(57)【要約】第一の局面において、標的タンパク質の調節因子をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、標的タンパク質を候補因子と接触させる工程；およびこの候補因子がその標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定する工程；を包含し、その標的タンパク質は、ＫＩＦ１４（配列番号２）またはＫＩＦ１４モータードメイン（配列番号３）に対して８０％より高いアミノ酸配列同一性を有する配列を含む。第二の局面において、本発明は、細胞増殖を調節する方法を提供し、この方法は、細胞に、有効量の標的タンパク質の活性の調節因子を投与する工程を包含する。この局面のいくつかの実施形態は、細胞過剰増殖障害（例えば、癌）を有する被験体を処置するための方法を提供する。第三の局面において、本発明は、標的タンパク質の活性のインヒビターを用いる処置のための候補被験体を同定するための方法を提供する。
2007515945.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
標的タンパク質を候補因子と接触させる工程；および
該候補因子が該標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定する工程；
を包含し、該標的タンパク質は、配列番号２または配列番号３において提供される配列に対して８０％より高いアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、（ａ）前記標的タンパク質を、第一濃度の前記候補因子と接触させ、該標的タンパク質の第一の活性レベルを測定し；（ｂ）該標的タンパク質を、第二濃度の該候補因子と接触させ、該標的タンパク質の第二の活性レベルを測定し；該標的タンパク質の第一の活性レベルと第二の活性レベルとの間の差異は、該候補因子が該標的タンパク質の活性を調節することを示す、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記標的タンパク質を、インビボで前記候補因子と接触させる、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記標的タンパク質を、インビトロで前記候補因子と接触させる、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、微小管刺激ＡＴＰアーゼアッセイを、前記候補因子が前記標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定するために使用する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、結合アッセイを、前記候補因子が前記標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定するために使用する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、微小管結合アッセイを、前記候補因子が前記標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定するために使用する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、微小管滑動アッセイを、前記候補因子が前記標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定するために使用する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、高スループットスクリーニングアッセイを、前記候補因子が前記標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定するために使用する、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載方法であって、蛍光、発光、放射能、または吸光度を、前記候補因子が前記標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定するために使用する、方法。
【請求項１１】
請求項３に記載の方法であって、前記標的タンパク質を前記候補因子とインビボで接触させる工程は、該標的タンパク質を細胞中で発現させる工程を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項３に記載の方法であって、細胞生存度アッセイを、前記候補因子が前記標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定するために使用する、方法。
【請求項１３】
請求項３に記載の方法であって、細胞形態アッセイを、前記候補因子が前記標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定するために使用する、方法。
【請求項１４】
請求項３に記載の方法であって、細胞増殖アッセイを、前記候補因子が前記標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定するために使用する、方法。
【請求項１５】
請求項３に記載の方法であって、細胞周期分布アッセイを、前記候補因子が前記標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定するために使用する、方法。
【請求項１６】
請求項３に記載の方法であって、アポトーシスアッセイを、前記候補因子が前記標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定するために使用する、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、前記標的タンパク質は、配列番号２において提供されるアミノ酸配列、配列番号３において提供されるアミノ酸配列、またはＡＴＰアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメントを含む、方法。
【請求項１８】
細胞増殖を調節する方法であって、該方法は、
細胞に、有効量の標的タンパク質の活性の調節因子を投与する工程
を包含し、該標的タンパク質は、配列番号２または配列番号３において提供される配列に対して８０％より高い配列同一性を有する配列を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記調節因子を、インビボで細胞に投与する、方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法であって、前記調節因子は、インヒビターである、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記インヒビターは、ＲＮＡインヒビターである、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記インヒビターは、ＫＩＦ１４  ＲＮＡインヒビターである、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記ＫＩＦ１４  ＲＮＡインヒビターは、配列番号８において提供される配列、配列番号９において提供される配列、または配列番号２３において提供される配列を含む、方法。
【請求項２４】
請求項２０に記載の方法であって、前記インヒビターは、セミカルバゾンである、方法。
【請求項２５】
請求項２０に記載の方法であって、前記インヒビターは、チオセミカルバゾンである、方法。
【請求項２６】
細胞過剰増殖障害を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、
細胞過剰増殖障害を有する被験体に、治療上有効な量の標的タンパク質の活性のインヒビターを投与する工程、
を包含し、該標的タンパク質は、配列番号２または配列番号３において提供される配列に対して８０％より高い配列同一性を有する配列を含む、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記細胞過剰増殖障害は、癌である、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記癌は、乳癌である、方法。
【請求項２９】
請求項２６に記載の方法であって、前記調節因子は、インヒビターである、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記インヒビターは、ＲＮＡインヒビターである、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記インヒビターは、ＫＩＦ１４  ＲＮＡインヒビターである、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記ＫＩＦ１４  ＲＮＡインヒビターは、配列番号８、配列番号９、または配列番号２３において提供される配列を含む、方法。
【請求項３３】
請求項２９に記載の方法であって、前記インヒビターは、セミカルバゾンである、方法。
【請求項３４】
請求項２９に記載の方法であって、前記インヒビターは、チオセミカルバゾンである、方法。
【請求項３５】
標的タンパク質の活性のインヒビターを用いる処置のための候補被験体を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）被験体の異常に増殖する細胞における標的タンパク質の発現レベルを測定する工程であって、該標的タンパク質は、配列番号２または配列番号３において提供される配列に対して８０％より高い配列同一性を有する配列を含む、工程；および
（ｂ）該異常に増殖する細胞における該標的タンパク質の発現レベルがコントロール細胞においてよりも有意に高い場合に、該被験体を、該標的タンパク質の活性のインヒビターを用いる処置のための候補被験体として同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記異常に増殖する細胞は、乳癌細胞である、方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法であって、前記標的タンパク質は、配列番号２において提供されるアミノ酸配列、配列番号３において提供されるアミノ酸配列、またはＡＴＰアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメントを含む、方法。
【請求項３８】
請求項３５に記載の方法であって、前記異常に増殖する細胞における前記標的タンパク質の発現レベルを、ｍＲＮＡレベルにて測定することにより決定する、方法。
【請求項３９】
請求項３５に記載の方法であって、前記候補被験体を、前記標的タンパク質の活性のインヒビターで処置する工程をさらに包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＫＩＦ１４タンパク質および関連タンパク質の活性の調節因子を同定するための方法、およびこれらの調節因子を使用して癌などの状態を処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
乳癌は、女性において最も一般的な癌であり、そして米国において２番目に一般的な癌死亡原因である。ＫＩＦ１４は、その発現が、診断において局所リンパ節中に腫瘍細胞を含まない患者における遠隔転移に対する時間間隔によって評価した場合に、乳癌の予後が悪い結果と正に相関する遺伝子として、同定された（ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：５３０〜５３６）。ＫＩＦ１４は、キネシンファミリー（ＫＩＦ）タンパク質のメンバーである。キネシンは、微小管依存性分子モーターであり、これは、ＡＴＰ加水分解からのエネルギーを使用して、微小管に沿って荷物を移動する。多くのキネシンは、細胞分裂において重要な役割を果たすことが示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
細胞増殖を阻害し、細胞増殖性障害（例えば、乳癌）を有する患者を処置するために有用である化合物を同定するための方法についての必要性が、存在する。特に、標的タンパク質（例えば、ＫＩＦ１４）の活性の調節因子を同定するための方法についての必要性が存在し、その標的タンパク質の発現は、癌患者において予後が悪いことに関連する。本発明は、これらの必要性に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
ＫＩＦ１４  ｃＤＮＡの配列が、配列番号１において提供される。第一の局面において、本発明は、標的タンパク質の調節因子をスクリーニングするための方法を提供し、その標的タンパク質は、ＫＩＦ１４（配列番号２）またはＫＩＦ１４モータードメイン（配列番号３）に対して、８０％より高いアミノ酸配列同一性を有する配列を含む。この方法は、標的タンパク質を候補因子と接触させる工程；およびその候補因子がこの標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定する工程；を包含する。いくつかの実施形態は、（ａ）上記標的タンパク質を、第一濃度の上記候補因子と接触させ、上記標的タンパク質の第一の活性レベルを測定し；（ｂ）上記標的タンパク質を、第二濃度の上記候補因子と接触させ、上記標的タンパク質の第二の活性レベルを測定する、方法を提供し、上記標的タンパク質の第一の活性レベルと第二の活性レベルとの間の差異は、上記候補因子が上記標的タンパク質の活性を調節することを示す。いくつかの実施形態において、上記標的タンパク質は、ＫＩＦ１４のアミノ酸配列（配列番号２）を含む。上記標的タンパク質はまた、ＫＩＦ１４モータードメインをコードするアミノ酸３５６〜７０９（配列番号３）を含み得るか、またはＡＴＰアーゼ活性を有する配列番号３の任意のフラグメントを含み得る。例えば、上記標的タンパク質は、ＫＩＦ１４タンパク質のアミノ酸３４２〜７２０の間の配列（配列番号４）を含むタンパク質、ＫＩＦ１４タンパク質のアミノ酸３４２〜７１０の間の配列（配列番号５）を含むタンパク質、ＫＩＦ１４タンパク質のアミノ酸３５４〜アミノ酸７２０の間の配列（配列番号６）を含むタンパク質、またはＫＩＦ１４タンパク質のアミノ酸３５４〜アミノ酸７１０の間の配列（配列番号７）を含むタンパク質であり得る。
【０００５】
上記標的タンパク質は、インビボまたはインビトロで上記候補因子と接触させられ得る。例えば、この方法はまた、細胞中で上記標的タンパク質を発現させる工程も包含し得る。上記標的タンパク質の活性を測定するために使用されるアッセイとしては、ＡＴＰアーゼアッセイ、結合アッセイ、微小管結合アッセイ、微小管滑動（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｇｌｉｄｉｎｇ）アッセイ、細胞増殖アッセイ、細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）アッセイ、細胞周期分布（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）アッセイ、および細胞死アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。これらのアッセイは、上記候補因子が上記標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定するために、蛍光、発光、放射能、または吸光度を使用し得る。いくつかの実施形態において、高スループットスクリーニングアッセイが、上記候補因子が上記標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定するために使用される。
【０００６】
第二の局面において、本発明は、細胞増殖を調節する方法を提供し、この方法は、細胞に、有効量の標的タンパク質の活性の調節因子を投与する工程を包含し、この標的タンパク質は、配列番号２または配列番号３において提供される配列に対して８０％より高い配列同一性を有する配列を含む。上記調節因子は、インビトロ（例えば、組織培養中）またはインビボで（例えば、被験体に）細胞に投与され得る。いくつかの実施形態において、上記標的タンパク質は、配列番号２において提供されるアミノ酸配列、配列番号３において提供されるアミノ酸配列、またはＡＴＰアーゼ活性を有する配列番号３の任意のフラグメントを含む。上記標的タンパク質の活性の調節因子は、インヒビター（例えば、標的タンパク質発現のインヒビター、またはその標的タンパク質による微小管依存性ＡＴＰ加水分解のインヒビター）であり得る。いくつかの実施形態において、上記調節因子は、ＲＮＡインヒビター（例えば、配列番号８において提供される配列、配列番号９において提供される配列、または配列番号２３において提供される配列を含む、ＫＩＦ１４  ＲＮＡインヒビター）である。いくつかの実施形態において、上記調節因子は、上記標的タンパク質による微小管依存性ＡＴＰ加水分解のインヒビターである。上記標的タンパク質による微小管依存性ＡＴＰ加水分解のインヒビターとしては、有機低分子化合物（例えば、セミカルバゾンおよびチオセミカルバゾン）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、上記インヒビターは、アリルチオセミカルバゾンであり得る。
【０００７】
本発明のこの局面のいくつかの実施形態は、細胞過剰増殖障害（例えば、癌）を有する被験体を処置するための方法を提供する。これらの方法は、細胞過剰増殖障害（例えば、乳癌）を有する被験体に、治療上有効な量の標的タンパク質の活性のインヒビターを投与する工程を包含し、この標的タンパク質は、配列番号２または配列番号３において提供される配列に対して８０％より高い配列同一性を有する配列を含む。本発明のこの局面のいくつかの実施形態は、細胞過剰増殖障害を有する被験体に、治療上有効な量の既知治療剤と、標的タンパク質の活性のインヒビターとを投与する工程によって、その細胞増殖障害を有する被験体を処置する方法を提供する。
【０００８】
第三の局面において、本発明は、標的タンパク質の活性の調節因子を用いる処置のための候補被験体を同定するための方法を提供し、その標的タンパク質は、配列番号２または配列番号３において提供される配列に対して８０％より高い配列同一性を有する配列を含む。これらの方法は、（ａ）被験体のサンプル細胞における標的タンパク質の発現レベルを測定する工程；および（ｂ）そのサンプル細胞における上記標的タンパク質の発現レベルがコントロール細胞においてよりも有意に異なる場合に、その被験体を、上記標的タンパク質の活性の調節因子を用いる処置のための候補被験体として同定する工程；を包含する。いくつかの実施形態において、上記標的タンパク質は、配列番号２において提供されるアミノ酸配列、配列番号３において提供されるアミノ酸配列、またはＡＴＰアーゼ活性を有する配列番号３の任意のフラグメントを含む。サンプル細胞における上記標的タンパク質の発現レベルは、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルにて測定することにより決定され得る。上記方法は、上記候補被験体を、上記標的タンパク質の活性の調節因子で処置する工程をさらに包含し得る。
【０００９】
いくつかの実施形態は、（ａ）被験体の異常に増殖する細胞における標的タンパク質の発現レベルを測定する工程；および（ｂ）その異常に増殖する細胞における上記標的タンパク質の発現レベルがコントロール細胞においてよりも有意に高い場合に、その被験体を、上記標的タンパク質の活性のインヒビターを用いる処置のための候補被験体として同定する工程によって、上記標的タンパク質の活性のインヒビターを用いる処置のための候補被験体を同定するための方法を提供する。上記方法は、上記候補被験体を、上記標的タンパク質の活性のインヒビターを用いて処置する工程をさらに包含し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、標的タンパク質の調節因子をスクリーニングするための方法を提供する。本発明はまた、有効量の標的タンパク質インヒビターを投与することにより、細胞増殖を阻害するための方法および細胞増殖障害を有する被験体を処置する方法を提供する。さらに、本発明は、標的タンパク質のインヒビターを用いる処置のための候補被験体を同定するための方法を提供する。これらの方法のいくつかの実施形態において、上記標的タンパク質は、ＫＩＦ１４タンパク質（配列番号２）である。いくつかの実施形態において、上記標的タンパク質は、ＫＩＦ１４タンパク質（配列番号２）またはＫＩＦ１４のモータードメイン（配列番号３）に対して８０％より高いアミノ酸配列類似性を有する配列を含むタンパク質である。
【００１１】
ＫＩＦ１４転写物（配列番号１）の発現は、診断において局所リンパ節中に腫瘍細胞を含まない患者における遠隔転移に対する時間間隔によって評価した場合に、乳癌の予後が悪い結果と正に相関することが、見出された（ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：５３０〜５３６）。ＫＩＦ１４遺伝子は、推定キネシンモータードメイン（ＭＤ）（配列番号３）を含むタンパク質（配列番号２）をコードする。本明細書中で使用される場合、用語「モータードメイン」とは、キネシンスーパーファミリーモータードメインにおける構成員であることを与える、標的タンパク質のドメインを指す（例えば、ＶａｌｅおよびＦｌｅｔｔｅｒｉｃｋ（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３：７４５〜７７参照）。ＫＩＦ１４転写物（配列番号１）の発現は、実施例１に記載されるように、腫瘍細胞において上昇する。増殖因子で処理された細胞株におけるＫＩＦ１４発現パターンは、実施例２において記載されるような、有糸分裂性キネシンのＫＩＦ１４発現パターンと類似する。さらに、有糸分裂の間のＫＩＦ１４  ｍＲＮＡの蓄積および有糸分裂の間のＫＩＦ１４タンパク質の動的細胞局在化は、実施例３において記載されるように、有糸分裂性キネシンについて観察されるものと類似する。さらに、細胞におけるＫＩＦ１４発現の減少は、実施例４において記載されるように、増殖阻害および細胞死をもたらす。具体的には、ＫＩＦ１４発現の減少は、実施例５および実施例６において記載されるように、異常な細胞質分裂と関連する。細胞質分裂におけるＫＩＦ１４除去の影響は、実施例６において示されるように、正常細胞においてよりも腫瘍細胞において顕著である。
【００１２】
第一の局面において、本発明は、標的タンパク質の調節因子をスクリーニングするための方法を提供し、その標的タンパク質は、ＫＩＦ１４（配列番号２）またはＫＩＦ１４モータードメイン（配列番号３）に対して８０％より高いアミノ酸配列同一性を有する配列を含む。上記方法は、標的タンパク質を候補因子と接触させる工程；およびその候補因子がこの標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定する工程；を包含する。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、用語「標的タンパク質」とは、ＫＩＦ１４の生物学的活性（例えば、ＡＴＰアーゼアッセイにおいて試験されるような、微小管により刺激されるＡＴＰアーゼ活性が挙げられるが、これに限定はされない）のうちの１つ以上を有するタンパク質を指す。「ＡＴＰアーゼ活性」とは、ＡＴＰを加水分解する能力を指す。生物学的活性はまた、微小管滑動（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｇｌｉｄｉｎｇ）アッセイまたは微小管結合アッセイにおいて、実証され得る。標的タンパク質の他の生物学的活性としては、重合／解重合（微小管の動態に対する影響）、紡錘体の他のタンパク質への結合、細胞周期制御に関与するタンパク質への結合、または他の酵素（キナーゼもしくはプロテアーゼ）に対する基質として作用すること、および特定のキネシン細胞活性（染色体分離への関与）が挙げられ得る。用語「タンパク質」とは、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を含む化合物を指す。この標的タンパク質は、真核生物または原核生物（例えば、哺乳動物、真菌、細菌、昆虫、植物、およびウイルス）に由来し得る。
【００１４】
さらに、本発明の方法において使用される標的タンパク質は、ＫＩＦ１４（配列番号２）またはＫＩＦ１４モータードメイン（配列番号３）に対して８０％より高いアミノ酸配列同一性（例えば、９０％より高いアミノ酸配列同一性、９５％より高いアミノ酸配列同一性、または９９％より高いアミノ酸配列同一性）を有する配列を有するタンパク質である。用語「同一」または「同一性」パーセントとは、２つ以上のアミノ酸配列の文脈においては、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用するかまたは手作業整列および視認により測定して、比較ウィンドウにわたって比較して最大対応について整列した場合に、同じであるか、もしくは特定の割合の同じアミノ酸残基を有する、２つ以上の配列もしくは部分配列を指す。
【００１５】
同一ではないアミノ酸位置は、しばしば、保存的アミノ酸置換によって異なり、この保存的アミノ酸置換において、あるアミノ酸残基が、類似する化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基を置換しており、従って、その分子の機能的特性を変化させないことが、認識される。配列が保存的置換にて異なる場合、配列同一性パーセントは、その置換の保存的性質について補正するために上向きに調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者にとって周知である。保存的置換のスコアリングは、例えば、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒｓ（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１〜１７のアルゴリズムに従って計算され得る。
【００１６】
「比較ウィンドウ」とは、連続する位置（例えば、約２５位置と約６００位置との間、または約５０位置〜２００位置の間、または約１００位置と１５０位置との間）のセグメントに対する言及を包含し、そのセグメント全体にわたって、配列と参照配列とが最適に整列された後で、その配列は、同じ連続位置数の参照配列と比較され得る。比較のために配列を整列する方法は、当該分野で周知である。比較のために配列を最適に整列することは、例えば、局所相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）、グローバルアライメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）、類似性検索方法（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜４０２））、代表的にはデフォルト設定を使用するこれらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＢＬＡＳＴ）、または手作業による整列および視認（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）Ａｕｓｕｂｅｌら編参照）によって、実施され得る。例えば、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレンクス＝３を使用して実施され得、ＫＩＦ１４のアミノ酸配列（配列番号２）またはＫＩＦ１４モータードメインのアミノ酸配列（配列番号３）に対して８０％より高く同一であるアミノ酸配列が、得られ得る。
【００１７】
有用なアルゴリズム実施の一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進行性対合アライメントを使用して、一群の関連配列から多重配列アライメントを作成する。ＰＩＬＥＵＰはまた、そのアライメントを作成するために使用されるクラスター化の関連性を示す樹状図をプロットし得る。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜６０の進行性整列方法の単純化を使用する。使用される方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜３により記載された方法と類似する。この多重アライメント手順は、最も類似する２つの配列の対合アライメントから始まり、整列された２つの配列のクラスターを作成する。その後、このクラスターは、次に最も関連する配列とか、または整列された配列のクラスターと、整列され得る。２つの配列クラスターは、２つの個々の配列の対合アライメントの単純な伸長によって、整列され得る。各反復においてますます類似しない配列および配列クラスターを含むこのような一連の対合アライメントは、最終アライメントを作成する。
【００１８】
標的タンパク質の定義はまた、ＫＩＦ１４をコードする配列（配列番号１）にハイブリダイズして、ＫＩＦ１４（配列番号１）ホモ二重鎖のＴｍの２０℃以内にあるＴｍでヘテロ二重鎖を形成する核酸配列によってコードされるタンパク質を包含する。ＤＮＡ二重鎖の融解温度は、式：
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ+］＋０．４１（Ｇ＋Ｃ画分）−０．６３（ホルムアミド％）−（６００／ｌ）
を使用して計算され、ｌは、塩基対で示したそのハイブリッドの長さである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、第９．５１頁）。この等式は、ＯＤ２５７における深色性の光学的測定によって定義される、「可逆的」Ｔｍに適用される。この融解温度は、配列同一性が１％減少することに対して１℃〜１．５℃減少する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、第９．５１頁）。
【００１９】
また、本発明の標的タンパク質の定義内に包含されるのは、野生型標的タンパク質のアミノ酸配列改変体である。これらの改変体は、置換改変体、挿入改変体、または欠失改変体という３つの種類のうちの１つ以上に当てはまる。これらの改変体は、標的タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって調製され得る。部位特異的変異誘発は、カセット変異誘発もしくはＰＣＲ変異誘発または当該分野で周知の他の技術を使用して実施され得、その改変体をコードするＤＮＡが生成され得、その後、そのＤＮＡは組換え細胞培養物中で発現され得る。約１００〜１５０アミノ酸残基までを有する改変体標的タンパク質フラグメントが、確立された技術を使用してインビトロ合成により調製され得る。アミノ酸配列改変体は、その改変の所定の性質（その標的タンパク質アミノ酸の天然に存在する対立遺伝子改変体または種間改変から、その改変体を際立たせる特徴）によって特徴付けられる。その改変体は、代表的には、天然に存在するアナログと同じ定性的生物学的活性を示すが、改変された特性を有する改変体もまた、選択され得る。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野で周知である（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５〜９）。
【００２０】
アミノ酸置換は、代表的には、一残基の置換である。挿入は、通常は、ほぼ、約１アミノ酸〜約２０アミノ酸であるが、かなり長い挿入が、許容され得る。欠失は、約１残基〜約２０残基の範囲であるが、いくつかの場合、欠失は、もっと長いものであり得る。置換、欠失、および挿入、またはこれらの任意の組み合わせが、最終誘導体に到達するために使用され得る。
【００２１】
従って、上記方法のいくつかの実施形態において、上記標的タンパク質は、ＫＩＦ１４タンパク質（配列番号２）を含む。他の実施形態において、上記標的タンパク質は、ＫＩＦ１４モータードメイン（配列番号３）をコードするＫＩＦ１４タンパク質（配列番号２）の一部、または微小管依存性ＡＴＰアーゼ活性を有するそのフラグメントを含む。例えば、上記標的タンパク質は、ＫＩＦ１４タンパク質のアミノ酸３４２〜アミノ酸７２０の間の配列（配列番号４）を含むタンパク質であり得る。あるいは、上記標的タンパク質は、ＫＩＦ１４タンパク質のアミノ酸３４２〜アミノ酸７１０の間の配列（配列番号５）を含むタンパク質、ＫＩＦ１４タンパク質のアミノ酸３５４〜アミノ酸７２０の間の配列（配列番号６）を含むタンパク質、またはＫＩＦ１４タンパク質のアミノ酸３５４〜アミノ酸７１０の間の配列（配列番号７）を含むタンパク質であり得る。
【００２２】
本発明の方法において使用される標的タンパク質は、代表的には、発現系を使用して発現され、そして精製される。発現系は、発現ベクターおよび宿主細胞を含む。この発現ベクターは、自己複製する染色体外ベクター、または宿主ゲノム中に組み込むベクターのいずれかであり得る。一般的には、発現ベクターは、転写調節核酸および翻訳調節核酸を、上記標的タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されて含む。用語「制御配列」とは、作動可能に連結されたコード配列が特定の宿主生物において発現するために必要な、ＤＮＡ配列を指す。原核生物のために適切な制御配列としては、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。核酸は、その核酸が別の核酸配列と機能的関係にあるように配置された場合に、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、あるポリペプチドのＤＮＡに対して、そのＤＮＡがそのポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合に、作動可能に連結されている。プロモーターまたはエンハンサーは、あるコード配列に対して、そのプロモーターまたはエンハンサーがそのコード配列の転写に影響を与える場合に、作動可能に連結されている。あるいはリボソーム結合部位は、あるコード配列に対して、そのリボソーム結合部位が翻訳を促進するように配置された場合に、作動可能に連結されている。作動可能に連結されているＤＮＡ配列は、連続的していても、不連続であってもよい。連結は、ライゲーションによって（例えば、好都合な制限部位におけるライゲーションによって）、達成され得る。そのような部位が存在しない場合には、平滑末端ライゲーションおよび／または合成オリゴヌクレオチドアダプターもしくは合成オリゴヌクレオチドリンカーが、使用され得る。上記転写調節核酸および翻訳調節核酸は、一般的には、上記標的タンパク質を発現するために使用される宿主細胞にとって適切である。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来の転写調節核酸配列および翻訳調節核酸配列が、好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓにおいて上記標的タンパク質を発現するために使用される。多数の型の適切な発現ベクターおよび適切な調節配列が、種々の宿主細胞について当該分野で公知である。
【００２３】
一般的には、上記転写調節配列および翻訳調節配列はとしては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終止配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。プロモーター配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターをコードする。これらのプロモーターは、天然に存在するプロモーターであっても、またはハイブリッドプロモーターであってもよい。ハイブリッドプロモーターは、１つより多くのプロモーターのエレメントを合わせており、これもまた、当該分野で公知である。
【００２４】
発現ベクターは、さらなるエレメントを含み得る。例えば、その発現ベクターは、２つの複製系を有し得、それにより、その発現ベクターが２種の生物において（例えば、発現のために哺乳動物細胞または昆虫細胞中にて、そしてクローニングおよび複製のために原核生物宿主において）維持されるのを可能にし得る。さらに、発現ベクターを組み込むために、その発現ベクターは、宿主細胞ゲノム中の配列に対して相同な少なくとも１つの配列を含み、好ましくは、その発現構築物に隣接する２つの相同な配列を含む。その組み込みベクターは、そのベクター中に含めるために適切な相同な配列を選択することによって、その宿主細胞中の特定の位置に対して向けられ得る。組み込みベクターのための構築物は、当該分野で周知である。
【００２５】
さらに、発現ベクターは、代表的には、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は、当該分野で周知であり、そしてそれは、使用される宿主細胞により変化する。
【００２６】
本発明において使用される標的タンパク質は、標的タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、その標的タンパク質の発現を誘導するかまたは引き起こすために適切な条件下で培養することによって、生成され得る。標的タンパク質発現のために適切な条件は、その発現ベクターおよび宿主細胞の選択により変化し、そしてそれは、慣用的実験を使用して当業者によって容易に確定される。例えば、その宿主細胞の成長および増殖は、その発現ベクター中での構成的プロモーターの使用のために最適にされ得る。誘導のために適切な増殖条件が、誘導性プロモーターの使用のために提供される。さらに、いくつかの実施形態において、例えば、バキュロウイルス系を使用する場合には、採集の時期が重要である。
【００２７】
適切な宿主細胞としては、酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞、真菌細胞、および昆虫細胞、および動物細胞（哺乳動物細胞を包含する）が挙げられる。特に興味深いのは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび他の酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｆ９細胞、Ｃ１２９細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＴＨＰ１細胞株（マクロファージ細胞株）、ならびにヒト細胞およびヒト細胞株である。
【００２８】
従って、いくつかの実施形態において、上記標的タンパク質は、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現系もまた、当該分野で公知であり、それには、レトロウイルス系が挙げられる。ウイルス遺伝子由来のプロモーターは、哺乳動物発現系において頻繁に使用される。なぜなら、このウイルスの遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広い宿主範囲を有するからである。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびＣＭＶプロモーターが挙げられる。代表的には、哺乳動物細胞により認識される、転写終結配列およびポリアデニル化配列が、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントとともにコード配列に隣接する。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０に由来する、転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルが挙げられる。
【００２９】
外因性核酸を哺乳動物宿主および他の宿主に導入する方法は、当該分野において周知であり、使用される宿主細胞とともに変化する。技術としては、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、ポリヌクレオチドのリポソームへの封入およびＤＮＡの核への直接のマイクロインジェクションが挙げられる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、上記標的タンパク質は、細菌系において発現される。細菌発現系は、当該分野において周知である。バクテリオファージからのプロモーターがまた使用され得、そして当該分野において公知である。さらに、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターがまた有用である；例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列とｌａｃプロモーター配列とのハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターとしては、細菌性ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始する能力を有する非細菌性起源の天然に存在するプロモーターが挙げられ得る。機能的プロモーター配列に加えて、有効なリボソーム結合部位が所望される。発現ベクターはまた、細菌中で上記標的タンパク質の分泌を提供する、シグナルペプチド配列を含み得る。上記標的タンパク質は、増殖培地中に分泌されるか（グラム陽性細菌）、または上記細胞の内膜と外膜との間に位置するペリプラズム空間に分泌されるか（グラム陰性細菌）のいずれかである。上記発現ベクターはまた、上記標的タンパク質のアフィニティー精製を提供するエピトープ標識を含み得る。上記細菌発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子を含み、形質転換された細菌株の選択を可能にし得る。適切な選択遺伝子としては、上記細菌を、薬物(例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリン)に対して耐性にする遺伝子が挙げられる。選択マーカーとしてはまた、生合成遺伝子（例えば、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシンの生合成経路における生合成遺伝子）が挙げられる。これらの構成要素は、発現ベクター中に集められる。細菌のための発現ベクターは、当該分野において周知であり、そしてこれらの発現ベクターとしては、とりわけ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓに対するベクターが挙げられる。上記細菌発現ベクターは、当該分野における周知技術（例えば、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーションなど）を用いて細菌宿主細胞に形質転換される。細菌発現系を用いたＫＩＦ１４運動性ドメインタンパク質の発現のための例示的方法は、実施例７に記載される。
【００３１】
標的タンパク質はまた、昆虫細胞中で生成され得る。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター（特に、バキュロウイルスベースの発現ベクター）は、当該分野において周知である。さらに、標的タンパク質は、酵母細胞中で生成され得る。酵母発現系は、当該分野において周知であり、そしてこれらとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅならびにＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのための発現ベクターが挙げられる。
【００３２】
上記標的タンパク質はまた、当該分野における周知技術を用いて、融合タンパク質として作製され得る。例えば、上記標的タンパク質は、融合タンパク質として作製されて、発現を上昇し得るかまたは標的タンパク質と、抗標識抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供する標識ポリペプチドとを結合し得る。例示的標識としては、ｍｙｃエピトープおよび６−ヒスチジンが挙げられる。上記エピトープ標識は、一般的に、上記標的タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に位置する。標的タンパク質のこのようなエピトープ標識形態の存在は、上記標識ポリペプチドに対する抗体を用いて検出され得る。従って、上記エピトープ標識は、上記標的タンパク質が、抗標識抗体または上記エピトープ標識に結合する別の型のアフィニティーマトリックスを用いるアフィニティー精製によって容易に精製されることを可能にする。種々の標識ポリペプチドおよびそれらの対応する抗体は、当該分野において周知である。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）標識またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）標識；ｆｌｕ  ＨＡ標識ポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９−６５）；ｃ−ｍｙｃ標識およびその８Ｆ９抗体、３Ｃ７抗体、６Ｅ１０抗体、Ｇ４抗体、Ｂ７抗体および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３６１０−６）ならびに単純疱疹ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）標識およびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら（１９９０）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．３（６）：５４７−５３）が挙げられる。他の標識ポリペプチドとしては、Ｆｌａｇペプチド（Ｈｏｐｐら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６：１２０４−１０）；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１９２−４）；チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら（１９９１）Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５１６３−６）；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチド標識（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３９３−７）が挙げられる。
【００３３】
本発明の方法において使用される標的タンパク質は、標識され得る。本明細書中で使用される場合、用語「標識された」とは、上記標的タンパク質の検出を可能にするための少なくとも１つの元素、同位体または化学化合物の結合をいう。標識は、分光学的手段、光化学的手段、生物化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学手段によって検出され得る任意の組成物である。従って、標識は、同位体標識（放射性同位体であっても重同位体であってもよい）、免疫標識（抗体であっても抗原であってもよい）および色素または蛍光色素であり得る。上記標識は、任意の位置で、上記標的タンパク質に組み込まれ得る。例えば、上記標識は、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで、検出可能シグナルを生成可能であるべきである。上記検出可能部分は、放射性同位体、蛍光化合物もしくは化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリン）または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る。上記標識を上記標的タンパク質に結合するための当該分野において公知の任意の方法が、用いられ得る。
【００３４】
標的タンパク質の共有結合改変は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合改変の１つの型としては、標的タンパク質の標的アミノ酸残基と、標的タンパク質の選択された側鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基との反応を可能にする有機誘導体化試薬との反応が挙げられる。二官能性試薬を用いた誘導体化は、例えば、標的タンパク質を、非水溶性の支持体マトリックスまたはスクリーニングアッセイにおける用途のための表面に架橋するために、有用である。一般的に使用される架橋剤としては、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、同種二官能性イミドエステル（ジスクシンイミジルエステル（例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート））、二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような試薬を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
上記標的タンパク質は、発現後に精製または単離され得る。用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋」とは、実質的または本質的に、天然の状態に見られるような通常はそれに付随する成分を、含まない物質をいう。純度および均一性は、代表的に、分析化学技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィー）を用いて決定される。調製物中に存在する主要な種類であるタンパク質は、実質的に純粋である。用語「精製された」とは、タンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを示す。例えば、用語「精製された」は、上記タンパク質が、少なくとも８５％純粋（例えば、少なくとも９５％純粋、例えば、少なくとも９９％純粋）であることを意味する。
【００３６】
標的タンパク質は、他のどの成分がそのサンプル中に存在するかに依存して、当業者に公知の種々の方法で、単離または精製され得る。標準的な精製方法としては、電気泳動技術、分子技術、免疫学的技術およびクロマトグラフィー技術（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーおよびクロマトフォーカシング（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）を含む）が挙げられる。例えば、上記標的タンパク質は、標準的な抗ＫＩＦ１４抗体カラム（例えば、ＫＩＦ１４抗体  ａｂ３７４６，Ａｂｃａｍを参照のこと）を用いて精製され得る。タンパク質濃縮と組み合わせた限外濾過技術および透析技術はまた、有用である。適切な精製技術は、当該分野において標準的なものである（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（１９８２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹを参照のこと）。精製の必要性の程度は、上記標的タンパク質の用途に依存して変化する。いくつかの場合、精製は必要とされなくてもよい。本発明の方法における使用のために標的タンパク質を精製するための例示的なプロトコールは、実施例７および８に提供される。
【００３７】
本発明のこの局面の方法の第１の工程において、上記標的タンパク質は、候補因子と接触される。候補因子は、多くの化学的なクラスを含み得る。代表的に、候補因子は、有機分子（好ましくは、１００ダルトン超かつ約２５００ダルトン未満の分子量を有する低分子有機化合物）である。低分子は、本明細書中で、１５０ダルトンと２０００ダルトンとの間の分子量（例えば、１５００ダルトン未満または１２００ダルトン未満または１０００ダルトン未満または７５０ダルトン未満または５００ダルトン未満）を有するとしてさらに規定される。従って、低分子は、約１００ダルトン〜２００ダルトンの分子量を有し得る。候補因子は、タンパク質との構造的相互作用（特に、水素結合）のために必要な官能基を含み、そして代表的には、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくは、上記官能化学基のうちの少なくとも２つを含む。上記候補因子は、しばしば、上記官能基のうちの１つ以上で置換された環状炭素または複素環構造および／または芳香環構造もしくはポリ芳香環構造を含む。候補因子はまた、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログまたはそれらの組み合わせを含む生体分子中に見られる。
【００３８】
候補因子は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む広範な種々の供給源からもたらされ得る。例えば、多くの手段が、広範な種々の有機化合物および生体分子のランダムな合成または直接的な合成のために利用可能であり、これらの手段としては、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現が挙げられる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態にある天然化合物のライブラリーが、利用可能であるかまたは容易に生成される。さらに、天然にまたは合成的に生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段および生物化学的手段を介して容易に改変される。公知の薬理学的な因子は、直接的な化学的改変またはランダムな化学的改変（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化およびアミド化）に供されて、構造アナログを生成し得る。
【００３９】
上記方法の第２の工程は、上記候補因子が、上記標的タンパク質の活性を調節するか否かを決定する工程を包含する。本明細書中で使用される場合、用語「標的タンパク質の活性を調節する」とは、上記標的タンパク質の活性のあらゆる変化（例えば、上記活性の減少または上昇）をいう。代表的に、サンプルまたはアッセイは、試験濃度およびコントロール濃度で、候補因子を用いて処理される。上記コントロール濃度は、ゼロであり得る。上記２つの濃度の間で標的タンパク質活性に変化がある場合、この変化は、上記候補因子が、上記標的タンパク質の活性を調節することを示す。従って、いくつかの実施形態は、（ａ）上記標的タンパク質が、第１の濃度で上記候補因子と接触され、そして上記標的タンパク質の活性の第１のレベルが測定され；そして（ｂ）上記標的タンパク質が、第２の濃度で上記候補因子と接触され、そして上記標的タンパク質の活性の第２のレベルが測定される、方法を提供し、ここで、上記標的タンパク質の上記活性の第１のレベルと上記活性の第２のレベルとの間の差は、上記候補因子が、上記標的タンパク質の活性を調節することを示す。活性の差は、上昇しても減少してもよく、コントロールと比較して、少なくとも２０％〜５０％（例えば、少なくとも５０％〜７５％、例えば、少なくとも７５％〜１００％、例えば、少なくとも１５０％〜２００％、例えば、少なくとも２００％〜１０００％）の変化であり得る。さらに、活性の差は、結合特異性および基質の変化によって示され得る。
【００４０】
上記標的タンパク質の活性は、インビトロアッセイおよび精製タンパク質または部分的に精製されたタンパク質を用いて測定され得る。上記標的タンパク質の活性はまた、細胞内で上記標的タンパク質を発現することによるインビトロアッセイを用いて測定され得る。使用されるアッセイは、少なくとも２つのデータ点を有する複数時間点（ｍｕｌｔｉ−ｔｉｍｅ−ｐｏｉｎｔ）（速度論的）アッセイであり得る。複数測定の場合、上記タンパク質活性の絶対的速度が決定され得る。当業者に理解されるように、上記アッセイにおける成分は、標的タンパク質活性をアッセイし、そして最適シグナルを与えるための緩衝液中および試薬中に添加され得る。さらに、速度論的測定を可能にするために、インキュベーション時間は、代表的に、最適化されて、バックグラウンドを上回る充分な検出シグナルを与える。
【００４１】
上記標的タンパク質の活性を測定するためのアッセイとしては、ＡＴＰアーゼ活性、微小管滑動（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｇｌｉｄｉｎｇ）、微小管重合／脱重合活性（微小管動力学に対する効果）および結合活性（例えば、微小管結合、紡垂体のタンパク質への結合、細胞周期制御に関与するタンパク質への結合またはヌクレオチドアナログの結合）の測定が挙げられる（例えば、Ｋｏｄａｍａら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９：１４６５−７２；Ｓｔｅｗａｒｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５２０９−１３；Ｌｏｍｂｉｌｌｏら（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２８：１０７−１５；Ｖａｌｅら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４２：３９−５０を参照のこと）。使用される標的タンパク質が、別の特定の活性（例えば、有糸分裂または軸索輸送への関与）を有する場合、それらの特定の活性のためのアッセイが使用され得る。例示的なアッセイは、以下に記載される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、上記標的タンパク質の活性を測定するために使用されるアッセイとしては、実施例７〜９に記載されるようなＡＴＰアーゼ活性の測定が挙げられる。従って、ＡＤＰまたはホスフェートが、標的タンパク質活性のための読み出しとして使用される。これらの実施形態において、上記標的タンパク質は、上記標的タンパク質によるＡＤＰまたはホスフェートの生成を可能にする条件下で、上記候補因子と接触され、そして、上記標的タンパク質による上記候補因子のＡＤＰまたはホスフェートの生成に対する効果が測定される。上記標的タンパク質によるＡＤＰまたはホスフェートの生成を可能にする条件は、上記標的タンパク質の活性を調節する候補因子の非存在下で、ＡＤＰまたはホスフェートを生成する反応が通常生じる条件である。
【００４３】
ＡＤＰまたはホスフェートの上記生成は、酵素学的に測定され得る。ＡＤＰを基質として使用する、当該分野において公知の多くの酵素反応が存在する。例えば、キナーゼ反応（例えば、ピルビン酸キナーゼ反応）は、周知であり、そしてＡＴＰの再生成を可能にする（例えば、Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ（１９５６）Ｎａｔｕｒｅ  １７８：６３２−４を参照のこと）。上記酵素反応の活性レベルは、直接的に決定され得る。例えば、ピルビン酸キナーゼ反応において、ピルベートまたはＡＴＰは、当該分野において公知の従来方法により測定され得る。ＡＤＰを基質として使用する酵素反応の活性レベルはまた、別の反応（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ反応）と連結することにより、間接的に測定され得る。連結による酵素反応の測定は、当該分野において公知である（例えば、Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ（１９５６）Ｎａｔｕｒｅ  １７８：６３２−４を参照のこと）。
【００４４】
さらに、ホスフェートを利用する多くの反応（例えば、プリンヌクレオシドリン酸化反応）が存在する。この反応は、当該分野において公知の従来方法によって直接的に測定され得る。上記反応はまた、上記反応と別の反応（例えば、通常、プリンアナログの切断を可能にする条件下での、プリンアナログ切断反応）とを連結することによって、間接的に測定され得る（例えば、Ｗｅｂｂ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４８８４−７；Ｒｉｅｇｅｒら（１９９７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４６：８６−９５；Ｂａｎｉｋら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６６：６１１−４を参照のこと）。あるいは、キサンチンオキシダーゼは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼと連結して使用されて、ホスフェート生成と、キサンチンオキシダーゼに対する基質の吸光度の変化とを連結し得る（Ｕｎｇｅｒｅｒら（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．２２３：１４９−５７）。
【００４５】
ＡＤＰまたはホスフェートの上記生成は、例えば、上記ＡＤＰまたはホスフェートと検出可能化合物との結合または反応によって、非酵素的に検出され得る。例えば、遊離のホスフェートのホスホモリブデート錯体への変換を含むホスホモリブデートベースのアッセイが、使用され得る（Ｆｉｓｋｅら（１９２５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６６：３７５−４００）。上記ホスホモリブデートを定量する１つの方法は、マラカイトグリーン（ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ）を用いる。あるいは、ホスフェート結合タンパク質（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉホスフェート結合タンパク質）の蛍光標識形態が使用されて、その蛍光のシフトによってホスフェートを測定し得る。
【００４６】
好ましい実施形態において、上記アッセイの検出は、検出可能標識（例えば、同位体標識（放射性同位体または重同位体）、磁気、電気、熱、色素または蛍光色素、酵素、粒子（例えば、磁気粒子））を使用して実施される。上記色素は、発色団、リン光体または蛍光色素であり得る。代表的に、蛍光シグナルは、検出のための良好なシグナル対ノイズ比を提供する。本発明における使用のために適切な色素としては、蛍光ランタニド錯体（ユーロピウムおよびテルビウムの蛍光ランタニド錯体を含む）、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ）、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）およびそれらの誘導体ならびにその他が挙げられるが、これらに限定されない（また、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｈｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第６版を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ホスフェート生成は、色素キナルジンレッドを用いて測定され、この色素キナルジンレッドは、実施例７〜９に記載されるように、無機ホスフェートに結合すると、５４０ｎｍの波長で光を吸収する。
【００４７】
本発明は、標的タンパク質活性の調節因子として働く能力に対して、候補因子をスクリーニングする方法を提供する。例えば、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）システムが使用され得る。ＨＴＳシステムは、ロボットシステムの使用を含み得、そして多くのサンプルが短時間で処理され得るという利益を提供し得る。ＨＴＳシステムは、市販されている（例えば、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、Ｍａｓｓ．；Ａｉｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｍｅｎｔｏｒ、Ｏｈｉｏ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆ．；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓ．を参照のこと）。ＨＴＳシステムは、代表的に、手順全体（全てのサンプルおよび試薬のピペッティング、液体の分配、決められた時間のインキュベーションおよび上記アッセイのために適切な検出器におけるマイクロプレートの最終的な読み取りを含む）を自動化する。これらの設置可能なシステムは、変更され得、そして高スループット、迅速な始動および高度な柔軟性を提供し得る。
【００４８】
複数のアッセイ混合物が、種々の候補因子濃度で並行して実行されて、その種々の濃度に対する示差的反応をもたらし得る。代表的に、これらの濃度のうちの１つは、ネガティブコントロール（すなわち、ゼロまたは検出レベルより下の候補因子濃度）として働く。しかし、あらゆる濃度が、比較の目的のためのコントロールとして使用され得る。
【００４９】
ＨＴＳ方法は、一般的に、多くの数の候補因子を含むライブラリーを提供する工程を包含する。例えば、コンビナトリアルケミカルライブラリーは、１つ以上のアッセイにおいてスクリーニングされて、本明細書中で記載されるように、所望される特徴的な活性を示すそれらのライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定し得る。従って、同定された化合物は、従来のリード化合物として働いても、それ自体が、潜在的な治療化合物または実際の治療化合物として使用されてもよい。
【００５０】
例えば、候補因子は、マルチウェルプレートを用いること、そして上記候補因子を、各々別個にウェルに配置するかまたは混合物中で試験することによって、高度に並行した様式でアッセイされ得る。次いで、アッセイ化合物（例えば、標的タンパク質、タンパク質フィラメント、結合酵素および基質のような）およびＡＴＰが、上記ウェルに添加され得、そして上記プレートの各ウェルの吸光度または蛍光が、プレートリーダーによって測定され得る。上記標的タンパク質の機能を調節する候補因子は、その候補因子の非存在下でのコントロールアッセイと比較した、ＡＴＰ加水分解速度の上昇または減少によって同定される。
【００５１】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、標的タンパク質活性は、上記に記載されるようなＡＴＰ加水分解アッセイによって同定される。しかし、標的タンパク質活性は多くのアッセイによって同定され得ることが、理解される。このようなアッセイとしては、微小管滑動、脱重合／重合ならびに結合およびＡＴＰアーゼ活性の両方を必要とする任意の活性が挙げられる。一般的に、運動性アッセイは、上記系のうちの１つの成分（例えば、上記標的タンパク質または上記微小管）を固定化する工程、そして次いで、他の成分の移動またはその変化を検出する工程を包含する。従って、例えば、上記標的タンパク質は、固定化（例えば、固体基板への結合）され得、そして微小管の移動が、モニタリングされ得る。代表的に、検出されるべき分子は、（例えば、蛍光標識を用いて）標識されて、検出を容易にする。運動性アッセイを実施する方法は、当業者に周知である（例えば、Ｈａｌｌら（１９９６）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７１：３４６７−７６、Ｔｕｒｎｅｒら（１９９６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２（１）：２０−５；Ｇｉｔｔｅｓら（１９９６）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７０（１）：４１８−２９；Ｓｈｉｒａｋａｗａら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１９８：１８０９−１５；Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎら（１９９５）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６８：２４４４−５３；Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎら（１９９５）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６８：７２Ｓを参照のこと）。
【００５２】
さらに、使用されるタンパク質が、別の特定の活性（例えば、有糸分裂または軸索輸送への関与）を有する場合、それらの活性に対する特定のアッセイが利用され得る。例えば、標的タンパク質活性は、培養細胞を用いてインビトロでの標的タンパク質活性の調節を決定することによって調べられ得る。上記細胞は、上記標的タンパク質を内因的に発現し得るか、または上記細胞は、例えば、上記のように、上記標的タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを導入することによって、遺伝子操作されて標的タンパク質を発現し得る。上記細胞は、候補因子を用いて処理され、そして次いで、上記細胞に対する上記候補因子の効果が、直接的にかまたは関連する代替的マーカーを調べることによってかのいずれかで決定される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、標的タンパク質を含む細胞は、細胞増殖に対する候補因子の効果を評価することによる、候補因子スクリーニングアッセイにおいて使用される。有用な細胞型としては、正常細胞および異常な増殖率を有する細胞（例えば、腫瘍細胞）が挙げられる。細胞増殖を評価する方法は、当該分野において公知であり、そしてこれらの方法としては、培養細胞を用いる増殖アッセイおよび生存度アッセイが挙げられる。このようなアッセイにおいて、細胞集団は、しばしば、時間をかけて、そして種々の濃度の上記候補因子と一緒にかまたは上記候補因子なしでインキュベートされたサンプルと比較して、増殖および／または生存度についてモニタリングされる。細胞数は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｍ）ブロミド（ＭＴＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）およびａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭのような試薬を用いて定量され得、これらの試薬は、代謝的に活性な細胞の存在下で、色素化合物または蛍光化合物に変換される。あるいは、細胞タンパク質に結合する色素（例えば、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）またはクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ））が使用されて、細胞数を定量し得る。細胞はまた、粒子計測器（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒにより製造されるＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて直接計数され得るか、または顕微鏡を用いて、ヘモサイトメーター上で細胞を観察することによって計数され得る。代表的に、上記ヘモサイトメーターを用いて計数された細胞は、トリパンブルーの溶液中で観察されて、生細胞を死細胞から区別する。細胞数を定量する他の方法は、当業者に公知である。これらのアッセイは、壊死状態にある細胞を含む、上記細胞のいずれに対しても実施され得る。
【００５４】
さらに、アポトーシスが、当該分野において公知の方法によって決定され得る。例えば、アポトーシスに対するマーカーは、公知であり、そしてＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ媒介性ｄＵＴＰ−フルオレセインニック末端標識）キットは、市販され得る（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、カタログ番号１６８７９５）。アポトーシスに対する他のマーカーとしては、実施例４に記載されるようなカスパーゼ活性が挙げられる。
【００５５】
上記細胞増殖アッセイは、生理学的シグナル（例えば、ホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、増殖因子、活動電位、薬理学的な因子（化学療法剤、放射線、発癌性物質または他の細胞（すなわち、細胞−細胞接触）を含む））の存在下もしくは非存在下、またはそれらに曝す前または曝した後に評価される。さらに、上記細胞増殖アッセイは、細胞周期プロセスの種々の段階で評価されて、特徴（例えば、有糸分裂紡錘体形態および細胞周期分布）を評価し得る（例えば、Ｍａｙｅｒら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９７１−４を参照のこと）。
【００５６】
ＫＩＦ１４発現細胞の増殖および生存度に対する候補因子の効果を評価するための例示的な方法は、実施例４および９に記載される。高い増殖率を有する細胞（例えば、癌細胞）は、一般的に、実施例１に記載されるように高いレベルのＫＩＦ１４を発現する。逆に、ＲＮＡ干渉を用いたＫＩＦ１４発現の低下は、実施例４に記載されるように、増殖阻害および細胞死をもたらす。従って、ＫＩＦ１４活性を調節する候補因子は、実施例９に記載されるように、ＫＩＦ１４発現細胞の細胞増殖または生存度の変化をもたらし得る。
【００５７】
特徴（例えば、ＫＩＦ１４発現細胞の有糸分裂紡錘体形態および細胞周期分布）に対する候補因子の効果を評価するための例示的な方法は、実施例５および６に記載される。ＲＮＡ干渉を用いたＫＩＦ１４発現の低下は、実施例５および６に記載されるように、異常なサイトカインおよび二核性細胞の形成をもたらす。従って、ＫＩＦ１４活性を調節する候補因子は、ＫＩＦ１４を発現しない細胞においては効果を有さないかまたは最小の効果を有しながら、ＫＩＦ１４発現細胞においては、サイトカイン変化をもたらし得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、標的タンパク質の活性を調節する候補因子は、競合的結合アッセイを用いて同定され得る。これらのアッセイにおいて、競合因子は、上記標的タンパク質に結合することが公知である結合部分（例えば、抗体、ペプチド、結合パートナーまたはリガンド）である。
【００５９】
競合的スクリーニングアッセイは、第１のサンプル中で、上記標的タンパク質と、候補因子とを合わせることによって実施され得る。第２のサンプルは、その候補因子、上記標的タンパク質およびその標的タンパク質に結合することが公知である化合物を含有する。これらのアッセイは、微小管の存在下または非存在下のいずれかで実施され得る。上記候補因子の結合は、両方のサンプルに対して決定され、そして上記２つのサンプル間の結合の変化または差は、上記標的タンパク質に結合可能であり、そして潜在的にその活性を調節可能な因子の存在を示す。すなわち、上記候補因子の結合が、上記第１のサンプルに対して上記第２のサンプルにおいて異なる場合、その候補因子は、上記標的タンパク質に結合可能である。
上記候補因子は、標識され得る。上記候補因子もしくは上記競合因子のいずれか、またはその両方は、第１に、結合させるために充分な時間、上記標的タンパク質に添加される。インキュベーションは、最適な活性を容易にする任意の温度（代表的には、４℃と４０℃との間）で実施され得る。インキュベーション時間はまた、最適化されて、迅速な高スループットスクリーニングを容易にし得る。代表的に、０．１時間と１時間との間が、充分である。過剰な試薬は、一般的に、除去されるかまたは洗浄されて除かれる。次いで、上記第２の成分が添加され、そして結合を示すために、上記標識成分の存在または非存在が追跡される。
【００６０】
競合剤が、最初に添加され得、続いて、候補因子が添加され得る。この競合剤の置換は、候補因子が標的タンパク質に結合し、従って、候補因子がこの標的タンパク質に結合し得、そして潜在的にこの標的タンパク質の活性を調節し得るという指標である。この実施形態では、いずれかの成分が標識され得る。従って、例えば、この競合剤が標識される場合、洗浄溶液における標識の存在は、この薬剤による置換を示す。あるいは、この候補因子が標識化される場合、支持体上の標識の存在は、置換を示す。
【００６１】
あるいは、この候補因子は、最初に添加され得、続いて競合剤が添加され得る。競合剤による結合が存在しないことは、この候補因子がより高い親和性で標的タンパク質に結合されていることを示し得る。従って、この候補因子が標識される場合、競合剤の結合の欠如を伴った、支持体上の標識の存在は、この候補因子が標的タンパク質に結合し得ることを示し得る。
【００６２】
第２の局面では、本発明は、細胞増殖を調節するための方法を提供する。この方法は、標的タンパク質の活性の有効量の調節因子を細胞に投与する工程を包含し、ここで、上記標的タンパク質は、配列番号２または配列番号３に提供される配列に対して８０％より高い配列同一性を有する配列を含む。本発明のこの局面の方法において使用される標的タンパク質は、本発明の第１の局面の方法について上で記載された通りである。この標的タンパク質の活性の調節因子は、上で規定されるように、その投与によりこの標的タンパク質の活性に変化が生じる薬剤である。例えば、標的タンパク質の活性の調節因子は、この標的タンパク質の活性を阻害または刺激し得る。本発明のこの局面において使用され得る調節因子は、本発明の第一の局面について上で記載されたように、候補因子をスクリーニングすることにより同定され得る。
【００６３】
代表的には、この標的タンパク質の活性を阻害する調節因子の投与は、実施例４または実施例９において記載されているように、細胞の増殖を阻害する効果または細胞死を引き起こす効果を有する。このような阻害性調節因子の投与は、例えば、細胞の過剰増殖（例えば、癌、再狭窄、自己免疫疾患、関節炎、移植片拒絶、炎症性腸疾患、または医療行為の後に誘導される増殖）が存在する状態を処置するために有用である。
【００６４】
逆に、標的タンパク質の活性を増加する調節因子は、実施例１に記載されているように、細胞分裂を刺激する効果を有する。このような刺激性調節因子の投与は、例えば、細胞の過剰増殖が存在する状態または細胞増殖の増強が望まれる状態（例えば、損傷治癒の間または幹細胞の拡大の間）を処置するために有用である。
【００６５】
いくつかの実施形態は、この標的タンパク質の活性のインヒビターを投与することにより細胞増殖を調節する方法を提供する。このインヒビターは、ＲＮＡインヒビターであり得る。用語「ＲＮＡインヒビター」とは、標的タンパク質の発現をＲＮＡ干渉によりサイレンシングする阻害性ＲＮＡをいう（ＭｃＭａｎｕｓおよびＳｈａｒｐ（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３：７３７〜４７；Ｈａｎｎｏｎ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：２４４〜５１；ＰａｄｄｉｓｏｎおよびＨａｎｎｏｎ（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２：１７〜２３）。ＲＮＡ干渉は、進化を通じて（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓからヒトまで）ずっと保存されており、ＲＮＡウイルスの浸潤から細胞を保護する際に機能すると考えられる。細胞がｄｓＲＮＡウイルスにより感染された場合、このｄｓＲＮＡは、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ型酵素により、切断のために認識され、そして標的化される。このダイサー酵素は、このＲＮＡを２１ヌクレオチドの短い二重鎖（短い干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと呼ばれる）へと「ダイス」し、この２１ヌクレオチドの短い二重鎖は、各鎖の３’末端において完全に対にされたリボヌクレオチドと対になっていない２個のヌクレオチドとの１９ヌクレオチドからなる。これらの短い二重鎖は、ＲＩＳＣと呼ばれるマルチタンパク質複合体と結合し、そしてこの複合体を上記ｓｉＲＮＡに対して配列類似性を有するｍＲＮＡ転写産物へと方向付ける。結果として、ＲＩＳＣ複合体に存在するヌクレア−ゼは、ｍＲＮＡ転写産物を切断し、これにより遺伝子産物の発現を廃止する。ウイルス感染の場合、この機構は、ウイルス転写産物の破壊をもたらし、このようにしてウイルス合成を妨害する。ｓｉＲＮＡは、二重鎖であるので、いずれかの鎖がＲＩＳＣと結合する潜在能力を有しており、そして配列類似性を有する転写産物のサイレンシングを指向する。
【００６６】
最近、遺伝子のサイレンシングが、細胞にｓｉＲＮＡ（ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）切断の産物を模倣している）を与えることにより、誘導され得るという結論が出された（Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４〜８；Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８〜２００）。合成ｓｉＲＮＡ二重鎖は、ＲＩＳＣと結合する能力を維持し、そしてｍＲＮＡ転写産物のサイレンシングを指向し、これにより、哺乳類細胞における遺伝子サイレンシングのための強力なツールを研究者に提供する。遺伝子サイレンシングのためのｄｓＲＮＡを導入するさらに別の方法は、ｓｈＲＮＡ（短いヘアピン状ＲＮＡ）である（Ｐａｄｄｉｓｏｎら（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：９４８〜５８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０〜３；Ｓｕｉら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：５５１５〜２０）。この場合、所望のｓｉＲＮＡ配列が、介在ループ配列を有する逆方向反復配列としてプラスミド（またはウイルス）より発現され、ヘアピン構造を形成する。結果として生じた、このヘアピンを含むＲＮＡ転写産物が、後にダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によりプロセシングされ、サイレンシングのためのｓｉＲＮＡを産生する。プラスミドベースのｓｈＲＮＡは、細胞中で安定に発現され得、細胞内（または、動物内においてさえ）長期間の遺伝子サイレンシングを可能にする（ＭｃＣａｆｆｒｅｙら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３８〜９；Ｘｉａ（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６〜１０；Ｌｅｗｉｓら（２００２）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３２：１０７〜８；Ｒｕｂｉｎｓｏｎら（２００３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３３：４０１〜６；Ｔｉｓｃｏｒｎｉａら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：１８４４〜８）。ＲＮＡ干渉は、マウスを劇症肝炎から保護するために、治療上首尾よく使用されている（Ｓｏｎｇら（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：３４７〜５１）。
【００６７】
従って、本発明のいくつかの実施形態において、細胞増殖は、実施例４〜実施例６において記載されているように、ＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡを投与することにより阻害される。このＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡは、配列番号８、配列番号９、または配列番号２３に提供される配列を含み得る。
【００６８】
いくつかの実施形態において、細胞増殖は、標的タンパク質による微小管依存性ＡＴＰ加水分解のインヒビターを投与することにより阻害される。例示的なインヒビターとしては、低分子有機化合物（例えば、セミカルバゾンおよびチオセミカルバゾン）が挙げられる。例えば、このインヒビターは、実施例９に記載されているように、アリールチオセミカルバゾンであり得る。例示的なアリールチオセミカルバゾンインヒビターとしては、１，１’−ビフェニル−４−カルバルデヒドチオセミカルバゾン（化合物１）、４−イソプロピルベンズアルデヒドチオセミカルバゾン（化合物２；例えば、米国特許第３，８４９，５７５号を参照のこと）、４−シクロへキシルベンズアルデヒドチオセミカルバゾン（化合物３）および４−イソプロピル−３−ニトロベンズアルデヒドチオセミカルバゾン（化合物４；例えば、Ｓａｒｉｐｉｎａｒら（１９９６）Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  ４６（ＩＩ）：８２４〜８を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
調節因子は、例えば、調節因子を組織培養物中の細胞に投与することによりインビトロで細胞に投与され得る。調節因子は、当該分野の従来のプロトコール（トランスフェクション、リポフェクション、マイクロインジェクション、および上に記載の他のプロトコールが挙げられる）を用いてインビトロで細胞へ投与され得る。この調節因子はまた、この調節因子を被験体に投与することにより、インビボで細胞へと投与され得る。用語「被験体」とは、生きている生物（例えば、植物または動物）をいう。例示的な被験体は、哺乳類（例えば、ヒト）である。例えば、この被験体は、ヒトの癌患者であり得る。調節因子の被験体への投与は、任意の有効な経路（例えば、局所経路、全身性経路、非経口経路または経口経路）により達成される。例えば、阻害性調節因子は、腫瘍中に直接的に注入され得るか、または血液を腫瘍に供給する血管へと注入され得る。非経口送達の方法としては、局所的投与、動脈内投与、皮下投与、骨髄内投与、静脈投与、または鼻内投与が挙げられる。
【００７０】
本発明のこの局面の方法で実際に投与される調節因子の量は、有効量である。用語「有効量」とは、実質的な効果を生み出すのに必要とされる量をいう。本発明のこの局面の方法で投与される調節因子の有効量は、一般的に、最大寛容投薬量までの範囲であるが、大幅に変動し得る。使用される正確な量は、化合物、投与経路、被験体の身体状態、および他の要因に依存して変動する。この日投薬量は、単回投薬量として投与され得るか、または、投与のための複数回用量へと分割され得る。
【００７１】
この調節因子の有効量は、インビトロの系または動物モデル試験系に由来する用量−応答曲線から外挿され得る。この動物モデルはまた、代表的には、望ましい濃度範囲および投与経路を決定するのに使用される。次いで、このような情報は、ヒトまたは他の哺乳類における有用な用量および投与経路を決定するのに使用され得る。有効用量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内にある。従って、実際に投与される量は、処置が適用される個体に依存し、そして好ましくは、所望の効果が著しい副作用なしに達成されるように最適化された量である。
【００７２】
この調節因子の治療上の効力および発生し得る毒性（例えば、ＥＤ５０（母集団の５０％において治療上有効な用量）；ＬＤ５０（母集団の５０％に致死的な用量））は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により決定され得る。治療上の効果と毒性の効果との間の用量比率は、治療上の指数であり、そしてそれは、比率ＥＤ５０／ＬＤ５０として表現され得る。大きな治療上の指数を示す調節性化合物は、本発明の方法の実施において特に適切である。細胞培養アッセイおよび動物研究より得られるデータは、ヒトまたは他の哺乳類における使用のための投薬量の範囲を定式化する際に使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんど有さないかまたは全く有さないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。この投薬量は、代表的には、使用される投薬形態、患者の感受性、および投与経路に依存するこの範囲内で変動する。従って、最適量が、投与方法と共に変動し、そして一般的に、同一または類似の形態で投与される従来の医薬の量と一致する。
【００７３】
この調節因子は、組成物中に処方され得、この組成物は、薬学的に受容可能な適切なキャリアをさらに含有し、このキャリアとしては、賦形剤およびこの調節因子の哺乳類被験体への投与を促進する他の化合物が挙げられる。処方および投与に関する技術のさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）の最新版において見出され得る。
【００７４】
経口投与のための組成物は、当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて、経口投与に適した投与量で処方され得る。このようなキャリアのおかげで、インヒビターを含有する組成物が、被験体による接種に対して適切な、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして処方されることが可能になる。経口使用のための組成物が、例えば、固体の賦形剤と組み合わせて処方され、必要な場合には適切な付加化合物を添加した後、生じた混合物を必要に応じて削合し、そして顆粒剤の混合物を処理し、錠剤または糖剤のコアを得得る。適切な賦形剤としては、炭水化物の充填材またはタンパク質の充填材が挙げられる。これらとしては、糖類（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトール、トウモロコシ由来のデンプン、コムギ由来のデンプン、コメ由来のデンプン、ジャガイモ由来のデンプン、もしくは他の植物由来のデンプンが挙げられる）；セルロース（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、もしくはカルボキシメチルセルロースナトリウム）；およびゴム（アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含む）；ならびにタンパク質（例えば、ゼラチンおよびコラーゲン）が挙げられるが、これらに限定されない。所望の場合、崩壊剤または溶解補助剤（例えば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはこれらの塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）が添加され得る。
【００７５】
適切なコーティング（例えば、濃縮された糖類の溶液）を有する糖剤のコアが提供され、このコーティングはまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル（ｃａｒｂｏｐｏｌ  ｇｅｌ）、ポリエチレングリコール、および／もしくは二酸化チタン、ラッカー（ｌａｃｑｕｅｒ）溶液、および適切な有機溶媒、または溶媒混合物が挙げられ得る。染料または色素は、製品の同定のためにまたは活性化合物の量（すなわち、投薬量）を特徴付けるために錠剤もしくは糖剤のコーティングに添加され得る。
【００７６】
経口投与のための調節因子は、例えば、ゼラチン製の押しはめる（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセルとして、および軟質ゼラチンおよびコーティング（例えば、グリセロールまたはソルビトール）の密閉カプセルとして処方され得る。押しばめカプセルは、充填材または結合剤（例えば、ラクトースもしくはデンプン）、潤滑剤（例えば、タルクもしくはステアリン酸マグネシウム）および必要に応じて安定剤、と混合された調節因子を含有し得る。軟性カプセルでは、調節因子は、安定な液体（例えば、脂肪油、液体パラフィン、もしくは液体ポリエチレングリコール）中に、安定剤ありまたはなしで溶解または懸濁され得る。
【００７７】
非経口投与のための組成物としては、一種以上の調節因子の水溶液を含有する。注射のために、この調節因子は、水溶液中（例えば、生理学的に適合性の緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理学的に緩衝化された生理食塩水の中）に処方され得る。水溶性の注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン）を含有し得る。さらに、この調節因子の懸濁物は、適切な油性注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド）あるいはリポソームが挙げられる。必要に応じて、この懸濁物はまた、この調節因子の溶解度を増加させて非常に濃縮された溶液の調製を可能にする適切な安定剤または薬剤を含有し得る。
【００７８】
局所投与または鼻内投与に関して、特定の障壁に対して適切な浸透すべき浸透剤は、この処方において代表的に使用される。これらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチル−ホルムアミド、プロピレングリコール、メチルアルコールもしくはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、およびアゾン（ａｚｏｎｅ）である。さらなる薬剤としては、この処方物を化粧品として受容可能にするために、さらに含まれ得る。これらの例は、脂肪、蝋、油、染料、芳香剤、保存剤、安定剤、および界面活性剤である。角質溶解性の薬剤（例えば、当該分野において公知のもの）がまた含まれ得る。例は、サリチル酸および硫黄である。
【００７９】
これらの種々の型の添加物の各々の量は、当業者において容易に明らかであり、最適量は、同一の投与の型のために設計された他の公知の処方物における量と同一である。例えば、角質層浸透促進剤（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）は、代表的には、約０．１％〜１５％の範囲内のレベルに含まれる。
【００８０】
調節因子を含有する組成物は、当該分野で公知の様式と類似の様式で（例えば、従来の混合プロセス、溶解プロセス、造粒プロセス、糖剤製造プロセス、研和プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、トラッププロセス、もしくは凍結乾燥プロセスにより）製造され得る。この組成物はまた、適切な放出の特徴（例えば、従来の手段（例えば、コーティング）による徐放性放出もしくは標的化放出）を提供するために改変され得る。
【００８１】
この調節因子を含有する組成物は、塩として提供され得、そして多くの酸（塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などが挙げられるが、これらに限定されない）とともに形成され得る。塩は、水性溶媒または他のプロトン性溶媒において、対応する遊離塩基形態より溶解性である傾向がある。
【００８２】
調節因子および受容可能なキャリアを含有するように処方された組成物が調製された後、この組成物は、適切な容器中に設置され、そして使用のために標識される。
【００８３】
本発明のこの局面のいくつかの実施形態は、細胞の過増殖障害を有する被験体を、被験体に対する標的タンパク質の活性の治療上有効な量のインヒビターを投与することにより処置する方法を提供し、ここで、この標的タンパク質は、配列番号２または配列番号３に提供される配列に対して８０％より高い配列同一性を有する配列を含む。
【００８４】
用語「細胞の過増殖障害」とは、細胞の過剰の増殖が存在する任意の状態（例えば、癌、再狭窄、自己免疫疾患、関節炎、移植片拒絶、炎症性腸疾患、または医療行為の後に誘導される増殖）をいう。いくつかの実施形態では、細胞の過増殖障害は、癌（脳の癌、頭部癌および頚部癌、食道癌、乳癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、結腸癌、膀胱癌、腎臓癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮癌、黒色腫、多発性黒色腫、白血病、およびリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない）である。上記方法のこの実施形態において投与されるインヒビターは、阻害性ＲＮＡ（例えば、ＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡ）であり得る。このＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡは、配列番号８、配列番号９、または配列番号２３において提供される配列を含み得る。投与されるインヒビターはまた、標的タンパク質による微小管依存性ＡＴＰ加水分解のインヒビターであり得る。例示的なインヒビターとしては、低分子有機化合物（例えば、セミカルバゾンおよびチオセミカルバゾン）が挙げられる。例えば、このインヒビターは、実施例９に記載されるような、アリールチオセミカルバゾン（例えば、１，１’−ビフェニル−４−カルバルデヒドチオセミカルバゾン（化合物１）、４−イソプロピルベンズアルデヒドチオセミカルバゾン（化合物２；例えば、米国特許第３，８４９，５７５号を参照のこと）、４−シクロへキシルベンズアルデヒドチオセミカルバゾン（化合物３）または４−イソプロピル−３−ニトロベンズアルデヒドチオセミカルバゾン（化合物４；Ｓａｒｉｐｉｎａｒら（１９９６）Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  ４６（ＩＩ）：８２４〜８を参照のこと）であり得る。有効量および有用な投与経路が上に記載される。
【００８５】
本発明のこの局面のいくつかの実施形態は、治療上有効な量の公知の治療用薬剤および標的タンパク質の活性のインヒビターを細胞の過増殖障害を有する被験体に投与することにより、この被験体を処置する方法を提供し、ここで、この標的タンパク質は、配列番号２または配列番号３に提供される配列と８０％より高い配列同一性を有する配列を含む。本明細書中で用いられる場合、用語「公知の治療用薬剤」としては、抗癌剤および放射線治療が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明の標的タンパク質インヒビター（例えば、上に記載されたインヒビター）は、公知の抗癌剤と組み合わせて投与され得る。このような薬剤の例は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ＤｅｖｉｔａおよびＨｅｌｌｍａｎ編）、第６版（２００１年２月１５日）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓに見出され得る。当業者は、薬剤のどの組み合わせが有用であるかを薬物および関連する癌の特定の特徴に基づいて識別し得る。このような抗癌剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：エストロゲンレセプター調節因子、アンドロゲンレセプター調節因子、レチノイドレセプター調節因子、細胞傷害性／細胞増殖抑制性の薬剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼインヒビター、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターおよび他の新脈管形成インヒビター、細胞増殖および細胞生存のシグナル伝達のインヒビター、細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤、ＨＩＶプロテアーゼインヒビター、逆転写酵素インヒビター、および他の新脈管形成インヒビター。
【００８６】
「エストロゲンレセプター調節因子」とは、機構に関わらず、レセプターへのエストロゲンの結合を妨害または阻害する化合物をいう。エストロゲンレセプターの調節因子の例としては、タモキシフェン、ラロキシフェン、イドキシフェン、ＬＹ３５３３８１、ＬＹ１１７０８１、トレミフェン、フルベストラウント（ｆｕｌｖｅｓｔｒａｎｔ）、４−［７−（２，２−ジメチル−１−オキソプロポキシ−４−メチル−２−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル］−フェニル−２，２−ジメチルプロパエート、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン−２，４−ジニトロフェニル−ヒドラゾン、およびＳＨ６４６が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
「アンドロゲンレセプター調節因子」とは、機構に関わらず、レセプターへのアンドロゲンの結合を妨害または阻害する化合物をいう。アンドロゲンレセプター調節因子の例としては、フィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）および他の５α−レダクターゼインヒビター、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、フルタミド、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、リアロゾール（ｌｉａｒｏｚｏｌｅ）、およびアビラテロンアセテート（ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ  ａｃｅｔａｔｅ）が挙げられる。
【００８８】
「レチノイドレセプター調節因子」とは、機構に関わらず、レセプターへのレチノイドの結合を妨害または阻害する化合物をいう。このようなレチノイドレセプター調節因子の例としては、ベキサロテン（ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ）、トレチノイン、１３−シス−レチノイン酸、９−シス−レチノイン酸、α−ジフルオロメチルオルニチン、ＩＬＸ２３−７５５３、トランス−Ｎ−（４’−ヒドロキシフェニル）レチンアミドおよびＮ−４−カルボキシフェニルレチンアミドが挙げられる。
【００８９】
「細胞傷害性／細胞増殖抑制性の薬剤」とは、主として直接的に細胞の機能を妨害することにより細胞死を引き起こすかもしくは細胞増殖を阻害する化合物、または細胞減数分裂を阻害もしくは妨害する化合物（アルキル化剤、腫瘍壊死因子、インターカレーター、低酸素症活性化化合物、微小管インヒビター／微小管安定化剤、有糸分裂キネシンのインヒビター、有糸分裂の進行に関与するキナーゼのインヒビター、代謝拮抗物質）；生物学的応答の改変剤；ホルモン性／抗ホルモン性の治療用薬剤、造血性増殖因子、治療用薬剤に標的化されたモノクローナル抗体、トポイソメラーゼインヒビター、プロテオソ−ムインヒビターおよびユビキチンリガーゼインヒビターをいう。
【００９０】
細胞傷害性薬剤の例としては、セルテネフ（ｓｅｒｔｅｎｅｆ）、カケクチン、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、タソネルミン（ｔａｓｏｎｅｒｍｉｎ）、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、カルボプラチン、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、プレジニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ジブロモモジュルシトール（ｄｉｂｒｏｍｏｄｕｌｃｉｔｏｌ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ホテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、ヘプタプラチン（ｈｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、インプロスルファントシレート（ｉｍｐｒｏｓｕｌｆａｎ  ｔｏｓｉｌａｔｅ）、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニムスチン、ジブロスピジウムクロライド（ｄｉｂｒｏｓｐｉｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、プミテパ（ｐｕｍｉｔｅｐａ）、ロバプラチン（ｌｏｂａｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）、プロフィロマイシン（ｐｒｏｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、シスプラチン、イロフルベン（ｉｒｏｆｕｌｖｅｎ）、デキシホスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、シス−アミンジクロロ（２−メチル−ピリジン）プラチナ、ベンジルグアニン、グルホスファミド（ｇｌｕｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ＧＰＸ１００、（トランス、トランス、トランス）−ビス−ｍｕ−（ヘキサン−１，６−ジアミン）−ｍｕ−［ジアミン−プラチナ（ＩＩ）］ビス［ジアミン（クロロ）プラチナ（ＩＩ）］テトラクロライド、ジアリジジニルスペルミン（ｄｉａｒｉｚｉｄｉｎｙｌｓｐｅｒｍｉｎｅ）、三酸化ヒ素、１−（１１−ドデシルアミノ−１０−ヒドロキシウンデシル）−３，７−ジメチルキサンチン、ゾルビシン、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ピラルビシン、ピナフィド（ｐｉｎａｆｉｄｅ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、アムルビシン（ａｍｒｕｂｉｃｉｎ）、アンチネオプラストン（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｏｎ）、３’−デアミノ−３’−モルホリノ−１３−デオキソ−１０−ヒドロキシカルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アンナマイシン（ａｎｎａｍｙｃｉｎ）、ガラルビシン（ｇａｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、エリナフィド（ｅｌｉｎａｆｉｄｅ）、ＭＥＮ１０７５５、および４−デメトキシ−３−デアミノ−３−アジリジニル−４−メチルスルホニル−ダウノルビシン（ＷＯ  ００／５００３２を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
低酸素症活性可能化合物の例は、チラパザミン（ｔｉｒａｐａｚａｍｉｎｅ）である。
【００９２】
プロテオソームインヒビターの例としては、ラクタシスチンおよびＭＬＮ−３４１（Ｖｅｌｃａｄｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
微小管インヒビター／微小管安定化剤の例としては、パクリタキセル、硫酸ビンデシン、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカリューコブラスチン（ｎｏｒｖｉｎｃａｌｅｕｋｏｂｌａｓｔｉｎｅ）、ドセタキソール、リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、ミボブリン（ｍｉｖｏｂｕｌｉｎ）イセチオネート、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、セマドチン（ｃｅｍａｄｏｔｉｎ）、ＲＰＲ１０９８８１、ＢＭＳ１８４４７６、ビンフルニン（ｖｉｎｆｌｕｎｉｎｅ）、クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、無水ビンブラスチン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、ＴＤＸ２５８、エポチロン（例えば、米国特許第６，２８４，７８１号および同第６，２８８，２３７号を参照のこと）ならびにＢＭＳ１８８７９７が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、エポチロンが微小管インヒビター／微小管安定化剤に含まれない。
【００９４】
トポイソメラーゼインヒビターの例としては、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ヒカプタミン（ｈｙｃａｐｔａｍｉｎｅ）、イリノテカン、ルビテカン（ｒｕｂｉｔｅｃａｎ）、６−エトキシプロピオニル−３’，４’−Ｏ−エキソ−ベンジリデン−チャートレウシン（ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｎ）、９−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−ニトロピラゾロ［３，４，５−ｋｌ］−アクリジン−２−（６Ｈ）−プロパンアミン、１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：ｂ，７］−インドリジノ［１，２ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）ジオン、ルルトテカン（ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）、７−［２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル］−２０Ｓカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ＢＮＰ１３５０、ＢＮＰＩ１１００、ＢＮ８０９１５、ＢＮ８０９４２、リン酸エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、ソブゾキサン（ｓｏｂｕｚｏｘａｎｅ）、２’−ジメチルアミノ−２’−デオキシエトポシド、ＧＬ３３１、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−９−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−カルボキサミド、アスラクリン（ａｓｕｌａｃｒｉｎｅ）、（５ａ，５ａＢ，８ａａ，９ｂ）−９−［２−［Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］エチル］−５−［４−ヒドロオキシ−３，５−ジメトキシフェニル］−５，５ａ，６，８，８ａ，９−ヘキソヒドロフロ  （３’，４’：６，７）ナフト（２，３−ｄ）−１，３−ジオキソール−６−オン、２，３−（メチレンジオキシ）−５−メチル−７−ヒドロキシ−８−メトキシベンゾ［ｃ］−フェナンチリジニウム、６，９−ビス［（２−アミノエチル）アミノ］ベンゾ［ｇ］イソギノリン−５，１０−ジオン、  ５−（３−アミノプロピルアミノ）−７，１０−ジヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシエチルアミノメチル）−６Ｈ−ピラゾロ［４，５，１−デ］アクリジン−６−オン、Ｎ−［１−［２（ジメチルアミノ）エチルアミノ］−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−チオキサンテン−４−イルメチル］ホルムアミド、Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）アクリジン−４−カルボキサミド、６−［［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ］−３−ヒドロキシ−７Ｈ−インデノ［２，１−ｃ］キノリン−７−オン、およびジメスナ（ｄｉｍｅｓｎａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
有糸分裂のキネシン（特にヒトの有糸分裂キネシンＫＳＰ）のインヒビターの例は、ＰＣＴ公報ＷＯ  ０１／３０７６８およびＷＯ  ０１／９８２７８、ならびに（２００１年１２月６日に出願された）係属中の米国特許出願番号６０／３３８，７７９、（２００１年１２月６日に出願された）６０／３３８，３４４、（２００１年１２月６日に出願された）６０／３３８，３８３、（２００１年１２月６日に出願された）６０／３３８，３８０、（２００１年１２月６日に出願された）６０／３３８，３７９、ならびにＷＯ  ０３／３９４６０に記載されている。ある実施形態では、有糸分裂キネシンのインヒビターとしては、ＫＳＰのインヒビター、ＭＫＬＰ１のインヒビター、ＣＥＮＰ−Ｅのインヒビター、ＭＣＡＫのインヒビターおよびＲａｂ６−ＫＩＦＬのインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
有糸分裂の進行に関与するキナーゼのインヒビター」としては、オーロラキナーゼのインヒビター、Ｐｏｌｏ様キナーゼ（ＰＬＫ）のインヒビター（特に、ＰＬＫ−１のインヒビター）、ｂｕｂ−１のインヒビターおよびｂｕｂ−Ｒ１のインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
「抗増殖剤」としては、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、Ｇ３１３９、ＯＤＮ６９８、ＲＶＡＳＫＲＡＳ、ＧＥＭ２３１、およびＩＮＸ３００１、および代謝拮抗剤（例えば、エノシタビン、カルモフール（ｃａｒｍｏｆｕｒ）、テガファー（ｔｅｇａｆｕｒ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ガロシタビン（ｇａｌｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビンオクホスフェート（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ  ｏｃｆｏｓｆａｔｅ）、ホステアビンナトリウム水和物、ラルチトレキシド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、パルチトレキシド（ｐａｌｔｉｔｒｅｘｉｄ）、エミテフール（ｅｍｉｔｅｆｕｒ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ノラトレキシド（ｎｏｌａｔｒｅｘｅｄ）、ペメトレキシド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ネルザラビン（ｎｅｌｚａｒａｂｉｎｅ）、２’−デオキシ−２’−メチリデネシチジン、２’−フルオロメチレン−２’−デオキシシチジン、Ｎ−［５−（２，３−ジヒドロ−ベンゾフリル）スルホニル］−Ｎ’−（３，４−ジクロロフェニル）尿素、Ｎ６−［４−デオキシ−４−［Ｎ２−［２（Ｅ），４（Ｅ）−テトラデカジエノイル］グリセルアミノ］−Ｌ−グリセロ−Ｂ−Ｌ−マンノ−ヘプトピラノシル］アデニン、アピリジン、エクテイナスシジン（ｅｃｔｅｉｎａｓｃｉｄｉｎ）、トロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）、４−［２−アミノ−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−ピリミジノ［５，４−ｂ］［１，４］チアジン−６−イル−（Ｓ）−エチル］−２，５−チエノイル−Ｌ−グルタミン酸、アミノプテリン、５−フルオロウラシル、アラノシン、１１−アセチル−８−（カルバモイルオキシメチル）−４−ホルミル−６−メトキシ−１４−オキサ−１，１１−ジアザテトラシクロ（７．４．１．０．０）−テトラデカ−２，４，６−チエン−９−イル酢酸エステル、スワインソニン（ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ）、ロメトレキソール（ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）、デキシラゾキサン（ｄｅｘｒａｚｏｘａｎｅ）、メチオニナーゼ（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ）、２’−シアノ−２’−デオキシ−Ｎ４−パルミトイル−１−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、３−アミノピリジン−２−カルボキサルデヒド（ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ）チオセミカルバゾンおよびトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
モノクローナル抗体を標的とする治療剤の例としては、細胞傷害性薬剤を有する治療剤、または癌細胞特異的モノクローナル抗体もしくは標的細胞特異的モノクローナル抗体に結合された放射性同位元素が挙げられる。例としては、Ｂｅｘｘａｒが挙げられる。
【００９９】
「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター」とは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼのインヒビターをいう。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対して阻害活性を有する化合物は、当該分野において周知のアッセイを使用することによって、容易に同定され得る。例えば、米国特許第４，２３１，９３８号第６欄、およびＷＯ８４／０２１３１の３０〜３３頁に記載されるかまたは引用されるアッセイを参照のこと。用語「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター」および「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのインヒビター」は、本明細書中で使用される場合、同じ意味を有する。
【０１００】
使用され得るＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターの例としては、ロバスタチン（ＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）；米国特許第４，２３１，９３８号、同第４，２９４，９２６号および同第４，３１９，０３９号を参照のこと）、シンバスタチン（ＺＯＣＯＲ（登録商標）；米国特許第４，４４４，７８４号、同第４，８２０，８５０号、および同第４，９１６，２３９号を参照のこと）、プラバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ（登録商標）；米国特許第４，３４６，２２７号、同第４，５３７，８５９号、同第４，４１０，６２９号、同第５，０３０，４４７号、および同第５，１８０，５８９号を参照のこと）、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ（登録商標）；米国特許第５，３５４，７７２号、同第４，９１１，１６５号、同第４，９２９，４３７号、同第５，１８９，１６４号、同第５，１１８，８５３号、同第５，２９０，９４６号、および同第５，３５６，８９６号を参照のこと）、アトロバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）（ＬＩＰＩＴＯＲ（登録商標）；米国特許第５，２７３，９９５号、同第４，６８１，８９３号、同第５，４８９，６９１号、および同第５，３４２，９５２号を参照のこと）ならびにセリバスタチン（リバスタチン（ｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）およびＢＡＹＣＨＯＬ（登録商標）としてもまた公知、米国特許第５，１７７，０８０号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法において使用され得る、これらのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターおよびさらなるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターの構造式は、Ｍ．Ｙａｌｐａｎｉ、「Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｏｗｅｒｉｎｇ  Ｄｒｕｇｓ」，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，８５−８９頁（１９９６年２月５日）の８７頁、ならびに米国特許第４，７８２，０８４号および同第４，８８５，３１４号に記載されている。用語ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターとは、本明細書中で使用される場合、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害活性を有する化合物の、全ての薬学的に受容可能なラクトンおよび開環酸（ｏｐｅｎ−ａｃｉｄ）形態（すなわち、ラクトン環が開いて遊離酸を形成しているもの）、ならびに塩形態およびエステル形態を包含し、従って、このような塩、エステル、開環酸形態およびラクトン形態の使用は、本発明の範囲内に含まれる。ラクトン部分およびその対応する開環酸形態の説明は、以下に構造ＩおよびＩＩとして示される。
【０１０１】
【化１】
2007515945.tif 000003
開環酸形態が存在し得るＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターにおいて、塩形態およびエステル形態は、開環酸から形成され得、そしてこのような全ての形態は、本明細書中で使用される場合の用語「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター」の意味に含まれる。いくつかの実施形態において、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターは、ロバスタチンおよびシンバスタチンから選択され、そしてさらなる実施形態においては、シンバスタチンである。本明細書中で、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターに関する用語「薬学的に受容可能な塩」は、本発明において使用される化合物の非毒性の塩を意味するべきであり、これらの塩は、一般に、遊離酸を、適切な有機塩基または無機塩基と反応させることによって、調製される。特に、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛およびテトラメチルアンモニウムのようなカチオンから形成される塩、ならびにアンモニア、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、１−ｐ−クロロベンジル−２−ピロリジン−１’−イル−メチルベンゾ−イミダゾール、ジエチルアミン、ピペラジン、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのようなアミンから形成される塩である。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターの塩形態のさらなる例としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物塩、エデト酸カルシウム塩、ｄ−カンファースルホン酸塩、炭酸塩、塩化物塩、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート（ｅｓｔｏｌａｔｅ）、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン（ｈｙｄｒａｂａｍｉｎｅ）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩（ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｔｈｏａｔｅ）、ヨウ化物塩、イソチオネート（ｉｓｏｔｈｉｏｎａｔｅ）、乳酸塩、ラクトビオン酸塩（ｌａｃｔｏｂｉｏｎａｔｅ）、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシレート、メチルスルホン酸塩、ムチン酸塩、ナプシラート、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクトロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクラート（ｔｅｏｃｌａｔｅ）、トシラート、トリエチオジド、および吉草酸塩が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１０２】
記載されるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター化合物のエステル誘導体は、プロドラッグとして働き得、このプロドラッグは、温血動物の血流に吸収されると、薬物形態を放出し、そしてこの薬物が、改善された医療効力を与えることを可能にするような様式で開裂し得る。
【０１０３】
「プレニル−タンパク質トランスフェラーゼインヒビター」とは、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ酵素のいずれか１つまたは任意の組み合わせを阻害する化合物をいい、この化合物としては、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ（ＦＰＴａｓｅ）、ゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼＩ型（ＧＧＰＴａｓｅ−Ｉ）、およびゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼＩＩ型（ＧＧＰＴａｓｅ−ＩＩ、Ｒａｂ  ＧＧＰＴａｓｅともまた称される）が挙げられる。プレニル−タンパク質トランスフェラーゼを阻害する化合物の例としては、（±）−６−［アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン、（−）−６−［アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン、（＋）−６−［アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン、５（Ｓ）−ｎ−ブチル−１−（２，３−ジメチルフェニル）−４−［１−（４−シアノベンジル）−５−イミダゾリルメチル］−２−ピペラジノン、（Ｓ）−１−（３−クロロフェニル）−４−［１−（４−シアノベンジル）−５−イミダゾリルメチル］−５−［２−（エタンスルホニル）メチル）−２−ピペラジノン、５（Ｓ）−ｎ−ブチル−１−（２−メチルフェニル）−４−［１−（４−シアノベンジル）−５−イミダゾリルメチル］−２−ピペラジノン、１−（３−クロロフェニル）−４−［１−（４−シアノベンジル）−２−メチル−５−イミダゾリルメチル］−２−ピペラジノン、１−（２，２−ジフェニルエチル）−３−「Ｎ−（１−（４−シアノベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イルエチル）カルバモイル］ピペリジン、４−｛５−［４−ヒドロキシメチル−４−（４−クロロピリジン−２−イルメチル）−ピペリジン−１−イルメチル］−２−メチルイミダゾール−１−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−｛５−［４−ヒドロキシメチル−４−（３−クロロベンジル）−ピペリジン−１−イルメチル］−２−メチルイミダゾール−１−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−｛３−［４−（２−オキソ−２Ｈ−ピリジン−１−イル）ベンジル］−３Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−｛３−［４−（５−クロロ−２−オキソ−２Ｈ−［１，２’］ビピリジン−５’−イルメチル］−３Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−｛３−［４−（２−オキソ−２Ｈ−［１，２’］ビピリジン−５’イルメチル］−３Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−［３−（２−オキソ−１−フェニル−１，２−ジヒドロピリジン−４−イルメチル）−３Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル｝ベンゾニトリル、１８，１９−ジヒドロ−１９−オキソ−５Ｈ，１７Ｈ−６，１０：１２，１６−ジメテノ−１Ｈ−イミダゾ［４，３−ｃ］［１，１１，４］ジオキサアザシクロ−ノナデシン−９−カルボニトリル、（±）−１９，２０−ジヒドロ−１９−オキソ−５Ｈ，１８，２１−エタノ−１２，１４−エテノ−６，１０−メテノ−２２Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾ［４，３−ｋ］［１，６，９，１２］オキサトリアザ−シクロオクタデシン−９−カルボニトリル、１９，２０−ジヒドロ−１９−オキソ−５Ｈ，１７Ｈ−１８，２１−エタノ−６，１０：１２，１６−ジメテノ−２２Ｈ−イミダゾ［３，４−ｈ］［１，８，１１，１４］オキサトリアザシクロエイコシン−９−カルボニトリル、および（±）−１９，２０−ジヒドロ−３−メチル−１９−オキソ−５Ｈ−１８，２１−エタノ−１２，１４−エテノ−６，１０−メテノ−２２Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾ［４，３−ｋ］［１，６，９，１２］オキサ−トリアザシクロオクタデシン−９−カルボニトリルが挙げられる。
【０１０４】
プレニル−タンパク質トランスフェラーゼインヒビターの他の例は、以下の刊行物および特許に見出され得る：ＷＯ  ９６／３０３４３、ＷＯ９７／１８８１３、ＷＯ  ９７／２１７０１、ＷＯ９７／２３４７８、ＷＯ  ９７／３８６６５、ＷＯ  ９８／２８９８０、ＷＯ  ９８／２９１１９、ＷＯ  ９５／３２９８７、米国特許第５，４２０，２４５号、米国特許第５，５２３，４３０号、米国特許第５，５３２，３５９号、米国特許第５，５１０，５１０号、米国特許第５，５８９，４８５号、米国特許第５，６０２，０９８号、欧州特許公開第０  ６１８  ２２１号、欧州特許公開第０  ６７５  １１２号、欧州特許公開第０  ６０４  １８１号、欧州特許公開第０  ６９６  ５９３号、ＷＯ  ９４／１９３５７、ＷＯ  ９５／０８５４２、ＷＯ  ９５／１１９１７、ＷＯ  ９５／１２６１２、ＷＯ  ９５／１２５７２、ＷＯ  ９５／１０５１４、米国特許第５，６６１，１５２号、ＷＯ  ９５／１０５１５、ＷＯ  ９５／１０５１６、ＷＯ  ９５／２４６１２、ＷＯ  ９５／３４５３５、ＷＯ９５／２５０８６、ＷＯ  ９６／０５５２９、ＷＯ９６／０６１３８、ＷＯ  ９６／０６１９３、ＷＯ  ９６／１６４４３、ＷＯ  ９６／２１７０１、ＷＯ  ９６／２１４５６、ＷＯ  ９６／２２２７８、ＷＯ  ９６／２４６１１、ＷＯ９６／２４６１２、ＷＯ  ９６／０５１６８、ＷＯ  ９６／０５１６９、ＷＯ  ９６／００７３６、米国特許第５，５７１，７９２号、ＷＯ  ９６／１７８６１、ＷＯ  ９６／３３１５９、ＷＯ  ９６／３４８５０、ＷＯ  ９６／３４８５１、ＷＯ  ９６／３００１７、ＷＯ  ９６／３００１８、ＷＯ  ９６／３０３６２、ＷＯ  ９６／３０３６３、ＷＯ  ９６／３１１１１、ＷＯ  ９６／３１４７７、ＷＯ  ９６／３１４７８、ＷＯ  ９６／３１５０１、ＷＯ９７／００２５２、ＷＯ  ９７／０３０４７、ＷＯ  ９７／０３０５０、ＷＯ  ９７／０４７８５、ＷＯ  ９７／０２９２０、ＷＯ  ９７／１７０７０、ＷＯ  ９７／２３４７８、ＷＯ  ９７／２６２４６、ＷＯ  ９７／３００５３、ＷＯ  ９７／４４３５０、ＷＯ  ９８／０２４３６、および米国特許第５，５３２，３５９号。
【０１０５】
プレニル−タンパク質トランスフェラーゼインヒビターの、新脈管形成に対する役割の例については、Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ３５（９）：１３９４−１４０１（１９９９）を参照のこと。
【０１０６】
「新脈管形成インヒビター」とは、機構にかかわらず、新たな血管の形成を阻害する化合物をいう。新脈管形成インヒビターの例としては、チロシンキナーゼインヒビター（例えば、チロシンキナーゼレセプターＦｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ１）のインヒビターおよびＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）のインヒビター）、上皮由来線維芽細胞誘導体のインヒビター、または血小板由来増殖因子のインヒビター、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテイナーゼ）インヒビター、インテグリンブロッカー、インターフェロン−α、インターロイキン−１２、ペントサンポリスルフェート、シクロオキシゲナーゼインヒビター（アスピリンおよびイブプロフェンのような非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ならびにセレコキシブおよびロフェコキシブのような選択的シクロオキシゲナーゼ−２インヒビターが挙げられる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：７３８４（１９９２）；Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．６９：４７５（１９８２）；Ａｒｃｈ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．１０８：５７３（１９９０）；Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．２３８：６８（１９９４）；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７２：８３（１９９５）；Ｃｌｉｎ，Ｏｒｔｈｏｐ．３１３：７６（１９９５）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６：１０７（１９９６），Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５：１０５（１９９７）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：１６２５（１９９７）；Ｃｅｌｌ  ９３：７０５（１９９８）；Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２：７１５（１９９８）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：９１１６（１９９９）））、ステロイド系抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド、鉱質コルチコイド、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレド（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄ）、ベタメタゾン）、カルボキシアミドトリアゾール、コンブレスタチンＡ−４、スクアラミン、６−Ｏ−クロロアセチル−カルボニル）−フマギロール、サリドマイド、アンギオスタチン、トロポニン−１、アンギオテンシンＩＩアンタゴニスト（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら．（１９８５）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１０５：１４１−５を参照のこと）ならびにＶＥＧＦに対する抗体（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６３−８（１９９９）；Ｋｉｍら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１−４；ＷＯ  ００／４４７７７；およびＷＯ  ００／６１１８６を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
新脈管形成を調節または阻害し、そしてまた、標的タンパク質インヒビターと組み合わせて使用され得る、他の治療剤としては、凝固系およびフィブリン溶解系を調節または阻害する薬剤が挙げられる（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａ．Ｍｅｄ．３８：６７９−９２（２０００）における概説を参照のこと）。凝固経路およびフィブリン溶解経路を調節または阻害するような薬剤の例としては、ヘパリン（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８０：１０−２３（１９９８）を参照のこと）、低分子量ヘパリンおよびカルボキシペプチダーゼＵインヒビター（活性トロンビン活性化可能フィブリン溶解インヒビター［ＴＡＦＩａ］のインヒビターとしてもまた公知）（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．１０１：３２９−５４（２００１）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。ＴＡＦＩａインヒビターは、ＷＯ  ０３／１３５２６および米国特許出願番号６０／３４９，９２５（２００２年１月１８日出願）に記載されている。
【０１０８】
「細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤」とは、細胞周期チェックポイントシグナル伝達を形質導入するプロテインキナーゼを阻害し、これによって、癌細胞をＤＮＡ損傷薬剤に対して感受性にする化合物をいう。このような薬剤としては、ＡＴＲキナーゼのインヒビター、ＡＴＭキナーゼのインヒビター、Ｃｈｋ１キナーゼのインヒビターおよびＣｈｋ２キナーゼのインヒビター、ならびにｃｄｋキナーゼインヒビターおよびｃｄｃキナーゼインヒビターが挙げられ、そして具体的には、７−ヒドロキシスタウロスポリン（７−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎ）、フラボピリドール（ｆｌａｖｏｐｉｒｉｄｏｌ）、ＣＹＣ２０２（Ｃｙｃｌａｃｅｌ）およびＢＭＳ−３８７０３２によって例示される。
【０１０９】
「細胞の増殖および生存のシグナル伝達経路のインヒビター」とは、細胞表面レセプターの下流のシグナル伝達カスケードを阻害する化合物をいう。このような薬剤としては、セリン／スレオニンキナーゼ（ＷＯ  ０２／０８３０６４、ＷＯ  ０２／０８３１３９、ＷＯ  ０２／０８３１４０およびＷＯ  ０２／０８３１３８に記載されるようなＡｋｔのインヒビター、Ｒａｆキナーゼのインヒビター（例えば、ＢＡＹ−４３−９００６）、ＭＥＫのインヒビター（例えば、ＣＩ−１０４０およびＰＤ−０９８０５９）、ｍＴＯＲのインヒビター（例えば、Ｗｙｅｔｈ  ＣＣＩ−７７９）、ならびにＰＩ３Ｋのインヒビター（例えば、ＬＹ２９４００２）が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。
【０１１０】
ＮＳＡＩＤとの組み合わせは、強力なＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳＡＩＤの使用に関する。本明細書の目的で、ＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ−２の阻害に関して、細胞アッセイまたはミクロソームアッセイによって測定される場合に、１マイクロモル濃度以下のＩＣ５０を保有する場合に、強力である。
【０１１１】
本発明はまた、選択的ＣＯＸ−２インヒビターであるＮＳＡＩＤとの組み合わせを包含する。本明細書の目的で、ＣＯＸ−２の選択的インヒビターであるＮＳＡＩＤは、細胞アッセイまたはミクロソームアッセイによって評価される、ＣＯＸ−１についてのＩＣ５０に対するＣＯＸ−２についてのＩＣ５０の比によって測定される場合に、ＣＯＸ−１の阻害に対して少なくとも１００倍の、ＣＯＸ−２の阻害に対する特異性を保有するＮＳＡＩＤとして定義される。このような化合物としては、米国特許第５，４７４，  ９９５号（１９９５年１２月１２日発行）、米国特許第５，８６１，４１９号（１９９９年１月１９日発行）、米国特許第６，００１，８４３号（１９９９年１２月１４日発行）、米国特許第６，０２０，３４３号（２０００年２月１日発行）、米国特許第５，４０９，９４４号（１９９５年４月２５日発行）、米国特許第５，４３６，２６５号（１９９５年７月２５日発行）、米国特許第５，５３６，７５２号（１９９６年７月１６日発行）、米国特許第５，５５０，１４２号（１９９６年８月２７日発行）、米国特許第５，６０４，２６０号（１９９７年２月１８日発行）、米国特許第５，６９８，５８４号（１９９７年１２月１６日発行）、米国特許第５，７１０，１４０号（１９９８年１月２０日発行）、ＷＯ  ９４／１５９３２（１９９４年７月２１日公開）、米国特許第５，３４４，９９１号（１９９４年６月６日発行）、米国特許第５，１３４，１４２号（１９９２年７月２８日発行）、米国特許第５，３８０，７３８号（１９９５年１月１０日発行）、米国特許第５，３９３，７９０号（１９９５年２月２０日発行）、米国特許第５，４６６，８２３号（１９９５年１１月１４日発行）、米国特許第５，６３３，２７２号（１９９７年５月２７日発行）、および米国特許第５，９３２，５９８号（１９９９年８月３日発行）、）に記載される化合物が挙げられるが、これらに限定されず、これらの全ては、本明細書中に参考として援用される。
【０１１２】
本発明の処置方法において有用なＣＯＸ−２のインヒビターとしては、３−フェニル−４−（４−（メチルスルホニル）フェニル）−２−（５Ｈ）−フラノン；および
【０１１３】
【化２】
2007515945.tif 000004
５−クロロ−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−２−（２−メチル−５−ピリジニル）ピリジン；
【０１１４】
【化３】
2007515945.tif 000005
またはこれらの薬学的に受容可能な塩が挙げられる。
【０１１５】
上記ＣＯＸ−２インヒビターの調製のための、一般的な合成手順および特殊な合成手順は、米国特許第５，４７４，９９５号（１９９５年１２月１２日発行）、米国特許第５，８６１，４１９号（１９９９年１月１９日発行）、および米国特許第６，００１，８４３号（１９９９年１２月１４日発行）に見出され、これらの全ては、本明細書中に参考として援用される。
【０１１６】
従って、ＣＯＸ−２の特異的インヒビターとして記載されている化合物は、本発明において有用であり、これらの化合物としては、以下：
【０１１７】
【化４】
2007515945.tif 000006
【０１１８】
【化５】
2007515945.tif 000007
またはこれらの薬学的に受容可能な塩が挙げられる。
【０１１９】
従って、ＣＯＸ−２の特異的インヒビターとして記載されている化合物は、本発明、およびその合成方法において有用であり、以下の特許、係属中の出願および刊行物に見出され得、これらは、本明細書中に参考として援用される：ＷＯ  ９４／１５９３２（１９９４年７月２１日公開）、米国特許第５，３４４，９９１号（１９９４年６月６日発行）、米国特許第５，１３４，１４２号（１９９２年７月２８日発行）、米国特許第５，３８０，７３８号（１９９５年１月１０日発行）、米国特許第５，３９３，７９０号（１９９５年２月２０日発行）、米国特許第５，４６６，８２３号（１９９５年１１月１４日発行）、米国特許第５，６３３，２７２号（１９９７年５月２７日発行）、および米国特許第５，９３２，５９８号（１９９９年８月３日発行）。
【０１２０】
従って、ＣＯＸ−２の特異的インヒビターである化合物は、本発明、およびその合成方法において有用であり、以下の特許、係属中の出願および刊行物に見出され得、これらは、本明細書中に参考として援用される：米国特許第５，４７４，９９５号（１９９５年１２月１２日発行）、米国特許第５，８６１，４１９号（１９９９年１月１９日発行）、米国特許第６，００１，８４３号（１９９９年１２月１４日発行）、米国特許第６，０２０，３４３号（２０００年２月１日発行）、米国特許第５，４０９，９４４号（１９９５年４月２５日発行）、米国特許第５，４３６，２６５号（１９９５年７月２５日発行）、米国特許第５，５３６，７５２号（１９９６年７月１６日発行）、米国特許第５，５５０，１４２号（１９９６年８月２７日発行）、米国特許第５，６０４，２６０号（１９９７年２月１８日発行）、米国特許第５，６９８，５８４号（１９９７年１２月１６日発行）、および米国特許第５，７１０，１４０号（１９９８年１月２０日発行）。
【０１２１】
新脈管形成インヒビターの他の例としては、エンドスタチン、ウクライン（ｕｋｒａｉｎ）、ランピルナーゼ（ｒａｎｐｉｒｎａｓｅ）、ＩＭ８６２、５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）オキシラニル］−１−オキサスピロ［２，５］オクト−６−イル（クロロアセチル）カルバメート、アセチルジナナリン（ａｃｅｔｙｌｄｉｎａｎａｌｉｎｅ）、５−アミノ−１−［［３，５−ジクロロ−４−（４−クロロベンゾイル）フェニル］メチル］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−カルボキサミド、ＣＭ１０１、スクアラミド、コンブレスタチン、ＲＰＩ４６１０、ＮＸ３１８３８、硫酸化マンノペンタオースホスフェート、７，７−（カルボニル−ビス［イミノ−Ｎ−メチル−４，２−ピロロカルボニルイミノ［Ｎ−メチル−４，２−ピロール］−カルボニルイミノ］−ビス−（１，３−ナフタレンジスルホネート）、および３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
上で使用されるように、「インテグリンブロッカー」とは、αｖβ３インテグリンへの生理学的リガンドの結合に、選択的に拮抗するか、阻害するか、または反作用する化合物、αｖβ５インテグリンへの生理学的リガンドの結合に、選択的に拮抗するか、阻害するか、または反作用する化合物、αｖβ３インテグリンとαｖβ５インテグリンとの両方への生理学的リガンドの結合に拮抗するか、阻害するか、または反作用する化合物、ならびに毛細血管内皮細胞上で発現される特定のインテグリンの活性に拮抗するか、阻害するか、または反作用する化合物をいう。この用語はまた、αｖβ６インテグリン、αｖβ８インテグリン、α１β１インテグリン、α２β１インテグリン、α５β１インテグリン、α６β１インテグリンおよびα６β４インテグリンのアンタゴニストをいう。この用語はまた、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、αｖβ８インテグリン、α１β１インテグリン、α２β１インテグリン、α５β１インテグリン、α６β１インテグリンおよびα６β４インテグリンの任意の組み合わせのアンタゴニストをいう。
【０１２３】
チロシンキナーゼインヒビターのいくつかの具体例としては、Ｎ−（トリフルオロメチルフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−カルボキサミド，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル）インドリン−２−オン，１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン，４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−［３−（４−モルホリニル）プロポキシル］キナゾリン，Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリナミン、ＢＩＢＸ１３８２、２，３，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−１０−（ヒドロキシメチル）−１０−ヒドロキシ−９−メチル−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１−オン、ＳＨ２６８、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、ＳＴＩ５７１、ＣＥＰ２５６３、４−（３−クロロフェニルアミノ）−５，６−ジメチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンメタンスルホネート、４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン，４−（４’−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、ＳＵ６６６８、ＳＴＩ５７１Ａ、Ｎ−４−クロロフェニル−４−（４−ピリジルメチル）−１−フタラジナミン、およびＥＭＤ１２１９７４が挙げられる。
【０１２４】
抗癌化合物以外の化合物との組み合わせもまた、本発明の方法において企図される。例えば、本願発明の化合物と、ＰＰＡＲ−γ（すなわち、ＰＰＡＲ−ガンマ）アゴニストおよびＰＰＡＲ−δ（すなわち、ＰＰＡＲ−デルタ）アゴニストとの組み合わせは、特定の悪性疾患の処置において有用である。ＰＰＡＲ−γおよびＰＰＡＲ−δは、核ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγおよび核ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターδである。内皮細胞上でのＰＰＡＲ−γの発現およびその新脈管形成への関与は、文献に報告されている（Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９８）３１：９０９−１３；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：９１１６−２１；Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｉｎｏｌ  Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．（２０００）４１：２３０９−１７を参照のこと）。より最近、ＰＰＡＲ−γアゴニストは、インビトロにおいて、ＶＥＧＦに対する脈管形成応答を阻害することが示された；トログリタゾンとマレイン酸ロシグリタゾンとの両方が、マウスにおいて、網膜新生血管形成の発達を阻害する（Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．（２００１）１１９：７０９−１７）。ＰＰＡＲ−γアゴニストおよびＰＰＡＲ−γ／αアゴニストの例としては、チアゾリジンジオン（例えば、ＤＲＦ２７２５、ＣＳ−０１１、トログリタゾン、ロシグリタゾン、およびピオグリタゾン）、フェノフィブレート、ゲムフィブロジル、クロフィブレート、ＧＷ２５７０、ＳＢ２１９９９４、ＡＲ−Ｈ０３９２４２、ＪＴＴ−５０１、ＭＣＣ−５５５、ＧＷ２３３１、ＧＷ４０９５４４、ＮＮ２３４４、ＫＲＰ２９７、ＮＰ０１１０、ＤＲＦ４１５８、ＮＮ６２２、ＧＩ２６２５７０、ＰＮＵ１８２７１６、ＤＲＦ５５２９２６、２−［（５，７−ジプロピル−３−トリフルオロメチル−１，２−ベンゾイソオキサゾール−６−イル）オキシ］−２−メチルプロピオン酸（ＵＳＳＮ  ０９／７８２，８５６に開示される）、および２（Ｒ）−７−（３−（２−クロロ−４−（４−フルオロフェノキシ）フェノキシ）プロポキシ）−２−エチルクロマン−２−カルボン酸（米国出願番号６０／２３５，７０８および同６０／２４４，６９７に開示される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
本発明のいくつかの実施形態において、標的タンパク質インヒビターは、癌の処置のための遺伝子両方と組み合わせて使用される。癌を処置するための遺伝子的ストラテジーの概説については、Ｈａｌｌら（１９９７）、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６１：７８５−９およびＫｕｆｅら（２０００）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第５版、８７６−８９頁、ＢＣ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｈａｍｉｌｔｏｎを参照のこと。遺伝子療法を使用して、任意の腫瘍抑制遺伝子を送達し得る。このような遺伝子の例としては、ｐ５３（これは、組換えウイルス媒介遺伝子移入を介して送達され得る（例えば、米国特許第６，０６９，１３４号を参照のこと））、ｕＰＡ／ｕＰＡＲアンタゴニスト（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｕＰＡ／ｕＰＡＲ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｒｓ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ」、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５（８）：１１０５−１３（１９９８））およびインターフェロンγ（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２１７−２２（２０００））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
標的タンパク質インヒビターはまた、固有の多剤耐性（ＭＤＲ）（特に、トランスポータータンパク質の高レベルの発現に関連するＭＤＲ）のインヒビターと組み合わせて、投与され得る。このようなＭＤＲインヒビターとしては、ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）（例えば、ＬＹ３３５９７９、ＸＲ９５７６、ＯＣ１１４−０９３、Ｒ１０１９２２、ＶＸ８５３およびＰＳＣ８６６（バルスポダール（ｖａｌｓｐｏｄａｒ）））のインヒビターが挙げられる。
【０１２７】
標的タンパク質インヒビターは、悪心および嘔吐（急性嘔吐、遅延型嘔吐、後期（ｌａｔｅ  ｐｈａｓｅ）嘔吐、および予測性嘔吐が挙げられ、これらは、単独でかまたは放射線療法と組み合わせた本発明の化合物の使用から生じ得る）を処置するために、制吐薬と組み合わせて使用され得る。嘔吐の予防または処置のために、本発明の化合物は、他の制吐剤（特に、ニューロキニン−１レセプターアンタゴニスト、５ＨＴ３レセプターアンタゴニスト（例えば、オンダンセトロン、グラニセトロン、トロピセトロン、およびザチセトロン）、ＧＡＢＡＢレセプターアゴニスト（例えば、バクロフェン）、コルチコステロイド（例えば、Ｄｅｃａｄｒｏｎ（デキサメタゾン）、Ｋｅｎａｌｏｇ、Ａｒｉｓｔｏｃｏｒｔ、Ｎａｓａｌｉｄｅ、Ｐｒｅｆｅｒｉｄ、Ｂｅｎｅｃｏｒｔｅｎ）、または他のもの（例えば、米国特許第２，７８９，１１８号、同第２，９９０，４０１号、同第３，０４８，５８１号、同第３，１２６，３７５号、同第３，９２９，７６８号、同第３，９９６，３５９号、同第３，９２８，３２６号および同第３，７４９，７１２号に開示されるもの）、抗ドパミン作用薬（例えば、フェノチアジン（例えば、プロクロルペラジン、フルフェナジン、チオリダジンおよびメソリダジン））メトクロプラミドまたはドロナビノール）と組み合わせて使用され得る。標的タンパク質インヒビターの投与の際に生じ得る嘔吐の処置または予防のために、制吐薬との併用療法は、ニューロキニン−１レセプターアンタゴニスト、５ＨＴ３レセプターアンタゴニスト、およびコルチコステロイドから選択され得る。
【０１２８】
本発明の標的タンパク質インヒビターと組み合わせて使用するニューロキニン−１レセプターアンタゴニストは、例えば、以下に完全に記載される：米国特許第５，１６２，３３９号、同第５，２３２，９２９号、同第５，２４２，９３０号、同第５，３７３，００３号、同第５，３８７，５９５号、同第５，４５９，２７０号、同第５，４９４，９２６号、同第５，４９６，８３３号、同第５，６３７，６９９号、同第５，７１９，１４７号；欧州特許公開番号ＥＰ  ０  ３６０  ３９０、同ＥＰ  ０  ３９４  ９８９、同ＥＰ  ０  ４２８  ４３４、同ＥＰ  ０  ４２９  ３６６号、同ＥＰ  ０  ４３０  ７７１号、同ＥＰ  ０  ４３６  ３３４、同ＥＰ  ０  ４４３  １３２、同ＥＰ  ０  ４８２  ５３９、同ＥＰ  ０  ４９８  ０６９、同ＥＰ  ０  ４９９  ３１３、同ＥＰ  ０  ５１２  ９０１、同ＥＰ  ０  ５１２  ９０２、同ＥＰ  ０  ５１４  ２７３、同ＥＰ  ０  ５１４  ２７４、同ＥＰ  ０  ５１４  ２７５、同ＥＰ  ０  ５１４  ２７６、同ＥＰ  ０  ５１５  ６８１、同ＥＰ  ０  ５１７  ５８９、同ＥＰ  ０  ５２０  ５５５、同ＥＰ  ０  ５２２  ８０８、同ＥＰ  ０  ５２８  ４９５、同ＥＰ  ０  ５３２  ４５６、同ＥＰ  ０  ５３３  ２８０、同ＥＰ  ０  ５３６  ８１７、同ＥＰ  ０  ５４５  ４７８、同ＥＰ  ０  ５５８  １５６、同ＥＰ  ０  ５７７  ３９４、同ＥＰ  ０  ５８５  ９１３、同ＥＰ  ０  ５９０  １５２、同ＥＰ  ０  ５９９  ５３８、同ＥＰ  ０  ６１０  ７９３、同ＥＰ  ０  ６３４  ４０２、同ＥＰ  ０  ６８６  ６２９、同ＥＰ  ０  ６９３  ４８９、同ＥＰ  ０  ６９４  ５３５、同ＥＰ  ０  ６９９  ６５５、同ＥＰ  ０  ６９９  ６７４、同ＥＰ  ０  ７０７  ００６、同ＥＰ  ０  ７０８  １０１、同ＥＰ  ０  ７０９  ３７５、同ＥＰ  ０  ７０９  ３７６、同ＥＰ  ０  ７１４  ８９１、同ＥＰ  ０  ７２３  ９５９、同ＥＰ  ０  ７３３  ６３２、および同ＥＰ  ０  ７７６  ８９３号；ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ  ９０／０５５２５、同ＷＯ  ９０／０５７２９、同ＷＯ  ９１／０９８４４、同ＷＯ  ９１／１８８９９、同ＷＯ  ９２／０１６８８、同ＷＯ  ９２／０６０７９、同ＷＯ  ９２／１２１５１、同ＷＯ  ９２／１５５８５、同ＷＯ  ９２／１７４４９、同ＷＯ  ９２／２０６６１、同ＷＯ  ９２／２０６７６、同ＷＯ  ９２／２１６７７、同ＷＯ  ９２／２２５６９、同ＷＯ  ９３／００３３０、同ＷＯ  ９３／００３３１、同ＷＯ  ９３／０１１５９、同ＷＯ  ９３／０１１６５、同ＷＯ  ９３／０１１６９、同ＷＯ  ９３／０１１７０、同ＷＯ  ９３／０６０９９、同ＷＯ  ９３／０９１１６、同ＷＯ  ９３／１００７３、同ＷＯ  ９３／１４０８４、同ＷＯ  ９３／１４１１３、同ＷＯ  ９３／１８０２３、同ＷＯ  ９３／１９０６４、同ＷＯ  ９３／２１１５５、同ＷＯ  ９３／２１１８１、同ＷＯ  ９３／２３３８０、同ＷＯ  ９３／２４４６５、同ＷＯ  ９４／００４４０、同ＷＯ  ９４／０１４０２、同ＷＯ  ９４／０２４６１、同ＷＯ  ９４／０２５９５、同ＷＯ  ９４／０３４２９、同ＷＯ  ９４／０３４４５、同ＷＯ  ９４／０４４９４、同ＷＯ  ９４／０４４９６、同ＷＯ  ９４／０５６２５、同ＷＯ  ９４／０７８４３、同ＷＯ  ９４／０８９９７、同ＷＯ  ９４／１０１６５、同ＷＯ  ９４／１０１６７、同ＷＯ  ９４／１０１６８��同ＷＯ  ９４／１０１７０、同ＷＯ  ９４／１１３６８、同ＷＯ  ９４／１３６３９、同ＷＯ  ９４／１３６６３、同ＷＯ  ９４／１４７６７、同ＷＯ  ９４／１５９０３、同ＷＯ  ９４／１９３２０、同ＷＯ  ９４／１９３２３、同ＷＯ  ９４／２０５００、同ＷＯ  ９４／２６７３５、同ＷＯ  ９４／２６７４０、同ＷＯ  ９４／２９３０９、同ＷＯ  ９５／０２５９５、同ＷＯ  ９５／０４０４０、同ＷＯ  ９５／０４０４２、同ＷＯ  ９５／０６６４５、同ＷＯ  ９５／０７８８６、同ＷＯ  ９５／０７９０８、同ＷＯ  ９５／０８５４９、同ＷＯ  ９５／１１８８０、同ＷＯ  ９５／１４０１７、同ＷＯ  ９５／１５３１１、同ＷＯ  ９５／１６６７９、同ＷＯ  ９５／１７３８２、同ＷＯ  ９５／１８１２４、同ＷＯ  ９５／１８１２９、同ＷＯ  ９５／１９３４４、同ＷＯ  ９５／２０５７５、同ＷＯ  ９５／２１８１９、同ＷＯ  ９５／２２５２５、同ＷＯ  ９５／２３７９８、同ＷＯ  ９５／２６３３８、同ＷＯ  ９５／２８４１８、同ＷＯ  ９５／３０６７４、同ＷＯ  ９５／３０６８７、同ＷＯ  ９５／３３７４４、同ＷＯ  ９６／０５１８１、同ＷＯ  ９６／０５１９３、同ＷＯ  ９６／０５２０３、同ＷＯ  ９６／０６０９４、同ＷＯ  ９６／０７６４９、同ＷＯ  ９６／１０５６２、同ＷＯ  ９６／１６９３９、同ＷＯ  ９６／１８６４３、同ＷＯ  ９６／２０１９７、同ＷＯ  ９６／２１６６１、同ＷＯ  ９６／２９３０４、同ＷＯ  ９６／２９３１７、同ＷＯ  ９６／２９３２６、同ＷＯ  ９６／２９３２８、同ＷＯ  ９６／３１２１４、同ＷＯ  ９６／３２３８５、同ＷＯ  ９６／３７４８９、同ＷＯ  ９７／０１５５３、同ＷＯ  ９７／０１５５４、同ＷＯ  ９７／０３０６６、同ＷＯ  ９７／０８１４４、同ＷＯ  ９７／１４６７１、同ＷＯ  ９７／１７３６２、同ＷＯ  ９７／１８２０６、同ＷＯ  ９７／１９０８４、同ＷＯ  ９７／１９９４２、および同ＷＯ  ９７／２１７０２；ならびに英国特許公開番号第２  ２６６  ５２９号、同第２  ２６８  ９３１号、同第２  ２６９  １７０号、同第２  ２６９  ５９０号、同第２  ２７１  ７７４号、同第２  ２９２  １４４号、同第２  ２９３  １６８号、同第２  ２９３  １６９号、および同第２  ３０２  ６８９号。このような化合物の調製は、前述の特許および公報に完全に記載され、これらは、本明細書中で参考として援用される。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、本発明の化合物と組み合わせて使用するためのニューロキニン−１レセプターアンタゴニストは、２−（Ｒ）−（１−（Ｒ）−（３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル）エトキシ）−３−（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−４−（３−（５−オキソ−１Ｈ，４Ｈ−１，２，４−トリアゾロ）メチル）モルホリン、またはその薬学的に受容可能な塩から選択され、これは、米国特許第５，７１９，１４７に記載される。
【０１３０】
標的タンパク質インヒビターはまた、貧血の処置に有用な薬剤と一緒に投与され得る。このような貧血処置薬剤は、例えば、持続的赤血球生成（ｅｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）レセプター活性化因子（例えば、エポエチンα）である。
【０１３１】
標的タンパク質インヒビターはまた、好中球減少症の処置に有用な薬剤と一緒に投与され得る。このような好中球減少症処置薬剤は、例えば、好中球の産生および機能を制御する造血成長因子（例えば、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ））である。Ｇ−ＣＳＦの例としては、フィルグラスチムが挙げられる。
【０１３２】
標的タンパク質インヒビターはまた、免疫学的増強薬（例えば、レバミゾール、イソプリノシンおよびザダキシン（Ｚａｄａｘｉｎ））と一緒に投与され得る。
【０１３３】
第３の局面において、本発明は、標的タンパク質の活性の調節因子での処置のために候補被験体を同定するための方法を提供する。この方法は、（ａ）被験体からのサンプル細胞における標的タンパク質の発現レベルを測定する工程であって、ここで上記標的タンパク質は、配列番号２または配列番号３において提供される配列に対して８０％より高い配列同一性を有する配列を含む、工程；および（ｂ）上記サンプル細胞における標的タンパク質の発現レベルがコントロール細胞においてよりも有意に異なる場合に、上記被験体を、標的タンパク質の活性の調節因子で処置するための候補被験体として同定する工程、を包含する。
【０１３４】
第１の工程において、被験体のサンプル細胞における標的タンパク質の発現レベルが測定される。本明細書中で使用される場合、用語「サンプル細胞」とは、任意の臨床的に関連性のある組織サンプル（例えば、腫瘍生検もしくは細針吸引物）、または体液のサンプル（例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、腹水液、嚢胞性液、尿、もしくは乳頭滲出液）由来の細胞をいう。上記サンプルは、ヒト被験体または非ヒト被験体から採られ得る。本発明のこの局面の方法で使用される標的タンパク質は、上記のように、本発明の第１の局面の方法のためのものである。
【０１３５】
標的タンパク質の発現レベルは、当該分野で公知の任意の手段によって決定され得る。この発現レベルは、標的タンパク質をコードする遺伝子から転写された核酸を単離してその量を測定することにより決定され得る。あるいは、またはさらに、翻訳された標的タンパク質の量が決定され得る。例えば、標的タンパク質の発現レベルは、ＲＮＡをサンプルから単離して、それを、その標的タンパク質をコードする遺伝子の転写物に相当するＤＮＡまたはＲＮＡに特異的な核酸プローブにハイブリダイズすることによって決定され得る。ｍＲＮＡレベルを測定するのに有用な技術としては、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、ノーザン分析、ＲＮａｓｅ保護、およびマイクロアレイへのハイブリダイゼーションが挙げられるが、これらに限定されない。標的タンパク質の発現レベルはまた、タンパク質レベルにおいて評価され得る。タンパク質レベルを測定するのに有用な技術としては、標的タンパク質に対する抗体を使用する、標準的な免疫アッセイ、質量分析アッセイ、抗体マイクロアレイ、および２Ｄゲル電気泳動アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。標的タンパク質の発現レベルを測定するための例示的な方法は、実施例１、２および６に提供される。
【０１３６】
第２の方法において、サンプル細胞における標的タンパク質の発現レベルがコントロール細胞においてよりも有意に異なる場合に、上記被験体は、標的タンパク質の活性の調節因子で処置するための候補被験体として同定される。用語「コントロール細胞」とは、所望のレベルの標的タンパク質を発現する参照細胞をいう。このコントロール細胞は、サンプル細胞が得られた被験体と同じ被験体からの細胞であり得るが、そうである必要はない。コントロール細胞は、サンプル細胞が得られた組織と同じ組織から得られ得る。このコントロール細胞はまた、同じ組織型由来であるが異なる被験体由来の細胞であり得る。コントロール細胞はまた、仮想細胞（例えば、複数の被験体における標的タンパク質の発現レベルの平均を表す想像の細胞、または標的タンパク質の理想的な発現レベルを表す想像の細胞）を含み得る。
【０１３７】
サンプル細胞における発現レベルとコントロール細胞における発現レベルとの比較は、当該分野の従来の方法を使用してなされ得る。例えば、発現レベルの比較は、視覚的に達成され得るか、または濃度計によって達成され得る。一般的に、遺伝子発現レベルを比較するための方法は、発現レベルにおける差異の統計学的有意性の見積もりを提供する。例えば、個々のサンプルの反復測定は、測定された発現レベルの平均および標準誤差を見積もるために使用され得る。本発明のこの局面の方法に従って、コントロール細胞と異常に増殖する細胞とにおける発現レベルの差異が、統計学的に有意であると決定される場合、被験体は、標的タンパク質の活性の調節因子での処置のための候補被験体として同定される。いくつかの実施形態において、本発明のこの局面の方法は、さらに、上記のように、標的タンパク質の活性の調節因子を投与することにより候補被験体を処置する工程を包含する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、上記方法は、標的タンパク質の活性のインヒビターでの処置のための候補被験体を同定する。しかし、本発明のこの局面の方法はまた、標的タンパク質の活性を刺激する調節因子での処置のための候補被験体を同定するために、適用可能である。標的タンパク質の活性のインヒビターでの処置のための候補被験体を同定するための方法は、以下の工程を包含する：（ａ）被験体の異常に増殖する細胞における標的タンパク質の発現レベルを測定する工程であって、ここで、上記標的タンパク質は、配列番号２または配列番号３において提供される配列に対して８０％より高い配列同一性を有する配列を含む、工程；および（ｂ）上記異常に増殖する細胞における標的タンパク質の発現レベルがコントロール細胞においてよりも有意に高い場合に、上記被験体を、標的タンパク質の活性のインヒビターでの処置のための候補被験体として同定する工程。本実施形態に従って、上記サンプル細胞は、異常に増殖する細胞である。代表的には、本実施形態で使用されるコントロール細胞は、異常に増殖しない細胞である。いくつかの実施形態において、本発明のこの局面の方法は、上記のような、標的タンパク質の活性のインヒビターを投与することにより候補被験体を処置する工程をさらに包含する。
【０１３９】
本発明はまた、配列番号２または配列番号３において提供される配列に対して８０％より高い配列同一性を有する配列を含む標的タンパク質の調節因子をスクリーニングするためのキットを提供する。これらのキットは、標的タンパク質の調節因子をスクリーニングするための材料および試薬、ならびにそのスクリーニングをどのように行うかを説明する指示書を備え得る。例えば、上記キットは、生物学的に活性な標的タンパク質、反応チューブ、およびその標的タンパク質の活性を試験するための指示書を備え得る。上記キットは、標的タンパク質の活性に対する特異的なアッセイの使用のために作製され得る。従って、上記キットは、ＡＴＰアーゼアッセイ、微小管結合アッセイ、微小管滑動アッセイ、または細胞の増殖および生存度のアッセイのために作製され得る。
【０１４０】
提供される実施例は、本発明のさらなる理解を補助することを意図し、そして本発明を実施するためにここで企図される最も良好な様式を例示する。使用される特定の材料、種および条件は、本発明の例示であり、本発明の合理的な範囲を限定しないことを意図する。
【実施例】
【０１４１】
（実施例１）
本実施例は、正常細胞および腫瘍細胞におけるＫＩＦ１４発現レベルを記載する。
【０１４２】
ＫＩＦ１４  ｍＲＮＡ発現レベルを、２つの正常細胞株（ヒト乳房上皮細胞ＨＭＥＣ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、カタログ番号ＣＣ−２５５１）およびヒト骨格筋細胞ＳＫＭＣ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、カタログ番号ＣＣ−２５６１））、ならびに２つの腫瘍細胞株（結腸直腸癌細胞株ＨＴ−２９（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、カタログ番号ＨＴＢ−３８）および乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−２２））において評価した。これらの細胞株由来のＲＮＡを、標準的なＱＩＡシュレッダー（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７９６５６）ホモジナイゼーション、およびＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ工程（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７９２５）を使用するＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０６）に従うことによって収集した。カスタムメイドのヒトｈｕ２５ｋマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）へのハイブリダイゼーションのための標識コピーＲＮＡの調製、ハイブリダイゼーション条件、および続いてのデータ処理は、以前に記載される通りである（ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：５３０−５３６）。
【０１４３】
（結果）
ＫＩＦ１４  ｍＲＮＡの発現レベルは、表１に示すように、正常細胞においてよりも、腫瘍細胞株において約４倍〜約６．６倍高かった。
【０１４４】
（表１．正常細胞および腫瘍細胞におけるＫＩＦ１４  ｍＲＮＡ発現）
【０１４５】
【表１】
2007515945.tif 000008
異なるヒト組織および腫瘍細胞株のパネルにおけるＫＩＦ１４  ｍＲＮＡ発現を測定するために、ＫＩＦ１４転写配列（配列番号１）にわたる位置由来の２９個のオリゴヌクレオチドプローブを生成して、マイクロアレイに配置させた。６８個の組織／細胞株由来のＲＮＡを、全長増幅プロトコルを使用して増幅し、Ｃｙ３色素またはＣｙ５色素のいずれかで標識し、そしてマイクロアレイにハイブリダイズした（Ｈｕｇｈｅｓら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３４２−３４７およびｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：５３０−５３６に以前に記載されたように）。各組織におけるｍＲＮＡ発現を、バックグラウンド除去および色素標準化の後に、プローブの自然対数強度の平均の指数として計算した。見積誤差は、モデル化プローブの測定誤差とプローブ間の差異との組み合わせを表す。ＫＩＦ１４は、一般的に、表２に示すように、腫瘍細胞株において高レベルで発現され、そしてヒト組織においてはより低いレベルで発現されることが見出された。
【０１４６】
（表２．ヒト組織および腫瘍細胞株におけるＫＩＦ１４  ｍＲＮＡ発現）
【０１４７】
【表２−１】
2007515945.tif 000009
【０１４８】
【表２−２】
2007515945.tif 000010
（実施例２）
本実施例は、有糸分裂キネシンのｍＲＮＡ発現パターンに対する、成長因子で処理した細胞株におけるＫＩＦ１４  ｍＲＮＡ発現パターンの類似性を記載する。
【０１４９】
実施例１に記載した細胞株ＭＣＦ−７、ＨＴ−２９、ＳＫＭＣおよびＨＭＥＣを使用した。５６の１０ｃｍプレートに、本実験の最初の日に７０〜８０％コンフルエンスの密度を与えるように、各細胞株を播種した。この細胞を、１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭを吸引して０．２％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ  （タンパクシツ除去（ｃｈａｒｃｏａｌ  ｓｔｒｉｐｐｅｄ）血清）を加えることによって、血清を枯渇させた。３７℃での血清枯渇の２４時間後、５個のプレートの５セットを、１００  ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号０１−４０７）、１００  ｎｇ／ｍＬのβ−ＦＧＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ５０７Ａ）、１００  ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ３７６９）、１００  ｎｇ／ｍＬのインスリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ２７６７）、および３０ｎｇ／ｍＬのヘレグリン（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、カタログ番号ＲＰ−３１８−Ｐ１ＡＸ）で処理した。成長因子を再懸濁し（ここで適用可能）、製造業者の指示書に従って保存した。５個のプレートの５セットを、コントロール溶液として０．２％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（タンパクシツ除去（ｃｈａｒｃｏａｌ  ｓｔｒｉｐｐｅｄ）血清）で対応するように処理した。さらなる６個のプレートを、５種の成長因子のうちの１つまたはコントロールで処理した。コントロールプレートを、それらの適合した処理したサンプルと並行して処理した。これらの後者の６個のプレートを溶解し、１５分後、リン酸化ＡｋｔおよびＭＡＰＫの標準的なウエスタンブロッティングを行い、刺激が起こったことを確認した。残りのプレートを、処理したサンプルとコントロールサンプルのペアにおいて、固定時間（３０分、２時間、６時間、１８時間、および２４時間）インキュベートし、その後、標準的なＱＩＡシュレッダー（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７９６５６）ホモジナイゼーション、およびＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ工程（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７９２５）を使用するＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０６）に従ってＲＮＡを収集した。カスタムメイドのヒトｈｕ２５ｋマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）へのハイブリダイゼーションのための標識コピーＲＮＡの調製、ハイブリダイゼーション条件、および続いてのデータ処理は、以前に記載される通りである（ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：５３０−５３６）。
【０１５０】
（結果）
図１に示すように、成長因子で処理した細胞株におけるｍＲＮＡ発現パターンは、ニューロンキネシンのｍＲＮＡ発現パターンと異なったが、９個の公知の有糸分裂サイクリンである、ＣＥＮＰ−Ｅ、ＫＩＦ４Ａ、ＭＰＯＨＯＰＨ１、ｈｋｌｐ２、ＫＮＳＬ６、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ、ＫＮＳＬ５、ＫＮＳＬ４、およびＫＮＳＬ１のｍＲＮＡ発現パターンと類似であった。
【０１５１】
（実施例３）
本実施例は、有糸分裂の間の、ＫＩＦ１４  ｍＲＮＡの蓄積およびＫＩＦ１４タンパク質の動的な細胞局在を記載する。
【０１５２】
有糸分裂の間の転写物蓄積は、有糸分裂キネシンの決定的な特徴である（Ｙｅｎら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５９（６３９５）：５３６０９；Ｈｉｌｌら（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９（２１）：５７１１−９）。さらに、細胞局在の研究は、有糸分裂サイクリンの機能を解明することに役立った（Ｙｅｎら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５９（６３９５）：５３６０９；Ｈｉｌｌら（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９（２１）：５７１１−９；Ｍａｔｕｌｉｅｎｅら（２００２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１３（６）：１８３２−４５；Ａｂａｚａら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３）：２７８４４−５２）。免疫蛍光顕微鏡を、細胞周期の間のＫＩＦ１４タンパク質の局在を可視化するために使用し、マイクロアレイプロファイリングを、同調された細胞におけるＫＩＦ１４  ｍＲＮＡの蓄積を分析するために使用した。
【０１５３】
（チミジン細胞同調）
ＨＣＴ１１６細胞を、１０ｃｍのプレートに、１プレートあたり１．５×１０６の細胞で播種し、そして一晩増殖させた。もともとの培地を吸引し、そして２  ｍＭのチミジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ−１８９５、ロット番号２８Ｈ０３９３）を含有する１０ｍｌの新鮮な濾過した培地を、Ｇ１／Ｓで細胞をブロックするために各プレートに添加した。細胞を、３７℃で１５〜１６時間インキュベートした。チミジン含有培地を吸引し、そして細胞をチミジンブロックから放出し、２×５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、続いて２４μＭのデオキシシチジンを含有する培地を１０ｍｌ添加した。細胞を３７℃で１０時間インキュベートし、続いて培地を吸引し、５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、そして２ｍＭのチミジン含有培地を１０ｍｌ添加することによってＧ１／Ｓブロックを繰り返した。チミジンブロックの１５時間後、上記細胞を洗浄し、そしてデオキシシチジン培地に入れ、この時ｔ＝０であり、そして時間経過させた。サンプルをＦＡＣＳのために収集し、ＲＮＡを、ｔ＝０〜２４時間の間、２時間間隔で抽出し、さらにもう１点３６時間に抽出した。
【０１５４】
（同調ＨＣＴ１１６細胞の分子プロファイリング）
各１０ｃｍプレートについて、各指定したタイムポイントにおいて、上記培養培地を完全に吸引し、そして細胞を、１％ＢＭＥを含有するＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ），ＲＮｅａｓｙキット）中に溶解した。細胞を小片にし、そして溶解物をピペットで取って混合して、凝集物を減らした。細胞溶解物を、ＱＩＡシュレッダースピンカラムを使用してホモジナイズし、そして細胞ＲＮＡの全体を、Ｒｎｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ＲＮＡ増幅、標識、およびｈｕ２５ＫインクジェットＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーションを、以前に記載したように行った（Ｈｕｇｈｅｓら（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３４２−７；ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４ｌ５：５３０−６）。
【０１５５】
ＫＩＦ１４転写物は、Ｇ２／Ｍを経た細胞において蓄積した。ＫＩＦ１４発現の細胞周期依存型制御は、公知の有糸分裂キネシン、ＣＥＮＰＥの制御を反映した。これらの観察は、ＫＩＦ１４が有糸分裂キネシンとして機能するという仮説を強く支持することを補助する。
【０１５６】
（免疫蛍光顕微鏡）
ガラスチャンバウェルスライド上で培養したＨｅＬａ−Ｓ３細胞を固定し、１００  ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐＨ  ６．８）、１０  ｍＭ  ＥＧＴＡ、１  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４％ホルムアルデヒドを含有する免疫組織化学的緩衝液（Ｋａｐｏｏｒら（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５０（５）：９７５−８８）中で１５分間透過化処理した。固定の後、細胞をＴＢＳＴで２回洗浄し（実施例５を参照のこと）、２時間３７℃で一次抗体とインキュベートした。ウサギ抗ＫＩＦ１４ポリクローナル抗体をＡｂｃａｍ，Ｉｎｃ．（ａｂ３７４６）から得て、１：５００希釈で使用した。抗αチューブリンモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ  ＤＭ１Ａ０）を、ＳＩＧＭＡから得て、１：５００希釈で使用した。細胞をＴＢＳＴで２回洗浄し、そして一次抗体結合を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して（両方とも１：２５０希釈で使用した）検出した。二次抗体とのインキュベーションを、室温で１時間行い、続いて、ＴＢＳＴで３回洗浄し、ＤＮＡを染色するために１０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔを補充した。スライドを、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に取り付け、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、およびＲＤ−ＴＲ−ＰＥフィルターセット（それぞれ、青色、緑色、および赤色用）を使用して、Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎ  ｖ３．５デコンボルーション顕微鏡（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）で直接可視化した。
【０１５７】
ＫＩＦ１４は、間期細胞においては細胞質内に散在して分散したが、前期細胞においては、中心体およびそれらの関連する微小管に局在した。中期細胞において、ＫＩＦ１４は、紡錘体の極に、および紡錘体微小管に沿って位置した。後期細胞において、ＫＩＦ１４は、紡錘体の中間帯に見出され、一方、終期細胞において、ＫＩＦ１４は、より濃縮され、中央体マトリックスおよび収縮環と共存した。ＫＩＦ１４はまた、チューブリンに結合する細胞外環様構造体（細胞脱離が完了した後の収縮環を連想させる）に局在することが見出された。ＫＩＦ１４の細胞より下での局在は、細胞質分裂におけるこのタンパク質の役割を示唆する。対照に、ＫＬＰ３８Ｂ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＫＩＦ１４相同分子種（Ｍｏｌｉｎａら（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３９（６）：１３６１−７１））は、濃縮クロマチンと共存し、ＫＩＦ１４が染色体分離の間に機能することを示唆している。
【０１５８】
（実施例４）
本実施例は、ＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションが、細胞増殖阻害および細胞死をもたらすことを記載する。
【０１５９】
（ｓｉＲＮＡのトランスフェクション）
ＫＩＦ１４の機能喪失表現型を決定するため、ｓｉＲＮＡのトランスフェクトを使用してＫＩＦ１４  ｍＲＮＡのレベルを低下させた。トランスフェクションの前日、ＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で約９０％コンフルエンシーまで増殖した、１００μｌの子宮頸癌ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ−２）、直腸結腸癌ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ−２４７）、または黒色腫Ａ２０５８細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１１４７）を、１５００細胞／ウェルで９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に播種した。各トランスフェクションについて、８５μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、２０μＭストックからの５μｌのｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｄｅｎｖｅｒ）と混合した。以下の２つのＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡ配列を使用した：
ＫＩＦ１４−４４７６：５’ＡＡＡＣＵＧＧＧＡＧＧＣＵＡＣＵＵＡＣｄＴｄＴ  ３’（配列番号８）；および
ＫＩＦ１４−５１２８：５’ＣＵＣＡＣＡＵＵＧＵＣＣＡＣＣＡＧＧＡｄＴｄＴ  ３’（配列番号９）。
【０１６０】
コントロールとしてルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（５’ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ  ３’，配列番号１０）を３つの異なる細胞株の各々にトランスフェクトした。各トランスフェクションについて、５μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）を、５μｌのＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温で５分インキュベートした。この１０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）／ＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ混合物をＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）／ｓｉＲＮＡ混合物を有する各チューブに分散し、混合して、室温で１５〜２０分インキュベートした。１０μｌのトランスフェクション混合物を、９６ウェルプレートの各ウェルにアリコートし、３７℃および５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。４時間後、１００μｌ／ウェルのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清を添加し、このプレートを、３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。
【０１６１】
（細胞増殖についてのａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭアッセイ）
ａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭアッセイは、細胞呼吸の尺度であり、生細胞の数の尺度として使用される。増殖中の細胞の内部環境は、非増殖細胞の内部環境より還元されている。具体的には、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ、ＦＡＤＨ／ＦＡＤ、ＦＭＮＨ／ＦＭＮ、およびＮＡＤＨ／ＮＡＦの比は、増殖の間、増加する。ａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭは、これらの代謝中間体によって還元され得、従って、細胞増殖をモニタリングするために使用され得る。
【０１６２】
ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクション後７２時間で、ＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡトランスフェクションが、細胞増殖の低下および／または細胞死の上昇をもたらすか否かを決定するために、ａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭアッセイを実行した。トランスフェクション後７２時間で、培地を、ウェルから除去し、１００μｌ／ウェルのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭ試薬（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）および０．００１体積の１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ緩衝組織培養試薬  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む）に置換した。このプレートを３７℃で２時間インキュベートし、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  ３．１．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、このプレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプラスプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で５７０ｎｍおよび６００ｎｍの波長にて読み取った。
【０１６３】
以下の式を使用して還元した％として、ａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭ還元を算出した。
【０１６４】
【数１】
2007515945.tif 000011
ここで：
λ１＝５７０ｎｍ
λ２＝６００ｎｍ
（εｒｅｄ  λ１）＝１５５，６７７（５７０ｎｍでの還元したａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭのモル吸光係数）
（εｒｅｄ  λ２）＝１４，６５２（６００ｎｍでの還元したａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭのモル吸光係数）
（εｏｘ  λ１）＝８０，５８６（５７０ｎｍでの酸化したａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭのモル吸光係数）
（εｏｘ  λ２）＝１１７，２１６（６００ｎｍでの酸化したａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭのモル吸光係数）
（Ａ  λ１）＝５７０ｎｍでの試験ウェルの吸光度
（Ａ  λ２）＝６００ｎｍでの試験ウェルの吸光度
（Ａ’λ１）＝培地およびａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭを含むが、細胞を添加していないネガティブコントロールのウェルの５７０ｎｍでの吸光度
（Ａ’λ２）＝培地およびａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭを含むが、細胞を添加していないネガティブコントロールのウェルの６００ｎｍでの吸光度。
【０１６５】
培地を含まないウェルの還元％を、サンプルを含むウェルの還元％から差し引いて、上記のバッググランドの還元％を決定した。ＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞についての還元％を、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡトランスフェクトウェルと比較した。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡトランスフェクトウェルについての還元％について計算した数値を１００％であるとみなした。
【０１６６】
（カスパーゼ活性測定）
カスパーゼ活性は、細胞死の指標である。コントロールおよびＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるカスパーゼ活性を測定するために、１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ（抗生物質を添加せず）中に９６ウェル黒色壁で透明の底の組織培養処理したＣｏｓｔａｒプレート（Ｃｏｓｔａｒ，カタログ番号３６０３）にてＨｅＬａ細胞を２０００細胞／ウェルの密度で播種した。加湿の５％  ＣＯ２インキュベーターにて全ての３７℃インキュベーションを実行した。３７℃で一晩インキュベーション後、トランスフェクション混合物を用いて各ウェルを処理して、合計１０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（登録商標）（添加する前に周囲温度で１５〜２０分放置させた）中、０．５μｌのＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１２２５２−０１１）とともに最終濃度１００ｎＭのオリゴ二重鎖（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ａ４  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を生成させた。３７℃で４〜１６時間後、９０μｌの温めた培地をさらに添加した。３７℃で合計４８時間の間、トランスフェクション混合物とともに細胞をインキュベートした。次いで、４℃で１０分間、１２００ｒｐｍでＢｅｃｋｍａｎ遠心機（ローターＪＳ−４．２）にてこのプレートをスピンさせた後、培地を吸引し、そして各ウェルに４０μｌの溶解緩衝液（ＡｐｏＡｌｅｒｔキット、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ−蛍光検出カスパーゼ３キット、カタログ番号Ｋ２０２６−２から）を添加した。１０μｌの基質反応ストック溶液を添加する前に、４℃で２０分間このプレートをインキュベートした。このストックは、２０μｌの１０ｍＭ  ＤＥＶＤ−ａｆｃ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，カタログ番号７７−９３５，２５ｍｇ，−１０ｍＭまでＤＭＳＯを添加から）、２０μｌの１Ｍ  ＤＴＴ（最終濃度約６ｍＭ）、および７６０μｌの５×緩衝剤の溶液である。この５×緩衝剤は、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および２５％グリセロールから構成される。接着箔でこのプレートを覆い、３７℃で一晩インキュベートした。Ｇｅｍｉｎｉ  ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘにおいて励起４００ｎｍ、発光５０５ｎｍでプレートを読み取った。
【０１６７】
（結果）
表３に示されるように、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたコントロール細胞と対照的に、２つのＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡのいずれのトランスフェクションの後に、３つ全ての細胞の型の有意な増殖阻害が存在した。
【０１６８】
【表３】
2007515945.tif 000012
表４に示されるように、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ処理したＨｅＬａ細胞と対照的に、ＫＩＦ  ｓｉＲＮＡ処理したＨｅＬａ細胞においてカスパーゼ活性の有意な誘導が存在した。ＫＩＦ  ｓｉＲＮＡ処理したＨｅＬａ細胞における相対量のカスパーゼ活性は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭアッセイにおいて観察した増殖阻害は、少なくとも部分的に、細胞死に起因することを示唆する。
【０１６９】
【表４】
2007515945.tif 000013
（実施例５）
本実施例は、ＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションが、ＨｅＬａ細胞において異常な細胞質分裂および／またはアポトーシスを生じることを記載する。
【０１７０】
（細胞形態学免疫蛍光法）
１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ（抗生物質を添加せず）中に９６ウェル黒色壁で透明の底の組織培養処理したＣｏｓｔａｒプレート（Ｃｏｓｔａｒ，カタログ番号３６０３）にてＨｅＬａ細胞を２０００細胞／ウェルの密度で播種した。３７℃で一晩インキュベーション後、トランスフェクション混合物を用いて各ウェルを処理して、合計１０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（登録商標）（添加する前に周囲温度で１５〜２０分放置させた）中、最終濃度１００ｎＭのオリゴ二重鎖（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ａ４  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）、０．５μｌのＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１２２５２−０１１）を生成した。コントロールとして、ＨｅＬａ細胞をＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ単独でｍｏｃｋトランスフェクトした。３７℃で４〜１６時間後、９０μｌの温めた培地をさらに添加した。３７℃で指定数の時間（２４時間、４８時間または７２時間）の間、トランスフェクション混合物とともに細胞をインキュベートした。これらを１バット（ｖａｔ）の−２０℃のメタノール中に浸水する前に、このプレートからこの培地を吸引した。−２０℃で１０分後、メタノールを除去し、１００μｌの事前に作製した試薬の混合物を添加した。この混合物は、１０ｍｌ  ＴＢＳＴ（０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｔ  ９２８４）、５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号１００３７７）、および０．０５％  ＮａＮ３を含むＴＢＳ）、１：１０００  ＤＭ１Ａモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１，Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｔ  ９０２６）、１：１０００  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  カタログ番号Ａ−１１０２９、４８８ｎｍヤギ抗マウス）、および１０μｌのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｄ  ９５４２）の１ｍｇ／ｍＬストックから構成された。次いで、このプレートのＴＢＳＴでのリンスおよび画像化の前に、このプレートを４℃で１〜２時間保管した。
【０１７１】
（ＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡの時間経過からの画像化データの作表のための手順）
免疫蛍光についての手順に従って、９６ウェルプレートから得られた個々の４０×視野からＨｅＬａ細胞を手動で数えた。各細胞を、以下の状態であるとして分類した：（１）細胞質分裂、（２）正常な外見の、他の相の有糸分裂、（３）異常な外見の、他の相の有糸分裂（三分裂中期、星状体または部分的星状体、遅れている染色体など）、（４）２つの核を有する間期（二核性）、（５）２つより多くの核を有する間期（多核性）、（６）アポトーシス（小胞形成、および／または丸まった染色質および凝集した染色質によって特徴付けられる）、または（７）その他。上記の分析のために１回より多く数えた細胞はなかった。１視野あたりの合計数もまた評価し、なお、１つの細胞として細胞質分裂のプロセスにおける二核性、多核性、または細胞を数えた。
【０１７２】
（結果）
表５は、細胞質分裂における全細胞の百分率、正常な有糸分裂における細胞の百分率、異常な有糸分裂における細胞の百分率、二核細胞の百分率、多核細胞の百分率、およびアポトーシス細胞の百分率を示す。これらの結果は、ＫＩＦ１４が、細胞質分裂に関与し得、ＲＮＡ干渉を使用したＫＩＦ１４の低下は、異常な細胞質分裂、二核細胞の形成、およびアポトーシスをもたらし得ることを示唆する。
【０１７３】
【表５−１】
2007515945.tif 000014
【０１７４】
【表５−２】
2007515945.tif 000015
（実施例６）
本実施例は、種々の効能のあるＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションが、正常細胞における明白な細胞質分裂よりも、腫瘍細胞においてより明白な細胞質分裂を生じることを記載する。
【０１７５】
導入遺伝子の過剰発現、抗体マイクロインジェクションおよびｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングは、Ｒａｂ６−ＫＩＦＬ、ＣＨＯ１、およびＭＰＨＯＳＰＨ１（細胞質分裂を調節する３つの哺乳類Ｎ６キネシン（Ｈｉｌｌら（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９（２１）：５７１１−９；Ｍａｔｕｌｉｅｎｅら（２００２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１３（６）：１８３２−４５；Ａｂａｚａら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３））：２７８４４−５２））の必須の役割を規定するために使用されている。これらの遺伝子産物の機能的分裂に関連する表現型は、アポトーシスの誘導、ならびに／または二核細胞および多核細胞の形成を含み、これらの全ては、細胞質分裂における欠損に起因する（Ｈｉｌｌら（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９（２１）：５７１１−９；Ｍａｔｕｌｉｅｎｅら（２００２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１３（６）：１８３２−４５；Ａｂａｚａら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３））：２７８４４−５２）。本実施例において、細胞分裂のＫＩＦ１４の欠乏の効果を調査するために、ＫＩＦ１４を標的とする複数のｓｉＲＮＡを使用した。
【０１７６】
（細胞培養およびｓｉＲＮＡトランスフェクション）
１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ中でＨＣＴ１１６細胞およびＨｅＬａ−Ｓ３細胞を培養した。ヒト腎上皮細胞（ＨＲＥ）をＣａｍｂｒｅｘ（Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ＮＪ）から得た。Ｃａｍｂｒｅｘの推奨に従い、ＨＲＥ細胞を、ＲＥＧＭＴＭを補充した弾丸キット（ｂｕｌｌｅｔ  ｋｉｔ）（ＣＣ−３１９０）中で培養した。全て３つの細胞株を、５％  ＣＯ２にて３７℃で培養した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションのために、血清を含む適切な増殖培地２ｍｌ中、６ウェル（９．６０ｃｍ２）培養皿に６０，０００〜９０，０００細胞／ウェルの密度で細胞を播種し、通常の増殖条件下でインキュベートした。播種した後２４時間で、７０μｌの無血清のＯＰＴＩＭＥＭ（登録商標）中に１００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを希釈し、２０μｌの無血清のＯＰＴＩＭＥＭ中に希釈した５μｌのＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬を、上記希釈したｓｉＲＮＡに添加した。室温で２０分のインキュベーション後、ｓｉＲＮＡ：Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を、直接細胞に滴下した。次いで、トランスフェクション後の特定の時点で分析のために細胞収集するまでに、通常の増殖条件下で細胞をトランスフェクト複合体とともにインキュベートした。全てのｓｉＲＮＡ二重鎖は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ  Ｃｏ．）より購入した。２つのＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡ配列および１つのＫＳＰ  ｓｉＲＮＡ配列を使用した。Ｔｕｓｃｈｌルール（ＡＡリーディングダイマー，ＡＴＧの下流＞＝７５塩基，ＧＣ％範囲）およびＦＡＳＴＡヒットに対しての特異的スクリーニングを使用して、弱めとして設計したＫＩＦ１４：２０４（５’ＡＡＡＣＵＧＧＧＡＧＧＣＵＡＣＵＵＡＣＴＴ  ３’，配列番号８）を選択した。ＧＣ％、塩基対開始、およびリーディングダイマーを考慮して遺伝子を横断して、一様に分布するｓｉＲＮＡを選択する疑似ランダム設計アルゴリズムによって、強めとして設計したＫＩＦ１４：３０５３（５’ＧＵＵＧＧＣＵＡＧＡＡＵＵＧＧＧＡＡＡＴＴ  ３’，配列番号２３）を選択した。ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅＴＭ  ｓｉＲＮＡ設計ソフトウェアを使用して、ＫＳＰ：１１９（５’ＧＧＡＣＡＡＣＵＧＣＡＧＣＵＡＣＵＣＵＴＴ  ３’，配列番号２４）を選択した。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（５’ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ  ３’，配列番号１０）をコントロールとして使用した。
【０１７７】
（定量的ＰＣＲ）
１％  ＢＭＥを含むＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット）中に、トランスフェクトした細胞を溶解した。ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、溶解物をホモジェナイズし、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全細胞ＲＮＡを精製した。ランダムプライマーおよび逆転写試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＴａｑｍａｎリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＳＤＳ  ７０００システム，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＫＩＦ１４およびグルクロニダーゼβ（ｈＧＵＳ）ｍＲＮＡ発現を測定した。ＫＩＦ１４（Ｈｓ００２０８４０８）およびｈＧＵＳ（４３１０８８８Ｅ）のための遺伝子特異的プライマープローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得た。以下の計算を使用して、相対的ＫＩＦ１４発現を決定した：相対的発現＝２−ΔΔＣｔ（ここで、このΔΔＣｔ＝（Ｃｔ標的−ＣｔｈＧＵＳ）ＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡ−（Ｃｔ標的−ＣｔｈＧＵＳ）ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ）。
【０１７８】
（ＫＩＦ１４発現のウェスタンブロッティング分析）
トランスフェクトした細胞を、トリプシン処理し、遠心分離（５分、３００×ｇ）により収集し、そしてＰＢＳで１回洗浄した。小さい体積（＜１００μｌ）の溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ  ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１×プロテアーゼインヒビターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ））中に細胞ペレットを再懸濁させ、氷上で１０分インキュベートした。遠心分離（１０分、１００００×ｇ）の後、上清を収集し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＤＣタンパク質アッセイキットを使用して、タンパク質濃度を決定した。２５μｇの各サンプルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｒｅａｄｙ−Ｇｅｌｓ（７．５％アクリルアミドまたは４〜１５％アクリルアミド勾配）においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。製造者の取扱説明書に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌを使用して、タンパク質をニトロセルロース膜にトランスファーした。５％無脂肪ドライミルクを含むＴＢＳ−Ｔ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．６、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）（ブロッキング緩衝液）中で撹拌しながら、膜を室温で３０分間ブロッキングした。次いで、ブロッキング緩衝液中に１：１０００で希釈したアフィニティー精製したポリクローナル抗ＫＩＦ１４（Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．ａｂ３７４６）とともに撹拌しながら室温で９０分間、膜をインキュベートした。ＴＢＳ−Ｔ中で３回膜を洗浄し、次いで、再度ブロッキングした。ブロッキング緩衝液中に１：１００００で希釈したＨＲＰ−結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ）とともに撹拌しながら室温で４５分間、膜をインキュベートした。ＴＢＳ−Ｔ中で３回膜を洗浄した後、化学発光検出試薬（ＥＣＬ−ｐｌｕｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で膜をインキュベートし、ＣＣＤカメラ（Ｋｏｄａｋ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４４０ＣＦ）を使用して画像を取り込んだ。
【０１７９】
（細胞周期分析）
細胞周期プロフィールを分析するため、その後のフローサイトメトリー分析のための接着細胞および浮遊細胞の両方を得るために、細胞に付随する培地とともに、約１×１０５〜５×１０５細胞を収集し、遠心分離によりペレットにした。２００μｌのＰＢＳ中に細胞を再懸濁させ、１ｍｌの１００％冷エタノールの添加により、この細胞を氷上で３０分間固定した。次いで、細胞をペレットにし、そして凝集塊を破壊するようにＰＢＳで１回洗浄した。１０ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムおよび１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを含むＰＢＳ中でエタノール固定した細胞を３７℃で３０分間固定した。各サンプルについて、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、１０，０００イベントを収集し、ヨウ化プロピジウムの取り込みを、ＤＮＡ含有量のマーカーとして使用した。ＦｌｏｗＪｏサイトメトリー分析ソフトウェアバージョン４．０．２を使用して、細胞周期プロフィールを分析した。
【０１８０】
（ＢｒｄＵ取り込みアッセイ）
ＨｅＬａ−Ｓ３およびＨＲＥを、１００μｌの増殖培地中、９６ウェルプレート（３×１０３細胞／ウェル）に別々に播種した。播種した後２４時間で、種々のｓｉＲＮＡオリゴを用いて細胞をトランスフェクトした。上記の６ウェルのプロトコールに従って、トランスフェクトを行った。２００μｌの培地に添加したｓｉＲＮＡ：オリゴフェクタミン複合体の量を、５０ｎＭ／ウェルの最終ｓｉＲＮＡ濃度を維持するように調整した。比色ＢｒｄＵ  ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、トランスフェクション後２４時間、４８時間および７２時間に細胞増殖を測定した。製造者のプロトコール（Ｒｏｃｈｅ）に従って、細胞固定およびＤＮＡ変性の前に、細胞を１０ｎＭ  ＢｒｄＵで、３７℃で２．５時間パルスした。１００μｌのペルオキシダーゼ結合体化モノクローナル抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ抗体（１：１００に希釈した）（Ｒｏｃｈｅ）とともに固定した細胞を室温で９０分間、インキュベートした。次いで、２５０μｌの１×ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、明白な色の差異の出現がポジティブコントロールとネガティブコントロールとの間で検出されるまで、この細胞を室温で１００μｌの基質溶液（Ｒｏｃｈｅ）とともにインキュベートした。分光光度計を使用して、各サンプルの光発光を３７０ｎｍ（４９２ｎｍの波長を基準）にて測定した。
【０１８１】
（結果）
ＫＩＦ１４の欠乏は、表６に示されるように、細胞質分裂の欠陥と関連し、そしてｓｉＲＮＡ効能の機能である腫瘍選択的表現型を誘導する。ＨｅＬａ細胞およびＨＲＥ細胞を、１００ｎＭの、４つの別々のｓｉＲＮＡ二重鎖（ルシフェラーゼ、ＫＩＦ１４：２０、ＫＩＦ１４：３０５３、，およびＫＳＰ：１１９）でトランスフェクトした。ＫＩＦ１４特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたサンプルを、トランスフェクション後７２時間で分析し、ＫＳＰ特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたサンプルを、トランスフェクション後４８時間で分析した。
【０１８２】
【表６】
2007515945.tif 000016
特定のｓｉＲＮＡの効能および終末点での効力に依存するＫＩＦ１４サイレンシングに応答した２つの特異的な表現型が観察された。弱いｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＩＦ１４：２０４）は、約６０〜約８０％のＫＩＦ１４サイレンシングを生じ、二核細胞の増加によって達成されたトランスフェクション（表６）後３日で最大となるアポトーシスを誘発した。この表現型は、ミッドボディ（ｍｉｄｂｏｄｙ）形成の後に細胞質分裂を完了できなかったことと一致する（Ａｂａｚａら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３）：２７８４４−５２）。強いｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＩＦ：３０５３）は、約８０％より大きいＫＩＦ１４サイレンシングを生じ、四倍体（４Ｎ）および倍数体（＞４Ｎ）のＤＮＡ含有量（表６）および多核細胞を示す細胞の顕著な蓄積を誘導した。強いＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトの後の細胞死の証拠は、表６に示されるより短期間の実験では見られなかったが、他の実験は、このような細胞が、コロニー形成能力の有意な減少を有したことを示した。細胞分裂（核内倍加）の非存在下で連続性染色体の複製は、ＨｅＬａ細胞（機能的なＴＰ５３調節性四倍体チェックポイントおよびＲＢ１調節性四倍体チェックポイントを欠損する）のような細胞で起き得、これは、４Ｎ  ＤＮＡ含有量でＧ１に入った細胞の増殖をブロックする（Ｈｉｌｌら（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９（２１）：５７１１−９）。これらの倍数体細胞は、長期の増殖を持続しないことが予期され、コロニーを形成しないようである。従って、弱いＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡおよび強いＫＩＦ１４  ｓｉＲＮＡの両方によって誘発される表現型は、細胞質分裂におけるＫＩＦ１４に対する役割を示す。
【０１８３】
明白な細胞質分裂欠陥および／またはアポトーシスはまた、ＫＩＦ１４の欠陥の後、他の腫瘍細胞（ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６およびＡ５４９）において観察された。しかしながら、正常なヒト腎上皮細胞（ＨＲＥ）におけるＫＩＦ１４のｓｉＲＮＡ媒介性の欠陥は、さらにより控えめな効果を誘導した：３日後、二核細胞の約２０％の増加および細胞増殖全体において約５０％の低下が存在した。従って、細胞質分裂に対するＫＩＦ１４の効果は、正常細胞よりも試験した腫瘍細胞においてより明白であった。ＫＩＦ１４  ｍＲＮＡおよびタンパク質のサイレンシングは、両方の細胞型において類似していたことから、この腫瘍細胞の選択性は、ＫＩＦ１４欠乏における差異に起因しなかった。この選択性は、ＫＳＰ（ＫＩＦ１１）（表６）または細胞質分裂（ＫＮＳＬ５、ＲＡＢ６−ＫＩＦＬ、およびＭＰＰ１）、紡錘体形成もしくは染色体移動（ＭＣＡＫ、ＣＥＮＰＥ）における公知の役割を有する他のキネシンの欠乏よりもＫＩＦ１４の欠乏について明白であった。
【０１８４】
ＫＩＦ１４欠乏における腫瘍細胞選択性についての理由は、現在理解されていない。文献からの１つのもっともらしい説明は、大部分の腫瘍細胞が、ＴＰ５３／ＲＢ１調節性四倍体チェックポイントを欠如するというものである。
【０１８５】
（実施例７）
本実施例は、ＫＩＦ１４モータードメインの発現および機能的特徴づけを記載する。
【０１８６】
（材料）
ＰｆｕポリメラーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓより入手した。アンピシリン、カルベニシリンを、Ｓｉｇｍａより入手した。ｐＥＴ２２ｂを、Ｎｏｖａｇｅｎより購入した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。ＭｇＣｌ２、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ＮａＣｌ、イミダゾール、β−メルカプトエタノール、リゾチーム、ＰＩＰＥＳ、ＢＳＡ、ＥＧＴＡ、およびＮａ−ＡＴＰを、Ｓｉｇｍａより購入した。Ｔｗｅｅｎを、Ａｌｄｒｉｃｈより購入し、ＤＴＴを、Ｐｒｏｍｅｇａより購入し、そしてＫＣｌを、Ｆｉｓｈｅｒより購入した。タキソール（Ｔａｘｏｌ（登録商標））およびチューブリン（微小管を形成するのに使用される）を、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎより購入した。キナルジンレッドを、Ａｃｒｏｓより購入した。
【０１８７】
（Ｋ１４モータードメインのクローニング）
Ｖ３４２〜Ｋ７２０の範囲におよぶＫＩＦ１４モータードメイン（ＭＤ）（配列番号４）をコードするＤＮＡ配列を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドベクターにクローン化されたＫＩＦ１４のｃＤＮＡ（配列番号１）からのＰＣＲにおいて、Ｐｆｕポリメラーゼにより増幅した。そのＤＮＡを増幅するために使用したプライマーは、５’末端においてＮｄｅＩ部位を組み込み、そして３’末端においてＸｈｏＩ部位を組み込んだ隣接配列を有した。（プライマー１：５’−ＧＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＣＡＧＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＡ−３’（配列番号１１）；プライマー２：５’−ＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＣＡＡＴＴＣＴＣＴＡＡＴＴＡＡＣＴＴ−３’（配列番号１２））。内部のＮｄｅＩ重複を、部分伸長によるスプライシング（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｄｉｏｎ）（ＳＯＥ）として公知の変異誘発方法を使用して破壊した。得られたフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、そして同様に処理したｐＥＴ２２ｂプラスミドベクターに連結した。このライゲーション混合物を、化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、細胞をアンピシリンで選別し、そして所望のクローンを制限断片長多型（ＲＦＬＰ）およびジデオキシヌクレオチド配列決定法により、スクリーニングした。単一のポジティブクローンを、ＰＣＲの鋳型として２つのさらなるプライマー（プライマー３：５’−ＧＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＴＡＧＡＧＡＡＴＡＧＴＣＡＡＧＴＧ−３’（配列番号１３）；プライマー４：５’−ＴＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＡＧＣＡＡＴ−３’（配列番号１４）とともに使用して、Ｖ３４２〜Ｄ７１０（配列番号５）、Ｖ３５４〜Ｋ７２０（配列番号６）、およびＶ３５４〜Ｄ７１０（配列番号７）に広がる、より小さな３つのＭＤをコードするＤＮＡを産生した。オリジナルのようにして全てを消化し、連結し、そしてスクリーニングして、ｐＥＴ２２ｂプラスミドベクター中にある単一のポジティブクローンを生成した。このｐＥＴ２２ｂベクターは、遺伝子にＤＮＡ配列を付加し、その遺伝子は、そのＣ末端において６個のヒスチジン残基を有する発現タンパク質を生じる。
【０１８８】
（ＫＩＦ１４  モータードメインの発現）
４つ全てのクローンをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換し、遺伝子発現について単一のコロニーを選別した。培養物（０．５Ｌ）を、新鮮な飽和培地を用いて１％の最終容量まで接種した後、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で、１８℃にて５０時間増殖させた。
【０１８９】
（ＫＩＦ１４モータードメインの精製）
精製手順全てを、４℃にて実行した。細胞を溶菌緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ、１０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に懸濁し、それにリゾチームを１ｍｇ／ｍＬまで添加し、そして４℃で１０分間反応させた。細胞を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ中でマイクロチップを使用して各々３０秒間の４回の振動で溶菌した。溶解産物を、６０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｎｉｃｋｅｌ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（床体積  ０．２５ｍＬ）に１２０分間バッチ結合させることにより、澄ませた。樹脂を、低速の遠心分離により回収し、その樹脂を、２０カラム容量の溶菌緩衝液で洗浄するＢｉｏ−Ｒａｄ  使い捨てカラムに移した。タンパク質を、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭおよび２５０ｍＭのイミダゾールを含有する溶菌緩衝液の５カラム容量の勾配の工程にてその樹脂から溶出させた。各々の画分の試料（１０μＬ）を、４〜２０％  Ｔｒｉｓ−グリシン  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ）で分析した。少なくとも５０％のＫＩＦ１４  ＭＤ  （４４．０ｋＤＡ〜４１．６ｋＤＡの間の分子量）を含有する画分を、プールし、４００容量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｗｅｅｎ、１ｍＭ  ＤＴＴに対して透析し、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Ａｍｉｃｏｎ）中で５倍に濃縮した。タンパク質の定量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に従った。試料を、５つ〜６つのアリコートに分割し、液体窒素Ｎ２中で急速凍結し、−８０℃にて貯蔵した。
【０１９０】
（ＫＩＦ１４モータードメインアッセイ）
ＫＩＦ１４  ＭＤを、微小管（ＭＴ）依存性ＡＴＰ加水分解について、キナルジンレッド色素（無機リン酸塩（Ｐｉ）に結合した場合、５４０ｎｍの光を吸収する）を使用してＰｉ放出の速度を測定することにより、アッセイした。アッセイ（５０μＬ）は、５０ｍＭ  Ｋ−ＰＩＰＥＳ  （ｐＨ  ６．９）（９０ｍＭ  ＫＣｌを含有する）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ（ｐＨ  ８．０）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  Ｎａ−ＡＴＰ（ｐＨ  ７．０）、０．２５〜５μＭ  ＭＴ（等モル量のタキソール（登録商標）を含む）、および２０〜２００ｎＭ  ＫＩＦ１４  ＭＤ酵素を含有した。反応を酵素の添加により開始し、決まった時間間隔における５０μＬの１．８Ｍ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡの添加によりその反応をクエンチするまで、室温にて進行させた。これに、１５０μＬのキナルジンレッド色素溶液（０．０７ｍｇ／ｍＬ  キナルジンレッド、０．０９％  ポリビニルアルコール、４．１ｍＭ  モリブデン酸アンモニウム、および３８０ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４）を添加した。室温で１０分間インキュベーションした後、５４０ｎＭにおける吸収を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  プレートリーダー（ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）上で読取った。その反応の直線（定常状態）期を使用して、速度を計算した。
【０１９１】
（結果）
表７は、４つの異なるＫＩＦ１４  ＭＤクローンを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞から調製される部分精製ＫＩＦ１４  ＭＤタンパク質抽出物により、タキソール安定化微小管の速度論的利用性を示す。ｋ（ｏｂｓ）（／分）は、生成物が形成される酵素の量（μＭ）によって除算した速度（μＭ／分）を指す。放出された［Ｐｉ］とは、形成された生成物の量（μＭ）を指し、速度の計算において分子を形成する。ＫＩＦ１４  ＭＤタンパク質全ては、微小管依存性のＡＴＰ加水分解活性を示した。Ｖ３４２〜Ｋ７２０（配列番号４）およびＶ３５４〜Ｋ７２０（配列番号６）は、上位の（かつ匹敵する）速度効率を示した。これらのデータは、以前に同定された他のキネシン（例えば、Ｅｇ５（Ｍａｙｅｒら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９７１−９７４）に対して配列相同性を有するＫＩＦ１４  ＭＤタンパク質は、他の公知のキネシンタンパク質に特有の微小管依存性ＡＴＰ加水分解活性を有することを証明する。
【０１９２】
（表７．ＫＩＦ１４  ＭＤによるタキソール安定化微小管の速度論的利用性）
【０１９３】
【表７】
2007515945.tif 000017
表８に、上記ＫＩＦ１４  ＭＤの２つのうちの１つに速度論的特徴を、他の一群のヒトキネシンモータードメインと比較したものを示す。
【０１９４】
（表８．ヒトキネシンモータードメインの速動性特性）
【０１９５】
【表８−１】
2007515945.tif 000018
【０１９６】
【表８−２】
2007515945.tif 000019
ＫＩＦ１４  Ｖ３４２〜Ｋ７２０（配列番号４）によるタキソール安定化微小管利用の速度論的パラメータを、ミこのデータを得、カエリス−メンテン式に当てはめることにより、２１．３＋／−３．５（標準偏差）のｋｃａｔおよび２．６＋／−１．１（標準偏差）のｋｍを生じた。
【０１９７】
（実施例８）
本実施例は、ＫＩＦ１４モータードメイン  Ｖ３４２〜Ｋ７２０（配列番号４）の微小管の使用の効率の最適化を記載する。
【０１９８】
（ＫＩＦ１４モータードメインの２段階精製）
ＫＩＦ１４モータードメイン  Ｖ３４２〜Ｋ７２０（配列番号４）の透析工程までの精製を、実施例７に記載した。一晩の透析物を、陽イオン交換カラム緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）に入れた。試料を、平衡化された５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰに適用し、１０カラム容量の緩衝液で洗浄し、次いで、１２カラム容量をより多い緩衝液中の７５０ｍＭ  ＫＣｌに対する直線勾配により２ｍＬ／分の流速にて溶出させた。画分（２ｍＬ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）により分析し、純度が９０％より高いＫＩＦ１４  ＭＤを有する画分を、プールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０で濃縮し、そして１０％スクロース中で−８０℃にて貯蔵した。この手順により、純度が９５％より高い、収量０．４ｍｇ／ＬのＫＩＦ１４  Ｖ３４２〜Ｋ７２０モータードメイン（配列番号４）を得た。
【０１９９】
（ＫＩＦ１４モータードメイン活性化のためのｐＨおよびイオン強度の最適化）
ｐＨおよびイオン強度を最適化するために、モータードメインアッセイを、以下の改変を伴って、実施例７に記載されるとおりに実行した。ｐＨの最適化について、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液系列（５．５〜６．９のｐＨ範囲にわたり、各々一定のイオン強度を有する）を、使用した。イオン強度の最適化について、その緩衝液は、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．９）（２０ｍＭ  ＫＣｌを含有）であり、その緩衝液に、２０〜１２０ｍＭのさらなるＫＣｌを添加した。ＫＩＦ１４  Ｖ３４２〜Ｋ７２０  ＭＤタンパク質（配列番号４）の活性のためのｐＨ最適値は、約５．９であることを決定した。ＫＩＦ１４  Ｖ３４２〜Ｋ７２０  ＭＤ（配列番号４）活性のための緩衝液の最適なイオン強度は、約４０ｍＭ  ＫＣｌであることが見出された。
【０２００】
ｐＨおよびイオン強度の最適化により、ＫＩＦ１４  Ｖ３４２〜Ｋ７２０  ＭＤタンパク質（配列番号４）による微小管の増加した使用効率が得られた。例えば、最適化されていない条件下（Ｋ−ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．７、９０ｍＭ  ＫＣｌ）で、Ｖ３４２〜Ｋ７２０モータードメイン（配列番号４）についてのｋｃａｔ／ｋｍは２２４であり、それと比較して最適化された条件（ＭＥＳ、ｐＨ６．０、４０ｍＭ  ＫＣｌ）は、１３．２であった。
【０２０１】
（Ｍｇ２＋およびＡＴＰへのＫＩＦ１４  モータードメイン結合の特徴付け）
モータードメインアッセイは上記のとおりであり、ただし、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、添加された２０ｍＭ  ＫＣｌを使用したこと、そしてＭｇＣｌ２濃度を、０〜４ｍＭに変化させるか、またはＡＴＰ濃度を０〜１ｍＭに変化させた。ＫＩＦ１４  Ｖ３４２〜Ｋ７２０（配列番号４）タンパク質の活性のためのＭｇＣｌ２の最適な濃度は、１ｍＭであることが見出された。最大速度に到達するための最小限のＡＴＰ濃度は、２５０ｍＭであることが決定された。
【０２０２】
（ＫＩＦ１４モータードメイン活性に対する温度の効果）
モータードメインアッセイは、上記のとおりであり、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、添加された２０ｍＭ  ＫＣｌを使用し、温度変化を、２１℃〜３７℃で変動させた。ＫＩＦ１４  Ｖ３４２〜Ｋ７２０  ＭＤ（配列番号４）による生成物形成の速度は、温度を２１℃から３７℃に増加した場合、４．１倍に増加することが観察された。
【０２０３】
（高スループットスクリーニングについてのＫ１４モータードメインの適合性）
モータードメインアッセイは、上記のとおりであり、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、添加された２０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５μＭ  ＭＴを３７℃の温度で使用し、酵素濃度を０〜１０ｍＭに変動させた。シグナル対バックグラウンド比（酵素の非存在下に対する酵素の存在下において９０分間のインキュベーション後に、形成されたＰｉの量として計算した）を、種々の濃度のＶ３４２〜Ｋ７２０  モータードメイン（配列番号４）を使用して決定した。それを表９に示す。高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を可能にするのに十分に高いバックグラウンドに対するシグナルが、低濃度の酵素において得られた。さらには、Ｖ３４２〜Ｋ７２０  モータードメイン（配列番号４）は、少なくとも９０分間の反応において安定であった。
【０２０４】
（表９．種々のＫＩＦ１４モータードメインにおけるシグナル対バックグラウンド比）
【０２０５】
【表９】
2007515945.tif 000020
（実施例９）
本実施例は、ＫＩＦ１４モータードメインの活性の調節因子の同定を記載する。
【０２０６】
（ＫＩＦ１４調節因子のスクリーニング）
実施例７に記載されたＡＴＰアーゼアッセイ（実施例８で最適化された）を、ＫＩＦ１４  Ｖ３４２〜Ｋ７２０  ＭＤタンパク質（配列番号４）の活性を調節する化合物についてスクリーニングするのに使用した。試験したいくつかの化合物は、ＫＩＦ１４  Ｖ３４２〜Ｋ７２０  ＭＤタンパク質（配列番号４）の候補インヒビターであることが見出され、それらのうちの４つは、表１０に示されるとおりに、関連するキネシンモータードメインＫＳＰ（配列番号１５）、ＫＩＦ３Ａ（配列番号１６）、ｕＫＨＣ（配列番号１７）、ｎＫＨＣ（配列番号１８）、ＣＥＮＰ−Ｅ（配列番号１９）、ＭＫＬＰ−１（配列番号２０）、ＫＩＦ１Ｂ（配列番号２１）およびＭＣＡＫ（配列番号２２）と比較して、ＫＩＦ１４  ＭＤに対する選択的阻害活性を有した。これら４つの化合物は、１，１’−ビフェニル−４−カルバルデヒドチオセミカルバゾン（化合物１）、４−イソプロピルベンズアルデヒドチオセミカルバゾン（化合物２；例えば、米国特許第３，８４９，５７５号を参照のこと）、４−シクロヘキシルベンズアルデヒドチオセミカルバゾン（化合物３）、および４−イソプロピル−３−ニトロベンズアルデヒドチオセミカルバゾン（化合物４；例えば、Ｓａｒｉｐｉｎａｒら（１９９６）Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  ４６（ＩＩ）：８２４−８を参照のこと）であった。
【０２０７】
（表１０．４つのＫＩＦ１４  ＭＤインヒビターの特徴付け）
【０２０８】
【表１０】
2007515945.tif 000021
（Ｈｅｌａ細胞における候補ＫＩＦ１４調節因子の特徴付け）
スクリーニングにおいて同定された４つの候補ＫＩＦ１４インヒビター（化合物１〜４）の効果を、実施例４に記載される細胞増殖のためのａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭアッセイを使用して、Ｈｅｌａ細胞において試験した。Ｈｅｌａ細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６０６）において、１０％ＤＭＥＭ中で１ウェルあたり２０００／細胞の密度で２０時間プレーティングし、その後、一連の希釈物（２００μＬの培地に添加されるＫＩＦ１４阻害化合物の１１倍濃縮溶液２０μＬ）中のＫＩＦ１４阻害化合物で処理した。その細胞を、３７℃で７２時間インキュベートし、その後、１ウェルあたり１００μＬの培地を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）  ａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭ試薬で置き換えた。３７℃で２時間インキュベーションした後、そのプレートを、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ分光蛍光計（励起  ５４４ｎｍ、発光  ５９０ｎｍ）で読み取った。バックグラウンド値（細胞を含まないウェルより平均化した）を、各々の読み取り値より減算した。その読み取り値を、ＤＭＳＯコントロールを使用した０％阻害（または、１００％の生存度）に対して正規化し、そして候補ＫＩＦ１４調節因子の最大阻害濃度を使用した１００％阻害（または０％生存度）に対して正規化した。試験した３つの候補ＫＩＦ１４調節因子は、表１１に示されるとおりに、１．０μＭと５．０μＭとの間のＩＣ５０を示した。
【０２０９】
（表１１．候補ＫＩＦ１４調節因子によるＨｅｌａ細胞における増殖阻害）
【０２１０】
【表１１】
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（Ａ２７８０細胞における候補ＫＩＦ１４調節因子の特徴付け）
スクリーニングにおいて同定された４つの候補ＫＩＦ１４インヒビター（化合物１〜４）の効果を、実施例４に記載される細胞増殖のためのａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭアッセイを使用して、Ａ２７８０細胞において試験した。Ａ２７８０細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６０６）において、ＲＰＭＩ１６４０（１０％  ＦＢＳ、１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、０．０１ｍｇ／ｍｌ  インスリン）中で、１ウェルあたり４０００／細胞の密度で１６時間プレーティングし、その後、処理した。化合物の希釈プレートを、ＤＭＳＯ中の３倍連続希釈系列を使用して、１０ｍＭのストック溶液から調製した。各濃度の１．２μＬのアリコートを、０．６ｍＬの培地中へ移した。各濃度の１００μＬのアリコートを、化合物を含まない培地１００μＬをすでに含む適切なウェルに添加した。３７℃で４８時間インキュベーションした後、２０μＬのａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭを各ウェルに添加した（１０％  ｖｏｌ／ｖｏｌ）。３７℃でさらに６時間インキュベーションした後、そのプレートを、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ分光蛍光計（励起  ５４４ｎｍ、発光  ５９０ｎｍ）で読み取った。バックグラウンド値（細胞を含まないウェルより平均化した）を、各々の読み取り値より減算した。その読み取り値を、ＤＭＳＯコントロールを使用した０％阻害（または、１００％の生存度）に対して正規化し、そして公知のコントロール化合物を使用した１００％阻害（または０％生存度）に対して正規化した。試験した４つの候補ＫＩＦ１４調節因子は、表１２に示されるとおりに、１００００ｎＭと３６００ｎＭとの間のＥＣ５０を示した。
【０２１１】
（表１２．候補ＫＩＦ１４調節因子によるＡ２７８０細胞における増殖阻害）
【０２１２】
【表１２】
2007515945.tif 000023
本発明の好ましい実施形態が、例示されかつ記載されているが、種々の変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくその中でなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
本発明の上記の局面および付随する利点の多くは、上記詳細な説明を添付の図面とともに考慮して参照することによって、より良く理解されるので、より容易に認識される。
【図１】図１は、実施例２に記載されるような、漸増する時間量の間に一群の増殖因子で処理した種々の細胞株における遺伝子調節パターンを示す。腫瘍細胞（ＭＣＦ７、ＨＴ２９）および正常細胞（ＨＭＥＣ、ＳＫＭＣ）が、血清除去され、その後、増殖因子であるヒレグリン、インスリン、ＩＧＦ１、ＦＧＦ、およびＥＧＦを用いて０．５時間、２時間、６時間、１８時間、または２４時間刺激された。白棒は、アップレギュレートされた遺伝子を示す。黒棒は、ダウンレギュレートされた遺伝子を示す。各列は、種々の増殖因子で処理された細胞を、上向きに増加する処理時間とともに示す。データは、ｈｕ２５ｋアレイ上に存在するキネシン配列によりクラスター化された。有糸分裂機能を有するとしてＬｏｃｕｓＬｉｎｋにおいて注釈されたキネシンが、菱形で示されている。輸送機能として注釈されたキネシンが、四角で示されている。有糸分裂機能および輸送機能の両方を有すると注釈されたキネシンが、円形で示されている。矢印は、ＫＩＦ１４を示す。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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