(57)【要約】  本発明は、ポリマー成分および塩成分を有する水性２相系を使用することによって、バイオマスからプラスミドＤＮＡを単離する方法であって、使用されるバイオマスの再懸濁、バイオマスのアルカリ溶解、アルカリ溶解バッチの中和、および混入物（例えば、細胞壊死組織片、ＲＮＡおよびｇＤＮＡなど）からのプラスミドＤＮＡの分離が単一反応容器（ワンポット方法）で行われることを特徴とする方法に関する。本発明に従って、アルカリ溶解バッチの中和がリン酸カリウムの添加によって、１つおよび同じ容器内で行われ、したがって、水性２相系の一方の成分が既に存在する点から、かつ水性２相系の第２成分が数平均で約６００ｇ／ｍｏｌ〜１，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥＧであるが、好ましくはＰＥＧ６００とＰＥＧ１０００との混合物から形成されるという点から、これが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー成分および塩成分を有する水性２相系を使用することによって、バイオマスからプラスミドＤＮＡを単離する方法であって、以下の段階：
ａ）バイオマスを再懸濁する段階と、
ｂ）溶解バッファーを添加し、バイオマスを溶解するのに十分に長い時間インキュベートする段階と、
ｃ）塩成分を添加し、十分に長い時間インキュベートする段階と、
ｄ）ポリマー成分を添加し、溶液を完全に混合し、相の形成を待つ段階と、を含み、使用されるバイオマスの再懸濁、バイオマスのアルカリ溶解、アルカリ溶解バッチの中和、および混入物からのプラスミドＤＮＡの分離が単一容器内で行われることを特徴とする、方法。
【請求項２】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、水性２相系のポリマー成分として使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
使用されるＰＥＧが、数平均で約６００ｇ／ｍｏｌ〜１，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは数平均で７００ｇ／ｍｏｌ〜９００ｇ／ｍｏｌ、特に好ましくは数平均で７５０ｇ／ｍｏｌ〜８８０ｇ／ｍｏｌの分子量を有することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
使用されるＰＥＧが、平均分子量６００ｇ／ｍｏｌを有するＰＥＧ（ＰＥＧ６００）３０〜５０％（ｗ／ｗ）と、平均分子量１，０００ｇ／ｍｏｌを有するＰＥＧ（ＰＥＧ１０００）５０〜７０％（ｗ／ｗ）との混合物、好ましくはＰＥＧ６００ ３３〜４５％（ｗ／ｗ）と、ＰＥＧ１０００ ５５〜６７％（ｗ／ｗ）との混合物、特に好ましくはＰＥＧ６００ ３６〜４０％（ｗ／ｗ）と、ＰＥＧ１０００ ６０〜６４％（ｗ／ｗ）との混合物、非常に特に好ましくはＰＥＧ６００ ３８％（ｗ／ｗ）と、ＰＥＧ１０００ ６２％（ｗ／ｗ）との混合物であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＰＥＧの濃度が、最低でも、２つの相が２相系の塩成分と共に形成されるほど高く、最高でも、その濃度でプラスミドＤＮＡが下相から上相へと変化する濃度を超えないほど高く、かつＲＮＡおよびｇＤＮＡなどの混入物が上相または中間相に残るように選択されることを特徴とする、請求項２から４の一項に記載の方法。
【請求項６】
ＰＥＧの含有率が少なくとも１０％（ｗ／ｗ）であり、最高でも、その濃度でプラスミドＤＮＡが下相から上相へと変化する濃度を超えないほど高く、かつＲＮＡおよびｇＤＮＡなどの混入物が上相または中間相に残ることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
リン酸三カリウム（Ｋ3ＰＯ4）、リン酸水素二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）および／またはリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、好ましくはＫ2ＨＰＯ4および／またはＫＨ2ＰＯ4が塩成分として使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記塩成分が、バッファー溶液の形で、好ましくはＫ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4バッファーとして添加されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記塩成分の濃度が、最低でも、２つの相が２相系のポリマー成分と共に形成されるほど高く、最高でも、その濃度でプラスミドＤＮＡが下相から上相へと変化する塩成分の濃度を超えないほど高く、かつＲＮＡおよびｇＤＮＡなどの混入物が上相または中間相に残るように選択されることを特徴とする、請求項７または８の一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｋ2ＨＰＯ4および／またはＫＨ2ＰＯ4が、総濃度５〜３０％（ｗ／ｗ）、好ましくは総濃度１０〜２５％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは総濃度２０％（ｗ／ｗ）で使用されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記塩成分のバッファー系が、ｐＨ５．８〜ｐＨ８．５の範囲のｐＨ、好ましくはｐＨ６．５〜ｐＨ８の範囲のｐＨを有することを特徴とする、請求項８から１０の一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｋ3ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4および／またはＫＨ2ＰＯ4、好ましくは、独占的に水性２相系の塩成分（１種または複数種）が、アルカリ溶解バッチの中和に使用されることを特徴とする、請求項１から１１の一項に記載の方法。
【請求項１３】
単離されるべきプラスミドＤＮＡが、プラスミド、コスミドおよびプラスミド、ならびに真核生物のベクターを含むことを特徴とする、請求項１から１２の一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記の真核生物のベクターが酵母ベクターであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
使用されるバイオマスが、このプラスミドＤＮＡを保有し、増殖させるか、またはその子孫に運ぶことができるすべての生物形態を含み、かつ好ましくは細菌および／または酵母であることを特徴とする、請求項１から１４の一項に記載の方法。
【請求項１６】
使用されるバイオマスが、公知の手法において、アルカリ溶解によって、好ましくは硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）を含有するバッファーを用いて破砕されることを特徴とする、請求項１から１５の一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記バイオマスが溶解バッチの攪拌で溶解されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
バイオマスの代わりに、清澄化ライセートが出発物質として使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の段階ｄ）において形成する下相がさらに、混入物から１度、精製されることを特徴とする、請求項１から１８の一項に記載の方法。
【請求項２０】
更なる精製段階（１つまたは複数）が：
ｅ）請求項１に記載の段階ｄ）で形成され、かつ混入物を含有する上相から、請求項１に記載の段階ｄ）で形成する下相を分離する段階と、
ｆ）請求項１に記載の段階ｃ）による塩成分の濃度となる形で塩成分を添加する段階と、
ｇ）請求項１に記載の段階ｄ）によるポリマー成分を再び添加する段階と、
ｈ）溶液を完全に混合し、相の形成を待つ段階と、を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の段階ｄ）で形成する下相からのプラスミドＤＮＡの前記単離および脱塩が、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって行われることを特徴とする、請求項１、１９または２０の一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の段階ｄ）における相の形成が、バッチの遠心分離によって促進されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の段階ｃ）からの混合物が、塩成分の添加中および／または添加後に攪拌されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
この方法が自動化プロセスにおいて用いられることを特徴とする、請求項１から２３の一項に記載の方法。
【請求項２５】
プラスミドＤＮＡが、工業的規模で、好ましくは溶解バッチ当たり２ｇを超えるプラスミドＤＮＡを製造する工業的規模で、製造されることを特徴とする、請求項１から２４の一項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１から２５に記載の方法によって単離されたことを特徴とする、プラスミドＤＮＡ。
【請求項２７】
遺伝子治療または遺伝子接種における、請求項２６に記載のプラスミドＤＮＡの使用。
【請求項２８】
以下の成分を含む請求項１から２５の一項に記載の方法を実施するためのキット。
ａ）ＰＥＧおよび／または、
ｂ）リン酸カリウムバッファーおよび／または、
ｃ）アルカリ溶解バッファーおよび／または、
ｄ）再懸濁バッファー、を備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー成分と塩成分とを有する水性２相系を使用することによって、例えば細菌などのバイオマスからプラスミドＤＮＡを単離するための、より短時間の簡略化された方法、およびこのようにして得られたプラスミドＤＮＡを遺伝子治療および遺伝子接種（genetic vaccination）において使用することに関する。本発明はさらに、方法を実施するためのキットに関する。
【０００２】
バイオマスからプラスミドＤＮＡを単離する可能性のうちの１つは、バイオマスを溶解し、続いて、水性２相系において清澄化されたライセートをバイオマスから分離することである。オランダの微生物学者ベイエリンク（Beijerinck）は既に１８９６年に、水中で寒天と可溶性デンプンとを混合した後、２つの水層がしばらくした後に形成することを発見している。いくつかのポリマーのこの特性は、おおよそ１９６０年にペル・アルバートソン（Per Albertson）によって再発見され、探究された。ウイルス、細胞、およびさらには細胞成分を精製するためのかかる系の可能性が認められた。生体適合性媒体の高い含水率および相成分の安定化特性のために、かかる相系はそれに対応して、敏感な生体分子の精製に特に適している。水性２相系は、２つの異なるポリマー（ポリマー／ポリマー系；例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストラン）の添加によって、またはポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）および高濃縮塩（例えば、クエン酸塩、硫酸塩、またはリン酸塩）を添加することによって得られる。
【０００３】
組換えＤＮＡを作製するための広く使用されている技術、ならびに大部分の様々な疾患を治療する遺伝子治療および遺伝接種に対して絶えず高まっている関心から、工業的規模で使用して増加させることもできる、プラスミドＤＮＡを精製する方法の需要が生じている。したがって、工業的規模で製造するために用いられるべき毒性または可燃性物質の量と同様に、物質の毒性のために、治療用途用に得られたプラスミドＤＮＡに対しては、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配遠心法またはフェノール抽出などの代替方法は考えられない。
【０００４】
従来技術は、塩成分とポリマー成分とを有する水性２相系が使用される、プラスミドＤＮＡの単離方法も含む。コール(Cole)は、ポリマー成分としてＰＥＧ、塩成分として例えば硫酸アンモニウムまたはリン酸二水素ナトリウムを使用して、プラスミドを単離するための水性２相系を発表した(Biotechniques. 1991 Jul;11(1):18, 20, 22-24)。大腸菌ＤＨ５αからのプラスミドｐＴＺ １８Ｕの単離が具体的に述べられている。ＳＤＳおよびＮａＯＨを含有する溶解バッファーによって、相当する細胞ペレットを破砕した。ライセートを適切な相形成系に導入し、その混合物を混合し、次いで遠心分離した。これを下相でもう２回繰り返した結果、新たな上相はライセートを含有しなかった。次いで、下相をトリス／ＥＤＴＡバッファーに対して透析し、このようにして最後にプラスミドを単離した。
【０００５】
リベイロ（Ribeiro）らによってさらに、ポリマー成分としてＰＥＧ、塩成分としてリン酸水素二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）を有する水性２相系が記述されている(Biotechnol. Bioeng. 2002 May 20;78(4):376-84)。大腸菌ＤＨ５αからのプラスミドｐＣＦ１−ＣＦＴＲの単離が報告されている。これに関しては、アルカリ溶解（ＮａＯＨおよびＳＤＳを含有する溶解バッファー）を使用することによって、細胞を最初に破砕し、次いでライセートを３Ｍ酢酸ナトリウムで中和した。続いて、細胞壊死組織片、タンパク質およびゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をバッチの遠心分離によって除去した。上述の水性２相系において、清澄化されたライセートを使用した。しかしながら、この方法は、装置および時間の面から非常に費用がかかるという不利点を有する。大事な事を一つ言い残したが、時間が費やされる理由は、バイオマスの溶解が最初に、この系において別個のバッチにおいて行われ、したがって複数の反応容器がかかる方法に必要であるためである。
【０００６】
本発明は、従来技術において公知の方法の不利点を克服することを意図し、特に本発明の目的は、バイオマスからプラスミドＤＮＡを単離するための従来技術において公知の方法の簡略化および時間の短縮である。さらに、本発明の目的は、実験室規模だけでなく、工業的規模でも行うことができ、その方法を用いて、例えば遺伝子治療または遺伝子接種での臨床用のプラスミドＤＮＡを作製することができる方法を提供することである。本発明の他の目的は、容易に自動化することができる方法を提供することである。
【０００７】
ポリマー成分および塩成分を有する水性２相系を使用することによって、バイオマスからプラスミドＤＮＡを単離する方法であって、用いられるバイオマスの再懸濁、バイオマスのアルカリ溶解、アルカリ溶解バッチの中和、および混入物（例えば、細胞壊死組織片、ＲＮＡおよびｇＤＮＡなど）からのプラスミドＤＮＡの分離が単一反応容器（ワンポット方法）で行われることを特徴とする方法によって、この目的は本発明に従って達成される。アルカリ溶解バッチの中和がリン酸カリウムの添加によって１つおよび同じ容器内で行われ、したがって、水性２相系の一方の成分が既に存在する点から、かつ水性２相系の第２成分が数平均で約６００ｇ／ｍｏｌ〜１，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥＧであるが、好ましくはＰＥＧ６００とＰＥＧ１０００との混合物によって形成されるという点から、これが本発明に従って可能となる。
【０００８】
本発明による方法は以下の段階：
ａ）バイオマスを再懸濁する段階と、
ｂ）溶解バッファーを添加し、バイオマスを溶解するのに十分に長い時間インキュベートする段階と、
ｃ）塩成分を添加し、十分に長い時間インキュベートする段階と、
ｄ）ポリマー成分を添加し、溶液を完全に混合し、相の形成を待つ段階と、を含む。
【０００９】
ワンポット方法のため簡単であることから、本発明による方法は、プラスミドＤＮＡを単離するための、有利に自動化可能なプロセスである。例えばクローンの迅速な同定のために、比較的小規模でのかかる方法のオートマタビリティ（automatability）の需要がますます高まっている。公知の２相系では、かかるオートマタビリティを何とか実現することができるが、かかる自動化は本発明による方法でのみ、容易に達成することができる。
【００１０】
請求される方法は、工業的規模でのプラスミドＤＮＡの作製にも有利に利用することができる。これについての理由は、単純さ、装置にかける費用が少ないこと、非毒性かつ安価な成分の使用にある。
【００１１】
本発明に対して必須である、この方法の特徴の１つは、使用されるバイオマスの再懸濁、バイオマスのアルカリ溶解、アルカリ溶解バッチの中和、および混入物からのプラスミドＤＮＡの分離が水性２相系において単一容器内で、すなわちワンポット方法として連続的に行われ、沈殿物のその後の分離除去を有する中間の遠心分離段階がないことである。本発明による方法は、この手段によって大幅に簡略化され、従来技術において公知の方法と比較して、装置の面から極めて費用が低く、かつ時間が大幅に短縮される。
【００１２】
本発明による方法では、ポリマー成分と塩成分との２相系を使用する。これは、使用される塩が、２つの異なるポリマー成分を有する２相系における第２ポリマー成分（例えば、デキストラン）と比べて比較的安価であるという利点を有する。
【００１３】
本発明の場合には、「プラスミドＤＮＡ」という用語は、プラスミドの他に、コスミドならびにプラスミド、さらに、真核生物のベクター、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）などの酵母ベクターおよび同様な構造も含む。本発明のコンテクストにおいて、「バイオマス」という用語は、例えば、細菌、酵母等の、このプラスミドＤＮＡを保有し、増殖させるか、またはその子孫（descendant）に運ぶことができるすべての生物形態を含む。
【００１４】
プラスミドＤＮＡを保有するバイオマスは、このコンテクストにおいて、適切なインキュベーションバッチの遠心分離またはバイオマスを遠心分離する他の適切な方法によって得られる。当業者は、かかる方法およびそれをどのように実施するかについてよく知っている。バイオマス、例えば細菌ペレットの再懸濁、続いて、同様にバイオマスのアルカリ溶解は、例えば市販のＱＩＡＧＥＮプラスミドキットおよびそれに含まれる再懸濁バッファーＰ１および溶解バッファーＰ２（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社）または他の適切なバッファーを使用することによって、当業者に適切であると思われる容器内で当業者に公知の手法および方法で行われる。このポイントまで、この手順は従来通り、特定の公知の説明書に従う。溶解バッファーは、成分の１つとしてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有することが好ましい。
【００１５】
有利かつ驚くべきことに、バイオマスの溶解および塩成分の添加中および添加後のライセートの溶解はさらに、力強い振盪および／または攪拌等の、溶解バッチまたはライセートの攪拌下で行うことができる。従来技術において公知の方法は、溶解バッチまたはライセートのかかる処理中に剪断力によって必然的に形成されるｇＤＮＡ断片を、単離されるべきプラスミドＤＮＡから満足できる程度まで分離することができないという不利点を有する。したがって、溶解バッチまたはライセートのかかる処理は通常、当業者であれば避ける。しかしながら、本発明による水性２相系において、このようにして形成されるｇＤＮＡ断片も、プラスミドＤＮＡから分離除去される。この結果、一方では、系がｇＤＮＡによるプラスミドＤＮＡのコンタミネーションを受け難くなり、さらに、例えば力強い攪拌、振盪等の溶解バッチの攪拌によって、さらに有利になことに、バイオマスからのプラスミドＤＮＡの放出が増加し、例えば本発明による塩成分の添加中および／または添加後の、力強い攪拌、振盪等のライセートの攪拌によって、さらに有利なことに、沈殿物凝集塊からのプラスミドＤＮＡの放出が増加し、その結果プラスミドＤＮＡの収率が著しく増加する。好ましい実施形態において、溶解バッチまたはライセートの攪拌によってせん断されるｇＤＮＡは、溶解後の別の従来の酢酸カリウム沈殿と比較して、プラスミドＤＮＡから、＞９０％程度、特に好ましくは９５％程度、非常に特に好ましくは＞９９％程度まで除去される。
【００１６】
例えば、酢酸カリウムなどの当業者には従来通りの物質は、アルカリ溶解のバッチの中和およびタンパク質の沈殿に対して報告されていない。本発明に従って、アルカリ溶解バッチは有利なことに、本発明による塩成分で中和される。本発明のコンテクストにおける塩成分は、本発明に従って理解されるリン酸カリウム、リン酸三カリウム（Ｋ3ＰＯ4）、リン酸水素二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）および／またはリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）である。好ましくは、これらのリン酸カリウムのうち１種類のみ、またはこれらのリン酸カリウムの混合物が、アルカリ溶解バッチに添加される。Ｋ2ＨＰＯ4および／またはＫＨ2ＰＯ4が使用されることが特に好ましい。ＳＤＳを溶解バッファーにおいて使用する場合、本発明による方法はさらに、ドデシル硫酸カリウム（ＰＤＳ）−タンパク質複合体の形で、溶解バッチからタンパク質を沈殿させることを可能にする。本発明に従って、２相系がポリマー成分組成のうちの一方と共に形成し、かつ本発明による濃度であるが、それが低い濃度である下相（塩相）から上相（ポリマー相）へと、その濃度でプラスミドＤＮＡが変化する、塩成分の濃度を超えず、かつＲＮＡおよびｇＤＮＡなどの混入物が上相または中間相に残るように、塩成分が使用される。限界濃度を超えた場合のみ、２相系が生じることはよく知られている。かかる限界濃度の過程を状態図にプロットすることができる。当業者にはこれを達成するのは容易である。
【００１７】
本発明による方法の好ましい実施形態において、プラスミドＤＮＡからのＲＮＡ混入物の除去は、バイオマスの溶解後に従来のように用いられる酢酸カリウム沈殿と比較して、＞８０％であり、ＲＮＡ混入物の除去は特に好ましくは＞８５％であり、ＲＮＡ混入物の除去は非常に特に好ましくは＞９０％である。
【００１８】
本発明による方法では、リン酸カリウムは、バッファーの形で添加することが好ましい。このコンテクストにおいて、バッファーは特に好ましくは、Ｋ2ＨＰＯ4とＫＨ2ＰＯ4との混合物を含有する。本発明によるバッファーは、５．８〜ｐＨ８．５のｐＨ範囲、好ましくは６．５〜ｐＨ８のｐＨ範囲で使用される。例えば、３．８３Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4および２．４５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4の組成物（ｐＨ約７となる）を本発明による方法において使用できることが特に好ましい。このコンテクストにおいて、Ｋ2ＨＰＯ4およびＫＨ2ＰＯ4は、２相系に対して総濃度５〜３０％（ｗ／ｗ）、好ましくは総濃度１０〜２５％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは総濃度２０％（ｗ／ｗ）で使用される。リン酸カリウムは通常、氷冷温度から室温の温度範囲で添加される。本発明のコンテクストにおける室温とは、１８〜２５℃の温度範囲を示す。氷冷リン酸バッファーが、本発明による方法で使用されることが好ましい。リン酸カリウムを添加した後、長いインキュベーション時間は有利なことに、必要ではなく、添加後の、できる限り完全かつ均一な、溶液の完全な混合が決め手となる。インキュベーション時間は通常、約５〜１５分である。好ましくは上記のように、塩成分の添加中および／または添加後に、例えば力強い振盪、攪拌等にかけるなどして、バッチを攪拌する。
【００１９】
本発明のコンテクストにおいてポリマー成分はＰＥＧである。本発明による方法の他の必須の特徴は、数平均で約６００〜１，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは数平均で７００〜９００ｇ／ｍｏｌ、特に好ましくは数平均で７５０〜８８０ｇ／ｍｏｌの分子量を有するポリエチレングリコールが、２相系の２つの成分のうちの１つとして使用されることである。本発明において、使用されるＰＥＴＧは、平均分子量６００ｇ／ｍｏｌを有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ６００）と、平均分子量１，０００ｇ／ｍｏｌを有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ１０００）との混合物を含むことが好ましい。どちらもＰＥＧも市販されている（例えば、スイス，ブッフスのフルカ社）。このコンテクストにおいて、すぐ使用できるＰＥＧ混合物は、ＰＥＧ６００ ３０〜５０％（ｗ／ｗ）およびＰＥＧ１０００ ５０〜７０％（ｗ／ｗ）、好ましくはＰＥＧ６００ ３３〜４５％（ｗ／ｗ）およびＰＥＧ１０００ ５５〜６７％（ｗ／ｗ）、特に好ましくはＰＥＧ６００ ３６〜４０％（ｗ／ｗ）およびＰＥＧ１０００ ６０〜６４％（ｗ／ｗ）、非常に特に好ましくはＰＥＧ６００ ３８％（ｗ／ｗ）およびＰＥＧ１０００ ６２％（ｗ／ｗ）を含む。
【００２０】
本発明による水性２相系中でのＰＥＧの濃度は、２つの相が塩成分と共に形成されるが、その相においてそれが低い濃度である下相（塩相）から上相へとその濃度でプラスミドＤＮＡが変化する、ＰＥＧ濃度を超えないように選択される。しかしながら、好ましくは、ＰＥＧ含有率は少なくとも１０％（ｗ／ｗ）であり、上限は、その相においてそれが低い濃度である下相から上相へとその濃度でプラスミドＤＮＡが変化する、ＰＥＧの濃度によって決定される。ＰＥＧを添加した後、その溶液は、好ましくは１０〜５０℃、特に好ましくは１５〜４０℃の温度を有するべきである。バッチの体積に応じて、数分から数時間かかって相が形成した後、プラスミドＤＮＡは、塩を含有する下相中にある。相の形成は任意に、バッチの遠心分離によって促進することができ、その結果として有利なことに、本発明による方法の時間がさらに短縮される。かかる遠心分離段階が行われる条件は、当業者にはよく知られている。
【００２１】
水性２相系は、実際には相における溶解性によってのみ制限される、精製すべきプラスミドＤＮＡに対するはるかに高い容量を有するという、マトリックスまたは他の固相に基づいて働く相系を超える利点を有する。さらに、方法の大きさは、装置が非常に単純であるため、実質的に所望のように選択することができる。しかしながら、本明細書で請求される簡略化のみによって、自動化と、これとは無関係に、例えば、溶解バッチ当たり２ｇを超えるプラスミドＤＮＡを製造する工業的規模での製造と、のどちらも容易に達成することができる。プラスミドＤＮＡは、本発明によって非常に高い程度までタンパク質、ＲＮＡおよびｇＤＮＡから有利に除去することもできる。本発明による方法によって単離されるプラスミドＤＮＡは、更なる精製（例えばＱＩＡＧＥＮ−Ｒｅｓｉｎ（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社）による）段階後に、遺伝子治療または遺伝子接種において問題なく用いることができる。このように、非毒性物質を使用し、かつかかる費用が比較的少ない装置において、非常に低い出費で大量の高純度プラスミドＤＮＡを有利に製造することができる。しかしながら、これに関しては、例えばＣｓＣｌ密度勾配遠心法またはフェノール抽出などの他の単離法と比較して、本発明による２相系において使用される物質は許容可能であり、かつ精製プラスミドＤＮＡから完全かつ容易に除去することができることが述べられる。
【００２２】
本発明による方法の大きな利点の１つは、意外なことに、単離されるべきプラスミドＤＮＡから開環状プラスミドＤＮＡ（ｏｃＤＮＡ）が減少することである。従来技術において公知の方法で単離されたプラスミドＤＮＡと比較して、本発明による方法で単離されるプラスミドＤＮＡは、好ましいスーパーコイル状（ｓｃＤＮＡ）と比較してｏｃＤＮＡ混入物の含有率が低い。したがって、この方法は、プラスミドトポイソマーの分離、つまりｏｃＤＮＡおよびｓｃＤＮＡの分離に対する選択性を示す。正確には、プラスミドトポイソマーの分離および既に言及されているｇＤＮＡの低減は、特に、工業的規模でのプラスミドＤＮＡの単離およびいくつかの用途におけるプラスミドＤＮＡのその後の臨床使用中に極めて重要であり、プラスミドＤＮＡを単離する今までの方法では満足な程度まで実現されていない。
【００２３】
本発明による他の実施形態において、段階ｄ）で形成するプラスミドＤＮＡを含有する下相は、混入物を含有する上相から分離される。次いで、下相は、段階ｃ）による塩成分の濃度となる形で塩成分を添加することによって、次いで、段階ｄ）によるポリマー成分を添加することによって、２相系を形成するために再度セットアップされる。本発明による方法の最後の部分のこの繰り返しにおいて、ポリマー成分を添加した後に、再び混合物を完全に混合し、相の形成を待つ。ここでも、プラスミドＤＮＡは下相にある。この段階は任意に、１回または当業者にとって適切だと思われる回数で行うことができる。この任意の段階を実施することによって、プラスミドＤＮＡの精製が繰り返され、その結果、例えばＲＮＡなどの混入物がプラスミドＤＮＡからさらに除去される。更なる精製段階（１つまたは複数）は以下の段階：
ｅ）段階ｄ）で形成され、混入物を含有する上相から、段階ｄ）で形成する下相を分離する段階と、
ｆ）段階ｃ）による塩成分の濃度となる形で塩成分を添加する段階と、
ｇ）段階ｄ）によるポリマー成分を再び添加する段階と、
ｈ）溶液を完全に混合し、相の形成を待つ段階と、を含む。
【００２４】
本発明による方法の後、段階ｄ）で形成された下相から、引き続きプラスミドＤＮＡを得なければならない。段階ｄ）で形成された下相からのプラスミドＤＮＡの単離および脱塩は従来法で、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって行われる。しかしながら、当業者にとって適切だと思われる、下相からのプラスミドＤＮＡの単離および／または脱塩の他の方法も、本発明のコンテクストにおいて使用することができる。
【００２５】
代替の実施形態において、バイオマスの代わりに、単離すべきプラスミドＤＮＡを含有する清澄化ライセートも、本発明による方法において出発物質として用いることができる。本発明のこの実施形態において、当然のことながら溶解段階は省略されるか、ライセートの清澄化がさらに、溶解段階後に行われる。当業者にとって適切だと思われる、すべての方法を清澄化ライセートの調製に使用することができる。従来技術における従来の方法は、酢酸カリウムで沈殿させ、続いてその混合物を遠心分離して、形成された沈殿物を分離除去することによる、ライセートの清澄化である。この場合については、上記の記載に相当するリン酸カリウムが最初に、清澄化ライセートに添加され、次いで、本発明に従ってＰＥＧが添加される。他のすべての段階は、バイオマスが開始点として用いられる、本発明による方法と同一である。ライセートを清澄化するための上述の沈殿段階をリン酸カリウムで行う場合、記載のようにＰＥＧは清澄化ライセートに直接添加される。リン酸化リウムが使用される場合および酢酸カリウムが使用される場合のどちらの場合にも、上述のように沈殿反応に必要とされる実験条件は、当業者にはよく知られている。
【００２６】
図面の説明
図１は、ゲル電気泳動（０．８％アガロース）の形で、本発明による方法（実施例１参照）によって大腸菌ＤＨ５αからｐＣＭＶβを単離した結果を示す。長さ標準はトラック１で見ることができる。トラック２は未処理の上相を示し、その相中には膨大な量のＲＮＡが存在する。プラスミドＤＮＡは上相中で検出することができなかった。トラック３は未処理の下相を示し、その相中では、プラスミドは非常に濃度が高く（広く、はっきりしないバンド）、ＲＮＡはその相中で検出することができなかった。トラック４は、限外濾過によって脱塩した後の下相を示す。ここでもまた、プラスミドＤＮＡのみを検出することができ、プラスミドは大部分が、望ましいスーパーコイル状（ｓｃＤＮＡ）であり、微量の開環状プラスミドＤＮＡ（ｏｃＤＮＡ）も検出することができた。トラック５はｐＣＭＶβ標準（１８μｇ／ｍｌ）を示し、トラック６はｇＤＮＡ標準（２３μｇ／ｍｌ）を示す。
【実施例】
【００２７】
実施例１：大腸菌ＤＨ５αからｐＣＭＶβを得る
プラスミドｐＣＭＶβを単離するために、大腸菌ＤＨ５αの一晩の培養（１ＬのＬＢ培地：５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌトリプトン、８５．６ｍＭ  ＮａＣｌ）からのバイオマス０．６ｇを遠心分離（５，０００×ｇ，１０分，４℃）によって得た。再懸濁バッファーＰ１（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社）６．９ｍｌを添加し、室温で激しく振盪することによって、細菌ペレットを再懸濁した。再懸濁が完了したら、溶解バッファーＰ２（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社；室温）７．５ｍｌを添加し、容器を数回反転させることによって、バッチを混合した。５分後、Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4バッファー（ＫＨ2ＰＯ4 ２．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ５ｇ、Ｈ2Ｏ ７．５ｍｌ；ｐＨ７；氷冷された）を全バッチに添加し、容器を注意して反転し、バッチを氷上で１０分間インキュベートした。続いて、全バッチを室温に温め、ＰＥＧ（ＰＥＧ６００ ２．１３７ｇ、ＰＥＧ１０００ ３．４８８ｇ、Ｈ2Ｏ １．８７５ｍｌ）を添加し、バッチを注意して混合した。相分離には数分かかった。
【００２８】
ゲル電気泳動により、下相中にｇＤＮＡおよびＲＮＡを検出できなかった。プラスミドＤＮＡのバンドは、下相において塩濃度が高いために、図１において、通常と異なり、広く、ぼんやりして見える（トラック３）。限外濾過による下相の脱塩（トラック４）によって、プラスミド標準（トラック５）に実質的に相当する、明瞭なバンドがそれに応じて生じる。ゲノムＤＮＡおよびタンパク質が、ドデシル硫酸カリウム（ＰＤＳ）凝集塊および中間相において見出されるはずである。
【００２９】
実施例２：大腸菌ＤＨ５αからｐＣＭＶβを得る（２０％ＰＥＧ；１２％リン酸塩）
プラスミドｐＣＭＶβを単離するために、再懸濁バッファーＰ１（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社）中の１０％（ｗ／ｗ）バイオマス懸濁液（大腸菌ＤＨ５α）を室温で激しく振盪することによって調製した。再懸濁が完了したら、このバッチ１０ｇを溶解バッファーＰ２（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社；室温）１０ｍｌと混合し、容器を数回反転させた。５分後、Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4バッファー（ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ４ｇ、Ｈ2Ｏ ６ｍｌ；ｐＨ７．４；氷冷）を全バッチに添加し、バッチを氷上で１０分間インキュベートした。オーバヘッド振盪機上で室温にて１０分間、バッチをインキュベートした。続いて、バッチを室温に温め、ＰＥＧ（ＰＥＧ６００ ３．８ｇ、ＰＥＧ１０００ ６．２ｇ、Ｈ2Ｏ ８．００３ｍｌ）を添加し、オーバヘッド振盪機上で室温にてさらに１０分間、バッチを混合した。１，３００×ｇで５分間遠心分離することによって、相分離を促進した。得られた下相は体積約１５ｍｌであった。
【００３０】
ＨＰＬＣ（ＨＰ１０９０，ドイツ，ＷａｌｄｂｒｏｎｎのＡｇｉｌｅｎｔ社）および（ＮＨ4）2ＳＯ4勾配を用いたｓｏｕｒｃｅ  １５ＰＨＥ  ４．６／１００（ドイツ，フライブルクのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して、分析を行った。２６０ｎｍでの吸光測定による検出を行った。以下の値は、２相系：プラスミドＤＮＡ４４μｇ／ｍｌおよびＲＮＡ１２３μｇ／ｍｌの２相系の下相について決定された。
【００３１】
これらの値を清澄化ライセートからの値と比較した。この清澄化ライセートを調製するために、最初に記載されている１０％バイオマス懸濁液１ｍｌを、容器を数回反転させることによって１ｍｌ溶解バッファーＰ２（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社；室温）と混合し、バッチを室温で５分間インキュベートした。次いで、中和バッファーＰ３（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社；氷冷）１ｍｌを添加し、オーバヘッド振盪機上で室温にて１０分間、バッチをインキュベートした。遠心分離した後（５分，１，３００×ｇ，室温）、上清（清澄化ライセート）中のプラスミドの濃度およびＲＮＡの濃度をＨＰＬＣによって測定した。使用されたバイオマスは、清澄化ライセート中に、バイオマスｇ当たりプラスミドＤＮＡ７１０μｇ、バイオマスｇ当たりＲＮＡ１１ｍｇを含有した。
【００３２】
清澄化ライセートにおけるバイオマスの開始値に基づいて、２相系ではプラスミド収率９３％およびＲＮＡ除去率（RNA depletion）８３％という結果となった。
【００３３】
実施例３：大腸菌ＤＨ５αからｐＣＭＶβを得る（１３％ＰＥＧ；１６％リン酸塩）
プラスミドｐＣＭＶβを単離するために、再懸濁バッファーＰ１（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社）中の１０％（ｗ／ｗ）バイオマス懸濁液（大腸菌ＤＨ５α）を室温で激しく振盪することによって調製した。再懸濁が完了したら、このバッチ１０ｇを溶解バッファーＰ２（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社；室温）１０ｍｌと混合し、容器を数回反転させた。５分後、Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4バッファー（ＫＨ2ＰＯ4 ２．６６６ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ５．３３３ｇ、Ｈ2Ｏ ８ｍｌ；ｐＨ７．４；氷冷）を全バッチに添加し、オーバヘッド振盪機上で室温にて１０分間、バッチをインキュベートした。続いて、全バッチを室温に温め、ＰＥＧ（ＰＥＧ６００ ２．４７１ｇ、ＰＥＧ１０００ ４．０３２ｇ、Ｈ2Ｏ ７．４９８ｍｌ）を添加し、オーバヘッド振盪機上で室温にてさらに１０分間、バッチを混合した。１，３００×ｇで５分間遠心分離することによって、相分離を促進した。得られた下相は体積約２５ｍｌであった。
【００３４】
ＨＰＬＣ（ＨＰ１０９０，ドイツ，ＷａｌｄｂｒｏｎｎのＡｇｉｌｅｎｔ社）および（ＮＨ4）2ＳＯ4勾配を用いたｓｏｕｒｃｅ  １５ＰＨＥ  ４．６／１００（ドイツ，フライブルクのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して、分析を行った。２６０ｎｍでの吸光測定による検出を行った。以下の値は、２相系：プラスミドＤＮＡ２８．４μｇ／ｍｌおよびＲＮＡ１８７μｇ／ｍｌの２相系の下相について決定された。
【００３５】
これらの値を清澄化ライセートからの値と比較した。この清澄化ライセートを調製するために、最初に記載されている１０％バイオマス懸濁液１ｍｌを、容器を数回反転させることによって溶解バッファーＰ２（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社；室温）１ｍｌと混合し、バッチを室温で５分間インキュベートした。次いで、中和バッファーＰ３（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社；氷冷）１ｍｌを添加し、オーバヘッド振盪機上で室温にて１０分間、バッチをインキュベートした。遠心分離した後（５分，１，３００×ｇ，室温）、上清（清澄化ライセート）中のプラスミドの濃度およびＲＮＡの濃度をＨＰＬＣによって測定した。使用されたバイオマスは、清澄化ライセート中に、バイオマスｇ当たりプラスミドＤＮＡ７１０μｇおよびバイオマスｇ当たりＲＮＡ１１ｍｇを含有した。
【００３６】
清澄化ライセートにおけるバイオマスの開始値に基づいて、２相系ではプラスミド収率＞９９％およびＲＮＡ除去率５８％という結果となった。
【００３７】
実施例４：大腸菌ＤＨ５αからｐＣＭＶβを得る（３０％ＰＥＧ；１０％リン酸塩）
プラスミドｐＣＭＶβを単離するために、再懸濁バッファーＰ１（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社）中の１０％（ｗ／ｗ）バイオマス懸濁液（大腸菌ＤＨ５α）を室温で激しく振盪することによって調製した。再懸濁が完了したら、このバッチ１０ｇを溶解バッファーＰ２（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社；室温）１０ｍｌと混合し、容器を数回反転させた。５分後、Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4バッファー（ＫＨ2ＰＯ4 １．６６６ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ３．３３３ｇ、Ｈ2Ｏ ５ｍｌ；ｐＨ７．４；氷冷）を全バッチに添加し、オーバヘッド振盪機上で室温にて１０分間、バッチをインキュベートした。続いて、全バッチを室温に温め、ＰＥＧ（ＰＥＧ６００ ５．７ｇ、ＰＥＧ１０００ ９．３ｇ、Ｈ2Ｏ ５ｍｌ）を添加し、４０℃の水浴中で１５分間、バッチを温度制御し、容器を数回反転させた。１，３００×ｇで５分間遠心分離することによって、相分離を促進した。得られた下相は体積約１１ｍｌであった。
【００３８】
ＨＰＬＣ（ＨＰ１０９０，ドイツ，ＷａｌｄｂｒｏｎｎのＡｇｉｌｅｎｔ社）および（ＮＨ4）2ＳＯ4勾配を用いたｓｏｕｒｃｅ  １５ＰＨＥ  ４．６／１００（ドイツ，フライブルクのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して、分析を行った。２６０ｎｍでの吸光測定による検出を行った。以下の値は、２相系：プラスミドＤＮＡ６１．８μｇ／ｍｌおよびＲＮＡ１７３μｇ／ｍｌの２相系の下相について決定された。
【００３９】
これらの値を清澄化ライセートからの値と比較した。この清澄化ライセートを調製するために、最初に記載されている１０％バイオマス懸濁液１ｍｌを、容器を数回反転させることによって溶解バッファーＰ２（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社；室温）１ｍｌと混合し、バッチを室温で５分間インキュベートした。次いで、中和バッファーＰ３（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社；氷冷）１ｍｌを添加し、オーバヘッド振盪機上で室温にて１０分間、バッチをインキュベートした。遠心分離した後（５分，１，３００×ｇ，室温）、上清（清澄化ライセート）中のプラスミドの濃度およびＲＮＡの濃度をＨＰＬＣによって測定した。使用されたバイオマスは、清澄化ライセート中に、バイオマスｇ当たりプラスミドＤＮＡ７１０μｇおよびバイオマスｇ当たりＲＮＡ１１ｍｇを含有した。
【００４０】
清澄化ライセートにおけるバイオマスの開始値に基づいて、２相系ではプラスミド収率９６％およびＲＮＡ除去率８３％という結果となった。
【００４１】
実施例５：ｇＤＮＡの除去
再懸濁バッファーＰ１（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社）４ｇおよびバイオマス（大腸菌ＤＨ５α，プラスミドを含有しない）１ｇを計量することによって、２０％バイオマス懸濁液を調製した。超音波（変換器タイプ１０２を有するＢｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０，設定：サイクル４０％；強度４、２回、３分）でこれを氷上で破砕した。それによってｇＤＮＡは細胞から放出され、激しい剪断力にかけられ、断片化された。次いで、５，０００×ｇおよび４℃で１０分間、バッチを遠心分離した。次いで、溶解バッファーＰ２（ドイツ，ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ社；室温）３００μｌを上清３００μｇに添加し、バッチを混合した。５分後、Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4バッファー（ＫＨ2ＰＯ4 １００μｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ２００μｇ、Ｈ2Ｏ ３００μｌ；ｐＨ７．４；氷冷）を全バッチと混合し、オーバヘッド振盪機上で室温にて１０分間、バッチをインキュベートした。続いて、全バッチを室温に温め、ＰＥＧ（ＰＥＧ６００ ８５．５μｇ、ＰＥＧ１０００ １３９．５μｇ、Ｈ2Ｏ ７５μｌ）を添加し、オーバヘッド振盪機上で室温にてさらに１０分間、バッチを混合した。１，３００×ｇで５分間遠心分離することによって、相分離を促進した。下相は体積約０．７５ｍｌであった。
【００４２】
ＨＰＬＣ（ＨＰ１０９０，ドイツ，ＷａｌｄｂｒｏｎｎのＡｇｉｌｅｎｔ社）および（ＮＨ4）2ＳＯ4勾配を用いたｓｏｕｒｃｅ  １５ＰＨＥ  ４．６／１００（ドイツ，フライブルクのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して、分析を行った。２６０ｎｍでの吸光測定による検出を行った。破砕操作の上清（超音波処理後に遠心分離）中のｇＤＮＡ濃度をｇＤＮＡ４３３μｇ／ｍｌと決定した。２相系の下相において、ＨＰＬＣによって、残留濃度ｇＤＮＡ１．７μｇ／ｍｌが決定され、激しくせん断されたｇＤＮＡの＞９９％の除去率に相当する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ゲル電気泳動（０．８％アガロース）の形で、本発明による方法（実施例１参照）によって大腸菌ＤＨ５αからｐＣＭＶβを単離した結果を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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