(57)【要約】  本発明により、Ｎ−置換−２（１Ｈ）ピリドンまたはその薬学的に許容される塩、およびこの化合物を含む薬学的調製物が提供される。本発明の化合物は、種々の線維症疾患、例えば、肝線維症を効率よく処置するために使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩：
【化１】
2007510618.tif 000010
式中、
Ｒ１は、３、４、５、または６位のメチル、エチル、トリフルオロメチルであり；
Ｒ２は、２、３、または４位のヒドロキシル、スルフヒドリル、メチルチオ基、またはエチルチオ基である。
【請求項２】
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がヒドロキシルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が５位のメチルであり、Ｒ２が４位のヒドロキシルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
薬学的に許容される担体と、安全であり有効な量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物。
【請求項５】
組成物の全重量を基準として、０．０１〜９９％の前記式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記薬学的組成物の投薬形態が、錠剤、カプセル剤、アンプル剤、または丸剤である、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
以下の工程：
（ａ）銅粉末と無水アルカリ土類金属炭酸塩の存在下で、式ＩＩの化合物と式ＩＩＩの化合物を１６０〜２００℃で反応させ、それによって式Ｉａの化合物を生産する工程であって；
【化２】
2007510618.tif 000011
式中、Ｒ１は、３、４、５、または６位のメチル、エチル、またはトリフルオロメチルであり、Ｒ３は、２、３、または４位の−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、または−ＳＣ２Ｈ５であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである工程；
（ｂ）式Ｉａの化合物とＢＢｒ３を、不活性な溶媒中で−１０℃から１５℃で反応させ、それによって式Ｉの化合物を生産する工程であって：
【化３】
2007510618.tif 000012
式中、Ｒ１およびＲ３は、上記で定義されたとおりであり、Ｒ２は、−ＯＨまたは−ＳＨである工程、
を含む、式Ｉの化合物を生産するための方法。
【請求項８】
請求項１に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を薬学的に許容される担体と混合して、全重量を基準として０．０１〜９９ｗｔ％の式Ｉの化合物を含む薬学的組成物を生産する工程を含む、薬学的組成物を生産するための方法。
【請求項９】
請求項１に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の、線維症を予防するための薬剤の製造における使用。
【請求項１０】
安全であり有効な量の請求項１に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、それが必要である被験体へ投与することを含む、線維症疾患を処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製剤の分野に、具体的には、線維症を処置するためのピリドン誘導体、その調製および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、人体の種々の臓器に影響を及ぼす広範囲の疾患である。これは、炎症反応によって生じるコラーゲンタンパク質の過剰生産および蓄積が主な原因で、複数の臓器の機能に悪影響を与える。線維症は、心筋、肝臓、肺、腎臓、および皮膚のような、人体の種々の組織および臓器に生じる。一旦線維症が発症すると、この臓器の機能と、さらには全身が、通常は、極めて大きな損傷を受ける。例えば、皮膚によって生じる瘢痕組織の増殖は外見に影響を与えるだけではなく、重症の症例においては、手足の運動機能にまで影響が及ぶ。冠状動脈性心臓病によって引き起こされる心筋の線維症は、心不全の大きな要因である。慢性糸球体腎炎および腎盂腎炎によって引き起こされる腎線維症は、９０％以上が、腎不全によって引き起こされる尿毒症が原因である。複数の肺の病理学的変化によって引き起こされる肺線維症は、しばしば、呼吸不全が原因である死亡を生じる。２００３年に突然発生した典型的ではない肺炎の主な症状の１つは、肺組織の線維症である。
【０００３】
肝線維症は、慢性肝疾患の進行についての一般的な病理学的基準である。種々の慢性的な損傷により、肝細胞の変性および壊死が生じ、線維性結合組織の異常な増殖および過剰な蓄積が生じる。増殖性の過剰に蓄積した線維性結合組織は、再生された肝細胞を封入して、「偽小葉（ｐｓｅｕｄｏ−ｌｏｂｕｌｅ）」を形成し、これは、肝臓のもとの構造を破壊し、最終的には小節の形成、硬化症、および肝硬変へと導き、肝機能を低下させるか、または、完全になくしてしまう場合さえもある。世界中では、毎年、肝硬変によっておよそ１００万人が死亡しており、これはなおも上昇傾向にある。肝硬変は、欧州諸国、米国、日本、および中国においては、脳血管障害、心臓血管障害、および悪性腫瘍に次ぐ主要な死亡原因である。
【０００４】
多くの慢性的な肝疾患、例えば、慢性ウイルス性肝炎、慢性アルコール依存症、胆汁うっ滞、先天性酵素欠損の代謝障害、ならびに、毒素および薬物との長期にわたる接触は、肝線維症を引き起こす可能性がある。中でも、慢性ウイルス性肝炎は、最も一般的な原因である。Ｂ型肝炎は中国では極めて一般的である。ＨＢＶ抗原は、肝硬変を有している肝臓組織の約７６％において検出することができる。科学的な調査によっては、世界中には５億人を超えるＢ型肝炎ウイルスのキャリアがいることが示されている。中国では、６億人がすでにＢ型肝炎に感染しており、約１億２千万人がＢ型肝炎ウイルスのキャリアであり、３千万を超える人が慢性Ｂ型肝炎に罹患しており、その２０〜３０％が５〜１０年以内に肝硬変を発症すると予想され、肝硬変を有している人の約２０％が原発性肝ガンを発症すると予想される。Ｂ型肝炎ウイルスと肝硬変と肝ガンとの間の連鎖関係を考慮すると、中国においてＢ型肝炎への感染後の肝硬変と肝ガンによって死亡する人は４０万人にのぼる。肝疾患の患者の肝線維症および肝硬変を効果的に予防することは極めて重要な意味がある。
【０００５】
抗ウイルス剤および抗炎症剤はＢ型肝炎の処置の基本であるが、実際は、Ｂ型肝炎ウイルスに感染している患者のほとんどの症状は慢性的な進行性の発症である。抗ウイルス剤だけでは疾患の進行を妨げることはできない。これらの患者の大部分は、肝硬変または肝不全を徐々にいや応なく発症する。これは、慢性肝疾患の後期であり、長期にわたる肝細胞の壊死によって誘導される肝線維症の結果である。症状をコントロールすることができなければ、種々の臓器の損傷が連続して生じる。このような損傷には主に、肝機能の低下、門脈圧亢進症、消化管の出血、肝性脳症、および同時感染のような重症合併症が含まれる。現在利用できる有効な治療方法がないことが原因で、死亡率は極めて高い。中国や東南アジアのような肝疾患が一般的である地域では、毎年数十万人の若い人が、これらの合併症の結果として命を落としている。
【０００６】
現在は、肝硬変の病巣は不可逆的と考えられている。たとえ主原因が除かれたとしても、症状はなおも進行し、悪化する。肝線維症は種々の慢性肝疾患が肝硬変へと至る進行における初期段階であり、これは肝硬変の一般的な病理学的基準でもある。処置の観点からすると、この段階は可逆的である。これは、処置により常態へと回復させることができる。したがって、肝硬変を発症する前に可能な限り早く肝線維症を阻止し、回復させることによって、難治性の肝疾患のほとんどを治癒させることが重要であり、これが破過点である。
【０００７】
抗線維化薬の開発は通常、コラーゲンの合成を阻害すること、コラーゲンｍＲＮＡの発現を阻害すること、コラーゲンの分解を増強させること、および器官の免疫応答を阻害することを含む、以下の態様から出発する。インターフェロン、コルヒチン、コルチコステロンホルモン、マロチエート（ｍａｌｏｔｉａｔｅ）のような現行のいくつかの薬剤は、抗線維化薬の研究に使用されている。しかし、これらの薬剤には、高い毒性と副作用があり、そして高価であるという欠点があり、このためにその臨床適用が限られている。現在は、線維症の有効な治療手段はない。
【０００８】
特許文献１には、タンパク質の加水分解阻害因子の投与により線維症疾患を処置するための方法が開示されている。ここでは、阻害因子は、Ｎ−置換ヒドロキシルピリドン誘導体である。
【０００９】
特許文献２には、サイトカインによって引き起こされる疾患を処置するための、Ｎ−置換−２（１Ｈ）ピリドンまたはＮ−置換−３（１Ｈ）ピリドンの使用が開示されている。
特許文献３には、ガン、例えば、リンパ腫および白血病などを処置するための、Ｎ−置換−２（１Ｈ）ピリドンまたはＮ−置換−３（１Ｈ）ピリドンの使用が開示されている。
【００１０】
特許文献４には、線維化した損傷を処置するための５−メチル−１−フェニルー２−（１Ｈ）−ピリドンの使用が開示されている。
パーフェニドン（ＰＦ）は、１９８０年代初期に最初に発明された低分子化合物である。これは、コラーゲンの合成を阻害する作用、サイトカインの分泌を減少させる作用、そして線維芽細胞の増殖を妨げる作用を有している。この因子の特異的標的遺伝子は依然不明なままである。その後、これは、種々の動物モデルにおいて、心臓、腎臓、肺、および血管内壁の線維症をうまく阻害するために使用されている。この薬剤は、米国において肺の突発性線維症（ＩＰＦ）の処置についての第３段階の臨床試験にある。しかし、ＰＦの阻害活性は十分満足できるものではない。
【００１１】
抗線維化薬は市場において多くの需要がある。米国においては、死亡原因の４５％は線維化した増殖の生理障害、例えば、肝線維症／肝硬変、腎線維症、心臓線維症、および肺線維症に関係があると推定される。したがって、この分野では、種々の線維症を効果的に阻害するための新規の化合物および薬剤を開発することが急務である。
【特許文献１】米国特許第５７８９４２６号
【特許文献２】米国特許第６０９０８２２号
【特許文献３】ＷＯ００／４４３８１
【特許文献４】欧州特許第１１３８２９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、種々の線維症を効果的に阻害するための化合物、およびその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第１の態様においては、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩が提供される：
【００１４】
【化１】
2007510618.tif 000002
【００１５】
式中、
Ｒ１は、３、４、５、または６位のメチル、エチル、トリフルオロメチルであり；
Ｒ２は、２、３、または４位のヒドロキシル、スルフヒドリル、メチルチオ基、エチルチオ基である。
【００１６】
別の好ましい実施形態においては、Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がヒドロキシルである。さらに好ましくは、Ｒ１が５位のメチルであり、Ｒ２が４位のヒドロキシルである。
本発明の第２の態様においては、薬学的に許容される担体と、安全であり有効な量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物が提供される。
【００１７】
通常は、薬学的組成物には、組成物の全重量を基準として、０．０１〜９９％、好ましくは、０．１％〜９０％、さらにより好ましくは、１〜８０％の、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩が含まれる。
【００１８】
別の好ましい実施形態においては、薬学的組成物の投薬形態は、錠剤、カプセル剤、アンプル剤、または丸剤である。
本発明の第３の態様においては、以下の工程を含む、式Ｉの化合物を生産するための方法が提供される：
（ａ）銅粉末と無水アルカリ土類金属炭酸塩（例えば、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム）の存在下で、式ＩＩの化合物と式ＩＩＩの化合物（約０．８〜１．２：０．８〜１．２のモル比で）を１６０〜２００℃で反応させ、それによって式Ｉａの化合物を生産する工程であって；
【００１９】
【化２】
2007510618.tif 000003
【００２０】
式中、Ｒ１は、３、４、５、または６位のメチル、エチル、またはトリフルオロメチルであり、Ｒ３は、２、３、または４位の−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、または−ＳＣ２Ｈ５であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである工程；
（ｂ）式Ｉａの化合物をＢＢｒ３と、不活性な溶媒（例えば、ジクロロメタン、四塩化炭素、ベンゼン、メチルベンゼン、シクロヘキサン、またはそれらの混合物）中で、−１０℃から１５℃（より好ましくは、−５℃から１０℃）で反応させ、それによって式Ｉの化合物を生産する工程であって：
【００２１】
【化３】
2007510618.tif 000004
【００２２】
式中、Ｒ１およびＲ３は、上記で定義されたとおりであり、Ｒ２は、−ＯＨまたは−ＳＨである工程。
本発明の第４の態様においては、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩と薬学的に許容される担体を混合して、全重量を基準として０．０１〜９９ｗｔ％の式Ｉの化合物を含む薬学的組成物を生産する工程を含む、薬学的組成物を生産するための方法が提供される。
【００２３】
本発明の第５の態様においては、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の、線維症を予防するための薬剤の製造における使用が提供される。
本発明により、また、安全であり有効な量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩のそれが必要である被験体への投与を含む、線維症疾患を処置するための方法も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
パーフェニドンを含む、炎症反応を阻害するための種々の種の既知の低分子化合物の構造の分析を通じて、本発明の発明者らは、新しい化合物のシリーズを設計して合成し、さらに、生体外で培養された線維芽細胞の分裂および増殖を有意に阻害する、細胞に対して観察できるほどの毒性を有さない、１種のピリドン誘導体をスクリーニングした。
【００２５】
本明細書中で使用される場合は、用語「本発明の化合物」、「式Ｉの化合物」は同義的に使用され得、構造式Ｉを有している化合物またはその薬学的に許容される塩を意味する。ここでは、基は上記で定義されたとおりである。
【００２６】
【化１】
2007510618.tif 000005
【００２７】
特に好ましい化合物は、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（１Ｈ）−ピリドンであり、これは、Ｆ３５１と呼ばれる。
【００２８】
【化４】
2007510618.tif 000006
【００２９】
Ｆ３５１のような本発明の化合物は、その小さい分子量（約２００）、高い水溶性、経口投与、および合成が容易であることを特徴とする。この化合物は、細胞組織における線維芽細胞の増殖を阻害することができ、それにより、コラーゲンの合成を劇的に減少させることができる。動物実験の結果は、Ｆ３５１が強力な抗線維化作用を有していること、さらには、これが肝臓の抗線維化薬としてのその作用に加えて、肝細胞の壊死を大幅に減少させることができることを示している。これは、急性のウイルス性肝炎を含む疾患の処置において、肝細胞の損傷を少なくするために使用することができる。実験は、この化合物が細胞組織および動物に対して、高濃度でもきわめて安全であることを示している。
【００３０】
本発明の化合物はまた、種々の線維症疾患、および線維症へと至る炎症、例えば、心筋、肝臓、肺、腎臓、血管、および皮膚の線維症または線維性腫瘍を処置するためにも使用することができる。例として、肝線維症、肝硬変、肝臓の壊死、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、心筋線維症、腎線維症、血管線維症、皮膚瘢痕などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の化合物にはまた、薬学的または生理学的に許容される酸あるいは塩基に由来する塩も含まれる。このような塩としては、以下の無機酸に由来する塩：塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、および以下の有機酸に由来する塩：酢酸、エタンニ酸、ブタンニ酸、酒石酸、メタンスルホン酸、およびマレイン酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の塩としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、またはマグネシウム）を用いて、エステル、カルバミン酸塩、または他の従来の「プロドラッグ」（これは、生体内で有効成分に変換され得る）の形態に形成されたものが挙げられる。
【００３２】
本発明にはまた、薬学的組成物、ならびに、薬学的有効量の式Ｉの化合物の哺乳動物への投与を含む治療方法も含まれる。
本発明の化合物が上記適用において使用される場合は、これは、１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤（例えば、溶媒、希釈剤など）と混合され得る。これは、以下の投薬形態で経口投与され得る：錠剤、ペレット剤、カプセル剤、分散させることができる粉末剤、顆粒剤、または懸濁液（例えば、約０．０５〜５％の懸濁剤を含む）、シロップ剤（例えば、約１０〜５０％の糖類を含む）、およびエリキシル剤（例えば、約２０〜５０％のエタノールを含む）。あるいは、軟膏、ゲル剤、薬剤を含むゴムセメントなどの形態で、外用によって投与され得る。あるいは、滅菌の注射可能な溶液または懸濁液（約０．０５〜５％の懸濁剤を等張性の媒体中に含む）の形態で全身的に投与され得る。例えば、これらの薬学的調製物には、約０．０１〜９９ｗｔ％、より好ましくは、約０．１〜９０ｗｔ％の、担体と混合させられた有効成分が含まれ得る。
【００３３】
使用される有効成分の有効用量は、使用される化合物、投与態様、および処置される疾患の重篤度に応じて変化し得る。しかし、通常は、所望される結果は、本発明の化合物が１日当たり約０．２５〜１０００ｍｇ／動物の体重１ｋｇの用量で投与される。より好ましくは、１日あたり２〜４回に分けられた投与量で、または徐放形態で投与される。大きな哺乳動物のほとんどについては、１日あたりの全用量は約１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、約２〜８０ｍｇ／ｋｇである。内服に適している投薬形態には、固体または液体の薬学的に許容される担体と十分に混合させられた約０．２５〜５００ｍｇの活性のある化合物が含まれる。投与量は、最良の処置応答が提供されるように調整され得る。例えば、症状を緊急に処置する必要がある場合には、１日あたり数回に分けられた投与量が投与され得るか、または投与量は比例的に減少させられ得る。
【００３４】
これらの活性のある化合物は、経口で、静脈内に、筋肉内に、または皮下に投与され得る。固体の担体としては、デンプン、乳糖、リン酸ニカルシウム、微結晶セルロース、スクロース、および白土が挙げられ、一方、液体の担体としては、滅菌水、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、および食用油（例えば、コーン油、ピーナッツ油、およびゴマ油）が、これらの担体が有効成分と所望される特異的な投与手段の特性に適している限りにおいて、挙げられる。薬学的組成物の生産において一般的に使用されているアジュバント、例えば、香味剤、着色剤、保存剤、および抗酸化剤、例えば、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ＢＨＴ、およびＢＨＡも含まれることが有利である。
【００３５】
容易な生産および投与の観点からは、好ましい薬学的組成物は固体の組成物であり、具体的には、錠剤、および固体または液体が充填されたカプセル剤である。化合物の経口投与が好ましい。
【００３６】
これらの活性のある化合物は、非経口的にまたは腹腔内に投与され得る。これらの活性のある化合物（遊離の塩基または薬学的に許容される塩として）は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン）と適切に混合された水中の溶液または懸濁液に処方され得る。分散物はまた、グリシン、液体ポリエチレングリコール、および油の中のこれらの活性のある化合物の混合物から調製され得る。通常の保存および使用条件では、これらの調製物には、微生物の増殖を妨げるための保存剤が含まれる。
【００３７】
注射に適している薬学的形態としては、滅菌水または分散液、および滅菌の粉末（滅菌の注射可能な溶液または分散液を即座に調製するために使用される）が挙げられる。全ての場合において、これらの形態は滅菌でなければならず、これらは、注射器から流体を放出できる程度に流動性でなければならない。これらの形態は、生産および貯蔵の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば、細菌および真菌）の混入を防ぐことができなければならない。担体は、例えば、水、アルコール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、を含む溶媒または分散媒体、それらの混合物、および植物油であり得る。
【００３８】
さらに、本発明の化合物は、線維症を処置するための他の薬剤、例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、副腎皮質ホルモン、およびメトトレキセートと組み合わせて使用され得る。
【００３９】
本発明の主な利点としては、（ａ）線維症を阻害することにおける良好な作用；（ｂ）少ない副作用、および（ｃ）線維症に至る炎症および組織の壊死を阻害する能力が挙げられる。
【００４０】
本発明は以下の実施例によってさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためだけに意図され、本発明の範囲を限定することはない。以下の実施例の実験方法については、これらは、日常的な条件のもとで、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｃｌｏｎｅ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている条件のもとで、あるいは、他の場所に具体的に示されていない限りは製造業者に指示されるように行われる。
【実施例１】
【００４１】
Ｆ３５１の合成および特性決定
工程１：５−メチルピリドンの合成
【００４２】
【化５】
2007510618.tif 000007
【００４３】
１．２−アミノ−メチルピリドン（３０ｇ、０．２７８ｍｏｌ）を、８００ｍｌの６．３％硫酸に溶解させた。
２．窒化ナトリウム（３６ｇ、０．５２２ｍｏｌ）を、１００ｍｌの水に溶解させ、その後、室温にて、１滴ずつ溶液中に添加した。この反応は発熱反応であり、大量の気体が発生した。
３．添加の完了後、溶液を２時間攪拌し、その後、温度を上昇させながら４時間還流させた。薄黄色の溶液が黒くなった。これを自然に室温にまで冷ました。
４．氷浴によって温度を低下させる条件で、炭酸ナトリウムを溶液に添加して中和した。ｐＨ値を８に調整した。この反応は発熱反応であり、大量の気体が発生した。
５．反応混合物を、６５℃の減圧下で蒸留によって濃縮した。濃縮した溶液をジクロロメタンで抽出した。抽出を、有機相のブロットプレートが生成物のブロットを示さなくなるまで、数回繰り返した。抽出溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、回転によって乾燥させると、粗生成物が得られた。
６．粗生成物をエーテル−ジクロロメタン（１０／１）で再結晶させると、２７．３ｇ（０．２５ｍｏｌ）の標題化合物が、薄黄色の固体として得られた。収率は８９％であった。
【００４４】
工程２：５−メチル−１−（４−メトキシフェニル）−２−（１Ｈ）−ピリドンの合成
【００４５】
【化６】
2007510618.tif 000008
【００４６】
１．パラ−ブロモアニソール（１１５ｍｌ）、５−メチルピリドン（２６ｇ）、無水炭酸カリウム（３６．４ｇ）、および銅粉末（５２０ｍｇ）を１８０℃で１８時間攪拌し、その後、室温まで冷ました。
２．混合物をセライトで濾過し、その後、ジクロロメタンで溶出すると、濃縮溶液が得られた。
３．濃縮溶液を減圧下で蒸留させた。その後、パラ−ブロモアニソールの溶媒を蒸留によって除去した。残渣が所望される粗生成物であった。
４．粗生成物を溶媒エチル酢酸で再結晶させた。エーテルを溶離剤として使用した。２８ｇの標題化合物が得られた。収率は５８％であった。
【００４７】
工程３：５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（１Ｈ）−ピリドンの合成
【００４８】
【化７】
2007510618.tif 000009
【００４９】
１．１００ｇの５−メチル−１−（４−メトキシフェニル）−２−（１Ｈ）−ピリドンを２Ｌのジクロロメタンに溶解させ、三臭化ホウ素（１０００ｍｌ、ジクロロメタン中１Ｍ）を段階的に（一滴ずつ）、氷浴中の０℃の溶液に添加した。温度は５℃を超えないようにした。２／３の三臭化ホウ素溶液を添加した時点で固形物が沈殿した。滴下が完了した後、溶液を０℃で１時間攪拌した。
２．４００ｍｌのエーテルを溶液に滴下して、エーテルと三臭化ホウ素の錯体化合物を形成させた。これは発熱反応であった。滴下速度は、１０℃を超えない系の温度を維持するように制御した。添加の完了後、溶液を０℃で４０分間攪拌した。
３．反応を、水を添加することによって停止させた。これは発熱反応であった。添加速度は、１５℃を超えない系の温度を維持するように制御した。
４．固形物を減圧濾過によって回収した。
５．固形物を、溶媒エタノールで再結晶させると、４０ｇの標題化合物が得られた。これをＦ３５１と命名した。収率は４０％であった。
【００５０】
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）：２．１６（ｓ，３Ｈ）；６．５８（ｄ，１Ｈ）；６．９２（ｄ，２Ｈ）；７．１９（ｄ，２Ｈ）；７．３９（ｓ，１Ｈ）；７．５１（ｄｄ．１Ｈ）
１３ＣＮＭＲ（ｐｐｍ）：１６．９；１１８．３；１２１．０；１２７．８；１２９．８；１３０．５；１３７．５；１４２．５；１４５．４
【実施例２】
【００５１】
Ｆ３５１は生体外で培養された線維芽細胞の増殖を阻害した。
生体外で培養された線維芽細胞の増殖に対するＦ３５１の阻害作用を、以下の方法を使用して試験した。Ｆ３５１を０．５％のＤＭＳＯに溶解させた。線維芽細胞を種々の量のＦ３５１（図１および図２）で５日間処理した。試薬を、４８時間ごとに新しいものにした。パーフェニドンを、これらの２つの試薬の作用を比較するために、平行して行った実験において使用した。
【００５２】
ＭＴＴアッセイ：１００ｍｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加した。１グループについて４つの同時平行ウェルとした。試薬の濃度と培養時間は変化させないままにした。その後、１０μＬの５ｇ／ＬのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−臭化ジフェニルテトラゾリウム）をそれぞれのウェルに添加し、さらに４時間培養した。１００μＬのＤＭＳＯをそれぞれのウェルに添加した。穏やかにボルテックスして均一な混合物とした。約１０分後、５７０ｎｍと６３０ｎｍでのＯＤ値を、酵素結合免疫検出装置（ＢＩＯ  ＲＡＤ  ５５０）によって測定した。細胞の生存率を以下の式にしたがって計算した：
生存率＝［（実験ウェルのＯＤ５７０−実験ウェルのＯＤ６３０）／（対照ウェルのＯＤ５７０−対照ウェルのＯＤ６３０）］×１００％
阻害率（または増殖率）＝１００％−生存率
結果は、線維芽細胞に対するＦ３５１の阻害作用がパーフェニドンの阻害作用よりも顕著であることを示している（図１および図２）。
【実施例３】
【００５３】
Ｆ３５１は、肝線維症モデルにおいて明らかな抗線維化効果を示し、これはまた肝細胞の壊死も減少させた。
ラットの肝線維症モデルを、それぞれ、ＣＣｌ４およびＤＭＮ（ジメチルニトロサミン）での誘導によって確立させ、４週間、または８週間の間、Ｆ３５１で処置した。動物の肝臓を回収して、病理学的結果を観察した。方法は以下の通りである：
（ａ）四塩化炭素モデル（油と混合した４０％のＣＣｌ４を０．４ｍｌ／１００ｇ用いて、１週間に２回、４週間継続して腹腔内に注射した）と、ジメチルニトロサミン肝線維症モデル（１％のＤＭＮを１０ｍｇ／Ｋｇ用いて、１週間に２回、８週間継続して腹腔内に注射した）を作成した。
（ｂ）これらの２つのモデルの動物に、モデルの確立の０日目から２５０ｍｇ／Ｋｇの用量のＦ３５１を用いて、１日に１回、４週間または８週間の間継続して胃内に投与した。
【００５４】
結果：
（ａ）ＤＭＮモデル：
正常なラット（図３）と比較して、中心静脈周辺の肝細胞の壊死、出血、およびコラーゲンの蓄積、膿瘻周辺の線維症が、４週間でモデルグループにおいて明らかに観察された。Ｆ３５１で処置したグループの病変は、有意に小さくなっており（Ｐ＜０．００１）、ごく少量のコラーゲンの蓄積と、壊死後の線維性の隔壁の形成が、中心静脈の周辺で観察された（図４および図５）。
【００５５】
８週間では、モデル動物においては、中心静脈周辺の細胞が壊死後に線維化し、局所性の病変が炎症細胞に浸潤しており、新たな出血と壊死があった。線維症が膿瘻周辺に生じ、線維性の隔壁が形成されていた。Ｆ３５１で処置したグループにおいては、病理学的結果は、中心静脈周辺の壊死の直径が小さくなり、線維症の直径が小さくなり、線維症の境界線が明確になり、膿瘻周辺の線維症は、正常なグループにおいて見られるものよりも大きかったが、対照グループよりも明らかに良好であったことを示していた（図６および図７）。
【００５６】
これらの結果は、Ｆ３５１が、ＤＭＮによって引き起こされた肝細胞の炎症および壊死に対して明らかな治療効果を有していること、そしてこれにより、肝細胞の壊死を阻害することができ、ＤＭＮによって引き起こされる肝線維症の進行を効果的にブロックすることができることを示していた（Ｐ＜０．００１）。肝細胞の壊死は、Ｆ３５１での処置により有意に減少し、このことは、Ｆ３５１が肝細胞の壊死に対する阻害作用を有していることを示している。したがって、Ｆ３５１は中毒性肝炎のような疾患を処置するために使用することができる。
（ｂ）ＣＣｌ４モデル：
実験を４週間行った。モデルグループについての病理学的スコアは、Ｓ４〜Ｓ６のレベルであったが、Ｆ３５１グループの病理学的変化は、明らかに小さくなり、中心静脈周辺および膿瘻周辺の線維症の直径も明らかに減少した（４週、Ｐ＝０．００１）（図８および図９）。
【００５７】
これらの結果は、Ｆ３５１がラットのＣＣｌ４モデルグループの肝線維症の進行を効果的にブロックできることを示している。
【実施例４】
【００５８】
肝線維症モデルでのラットの死亡率はＦ３５１での処置後に低下した。
ＣＣｌ４およびＤＭＮでの誘導によって確立したラットの肝線維症モデルを、実施例３と同じ様式でＦ３５１で処置した。ラットの体重と死亡率を観察した。
【００５９】
結果は、ＤＭＮまたはＣＣｌ４での処置が、ラットの体重と死亡率に大きな影響を与え得ることを示している。Ｆ３５１の投与後、ＣＣｌ４によって誘導した肝線維症モデルの場合には、Ｆ３５１はラットの死亡率を増大させることはなかった。ＤＭＮによって誘導した肝線維症モデルの場合には、Ｆ３５１は動物の死亡率を大きく減少させることができた。これは、対照グループとは明らかに区別される（対照グループにおいては、４週間および８週間で、それぞれ、２５匹のラットのうち７匹および２匹のラットが生存しており、一方、Ｆ３５１で処置したグループでは、それぞれ２４匹および１８匹のラットが生存していた）。
【実施例５】
【００６０】
Ｆ３５１での処置によって肝線維症モデルにおいてラットの肝機能が有意に改善した。
ＣＣｌ４およびＤＭＮでの誘導によって確立したラットの肝線維症モデルを、実施例３と同じ様式でＦ３５１で処置した。ラットの血清を抽出し、血清トランスアミナーゼのレベルを測定した。
【００６１】
結果は、実験の４週間目で、Ｆ３５１がＤＭＮまたはＣＣｌ４によって誘導した肝線維症を有しているラットにおいてＡＬＴ血清レベルを減少させることができたことを示している（対照グループ：２７±５．０９、ＣＣｌ４モデルグループ：５２±１７．１５、ＣＬ４モデルグループ＋Ｆ３５１：４５±１７．６８；ＤＭＮモデルグループ：７４±１８．２５、ＤＭＮモデルグループ±Ｆ３５１グループ：５４±１７．２５；Ｐ＜０．０５）（図１０）。これらの結果は、Ｆ３５１が血清トランスアミナーゼレベルを効果的に減少させ、肝機能を改善させることができることを示している。
【実施例６】
【００６２】
Ｆ３５１を含む薬学的組成物の調製
（ａ）錠剤
Ｆ３５１
１００〜５００ｍｇ
ポリビニルピロリドン
２〜４ｍｇ
サリチル酸
１ｍｇ
デンプン
４０〜８０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム
１〜５ｍｇ
乳糖
５〜１０ｍｇ
タルカムパウダー
５〜１０ｍｇ
Ｆ３５１、乳糖、およびデンプンを、それぞれ、１０００個の錠剤用に（上記の処方）量りとり、粉砕し、８０メッシュスクリーンで篩にかけ、混合し、次いで、ポリビニルピロリドンとサリチル酸とともに混合した。その後、デンプンを添加した。混合物を水で湿らせ、１６〜１８メッシュスクリーンを用いて粒子になるように処方し、６０℃で乾燥させ、顆粒状にし、タルカムパウダーと共に均一になるように混合し、錠剤へと圧縮した。
（ｂ）非経口用溶液
Ｆ３５１
２０〜１００ｍｇ
塩化ナトリウム
１〜５ｍｇ
注射用水
１０ｍｌになるように
上記の処方にしたがって、Ｆ３５１と塩化ナトリウムを量りとり、溶液になるように処方し、その後、１０ｍｌの非経口溶液用バイアルに注ぎ、滅菌後にパックし、注射に使用した。
（ｃ）カプセル剤
Ｆ３５１  ５０
２００ｍｇ
ポリビニルピロリドン  ２
１０ｍｇ
デンプン  ５０
１００ｍｇ
乳糖  ２
１０ｍｇ
上記の成分を、それぞれ、１０００個のカプセル剤用の量で量りとり、粉砕し、そして篩にかけ、均一になるように混合した。次いで、Ｆ３５１を等量の増分で徐々に増加する様式で添加し、均一に分散するように完全に粉砕し、８０メッシュスクリーンを用いて篩にかけ、カプセルに充填した。
【００６３】
本明細書中で引用される全ての文献は、それらのそれぞれが個々に組み入れられているかのように、引用により本明細書中に組み入れられる。さらに、本発明の上記教示においては、当業者は本発明に対して特定の変形や修飾を行うことができ、これらの等価物もなお、本願の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲にあることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】Ｆ３５１が線維芽細胞の増殖と細胞生存性を阻害することを示す。
【図２】線維芽細胞の生存性を阻害することについてのＦ３５１の活性が、パーフェニドンの対照の活性よりも高いことを示しており、これは、Ｆ３５１がコラーゲンの合成を有意に阻害することを示している。
【図３】正常なラットの肝臓組織のＭａｓｓｏｎ  ｔｒｉｐｌｅ染色を示す。２．５×１０。
【図４】４週間でのＤＭＮモデルグループのＭａｓｓｏｎ  ｔｒｉｐｅｌ染色を示す。２．５×１２．５。出血および壊死の後、コラーゲンの蓄積と膿瘻周辺の線維症が観察された。
【図５】４週間でのＤＭＮ＋Ｆ３５１で処置したグループのＭａｓｓｏｎ  ｔｒｉｐｌｅ染色を示す。２．５×１６。壊死の後、少量のコラーゲンの蓄積と線維性中隔の形成が中心静脈の周辺で観察された。
【図６】８週間でのＤＭＮモデルグループのＨＥ染色を示す。２．５×２０。中心静脈周辺の線維症、鉄を含むキサントヘマチンの蓄積、およびそれに伴う新たな出血が観察された。
【図７】８週間でのＤＭＮ＋Ｆ３５１で処置したグループのＨＥ染色を示す。２．５×１６。中心静脈の周辺での壊死はほとんどなく、線維症の直径は小さく、膿瘻周辺の線維症は、正常なグループにおいて見られるよりも大きかった。
【図８】４週間でのＣＣｌ４モデルグループのＭａｓｓｏｎ染色である。２．５×１０。
【図９】４週間でのＣＣｌ４＋Ｆ３５１で処置したグループのＭａｓｓｏｎ染色である。２．５×１０。
【図１０】Ｆ３５１での処置の４週間後の血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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