(57)【要約】  本発明は心臓血管疾患に関連した哺乳動物由来のサンプルの解析のためのインビトロでの方法に関し、該方法はa)骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来血中前駆細胞（BDPs）を細胞特異的な表面マーカーで単離し、b)単離されたBMPsおよび／または BDPsの心臓血管機能性を適切な遊走性アッセイによって決定するステップからなる。本発明の方法を心臓血管疾患の診断および／または予後に関するキットとして使用すれば、これら疾患への療法をモニタリングすること、および／または虚血組織への灌流を増大するまたは組織欠損部分（たとえば心不全）を再生する目的で幹細胞および／または前駆細胞による有望な細胞療法の患者を層別化すること、がそれぞれ可能になる。別の態様として本発明は、適切な遊走性アッセイにより特定の骨髄前駆細胞（BMPs）を単離するインビトロの方法に関する。本発明によりこれらのBMPsおよび／またはBDPsを使用すれば、安定な冠動脈疾患、急性冠症候群、急性心筋梗塞、慢性虚血心筋症（ICMP）、拡張型心筋症（DCM）または心不全の他の誘因からなる群から選択される心臓血管疾患の治療が可能である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓血管疾患に関連した哺乳動物由来のサンプルを解析するインビトロでの方法であって、前記方法が下記のステップ：
ａ）骨髄前駆細胞（BMP）および／または血液由来血中前駆細胞（BDP）を細胞特異的な表面マーカーで単離し、および
ｂ）単離されたBMPおよび／または BDPの心臓血管機能性を適切な遊走性アッセイ（migration assay）によって決定する、
を含む方法。
【請求項２】
サンプルから得た調査結果を基準値および／または基準サンプルの結果と比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
調査するサンプルがヒト由来である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
調査するサンプルが骨髄、末梢血またはその分画および細胞培養懸濁液またはその分画からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
凝固阻害物質、特にヘパリンまたはEDTAが末梢血に加えられる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
調査するサンプルが骨髄からの穿刺によって得られる請求項４に記載の方法。
【請求項７】
単離が密度勾配遠心分離法、細胞特異的表面マーカーおよび／または免疫学的方法を使用することによって行われる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
単離がFACSまたは免疫磁気分離法を使用することによって行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
BMPの細胞特異的表面マーカーがCD34、CD45および／またはCD133から選択され、BDPのそれがVEGFR2、CD105、vWFおよびCD31から選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
遊走性アッセイ（migration assay）がボイデンチャンバーまたは修正ボイデンチャンバーにおいて実施される請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
遊走性アッセイ（migration assay）がSDF-1、VEGF、SDF-1またはP1GFまたはMCP-1を使用することによって実施される請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
心臓血管疾患が、安定および不安定な狭心症、安定な冠状動脈心臓病、急性冠症候群、心筋梗塞、急性心筋梗塞、急性心症候群、冠動脈疾患、慢性虚血心筋症（ICMP）、拡張型心筋症（DCM）、心不全、または心臓病弱のほかの誘因からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該方法が哺乳動物への細胞注入の直前に実施される請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
調査され単離されたBMPおよび／またはBDPが、該哺乳動物の自己由来および／または異種由来である請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実施する手段を、任意に選択する追加の成分および／または賦形剤と共に含む診断キット。
【請求項１６】
心臓血管疾患を診断および／または予知すること、それら疾患への療法をモニタリングすること、および／またはBMPsまたはBDPsの心臓血管機能性を測定し、虚血組織での灌流を増大するまたは特に心不全における組織欠損部分を再生するために幹細胞および前駆細胞による有望な細胞療法の患者を層別化すること、および／またはBMPsまたはBDPsの心臓血管機能性を改善するために患者のそれらを予め生体外処理し、その利益を後に受ける患者を細胞の再移植の前に同定すること、を目的とする請求項１５に記載のキットの使用。
【請求項１７】
特異的骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来血中前駆細胞（BDPs）を単離するインビトロの方法であって、下記のステップからなる方法：
ａ） ドナー哺乳動物からサンプルを採取する、
ｂ） このように入手したサンプルからBMPsおよび／またはBDPsを単離する、および
ｃ） 単離されたBMPsおよび／またはBDPsの心臓血管機能性を、適切な遊走性アッセイ（migration assay）によって決定する。
【請求項１８】
調査するサンプルがヒト由来である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
調査するサンプルが骨髄、末梢血またはその分画および細胞培養懸濁液またはその分画からなる群から選択される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
調査するサンプルが骨髄からの穿刺によって得られる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
単離が密度勾配遠心分離法、細胞特異的表面マーカーおよび／または免疫学的方法によって行われる、請求項１７〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
単離がFACSまたは免疫磁気分離法を使用することによって行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
BMPの細胞特異的表面マーカーがCD34、CD45および／またはCD133から選択され、BDPのそれがVEGFR2、CD105、vWFおよび／またはCD31から選択される、請求項１７〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
遊走性アッセイ（migration assay）がボイデンチャンバーまたは修正ボイデンチャンバーにおいて実施される請求項１７〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
遊走性アッセイ（migration assay）がSDF-1、VEGF、SDF-1またはP1GFまたはMCP-1を使用することによって実施される請求項１７〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
単離されたBMPおよび／またはBDPに、とくに該細胞の心臓血管機能性を改善するためにさらに遺伝子的修飾を加える請求項１７〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
請求項１７〜２６のいずれかの記載によって産生される特定の骨髄前駆細胞（BMP）または血液由来血中前駆細胞（BDP）。
【請求項２８】
単離されたBMPsおよび／または単離されたBDPsが該哺乳動物の自己由来および／または異種由来である、請求項２７に記載の特定の骨髄前駆細胞（BMP）または血液由来血中前駆細胞（BDP）。
【請求項２９】
医薬組成物を製造する方法であって、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法、およびさらに通常の医薬的に受容可能な担体および／または希釈剤と混合することによって前記医薬組成物を製剤化することを含む方法。
【請求項３０】
製剤化が、スタチン、特にアトルバスタチン、VEGFおよび／またはエリスロポイエチンと混合することをさらに含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２９または３０によって製造される医薬組成物。
【請求項３２】
安定および不安定な狭心症、安定な冠状動脈心臓病、急性冠症候群、心筋梗塞、急性心筋梗塞、急性心症候群、冠動脈疾患、慢性虚血心筋症（ICMP）、拡張型心筋症（DCM）、心不全、または心臓病弱のほかの誘因からなる群から選択される心臓血管疾患の治療のための、請求項２７または２８に記載の特定のBMPおよび／またはBDPまたは請求項３１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３３】
該治療が細胞の哺乳動物への注入を含む請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
該治療がスタチン、特にアトルバスタチン、VEGFおよび／またはエリスロポイエチンの投与をさらに含む請求項３２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は心臓血管疾患に関連した哺乳動物由来のサンプルを解析するためのインビトロでの方法に関し、該方法はa)骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来血中前駆細胞（BDPs）を細胞特異的な表面マーカーで単離し、b)単離されたBMPsおよび／または BDPsの心臓血管機能性を適切な遊走性アッセイ（migration assay）によって検出するステップからなる。本発明の方法を心臓血管疾患の診断および／または予後に関するキットとして使用すれば、これら療法をモニタリングすること、および／または虚血組織への灌流を増大するまたは組織欠損部分（たとえば心不全）を再生する目的で幹細胞および／または前駆細胞による有望な細胞療法の患者を層別化すること、がそれぞれ可能になる。別の態様として本発明は、特定の骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来血中前駆細胞（BDPs）を単離するインビトロの方法に関し、a)哺乳動物ドナーからサンプルを採取する、b)このようにして入手したサンプルからBMPsおよび／またはBDPsを細胞特異的な表面マーカーにより単離し、c)単離したBMPおよび／またはBDPの心臓血管機能性を適切な遊走性アッセイで検出することを含む。本発明によりこれらのBMPsおよび／またはBDPsを使用すれば、安定な冠動脈疾患、急性冠症候群、急性心筋梗塞、慢性虚血心筋症（ICMP）、拡張型心筋症（DCM）または心不全の他の誘因からなる群から選択される心臓血管疾患の治療が可能であり、とりわけ医薬組成物中に存在可能である。
【背景技術】
【０００２】
梗塞後の心不全は、依然として罹患率と死亡率の主要原因である。閉塞した動脈を直ちに再灌流すれば死亡率は有意に低下するが（Lange RA, Hillis LD  急性心筋梗塞における再潅流療法Reperfusion therapy in acute myocardial infarction. N EngI J Med. 2002:346:954-5.（非特許文献１））、心室の再造形手技は梗塞領域の進行性拡大と左心室腔の拡張を特徴とするので、相当数の患者は急性心筋梗塞を生き延びたものの心不全を発症する（Pfeffer MA, Braunwald E  心筋梗塞後の心室再造形。実験観察と臨床上の意義（Ventricular remodeling after myocardial infarction. Experimental observations and clinical implications）. Circulation. 1990:81:1161 -72.（非特許文献２））。再造形箇所の復元には梗塞領域内での新血管形成の刺激ならびに心筋細胞再生の増強が主な目標である。
【０００３】
特定の骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来血中前駆細胞（BDPs）を移植すると急性心筋梗塞後の再生が改善することが最近の実験と臨床研究により示されている（Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H, Yamaguchi Jl, Uchida S, Masuda H, Silver M, Ma H, Kearney M, Isner JM, Asahara T.生体外で拡大した内皮前駆細胞の心筋虚血に対する治療潜在性（Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia）. Circulation. 2001; 103:634-7.（非特許文献３）, Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ, Takuma S, Burkhoff D, Wang J, Homma S, Edwards NM, Itescu S. ヒト骨髄由来血管芽細胞による虚血心筋の新血管形成が心筋細胞のアポトーシスを防止し、再造形を低減し心機能を改良する（Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function）. Nat Med. 2001:7:430-6.（非特許文献４）, Fuchs S, Baffour R, Zhou YF, Shou M, Pierre A, Tio FO, Weissman NJ, Leon MB, Epstein SE, Kornowski R. 自己骨髄の経心内膜送達が実験的慢性心筋虚血を有する豚の副行灌流および局所機能を増強する（Transendocardial delivery of autologous bone marrow enhances collateral perfusion and regional function in pigs with chronic experimental myocardial ischemia）. J Am Coil Cardiol. 2001;37:1726-32.（非特許文献５））。したがって骨髄系幹細胞／前駆細胞による細胞療法は、虚血性心疾患における新血管形成ならびに心機能を改良する新規の選択肢である。実際、急性心筋梗塞の患者における成人前駆細胞の冠動脈内注入が可能で安全であり、かつ局所および全体のLV（左心室）の機能の有意な改良に関連していることを示すことができた。それにもかかわらず、注入して改良する特定の状況が明らかにされていない。加えて、骨髄幹細胞／前駆細胞による細胞療法を目的としてこれを有効にするには、移植した骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来血中前駆細胞（BDPs）によって最大級の再生能、したがって有効性が確実に発揮される必要がある。
【非特許文献１】N EngI J Med. 2002:346:954-5.
【非特許文献２】Circulation. 1990:81:1161 -72.
【非特許文献３】Circulation. 2001; 103:634-7.
【非特許文献４】Nat Med. 2001:7:430-6.
【非特許文献５】J Am Coil Cardiol. 2001;37:1726-32.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって本発明の目的は、心臓血管疾患の診断および／または予後のための改良された方法の提供であり、その方法によりこれら疾患への療法をモニタリングし、および／または虚血組織への灌流を増大するまたは例えば心不全における組織欠損部分を再生する目的で骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来血中前駆細胞（BDPs）に基づく有望な細胞療法の患者を層別化することである。
【０００５】
本発明のさらなる目的は、細胞療法に有効でかつ適切な骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来血中前駆細胞（BDPs）を同定し単離することのできる、安全な方法を提供することである。
【０００６】
最後に、本発明のさらなる目的は、細胞療法に適切であり本発明によって単離した骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来血中前駆細胞（BDPs）を含む医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第一の態様によれば、本発明の1の目的は心臓血管疾患に関連した哺乳動物由来のサンプルを分析するインビトロ方法によって解決され、本発明の該方法は、a)骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来血中前駆細胞（BDPs）を細胞特異的な表面マーカーで単離し、そしてb)単離されたBMPsおよび／またはBDPsの心臓血管機能性を適切な遊走性アッセイで決定し／検出するステップを含む。
【０００８】
驚いたことに、新血管形成の能力と、骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来血中前駆細胞（BDPs）の遊走能との間にある関係が存在することが判明した。このため遊走性アッセイは、心臓血管疾患に関連した哺乳動物由来のサンプルを分析するのに有用なツールとして使用することができる。
【０００９】
さらに、驚いたことに、一部のドナーおよび／または心発作の患者由来の骨髄に存在し得る機能不全により、その骨髄から直接採取可能な細胞（たとえばBMPs、穿刺による）が新規の血管を形成し心臓の再生を支援する機能に制限を受けている可能性があることが判明した。本発明によるアッセイによりこれらのドナーを効果的に除外することが可能であるとともに、新血管形成の能力に劣る高リスクの患者を同定可能である。したがってこれらの患者を適切に治療でき、とりわけ予防および／または支援する様式で治療可能である。あるいは、前駆細胞療法の高い利益を受ける筈の患者をこれらのアッセイで同定することも可能である。
【００１０】
本発明において、BMPsおよび／またはBDPsの上記の特徴はいずれも「心臓血管機能性」として理解される。
【００１１】
Vasaら（Vasa M. et al., Circ Res 2001 Jul 6;89(1):E1-7）は、血中内皮前駆細胞（EPCs）の数と遊走活性は冠動脈疾患（CAD）の危険因子と逆の相関にあると述べている。冠動脈疾患の患者のEPCsは機能障害を示す。EPCsの機能活性は、ボイデンチャンバーの遊走アッセイによる遊走能（「走化因子（chemo attractant）」としてのVEGFの方向への遊走）に基づいて試験される。出生後の新血管形成は骨髄由来血中前駆細胞（EPCs）に関与しており、この細胞が由来する造血幹細胞は細胞表面マーカーCD34、または成熟度の低い細胞ではCD133を特徴としている。CD34+細胞はマウスモデルの虚血領域にコロニー形成し、実験でCD34+細胞を注入すると新血管形成を促進し、これらの複数のマウスにおいて心機能を改善する。さらに、CAD（冠動脈疾患）の患者のEPCsの数と機能活性を健常人との比較で調査し、危険因子がEPCsの数と機能活性に与える影響も調査した。CADの患者におけるCD34+ KDR+（= VEGF受容体）二重陽性細胞の数は、健常人と比較して著しく低いが、それにもかかわらずCD34+または分化の低いCD133+細胞の総数は患者と健常人の間で相違はない。EPCsの遊走能力はCADの患者において低減する。VasaらはEPCsの活性が低下すればそれはCADの患者における新血管形成の低下に貢献し得るだろうと示唆している。それにもかかわらず、骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来の血中前駆細胞（BDPs）の解析に基づいた患者の層別化の可能性についての言及はない。
【００１２】
さらに、Vasaら（Vasa M. et al., Circulation, 2001 Jun 19;103(24):2885-90）は、安定したCADの患者におけるスタチン療法による血中内皮前駆細胞（EPCs）の増加について記述している。これによれば、EPCsによる新血管形成はスタチンによって維持されている。EPCsの機能活性は遊走性アッセイによって検出された。それにもかかわらず、骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来の血中前駆細胞（BDPs）の解析に基づいた患者の層別化の可能性についても言及がない。
【００１３】
Emersonら（in Circulation 2003, 107, 2294-2302）は、多能性幹細胞は心筋細胞と内皮細胞に分化可能であると記述している。したがって、これらの細胞は虚血性心疾患における心機能と灌流を改良することができる。よって骨髄細胞を注入カテーテルによって患者の心筋に安全に注入可能かどうかが調査された。さらに、進行状態にある冠動脈性心臓病の患者の左心腔の虚血領域に自己単核骨髄細胞を直接注入するとの記述がある。前駆細胞は密度勾配遠心分離法によって骨髄から単離され、異なる細胞表面マーカーに基づくFACS解析を使用して特徴付けられたが、分別されなかった。したがって、明細書の表3によれば、造血前駆細胞は注入された細胞の中の少量画分に過ぎず（約2.5%）、主要部分はT細胞およびB細胞ならびに単核細胞により形成されている。造血前駆細胞CD34+ CD45lo細胞またはCD133+ CD45lo細胞がそれぞれ記述されている。単核骨髄細胞について「増殖率」と「クローン原性」を調べた。骨髄細胞をヘパリンと5%ヒト血清アルブミンの入った生理的食塩水に注入している。それにもかかわらず、骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来の血中前駆細胞（BDPs）の解析に基づいた患者の層別化の可能性については言及されていない。さらに、内皮前駆細胞は単離されておらず、使用した全単核骨髄細胞はさらに分画されていない。
【００１４】
Kawamotoら（Circulation 2003,107, 461-468）は、末梢血由来の内皮前駆細胞（EPCs）がCD34+単核細胞として単離できると記述している。虚血性疾病において、骨髄由来のEPCsは移動して初期の心血管新生の領域にコロニー形成し、成熟内皮細胞に分化する。そこで、前駆細胞を直接心筋に移植した場合に、虚血組織における新血管形成が促進されるかどうか調査された。自己前駆細胞を心筋に直接注入すると、豚の虚血モデルにおいて新血管形成が増大した。さらに、ヒト前駆細胞をラットの虚血心臓部分に異種間注入した。このために、ヒト単核細胞CD34+末梢血細胞をEPC強化細胞分画として使用されている。
【００１５】
Aicherら（Circulation 2003, 107, 2134-2139）は、ラットに注入された後の放射活性物質で標識したEPCsの様々な組織におけるコロニー形成について記述している。このために該論文に記述されているシステムでは、健常ドナー由来のヒトEPCsが、事前に梗塞を手術的に誘発したラットまたは梗塞のない対照動物に異種間移植された。EPCsの単離は開示されておらず、CD34+末梢血細胞としての分類についての言及はない。細胞は培養され、すなわち拡大され、続いて111インジウムオキシンで放射性活性標識して、注入後のアクセプター生物におけるEPCsの分布の調査を可能とした。放射性活性標識後の細胞の「機能性能力」が、標識されていない細胞と異なるかどうかも調査された。「機能性能力」は遊走測定を使用して、すなわち細胞の成長因子VEGFの方向への遊走に基づいて調査した。注入された全細胞の僅か約1%が心臓内にコロニーを形成していることが示された。したがって当業者は、EPCsの遊走能力は標的組織における、またおそらく梗塞の領域における、細胞のコロニー形成に関連していると推測する。それにもかかわらず、該論文では非標識細胞を基準として使用しているので、この「品質管理」を非放射性標識細胞で実施することは明らかではなかった。
【００１６】
最後に、Wolfrumら（Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003, 23, 729-736）が、スタチンが内皮細胞におよぼす影響について一般的に記述している。
【００１７】
本発明による方法は、調査したサンプルから得られた結果を、基準値および／または基準サンプルの結果と比較することをさらに含むことが望ましい。このような基準値は、療法の進行中に個々に治療すべき患者から得るか、または大規模研究の結果のいずれかである。一般に、基準値はいわゆる健常な対照群から得られる。当業者は適切な研究プロトコルを容易に選択して適切な基準値を得ることができる。
【００１８】
本発明による方法では、調査するサンプルはヒトから採取されるのが望ましい。したがって、調査するサンプルを骨髄、末梢血またはその分画および細胞培養懸濁液またはその分画からなる群から選択され得る。個々のサンプルの選択は、調査する前駆細胞と前駆細胞の特徴を決定する方法に依存する。さらに好ましくは、採血時に凝固阻害物質、特にヘパリンまたはEDTAが末梢血に加えられる。これにより追加の処理ステップが容易となる。本発明のさらなる態様において、調査するサンプルは穿刺により骨髄から得られる。この採取はBMPを獲得するベースとなる。本発明のさらなる処理には、密度勾配遠心分離法および／または免疫学的方法、たとえば、特にFACSを使用した免疫磁性法、を使用することによる単離が含まれ得る。したがって、本発明によれば、BMPのための選択された特定表面マーカーはCD34、CD45、および／またはCD133から選択され、BDPのための選択された特定表面マーカーはVEGFR2、CD105、vWFおよび／またはCD31から選択されることがさらに望ましい。
【００１９】
本発明の好ましい方法によれば、遊走性アッセイはボイデンチャンバーまたはその修正バージョンにおいて実施される。それにもかかわらず、遊走能力を決定するさらなる方法を本発明の範囲を逸脱することなく使用可能であることは当業者には自明である。このことは特に、測定の自動化および／または「ポイントオブケア」アッセイの実現のいずれかに適用される遊走性アッセイの態様例に関連する。
【００２０】
特に好ましくは、本発明による方法では、SDF-1またはVEGFをBMPまたはBDPに対する走化因子として使用することによって遊走性アッセイが実施される。ここに記載の実験から分かるように、SDF-1はBMPに対する好ましい刺激物質であり、VEGFはBDPに対する刺激物質である。さらにP1GFまたはMCP-1も使用できる。
【００２１】
Voermansらは、造血前駆細胞（CD34(+)細胞）のSDF-1によって誘引される泳動の役割ならびにそれぞれの遊走性アッセイについて記述している（Voermans C, et al. Exp Haematol 2001 Dec;29(12):1456-64）。
【００２２】
細胞療法を成功させる前提条件は、いわゆる「ホーミング」すなわち特に血管内投与を選択した場合、細胞が所望の標的領域にコロニー形成するための標的遊走である。したがって発明者らは、成人前駆細胞のそれらの生理学的走化因子の方向への遊走能が、梗塞領域へ遊走するそれらの能力を反映し得ると想定した。実際、移植された細胞の罹患組織への遊走およびヒト前駆細胞の静脈内注入により誘発された新血管形成の改良は、SDF-1により誘引されるBMPの遊走能ならびにVEGFにより誘引されるBDPの遊走能と強く相関している。それにもかかわらず、実証されていない仮定であって、本発明に関連して実施した実験によってのみ確認された。さらに、この遊走能が独立の予測因子として適切であるので、それに基づいた診断がCADの治療を改良するであろうことは予想外であった。要約すれば、注入された前駆細胞の機能活性に相関して局所収縮性の心筋機能が改良されることから、前駆細胞の遊走能と急性心筋梗塞の患者における細胞療法の成功の間の因果関係は明らかである。したがって本発明は、心臓血管疾患の患者における細胞療法の改良／最適化を可能にする新規の診断方法を開示する。本方法は、前駆細胞の機能活性の測定に基づき、個々の患者が破壊され損傷を受けた心筋組織の再生のための細胞療法（自身の前駆細胞の移植）の恩恵を得るかどうか、または標的組織にコロニー形成する能力が細胞に不足しているためにこの療法の成功の見込みがないかどうかを高い信頼性で予測可能とする。
【００２３】
本発明による方法をすべての心臓血管疾患の診断および／または療法に採用すれば、前駆細胞の移植による治療上の利点が常に期待できる。本発明による方法は好ましくは、安定なおよび不安定な狭心症、安定した冠状動脈心臓病、急性冠症候群、心筋梗塞、急性心筋梗塞、急性心症候群、冠動脈疾患、慢性虚血心筋症（ICMP）、拡張型心筋症（DCM）または心不全のほかの誘因からなる群から選択される心臓血管疾患に用いられる。
【００２４】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の方法は哺乳動物への細胞注入の直前に実施可能である。記述の通り、本発明による測定により新血管形成能力が劣るドナーを効率よく除外可能で、同時に高リスクの患者を同定可能である。次いでこれらの患者は適切に、特に予防的および／または支援的に治療可能である。あるいは、前駆細胞療法からさらなる利益を享受可能な患者を同定可能である。本発明によるこの方法のさらなる態様において、この方法が治療に関する場合には、単離し試験するBMPおよび／またはBDPは治療を受ける患者、特に哺乳動物にとって自己由来および／または異種由来である。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、本発明による前記の方法を実施する手段に加えて、さらなる適切なコンポーネントおよび／または賦形剤を含む診断キットに関する。キットは1または数個の分離されたコンテナからなることができる。特に、適切なコンポーネントは基準値に基づいて測定結果を整理するためのマニュアルまたはカラーチャートであることができる。
【００２６】
本発明によれば、該キットは好ましくは心臓血管疾患の診断および／または予後、疾患の治療のモニタリングおよび／またはたとえば心不全における虚血組織の灌流の改善または組織欠損部分の再生を目的として幹細胞および前駆細胞による有望な細胞療法の患者を層別化するのに使用される。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、特定の骨髄前駆細胞（BMPs）および／または血液由来血中前駆細胞（BDPs）を単離するためのインビトロでの方法に関し、該方法はa)哺乳動物ドナーからサンプルを採取する、b)このようにして入手したサンプルから（BMPs）および／または（BDPs）を細胞特異的な表面マーカーにより単離し、c)単離したBMPsおよび／またはBDPsの心臓血管機能性を適切な遊走性アッセイ法で決定する ことからなる。本発明によれば、好ましくは調査するサンプルは哺乳動物、とりわけヒトから採取される。
【００２８】
既に述べたように、本発明による方法は、ドナーから採取したすべての幹細胞集団および前駆細胞集団に使用可能であって、それらの集団が適切なBMPsまたはBDPsを含有している限りサンプルを入手した態様には関係しない。本発明による方法は、調査するサンプルが骨髄、末梢血またはその分画および細胞培養懸濁液またはその分画からなる群から選択されることが望ましい。本発明による方法は、調査するサンプルが適切な態様で骨髄から入手されることが特に望ましい。調査するサンプルは、穿刺により骨髄から入手することが望ましい。
【００２９】
採取中に種々な前駆細胞の異種混合物が主に得られるとの事実から、本発明による好ましい方法は密度勾配遠心分離法および／または免疫学的方法による単離を含む。単離のための特に好ましい方法は、FACSまたは免疫磁気分離法を使用して行なわれ、この場合細胞特異的表面マーカーはBMPについてはCD34、CD45および／またはCD133から、BDPについてはVEGF2、CD105、vWFおよび／またはCD31から選択される。
【００３０】
既に述べたように、本発明のさらなる態様において、遊走性アッセイはボイデンチャンバーまたはその修正バージョンにおいて実施される（上記参照）。この場合も遊走性アッセイに使用する走化因子はSDF-1、VEGF、P1GFまたはMCP-1であることが望ましい。
【００３１】
本発明の本質的な態様は、特定のドナーより入手した前駆細胞の心臓血管機能性の測定である。細胞療法のための入手した前駆細胞の有用性と効率に関して、本発明による方法から得た所見に基づいてこの療法を個々の患者別に調整することができる。既に上記に示したように、特定のドナーまたは患者の骨髄、特にICMBの患者においては、前駆細胞の心臓血管機能性に影響を与える機能不全が存在すると想定される。特定のケースにおいてこれらの機能的な障害を「補償する」ことができるように、本発明がさらなる態様として提供する方法では、単離されたBMPsおよび／またはBDPsを、細胞の心臓血管機能を改良する目的の遺伝子的修飾を加える。BMPsおよび／またはBDPsを修飾するための方法およびそれに適切な遺伝子構築物は当事者には公知で、当業者によって容易に作成かつ使用可能である。一部の患者における心臓血管機能性の障害の正確な遺伝的機序は不明であるが、本発明の実験結果によればこれらのドナー由来の前駆細胞は遊走性が損なわれていた。これらの障害を補償するアプローチとしては、前駆細胞にそれぞれの走化因子に特異的な受容体（特にBMPに対するSDF-1およびBDPに対するVEGF）を形質導入することであろう。したがってアプローチの一つはBMPにCXCR4の発現構築物またはCXCR4の調節に影響する構築物を形質導入することであって、その結果、障害のあるBMPsに存在するCXCR4はダウンレギュレートされると想定された。もう一つのアプローチはインテグリン、たとえばCD49a等の因子、たとえばVCAM-1またはそれと相互作用する因子の修飾であろう。
【００３２】
したがってさらなる態様は、本発明の上記の方法で作成された特定の骨髄前駆細胞（BMP）または血液由来血中前駆細胞（BDP）に関する。本発明によるこれら特定の骨髄前駆細胞（BMP）または血液由来血中前駆細胞（BDP）は、哺乳動物／患者（すなわち、それぞれのアクセフプター）にとって自己（自身）由来のおよび／または異種（外来）由来の単離されたBMPsおよび／または単離されたBDPsとして存在可能である。細胞の混合物も当然可能である。
【００３３】
既に述べたように、単離されたBMPsおよび／または単離されたBDPsは細胞療法に関連して使用可能である。したがって本発明のさらなる態様は医薬組成物の製造の方法に関し、その方法は、まず上記した本発明方法、および更に通常の医薬的に受容可能な担体および／または希釈剤と混合することによって医薬組成物を製剤化することを含む。それぞれの適切な担体および／または希釈剤は当業者に公知であり、それぞれの特定の用途に容易に適合させることができる。好ましくは、前駆細胞は以前に移植したステントの向こう側に注入される。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、本発明によって産生された医薬組成物に関する。本発明による製剤は、さらに追加の医薬的活性物質と混合した状態で存在可能である。したがってアスピリン、クロピドゲル、ACE-阻害剤、ベータ遮断薬、スタチン、特にアトルバスタチン、エリスロポイエチンおよび／またはVEGFから選択される物質が好ましい。投与した前駆細胞の心臓血管機能性に消極的な影響を与えない限り、そのほかの物質も可能である。
【００３５】
最後に本発明は、本発明による特定のBMPおよび／またはBDPの使用または、安定なおよび不安定な狭心症、安定した冠状動脈心臓病、急性冠症候群、心筋梗塞、急性心筋梗塞、急性心症候群、冠動脈疾患、慢性虚血心筋症（ICMP）、拡張型心筋症（DCM）または心不全のほかの誘因からなる群から選択される心臓血管疾患の治療のための本発明による医薬組成物に関する。したがって本発明による好ましい使用方法での治療には細胞を哺乳動物へ注入することを含む。したがって上記のように、そのほかの医薬的活性物質の投与も可能で、特に好ましい治療ではスタチン、特にアトルバスタチン、VEGFおよび／またはエリスロポイエチンの投与が含まれる。
【００３６】
発明者らが最近行なった実験によれば、CADの患者の前駆細胞の遊走能は、後肢虚血後に複数のヌードマウスへの移植後の新生血管の改善との非常に強い相関を示した（r = 0.783; p = 0.001: n = 11）。したがって、発明者らは、移植された前駆細胞の機能特性を4ヵ月後の効果の定量的結果と関連付けるために、急性心筋梗塞の患者への冠動脈内注入の直前に移植された前駆細胞の遊走能の測定に専念した。その結果、注入された前駆細胞の遊走能により、LV心室のポンピング機能の改善と梗塞の大きさの減少が予測されることが示され、前駆細胞の遊走能と損傷した心筋のある急性心筋梗塞の患者における細胞療法後の心機能の再生との間に因果関係のあることが示唆された。
【００３７】
このように本発明は、移植された前駆細胞の機能性能力が局所的左心室機能の移植後改善を決定する主要な独立要因であり、それにより冠動脈内細胞移植に続く梗塞領域の減少が予測されることを初めて示した。興味深いことに、細胞の遊走能で決まる細胞の機能活性は細胞数よりずっと有益な情報となった。要約すれば、これらのデータは心筋障害の患者における前駆細胞療法と左心室のポンピング機能／心室再生の改善との間の因果関係を初めて示すものである。
【００３８】
これまでの実験による調査で、実験的に誘引された心筋梗塞に続く心室機能の改善は刺激を受けた血管新生によるもので、これが心筋血流量の増加による後期心筋の再造形、安静時心筋のレスキュー、心筋線維形成の減少と梗塞周囲領域における肥大性筋細胞のアポトーシスの低減に至ることを示唆した（Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H, Yamaguchi Jl, Uchida S, Masuda H, Silver M, Ma H, Kearney M, Isner JM, Asahara T.生体外で拡大した内皮前駆細胞の心筋虚血に対する治療潜在性（Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia）. Circulation. 2001; 103:634-7., Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ, Takuma S, Burkhoff D, Wang J, Homma S, Edwards NM, Itescu S. ヒト骨髄由来の血管芽細胞による虚血心筋の新血管形成が心筋細胞のアポトーシスを防止し、リモデリングを低減しそして心機能を改善する（Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function）. Nat Med. 2001:7:430-6., Takahashi T, Kalka C, Masuda H, Chen D, Silver M, Kearney M, Magner M, Isner JM, Asahara T.骨髄由来内皮前駆細胞が虚血およびサイトカインの誘引により遊走し新血管を形成する（Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization）. Nat Med. 1999:5:434-8., Murohara T, Ikeda H, Duan J, Shintani S, Sasaki K, Eguchi H, Onitsuka I, Matsui K, Imaizumi T. 移植臍帯血由来内皮前駆細胞が生後の新血管形成を増大する（Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization）. J Clin Invest. 2000:105:1527-36.）。さらに、BMPsの心筋内注入により収縮性心筋の有意量が再生するので、心筋の新規の生成により成人前駆細胞の局所投与に続く心筋梗塞出現が改善される可能性のあることが示唆された。実際、BDPsには機能性心筋細胞内へ分化転換する能力が残っていることを、最近発明者らは示すことができた（Badorff C, Brandes RP, Popp R, Rupp S, Urbich C, Aicher A, Fleming I, Busse R, Zeiher AM, Dimmeler S. 血液由来ヒト成人内皮前駆細胞の機能的に活性のある心筋細胞への分化転換（Transdifferentiation of blood-derived human adult endothelial progenitor cells into functionally active cardiomyocytes）. Circulation. 2003:107:1024-32.)。これはBMPs についても同様である(Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Jakoniuk I, Anderson SM, Li B, Picket J, McKay R, Nadal-Ginard B, Bodine DM, Leri A, Anversa P. 骨髄細胞が梗塞を起こした心筋を再生する（Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium）. Nature. 2001 ;410:701 -5.）。
【００３９】
明らかに本研究は、前駆細胞療法に続いて起こる改善された左心室の再造形プロセスに関連する細胞機序を開示することはできない。それにもかかわらず、後肢虚血の患者で実施された最近の研究で、前駆細胞の腓腹筋への筋肉注射が後肢灌流の有意な改善に至ることが示された（Tateishi-Yuyama E, Matsubara H, Murohara T, Ikeda U, Shintani S, Masaki H, Amano K, Kishimoto Y, Yoshimoto K, Akashi H, Shimada K, Iwasaka T, Imaizumi T. 骨髄細胞の自己移植による肢虚血の患者の治療的血管形成；試験的研究と無作為化対照試験（Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells）; a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 2002; 360: 427-35.）。前駆細胞の冠動脈内注入が標的領域の灌流指数の改善に関連していたとの事実と一致するので、これらのデータから、梗塞領域への前駆細胞のコロニー形成化が改善された新血管形成に至ることが可能で、これがLV拡張の減少および安静時心筋のレスキューによる収縮性能の維持、心筋線維形成の低減および梗塞周囲領域におけるアポトーシスの低減をもたらすことが可能である。さらに、遊走した前駆細胞は多数の血管新生成長因子を放出し、梗塞の境界における内生の新血管形成プロセスを増幅するのみならず、血中または組織定着の心臓前駆細胞を引き込む因子も放出して心筋の内在修復機序を増幅する。最後に、注入された細胞数によって後続の機能改善が予測されることはなかったが、定着した前駆細胞が多分機能的に活性の心筋細胞中に分化し、これにより収縮性心筋の有意量が再生に至るとの可能性を我々は排除できない。収縮性細胞と非収縮性細胞の移植を実験研究で比較したところ、心室収縮の改善は収縮性細胞に特異的に依存しており、一方心室拡張は細胞のタイプとは無関係に改善されることが示された（Hutcheson KA, Atkins BZ, Hueman MT, Hopkins MB, Glower DD, Taylor DA. 骨格筋形成術と線維芽細胞による細胞心筋形成術の心筋性能の利点の比較（Comparison of benefits on myocardial performance of cellular cardiomyoplasty with skeletal myoblasts and fibroblasts）. Cell Transplant. 2000;9:359-68., Sakai T, Li RK, Weisel RD, Mickle DA, Jia ZQ, Tomita S, Kirn EJ, Yau TM. 胎児細胞移植：3種類の細胞型の比較（Fetal cell transplantation: a comparison of three cell types）. J Thorac Cardiovasc Surg. 1999; 118:715-24.）。本研究では収縮機能が著しく改善したがこれは骨髄由来の血管芽細胞の移植に続く実験結果と一致している（Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ, Takuma S, Burkhoff D, Wang J, Homma S, Edwards NM, Itescu S. ヒト骨髄由来血管芽細胞による虚血心筋の新血管形成が心筋細胞のアポトーシスを防止し、再造形を低減し心機能を改善する（Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function）. Nat Med. 2001:7:430-6.）。
【００４０】
要約すれば本発明は、前駆細胞の遊走能が、細胞療法後の成人前駆細胞の冠動脈内注入に続く機能改善と梗塞領域の低減を予測するための主要な独立決定要因であることを開示する。さらに本発明により、虚血性障害に続く心臓の再生をさらに改善する目的で移植前の成人前駆細胞の機能性能力を改善することが可能である。
【００４１】
本研究のデータによれば、虚血性心筋症の患者の骨髄から単離された単核球には、インタラプト−後肢虚血を誘引した複数のヌードマウスにおける新血管形成を支援する活性が有意に低下していることが示される。したがって、BMPの機能活性は、ICMPの患者から単離したBMPのSDF-1上でのそれらのコロニー形成能力ならびにそれらの遊走応答から測定すると、有意に低減した。ICMPの患者由来のこれらのBMPsを後肢虚血のある複数のマウスに注入すると、大腿動脈の片側結紮後の後肢灌流を再構成する能力が有意に低下した。このことから機能活性が低下するとICMPの患者由来のBMPsが新血管を形成する可能性は制限されると結論できる。ICMPの患者由来のBMPsが機能障害すると、それら細胞による医学的細胞療法の治療可能性が制限される。前駆細胞が走化因子の濃度勾配に抗して虚血組織に遊走する必要のある血管内投与経路を使用する場合は特に制限される。治療前に前駆細胞の遊走とコロニー形成活性をモニタリングすることは、細胞療法から大きな利益を受けることのできる患者を同定する代わりを勤めることができる。一方、最近の実験研究により、複数の健常なドナーマウス由来の完全に機能するBMPsが障害のある新血管形成のマウスモデルにおいて加齢に関係した宿主心血管形成を再構成できることが示唆された。したがって、注入前に機能障害のあるBMPsを薬理学的に処理または遺伝子操作を加えることによりそれらの機能活性を改善し、したがってその療法から患者が得る治療的有用性を向上することが可能であるとの推測は魅力的である。
【００４２】
添付図面を参照しながら以下の実施例で本発明をさらに説明するが、本発明は必ずしもこれらに限定されるわけではない。図において：
【００４３】
図1は左心室の定量的血管造影を示したもので、循環血液由来（BDP）または骨髄由来（BMP）の前駆細胞の注入を受けた患者と非無作為化対照群の患者のベースライン時とフォローアップ時の駆出分画（A）、収縮末期および拡張末期の容量（B）を示している。
【００４４】
図2はベースライン時の左心室駆出分画と駆出分画の改善の相関を、全体の研究グループに対する回帰線と共に示したものである。
【００４５】
図3は患者の機能改善の平均値と梗塞の大きさの減少を示したもので、低または高遊走能を有する前駆細胞が示されている。
【００４６】
図4は健常な対照と安定な虚血性心筋症の患者由来のBMPにける前駆細胞マーカーのフローサイトメトリー分析を示したものである。aからcにおいて2群間の有意差は認められなかった。さらに、
【００４７】
図5は健常な対照と安定な虚血性心筋症の患者由来のBMPの機能活性を示したもので、14日後にaでは5 x 105 BMPs当たりのコロニー形成ユニットが検出された。bはストロマ細胞由来因子1（SDF-1）に対応するBMPsの遊走能である。cではBioCoat(R)侵襲アッセイを使用して測定した血管内皮増殖因子（VEGF）である。dはSDF-1誘引遊走とコロニー形成能力との間の相関で、eはVEGF誘引遊走とコロニー形成能力との間の相関を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】左心室の定量的血管造影を示したもので、循環血液由来（BDP）または骨髄由来（BMP）の前駆細胞の注入を受けた患者と非無作為化対照群の患者のベースライン時とフォローアップ時の駆出分画（A）、収縮末期および拡張末期の容量（B）を示している。
【図２】ベースライン時の左心室駆出分画と駆出分画の改善の相関を、全体の研究グループに対する回帰線と共に示したものである。
【図３】患者の機能改善の平均値と梗塞の大きさの減少を示したもので、低または高遊走能を有する前駆細胞が示されている。
【図４】健常な対照と安定な虚血性心筋症の患者由来のBMPにける前駆細胞マーカーのフローサイトメトリー分析を示したものである。
【図５】健常な対照と安定な虚血性心筋症の患者由来のBMPの機能活性を示したもので、14日後にaでは5 x 105 BMPs当たりのコロニー形成ユニットが検出された。bはストロマ細胞由来因子1（SDF-1）に対応するBMPsの遊走能である。cではBioCoat(R)侵襲アッセイを使用して測定した血管内皮増殖因子（VEGF）である。dはSDF-1誘引遊走とコロニー形成能力との間の相関で、eはVEGF誘引遊走とコロニー形成能力との間の相関を示す。
【実施例】
【００４９】
患者
急性ST上昇型の心筋梗塞を初回に発症し、GPIIb/IIIaブロッキングによる冠状動脈ステントで緊急処置された年齢18歳から75歳の患者が本研究に組み込まれた。除外基準は心原性ショック（収縮期血圧 ＜ 80 mmHgと定義され静脈内昇圧または大動脈内バルーンアンチパルスを必要とした）の存在、救急再灌流処置の後輸血を要する大出血、白血球減少症、血小板減少症、肝機能異常または腎機能異常の病歴、悪性疾患の徴候または参画意思なしとした。ヨハン・ウオルフガング・ゲーテ大学、フランクフルト、ドイツ、の倫理委員会によって本研究のプロトコルが実施の通り承認され、本研究はヘルシンキ宣言にしたがって実施された。それぞれの患者から書面によるインフォームドコンセントを入手した。
【００５０】
病院に提供された注意の基準を反映した内部基準グループとして、ステント移植による救急再灌流治療が行なわれ、救急修復および4ヶ月フォローアップ修復のLV血管造影図が入手できる集団と、駆出分画、梗塞の場所および梗塞の大きさが一致した患者15名が選択された。
【００５１】
実施された本研究のプロトコル
研究プロトコルは早期に記述された（Assmus B, Schachinger V, Teupe C, Britten M, Lehmann R, Dobert N, Grunwald F, Aicher A, Urbich C, Martin H, Hoelzer D, Dimmeler S, Zeiher AM. 急性心筋梗塞にける前駆細胞の移植と再生の亢進（Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction）(TOPCARE-AMI. Circulation. 2002;106:3009-17.）。簡単に言えば、急性心筋梗塞後4日に骨髄前駆細胞（BMP）および／または血液由来血中前駆細胞（BDP）のいずれかの冠動脈内注入を受けるように患者を無作為にグループ分けした。
【００５２】
骨髄前駆細胞（BMPs）を注入された患者から、細胞移植の日の朝に骨髄穿刺液50 mlを採取した。骨髄由来の単核細胞（BMCs）は密度勾配遠心分離法で取得した。2洗浄ステップの後、該細胞を10 ml エキソビボ10培地（Biowhittaker）に再懸濁した。異種細胞集団で構成された細胞懸濁液は、抗−ヒトCD34（FITC, Becton Dickinson）、抗−CD45（Becton Dickinson）、CD14（BD Pharmingen, San Diego, US）、CXCR4（BD Pharmingen）、CD49d（BD Pharmingen ）およびCD133（Miltenyl Biotech, Bergisch Gladbach, DE）に対する共役抗体を直接使用したFACS−解析によって検出された造血前駆細胞に加えて、ほかの細胞型（たとえばサイド集団細胞、間質細胞など）も含有していた。総計で、患者当たり（219 ± 82 x 106単核細胞中）平均値で5.5 ± 3.6 x 106 CD34/CD45の陽性細胞が注入された。
【００５３】
血液由来血中前駆細胞（BDP）の注入を受けた患者から、無作為グループ分けの直後（急性心筋梗塞の24時間後）に250 mlの静脈血が採血された。エキソビボ−15培地（Biowhittaker, Apen, DE）に単核細胞が懸濁され、無担体ヒト組換え型VEGF（R&D, Wiesbaden, DE）1 ng/ml、アトルバスタチン（Pfizer, Freiburg, DE）0.1 μMを追加し、それぞれの患者から20%ヒト血清を採取した。この細胞をフィブロネクチン被覆シャーレ（Roche, Grenzach, DE）に6.4 x 105細胞／mm2の密度で播種した。3日間培養後、細胞を0.5 mMのEDTAで2回洗浄し、10 mlエキソビボ10培地の最終容量に再懸濁させた。得られた細胞懸濁液（注入された細胞の平均17 ± 12 x 106）には、前駆細胞の異種集団が含有されていた。それにもかかわらず、90%以上の細胞が、希釈−アセチル化LDL−摂取およびレクチン結合およびVEGFR2（KDR）（ReliaTech, Braunschweig, DE）、エンドグリン（CD105）（NeoMarkers, Asbach. DE）、フォンヴィレブランド因子（vWF）（Oncogene, Schwalbach, DE）および血小板内皮細胞接着分子−1（PECAM-1/CD31）を含む典型的な内皮マーカー蛋白質発現によって示されたように、内皮特性を示した（Dianova, Hamburg; Assmus B, Schachinger V, Teupe C, Britten M, Lehmann R, Dobert N, Grunwald F, AicherA, Urbich C, Martin H, Hoelzer D, Dimmeler S, ZeiherAM. 急性心筋梗塞における前駆細胞の移植と再生の亢進（Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction）(TOPCARE-AMI). Circulation. 2002;106:3009-17., Dimmeler S, Aicher A, Vasa M, Mildner-Rihm C, Adier K, Tiemann M, Rutten H, Fichtlscherer S, Martin H, Zeiher AM. HMG-CoAレダクターゼ阻害物質（スタチン）はPI 3-キナーゼ/Akt経路を経て内皮前駆細胞を増大する（HMG-CoA reductase inhibitors (statins) increase endothelial progenitor cells via the PI 3-kinase/Akt pathway）. J din Invest. 2001;108:391-7., Vasa M, Fichtlscherer S, AicherA, AdIerK, Urbich C, Martin H, Zeiher AM, Dimmeler S. 血中内皮前駆細胞の数と遊走活性は冠動脈疾患の危険因子と逆の相関にある（Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease）. Circ Res. 2001;89:E1-7., Vasa M, Fichtlscherer S, Adier K, AicherA, Martin H, Zeiher AM, Dimmeler S. 安定な冠状動脈疾患の患者におけるスタチン療法による血中内皮前駆細胞の増加（Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease）. Circulation. 2001 ,-103:2885-90.）。
【００５４】
細胞はワイヤ上のバルーンカテーテル経由で注入されたが、このバルーンはこの方法の早期に移植したステントの中へ突き出しており、バルーンを低圧で膨張させて血流を3分間完全にブロックし注入した細胞が内皮によって接着しかつ可能な移住ができるようにしてある。この操作は、合計10 mlの前駆細胞を注入するように3回繰り返され、各回の間ではバルーンを収縮して3分間逆流させ虚血が拡がるのを最小にした。冠動脈内細胞移植が完了すると、冠動脈血管造影を繰り返して、血管の開口と造影剤が制限を受けないで流れるようにした。
【００５５】
移植前駆細胞の遊走能の検出
冠動脈内細胞注入の直前に、前駆細胞のサンプルを500μlの内皮ベースの培地（EBM、セルシステム）に再懸濁させ、計数し、2 x 104の細胞を改造ボイデンチャンバーの上部チャンバーに入れた。続いてこのチャンバーを、EBMと、血液由来血中前駆細胞の遊走能を測定するための50 ng/ml のVEGFをまたは骨髄由来前駆細胞の遊走能を測定するための100 ng/ml のSDF-1をのいずれかを含有する24‐ウエル培養皿に入れた。37℃で24時間培養した後、フィルターの底面をPBSで洗浄し、2%パラホルムアルデヒドで固定した。測定のために細胞核をDAPIで着色した。下部チャンバー内に遊走した細胞は、5つの無作為顕微鏡視野下で検査員によって盲検的に手動で計数された（Vasa M, Fichtlscherer S, Aicher A, AdIer K, Urbich C, Martin H, Zeiher AM, Dimmeler S. 血中内皮前駆細胞の数と遊走能は冠状動脈疾患の危険因子と逆の相関にある（Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease）. Circ Res. 2001;89:E1-7., Asahara T, Takahashi T, Masuda H, Kalka C, Chen D, Iwaguro H, Inai Y, Silver M, Isner JM. VEGFは骨髄由来の内皮前駆細胞を動員することによって生後の新血管形成に貢献する（VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells）. Embo J. 1999; 18:3964-72.）。
【００５６】
コロニー形成ユニットの測定
BMPs（シャーレ当たり1 x 105）を、幹細胞因子、G-CSF、GM-CSF、インターロイキン-3、インターロイキン-6（CellSystems, St. Katharinen, DE）を含有したメチルセルロース−プレート（Methocult GF H4535）に播種した。これらのプレートを位相差顕微鏡法で調べ、培養14日後に顆粒球-マクロファージのコロニー形成ユニット（CFU-GM：コロニー）を2名の異なる研究員が計数した。
【００５７】
左心室血管造影
標準記録ガイドラインにしたがって左心室血管造影図を得た。左心室駆出分画および左心室容量を面積長さ法を使用して計算した。（Dodge HT Sh, Ballew DW, et al.）男性における左心室容量の測定のための2方向血管造影の使用（The use of biplane angiography for the measurement of left ventricule volume in man.）Eur Heart J. 1960;60:762-776.）、心室壁の局所移動を中心線索手法（centerline-chord-method）を使用して測定した（Sheehan F, Bolson E, Dodge H, Mathey D, Schofer J, Woo H. 局所心室機能の特徴付けのための中心線手法の利点と適用（Advantages and applications of the centreline method for characterizing regional ventricular function）. Circulation. 1986;74:293-305.）。
【００５８】
統計解析
連続型変数は平均値 ± SDで示した。カテゴリ変数をカイ二乗検定またはフィッシャーの直接確率検定で比較した。初期値とフォローアップ値の統計比較を、対応のある信号試験（signal-test）を使用したノンパラメトリック法で実施した。スピアマンの相関を使用して線形ノンパラメトリック相関を計算した。線形回帰モデルを使用して多変量解析を行った。p < 0.05である場合に統計的有意性ありと仮定した。統計的分析はすべてSPSS（バージョン11.0、SPSS Inc.）を使用して行なった。
【００５９】
表1に研究母集団の人口統計、臨床および血管造影特性を示す。いずれのベースラインパラメータにおいても有意差はなかった。
【００６０】
前駆細胞療法のLV機能に与える影響
冠動脈前駆細胞注入前および4ヵ月後のLV−駆出分画、収縮末期容量および拡張末期LV容量を図1と表1に示す。注入した細胞の型とは無関係に、前駆細胞の移植は49.2±10 %から58.3±10 %（p < 0,001、図1A）へLV−駆出分画の大幅な改善と、55.2±18 mlから44.1±19 ml（p = 0.009, F図1B）へLV−収縮末期容量の有意な低下と相関していた。壁の局所移動を詳細に分析したところ、梗塞の中央領域に隣接する境界領域が最も顕著に改善した（表2）。
【００６１】
これとは対照的に、前駆細胞は注入されなかったが同等な治療を受けた患者の基準グループでは、有意な変化は検出されなかった（図1および表2）。したがって、初期値は同じでも、基準グループでは左心室全体の駆出分画の改善は有意に低く（p = 0.024）収縮末期LV−容量は4ヵ月後にむしろ増大した（p = 0.002）。
【００６２】
前駆細胞で治療した患者におけるLV−機能の改善は心エコー検査で確認され、この改善は直ちに12ヵ月のフォローアップを行なった患者において維持された（BDP n = 14、BMP n = 10）。これら患者全員がフォローアップ期間中悪性の不整脈を経験しなかった。
【００６３】
図2は、ベースライン時のLV−駆出分画と4ヶ月のフォローアップ期間中の駆出分画の改善の間にまったく逆の相関があることを示しており、LV−機能に最も重篤な障害のある患者は、注入された細胞型とは無関係に、駆出分画の改善の見地から最大の利益を受けたことを示唆している。
【００６４】
前駆細胞療法がMRIで測定した梗塞の大きさに与える影響
これらの患者26名は初期のMRIと4ヶ月のフォローアップを受け、LV−駆出分画の改善（50.7±8%から60.5±8%, p < 0.001）または収縮末期LV−容量の低下（53.7±17 ml から40.8±15 ml, p < 0.002）の観点から研究全体と異なるところはなかった。重要なことは、後期増幅（late-amplification）容量が39.3±34から31.6±28 mlへ有意に低下（p < 0.038）した冠動脈内前駆細胞注入があったことで、これは梗塞の大きさが有意に低減したことを示している。ここでもBDPを注入された患者とBMPの注入を受けた患者の間に有意差はなかった。
【００６５】
移植された前駆細胞の数と遊走能
全体の細胞計数またはサブグループ（たとえば、CD34/CD45またはCD34/CD133陽性細胞）を使えば、注入された前駆細胞の絶対数は改善された全体または局部LV−機能または梗塞の大きさの低減との相関はなかった（全体の駆出分画：BDP：r = -0.73, p =0.2；BMP：r = -0.147, p = 0.517；梗塞の大きさ：BDP：r = -0.187, p = 0.5；BMP：r = -0.084, p = 0.776）。細胞計数を二分すると機能の改善において有意差はなかった。
【００６６】
これとは対照的に、前駆細胞の遊走能を平均値以上と以下に2分し、遊走能の高い方の前駆細胞を注入された患者は低い方の遊走能の前駆細胞を注入された患者に比べて局所LV−機能に有意な改善が見られ、これは梗塞領域の境界における定量的LV−血管造影で示された通りである（図3）。図3に示すように後期増幅における絶対低減は、低遊走能の前駆細胞を注入された患者と比較して、高遊走能の前駆細胞を注入された患者において有意に高かった。
【００６７】
それにもかかわらず、細胞移植前の臨床的変数や機能パラメータ、たとえば全体LV−駆出分画、LV拡張期末容量および収縮期末容量または局所LV−機能は、スタートラインにおける両群間で異なることはなかった（表3）、したがって疾病の重篤度がベースライン時の細胞遊走活性に与える有力な影響は全て除外された。
【００６８】
機能改善と梗塞の大きさの低減の独立予測因子の多変量解析
機能改善と梗塞の大きさの低減の独立予測因子を同定するために、急性心筋梗塞の患者の梗塞動脈内への冠動脈前駆細胞の注入に続いて、発明者らは統計的に有意なパラメータまたは単変量解析によってほぼ統計的に有意なパラメータまたはLV−機能または梗塞の大きさに影響することがわかったパラメータを含む多変量解析を実施した。図4Aに示すように、移植された前駆細胞の遊走能は、梗塞の大きさの低減が最大の統計的に有意な独立予測因子のままで、後期増幅量の低減で測定された。そのほかの唯一の予測因子はベースライン時の駆出分画で、梗塞の最初の大きさ、年齢、性別または血管再生までの時間も独立の予測因子ではなかった。同様に、表4Bに要約したように、遊走能によってそれだけで局所LV−機能改善を予測した。したがって、注入された細胞の遊走能が、急性心筋梗塞の患者における前駆細胞療法に続く機能改善と梗塞の大きさの低減に対する独立した主要決定要因である。
【００６９】
BMPsの数と遊走能
BMPsの特性と機能活性を、ICMPの患者18例と計8例の志願者の骨髄穿刺液を使って調べた。調査対象集団のベースライン時の特性を表5に示す。
【００７０】
全体の対照と比較してICMPの患者における前駆細胞数がBMPsに関して低下したかどうかを調査するために、マーカー蛋白質CD34の発現を特徴とする造血前駆細胞の数を測定した。CD34+/CD45+の数は、健常な対照とICMPの患者のいずれにおいてもよく似ていた（図4）。さらに、CD133+/CD34+細胞および非割当てライン−/CD34+と定義される造血前駆細胞の未熟小集団も両群において異なることはなかった（図4）。
【００７１】
さらに骨髄穿刺液における前駆細胞の活性を、コロニー形成率と遊走を測定することによって決定した。興味深いことに、ICMPの患者由来のBMPsは健常な対照由来のBMPと比較してコロニー形成ユニットの数が有意に少なかった（37.3±25.0 CFU-GM/シャーレ対113.8±70.4 CFU-GM/シャーレ、p = 0.009）（図5a）。SDF-1とVEGFの遊走応答も健常な対照由来のBMPと比較してICMPの患者のBMPsにおいて有意に低かった（VEGF: 34±24.2 対 54.8±29.3 細胞／顕微鏡視野；p = 0.027; SDF-1: 46.3±26.2 対 108.6±40.4細胞／顕微鏡視野；p = 0,001）（図5bおよびc）。これに対して、コロニー形成能力はSDF-1に対する遊走能と密接に相関していた（r = 0.65；p < 0.001）（図5d）。
【００７２】
BMPsの機能活性の独立予測因子
SDF-1誘引遊走（ただし基礎遊走ではない）またはVEGF誘引遊走は、後肢虚血モデルにおける新血管形成の機能改善と相関があった（r = 0.78；p < 0.001）（図6）。BMPのコロニー形成率も細胞の新血管形成能と有意に関連していた（r = 0.74；p < 0.001）。患者の種々の臨床ベースライン時特性も後肢虚血のマウスモデルにおけるBMPsの治療効果と関連していたが（表6、左の欄）、SDF-1誘引遊走を除くすべての変数は、分析をICBMの患者に限るとそれらの統計的有意性はなくなった（表6、右の欄）。
【００７３】
上記のBMPsの調製のための新血管形成の機能改善の閾値ngを予測するために、SDF-1およびVEGFをベースにした可能性のある閾値を例示的に決定し、次の値となった:
【００７４】
BMPsの遊走
【表Ａ】
2007511206.tif 000002
数字は、使用した500,000細胞のうち24時間内に遊走した細胞数を示す。したがって100 x 1000は細胞の20%が遊走したことを示す。
【００７５】
上記のBDPsの調製のために新血管形成の機能改善の閾値ngを予測するために、VEGFをベースにした可能性のある閾値を例示的に決定し、次の値となった。
【００７６】
BDPの遊走
【表Ｂ】
2007511206.tif 000003
SDF-1によるテストにおける中央値に基づいたBMPの許容し得る（好ましい）閾値は70 x 1000遊走細胞となろう（すなわち、約14%）。VEGFによるテストにおける中央値に基づいたBMPのさらに許容しうる（好ましい）閾値は43 x 1000遊走細胞となろう（すなわち、約8.6%）。
【００７７】
対照的に、VEGFによるテストにおける中央値に基づいたBDPの許容しうる（好ましい）閾値は、4.85 x 1000遊走細胞（すなわち、約1%）である。
【００７８】
すべての細胞集団が完全に同じように遊走しないとの事実にもかかわらず、すべての細胞が全体的に遊走することに基づけば、患者の細胞がいかに良く遊走し、それら細胞が適切であるかどうかに関する情報が得られる。
【００７９】
調査対象集団の人口統計、臨床および血管造影における特性
【表１】
2007511206.tif 000004
【００８０】
全体および局所LVへの定量的機能
【表２】
2007511206.tif 000005
【００８１】
高遊走能を有する細胞を注入された患者と低遊走能を有する前駆細胞を注入された患者のベースライン時パラメータの比較
【表３】
2007511206.tif 000006
【００８２】
梗塞の大きさの低減の独立予想因子の多変量解析
【表４Ａ】
2007511206.tif 000007
【００８３】
LV-機能の局所改善の独立予測因子の多変量解析
【表４Ｂ】
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【００８４】
調査対象集団のベースライン時特性
【表５】
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【００８５】
臨床特性ならびにインビトロでの測定値と後肢虚血のあるマウスモデルにおけるBMPsの新血管形成能との間の関係の単変量線形回帰分析
【表６】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【国際調査報告】
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