(57)【要約】  本発明は、治療環境においてヒストンデアセチラーゼの阻害を最大となるよう最適化するための、特異的な二相性薬物動態プロファイルを示す、バルプロ酸又はその誘導体の内服可能な医薬製剤に関する。  この特異的医薬製剤は、悪性の疾患及びヒストンの低アセチル化に誘発される疾患、即ち過アセチル化の誘導が有益な効果を発揮する疾患を例えば分化及び／又はアポトーシスを誘導させることによって治療することが出来る。  このような二相性放出パターンによって、得られた薬物動態プロファイルは、標的酵素であるHDACを最も効果的に阻害し且つそれに伴いヒストンの過アセチル化を急速且つ永続的に誘導することが可能である。  このようなプロファイルによって、所望とする標的遺伝子発現特性の効率的な制御・調整を行って、治療上の便益に貢献出来ることが確保されるのである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）少なくとも一種のヒストン脱アセチラーゼ阻害剤を含有する区画部からなる急速放出成分及び（ｉｉ）少なくとも一種のヒストン脱アセチラーゼ阻害剤を含有する区画部からなる緩徐放出成分とを含んで成る医薬製剤であって、該急速放出成分区画部が、該緩徐放出成分区画部とは異なることを特徴とする、前記医薬製剤。
【請求項２】
少なくとも一種のヒストン脱アセチラーゼ阻害剤を含んで成る医薬製剤であって、１００ｒｐｍにおけるｐＨ６．８緩衝液ＵＳＰ９００ｍｌ中においてアメリカ薬局方２４、方法７２４、装置２に従って測定した場合、該製剤中のヒストン脱アセチラーゼ阻害剤の１０乃至６０％が３０分以内に放出され、また該製剤中のヒストン脱アセチラーゼ阻害剤の５０乃至１００％が６時間以内に放出されることを特徴とする、前記医薬製剤。
【請求項３】
少なくとも一種のヒストン脱アセチラーゼ阻害剤が、選択されたヒストン脱アセチラーゼを優先的に阻害する性能を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載された医薬製剤。
【請求項４】
選択された該ヒストン脱アセチラーゼが、クラスＩヒストン脱アセチラーゼであることを特徴とする、請求項３に記載された医薬製剤。
【請求項５】
選択された該ヒストン脱アセチラーゼが、クラスＩＩヒストン脱アセチラーゼであることを特徴とする、請求項３に記載された医薬製剤。
【請求項６】
少なくとも一種のヒストン脱アセチラーゼ阻害剤が、構造式Ｉ：
【化１】
2007535518.tif 000009
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、選択的に一つまた数個のヘテロ原子を含みまた置換されていてもよい、線状又は分枝状、飽和又は不飽和、脂肪族のＣ３―２５の炭化水素鎖であり、Ｒ３は、ヒドロキシル、ハロゲン、アルコキシ又はアルキル化されていてもよいアミノ基である］で表される化合物又は薬学的に受容可能なその塩であることを特徴とする、請求の範囲１乃至４項の内のいずれか一項に記載された医薬製剤。
【請求項７】
Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、選択的に一つの二重結合又は三重結合を含む、線状又は分枝状のＣ３―２５の炭化水素鎖であることを特徴とする、請求項６に記載された医薬製剤。
【請求項８】
少なくとも一種のヒストン脱アセチラーゼ阻害剤が４−イン−ＶＰＡ又は薬学的に受容可能なその塩であることを特徴とする、請求項７に記載された医薬製剤。
【請求項９】
少なくとも一種のヒストン脱アセチラーゼ阻害剤が、バルプロ酸又は薬学的に受容可能なその塩であることを特徴とする、請求項６に記載された医薬製剤。
【請求項１０】
少なくとも一種のヒストン脱アセチラーゼ阻害剤が、バルプロ酸ナトリウムであることを特徴とする、請求項９に記載された医薬製剤。
【請求項１１】
少なくとも一種のヒストン脱アセチラーゼ阻害剤が、ヒドロキサム酸誘導体、ベンズアミド類、ピロキサミド類及びそれらの誘導体、ＨＤＡＣ阻害活性を示す微生物代謝産物類、脂肪酸類及びそれらの誘導体、環状テトラペプタイド類、ペプチド化合物類、ＨＤＡＣクラスＩＩＩ阻害剤及びＳＩＲＴ阻害剤であることを特徴とする、請求項１乃至５の内のいずれか一項に記載された医薬製剤。
【請求項１２】
少なくとも一種のヒストン脱アセチラーゼ阻害剤が、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、トリコスタチンＡ（Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ；ＴＳＡ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＣＢＨＡ、ピロキサミド（Ｐｙｒｏｘａｍｉｄｅ）、スクリプテイド（Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ）、Ｃｌ−９９４，ＣＧ−１５２１、クラミドシン（Ｃｈｌａｍｉｄｏｃｉｎ）、ヒドロキサム酸ビアリールエステル、Ａ−１６９０６、二環式アリール−Ｎ−ヒドロキシカルボキサミド類、ＰＸＤ−１０１、スルホンアミドヒドロキサム酸、ＴＰＸ−ＨＡ類似体（ＣＨＡＰ）、オキサムフラチン（Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ）、トラポキシン（Ｔｒａｐｏｘｉｎ）、デプデシン（Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ）、アピディシン（Ａｐｉｄｉｃｉｎ）、ＭＳ−２７−２７５、ピロキサミド類及びその誘導体、酪酸及びその誘導体、ピバネックス（Ｐｉｖａｎｅｘ；酪酸ピバロイルオキシメチルエステル）、トラポキシンＡ（Ｔｒａｐｏｘｉｎ  Ａ）、デプシペプタイド（Ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ；ＦＫ−２２８）及び関連ペプチド化合物類、タセディナリン（Ｔａｃｅｄｉｎａｌｉｎｅ）及びＭＧ２８５６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載された医薬製剤。
【請求項１３】
静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経鼻若しくは腹腔内による又は坐剤を用いた投与を目的とする、請求項１乃至１２に記載された医薬製剤。
【請求項１４】
急速放出成分の緩徐放出成分に対する比率が、１：０．５と１：４との間であることを特徴とする、請求項２乃至１３の内のいずれか一項に記載された医薬製剤。
【請求項１５】
インビトロ放出が、１００ｒｐｍにおけるｐＨ６．８緩衝液ＵＳＰ９００ｍｌ中においてアメリカ薬局方２４、方法７２４、装置２に従って測定した場合、３０分以内に２０乃至５０％、２時間以内に２５乃至６５％、４時間以内に５５乃至８５％、６時間以内に７０乃至１００％であることを特徴とする、請求項１乃至１４の内のいずれか一項に記載された医薬製剤。
【請求項１６】
１００ｒｐｍにおけるｐＨ６．８緩衝液ＵＳＰ９００ｍｌ中においてアメリカ薬局方２４、方法７２４、装置２に従って測定した場合、急速放出成分のインビトロ放出が、１５分以内でバルプロ酸ナトリウムの少なくとも９０％でありまた緩徐放出成分のインビトロ放出が、１時間以内で０乃至３０％、４時間以内で２０乃至６０％また６時間以内で５５乃至９５％であることを特徴とする、請求項２乃至１５の内のいずれか一項に記載された医薬製剤。
【請求項１７】
緩徐放出成分が、ヒストン脱アセチラーゼ阻害剤を５０乃至９６重量％含有し且つ急速放出成分が、ヒストン脱アセチラーゼ阻害剤を５０乃至９６重量％含有することを特徴とする、請求項２乃至１６の内のいずれか一項に記載された医薬製剤。
【請求項１８】
単一区画部の最大の寸法が３ｍｍであることを特徴とする、複数の区画部から成る多回単位投与剤型である、請求項１乃至１７の内のいずれか一項に記載された医薬製剤。
【請求項１９】
単一区画部の寸法が０．５乃至２．５ｍｍであることを特徴とする、請求項１８に記載された医薬製剤。
【請求項２０】
０．１乃至３グラムのヒストン脱アセチラーゼ阻害剤を含んで成ることを特徴とする、請求項１乃至１９の内のいずれか一項に記載された医薬製剤。
【請求項２１】
急速放出成分が、コーティングされた微小錠剤でありまた緩徐放出成分が、コーティングされた微小錠剤であることを特徴とする、請求項２乃至２０項の内のいずれか一項に記載された医薬製剤。
【請求項２２】
コーティングされた微小錠剤が、バルプロ酸ナトリウム、潤滑剤、ポリマー及び滑剤からなることを特徴とする、請求項２１に記載された医薬製剤。
【請求項２３】
潤滑剤が、硫酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はステアリン酸であることを特徴とする、請求項２２に記載された医薬製剤。
【請求項２４】
滑剤が、二酸化珪素、メチル化二酸化珪素又はタルクであることを特徴とする、請求項２２又は２３に記載された医薬製剤。
【請求項２５】
ポリマーが、メタクリル酸アンモニウムコポリマー、エチルセルロース又はハイプロメロースであることを特徴とする、請求項２２乃至２４の内のいずれか一項に記載された医薬製剤。
【請求項２６】
コーティングされた急速放出成分の微小錠剤のコーティングが、少なくとも一種のポリマー及び少なくとも一種の適当な可塑剤を含んで成ることを特徴とする、請求項２１乃至２５の内のいずれか一項に記載された医薬製剤。
【請求項２７】
ポリマーが、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリビニルアルコール又はハイプロメロースであることを特徴とする、請求項２６項に記載された医薬製剤。
【請求項２８】
コーティングされた緩徐放出成分の微小錠剤のコーティングが、少なくとも一種のポリマーと少なくとも一種の適当な可塑剤とを含んで成ることを特徴とする、請求項２１乃至２７の内のいずれか一項に記載された医薬製剤。
【請求項２９】
ポリマーが、メタクリル酸アンモニウムコポリマー又はエチルセルロースであることを特徴とする、請求項２８に記載された医薬製剤。
【請求項３０】
内服用医薬製剤であることを特徴とする、請求項１乃至２９の内のいずれか一項に記載された医薬製剤。
【請求項３１】
放出プロファイルが、１００ｒｐｍにおけるｐＨ６．８緩衝液ＵＳＰ９００ｍｌ中においてアメリカ薬局方２４、方法７２４、装置２に従って測定されることを特徴とする、請求項１乃至３０の内のいずれか一項に記載された医薬製剤。
【請求項３２】
下記する疾病・障害を治療又は予防する医薬を製造するための、前記請求項の内のいずれか一項に記載された医薬製剤の使用：即ち、エストロゲン受容体依存性乳ガン、エストロゲン受容体非依存性乳ガン、ホルモン受容体依存性前立腺ガン、ホルモン受容体非依存性前立腺ガン、脳腫瘍、腎臓ガン、大腸ガン、結腸直腸ガン、膵臓ガン、膀胱ガン、食道ガン、胃ガン、尿生殖器ガン、胃腸のガン、子宮ガン、卵巣ガン、星状膠細胞腫、膠腫、皮膚ガン、扁平上皮ガン、角化棘細胞腫、ボウエン病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、基底細胞ガン腫、光学活性角化症；魚麟癬；ざ瘡、尋常性ざ瘡、肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、頭と首のガン、小細胞肺ガン、非小細肺ガン、白血病、リンパ腫及び／又は他の血液細胞ガン、甲状腺耐性症、糖尿病、地中海貧血、硬変症、原生動物感染症、リウマチ性関節炎、リウマチ性脊椎炎、全ての形態のリウマチ、骨関節炎、痛風性関節炎、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、非インシュリン依存性糖尿病、喘息、鼻炎、葡萄膜炎、紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性大腸疾患、慢性下痢、乾癬、アトピー性皮膚炎、骨疾患、繊維増殖性障害、アテローム性動脈硬化症、再生不良性貧血、ディ・ジョルジ症候群、グレーブス病、癲癇、アルツハイマー病、うつ病、精神分裂病、分裂性情動障害、躁病、脳卒中、気分不一致精神病徴候、双極性障害、情動障害、髄膜炎、筋ジストロフィー、多発硬化症、激昂、心肥大、心不全、再灌流傷害及び/又は肥満症。
【請求項３３】
医薬が、二相性放出プロファイルを示す医薬製剤であることを特徴とする、下記する疾病・障害を治療又は予防する該医薬を製造するためのヒストン脱アセチラーゼ阻害剤の使用：即ち、エストロゲン受容体依存性乳ガン、エストロゲン受容体非依存性乳ガン、ホルモン受容体依存性前立腺ガン、ホルモン受容体非依存性前立腺ガン、脳腫瘍、腎臓ガン、大腸ガン、結腸直腸ガン、膵臓ガン、膀胱ガン、食道ガン、胃ガン、尿生殖器ガン、胃腸ガン、子宮ガン、卵巣ガン、星状膠細胞腫、膠腫、皮膚ガン、扁平上皮ガン、角化棘細胞腫、ボウエン病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、基底細胞ガン腫、光学活性角化症；魚麟癬；ざ瘡、尋常性ざ瘡、肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、頭と首のガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、白血病、リンパ腫及び/又は他の血液細胞ガン、甲状腺耐性症、糖尿病、地中海貧血、硬変症、原生動物感染症、リウマチ性関節炎、リウマチ性脊椎炎、全ての形態のリウマチ、骨関節炎、痛風性関節炎、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、非インシュリン依存性糖尿病、喘息、鼻炎、葡萄膜炎、紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性大腸疾患、慢性下痢、乾癬、アトピー性皮膚炎、骨疾患、繊維増殖性疾患、アテローム性動脈硬化症、再生不良性貧血、ディ・ジョルジ症候群、グレーブス病、癲癇、アルツハイマー病、うつ病、精神分裂病、分裂性情動障害、躁病、脳卒中、気分不一致精神病徴候、双極性障害、情動障害、髄膜炎、筋ジストロフィー、多発硬化症、激昂、心肥大、心不全、再灌流傷害及び/又は肥満症。
【請求項３４】
医薬製剤が、特許請求の範囲１乃至３１の内のいずれか一項に記載された医薬製剤であることを特徴とする、請求項３３に記載された使用。
【請求項３５】
医薬が、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経鼻、腹腔内又は坐剤を用いて投与されることを特徴とする、請求項３２乃至３４項の内のいずれか一項に記載された使用。
【請求項３６】
複数の区画部からなる多回単位投与剤型を得られるようにヒストン脱アセチラーゼ阻害剤を含有する急速放出成分とヒストン脱アセチラーゼ阻害剤を含有する緩徐放出成分とを組み合わせて成る、二相性放出プロファイルを示す医薬製剤を調製する方法。
【請求項３７】
単一薬を含む区画部が、造粒、押出し、ホットメルト、ペレット化、打錠及びコーティングの方法により調製されることを特徴とする、請求項３６に記載された調製方法。
【請求項３８】
急速放出成分と緩徐放出成分とが、所定の割合で混合され、次いでカプセル又は単回投与のためのコンテナーに充填されることを特徴とする、請求項３６又は３７項に記載された方法。
【請求項３９】
急速放出成分又は緩徐放出成分が、予め混合されることなくカプセル又は単回投与のためのコンテナーに逐次・連続して充填されることを特徴とする、請求項３６又は３７に記載され方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療環境においてヒストンデアセチラーゼの阻害を最大にするように最適化された特異的二相性薬物動態プロファイル（特性）を示す、内服可能なバルプロ酸又はその誘導体の新規な医薬製剤に係わる。
この特異的な医薬製剤は、悪性疾患及びヒストンの低アセチル化に関連する疾患、即ち過アセチル化の誘導が有益な効果を発揮する疾患を、例えば分化及び／又はアポトーシスを誘導することによって治療することが出来るように意図されたものである。
このような二相性放出パターンによって、生じた薬物動態プロファイルは、標的酵素であるHDACを最も効率的に阻害し而もこれに伴いヒストンの過アセチル化を急速且つ永続した態様で誘導させることが可能である。かかるプロファイルによって、所望とする標的遺伝子発現を効率的に調整することが確保され、その結果治療上の恩恵に寄与するのである。
【背景技術】
【０００２】
クロマチン制御と疾患
クロマチンの局所的なリモデリングは、遺伝子の転写活性化において最も重要な工程の一つである。転写性タンパク質をＤＮＡの鋳型（テンプレート）に接触させるためには、ＤＮＡのヌクレオソームパッケージングに動的な変化を生起させる必要がある。クロマチンのリモデリング及び遺伝子転写に影響を与える最も重要なメカニズムの一つは、ヒストン及びその他の細胞性タンパク質のアセチル化による翻訳後修飾及びそれに伴うクロマチン構造の変化である。（Ｄａｖｉｅ、１９９８、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ８、１７３−８；Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ，１９９９、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ９，４０−８；Ｓｔｒａｈｌ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓ、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４１−４）。ヒストンの過アセチル化が生起した場合は、疎水性のアセチル基により惹起されたＤＮＡに対する静電気的引力及び立体障害に変化が生じるため、ヒストンとＤＮＡの間の相互作用が不安定化する。その結果、ヒストンのアセチル化は、ヌクレオソームを解裂崩壊させて、ＤＮＡが、転写装置と接触可能な状態になることが出来る。アセチル基の脱離は、ヒストンがＤＮＡ及び隣接したヌクレオソームとより強固に結合することを可能にし、かくして転写が抑制されたクロマチン構造を維持することを可能とする。アセチル化は、ヒストンアセチル転移酵素（ＨＡＴ）活性を有する一連の酵素により媒介される。逆に、アセチル基は、特定のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）酵素によって除去される。
【０００３】
これらのメカニズムの破壊は、転写の誤調節を惹起し、自己免疫性、炎症性又は例えば腫瘍化や腫瘍プログレッションなどの過増殖性の障害を含む、多種多様なヒトの疾患の原因となる可能性がある。
更に例えば転写因子のような他の分子は、アセチル化の状態に依存して、その活性及び安定性を変えるのであって、例えば、急性前骨髄性白血病（ＡＰＬ）に関連した融合タンパクであるＰＭＬ−ＲＡＲは、ｐ５３の脱アセチル化やp５３の分解を媒介することによってｐ５３を阻害し、かくしてＡＰＬ芽細胞が、ｐ５３依存性のガン監視経路を潜り抜けることが可能となるのである。
【０００４】
造血前駆細胞においてＰＭＬ−ＲＡＲが発現すると、Ｐ５３が媒介する転写活性化が抑制されることになり、遺伝毒性ストレス（Ｘ線、酸化的ストレス）によって惹起されるｐ５３依存性アポトーシスが妨害されることになる。しかしながら、ｐ５３の機能は、ＨＤＡＣ阻害剤の存在下では復元されるのであって（Ｉｎｓｉｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｂｒｕａｒｙ    ２００４、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１−１１）、このことは、ｐ５３阻害の根本原因である機構としてＰＭＬ−ＰＡＲによるＨＤＡＣのｐ５３への補充を活発にすること包含する。従って、例えばｐ５３のアセチル化など、ヒストンとは異なるタンパク質のアセチル化が、ＨＤＡＣ阻害剤が有する抗腫瘍活性に決定的な役割を果たすのである。
【０００５】
核内受容体とヒストンデアセチラーゼ
核ホルモン受容体は、リガンド依存性転写因子であり、遺伝子発現の正及び負の制御の双方を経由して発生及び恒常性維持を制御している。これらの調節プロセスの欠陥・破綻は、多くの疾患の原因の根底となり、又ガン発生において重要な役割を果たしている。Ｔ３Ｒ、ＲＡＲ及びＰＰＡＲを含む多くの核内受容体が、Ｎ−ＣｏＲ及びＳＭＲＴのようなコリプレッサー物質とリガンド不存在下でも相互作用することが出来、それによって転写を阻害することが出来る。更には、Ｎ−ＣｏＲもまた、アンタゴ二ストによって封鎖されたプロゲステロンとエストロゲン受容体と相互作用をするとの報告がある。非常に興味深いことに、Ｎ−ＣｏＲ及びＳＭＲＴは、ｍＳｉｎ３タンパク質及びヒストンデアセチラーゼも含む大型のタンパク質複合体内に共存することが判明している（Ｐａｚｉｎ  ａｎｄ  Ｋａｄｏｎａｇａ、１９９７；Ｃｅｌｌ８９、３２５−８）。即ち、核内受容体がリガンドに誘導されて抑制から活性化に切り替わることは、アンタゴニスト酵素活性を有するコリプレッサー複合体とコアクチベータ複合体とが交換することを反映している。
【０００６】
核内受容体による遺伝子調節
ＨＤＡＣ活性を含有するコリプレッサー複合体は、核内受容体による抑制を媒介するだけでなく、Ｍａｄ−１、ＢＣＬ−６やＥＴＯなどの追加的な転写因子と相互作用する。これらタンパク質の多くは、細胞増殖や細胞分化の障害において重要な役割を果たしている。（Ｐａｚｉｎ  ａｎｄ  Ｋａｄｏｎａｇａ、１９９７；Ｃｅｌｌ  ８９、３２５−８；Ｈｕｙｎｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｄｗｅｌｌ、１９９８、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７、２４７３−８４；Ｗａｎｇ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５、１０８６０−５）。例えばＴ３Ｒは元来、ウィルス性ガン遺伝子ｖｅｒｂＡとの相同性に基いて同定されたものであるが、このガン遺伝子は、野生型受容体とは異なりリガンドに結合するのではなく、本質的な転写のリプレッサーとして機能する。更にＲＡＲｓにおける変異は、多くのヒトのガン、特に急性前骨髄性白血病（ＡＰＬ）及び肝細胞ガンと関連している。ＡＰＬの患者においては、染色体転座の結果生じたＲＡＲ融合タンパク質が、前骨髄性白血病タンパク質（ＰＭＬ）又は骨髄性ジンクフィンガータンパク質（ＰＬＺＦ）を含む。いずれの融合タンパク質も、コリプレッサー複合体の成分と相互作用することが出来るが、レチノイン酸を追加するとコリプレッサー複合体はＰＭＬ−ＰＡＲから放逐されるが、他方ではＰＬＺＦ−ＲＡＲは構造的に相互作用する。これらの知見は、レチノイン酸による治療後にＰＭＬ−ＰＡＲ  ＡＰＬの患者が完全な軽減を達成するのに対して、ＰＬＺＦ−ＲＡＲ  ＡＰＬの患者の反応は極めて貧弱であった理由を説明するものである。（Gｒｉｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｎａｔｕｒｅ３９１，８１１−４）。
【０００７】
最近、レチノイン酸での治療後に幾度か再発を経験したＰＭＬ−ＲＡＲの患者が、
ＨＤＡＣ阻害剤であるフェニルブチレートによる治療を受け、その結果白血病が完全に治癒している（Ｗａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９０、１６２１−１６２５）。
【０００８】
ヒストンデアセチラーゼのタンパク質ファミリー
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴｓ）及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＡＤＡＣｓ）の補充が、細胞増殖及び分化において重要な役割を果たしている多くの遺伝子を動力学的に制御するうえで重要な要素であると考えられている。ヒストンＨ３とＨ４のＮ−末端の過アセチル化は、遺伝子の活性化と相関関係があり、一方脱アセチル化は、転写の抑制を媒介する。従って、多くの疾患が、転写因子に影響を及ぼす変異によって惹起せられる遺伝子発現の変化に関連しているのである。例えばＰＭＬ−ＲＡＲ、ＰＬＺＦ−ＲＡＲ、ＡＭＬ−ＥＴＯ、及びＳｔａｔ５−ＲＡＲのような白血病融合タンパク質による異常な抑制は、この点に関する原型的な例である。これらの事例のすべてにおいて、染色体の転座は、転写アクチベータをリプレッサーに変化させ、これによって、ＨＤＡＣｓの補充を経由した造血分化に重要である標的遺伝子を本質的に抑制する。同様の事象が、多くの他のタイプのガンの発病の原因になっている可能性が大いにあり得る。同様のことが、自己免疫、炎症又は過増殖性障害などについてもあてはまるとの証拠が増大している。
【０００９】
哺乳類のヒストンデアセチラーゼは、３種のサブクラス（Ｇｒａｙ及びＥｋｓｔｒｏｅｍ、２００１）に分類されることが出来る。ＨＤＡＣ１、２、３、及び８は酵母ＲＰＤ３タンパク質の相同体であって、クラスＩを構成する。ＨＤＡＣ４、５、６、７、９、及び１０は、酵母Ｈｄａ１タンパク質に関連ずけられ、クラスＩＩを構成する。最近、酵母Ｓｉｒ２タンパク質の哺乳類由来相同体が幾つか、同定されており、ＮＡＤ依存性であるデアセチラーゼの第三のクラスを形成する。更にＨＤＡＣ１１は、クラスＩＩの構造の特徴をもつクラスＩヒストンデアセチラーゼとして分類されている。これらＨＤＡＣ類は全て、多タンパク質複合体のプレトラ（ｐｌｅｔｈｏｒａ）のサブユニットとして細胞内に存在するように思われる。特にクラスＩとクラスＩＩのＨＤＡＣ類は、転写性のコリプレッサー、ｍＳｉｎ３、Ｎ−ＣｏＲ及びＳＭＲＴと相互作用することが明らかにされたが、これらのコリプレッサーは、ＨＤＡＣ類を転写因子に補充するために要求される架橋因子として機能する。
【００１０】
ＨＤＡＣ阻害剤を用いた治療
更なる臨床研究が最近、ＨＤＡＣ阻害の原理に基づいてガン患者の組織的な臨床治療を開発するために開始されている。現在のところ、第ＩＩ相臨床試験が、単一療法として密接に関連した酪酸誘導体であるＰｉｖａｎｅｘ（Ｔｉｔａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いて終了しているが、その結果ステージＩＩＩ／ＩＶの非小細胞肺ガンにおける活性が証明された（Ｋｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、ＡＳＣＯ、Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１２５３）。更に多くのＨＤＡＣ阻害剤が同定されており、その内ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びＳＡＨＡ（Ａｔｏｎ Ｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．）は、第ＩＩ相臨床試験において試験されたヒドロキサム酸の構造クラスに属するものである（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  1、１９４−２０２）。別のクラスは、環状テトラペプチドから成る群であり、例えばＴ−細胞リンパ腫の治療を目的とした第ＩＩ相臨床試験に使用され好結果を得たデプシペプタイド（ＦＲ９０１２２８−藤沢）がある（Ｐｉｅｋａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｂｌｏｏｄ ９８、２８６５−８）。更には、ベンズアミドクラスに関連した化合物であるＭＳ−２７−２７５（三井製薬）は、現在血液悪性腫瘍患者に対する第Ｉ相臨床試験において試験中である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
バルプロ酸
バルプロ酸（ＶＰＡ；２−プロピル−ペンタン酸）は、異なる分子作用機序に依拠した多様な生理活性を有している：
−  ＶＰＡは、抗癲癇薬である。
−  ＶＰＡは、催奇形性である。妊娠中に抗癲癇薬として用いられた場合、ＶＰＡは、生まれた子供に、数パーセントの先天性欠損（神経管閉鎖欠損症及びその他の奇形・形成異常）を誘発する。マウスでは、ＶＰＡは、適量を投与した場合マウス胎児の多数において催奇形性を示す。
−  ＶＰＡは、核内ホルモン受容体（ＰＰＡＲδ）を活性化する。いくつかの別の転写因子が抑制されるだけでなく、因子の中には有意に抑制されないものもある（グルココルチコイド受容体、ＰＰＡＲα）。
−  ＶＰＡは、時に肝毒性を惹起することがあるが、これはコエンザイムＡで代謝されにくいエステル類に依存して変る。
−  ＶＰＡは、ＨＤＡＣ類の阻害剤である。
【００１２】
ＶＰＡ誘導体の使用によって、これら異なる活性が、異なる分子作用機序により媒介されることを決定することが出来た。催奇形性と抗癲癇作用とは、異なる作用様式に従ったものであって、その理由は、これらの化合物について優先的に催奇形性のもの又は優先的に抗癲癇性であるものを単離することが可能であるからである（Ｎａｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．６９、３１０−３２１）。ＰＰＡＲδの活性化は、催奇形性と厳密に相関関係を有していることが判明しており（Ｌａｍｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１６０、２３８−２４９）、ＰＰＡＲδ活性と催奇形性のいずれもが、ＶＰＡが持つ同一の分子活性を必要としていることが示唆されている。また、Ｆ９細胞の分化は、Ｌａｍｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９が示唆しまた分化マーカーの分析によって報告・文献化されている（Ｗｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９、１２６９−１２７６）ように、ＰＰＡＲδの活性化と催奇形性と厳密な相関関係を有している。ＰＰＡＲδの活性化は、ＶＰＡ及びその誘導体が持つＨＤＡＣ阻害活性に由来することが示されている（ＷＯ ０２／０７７２２  Ａ２；ＷＯ  ０３／０２４４４２  Ａ２）。更には確立されたＨＤＡＣ阻害剤であるＴＳＡが、ＰＰＡＲδを活性化し、ＶＰＡと同一形式のＦ９細胞分化を誘発することも明らかにされている。これらの結果から、ただ単にＰＰＡＲδの活性化だけでなくまたＶＰＡ又はＶＰＡ誘導体持つＦ９細胞分化と催奇形性の誘発も、ＨＤＡＣ阻害により惹起されるものと結論ずけられる。
【００１３】
抗癲癇活性及び鎮静活性は、異なった複数の構造―活性の関係に従うものであり、かくしてＨＤＡＣ阻害剤とは明確に異なった主たるＶＰＡ活性に依存することは明白である。肝毒性の機構は、よく理解されておらず、ＶＡＰ−ＣｏＡエステルの形成に関連するのかどうかは、分かっていない。ＨＤＡＣ阻害剤は、しかしながら、ＣｏＡエステルの形成を必要としないように見える。
【００１４】
ヒストンデアセチラーゼの阻害剤としてのバルプロ酸
ＶＰＡは癲癇に使用される薬剤として開発されてきた。従って、ＶＰＡは、全身的にか、経口によってか又は静脈内に投与されて、脳血液関門を通過して脳組織内の癲癇の標的領域に到達し、かくして抗癲癇の使命を果たし得ることになる。更にＶＰＡは、多くの異なった型のヒトのガン治療に、単剤として又は全ての他の種々の坑腫瘍治療と併用して用いられた場合に有益な効果があることが分かっているが、この場合かかる抗腫瘍治療剤はそれぞれ、顕著に異なる作用様式に依拠して、ＨＤＡＣ活性を持つ酵素の特異的セットを阻害し、かくして分化及び／又はアポトーシスを引き起こすことになる（ＷＯ  ０２／０７７２２  Ａ２、ＥＰ１１７０００８；ＷＯ  ０３／０２４４４２、ＥＰ１２９３２０５Ａ１）。悪性疾患、自己免疫疾患又は他の炎症性又は過増殖性の障害を治療又は予防するために、ＶＰＡもまた、全身的にか経口によってか又は静脈内に投与される。更にＶＰＡは、効果的にヒトの皮膚に浸透し、従って自己免疫疾患、炎症性疾患又はヒトの皮膚の過増殖性疾患、例えば乾癬及びヒトの皮膚ガンなどの治療又は予防に使用する場合、皮膚に局所投与して、有益な効果を発揮させることが可能である（ＥＰ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．０３０１４２７８．０）。
【００１５】
ガン治療のためのテーラーメイド薬剤
経口投与を行うために、ＶＰＡは、“緩徐放出”のみならず“急速放出”投与製剤として開発されている。しかしながら、“緩徐放出”製剤を使用した場合は、長期間に亘って血中のＶＰＡ濃度の増加が遅くなり、ヒストンデアセチラーゼ活性を持つ酵素を阻害するのに必要なＶＰＡの血漿濃度に効率的に到達することが出来ない。更には、細胞による代償的反作用が幾つか、ＶＰＡ濃度の緩徐な上昇の過程で効果的な血漿濃度に到達しないうちに誘発され、その結果ＶＰＡは、ヒストンデアセチラーゼ活性を持つ酵素阻害効果が低減してしまう。一方ＶＰＡの“急速放出”製剤のみに基づく製剤は、血中のＶＰＡの初期高濃度を招来し、その結果効果的ＨＤＡＣ阻害の期間が短くなる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
驚くべきことに、本発明者らは、ＶＰＡの絶対的血中濃度だけでなく、治療中のおけるＶＰＡの効果的な濃度の持続が、ヒストンデアセチラーゼ活性阻害を最大にするために非常に重要であることを証明することが出来た。所望とされ且つ最も有益な薬物動態プロファイルは、従来通暁され而も確立された医薬製剤の使用によっては得ることは出来ない。
【００１７】
従って、従来確立された製剤の持つ幾つかの欠点を検討した結果、本願発明は、少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含んで成る、二相性放出プロファイルを有する医薬製剤に関するものである。好ましくは、該製剤は内服製剤である。
また本願の別の局面は、（ｉ）少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含有する区画部からなる急速放出成分及び（ｉｉ）少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含有する区画部からなる緩徐放出成分とから成る医薬製剤であって、急速放出成分の区画部が、緩徐放出成分の区画分とは異ることを特徴とする、前記医薬製剤である。
【００１８】
更に本願のまた別の局面は、少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含んで成る医薬製剤であって、１００rpmにおけるｐＨ６．８緩衝液ＵＳＰ９００ｍｌ中においてアメリカ薬局方２４、方法７２４、装置２に従って測定した場合、該製剤中のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の１０から６０％が３０分以内に放出され、且つヒストンデアセチラーゼ阻害剤の５０から１００％が６時間以内に放出されることを特徴とする、前記医薬製剤である。
本明細書において使用される“放出”なる用語は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の該医薬製剤からの放出を言う。
【００１９】
本明細書において使用される“放出プロファイル（特性）”なる用語は、一定期間に亘って生起するヒストンデアセチラーゼ阻害剤の放出を言う。医薬製剤のインビトロでの放出プロファイルの決定・測定方法は、当業者にとっては公知である。本願発明に従った好ましい測定方法は、１００ｒｐｍにおける９００ｍｌのｐＨ６．８緩衝液ＵＳＰ中でのアメリカ薬局方（ＵＳＰ）２４、方法７２４、装置２である。
“二相性”の放出プロファイルは、急速放出（即座の放出）の第一相と後続する緩徐放出（持続放出）の第二相を示す。好ましくは、製剤中のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の１０から６０％が３０分以内に放出され、また製剤中のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の５０から１００％が６時間以内に放出される。より好ましくは、製剤中のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の２０から５０％が３０分以内に放出され、また製剤中のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の６０から１００％が６時間以内に放出される。
【００２０】
本明細書において用いられる “ヒストンデアセチラーゼ阻害剤”なる用語は、ヒストンデアセチラーゼ活性を有する酵素のヒストンデアセチラーゼ活性を阻害する性能を有する物質を表す。
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の阻害活性は、本願明細書の実施例１に記載したインビトロ検定定量試験により測定・決定することが出来る。ＩＣ５０値は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の阻害活性の尺度として用いることが出来る。低いＩＣ５０値は、高い阻害活性を意味する；高いＩＣ５０値は、低い活性を示す。本願発明に従って使用されるヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼについて好ましくはＩＣ５０値が１ｍＭ以下、より好ましくは５００μＭ以下の数値を示す。
【００２１】
好ましい一つの実施態様に従えば、かかるヒストンデアセチラーゼ阻害剤、即ち少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ヒストンデアセチラーゼのサブセット又は選択されたデアセチラーゼを優先的に阻害する性能を有する。本明細書において用いられる“優先的に阻害する”なる用語は、第一群のヒストンデアセチラーゼが、第二群のヒストンデアセチラーゼよりもある特定のヒストンデアセチラーゼ阻害剤によってより強度に阻害される場合を言う。通常は、第一群のヒストンデアセチラーゼを優先的に阻害するヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、前記した第一群のヒストンデアセチラーゼに関してＩＣ５０値が８００μＭ以下より好ましくは５００μＭ以下である。第二群のヒストンデアセチラーゼに関するＩＣ５０値は、通常８００μＭ以上、好ましくは１ｍＭ以上である。
【００２２】
第一の具体的な実施態様においては、該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、即ち少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、好ましくはクラスＩヒストンデアセチラーゼを阻害する性能を有する。かかる第一の実施態様に従えば、クラスＩヒストンデアセチラーゼは、クラスＩＩヒストンデアセチラーゼよりも強度に阻害される。かかる第一の実施態様においては、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ヒストンデアセチラーゼ酵素ＨＤＡＣ１，２，３及び８に対してＩＣ５０値が、通常は８００μＭ以下、好ましくは５００μＭ以下である。更に、該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、クラスＩＩ酵素ＨＤＡＣ４，５，６，７，９及び１０に対してはＩＣ５０値が通常は、８００μＭ以上、好ましくは１ｍＭ以上である。
【００２３】
第二の具体的実施態様においては、該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、即ち少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、クラスＩＩヒストンデアセチラーゼを優先的に阻害する性能を有する。かかる第二の具体的な実施態様に従えば、クラスＩＩヒストンデアセチラーゼは、クラスＩヒストンデアセチラーゼよりも強度に阻害される。かかる第二の具体的実施態様においては、該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、クラスＩＩ酵素ＨＤＡＣ４，５，６，７，９及び１０に対してＩＣ５０値が、通常は８００μＭ以下、好ましくは５００μＭ以下であるのに対して、クラスＩ酵素ＨＤＡＣ１，２，３及び８に対するＩＣ５０が、好ましくは８００μＭ以上、より好ましくは１ｍＭ以上である。
【００２４】
好ましいヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、バルプロ酸、バルプロ酸の薬学的に受容可能な塩類、バルプロ酸の誘導体類及びこれらの薬学的に受容可能な塩類である。最も好ましいのは、バルプロ酸及び例えばバルプロ酸ナトリウム塩などその薬学的に受容可能な塩類である。
【００２５】
バルプロ酸の誘導体としては、構造式Ｉの化合物を含むが、これらに限定はされない：
【化１】
2007535518.tif 000002
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、選択的に一つまた数個のヘテロ原子を含みまた置換されていてもよい、線状又は分枝状の、飽和又は不飽和の、Ｃ３―２５脂肪族炭化水素基であり、Ｒ３は、ヒドロキシル、ハロゲン、アルコキシ又はアルキル化されていてもよいアミノ基である］。
【００２６】
Ｒ１及びＲ２残基が異なる場合は、キラル化合物が生じる。通常立体異性体の一方は、他方の異性体よりも強い催奇形性を有し、かかる催奇形性の強い異性体は、より効率的にＰＰＡＲδを活性化する。従ってかかる異性体は、ＨＤＡＣｓをより強力に阻害することが期待される（ＷＯ  ０２／０７７２２Ａ２）。本願発明は、それぞれの化合物のラセミ混合物及び特に活性のより強い異性体を包含する。
【００２７】
Ｒ１及びＲ２の炭化水素鎖は、当該炭化水素鎖における炭素原子を置換する一つ又は数個のヘテロ原子（例えば酸素、窒素、硫黄）を含んで成っていてもよい。このことは、ヘテロ原子が相当する炭素群と同一形式の混成を有する場合は、炭素群に類似した構造が、ヘテロ原子群によってとり得る可能性がある、という事実によるものである。
Ｒ１及びＲ２は、置換されていてもよい。可能な置換基としては、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシ基及びアルコキシ基並びにアリール基及び複素環基を含む。
【００２８】
好ましくは、Ｒ１及びＲ２は独立して、３乃至１０、４乃至１０又は５乃至１０の炭素原子を含んで成る。またＲ１及びＲ２は独立して、飽和であるか又は一つの二重結合若しくは一つの三重結合を含んでいることが好ましい。特に側鎖（Ｒ１）の一つは好ましくは、ｓｐ１混成炭素原子を２位及び３位に含むか又は類似構造を生成するヘテロ原子を含んで成る。この側鎖は、三つの炭素原子又はヘテロ原子を含むはずのものであるが、これより長い鎖もまた、ＨＤＡＣ阻害する分子を生成する可能性がある。また芳香族環又はへテロ原子をＲ２に含有させることによって、ＨＤＡＣタンパク質の接触性位置は、広範な結合性分子を収容するものであることは明らかであるから、ＨＤＡＣ阻害活性を有する化合物を生成させるものと考えられる。催奇形性を有するＶＰＡ誘導体がＨＤＡＣ阻害剤となるという観察結果によって、これまで適当な抗癲癇薬としては無視されてきた化合物もまた、ＨＤＡＣ阻害剤と考えられている（ＷＯ０２／０７７２２  Ａ２）。特に、但し専らこれのみではないが、Ｒ１としてプロピニル残基を有し且つＲ２として７又はそれ以上の炭素原子の残基を有する化合物が検討されている（Ｌａｍｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）。
【００２９】
好ましくは、“ＣＯＲ３”基は、カルボキシル基である。またカルボキシル基の誘導体化も、潜在的なＨＤＡＣ阻害活性を有する化合物を生成させるために検討されねばならない。このような誘導体は、ハロゲン化物類（例えば塩化物など）、エステル類又はアミド類であればよい。Ｒ３がアルコキシ基である場合は、かかるアルコキシ基は、１乃至２５、好ましくは１乃至１０の炭素原子を含んで成る。Ｒ３が、モノー又はジ−アルキルアミノ基である場合、かかるアルキル置換基は、１乃至２５、好ましくは１乃至１０の炭素原子含んで成る。
【００３０】
ある一つの実施態様において、Ｒ１及びＲ２は独立して、一つの二重結合又は三重結合を含んで成っていてもよい線状又は分枝状のＣ３−２５の炭化水素鎖である。この実施態様の好ましい一例は、４−イン−ＶＰＡ又はその薬学的に受容可能な塩である。
更なるヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、このような二相性放出製剤として使用され、下記のものを包含するが、これらに限定されるものではない。即ち、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、トリコスタチンＡ（Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ；ＴＳＡ）、ヒドロキサム酸スベロイルアニリド、ＣＢＨＡ、ピロキサミド（Ｐｙｒｏｘａｍｉｄｅ）、スクリプテイド（Ｓｃｒｉｐａｉｄ）、ＣＩ−９９４、ＣＧ−１５２１、クラミドシン（Ｃｈｌａｍｙｄｏｃｉｎ）、例えばＡ−１６１９０６、二環式アリール−Ｎ−ヒドロキシカルボキサミドなどのヒドロキサム酸のビアリールエステル、ＰＸＤ−１０１、スルホンアミドヒドロキサム酸、ＴＰＸ−ＨＡ類似体（ＣＨＡＰ）、オキサムフラチン（Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ）、トラポキシン（Ｔｒａｐｏｘｉｎ）、デプデシン（Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ）、ＨＤＡＣ阻害活性を示す微生物代謝産物、アピディシン（Ａｐｉｄｉｃｉｎ）、例えばー但しこれらに限定されないーＭＳ−２７−２７５、ピロキサミドとその誘導体などのヒドロキサム酸誘導体、例えばー但しこれらに限定されないー酪酸及びその誘導体、例えばピバネックス（Ｐｉｖａｎｅｘ；酪酸ピバロイルメチルエステル）などの短鎖脂肪酸類、例えばー但しこれに限定されないートラポキシンＡ、デプシペプタイド（ＦＫ−２２８）や関連ペプチド化合物などの環状テトラペプチド化合物類、タセディナリン（Ｔａｃｅｄｉｎａｌｉｎｅ）、ＭＧ２８５６、及びＨＤＡＣクラスＩＩＩ阻害剤，即ちＳＩＲＴ阻害剤、又はＨＤＡＣアイソエンザイム阻害特異性を発揮する化合物類である。
【発明の効果】
【００３１】
バルプロ酸エステルの医薬製剤、投与と薬物動態プロファイル
定常状態での一日２回の経口投与に対する最適な血清プロファイルは、ＶＰＡの血清濃度を３０分以内に９０と２００μｇ／ｍｌとの間の量、より好ましくは１１０と１８０μｇ／ｍｌとの間のレベルにまで急激に増加させることを特徴とする。このような血清濃度レベルは、８乃至１０時間は一定のままであり、次に１１０μｇ／ｍｌ以下に低下する。しかしながら、ＶＰＡの血清濃度準位は、治療・処置の間は８０μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１００μｇ／ｍｌ以上に永続的に留まる。表示した時間は、経口投与の（の開始から）経過時間を言う。
【００３２】
経口投与のための放出制御製剤においては、多回投与単位製剤が、単回単位投与製剤よりも優れている。有効成分の放出は、胃の充満の程度には依存することはなく、異なる患者においても放出のプロファイルは類似したものとなる。更には投薬ダンピングの現象を回避することが出来る。（J  Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８，１２２−１３８）。
ＶＰＡ及びその塩類の投与のための種々の医薬組成物は、例えば非経口製剤、経口用液剤、胃液非溶解性コーティング錠剤、徐放性錠剤及び微小錠剤などが一般的に利用可能である。ＶＰＡの液性及びバルプロ酸ナトリウムの吸湿性の故に、多回投与単位製剤の処方は、技術的にやり甲斐があり、興味深い。
【００３３】
上記したＶＰＡとその塩類の所望とする血清濃度準位は、現存する製剤によって実現出来ないインビトロでの急速放出パターンと緩徐放出パターンとの組み合わせによって達成することが出来るのであって、かくして効果的にＨＤＡＣの標的酵素を阻害出来る。例えばガン又はその他の過増殖性若しくは炎症性の障害をヒストンデアセチラーゼの阻害によって治療又は予防するために、所望とするＶＰＡの血清濃度プロファイルを実現出来る、経口投与のための新規の医薬製剤に対する要求がある
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
このような要求は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、例えばバルプロ酸ナトリウムの二相性放出パターンを有する薬剤組成物によって好ましくは満たされる。本発明に従った医薬組成物は従って、急速放出成分と緩徐放出成分とを通常は所定の割合で含んで成るのが好ましい。ある一つの具体的な実施態様においては、かかる医薬組成物は本質的に、所定の比率での急速放出成分と緩徐放出性の成分とから成る。
急速放出成分と緩徐放出成分との比率は、好ましくは１：０．５と１：４との間、より好ましくは１：１と１：３との間である。ある一つの実施態様においては、その比率は、重量対重量基準である。また別の実施態様では、その比率は、それぞれの成分中の区画（例えば微細な錠剤）の数の比率である。
【００３５】
かかる医薬製剤は、インビトロ放出が、３０分以内に２０乃至５０％、２時間以内で２５乃至６５％、４時間以内で５５乃至８５％、また６時間以内で７０乃至１００％である（１００ｒｐｍにおけるｐH６．８緩衝液ＵＳＰ９００ｍｌ中でのアメリカ薬局方２４、方法７２４、装置２）。このような両成分の組み合わせの吸水量は、２５℃で相対湿度４０％に暴露した場合２４時間以内で通常５％以下である。
【００３６】
急速放出成分は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばバルプロ酸ナトリウム）のインビトロ放出が１５分で少なくとも９０％であるのが好ましい（１００ｒｐｍにおけるｐH６．８緩衝液ＵＳＰ９００ｍｌ中でのアメリカ薬局方２４、方法７２４、装置２）。この成分の吸水量は、２５℃で相対湿度４０％に暴露した場合、２４時間以内で通常は５％以下である。
緩徐放出成分のインビトロ放出は、１時間以内で０乃至３０％、４時間以内で２０乃至６０％、そして６時間以内で５５乃至９５％であるのが好ましい（１００ｒｐｍにおけるｐH６．８緩衝液ＵＳＰ９００ｍｌ中でのアメリカ薬局方２４、方法７２４、装置２）。この成分の吸水量は、２５℃で相対湿度４０％に暴露した場合、２４時間以内で通常５％以下である。
【００３７】
緩徐放出成分は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばバルプロ酸ナトリウム）の含量が通常は５０乃至９６重量％、好ましくは７０乃至９５％である。急速放出成分は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばバルプロ酸ナトリウム）の含量が通常５０乃至９６重量％、好ましくは７０乃至９５％である。
【００３８】
大量の薬物が投与されなければならないので、多粒子製剤が好ましい。従って、本発明の医薬製剤は、ある一つの実施態様においては、多数の区画部からなる多回単位投与製剤である。この“区画部”なる用語は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含有する粒子を意味する。この粒子は、一つ又はそれ以上のコーティング層を有していてもよい。かかる粒子に含有されるヒストンデアセチラーゼ阻害剤は好ましくは、前記一つ又はそれ以上のコーティング層によって環境から隔離されるのが好ましい。好ましくは粒子は微細錠剤（ｍｉｃｒｏｔａｂｌｅｔｓ）である。その粒子は、形状が異なっていてもよく、好ましくは球状又は両凸状である。かかる単一区画部の最大の径（例えば直径）は、通常３ｍｍ、好ましくはかかる単一区画部の径は、０．５乃至２．５ｍｍである。
【００３９】
急速放出成分は、複数の区画部を含んで成り、好ましくはかかる急速放出成分は、本質的に複数の区画部から成る。緩徐放出成分は、複数の区画部を含んで成り、好ましくは緩徐放出成分は、本質的に複数の区画部から成る。ある一つの具体的な実施態様においては、急速放出成分及び緩徐放出成分とは、複数の区画部を含んで成り、好ましくは急速放出成分及び緩徐放出成分とは、本質的に区画部から成る。
【００４０】
急速放出成分の単一区画部は、緩徐放出成分の単一区画部とは異なる。
急速放出成分の単一区画部は、経口投与後にヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばバルプロ酸ナトリウム）の放出が極めて速い。かかる単一区画部は、一般に知られた造粒法、ペレット化法又は打錠法により製造される。
純粋な物質と比較すると、優れた取扱い性は、適切な賦形剤及び製剤方法を用いることによって吸湿性低下を行うことによって達成されるのである。例えば、これらの成分は、吸湿性能の低下を実現するために適当なポリマーを用いてコーティングすることが出来る。
【００４１】
緩徐放出成分の単一の区画部は、経口投与の後、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばバルプロ酸ナトリウム）の放出が緩徐である。かかる区画部の最大径は、通常３ｍｍであり、一般に知られた造粒法、ペレット化方法、又は打錠方法により製造される。
既に述べたように、優れた取扱い性は、純粋な薬物と比較した場合吸湿性能を低下させることによって達成されるが、かかる吸湿性能低下は、適切な賦形剤及び製剤方法を用いることによって実現される。例えば、かかる成分は、吸湿性能の低下及び緩徐放出パターンを達成するために適当なポリマーを用いてコーティングすることが出来る。
【００４２】
これらの区画部は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばバルプロ酸ナトリウム）の含有量が５０乃至９５重量％、好ましくは６０乃至８５％である。
本発明の一つの局面においては、かかる区画部は、コーティングされた微小錠剤である。通常、急速放出成分をコーティング処理した微小錠剤は、緩徐放出成分の微小錠剤とはコーティングが異なっている。
【００４３】
一つの具体的な局面において、コーティングされた微小錠剤は、少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばバルプロ酸ナトリウム）、滑剤、ポリマー及び潤滑剤からなる。好ましくはコーティングされた微小錠剤は、本質的にこれらの成分から成る。滑剤は好ましくは、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム及び／又はステアリン酸である。適当な潤滑剤は、二酸化珪素、メチル化二酸化珪素及び／又はタルクを含む。ポリマーは好ましくは、メタクリル酸アンモニウムコーポリマー、エチルセルロース及び／又はハイプロメロース（ｈｙｐｒｏｍｅｌｌｏｓｅ）である。
また別の局面においては、急速放出成分のコーティングされた微小錠剤のコーティングは、少なくとも一種のポリマーと少なくとも一種の適当な可塑剤を含んで成る。かかるポリマーは好ましくは、アミノアルキルメタクレート共重合体、ポリビニルアルコール及び／又はハイプロメロースである。適当な可塑剤は、トリアセチン（Ｔｒｉａｃｅｔｉｎ）、セバシン酸二ブチルエステル、クエン酸トリエチルエステル、ポリエチレングリコールを含む。その他の可塑剤は、文献で概観することが出来る（例えば、Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｄｅｒ  Ｈｉｌｆｓｓｔｏｆｆｅ，Ｈ．Ｐ．  Ｆｉｅｌｄｅｒ，  Ｅｄｉｔｉｏ  Ｃａｎｔｏｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ，４．Ａｕｆｌａｇｅ  １９９８）。
【００４４】
また更なる局面においては、緩徐放出成分のコーティングされた微小錠剤のコーティングは、少なくとも一種のポリマーと少なくとも一種の適当な可塑剤とを含んで成る。適当なポリマーは好ましくは、メタクリル酸アンモニウムコーポリマー及び／又はエチルセルロースである。
これら両成分とも、所定の割合でカプセル又は単回量投与のためのコンテナー容器に封入する。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばバルプロ酸ナトリウム）のカプセル又は単回量投与のためのコンテナー容器中の含量は、０．１乃至３グラム、好ましくは０．２乃至１．５グラムの範囲であればよい。
単回量投与ためのコンテナー容器は、シャセイ（sachets）又はパウチ（pouches）であってもよい。湿度に対する充分な障壁を与えるために、最小厚みが９μｍのアルミニウムホイル又はその代わりに相当する特性を有するコート紙又はその他の材料から成る。
【００４５】
治療のためのヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばバルプロ酸ナトリウム）の最適量は個別に、それぞれの投与間隔で単回投与のためのカプセル又はコンテナー容器を必要量投与することにより達成・実現される。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばバルプロ酸ナトリウム）の治療に最適の量は、患者の体重に依存して異なる。
本発明は更に、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む急速放出成分をヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む緩徐放出成分とを組み合わせ、かくして区画部を含んで成る多回投与単位製剤を得ることからなる、二相性放出プロファイルを有する医薬製剤の調製方法に係わる。本発明の医薬製剤に関して本明細書において記載した様々な実施態様は、この方法を準用する。
【００４６】
好ましくは、単一医薬を含有する区画部（例えば被覆された微小錠剤）は、造粒、押出し、ホットメルト、ペレット化、打錠及びコーティングなどの方法により製造される。
これら両成分は、所定の割合で混合し、カプセル又は単回投与のためのコンテナー容器に充填すればよい。或いはその代わりに、両成分は、前もって混合することなく順次カプセル又は単回投与のためのコンテナー容器に充填してもよい。カプセル又は単回投与のためのコンテナー容器のバルプロ酸ナトリウムの含量は、０．１乃至３グラム、好ましくは０．２乃至１．５グラムである。
【００４７】
本発明はさらに、本明細書に記載した医薬製剤を下記する疾患・障害を治療するための医薬を製造する目的に使用する用途に係わる。即ち、エストロゲン受容体依存性乳ガン、エストロゲン受容体非依存性乳ガン、ホルモン受容体依存性前立腺ガン、ホルモン受容体非依存性前立腺ガン、脳腫瘍、腎臓ガン、大腸ガン、結腸直腸ガン、膵臓ガン、膀胱ガン、食道ガン、胃ガン、尿生殖器ガン、胃腸ガン、子宮ガン、卵巣ガン、星状膠細胞腫、膠腫、皮膚ガン、扁平上皮ガン、角化棘細胞腫、ボウエン病、皮膚Ｔ−細胞リンパ腫、黒色腫、基底細胞ガン、紫外線角化症；魚麟癬；ざ瘡、尋常性ざ瘡、肉腫類、カポジ肉腫、骨肉腫、頭と首のガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、白血病類、リンパ腫類及び/又はその他の血液細胞ガン、甲状腺耐性症候群、糖尿病、地中海貧血（サラセミア）、硬変症、原生動物感染症、リウマチ性関節炎、リウマチ性脊椎炎、全ての形態のリウマチ、骨関節炎、痛風性関節炎、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、非インシュリン依存性糖尿病、喘息、鼻炎、葡萄膜炎、紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性大腸疾患、慢性下痢、乾癬、アトピー性皮膚炎、骨疾患、繊維増殖性疾患、アテローム性動脈硬化症、再生不良性貧血、ディ・ジョルジ症候群、グレーブス病、癲癇、アルツハイマー病、うつ病、精神分裂病、分裂性情動障害、躁病、脳卒中、気分不一致精神病徴候、双極性不調、情動障害、髄膜炎、筋ジストロフィー、多発性硬化症、激昂、心肥大、心不全、再灌流障害及び又は肥満症である。
【００４８】
別の局面においては、本発明は、これら障害・疾患の一つ又はそれ以上の治療又は予防のための薬剤の製造をするためにヒストンデアセチラーゼ阻害剤を使用する方法において、該薬剤が、二相性放出プロファイルを示す薬剤組成物であることを特徴とする前記使用方法に係わる。本明細書において発明の医薬製剤に関して記載した種々の実施態様は、かかる使用方法を準用する。
本発明の更なる別の局面は、上記にて列挙した障害・疾患の一つ又はそれ以上を治療する方法であって、本明細書において既述した医薬製剤の有効量を治療を必要とする患者に投与することから成る前記治療方法である。かかる医薬製剤の有効量を投与することは、治療するべき患者の症状を改善するのに適している。本明細書において発明の医薬製剤に関して記載した種々の実施態様は、かかる治療方法を準用する。
【００４９】
本発明は、ＨＤＡＣタンパク質の効果的に阻害する、二相性薬物動態放出プロファイルをもつ薬剤組成物を提供する。かかる製剤は、負の副作用を亢進することなく、極めて有益な特性を示す。かくして、当該化合物を当初に急速に放出する結果、投薬後間もなく細胞性ＨＤＡＣ活性を阻害するだけの関連薬物濃度が得られる。追加の化合物が引き続いて緩徐に放出されるため、有効治療用量を僅かに上回る血清量においてＨＤＡＣ阻害が長期間維持されることが可能となる。当該化合物の濃度を治療範囲内に一定に持続させる結果、ヒストンデアセチラーゼ活性を有する標的酵素に対するＶＰＡの効果が延長されることになる。このような効果は、例えばＶＰＡで治療中の患者の抹消血液中のヒストン過アセチル化ヒストンなどの代用のマーカーの分析することによってモニターすることが出来る。重要なことには、ＶＰＡは、ＨＤＡＣクラスＩＩ（２）の酵素に対する阻害活性がより弱いのとは対照的に、ＨＤＡＣクラスＩ（１）アイソザイムを優先的に阻害することが知られている。このようなプロファイルは、ＨＤＡＣクラスＩＩ（２）酵素の阻害が、心毒性の副作用に関連している（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ２００２、１１０：４７９−４８８；Ａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＪＢＣ  ２００３、２７８：２８９３０−７）可能性があるため、大いに望まれていることである。即ち、ＶＰＡの血清濃度が薬学的に関連した濃度内に持続されるため、ヒストンデアセチラーゼ、特にクラスＩアイソザイムの阻害が延長し、その結果心毒性の副作用が最少化されことになる。
【００５０】
本発明において記載されたヒストンデアセチラーゼ阻害剤の医薬製剤を投与することによって、ヒストンデアセチラーゼの異常補充・回復に基く、例えば過増殖性又は炎症性の諸障害などの悪性症状及び/又は疾患に罹患した患者においてヒストンデアセチラーゼ活性を示す酵素の阻害が延長することは、このような疾患に罹患した患者に対する予防及び治療のストラテジーを最適化する一つの新規な問題解決法であることは明らかである。即ち、急速放出と緩徐放出の薬物導体プロファイルを組み合わせてなる内服用組成物を使用することは、ＶＰＡ，即ちヒストンデヒストンデアセチラーゼ阻害剤をたとえば悪性腫瘍疾患又は炎症性疾患などの過増殖性障害の治療又は予防に適用するうえで極めて有益であると見なされる。
【００５１】
本発明の別の実施態様においては、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤のその他の種類の投与法、例えばー但しこれらに限定されないがー本発明において記載されたヒストンデアセチラーゼ阻害剤の放出パターン及び血清濃度準位を創出することを可能ならしめるような静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、局所投与（貼付薬剤を含む）、他の経口投与、経鼻投与、腹腔内投与又は坐薬を用いた投与などを含むものである。
【実施例】
【００５２】
実施例１
ＶＰＡは、ヒストン脱アセチラーゼクラスＩ酵素（図１）の優先的阻害剤として作用を発揮し、患者の細胞系及び末梢血細胞（図３）においてヒストン過アセチル化を誘導する。本発明のために提示された証拠は、次の特許にも関連している：  即ち、ＷＯ０２／０７７２２Ａ２、ＥＰ  １１７０００８；  ＷＯ０３／０２４４４２Ａ２、ＥＰ１２９３２０５Ａ１；  ＥＰ出願番号第０３０１４２７８．０号である。
【００５３】
方法：
インビトロＨＤＡＣ分析でのＩＣ５０値の測定：Ｈｉｇｈ５昆虫細胞中での発現により誘導された、組み換えＨＤＡＣタンパク質におけるヒストン脱アセチラーゼ活性の測定は、人工基質（Ｆｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓ、Ｂｉｏｍｏｌ）の特異的脱アセチル化に依拠し、基くものである。
【００５４】
この基質の代謝回転は、フルオロメトリーにより検出し且つ数量化・定量化することが可能である。ＨＤＡＣ阻害剤の添加によって基質の加水分解が制約されるため、その結果フルオロメトリーのシグナルが低下する。ＩＣ５０値は、用量―反応（ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ）曲線から算出される。この検定定量法は、二つの工程に分けられる：即ち、第一の工程においては、基質（Ｆｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓ／Ｂｉｏｍｏｌ  ＫＩ−１０４）が、ヒストン脱アセチラーゼにより加水分解され、また第二の工程では、ＨＤＡＣ活性が停止されるが、蛍光基は感光液（Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ／Ｂｉｏｍｏｌ  ＫＩ−１０５）の添加により活性化される。組み換え型タンパク質及びＨＤＡＣ阻害剤は、９６ウェルプレートの各ウェル毎に合計容量として２５μｌとなるように反応緩衝液（Ｂｉｏｍｏｌ  ＫＩ−１４３）と混合する。ウエル当り２５μｌの基質（反応緩衝液で１：１００に希釈）を加えて反応を開始させる。ヒストン脱アセチラーゼ活性を有さない陰性対照（ネガティブコントロール）及びＨＤＡＣ阻害活性を有する陽性対照（ポジティブコントロール）も、同様にして処理する。反応は、１５乃至６０分後に感光液（反応緩衝液に１:２０に希釈）５０μｌを加えて終了させる。更に室温で１５分のインキュベーションを行った後では、蛍光シグナルは６０分間安定であり、蛍光読み取り器（励起フィルター：３９０ｎｍ、発光フィルター：４６０ｎｍ）により検出可能である。組み換え型ヒストン脱アセチラーゼ類は、Ｂｕｇｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｓｔｏｎｅ  （新規なヒトヒストン脱アセチラーゼのクローニング及び特性化）、ＨＤＡＣ８．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２０００  Ａｕｇ  １５；３５０  Ｐｔ  １：１９９−２０５において記載された方法に従って製造し且つ精製することが出来る。
【００５５】
マウス異種移植モデル：２４匹の胸腺欠損Ｎｕ／Ｎｕ−１−（Ｈａｒｌａｎ）マウスに、１００μｌのＰＢＳ（燐酸緩衝液）中１×１０６のＰＣ３前立腺ガン細胞を右脇腹（一群は８匹の動物）に注入した。腫瘍を４日間増殖させた。動物は、ＰＢＳ（コントロール・対照）又はＶＰＡを２×２００ｍｇ／ｋｇ／ｄ又は２×２００ｍｇ／ｋｇ／ｄなる用量でそれぞれ、ｄａｙ  ５からｄａｙ  ２１まで投与・処置した。腫瘍容積は、３乃至４日毎に測定した。
【００５６】
ウェスターンブロット：第Ｉ／ＩＩ相臨床試験においてＶＰＡの静脈内投与治療を受けている患者からＶＰＡ治療の開始前及び開始後６時間後、２４時間及び４８時間後に抹消血細胞を採取した。全細胞抽出物は、１２％変性ポリアクリルアミドゲル上での変性ＳＤＳゲル電気泳動を実施するためにＲＩＰＡ緩衝液及びタンパク質阻害剤中で細胞溶解を行うことによって調製された。アセチル化ヒストンＨ３及びＨ４及び標識タンパク質ＨＤＡＣ２は、抗アセチルヒストンＨ３抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ、＃０６−９４２）、抗―アセチルヒストンＨ４抗体（クローン  Ｔ２５；ＥＰ特許出願第０２．０２１９８４．６号）、及び抗−ＨＤＡＣ２抗体（ＳＣＢＴ、ＳＣ−７８９９）を用いてウェスターンブロット分析により検出した。等量負荷対照として、ＰＶＤＶ膜はクーマシーで染色した。
【００５７】
結果：
以前の特許出願において、本発明者らはこれまでに、ＶＰＡが多くの異なった種類のヒトのガン及び他の過増殖性又は炎症性の障害の治療に、単一薬剤として又は顕著に異なる作用様式に依拠した全ての種類の他の抗腫瘍薬剤と組み合わせて使用することが出来る、という証拠を提示してきた（特許出願：ＷＯ０２／０７７２２  Ａ２、ＥＰ  １１７０００８；ＷＯ０３／０２４４４２  Ａ２、ＥＰ  １２９３２０５Ａ１；ＥＰ出願第０３０１４２７８．０号）。本明細書においては、本発明者らは、ＶＰＡがヒストン脱アセチラーゼクラスＩ酵素（図１）の優先的な阻害剤として作用を発揮し、従って患者に使用してヒストン過アセチル化及び標的タンパク質であるＨＤＡＣ２（図３）の制御を誘導するに有効な、治療血清濃度に到達することが出来る証拠を示すこととする。
【００５８】
図１は、ＶＰＡのＨＤＡＣイソ酵素阻害特異性を調べるインビトロ定量検定法の結果を示す。Ｈｉｇｈ５昆虫細胞から精製された組み換え型タンパク質についてＶＰＡの異なる投与量を用いて用量―応答曲線を作成した結果、ＨＤＡＣ１及び８（何れもクラスＩ）に対するＩＣ５０値が、それぞれ２００μＭ及び３００μＭであるのに対して、ＨＤＡＣ６（クラスＩＩ）のＩＣ５０値は１．１ｍＭであって、ＶＰＡが優先的にＨＤＡＣクラスＩ酵素を阻害することが明らかとなった。これらのデータは、免疫沈降物中で単離されたヒトＨＤＡＣ酵素から得られた結果によって支持されている（Ｇｏｅｔｔｌｉｃｈｅｒ他、ＥＭＢＯ  Ｊ。（２００１）、２０：６９６９−７８）。このような免疫沈降法による検定定量試験をおこなった結果、クラスＩＨＤＡＣ酵素（例えばＨＤＡＣ１、２、３、及び８）に対するＶＰＡ阻害ＩＣ５０値が、約１００μＭから４００μＭまでの範囲に渉り、クラスＩＩ酵素（例えばＨＤＡＣ５、６、及び１０）に対しては約１１００から２８００μＭまでの範囲に渉ることが判明した。このＨＤＡＣクラスＩ酵素の優先的な阻害は、ＨＤＡＣクラスＩＩ酵素の阻害が心毒性の副作用に関連している可能性があるため、非常に望ましいプロファイルである（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、２００２、１１０：４７９−４８８；Ａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＪＢＣ、２００３、２７８：２８９３０−７）。
【００５９】
更にはマウスＰＣ３異種移植モデルから得られたインビボデータから、有益な抗腫瘍効果を得るためには、幾つかの閾値服用量しなければならないことが判る。図４において理解出来るように、ＰＣ−３腫瘍容積は、マウスを４００ｍｇ／ｋｇ／ｄのＶＰＡをで一日に２回投与・処置した場合ＰＢＳで対照として処置された腫瘍と比較して、２５％以上（＞２５％）減少したのに対して、２００ｍｇ／ｋｇ／ｄを一日２回投与・処置した場合抗腫瘍効果は全く認められなかった。
【００６０】
表１は、第Ｉ／ＩＩ相臨床試験期間中にＶＰＡを静脈内投与した患者で得られたＶＰＡ血清濃度を示すものであるが、当該患者においては、ＨＤＡＣ酵素を阻害する効果的な血清濃度に到達出来ることが判る。ＶＰＡの総血清濃度が２１０μｇ／ｍｌ（ほぼ１．４５ｍＭ）以上になると、神経細胞副作用が観察される。従って認容可能な治療血清濃度は、ＨＤＡＣクラスＩ酵素阻害に要求される効果的な投与量（遊離ＶＰＡの０．２ｍＭ位、概算で総ＶＰＡ１．０ｍＭ）よりはるかに高くなるであろうが、それでもなおＨＤＡＣクラスＩＩ酵素を阻害しないほど充分に低い値であり、かくして心毒性の副作用を回避することが出来る。
【００６１】
【表１】
2007535518.tif 000003
【００６２】
表１：ＶＰＡ静脈内投与による第Ｉ／ＩＩ相臨床試験で得られたＶＰＡ血清濃度
この表は、クラスＩＨＤＡＣイソ酵素を効果的に阻害するために必要なＶＰＡ血清濃度を示す。総血清濃度がほぼ１４４．２μｇ／ｍｌである場合、クラスＩ酵素阻害のＩＣ５０の濃度範囲（ほぼ０．２ｍＭ）に収まるＶＰＡの遊離分画（すなわち血清タンパク質に結合しない）が存在する。神経細胞副作用が、総ＶＰＡ血漿濃度が２１０μｇ／ｍｌ（~１．４５ｍＭ）以上になると観察される。これらのデータに基いて、本発明者らは、本発明において記載したＶＰＡの新規な薬物製剤を開発した。本製剤は、関連性・意義が最も高いＨＤＡＣクラスＩ標的酵素の効率的な阻害を確保するものであり、これに伴って急速に且つ永続してヒストン過アセチル化を誘導し、他方ではクラスＩＩＨＤＡＣ酵素の阻害に必要とされる血清濃度（特に遊離ＶＰＡの血清濃度）にまでは到達することはない（ＭＷ：分子量）。
【００６３】
図２及び３は、第Ｉ／ＩＩ相臨床試験期間中にＶＰＡを静脈内投与した患者において得られたデータを示す。ＶＰＡ治療の効果の一つのマーカーとしてのヒストン過アセチル化の誘導を、ＶＰＡ治療の開始前及び開始後６時間後、２４時間４８時間後に患者から採取した抹消血細胞で検査した。ＶＰＡの血清中のピークレベルとヒストン過アセチル化の誘導には、明瞭な相関関係が認められた（図２）。ヒストンＨ３及びＨ４の過アセチル化及び標識タンパク質ＨＤＡＣ２のダウンレギュレーションは、治療血漿濃度を上回る血清濃度を示す患者において検出することが出来た（図３）。
【００６４】
即ち、ＶＰＡは、種々の細胞系においてだけでなく治療環境においても、悪性腫瘍疾患又は他の過増殖性若しくは炎症性の障害の患者の治療又は予防のためのヒストン脱アセチラーゼの特異的阻害剤であるイソ酵素の一つである。
【００６５】
実施例２
ＶＰＡによるＨＤＡＣ阻害の最大化には、初期のピーク濃度及びそれに引き続いて治療濃度を上回る濃度を延長させ、持続させることが必要である。
【００６６】
方法：
ウェスターンブロット：６ウェルのプレートに２９３Ｔ細胞を播種し、“急速放出”（“ＶＰＡ通常”）、“緩徐放出”（“ＶＰＡ遅延”）及び二相性（“ＶＰＡ  ＰＥＡＣ”）放出型を代表するスキームに従って処理した。暴露期間は、“急速放出” を代表する通常ＶＰＡ製剤では６時間、ＶＰＡの遅延型“急速放出”を代表する製剤は１５時間、また二相性放出型を代表するＰＥＡＣ製剤では２４時間と算出された。全細胞抽出物は、ＲＩＰＡ緩衝液中での細胞の溶解及び１２％変性ポリアクリルアミドゲル上での変性ＳＤＳゲル電気泳動のためのタンパク質阻害剤とによって調製した。アセチル化ヒストンＨ３は、抗アセチルヒストンＨ３抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ、＃０６−９４２）を用いたウェスターンブロット分析により検出した。
【００６７】
ＳＲＢ増殖試験：  細胞の生体量の減少は、ＳＲＢ定量法によって測定した。この定量法のために、細胞を９６ウェルの培養皿に、３０００と８０００細胞／ウェルの間の細胞密度で播種した。２４時間の回復後、細胞をＶＰＡの記載濃度の不存在又は存在下に７２時間培養した。細胞は、最終のＴＣＡ濃度が１０％となるように冷トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で固定化した。摂氏４度で１時間培養した後、細胞を水で５回洗浄し、風乾した。固定化した細胞は、１％酢酸溶液に溶解した０．４％（重量／容積）スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）溶液で３０分間染色し、次いで結合なかった染料を除去するために１％酢酸で４回洗浄した。風乾した後、結合した染料を１０ｍＭの未緩衝トリス塩基（ｐＨ１０．５）で５分間で可溶化した。光学的密度（ＯＤ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｖｅｒｓａ  Ｍａｘの整調可能微小プレート読み取り器で５２０乃至５５０ｎｍにおいて読み取りした。それぞれの用量―応答のための４つの試験ウェルが、各細胞株当たり１２の対照ウェルと平行して設定された。時間ゼロ（Ｔ０；薬を加えた時間）における細胞集団密度の測定も、試験プレートに薬物を加える直前にＴＣＡにより固定化した細胞の１２の対照ウェルについて行われた。前記したように、５％ＦＢＳで固定化されまた染色された完全培地についての背景ＯＤ（即ち、完全培地プラス染料のＯＤ及びＴ０における細胞のＯＤ）もまた、１２の別個のウェルにおいて測定された。各マイクロタイタープレートからの未処理ＯＤデータから、背景ＯＤ測定値（即ち、完全培地プラス染料のＯＤ及びＴ０における細胞のＯＤ）を引き算して、かくして細胞の細胞性生物量の減少分を得た。
【００６８】
結果：
ＨＤＡＣ活性及びガン細胞株の細胞増殖の双方の阻害を最大化するために、ＶＰＡの必要有効濃度を達成するだけでなく、これら濃度を可能な限り長期間維持することが重要である。図５は、クラスＩＨＤＡＣ酵素類について算定されたＩＣ５０値以上の濃度におけるＶＰＡによる処理後細胞内で認められる過アセチル化度が、曝露期間が延長された場合に強度に増大・増強されることを説得力をもって示している。曝露の持続期間は、通常の“急速放出”通常VＰＡ製剤を代表するものでは６時間と算出され、遅延された“緩徐放出”ＶＰＡ製剤を代表するものでは１５時間と算出され、またＰＥＡＣ製剤の二相性放出パターンを代表するものは２４時間と算出された。
【００６９】
更には二つのガン細胞株、即ちＣｏｌｏ３２０ＤＭ及びＰＣ−３において得られた、ＶＰＡによる増殖抑制の結果から、ＶＰＡは、増殖抑制の最適化を実現するためには治療濃度における長期間投与を行わなければならないことが明らである。図６Ａにおいて認められるように、細胞株の１ｍＭＶＰＡへの暴露は、７２時間の培養期間に４０時間の処理なし間隔をおいた２×８時間の処理（“８ｈ  ｄ”）及び２６時間の処理なし間隔をおいた２×２０時間の処理（“２０ｈ  ｄ”）から６６時間連続の処理に到るまで時間を変えて行ったところ、本発明の二相性放出の原理（“連続的”）により達成されるような血清濃度が得られた。図６Ｂは、増殖阻害がＶＰＡへの曝露を延長すると共に増強されることを具体的に示している。２×８時間（“８ｈ  ｄ”）の曝露を行ったところ、増殖阻害は２６％（ＰＣ３）及び２７％（Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ）となるが、これに対して２×２０時間（“２０ｈ  ｄ”）の曝露を行うことによって、増殖阻害が、ＰＣ３の細胞で４３％またＣｏｌｏ３２０ＤＭの細胞では５７％にまで増加した。最大の増殖阻害は、ＶＰＡへの連続的な曝露において認められ、ＰＣ３の細胞で５７％の阻害またＣｏｌｏ３２０ＤＭの細胞において８０％(連続的)の阻害であった。
【００７０】
即ち、ガン、自己免疫及び抗炎症治療に使用するのに最適のＶＰＡ処方のための製剤としての必要要件は、特異的な二相性薬力学的プロファイルであって、これはＨＤＡＣクラスＩ標的酵素を最も効率的に阻害し、それに伴ってヒストンの過アセチル化を急速且つ永続的な態様で誘導し且つ例えばガン細胞又は例えば免疫学的障害における免疫細胞などの疾病化した過増殖性細胞の増殖阻害又は分化誘導を最大限にまで誘発するために必要である。このようなプロファイルは、所望の標的遺伝子及びタンパク質発現プロファイルとの効率的な調節を確保可能なものであり、かくして治療上の便益・有益さに貢献すると共にヒストン脱アセチラーゼ活性をもつ酵素の阻害が有益治療効果を発揮する、過増殖性、前癌性や悪性の疾患又は自己免疫性や炎症性の障害の治療又は予防に適しているのである。これらの疾患・障害としては、例えばー但しこれらに限定されないがー、エストロゲン受容体依存性及び非依存性の乳ガン、ホルモン受容体依存性及び非依存性の前立腺ガン、脳腫瘍、腎臓ガン、大腸及び結腸直腸のガン、膵臓ガン、膀胱ガン、食道ガン、胃ガン、尿生殖器ガン、胃腸ガン、子宮ガン、卵巣ガン、星状膠細胞腫、膠腫、皮膚ガン、扁平上皮ガン、角化棘細胞種、ボウエン病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、基底細胞ガン、紫外線角化症、魚麟癬、ざ瘡、尋常性ざ瘡、カポジ肉腫や骨肉腫などの肉腫、頭や首のガン、小細胞及び非小細胞肺ガン、白血病、リンパ腫及びその他の血液細胞ガン、甲状腺耐性症候群、糖尿病、地中海貧血、硬変症、原生動物感染症、リウマチ性関節炎、リウマチ性脊椎炎、あらゆる形態のリウマチ、骨関節炎、痛風性関節炎、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病及びインシュリン非依存性糖尿病、喘息、鼻炎、葡萄膜炎、紅斑性狼瘡症、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性大腸疾患、慢性下痢、乾癬、アトピー性皮膚炎、骨疾患、繊維増殖性疾患（例えば結合織の疾患）、アテローム性動脈硬化症、再生不良性貧血、ディ・ジョルジ症候群、グレーブス病、癲癇、癲癇重積持続状態、アルツハイマー病、うつ病、精神分裂病、分裂性情動障害、躁病、脳卒中、 気分不一致精神病徴候、双極性障害、情動障害、髄膜炎、筋ジストロフィー、多発性硬化症、激昂、心肥大、心不全、再灌流傷害、肥満症が挙げられる。
【００７１】
実施例３
所望とする溶解プロファイルを有する医薬組成物の製造
1. 微小錠剤の製造
処方（微小錠剤一錠当たりの重量）
【００７２】
【表２】
2007535518.tif 000004
注記：＊、乾燥後の最終製品中には最早や存在しない。
製剤１，２，３，４の調製（バッチサ-イズ：微小錠剤として１００００００錠）：
成分“ａ”を、４０％の成分“ｂ”、４５％の成分“ｃ”及び６０％の成分“ｄ”と適当な高せん断ミキサーにて混合する。得られた混合物は次いで、回転コンパクターで造粒する。得られた顆粒物は、成分“ｂ”、“ｃ”及び“ｄ”の残量と回転式混和機で混和し、指定のパンチサイズの回転式打錠機で打錠し、所定の錠剤重量の微小錠剤（ミニタブレット）を得る。
【００７３】
製剤５，６の調製（バッチサイズ：微小錠剤として１００００００錠）：
成分“ａ”を、５５％の成分“ｂ”、４５％の成分“ｃ”と適当な高せん断ミキサー中で混合する。得られた混合物は、“ｄ”を“ｅ”中に分散した分散液と共に造粒する。得られた顆粒は、乾燥し、ふるい分けし、次いで成分“ｂ”及び“ｃ”の残量と共に、回転式混和機で混和し、指定パンチサイズの回転式打錠機で打錠し、所定の錠剤重量の微小錠剤を得る。
【００７４】
製剤７，８，９，１０の調合（バッチサイズ：微小錠剤として１００００００錠）：
成分“ａ”を、７０％の成分“ｂ”、４５％の成分“ｃ”と適当な高せん断ミキサーで混合する。得られた混合物は、“ｄ”を“ｅ”に分散させた分散液と共に造粒する。得られた顆粒は、乾燥し、ふるい分けし、次いで成分“ｂ”及び“ｃ”の残量と共に、回転式混和機の中で混和し、指定パンチサイズの回転式打錠機で打錠し、所定の錠剤重量の微小錠剤を得る。
【００７５】
２．緩徐放出微小錠剤の製造
処方（微小錠剤一錠当りの重量）
【００７６】
【表３】
2007535518.tif 000005
注記：＊、乾燥後の最終製品中には存在しない。
製剤１１−２０の調製（バッチサイズ：微小錠剤、１００００００錠）：
成分“ａ”を 適当なコーティング装置で“ｂ”、“ｃ”、“ｄ”及び“ｅ”の分散液でコーティングする。
【００７７】
３．急速放出微小錠剤の製造
処方（微小錠剤一錠当たりの重量）：
【表４】
2007535518.tif 000006
＊乾燥した最終製品中には存在しない。
製剤２１−２８の調製（バッチサイズ：微小錠剤、１００００００錠）：
成分“ａ”は、適当なコーティング装置で “ｂ”、“ｃ”、“ｄ”及び“ｅ”の混合物でコーティングする。
【００７８】
４．投与製剤の製造
処方（微小錠剤一錠当たりの重量）
【表５】
2007535518.tif 000007
【００７９】
【表６】
2007535518.tif 000008
製剤２９−４８の調製：
成分“ａ”と “ｂ”をカプセル又は単回投与コンテナー容器に充填する。
成分“ｂ”は、静電現象を低減させるために０．２％の二酸化珪素と混合してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ＶＰＡは、組換え型ＨＤＡＣ酵素の活性を阻害する。  図１は、ＶＰＡが腫瘍に関連するクラスＩＨＤＡＣ酵素を優先的に阻害する（ＩＣ５０は、クラスＩＨＤＡＣ酵素について例示するとほぼ２００μＭである）が、クラスＩＩＨＤＡＣ酵素に対しては活性が弱いことを示す（ＩＣ５０は、クラスＩＩ酵素ＨＤＡＣ８について例示するとほぼ１．１ｍＭである）。これらのデータに関して注目すべき重要なことは、第Ｉ相臨床試験において得られた薬力学データから、ガン患者でのＶＰＡの血清濃度が、該当するクラスＩイソ酵素を成功裏に阻害するのに充分であることが明らかになったことある。これに対して、クラスＩＩＨＤＡＣ酵素の阻害に必要なＶＰＡの濃度は、防止・回避することが出来るのである。このことは、クラスＩＩ酵素の阻害が心毒性を惹起するものと考えられるため、非常に望ましいプロファイルである（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、２００２、１１０：４７９−４８８；Ａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＪＢＣ、２００３、２７８：２８９３０−７）。
【図２】ＶＰＡの血清中濃度とヒストン過アセチル化との間の相関関係。  図２は、進行した悪性疾患に罹患した患者に対してＶＰＡを静脈内投与したて行った第Ｉ／ＩＩ相臨床試験の結果を示す。ＶＰＡ治療の薬効の標識の一つとしてのヒストン過アセチル化誘導（誘導倍率として示す）は、ＶＰＡ治療の開始前及び開始後６時間、２４時間及び４８時間後に患者から採取した抹消血細胞で検査した。ＶＰＡの血清ピーク濃度（μｇ／ｍｌ単位で表示）とヒストン過アセチル化との明瞭な相関関係が、認められた。
【図３】ＶＰＡは、ヒストン過アセチル化と第Ｉ／ＩＩ相臨床試験の患者からの末梢血中の標識遺伝子の調節・制御を誘導する。  図３は、ＶＰＡを静脈内投与した、第Ｉ／ＩＩ相臨床試験のスコープに包含される、進行悪性疾患の患者二名（患者＃１及び患者＃２）から採取した抹消血細胞の溶解液について行ったウェスタンブロット分析を示す。血液試料は、ＶＰＡ治療の開始前及び開始後６時間、２４時間と４８時間に患者から採取した。ヒストンＨ３及びＨ４の過アセチル化及び標識タンパク質ＨＤＡＣ２のダウンレギュレーションは、血清濃度が治療血漿濃度を上回る患者において検出することが出来た。
【図４】ＰＣ３マウス異種移植モデル。  図４は、マウスＰＣ３異種移植モデルから得られた結果を示す。  ２４匹の胸腺欠損Ｎｕ／Ｎｕ-1-マウスに、１００μｌＰＢＳ（燐酸緩衝液）中１×１０６個のＰＣ３前立腺ガン細胞を右側腹部内（１群は８匹の動物）に注入した。腫瘍を４日間増殖させた。動物にＰＢＳ（対照）、２×２００ｍｇ／ｋｇ／ｄ又は２×４００ｍｇ／ｋｇ／ｄをそれぞれ、ｄａｙ５からｄａｙ２１に投与した。腫瘍体積を３−４日毎に測定した。この場合でもやはり、有益な抗腫瘍効果を得るためには、幾つかの閾値量を投与する必要があることが明らかになった（マウスに４００ｍｇ／ｋｇ／ｄを一日当たり２回投与した場合、＞２５％まで腫瘍は減縮したが、２００ｍｇ／ｋｇ／ｄを一日当たり２回投与したマウスにおいては、抗腫瘍効果は認められなかった）。
【図５】種々のＶＰＡ製剤により誘導されるヒストン過アセチル化。  図５は、“急速放出”（“ＶＰＡ“通常””−Ａ）、“緩徐放出” （“ＶＰＡ“遅延”“−Ｂ）及び新規な二相性薬力学的プロファイル（“ＶＰＡ  ＰＥＡＣ“−Ｃ）におけるＶＰＡ血清濃度の企図された経時変化を例示するものである。“急速放出”（Ａ）、“緩徐放出”（Ｂ）、又は新規な二相性薬力学的プロファイルＰＥＡＣ（Ｃ）を代表するＶＰＡを用いて表示した時間（ｈｒｓ）に処理した２９３Ｔ細胞の溶解液を、抗−ヒストンＨ３抗体を用いたウェスタンブロッティング分析法で分析した。比較した結果、“急速放出”製剤又は“緩徐放出”製剤をそれぞれ単独で用いた場合、本明細書で記載した新規な二相性薬物製剤における双方の放出特性を組み合わせた概念である、ＰＥＡＣの活性と比較してヒストン過アセチル化誘発度に関しては効果は低くなる。
【図６】Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ及びＰＣ−３細胞株の間欠（インターバル）処理。  図式６Ａは、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ及びＰＣ−３細胞株のＶＰＡ処理のスケジュールを記述するものである。細胞はいずれも、１ｍＭのＶＰＡを用いて“急速放出”のＶＰＡ製剤の代表して処理なし間隔を４０時間として２×８時間の処理を行い（“８ｈ  ｄ”）、また“緩徐放出”製剤を代表して処理なし間隔を２６時間として２０時間に２回処理を行い（“２０ｈ  ｄ”）、又はＰＥＡＣの概念に従った新規な二相性化合物放出プロファイルを用いて実現可能な血清濃度を代表して６６時間の連続処理を行った（“連続的”）。  図式６Ｂは、図式６Ａで述べたスケジュールに従って処理したＣｏｌｏ３２０ＤＭ及びＰＣ−３細胞株について行ったＳＲＢ試験の結果を示す。２×８時間（“８ｈ  ｄ”）曝露を行った結果、増殖阻害は僅か２６％（ＰＣ３）及び２７％（Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ）に留まったのに対して、一方２×２０時間（“２０ｈ  ｄ”）曝露したところ、増殖阻害は、ＰＣ３の細胞では４３％またＣｏｌｏ３２０ＤＭの細胞では５７％にまでそれぞれ増大した。最大の増殖阻害は、長期間に亘って二相性化合物放出プロファイルを用いて達成・実現される可能性がある治療有効血清濃度を代表するＶＰＡに連続して曝露した場合に認められており、ＰＣ３の細胞で８０％またＣｏｌｏ３２０ＤＭの細胞で８０％の増殖阻害であった(“連続的処理”)。
【図７】本発明に従った製剤についての典型的なインビトロ放出プロファイルを示す。  医薬製剤は、実施例３に記載した通りに製造した。インビトロ放出プロファイルは、１００ｒｐｍにおけるｐＨ６．８緩衝液ＵＳＰ９００ｍｌ中においてＵＳＰ２４、方法７２４、装置２に従って測定し、決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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