(57)【要約】【課題】本発明は、細胞および／または細胞核内部への対象物質の侵入およびを促進することが可能なアミノ酸配列に関する。【解決手段】前記アミノ酸配列は、以下の化学式を有しする：（Ｘ１）ｐ［（Ｘ）ｏ（Ｂ）ｎＸ  Ｂ  Ｘ  Ｘ  Ｂ］ｍ（Ｘ２）ｑ（Ｉ）。ここで、Ｘ１およびＸ２は、１〜２０個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、ｐおよびｑは、０〜５の自然数であり、Ｂは塩基性アミノ酸であり、Ｘは、非塩基性、好適には疎水性のアミノ酸であり、例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンまたはチロシンであり、ｎは２または３であり、ｍは１〜４であり、ｏは０または１である。０と５との間；Ｂは塩基性アミノ酸であり、Ｘは、非塩基性、好適には疎水性のアミノ酸であり、例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンまたはチロシンであり、ｎは２または３であり、ｍは１〜４であり、ｏは０または１である。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞および／または細胞核内部への対象物質の侵入およびを促進することが可能なアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、以下の化学式を有し、
（Ｘ１）ｐ［（Ｘ）ｏ（Ｂ）ｎＸ  Ｂ  Ｘ  Ｘ  Ｂ］ｍ（Ｘ２）ｑ（Ｉ）
ここで、
Ｘ１およびＸ２は、１〜２０個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、
ｐおよびｑは、０〜５の自然数であり、
Ｂは塩基性アミノ酸であり、
Ｘは、非塩基性、好適には疎水性のアミノ酸であり、例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンまたはチロシンであり、
ｎは２または３であり、
ｍは１〜４であり、
ｏは０または１である、
アミノ酸配列。
【請求項２】
・ｏは１であり、かつ／または
・ｐまたはｑは０であり、かつ／または
・Ｘ１またはＸ２は、２〜５個のアミノ酸の配列であり、かつ／または
・ｎは２または３であり、かつ／または
・ｍは２である、
請求項１に記載のアミノ酸配列。
【請求項３】
前記アミノ酸配列は、以下の化学式を有する：
Ｘ  Ｂ  Ｂ  Ｘ  Ｂ  Ｘ  Ｘ  Ｂ  Ｘ  Ｂ  Ｂ  Ｘ  Ｂ  Ｘ  Ｘ  Ｂ（ＩＩ）
（Ｘ１）ｐ  Ｘ  Ｂ  Ｂ  Ｂ  Ｘ  Ｂ  Ｘ  Ｘ  Ｂ  Ｘ  Ｂ  Ｂ  Ｂ  Ｘ  Ｂ  Ｘ  Ｘ  Ｂ（ＩＩＩ）
ここで、Ｘ１、Ｘ、Ｂおよびｐは、請求項１におけるものと同一の意味を持つ、
請求項１または２のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項４】
１００個未満のアミノ酸を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項５】
７〜２５個のアミノ酸を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項６】
７〜１５個のアミノ酸を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項７】
１５〜２５個のアミノ酸を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項８】
前記アミノ酸配列は、以下の化学式を有する：
・Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）
・Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）、
請求項１〜５のいずれかまたは請求項７に記載のアミノ酸配列。
【請求項９】
前記細胞膜上の成分に結合し、前記成分を介して上記細胞膜を横断することによって特徴付けられる、前記請求項のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項１０】
前記アミノグリカンと反応可能なことによって特徴付けられる、前記請求項のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項１１】
前記グリコアミノグリカンと反応可能なことによって特徴付けられる、請求項１０に記載のアミノ酸配列。
【請求項１２】
ヘパリン、コンドロイチン硫酸塩およびその誘導体と反応可能なことによって特徴付けられる、請求項１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項１３】
抗体フラグメント、有利には多反応性抗体フラグメントに由来する少なくとも１つの第２のアミノ酸配列に結合される、前記請求項のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項１４】
前記第２のアミノ酸配列は、抗体の超可変領域の全体または一部である、請求項１３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１５】
前記第２のアミノ酸配列は、抗体の重鎖の断片である、請求項１３または１４のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項１６】
前記第２のアミノ酸配列は、ヒト抗ＤＮＡ抗体またはその一部である、請求項１３〜１５のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項１７】
前記抗体は、ＩｇＭおよびＩｇＧを含む群から選択される、請求項１６に記載のアミノ酸配列。
【請求項１８】
前記第２のアミノ酸配列は、抗体のＣＤＲ２、ＣＤＲ３領域の全体または一部を含む群において選択される、請求項１６に記載のアミノ酸配列。
【請求項１９】
対象物質を持つ、請求項１〜１８のいずれかに記載のアミノ酸配列の組み合わせ。
【請求項２０】
対象物質を細胞中に運搬するための組成を作製するための、請求項１〜１８のいずれかに記載のアミノ酸配列の使用。
【請求項２１】
対象物質の細胞質内および／または細胞質内および／または細胞核内体内運搬のためのベクターであって、請求項１〜１８のいずれかに記載の少なくとも１つのアミノ酸配列によって構成されるかまたは請求項１〜１８のいずれかに記載の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、ベクター。
【請求項２２】
細胞および／または前記細胞の細胞核中に自然的ににまたは非自然的に取り入れることが可能な少なくとも１つの対象物質に結合される請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
前記対象物質は、前記アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端において結合される、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
前記対象物質は、核酸、タンパク質、薬物、抗原、抗体、ポリマー、蛍光色素などのマーカーを含む群から選択される、請求項２１〜２３のいずれかに記載のベクター。
【請求項２５】
前記対象物質（単数または複数）は、前記対象物質について強い自然親和性を有する少なくとも１つの固定分子を介して前記ベクターに結合される、請求項２１〜２４のいずれかに記載のベクター。
【請求項２６】
前記対象物質（単数または複数）は、遺伝子工学または化学、生化学的、酵素的結合によって前記ベクターに結合される、請求項２１〜２４のいずれかに記載のベクター。
【請求項２７】
請求項１〜１８のいずれかに記載のアミノ酸配列または請求項２１〜２６のいずれかに記載のベクターを含む真核細胞。
【請求項２８】
請求項１〜１８のいずれかに記載のアミノ酸配列、請求項２１〜２６のいずれかに記載のベクター、または請求項２７に記載の真核細胞を有効成分として含む、生物学的、薬学的、整形外科的、農業食品、診断的またはトラッキング組成。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性物質の細胞および／または細胞核上への送達のための方法および組成の分野に関する。より詳細には、本発明は、薬物等の対象物質の細胞および／または細胞核中への侵入を促進する能力を有するアミノ酸配列について説明する。
【背景技術】
【０００２】
外部媒体からの運搬対象物質を細胞（より詳細には細胞核）内部に運搬することが可能な組成および方法に対する需要がある。このような組成および方法は、治療対象の宿主生物から細胞質および／または細胞核の薬物の送達を向上させる際に有用である。このような組成および方法の重要な適用は、遺伝子治療分野に関連する。遺伝子治療分野では、細胞（より詳細には細胞核）中へのＤＮＡ導入のために、選択的かつ非毒性のベクターが必要となる。
【０００３】
ペプチド配列およびアミノ酸配列が、外部媒体からの対象物質を細胞内に運搬するために提案されている。たとえば、Ｎｏ．ＷＯ０１／６４７３８として公開されているＰＣＴ特許出願では、以下のようなアミノ酸配列に関する記載がある。これらのアミノ酸配列は、アミノグリカンと反応し、広範囲の活性物質（生物学的、薬学的、整形外科的、栄養学的、診断的、またはトレーサ）（例えば、核酸、タンパク質、薬物、抗原または抗体）を運搬する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、体内および対外の両方で対象物質を細胞中へインターナリゼーションするための作用物質として使用することが可能な新規なアミノ酸配列が発見されている。そのため、本発明は、細胞および／または細胞核中への対象物質の侵入を促進することが可能であり、かつ、以下の化学式を有するアミノ酸配列に関する。
（Ｘ１）ｐ［（Ｘ）ｏ（Ｂ）ｎＸ  Ｂ  Ｘ  Ｘ  Ｂ］ｍ（Ｘ２）ｑ（Ｉ）
ここで、
Ｘ１およびＸ２は、１〜２０個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、
ｐおよびｑは、０〜５の自然数であり、
Ｂは塩基性アミノ酸であり、
Ｘは、非塩基性、好適には疎水性のアミノ酸であり、例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンまたはチロシンであり、
ｎは２または３であり、
ｍは１〜４であり、
ｏは０または１である。
【０００５】
一般的に、化学式（Ｉ）のアミノ酸配列は、１００個未満のアミノ酸を有し、５０個未満のアミノ酸がより良いと考えられ、２５個未満のアミノ酸がさらに良い。
【０００６】
有利なことに、本発明によるアミノ酸配列は、７〜２５個のアミノ酸を有し、好適には７〜１５個のアミノ酸を有し、より好適には１５〜２５個のアミノ酸を有する。
【０００７】
一般的に、このアミノ酸配列は、多数の塩基性アミノ酸（Ｂ）（例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン）を含む。
【０００８】
「多数」とは、少なくとも３と等しいと理解されるべきである。
【０００９】
本発明による好適なアミノ酸配列では、
・ｏは１、かつ／または、
・ｐまたはｑは０、かつ／または、
・Ｘ１またはＸ２は２〜５個のアミノ酸の配列であり、かつ／または、
・ｎは２または３であり、かつ／または、
ｍは２である。
【００１０】
これらのうち、特に好適なアミノ酸は、以下の化学式を有する：
Ｘ  Ｂ  Ｂ  Ｘ  Ｂ  Ｘ  Ｘ  Ｂ  Ｘ  Ｂ  Ｂ  Ｘ  Ｂ  Ｘ  Ｘ  Ｂ（ＩＩ）
（Ｘ１）ｐ  Ｘ  Ｂ  Ｂ  Ｂ  Ｘ  Ｂ  Ｘ  Ｘ  Ｂ  Ｘ  Ｂ  Ｂ  Ｂ  Ｘ  Ｂ  Ｘ  Ｘ  Ｂ（ＩＩＩ）
ここで、Ｘ１、Ｘ、Ｂおよびｐは、上記と同一の意味を持つ、
【００１１】
別の実施形態において、上記アミノ酸配列のＬアミノ酸のうちいくつかまたは全てをＤアミノ酸に変更してもよい。特定の好適な実施形態において、上記Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸はＤ−アミノ酸である。
【００１２】
上記化学式による特に興味深いアミノ酸配列は：
ＤＰＶ１５：Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）
ＤＰＶ１５ｂ：Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）である。
【００１３】
本発明は、対象物質の細胞中へのインターナリゼーションのための作用物質として体内および対外のどちらででも使用可能な以下のアミノ酸配列にも関する：
ＤＰＶ３：ＮＨ２−Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｓ−ＣＯＯＨ
ＤＰＶ３／１０：ＮＨ２−Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｒ  Ｒ  Ａ  Ｒ  Ｒ  Ｓ  Ｐ  Ｒ  Ｈ  Ｌ−ＣＯＯＨ
ＤＰＶ６：ＮＨ２−Ｇ  Ｒ  Ｐ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｇ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｋ  Ｒ  Ｋ  Ｒ  Ｌ  Ｋ  Ｐ−ＣＯＯＨ
ＤＰＶ７：ＮＨ２−Ｇ  Ｋ  Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｋ  Ｇ  Ｋ  Ｌ  Ｇ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｄ  Ｐ−ＣＯＯＨ
ＤＰＶ７ｂＮＨ２−Ｇ  Ｋ  Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｋ  Ｇ  Ｋ  Ｌ  Ｇ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｐ  Ｒ  Ｓ  Ｒ−ＣＯＯＨ
ＤＰＶ１０：ＮＨ２−Ｓ  Ｒ  Ｒ  Ａ  Ｒ  Ｒ  Ｓ  Ｐ  Ｒ  Ｈ  Ｌ  Ｇ  Ｓ  Ｇ−ＣＯＯＨ
ＤＰＶ１０／６：ＮＨ２−Ｓ  Ｒ  Ｒ  Ａ  Ｒ  Ｒ  Ｓ  Ｐ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｇ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｋ  Ｒ  Ｋ  Ｒ−ＣＯＯＨ
それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤはＮｏ４、５、６、８、９、３、７である。
【００１４】
本発明は、Ｃ末端システインを持つかまたは持たないこれらの配列に関する。システインを上記配列のＣ末端またはＮ末端位置に追加して、ペプチドを分子に共役することができる。
【００１５】
よって、本発明は、細胞および／または細胞核内部への対象物質の侵入を促進するＤＰＶに関する。本明細書中、以下の定義および詳細な記述は、ＤＰＶ１５、ＤＰＶ１５ｂおよびＤＰＶ３、３／１０、６、７、７ｂ、１０、１０／６のどちらにも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
上記アミノ酸配列は、アミノグリカンまたはグリコアミノグリカンおよびより詳細にはヘパリン、コンドロイチン硫酸塩およびその誘導体と体内で反応することができる。
【００１７】
よって、本発明によるペプチド（アミノ酸配列）およびよって上記ペプチドと結合された対象物質のインターナリゼーションのためのメカニズムは、エネルギーに依存する。そのため、上記ペプチドを用いたベクター化は、受動的システムから得られたものではないという点が注目に値する。よって、本発明によるアミノ酸配列は、アミノグリカン、グリコアミノグリカン、アミノグリカン硫酸塩、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸塩と体内で反応することができる点と、細胞膜を通過することができる点とによって特徴付けられる。
【００１８】
よって、本発明によるペプチドは、アクティブメカニズムによって細胞膜を通過した後、細胞質および／または細胞核内に入り込むことができるため、以下のようなベクターを持つことができる点において注目に値する。このベクターは、細胞中に入る際、その用途が運搬対象物質のサイズによって限定されない。実際、本発明による（ペプチド／アミノ酸によって構成されるかまたはペプチド／アミノ酸を含む）ベクターは、微細化学分子（低分子量）からタンパク質またはプラスミド型核酸（高分子量）にわたる薬剤を運搬することが可能である。
【００１９】
よって、これらのベクターの使用により、細胞内タンパク質治療または遺伝子治療における新たな道が開かれる。本発明におけるこの特殊なベクター侵入能力により、細胞中の薬物を選択的に標的とすることで、当該薬物の毒性の低減の可能性および有効係数増加の可能性に貢献することが可能になる。
【００２０】
「ヘパリンまたはコンドロイチン硫酸塩誘導体」または「ヘパリンまたはコンドロイチン硫酸塩のようなアミノグリカン」は、以下の従来技術において定義されているような任意の生成物または副生成物と解釈されるべきである（Ｃａｒｄｉｎ  Ａ．Ｄ．＆Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  Ｈ．Ｊ．Ｒ．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ９：２１（１９８９）；Ｍｅｒｔｏｎ  Ｂ．ら．Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：３６５（１９９２）；Ｄａｖｉｄ  Ｇ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：１０２３（１９９３））。
【００２１】
「侵入を促進する」とは、外部媒体から細胞内媒体中への物質の通過または転移の促進を指すもの理解され、より具体的には、外部媒体から細胞質および／または細胞核中への物質の通過または転移の促進を指すもの理解される。この侵入は、例えば培養細胞の存在下にアミノ酸配列を培養する最初の工程と、引続き行なわれる上記細胞の固定と透過性上昇の工程、次いで細胞内における当該アミノ酸配列の存在検出工程とを包含する細胞侵入試験といった様々なプロセスによって測定することができる。この存在検出工程は、当該配列に対する標識抗体の存在下に新たに培養し、その後、細胞質内または細胞核のすぐ近く、若しくは更に細胞核の内部で、当該配列と標識抗体との間の免疫反応を検出することによって行うことが可能である。更に、検出は、本発明のアミノ酸配列を標識し、これらの細胞画分において上記標識の存在を検出することによっても行うことができる。細胞侵入試験は、特許出願Ｎｏ．ＷＯ９７／０２８４０に記載された。
【００２２】
「対象物質」とは、特に生物学的、医薬学的、診断上、追跡上、または農産物上の利益を呈する全ての生成物と理解される。「対象物質」は、様々な起源、特にヒト、ウイルス、動物、真核生物または原核生物、植物、合成等々に由来しており、簡単なオリゴヌクレオチドからゲノムまたはゲノム断片に至る様々な大きさを有する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ａＲＮＡ）であり得る。また、「対象物質」は、ウイルスゲノムまたはプラスミドであっても良い。更に、上記物質は、酵素、ホルモン、サイトカイン、アポリポタンパク質、増殖因子、抗原、抗体等のタンパク質であってもよい。或いは、上記物質は、毒素、抗生物質、抗ウイルス分子または免疫調節因子であってもよい。さらに、上記物質は、ポリマー型成分（例えば、ミクロスフェアまたはナノスフェア）であってもよい。
【００２３】
一般に対象物質は、化学物質、生化学物質、天然物若しくは合成物であり、薬剤の有効成分も含まれる。対象物質は、分子量約５００ダルトンの小さな分子、若しくは数千ダルトンのタンパク質等の大きな分子であってもよい。しかし、有効成分は、マーカー、例えば、蛍光色素（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ））であってもよい。
【００２４】
対象物質は、アミノ酸配列によって、別の作用物質によって、または環境条件によってｉｎ  ｓｉｔｕで直接活性化され得るか、または活性化可能となり得る。本発明の範囲には、上記アミノ酸配列と、上記で定義した対象物質との組み合わせも包含される。
【００２５】
本発明による別の種類の好適な配列は、ｉ）上記にて定義されたような第１のアミノ酸配列およびｉｉ）抗体フラグメントに対応する第２のアミノ酸配列によって構成される。
【００２６】
この実施形態において、上記第１のアミノ酸配列は、上記第２のアミノ酸配列に結合（直接的または間接的に連結）される。
【００２７】
上記第２のアミノ酸配列（ペプチド）は、有利なことに、ヒト抗ＤＮＡ抗体の可変部分から由来する。
【００２８】
ヒト抗ＤＮＡ抗体の可変部分から由来するアミノ酸配列およびペプチドを同一分子内で結合させると、対象物質の転移および細胞内運搬に特に効果的なペプチドベクターが作製される。
【００２９】
また、この組み合わせから、ヒト内での使用に特に適合する転移および運搬ベクターが得られる。実際、上記にて示したように、ＷＯ  ９７／０２８４０から公知のネズミ由来ペプチドベクターは生殖細胞系でコードされており、突然変異を含まない為、抗原的にヒトに認められるものに近い筈であるが、これらをヒトに注入すると、免疫反応を誘発する可能性がある。本発明によるアミノ酸配列から形成されかつ抗ＤＮＡ抗体から誘導されるペプチドから形成されるペプチドベクターは、この問題を回避する。
【００３０】
ヒト抗ＤＮＡから誘導される上記ペプチドの一般的特徴は、特許出願ＷＯ９９／０７４１４に記載されているマウス由来のペプチドのものに近いが、これらと区別し得る付加的な特性も有している。即ち：
【００３１】
１）細胞内に侵入する為には細胞の活性代謝（２５〜３９℃、好ましくは３７℃の培養温度）を必要とするのに対し、マウスペプチドの場合は明らかに依存性が低い；
２）マウスベクターに比べ、ＤＮＡとの反応性が非常に弱い；
３）侵入能力は、細胞内に輸送しようとする分子により、有意に影響されない；
４）ヒト由来細胞は、他の由来細胞に比べて容易に侵入する。
【００３２】
上記で定義したペプチドは、これらに共有結合または非共有結合している分子を細胞内に運搬することができる為、対象物質を細胞内に運搬する有効なベクターとなる。
【００３３】
ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧ（図１８および図４２を参照）のインターナリゼーションに関連する例に示すように、本発明によるペプチドは、細胞内にいったん入り込むと活性状態のままである分子を、細胞内に運搬することができる。
【００３４】
よって、本発明は、上記にて定義したアミノ酸配列を用いて、運搬対象物質を細胞中に運搬するように設計された組成を作製することを目指す。この様な本発明ペプチドの能力は、生体膜を通過して、特に血液脳関門、血液網膜関門、腸関門、肺関門を超えて活性物質を運搬するのに有用である。本発明のペプチドは、それらが結合している活性物質及び標的細胞の種類、特に上記関門の通過を必要とする細胞の種類に適合した投与形態によって使用できるという利点を有している。
【００３５】
別の実施形態において、本発明は、上記アミノ酸配列をペプチドベクターとして使用することに関する。上記アミノ酸配列の特性により、これらのベクターはヒトへの危険性も無く、ベクターに結合した対象物質の分解も伴うこと無しに、ヒトの細胞質内、細胞質内および／または細胞核内への運搬目的のために、容易に使用することができる。
【００３６】
本発明によるベクターは、上記にて定義したようなアミノ酸配列から構成されるかまたは上記にて定義したようなアミノ酸配列を含む点により、特徴付けられる。
【００３７】
上記にて示した通り、ベクターは、１つ以上の抗体フラグメント（好適には多反応性のもの）も含んでもよく、より詳細には、本発明によるアミノ酸配列に連結された抗体の超可変領域からの１つ以上の断片を含んでもよい。好適には、本発明の対象であるベクターは、抗体のＨ鎖断片を含むことを特徴とする。
【００３８】
本発明は、１つ以上の本発明によるアミノ酸配列および１つ以上のＩｇＭまたはＩｇＧの断片を含有することを特徴とする、細胞インターナリゼーションベクターを対象とするものである。
【００３９】
好ましくは、上記ベクターは、抗体のＣＤＲ２領域の全部または一部を含有する。或いは、上記ベクターは、抗体のＣＤＲ３領域の全部または一部を含有する。より詳細には、上記ベクターは、ＲＴＴ７９、ＮＥ−１及びＲＴ７２よりなる群から選択される、ヒト抗ＤＮＡ抗体の少なくとも一つのＣＤＲ３領域を含むものである。
【００４０】
別の実施形態において、上記ベクターは、ＣＤＲ２領域の全部または一部、若しくはＣＤＲ３領域の全部または一部も含み得る。
【００４１】
「全部または一部」とは、ベクターが細胞内に侵入する能力を維持している（機能的同族体）ことを条件として、本発明のベクターが関与するＣＤＲ領域全体、またはその一部のみを含み得るものと解釈しなければならない。「ＣＤＲ領域の一部」とは、１またはそれ以上のアミノ酸末端を欠くＣＤＲ領域と解釈しなければならない。同時に、１またはそれ以上の内部残基が欠失されている、若しくは別のアミノ酸、好ましくは同じ性質のアミノ酸（例えば塩基性アミノ酸）で置換されているＣＤＲ領域であってもよい。
【００４２】
上記にて示した通り、本発明におけるベクターは、対象物質の細胞内および細胞核内への運搬に特に適している。
【００４３】
よって、本発明は、細胞および／または当該細胞の核に組込まれ得る物質を含有することを特徴とする、上記ベクター等のベクターの供給を目的とするものである。
【００４４】
より詳細には、本発明は、侵入能力が、結合している対象物質の性質に殆ど依存しないベクターを対象とするものである。マウスベクターと比較した場合、上記ヒトベクターに固有の特徴は、これらのベクターの計画的使用に対して、何よりも重要な利点である。しかし、本発明は、結合している対象物質に適合するベクターにも考慮している。
【００４５】
「結合」とは、対象物質とベクターとの間の物理的結合を可能にするあらゆる種類の相互作用であると理解され、生物学的環境および／または本発明のペプチドによって運搬される対象物質によって開裂可能なまたは非開裂可能な結合、更には活性物質に結合したベクターを投与する生物に適用される物理的手段によって開裂可能な結合も包含される。そのため、対象物質の生物学的作用が発現する為には、当該物質がベクターから遊離することが必要な場合がある。ベクターから遊離することが好ましい対象物質の例として、ドキソルビシンが挙げられる。
【００４６】
しかし、ベクターが細胞へ侵入する前にまたは侵入中に分離しない様、相互作用は充分強固でなければならない。上記理由により、本発明による好ましい結合は共有結合であるが、非共有結合であっても構わない。対象物質は、両末端のいずれか（Ｎ−末端またはＣ−末端）で、１つの側鎖上で、もしくはアミノ酸の１つで、ペプチドに直接結合することができる。更に対象物質は、ペプチドの両末端のいずれかで、若しくはアミノ酸の１つの側鎖で、結合鎖を介して間接的に結合することも可能である。共有結合を促進するために、アミノ酸配列の末端のうちのいずれか１つかまたは上記アミノ酸配列の任意位置にシステイン残基を付加してもよい。
【００４７】
結合は、当業者に周知の化学的、生化学的、または酵素的若しくは遺伝学的結合といったあらゆる方法によって行なわれるが、一般に４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシニミジル（ＳＭＣＣ）型のホモまたはヘテロ官能性架橋試薬を使用することが好ましい。更に結合手段として、アルキル、アリール、アラルキルまたはペプチド基、エステル、アルデヒドまたはアルキル、アリールまたはアラルキル酸、マレイミル安息香酸、マレイミルプロピオン酸の誘導体及びスクシニミジル誘導体等の無水物、スルフヒドリルまたはカルボキシル基、臭化または塩化シアンの誘導体、カルボニルジイミダゾール、スクシニミドのエステル、またはハロゲン化スルホン酸を含む二または多官能性作用物質より選択されるものが挙げられる。
【００４８】
本発明の別の実施形態において、上記対象物質の結合は、当業者に周知のあらゆる遺伝子工学手法によっても実施することができる。「遺伝子工学」とは、ペプチドベクターをコードするＤＮＡ対象遺伝子の相補的ＤＮＡの５’および／または３’の相でクローン化される発現ベクターの使用であると理解される。融合タンパク質の発現は、プロモーターの制御下になされる。発現系は、融合タンパク質の生成の為、原核または真核宿主細胞で使用することができる。
【００４９】
第１の実施形態において、本発明によるアミノ酸配列のＮ末端で上記対象物質の結合を行なう。第２の実施形態では、上記配列のＣ末端で当該対象物質の結合を行なう。
【００５０】
驚いたことに、本発明の対象であるベクターは、生物活性を増強し得ると共に、結合する上記物質の毒性を、潜在的に低減し得ることが示された。より詳細には、上記ベクターの使用により、対象が抗癌分子等の活性物質に対して発展させる薬物抵抗を解消する可能性が得られる。
【００５１】
よって、本発明は、結合している対象物質の生物学的活性を増加させることが可能な点によって特徴付けられるベクターを対象とする。
【００５２】
また、本発明の対象であるベクターは、対外で細胞をトランスフェクションし得ることも示された。
【００５３】
本発明の特定の実施形態では、ベクターは、インターナリゼーションする対象物質に対し、強い親和性を有する少なくとも一つの天然の分子（所謂「固定分子」）を介して対象物質に結合される。対象物質に対する天然の固定分子の親和性により、運搬体が上記対象物質と非共有結合的に相互作用し、しかも細胞内転移の際に相互作用することが可能になる。
【００５４】
この種の運搬体における特に興味深いもう一つの利点は、対象物質に対する天然の固定分子の親和性によって、これら二つの結合が、化学的または生化学的相互作用を伴うこと無く、全く自然に行われるということである。
【００５５】
この種の運搬体は、その大きさおよび／または構造の為に、アミノ酸配列に直接結合するのが困難であると判明したときに特に有用である。また、この種の運搬体は、対象物質があまり安定でなく、その結合に関与する何らかの化学的相互作用によって物質が破壊され得るか、またはその活性が変化され得るときにも、非常に有用であると考えられる。
【００５６】
更に、この運搬体は、一つの対象物質のみに特異的なものではなく、逆に、幾つかの異なる対象物質を細胞内および／または細胞核内にインターナリゼーションすることができる。
【００５７】
更に本発明は、上記にて定義したようなアミノ酸配列を含む真核細胞に関するものである。また本発明は、本発明のアミノ酸配列、ベクターおよび／または運搬体を含む真核細胞に関するものである。本発明はまた、本発明のベクターおよび／または運搬体によってトランスフェクションされたあらゆる種類の真核細胞に関するものである。
【００５８】
更に、本発明は、対外で対象物質を細胞内に運搬し、当該対象物質の生物活性を向上させる方法に関し、以下の工程を包含するものである。
ａ）上記で述べた本発明によるアミノ酸配列、ベクター、または運搬体へ物質を結合させる工程、及び
ｂ）上記細胞の能動代謝を可能にする培養温度において、上記結合産物と細胞をインキュベーションする工程。
【００５９】
この様な温度は、２５〜３９℃、好ましくは３７℃である。
【００６０】
更に、本発明は、有効成分として、本発明による少なくとも一つの対象物質を「担う」アミノ酸配列、ベクター若しくは運搬体、または本発明に従ってトランスフェクションされた真核細胞を含む組成物に関するものである。本発明はまた、上記組成物を、生物学的、医薬、化粧品及び農産物の製剤化及び調製に使用することを対象とするものである。
【００６１】
「担う」とは、上記にて示した通り、少なくとも１つの対象物質と直接的に連結されたかまたは間接的に共役された、本発明によるアミノ酸配列、ベクターまたは運搬体を指す。
【００６２】
本発明は、少なくとも一つの対象物質を担うベクター及び運搬体の、医薬的に許容されるアルカリ付加塩または酸付加塩、水和物、エステル、溶媒和物、前駆物質、代謝産物または立体異性体を包含するものである。更に本発明は、医薬的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤と結合する少なくとも一つの対象物質を担うベクター及び運搬体を含む医薬製剤を包含するものである。
【００６３】
「医薬的に許容される塩」という表現は、一般に遊離塩基を適当な有機酸または無機酸と反応させて調製することが可能な本発明によるアミノ酸配列の無毒性塩を意味する。これらの塩は、遊離塩基の生物学的効果および特性を保持する。この様な塩の代表的な例として、酢酸塩、アンソネート（４，４−ジアミノスチルベン−２，２’−ジスルホネート）、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、カムシラート、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、ジクロロヒドレート、エデト酸塩、エディシレート、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキサフルオロリン酸塩、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオネート、乳酸塩、ラクトビオネート、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシレート、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシレート、硝酸塩、３−ヒドロキシ−２−ナフトエート、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモエート（１，１−メチレン−ビス−２−ヒドロキシ−３−ナフトエート、エンボエート）、パントテン酸塩、リン酸塩／ニリン酸塩、ピクリン酸塩、ポリガラクツロネート、プロピオン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホサリチル酸塩、スラメート、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクレート、トシレート、トリエチオダイド、吉草酸塩及びＮ−メチルグルカミンアンモニウム塩等の水溶性及び水不溶性の塩が挙げられる。
【００６４】
対象者は、少なくとも一つの対象物質を担う、本発明のペプチド、ベクターまたは運搬体の医薬上有効な量で治療することができる。「医薬上有効な量」という表現は、研究者または担当医師が期待する組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を得る為に、対象物質を充分侵入させることができる量を意味する。
【００６５】
更に本発明は、対象物質の細胞内または細胞核内への導入に適した医薬組成物を対象とするものである。上記組成物は、単独で、或いは１またはそれ以上の医薬上許容される担体と組合わせて、少なくとも一つの対象物質を「担う」、本発明によるアミノ酸配列、ベクターまたは運搬体の有効量を含む。上記組成物は、非常に毒性が低いか、または全く毒性がないという意味で特に有用である。
【００６６】
少なくとも一つの対象物質を「担う」、本発明によるベクター若しくは運搬体、またはそれらの塩の投与は、治療薬が許容し得る任意の投与方法によって行なうことができる。これらの方法には、例えば経口、鼻腔、非経口的な全身投与、または例えば経皮的な局所投与、若しくは更に例えば外科的頭蓋内経路による中枢投与、或いは更に眼内投与が含まれる。
【００６７】
経口投与は、錠剤、ゼラチンカプセル、軟カプセル（遅延または持続放出性製剤を含む）、丸剤、粉末、顆粒剤、エリキシル、チンキ剤、懸濁液、シロップ及び乳剤によって行なわれる。この剤型は特に、腸関門の通過に適している。
【００６８】
非経口投与は、一般に皮下、筋肉内または静脈内注射、或いはかん流によって行なわれる。注射用組成物は、懸濁液または溶液の一般形態、或いは液体中への即時溶解に適した固体形態として調製することができる。この剤型は特に、血液脳関門の通過に適している。
【００６９】
非経口投与に関する可能性の一つとして、例えばＵＳ−Ａ−３  ７１０  ７９５号では、一定用量レベルの維持を保証する徐放性または持続放出性システムの移植を使用する。
【００７０】
鼻内投与に当たっては、適切な鼻内ビヒクルを使用することができる。
【００７１】
経皮投与に当たっては、当業者に周知の経皮パッチを使用することができる。経皮放出システムにより、持続的投与が可能になる。
【００７２】
その他の好ましい局所製剤として、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレー及びゲルが挙げられる。
【００７３】
計画される投与方法に基づいて、化合物は固体、半固体または液体の形態とすることができる。
【００７４】
遊離状態またはゼラチンカプセルに封入された状態の錠剤、丸剤、粉末または顆粒剤等の固体組成物では、有効成分を以下に記載のものと組合わて使用することができる：ａ）希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン；ｂ）潤滑剤、例えばシリコーン、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウムまたはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコール；ｃ）結合剤、例えばケイ酸マグネシウム及びケイ酸アルミニウム、澱粉糊、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン；必要に応じてｄ）崩壊剤、例えば澱粉、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩、または発泡性混合物；および／またはｅ）吸収剤、着色料、香料及び甘味剤。賦形剤としては、例えばマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム及び製剤品質上の類似化合物が挙げられる。
【００７５】
坐剤等の半固形組成物では、賦形剤は、例えば乳剤または脂肪懸濁液であるか、またはポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコールを主成分とすることができる。
【００７６】
特に注射用または軟カプセルに封入する液体組成物は、例えば水、生理的血清、水性デキストロース、グリセロール、エタノール、油及び類似化合物等の医薬上純粋な溶媒への有効成分の溶解、分散等々によって調製することができる。
【００７７】
更に、少なくとも一つの対象物質を「担う」、本発明のベクターまたは運搬体は、単層小胞、単層大型胞及び多層小胞の形態等の、リポソームタイプの放出系形態で投与することができる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含む様々なリン脂質から生成される。一実施形態では、ＵＳ−Ａ−５  ２６２  ５６４号に記載されている様に、液体成分の薄層を薬剤の水溶液で水和し、当該薬剤を包み込む脂質層を形成することができる。
【００７８】
これは、滅菌する、および／またはアジュバント及び防腐剤、安定剤、湿潤剤または乳化剤、溶解を促進する作用物質、浸透圧を調節する為の塩および／または緩衝剤等の無毒性の補助剤が含まれる。これらには、治療上有用な他の物質が含まれる。これら組成物は夫々、混合、顆粒化または被覆等の一般的な方法で調製することができ、約０．１〜７５％、好ましくは約１〜５０％の有効成分を含有する。
【００７９】
更に、少なくとも一つの対象物質を「担う」、本発明のアミノ酸配列、ベクターまたは運搬体は、標的可能な薬剤の保持体等の可溶性ポリマーと結合することができる。この様なポリマーとして、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシ−エチル−アスパナミド−フェノールまたはパルミトイル残基で置換されたポリ（エチレンオキシド）−ポリリシンが挙げられる。更に本発明の化合物は、制御された薬剤の放出を実施する為に有用な一連の生分解性ポリマー、例えばポリ（乳酸）、ポリ（エプシロン−カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート及び網状または両親媒性の連続するヒドロゲルのコポリマーに結合することができる。
【００８０】
少なくとも一つの対象物質を担う、本発明のアミノ酸配列、ベクター、または運搬体の投与用量は、対象者のタイプ、種、年齢、体重、性別及び医学的状態；治療状態の重症度；投与経路；対象者の腎及び肝機能の状態、並びに使用する個々の化合物または塩の性質を含めて、様々な因子に応じて選択される。正式な経験を有する医師または獣医師であれば、治療する医学的状態の進行を予防する、阻止する若しくは停止させる為に必要な対象物質を担うベクターまたは運搬内の有効量を容易に決定し、処方するだろう。
【００８１】
上記医薬組成物の一つは、０．１〜９９％、好ましくは１〜７０％の有効成分を含み得る。
【００８２】
一例として、少なくとも一つの対象物質を担う、本発明によるアミノ酸配列、ベクターまたは運搬体の経口投与用量は、指示される作用目的で使用するとき、経口経路で約０．０５〜１，０００ｍｇ／日であり、好ましくは０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０及び１，０００．０ｍｇの有効成分を含む錠剤の形態で投与される。少なくとも一つの対象物質を担うベクターまたは運搬体の有効血漿レベルは、１日当り０．００２ｍｇ−５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。
【００８３】
少なくとも一つの対象物質を担う、本発明のアミノ酸配列、ベクターまたは運搬体は、１日１回の用量で投与しても良いし、１日当たりの合計量を１日２回、３回または４回用量に分けて投与しても良い。
【００８４】
特定の適用に当たっては、本発明は、本発明による少なくとも一つのアミノ酸配列、ベクター、運搬体および／または細胞によって構成されるか、またはこれらを含む、対外で使用する為の診断薬に関するものである。この様な診断薬は、体内で使用することもできる。
【００８５】
従って、本発明は、上記診断薬を含む診断キットも対象とするものである。より詳細には上記診断キットは、一またはそれ以上の容器中に、予め定められた量の本発明組成物を含んでいる。
【００８６】
同様に、本発明によるアミノ酸配列、若しくは上記アミノ酸配列を含むベクターおよび／または運搬体、或いは当該ベクターを用いてトランスフェクションされる細胞は、予防目的で、例えば非制限的に、ウイルス感染、転移、細胞のアポトーシス（例えば、変性性疾患、組織虚血…）の予防目的で、或いは治療目的で、例えば感染症（ウイルス、細菌…）、癌及び血管新生性疾患の治療目的で、体内で使用され得る。
【実施例】
【００８７】
本発明の他の利点及び特徴は、添付の図面を参照して、下記の実施例によって明らかになるだろう。以下に、本発明を説明するための例を挙げるが、これらは特許請求の範囲を限定するものではない。
【００８８】
実施例１：生物学的効果（ペルオキシダーゼ）を生じない、制御分子のインターナリゼーション（Ｉｎｔｅｒｎｅａｌｉｚａｔｉｏｎ）
【００８９】
１）材料および方法
１．１）リガンドの性質
中規模サイズのタンパク質（４００００Ｄａ）のインターナリゼーションを行うため、ＤＰＶ１５およびＤＰＶ１５ｂの能力を表すのにペルオキシダーゼを選択した。事前活性化された形態のタンパク質を用いることにより、同一共役（ＰＯ分子あたり１ＤＰＶのみ）の作製が可能となる。ＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）細胞系およびＨｅＬａ（頸腺癌）細胞系双方において、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの侵入を試験した。
【００９０】
・ＥＺリンクマレイミド活性化ホースラディシュペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ  ３１４８５）（図１）
ペルオキシダーゼコンジュゲートの作製を容易にするため、ＥＺリンクマレイミドホースラディシュペルオキシダーゼ（ＰＯ）（Ｍ．Ｗ＝４０．０００）を用いる。これは、事前活性化されかつ安定したＰＯ誘導体であり、スルフヒドリル（−ＳＨ）基と反応する。この生成物を用いて、遊離ＳＨ基を含む任意のリガンドとＰＯとの共役を行うことができる。
【００９１】
・ペプチドベクター
ＤＰＶ１５：対象物質との結合のためにＣ末端にシステイン残基が設けられた、Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  （ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．１）
【００９２】
ＤＰＶ１５ｂ：対象物質との結合のためにＮ末端にシステイン残基が設けられた、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）
【００９３】
ＤＰＶ１５およびＤＰＶ１５ｂは、対象物質との結合のために、Ｃ末端およびＮ末端のいずれかまたは両方にシステイン残基を含んでもよい。
【００９４】
ＤＰＶ１０：対象物質との結合のためにＣ末端にシステイン残基が設けられた、Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３）（この配列は、Ｎｏ．ＷＯ０１／６４７３８の下で公開されたＰＣＴ特許出願に開示されている）。
【００９５】
・ビバスピン（ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）：限外ろ過細胞膜（６ｍＬ／カットオフ閾値＝１００００ダルトン）。これは、共役化合物の濃縮および精製のために用いられる（過剰試薬の除去）。
【００９６】
・制御のための遊離ペルオキシダーゼ（シグマ  ｒｅｆＰ−６７８２）。
【００９７】
１．２）コンジュゲーションプロトコル
５００μｇのＤＩＡＴＯＳペプチドを、５０μｌの共役緩衝液に溶解させる（ＮａＣｌ０．５Ｍ、リン酸ナトリウム５０ｍＭ、ＥＤＴＡ５ｍＭ、ｐＨ７）。
【００９８】
１ｍｇのマレイミド活性化ペルオキシダーゼを、２００μｌの共役緩衝液中に溶解させる。
４３μｌのＤＩＡＴＯＳペプチドを、１ｍｇ（２００μｌ）のマレイミド活性化ペルオキシダーゼ（モル比：５ｐｅｐｔ／ＰＯ−マレイミド）に付加する。
混合し、室温で３時間培養する。
１ｍｌの０．５ＭのＮａＣｌを追加する。
ビバスピンでＤＰＶ−ＰＯを濃縮する。遠心分離を１０〜１５分間、３３００ｇ、２０℃で行う。
２ｍｌの０．１５ＭのＮａＣｌをビバスピンに再注入し、コンジュゲートを再度濃縮する。
この最終工程をもう一度繰り返す。
システインにリンクされたＰＯからなる制御が行われた。
【００９９】
１．３）コンジュゲートの保存
ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートを凍結させておき（−２０℃）、０．１５ＭのＮａＣｌ中で希釈する。
【０１００】
１．４）共役化合物の特徴付け
ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
１５μｇの各サンプルを、１０％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せる。
移動（１００Ｖで１時間）。
このゲルを、ブリリアントブルークマシー溶液で１時間染色する。
Ｈ２Ｏ／エタノール／酢酸中で１時間脱染（６Ｖ／３Ｖ／１Ｖ）。
【０１０１】
図２Ａは、結合後の分子量増加を示す（バンド１は、レーン３および４におけるよりもレーン２において低い）。図２Ｂ中の表は、Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌソフトウェアを用いて共役分子量を計算した結果を示す。各コンジュゲートについて、およそ２ｋＤａの増加があり、これは、ＰＯ分子に追加されたＤＰＶの分子量に対応する。レーン３および４中に単一バンドが存在するが、これは、溶液中の唯一の分子は実際はＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートであり、かつ、溶液中に遊離ＰＯは無いことを示す。
【０１０２】
ｂ）ヘパリンコートされたプレート上でのＥＬＩＳＡ試験
【０１０３】
ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートおよび制御（遊離ＰＯおよびＣｙｓ−ＰＯ）を、５μｇ／ｍｌのヘパリンで事前コーティングされたＥＬＩＳＡプレート上に載せる（これにより、共役化合物のみが結合し、ＰＯ基板と反応する）。
【０１０４】
希釈されたサンプル（３０ｎｇ／ｍｌ）を３７℃で１時間培養し、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ中で５回洗浄する。
【０１０５】
染色は、ＰＯ基板（Ｏ−フェニルエネジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）（シグマ）錠剤）−５ｍｇ丸薬を１０ｍｌのクエン酸塩−クエン酸バッファ０．１Ｍ＋１００μｌのＨ２Ｏ２３％で希釈したもの）で行う。
【０１０６】
５０μｌのＨ２ＳＯ４  ２Ｎを追加することにより、反応を停止させる。
【０１０７】
４９０ｎｍにおいて、Ｏ．Ｄ．を読み出す。
【０１０８】
この試験により、溶液中のコンジュゲートの検出が可能となり、図２Ａに示す結果が再度確認された。しかし、この試験では、溶液中のコンジュゲートの定量化は可能ではなく、定量化は、ＩＩ．４．ｃにおいて述べる実験後のみにおいて可能となる。
【０１０９】
ｃ）溶液中の共役化合物の濃度の決定
【０１１０】
溶液中のＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの定量化は、溶液中に遊離ペルオキシダーゼが存在しないと仮定すると、Ｅｌｉｓａによる適切な結合の確認後に実現され、ＰＯタンパク質そのものの活性に基づく。
【０１１１】
遊離ＰＯに対する標準的希釈（１０ｎｇ／ｍｌから、その後  希釈）。
ＤＰＶ−ＰＯサンプルの１／１６００００の希釈後、希釈。
９６ウェルのＥｌｉｓａプレートのウェル中に５０μｌの溶液を入れる。
ＰＯ基板（ＯＰＤ）を追加。
９分後、５０μｌのＨ２ＳＯ４  ２Ｎを追加することによって反応を停止させる。
４９０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．を読み取り、遊離ＰＯについて得られたものと比較する。
【０１１２】
１．５）インターナリゼーションプロトコル
【０１１３】
インターナリゼーション実験を、ＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）細胞系およびＨｅｌａ（子宮頸部腺癌）細胞系双方において実現した。インターナリゼーションを、先ず単一時点において評価した（４時間）。
ＨＣＴ１１６培地：Ｍｅ  Ｃｏｙ’ｓ  ５ａ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）＋１．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋１０％ＳＶＦ
ＨｅＬａ培地：ＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）＋２ｍＭＬ−グルタミン＋１ｍＭＮａ  ピルビン酸塩＋１０％ＳＶＦ
【０１１４】
ａ）定量分析
０日目において、８ウェルＬａｂｔｅｋスライドガラス（０．７ｃｍ２／ウェル）中に、定期的に以下を供給した：すなわち、ＨｅＬａ細胞の場合３．６．１０４細胞／ｃｍ２を、または、ＨＣＴ１１６細胞の場合７．１０４細胞／ｃｍ２を供給した。侵入調査を１日目に行った。
【０１１５】
プロトコル：
ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中のコンジュゲートを７５μｇ／ｍｌ中で希釈する。
細胞を培地から除去する。
コンジュゲートを、３７℃で４時間、５％ＣＯ２−１００μｌ／ウェル（すなわち、７．５μｇ／ウェル）で培養する。
細胞をＰＢＳ中で３回洗浄する。
細胞を１００μｌのトリプシン−ＥＤＴＡ中で３７℃で３０分間培養する。
１５０μｌの完全培地中で細胞を再度懸濁する。
細胞をカウントする。
細胞を遠心分離機にかけ、良く冷えたＰＢＳ中で２回洗浄する。
２２０μｌの冷却溶解物バッファ（０．１Ｍのトリス（ｐＨ８）、０．５％のＮＰ４０）中で再度懸濁する。
４℃で１５分間培養する。
細胞溶解物を遠心分離機にかける。
９６ウェルプレート中において、１つのウェルに１００μｌずつ分配する。
溶解バッファ（１０ｎｇ／ｍｌから。ＰＢＳ中で希釈。１０ポイント）におけるペルオキシダーゼ標準曲線を作成する。試験後の溶液をカウントし、インターナリゼーション％を計算する。
可溶性ペルオキシダーゼ基板（５ｍｇのＯＰＤ（シグマ）の１個の丸薬＋１０ｍｌのクエン酸塩−クエン酸バッファ（０．１Ｍ）、ｐＨ５．５＋１００μｌの３％Ｈ２０２）を追加する。
９分後、５０μｌのＨ２ＳＯ４  ２Ｎを追加することにより、反応を停止させる。
４９０ｎｍにおいて吸光度を読み取る。
【０１１６】
ｂ）ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションの定性的評価
【０１１７】
０日目において、以下の条件において、８ウェルガラスｌａｂｔｅｃｋスライド（１ｃｍ２）上に、定期的に以下を供給した。すなわち、ＣＨＯ細胞（マウス卵巣細胞）の場合０．３  １０５細胞／ウェルを、ＰｇｓＡ−７４５細胞（グリコスアミノグリカン（ＧＡＧ）発現およびＨｅＬａ細胞の欠失したマウス卵巣細胞）の場合、０．２５  １０５細胞／ウェルを供給した。供給は、常に２５０μｌの媒体で行った。これらの細胞系全てについて、侵入調査を１日目に定期的に行う。
【０１１８】
プロトコル：
適切な濃度のＤＭＥＭ＋１０％ＳＶＦ中でコンジュゲートを希釈する。
細胞を培地から除去する。
コンジュゲートを適切な条件下で培養する。
細胞をＰＢＳ中で３回洗浄する。
室温（ＲＴ）において、３．７％ＰＦＡ中で２０分間固定する。
室温（ＲＴ）において、ＰＢＳ中で洗浄する。
適切な抗体で免疫染色を行い、第２は蛍光色素と共役される。
Ｄａｐｉの存在下のもとでマウントする。
【０１１９】
２）結果
２．１）定量的な細胞内蓄積
図３は、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのＨＣＴ１１６細胞への定量的侵入を示す。濃度７５μｇ／ｍｌ（およそ１．８μＭに対応する）の初期ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートにおいて４時間培養後、細胞溶解を行った。結果を、３つの独立した実験（これらは全て正副２個実現した）において平均値として得る。
【０１２０】
表１は、ＨＣＴ１１６細胞においてインターナリゼーションされたＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの正味数量を示す。結果は、ＰＯ／細胞（１０００個）をピコグラムで表した。
【０１２１】
【表１】
2007529194.tif 000002
【０１２２】
図４は、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのＨｅＬａ細胞への定量的侵入を示す。コンジュゲートの存在下、細胞を初期濃度７５μｇ／ｍｌで４時間培養した。結果を、３つの独立した実験（これらは全て正副２個実現した）において平均値として得る。
【０１２３】
表２は、ＨｅＬａ細胞中においてインターナリゼーションされたＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの正味数量を示す。結果を、ピコグラム／細胞（１０００個）で示す。
【０１２４】
【表２】
2007529194.tif 000003
【０１２５】
図５は、ＨｅＬａ細胞およびＨＣＴ１１６細胞中のＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションレベルを比較したものである。
【０１２６】
表３：各細胞型においてインターナリゼーションされた共役分子（細胞１個あたり百万個の共役分子）の推定数およびＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのＨｅＬａ中細胞内蓄積のＨＣＴ１１６細胞に対する比。
【０１２７】
【表３】
2007529194.tif 000004
【０１２８】
図３〜５および表１〜３から分かるように、ＤＰＶ−ＰＯ細胞内蓄積レベルは、ＤＰＶの関数および細胞系の関数として変動する。
【０１２９】
２．２）ＨｅＬａ細胞中のＤＰＶ−ペルオキシダーゼのインターナリゼーションの定性的評価
ガラスＬａｂｔｅｋスライド上で培養されたＨｅＬａ細胞で、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートを培養した（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳの７５μｇ／ｍｌ溶液で３７℃で４時間の培養）。この実験は、上述した定量的実験において用いられたペプチド−ＰＯコンジュゲートと同一のもので、全く同一条件において実現した。
【０１３０】
図６は、ＨｅＬａ細胞中のＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの局在化を示す。
【０１３１】
８ウェルＬａｂｔｅｋスライドガラス上のＨｅＬａ細胞上で、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートを初期濃度７５μｇ／ｍｌで４時間培養した。セクションＩＩＩ−２において述べるようなジアミノベンジジンを用いて、ペルオキシダーゼ存在検出を行った。Ｌｅｉｃａ顕微鏡（２０×レンズ＋０．６３×アダプター）上で視覚化後、Ｎｉｋｏｎ  ｃｏｏｌｐｉｘデジタルカメラの最大ズームで写真を撮影した。
【０１３２】
図６は、ＨｅＬａ細胞中へのコンジュゲート侵入およびペルオキシダーゼのジアミノベンジジン（ＤＡＢ）存在検出後に観察される典型的な画像を示す。ＤＰＶ１５−ＰＯおよびＤＰＶ１５ｂ−ＰＯは、明らかに常に主に細胞核であった。
【０１３３】
図７は、ＤＰＶ１５ｂ−ＰＯインターナリゼーション後のＨｅＬａ細胞の詳細を示す。図６について述べたのと同じ条件で写真を撮影した。その後、数値拡大が得られた。
【０１３４】
図７は、観察物をより正確にしたものを示す。ＤＰＶ１５ｂ−ＰＯについては、細胞核および核小体が明確に染色されており、細胞質も（かなり弱くではあるが）染色されている。
【０１３５】
図７は、ＨｅＬａ細胞中における３７℃で４時間のインターナリゼーション後のＤＰＶ１５ｂ−ＰＯコンジュゲートおよびＤＰＶ１５−ＰＯコンジュゲートの免疫蛍光染色を示す。ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートは、８ウェルＬａｂｔｅｋスライドガラス上のＨｅＬａ細胞上で、初期濃度７５μｇ／ｍｌで４時間培養した。ペルオキシダーゼ存在検出は、先ずペルオキシダーゼに対するモノクローナル抗体を用い、次に抗マウスＴＲＩＴＣ共役抗体を用いて行った。
【０１３６】
２．３）細胞内蓄積レベルに対する初期濃度の影響
ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションに関する全ての予備実験は、初期コンジュゲート濃度７５μｇ／ｍｌで実現されてきた。インターナリゼーションメカニズムが飽和し得るか否かを確認するために、コンジュゲート細胞内蓄積レベルに対する初期コンジュゲート濃度の影響について調査した。
【０１３７】
ＤＰＶ１５ｂ−ＰＯおよびＤＰＶ１５−ＰＯのインターナリゼーション（図８）は、試験された濃度範囲内では、停滞期に至らなかったことを示す。
【０１３８】
図８は、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションを初期コンジュゲート濃度の関数として示したものである。ガラスＬａｂｔｅｋスライド上で２４時間培養されたＨｅＬａ細胞を、図上で示した初期濃度のＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの存在下で４時間培養した。トリプシンでの広範囲処理によって表面結合材料およびその後の細胞溶解を除去後、インターナリゼーションされたＰＯを定量化した。結果を、細胞１０００個あたりのＰＯ（ピコグラム）で表す。
【０１３９】
全ての後続実験は、初期ＤＰＶ−ＰＯ濃縮２５μｇ／ｍｌで実現した。
【０１４０】
２．４）ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションに対する温度の影響
ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションがエネルギー依存現象であるか否かを判定するため、３７℃または４℃のいずれかで定量的実験を行った。
図９は、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションレベルに対する温度の影響を示す。ガラスＬａｂｔｅｋスライド上で２４時間培養されたＨｅＬａ細胞を、初期濃度２５μｇ／ｍｌで、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの存在下で４時間３７℃または４℃のいずれかで培養した。トリプシンでの広範囲処理によって表面結合材料の除去およびその後の細胞溶解を行った後、インターナリゼーションされたＰＯを定量化した。結果は、細胞１０００個あたりのＰＯをピコグラムで表した。
【０１４１】
図９に示すように、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションは４℃において抑制され、これは、アクティブエンドサイトーシス現象を呈する。
【０１４２】
２．５）ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションに対する細胞表面グリコスアミノグリカン（ＧＡＧ）の影響
ＤＰＶは、ヒトヘパリン結合タンパク質から由来し、結果的に対外でヘパリンに結合する。体内でのＧＡＧ結合工程の必要性を確認するため、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＰｇｓＡ−７４５細胞双方においてインターナリゼーション実験を行った。これは、キシロシルトランスフェラーゼを欠失したＣＨＯのクローンであるため、検出可能レベルのプロテオグリカンは生成されなかった（Ｅｓｋｏら、１９８５；ＲｏｓｔａｎｄおよびＥｓｋｏ、１９９７）。
【０１４３】
図１０は、ＣＨＯ細胞およびＰｇｓＡ−７４５細胞中のＤＰＶ１５ｂ−ＰＯおよびＣｙｓ−ＰＯのインターナリゼーションレベルの比較を示す。ガラスＬａｂｔｅｋスライド上で２４時間培養されたＣＨＯ−Ｋ１細胞またはＰｇｓＡ−７４５細胞を、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの存在下で初期濃度２５μｇ／ｍｌで３７℃で４時間培養した。トリプシンでの広範囲処理によって表面結合材料およびその後の細胞溶解を除去後、インターナリゼーションされたＰＯを定量化した。結果を、細胞１０００個あたりのＰＯ（ピコグラム）で表す。
【０１４４】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＰｇｓＡ−７４５細胞におけるコンジュゲートインターナリゼーションレベルの比較（図１０）は、ＰｇｓＡ−７４５細胞表面においてプロテオグリカンが存在しないと、インターナリゼーションされたコンジュゲートのレベルの重大な低下に繋がることを示し、よって、ＤＰＶ−ＰＯインターナリゼーションにおける第１の工程としてのＧＡＧ結合が確認された。
【０１４５】
２．６）ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションのヘパリン抑制
コンジュゲートのインターナリゼーションのための必要条件としてのＤＰＶのＧＡＧへの結合を確認するため、培養媒地中のヘパリンの存在下で、インターナリゼーション実験を実現した。ヘパリンはＤＰＶに結合すべきであり、細胞表面への自身の結合およびその後のインターナリゼーションを回避すべきである。
【０１４６】
図１１は、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの細胞内蓄積に対するヘパリンの抑制効果を示す。ガラスＬａｂｔｅｋスライド上で２４時間培養されたＨｅＬａ細胞を、図示のヘパリン濃度で３７℃で１時間事前培養した。その後、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの存在下で、同量のヘパリンを含む細胞培地中で２５μｇ／ｍｌで細胞を４時間培養した。トリプシンでの広範囲処理によって表面結合材料およびその後の細胞溶解を除去後、インターナリゼーションされたＰＯを定量化した。結果を、細胞１０００個あたりのＰＯ（ピコグラム）で表す。
【０１４７】
図１１に示すように、ヘパリンの存在下でのコンジュゲート培養により、ＨｅＬａ細胞中のそのインターナリゼーションが抑制され、よって、ＧＡＧとＤＰＶとの間の相互作用が確認された。
【０１４８】
２．７）ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションのポリ−Ｌ−Ｌｙｓ抑制
グリコスアミノグリカン合成における欠陥を示す細胞中のＤＰＶ−ＰＯインターナリゼーションの抑制（ＣＨＯ−Ｋ１細胞と比較したＰｇｓＡ−７４５細胞）と、細胞培地におけるヘパリン存在下のＤＰＶコンジュゲートのインターナリゼーション抑制とは、細胞結合型ヘパラン−硫酸塩プロテオグリカンが、細胞外ＤＰＶインターナリゼーションのための細胞表面結合部位として機能することを示す。
【０１４９】
この仮説を証明するため、培養媒地中のポリ−Ｌ−リジンの存在下で、ＨｅＬａ細胞中のＤＰＶ−ＰＯインターナリゼーションの抑制を試験した：プラスに帯電したポリ−Ｌ−Ｌｙｓは、細胞表面の負電荷に結合するはずであり、ＤＰＶの結合を回避するはずである。
【０１５０】
図１２は、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの細胞内蓄積に対するポリ−Ｌ−Ｌｙｓの抑制効果を示す。ガラスＬａｂｔｅｋスライド上で２４時間培養されたＨｅＬａ細胞を、ポリ−Ｌ−Ｌｙｓの図示濃度で３７℃で１時間事前培養した。その後、同量のポリ−Ｌ−Ｌｙｓを含む細胞培地中で、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの存在下で、細胞を２５μｇ／ｍｌで４時間培養した。トリプシンでの広範囲処理によって表面結合材料およびその後の細胞溶解を除去後、インターナリゼーションされたＰＯを定量化した。結果を、細胞１０００個あたりのＰＯ（ピコグラム）で表す。
【０１５１】
図１２に示すように、ＤＰＶ−ＰＯインターナリゼーションが強力に抑制されている。ＩＣ５０（最大インターナリゼーションの５０％が達成されたときの濃度）は、ＨｅＬａ細胞中の２５μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−Ｌｙｓの周囲に存在する。
【０１５２】
これらの実験は、細胞周囲に存在する負電荷のマスキングは、ペルオキシダーゼとの共役の際において、ＤＰＶインターナリゼーションを抑制するのに充分であることを示す。
【０１５３】
実施例２：生物学的効果の無い制御分子のインターナリゼーション（抗体抗ペルオキシダーゼ）
１）材料および方法
１．１）リガンドの性質
分子量の非常に高いタンパク質（１５００００Ｄａ）をインターナリゼーションするためのＤＰＶ１５およびＤＰＶ１５ｂの能力を示すために、抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリン（抗ＰＯ−ＩｇＧ）を選択した。
【０１５４】
−タンパク質Ｇ−セファロースカラムに対するクロマトグラフィーによって腹水から精製されたモノクローナル抗ＰＯ抗体：バッファリン酸塩（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中２ｍｇ／ｍＬ．（由来：Ｄｉａｔｏｓ−ＴＴ）。
−架橋剤：サクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ、Ｐｉｅｒｃｅ）
−ペプチドベクター：ＤＰＶ１５、ＤＰＶ１５ｂ
−ビバスピン（ビバサイエンス）：ＩｇＧの濃縮および精製および過剰試薬の除去のための限外ろ過細胞膜（カットオフ閾値＝１００００または３００００ダルトン）
−溶液およびバッファ：
・リン酸塩０．１Ｍ（ｐＨ７．４）（リン酸カリウム）
・ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
・共役緩衝液：０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ（この３つのｐＨは７）
・ＮａＣｌ：０．１５Ｍ
・ＮａＣｌ：０．５Ｍ
【０１５５】
１．２）コンジュゲーションプロトコル
【０１５６】
この共役方法は、以下の４つの工程を含む。
架橋剤（ＳＭＣＣ、Ｐｉｅｒｃｅ）によるＩｇＧ活性化
活性化されたＩｇＧのビバスピン上での濾過
ＤＩＡＴＯＳペプチドとの共役
遊離ペプチドの除去
【０１５７】
ａ）免疫グロブリンのＳＭＣＣ活性化
・１ｍＬのリン酸塩バッファ（０．１Ｍ、ｐＨ：７．４）中に、２ｍｇのＩｇＧを溶解させる。
・２００μｇのＳＭＣＣを、２０μＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解させる。
・１１．１μＬのＳＭＣＣを、ＩｇＧ溶液（比：２５ＳＭＣＣ／ＩｇＧ）に付加する。
・混合し、室温で３０〜４０分間培養する。
【０１５８】
ｂ）活性化されたＩｇＧの濾過
活性化されたＩｇＧ作成物中に１−２ｍＬの共役緩衝液を追加し、ビバスピン中での遠心分離に３３００ｇ、２０℃で１０〜１５分かける。
・２ｍＬの共役緩衝液を追加する。
・再度遠心分離を行い、この工程を２回繰り返す。
【０１５９】
ｃ）ペプチドとの共役
・６０μＬの共役緩衝液中に、６００μｇのＤＩＡＴＯＳペプチドを溶解させる。
・５４．５μＬのＤＩＡＴＯＳペプチドをＩｇＧ−ＳＭＣＣに付加する（比：１２ｐｅｐｔ／ＩｇＧ−ＳＭＣＣ）。
・混合し、３時間培養する。
【０１６０】
ｄ）非共役ペプチドおよび過剰試薬の除去
・１ｍＬの０．５ＭのＮａＣｌを、共役したＩｇＧ作製物中に付加する。
・ビバスピン中で、ＩｇＧ−ＳＭＣＣ−ペプチドを濃縮する。３３００ｇおよび２０℃で、遠心分離に１０〜１５分間かける。
・２ｍＬの０．１５ＭのＮａＣｌを追加し、コンジュゲートを再度濃縮する。
・この最終工程をもう一度繰り返す。
システインにリンクされた抗ＰＯ  ＩｇＧからなる制御が行われた。
【０１６１】
１．３）コンジュゲートの保存
ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧは、０．１５ＭのＮａＣｌで希釈された１００μｌの凍結アリコート中で保持される。
【０１６２】
１．４）共役化合物の特徴付け
ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ．
１２μｇの各サンプルを、１０％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せる。
移住（１００Ｖで１時間）。
このゲルを、ブリリアントブルークマシー溶液で１時間染色する。
Ｈ２Ｏ／エタノール／酢酸中で１時間脱染（６Ｖ／３Ｖ／１Ｖ）。
【０１６３】
図１３は、ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離の例を示す。およそ１２μｇの各コンジュゲートが、１００Ｖでの移動およびその後のクマシー青色染色の前に、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に担わされた。
【０１６４】
レーン１：分子量基準
レーン２：抗ＰＯ  ＩｇＧ
レーン３：ＤＰＶ１５−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲート
レーン４：ＤＰＶ１５ｂ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲート
【０１６５】
図１３は、ＩｇＧの重鎖および軽鎖双方との結合後の分子量の増加を示す。レーン２中の２５ｋＤａバンド（ＩｇＧの軽鎖）は、レーン３および４中のバンドよりも低い。レーン３および４中の２５〜３０ｋＤａの複数のバンドの存在は、不均一結合を示す。ＩｇＧの重鎖に対応するバンド（レーン２中の５０ｋＤａバンド）も、レーン３および４中においてより高くなっており、ＩｇＧの両鎖上でのＤＰＶの結合を示す。
【０１６６】
コンジュゲートの不均一性が重大であると、ＩｇＧ分子あたりのコンジュゲートしたＤＰＶの数をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって正確に決定することができなくなる。
【０１６７】
ｂ）ヘパリンコートされたプレート上でのＥＬＩＳＡ試験
ＤＰＶ−抗ＰＯコンジュゲートおよび制御（遊離抗ＰＯ  ＩｇＧおよびＣｙｓ−抗ＰＯ  ＩｇＧ）を、５μｇ／ｍｌのヘパリンで事前コーティングされたＥＬＩＳＡプレート上に担わせる（これにより、共役化合物のみが結合し、ＰＯと反応する）。
【０１６８】
サンプルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の最終１０μｇ／ｍｌ濃度まで希釈する。その後、希釈を行う。
プレート上でコンジュゲートを３７℃で１時間培養し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄する。
各ウェル中でＰＯを１μｇ／ｍｌで３７℃で１時間培養し、その後、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ中で５回洗浄する。
その後、ＰＯ基板を追加する（５ｍｇＯＰＤ（シグマ）の１個の丸薬＋１０ｍｌのクエン酸塩−クエン酸バッファ、０．１Ｍ、ｐＨ５．５＋１００μｌＨ２０２３％）。
５分後、５０μｌのＨ２０４２Ｎによって、反応を停止させる。
４９０ｎｍにおいてＯＤを読みとる。
【０１６９】
この試験により、ＩｇＧ分子上のＤＰＶの存在を可能することが可能となる。とはいうものの、各ＤＰＶのヘパリンに対する親和性は異なり、溶液中の化合物の定量化は不可能である。この定量化は、ＯＤ２８０を測定することによって行われ、１．４ＯＤ単位＝１ｍｇ／ｍｌコンジュゲートということが分かる。
【０１７０】
１．５）インターナリゼーションプロトコル
インターナリゼーション実験を、ＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）細胞系およびＨｅＬａ（子宮頸部腺癌）細胞系双方において実現した。細胞内蓄積を、単一時点において評価した（４時間）。
【０１７１】
ａ）定量分析
０日目において、細胞を定期的に供給した：すなわち、２ウェルＬａｂｔｅｋスライドガラス（４ｃｍ２／ウェル）において、ＨｅＬａ細胞の場合３．６．１０４細胞／ｃｍ２、またはＨＣＴ１１６細胞の場合７．１０４細胞／ｃｍ２を供給した。侵入調査を１日目に行った。
【０１７２】
プロトコル：
ＤＭＥＭ＋１０％ＳＶＦ中において、コンジュゲートを１００μｇ／ｍｌで希釈する。
細胞を培地から除去する。
コンジュゲートを、３７℃で４時間、５％ＣＯ２−１００μｌ／ウェル（すなわち、４０μｇ／ウェル）で培養する。
細胞をＰＢＳ中で３回洗浄する。
細胞を２００μｌのトリプシン−ＥＤＴＡ中で３７℃で３０分間培養する。
４００μｌの完全培地中で細胞を再度懸濁する。
細胞をカウントする。
細胞を遠心分離機にかけ、良く冷えたＰＢＳ中で２回洗浄する。
２２０μｌの冷却溶解物バッファ（０．１Ｍのトリス（ｐＨ８）、０．５％のＮＰ４０）中で再度懸濁する。
４℃で１５分間培養する。
細胞溶解物を遠心分離機にかける。
抗マウスＩｇＧ（１００μｌで２回）で事前コーティングされた９６ウェルプレート中に細胞溶解物を分配する。１０ｎｇ／ｍｌからの抗ＰＯ  ＩｇＧについて、標準曲線を作成する。
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の細胞溶解物  を希釈し、１０ｎｇ／ｍｌにおける抗ＰＯ  ＩｇＧについて標準曲線を作成する。
３７℃で１時間培養し、４℃で一晩放置する。
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄する。
ペルオキシダーゼをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で１μｇ／ｍｌ、３７℃で１時間培養する。
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄する。
ペルオキシダーゼ基板（１丸薬ＯＰＤ＋１０ｍｌのクエン酸塩−クエン酸バッファ（０．１Ｍ）、ｐＨ５．５＋１００μｌの３％Ｈ２Ｏ２）を追加する。
９分後、５０μｌのＨ２ＳＯ４  ２Ｎを追加することにより、反応を停止させる。
４９０ｎｍにおいて吸光度を読み取り、標準曲線の値と比較する。
【０１７３】
ｂ）ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートのインターナリゼーションの定性的評価
・ＰＯ−ペルオキシダーゼ基板の染色
０日目において、８ウェルガラスｌａｂｔｅｃｋスライド（０．７ｃｍ２）上に、定期的に以下を供給した。すなわち、ＨｅＬａ細胞の場合３．６．１０４細胞／ｃｍ２を、またはＨＣＴ１１６細胞の場合７．１０４細胞／ｃｍ２を供給した。侵入調査を１日目に定期的に行った。
【０１７４】
プロトコル：
完全培地中において１００μｇ／ｍｌでコンジュゲートを希釈する。
細胞を培地から除去する。
５％ＣＯ２−１００μｌ／ウェル（すなわち、１０μｇ／ウェル）で３７℃で４時間コンジュゲートを培養する。
細胞をＰＢＳ中で３回洗浄する。
冷却エタノール中で−２０℃で５分間固定する。
ＲＴにおいてＰＢＳ中で洗浄する。
ＰＯ（完全培地中で１０μｇ／ｍｌ）を室温で１時間追加する。
ＰＢＳ中で３回洗浄する。
ペルオキシダーゼ基板（ジアミノベンジジン、１０ｍｌＨ２０＋３３０ｐｌＨ２０２３％中の１錠剤）を追加する。
ＰＢＳ中で３回洗浄する。
写真を撮影する。
【０１７５】
・ＴＲＩＴＣ共役された抗マウスＩｇＧ染色
０日目において、細胞を定期的に供給した：すなわち、８ウェルＬａｂｔｅｋスライドガラス（０．７ｃｍ／ウェル）において、ＨｅＬａ細胞の場合３．６．１０４細胞／ｃｍ２を供給し、またはＨＣＴ１１６細胞の場合７．１０４細胞ｓ／ｃｍを供給した。侵入調査を１日目に行った。
【０１７６】
プロトコル：
コンジュゲートを、完全培地において１００μｇ／ｍｌで希釈する。
細胞を培地から除去する。
コンジュゲートを、３７℃で４時間、５％ＣＯ２−１００μｌ／ウェル（すなわち、１０μｇ／ウェル）で培養する。
細胞をＰＢＳ中で３回洗浄する。
冷却メタノール／アセトン（１／１）中でー２０℃で５分間固定する。
ＲＴにおいてＰＢＳ中で洗浄する。
ＲＴにおいて、ＰＢＳ＋５％ロバ血清（ｓｏｌＡ）中において３０分間ブロックする。
溶液Ａ中においてＴＲＩＴＣ−共役抗マウス７μｇ／ｍｌで、３０分間ＲＴで暗所において培養する。
溶液Ａ中で洗浄後、ＰＢＳ中で洗浄する。
平衡緩衝液中で平衡化させ、ＤＡＰＩによるＳｌｏｗ  Ｆａｄｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｋｉｔ中にマウントする（分子プローブＳ−２４６３６）。
【０１７７】
２）結果
２．１）定量的侵入
図１４は、ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートのＨＣＴ１１６細胞中への定量的侵入を示す。濃度１００μｇ／ｍｌの初期ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートにおける４時間の培養後、細胞溶解を行った。結果を、３つの独立した実験（これらは全て正副２個実現した）において平均値として得る。
【０１７８】
表４は、ＨＣＴ１１６細胞中においてインターナリゼーションされたＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートの正味数量を示す。結果は、ＰＯ／細胞（１０００個）を、３つの独立した実験の平均値としてピコグラムで表す。
【０１７９】
【表４】
2007529194.tif 000005
【０１８０】
図１５は、ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートのＨｅＬａ細胞中への定量的侵入を示す。コンジュゲート存在下で、細胞を初期濃度１００μｇ／ｍｌで４時間培養した。結果を、３つの独立した実験（これらは全て正副２個実現した）において平均値として得る。
【０１８１】
表５は、ＨｅＬａ細胞中でインターナリゼーションされたＤＰＶ−抗ＰＯコンジュゲートの正味数量を示す。結果は、３つの独立した実験においてＰＯ／細胞（１０００個）をピコグラムで表した。
【０１８２】
【表５】
2007529194.tif 000006
【０１８３】
図１６は、ＨｅＬａ細胞およびＨＣＴ１１６細胞中のＤＰＶ−抗ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションレベルを比較したものである。インターナリゼーションレベルは、細胞系およびＤＰＶ双方に依存する。
【０１８４】
表６は、各細胞型においてインターナリゼーションされた共役分子（細胞１個あたり百万個の共役分子）の数を示す。
【０１８５】
【表６】
2007529194.tif 000007
【０１８６】
２．２）ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧのインターナリゼーションの定性的評価
ガラスＬａｂｔｅｋスライド上で成長させたＨｅＬａ細胞により、ＤＰＶ−抗ＰＯコンジュゲートを培養した（細胞培地中での１００μｇ／ｍｌ溶液の３７℃での４時間の培養）。この実験は、上述した定量的実験において用いられたものと同一のペプチド−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートによって実現した。
【０１８７】
図１７〜図１８に示すように、ＨｅＬａ細胞においては、ＰＶ１５ｂ抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートおよびＤＰＶ１５−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートの細胞内局在化は、細胞核に主に限定されている（弱い細胞質染色部分は、細胞膜と細胞核との間で未だ運搬中のコンジュゲートの数量に部分的に対応し、また、最終的局在化が細胞質となるコンジュゲートの比率に部分的に対応する）。
【０１８８】
図１７は、ＨｅＬａ細胞中のＤＰＶ１５−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートおよびＤＰＶ１５ｂ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートの局在化を示す。ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートは、８ウェルＬａｂｔｅｋスライドガラス上で、初期濃度１００μｇ／ｍｌでＨｅＬａ細胞上で４時間培養した。コンジュゲートの存在検出は、その基板：ジアミノベンジジンによって視覚化されたペルオキシダーゼを用いて行った。Ｌｅｉｃａ顕微鏡（２０×レンズ＋０．６３×アダプテータ）上で視覚化後、Ｎｉｋｏｎ  ｃｏｏｌｐｉｘデジタルカメラの最大ズームで写真を撮影した。ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧではその抗原（すなわち、ペルオキシダーゼ）が未だ見られるため、ＤＰＶに結合されて細胞中にインターナリゼーションされた後もＩｇＧが活性状態であることが分かった。
【０１８９】
図１８は、ＤＰＶ１５ｂ−抗ＰＯ  ＩｇＧおよびＤＰＶ１５−抗ＰＯのインターナリゼーション後のＨｅＬａ細胞の詳細を示す。コンジュゲートのインターナリゼーションおよび画像取得は、図１７と同条件で実現した。第２の工程において、拡大を行った。
【０１９０】
図１８は、３７℃で４時間のＨｅＬａ細胞中でのインターナリゼーション後の、ＤＰＶ１５−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートおよびＤＰＶ１５ｂ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートの免疫蛍光染色を示す。ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートは、８ウェルＬａｂｔｅｋスライドガラス上のＨｅＬａ細胞上で初期濃度１００μｇ／ｍｌで４時間培養した。ＩｇＧの存在検出は、抗マウスＴＲＩＴＣ−コンジュゲート抗体を用いて行った。
【０１９１】
図１９は、３７℃で４時間のＨＣＴ１１６細胞中でのインターナリゼーション後の、ＤＰＶ１５ｂ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートの免疫蛍光染色を示す。ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートは、８ウェルＬａｂｔｅｋスライドガラス上でＨＣＴ１１６細胞上で初期濃度１００μｇ／ｍｌで４時間培養した。ＩｇＧの存在検出は、抗マウスＴＲＩＴＣ−コンジュゲート抗体を用いて行った。
【０１９２】
図１９は、ＨＣＴ１１６細胞中のＤＰＶ１５ｂ−ＩｇＧコンジュゲートの細胞内局在化を示す。２つのコンジュゲートの最終的細胞内局在化は、ＨｅＬａ細胞およびＨＣＴ１１６細胞において同様に見られた。
【０１９３】
実施例３：生物学的効果（テトラメチルローダミン「ＴＭＲ」）の無い制御分子のインターナリゼーション
１）材料および方法
１．１）リガンドの性質
ＤＰＶ１５およびＤＰＶ１５ｂの能力を表すためにテトラメチルローダミンを選択し、小分子（５００ダルトン）をインターナリゼーションした。
テトラメチルローダミン−５−マレイミド（分子プローブＴ−６０２７）
【０１９４】
１．２）コンジュゲーションプロトコル
ＴＭＲ−５−マレイミド５ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２０７．７μｌ中に溶解させる（最終濃度５０ｍＭ）。
ＤＰＶ１５ｂ３０ｍｇまたはＤＰＶ１５１５．４ｍｇをＤＭＦ７００μｌ中に溶解させる（最終濃度１０ｍＭ）。
ＴＭＲ溶液２００μｌおよびＤＰＶ溶液７００μｌを混合し、暗所にて室温で２時間培養する。
Ｈ２Ｏ２ｍｌおよびジクロロメタン（ＤＣＭ）８ｍｌを追加（Ａｄ）する。
混合し、３０００ｇでの遠心分離に２分間かける。
水相（上相）を取る。
工程４〜６を２回繰り返す。
【０１９５】
１．３）コンジュゲートの保存
ＤＰＶ−ＴＭＲコンジュゲートをドライパウダーとしてアルゴン下で−２０℃で４時間保持した。
【０１９６】
１．４）インターナリゼーションプロトコル
ａ）定量分析
０日目において、細胞を定期的に供給した：すなわち、２ウェルＬａｂｔｅｋスライドガラス（４ｃｍ２／ウェル）において、ＨｅＬａ細胞の場合１．１０５細胞／ｃｍ２を、ＨＣＴ１１６細胞の場合２．１０５細胞ｓ／ｃｍ２を供給した。侵入調査を１日目に行った。
【０１９７】
プロトコル：
完全培地（＋１０％ＳＶＦ）中で、２０μＭでコンジュゲートを希釈する。
細胞を培地から除去する。
コンジュゲートを、３７℃で２時間、５％ＣＯ２−６００μｌ／ウェルで培養する。
完全培地中で２回、ＰＢＳ中で２回洗浄する。
細胞を、４００μｌのトリプシン−ＥＤＴＡ中で３７℃で３０分間培養する。
６００μｌの完全培地（＋１０％ＳＶＦ）中で細胞を再度懸濁する。
細胞をカウントする。
細胞を遠心分離機にかけ、ＰＢＳ中で２回洗浄する。
１ｍｌの冷却溶解物ＲＩＰＡバッファ中で再度懸濁する。
４℃で３０分間培養する。
システイン−ＴＭＲについて２００ｎＭにおける標準曲線を作成する。
ＢｉｏＲａｄ蛍光測定器上で蛍光を測定する（励起４８０ｎｍおよび放射５９０ｎｍ）。
【０１９８】
ｂ）ＤＰＶ−ＴＭＲコンジュゲートのインターナリゼーションの定性的評価
０日目において、細胞を定期的に供給した：すなわち、８ウェルＬａｂｔｅｋスライドガラス（０．７ｃｍ２／ウェル）において、ＨｅＬａ細胞の場合１．１０５細胞ｓ／ｃｍ２を、またはＨＣＴ１１６細胞の場合２．１０５細胞ｓ／ｃｍ２を供給した。侵入調査を１日目に行った。
【０１９９】
プロトコル：
完全培地（＋１０％ＳＶＦ）中、２０μＭにおいてコンジュゲートを希釈する。
細胞を培地から除去する。
コンジュゲートを、３７℃で２時間、５％ＣＯ２−１００μｌ／ウェルで培養する。
完全培地中で２回、ＰＢＳ中で２回洗浄する。
４％ＰＦＡ中中で２０分間室温で固定する。
ＰＢＳ中で３回洗浄する。
【０２００】
２）結果
２．１）定量的細胞内蓄積
図２０は、ＤＰＶ１５−およびＤＰＶ１５ｂ−ＴＭＲのＨｅＬａ細胞中への定量的侵入を示す。初期ＤＰＶ−ＴＭＲコンジュゲート濃度２０μＭでの培養を２時間行った後に、細胞溶解を行った。結果を、２つの独立した実験において平均値として得る。
【０２０１】
表７は、ＨｅＬａ細胞中でインターナリゼーションされたＤＰＶ−ＴＭＲコンジュゲートの正味数量を示す。結果は、ＰＯ／細胞（１０００個）をピコグラムで表した。
【０２０２】
【表７】
2007529194.tif 000008
【０２０３】
図２１は、ＤＰＶ１５−ＴＭＲおよびＤＰＶ１５ｂ−ＴＭＲのＨＣＴ１１６細胞中への定量的侵入を示す。初期ＤＰＶ−ＴＭＲコンジュゲート濃度２０μＭでの培養を２時間行った後に、細胞溶解を行った。結果を、２つの独立した実験において平均値として得る。
【０２０４】
表８は、ＨＣＴ１１６細胞中でインターナリゼーションされたＤＰＶ−ＴＭＲコンジュゲートの正味数量を示す。結果は、ＰＯ／細胞（１０００個）をピコグラムで表した。
【０２０５】
【表８】
2007529194.tif 000009
【０２０６】
図２２は、ＨｅＬａ細胞およびＨＣＴ１１６細胞中でのＤＰＶ−ＴＭＲのインターナリゼーションレベルを比較したものを示す。
【０２０７】
表９は、各細胞型においてインターナリゼーションされた共役分子（細胞１個あたり百万個の共役分子）の推定数およびＤＰＶ−ＴＭＲコンジュゲートのＨｅＬａ中細胞内蓄積のＨＣＴ１１６細胞に対する比を示す。
【０２０８】
【表９】
2007529194.tif 000010
【０２０９】
２．２）ＤＰＶ−ＴＭＲのＨｅＬａ細胞中へのインターナリゼーションの定性的評価
図２３は、ＨｅＬａ細胞中でのインターナリゼーション後のＤＰＶ１５ｂ−ＴＭＲの細胞質強調染色を示す。初期濃度２０μＭで３７℃で２時間、ＨｅＬａ細胞でコンジュゲートを培養した。
【０２１０】
図２４は、ＨＣＴ１１６細胞中でのインターナリゼーション後のＤＰＶ１５ｂ−ＴＭＲの細胞質強調染色を示す。初期濃度２０μＭで３７℃で２時間、ＨＣＴ１１６細胞でコンジュゲートを培養した。細胞核をＤＡＰＩで染色する。
【０２１１】
２．３）ＤＰＶ１５ｂ−ＴＭＲコンジュゲートのインターナリゼーションへの温度の影響
図２５は、ＤＰＶ１５ｂ−ＴＭＲコンジュゲートのインターナリゼーションレベルへの温度の影響を示す。ＤＰＶ１５ｂ−ＴＭＲコンジュゲートの存在下で、初期濃度２５μＭでＨｅＬａ細胞を３７℃または４℃のいずれかで２時間培養した。その後、細胞をトリプシン処理した後、ＲＩＰＡバッファ中で溶解させ、蛍光を定量化した。各値を、３つの独立した実験（これらは全て正副２個実現した）の結果として得る。
【０２１２】
２．４）ＤＰＶ−ＴＭＲコンジュゲートのインターナリゼーションへの細胞グリコサミノグリカンの影響
図２６は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＰｇｓＡ−７４５細胞中でのインターナリゼーションのＤＰＶ１５ｂ−ＴＭＲコンジュゲートの定量化を示す。培養を３７℃で２時間行った後、トリプシン処理およびＲＩＰＡバッファ中での溶解を３０分間４℃で行った。各値を、３つの独立した実験の結果として得る。
【０２１３】
実施例４：共役活性分子（クロラムブシル）の活性
１）リガンドの性質
クロラムブシル（Ｃｈｌ）は、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成の阻害物質であり、ＤＮＡ分子中での内部架橋または相互架橋を生じさせるアルキル化作用物質である。反応基は、２つのＣｌ基である。その化学式を図２７に示す。
【０２１４】
クロラムブシルに対する抵抗は、（ｉ）排出ポンプＭＲＰ１および（ｉｉ）グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴｓ）の増加とリンクする。これらは、求電子毒の解毒において発生する（Ｍｏｒｒｏｗ  ＣＳ．、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３：２０１１４）。
【０２１５】
臨床における主要な問題として、クロラムブシルでの治療後の二次性白血病の誘発危険性がある（Ｔｒａｖｉｓ  ＬＢ．、１９９４、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、８６：１４５０）。
【０２１６】
ペプチドベクター（ＤＰＶ）をクロラムブシルに結合させると、以下の２つの利点が得られる：
【０２１７】
・ＤＰＶは、広範囲の抗癌薬物を押し出すことができる細胞膜排出ポンプ（例えば、Ｐ−グリコタンパク質（Ｐ−ｇｐ）または多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ））の発現に起因する多剤耐性（ＭＤＲ）表現型に耐える。
【０２１８】
・ＤＰＶは、クロラムブシルのＨ２Ｏ中での溶解性を増加させる。
【０２１９】
そのため、ＤＰＶ−クロラムブシルコンジュゲートは、より高い可溶性およびより高い腫瘍耐性を持ち得る。
【０２２０】
２）コンジュゲーション
２．１）材料
ＤＰＶ１５−Ｅ−Ｃｈｌコンジュゲートを非共役Ｃｈｌと比較した（Ｆｌｕｋａ、Ｃａｔ＆ｎｕｍ；２３１２５）。
【０２２１】
Ｃｈｌは水溶液に対して可溶性ではないが、エタノールに対しては可溶性である。
【０２２２】
生死判別試験のため、Ｃｈｌを５０ｍＭでエタノール中に可溶化させ、その後、１ｍＭで培地中に希釈した（これにより、試験された細胞の最高濃度は２％エタノールを含む）。
【０２２３】
Ｃｈｌについて、２５８ｎｍでのモル吸光係数を計算した：１７．９００±１．２００。
【０２２４】
Ｈ２０中の１／１００希釈後、Ｃｈｌ溶液およびＤＰＶ１５−Ｅ−Ｃｈｌ溶液の正確な濃度を計算した。測定は、ＯＤ２５８ｎｍを測定し、以下の化学式を用いた
［モル濃度］＝ＯＤ２５８ｎｍ／１７．９００
【０２２５】
２．２）コンジュゲーションプロトコル
図２８および２９に示すように、ＣＯ２Ｈ基上のエステル結合（Ｅ）により、クロラムブシルをＤＰＶ１５と共役する。この共役は、Ｅｃｏｌｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｓｕｐeｒｉｅｕｒｅ  ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ  ｄｅ  Ｐａｒｉｓ（ＥＮＳＣＰ）におけるＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｑｕｅ  ｅｔ  ｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｍｏｌeｃｕｌａｉｒｅ  ｅｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ（ＬＣＢＢＭＣ）によって行われた。
【０２２６】
２つの反応基（Ｃｌ−）は遊離であるため、コンジュゲートを開裂して活性にする必要は無い。
【０２２７】
ＤＰＶ１５：ＮＨ２−Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｒ  Ｑ  Ｓ  Ｒ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｒ  Ｑ  ＳＲ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ（１６＋１ａａ）
核局在（ＤＰＶ１５−ＰＯ＆ＤＰＶ１５−ｍＡｂ、抗ＰＯ）
ＤＰＶ１５−Ｅ−クロラムブシル：
１バッチ：１１／１０／２００１  ７０ｍｇ（水中で１０ｍｇ／ｍｌで可溶性）、分子量＝２８２５．１５
ＨＰＬＣ純度〜９０％、正味ペプチド内容＝６０％（対イオン＝ＴＦＡ）
ＨＰＬＣ分析では、吸光度スペクトルが異なると、調合液は９０％のＤＰＶ１５−Ｅ−Ｃｈｌおよび１０％の「変性」ＤＰＶ１５−Ｅ−Ｃｈｌが見られた。この変性は、エステル結合のタンパク質分解に起因するものではなく、前述したようなＣｈｌの不安定性に起因する可能性が最も高い（Ｂｏｓａｎｑｕｅｔ  ＡＧ．、１９８６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１８：１７６）。これは、（ｉ）Ｃｈｌの芳香核の変性または（ｉｉ）Ｈ２０分子と共にＣｈｌ中に含まれる２Ｃｌ原子の相互作用に起因し得る。この成分を識別するため、質量分析を行う必要があった。
【０２２８】
室温において遮光状態で一夜培養後、Ｃｈｌ（Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ中の０．１ｍｇ／ｍｌ）およびＤＰＶ１５−Ｅ−Ｃｈｌ（Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ中の０．５ｍｇ／ｍｌ）が劣化する（５０％の劣化）。
【０２２９】
３）生死判別試験
３．１）ヒト細胞系
ＨＣＴ１１６：ヒト結腸癌（由来：ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２４７）
ＨＴ２９：ヒト結腸癌、低Ｐ−ｇｐ発現（由来：ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−３８）Ｋ５６２：ヒト慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（由来：ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２４３）
【０２３０】
３．２）生死判別試験
生死判別試験を行った。簡潔に述べると、９６ウェルプレート中に細胞を供給し、薬物濃度を上げて１時間培養した（ｉ）その後、細胞を洗浄し、薬物無しで新鮮培地で４８時間の培養、または、（ｉｉ）４８時間行う。ＷＳＴ−１試験（Ｒｏｃｈｅから）を行って、シグモイダル回帰からＩＣ５０値（５０％の細胞生存を抑制する薬物濃度）を推定した。
【０２３１】
４）対外有効性
ヒト細胞癌および白血病細胞の対外細胞増殖抑制について、ＤＰＶ１５−Ｅ−Ｃｈｌコンジュゲートを非共役Ｃｈｌおよび５Ｆｕｒａと比較した。ＩＣ５０値ｓ＝５０％の細胞生存を抑制する薬物濃度を計算した。
【０２３２】
【表１０】
2007529194.tif 000011
【０２３３】
５）結論−議論
５．１）可溶化について
ＤＰＶ１５をクロラムブシルに共役すると、水溶性コンジュゲートが得られた。
【０２３４】
５．２）腫瘍細胞成長に対する有効性について
・Ｋ５６２白血病において、ＤＰＶ１５−Ｅ−Ｃｈｌコンジュゲートは、Ｃｈｌよりもずっと高効率である（短時間露出後に≧１６倍、および長時間露出後に８倍）。
【０２３５】
・ＨＣＴ１１６結腸癌においては、ＤＰＶ１５−Ｅ−ＣｈｌコンジュゲートはＣｈｌよりもずっと高効率（短時間露出後に１２倍、長時間露出後に８倍）であり、これを示すため（すなわち５Ｆｕｒａ）において臨床において用いられる薬物と同程度の効率である。
【０２３６】
・５Ｆｕｒａに対する耐性を有するＨＴ２９結腸癌において、ＤＰＶ１５−Ｅ−ＣｈｌコンジュゲートはＣｈｌよりもずっと高効率（短時間露出後に１１倍）であり、短時間露出後５ＦＵｒａよりもより高効率である（≧１７倍）。
【０２３７】
（＃：長時間露出後に得られた予期しない高い値についての説明は無い）。
【０２３８】
Ｃｈｌの活性が無いのは、可溶化（エタノール）に用いられた溶媒に起因するものではない。というのも、ＤＰＶ１５−Ｅ−Ｃｈｌの水およびエタノールへの溶解において同じ結果が得られたからである（データは不図示）。
【０２３９】
それにもかかわらず、Ｃｈｌについて何の活性も検出されなかったのは、Ｃｈｌがエタノール中に良好に溶解しなかったためであり得る。文献では、Ｃｈｌの有効性については、メジアンＩＣ５０の４０．５ｍＭでの対外でのＢ−ＣＬＬについて記載がある（Ｓｉｌｂｅｒ  Ｒ．、１９９４、Ｂｌｏｏｄ、８４：３４４０）。
【０２４０】
実施例５：共役活性分子の活性（パクリタキセル）
１）リガンドの性質
タキサンは、βチューブリン脱重合の抑制を通じて細胞分裂の間の紡錘体を抑制する細胞毒性薬である（Ｎｏｇａｌｅｓ  Ｅ．、１９９９、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ．５６：１３３）。臨床においては、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））の２つのタキサンが用いられている。パクリタキセルは、１９６０後半においてＰａｃｉｆｉｃ  Ｙｅｗ、Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａの樹皮から抽出された（Ｗａｌｌ  ＭＥ．、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：７５３）。ドセタキセルは、１９８０中頃において、１０−ｄｅａｃｅｔｙｌ  ｂａｃｃａｔｉｎＩＩＩ（これは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｙｅｗ  ｔｒｅｅｎ  Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａの針状葉から抽出された前駆物質である（Ｇｕｅｒｉｔｔｅ−ＶｏｅｇｅｌｅｉｎＦ．、１９９１、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３４：９９２）を用いたパクリタキセルおよび相似器官を得るための半合成プロセスを開発する重大な化学的研究過程の一部として得られたものである。
【０２４１】
パクリタキセルにつて最も頻繁に記述される抵抗メカニズムとして、ｍｄｒ１遺伝子によてコード化されかつ広範囲の抗癌薬物を押し出すことが可能な１７０ｋＤａＰ−グリコタンパク質（Ｐ−ｇｐ）細胞膜排出ポンプによって媒介される多剤耐性（ＭＤＲ）表現型がある。この輸送系の過剰発現は、タクソール（登録商標））ｓに対する抵抗の関連メカニズムとして認識される（Ｚｕｎｉｎｏ  Ｆ．、１９９９、Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．Ｕｐｄａｔ．２：３５１）。
【０２４２】
パクリタキセルは水溶性ではなく、ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（ポリオキシエチル化ヒマシ油）またはエタノール中に溶解する。臨床では、パクリタキセルの投与は静脈内（静脈）で行われ、これら２つの賦形剤は、パクリタキセルでの治療を受けている患者の過敏性（ＨＳＲ）と関連がある。
【０２４３】
Ｄｉａｔｏｓペプチドベクター（ＤＰＶ）をパクリタキセル（ＰＴＸ）に結合させることによって得られる利点は以下の２つであり得る。
−ＤＰＶは、Ｐ−ｇｐ発現によりＭＤＲ表現型に耐え得る。
−ＤＰＶは、パクリタキセルの水溶性を増加し得る。
そのため、ＤＰＶ−ＰＴＸコンジュゲートは、より可溶性が高く、かつ、腫瘍に対する耐性がより活発であり得る。
【０２４４】
２）共役
パクリタキセル（ＰＴＸ）およびＤＰＶを共役した。
ＤＰＶ１５／ＤＰＶ３−Ｅ−ＰＴＸコンジュゲートを以下のものと比較した。
−非処方パクリタキセル（Ｈａｕｓｅｒから）（Ｌｏｔ＃Ｔｅｃｈ−６−００６００−Ａ）
−臨床グレード処方タクソール（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂから）（Ｌｏｔ＃０１Ｈ２５−Ａ）
パクリタキセルは、水溶性ではないが、ポリオキシエチル化ヒマシ油に対して可溶性である（ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ＃Ｃ５１３５）。
【０２４５】
生死判別試験のため、２０％のｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬを含む水中にパクリタキセルを５ｍＭで溶解させた後、培地中で５００μＭで希釈した（これにより、細胞上で試験される最高濃度は２％のｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬを含む）。
【０２４６】
ＤＰＶ１５−Ｅ−ＰＴＸコンジュゲートおよびＤＰＶ３−ｅ−ＰＴＸコンジュゲートは、Ｅｃｏｌｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｓｕｐeｒｉｅｕｒｅ  ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ  ｄｅ  Ｐａｒｉｓ（ＥＮＳＣＰ）におけるＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｑｕｅ  ｅｔ  ｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｍｏｌeｃｕｌａｉｒｅ  ｅｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ（ＬＣＢＢＭＣ）によって供給された。
【０２４７】
２’−ＯＨ基上のエステル結合（Ｅ）により、パクリタキセル（Ｈａｕｓｅｒから）をＤＰＶ１５およびＤＰＶ３と共役した。この２’−ＯＨ基は、パクリタキセル活性にとって重要である（図３０および３１を参照）。そのため、ＤＰＶ−Ｅ−ＰＴＸコンジュゲートは部分的に活性であり、エステラーゼによるエステル結合の開裂後に完全活性化するｐｒｏｄｕｇｓである。
【０２４８】
ＤＰＶ１５：
ＮＨ２−Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｒ  Ｑ  Ｓ  Ｒ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｒ  Ｑ  Ｓ  Ｒ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ（１６＋１ａａ）
核局在：ＤＰＶペルオキシダーゼコンジュゲートのインターナリゼーションに関する調査およびＤＰＶ抗体抗ペルオキシダーゼコンジュゲートのインターナリゼーションに関する調査において報告された通り。
【０２４９】
ＤＰＶ３：
ＮＨ２−Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  ＥＳ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ（１６＋１ａａ）
細胞質局在化：ＤＰＶペルオキシダーゼコンジュゲートのインターナリゼーションに関する調査およびＤＰＶ抗体抗ペルオキシダーゼコンジュゲートのインターナリゼーションに関する調査において報告された通り。
【０２５０】
備考：共役のため、ＤＰＶアミノ酸配列に対してシステイン（Ｃｙｓ）を追加する。ＤＰＶ１５−Ｅ−ＰＴＸ（図３１上の化学式を参照）。
理論分子量：３３３１．７３
溶解性：水溶性（≧１０ｍｇ／ｍｌ）
対イオン：ＴＦＡ
ＤＰＶ１５の場合２ロット。
ＤＩＡＴ００４９（ＡＬＬ００５０）５５ｍｇ（０６／１２／２００１）ＨＰＬＣ純度＞９９％、正味ペプチド内容量＝８０％
ＤＩＡＴ００５０（ＡＬＬ００５０ｂｉｓ）１５ｍｇ（０６／１２／２００１）ＨＰＬＣ純度＞９９％、正味ペプチド内容量＝８８％
ＤＰＶ３：ＤＩＡＴ００５７、ＨＰＬＣ純度＞９９％
【０２５１】
３）生死判別試験
【０２５２】
３．１）ヒト細胞系
ＯＶＣＡＲ−３：ヒト卵巣癌（由来：ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１６１）
ＮＣＩ−Ｈ１２９９：ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（由来：ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−５８０３）
ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５：ヒト子宮肉腫が、パクリタキセルに対して耐性を持ち、高Ｐ−ｇｐを発現する（由来：ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１９７７）。
【０２５３】
３．２）生死判別試験
生死判別試験を行った。簡潔に言うと、９６ウェルプレート中に細胞を付加し、薬物濃度を上げて１時間培養し、その後、細胞を洗浄し、薬物無しで新鮮培地で７２時間培養する。ＷＳＴ−１試験（Ｒｏｃｈｅから）を行って、シグモイダル回帰からＩＣ５０値（５０％の細胞生存を抑制する薬物濃度）を推定した。
【０２５４】
４）結果
ＤＰＶ１５−Ｅ−ＰＴＸコンジュゲートおよびＤＰＶ３−Ｅ−ＰＴＸコンジュゲートを、非処方パクリタキセル（Ｈａｕｓｅｒから）、臨床グレード処方のタクソール（登録商標）（ＢＭＳから）、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）およびＤＰＶ１０４７−Ｅ−Ｄｏｘコンジュゲート（このコンジュゲートについては、ＷＯ０１／６４７３８ＤＰＶ１０４７として公開されているＰＣＴ特許出願中に記載され、核局在が報告されている）と比較した。
ＤＰＶ１０４７：
ＮＨ２−Ｃｙｓ−Ｖ  Ｋ  Ｒ  Ｇ  Ｌ  Ｋ  Ｌ  Ｒ  Ｈ  Ｖ  Ｒ  Ｐ  Ｒ  Ｖ  Ｔ  Ｒ  Ｍ  ＤＶ−ＣＯＯＨ（１９＋１アミノ酸）（共役のため、ＤＰＶアミノ酸配列にシステイン（Ｃｙｓ）を追加している）。
【０２５５】
ヒト癌細胞の対外細胞増殖の抑制を試験し、ＩＣ５０値ｓ＝５０％の細胞生存を抑制する薬物濃度を計算した。
【０２５６】
【表１１】
2007529194.tif 000012
【０２５７】
ＨａｕｓｅｒからのパクリタキセルをＢＭＳからのＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬタクソール（登録商標）中に溶解させ、すでに処方した（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ中）。
【０２５８】
ＤＰＶ１５−Ｅ−ＰＴＸおよびＤＰＶ３−Ｅ−ＰＴＸを水中に溶解させる。
【０２５９】
ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ中に溶解された遊離パクリタキセル（Ｈａｕｓｅｒから）において観察された細胞毒性は、可溶化に用いられた溶媒に起因するものではなかった。なぜならば、使用された最高濃度（２％）（データは不図示）において、溶媒のいかなる細胞毒性も観察されなかったからである。
【０２６０】
Ｈａｕｓｅｒからの非処方パクリタキセル（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ中に溶解）と、ＢＭＳからの臨床グレード処方タクソール（登録商標）との間の比較は、同一の有効性を示した（ただし、タクソールの有効性がパクリタキセルの有効性の１０倍であるＨ１２９９細胞は除く）。
【０２６１】
可溶化について
エステル結合によるＤＰＶ１５およびＤＰＶ３とパクリタキセルとの共役により、水溶性コンジュゲートが得られた。
【０２６２】
対外腫瘍細胞増殖に対する有効性について
【０２６３】
・ドキソルビシンおよびパクリタキセルに対して感受性を持つＯＶＣＡＲ−３卵巣癌において、双方のＤＰＶ−Ｅ−ＰＴＸコンジュゲートはパクリタキセルよりも低効率であり（９倍）、かつ、ドキソルビシンおよびＤＰＶ１０４７−Ｅ−Ｄｏｘコンジュゲートよりも高効率である（２２倍）。
【０２６４】
・ドキソルビシンおよびパクリタキセルに対して感受性を持つＨ１２９９非小細胞肺癌において、双方のＤＰＶ−Ｅ−ＰＴＸコンジュゲートは、パクリタキセルよりも低効率であり（１６倍）、かつ、ドキソルビシンおよびＤＰＶ１０４７−Ｅ−Ｄｏｘコンジュゲートよりも高効率である（６倍）。
【０２６５】
ドキソルビシンおよびパクリタキセルに対して耐性を持つＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５子宮肉腫において、双方のＤＰＶ−Ｅ−ＰＴＸコンジュゲートは、以下のものよりもよりも高効率である：パクリタキセル（１５〜３１倍）、ドキソルビシン（１０〜２２倍）およびＤＰＶ１０４７−Ｅ−Ｄｏｘコンジュゲート（３〜５．５倍）。
【０２６６】
実施例６：ＤＰＶ１５−アンホテリシンＢコンジュゲートの毒性評価
【０２６７】
１）リガンドの性質
アンホテリシンＢ（ＡｍＢ）は、ストレプトマイシスノドーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｄｏｓｕｓ）によって産生されるヘプタンマクロライドであり、その毒性にもかかわらず、系統真菌感染症と戦うために用いられる最も有力かつ効果的な抗生物質の１つである。ＡｍＢは、細胞膜内のステロールに結合することにより、生物学的細胞膜に対して毒作用を施す。ＡｍＢは、水素結合およびファンデルワールス力を介して、真菌細胞膜中においてエルゴステロールに結合し、哺乳類細胞（よってその毒性）中においてコレステロールに結合する。
【０２６８】
２）共役
エステル結合により、アンホテリシンＢ（ＡｍＢ）をＤＰＶ１５に共役させる。
ＤＰＶ１５：ＮＨ２−Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｒ  Ｑ  Ｓ  Ｒ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｒ  Ｑ  ＳＲ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ（共役のため、システインを追加する）。
水（３．４ｍｌ）中の溶液ＤＰＶ１５（１１２ｍｇ）に、水素化ホウ素ナトリウム（１２ｍｇ；０．３４ｍｍｏｌ）を付加し、この溶液を２２℃で２０分間攪拌した。酢（ａｃｅｔｉｃ）（０．０３７ｍｌ、０．６８ｍｍｍｏｌ）を付加することにより、過剰ＮａＢＨ４を崩壊させた。固形ＮａＨＣＯ３を追加して、溶液のｐＨを５．５に調節した。ジメチルホルムアミド（１．５ｍｌ）中のアンホテリシンＢ  ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ  ａｍｉｄｅ（４０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）の溶液を滴下方向において還元ペプチドに追加し、その結果得られた混合物を室温で２．５時間攪拌した。ＨＰＬＣによる精製後ｌｉｏｐｈｙｌｉｓａｔｉｏｎを行って、ＤＰＶ１５−ＡｍＢコンジュゲートのトリフルオロ酢酸塩（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ  ｓａｌｔ）を得た。
【０２６９】
図３２は、ＤＰＶ１５−ＡｍＢコンジュゲート化学式を示す。
【０２７０】
３）対外有効性分析
ＤＰＶ１５−ＡｍＢコンジュゲートの対外抗真菌活性を４つの真菌種（すなわち、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（ＡＴＣＣ２２０１９）、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ９００２８）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（ＩＰ２００１／１８３．０２）およびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ（ＮＩＨ５２Ｄ））上で評価し、アンホテリシンＢおよびＤＰＶ１５．ＭＩＣ８０（薬物遊離制御と比較して株成長を８０％だけ低減させる最低薬物濃度）との比較を、ＭＯＰＳで緩衝されたＲＰＭＩ  １６４０中でにおいて、ＮＣＣＬＳ  Ｍ２７Ａ基準（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、文書Ｍ２７Ａ）に従ってＮＣＣＬＳ  Ｍ２７Ａ基準のマイクロタイター変性を用いて行う。この最低抑制濃度は、４８時間および培養温度３７℃後で決定される。
【０２７１】
結果：
ＤＰＶ１５−ＡｍＢおよびコンパレータの真菌種に対する対外活性を以下の表１２中にて示す。
【０２７２】
【表１２】
2007529194.tif 000013
【０２７３】
表１２に示すように、ＡｍＢの抗真菌活性は、ＤＰＶ１５との結合後に維持される。ＤＰＶ１５−ＡｍＢコンジュゲートは、ＡｍＢと同じ濃度において、Ｃａｎｄｉｄａ株の成長を抑制した。ＡｍＢと比較してＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓに対して、ＤＰＶ１５−ＡｍＢのＭＩＣが増加した（×４倍）が、コンジュゲートは、活性生成物（ＭＩＣ＜８μｇ／ｍｌ）を残す。＊
【０２７４】
４）体内抗真菌活性
致死的マウスカンジダ症モデル（ＡｍＢ感受性株）において、ＤＰＶ１５−ＡｍＢコンジュゲートの体内抗真菌活性を評価する。ＬＤ１００（１００％致死量）のＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ  ９００２８）をマウスに静脈接種（ｉ．ｖ．）した。．試験物質（ＤＰＶ１５−ＡｍＢおよびＡｍＢ（ファンギゾン））ならびにビヒクル（ｖｅｈｉｃｕｌｅ）制御を投与した（ｉ．ｖ．真菌接種３時間後の試験動物に相当する０．２５ｍｇ／ｋｇ〜２．５ｍｇ／ｋｇＡｍＢの量）。１日１回の死亡記録を８日間行った。
【０２７５】
図３３は、これらの治療計画のいずれも１００％生存の結果を示さなかったことを示す。しかし、ＤＰＶ１５−ＡｍＢコンジュゲートに相当する１および０．５ｍｇ／ｋｇＡｍＢ（図中に図示されたＡｍＢ−ＤＰＶ１５）は、同じ濃度のファンギゾンの２０％および１０％生存それぞれと比較して、８日目に５０％生存を示した。８日目において、２．５ｍｇ／ｋｇＡｍＢ（ファンギゾン）について５０％の生存が得られた。１週間にわたる死亡回避を示す対応量の差は、ＤＰＶ１５−ＡｍＢが基準化合物（ファンギゾン）よりも低い量で活性であることを示す。
【０２７６】
５）体内毒性評価
５−ａ）溶血性活性
ＤＰＶ１５のＡｍＢへの共役は、分子の溶解性を大幅に向上させることを示した。静脈注射が最も好適なものであり、ヒト赤血球上のコンジュゲートの細胞毒活性を試験する。試験された濃度は、０〜４μｇ／ｍｌであった。コンジュゲートの溶血性活性は、ＡｍＢおよびＡｂｅｌｃｅ（登録商標）（ＡｍＢの脂質処方）と比較する。
【０２７７】
様々な分子の存在下で、ヒト赤血球を３７℃で１時間培養した。図３４上に示すように、生成物を希釈した。溶血反応のパーセンテージを２つの独立した値の平均として得る。図３４は、およそ１μｇ／ｍｌのＡｍＢについてＩＣ５０を示し、これは、文献において示された値に対応する（Ｔａｂｏｓａ  Ｄｏ  Ｅｇｉｔｏら、対外  ａｎｄ  体内  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ａｍｐｈｏｔｈｅｒｉｃｉｎ  Ｂ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｖｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９６Ｓｅｐ；３８（３）：４８５−９７）。それと対照的に、Ｂ−ＤＰＶ１５コンジュゲート（図中ＡｍＢ−ＤＰＶ１５として記載）については、試験された濃度範囲において、５０％の溶血反応に至らなかった。ＡｍＢのＤＰＶ１５ペプチドへの共役では、その溶血性活性が低下する。
【０２７８】
５−ｂ）単回投与毒性
ＤＰＶ１５−ＡｍＢコンジュゲートの単回投与毒性を、静脈注射による単回投与の後の死亡および／または体重減少によって評価した。ＤＰＶ１５−ＡｍＢ（２．５７、３．６８、５．５２、７．３６、９．２、１８．４および３６．８ｍｇ／ｋｇ）を溶媒（ＮａＣｌ／Ｈ２Ｏ  ９／１ｖ／ｖ）と共に用いて、マウスを治療した。これらの異なる投与量は、０．７、１、１．５、２、２．５、５および１０ｍｇ／ｋｇのＡＭＢにそれぞれ対応する。１ｍｇ／ｋｇの投与量は、文献に記載されているＡｍＢのＭＴＤに対応する（Ｔａｂｏｓａ  Ｄｏ  Ｅｇｉｔｏ  ｅｔａｌ．、対外  ａｎｄ  体内  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ａｍｐｈｏｔｈｅｒｉｃｉｎ  Ｂ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｖｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９６  Ｓｅｐ；３８（３）：４８５−９７）。
【０２７９】
試験投与量が増えると（３６．８ｍｇ／ｋｇ）重大な致死的毒性が観察されたが、他のものでは見られなかった。
【０２８０】
２８日目において、ＤＰＶ１５−ＡｍＢによって２．５７、３．６８、５．５２、７．３６および９．２ｍｇ／ｋｇで治療されたマウスにおいて、体重への効果は観察されなかった。１８．４ｍｇ／ｋｇが注射されたマウスについては、注射後２４時間後にケージ中でマウスが１匹死亡しているのが発見された。他の２匹の生存しているマウスについては、注射後２４時間後において、初期体重からおよそ１２％の体重減少が見られた。１５日目後、これらのマウスは体重を回復した。このデータは、ＤＰＶ１５−ＡｍＢコンジュゲートの最大耐量は１８．４〜９．２ｍｇ／ｋｇ（それぞれ、５ｍｇ／ｋｇＡｍＢおよび２．５ｍｇ／ｋｇＡｍＢに相当する）であることを示す。
【０２８１】
実施例７：１２５Ｉ抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体の細胞内送達のためのＤＰＶの使用
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、（ほとんど全ての結腸直腸腫瘍における過剰発現（＞９５％）、高抗原濃度の発現（細胞１個あたり１×１０６ＣＥＡ分子まで）、および細胞表面における極めて長い滞留時間に起因する）胃腸腫瘍の免疫ターゲティングのための基準抗原である。しかし、ラジオイムノアッセイ治療（ＲＩＴ）において、ＣＥＡの非インターナリゼーションにより、極小腫瘍小結節の治療にとって魅力的な低範囲のラジオアイソトープ（例えば、オーガーエミッタ）の使用が除外される。この限定を無くすため、抗体抗ＣＥＡＭＡｂ３５Ａ７（３７Ａ７として示す）のインターナリゼーションを誘発するためにＤＰＶ１５が用いられ、オージェ電子治療のためにコンジュゲート１２５Ｉ−３５Ａ７−ＤＶＰ１５の可能性が分析されている。
【０２８２】
１）共役
実施例２について述べた基本計画に従って、共役を行っている。サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎａ）−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いて、抗体分子あたり３〜５個のペプチド分子を含む抗体−ＤＰＶコンジュゲートを作製する。
ＤＰＶ１５：ＮＨ２−Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｒ  Ｑ  Ｓ  Ｒ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｒ  Ｑ  ＳＲ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ（共役のため、システインを追加している）。
【０２８３】
２）対外調査
免疫蛍光顕微鏡法を用いて、ＬＳ１７４Ｔヒト結腸腺癌細胞中のインターナリゼーションをを分析した。
【０２８４】
クローン形成法において、細胞毒性を測定した。全実験において、無関係の抗体ＰＸを制御として用いた。
【０２８５】
免疫蛍光分析では、３５Ａ７−ＤＰＶ１５コンジュゲートはＬＳ１７４Ｔ細胞中でインターナリゼーションされたものの、ネイティブ３５Ａ７はそうではなかったことが分かった。
【０２８６】
クローン形成法では、１２５Ｉ−３５Ａ７−ＤＶＰｌ５コンジュゲートは細胞毒性を示した。非放射性標識３５Ａ７コンジュゲートおよび３５Ａ７−ＤＰＶ１５コンジュゲートならびに１２５Ｉ−３５Ａ７は、いかなる細胞毒性も示さなかった。ＬＳ１７４Ｔ細胞全てを根絶するための特定抗体の必要性を示す１２５Ｉ−３５Ａ７−ＤＶＰ１５と比較して、この無関係のコンジュゲートである１２５Ｉ−ＰＸ−ＤＰＶｌ５は限定された細胞毒性を示した。
【０２８７】
これらの対外調査は、１２５Ｉ−３５Ａ７の治療効果が、オージェ電子の極めて短い粒子範囲に起因するインターナリゼーションに依存することを示す。ＤＰＶによって由来する１２５Ｉ−抗−ＣＥＡＭＡｂは、消化器癌におけるオージェ電子ラジオイムノアッセイ治療の潜在的候補である。
【０２８８】
３）１２５Ｉ−３５Ａ７−ＤＰＶｌ５３の体内治療効果分析
３．１）第１の調査：単回投与
ＳＷＩＳＳヌードマウス上で、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍をＮａＣｌと比較して、１２５Ｉ−３５Ａ７−ＤＰＶｌ５３について調査した。ＬＳ１７４Ｔ腫瘍は、１日目でのマウスへの（ｂｙ  ｍｏｕｓｅ）皮下注射２×１０６によって確立した。１２５Ｉ−３５Ａ７−ＤＰＶ１５の単回投与は、細胞移植後８日後において静脈（ｉ．ｖ．）経由で注射した。１２５Ｉ−３５Ａ７−ＤＰＶ１５を０．１２５ｍＣｉ、０．２５ｍＣｉ、０．５ｍＣｉおよび１ｍＣｉに注射した。移植後４５日間が経過するまで、腫瘍量、延髄毒性およびマウス体重を観察および制御した。
【０２８９】
この第１の体内調査から、１２５Ｉ−３５Ａ７−ＤＰＶ１５を用いた場合、ＮａＣｌと比較してＬＳ１７４Ｔ腫瘍成長が低速になることが分かった。これらの結果は、効果的投与量は１ｍＣｉよりも高くあるべきであることを示している。さらに、毒性は観察されなかった。
【０２９０】
３．２）第２の調査：２回の注射
第２の調査において、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を持つＳＷＩＳＳヌードマウスを、ＮａＣｌとの比較として、１２５Ｉ−３５Ａ７−ＤＰＶ１５を２回注射することで治療した。細胞移植後８〜１２日後、コンジュゲートを静脈（ｉｖ）経由で注射した。用いた投与量は、２×ＮａＣｌ、２×０．５ｍＣｉおよび２×１ｍＣｉであった。移植後６０日が経過するまで、腫瘍量、延髄毒性およびマウス体重を観察および制御した。
【０２９１】
ＮａＣｌと比較すると、上記治療により腫瘍成長速度が著しく低速化した。メジアン生存時間は、ＮａＣｌでの治療群中のマウスの場合２０日であり、２×０．５ｍＣｉの１２５Ｉ−３５Ａ７−ＤＰＶ１５での治療群中のマウスの場合３０日であり、２×１ｍＣｉ１２５Ｉ−３５Ａ７−ＤＰＶｌ５での治療群中のマウスの場合約４０日である。さらに、毒性は観察されなかった。
【０２９２】
実施例８−ＤＰＶ１５およびＤＰＶ１５ｂドキソルビシンコンジュゲートに関する体内有効性調査
１）ペプチドのドキソルビシンへの結合
抗腫瘍作用物質であるドキソルビシンを、ＷＯ０４／０１１０３３として公開されたＰＣＴ特許出願中に記載の方法に基づいて、ＤＰＶ１５およびＤＰＶ１５ｂに共役させた。
ＤＰＶ１５：ＮＨ２−Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｒ  Ｑ  Ｓ  Ｒ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｒ  Ｑ  ＳＲ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
ＤＰＶ１５ｂ：ＮＨ２−ＣｙＳ−Ｇ  Ａ  Ｙ  Ｄ  Ｌ    Ｒ  Ｒ    Ｒ    Ｅ  Ｒ  Ｑ  Ｓ  Ｒ  Ｌ    Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｒ  Ｑ  Ｓ  Ｒ−ＣＯＯＨ
共役のため、システインを追加した。
【０２９３】
２）方法
マウス：無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）ヌードマウス、メス、ＮＭＲＩ−ｎｕ（ｎｕ／ｎｕ）−ヌード
腫瘍モデル：ＨＣＴ１１６ヒト結腸直腸癌（ＡＴＣＣ番号：Ｃｌ−２４７）
【０２９４】
腫瘍を持つマウスに実験を行った。１００μｌの細胞懸濁液（１０７個の細胞／０．１ｍＬ）をマウスの右側腹に皮内注射することにより、ＨＣＴ１１６腫瘍を確立した。
【０２９５】
薬物を水中（Ｃｏｏｐｅｒ）で希釈し、注射（最終量の１０％）とした。完全に溶解させた後、注射用の０．９％ＮａＣｌ溶液（Ｃｏｏｐｅｒ）を０．９％追加した。これらの溶液を、０．２μｍフィルタで濾過した。ドキソルビシンおよびＤＰＶ−ドキソルビシンの濃度を、分光測光法においてドキソルビシン濃度の標準曲線により制御した。
【０２９６】
第１の実験：ＤＰＶ１５−ドキソルビシン
Ｑ２Ｄ３×３Ｗ投与スケジュールに従って（１週間に３回注射、各注射を２日間間隔で行い、これを３週間行う）、これらの溶液を静脈内（静脈）（ｉ．ｖ）経由で側尾静脈に注射した（ドキソルビシンの場合３．５、５および６．５μｍｏｌ／ｋｇならびにＤＰＶ１５−Ｄｏｘの場合１５μｍｏｌ／ｋｇ）。
【０２９７】
第２の実験：ＤＰＶ１５ｂ−ドキソルビシン
Ｑ２Ｄ３×３Ｗ投与スケジュールに従って、これらの溶液を側尾静脈経由で注射した（ドキソルビシンの場合５、６および７μｍｏｌ／ｋｇおよびＤＰＶ１５ｂ−Ｄｏｘコンジュゲートの場合１０μｍｏｌ／ｋｇ）。
【０２９８】
２）結果
第１の実験：
図３５は、ＤＰＶ１５−ドキソルビシンコンジュゲートの抗腫瘍活性を示す。腫瘍量（ｍｍ３）を、細胞移植後の時間（日）関数として表す。
【０２９９】
以下の表１３は、腫瘍成長遅延時間および腫瘍倍増時間を示す。
【０３００】
【表１３】
2007529194.tif 000014
【０３０１】
ＤＰＶ１５−ドキソルビシンは、このモデル上の６．５μｍｏｌ／ｋｇ（最高試験投与量）での遊離ドキソルビシンよりも高い抗腫瘍活性を示した。
【０３０２】
第２の実験：
図３６は、ＤＰＶ１５ｂドキソルビシンコンジュゲートの抗腫瘍活性を示す。腫瘍量（ｍｍ３）を、細胞移植後の時間（日）関数として表す。グラフ中、ＤＰＶ１５ｂドキソルビシンをＤＰＶ１５ｂ−Ｅ−ｄｏｘｏとして示す。
【０３０３】
以下の表１４は、腫瘍成長遅延時間および腫瘍倍増時間を示す。
【０３０４】
【表１４】
2007529194.tif 000015
【０３０５】
１０μｍｏｌ／ｋｇにおけるＤＰＶ１５−ドキソルビシンは、６μｍｏｌ／ｋｇ（これは、このモデル上のドキソルビシンＭＴＤよりも高い）における遊離ドキソルビシンよりも高い抗腫瘍活性を示し、また、７μｍｏｌ／ｋｇにおける遊離ドキソルビシンよりも低い活性を示した。しかし、この投与量（７μｍｏｌ／ｋｇ）におけるドキソルビシンは、重要な毒性（２０％よりも高いマウス体重減少および神経毒性サイン）を示した。
【０３０６】
３）結論
ドキソルビシンとＤＰＶ１５またはＤＰＶ１５ｂとの共役は、ドキソルビシン毒性低減を誘発し、その抗腫瘍活性の増加を可能にする。
【０３０７】
実施例９−ＤＰＶ７ｂドキソルビシンコンジュゲートの抗腫瘍活性の体内評価
１）ペプチドのドキソルビシンへの結合
ＰＣＴ特許出願（公開番号ＷＯ０４／０１１０３３）中に記載の方法に従って、ドキソルビシンをＤＰＶ７ｂと共役させる。
ＤＰＶ７ｂ：ＮＨ２−Ｇ  Ｋ  Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｋ  Ｇ  Ｋ  Ｌ  Ｇ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｐ  Ｒ  ＳＲ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ（共役のため、システインを追加している）。
【０３０８】
２）体内評価
方法
ヌードマウスの右側腹に、１０７ＨＣＴ１１６細胞（ＨＣＴ１１６ヒト結腸直腸癌細胞系）を皮内注射する。３日目において、確立された固形腫瘍（腫瘍サイズは８０〜９０ｍｍ３）上に治療を行った。異なる群中のマウス（腫瘍サイズは同等）を無作為化した（１つの群に６匹のマウス）。３つのマウス群を治療する（２００μｌ／マウス（２０ｇ）のＭｉｃｒｏ−ｆｉｎｅ＋による注射、Ｕ−１００インスリン（０．５ｍｌ）、０．３３×１２．７ｍｍ／２９Ｇｌ／２：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。すなわち、制御群（ＮａＣｌ）、治療群（ＤＰＶ７ｂ−ドキソルビシン：１５μｍｏｌ／ｋｇ）、および治療制御群（ドキソルビシン：３．５、５および６．５μｍｏｌ／ｋｇを治療する。
【０３０９】
注射は、ｉ．ｖ．（静脈）経由で尾静脈に行い、Ｄ３（３日目）、Ｄ５、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１２、Ｄ１４、Ｄ１７、Ｄ１９、Ｄ２１（Ｑ２Ｄ３×３Ｗ投与スケジュール）に行う。
【０３１０】
注射日および治療後３〜４日毎、および実験終了時（ｄａｙ５２）において、マウスの体重および腫瘍サイズを制御する。
【０３１１】
結果：
図３７は、ＤＰＶ７ｂドキソルビシンコンジュゲートの抗腫瘍活性を示す。腫瘍量（ｍｍ３）を、細胞移植後の時間（日）関数として表す。
【０３１２】
以下の表１５は、腫瘍成長遅延時間および腫瘍倍増時間を示す。
【０３１３】
【表１５】
2007529194.tif 000016
【０３１４】
ＤＰＶ７ｂドキソルビシンコンジュゲートは、ＨＣＴ１１６腫瘍に対する体内抗腫瘍の有効性有効性を示す。
【０３１５】
実施例１０：−ＤＰＶ３−ＲＮＡｓｅＡコンジュゲートの抗腫瘍活性の体内評価
【０３１６】
ＲＮＡｓｅＡ（リボヌクレアーゼＡ）は、分子量１４．４ｋＤａを示す。
【０３１７】
１）ペプチドのリボヌクレアーゼＡへの結合
基本計画（実施例１を参照）に従って、コンジュゲートＤＰＶ３−ＲＮＡｓｅを作製した。
ＤＰＶ３：ＮＨ２−Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  ＥＳ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ（共役のため、システインを追加している）。
【０３１８】
２）体内評価
方法
ＮＭｒｉヌードマウスの右側腹に、ＨＣＴ１１６ヒト結腸直腸癌細胞を皮内注射する。
Ｑ２Ｄ３×２Ｗ投与スケジュールに従って、溶液（Ｈ２Ｏ／ＮａＣｌ（ｖ／ｖ：１／９）、ＲＮＡｓｅ（１００ｇ、０、５ｍｇ／ｍｌ）およびＤＰＶ３−ＲＮＡｓｅ（１００μｇ、０、５ｍｇ／ｍｌ））腫瘍周辺注射により、マウスを治療した。
【０３１９】
結果
結果を図３８に示す：腫瘍量（ｍｍ３）を、細胞移植後の時間（日）関数として表す。
【０３２０】
６００μｇのＤＰＶ３−ＲＮＡｓｅ  Ａを２週間投与すると、ＲＮＡｓｅ  Ａのみと比較して、腫瘍成長が低減する。
【０３２１】
実施例１１−ＤＰＶ−ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＤＰＶ−ＰＯ）の対外比較インターナリゼーション
【０３２２】
中規模サイズのタンパク質（４００００Ｄａ）をインターナリゼーションするためのＤＰＶの能力を表すため、ペルオキシダーゼ（ＰＯ）を選択した。事前活性化された形態のタンパク質を使用すると、同一コンジュゲート（ＰＯ分子あたり１ＤＰＶ）の調合液が得られる。ＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）細胞系およびＨｅＬａ（頸腺癌）細胞系双方において、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの侵入を試験した。
【０３２３】
実施例１に従って、共役およびインターナリゼーションのプロトコルを行った。
ＤＰＶを以下のものと比較した。
ＤＰＶ３：ＮＨ２−Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｃ−ＣＯＯＨ
ＤＰＶ３／１０：ＮＨ２−Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｒ  Ｒ  Ａ  Ｒ  Ｒ  Ｓ  Ｐ  Ｒ  Ｈ  Ｌ  Ｃ  Ｃ−ＣＯＯＨ
ＤＰＶ６：ＮＨ２−Ｇ  Ｒ  Ｐ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｇ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｋ  Ｒ  Ｌ  Ｋ  Ｐ  Ｃ−ＣＯＯＨ
ＤＰＶ７：ＮＨ２−Ｇ  Ｋ  Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｋ  Ｇ  Ｋ  Ｌ  Ｇ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｄ  Ｐ  Ｃ−ＣＯＯＨ
ＤＰＶ７ｂ：ＮＨ２−Ｇ  Ｋ  Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｋ  Ｇ  Ｋ  Ｌ  Ｇ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｐ  Ｒ  Ｓ  Ｒ  Ｃ−ＣＯＯＨ
ＤＰＶ１０：ＮＨ２−Ｓ  Ｒ  Ｒ  Ａ  Ｒ  Ｒ  Ｓ  Ｐ  Ｒ  Ｈ  Ｌ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｃ−ＣＯＯＨ
ＤＰＶ３：ＮＨ２−Ｓ  Ｒ  Ｒ  Ａ  Ｒ  Ｒ  Ｓ  Ｐ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｇ  Ｋ  Ｋ  Ｒ  Ｋ  Ｒ  Ｋ  Ｒ  Ｃ−ＣＯＯＨ
【０３２４】
ＳＥＱ  ＩＤＮｏ４、５、６、８、９、３、７それぞれとＣ末端システイン
【０３２５】
結果
ＨＣＴ１１６細胞中へのＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの定量的侵入を図３９中に示す。初期ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲート濃度７５μｇ／ｍｌ（およそ１．８μＭに相当）における４時間培養後、細胞溶解を行った。結果を、３つの独立した実験（これらは全て正副２個実現した）において平均値として得る。
【０３２６】
以下の表１６は、ＨＣＴ１１６細胞中においてインターナリゼーションされたＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの正味数量を示す。結果は、ＰＯ／細胞（１０００個）をピコグラムで表す。
【０３２７】
【表１６】
2007529194.tif 000017
【０３２８】
ＨｅＬａ細胞中へのＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの定量的侵入を図４０に示す。コンジュゲートの存在下で、初期濃度７５μｇ／ｍｌで細胞を４時間培養した。結果を、３つの独立した実験（これらは全て正副２個実現した）において平均値として得る。
【０３２９】
以下の表１７は、ＨｅＬａ細胞においてインターナリゼーションされたＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの正味数量を示す。結果は、ＰＯ／細胞（１０００個）をピコグラムで表す。
【０３３０】
【表１７】
2007529194.tif 000018
【０３３１】
以下の表１８は、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの細胞局在化レベルおよび細胞内蓄積レベルを開示する。
【０３３２】
【表１８】
2007529194.tif 000019
【０３３３】
ＤＰＶ−ＰＯ細胞内蓄積レベルは、ＤＰＶの関数および細胞系の関数（これは、ＨｅＬａ細胞において常時より高い）として変動する。それにもかかわらず、ＤＰＶの一般的再分配は、３つの主要群の高レベル細胞内蓄積、中レベル細胞内蓄積、および低レベル細胞内蓄積について、観察された２つの細胞系において主に同一である。「核」ＤＰＶ（ＤＰＶ１０）の細胞内蓄積レベルが「細胞質」ＤＰＶ（ＤＰＶ３、６および７）の細胞内蓄積レベルよりもずっと低い点に着目することが重要である。
【０３３４】
実施例１２−ＤＰＶ抗ＰＯ  ＩｇＧの接着細胞中の対外比較細胞内蓄積
【０３３５】
各高分子量タンパク質（１５００００Ｄａ）をインターナリゼーションするためのＤＰＶの能力を表すため、抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリン（抗ＰＯ  ＩｇＧまたはａＰＯ）を選択した。
【０３３６】
インターナリゼーション実験は、ＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）細胞系およびＨｅＬａ（子宮頸部腺癌）細胞系双方において実現した。細胞内蓄積は、単一時点（４時間）において評価した。
【０３３７】
実施例２に従って、共役およびインターナリゼーションのプロトコルを実行する。
【０３３８】
使用および比較用のＤＰＶアミノ酸配列は、実施例１１中に記載したものである。
【０３３９】
結果：
ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートのＨＣＴ１１６細胞中への定量的侵入を図４１中に示す。コンジュゲートの存在下で、初期濃度１００μｇ／ｍｌで細胞を４時間培養した。結果を、３つの独立した実験（これらは全て正副２個実現した）において平均値として得る。
【０３４０】
以下の表１９は、ＨＣＴ１１６細胞中においてインターナリゼーションされたＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲート（ＤＰＶ−ａＰｏとして記載）の数量を示す。結果は、ＰＯ／細胞（１０００個）を、３つの独立した実験の平均値としてピコグラムで表す。
【０３４１】
【表１９】
2007529194.tif 000020
【０３４２】
ＨｅＬａ細胞中へのＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートの定量的侵入を図４２中に示す。コンジュゲートの存在下で、初期濃度１００μｇ／ｍｌで細胞を４時間培養した。結果を、３つの独立した実験（これらは全て正副２個実現した）において平均値として得る。
【０３４３】
以下の表２０は、ＨｅＬａ細胞中においてインターナリゼーションされたＤＰＶ−抗ＰＯコンジュゲートの正味数量を示す。結果を、３つの独立した実験において平均値（ＰＯ／細胞（１０００個）（ピコグラム））として得る。
【０３４４】
【表２０】
2007529194.tif 000021
【０３４５】
以下の表２１は、ＤＰＶ抗ＰＯコンジュゲートの細胞局在化レベルおよび細胞内蓄積レベルを開示する。
【０３４６】
【表２１】
2007529194.tif 000022
【０３４７】
ＤＰＶ−ＩｇＧコンジュゲートのインターナリゼーションレベルは、試験された２つの細胞系において異なる。細胞内蓄積は、ＨｅＬａ細胞において常により高い。さらに、その細胞内蓄積レベルを考慮して３つの群に分類されたコンジュゲートについては、これらのうちどの２つ（ＰＯまたは免疫グロブリン）を共役させた場合も、全く同一のＤＰＶ再分配が得られた。
【０３４８】
実施例１３−ＤＰＶ−ＴＭＲコンジュゲート（ＴＭＲテトラメチルローダミン−５−マレイミド）の対外比較インターナリゼーション
【０３４９】
ＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）細胞系およびＨｅＬａ（頸腺癌）細胞系双方において、ＤＰＶ−ＴＭＲコンジュゲートの侵入を試験した。
【０３５０】
実施例３に従って、共役およびインターナリゼーションのプロトコルを実施した。
【０３５１】
使用および比較されたＤＰＶアミノ酸配列は、実施例１１中に記載されたものである。
【０３５２】
結果
ＨｅＬａ細胞およびＨＣＴ１１６細胞中のＤＰＶ−ＴＭＲコンジュゲートのインターナリゼーションレベルを図４３に示す。
【０３５３】
ＤＰＶ−ＴＭＲコンジュゲートを３７℃で２時間蓄積させた後、細胞をトリプシン処理および溶解し、細胞溶解物中の蛍光を定量化した。結果は、少なくとも４値の平均である。
【０３５４】
以下の表２２は、ＤＰＶ−ＴＭＲコンジュゲートのインターナリゼーションレベルを示す。初期濃度２０μＭの共役において、インターナリゼーションを３７℃で２時間行った後のＨｅＬａ細胞およびＨＣＴ１１６細胞中のＴＭＲ／細胞（１０００個）（ｐｇ）で表す。
【０３５５】
【表２２】
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【０３５６】
図４３および表２２に示すように、コンジュゲートおよびその細胞系によって、これらの様々なＤＰＶ−ＴＭＲコンジュゲートの間のインターナリゼーションレベルに重要な差がある。それにもかかわらず、ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートおよびＤＰＶ−ＩｇＧコンジュゲートについて上記にて観察された通り、インターナリゼーションされたＴＭＲの数量の関数としてのＤＰＶの分類は、双方の細胞系において同様であり、以下のようになる：ＤＰＶ３≧ＤＰＶ３／１０≧ＤＰＶ１０／６≧ＤＰＶ７ｂ＞ＤＰＶ７＞ＤＰＶ６＞ＤＰＶ１０。
【図面の簡単な説明】
【０３５７】
【図１】ＥＺリンクマレイミド活性化ホースラディシュペルオキシダーゼを示す。Ｍ．Ｗ＝４０．０００。Ｒは、ＤＰＶまたはシステインのいずれかを示す。
【図２Ａ】以下のＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離の例を示す。Ａ：１５μｇの各ＤＰＶ−ＨＲＰコンジュゲートを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に担わせた。Ｂ：各コンジュゲートについての分子量計算（Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌソフトウェア）。
【図２Ｂ】以下のＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離の例を示す。Ａ：１５μｇの各ＤＰＶ−ＨＲＰコンジュゲートを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に担わせた。Ｂ：各コンジュゲートについての分子量計算（Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌソフトウェア）。
【図３】上記ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのＨＣＴ１１６細胞中への定量的侵入を示す。
【図４】上記ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのＨｅＬａ細胞中への定量的侵入を示す。
【図５】ＨｅＬａ細胞およびＨＣＴ１１６細胞中のＤＰＶ１５−ＰＯ、ＤＰＶ１５ｂ−ＰＯおよびＤＰＶ１０−ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションレベルの比較を示す。
【図６】ＨｅＬａ細胞中でのＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの局在化を示す。
【図７】ＨｅＬａ細胞中での３７℃での４時間のインターナリゼーション後のＤＰＶ１５ｂ−ＰＯコンジュゲートおよびＤＰＶ１５−ＰＯコンジュゲートの免疫蛍光染色を示す。
【図８】ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションを初期コンジュゲート濃度の関数として示す。
【図９】ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションレベルに対する温度の影響を示す。
【図１０】ＣＨＯ細胞およびＰｇｓＡ−７４５細胞中のＤＰＶ１５ｂ−ＰＯおよびＣｙｓ−ＰＯのインターナリゼーションレベルの比較を示す。
【図１１】ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの細胞内蓄積に対するヘパリンの抑制効果を示す。
【図１２】ＤＰＶ−ＰＯコンジュゲートの細胞内蓄積に対するポリ−Ｌ−Ｌｙｓの抑制効果を示す。
【図１３】上記ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離の例を示す。
【図１４】上記ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートのＨＣＴ１１６細胞中への定量的侵入を示す。
【図１５】上記ＤＰＶ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートのＨｅＬａ細胞中への定量的侵入を示す。
【図１６】ＨｅＬａ細胞およびＨＣＴ１１６細胞中への上記ＤＰＶ１５−抗ＰＯ、ＤＰＶ１５ｂ−抗ＰＯおよびＤＰＶ１０−抗ＰＯコンジュゲートのインターナリゼーションレベルの比較を示す。
【図１７】ＤＰＶ１５−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートおよびＤＰＶ１５ｂ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートのＨｅＬａ細胞中での局在化を示す。
【図１８】ＨｅＬａ細胞中での３７℃でのインターナリゼーションを４時間行った後のＤＰＶ１５−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートおよびＤＰＶ１５ｂ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートの免疫蛍光染色を示す。
【図１９】ＨＣＴ１１６細胞中での３７℃でのインターナリゼーションを４時間行った後のＤＰＶ１５ｂ−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートの免疫蛍光染色を示し、ＤＰＶ１５ｂ−ＩｇＧコンジュゲートのＨＣＴ１１６細胞中での上記細胞内局在化を示す。
【図２０】上記ＤＰＶ１５−およびＤＰＶ１５ｂ−ＴＭＲのＨｅＬａ細胞中での定量的侵入を示す。
【図２１】ＤＰＶ１５−およびＤＰＶ１５ｂ−ＴＭＲのＨＣＴ１１６細胞中での定量的侵入を示す。
【図２２】ＤＰＶ−ＴＭＲのＨｅＬａ細胞およびＨＣＴ１１６細胞中でのインターナリゼーションレベルの比較を示す。
【図２３】ＨｅＬａ細胞中でのインターナリゼーション後のＤＰＶ１５ｂ−ＴＭＲの細胞質強調染色を示す。
【図２４】ＨＣＴ１１６細胞中でのインターナリゼーション後のＤＰＶ１５ｂ−ＴＭＲの細胞質強調染色を示す。
【図２５】ＤＰＶ１５ｂ−ＴＭＲコンジュゲートのインターナリゼーションレベルに対する温度の影響を示す。
【図２６】ＣＨＯ細胞およびＰｇｓＡ−７４５細胞中でのＤＰＶ１５ｂ−ＴＭＲコンジュゲートのインターナリゼーションの定量化を示す。
【図２７】クロラムブシル化学式を示す。
【図２８】ＯＨ基上のエステル結合（Ｅ）によってＤＰＶ１５に共役されたクロラムブシルを示す。
【図２９】ＯＨ基上のエステル結合（Ｅ）によってＤＰＶ１５に共役されたクロラムブシルを示す。
【図３０】パクリタキセル化学式をその反応部位と共に示す。
【図３１】ＤＰＶ１５−Ｅ−ＰＴＸ化学式を示す。
【図３２】ＤＰＶ１５−アンホテリシンＢ化学式を示す。
【図３３】単回静脈投与後の致死的マウスカンジダ症モデル中のＤＰＶ１５−ＡｍＢコンジュゲートの有効性を示す。
【図３４】ＤＰＶ１５−ＡｍＢコンジュゲートおよび関連分子の溶血性活性を示す。
【図３５】マウス中のＤＰＶ１５−ドキソルビシンコンジュゲートの抗腫瘍活性を示す。
【図３６】マウス中のＤＰＶ１５ｂ−ドキソルビシンコンジュゲートの抗腫瘍活性を示す。
【図３７】マウス中のＤＰＶ７ｂ−ドキソルビシンコンジュゲートの抗腫瘍活性を示す。
【図３８】マウス中のＤＰＶ３−ＲＮＡｓｅ  Ａコンジュゲートの抗腫瘍活性を示す。
【図３９】ＤＰＶ３、６、７、７ｂ、１０、３／１０および１０／６−ＰＯコンジュゲートのＨＣＴ１１６細胞中での定量的侵入を示す。
【図４０】ＤＰＶ３、６、７、７ｂ、１０、３／１０および１０／６−ＰＯコンジュゲートのＨｅＬａ細胞中での定量的侵入を示す。
【図４１】ＤＰＶ３、６、７、７ｂ、１０、３／１０および１０／６−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートのＨＣＴ１１６細胞中での定量的侵入を示す。
【図４２】ＤＰＶ３、６、７、７ｂ、１０、３／１０および１０／６−抗ＰＯ  ＩｇＧコンジュゲートのＨｅＬａ細胞中での定量的侵入を示す。
【図４３】ＤＰＶ３、６、７、７ｂ、１０、３／１０および１０／６−ＴＭＲコンジュゲートのＨｅＬａ細胞およびＨＣＴ１１６細胞中でのインターナリゼーションレベルを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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