(57)【要約】  粒子検出の分析精度を改善する方法が提供され、この方法は、粒子により生じる第１の電磁放射信号を測定するステップと、相互相関により、粒子により生じる電磁放射信号を比較するステップと、相互相関事象に分析フィルタを適用するステップとを有し、これにより粒子検出の分析精度を改善する。
2007533971.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子検出の分析精度を改善する方法であって、
第１の検定容量内にある粒子により生じる第１の電磁放射信号を測定し、任意に、第１の電磁放射信号に第１の分析フィルタを適用するステップと、
第２の検定容量内にある粒子により生じる第２の電磁放射信号を測定し、任意に、第２の電磁放射信号に第２の分析フィルタを適用するステップと、
相互相関により、第１の検定容量内にある粒子により生じる電磁放射信号と、第２の検定容量内にある粒子により生じる電磁放射信号とを比較するステップと、
相互相関事象に第３の分析フィルタを適用するステップとを有し、
これにより粒子検出の分析精度を改善することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
第１および第２の分析フィルタの一方または両方が適用されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
第１および第２の分析フィルタの両方が適用され、
第１および第２の分析フィルタは、同一の分析フィルタであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
第１および第２の分析フィルタは、所定の閾値レベルより大きい信号、所定数の隣接する時間区分内の信号、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されたことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
第３の分析フィルタを適用するステップは、発光強度、バーストサイズ、バースト期間、蛍光寿命、蛍光偏光、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された粒子特性を検出するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
粒子特性は、粒子の内因性または外因性のパラメータの１つにより与えられることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
外因性パラメータは、染料タグ、散乱光タグ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１つの標識を用いてマーキングすることにより与えられることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
第１のおよび第２の電磁放射信号を相互相関する前に、第１、第２および第３の分析フィルタを適用することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
第１および第２の検定容量は、発光ダイオード、連続レーザ波、およびパルスレーザからなる群から選択された少なくとも１つの励起光源に関して電磁気的に連通していることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、
粒子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ナノスフィア、マイクロスフィア、デンドリマ、染色体、糖質、ウィルス、バクテリア、細胞、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、
粒子は、アミノ酸、ヌクレオチド、脂質、糖質、毒素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、
粒子は、集合体、複合体、細胞小器官、ミセル、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、
電気運動力、圧力差、浸透圧差、イオン差、重力、表面張力、遠心力、磁場、光学的フィールド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された力を用いて、標的粒子を第１の検定容量を通過させ、第２の検定容量を通過させることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、
標的粒子は、異なる粒子の集合体の１つであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、
正の圧力、負の圧力、重力、表面張力、慣性力、遠心力、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された力を用いて、標的粒子を、異なる粒子の集合体として、一定の速度で第１の検定容量を通過させ、第２の検定容量を通過させることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、
電気運動力、遠心力、磁力、光学的力、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された力を用いて、標的粒子を、異なる粒子の集合体として、異なる速度で第１の検定容量を通過させ、第２の検定容量を通過させることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、
標的粒子の可動性は、粒子の内因的または外因的パラメータにより特定されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、
標的粒子の外因的パラメータは、電荷タグ、質量タグ、電荷／質量タグ、磁気タグ、光学的タグ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された標識により与えられることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法であって、
電磁放射信号は、誘導放出光、蛍光、弾性散乱光、非弾性散乱光、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法であって、
電磁放射信号は、検出装置の像平面に設けた光学的バンドパスフィルタを通過することを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、
光学的バンドパスフィルタにより、発光スペクトルを有する差別的な検出を可能にすることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、
分析は、分析フィルタを適用し、第１の検定容量内にある粒子により生じる電磁放射信号と、第２の検定容量内にある粒子により生じる電磁放射信号とを比較するプロセスを複数回行うことにより行われることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００３年９月３０日付けで出願された米国特許仮出願６０／５０７，２４３号の優先権を主張し、その内容は参考に一体のものとしてここに統合される。
【０００２】
＜連邦政府後援の研究開発に関する説明＞
適用なし。
【０００３】
＜コンパクトディスクにより提出される、参考に一体のものとしての統合される刊行物＞
適用なし。
【０００４】
本発明は、一般に、超低濃度で流れる溶液中に含まれる個々の粒子の検出および識別に関する。粒子からの電磁波放射は、粒子が２つの検定容量（インタロゲイション容量）内を通過するときに検出され、各検定容量で検出器により収集されたデータは、相互相関され、分析フィルタを適用することにより分析され、背景から粒子信号が分別される。
【背景技術】
【０００５】
生物学および薬学の進歩により分子レベルの探究が可能となるにつれ、極めてより低い濃度の生物学的分子を検出する技術が必要とされている。臨床的診断を導くバイオマーカの測定に際して、生物学的分子の超高感度での検出が必要となることがしばしばある。現在利用可能な最も高感度の分子検出技術は蛍光発光の検出を利用するが、蛍光に基づく単一分子検出（ＳＭＤ）法は、生物学的分子を検出するための有望視される手法となったことが、一般に認識されている。蛍光単一分子検出（ＳＭＤ）法における課題は、検出可能な限界を継続して小さくしつつも、背景に対する信号の比を最大化することである。単一分子の検出および定量化に加えて、混合物に含まれる異なる分子を特定または識別する情報は、ＳＭＤ技術を成功裡に応用する上で極めて重要である。現在ある単一分子検出（ＳＭＤ）手法を用いたとき、人為的ノイズまたはサンプル中の不純物からの蛍光により、誤った結論が導かれることがある。改善された分析手法は、非常に微量のサンプルを扱い、低濃度の物質を検出する上で極めて有用となる。
【０００６】
蛍光強度の変動に関する最初の研究によれば、単位時間あたりに検出される一定の容量中の蛍光分子数の変動を測定することが可能となった。これにより、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）と呼ばれる技術が確立された。蛍光相関分光法（ＦＣＳ）は、分子の集合体中の長期間の動的過程に関する情報を得る上で有用であるが、同様に単一分子検出（ＳＭＤ）においても有用である。基本的に装置により、微量で、開放的で、静止した測定容量からの蛍光発光が検出される。この測定容量は、焦点に集められた蛍光励起レーザビーム、および蛍光を集光する顕微鏡の像平面に設けたピンホールにより特定される。蛍光発光が測定容量に対して内外に散乱するとき、そして蛍光発光が観測中の化学反応により生成され、消滅するとき、蛍光発光は存在する蛍光分子数に比例する。検出された蛍光発光データは、自動相関分析に基づいて処理される。自動相関分析の問題点は、一般に、無作為の背景ノイズが分析に取り込まれる点にある。これとは対照的に、相互相関分析は、２つの検出器からのデータを必要とするが、両方の検出器からではなく、一方の検出器からのみ検出される無作為の背景から信号を取り除くことができる。
【０００７】
分子を検出し、識別する方法および装置がこれまでにも教示されてきた。ほとんどの場合、データ分析技術は、標的粒子のただ１つの測定可能な特徴を利用する。これらの分析技術は、検出および識別の単純なケースに対しては十分であるが、複雑な混合物で構成されるサンプルに対しては信頼性の高い結果を与えることができない。ほとんどの標的は、測定可能な複数の特徴を有しており、データ分析に際して、これらの複数の測定がなされるとき、分析能力は増大する。
【０００８】
２つの検出器およびフローサンプル（流れるサンプル）を有する装置がこれまでにも開示されてきたが、これらの装置は相互相関分析技術を利用することができるものの、上述のシステム内の標的粒子の速度にのみ基づいて標的粒子を識別することができる。一般に、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）は、静止したサンプルの拡散度合い、またはフローサンプルの速度に応じて、異なる粒子を識別する。蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）と同様のタイプのデータを用いるが、異なる手法でデータ処理し、特定の明るさに応じて粒子を識別する。すなわち、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）および蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）は、特定の単一の物理特性を測定することに依拠している。
【０００９】
蛍光の減衰寿命にのみ依拠して粒子を識別する手法がこれまでにも教示されてきた。フローサンプル（流れるサンプル）を用いた手法および装置により、サンプルストリーム（サンプルの流れ）内の単一位置にある粒子にパルスレーザを照射して、時間分解蛍光減衰を測定する。フォトンバーストは、これを生成するレーザパルスに関連するが、このシステムにおける粒子の識別は、粒子の流速とは無関係である。
【００１０】
２色蛍光の相互相関分光法による識別は、発光波長にのみ依拠する。これらの研究は、流れるサンプル、およびそれぞれ異なる発光波長で測定する２つの検出器により収集されたデータを用いる。１つの色で蛍光発光し、ただ１つの検出器で検出される粒子は、両方の色で発光し、両方の検出器で検出される粒子とは区別される。静止したサンプルおよび２つの検出器を用いた同様の技術がこれまでにも教示されてきた。他方では、２つの検出器を用いて、単一の検定容量から異なる複数の波長を測定できることが立証されてきた。これは同時分析と呼ばれることもあるが、これらの手法は、迅速かつ正確に標的を特定することができるが、やはりただ１つの粒子特性に依拠するに過ぎない。
【００１１】
２つ以上の測定可能な特徴を用いて、標的分子を検出し、識別する手法が同様にこれまでにも教示されてきた。ある者は、バーストサイズの１つの特徴に依拠した類似したスペクトル特性を用いて複数の粒子を識別する方法を用いるが、背景を低減するために、バースト内蛍光減衰（蛍光発光寿命）の別の特徴を利用する。こうした手法は、単一の検定容量を有するフローサンプル、検出器、およびパルスレーザを用いる。測定結果データは、バーストサイズおよび蛍光発光寿命の測定を相関させることにより分析し、背景バーストおよび偶発的な同時発生事象を取り除く。蛍光バーストサイズおよび寿命は、ともに、データ分析のために組み合わせる機能を制限する検出システムの人為的ノイズに曝されるスペクトル特性に似ている。
【００１２】
別の技術において、蛍光を用いたセルソーティング（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリは、異なる波長の蛍光強度や異なる方向の散乱光などの２つ以上のパラメータを用いて、標的粒子を識別するが、粒子は一定の速度で移動するので、粒子の可動性（モビリティ）に関する測定には用いられない。
【００１３】
すなわち、実際の粒子および検出システムの一般的な放射背景を正確に識別することにより、サンプル分析の信頼性を改善する、標的のさまざまな特性を測定する手法が必要とされている。
【発明の開示】
【００１４】
したがって、本発明の１つの目的は、これらの問題点および関連技術が有する他の問題点を解決することにある。これらの、および他の目的、特徴、および技術的利点は、サンプルが貫通する２つの検定容量を用い、これらの検定容量から収集される２通りのデータの相互相関分析を行い、標的粒子に起因してより高い確率で生じる事象を選択するための分析フィルタを適用することにより実現される。
【００１５】
本発明は、粒子検出の分析精度を改善する方法を提供し、この方法は、第１の検定容量内にある粒子により生じる第１の電磁放射信号を測定し、任意に、第１の電磁放射信号に第１の分析フィルタを適用するステップと、第２の検定容量内にある粒子により生じる第２の電磁放射信号を測定し、任意に、第２の電磁放射信号に第２の分析フィルタを適用するステップと、相互相関により、第１の検定容量内にある粒子により生じる電磁放射信号と、第２の検定容量内にある粒子により生じる電磁放射信号とを比較するステップと、相互相関事象に第３の分析フィルタを適用するステップとを有し、これにより粒子検出の分析精度を改善する。
【００１６】
本発明のさらなる態様によれば、第１および第２の分析フィルタの一方または両方が適用される。１つの択一例では、第１および第２の分析フィルタの両方が適用され、第１および第２の分析フィルタは、同一の分析フィルタである。好適には、第１および第２の分析フィルタは、所定の閾値レベルより大きい信号、所定数の隣接する時間区分内の信号、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。本発明のさらなる態様によれば、第３の分析フィルタを適用するステップは、発光強度、バーストサイズ、バースト期間、蛍光寿命、蛍光偏光、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された粒子特性を検出するステップを含む。
【００１７】
本発明のさらなる態様によれば、粒子特性は、粒子の内因性または外因性のパラメータの１つにより与えられる。外因性パラメータは、染料タグ、散乱光タグ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１つの標識を用いてマーキングすることにより与えられる。
【００１８】
本発明のさらなる態様によれば、第１のおよび第２の電磁放射信号を相互相関する前に、第１、第２および第３の分析フィルタを適用する。
【００１９】
本発明のさらなる態様によれば、第１および第２の検定容量は、発光ダイオード、連続レーザ波、およびパルスレーザからなる群から選択された少なくとも１つの励起光源に関して電磁気的に連通している。
【００２０】
本発明のさらなる態様によれば、粒子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ナノスフィア、マイクロスフィア、デンドリマ、染色体、糖質、ウィルス、バクテリア、細胞、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。粒子は、アミノ酸、ヌクレオチド、脂質、糖質、毒素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。粒子は、集合体、複合体、細胞小器官、ミセル、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２１】
本発明のさらなる態様によれば、電気運動力、圧力差、浸透圧差、イオン差、重力、表面張力、遠心力、磁場、光学的フィールド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された力を用いて、標的粒子を第１の検定容量を通過させ、第２の検定容量を通過させる。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、標的粒子は、異なる粒子の集合体の１つである。１つの択一例では、正の圧力、負の圧力、重力、表面張力、慣性力、遠心力、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された力を用いて、標的粒子を、異なる粒子の集合体として、一定の速度で第１の検定容量を通過させ、第２の検定容量を通過させる。別の択一例では、電気運動力、遠心力、磁力、光学的力、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された力を用いて、標的粒子を、異なる粒子の集合体として、異なる速度で第１の検定容量を通過させ、第２の検定容量を通過させる。好適には、標的粒子の可動性は、粒子の内因的または外因的パラメータにより特定される。さらに好適には、標的粒子の外因的パラメータは、電荷タグ、質量タグ、電荷／質量タグ、磁気タグ、光学的タグ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された標識により与えられる。
【００２３】
本発明のさらなる態様によれば、電磁放射信号は、誘導放出光、蛍光、弾性散乱光、非弾性散乱光、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２４】
本発明のさらなる態様によれば、電磁放射信号は、検出装置の像平面に設けた光学的バンドパスフィルタを通過する。好適には、光学的バンドパスフィルタにより、発光スペクトルを有する差別的な検出を可能にする。
【００２５】
本発明のさらなる態様によれば、分析は、分析フィルタを適用し、第１の検定容量内にある粒子により生じる電磁放射信号と、第２の検定容量内にある粒子により生じる電磁放射信号とを比較するプロセスを複数回行うことにより行われる。
【００２６】
本発明のこれらの、および他の特徴、態様および利点が、以下の開示、具体例、および添付クレームを参照するとより十分に理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（略語および定義）
本発明を理解しやすくするために、ここで用いられる数多くの用語および略語は、次のように定義される。
【００２８】
分析フィルタ：
ここでいう「分析フィルタ」なる用語は、相互相関により特定される電磁気信号または事象の測定結果が、標的粒子の特徴と一致することが知られている基準と比較される手法を意味する。フィルタが適用されると、フィルタの基準に合致する信号または事象だけが選択され、計測され、分析結果に採用される。
【００２９】
背景信号：
ここでいう「背景」なる用語は、検出される信号を意味するが、サンプル中の標的粒子以外から生じるものである。背景信号の発信源は、溶液、キャピラリ壁、およびサンプル内の蛍光汚染物質からのラマン散乱およびレーリ散乱である。
【００３０】
バンドパスフィルタ：
ここでいう「バンドパスフィルタ」は、特定の範囲の周波数を有する電磁波を透過させ、その範囲より大きい周波数および小さい周波数を有する電磁波を阻む光学的フィルタを意味する。
【００３１】
結合パートナ：
ここでいう「結合パートナ」なる用語は、複合体を形成するために分子認識により組み合わされた巨大分子を意味する。分子認識には、位相的互換性、または各パートナの相互作用表面との照合が含まれる。このパートナは相補的であり、さらには接触表面の特徴が互いに相補的であると説明することができる。結合力は、親水性、疎水性、イオン性、水素結合性、共有結合性、ハイブリダイゼーション性、誘導適合性、分極性、誘電分極性、およびインターカレーション性のものであってもよい。結合パートナの具体例は、抗原／抗体、オリゴヌクレオシド／核酸、反応抑制剤／酵素、およびリガンド／レセプタである。
【００３２】
ビン：
ここでいう「ビン」なる用語は、それぞれの検出チャンネルで記録された電磁放射信号を分割するために用いられる任意に選択された一定の時間区分を意味する。ビン幅は通常１μ秒〜５ｍ秒である。
【００３３】
輝度：
ここでいう「輝度」なる用語は、フォトンの数が平均的なフォトン背景数より大きいときの隣接する時間区分（ビン）からなる発光ピーク内で検出されるフォトンの全体数を意味する。同義語は、蛍光バーストサイズである。
【００３４】
電荷タグ：
ここでいう「電荷タグ」なる用語は、標的に結合し、関連付けられた際、質量、電荷、または質量−電荷比に基づいて、標的単体から電荷タグ＋標的を区別するための任意の電荷保持エンティティを意味する。電荷タグは標識（ラベル）となり得る。
【００３５】
電荷／質量タグ：
ここでいう「電荷／質量タグ」なる用語は、質量、電荷、または質量−電荷比に基づいて、標的単体から電荷／質量タグ＋標的を区別するための任意の電荷・質量保持エンティティを意味する。電荷／質量タグは標識（ラベル）となり得る。
【００３６】
相互相関：
ここでいう「相互相関」なる用語は、２通りのデータ組ｇｊおよびｈｋを分析することであって、各検出器（好適には、フォトン検出器）からのデータ対を次式に代入する。
2007533971.tif 000003
（ｊ＝-(N-1), -(N-2), ..., -1, 0, 1, ..., N-1）
ここで、Ｎはデータポイントの全体数である。特定の粒子が第１の検出器から第２の検出器まで移動する時間に相当する遅延時間（好適には、単一分子分析システムにおいて）において、第１の検出器からの第１のデータ組（ｇ）（好適には、背景レベルを超えるフォトンカウント数）が、第２の検出器からの第２のデータ組（ｈ）（好適には、背景レベルを超えるフォトンカウント数）に似ているとき、データ相互相関は値ｊで大きくなる。電場をサンプルに印加する単一分子電気泳動装置において、毛細管の長さ方向に配列された複数のフォトン検出器の間の検出のため遅延時間は、検出される粒子の電気泳動速度に関係する。
【００３７】
染料：
ここでいう「染料」なる用語は、着色材料に用いられる、あるいはルミネッセンス発光または蛍光発光を可能にする物質を意味する。染料は、光を吸収するか、あるいは特定波長の光を発する。染料は、標的に対して介在するか、非共有結合するか、あるいは共有結合する。染料自体が微細な溝、構造物、十字物、ループ、または他の分子の経常的特徴を検出する標識を構成してもよい。染料は、BODIPYおよびALEXA染料、Cy[n]染料、SYBR染料、臭化エチジウムおよび関連染料、アクリジンオレンジ、TOTO、YOYO、BOBO、TOPRO、POPRO、POPOなどの二量体シアニン染料およびそれらの派生物質、ビスベンズイミド、オリグリーン、ピコグリーンおよび関連染料、シアニン染料、フルオレセイン、LDS751、DAPI、AMCA、カスケードブルー、CL-NERF、ダンシル、ジアルキルアミノクマリン、4',5'-ダイクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、2',7'-ダイクロロフルオレセイン、DM-DERF、エオシン、エリトロシン、フルオロセイン、ハイドロキシクルマリン、イソスルファンブルー、リサミンローダミンＢ、マラカイトグリーン、ナフサフルオレセイン、NBD、オレゴングリーン、PyMPO、ピレン、ローダミン、ロードルグリーン、2',4',5',7'-テトラブロモスルフォンフルオレセイン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、Ｘ−ローダミンを含んでいてもよい。追加的なフルオロフォアファミリは、Dyomicsシリーズ、Atto tecシリーズ、クルマリン、巨大分子、フィコビリ蛋白質（フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニンを含む）、グリーン、イエロー、レッド、および他の蛍光蛋白質、アップコンバーティングリン光体、および量子ドットである。当業者ならば、本発明の範囲内で利用可能な他の染料を認識することができる。
このリストは、現在知られているすべての染料に限定されることなく、本発明の標識化されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドの検出を可能にするために将来に利用可能となる染料を含む。
【００３８】
経過時間：
ここでいう「経過時間」なる用語は、粒子が２つの検定容量の間の距離を移動するために要する秒数または１秒の何分の１、すなわちｍ秒（ミリ秒）を意味する。同義語は、移動時間、時間オフセット、および速度の逆数である。
【００３９】
電気泳動速度：
ここでいう「電気泳動速度」なる用語は、背景電解液に対する、帯電して電場の影響を受けた標的の速度を意味する。毛細管システム内の正味の速度は、電気動的速度および電気浸透速度の合成値であってもよい。
【００４０】
発光：
ここでいう「発光」なる用語は、蛍光、弾性散乱光または非弾性散乱光（ラマン）などのプロセス中に分子または粒子から生じる放射光を意味する。
【００４１】
発光波長：
ここでいう「発光波長」なる用語は、発光中に解放され、分析装置に用いられる検出器で測定されるフォトンのスペクトルを意味する。溶液中の多元素粒子に対して、蛍光フォトン発光は、通常、１００〜１５０ｎｍの範囲のスペクトルに対して生じる。選択された一部のスペクトルは、装置に用いられる光学的バンドパスフィルタを介して、検出器に到達することができる。同一のスペクトル範囲で検出された標識は同一の発光波長を有するものと考えられる。
【００４２】
事象：
ここでいう「事象」なる用語は、相互相関された信号を意味する。事象は、標的粒子からの蛍光の結果であってもよいし、なくてもよい。標的粒子の特徴と一致することが知られている追加的な条件に合致したとき、事象は懸案のものと考えることができる。
【００４３】
流体：
ここでいう「流体」なる用語は、粒子が懸濁し、移動する媒体を意味する。流体は、ガス性、水性、非水性、または任意の組み合わせであってもよい。いくつかの場合には、流体は、電場が印加されるか、電流を導通させてもよい。流体は、塩、イオン、ポリマ、巨大分子、またはポリペプチドやポリヌクレオチドと相互作用して、移動に影響を与える他の試薬を含んでいてもよい。
【００４４】
蛍光：
ここでいう「蛍光」なる用語は、励起されたフルオロフォアがグランド状態に戻ったときに生じるフォトンエネルギを意味する。生じたフォトンのエネルギは、励起フォトンに比して、一般に、常ではないが、より低く、その波長はより長い。
【００４５】
蛍光バースト期間：
ここでいう「蛍光バースト期間」なる用語は、発光事象が検出されている時間間隔を意味する。同義語はピーク幅である。
【００４６】
蛍光強度：
ここでいう「蛍光強度」なる用語は、単一の時間区分（例えば、背景レベルを超える１ミリ秒以上）の間に測定されるフォトンの全体数を意味する。
【００４７】
蛍光寿命：
ここでいう「蛍光寿命」なる用語は、Ｎ個の励起されたフルオロフォアの集合体が蛍光発光および他の減衰過程を経て励起エネルギを失い、指数関数的にＮ／ｅ個まで低減するのに必要な時間を意味する。
【００４８】
蛍光偏光：
ここでいう「蛍光偏光」なる用語は、溶液中の蛍光粒子の特性を意味する。フルオロフォアの励起および発光サイクル中に静止したままの状態であるならば、面偏光した光で励起され、固定的な面に光を発する（すなわち光は偏光したまま）。
【００４９】
検定容量（インタロゲイション容量）：
ここでいう「検定容量」なる用語は、少なくとも１つの粒子が横切る空間であって、粒子が照明光源により照明され、観察され、感知され、あるいは検出器により検出される空間を意味する。
【００５０】
標識：
ここでいう「標識（ラベル）」なる用語は、本発明の標的粒子が固着したとき、電磁発光または電気泳動速度などの粒子の測定可能なパラメータを変化させるエンティティを意味する。標識は、例えば、これに限定するものではないが、フルオロフォア、クロモフォア、放射性同位体、スピン標識、酵素標識、質量タグ、電荷タグ、および電荷／質量タグを含む。こうした標識により、標識化された組成物を適当な検出器により検出することができる。加えて、こうした標識は、複数の成分を標識化するスキームの成分を含み、このスキームは、例えば、標的が特定の高い親和度で結合パートナと結合する系であって、例えば、標識化された抗体が対応すね抗原と結合する。したがって、標識と「タグ」は同期的に用いられる。
【００５１】
光散乱：
ここでいう「光散乱」なる用語は、フォトンが方向を変えるプロセスを意味する。光散乱は、波長を変化させることなく、フォトンの方向が変化する弾性光散乱と、入射光とは異なる（通常、低い）エネルギを有する非弾性散乱とを含む。
【００５２】
質量タグ：
ここでいう「質量タグ」なる用語は、標的に付加される質量を意味し、質量検出または質量−電荷比に基づいて、標的単体から質量タグ＋標的を分別することができる。質量タグは標識となり得る。
【００５３】
粒子：
ここでいう「粒子」なる用語は、本発明において検出され、カウントされ、そして／または識別され得るエンティティを意味する。粒子の具体例は、蛋白質、核酸、ナノスフィア、マイクロスフィア、集合体、デンドリマ、細胞小器官、染色体、糖質、ミセル、ウィルス、バクテリア、細胞、プリオン、化学的エンティティ（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、脂質、糖質、毒素、毒液、薬剤、反応生成物、および基質）である。
【００５４】
サンプル：
ここでいう「サンプル」なる用語は、少なくとも１つの検出可能な粒子を含む連続的用量を意味する。この用語は、これに限定するものではないが、サンプル測定中に粒子を検出することを含む。この用語「サンプル」は、当初の標的粒子から解放され、解放された状態で分析されたとき、検出可能な標識だけを含む用量をも意味する。
【００５５】
信号：
ここでいう「信号」なる用語は、蛍光を発する粒子からの電磁放射を測定する検出システムの出力を意味する。
【００５６】
ＳＭＤ：
ここでいう「ＳＭＤ」なる用語は、単一分子検出を意味する。
【００５７】
標的：
ここでいう「標的」なる用語は、アッセイ中に検出される粒子を意味する。この用語は、アナライトとして当業者に知られている。
【００５８】
（粒子分析の検出精度を改善する方法）
本発明は、実際の粒子と背景放射を正確に識別することにより、サンプル分析の信頼性を改善する方法を提供する。これは、サンプルが通過する２つの検定容量を用いた技術、これらの検定容量から収集された２通りのデータの相互相関分析法、および標的粒子に起因して高い確率で生じる事象を選択するための分析フィルタを組み合わせることにより実現される。
【００５９】
本発明の方法は、標的粒子、不純物、および検出システムの全般的ノイズを識別することにより、ＳＭＤデータ分析の信頼性を向上させようとするものである。加えて、本発明によれば、データ分析のために行われる一連の新規なステップにより、混合物中の粒子間の識別精度を改善させることができる。こうした分析により、２つの検定容量内で独立して測定された粒子の発光を相互相関させて、粒子の可動性（モビリティ：mobility）を決定し、相互相関分析法とともに、電磁放射線の特徴に基づいて分析フィルタを適用することにより、真の相互相関事象を特定することができる。
【００６０】
本発明は、ＳＭＤの進歩における１つの重要なステップである。生物学および医学は、極めて低いレベルの粒子を検出するための方法に関する改善を推進している。要求される究極の検出レベルは、個々の粒子、個々の粒子間の反応、粒子の個々の複合体に関するレベルである。超高感度検出に対する用途は、細菌兵器物質のモニタリングの用途と、ドラッグ濫用の検出、処方用量をモニタするためのバイオマーカ、健康状態、移植のためのドナー照合、妊娠の有無、疾病の検出、病原体の有無など臨床的用途と、環境、生態系、および産業上のモニタリングの用途、製造プロセスのモニタリングの用途と、食品の安全のモニタリングの用途とを含む。
【００６１】
単一粒子検出の目標を達成することは、レーザ誘起検出システムの範囲に含まれるが、検出レベルが低ければ低いほど、背景に対する信号の比率を最大化することより困難となる。背景放射源に依存するが、極めて微小な検定用量、特定のバンドパスフィルタ、時間制御検出を用いたパルスレーザ、および近赤外線の受発光を利用することにより、背景放射を低減するためのさまざまな方法が提案されている。背景放射から真の信号を識別するためのデータ分析手法も同様に用いることができる。本発明は、データ分析プロセスを用いて、単一粒子検出の感度および精度を改善する。このプロセスは、相互相関分析に電磁放射に基づくフィルタ処理方法を組み合わせて、分析の識別精度を改善する。
【００６２】
本発明で利用されるサンプルは標的粒子を含む。こうした粒子は、分子および有機体を含む。分子粒子は、例えば、蛋白質、核酸、糖質、微細な分子化学エンティティなどのバイオポリマである。化学的エンティティは、アミノ酸、ヌクレオチド、脂質、糖質、薬剤、毒素（toxin）、毒液（venom）、基質、反応生成物、ファーマコフォア、およびこれらの混合物などの微細な分子を含む。粒子の他の具体例は、ナノ粒子、マイクロ粒子、デンドリマ、染色体、細胞小器官、ミセル、およびキャリア粒子を含む。細胞小器官の具体例は、細胞核、ミトコンドリア、エンドソームなどの細胞内粒子を含む。有機体の具体例は、ウィルス、バクテリア、真菌細胞、動物細胞、植物細胞、真核性細胞、原核生物細胞、アルケオバクテリア、プリオン、およびこれらの混合物などを含む。同様に、分子複合体からなる粒子、標識化された有機体、２つ以上の核酸からなる錯体、２つ以上の抗体または抗体フラグメントが結合した標的粒子の錯体などが含まれる。さらに、２つ以上のタイプの単一粒子が検出された場合の錯体が含まれ、例えば、蛋白質、レセプタ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐＮＡ、ＬＮＡ、糖質、ウィルス、細胞、バクテリア、真菌、およびこれらのフラグメント、さらにはこれらの任意のまたはすべての複合体および／または任意のまたはすべての錯体からなる群から選択された任意の粒子が含まれる。
【００６３】
１つの実施形態において、化学的エンティティは、自然発生的なホルモン、自然発生的な薬剤、人工的な薬剤、汚染物質、アレルゲン、エフェクタ分子、成長ファクタ、ケモカイン、サイトカイン、リンフォカイン、アミノ酸、オリゴヘプチド、化学中間体、ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを含む。
【００６４】
別の実施形態では、粒子は標識を含み、標的粒子に結合したもの、非結合標識から分離したもの、および試薬と相互反応して結合標識を解放するものがある。これらの解放された標識は、粒子として考えることができ、本発明の方法を用いて解析して、当所の標的粒子を間接的に検出することができる。
【００６５】
特に関心があるのは、ウィルスと、原核生物細胞と、真核性細胞と、菌類、動物およびほ乳類の細胞およびそのフラグメントなどの単細胞および多細胞の有機体細胞とを含む微生物および細胞を検出することにある。同様に、本発明の方法を用いて、病原体を検出することができる。関心のある病原体は、これらに限定するものではないが、ヘルペスウィルス、ボックスウィルス、トガウィルス、フラビウィルス、ピコルナウィルス、オルトミクソウィルス、パラミクソウィルス、ラヴドウィルス、コロナウィルス、アレナウィルス、およびレトロウィルスなどのウィルスである。また関心のある病原体は、これらに限定するものではないが、大腸菌、緑膿菌、腸内細菌、ブドウ球菌、大便連鎖球菌、肺炎かん菌、ネズミチフス菌、表皮ブドウ球菌、霊菌、ウシ結核菌、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌、および変形菌を含む。
【００６６】
こうした病原体の具体例は、上記列挙したものに限定されず、当業者ならば、どの種の微生物および寄生生物が特に重要であるか周知している。非網羅的に列挙したこれらの有機体および関連する疾病は、Warinnerに付与された米国特許第５，７９５，１５８号に具体例として記載されており、その内容がここに一体のものとして統合される。
【００６７】
本発明の粒子は、分離された、あるいはフィルタ処理されない生物学的液体を含む生物学的標本から得ることができる。こうした生物学的標本は、尿、脳脊髄液、胸膜液、滑液、腹水、羊水、胃液、血液、血清、血漿、リンパ液、間湿液、組織ホモジネート、細胞抽出物、唾液、痰、大便、生理学的分泌物、涙、粘液、汗、乳、精液、膣分泌液、潰瘍からの流体、および他の表面吹出物、水膨れ、膿瘍、および通常組織、悪性組織、および被擬組織を含む組織の抽出物、または懸案の標的粒子を含み得るからだの任意の組成物を含む。細胞または組織培養物などの他の同様の標本にも関心がある。血液から血漿を生成し、粘性を有する流体を希釈化するなど、テスト用サンプルは使用前に処理を行ってもよい。処理の方法は、濾過、希釈、凝縮、干渉成分の不活化、および試薬の添加などを含み得る。
【００６８】
（複数の粒子の検定）
１つの実施形態では、同一サンプル内にある数種類の粒子を検出して、識別することができる。本発明の用途において特に関心のある粒子の組み合わせは、例えば、伝染性の抗原／抗体、伝染性の試薬／核酸／毒素、ガン細胞／無調整蛋白質、ｍＲＮＡ／対応蛋白質トランスクリプト、遺伝子（ＤＮＡ）／伝令（ＲＮＡ）、遺伝子（ＤＮＡ）／蛋白質、ウィルス／毒素、バクテリア／毒素、酵素／基質、酵素／生成物である。
【００６９】
反応性粒子は、特定のリガンド、共同因子、作動因子、または抑制因子との相互反応を介して分析することができる。さらに酵素の基質の変化または基質と相互反応する物質の変化（電気泳動速度、輝度、またはその他の特性）をモニタすることにより、溶液中の酵素を検出することができる。別の実施形態では、同種の複数の粒子を同一サンプル内で識別する。例えば、長さまたはシーケンスが変化する核酸フラグメントの混合物、あるいは異なる大きさまたは質量−電荷比を有する蛋白質混合物を分別することができる。
【００７０】
粒子は、直接的あるいは間接的に、検出すべき電磁波を放射する必要がある。電磁放射は、粒子に固有（内因性）の特性を有するもの、粒子に外因性の特性を有するもの、あるいはそれらの組み合わせたものを含み得る。粒子に固有の特性は、例えば、蛍光発光および散乱光である。粒子は、自らを検出可能にする２つ以上の内因性特性を有し得る。外因性特性は、標識が粒子に固着した際の標識に起因するものである。標識は、粒子を検定流体内に配置する前後またはこれと同時に供給される。粒子が検出可能に識別されると、当業者に知られた任意の適当な検出手段を用いることができる。発光波長、発光強度、バーストサイズ、バースト期間、蛍光偏光を含む、電磁放射の異なる特徴を検出してもよい。唯一の条件は、米国特許第４，７９３，７０５号に開示されたようなＳＭＤ装置に応じて検出手段を用いられることで、この米国特許の内容は参考にここに一体のものとして統合される。粒子は、内因性特性および外因性特性の任意の組み合わせに基づいて検出可能であってもよい。好適には、検出手段は蛍光標識である。
【００７１】
本発明の１つの態様において、蛍光を発するサンプルからのフォトンが計数される。しかし、ある実施形態では、散乱光またはラマン放射などの蛍光以外の光源からのフォトン数をモニタすることが好ましい。
【００７２】
好適な実施形態では、連続的な時間間隔で計数されたフォトン数の観点で、発せられた放射をモニタする。別の好適な実施形態では、２つの検出器におけるフォトンの到達時間の観点から発光をモニタする。さらに好適な実施形態では、連続したフォトンバースト間の時間間隔の観点で発光をモニタする。
【００７３】
検出手段で粒子に標識（ラベル）を付すことは、当業者の通常の技術範囲に含まれる。直接的に固着させるか、あるいは結合パートナを用いるなど、ラベルを粒子に固着するために任意の既知の手法を用いることができる。いくつかの場合には、標識方法（ラベル付け方法）は特定のものでなく、例えば、特定のヌクレオチドシーケンスによらず、すべての核酸を標識化する方法である。その他の場合では、標識方法は特定のものであり、このとき、標識化されたオリゴヌクレオチドは特定の標的核酸シーケンスに結合する。特定または非特定の標識化技術は、次節でより詳細に説明する。
【００７４】
標識は、染料タグ、電荷タグ、質量タグ、量子ドット、ビーズ、磁気タグ、散乱光タグ、ポリマタグ、ポリマに固着された染料を含む。染料は、物質に着色するか、あるいはルミネッセンス発光または蛍光発光を生じさせる、極めて広範なカテゴリの組成物を含む。染料は、光を吸収するか、あるいは１種類以上の波長を有する光を発する。染料は、挿入するか、あるいは共有結合または非共有結合により粒子に結合してもよい。染料自体が粒子の微小な溝構造、十字曲線、ループ、またはその他の構造的要素を検出する染料プローブを構成してもよい。１つの実施形態において、標識は、非結合状態にある非蛍光性のものであってもよいが、標的粒子に結合したとき、分子内で生じる変化により蛍光性を有するようになる。
【００７５】
蛍光性粒子や蛍光共役抗体などの蛍光性マーカを付加することにより、蛍光粒子により吸収され、光測定デバイスにより測定される光をサンプルに照射してもよい。
【００７６】
有用な散乱光タグは、金、セレンおよび酸化チタンなどの金属や、セラミックまたは金属などのナノクラスタ材料を含む。同様に、所定のマイクロスフィアまたはビーズを散乱光タグとして用いることができる。
【００７７】
さらに別の態様において、標識は、同一サイズまたは異なるサイズを有する標的粒子の電気泳動速度および／または分離に影響を与える。これらの標識は、電荷／質量タグと呼ばれる。標識が固着すると、シービングメディア（sieving media）または非シービングメディアにおける電気泳動モビリティおよび分離に影響を与えるのに十分な程度に、標的粒子の翻訳ドラッグに対する電荷比を変化させることができる。別の実施形態では、標識
は、電荷、質量、または電荷と質量の組み合わせを変化させる。粒子に結合した電荷／質量タグは、電場における挙動において空間的な差異があるため、あるいは電場における挙動の速度の差異があるため、非結合粒子または非結合タグとは識別することができる。
【００７８】
多糖類で被膜した常磁性体のマイクロスフィアまたはナノスフィアを用いて、粒子を標識化することができる。ここに参考に一体のものとして統合される米国特許第４，４５２，７７３号は、鉄−デキストランの磁性体ビーズを開示し、生物学的材料に固着するのに適した粒子を作成するさまざまな手段について要約している。急勾配磁性分離法（ＨＧＭＳ）で用いられる磁性粒子のためのポリマコーティングについて、ドイツ特許第３７２０８４４号および米国特許第５，３８５，７０７号に開示されており、これらの内容はここに一体のものとして統合される。常磁性体ビーズを作製する手法は、米国特許第４，７７０，１８３号に開示され、その内容はここに一体のものとして統合される。本発明を実施する上で、ビーズを粒子に固定させる正確な手法は特に有用ではなく、数多くの択一的手法が当業者により知られている。こうした固着は、一般に、ビーズ上のコーティングに結合し、相互作用のための官能基を有する特定の結合パートナと、粒子が相互作用することにより生じる。抗体は、ビオチンなどの高親和性係合系の１つの要素と結合し、粒子は、アビジンなどの他の要素に固着し得る。抗マウスＩｇや抗ラットＩｇなどの主たる抗体の種固有の抗原決定基を認識する第２の抗体を用いてもよい。間接的結合手法により、さまざまな粒子に対して、抗体およびアビジンなどの単一の磁性結合エンティティを用いることができる。
【００７９】
この技術の１つの用途において、標的粒子は磁性タグに結合し、チャンバ内の流体中に懸濁する。チャンバの両端に磁場を加えた状態で、磁性で標識化された標的がチャンバ内に保持される。磁性標識を有さない物質はチャンバ内を通過する。磁場の強さを変化させるか、磁場の印加を停止することにより、保持された物質を溶離させる。磁場が両端に印加されたチャンバには、しばしば、適当な磁性感度を有する材料からなるマトリックスが設けられ、その結果、マトリックスの表面付近にある容量において、チャンバ内に局所的に高い磁場が誘起される。これにより、弱く磁性化された粒子を保持でき、このアプローチは急勾配磁性分離法と呼ばれている。
【００８０】
光学タグは、当業者に広く知られており、粒子に結合したときに標的粒子の光学的特性を増大させる任意のエンティティを有する。その一例として、ビーズ、量子ドット、反射率や吸収率などの特性に影響を与え得る他の分子であってもよい。
【００８１】
本発明のさらなる実施形態において、粒子を検出可能にする外因性特性は、特徴的なフォトン生成に関する少なくとも２つの標識により与えられる。例えば、標的粒子は、２つ以上の標識により標識化され、それぞれの標識は、他の標識の発光とは区別可能な２つ以上の波長で検出される発光に起因して異なる。この具体例において、２つ以上の波長で検出される発光の比により、粒子を標識のないものから区別することができる。別の具体例では、２つ以上の標識を用いて粒子を標識化し、少なくとも２つの標識が同一波長で発光する。この具体例では、それぞれの粒子に固着した２つ、３つ、またはそれ以上の標識からの発光により生じる検出された蛍光の強度における差異に基づいて、粒子を区別する。
【００８２】
別の実施形態において、染料が同一または重複する励起スペクトルを有するが、区別可能な発光スペクトルを有する。好適には、染料が実質的に異なる発光スペクトルを有するように、好適には、最大発光波長が１０ｎｍ以上離れ、より好適には２５ｎｍ以上離れ、さらにより好適には５０ｎｍ以上離れるように、染料を選択する。装置的方法を用いて２つの染料を差別化することが好ましい場合、さまざまな光学部品および回折格子を用いることにより、それぞれの発光スペクトルを個々に検出することができる。同様に、広い帯域より狭い帯域を有する染料を選択することにより、装置的な分別を改善することができるが、こうした染料は、振幅の大きい発光を有するか、あるいは合成された信号強度が信号検出に悪影響を与えない程度に十分な染料濃度で存在する必要がある。
【００８３】
１つの実施形態では、第２の標識は、第１の標識の蛍光を消光してもよく、二重に標識化された粒子に対する蛍光信号の損失を招く。好適な蛍光／消光の対は、5'6-FAMTMと3' Dabcylの対、5' Oregon Green (登録商標) 488-X NHS Esterと3' Dabcylの対、5' Texas Red (登録商標) X NHS Esterと3' BlackHole Quencher TM-1の対である（アイオワ州コラルビルのIntegrated DNA Technologies）。
【００８４】
１つの実施形態において、２つの染料分子の励起状態の間での距離依存反応である共鳴による励起エネルギ移動（ＦＲＥＴ）のために２つの標識を用いてもよい。この場合、ドナー分子からフォトンが生じることなく、ドナー分子からアクセプタ分子に励起が移動する。ドナー分子およびアクセプタ分子は、極めて接近して（１〜１０ｎｍ）いなければならない。適当なドナー分子とアクセプタ分子の対は、フルオレセインとテトラメチルローダミンの対、IAEDANSとフルオレセインの対、EDANSとdabcylの対、フルオレセインとQSY7の対（Haugland, 2002）、および数多くの他の対が当業者により知られている。
【００８５】
粒子は、検出および／または識別を支援するために、染料タグおよび質量タグなどの１種類以上の標識を用いて標識化してもよい。例えば、１つの蛋白質を２種類の抗体で標識化してもよく、一方が標識化されず、質量または質量／電荷タグとして機能し、もう一方が染料タグを有する。（質量が増大するか、追加的に結合した抗体の質量／電荷が変わったことに起因する）速度の差異により、染料タグとともに抗体にのみ結合する同等サイズの別の蛋白質と、この蛋白質を区別することができる。
【００８６】
（識別するラベル）
標識化された粒子を正確に検出するためには、標識化された粒子が非結合標識とは区別されなければならない。これを実現する数多くの方法は、当業者にとって馴染みのあるものである。例えば、不均一アッセイにおいて、非結合標識は、標識化された粒子から分析する前に分離される。好適な実施形態において、アッセイは均一アッセイであって、非結合標識を含むサンプルは、電気泳動および単一粒子蛍光検出の組み合わせにより分析される。この場合、電気泳動条件は、標識化された粒子および非結合標識に異なる速度を与えるように選択される。
【００８７】
核酸の非特定標識は、一般に、特定のヌクレオチドシーケンスによらず、すべての核酸を標識化する。当業者ならば、核酸の一般的な標識化に対するさまざまな技術を熟知している。その方法とは、TOTO、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウムなどの挿入染料と、配位錯体を形成するためのULYSISキットと、標識が容易に固着できる化学的活性を有するヌクレオチド類似体、およびストレプトアビジン結合標識を固着させるヌクレオチド類似体を含むビオチンを取り込むためのARESキットとを有する。標識化されたヌクレオチド類似体を、酵素を用いて取り込むことは別の手法である。
【００８８】
蛋白質を不特定に標識化する技術も同様に当業者に広く知られている。蛋白質表面上の化学的活性を有するいくつかのアミノ酸（例えば、リジンなどの１級アミン）が用いられている。さらに標識は、蛋白質上の糖質モイエティ（moiety）に添加することができる。Zenon標識などの抗体を標識化するためのアイソタイプの特定試薬が開発された。
【００８９】
好適な実施形態において、混合物中の特定の粒子だけが標識化される。特定の標識化は、標的粒子を標識化された結合パートナと組み合わせることにより実現され、結合パートナは、相補的な結合表面を介して、特定の標的粒子と反応する。パートナ間の結合力は、疎水性、親水性、イオン性、水素結合、ファンデルワールス引力、または配位錯体形成など、共有結合反応または非共有結合反応であってもよい。結合パートナの具体例は、作動因子と細胞膜受容体のための抑制因子、毒素（toxin）と毒液（venom）、抗体とウィルス性抗原決定基、ホルモン（オピオイドペプチドおよびステロイド）とホルモン受容体、酵素と酵素物質、酵素と酵素抑制剤、結合共同因子と標的シーケンス、薬剤と薬剤標的、オリゴヌクレオチドと核酸、蛋白質とモノクロナール抗体、抗原と特定の抗体、ポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド結合蛋白質、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、酵素と酵素共同因子、およびレクチンと特定の糖質を含む。結合パートナとして作用する受容体は、実例として、自然発生的受容体であって、例えば、チロキシン結合グロブリン、レクチン、細胞表面上で確認されるさまざまな蛋白質（cluster differentiation、cluster designation、またはCD分子）などである。例えばCD4は、主にヘルパーＴリンパ球を形成する分子である。関連する実施形態において、結合パートナは、特に関連する粒子と結合することができる。１つの例は、関連する酵素ファミリと結合するペプチドである。
【００９０】
１つの実施形態において、サンプルは、標的粒子と反応する結合パートナで被膜されたビーズまたはマイクロスフィアと反応する。ビーズは、サンプルの任意の非結合成分から分離され、本発明の分析装置が結合粒子を含むビーズを検出する。蛍光着色されたビーズは、これらの方法においてとりわけ好適である。例えば、オリゴマシーケンスで被膜された蛍光ビーズは、相補的な標的シーケンスと特異的に結合し、適当な分離ステップの後、標的シーケンスを検出することができる。
【００９１】
１つの実施形態において、粒子を検出する方法は、結合パートナとしてのモノクロナール抗体を用いたサンドイッチアッセイを用いる。抗体は、表面に連結し、捕獲抗体として機能する。サンプルが加えられ、この抗体で認識される抗原決定基を有する粒子が表面上で抗体と結合する。非結合粒子は洗い流され、特異的に結合したものだけが実質的に残る。結合した粒子／抗体は、検出可能な標識を含む検出抗体と反応させることができる。検出抗体と粒子が反応できるように培養した後、非結合検出抗体を洗い流す。粒子および検出抗体を表面から解放して、本発明の装置で検出することができる。択一的には、検出抗体だけを解放して検出することにより、間接的に粒子を検出することができる。
【００９２】
１つの変形例では、細胞受容体により認識されるリガンドが用いられる。この実施形態では、リガンドが表面に結合して、特定の受容体を意味する細胞を捕獲する。受容体は、例えば、表面免疫グロブリン、および細胞を標識化するために用いられる標識化リガンドであってもよい。したがって、関心のあるリガンドを、表面に結合する受容体に相補的にすることで、こうしたリガンドに対して、特定の免疫グロブリンを有する細胞を検出することができる。別の実施形態において、非共有結合でリガンドを表面に固着させるために、リガンドに対する抗体を表面に結合させることができる。
【００９３】
別の実施形態では、結合パートナは、蛍光を有する形態に基質を変える酵素、または別の分子では蛍光性を有する化学物質など、酵素などの検出可能な粒子を生成する任意のエンティティを含む。
【００９４】
（推進力）
検出されるサンプルは、電気泳動に曝される。サンプル流体内の粒子の可動性は、粒子の特性により変化する。電気運動力により得られる運度速度は、個々の粒子とそれを収容する幸田的な電荷と質量によって決まる。粒子の運動は、電荷／質量タグなど、粒子に固着した標識のタイプにより変化し得る。したがって、検出可能に標識化された粒子のそれぞれの電気泳動速度を決定することができる。検出可能に標識化された粒子のそれぞれの電気泳動速度に基づいて、複数の粒子からなるサンプル中の個々の粒子を特定することができる。イムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーション標識化技術と組み合わせて、任意の電気泳動分離技術を、本発明の利用に際して適用することができる。
【００９５】
さらなる実施形態において、２つ以上の粒子が存在する場合、少なくとも１つの粒子を、他方の粒子とは反対の方向に、少なくとも２つの検定容量を通過させるようにしてもよい。
【００９６】
好適には、サンプルは緩衝液を含む。任意の適当な緩衝液を用いることができるが、好適な緩衝液は、蛍光背景が少なく、検出可能に標識化された粒子に対して不活性であり、作動ｐＨが一定に維持することができ、電気泳動に適したイオン強度を形成するための適当な試薬と組み合わせることができるものである。緩衝液の濃度は、１〜２００ｍＭの範囲の任意の適当な濃度であってよい。好適には、緩衝液は、Gly-Gly、bicine、tricine、2-モルフォリンエタンスルホン酸塩（MES）、4-モルフォリンプロパンスルホン酸塩（MOPS）、および2-アミノ-2メチル-1-プロパノール塩酸塩（AMP）である。特に好適な緩衝液は、ｐＨ８の２ｍＭTris/ホウ酸塩であるが、Tris/アミノ酸塩およびTris/塩酸も同様に許容できる。好適なイオン強度は、少なくとも５０ｍＭである。
【００９７】
いくつかの用途において、緩衝液は、好適には、この実施形態での使用のためのシービング基質を有していてもよい。任意の好適なシービング基質を用いることができるが、シービング基質は、蛍光背景が少なく、とりわけ検出可能に標識化された粒子が流体中の他の成分に対し、大きさに依存して遅延するようなものであることが好ましい。シービング基質の濃度は任意の適当な濃度であってもよいが、約０．１％から約１０％が好ましい。任意の適当な分子量を用いてもよいが、約１０万〜約１０００万が好ましい。シービング基質の具体例は、ポリエチレンオキシド（PEO）、ポリビニルピロリドン（PVP）、直鎖状ポリアクリルアミド（LPA）、ヒドロキシプロピル・メチルセルロース（HPMC）、ヒドロキシエチルセルロース（HEC）であって、これらはすべて水溶性であり、希釈濃度（０．３％wt/vol）で例外的に低い粘度を有する。これらのポリマ溶液は、作製、フィルタ処理し、毛細管内への充填が容易である。シープ処理のために、エンタングルメント閾値を超える濃度でポリマを用いる。Tris/ホウ酸塩緩衝液に、０．２％のLPA（5,000,000〜6,000,000）を添加すると、１分間の電気泳動分離により、ＩｇＧおよび１．１ｋｂの核酸フラグメントを識別することができた（下記の実施例４を参照されたい。）。
【００９８】
電気運動力に、圧力、真空力、表面張力、重力、および遠心力などの他の推進力を組み合わせて、粒子を識別することができる。１つの実施形態において、これらの力は、２つ以上の粒子が存在する場合、サンプル内の異なる粒子に対して異なる影響を与えるように選択することができ、その結果、少なくとも１つの粒子を、他方の粒子とは反対の方向に、少なくとも２つの検定容量を通過させることができる。粒子の速度を流体の速度に合わせるか、あるいは少なくとも１つの粒子を流体の流れとは逆行するように移動させることもできる。別の実施形態において、少なくとも１つの粒子は、流体の流れの速度を超える反対方向の速度を有する。別の実施形態では、少なくとも１つの粒子は、流体の流れに対して垂直方向に移動する。また別の実施形態では、少なくとも１つの粒子は、流体の流れに対して反対方向および垂直方向の速度を組み合わせた速度で移動する。
【００９９】
さらに別の態様において、毛細管ゲル電気泳動法、ミセル電気運動クロマトグラフィ、等速電気泳動法、磁場、オプティカルフィールド、ソープション、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択された分離方法を粒子に適用することにより、第１の検定容量と第２の検定容量の間で粒子を移動させる。
【０１００】
当業者ならば理解されるように、毛細管ゲル電気泳動法、ミセル電気運動クロマトグラフィ、等速電気泳動法、および磁場分離法は、標準的な生物学的手法である。粒子の移動、散乱、および捕捉（光学ピンセット）のためにオプティカルフィールドを利用することは、米国特許第６，７８４，４２０号および第６，７４４，０３８号に開示されており、その内容は参考にここに一体のものとして統合される。オプトフォレシス（登録商標出願：Optophoresis）は、粒子に光学的な力、特に移動光学勾配力を与える。通常、多少の粘性を有する媒体を介し、粒子に対して光を移動させることにより、粒子に与えられた光学的な力および粒子の誘電率に少なくとも部分的に依存して、粒子は分離されるか、あるいは特徴付けられる。一般に、光源はレーザであって、分離は、本発明のために説明した装置と互換性を有する毛細管またはマイクロチャンネル構造体の中で行われる。
【０１０１】
（装置構成）
本発明の１つの実施形態において、図１に示す単一分子検出（ＳＭＤ）システムを用いてもよい。図１に図示されるように、本発明に係る１つの実施形態による分析装置の全体が参照符号１０で図示されている。分析装置１０は、２つの電磁放射源１２と、ミラー１４、レンズ１６、毛細管フローセル１８、２つの顕微鏡対物レンズ２０、２つの開口部５６、２つの検出レンズ２４、２つの検出フィルタ２６、２つの単一フォトン検出器２８、および検出器に動作可能に接続されたプロセッサ３０を備える。
【０１０２】
動作に際して、放射源１２は、そのビーム２２，２４がミラー１４の前方表面に反射するように位置合わせされている。レンズ１６は、ビーム２２，２４を２つの独立した検定容量（図２で示す毛細管フローセル１８の検定容量）に焦点を絞る。顕微鏡対物レンズ２０は、サンプル粒子からの光を集光し、開口部５６上にビーム２２，２４の像を結ぶ。開口部５６は、毛細管フローセル１８の壁部からの散乱光を遮断する。検出レンズ２４は、開口部５６を通過した光を集光し、検出フィルタ２６を通過した後、検出器２８の活性領域上に焦点を絞る。検出フィルタ２６は、ノイズ信号（例えば、散乱光や周辺光）を極力抑え、粒子からの光信号を最大化することに寄与する。プロセッサ３０は、ここで教示された方法により、粒子からの光信号を処理する。１つの実施形態では、顕微鏡対物レンズ２０は、高開口数を有する顕微鏡対物レンズである。
【０１０３】
このシステムの核心部分は、図２に示すガラス製の毛細管フローセルの装置１８である。２つのレーザビーム２２，２４は、その光学的焦点が約１００μｍ離間し、サンプルが充填された毛細管の長さ方向に対して垂直方向に照射されている。レーザ１２（図１）は、励起すべき分子の特性に依存した特定の波長で動作させる。この検出システムの検定容量３８，４０は、レーザビーム２２または２４の断面積、および検出器に光を照射する光学部品により選択されたレーザビームの断片により決定される。検定容量３８また４０は、適当なサンプル濃度を維持して、観測中の各時間間隔において、単一の粒子が検定容量中に含まれるように設定される。ガウス強度分布を有するレーザビーム２２，２４が励起光源として採用された場合、検定容量が非常に小さく、レーザビームの中心に閉じ込められていなければ、検定容量における照射強度は均一ではない。その結果、粒子は異なる励起強度を受け、粒子が中心を通過するか、あるいは端部を通過するかに依存して、異なる数のフォトンが生じる。したがって、同一粒子の母集団により、発光強度の分布が得られる。
【０１０４】
単なる（bulk）流体フローか、サンプルに電場を印加するか、その組み合わせの流体フローを、粒子が通過する。電気泳動条件の下では、同様の粒子が詰まった状態で毛細管を移動する（栓流）。粒子がそれぞれのレーザビームを横切ると、１つのフォトン励起により、各蛍光粒子が励起する。ほんの短い時間で、励起粒子は緩和し、検出可能な光のバーストを発する。粒子がレーザビームを横切るたびに、励起光サイクルが粒子により何度も反復され、その結果装置は、１秒間に数百個の粒子を検出することができる。蛍光粒子から生じるフォトンは、一方の検出器の検定容量を通過する時刻から他方の検出器の検定容量を通過する時刻までの時間差に相当する遅延時間をもって、両方の検出器で記録される。
【０１０５】
電磁放射は、少なくとも２つの検出器により検出され、２つの検定容量のそれぞれに対して少なくとも１つの検出器により検出される。１つの実施形態において、電磁放射は、刺激に応じた粒子からのフォトンの放出と呼ばれる。蛍光発光の場合、刺激は吸収光である。
【０１０６】
弾性光散乱に関して、発光は入射光と同じ波長を有するが、粒子により分散される。その他の場合、散乱光は入射光とは異なる波長を有する。例えば、ナノサイズの金属コロイド粒子に標準的な白色光源を用いて光照射したとき、強烈な単色光の散乱光が生じる。
【０１０７】
光は、検出するための好適な電磁放射であって、とりわけ紫外、可視および赤外領域の光が好ましい。この装置の検出器は、振幅と、蛍光粒子からのフォトンバーストに隣接した時間区分とを捕捉し、これらを電気信号に変換することができる。ＣＣＤカメラなどの検出デバイス、Foveon X3 (登録商標)センサ、ビデオ入力モジュールカメラ、ストリークカメラを用いて、連続的信号により像を生成することができる。別の実施形態では、ボロメータ、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、アバランシェフォトダイオード、および光電子増倍管を用いることができる。好適な実施形態においては、アバランシェフォトダイオードを用いて、個々のフォトンを極めて精緻に検出することができる。検定容量と検出器の間に特定の光学部品を設けて、生じた電磁放射線のいくつかの際だった特徴、すなわち発光波長、発光強度、バーストサイズ、バースト期間、蛍光寿命および蛍光偏光を検出することができる。好適な特徴は発光強度である。発光強度は、染料の蛍光量子収率、励起光源強度、極性、波長、および装置の検出効率に定量的に依存する。同様に、発光強度は、溶媒、イオン（ｐＨを決定付けるイオン）、および染料の濃度を含む溶液の成分により影響を受ける。粒子がフォトブリーチング（光漂白）を招く光源に曝されたとき、染料強度は変化し得る。当業者ならば理解されるように、それぞれの検定容量に２つ以上の検出器を設け、個々の検出器は上記列挙した発光した電磁放射線の任意の１つの特徴を検出するために構成することができる。
【０１０８】
好適な照明光源は、２００〜１１００ｎｍの波長を有する連続的レーザ光である。これらの照明光源は、小型で、耐久性があり、比較的に安価であるという利点を有する。さらにこれらの照明光源は、一般に、大量の蛍光信号を生成する能力を有する。好適なレーザの特定の具体例は、アルゴンレーザ、クリプトンレーザ、ヘリウム−ネオンレーザ、および波長可変ダイオードレーザを含み、それぞれは周波数ダブリングの可能性を有する。これらのレーザは、連続照明光を提供し、シャッタなどの付属的な電気的または機械的デバイスを用いることなく、照明光を中断させることができる。発光ダイオード（ＬＥＤ）は、安価で高信頼性の別の照明光源である。近年、高い吸収断面および量子収率を有する染料を組み合わせた超高輝度ＬＥＤが開発されたことにより、超高輝度ＬＥＤを単一粒子検出に応用すしやくなった。こうしたレーザを単独で、あるいは水銀アークランプ、単純アークランプ、ハロゲンランプ、アーク放電、プラズマ放電、発光ダイオード、またはこれらの組み合わせなどの他の光源と組み合わせ用いることができる。最適のレーザ強度は、個々の染料のフォトブリーチングの特性と、検定容量を横切るために必要な時間の長さ（粒子の速度、検定容量間の距離、検定容量のサイズ）とに依存する。最大の信号を得るためには、染料を過度に光漂白することなく、最大のレーザ強度でサンプルに光照明することが好ましい。好適なレーザ強度は、粒子が最後の検定容量を横切るまでに、５％以下の染料が漂白されるように設定される。
【０１０９】
択一的には、照明光源としてパルスレーザを用いることができる。時間制御された検出器とともにパルスレーザを用いて、検出および識別のための１つのオプションとして、粒子の蛍光寿命を決定することができる。蛍光発光の場合、検出されるフォトン信号は、蛍光発光の波長スペクトルと、装置の検出器とともに用いられるフィルタに依存する。したがって、異なるが重複する発光スペクトルを有する粒子は、フィルタ範囲が両方のスペクトルを含む場合、識別することができない。
【０１１０】
（データ分析）
以下のステップの要領にしたがってデータを分析することができる。
１．第１の検定容量内にある粒子から生じた第１の電磁放射信号を測定し、第１の分析フィルタを第１の電磁放射信号に適用するとともに、第２の検定容量内にある前記粒子から生じた第２の電磁放射信号を測定し、第２の分析フィルタを第１の電磁放射信号に適用するステップ；
２．相互相関法により、第１の検定容量内にある前記粒子から生じたフィルタ処理済みの電磁放射信号と、第２の検定容量内にある前記粒子から生じたフィルタ処理済みの電磁放射信号とを比較するステップ；および
３．相互相関事象に別の分析フィルタを適用するステップ。
【０１１１】
さらなる実施形態においては、この分析方法は以下のステップを有していてもよい。
１．サンプル測定期間中、すべての電磁放射信号を検出する。
２．任意の時間区分にデータを分割し、両方の検出チャンネルで収集されたデータとは独立して、すべての時間区分（ビン）にわたって電磁放射の背景レベルを特定する。
３．背景レベルより大きい閾値レベルを設定し、分析フィルタを適用して、閾値より大きい電磁放射信号を有し、ピークを形成する信号を選択する。ピークは、各検出チャンネルで収集されたデータとは独立して特定される。分析フィルタの基準は、同様の粒子の信号を一致させることが知られている基準に合わせられる。
４．一定の時間範囲で、チャンネル１で得られた上記選択されたピークと、チャンネル２のピークを相互相関させる。
５．相互相関された事象に対して分析フィルタを適用して、標的粒子の信号輝度またはピーク幅に関する既知の特徴と照合する。
６．それぞれの相互相関された事象をプロットし、経過した単位時間における事象の密度を示すヒストグラムを描写する。
７．経過時間範囲の一部、または測定期間の一部にのみ含まれる事象を観測することにより、データ設定をさらに限定する。
【０１１２】
とりわけ、第１および第２の検出器のそれぞれが検出した複数の信号は、自在に選択可能な時間チャンネル幅を用いて、任意の時間区分に分割される。好適なチャンネル幅（ビン）は、１μ秒〜５ｍ秒の範囲にある。このとき、各区分に含まれる信号の数が決定される。好適な実施形態において、検出された信号は、まず、分析されて背景を決定する。背景は、非常に数多くのビンにおける信号を平均化することにより決定される。１つの実施形態において、平均信号は、サンプルにおける全体ビン数を用いて計算される。好適な実施形態において、最初の背景計算より標準偏差の２〜３倍大きいフォトンを含むビンを取り除いて、第２の平均が計算される。他の実施形態において、背景レベルは、平均のノイズレベルまたは二乗平均平方根から決定される。他のケースにおいては、ノイズの典型値または統計値が選択される。単一フォトン計数検出器の場合、ノイズはポアソン分布になるものと期待される。
【０１１３】
好適な実施形態において、データを相互相関する前に、閾値を超える検出信号が選択される。閾値は、背景から真の信号（ピーク、バンプ、粒子）を識別するように決定される。無作為の背景から偽の明確な信号の数が最小化され、排除される真の信号の数が最小化されるように、注意して閾値を決定しなければならない。閾値を選択する方法は、算術方法および統計的方法を含み、背景レベルを超える固定値を決定し、背景信号の分布に基づき閾値を計算する。好適な実施形態では、閾値は、背景レベルを超える、標準偏差の固定数倍に設定される。背景をポアソン分布であると仮定し、この手法を用いると、実験中に検出された偽の明確な信号の数を推定することができる。
【０１１４】
閾値レベルより大きい信号と、同様の粒子から生じることが知られている信号とを比較することにより、閾値レベルより大きい信号に分析フィルタを適用し、隣接する時間区分で生じる閾値を超えるフォトンの数に関する基準が選択される。第１の検出チャンネルから選択されたそれぞれの信号に対し、所定の時間範囲内で第２の検出チャンネルから選択された信号を用いて相互相関分析が行われる。このように、少なくとも２つの検出チャンネル内の相関信号の有無に基づいて、背景から事象が識別される。相互相関信号の経過時間により、対応する検出器間の移動時間が得られ、検出器間の距離に基づいて粒子の速度が決定される。相関のための経過時間が既知の経過時間と一致したとき、粒子を検出することができる。他の場合では、粒子の検出および識別のための最適化条件が得られるまで、より広いまたはより狭い範囲を用いた相互相関を分析にて繰り返し行うことにより、実験的に決定される未知の経過時間を用いて、粒子を特定する。
【０１１５】
さらなる実施形態においては、検定容量の相対的位置または検出される波長において異なる３、４、５、６、７、８、およびそれ以上の２つ以上の検出器からのデータに対して相互相関分析を行うこともできる。この場合、任意に組み合わせた異なる検出器からのデータに対して相互相関分析を行うこともできる。例えば、検出器が３つある場合、異なる電磁放射特徴（Ｒ，Ｇ，Ｂ）を検出する各検出器がそれぞれ２つの検定容量（１，２）であり、Ｒ１がＲ２と相関付けられ、Ｇ１がＧ２と相関付けられ、Ｂ１がＢ２と相関付けられ、その結果、個々の検出器により検出される特徴的な光を有する粒子に対する経過時間が得られる。Ｒ１がＧ１に相関付けられ、Ｒ１がＢ１に相関付けられ、Ｇ１がＢ１に相関付けられる場合の重複する対など、相互相関分析の他の組み合わせを行うことができる。これらの相互相関分析の結果は、二重標識化粒子の周波数を示唆する。相互相関分析の異なる組み合わせを互いに利用して、速度および電磁的特徴に基づいて粒子を識別する。例えば、Ｒ１がＧ１に相関付けられ、組み合わせは、Ｒ２とＧ２の相関に相関付けられる。さらに、複数の相互相関分析を用いることにより、混合物内の個々の粒子の特性をより正確に決定することができる。
【０１１６】
別の実施形態において、異なる位置およびまたは特徴の任意のまたはすべての組み合わせにおける検出器からのデータに対して相互相関分析を行うような分析手法が採用される。
【０１１７】
粒子が一定の速度で移動するサンプルに対して、期待される速度を有する相互相関信号が関心事象であると特定される。異なる速度で移動する粒子のサンプルに対して、所定の速度において、相互相関信号が特定の装置システム構成における速度に対する期待される（予定された）フォトンバースト属性を有するとき、その相互相関信号が関心事象であると特定される。より迅速に移動する粒子は、より遅い移動粒子に比して、隣接する時間区分内において、より少ない数のフォトンバーストを有する。
【０１１８】
サンプル内の蛍光不純物、毛細管を通過する間にただ１つの検定容量しか横切らなかった場合、または誤った相互相関がなされた場合などのいくつかの理由のうち、任意の１つの理由に起因して、粒子が期待される速度を有しないとき、偽の相互相関事象が検出される。他の粒子からのフォトンが「正しい」粒子に付随する「正しい」フォトンの直前または直後に近接して移動するとき、誤った相互相関が生じ得る。
【０１１９】
相互相関に続いて、標的粒子の既知の特徴からずれた事象を取り除いた相互相関データに少なくとも１つの分析フィルタを適用する。これらのフィルタは、蛍光輝度（強度）、閾値（ビン数）を超える発光信号の幅などの電磁気学的特徴を根拠とすることができる。これらのフィルタは、相互相関前の信号に適用されるフィルタとは異なるものである。所定範囲の評価される経過時間、またはサンプルが分析される一部の時間に、事象を限定することができる。２つ以上のフィルタを同時にデータセットに適用することができる。
【０１２０】
フィルタ処理を行うことにより、粒子により相互相関事象が形成された時間を特定する（発光は、予め決定されていたように、これらの状況下で期待される時間、強度、および／または規模を有する。）。他の特徴または他の特徴の組み合わせを用いて、粒子の事象を検出することができる。こうして、フィルタ処理することにより、期待される速度で移動し、この速度で移動する発光特徴を有する粒子を検出することができる。
【０１２１】
最後に、コンピュータは、サンプル中に存在する各蛍光粒子のピークを示す速度のヒストグラムを作成する。サンプルが毛細管中のバルク流体フローを移動するとき、すべての粒子は同じ速度で移動する。サンプルに電場が印加されたとき、粒子が検出器間を移動する時間は、粒子の特徴的な電荷量、サイズおよび大きさに依存する。
【０１２２】
ここに開示された方法によれば、粒子は、検定容量を個々に通過する際にカウントされる。サンプルの濃度は、カウントされた粒子数と、既知の時間内に検定容量を通過したサンプル容量に基づいて特定することができる。検定容量がサンプルストリーム（流れ）の全体的な断面を包囲する場合、サンプル濃度を計算するためには、カウントされた粒子数と既知の時間内にサンプルストリームの断面を通過した容量だけが必要となる。検定容量がサンプルストリームより小さい場合、標準的な濃度を有する制御サンプルを用いて得られた標準曲線から補間することにより、粒子の濃度を特定することができる。さらなる実施形態において、測定された粒子を内部または外部粒子基準と比較することにより、粒子の濃度を特定することができる。サンプルの希釈度が分かれば、当初のサンプルに含まれる粒子濃度を計算することができる。
【０１２３】
さらに詳細な説明するまでもなく、当業者ならば、上述の開示内容をもって、本発明を十分に活用できるものと確信される。以下の特定の実施例は、本発明を説明するために提供されるもので、開示内容を限定するものではない。
【実施例１】
【０１２４】
（相互相関および分析フィルタを用いた、一定速度で移動する核酸標的の検出）
<1a>  ULYSIS(登録商標)核酸標識化キット（オレゴン州ユージーンのMolecular Probes, Inc）を用い、製造仕様書に基づいて、線形化pUC19をAlexa Fluor(登録商標)647により標識化した。非結合標識が排除され、サンプルを０．０１％のカゼイン加水分解物とともにリン酸緩衝食塩水に７．５ｆＭで懸濁させ、分析装置の検定容量に１μｌ／分でポンプ供給した。
【０１２５】
<1b>  別のサンプルは、上述のように標識化された７．２ｋｂのＤＮＡフラグメントからなり、０．２×ＴＢ，０．０１％ＳＤＳにおいて６０秒間３０００Ｖの電気泳動に曝された。分析されたデータを図３に示す。パネル３Ａ，３Ｂは、ポンピングにより、分析装置中を通過する７．５ｍＭの線形化ｐＵＣ１９からのデータを示す。検出された信号は、平均的背景に対して２倍の標準偏差より大きいものを選択するようにフィルタ処理された。フィルタ処理された信号は、相互相関された後、プロットされた。ドットプロットは、相互相関された事象対のそれぞれの輝度（ｙ軸）と経過時間（ｘ軸）を示し、丸はチャンネル１で生じた事象を示し、十字はチャンネル２で生じた事象を示す。実線は、ドットが密集したヒストグラムである。Ａ）フィルタ処理した信号の最初の相互相関では、認識可能なピークは現れなかった。Ｂ）相互相関事象に別の分析フィルタを適用して、８０ｍ秒付近で顕著なピークを有するものとして移動する１５〜５００個のフォトンの輝度を有する事象を選択することができる。
【０１２６】
パネル３Ｃ，３Ｄは、電気泳動により分析装置の中を通過する７．２ｋｂのＤＮＡフラグメントからのデータを示す。検出された信号は、平均的背景に対して６倍の標準偏差より大きいものを選択するようにフィルタ処理された。フィルタ処理された信号は、相互相関された後、プロットされた。ドットプロットは、相互相関された事象対のそれぞれの輝度（ｙ軸）と経過時間（ｘ軸）を示し、丸はチャンネル１で生じた事象を示し、十字はチャンネル２で生じた事象を示す。実線は、ドットが密集したヒストグラムである。Ｃ）ピーク上のショルダは、主にサンプル測定後半で生じた事象からなり（ドット密度はグラフのトップ付近にあってより高い）、電気泳動システムに時間的変化があったことを示唆している。Ｄ）実験開始後の最初の３０秒間のデータに限定すると、電気泳動システムの変化による人工的なノイズであるショルダが形成されることなく、単一の主要ピークを示すヒストグラムを得ることができる。
【実施例２】
【０１２７】
（所定の電気泳動速度範囲を用いた、サンプル中の２つの粒子の一方の自動的検出）
本質的に蛍光性を有する蛋白質複合体PBXL-3、および１．１ｋｂの核酸を用いて、特徴的な電気泳動速度の範囲を予め決定する。核酸は、ULYSIS(登録商標)核酸標識化キット（オレゴン州ユージーンのMolecular Probes, Inc）のプロトコルに従い、Alexa Fluor(登録商標)647を用いて標識化した。サンプルは電気泳動に曝され、相互相関した後に、輝度およびピーク幅に関する分析フィルタを適用した点を除き、上述の手順に従ってデータを分析した。蛋白質複合体および核酸は、個別に分析され、ピーク高さ、ピーク幅、経過時間に関する特徴的な範囲を用いて、各粒子が検出されることが期待される位置を特定した。（表１）
【表１】
2007533971.tif 000004
【０１２８】
これらの特徴を用いて、４つのサンプルを分析し、各ウィンドウで生じる相互相関事象の数を特定した（表２）。これらの事前に設定されたウィンドウを用いて、含有物の不明なサンプルを分析することができる。両方のウィンドウで事象が起こった場合、サンプルは粒子の混合物からなる。一方のウィンドウでのみ事象が起こった場合、一方のタイプの粒子が存在する。
【表２】
2007533971.tif 000005
【実施例３】
【０１２９】
（相互相関分析および分析フィルタを用いた、一定速度で移動する混合物中の粒子の検出および識別）
本質的に蛍光性を有する蛋白質複合体PBXL-3は、Alexa Fluor(登録商標)647を用いて標識化した線形化pUC19の核酸に比して、大きい強度で発光する。ULYSIS(登録商標)の核酸標識化キット（オレゴン州ユージーンのMolecular Probes, Inc）のプロトコルに従い、Alexa Fluor(登録商標)647を用いてpUC19 ＤＮＡを標識化した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ７．２）に０．０１％のカゼイン加水分解物（ミズーリ州、セントルイスのSigma-Aldrich Corp.）を補完して用い、蛋白質のみ、核酸のみ、および両方の混合物を含む一連の希釈液（２．５，５，７．５，１０，２０ｆＭ）を作製した。１μｌ／分で４分間ポンプ供給することにより、サンプルを分析装置に供給した。
【０１３０】
上述のようにデータを分析した。検出された信号は、平均的背景に対して４倍の標準偏差より大きいものを選択するようにフィルタ処理された。図４Ａは、蛋白質複合体および核酸単体に対して、相互相関処理し、フィルタ処理した信号をプロットしたものである。ピークを有する事象を示し、蛋白質複合体および核酸単体の異なる特徴的な蛍光強度を強調するように、経過時間の範囲を限定した（図４Ａ）。５００フォトンの輝度レベルを選択して、蛋白質複合体に対する強度の明るいウィンドウと、核酸に対する強度の暗いウィンドウに分離した。核酸に対しては、１５〜５００の輝度に基づく分析フィルタ、蛋白質複合体に対しては、５００〜９００の輝度に基づく分析フィルタをデータに適用した。
これらの方法で特定された事象の数は、蛋白質複合体および核酸の両方に対する一連の濃度で計測された。輝度ウィンドウを用いて、蛋白質および核酸に対して標準曲線をプロットし、曲線の勾配を求めた。
【０１３１】
３つの異なる混合物において、蛋白質複合体および核酸は、強度に基づいて識別された。輝度に対する分析フィルタを適用して、PBXL-3およびpUC19の混合物中に検出される分子の数を用いて、標準曲線の傾斜に基づいて各成分の濃度を計算した。蛋白質および核酸に対して測定された濃度と予想値を比較することにより、サンプル成分の濃度は、サンプル中に検出された分子と標準曲線（図４Ｂ）を比較することにより求められることを示している。
【０１３２】
（最適化された相互相関分析およびフィルタ処理を用いた、異なる速度で混合物中を移動する粒子の検出および識別）
蛋白質および核酸に対して、Alexa Fluor(登録商標)647を用い、製造業者のプロトコルに従い、ＩｇＧおよび１．１ｋｂのPCR生成物を標識化した。１８ｍＭのTris、１８ｍＭのホウ酸水溶液（ｐＨ８．６）（０．２％の直鎖状ポリアクリルアミド（LPA, 5,000,000〜6,000,000MW）を含む）、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液、ウシ血清アルブミン、Ficoll(登録商標)、ポリビニルピロリドンからなるシービング緩衝溶液中に、１３ｆＭのＩｇＧと５ｆＭの核酸を懸濁させた。混合物を作製する前に、非結合標識を取り除き、サンプルを３００Ｖ／ｃｍの電気泳動に１分間曝して、分子を分析装置の検定容量に通過させる。
【０１３３】
ピーク幅（ビン）に基づいた一連の分析フィルタを相互相関処理された事象に適用する点を除いて、上述のようにデータを分析した。図５Ａは、最も幅広のフィルタ（０〜５ビン）を用いたときに、蛋白質および核酸の両方のためのピークが観測されることを示している。より狭い経過時間フィルタを適用することにより、蛋白質分子（図５Ｂ（０〜１ビン））または核酸分子（図３Ｃ（１〜５ビン））のいずれかの信号が選択される。これは、分積フィルタを用いて、異なる速度により分別された混合物中の分子の同定を確認できることを証明している。
【０１３４】
（その他の実施形態）
これまで開示した詳細な説明は、本発明を実施する当業者を支援するために提供されたものである。しかしながら、ここに開示された特定の実施形態が本発明のいくつかの態様を説明するためのものであるから、ここに教示され、クレームされた本発明がこれらの実施形態によりその権利範囲が限定されるものではない。任意の均等な実施形態が本発明の範疇に入るもことが意図されている。実際、ここに図示され開示されたものに加えて、本発明の開示内容の精神と範疇から逸脱しない上記開示から、本発明のさまざまな変形例が当業者にとって明らかとなる。
【０１３５】
（引用文献）
本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、特許出願、および他の引用文献が参考にここに一体のものとして統合され、刊行物、特許、特許出願、および他の引用文献のそれぞれが明確にかつ個々に示唆されているかのようにすべての目的で統合される。ここに引用された文献は本発明の先行技術文献として自認したものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】レーザ励起蛍光を用いた単一分子検出の基本的な装置の概略図である。
【図２】単一分子分析装置のための検定チャンバの概略図である。
【図３】パネルは、１ｍｌ／分で分析装置にポンプ供給された、０．０１％のカゼイン加水分解物を含む７．５ｆＭの線形化pUC19を示す。データの当初の相互相関は、識別可能なピークを示さなかった。
【図４】パネルは、１ｍｌ／分で分析装置にポンプ供給された、０．０１％のカゼイン加水分解物を含む７．５ｆＭの線形化pUC19を示す。１５〜５００の輝度を有する事象に限定して相互相関することにより、８０ｍ秒付近で主たるピークを検出することができた。パネルＣ，３は、経過時間と、Alexa Fluor(登録商標)647を用いて標識化した７．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを含み、０．２×ＴＢ，０．０１％ＳＤＳにおいて６０秒間３０００Ｖの電気泳動に曝されたサンプルの時間とをプロットしたものである。
【図５】パネルは、１ｍｌ／分で分析装置にポンプ供給された、０．０１％のカゼイン加水分解物を含む７．５ｆＭの線形化pUC19を示す。ピーク上のショルダは、主にサンプル測定の後半で生じた事象からなり（ドット密度はグラフのトップ付近にあってより高い）、これは電気泳動システムに時間的変化があったことを示唆している。
【図６】パネルは、１ｍｌ／分で分析装置にポンプ供給された、０．０１％のカゼイン加水分解物を含む７．５ｆＭの線形化pUC19を示す。時間に基づいて設定されたデータを限定すると、サンプル測定の最後の３０秒を除く同じデータを示す。その結果のヒストグラムは、電気泳動システムにおける人工的ノイズの変化であるショルダが形成されることなく、単一の主要ピークを示す。
【図７】２つの検出器の間の経過時間に対する蛍光輝度をプロットしている。各スポットは、単一分子に対する測定結果である。ピーク内に生じる事象を強調するために、ｘ軸（経過時間）の大きさを制限した。５００フォトンの選別値を用いて、暗いウィンドウから明るいウィンドウを分割した。PBXL-3分子（本図）は、pUC19分子（図８）より大きい平均強度で発光する。
【図８】２つの検出器の間の経過時間に対する蛍光輝度をプロットしている。各スポットは、単一分子に対する測定結果である。ピーク内に生じる事象を強調するために、ｘ軸（経過時間）の大きさを制限した。５００フォトンの選別値を用いて、暗いウィンドウから明るいウィンドウを分割した。PBXL-3分子（図７）は、pUC19分子（本図）より大きい平均強度で発光する。
【図９】混合物中のPBXL-3成分およびpUC19成分の濃度測定値が予想される値と比較される。
【図１０】図５。Alexa Fluor(登録商標)647を用いて標識化した蛋白質と核酸を含むサンプル。最も幅広のピーク幅フィルタ（０〜５ビン）が２つのピークを件出するためには最適である。電気泳動速度およびピーク幅の両方に基づいた識別を示す。
【図１１】Alexa Fluor(登録商標)647を用いて標識化した蛋白質と核酸を含むサンプル。より狭いピーク幅分析フィルタを用いて分析を行うと、ただ１つのピークが確認され、より速い移動ピークが蛋白質（０〜１ビン）に対応する。
【図１２】Alexa Fluor(登録商標)647を用いて標識化した蛋白質と核酸を含むサンプル。より狭いピーク幅分析フィルタを用いて分析を行うと、より遅い移動ピークが核酸（１〜５ビン）に対応する。
【符号の説明】
【０１３７】
１０：分析装置、１２：電磁放射源、１４：ミラー、１６：レンズ、１８：毛細管フローセル、２０：顕微鏡対物レンズ、２２：ビーム、２４：検出レンズ、２６：検出フィルタ、２８：単一フォトン検出器、３０：プロセッサ、３８，４０：検定容量、５６：開口部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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