(57)【要約】  本発明は、細胞外マトリックスが損傷される場合に組織の修復および再生を容易にするための方法および新規化合物に関する。具体的に、β１インテグリンの結合は、その機能活性の調節を提供し、細胞外マトリックス同化作用のアップレギュレーションをもたらすことが示される。したがって、本発明は、肺、皮膚、肝臓および骨などの多くの系において組織再生を容易にすることができる方法および新規化合物を提供する。特に、ＪＢ１ａ抗体と成熟β１インテグリンのアミノ酸残基８２〜８７の部位との結合は、記載の組織修復効果を仲介するのに特に有効であることが示される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織修復を促進する方法であって、修復を必要とする組織に、β１インテグリンの機能を調節する化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
化合物は、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）バランスを調節する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物は、アポトーシスを調節する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アポトーシス活性の調節は、結果として起こるメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）バランスにおける調節を有する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
組織修復で使用するのに適している化合物を同定するためのアッセイ方法であって、前記アッセイは、
−候補化合物を準備するステップと、
−候補化合物をβ１インテグリンと接触させるステップと、
−候補化合物によるβ１インテグリン活性の調節の有無を決定するステップと
を含み、β１インテグリン活性の調節は、組織修復におけるその化合物の有用性を示すアッセイ方法。
【請求項６】
β１インテグリン活性の調節は、ＭＭＰレベルの変動をモニターすることによって評価される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
β１インテグリン活性の調節は、結果として起こるアポトーシスに対する調節によって評価される請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
化合物は、β１インテグリンの機能を調節し、調節には、β１インテグリンの機能の変化、すなわち切り出しが含まれる請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
化合物は、成熟β１インテグリン分子の配列のアミノ酸残基８２〜８７の領域でβ１インテグリン分子と結合する請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
化合物は、配列番号１のアミノ酸配列、ＴＡＥＫＬＫと結合する請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
化合物は、合成ペプチドである請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
化合物は、抗体である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
化合物は、ヒト化またはキメラ抗体である前記請求項６〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
損害組織を治療するための医薬品の調製におけるβ１インテグリンと結合する化合物の使用。
【請求項１５】
化合物は、抗体である請求項１２に記載の化合物の使用。
【請求項１６】
抗体は、市販のクローンＪＢ１ａによって産生されるモノクローナル抗体である請求項１３に記載の化合物の使用。
【請求項１７】
請求項５の方法によって同定される化合物。
【請求項１８】
組織修復で使用するための医薬組成物であって、組成物には、活性成分として、β１インテグリンの機能を改変する化合物が含まれる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、細胞外マトリックスが分解された組織を修復する方法および組織を修復するための化合物に関する。より詳細には、本発明は、細胞外マトリックス同化作用を高める抗体を含む化合物および細胞外マトリックス同化作用を高めるために治療に使用することができる化合物を同定するための新規経路の同定に関する。
【発明の背景】
【０００２】
細胞外マトリックス：組成および構造
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、タンパク質、糖タンパク質およびプロテオグリカン（ＰＧ）の複雑な複合体である。この複雑性の認識は、ＥＣＭ成分が、個別に、または互いにもしくは他の細胞外分子と協調して、細胞の生物学、さらには細胞が包埋されている全構造の生理学に深く影響を及ぼしていることが認識されたことによって強められてきた。これまで記載されているＥＣＭの機能は数多いが、細胞増殖の制御として単にカテゴリー化されることがあり、構造上の支持および物理的安定化を提供し、細胞分化に影響を及ぼし、発生を指揮し、代謝応答を調整する（４２）。
【０００３】
ＰＧは、不均質でかつ遺伝的に無関係な分子のファミリーである。フルタイムメンバーならびにパートタイムメンバーの数は、絶えず増加している。用語「フルタイム」および「パートタイム」は、一部の既知ＰＧは、糖タンパク質として存在することがあり、一部のタンパク質は、グリコシル化体として見いだされることがあるという事実を指す。一般に、ＰＧは、１本または複数のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖がＮまたはＯ結合によって共有結合しているコアタンパク質で構成されている。ＧＡＧは、二糖類の反復配列でできている高度にアニオン性の直鎖状ヘテロ多糖である（５３）。しかしながら、ＧＡＧ側鎖を欠くＰＧが報告されている（４；１０６）。ＧＡＧは、それらの化学組成に基づき、４つの異なるカテゴリーに分類することができる（５３）。第一のカテゴリーは、交互にあるガラクトサミンおよびグルクロン酸／イズロン酸単位からなるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸（ＣＳ／ＤＳ）である。群を抜いて最も構造的に多様である第二のクラスは、交互にあるグルコサミンおよびグルクロン酸／イズロン酸反復からなるヘパリン／ヘパラン硫酸（Ｈ／ＨＳ）グループである。第三のタイプは、ケラタン硫酸（ＫＳ）ＧＡＧを含有するグルコサミンおよびガラクトースである。ヒアルロン酸（ＨＡ）は、グルコサミンおよびグルクロン酸反復で構成される。ヒアルロン酸は、硫酸化されておらず、ＰＧのコアタンパク質と共有結合していないことから、最も異なるＧＡＧである。その代わり、ＰＧコアタンパク質とのＨＡの結合は、細胞表面上および細胞内で、ＥＣＭ中に存在するＨＡ結合タンパク質として知られるある種のタンパク質によって仲介される（９３）。
【０００４】
パールカンは、３本のＨＳ鎖を有することが知られているコアタンパク質サイズが４００〜４５０ｋＤａの大きなＨＳＰＧである。パールカンは、Ｈａｓｓｅｌｌ他（４４）によって初めて単離された。パールカンは、ロータリーシャドウイング電子顕微鏡における弦の上の真珠のように見えるその外観からその名前を得た。パールカンは、大きなマルチドメインタンパク質であり、したがって、最も複雑な遺伝子産物の１つである（２３；５２）。ドメインＩはＮ末端であり、ヘパラン硫酸の重合を容易にする酸性アミノ酸残基を含有している（５２）。しかしながら、組換えドメインＩは、ＨＳ鎖またはＣＳ鎖を受け入れることが分かっており、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）およびウシ胎仔血清に応答して合成されるＰＧの特徴を明らかにし、パールカンをＣＳ鎖で合成することができることを示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって裏付けられている知見である（１３）。Ｅｔｔｎｅｒ他（２６）は、ＥＣＭ糖タンパク質ラミニンが、双方ともＨＳ側鎖を持つことができるパールカンのドメインＩおよびドメインＶと結合することを明らかにした。ＨＳ鎖の欠如により、結合しなくなった。
【０００５】
球状ドメインＩＩは、相同性により、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体によるリガンド結合を仲介すると想定された（３０；７９）。ヘパリチナーゼ処理は、この相互作用を阻止し、ＨＳ  ＧＡＧ側鎖が、結合に関与している事実を示している（３０）。
【０００６】
パールカンのドメインＩＩＩは、インテグリン受容体に対する結合能力を提供し、細胞に足場を提供するＲＧＤトリペプチド配列を含む（１８）。Ｙａｍａｇａｔａ他は、二重免疫蛍光を用い、パールカンが、培養線維芽細胞中でインテグリンと共存することを明らかにした（１０４）。このドメインは、ラミニン短腕と相同的であることも分かっている（５１）。
【０００７】
ドメインＩＶは、接着分子のＩｇスーパーファミリーに見いだされるものと類似した一連の免疫グロブリン（Ｉｇ）様反復を含むパールカンの最大のドメインであり、このドメインが分子間相互作用において機能しているという推測に導いている（４７）。最後に、ラミニンの長腕と相同的な３個の球状ドメインを有するドメインＶは、自己組織化およびラミニン仲介性細胞接着を担っていると考えられている（１４）。
【０００８】
パールカンの構造ドメインが多数であり多様であることは、その潜在的機能を示している。パールカンは、ラミニンおよびインテグリンとの結合の他に、そのコアタンパク質を介してフィブロネクチンと結合することが分かっている（５１）。また、パールカンのＨＳ鎖は、多様であることが判明している極めて重要な機能的役割を有する。パールカンは、ＨＳ  ＧＡＧ側鎖を介し、骨格筋細胞とコラーゲンＩＶとの相互作用を仲介することが報告されている（９８）。最近の研究は、腎臓におけるＬ−セレクチンに対するリガンドとしてのパールカンの同定および特徴付けをもたらした（６５）。この相互作用が、コアタンパク質および／またはＨＳ側鎖を介するか否かは不明である。Ｖａｒｋｉのグループは、一連の実験において、Ｅ−セレクチンではなくＬ−とＰ−セレクチン双方のリガンドとして内皮細胞からＨＳ  ＧＡＧならびにヘパリンを同定した（５９；８０）。一般に、ＨＳ側鎖、特にパールカンコアタンパク質に結合しているＨＳ側鎖は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）−２、ＦＧＦ−７、ＴＧＦ−β、血小板第４因子および血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）などの成長因子と結合することが知られている（３１；５２）。これらの相互作用の機能的意義は、血管新生（５；８７）、平滑筋細胞増殖の制御（１０）ならびに基底膜の成熟および維持（１９）におけるパールカンの役割を示す多くの研究によって強調されている。パールカンの機能的重要性は、パールカン遺伝子発現を欠くマウスの研究によって明らかにされている（１９）。ホモ接合ヌルマウスは、胎令の１０日目と１２日目の間に死亡した。心筋などの高い機械的ストレスに通常からさらされている基底膜は、それらの完全性を失い、結果として、心筋中に小さな裂け目が形成され、心嚢における出血および心停止をもたらした。また、ホモ接合体は、通常は基底膜を欠く組織であるにもかかわらず、軟骨異形成を特徴とする重症の軟骨欠損を有した。この知見は、軟骨におけるパールカンの潜在的なタンパク質分解保護機能として解釈された（１９）。Ｅ１０までの異常を検出する際の遅れは、基底膜ＨＳＰＧコラーゲンＸＶＩＩＩ（３８）およびアグリン（３６）などの、パールカンの代わりをすることができる代償性分子によるある種の重複機能を示唆している。
【０００９】
現在まで、大きな集合性ＰＧは、４種のメンバー、すなわちバーシカン、アグリカン、ニューロカンおよびブレビカンで構成される（５２）。これらのＰＧの特徴は、ヒアルロン酸と結合して高度に水和された集合体を形成する能力である。また、それらのＰＧは、ＨＡ結合が生じるＮ末端ドメイン、ＧＡＧ側鎖を持つ中央ドメインおよびレクチン結合Ｃ末端で構成されるそれらのトリドメイン構造を特徴とする。
【００１０】
バーシカンは、最初はヒト線維芽細胞から単離されたコアタンパク質が２６５〜３７０ｋＤａのＰＧであり、トリＰＧ−Ｍの相同体である（１１０）。バーシカンは、ＣＳの１０〜３０本の鎖を有することがあり、ＫＳ  ＧＡＧ鎖を持つことも報告されている（１０９）。バーシカンは、ケラチノサイト、血管の平滑筋細胞、脳および腎臓のメサンギウム細胞によって発現される。Ｎ末端ドメインは、バーシカンのヒアルロン酸結合特性を担っている（６１）。バーシカンの中央ドメインは、ＧＡＧ結合サブドメインであるＧＡＧ−αおよびＧＡＧ−βからなる。これらのサブドメインは、２つの選択的にスプライシングされたエキソンによってコードされ、様々なバーシカンアイソフォームを生み出す。今日まで、４つのアイソフォームが認められている。Ｖ０は、ＧＡＧ−αとＧＡＧ−βを共に含む。Ｖ１およびＶ２は、それぞれドメインＧＡＧ−βおよびＧＡＧ−αを有することが知られている（１０９）。Ｖ３は、２種のサブドメインのどちらも含まない変異体であるため、ＣＳ／ＤＳ  ＧＡＧ側鎖を持たず、様々な哺乳類組織中に局在している（６３；８２；１０５）。バーシカンの第三のドメインは、Ｃ末端であり、レクチン結合ドメイン、ＥＧＦ様ドメインおよび補体制御タンパク質様ドメインからなる。このＣ末端は、ＥＣＭ糖タンパク質、テネイシン（３）、ヘパリンおよびヘパラン硫酸（８８）ならびにフィビュリン（２）と結合する。バーシカンは、間葉性軟骨形成に対する阻害作用を有していることが知られており（１０８）、増殖（１０７）および細胞表面と結合したヒアルロン酸との相互作用を介する細胞周囲マトリックスの形成を介する移動（２７）を促進する。細胞周囲マトリックスの形成は、ＨＡとのコアタンパク質の会合を介してばかりでなく、細胞骨格関連の細胞表面受容体ＣＤ４４とのＧＡＧ側鎖相互作用によっても行われる（５５）。移動におけるバーシカンの仮想的役割は、ＣＳ／ＤＳ  ＧＡＧ側鎖を介するＬ−セレクチンとＰ−セレクチン双方との相互作用に関する最近の知見によってもさらに強化されている（５６）。さらに、バーシカンＧＡＧ側鎖は、ケモカイン応答を調節し（４５）、最近では、成長因子結合能力（１１１）を有し、β１インテグリン（Ｗｕ，Ｃｈｅｎ他２００２  ３９４）と結合することが報告されている。
【００１１】
アグリカンは、別の大きな集合性プロテオグリカンである。アグリカンは、軟骨の主要な構造成分であることが知られている。アグリカンは、３つの球状ドメインおよび２つのＧＡＧ結合ドメインで構成される（１００）。Ｎ末端球状ドメイン（Ｇ１）は、ＨＡおよびリンクタンパク質と結合して大きな集合体を形成する。第二の球状（Ｇ２）ドメインは、アグリカンに特有であって、ＨＡ結合能力を持たない。このドメインの機能は、明確にされていない。Ｇ１とＧ２の間の球間ドメインは、メタロプロテイナーゼのためのタンパク質分解的切断部位を含み、したがって、骨関節症などのこのドメインの分解が特徴である病状において深く研究されている。ＫＳドメインは、Ｇ２ドメインのＣ末端に位置し、ＣＳドメインが続く。ＣＳドメインは、アグリカンの最大のドメインであり、アグリカンの水和ゲル様形成能力、したがって、荷重支持（ｌｏａｄ−ｂｅａｒｉｎｇ）機能におけるアグリカンの重要性に寄与するドメインである。最後のドメインは、３つのモジュール、すなわち上皮成長因子様ドメイン、レクチンモジュールおよび補体制御モジュールを含む球状ドメイン（Ｇ３）である。このドメインは、アグリカンとＥＣＭ糖タンパク質テネイシンとの相互作用を担っている。
【００１２】
細胞外マトリックスプロテオグリカンの機能
結合組織の機械的性質に寄与する他に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ＰＧは、特異的クラスの表面受容体を介して得られる生物学的機能を有する。２つの主なクラスは、シンデカンおよびインテグリン受容体ファミリーである（４２）。しかしながら、他の受容体も、糖タンパク質のセレクティングファミリーなどのＥＣＭ成分（８０）、その変異体すべてを含むＣＤ４４（３３）、ヒアルロン酸シンターゼなどの細胞表面酵素（８９）、およびＰＧ（５２）と結合することが記載されている。ＥＣＭの効果は、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境において、他の分子の影響なしには絶対に生じず、かつ生じえない。この陳述は、２つのよく述べられている概念に基づいている。一つ目は、成長因子、サイトカイン、ホルモンおよびビタミン、ならびに細胞間接触および物理的力の効果の一部がＥＣＭ産生の変化であるということである。第二の概念は、細胞に対するＥＣＭの効果が、上述の因子に応答して観察される効果と著しい類似性を有していることである。これは、「相互互恵性（ｍｕｔｕａｌ  ｒｅｃｉｐｒｏｃｉｔｙ）」（４２）として知られている現象であり、複雑なモジュール相互作用セットの単純化し過ぎた考え、すなわち、Ｈａｒｔｗｅｌｌ他（４３）によって定義されているように「相互作用分子の多くの種で構成されている「モジュール」によって行われる細胞機能」である。その結果は、非ベクトル的に互いに相互作用することが多いこれらのモジュールすべての総和である。
【００１３】
インテグリンは、細胞外接着分子と細胞内アクチン細胞骨格との間の動的結合を仲介するα、βヘテロ二量体受容体のファミリーである。インテグリンは、すべての多細胞動物によって発現されるが、それらの多様性は、種間で大きく異なる（４９；７３；９４）。今日まで、１９個のαおよび８個のβサブユニット遺伝子が、結合して２５種の異なる受容体を形成するポリペプチドをコードしている。インテグリンは、インテグリン機能の分子基盤および細胞基盤を検討する広範囲な研究の対象とされてきた。インテグリンは、組織の完全性の維持と細胞移動の促進の双方に対する主要な寄与物である。インテグリン−リガンド相互作用は、細胞粘着のための物理的支持、細胞運動における牽引力の発生を提供し、シグナル伝達複合体を組織化して分化および細胞運命などの細胞機能を調節する。ＰＧは、インテグリンと相互作用してそれらの機能を修飾する重要なＥＣＭ成分であるため、インテグリンは、ＥＣＭ  ＰＧの重要なレギュレーターである。
【００１４】
現在のところ、組織形成および細胞輸送、ならびに疾患におけるそれらのプロセスの調節の基礎をなす機構、およびインテグリン機能の分子基盤を決定する機構に関してはほとんど分かっていない。受容体内の異なる領域の機能を同定する情報は一切提供されていない。
【００１５】
多くの報告がβ１インテグリンに対する抗体を用いる機能修飾アプローチを用いてきたにもかかわらず、定義による機能修飾が不明瞭なままであるのは、限定された条件下での基質に対する接着の活性化または阻止に主に重点が置かれているためである。そのような定義の限界は明らかである。第一に、他の受容体と異なり、インテグリンは、不活性、活性および活性かつ被占状態で存在することがあるということを考慮に入れていない。第二に、機能調節は、様々なドメインを介して行われることが多いため、異なる下流細胞内シグナル伝達を必要とすることがあり、したがって、たとえ接着に対する効果が類似していても、各領域が異なる機能を有しているように見えるため、機能的最終転帰は異なることがある（２１；４８；４９；７２）。第三に、β１インテグリンは、４種の異なるスプライス変異体として存在し、その差は、細胞質ドメイン中にあるため、異なる下流シグナル伝達をほのめかしている。スプライス変異体間のシグナル伝達下流効果の差は、まだ明らかにされていない。したがって、機能修飾という用語の使用は、接着の「阻止」および「活性化」という用語が多くのインテグリンの唯一の機能を指すことから、上述の指摘を考慮に入れるのに最適である。
【００１６】
β１インテグリンのヘテロ二量体は、コラーゲン（α１、α２）、ラミニン（α１、α２、α３、α７、α９）およびフィブロネクチン（α３、α４、α５、α８、αｖ）と結合する。このヘテロ二量体は、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）などの分子にとっての細胞カウンター受容体として役割を果たすこともある。さらに、最近の報告は、β１インテグリンが、ＭＭＰ２（６４）およびＭＭＰ９（２８）などのメタロプロテイナーゼとも結合し、それらの活性化状態に影響を及ぼすことができることを明らかにした。両ＭＭＰは、細胞−マトリックス相互作用および恒常性のインテグリンシグナル伝達を妨げることにより、低酸素−再酸素化後のカスパーゼ仲介性脳内皮細胞死の一因となることが分かっている（７）。ＴＧＦβ１がβ１インテグリンと結合することも報告されている。
【００１７】
インテグリンのアウトサイドインシグナル伝達は、接着、増殖、生存、分化、および移動などの多くの細胞機能にとって不可欠である。特異的なＥＣＭ基質の利用能に加えて、インテグリン受容体ヘテロ二量体の数および種類は、どの細胞機能が影響を受けるかを決定する際に重要である。新たなインテグリンの合成および膜への挿入、細胞表面からの除去、またはそのどちらも、利用可能なインテグリン受容体数を制御するためのありうる機構である。新たな合成には、発現のアップレギュレーションおよび細胞質中で過剰のβ１と対をなす特異的α鎖を識別すること、および細胞表面上の正確な位置における新たなα／βヘテロ二量体の提示が必要とされる可能性があり、あまり標的とされる機構ではない。調節の代替法は、細胞表面における切断、すなわち切り出しである可能性があり、これは、特異的なインテグリン−ＥＣＭ接触を除去するための即効性の方法として、特異的機能を調節するためのより集中的な機構を提供するからである。さらに、切り出されたβ１断片は、細胞またはＥＣＭ成分と結合するか、あるいは、シグナル伝達ならびに細胞増殖およびリモデリングに関与する生物学的事象に関与する可能性がある。実際、筋細胞および線維芽細胞では、サイズおよび形状の変化が、細胞のＥＣＭとの接触に変化をもたらすことが分かっている。このことは、細胞表面からのβ１インテグリン断片の切り出しにつながる（３２）。
【００１８】
組織の損害および修復におけるβ１インテグリンの役割に関しては、梗塞を起こした心筋層において著しく活性化されることが分かっている。インテグリンβ１は、炎症および線維症の部位において特に活性である（９０）。インテグリンおよび細胞骨格関連の細胞質限局性接着タンパク質は、内皮創傷縫合のプロセスに関与することが示唆されており、抗β１インテグリン機能修飾抗体によるヒトの冠状動脈内皮細胞の治療は創傷縫合を亢進した（１）。他のｉｎ  ｖｉｖｏの証拠は、ケラチノサイトにおけるβ１インテグリンの欠如が、創傷治癒において重度の欠陥を引き起こすことを明らかにしている。β１ヌルケラチノサイトは、移動障害を示し、過増殖性上皮中に高密度に集まり、再上皮化の不全をもたらした。結果として、重要な創傷調節遺伝子の発現に劇的な変化をもたらす炎症反応の延長が見られた。最終的に、β１欠損上皮は、創傷床を覆ったが、上皮構築は異常であった。これらの知見は、創傷治癒におけるβ１インテグリンの重要な役割を示している（３７）。
【００１９】
アポトーシスは、障害が起きた細胞または過剰な細胞を除去する細胞死の形態である。アポトーシスは、外部の成長因子、生存因子、または死亡因子に対する活性応答を仲介する複数のシグナル伝達およびエフェクター経路によって制御される。細胞周期チェックポイント制御は、アポトーシス酵素カスケードと関係があり、これらのリンクおよび他のリンクの完全性は、癌などの多くの疾患において遺伝的に損なわれることがある。アポトーシスをよく表す特徴は、細胞形態の完全な変化であり、細胞は、収縮、クロマチンの辺縁趨向、膜のブレッビング、核凝縮と、次いで断片化、およびアポトーシス小体への分割を受け、貪食される。アポトーシス細胞におけるＤＮＡ断片化の後に、通常は数時間以内に細胞死および組織からの除去が続く。１日当たり２５％という早い組織退化率は、常に２〜３％に過ぎない細胞における見かけのアポトーシスから生じることは注目に値する。
【００２０】
β１インテグリンもアポトーシスに関係している（７６；７７；１０１）。ヒト神経芽腫細胞におけるβアミロイドタンパク質（β−ＡＰ）誘発性アポトーシスへのβ１インテグリンの関与（１２）。コラーゲンＩ型、フィブロネクチン、またはラミニンの存在下で、β−ＡＰ毒性は、大幅に低下した。この保護効果は、インテグリンによって仲介されているように見えるが、それは、β１およびα１インテグリンサブユニットを対象とする抗体による神経芽腫細胞のプレインキュベーションが、β−ＡＰ誘発性アポトーシスを大いに亢進したためである。
【００２１】
肝細胞におけるβ１−インテグリン受容体の活性の欠如は、コラーゲンとの接着を制御し、この接着能力の欠如より先行するように見えた。肝傷害血清と一緒に培養した細胞へのβ１−インテグリン抗体（ＴＳ２／１６）の添加は、コラーゲンとの接着を著しく増加させ、著しいアポトーシスを妨げた（７８）。しかしながら、この効果は、インテグリンβ１に対する抗体による実験から、コラーゲン−軟骨細胞相互作用がインテグリンβ１によって仲介され、これらの相互作用が、アポトーシスから軟骨細胞を保護することが示唆されることから、議論の余地があるように見える（１６）。
【００２２】
アポトーシスへの貢献に先立って、アポトーシス刺激によって開始されるシグナルは、インテグリンの活性化状態および／または利用能に加えて、細胞形状を変化させることがあり、死にかけている細胞周辺のマトリックス分解活性を促進すると想定されてきた。この経路は、ＥＣＭによって仲介される生存シグナル伝達を妨害し、したがって、細胞死プログラムを加速するかも知れない（６４）。
【００２３】
細胞外マトリックスの維持
ＥＣＭの恒常性は、正常な生理学的条件下において、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）および組織性メタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）の阻害剤によって指揮されている分解と合成の微妙なバランスによって維持されている。この恒常性は、胚発生、骨成長、神経成長、排卵、子宮退縮、および創傷治癒などの多くの生理学的プロセスに不可欠である。また、ＭＭＰは、関節炎（６６；７０；８４）、慢性閉塞性肺疾患（１７；９２）およびアテローム性動脈硬化症（６７）などの病理学的プロセスにおいて大きな役割を有している。しかしながら、ＭＭＰがどのようにして細胞の外側に固定されているかについてはほとんど知られていない。
【００２４】
機械力は、タンパク質合成、増殖、移動または生存などの様々な細胞機能を調節し、そうすることによって組織の構造および機能を調節することが知られている。機械力が細胞活性に影響を及ぼす経路は、メカノトランスダクションとして定義されており、テンセグリティー構造モデルおよびＥＣＭ結合分子を含む細胞表面機械受容器によるシグナル伝達が含まれる。テンセグリティー構造モデルは、細胞が、アクチンミクロフィラメントおよび中間体フィラメントによって、活動により発生する初期応力のレベルを維持していることを想定している（６８）。この活性応力要素は、圧縮に抵抗する構造、主に、細胞内の微小管およびＥＣＭの成分によってバランスを保っている。機械力に応答するマトリックスリモデリングは、軟骨および肺を含む機械感覚性組織におけるテンセグリティーを維持するための適応応答である。ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ知見は、最適な軟骨および肺の構造および機能を維持するためには機械的な刺激が必要であることを示している（８１；８１；９１；１０３）。したがって、機械力は、ＥＣＭ組成を調節し、相互互恵的に組織における機械的微小環境を修飾するはずである。この側面は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物学的機能を検討するための価値あるツールを提供した。
【００２５】
細胞外マトリックスの異化作用および同化作用
ＥＣＭは、体内のほとんどすべての器官に構造サポートならびに生物学的シグナルを提供する。肺において、ＥＣＭは、構造サポートを提供し、接着剤ならびに多様な生物学的プロセスを誘導する合図としての役割を果たす。コラーゲンは、肺における最も豊富なＥＣＭ成分であり、肺間質の６０〜７０％を構成し、エラスチン、ＰＧ、および糖タンパク質と続く（９６）。
【００２６】
器官のＥＣＭ組成は、様々な解剖学的部位と構造的部位とで異なる。
【００２７】
肺ＰＧは、最近になって特徴が明らかにされ始めている。パールカンおよびバーマカン（ｂａｍａｃａｎ）であると考えられているものは、すべての肺基底膜中に見いだされている（２０；７４）。ＳＬＲ−ＰＧのうち、ルミカンは、血管壁のＥＣＭ中で、それほどではないにせよ気道壁および肺胞中隔中で支配的であり、主に見いだされることが分かっている（２２）。免疫組織化学的研究は、極めて少量であるが、肺末梢部におけるビグリカンの存在と、そこで気道および血管壁と関係することを明らかにしている（９；２２；２４）。さらに、ビグリカンは、特に発生中の上皮細胞層と関係していることが分かった。デコリンは、気管軟骨に局在し、血管および気道、ならびに肺小葉間中隔を取り囲んでいる（９）。しかしながら、ウエスタン分析は、肺実質におけるデコリン発現が検出不可能であることを明らかにした（２２）。同様に、この研究では、フィブロモジュリン発現も検出不可能であることが分かり、その知見は、Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ−Ｔｈｏｒｓｓｏｎ他（１０２）によって、このＰＧに対する検出不可能なｍＲＮＡレベルによって裏付けられた。大きな集合性ＰＧであるアグリカンは、リンクタンパク質によって安定化されている複合体として、ＨＡを伴って気管軟骨中にのみ見いだされる（８５）。一方、バーシカンは、平滑筋細胞（９７）および線維芽細胞（５４）と関連して気道および血管壁中に少量見いだすことができ（２９）、エラスチン繊維と共存している（８５）。ＨＡは、気管軟骨（８５）、細気管支上皮の側底面ならびに血管および気道の外膜（３４；３５）中に見いだすことができる。ＨＡ受容体のＣＤ４４は、主に気道上皮および肺胞マクロファージによって発現される（５７；６２）。シンデカンは、肺胞上皮細胞によって多く発現されると報告されている（６９）。
【００２８】
疾患における細胞外マトリックスの重要性
細胞外マトリックス重要性の認識は、細胞外マトリックスが、細胞の生物学、したがって、機械的かつ生化学的に、細胞が包埋されている全構造の生理学に深く影響を及ぼしているという認識によって強められてきた。慢性閉塞性肺疾患において見いだされるように、臨床像の一部が異化作用対同化作用の不均衡によって助長される新規な治療的介入の開発への現実的な手がかりになる可能性がある。
【００２９】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、慢性気管支炎および肺気腫を含み、世界中で慢性罹患率および死亡率の主な原因である。英国において、ＣＯＰＤは、死亡の５番目に多い原因であり、毎年、２６，０００人の死および２４０，０００人の入院をもたらしている。ＣＯＰＤに関連する入院の英国国民医療サービスに与える費用は、毎年４億８千６００万ポンドを超える（１５）。呼吸器感染およびうつ病などの併存疾患のため、さらなる費用が負担されている。肺気腫病理の研究およびその治療は、肺気腫が主に自己加害的であるという考え方のため、ほとんど無視されてきた。したがって、肺気腫を効率的に管理するための戦略は、健康増進と並行して必要とされる。
【００３０】
ＣＯＰＤの病理
ＣＯＰＤは、末梢気道疾患（閉塞性細気管支炎）および実質破壊（肺気腫）の結果としての進行性でかつ不可逆的な気流の制限（９５）を特徴とする。肺実質の破壊は、末梢気道への肺胞壁の欠如、肺弾性収縮力の低下、およびその結果としての、呼息中に開いたままにする気道の能力の低下を特徴とする（８）。
【００３１】
ＣＯＰＤの主な危険因子は喫煙であるが、他の素因も同定されている（８６）。肺気腫は、炎症、肺におけるプロテイナーゼと抗プロテイナーゼの不均衡（遺伝性α−１アンチトリプシン欠損症に代表される）およびＥＣＭの破壊につながる酸化的ストレスによって引き起こされる。
【００３２】
ＣＯＰＤおよび肺気腫の最近の治療法
今日まで、ＣＯＰＤ患者にとって唯一の利用可能な薬物治療法は、主に、抗コリン薬および二重β２−ドーパミン２受容体作用薬を用いる気管支拡張に重点が置かれてきた。ＣＯＰＤにおける炎症は、コルチコステロイドに抵抗性がある。最近、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤がＣＯＰＤを治療するために開発されているが、現行の処方では、重大な毒性副作用がそれらの使用を制限することはほぼ間違いない。真偽が問われているままであるが、レチノイドも肺胞修復を引き起こすことが分かっている。しかしながら、そのような有望なすべての取組みにもかかわらず、明らかに欠けているものは、損傷したＥＣＭの修復に役立つ薬剤である。
【００３３】
要約すれば、ＣＯＰＤ／肺気腫は、それらの病態生理学への主要な寄与物としてのＥＣＭリモデリングという強力な要素を有する疾患の実例である。組織修復を必要とする他の器官には、皮膚、中枢神経系、肝臓、腎臓、心血管系、骨および軟骨が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、現行の治療は、主に予防的または症状軽減治療法に重点が置かれてきた。しかしながら、診断が遅れることが多いことに加え、両疾患の進行性の性質のため、正常な機能を取り戻すことは問題のままである。
【００３４】
最近、インテグリン機能を標的とする新規な治療的アプローチが採用されている。現在、極めて最近の抗原−４（ＶＬＡ４）またはα４インテグリン拮抗薬は、喘息、多発性硬化症およびクローン病の治療のための治験の進行段階にある（５８；６０；７１）。αｖβ３インテグリンに対する拮抗薬は、アジュバント誘発関節炎を軽減して、現在、治験中である（６）。機能的遮断または拮抗作用の標的は、炎症を軽減することであり、これが、通常そのような状態に伴うＥＣＭ変化に影響を及ぼすことは明らかにされていない。
【００３５】
今回、驚いたことに、発明者らは、β１インテグリンの機能を調節する化合物が、組織修復の改善および再生を促進することを明らかにした。
【発明の概要】
【００３６】
本発明によれば、組織修復を促進する方法が提供され、この方法は、β１インテグリンの機能を調節する化合物を投与するステップを含む。
【００３７】
化合物は、β１インテグリンの活性を機能的に調節することが好ましい。理論にとらわれることなく、発明者らは、結合によるβ１インテグリンの調節が、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）バランスの変化をもたらし、および／またはアポトーシス経路ならびに関連する細胞内アポトーシス活性およびシグナル伝達を阻害することができるという理論をたてた。
【００３８】
「修飾」または「調節」には、β１インテグリンの機能の変化、すなわち切り出しが含まれる。
【００３９】
本発明による化合物は、上述のように、β１インテグリンを切り出すこと、および／またはＭＭＰ／ＴＩＭＰバランスに影響を及ぼすことによっても作用すると考えられる。さらに、化合物は、アポトーシス経路に影響を及ぼすことがある。
【００４０】
本明細書で使用する用語「組織修復」は、損傷または外傷後の組織の修復または再生に関する。
【００４１】
β１インテグリンの調節が組織修復に有用であるという発見は、組織修復に有用な他の新規化合物の提供を可能にする。
【００４２】
したがって、本発明の他の態様は、組織修復に使用するための化合物をスクリーニングする方法を提供し、その方法には、化合物がβ１インテグリンの機能を修飾または調節する能力を決定するステップが含まれる。
【００４３】
この方法には、化合物が成熟ベータ１（β１）インテグリンの残基８２〜８７に対応するドメインと結合する能力を決定するステップが含まれることが好ましい。これらの残基は、配列番号１で定義される配列、すなわちＴＡＥＫＬＫ（スレオニン−アラニン−グルタミン酸−リジン−ロイシン−リジン）を有する。
【００４４】
本発明のさらに他の態様は、β１インテグリンの機能を調節する本明細書に記載のアッセイ方法から同定される新規化合物を提供する。
【００４５】
本発明の新規化合物は、任意の組織、例えば、肺、皮膚、肝臓、腎臓、神経系、軟骨、骨および心血管系の組織における組織修復に使用することができる。
【００４６】
一実施形態において、新規化合物は、成熟ベータ１（β１）インテグリン分子の残基８２〜８７に対応するアミノ酸配列においてβ１インテグリン分子と結合する。しかし、当然のことながら、これは限定的ではなく、化合物が結合することができるβ１インテグリン分子中の他のドメインが存在する。
【００４７】
既知配列において、残基８２〜８７は、命名法配列番号１：ＴＡＥＫＬＫ（スレオニン−アラニン−グルタミン酸−リジン−ロイシン−リジン）によって識別される配列の残基である。
【００４８】
化合物は、ペプチドまたはその類似体、あるいは化学物質であってよい。さらに、化合物は、合成ペプチドまたは合成化学物質であってよい。
【００４９】
好ましい実施形態において、化合物は、抗体である。
【００５０】
抗体は、ヒト化抗体であることが好ましい。
【００５１】
抗体は、キメラ抗体であってよい。あるいは、抗体は、ヒト抗体であってよい。
【００５２】
一実施形態において、抗体は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから市販されているクローンＪＢ１ａ（この抗体は、Ｊ１０としても知られている）によって産生され、入手可能なβ１インテグリンの機能修飾抗体をベースとするか、あるいは誘導することができる。
【００５３】
他の実施形態において、抗体は、抗体６Ｓ６をベースとするか、あるいは誘導することができる。６ＳＳは、まだ具体的に確認されていないが、ＪＢ１ａ抗体が標的とする成熟β１インテグリン分子の８２〜８７ドメインと異なるＥＧＦ様反復ドメイン中にあると考えられるβ１インテグリンのドメインを標的とする。
【００５４】
本発明のさらに他の態様は、組織の修復および再生を改善する方法を提供し、この方法には、
−β１インテグリンと結合することができる化合物またはその類似体が含まれる組成物を選択するステップと、
−治療を必要とする対象に、治療上有用な量の組成物を投与するステップと
が含まれる。
【００５５】
治療上有用な量の組成物は、β１インテグリンの活性が調節され、組織の修復および再生が生じるようにβ１インテグリンの結合をもたらすことが好ましい。
【００５６】
本発明のさらに他の態様は、組織修復に使用するためにβ１インテグリンの機能を調節する化合物を提供する。
【００５７】
そのような化合物は、本発明の方法に使用することができる。
【００５８】
本発明のさらに他の態様は、組織を修復するための医薬品の調製におけるβ１インテグリンの機能を調節する化合物の使用を提供する。
【００５９】
さらに、本発明は、任意の治療経路を介して投与される傷害された組織を治療するために医薬品の調製におけるβ１インテグリンに対する抗体の使用を提供する。
【詳細な説明】
【００６０】
治療
本明細書で使用する用語「治療」は、ヒトまたはヒト以外の動物に利益をもたらすことができる任意の制度を指す。治療は、既存の状態に関してか、あるいは予防的（予防的治療）であってよい。治療には、治癒、軽減または予防効果が含まれる。
【００６１】
抗体
「抗体」は、天然であるか、あるいは部分的または全体的に合成的に製造されたかにかかわらず免疫グロブリンである。また、この用語は、抗体結合ドメイン、特にＪｂ１ａ抗体または６ＳＳ抗体が結合するβ１インテグリンの抗体結合ドメインであるか、それらと相同的な結合ドメインを有する任意のポリペプチド、タンパク質またはペプチドを包含する。そのようなポリペプチド、タンパク質またはペプチドは、天然源から誘導することができるか、あるいは部分的または全体的に合成的に製造されてよい。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプおよび抗原結合ドメインを含むそれらのアイソタイプのサブクラスおよび断片である。
【００６２】
例えば、Ｊｂ１ａもしくは６Ｓ６抗体またはその類似体が含まれる本発明において使用するための抗体。
【００６３】
そのような抗体の類似体は、例えば、タンパク質をコードする核酸の操作によるか、あるいはタンパク質自体を変化させることにより、抗体のアミノ酸配列を変えることによって作製することができる。アミノ酸配列のそのような誘導体は、１個または複数のアミノ酸の挿入、付加、欠失および／または置換を含むことがある。
【００６４】
そのような類似体は、好ましくは５個以下、最も好ましくは１または２個のアミノ酸の挿入、付加、欠失および／または置換を含む。
【００６５】
類似体には、抗体のペプチド配列の誘導体も含まれ、カップリング相手、例えば、エフェクター分子、標識、薬物、毒素および／または担体または輸送分子に結合しているペプチドが含まれる。ペプチジルカップリング相手と非ペプチジルカップリング相手の双方に本発明のペプチドをカップリングさせる技法は、当技術分野においてよく知られている。
【００６６】
本発明の類似体および本発明において使用するための類似体は、β１インテグリン調節活性を保持することが好ましい。
【００６７】
本発明において使用するための抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナル、またはその断片であってよい。抗体の定常領域は、ヒトクラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含むがそれらに限定されない任意のクラスであってよい。抗体は、任意のサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に属していてよい。
【００６８】
用語「抗体」には、「ヒト化」された抗体が含まれる。ヒト化抗体を作製するための方法は、当技術分野において知られている。そのような方法は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号に記載されている。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域およびヒト抗体の定常領域を有する修飾抗体であってよい。したがって、結合メンバーは、ヒト定常領域を含むことがある。
【００６９】
多くの方法で抗体を修飾することができるため、用語「抗体」は、必要な特異性のある結合ドメインを有する任意の結合メンバーまたは物質を包含していると解釈するべきである。したがって、この用語は、抗体断片、誘導体、抗体の機能的等価体および相同体も包含し、天然であるか、全体的または部分的に合成的であるかにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドが含まれる。したがって、別のポリペプチドと融合している、免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子、または等価体が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。
【００７０】
全抗体の断片が、抗原結合の機能を実行することができることが分かっている。
【００７１】
そのような結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（９９）、（ｖ）単離したＣＤＲ領域、（ｖｉ）２個の連結したＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ′）２断片、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインを会合させて抗原結合部位を形成するペプチドリンカーによって連結されている）（１１；５０）、（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および（ｉｘ）遺伝子融合によって構築された多価または多重特異性断片である「二重特異性抗体」（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；（４６））である。
【００７２】
本発明において使用するための抗体の結合エピトープに対して置換を行うことができ、例えば、アミノ酸残基を、同一または類似の化学的クラスの、結合エピトープの実質的な立体構造変化をもたらさない残基によって置換することができる。
【００７３】
本発明の抗体および本発明において使用するための抗体は、標準的技法に従って調製することができる。タンパク質で動物、例えばマウスを免疫化するための手順および免疫原特異的モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、当技術分野においてよく知られている。抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００７４】
医薬組成物
さらに、本発明は、β１インテグリンの機能を調節するための医薬品および医薬組成物にまで及ぶ。
【００７５】
したがって、本発明のさらに他の態様は、組織修復に使用するための医薬組成物を提供し、その組成物には、活性成分として、β１インテグリンの機能を修飾する化合物が含まれる。
【００７６】
本発明による、および本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分の他に、薬学的に許容できる賦形剤、担体、緩衝安定化剤または当業者によく知られている他の材料を含むことができる。そのような材料は、非毒性であり、活性成分の有効性を妨害してはならない。担体または他の材料の正確な性質は、投与の経路に左右される。
【００７７】
投与量
組成物は、「治療上有効な量」で個人に投与されることが好ましく、これは、個人に有益性を示すに十分である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、個人および治療されている状態に左右される。
【００７８】
最適投与量は、例えば、個人の年齢および組織損傷の程度、投与されている組成物の正確な形態および投与の経路を含む多くのパラメータに基づいて決定することができる。
【００７９】
組成物は、ミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子送達システムまたは血液を含む特定の組織に入れられた徐放性製剤を介して投与することができる。徐放性担体の適当な例には、共用商品の形態をした半透性ポリマーマトリックス、例えば、坐剤またはマイクロカプセルが含まれる。
【００８０】
上述の技法およびプロトコルならびに本発明に従って使用することができる技法およびプロトコルの例は、その全開示が参考文献により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；第２０版（２０００年、１２月１５日）ＩＳＢＮ  ０−９１２７３４−０４−３およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃ．他  第７版  ＩＳＢＮ  ０−６８３３０５−７２−７に見いだすことができる。
【００８１】
アッセイ
上述のように、本発明は、組織修復に使用することができる化合物を決定するためのアッセイ系およびスクリーニング方法を提供する。本明細書で使用する用語「アッセイ系」は、特定の１つまたは複数の事象を検出および／または測定するアッセイを行い、アッセイの結果を分析するために必要なすべての構成要素を包含する。
【００８２】
β１インテグリンに対する特異的結合活性を有する抗体、ペプチドおよび化学物質などの化合物の活性を検出するために様々なアッセイが利用可能である。
【００８３】
本発明の１種または複数のアッセイの正確なフォーマットは、ルーチンな技術および知識を用いる当業者によって異なることがある。
【００８４】
好ましいスクリーニングアッセイは、ハイスループットまたはウルトラハイスループットであり、したがって、自動化された対費用効果の高いスクリーニング手段を提供する。
【００８５】
β１インテグリンの修飾が、組織修復に有用であるという発見は、組織修復に有用な他の新規化合物の確認を可能にする。
【００８６】
したがって、本発明の他の態様は、組織修復で使用するのに適している化合物を同定するためのアッセイを提供し、前記アッセイは、
−候補化合物を準備するステップと、
−候補化合物をβ１インテグリンまたはその類似体と接触させるステップと、
−候補化合物によるβ１インテグリン活性の調節の有無を決定するステップとを含み、
β１インテグリン活性の調節は、組織修復におけるその化合物の有用性を示す。
【００８７】
この方法には、化合物が成熟ベータ１（β１）インテグリンの残基８２〜８７に対応するドメインと結合する能力を決定するステップが含まれることが好ましい。これらの残基は、配列番号１で定義される配列、すなわちＴＡＥＫＬＫ（スレオニン−アラニン−グルタミン酸−リジン−ロイシン−リジン）を有する。
【００８８】
別の実施形態において、β１インテグリン活性の有無は、ＭＭＰ活性の調節をモニターすることによって評価される。
【００８９】
β１インテグリン調節活性は、任意の適当な手段を用い、本発明のアッセイで評価することができる。例えば、ＭＭＰレベルまたはバランスに対する薬剤の効果、および／またはアポトーシスおよびアポトーシス経路に対する効果。例示的アッセイは、活性型と不活性型双方のＭＭＰタンパク質用のウエスタンブロッティング分析およびＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイ、ウエスタン分析およびＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイを用いるプロテオグリカン合成、細胞接着をベースとしたアッセイ、インサイツ標識を用いるアポトーシスアッセイ、免疫組織化学およびゲル分析である。
【００９０】
様々な他の態様において、本発明は、スクリーニングおよびアッセイ方法ならびにそれらによって同定される物質に関する。
【００９１】
本発明のアッセイを用いて同定される新規化合物は、本発明の他の独立した態様を形成する。
【００９２】
本発明のアッセイにおいて、β１インテグリンの類似体を使用することができる。そのような類似体は、β１インテグリンの１つまたは複数の結合部位、例えば、成熟β１インテグリン分子のアミノ酸残基８２〜８７に対応する結合部位を含むことができる。別法として、類似体は、β１インテグリン模倣体を含むことができる。当業者は、そのような模倣体を設計する方法を熟知している。手短に言うと、ファルマコフォアを模倣する化学基を継ぎ足すことができるテンプレート分子を選択する。テンプレート分子およびテンプレート分子に継ぎ足された化学基は、模倣体を合成するのが容易で、薬理学的に許容できそうであり、ｉｎ  ｖｉｖｏで分解せずにβ１インテグリンの生物活性を維持するように好都合に選択することができる。
【００９３】
次いで、このアプローチによって見いだされる模倣体を、β１インテグリンの代わりに本発明のアッセイで使用し、標的特性、例えばβ１インテグリン活性を有するか否か、あるいはどの程度の活性を示すかを見ることができる。次いで、さらに最適化または変更を行い、ｉｎ  ｖｉｖｏもしくは臨床試験のためか、あるいは本発明のアッセイで使用するための１個または複数の最終模倣体に到達することができる。
【００９４】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本発明の各態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えて、互いの態様と同様である。
【００９５】
他に指示がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、当業者によって、および本発明の分野において一般的に理解されている意味を有する。
【００９６】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書を通じ、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」もしくは「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」もしくは「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形例は、述べられた整数または整数の群の包含を意味し、その他の整数または整数の群の排除を意味しないことを理解されよう。
【００９７】
本明細書では、例示の目的のために提供され、本発明を制限していると解釈されるべきではない以下の非限定的実施例を参照して本発明を例示する。さらに添付の図面に言及する。
【００９８】
予備実験において、本発明者他は、ＣＯＰＤなどの疾患において変化し、微視的および巨視的に肺および軟骨機能にとって重要であるＥＣＭの合成における細胞表面受容体の役割を検討しようと試みた。健康および疾患におけるそれらのＥＣＭ分子の重要性は、肺だけに限定されるものではない。
【００９９】
本明細書に記載の結果は、アミノ酸残基８２〜８７に対応するドメインによる、および、それほどではないにせよ、まだ具体的に同定されていないが、８２〜８７ドメインと異なるＥＧＦ様反復ドメイン中にあると考えられるドメインによるβ１インテグリン機能修飾が、単層のヒト肺上皮細胞系（ＮＣＩ−Ｈ４４１）およびヒト肺外移植片ならびに単層または共培養系のヒト肺由来の培養液においてＥＣＭの実質的な時間依存的および用量依存的増加を引き起こすことを示している。応答は、β１インテグリンに対する２種の異なる抗体を用いて観察されたが、応答の大きさは多様であった。これらのドメインは、アミノ酸残基配列２０７〜２１８と結合する既報のドメインとは異なる。これらのドメインは、それらのアミノ酸残基ならびに残基６５７〜６７０および６７１〜７０３に限局される既知の刺激性ドメインとも異なる。サイトカインＴＧＦ−βの調節は、やはり時間依存的および用量依存的であるあまり著しくない増加を引き起こした。すべてのＥＣＭ  ＰＧのこの増加は、追加の投与なしに長時間維持された。
【０１００】
これらの実験は、ＥＣＭの増加が、動物モデルの肺由来の細胞および組織において、細胞表面受容体の調節を介し、および、それほどではないにせよ、時間依存的および用量依存的に可溶性因子の結合を調節することにより実現できるという新規な知見を示している。可能性があるが拘束力のない機構的仮説は、この調節が、損傷した環境の細胞接着の変化をもたらし、細胞死を防いで修復を生じさせたのではというものである。すなわち、この変化は、細胞表面上に隔離することができるプロテイナーゼ／抗プロテイナーゼバランスに影響を及ぼす可能性がある。さらに、この応答は、遺伝子の転写または翻訳の変化の結果である可能性がある。我々の実験は、この応答が、上記すべての組合せによるものであることを明らかにした。β１インテグリン機能修飾に対するＥＣＭ応答は、細胞死の減少ならびにＴＩＭＰ１、不活性ＭＭＰ９および活性ＴＧＦβ１の増加ならびにＭＭＰ１の減少を伴った。
【０１０１】
気腫性肺を有する動物に投与した場合、この治療は、気腔拡大、肺サイズおよび異常な肺機能ならびに炎症徴候の指標としての平均リニアインターセプト（ＬＭ）の異常な増加を逆転させた。さらに、細胞死の減少が認められた。
【０１０２】
これらの知見の可能性は、ＣＯＰＤが含まれるがそれに限定されない疾患におけるように、マトリックスが分解され、補充することができない疾患における組織修復にある。現在唯一の治療方針は、抗炎症剤の使用によって症状を軽減することに重点を置いているが、機能を取り戻す可能性を持たない疾患において、本知見は、治療的介入の場を提供することができる。これは、β１インテグリンと結合して細胞死を阻害することができるヒト化、キメラもしくはヒト抗体または合成ペプチドもしくは化学物質の投与を介して実現される可能性がある。
【０１０３】
要約すれば、本明細書の結果は、異化作用を減少させる代わりに細胞生存度およびＥＣＭ同化作用を増加させることに重点を置いた様々な可能性のある治療法に対応する。
【０１０４】
実験プロトコル
ヒト肺外移植培養およびヒト肺由来細胞の単離
ヒトの肺組織試料を、同意を得て採取し、２０〜３０ｍｇの外移植片または細胞として培養した。
【０１０５】
細胞を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（緩衝液Ａ：０．１３Ｍ  ＮａＣｌ、５．２ｍＭ  ＫＣｌ、１０．６ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２．６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、ｐＨ７．４）を用いて組織（１０ｇ）を洗浄する、Ｍｕｒｐｈｙら（２５）やＥｌｂｅｒｔら（７５）の方法を改変した順次消化法によって単離した。次に組織を、エラスターゼ（Ｒｏｃｈｅ）０．８５５ｍｇ、０．５％トリプシン、ＤＮＡｓＩ  ２００Ｕ／ｇ、１．９ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１．２９ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む緩衝液Ａ  ４０ｍＬ中、３７℃で４０分間インキュベーションした。
【０１０６】
消化用緩衝液を吸引し、懸濁した細胞を緩衝液Ａで３回洗浄する。各洗浄の間の細胞は、懸濁液を１１００ｒｐｍで４℃において１０分間遠心し、沈降させた。最後の洗浄の後に、細胞を緩衝液Ａに再び懸濁し、４０μｍのフィルターを通し、不連続パーコール勾配遠心（１．０８９／１．０４ｇ／ｍＬ）を行った。次に細胞を、マルチウェル培養プレート上およびポアサイズ０．３μｍの組織培養用トランスウェル（Ｓｉｇｍａ）上に播種し、１％ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン、および抗生物質／抗真菌薬／抗菌薬の混合物を含む、ＤＭＥＭ／Ｆ１２が１：１の小気道成長培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｎｃｅ  Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ  Ｌｔｄ．）を用いる培養で維持し、ＣＯ２インキュベーター中で５％炭酸ガスで維持した。
【０１０７】
残った組織を、４０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭで処理し、消化酵素を不活化し、次に溶液Ａを用いて洗浄した。次に組織を、コラゲナーゼ１ｍｇ／ｍＬ、０．５％トリプシン、およびＤＮＡｓＩ  ２００Ｕ／ｇを含むＤＭＥＭ中でインキュベーションし、ＣＯ２インキュベーター中、炭酸ガス５％で維持した。細胞懸濁液を上記と同様に洗浄し、細胞を、１０％ウシ胎仔血清、グルタミン、および抗生物質／抗真菌薬／抗菌薬の混合物を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中でマルチウェル培養プレート上に播種し、ＣＯ２インキュベーター中、５％炭酸ガスで維持した。
【０１０８】
また、肺由来の腺癌細胞株（Ｈ４４１）を用いて、マトリックス合成に対する抗体の作用を調べた。この細胞株は、上皮ＩＩ型の特徴を有する。
【０１０９】
培養物を、０．５％ウシ胎仔血清を含む培地中で１晩血清飢餓にかけた。コラゲナーゼ消化を行ったプレートには、飢餓状態開始時にエラスターゼ消化を行ったトランスウェルと共培養したものもある。
【０１１０】
β１インテグリンに対する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、クローンＪＢ１ａ）を機能修飾した抗体１．４４μｇ／ｍＬおよび０．４８μｇ／ｍＬを、培養物に添加した。また、β１インテグリンに対する刺激性抗体であるＴＳ２／１６  ０．９μｇ／ｍＬを、ＪＢ１ａの作用の特異性を示すために、１時間添加した。β１インテグリンの抑制性抗体である６Ｓ６も、１μｇ／ｍＬおよび２μｇ／ｍＬを１時間添加した。ＴＧＦβの中和抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、クローン１Ｄ１１）は、０．１μｇ／ｍＬおよび０．３μｇ／ｍＬの濃度で添加したが、低い方の濃度ではＴＧＦβアイソフォーム１および３を中和し、高い方の濃度ではそのアイソフォーム２を中和する。培養中の細胞に抗体を添加した後に、培地を吸引し、細胞層を氷冷ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウム不含）で２回すすいだ。培地を吸引し、プロテアーゼ阻害剤を添加後に−８０℃で保存した。ＰＧは、プロテアーゼ阻害剤を含む抽出緩衝液（４Ｍ塩酸グアニジン、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、プロテアーゼ阻害剤を含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．８）で、細胞層から４℃で２４時間抽出する。
【０１１１】
追加の実験では、β１インテグリンによるＰＧの増加に対するタンパク質合成阻害の影響を、２５μＭシクロヘキシミドでヒト肺由来細胞を前処理することによって調べた。
【０１１２】
β１インテグリンによるＰＧ増加に対するＭＭＰ類の非特異的活性化の影響を、０．５Ｍ  ＡＰＭＡ（酢酸アミノフェニル水銀）でヒト肺由来細胞を前処理することによって調べた。
【０１１３】
β１インテグリンで認められる反応の開始に対する、選択したＭＭＰの関与を調べるために、ＭＭＰ７（１：１０００、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＭＭＰ９（クローン６−６Ｂを１：１０００で、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に対する特異的な中和抗体を使用した。また、ホモフェニルアラニルヒドロキサミン酸をベースとした広域スペクトルを有するＭＭＰ類の阻害剤（ＭＭＰ阻害剤ＩＩＩ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、２．３ｎＭで用いた。
【０１１４】
総タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて評価した。
【０１１５】
ポリアクリルアミドアガロースコンポジットゲル電気泳動のための試料の調製
抽出物を９ｖ／ｖのエタノールによって−２０℃で１晩沈殿させ、１２０００ｒｐｍで４０分間、４℃で遠心し、０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．３）に再懸濁し、再びエタノールで１晩沈殿させ、遠心した。試料を０．５％ＳＤＳに再懸濁し、５０％ｗ／ｗショ糖を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．５％ＳＤＳ、および０．０５％ブロモフェノールブルーと１：１量で混合した。タンパク質２０μｇをゲルに載せた。
【０１１６】
ゲル電気泳動
０．２５ｍＭ硫酸ナトリウム含有Ｔｒｉｓ−酢酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．８）に０．６％アガロースおよび１．２％ポリアクリルアミドを含むコンポジットゲル（厚さ１．５ｍｍ）を、Ｃａｒｎｅｙ法にしたがった関連条件下に、高分子量ＰＧ、バーシカン、アグリカン、およびパールカンの分離に用いた。
【０１１７】
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、変性させたＰＧおよびタンパク質を分離した。
【０１１８】
電気泳動による分離の後に、試料をハイボンドＥＣＬ−ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に、湿式ブロッティング装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて転写した。膜を、０．１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％アジ化ナトリウムを含むｐＨ７．４のＴＢＳ中の５％ミルクによってブロッキングし、次にＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した１次抗体で、室温で１時間または４℃で１晩、インキュベーションした。
【０１１９】
バーシカンに対する１次抗体（１２Ｃ５）は、５００倍希釈のマウス抗ヒト（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ、Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ、Ｉｏｗａ）であった。この抗体は、バーシカンのヒアルロン酸結合部位を認識する（８３）。アグリカン抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＨＡＧ７Ｅ１）は、アグリカンの５００倍希釈で用いた。この抗体がエピトープ自体を認識しているか不明であるため、追加の抗体を使用した。パールカン抗体（７Ｂ５、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、１０００倍希釈で使用した。この抗体は、非消化のパールカンと免疫反応をすることが示されている（７３）。ＭＭＰ１抗体（４１−１Ｅ５）、不活性型ＭＭＰ９抗体（７−１１Ｃ）、およびＴＩＭＰ１抗体（７−６Ｃ１）は、全てＯｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ製を、１０００倍希釈で使用した。
【０１２０】
ブロット物には、１００ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、および６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．７）を用いて５６℃で２０分間、除去したものもある。次に、除去したブロット物を別の抗体を用いて再プローブ化した。
【０１２１】
西洋わさびパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇ、Ｄａｋｏ）を添加した。シグナルは、ＥＣＬｐｌｕｓ（化学発光を増強）測定法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて可視化した。
【０１２２】
上記の詳細な記述と同一の分析を、製造元（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の取扱説明書に従ってプロテインＡセファロースを用いた免疫沈降によって、機能改変した抗体の事前除去を施した抽出物を用いて実施した。
【０１２３】
免疫組織化学（凍結切片）
追加の実験では、ＰＧに対する免疫組織化学染色を、ＯＣＴに包埋したヒト肺の５μｍ厚の外移植凍結切片について実施した。スライドガラスを、汎用ブロッキング液中で室温にて１０分間インキュベーションすることによってブロッキングし、次にビオチンブロッキング液（Ｄａｋｏ）によって１０分間ブロッキングした。次に切片をＴＢＳ（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）ですすぎ、１次抗体とインキュベーションした。ＴＢＳで洗浄後に、組織を、ＴＢＳで２００倍希釈したビオチン標識ヤギ抗マウスと共に１時間、インキュベーションし、ＴＢＳですすぎ、次に、ＴＢＳで１００倍希釈したアルカリホスファターゼ結合アビジンとさらに１時間インキュベーションした。さらに洗浄した後に、切片を、アルカリホスファターゼ基質中でＦａｓｔ  Ｒｅｄ  ｓａｌｔ１ｍｇ／ｍＬによって室温で１５分間発色させた。切片を、Ｇｉｌのヘマトキシリンによって４５秒間対比染色し、次に水で洗浄した。切片を、クリスタルマウントの薄層で封入し、乾燥器中、３７℃で１晩乾燥した。
【０１２４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ損傷動物モデルを用いた治療効果：ブタ膵臓エラスターゼの注入によって誘導した肺気腫モデル
Ｃ５７／ＢＬ６マウス、メス（６〜８週齢）には、金属製カニューレを用いて気管内に体重１ｇ当たり１ＩＵのブタ膵臓エラスターゼ（Ｒｏｃｈｅ）を注入した。注入１０日目にマウスから試料を採取し、気腔拡大の存在を検証するために組織学的に検索した。マウスは、１２日目に滅菌ＰＢＳに溶解したインテグリン抗体を１匹当たり５０μｇで気管内に投与した。対照群には、初回はＰＢＳを、１２日目は対照ＩｇＧ１アイソタイプ（５０μｇ／マウス）を注入した。エラスターゼ注入後１９日目に、マウスを屠殺し、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を採取し、サンドイッチＥＬＩＳＡ法（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたサイトカイン（ＫＣ（ヒトＩＬ８のマウス相同物）および活性型ＴＧＦｂ１）定量に使用した。
【０１２５】
肺全体を切除し、損傷の組織学的評価および形態計測解析（平均リニアインターセプション）のために、水柱２５ｃｍ圧でホルマリン固定した。ブロックを５μｍに薄切し、ヘマトキシリンおよびエオジンを用いて染色した。各マウスからの矢状方向の切片を用いた。１切片当たり１０視野からの倍率１００倍の画像を、Ｓｃｉｏｎ  ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ）を用いてデジタル処理し分析した。実際の視野サイズは、１．３３ｍｍ（水平方向）×１．０３ｍｍ（垂直方向）であった。水平線および垂直線を横切る肺胞壁の数を計測した。前記線長を、横切った数で除することによって、各視野（水平方向および垂直方向）で平均リニアインターセプトを算出した。
【０１２６】
追跡試験では、Ｃ５７／ＢＬ６マウス、メス（６〜８週齢）に、微小噴霧装置（Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ、ＵＳＡ）を用いて気管内に体重１ｇ当たり０．２ＩＵのブタ膵臓エラスターゼ（Ｒｏｃｈｅ）を注入した。注入１４日目にマウスから試料を採取し、気腔拡大の存在を検証するために組織学的に検索した。マウスには、１４日目または２１日目に、微小噴霧装置を用いて、滅菌ＰＢＳに溶解したインテグリン抗体６０μｇ／マウスを気管内投与した。対照群には、初回にＰＢＳと、１４日目または２１日目にＰＢＳとを注入した。１４日目に投与した群では、２１日目に以下のようにマウスを屠殺した。マウスを、ペントバルビトンナトリウム（４５ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔し、臭化パンキュロニウム（０．８ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻痺させ、気管切開し、小動物用呼吸装置（Ｆｌｅｘｉｖｅｎｔ、ＳＣＩＲＥＱ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ）を用いて、８ｍＬ／ｋｇ、１５０呼吸／分で、呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）は３．５ｃｍ水柱圧の従圧式で、肺換気を行った。コンピュータ管理した呼吸装置によって、断続的信号の作動による呼吸機構（気道抵抗、組織抵抗および組織弾性、圧−容積曲線）の測定が可能となる。複合抵抗の測定のためには、１９素数正弦波を含む８秒間の信号を１．６ｍＬ／ｋｇで０．５および１９．６Ｈｚの間の振幅で作動させる。摂動中に得られる、シリンダー圧およびピストン容積変化の信号を、ローパスフィルターに通し、定常相モデルを用いた分析用（３９〜４１）にコンピュータに蓄積する。定常相モデルのニュートン抵抗または気道抵抗（Ｒａｗ）は、中心気道抵抗を表す。組織の給湿（Ｇ）が、組織抵抗と密接に関係し、肺組織でのエネルギー消失を示す。パラメータＨは、組織エラスタンスと密接に関係し、肺組織でのエネルギー保存を示す。
【０１２７】
圧−容積曲線を、１６秒間容積摂動を徐々に作動させることによって、膨張と収縮との間に段階的な様式で取得する。圧信号を記録し、圧−容積（Ｐ−Ｖ）曲線を各段階の平坦域から算出する。定数Ｋは、Ｓａｌａｚａｒ−Ｋｎｏｗｌｅｓ方程式を用いて取得され、収縮ＰＶ曲線の上部の曲率を示す。準静的エラスタンス。準静的エラスタンスが、所与の肺容積での肺の静的弾性反動圧を示す。これは、Ｐ−Ｖ曲線の直線部分の傾きを計算することによって得られる。
【０１２８】
測定後に、マウスを屠殺し、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を採取した。ＢＡＬＦを２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を−７０℃で保存した。
【０１２９】
組織化学
次に肺全体を切除し、水柱２５ｃｍ圧でホルマリン固定した。肺をパラフィン包埋し、４μｍ厚さの切片に薄切した。各マウスからの矢状方向の切片を、損傷の組織学的、免疫組織化学的評価および形態計測解析（平均リニアインターセプション、Ｌｍ）に用いた。
【０１３０】
Ｌｍによる形態計測解析を、脱パラフィン（キシレンおよび無水エタノール、次に９０％、７０％、および５０％のエタノールを用いる）し、次にヘマトキシリンおよびエオジンで染色した切片で実施した。１切片当たり１０視野からの１０倍の対物レンズを使用した画像をデジタル処理し、視野サイズは０．８３μｍ×０．６３μｍであった。
【０１３１】
弾性線維の損傷の組織学的評価を、脱パラフィン（キシレンおよび無水エタノール、次に９０％、７０％、および５０％のエタノールを用いる）した組織切片をレゾルシン酸フクシン（Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）で製造元の取扱説明書に従って染色し、実施した。対比染色を、０．５％タルトラジンの０．２５％酢酸液を用いて実施した。弾性線維が暗赤色または紫色で示され、組織の他の部分が黄色で示される。
【０１３２】
ターミナルデオキシリボヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を介したｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ法）
組織切片を、キシレンおよび無水エタノール、次に９０％および７０％エタノールを用いて脱パラフィンした。切片を、ＡｐｏｐＴａｇ（商標）Ｒｅｄキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて、製造元の取扱説明書に従って染色した。
【０１３３】
この技術の原理は、ＤＮＡ小断片の３’−ＯＨ末端にＴｄＴによってヌクレオシドを付加することである。前記酵素は、二価陽イオンの存在下に、平滑、突出、または陥凹末端であろうと、３’−ＯＨ末端にヌクレオチドを転移させる。ＴＵＮＥＬ法の標識物は、非常に用途が広い。ジゴキシゲニン−１１標識したｄＵＴＰやｄＡＴＰで標識する、ＴｄＴを利用したアポトーシス検出で使用するＴＵＮＥＬ法は、２本鎖や１本鎖のＤＮＡの３’−ＯＨ末端を末端延長するために使用される。次に、ローダミン標識抗ジゴキシゲニンを免疫組織化学的な染色に使用する。ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニンでの標識系は、バックグラウンドが低いためアビジン／ビオチン系より好ましいことは述べる価値がある。前者の系のシグナル発生は、後者より３８倍も強い。ＴＵＮＥＬ法に併用して、ＤＡＰＩを核の蛍光対比染色に使用した。アポトーシスを起こしている核の定量化（染色陽性）を、４０倍の対物レンズで共焦点顕微鏡を使用して実施した。総面積０．９２１ｍｍ×０．９２１ｍｍからなる積層（４×４）によって、８ｍｍ×８ｍｍの切片から画像を取得した。水平線および垂直線を横切る肺胞壁の数を計測した。前記線長を、横切った数で除して、各視野（水平方向および垂直方向）で平均リニアインターセプトを算出した。
【０１３４】
陽性対照も使用した。切片を、キシレンおよび無水エタノール、次に９０％および７０％エタノールを用いて脱パラフィンした。次に組織切片を、室温で１０分間ＤＮＡｓ（２０００Ｕ／ｍＬを３０ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ塩基、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．２に）処理した。含めた陰性対照は、反応酵素不含でヌクレオチドとのみインキュベーションした切片であった。
【０１３５】
本実験は、ＥＣＭのＰＧ類の同化作用の上昇が、ヒト肺外移植およびヒト肺由来細胞共培養と同様に肺由来上皮細胞株において、細胞表面のβ１インテグリンの機能修飾を通して、程度は低いが時間および用量のいずれにも依存してＴＧＦβを中和することを通して、達成可能であるという新規の知見を示す。本実験は、ＥＣＭのＰＧの増加が、一部はデノボのタンパク質合成によるものであることを示している。前記変化には、ＴＩＭＰ１の増加、ＭＭＰ９の不活性化、およびＭＭＰ１の減少を伴った。
【０１３６】
ブタの膵臓エラスターゼを用いて、肺気腫による損傷を肺で誘導してきた。エラスターゼによって、平均リニアインターセプト（Ｌｍ）が統計的に有意に２〜３倍増加し、肺のサイズ増加を伴った。抗β１インテグリン１用量を、１２、１４、または２１日目に気管内投与した肺気腫マウスは、１９〜２１、および３５日目に肺サイズの著しい減少を示した。変化には、Ｌｍの有意な減少、肺機能の改善、および弾性線維の回復を伴った。また、前記変化には、細胞死の低下を伴った。したがって、β１インテグリンの機能的改良が、基盤のＥＣＭの損傷部から細胞を「緩和（ｌｏｏｓｅｎｉｎｇ）」し、そのため、続いて修復が可能となるように機械的感知（衝撃吸収）の改良を引き起こした場合があると推定する。加えて、この機序は、ＭＭＰ／ＴＩＭＰの均衡の変更を含んだ上記の機序であってもよい。
【０１３７】
さらに、ブタの膵臓エラスターゼは、気管支肺胞洗浄液中の活性型ＴＧＦβ１を減少させたが、投与による回復が示された。活性型ＴＧＦβ１の値は、Ｌｍとの統計的に有意な相関（ｒ＝０．９６、ｐ＜０．０１）を示した。
【０１３８】
本明細書に引用した全ての文献を、本明細書に引用することによって援用する。本発明の実施形態に記載された、様々な改良および変更は、本発明の範囲を逸脱することなく当該技術者に明らかとなるものである。本発明は、ことに好ましい実施形態に関連して記載されているが、クレームされた発明は、そのような好ましい実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。実際、当該技術者に明らかな、本発明の実施に当たって記載された形態の様々な改良は、本発明に含まれることを意図したものである。
【０１３９】
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【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】Ｈ４４１細胞系由来のＥＣＭ  ＰＧに対するβ１インテグリンおよび中和ＴＧＦ−βの機能修飾の時間依存的な影響を例示する図である。
【図２】β１インテグリン機能調節後に６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離されたアルギン酸培養液中の軟骨細胞およびＨ４４１細胞の培地における１１０ｋＤａ  β１インテグリンの存在を示す図である。
【図３】ヒト肺外移植片におけるＥＣＭ  ＰＧに対するβ１インテグリンの機能変更の時間依存的な影響および対照β１インテグリン抗体を用いる影響の欠如を例示する図である。
【図４】ヒト肺外移植片におけるＥＣＭ  ＰＧに対するβ１インテグリンの機能修飾の影響を例示する図である。
【図５】β１インテグリン機能調節後のヒト肺外移植片の培地における不活性ＭＭＰ９の増加を示すウエスタン分析を示す図である。
【図６】β１インテグリン機能調節（β１  Ａｂ）後の培養ヒト肺細胞の培地（コラゲナーゼ消化単独か、あるいはエラスターゼ消化との共培養における）におけるＥＣＭ  ＰＧ、パールカンの増加を示すウエスタン分析を示す図である。この図は、β１インテグリン機能調節へのＰＧ応答に対するシクロヘキシミド（ＣＸＨ）およびＡＰＭＡの影響も示している。さらに、中和ＭＭＰ７および９ならびにＭＭＰの影響を示している。
【図７】β１インテグリン機能調節（β１  Ａｂ）後の培養ヒト肺細胞の培地（コラゲナーゼ消化単独か、あるいはエラスターゼ消化との共培養における）におけるＴＩＭＰ１の増加を示すウエスタン分析を示す図である。この図は、β１インテグリン機能調節へのＴＩＭＰ１応答に対するシクロヘキシミド（ＣＸＨ）およびＡＰＭＡの影響も示している。さらに、中和ＭＭＰ７および９ならびにＭＭＰの影響を示している。
【図８】β１インテグリン機能調節（β１  Ａｂ）後の培養ヒト肺細胞の培地（コラゲナーゼ消化単独か、あるいはエラスターゼ消化との共培養における）におけるＭＭＰ１の減少を示すウエスタン分析を示す図である。この図は、β１インテグリン機能調節へのＴＩＭＰ１応答に対するシクロヘキシミド（ＣＸＨ）およびＡＰＭＡの影響も示している。さらに、中和ＭＭＰ７および９ならびにＭＭＰの影響を示している。
【図９】β１インテグリン機能調節（β１  Ａｂ）後の培養ヒト肺細胞の培地（コラゲナーゼ消化単独か、あるいはエラスターゼ消化との共培養における）における不活性ＭＭＰ９の増加を示すウエスタン分析を示す図である。この図は、β１インテグリン機能調節へのＴＩＭＰ１応答に対するシクロヘキシミド（ＣＸＨ）およびＡＰＭＡの影響も示している。さらに、中和ＭＭＰ７および９ならびにＭＭＰの影響を示している。
【図１０】肺気腫マウス（ＰＰＥ）の肺サイズに対するβ１インテグリン機能修飾の効果を示す写真を示す図である。
【図１１】マウスのエラスターゼ誘発性肺気腫における肺構造の修復に対するβ１インテグリン機能修飾の効果を示す４ｕｍのホルマリン固定パラフィン包埋切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す図である。
【図１２】マウスのエラスターゼ誘発性肺気腫における気腔拡大に対するβ１インテグリン機能修飾の効果を示す図である。
【図１３】マウスのエラスターゼ誘発性肺気腫における気管支肺胞洗浄液中の活性ＴＧＦβ１レベルに対するβ１インテグリン機能修飾の効果を示す図である。
【図１４】マウスのエラスターゼ誘発性肺気腫における気管支肺胞洗浄液中の活性ＴＧＦβ１レベルおよび気腔拡大指数とβ１インテグリン機能修飾の効果との相関関係を示す図である。
【図１５】β１インテグリン機能調節（β１  Ａｂ）後の培養ヒト肺細胞（ＮＣＩ−Ｈ４４１）の培地におけるＥＣＭ  ＰＧ、パールカンの増加を示すウエスタン分析を示す図である。６Ｓ６抗β１インテグリン抗体も使用した。この図は、β１インテグリン機能調節へのＰＧ応答に対するシクロヘキシミド（ＣＸＨ）およびＡＰＭＡの影響も示している。
【図１６】β１インテグリン機能調節（β１  Ａｂ）後の培養ヒト肺細胞（ＮＣＩ−Ｈ４４１）の培地における不活性ＭＭＰ９の増加を示すウエスタン分析を示す図である。６Ｓ６抗β１インテグリン抗体も使用した。この図は、β１インテグリン機能調節へのＰＧ応答に対するシクロヘキシミド（ＣＸＨ）およびＡＰＭＡの影響も示している。
【図１７】呼吸器系の圧−容積曲線に対するマウスにおけるブタ膵エラスターゼ（ＰＰＥ）注入の時間経過効果を示す図である。
【図１８】ＰＰＥを気管内に注入され、１４日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、２１日目に終結したマウスにおけるＰＰＥの圧−容積特性に対する効果の逆転に対するβ１インテグリン機能調節の効果を示す図である。
【図１９】ＰＰＥを気管内に注入され、２１および２８日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、３５日目に終結したマウスにおけるＰＰＥの圧−容積特性に対する効果の逆転に対するβ１インテグリン機能調節の効果を示す図である。
【図２０】ＰＰＥを気管内に注入され、１４日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、２１日目に終結したか（２１ｄ）、あるいは２１および２８日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、３５日目に終結した（３５ｄ）マウスにおけるＰＰＥの圧−容積の上部の曲率（Ｋ）に対する効果の逆転に対するβ１インテグリン機能調節の効果を示す図である。
【図２１】ＰＰＥを気管内に注入され、１４日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、２１日目に終結したか（２１ｄ）、あるいは２１および２８日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、３５日目に終結した（３５ｄ）マウスにおけるＰＰＥの５〜１３ｃｍＨ２Ｏ圧の準静的エラスタンスに対する効果の逆転に対するβ１インテグリン機能調節の効果を示す図である。
【図２２】ＰＰＥを気管内に注入され、１４日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、２１日目に終結したか（２１ｄ）、あるいは２１および２８日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、３５日目に終結した（３５ｄ）マウスにおけるＰＰＥの圧−容積作戦から得られるピーク圧力に対する効果の逆転に対するβ１インテグリン機能調節の効果を示す図である。
【図２３】ＰＰＥを気管内に注入され、１４日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、２１日目に終結したか（２１ｄ）、あるいは２１および２８日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、３５日目に終結した（３５ｄ）マウスにおけるＰＰＥの準静的ヒステリシスに対する効果の逆転に対するβ１インテグリン機能調節の効果を示す図である。
【図２４】ＰＰＥを気管内に注入され、１４日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、２１日目に終結したか（２１ｄ）、あるいは２１および２８日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、３５日目に終結した（３５ｄ）マウスにおけるＰＰＥのニュートン抵抗（Ｒａｗ、気道抵抗としても知られる）に対する効果の逆転に対するβ１インテグリン機能調節の効果を示す図である。
【図２５】ＰＰＥを気管内に注入され、１４日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、２１日目に終結したか（２１ｄ）、あるいは２１および２８日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、３５日目に終結した（３５ｄ）マウスにおけるＰＰＥの組織抵抗（Ｇ）に対する効果の逆転に対するβ１インテグリン機能調節の効果を示す図である。
【図２６】ＰＰＥを気管内に注入され、１４日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、２１日目に終結したか（２１ｄ）、あるいは２１および２８日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、３５日目に終結した（３５ｄ）マウスにおけるＰＰＥの組織エラスタンス（Ｈ）に対する効果の逆転に対するβ１インテグリン機能調節の効果を示す図である。
【図２７】ＰＰＥを気管内に注入され、１４日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、２１日目に終結したか（２１ｄ）、あるいは２１および２８日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、３５日目に終結した（３５ｄ）マウスにおけるＰＰＥの平均リニアインターセプト（Ｌｍ）を用いる気腔拡大に対する効果の逆転に対するβ１インテグリン機能調節の効果を示す図である。
【図２８】ＰＰＥを気管内に注入され、１４日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、２１日目に終結したか（２１ｄ）、あるいは２１および２８日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、３５日目に終結した（３５ｄ）マウスの肺におけるＰＰＥのアポトーシスに対する効果の逆転に対するβ１インテグリン機能修飾の効果を示す４ｕｍのホルマリン固定パラフィン包埋切片の免疫組織化学的染色を示す図である。赤く（ローダミン）見えるＴＵＮＥＬ陽性細胞（アポトーシスの）を矢印で示す。ＤＡＰＩ核染色は灰色に見える。
【図２９】ＰＰＥを気管内に注入され、１４日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、２１日目に終結したか（２１ｄ）、あるいは２１および２８日目にＪＢ１ａ抗体を用いて処置され、次いで、３５日目に終結した（３５ｄ）マウスの肺におけるＰＰＥ誘発性損傷後の弾性繊維の修復に対するβ１インテグリン機能変更の効果を示す４ｕｍのホルマリン固定パラフィン包埋切片のレゾルシン−酸性フクシン染色を示す図である。
【図３０】（表１）肺の生理学的測定値と平均リニアインターセプト（Ｌｍ）との相関係数（ｒ）および相関関係の有意性を示す表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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