(57)【要約】  本発明は、真菌界の生物中でのコレステロールの生産に関する。より具体的には、本発明は、単純な炭素源からコレステロールを独立に産生する遺伝的に修飾された真菌類に関する。本発明は、標識されていないコレステロール及び標識されたコレステロールを生産するための本発明の真菌類の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自律的にコレステロールを産生する真菌界の生物。
【請求項２】
遺伝的に修飾されていることを特徴とする、請求項１に記載の生物。
【請求項３】
単純な炭素源からコレステロールを産生することを特徴とする、請求項１又は２に記載の生物。
【請求項４】
７−デヒドロコレステロール還元酵素及び３β−ヒドロキシステロールΔ２４−還元酵素を発現することを特徴とする、請求項１から３の何れか１項に記載の生物。
【請求項５】
ステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素が不活化されている、請求項４に記載の生物。
【請求項６】
Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ酵素が不活化されている、請求項４又は５に記載の生物。
【請求項７】
７−デヒドロコレステロール還元酵素及び３β−ヒドロキシステロールΔ２４還元酵素の発現が生物の形質転換によって得られることを特徴とする、請求項４ないし６の何れか１項に記載の生物。
【請求項８】
ステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素の不活化が遺伝子不活化によって実施されることを特徴とする、請求項５から７の何れか１項に記載の生物。
【請求項９】
Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ酵素の不活化が遺伝子不活化によって実施されることを特徴とする、請求項５から８の何れか１項に記載の生物。
【請求項１０】
サッカロミケス属又はシゾサッカロミケス属から選択されることを特徴とする、先行する請求項１ないし９の１項に記載の生物。
【請求項１１】
登録番号Ｉ−３２０３で、２００４年４月２２日に、微生物の培養の国立収集所（ＣＮＣＭ［Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｇｒａｎｉｓｍｅｓ］）に寄託されたＷＧＩＦ０４株であることを特徴とする、サッカロミケス・セレビシアエ酵母株。
【請求項１２】
先行する請求項１ないし１１の１項に記載の生物の培養を含む、非動物起源のコレステロールを生産する方法。
【請求項１３】
生物を培養する工程の後にコレステロールを抽出する工程が続くことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
コレステロールの抽出が非水混和性溶媒を用いて実施されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
コレステロールの抽出の前に、鹸化工程が実施されることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
コレステロールの鹸化又は抽出の前に、細胞の機械的破砕を行う工程が実施されることを特徴とする、請求項１３、１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
１３Ｃ若しくは１４Ｃで標識された、コレステロール又はその代謝的中間体の１つ又はステロールの混合物を生産するための、請求項１ないし１１の１項に記載の生物の使用。
【請求項１８】
−１３Ｃ標識又は１４Ｃ標識された基質上で、請求項１ないし１１の１項に記載の生物を培養する工程と；及び
−コレステロール又はその代謝中間体の１つ又はステロールの混合物を抽出する工程と；を含む、１３Ｃ若しくは１４Ｃで標識された、コレステロール又はその代謝中間体の１つ又はステロールの混合物を生産するための方法。
【請求項１９】
標識された基質上で、次いで、非標識基質上で、請求項１ないし９の１項に記載の生物を培養することを含み、所定の同位体プロファイルを得るためにこれらの基質の各々の上での培養時間が選択される、同位体標識を用いて様々な位置で標識された、コレステロールの、コレステロール中間体の、又はコレステロール代謝物の同位体混合物を生産するための方法。
【請求項２０】
同位体標識を用いて様々な位置で標識され、且つ所定の同位体プロファイルを有する、コレステロールの、コレステロール中間体の、又はコレステロール代謝物の同位体混合物を、追跡可能標識として含有する組成物。
【請求項２１】
ヒト又は動物の食物又は治療の分野を対象とすることを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
所定の同位体プロファイルを有し、且つ請求項１９に記載の生産方法を用いて取得することが可能である、同位体標識を用いて様々な位置に標識された、コレステロールの、コレステロール中間体の、又はコレステロール代謝物の分子の試料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌界の生物中でのコレステロールの産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロール（図１参照）は、最も重要な動物性ステロールである。コレステロールは、細胞膜の基本的な成分で、細胞膜の流動性を調節しており、全ての動物組織中、特に神経組織中に存在する。
【０００３】
コレステロールは、多大な産業的関心が寄せられている生産物である。このため、コレステロールは、化粧品産業において一般的に使用されている。コレステロールは、製薬産業において、例えば、薬物送達においても使用されており、細胞培養においても使用されている。
【０００４】
コレステロールは、ビタミンＤ３の産業的合成においても使用されている。その後、このビタミンは、ヒトの食物（例えば、酪農製品）及び動物の食物を強化するために使用される。コレステロールは、動物の食物、特に、養殖エビを対象とした食物中の添加物としても有利に使用される。
【０００５】
現在、市場で販売されているコレステロールの圧倒的多数は、動物組織から抽出されている（ごく少量は、化学的合成によって生産されている。）。コレステロールの抽出のために、ウシから得た脊髄及びラノリン（羊毛の天然脂肪である。）という２つの主要な出発源が使用されている。
【０００６】
出発産物としての動物組織の使用は、問題を引き起こす。このため、ヒツジのスクレイピーの原因であるプリオンのウシへの伝染（ウシでは、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）と呼ばれる疾病）に付随する最近の問題は、動物組織を出発材料として使用する場合には、注意が必要であることを改めて想起させた。しかしながら、措置が講じられたとしても、病原性因子の伝達のリスクを完全に除外することはできない。従って、動物組織由来でないコレステロール源を有することは極めて有利であろう。
【０００７】
本発明の目的は、健康の観点から安全である豊富なコレステロール源を提供することである。本発明者らは、驚くべきことに、コレステロールを生産するために、真菌中でのエルゴステロールの天然産生を逸らせることが可能なことを示した。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の第一の側面は、自律的にコレステロールを産生する真菌界の生物に関する。
【０００９】
本発明の第二の側面は、遺伝的に修飾された上記真菌界の生物に関する。
【００１０】
本発明の第三の側面は、単純な炭素源からコレステロールを産生する上記真菌界の生物に関する。
【００１１】
本発明は、７−デヒドロコレステロール還元酵素及び３β−ヒドロキシステロールΔ２４−還元酵素を発現する、上記真菌界の生物にも関する。より具体的には、本発明は、ステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素が不活化されており、及び／又はＣ−２２ステロールデサチュラーゼ酵素が不活化されている、上記生物に関する。
【００１２】
本発明の別の側面は、７−デヒドロコレステロール還元酵素及び３β−ヒドロキシステロールΔ２４還元酵素の発現が生物の形質転換によって得られる、上記真菌界の生物に関する。
【００１３】
本発明は、ステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素の不活化が遺伝子の不活化によって実施され、及び／又はＣ−２２ステロールデサチュラーゼ酵素の不活化が遺伝子不活化によって実施される、上記真菌界の生物にも関する。
【００１４】
本発明の別の側面は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）門から、より具体的には、サッカロミケス菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門、さらに具体的には、サッカロミケス菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）綱又はシゾサッカロミケス菌（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）綱、さらに具体的には、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目又はシゾサッカロミケス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目、さらに具体的には、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）科又はシゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）科、さらに具体的にはサッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属又はシゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属から選択される、上記真菌界の生物に関する。
【００１５】
本発明の別の側面は、サッカロミケス・セレビシアエ種又はシゾサッカロミケス・ポンベ種の酵母である上記真菌界の生物に関する。
【００１６】
本発明は、上記生物の培養を含む、非動物起源のコレステロールを生産する方法にも関する。より具体的には、本方法では、生物を培養する工程の後に、コレステロールを抽出する工程が続く。好ましくは、コレステロールの抽出は、非水混和性溶媒を用いて実施される。
【００１７】
より具体的には、上記定義の方法では、コレステロールの抽出の前に、鹸化工程が実施される。より具体的には、上記定義の方法では、鹸化又はコレステロールの抽出の前に、細胞の機械的破砕を行う工程が実施される。
【００１８】
本発明の別の側面は、１３Ｃ若しくは１４Ｃで標識された、コレステロール又はその代謝的中間体の１つ又はステロールの混合物を生産するための、上記真菌界の生物の使用に関する。
【００１９】
本発明は、
−１３Ｃ標識又は１４Ｃ標識された基質上で、上記真菌界の生物を培養する工程と；及び
−コレステロール又はその代謝的中間体の１つ又はステロールの混合物を抽出する工程と；
を含む、１３Ｃ又は１４Ｃで標識された、コレステロール又はその代謝的中間体の１つ又はステロールの混合物を生産するための方法にも関する。
【００２０】
本発明は、標識された基質上で、次いで、非標識基質上で上記真菌界の生物を培養することを含み、所定の同位体プロファイルを得るためにこれらの基質の各々の上での培養回数が選択される、放射性標識を用いて様々な位置で標識された、コレステロールの、コレステロール中間体の、又はコレステロール代謝物の同位体混合物を生産するための方法にも関する。本発明は、所定の同位体プロファイルを有し、且つこの生産方法を用いて取得することが可能である、同位体標識を用いて様々な位置に標識された、コレステロールの、コレステロール中間体の、又はコレステロール代謝物の分子の試料にも関する。
【００２１】
本発明は、同位体標識を用いて様々な位置で標識され、且つ所定の同位体プロファイルを有する、コレステロールの、コレステロール中間体の、又はコレステロール代謝物の同位体混合物を、追跡可能標識として含有する組成物にも関する。より具体的には、該組成物は、ヒト又は動物の食物又は治療の分野を対象とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、真菌界の生物中でのコレステロールの産生に関する。真菌中には、自然の状態でコレステロールは見られず、後者は、動物性ステロールである。これらの生物の細胞膜の主なステロールは、エルゴステロールである。
【００２３】
本発明によって、真菌の増殖を通じて、単純な炭素源の存在下で、コレステロール合成を実施することが可能となる。本発明によって提案される方法は、真菌界の生物の培養及び容易に商業的に入手可能な単純な炭素源の添加を使用するので、本発明によって提案される方法により、低価格で、大量のコレステロールを取得することが可能となる。
【００２４】
本発明において、「単純な炭素源」という用語は、真菌、特に酵母の正常な増殖のために当業者によって使用可能な炭素源を意味するものとする。本用語は、特に、グルコース、ガラクトース又はスクロース又は糖蜜又はこれらの糖の副産物など、様々な同化可能な糖を表すものとする。最も好ましい単純な炭素源は、エタノール及びグリセロールである。
【００２５】
生産が自律的に行われるという事実は、コレステロールを取得するために基質を添加する必要がなく、生物が、単純な出発炭素源のみからコレステロールを産生可能であることを意味する。本発明に係る生物の株がコレステロール産生のための代謝経路を完結させるために必要とされる全ての遺伝子を含有している限り、この株は代謝経路中の上流に位置する基質を用いてコレステロールを産生可能であることも明らかである。
【００２６】
本発明は、具体的には、単純な炭素源からコレステロールを自律的に産生する、遺伝的に修飾された真菌界の生物（真菌類（Ｆｕｎｇｕｓ））に関する。
【００２７】
エルゴステロール産生の天然の代謝経路を、コレステロールの産生の方向に逸らせるために、真菌の遺伝的修飾の一定数を施すことが可能である。このため、本発明は、７−デヒドロコレステロール還元酵素及び３β−ヒドロキシステロールΔ２４−還元酵素を発現する真菌界の遺伝的に修飾された生物に関する。このようにして修飾された真菌界の生物の株は、コレステロールを産生する。本出願人は、実際に、得られた結果（本発明の実施例の部を参照）を用いて、エルゴステロールをもたらす代謝経路及びその誘導体の幾つかをモデル化することができた（図２）。真菌Ｓ．セレビシアエ中での７−デヒドロコレステロール還元酵素及び３β−ヒドロキシステロールΔ２４還元酵素の発現は、エルゴステロールに対する生合成系経路の一部を逸らせることによって、コレステロールの産生を可能とすることができる。
【００２８】
７−デヒドロコレステロール還元酵素は、国際酵素分類で番号ＥＣ：１．３．１．２１を有する。７−デヒドロコレステロール還元酵素は、本文書の残りの箇所で、デルタ−５，７−ステロール−デルタ−７−還元酵素、７−ＤＨＣ還元酵素又はステロールデルタ−７−還元酵素とも称され、デルタ−７ステロール還元酵素、デルタ−７Ｒｅｄ、デルタ７還元酵素又はΔ７−還元酵素とも称される。この酵素は、植物中の天然状態で、例えば、デルタ−５，７−コレスタジエノールの、デルタ−５−コレスタエノールへのＮＡＤＰＨ依存性還元又は７−８位に二重結合を有するステロール中間体の還元を触媒する（Ｔａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｈｉｅｒ，１９９１）。７−デヒドロコレステロール還元酵素をコードする遺伝子は、植物アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）中で、初めて単離され、対応する遺伝子の単離及び酵母サッカロミケス・セレビシアエ中での本酵素の発現は、特許第ＥＰ７２７  ４８９号に記載されている。本遺伝子及び本タンパク質の配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｕ４９３９８で入手可能である（Ｌｅｃａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００２９】
本遺伝子の相同体の一定数は、他の種に記載されている。これらは、例えば、ヒトでの相同遺伝子（そのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ０３４５４４で入手可能であり、そのタンパク質配列はＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＣ０５０８６で入手可能である。）（Ｍｏｅｂｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）；ラット（ラッタス・ノルベジカス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））中の相同遺伝子（そのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＢ０１６８００で入手可能であり、そのタンパク質配列はＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＡ３４３０６で入手可能である。）である。相同遺伝子は、ニワトリ  ガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）中（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号はＢＭ４９０４０２）、又はヒキガエル  ゼノパス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）中（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＢＩ３１５００７）、又はゼブラフィッシュダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）中（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号はＢＱ１３２６６４）にも同定されている。デルタ７ステロール還元酵素活性をコードする遺伝子は、コメ、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＣＡ７５３５４５号である。）、又はイモ、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＢＦ３４２０７１）などの植物中にも見出される。デルタ７ステロール還元酵素活性をコードするこの遺伝子は、原生生物マスティガモエバ・バラムチ（Ｍａｓｔｉｇａｍｏｅｂａ  ｂａｌａｍｕｔｈｉ）中に見出すことも可能である（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＢＥ６３６５６２）。
【００３０】
当業者は、他の生物中に、７−デヒドロコレステロール還元酵素をコードする他の相同遺伝子を容易に単離することが可能であろう。当業者は、特に、デルタ−５，７−ステロール−デルタ−７−還元酵素を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離するためのクローニング方法を記載する、特許ＥＰ７２７  ４８９号の実施例１に記載されているクローニング方法を参照してもよい。当業者は、特に、特許ＥＰ  ７２７  ４８９号の実施例１にも記載されている活性アッセイを用いて、対応するタンパク質の７−デヒドロコレステロール還元酵素活性を容易に決定してもよい。
【００３１】
本発明に従う真菌界の生物中での７−デヒドロコレステロール還元酵素の発現は、当業者に公知の任意の手段によって取得することが可能である。これは、特に、当業者に公知の通常の規則に従って、転写プロモーター（好ましくは、相同的な転写プロモーター）、７−デヒドロコレステロール還元酵素をコードするオープンリーディングフレーム及び適切な転写ターミネーターからなる発現カセットを含む構築物によって生物を形質転換することを含んでもよい。相同的プロモーターとしては、一般に、異種タンパク質の十分且つ機能的な発現を可能にするのに適したプロモーターが使用されるであろう。プロモーターは、例えば、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＧＡＬ１０ＣＹＣ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター又はＴＰＩプロモーターであってもよい。ターミネーターは、例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のターミネーターであってもよい。前記発現カセットは、１若しくは複数のコピーの形態で、宿主の核若しくはミトコンドリアゲノム中に組み込むことが可能であり、又は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）タイプの人工構造によって担持され、若しくは、プラスミドなどのエピソーム遺伝因子によって担持されることが可能である。この種の発現を実施するために、例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｉｔｉｃａ）、クルイベロミケス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）タイプの酵母を使用することが可能である。
【００３２】
好ましくは、発現される７−デヒドロコレステロール還元酵素は、植物アラビドプシス・サリアナの酵素である（酵母サッカロミケス・セレビシアエ中で本酵素を発現する方法の例は、特許７２７  ４８９号に記載されている。）。しかしながら、これは、同じ酵素活性を示す、相同的又は非相同的な、天然又は人工の任意の酵素であってもよい。
【００３３】
３β−ヒドロキシステロールΔ２４−還元酵素（ＤＨＣＲ２４又は２４−デヒドロコレステロール還元酵素とも称される。）は、天然には、デスモステロール（コレスタ−５，２４−ジエノール）の還元又は側鎖上の２４−２５位に二重結合を有するラノステロール誘導体（例えば、１４−デスメチル−ラノステロール、ジモステロール又はコレスタ−７，２４−ジエノール）の還元を触媒し、この還元は、特に、ヒトでのコレステロールの生合成に必要である（ＨＲ．  Ｗａｔｅｒｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。この酵素は、本文書の残りの部分において、デルタ２４−（２５）ステロール還元酵素、デルタ２４ステロール還元酵素又はΔ２４−還元酵素とも称されるであろう。
【００３４】
３β−ヒドロキシステロールΔ２４−還元酵素をコードする遺伝子は、ヒトで初めて単離され、対応する遺伝子の単離及び酵母サッカロミケス・セレビシアエ中での本酵素の発現は、刊行物「ＨＲ．  Ｗａｔｅｒｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１」に記載されている。この遺伝子及びタンパク質の配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０１４７６２及びＮＰ＿０５５５７７で入手可能である。
【００３５】
本遺伝子の相同体の一定数は、他の種に記載されている。それらは、例えば、マウス（ムス・ムスカラス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））での相同遺伝子（そのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿０５３２７２で入手可能であり、そのタンパク質配列はＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿４４４５０２で入手可能である。）。相同体が、寄生虫シーノラブディティス・エレガンス中に記載されており、特に、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＡＦ０２６２１４の相補的ＤＮＡが記載されている。相同的配列は、ワタ、ゴッシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＡＡＭ４７６０２．１）、コメ、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｓａ  ｓａｔｉｖａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＡＡＰ５３６１５）又はマメ、ピサム・サティバム（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＡＡＫ１５４９３）などの植物中にも記載されている。
【００３６】
当業者であれば、他の生物中に、３β−ヒドロキシステロールΔ２４−還元酵素をコードする他の相同遺伝子を容易に単離することが可能であろう。当業者は、特に、刊行物「ＨＲ．  Ｗａｔｅｒｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１」に記載されているクローニング方法を参照してもよい。当業者は、特に刊行物（Ｗａｔｅｒｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）にも記載されている活性アッセイを用いて、対応するタンパク質の３β−デヒドロキシステロールΔ２４−還元酵素活性を容易に決定することも可能であろう。
【００３７】
本発明に従う、真菌界の生物中での３β−ヒドロキシステロールΔ２４−還元酵素の発現は、当業者に公知の任意の手段によって取得することが可能である。これは、特に、７−デヒドロコレステロール還元酵素の発現に関して上述されている手段を含んでもよい。
【００３８】
好ましくは、発現された３β−ヒドロキシステロールΔ２４−還元酵素は、ヒト酵素である。対応する遺伝子の単離及び酵母サッカロミケス・セレビシアエ中での本酵素の発現の例は、刊行物「ＨＲ．Ｗａｔｅｒｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１」に記載されている。しかしながら、これは、同じ酵素活性を示す、相同的又は非相同的な、天然又は人工の任意の酵素であってもよい。
【００３９】
有利に、本発明の真菌界の生物は、７−デヒドロコレステロール還元酵素及び３β−ヒドロキシステロールΔ２４−還元酵素を発現し、ステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素の不活化も示す。
【００４０】
ステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素は、国際酵素分類で番号ＥＣ−２．１．１．４１を有する。ステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素は、ＥＲＧ６ｐ、デルタ（２４）−メチル転移酵素、デルタ（２４）−ステロールメチル転移酵素、ジモステロール−２４−メチル転移酵素、Ｓ−アデノシル−４−メチオニン：ステロールデルタ（２４）−メチル転移酵素、ＳＭＴ１、２４−ステロールＣ−メチル転移酵素、Ｓ−アデノシルＬ−メチオニン：デルタ（２４（２３））−ステロールメチル転移酵素又はフィトステロールメチル転移酵素とも称される。この酵素は、天然では、ジモステロールのＣ−２４メチル化を触媒し、フェコステロールの形成をもたらす。
【００４１】
ステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素をコードする遺伝子は、酵母サッカロミケス・セレビシアエではＥｒｇ６と命名された。該遺伝子の配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ＿００１１４５で入手可能である。対応するタンパク質の配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０１３７０６で入手可能である（Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）（Ｇｏｆｆｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００４２】
該遺伝子の相同体の一定数が、他の真菌に記載されている。これらは、例えば、シゾサッカロミケス・ポンベでの相同遺伝子（そのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ９９７５９で入手可能であり、そのタンパク質配列はＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１６８９７で入手可能である。）（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）中の相同遺伝子（そのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＣＢ２４Ｐ７で入手可能であり、そのタンパク質配列はＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ９７２８９で入手可能である。）；カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）中の相同遺伝子（そのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０３１９４１で入手可能であり、そのタンパク質配列はＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ２６６２６で入手可能である。）（Ｊｅｎｓｅｎ−Ｐｅｒｇａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）である。ＥＲＧ６に相同的な酵素をコードする遺伝子は、カンジダ・ルシタニアエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）中にも記載されており（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号はＡＡ０２１９３６．１）、及びニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）（Ｋａｎｅｓｈｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）又はクルベロミケス・ラクティス（Ｏｚｉｅｒ−Ｋａｌｏｇｅｒｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）にも記載されている。
【００４３】
当業者であれば、真菌界の生物中のＥｒｇ６遺伝子に相同な他の遺伝子を容易に単離することが可能であろう。当業者は、特に、これらの遺伝子について破壊された酵母株の機能的相補を活性アッセイとして用いて、対応するタンパク質のステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素活性を容易に測定することも可能であろう。次いで、２４位で分岐されているステロールの形成によって、特に、２４−２８位にメチレン基を有するエルゴスタ型のステロールの形成によって、相補性が証明される。ＥＲＧ６型ステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素の生物学的活性の存在は、（ＭｃＣａｍｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）によって、又はＴａｙｌｏｒ及びＰａｒｋｓ（Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ，１９７８）によって開発された技術を用いて、インビトロでも測定されるであろう。さらに、産生されたステロール及びＥＲＧ６酵素に対する酵素は、（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １１１  ｐａｒｔ  Ｂ，１９８５，“Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｏｌｓ”，ｐｐ．３−３７）において、Ｎｅｓによって開発された技術に従って、ガスクロマトグラフィーによって分離されるであろう。
【００４４】
７−デヒドロコレステロール還元酵素及び３β−ヒドロキシステロールΔ２４−還元酵素を発現し、且つステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素の不活化も示す本発明の真菌界の生物の株は、コレステロールを産生する。出願人は、実際、驚くべきことに、ステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素の不活化が、エルゴステロールへの生合成経路を上流で遮断し、真菌株によるコレステロールの産生を増加させることができることを決定することができた（本出願の実施例の部を参照）。
【００４５】
７−デヒドロコレステロール還元酵素及び３β−ヒドロキシステロールΔ２４還元酵素は、上述のように発現される。
【００４６】
ステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素の不活化は、当業者に公知である任意の手段によって実施することができる。ステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素の不活化は、特に、突然変異導入によって、ナンセンス変異、前記タンパク質をコードする遺伝子中のリーディングフレーム中に変化を引き起こす挿入又は欠失を導入することを含んでもよい。ステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素の不活化は、前記タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡに対して相補的なアンチセンスＲＮＡの発現又はＲＮＡｉ（小分子干渉ＲＮＡ）として当業者に公知の遺伝子サイレンシング系及び関連する酵素系（自然の状態で、これらが宿主中に存在しない場合）を含んでもよい。突然変異導入は、コードされるタンパク質を不活性にするために、又はコードされるタンパク質の発現若しくはその翻訳を抑制するために、コード配列中又は非コード配列中に実施することが可能である。突然変異導入は、検討されている遺伝子中の１以上の塩基の抑制、置換、欠失及び／又は付加によって、又は遺伝子の不活化によって、インビトロ又はインシチュにおいて実施することが可能である。
【００４７】
これは、特に、コード配列又はプロモーター配列（例えば、相同的プロモーター及び／又はターミネーター並びに異種のコーディング部分を有する発現カセット）中に外来ＤＮＡを導入することを含んでもよい。発現カセットは、選択マーカーの発現を有利に可能とする。発現のレベルを低減するために、遺伝子のプロモーターを修飾することも可能である。真菌の場合、不活化は、異種又は相同マーカー遺伝子のコーディング配列によって、コーディング配列を中断することによっても実施される。真菌から遺伝子を中断するための主な技術は、Ｊｏｈｎｓｔｏｎら（２００２）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３５０  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒｒｙ  Ｆｉｎｋ；“Ｇｅｎｅ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ”；Ｍ．  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  Ｌ．Ｒｉｌｅｓ，Ｊ．Ｈｅｇｅｍａｎｎ，ｐｐ．２９０−３１５）による論文に記載されている。
【００４８】
有利に、本発明の真菌界の生物は、７−デヒドロコレステロール還元酵素及び３β−ヒドロキシステロールΔ２４−還元酵素を発現し、Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ酵素の不活化も示す。
【００４９】
Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ酵素は、ＥＲＧ５ｐ、Ｃｙｐ６１、シトクロムｐ−４５０６１又はステロールデルタ２２−デサチュラーゼとも称される。この酵素は、自然の状態では、Ｃ２２の位置に二重結合を付加することによって、エルゴスタ−５，７，２４（２８）−トリエノールのエルゴスタ−５，７，２２，２４（２８）−テトラエノールへの変換を触媒する（図２参照）。
【００５０】
Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子は、酵母サッカロミケス・セレビシアエではＥｒｇ５と命名された。本遺伝子の配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｕ３４６３６で入手可能である。対応するタンパク質の配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＢ０６２１７（Ｓｋａｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）又はＰ５４７８１（Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）で入手可能である。
【００５１】
本遺伝子の相同体の一定数は、他の真菌に記載されている。それらは、例えば、シゾサッカロミケス・ポンベでの相同遺伝子（そのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ９８９７４で入手可能であり、そのタンパク質配列はＧｅｎＢａｎｋ番号ＣＡＢ１１６４０で入手可能である。）（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）；シンビオタフリナ・ブフネリ（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）中の相同遺伝子（そのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＢ０８６８９６で入手可能であり、そのタンパク質配列はＧｅｎＢａｎｋ番号：ＢＡＣ０１１４２で入手可能である。）（Ｎｏｄａ  ａｎｄ  Ｋｏｉｚｕｍｉ，２００３）；シンビオタフリナ・コチイ（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ  ｋｏｃｈｉｉ）中の相同遺伝子（そのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＢ０８６８９０で入手可能であり、そのタンパク質配列はＧｅｎＢａｎｋ番号：ＢＡＣ０１１３９で入手可能である。）；（Ｎｏｄａ  ａｎｄ  Ｋｏｉｚｕｍｉ，２００３）；カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）中の相同遺伝子（そのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＬ０３３３９６で入手可能であり、そのタンパク質配列はＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＡ２１９５３で入手可能である。）（Ｔａｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）である。ＥＲＧ５遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＡＡＯ４８６０１で、カンジダ・ルシタニアエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）中にも記載されている。
【００５２】
当業者であれば、真菌界の生物中のＥｒｇ５遺伝子に相同な他の遺伝子を容易に単離することが可能であろう。当業者は、特に「Ｂ．Ａ．Ｓｋａｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６」によって記載されている活性アッセイを用いて、対応するタンパク質のＣ−２２ステロールデサチュラーゼ活性を容易に決定することも可能であろう。この活性は、ｅｒｇ５遺伝子が予め破壊されたＳ．セレビシアエ酵母の機能的相補によって実証してもよい。この相補は、相補された株において、エルゴスタ−５，７，２２−トリエノールの存在によって確認されるであろう。Ｃ２２ステロールデサチュラーゼ活性は、「Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ（１９９７）」によって記載された方法を用いて、酵母の溶解後に（Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、インビトロで測定することも可能である。
【００５３】
７−デヒドロコレステロール還元酵素及び３β−ヒドロキシステロールΔ２４−還元酵素を発現し、Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ酵素の不活化も示す本発明の真菌界の生物の株は、コレステロールを産生する。出願人は、実際に、Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ酵素の不活化が、コレステロールのコレスタ−５，２２−ジエノールへの変換を有利に遮断し、コレステロールの産生の安定化を可能とすることを決定することができた（本出願の実施例の部を参照）。この遮断は、コレスタ−５，７−ジエノール（コレステロールの前駆体）の、コレスタ−５，７，２２−トリエノール（コレスタ−５，２２−ジエノールの前駆体）への変換のレベルでも起こる。驚くべきことに、Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ酵素は、実際に、コレステロールを基質として受容し、コレステロールをコレスタ−５，２２−ジエノールへと変換する。この寄生性反応は、出願人が測定可能であったように、Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ酵素を不活化することによって除去することが可能である。
【００５４】
７−デヒドロコレステロール還元酵素及び３β−ヒドロキシステロールΔ２４還元酵素の発現は、上述のように実施される。Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ酵素の不活化は、当業者に公知である任意の手段によって実施することができる。それらは、特に、ステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素の不活化に関して上述されている方法であってもよい。
【００５５】
有利に、本発明の真菌界の生物は、７−デヒドロコレステロール還元酵素及び３β−ヒドロキシステロールΔ２４−還元酵素を発現し、Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ酵素の不活化及びステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素の不活化も示す。これらの菌株は、実際、２つの不活化の累積的な利点を示し、コレステロール産生菌株である。
【００５６】
７−デヒドロコレステロール還元酵素及び３β−ヒドロキシステロールΔ２４還元酵素の発現並びにＣ−２２ステロールデサチュラーゼの不活化及びステロール２４−Ｃ−メチル転移酵素の不活化は、上述のように実施される。
【００５７】
一実施形態において、コレステロールは、本発明の生物の株によって産生される総ステロール（特に、合成中間体）の２０％超、好ましくは３５％超、最も好ましくは５０％以上の割合で、本発明の生物の株中に存在する。
【００５８】
好ましくは、本発明の真菌界の生物は子嚢菌門から選択され、より好ましくは、それらはサッカロミケス菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門から選択され、さらに好ましくは、それらはサッカロミケス菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）綱又はシゾサッカロミケス菌（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）綱から選択され、さらに好ましくは、それらはサッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目又はシゾサッカロミケス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目から選択され、さらに好ましくは、それらはサッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）科又はシゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）科から選択され、さらに好ましくは、それらはサッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属又はシゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属から選択され、極めて好ましくは、本発明の真菌界の生物はサッカロミケス・セレビシアエ又はシゾサッカロミケス・ポンベに属する。
【００５９】
本発明は、
−上記真菌界の生物が培養される工程と、
−該生物によって産生されたコレステロールが抽出される工程と、
を含む、非動物性起源のコレステロールを製造する方法にも関する。
【００６０】
抽出は、コレステロールのための溶媒、好ましくは非水混和性溶媒による真菌の処理に基づく。この処理は、好ましくは、細胞の機械的破砕のあらゆる方法と組み合わせることが可能である。より好ましくは、溶媒での抽出の前に、特に、脂肪酸などの他の細胞成分に結合されている可能性があるコレステロールを放出することを目的とした鹸化混合物で、真菌が処理されるであろう。この鹸化混合物は、塩基、例えば、アンモニア水、水の中に、又は、より好ましくは、例えば、メタノール若しくはエタノールなどの水混和性有機溶媒中若しくは溶媒−水混合物中に溶解された水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムからなってもよい。鹸化は、６０ないし１２０℃の温度に加熱せずに、又は、好ましくは６０ないし１２０℃の温度に加熱しながら、大気圧又は低圧で実施してもよい。非水混和性溶媒による抽出は、疎水性樹脂上での固相抽出と置き換えてもよい。ステロール抽出法は、Ｌ．Ｐａｒｋｓら（１９８５）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１１  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌ  Ｒｉｌｌｉｎｇ，  Ｌ．  Ｐａｒｋｓ，  Ｃ．  Ｂｏｔｔｅｍａ，  Ｒ．  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｌｅｗｉｓ  ｐｐ３３３−３３９）によって記載されている。
【００６１】
このようにして得られた未精製コレステロールは、当業者に公知の任意の方法、特に、「Ｂｏｓｅｌｌｉ  Ｅ，  Ｖｅｌａｚｃｏ  Ｖ，  Ｃａｂｏｎｉ  Ｍｆ  ａｎｄ  Ｌｅｒｃｋｅｒ  Ｇ  Ｊ，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．  ２００１  Ｍａｙ  １１；９１７（ｌ−２）：２３９−４４」によって記載されている方法によって精製してもよい。
【００６２】
羊毛からコレステロールを抽出するために記載されている方法など、他の方法を使用してもよい。当業者は、特に、米国特許２，６８８，６２３号若しくは米国特許２，６５０，９２９号又は英国特許ＧＢ６９０８７９号、ＧＢ６４６２２７号若しくはＧＢ６１３７７８号に記載されている方法を参照してもよい。
【００６３】
本発明の別の側面は、コレステロール又はその代謝中間体の１つ又はステロールの標識された混合物を得るための、本発明の株の使用に関する。「コレステロールの代謝中間体」という用語は、特に、図２に明記されているステロールを意味するものとする。それらは、特に、コレスタ−８，２４（２５）−ジエノール、コレスタ−７，２４（２５）−ジエノール、コレスタ−５，７，２４（２５）−トリエノール、コレスタ−５，２４（２５）−ジエノール又はコレスタ−５，２２−ジエノールであってもよい。
【００６４】
標識されたコレステロールを得るための原理は、図１０に記載されている。この操作では、まず、完全に標識された基質上で真菌株を増殖させる。次いで、非標識基質上で細胞を培養する。このため、炭素源の同位体標識の変化が存在する。代謝中間体の新規合成、次いで、コレステロールを含むステロールの合成が行われ、標識の漸次の変化を含む。従って、これは、複雑であるが実験的に完全に測定可能なプロファイルであり、同時に、以下に依存する特有の同位体シグナチャを呈するプロファイルを伴う。
【００６５】
−１）標識プロトコール、並びに、特に、標識及び非標識基質を用いた培養時間及び条件、
−２）使用した株の正確な遺伝的構造、
−３）培養を停止する正確な時間。
【００６６】
（例えば、細胞溶解によって、又は細胞毒性若しくは細胞分裂停止抗真菌産物の致死未満濃度の存在下で培養を停止することによって）一旦、培養が停止されたら、上述されているように、標識されたコレステロール又はその代謝中間体の１つ又はステロールの標識された混合物を抽出及び精製する。
【００６７】
標識されたコレステロールの、又はその代謝中間体の１つの、又はステロールの標識された混合物の同位体プロファイルは、幾つかの特有の性質を有している。
【００６８】
−１）溶媒条件、使用される株及び選択されるステロールを調整することによって、所望に応じて調節することが可能である。従って、特有の標識登録を作製することが可能である。
【００６９】
−２）「組み合わせ可能」である、すなわち、それら自体調節可能である同位体プロファイルで標識された幾つかの特有のステロールに対応するに対応する幾つかの同位体サインは、「分子アルファベット」を形成するために組み合わせることが可能である。
【００７０】
−３）再現性があり、実験的に測定することが容易。
【００７１】
−４）単離が容易で、安定、無色及び無臭、不揮発性及び無毒であり、食物、医薬品、添加物又はヒトによって同化されることが可能な他の製品中に取り込まれることができる分子追跡混合物に相当する。
【００７２】
−５）特異的な組換え株並びに極めて正確な標識、培養及び抽出条件を有することなしに改ざんすることができない。さらに、同位体サインが明らかとなっても、同位体サインの作製を可能とするパラメータへ遡ることはできない。
【００７３】
このため、本発明を使用することによって、改ざんが不可能で、且つあらゆる種類の製品（消耗品を含む。）中に取り込むことが可能な一般的用途のための「同位体アルファベット」を容易に取得することが可能である。標識プロファイルとステロールの様々な種類の双方を使用することによって、このようなアルファベットから構成されることが可能な実質的に無限の数の「同位体ワード」が存在する。従って、多くの多様な製品中にこのようなサインを取り込むことは、例えば、一旦、知られてしまえば再現が可能となるＤＮＡサインとは異なり偽造が不可能な特有の標識方法を構成する。さらに、サインは、例えば、レーザーイオン化後の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦなど）によって、非破壊的に読み取ることが可能である。
【００７４】
本発明の真菌株を培養するための非標識炭素源に代えて、１３Ｃ標識基質を使用することによって、（１３Ｃ炭素を少なくとも９５％含む）極めて高度に標識されたステロール、特に、コレステロールを合成することが可能となる。同じアプローチによって、１４Ｃ放射性ステロール及びコレステロールの調製も可能である。この方法は、例えばＲＩＡアッセイ用に、１３Ｃ−標識又は１４Ｃ−標識されたステロイドを生産するために、ステロイド、特にヒドロコルチゾン（特許出願ＷＯ０２／０６１１０９号を参照）を産生する酵母株に取り入れることも可能である。
【００７５】
以下の実施例を用いて本発明を説明するが、以下の実施例は、非限定的な例示と解釈しなければならない。
【００７６】
使用された分子生物学の技術は、Ａｕｓｕｂｅｌらによって記載されており、酵母の取り扱いの幾つかは、Ａｄａｍｓら（Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍ，１９９６）によって記載されている。
【実施例１】
【００７７】
ｅｒｇ６遺伝子中に中断を有するＳ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母株の構築（ＷＧＩＦ０１株）：
ＥＲＧ６遺伝子がＴＲＰ１遺伝子で中断されたＳ．セレビシアエ酵母株ＷＧＩＦ０１は、ＥＲＧ６遺伝子に対して相同な末端に隣接した機能的ＴＲＰ１遺伝子を有するＰＣＲ産物によってＢＭ６４株を形質転換することによって得られた。
【００７８】
（遺伝子型ＭＡＴａ；ｕｒａ３−５２；ｔｒｐ１Δ２；ｌｅｕ２−３＿１１２；ｈｉｓ３−１１；ａｄｅ２−１；ｃａｎ１−１００の）ＢＭ６４株は、ＴＲＰ１遺伝子の完全な欠失によるＳ．セレビシアエ酵母株Ｗ３０３  ＭＡＴαの誘導物である。ＢＭＡ６４株及びＷ３０３  ＭＡＴα株は、Ｂａｕｄｉｎ−Ｂａｉｌｌｉｅｕらによる刊行物に記載されている（Ｂａｕｄｉｎ−Ｂａｉｌｌｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００７９】
ＴＲＰ１遺伝子を単離するために、Ｔａｋａｒａ社（ＰａｎＶｅｒａ  ＬＬＣ  ５０１  Ｃｈａｒｍａｎｙ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１９  ＵＳＡ）によって供給されているＺ−ＴａｑＩ（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて、プラスミドｐＦＬ４４のＴＲＰ１遺伝子（Ｂｏｎｎｅａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）を増幅した。使用したプライマーの対によって、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＥＲＧ６遺伝子に対応する配列が隣接したＴＲＰ１遺伝子を増幅することが可能となる。
【００８０】
これらのプライマーの配列は、以下のとおりである。
【００８１】
【化１】
2007535960.tif 000002
【００８２】
予想されたサイズに対応する断片の電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によって、このようにして得られたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を精製し、（Ｇｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）によって記載されているとおりに、塩化リチウム技術によってＢＭ６４株を形質転換するために使用する。
【００８３】
形質転換後、トリプトファンを含有しない最小培地上に、処理した酵母を播種する（Ｇｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。このようにして、トリプトファンに対して原栄養性である形質転換された４１個のＢＭ６４コロニーが得られる。次いで、ナイスタチンに対する感受性、ＴＲＰ１遺伝子の挿入のゲノム構造及びコロニーが産生する総ステロールのガスクロマトグラフィーによるプロファイルという３つの特性について、コロニーを調べる。
【００８４】
このために、それぞれ、ナイスタチン１０、２０又は５０μｇ／ｍＬを含有する最小培地上に４１個のコロニーを移し、約１０個のコロニーが、ナイスタチン５０μｇ／ｍＬの用量を含有する培地上で増殖させることが可能である。それらの遺伝子構造及びそれらのステロール組成を確認するために、これらの耐性コロニーを選択する。
【００８５】
ＥＲＧ６遺伝子中へのＴＲＰ１遺伝子の挿入は、機能的ＴＲＰ１遺伝子と破壊されたＥＲＧ６間の連結部を包含するオリゴヌクレオチドの対を使用するＰＣＲによって確認する。オリゴヌクレオチドのこの対は、以下の通りである。ＯＥＲＧ６ｔｒｐ３：ＡＧＧＧＣＣＧＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣ（配列番号３）及びＯＥＲＧ６ｔｒｐ４：ＧＧＣＡＡＡＣＣＧＡＧＧＡＡＣＴＣＴＴＧＧ（配列番号４）。
【００８６】
幾つかの株は、予想されたＰＣＲプロファイル、すなわち、ＥＲＧ６中へのＴＲＰ１挿入について予想されるサイズに対応する８００塩基対の断片を示す。
【００８７】
これらの株でＥＲＧ６遺伝子が実際に不活化されていることを確認する目的で、ガスクロマトグラフィー及び高圧液体クロマトグラフィーによるこれらの株のステロール組成の分析を行った（Ｄｕｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｓｚｃｚｅｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００８８】
これらの分析によって、エルゴステロール合成の不存在及び破壊された株中の生合成経路の予測された破壊と合致した異常なステロールの蓄積が確認される。１つの株が、より具体的に選択され、ＷＧＩＦ０１と名付けられた。
【実施例２】
【００８９】
ＣＡ１０、ＣＡ１４及びＣＡ２３株の構築。
【００９０】
（遺伝子型：ＭＡＴα、ｒｈｏ＋、ＧＡＬ２、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐ１−Δ６３、ｈｉｓ３−Δ２００、ｅｒｇ５：：ＨＹＧＲＯＲ、ａｄｅ２：：ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１：：Δ７還元酵素：：ＰＧＫ１、ＬＥＵ２：：ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１：：ｍａｔＡＤＲ：：ＰＧＫ１の）ＣＡ１０株、（遺伝子型：ＭＡＴα、ｒｈｏ＋、ＧＡＬ２、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐ１−Δ６３、ｈｉｓ３−Δ２００、ｅｒｇ５：：ＨＹＧＲＯＲ、ａｔｆ２：：Ｇ４１８Ｒ、ａｄｅ２：：ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１：：Δ７還元酵素：：ＰＧＫ１、ＬＥＵ２：：ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１：：ｍａｔＡＤＲ：：ＰＧＫ１）のＣＡ１４株及び（遺伝子型：ＭＡＴα、ｒｈｏ＋、ＧＡＬ２、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐ１−Δ６３、ｈｉｓ３−Δ２００、ｅｒｇ５：：ＨＹＧＲＯＲ、ａｒｅ１：：Ｇ４１８Ｒ、ａｒｅ２：：ＨＩＳ３、ａｄｅ２：：ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１：：Δ７還元酵素：：ＰＧＫ１、ＬＥＵ２：：ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１：：ｍａｔＡＤＲ：：ＰＧＫ１の）ＣＡ２３株並びにこれらの構築は、参考文献Ｄｕｐｏｒｔらに記載されており、これらの株の構築に関するその技術内容は、参照により、本出願中に組み込まれる。
【００９１】
これらの株は、それらの膜内に、非天然ステロール（欧州特許出願ＥＰ  ０７２７  ４８９）及び特にエルゴスタ−５−エノール（キャンペステロール）を産生し、含有する。
【００９２】
これら３つの株は、ハイグロマイシン耐性遺伝子のそのコード配列中に挿入するために非機能的であるＥＲＧ５遺伝子の産物を発現しない。さらに、これらの株は、植物Δ７還元酵素をコードするｃＤＮＡを発現する（欧州特許出願ＥＰ  ０７２７  ４８９は、特に、植物アラビドプシス・サリアナのΔ７還元酵素のクローニングを記載しており、参照により、本出願中に組み込まれる。この配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＡＴＵ４９３９８である。）。
【００９３】
ＣＡ１４株は、ＡＴＦ２遺伝子の破壊によって、ＣＡ１０株から得られる。この遺伝子の産物は、（特許出願ＷＯ９９／４０２０３中に記載されているように）プレグネノロンの３位にアセチル化をもたらす。
【００９４】
ＣＡ２３株は、ＡＲＥ１及びＡＲＥ２遺伝子の欠失によって、ＣＡ１０株から得られる株である。２つのタンパク質Ａｒｅ１ｐ及びＡｒｅ２ｐは、哺乳動物中でのコレステロールのエステル化に必要とされる酵素（ＡＣＡＴ）に相同的であるので、これら２つのタンパク質は、エルゴステロールのエステル化にとって必要であり（Ｓｔｕｒｌｅｙ，２０００）、コレステロールのエステル化におそらく必要である。
【実施例３】
【００９５】
ヒト起源のΔ２４−２５還元酵素を発現するためのプラスミドの構築（プラスミドｐＹＥＳ＿Ｄｅｌｔａ２４）
本プラスミドの構築は、Ｗａｔｅｒｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１によって記載された。この構築では、デルタ２４ステロール還元酵素をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳＡＲＬ，Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）中で、ｐＧＡＬ１プロモーターの調節下及びｔＣＹＣ１ターミネーターの調節下に置く。このプラスミドは、Ｅ．コリ／Ｓセレビシアエシャトルプラスミドであり、２ミクロンの複製起点及びＵＲＡ３遺伝子を含有しており、酵母中での該プラスミドの複製を可能とし、このプラスミドで形質転換された酵母の選択を容易にする。
【００９６】
さらに、ＧＡＬ１プロモーターは、ガラクトース誘導性である。
【実施例４】
【００９７】
Δ７−還元酵素を発現するＡ．サリアナを発現するプラスミドｐＡＧ１の構築
単一コピーベクター上で、Ａ．サリアナのデルタ７−還元酵素の発現のために特別にプラスミドを構築した。この構築のために、プラスミドｐＡＭ１を使用した。このプラスミド（その構築は、ＰＣＴ出願ＷＯ０２／０６１１０９号に記載されている。（この出願の実施例９．ｂを参照。この出願は、参照により、本出願中に組み込まれる。）は、自己複製配列と動原体（ＡＲＳ  ＣＥＮ）を基礎としたＥ．コリ／Ｓ．セレビシアエシャトルプラスミドである。選択マーカーは、ＡＤＥ２遺伝子である。このプラスミドは適合性であり、従って、２ミクロン複製起点に基づくプラスミドと同時に複製することが可能である。このプラスミドは、特に、上記ＰＣＴ出願に記載されているように、発現カセットをクローニングするための唯一のＮｏｔＩ部位を有する。
【００９８】
ＣＡ１０株に由来するＡ．サリアナのデルタ７−還元酵素発現カセットをクローニングするために、この部位を使用した。実際、この発現カセットは極めて有効であり、同じくＥＲＧ５が破壊されているＣＡ１０が、主なステロールとしてカンペステロール（エルゴスタ−５−エノール）を産生することを可能とする（Ｄｕｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。デルタ７−還元酵素遺伝子を含有するＣＡ１０株のゲノムＤＮＡ断片は、以下のプライマーを用いて増幅される。
【００９９】
【化２】
2007535960.tif 000003
【０１００】
Ａｄａｍｓら（Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍ，１９９６）によって記載されているように、迅速フェノール／クロロホルム抽出技術によって調製されたＣＡ１０株のゲノムＤＮＡに対して増幅を実施する。
【０１０１】
プライマーＯＳＡ７２及びＯＳＡ７７を用いた増幅のためのマトリックスとして、ＣＡ１０ゲノムＤＮＡ５０ｎｇを使用する。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及び酵素的条件は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から得られる。増幅条件は、以下のとおりであった。９５℃で５分間の初期変性、その後、続いて、９５℃での３０秒間の変性、５０℃での３０秒間のハイブリダイゼーション、次いで、７２℃で１分間の伸長からなる３０サイクルを実施した。７２℃での１０分間の最終伸長によって、反応を停止する。
【０１０２】
次いで、ＮｏｔＩ酵素を用いてＰＣＲ断片を消化し、アガロースゲル上で精製した後、プラスミドｐＡＭ１の唯一のＮｏｔＩ部位中に、慣用の方法でクローニングする。このようにして得られた化合物は、ｐＡＧ１と名付けられた。
【０１０３】
これは、Ａ．タリアナのデルタ７−還元酵素を酵母中で発現するための単一コピーベクターであり、デルタ７−還元酵素遺伝子がＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーターの調節下に配置されている（Ｌｅｃａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【実施例５】
【０１０４】
分析のための、酵母中の遊離ステロール及びエステル化されたステロールの抽出：
１）酵母中の遊離ステロール及びエステル化されたステロールを抽出するための条件（手順１）
ａ）遊離ステロールを抽出するための条件：
ガラスチューブ中で、脱イオン化及びろ過された水５００μＬにより細胞ペレットを２回洗浄する。
【０１０５】
次いで、チューブ中の液体１５０μＬに対応する、０．５ｍｍのガラスビーズを含有する水５００μＬ中に細胞を再懸濁する。
【０１０６】
ボルテックス上で、１０分間激しく撹拌しながら、１，２−ジクロロエタン２ｍＬで抽出を２回行う。最初の抽出後、２つの相を分離するために、１５００ｇで５分間、細胞、ガラスビーズ及び溶媒の混合物を遠心する。
【０１０７】
２つの連続する抽出から得られた２つの有機画分を合わせて、窒素流の下で、数時間乾燥させる。高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって分析するために、アセトニトリル１００μＬ中にステロール抽出物を懸濁し（Ｓｚｃｚｅｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、又はガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析のためにヘキサン１００μＬ中に懸濁する（Ｄｕｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０１０８】
ｂ）総ステロールを抽出するための条件：エステル化されたステロールの鹸化及び抽出、定性的分析手順１：
精製された水５００μＬ中に、細胞ペレットを再懸濁する。メタノール中の１０％水酸化カリウムＫＯＨ２ｍＬを、この懸濁液に添加する。閉鎖されたチューブ中、６０℃で１時間、混合物を加熱する。インキュベーション後、チューブが周囲温度に戻ったら、ヘキサン２ｍＬで、混合物を３回抽出する。各抽出間で、１５００ｇでの５分間の遠心によって、２つの相を分離する。各抽出後、新しいチューブ中に有機相を移し、次いで、３つの有機相を合わせた後、窒素流の下で乾燥させる。
【０１０９】
高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって分析するために、１００％アセトニトリル１００μＬ中にステロール残留物を再懸濁し（Ｓｚｃｚｅｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、又はガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析のためにヘキサン１００μＬ中に再懸濁する（Ｄｕｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０１１０】
２）定性分析のために、酵母中の遊離ステロール及びエステル化されたステロールを抽出するための条件（手順２）
凍結乾燥された細胞５００ｍｇを得るために、炭素源として２％グルコースを加えた富栄養培地（バクトペプトン１０ｇ／Ｌ及び酵母抽出物１０ｇ／Ｌ）中で、前記株を培養する。ＫＯＨ１ｇ及びピロガロール少量を含有するメタノール３ｍＬ（１００％）中に、これらの乾燥された細胞を採取し、次いで、９０℃で４５分間、混合物をインキュベートする。周囲温度まで戻った後、ヘキサン５ｍＬでステロールを抽出する。有機相を、同じ容量を有する３つの試料に分け、空気流の下で乾燥させる。ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）及びガスクロマトグラフィー／質量分析ＧＣ／ＭＳによる分析のために、抽出されたステロールの試料のうち２つをヘキサン１００μＬ中に採取し、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）研究のために、３つ目の試料をメタノール１５０μＬ中に採取する。
【実施例６】
【０１１１】
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による、酵母中の遊離ステロール及びエステル化されたステロールの分析：
１）  ＦＩＤ（炎イオン化検出）を用いたガスクロマトグラフィー
手順１（実施例５  １）  ａ）及びｂ）参照）に従って、ヘキサン中に懸濁された（遊離又は総）ステロール抽出物を調製する。ステロール混合物（一般的には、１０ないし５０ｎｇ／μＬの濃度のコレステロール）に、注入対照を添加する。
【０１１２】
次いで、以下の条件下で、ガスクロマトグラフィー装置上に試料１から３μＬまでを注入する。Ａｌｌｔｅｃｈ  ＳＥ３０タイプのカラム（カラム参照：３０ｍ×０．３２ｍｍ  ＩＤＸ０．２５μｍ）上に、１ないし３μＬを注入した。気体ベクターはヘリウムである。分割比は、５０と８０の間である。カラムヘッドの圧力は３０ｐｓｉである。インジェクターは２８０℃に設定する。カラムの初期温度は、０．５分間、１３０℃である。温度は、４０℃／分の速度で２３０℃まで増加し、次いで、３℃／分の速度で２３０℃から２８０℃まで増加する。次いで、カラムを２９０℃に維持する。検出器の温度は３１０℃である。
【０１１３】
２）質量分析を連結した、ＦＩＤ（炎イオン化検出）を用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）（ＧＣ／ＭＳ）
手順２に従って、ヘキサン中に懸濁された総ステロール抽出物を調製する。使用したＧＣには、長さ３０メートル及び直径０．２５ｍｍである慣用のＤＢ５カラムとともに慣用の「スプリット／スプリットレス」注入口が装着されている。
【０１１４】
注入は、２ｍＬ／分の流速で、ヘリウムを気体ベクターとして、２３０℃で実施する。カラムは、４段階で、１３０から２９０℃になる。カラムは、注入前には１３０℃に維持され、次いで、４０℃／分の傾斜で２３０℃まで増加し、次いで、３℃／分の傾斜で２３０℃から２８０℃まで、次いで、３０℃／分の傾斜で２８０℃から２９０℃まで増加する。カラムは、５分間、２９０℃を保つ。
【０１１５】
次いで、ガスクロマトグラフィーカラムの排出口で、Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒのＴｕｒｂｏ  Ｍａｓｓタイプの装置のイオン化チャンバーなどのイオン化チャンバー中において、スプレー質量分析を用いて分子を分析する。高エネルギーの電子ビームによって、分子を断片化する。次いで、四重極フィルター上で、様々な断片を分離した後、イオン検出器上で検出する。Ｍ＋イオンの断片化の全産物の質量を含む質量スペクトルは、イオン電流グラフ上に位置する各質量に対応する。カラム上で所定の保持時間で得られたこの質量スペクトルを断片化された産物のライブラリーと比較し、Ｑｕａｉｌとｋｅｌｌｙによってステロールについて記載されている断片化された産物のライブラリーとも比較する（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．５３  Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｅｖａｎｓ；  Ｍ，  Ｑｕａｉｌ  ａｎｄ  Ｓ，  Ｋｅｌｌｙ  “Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｙｅａｓｔ”ｐｐ  １２３−１３１  （１９９６））。
【０１１６】
このようにして、ＷＧＩＦ０１株中でのＥＲＧ６遺伝子の検出の効果を実証し、特に、エルゴスタ−８，２４（２８）−ジエノールの不存在及び２４（２５）位に二重結合を有するコレスタ型のステロールの存在を実証することができた。
【実施例７】
【０１１７】
ＵＶ検出又は質量分析による検出を用いた高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による、酵母中の遊離ステロール及びエステル化されたステロールの分析
１）ＵＶ検出ＨＰＬＣによる分析：
（アセトニトリル又はメタノール中に懸濁され、手順１又は２（実施例５参照）に従って調製された）ステロール抽出物１０ないし３０μＬを、Ｘ  ｔｅｒｒａ  ＲＰ１８タイプ４．６×１００ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ０１７５７  ＵＳＡ）上に注入する。
【０１１８】
分離は、０．０２％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）（緩衝液Ａ）及び純粋なアセトニトリル（緩衝液Ｂ）を含有する水から構成されるグラジエントで、分離を行う。分析の間、カラムは６０℃に維持される。
【０１１９】
使用したＨＰＬＣ装置は、「Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ」タイプ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ０１７５７  ＵＳＡ）のＨＰＬＣ装置である。ＵＶ検出は、２０６ｎｍから３５０ｎｍまでの波長をカバーするダイオードアレイ検出器で実施した。緩衝液Ａ（アセトニトリル）２０％（ｖ／ｖ）と緩衝液Ｂ（０．０２％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含有する水）８０％とを含有する緩衝液でカラムを平衡化した。緩衝液Ａ５０％及び緩衝液Ｂを含有する溶液から線形グラジエントが形成される。１０分後に、溶出緩衝液の組成は、緩衝液Ａが２５％、緩衝液Ｂが７５％である。次いで、３０分の時点で、グラジエントが緩衝液Ｂ  １００％の値に達するように、新たな線形グラジエントが適用される。カラムを清浄にするために、この値を５分間維持する。
【０１２０】
２）ＨＰＬＣによる分析、質量分析による検出（ＨＰＬＣ／ＭＳ）：
質量分析による分析の場合、分析の間、試料を３０℃に維持し、カラムを６０℃に維持する。使用したＨＰＬＣ装置は、「Ｗａｔｅｒｓ  ＭｉｃｒｏＭａｓｓ  ＺＱ」質量検出器に連結された「Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＴ  Ｗａｔｅｒｓ  ２７９０」タイプのＨＰＬＣ装置である。先述の検出方法とは異なり、溶出緩衝液ＡはＴＦＡを全く含有しないが、２つの緩衝液Ａ及びＢは、ギ酸０．０１％（ｖ／ｖ）を含有する。
【０１２１】
緩衝液Ａ’（ギ酸０．０１％（ｖ／ｖ）を含有する水）８０％及び緩衝液Ｂ’（ギ酸０．０１％（ｖ／ｖ）を含有するアセトニトリル）２０％を含有する緩衝液でカラムを平衡化した。
【０１２２】
注入は、これら２つの緩衝液を５０％含有する緩衝液から始まる。緩衝液Ａ’５０％及び緩衝液Ｂ’５０％を含有する溶液から、２つの傾斜を有する線形グラジエントが形成される。
【０１２３】
１０分後に、溶出緩衝液の組成は、緩衝液Ａ’が２５％、緩衝液Ｂ’が７５％である。次いで、グラジエントの傾斜は、２５分間の分析後に、緩衝液Ａ’１２．５％及び緩衝液Ｂ’８７．５％に達し、３０分で緩衝液Ｂ  １００％に達するように修正される。カラムを再生するために、この値を５分間維持する。
【０１２４】
正の電気スプレーイオン化スキャニングのために、「Ｗａｔｅｒｓ  ＭｉｃｒｏＭａｓｓ  ＺＱ」質量検出器を設定する。ｍ／ｚの値は、２９５と４５０の間にある。スキャニングのために「連続」収集モードを選択する。さらに、分析すべきステロールに対する天然の同位体存在量によって、全ての予測される質量で、「ＳＩＲ」モードでのシグナル抽出を平行して行う。ｍ／ｚが１単位異なる分子からの妨害なしに完全に分割できるように、検出器を設定する。スキャニングに相当する総収集時間及び全てのＳＩＲの収集のための総時間が２秒未満に保たれるように、全ての収集をパラメーター化する。
【実施例８】
【０１２５】
１３Ｃ標識あり又はなしのステロール含量を分析するための酵母株の培養：
通常のＤ−グルコース又はＤ−グルコース−Ｕ−１３Ｃ６の２％を含有するＫａｐｐｅｌｉ培地（Ｋａｐｐｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）５０ｍＬの容量中で、分析すべき株を培養した（標識実験については、図１０を参照）。
【０１２６】
出発培地の光学密度は、６００ｎｍで０．１である。２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃の温度で７２時間、この培地をインキュベートする。
【０１２７】
次いで、６００ｇで１０分間の培地の遠心によって細胞を回収する。次いで、実施例５に記載されている分析技術によって、細胞ペレットを直接分析する（ガラクトースでの誘導を必要としない研究の場合）。
【０１２８】
しかしながら、デルタ７−還元酵素及びデルタ２４−還元酵素の発現の誘導の速度論の研究の場合（プラスミドｐＹＥＳ＿Ｄｅｌｔａ２４及び／又はｐＡＧ１で形質転換された株）、２％ガラクトース（１３Ｃ炭素で標識されていない）を含有する新鮮なＫａｐｐｅｌｉ培地５０ｍＬ中にペレットを再懸濁する。
【０１２９】
２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃の温度で、この培地をインキュベートする。
【０１３０】
培養の０時間、２時間、４時間、８時間及び２４時間後に、培地１０ｍＬを回収する。
【０１３１】
８００ｇで１０分間、これらの培養試料を遠心し、細胞ペレットを凍結し、実施例５に記載されている方法によるステロール抽出の前に−２０℃で保存する。
【実施例９】
【０１３２】
分析された株の中に存在するステロールの同定：
ステロールの同定は、以下の原理の組み合わせに基づいている。
【０１３３】
−カンペステロール（エルゴスタ−５−エノール）、エルゴステロール（エルゴスタ−５，７，２２−トリエノール）、コレステロール（コレスタ−５−エノール）、デスモステロール（コレスタ−５，２４−ジエノール）、コレスタ−５，２２−ジエノール及びジモステロール（コレスタ−８，２４−ジエノール）の場合に、ＧＣ、ＨＰＬＣ、ＧＣ／ＭＳ及びＨＰＬＣ／ＭＳによって、真正標準と挙動を比較。
【０１３４】
−ＨＰＬＣ及びダイオードアレイＵＶ検出による吸収スペクトルの分析（実施例７−１参照）：
この方法によって、スペクトルに基づいて、ステロールの５つのクラスを明確に同定することが可能となる。１）クラスＳＡ１：非共役ジエン系、２）クラスＳＡ２：５，７−ジエン系の存在；３）クラスＳＡ３：２２，２４（２５）−ジエン系の存在；４）クラスＳＡ４：８，１４−ジエン系の存在；５）クラスＳＡ５：２２，２４（２８）−ジエン系の存在。クラスＳＡ３及びＳＡ５は、構造的な理由のため、共存することができない。クラスＳＡ２とＳＡ４は、生合成的な理由のために、共存することができず、クラスＳＡ２は、クラスＳＡ１、ＳＡ３、ＳＡ５の構造単位と組み合わされて、追加の複合スペクトルを形成し得る。
【０１３５】
−不飽和の各種類に、及びエルゴスタ又はコレスタ型の骨格の存在に伴う保持時間のシフトが概ね加算的であることに基づいて、ＧＣ及びＨＰＬＣ中で保持時間を分析する。この基準は絶対的なものではないので、同定の補助として、及び曖昧さを取り除くために使用されるが、単独で使用した場合には、誤りが生じる危険性がある。従って、他の基準と組み合わせて使用されるにすぎない。
【０１３６】
−スペクトルライブラリーと比較することが可能な分子質量及び断片化プロファイルを与える、ＧＣ／ＭＳ分析（実施例６−２参照）。
【０１３７】
−３−ヒドロキシステロールの場合には、分子質量−１７（プロトン化（＋１）及び水分子の喪失（−１８））に主要なシグナルを与えるＨＰＬＣ／電気スプレー−ＭＳ分析（実施例７−２参照）
−生合成の様々な点で破壊された様々な参照酵母株のステロール組成の、上記全ての系を用いた分析
−様々な生合成酵素を用いた相補中のステロール組成の変動の分析及びこの相補の誘導中におけるこの相補の速度論の分析
−炭素−１３同位体を有する様々なステロールの標識のためのプロファイルの分析。
【０１３８】
−ある保持時間でＨＰＬＣによって分離されたステロールのＵＶスペクトルの分析。２つの５，７−共役二重結合は、２６５と２８０ｎｍの間に２つの吸収ピークを有する典型的なスペクトルを示すのに対して、２つの２２，２４−共役二重結合は、２３５ｎｍに吸収ピークを示す。最後の８，１４−共役、二重結合は、２４５ｎｍの吸収ピークによって同定することが可能である。
【実施例１０】
【０１３９】
ＢＭＡ６４株の中に存在するステロールの同定：
ステロールの定量的及び比較的分析のために、Ｄ−グルコース２％を含有するＫａｐｐｅｌｉ培地５０ｍＬの容量中でＢＭＡ６４株を培養する。
【０１４０】
出発培養物の光学密度は、６００ｎｍで０．１である。２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃の温度で７２時間、この培養物をインキュベートする。
【０１４１】
次いで、６００ｇで１０分間、培地を遠心することによって細胞を回収し、実施例５に示されている技術によって細胞ペレットを分析する。記載されている様々な分析によって、この株によって産生されるステロールを同定することが可能となる。
【０１４２】
この株は、その遊離ステロールの８０％超を、エルゴステロール（エルゴスタ−５，７，２２−トリエノール）の形態で蓄積することがこのようにして決定された（図８参照）。他の微少な検出可能な２つのステロールがこの株によって産生される。これらは、エルゴスタ−５，７−ジエノール（ＥＲＧ５遺伝子の産物に対する基質）（１２％）及びジモステロール（エルゴスタ−８，２４−ジエノール）（５％）である。コレステロールの痕跡は全く検出できない（この方法の検出の限界は、観察可能なステロールの約０．５％である。）。（総ステロールの分析においてのみ）少量のラノステロールも検出可能である。
【実施例１１】
【０１４３】
ＷＧＩＦ０１株の中に存在するステロールの同定：
ステロールの定量的及び比較的分析のために、Ｄ−グルコース２％を含有するＫａｐｐｅｌｉ培地（Ｋａｐｐｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）５０ｍＬの容量中でＷＧＩＦ０１株（実施例１参照）を培養した。
【０１４４】
出発培養物の光学密度は、６００ｎｍで０．１である。２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃の温度で７２時間、この培養物をインキュベートする。
【０１４５】
次いで、６００ｇで１０分間、培地を遠心することによって細胞を回収し、実施例５に示されている技術によって細胞ペレットを分析する。記載されている様々な分析によって、この株によって産生されるステロールを同定することが可能となった。
【０１４６】
クロマトグラム中での、エルゴスタ−５，７，２２−トリエノール（エルゴステロール）又はエルゴスタ−５，７−ジエノールの探索は、質量分析に連結されたＨＰＬＣでは否定的である（ＢＭＡ６４で得られた値の０．５％未満）。遊離ステロールに関しては、この株は、ＥＲＧ６遺伝子の産物に対する基質である総ジモステロール（コレスタ−８，２４−ジエノール）の５０％、並びに、それぞれ、コレスタ−５，７，２４−トリエノール及びコレスタ−５，７，２２，２４−テトラエノール（おそらくは、親株中でエルゴスタ−５，７−ジエノール及びエルゴスタ−５，７，２２−トリエノールをもたらすものと同じ合成機序から生じる。）の３０％及び２０％を蓄積する（図３及び８参照）。ＥＲＧ６ｐ酵素（Ｓ−アデノシルメチオニンデルタ２４ステロールＣ−メチル−転移酵素）は、コレスタ−８，２４（２５）−ジエノールをエルゴスタ−８，２４（２８）−ジエノールへと変換するので（図２参照）、このことは、生合成経路がｅｒｇ６のレベルで遮断されていることを明確に示している。この蓄積は、ＷＧＩＦ０１株がｅｒｇ６遺伝子の機能的コピーを保有していないことを明確に示している。酵母中のエルゴステロールに対する正常な生合成経路、特に、ステロール８，７−イソメラーゼ、ステロール５−デサチュラーゼ及びステロールデルタ２２−デサチュラーゼが、かなり残存している活性を有するコレスタ型基質を変換することが可能であることも、この結果は示している。
【実施例１２】
【０１４７】
ＷＧＩＦ０２株の構築及びこの株中に存在するステロールの同定：
Δ２４−還元酵素発現カセットを有するプラスミドｐＹＥＳ２（ｐＹＥＳ＿Ｄｅｌｔａ２４、実施例３参照）によるＷＧＩＦ０１株の形質転換によって、ＷＧＩＦ０２株を得た。ウラシルを欠く培地上でクローンを選択し、手順１を用いて、これらの形質転換体のステロールを分析することによって、Δ２４−還元酵素ｃＤＮＡの存在及び発現を確認する（実施例５−１参照）。
【０１４８】
ＷＧＩＦ０１株とは異なるステロールプロファイルを有していたので、ＷＧＩＦ０２と名付けられたクローンを選択した。さらに、さらなるステロールが、コレステロールの保持時間と類似する保持時間を有していた（図７参照）。ステロールの定量的及び比較的分析のために、Ｄ−グルコース２％を含有するＫａｐｐｅｌｉ培地（Ｋａｐｐｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）５０ｍＬの容量中にＷＧＩＦ０２株を培養する。
【０１４９】
出発培養物の光学密度は、６００ｎｍで０．１である。２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃の温度で７２時間、この培養物をインキュベートする。
【０１５０】
次いで、６００ｇで１０分間、培地を遠心することによって細胞を回収し、実施例５に示されている技術によって細胞ペレットを分析する。記載されている様々な分析によって、この株によって産生されるステロールを同定することが可能となった。
【０１５１】
その質量、その保持時間及びその共役二重結合によって、コレスタ−５，７，２２−トリエノールとして同定された新しいピーク（図２、３及び７）の出現を除いて、ＷＧＩＦ０１株及びＷＧＩＲ０２株に対する２つのステロール抽出物プロファイルは類似している。この化合物の存在は、コレスタ−５，７，２２，２４（２５）−テトラエノールの２４（２５）位中の二重結合に対する、２４，２５−ステロール還元酵素活性の存在が予想されることを示唆している。さらに、ＷＧＩＦ０２株中へのコレスタ−５，７，２２−トリエノールの出現とともに、コレスタ−５，７，２４−トリエノールの量が減少している（図７及び８）。ＷＧＩＦ０１株中では３０％に相当し、ＷＧＩＦ０２では僅かに１２％に相当するコレスタ−５，７，２４−トリエノールの変換によって、この酵素の活性が実証され、その差、すなわち１８％は、ＷＧＩＦ０２株中では、完全に、コレスタ−５，７，２２−トリエノールの形態である。デルタ２４−還元酵素によるコレスタ−５，７，２４の変換の産物が、ＷＧＩＦ０２中には存在しないコレスタ−５，７であり、従って、定量的にコレスタ−５，７，２２へと変換される限りにおいて、これは予想外の結果である。これは、別の予想外の結果、すなわち、コレスタ−５，７がステロール２２−デサチュラーゼに対する基質であるのに対して、ＷＧＩＦ０１株に対するステロールプロファイルによれば、コレスタ−５，７，２４は優れた基質でないということを示している。
【実施例１３】
【０１５２】
ＷＧＩＦ０３株の構築及びこの株中に存在するステロールの同定
プラスミドｐＡＧ１でＷＧＩＦ０１株を形質転換することによって、ＷＧＩＦ０３株を得た。Ｅ．コリとＳ．セレビシアエとの間のこのシャトルプラスミドは、Δ７−還元酵素に対する発現カセットを保有しており、この酵素の対応するｃＤＮＡは、ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーターの調節下にある。塩化リチウム技術によって、ＷＧＩＦ０１株を形質転換し、アデニンを含有しない培地上で、形質転換体を選択した。正しいクローンのステロールプロファイル中にコレスタ−５，２４（２５）−ジエノールが出現することによって、デルタ７−還元酵素の発現を確認した。これらの基準を満たすクローンを、より具体的に選択し、ＷＧＩＦ０３と名付けた。
【０１５３】
ステロールの定量的及び比較的分析のために、Ｄ−グルコース２％を含有するＫａｐｐｅｌｉ培地（Ｋａｐｐｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）５０ｍＬの容量中でＷＧＩＦ０３株を培養した。
【０１５４】
出発培養物の光学密度は、６００ｎｍで０．１である。２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃の温度で７２時間、この培養物をインキュベートする。
【０１５５】
次いで、６００ｇで１０分間、培地を遠心することによって細胞を回収し、実施例５に示されている技術によって細胞ペレットを分析する。記載されている様々な分析によって、この株によって産生されるステロールを同定することが可能となった。
【０１５６】
（ＷＧＩＦ０３株を与えるための）ＷＧＩＦ０１株中でのデルタ７−ステロール還元酵素の発現は、デルタ２４−ステロール還元酵素の発現とは異なり、この株のステロールプロファイルに多大な変化をもたらし、コレスタ−５，７，２２，２４−テトラエノール、コレスタ−７，２４−ジエノール及びコレスタ−８，２４−ジエノールがほぼ完全に消滅する。
【０１５７】
この活性は、コレスタ−５，２４−ジエノール又はデスモステロールとして以前に記載されているように同定された主要ピークの出現も特徴とする。コレスタ−８，２４−ジエノールの量は、１２から４８％まで変化する。ＷＧＩＦ及びＷＧＩＦ０３株の場合、それぞれ、検出されたコレスタ−５，７，２４−トリエノールは、３０から３％まで変化し、検出されたコレスタ−５，７，２２，２４−テトラエノールは２３から４％まで変化する。これらの観察は、ステロールの側鎖によって保有される飽和の性質とはほぼ独立した様式で、ステロールデルタ７−還元酵素がコレスタ−５，７−ジエノールを還元することを予想外に示している。この結果は、ステロールデルタ２４−還元酵素で観察された結果とは逆である。予想外のことに、ステロールデルタ７−還元酵素の発現は、コレスタ−５，７−ジエノールと一緒に移動する分子の蓄積（１２％）ももたらす。しかしながら、この分子がコレスタ−５，７−ジエノールである可能性は、不可能ではないが、比較的低いようであり、コレスタ−５，７−ジエノールの理論的なレベルは、これらの条件下では減少し、増加しないはずである。コレスタ−５，２２，２４−トリエノールが少量（８％）出現することも興味深い。後者のステロールは、ＷＧＩＦ０３株中での主要なステロール（６０％）であるコレスタ−５，２４−ジエノール（ステロールデルタ７−還元酵素による、コレスター５，７，２４−トリエノールの還元によって生じる。）に対するステロール２２−デサチュラーゼの作用の予想される産物である。コレスタ−５，２２，２４−トリエノールの少量の蓄積は、コレスタ−５，２４−ジエノールがステロール２２−デサチュラーゼに対する優れた基質でないことを予想外に示している。ＷＧＩＦ０２株で得られた結果により（実施例１２参照）、２４位中の不飽和の存在によって（コレスタ−５，２４−ジエノール又はコレスタ−５，７，２４−トリエノール）、ステロール２２−デサチュラーゼがステロールを代謝することが困難になるものと推測することができる。従って、２４位が不飽和のコレスタを、エルゴスタへと変換するＥＲＧ６ｐ酵素の作用は、ＥＲＧ５遺伝子（２２−デサチュラーゼ）に対する不良な基質を、優れた基質へと変換する。
【実施例１４】
【０１５８】
ＷＧＩＦ０４の構築及びこの株中に存在するステロールの同定
塩化リチウム技術によってプラスミドｐＡＧ１でＷＧＩＦ０２株を形質転換することによって、ＷＧＩＦ０４株を取得し、アデニン及びウラシルを含有しない培地上で、形質転換体を選択した。次いで、コレステロール蓄積の検出に基づいて、正しい形質転換体を確認した。これらの基準を満たすクローンを、より具体的に選択し、ＷＧＩＦ０４と名付けた。登録番号Ｉ−３２０３で、２００４年４月２２日に、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，  ２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，  Ｆｒａｎｃｅにある、微生物の培養の国立収集所（ＣＮＣＭ；Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］）にＷＧＩＦ０４株の試料を寄託した。
【０１５９】
ｐＹＥＳ＿Ｄｅｌｔａ２４でＷＧＩＦ０３株を形質転換し、同じ選択を適用することによって、ＷＧＩＦ０４と区別できない株を取得することも可能である。
【０１６０】
ステロールの定量的及び比較的分析のために、Ｄ−グルコース２％を含有するＫａｐｐｅｌｉ培地５０ｍＬの容量中でＷＧＩＦ０４株を培養した。
【０１６１】
出発培養物の光学密度は、６００ｎｍで０．１である。２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃の温度で７２時間、この培養物をインキュベートする。
【０１６２】
次いで、６００ｇで１０分間、培地を遠心することによって細胞を回収し、実施例５に示されている技術によって細胞ペレットを分析する。記載されている様々な分析によって、この株によって産生されるステロールを同定することが可能となった。
【０１６３】
コレステロールは、ＷＧＩＦ０４株の遊離ステロールの２５％に相当する（図９参照）。この株中でのコレステロールの形成は、真正な標準との同時移動によって、並びにＧＣ／ＭＳ及びＨＰＬＣ／ＭＳの両方で確認することによって、ＧＣ及びＨＰＬＣ中で独立に実証される。デルタ７−還元酵素及びデルタ２４−還元酵素を同時に発現しない全ての株で、コレステロールは検出できない（総ステロールの０．５％未満）。
【０１６４】
ｅｒｇ６遺伝子中に破壊を有しない株は、コレステロールを産生することが可能であるが、これは、総遊離コレステロールの５％未満に相当する。このため、ｐＹｅｓ＿Ｄｅｌｔａ２４及びｐＡＧ１で同時形質転換されたＢＭＡ６４から得られたＢＭＡ６４−ｐＹＥＳ＿Ｄｅｌｔａ２４−ｐＡＧ１株を構築することが可能であった。この株はコレステロールを産生し、コレステロールは総ステロールの数％に相当する。
【０１６５】
ＣＡ１０株は、プラスミドｐＹＥＳ＿Ｄｅｌｔａ２４で形質転換した。この株もコレステロールを産生し、コレステロールは総ステロールの数％に相当する。
【０１６６】
さらに、コレステロールの形成には、デルタ７−還元酵素及びデルタ２４−還元酵素プロモーターの誘導が明らかに必要であることを実証することができた（図４及び５参照）。これらの遺伝子を含有する株は、誘導の不存在下でコレステロールを産生しない。図５は、約２４時間の誘導後に、コレステロールのレベルが最大に達することを示している。コレステロール（コレスタ−５−エノール）の形成と平行して、コレスタ−５，２２−ジエノールの形成も観察される。図４及び図５の分析は、後者の化合物の形成が、誘導後に、コレステロールの形成よりさらに素早く起こることを示しており、誘導前にさえ開始することを示している（図５Ａ：ｍ／ｚ＝３６７参照）。しかしながら、この株が２つのプラスミドｐＡＧ１及びｐＹＥＳ＿Ｄｅｌｔａ２４を保有していなければ、この化合物は完全に存在しない。従って、２２−デヒドロコレステロールの形成は、コレステロール形成のプロセスよりさらに迅速なプロセスであるが、このプロセスには、誘導後に急速に消滅する前駆体が伴い、コレステロールの形成に対する余地が残される。コレステロールは、Δ２４−還元酵素を介してコレスタ−５，２４から、又はΔ７−還元酵素を介してコレスタ−５，７から形成されることが可能である。コレスタ−５，７−ジエノールはコレスタ−５，７，２２−トリエノールへと直ちに変換されるという事実のために、コレスタ−５，７−ジエノールは蓄積できないということが本実施例において示された。従って、誘導時には存在せず、２４時間付近で減少する前に、誘導の４ないし８時間付近で蓄積するコレスタ−５，２４−ジエノールが、コレステロール源である（図５）。コレスタ−５，２４−ジエノールの事前の合成が必要なので、このことは、コレステロールの遅い出現を説明する。逆に、コレスタ−５，２２−ジエノールに対する２つの前駆体となり得るのは、コレスタ−５，７，２２−トリエノール及びコレスタ−５，２２，２４−トリエノールである。誘導の開始時には、後者は存在しない（図４）のに対して、前者は存在し、次いで、コレスタ−５，２２−ジエノールの形成の安定化と平行して急速に減少する。このことから、コレステロール源は、Δ２４−還元酵素による５，２４−ジエノールの還元であるのに対して、コレスタ−５，２２−ジエノールの形成は、Δ７−還元酵素による５，７，２２−トリエノールの還元から生じると結論付けてもよい。コレステロールに対するΔ２２−デサチュラーゼの作用を用いたコレスタ−５，２２−ジエノールの形成は、完全に問題にならないわけではないが、速度論の長い時点（２４ｈ）におけるコレスタ−５，２２−ジエノールと比べて、コレステロールが優先的に蓄積されることに基づき、主要なプロセスでないと思われる（図４及び５）。
【実施例１５】
【０１６７】
コレステロールに対する生合成経路の最適化、Δ２２−デサチュラーゼの役割：
ＷＧＩＦ０４株に対する２４時間のオーダーの誘導時間の場合、コレスタ−５，２２−ジエノールの蓄積は、遊離ステロールに関して、コレステロールの蓄積の約５０％に相当する（図４）。Δ２２−デサチュラーゼ遺伝子の破壊は、コレステロール産生を最適化するための選択肢である。Δ２２−デサチュラーゼ（ｅｒｇ５遺伝子）とｅｒｇ６遺伝子が二重に破壊され、且つΔ７−還元酵素とΔ２４−還元酵素を発現する株の構築を完全に想定することができる。Δ２２−デサチュラーゼの破壊、Δ７−還元酵素の発現及びΔ２４−還元酵素の発現というサブセットを保有する株を作製した。塩化リチウム技術によってプラスミドｐＹＥＳ＿Ｄｅｌｔａ２４でＣＡ１０株を形質転換することによって、及びウラシルに関する原栄養性について選択することによってこの株を取得した。得られた株をＣＡ１０／Δ２４と名付けた。
【０１６８】
Δ２４ステロール還元酵素を発現するＣＡ１０株は、コレステロールを比較的少量産生し（図６及び７参照）、主に、エルゴスタ−５−エノールを蓄積し、エルゴスタ−５，７−ジエノールの中間量を蓄積する。コレスタ−５，７−ジエノールの蓄積は、このような株では極めて少量であり、ｅｒｇ６遺伝子の破壊が、コレスタ系列の誘導体の大量蓄積にとって不可欠であることを示している。従って、Δ２４−還元酵素の活性は、驚くべきことに、ｅｒｇ６遺伝子の産物の活性と比較的僅かに競合する。従って、これらの結果から、コレステロールの産生を最適化するためには、ｅｒｇ５及びｅｒｇ６遺伝子の同時破壊が重要であると結論付けてもよい。
【０１６９】
ＷＧＩＦ０４株中のｅｒｇ５遺伝子の破壊によって、当業者は、コレステロールの産生をかなり増加させることが可能であろう。このような株の実現可能性は、ＷＧＩＦ０４及びＣＡ１０／Δ２４株の構築によって、及び、この株が先行する２つの株から産生されるべき明らかな遺伝子の組み合わせに過ぎないという事実によって確定される。ＷＧＩＦ０４から得られたデータは、Δ２４−還元酵素が発現されると（ＷＧＩＦ０３を用いて得られた結果及びＷＧＩＦ０４を用いて得られた結果を比較して）、コレスタ−５，２４が急速に消滅することを示している。このことから、ｅｒｇ５及びｅｒｇ６遺伝子が同時に破壊され、且つΔ７−還元酵素とΔ２４−還元酵素を同時発現する株において、コレステロールが極めて効率的に合成され得ることを予想することが可能となり、その後、コレステロールは唯一の最終ステロールとなる。
【０１７０】
結論として、総ステロールの２０％以上の閾値でコレステロールを産生するための最小要件は、ｅｒｇ６遺伝子の破壊並びにΔ７−還元酵素及びΔ２４−還元酵素の発現である。Δ２２−デサチュラーゼの相補的破壊によって、コレステロールの生産性を向上させ、最終ステロールとして、コレスタ−５，２２−ジエノールが寄生的に形成されないようにすることが可能となるであろう。
【実施例１６】
【０１７１】
コレステロールの同位体標識及び同位体サインの定義：
標識されたコレステロールの生産原理は、図１０に記載されている。この操作では、まず、３０℃で７２時間培養する間、１３Ｃで完全に標識されたグルコース上で酵母を増殖する。
【０１７２】
次いで、６００ｇでの１０分間、培地を遠心することによって、細胞を回収する。次いで、１３Ｃ炭素で標識されていない２％ガラクトースを含有する新鮮なＫａｐｐｅｌｉ培地５０ｍＬ中に細胞ペレットを懸濁する。ガラクトースに切り替えてから２時間、４時間、８時間又は２４時間後に、培養を停止し、ステロールを抽出し、次いで分析する（実施例７参照）。グルコースからガラクトースへの切り替えによって、Δ７−還元酵素遺伝子及びΔ２４−還元酵素遺伝子の両方を調節するＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーターが誘導される。同時に、炭素源の同位体標識の変化が存在する。代謝中間体の新規合成、次いで、コレステロールを含むステロールの合成が行われ、標識の漸次の変化を含む。標識のこの変化は、各中間ステロールの質量プロファイルによって特徴付けることが可能である。実際に、各１３Ｃ原子の取り込みは、１原子質量単位（ＡＭＵ）の質量シフトを誘導する。このため、例えば、標識の程度に応じて、３８６から４１３ダルトンまでのモル質量を有するコレステロールが現れる。正の電気スプレーイオン化を用いてたＨＰＬＣ−質量分析による分析では、これは、３６９から３９６までのｍ／ｚ（質量／電荷）値に相当する（イオンＭ＋Ｈ＋−Ｈ２Ｏ、すなわち、Ｍ＋１−１８＝３８５−１７＝３６９）。ＨＰＬＣ中でのステロールの保持時間は、標識の程度に、検出可能には依存しない。単一のステロール「Ｘ」に対応するＨＰＬＣピークの質量スペクトルは、質量分布に対応する（この質量分布は、従って、標識後の様々な時点で合成されたステロール「Ｘ」に対する質量分布の重ね合わせ（合計）である。）。従って、これは、複雑だが（図１１）、実験的に完全に測定可能であり、同時に、以下に依存するユニークな同位体サインを呈するプロファイルである。
【０１７３】
−１）標識プロトコール、並びに、特に、１２Ｃグルコース及び１３Ｃガラクトースを用いた培養時間及び条件、
−２）使用した菌株の正確な遺伝的構造、
−３）培養を停止する正確な時間。
【０１７４】
この同位体プロファイルは、幾つかのユニークな特性を有する。
【０１７５】
−１）溶媒条件、使用される株及び選択されるステロールを調整することによって、所望に応じて調節することが可能である。従って、特有の標識登録を作製することが可能である。
【０１７６】
−２）「組み合わせ可能」である、すなわち、それら自体調節可能である同位体プロファイルで標識された幾つかの特有のステロールに対応するに対応する幾つかの同位体サインは、「分子アルファベット」を形成するために組み合わせることが可能である。
【０１７７】
−３）再現性があり、プロファイルの再現性を示す二重又は三重プロットを実験的に測定することが容易（図１１及び１２参照）。
【０１７８】
−４）単離が容易で、安定、無色及び無臭、不揮発性及び無毒であり、食物、医薬品、添加物又はヒトによって同化されることが可能な他の製品中に取り込まれることができる分子追跡混合物に相当する。
【０１７９】
−５）特異的な組換え株並びに極めて正確な標識、培養及び抽出条件を有することなしに改ざんすることができない。さらに、同位体サインが明らかとなっても、同位体サインの作製を可能とするパラメータへ遡ることはできない。
【０１８０】
要約すれば、本発明を使用することによって、改ざんが不可能で、且つあらゆる種類の製品（消耗品を含む。）中に取り込むことが可能な一般的用途のための「同位体アルファベット」を容易に取得することが可能である。標識プロファイルとステロールの様々な種類の両方を使用することによって、このようなアルファベットから構成することが可能な実質的に無限の数の「同位体ワード」が存在する。従って、最も多様な製品中にこのようなサインを取り込むことは、例えば、一旦、知られてしまえば再現が可能となるＤＮＡサインとは異なり偽造が不可能な特有の標識方法を構成する。さらに、サインは、例えば、レーザーイオン化後の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦなど）によって、非破壊的に読み取ることが可能である。
【実施例１７】
【０１８１】
１３Ｃで高度に標識された非動物性コレステロールの作製：
ステロール分析について上記した条件下でＷＧＩＦ０４株を培養するための非標識炭素源に代えて、１３Ｃガラクトース又は１３Ｃエタノール及びグルコースを使用することによって、（１３Ｃ炭素を少なくとも９５％含む）極めて高度に標識されたステロール、特に、コレステロールを合成することが可能となる。同じアプローチによって、１４Ｃ放射性ステロール及びコレステロールの調製も可能である。この方法は、例えば、ＲＩＡアッセイ用に、１３Ｃ−標識又は１４Ｃ−標識されたステロイドを生産するために、ステロイド、特にヒドロコルチゾン（特許出願ＷＯ０２／０６１１０９号を参照）を産生する酵母株中に導入することも可能である。
【実施例１８】
【０１８２】
主にコレステロールを産生する株の構築：
ＣＤＲ０７  Ｍａｔａ株は、ＷＯ０２／０６１１０９号に公開されている特許出願に記載されており、ＣＮＣＭにおいて、登録番号Ｉ−２６１６で、２００１年１月２４日に、ブダペスト条約の規定に従って、ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，  Ｆｒａｎｃｅにある、微生物の培養の国立収集所（ＣＮＣＭ；Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］）に寄託した。
【０１８３】
ＣＤＲ０７  ＭＡＴａ株（関連マーカー：ａｄｅ２：：ＧＡＬ１０／ＣＹＰ１ｐ：：Δ７；ｅｒｇ５：：ＰＫＧ１ｐ：：ｈｙｇｒｏＲ；ＥＲＧ６）を、実施例１に記載されているＷＧＩＦ０１株（相対マーカー：ＥＲＧ５；ｅｒｇ６：：ＴＲＰ１）と掛け合わせた。
【０１８４】
二倍体の芽胞形成後、実施例６に記載されているように、コレステロールの前駆体であるデスモステロールを産生する芽胞を発見するために、芽胞のステロール組成を決定する。ＰＣＲ分析によって示されるように、機能的ＴＲＰ１遺伝子を有し、及びアラビドプシス・サリアナのΔ７−還元酵素ｃＤＮＡを担持するデスモステロールを産生する芽胞を、このようにして同定した。さらに、ＹＩＭ５９と称されるこの株は、ハイグロマイシンに対して感受性であり、ＥＲＧ５遺伝子が機能的であることを示している。
【０１８５】
実施例６及び９に記載されているとおりに調製されたステロール調製物は、このＹＩＭ５９株がジモステロール及びデスモステロールと同じ保持時間を有するステロールを産生することを示した。ＹＩＭ５９株は、アデニン、ロイシン、ウラシル及びヒスチジンに対して栄養要求性であることも示した。デスモステロールの存在は、この株がステロールΔ７還元酵素を発現すること、及びこの株が非機能的ｅｒｇ６対立遺伝子を保有することを示す。
【０１８６】
ヒトＤＨＣＲ２４の発現のレベルを改善する目的で、ＤＨＣＲ２４  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を修飾した。開始ＡＴＧでの翻訳を改善させるために、ＤＨＣＲ２４の発現を調節するプロモーターも修飾した。選択された新たなプロモーターは、プラスミドｐＹＥＳ＿Ｄｅｌｔａ２４のＧＡＬ１誘導性プロモーターに対する置換として、シトクロムｃ１のＣＹＣ１プロモーターである（実施例３参照）。
【０１８７】
ＣＹＣ１プロモーターとの融合物として、ＤＨＣＲ２４還元酵素の末端ＮＨ２に対応する配列を、以下のように修飾した。
【０１８８】
【化３】
2007535960.tif 000004
【０１８９】
小文字は、ＡｔｔＢ１組換え配列がその後に続き、次いで、開始ＡＴＧの前にＡＡＡＡ配列が先行するＣＹＣ１プロモーターの部分的ヌクレオチド配列を表す。最初の２つのコドンの配列も修飾した（ＡＴＧ開始コドン後の配列ＧＡＡ−ＣＣＴ）。
【０１９０】
ＣＹＣ１プロモーターの調節下にあるＤＣＨＲ２４  ｃＤＮＡを保有し、Ｓ．セレビシアエの２μ複製起点及びＵＲＡ３−ｄ選択マーカーも保有する最終プラスミドをｐＩＭ３３１と称した。ＤＨＣＲ２４  ｃＤＮＡを持たないその同等物をｐＩＭ３０３と称した。
【０１９１】
プラスミドｐＩＭ３０３及びｐＩＭ３３１によって、ＹＩＭ５９株を独立に形質転換し、プラスミドｐＩＭ３０３（ＹＩＭ５９／ｐＩＭ３０３株）又はｐＩＭ３３１（ＹＩＭ５９／ｐＩＭ３３１株）を保有する２つの形質転換体を、より具体的に選択する。
【０１９２】
６００ｎｍで４０の吸光度を達成するために、Ｋａｐｐｅｌｉタイプの再構成された富栄養培地中、２８℃で７２時間、これらの株を培養する。ＹＩＭ５９／ｐＩＭ３０３株（ＤＨＣＲ２４  ｃＤＮＡを保有していない。）の、及びＹＩＭ５９／ｐＩＭ３３１株（ＤＨＣＲ２４  ｃＤＮＡを保有している。）の総ステロール抽出物（エステル化されたステロール及び遊離ステロール）が、メタノール性の水酸化カリウムの存在下で産生される（実施例５及び６参照）。これら２つの株がコレステロールを産生する能力について検査する。結果の幾つかが（ＧＣ）、図１３に示されている。表示されている保持時間は、２つのクロマトグラム上で、分で表されている。
【０１９３】
このように、ＤＨＣＲ２４（ＹＩＭ５９／ｐＩＭ３０３株）の発現用ベクターを保有しない株はコレステロールを産生しないが（パートＡ）、主にデスモステロール（パートＡ）を産生することを示すことができた。逆に、ＤＨＣＲ２４  ｃＤＮＡ（ＹＩＭ５９／ｐＩＭ３３１株）を保有する株は、コレステロールの保持時間を有するステロールを産生する（パートＢ）。電子衝撃質量分析に連結されたガスクロマトグラフィーの技術によって（実施例６に記載されているように）、このステロールが実際にコレステロールであることを実証することができた。ステロールピークの各々の表面積を用いて、ＹＩＭ５９／ｐＩＭ３３１株によって産生されたコレステロールの量がステロールの５７％であることを推測することができた。
【０１９４】
生物学的材料の寄託
ブダペスト条約の規定に従って、２００４年４月２２日に、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，  Ｆｒａｎｃｅにある、微生物の培養の国立収集所（ＣＮＣＭ）（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］）に、以下の生物を寄託した。
【０１９５】
−登録番号Ｉ−３２０３で寄託されたＷＧＩＦ０４株。
【０１９６】
記載されている全ての刊行物及び特許は、参照により、本出願中に組み込まれる。
【０１９７】
【表１】
2007535960.tif 000005
2007535960.tif 000006
【０１９８】
【表２】
2007535960.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】コレステロールの化学式、並びに様々な炭素に付番するために一般的に使用される命名法及び様々な環の名称。コレステロール分子の４つの環は、それぞれ、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤと名付けられており、炭素には、１から２７までの番号が付番されている。
【図２】天然酵母又は改変された酵母における、エルゴスタ及びコレスタ類のステロールに対する生合成経路の後半部分を簡略化したスキーム。本スキームは、網羅的ではないが、本文書に明記されている酵素が関与する段階を確定することが可能である。ＥＲＧ２ｐ、ＥＲＧ３ｐ、ＥＲＧ５ｐ及びＥＲＧ６ｐタンパク質は、真菌又は酵母タンパク質であるのに対して、デルタ−７Ｒｅｄ（デルタ−７ステロール還元酵素）及びデルタ−２４（２５）Ｒｅｄ（デルタ２４−（２５）ステロール還元酵素）タンパク質は哺乳動物又は植物に由来する異種タンパク質である。
【図３】ＢＭＡ６４株から得られた株の遊離ステロールの比較されたＨＰＬＣプロファイル（２０６ｎｍでＵＶ検出）及びこれらのステロールの同定。調べた株は、以下のとおりである。ＷＧＩＦ０１（ｅｒｇ６遺伝子が破壊されたＢＭＡ６４株（実施例１参照））、ＷＧＩＦ０２（ｅｒｇ６遺伝子が破壊されており、Δ２４還元酵素を発現するＢＭＡ６４株、実施例１２）、ＷＧＩＦ０３（ｅｒｇ６遺伝子が破壊されており、Δ７還元酵素を発現するＢＭＡ６４株、実施例１３）、ＷＧＩＦ０４（ｅｒｇ６遺伝子が破壊されており、Δ７還元酵素及びΔ２４還元酵素を発現するＢＭＡ６４株、実施例１４）。Ｃ５：コレスタ−５−エノール（コレステロール）；Ｃ５，２２：コレスタ−５，２２−ジエノール；Ｃ５，２４：コレスタ−５，２４−ジエノール（デスモステロール）；Ｃ８，２４：コレスタ−８，２４−ジエノール（ジモステロール）；Ｃ５，７，２２：コレスタ−５，７，２２−トリエノール；Ｃ５，７，２４：コレスタ−５，７，２４−トリエノール；Ｃ５，２２，２４：コレスタ−５，２２，２４−トリエノール；Ｃ５，７，２２，２４：コレスタ−５，７，２２，２４−テトラエノール；ｌａｎ：ラノステロール。
【図４】ガラクトースでの誘導から０、２、４、８及び２４時間後の、ＷＧＩＦ０４株（ｅｒｇ６遺伝子が破壊され、且つΔ７−還元酵素とΔ２４−還元酵素を発現しているＢＭＡ６４株、実施例１４）の遊離ステロールの比較されたＨＰＬＣプロファイル（２０６ｎｍでＵＶ検出）。Δ：ＷＧＩＦ０１株（実施例１）。ＷＧＩＦ０４株については、炭素源をガラクトースに切り替えた後０、２、４、８及び２４時間後に試料を採取する。ｅｒｇ６破壊を有するＢＭＡ６４株（ＷＧＩＦ０１）に対して提示されているプロファイルは、ガラクトースに切り替えた直後に得られたプロファイルである。このプロファイルは、誘導中（０−２４時間）、実質的に変化しない状態を保つ。２０６ｎｍでの吸収シグナルは、ステロールごとに変化する吸光係数に対応する。Ｃ５：コレスタ−５−エノール（コレステロール）；Ｃ５，２２：コレスタ−５，２２−ジエノール；Ｃ５，２４：コレスタ−５，２４−ジエノール（デスモステロール）；Ｃ８，２４：コレスタ−８，２４−ジエノール（ジモステロール）；Ｃ５，７，２２：コレスタ−５，７，２２−トリエノール；Ｃ５，７，２４：コレスタ−５，７，２４−トリエノール；Ｃ５，２２，２４：コレスタ−５，２２，２４−トリエノール；Ｃ５，７，２２，２４：コレスタ−５，７，２２，２４−テトラエノール；ｌａｎ：ラノステロール。
【図５】ガラクトースによる誘導から０、２、４、８及び２４時間後における、正のイオン化電気スプレー検出（質量分析）を用いた、ＷＧＩＦ０４株の遊離ステロール（実施例１４）の比較されたＨＰＣＬプロファイル。Δ：ＷＧＩＦ０１株。Ｃ５：コレスタ−５−エノール（コレステロール）；Ｃ５，２２：コレスタ−５，２２−ジエノール；Ｃ５，２４：コレスタ−５，２４−ジエノール（デスモステロール）；Ｃ８，２４：コレスタ−８，２４−ジエノール（ジモステロール）。ＨＰＬＣプロファイルは、図４のアッセイと同一のアッセイから得られる。図５Ａ（左）：ｍ／ｚ＝３６７で検出、図５Ｂ（右）：ｍ／ｚ＝３６９で検出。ｙ軸：計数されたイオンの数／秒。ｘ軸：分で表した溶出時間。
【図６】３つの株：ＷＧＩＦ０１、デルタ２４ステロール還元酵素に対する発現プラスミドを有するＣＡ１０及びＷＧＩＦ０４に対する、ＨＰＬＣによるｍ／ｚ＝３６９でのプロファイルの詳細。内部標準として、コレステロールが注入されている。３つの株に対して注入された総ステロールの量は、６００ｎｍでの吸光度によって測定された培養の同一量に対して実施された抽出に対応する。
【図７】ＷＧＩＦ０１（ｅｒｇ６の欠失）、ＷＧＩＦ０２（ｅｒｇ６の欠失、Δ２４−還元酵素を発現）、ＷＧＩＦ０３（ｅｒｇ６の欠失、Δ７−還元酵素を発現）、ＷＧＩＦ０４（ｅｒｇ６の欠失、Δ２４−還元酵素及びΔ７−還元酵素を発現）及びＣＡ１０  ｐＹＥＳ＿Ｄｅｌｔａ２４（ＦＹ１６７９遺伝的背景、ｅｒｇ５の欠失、Δ２４−還元酵素、Δ７−還元酵素、ｅｒｇ５を発現）株の、ガスクロマトグラフィーによる、総ステロール（遊離及びエステル）の比較されたプロファイル。反応のスケール（炎イオン化電流）は任意である。これらのプロファイルは、株ごとに定性的にのみ比較すべきである。しかしながら、保持時間のスケールは、全ての株について同一である（保持時間は、分で表されている。）。ステロールは、本出願に記載されている基準に従って同定される。
【図８】ＵＶスペクトルに基づいて評価された、酵母株（ＢＭＡ６４（図８Ａ）、ＷＧＩＦ０１（図８Ｂ）、ＷＧＩＦ０２（図８Ｃ）及びＷＧＩＦ０３（図８Ｄ））中の主な遊離ステロールの定量的分布。分布は、図面に記されている全ての種（全ての種のみが大量に検出できる。）の％で表されている。中間体ステロールの幾つかに対する標準の不存在下において、以下に記されている評価された吸光係数を用いて、ＨＰＬＣクロマトグラムのピークの各々に付随するＵＶスペクトルに基づいて定量を行う（表１参照、吸光係数は、ｍＭ／Ｌ及び／ｃｍで表されている。）。これを実施するために、あるステロールの構造中に存在する不飽和構造単位に対応する吸光係数が表１中に求められ、ステロールの各種類の吸光係数を評価するために、（数個の単位が、同一分子中に存在する場合には）必要に応じて追加される。ＨＰＬＣによる各吸収シグナルから各ステロールの濃度を評価するために、２８０ｎｍの波長で吸収性である少なくとも１つの単位が存在する場合には、２８０ｎｍでの値を用いて評価を行い、これが不可能である場合には、波長２３５ｎｍを使用し、２３５ｎｍの波長での吸収が行われない場合には、２０６ｎｍの波長を使用する。
【図９】ＵＶスペクトルに基づいて評価が行われた、ＷＧＩＦ４酵母株中の主な遊離ステロールの定量的分布。定量は、図８に記載されている方法と同様に行われる。
【図１０】炭素源の置換による、ステロールの同位体標識の原理。
【図１１】誘導から４、８及び２４時間後にＷＧＩＦ０４株中で産生されたコレステロールに対する同位体標識プロファイルの評価。遊離ステロールを抽出し、記載されているとおりにＨＰＬＣによって分離する。溶出の間、０．２秒ごとに、ｍ／ｚ３００とｍ／ｚ＝４５０の値の間で質量分析を収集する。ついで、１．８秒の時間枠にわたってこれらのスペクトルを平均した後、検討されているベクトルに応じて０と１の間を変化する各炭素上での標識確率を有する、分子の２７の位置の各々に存在する炭素１３のランダムな取り込みにつき、標識されたコレステロールの理論的質量分布を代表する２４のベクトル群を、独立した選択によって、回帰の基礎として使用する多重線形回帰に供する。基礎として使用される様々なベクトルに対する標識確率は、その基礎の２つの連続するベクトルの分布に対する相互相関係数が０．９２であるように選択される（基礎は、炭素１２上の全ての位置において、１００％の存在確率に対応するベクトルから始まる。）。多重線形調整は、最小二乗統計基準に基づいて行われ、ガウス法（最大数値フィルタリング）の偏導関数の積の行列の非対角項をゼロにする。分析後、次いで、最適化された基礎に対して、質量スペクトルを再構築する。従って、図面に表されている曲線は、最大振幅を値１００に標準化した後の、フィルタリングされた最適な再構築の結果を表している。  各誘導時間について、２つの曲線は、１．８秒異なる溶出時間に対応し、及びコレステロール溶出ピークの中央ゾーンに位置するスペクトルに対応する２つの独立したプロファイルを表している。図は、分析が高度に再現性があることを示している。
【図１２】様々なステロール又は様々な誘導時間を有する様々な同位体サインの例。図１１と同じ計算及び表現であるが、様々なステロール及び様々な誘導時間に対する。ＲＴの値は、計算に対して使用された保持時間（分）の範囲を示している。この範囲に対する値は、以下のとおりである。  図１２Ａ：ＲＴ＝１２．２５−１２．４２、  図１２Ｂ：ＲＴ＝１２．２−１２．７、  図１２Ｃ：ＲＴ＝１２．２５−１２．３５、  図１２Ｄ：ＲＴ＝１３．３−１３．６。  誘導時間は、８又は２４時間である。  ｍ／ｚの値は、ｍ／ｚの値の左及び右限界を表す。各ボックスに対するｍ／ｚの最小値は、完全に炭素１２から構成されたステロールに対するｍ／ｚに対応する。
【図１３】ガスクロマトグラフィーにおける、ＹＩＭ５９／ｐＩＭ３０３株（図の部分Ａ）及びＹＩＭ５９／ｐＩＭ３３１株（図の部分Ｂ）の総ステロール（遊離及びエステル）の比較されたプロファイル（実施例１８参照）。応答のスケールは任意である。保持時間のスケールは、両株について同一である（保持時間は、分で表されている。）。ステロールは、本出願に記載されている基準に従って同定される。
【図１】
2007535960.tif 000008
【図２】
2007535960.tif 000009
【図３】
2007535960.tif 000010
【図４】
2007535960.tif 000011
【図５】
2007535960.tif 000012
【図６】
2007535960.tif 000013
【図７】
2007535960.tif 000014
【図８】
2007535960.tif 000015
【図９】
2007535960.tif 000016
【図１０】
2007535960.tif 000017
【図１１】
2007535960.tif 000018
【図１２】
2007535960.tif 000019
【図１３】
2007535960.tif 000020
【配列表】
2007535960000001.xml
【国際調査報告】
2007535960.tif 000023
2007535960.tif 000024
2007535960.tif 000025
2007535960.tif 000026
2007535960.tif 000027
2007535960.tif 000028
2007535960.tif 000029
2007535960.tif 000030