(57)【要約】  癌，特に乳癌のリスクを予測するために用いることができる診断方法が開示される。この方法は，（ｉ）患者から生物学的サンプルを単離し；そして（ｉｉ）本明細書において配列番号１として識別される配列中に含まれる遺伝子の存在または発現を検出することを含み，ここで，遺伝子の存在または発現は，癌の存在またはリスクを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において癌の存在またはリスクを検出する方法であって，
（ｉ）患者から生物学的サンプルを単離し；そして
（ｉｉ）配列番号１として識別されるヌクレオチド配列を特徴とする遺伝子の存在または発現を検出する
の各工程を含み，ここで，遺伝子の存在または発現は癌の存在またはリスクを示す，
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
遺伝子が配列番号２として識別されるものである，請求項１記載の方法。
【請求項３】
サンプルが乳組織，子宮，精巣または卵巣から得られたものである，請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
癌が乳癌である，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
検出がポリメラーゼ酵素を用いて遺伝子を増幅することにより行われる，請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
本明細書において配列番号１として識別されるヌクレオチド配列，またはその相補体，またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該配列（またはその相補体）にハイブリダイズする少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのポリヌクレオチドを含む，単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列が本明細書において配列番号２として識別される配列である，請求項６記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
患者において癌のリスクを試験するためのインビトロ診断アッセイにおける，請求項６記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項９】
癌が乳癌である，請求項８記載の使用。
【請求項１０】
本明細書において配列番号３として識別される配列，またはその少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基のフラグメントを含むペプチド。
【請求項１１】
請求項１０記載のペプチドに対して少なくとも１０-6Ｍの親和性を有する抗体。
【請求項１２】
請求項６または７に記載のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子にハイブリダイズするかまたはその発現を阻害する第２のポリヌクレオチドの，癌，特に乳癌の治療用の医薬品の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は，癌，特に乳癌の存在またはリスクの検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
世界で１年に１００万件以上の乳癌の症例があり，そのうち米国はおよそ５０万人，英国は４万人，およびアイルランドはほぼ２，０００人である。女性ではこれは癌による死亡の第１位である。西洋では，疾病の全体的な発症率は増加しているが，より広いスクリーニングおよび改良された治療により，致死率は１９９１年から１年に約１％で徐々に低下している。初期の乳癌と診断された患者は，９０％を越える５年生存率を有するが，これに対し遠位転移乳癌と診断された患者の場合は２０％である。いずれにしても，乳癌に対する確実な初期スクリーニング試験は存在せず，現在，診断はマンモグラフィーおよび細針生検の結果により行われている。マンモグラフィーには限界があり，疑わしい結果の８０％以上は擬陽性であることが後にわかり，乳癌を有する女性の１０−１５％は擬陰性の結果を与える。しばしば，腫瘍は検出の前に後期の発達段階に達しており，患者の生存の確率は低下し，治療およびシステムの管理のコストが増加する。患者の死亡率を低下させるために，乳の小さい（直径２ｃｍ未満）の初期のインシトゥー癌腫を検出するより感度の高い方法が求められている。初期の検出に加え，既知の癌の分類および腫瘍タイプの区別において，疾病を良性であるか悪性であるかに分類する上で深刻な問題が存在する。さらに，現在進行中の治療の効果をモニターし，特定の治療法に耐性となりつつある患者を識別することが求められている。乳腺は成人期の間，特に妊娠，授乳および退縮の間に形態学的および機能的に著しく変化するいくつかの臓器の１つであり，この変化は同じ乳腺の分子シグニチャーが経時的に変化することにつながる可能性があるため，そのような検出プロセスはさらに複雑である。
【０００３】
疾病の診断は，しばしば，小数の生物学的マーカーの相対的レベルの注意深い検査により行われる。最近の進歩にもかかわらず，患者のケアおよび臨床的帰結に対する現在のバイオマーカーの貢献は限られている。これは，現存するマーカーは診断の感度および疾病特異性が低いためである。しかし，分子バイオマーカーのいくつかは，疾病診断において日常的に用いられており，例えば，前立腺癌スクリーニングには前立腺特異的抗原が用いられており，新たな候補マーカーが発見される速度は増加している（Ｐｒｉｔｚｋｅｒ，２００２）。よく検証されたバイオマーカーのパネルの使用が，試験の陽性予測価値を高め，擬陽性または擬陰性を最小にするであろうことが認められつつある（Ｓｒｉｎｉｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。さらに，現在ニューラルネットワークに対する興味が増加しており，これは，種々のバイオマーカーからの弱いが独立した情報を組み合わせて，各バイオマーカー単独より有益な予後／予測指標を与えることの有望性を示す（Ｙｏｕｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０００４】
より多くの分子情報を照合すると，患者の帰結につながる遺伝的シグニチャーにしたがって乳癌等の疾病をさらに分類することができ，医師にとって価値のある情報を与えることができる。分子医薬において新たに生じた技術は，伝統的な病理学的基準では認識できない疾病のサブタイプ間を区別するのに（Ｓｏｒｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１），および癌の進行に関与する特異的な遺伝的事象を同定するのに（Ｓｒｉｎｉｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２），有力であることが示されている。平行して考慮する必要がある別の問題は，性別および人種の間のバイオマーカーの有効性に関するものであり，したがって，異なる集団の大規模なスクリーニングが必要である。
【０００５】
通常は乳においてのみ発現しているが，疾病の結果身体のあらゆる場所で見いだされる新規マーカーを用いることにより，乳癌の管理を改良することができる。疾病の活性を予測しうる物，特に本来の位置の腺管癌が発達して侵襲性の腺管癌となるか否かを予測しうる物は，疾病の管理においても利用価値がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明の第１の観点にしたがえば，以下の各工程を含む，患者における癌の存在またはリスクを検出する方法が提供される：
（ｉ）患者から生物学的サンプルを単離し；そして
（ｉｉ）配列番号１として識別されるヌクレオチド配列を特徴とする遺伝子の存在または発現を検出し，
ここで，該遺伝子の存在または発現は，癌の存在またはリスクを示す。
【０００７】
本発明の第２の観点にしたがえば，単離されたポリヌクレオチドは，本明細書において配列番号１として識別されるヌクレオチド配列，またはその相補体，またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該配列（またはその相補体）にハイブリダイズする少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのポリヌクレオチドを含む。
【０００８】
本発明の第３の観点にしたがえば，単離されたペプチドは，配列番号３として識別される配列，またはその少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基のフラグメントを含む。
【０００９】
本発明の第４の観点にしたがえば，抗体は，上で定義したペプチドに対して少なくとも１０-6Ｍの親和性を有する。
【００１０】
本発明の第５の観点にしたがえば，内因性ＤＤ２０遺伝子とハイブリダイズするかまたは他の方法によりその発現を阻害するポリヌクレオチドを，癌，特に乳癌の治療用の医薬品の製造のために用いる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の説明
本発明は，癌，特に乳癌，子宮癌または精巣癌に罹患している患者において発現されている遺伝子の同定に基づく。患者から取得したサンプルにおける遺伝子（またはその発現産物）の同定は，患者における癌の存在またはリスクを示す。
【００１２】
本発明はさらに，癌の素因を検出，診断，モニタリング，予後予測，予防，イメージング，治療または判定するのに有用な試薬，例えばポリペプチド配列に関する。
【００１３】
診断を実施する方法は，試験サンプル中のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し，遺伝子またはそのフラグメントに対応する適当な部分としてｃＤＮＡを増幅し，産物をその組織における疾病の存在の指標として検出する，または遺伝子配列を含むｍＲＮＡの翻訳産物を疾病の存在の指標として検出することを含むことができる。
【００１４】
有用な試薬には，診断方法，例えば，生検組織，血液または他の試験サンプルから抽出されたｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ，ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用なポリペプチドまたはそのフラグメント，またはそのようなｍＲＮＡの翻訳産物である蛋白質，またはこれらの蛋白質に対する抗体が含まれる。これらのアッセイはまた，体内で生じうる可能な修飾，例えば，サブユニット複合体の形成における，補因子，阻害剤，アクチベータおよび他の蛋白質等の分子との相互作用を考慮して，遺伝子産物（蛋白質）を検出する方法を含む。
【００１５】
癌に関連する遺伝子は，配列番号１で示されるポリヌクレオチド配列を特徴とする。推定コーディング配列は配列番号２に示される。遺伝子の発現産物は，本明細書において配列番号３で示される。遺伝子またはその発現産物の同定は，ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの検出または特性決定について知られる手法を用いて行うことができる。例えば，患者から単離された遺伝子材料を，標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする短いオリゴヌクレオチドを用いて探索することができる。オリゴヌクレオチドプローブは，標的遺伝子とハイブリダイゼーションしたときにプローブを検出しうるように，例えば蛍光団で検出可能なように標識してもよい。あるいは，ポリメラーゼ連鎖反応を用いて遺伝子またはその一部を増幅し，この産物を標識オリゴヌクレオチドを用いて同定してもよい。
【００１６】
この遺伝子，または関連する蛋白質または抗体を利用した診断アッセイとしては，限定されないが，
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
逆転写ＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲ
インシトゥーハイブリダイゼーション
サザンドットブロット
免疫組織化学
リボヌクレアーゼ保護アッセイ
ｃＤＮＡアレイ手法
ＥＬＩＳＡ
結合実験において有用な，ガラスまたはセラミクス等の固体支持体上の蛋白質，抗原または抗体アレイ
小干渉ＲＮＡ機能アッセイ
が挙げられる。上述の手法はすべて当業者にはよく知られている。
【００１７】
本発明はまた，配列番号１または配列番号２として識別される配列，またはその相補体を含む単離されたポリヌクレオチド，または少なくとも１５個の連続するヌクレオチド，好ましくは３０個のヌクレオチド，より好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチドを含むそのフラグメントに関する。上述のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲内である。ハイブリダイゼーションは，通常，ストリンジェントな条件下で行う。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者に知られており，非相補的ハイブリダイゼーションの可能性を低下させるように選択される。適当な条件の例は，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ  ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９８５）に開示されている。より詳細には，ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は，５０％ホルムアミド，５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム），５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐｈ７．６），５ｘデンハルト溶液，１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベーションし，次に０．１ｘＳＳＣ中で約６５℃で洗浄することを含む。
【００１８】
また，遺伝子の同定により，その遺伝子が治療用分子の標的である治療法を開発することが可能となる。例えば，遺伝子治療用に開発された，特定の遺伝子を標的としその発現を防止する多くの既知の分子が存在する。１つの特定の分子は，小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり，これは，標的ｍＲＮＡの分解を促進することにより，特定の標的蛋白質の発現を抑制する。目的とする遺伝子に結合して発現を改変することができる他の合成オリゴヌクレオチド（またはその制御要素）も知られている。ＤＮＡと結合させたペプチド核酸（ＰＮＡ）（ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ）もまた，強いデコイ活性を有しており，目的とする遺伝子の発現を変更することが示されている。これらの分子を用いて，遺伝子またはその制御上流要素に結合させて，発現を防止する。
【００１９】
本発明はまた，目的とする遺伝子の単離されたポリペプチド産物に関する。本発明の単離されたポリペプチドは，本明細書において配列番号３として識別される配列，または少なくとも１０個の連続するアミノ酸，好ましくは少なくとも１５個の連続するアミノ酸，より好ましくは少なくとも２０アミノ酸を有するそのフラグメントを含む。ポリペプチドは，抗体の作成，またはインビボで蛋白質に結合してその活性を阻害しうる蛋白質結合分子の開発に有用であろう。
【００２０】
本発明はまた，本発明のペプチドに対して生成された抗体を含む。抗体は，通常，ペプチドに対して少なくとも１０-6Ｍ，より好ましくは１０-9Ｍ，最も好ましくは少なくとも１０-11Ｍの親和性を有する。抗体は適当ないずれのタイプのものであってもよく，例えば，モノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。試験サンプルにおけるペプチド抗原の存在を判定するためのアッセイキットもまた含まれる。１つの態様においては，アッセイキットは，抗原に特異的に結合する抗体の入った容器を含み，ここで，抗原は，ＤＤ２０遺伝子によりコードされる少なくとも１つのエピトープを含む。これらのキットはさらに，試験サンプル，例えば，血液，唾液，尿または糞を回収するのに有用な道具の入った容器を含むことができる。そのような道具としては，血液を採取し安定化させるためのランセットおよび吸収紙または布，唾液を採取し安定化させるための綿棒，尿および糞サンプルを採取し安定化させるためのカップが挙げられる。抗体は，固相，例えば，ガラスまたはセラミック表面に結合させることができる。
【００２１】
これらの抗体を含むと疑われる試験サンプル中で，抗原と特異的に結合する抗体の検出を行うこともできる。この検出方法は，試験サンプルを遺伝子の少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドと接触させることを含む。接触は，抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件で行う。この方法はさらにポリペプチドを含む複合体を検出することも意味する。ポリペプチド複合体は，組換えまたは合成により製造することができ，あるいは天然起源から精製してもよい。
【００２２】
本発明の別の態様においては，その抗原に対する抗体またはそのフラグメントを用いて，疾病または状態を検出または診断する目的で，患者における抗原の局在の画像を検出することができる。そのような抗体は，モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく，または分子生物学手法で作成してもよく，種々の検出可能な試薬，例えば，限定されないが，放射性同位体で標識することができる。
【００２３】
さらに別の態様においては，抗体またはそのフラグメント（モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく，分子生物学手法により作成してもよい）は，本発明の遺伝子の発現により特徴づけられる疾病の治療のための治療薬として用いることができる。抗体は誘導化せずに使用してもよく，細胞傷害剤，例えば，放射性同位体，酵素，トキシン，薬剤，プロドラッグ等で誘導化してもよい。
【００２４】
"抗体"との用語は，広くすべての免疫学的結合剤，例えばＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤおよびＩｇＥを表す。抗体はまた，抗原結合領域を有するすべての抗体様分子を表し，例えば，限定されないが，シングルドメイン抗体（ＤＡＢＳ），Ｆｖ，ｓｃＦｖ，アプタマー等の抗体フラグメントが含まれる。抗体に基づく種々のコンストラクトおよびフラグメントを製造し使用する手法は，当該技術分野においてよく知られている。
【００２５】
所望の場合には，診断または予後のさらに信頼性の高い指標を与えるために，本発明の癌スクリーニング方法を他の方法と容易に組み合わせて，マルチマーカー試験とすることができる。
【実施例１】
【００２６】
以下の実施例では，添付の図面を参照して本発明を説明する。
【００２７】
乳癌患者のマッチした臨床サンプルに由来するｃＤＮＡ集団から，非同位体ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）を用いて，多数の異なるように発現されている遺伝子フラグメントを単離した。これらのフラグメントの１つ（本明細書においてＤＤ２０と称する）は，多数のドナーからの乳腫瘍組織サンプルにおいて，有意にアップレギュレートされていることが明らかとなった。この新規の分子マーカーの発現プロファイル，その全長および対応する推定蛋白質配列を以下に詳細に説明する。
【００２８】
材料および方法
同じドナーからの正常な乳組織と腫瘍組織とのマッチした対の間のディファレンシャル遺伝子発現を実施した。組織サンプルは，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｐｌｃ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫから，完全な倫理学的認可および患者のインフォームドコンセントをもって入手した。腫瘍を外科的に除去した後，腫瘍組織の１つのサンプルを採取し，共に切り出された隣接する正常な組織からのサンプルも採取した。それぞれ，ＤｙｎａＩ  ｄＴ18−タグ付きダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写プロトコルを用いて，メッセンジャーＲＮＡを抽出し，次にｃＤＮＡを合成した。ディファレンシャルディスプレイ逆転写ＰＣＲ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）を用いて，これらのマッチしたサンプルの遺伝子発現プロファイルの間の相違を観察し，アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを示す個々の遺伝子転写産物を単離し，さらに調べた。
【００２９】
Ｌｉａｎｇ＆Ｐａｒｄｅｅ（１９９２）により最初に記載されているように，ディファレンシャルディスプレイ逆転写ＰＣＲ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）は，２またはそれ以上の生物学的サンプルからのｍＲＮＡを，３つの可能なアンカープライマーの１つを用いて，逆転写による代表的ｃＤＮＡ合成のテンプレートとして用いる。そのそれぞれのアンカープライマーを８０個の任意配列１３−ｍｅｒプライマーの１つと組み合わせて，３つの亜集団のそれぞれをＰＣＲ増幅した。このプライマーの組み合わせの数は，ｍＲＮＡ集団中で発現された遺伝子の９６％を表すことを容易にすると見積もられている（Ｓｔｕｒｔｅｖａｎｔ，２０００）。この集団をさらに分割して，各プライマーセットについて，第２鎖ｃＤＮＡ合成の終了後には，真核生物細胞中で発現していると見積もられる１２，０００−１５，０００個のｍＲＮＡを１００−１５０の転写産物に減少させた。これは，マッチしたプライマーセットをポリアクリルアミドゲル上で平行に電気泳動分離し，正確に可視化することを容易にし，一方の組織サンプルで発現しているが他方では発現していない遺伝子フラグメントの同定につながる。
【００３０】
目的とするフラグメントを切り出して再増幅した後，逆サザンドットブロットにより擬陽性を除いた。これを用いて各再増幅フラグメントを２枚のナイロン膜（ＨｙｂｏｎｄＮ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にスポットし，フラグメントが由来するドナーの腫瘍または正常な組織ｃＤＮＡ集団のいずれかを用いてハイブリダイズさせた。次に，異なるように発現されていることが確認されたフラグメントを，クローニングせずに直接配列決定し，ウエブに基づくデータベース検索を行って，各遺伝子が新規であるかどうかを判定した。既知の遺伝子とマッチしなかったフラグメントは，それが由来する乳癌の新規マーカーを表す可能性があると考えた。多数の乳腫瘍ドナーからの一連のマッチしたｃＤＮＡ集団を用いて，半定量的ＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲのいずれかにより，各転写産物のさらなるスクリーニングを行った。すべての場合において，ｃＤＮＡテンプレートを検定するために，およびＰＣＲの間の内部陽性対照として，β−アクチンを構成的参照遺伝子として用いた。各推定新規マーカー遺伝子の発現は，検定したテンプレートについて，遺伝子特異的プライマーセットを用いて行った。次に，オープンリーディングフレームを含む新規遺伝子フラグメントの全長転写産物を，５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）を用いて合成した。これは，遺伝子特異的伸長および増幅を組み込んでおり，配列決定により確認可能である。
【００３１】
組織特異性の決定は，非乳組織，例えば，脳，心臓，リンパ球，脾臓，腎臓，精巣および筋肉からのｃＤＮＡ集団（Ｏｒｉｇｅｎｅから入手）に対して，各新規マーカーからの遺伝子特異的プライマーを用いてアッセイした。ＤＤ２０分子マーカーは，２２のヒト組織タイプのより包括的なパネルに由来するｃＤＮＡ集団を用いてさらに試験した。これらは以下のとおりである。
【００３２】
【表１】
2007510424.tif 000002
【００３３】
なお，これらのサンプルの大部分は，Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｐａｎｅｌ  ＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の一部であるが，アスタリスクで印を付けた２つのサンプルはＭｅｄｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｐｌｃ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫから組織塊として入手し，Ｒａｎｄｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．で加工したものである。
【００３４】
さらに，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｐｌｃを通して入手したある範囲の倫理学的に認定されたヒト腫瘍サンプルについてアッセイを行った。卵巣，精巣，胃，肝臓，肺，膀胱，結腸および膵臓からの腫瘍を代表するｃＤＮＡを，β−アクチンとＤＤ２０の両方に対してリアルタイムＰＣＲにより調べた。
【００３５】
新規のマーカーの発現分析と組み合わせて，乳組織のそれぞれのマッチした対について分子シグニチャー分析を行った。これは各組織ｃＤＮＡに対する半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて，先に公表されている多数の乳癌分子マーカーに特異的な１組のプライマーを用いて行う。各分子マーカー間の関係を判定し，各サンプルについて一覧表にして，参照として用いる。これに対して新たなマーカーを比較することができる。これは，腫瘍タイプを副分類し，新規マーカーをそのようなサブタイプと関連づけることができるようにして，診断マーカーの力を著しく増加させることを目的として行った。
【００３６】
結果および考察
ディファレンシャルディスプレイを用いると，乳癌ドナーからのマッチした組織のｃＤＮＡ集団に由来する，ＤＤ２０と名付けられた遺伝子フラグメントは，対応する正常組織ｃＤＮＡと比較して，腫瘍ｃＤＮＡ集団中で有意にアップレギュレートされていることが認められた。この１８７ヌクレオチドの産物は，リバースサザンドットブロットにより，異なるように発現されていることが確認された。配列分析および続くデータベース検索により，ＤＤ２０はそれぞれＥＭＢＬおよびＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースにおいて既知の遺伝子または蛋白質と相同ではないことが決定され，したがって，新規である可能性が高いと考えられた。しかし，これは，ポリＡテールを除去した後に，ヒトゲノムの染色体１１からのクローンと１００％相同であった。
【００３７】
このフラグメントの腫瘍特異性は，遺伝子特異的プライマーを用いて，ドナーからのマッチした組織サンプルに対する半定量的ＰＣＲにより確認した。これらのデータは，ＤＤ２０が乳腫瘍の存在の推定マーカーであることを示唆する（図３）。
【００３８】
さらなる分析を容易にするために，５’−ＲＡＣＥを用いて，遺伝子の全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および５’非コーディング配列を含むよう，フラグメントを伸長した。この手法を用いて，４２７ヌクレオチドの推定全長産物が導かれた（配列番号１）。これは，続くデータベース調査により，先のヒト染色体１１に対するホモロジーが確認され，配列の全長にわたり１００％相同である（４２７／４２７）ことが確認された。この配列から，６つすべてのアミノ酸リーディングフレームを生成して，＋３フレームで，６７アミノ酸を含み停止コドンを含む（配列番号３）小さい推定ＯＲＦが見いだされた。この小さい蛋白質は，ＳＷＡＬＬデータベースにおいていずれの既知の蛋白質とも高いホモロジーを示さず，したがって新規であると考えられる。マウスおよびヒトの両方の誘導性サイトカインＡ２２前駆体のｓｍａｌｌと妥当なホモロジーを有しており，ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースにおいて他のサイトカインと同様のサイズであったため，最初はこれはｓｍａｌｌであるかもしれないと考えられた。しかし，ＤＤ２０にはただ１つのジスルフィド架橋（システイン残基により示して）しかなく，一方，すべてのサイトカインは２つのジスルフィド架橋を含む。さらに，この単一の架橋はサイトカイン中に存在するいずれの架橋とも適合していない。
【００３９】
他の患者から寄贈された多数のマッチした乳腫瘍組織に由来するｃＤＮＡ集団について，半定量的リアルタイムＰＣＲ分析を用いてＤＤ２０をさらにスクリーニングした。慣用の半定量的ＰＣＲのためには，ｃＤＮＡ集団の６個のマッチした対を最初に４０サイクルの増幅でアッセイし，検出されたＤＤ２０のレベルが低かったため，次に４５サイクルの増幅を行った（図２）。β−アクチンをＰＣＲのテンプレート検定およびポジティブコントロールとして用いた。これらのサンプルの多くについて，正常な対応物と比較して腫瘍サンプルにおいて顕著に増加した発現が認められた。これらのデータから，ＤＤ２０が乳腫瘍の存在の推定分子マーカーであることが確認された。
【００４０】
以下に示すように，現在入手可能なすべてのマッチした乳組織サンプルの分子シグニチャー分析により，この分析を実証した：
【表２】
2007510424.tif 000003
【００４１】
臓器特異性を判定するために，２２の非乳ヒト組織からのｃＤＮＡ集団を，慣用のＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲの両方により，ＤＤ２０プライマーに対して試験した。さらに，８種類の腫瘍組織サンプルを同じようにしてＤＤ２０発現について調べた。また，同じサンプルを，ポジティブコントロールとして構成的ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンからのプライマーを用いて試験して，半定量的ＰＣＲ分析のテンプレートのキャリブレーションを行った。β−アクチン生成物は，調べたすべてのｃＤＮＡ集団において強く増幅され，このことから，発現は半定量的であると想定されることが確認された。慣用のＰＣＲの結果を図３に示す。３０の組織サンプルのパネルから，ＤＤ２０は，選択的に発現されているようである。ほとんどの場合，この推定マーカーの強い発現は，生殖ホルモンの影響下にある組織，例えば，卵巣，精巣，子宮および胎盤に限定されている。より弱い発現は他の臓器，例えば，骨髄，脾臓，胸腺および甲状腺においても示される。腫瘍のうち，発現は，卵巣および精巣においてのみ明らかに強く，膵臓腫瘍においてはより弱かった。
【００４２】
この分子マーカーは，乳特異的または腫瘍特異的ではないが，多数の乳腫瘍において有意に増加した発現を示し，腫瘍の段階の特定のサブグループと関連しているかもしれない。このように，乳腫瘍のタイプの亜分類に有用でありうる。組織サンプルにおけるＤＤ２０の発現プロファイルを分子シグニチャーに対して比較すると，このマーカーと，疾病の分類および予後予測と関連づけられている他の先に発表されている乳癌マーカーとの間の相関が明らかになるであろう。
【００４３】
なお，ＤＤ２０は最も"標準的"であると考えられている乳癌マーカーのいくつか，例えば，エストロゲンレセプター（ＥＲａ）およびヒト表皮成長因子レセプター（ｃ−ＥｒｂＢ−２）と非常に好ましく比較されることを指摘することは重要である。このことは，すべてのマッチした乳癌組織サンプルの分子シグニチャー分析において，多くの症例について同じ患者からの両方のサンプルにおいて発現が類似していること，およびヒトの正常および腫瘍組織からの３０のｃＤＮＡ集団のパネルに対して標的特異的プライマーを用いる場合においても明らかである。
【００４４】
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【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は，種々の組織における，目的とする遺伝子の存在を判定するためのスクリーニングアッセイの結果を示す。Ｔは腫瘍組織のｃＤＮＡを表し，Ｍは同じドナーから共に切除した乳組織のｃＤＮＡを表す。
【図２】図２は，種々の組織サンプルにおける，目的とする遺伝子の発現を判定するために行った発現分析の結果を示す。
【図３】図３は，３０のヒト組織ｃＤＮＡサンプルのパネルに対する目的とする遺伝子の半定量的ＰＣＲ発現分析の結果を示す。
【図１】
2007510424.tif 000004
【図２】
2007510424.tif 000005
【図３】
2007510424.tif 000006
【配列表】
2007510424000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月9日(2005.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において癌の存在またはリスクを検出する方法であって，単離されたサンプル中で、配列番号１として識別されるヌクレオチド配列を特徴とする遺伝子の存在または発現を検出する工程を含み，ここで，遺伝子の存在または発現は、サンプルを単離した患者における癌の存在またはリスクを示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
遺伝子が配列番号２として識別されるものである，請求項１記載の方法。
【請求項３】
サンプルが乳組織，子宮，精巣または卵巣から得られたものである，請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
癌が乳癌である，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
検出がポリメラーゼ酵素を用いて遺伝子を増幅することにより行われる，請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
本明細書において配列番号１として識別されるヌクレオチド配列，またはその相補体，またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該配列（またはその相補体）にハイブリダイズする少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのポリヌクレオチドを含む，単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列が本明細書において配列番号２として識別される配列である，請求項６記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
患者において癌のリスクを試験するためのインビトロ診断アッセイにおける，請求項６記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項９】
癌が乳癌である，請求項８記載の使用。
【請求項１０】
本明細書において配列番号３として識別される配列，またはその少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基のフラグメントを含むペプチド。
【請求項１１】
請求項１０記載のペプチドに対して少なくとも１０-6Ｍの親和性を有する抗体。
【請求項１２】
配列番号１または２のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子にハイブリダイズするかまたはその発現を阻害する第２のポリヌクレオチドの，癌，特に乳癌の治療用の医薬品の製造における使用。
【請求項１３】
第２のポリヌクレオチドが小干渉ＲＮＡである、請求項１２記載の使用。
【国際調査報告】
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