(57)【要約】  本発明は、ヒトにおける癌を治療するための方法であって、（a）（i）薬学的に許容される担体及び（ii）ヒトＴＮＦ−αをコードし、プロモーターに機能的に連結された核酸配列を含むアデノウイルスベクター、を含む医薬組成物の一用量であって、約４×１０７から約４×１０１２粒子単位（pu）のアデノウイルスベクターを含む用量を、約１０週までを含む治療期間に少なくとも一度、該ヒトに投与すること、（b）治療期間の期間中、該ヒトに電離放射線の一用量を投与すること、及び（c）治療期間の期間中、該ヒトに１以上の化学療法剤の一用量を投与すること、を含み、それにより該ヒトにおける該癌が治療される、方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける切除不可能な局所進行性膵臓癌（ＬＡＰＣ）を治療するための方法であって、
（a）（i）薬学的に許容される担体及び（ii）ヒトＴＮＦ−αをコードし、プロモーターに機能的に連結された核酸配列を含むアデノウイルスベクター、を含む医薬組成物の一用量であって、約４×１０７から約４×１０１２粒子単位（pu）のアデノウイルスベクターを含む用量を、約１０週までを含む治療期間に少なくとも一度、該ヒトに投与すること、
（b）治療期間の期間中、該ヒトに電離放射線の一用量を投与すること、及び
（c）治療期間の期間中、該ヒトに１以上の化学療法剤の一用量を投与すること、
を含み、それにより該ヒトにおける該切除不可能な局所進行性膵臓癌が治療される、方法。
【請求項２】
ヒトにおける局所進行性の切除可能な食道癌を治療するための方法であって、
（a）（i）薬学的に許容される担体及び（ii）ヒトＴＮＦ−αをコードし、プロモーターに機能的に連結された核酸配列を含むアデノウイルスベクター、を含む医薬組成物の一用量であって、約４×１０７から約４×１０１２粒子単位（pu）のアデノウイルスベクターを含む用量を、約１０週までを含む治療期間に少なくとも一度、該ヒトに投与すること、
（b）治療期間の期間中、該ヒトに電離放射線の一用量を投与すること、及び
（c）治療期間の期間中、該ヒトに１以上の化学療法剤の一用量を投与すること、
を含み、それにより該ヒトにおける該食道癌が治療される、方法。
【請求項３】
ヒトにおける局所進行性の切除可能な直腸癌を治療するための方法であって、
（a）（i）薬学的に許容される担体及び（ii）ヒトＴＮＦ−αをコードし、プロモーターに機能的に連結された核酸配列を含むアデノウイルスベクター、を含む医薬組成物の一用量であって、約４×１０７から約４×１０１２粒子単位（pu）のアデノウイルスベクターを含む用量を、約１０週までを含む治療期間に少なくとも一度、該ヒトに投与すること、
（b）治療期間の期間中、該ヒトに電離放射線の一用量を投与すること、及び
（c）治療期間の期間中、該ヒトに１以上の化学療法剤の一用量を投与すること、
を含み、それにより該ヒトにおける該局所進行性直腸癌が治療される、方法。
【請求項４】
治療期間の期間中、アデノウイルスベクター、電離放射線の用量、及１以上の化学療法剤の用量がヒトに同時に投与される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
医薬組成物が腫瘍に接触し、該腫瘍中の腫瘍細胞が破壊される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
腫瘍のサイズが縮小する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
プロモーターが化学誘導性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
プロモーターが放射線誘導性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
放射線誘導性プロモーターがＥＧＲ−１プロモーターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
約３から７週を含む治療期間において週に約１回、医薬組成物の一用量が腫瘍に投与される、請求項５〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
治療期間が６週までを含み、該方法は医薬組成物の一回分の用量を該治療期間のそれぞれの週に投与することを含む、請求項５〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
経皮経腹的投与、内視鏡投与、又は内視鏡超音波誘導投与により医薬組成物が腫瘍に投与される、請求項５〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
２〜５回の注射で医薬組成物が腫瘍に投与される、請求項５〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
電離放射線の用量が約４０Gray（Gy）から約６０Gyを含み、治療期間の期間中投与される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
1日につき電離放射線の用量の一分画を治療期間の各週に５日間投与する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
電離放射線の用量の分画が約１〜２Gyである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
電離放射線の用量の分画が医薬組成物の投与の少なくとも４時間後にヒトに投与される、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
１以上の化学療法剤が、アドリアマイシン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロランブシル、シタラビン、シクロフォスファミド、カンプトテシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキシル、ドキソルビシン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メプルハラン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、トランスプラチナ、及び５−フルオロウラシルからなる群より選択される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
１以上の化学療法剤が、５−フルオロウラシル、カペシタビン、及びシスプラチンからなる群より選択されるか、又は、それらの組み合わせである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
化学療法剤が、５−フルオロウラシルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
５−フルオロウラシルの用量が、約100mg/m2/dayから約300mg/m2/dayまでを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
化学療法剤が、カペシタビンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
カペシタビンの用量が、約800mg/m2/dayから約1000mg/m2/dayまでを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
治療期間が５週を含み、該治療期間の２つの別個のそれぞれの日に開始し、約50〜100mg/m2のシスプラチン及び約900〜1100mg/m2の５−フルオロウラシルを投与することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
治療期間の１日目及び２９日目に開始し、約75mg/m2のシスプラチン及び約1000mg/m2の５−フルオロウラシルを投与することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
電離放射線の用量の投与の24時間以内に、１以上の化学療法剤が投与される、請求項２０〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
治療期間完了後、腫瘍の外科的切除をさらに含む、請求項５〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
治療期間完了後４〜１０週の、腫瘍の外科的切除を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
治療期間完了後３〜６週の、腫瘍の外科的切除を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍の外科的切除後に、アジュバント化学療法を投与することを含む、請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍の外科的切除後２〜４週に、アジュバント化学療法が投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
局所進行性の切除可能な直腸癌のステージがＴ３又はＴ４である、請求項３に記載の方法。
【請求項３５】
局所進行性の切除可能な食道癌のステージが、ステージIII又はステージIVである、請求項２に記載の方法。
【請求項３６】
Ｈ２ブロッカー又はプロトンポンプ阻害剤の一用量を投与することをさらに含む、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
約５〜１０Gyを含む電離放射線のブースター用量を腫瘍に投与することをさらに含む、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
局所進行性の切除可能な食道癌又は局所進行性直腸癌の治療が、該切除された組織における腫瘍組織の欠乏によって証明される、請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
局所進行性の切除可能な直腸癌の治療が、少なくとも約９０％のネクローシス百分率を含む該切除された腫瘍によって証明される、請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
局所進行性の切除可能な直腸癌の治療が、治療期間完了後４〜１２週における癌胎児性抗原（ＣＥＡ）レベルが、該治療期間前のＣＥＡレベルと比較して、少なくとも１０％減少することによって証明される、請求項５に記載の方法。
【請求項４１】
切除不能な局所進行性膵臓癌の治療が、治療期間完了後の少なくとも４週の間の腫瘍サイズが、該治療期間前の腫瘍領域と比較して、約２５％から５０％縮小することによって証明される、請求項５に記載の方法。
【請求項４２】
切除不能な局所進行性膵臓癌の治療が、治療期間完了後の少なくとも４週の間の腫瘍サイズが、該治療期間前の腫瘍領域と比較して、少なくとも約５０％縮小することによって証明される、請求項５に記載の方法。
【請求項４３】
切除不能な局所進行性膵臓癌の治療が、少なくとも４週間維持される腫瘍の消失によって証明される、請求項５に記載の方法。
【請求項４４】
切除不能な局所進行性膵臓癌の治療が、治療期間完了後４〜１２週におけるＣＡ１９−９腫瘍抗原レベルが、該治療期間前の該ＣＡ１９−９腫瘍抗原レベルと比較して、少なくとも１０％減少することによって証明される、請求項５に記載の方法。
【請求項４５】
切除不能な局所進行性膵臓癌の治療が、治療期間完了後１２週において、腫瘍の外科的ステージが切除不能から切除可能に転向することによって証明される、請求項５に記載の方法。
【請求項４６】
切除不能な局所進行性膵臓癌の治療が、治療期間完了後１２週間中の任意の連続する４週間の臨床利益反応基準により規定される疼痛強度が、該治療期間前の該疼痛強度と比較して、少なくとも５０％減少することによって証明される、請求項５に記載の方法。
【請求項４７】
切除不能な局所進行性膵臓癌の治療が、治療期間完了後１２週間中の任意の４つの連続する４週間の臨床利益反応基準により規定される鎮痛剤消費量が、該治療期間前の該鎮痛剤消費量と比較して、少なくとも５０％減少することによって証明される、請求項５に記載の方法。
【請求項４８】
切除不能な局所進行性膵臓癌の治療が、治療期間完了後１２週間中の任意の連続する４週間の臨床利益反応基準により規定されるカルノフスキーパフォーマンススケールスコアが、該治療期間前の該スコアと比較して、少なくとも２０ポイント上昇することによって証明される、請求項５に記載の方法。
【請求項４９】
ヒトにおける神経膠腫を治療するための方法であって、
（a）（i）薬学的に許容される担体及び（ii）ヒトＴＮＦ−αをコードし、プロモーターに機能的に連結された核酸配列を含むアデノウイルスベクター、を含む医薬組成物の一用量であって、約４×１０７から約４×１０１２粒子単位（pu）のアデノウイルスベクターを含む用量を、約１０週までを含む治療期間に少なくとも一度、該ヒトに投与すること、及び
（b）治療期間の期間中、該ヒトに電離放射線の一用量を投与すること、
を含み、それにより該ヒトにおける該神経膠腫が治療される、方法。
【請求項５０】
神経膠腫が、切除可能な多形成グリア芽細胞腫である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
電離放射線の用量が約１０Gray（Gy）から約４０Gyを含み、治療期間の期間中投与される、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５２】
1日につき電離放射線の用量の一分画を投与する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
電離放射線の用量の分画が約４〜５Gyである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
電離放射線の用量の分画が医薬組成物の投与後少なくとも３日ヒトに投与される、請求項５２又は５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおける癌を治療するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌研究における要望は、１又は多くの異なる型の癌に効果的な治療方法を確立することである。昨年、米国癌学会は単独で多数の癌型の機構を解明するために働いている癌研究者に約１億ドルを配分した。しかし、該疾患についての数多くの研究にも関わらず、医療界において効果的な癌治療方法は未だ解明すべき課題であり続けている。臨床家は現在の標準的治療方法によって、限られた成果しか得ていない（化学療法、放射線療法、及び外科的療法）。しかしながら、各治療法には内在的な限界がある。化学療法及び放射線療法は、該治療法を異常組織（例えば、腫瘍）にターゲッティングする努力にも関わらず、正常で健康な組織に深刻な障害を引き起こす。外科的療法は癌細胞の塊を除去するには効果的であり得るが、最も有能な外科医でさえ、罹患組織の完全な切除を保証できないであろうし、全ての腫瘍が外科的除去可能な解剖学的部位にあるわけでもない。現存の治療方法の限界は、全ての癌を合わせた際の５年相対生存率が６０％であることに反映されている（Cancer Facts & Figures 2001, The American Cancer Society, New York, NY）。
【０００３】
臨床家は、現存する癌治療法に対する有力な代替法として、治療的核酸配列のデリバリーを目指してきた。in vivoでの標的部位における生物学的に有効な量の治療的物質の局所的な産生は、それにより正常組織への毒性を軽減し、従来の治療法に関連するいくつかの限界を解決する。最も有望な抗腫瘍物質の1つは腫瘍壊死因子（TNF）、特にTNF-αであり、多数の癌細胞株について活性を示してきた。TNF-αはマクロファージや単球により分泌される１７kDaのポリペプチドである。TNF-αは腫瘍血管系を選択的に破壊し、無数の免疫細胞を活性化するとともに、ある種の癌細胞のアポトーシスを誘導することが示されてきた（Baher et al., Anticancer Reseach, 19, 2917-2924(1999)及びMauceri et al., C. R. Acad. Sci. III, 322, 225-228(1998)）。しかしながら、抗癌剤としてのヒトにおけるTNFの使用は、低血圧及び呼吸不全を含む、その深刻な全身的作用によって制限されている（Mauceri et.al., 前記）。さらに、例えば、膵癌（Brown et al., J. Immunotherapy, 10 , 376-378(1991)）、胃癌（Muggia, Anticancer Drugs, 3, 211-217(1992)）、転移性乳癌（Budd et al, Cancer, 68, 1694-1695(1991)）、及び直腸結腸癌（Heim et al., Onkologie, 13, 444-447(1990)）等の多くの癌型がTNF−α蛋白質による処置に抵抗性である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、患者における様々な癌型の治療での使用に適当な組成物の必要性は残っているし、該組成物を癌を処置するためにデリバリーするための方法の必要性も依然として残っている。特に、毒性を最小限に抑えつつ、TNF等の抗癌剤の局所作用を最適化する組成物及び方法の必要性が残っている。本発明はかかる組成物及び方法を提供する。本発明のこれらのそして他の利点はもちろん、さらなる進歩的特徴が、ここで提供される発明の記載から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（本発明の簡単な要約）
本発明は、ヒトにおける切除不可能な局所進行性膵臓癌（LAPC）癌、切除可能な局所進行性食道癌、及び局所進行性直腸癌を治療する方法を提供する。本方法は、（a）（i）薬学的に許容される担体及び（ii）ヒトＴＮＦ−αをコードし、プロモーターに機能的に連結された核酸配列を含むアデノウイルスベクター、を含む医薬組成物の一用量であって、約４×１０７から約４×１０１２粒子単位（pu）のアデノウイルスベクターを含む用量を、約１０週までを含む治療期間に少なくとも一度、該ヒトに投与すること、（b）治療期間の期間中、該ヒトに電離放射線の一用量を投与すること、及び（c）治療期間の期間中、該ヒトに１以上の化学療法剤の一用量を投与すること、を含み、それにより該ヒトにおける該癌が治療される、方法である。
【０００６】
本発明はヒトにおける神経膠腫を治療する方法をも提供する。本方法は、（a）（i）薬学的に許容される担体、及び（ii）ヒトＴＮＦ−αをコードし、プロモーターに機能的に連結された核酸配列を含むアデノウイルスベクター、を含む医薬組成物の一用量であって、約４×１０７から約４×１０１２粒子単位（pu）のアデノウイルスベクターを含む用量を、約１０週までを含む治療期間に少なくとも一度、該ヒトに投与すること、（b）治療期間の期間中、該ヒトに電離放射線の一用量を投与すること、及び（c）治療期間の期間中、該ヒトに１以上の化学療法剤の一用量を投与すること、を含み、それにより該ヒトにおける該神経膠腫が治療される、方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明はヒト（例えば、かかる治療を必要とする患者）における癌を治療する方法を提供する。本方法は、好ましくは、化学療法及び電離放射線を組み合せた、ＴＮＦ-αの腫瘍への（好ましくは腫瘍への直接的な）デリバリーを含み、それにより腫瘍のサイズが縮小する。特に、本方法は、治療を必要とするヒトに対して、薬学的に許容される担体の中にヒトTNF-αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクター（好ましくは複製能欠損アデノウイルスベクター）を含む医薬組成物を投与することを含む。本方法は、好ましくは、電離放射線の一用量及び１以上の化学療法剤の一用量を該ヒトに対して投与することをさらに含む。ヒトTNF-αをコードする配列のデリバリー、特に放射線及び化学療法を組み合せたデリバリーは、局所効果を最適化し全身毒性を最小化することにより、可溶性TNF蛋白質を用いる従来の治療法を超えた改良をもたらす。実際、本発明は、患者への重篤な毒性なしに腫瘍サイズが縮小し得るという驚くべき発見に部分的に基づいている。加えて、本発明の方法は、TNF-α蛋白質を用いての治療に抵抗性である腫瘍のサイズを縮小することを実証している。本発明の方法の種々の側面については後述する。それぞれのパラメーターは独立に議論されているが、本発明の方法は以下に示すヒトの癌を治療するためのパラメーターの組合せも含む。したがって、パラメーターのいかなる組合せも本発明の方法に従って用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
アデノウイルスベクター
【０００９】
本発明の方法は、薬学的に許容される担体の中にヒトTNF-αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターを含む医薬組成物を、ヒトに対して投与することを含む。アデノウイルス（Ad）は種々の異なる標的細胞タイプにin vivoでDNAを効率よく移行させる３６kbの二本鎖DNAウイルスである。該ベクターは高力価で産生することができ、該ベクターは分裂細胞及び非分裂細胞にDNAを効率よく移行することができる。アデノウイルスベクターのためのウイルスゲノム供給源として、任意のサブタイプ、サブタイプの混合物、又はキメラアデノウイルスを用いることができる。アデノウイルスの供給源として用いることのできるアデノウイルスストックは、現在American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能なアデノウイルス血清型１〜５１、又は他のいずれかの供給源から入手可能な他のいずれかのアデノウイルス血清型から増幅される。例えば、アデノウイルスは、サブグループA（例；血清型１２、１８、及び３１）、サブグループB（例；血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、及び５０）、サブグループC（例；血清型１、２、５、及び６）、サブグループD（例；血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、及び４２〜４８）、サブグループE（例；血清型４）、サブグループF（血清型４０及び４１）、未分類の血清型グループ（例；血清型４９及び５１）、又は他のいずれかのアデノウイルス血清型であり得る。アデノウイルスベクターはサブグループCであることが好ましく、特に血清型２又は５が好ましい。
【００１０】
TNF-αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターは、理想的には、標的組織内でベクターの複製が制限されるよう操作されている。例えば、医薬組成物のアデノウイルスベクターは、実施者によりあらかじめ定められた条件下で複製するように設計された条件的複製アデノウイルスベクターであってもよい。例えば、複製に必須な遺伝子機能（例えば、アデノウイルス初期領域によりコードされる遺伝子機能）を、誘導性、抑制性、又は組織特異的転写コントロール配列（例えば、プロモーター）と機能的に連結してもよい。本実施形態においては、複製には、転写調節配列と相互作用する特異的因子の存在又は非存在が必要となる。アデノウイルスベクターの複製は標的組織に限られ得ることから、該ベクターの該組織へのより広い分布を許容すると同時に複製サイクルの間に細胞を溶解させるというアデノウイルスに自然に備わった能力を利用することで、腫瘍細胞を殺傷する付加的態様を提供する。条件的複製アデノウイルスベクターについては米国特許5,998,205にさらに記載されている。
【００１１】
好ましくは、アデノウイルスベクターは複製欠損性である。「複製欠損性」とは、少なくとも１つの複製に必須の遺伝機能を欠くアデノウイルスゲノムを有するアデノウイルスベクターを意味する（すなわち、該アデノウイルスベクターは典型的な宿主細胞、特に本発明による治療過程においてアデノウイルスベクターにより感染され得るヒト患者内の宿主細胞、においては複製しない）。ここで用いられた遺伝子、遺伝子機能、又は遺伝子もしくはゲノム領域における欠損とは、核酸配列の全部又は一部が欠失して遺伝子の機能が損傷又は破壊されるような、ウイルスゲノムの十分な遺伝子構成要素の欠失であると定義される。多くの場合、複製に必須な遺伝子機能を破壊するには、遺伝子領域全体の欠失を要しない。しかしながら、アデノウイルスゲノム中に１つ以上の導入遺伝子のための十分なスペースを用意する目的で、大部分の遺伝子領域を除去することが望ましいかもしれない。複製に必須な遺伝子機能とは、複製（例；増殖（propagation））に必要とされ、例えば、アデノウイルス初期領域（例；E1、E2、及びE４領域）、後期領域（例；L1〜L5領域）、ウイルスのパッケージングに関わる遺伝子（例；IVa２遺伝子）、及びウイルス関連RNA（例；VA-RNA1及び／又はVA-RNA２）によりコードされる遺伝子機能をいう。好ましくは、複製欠損性アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの１以上の領域の複製に必須な少なくとも１つの遺伝子機能におけるアデノウイルスゲノムの欠損（例えば、アデノウイルスゲノムE1領域の内部又はE１領域の欠失）を単独で、あるいは、アデノウイルスベクターの複製欠損性に影響しないアデノウイルスゲノムの欠失（例えば、アデノウイルス複製には必須ではない、アデノウイルスゲノムE3領域の内部又はE3領域の欠失）と組合せて、を含む。好ましくは、アデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要とされるアデノウイルスゲノムE1領域の少なくとも1つの遺伝子機能が欠損している（E1欠損アデノウイルスベクターと称する）。かかるE1領域における欠損に加えて、組換えアデノウイルスは、国際特許出願WO00/00628記載のように、主要後期プロモーター（MLP）中に変異を有していてもよい。より好ましくは、該ベクターは、少なくとも1つの複製に必須なE1領域の遺伝子機能（望ましくは、全ての複製に必須な遺伝子機能）及び非必須なE3領域の少なくとも一部（例えば、E3領域のXbaＩ欠失）が欠損している（E1/E3欠損アデノウイルスベクターと称する）。E1領域については、アデノウイルスベクターは、E1A領域の一部又は全部及びE1B領域の一部又は全部（例えば、E1A及びE1B領域それぞれの少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能）が欠損し得る。E１欠損の場合、アデノウイルスベクターゲノムは、335〜375の間のいずれかのヌクレオチド（例；ヌクレオチド356）から始まり、3310〜3350（例；ヌクレオチド3329）又は3490〜3530（例；ヌクレオチド3510）の間のいずれかのヌクレオチドで終わる欠失を含み得る（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）。E2A欠損の場合、アデノウイルスベクターゲノムは、22425〜22465の間のいずれかのヌクレオチド（例；ヌクレオチド22443）から始まり、24010〜24050（例；ヌクレオチド24032）の間のいずれかのヌクレオチドで終わる欠失を含み得る（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）。E3欠損の場合、アデノウイルスベクターゲノムは、28575〜29615の間のいずれかのヌクレオチド（例；ヌクレオチド28594）から始まり、30450〜30490（例；ヌクレオチド30469）の間のいずれかのヌクレオチドで終わる欠失を含み得る（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）。アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの1つの領域中に少なくとも1つの複製に必須な遺伝子機能を欠損している場合、該アデノウイルスは「単独複製欠損」と称される。
【００１２】
好ましくは、アデノウイルスベクターは「多重欠損（multiply deficient）」であり、アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれにおいてウイルス複製に必要な1つ以上の遺伝子機能を欠損していることをいう。例えば、上述したE1欠損又はE1/E3欠損アデノウイルスベクターはさらに、E4領域の、複製に必須な遺伝子機能の少なくとも1つを欠損し得る（E1/E4又はE1/E3/E4欠損アデノウイルスベクターと称する）。E4領域全体が除去されたアデノウイルスベクターは、より低い宿主免疫反応を誘導し得る。E4欠損の場合、アデノウイルスベクターゲノムは、任意でE1領域における欠失（例；ヌクレオチド356〜3329又はヌクレオチド356〜3510）及び／又はE3領域における欠失（例；ヌクレオチド28594〜30469又はヌクレオチド28593〜30470）に加えて、例えば、32805〜32845の間のいずれかのヌクレオチド（例；ヌクレオチド32826）から始まり、例えば、35540〜35580（例；ヌクレオチド35561）の間のいずれかのヌクレオチドで終わる欠失を含み得る（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）。
【００１３】
あるいは、アデノウイルスベクターは、E1領域の少なくとも1つの遺伝子機能が欠損しており、かつ、E2領域の少なくとも1つの遺伝子機能が欠損している（E1/E2A又はE1/E2A/E3欠損アデノウイルスベクターと称する）。本発明のアデノウイルスベクターが複製に必須なE2A領域の遺伝子機能を欠損している場合、該ベクターは好ましくはE2A領域の完全な欠失を含まず、該欠失は全長約230塩基対未満である。一般に、アデノウイルスのE2A領域は、DNA複製に必要なポリペプチドであるDBP（DNA binding protein）をコードする。DBPはウイルス血清型に依存して473〜529アミノ酸からなる。DBPは、伸長型Ntドメインを伴った球状Ctドメインから構成される長楕円として存在する非対称蛋白質であるといわれている。Ctドメインが、核酸に結合し、亜鉛に結合し、DNA合成のDNA鎖伸長段階において機能するというDBPの能力に関与することが研究により示されている。しかしながら、Ntドメインは、転写及び転写後の両段階において後期遺伝子発現中に機能するといわれており、蛋白質の効率的な核局在に関与し、さらにDBP自体の発現上昇にも関連し得る。Ntドメインの２〜38の間のアミノ酸を欠失させることにより、該領域がDBPの機能に重要であることが示されている（Brough et al., Virology, 196, 269-281(1993)）。DBPのCt領域をコードするE2A領域の欠失はウイルス複製に何の影響も与えないが、DBPのNtドメインの2〜38アミノ酸をコードするE2A領域を欠失させるとウイルス複製が損なわれる。いずれの多重複製欠損アデノウイルスベクターにもアデノウイルスゲノムE2A領域の当該部分が含まれることが好ましい。特に、保持されるべきE2A領域の部分として望ましいのは、例えば、E2A領域の５’末端で示されるアデノウイルスゲノムE2A領域部分であり、特に、血清型Ad5のアデノウイルスゲノムE2A領域のAd（23816）からAd（24032）の部位である。現在のE2A細胞株においては所望のウイルス増殖レベルを与えるように補完されないことから、アデノウイルスゲノムの当該部位は、望ましくは、アデノウイルスベクターに包含される。
【００１４】
特に好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターは、E1及びE4領域それぞれにおいて１つ以上の複製に必須な遺伝子機能を欠損したアデノウイルスゲノム（すなわち、該アデノウイルスベクターはE1/E4欠損アデノウイルスベクターである）、好ましくはアデノウイルスゲノムからE4領域のコード領域全体が除去されたアデノウイルスゲノムを含む。換言すれば、E4領域のオープンリーディングフレーム（ORF）の全てが除去されたものである。アデノウイルスベクターE4領域は、好ましくは、自然のE4プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及び／又は右側逆位の末端反復配列（ITR）を保持する。
【００１５】
多重複製欠損、特にE1及びE4領域の複製に必須な遺伝子機能を欠損させた場合、単独複製欠損アデノウイルスベクター（特にE1領域に欠損を含むアデノウイルスベクター）と同様の補完的細胞株におけるウイルス増殖を与えるために、アデノウイルスベクターは、好ましくは、スペーサーエレメントを含む。該スペーサーエレメントは、所望の長さの1つ又は複数のいかなる配列、例えば、少なくとも15塩基対（例；約15塩基対〜約12000塩基対）、好ましくは約100〜約10000塩基対、より好ましくは約500〜約8000塩基対、さらに好ましくは約1500〜約6000塩基対、もっとも好ましくは約2000〜約3000塩基対の長さの配列をも含むことができる。該スペーサー配列は、アデノウイルスゲノムのコード領域又は非コード領域であってもよく、アデノウイルスゲノムに関してネイティブ又は非ネイティブであってもよいが、欠損領域に複製に必須な機能を取り戻させてはならない。スペーサーがない場合、単独複製欠損アデノウイルスベクターと比較して、ファイバー蛋白質産生及び／又は多重複製欠損アデノウイルスベクターのウイルス増殖が減少する。しかしながら、少なくとも１つの欠損アデノウイルス領域、好ましくはE4領域、にスペーサーを含有させることにより、ファイバー蛋白質産生及びウイルス増殖の減少を相殺することができる。アデノウイルスベクターにおけるスペーサーの使用は米国特許5,851,806に記載されている。
【００１６】
望ましくは、アデノウイルスベクターは、複製（すなわち、増殖）のために、多くとも、アデノウイルスゲノムのE1、E2A、及び／又はE4領域の複製に必須な遺伝子機能の補完を要する。しかしながら、アデノウイルスゲノムは、該アデノウイルスベクターが欠損であり、かつ、例えば補完的細胞及び／又は破壊された複製に必須な遺伝子機能をコードする外来性DNA（例；ヘルパーアデノウイルス）を用いて増殖し得るかぎり、実施者の希望通りに１つ以上の複製に必須な遺伝子機能を破壊するように改変され得る。この点において、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域のみ、アデノウイルスゲノムの後期の領域のみ、及びアデノウイルスゲノムの初期及び後期領域の両方の複製に必須な遺伝子機能における欠損であり得る。アデノウイルスベクターは基本的にアデノウイルスゲノム全体をも除去することができ、かかる場合、少なくとも、逆位末端反復配列（ITR）及び１つ以上のプロモーター、又は、ウイルスITR及びパッケージングシグナル、のいずれかが損傷なく残存していることが好ましい（すなわち、アデノウイルスアンプリコン）。除去されるアデノウイルスゲノムの領域が大きくなればなるほど、ゲノムに挿入可能な外来性核酸配列の断片も大きくなる。例えば、アデノウイルスゲノムが３６kbだとすると、ウイルスITR及び１つ以上のプロモーターを損傷なく残すことによって、アデノウイルスの外来性挿入能は約３５kbとなる。あるいは、ＩＴＲ及びパッケージングシグナルのみを含む多重欠損アデノウイルスベクターは、約37〜38kbの外来性核酸配列を効率よく挿入させることができる（その場合、アデノウイルスは野生型アデノウイルスゲノムの約１０５％のサイズまでのＤＮＡをパッケージングすることができる）。当然ながら、いずれかの又は全ての欠損アデノウイルス領域においてスペーサーエレメントを含有させることは、アデノウイルスベクターの大きな断片を挿入する能力を減少させ得る。多重複製欠損アデノウイルスベクターを含む、適切な複製欠損アデノウイルスベクターは、米国特許5,837,511、5,851,806、5,994,106、及び6,579,522、米国特許出願公開番号2001/0043922A1、2002/0004040A1、2002/0031831A1、及び2002/0110545A1、並びに国際特許出願WO95/34671、WO97/12986、及びWO97/21826に開示されている。
【００１７】
本発明に照らして使用するための特に好ましいアデノウイルスベクターは、３３５から３７５（例、ヌクレオチド３５６）の間のヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドから始まって、３３１０から３３５０（例、ヌクレオチド３３２９）の間のヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドで終わる欠失、及び２８５７５から２９６１５（例、ヌクレオチド２８５９４）の間のヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドから始まって、３０４５０から３０４９０（例、ヌクレオチド３０４６９）の間のヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドで終わる欠失を含む（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）。あるいは、該アデノウイルスベクターは、好ましくは、３３５から３７５（例、ヌクレオチド３５６）の間のヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドから始まって、３４９０から３５３０（例、ヌクレオチド３５１０）の間のヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドで終わる欠失、２８５７５から２９６１５（例、ヌクレオチド２８５９３）の間のヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドから始まって、３０４５０から３０４９０（例、ヌクレオチド３０４７０）の間のヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドで終わる欠失、及び３２８０５から３２８４５（例、ヌクレオチド３２８２６）の間のヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドから始まって、例えば、３５５４０から３５５８０（例、ヌクレオチド３５５６１）の間のヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドで終わる欠失を含むものが好ましい（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）。欠失したヌクレオチド部分を定義する終点は正確に決定され難く、一般に、アデノウイルスベクターの性質に重大な影響を与えない。すなわち、上記のヌクレオチド番号はそれぞれ＋／−１、２、３、４、５、１０、又は２０ヌクレオチドですらあり得る。本発明の方法における使用のための特に好ましいアデノウイルスベクターとして、米国特許6,579,522、及び国際特許出願WO02/00906に記載のものがあげられる。該アデノウイルスベクターは、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。即ち、アデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムは、例えば、ヒトＴＮＦ-αをコードするアデノウイルスベクターのアデノウイルス部分（ヌクレオチド配列を配列番号１に示す）であってもよい。
【００１８】
理想的には、医薬組成物は、複製能を有するアデノウイルス（ＲＣＡ）の混入が事実上存在しない（例えば、該医薬組成物が1%未満のＲＣＡ混入しか含まない）。最も望ましくは、該医薬組成物はＲＣＡフリーである。ＲＣＡフリーであるアデノウイルスベクター組成物及びストックは、米国特許5,944,106及び6,482,616、米国特許出願公開番号2002/0110545A1、並びに国際特許出願WO95/34671に記載されている。国際特許出願WO03/040314において詳述されるように、アデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムの他領域の複製に必須な遺伝子機能における他の欠損との組合せでＥ１を欠損している場合、該医薬組成物はＥ１復帰突然変異株も存在しないのが理想的である。
【００１９】
複製に必須な遺伝子機能をコードするアデノウイルス配列の改変（例えば、欠失、変異、又は置換）に加えて、アデノウイルスゲノムは良性又は非致死性の改変を含むことができる。すなわち、たとえそのような改変が、複製に必須な遺伝子領域を含むアデノウイルスゲノムの領域におけるものであっても、アデノウイルスを複製欠損にさせない改変、又は、望ましくは、ウイルス機能及び／又はウイルス蛋白質の生産に逆に悪影響を与えない改変を含むことができる。そのような改変は一般にDNA操作に起因し、発現ベクター構築促進に役立つ。例えば、アデノウイルスゲノムの制限酵素部位を除去又は導入するのに有利となり得る。そのような良性変異は、しばしばウイルス機能に検出可能な悪影響をもたらさない。例えば、アデノウイルスベクターはVA−1転写に関連する10594及び10595のヌクレオチド（アデノウイルス血清型５のゲノムに基づく）の欠失を含み得るが、該欠失はVA-1の産生を妨げない。
【００２０】
本発明の方法における使用のための好ましいE1/E4欠損アデノウイルスベクターでは、L5ファイバー領域が保持され、スペーサーがL5ファイバー領域と右側LTRとの間に位置する。より好ましくは、そのようなアデノウイルスベクターでは、当該ベクターのウイルス産生が単独複製欠損アデノウイルスベクター（特にE1欠損アデノウイルスベクター）のウイルス産生に近づくように、保持されたL5ファイバー領域を右側ITRから十分に分離するため、E4ポリアデニル化配列が単独で、又は最も好ましくは他の配列との組み合わせで、L5ファイバー領域と右側ITRとの間に存在する。
【００２１】
アデノウイルスゲノム内に挿入されたスペーサーエレメントは、任意のプロモーター（細胞又はウイルスの）、外来性核酸配列、及び／又はポリアデニル化配列を含み得るプロモーター可変発現カセットを含むことができる。好ましくは、E4領域（コード配列が除去されている）内にスペーサーエレメントが挿入された場合、E４ポリアデニル化配列及びE4プロモーターの両方ともベクターに残存している。そのような実施形態においては、スペーサーエレメントはE４ポリアデニル化部位とE4プロモーターとの間に位置しており、あるいは、E4プロモーターがベクターに存在しない場合、スペーサーエレメントは右側（３’）ITRに近接している。
【００２２】
該スペーサーエレメントは、任意の適当なポリアデニル化配列をも含み得る。適当なポリアデニル化配列の例として、BGH（Bovine Growth Hormone）、ポリオーマウイルス、TK（Thymidine Kinase）、EBV（Epstein Barr Virus）、及びヒトパピローマウイルスやBPV（Bovine Papilloma Virus）を含むパピローマウイルスのポリアデニル化配列や、合成された最適化配列があげられる。好ましくは、該スペーサーエレメントはSV40（Human Sarcoma Virus-40）ポリアデニル化配列を含む。SV40ポリアデニル化配列は、多重複製欠損アデノウイルスベクターの高いウイルス産生レベルを可能にする。仮にスペーサーエレメントがコード配列の全部又は一部を含んでおり、遺伝子産物の産生が望まれていない場合は、該スペーサーエレメントをポリアデニル化配列に隣接させることができる。
【００２３】
外来性コード配列もアデノウイルスゲノムのE4欠損領域におけるスペーサーエレメントとして機能し得る。該外来性コード配列は、ベクターが受け入れ可能なインサートのサイズによってのみ制限され、いかなる適当なコード配列であってもよい。適当な外来性コード配列の例として、限定されないが、pGUS、分泌性アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、及びヒトアンチトリプシン等のマーカー遺伝子；治療因子；B3-19K、E3-14.７、ICP47、fasリガンド、及びCTLA4等の潜在的免疫修飾因子；生物学的不活性配列（例えば、（i）産物を産生するよう転写されない配列、又は（ii）欠陥もしくは生物学的に不活性な産物をコードする配列）、をコードするコード配列、並びにグルクロニダーゼ遺伝子等の他の無害な配列があげられる。
【００２４】
アデノウイルスベクターの異なる領域の欠失は、哺乳動物の免疫応答を変化させ得ることを理解すべきである。特に、異なる領域の欠失はアデノウイルスベクターによって惹起される炎症性応答を減少させ得る。さらに、国際特許出願WO98/40509記載のように、野生型コート蛋白質に対する中和抗体によって認識されるアデノウイルスベクターの能力または無力を減少させるように、アデノウイルスベクターのコート蛋白質が改変され得る。
【００２５】
同様に、アデノウイルスベクターのコート蛋白質は、潜在的宿主細胞上のウイルス受容体へのアデノウイルスベクターの結合特異性又は認識を改善するように操作され得る。そのような操作として、ファイバー、ペントン、ヘキソン、pIIIa、pVI、及び／又はpIX領域の欠失、コート蛋白質の部分への種々のネイティブ又は非ネイティブなリガンドの挿入等があげられる。コート蛋白質の操作により、アデノウイルスベクター感染細胞の範囲が拡大され、アデノウイルスベクターの特異的細胞型へのターゲッティングが可能となる。
【００２６】
例えば、一実施形態では、アデノウイルスベクターは、非ネイティブアミノ酸配列の導入による（カルボキシ末端又はその付近であることが好ましい）野生型（すなわち、ネイティブ）コート蛋白質とは異なるキメラコート蛋白質（例えば、ファイバー、ヘキソン、pIX、pIIIa、又はペントン蛋白質）を含む。好ましくは、該非ネイティブアミノ酸配列は、内部コート蛋白質配列の中もしくはその代わりに挿入される。該非ネイティブアミノ酸配列は内部コート蛋白質配列の中に又はその末端に挿入され得る。得られたキメラウイルスコート蛋白質は、キメラウイルスコート蛋白質ではなく野生型ウイルスコート蛋白質を含有することを除いては同一であるアデノウイルスベクターと比較して、より効率よく細胞へ侵入するコート蛋白質を含むアデノウイルスベクターの細胞への直接的な進入を可能とする。好ましくは、キメラコート蛋白質は、野生型コート蛋白質を含有するアデノウイルスベクターによっては認識されないか、不十分にしか認識されない細胞表面に存在する新たな内因性結合部位に結合する。侵入効率上昇の１つの直接的な結果は、該アデノウイルスベクターは、野生型コート蛋白質を含むアデノウイルスは一般に侵入できないか、低効率でしか侵入できない細胞型に結合し、侵入できることである。所望ならば、アデノウイルスコート蛋白質（例えば、ファイバー又はペントンベース）のネイティブな結合を取り除いてもよい。
【００２７】
別の実施形態において、アデノウイルスベクターは真核細胞の特定の型に対して選択的ではないキメラウイルスコート蛋白質を含む。該キメラコート蛋白質は、非ネイティブアミノ酸配列を内部コート蛋白質配列の中に又はその代わりに挿入することによって、野生型コート蛋白質と相違する。例えば、約５から約９のリジン残基（好ましくは７つのリジン残基）含むリガンドが、非コードスペーサー配列を介してアデノウイルスファイバー蛋白質のＣ末端に付加される。この実施形態においては、国際特許出願WO97/20051記載のように、キメラウイルスコート蛋白質は、野生型ウイルスコートと比較してより広い範囲の真核細胞と効率よく結合する。腫瘍は癌細胞の均質な集団を含まないことから、そのようなアデノウイルスベクターは特に好ましい。
【００２８】
米国特許5,962,311で論じられているように、アデノウイルスベクターの所与の細胞に対する特異的結合もまた、short-shaftedアデノウイルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスの使用により調節することができる。short-shaftedアデノウイルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスの使用により、アデノウイルスファイバーのその細胞表面受容体への結合レベル又は効率が減少し、アデノウイルスペントンベースのその細胞表面受容体への結合が上昇し、それによって所与の細胞へのアデノウイルスベクターの結合の特異性が上昇する。あるいは、short-shaftedファイバーを含むアデノウイルスの使用により、ペントンベース又はファイバーノブのいずれかの中への非ネイティブアミノ酸配列の導入により、所望の細胞表面受容体へのアデノウイルスのターゲッティングが可能となる。
【００２９】
もちろん、アデノウイルスベクターが潜在的宿主細胞を認識する能力は、コート蛋白質を遺伝子操作せずに（すなわち、二重特異性分子の使用により）調節できる。例えば、アデノウイルスをペントンベース結合ドメイン及び特定の細胞表面結合部位に選択的に結合するドメインを含む二重特異性分子と複合体化させることにより、特定の細胞型へアデノウイルスベクターをターゲッティングすることができる。
【００３０】
アデノウイルスベクターの適切な改変は、米国特許5,543,328、5,559,099、5,712,136、5,731,190、5,756,086、5,770,442、5,846,782、5,871,727、5,885,808、5,922,315、5,962,311、5,965,541、6,057,155、6,127,525、6,153,435、6,329,190、6,455,314、及び6,465,253、米国特許出願公開番号2001/0047081A1、2002/0099024A1、及び2002/0151027A1、並びに国際特許出願WO95/02697、WO95/16772、WO95/34671、WO96/07734、WO96/22378、WO96/26281、WO97/20051、WO98/07865、WO98/07877、WO98/40509、WO98/54346、WO00/15823、WO01/58940、及びWO01/92549に記載されている。アデノウイルスベクターの構築及び増殖は当該分野で周知である。さらに、多数のアデノウイルスベクターが市販されている。
【００３１】
複製欠損アデノウイルスベクターは、一般に、複製欠損アデノウイルスベクターには存在しないが、高力価のウイルスベクターストックを産生するために適切なレベルで、ウイルスを増殖させるのに必要な遺伝子機能を提供する補完細胞株中で産生される。望ましい細胞株は複製欠損アデノウイルスには存在しない複製に必須な遺伝子機能の少なくとも1以上、好ましくは全てを補完する。補完細胞株は、全てのアデノウイルスの機能（例えば、アデノウイルスアンプリコンの増殖を可能にするためのもの）を含む、初期領域、後期領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルス関連ＲＮＡ領域、又はそれらの組合せによってコードされる少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能における欠損を補完し得る。もっとも好ましくは、補完細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能（例えば、２以上の複製に必須な遺伝子機能）、特にＥ１Ａ及びＥ２Ｂ領域それぞれの複製に必須な遺伝子機能における欠損を補完する。さらに、補完的細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ２（特にアデノウイルスＤＮＡポリメラーゼ及び末端蛋白質について）及び／又はＥ４領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能における欠損を補完し得る。望ましくは、Ｅ４領域における欠損を補完する細胞は、E4-ORF6遺伝子配列を含み、E4-ORF6蛋白質を産生する。そのような細胞は、望ましくは、アデノウイルスゲノムのＥ４領域のORF6を少なくとも含み、他のORFを含まない。該細胞株は、好ましくは、さらに、アデノウイルスベクターと重複しない様式で補完遺伝子を含み、ベクターゲノムが細胞内ＤＮＡと組換えを起こす可能性を最小限にし、事実上排除することにより特徴付けられる。したがって、複製能を有するアデノウイルス（RCA）の存在は、ベクターストック中で避けるとまではいかないにせよ最小化され、それゆえに特定の治療目的、特に遺伝子治療目的に適している。ベクターストック中でのＲＣＡの欠如は、非補完細胞におけるアデノウイルスベクターの複製を回避する。そのような補完細胞株の構築は  標準的な分子生物学及び細胞培養の技術を含み、これらはSambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)、及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y.(1994)に記載されている。
【００３２】
アデノウイルスベクターを産生するための補完細胞株としては、特に限定されないが、293細胞（例えば、Graham et al., J. Gen. Virol., 36, 59-72(1977)に記載）、PER.C6細胞（例えば、国際特許出願WO97/00326、並びに米国特許5,994,128及び6,033,908に記載）、及び293-ORF6細胞（例えば、国際特許出願WO95/34671及びBrough et al., J. Virol., 71, 9206-9213(1997)に記載）があげられる。場合によっては、該補完細胞は必要とされるアデノウイルス遺伝子機能の全てを補完しないこともある。アデノウイルスベクターの複製を可能にするための、細胞又はアデノウイルスゲノムによってコードされていない遺伝子機能をトランスに提供するためにヘルパーウイルスを用いることができる。例えば、本明細書で特定された他の参考文献と同様に、米国特許5,965,358、5,994,128、6,033,908、6,168,941、6,329,200、6,383,795、6,440,728、6,447,995、及び6,475,757、米国特許出願公開番号2002/0034735A1、並びに国際特許出願WO98/53087、WO98/56937、WO99/15686、WO99/54441、WO00/12765、WO01/77304、及びWO02/29388に示される材料及び方法を用いて、アデノウイルスベクターを構築、増殖、及び／又は精製することができる。
【００３３】
ＴＮＦをコードする核酸配列
【００３４】
アデノウイルスベクター、好ましくは、複製欠損アデノウイルスベクターは、ＴＮＦ−α、好ましくはヒトＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含む。FasリガンドやCD40リガンド等のTNFファミリー蛋白質の他のメンバーは多くの疾患を治療することにおいて有用であるが、TNF−αは効果的な抗癌剤であることが示されている。癌に対するTNF−αの効果は、アポトーシス及び腫瘍ネクローシスの誘導を含む多機能的なものである。TNF−αの間接的全身作用として、サイトカイン分泌の誘導及び血管凝固系の活性化を含む免疫エフェクター細胞の活性化があげられる。TNF−αは、血管内皮細胞の好中球及び血小板への接着性を誘導し、トロンボモジュリン産生を減少させる（Koga et al., Am. J. Physiol., 268, 1104-1113(1995)）。その結果、腫瘍新生血管系において凝血塊が形成され、引き続き腫瘍の出血性ネクローシスがおこる。ヒトTNF−αをコードする核酸配列は、米国特許4,879,226に詳細に記載されている。
【００３５】
ヒトTNF−αをコードする核酸配列としては米国特許4,879,226に示されるもの（ヌクレオチド配列を配列番号２に示す）が好ましいが、本発明に照らして多数の核酸配列の改変体及び変異体も可能であり、適切である。例えば、遺伝子コードの縮退が、翻訳停止シグナルの場合と同様に、コードされるポリペプチドを変化させずにポリペプチドコード領域にわたってヌクレオチドを置換することを可能にしている。そのような置換可能な配列は、既知のヒトTNF−αのアミノ酸配列又はヒトTNF−αをコードする核酸配列（米国特許4,879,226で開示される配列等）から推定することができ、従来の合成法又は部位特異的突然変異誘発法によって構築され得る。DNA合成法は、Itakura et al., Science, 198, 1056-1063(1977)及びCrea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5765-5769(1978)の方法に実質的に従って実施することができる。部位特異的突然変異誘発法は、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY(2d ed. 1989)に記載されている。
【００３６】
また、ヒトＴＮＦ−αのホモログをコードする核酸配列（すなわち、該蛋白質とアミノ酸レベルで約７０％を超えて同一（好ましくは約８０％を超えて同一、より好ましくは約９０％を超えて同一、もっとも好ましくは約９５％を超えて同一）であり、かつ、ヒトＴＮＦ−αと同程度の抗癌活性を示す任意の蛋白質をアデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）に組み込んでもよい。アミノ酸の同一性の程度は、ＢＬＡＳＴ配列データベース等の当該分野で公知の任意の方法を用いて決定することができる。さらに、該蛋白質のホモログは、少なくとも中程度の、好ましくは高いストリンジェント条件下で該蛋白質とハイブリダイズし、かつ、抗癌活性を保持している任意のペプチド、ポリペプチド、又はそれらの部分であってもよい。典型的な中程度のストリンジェント条件として、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（pH7.6）、５×デンハルト液、１０％デキストラン硫酸、及び２０mg/mlの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で37℃で一晩インキュベーションした後、約３７−５０℃でフィルターを１×ＳＳＣ中で洗浄する条件、又は実質的に同等な条件（例えば、上記のSambrook et al.に記載される中程度のストリンジェント条件）があげられる。高いストリンジェント条件とは、例えば、（１）５０℃で、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の洗浄のための低イオン強度及び高温、（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミド等の変性剤を用い（例えば、４２℃で、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムでｐＨを６．５にした５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を含む５０％（v/v）ホルムアミド）、又は（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液、ソニケートされたサケ精子ＤＮＡ（５０μg/ml）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％デキストラン硫酸を用い、（i）０．２×ＳＳＣ中で４２℃、（ii）５０％ホルムアミド中で５５℃、及び（iii）０．１×ＳＳＣ中で５５℃、で洗浄（ＥＤＴＡと組み合せるのが好ましい）する条件をいう。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについての、さらなる詳細及び説明は、例えば上記のAusubel et al.に述べられている。
【００３７】
核酸配列はヒトＴＮＦ−αの機能的部分、すなわち、自然に起こる完全長蛋白質の生物学的活性を測定可能なレベルで保持する該蛋白質の任意の部分をコードしてもよい。アデノウイルスベクター、好ましくは複製欠損アデノウイルスベクターの核酸配列の発現によって産生された機能的ＴＮＦ−α断片は、該蛋白質断片をコードする核酸配列を用いて一過性にトランスフェクトされたヒト細胞内の該断片の生物学的活性を解析する等の標準的な分子生物学技術及び細胞培養技術を用いて特定することができる。
【００３８】
あるいは、ヒトＴＮＦ−αをコードする核酸配列は、ＴＮＦ−αの活性を変化させるように（好ましくは上昇させるように）操作されていてもよい。ＴＮＦ−α蛋白質の分泌を上昇させたり、細胞表面に結合し続けるＴＮＦ−α蛋白質をコードしたりするように該核酸配列を操作してもよい。ＴＮＦ−α蛋白質の安定性（例えば、悪条件下でも適切な三次元構造を保持する）を向上させたり、ＴＮＦ−α蛋白質がＴＮＦ受容体を活性化させる効力を上昇させたりするように該核酸配列を操作してもよい。このように、本発明は米国特許4,879,226の具体的な核酸配列に限られず、核酸配列の改変も本明細書において意図される。
【００３９】
該核酸配列は、望ましくは発現カセット（すなわち、サブクローニング及び核酸配列の回収を促進する機能（例えば、１以上の制限酵素部位）又は核酸配列の発現を促進する機能（例えば、ポリアデニル化もしくはスプライシング部位）を有する特定の塩基配列）の一部として存在する。ヒトＴＮＦ−αをコードする核酸配列は、好ましくは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域（例えば、Ｅ１領域の全部又は一部を置換する）に位置する。例えば、E1領域を、例えば図１及び図２（それぞれ未改変及び改変アデノウイルスベクターを示す）に示されるように、ヒトＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むプロモーターを変えることのできる発現カセットで置換してもよい。放射線誘導性プロモーター（１４）、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列（１５）及びポリアデニル化配列（１６）を含む発現カセット（１３）で、Ｅ１領域（１０）を置換してもよい。該発現カセットは、好ましくは、５’−３’方向（例えば、発現カセットの転写方向が周囲のアデノウイルスゲノムの転写方向と同じになるような方向）に挿入される。ヒトＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含む発現カセットに加えて、アデノウイルスベクターは他の産物をコードする核酸配列を含む他の発現カセットを含んでいてもよく、該カセットはアデノウイルスゲノムの任意の欠失した領域と置換することできる。アデノウイルスゲノム（例えば、ゲノムのＥ１領域）への発現カセットの挿入は、公知の方法、例えば、アデノウイルスゲノムの任意の位置に唯一の制限酵素部位を導入することによって容易にすることができる。前述したように、好ましくは、アデノウイルスベクターのE3領域（１１）が欠失し（１７）、E4領域（１２）がスペーサーエレメント（１８）により置換される。
【００４０】
好ましくは、ヒトTNF−αをコードする核酸配列は、TNF−αコード配列の３’側（コード配列の転写方向）に位置するポリアデニル化配列等の転写終結領域をさらに含む。任意の適当なポリアデニル化配列を用いることができ、BGH（Bovine Growth Hormone）、ポリオーマウイルス、TK（Thymidine Kinase）、EBV（Epstein Barr Virus）、及びヒトパピローマウイルスやBPV（Bovine Papilloma Virus）を含むパピローマウイルスのポリアデニル化配列と同様に、合成された最適化配列が含まれる。好ましいポリアデニル化配列は、SV40（Human Sarcoma Virus-40）のポリアデニル化配列である。
【００４１】
好ましくは、ヒトTNF−αをコードする核酸配列は、例えば、プロモーターを変えることのできる発現カセットの一部として、1以上のプロモーター及び／又はエンハンサーエレメントに機能的に連結されている（すなわち、転写制御下にある）。配列をともに機能的に連結させるための技術は当該分野では周知である。任意の適当なプロモーター又はエンハンサー配列を本発明に照らして用いることができる。適当なウイルスプロモーターとして、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（CMV前初期遺伝子プロモーター等（例えば、米国特許5,168,0632に記載））、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）由来のプロモーター（HIV末端反復配列プロモーター等）、ルイスサルコーマウイルス（RSV）プロモーター（RSV末端反復配列等）、マウス乳癌ウイルス（MMTV）プロモーター、HSVプロモーター（Lap2プロモーター又はヘルペスチミジンキナーゼプロモーター等（Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 144-145(1981)））、SV40又はエプスタインバーウイルス由来のプロモーター、アデノ随伴ウイルスプロモーター（p5プロモーター等）等があげられる。核酸配列が機能的に連結された制御配列は、また、組織特異的プロモーター（すなわち、所与の組織で選択的に活性化され、活性化された組織で遺伝子産物（特にTNF−α）の産生をもたらすプロモーター）を含んでいてもよい。例えば、例として内皮細胞又は間質細胞で選択的に活性な制御配列は、癌細胞環境において外来性核酸配列を発現させるのに理想的である。
【００４２】
上述したプロモーターの多くは構成的プロモーターである。構成的プロモーターの代わりに、プロモーターは誘導性プロモーター（すなわち、適切なシグナルに応答して上方調節及び／又は下方調節されるプロモーター）であってもよい。例えば、化学療法剤により上方調節される発現制御配列は、癌への適用に特に有用である（例、化学誘導プロモーター）。さらに、発現調節配列は、放射エネルギー源又は細胞障害性物質によって上方調節されてもよい。例えば、発現制御配列は、超音波、光活性化化合物、高周波、化学療法、及び寒冷凍結（cyofreezing）によって上方調節され得る。本発明において好ましいアデノウイルスベクターは、ヒトＴＮＦ−αをコードする核酸配列に機能的に連結された化学誘導性又は放射線誘導性プロモーターを含む。放射線誘導性プロモーターの使用は、例えば、アデノウイルスベクターを含む細胞又は宿主に放射線を投与することにより、ＴＮＦ−α産生の局所制御を可能にし、その結果、全身毒性を最小化する。任意の適当な放射線誘導性プロモーターを本発明に照らして用いることができる。本発明に照らして使用される好ましい放射線誘導性プロモーターは、初期成長領域-I（EGR-1）プロモーター、特にＥＧＲ-１プロモーターのＣＡｒＧドメインである。放射線誘導性に責めを負うであろうＥＧＲ−１プロモーターの領域は、ヌクレオチド−５５０ｂｐから−５０ｂｐの間に位置している。ＥＧＲ−１プロモーターは、米国特許5,206,152及び国際特許出願WO94/06916及び米国特許6,605,712に詳述されている。他の適当な放射線誘導性プロモーターはc-Junプロモーターであり、それはＸ線によって活性化される。放射線誘導に責めを負うであろうc-Junプロモーターの領域は、ヌクレオチド−１．１ｋｂから−７４０ｂｐの間に位置すると考えられている。c-Junプロモーター及びEGR-1プロモーターは、例えば、米国特許5,770,581にさらに記載されている。アデノウイルスゲノムの所与の領域における唯一の制限酵素部位の使用等の任意の適当な方法により、プロモーターをアデノウイルスゲノムに導入することができる。あるいは、該プロモーターは、ヒトＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含む発現カセットの一部として挿入され得る。
【００４３】
他のアデノウイルスベクターの検討事項
【００４４】
述べられたアデノウイルスベクターはヒトＴＮＦ−αをコードする核酸配列以外の核酸配列、例えば、他の同様の又は異なる疾患及び／又は苦痛（限定されないが、肺気腫、喘息、成人呼吸窮迫症候群、及び慢性気管支炎等の慢性肺疾患、及び冠状動脈性心臓病、癌に伴う一般的な合併症、並びに遺伝子治療、ワクチン等により適切に治療又は予防される他の苦痛等が含まれる）を治療する核酸配列を含むことができる。付加的核酸配列（すなわち、導入遺伝子）が予防上の又は治療上の利益をもたらす場合、該核酸配列はＲＮＡ又は蛋白質レベルでその効果を発揮し得る。あるいは、付加的核酸配列は、アンチセンス分子、リボザイム、スプライシングもしくは３’プロセッシング（例えば、ポリアデニル化）に影響を与える蛋白質、又は、ｍＲＮＡ蓄積もしくは輸送の変化率、又は転写後制御における変化を介在による等で、細胞内の他の遺伝子の発現レベルに影響する蛋白質（すなわち、ここで、遺伝子発現とは、転写開始からプロセッシングされた蛋白質の産生までの全工程を含むものと広範に考えられる）をコードしてもよい。付加的核酸配列は組合せ治療のためのキメラ蛋白質をコードしてもよい。付加的核酸配列はＴＮＦ−αとは異なる標的に対して作用する因子をコードしていてもよく、その結果、多元的な癌治療を提供する。もしくは、付加的核酸配列はＴＮＦ−αの効果を増強する因子をコードしてもよい。そのような因子の例として、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼであるＰＫＲがあげられ、癌細胞をよりアポトーシスさせやすくする（例えば、米国特許5,976,800参照）。
【００４５】
アデノウイルスベクターは、ＴＮＦ−α以外の抗血管新生物質をコードする付加的核酸配列を含んでいてもよい。抗血管新生物質とは、血管新生を防止又は改善するいずれかの生物学的因子である。該抗血管新生物質は、血管新生の一部又は全部の防止及び改善に効果をもたらし、治療効果を達成し得る。抗血管新生物質として、例えば、抗血管新生因子、血管新生因子に特異的なアンチセンス分子、リボザイム、血管新生因子の受容体、及び血管新生因子の受容体に結合する抗体があげられる。癌の拡大につながり得る周囲の組織への血管漏出を防ぐために、アデノウイルスベクターは、例えば、アンジオポエチン（Ang、例えば：Ang-1及びAng-2）、ミドカイン（ＭＫ）、ＣＯＵＰ−ＴＦII、及びヘパリン結合性神経栄養因子（ＨＢＮＦ、ヘパリン結合性成長因子としても知られる）等の血管成熟因子をコードする付加的核酸配列を含んでいてもよい。アデノウイルスベクターを宿主に投与した結果生じるあらゆる不適切な免疫応答を減少させるために、免疫抑制因子をコードする核酸配列がアデノウイルスベクターに組み込まれていてもよい。
【００４６】
アデノウイルスベクターはさらに、インターフェロン（ＩＮＦα、β、γ）、コロニー刺激因子、又はインターロイキン（IL-1、IL-2、IL-3、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15等）等のサイトカインをコードする核酸配列を含んでいてもよい。付加的核酸配列は、ＨＳＶチミジンキナーゼ（例えば、国際特許出願WO01/24684を参照）等のプロドラッグを変換する酵素をコードしてもよい。付加的核酸配列は、好ましくは、哺乳動物癌細胞にとって有害な蛋白質（すなわち、「有害蛋白質」）をコードする。癌細胞にとって有害な蛋白質をコードする核酸配列は当該分野で公知であり、例えば、ｐ５３、Ｆａｓ、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＦａｓＬＭ４５（プロテアーゼ切断部位に欠失を有するＦａｓＬの誘導体）、デスドメインを有するＦａｓ関連蛋白質（ＦＡＤＤ；受容体誘導性毒性介在物質（ＭＯＲＴ−１）としても知られる）、Ｎ末端に欠失を含むＢｃｌ−２の細胞死誘導コード配列、Ｎ末端に欠失を含むＢｃｌ−xの細胞死誘導コード配列、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１（インターロイキン−１ β−変換酵素（ＩＣＥ））、カスパーゼ３、カスパーゼ８（ＭＡＣＨ／ＦＬＩＣＥ（ＦＡＤＤ類似ＩＣＥ−ＣＥＤ３様プロテアーゼ）／Ｍｃｈ５）、及びカスパーゼ１０（Ｍｃｈ４））、受容体相互作用蛋白質（ＲＩＰ）、細胞死異常（ＣＥＤ４）、Apaf-1、ＲＩＰ関連ＩＣＨ−１／デスドメインを有するＣＥＤ−３ホモログ蛋白質（ＲＡＩＤＤ）／デスドメインを有するカスパーゼ及びＲＩＰアダプター（ＣＲＡＤＤ）、ＮＦ−κＢインヒビター（ＩκＢ）、ＤＮＡ断片化因子（ＤＦＦ）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ；apo2リガンド（Apo2L））、デスレセプター４（ＤＲ４）、ＤＲ５、bax、bak、bid、bad、bik、bif-2、c-myc、JUN、ドミナントネガティブＪＵＮ産物、プロテアーゼ、プロテインキナーゼ、転写活性因子、シグナル伝達蛋白質、プロテインキナーゼＣ、ＲＩＴＳＬＲＥキナーゼ、ＤＡＰキナーゼ、ＪＵＮＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）／ＳＡＰＫ、Daxx、ras、Raf、NIK、MEKK1、ASK1、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、Ｒｂ１９４、アデノウイルスＥ１Ａ産物、アデノウイルスＥ２Ｆ産物、合成した細胞周期非依存型アデノウイルスＥ２Ｆ産物、アデノウイルスＥ４／ＯＲＦ４産物、apoptin、上記いずれかのアポトーシス活性化部位、及び上記の２以上の組合せをコードする核酸配列があげられる。
【００４７】
付加的核酸配列は、緑色蛍光蛋白質又はルシフェラーゼ等のマーカー蛋白質をコードしてもよい。そのようなマーカー蛋白質は、ベクター構築及びベクター移入を判定するのに有用である。マーカー蛋白質は、広範囲の治療領域を与えるように効率よく医薬組成物の投与を間隔をおいて配置するために、投与部位を判定するのにも用いることができる。あるいは、核酸配列は選択因子（例えば、抗生物質耐性因子）をコードしてもよく、ベクター構築プロトコールにおいても有用である。所望の場合、（複数の）付加的核酸配列は（複数の）発現カセットの一部であってもよい。
【００４８】
本明細書で述べられた核酸配列はいずれも、ネイティブ型から治療効果を増大させるように変化させてもよい。例えば、治療遺伝子産物の細胞質型は、シグナルペプチドをコードされた遺伝子産物に組み込むことによって分泌型に変換させることができる。遺伝子産物は、ＶＰ２２とのペプチド融合によって近隣の細胞に取り込まれるよう設計することもできる。
【００４９】
医薬組成物
【００５０】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体、及び、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）を含む。任意の適当な薬学的に許容される担体は本発明に照らして用いられ、そのような担体は当該分野では周知である。担体の選択は、部分的には、医薬組成物が投与される特定の部位、及び、医薬組成物の投与に用いられる特定の方法により判定され得る。
【００５１】
適当な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤もしくは意図するレシピエントの血液又は他の体液と該製剤とを等張化する溶質を含有し得る水性及び非水性溶液、等張滅菌溶液、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、もしくは保存剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液を含む。該薬学的に許容される担体は、好ましくは、緩衝剤及び塩を含む液体である。該製剤は、単位用量又は複数回用量の、アンプル、バイアル等の密封容器で供試され、使用直前に滅菌液体担体（例えば、水）を加えることのみを必要とする凍結乾燥（lyophilized）状態で保存され得る。製剤がバイアルで供試される場合、該バイアルは医薬組成物を保管するのに適した任意の素材で構成され得る。該バイアルは、ガラス又はプラスチックで作製されることが望ましい。該バイアルは好ましくはガラス製バイアルである。ガラスバイアルは一般に透明ガラス、あるいは、バイアルに封入された感光性医薬組成物を分解から保護するために着色ガラス（例えば、緑、青、もしくは黄色）から構成される。即時調製の溶液及び懸濁剤は、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。好ましくは、薬学的に許容される担体は、緩衝生理食塩水溶液である。
【００５２】
より好ましくは、該医薬組成物は、アデノウイルスベクターを投与前の損傷から保護するように製剤化される。特定の製剤が、望ましくは、アデノウイルスベクターの感光性及び／又は温度感受性を減少させる。実際、医薬組成物は様々な期間にわたって保管されるであろうから、投与時まで安定性及び最大活性を保証するように製剤化すべきである。一般に、医薬組成物は０℃超、好ましくは４℃またはそれ以上（例えば、４−１０℃）で保管される。ある実施形態において、１０℃もしくはそれ以上（例えば、１０−２０℃）、２０℃もしくはそれ以上（例えば、２０−２５℃）、又はさらに３０℃もしくはそれ以上（例えば、３０−４０℃）の温度で、医薬組成物を保管するのが望ましい。前記の温度で少なくとも１日（例えば、７日（1週間）以上）、しかしながら該期間は３、４、５、又は６週間のようにより長く、少なくとも１０、１１、又は１２週間のようにさらに長いのが一般的であるが、医薬組成物は患者への投与前に保管される。期間中、アデノウイルス遺伝子移入ベクターは、ある程度の活性の損失は許容されるものの、特に比較的高い保存温度及び／又は比較的長い保存期間の場合に、活性を失わない、又は、実質的に活性を失わないのが好ましい。アデノウイルスベクター組成物の活性は、望ましくは、前記のあらゆる期間の後、約５０％もしくはそれ以下、好ましくは約２０％もしくはそれ以下、より好ましくは約１０％もしくはそれ以下、及びもっとも好ましくは約５％もしくはそれ以下に減少する。
【００５３】
この目的のため、医薬組成物は、好ましくは、例えば、上述されたもの、並びに、ポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、α−Ｄ−グルコピラノシルα−Ｄ−グルコピラノシドジハイドレート（一般にトレハロースとして知られる）、及びそれらの組合せからなる群より選ばれた安定化剤等の薬学的に許容される液体担体を含む。より好ましくは、安定化剤はトレハロース又はポリソルベート８０と組み合せたトレハロースである。該安定化剤は、医薬組成物中に任意の適当な濃度で存在していてもよい。安定化剤がトレハロースの場合、トレハロースは、望ましくは、医薬組成物の約１−２５％（wt./vol.）、好ましくは約２−１０％（wt./vol.）、及びより好ましくは約４−６％（wt./vol.）の濃度で存在する。トレハロース及びポリソルベート８０が医薬組成物中に存在する場合、トレハロースは好ましくは約４−６％（wt./vol.）、より好ましくは約５％（wt./vol.）の濃度で存在し、一方、ポリソルベート８０は望ましくは約０．００１−０．０１５％（wt./vol.）、より好ましくは約０．００２５％（wt./vol.）の濃度で存在する。医薬組成物中に安定化剤（例えば、トレハロース）が含まれる場合、薬学的に許容される液体担体は、好ましくは、トレハロース以外の糖類を含む。医薬組成物は、さらに医薬組成物をより安定化するために、約０．０５−３ｍＭ（例えば、約０．０５−２ｍＭ、約０．０５−１．８ｍＭ、約０．０５−１．５ｍＭ、約０．５−１．５ｍＭ、又は約０．０５−１ｍＭ）、好ましくは約１ｍＭ又は約２ｍＭの二価金属塩及び／又はカチオン性ポリマーを含んでいてもよい。望ましくは、二価金属塩はＭｇＣｌ２である。加えて、該医薬組成物はさらに、約５０−１５０ｍＭ、好ましくは約７５ｍＭのＮａＣｌ等の、適当量のＮａＣｌを含んでいてもよい。液体担体は一般に水であり、好ましくは感染に適切な水（ＷＦＩ）である。医薬組成物の適当な製剤は、米国特許6,225,289及び6,514,943、米国特許出願公開番号2002/0019041A1及び2003/0153065A1、並びに国際特許出願WO00/34444及びWO03/59292に詳述されている。アデノウイルスベクターは、もっとも好ましくは、５％（wt./vol.）トレハロース、０．００２５％（wt./vol.）ポリソルベート８０、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．６±０．０２）を含む水性製剤緩衝液に分散されている。
【００５４】
医薬組成物は、さらに、ガラス製品、シリンジ、カテーテル、又は針等の、発現ベクターの調製、保存、又は投与に用いられる装置上へのアデノウイルスベクターの付着による損失を減少するように製剤化されていてもよい。そのような医薬組成物の使用は、医薬組成物の有効期限を延長させ、投与を容易にし、本発明の方法の効率を上昇させ得る。その際、アデノウイルスベクターの標的臓器中の拡散を促進し、及び／又は、形質導入効率を上昇させるように医薬組成物を製剤化することもできる。本目的のため、医薬組成物は、アデノウイルスベクターの取り込みを上昇させることが示されているヒアルロニダーゼを含むこともできる。医薬組成物へのプロテアーゼの添加は、腫瘍中へのアデノウイルスベクターの拡散を促進することができる。アデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）が標的組織中に残存し、かつ、周囲の正常組織へ漏出しないように（すなわち、医薬組成物の標的組織への保持を上昇させるように）組成物を製剤化するのが望ましい。したがって、刺激感受性ポリマー等の医薬組成物の粘度を上昇させる剤を含んでいてもよい。あるいは、医薬組成物のアデノウイルスベクターは、サイズによって標的組織に残存する粒子担体（例えば、ビーズ、ウェーハ等）等の生体適合性固相担体に結合していても、あるいはゲルもしくは気泡等のマトリックス内に組み込まれていてもよい。
【００５５】
さらに、該医薬組成物は追加的な治療的な又は生理的に活性な剤を含んでいてもよい。例えば、特定の兆候の治療に有用な治療因子が存在していてもよい。例えば、特定の兆候を治療するのに有用な治療因子が存在していてもよい。イブプロフェンやステロイド等の炎症を制御する因子は、アデノウイルスベクターのin vivo投与及び生理学的苦痛に関連する膨潤及び炎症を軽減させるための医薬組成物の一部となり得る。免疫系抑制剤は、アデノウイルスベクター自体への又は障害に関連する任意の免疫応答を軽減するように医薬組成物とともに投与され得る。あるいは、疾患に対する身体の自然な防御力を上昇させるために、免疫賦活薬が医薬組成物に含まれていてもよい。さらにそのうえ、免疫エフェクター細胞を腫瘍部位に呼び寄せるために、医薬組成物とともにTNF−α以外のサイトカインを投与してもよい。
【００５６】
可溶性成長因子受容体（例えば、sflt）、成長因子拮抗薬（すなわち、アンジオテンシン）等などの抗血管新生因子も、医薬組成物の一部となり得る。同様に、ビタミンやミネラル、抗酸化剤、及び微量栄養素も医薬組成物とともに併投与され得る。遺伝子移入処置及び他の障害に関連する感染の危険性を減少させるために、抗生物質(すなわち、抗菌薬及び抗真菌薬)が存在していてもよい。医薬組成物への化学療法剤の添加によって、腫瘍縮小効果に付加的作用機序を与えることができる。
【００５７】
標的組織
【００５８】
本発明の方法は、ヒトTNF−αをコードする核酸配列をアデノウイルスベクター（本明細書で述べられたアデノウイルスベクター等）によって形質転換され得る任意の標的組織（例えば、腫瘍組織）にデリバリーするのに用いられ得る。好ましくは、TNF−αが標的組織に対して生物学的活性を及ぼすことができるように、該組織はTNF−α受容体を含む。理想的には、該標的組織は、例えば、固形腫瘍又は軟組織に関連する腫瘍（例えば、軟組織肉腫）といったヒトにおける腫瘍である。用語「腫瘍」は、腫瘍細胞及び付随する間質細胞の両方をいう。腫瘍は、口腔及び咽頭、消化器系、呼吸器系、骨及び関節（例えば、骨転移）、軟組織、皮膚（例えば、メラノーマ）、胸部、生殖器系、泌尿器系、眼及び眼窩、脳及び神経系（例えば、グリオーマ）、又は内分泌系（例えば、甲状腺）の癌と関連し（すなわち、存在し）得、原発腫瘍である必要はない。口腔に関連する組織としては、舌及び口内組織があげられるが、これらに限られない。消化器系の組織、例えば、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肛門、肝、胆嚢、及び膵臓の内に癌が発生し得る。呼吸器系の癌は喉頭、肺、及び気管支に影響し、例えば、非小細胞性肺癌が含まれる。腫瘍は、男性及び女性生殖器を作り出す子宮頸部、子宮体部、卵巣外陰部、膣、前立腺、精巣、及び陰茎、並びに、泌尿器系を構成する膀胱、腎、腎盂、及び尿管に発生し得る。標的組織は、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病リンパ腫）、多発性骨髄腫、又は白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病等）にも関連する。
【００５９】
腫瘍はどの段階のものであってもよい。「腫瘍の段階」という用語は、当該分野では腫瘍の種類及び腫瘍が広がる程度を記述するのに用いられる。多くの腫瘍段階システムが当該分野では公知であり、任意の適当な段階システムを治療される腫瘍の段階を決定するのに用いることができる。例えば、TNM（腫瘍、リンパ節、転移）システムは国際的に受け入れられたシステムであり、腫瘍の段階を決定するのによく用いられる。この際、「T」は原発腫瘍のサイズ、奥行き、及び面積を示す。「TX」は原発腫瘍が判定できないことを示す。「T０」は原発腫瘍の証拠はないことを示す。「Tis」はin situのカルシノーマ（すなわち、悪性細胞が組織の上皮細胞層で確認される）を示す。「T1」は限局腫瘍の直径が２センチメートル（ｃｍ）以下で、起源器官で確認されることを示す。「T2」は限局腫瘍の直径が５ｃｍ以下で、同じ器官の隣接する組織にまで拡張したものを示す。「T3」は同じ器官の隣接する組織をより巻き込んだ腫瘍径が５cm超の進行した腫瘍を示し、「T4」は神経、血管、骨、又は他の器官にまで拡大した大規模な腫瘍を示す。「N」は所属リンパ節に癌が拡張したかどうかを示す。この点において、「NX」は所属リンパ節が判断できないことを示す。「N0」は所属リンパ節への転移の証拠がないことを示し、段階「N1」、「N2」、及び「N3」は所属リンパ節の増大する関与を示す。「M」分類は遠隔転移の有無を示す。この点において、「MX」は遠隔転移が判断できないことを示す。「M0」は転移の証拠がないことを示し、「M1」は遠隔転移が存在することを示す。腫瘍がTNMシステムに従って分類された場合、各分類は組み合わされ、次に全体の段階としてのI、II、III、又はIVが該腫瘍に割り当てられる。上述したTNMシステムは一般に大部分の腫瘍のタイプに適用されるが、各段階の個別の定義は癌のタイプに依存して変化し得る。癌段階についてのさらなる情報は、例えば、AJCC Cancer Staging Manual 6th ed., American College of Surgeons, Lippincott-Raven. Philadelphia(2002)に記載されている。
【００６０】
本発明の方法はあらゆるグレードの癌を治療するのにも有用である。癌の「グレード」とは、腫瘍細胞の分化の程度をいう。腫瘍のグレードは、一般に、腫瘍試料の組織学的特徴及び腫瘍細胞の成長率（分裂指数を測定すること等）の決定により評価される。一般に、よく分化した腫瘍細胞は正常細胞と似ており、より低いグレードとなる（例えば、グレード１又は２）が、未分化腫瘍細胞は一般により侵襲的であり、より高いグレードとなる（例えば、グレード３又は４）。
【００６１】
腫瘍は異なる治療法を受け得る。この点において、本発明の方法は、放射線抵抗性腫瘍等の他の様式の癌治療方法に抵抗性があると判明している腫瘍を治療するのに（すなわち、腫瘍細胞の破壊又は腫瘍サイズの縮小に）有用である。腫瘍はいかなるサイズであってもよい。実際に、本発明は、一部は初期の大きな腫瘍のサイズ（例えば、42cm2又は4400cm3）を顕著に縮小する本発明の方法の驚くべき能力に基づき予測されたものである。理想的には、ヒト癌治療において、本発明の方法は癌（腫瘍）細胞死及び／又は腫瘍サイズの縮小をもたらす。例えば支持細胞の存在、脈管化、繊維マトリクス等により実質的な腫瘍サイズの減少なく腫瘍細胞死が起こることが理解される。したがって、腫瘍サイズが縮小するのが好ましいが、癌の治療には必要とされない。
【００６２】
標的組織は外科的除去（すなわち、「切除」）に従順な腫瘍であってもよい。この点において、本発明の方法は、残存腫瘍細胞を全て排除するために、本明細書で述べられたように外科的切除後に使用され得る。あるいは、標的組織は外科的に切除できない腫瘍であってもよい。この場合において、本発明の方法は腫瘍縮小をもたらすように使用され得、その結果外科的切除を促進する。本発明の一実施形態において、標的組織は、好ましくは、切除不可能な、局所進行性膵臓癌（LAPC）に関連する腫瘍であり、それは血管関与及び主要な血管の衝突を有し、大腸、副腎、又は腎の関与、腹膜播種（X線写真で観察される）及び転移性疾患を有しない膵臓癌として定義される。本発明の方法は、段階II又はIIIの切除可能な食道のアデノカルシノーマ又は扁平上皮癌として定義される局所進行性の切除可能な食道癌の治療にも適している。さらに、本発明の方法は、腹膜反転の下に位置する直腸のアデノカルシノーマであり、肛門のパジェット病を除くものであると定義される局所進行性の切除可能な直腸癌の治療に用いられ得る。本発明の方法は、グレードIVの星状細胞腫とも言い、脳のグリア（支持）組織から発生する、再発性の多形性膠芽腫（GBM）の治療にも適している。しかしながら、本発明の方法はこれらの特定の腫瘍のタイプに限られない。実際、上述したように、本発明の方法はいずれの腫瘍のタイプの治療にも有用である。
【００６３】
投与方法
【００６４】
本発明の方法は医薬組成物を癌治療のためにヒトに投与することを含む。ヒトにおける抗癌剤／抗腫瘍剤としてのＴＮＦ−α蛋白質の使用は、治療の結果として生じる重篤な全身性作用によって制限されてきた。したがって、そのような負の副作用を軽減又は防止するために、ヒトＴＮＦ−αをコードする核酸配列を必要とされる組織（すなわち、腫瘍）にのみ投与すること、又は、どんなに少なくとも、主に腫瘍組織で該核酸配列の発現を促進することが望ましい。したがって、医薬組成物は、標的組織内で、又は標的組織の近傍でＴＮＦ−αが産生されるような任意の手段で投与され得る。
【００６５】
本発明は、好ましくは、ヒトＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）を含む医薬組成物を、局所的な方法で標的組織に投与することにより、標的組織に接触することを含む。医薬組成物を標的組織（例えば、腫瘍）に投与する任意の適当な手段が本発明に照らして用いられ得るが、腫瘍への局所投与は、好ましくは、ヒトＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターを含む医薬組成物を腫瘍内へ直接注射することにより達成される。用語「注射」することは、医薬組成物が標的組織内に強制的に導入されることをいう。好ましくは、医薬組成物は経皮的に（すなわち、皮膚を通じて）注射される。医薬組成物を標的組織内に注射するのに用いられる個別の経路は、体内における標的組織の位置に依存する。この点において、例えば、標的組織が膵臓腫瘍の場合、経腹的経路で医薬組成物を投与するのが好ましい。さらに、標的組織が直腸腫瘍の場合、直腸内又は経会陰経路で医薬組成物を投与するのが好ましい。もちろん、医薬組成物の投与は、標的組織へアデノウイルスベクターを効率よくデリバリーする任意の経路を介して達成され得る。
【００６６】
医薬組成物は、好ましくは、腫瘤にわたって均一な様式で投与される。このように、注射により医薬組成物を投与する場合、該注射は腫瘍全体に最大限に分布するように行われる。例えば、注射装置の針は、腫瘍組織の表面（一般に、腫瘍体積に依存して、約１ｃｍから約５ｃｍ、好ましくは約２ｃｍから約４ｃｍ（例えば、３ｃｍ）の深度へ）を刺し、ベクターが針の軌道に沿って放出されるように針が組織からゆっくりと引抜かれるにつれて、医薬組成物がデリバリー装置から排出される。さらに、各々の注射のタイミングは、医薬組成物が腫瘍に均一にデリバリーされるように制御され得る。換言すれば、周囲の組織によってアデノウイルスベクターが効率よく取り込まれるために、医薬組成物は注射装置からゆっくりと排出される（例えば、一回の注射につき５秒間、好ましくは一回の注射につき１０秒間、及びより好ましくは一回の注射につき１５秒間）。一実施形態において、約１μlから約１０μlの医薬組成物が、約１０分から約３０分かけて腫瘍に投与される（例えば、約10分かけて、約２０分かけて、又は約３０分かけて）。あるいは、医薬組成物を、ベクターを強引に取り込ませるために注射装置（例えば、「スプレー」で）から素早く、効果的に排出してもよい。実際、医薬組成物が標的組織に接触する前に正常細胞を横断するように、該医薬組成物を投与してもよい。もちろん、標的組織全域への医薬組成物の均質な分布は要求されない。
【００６７】
皮膚を通じて腫瘍が容易に視認できない場合には、臨床家は腫瘍を視覚化し、腫瘍体積を見積もり、及び注射部位をガイドするために医学装置を用いることができる。癌診断の画像化技術は非常に進歩している。超音波及びコンピューター断層撮影（ＣＴ）装置は腫瘍塊を検出するのによく用いられる。しかしながら、より進歩した画像化技術が開発されており、組織の代謝活性を明らかにする陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射型コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、スパイラルＣＴ、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、及び探触子に繊維状光学内視鏡を取り付けた超音波内視鏡検査（ＥＵＳ）があげられる。
【００６８】
本発明に照らして、任意の適当な注射装置を用いることができる。例えば、皮下腫瘍の中に医薬組成物を直接注射するのに一般的な医療用シリンジを用いることができる。医療用シリンジは、任意の適当な注射針に適合させることができる。適当な注射針として、Winston-Cook injection needles（例えば、Varices Injector）（Winston-Salem, North Carolina）、EchoTip（登録商標）Ultrasound needle、及びQuadra-Fuse injection needle（Rex Medical, Conshohocken, PA）があげられるが、これらに限られない。もちろん、皮膚の真下に存在しない標的組織（例えば、腫瘍）に注射するのに、標準的な医療用シリンジを用いてもよい。腫瘍に容易にアクセスできない場合は、注射を可能にするために外科的処置の間、該腫瘍を曝露してもよい。しかしながら、侵襲を最小限にしたデリバリー装置により、侵襲的医療処置のない医薬組成物の投与が可能となる。そのような装置は、例えば、５インチ未満の小さな切開によって、皮膚を通じて直接アクセスすることなしに標的組織にアクセスするのを可能にする。侵襲を最小限にしたデリバリー装置は、小さな切開により肝臓等の器官の湾曲した外面にアクセスできるように柔軟かつ可動性の注射器の先端を含み得る。他の非侵襲的注射の手段として、Bioject, Incより入手可能なBiojector 2000 Needle-Free Injection Management System（登録商標）等の無針注射装置の使用があげられる。医薬組成物はカテーテルを用いて標的組織に投与されてもよい。例えば、経カテーテル化学塞栓術は、皮膚の小さな切開を通じた標的組織にカテーテルの挿入を含む。標的組織に栄養を与える血管系内にカテーテルをガイドするのに血管造影が用いられ、すぐに標的組織への血流を阻止する特定の物質とともに治療剤が放出される。治療剤が周辺組織内へ漏出せず、腫瘍は栄養欠乏状態となる。内視鏡検査は、カテーテル法と類似しているが、医薬組成物を投与する間、標的組織の視覚化を許容する。カテーテルは、腫瘍に栄養を与える血流に医薬組成物を放出するのにも、医薬組成物を腫瘍組織に注射するのにも有用である。特定の配置で複数回の注射を可能にするために、過去の注射部位をはっきりと線引きするようなマーキングシステムが用いられ得る。腫瘍及び注射の可視化の向上は、明確に区別できる配置パターンで複数回適用することによって医薬組成物を腫瘍組織に投与する場合に特に保証される。
【００６９】
医薬組成物を腫瘍に直接注射するのに加えて、該医薬組成物を腫瘍に局所的に適用してもよい。例えば、医薬組成物に腫瘍組織を浸し、その結果、組織表面及び周囲の環境に効果的な遺伝子移行がおこる。もちろん、例えば、医薬組成物が腫瘍組織に注射され、かつ、局所的に投与される等の１以上の投与経路が用いられてもよい。医薬組成物を腫瘍組織に浴びせることを含む局所投与は、当該組織を一般的な注射が可能にするよりも、より長い期間アデノウイルスベクターに曝露させることを可能にする。医薬組成物への組織の長期間の曝露は、標的細胞及び支持細胞における取り込みのレベルを上昇させ得る。同様に、任意の適当なデリバリー装置（例えば、カテーテル）を用いて一定期間、標的組織を医薬組成物で灌流してもよい。形質導入が起こる限り、任意の期間（例えば、約１分から約２０時間（例えば、約1分から約１２時間）、好ましくは約１５分から約１０時間（例えば、約１５分から約６時間）、より好ましくは約３０分から約５時間（例えば、約３０分から約３時間）、及びより好ましくは約１−２時間）、腫瘍を医薬組成物で灌流することができる。
【００７０】
あまり好ましくはないが、医薬組成物を投与するのに他の投与経路を用いることもできる。実際、医薬組成物を投与するのに１以上の経路が用いられ得るが、特定の経路は他の経路よりもより迅速かつより効率よい反応を与え得る。例えば、特に好ましくはないものの、医薬組成物は、体腔内に適用又は注入され、皮膚、吸入を通して吸収され、又は非経口的に投与（例えば、筋肉内、静脈内、腹膜、もしくは動脈内投与）され得る。好ましくは、非経口的に患者に投与された医薬組成物のアデノウイルスベクターは、特定の細胞（例えば、癌細胞）に特異的にターゲッティングされる。局所デリバリーのために、医薬組成物は動脈内又は静脈内に投与され得る（例えば、肝臓にデリバリーするには肝臓動脈経由で、あるいは、脳にデリバリーするには頚動脈経由で）。脳への投与のために、医薬組成物を腫瘍内デリバリーカテーテル、リザーバー（例えば、Ommaya reservoir）に付属した心室シャントカテーテル、注入ポンプを用いて腫瘍組織へ導入してもよく、あるいは、腫瘍切除腔（Gliasite、Proxima、Therapeutics等）に導入してもよい。脳内腫瘍組織には、連続的注入カテーテルを用いた灌流を介して、又は、脳脊髄液を通して、医薬組成物を投与することによっても接触し得る。あるいは、医薬組成物を肺にデリバリーするために胸膜腔に投与してもよく、中皮腫には腹膜腔に投与してもよい。さらに、例えば腫瘍内投与後に、リンパ節にデリバリーするためにリンパ系にアクセスしてもよい。局所デリバリーのためには、標的組織に栄養を与える動脈内に医薬組成物を直接デリバリーするのが好ましい。本明細書で述べたように、アデノウイルスベクターは、潜在的宿主細胞上の受容体へのアデノウイルスベクターの結合特異性又は認識を変化させるように改変することができる。アデノウイルスに関して、そのような操作として、ファイバー、ペントン、又はヘキソン領域の欠失、コート蛋白質の部分への種々のネイティブな又は非ネイティブなリガンドの挿入等があげられる。適切な宿主細胞に医薬組成物のアデノウイルスベクターを効率よくデリバリーするために、非経口投与では大用量の又は複数回の投与を必要とし得る。
【００７１】
ある場合においては、治療効果を実現するために医薬組成物は直接標的組織に接触する必要はない。例えば、医薬組成物は支持組織に投与されてもよく、それによりアデノウイルスベクター又は生じたTNF−αのいずれかが標的組織に透過し、その生物学的効果を発揮する。例えば、驚くべきことに、本発明の方法による腫瘍組織への直接医薬組成物の投与が、体内の他の領域に存在する病巣の治療を促進することが観察されている。換言すれば、腫瘍への医薬組成物のデリバリーが、体内のいずこかに存在する付加的（すなわち、１以上の）腫瘍（例えば、転移）の退行を促進し得る。したがって、本発明の方法は、ヒト多発性（すなわち、1以上の他の）腫瘍を、好ましくはヒト体内の多発性腫瘍のサイズを縮小させることにより、治療することができる。特に、医薬組成物を最初の腫瘍にデリバリーすることで、体内の異なる領域に存在する多発性腫瘍（例えば、最初の腫瘍が肩に存在し、第二の腫瘍が腹部に存在する）を治療することができる。この実施形態において、医薬組成物は最初の腫瘍に投与され、最初の腫瘍を治療し、さらに、医薬組成物が直接投与されていない1以上の他の腫瘍を治療することができる。好ましくは、最初の腫瘍及び１以上の付加的腫瘍中の腫瘍細胞が破壊される。また好ましくは、最初の腫瘍及び１以上の付加的腫瘍のサイズが縮小する。したがって、医薬組成物の局地的（直接）又は領域的なデリバリー（例えば、所属リンパ節又は血液供給中への直接デリバリー）を通じて全身的な生物学的効果が達成され得る。
【００７２】
スポンジ、生体適合性網細工、機械的リザーバー、又は機械的移植片等のアデノウイルスベクターの制御された又は持続的な放出を可能とするような装置内又は上で医薬組成物を投与してもよい。移植可能な装置（例えば、機械的リザーバー又はポリマー組成物からなる移植片もしくは装置）等の移植片（例えば、米国特許5,443,505参照）、装置（例えば、米国特許4,863,457参照）、はアデノウイルスベクターの投与に特に有用である。本発明の医薬組成物は、例えば、ゲル発泡体、ヒアルロン酸、ゲラチン、コンドロイチン硫酸、ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタレート（BHET）等のポリホスホエステル、及び／又はポリ乳酸−グリコール酸を含む徐放性剤（例えば、米国特許5,378,475参照）の形で投与されてもよい。
【００７３】
医薬組成物は、後に患者に投与されるガラス又は磁気ビーズ等の他の物質に組み込まれていたり、被覆していてもよい。例えば、FDAは潜在組織（例えば、侵襲性癌、体腔深部腫瘍等）に対する集中放射療法をデリバリーするための放射活性ガラスビーズを使用する研究を認可した。そのようなビーズは医薬組成物を含有するか、医薬組成物に覆われることができる。あるいは、医薬組成物で覆われた磁気ビーズを患者に投与し、腫瘍付近に磁石を配置することで標的組織に導いてもよい。ビーズは強制的に除去しない限り体内に留まる傾向にあるが、生体内分解性デリバリー装置は分解されて毒性のない最終産物となり、体内から自然に除去される。例えば、最近Gliadel（登録商標）ウエハーが、化学療法薬を膠芽細胞腫部位にデリバリーするのに用いられている。そのような生体内分解マトリクスは一度移植すれば、TNF−αをコードするアデノウイルスベクターをマトリクスが分解されるまで放出することができ、したがって臨床家の介入なしに関連部位に治療剤をデリバリーする。
【００７４】
単回用量の複数回適用
【００７５】
医薬組成物の一用量の投与は単回の適用で達成することができるが（例えば、単回の注射又は標的組織への単回の局所適用）、単回用量は標的腫瘍の異なる点への医薬組成物の複数回適用により投与されるのが好ましい。複数回適用は、腫瘍のサイズや位置に依存して、約２回の適用から約50回の適用又はそれ以上（２から50までの全ての整数を含む）に達し得る。例えば、単回用量を関連組織に４０の別個の注射又はそれ以上で投与してもよい。医薬組成物の単回用量は、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の適用（例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０、又は４５の適用）で投与され、より好ましくは約２−８の適用であり、さらにより好ましくは約２−５の適用である。適用の回数は腫瘍の位置、腫瘍のサイズ、腫瘍のタイプ等に依存する。例えば、一般に非常に大きな（例えば、最も大きな寸法で７８ｃｍ）軟組織肉腫に投与する場合、単回用量は約３−８の適用で投与されることが好ましい。より小さく、より小型の固形腫瘍には、２−５だけ適用するのが好ましい。複数回適用は、各々の適用が投与される腫瘍の位置により決定される特定の配置といったパラメーターによって操作できるという点で単回の適用より有利である。医薬組成物の単回用量の投与は複数回適用を用いることによって、より良く制御され、任意の所与の用量が投与される効率は最大となり得る。さらに、この方法で、アデノウイルスベクター及び、究極的にはTNF−αの産生が腫瘍全体に均一に分布し得る。
【００７６】
複数回投与の特異的な配置は、二次元空間であろうと三次元空間であろうと、医薬組成物の各々の適用が投与される標的組織上の位置により定義される。各々の適用の位置は腫瘍のタイプ及び体積により決定され得る。複製欠損アデノウイルスベクター及び、究極的には産生されたTNF−α蛋白質が腫瘍に広範囲に分布するように、適用のパターンが選択される。二次元空間における複数回適用の特異的な配置に関しては、特異的配置は複数回適用が位置する平面（すなわち、標的組織の断面）により定義される。複数回適用により定義される平面は、標的組織表面から一定の距離に位置するか（すなわち、実質的に標的組織表面に平行）、あるいは、該平面は標的組織表面に対して斜めに位置する。さらに、複数回適用は任意の適当なパターン又は特異的配置を定義し得る。したがって、例えば、二次元空間においては、複数回適用は正方形を定義し得るが、一方、三次元的空間においては、複数回適用は立方体を定義し得る。本発明の方法は複数の治療期間（すなわち、後述するように、一定期間（治療期間）にわたる医薬組成物の複数回用量の投与）を含むことから、治療期間にわたって医薬組成物の最大限の分布を達成するために複数回適用の配置を循環させたり、シフトさせたりするのが望ましい。一貫してパターン化された医薬組成物の適用を補助するために、注射をガイドするのにグリッド又はテンプレートオーバーレイが役立つであろうし、マーキング装置により過去の注射点の記録が可能となり、さらに標的組織を視覚化するのに画像化技術を用いることができる。
【００７７】
医薬組成物を固形腫瘍に直接投与する場合には、腫瘍周辺への複数回適用を通じて単回用量の医薬組成物が投与されるのが好ましく、特に腫瘍塊の約１ｃｍから約５ｃｍ、好ましくは約２ｃｍから約４ｃｍ（例えば、約３ｃｍ）の深度に投与装置（例えば、針）が挿入される。理想的には、複数回適用は腫瘍へ、その周囲（周辺）に等間隔で投与される（例えば、時計回り又は反時計回り（例、12時、３時、6時、及び9時の位置）、並びに、単回用量の医薬組成物の複数回適用のための好ましいパターンの説明とともに、腫瘍の端面図及び側面図を描いた図３Ａ及び図３Ｂにそれぞれ示されるような、前部−後部又は背面−尾側の位置。複数回投与の配置は、次回の投与においてシフトされる。例えば、特に好ましい実施形態において、本発明の方法は次のパターンで医薬組成物を投与することを含む：（a）第一週の各投与については12時（３１）、３時（３２）、6時（３３）、及び9時（３４）の位置、並びに前部−後部又は背面−尾側の位置（３５）、（b）第二週の最初の投与については1時、4時、7時、及び１０時の位置、並びに前部−後部又は背面−尾側の位置、（c）第二週の二回目の投与については２時、５時、８時、及び１１時の位置、並びに前部−後部又は背面−尾側の位置、そして（d）その後の各投与については平行注射（３６）を用いて腫瘍の周囲で（a）−（c）を繰り返す。
【００７８】
軟組織肉腫に関連する等の広範性又は大きな腫瘍に医薬組成物を投与する場合、腫瘍の周囲に注射するのは不可能である。したがって、注射は、単回用量の医薬組成物の軟組織肉腫への複数回適用（４２）のための好ましいパターンの説明とともに、軟組織肉腫（４１）の端面図を描いた図４に示されるような、一連の平行線を含むパターンで投与される。あるいは、同心円で注射が投与されてもよい。各場合において、適用の特異的配置はアデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）を広範囲にデリバリーするという目的に添って選択される。ある実施形態において、医薬組成物の一用量は腫瘍組織に直接投与されないが、腫瘍の拡大を防ぐために腫瘍の周辺の細胞／組織に局所的に投与される。
【００７９】
操作し得る複数回適用の他のパラメーターは、各々の適用間の時間差である。各複数回適用は、好ましくは互いに約１０分以内（例えば、約０．５−１０分）に、より好ましくは互いに約８分以内（例えば、約１−８分）に、さらに好ましくは互いに約６分以内（例えば、約３−６分）に投与される。単回用量の全ての複数回適用が、上記時間枠内に投与されるのがもっとも好ましい。
【００８０】
用量
【００８１】
医薬組成物の用量、及び特にＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターの量は、腫瘍のサイズ、いずれかの副作用の程度、特定の投与経路等の多数の因子に依存し得る。用量は、ＴＮＦ−αに関連する負の副作用が最小限となるようにすべきである。望ましくは、医薬組成物の単回用量は、少なくとも約１×１０５粒子（粒子単位とも言われる）から少なくとも約１×１０１３粒子のアデノウイルスベクターを含む。用量は、少なくとも約1×106粒子（例えば、約４×106−４×1012粒子）、より好ましくは少なくとも約1×10７粒子、より好ましくは少なくとも約1×10８粒子（例えば、約４×10８−４×1011粒子）、もっとも好ましくは少なくとも約1×10９粒子から少なくとも約1×10１０粒子（例えば、約４×10９−４×1010粒子）のアデノウイルスベクターである。あるいは、医薬組成物の用量は、たった約1×1014粒子、好ましくはたった約1×10１３粒子、より好ましくはたった約1×10１２粒子、より好ましくはたった約1×10１１粒子、もっとも好ましくはたった約1×10１０粒子（例えば、たった約1×10９粒子）を含む。換言すれば、医薬組成物の単回用量は、約1×10６粒子単位（pu）、４×10６pu、１×10７pu、４×10７pu、１×10８pu、４×10８pu、１×10９pu、４×10９pu、１×10１０pu、４×10１０pu、１×10１１pu、４×10１１pu、１×10１１pu、４×10１１pu、１×10１２pu、又は４×10１２puのアデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）を含み得る。単回用量のための複数回適用プロトコールの各適用は、個々の適用の集合が上述したような単回用量に等しくなるように全体の適切な分画を含み得る。したがって、医薬組成物の単回用量の５回適用の場合には、それぞれの適用におけるアデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）の量は上述した単回用量の5分の１であることが望ましい。
【００８２】
本明細書で述べられた用量は、約3ｃｍ2から約300ｃｍ2（例えば、約５ｃｍ2、７ｃｍ2、８ｃｍ2、又は９ｃｍ2）、一般的には約１０ｃｍ2から約２００ｃｍ2（例えば、約１５ｃｍ2、２０ｃｍ2、２５ｃｍ2、３０ｃｍ2、３５ｃｍ2、４０ｃｍ2、４５ｃｍ2、又は５０ｃｍ2）、より一般的には約５０ｍ2から約１２５ｃｍ2（例えば、７５ｃｍ2、８０ｃｍ2、８５ｃｍ2、９０ｃｍ2、又は１１０ｃｍ2）の量の標的組織に適しているが、3ｃｍ2より小さな腫瘍又は３００ｃｍ2より大きな腫瘍も本発明の方法により治療し得る。標的組織内に直接医薬組成物を注射する場合には、単回の適用は、約１００μｌから約２０ｍｌ、好ましくは約２５０μｌから約１０ｍｌ、より好ましくは約５００μｌから５ｍｌ（例えば、１ｍｌ、２ｍｌ、又は３ｍｌ）の医薬組成物を含み得る。理想的には、注射により単回用量の複数回適用を投与する場合には、それぞれの適用は約１ｍｌの医薬組成物を含む。
【００８３】
したがって、例えば、ＥＧＲ−１プロモーターの制御下にあるヒトＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むE1A/E1B/E3/E4欠損アデノウイルスベクター（例えば、国際特許出願WO02/00906及び米国特許6,579,522に記載）を含む医薬組成物の単回用量において、約３ｃｍ2から１５０ｃｍ2の推定量の腫瘍に約１×10８−１×10１２のアデノウイルス粒子が投与される。これらの条件下において、ＴＮＦ−α蛋白質の全身投与に関連する負の副作用を生じさせずに、標的組織において十分なレベルのＴＮＦ−α産生が達成される。
【００８４】
投与時期
【００８５】
癌の増殖する性質は、体内からの該疾患の完全な除去を妨げる。どんなに治療しようとも、生存癌細胞が直ちに複製するので、治療剤の単回用量によっては完全な抗癌効果が達成されなさそうである。実際、最も慢性的な疾患と同様に、複数の用量の治療剤を含む長期にわたる治療が必要となり得る。したがって、一実施形態において、本発明の方法は一定期間（すなわち、治療期間）にわたって医薬組成物の複数の用量をデリバリーすることを含む。
【００８６】
本発明に関して、時期についての２つの論点が存在する。それは、全体の治療期間、換言すれば、治療が行われる時間の全体の長さ、並びに、医薬組成物の用量及び／又はアジュバント治療の投与間隔である。理想的には、治療期間は長さにして約１０週より長くないが（例えば、長さにして約１−１０週を含む治療期間）、１週より短くても（例えば、１、２、３、４、５、又は６日）、１０週より長くても（例えば、長さにして１２、１４、１６、又は１８週）よい。好ましくは、治療期間は約２−９週（すなわち、長さにして約２、３、４、５、６、７、８、又は９週）であり、より好ましくは約３−８週（例えば、４−７週）、もっとも好ましくは長さにして約５−６週（例えば約５週半）である。５−７週の治療期間は、患者のコンプライアンスを脅かさない限りにおいて、癌を効果的に攻撃するのに十分な時間を提供する。理想的には、医薬組成物、電離放射線の一用量、及び１以上の化学療法剤の一用量を、治療期間にわたって同時に投与する。
【００８７】
医薬組成物の複数用量の投与については、好ましくは、治療期間にわたって週に約1回、一用量が投与される。治療開始時には、例えば、２日／週、３日／週、４日／週、５日／週、６日／週、又は７日／週（毎日投与）で単回用量を投与するように、より頻繁な投与を必要としてもよい。一実施形態においては、治療期間の第１週の間に、必要であれば第２週の間も、少なくとも2回用量が投与される。その後、治療期間の残りの各週に医薬組成物の単回用量が投与され得る。理想的には、治療期間は６週までを含み、本方法は治療期間の各週に一回用量の医薬組成物を投与することを含む。
【００８８】
しかしながら、投与時期は、患者の治療に対する耐性、疾患の程度、臨床家の供給等の多くの因子に依存し得るが、投与の間が１週間を経過することは容認される。例えば、１０日毎、2週間毎、１８日毎、３週間毎、２５日毎、１月毎、又は２月毎に、一用量を投与してもよい。好ましくは、治療期間中ＴＮＦ−αのレベルがバックグラウンドのレベルより高いままであり続けるように、医薬組成物の複数の用量が投与される。
【００８９】
実際には、遺伝子発現（すなわち、ヒトＴＮＦ−αをコードする配列の発現）が起こり、所望の生物学的効果が実現するように、投与時期が選択される。したがって、投与時期は特定の腫瘍のタイプを縮小させるように最適化され得る。例えば、軟組織肉腫のように、腫瘍が大きく拡散している場合には、第１週には医薬組成物の２回用量を投与し、その後のそれぞれの週（例えば、２−５週）には医薬組成物の１回用量を投与するといったように、治療期間は５週までを含むのが好ましい。小さく小型な固形腫瘍の場合には、第１−２週には医薬組成物の２回用量を投与し、その後のそれぞれの週（例えば、３−６週）には医薬組成物の１回用量を投与するといったように、治療期間は６週までを含むのが望ましい。各々の場合において、１週間に医薬組成物の２回用量が投与される場合には、該用量は治療の1日目及び４日目に投与するのが好ましい。
【００９０】
ある実施形態において、医薬組成物を投与する方法であって、一用量を長期間にわたって標的組織に持続的に投与する方法を採用するのが有利となり得る。例えば、標的組織の医薬組成物による持続的な灌流が望ましい。したがって、本発明の方法は治療期間中少なくとも一回は標的組織（例えば、腫瘍）に接触することを含んでいてもよい。換言すれば、医薬組成物の一用量の単回投与は、例えば、1週より短いこともあるが、長さにして１−１０週（例えば、１日、2日、3日、4日、5日、6日、2週、３週、４週、５週、６週、7週、８週、又は９週）、又は１０週以上（例えば、１２、１４、１６、又は１８週）等の長期間にわたってデリバリーされる。そのようなデリバリー戦略は、例えば、徐放性装置又はリザーバーへの医薬組成物の組み込み及び患者への移植を通じて達成され得る。
【００９１】
放射線療法
【００９２】
大部分のタイプの癌に対する一般的な治療コースは、放射線療法である。放射線療法は、細胞内ＤＮＡに変異を誘導して癌細胞を全滅させるために、Ｘ線やガンマ線等の高エネルギー粒子のビーム又は波動を用いる。癌細胞は正常細胞より早く分裂するので、腫瘍組織は正常組織より放射線に感受性がある。放射線は曝露された細胞における外来性ＤＮＡの発現を促進することが示されている。好ましい実施形態において、本発明の方法は、さらに治療期間にわたって患者に放射線の一用量を投与することを含む。ＴＮＦ−αをコードする核酸の腫瘍内デリバリー及び腫瘍部位への共焦点放射線は、２つの強力な抗癌療法の局所へのデリバリーをもたらす。ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を放射線誘導性プロモーターに機能的に連結させた場合、放射線を照射されている腫瘍細胞における放射線とＴＮＦ−αの相加効果又は相乗効果に加えて、放射線はＴＮＦ−αの産生を増強し、放射線療法期間中に腫瘍部位において持続的にＴＮＦ−αの治療レベルを維持する（例えば、Hersh et al., Gene Therapy, 2, 124-131(1995)及びKawashita et al., Human Gene Therapy, 10, 1509-1519(1999)を参照）。
【００９３】
重篤な負の副作用を起こさずに放射線の一用量に患者が耐え得る限りにおいて、任意のタイプの放射線を患者に投与することができる。放射線療法の適当なタイプとしては、例えば、電離（電磁気）放射療法（例えば、Ｘ線やガンマ線）又は粒子ビーム放射線療法（例えば、高エネルギー線形放射線）があげられる。電離放射線とは、電離（すなわち、電子を得る又は失うこと）を起こすのに十分なエネルギーを有する粒子又は光子を含む放射線と定義される（例えば、米国特許5,770,581に記載）。放射線の効果は、少なくとも部分的には臨床家が制御することができる。曝露される標的細胞を最大にする及び毒性を減少させるために、放射線の用量を分割するのが好ましい。腫瘍細胞の殺傷を上昇させる放射線増感剤、又は、正常細胞を放射線の有害な効果から守る放射線防護剤（例えば、IL-1やIL-6）と同時に放射線を投与してもよい。同様に、熱（すなわち、発熱療法）又は化学療法を適用することにより、組織を放射線感受性にすることができる。
【００９４】
放射線源は患者の外部にあっても内部にあってもよい。外部放射線療法は最も一般的であり、例えば、線形加速器を用いることにより皮膚を透過して腫瘍部位に対して高エネルギーの放射線ビームを向けることを含む。放射線のビームは腫瘍部位に局限されるものの、正常で健全な組織の曝露を回避するのはほぼ不可能である。しかしながら、通常患者はよく外部放射線に耐える。内部放射線療法は、ビーズ、ワイヤー、ペレット、カプセル等の放射線放出源を体内の腫瘍部位に又はその近傍に移植することを含む。そのような移植片はその後の処置により除去することができるし、不活性な状態で体内に残留させてもよい。内部放射療法のタイプとして、近接照射療法、組織内照射、及び腔内照射があげられるが、これらに限られない。内部放射療法は、本発明の医薬組成物が移植片構造物の中に又は表面に組み込まれており、故に２つの癌治療法を同時に投与するのを可能にするようなアデノウイルスベクターを用いた癌治療に特に適している。あまり一般的でない内部放射線療法として、放射活性物質を結合した腫瘍特異的抗体を患者に投与する放射免疫治療があげられる。該抗体が腫瘍抗原を探し出して結合する結果、関連組織に一定量の放射線が効果的に投与される。
【００９５】
投与方法を問わず、本発明に照らして患者に投与される放射線の全体用量は、好ましくは約５Gray（Gy）から約７０Gyである。より好ましくは、約１０Gyから約６５Gy（例えば、約１５Gy、２０Gy、２５Gy、３０Gy、３５Gy、４０Gy、４５Gy、５０Gy、５５Gy、もしくは６０Gy）又は約１０Gyから約４０Gy（例えば、約１５Gy、２０Gy、２５Gy、３０Gy、もしくは３５Gy）が治療経過全体にわたって投与される。放射線の全用量を経過中の一日で投与することもできるが、例えば、電離放射線の用量の一分画を数日の経過にわたる各々の日に投与するというように、全体用量を部分に分けて、数日にわたって投与するのが理想的である。望ましくは、放射療法は、少なくとも3日（例えば、少なくとも４、５、７、１０、１４、１７、２１、２５、２８、３２、３５、３８、４２、４６、５２、又は５６日（約１−８週））の経過にわたって投与される。したがって、放射線の一日用量は、約１−５Gy（例えば、１Gy、１．５Gy、１．８Gy、２Gy、２．５Gy、２．８Gy、３Gｙ、３．２Gy、３．５Gy、３．８Gy、４Gy、４．２Gy、４．５Gy、又は５Gy）、好ましくは３−５Gy（例えば、約３−４Gy又は４−５Gy）、より好ましくは１−２Gy（例えば、１．５−２Gy）を含む。該放射線の一日用量は、放射線誘導性プロモーターに機能的に連結された場合に、核酸配列の発現を誘導するのに十分とすべきである。期間が延びた場合、放射線を毎日投与しないのが好ましく、それにより患者を休息させ、治療効果が実現される。例えば、各治療週で、放射線を5日連続で投与し、2日は投与しないのが望ましく、したがって週に2日の休息を許容する。しかしながら、治療に対する患者の応答及び任意の可能性のある副作用に依存して、1日／週、２日／週、３日／週、４日／週、５日／週、６日／週、又は７日全部／週で放射線を投与してもよい。放射線療法は治療期間における任意の時期に始めることができる。好ましくは、放射線は第1週又は第２週に開始し、残りの治療期間中投与する。例えば、６週を含む、例えば固形腫瘍の治療のための治療期間の、１−６週又は２−６週に放射線が投与される。あるいは、５週を含む治療期間の１−５週又は２−５週に放射線が投与される。あるタイプの癌の治療は、最初の放射線治療が完結した後に付加的な電離放射線用量（「ブースター」用量）を必要とし得る。そのような場合において、ブースター用量は治療効果を上昇させるのに適したいかなる用量であってもよいが、好ましくは、約５から約１０Gyを含み、より好ましくは約５．４から約９Gyである。
【００９６】
ある実施形態において、TNF−αをコードする核酸配列が放射線誘導性プロモーターに機能的に連結されたような場合、本発明の方法は、プロモーターの活性を上方調節するのに十分な用量で医薬組成物を投与した後、すぐに腫瘍を放射線に暴露することを含む。しかしながら、ヒトにおいて、放射線暴露と医薬組成物投与との間を２ヶ月まであけることができることが、Cancer Facts and Figures 2001, American Cancer Society, New York, NY、及び国際特許出願WO01/24684に詳述されている。したがって、癌治療における本発明の様々な実施形態の効果を決定するために、臨床家は標準的なテストを用いることができる。しかしながら、腫瘍のサイズ及び拡大に加えて、臨床家は治療効果を評価して生活の質及び患者の生存をも考慮しなければならない。
【００９７】
腫瘍由来又は医薬組成物投与由来の創傷（すなわち、潰瘍）を治癒し、過度の放射線暴露から保護するように、注意すべきである。望ましくは、少なくとも１つの放射線の適用は、医薬組成物が投与された日に投与される。もっとも好ましくは、医薬組成物の投与後に、特にアデノウイルスベクター（例えば複製欠損アデノウイルスベクター）が、放射線誘導性プロモーターの活性及び結果として生じるTNF−αの産生を最大限に上方調節するように、放射線誘導性プロモーターに機能的に連結されたヒトTNF−αをコードする核酸配列を含む場合には、約３０分から約８時間（例えば、約３時間）、好ましくは少なくとも約４時間（例えば、約４−６時間）標的部位が放射線に暴露される。もちろん、内部放射線源が用いられる場合には（例えば、近接照射療法又は放射免疫療法）、暴露時間は一般に増加し、それに対応して放射線強度は減少する。
【００９８】
化学療法
【００９９】
放射線と同様に、化学療法は大部分の癌のタイプのための標準的な治療である。好ましい実施形態において、本発明の方法はさらに1以上の化学療法剤の一用量を治療期間にわたって患者に投与することを含む。任意の適当な化学療法剤が本発明の方法に用いられる。適当な化学療法剤として、特に限定されないが、アドリアマイシン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロランブシル、シタラビン、シクロフォスファミド、カンプトテシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキシル、ドキソルビシン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メプルハラン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソウレア（nitrosurea）、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、トランスプラチナ、抗血管内皮増殖因子化合物（「anti-VEGF」）、抗表皮増殖因子受容体化合物（「anti-EGFR」）、５−フルオロウラシル等があげられる。１以上の化学療法剤の一用量が、本発明の方法に従って投与され得る。本発明の方法で用いられる化学療法剤のタイプ及び数は、個別の腫瘍タイプについての標準的な化学療法剤投与計画に依存し得る。換言すれば、特定の癌は単独の化学療法剤で日常的に治療され得るが、他の癌は化学療法剤の組み合わせにより日常的に治療され得る。好ましくは、本発明の方法は、５−フルオロウラシル（５−FU）、シスプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シクロフォスファミド、カペシタビン、及び／又はドキソルビシンの投与を含む。1以上の化学療法剤の任意の適当な用量がヒトに投与され得る。上述した化学療法剤の適当な用量は当該分野では公知であり、例えば、米国出願公開2003/0082685A1に記載されている。一用量の５−ＦＵが患者に投与される実施形態において、該用量は、好ましくは、一日につき患者の体表面積ｍ２につき約５０ｍｇ（すなわち、mg/m2/day）から約１５００mg/m2/day（例えば、約１００mg/m2/day、約５００mg/m2/day、及び約１０００mg/m2/day）を含む。より好ましくは、５−ＦＵの用量は、約１００mg/m2/dayから約３００mg/m2/day（例えば、約２００mg/m2/day）又は約９００mg/m2/dayから約１１００mg/m2/day（例えば、約１０００mg/m2/day）を含む。シスプラチンの一用量が患者に投与される場合、該用量は、好ましくは、約２５mg/m2/dayから約５００mg/m2/day（例えば、約５０mg/m2/day、約１００mg/m2/day、又は約３００mg/m2/day）を含む。より好ましくは、シスプラチンの用量は約５０−１００mg/m2/dayであり、もっとも好ましくは７５mg/m2/dayを含む。カペシタビンの一用量が患者に投与される場合、該用量は、好ましくは、約５００mg/m2/dayから約１５００mg/m2/day（例えば、約７００mg/m2/day、約８００mg/m2/day、又は約９００mg/m2/day）を含む。より好ましくは、カペシタビンの用量は約８００mg/m2/dayから約１��００mg/m2/day（例えば、約９００mg/m2/day）を含む。
【０１００】
放射線と同様に、期間が延びた場合、化学療法を毎日投与しないのが好ましく、それにより患者を休息させ、治療効果が実現される。例えば、各治療週で、化学療法を5日連続で投与し、2日は投与しないのが望ましく、したがって週に2日の休息を許容する。しかしながら、治療に対する患者の応答及び任意の可能性のある副作用に依存して、1日／週、２日／週、３日／週、４日／週、５日／週、６日／週、又は７日全部／週で化学療法を投与してもよい。例えば、本発明の一実施形態において、１以上の化学療法剤の投与は、治療期間の２つの分離した日のいずれかから開始する。この点に関して、１以上の治療剤の一用量は治療期間の任意の２つの日から始めることができる。特に好ましい実施形態において、５週の治療期間の1日目及び２９日目から５−ＦＵ及びシスプラチンの一用量を患者に投与する。
【０１０１】
化学療法は治療期間における任意の時期に始めることができる。好ましくは、化学療法は放射線療法の開始と同じ日（「１日目」を示す）の１週目から開始され、治療期間中投与される。例えば、６週を含む、例えば固形腫瘍を治療するための治療期間の１−６週又は２−６週に化学療法が投与される。あるいは、５週を含む治療期間の１−５週又は２−５週に化学療法が投与される。１以上の化学療法剤の一定量は、電離放射線の一定量の後に投与される。もっとも好ましくは、電離放射線の一定量への暴露から約２４時間以内（例えば、約１２時間前後）に、患者が化学療法に暴露される。
【０１０２】
ある実施形態において、１以上の化学療法剤を投与する方法を用いるのは有利となり得、一定用量が長期間にわたって患者に持続的に投与される。例えば、化学療法剤の患者への持続的な注入が望ましいかもしれない。この点において、１以上の化学療法剤の一用量の投与の期間は、任意の適当な長さの時間であってもよい。本明細書で述べられた化学療法剤の標準的な注入速度は当該分野では公知であり、本発明の方法に用いることができ、又は疾患の性質に従って任意の適当な様式に改変することができる。例えば、化学療法剤として５−ＦＵを用いて本発明の方法が実施された場合、一般的な注入速度は治療週間につき約９６時間（すなわち、週に５日）である。癌化学療法の他の態様及び投与計画は、例えば、Bast et al.(eds), Cancer Medicine, 5th edition, BC. Decker Inc., Hamilton, Ontario(2000)に記載されている。
【０１０３】
外科的切除
【０１０４】
一実施形態において、医薬組成物は腫瘍の外科的切除の前、最中、又は後に投与される。腫瘍組織の完全な外科的除去は、周辺組織内への腫瘍組織の侵襲及び不明確な腫瘍塊の境目により、しばしば複雑である。本明細書で述べたように、本発明の方法を用いた腫瘍の治療は腫瘍の縮小をもたらし、切除を促進し得る。理想的には、腫瘍の外科的切除治療は治療期間の完了後に行われる。医薬組成物、電離放射線、及び化学療法の投与から患者が回復するのに十分な期間を許容する限りにおいて、腫瘍の外科的切除は治療期間完了後の任意の時期に行うことができる。望ましくは、腫瘍の外科的切除は、治療期間完了後の少なくとも１週後に行われる。好ましくは、腫瘍の外科的切除は、治療期間完了後の約３−１５週（例えば、約４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、又は１４週）に行われる。より好ましくは、腫瘍の外科的切除は、治療期間完了後の約３−６週（例えば、約４週もしくは５週）又は約４−１０週（例えば、約６週、７週、もしくは８週）に行われる。
【０１０５】
多くの場合、外科的手術後の（本発明の方法を用いて）医薬組成物の投与は、腫瘍の外科的切除後に残存した残余腫瘍細胞をすべて排除し得る。アジュバント放射線及び／又は化学療法は、しばしば腫瘍組織の外科的切除後における標準的治療方法の一部でもある。したがって、外科的手術後の医薬組成物、電離放射線の一定量、及び／又1以上の化学療法剤の一定量の（本発明の方法を用いて）投与は、あらゆる残余腫瘍細胞を排除することにも用いられ得る。外科的手術から患者が回復するのに十分な期間を許容する限りにおいて、アジュバント放射線及び／又は化学療法は腫瘍の外科的切除後の任意の時期に投与され得る。一実施形態において、アジュバント化学療法が、腫瘍の外科的切除後の少なくとも１週目に患者に投与される。好ましくは、アジュバント化学療法は、腫瘍の外科的切除後の約1週から約１０週（例えば、約３週、約５週、又は約７週）に投与され、より好ましくは腫瘍の外科的切除後から約２週から約４週（例えば、約３週）である。腫瘍の外科的切除後のアジュバント化学療法の一部として、本明細書に述べたような任意の1の化学療法剤又はそれらの組合せを任意の適当な用量で患者に投与することができる。一実施形態において、アジュバント化学療法は、５−ＦＵ及びロイコボリン葉酸誘導体の患者への投与を含む。
【０１０６】
治療効果の評価
【０１０７】
本発明の方法は、疾患の予防又は治療処置のために、ヒトにＴＮＦ−αをデリバリーするための効率的で安全な治療方法を提供する。理想的には、本発明の方法は、ヒトの癌治療がなされるように、腫瘍細胞増殖の抑制、腫瘍血管新生の抑制、腫瘍細胞の根絶、及び／又は少なくとも1つの腫瘍サイズの縮小を促進する。「癌治療」とは、全体又は一部の癌を軽減することをいう。アデノウイルス介在性遺伝子移入を用いて、ヒト患者にヒトＴＮＦ−αを投与する場合に考慮される多くのパラメーターは、本明細書中に述べられている。個別の状況のためのパラメーターの適切な組合せは、臨床家により構築され得る。癌治療における本発明の方法の進捗（例えば、腫瘍サイズの縮小又は癌細胞の根絶）は、診療室において腫瘍のサイズ及び癌進行を追跡するのに最近用いられる方法等の任意の適当な方法を用いることで確認することができる。本発明の方法による癌治療を評価するのに用いられる第一の有効性パラメーターは、好ましくは、腫瘍サイズの縮小である。腫瘍サイズは、Wake Forest Universityで開発された腫瘍体積の正確な推定を可能にするFreeflight software等の市販のコンピューターソフトウェアを用いて推定された面積測定、腫瘍体積等の任意の適当な技術を用いて計算される。腫瘍サイズは、例えば、ＣＴ、超音波、ＳＰＥＣＴ、スパイラルＣＴ、ＭＲＩ、写真等を用いた腫瘍の画像化によって決定することもできる。治療期間完了後に腫瘍が外科的に切除される実施形態において、腫瘍組織の存在及び腫瘍サイズは、切除される組織の肉眼的解析、及び／又は切除された組織の病理学的解析により決定され得る。
【０１０８】
望ましくは、本発明の方法の結果として腫瘍の増殖が安定する（すなわち、腫瘍増殖が増加又は減少しない）。好ましくは、本発明の方法は、腫瘍サイズを少なくとも約５％（例えば、少なくとも約１０％、１５％、２０％、又は２５％）縮小する。より好ましくは、腫瘍サイズが少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、又は６５％）縮小する。さらに好ましくは、腫瘍サイズが少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％）縮小する。もっとも好ましくは、腫瘍は完全に排除される。
【０１０９】
本発明の方法の腫瘍サイズに対する効果は、腫瘍の反応の点から分類することもできる。この点において、本発明の方法に従って治療した腫瘍の体積の５０％を超える縮小（すなわち、「治療された腫瘍」）が、「部分反応」（ＰＲ）を示す。治療期間前の腫瘍サイズの１２５％を超えた治療された腫瘍の成長は、「進行性疾患」（ＰＤ）を示す。「治療期間前」とは、治療期間の開始前まもなく又は直前の時期を意味する。腫瘍の消失の観察後、少なくとも４週間の間、治療された該腫瘍の完全な消失は、「完全反応」（ＣＲ）を示す。治療された腫瘍のサイズが治療期間前の腫瘍サイズの７５％から１２５％の間である場合、腫瘍反応は「安定した疾患」（ＳＤ）とみなされる。「辺縁反応」（ＭＲ）は、治療された腫瘍サイズの縮小が治療期間前の腫瘍サイズの５０％から７５％の間であることを示す。したがって、本発明の方法のための第一の有効性パラメーターは、「目標腫瘍反応（objective tumor response）」とも呼ばれ、部分反応又は完全反応として定義される。部分反応又は完全反応が好ましいが、本発明の方法による患者中の癌の治療は安定した疾患によっても明らかとなり得る。
【０１１０】
治療期間完了後に腫瘍が外科的切除を受けた場合に、本発明の方法の腫瘍サイズの縮小における有効性は、壊死した（すなわち、死んだ）切除組織の百分率を測定することで決定することができる。この点において、切除組織に占める壊死の百分率が約５０％より大きい場合（例えば、約６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％）、より好ましくは約９０％又はそれより大きい場合に（例えば、約９０％、９５％、もしくは１００％）、癌が治療されたといえる。もっとも好ましくは、切除組織の壊死の百分率は１００％であり、すなわち、腫瘍組織が存在しない。
【０１１１】
本発明の方法の有効性を決定するために、多数の第二のパラメーターを用いることができる。第二のパラメーターの例として、新たな腫瘍の検出、腫瘍抗原又はマーカー（例えば、ＣＥＡ、ＰＳＡ、又はＣＡ−１２５）の検出、生検、外科的進展度の低下（すなわち、腫瘍の外科的進展度の切除不能から切除可能への転換）、ＰＥＴスキャン、生存率、疾患の非進行生存率、疾患進行期間、臨床利益反応基準（Clinical Benefit Response Assessment）等の生活の質の評価等（これら全てが、ヒトにおける癌の全体的な進行（又は退行）を示し得る）があげられるが、これらに限られない。組織内癌細胞の根絶を検出するのに、生検が特に有用である。放射免疫検出法（ＲＡＩＤ）は、腫瘍により産生される及び／又は腫瘍に関連するマーカー（抗原）（「腫瘍マーカー」又は「腫瘍関連抗原」）の血清レベルを用いて腫瘍を位置づけて、段階づけするのに用いられ、かつ、治療前診断の基礎、治療後診断における再発の指標、及び治療後の治療有効性の指標として有用であり得る。治療効果の指標として評価され得る腫瘍マーカー又は腫瘍関連抗原の例として、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ−１２５、ＣＡ１９−９、ガングリオシド分子（例えば、ＧＭ２、ＧＤ２、及びＧＤ３）、ＭＡＲＴ−１、熱ショック蛋白質（例えば、gp96）、シアリルTn（STｎ）、チロシナーゼ、MUC-1、HER-2/neu、c-erb-B2、KSA、PSMA、p53、RAS、EGF-R、VEGF、MAGE、及びgp100があげられるが、これらに限られない。他の腫瘍関連抗原は当該分野で公知である。内視鏡検出系を組み合せたRAID技術は、小さな腫瘍と周囲の組織を区別するのにも効果的である（例えば、米国特許4,932,412参照）。
【０１１２】
本発明の方法に従い、ヒト患者における癌治療は、望ましくは、1以上の次の結果により明らかとなる：（a）腫瘍の完全な消失（すなわち、完全反応）、（b）治療期間前の腫瘍サイズと比較して、治療期間完了後少なくとも４週間における、腫瘍サイズの約２５％から約５０％の縮小、（c）治療期間前の腫瘍サイズと比較して、治療期間完了後少なくとも４週間における、腫瘍サイズの少なくとも約５０％の縮小、及び（d）治療期間前の腫瘍関連抗原レベルと比較して、治療期間完了後の約４−１２週における、特異的腫瘍関連抗原レベルの少なくとも２％（例えば、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の減少）の減少。腫瘍関連抗原レベルの少なくとも２％の減少が好ましいが、腫瘍関連抗原レベルのいかなる減少も本発明の患者における癌治療の証拠となる。例えば、切除不可能で局所的進行性膵臓癌に関しては、治療期間前のCA19-9レベルと比較して、治療期間完了後の４−１２週において、CA19-9腫瘍関連抗原レベルの少なくとも約１０％の減少により、治療が証明される。同様に、局所進行性直腸癌に関しては、治療期間前のCEAレベルと比較して、治療期間完了後の４−１２週において、CEA腫瘍関連抗原レベルの少なくとも約１０％の減少により、治療が証明される。
【０１１３】
臨床利益反応基準等の生活の質の評価に関しては、本発明に関する治療上の利益は、痛みの強度、鎮痛剤消費量、及び／又はカルノフスキーパフォーマンススケールスコアの観点から証明され得る。カルノフスキーパフォーマンススケールスコアは、機能的な障害に従って患者を分類し得る。カルノフスキーパフォーマンススケールは、０−１００でスコアリングされる。一般に、低いカルノフスキースコアは、生存に関して不良な予後を予測する。したがって、ヒト患者における癌治療は代替的に、又は追加的に（a）治療期間前の患者により報告される痛み強度と比較して、治療期間完了後の１２週のうち任意の連続した４週間において、患者により報告される痛み強度が少なくとも５０％減少（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の減少）すること、（b）治療期間前の患者により報告される鎮痛剤消費量と比較して、治療期間完了後の１２週のうち任意の連続した４週間において、患者により報告される鎮痛剤消費量が少なくとも５０％減少（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の減少）すること、及び／又は（c）治療期間前の患者により報告されるカルノフスキーパフォーマンススケールと比較して、治療期間完了後の１２週のうち任意の連続した４週間において、患者により報告されるカルノフスキーパフォーマンススケールが少なくとも２０ポイント増加（例えば、少なくとも３０ポイント、５０ポイント、７０ポイント、又は９０ポイントの増加）すること、によって証明される。
【０１１４】
ヒト患者における癌治療は、望ましくは、1以上（任意の組み合わせで）の前記結果によって証明されるが、参考試験及び／又は他の試験の代替的又は付加的結果も治療有効性を証明し得る。
【０１１５】
本発明に従って、本発明の方法の結果として、好ましくは、ヒトにおける重篤な有害事象が起こることなく腫瘍サイズが縮小する。国立癌研究所（NCI）の癌治療評価プログラム（CTEP）によって、有害事象が分類又は「グレード化」され、グレード０は最小限の有害な副作用を表し、グレード４は最も重篤な有害事象を表す。NCI毒性基準（1999年４月発行）及び共通毒性基準マニュアル（1999年8月更新）はNCIを通じて（例えば、NCIのインターネットウェブサイト http://www.ctep.info.nhi.gov を通じて、又は、NHI癌治療診断部門（1998年4月更新）の後援による治験薬の臨床試験における参加者のための治験責任者便覧（Investigator's Handbook）中に）入手可能である。望ましくは、本発明の方法は、最小限の有害事象（例えば、CTEP／NCIによりグレード化されるような、グレード０、グレード１、又はグレード２の有害事象）に関連する。しかしながら、本明細書で述べたように、腫瘍細胞への放射にも関わらず実際の腫瘍サイズは縮小しないであろうから、腫瘍サイズの縮小は、好ましくはあるが、必要とされない。癌細胞への放射は治療効果を実現するのに十分である。同様に、腫瘍サイズのいかなる減少も治療効果を実現するのに十分である。
【０１１６】
ヒトにおける様々な癌の検出、モニタリング、及び等級は、Cancer Facts and Figures 2001, American Cancer Society, New York, NY及び国際特許出願WO01/24684に詳述されている。したがって、臨床家は癌治療における本発明の方法の様々な実施形態の有効性を決定するのに標準的な試験を用いることができる。しかしながら、腫瘍サイズ及び腫瘍の拡大に加えて、治療有効性を評価する場合において、臨床家は生活の質及び患者の生存率をも考慮すべきである。
【０１１７】
他の考慮事項
【０１１８】
本発明の方法は、患者において所望の生物学的効果を達成するために他の治療方法と組み合せて実施してもよい。一実施形態において、治療期間中に電離放射線の副作用から胃腸系（たとえば、胃）を保護するために、H2ブロッカー及び／又はプロトンポンプ阻害剤等の薬物を、患者に投与してもよい。本発明の方法は、疾患を治療するための体内のホルモンレベルの操作である、ホルモン療法と平行して実施してもよい。多数の癌が何らかの形で体内ホルモンレベルの影響を受け、例えば、ホルモン療法に関連する典型的な治療剤（例えば、タモキシフェン）は循環ホルモンレベルを減少させ、及び／又は、ホルモンがホルモン受容体に結合するのを阻止するように作用する。
【０１１９】
発熱療法とは、定義の通り、治療手段として体内温度を上昇させることである。発熱療法は、化学療法、放射線療法、及び免疫療法の効果を上昇させる効果的なアジュバント治療法であることが研究により示されている（Ito et al., Cancer Gene Therapy, 8(9), 649-654(2001)）。体の特定領域（例えば、腫瘍部位）の温度が、加温装置（例えば、マイクロ波を放射する装置）又は発熱もしくは炎症を誘導する毒素を投与することによって上昇され得る。治療領域は局部的で体内にあるので、発熱するように誘導される粒子を患者に投与してもよい。磁気粒子は、ヒステレシス損失によって交番磁界（AMF）下で熱を発生することが示されている（Ito et al.,上記参照）。そのようなサブミクロン粒子を標的組織に投与し、AMFによって活性化することができる。所望であれば、TNF−αをコードする核酸配列を熱又はAMF照射に反応するプロモーターに機能的に連結してもよく、その結果、TNF−αの産生が標的組織に限局されるので、さらなる安全な目安を与える。
【０１２０】
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、言うまでもなく、決して本発明の範囲を制限するように解釈すべきではない。
【実施例１】
【０１２１】
本実施例は、臨床的に関連のある動物モデルにおいて、（i）薬学的に許容される担体及び（ii）放射線誘導プロモーターに機能的に連結されたＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクター、を含む本発明の医薬組成物であって、その用量が約４×109から約４×1011粒子単位（pu）のアデノウイルスベクターを含む医薬組成物の安全性及び効率性を実証する。
【０１２２】
前臨床毒性研究が、ヒトＳＱ−２０Ｂ扁平上皮癌異種移植片を有するヌードマウス（nu/nu）（n=80）及びBalb/cマウス（n=100）で実施された。合計８０匹のマウスを１０nu/nu mice/sex/groupごとの４群にして該研究に用いた。該４群は、（１）対照ビヒクル、（２）対照ビヒクルに加えて放射線、（３）４×１０９puのアデノウイルスベクターを含む医薬組成物に加えて放射線、及び（４）４×１０10puのアデノウイルスベクターを含む医薬組成物に加えて放射線、からなる。ビヒクル又はアデノウイルスベクターを含む医薬組成物の1回用量を、直径0.4cmから0.6cmの確立されたＳＱ−２０Ｂヒト扁平上皮細胞腫瘍に腫瘍内注射により投与した（２つの部位に20μl、全40μｌ）。合計１００匹のマウスもまた、１０Balb/c mice/sex/groupごとの５群にして該研究に用いた。該群は、（１）対照ビヒクル、（２）ビヒクルに放射線を加えた対照、（３）４×１０９puのアデノウイルスベクターを含む医薬組成物に加えて放射線、（４）４×１０10puのアデノウイルスベクターを含む医薬組成物に加えて放射線、及び（５）４×１０11puのアデノウイルスベクターを含む医薬組成物に加えて放射線からなる。ビヒクル又はアデノウイルスベクターを含む医薬組成物の1回用量を、（i）各Balb/cマウスの右後肢内への皮下（S.C.）注射により投与するか、又は（ii）注射後4時間から開始する、０日目から４日目及び７日目から１１日目に毎日投与される５Gy／分画の放射線照射用量（全体で５０Gy用量）とともに、０、３、７、及び１０日目にnu/nuマウス内の腫瘍内に投与した。放射線照射は（i）Balb/cマウスの右後肢又は（ii）nu/nuマウスの腫瘍部位に対して行ない、身体の残りの部分は保護した。
【０１２３】
アデノウイルスベクターは、E1領域に位置し、EGR-1プロモーターに機能的に連結された、ヒトTNF−αをコードする核酸配列を含むE1A／E１B／E3／E4／欠損アデノウイルス血清型５ウイルスバックボーンを含有した。該アデノウイルスベクターは、さらにE4領域内にスペーサー配列を含有した。臨床的cage-side観察、食料消費量、血液学もしくは化学、及び臨床病理学が評価された。被検体は１４日目及び２８日目に剖検された。
【０１２４】
さらに、ヌードマウス（n=33）において薬物動態研究を実施した。４×１０９puのアデノウイルスベクターを含む医薬組成物の1回用量を、０−２日目又は2週間にわたって５日／週で毎日、上記の放射線療法とともに又はなしで、マウスに腫瘍内注射した。被検体は３日目又は２８日目に屠殺した。血漿及び腫瘍組織におけるTNF−αレベルをELISAにより定量した。
【０１２５】
臨床研究のために推奨された最大３５０倍までの用量が（ｋｇ重量に基づく）、重篤な毒性なく容認された。全ての用量の群において注射部位の皮膚紅斑がBalb/c及びnu/nuマウスの両方で観察され、これは可溶性組換えヒトTNFをヒトにs.c.投与した後に報告された紅斑と一致している。観察された他の毒性の大多数が最も高い用量の群（４×１０11pu）で発見され、それらは放射線照射とは独立していた。これらの毒性は、潰瘍形成、脱毛症、及び皮膚変色等の局所反応からなった。観察されるすべての全身反応は、治療群をビヒクル治療対照と比較した場合、統計的に有意差があった。しかしながら、正常レベルと比較したこれらのパラメーターにおける変化は有意な毒性とは考えられなかった。４×１０９又は４×１０10puのアデノウイルスベクターを含む医薬組成物を５０Gyの放射線と組み合せて投与した場合、死亡したマウス又は重篤な毒性をもったマウスはなかった。さらに、放射線療法と組み合せた医薬組成物の腫瘍内デリバリーにより、血漿中に「流出」することなく、腫瘍ホモジネート中に有意かつ持続的なレベルのTNF−αがもたらされ、明白な抗新生物活性を示した。実際に、放射線はTNF−αの腫瘍内レベルを１２倍上昇させた。
【０１２６】
上記の結果は本発明の医薬組成物の安全性及び有効性を実証し、動物モデルにおける方法は当該分野においてヒトにおける成功を合理的に予測すると考えられた。
【実施例２】
【０１２７】
本実施例は、腫瘍塊のサイズの縮小を指標として、ヒトにおける癌を治療的に処置するための本発明の方法の使用を示す。
【０１２８】
反復した腫瘍内注射のために到達可能な固形腫瘍を有する患者を、本発明の方法を使用した治療のために選んだ。これらの患者は1以上の以前の治療で失敗している。患者は、5分の１用量のレベルのTNF−αをコードする配列を含む、実施例１で述べたアデノウイルスベクター（1／２log増分で４×１０９〜４×１０11pu）を含む医薬組成物を、最大６週の治療期間にわたって腫瘍内注射された。数人の患者は放射線のみで治療された病巣を含み、これを対照として扱った。医薬組成物の単回用量を、治療期間の第１及び２週の１日目及び４日目に、そして第３−６週には週に一回、複数回注射により腫瘍に投与した。それぞれの用量に関して、注射が腫瘍の周囲にわたって等間隔になるように複数回注射を投与した。例えば、次のパターンで腫瘍に注射が投与された：第一週の各投与については12時、３時、6時、及び9時の位置、並びに前部−後部又は背面−尾側の位置、（b）第二週の最初の投与については1時、4時、7時、及び１０時の位置、並びに前部−後部又は背面−尾側の位置、（c）第二週の二回目の投与については２時、５時、８時、及び１１時の位置、並びに前部−後部又は背面−尾側の位置、そして、その後の各用量投与については腫瘍の周囲で（a）−（c）を繰り返す。第２週から開始された同時放射線療法が、治療期間の残りの各週では、連続する５日間にわたって投与され、２日間は投与せず、全用量は３０−７０Gyに達した。腫瘍サイズを治療の終点及び、可能であれば、治療後２−３月に計算した。
【０１２９】
【表１】
2007511507.tif 000002
【０１３０】
安全性に関しては、試験されたすべての範囲のアデノウイルスベクターの用量にわたって、用量規定毒性は観察されなかった。注射部位疼痛及び冷感を含む最小限の有害事象は起こったものの、薬物に関連した重篤な有害事象は患者に起こらなかった。ベースラインを上回る血清中のTNF−αレベルの有意な上昇は、試験された全ての時点において観察されなかった（１−５０pg/ml）。血液又は尿から採取した培養液中にウイルスは検出されず、ベクターに対する抗体価は試験された8人の患者中７人で上昇しなかった。
【０１３１】
本治療プロトコールの有効性に関して、腫瘍反応の要約は上記の表で与えられ、次の略語は示された意味を有する：NSCLC−非小細胞性肺癌；PR−部分応答、注射された病巣の体積が５０％を超えて縮小；PD−進行性疾患、病巣が試験前の値の１２５％を超えて増殖；CR−完全応答、考証の日から少なくとも４週間病巣が完全に消失；SD−安定疾患、腫瘍が治療前の値の７５％から１２５％の間；MR−治療前の値の５０％から７５％の間に縮小。PR及びCRは通常「目標腫瘍反応」とされる。
【０１３２】
目標腫瘍応答は、被験患者のうち５７％において観察され、28.5％の患者は完全応答を示し、28.5％の患者は部分応答を示した。全ての患者においてある程度の腫瘍縮小が達成され、平均して注射された病巣におけるサイズの５４％が減少した。対照病巣においては縮小は観察されなかった。これらの結果は、体内の位置に関わらず、幅広い範囲の固形腫瘍を治療する本発明の方法の有用性を証明する。
【実施例３】
【０１３３】
本実施例は、軟組織肉腫に関連した腫瘍のサイズを減少させるための本発明の方法の使用について説明する。
【０１３４】
体肢軟組織肉腫を有する患者が、本発明の方法を用いた治療のために選択された。患者は、5分の１用量のレベルのTNF−αをコードする配列を含む、実施例１で述べたアデノウイルスベクター（1／２log増分で４×１０９〜４×１０12pu）を含む医薬組成物を、最大５週の治療期間にわたって腫瘍内注射された。医薬組成物の１回用量を、治療期間の第１週の１日目及び４日目に、そして第２−５週には週に一回、複数回注射により腫瘍に投与した。それぞれの用量に関して、平行線状に腫瘍に複数回注射を投与した。同時放射線療法は第1週から開始され、治療期間の残りの各週では、連続する５日間にわたって投与され、２日間は投与せず、全用量は３０−７０Gyに達した。
【実施例４】
【０１３５】
本実施例は、切除不可能な、局所進行膵臓癌（LAPC）に関連した腫瘍のサイズを減少させるための本発明の方法の使用について説明する。
【０１３６】
新たに診断された切除不可能な局所進行膵臓癌（LAPC）に関連する腫瘍を有する患者が、本発明の方法を用いた治療のために選択された。患者は、経皮経腹的投与（PTA）（CTもしくは超音波誘導）により、又は内視鏡超音波（EUS）誘導細針注射投与により、実施例１に述べた医薬組成物を腫瘍内に注射された。特に、患者は、３分の１用量のレベルのTNF−αをコードする配列を含む、実施例１で述べたアデノウイルスベクター（２ｍｌ体積に４×１０９、４×１０10、又は４×１０11pu）を含む医薬組成物を、最大5.5週の治療期間にわたって腫瘍内注射された。医薬組成物の単回用量を、５週の治療期間にわたり週に一度腫瘍に投与した。PTA投与に関しては、それぞれの投与セッションにおいて、全体積２ｍLの医薬組成物の単回用量を一回の通針で単一の腫瘍部位に投与した。EUS誘導デリバリーのために、全体積２ｍLの医薬組成物の一回用量を最大４回の通針及び４回の注射で扇状に腫瘍部位に投与した。
【０１３７】
電離放射線を、治療期間の1日目の医薬組成物の投与後約４時間から開始してそれぞれの患者に投与した。50.4Gyの全体放射線量を各1.8Gyからなる２８の分画によりデリバリーした。それぞれの放射線分画は、治療期間の各週について、連続する５日間にわたって投与され、２日間は投与されなかった。治療期間の各週の初日に、５−フルオロウラシル（５−FU）をその日の放射線治療の前に投与した。５−FUを、治療期間の各週の連続する５日間にわたり200mg/m2/dayの持続的注入で投与し、結果として週の全体の注入時間は約９６時間であった。５−FUの投与は放射線治療の期間中継続し、放射線治療の完了後に中止した。
【０１３８】
上述の治療はよく容認された。治療期間の完了後から４週目に、治療を受けた患者の１６％は不変のCA19-9レベルを示したものの、約５６％の患者は膵臓癌関連抗原CA19-9のレベルの減少を示した。CA19-9試験の結果により、上昇したCA19-9レベルと疾患進行との間のある程度の相関が示された。治療期間の完了後から３月に、全体的な疾患の進行の阻害（目標腫瘍反応又は安定した疾患に加えて転移のない疾患と定義される）が、４×１０９pu用量の医薬組成物で治療を受けた患者の２５％で、４×１０10pu用量の医薬組成物で治療を受けた患者の５０％で観察された。安定した疾患又は腫瘍サイズの縮小が、４×１０９pu用量の医薬組成物で治療を受けた患者の６７％で、４×１０10pu用量の医薬組成物で治療を受けた患者の７０％で観察された。
【０１３９】
これらの結果は、切除不可能な局所進行膵臓癌の治療のための本発明の方法の効果を証明する。
【０１４０】
本明細書に引用された全ての参考文献（刊行物、特許出願、及び特許を含む）は、各参考文献が参考として引用されると個々にかつ具体的に示され、その全体が本明細書中で示されたのと同じ程度まで、本明細書で参考として援用される。本発明を説明することに関して（特に、添付の特許請求の範囲に関して）用語「a」及び「an」及び「the」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中で他のように示されるか又は文脈によって明確に否定されるかしない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中で他のように示されない限り、その範囲内に入る各別個の値を個々に参照する簡略な方法として働くことが意図されているだけであり、各別個の値は、それが本明細書中で個々に列挙されているかのごとく本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他のように示される又は文脈によって明確に否定されるかしない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書中に提供される任意及び全ての例又は例示的語句（例えば、「例えば／〜のような」）の使用は、本発明をよりよく例示するためだけに意図されているのであり、他のように特許請求されない限り本発明の範囲に対する限定ではない。本明細書中の語句は、任意の特許請求されていない要素を本発明の実施に必須であるとして示していると解釈すべきではない。
【０１４１】
本発明を実施するための本発明者等が知る最良の様式を含む本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載される。もちろん、好ましい実施形態のバリエーションは、上記の説明を読んだときに当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が適切な場合にこのようなバリエーションを使用することを予測しており、本発明者らは、本発明が本明細書中に具体的に記載されているのとは異なって実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用可能な法律によって許容されるような本明細書に添付された特許請求の範囲中に列挙される対象の全ての改変及び等価物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上記の要素の任意の組合せが、本明細書中で他のように示されるか又は文脈によって明確に否定されるかしない限り、本発明によって包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１は、未改変アデノウイルスベクターゲノムの略図である。
【図２】図２は、改変アデノウイルスゲノム及び本発明の１つの実施形態に基づく遺伝子要素を含むアデノウイルスベクターの略図である。
【図３Ａ】図３Ａは、固形腫瘍に対する一用量の医薬組成物の複数回適用についての好ましい様式に説明を付した固形腫瘍の端面図（end-on view）である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、固形腫瘍に対する医薬組成物の単回用量の複数回適用についての好ましい様式の説明を付した固形腫瘍の側面図である。
【図４】図４は、軟部組織肉腫に対する医薬組成物の単回用量の複数回適用についての好ましい様式の説明を付した軟部組織肉腫の端面図（end-on view）である。
【図１】
2007511507.tif 000003
【図２】
2007511507.tif 000004
【図３Ａ】
2007511507.tif 000005
【図３Ｂ】
2007511507.tif 000006
【図４】
2007511507.tif 000007
【配列表】
2007511507000001.app
【国際調査報告】
2007511507.tif 000008
2007511507.tif 000009
2007511507.tif 000010
2007511507.tif 000011
2007511507.tif 000012