(57)【要約】  本発明はＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする核酸、前記核酸を含むＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生きた組換えキャリヤー及び宿主細胞に関する。本発明はＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質と前記蛋白質に対する抗体にも関する。本発明の別の態様はワクチン用としての前記蛋白質と、前記ワクチンの製造における前記蛋白質の使用に関する。更に、本発明の１態様は前記核酸、ＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生きた組換えキャリヤー、宿主細胞、蛋白質又は前記蛋白質に対する抗体を含有するワクチンに関する。最後に、本発明の更に別の態様は前記ワクチンの製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５９．８ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部（前記核酸又は前記その一部は配列番号１に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。）。
【請求項２】
配列が配列番号１に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつことを特徴とする請求項１に記載の核酸又はその一部。
【請求項３】
５８．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部（前記核酸又は前記その一部は配列番号３に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。）。
【請求項４】
配列が配列番号３に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつことを特徴とする請求項３に記載の核酸又はその一部。
【請求項５】
４６．０ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部（前記核酸又は前記その一部は配列番号５に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。）。
【請求項６】
配列が配列番号５に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつことを特徴とする請求項５に記載の核酸又はその一部。
【請求項７】
３７．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部（前記核酸又は前記その一部は配列番号７に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。）。
【請求項８】
配列が配列番号７に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつことを特徴とする請求項７に記載の核酸又はその一部。
【請求項９】
４５．６ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部（前記核酸又は前記その一部は配列番号９に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。）。
【請求項１０】
配列が配列番号９に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつことを特徴とする請求項９に記載の核酸又はその一部。
【請求項１１】
４２．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部（前記核酸又は前記その一部は配列番号１１に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。）。
【請求項１２】
配列が配列番号１１に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつことを特徴とする請求項１１に記載の核酸又はその一部。
【請求項１３】
３４．０ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部（前記核酸又は前記その一部は配列番号１３に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。）。
【請求項１４】
配列が配列番号１３に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつことを特徴とする請求項１３に記載の核酸又はその一部。
【請求項１５】
３２．９ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部（前記核酸又は前記その一部は配列番号１５に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。）。
【請求項１６】
配列が配列番号１５に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつことを特徴とする請求項１５に記載の核酸又はその一部。
【請求項１７】
請求項１から１６に記載の核酸を含むＤＮＡフラグメント。
【請求項１８】
機能的に連結されたプロモーターの制御下に請求項１から１６に記載の核酸又は請求項１７に記載のＤＮＡフラグメントを含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項１９】
請求項１から１６に記載の核酸、請求項１７に記載のＤＮＡフラグメント又は請求項１８に記載の組換えＤＮＡ分子を含む生きた組換えキャリヤー。
【請求項２０】
請求項１から１６に記載の核酸、請求項１７に記載のＤＮＡフラグメント、請求項１８に記載の組換えＤＮＡ分子又は請求項１９に記載の生きた組換えキャリヤーを含む宿主細胞。
【請求項２１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ５９．８ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項２２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％のアミノ酸配列相同度をもつ請求項２１に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項２３】
請求項１又は２に記載の核酸によりコードされることを特徴とする５９．８ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又はその免疫原性フラグメント。
【請求項２４】
配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ５８．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項２５】
配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％のアミノ酸配列相同度をもつ請求項２４に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項２６】
請求項３又は４に記載の核酸によりコードされることを特徴とする５８．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又はその免疫原性フラグメント。
【請求項２７】
配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ４６．０ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項２８】
配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％のアミノ酸配列相同度をもつ請求項２７に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項２９】
請求項５又は６に記載の核酸によりコードされることを特徴とする４６．０ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又はその免疫原性フラグメント。
【請求項３０】
配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ３７．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項３１】
配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％のアミノ酸配列相同度をもつ請求項３０に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項３２】
請求項７又は８に記載の核酸によりコードされることを特徴とする３７．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又はその免疫原性フラグメント。
【請求項３３】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ４５．６ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項３４】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％のアミノ酸配列相同度をもつ請求項３３に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項３５】
請求項９又は１０に記載の核酸によりコードされることを特徴とする４５．６ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又はその免疫原性フラグメント。
【請求項３６】
配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ４２．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項３７】
配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％のアミノ酸配列相同度をもつ請求項３６に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項３８】
請求項１１又は１２に記載の核酸によりコードされることを特徴とする４２．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又はその免疫原性フラグメント。
【請求項３９】
配列番号１４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ３４．０ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項４０】
配列番号１４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％のアミノ酸配列相同度をもつ請求項３９に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項４１】
請求項１３又は１４に記載の核酸によりコードされることを特徴とする３４．０ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又はその免疫原性フラグメント。
【請求項４２】
配列番号１６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ３２．９ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項４３】
配列番号１６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％のアミノ酸配列相同度をもつ請求項４２に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項４４】
請求項１５又は１６に記載の核酸によりコードされることを特徴とする３２．９ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又はその免疫原性フラグメント。
【請求項４５】
ワクチン用としての請求項１から１６に記載の核酸、請求項１７に記載のＤＮＡフラグメント、請求項１８に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項１９に記載の生きた組換えキャリヤー、請求項２０に記載の宿主細胞又は請求項２１から４４に記載の蛋白質もしくはその免疫原性フラグメント。
【請求項４６】
Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ感染の防除用ワクチンの製造のための、請求項１から１６に記載の核酸、請求項１７に記載のＤＮＡフラグメント、請求項１８に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項１９に記載の生きた組換えキャリヤー、請求項２０に記載の宿主細胞又は請求項２１から４４に記載の蛋白質もしくはその免疫原性フラグメントの使用。
【請求項４７】
請求項１から１６に記載の核酸、請求項１７に記載のＤＮＡフラグメント、請求項１８に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項１９に記載の生きた組換えキャリヤー、請求項２０に記載の宿主細胞又は請求項２１から４４に記載の蛋白質もしくはその免疫原性フラグメントと、医薬的に許容可能なキャリヤーを含有することを特徴とするＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ感染の防除用ワクチン。
【請求項４８】
請求項２１から４４に記載の蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントに対する抗体と、医薬的に許容可能なキャリヤーを含有することを特徴とするＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ感染の防除用ワクチン。
【請求項４９】
アジュバントを含有することを特徴とする請求項４７に記載のワクチン。
【請求項５０】
家禽に対して病原性のウイルスもしくは微生物に由来する付加抗原、前記抗原に対する抗体又は前記抗原をコードする遺伝情報を含有することを特徴とする請求項４７から４９に記載のワクチン。
【請求項５１】
ニワトリに対して病原性のウイルス又は微生物が鶏痘ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病（ガンボロ病）ウイルス、マレック病ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、トリレオウイルス、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（コリーザ）、ニワトリポックスウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、アヒルペストウイルス、ニューカッスル病ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、シチメンチョウヘルペスウイルス、エイメリア種、Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ、サルモネラ種及び大腸菌から構成される群から選択されることを特徴とする請求項５０に記載のワクチン。
【請求項５２】
請求項１から１６に記載の核酸、請求項１７に記載のＤＮＡフラグメント、請求項１８に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項１９に記載の生きた組換えキャリヤー、請求項２０に記載の宿主細胞、請求項２１から４４に記載の蛋白質もしくはその免疫原性フラグメント、又は請求項２１から４４に記載の蛋白質に対する抗体と、医薬的に許容可能なキャリヤーを混合する段階を含む請求項４７から５１に記載のワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオルニトバクテリウム・ライノトラキアル（Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）蛋白質をコードする核酸、前記核酸を含むＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生きた組換えキャリヤー及び宿主細胞、Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質、前記蛋白質に対する抗体、ワクチン用としての前記蛋白質、前記ワクチンの製造における前記蛋白質の使用、前記核酸、ＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生きた組換えキャリヤー、宿主細胞、蛋白質又は前記蛋白質に対する抗体を含有するワクチン、並びに前記ワクチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅは比較的最近発見された細菌であり、家禽飼養場や野生鳥類にますます多発している。特に商業的養鶏場、七面鳥飼養場及びアヒル飼養場の動物に感染することが多い。商業的家禽では、感染は呼吸器疾患に関連付けられ、気嚢炎と肺炎がＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ感染の最も一般的な特徴である。これらの徴候はエアゾールによる微生物の気管内又は胸部内投与で誘導することができ、呼吸器ウイルス、細菌又は最適状態に満たない住環境等の他の因子により悪化する。静脈内投与により誘導することができる疾患としては、骨炎、脳膜炎及び関節感染がＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅに関連付けられている。感染は水平感染と卵を介する垂直感染があり、そのために急速に世界中に広がると考えられる。Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌの詳細はｖａｎ  Ｅｍｐｅｌ，Ｐ．Ｃ．Ｍ．ａｄ  Ｈａｆｅｚ，Ｈ．Ｍ．によりＡｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２８：２１７−２２７（１９９９）に記載されている。ヨーロッパ特許ＥＰ０．６２５．１９０号はＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ細菌とＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅに対するワクチンの両者に関する。
【０００３】
血清学的研究の結果、Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ株には株の地理的起源と株を単離した宿主動物にある程度まで依存して種々の血清型があることが判明した。現時点では、１８種の異なる血清型が存在する。
【０００４】
通常の抗生物質に対する獲得免疫は属内で非常に一般的であるため、疾患の治療処置が困難になる場合がある。更に、公衆衛生と環境上の理由から食用動物で抗生物質を使用することに対する抵抗はますます強まっている。
【０００５】
ワクチン接種は抗生物質による治療処置の代用であるが、これまでは弱毒生ワクチンと不活化全細胞ワクチンしか接種できなかった。
【０００６】
Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅに特異的な弱毒生ワクチンの成功は弱毒化と免疫系のトリガの適正なバランスに大きく依存している。不活化全細胞ワクチンは基本的に安全であるため、安全性の観点から好ましい型のワクチンであると思われる。
【０００７】
しかし、不活化全細胞ワクチンは弱毒生ワクチンに比較して高用量を投与する必要がある。一般に、細菌に存在する蛋白質の大半は免疫系のトリガに関与せず、即ち該当免疫原ではない。このため、不活化全細胞ワクチンの場合には、ヒト又は動物に十分なレベルの該当免疫原を提供するためには多量の非防御物質を付加的且つ不可避的に投与する。これは望ましい状況ではない。
【０００８】
サブユニットワクチンの使用はこの問題を解決することができるので非常に好ましいが、Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅを防除するための免疫原性サブユニットワクチンは現時点では当分野で知られていない。
【０００９】
更に、弱毒生ワクチンと不活化全細胞製剤は全Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ株に対して所定レベルの交差防御を提供することが知られているが、サブユニットワクチンは交差反応性を誘導する場合としない場合がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は交差反応性を誘導するＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅサブユニットに基づくワクチンを初めて提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この目的は防御免疫応答をトリガするのに意外にも重要な役割を果たす８種の新規Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質を提供し、これらの新規免疫原性蛋白質の１種以上を含有するワクチンを提供することにより達成される。更に驚くべきことに、これらの８種の新規蛋白質は同種防御免疫応答を誘導するのみならず、交差反応性防御免疫応答も誘導することが判明した。
【００１２】
同種免疫応答は同一血清型の株に対する応答であり、交差反応性免疫応答は血清学的に同種と異種の株の両者に対する応答である。
【００１３】
分子量５９．８ｋＤをもつ第１の新規蛋白質Ｏｒ０１は配列番号１に記載のヌクレオチド配列をもつ核酸によりコードされる。
【００１４】
多数の異なるヌクレオチド配列が同一蛋白質をコードできることは当分野で周知である。この現象はアミノ酸をコードする各トリプレットの２番目、特に３番目の塩基のゆらぎとして一般に知られている。この現象の結果、同一蛋白質をコードする２種のヌクレオチド配列は約２０−３０％が不均一になる可能性がある。従って、約８０％のヌクレオチド配列相同度をもつ２種の核酸は同一蛋白質をコードすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
従って、１態様は５９．８ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部に関し、前記核酸又は前記その一部は配列番号１に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。
【００１６】
前記蛋白質（及び他の７種の蛋白質）の分子量はアミノ酸配列で与えられるアミノ酸の分子量に基づいて決定される。
【００１７】
好ましくは、この５９．８ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする本発明の核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部は配列番号１に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつ。
【００１８】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００１９】
ヌクレオチド相同度レベルはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで入手可能なサブプログラム「ＢＬＡＳＴＮ」を選択することによりコンピュータープログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」を使用して決定することができる。
【００２０】
このプログラムの１参考文献はＴａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７４：２４７−２５０（１９９９）である。使用するパラメーターは以下のデフォルトパラメーターである。マッチのリウォード：＋１。ミスマッチのペナルティ：−２。オープンギャップ：５。伸長ギャップ：２。ギャップｘ＿ドロップオフ：５０。
【００２１】
所定核酸配列が本発明の核酸配列であるか否かを決定するための別のアプローチはこの所定核酸配列が配列番号１（又は配列番号３、５、７、９、１１、１３又は１５、下記参照）に記載のヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするか否かに関する。核酸配列が配列番号１、又は当然のことながら配列番号３、５、７、９、１１、１３及び１５に記載のヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするならば、本発明の核酸配列であるとみなされる。
【００２２】
ストリンジェント条件の定義はＭｅｉｎｋｏｔｈとＷａｈｌ（１９８４．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｎ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４．）の式：
Ｔｍ＝［８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ］−１℃／１％ミスマッチ
に従う。
【００２３】
なお、上記式中、Ｍは１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの百分率であり、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さである。
【００２４】
ストリンジェント条件は核酸配列又はそのフラグメントが最大２０％、好ましくは１０％、より好ましくはこの順番ないし優先順に８、６、５、４、３、２、１又は０％のミスマッチをもつ場合にも配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５のいずれかに記載の核酸配列とハイブリダイズする条件である。
【００２５】
別の態様は５８．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質Ｏｒ０２をコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部に関し、前記核酸又は前記その一部は配列番号３に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。
【００２６】
好ましくは、この５８．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする本発明の核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部は配列番号３に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつ。
【００２７】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００２８】
更に別の態様は４６．０ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質Ｏｒ０３をコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部に関し、前記核酸又は前記その一部は配列番号５に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。
【００２９】
好ましくは、この４６．０ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする本発明の核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部は配列番号５に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつ。
【００３０】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００３１】
更に別の態様は３７．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質Ｏｒ０４をコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部に関し、前記核酸又は前記その一部は配列番号７に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。
【００３２】
好ましくは、この３７．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする本発明の核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部は配列番号７に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつ。
【００３３】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００３４】
別の態様は４５．６ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質Ｏｒ１１をコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部に関し、前記核酸又は前記その一部は配列番号９に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。
【００３５】
好ましくは、この４５．６ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする本発明の核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部は配列番号９に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつ。
【００３６】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００３７】
更に別の態様は４２．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質Ｏｒ７７をコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部に関し、前記核酸又は前記その一部は配列番号１１に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。
【００３８】
好ましくは、この４２．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする本発明の核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部は配列番号１１に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつ。
【００３９】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００４０】
更に別の態様は３４．０ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質Ｏｒ９８Ａをコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部に関し、前記核酸又は前記その一部は配列番号１３に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。
【００４１】
好ましくは、この３４．０ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする本発明の核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部は配列番号１３に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつ。
【００４２】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００４３】
別の態様は３２．９ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質Ｏｒ９８Ｂをコードする核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部に関し、前記核酸又は前記その一部は配列番号１５に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８０％の相同度をもつ。
【００４４】
好ましくは、この３２．９ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする本発明の核酸又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸の一部は配列番号１５に記載のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子の核酸に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同度をもつ。
【００４５】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００４６】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３もしくは１５に記載の配列に相補的なヌクレオチド配列又は本発明の配列のタンデムアレーを含むヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれる。
【００４７】
本発明は８種の新規Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質を開示するので、これらの蛋白質を有意量で獲得することが初めて可能になった。これは例えば発現システムを使用して前記蛋白質又はその免疫原性フラグメントをコードする遺伝子全体又はその一部を発現させることにより実施することができる。
【００４８】
従って、本態様の好ましい１形態において、本発明は本発明の核酸を含むＤＮＡフラグメントに関する。ＤＮＡフラグメントは本発明の核酸のキャリヤーとして機能するヌクレオチド鎖である。このようなＤＮＡフラグメントは例えば本発明の核酸をクローニングするプラスミドとすることができる。このようなＤＮＡフラグメントは例えば以下に記載するようにプライマーとしてＤＮＡ量を増加させるためや、本発明の核酸を発現させるために有用である。
【００４９】
核酸の発現の必須要件は核酸をプロモーターの制御下におくように適切なプロモーターが核酸に機能的に連結されていることである。当業者に自明の通り、プロモーターの選択は蛋白質発現用宿主細胞として使用される細胞で遺伝子転写を誘導することが可能な任意真核、原核又はウイルスプロモーターに及ぶ。
【００５０】
従って、本態様のより好ましい形態は本発明のＤＮＡフラグメント及び／又は核酸を含む組換えＤＮＡ分子に関し、本発明の核酸は機能的に連結されたプロモーターの制御下におかれている。これは例えば標準分子生物学技術により得られる（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１９８９．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６））。
【００５１】
機能的に連結されたプロモーターとは連結されている核酸の転写を制御することが可能なプロモーターである。
【００５２】
このようなプロモーターは新規遺伝子の天然プロモーター、即ち本発明の蛋白質をコードする核酸の転写に関与するプロモーター、又はプロモーターが発現に使用される細胞で機能的であるという条件でＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅの別のプロモーターとすることができる。異種プロモーターでもよい。
【００５３】
宿主細胞が細菌である場合には、使用可能な有用な発現制御配列としてはＴｒｐプロモーター及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８，４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６１５，１９７８）；外膜蛋白質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｉｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，７７１−７７５，１９８２）；バクテリオファージλプロモーター及びオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，４６７７−４６８８，１９８３）；αアミラーゼ（枯草菌）プロモーター及びオペレーター、終結配列並びに選択された宿主細胞に適合可能な他の発現強化及び制御配列が挙げられる。宿主細胞が酵母である場合には、有用な発現制御配列としては例えばα接合因子が挙げられる。昆虫細胞には、バキュロウイルスの多核体又はｐ１０プロモーターを使用することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が脊椎動物起源の場合には、有用な発現制御配列の例としては（ヒト）サイトメガロウイルス極初期プロモーター（Ｓｅｅｄ，Ｂ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９，８４０−８４２，１９８７；Ｆｙｎａｎ，Ｅ．Ｆ．ら．，ＰＮＡＳ  ９０，１１４７８−１１４８２，１９９３；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，１７４５−１７４８，１９９３）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（ＲＳＶ，Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．ら．，ＰＮＡＳ  ７９，６７７７−６７８１，１９８２；Ｆｙｎａｎら．，前出；Ｕｌｍｅｒら．，前出）、ＭＰＳＶ  ＬＴＲ（Ｓｔａｃｅｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５０，７２５−７３２，１９８４）、ＳＶ４０極初期プロモーター（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｊ．ら．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５，７７３，１９８３）、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９８３）、メタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６，３９−４２，１９８２）、熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）、Ａｄ２の主要後期プロモーター及びβアクチンプロモーター（Ｔａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６，１５２−１５４，１９９２）が挙げられる。調節配列としては更にターミネーター及びポリアデニル化配列が挙げられる。使用可能な配列としては周知ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリアデニル化配列、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ターミネーター及びポリアデニル化配列が挙げられる。
【００５４】
細菌、酵母、真菌、昆虫及び脊椎動物細胞発現システムは非常によく使用されているシステムである。このようなシステムは当分野で周知であり、一般に入手可能であり、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．４０３０  Ｆａｂｉａｎ  Ｗａｙ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４３０３−４６０７，米国から市販されている。これらの発現システムに次いで寄生虫系発現システムが魅力的な発現システムである。このようなシステムは例えば仏国特許出願公開第２７１４０７４号とＵＳ  ＮＴＩＳ公開第ＵＳ０８／０４３１０９号（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ，Ｗ．：公開日１９９３年１２月１日）に記載されている。
【００５５】
本発明の本態様の更に好ましい１形態は本発明のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質もしくはその免疫原性フラグメントをコードする核酸、本発明のＤＮＡフラグメント又は本発明の組換えＤＮＡ分子を含む生きた組換えキャリヤー（ＬＲＣ）に関する。これらのＬＲＣは付加遺伝情報（この場合には本発明のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質もしくはその免疫原性フラグメントをコードする核酸、ＤＮＡフラグメント又は組換えＤＮＡ分子）をクローニングした微生物又はウイルスである。このようなＬＲＣに感染したニワトリはキャリヤーの免疫原に対してだけでなく、その遺伝コードを付加的にＬＲＣにクローニングする蛋白質（例えば本発明のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質遺伝子）の免疫原性部分に対しても免疫応答を発生する。
【００５６】
細菌ＬＲＣの１例としては、当分野で公知の弱毒サルモネラ株を非常に有利に使用することができる。
【００５７】
生きた組換えキャリヤー寄生虫も例えばＶｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ａ．Ｎ．（Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２８：１１２１−１１３０（１９９８））に記載されている。
【００５８】
更に、核酸を標的細胞に導入する手段としてＬＲＣウイルスを使用することもできる。生きた組換えキャリヤーウイルスはベクターウイルスとも言う。ベクターとして使用されることが多いウイルスはワクシニアウイルス（Ｐａｎｉｃａｌｉら；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７（１９８２））、ヘルペスウイルス（Ｅ．Ｐ．Ａ．０４７３２１０Ａ２）、及びレトロウイルス（Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｄ．ら；ｉｎ  Ｂａｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉｃｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖａ，Ｅ．ａｎｄ  Ｐｌｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．（Ｅｄｓ．），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｔｏｄａｙ−１９８８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ｐｐ．９２−９９（１９８９））である。
【００５９】
特に家禽で非常に適切なベクターウイルスとして当分野で使用されている公知ウイルスは鶏痘ウイルス、マレック病血清型３ウイルス、シチメンチョウヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス及びニューカッスル病ウイルスである。
【００６０】
生きた組換えキャリヤーは「生きたベクター」、又は簡単に「ベクター」としても当分野で公知である。従って、生きた組換えキャリヤーに基づくワクチンもベクターワクチンとして当分野で公知である。
【００６１】
挿入した本発明の核酸の発現を宿主動物で誘導することが可能な選択細菌、寄生虫又はウイルスのゲノムに組換え核酸を導入するためには当分野で周知のｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え技術を使用することができる。
【００６２】
最後に、本発明の本態様の別の形態は機能的に連結されたプロモーターの制御下に本発明の蛋白質をコードする核酸、前記核酸を含むＤＮＡフラグメント又は前記核酸を含む組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞に関する。この形態は更に本発明のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又はその免疫原性フラグメントをコードする核酸分子を含む生きた組換えキャリヤーを含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は細菌（例えば大腸菌、枯草菌及び乳酸菌種）起源の細胞とすることができ、細菌系プラスミド（例えばｐＢＲ３２２）もしくは細菌発現ベクター（例えばｐＧＥＸ）、又はバクテリオファージと組み合わせる。宿主細胞は真核起源でもよく、例えば酵母細胞と酵母特異的ベクター分子の組み合わせや、高等真核細胞では昆虫細胞（Ｌｕｃｋｏｗら；Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７−５５（１９８８））とベクター又は組換えバキュロウイルスの組み合わせ、植物細胞と例えばＴｉプラスミド系ベクター又は植物ウイルスベクター（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ｅら；Ｃｅｌｌ  ３２：１０３３（１９８３））の組み合わせ、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はネコ腎由来細胞等の哺乳動物細胞と適当なベクター又は組換えウイルスの組み合わせが挙げられる。
【００６３】
本発明の別の態様は本発明のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００６４】
免疫原性フラグメントの概念については以下に定義する。
【００６５】
本態様の１形態は配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ５９．８ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００６６】
好ましい１形態において、本態様は配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列相同度をもつ前記Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００６７】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００６８】
蛋白質相同度レベルはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈ  ｔｍｌで入手可能なサブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択することによりコンピュータープログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」を使用して決定することができる。
【００６９】
このプログラムの１参考文献はＴａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７４：２４７−２５０（１９９９）である。使用するマトリックスは「ｂｌｏｓｕｍ６２」である。使用するパラメーターは以下のデフォルトパラメーターである。オープンギャップ：１１。伸長ギャップ：１。ギャップｘ＿ドロップオフ：５０。
【００７０】
本態様の別の形態は配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ５８．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００７１】
好ましい１形態において、本態様は配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列相同度をもつ前記Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００７２】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００７３】
本態様の更に別の形態は配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ４６．０ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００７４】
好ましい１形態において、本態様は配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列相同度をもつ前記Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００７５】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００７６】
本態様の更に別の形態は配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ３７．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００７７】
好ましい１形態において、本態様は配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列相同度をもつ前記Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００７８】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００７９】
本態様の更に別の形態は配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ４５．６ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００８０】
好ましい１形態において、本態様は配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列相同度をもつ前記Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００８１】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００８２】
本態様の他の１形態は配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ４２．２ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００８３】
好ましい１形態において、本態様は配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列相同度をもつ前記Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００８４】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００８５】
本態様の更に別の形態は配列番号１４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ３４．０ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００８６】
好ましい１形態において、本態様は配列番号１４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列相同度をもつ前記Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００８７】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００８８】
最後に本態様の別の形態は配列番号１６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列相同度をもつ３２．９ｋＤ  Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００８９】
好ましい１形態において、本態様は配列番号１６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列相同度をもつ前記Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質とその免疫原性フラグメントに関する。
【００９０】
９８％、９９％又は１００％の相同度レベルが更に好ましい。
【００９１】
本態様の別の形態は本発明の核酸によりコードされる本発明の前記Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質と前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００９２】
当然のことながら、本発明の特定蛋白質には、個々のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ株間に天然変異が存在し得る。これらの変異としては全長配列のアミノ酸変異や、前記配列中の１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位又は付加が挙げられる。生物及び免疫活性を本質的に変化させないアミノ酸置換は例えばＮｅｕｒａｔｈらにより“Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９）に記載されている。同族アミノ酸間のアミノ酸置換又は進化において頻発する置換は特にＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３参照）である。他のアミノ酸置換としてはＡｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ及びＡｌａ／Ｇｌｕが挙げられる。この情報に基づき、ＬｉｐｍａｎとＰｅａｒｓｏｎは相同蛋白質間の機能的類似度を決定する迅速で高感度な蛋白質比較法を開発した（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）。得られる蛋白質がその免疫反応性を維持する限り、本発明の典型的態様のこのようなアミノ酸置換と、欠失及び／又は挿入をもつ変異も本発明の範囲に含まれる。
【００９３】
これは、本発明のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質が異なるフィールド単離株から単離した場合に同一免疫特徴をもつ同一蛋白質でありながら約８０％の相同度レベルでよいことを説明するものである。Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ感染又は少なくとも前記感染の臨床徴候に対する免疫応答を誘導することが可能な蛋白質を提供する本発明の所定蛋白質のアミノ酸配列の前記変異は「免疫原性に本質的に影響を与えない」とみなされる。
【００９４】
しかし、蛋白質を例えばワクチン接種目的又は抗体生産に使用する場合には、全長蛋白質を使用する必要はない。単独又は例えばＫＬＨ等のキャリヤーと結合して該当蛋白質に対する免疫応答を誘導することが可能な該当蛋白質のフラグメント、即ち所謂免疫原性フラグメントを使用することも可能である。「免疫原性フラグメント」とは脊椎動物宿主に免疫応答を誘導する能力を維持している全長蛋白質のフラグメント、例えばＢ又はＴ細胞エピトープを含むフラグメントを意味する。つまり、免疫原性フラグメントとは本発明のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質に対する免疫応答を誘導することが可能なフラグメントである。現在、抗原フラグメント（決定基）をコードするＤＮＡフラグメントを容易に同定するための各種技術が入手可能である。Ｇｅｙｓｅｎら（特許出願ＷＯ８４／０３５６４、特許出願ＷＯ８６／０６４８７、米国特許第４，８３３，０９２号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３９９８−４００２（１９８４），Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５９−２７４（１９８７））により記載されている方法、即ち所謂ＰＥＰＳＣＡＮ法は蛋白質の免疫学的に重要な領域であるエピトープの検出方法として、実施し易い迅速な定着方法である。この方法は世界中で使用されており、それ自体当業者に周知である。この（経験的）方法はＢ細胞エピトープの検出に特に適している。また、任意蛋白質をコードする遺伝子の配列が分かっているならば、コンピューターアルゴリズムにより、現在公知のエピトープとの配列及び／又は構造一致に基づいて特定蛋白質フラグメントを免疫学的に重要なエピトープとして指定することができる。これらの領域の決定はＨｏｐｐとＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４８−３８２８（１９８１））による親水性基準と、ＣｈｏｕとＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４７：４５−１４８（１９８７）及び米国特許第４，５５４，１０１号）による二次構造側面の組み合わせに基づく。Ｔ細胞エピトープもＢｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５，１０５９−１０６２（１９８７）及び米国特許出願ＮＴＩＳ  ＵＳ０７／００５，８８５）を使用してコンピューターにより配列から同様に予測することができる。概要は一般原理についてＳｈａｎ  Ｌｕ，Ｔｉｂｔｅｃｈ  ９：２３８−２４２（１９９１）、マラリアエピトープについてＧｏｏｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１０５９−１０６２（１９８７）、総論についてＬｕ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １０：３−７（１９９２）、ＨＩＶエピトープについてＢｅｒｚｏｗｓｋｙ，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５：２４１２−２４１８（１９９１）に夫々記載されている。免疫原性フラグメントは通常８アミノ酸、好ましくは９アミノ酸以上、例えば９、１０、１２、１５又は２０アミノ酸の最短長をもつ。従って、このようなフラグメントをコードする核酸は少なくとも２４、好ましくは２７、３０、３６、４５又は６０核酸長をもつ。
【００９５】
従って、本発明の更に別の態様の１形態は医薬的に許容可能なキャリヤーと共に上記のような本発明のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又はその免疫原性フラグメントを含有するＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ感染の防除用ワクチンに関する。
【００９６】
本発明の更に別の態様はワクチン用としての本発明のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又はその免疫原性フラグメントに関する。
【００９７】
本発明の更に別の態様はＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ感染の防除用ワクチンの製造における本発明の核酸、ＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生きた組換えキャリヤー、宿主細胞又は蛋白質もしくはその免疫原性フラグメントの使用に関する。
【００９８】
本発明のワクチンの製造方法の１例は細菌を増殖させた後にＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又はその免疫原性フラグメントを細菌から生化学的に精製する方法である。しかし、この方法は非常に時間のかかるワクチン製造方法である。
【００９９】
従って、Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又はその免疫原性フラグメントをコードする遺伝子の発現産物をワクチンで使用するほうが著しく簡便である。本発明ではＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質をコードする核酸が提供されるので、この方法が初めて可能になった。
【０１００】
これらの遺伝子の発現産物に基づくワクチンは下記のように本発明の蛋白質又は本発明のその免疫原性フラグメントを医薬的に許容可能なキャリヤーと混合することにより容易に製造することができる。
【０１０１】
あるいは、本発明のワクチンは本発明の蛋白質又はその免疫原性フラグメントを発現することが可能な上記のような生きた組換えキャリヤーを含むことができる。例えばサルモネラキャリヤー又はウイルスキャリヤー（例えばヘルペスウイルスベクター）に基づくこのようなワクチンはＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅの自然感染方法によく似ているという点でサブユニットワクチンよりも有利である。更に、組換えキャリヤーは免疫に必要な量が非常に少量ですむのでその自己増殖も利点である。
【０１０２】
ワクチンは本発明の蛋白質又はその免疫原性フラグメントを含む上記のような宿主細胞に基づくこともできる。
【０１０３】
上記全ワクチンは能動的ワクチン接種に利用され、即ち宿主の防御系をトリガする。
【０１０４】
あるいは、抗体を例えばウサギで生産することもできるし、下記のように抗体産生細胞株から得ることもできる。その後、このような抗体をニワトリに投与することができる。このワクチン接種方法即ち受動的ワクチン接種は動物が既に感染しており、自然免疫応答をトリガさせる時間がない場合の選択ワクチン接種である。これは急激に高い感染圧を受け易い動物にワクチン接種する場合にも好適な方法である。投与した本発明の蛋白質又はその免疫原性フラグメントに対する抗体はこれらの場合にはＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅと直接結合することができる。これはＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ増殖を低下又は停止させるという利点がある。
【０１０５】
従って、本発明の本態様の他の１形態は本発明のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又はその免疫原性フラグメントに対する抗体と、医薬的に許容可能なキャリヤーを含有するＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ感染の防除用ワクチンに関する。
【０１０６】
本発明の更に別の態様は本発明のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントに対する抗体に関する。
【０１０７】
本発明の抗体の大規模製造方法も当分野で公知である。このような方法は本発明の蛋白質をコードする遺伝情報（のフラグメント）をファージディスプレイ用繊維状ファージにクローニングすることに依存している。このような技術は例えばｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ａｅｐｐｈａｇｅ．ｈｔｍｌ．で“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｇｅ”に“ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ” の項目で記載されており、更にＣｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．ら，（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２：２６２−２６７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２：１７３−１８３、Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら，（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：４３３−４５５、及びＬｉｔｔｌｅ，Ｍ．ら，（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ａｄｖ．１２：５３９−５５５の各論文に記載されている。その後、ファージを使用してラクダ科動物重鎖抗体を発現するラクダ科動物発現ライブラリーをスクリーニングする。（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．ａｎｄ  Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｍ．，Ｊｏｕｒｎ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎ．１２：１３１−１４０（１９９９）及びＧｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４：５１２−５２６（１９９７））。所望抗体を発現するライブラリーに由来する細胞を複製した後、抗体の大規模発現に使用することができる。
【０１０８】
更に別の態様は本発明の抗体と医薬的に許容可能なキャリヤーを混合する段階を含む本発明のワクチンの製造方法に関する。
【０１０９】
効率的な代替ワクチン接種方法は該当抗原をコードするＤＮＡの直接ワクチン接種である。蛋白質をコードするＤＮＡの直接ワクチン接種は多種多様の蛋白質で成功している。（例えばＤｏｎｎｅｌｌｙら，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：２０−２６（１９９３）参照）。このワクチン接種方法はＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ感染に対するニワトリのワクチン接種に非常に魅力的な方法である。
【０１１０】
従って、本発明の本態様の更に他の形態は本発明の蛋白質もしくはその免疫原性フラグメントをコードする核酸、前記核酸を含むＤＮＡフラグメント、又は本発明の組換えＤＮＡ分子と、医薬的に許容可能なキャリヤーを含有するワクチンに関する。
【０１１１】
本発明のＤＮＡワクチンで使用するのに適したＤＮＡプラスミドの例は細菌、真核及び酵母宿主細胞用の従来のクローニング又は発現プラスミドであり、前記プラスミドの多くは市販されている。このようなプラスミドの周知例はｐＢＲ３２２とｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。本発明のＤＮＡフラグメント又は組換えＤＮＡ分子はヌクレオチド配列の蛋白質発現を誘導できなければならない。ＤＮＡフラグメント又は組換えＤＮＡ分子は本発明の１種以上のヌクレオチド配列を含むことができる。更に、ＤＮＡフラグメント又は組換えＤＮＡ分子は非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドをもつ免疫刺激オリゴヌクレオチドや、他の抗原蛋白質又はアジュバント用サイトカインをコードするヌクレオチド配列等の他のヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１１２】
本発明のワクチンで使用する本発明のヌクレオチド配列又は本発明のヌクレオチド配列を含むＤＮＡプラスミドは転写調節配列に機能的に連結することが好ましく、裸でもよいし、送達システムにパッケージングしてもよい。適切な送達システムは脂質小胞体、ｉｓｃｏｍ、デンドロマー、ニオソーム、多糖マトリックス等（詳細については下記参照）であり、いずれも当分野で周知である。上記のようなサルモネラ種等の生きた弱毒細菌や、ヘルペスウイルスベクター等の生きた弱毒ウイルスも送達システムとして非常に適切である。
【０１１３】
ＤＮＡワクチンは例えば無針注射器の使用等の皮内投与により簡単に投与することができる。この投与方法はワクチン接種すべき動物の細胞にＤＮＡを直接送達する。１０ｐｇ〜１０００μｇのＤＮＡ量で良好な結果が得られる。１〜１００μｇのμｇ範囲の量を使用することが好ましい。
【０１１４】
別の態様では、本発明のワクチンは家禽に病原性のウイルスもしくは微生物に由来する１種以上の付加抗原、前記抗原に対する抗体又は前記抗原をコードする遺伝情報を含有する。
【０１１５】
当然のことながら、前記抗原は例えば他のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ抗原とすることができる。本発明の蛋白質もしくはその免疫原性フラグメント、前記蛋白質もしくはその免疫原性フラグメントに対する抗体、又は前記蛋白質もしくはその免疫原性フラグメントをコードする遺伝情報の２種以上を同一ワクチンで併用すると有益である。
【０１１６】
これに次いで、家禽に病原性の別の微生物もしくはウイルスに由来する抗原、前記抗原に対する抗体又は前記抗原をコードする遺伝情報を本発明のワクチンに加えると有益である。
【０１１７】
前記ウイルス又は微生物は鶏痘ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病（ガンボロ病）ウイルス、マレック病ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、トリレオウイルス、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（コリーザ）、ニワトリポックスウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、アヒルペストウイルス、ニューカッスル病ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、シチメンチョウヘルペスウイルス、エイメリア種、Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ、サルモネラ種及び大腸菌から構成される群から選択することが好ましい。
【０１１８】
本発明のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質に基づくワクチンはマーカーワクチンとしても非常に適切である。マーカーワクチンは例えば野生型感染により誘導される抗体パネルと異なる特徴的抗体パネルに基づいてワクチン接種済みニワトリとフィールド感染ニワトリを区別することができるワクチンである。例えば野生型細菌に存在する免疫原性蛋白質がワクチンに存在しない場合に異なる抗体パネルが誘導され、その場合、宿主はワクチン接種後に該当蛋白質に対する抗体を産生しない。従って、Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅの野生型生ワクチン、弱毒生ワクチン又は不活化全細胞ワクチンは細菌蛋白質の全部又は大半に対する抗体を誘導するが、本発明のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質に基づくワクチンはこの蛋白質に対する抗体しか誘導しない。
【０１１９】
ニワトリ由来血清を試験し、ニワトリが本発明のサブユニットワクチンを接種されているか又はＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅフィールド感染しているかを調べるためには、本発明の１種の蛋白質を添加したウェルと本発明の別の蛋白質を添加したウェルとを使用する単純ＥＬＩＳＡ試験で十分であり、本発明の１種の蛋白質を含有するワクチンを接種したニワトリは本発明の別の蛋白質に対する抗体をもたない。他方、Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅのフィールド感染を受けたニワトリは全免疫原性Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ蛋白質に対する抗体をもち、従って、本発明の別の蛋白質に対する抗体ももつ。
【０１２０】
本発明の全ワクチンは医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。医薬的に許容可能なキャリヤーは例えば滅菌水又は滅菌生理食塩水とすることができる。より複雑な形態では、キャリヤーは例えば緩衝液とすることができる。
【０１２１】
ワクチンの製造方法は本発明の蛋白質もしくはその免疫原性フラグメント、及び／又は前記蛋白質もしくはその免疫原性フラグメントに対する抗体、及び／又は本発明の核酸及び／又はＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生きた組換えキャリヤーもしくは宿主細胞と、医薬的に許容可能なキャリヤーを混合する段階を含む。
【０１２２】
本発明のワクチンは好ましい形態では更に免疫刺激物質（所謂アジュバント）を加えることができる。アジュバントは一般に非特異的に宿主の免疫応答を刺激する物質を含む。多種多様のアジュバントが当分野で公知である。ニワトリワクチンで多用されているアジュバントの例はムラミルジペプチド、リポ多糖、数種のグルカン及びグリカン並びにＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（ホモポリマー）である。
【０１２３】
ワクチンは更に所謂「ビークル」を加えることができる。ビークルは蛋白質が共有結合せずに接着する化合物である。このようなビークルは例えばバイオマイクロカプセル、アルギン酸マイクロカプセル、リポソーム及びマクロゾルであり、いずれも当分野で公知である。
【０１２４】
抗原をビークルに部分的に埋込んだこのようなビークルの特殊形が所謂ＩＳＣＯＭ（ＥＰ  １０９．９４２，ＥＰ  １８０．５６４，ＥＰ  ２４２．３８０）である。更に、ワクチンは１種以上の適切な表面活性化合物又は乳化剤（例えばＳｐａｎ又はＴｗｅｅｎ）を添加することができる。
【０１２５】
多くの場合には、例えば易分解性蛋白質を分解から保護するため、ワクチンの保存期間を延ばすため、又は凍結乾燥効率を改善するためにワクチンを安定剤と混合する。有用な安定剤は例えばＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ５９：５０９（１９５０））、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、澱粉、スクロース、デキストラン又はグルコース）、蛋白質（例えばアルブミン又はカゼインもしくはその分解物）、及び緩衝液（例えばアルカリ金属リン酸塩）である。
【０１２６】
更に、ワクチンを生理的に許容可能な希釈剤に懸濁してもよい。言うまでもなく、他のアジュバント添加、ビークル化合物もしくは希釈剤添加、蛋白質乳化又は安定化方法も本発明で実施される。
【０１２７】
本発明の蛋白質又はその免疫原性フラグメントに基づく本発明のワクチンは動物１頭当たり蛋白質１〜１００μｇを投与すると非常に適切であるが、一般にもっと少量を使用することもできる。１００μｇを上回る用量は免疫学的には非常に適切であるが、商業的理由からあまり魅力的ではない。
【０１２８】
上記ＬＲＣ−ウイルス及び細菌等の生きた弱毒組換えキャリヤーに基づくワクチンは感染中に自己増殖するので著しく低用量を投与することができる。従って、非常に適切な量は細菌／ウイルスで夫々１０３〜１０９ＣＦＵ／ＰＦＵである。
【０１２９】
本発明のワクチンは例えば皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は粘膜表面（例えば経口又は鼻腔内）投与することができる。
【０１３０】
生きた組換えキャリヤーワクチン又はベクターワクチンは噴霧、エアゾール又は飲料水投与により最も効率的に投与することができる。
（実施例）
【実施例１】
【０１３１】
ライブラリー構築、血清及びスクリーニング。
【０１３２】
Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ血清型Ｇ株Ｏ−９５０２９  ｎｒ．１６２７９の発現ライブラリーの構築のために、Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）に記載の方法に従って１００ｒｐｍシェーカーでＴｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔブロス（ＴＨＢ）中にて２４時間３７℃で増殖させた細胞からゲノムＤＮＡを単離した。制限酵素消化により１−４ｋｂのＤＮＡフラグメントを得、λＴｒｉｐｌＥｘベクターアーム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，米国）にライゲーションした。次にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，米国）ｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングエキストラクトを使用してパッケージングを実施した。１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４と０．２％マルトースを補充したＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロスで増殖させた大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞をトランスフェクションに使用した。構築した発現ライブラリーの複雑度を試験した処、６．９であり、組換え細胞９７％を含んでいた。
【０１３３】
Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ血清型Ｇ発現ライブラリーを数種のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ血清型の完全生体に対するポリクローナル抗血清でスクリーニングした。血清型Ｂ（ＧＧＤ  １２６１株）、血清型Ｇ（Ｏ−９５０２９  ｎｒ．１６２７９株）又は血清型Ｍ（ＴＯＰ  ９８０３６  ４５００株）の生きたＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ菌を２週齢でエアゾール噴霧することによりワクチン接種したブロイラーニワトリから血清を採取した。３週間後にＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ血清型Ａ（Ｂ３２６３／９１株）でニワトリに静脈内攻撃した。攻撃から１週間後に血清を採取した。ワクチン接種した全ニワトリはワクチン接種しない対照ニワトリに比較して病状の緩和（１０％〜６０％）を示した。発現ライブラリースクリーニングで使用する前に、非特異的バックグラウンドシグナルを低減するためにＭａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）に記載されているように大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞溶解液に抗血清を吸着させた。
【０１３４】
プラーク約２０，０００個の初期スクリーニングを使用してプラークリフトにより発現ライブラリーをスクリーニングした。操作は製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，米国）のハンドブックに記載されているように実施した。全ライブラリースクリーニングは天然条件下で実施した。要約すると、いずれも１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４を補充したＬＢ寒天プレートのＬＢ上層寒天にファージ感染大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞をプレーティングした。次にプレートを４２℃で４時間インキュベートした。クローニングしたＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅインサートによりコードされる蛋白質の発現を誘導するために、１０ｍＭ  ＩＰＴＧに予め浸しておいたニトロセルロースフィルターディスク（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，ドイツ）を各プレートに載せた。３７℃で４時間インキュベーション後に全フィルターをプレートから取出した。洗浄とブロッキング後にフィルターをニワトリ抗血清（１０羽からプール、２５０倍希釈）と共にインキュベートした。最初のスクリーニングで使用した抗血清はＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ血清型Ｇの生ワクチンを接種した後にＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ血清型Ａで攻撃したニワトリから取得した。二次抗体としてウサギ抗ニワトリＩｇＧペルオキシダーゼ（Ｎｏｒｄｉｃ，Ｔｉｌｂｕｒｇ，オランダ）を１０００倍に希釈して使用した。基質溶液としてＶｅｃｔｏｒ  ＳＧ（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，米国）を使用した。
【０１３５】
プラーク２０，０００個の初期スクリーニングから、反応性プラーク２００個を寒天プレート上に確認し、単離した。上記のようなプラークリフトとスクリーニングを２回繰返した結果、純反応性シングルプラーク１７５個が得られた。次に純クローンを大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ上層寒天に２回スポットし、直径約５ｍｍのコンフルエントプラークを得た。再びプラークリフトを実施し、Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ血清型Ｂ又は血清型Ｍの生ワクチンを接種後にＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ血清型Ａで攻撃したニワトリから取得した抗血清と共にフィルターをインキュベートした。反応性プラーク１７５個から、Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ血清型Ｂ、血清型Ｇ、又は血清型Ｍの生ワクチンを接種し、Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ血清型Ａで攻撃したニワトリからの血清に対して交差反応性であるプラーク３０個を選択した。
【実施例２】
【０１３６】
抗原蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の同定と大腸菌における発現。
【０１３７】
抗原蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを同定するために、選択した３０個のプラークのＤＮＡインサートを分析した。λＴｒｉｐｌＥｘベクターアーム用に設計したオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅と配列決定の両方に使用した。ｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，米国）５０μＭ、両者プライマー１０ｐｍｏｌ、Ｓｕｐｅｒｔａｑ  ｐｌｕｓポリメラーゼ２０Ｕ／ｍｌ及び１０倍Ｓｕｐｅｒｔａｑ緩衝液（いずれもＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，英国）を水中に含有する最終反応容量５０μｌ中でＰＣＲを実施した。新たにプレーティングしたプラークを爪楊枝で釣菌し、このＤＮＡを爪楊枝から反応ミックスに移すことによりファージＤＮＡを加えた。９４℃で３分間変性後、９４℃で１分間変性、５０℃で２分間アニーリング及び６８℃で２分３０秒間伸長を３０サイクル後に６８℃で１０分間最終伸長の条件を使用した。増幅したＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を決定するために、２０μｌ反応容量中でＢｉｇ  ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅａｄｙ反応ミックス（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，ＣＡ，米国）、鋳型ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）５０ｎｇ及びプライマー２．４ｐｍｏｌを使用してシーケンス反応を実施した（９４℃１０秒；５０℃５秒；６０℃２分間を２５サイクル）。
【０１３８】
配列分析後、クローン３０個が８種の異なる遺伝子に相当すると思われた。大半のオープンリーディングフレームはλＴｒｉｐｌＥｘベクターのｌａｃＺ遺伝子との融合体であったので、この遺伝子の５’末端は欠損していた。このため、内部プライマーと鋳型としてＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ血清型Ｇの染色体ＤＮＡを使用してシーケンス反応を実施し、欠損５’ギャップを配列決定した。
【０１３９】
Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ血清型Ｇ株０−９５０２９  ｎｒ．１６２７９のゲノムＤＮＡに由来する８種の交差反応性抗原（Ｏｒ０１、Ｏｒ０２、Ｏｒ０３、Ｏｒ０４、Ｏｒ１１、Ｏｒ７７、Ｏｒ９８Ａ及びＯｒ９８Ｂ）をコードする全長オープンリーディングフレームを増幅するようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計した（表１参照）。５’オリゴヌクレオチドプライマーは制限部位（下線部）とこれに先行するＡＴＧ開始コドン（太字）と後続する該当遺伝子に由来する配列（斜体）を含む。３’オリゴヌクレオチドはコーディング配列（斜体）と後続する制限部位（下線部）を含む。ＰＣＲ産物を該当発現ベクターにクローニングした。蛋白質発現のために、ライゲーション産物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コドンＲＩＬ  ｐＬｙｓＳ宿主（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，米国）に形質転換した。ｐＥＴプラスミドベクター（ｐＥＴ２２ｂ）とＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現システム（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，米国）を使用することにより、組換え蛋白質を大腸菌で発現させ、大腸菌ｐｅｌＢリーダーペプチドを蛋白質のアミノ末端部分に融合（蛋白質Ｏｒ０２、Ｏｒ０３、Ｏｒ１１、及びＯｒ７７のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅリーダーペプチドを置換）し、カルボキシ末端に６ヒスチジン残基を融合した。ｐＥＴシステムマニュアル（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，米国）に記載されているようにＩＰＴＧ誘導中に高レベル発現のために大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）コドンＲＩＬ  ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＬ，米国）を使用した。
【実施例３】
【０１４０】
抗原の精製、ワクチン製剤化及び血清学的分析。
【０１４１】
大腸菌で発現された組換え抗原を上清から単離し（Ｏｒ７７）、ｔａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，米国）を製造業者により記載されているように使用する金属アフィニティークロマトグラフィー（Ｏｒ０３，Ｏｒ０４，Ｏｒ９８Ａ及びＯｒ９８Ｂ）、又は凍結解凍、音波処理、及び遠心サイクルの反復（Ｏｒ０１，Ｏｒ０２及びＯｒ１１）により精製した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）後にクーマシーブリリアントブルー染色を使用して組換え蛋白質の純度を評価した。ウシ血清アルブミンを標準として使用して蛋白質濃度を推定した。
【０１４２】
全精製組換え蛋白質（Ｏｒ０１，Ｏｒ０２，Ｏｒ０３，Ｏｒ０４，Ｏｒｌ１，Ｏｒ７７，Ｏｒ９８Ａ及びＯｒ９８Ｂ）を油中水エマルションに個々に製剤化した。更に、８種の組換え抗原のうちの異なる組成物を含有する５種の異なるサブユニットワクチン（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ及びＥ）を製剤化した（表２）。５種の併用ワクチンのクーマシー染色の結果、組換え蛋白質Ｏｒ０１、Ｏｒ０２及びＯｒ７７に対応するはっきり識別可能な蛋白質バンドが確認された。Ｏｒ０３、Ｏｒ０４及びＯｒ１１の分子量とＯｒ９８Ａ及びＯｒ９８Ｂの分子量はほぼ同一であるので、個々の蛋白質バンドを区別することはできなかった（図１）。全蛋白質は５０ｍｇ／抗原／ｌ（２５μｇ／用量）のほぼ等濃度で存在する。従って、ワクチンＡ〜Ｄの合計抗原含有量は２００ｍｇ／ｌである。ワクチンＥの抗原濃度は４００ｍｇ／ｌである。蛋白質バックグラウンドは組換えＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ抗原を発現させるために使用した大腸菌株に由来する残留物である。
【０１４３】
２週齢ＳＰＦブロイラーニワトリにワクチン０．５ｍｌを皮下注射することにより、各種サブユニットワクチンが体液性免疫系を刺激して蛋白質特異的抗体を産生できるかどうを試験した。ワクチン接種から４週間後に血清サンプルを採取し、組換え蛋白質に対して反応性の抗体が存在するか否かを試験した。Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．，Ｓｔａｅｈｌｉｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：４３−５０に従ってセミドライ式ウェスタンブロッティングを実施した。ワクチンの蛋白質相をブロットし、ワクチンを接種したニワトリと接種していないニワトリからプールした血清（１００倍希釈）と共にインキュベートした。８種の各ワクチンＯｒ０１〜Ｏｒ９８Ｂを接種したニワトリから得られた血清は蛋白質特異的反応性を示した（図２）。図３はサブユニットワクチンＡ〜Ｅ（表２及び図１参照）を接種したニワトリから得られた抗血清のウェスタンブロットにおける同一ワクチンに対する反応性を示す。例えば、ブロットＡはワクチンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ（レーンＡ〜Ｅに対応）を添加している。一次抗体結合に使用した血清はワクチンＡ（ブロット番号に対応）を接種したニワトリから得られたものである。このため、この血清にはα−Ｏｒ０１、α−Ｏｒ０２、α−Ｏｒ０３及びα−Ｏｒ０４抗体が存在する。ブロットＡでは、これらの４種の蛋白質はレーンＡ、Ｄ、及びＥ即ちこれらの抗原（Ａ、Ｄ、及びＥ）を含有する３種のワクチンを添加したレーンで染色される。ブロットＢはブロットＡと同様に添加し、使用した血清はワクチンＢを接種したニワトリから得られたものである。α−Ｏｒ７７、α−Ｏｒ１１、α−Ｏｒ０３、及びα−Ｏｒ０４抗体はブロットＢ上のレーンＢ、Ｃ、及びＥで対応する抗原を染色する。ワクチンＢに存在しない他の抗原はこのブロットで検出することができなかった。ワクチンＥは全８種のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ抗原を含有しているので、ブロットＥでは全蛋白質が染色される。ウェスタンブロットＦで使用した血清は負の対照として使用したワクチンを接種していないニワトリから採取したものである。この血清を使用した場合には組換えＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ抗原を検出することはできなかった。
【実施例４】
【０１４４】
防御試験
異なるサブユニットワクチン（併用ワクチンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及び単独ワクチンＯｒ７７）により誘導される抗体応答の交差防御能を評価するために、動物実験を実施した。ＳＰＦブロイラーに上記のように２週齢でワクチンを接種した。５週齢でニワトリをエアゾール噴霧によりＮＤ  ＬａＳｏｔａ（用量：１羽当たり１＊１０６Ｅ．Ｉ．Ｄ．）でプライミングした。６週齢でニワトリをＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ血清型Ａ株Ｂ３２６３／９１で攻撃した（異種攻撃）。攻撃はＴＨＢ１ｍｌ当たり８．５＊１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含有する新鮮な細菌培養液のエアゾール噴霧により実施した。エアゾール攻撃中に約１．５ｍ３のアイソレーターで商業用塗料吹き付け器を使用して細菌培養液を微細スプレーとしてニワトリに投与した。アイソレーター内で発生したミストを空気循環の遮断により少なくとも１０分間維持した。攻撃対照群とＮＤプライミング群も試験に加えた。攻撃から１週間後に７週齢でニワトリを屠殺し、呼吸器疾患に関する以下のＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅスコアリングシステムを使用して臓器病変を肉眼採点した。胸部気嚢について、０＝異状なし、１＝一方の気嚢が重度線維素性気嚢炎を発症又は両方の気嚢に線維素性浸出液の限定的帽針頭大病巣、２＝両方の気嚢が重度線維素性気嚢炎を発症；腹部気嚢について、０＝異状なし、１＝線維素性浸出液の帽針頭大病巣又は軽度びまん性線維素性気嚢炎、２＝重度線維素性気嚢炎。気嚢炎スコアは両方のスコアの和とする。肺について、０＝異状なし、１＝片側肺炎、２＝両側肺炎。平均群スコアは可能な最高スコアの百分率とする。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計分析を実施した。図４は５種の異なるサブユニットワクチンＡ〜Ｅの交差防御能を示す。攻撃対照群はワクチン接種せず、プライミングと攻撃を行なったものであり、最高スコアを示した。ワクチンＥ（全８種の抗原を含有）を接種したニワトリはワクチン接種と攻撃を行わずにニューカッスル病ウイルスでプライミングした群の結果と同等のほぼ完全な防御を示した。ワクチンＡ、Ｂ及びＣを接種したニワトリでは程度は多少劣るが、依然として有意な交差防御（Ｐ＜０．０５）を観察することができた。併用ワクチンＤは有意性の低い（ｐ＝０．１９）の交差防御を示した。未処置ニワトリは臓器病変を示さなかった。
【０１４５】
図５から明らかなように、Ｏｒ７７（＝血清型Ｇ株）ワクチンを接種し、血清型Ａで攻撃した動物もワクチンを接種しない対照群に比較して呼吸器病変の有意（ｐ＜０．０５）低下を示す。
【０１４６】
【表１】
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【０１４７】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】５種類の併用ワクチン（Ａ〜Ｅ）のクーマシー染色。各ワクチンは８種の精製組換え蛋白質の異なる組成物を含有する。サブユニットワクチンＡはレーンＡに対応し、サブユニットワクチンＢはレーンＢに対応し、サブユニットワクチンＣはレーンＣに対応し、サブユニットワクチンＤはレーンＤに対応し、サブユニットワクチンＥはレーンＥに対応する。ほぼ等しい分子量をもつ組換え蛋白質を矢印で示す。
【図２】単独組換えサブユニットワクチンを接種したニワトリから得られた１価抗血清のウェスタンブロットにおける同一蛋白質に対する反応性。反応性ワクチン蛋白質を黒い矢印で示す。
【図３】サブユニットワクチンＡ〜Ｅを接種したニワトリから得られた抗血清のウェスタンブロットにおける反応性。各ブロットにワクチンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ（レーンＡ〜Ｅに対応）の蛋白質を添加する。スクリーニングに使用した血清はワクチンＡ（ブロットＡ）、ワクチンＢ（ブロットＢ）、ワクチンＣ（ブロットＣ）、ワクチンＤ（ブロットＤ）又はワクチンＥ（ブロットＥ）を接種したニワトリから得られたものである。ウェスタンブロットＦで使用した血清はワクチンを接種していないニワトリから得られたものである。反応性ワクチン蛋白質を黒線で示す。
【図４】攻撃及びＮＤＶ対照群に比較して可能な最高呼吸器病変スコアとして表したサブユニットワクチンＡ〜Ｅの交差防御能。
【図５】攻撃及びＮＤＶ対照群に比較して可能な最高呼吸器病変スコアとして表したサブユニットワクチンＯｒ７７の交差防御能。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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