(57)【要約】  多量体分子を生成する方法が開示される。本発明の方法は二重特異性抗体のような多量体分子の両イン・ビトロおよびイン・ビボの生成のために有用である。
2007515493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントを含有する第１の分子を提供し；
ｂ）ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントを含有する第２の分子を提供し；
ｃ）溶液において第１の分子と第２の分子を混合し；そして
ｄ）混合液をインキュベートする
段階を含んでなる、多量体分子の生成方法。
【請求項２】
ａ）ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４重鎖フラグメントを含有する第１の抗体を提供し；
ｂ）ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４重鎖フラグメントを含有する第２の抗体を提供し；
ｃ）溶液において第１の抗体と第２の抗体を混合し；そして
ｄ）混合液をインキュベートする
段階を含んでなる、二重特異性抗体の生成方法。
【請求項３】
溶液が生理食塩溶液を含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
生理食塩溶液のｐＨが約６．０〜約８．０である、請求項１または２の方法。
【請求項５】
生理食塩溶液がＤ−ＰＢＳである、請求項１または２の方法。
【請求項６】
インキュベーションがほぼ室温で実施される、請求項１または２の方法。
【請求項７】
ａ）ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４重鎖フラグメントを含有する第１の分子を提供し；
ｂ）ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４重鎖フラグメントを含有する第２の分子を提供し；
ｃ）動物に対して第１の分子を投与し；そして
ｄ）動物に対して第２の分子を投与する
段階を含んでなる、イン・ビボでの多量体分子の生成方法。
【請求項８】
ａ）ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４重鎖フラグメントを含有する第１の抗体を提供し；
ｂ）ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４重鎖フラグメントを含有する第２の抗体を提供し；
ｃ）動物に対して第１の抗体を投与し；そして
ｄ）動物に対して第２の抗体を投与する
段階を含んでなる、イン・ビボでの二重特異性抗体の生成方法。
【請求項９】
動物が哺乳動物である、請求項７または８の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の抗体の投与が注射による投与である、請求項７または８の方法。
【請求項１１】
ＩｇＧ４由来の重鎖フラグメントがアミノ酸配列ＣＰＳＣ（配列番号：１）を含有する、請求項１、２、７または８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は二重特異性抗体のような多量体分子の生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療試薬としてのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用は、種々の疾病の処置への有効なアプローチになっている。その上、ｍＡｂは、種々の疾病の免疫病因論のより良好な理解を得るための有力な研究道具を表す。ＩｇＧイソタイプｍＡｂは治療試薬および研究道具として一般に使用される。
【０００３】
ほとんどのＩｇＧタイプの抗体は、２本の同一重（Ｈ）鎖と２本の同一軽（Ｌ）鎖から形成されるホモ二量体分子であり、典型的にはＨ２Ｌ２と略記される。かくして、これらの分子は一般に抗原結合に関しては二価である、すなわち、ＩｇＧ分子の両抗原結合性（Ｆａｂ）アームは同一な結合特異性を有する。
【０００４】
ＩｇＧ４イソタイプ重鎖は、重鎖間または重鎖内いずれのジスルフィド結合をも形成することが可能なそれらのヒンジ部中にＣＰＳＣ（配列番号：１）モチーフを含有している、すなわち、ＣＰＳＣモチーフ中の２個のＣｙｓ残基は、他のＨ鎖中の対応するＣｙｓ残基とジスルフィド結合されてもよく（重鎖間）、あるいは特定のＣＰＳＣモチーフ内の２個のＣｙｓ残基は、各々他の残基とジスルフィド結合されてもよい（重鎖内）。イン・ビボのイソメラーゼ酵素はＩｇＧ４分子の重鎖間結合を重鎖内結合に変換することが可能であり、そしてその逆も可能であると考えられている（図１）（非特許文献１）。したがって、ヒンジ部に重鎖内結合を有するそれらのＩｇＧ４分子におけるＨＬペアは、互いに共有的に会合されないので、それらはＨＬ単量体に分離し、次に、これが他のＩｇＧ４分子から得られるＨＬ単量体と再会合して、二重特異性の、ヘテロ二量体のＩｇＧ４分子を形成することができるであろう（図２）。二重特異性ＩｇＧ抗体では、抗体分子の２個のＦａｂはそれらが結合するエピトープにおいて異なる。
【０００５】
動物研究では、二重特異性抗体に基づく処置物の投与が腫瘍細胞を破壊し、そしてがんの生存率を改善することが例証された。さらに、二重特異性抗体は、標的抗原のレベルが低い場合でさえ、慣用の抗体よりも低濃度での処置に有効であることが報告された。参照、非特許文献２および非特許文献３。
【０００６】
二重特異性抗体による疾病の処置の潜在的な有用性は、これらの分子を生産するために多数の異なるアプローチをもたらした。これらは、２種の別々なＡｂを生成する２種のハイブリドーマ系の細胞を融合することによって形成されたヘテロハイブリドーマ細胞系、２種の別々なＦａｂフラグメントの化学的なコンジュゲーション、遺伝子工学的に生成されたジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、２個のＦｖドメインのＦｏｓ／Ｊｕｎ媒介の二量体化および非特許文献２に概説される他の技術の使用を含む。
【０００７】
しかしながら、二重特異性ｍＡｂの生成に対する多くのこれらのアプローチは、労力の集中と費用を要する。また、多くの例では、これらの方法によって生産される二重特異性抗体は十分には組み立てられず、そして多くの望ましくない分子種から所望される二重特異性分子種を精製することが要求される。さらに、各先行アプローチは、イン・ビボの研究を開始するか、または二重特異性抗体を利用する処置に着手する前に、二重特異性抗体の調製を必要とする。
【０００８】
かくして、両イン・ビトロおよびイン・ビボで、二重特異性抗体のような多量体分子を速やかに生成できる方法の必要性が存在する。
【非特許文献１】Ａａｌｂｅｒｓｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｉｍｕｕｎｏｌｏｇｙ  １０５，９−１９（２００２）
【非特許文献２】Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １８，３１−４０（２００１）
【非特許文献３】Ｒｅｉｐｐ  ａｎｄ  Ｖａｌｅｒｉｕｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０，ｐｐ．５０７−５１１（２００２）
【発明の開示】
【０００９】
本発明の１つの態様は、ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントを含有する第１の分子を提供し；ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントを含有する第２の分子を提供し；溶液において第１の分子と第２の分子を混合し；そして混合液をインキュベートする段階を含んでなる、多量体分子を生成する方法である。
【００１０】
本発明のその他の態様は、ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４重鎖フラグメントを含有する第１の抗体を提供し；ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４重鎖フラグメントを含有する第２の抗体を提供し；溶液において第１の抗体と第２の抗体を混合し；そして混合液をインキュベートする段階を含んでなる、二重特異性抗体を生成する方法である。
【００１１】
本発明のその他の態様は、ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４重鎖フラグメントを含有する第１の分子を提供し；ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４重鎖フラグメントを含有する第２の分子を提供し；動物に対して第１の分子を投与し；そして動物に対して第２の分子を投与する段階を含んでなる、イン・ビボで多量体分子を生成する方法である。
【００１２】
本発明のその他の態様は、ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４重鎖フラグメントを含有する第１の抗体を提供し；ヒンジ部重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４重鎖フラグメントを含有する第２の抗体を提供し；動物に対して第１の抗体を投与し；そして動物に対して第２の抗体を投与する段階を含んでなる、イン・ビボで二重特異性抗体を生成する方法である。
【００１３】
限定されるものではないが、本明細書において引用される特許および特許出願を含む、すべての公表物は、完全な記述をとおして引用によって本明細書に組み入れられている。
【００１４】
本明細書で使用されるところの用語「抗体」は、広範な意味において意味され、そしてポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体および抗体フラグメントを含む、免疫グロブリンまたは抗体分子を含む。
【００１５】
典型的には、抗体軽鎖は、１個の共有ジスルフィド結合によって抗体重鎖に結合されているが、抗体の２本のＨ鎖間のジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖間で異なる。また、各重鎖および軽鎖は、規則的に間を空けた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、１つの末端に可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続く多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、１つの末端に可変ドメイン（ＶＬ）およびその他の末端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと並列され、そして軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並列されている。いずれの脊椎動物種の抗体軽鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２種の明確に異なるタイプ、すなわちカッパ（κ）およびラムダ（λ）の１つに指定することができる。
【００１６】
免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５種の主要クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに指定することができる。ＩｇＡおよびＩｇＧは、さらに、イソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のようにサブクラスに分けられる。
【００１７】
本明細書で使用されるところの用語「二重特異性抗体」は、２種の異なるエピトープを結合させる抗体を意味する。
【００１８】
本明細書で使用されるところの用語「ＩｇＧ４抗体重鎖フラグメント」は、完全なＩｇＧ４重鎖またはその誘導体のようなＩｇＧ４重鎖から得られるペプチドまたはポリペプチド、、例えば、ペプシンまたはマトリックス・金属プロテイナーゼ−３消化によって誘導されるか、または組み換え技術によって発現することができるような、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントまたはホモ二量体Ｆ（ａｂ’）２ドメインを安定化するように設計された改変Ｆ（ａｂ’）２様フラグメントを意味する。さらに、ＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントは、ＣＰＳＣのヒンジ部配列モチーフ（配列番号：１）を有することによってＩｇＧ４様であるように改変されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３重鎖を含んでもよい。
【００１９】
本明細書で使用されるところの用語「ミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）」は、一般式（Ｉ）：
（Ｖ１（ｎ）−Ｐｅｐ（ｎ）−Ｆｌｅｘ（ｎ）−Ｖ２（ｎ）−ｐＨｉｎｇｅ（ｎ）−
ＣＨ２（ｎ）−ＣＨ３（ｎ））（ｍ）                    （Ｉ）
［式中、Ｖ１は免疫グロブリン可変部のＮ末端の少なくとも１部分であり、Ｐｅｐはエピトープに結合する少なくとも１種の生物活性ペプチドであり、Ｆｌｅｘは、ミメティボディをもう一方の方向づけと結合特性をもつようにさせることによって構造的柔軟性を与えるポリペプチドであり、Ｖ２は免疫グロブリン可変部のＣ末端の少なくとも１部分であり、ｐＨｉｎｇは免疫グロブリンヒンジ部の少なくとも１部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２定常部の少なくとも１部分であり、そしてＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３定常部の少なくとも１部分であり、ここでｎおよびｍは整数１〜１０であってもよい］
を有するタンパク質を意味する。ミメティボディは、構築物に存在する重鎖定常ドメインアミノ酸配列に応じて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような免疫グロブリン分子の異なるタイプの特性および機能を模していてもよい。
【００２０】
本明細書で使用されるところの用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（または抗体フラグメント）を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異性であり、典型的には単一な抗原決定基に対向される。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な特徴を示し、いずれか特定の方法による抗体の生産を必要としない。例えば、マウスｍＡｂはＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）のハイブリドーマ法によって作成されてもよい。アクセプター抗体（典型的には、ヒトのようなその他の哺乳動物種）由来の軽鎖および重鎖定常部に関連してドナー抗体（典型的には、マウス）由来の軽鎖および重鎖可変部を含有するキメラｍＡｂは、米国特許第４，８１６，５６７号に開示された方法によって調製されてもよい。非ヒト・ドナー免疫グロブリン（典型的にはマウス）由来のＣＤＲおよび場合によっては結合親和力を維持するように変えられたフレームワーク支持残基を有する１種以上の免疫グロブリンに由来する分子の残りの免疫グロブリン由来の部分を有する、ヒト化ｍＡｂは、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８６：１００２９−１００３２，（１９８９）およびＨｏｄｇｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１，（１９９１）において開示された技術によって得ることができる。
【００２１】
いずれの非ヒト配列もを欠く完全にヒトのｍＡｂは、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１，（１９９６）およびＭｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６，（１９９７）において引用される技術によってヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから調製されてもよい。ヒトｍＡｂはまた、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，（２０００）およびＫｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７−８４，（２００１）によって引用される技術によってファージ・ディスプレイライブラリーから調製され、そして最適化されてもよい。
【００２２】
本明細書および請求項において使用されるところの用語「多量体分子」は、４次構造を有し、そして２個以上のサブユニットの会合によって形成される。
【００２３】
本発明は、イン・ビトロまたはイン・ビボにおいて多量体分子または二重特異性抗体を生成するために有用な方法を提供する。本発明の１つの実施態様では、多量体分子は、重鎖内ヒンジ部ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントを含有する第１の分子を提供し、重鎖内ヒンジ部ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントを含有する第２の分子を提供し、溶液において第１および第２の分子を混合し、そして混合液をインキュベートすることによってイン・ビトロで生成される。
【００２４】
本発明のその他の実施態様では、二重特異性抗体は、重鎖内ヒンジ部ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントを含有する第１の抗体を提供し、重鎖内ヒンジ部ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントを含有する第２の抗体を提供し、溶液において第１および第２の分子を混合し、そして混合液をインキュベートすることによってイン・ビトロで生成される。
【００２５】
本発明の方法では、分子または抗体は生理食塩溶液において混合されてもよい。１つの実施態様では、生理食塩溶液は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）を含んでもよい。
【００２６】
当業者は、本発明の方法において混合する分子または抗体の量を容易に決定することができる。例えば、そのような量は、約３５μｇ／ｍｌ〜約７５μｇ／ｍｌである各分子または抗体の濃度をもたらす量であってもよい。
【００２７】
本発明の方法では、インキュベーションは温度の範囲を越えて実施されてもよい。そのような温度は当業者によって認識でき、そして例えば、変性または分解のような有害な物理的変化が混合される分子または抗体において起こらないインキュベーション温度を含む。１つの実施態様では、インキュベーションは室温で実施される。典型的には室温は約１０℃〜約３５℃である。代表的温度は約２５℃である。
【００２８】
本発明はまた、イン・ビボにおいて多量体分子または二重特異性抗体を生成するために有用な方法を提供する。本発明のこの実施態様では、多量体分子は、重鎖内ヒンジ部ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントを含有する第１の分子を提供し、重鎖内ヒンジ部ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントを含有する第２の分子を提供し、動物に対して第１の分子を投与し、そして動物に対して第２の分子を投与することによってイン・ビボで生成される。
【００２９】
本発明のその他の実施態様では、二重特異性抗体は、重鎖内ヒンジ部ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントを含有する第１の抗体を提供し、重鎖内ヒンジ部ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントを含有する第２の抗体を提供し、動物に対して第１の分子を投与し、そして動物に対して第２の分子を投与することによってイン・ビボで生成される。本発明の方法によってイン・ビボで生成される多量体分子または二重特異性抗体は、治療剤、診断剤または研究試薬として有用である。
【００３０】
動物において形成される二重特異性抗体は、動物の血液から精製され、そして他の目的のために使用されてもよい。イン・ビボにおけるジスルフィドイソメラーゼ酵素は、すべてのＩｇＧ４分子が１回またはその他ＨＬ交換にかけられるように、ほとんどすべてのＩｇＧ４分子において重鎖内ジスルフィド結合を与えることができるので、二重特異性抗体の調製へのイン・ビボのアプローチは、イン・ビトロで得られると考えられるものより高い割合の二重特異性抗体を生成するであろう。これに対して、既に重鎖内ジスルフィド結合を含有しているそれらのＩｇＧ４分子のみが、イン・ビトロでのＨＬ交換に関与するようである。
【００３１】
あるいはまた、２種のＩｇＧ４抗体のイン・ビトロの混合から得られる二重特異性抗体の収量は、Ｈ鎖間の結合をＨ鎖内の結合に変換できるジスルフィドイソメラーゼまたはいくつかの他の実体とのイン・ビトロでの同時インキュベーションによって増進されてもよい。所望の酵素活性は、精製イソメラーゼから、またはイソメラーゼを発現する培養細胞から得ることができるであろう。
【００３２】
さらにまた、特にイン・ビボで、さらなるＨＬ交換を受ける可能性が低いように、所望の二重特異性抗体分子を安定化させることが、若干の応用においては得策であろう。これは、新しいジスルフィド結合が、所望のＩｇＧ４ハイブリッドの２本の重鎖の間では形成されるが、元のＩｇＧ４抗体の２本の重鎖の間では形成されないように、１つのＩｇＧ４重鎖には戦略的部位におけるＣｙｓ残基を、そして他のＩｇＧ４重鎖には異なる部位におけるＣｙｓ残基を導入することによって達成することができるであろう。また、本発明の方法は、それを必要とする動物の処置のために使用されてもよい。
【００３３】
本発明の方法では、分子または抗体は動物に投与することができる。動物への投与は、注射、摂取、投与手段の組み合わせまたは当業者には容易に認識される他の投与手段によって達成されてもよい。１つの実施態様では、分子または抗体は哺乳類である動物に投与される。本発明の方法に適合する哺乳類の例は、マウス、ラット、チンパンジーおよびヒトを含む。
【００３４】
本発明の１つの実施態様では、動物に投与される少なくとも１種の分子または抗体は注射によって投与されてもよい。そのような注射は動物における異なる部位または同じ部位において生じてもよい。好ましくは、注射は腹腔内に実施されるが、また、注射または投与が他の経路をとおして、例えば、筋肉内で生じてもよい。
【００３５】
本発明の方法によってイン・ビトロまたはイン・ビボで生成される多量体分子または二重特異性抗体は、治療剤、診断剤または研究試薬として有用である。例えば、二重特異性抗体は、１つのＦａｂがＦｃ受容体に結合し、そして他のＦａｂが腫瘍特異抗原に結合するヘテロ二量体ＩｇＧを包含してもよい。そのような二重特異性抗体は腫瘍細胞に特異的に結合し、次いで、腫瘍細胞を殺傷できる免疫系細胞を結合させる。
【００３６】
第２の例は、１つのＦａｂがＴｒｅｇ細胞に結合し、そして他のＦａｂが、炎症に関連する抗原、例えばセレクチン（ｓｅｌｅｃｔｉｎ）分子に結合するヘテロ二量体ＩｇＧである。そのような二重特異性抗体は、炎症の部位に炎症抑制性Ｔｒｅｇ細胞を補強し、そして免疫ホメオスタシスを回復することが期待でき、これは自己免疫疾患を処置するための可能性のある魅力的なアプローチである。
【００３７】
第３の例は、１つのＦａｂが標的分子の第１のエピトープに結合し、そして他のＦａｂが同じ分子の第２のエピトープに結合するヘテロ二量体ＩｇＧである。このタイプの二重特異性抗体は、ウイルス融合タンパク質またはキナーゼのようなタンパク質におけるコンホメーションの変化を防ぎ、そしてウイルス感染を防御するかまたはキナーゼ・シグナル伝達に関連する疾病を制御することができるであろう。
【００３８】
第４の例は、１つのＦａｂが長命の標的、例えば赤血球に結合し、そして第２のＦａｂが特定の抗原特異性かまたはアゴニストドメインのいずれかを含有するヘテロ二量体ＩｇＧである。このタイプの二重特異性抗体は、第２のＦａｂが薬物を構成する長期間の薬物送達のために使用することができるであろう。
【００３９】
第５の例は、１つのＦａｂが、例えば、固定化された組み換え抗原の人工アレイにおける、１種の診断マーカーに結合し、そして他のＦａｂが組織試験サンプルに存在するであろう第２の診断マーカーに結合するヘテロ二量体ＩｇＧである。そのようなこのタイプの二重特異性抗体は、関心のある２種の診断マーカーの存在について同時に試験するために使用することができるであろう。
【００４０】
第６の例は、１つのＦａｂが、免疫応答の引き金を引くことに関与することが知られている特異的な細胞表面の標的、例えばマクロファージのマンノース受容体に結合し、そして他のＦａｂが、いずれか、免疫応答が所望されるか、またはそれ自体免疫応答の所望の標的である抗原に結合するヘテロ二量体ＩｇＧである。抗体に対する抗イディオタイプ免疫応答は、その抗体のＩｇＧ４バージョンを調製し、次いでそのＩｇＧ４と、マクロファージのマンノース受容体を結合させるＩｇＧ４抗体との混合物により動物を免疫することによって、この方法で得られてもよい。そのような二重特異性抗体は、マクロファージ中に取り込まれ、処理され、そしてペプチドフラグメントをＴ細胞へ提示することが期待されるであろう。
【００４１】
重鎖内ヒンジ部ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントを含有する分子は、限定されるものではないが、抗体、ミメティボディ、抗体フラグメント、低分子ペプチドハイブリッドまたはこれらの模倣物を含む。ヘテロ二量体生成物は、それらのタイプの分子のいかなる組み合わせ物をも混合することによって得ることができる、例えば、ある抗体とミメティボディを混合してヘテロ二量体抗体／ミメティボディ構築物を生成することが考えられてもよい。
【００４２】
本発明の方法では、重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＩｇＧ４抗体重鎖フラグメントは、ヒンジ部配列モチーフＣＰＳＣ（配列番号：１）を含む。またＩｇＧ４重鎖フラグメントは、特定の種の既知のγ４重鎖配列に対して少なくとも約８０％、９０％または９５％の同一性を有するＩｇＧ４抗体重鎖の改変体を含む。２種のタンパク質間の同一性パーセントは、フィルタリングを解除し、そしてすべての他の不履行設定を変更せずに、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２（１９９７））を用いて決定することができる。さらに、これらの改変体は、ＣＰＳＣ（配列番号：１）、ＣＰＨＣ（配列番号：２）、ＣＰＹＣ（配列番号：３）またはＣＰＦＣ（配列番号：４）のヒンジ部配列モチーフを含んでもよい。
【００４３】
本発明は、ここに、次に示す特定の、限定されることのない実施例に関して記述される。
【実施例１】
【００４４】
二重特異性抗体のイン・ビトロ形成
抗腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）抗体ｃＡ２  Ｇ４および抗組織因子（ＴＦ）抗体ＣＮＴＯ  ８５９が使用されて、二重特異性の抗ＴＮＦ−α／抗ＴＦ抗体が調製された。ｃＡ２  Ｇ４抗体は、インタクトのヒトＩｇＧ４ヒンジ部を有するヒトＴＮＦ−αに対するマウス・ヒトＩｇＧ４キメラモノクローナル抗体である。ｃＡ２  Ｇ１抗体は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ部を含有するｃＡ２  Ｇ４のＩｇＧ１バージョンである。ＣＮＴＯ  ８５９抗体は、インタクトのヒトＩｇＧ４ヒンジ部を有するヒトＴＦに対するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ＣＮＴＯ  ８５９ＦａｂフラグメントはＩｇＧ４ヒンジ部とＦｃドメインを欠如している。
【００４５】
図３において指示されるように、ＣＮＴＯ  ８５９、ｃＡ２  Ｇ４またはｃＡ２  Ｇ１抗体またはＣＮＴＯ８５９Ｆａｂを含有する試験サンプルは、それらの同時インキュベーション中の各抗体の最終濃度が約７１μｇ／ｍｌであるように、中性ｐＨにおけるＤ−ＰＢＳにおいて調製された。試験サンプルは室温で１時間インキュベートされた。
【００４６】
試験サンプルは二重特異性抗体の形成についてアッセイされた。組み換えヒトＴＮＦ−αまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）対照タンパク質は、ウェルにＤ−ＰＢＳ中ＴＮＦまたはＢＳＡの１μｇ／ｍｌ溶液の５０μｌを入れ、そして室温で１時間インキュベートすることによって、９６穴酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）プレート上にコートされ、その後４℃で保存された。使用前に、プレートは１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＤ−ＰＢＳ溶液で洗浄された。アッセイでは、抗体試験サンプルは、各抗体の最終濃度が４．３μｇ／ｍｌになるように、Ｄ−ＰＢＳにおいて希釈された。希釈サンプル５０μｌが次にＴＮＦでコートされたプレートに添加され、そしてプレートは室温で１時間インキュベートされた。
【００４７】
プレートは１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＤ−ＰＢＳ溶液で再び洗浄され、次いでＣＮＴＯ  ８５９に特異的なビオチン化抗イディオタイプｍＡｂ（ＣＮＴＯ  ４１０４）の５０μｌが、０．４μｇ／ｍｌの最終濃度までウェルに添加された。結合されたＣＮＴＯ４１０４ｍＡｂが、０．１μｇ／ｍｌの濃度でストレプトアビジン共役セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＳＴＲＥＰＴ−ＨＲＰ）を、続いて発色性ペルオキシダーゼ基質ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）を添加することによって検出された。得られる４９０ｎｍにおけるサンプルの吸光度が、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ−３４０ＰＣプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて決定された。各サンプルは２並列で試験された。
【００４８】
図３における結果は、ｃＡ２  Ｇ４とＣＮＴＯ８５９モノクローナル抗体の室温での混合が、両ＴＮＦおよび抗ＣＮＴＯ８５９抗体に同時に結合することができる二重特異性抗体のイン・ビトロ形成をもたらしたことを示している。
【実施例２】
【００４９】
イン・ビトロの二重特異性抗体形成の阻害
二重特異性ＩｇＧ４抗ＴＦ／ＴＮＦ−α抗体の形成に及ぼすコンペティター（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）ＩｇＧ４抗体の影響が試験された。α−ＣＤ１８  ＩｇＧ４抗体ＣＮＴＯ３２５４は、インタクトのヒトＩｇＧ４ヒンジ部を含有するヒトＣＤ１８に対するマウス−ヒトキメラモノクローナル抗体である。α−ＣＤ４  ＩｇＧ４抗体ＣＮＴＯ４１３２（またはｃＭ−Ｔ４１３）は、インタクトのヒトＩｇＧ４ヒンジ部を含有するヒトＣＤ４に対するマウス−ヒトキメラモノクローナル抗体である。
【００５０】
組み換えヒトＴＮＦ−αまたはＢＳＡは、ウェルにＤ−ＰＢＳ中ＴＮＦまたはＢＳＡの１μｇ／ｍｌ溶液の５０μｌを入れ、そして室温で１時間インキュベートすることによって、９６穴ＥＩＡプレート上にコートされ、その後４℃で保存された。次いで、ＣＮＴＯ  ８５９およびｃＡ２  Ｇ４抗体は、ｃＡ２  ＩｇＧ１対照、α−ＣＤ１８  ＩｇＧ４およびｃＭ−Ｔ４１３  ＩｇＧ４コンペティター抗体の存在下で、中性ｐＨにおけるＤ−ＰＢＳにおいて一緒に混合された。ＣＮＴＯ  ８５９およびｃＡ２  Ｇ４抗体の最終濃度は、約４１μｇ／ｍｌであり、一方、コンペティター抗体は図４に示された量において存在した。ＣＮＴＯ  ８５９、ｃＡ２  Ｇ４およびコンペティター抗体の混合液は、次に室温で１時間インキュベートされた。
【００５１】
次いで、イン・ビトロで調製された混合物は、二重特異性抗体の形成に関してアッセイされた。二重特異性抗体アッセイは実施例１に記述されたように実施された。
【００５２】
図４における結果は、α−ＣＤ１８  ＩｇＧ４およびｃＭ−Ｔ４１３  ＩｇＧ４コンペティター抗体の増加量が、ｃＡ２  Ｇ４／ＣＮＴＯ８５９（ＴＮＦ−α／ＴＦ）二重特異性抗体の形成を阻害することを示しており、またそれらのコンペティター抗体は、それらが、少ないｃＡ２  Ｇ４／ＣＮＴＯ８５９ハイブリッドの形成をもたらすように進行するＨＬ交換に関与していることを指示している。これに対して、ヒトＩｇＧ１ヒンジ部を含有するｃＡ２  Ｇ１抗体は、ｃＡ２  Ｇ４／８５９二重特異性抗体の形成における減少を惹起しなかった。
【実施例３】
【００５３】
イン・ビトロの二重特異性抗体の形成の時間
室温におけるヒトＴＮＦ−α／ＴＦ二重特異性抗体の形成の時間経過が試験された。組み換えヒトＴＮＦ−αまたはＢＳＡは、ウェルにＤ−ＰＢＳ中ＴＮＦまたはＢＳＡの１μｇ／ｍｌ溶液の５０μｌを入れ、そして室温で１時間インキュベートすることによって、９６穴ＥＩＡプレート上にコートされ、その後４℃で保存された。次いで、ＣＮＴＯ  ８５９およびｃＡ２  Ｇ４抗体は、図５に示されるように、中性ｐＨにおけるＤ−ＰＢＳ中に入れられた。ＣＮＴＯ  ８５９およびｃＡ２  Ｇ４抗体の最終濃度は約４１μｌ／ｍｌであった。サンプルは室温でイン・ビトロでインキュベートされた。
【００５４】
イン・ビトロで調製されたサンプルは、図５に指示される時点において二重特異性抗体の形成についてアッセイされた。二重特異性抗体のアッセイは、実施例１に記述されたように行われた。
【００５５】
図５における結果は、最大の二重特異性抗体の形成が、イン・ビトロで、抗体混合後約３０分に起き、そして混合後１５分の早期に検出可能であることを示している。
【実施例４】
【００５６】
ポリクローナルヒトＩｇＧによるイン・ビトロの二重特異性抗体形成の阻害
ヒト・ポリクローナルＩｇＧは、種々のＩｇＧ抗体分子イソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体分子を含有する。任意に選ばれた無関係のＩｇＧ４モノクローナル抗体がＨＬ交換に関与することができるという観察をさらに推し進めるために、より生理学的に関係のあるコンペティター、総ヒト・ポリクローナルＩｇＧが、ＴＮＦ−α／ＴＦ二重特異性ＩｇＧ４抗体の形成を阻害するその能力について試験された。
【００５７】
組み換えヒトＴＮＦまたはＢＳＡは、ウェルにＤ−ＰＢＳ中ＴＮＦまたはＢＳＡの１μｇ／ｍｌ溶液の５０μｌを入れ、そして室温で１時間インキュベートすることによって、９６穴ＥＩＡプレート上にコートされ、その後４℃で保存された。次いで、ＣＮＴＯ  ８５９およびｃＡ２  Ｇ４抗体は、図６に示されるように、ヒト・ポリクローナルＩｇＧコンペティターの存在下で、中性ｐＨにおけるＤ−ＰＢＳ中で一緒に混合された。ＣＮＴＯ  ８５９およびｃＡ２  Ｇ４抗体の最終濃度は約４１μｌ／ｍｌであったが、一方、コンペティター抗体は、図６に指示される量において存在した。次いで、ＣＮＴＯ  ８５９、ｃＡ２  Ｇ４およびコンペティター抗体の混合後は、室温で１時間イン・ビトロでインキュベートされた。
【００５８】
次いで、イン・ビトロで調製された抗体試験サンプルは、二重特異性抗体の形成についてアッセイされた。二重特異性抗体のアッセイは、実施例１に記述されたように行われた。  図６における結果は、ヒト・ポリクローナルＩｇＧの過剰量が、両ＴＮＦおよび抗ＣＮＴＯ８５９抗体へ同時に結合することができる二重特異性抗体のイン・ビトロ形成を低下させることができることを示しており、そして天然に存在するヒトＩｇＧ４がＨＬ交換反応をまた受けることを暗示している。
【実施例５】
【００５９】
二重特異性抗体のイン・ビボ形成
体重約２５ｇのメスＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｒｅｉｇｈ，ＮＣ）が、プラスチックフィルターの蓋のあるケージ中にグループ別に入れられ（６マウス／ケージ）、そして市販の齧歯類の食餌および酸性の水を自由供給された。
【００６０】
０日目に、マウスは表１に示されるように２回の腹腔内（ＩＰ）注射を受けた。ＣＮＴＯ８５９、ｃＡ２  Ｇ４およびｃＡ２  Ｇ１抗体は実施例１に記述されたとおりであった。試薬は注射前に混合されず、２つの異なる部位に別々に注射された。各マウスについて、２回の注射が互いに５分間隔内に行われた。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
約２００μｌの血液サンプルが、ＣＯ２麻酔されたマウスから注射後０．５、３、２４または７２時間に眼窩後採血によって収集された。各マウスは２回採血された。血液は室温で少なくとも３０分間、しかし１時間未満の間放置された。次いで、サンプルは２５００ＲＰＭにおいて２０分間遠心分離され、そして血清が除去された。血清をチューブ中に入れ、そして二重特異性抗体の形成について分析する前にフリーザーで保存された。
【００６３】
組み換えヒトＴＮＦは、ウェルにＤ−ＰＢＳ中ＴＮＦまたはＢＳＡの１μｇ／ｍｌ溶液の５０μｌを入れ、そして室温で１時間インキュベートすることによって、９６穴ＥＩＡプレート上にコートされ、その後４℃で保存された。次いで、血清サンプルは二重特異性抗体の形成についてアッセイされた。二重特異性抗体のアッセイは、未希釈の血清サンプルがアッセイされた以外は、実施例１に記述されたように行われた。
【００６４】
結果は、マウス中へのｃＡ２  Ｇ４およびＣＮＴＯ８５９モノクローナル抗体の注射が二重特異性抗体のイン・ビボ形成をもたらしたことを示した。ＩｇＧ４注射後ちょうど０．５時間に収集されたものを含む全血液サンプルが、ｃＡ２  Ｇ４／ＣＮＴＯ８５９二重特異性Ａｂの存在を表した。３時間時点からの結果が図７において示される。
【実施例６】
【００６５】
単一ＩｇＧ４抗体により処置されたマウスにおけるイン・ビボの二重特異性抗体形成の欠如
実施例５における表１のマウス処置群１，２，３，４および８からの血清サンプルは、ヒトＩｇＧ４ヒンジ部を含有する単一ＩｇＧ４抗体によるマウスの注射が二重特異性抗体（すなわち、ヒトＩｇＧ４とマウスＩｇＧのハイブリッド）の形成をもたらすか否かを決定するために、さらに分析された。ＴＮＦの２分子を結合させることが可能な二価の抗体（例えば、各アームにおいてＴＮＦの１分子を結合させるｃＡ２  Ｇ４）を検出するためのアッセイがこの決定をするために実施された。実施されたアッセイは、血清サンプル中に存在する抗体によって結合されるＴＮＦ分子数の減少に敏感であった。ＨＬ交換が、２個のＴＮＦ分子を結合させることが可能なあるＴＮＦに特異的な抗体を、１個のみのＴＮＦ分子とある第２の分子を特異的に結合させることが可能な二重特異性抗体に変換させた場合に、ＴＮＦ結合におけるそのような減少がおきるであろう。
【００６６】
これらのアッセイでは、組み換えＴＮＦは、ウェルにＤ−ＰＢＳ中ＴＮＦの１μｇ／ｍｌ溶液の５０μｌを入れ、そして室温で１時間インキュベートすることによって、９６穴ＥＩＡプレート上にコートされ、その後４℃で保存された。マウス処置群１，２，３，４および８から採血された注射後２４時間に対応する血清サンプル５０μｌが、次いで、図８に示されるように希釈され、そしてＴＮＦをコートされたプレートに添加された。次に、プレートは室温で１時間インキュベートされた。次いで、プレートは１％ＢＳＡを含有するＤ−ＰＢＳ溶液で洗浄され、次いでビオチン化ＴＮＦ５０μｌが、０．４μｇ／ｍｌの最終濃度までウェルに添加された。結合されたビオチン化ＴＮＦが、０．１μｇ／ｍｌの濃度でＳＴＲＥＰＴ−ＨＲＰを、続いて発色性ペルオキシダーゼ基質ＯＰＤを添加することによって検出された。得られる４８０ｎｍにおけるサンプルの吸光度が、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ−３４０ＰＣプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて決定された。
【００６７】
図８における結果は、マウスへのｃＡ２  Ｇ４単独の注射がｃＡ２  Ｇ１対照に比較してＴＮＦ結合における減少を起こさなかったことを示している。これに対して、両ｃＡ２  Ｇ４とＣＮＴＯ８５９抗体の注射は、ＨＬ交換の結果として明らかにＴＮＦ結合の減少をもたらした。図８における結果を総合すると、ヒトＩｇＧ４ヒンジ部を含有する単一ＩｇＧ４抗体を注射されたマウスでは二重特異性抗体形成の欠如があることが示された。
【００６８】
本発明は、ここに、完全に記述されたが、それに対して多くの変更および修飾が、付随する請求項の精神および範囲から逸脱することなく作成できることは、当業者にとっては明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４イソタイプのヒンジ部におけるジスルフィド結合の図示である。
【図２】図２は、２個のＩｇＧ４抗体間の可能な重鎖および軽鎖の交換を示す。
【図３】図３は、二重特異性抗体のイン・ビトロの形成を示す。
【図４】図４は、イン・ビトロの二重特異性抗体形成の阻害を示す。
【図５】図５は、イン・ビトロの二重特異性抗体の急速形成を示す。
【図６】図６は、ポリクローナルヒトＩｇＧによるイン・ビトロの二重特異性抗体形成の阻害を示す。
【図７】図７は、二重特異性抗体のイン・ビボ形成を示す。
【図８】図８は、単一ＩｇＧ４抗体により処置されたマウスにおけるイン・ビボの二重特異性抗体形成の欠如を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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