(57)【要約】  パリエタリアジュダイカの主要アレルゲンParj1またはParj2のいずれかの配列を実質的に有する少なくとも1つの第1のアミノ酸配列、およびパリエタリアジュダイカの主要アレルゲンParj1またはParj2のいずれかの配列を実質的に有する第2のアミノ酸配列、ならびにパリエタリアジュダイカの主要アレルゲンParj1またはParj2のいずれかの第3の配列を含む、多量体タンパク質分子。この分子はまた、ループ1に対応するアミノ酸領域において突然変異しており、したがって低アレルギー性である。この分子は、低アレルギー性物質として医療に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パリエタリアジュダイカの主要アレルゲンParj1またはParj2のいずれかの配列を実質的に有する少なくとも1つの第1のアミノ酸配列、およびパリエタリアジュダイカの主要アレルゲンParj1またはParj2のいずれかの配列を実質的に有する第2のアミノ酸配列を含む多量体タンパク質分子。
【請求項２】
パリエタリアジュダイカの主要アレルゲンParj1またはParj2のいずれかの少なくとも1つの第3の配列をさらに含む、請求項1に記載の多量体タンパク質分子。
【請求項３】
主要アレルゲンParj1の配列が実質的に配列番号1の配列であり、主要アレルゲンParj2の配列が実質的に配列番号3の配列である、請求項1または2に記載の多量体タンパク質分子。
【請求項４】
パリエタリアジュダイカの主要アレルゲンParj1および/または主要アレルゲンParj2の配列がループ1のアミノ酸領域中で突然変異しており、配列番号1および/または配列番号3のアミノ酸1〜30を実質的に含む、請求項1または2に記載の多量体タンパク質分子。
【請求項５】
突然変異した主要アレルゲンParj1の配列が実質的に配列番号2の配列である、請求項4に記載の多量体タンパク質分子。
【請求項６】
突然変異した主要アレルゲンParj2の配列が実質的に配列番号4の配列である、請求項4に記載の多量体タンパク質分子。
【請求項７】
突然変異した主要アレルゲンParj1の配列が実質的に配列番号2の配列であり、突然変異した主要アレルゲンParj2の配列が実質的に配列番号4の配列である、請求項4に記載の多量体タンパク質分子。
【請求項８】
請求項1から7のいずれか一項に記載の多量体タンパク質分子をコードする核酸。
【請求項９】
適切な転写プロモーター系の制御下において請求項8に記載の核酸を含む、原核細胞中での発現用の組換えベクター。
【請求項１０】
適切な転写プロモーター系の制御下において請求項8に記載の核酸を含む、真核細胞中での発現用の組換えベクター。
【請求項１１】
医療に使用するための、請求項1から7のいずれか一項に記載の多量体タンパク質分子。
【請求項１２】
低アレルギー性物質として医療に使用するための、請求項1から7の一項に記載の多量体タンパク質分子。
【請求項１３】
有効かつ許容可能な量の請求項1から7のいずれか一項に記載の多量体タンパク質分子ならびに適切なアジュバントおよび/または希釈剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パリエタリアジュダイカ(Parietaria judaica)の主要アレルゲンに由来する低アレルギー性タンパク質分子、その使用および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
I型過敏症反応としても知られるアレルギー性反応は、動物の鱗屑、埃ダニおよび花粉中に存在する通常有害な環境中の抗原に対するIgE仲介の応答によって引き起こされる。症状には蕁麻疹および皮膚の発疹、鼻結膜炎、呼吸困難、ならびに喘息およびアナフィラキシーなどの他のさらに重度の状態がある。
【０００３】
過敏症が抗原との最初の接触で現れることはなく、それは感作の初期後に出現する。このプロセスは、その主な役割が抗原を捕えそれを小さな断片に消化し、次いでそれらの断片を特定の糖タンパク質、すなわち主要組織適合性(MHC)抗原クラスIIと結合した細胞膜表面上に提示することである抗原提示細胞(APC)と、アレルゲンが接触すると誘発される。
【０００４】
呼吸アレルギーは、それらが出現する年季に応じて季節性または通年性として分類することができる。季節性の呼吸アレルギーでは、障害を引き起こすアレルゲンは、主として春に咲く植物の花粉中に存在する。大気中に浮遊する花粉が吸入され呼吸管の粘膜に達し、そこで花粉周囲の保護外皮が粘膜分泌液中に存在する酵素および水分によって溶かされ、それによって外皮中に含まれるタンパク質が放出される。
【０００５】
最も一般的なアレルギー性植物種はいくつかの大きな科、すなわちブナ、イラクサ、モクセイ、キクおよびイネ科に属する。イタリアの大陸側では、イネ科がアレルギー性反応の主な原因であり、一方地中海領域では、主なアレルギー性植物はパリエタリアジュダイカ(Pj)である。Parietaria属はイラクサ科に属し、アレルギーの重要性によってランク付けされる5種を含み、それらはP.judaica、P.officinalis、P.lusitanica、P.creticaおよびP.mauritanicaである(1)。生化学的方法(CIEおよびCRIE)を使用する初期の実験研究は、Pjの花粉は、分子量およびIgEとの結合能力が異なる多数のアレルゲンを含むことを示した。アレルゲンの分子量の範囲は10〜80kDaであり、10〜14kDaの分子量を有するアレルゲンはアレルギー性被験体の全血清と反応し、主要アレルゲンをこの範囲で見ることができることが示唆される(2、3)。発現ライブラリーから始まり、Pjの主要アレルゲンを単離するための組換えDNA技法は、主要アレルゲン、Parj1およびParj2、ならびにいくつかのそれらのイソ型の単離および特徴付けを可能にした(4)。Parj1からは、Parj1.0102およびParj1.0201で表す2つの変異体を単離した。Parj1.0102は794ヌクレオチドの挿入体、18.450Daの分子量を有する176のアミノ酸を含む推定アミノ酸配列を有する。NH2末端配列は、グリコシル化タンパク質シグナル配列の特徴的なアミノ酸配列を有する。成熟タンパク質は、139のアミノ酸および14.476Daの分子量を有する(図1、パネルa)。Parj1.0102クローンの配列分析は、637ヌクレオチドの挿入体、139アミノ酸のアミノ酸配列、および14.400Daの分子量を示した。それはシグナル配列特性を有するアミノ末端領域も含む。成熟タンパク質は102のアミノ酸を含み、10.677Daの分子量を有する。アミノ酸レベルでは、Parj1.0201のコード領域はParj1.0102のコード領域と89%相同であるが、3'および5'非翻訳領域の相同性の欠如は、2つのクローンが別個の遺伝子の転写に由来することを示唆する。特にParj1.201は、Parj1.0102の短い変異体であると考えることができる(5、6)。
【０００６】
cDNA遺伝子ライブラリーから単離したParj2のクローンは、133アミノ酸の正確なリーディングフレームおよび31アミノ酸のシグナルペプチドを有する622ntの挿入体を含む。成熟タンパク質は102のアミノ酸を含み、11.344Daの分子量を有する(図1、パネルC)。アミノ酸レベルでは、それはParj1と45%の相同性を示し主要アレルゲンでもある。何故ならそれは、アレルギー性被験体のほぼすべての血清と反応するからである(7)。それらの構造相同性にもかかわらず、交差反応性の実験によって実証されたように、Parj1とParj2は2つの別個のアレルゲンである(7)。さらに、アレルギー性被験体由来の血清のプールを組換えアレルゲンParj1およびParj2と共にプレインキュベートすると、Pj花粉の10〜14kDa領域中のIgE結合が完全に阻害され、これら2つのアレルゲンのみがこの領域中に存在し、さらにそれらはPjアレルゲンに対する特異的IgEの大部分を阻害することができることが示唆される(7)。
【０００７】
さらに、EMBLデータバンクの調査によって、Parj1およびParj2は、細胞膜を越えて脂質分子を輸送することができる非特異的脂質輸送タンパク質(ns-LTP)として知られる、タンパク質のファミリーに属することが明らかになった。これらのタンパク質は、充分に保存されたα-α-α-α-β二次構造を有する4個のジスルフィド架橋(図2)を形成することができる8個のシステインの存在などの、多数の特徴を共有する(8)。
【０００８】
Parj1はns-LTPのすべての特徴を示すので、参照としてダイズns-LTPの結晶を使用して構造モデルを構築した。このモデルによれば、Parj1およびParj2は、4-52、14-29、30-75、50-91の順で4個のスルフィド架橋を示す。さらに、部位特定突然変異誘発戦略を施すことによって、IgEエピトープの形成におけるジスルフィド架橋、およびアミノ酸1〜30のループ1領域中の主要エピトープの存在の重要性を我々は実証した(図3および[8])。
【０００９】
アレルギー症状は薬理学的に治療することができるが、唯一の予防療法は、希釈量のアレルゲンを皮下に投与してアレルゲンに対する特異的反応性を抑える、特異的免疫療法(SIT)である(9)。しかしながら、最も市販されているタンパク質抽出物は粗製抽出物、標準化するのが困難である多数のアレルギー性要素の混合物である。
【００１０】
さらにこのような戦略は、患者がそれに対して感受性がないアレルギー性要素を投与して、それによって抽出物中の他の要素に対して特異的なIgEを生成することを誘導することを含むことができる(10)。さらに、アレルゲンをそのまま投与することには、アナフィラキシーショックを引き起こす可能性もある副作用の危険がある。これらの欠点を排除するための、主な目的の1つは、少ない副作用を有する他の分子、すなわちIgEと相互作用しない分子を特徴付けし開発することである。アナフィラキシーの低い危険性を有する分子を作製するための試みにおける本来のアレルゲンの修飾は、Marchらによって提案されており、彼らは粗製抽出物とホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドの重合を示唆した(11)。臨床試験はこれらの修飾分子の有効性を実証したが、これらの修飾分子は、抽出物を正確に標準化することの難点に関して前に記載した、あらゆる欠点を依然として有していた。しかしながら、アレルゲンを遺伝的に改変する可能性は、このような分子のヌクレオチド配列、したがってアミノ酸配列の知識のためにさらに信頼できる解決策となり、完全に再生可能な純粋な形の突然変異したタンパク質の生成を可能にする。
【００１１】
WO02/20790は、ジスルフィド架橋を形成する低い能力を有する本発明のアレルゲンが属する、ns-LTPアレルゲンのファミリーの変異体に関する。
【００１２】
WO02/22674は、リシン残基が置換されているかあるいは欠失している主要アレルゲンParj2の低アレルギー性変異体に関する。
【００１３】
しかしながら、従来技術の2つの文献は特定のアレルゲンの変異体に関するものであり、1つの低アレルギー性基準として有利に使用することができる、一種のアレルゲンおよび/または異なるアレルゲンに由来する領域の多量体を含むように工学処理された分子は生み出さない。
【特許文献１】WO02/20790
【特許文献２】WO02/22674
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって本発明の目的は、パリエタリアジュダイカの主要アレルゲンParj1またはParj2のいずれかの配列を実質的に有する少なくとも1つの第1のアミノ酸配列、およびパリエタリアジュダイカの主要アレルゲンParj1またはParj2のいずれかの配列を実質的に有する第2のアミノ酸配列を含む、多量体タンパク質分子である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
好ましい実施形態では、本発明の多量体タンパク質分子は、パリエタリアジュダイカの主要アレルゲンParj1またはParj2のいずれかの少なくとも1つの第3の配列も含む。
【００１６】
好ましい実施形態では、主要アレルゲンParj1の配列が実質的に配列番号1の配列であり、主要アレルゲンParj2の配列が実質的に配列番号3の配列である。
【００１７】
好ましい実施形態では、パリエタリアジュダイカの主要アレルゲンParj1および/または主要アレルゲンParj2の配列がループ1のアミノ酸領域中で突然変異しており、配列番号1および/または配列番号3のアミノ酸1〜30を実質的に含む。好ましくは、突然変異した主要アレルゲンParj1の配列は実質的に配列番号2の配列であり、好ましくは、突然変異した主要アレルゲンParj2の配列が実質的に配列番号4の配列である。より好ましくは、突然変異した主要アレルゲンParj1の配列は実質的に配列番号2の配列であり、突然変異した主要アレルゲンParj2の配列は実質的に配列番号4の配列である。
【００１８】
本発明の他の目的は、本発明の多量体タンパク質分子をコードする核酸である。
【００１９】
本発明の他の目的は、適切な転写プロモーター系の制御下において本発明の核酸を含む、原核細胞中での発現用の組換えベクターである。
【００２０】
本発明の他の目的は、適切な転写プロモーター系の制御下において本発明の核酸を含む、真核細胞中での発現用の組換えベクターである。
【００２１】
本発明の他の目的は、好ましくは低アレルギー性物質として医療に使用するための、本発明の多量体タンパク質分子である。
【００２２】
本発明の他の目的は、有効かつ許容可能な量の本発明の多量体タンパク質分子ならびに適切なアジュバントおよび/または希釈剤を含む医薬組成物である。
【００２３】
以下の図面を参照しながら非制限的な例で、本発明を以下に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
物質および方法
野生型Parj1およびParj2のクローニングおよび発現
Pjの主要アレルゲンParj1を生成するために、pQE30原核生物ベクター(Qiagen)を使用した。このベクターは、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)によって誘導的な方法で、短いヒスチジン尾部と融合した組換えタンパク質を発現することができる。ヒスチジン残基は、親和性クロマトグラフィーによる組換えタンパク質の精製を可能にする。処理型Parj1(EMBL受託番号X77414)を含むP5クローンに、条件:94℃で1分間、52℃で1分間、72℃で1分間、30サイクルの下でDNAポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の1サイクルを施した。使用した合成オリゴヌクレオチドは以下のものであった:
【化１】
2007535904.tif 000002
(太字はこのプロセスで使用した制限酵素配列を示す)。主要アレルゲンParj2は、オリゴヌクレオチドおよび鋳型以外は、Parj1に関して記載したのと同じベクターおよび同じ方法を使用して作製した。この目的のために、P2クローン(EMBL受託番号X95865)およびオリゴヌクレオチドの塩基配列を決定するための鋳型は以下のものであった:
【化２】
2007535904.tif 000003
(太字はこのプロセスで使用した制限酵素配列を示す)。
【００２５】
次いで作製した断片を1%アガロースゲル上1×TBE中に分別し、ゲルから抽出し、精製し、BamHIおよびHindIII制限酵素で消化した。pQE30ベクターは同じ制限酵素を使用して消化した。直鎖状ベクターおよび消化断片は、さまざまな化学両論比に従いDNAリガーゼ酵素の存在下において16℃で4時間インキュベートした。この反応混合物を使用して、細菌菌株M15を形質転換した。組換えクローンを単離し、サンガー法を使用してプラスミドDNAの塩基配列を決定した。生成したヌクレオチド配列は、pQE30ベクター中に挿入したDNA断片が、我々が以前に公開した結果と同一であったことを示した。
【００２６】
Parj1およびParj2ループ1突然変異体の構築
Parj1およびParj2の点突然変異体を、これらのアレルゲンの野生型バージョンをコードする前に記載したcDNAを、鋳型として使用してPCRによって作製した。特に、Pj1ループクローン用に、以下のオリゴヌクレオチドを使用して:
【化３】
2007535904.tif 000004
Parj1の第1の30アミノ酸末端をコードするDNA断片を合成し、その中でアミノ酸Lys23、G1u24、Lys27は中性アラニンアミノ酸に置換されていた。生成したDNA断片を、次いでそれぞれ制限酵素BamHIおよびPstIを用いて5'および3'において消化し、同じ制限酵素を用いて消化したPj1発現ベクター中にインフレームで導入した(太字はクローニング用に使用した制限酵素部位を示し;小文字は突然変異誘発用の置換ヌクレオチドを示す;アミノ酸の番号および位置に関しては、図1、パネルBおよび図3、図4を参照のこと)。
【００２７】
以下のヌクレオチドをPj2ループクローン用に使用して:
【化４】
2007535904.tif 000005
Parj2アミノ酸末端の第1の30アミノ酸をコードするDNA断片を合成し、その中でアミノ酸Lys23、G1u24、Lys27は中性アラニンアミノ酸に置換されていた。生成したDNA断片を、次いでそれぞれ制限酵素BamHIおよびPstIを用いて5'および3'において消化し、同じ制限酵素を用いて消化したPj2発現ベクター中に導入した(太字はクローニング用に使用した制限酵素部位を示し;小文字は突然変異誘発用の置換ヌクレオチドを示す;アミノ酸の番号および位置に関しては、図1、パネルEおよび図3、図4を参照のこと)。
【００２８】
野生型Parj1およびParj2ならびにループ1領域の突然変異形に関する遺伝情報を含む二量体分子の構築
主要アレルゲンParj1およびParj2に関する遺伝情報を含むヘテロ二量体分子を構築するために、合成オリゴヌクレオチド:
【化５】
2007535904.tif 000006
およびPj2クローンを鋳型として使用して、同じPCR条件下:94℃で1分間、52℃で1分間、72℃で1分間、30サイクルで、野生型Parj2配列を含むDNA断片を最初に作製した。生成した断片を次いで精製し、BamHI制限酵素を用いて消化し、同じ制限酵素を用いて事前に消化したPj1プラスミド中に挿入した。正確な方向に挿入されたParj2断片のコピーを含む組換えプラスミドを単離し、安定した組換え多量体タンパク質(二量体Parj2-Parj1)(図4、PjEDクローン)を発現するそれらの能力に関してアッセイした。断片のクローニング用に使用する制限部位を導入することによって、2つのアミノ酸(GおよびS)を、正確なリーディングフレームを変えずに接合部位のレベルで導入した。
【００２９】
Parj1およびループ1領域で突然変異誘発したParj1アレルゲンのそれぞれのコピーを含むヘテロ二量体を、Parj1-Parj2ヘテロ二量体の形成に関して記載したのと同一のPCR戦略を使用し、PCRに使用した鋳型のみを変えて作製した。詳細には、Pj2ループクローンを、Pj2正方向およびPj2逆方向オリゴヌクレオチドを使用して増幅させた。生成した断片を次いで精製し、BamHI制限酵素を用いて消化し、同じ制限酵素を用いて事前に消化したPj1ループプラスミド中に挿入した。正確な方向に挿入されたPj2ループ断片のコピーを含む組換えプラスミドを単離し、安定した組換え二量体(いずれもループ1領域で突然変異したParj2-Parj1二量体)(図3および図4[PjEDmutクローン])を発現するそれらの能力に関してアッセイした。断片のクローニング用の制限部位を導入することによって、2つのアミノ酸(GおよびS)を、正確なリーディングフレームを変えない接合部位のレベルで導入した(図4のヘテロ二量体)。
【００３０】
多量体Parj2分子および2つの主要アレルゲンを含むヘテロ二量体の構築
Parj2三量体を構築するために、プラスミドベクターpQE31、Parj2組換えタンパク質をコードするDNA、および大腸菌のXLIblue細菌菌株を使用した。4つの制限エンドヌクレアーゼBamHI、SacI、SalIおよびHindIIIを使用した。
【００３１】
配列自体を変えずにParj2のDNA配列の境界に制限酵素部位を挿入するために、Parj2のDNAを以下のプライマー:
【化６】
2007535904.tif 000007
を使用して以下の条件:94℃で1分間、52℃で1分間、72℃で1分間、30サイクルの下でPCRによって増幅させた(太字は制限酵素部位を示す)。
【００３２】
第1のParj2モノマーを含む組換えプラスミドを構築するために、直接BamHIおよび逆方向SacIプライマーを使用して、Parj2抗原に関する遺伝情報を含むcDNAを増幅させた。このようにして、Parj2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を破壊せずにPCR産物を消化した。次いで消化したDNAを、同じ酵素で消化したpQE3Iベクターと正確なリーディングフレームで結合させた。
【００３３】
生成した組換えプラスミドを次いで使用して、細菌菌株XLlblueを形質転換した;IPTGを用いて誘導した陽性クローンをウェスタンブロット分析、および組換えタンパク質中に存在する6個のヒスチジン残基を認識するHis-プローブとのハイブリダイゼーションによってアッセイした。クローニングの正確さは、組換えプラスミドDNAの塩基配列を決定することによって確認した。
【００３４】
二量体クローンを構築するために、プラスミド構築体をSacIおよびSalI酵素を用いて消化した。次いで直鎖状プラスミドを、直接SacIおよび逆方向SalIプライマーを使用したPCRによる増幅後に、Parj2アレルゲンを含むDNA断片と共にインキュベートした。組換えクローンを前に記載したのと同様に分析し調節した。三量体構築体を含むクローンを構築するために、Parj2二量体を含むプラスミドDNAはSalIおよびHindIII酵素を用いて消化し、次いでリガーゼ反応において、直接SalIおよび逆方向HindIIIプライマーを用いて増幅させたParj2に関する情報を含むDNA断片と共にインキュベートした。このクローン中に停止コドンを挿入することを、記さなければならない。クローニングは、組換えプラスミドDNAの塩基配列を決定することによって確認した。
【００３５】
断片をクローニングするために制限部位を導入することによって、2つのアミノ酸(GおよびS)を、正確なリーディングフレームを変えない接合部位のレベルで導入した(図4のヘテロ三量体)。
【００３６】
主要アレルゲンParj1とParj2の両方を含むヘテロ多量体分子を構築するために、PjEDクローンに関して前に記載した以下の戦略を使用した。正確な方向に挿入されたParj2断片の2つのコピーを含む組換えプラスミドを単離し、安定した組換え多量体タンパク質(Parj2-Parj2-Parj1三量体)を発現するそれらの能力に関してアッセイした。断片のクローニング用に使用した制限部位を導入することによって、2つのアミノ酸(GおよびS)を、正確なリーディングフレームを変えない接合部位のレベルで導入した(図4のヘテロ三量体)。
【００３７】
組換えタンパク質の誘導および精製
それぞれ100μ/mlおよび10μg/mlの最終濃度でアンピシリンおよびカナマイシンを含む400mlの2YTの培養培地に接種するために、10mlのo/n培養物を使用した。攪拌下で37℃において培養物を増殖させた。2時間後、IPTGを1mMの最終濃度で培養物に加え、攪拌下で37℃において4時間、培養物を増殖させた。このステップの最後に、細菌の培養物を5000rpmで15分間遠心分離にかける。ペレットは開始バッファー(10mMのリン酸ナトリウムpH7.4および6M尿素)に懸濁させ、細胞は超音波処理する。次いで溶解物を14.000rpmで30分間遠心分離にかけ、浄化した溶解物をCMセファロース(Pharmacia)カラムに充填した。タンパク質はNaClの不連続勾配を使用して希釈し、当該のタンパク質を含む分画を、10mMのリン酸ナトリウムpH7.4および1MのNaClを含むバッファーに対して2時間透析して、本来の三次元構造を形成させる。次いで組換えタンパク質を、製造者の教示書に従いHis Trapカラム(Amersham)を使用して最終的に精製した。希釈した分画は次いで16%ポリアクリルアミドゲル上で分析し、組換えタンパク質を含む分画は、ブラッドフォード法による染色後に分光測光法によって定量的に評価した。最後に、SephadexG-25カラム(Pharmacia)を使用してタンパク質を脱塩した。
【００３８】
組換え技法によって生成したタンパク質は、16%SDSポリアクリルアミドゲル上での電気泳動に施した。それらの純度および濃度は、クーマシーブリリアントブルー染色によって決定した。
【００３９】
ELISA
ELISA試験をBonura他中に記載されたのと同様に実施した(13)。それぞれのウエルで使用した抗原の濃度は5μg/mlであった。患者(n=8)はパリエタリアジュダイカに対するアレルギーの明らかな病歴を有しており、市販の製品を使用する皮膚試験に対していずれも陽性反応が出た。
【００４０】
ヒスタミン放出アッセイ
ヒスタミン放出アッセイを、アレルギー性被験体から抽出したヘパリン化血液を使用し、0.0001μg/ml〜10μg/mlのアレルゲンの濃度範囲を使用して行った。放出プロトコルは前に記載されたのと同様に実施した(13)。S-アデノシル-L-メチオニン-H3(Amersham、UK)は、オスラットの腎臓から調製したメチルトランスフェラーゼヒスタミン酵素の存在に関する放射能反応マーカーとして使用した。ヒスタミンの合計量は、1体積の0.05Mリン酸バッファーph7.9で希釈した100μg/mlの血液の放射能を、10分間サンプルを煮沸した後に測定することによって計算した。自発的放出は、希釈バッファーの存在下でサンプルをインキュベートすることによって計算した。放出されたヒスタミンの割合は、刺激なしでサンプルによって自発的に放出された割合を引いた後に、放出されたヒスタミンの割合として計算した。
【００４１】
結果
パリエタリアジュダイカ花粉に対するアレルギーは、地中海領域におけるアレルギーの最も一般的な形の1つである。特にParj1およびParj2は、アレルギー反応における2つの主要な役割を担う物質であり、したがってPjアレルギーを治療するための特異的免疫療法において使用するための産物を探索する際の2つの主要な標的となる。この2つの別個のアレルゲンは、それらがns-LTPファミリーに属する点で類似の特性を示す。植物タンパク質のこのファミリーは、構造レベルで特徴付けられてきている。すべてのその要素は、4-52、14-29、30-75、50-91の順で(これらの数字は図1、パネルAに示す成熟Parj1の主要配列を指す)4個のイオウ架橋を形成する8個のシステイン残基によってもたらされる4個のアルファヘリックスを含む非常にコンパクトな構造を有する(図2参照)。以下に記載するすべての戦略は、元の相当物と類似した三次元構造を保ちながら、低いアレルギー誘発能力を有する分子を作製することを目的とする。特に、明確な領域ループ1中に含まれる(図1、図2、図3参照)Parj1およびParj2のアミノ酸Lys23、G1u24、Lys27の部位特定突然変異誘発によって、それらはヒトIgEとの結合能力に大きく影響を与えることができることが示された。図5では、ELISA分析が、Pj1ループおよびPj2ループ突然変異体に関するIgE結合が著しく減少し、非アレルギー性患者の血清のレベルに匹敵する活性レベルに達することを実証する。図6は、Pjアレルギー患者(n=5)の全血を多量のPj1ループまたは野生型突然変異体と共にインキュベートするときの、ヒスタミン放出概略を示す。これらの患者の40%は、放出の割合は野生型分子によって放出された割合より低かった(図6、パネルCおよびE)。残りの患者は、野生型分子のそれに匹敵する概略を有する、ある程度不均一な応答を示した。この型の突然変異誘発は、タンパク質の一般的構造に干渉しないようである。図7は、Pj1野生型分子を用いた免疫処置によって得られたポリクローナルウサギ抗体と結合するそれらの能力に関して、野生型PjとPj1ループを比較したELISA試験を示す。この分析はPj1ループ分子に関する高い割合の結合も示し、本来の分子のドメインに匹敵する多数のタンパク質構造ドメインの持続性を実証する。
【００４２】
この戦略は、タンパク質の三次元構造(図2中、および図7のデータ中に記載したモデルを参照)に干渉しない溶媒に曝された領域中に位置する、わずか3個のアミノ酸の修飾が、それぞれの野生型相当物と比較して、特異的に結合するIgEの量を大幅に低下させる可能性があることを示す(図6参照)。このことは、これらの分子が有効な解決策であり、Pjアレルギー性被験体の群全体に適用可能であることを示唆する。これらのデータに照らし、両方のアレルゲンがPjアレルギー性被験体中でIgEの生成を誘導することができる観察結果に基づいて、Pj花粉脱感作療法で使用するための一種の薬剤配合物を作製する試みにおいて、2つの一種のアレルゲンの頭部から尾部の連結によって形成される新しいクラスの分子を作製することを決定した。さらに、他のアレルギー源に関して、一種のペプチドの多量体化が、低いアナフィラキシー性を有するタンパク質の形成をもたらす可能性があることが示された(11、12)。この目的のために、Parj2およびParj1の頭部から尾部の連結から構成されるプラスミド構築体(詳細に関しては図4のPjEDクローンを参照のこと)、および同時に、Pj1ループおよびPj2ループクローン(図4、PjEDmutクローン)の頭部から尾部の連結から構成されるプラスミド構築体をそれらの本来の型で作製した。突然変異体は、いずれも位置23、24および27のアミノ酸が修飾された2つの主要アレルゲンをコードする配列を含む(図1)。PjEDおよびPjEDmutクローンの結合活性は、ヒスタミン放出技法を使用してアッセイした。それらの活性を、2つのParj1およびParj2モノマーの等モル混合物の活性と比較した。図6、パネルF、GおよびH中のグラフの分析は、2つのアレルゲン(PjEDクローン)の結合は、いくつかの被験体でヒスタミン放出の低い能力をもたらし(図6、パネルGおよびH)、さらに顕著に、二重突然変異体(PjEDmut)は、試験した患者の1人でヒスタミン放出の低い能力を有することを示す(図6、パネルF)。
【００４３】
何人かの患者において重合の事象自体がアナフィラキシーを低下させることができる場合、PjEdおよびPjEDmut突然変異体に関するこれらの結果に照らして、その中でParj1とParj2のさまざまな対が融合した多量体を作製することを決定した。詳細には、図4に示すように、Pj2三量体突然変異体は頭部から尾部が連結したParj2アレルゲンコピーの三対から構成される。この分子は、4人のPjアレルギー性被験体でのヒスタミン放出試験において試験した。すべての被験体が、それらの活性がモノマーParj2の活性に匹敵した点で、ヒスタミン放出の顕著な低下を示した(図8)。同様に、二対のParj2アレルゲンが一対のParj1アレルゲンと頭部から尾部まで連結したとき(図4、ヘテロ三量体クローン)、ハイブリッド多量体分子を得て、その中のアレルギー特性は、それらをそれらのモノマーアレルゲン相当物の活性と比較することによって研究した。さらにこの場合、ヒスタミンの低い放出をアレルギー性患者の血液中で観察した(図9)。
【００４４】
最後に、低いアレルギー活性を有する、2つのPj主要アレルゲンParj1およびParj2の2ファミリーの突然変異体の、設計、生成およびアレルギー分析を記載する。
［参考文献］
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【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】主要アレルゲンParj1(A)(配列番号1)およびParj2(C)(配列番号3)のアミノ酸配列の図である。配列Bはループ1領域中が突然変異したParj1の低アレルギー性誘導体を示し(配列番号2);配列Dは、ループ1領域中のParj2の低アレルギー性誘導体を示し(配列番号4);下線のアミノ酸は挿入された突然変異を示す。
【図２】ns-LTPファミリーに典型的な4個のアルファヘリックスから構成される構造を示す、Parj1の三次元モデルの概略図である。
【図３】それらの三次元構造に関するParj1.0102およびParj2.0101のアミノ酸配列のアラインメントの図である。数字はParj1.0102の配列を指す。矢印は置換されたアミノ酸を示す。
【図４】プラスミド構築体の概略図である。組換えタンパク質の発現用に使用したpQE30およびpQE31発現ベクターによって発現された第1のメチオニンから始まる、アミノ酸の位置を数字が示す。添加または置換されたアミノ酸を示す。
【図５】それぞれの野生型分子と比較した、Pj1ループおよびPj2ループ突然変異体がヒトIgEと結合する能力を示す、ELISA試験の図である。黒い四角を有する線はPjアレルギー性被験体の血清を示し;白い四角を有する線は非アレルギー性被験体由来の血清の結合活性を示す。
【図６】Pj1ループ、PjEDおよびPjEDmut突然変異体のヒスタミン放出の概略の図である。パネルA〜Eは、Pj1ループ突然変異体およびParj1野生型分子によって放出されたヒスタミンの量を示す。パネルF〜Hは、等モル量のParj1およびParj2アレルゲンを含む混合物と比較した、PjEDおよびPjEDmut突然変異体によって放出されたヒスタミンの量を示す。それぞれのパネルは1人のアレルギー患者を表す。x軸上の値はμg/mlで抗原の濃度を示す。y軸上の値は、全ヒスタミン量と比較した放出されたヒスタミンの割合を表す。
【図７】抗原として野生型Parj1(Pj1)およびPj1ループ分子を使用する、ELISA試験の図である。y軸上の値は、Parj1分子に対するポリクローナル抗体と比較した分子の結合能力を示す。
【図８】等モル量のモノマーParj2アレルゲンと比較した、Pj2三量体突然変異体のヒスタミン放出アッセイの図である。パネルA〜Dは、それぞれのアレルギー患者によって放出されたヒスタミンの量を示す。x軸はng/mlで表した抗原の濃度を示す。y軸は、全ヒスタミン量と比較した放出されたヒスタミンの割合を表す。
【図９】Parj1およびParj2モノマーと比較した、ヘテロ三量体突然変異体のヒスタミン放出の概略の図である。パネルA〜Cは、それぞれの患者によって放出されたヒスタミンの量を示す。x軸上の値はμg/mlで表した抗原の濃度を示す。y軸上の値は、全ヒスタミン量と比較した放出されたヒスタミンの割合を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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