(57)【要約】  センスＲＮＡ分子を作製するための方法およびキットを提供する。センスＲＮＡ分子は、核酸マイクロアレイに関係する遺伝子発現などの種々の研究および診断適用に使用することができる。
2007515938.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センスＲＮＡ分子を作製するための方法であって、
５’末端および３’末端を有する１本鎖ｃＤＮＡ分子を提供するステップと、
前記１本鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端にオリゴデオキシヌクレオチドテイルを結合するステップと、
センス鎖およびアンチセンス鎖を有する２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを提供するステップであって、前記センス鎖が、前記オリゴデオキシヌクレオチドテイルに相補的な配列を含む１本鎖３’末端オーバーハングを含むステップと、
前記３’末端オーバーハング配列と相補的塩基対形成することによって、前記オリゴデオキシヌクレオチドテイルに前記２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをアニーリングするステップと、
前記オリゴデオキシヌクレオチドテイルの３’末端に前記２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのアンチセンス鎖の５’末端をライゲーションするステップと、
前記２本鎖プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ転写を開始し、センスＲＮＡ分子を作製するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
ａ）が、５’末端および３’末端を有するｍＲＮＡ転写物を提供するステップと、前記ｍＲＮＡ転写物から１本鎖ｃＤＮＡ分子を合成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１本鎖ｃＤＮＡ分子の合成が、ｍＲＮＡ分子とＲＮａｓｅＨ-逆転写酵素を反応させるステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１本鎖ｃＤＮＡ分子の合成が、ｍＲＮＡ分子とオリゴｄＴプライマーを反応させるステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記１本鎖ｃＤＮＡ分子の合成が、ｍＲＮＡ分子とランダムプライマーを反応させるステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴデオキシヌクレオチドテイルに結合するステップの前に、１本鎖ｃＤＮＡ分子を精製するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記１本鎖ｃＤＮＡ分子を精製するステップの前に、前記ｍＲＮＡ転写物を分解するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１本鎖ｃＤＮＡ分子を精製するステップの前に、前記ｍＲＮＡ転写物が分解されない、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴデオキシヌクレオチドテイルがホモポリマーテイルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ホモポリマーテイルがポリｄＴテイルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴデオキシヌクレオチドテイルが、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、前記１本鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ７プロモーターである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１本鎖３’末端オーバーハングがアデノシン塩基の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ライゲーションが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡ転写が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して開始される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮＡ転写を開始する前に、第２の鎖ｃＤＮＡを合成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の鎖ｃＤＮＡがＤＮＡポリメラーゼを使用して合成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の鎖ｃＤＮＡが、前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス鎖の３’末端オーバーハングの伸長によって合成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の鎖ｃＤＮＡがランダムプライマーを使用して合成され、ランダム−プライミングされた第２の鎖ｃＤＮＡ断片を作製する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ＲＮＡ転写を開始する前に、ランダム−プライミングされた前記第２の鎖ｃＤＮＡ断片をライゲーションする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
得られるｓＲＮＡ分子を増幅するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｓＲＮＡ分子の増幅が、オリゴｄＴとランダムプライマーの組み合わせを使用して開始される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記得られるｓＲＮＡ分子がポリＡテイルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリＡテイルが、ポリＡテイルポリメラーゼを使用して結合される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記得られるｓＲＮＡ分子を逆転写し、それによって１本鎖ｃＤＮＡ分子を作製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記逆転写が、検出可能であるように標識されたヌクレオチドを１本鎖ｃＤＮＡ分子に組み入れることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出可能であるように標識されたヌクレオチドが蛍光色素を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記蛍光色素がｃｙ３またはｃｙ５である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記得られるｃＤＮＡ分子に少なくとも１つの検出可能な標識を結合するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
核酸マイクロアレイに、請求項２７、２８、２９または３０に記載の検出可能であるように標識されたｃＤＮＡを接触させるステップを含む、核酸マイクロアレイをプロービングするための方法。
【請求項３２】
前記ｍＲＮＡ転写物が哺乳類起源である、請求項２に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｍＲＮＡ転写物がヒト起源である、請求項２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｍＲＮＡ転写物が、分解したＲＮＡを含む生物起源から単離される、請求項２に記載の方法。
【請求項３５】
２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス鎖が１本鎖３’末端オーバーハング配列を含む、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、前記２本鎖プロモーターを使用してｓＲＮＡ分子を作製するための取扱説明物を含む、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を作製するためのキット。
【請求項３６】
前記２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの１本鎖３’末端オーバーハング配列に相補的なオリゴデオキシヌクレオチドテイルを１本鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端に結合するための少なくとも１つの酵素と、前記２本鎖プロモーターを前記ｃＤＮＡ分子の３’末端にライゲーションするための少なくとも１つの酵素をさらに含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼとＴ４ＤＮＡリガーゼをさらに含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、ｄＮＴＰ、およびＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本願は、開示内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる、２００３年５月９日提出の米国仮出願６０／４６９，３８３号の利益を主張する。
【０００２】
背景技術
マイクロアレイ技術は、遺伝子発現プロファイルを作製し、分析するための強力なツールとなっている。しかし、一般に、マイクロアレイ発現分析は、入手できないことが多いＲＮＡを大量に必要とする（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３４：３９４−４００（２０００）参照）。この問題を克服するためにいくつかのＲＮＡ増幅技法が開発されている。しかし、これらの技法は、一般に、増幅バイアスとして知られている現象を受ける（例えば、米国特許第６，５８２，９０６号参照）。これらの場合には、増幅されたＲＮＡ分子集団は、元の試料に存在するＲＮＡ分子集団との比例を示さない。
【０００３】
例えばＥｂｅｒｗｉｎｅら（例えば、米国特許第５，５４５，５２２号；同第５，７１６，７８５号；５，８９１，６３６号；同第５，９５８，６８８号および同第６，２９１，１７０号参照）によって開示されている方法では、Ｔ７プロモーターおよびプライマーが提供されている化合物オリゴヌクレオチドが増幅に使用されている。化合物オリゴヌクレオチドを使用して最初のｍＲＮＡ転写物のｃＤＮＡコピーを作製し、続いて第２の鎖の合成が２本鎖であるｃＤＮＡを合成する。ＲＮＡ増幅は化合物オリゴヌクレオチドのプロモーター部分により実施され、転写はｃＤＮＡの第２の鎖から進む。第２の鎖が転写に使用されるので、Ｅｂｅｒｗｉｎｅの方法は、最初のｍＲＮＡ配列のアンチセンスである増幅ＲＮＡを作製する。
【０００４】
しかし、Ｅｂｅｒｗｉｎｅの方法は、使用する酵素のＤＮＡ鎖伸長能の不完全さ（すなわち、酵素が核酸分子に結合し続けていられないこと）およびＲＮＡポリメラーゼプロモーターの位置決めにより各段階において３’バイアスを導入する（例えば、米国特許第６，５８２，９０６号および米国特許広報ＵＳ２００３／０１０４４３２号参照）。例えば、ｃＤＮＡ第１鎖を作製するために使用する化合物オリゴヌクレオチドは、メッセージの３’末端に対応するｃＤＮＡの５’末端にプロモーターを配置する。これが、ＲＮＡポリメラーゼが一部の鋳型の転写を終了することができないこと（おそらく、長いポリＡテイル領域または鋳型の二次および三次構造による干渉による）と相まって、増幅されるアンチセンスＲＮＡ集団の３’バイアスを生じる。また、ＤＮＡポリメラーゼによる第２の鎖ｃＤＮＡ合成が不完全である場合には、これらのｃＤＮＡは機能的なプロモーターを欠損し、増幅される集団に元のＲＮＡ分子が現れるのが少ない（または場合によってはまったく存在しない）。
【０００５】
３’バイアス問題を克服するためにいくつかのＲＮＡ増幅技法が開発された。例えば、米国特許広報ＵＳ２００３／０１０４４３２号は、１本鎖または２本鎖バクテリオファージプロモータープライマーを、Ｔ４  ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを使用してｃＤＮＡ第１鎖分子の３’末端にライゲーションするセンスＲＮＡ（ｓＲＮＡ）を増幅するための方法を開示している。第２の鎖のｃＤＮＡ合成後、プロモーターのインビトロにおける転写を使用してセンスＲＮＡ分子を合成する。しかし、この方法の欠点は、平滑末端核酸分子のライゲーションは効率が悪く、低いインキュベーション温度において実施しなければならないことである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）参照）。したがって、一部のｃＤＮＡは機能的プロモータープライマーを欠損しており、増幅される集団に元のＲＮＡ分子が現れるのが少ない（または場合によってはまったく存在しない）。
【発明の開示】
【０００６】
発明の開示
出願人らは、２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、スタッガード（「付着末端」としても知られている）ライゲーション反応において第１のｃＤＮＡの３’末端に結合している核酸鋳型からセンスＲＮＡ（ｓＲＮＡ）を作製するための方法を発明した。出願人らは、スタッガードライゲーション反応によるｃＤＮＡ第１鎖の３’末端へのプロモーターの結合は、平滑末端ライゲーション反応による結合より効率がよく、従来技術の方法によって得られるものと比べて、ｍＲＮＡ転写物混合物中の各ｍＲＮＡ転写物の相対量をより良く反映するｓＲＮＡ分子を作製することを発見した。
【０００７】
本発明の一態様は、ｓＲＮＡ分子を作製するための方法であって、５’末端および３’末端を有する１本鎖ｃＤＮＡ分子を提供するステップと、１本鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端にオリゴデオキシヌクレオチドテイルを結合するステップと、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを提供するステップであって、センス鎖が、オリゴデオキシヌクレオチドテイルに相補的な配列を含む１本鎖３’末端オーバーハングを含むステップと、３’末端オーバーハング配列と相補的塩基対形成することによって、オリゴデオキシヌクレオチドテイルに２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをアニーリングするステップと、オリゴデオキシヌクレオチドテイルの３’末端に２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのアンチセンス鎖の５’末端をライゲーションするステップと、２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ転写を開始し、ｓＲＮＡ分子を作製するステップを含む方法に関する。
【０００８】
出願人らはさらに、２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモータースタッガードライゲーション反応においてｃＤＮＡ第１鎖の３’末端に結合している、核酸鋳型からセンスＲＮＡ分子を作製するためのキットも発明した。
【０００９】
したがって、本発明の別の態様は、１本鎖３’末端オーバーハング配列を含むセンス鎖を有する２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、２本鎖プロモーターを使用してｓＲＮＡ分子を作製するための取扱説明物を含む、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を作製するためのキットに関する。いくつかの実施態様において、本発明のキットは、２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの１本鎖３’ 末端オーバーハング配列に相補的であるオリゴデオキシヌクレオチドテイルを１本鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端に結合するための少なくとも１つの酵素と、２本鎖プロモーターをｃＤＮＡ分子の３’末端にライゲーションするための少なくとも１つの酵素をさらに含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、ｓＲＮＡ分子を作製するための方法とキットに関する。「ｓＲＮＡ分子」、「ｍＲＮＡ分子」および「ｃＤＮＡ分子」は、各々、一分子、単一種の複数の分子および異なる種の複数の分子を含むことが意図されている。本発明の方法は、１本鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端にオリゴデオキシヌクレオチドテイルを結合するステップと、そのセンス鎖がオリゴデオキシヌクレオチドテイルに相補的な配列を含有する１本鎖３’末端オーバーハングを含有する２本鎖プロモーターにオリゴデオキシヌクレオチドテイルをライゲーションするステップとを含む。３’オリゴデオキシヌクレオチドテイルに相補的な配列を含有する３’末端オーバーハングを使用すると、効率的なスタッガードライゲーションにとって適切にプロモーターおよびｃＤＮＡ分子を配向する。次いで、得られるプロモーター含有１本鎖ｃＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロにおける転写反応に使用して、ｓＲＮＡを作製する。このようなｓＲＮＡ分子は、１本鎖ｃＤＮＡが得られる元のｍＲＮＡ転写物の増幅されたコピーに相当する。
【００１１】
本発明の方法は、プロモーター配列をｃＤＮＡ第１鎖分子の５’末端に組み込む現在利用可能な技術とは異なる。そのような技術では、ＲＮＡの転写は、元のｍＲＮＡ転写物に対してｃＤＮＡ第１鎖合成と同じ方向に進行し、元のｍＲＮＡ転写物の３’ポリＡテイルに近位のヌクレオチドを多く含むバイアスを含むアンチセンスＲＮＡ分子が作製される。ｃＤＮＡ分子の３’末端にプロモーター配列を導入することによって、本発明の方法は、元のｍＲＮＡ転写物の両方の末端の遺伝情報をコピーし、増幅することを可能にする。得られるｓＲＮＡ分子は、完全長の各元のｍＲＮＡ転写物を従来技術の方法によって得られるものより代表しており、ｍＲＮＡ転写物の混合物中の各ｍＲＮＡ転写物の相対量を従来技術の方法によって得られるものと比べてより良く反映している。
【００１２】
本発明の方法はまた、プライミングバイアスを全く組み入れないで、ランダムプライミングに組み合わせることもできる。ｓＲＮＡ分子は、下流アッセイにおいてより効率的に使用するためのポリＡテイルを含有することができる。さらに、本発明の方法は、相補的な塩基対形成を使用して、ライゲーションの前にｃＤＮＡ分子の３’末端にプロモーターを適切に配向するので、それらは、低温において平滑末端ライゲーションを使用してｃＤＮＡ分子にプロモーターを結合するような方法より効率的である（例えばＵＳ２００３／０１０４４３２号）。
【００１３】
本発明の方法は、分子生物学分野の通常の技法を使用している。一般的な分子生物学方法を開示している基本的な教本には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４年）が挙げられる。
【００１４】
ｃＤＮＡ第１鎖分子を合成するための数多くの方法および市販のキットが当技術分野において既知である。例として、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）、Ａｒｒａｙ  ５０（商標）、Ａｒｒａｙ  ３５０（商標）およびＡｒｒａｙ  ９００（商標）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ、ハットフィールド、ペンシルベニア州）ならびにＣｙＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｐｏｓｔ−Ｌａｂｅｌｌｉｎｇキット（アマシャム、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が挙げられる。一般に、関心対象の起源由来の大量のｍＲＮＡ分子（すなわち、元のｍＲＮＡ転写物）を逆転写反応の鋳型として使用する。ＲＮＡは、任意の生物または環境試料に見られるビリオン、原核生物および真核生物起源を含む任意の組織または細胞起源から入手することができる。好ましくは、起源は真核生物組織であり、さらに好ましくは、哺乳類組織であり、もっとも好ましくは、ヒト組織である。
【００１５】
熱安定およびＲＮａｓｅ  Ｈ-逆転写酵素を含む任意の逆転写酵素を逆転写反応に使用することができる。好ましくは、ＲＮａｓｅ  Ｈ-逆転写酵素を使用する。
【００１６】
ｃＤＮＡ第１鎖合成のプライマーは市販品を購入してもまたは当技術分野において既知の技法を使用して合成して精製してもよい。ｃＤＮＡ第１鎖合成のプライマーは、３’ポリＡテイルを有する任意の元のｍＲＮＡ転写物にアニーリングするオリゴＴテイルを３’末端に含む１本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを含む（図１ａ参照）。テイルは、一般に、長さ約１０〜約３０ヌクレオチドの範囲であり、好ましくは、長さ約１７〜約２４ヌクレオチドの範囲である。遺伝子特異的なプライマーもｃＤＮＡ第１鎖合成に使用することができる。
【００１７】
または、逆転写反応は、元のｍＲＮＡ転写物各々の長さの種々の位置にアニーリングするランダムプライマーを使用して開始することができる。プライマーは、一般に、長さ約４〜約２０ヌクレオチドの範囲であり、好ましくは、長さ約６〜約９ヌクレオチドの範囲である。ランダムプライマーの使用は、最終的には、オリゴＴプライマーを使用して作製されるものより、元のｍＲＮＡ転写物各々の全体の長さをより代表するｓＲＮＡ分子を作製することを当業者は認識している。さらに、ｃＤＮＡを作製するためにランダムプライマーを使用することは、分解したＲＮＡまたは細菌由来のＲＮＡなどの、増幅を免除されていると思われるＲＮＡを使用して増幅ｓＲＮＡ分子を作製することができることを意味する。その後のインビトロにおける転写中に作製される増幅ｓＲＮＡ分子がポリＡテイルを有するように、一般に長さ約１０〜約３００ヌクレオチド、好ましくは、長さ約１７ヌクレオチド〜約２４ヌクレオチドの範囲のオリゴＴ配列を５’末端に含むようにランダムプライマーを改良することができる。
【００１８】
ｃＤＮＡ第１鎖合成後、ＲＮＡは、一般にｃＤＮＡ第１鎖分子の精製前に分解される（図１ｂ参照）。ＮａＯＨ処理などの、ＲＮＡを分解する任意の方法を使用することができる。または、ＲＮＡは無傷のままであることもあり、ｃＤＮＡ第１鎖分子はＲＮＡ／ｃＤＮＡ２本鎖から精製される。ＤＮＡ分子を精製するための数多くの方法およびキットが存在する。例として、ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）ＰＣＲ精製キット（キアゲン，バレンシア，カリフォルニア州、ＳｐｉｎＰｒｅｐ（商標）ＰＣＲ  クリーン−アップキット（ノバジェン，マディソン，ウィスコンシン州）および同様のＤＮＡ分取原理に基づいた他の精製システムが挙げられる。
【００１９】
ｃＤＮＡ第１鎖精製後、１本鎖オリゴデオキシヌクレオチドテイルをｃＤＮＡ分子の３’末端に結合する（図１ｃ参照）。オリゴデオキシヌクレオチドテイルは、デオキシヌクレオチドを１本鎖ＤＮＡに結合する任意の手段によって組み入れることができる。好ましくは、オリゴデオキシヌクレオチドテイルは、適当なデオキシヌクレオチドの存在下においてターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼまたは他の好適な酵素を使用して１本鎖ｃＤＮＡに結合される。好ましくは、オリゴデオキシヌクレオチドテイルはホモポリマーテイル（すなわち、ポリｄＡ、ポリｄＧ、ポリｄＣまたはポリｄＴ）である。さらに好ましくは、オリゴデオキシヌクレオチドテイルはポリｄＴテイルである。テイルは、一般に、長さ約３〜５００ヌクレオチド超の範囲であり、好ましくは、長さ約２０〜約１００ヌクレオチドの範囲である。
【００２０】
１本鎖オリゴデオキシヌクレオチドテイルを１本鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端に結合後、２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、ＤＮＡライゲーションによって３’オリゴデオキシヌクレオチドテイルに結合される（図１ｄ参照）。これは、３’オリゴデオキシヌクレオチドテイルと相補的なデオキシヌクレオチドの配列を有する２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス鎖の３’末端のオーバーハング配列との間の相補的な塩基対形成により促進される。例えば、オリゴデオキシヌクレオチドテイルがポリｄＴテイルである場合には、プロモーターの３’末端オーバーハングは、一般に長さ約３〜５０ヌクレオチド超、好ましくは長さ約１０〜約３０ヌクレオチドの範囲のアデノシン塩基の配列を３’末端に有する。３’末端オーバーハング配列の特定のヌクレオチド配列は３’オリゴデオキシヌクレオチドテイルの特定のヌクレオチド配列と完璧に（すなわち、１００％）相補的である必要はなく、また３’末端オーバーハングの長さは、配列が互いに相補的であることが考慮される３’オリゴデオキシヌクレオチドテイルの長さと全く同じである必要はない。必要なことは、３’末端オーバーハングが３’オリゴデオキシヌクレオチドテイルにアニーリングし、それによって２本鎖プロモーターをｃＤＮＡ分子の３’末端に適切に位置づけることができるように、２つの配列間に十分な相補性が存在することだけであることを当業者は認識している。２本鎖プロモーターは、適切に位置づけられたら、オリゴデオキシヌクレオチドテイルの３’末端にプロモーターのアンチセンス鎖の５’末端をライゲーションすることによって３’オリゴデオキシヌクレオチドテイルに結合される。このような「スタッガード」ライゲーション反応は、平滑末端ライゲーション反応より効率がよく、高い温度で実施することができる。任意のＤＮＡリガーゼをライゲーション反応に使用することができる。好ましくは、ＤＮＡリガーゼはＴ４ＤＮＡリガーゼである。
【００２１】
２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される配列を有する。特異的なプロモーター配列が、ポリメラーゼによって認識されることが既知である限り、任意のＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。好ましくは、使用されるプロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなどのバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって認識される。例示的なＴ７ポリメラーゼプロモーターセンス配列はＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号：１）である。例示的なＴ３ポリメラーゼプロモーターセンス配列はＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧ（配列番号：２）である。例示的なＳＰ６ポリメラーゼプロモーターセンス配列はＡＡＴＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ（配列番号：３）である。
【００２２】
アニーリングおよびライゲーションによって１本鎖３’オリゴヌクレオチドテイルへの２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの結合後に、組み込まれていない２本鎖プロモーターは、好ましくは、ＤＮＡ精製によって除去されて、短い増幅産物の産生を防ぐ。次いで、適当なＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチドを添加することによってインビトロにおける転写を開始する（図１ｅ参照）。このような転写により、大量の増幅ｓＲＮＡを産生することができる。インビトロにおける転写を実施するための方法およびキットは当技術分野において既知であり、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）転写キット（アンビオン，オースティン，テキサス州）およびＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）高収率転写キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，マディソン，ウィスコンシン州）が挙げられる。
【００２３】
本発明の方法は、好ましくは、ｃＤＮＡ第２鎖合成を行わないで実施されるが、ｃＤＮＡ第２鎖は、ｄＮＴＰの存在下においてＤＮＡポリメラーゼを使用するＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス鎖の３’末端オーバーハングの伸長によって選択的に合成することができることを当業者は認識している。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはクレノー酵素である。または、ｃＤＮＡ第２鎖合成はランダムプライマーを使用して合成することができる。ランダムプライマーはｃＤＮＡ第１鎖の種々の位置にアニーリングし、ｄＮＴＰの存在下においてＤＮＡポリメラーゼによって伸長されうる。これらのランダム−プライミングされたｃＤＮＡ第２鎖断片は、選択的に、ライゲーションして、第２の１本鎖ｃＤＮＡ分子を作製することができる。このようなｃＤＮＡ第２鎖分子は、インビトロにおける転写中にｃＤＮＡ第１鎖を安定化し（例えば二次および三次構造を除去し）、高収率のｓＲＮＡ分子を生ずることができる。
【００２４】
得られたｓＲＮＡ分子は、記載されているものと同じ方法を使用して、追加のラウンドの増幅を実施することができる。例えば、オリゴｄＴ−媒介性ｃＤＮＡ第１鎖（すなわち、第１ラウンドのｓＲＮＡ分子）から作製されるｓＲＮＡ分子は、オリゴｄＴ−媒介性ｃＤＮＡ第１鎖合成の第２ラウンドのプライミング部位として働くことができるポリＡテイルを３’末端に示す。または、ランダムプライマーを使用して、第１ラウンドのｓＲＮＡ分子からｃＤＮＡ第１鎖を逆転写することができる。オリゴｄＴおよびランダムプライマーの組み合わせおよび混合物も第２ラウンドのｃＤＮＡ合成に使用することができる。次いで、２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを上記のように第２ラウンドの１本鎖ｃＤＮＡ分子に結合し、次に適当なＲＮＡポリメラーゼで第２ラウンドのインビトロ転写を実施する。追加のラウンドの増幅を実施することにより、最初のラウンドの増幅に少量のｍＲＮＡを使用することができる。
【００２５】
市販のポリＡテイル付加キットを使用して、（従来のランダムプライミングしたｃＤＮＡ第１鎖から作製されるものなどの）ポリＡテイルを欠損する増幅されたｓＲＮＡ分子の３’末端にポリＡテイルを付加することができる。このようなキットの一例はポリ（Ａ）テイル付加キット（Ａｍｂｉｏｎ）である。または、ポリＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、インビトロジェンおよびＡｍｂｉｏｎ社製）を適当な緩衝液中でＡＴＰおよび増幅ｓＲＮＡ分子と組み合わせて使用して、ｓＲＮＡ分子の３’末端にポリＡテイルを合成することができる。ポリＡテイルの付加は、増幅ｓＲＮＡ分子を使用することができる下流アッセイの数および種類を増加するだけでなく、そのようなアッセイにおけるさらに費用のかからないＲＮＡラベリング別法の使用を可能にする。
【００２６】
本発明の方法によって作製されるｓＲＮＡ分子は、遺伝子発現研究、遺伝子クローニングおよびサブトラクティブハイブリダイゼーションを含む、ｍＲＮＡを典型的に使用する任意の目的に使用することができる。例えば、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマーまたはそれらの組み合わせを使用して、最初にＲＮＡ分子を１本鎖ｃＤＮＡ分子に逆転写することができる。蛍光標識ヌクレオチドなどの検出可能であるように標識したヌクレオチドの存在下において逆転写反応を実施することができる。このようなヌクレオチドには、Ｃｙ３およびＣｙ５で標識したヌクレオチドが挙げられる。または、ｃＤＮＡ分子に少なくとも１つの検出可能な標識を結合することによって、ｃＤＮＡ分子を合成後に標識する。好ましくは、３ＤＮＡ（商標）技術（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ）を使用してｃＤＮＡ分子を標識する。これらの樹状（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ）試薬は、ニルソンら，Ｊ．  Ｔｈｅｏｒ．  Ｂｉｏｌ．，  １８７：  ２７３−２８４（１９９７）；Ｓｔｅａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ３：  ９３−９９（２０００）；および米国特許第５，１７５，２７０号；同第５，４８４，９０４号；５，４８７，９７３号；同第６，０７２，０４３号；同第６，１１０，６８７号および同第６，１１７，６３１号にさらに記載されている。
【００２７】
本発明のｓＲＮＡ分子から作製した標識１本鎖ｃＤＮＡ分子は遺伝子発現研究のプローブとして有用である。ｃＤＮＡ分子を、相補的なポリヌクレオチドを含む核酸アレイに接触させることができる。好ましくは、マイクロアレイはＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンタクララ、カリフォルニア州）である。本発明の方法によって作製されるｓＲＮＡ分子は、従来の核酸増幅技法を使用して得られるものと比べて元のｍＲＮＡ転写物の全体の長さをより良く示しており、元のｍＲＮＡ転写物各々の相対量をより反映するので、遺伝子発現研究について得られる結果は、従来の核酸増幅技法を使用して得られるものより有意義（例えば、正確）となりうる。
【００２８】
本発明はまた、本明細書に記載する方法の実施を容易にするためのキットも提供する。このようなキットは、種々の研究および診断適用に使用することができる。例えば、本発明の方法およびキットを使用して、異なる細胞もしくは組織、同じ細胞もしくは組織の異なる亜集団、同じ細胞もしくは組織の異なる生理状態、同じ細胞もしくは組織の異なる発生段階または同じ組織の異なる細胞集団における１つ以上の遺伝子の発現の比較分析を容易にすることができる。このような分析は、遺伝子の発現レベルの統計学的に有意な差を明らかにすることができ、分析対象の細胞または組織に応じて、種々の疾患状態の診断を容易にするために使用することができる。
【００２９】
本発明により種々のキットを調製することができる。例えば、キットは、２本鎖プロモーターのセンス鎖が１本鎖３’末端オーバーハング配列を含む２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、２本鎖プロモーターを使用してｓＲＮＡ分子を作製するための取扱説明書含んでもよい。取扱説明書は、典型的には、書面または印刷物を含むが、これに限定されない。このような取扱説明書を保存し、エンドユーザーにそれらを伝達することができる任意の媒体が本発明によって考慮されている。このような媒体には、電子記憶媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）等が挙げられるが、これらに限定されない。このような媒体は、このような取扱説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含んでもよい。
【００３０】
本発明のキットは以下の要素または試薬の１つ以上をさらに含んでもよい。逆転写酵素、ＲＮａｓｅ阻害剤、２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの１本鎖３’末端オーバーハング配列に相補的であるオリゴデオキシヌクレオチドテイルを１本鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端に結合するための酵素（例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、１本鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端に２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをライゲーションするための酵素（例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼ）、２本鎖ｃＤＮＡを選択的に合成するために酵素（例えば、クレノー酵素）、およびプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）。キットは、さらに、本発明の方法によるｓＲＮＡ分子の作製に適合している緩衝液、プライマー（例えばオリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー）、ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、ＲＮａｓｅフリー水、容器、バイアル、反応チューブ等を含んでもよい。要素および試薬は、個別に提供されてもまたは好適な保存媒体と組み合わせて容器内に入れて提供されてもよい。
【００３１】
本発明の方法による具体的な実施態様は以下の実施例に記載されている。実施例は例示的なものにすぎず、本発明の範囲をいかなる意味においても限定することは意図されていない。
【００３２】
実施例
【実施例１】
【００３３】
ｃＤＮＡ第１鎖合成
ｃＤＮＡ第１鎖を合成するためには、ＲＮＡｑｕｏｕｓ（登録商標）キット（アンビオン）を使用して精製した１〜１０μｌのラット脳総ＲＮＡ（最高１μｇ）を２μｌのオリゴｄＴ24プライマー（５０ｎｇ／μｌ）（５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ−３’；配列番号：４）と混合し、ＲＮａｓｅフリー水で１１μｌにした。ＲＮＡ／プライマー混合物を８０℃において１０分間加熱し、速やかに氷上で１〜２分冷却した。次いで、混合物を９μｌのマスター混合物溶液と混合して、最終容量を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０Ｕ  Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（商標）（アンビオン）および２００Ｕ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン）を含む２０μｌにした。混合物を短時間遠心分離し、４２℃において２時間インキュベーションした。０．５Ｍ  ＮａＯＨ／５０ｍＭ  ＥＤＴＡの３．５μｌを添加して、６５℃で１５分間加熱することによって反応を停止した。短時間の遠心分離後、反応を１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で中和して、１×ＴＥ、ｐＨ８．０で５０μｌに調整した。製造業者のプロトコールによりＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を使用して反応液を精製した。ｃＤＮＡ第１鎖分子は、製造業者により提供された１０μｌのＥＢ緩衝液で溶出した。
【００３４】
ｃＤＮＡ第１鎖のテイル付加
ｃＤＮＡ第１鎖分子を８０℃において１０分間加熱し、速やかに氷上で１〜２分冷却した。次いで、ｃＤＮＡ分子の１０μｌを１５μｌのマスター混合物溶液と混合し、最終容量を、６．５μｌ  ＲＮａｓｅフリー水、１×  テイル付加緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2）、１．５ｍＭ  ｄＴＴＰおよび３０Ｕ  ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（インビトロジェン）を含む２５μｌにした。混合物を短時間遠心分離し、３７℃において３０分間インキュベーションした。６５℃で１５分間加熱し、室温において１〜２分間冷却することによって反応を停止した（以下のライゲーション反応の加熱段階に直接進む場合には、この段階を省略してもよい）。
【００３５】
Ｔ７プロモーターのライゲーション
オリゴｄＴ−テイル付加ｃＤＮＡ分子を９５〜１００℃において１０分間加熱して、速やかに氷上で１〜２分冷却した。４部のライゲーションミックス希釈干渉液（３９５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、３０ｍＭ  ＡＴＰ）を１部の６×ライゲーションミックスと合わせることによって６×ライゲーションミックスの１：５希釈液を調製した。希釈した６×ライゲーションミックスは、５’リン酸化Ｔ７ライゲーションオリゴ（７ｎｇ／μｌ）（５−ＣＣＣ  ＴＡＴ  ＡＧＴ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＴＡ−３’；配列番号：５）およびＴ７  ｄＡ  ブリッジオリゴ（１３．１ｎｇ／μｌ）（５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ−３’；配列番号：６）を、３９５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、３０ｍＭ  ＡＴＰ中に含有する。２つのオリゴは、一緒にアニーリングすると、３’ポリｄＡセンス鎖オーバーハングを有する２本鎖Ｔ７プロモーターを作製する。次いで、テイル付加したｃＤＮＡ分子の２５μｌを５μｌの希釈した６×ライゲーションミックスおよび２μｌ（２Ｕ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（インビトロジェン）と混合した。混合物を短時間遠心分離し、２３℃において３０分間インキュベーションした。０．５Ｍ  ＥＤＴＡの３．５μｌを添加し、６５℃までの温度で１０分間加熱することによって反応を停止した。１×ＴＥ、ｐＨ８．０で反応液を５０μｌに調整した。製造業者のプロトコールにより、ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）ＰＣＲ精製キットを使用して反応液を精製した。Ｔ７プロモーターとライゲーションしたｃＤＮＡ分子は１０μｌのＥＢ緩衝液で溶出した。
【００３６】
インビトロにおける転写
２μｌのＴ７  ｄＡブリッジオリゴ（５０ｎｇ／μｌ）（配列番号：６）をＴ７プロモーター−ライゲーションしたｃＤＮＡ分子に添加し、ＲＮａｓｅ−水で容量を１６μｌに調整した。混合物を９５℃において１０分間加熱し、速やかに２分間氷冷した。次いで、混合物を３７℃において１０〜１５分間加熱し、次いで２４μｌのマスター混合物溶液と混合し、最終容量を、１×反応緩衝液、５ｍＭ各ｒＮＴＰおよび２μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）転写キット、アンビオン）を含む４０μｌにした。混合物を短時間遠心分離し、３７℃のヒートブロックで５分間インキュベーションし、次に３７℃のハイブリダイゼーション用エアーオーブンにおいて６〜１４時間インキュベーションした。製造業者のプロトコールによりＲｎｅａｓｙ（登録商標）キットを使用して、増幅したｓＲＮＡ分子を精製した。ｓＲＮＡ分子は５０μｌのＲＮａｓｅフリー水に溶出し、同じ溶出液で再溶出し、波長比２６０／２８０でＵＶ−分光測定法で定量した。
【実施例２】
【００３７】
実施例１の方法を実施したが、ｃＤＮＡ第１鎖合成はオリゴＴ24プライマーの代わりにランダムプライマーを使用して実施した。簡単に説明すると、１〜１０μｌの総ＲＮＡ（最高１μｇ）を２μｌランダム９ｍｅｒプライマー（２５０ｎｇ／μｌ）（５’−ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ−３’；配列番号：７）と混合し、ＲＮａｓｅフリー水で１１μｌにした。ＲＮＡ／プライマー混合物を８０℃において１０分間加熱し、速やかに氷上で１〜２分間冷却した。次いで、混合物を９μｌのマスター混合物溶液と混合し、最終容量を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭジチオスレイトール、０．５ｍＭ各ｄＮＴＰ、１０Ｕ  Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（商標）および２００Ｕ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素を含む２０μｌにした。混合物を短時間遠心分離し、４２℃において２時間インキュベーションした。０．５Ｍ  ＮａＯＨ／５０ｍＭ  ＥＤＴＡの３．５μｌを添加し、６５℃で１５分間加熱することによって反応を停止した。短時間の遠心分離後、反応液を１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の５μｌで中和し、１×ＴＥ、ｐＨ８．０で５０μｌに調整した。製造業者のプロトコールによりＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）ＰＣＲ精製キットを使用して反応液を精製した。ｃＤＮＡ第１鎖分子は、製造業者によって提供された１０μｌのＥＢ緩衝液で溶出し、６×Ｔ７ライゲーションミックスをライゲーション反応において未希釈で使用した以外は、実施例１に記載するようにさらに処理した。
【実施例３】
【００３８】
実施例１および２の方法のどちらかを実施したが、ｃＤＮＡ第１鎖合成後に、ＲＮＡは、ｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）精製カラムに適用する前は無傷のままとした（すなわち、塩基性加水分解しない）。ｃＤＮＡ第１鎖分子は製造業者によって提供された１０μｌのＥＢ緩衝液で溶出し、実施例１に記載するようにさらに処理した。
【実施例４】
【００３９】
ポリ（Ａ）テイル付加キット（アンビオン）を使用して実施例２および３のランダムプライマー方法によって作製した増幅ｓＲＮＡ分子にポリＡテイルを付加した。Ａｒｒａｙ３５０（商標）検出キット（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ）を使用してポリＡ−テイル付加ｓＲＮＡを標識ｃＤＮＡに変換し、検出キットの製品マニュアルに公表されている標準的な技法によってマイクロアレイにハイブリダイゼーションする。
【実施例５】
【００４０】
上記の方法で作製した種々の量のｓＲＮＡを、臭化エチジウムで染色した１％アガロース変性ゲル上で可視化した。図２に示すように、本発明の方法（ＳｅｎｓｅＡｍｐとして同定されている、レーンＥ〜Ｇ）は、市販のＥｂｅｒｗｉｎｅによる方法（ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）として同定されている、アンビオン、レーンＢ〜Ｄ）と比較して、大型の増幅ＲＮＡ分子を作製した。本発明の方法を使用すると、出発ＲＮＡ試料の最高〜１０００倍の増幅収率が得られた。ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）を使用して作製される増幅アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）と本発明の方法を使用して作製される増幅ｓＲＮＡの比較によって作製される実験データは、本発明の方法は、元の未増幅ＲＮＡ試料に見られるｍＲＮＡ転写物の相対量を維持する上で、Ｅｂｅｒｗｉｎｅによる方法より正確であることを示した。ピアソンの対数相関係数は、それぞれ、０．９１および０．８６であった。未増幅試料と増幅試料の完璧な相関は、ピアソンの対数相関が１．００であることによって反映されると思われる。
【実施例６】
【００４１】
実施例１および３のオリゴｄＴ方法のどちらかを実施したが、精製ｓＲＮＡ分子に第２ラウンドのＲＮＡ増幅を実施した。簡単に説明すると、第１ラウンドの増幅ｓＲＮＡ分子を含有するインビトロ転写反応を３０μｌのＲＮａｓｅ−フリー水でＲｎｅａｓｙ（登録商標）カラムから溶出し、同じ溶出液で再溶出した。溶出液を１μｌのオリゴｄＴ24プライマー（５０ｎｇ／μｌ）（配列番号：４）および２μｌのランダム９ｍｅｒプライマー（２５ｎｇ／μｌ）（配列番号：６）と混合し、ＲＮａｓｅフリー水で３７μｌにした。ＲＮＡ／プライマー混合物を８０℃において１０分間加熱し、速やかに氷上で１〜２分間冷却した。次いで、混合物を２３μｌのマスター混合物溶液と混合し、最終容量を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．３３ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０Ｕ  Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（商標）および２００Ｕ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素を含む６０μｌにした。混合物を短時間遠心分離し、４２℃において２時間インキュベーションした。１×ＴＥ、ｐＨ８．０で反応液を１００μｌに調整した。製造業者のプロトコールによりＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）ＰＣＲ精製キットを使用して反応液を精製した。ｃＤＮＡ第１鎖分子は、製造業者によって提供された１０μｌのＥＢ緩衝液で溶出し、実施例１に記載するようにさらに処理した。
【実施例７】
【００４２】
ｓＲＮＡ分子を作製するためのキットは、以下の要素が集成されている：
オリゴｄＴ24プライマー（５０ｎｇ／μｌ）、
ランダム９ｍｅｒプライマー（２５０ｎｇ／μｌ）
ｄＮＴＰミックス（各１０  ｍＭ）、
Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（商標）（アンビオン）、
ｄＴＴＰテイル付加ミックス（１０ｍＭ）；
１０×テイル付加緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2）；
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（１５〜３０Ｕ／μｌ）、
５’リン酸化Ｔ７ライゲーションオリゴ（３５ｎｇ／μｌ）およびＴ７ｄＡブリッジオリゴ（６５．６ｎｇ／μｌ）を３９５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の溶液、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、３０ｍＭ  ＡＴＰを含有する６×ライゲーションミックス、
ライゲーションミックス希釈緩衝液（３９５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、３０ｍＭ  ＡＴＰ）、
Ｔ７ｄＡブリッジオリゴ（５０ｎｇ／μｌ）、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μｌ）、および
ヌクレアーゼフリー水。
【００４３】
要素は番号付きのバイアルに入れられ、キット要素を使用して増幅ｓＲＮＡ分子を作製するための書面の取扱説明書と共に容器に入れられている。ｃＤＮＡ第２鎖合成が望ましい場合には、キットは、選択的に、クレノー酵素（７．５Ｕ／μｌ）を含有してもよい。
【００４４】
明細書に引用されているすべての刊行物、特許公報および特許以外の刊行物は、本発明が属する当技術分野の当業者のレベルを示す。これらの刊行物は全て、個々の刊行物各々が具体的および個別に参照により組み入れているように示されるのと同じ程度で全体の内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４５】
本発明は、本明細書において特定の実施態様を参照して記載されているが、これらの実施態様は本発明の原理および適用を例示するにすぎないことが理解されるべきである。従って、以下の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱しないで、数多くの改良を例示的な実施態様に加えることができることおよび他のアレンジを考案することができることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の方法の一実施態様を図示するフローチャートである。
【図２】臭化エチジウムで染色した１％アガロース変性ゲル上で可視化した本発明の方法によって作製した種々の量のｓＲＮＡを図示する写真である。
【図１ａ−１ｃ】
2007515938.tif 000003
【図１ｄ−１ｅ】
2007515938.tif 000004
【図２】
2007515938.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月27日(2007.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
前記１本鎖ｃＤＮＡ分子を提供するステップが、５’末端および３’末端を有するｍＲＮＡ転写物を提供するステップと、前記ｍＲＮＡ転写物から１本鎖ｃＤＮＡ分子を合成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２５】
前記ポリＡテイルが、ポリＡポリメラーゼを使用して結合される、請求項２４に記載の方法。
【国際調査報告】
2007515938.tif 000006
2007515938.tif 000007