(57)【要約】  野生型ウイルスと比較してアデノウイルスの親和性を拡大させる改変ファイバータンパク質を含む組み換えアデノウイルスを開示する。本明細書中に記載する改変ファイバータンパク質は、固定及び可変アミノ酸残基両方を含有する１４アミノ酸コア配列を含む、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含有する。本発明は、開示される改変アデノウイルスファイバータンパク質をコードする単離された核酸分子、ならびに、前記核酸分子を含有する組み換えベクター及び宿主細胞を含む。ＣＡＲ以外の細胞結合部位に結合するペプチドリガンドを同定する方法には、ＣＡＲ陰性細胞におけるアデノウイルスファイバーノブのコンテクスト内に発現されるペプチドリガンドのファージディスプレイライブラリーのスクリーニングが含まれる。本発明の組み換えアデノウイルスは、アデノウイルス感染に対する抵抗性があることが示されている遺伝子治療／遺伝子ワクチン接種治療計画の一部として、重要な細胞及び組織標的に対するアデノウイルスの形質導入能を向上させるものと思われる。
2007503843.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含む改変ファイバータンパク質を有し、前記ペプチドリガンドが１４残基位置のコアアミノ酸配列を含み、該コアアミノ酸配列において、
（ａ）残基位置１、２及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり；
（ｂ）残基位置３及び１２がＣｙｓ残基であり；
（ｃ）残基位置４から１１がＸａａ残基であり、好ましくはＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＶａｌであり；
（ｄ）残基位置１４がＸａａ残基であり、好ましくはＰｒｏであり；
位置３及び位置１２以外の前記配列内のいずれかの残基位置において、１つ又は複数の残基が前記コアアミノ酸配列から欠失されることができ、領域（ｃ）が少なくとも２個のアミノ酸残基を含み、最高１０個のアミノ酸残基が部分（ｂ）で述べられた残基位置の間に付加されることができる（但し、前記コアアミノ酸配列は、部分（ｂ）で述べられた残基位置の間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含まず、前記ペプチドリガンドは、配列番号４６で述べられるアミノ酸配列からなるものではない。）、
組み換えアデノウイルス。
【請求項２】
前記ペプチドリガンドが、ファイバータンパク質ノブのループドメイン内に挿入されている、請求項１に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３】
前記改変ファイバータンパク質が、Ａｄ５ファイバータンパク質である、請求項１に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４】
前記ペプチドリガンドが、ファイバータンパク質ノブのＨＩループ内に含有されている、請求項１に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５】
前記改変ファイバータンパク質が、ＣＡＲを結合しない、請求項１に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６】
前記ペプチドリガンドが、Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸残基５４６とアミノ酸残基５４７との間に位置する、請求項１に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７】
前記Ａｄ５ファイバータンパク質が、ＣＡＲ結合がなくなるように、アミノ酸残基４８９からアミノ酸残基４９２までの欠失を含有する、請求項６に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８】
ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含む改変ファイバータンパク質を有し、前記ペプチドリガンドが１４残基位置のコアアミノ酸配列を含み、該コアアミノ酸配列において、
（ａ）残基位置１及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり；
（ｂ）残基位置２が、Ｐｈｅ残基であり；
（ｃ）残基位置３及び１２が、Ｃｙｓ残基であり；
（ｄ）残基位置４から１１が、Ｘａａ残基であり、好ましくはＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＶａｌであり；
（ｅ）残基位置１４が、Ｘａａ残基であり、好ましくは、Ｐｒｏ残基であり；
位置２、３又は１２以外の前記配列内のいずれかの残基位置において、１つ又は複数の残基が前記コアアミノ酸配列から欠失されることができ、領域（ｄ）が少なくとも２個のアミノ酸残基を含み、最高１０個のアミノ酸残基が部分（ｃ）で述べられた残基位置の間に付加されることができる（但し、前記コアアミノ酸配列は、部分（ｃ）で述べられた残基位置の間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含まない。）、
組み換えアデノウイルス。
【請求項９】
ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含む改変ファイバータンパク質を有し、前記ペプチドリガンドが１４残基位置のコアアミノ酸配列を含み、該コアアミノ酸配列において、
（ａ）残基位置１、２及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり；
（ｂ）残基位置３及び１２が、Ｃｙｓ残基であり；
（ｃ）残基位置４から７が、Ｘａａ残基であり、好ましくはＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＶａｌであり；
（ｄ）残基位置８及び９が、Ｇｌｙ残基であり；
（ｅ）残基位置１０及び１１が、Ｓｅｒ残基であり；
（ｆ）残基位置１４がＸａａ残基であり、好ましくはＰｒｏであり；
位置１、２、４から７、１３及び１４を含むいずれかの可変残基位置において、１つ又は複数の残基が前記コアアミノ酸配列から欠失されることができ、最高１０個のアミノ酸残基が残基位置３と残基位置８との間に付加されることができる（但し、前記コアアミノ酸配列は、残基位置３と８との間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含まない。）
組み換えアデノウイルス。
【請求項１０】
ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含む改変ファイバータンパク質を有し、前記ペプチドリガンドが１４残基位置のコアアミノ酸配列を含み、該コアアミノ酸配列において、
（ａ）残基位置１及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり；
（ｂ）残基位置２が、Ｐｈｅ残基であり；
（ｃ）残基位置３及び１２が、Ｃｙｓ残基であり；
（ｄ）残基位置４から７が、Ｘａａ残基であり、好ましくは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又はＶａｌであり；
（ｅ）残基位置８及び９が、Ｇｌｙ残基であり；
（ｆ）残基位置１０及び１１が、Ｓｅｒ残基であり；
（ｇ）残基位置１４がＸａａ残基であり、好ましくは、Ｐｒｏであり；
位置１、４から７、１３及び１４を含むいずれかの可変残基位置において、１つ又は複数の残基が前記コアアミノ酸配列から欠失されることができ、最高１０個のアミノ酸残基が残基位置３と残基位置８との間に付加されることができる（但し、前記コアアミノ酸配列は、残基位置３と８との間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含まない。）
組み換えアデノウイルス。
【請求項１１】
ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含む改変ファイバータンパク質を有し、前記ペプチドリガンドが配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、組み換えアデノウイルス。
【請求項１２】
前記ペプチドリガンドが、ファイバータンパク質ノブのループドメイン内に挿入されている、請求項１１に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１３】
前記改変ファイバータンパク質が、Ａｄ５ファイバータンパク質である、請求項１１に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１４】
前記ペプチドリガンドが、ファイバータンパク質ノブのＨＩループ内に含まれている、請求項１１に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１５】
前記改変ファイバータンパク質が、ＣＡＲを結合しない、請求項１１に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１６】
前記ペプチドリガンドが、Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸残基５４６とアミノ酸残基５４７との間に位置する、請求項１１に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１７】
前記Ａｄ５ファイバータンパク質が、ＣＡＲ結合をなくすように、アミノ酸残基４８９からアミノ酸残基４９２までの欠失を含有する、請求項１６に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１８】
ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含み、前記ペプチドリガンドが１４残基位置のコアアミノ酸配列を含み、該コアアミノ酸配列において、
（ａ）残基位置１、２及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり；
（ｂ）残基位置３及び１２がＣｙｓ残基であり；
（ｃ）残基位置４から１１がＸａａ残基であり、好ましくはＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＶａｌであり；
（ｄ）残基位置１４がＸａａ残基であり、好ましくはＰｒｏであり；
位置３及び位置１２以外の前記配列内のいずれかの残基位置において、１つ又は複数の残基が前記コアアミノ酸配列から欠失されることができ、領域（ｃ）が少なくとも２個のアミノ酸残基を含み、最高１０個のアミノ酸残基が部分（ｂ）で述べられた残基位置の間に付加されることができる（但し、前記コアアミノ酸配列は、部分（ｂ）で述べられた残基位置の間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含まず、前記ペプチドリガンドは、配列番号４６で開示されているアミノ酸配列からなるものではない。）、
単離されたアデノウイルスファイバータンパク質。
【請求項１９】
前記ペプチドリガンドが、ファイバータンパク質ノブのループドメイン内に挿入されている、請求項１８に記載の単離されたアデノウイルスファイバータンパク質。
【請求項２０】
前記改変ファイバータンパク質が、Ａｄ５ファイバータンパク質である、請求項１８に記載の単離されたアデノウイルスファイバータンパク質。
【請求項２１】
前記ペプチドリガンドが、ファイバータンパク質ノブのＨＩループ内に含まれている、請求項１８に記載の単離されたアデノウイルスファイバータンパク質。
【請求項２２】
前記改変ファイバータンパク質が、ＣＡＲを結合しない、請求項１８に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２３】
前記ペプチドリガンドが、Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸残基５４６とアミノ酸残基５４７との間に位置する、請求項１８に記載の単離されたアデノウイルスファイバータンパク質。
【請求項２４】
ＣＡＲ結合をなくすように、前記Ａｄ５ファイバータンパク質が、アミノ酸残基４８９からアミノ酸残基４９２までの欠失を含有する、請求項２３に記載の単離されたアデノウイルスファイバータンパク質。
【請求項２５】
ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含み、該ペプチドリガンドが、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたアデノウイルスファイバータンパク質。
【請求項２６】
前記ペプチドリガンドが、ファイバータンパク質ノブのループドメイン内に挿入されている、請求項２５に記載の単離されたアデノウイルスファイバータンパク質。
【請求項２７】
前記改変ファイバータンパク質が、Ａｄ５ファイバータンパク質である、請求項２５に記載の単離されたアデノウイルスファイバータンパク質。
【請求項２８】
前記ペプチドリガンドが、ファイバータンパク質ノブのＨＩループ内に含まれている、請求項２５に記載の単離されたアデノウイルスファイバータンパク質。
【請求項２９】
前記改変ファイバータンパク質が、ＣＡＲを結合しない、請求項２５に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３０】
前記ペプチドリガンドが、Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸残基５４６とアミノ酸残基５４７との間に位置する、請求項２５に記載の単離されたアデノウイルスファイバータンパク質。
【請求項３１】
ＣＡＲ結合をなくすように、前記Ａｄ５ファイバータンパク質が、アミノ酸残基４８９からアミノ酸残基４９２までの欠失を含有する、請求項３０に記載の単離されたアデノウイルスファイバータンパク質。
【請求項３２】
前記ペプチドリガンドのアミノ酸配列が、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３３】
ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含み、前記ペプチドリガンドが１４残基位置のコアアミノ酸配列を含み、該コアアミノ酸配列において、
（ａ）残基位置１、２及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり；
（ｂ）残基位置、３及び１２がＣｙｓ残基であり；
（ｃ）残基位置、４から１１がＸａａ残基であり、好ましくはＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＶａｌであり；
（ｄ）残基位置、１４がＸａａ残基であり、好ましくはＰｒｏであり；
位置３及び位置１２以外の前記配列内のいずれかの残基位置において、１つ又は複数の残基が前記コアアミノ酸配列から欠失されることができ、領域（ｃ）が少なくとも２個のアミノ酸残基を含み、最高１０個のアミノ酸残基が部分（ｂ）で述べられた残基位置の間に付加されることができる（但し、前記コアアミノ酸配列は、部分（ｂ）で述べられた残基位置の間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含まず、前記ペプチドリガンドは、配列番号４６で述べられるアミノ酸配列からなるものではない。）、
改変アデノウイルスファイバータンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項３４】
請求項３３に記載の核酸分子を含む、組み換え細胞において改変アデノウイルスファイバータンパク質を発現させるための、発現ベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載の発現ベクターを含有する、改変アデノウイルスファイバータンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項３６】
（ａ）請求項３４に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクションすることと；
（ｂ）前記発現ベクターから改変アデノウイルスファイバータンパク質を発現させる条件下で、段階（ａ）の宿主細胞を培養することと、を含む、組み換え宿主細胞において改変アデノウイルスファイバータンパク質を発現させるプロセス。
【請求項３７】
請求項３３に開示されているペプチドリガンドをコードし、前記ペプチドリガンドのアミノ酸配列が配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択される、単離された核酸分子。
【請求項３８】
改変アデノウイルスファイバーノブに融合したファージ外殻タンパク質を含む融合タンパク質をそれぞれがその外面にディスプレイすることができる組み換えファージを、複数含み、前記改変ファイバーノブが、１４残基位置のコアアミノ酸配列を含む、ＣＡＲ以外の表面結合部位に対するペプチドリガンドを含有し、前記コアアミノ酸配列において、
（ａ）残基位置１、２及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり；
（ｂ）残基位置３及び１２がＣｙｓ残基であり；
（ｃ）残基位置４から１１がＸａａ残基であり、好ましくはＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＶａｌであり；
（ｄ）残基位置１４がＸａａ残基であり、好ましくはＰｒｏであり；
位置３及び位置１２以外の前記配列内のいずれかの残基位置において、１つ又は複数の残基が前記コアアミノ酸配列から欠失されることができ、領域（ｃ）が少なくとも２個のアミノ酸残基を含み、最高１０個のアミノ酸残基が部分（ｂ）で述べられた残基位置の間に付加されることができる（但し、前記コアアミノ酸配列は、部分（ｂ）で述べられた残基位置の間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含まず、前記ペプチドリガンドは、配列番号４６で開示されているアミノ酸配列からなるものではない。）、
ファージディスプレイライブラリー。
【請求項３９】
改変アデノウイルスファイバーノブに融合したファージ外殻タンパク質を含む融合タンパク質をそれぞれがその外面にディスプレイすることができる組み換えファージを、複数含み、前記改変ファイバーノブが、１４残基位置のコアアミノ酸配列を含む、ＣＡＲ以外の表面結合部位に対するペプチドリガンドを含有し、前記コアアミノ酸配列において、
（ａ）残基位置１、２及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり；
（ｂ）残基位置３及び１２がＣｙｓ残基であり；
（ｃ）残基位置４から１１がＸａａ残基であり、好ましくはＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＶａｌであり；
（ｄ）残基位置１４がＸａａ残基であり、好ましくはＰｒｏであり；
図１３に図示されているように、位置３及び位置１２以外の前記配列内のいずれかの残基位置において、１つ又は複数の残基が前記コアアミノ酸配列から欠失されることができ、領域（ｃ）が少なくとも２個のアミノ酸残基を含む（但し、前記コアアミノ酸配列は、部分（ｂ）で述べられた残基位置の間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含まず、前記ペプチドリガンドは、配列番号４６で開示されているアミノ酸配列からなるものではない。）、
ファージディスプレイライブラリー。
【請求項４０】
前記ペプチドリガンドが、ファイバーノブのループドメイン内に挿入されている、請求項３８に記載のファージディスプレイライブラリー。
【請求項４１】
前記改変ファイバーノブが、Ａｄ５ファイバーノブである、請求項３８に記載のファージディスプレイライブラリー。
【請求項４２】
前記ペプチドリガンドが、ファイバーノブのＨＩループ内に含まれている、請求項３８に記載のファージディスプレイライブラリー。
【請求項４３】
前記ライブラリーが、バクテリオファージλ上にディスプレイされる、請求項３８に記載のファージディスプレイライブラリー。
【請求項４４】
前記ファージ外殻タンパク質が、バクテリオファージλの主要頭部Ｄタンパク質である、請求項３８に記載のファージディスプレイライブラリー。
【請求項４５】
（ａ）請求項４４に記載のファージディスプレイライブラリーを提供する段階と、
（ｂ）ＣＡＲ陽性又はＣＡＲ陰性細胞に対する前記ライブラリーをスクリーニングする段階と、を含む、ＣＡＲ以外の細胞特異的結合部位に対するペプチドリガンドを同定するための方法。
【請求項４６】
前記ライブラリーがＮＩＨ−３Ｔ３細胞上でスクリーニングされる、請求項４５に記載の、ＣＡＲ以外の細胞特異的結合部位に対するペプチドリガンドを同定するための方法。
【請求項４７】
請求項１に記載の組み換えアデノウイルスを投与する段階を含む、宿主細胞に対してインビボで形質導入を行う方法。
【請求項４８】
前記細胞がＣＡＲを殆ど又は全く発現しない、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が樹状細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が筋肉細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞がメラノサイトである、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体的に、野生型ウイルスと比較してアデノウイルスの親和性を広げる、改変ファイバータンパク質を有する組み換えアデノウイルス関する。この改変ファイバータンパク質は、固定及び可変アミノ酸残基両方を含有する１４アミノ酸コア配列を含む、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含有する。このペプチドリガンドは、代替的な細胞表面結合部位に接近できるように、及びなおファイバーノブ三量体化が保存されるように、アデノウイルスファイバータンパク質配列内に挿入されている。本発明はまた、開示する改変アデノウイルスファイバータンパク質をコードする単離された核酸分子、ならびに、前記核酸分子を含有する組み換えベクター及び宿主細胞にも関する。本発明はさらに、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含有する改変アデノウイルスファイバーノブに融合させられたファージ外殻タンパク質を発現する組み換えファージ集団を含有する、ファージディスプレイライブラリーに関する。本発明はまた、ＣＡＲ陰性又はＣＡＲ陽性細胞において前記ライブラリーをスクリーニングすることによって前記ペプチドリガンドを同定する方法、ならびに本明細書中で述べる組み換えアデノウイルスを用いて細胞及び／又は組織に対して形質導入を行うための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えアデノウイルスベクターは、異常細胞又は組織を標的として組み換え遺伝子を導入するための効率的であり用途の広い遺伝子治療系であることが証明されている。アデノウイルスベクターは、広い範囲の標的細胞に感染するが、高いレベルで遺伝子導入されるか否かは、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）が標的とする細胞に存在するか否かに依存する。遺伝子治療にとって重要な標的に相当する細胞型及び組織の中には、アデノウイルス感染が起こりづらいものがいくつかあるが、それは主に、ＣＡＲ発現レベルが低いことに起因する（例えば、Ｈａｖｅｎｇａら、２００１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３３３５−３３４２参照。）。同様に、アデノウイルスが容易に感染する標的細胞の中には、導入を遂行するためにアデノウイルス粒子が高レベルである必要があり（Ａｒｔｈｕｒら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１７−２５）、アデノウイルス感染に付随する何らかの免疫反応を悪化させるものがある。従って、治療上意義のあるヒト細胞及び組織に対するアデノウイルス送達の効率を向上させることに対して多大な努力が払われてきた。
【０００３】
アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）の細胞侵入メカニズムは、２つの別個の連結しない段階からなる。第一に、ウイルスファイバータンパク質の三量体のカルボキシ末端のノブドメインと細胞表面に提示されるＣＡＲとの間の高親和性相互作用を介してウイルスが宿主細胞に結合する。ウイルスの感染性を決定するこの最初の相互作用に続いて、細胞表面上のαｖβ３及びαｖβ５インテグリンとの、ペントンベースにおけるＲＧＤ配列の会合が起こり、それにより、ウイルスの内在化が活性化される。Ａｄ５親和性を変更するためのストラテジーは、代替的な細胞特異的受容体を認識できるようにウイルスキャプシドタンパク質を改変することを利用するものである。アデノウイルスキャプシドタンパク質には、ヘキソン、ペントンベース及びファイバータンパク質が含まれる。ウイルスがその同起源の細胞性受容体と結合することでそのウイルスの親和性が調節されるため、そのファイバータンパク質のカルボキシ末端のノブドメインを遺伝子レベルで改変するための研究が盛んに行われてきた（総説として、Ｋｒａｎｓｎｙｈｋら、２０００、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：３９１−４０５を参照。）。多くの研究グループにより、Ａｄ５ファイバー遺伝子を部分的に、又は完全に、異なるアデノウイルス血清型のもので置換すること、つまり、ドナーの血清型由来の親和性を作り出すことが可能であることが示されてきた。実際に、作製されたＡｄ５キメラのうちいくつかでは、選択した細胞型に対して親和性が増強されていた。しかし、利用可能な血清型の数及びそれらの親和性が限定的であることにより、この「ファイバー交換」アプローチは、あまり柔軟ではないものとなっている。さらに、ウイルスキメラの生存性が低く、ウイルスキメラの回収率が低いために、このストラテジーの開発は進んでいない。
【０００４】
近年、様々な研究グループが、短いペプチドをＡｄ５ファイバーノブドメインの規定した部位に組み込むことができることを示してきた。このノブドメインから突出したＨＩループには、ファイバーの三量体化を残し、及びＣＡＲ結合機能を変化させずに、構造的に多くのペプチド配列を挿入することができる。これらの知見により、所望する結合特異性を有するリガンドを同定するための有望な経路として、ファージディスプレイペプチドライブラリーのスクリーニングが進歩した。異なるタンパク質の位置、つまり、Ａｄ５ファイバーノブのＨＩループへと移した場合に、ファージライブラリーから選択されるリガンドがその結合特性を保持していないことが多いという事実があるために、このストラテジーを用いた成功例の報告は少ない。さらに、これらのペプチドの挿入は、ファイバーの三量体化及びウイルスアセンブリーに影響を与え得る。
【０００５】
Ｋｒａｓｎｙｋｈら（１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１８４４−１８５２）は、組み換えを利用して、ファイバーノブのＨＩループドメイン中にＦＬＡＧオクタペプチドを含有するＡｄ５ファイバータンパク質を発現させた。この異種ペプチドは、ファイバー三量体化を妨害しないか、又はノブ中の細胞結合部位の形成を妨害しなかった。前記改変Ａｄ５ファイバータンパク質を含有する組み換えアデノウイルスは、適切な生物学的機能を維持していた。
【０００６】
Ｄｍｉｔｒｉｅｖら（１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９７０６−９７１３）は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含有するペプチドをＡｄ５ファイバーループのＨＩループへ組み込むことにより、得られる組み換えファイバーが、ＣＡＲへの代替的感染経路として、ＲＧＤ−インテグリン相互作用を利用できるようになることを示している。
【０００７】
Ｅｉｎｆｅｌｄら（１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９１３０−９１３６）は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質由来の線状デカペプチドを認識する膜−アンカー単鎖抗体からなる擬似受容体（ｐｓｅｕｄｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）を開発した。このＨＡペプチドをＡｄ２ファイバーノブのＨＩループに組み込むことにより、得られる組み換えアデノウイルスが、ＣＡＲ結合が阻害される条件下で、擬似受容体発現細胞に対して形質導入できるようになった。
【０００８】
Ｘｉａら（２０００、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１３５９−１１３６６）は、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に特異的なエピトープを同定するために、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）の細胞外ドメインに対して、ノナペプチドファージディスプレイライブラリーのスクリーニングを行った。同定された配列のうち２つをＡｄ５ファイバーノブのＨＩループに挿入したところ、適切な三量体化及びｈＴｆＲ発現細胞への遺伝子導入が見られた。
【０００９】
Ｎｉｃｋｌｉｎら（２００１、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：５３４−５４２）は、ＣＡＲ結合がないファイバーノブのＨＩループ中に挿入された場合、２種類の内皮細胞（ＥＣ）結合ペプチドが、ＥＣに対するアデノウイルス親和性を変化させることを示した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、主要な頭部タンパク質Ｄ対するカルボキシ末端融合物として、バクテリオファージλのキャプシドにおいて機能的Ａｄ５ファイバーノブドメインを発現させることにより、先行研究の限界を打開する。野生型ＣＡＲへの結合がない状態で機能的Ａｄ５ファイバーノブ内に組み込まれたペプチド配列の大規模コレクションを構築するために、このファージディスプレイ系を使用した。ＣＡＲ陰性マウス胚繊維芽細胞  ＮＩＨ−３Ｔ３においてこのライブラリーで選択を行った後、ＣＡＲ陰性細胞への結合を示す、このノブコンテクスト中の３種類のペプチドリガンドを単離した。
【００１１】
これらのペプチドリガンドを組み込んでいるウイルスはＣＡＲ陰性細胞及びＣＡＲの発現レベルが低い細胞への感染性が増強されている。従って、これらの新規ペプチドリガンドを組み込んでいる改変ファイバータンパク質を含む組み換えアデノウイルスを作製することにより、アデノウイルス遺伝子治療／遺伝子ワクチン接種系の活性及び機能性が高まる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含む、改変ファイバータンパク質を有する、組み換えアデノウイルスに関する。このペプチドリガンドは、残基位置１、２及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり；残基位置３及び１２がシステイン（Ｃｙｓ）残基であり；残基位置４から１１がＸａａ残基であり、好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）又はバリン（Ｖａｌ）であり；残基位置１４がＸａａ残基であり、好ましくはプロリン（Ｐｒｏ）であるような、１４残基位置のコアアミノ酸配列を含有する。このコアアミノ酸配列において、位置３及び位置１２の固定されたＣｙｓ残基以外の前記配列のいずれかの残基位置で１つ又は複数の残基が前記コアアミノ酸配列から欠失され得る。固定されたＣｙｓ残基の間に位置するコアアミノ酸配列の領域が少なくとも２個のアミノ酸残基を含有することが好ましい。さらに、最高で１０個までのアミノ酸残基が、残基位置３と残基位置１２との間に付加され得る。このペプチドリガンドのアミノ酸配列は、残基位置３と残基位置１２との間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含有せず、前記ペプチドリガンドは、配列番号４６で述べられるようなアミノ酸配列からなるものではない。ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位への結合能がある改変ファイバータンパク質を有する組み換えアデノウイルスは、アデノウイルスの野生型親和性を拡大する効果を有し、遺伝子治療のためのアデノウイルス系の機能性を広げる。
【００１３】
本発明はさらに、残基位置１及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり；残基位置２が、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）残基であり；残基位置３及び１２が、システイン（Ｃｙｓ）残基であり；残基位置４から１１が、Ｘａａ残基であり、好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）又はバリン（Ｖａｌ）であり；残基位置１４が、Ｘａａ残基であり、好ましくは、プロリン（Ｐｒｏ）であるような１４残基位置のコアアミノ酸配列を含有する、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含む、改変ファイバータンパク質を有する、組み換えアデノウイルスに関する。前記コアアミノ酸配列から、位置３又は位置１２の固定されたＣｙｓ又は位置２のＰｈｅ残基の位置以外の前記配列内のいずれかの位置で１つ又は複数の残基が欠失され得る。固定されたＣｙｓ残基の間に位置するコアアミノ酸配列の領域が少なくとも２個のアミノ酸残基を含有することが好ましい。さらに、最高で１０個までのアミノ酸残基が、残基位置３と残基位置１２との間に付加され得る。本ペプチドリガンドのアミノ酸配列は、残基位置３と１２との間に、連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含有しない。
【００１４】
本発明はまた、残基位置１、２及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり；残基位置３及び１２が、システイン（Ｃｙｓ）残基であり；残基位置４から７が、Ｘａａ残基であり、好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）又はバリン（Ｖａｌ）であり；残基位置８及び９が、グリシン（Ｇｌｙ）残基であり；残基位置１０及び１１が、セリン（Ｓｅｒ）残基であり；残基位置１４がＸａａ残基であり、好ましくはプロリン（Ｐｒｏ）であるような１４残基位置のコアアミノ酸配列を含有する、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対する、ペプチドリガンドを含む、改変ファイバータンパク質を有する、組み換えアデノウイルスにも関する。前記コアアミノ酸配列から、位置１、２、４から７、１３及び１４を含む前記配列内の可変残基位置で１つ又は複数の残基が欠失され得る。さらに、最高で１０個までのアミノ酸残基が残基位置３と残基位置８との間に付加され得る。このペプチドリガンドのアミノ酸配列は、残基位置３から８の間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含有しない。
【００１５】
本発明はさらに、残基位置１及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり；残基位置２が、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）残基であり；残基位置３及び１２が、システイン（Ｃｙｓ）残基であり；残基位置４から７が、Ｘａａ残基であり、好ましくは、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）又はバリン（Ｖａｌ）であり；残基位置８及び９が、グリシン（Ｇｌｙ）残基であり；残基位置１０及び１１が、セリン（Ｓｅｒ）残基であり；残基位置１４がＸａａ残基であり、好ましくは、プロリン（Ｐｒｏ）であるような１４残基位置のコアアミノ酸配列を含有する、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含む、改変ファイバータンパク質を有する、組み換えアデノウイルスに関する。前記コアアミノ酸配列から、位置１、４から７、１３及び１４を含む前記配列内の可変残基位置で１つ又は複数の残基が欠失され得る。さらに、最高で１０個までのアミノ酸残基が残基位置３と残基位置８との間に付加され得る。このペプチドリガンドのアミノ酸配列は、残基位置３から８の間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含有しない。
【００１６】
本発明はまた、上記で挙げた実施形態のそれぞれにおいて説明したようなコアアミノ酸配列を含有する、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するプチドリガンドを含む、改変ファイバータンパク質を有する、組み換えアデノウイルスに関する。このコアアミノ酸配列から、固定された残基位置を除く、前記配列内のいずれかの可変残基位置で１つ又は複数の残基が欠失され得る。位置３及び１２における固定されたＣｙｓ残基の間に位置するコアアミノ酸配列の領域が少なくとも２個のアミノ酸残基を含有することが好ましい。このペプチドリガンドのアミノ酸配列は、残基位置３から１２の間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含有せず、このペプチドリガンドは、配列番号４６で記載されているようなアミノ酸配列からなるものではない。
【００１７】
本発明はまた、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含有する、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含む、改変ファイバータンパク質を有する組み換えアデノウイルスに関する。
【００１８】
本発明は、細胞表面結合部位へ該ペプチドリガンドが接近できるように、改変されたアデノウイルスファイバータンパク質のペプチドリガンドが該ファイバータンパク質のいずれかの部分に組み込まれるような、本明細書中で述べるように改変されたファイバータンパク質を含有する組み換えアデノウイルスに関する。ある実施形態において、前記ペプチドリガンドは、ファイバータンパク質ノブの露出したループドメイン内に挿入されており、好ましくはＡｄ５由来であり、これにはＡｄ５ファイバーノブのＨＩループが含まれるがこれに限定されない。特に、該ペプチドリガンドは、該ファイバーノブのＨＩループ内Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸残基５４６とアミノ酸残基５４７との間に挿入される。
【００１９】
本発明は、図１で開示されており、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる改変Ａｄ５ファイバータンパク質を含む組み換えアデノウイルスに関する。
【００２０】
本発明はまた、図２で開示されており、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる改変Ａｄ５ファイバータンパク質を含む組み換えアデノウイルスにも関する。
【００２１】
本発明はさらに、図３で開示されており、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる改変Ａｄ５ファイバータンパク質を含む組み換えアデノウイルスに関する。
【００２２】
本発明はまた、改変前にアデノウイルスが第一の血清型であり；改変後に前記第一のアデノウイルス血清型のファイバータンパク質の少なくとも一部が除去されるか、又は第二のアデノウイルス血清型由来のファイバータンパク質の同じ又は類似部分で置換されており、第二のアデノウイルス血清型ファイバータンパク質の前記部分が本明細書中で述べるように改変されている、組み換えアデノウイルスにも関する。前記第一のアデノウイルス血清型から除去したファイバータンパク質の部分を置換するために使用される前記第二のアデノウイルス血清型由来のファイバータンパク質の部分は、本明細書中で述べるようなペプチドリガンドを含有する。従って、本発明のある実施形態は、ファイバータンパク質又はその一部が改変ファイバータンパク質又はその一部で置換されており、ヒト又は非ヒト起源の代替血清型のペプチドリガンドを含有する、組み換えアデノウイルスに関する。この改変アデノウイルスファイバータンパク質がそのノブドメイン内に含有されるペプチドリガンドを含む場合、代替的なアデノウイルス血清型の野生型ノブドメインを置換するために、そのペプチドリガンドを含むノブドメインを使用することができる。特に、本発明は、そのファイバータンパク質のノブドメインが、本明細書中で述べるようなペプチドリガンドを含有するＡｄ５ファイバーノブのノブドメインで置換されている、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ネコ及び鳥類を含むがこれらに限定されない、ヒト起源又は非ヒト起源のあらゆる血清型の組み換えアデノウイルスに関する。
【００２３】
本発明はファイバータンパク質の野生型細胞表面結合がないようにさらに改変された、本明細書中で開示するような改変ファイバータンパク質を含む、組み換えアデノウイルスにも関する。ある実施形態において、本明細書中で開示するような改変Ａｄ５ファイバータンパク質はさらに、該改変タンパク質のＣＡＲ結合が起こらないように改変される。Ａｄ５ファイバータンパク質のＣＡＲ結合は、本タンパク質のアミノ酸残基４８９からアミノ酸残基４９２の欠失を含むがこれに限定されない、該ファイバータンパク質に対する特異的配列改変の結果として除去される。本発明の組み換えアデノウイルスがその野生型細胞表面結合部位に結合する能力がないことは、改変ファイバードメイン内に組み込まれる特定のペプチドリガンドの細胞表面部位を発現する特異的細胞型を組み換えアデノウイルスが標的とすることに役立つ。
【００２４】
本発明は、図７に開示されており配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる改変Ａｄ５ファイバータンパク質を含有し、該改変Ａｄ５ファイバータンパク質の野生型ＣＡＲ結合がない、組み換えアデノウイルスに関する。
【００２５】
本発明はまた、図８に開示されており配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる改変Ａｄ５ファイバータンパク質を含有し、該改変Ａｄ５ファイバータンパク質の野生型ＣＡＲ結合がない、組み換えアデノウイルスにも関する。
【００２６】
本発明はさらに、図９に開示されており配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる改変Ａｄ５ファイバータンパク質を含有し、該改変Ａｄ５ファイバータンパク質の野生型ＣＡＲ結合がない、組み換えアデノウイルスに関する。
【００２７】
本発明は、上述の特性を包含するように改変された単離されたアデノウイルスファイバータンパク質に関する。ヒト又は非ヒトアデノウイルスの血清型のいずれか１つを、ファイバータンパク質遺伝子のソースとして使用することができる。改変Ａｄ５ファイバータンパク質を含むがこれに限定されない、本発明の改変アデノウイルスファイバータンパク質は、本明細書で述べるように、そのコード領域内に挿入されているペプチドリガンドを有するファイバータンパク質である。ある実施形態において、本ペプチドリガンドは、ＨＩループドメインを含むがこれに限定されない、ファイバーノブの露出したループドメインに挿入されている。例えば、Ａｄ５ファイバータンパク質のＨＩループ内に位置するアミノ酸残基５４６とアミノ酸残基５４７との間に本ペプチドリガンドを挿入することができる。本発明はまた、ある１つのアデノウイルス血清型のファイバータンパク質のノブドメインが、本発明のペプチドリガンドを含有する、代替的なアデノウイルス血清型のノブドメインで置換されている、改変ファイバータンパク質も含む。本明細書で述べるように改変されている単離されたアデノウイルスファイバータンパク質を、この改変タンパク質が結合するであろう治療上意義のある細胞及び組織を同定するためのツールとして使用することができるが、これは前記改変ファイバータンパク質を含有するベクターを用いて形質導入する可能性を意味する。説明するようなこの改変単離アデノウイルスファイバータンパク質はまた、他のある部分を標的受容体に向けさせるために、該部分に結合させ得る「結合決定基」（つまり、ウイルス、タンパク質又はＤＮＡ）としても使用することができる。
【００２８】
本発明はまた、改変前にファイバータンパク質が第一の血清型のものであり；改変後に前記第一のアデノウイルス血清型のファイバータンパク質の少なくとも一部が除去されており、第二のアデノウイルス血清型の改変ファイバータンパク質の類似部分で置換されている、改変アデノウイルスファイバータンパク質にも関する。前記第一のアデノウイルス血清型から除去された部分を置換するために使用される第二のアデノウイルス血清型由来のファイバータンパク質の部分は、本明細書中で述べるようなペプチドリガンドを含有する。従って、本発明のある実施形態は、本明細書で述べるようなペプチドリガンドを含有する、代替的アデノウイルス血清型由来のファイバータンパク質の一部を含有する、改変アデノウイルスファイバータンパク質に関する。この改変アデノウイルスファイバータンパク質がそのノブドメイン内にペプチドリガンドを含む場合、このペプチドリガンドを含むノブドメインは、代替的アデノウイルス血清型の野生型ノブドメインを置換するために使用することができる。とりわけ、本発明は、そのファイバータンパク質のノブドメインが、本明細書中で述べるようなペプチドリガンドを含有するＡｄ５ファイバーノブのノブドメインで置換されている、ヒト起源又は非ヒト起源のあらゆる血清型の改変アデノウイルスファイバータンパク質に関する。
【００２９】
本発明は、図１に開示されており配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる単離されたＡｄ５ファイバータンパク質に関する。
【００３０】
本発明はまた、図２に開示されており配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる単離されたＡｄ５ファイバータンパク質にも関する。
【００３１】
本発明はさらに、図３に開示されており配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる単離されたＡｄ５ファイバータンパク質に関する。
【００３２】
本発明はまた、その野生型細胞表面結合部位への結合がなくなるようにさらに改変されている、本明細書中で述べるような改変ファイバータンパク質にも関する。ある実施形態において、改変Ａｄ５ファイバータンパク質の野生型ＣＡＲ結合が除かれている。このＡｄ５ファイバータンパク質のＣＡＲ結合は、アミノ酸残基４８９からアミノ酸残基４９２までの欠失を含むがこれに限定されない、ファイバータンパク質に対する特異的配列改変の結果として除去される。
【００３３】
本発明は、改変Ａｄ５ファイバータンパク質の野生型ＣＡＲ結合がない、図７に開示されており配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる単離されたＡｄ５ファイバータンパク質に関する。
【００３４】
本発明はまた、改変Ａｄ５ファイバータンパク質の野生型ＣＡＲ結合がない、図８に開示されており配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる単離されたＡｄ５ファイバータンパク質にも関する。
【００３５】
本発明はさらに、改変Ａｄ５ファイバータンパク質の野生型ＣＡＲ結合がない、図９に開示されており配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる単離されたＡｄ５ファイバータンパク質に関する。
【００３６】
本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる単離されたペプチドリガンドに関する。
【００３７】
本発明はまた、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる単離されたペプチドリガンドにも関する。
【００３８】
本発明はさらに、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなる単離されたペプチドリガンドに関する。
【００３９】
本発明は、上述の特性を包含する、改変Ａｄ５ファイバータンパク質を含むがこれに限定されない、改変アデノウイルスファイバータンパク質をコードする、単離された核酸分子に関する。本発明の単離された核酸分子は、１本鎖（コード又は非コード鎖）又は２本鎖であり得る、デオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）ならびに合成１本鎖ポリヌクレオチド等の合成ＤＮＡを含み得る。本発明の単離された核酸分子はまた、リボ核酸分子（ＲＮＡ）も含み得る。本発明はまた、本明細書を通して開示する単離された核酸分子を含有する、組み換えベクター及び原核及び真核の組み換え宿主、さらに、組み換え宿主細胞における本発明の改変アデノウイルスファイバータンパク質の発現プロセスにも関する。
【００４０】
本発明は、図４に開示されており配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなる、改変Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする、単離された核酸分子に関する。
【００４１】
本発明はまた、図５に開示されており配列番号５に記載のヌクレオチド配列からなる、改変Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする、単離された核酸分子にも関する。
【００４２】
本発明はさらに、図６に開示されており配列番号６に記載のヌクレオチド配列からなる、改変Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする、単離された核酸分子に関する。
【００４３】
本発明は、図１０に開示されており配列番号１０に記載のヌクレオチド配列からなる、ＣＡＲ結合能を欠く、改変Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする、単離された核酸分子に関する。
【００４４】
本発明はまた、図１１に開示されており配列番号１１に記載のヌクレオチド配列からなる、ＣＡＲ結合能を欠く、改変Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする、単離された核酸分子にも関する。
【００４５】
本発明はさらに、図１２に開示されており配列番号１２に記載のヌクレオチド配列からなる、ＣＡＲ結合能を欠く、改変Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする、単離された核酸分子に関する。
【００４６】
本発明の他の局面には、Ｅ１及びＥ１活性の半分において少なくとも部分的に欠失があるアデノウイルスベクターを含むがこれに限定されない、本明細書中で述べる改変アデノウイルスファイバータンパク質をコードする核酸分子；該アデノウイルスベクターを含むパッケージング細胞；及び、２９３細胞又はＰＥＲ．Ｃ６（Ｒ）細胞を含むがこれらに限定されない、組み換えアデノウイルスを回収する宿主細胞を含有する、アデノウイルスベクターが含まれる。本発明のある実施形態において、本アデノウイルスベクターはさらに、パッセンジャー導入遺伝子を含む。
【００４７】
本発明の別の局面は、各組み換えファージがその外面に、アデノウイルスファイバータンパク質の改変ノブドメインに融合させられたファージ外殻タンパク質を含む融合タンパク質を表示する、組み換えファージのファージディスプレイライブラリーである。Ａｄ５ファイバーノブドメインを含むがそれに限定されないこの改変ファイバーノブは、残基位置１、２及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり；残基位置３及び１２がシステイン（Ｃｙｓ）残基であり；残基位置４から１１がＸａａ残基であり、好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）又はバリン（Ｖａｌ）であり；残基位置１４がＸａａ残基であり、好ましくはプロリン（Ｐｒｏ）である１４残基位置のコアアミノ酸配列を含有する、ペプチドリガンドを含有する。この改変ファイバーノブの部分は、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含有する。前記コアアミノ酸配列から、位置３及び位置１２の固定されたＣｙｓ残基以外の前記配列内のいずれかの残基位置で１つ又は複数の残基が欠失され得る。前記固定Ｃｙｓ残基の間に位置するそのコアアミノ酸配列の領域は、少なくとも２個のアミノ酸残基を含有することが好ましい。さらに、最高で１０個までのアミノ酸残基が残基位置３と残基位置１２との間に付加され得る。このペプチドリガンドのアミノ酸配列は、残基位置３と１２との間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含有せず、該ペプチドリガンドは、配列番号４６で述べられるアミノ酸配列からなるものではない。
【００４８】
本発明の別の実施形態は、各組み換えファージがその外面に、図１３に図示した様々なペプチドリガンド図のうち少なくとも１つを含有するアデノウイルスファイバーノブに融合させられたファージ外殻タンパク質を含む融合タンパク質を表示する、組み換えファージを含むファージディスプレイライブラリーである。従って、改変Ａｄ５ファイバーノブを含むがこれに限定されない改変ファイバーノブが前記ライブラリーに含まれ、その改変ファイバーノブは、残基位置１、２及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり；残基位置３及び１２がシステイン（Ｃｙｓ）残基であり；残基位置４から１１がＸａａ残基であり、好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）又はバリン（Ｖａｌ）であり；残基位置１４がＸａａ残基であり、好ましくはプロリン（Ｐｒｏ）である、１４残基位置のコアアミノ酸配列を含有する、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含有する。前記コアアミノ酸配列から、位置３及び位置１２の固定されたＣｙｓ残基以外の前記配列内のいずれかの残基位置で１つ又は複数の残基が欠失され得る。この実施形態において、このペプチドリガンドのアミノ酸配列は、残基位置３と１２との間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含有せず、該ペプチドリガンドは、配列番号４６で述べられるアミノ酸配列からなるものではない。
【００４９】
上記で挙げたように、本発明のファージディスプレイライブラリーに含有される、Ａｄ５ファイバーノブドメインを含むがそれに限定されない、この改変ファイバーノブの部分は、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含有する。本ファージディスプレイライブラリー内に含有されるファイバーノブはさらに、野生型表面結合がないように改変され得る。ある実施形態において、本ファージライブラリーで表示される改変ファイバーノブは、ＨＩループドメインを含むがこれに限定されない、該ノブの露出したループドメイン内に挿入されている、本明細書で述べるようなペプチドリガンドを含む。ある実施形態において、本ペプチドリガンドは、Ａｄ５ファイバータンパク質のファイバーノブ内に位置する、アミノ酸残基５４６とアミノ酸残基５４７との間に挿入され得る。
【００５０】
本発明のさらなる実施形態において、本明細書中で述べるファージディスプレイライブラリーは、バクテリオファージλ上に表示され、本改変ファイバーノブは、λファージの主要頭部Ｄタンパク質に融合させられている。本発明のファージディスプレイライブラリーは、アデノウイルスファイバーに組み込まれた場合に、結合特性の変化を保持するペプチドリガンドを同定するために使用される既存のファージディスプレイペプチドライブラリーの限界を乗り越えるが、これは候補ペプチドリガンドが、本ファージディスプレイ系の機能的なファイバーノブ内で発現されるからである。本発明のファージディスプレイ系を用いることにより、本ペプチドリガンドが、このファイバーノブコンテクストにおいてＣＡＲ以外に細胞表面結合部位と結合する能力があるか否かを調べる。
【００５１】
本発明はさらに、（ａ）上述した特性を有するファージディスプレイライブラリーを提供することと、（ｂ）ＣＡＲ陰性又はＣＡＲ陽性細胞において前記ライブラリーをスクリーニングすることとを含む、ＣＡＲ以外の細胞特異的結合部位に対するペプチドリガンドを同定するための方法に関する。ある実施形態において、本発明のファージディスプレイライブラリーは、ＣＡＲ陰性のＮＩＨ−３Ｔ３細胞上でスクリーニングされる。
【００５２】
本発明はまた、本明細書中で述べるような組み換えアデノウイルスを用いて細胞及び／又は組織に対して形質導入を行う方法にも関する。細胞／組織に対して形質導入を行うために本明細書中で述べるような組み換えアデノウイルスを用いることにより、アデノウイルス感染性の能力及び効率の両方が向上する。ある実施形態において、これらの方法は、ＣＡＲの発現がわずかであるか又は全くなく、Ａｄ５感染に対して耐性がある細胞に対して、本発明の組み換えアデノウイルスを用いて形質導入を行うことを含む。本発明の組み換えアデノウイルスを用いて形質導入が行われ得る細胞／組織には、これらに限定されないが、滑膜細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、癌細胞、原発腫瘍、樹状細胞、骨格筋、メラノサイト及びマウスメラノーマ細胞が含まれる。別の実施形態には、マウス又はヒト由来のものを含むがこれらに限定されない未成熟の樹状細胞、ならびにマウス骨格筋及びヒト初代メラノサイトに対して、本発明の組み換えアデノウイルスを用いて形質導入を行う方法が含まれる。
【００５３】
「実質的に他の核酸を含まない」とは、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％及びさらにより好ましくは９９．９％、他の核酸を含まないことを意味する。交換可能に用いられる場合、「実質的に他の核酸を含まない」、「実質的に精製された」、「単離された核酸」又は「精製された核酸」という用語はまた、他の細胞コンポーネントとは分けて精製された本発明の改変アデノウイルスファイバータンパク質に対するコード領域を含むＤＮＡ分子も意味する。従って、実質的に他の核酸がない改変アデノウイルスファイバータンパク質のＤＮＡ調製物に含まれる非改変アデノウイルスファイバータンパク質核酸は、非改変アデノウイルスファイバータンパク質核酸を、その全核酸の、１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、さらにより好ましくは０．１％未満含有する。例えば、臭化エチジウム染色など適切な染色法と組み合わせたアガロースゲル電気泳動等の核酸の精製度を評価する従来の技術により、又は配列決定により、ある改変アデノウイルスファイバータンパク質のＤＮＡ調製物に実質的に他の核酸が含まれているか否かを調べることができる。
【００５４】
「実質的に他のタンパク質がない」又は「実質的に精製されている」とは、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％及びさらにより好ましくは９９．９％、他のタンパク質が含まれていないことを意味する。従って実質的に他のタンパク質が含まれていない改変アデノウイルスファイバータンパク質調製物に含まれる非改変アデノウイルスファイバータンパク質は、その全タンパク質の、１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、さらにより好ましくは０．１％未満である。例えば銀染色又はイムノブロッティングなど適切な検出法と組み合わせたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等のタンパク質の精製度を評価する従来の技術により、ある改変アデノウイルスファイバータンパク質調製物に実質的に他のタンパク質が含まれているか否かを調べることができる。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「Ａｄ５」とは、アデノウイルス血清型５を意味する。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「ＣＡＲ」とは、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体を意味する。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「Ｘａａ」とは、２０種類のアミノ酸残基のいずれかを表す３文字表記を意味する。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、「可変アミノ酸残基位置」又は「可変残基位置」とは、２０種類のアミノ酸残基のいずれかを含有し得るアミノ酸残基位置を意味する。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、「結合部分」とは、標的細胞上で分子と結合することができる、アデノウイルスの表面に露出されている分子を意味する。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「標的細胞」とは、組み換えアデノウイルスがその結合部分を用いて結合することができる細胞を意味する。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、アデノウイルスファイバータンパク質内に組み込まれている「ペプチドリガンド」とは、標的細胞上の細胞表面結合部位への結合能を有する、異種（つまり、そのアデノウイルスファイバータンパク質に一般的に含有されるものではない。）ポリペプチドを意味する。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「ＲＧＤ」とは、連続するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐアミノ酸配列を意味する。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「ベクター」とは、プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む。）、バクテリオファージ及びコスミドを含むがこれらに限定されない、ＤＮＡ断片を宿主生物又は宿主組織に導入させることができる、ある手段を意味する。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「第一世代」とは、アデノウイルスベクターについて使用される場合、複製欠損のアデノウイルスベクターを言う。第一世代アデノウイルスベクターは一般に、Ｅ１遺伝子領域を欠失しているか、又は不活性化されており、好ましくは、Ｅ３遺伝子領域を欠失しているか、又は不活性化されている。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、「パッセンジャー導入遺伝子」は、本発明による、通常ベクターに存在せず、サブクローニングされる、いずれかの遺伝子である（例えば、アデノウイルスベクター）。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「ｗｔ」とは、野生型を意味する。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、「ｖｐ」とは、ウイルス粒子を意味する。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、「ＲＰＥ」とは、Ｒ−フィコエリスリンを意味する。
【００６９】
本発明の詳細な説明
本発明は、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含む、改変ファイバータンパク質を有する、組み換えアデノウイルスに関する。本改変ファイバータンパク質により、アデノウイルスの親和性を拡大することができ、従って、アデノイルス遺伝子治療系の活性及び機能性が高められる。前記改変ファイバータンパク質のペプチドリガンドは、アミノ酸残基を含有し得る、又は含有しなくてもよい、１４個の可能性のある残基位置を表すコアアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、コアアミノ酸残基は、位置１、２及び１３にＸａａ残基、好ましくは、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）；位置、３及び１２にシステイン（Ｃｙｓ）残基；位置４から１１にＸａａ残基、好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）又はバリン（Ｖａｌ）；位置１４にＸａａ残基、好ましくはプロリン（Ｐｒｏ）を含有する。Ｘａａは、その特定の残基位置に２０アミノ酸残基のいずれかが存在し得ることを表す３文字表記である。従って、この実施形態の組み換えアデノウイルスは、１４個の可能性のある残基位置のうち、２個の残基位置のみでアミノ酸残基が固定されている（位置３及び１２のＣｙｓ残基）ペプチドリガンドを含む、改変ファイバータンパク質を含有する。この実施形態において変化させることができるアミノ酸残基位置、位置１、２、４から１１、１３及び１４には、好ましい特定のアミノ酸残基がある。しかし、本ペプチドリガンドのアミノ酸配列は、位置３及び１２の固定されたＣｙｓ残基の間のフレキシブルループドメインにおいて連続的なＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）アミノ酸配列を含まない。さらに、本ペプチドリガンドは、配列番号４６において開示されているようなアミノ酸配列からなるものではない。
【００７０】
本コアアミノ酸配列の可変残基位置におけるアミノ酸の選好性は、本発明のアデノウイルスファイバータンパク質を改変するために使用されるペプチドリガンドのプールが作られる方法の結果生じる。実施例３において全体的に述べるように、かつ図１３で示すように、本発明のペプチドリガンドをコードするオリゴヌクレオチドは、レジンスプリット法により合成される。この方法を用いて、所望する長さの特異的なオリゴヌクレオチド配列を作製するために１個のアミノ酸残基をコードする核酸コドンを連続して付加する。例えば、本発明のペプチドリガンドは全て、残基位置３及び１２にＣｙｓ残基を含有し；従って、３番目及び１２番目の残基位置をコードするための核酸配列を合成する際、Ｃｙｓのみをコードするコドンを使用する。特定の残基位置にあらゆるアミノ酸を有する可能性のあるペプチドリガンドを作製するために（つまり、可変残基位置）、特定の残基位置を合成する際、各アミノ酸残基をコードする核酸コドンを利用する。その特定の残基位置を合成する際に、コドンプール内に特定のアミノ酸又はアミノ酸群をコードするコドンの割合を増加させることにより、可変残基位置に、特定のアミノ酸又はアミノ酸群が入りやすくなるようにする。この方法を用いることにより、本発明で述べるペプチドリガンドのコアアミノ酸配列が、特定のアミノ酸を優先させる可変残基位置を含有するように作製される。チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニン残基は、ある一部の位置において好ましいが、それは、これらの芳香環構造が疎水性受容体構造との相互作用を促進するからである。プロリンは、拡張構造を導入する傾向があるので、挿入したペプチドリガンドの接近性を高めるために、本発明リガンドの残基位置１４において好ましい。勿論、一般にこのコア配列の中程に位置する残りの可変残基位置（つまり、ペプチドリガンドのループドメイン）について、ループのフレキシビリティを高めるのを促進するアミノ酸が好ましい。つまり、これらの残基位置は、グリシン、セリン及びバリンなど、小さな側鎖を有するアミノ酸を含有することが多くなる。
【００７１】
本発明のペプチドリガンドのコアアミノ酸配列において、固定された残基位置を除く、このコア配列内のあらゆる残基位置で１つ又は複数の残基を欠失させ得る。つまり、このコア配列の１４個の可能性のある残基位置のいくつかは、アミノ酸残基を含まないであろう。可変アミノ酸残基位置でのみ欠失を起こすことができる（つまり、Ｘａａ残基で表されるもの。）。つまり、本明細書中で述べるように、固定されたアミノ酸残基が残基位置３及び１２に位置するＣｙｓ残基のみである場合、残りの１２個の可能性のある残基位置のいずれにおいてもアミノ酸残基が欠失され得る。位置３及び位置１２の固定されたＣｙｓ残基の間にあるコアアミノ酸配列の領域は、少なくとも２個のアミノ酸残基を含むことが好ましい。空のアミノ酸残基位置の数は、オリゴヌクレオチド合成中に各位置でコドンの欠失を導入する頻度に従い変化する。このコア配列内のアミノ酸残基の欠失は、１４個の可能性のあるアミノ酸残基位置の付番方式を変化させない。例えば、固定されたアミノ酸残基が３番及び１２番の位置にあるが、位置２のアミノ酸がアミノ酸残基を失うように削除されている場合、この固定されたアミノ酸残基の番号は同じままである。つまり、この例において、固定されたアミノ酸は、残基位置２番及び１１番に移動せずに、残基位置３番及び１２番に位置する。
【００７２】
さらに、本発明は、本ペプチドリガンドコア配列の固定された残基位置の間に最高で１０個までのアミノ酸残基を付加させ得ることを意図する。固定された残基は、本コアアミノ酸配列の末端付近に位置し；従ってこの固定された残基の間のアミノ酸残基付加により、本ペプチドリガンド配列のフレキシブルループドメインの長さが延長される。従って、可能な最大のペプチドリガンドの長さは２４アミノ酸長である。本コア配列のこの領域にアミノ酸残基を付加した場合、この１４個の可能なアミノ酸残基位置の付番は変化しない。例えば、残基位置番号３及び１２に固定された残基が位置し、この固定された残基位置の間に２個のアミノ酸残基が付加される場合、固定されたアミノ酸残基の付番は同じままである。つまり、この例において、固定されたアミノ酸は、残基位置番号３及び１４に移動せずに、残基位置番号３及び１２に位置する。本ペプチドリガンドのループドメイン内に付加された２個のアミノ酸は、プライム「’」記号を用いて付番する。例えば、アミノ酸１個を残基位置４と５との間に付加し、他のものを残基位置７と８との間に付加する場合、２個の新しい付加アミノ酸は、残基位置４プライム（４’）及び７プライム（７’）でそれぞれ含有されることになる。このループドメイン内に位置するアミノ酸残基位置に複数のアミノ酸を付加することができる。
【００７３】
本発明はさらに、１４個の可能性のあるアミノ酸残基位置のうち３個が特定のアミノ酸残基に固定されているような、１４残基位置のコアアミノ酸配列を含有する、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含む、改変ファイバータンパク質を有する組み換えアデノウイルスに関する。この実施形態において、残基位置１及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり；残基位置２が、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）残基であり；残基位置３及び１２が、システイン（Ｃｙｓ）残基であり；残基位置４から１１が、Ｘａａ残基であり、好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）又はバリン（Ｖａｌ）であり；残基位置１４が、Ｘａａ残基であり、好ましくは、プロリン（Ｐｒｏ）である。つまり、固定されたアミノ酸残基位置は、位置２，３及び１２に位置し、それぞれＰｈｅ、Ｃｙｓ及びＣｙｓ残基を含有する。可変残基位置に位置する好ましいアミノ酸残基を含む、この実施形態のコアアミノ酸配列は、前の実施形態に述べたようにして作製される。本コアアミノ酸配列から、可変アミノ酸残基位置において（つまり、位置２、３又は１２以外の全ての残基位置）１つ又は複数の残基が欠失され得る。固定されたＣｙｓ残基の間に位置するコアアミノ酸配列の領域が少なくとも２個のアミノ酸残基を含有することが好ましい。最高で１０個までのアミノ酸残基の付加は、本実施形態のペプチドリガンドのフレキシブルループドメイン内で許容され得る。ループドメインは、位置３と１２の固定されたＣｙｓ残基の間に位置し、従って最高で１０個までのアミノ酸残基が、前記アミノ酸残基位置の間に付加され得る。本明細書で述べるように、このコアアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付番は、本コア配列に対するアミノ酸欠失及び／又は付加が起こった場合も同じままである。本ペプチドリガンドのアミノ酸配列は、本実施形態の固定されたＣｙｓ残基間に位置するフレキシブルループドメインに、連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含有しない。
【００７４】
本発明はまた、１４個の可能性のあるアミノ酸残基位置のうち６個が特定のアミノ酸残基に固定されているような１４残基位置のコアアミノ酸配列を含有する、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含む、改変ファイバータンパク質を有する組み換えアデノウイルスにも関する。この実施形態において、残基位置１、２及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり；残基位置３及び１２が、システイン（Ｃｙｓ）残基であり；残基位置４から７が、Ｘａａ残基であり、好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）又はバリン（Ｖａｌ）であり；残基位置８及び９が、グリシン（Ｇｌｙ）残基であり；残基位置１０及び１１が、セリン（Ｓｅｒ）残基であり；残基位置１４がＸａａ残基であり、好ましくはプロリン（Ｐｒｏ）である。前の実施形態において、本ペプチドリガンドのフレキシブルループドメインを構成する８個の可能性のあるアミノ酸残基それぞれ（つまり、残基位置４から１１にわたり、４と１１を含む。）は、Ｘａａ残基を含有し、好ましくは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又はＶａｌ残基である。この実施形態において、フレキシブルループドメインの８個の可能性のあるアミノ酸残基のうち４個が固定されており：位置８及び９がＧｌｙ残基であり、位置１０及び１１がＳｅｒ残基である。本コアアミノ酸配列において、残基位置１、２、４から７、１３及び１４を含む配列内の可変残基位置で１つ又は複数の残基が欠失され得る。さらに、最高で１０個までのアミノ酸残基が残基の位置３と８とに位置する固定された残基位置の間に付加され得る。残基位置８から１１におけるフレキシブルループドメイン内に位置する固定されたアミノ酸残基は、４個の連続的なアミノ酸として残り、付加的なアミノ酸の挿入により分離されることはない。このペプチドリガンドのアミノ酸配列は、残基位置３と８とに位置する固定された残基位置の間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含有しない。
【００７５】
本発明はさらに、１４個の可能性のあるアミノ酸残基位置のうち７個が特定のアミノ酸残基に固定されているような、１４個の可能性のある残基位置のコアアミノ酸配列を含有する、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含む、改変ファイバータンパク質を有する組み換えアデノウイルスに関する。この実施形態において、残基位置１及び１３はＸａａ残基であり、好ましくは、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり；位置２は、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）残基であり；残基位置３及び１２は、システイン（Ｃｙｓ）残基であり；残基位置４から７は、Ｘａａ残基であり、好ましくは、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）又はバリン（Ｖａｌ）であり；残基位置８及び９は、グリシン（Ｇｌｙ）残基であり；残基位置１０及び１１は、セリン（Ｓｅｒ）残基であり；残基位置１４はＸａａ残基であり、好ましくは、プロリン（Ｐｒｏ）である。前の実施形態と同様に、本ペプチドリガンドのフレキシブルループドメイン内に位置する８個の可能性のあるアミノ酸残基のうち４個が固定されており、位置８及び９がＧｌｙ残基であり位置１０及び１１がＳｅｒ残基である。この実施形態において、本ペプチドリガンドのコアアミノ酸配列は、残基位置２に、Ｐｈｅ残基を含有する、１個の付加的な固定されたアミノ酸を含有し得る。本コアアミノ酸配列において、残基位置１、４から７、１３及び１４を含む配列内の可変残基位置で１つ又は複数の残基が欠失され得る。さらに、最高で１０個までのアミノ酸残基が残基の位置３と８との固定された残基位置の間に付加され得る。残基位置８から１１におけるフレキシブルループドメイン内に位置する固定されたアミノ酸残基は、４個の連続的なアミノ酸として残り、付加的なアミノ酸の挿入により分離されることはない。このペプチドリガンドのアミノ酸配列は、残基位置３と８とに位置する固定された残基位置の間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含有しない。
【００７６】
本発明はまた、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対する、ＦＣＶＡＳＲＧＧＳＳＣＹ（配列番号１３）、ＦＣＫＶＶＧＧＧＳＳＣＳＰ（配列番号１４）及びＦＦＣＶＳＤＧＧＧＳＳＣＰ（配列番号１５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含有するペプチドリガンドを含む改変ファイバータンパク質を有する組み換えアデノウイルスにも関する。
【００７７】
本発明はまた、改変前にアデノウイルスが第一の血清型であり；改変後に前記第一のアデノイルス血清型のファイバータンパク質の少なくとも一部が除去されるか、又は第二のアデノウイルス血清型由来のファイバータンパク質の同じ又は類似部分で置換されており、第二のアデノウイルス由来の血清型ファイバータンパク質の前記部分が本明細書中で述べるように改変されている、組み換えアデノウイルスにも関する。前記第一のアデノウイルス血清型ファイバータンパク質から除去した部分を置換するために使用される前記第二のアデノウイルス血清型由来のファイバータンパク質の部分は、本明細書中で述べるようなペプチドリガンドを含有する。この文脈において、「第二のアデノウイルス血清型由来のファイバータンパク質の同じ又は類似の部分」とは、前記第一のアデノウイルス血清型ファイバータンパク質から除去した部分を置換するために使用される前記第二のアデノウイルス血清型ファイバータンパク質の部分が、第一のアデノウイルス血清型ファイバータンパク質由来の除去部分とほぼ同じサイズであり、ほほ同じタンパク質ドメインからなることを意味する。従って、本発明のある実施形態は、ファイバータンパク質が代替的な血清型の改変ファイバータンパク質により置換されている、組み換えアデノウイルスに関する。別の実施形態において、改変アデノウイルスファイバータンパク質が、あるアデノウイルス血清型由来のそのノブドメイン内に含有されるペプチドリガンドを含む場合（本明細書中でさらに述べるように）、このペプチドリガンドを含むノブドメインは、適切なファイバー三量体化が維持される限りは、代替的なアデノウイルス血清型の野生型ノブドメインを置換するために使用することができる。とりわけ、本発明は、そのアデノウイルスのノブドメインが、本明細書で述べるような改変Ａｄ５ファイバーノブのノブドメインで置換されている、ヒト起源又は非ヒト起源のあらゆる血清型の組み換えアデノウイルスに関する。例えば、本明細書中で述べるようなキメラファイバータンパク質をコードするキメラウイルスゲノムを含有する組み換えアデノウイルスは、個別のウイルスベクターの再投与において存在し得る宿主の中和反応の抑制又は軽減を促進するための、遺伝子治療／遺伝子ワクチン接種のプライムブースト法において有用となろう。
【００７８】
本発明はさらに、アデノウイルスの生来の親和性を除去するためにさらに改変されている改変アデノウイルスファイバータンパク質を含有する組み換えアデノウイルスに関する。本発明はまた、上述のようにさらに改変される改変アデノウイルスファイバータンパク質にも関する。例えば、本明細書中で開示されている何らかの改変ＣＡＲ認識アデノウイルスファイバータンパク質はさらに、その改変タンパク質のＣＡＲ結合がなくなるように改変され得る。アデノウイルスファイバータンパク質のＣＡＲ結合は、Ｒｏｅｌｖｉｎｋら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６：１５６８−１５７１（参照により、本明細書中に組み込まれる。。）で述べられているような特異的な配列改変の結果としてなくすことができる。本発明のある実施形態において、本発明の改変Ａｄ５ファイバータンパク質は、このファイバータンパク質のアミノ酸残基４８９からアミノ酸残基４９２に位置する４個のアミノ酸配列ＴＡＹＴ（配列番号４５）の欠失によりＣＡＲ結合をなくすようにさらに改変される。本発明の組み換えアデノウイルスのその野生型細胞表面結合部位、例えばＡｄ５に対するＣＡＲ、への結合能の不活性化により、組み換えアデノウイルスが、本改変ファイバードメイン内に組み込まれた特定のペプチドリガンドの細胞表面結合部位を発現する特異的な細胞型を標的とすることを容易にするであろう。
【００７９】
本発明の組み換えアデノウイルス内に含有される単離されたアデノウイルスファイバータンパク質を以下に説明する。本明細書中で述べるように改変されている単離されたアデノウイルスファイバータンパク質は、前記改変タンパク質を含む組み換えアデノウイルスが結合し、その内容物を形質導入するであろう治療上意義のある細胞及び組織を同定するためのツールとして使用することができる。本明細書中で述べるようなこの改変単離アデノウイルスファイバータンパク質はまた、他のある部分（つまり、ウイルス、タンパク質又はＤＮＡ）を標的受容体に向けさせるために、該部分に結合させ得る「結合決定基」としても使用することができる。ヒト又は非ヒトアデノウイルスの血清型のいずれか１つを、ファイバータンパク質遺伝子のソースとして使用することができる。本発明のある実施形態において、本ファイバータンパク質遺伝子のソースは、Ａｄ５である。本ファイバータンパク質は、野生型アデノウイルスから単離したようなタンパク質（つまり、ネイティブタンパク質又は野生型タンパク質を含む。）において通常見られないアミノ酸残基を含むように、改変されている。これらの非野生型アミノ酸残基は、細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを表す配列を含む。非野生型アミノ酸残基は、好ましくは、遺伝子発現のレベルで本ファイバータンパク質に導入される（つまり、ペプチドリガンドをコードする核酸配列の導入による。）。
【００８０】
本発明のペプチドリガンドは、本明細書の中で詳細を述べるようにアミノ酸残基が付加又は欠失され得る１４個の可能性のあるアミノ酸残基位置のコアアミノ酸配列を含む。この配列は、結果として生じる改変アデノウイルスファイバータンパク質を含む、組み換えアデノウイルスに、ＣＡＲ以外、及びＣＡＲに加えての、細胞に対する細胞表面結合部位を介した結合能を与える。これにより、野生型アデノウイルスと比較して、組み換えアデノウイルスの親和性が拡大される。アデノウイルスファイバータンパク質及びペプチドリガンドは、このペプチドリガンドをコードするオリゴヌクレオチドを、本ファイバータンパク質をコードする遺伝子内に挿入できるようにするための、適合する新規の制限部位を含むように操作され得る。このために、核酸レベルにおいて、ファイバータンパク質へのペプチドリガンドアミノ酸配列の挿入を行うことができる。
【００８１】
細胞表面結合部位は、本明細書中で述べるような改変アデノウイルスファイバータンパク質に対する結合部分を含み、受容体（つまり、タンパク質、糖質、糖タンパク質又はプロテオグリカン）、何らかの逆の電荷を有する分子（つまり、その改変ファイバータンパク質に関して逆の電荷を有する。）又は、その改変ファイバータンパク質が結合でき、それにより細胞侵入が促進される他のタイプの細胞表面分子を包含する。本発明の改変ファイバータンパク質及びそれらの使用方法は、細胞相互作用の何らかの特定のメカニズム（つまり、特定の細胞表面結合部位との相互作用）に限定されず、そのように解釈されるものではない。本発明による細胞表面結合部位は、野生型アデノウイルスファイバータンパク質との相互作用のために今までは使用できなかった、又は非常に低いレベルでしか使用できなかった部位である。つまり、ペプチドリガンド挿入の結果としての、改変されたアデノウイルスファイバータンパク質は、野生型ファイバータンパク質が結合しない、又は非常に結合親和性が低い、細胞表面に存在する結合部位と相互作用することができる。これは、ベクターの細胞への侵入効率を上げる、ならびに特異性を上げ、アデノウイルスが標的とする範囲を拡大する効果を有する。
【００８２】
改変Ａｄ５ファイバータンパク質を含むがこれに限定されない、本発明の改変アデノウイルスファイバータンパク質は、本明細書中で述べるようにファイバータンパク質内に挿入されるペプチドリガンドを含む。本改変ファイバータンパク質のペプチドリガンドは、このペプチドリガンドが細胞表面結合部位に接近できるようにする本ファイバータンパク質のいずれかの部分内に組み込まれる。Ａｄ５ファイバーノブの結晶構造が述べられている（Ｘｉａら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１２５９−１２７０を参照。）。本ファイバーノブ単量体は、８本の逆平行βサンドイッチフォールド（ｓａｎｄｗｉｃｈ  ｆｏｌｄ）からなり；ファイバーノブ三量体の全体的な構造は、その羽根の面を含む３つの単量体それぞれの一定のβ鎖を有する、３枚羽根のプロペラに類似している。そのファイバーノブの３５％のみがβ鎖を含む。とりわけ、Ａｄ５ファイバーノブの次の残基は、β−サンドイッチモチーフにおける水素結合に重要であると思われる：４００−４０２、４１９−４２８、４３１−４４０、４５４−４６１、４７９−４８２、４８５−４８６、５１６−５２１、５２９−５３６、５５０−５５７及び５７３−５７８。単量体配列の残りの６５％は、そのβ鎖を連結するターン及びループからなる。Ａｄ５ファイバーノブ単量体の６個の突出したループは、本ファイバータンパク質二次構造の形成において重要ではないと思われる。とりわけ、４０３−４１８の両端を含む残基は、ＡＢループを含み、４４１−４５３の両端を含む残基は、ＣＤループを含み、４８７−５１４の両端を含む残基は、ＤＧループを含み、５２２−５２８の両端を含む残基は、ＧＨループを含み、５３７−５４９の両端を含む残基は、ＨＩループを含み、５５８−５７２の両端を含む残基は、ＩＪループを含む。
【００８３】
本ファイバータンパク質内のペプチドリガンドの付加により細胞標的化のための利用可能な結合部分が作り出されなければならないのと同時に、本ファイバータンパク質の三量体化能が妨害されてはならない。従って、少なくとも本ノブにおける分子内相互作用に関与する露出されたループドメイン内のペプチドリガンドの挿入が好ましい。つまり、本発明のある実施形態において、本ペプチドリガンドは、アデノウイルスファイバーノブの露出されたループドメイン内に挿入される。そのようなループがＡｄ５配列に関して本明細書中で定義されると同時に、他のファイバーノブ種の配列アラインメントが述べられている（Ｘｉａ、Ｄら、前出、を参照。）。タンパク質の結合／折り畳みに重要な本ファイバーノブにおける対応する残基は、様々なアデノウイルス血清型のファイバータンパク質間で保存されていると思われる。このことから、ファイバータンパク質の結晶構造が分からないそれらのアデノウイルス種に対してでさえ、これらの保存残基の外側には、非保存領域又はタンパク質の機能性に重要な残基に対して見られる高レベルの保存性を示さない領域があることが示唆される。これらの非保存領域における本ファイバータンパク質の配列は、このタンパク質のこれらの領域において重要な分子内相互作用がないため、ループとして存在すると思われる。
【００８４】
本発明のペプチドリガンドを挿入することができるファイバーノブループは、ＡＢ、ＣＤ、ＤＧ、ＧＨ、ＨＩ及びＩＪループからなる群から選択される。Ａｄ５において、これらのループは、それぞれ残基４０３−４１８、４４１−４５３、４８７−５１４、５２２−５２８、５３７−５４９及び５５８−５７２からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む。本発明のある実施形態において、ペプチドリガンドは、Ａｄ５ファイバーノブを含むがこれに限定されない、アデノウイルスファイバーノブのＨＩループ内に挿入される。Ａｄ５において、ＨＩループは、それぞれが親水性である、１３個のアミノ酸残基を含み、そのノブの外側に露出されている。このＨＩループは、非常に高いフレキシビリティを示すので、異種リガンドを組み込むのに最適な位置であることが示されている。また、様々なアデノウイルス血清型においてＨＩループの長さが様々であることから、この元のループ構造における変更が、このノブドメインの適切な折り畳みに影響を与えることなく受容されるであろうことが示唆される。本発明において、細胞表面結合部位に対する本ペプチドリガンドは、内因性のファイバータンパク質配列を除去することなく、本ファイバータンパク質内に、好ましくはこのファイバーノブのループドメイン内に、組み込むことができる。
【００８５】
あるいは、そのタンパク質の正常な機能を妨害することなく、アデノウイルスファイバータンパク質のタンパク質配列部分のかわりに本ペプチドリガンドを置き換えることができる。本発明のある実施形態において、及び本明細書中の実施例のセクションで例示するように、本ペプチドリガンドは、本ファイバーノブのＨＩループ内のＡｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸残基５４６とアミノ酸残基５４７との間に挿入することができる。この異種アミノ酸配列は、好ましくは、本ファイバータンパク質の核酸レベルで導入される。本ファイバータンパク質においてペプチドリガンドが存在することで、組み換えアデノウイルスがＣＡＲ非依存性遺伝子導入を達成できるようになる。
【００８６】
本発明の改変ファイバータンパク質が適切な三量体形成を維持することは標的細胞相互作用を支えるために重要である。三量体形成は、ワクシニア発現系を用いて評価することができる。全体的に、Ｆａｌｋｎｅｒ，１９８８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１８４９−１８５４により述べられている、組み換えワクシニアウイルスベクター、ｐＴＫｇｐｔ−３Ｓを使用して、アデノウイルスの残りの部分から単離した状態の改変アデノウイルスファイバータンパク質を生成させることができる。このベクターは、本ファイバータンパク質に対する都合の良いクローニング部位を有し、アデノウイルスファイバー遺伝子を含有する組み換えワクシニアウイルスに対する選択可能なマーカーとしてＥ．コリｇｐｔ遺伝子を含む。ファイバータンパク質はまた、Ｆｕｅｒｓｔら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８１２２−８１２６により述べられている、２ウイルスバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ法を用いて、組み換えワクシニアウイルスでも発現されている。組み換えレトロウイルスなど、他の真核発現ベクターもまた、三量体化の機能テストを行うのに十分な量の正常にグリコシル化されたファイバータンパク質を産生させるために使用することができる。このワクシニアで産生されたファイバータンパク質は、そのタンパク質の単量体と三量体とを区別することができるモノクローナル抗体と組み合わせたウエスタンブロット分析を用いて、三量体化について容易に試験することができる。そのような２種類のモノクローナル抗体、抗体４Ｄ２．５と抗体２Ａ６．３６の特性は、Ｈｏｎｇ及びＥｎｇｌｅｒ、１９９１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８５：７５８−７６７により調べられている。Ｈｏｎｇ及びＥｎｇｌｅｒにより述べられているように、標準的技術を用いて、他の抗体を作製することができる。これらの抗体を用いて、ウエスタンブロット及び間接的免疫蛍光法の両方により、本改変ファイバーの構造に関する情報を得ることができる。
【００８７】
本改変ファイバータンパク質の標的細胞への結合は、標準的技術を用いて調べることができる。例えば、本改変ファイバータンパク質を含有する本組み換えアデノウイルスを放射性標識して、細胞に添加し、インキュベーションすることができる。非結合ウイルスを洗い去り、その細胞に結合した放射活性量を測定する。あるいは、既知のウイルスタイターを用いて、本改変ファイバータンパク質を含む組み換えウイルスを細胞に感染させることができる。次に、細胞変性アッセイにより、細胞溶解を調べることができる。そのウイルスが結合する細胞のみが感染を起こし得、その結果細胞死に至る。
【００８８】
本発明は、ある部分、図１に開示されており、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる改変Ａｄ５ファイバータンパク質を含む組み換えアデノウイルスに関する。本発明のさらなる実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列からなる単離されたＡｄ５ファイバータンパク質である。配列番号１（Ａｄ５ｆｉｂｅｒ−Ｌ１タンパク質）は、配列番号１３で開示されるアミノ酸配列からなるＬ１ペプチドリガンドがアミノ酸残基５４６と５４７の間のファイバーノブのＨＩループ内に挿入されている、Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸配列を表す。配列番号１は以下のとおりであり、配列中、ノブドメインには下線を付し、Ｌ１ペプチドリガンド配列は斜字体で示し、本ペプチドリガンド挿入を容易にするため、及び野生型配列を維持するために野生型Ａｄ５ファイバー配列に付加した残基は、小文字で示す：
【００８９】
【化１】
2007503843.tif 000003
【００９０】
本発明はまた、ある部分、図２に開示されており、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる改変Ａｄ５ファイバータンパク質を含む組み換えアデノウイルスにも関する。本発明のさらなる実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列からなる単離されたＡｄ５ファイバータンパク質である。配列番号２（Ａｄ５ｆｉｂｅｒ−Ｌ１６タンパク質）は、配列番号１４で開示されるアミノ酸配列からなるＬ１６ペプチドリガンドがアミノ酸残基５４６と５４７の間のファイバーノブのＨＩループ内に挿入されている、Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸配列を表す。配列番号２は以下のとおりであり、配列中、ノブドメインには下線を付し、Ｌ１６ペプチドリガンド配列は斜字体で示し、本ペプチドリガンド挿入を容易にするため、及び野生型配列を維持するために野生型Ａｄ５ファイバー配列に付加した残基は、小文字で示す：
【００９１】
【化２】
2007503843.tif 000004
【００９２】
本発明はまた、ある部分、図３に開示されており、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる改変Ａｄ５ファイバータンパク質を含む組み換えアデノウイルスにも関する。本発明のさらなる実施形態は、配列番号３のアミノ酸配列からなる単離されたＡｄ５ファイバータンパク質である。配列番号３（Ａｄ５ｆｉｂｅｒ−Ｌ３３タンパク質）は、配列番号１５で開示されるアミノ酸配列からなるＬ３３ペプチドリガンドがアミノ酸残基５４６と５４７の間の本ファイバーノブのＨＩループ内に挿入されている、Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸配列を表す。配列番号３は以下のとおりであり、配列中、ノブドメインには下線を付し、Ｌ３３ペプチドリガンド配列は斜字体で示し、本ペプチドリガンド挿入を容易にするため、及び野生型配列を維持するために野生型Ａｄ５ファイバー配列に付加した残基は、小文字で示す：
【００９３】
【化３】
2007503843.tif 000005
【００９４】
本発明は、以下で開示される：
ＦＣＶＡＳＲＧＧＳＳＣＹである、
配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる単離されたペプチド（Ｌ１ペプチドリガンド）に関する。
【００９５】
本発明はまた、以下で開示される：
ＦＣＫＶＶＧＧＧＳＳＣＳＰである、
配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる単離されたペプチド（Ｌ１６ペプチドリガンド）にも関する。
【００９６】
本発明はさらに、以下で開示される：
ＦＦＣＶＳＤＧＧＧＳＳＣＰである、
配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなる単離されたペプチド（Ｌ３３ペプチドリガンド）に関する。
【００９７】
本発明はまた、その野生型細胞表面結合部位への結合をなくすようにさらに改変されている、本発明で開示されるような改変ファイバータンパク質にも関する。ＣＡＲは、多くの、しかし全てではない、アデノウイルス血清型にとって、主要な細胞表面結合部位である。ある実施形態において、改変Ａｄ５ファイバータンパク質の野生型ＣＡＲ結合がなくなっている。アデノウイルスのその野生型受容体（例えば、多くのアデノウイルス血清型にとってはＣＡＲ）への結合能をなくした場合、ウイルス増幅のための、そのウイルスキャプシドとＥ１発現細胞株において発現される受容体との間の代替的及び効果的な相互作用の存在が必要である。Ａｄ５ファイバータンパク質のＣＡＲ結合は、アミノ酸残基４８９からアミノ酸残基４９２までを含むがこれに限定されない、そのファイバータンパク質に対する特異的な配列改変により除かれる。
【００９８】
本発明は、ある部分、図７に開示されており配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる、単離されたＡｄ５ファイバータンパク質に関する。配列番号７（Ａｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ１タンパク質）は、ＣＡＲ結合を失わせる、Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸残基４８９−４９２からのアミノ酸残基ＴＡＹＴ（配列番号４５）の欠失があるＡｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸配列を表す。さらに、Ｌ１ペプチド（配列番号１３）は、アミノ酸５４６と５４７との間の、ファイバーノブのＨＩループに挿入されている。配列番号７は以下のとおりであり、配列中、ノブドメインには下線を付し、欠失に隣接するアミノ酸には二重線を付し、Ｌ１ペプチドリガンド配列は斜字体で示し、本ペプチドリガンド挿入を容易にするため、及び野生型配列を維持するために野生型Ａｄ５ファイバー配列に付加した残基は、小文字で示す：
【００９９】
【化４】
2007503843.tif 000006
【０１００】
本発明は、ある部分、図８に開示されており配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる、単離されたＡｄ５ファイバータンパク質に関する。配列番号８（Ａｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ１６タンパク質）は、ＣＡＲ結合を失わせる、Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸残基４８９−４９２からのアミノ酸残基ＴＡＹＴ（配列番号４５）の欠失があるＡｆ５ファイバータンパク質のアミノ酸配列を表す。さらに、Ｌ１６ペプチド（配列番号１４）は、アミノ酸５４６と５４７との間の、ファイバーノブのＨＩループに挿入されている。配列番号８は以下のとおりであり、配列中、ノブドメインには下線を付し、欠失に隣接するアミノ酸には二重線を付し、Ｌ１６ペプチドリガンド配列は斜字体で示し、本ペプチドリガンド挿入を容易にするため、及び野生型配列を維持するために野生型Ａｄ５ファイバー配列に付加した残基は、小文字で示す：
【０１０１】
【化５】
2007503843.tif 000007
【０１０２】
本発明はまた、ある部分、図９に開示されており配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる、単離されたＡｄ５ファイバータンパク質に関する。配列番号９（Ａｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ３３タンパク質）は、ＣＡＲ結合を失わせる、Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸残基４８９−４９２からのアミノ酸残基ＴＡＹＴ（配列番号４５）の欠失があるＡｆ５ファイバータンパク質のアミノ酸配列を表す。さらに、Ｌ３３ペプチド（配列番号１５）は、アミノ酸５４６と５４７との間の、ファイバーノブのＨＩループに挿入されている。配列番号９は以下のとおりであり、配列中、ノブドメインには下線を付し、欠失に隣接するアミノ酸には二重線を付し、Ｌ３３ペプチドリガンド配列は斜字体で示し、本ペプチドリガンド挿入を容易にするため、及び野生型配列を維持するために野生型Ａｄ５ファイバー配列に付加した残基は、小文字で示す：
【０１０３】
【化６】
2007503843.tif 000008
【０１０４】
異種ペプチドリガンド配列は、好ましくは、核酸レベルでファイバータンパク質内に挿入されることとなろう。従って、本発明はさらに、本明細書中で述べた特性を有するいずれかの改変アデノウイルスファイバータンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。本発明の単離された核酸分子は、１本鎖（コード又は非コード鎖）又は２本鎖であり得る、デオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）ならびに合成１本鎖ポリヌクレオチド等の合成ＤＮＡを含み得る。本発明の単離された核酸分子はまた、リボ核酸分子（ＲＮＡ）も含み得る。本発明の別の局面はまた、本明細書を通して開示する改変アデノウイルスファイバータンパク質をコードする単離された核酸分子を含有する、組み換えベクター及び、原核及び真核生物の組み換え宿主、さらに、組み換え宿主細胞において本発明の改変アデノウイルスファイバータンパク質を発現させるプロセスにも関する。
【０１０５】
本発明によると、本発明で開示するような改変ファイバータンパク質を生成する手段、特に異種ペプチドリガンド配列をＤＮＡレベルで導入する手段は、本分野で周知であり、分子生物学、微生物学及び組み換えＤＮＡ技術を使用し得る。このような技術は、文献において詳しく説明されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。本発明の核酸分子は、実質的に他の核酸分子が混ざっていない。
【０１０６】
特異的血清型の野生型アデノウイルスファイバータンパク質をクローニングするために、あらゆる様々な手段を使用し得る。これらの方法には、（１）ＲＡＣＥ  ＰＣＲクローニング技術（Ｆｒｏｈｍａｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８９９８−９００２）。全長ｃＤＮＡ配列を生成させるために５’及び／又は３’ＲＡＣＥを行い得る。このストラテジーには、アデノウイルスファイバータンパク質  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のために遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用することが含まれる。これらの遺伝子特異的プライマーは、公開されている核酸及びタンパク質データベースのいくつかを検索することにより、アデノウイルスファイバータンパク質配列の同定を通して設計される；（２）適切な発現ベクター系におけるアデノウイルスファイバータンパク質含有ｃＤＮＡライブラリーの構築後のアデノウイルスファイバータンパク質  ｃＤＮＡの直接的機能発現；（３）アデノウイルスファイバータンパク質のアミノ酸配列から設計した標識変性オリゴヌクレオチドプローブを用いた、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターにおいて構築したアデノウイルスファイバータンパク質含有ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング；（４）アデノウイルスファイバータンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡを用いた、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターにおいて構築したアデノウイルスファイバータンパク質含有ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング。この部分的ｃＤＮＡは、様々な血清型の様々なアデノウイルスファイバータンパク質に対して知られているアミノ酸配列からの変性オリゴヌクレオチドプライマーの設計を介した、アデノウイルスファイバータンパク質ＤＮＡ断片の特異的ＰＣＲ増幅により得られる；又は（５）特異的アデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長バージョンを単離するために、全長ｃＤＮＡが既知のＲＡＣＥ技術により生成され得るように、又は、多くのタイプのｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーの１つに対するスクリーニング用のプローブとして使用するためのコード領域の部分を生成させ単離するためにコード領域の一部がこれらの同じ既知のＲＡＣＥ技術により生成され得るように、テンプレートとして配列番号４−６内に位置する野生型Ａｄ５配列を用いて、Ａｄ５ファイバータンパク質のクローニング用の、５’及び３’遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計すること、が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
野生型アデノウイルスファイバータンパク質を単離した後、今回改変するアデノウイルスが、野生型タンパク質が持っていない結合部分を含有するように、本ペプチドリガンドをファイバータンパク質とともに挿入する。本ペプチドリガンドを、アデノウイルスファイバータンパク質配列の部分に挿入するか、又はこれで置換することができる。このような改変ファイバータンパク質を調製する方法は、以下の実施例セクションで説明する。一般に、その方法は、野生型ファイバータンパク質のタンパク質配列内、好ましくはそのファイバーノブのループ内に、本ペプチドリガンドを挿入するための、アデノウイルスファイバータンパク質をコードする核酸配列への、異種ペプチドリガンドをコードするオリゴヌクレオチド配列の導入を含む。プラスミド又は配列の操作を容易にするための他のベクターに、野生型ファイバータンパク質をコードする核酸配列をクローニングすることにより、これを遂行することができる。次に、さらなる配列、例えばペプチドリガンドＤＮＡ配列をファイバーＤＮＡ配列に挿入できる部位を作るために、このファイバータンパク質に１つ又は２つのユニークな制限部位を付加することができる。異種ペプチドリガンドをコードする２本鎖合成オリゴヌクレオチドは一般に、合成１本鎖センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを重複させることにより作製する。得られる２本鎖オリゴヌクレオチドは、そのファイバー遺伝子ＤＮＡに既に組み込まれているユニークな制限部位に対して相補的である隣接制限部位を含有する。そのプラスミド又は他のベクターを適切な制限酵素で切断し、適合する粘着末端を有するオリゴヌクレオチド配列をそのプラスミド又は他のベクターにライゲーションし、野生型ＤＮＡに付加するか、又はそれを置換する。ペプチドリガンド配列を本アデノウイルスファイバータンパク質コード配列に導入するために、市販のキットにより、当業者にとって公知の他のインビトロ部位特異的突然変異の手段を使用することができる（とりわけ、ＰＣＲを使用して）。
【０１０８】
本発明は、図１（配列番号１；Ａｄ５  ｆｉｂｅｒ−Ｌ１）で述べられている改変Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする、図４（Ａｄ５  ｆｉｂｅｒ−Ｌ１  ＤＮＡ）で述べられ、配列番号４に記載の、単離又は精製された核酸分子に関する。Ａｄ５  ｆｉｂｅｒ−Ｌ１のヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、配列中、ノブには下線を付し、Ｌ１ペプチドリガンドをコードする核酸配列は斜字体で示し、Ｌ１をコードするヌクレオチド配列の本ファイバー配列への挿入を容易にするために操作した制限部位を示す付加的配列変化は、小文字で示す：
【０１０９】
【化７】
2007503843.tif 000009
【０１１０】
本発明はまた、図２（配列番号２；Ａｄ５  ｆｉｂｅｒ−Ｌ１６）で述べられている改変Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする、図５（Ａｄ５  ｆｉｂｅｒ−Ｌ１６  ＤＮＡ）で述べられ、配列番号５に記載の、単離又は精製された核酸分子にも関する。Ａｄ５  ｆｉｂｅｒ−Ｌ１６のヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、配列中、ノブには下線を付し、Ｌ１６ペプチドリガンドをコードする核酸配列は斜字体で示し、Ｌ１６をコードするヌクレオチド配列の本ファイバー配列への挿入を容易にするために操作した制限部位を示す付加的配列変化は、小文字で示す：
【０１１１】
【化８】
2007503843.tif 000010
【０１１２】
本発明はさらに、図３（配列番号３；Ａｄ５  ｆｉｂｅｒ−Ｌ３３）で述べられている改変Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする、図６（Ａｄ５  ｆｉｂｅｒ−Ｌ３３  ＤＮＡ）で述べられ、配列番号６に記載の、単離又は精製された核酸分子に関する。Ａｄ５  ｆｉｂｅｒ−Ｌ３３のヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、配列中、ノブには下線を付し、Ｌ３３ペプチドリガンドをコードする核酸配列は斜字体で示し、Ｌ３３をコードするヌクレオチド配列の本ファイバー配列への挿入を容易にするために操作した制限部位を示す付加的配列変化は、小文字で示す：
【０１１３】
【化９】
2007503843.tif 000011
【０１１４】
本発明は、図７に開示されており配列番号７に記載されているような、本発明のＡｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ１タンパク質をコードする、図１０（Ａｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ１  ＤＮＡ）で述べられ、配列番号１０に記載の、単離又は精製された核酸分子に関する。この配列では、野生型Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする核酸配列のヌクレオチド１４６５から１４７６
【０１１５】
【化１０】
2007503843.tif 000012
【０１１６】
が欠失している。このヌクレオチド欠失は、Ａｄ５ファイバータンパク質のＣＡＲへの結合をなくす、本明細書中で述べた、アミノ酸残基ＴＡＹＴ（配列番号４５）の欠失に相当する。さらに、この配列は、ファイバーノブのＨＩループ内のＬ１ペプチドリガンドをコードする核酸配列を含有する。Ａｄ  ５ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ１のヌクレオチド配列は、次のとおりであり、配列中、ノブに下線を付し、欠失部分に隣接するヌクレオチドコドンに二重線を付し、Ｌ１ペプチドリガンドをコードする核酸配列は斜字体で表し、Ｌ１をコードするヌクレオチド配列の野生型ファイバーへの挿入を容易にするために、及び野生型配列を維持するための操作した制限部位を意味する付加的な配列変化は、小文字で表す：
【０１１７】
【化１１】
2007503843.tif 000013
【０１１８】
本発明はまた、図８に開示され配列番号８に記載されているような、本発明のＡｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ１６タンパク質をコードする、図１１（Ａｄ５ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ１６  ＤＮＡ）で述べられ、配列番号１１に記載の、単離又は精製された核酸分子に関する。この配列では、野生型Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする核酸配列のヌクレオチド１４６５から１４７６
【０１１９】
【化１２】
2007503843.tif 000014
【０１２０】
が欠失している。このヌクレオチド欠失は、Ａｄ５ファイバータンパク質のＣＡＲへの結合をなくす、本明細書中で述べた、アミノ酸残基ＴＡＹＴ（配列番号４５）の欠失に相当する。さらに、この配列は、ファイバーノブのＨＩループ内のＬ１６ペプチドリガンドをコードする核酸配列を含有する。Ａｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ１６のヌクレオチド配列は、次のとおりであり、配列中、ノブに下線を付し、欠失部分に隣接するヌクレオチドコドンに二重線を付し、Ｌ１６ペプチドリガンドをコードする核酸配列は斜字体で表し、Ｌ１６をコードするヌクレオチド配列の野生型ファイバーへの挿入を容易にするために、及び野生型配列を維持するための操作した制限部位を意味する付加的な配列変化は、小文字で表す：
【０１２１】
【化１３】
2007503843.tif 000015
【０１２２】
本発明はさらに、図９に開示され配列番号９に記載されているような、本発明のＡｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ３３タンパク質をコードする、図１２（Ａｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ３３  ＤＮＡ）で述べられ、配列番号１２に記載の、単離又は精製された核酸分子に関する。この配列では、野生型Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする核酸配列のヌクレオチド１４６５から１４７６
【０１２３】
【化１４】
2007503843.tif 000016
【０１２４】
が欠失している。このヌクレオチド欠失は、Ａｄ５ファイバータンパク質のＣＡＲへの結合をなくす、本明細書中で述べた、アミノ酸残基ＴＡＹＴ（配列番号４５）の欠失に相当する。さらに、この配列は、ファイバーノブのＨＩループ内のＬ３３ペプチドリガンドをコードする核酸配列を含有する。Ａｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ３３のヌクレオチド配列は、次のとおりであり、配列中、ノブに下線を付し、欠失部分に隣接するアミノ酸に二重線を付し、Ｌ３３ペプチドリガンドをコードする核酸配列は斜字体で表し、Ｌ３３をコードするヌクレオチド配列の野生型ファイバーへの挿入を容易にするために、及び野生型配列を維持するための操作した制限部位を意味する付加的な配列変化は、小文字で表す：
【０１２５】
【化１５】
2007503843.tif 000017
【０１２６】
遺伝暗号の縮重は、２つのアミノ酸を除く全てに対して、複数のコドンが特定のアミノ酸をコードすることである。これにより、合成又は組み換えＤＮＡのヌクレオチド配列が、配列番号４−６のヌクレオチド配列と著しく異なるが、同じ配列番号１−３の改変Ａｄ５ファイバータンパク質をそれぞれコードするという、本発明の特異的な改変Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする合成又は組み換えＤＮＡの構築が可能となる。そのような合成又は組み換えＤＮＡは、本発明の範囲内にあるものである。特定の宿主細胞又は生物においてそのような合成又は組み換えＤＮＡを発現させたい場合、その特定の宿主のコドン利用を反映するように、つまり、その宿主において改変Ａｄ５ファイバータンパク質の発現レベルを高くするように、そのような合成又は組み換えＤＮＡのコドン利用を調整し得る。言い換えると、特定のアミノ酸をコードする様々なコドンにおけるこの冗長性は、本発明の範囲内である。従って、本発明は、同一のタンパク質を発現するＤＮＡ分子が異なり得るというコドン縮重を開示する。
【０１２７】
本発明において使用される場合、「精製された」及び「単離された」は、これらに限定されないがヌクレオチド配列決定、制限酵素消化、部位特異的突然変異及び核酸断片の発現ベクターへのサブクローニング、ならびに、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体生成、アミノ酸配列決定及びペプチド消化を行う機会を得られるような純粋な量においてタンパク質又はタンパク質断片を得ることなど、当業者により操作され得るように、問題となる核酸、タンパク質又はそれらの個別の断片が実質的にそのインビボ環境から離されているという事柄を表すために、交換可能に使用される。従って、本明細書で主張する核酸は、全細胞又は細胞溶解液又は部分的に精製された、又は実質的に精製された形で存在し得る。核酸は、周囲の混入物質から離されている場合、実質的に精製されているとみなす。つまり、細胞から単離された核酸配列は、標準的方法により細胞性成分から精製されている場合、実質的に精製されているとみなし、同時に、化学的に合成された核酸配列は、その化学的前駆体から離されている場合、実質的に精製されているとみなす。
【０１２８】
本発明はさらに、本明細書を通じて開示される実質的に精製された核酸分子を含む組み換えベクターに関する。これらのベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡから構成され得る。大多数のクローニング目的にとって、ＤＮＡベクターが好ましい。一般的なベクターには、プラスミド、改変ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体及び、改変アデノウイルスファイバータンパク質をコードし得るエピソーム性又は統合ＤＮＡ（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ）の他の形が含まれる。特定の遺伝子導入又は他の用途に対する適切なベクターを決定することは、当業者の範囲内である。
【０１２９】
適切なプロモーター及び他の適切な転写制御因子を含有する発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２又はＬＩＴＭＵＳ２８など）へ分子クローニングし、組み換え改変アデノウイルスファイバータンパク質を産生させるために原核又は真核宿主細胞に導入することにより、上述の方法により得られた改変アデノウイルスファイバータンパク質をコードするクローニング核酸を組み換え発現させ得る。発現ベクターは、本明細書中において、適切な宿主におけるクローニングしたＤＮＡの転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列として定義する。そのようなベクターは、細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞などの様々な組み換え宿主細胞においてＤＮＡを発現させるために使用し得る。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自己複製のための複製起点、選択可能なマーカー、限定数の有用な制限酵素部位、大量コピー能力及び活性のあるプロモーターを含有する。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを高頻度でＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるように導くＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるものである。最適なレベルの改変アデノウイルスファイバータンパク質を生じさせるＤＮＡ配列を決定する方法は、本分野において周知である。最適な発現を生じるＤＮＡカセットの決定後、この改変アデノウイルスファイバータンパク質核酸コンストラクトを、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、細菌及び酵母細胞のためのものを含むがこれらに限定されない様々な発現ベクター（組み換えウイルスを含む。）に導入する。
【０１３０】
従って、本発明の別の局面には、本発明の改変アデノウイルスファイバータンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する及び／又は発現するように操作されている宿主細胞が含まれる。組み換えホスト細胞は、原核性又は真核性であり得、Ｅ．コリなどの細菌、酵母などの真菌細胞、ウシ、ブタ、サル及びげっ歯類由来の細胞株を含むがこれらに限定されない哺乳類細胞；及びハエ及びカイコ由来の細胞株を含むがこれらに限定されない昆虫細胞を含むがこれらに限定されない。このような組み換え宿主細胞は、改変アデノウイルスファイバータンパク質を産生させるのに適切な条件下で培養することができる。形質転換、トランスフェクション、原形質融合及びエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない数ある技術のいずれか１つにより宿主細胞に発現ベクターを導入し得る。改変アデノウイルスファイバータンパク質を産生するか否かを調べるために、この発現ベクター含有細胞を個別に解析する。アデノウイルスファイバータンパク質抗体を用いた免疫反応性を含むがこれに限定されないいくつかの方法により、改変アデノウイルスファイバータンパク質発現細胞を同定し得る。
【０１３１】
上述のように、改変アデノウイルスファイバータンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを、組み換え宿主細胞における改変アデノウイルスファイバータンパク質の発現のために使用し得る。従って、本発明の別の局面は、（ａ）改変アデノウイルスファイバータンパク質の核酸を含むベクターを適切な宿主細胞に導入することと；（ｂ）前記改変アデノウイルスファイバータンパク質の発現が可能な条件下でこの宿主細胞を培養することと、を含む、組み換え宿主細胞において改変アデノウイルスファイバータンパク質を発現させるためのプロセスである。
【０１３２】
宿主細胞における改変アデノウイルスファイバータンパク質の発現後に、この改変アデノウイルスファイバータンパク質を回収し得る。いくつかのタンパク質精製方法、すなわち、塩析による分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを様々に組み合わせる、又は個別に使用することによる、細胞溶解液及び抽出液、又は調整済み培地からの精製が利用可能であり、使用に適切である。さらに、アデノウイルスファイバータンパク質に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体で作られたイムノアフィニティーカラムを使用することにより、改変アデノウイルスファイバータンパク質を、他の細胞性タンパク質から分離することができる。
【０１３３】
ある実施形態において、本発明の核酸を、本タンパク質を効率的に発現するように設計した配列を含む発現カセットに組み込み得る。次に、この改変アデノウイルスファイバータンパク質発現カセットをベクターに挿入する。
【０１３４】
本ベクターは、プロモーターと連結された線状ＤＮＡ又はアデノ関連ウイルスもしくは改変ワクシニアウイルスベクターなどの他のベクターも使用し得るが、アデノウイルスベクターであることが好ましい。従って、本発明の別の局面には、野生型ファイバー遺伝子のかわりに本明細書中で述べる改変アデノウイルスファイバータンパク質をコードする核酸分子を含むアデノウイルスベクターが含まれる。これらのアデノウイルスベクターの特徴は、非機能的Ｅ１遺伝子領域を有することであり、アデノウイルスＥ１遺伝子領域を欠失していることが好ましい。さらに、これらのベクターは、場合によっては、非機能的なＥ３領域を有するか、Ｅ３領域を欠失している。このアデノウイルスゲノムは、Ｅ１及びＥ３領域両方を欠失している（ΔＥ１ΔＥ３）ことが好ましい。このアデノウイルスは、２９３細胞もしくはＰＥＲ．Ｃ６（Ｒ）細胞、又は追加的なタンパク質を発現するように一時的又は安定的に形質転換された２９３又はＰＥＲ．Ｃ６（Ｒ）細胞由来の細胞株などの、ウイルスＥ１遺伝子を発現する既知の細胞株で増殖させることができる。例えば、テトラサイクリン制御可能プロモーター系など、遺伝子発現が調節されているコンストラクトを使用する場合、その細胞株は、調節系に関与するコンポーネントを発現し得る。そのような細胞株の一例は、Ｔ−Ｒｅｘ−２９３であり、他のものは本分野で公知である。
【０１３５】
本アデノウイルスベクターの操作を容易にするために、アデノウイルスは、シャトルプラスミドの形態であり得る。本発明はまた、プラスミド部分及び、Ｅ１を欠失し場合によってはＥ３を欠失しているアデノウイルスゲノム（野生型ファイバータンパク質遺伝子を除去。）を含むアデノウイルス部分を含むシャトルプラスミドベクターに関し、これには本明細書中で述べる改変アデノウイルスファイバータンパク質を含む発現カセットが挿入される。好ましい実施形態において、このアデノウイルスベクターを容易に除去できるように、このプラスミドのアデノウイルス部分に隣接する制限部位が存在する。このシャトルプラスミドは、原核細胞又は真核細胞において複製され得る。
【０１３６】
形質転換、トランスフェクション、原形質融合及びエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない、数ある技術のいずれか１つを介して、このアデノウイルスベクターを適切な宿主細胞へ導入する。前記宿主は、本改変アデノウイルスファイバーが標的細胞のＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に特異的なペプチドリガンドを含む、感染性ウイルス粒子を産生するであろう。
【０１３７】
本発明のある実施形態において、本発明の改変アデノウイルスタンパク質を含むアデノウイルスベクターは、パッセンジャー導入遺伝子をさらに含むこととなろう。パッセンジャー導入遺伝子は、あらゆる遺伝子であり得、望ましくは、治療のための遺伝子又はレポーター遺伝子のいずれかである。好ましくは、パッセンジャー導入遺伝子は、ベクターが取り込まれた細胞で発現され得る。例えば、このパッセンジャー導入遺伝子は、レポーター遺伝子又はある様式で細胞において検出され得るタンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。このパッセンジャー導入遺伝子はまた、例えばＲＮＡ又はタンパク質のレベルでその効果を表す治療のための遺伝子など、治療のための遺伝子を含むことができる。例えば、導入された治療のための遺伝子によりコードされるタンパク質は、遺伝性疾患の治療に使用することができる。その治療のための遺伝子にコードされるタンパク質は、結果として細胞を殺滅することによりその治療効果を表し得る。例えば、それ自身におけるその遺伝子の発現により、ジフテリア毒素Ａ遺伝子の発現のように、細胞殺滅を導き得るか、又はその遺伝子の発現により、ある一定の薬物の殺滅効果に対して選択的に感受性のある細胞にならしめる。
【０１３８】
さらに、治療のための遺伝子は、例えば、アンチセンスメッセージ又はリボザイム（スプライシング又は３’プロセシングに影響を与える（例えばポリアデニル化）タンパク質）をコードすることにより、ＲＮＡレベルでその効果を表し得るか、又は、おそらく他の事柄の中で、ｍＲＮＡ蓄積の割合の変化、ｍＲＮＡ輸送の変更及び／又は転写後調節の変更を介して、その細胞内の別の遺伝子の発現レベルに影響を与えることにより作用するタンパク質（つまり、この場合、遺伝子発現は転写開始からプロセシングを受けたタンパク質の産生までの全段階を含むと広くみなされる。）をコードし得る。従って、「治療のための遺伝子」という用語の使用は、より一般的に遺伝子治療を意味し、及び当業者にとって公知である、これら及びあらゆる他の実施形態を包含することを意図する。同様に、本組み換えアデノウイルスは、遺伝子治療又は、インビトロもしくはインビボでのある細胞もしくは組織におけるその遺伝子発現の効果を研究するために使用し得る。
【０１３９】
「遺伝子治療」とは、生物の体内における適切な細胞に外的な核酸を付加することによる、病的状態の治療である。核酸は、その細胞内で機能を保持しているように細胞に付加又は導入されなければならない。大部分の遺伝子治療ストラテジーにとって、新しい核酸は、新しい遺伝子として機能するように、つまり、新しいメッセンジャーＲＮＡをコードし、同様に新しいタンパク質をコードするように設計される。遺伝子治療に有用な核酸には、組み換えウイルスが感染した細胞を同定するために使用されるタンパク質をコードするもの、ウイルスゲノムを含有する細胞を殺滅するように機能するタンパク質をコードするもの又は、体内で病態生理的状態を治療するために働く治療用タンパク質をコードするものが含まれる。
【０１４０】
本発明の別の局面は、組み換えファージのファージディスプレイライブラリーであるが、このライブラリーにおいて、各組み換えファージは、その外面に、アデノウイルスファイバータンパク質の改変ノブドメインに融合したファージ外殻タンパク質を含む融合タンパク質を表示する。Ａｄ５ファイバーノブドメインを含むがそれに限定されない、この改変ファイバーノブは、残基位置１、２及び１３がＸａａ残基であり、好ましくは、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり；残基位置３及び１２がシステイン（Ｃｙｓ）残基であり；残基位置４から１１がＸａａ残基であり、好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）又はバリン（Ｖａｌ）であり；残基位置１４がＸａａ残基であり、好ましくはプロリン（Ｐｒｏ）である、１４残基位置のコアアミノ酸配列を含有するペプチドリガンドを含有する。この改変ファイバーノブ部分は、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含有する。このコアアミノ酸配列では、位置３及び位置１２の固定されたＣｙｓ残基以外の前記配列内のいずれかの残基位置で１つ又は複数の残基が欠失され得る。前記固定Ｃｙｓ残基の間に位置するコアアミノ酸配列の領域は、少なくとも２個のアミノ酸残基を含有することが好ましい。空のアミノ酸残基位置の数は、オリゴヌクレオチド合成中に各位置においてコドンの欠失が導入される頻度に従い変化する。さらに、最高で１０個までのアミノ酸残基が残基位置３と残基位置１２との間に付加され得る。このペプチドリガンドのアミノ酸配列は、残基位置３と１２との間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含有せず、該ペプチドリガンドは、配列番号４６で述べられるようなアミノ酸配列からなるものではない。
【０１４１】
本発明の別の実施形態は、各組み換えファージがその外面に、図１３に図示した様々なペプチドリガンドのうち少なくとも１つを含有するアデノウイルスファイバーノブに融合させられたファージ外殻タンパク質を含む融合タンパク質を表示する、組み換えファージのファージディスプレイライブラリーである。組み換えファージの部分は、Ａｄ５ファイバーノブドメインを含むがこれに限定されない、１４残基位置のコアアミノ酸配列を含有する、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に対するペプチドリガンドを含有する改変ファイバーノブを表示するが、そのコアアミノ酸配列において、残基位置１、２及び１３はＸａａ残基であり、好ましくは、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり；残基位置３及び１２はシステイン（Ｃｙｓ）残基であり；残基位置４から１１はＸａａ残基であり、好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）又はバリン（Ｖａｌ）であり；残基位置１４はＸａａ残基であり、好ましくはプロリン（Ｐｒｏ）である。このコアアミノ酸配列では、位置３及び位置１２のＣｙｓ残基以外の前記配列内のいずれかの残基位置で１つ又は複数の残基が欠失され得る。前記固定Ｃｙｓ残基の間に位置するコアアミノ酸配列の領域は、少なくとも２個のアミノ酸残基を含有することが好ましい。この実施形態において、このペプチドリガンドのアミノ酸配列は、残基位置３と１２との間に連続したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含有せず、該ペプチドリガンドは、配列番号４６で述べられるアミノ酸配列からなるものではない。
【０１４２】
本発明のファージディスプレイライブラリー内に含有される、Ａｄ５ファイバーノブを含むがそれに限定されない、改変ファイバーノブは、上述のような様々なペプチドリガンドのうち少なくとも１つを含有する。これらのペプチドリガンドは、ノブコンテクストに表示される場合、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位への結合の可能性がある候補ペプチドのプールを与える。本明細書中で述べるファージディスプレイライブラリー内に含まれる候補ペプチドリガンドを生成するために使用する方法は、本明細書の実施例３において述べる。本明細書中で述べるファージディスプレイライブラリーにおいて発現されるべき候補ペプチドリガンドは、発現されたペプチドリガンドが可能性のある細胞表面結合部位に接近可能であるように、ファイバーノブ内に挿入される。本改変ファイバーノブの三量体構成は保持されなければならないため、この候補ペプチドリガンドを挿入する好ましい位置は、このノブの露出されたループドメイン内である。従って、ある実施形態において、本発明のファージライブラリーで表示される改変ファイバーノブは、ＨＩループドメインを含むがこれに限定されない、本ノブの露出されたループドメイン内に挿入される、本明細書中で述べるような候補ペプチドリガンドを含む。このファイバーノブがＡｄ５由来である場合、この候補ペプチドリガンドは、Ａｄ５ファイバータンパク質のファイバーノブ内に位置するアミノ酸残基５４６とアミノ酸残基５４７との間に挿入することができる。本発明のさらなる実施形態において、本発明のファージライブラリー内に表示されるファイバーノブはさらに、そのノブドメインの野生型表面結合がなくなるように改変される。アデノウイルスファイバーノブの野生型ＣＡＲ結合をなくすある方法は、例えば、残基４８９から４９２に位置するＡｄ５ファイバーノブ内の４個のアミノ酸配列ＴＡＹＴ（配列番号４５）を欠失させることなど、そのファイバーノブ配列を変更することである。
【０１４３】
本発明のさらなる実施形態において、本明細書で述べるファージディスプレイライブラリーは、バクテリオファージλ上に表示され、本改変ファイバーノブは、λファージの主要な頭部Ｄタンパク質に融合させられている。本発明のファージディスプレイライブラリーは、アデノウイルスファイバーに組み込まれた際に、結合特性の変化を保持するペプチドリガンドを同定するために使用される既存のファージディスプレイペプチドライブラリーの限界を乗り越えるが、これは候補ペプチドリガンドが、本ファージディスプレイ系の機能的なファイバーノブ内で発現されるからである。本発明のファージディスプレイ系を用いることにより、そのファイバーノブコンテクストにおいて可能性のあるペプチドリガンドを調べる。線状ファージディスプレイ系において、融合タンパク質は、細胞膜周辺腔の酸化環境に輸送され、その中で折り畳まれる。ファージ粒子は、細胞から分泌される前にここでアセンブリーする。逆に、バクテリオファージλ系では、融合タンパク質の折り畳み及びファージ粒子のアセンブリーは、細菌宿主の溶解前に、細胞質の還元性環境で起こる。これらの後者の状態は、細胞溶解前に哺乳類細胞核の還元性環境においてアセンブルするという、アデノウイルスファイバーが置かれる状態により近い。すなわち、酸化還元状態の変化は、改変ノブの折り畳み及び結合特性に影響を与え得る。従って、本発明のさらなる実施形態において、本明細書中で述べるライブラリーは、バクテリオファージλ上に表示され、本改変アデノウイルスファイバーノブが融合しているファージ外殻タンパク質には、λファージの主要頭部Ｄタンパク質が含まれるがこれに限定されない。アデノウイルスファイバードメイン内に位置する複雑性の高いペプチドリガンドを発現するファージディスプレイライブラリーの作製により、ファージライブラリーのハイスループットのスクリーニング能と本ファイバーノブコンテクストのペプチドリガンド発現とが組み合わされる。これによりまた、実行可能なファイバータンパク質三量体を妨害するペプチドリガンド配列が削除される。
【０１４４】
従って、本発明の別の局面は、（ａ）上述のファージディスプレイライブラリーを提供することと、（ｂ）ＣＡＲ陰性又はＣＡＲ陽性細胞に対する前記ライブラリーをスクリーニングすることとを含む、ＣＡＲ以外の細胞特異的結合部位に対するペプチドリガンドを同定するためのプロセスである。基本的に、本ライブラリーは、あらゆる細胞型においてスクリーニングすることができる。しかし、ＣＡＲ−陽性細胞を対象とする場合、ＣＡＲへの結合は、代替的な受容体に対するリガンドを同定する可能性を低下させる傾向がある。この問題は、２つの方法により解決できる。第一に、ＣＡＲへの結合をなくす突然変異を有するファイバーノブにおいて本ライブラリーを構築することができる。この方法を使用して、本明細書中において例示する本ライブラリーをスクリーニングし（実施例４参照）、ＣＡＲ以外の細胞表面結合部位に結合する３種類の新規ペプチドリガンド（配列番号１３、１４及び１５；ペプチドリガンドＬ１、Ｌ１６及びＬ３３にそれぞれ対応）を同定した。これらのペプチドリガンドは、Ａｄ５ゲノムに組み込まれた際に、正確にそれらの特異性を保持する。本新規ペプチドリガンドを含む組み換えアデノウイルスのＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する感染能力は、親ベクターと比較して向上している。この非ネイティブ親和性は、ウイルスノブと標的細胞上の未知の受容体との相互作用が介在するものである。このＣＡＲ−非依存性親和性は、ＣＡＲ発現とは関係なく、様々な種由来の様々な細胞型において活性化され得る。これらの結果は、アデノウイルス親和性を変化させ、様々な遺伝子導入適用に対するその治療域を広げる一般的な方法論として、このストラテジーを支持するものである。新規ペプチドリガンドのスクリーニングの代替的な方法は、操作していないＣＡＲ結合を有するライブラリーを作製することであるが、拮抗する過剰な野生型ノブタンパク質の存在下で前記ライブラリーをスクリーニングするものである。
【０１４５】
このために、本発明はまた、アデノウイルスの特異的細胞型又は組織に対する形質導入能を向上させる方法にも関する。本発明の組み換えアデノウイルスは、滑膜細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、癌細胞、原発腫瘍、樹状細胞、骨格筋、メラノサイト及びマウスメラノーマ細胞を含むがこれらに限定されない、野生型アデノウイルスファイバータンパク質表面受容体を発現しないか、又は前記表面受容体の発現量がわずかしかない細胞型又は組織に対して形質導入するために使用することができる。本発明の組み換えアデノウイルスの野生型親和性が失われない限り、本明細書で述べるように、本発明の組み換えアデノウイルスを、野生型アデノウイルスファイバータンパク質表面受容体を単独で、又は本改変ファイバータンパク質内に位置するペプチドリガンドの細胞特異的表面受容体とともに発現する細胞型又は組織に形質導入を行うために使用することもできる。本明細書中で述べるペプチドリガンドに対する細胞特異的表面受容体と組み合わせて野生型アデノウイルスファイバータンパク質表面受容体を発現する細胞に形質導入を行うために本発明の組み換えアデノウイルスを使用することにより、より効率のよいアデノウイルス感染を達成することが容易になり得る。
【０１４６】
本発明のある実施形態には、ＣＡＲ発現レベルが低い、マウス又はヒト由来の未成熟樹状細胞を含むがこれに限定されない、未成熟の樹状細胞（ＤＣ）に形質導入する方法が含まれる。樹状細胞は、抗原特異的免疫反応の制御において中枢となる役割を果たす重要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である（Ｊｏｎｕｌｅｉｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３９４−４００（２００１）；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５２（１９９８））。ＤＣの遺伝子改変は、ＤＣ機能を調整する経路として、ならびに、癌及び持続性のウイルス感染を含む広い範囲の疾患の治療のために、治療上非常に高い可能性を有する（Ｎａｉｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：１４４５−１４４６（１９９８））。別の実施形態において、本発明の組み換えアデノウイルスを、マウス骨格筋及びを含むがこれに限定されない骨格筋及び、ヒト起源の初代メラノサイトを含むがこれに限定されない初代メラノサイト（両者ともＣＡＲの発現量が低い。）に形質導入するために使用する。
【０１４７】
本明細書中で言及する全ての公表物は、本発明に関連して使用され得る方法論及び材料を説明し開示する目的で、参照により組み込まれる。本明細書中のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【０１４８】
付随する図面を参考として、本発明の好ましい実施形態を説明するが、本発明がそれらの明確な実施形態に限定されないこと、及び、添付の請求項に定義するように本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者によりそれらにおける様々な変更及び修正が行われ得ることを理解されたい。
【０１４９】
次の実施例は、本発明を限定することなく、本発明を説明するために提供する。
【実施例１】
【０１５０】
ファージλ細胞のキャプシドにおけるＡｄ５三量体ノブドメインの表示
細胞−ファージのプレーティング及び増幅のために、Ｅ．コリ株ＢＢ４及びＹ１０９０を使用した。
【０１５１】
プラスミドｐＤｋｎｏｂの構築−図１４で示すように、λＤ遺伝子の３’−末端を改変することにより、プラスミドｐＮＳ３７８５（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ及びＨｏｅｓｓ，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１６０９−１６１３）を、ｐＤｋｎｏｂに形質転換した。
【０１５２】
λＤａｍ１５ｉｍｍ２１ｎｉｎ５のユニークなＸｂａＩ部位にプラスミド全体をクローニングできるように、プラスミドｐＮＳ３７８５にＸｂａＩ制限部位を導入した。逆ＰＣＲにより、プライマーＸｂａＩ−ＮＳ．ｆｏｒ：
【０１５３】
【化１６】
2007503843.tif 000018
及び、ＸｂａＩ−ＮＳ．ｒｅｖ：
【０１５４】
【化１７】
2007503843.tif 000019
（ＸｂａＩ部位に下線を付す。）を用いて、プラスミドｐＮＳ３７８５を増幅した。ＤＮＡ合成の信頼度を上げるために、Ｔａｑ及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの混合物を用いて反応を行った（９５℃−３０秒、５５℃−３０秒、７２℃−２０分、２５増幅サイクル）。このように、生成されたＰＣＲ増幅産物をＸｂａＩエンドヌクレアーゼで消化し、プラスミドｐＤ−ＸｂａＩを作製するためにライゲーションを行った。
【０１５５】
オリゴヌクレオチド、ｌｉｎｋ−ＳＤ．ｓ：
【０１５６】
【化１８】
2007503843.tif 000020
と、ｌｉｎｋ−ＳＤ．ａｓ：
【０１５７】
【化１９】
2007503843.tif 000021
とをアニーリングさせることにより、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）及びＫｐｎＩ部位（下線）を含有する６５ｂｐのｄｓＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、プラスミド、ｐＫＭ３に、λＤ遺伝子の３’末端で、ＲｓｒＩＩとＥｃｏＲＩ制限部位との間にクローニングし、プラスミドｐＤ−ｌｉｎｋｅｒを作製した。
【０１５８】
Ｄ−ｆｂｒ．ｆｏｒ
【０１５９】
【化２０】
2007503843.tif 000022
及びＤ−ｆｂｒ．ｒｅｖ：
【０１６０】
【化２１】
2007503843.tif 000023
プライマーを用いてプラスミドｐＡＢ２６（Ｂｅｔｔら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１）からＡｄ５ファイバーノブドメインをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅した。得られた６００ｂｐの断片をＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、対応する部位の間で、λＤ遺伝子の３’末端において、プラスミドｐＤ−ｌｉｎｋｅｒに挿入し、プラスミドｐＤｋｎｏｂ＿ｌｉｎｋｅｒ０を作製した。複数のＧｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＳ）リピートを含有するリンカー配列を、プラスミド、ｐＤｋｎｏｂ＿ｌｉｎｋｅｒ０のＤとノブ遺伝子との間に挿入した。オリゴヌクレオチド、ＢａｍＨＩ−ｌｉｎｋ．ｓ：
【０１６１】
【化２２】
2007503843.tif 000024
と、ＢａｍＨＩ−ｌｉｎｋ．ａｓ：
【０１６２】
【化２３】
2007503843.tif 000025
とをアニーリングさせることにより、２．５ＧＳリピートをコードし、ＢａｍＨＩ部位を含有するｄｓＤＮＡ断片を得た。この５９ｂｐＤＮＡ断片を、プラスミドｐＤｋｎｏｂ＿ｌｉｎｋｅｒ０のＲｓｒＩＩとＫｐｎＩ部位との間に挿入し、プラスミドｐＤｋｎｏｂ＿Ｂｌｉｎｋｅｒを作製した。
【０１６３】
オリゴヌクレオチド、ＧＳ−ｌｉｎｋ．ｓ：
【０１６４】
【化２４】
2007503843.tif 000026
と、ＧＳ−ｌｉｎｋ．ａｓ：
【０１６５】
【化２５】
2007503843.tif 000027
とをアニーリングさせることにより、様々な長さのｄｓＤＮＡを調製し、重合体産物の形成を促進した。プラスミドｐＤｋｎｏｂ＿ＢｌｉｎｋｅｒのＢａｍＨＩ部位にこの混合物をクローニングすることにより、１つ（ｐＤｋｎｏｂ＿ｌｉｎｋｅｒ１）又は２つ（ｐＤｋｎｏｂ＿ｌｉｎｋｅｒ２）のインサートを含有した３種類のプラスミドが同定された。説明した実験において後者を使用し、ｐＤｋｎｏｂと名付けた。
【０１６６】
プラスミドｐＤｋｎｏｂ．Δの構築−Ｎｈｅ−ｆｂｒ．ｆｏｒ：
【０１６７】
【化２６】
2007503843.tif 000028
及びＤ−ｆｂｒ．ｒｅｖ：
【０１６８】
【化２７】
2007503843.tif 000029
プライマーを用いて、プラスミドｐＡＢ２６（Ｂｅｔｔら、１９９３、前出）からＡｄ５ファイバーノブのＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅した。この６００ｂｐの断片をＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ｐＴＲＣＨｉｓＢベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＨｉｓ．ｋｎｏｂを作製した。
【０１６９】
プライマーｋｎｏｂΔ：
【０１７０】
【化２８】
2007503843.tif 000030
及びｐＤ．ｒｅｖ
【０１７１】
【化２９】
2007503843.tif 000031
を用いて、プラスミドｐＤｋｎｏｂΔ．ＳＮ−Ｃｔｅｒｍから増幅し、ＢｇｌＩＩ及びＭｓｃＩ制限酵素で消化したＰＣＲ産物を、ＭｓｃＩ／ＢｇｌＩＩで消化したベクターｐＨｉｓ．ｋｎｏｂにクローニングすることにより、アミノ酸ＴＡＹＴ（配列番号４５）が欠失しているファイバーノブのコード配列を含有するコンストラクト、ｐＨｉｓ．ｋｎｏｂΔを得た。プライマーｋｎｏｂ−ｆｏｒ３：
【０１７２】
【化３０】
2007503843.tif 000032
及びｋｎｏｂＣ−Ｓｐｅ／Ｎｏｔ．ｒｅｖ
【０１７３】
【化３１】
2007503843.tif 000033
を用いてｐＤｋｎｏｂから得て、ＭｓｃＩ／ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化したＰＣＲ断片を、ＭｓｃＩ／ＢｇｌＩＩで消化したベクター、ｐＤｋｎｏｂにクローニングすることにより、プラスミド、ｐＤｋｎｏｂΔ．ＳＮ−Ｃｔｅｒｍを得た。
【０１７４】
プライマーｋｎｏｂΔ：
【０１７５】
【化３２】
2007503843.tif 000034
／Ｄ−ｆｂｒ．ｒｅｖ：
【０１７６】
【化３３】
2007503843.tif 000035
を用いて、プラスミド、ｐＨｉｓ−ｋｎｏｂΔからＰＣＲ断片を得た。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢＧｌＩＩ制限酵素で消化し、ベクターｐＤｋｎｏｂの対応する部位に挿入して、ｗｔ配列を置換した。得られたプラスミドｐＤｋｎｏｂΔでは、ＣＡＲ結合をなくす、ファイバーノブ遺伝子におけるＴＡＹＴ（配列番号４５）欠失が起こっている。
【０１７７】
ファージλ−ｋｎｏｂ及びλ−ｋｎｏｂΔの生成−ＸｂａＩ制限酵素で消化してプラスミドｐＤｋｎｏｂ及びｐＤｋｎｏｂ．Δを線状にし、プラスミド全体をλファージＤａｍ１５ｉｍｍ２１ｎｉｎ５のユニークなＸｂａＩ部位にクローニングし、ファージλｋｎｏｂ−ｗｔ及びλｋｎｏｂΔ−ｗｔをそれぞれ生成させた。４℃にて一晩インキュベーションした後、λパッケージングキット（ＡＰＢ，Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてライゲーション混合液をインビトロでパッケージングし、ＮＺＹ寒天プレートにトップアガーを用いてプレーティングした。ＰＣＲにより陽性クローンを同定し、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）で述べられているようにして増幅して精製した。ｐＤ派生物は全て、対応するλファージを生成した。
【０１７８】
抗体−標準的プロトコールに従い、細菌で発現させた組み換えＡｄ５ノブタンパク質及びλファージ粒子をそれぞれＮｅｗ  Ｚｅｅｌａｎｄラビットに免疫することにより、ウサギ抗ノブＲ３３０及び抗λ血清を得た。ヒト血清のパネルをスクリーニングすることにより、細菌で発現させた組み換えＡｄ５ファイバーノブの単量体及び三量体の両者と反応した試料（血清Ｎ９２）、又は三量体と特異的に反応した試料（血清Ｎ９３）を同定した。血清Ｒ３３０由来の抗体、抗−λ（Ａｂ抗−λ）及びＮ９２（ＡｂＮ９２）を、製造者の使用説明書に従い、プロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）で精製した。組み換えノブタンパク質で、血清Ｎ９３由来の抗体（ＡｂＮ９３）から抗体をアフィニティー精製した。マウスｍＡｂ１２Ｄ６（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣａｎａｄａのＦｒａｎｋ  Ｇｒａｈａｍより提供。）は、Ａｄ５ノブ三量体を選択的に認識する。
【０１７９】
ウイルス−Ｐｅｒ．Ｃ６細胞において組み換えアデノウイルスを増殖させ、標準的プロトコールに従いＣｓＣｌ勾配の遠心により精製した（Ｆａｌｌａｕｘら、１９９８、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．９：１０９０−１９１７）。
【０１８０】
ファージ−ＥＬＩＳＡ−マルチウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）中にそれぞれ２．２μｇ／ｍｌ又は５μｇ／ｍｌの濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）又は抗マウスＩｇＧ特異的（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で一晩４℃にて被覆した。その被覆溶液を除去した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳＴ）中５％脱脂粉乳から構成されている洗浄バッファーとともにプレートを３７℃にて６０分間インキュベーションした。ブロッキング溶液を捨て、ブロッキングバッファー中のＡｂＮ９３、ＡｂＮ９２又はｍＡｂ１２Ｄ６を添加し、室温（ＲＴ）にて２時間結合させた。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、結合バッファー（ＰＢＳ中５％脱脂粉乳）中のファージ溶解物  約１ｘ１０９ｐｆｕをＲＴにて４時間インキュベーションした。次に、プレートをＰＢＳで洗浄し、結合バッファー中の抗λポリクローナル抗体によりＲＴにて２時間、捕捉したファージ粒子を検出した。ＰＢＳで洗浄した後、結合バッファー中の抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結合抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で、室温にて２時間、プレートをインキュベーションした。次にプレートを洗浄し、ジエタノールアミン中でＳｉｇｍａ１０４ホスファターゼ基質（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともにインキュベーションしてアルカリホスファターゼ活性を検出した。自動ＥＬＩＳＡリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｂｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）でプレートを読み取った。
【０１８１】
結果−Ａｄ５ファイバーノブドメインをコードする遺伝子の、バクテリオファージλ上流の主要頭部Ｄタンパク質をコードする遺伝子で構成されるバイシストロニック系の合成を行うように、細菌性発現プラスミドを操作した。このＤタンパク質のＣ−末端に（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）１６ペプチドリンカー、続いて、リボソーム結合部位、Ｄ遺伝子アンバー翻訳コドンＴＡＧ及びＡｄ５ノブ遺伝子メチオニン開始コドンを付加するように、ベクターを設計した（図１４）。様々な長さの重合体を試験することによって、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）１６ペプチドリンカー配列により、λキャプシドにおけるノブ三量体発現が最も効率よく行われることが確実になることが明らかとなり、以後の実験で使用した。
【０１８２】
アンバー突然変異とともにＤ遺伝子のゲノムコピーを含有する、λＤａｍ１５ｉｍｍ２１ｎｉｎ５ゲノムのＸｂａＩ部位にプラスミドｐＤｋｎｏｂを挿入した。サプレッサー細菌宿主での形質転換後、得られたファージ、λｋｎｏｂ−ｗｔは、（ｉ）λゲノムＤ遺伝子にコードされるｗｔＤタンパク質（Ｄ）；（ｉｉ）プラスミドＤ遺伝子によりコードされる組み換えｗｔＤタンパク質（ｒｅＤ）；（ｉｉｉ）ｒｅＤ−ノブ融合（細菌サプレッションの結果）及び（ｉｖ）ノブタンパク質（翻訳再開による。）を発現すると予想される。ファージ粒子は、そのキャプシドにおいてＤ、ｒｅＤ及び融合ｒｅＤ−ノブタンパク質のキメラのアレイを表示するはずである。さらに、Ｄ及びノブタンパク質の両方がホモ三量体複合体を形成するので、ｒｅＤとノブとの間の条件付融合により、ノブ三量体をＸキャプシドにおいてアセンブルさせることができるようになるはずである。Ａｄ５ホモ三量体ノブ構造を選択的に認識するモノクローナル（ｍＡｂ１２Ｄ６）又はポリクローナル（ＡｂＮ９３）抗体は、ファージ酵素免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）においてλｋｎｏｂ−ｗｔ溶解物と特異的に反応し、ノブ三量体がそのファージ粒子のキャプシドで効率よく表示されることが示される（図１５）。
【０１８３】
Ａｄ５ファイバーＴＡＹＴ（配列番号４５）残基（ノブＤＧループの残基位置４８９から４９２）の欠失により、ＣＡＲに対するＡｄ５ファイバーの高親和性結合が完全になくなる（Ｒｏｅｌｖｉｎｋら、１９９９前出）。対応するλｋｎｏｂΔ−ｗｔ派生物は、抗ホモ三量体ノブ抗体と特異的に反応するが、これにより、この改変ノブも又はジキャプシドにおいてホモ三量体として表示されることが示される（図１５）。
【０１８４】
最後に、λｗｔ及びλＮＳ３（その表面においてＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質由来の８０アミノ酸を発現するネガティブ対照クローン）は、バックグラウンドレベルの結合しか示さなかった。
【実施例２】
【０１８５】
λ−介在Ａｄ５ノブは、９１１細胞上のヒトＣＡＲに特異的に結合する。
【０１８６】
細胞−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）からヒト胎児網膜芽９１１細胞を得た。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で９１１細胞を培養した。
【０１８７】
ウイルス−Ｐｅｒ．Ｃ６細胞で組み換えアデノウイルスを増殖させ、標準的プロトコールに従いＣｓＣｌ勾配の遠心により精製した（Ｆａｌｌａｕｘら、１９９８、前出）。
【０１８８】
ＦＡＣＳ解析−９１１細胞上に表示されているヒトＣＡＲへのファージλｋｎｏｂ−ｗｔの結合を次のように観察した。室温（ＲＴ）にて１時間、ＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２から構成される結合バッファー中で、２ｘ１０６細胞／ｍｌの懸濁液とともに、ファージ粒子（０．４ｘ１０１０から６ｘ１０１０ｐｆｕの範囲）をインキュベーションした。結合バッファーで細胞を洗浄し、４℃にて４５分間、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ）中のウサギ抗λ精製Ｉｇとともにインキュベーションした。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、４℃にて４５分間、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＰＥ結合抗体（Ｄｉａｍｅｄｉｘ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，ＵＳＡ）を含有するＦＡＣＳバッファー中でインキュベーションした。ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、ＦＡＣＳバッファー中で約６ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｒｅ  フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）で解析した。ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ  ソフトウェアにより蛍光強度を解析した。
【０１８９】
競合実験において、組み換えＨｉｓタグ付加ノブタンパク質ファイバー（又はＨｉｓタグ付加の無関係のタンパク質）１０μｇ／ｍｌを含有する結合バッファー２００μｌとともに、ＲＴにて３０分間、細胞を再びインキュベーションした。この混合液に対して、非結合タンパク質を除去せずに、ファージ（６ｘ１０１０ｐｆｕ）を添加し、さらに６０分間インキュベーションした。二次抗体としてヤギ抗ウサギＩｇＧＦＩＴＣ結合抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用した。
【０１９０】
結果−ファージ表示ノブの機能性を評価するために、その表面上にＣＡＲを高レベルで発現するヒト胎児網膜芽９１１細胞とともにλｋｎｏｂ−ｗｔビリオンをインキュベーションした。蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）解析によりＣＡＲ特異的結合をアッセイした。蛍光標識細胞の分布のばらつきにより示されるように、λｋｎｏｂ−ｗｔファージ粒子は９１１細胞に結合した（図１６Ａ）。細胞の中央値蛍光を測定したところ、ファージタイターの上昇により、直線的に結合ファージ量が上昇していた。一方、λｗｔ及びλＮＳ３の両者とも、結合は検出可能なレベルではなかった。同様に、９１１細胞をλｋｎｏｂΔ−ｗｔファージとともにインキュベーションしたところ、細胞結合は全く示されなかった。９１１細胞に対するλｋｎｏｂ−ｗｔの結合は、過剰量の組み換えノブとのインキュベーションにより阻害されたが、一方、非関連タンパク質  ＮＳ３とのインキュベーションでは何ら影響は見られなかった（図１６Ｂ）。同じ試薬で、λｗｔファージの結合活性は変化しなかった。
【実施例３】
【０１９１】
λにおいて表示される改変Ａｄ５ファイバーノブのライブラリーの作製。
【０１９２】
ウイルス−Ｐｅｒ．Ｃ６細胞で組み換えアデノウイルスを増殖させ、標準的プロトコールに従いＣｓＣｌ勾配の遠心により精製した（Ｆａｌｌａｕｘら、１９９８、前出）。
【０１９３】
λｋｎｏｂΔ−１４ａａ．ｃｙｓライブラリーの構築−ＨＩループにおいてユニークなＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ部位を導入するＰＣＲ増幅産物で、ｐＤ−ｋｎｏｂΔにおいてＢｇｌＩＩ／ＭｓｃＩ断片を置換することにより、プラスミドｐＤｋｎｏｂΔ−Ｌ０を作製した。プライマーｋｎｏｂ．ｆｏｒ２：
【０１９４】
【化３４】
2007503843.tif 000036
及びｋｎｏｂＨＩ−Ｓｐｅ／Ｎｏｔ．ｒｅｖ
【０１９５】
【化３５】
2007503843.tif 000037
又はｋｎｏｂＨＩ−Ｓｐｅ／Ｎｏｔ．ｆｏｒ
【０１９６】
【化３６】
2007503843.tif 000038
及びｋｎｏｂ．ｒｅｖ３：
【０１９７】
【化３７】
2007503843.tif 000039
を用いてプラスミドｐＤｋｎｏｂをＰＣＲ増幅することにより、２つの３２６ｂｐ及び９３ｂｐ  ＤＮＡ断片を得た。これらのＤＮＡ断片をＰＣＲライゲーションした。得られたプラスミドｐＤｋｎｏｂΔ−Ｌ０をＸｂａＩ消化により直線状にし、プラスミド全体をλＤａｍ１５ｉｍｍ２１ｎｉｎ５のユニークなＸｂａＩ部位にクローニングした。生成させたファージλｋｎｏｂΔ−Ｌ０を増幅してＣｓＣｌ精製した。λ粒子からＤＮＡを抽出し、ライブラリー構築に使用した。
【０１９８】
スプリット合成プロトコールに従い、ライブラリーオリゴヌクレオチドを合成し（Ｇｌａｓｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３９０３−３９１３）、プライマー伸長によりｄｓＤＮＡに変換し、ＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ消化し、λｋｎｏｂΔ−Ｌ０の対応するＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ部位にライゲーションした。このライゲーション混合物をインビトロでパッケージング（ＡＰＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）し、ＮＺＹ寒天プレートにプレーティングした。一晩インキュベーションした後、ＳＭバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．０１％ゼラチン、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）でプレートから溶出し、精製し、濃縮して、ＳＭバッファー、７％ＤＭＳＯ中で−８０℃にて保存した。λｋｎｏｂ−１４ａａ．ｃｙｓライブラリーの複雑性は、パッケージング混合物のプレーティングにより得られた個々のプラークの数から評価したところ、１．６ｘ１０５であった。無作為に選択した２０個のクローンの配列解析により、そのクローン全てにおいて、予想されたヌクレオチドが確認された。
【０１９９】
結果−ノブドメインのフレームワーク内の候補ペプチドリガンド配列の大規模コレクションを作製しスクリーニングするために、λｋｎｏｂディスプレイ系を用いた。ネイティブではない親和性に対するスクリーニングにおけるＣＡＲ結合の干渉を除くために、λｋｎｏｂΔ−ｗｔベクターにおいてこのライブラリーを構築した。外来ペプチドリガンド配列を挿入するための部位としてノブドメインのＨＩループを選択し、ペプチドリガンド挿入を容易にするために、ユニークなＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ制限配列を導入した。これらの操作の結果、派生物λｋｎｏｂΔ−Ｌ０は、野生型Ａｄ５タンパク質配列のＴ５４６とＰ５４７との間にさらなるペプチド性配列ＳＧＡＡＡ（配列番号３９）を組み込んだ（図１３の上パネル）。
【０２００】
レジンスプリット法により、ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ制限部位に隣接して１４個のアミノ酸残基をコードするようにオリゴヌクレオチドを合成した（図１３）。位置３及び１２に２個の不変のＣｙｓ残基を組み込むことにより、このペプチドリガンド配列に制約を加えた。位置１、２及び３は、疎水性の受容体構造との相互作用に好都合である芳香族アミノ酸が存在するようにした。拡張構造を導入する傾向があるプロリンは、挿入したペプチドリガンドの接近性を向上させるために位置１４に好都合であった。残りの４から１１の位置は、ループのフレキシビリティーを向上させるために、優先的に、小さな側鎖を有するアミノ酸（グリシン、セリン又はバリン）を受け入れるように設計した。最後に、固定されたシステインをコードする位置を除き、各位置においてコドンの５％を欠失させることにより、さらなる変更を導入した。適切なプライマーを用いたこれらのオリゴヌクレオチドの伸長によりｄｓＤＮＡ断片を生成させ、それをＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素消化し、ベクターλｋｎｏｂΔ−Ｌ０の対応する部位にクローニングした。そのライゲーション混合液のインビトロパッケージング及びプレーティングにより、２ｘ１０５の個々のクローンから構成される、λｋｎｏｂΔ−１４ａａ．ｃｙｓライブラリーが得られた。
【実施例４】
【０２０１】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するペプチドリガンド結合のための、ライブラリー、λｋｎｏｂΔ−１４ａａ．ｃｙｓライブラリーのスクリーニング
細菌−ファージのプレーティング及び増幅のために、Ｅ．コリ株ＢＢ４及びＹ１０９０を使用した。
【０２０２】
細胞−Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．Ｕ．Ｓ．Ａ）よりマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞を入手した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）でこの細胞を培養した。培地には全て、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した。
【０２０３】
細胞におけるライブラリーの抽出−２ｘ１０６細胞のＮＩＨ３Ｔ３細胞を６０ｍｍ直径のペトリ皿に播種し、５％ＣＯ２とともに、３７℃にて培養液中で４８時間インキュベーションした。次に、コンフルエントになった細胞を、５ｍｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ中、３％ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）とともに３７℃にて１時間インキュベーションして飢餓状態にした。次に、その溶液を捨て、ブロッキングバッファー１ｍｌ中のファージライブラリー  ５ｘ１０９ｐｆｕを添加し、３７℃にて３時間インキュベーションした。非結合ファージを除去し、細胞をブロッキングバッファーでよく洗浄した。次に、細菌に感染させて、結合したファージを増殖させた。この初回の選択から得られたファージのプールを記載（Ｂｅｇｈｅｔｔｏら、２００１、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３１：１６５９−１６６８）のように精製した。
【０２０４】
ＦＡＣＳ解析−ＦＡＣＳを利用したアッセイを用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するλファージの結合を解析した。２ｘ１０９ｐｆｕファージを含有する、ＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２から構成される結合バッファー中で、３７℃にて６０分間、２ｘ１０６細胞／ｍｌの懸濁液をインキュベーションした。結合バッファーで細胞を洗浄し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ）中のウサギ抗λ精製Ｉｇとともに４℃にて４５分間インキュベーションした。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、４℃にて４５分間、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＰＥ結合抗体（Ｄｉａｍｅｄｉｘ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，ＵＳＡ）を含有するＦＡＣＳバッファー中でインキュベーションした。ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、ＦＡＣＳバッファー中で約６ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｒｅフローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）で解析した。ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェアにより蛍光強度を解析した。
【０２０５】
組み換えλクローンの免疫学的スクリーニング−記載のようにファージプラークを調製し、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ  ＧｍｂＨ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に転写した（Ｂｅｇｈｅｔｔｏ，Ｅら、２００１、前出）。最初に、ＲＴにて１時間、フィルターをブロッキングバッファー（ＰＢＳ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ中５％脱脂粉乳）で飽和させた。次に、そのフィルターを、ブロッキングバッファーで希釈したヒトＡｂＮ９３又はウサギＲ３３０抗ノブ抗体（実施例１の抗体に関する記述を参照のこと。）とともに、室温（ＲＴ）にて２時間インキュベーションした。ＰＢＳＴで数回洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合二次抗体（抗ヒトＩｇＧ又は抗ウサギＩｇＧ）をブロッキングバッファーで希釈し、そのフィルターとともにＲＴにて１時間インキュベーションした。最後に、発色性基質（ニトロブルーテトラゾリウム及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート基質）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いてフィルターを発色させ、陽性のファージプラークを可視化した。
【０２０６】
組み換えＡｄ５ファイバーノブの発現及び精製−Ｎｈｅ−ｆｂｒ．ｆｏｒ：
【０２０７】
【化３８】
2007503843.tif 000040
及びＤ−ｆｂｒ．ｒｅｖ：
【０２０８】
【化３９】
2007503843.tif 000041
プライマーを用いて、プラスミドｐＡＢ２６（Ｂｅｔｔら、１９９３、前出）からＡｄ５ファイバーノブのＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅した。この６００ｂｐの断片をＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ｐＴＲＣＨｉｓＢベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＨｉｓ．ｋｎｏｂを生成させた。ｐＨｉｓ．ｋｎｏｂにクローニングすることにより、ｐＤｋｎｏｂΔ及びｐＤｋｎｏｂΔ−Ｌ０からの適切なＰＣＲ増幅産物、プラスミドｐＨｉｓ．ｋｎｏｂΔ及びｐＨｉｓ．ｋｎｏｂΔ−Ｌ０を得た。
【０２０９】
ＭｓｃＩ／ＢｇｌＩＩで切断したベクターｐＨｉｓ．ｋｎｏｂにクローニングすることにより、アミノ酸ＴＡＹＴ（配列番号４５）が欠失したファイバーノブのコード配列を含有する、コンストラクトｐＨｉｓ．ｋｎｏｂΔを得た。プライマーｋｎｏｂΔ：
【０２１０】
【化４０】
2007503843.tif 000042
及びｐＤ．ｒｅｖ
【０２１１】
【化４１】
2007503843.tif 000043
を用いてプラスミドｐＤｋｎｏｂΔ．ＳＮ−ＣｔｅｒｍからＰＣＲ産物増幅させ、ＢｇｌＩＩ及びＭｓｃＩ制限酵素で消化した。プライマーｋｎｏｂ−ｆｏｒ３：
【０２１２】
【化４２】
2007503843.tif 000044
及びｋｎｏｂＣ−Ｓｐｅ／Ｎｏｔ．ｒｅｖ
【０２１３】
【化４３】
2007503843.tif 000045
を用いてｐＤｋｎｏｂから得て、ＭｓｃＩ／ＥｃｏＲＩ酵素で切断したＰＣＲ断片を、ＭｓｃＩ／ＥｃｏＲＩで消化したベクターｐＤｋｎｏｂにクローニングし、プラスミドｐＤｋｎｏｂΔ．ＳＮ−Ｃｔｅｒｍを得た。
【０２１４】
プライマーｋｎｏｂΔ：
【０２１５】
【化４４】
2007503843.tif 000046
及びｐＤ．ｒｅｖ
【０２１６】
【化４５】
2007503843.tif 000047
を用いてプラスミドｐＤｋｎｏｂΔ−Ｌ０をＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ｐＨｉｓ．ｋｎｏｂベクターのＢｇｌＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。得られたｐＨｉｓ．ｋｎｏｂΔ．ＳＮ−ＨＩ  ｌｏｏｐベクターをＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ酵素で消化し、選択したエピトープを含有するクローニング断片用に使用した。後者は、プライマーｂｉｏＳＮ．ｆｏｒ：
【０２１７】
【化４６】
2007503843.tif 000048
及びｂｉｏＳＮ．ｒｅｖ：
【０２１８】
【化４７】
2007503843.tif 000049
を用いて、Ｌ派生物のλＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ酵素で消化し、ストレプトアビジンで被覆した電磁マイクロビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ａ．Ｓ．，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）で精製することにより得た。
【０２１９】
Ｎ末端の６個のＨｉｓ精製タグを含有する組み換えＡｄ５ファイバーノブ派生物（ｋｎｏｂΔ−Ｌ１、ｋｎｏｂΔ−Ｌ６及びｋｎｏｂΔ−Ｌ３３）を、Ｅ．コリで発現させ、Ｈｉ−ＴｒａｐキレートＨＰカラム（ＡＰＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でＦＰＬＣにより精製した。
【０２２０】
細胞−ＥＬＩＳＡ−２４ウェルプレートにおいて、培養液５００μｌ中の約８０，０００細胞／ウェルの細胞を播種して、３７℃にて、５％ＣＯ２とともに、４８時間インキュベーションした。次に、コンフルエントになった細胞を３７℃にて１時間、血清非添加の培地とともにインキュベーションして飢餓状態にし、冷ＰＢＳで１回洗浄し、次に、４％パラホルムアルデヒドとともに４℃にて１０分間インキュベーションすることにより固定した。冷ＰＢＳで細胞をよく洗浄し、ＰＢＢＳ＋＋バッファー（ＰＢＳ中１％  ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）とともに４℃にて３０分間インキュベーションしてブロッキングした。タンパク質結合を観察するために、細胞を４℃にて一晩、ＰＢＢＳ＋＋中で、精製タンパク質２０μｇ／ｍｌ希釈液とともにインキュベーションした。次に、プレートをＰＢＢＳ＋＋でよく洗浄し、ＰＢＢＳ＋＋バッファーで１：１０００に希釈した抗ＨｉｓＨＲＰ結合抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により捕捉したタンパク質を検出した。４℃にて２時間インキュベーションした後、プレートをよく洗浄し、ＴＭＢ液体基質系とともにインキュベーションしてペルオキシダーゼ活性を検出した。２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して発色反応を停止させた。自動ＥＬＩＳＡリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｂｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）でこのプレートの読み取りを行い、Ａ＝Ａ４０５ｎｍ−Ａ６２０ｎｍとして結果を表した。
【０２２１】
結果−ＣＡＲ以外の細胞表面受容体に結合するペプチドリガンドを選び出すために、改変ファイバーノブのライブラリーをスクリーニングした。表面のＣＡＲ表示レベルが検出できない程度であり、アデノウイルスによりあまり形質導入されないマウス胚繊維芽細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、標的細胞として選択した。λｋｎｏｂΔ−１４ａａ．ｃｙｓライブラリーの約５ｘ１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）を、プレーティングしたＮＩＨ３Ｔ３細胞に添加した。インキュベーション後、非結合ファージを除去し、細胞をよく洗浄し、細菌に感染させて結合ファージを増殖させた。約１ｘ１０５個のクローンを回収し、増殖させた。抗ノブ抗体を用いてこのファージのプールを免疫スクリーニングしたところ、クローンの２０％がその表面にノブを表示し、そのクローンの１００％において三量体複合体として発現されていた。一方、抗ノブ抗体でインプットライブラリーを調べたところ、そのクローンのうち２６％で陽性、その７５％が抗三量体ノブ抗体とも反応した。これらの知見から、ノブ発現が、増殖率低下を伴うことが示唆される。増幅中に、この傾向は、外来タンパク質を発現しないクローンに著しく片寄っていた。パニングサイクルから得られたファージのプールから、ノブ陽性クローンのうち３０個のクローンを無作為に選択した。これらのクローンそれぞれからファージ溶解物を調製し、ＮＩＨ３Ｔ３細胞への結合を細胞−ＥＬＩＳＡにより測定した（データを示さず。）。この予備スクリーニングは、３個のクローン（λｋｎｏｂΔ−Ｌ１、λｋｎｏｂΔ−Ｌ６、λｋｎｏｂΔ−Ｌ３３）における解析を目的としたものであり、ＮＩＨ３Ｔ３細胞へのそれらの結合をフローサイトメトリーにより観察した（図１７）。この方法により単離したこの３個の改変ファイバーノブは、親ベクターと比較して、蛍光標識細胞の分布中央値の変動を示したが、このことから、ＮＩＨ３Ｔ３細胞への結合が増加したことが示される。対照ファージλＮＳ３は、λｋｎｏｂΔ−ｗｔと相当する程度の効率でＮＩＨ３Ｔ３細胞に結合した。これらの３個の改変ファイバーノブの配列解析から、類似性が高いことが明らかとなり（図１８）、このことから、それらが同じ受容体と相互作用することが示唆される。
【０２２２】
同じＡｄ５ｋｎｏｂΔ−Ｌ１、Ｌ１６及びＬ−３３派生物を、組み換えタンパク質として細菌で発現させた。精製を容易にするため、及び検出の際のタグとして使用するために、そのＮ末端にヒスチジンテールを付加した。これらの組み換えノブタンパク質は、ホモ三量体複合体としてアセンブルし、ｋｎｏｂΔ―ｗｔタンパク質よりもＮＩＨ３Ｔ３細胞への結合が多かった（データを示さず。）。
【実施例５】
【０２２３】
改変ファイバーノブを有するアデノウイルスベクターは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して効率的に形質導入する。
【０２２４】
細胞−Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ）よりマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞を入手した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）でこの細胞を培養した。培地には全て、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した。
【０２２５】
ウイルス−Ｐｅｒ．Ｃ６細胞において組み換えアデノウイルスを増殖させ、ＣｓＣｌ勾配での遠心により精製した。分光学的にウイルス粒子タイターを測定したが、この場合、２６０ｎｍにおける光学密度１Ｕが、１．１ｘ１０１２粒子／ｍｌに相当する。Ａｄ５派生物に対する結合分子が分からないので、細胞あたりのウイルス粒子の等量とベクターを比較する必要がある。様々なバッチのＡｄ５派生物を用いたいくつかの実験からの一貫した結果及びＣＡＲ陽性細胞においてウイルス全てに対して測定した感染性が同程度であったことから、ウイルス調製物の質が形質導入効率で見られる変動に関与するという可能性が排除される。ウイルスゲノムの制限分析及びファイバーノブ領域の配列決定から、ウイルス調製物の同一性が確認された。Ａｄ５ｌｕｃ派生物全てが、Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔウイルスのものと同程度の、トランスフェクションから細胞変性効果までの時間の長さ、増幅率及びウイルス回収率を示した。ウイルスをＡｄ５ｌｕｃ−ＬＸと名づけた（ここで、「ｘ」とは、ウイルスゲノムに組み込まれたペプチドリガンドを示す。）。
【０２２６】
組み換えＡｄプラスミドの構築−Ｅ．コリ、ＢＪ５１８３における相同的組み換えにより、Ａｄ５ゲノムのＥ１領域の代わりにルシフェラーゼ発現カセット及びファイバーのＨＩループに選択したペプチドリガンドを含有する第一世代アデノウイルスを構築した。
【０２２７】
野生型ファイバー遺伝子を包含するＡｄ５  ２５２１９−２７０１８ヌクレオチド断片を、Ｌｉｔｍｕｓ２８ベクター（Ｎ．Ｅ．Ｂ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ）にクローニングした。ＭｆｅＩ−ＳｗａＩオリゴヌクレオチド
【０２２８】
【化４８】
2007503843.tif 000050
を自己アニーリングさせて、ＳｗａＩ制限部位を含有する１８ｂｐのｄｓＤＮＡ断片を得た。そのＭｆｅＩ−適合末端により、この断片をＬＩＴＭＵＳ  ２８−ファイバーのＭｆｅＩ部位にクローニングし、ファイバー遺伝子のすぐ下流にユニークなＳｗａＩ部位を作った。得られたプラスミドｐＬＩＴｆｂｒ−ＳｗａＩを用いて、細菌の相同的組み換えにより、ｐＡｄ５−Ｈ１０においてＳｗａＩ部位を導入し、このように、ｐＡｄ５−ＳｗａＩを作製したが、これは、トランスフェクションにおいて生存能力のあるウイルスを生成しない。
【０２２９】
Ａｄ５ゲノムのＥ１領域のかわりにルシフェラーゼ発現カセットを含有するＡｄ５ｌｕｃ及びＡｄ５ｌｕｃ−ＳｗａＩ派生物を以下のように構築した。プラスミドｐＧＧｌｕｃ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）をＭｃｓＩ及びＫｐｎＩ制限酵素で消化し、ＣＭＶ−ルシフェラーゼ発現カセットを単離した。得られた３．５−ｋｂのＣＭＶ−ルシフェラーゼ発現カセットを、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端にし、シャトルベクター、ｐΔＥ１ｓｐ１Ａ（Ｂｅｔｔら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８０２−８８０６）のＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、プラスミドｐΔＥ１ＣＭＶＬｕｃを得た。Ａｄ５ゲノム配列に隣接したルシフェラーゼ発現カセットを含有する６．４ｋｂのＤＮＡ断片を、Ｓｓｐ１／ＢｓｔＺ１７消化によりｐΔＥ１ＣＭＶＬｕｃから切り出し、Ｅ．コリ  ＢＪ５１８３細胞における相同的組み換えにより、Ｃｌａで線状化したｐＢＨＧ１０プラスミド（Ｃｈａｒｔｉｅｒら、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：４８０５−４８１０；Ｂｅｔｔら、１９９４、前出）に挿入した。この最後のクローンから８．８ｋｂのＡｖｒＩＩ／ＢｓｔＺ１７ＤＮＡ断片を得て、アデノウイルスＨ１０バックボーンのＰａｃＩ部位に挿入し（Ｓａｎｄｉｇら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１００４−１００７）、ｐＡｄ５ｌｕｃ−ｗｔ及びｐＡｄ５ｌｕｃ−ＳｗａＩを得た。図１３で報告するように、ノブＨＩループ領域においてユニークなＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ部位を入れたＡｄ５ファイバー遺伝子をｐＬＩＴＭＵＳ２０ベクターにクローニングすることにより、Ａｄ５ファイバーシャトルプラスミド、ｐＬＩＴｆｂｒ−Ｌ０を構築した。λＤＮＡテンプレートからペプチドリガンド配列をＰＣＲ増幅し、ＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ制限酵素消化し、ｐＬＩＴｆｂｒ−Ｌ０の対応する部位にクローニングして、プラスミドｐＬＩＴｆｂｒ−ＬＸを得た。細菌の相同的組み換えにより、ｐＬＩＴｆｂｒ−ＬＸプラスミド由来の、突然変異させたファイバー配列を、ｐＡｄ５ｌｕｃ−ＳｗａＩに組み込み、プラスミドｐＡｄ５ｌｕｃ−ＬＸを得た。
【０２３０】
細胞の形質導入−培地５００μｌ中の約５０，０００細胞／ウェルのＮＩＨ−３Ｔ３細胞を２４ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２とともに３７℃にて４８時間インキュベーションした。コンフルエントになった細胞をＤＦバッファー（ＤＭＥＭ中２％ＦＢＳ）で洗浄し、ＲＴにて３０分間、ＤＦバッファー中でＣｓＣｌ精製したアデノウイルスを感染させた。非結合ウイルスを除去し、細胞をＤＦバッファーで洗浄した。製造者の使用説明書に従い、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて細胞抽出及びルシフェラーゼアッセイを行った。タンパク質１ｍｇあたりの相対発光量（ＲＬＵ）としてルシフェラーゼ活性を表す。表示項目における各点は、３回測定の平均を表し、各値に対する標準偏差を報告する。
【０２３１】
結果−親和性を調べるために、ファイバーノブ内にペプチドリガンドを組み込むＡｄ５派生物を作製した。前記Ａｄ５派生物では、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する結合が増加していた。下流遺伝子トランスファーアッセイを簡素化するために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの転写調節下にあるホタルルシフェラーゼ遺伝子を、Ａｄ５バックボーンのＥ１領域の代わりに挿入した（Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔ）。細菌における相同的組み換えにより、ノブＨＩループ内の図１８に挙げるペプチドリガンドをウイルスゲノムの対応領域に入れたアデノウイルス派生物、Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ０、−Ｌ１、−Ｌ１６及び−Ｌ３３を作製した。ＣＡＲ結合を保持し、ウイルス増殖を可能にするために、ＴＡＹＴ（配列番号４５）欠失を移入しなかったが、Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔファイバー遺伝子においてこれらのペプチドリガンドを組み込んだことに留意されたい。
【０２３２】
Ａｄ５ｌｕｃ−ＬＸ派生物とＡｄ５ｌｕｃ−ｗｔウイルスとの間で、増幅率、ウイルス回収率及びウイルス粒子として測定したタイターに関しては顕著な違いは見られなかった。対照として、Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔを用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の遺伝子導入効率に関してＡｄ５ｌｕｃ−ＬＸ派生物を調べた。Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔと比較して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して、Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ１、Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ１６及びＡｄ５ｌｕｃ−Ｌ３３の形質導入率は顕著に高い（１００から７００倍まで）ことが示された（図１９）。
【０２３３】
Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ０対照ウイルスは、Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔと同じように作用したが、このことから、ファイバーのＨＩループのＴ５４６にＳＧＡＡＡ（配列番号３９）配列を挿入してもウイルス親和性に影響を与えないことが示された。
【０２３４】
Ａｄ５ｌｕｃ−ＬＸ派生物の感染経路を解析するために、組み換えノブタンパク質存在下でＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染させることにより、競合アッセイを行った。同種ｋｎｏｂΔ−Ｌ１６タンパク質とプレインキュベーションすることにより、対照ｋｎｏｂ−ｗｔタンパク質と比較して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＡｄ５ｌｕｃ−Ｌ１６の遺伝子導入活性が３０％に低下した（図２０）。これらのデータから、未知の細胞表面受容体への結合が介在するＣＡＲ非依存性感染経路を、本改変ノブが活性化することが示される。一方、同種ｋｎｏｂ−ｗｔタンパク質は、対照のｋｎｏｂΔ−Ｌ１６タンパク質と比較して、Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔが介在する、既に低いルシフェラーゼ発現レベルにはあまり影響を与えなかった（図２０）が、このことから、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてその形質導入活性が低いことにＣＡＲは介在していなかったことが示される。
【実施例６】
【０２３５】
改変Ａｄ５ファイバーの細胞侵入は、αｖインテグリンが介在する。
【０２３６】
細胞−Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．Ｕ．Ｓ．Ａ）よりマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞を入手した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）でこの細胞を培養した。培地には全て、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した。
【０２３７】
細胞の形質導入−培地５００μｌ中の約５０，０００細胞／ウェルのＮＩＨ−３Ｔ３細胞を２４ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２とともに３７℃にて４８時間インキュベーションした。コンフルエントになった細胞をＤＦバッファー（ＤＭＥＭ中２％ＦＢＳ）で洗浄し、ＲＴにて３０分間、ＤＦバッファー中でＣｓＣｌ精製したアデノウイルスを感染させた。非結合ウイルスを除去し、細胞をＤＦバッファーで洗浄した。製造者の使用説明書に従い、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて細胞抽出及びルシフェラーゼアッセイを行った。タンパク質１ｍｇあたりの相対発光量（ＲＬＵ）としてルシフェラーゼ活性を表す。表示項目における各点は、３回測定の平均を表し、各値に対する標準偏差を報告する。
【０２３８】
競合実験において、組み換えタンパク質  １０μｇ／ｍｌ又は、ＲＧＤもしくは対照ＲＧＥペプチド４ｍｇ／ｍｌとともにＤＦバッファー中でＲＴにて６０分間、細胞をプレインキュベーションした。次に、組み換えタンパク質又はペプチドを除去せずに、ウイルス（５０ｐｐ／細胞）を添加し、上述のように感染させた。結果は、それぞれ、対照タンパク質（Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔに対してｋｎｏｂΔ−Ｌ１６、及びＡｄ５ｌｕｃ−Ｌ１６に対してｋｎｏｂ−ｗｔ）又はＲＧＥペプチド存在下における細胞のルシフェラーゼ活性のパーセンテージとして表す。合成ペプチドは、Ｂｉｏ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，Ｔｅｘａｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手した。
【０２３９】
結果−ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、その表面上でＣＡＲを発現しないが、αｖβ３及びαｖβ５インテグリンの発現レベルはかなり高い。従って、発明者らは、ＲＧＥ（ＧＲＧＥＳＰ；配列番号４４）対照ペプチドと比較した、ＲＧＤ（ＧＲＧＤＳＰ；配列番号４３）ペプチドの存在下でのそれらの形質導入効率を測定することにより、Ａｄ５派生物の細胞侵入におけるインテグリン−ペントン相互作用の役割を調べた。ＲＧＤペプチドは、細胞αｖインテグリンとのＡｄ５ペントンベースのＲＧＤモチーフの相互作用を妨害し、それによりウイルス侵入を阻害する。ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＲＧＤペプチドとプレインキュベーションすることにより、対照ＲＧＥペプチドと比較して、Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ１、Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ１６及びＡｄ５ｌｕｃ−Ｌ３３の形質導入がそれぞれ、４０％、６０％及び６１％低下した。従って、それらが未知の細胞性受容体と最初に相互作用した後、Ａｄ５派生物は、αｖインテグリンへの結合を介して内在化される。Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔを用いて同様の実験をおこなったところ、既に低いその形質導入効率が顕著に低下することが明らかとなり、このことから、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるウイルスの感染性が低いのは、主にαｖインテグリンとの直接相互作用によるものであることが示される。
【実施例７】
【０２４０】
ＣＡＲ陰性細胞及びＣＡＲ陽性細胞における改変Ａｄ５ファイバーの遺伝子導入効率
細胞−Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．Ｕ．Ｓ．Ａ）よりチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）を入手した。この細胞をＭＥＭα培地で培養した。培地には全て、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した。
【０２４１】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．Ｕ．Ｓ．Ａ）よりマウス肝臓  ＮＭｕＬｉ細胞を入手した。この細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。培地には全て、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した。
【０２４２】
細胞の形質導入−培地５００μｌ中の約５０，０００細胞／ウェルのＮＩＨ−３Ｔ３細胞及びＮＭｕＬｉ細胞を２４ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２とともに３７℃にて４８時間インキュベーションした。コンフルエントになった細胞をＤＦバッファー（ＤＭＥＭ中２％ＦＢＳ）で洗浄し、ＲＴにて３０分間、ＤＦバッファー中でＣｓＣｌ精製したアデノウイルスを感染させた。非結合ウイルスを除去し、細胞をＤＦバッファーで洗浄した。ＣＨＯ細胞に対しては、ＭＥＭα培地を使用した。新鮮な完全培地を添加し、タンパク質発現のために４８時間、細胞をインキュベーションした。製造者の使用説明書に従い、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて細胞抽出及びルシフェラーゼアッセイを行った。タンパク質１ｍｇあたりの相対発光量（ＲＬＵ）としてルシフェラーゼ活性を表す。表示項目における各点は、３回測定の平均を表し、各値に対する標準偏差を報告する。
【０２４３】
結果−発明者らは、Ａｄ５突然変異体が用いる非ネイティブ感染経路がまた、ＮＩＨ３Ｔ３及びＮＭｕＬｉ以外の細胞型でも形質導入を促進するか否かを調べた。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞はその細胞表面にＣＡＲ及びαｖβ３インテグリンを検出不可能なレベルでしか発現せず、αｖβ５レベルが低いことから、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を選択した。予想通り、ＣＨＯ細胞は、Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔによりあまり形質導入されなかった（図２１）。しかし、３種類のＡｄ５派生物は全て、Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔよりも非常に高い効率でこの細胞に感染した。Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ１及びＡｄ５ｌｕｃ−Ｌ３３が最も効率が高く、それぞれ、対照ｗｔウイルスの、２７０倍及び３２０倍高かった。このように、ＣＨＯ細胞もまた、その表面にノブ突然変異体が標的とする受容体を表示する。ＣＡＲが存在せず、αｖβ５インテグリンのレベルが低い状態において、この相互作用により、ＣＨＯ細胞を効率的に形質転換できるようになる。
【０２４４】
Ａｄ５派生物が標的とする受容体が、ＣＡＲ陽性細胞でも発現されるか否かを調べるために、ＣＡＲ及びαｖインテグリンを高レベルで発現し、Ａｄ５により効率よく形質導入されるマウス肝臓ＮＭｕｌｉ細胞を感染させた（図１９）。３種類のＡｄ５派生物全てが、Ｎｍｕｌｉ細胞の感染を引き起こし、その効率はＡｄ５ｌｕｃ−ｗｔより高いか同等であった。過剰な組み換えｋｎｏｂ−ｗｔタンパク質により、Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔの感染性が５％に低下した（図２０）。一方、同じ条件は、派生物の形質導入効率に影響を与えず、このことから、ＣＡＲ非依存性細胞侵入経路がＮＭｕｌｉ細胞においても有効であることが分かった。
【実施例８】
【０２４５】
ヒト及びマウス樹状細胞、ヒト初代メラノサイト及びマウス筋肉組織の遺伝子導入効率
細胞−初代マウスＤＣは、Ｌｕｔｚら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２３：７７−９２で述べられているように、Ｂａｌｂ／ｃメス骨髄から得た。簡潔に述べると、トータル骨髄白血球を細菌学用ペトリ皿のＰＲＭＩ及びＧＭ−ＣＳＦ（２ｎｇ／ｍｌ）中にプレーティングした。培地を２日から３日ごとに交換した。インビトロ培養第７日に細胞を使用した。
【０２４６】
Ｅｎｇｅｒｉｎｇら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：２１１８−２１２６で述べられているように、ヒトＤＣ細胞を得た。簡潔に述べると、抗−ＣＤ１４（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いたアフィニティー精製により、健康な提供者の軟膜からヒト血液単球を単離した。ＩＬ−４（１００ｍｇ／ｍｌ；Ｄｕｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）及びＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ；Ｄｕｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）存在下においてＲＰＭＩ  １６４０／１０％  ＦＣＳで単球を培養して、未成熟ＤＣを得た。培地は３日ごとに交換し、第７日に細胞を使用した。
【０２４７】
患者から初代ヒトメラノサイトを単離し、インビトロで４継代にわたり次の培地で培養した。培地は、３０％  ｄｉ  Ｈａｍ’ｓＦ１２、２％  ＦＣＳ４，４ｍＭ  Ｌ−グルタミネナル（ｇｌｕｔａｍｍｉｎｅｎａｌｅ）、５０ＩＵ／ｍｌ−５０μｇ／ｍ  ペニシリン−ストレプトマイシン、２４．３μｇ／ｍｌ  アデニン、５μ／ｍｌ  インスリン、０．４μｇ／ｍｌ  ヒドロコルチゾン、１．３６ｎｇ／ｍｌ  トリヨードチロニン、１０−１０Ｍ  コレラ毒素、１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＦＧＦ，ＴＰＡを含む、６０％  ＤＭＥＭであった。
【０２４８】
細胞の形質導入−培地５００μｌ中の約２００，０００細胞／ウェルのマウス及びヒトＤＣを２４ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２とともに３７℃にて２４時間インキュベーションした。
【０２４９】
コンフルエントになった細胞をＲＦバッファー（ＲＰＭＩ中２％ＦＢＳ）で洗浄し、ＲＴにて４０分間、ＲＦバッファー中でＣｓＣｌ精製したアデノウイルスに感染させた。非結合ウイルスを除去し、細胞をＲＦバッファーで洗浄し、タンパク質発現のために完全培地とともに４８時間インキュベーションした。
【０２５０】
培地５００μｌ中の約５０，０００細胞／ウェルの初代ヒトメラノサイトを２４ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２とともに３７℃にて４８時間インキュベーションした。コンフルエントになった細胞をＤＦバッファー（ＤＭＥＭ中２％ＦＢＳ）で洗浄し、ＲＴにて３０分間、ＤＦバッファー中でＣｓＣｌ精製したアデノウイルスに感染させた。非結合ウイルスを除去し、細胞をＤＦバッファーで洗浄した。新鮮な完全培地を添加し、タンパク質発現のために４８時間、細胞をインキュベーションした。
【０２５１】
筋肉組織−８週齢メスＢａｌｂＣマウスの大腿四頭筋に、アデノウイルス野生型（Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔ）又はアデノウイルス派生物（Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ１及びＡｄ５ｌｕｃ−Ｌ３３）１０９、１０８又は１０７ｖｐを注射した。生理溶液  ５０μｌでウイルスを希釈した。１２個の筋肉に、各アデノウイルス派生物及び野生型ウイルスを注射した（各ｍｏｉに対して４個の筋肉を使用した。）。
【０２５２】
注射から４８時間後、マウスを屠殺し、筋肉を取り出し、ＰＢＳで洗浄して溶解バッファー（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ）  ３００μｌ中でホモジェナイズした。凍結融解を１回行った後、４℃にて、１４０００ｒｐｍ、２０分間、抽出液を遠心した。上清を回収し、ルシフェラーゼアッセイに３０μｌを使用した（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）によりタンパク質定量を行った。タンパク質１ｍｇあたりの相対発光量（ＲＬＵ）としてルシフェラーゼ活性を表す。
【０２５３】
結果−得られた結果から、Ａｄ５派生物のＣＡＲ非依存性親和性が、ある一定の細胞型又は一定の種に限定されないことが示唆された。選択した改変ファイバーが治療において関心のある細胞／組織に対する感染を行うためにより適しているかどうかを調べるために、樹状細胞（ＤＣ）、ヒトメラノサイト及び骨格筋組織を選択した。
【０２５４】
骨髄からマウス未成熟ＤＣを得て、インビトロで増殖させた。ＦＡＣＳ解析により、この集団がＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＭＨＣ−Ｉ及びＭＨＣ−ＩＩ陽性として確認された。骨髄由来のマウス未成熟ＤＣに、様々なｍｏｉで、Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ１及びＡｄ５ｌｕｃ−Ｌ３３を感染させた。両ウイルスとも、Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔと比較して高い効率でマウス未成熟ＤＣに対して形質導入した（図２２Ａ）。特に、Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ３３は、使用したｍｏｉに依存して、親ベクターよりも２４倍から１００倍、マウスＤＣに感染した。健康な提供者の末梢血液からＣＤ１４−アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、インビトロで分化させたヒト未成熟ＤＣに対して同様の実験を行った。ＦＡＣＳ解析により、この集団が、ＣＤ１ａ＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６＋及びＣＤ１４ｎｅｇとして確認された。文献により報告されているように、試験したｍｏｉでは、Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔは未成熟ヒトＤＣに対してあまり形質導入しなかった（図２２Ｂ）。一方、Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ１及びＡｄ５ｌｕｃ−Ｌ３３は、形質導入の効率の点で非常に優れていた。すなわち、ヒトＤＣに取り込まれたＡｄ５ｌｕｃ−Ｌ３３は、ｗｔウイルスと比較して１００倍増加していた。
【０２５５】
様々なｍｏｉにおいて、Ａｄ５ｌｕｃ−ＬＸ派生物をヒト初代メラノサイトに感染させた。Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔと比較して、３種類のＡｄ５ｌｕｃ派生物は、高い形質導入効率を示し、Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ３３の場合はＡｄ５ｌｕｃ−ｗｔの効率の５０倍から９００倍であった。
【０２５６】
ＢａｌｂＣマウス８週齢の大腿四頭筋に、アデノウイルス  ｗｔ又はアデノウイルス派生物（Ｌ１及びＬ３３）１０９、１０８又は１０７ｖｐを注射した。試験した３種類のｍ．ｏ．ｉ．全てにおいて、アデノウイルス派生物Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ１及びＡｄ５ｌｕｃ−Ｌ３３は、Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔと比較して、筋肉への高い形質導入効率を示した（図２３）。すなわち、１０８ｖｐを注射した場合、Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ３３及びＡｄ５ｌｕｃ−Ｌ１は、マウス筋肉をＡｄ５ｌｕｃ−ｗｔのそれぞれ８倍（ｐ＜１０ｅｘｐ−５）及び５倍（ｐ＜０．００１）よく形質導入した。
【図面の簡単な説明】
【０２５７】
【図１】図１は、配列番号１に記載の、改変Ａｄ５ファイバータンパク質、Ａｄ５ファイバー−Ｌ１のアミノ酸配列を示す。この配列は、該ファイバータンパク質のアミノ酸残基５４６と５４７との間のファイバーノブのＨＩループ内にＬ１ペプチドリガンド（配列番号１３）を含有する。そのノブドメインに下線を付す。Ｌ１ペプチドリガンド配列は、斜字体で表す。Ｌ１ペプチドリガンドの挿入を促進するために野生型Ａｄ５ファイバー配列に付加したアミノ酸残基は、小文字で表す。
【図２】図２は、配列番号２に記載の、改変Ａｄ５ファイバータンパク質、Ａｄ５ファイバー−Ｌ１６のアミノ酸配列を示す。この配列は、該ファイバータンパク質のアミノ酸残基５４６と５４７との間のファイバーノブのＨＩループ内にＬ１６ペプチドリガンド（配列番号１４）を含有する。そのノブドメインに下線を付す。Ｌ１６ペプチドリガンド配列は、斜字体で表す。Ｌ１６ペプチドリガンドの挿入を促進するために野生型Ａｄ５ファイバー配列に付加したアミノ酸残基は、小文字で表す。
【図３】図３は、配列番号３に記載の、改変Ａｄ５ファイバータンパク質、Ａｄ５ファイバー−Ｌ３３のアミノ酸配列を示す。この配列は、該ファイバータンパク質のアミノ酸残基５４６と５４７との間のファイバーノブのＨＩループ内にＬ３３ペプチドリガンド（配列番号１３）を含有する。そのノブドメインに下線を付す。Ｌ３３ペプチドリガンド配列は、斜字体で表す。Ｌ３３ペプチドリガンドの挿入を促進するために野生型Ａｄ５ファイバー配列に付加したアミノ酸残基は、小文字で表す。
【図４】図４は、図１で示すような、及び配列番号１に記載のＡｄ５ファイバー−Ｌ１タンパク質をコードする、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を示す。この配列は、Ｌ１ペプチドリガンドをコードする核酸配列を本ファイバーノブのＨＩループに対応する配列内に含有する、Ａｄ５ファイバー遺伝子を表す。そのノブをコードする領域に下線を付す。Ｌ１ペプチドリガンドをコードする核酸配列は、斜字体で表す。小文字で表した付加した配列変化は、野生型Ａｄ５ファイバーにＬ１をコードするヌクレオチド配列の挿入を容易にするために使用する操作を行った制限部位を表し、野生型ファイバーアミノ酸配列を維持するように作用する。
【図５】図５は、図２で示すような、配列番号２に記載のＡｄ５ファイバー−Ｌ１６タンパク質をコードする、配列番号５に記載のヌクレオチド配列を示す。この配列は、Ｌ１６ペプチドリガンドをコードする核酸配列を本ファイバーノブのＨＩループに対応する配列内に含有する、Ａｄ５ファイバー遺伝子を表す。そのノブをコードする領域に下線を付す。Ｌ１６ペプチドリガンドをコードする核酸配列は、斜字体で表す。小文字で表した付加した配列変化は、野生型Ａｄ５ファイバーにＬ１６をコードするヌクレオチド配列の挿入を容易にするために使用する操作を行った制限部位を表し、野生型ファイバーアミノ酸配列を維持するように作用する。
【図６】図６は、図３で示すような、配列番号３に記載のＡｄ５ファイバー−Ｌ３３タンパク質をコードする、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を示す。この配列は、Ｌ３３ペプチドリガンドをコードする核酸配列を本ファイバーノブのＨＩループに対応する配列内に含有する、Ａｄ５ファイバー遺伝子を表す。そのノブドメインをコードする領域に下線を付す。Ｌ３３ペプチドリガンドをコードする核酸配列は、斜字体で表す。小文字で表した付加した配列変化は、野生型Ａｄ５ファイバーにＬ３３をコードするヌクレオチド配列の挿入を容易にするために使用する操作を行った制限部位を表し、野生型ファイバーアミノ酸配列を維持するように作用する。
【図７】図７は、配列番号７に記載の、改変Ａｄ５ファイバー−Ｌ１タンパク質、Ａｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ１のアミノ酸配列を示す。この配列は、Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸残基４８９から４９２において、ＣＡＲ結合をなくす、アミノ酸残基ＴＡＹＴ（配列番号４５）の欠失を有する。さらに、これは、アミノ酸残基５４６から５４７の間において本ファイバーノブのＨＩループ内にＬ１ペプチドリガンド（配列番号１３）を含有する。このノブドメインに下線を付す。欠失部分に隣接するアミノ酸に二重線を付す。Ｌ１ペプチドリガンド配列は斜字体で表す。小文字で表すさらなる配列変化は、Ｌ１をコードするヌクレオチド配列の野生型ファイバーへの挿入を容易にするために使用する操作した制限部位を意味し、野生型ファイバーアミノ酸配列を維持するように作用する。
【図８】図８は、配列番号８に記載の、改変Ａｄ５ファイバー−Ｌ１６タンパク質、Ａｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ１６のアミノ酸配列を示す。この配列は、Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸残基４８９から４９２における、ＣＡＲ結合をなくす、アミノ酸残基ＴＡＹＴ（配列番号４５）の欠失を有する。さらに、これは、アミノ酸残基５４６から５４７の間において本ファイバーノブのＨＩループ内にＬ１６ペプチドリガンド（配列番号１４）を含有する。このノブドメインに下線を付す。欠失部分に隣接するアミノ酸に二重線を付す。Ｌ１６ペプチドリガンド配列は斜字体で表す。小文字で表すさらなる配列変化は、Ｌ１６をコードするヌクレオチド配列の野生型ファイバーへの挿入を容易にするために使用する操作した制限部位を意味し、野生型ファイバーアミノ酸配列を維持するように作用する。
【図９】図９は、配列番号９に記載の、改変Ａｄ５ファイバー−Ｌ３３タンパク質、Ａｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ３３のアミノ酸配列を示す。この配列は、Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸残基４８９から４９２における、ＣＡＲ結合をなくす、アミノ酸残基ＴＡＹＴ（配列番号４５）の欠失を有する。さらに、これは、アミノ酸残基５４６から５４７の間において本ファイバーノブのＨＩループ内にＬ３３ペプチドリガンド（配列番号１５）を含有する。このノブドメインに下線を付す。欠失部分に隣接するアミノ酸に二重線を付す。Ｌ３３ペプチドリガンド配列は斜字体で表す。小文字で表すさらなる配列変化は、Ｌ３３をコードするヌクレオチド配列の野生型ファイバーへの挿入を容易にするために使用する操作した制限部位を意味し、野生型ファイバーアミノ酸配列を維持するように作用する。
【図１０】図１０は、配列番号１０に記載の、本発明のＡｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。この配列は、野生型Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする核酸配列のヌクレオチド１４６５から１４７６（ＡＣＡＧＣＣＴＡＴＡＣＡ；配列番号４７）の欠失を有する。このヌクレオチドの欠失は、Ａｄ５ファイバータンパク質のＣＡＲ結合をなくす、本明細書で述べたアミノ酸残基ＴＡＹＴ（配列番号４５）の欠失に対応する。さらに、この配列は、本ファイバーノブのＨＩループ内のＬ１ペプチドリガンドをコードする核酸配列を含有する。このノブドメインに下線を付す。欠失部分に隣接するヌクレオチドコドンに二重線を付す。Ｌ１ペプチドリガンドをコードする核酸配列は斜字体で表す。小文字で表すさらなる配列変化は、Ｌ１をコードするヌクレオチド配列の野生型ファイバーへの挿入を容易にするために使用する操作した制限部位を意味し、野生型ファイバーアミノ酸配列を維持するように作用する。
【図１１】図１１は、配列番号１１に記載の、本発明のＡｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ１６タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。この配列は、野生型Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする核酸配列のヌクレオチド１４６５から１４７６（ＡＣＡＧＣＣＴＡＴＡＣＡ；配列番号４７）の欠失を有する。このヌクレオチドの欠失は、Ａｄ５ファイバータンパク質のＣＡＲ結合をなくす、本明細書で述べたアミノ酸残基ＴＡＹＴ（配列番号４５）の欠失に対応する。さらに、この配列は、本ファイバーノブのＨＩループ内のＬ１６ペプチドリガンドをコードする核酸配列を含有する。このノブドメインに下線を付す。欠失部分に隣接するヌクレオチドコドンに二重線を付す。Ｌ１６ペプチドリガンドをコードする核酸配列は斜字体で表す。小文字で表すさらなる配列変化は、Ｌ１６をコードするヌクレオチド配列の野生型ファイバーへの挿入を容易にするために使用する操作した制限部位を意味し、野生型ファイバーアミノ酸配列を維持するように作用する。
【図１２】図１２は、配列番号１２に記載の、本発明のＡｄ５  ｆｉｂｅｒΔ−Ｌ３３タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。この配列は、野生型Ａｄ５ファイバータンパク質をコードする核酸配列のヌクレオチド１４６５から１４７６（ＡＣＡＧＣＣＴＡＴＡＣＡ；配列番号４７）の欠失を有する。このヌクレオチドの欠失は、Ａｄ５ファイバータンパク質のＣＡＲ結合をなくす、本明細書で述べたアミノ酸残基ＴＡＹＴ（配列番号４５）の欠失に対応する。さらに、この配列は、本ファイバーノブのＨＩループ内のＬ３３ペプチドリガンドをコードする核酸配列を含有する。このノブドメインに下線を付す。欠失部分に隣接するヌクレオチドコドンに二重線を付す。Ｌ３３ペプチドリガンドをコードする核酸配列は斜字体で表す。小文字で表すさらなる配列変化は、Ｌ３３をコードするヌクレオチド配列の野生型ファイバーへの挿入を容易にするために使用する操作した制限部位を意味し、野生型ファイバーアミノ酸配列を維持するように作用する。
【図１３】図１３は、λｋｎｏｂΔ−１４ａａ．ｃｙｓファージディスプレイライブラリーの構造を示す。この図の上部は、野生型Ａｄ５ファイバー遺伝子のアミノ酸位置５４６から５４７のｋｎｏｂΔ−Ｌ０配列の部分を表す。アミノ酸残基は、三文字コードで示す。ｋｎｏｂΔ−Ｌ０において、位置５４６のスレオニン（Ｔｈｒ）及び位置５４７のプロリン（Ｐｒｏ）をコードするコドン配列の間にヌクレオチドが付加される。さらなるヌクレオチドにより、この領域にＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ部位を入れるが、これは本ファイバーノブ内の候補ペプチドリガンドの挿入を容易にする。このさらなるヌクレオチドは、太字、大文字で表し、それらがコードするさらなるアミノ酸残基は太字で表す。配列番号１６は、本ファイバータンパク質配列の残基５４６及び５４７、ならびにそれらの間に付加された新しい残基を含む、ｋｎｏｂΔ−Ｌ０の領域のアミノ酸配列断片を表す。配列番号１７は、本ファイバータンパク質のアミノ酸残基５４６及び５４７をコードするコドン配列ならびにそれらの間に付加された新しいヌクレオチドを含む、ｋｎｏｂΔ−Ｌ０の領域のヌクレオチド配列断片を表す。  下のパネルは、ｋｎｏｂΔ−１４ａａ．ｃｙｓライブラリーを作製するために使用される、候補ペプチドリガンドをコードするこのオリゴヌクレオチド混合物の組成を説明する。このペプチドは、レジンスプリット技術により調製した。このパネルの下部の数字は、ｋｎｏｂΔ−Ｌ０内に挿入される候補ペプチドリガンドの可能性のある１４個のアミノ酸残基位置を示す。各バー内の、影付きのボックスは、そのアミノ酸残基位置を作るために使用したコドンプールの個々のコドンの割合を表す。その影付きボックスに、積み重なった２個のボックスが付いているが、これらは、その個々のコドンの配列及びそれがコードするアミノ酸残基を示す。例えば、位置１及び２において、それらの位置に対するアミノ酸残基を作るために使用した個々のコドン配列の３５％がＮＮＳヌクレオチド配列を有する。コドン配列内の「Ｎ」は、４種類のヌクレオチド：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）又はグアニン（Ｇ）のうちいずれかを示す。「Ｓ」は、Ｃ及びＧヌクレオチドが等モル頻度であることを意味する。従って、ＮＮＳは、そのバーの上部ボックスにおいて「Ｘｘｘ」により表されている場合、いずれかのアミノ酸残基を表す。あるいは、それらの位置においてアミノ酸残基を作るために使用した個々のコドン配列の２０％が、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）をコードするＴＴＣヌクレオチド配列を有する。このライブラリーにさらなる変化を加えるために、位置３及び１２における固定されたシステイン（Ｃｙｓ）をコードするものを除き、可能性のある各アミノ酸残基位置を作るために使用したコドン配列の５％を欠失させる。ヌクレオチド及び１４個の可能性のあるアミノ酸残基位置に隣接する対応するアミノ酸配列は、この合成ペプチドリガンドがｋｎｏｂΔ−Ｌ０内に挿入される位置に相当する。このペプチドリガンドは、新しく作られたＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用して、ｋｎｏｂΔ−Ｌ０内に挿入される。この候補ペプチドリガンドを挿入した後、Ａｄ５ファイバータンパク質のアミノ酸残基５４��と５４７との間のｋｎｏｂΔ−Ｌ０に見られる付加されたＧｌｙ（Ｇ）残基を除去する。この新しく付加されたＳｅｒ残基（Ｓ）は、挿入されたペプチドリガンドのアミノ末端に隣接し、新しく付加されたＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ（ＡＡＡ）残基は、カルボキシ末端に隣接する。
【図１４】図１４は、λＤ−Ａｄ５ｋｎｏｂ発現カセットの構造を示す。λファージのＤタンパク質とＡｄ５遺伝子のノブ領域との間の領域のヌクレオチド配列（配列番号１８）及び対応するアミノ酸配列（配列番号１９）を詳述する。１６Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＳ）リピートのリンカー、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）配列及びアンバーコドン配列は、λＤタンパク質のカルボキシ末端とノブタンパク質のアミノ末端との間に位置する。数字は、野生型λＤのアミノ酸残基及びファイバーアミノ酸残基の位置を意味する。
【図１５】図１５は、λキャプシドにおける三量体Ａｄ５ノブドメインの表示を示している。マウスｍＡｂ１２Ｄ６及びヒトＡｂＮ９３（両者とも、Ａｄ５ノブの三量体型に対して特異的）、ならびにＡｂ９２抗体（単量体及び三量体構造の両方を検出する。）の、指示されるタンパク質への結合を、ファージ−ＥＬＩＳＡにより評価した。結果は、Ａ＝Ａ４０５ｎｍ−Ａ６２０ｎｍとして表す。各点は、３回測定した値の平均を表す。各値に対する標準偏差を報告する。
【図１６Ａ】図１６Ａ−Ｂは、λ表示Ａｄ５ｋｎｏｂのＣＡＲ−陽性９１１細胞との結合のＦＡＣＳ解析を示す。（Ａ）ファージ介在Ａｄ５ｋｎｏｂ−ｗｔ及びＡｄ５ｋｎｏｂΔ−ｗｔの９１１細胞との結合。ネガティブ対照（Ｓｗｔ及びｋＮＳ３）を含む。（Ｂ）ｋｎｏｂ−ｗｔタンパク質の存在下における９１１細胞へのλｋｎｏｂ−ｗｔの結合。タンパク質の非存在下又はλＮＳ３の存在下における対照反応も報告する。
【図１６Ｂ】図１６Ａ−Ｂは、λ表示Ａｄ５ｋｎｏｂのＣＡＲ−陽性９１１細胞との結合のＦＡＣＳ解析を示す。（Ａ）ファージ介在Ａｄ５ｋｎｏｂ−ｗｔ及びＡｄ５ｋｎｏｂΔ−ｗｔの９１１細胞との結合。ネガティブ対照（Ｓｗｔ及びｋＮＳ３）を含む。（Ｂ）ｋｎｏｂ−ｗｔタンパク質の存在下における９１１細胞へのλｋｎｏｂ−ｗｔの結合。タンパク質の非存在下又はλＮＳ３の存在下における対照反応も報告する。
【図１７】図１７は、λｋｎｏｂΔ−Ｌ１（Ｌ１）、λｋｎｏｂΔ−Ｌ１６（Ｌ１６）及びλｋｎｏｂΔ−Ｌ３３（Ｌ３３）からのファージ溶解物がＮＩＨ３Ｔ３細胞と結合することを示す。λファージのＮＩＨ３Ｔ３細胞への結合は、フローサイトメトリー解析によりアッセイした。データは、ＰＲＥ標識集団のパーセンテージとして報告する。
【図１８】図１８は、本発明の新規ペプチドリガンドのアミノ酸配列を示す。本ペプチドリガンドを構成するアミノ酸残基は一文字コードで示す。パネルの一番上の数字は、１４個の可能性のあるアミノ酸残基位置で構成される、本ペプチドリガンドのコアアミノ酸配列を示す。
【図１９】図１９は、ＮＩＨ３Ｔ３又はＮＭｕＬｉ細胞において野生型Ａｄ５ｌｕｃ及びＡｄ５ｌｕｃ−Ｌ０両方と比較した、Ａｄ５ｌｕｃ−ＬＸアデノウイルス派生物（Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ１、Ａｄｌｕｃ−Ｌ１６及びＡｄｌｕｃ−Ｌ３３）の遺伝子導入効率を示す。多重感染度（ｍｏｉ）５０で、指示されたウイルスをＮＩＨ３Ｔ３又はＮＭｕＬｉ細胞に感染させた。ルシフェラーゼ活性は、タンパク質１ｍｇあたりの相対発光量（ＲＬＵ）で表す。表示項目の各点は、３回測定した値の平均を表し、各値に対する標準偏差を報告する。ヒストグラムの上の値は、そのウイルスの活性と親Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔのウイルス活性との比を意味する。
【図２０】図２０は、ＮＩＨ３Ｔ３又はＮＭｕＬｉ細胞における、組み換えノブタンパク質、ｋｎｏｂΔ−Ｌ１６及びｋｎｏｂ−ｗｔとの、Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ１６感染の競合を示す。結果はヒストグラムの上部に示し、対照タンパク質存在下での細胞のルシフェラーゼ活性のパーセンテージとして表す（Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔに対してｋｎｏｂΔ−Ｌ１６、及びＡｄ５ｌｕｃ−Ｌ１６に対してｋｎｏｂ−ｗｔ。）。
【図２１】図２１は、Ａｄ５ｌｕｃ−ＬＸ派生物を用いたＣＨＯ細胞に対する感染を示す（Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ１、Ａｄ５ｌｕｃ−Ｌ１６及びＡｄ５ｌｕｃ−Ｌ３３）。様々なｍｏｉでＡｄ５ｌｕｃ派生物をＣＨＯ細胞に感染させた。ルシフェラーゼ活性は、タンパク質１ｍｇあたりの相対発光量（ＲＬＵ）で表す。表示項目の各点は、３回測定した値の平均を表し、各値に対する標準偏差を報告する。ヒストグラムの上の値は、このウイルスの活性と親Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔのウイルス活性との比を意味する。
【図２２】図２２は、Ａｄ５ｌｕｃ−ＬＸ派生物が効率的に樹状細胞（ＤＣ）に対して形質導入を行うことを示す。（Ａ）骨髄由来マウス未成熟ＤＣの感染。（Ｂ）単球由来ヒト未成熟ＤＣの感染。ルシフェラーゼ活性は、タンパク質１ｍｇあたりの相対発光量（ＲＬＵ）として表す。表示項目の各点は、３回測定した値の平均を表し、各値に対する標準偏差を報告する。
【図２３】図２３は、Ａｄ５ｌｕｃ−ＬＸ派生物がインビボにおいて筋肉への形質導入を促進することを示す。マウスの大腿四頭筋に、野生型又はＡｄ５ｌｕｃ−ＬＸ派生物（Ｌ１、Ｌ３３）  を１０９、１０８又は１０７ウイルス粒子（ｖｐ）を注射した。注射から４８時間後、マウス屠殺し、筋肉を取り出し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性は、タンパク質１ｍｇあたりの相対発光量（ＲＬＵ）として表す。各値に対する標準偏差を報告する。
【図２４】図２４は、Ａｄ５ｌｕｃ−ＬＸ派生物（Ｌ１、Ｌ１６及びＬ３３）を用いた、ヒト初代メラノサイトの感染を示す。細胞は、様々なｍｏｉでＡｄ５ｌｕｃ派生物を用いて感染させた。ルシフェラーゼ活性は、タンパク質１ｍｇあたりの相対発光量（ＲＬＵ）として表す。表示項目の各点は、３回測定した値の平均を表し、各値に対する標準偏差を報告する。ヒストグラムの上の値は、このウイルスの活性と親Ａｄ５ｌｕｃ−ｗｔのウイルス活性との比を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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