(57)【要約】    毛虫幼虫内の感染性バキュロウイルスによる封入体の生成を伴う方法と細胞培養の継代による多数のウイルス粒子の生成を伴う方法との組み合わせを用いてバキュロウイルスを生産する方法に関する。二段階方法は、最初に、毛虫幼虫内で感染性ウイルスを生産し、次に、大量の感染性バキュロウイルスを生産するために細胞培養で継代を限られた回数おこなうための接種材料として用いることによって、開発された。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
大量のバキュロウイルスを生産する方法であって、
バキュロウイルス接種材料を毛虫幼虫に接種すること、
前記接種された毛虫幼虫をインキュベートすること、
前記感染した毛虫幼虫からバキュロウイルスの封入体を収集すること、
前記封入体から封入体由来ウイルスを抽出すること、
前記封入体由来ウイルスの接種材料によって宿主昆虫細胞の培養に接種すること、
ウイルス／細胞培養をインキュベートすること、ならびに
インキュベートされたウイルス／細胞培養からバキュロウイルスを収集することを含む、大量のバキュロウイルスを生産する方法。
【請求項２】
前記ウイルス／細胞培養のインキュベーションが、好ましくはバキュロウイルスの継代を４ないし５回おこなえる期間にわたる、請求項１に記載の大量のバキュロウイルスを生産する方法。
【請求項３】
バキュロウイルスが、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）ＳＮＰＶ、
タバコガ（Helicoverpa zea）ＳＮＰＶ、
ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）ＭＮＰＶ、
大豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis）ＭＮＰＶ、
オウトグラファ・カリフォルニア（Autographa californica）ＭＮＰＶ、
アナグラファ・ファルフェラ （Anagrapha falcifera）ＭＮＰＶ、
マイマイガ（Lymantria dispar ）ＭＮＰＶ、
カイコ（Bombyx mori）ＭＮＰＶ、
シロイチモジヨトウ（Spodoptera
exigua ）ＭＮＰＶ、
イクラサギンウワバ（Trichoplusia ni）ＭＮＰＶ、
オルギア・シュードツガータ（Orgyia pseudotsugata）ＭＮＰＶ、
およびブズラ・スプレッサリア（Buzura suppressaria）ＳＮＰＶからなる群から選択されるいずれか一種から選ばれる、請求項１または２に記載の大量のバキュロウイルスを生産する方法。
【請求項４】
前記バキュロウイルスが、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）分離株である、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の大量のバキュロウイルスを生産する方法。
【請求項５】
適当な量の封入体通常株を生成するために、幼虫からバキュロウイルスを生成するステップが２つ以上存在する、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の大量のバキュロウイルスを生産する方法。
【請求項６】
封入体親株を形成するために最初のステップで幼虫からバキュロウイルスを生産し、次に前記封入体親株を用いて、封入体通常株を生成するための接種材料を提供する、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の大量のバキュロウイルスを生産する方法。
【請求項７】
前記封入体通常株が約２×１０１２個の封入体を有する一方で、前記封入体親株が約１０９個の封入体を有する、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の大量のバキュロウイルスを生産する方法。
【請求項８】
前記封入体由来ウイルス（ＯＤＶ）を、相対的に高いＭＯＩで細胞培養中にイノキュレートする、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の大量のバキュロウイルスを生産する方法。
【請求項９】
封入体由来ウイルスの接種材料が、２．５×１０１０個の少ない封入体から得られ、該接種材料を１ｍｌあたり５×１０５個の細胞を含む１０リットル・バイオリアクターに導入し、前記培養の規模を１０リットル容量（Ｐ１）から、１００リットル容量（Ｐ２）、続いて１，０００リットル（Ｐ３）、最終的には１０，０００リットル容量（Ｐ４）まで拡大することで、前記１０リットル培養で、１ｍｌあたり約１０７ＰＦＵ（バキュロウイルス）が得られ、前記１０，０００リットル培養では概算の細胞密度が１リットルあたり１．５〜２．０×１０９ＯＢ（約１５０ＯＢ／細胞）、および１リットルあたり２．５×１０１１ＯＢ（１細胞あたり約１５０ＯＢ）であり、さらに前記ＯＢは、タバコガ幼虫に対するＬＣ５０が０．２〜１．０ＯＢ／ｍｍ２である、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の大量のバキュロウイルスを生産する方法。
【請求項１０】
前記封入体由来ウイルスを、封入体の溶解させるためにアルカリを用いて抽出し、結果として生ずるウイルス粒子を適当な緩衝培地で安定化させる、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の大量のバキュロウイルスを生産する方法。
【請求項１１】
前記抽出の方法が、アルカリ溶液とＯＢ懸濁液とを混合し、該混合液をウイルス粒子が分離される温度で一定時間にわたってインキュベートし、さらにＯＶＤを安定化培地に懸濁することを含み、前記ＯＤＶがトリプシン処理を用いることなく、またＶＰＭ３培地中で血清を用いることなく抽出される、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の大量のバキュロウイルスを生産する方法。
【請求項１２】
バキュロウイルス産物であって、請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の方法によって生産されるバキュロウイルス産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バキュロウイルスの生産、具体的にはバキュロウイルスを商業的規模の量で生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バキュロウイルスは、組換えタンパク質の生産およびバイオ農薬としての使用等、種々の用途で使用されている。バキュロウイルスを商業的に使用することの問題点は、感染性のバキュロウイルスを大量に生産することが不可能であるということである。
バキュロウイルスの経済的な商業的生産は、１細胞あたり１５０ＯＢ（封入体（occlusion body））を上回るウイルス産生量を持つ少なくとも１０，０００リットルの生産が必要である（非特許文献１）。バキュロウイルス大量生産のための標準的なスケールアップ・プロセスは、凍結バキュロウイルス作業株用に十分なウイルスを得るために、細胞培養中のバキュロウイルスの継代を５回まで繰り返す必要がある。また経済的生産を達成するためには１０，０００リットル規模にまで生産プロセスの規模拡大をおこなうために、さらに６回の継代をおこなう必要がある（非特許文献２）。この標準的スケールアップ・プロセスによれば、１０，０００リットル規模での最終的なウイルス産物を得るためには、 ウイルスが連続的な継代過程で安定し、かつ依然として１細胞あたり１５０ＯＢを上回る生産を続けるものと仮定した場合、１１回の継代をおこなう。
しかし、バキュロウイルスは、自然発生的に突然変異を生じてＦＰ（少ない多角体（few polyhedra））突然変異体またはＤＩＰ（干渉粒子欠損（defective interfering particles）突然変異体を形成するように思われることから、細胞培養での連続的な継代中、安定ではない。ＦＰ突然変異体は、 ウイルス・ゲノムの２５ＫＦＰ遺伝子で自然突然変異が生ずることから、 細胞培養中に急激に集積する。ＨａＳＮＰＶに関しては、ＦＰ突然変異があまりにも急速なので６回の継代でウイルスの全個体数がＦＰ突然変異体から構成される。収率は、１細胞あたり１０ＯＢ未満であり、生産されたＯＢは生物学的活性を持たなかった（非特許文献３）。同様に、ＤＩＰもまた、細胞培養で高ＭＯＩを持つバキュロウイルスの連続した継代の過程で急速に集積することができる。ＡｃＭＮＰＶ感染のＤＩＰは、１細胞あたり１０ＰＦＵのＭＯＩを使用した場合に、継代数４という早さで検出された。ＤＩＰは、ウイルス・ゲノムに生じた大きな欠失の結果である。ＤＩＰは、複製のための「ヘルパー・ウイルス」（野生型ウイルス）である（非特許文献４）。これらの突然変異が生ずることによって、ウイルス接種から大規模生産に至る間に問題が生ずる。
ＨａＳＮＰＶの連続的な継代中に生ずるＦＰ突然変異は、ＤＩＰの出現よりも生産プロセスの規模拡大に対して、より大きな驚異を有する。ＦＰ突然変異は、ＭＯＩにかかわらず、ＤＩＰよりも速く、かつ早期に生ずる。
培養細胞中では、感染性ＯＢに関する選択圧はいっさい現れていない。ＦＰ突然変異体感染細胞は、ＭＰ（多くの多角体（many polyhedra））より多くのバキュロウイルスを発生させる。幼虫体内では、細胞培養中とは異なり、感染性ＯＢが他の幼虫に感染したバキュロウイルスの形態であることに選択的利点を有する（非特許文献５）。
連続的な継代は、大量のバキュロウイルスを生産すると思われるけれども、該ウイルスは感染性ではない。毛虫幼虫から大量のウイルスを生産することは、数多くの幼虫を必要とし、またウイルスを単離するのに必要なその後の大規模な精製が困難であるということから、現実的ではない。大量生産中の各継代後に封入体から封入体由来ウイルスを抽出する方法もまた、技術的に困難であり、現実的ではない。そのことは、プロセス全体にわたって無菌性を維持する一方で、各継代後に封入体を細胞から抽出して濃縮するために必要である。
現時点では、感染性バキュロウイルスを商業的に大量に、経済的に生産する方法は存在しない。
【０００３】
本発明の目的は、大量のバキュロウイルスを生産する別の方法を提供することである。
【０００４】
【非特許文献１】グリーンフィールド（Greenfield）、Ｐ．Ｆ．、レイド（Reid），Ｓ．、ワイス（Weiss）、Ｓ．、およびスコルツ（Scholz）、Ｂ．（１９９９）。生物農薬としてのバキュロウイルス：研究、生産、および商業上の問題（ Baculoviruses as biologicalcontrol agents: research, production and commercial issues）。 第５回アジア太平洋生物化学会議議事録（ The 5th Asia-PacificBiochemical Engineering Conference Proceedings）、タイ・プーケット。
【非特許文献２】ロデス（Rhodes）、Ｄ．Ｊ，（１９９６）。バキュロウイルス・昆虫生産システムの経済学（Economics of Baculovirus-insectcell production systems）。細胞検査（Cytotechnology）２０，２９１−２９７。
【非特許文献３】ルア（Lua）、Ｌ．Ｈ．、ペドリニ（Pedrini）、Ｍ．、レイド（Reid）、Ｓ．、ロバートソン（Robertson）、Ａ、およびトリベ（Tribe）、Ｄ．Ｅ．（２００２））。細胞培養で連続的に継代したオオタバコガ核多角体病ウイルスの表現型および遺伝子型分析（Phenotypic and genotypic analysis of Heficoverpaarmigera nucleopolyhedrovirus serially passaged in cell culture。一般ウイルス学雑誌（ Journal of General Virology）８３、９４７−９５７。
【非特許文献４】ピジルマン（Pijilman）、Ｇ．Ｐ，、バン・デン・ボム（van den Bom）、Ｅ、マーテンズ（Martens）、Ｄ，Ｅ．、およびブラク（Vlak）、Ｊ．Ｍ．（２００１）。大きなゲノム欠失を持つオウトグラファ・カリフォルニア・バキュロウイルスは、感染昆虫細胞内で急速に生ずる（Autographa californica baculoviruses with large genomic deletionsare rapidly generated in infected insect cells。ウイルス学（Virology）２８３、１３２−１３８。
【非特許文献５】ポッター（Potter）、Ｋ．Ｎ．、ジャクス（Jaques）、Ｒ．Ｐ．およびファウルクナー（Faulkner）、Ｐ．（１９７８）。生体内（in vivo）で継代したイクラサギンウワバ核多角体病ウイルスの改変（Modification of Trichoplusia ninuclear polyhedrosis virus passaged in vivo）。インターバイロロジー（Intervirology）９，７６−８５。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、商業的量の感染性バキュロウイルスＯＢを生産する必要性によって、想到され、かつ実施に至った。本発明は、毛虫幼虫での感染性バキュロウイルスによる封入体の生産および細胞培養での連続的継代による大量のウイルス粒子の生産という利点を確認することで、想到された。次に、二段階方法は、最初に、毛虫幼虫内で感染性ウイルスを生産し、次に、大量の感染性バキュロウイルスを生産するために細胞培養で継代を限られた回数おこなうための接種材料として用いることによって、開発された。
一態様では、本発明は大量のバキュロウイルスを生産する方法に関するもので、該方法は、
バキュロウイルス接種材料を毛虫幼虫に接種すること、
接種された毛虫幼虫をインキュベートすること、
感染した毛虫幼虫からバキュロウイルス封入体を収集すること、
封入体から封入体由来ウイルスを抽出すること、
封入体由来ウイルスからなる接種材料によって宿主昆虫細胞の培養に接種すること、
ウイルス／細胞培養をインキュベートすること、ならびに
インキュベートされたウイルス／細胞培養からバキュロウイルスを収集すること、を含む。
ウイルス／細胞培養のインキュベーションは、好ましくはバキュロウイルスの継代を４ないし５回おこなえる期間にわたる。
バキュロウイルスは、異なるバキュロウイルス種（例えば、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）ＳＮＰＶ、タバコガ（Helicoverpa zea）ＳＮＰＶ、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）ＭＮＰＶ、大豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis）ＭＮＰＶ、オウトグラファ・カリフォルニア（Autographa californica）ＭＮＰＶ、アナグラファ・ファルフェラ （Anagrapha falcifera）ＭＮＰＶ、マイマイガ（Lymantria dispar ）ＭＮＰＶ、カイコ（Bombyx mori）ＭＮＰＶ、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua ）ＭＮＰＶ、イクラサギンウワバ（Trichoplusia ni）ＭＮＰＶ、オルギア・シュードツガータ（Orgyia
pseudotsugata）ＭＮＰＶ、およびブズラ・スプレッサリア（Buzura
suppressaria）ＳＮＰＶが挙げられる）を包含する総括的な用語として、本明細書中に使用される。好ましいバキュロウイルスは、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）分離株である。好ましいオオタバコガ（Helicoverpa armigera）分離株は、Ｈ２５ＥＡ１株である。
元になるバキュロウイルス接種材料は、幼虫または細胞培養から得た封入体を含む任意の適当な供給源に由来するものであってもよい。
適当な量の封入体通常株（working stock）を生成するために、幼虫からバキュロウイルスを生産するステップが２つ以上あってもよい。
好ましい一形態では、封入体親株（master stock）を形成するために最初のステップで幼虫からバキュロウイルスを生産してもよい。
次に、封入体親株を用いて、封入体通常株を生成するための接種材料を提供することが可能である。好ましい形態では、封入体通常株が約２×１０１２個の封入体を有する一方で、封入体親株は約１０９個の封入体を有する。親株および通常株の両方を４℃または凍結して保存してもよい。
好ましくは、封入体由来ウイルス（ＯＤＶ）を、相対的に高いＭＯＩで細胞培養中にイノキュレートする。好ましい実施形態では、封入体由来の接種材料は、２．５×１０１０個という少ない封入体から得られ、１ｍｌあたり５×１０５個の細胞を含む１０リットル・バイオリアクターに導入される。この培養は、１０リットル容量（Ｐ１）から、１００リットル容量（Ｐ２）、続いて１，０００リットル（Ｐ３）、最終的には１０，０００リットル容量（Ｐ４）まで規模が拡大される。１０リットル培養で、１ｍｌあたり約１０７ＰＦＵ（バキュロウイルス）が得られる。１０，０００リットル培養では、好ましくは概算の細胞密度が１リットルあたり１．５〜２．０×１０１１ＯＢである（約１５０ＯＢ／細胞）。ＯＢは、タバコガ幼虫に対するＬＣ５０が０．２〜１．０ＯＢ／ｍｍ２である。
通常株から誘導された封入体の抽出は、任意の適当な方法によっておこなうことが可能である。好ましくは、封入体を溶解させるためにアルカリを用いることで、封入体由来ウイルスの抽出をおこない、結果として生ずるウイルス粒子を適当な緩衝培地で安定化させる。好ましい抽出方法は、アルカリ溶液とＯＢ懸濁液とを混合し、この混合液をウイルス粒子が分離される温度で一定時間にわたってインキュベートすることを含む。次に、好ましくは、ＯＶＤを安定化培地、好ましくはＶＰＭ３（図２に開示）に懸濁する。好ましくは、酸による中和ステップは含まれない。好ましいＯＤＶ抽出方法は、以下に概説されるＶＰＭ３抽出方法である。このＶＰＭ３抽出方法は、トリプシン処理が用いられないことおよびＶＰＭ３培地が血清を含まないという利点を有することから、この方法は従来の方法に比べて経済的であり、したがって大規模の商業的生産によりいっそう適している。
本発明の別の態様は、概して、上記方法により生産されたバキュロウイルス製品に関する。バキュロウイルス製品は、感染性バキュロウイルスの量が約２．５×１０１５ＯＢで、タバコガ亜種幼虫に対するＬＣ５０が０．２〜１．０ＯＢ／ｍｍ２であることを特徴とする。このような感染性バキュロウイルスの量は、単一の生体外（in vitro）生産方法によっていままで得ることはできなかった。別の利点として、このような感染性バキュロウイルスの量は、経済的に生産可能である。
結果として得られるバキュロウイルスを、生物農薬等、種々の目的に使用することができる。例として、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）ＯＢを５×１０１１ないし５×１０１２ＯＢ／Ｈａで作物に適用することで、オオタバコガ（Ｈ．armigera）害虫駆除を確実におこなうことができる。
【０００６】
（図面の簡単な説明）
本発明がより容易に理解されて実質的な効果が得られるように、ここで添付図面を参照する。
図１は、バキュロウイルスを大量に生産する方法を示す図である。
図２は、好ましい実施形態の抽出安定化培地ＶＰＭ３の処方を示す。
図３は、抽出に用いたＯＢ数と継代４回目で得られたＯＢ／細胞とを比較する。
図４は、２つの試料（フラスコＡおよびＢ）を用いて４回の継代にわたるＯＢ収量を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
大量のバキュロウイルスを生産する方法の好ましい実施形態は、最初にウイルスを毛虫幼虫で生産し、次に毛虫幼虫から誘導した封入体を用いて細胞培養をイノキュレートして細胞培養の連続的継代を限られた回数にする２段階のプロセスを伴う（図１参照）。
この方法は、最初に毛虫幼虫の封入体のマスターおよび通常株を調製することを含む。毛虫ＯＢのマスターおよび通常株は、それぞれ大きなオオタバコガ（Helicoverpa armigera）幼虫に約１，０００ＯＢ供給することで調製される。幼虫の死亡（感染後６日から１０日目）により、それらを収集して４℃で保存する。１回のランあたり２．５×１０１０ＯＢが必要であり、１匹の幼虫あたり約１．７×１０１０ＯＢが生産されることから、１０リットル（継代数１）接種材料に約１．５〜２匹の幼虫が必要である。十分な数の死んだ毛虫をプールした後、それらをＳＤＳ（３０分、０．５％最終濃度）よる抽出、ホモゲナイズ（ブレンダー・プロセス）、濾過（チーズクロス）、遠心沈降をおこない、さらに水に懸濁（１０１０ＯＢ／ｍｌ）する。水洗いを数回実施して過剰な残骸が取り除かれるのを助ける。ＯＢ懸濁液を冷蔵または凍結保存することができる。
【０００８】
ＯＢは、ＶＰＭ３抽出方法を用いて抽出される。この方法は、４０μｌのアルカリ溶液（０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３、１Ｍ  ＮａＣｌ）を０．７ｍｌの各ＯＢ懸濁液（１０１０ＯＢ／ｍｌ）に対して添加するステップを含むもので、この混合物を十分に混合して、２８℃で３０分間インキュベートする。次に、抽出したＯＢの各々０．７４ｍｌ（ＶＰＭ３の処方については図２を参照せよ）について、インキュベートしたＯＢ混合物を１０ｍｌのＶＰＭ３培地で希釈する。次に、希釈したＯＢ懸濁液を０．２２μｍフィルターによって濾過滅菌する。次に、結果として得られたＯＤＶ懸濁液を接種材料として用いる。
【０００９】
図３は、抽出に用いた１細胞あたりのＯＢの収量および継代数４で得られた１細胞あたりのＯＢの収量の例を示す。
約２．５×１０１０ＯＢは、１０リットル培養（５×１０５細胞／ｍｌ）を感染させるために接種材料として使用するのに十分なＯＤＶの生産に、必要である。
バキュロウイルスを接種した１０リットル培養をバイオリアクターで、２８℃で約３日間にわたって好気的にインキュベートした。このインキュベーションは、継代数１である。継代数２、３、および４がそれぞれ１００リットル、１，０００リットル、および１０，０００リットルとなるように、発酵の規模を徐々に拡大した。すべてのインキュベーションを２８℃で約２日間（しかし、最終のインキュベーションは１０〜１５日間）にわたり、通気させておこなった。
１０，０００リットル培養は、細胞密度が１リットルあたあり約１．５ないし２．０×１０９細胞であり、また１リットルあたり２．５×１０１１ＯＢ（１細胞あたり約１５０ＯＢ）である。ＯＢは、タバコガ亜種（Helicoverpa spp）毛虫に対するＬＣ５０が０．２ないし１．０ＯＢ／ｍｍ２であった。
【００１０】
図４に示す別の実験では、１０１１ＯＢを首尾よく抽出および濾過した。濾過滅菌抽出液をサンプリングして、同一の２つの１００ｍｌ培養（フラスコＡおよびフラスコＢ）に感染させた。継代数４の後のＯＢ収量（１０，０００リットル培養）は相対的に高く、フラスコＡおよびＢから得られた１細胞あたりそれぞれ２６３および２３９ＯＢであった。
【００１１】
バリエイション
上述のことがこの発明を説明するための例として挙げられた一方で、そのようなものならびに他の修飾および変化は、この明細書で説明されるように、この発明の広い範囲および境界内にあることを当業者が理解すると考える。
説明および特許請求の範囲を通して、この明細書では、「含む（comprise）」という言葉およびその言葉の変化したもの、例えば「含む（comprises）」および「含んでいる（comprising）」は、他の添加物、構成要素、整数、またはステップを排除することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】バキュロウイルスを大量に生産する方法を示す図である。
【図２−１】好ましい実施形態の抽出安定化培地ＶＰＭ３の処方を示す。
【図２−２】好ましい実施形態の抽出安定化培地ＶＰＭ３の処方を示す。
【図３】抽出に用いたＯＢ数と継代数４で得られたＯＢ／細胞とを比較する。
【図４】２つの試料（フラスコＡおよびＢ）を用いて４回を超える継代でのＯＢ収量を示す。
【図１】
2007510418.tif 000002
【図２−１】
2007510418.tif 000003
【図２−２】
2007510418.tif 000004
【図３】
2007510418.tif 000005
【図４】
2007510418.tif 000006
【国際調査報告】
2007510418.tif 000007
2007510418.tif 000008