(57)【要約】概して、本発明は、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物（例えばウシ及び他の有蹄動物）、及びこれらの哺乳動物の作製方法に関する。特に本発明は、内因性ＩｇＭ重鎖及び／又はプリオンタンパク質のレベルが低減したトランスジェニック有蹄動物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＭ重鎖をコードする２つの遺伝子の突然変異を含むゲノムを有するトランスジェニック有蹄動物。
【請求項２】
少なくとも１つの突然変異がヘミ接合性突然変異である、請求項１記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項３】
両方の突然変異がヘミ接合性突然変異である、請求項２記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項４】
少なくとも１つの突然変異がホモ接合性突然変異である、請求項１記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項５】
両方の突然変異がホモ接合性突然変異である、請求項４記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項６】
有蹄動物が機能性ＩｇＭ重鎖を欠損する、請求項５記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項７】
少なくとも１つの突然変異が外因性配列の挿入によるものである、請求項１記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項８】
対照有蹄動物と比較して１０％未満の内因性ＩｇＭ重鎖を産生し、かつＩｇＭ重鎖をコードする遺伝子の突然変異を含むゲノムを有するトランスジェニック有蹄動物。
【請求項９】
突然変異が機能性ＩｇＭ重鎖の発現を実質的に排除する、請求項８記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項１０】
有蹄動物がウシであり、遺伝子がＩｇμＵである、請求項９記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項１１】
有蹄動物がウシであり、遺伝子がＩｇμＡＹである、請求項９記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項１２】
ＰｒＰのホモ接合性突然変異を含む、請求項１記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項１３】
再配列を経て異種免疫グロブリンを発現する異種免疫グロブリン遺伝子の全部又は一部をコードする核酸をさらに含む、請求項１記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項１４】
異種免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである、請求項１３記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項１５】
核酸が染色体断片内に含まれる、請求項１３記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項１６】
染色体断片がΔＨＡＣ、ΔΔＨＡＣ又はκＨＡＣである、請求項１５記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項１７】
安定に移植されたヒト造血幹細胞をさらに含む、請求項１記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項１８】
安定に移植されたイヌ、ネコ、マウス又は非ヒト霊長類の造血幹細胞をさらに含む、請求項１記載のトランスジェニック有蹄動物。
【請求項１９】
ＩｇＭ重鎖をコードする２つの遺伝子の突然変異を含むゲノムを有するトランスジェニック有蹄動物体細胞。
【請求項２０】
少なくとも１つの突然変異がヘミ接合性突然変異である、請求項１９記載の細胞。
【請求項２１】
細胞がウシ細胞であり、２つの遺伝子がＩｇμＵ及びＩｇμＡＹである、請求項１９記載の細胞。
【請求項２２】
ＩｇμＡＹのヘミ接合性突然変異を含むゲノムを有するトランスジェニックウシ体細胞。
【請求項２３】
ＩｇμＡＹのホモ接合性突然変異を含むゲノムを有するトランスジェニックウシ体細胞。
【請求項２４】
再配列を経て異種免疫グロブリンを発現する異種免疫グロブリン遺伝子の全部又は一部をコードする核酸をさらに含む、請求項２３記載の細胞。
【請求項２５】
異種免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである、請求項２４記載の細胞。
【請求項２６】
核酸が染色体断片内に含まれる、請求項２４記載の細胞。
【請求項２７】
染色体断片がΔＨＡＣ、ΔΔＨＡＣ又はκＨＡＣである、請求項２６記載の細胞。
【請求項２８】
線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋細胞、胎盤細胞及び表皮細胞から選択される、請求項１９記載の細胞。
【請求項２９】
ＰｒＰのホモ接合性突然変異をさらに含む、請求項１９記載の細胞。
【請求項３０】
異種抗体の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項１９記載のトランスジェニック有蹄動物であって、再配列を経て異種免疫グロブリンを発現する異種免疫グロブリン遺伝子の全部又は一部をコードする核酸をさらに含む有蹄動物を準備するステップ；
（ｂ）上記有蹄動物に１又は複数の目的抗原を投与するステップ；及び
（ｃ）上記有蹄動物から異種抗体を回収するステップ
を含む方法。
【請求項３１】
異種抗体がヒト抗体を含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
有蹄動物において異種抗体を作製する方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項１９記載のトランスジェニック有蹄動物であって、移植された異種造血幹細胞をさらに含む有蹄動物を準備するステップ；及び
（ｂ）上記有蹄動物から異種抗体を回収するステップ
を含む方法。
【請求項３３】
異種抗体がヒト抗体を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
異種造血幹細胞を増殖させる方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項１９記載のトランスジェニック有蹄動物であって、移植された異種造血幹細胞をさらに含む有蹄動物を準備するステップ；及び
（ｂ）上記トランスジェニック有蹄動物において上記異種造血幹細胞を増殖させるステップ
を含む方法。
【請求項３５】
（ｃ）上記トランスジェニック有蹄動物からステップ（ｂ）の増殖した造血幹細胞を回収するステップをさらに含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
所望の組織又は器官をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて維持する方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項１９記載のトランスジェニック有蹄動物を準備するステップ；
（ｂ）上記トランスジェニック有蹄動物に所望の同種又は異種の組織又は器官を移植するステップ；及び
（ｃ）上記有蹄動物において上記組織又は器官を維持するステップ
を含む方法。
【請求項３７】
組織が皮膚、心臓、肺、膵臓、肝臓又は腎臓組織を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
内因性プリオン核酸の一方又は両方のアレルに非天然突然変異を含むウシ又はウシ胎仔。
【請求項３９】
突然変異が機能性プリオンタンパク質の発現を低減する、請求項３８記載のウシ又はウシ胎仔。
【請求項４０】
突然変異が機能性プリオンタンパク質の発現を実質的に排除する、請求項３８記載のウシ又はウシ胎仔。
【請求項４１】
突然変異がヘミ接合性である、請求項３８記載のウシ又はウシ胎仔。
【請求項４２】
突然変異がホモ接合性である、請求項３８記載のウシ又はウシ胎仔。
【請求項４３】
内因性抗体の発現を低減する突然変異をさらに含む、請求項３８記載のウシ又はウシ胎仔。
【請求項４４】
突然変異が機能性ＩｇＭ重鎖の発現を低減する、請求項４３記載のウシ又はウシ胎仔。
【請求項４５】
突然変異が機能性ＩｇＭ重鎖の発現を実質的に排除する、請求項４３記載のウシ又はウシ胎仔。
【請求項４６】
ウシ胎仔が受精後少なくとも３０日である、請求項３８記載のウシ又はウシ胎仔。
【請求項４７】
ウシが新生ウシである、請求項３８記載のウシ又はウシ胎仔。
【請求項４８】
ウシが少なくとも１週齢である、請求項３８記載のウシ又はウシ胎仔。
【請求項４９】
ウシが少なくとも２月齢である、請求項４８記載のウシ又はウシ胎仔。
【請求項５０】
請求項３８記載のウシ又はウシ胎仔により産生される産物。
【請求項５１】
乳汁、ゼラチン、コラーゲン又は血清である、請求項５０記載の産物。
【請求項５２】
組換えタンパク質である、請求項５０記載の産物。
【請求項５３】
プリオンタンパク質を実質的に欠損する産物の製造方法であって、内因性プリオン核酸の一方又は両方のアレルに非天然突然変異を含むウシ又はウシ胎仔において該産物を製造する、あるいは該ウシ又はウシ胎仔から該産物を得ることを含む方法。
【請求項５４】
産物が乳汁、ゼラチン、コラーゲン又は血清である、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
産物が組換えタンパク質である、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
２つの遺伝子改変を含む細胞の作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）第１遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物体細胞を準備するステップ；
（ｂ）上記細胞若しくはその後代、該細胞若しくはその後代由来のクロマチン塊、又は該細胞若しくはその後代由来の核を、有核若しくは脱核卵母細胞に挿入するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚をレシピエントに移入するステップ；
（ｄ）上記胚又はそれより生じる胎仔若しくは幼若仔から細胞を単離するステップであって、該細胞が第１遺伝子改変を含有する、上記ステップ；並びに
（ｅ）上記細胞若しくはその後代のゲノムに第２遺伝子改変を導入し、２つの遺伝子改変を含む細胞を生成するステップ
を含む方法。
【請求項５７】
第１遺伝子改変又は第２遺伝子改変が突然変異を含む、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
第１遺伝子改変が第１突然変異を含み、第２遺伝子改変が第２突然変異を含む、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
第１突然変異が内因性遺伝子の第１アレル内にあり、第２突然変異が内因性遺伝子の第２アレル内にある、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
第１突然変異が第１内因性遺伝子の第１アレル内にあり、第２突然変異が第２内因性遺伝子の第１アレル内にある、請求項５８記載の方法。
【請求項６１】
第１遺伝子改変又は第２遺伝子改変が人工染色体を含む、請求項５６記載の方法。
【請求項６２】
人工染色体が抗体をコードする、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
ステップ（ｅ）で得られた細胞又はその後代を用いて開始し、上記方法を１回又はそれ以上繰り返して行い、さらなる遺伝子改変を導入するステップをさらに含む、請求項５６記載の方法。
【請求項６４】
ステップ（ａ）における体細胞が胎仔細胞又は成体細胞である、請求項５６記載の方法。
【請求項６５】
胎仔又は成体細胞が、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球又は筋細胞からなる群より選択される、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
２つの遺伝子改変を含む非ヒト哺乳動物の作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項５６記載の方法により得られた細胞又はその後代を準備するステップ；
（ｂ）上記細胞若しくはその後代、該細胞若しくは該後代由来のクロマチン塊、又は該細胞若しくは該後代由来の核を、有核若しくは脱核卵母細胞に挿入するステップ；並びに
（ｃ）上記卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚を、該卵母細胞又は該胚が哺乳動物に発育可能な条件下でレシピエントに移入し、それにより２つの遺伝子改変を含む哺乳動物を作製するステップ
を含む方法。
【請求項６７】
哺乳動物が有蹄動物である、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
有蹄動物がウシである、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
２つの遺伝子改変を含む細胞の作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）第１遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物体細胞を準備するステップ；
（ｂ）上記哺乳動物体細胞を、クロマチン凝縮が可能な条件下にて透過性化処理するステップ；
（ｃ）上記透過性化細胞を有核若しくは脱核卵母細胞に挿入するステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚をレシピエントに移入するステップ；
（ｅ）上記胚又はそれより生じる胎仔若しくは幼若仔から細胞を単離するステップであって、該細胞が上記遺伝子改変を含有する、上記ステップ；並びに
（ｆ）上記細胞若しくはその後代のゲノムに第２遺伝子改変を導入し、それにより２つの遺伝子改変を含む細胞を作製するステップ
を含む方法。
【請求項７０】
第１遺伝子改変又は第２遺伝子改変が突然変異を含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
第１遺伝子改変が第１突然変異を含み、第２遺伝子改変が第２突然変異を含む、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
第１突然変異が内因性遺伝子の第１アレル内にあり、第２突然変異が内因性遺伝子の第２アレル内にある、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
第１突然変異が第１内因性遺伝子の第１アレル内にあり、第２突然変異が第２内因性遺伝子の第１アレル内にある、請求項７１記載の方法。
【請求項７４】
第１遺伝子改変又は第２遺伝子改変が人工染色体を含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７５】
人工染色体が抗体をコードする、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
ステップ（ｅ）で得られた細胞又はその後代を用いて開始し、上記方法を１回又はそれ以上繰り返し、それによりさらなる遺伝子改変を導入するステップをさらに含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７７】
ステップ（ａ）における体細胞が胎仔細胞又は成体細胞である、請求項６９記載の方法。
【請求項７８】
胎仔又は成体細胞が、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球又は筋細胞からなる群より選択される、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
２つの遺伝子改変を含む非ヒト哺乳動物の作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項６９記載の方法により得られた細胞又はその後代を準備するステップ；
（ｂ）上記細胞若しくはその後代、該細胞若しくは該後代由来のクロマチン塊、又は該細胞若しくは該後代由来の核を、有核若しくは脱核卵母細胞に挿入するステップ；並びに
（ｃ）上記卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚を、該卵母細胞又は該胚が哺乳動物に発育可能な条件下でレシピエントに移入し、２つの遺伝子改変を含む哺乳動物を作製するステップ
を含む方法。
【請求項８０】
哺乳動物が有蹄動物である、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
有蹄動物がウシである、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
請求項５６記載の方法から得られた細胞を用いて作製される非ヒト哺乳動物。
【請求項８３】
有蹄動物である、請求項８４記載の哺乳動物。
【請求項８４】
ウシである、請求項８３記載の哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
トランスジェニック動物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
相同組換えによる遺伝子ターゲティングは目的遺伝子を特異的に改変するための有効な手段である。胚性幹（ＥＳ）細胞の利用はマウスにおける遺伝子機能研究において有益であった。マウス以外の哺乳動物種においてはＥＳ細胞が存在しないが、これは一次体細胞における遺伝子ターゲティングと、その後の核移植によって克服されてきた。分子生物学技術の進歩にもかかわらず、一次細胞における遺伝子ターゲティングには、相同組換え頻度の低さ（McCreathら(2000) Nature 405:1066-1069）、一次細胞の短寿命、及び正確にターゲティングされた細胞を選択するための方法の制限についての課題がある。現在、一次細胞遺伝子ターゲティング及び子孫の作製は、サイレント遺伝子と比較して高い相同組換え頻度と関連している転写活性を有する遺伝子を用いて主に実施されている（Denningら(2001) Nat. Biotechnol. 19:559-562）。さらに、正確にターゲティングされた細胞の選択は、ターゲティング遺伝子のプロモーターが選択マーカーの発現を駆動することにより実施されており、このプロセスはサイレント遺伝子には適用することができない（Denningら, 前掲；Laiら(2002) Science 295:1089-1092；Yifanら(2002) Nat. Biotechnol. 20:251-255；Thomson, A.J.ら, (2003) Reprod. Suppl. 61:495-508）。
【０００３】
遺伝子改変の結果を十分に評価するためには、遺伝子の両方のアレルを破壊する必要がある。マウスにおいては、これは一般的には、ヘミ接合性トランスジェニック初代動物から戻し交配を行ってホモ接合性のターゲティング近交系を作出することにより行われる。ホモ接合性を得るための育種は、マウスにおいても非常に時間がかかるが、長い世代間隔を有し、同系交配の結果により否定的な結果が得られる種においてはさらに大きな障害がある。ブタにおいては、この制限を克服し、ホモ接合性β（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウト動物を作出するために、２つの画期的な手法が用いられている。ヘミ接合性ターゲティング一次細胞を、遺伝子の第２アレルにおける自然発生点突然変異から生じる酵素活性の欠損について（Denningら(2003) Reproduction 126:1-11）、又は有糸分裂組換え体について（Piedrahita (2000) Theriogenology 53: 105-16）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択し、クローン化子孫をホモ接合性ノックアウト細胞系から作製した。残念ながら、これらの手法はサイレント遺伝子にとっては一般的に有効ではなく、また活性遺伝子について広く適用可能なものでもなかった。従って、非ヒト哺乳動物における遺伝子機能研究のための改善された方法が望まれている。
【０００４】
遺伝子改変動物における抗体産生
１８９０年、北里柴三郎及びＥｍｉｌ  Ｂｅｈｒｉｎｇは、驚くべき実験結果を報告した。すなわち、彼らは、免疫動物から血清を得て、それを非免疫動物に注射することにより、免疫を一方の動物から他方の動物に移すことができることを実証した。この画期的な実験によって、受動免疫法が臨床的治療法に取り入れられる基盤が築かれた。今日、受動免疫法のためにヒト免疫グロブリンを調製し使用することは、標準的な医療行為である。米国だけでも、ヒト免疫グロブリンに対して年間１４億ドルの市場があり、毎年１６トンを超えるヒト抗体が静注抗体療法に使用されている。産業先進国の経済にはこれに匹敵するレベルの消費が存在し、発展途上国においても需要が急速に成長すると予想され得る。現在、受動免疫のためのヒト抗体はヒトドナーの血清プールから得ている。これは、治療的及び予防的用途のために利用可能なヒト抗体の量に先天的に限界があることを意味する。既に需要は供給を上回っており、深刻な量不足が慢性化している。
【０００５】
ヒト免疫グロブリンの供給不足に伴ういくつかの問題を克服するために、様々な技術が開発されている。例えば、組織培養において組換え法によりヒト免疫グロブリンを生成することは常套手段である。特に、ＣＨＯ発現系においてヒト免疫グロブリンを組換え発現することは周知であり、現在治療用途で使用されているいくつかのヒト免疫グロブリン及びキメラ抗体を生成するために目下利用されている。
【０００６】
未再配列ヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するマウスが、ヒト抗体（例えば、モノクローナル抗体）の生成のために開発されている（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３号；ＷＯ９６／３３７３５号；ＷＯ９７／１３８５２号；ＷＯ９８／２４８８４号；ＷＯ９７／０７６７１号；米国特許第５，８７７，３９７号；第５，８７４，２９９号；第５，８１４，３１８号；第５，７８９，６５０号；第５，７７０，４２９号；第５，６６１，０１６号；第５，６３３，４２５号；第５，６２５，１２６号；第５，５６９，８２５号；及び第５，５４５，８０６号を参照のこと）。
【０００７】
ＰＣＴ公開ＷＯ００／１０３８３号は、ヒト染色体断片を改変し、該断片を特定の細胞へミクロセル融合により移入する方法を記載している。米国特許第５，８４９，９９２号及び第５，８２７，６９０号は、マウス、ヒツジ、ブタ、ウシ及びヤギを含むトランスジェニック動物の乳汁におけるモノクローナル抗体の産生を記載しており、該トランスジェニック動物は、乳腺上皮細胞における抗体の発現をもたらすプロモーターの制御下でヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するものである。本質的には、この方法は、例えばウシのような動物の乳汁における抗体の発現をもたらす。米国特許公開第２００３−００３７３４７−０号は、クローン化トランスジェニック有蹄動物における異種ヒト免疫グロブリンの発現を記載している。
【０００８】
上記にかかわらず、この産業においては、異種抗体産生のための宿主として用いることができる有蹄動物を作製するためのさらに改善された方法に大きな価値がある。
【０００９】
プリオンタンパク質欠損ウシの作出
細胞性プリオンタンパク質ＰｒＰＣは、普遍的に発現される細胞膜グリコシルホスファチジルイノシトール結合型糖タンパク質である。このタンパク質は、伝達性海綿状脳障害、例えばウシにおけるＢＳＥ、及びヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）の発症に重要な役割を果たしている。その疾患に関連するプロテアーゼ抵抗型アイソフォームであるＰｒＰＳｃは、正常なＰｒＰＣをＰｒＰＳｃに変換する能力を有し、海綿状脳障害の発症及び伝達に必須であると考えられている。ニューロンにおけるＰｒＰＳｃの蓄積が致命的な神経変性に関係しているが、このタンパク質の正常な生理学的機能はまだ不明である。ＰｒＰ遺伝子のコード領域に限定した破壊を有するマウスが作出されたが、これはほんのわずかな表現型の欠損を示すにすぎない。重要なことに、これらはＰｒＰＳｃによる感染には抵抗性があり、このことは、ＰｒＰＣがプリオン病の発症に必要であることを示唆している（Prusinerら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10608-10612；Weissmannら(1994) Ann. NY Acad. Sci. 724:235-240）。
【００１０】
ＢＳＥは、最初に１９８６年に英国において確認され、現在では世界中の多くの国に広まっている。ＢＳＥは、汚染ウシ製品の直接消費によって、ＣＪＤの変化形態（ｖＣＪＤ）となってウシからヒトへと伝達しうる。現在、この致命的疾病のための治療はない。疾患原因であるＰｒＰＳｃタンパク質への暴露リスクを低減するため、高価な試験プログラムが実施され、多種多様な製品からウシ成分を除去する試みが多くの国で開始されている。ＰｒＰ遺伝子アレルにホモ接合性ヌル突然変異を有するウシを用いることによって、ＢＳＥ汚染ウシ製品についての懸念が解消される可能性がある。さらに、これらの動物は、マウスに加えて、ＢＳＥにおけるＰｒＰの関与を研究するためのモデルとして有用でありうる。
【特許文献１】ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３号
【特許文献２】ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５号
【特許文献３】ＰＣＴ公開ＷＯ９７／１３８５２号
【特許文献４】ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８８４号
【特許文献５】ＰＣＴ公開ＷＯ９７／０７６７１号
【特許文献６】米国特許第５，８７７，３９７号
【特許文献７】米国特許第５，８７４，２９９号
【特許文献８】米国特許第５，８１４，３１８号
【特許文献９】米国特許第５，７８９，６５０号
【特許文献１０】米国特許第５，７７０，４２９号
【特許文献１１】米国特許第５，６６１，０１６号
【特許文献１２】米国特許第５，６３３，４２５号
【特許文献１３】米国特許第５，６２５，１２６号
【特許文献１４】米国特許第５，５６９，８２５号
【特許文献１５】米国特許第５，５４５，８０６号
【特許文献１６】ＰＣＴ公開ＷＯ００／１０３８３号
【特許文献１７】米国特許第５，８４９，９９２号
【特許文献１８】米国特許第５，８２７，６９０号
【特許文献１９】米国特許公開第２００３−００３７３４７−０号
【非特許文献１】McCreathら(2000) Nature 405:1066-1069
【非特許文献２】Denningら(2001) Nat. Biotechnol. 19:559-562
【非特許文献３】Laiら(2002) Science 295:1089-1092
【非特許文献４】Yifanら(2002) Nat. Biotechnol. 20:251-255
【非特許文献５】Thomson, A.J.ら, (2003) Reprod. Suppl. 61:495-508
【非特許文献６】Denningら(2003) Reproduction 126:1-11
【非特許文献７】Piedrahita (2000) Theriogenology 53: 105-16
【非特許文献８】Prusinerら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10608-10612
【非特許文献９】Weissmannら(1994) Ann. NY Acad. Sci. 724:235-240
【発明の開示】
【００１１】
概して、本発明は、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物（例えばウシ及び他の有蹄動物）、及びこれらの哺乳動物の作製方法に関する。特に本発明は、内因性ＩｇＭ重鎖及び／又はプリオンタンパク質のレベルが低減したトランスジェニック有蹄動物に関する。
【００１２】
ＩｇＭ重鎖タンパク質が低減したトランスジェニック有蹄動物
本発明者は、ウシが２つのＩｇＭ重鎖コード遺伝子を有し、その各々が発現されてＶＤＪ再配列を受けることを見出した。さらに本発明者は、相同組換えを利用してウシ線維芽細胞においてこれらの遺伝子の各々を破壊したが、その細胞をクローニング方法において用いることにより、機能性ＩｇＭが低減した、実質的に排除された又は排除されたトランスジェニックウシを作製することができる。
【００１３】
他の有蹄動物では１つのＩｇＭコード遺伝子しか同定されていないが、本発明者の知見から、そのようなさらなる遺伝子が存在する可能性がある。
【００１４】
本発明のトランスジェニック有蹄動物は、例えば異種免疫グロブリン及び異種造血幹細胞の産生のため、並びに異種組織及び器官をｉｎ  ｖｉｖｏで維持するために有用である。
【００１５】
従って、本発明は、対照有蹄動物と比較して１０％未満の内因性ＩｇＭ重鎖を産生し、かつＩｇＭ重鎖をコードする遺伝子（例えばウシＩｇμＵ又はウシＩｇμＡＹ）の突然変異を含むゲノムを有するトランスジェニック有蹄動物に関する。望ましくは、有蹄動物は、一致する対照有蹄動物と比較して５％未満、２％未満又はさらに１％未満を産生する。最も望ましくは、有蹄動物は、ウエスタンブロットによる検出以下のレベルのＩｇＭ重鎖又はＩｇＭを産生する。
【００１６】
一実施形態において、有蹄動物は、ＩｇＭ重鎖をコードする２つの遺伝子の各々に突然変異を含むゲノムを有するトランスジェニック有蹄動物である。望ましくは少なくとも１つの突然変異がホモ接合性突然変異であり、より望ましくは両方の突然変異がホモ接合性突然変異である。突然変異は、挿入、欠失又は置換でありうるが、最も望ましくは、例えば相同組換えによる、外因性核酸の挿入により行われる。有蹄動物は依然としてある程度の機能性ＩｇＭ重鎖を生成するものであってもよいが、突然変異の結果として全ての機能性ＩｇＭ重鎖が欠損することが最も望ましい。
【００１７】
本発明はウシを例として説明しているが、他の有蹄動物（例えばヒツジ、ブタ及びヤギ）にも同等に適用可能である。ウシの場合には、２つのＩｇＭコード遺伝子はＩｇμＵ及びＩｇμＡＹである。
【００１８】
有蹄動物は、成体有蹄動物、胎仔有蹄動物、又は有蹄動物胚でありうる。
【００１９】
本発明はまた、（ｉ）上述したＩｇＭ重鎖をコードする２つの遺伝子の突然変異を含むゲノムを有するトランスジェニック有蹄動物体細胞、及び（ｉｉ）ＩｇμＡＹのヘミ接合性又はホモ接合性突然変異を含むゲノムを有するトランスジェニックウシ体細胞に関する。好適な細胞としては、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（Ｂ細胞及びＴ細胞）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋細胞及び表皮細胞が挙げられる。
【００２０】
本発明はさらに異種抗体の作製方法に関する。かかる方法の１つは、（ａ）本発明のトランスジェニック有蹄動物であって、移植された異種造血幹細胞を有する有蹄動物を準備するステップ、及び（ｂ）該有蹄動物から（例えば血清又は乳汁から）異種抗体を回収するステップを含む。
【００２１】
異種抗体を製造するための別の方法は、（ａ）本発明のトランスジェニック有蹄動物であって、再配列を経て異種免疫グロブリンを発現する異種免疫グロブリン遺伝子の全部又は一部をコードする核酸を有する有蹄動物を準備するステップ、（ｂ）該有蹄動物に１又は複数の目的抗原を投与するステップ、及び（ｃ）該有蹄動物から異種抗体を回収するステップを含む。
【００２２】
本発明はまた、異種造血幹細胞を増殖させる方法であって、（ａ）本発明のトランスジェニック有蹄動物であって、移植された異種造血幹細胞を有する有蹄動物を準備するステップ、及び（ｂ）上記トランスジェニック有蹄動物において上記異種造血幹細胞を増殖させるステップによる方法に関する。所望であれば、トランスジェニック有蹄動物から増殖した造血幹細胞を回収してもよい。
【００２３】
本発明はまた、所望の組織又は器官をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて維持する方法であって、（ａ）本発明のトランスジェニック有蹄動物を準備するステップ、（ｂ）上記有蹄動物に所望の同種又は異種の組織又は器官（例えば皮膚、心臓、肺、膵臓、肝臓又は腎臓組織）を移植するステップ、及び（ｃ）上記動物において上記組織又は器官を維持するステップを含む方法に関する。
【００２４】
本発明の上記態様のいずれにおいても、トランスジェニック有蹄動物は、場合により、再配列を経て１以上の異種免疫グロブリンを発現する異種免疫グロブリン遺伝子の全部又は一部をコードする１又はそれ以上の核酸を有していてもよい。好適な実施形態では、異種遺伝子の全部又は一部をコードする核酸は、実質的にヒトのものである。核酸は、ヒト抗体又はポリクローナル抗体等の異種抗体をコードするのが好ましい。様々な実施形態において、免疫グロブリン鎖又は抗体は、血清及び／又は乳汁中に発現される。他の実施形態では、核酸は、ΔＨＡＣ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８２、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１−１ つくば中央６）又はΔΔＨＡＣ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８１）等の染色体断片内に含まれる。さらに別の実施形態では、核酸は、有蹄動物細胞中で宿主染色体とは独立に維持される。
【００２５】
本発明の上記態様のいずれかのまた別の実施形態において、有蹄動物は、内因性α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＰｒＰ遺伝子、及び／又はＪ鎖遺伝子の一方又は両方のアレルの突然変異を有する。他の好ましい実施形態において、有蹄動物は、外因性Ｊ鎖、例えばヒトＪ鎖をコードする核酸を有する。好ましくは、突然変異は、内因性α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素、ガラクトシル（α１，３）ガラクトースエピトープ、プリオンタンパク質、及び／又はＪ鎖の発現を低減する又は排除する。また別の好ましい実施形態において、有蹄動物は、異種Ｊ鎖核酸、例えばヒトＪ鎖核酸を含有する。好ましくは、有蹄動物は、ヒトＪ鎖を含有するヒトＩｇＡ又はＩｇＭ分子を産生する。本発明の種々の実施形態において、内因性有蹄動物核酸を突然変異させるために用いる核酸（例えば、選択マーカーをコードする核酸と機能的に連結され、かつ突然変異させようとする遺伝子と実質的な配列同一性を有する核酸と機能的に連結されているプロモーターを含むノックアウトカセット）は、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクター内に含まれていない。例えば、核酸は、細胞のウイルス感染を行わないトランスフェクション又はリポフェクションなどの標準的な方法を用いて、有蹄動物細胞に挿入されるプラスミド又は人工染色体内に含まれうる。また別の実施形態において、内因性有蹄動物核酸を突然変異させるために用いる核酸（例えば、選択マーカーをコードする核酸と機能的に連結され、かつ突然変異させようとする遺伝子と実質的な配列同一性を有する核酸と機能的に連結されているプロモーターを含むノックアウトカセット）は、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクター内に含まれている。この実施形態においては、ウイルスベクターを含むウイルスを用いて有蹄動物細胞に感染させ、ウイルスベクターの一部又は全部を有蹄動物細胞に挿入する。
【００２６】
好ましくは、有蹄動物はウシ、ヒツジ、ブタ又はヤギである。好ましくは、トランスジェニック有蹄動物は、別の属に由来する免疫グロブリン鎖又は抗体、例えば任意の他の哺乳動物に由来する抗体を発現する。特に好ましい有蹄動物は、ヒツジ、オオツノヒツジ、ヤギ、バッファロー、アンテロープ、雄ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、カリブー、スイギュウ、ラクダ、ラマ、アルパカ、ブタ及びゾウである。
【００２７】
本発明はまた、異種（例えばヒト）免疫グロブリン遺伝子座を再配列し発現するトランスジェニック有蹄動物（例えばトランスジェニックウシ）を作製する方法に関する。これは、例えば、内因性免疫グロブリンに加えて又はその代わりに異種免疫グロブリンを産生するＢ細胞を有するトランスジェニック有蹄動物を作製するために、免疫グロブリン遺伝子を含有するヒト染色体断片を有蹄動物に安定に導入することにより実施しうる。これはまた、異種免疫グロブリン鎖又は異種抗体をコードする核酸を有蹄動物の染色体に組み込むことにより実施しうる。トランスジェニック有蹄動物は、ＩｇＭをコードする少なくとも２つの遺伝子に突然変異を有し、そのため内因性ＩｇＭの発現が低減される又は排除される。一実施形態において、本発明は、少なくとも２つのμ定常領域が破壊され、別の種の免疫グロブリン（好ましくはヒト）をコードする遺伝子座を含有する人工染色体が安定に組み込まれたトランスジェニック有蹄動物（例えばトランスジェニックウシ）の作製方法に関する。
【００２８】
また本発明は、少なくとも２つの内因性ＩｇＭ重鎖遺伝子の一方又は両方のアレルが、例えば相同組換えにより破壊されている有蹄動物体細胞又は胚性幹（ＥＳ）細胞、好ましくは線維芽細胞又はＢ細胞の作製方法に関する。
【００２９】
本発明はまた、少なくとも２つの内因性ＩｇＭ重鎖遺伝子が破壊されている有蹄動物に、非有蹄動物免疫グロブリン又はその重鎖若しくは軽鎖の機能的発現に十分な遺伝子を含有する核酸（例えば、人工染色体）を挿入する方法に関する。好ましくは、これらの免疫グロブリンは、これらの免疫グロブリン又は免疫グロブリン鎖をコードする核酸を有蹄動物体細胞、好ましくは線維芽細胞に導入し、該核酸が生殖系列に伝達しているクローン化有蹄動物を作出することによって作製されるヒト免疫グロブリンである。
【００３０】
また本発明は、免疫グロブリン発現をもたらす遺伝子を含有する人工染色体、好ましくはヒト人工染色体（ＨＡＣ）を、上記のホモ接合性ノックアウト細胞に導入して、免疫に応答してアフィニティ成熟を受ける非有蹄動物免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリンを発現する有蹄動物を作製する方法に関する。
【００３１】
本発明はまた、上述のトランスジェニック有蹄動物（例えばトランスジェニックウシ）に由来するＢ細胞を用いたハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の作製方法に関する。
【００３２】
また本発明は、ポリクローナルヒト免疫グロブリンを産生する上述のトランスジェニック有蹄動物を準備し、その有蹄動物から有蹄動物抗血清又は乳汁を回収することによる、ポリクローナルヒト免疫グロブリンを含む有蹄動物抗血清又は乳汁の製造方法に関する。かかるヒト免疫グロブリン、好ましくはヒトＩｇＧは、ヒト疾患の治療又は予防のための静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）として用いられうる。ポリクローナルヒト免疫グロブリンは目的の抗原に対して反応性であることが好ましい。
【００３３】
プリオンタンパク質が低減したトランスジェニック有蹄動物
本発明はまた、内因性プリオン核酸の一方又は両方のアレルに非天然突然変異を含むウシ又はウシ胎仔に関する。突然変異は、機能性プリオンタンパク質の発現を低減する、実質的に排除する又は排除するものであり、ヘミ接合性であっても又はホモ接合性であってもよい。さらに、ウシ又はウシ胎仔は、内因性抗体の発現を低減するさらなる突然変異を有してもよい。この突然変異は、例えば機能性ＩｇＭ重鎖の発現を低減する又は実質的に排除するものでありうる。好ましくは、ウシ胎仔は受精後少なくとも３０日であるが、出生までの任意の齢でありうる。好ましいウシとしては、新生ウシ、少なくとも１週齢の仔ウシであり、より好ましくは少なくとも２月齢である。
【００３４】
関連する態様において、本発明はさらに、本発明のウシ又はウシ胎仔から産生される産物、及びプリオンタンパク質を実質的に欠損する産物の製造方法、本発明のウシ又はウシ胎仔において産物を製造する又はそれから産物を得ることを含む方法に関する。産物の例としては、ウシ又はウシ胎仔から得られる乳汁、ゼラチン、コラーゲン及び血清、並びにウシ又はウシ胎仔において産生される組換えタンパク質が挙げられる。
【００３５】
多重アレル又は多重遺伝子突然変異を含む非ヒト哺乳動物及び細胞の作製方法
本発明は、２つの遺伝子改変（例えば突然変異又はトランスジーン若しくは人工染色体の挿入）を含む細胞の作製方法を提供する。該方法は、（ａ）第１遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物体細胞を準備するステップ、（ｂ）上記細胞若しくはその後代、該細胞若しくはその後代由来のクロマチン塊、又は該細胞若しくはその後代由来の核を、有核若しくは脱核卵母細胞に挿入するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚をレシピエントに移入するステップ、（ｄ）上記胚又はそれより生じる胎仔若しくは幼若仔から細胞を単離するステップであって、該細胞が第１遺伝子改変を含有する、上記ステップ、並びに（ｅ）ステップ（ｄ）の細胞若しくはその後代のゲノムに第２遺伝子改変を導入し、２つの遺伝子改変を有する細胞を生成するステップを含む。
【００３６】
従って本発明は、多重アレル又は多重遺伝子突然変異を含有する非ヒト哺乳動物及び細胞の作製方法を提供する。かかる哺乳動物の例は、有蹄動物（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ若しくはバッファロー）、ウサギ、マウス、ラット又は霊長類（例えばサル、ヒヒ若しくはゴリラ）がある。本明細書に記載する再生（rejuvenation）技術により、細胞の寿命が長くなり、それゆえ長期間にわたる細胞の遺伝的操作が可能となる。
【００３７】
一態様において、本発明は、多重アレル又は多重遺伝子突然変異を含有するウシ細胞の作製方法であって、(a)内因性遺伝子の第１アレルに突然変異を有する有蹄動物体細胞を準備するステップ、(b)上記細胞若しくはその後代、該細胞若しくはその後代由来のクロマチン塊、又は該細胞若しくはその後代由来の核を、有核若しくは脱核卵母細胞に挿入するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚をウシの卵管又は子宮に移入するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の移入された卵母細胞又は胚を胎仔まで発育させるステップ、（ｅ）在胎２５〜９０日に上記ウシから胎仔細胞を単離するステップ、並びに（ｆ）第１内因性遺伝子の第２アレルに又は異なる第２内因性遺伝子のアレルに突然変異を導入し、多重アレル又は多重遺伝子突然変異を含有するウシ細胞を生成させるステップを含む方法を提供する。所望であれば、本発明の方法はさらに、ステップ（ｆ）で得られる細胞又はその後代から開始して、上記方法を１回以上繰り返して行い、さらなるアレル又は遺伝子に突然変異を導入するステップを含む。
【００３８】
本発明はさらに、２つの遺伝子改変を含む非ヒト哺乳動物（例えば有蹄動物）の作製方法であって、（ａ）多重アレル又は多重遺伝子突然変異を含有する非ヒト哺乳動物細胞（例えば上述の細胞のいずれか１つ）を準備するステップ、（ｂ）上記細胞若しくはその後代、該細胞若しくは該後代由来のクロマチン塊、又は該細胞若しくは該後代由来の核を有核若しくは脱核卵母細胞に挿入するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚を非ヒト哺乳動物に移入するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の移入された卵母細胞又は胚を非ヒト哺乳動物に発育させ、それにより２つの遺伝子改変を含む非ヒト哺乳動物を作製するステップを含む方法を提供する。所望であれば、ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）で準備した細胞をクロマチン凝縮が可能な条件下で透過性化してもよい。
【００３９】
本発明の非ヒト哺乳動物の例としては、有蹄動物（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ又はバッファロー）、霊長類（サル、ヒヒ又はゴリラ）、ウサギ、マウス及びラットがある。望ましくは、本明細書に記載のクローニング方法を用いて２つの遺伝的改変を含むウシ（例えばBos taurus又はBos indicus)を作製する。
【００４０】
本発明の上記全ての態様において、任意の体細胞を用いることができる（例えば、胚、胎仔、仔動物又は成体動物からの細胞）。細胞の例としては、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、胎盤細胞及び筋細胞が挙げられる。非ヒト哺乳動物がウシである場合には、体細胞は、望ましくは在胎２５〜９０日、在胎３５〜６０日、在胎３５〜５０日、在胎３５〜４５日、在胎３８〜４３日、最も好ましくは在胎約４０日の仔ウシから単離される。場合により、体細胞は、卵母細胞への挿入前に、本明細書に記載のように透過性化してもよい。
【００４１】
遺伝子改変の１つのタイプは突然変異である。突然変異は、転写活性を有する遺伝子又は転写がサイレントな遺伝子に導入しうる。突然変異を導入しうる内因性遺伝子の例は、抗体コード遺伝子（例えば、Ｊ鎖、又はＩｇμＵ若しくはＩｇμＡＹなどのＩｇμ遺伝子）、α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、又はプリオン遺伝子である。
【００４２】
典型的には、突然変異は、ポリヌクレオチド（例えば抗生物質耐性遺伝子などのポジティブセレクションマーカー）の内因性遺伝子への挿入により導入する。場合により、内因性遺伝子に導入される突然変異は、この遺伝子の発現を低減しうる。あるいは、突然変異としてはポリペプチド（抗体など）をコードする異種核酸分子の挿入も挙げられる。所望であれば、ポリヌクレオチドはポジティブセレクションマーカーに隣接するリコンビナーゼ部位、例えばｌｏｘＰ部位を含有してもよく、それによりポジティブセレクションマーカーがリコンビナーゼ（例えばＣｒｅリコンビナーゼ）によって除去されうる。
【００４３】
遺伝子改変の別のタイプは、突然変異を導入することなく細胞のゲノムに挿入されたトランスジーンである。望ましいトランスジーンの１つは人工染色体、例えばヒト人工染色体である。異種抗体（例えばヒト抗体）の製造のための人工染色体の使用については本明細書で説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本明細書で使用する「アレル」とは、特定の染色体上で特定の位置を占めるＤＮＡ対の１つのメンバーを意味する。
【００４５】
「人工染色体」とは、選択マーカーの付加、クローニング部位の付加、１以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換等の人工的な改変を有する哺乳動物染色体又はその断片を意味する。「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」とは、１以上のヒト染色体から作製した人工染色体を意味する。人工染色体は、宿主細胞中で宿主細胞の内因性染色体とは独立に維持されうる。この場合、ＨＡＣは内因性染色体と共に安定して複製し、かつ分離することができる。あるいはまた、宿主細胞の内因性染色体に転座していてもよいし、又は挿入されてもよい。２つ以上の人工染色体を、宿主細胞に同時又は逐次的に導入することができる。例えば、ヒト１４番染色体（Ｉｇ重鎖遺伝子を含む）、ヒト２番染色体（Ｉｇκ鎖遺伝子を含む）及びヒト２２番染色体（Ｉｇλ鎖遺伝子を含む）から誘導される人工染色体を導入することができる。あるいはまた、異種Ｉｇ重鎖遺伝子及びＩｇ軽鎖遺伝子の両方を含む人工染色体（ΔＨＡＣ、ΔΔＨＡＣ又はκＨＡＣ等）を導入してもよい。重鎖遺伝子座と軽鎖遺伝子座は、異なる染色体腕上（すなわちセントロメアの異なる側）にあるのが好ましい。さらに別の好適な実施形態では、ＨＡＣの全体の大きさは、約１２、１０、９、８又は７メガベース以下である。
【００４６】
「ウシ胎仔」とは、受精後少なくとも３０日の子宮内のウシを意味する。
【００４７】
「胚由来の細胞」とは、胚における細胞の細胞分裂に起因する細胞を意味する。
【００４８】
「キメラ胚」とは、２以上の胚に由来する細胞から形成された胚を意味する。生じる胎仔又は子孫は、初期胚の１つのみに由来する細胞、又は、初期胚の２以上に由来する細胞を有することができる。所望により、胎盤組織及び胎仔組織に取込まれる、各胚に由来する細胞の割合（％）は、標準的なＦＩＳＨ分析又は１つの胚に加えた膜色素の分析を用いて決定することができる。
【００４９】
「キメラ有蹄動物」とは、２以上の胚に由来する細胞から形成された有蹄動物を意味する。有蹄動物は、初期胚の１つのみに由来する細胞、又は、初期胚の２以上に由来する細胞を有することができる。所望により、胎盤組織及び胎仔組織に取込まれる、各胚に由来する細胞の割合（％）は、標準的ＦＩＳＨ分析又は１つの胚に加えた膜色素の分析を用いて測定することができる。
【００５０】
「クロマチン塊」とは、膜で囲まれていない２以上の染色体を意味する。好ましくは、クロマチン塊は細胞の全ての染色体を含む。凝縮した染色体を含む人工誘導クロマチン塊は、本明細書に記載したように、核を有糸分裂再プログラム培地（例えば、有糸分裂抽出物）に曝露することにより形成することができる。あるいは、凝縮した又は部分凝縮した染色体を含む人工誘導クロマチン塊は、本明細書に記載したように、核を以下の１つに曝露することにより作製することができる：すなわち、抗ＮｕＭＡ抗体を含む有糸分裂抽出物、界面活性剤及び／若しくは塩溶液、又はプロテインキナーゼ溶液。クロマチン塊は、互いに物理的に接触していない別個の染色体を含んでもよいし、又は物理的に接触している２以上の染色体を含むものであってもよい。
【００５１】
所望により、染色体凝縮のレベルは、標準的方法を用いて、ＤＮＡ染色素であるＤＡＰＩによる染色の強度を測定することによって決定することができる。染色体が凝縮すると、この染色強度は増大する。従って、染色体の染色強度は、分裂間期における脱凝縮した染色体の染色強度（０％凝縮と呼ばれる）及び有糸分裂における最大に凝縮した染色体の染色強度（１００％凝縮と呼ばれる）と比較することができる。この比較に基づいて、最大凝縮率（％）を決定することができる。好ましい凝縮したクロマチン塊は、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％凝縮している。好ましい脱凝縮又は部分凝縮したクロマチン塊は、１０％未満が凝縮しているものである。
【００５２】
「在胎日数」とは、卵母細胞又は胚が子宮に移植された時点からの日数を意味する。
【００５３】
「ドナー細胞」とは、核又はクロマチン塊が誘導される細胞、又は透過性化細胞（permeabilized cell）を意味する。
【００５４】
「胚」又は「胚性」とは、母性宿主の子宮膜内に埋没していない、発育している細胞塊を意味する。従って、「胚」という用語は、受精した卵母細胞；ドナークロマチン塊、核若しくは再プログラム化細胞を含む卵母細胞；前胚盤胞期の発育している細胞塊；又は母性宿主の子宮膜への移植前かつ生殖隆起の形成前の発育期にある他の任意の発育している細胞塊を指すことができる。胚は、細胞発育の複数の段階を表すことができる。例えば、ある細胞胚は接合体と呼ばれることがあり、分割した胚に起因する細胞の固体球状塊は桑実胚と呼ばれることがあり、そして割腔を有する胚は胚盤胞と呼ばれることがある。「胚性細胞」は、胚から単離されたか又はそれに含まれる細胞である。
【００５５】
「胚クローニング」とは、別の動物に由来する細胞又は細胞性物質から胚を作製するプロセスを意味する。胚クローニングは、例えば、ドナー細胞、核又はクロマチン塊を卵母細胞に挿入する又はそれと融合することによって実施しうる。得られる卵母細胞又はこの卵母細胞から形成される胚は、次に動物の子宮に移されて、クローン化動物が作出される。
【００５６】
「因子の濃縮又は枯渇」とは、天然又は組換え因子が、再プログラム培地（例えば、細胞抽出物）中に元から存在する因子の量の少なくとも２０、４０、６０、８０又は１００％付加又は除去することを意味する。あるいは、再プログラム培地中に自然に存在しない天然又は組換え因子を添加することができる。好ましい因子としては、タンパク質、例えばＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストン、プロタミン、核ラミン、転写因子、アクチベーター及びリプレッサー；膜小胞及び細胞小器官が含まれる。一つの好ましい実施形態において、因子は、以下に記載するように、再プログラム培地に添加される前に精製される。あるいは、以下に記載する精製方法の１つを用いて、望ましくない因子を再プログラム培地から除去することができる。
【００５７】
「胎仔」とは、母性宿主の子宮膜内に埋没した、発育している細胞塊を意味する。「胎仔細胞」は、出生を含む在胎期間の任意の段階にある胎仔から単離されるか又はそれに含まれる任意の細胞である。
【００５８】
「フラグメント」とは、本発明の抗体の対応領域と同一であるが、完全長配列よりも短い、連続するアミノ酸の領域を有するポリペプチドを意味する。フラグメントは、標準的アッセイ、例えば本明細書に記載したものに基づいて、対応する抗体と同じ抗原と結合する能力を有する。好ましくは、抗原へのフラグメントの結合は、対応する抗体の結合の少なくとも２０、４０、６０、８０又は９０％である。
【００５９】
「遺伝子」とは、染色体上の特定の位置を占めるＤＮＡの配列からなる遺伝単位を意味し、生物における特定の形質を決定する。遺伝子は典型的には２つのアレルを有する。
【００６０】
「ヘミ接合性突然変異」とは、内因性遺伝子の一方のアレルが突然変異しており、他方のアレルが突然変異していないことを意味する。
【００６１】
「ホモ接合性突然変異」とは、内因性遺伝子の２つのアレルが突然変異していることを意味する。本発明においては、両方のアレルに突然変異を導入する事象は同じであっても又は同じでなくてもよい。従って、２つの異なるターゲティングベクターにより遺伝的にターゲティングされる内因性遺伝子の２つのアレルはホモ接合性突然変異であるとみなされうる。
【００６２】
「ホモ接合性ノックアウト非ヒト哺乳動物」とは、内因性遺伝子の２つのアレルが遺伝的にターゲティングされて、機能性遺伝子産物の発現が顕著に低減又は排除された、ヒト以外の哺乳動物を意味する。本発明においては、両方のアレルにおける遺伝子ターゲティング事象は同じであっても又は同じでなくてもよい。従って、内因性遺伝子の２つのアレルが２つの異なるターゲティングベクターにより遺伝的にターゲティングされて該内因性遺伝子がヌル発現となった非ヒト哺乳動物は、ホモ接合性ノックアウト非ヒト哺乳動物であるとみなされうる。
【００６３】
「不死化」とは、不死化細胞と同じ細胞型、属及び種の天然対照細胞よりも、又は不死化細胞を誘導したドナー細胞よりも、少なくとも２５、５０、７５、９０又は９５％多く細胞分裂を行う能力を有することを意味する。好ましくは、不死化細胞は、対照細胞よりも少なくとも２、５、１０又は２０倍多く細胞分裂を行うことができる。より好ましくは、不死化細胞は、無限数の細胞分裂を行うことができる。不死化細胞の例は、該細胞の正常な増殖調節プロセスを変更するｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの突然変異を自然に獲得する細胞を包含する。さらに他の好ましい不死化細胞としては、癌遺伝子、例えばｒａｓ、ｍｙｃ、ａｂｌ、ｂｃｌ２若しくはｎｅｕを発現するように遺伝的に改変された細胞、又は形質転換ＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルス、例えばエプスタイン・バーウイルス若しくはＳＶ４０ウイルスに感染させた細胞が挙げられる（Kumarら(1999) Immunol. Lett. 65:153-159；Knightら(1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:3130-3134；Shammahら(1993) J. Immunol. Methods 160:19-25；Gustafsson及びHinkula(1994) Hum. Antibodies Hybridomas 5:98-104；Kataokaら(1997) Differentiation 62:201-211；Chatelutら(1998) Scand. J. Immunol. 48:659-666）。また、細胞は、テロメラーゼ遺伝子を発現するように遺伝的に改変されていてもよい（Roquesら(2001) Cancer Res. 61:8405-8507)。
【００６４】
「ノックイン突然変異」とは、外因性核酸、任意によりポリペプチドをコードする核酸を、細胞の染色体に挿入することを意味する。
【００６５】
「突然変異」とは、天然又は参照核酸配列の変化、例えば挿入、欠失、フレームシフト変異、サイレント変異、ナンセンス変異又はミスセンス変異を意味する。好ましくは、核酸配列によりコードされるアミノ酸配列は、天然配列から少なくとも１つのアミノ酸の変化を有する。細胞、胚、胎仔又は哺乳動物の遺伝子配列を改変するための組換えＤＮＡ技術の例としては、ゲノムへの別の生物（例えば、ヒト）由来のＤＮＡ配列の挿入、１以上のＤＮＡ配列の欠失、及び標的ＤＮＡ配列への１以上の塩基変異（例えば、部位特異的又はランダム変異）の導入が挙げられる。これらの改変をもたらす方法の例としては、レトロウイルス挿入、人工染色体技術、遺伝子挿入、組織特異的プロモーターを用いるランダム挿入、相同組換え、遺伝子ターゲティング、トランスポゾンエレメント、及び外来ＤＮＡを導入するための任意の他の方法が含まれる。これらの技術の全ては分子生物学の当業者に周知である。「非天然突然変異」は、人工的、例えば組換え手法により導入されるものである。
【００６６】
「多重アレル突然変異を含む非ヒト哺乳動物」又は「多重アレル非ヒト哺乳動物」とは、内因性遺伝子の２つのアレルが突然変異を受けたヒト以外の哺乳動物を意味する。２つのアレルにおける突然変異は、同じ位置にあってもよいし又はなくてもよく、同じタイプの改変に起因するものであってもよいし又はなくてもよい。例えば、多重アレル非ヒト哺乳動物における遺伝子の２つのアレルは、２つの異なるポリヌクレオチド配列の挿入による突然変異を受けていてもよい。
【００６７】
「多重遺伝子突然変異を含む非ヒト哺乳動物」又は「多重遺伝子非ヒト哺乳動物」とは、２又はそれ以上の異なる遺伝子が突然変異を受けたヒト以外の哺乳動物を意味する。２つの遺伝子における突然変異は、同じ位置にあってもよいし又はなくてもよく、同じタイプの改変に起因するものであってもよいし又はなくてもよい。例えば、多重遺伝子非ヒト哺乳動物における２つの遺伝子は、２つの異なるポリヌクレオチド配列の挿入による突然変異を受けていてもよい。
【００６８】
「核」とは、細胞のＤＮＡの大部分又は全部を含む膜結合した細胞小器官を意味する。ＤＮＡは染色体に凝縮した形で詰め込まれている。好ましくは、ＤＮＡを被包する膜は、１若しくは２の脂質二重層を含むか、又はヌクレオポリンを有する。
【００６９】
「透過性化」とは、細胞膜における孔の形成、又は細胞膜の部分的若しくは完全な除去を意味する。
【００７０】
「胎盤」とは、妊娠期間に雌哺乳動物において発達する、子宮壁の内側に存在し、部分的に胎仔を被覆し、胎仔と臍帯で連結している膜質の血管に富む器官を意味する。
【００７１】
「精製された」とは、自然に付随する他の成分から分離されていることを意味する。典型的には、自然に会合するタンパク質、抗体及び天然有機分子が少なくとも５０重量％除去されている場合には、因子は実質的に純粋である。好ましくは、因子は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％純粋である。実質的に純粋な因子は、化学合成、天然源からの因子の分離、又は自然に因子を産生しない組換え宿主細胞での因子の産生によって得ることができる。当業者は、タンパク質、小胞及び細胞小器官を、標準的技術、例えばAusubelら（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1995）により記載された技術を用いて精製することができる。因子は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、光学密度、ＨＰＬＣ分析又はウエスタンブロット分析（Ausubelら、前掲）を用いて測定して、出発材料の少なくとも２、５又は１０倍純粋であることが好ましい。好ましい精製方法としては、免疫沈降、カラムクロマトグラフィー、例えばイムノアフィニティクロマトグラフィー、磁性ビーズイムノアフィニティ精製及びプレート結合抗体によるパンニング（panning）が挙げられる。
【００７２】
「再クローン化」とは、次の回（例えば２回目の）クローニングに用いることを意味する。特に、本発明の方法から作製した胚、胎仔又は成体に由来する細胞を、有糸分裂再プログラム培地（例えば、有糸分裂細胞抽出物）中でインキュベートして、上記のように脱核卵母細胞に挿入するためのクロマチン塊を形成することができる。あるいは、細胞を透過性化し、再プログラム培地中でインキュベートし、そして上記のように脱核卵母細胞に挿入することができる。２回以上のクローニングを行うと、ドナークロマチン塊又はドナー細胞のさらなる再プログラムを生じることができ、これによって最終回のクローニング後に生存子孫が得られる確率が増大する。
【００７３】
「内因性抗体の発現を低減する」とは、Ｂ細胞により産生される内因性の機能性抗体の量又はＢ細胞集団の量を低減することを意味する。内因性抗体の量のこの低減は、Ｂ細胞により産生される内因性抗体の量の減少、機能性の内因性Ｂ細胞の数の減少、又はその組み合わせに起因するものでありうる。好ましくは、Ｂ細胞により分泌されるか、又は内因性抗体を発現若しくは分泌するＢ細胞の表面上で発現される内因性抗体の量は、少なくとも２５、５０、７５、９０又は９５％低減する。別の好ましい実施形態において、レシピエント哺乳動物に由来するサンプル、例えば血液サンプル中の内因性Ｂ細胞の数は、少なくとも２５、５０、７５、９０又は９５％低減する。
【００７４】
「再プログラム培地」とは、細胞、核、クロマチン塊若しくは染色体からの因子の除去、又は細胞、核、クロマチン塊若しくは染色体への溶液からの因子の付加を許容する溶液を意味する。好ましくは、因子の付加又は除去により、ドナー細胞、クロマチン塊若しくは核中での、又は再プログラムされたクロマチン塊若しくは核を含む細胞中でのｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルが増加又は減少する。別の実施形態において、再プログラム培地における透過性化細胞、クロマチン塊又は核のインキュベーションにより、透過性化細胞又は再プログラムされたクロマチン塊若しくは核を含む細胞の表現型は、ドナー細胞の表現型と比較して変化する。また別の実施形態において、透過性化細胞、クロマチン塊又は核の再プログラム培地におけるインキュベーションにより、透過性化細胞又は再プログラムされたクロマチン塊若しくは核を含む細胞が、ドナー細胞と比較して活性を獲得又は損失する。
【００７５】
具体例としての再プログラム培地は、生物学的分子、例えばタンパク質又は核酸を含まない溶液（例えば緩衝液）を包含する。このような溶液は、核、クロマチン塊又は染色体から１以上の因子を除去するのに有用である。他の好ましい再プログラム培地は、抽出物、例えば細胞核若しくは細胞質からの細胞抽出物、又はその組み合わせである。具体例としての細胞抽出物は、卵母細胞（例えば、哺乳動物、脊椎動物又は無脊椎動物の卵母細胞）、雄性生殖細胞（例えば、哺乳動物、脊椎動物又は無脊椎動物の生殖細胞、例えば精祖細胞、精母細胞、精子細胞又は精子）、及び幹細胞（例えば、成体又は胚性幹細胞）からの抽出物を包含する。また他の再プログラム培地は、１以上の天然若しくは組換え因子（例えば、核酸又はタンパク質、例えばＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストン、プロタミン、核ラミン、転写因子、アクチベーター、リプレッサー、クロマチン再構築タンパク質、増殖因子、インターロイキン、サイトカイン又は他のホルモン）が付加されている溶液若しくは抽出物、又は１以上の因子が除去されている抽出物である。さらに他の再プログラム培地としては、界面活性剤（例えば、０．０１％〜０．１％、０．１％〜０．５％又は０．５％〜２％のイオン又は非イオン界面活性剤、例えば１以上の次の界面活性剤：ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸Ｎａ、ｎ−オクチルグルコシド、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、ＩＧＥＰＡＬ、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０又はＴｗｅｅｎ８０）、塩（例えば、約０．１、０．１５、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５又は２Ｍ  ＮａＣｌ又はＫＣｌ）、ポリアミン（例えば、約１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ又は１０ｍＭのスペルミン、スペルミジン、プロタミン又はポリ−Ｌ−リジン）、プロテインキナーゼ（例えば、サイクリン依存性キナーゼ１、プロテインキナーゼＣ、プロテインキナーゼＡ、ＭＡＰキナーゼ、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼ、ＣＫ１カゼインキナーゼ又はＣＫ２カゼインキナーゼ）、及び／又はホスファターゼ阻害剤（例えば、約１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭの１以上の次の阻害剤：オルトバナジン酸Ｎａ、ピロリン酸Ｎａ、フッ化Ｎａ、ＮＩＰＰ１、インヒビター２、ＰＮＵＴＳ、ＳＤＳ２２、ＡＫＡＰ１４９又はオカダ酸）の溶液が挙げられる。いくつかの実施形態において、再プログラム培地は抗ＮｕＭＡ抗体を含む。所望により、複数の再プログラム培地を同時又は順次に用いて、ドナー細胞、核又はクロマチン塊を再プログラムすることができる。
【００７６】
「再プログラム化細胞」とは、再プログラム培地に曝露された細胞を意味する。好ましくは、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００又はそれより多いｍＲＮＡ又はタンパク質分子が、ドナー細胞又は透過性化細胞中で発現されない再プログラム化細胞中で、発現される。別の好ましい実施形態において、再プログラム化細胞中で発現されるが、ドナー細胞又は透過性化細胞中では発現されないｍＲＮＡ又はタンパク質分子の数は、１〜５、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００又は２００〜３００（両端を含む）である。好ましくは、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００又はそれより多いｍＲＮＡ又はタンパク質分子が、再プログラム化細胞中で発現されないドナー細胞又は透過性化細胞中で、発現される。また別の好ましい実施形態において、ドナー細胞又は透過性化細胞中で発現されるが、再プログラム化細胞中では発現されないｍＲＮＡ又はタンパク質分子の数は、１〜５、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００又は２００〜３００（両端を含む）である。さらに別の好ましい実施形態において、これらのｍＲＮＡ又はタンパク質分子は、ドナー細胞（すなわち、ドナー細胞又は透過性化された出発細胞）及び再プログラム化細胞の両者で発現されるが、これらの細胞における発現レベルは、標準的アッセイ（例えば、Ausubelら，前掲）を用いて測定して、少なくとも２、５、１０及び２０倍異なる。
【００７７】
「実質的に同一」とは、別の配列に対して少なくとも８０、９０、９５、９８又は１００％の同一性を有する配列を有することを意味する。配列同一性は、典型的には、ＢＬＡＳＴ（登録商標）（Basic Local Alignment Search Tool）又はＢＬＡＳＴ（登録商標）２を用い、そこで規定されたデフォルトパラメータにより測定される（Altschulら(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410；Tatianaら(1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250参照）。これらのソフトウェアのプログラムは、種々の置換、欠失及び他の改変との相同性の程度を割り当てることにより、類似の配列と一致させるものである。保存的置換としては、典型的には、以下の群内での置換が挙げられる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシンの群；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンの群；セリン、スレオニンの群；リジン、アルギニンの群；及びフェニルアラニン、チロシンの群。
【００７８】
「生存子孫」とは、子宮外で生存する動物を意味する。好ましくは、哺乳動物は、それが母性宿主を出た時点から少なくとも１秒、１分、１時間、１日、１週間、１ヵ月、６ヵ月又は１年間生存する。動物は、生存するために子宮内環境の循環系を必要としない。
【００７９】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００８０】
図面の簡単な説明
図１は、ウシ一次線維芽細胞における逐次的遺伝子ターゲティングを説明する概略図である。ホルスタイン胎仔線維芽細胞（＃６９３９）をターゲティングし、その後、クロマチン移植系を用いてターゲティング細胞を含有するウエルを選択し、クローニングして、ＩｇμＵ−／＋胎仔を作製した。続いてＩｇμＵ−／＋細胞系（＃３２８７）を仔ウシの作製及びＩｇμＵの第２アレルのターゲティングのために用いた。再度、細胞を選択し、胎仔の作製により再生した。胎仔を、ＩｇμＵ−／−細胞系の作製、遺伝子発現分析、及び仔ウシの作製のために回収した。ＩｇμＵ−／−細胞系（＃４６５８）にＣｒｅリコンビナーゼ発現プラスミドをトランスフェクトし、ｎｅｏ遺伝子及びｐｕｒｏ遺伝子を同時に除去し、その後３回目のクロマチン移植を行ってクローン化胎仔及び細胞系を作製したが、これらにおいてはｎｅｏ及びｐｕｒｏ選択マーカー遺伝子の両方が除去されていた。Ｃｒｅで除去したＩｇμＵ−／−線維芽細胞系の１つ（＃１４０４）を３回目の遺伝子ターゲティングに使用して、三重ターゲティングＣｒｅ／ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／＋胎仔及び細胞系を作製した。１つの細胞系（＃８３３４）を４回目の遺伝子ターゲティングに供して、ホモ接合性二重ＫＯ（ｃｒｅ／ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／−）胎仔及び細胞系を作製し、ＰｒＰ遺伝子の発現を評価した。
【００８１】
図２Ａは、＃６９３９におけるＩｇμＵ定常領域遺伝子座の構造、第１ラウンドのターゲティングに用いられるｐｕｒｏベクター、及びターゲティング事象に用いられるゲノムＰＣＲアッセイを表す概略図である。ターゲティングベクターは、５’側相同腕（７．２ｋｂ）、３’側相同腕（２．０ｋｂ）、転写及び翻訳停止配列を含有するＳＴＯＰカセット、ＤＴ−Ａ（ジフテリアトキシンＡ遺伝子）、並びにｆｌｏｘｅｄ  ｐｕｒｏ遺伝子から構成される。ベクターは、ノックアウトカセットをＩｇμＵ定常領域遺伝子座のエキソン２に挿入するように設計されている。＃６９３９線維芽細胞において、多型配列は、示すようにアレルＡとアレルＢとを区別することがわかっている。プライマー対であるｐｕｒｏＦ２×ｐｕｒｏＲ２を用いて最初のターゲティング事象を確認した。ＰＣＲ及び配列決定産物によって、ＰＣＲ産物に示された多型配列に基づいて、ベクターが細胞系＃３２８７のアレルＢと、＃２１８４−１及び２細胞系のアレルＡに組み込まれたことが示された。
【００８２】
図２Ｂは、ｐｕｒｏＦ２×ｐｕｒｏＲ２プライマーを用いたゲノムＰＣＲによるＩｇμＵ−／＋胎仔の同定を表す写真である。Ｎはネガティブコントロール（１回目のＫＯベクター及び＃６９３９ゲノムＤＮＡの混合物）であり、Ｐはポジティブコントロール（ｐｕｒｏＦ２−ｐｕｒｏＲ２領域を含むプラスミドＤＮＡ約１０４コピー／μｌ及び＃６９３９ゲノムＤＮＡの混合物）である。細胞系＃２１８４−１、＃２１８４−２及び＃３２８７はＩｇμＵ−／＋であった。
【００８３】
図２Ｃは、ｐｕｒｏＦ２×ｐｕｒｏＲ２プライマーを用いたゲノムＰＣＲによるＩｇμＵ−／＋仔ウシの遺伝子型決定を表す写真である。Ｎはネガティブコントロール（１回目のＫＯベクター及び＃６９３９ゲノムＤＮＡの混合物）であり、Ｐはポジティブコントロール（ｐｕｒｏＦ２−ｐｕｒｏＲ２領域を含むプラスミドＤＮＡ約１０４コピー／μｌ及び＃６９３９ゲノムＤＮＡの混合物）である。出生した１３頭のＩｇμＵ−／＋仔ウシ（図２Ｃにも示す）のうち、５頭を遺伝子型決定し、最初のターゲティング事象が陽性であることを確認した。
【００８４】
図３Ａは、ＩｇμＵ−／＋＃３２８７アレルの構造、第２アレルのターゲティングに用いられるｎｅｏベクター、及びターゲティング事象のためのゲノムＰＣＲアッセイを説明する概略図である。プライマー対であるｎｅｏＦ３×ｎｅｏＲ３を用いてアレルＡにおけるｎｅｏターゲティング事象を確認した。ＢＣμｆ×ＢＣμｒは、野生型アレルの不在を確認するために用いられるプライマー対である。このプライマーは、ＳＴＯＰカセットの存在のためにターゲティングアレルから配列を増幅することはない。
【００８５】
図３Ｂは、ｐｕｒｏＦ２×ｐｕｒｏＲ２、ｎｅｏＦ３×ｎｅｏＲ３、及びＢＣμｆ×ＢＣμｒプライマーを用いたゲノムＰＣＲによるＩｇμＵ−／−胎仔及び線維芽細胞の同定を示す一連の写真である。「Ｐ」はポジティブコントロール（ｐｕｒｏＦ２−ｐｕｒｏＲ２領域又はｎｅｏＦ３−ｎｅｏＲ３領域を含むプラスミドＤＮＡ約１０４コピー／μｌ及び＃６９３９ゲノムＤＮＡの混合物）である。「Ｎ」はネガティブコントロール（１回目のＫＯベクター又は２回目のＫＯベクター、及び＃６９３９ゲノムＤＮＡの混合物）であり、＃６９３９は最初の線維芽細胞系である。細胞系＃４６５８、＃３６５５、＃５１０９、＃５１３９及び＃４５５４は、アレルＡ（ｎｅｏターゲティング）及びアレルＢ（ｐｕｒｏターゲティング）の両方におけるターゲティング事象について陽性であったが、野生型アレルについては陰性であった。
【００８６】
図３Ｃは、９０日目の胎仔における脾臓から抽出したｍＲＮＡにおけるＩｇμＵ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す写真である。ポジティブコントロール「Ｐ」（市販のポリＡ＋ウシ脾臓ＲＮＡ）及び野生型（＃６９３９）胎仔（＃１、＃２）からは明瞭な発現が検出されたが、ＩｇμＵ−／−胎仔からは検出されなかった。
【００８７】
図３Ｄは、ｐｕｒｏＦ２×ｐｕｒｏＲ２、ｎｅｏＦ３×ｎｅｏＲ３及びＢＣμｆ×ＢＣμｒプライマーを用いたゲノムＰＣＲによるＩｇμＵ−／−仔ウシの遺伝子型決定を示す一連の写真である。Ｎはネガティブコントロール（１回目のＫＯベクター又は２回目のＫＯベクター、及び＃６９３９ゲノムＤＮＡの混合物）であり、Ｐはポジティブコントロール（ｐｕｒｏＦ２−ｐｕｒｏＲ２領域又はｎｅｏＦ３−ｎｅｏＲ３領域を含むプラスミドＤＮＡ約１０４コピー／μｌ及び＃６９３９ゲノムＤＮＡの混合物）である。出生した２頭のＩｇμＵ−／−仔ウシ（そのうち１つを図３Ｄに示す）を遺伝子型決定し、ＩｇμＵ遺伝子のアレルＢ及びＡの両方におけるターゲティング事象が陽性であったが、野生型アレルについては陰性であった。
【００８８】
図４Ａは、ＩｇμＵ−／−＃４６５８アレルの構造、及び選択マーカー遺伝子のＣｒｅ−ｌｏｘＰ媒介除去についてのゲノムＰＣＲアッセイを説明する概略図である。プライマー対であるＣｒｅＥｘＦ×ＣｒｅＥｘＲからの増幅によって、ｐｕｒｏターゲティングアレルからの２．５ｋｂ断片、ｎｅｏターゲティングアレルからの４．３ｋｂ断片、又は両方の選択マーカー遺伝子が切り出された場合の短い０．４ｋｂ断片が生じる。
【００８９】
図４Ｂは、ＣｒｅＥｘＦ×ＣｒｅＥｘＲプライマーを用いたゲノムＰＣＲによるＣｒｅ／ＩｇμＵ−／−胎仔及び線維芽細胞の同定を示す写真である。＃４６５８細胞系においては、Ｃｒｅの導入前に、２．５ｋｂ（ｐｕｒｏ）及び４．３ｋｂ（ｎｅｏ）のＰＣＲ産物が検出される。５つのＣｒｅ／ＩｇμＵ−／−胎仔及び細胞系において、これらのバンドは完全に消失し、代わりに０．４ｋｂ（ｐｕｒｏ及びｎｅｏなし）のバンドが検出される。
【００９０】
図５Ａは、Ｃｒｅ／ＩｇμＵ−／−＃１４０４細胞系におけるＰｒＰ遺伝子座の構造、ＰｒＰ遺伝子のためのターゲティングベクター、及びターゲティング事象のためのゲノムＰＣＲアッセイを説明する概略図である。ベクターは、５’側相同腕（１．２ｋｂ）、３’側相同腕（８．３ｋｂ）、ＳＴＯＰカセット、ＤＴ−Ａ遺伝子及びｆｌｏｘｅｄ  ｎｅｏ遺伝子から構成された。ベクターは、ＰｒＰ遺伝子座のエキソン３に位置する最初のＡＴＧコドンのすぐ後ろにノックアウトカセットを挿入するように設計した。示すようにアレルＣとアレルＤの間に一塩基対多型が見とめられた。プライマー対であるｎｅｏＦ７×ｎｅｏＲ７は、ｎｅｏターゲティング事象を示し、その多型塩基を含むように設計した。ＰＣＲ及び配列決定の産物によって、ベクターがアレルＣに組み込まれたことが示された。
【００９１】
図５Ｂは、陽性ＰｒＰプライマー対であるｎｅｏＦ７×ｎｅｏＲ７及び陰性ＩｇμＵプライマー対であるＢＣμｆ×ＢＣμｒを用いたゲノムＰＣＲによる、三重ターゲティング胎仔及び線維芽細胞系（ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／＋）の同定を示す一連の写真である。Ｐはポジティブコントロール（ｎｅｏＦ７−ｎｅｏＲ７領域を含むプラスミドＤＮＡ約１０４コピー／μｌ及び＃６９３９ゲノムＤＮＡの混合物）であり、＃１４０４はネガティブコントロールである。胎仔＃８１０３、１６６１、８３７５、８１１２及び８４４３に由来する細胞系は、ＰｒＰターゲティングについて陽性であり、野生型ＩｇμＵアレルについて陰性であり、これは三重ターゲティング細胞系（ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／＋）であることを示している。
【００９２】
図６Ａは、ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／＋＃８４４３アレルの構造、第２アレルのターゲティングに用いられるｐｕｒｏベクター、及びターゲティング事象のためのゲノムＰＣＲアッセイを説明する概略図である。プライマー対であるｐｕｒｏＦ１４×ｐｕｒｏＲ１４は、アレルＤにおけるｐｕｒｏターゲティング事象を同定するために用いた。ＢＰｒＰｅｘ３Ｆ×ＢＰｒＰｅｘ３Ｒは、野生型アレルの不在を確認するために用いられるプライマー対である。このプライマーは、ホモ接合性挿入により生じるＰｒＰ遺伝子の両方のアレルにおけるＢＰｒＰｅｘ３Ｆプライマーのアニーリング部位の破壊のために、ターゲティングされたアレルから配列を増幅するものではない。
【００９３】
図６Ｂは、ｐｕｒｏＦ１４×ｐｕｒｏＲ１４、ｎｅｏＦ７×ｎｅｏＲ７及びＢＰｒＰｅｘ３Ｆ×ＢＰｒＰｅｘ３Ｒプライマーを用いたゲノムＰＣＲによる、ホモ接合性二重ＫＯ（ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／−）胎仔及び線維芽細胞の同定を示す一連の写真である。「Ｐ」はポジティブコントロール（ｐｕｒｏＦ１４−ｐｕｒｏＲ１４領域又はｎｅｏＦ７−ｎｅｏＲ７領域を含むプラスミドＤＮＡ約１０４コピー／μｌ及び＃６９３９ゲノムＤＮＡの混合物）である。「Ｎ」はネガティブコントロール（３回目のＫＯベクター又は４回目のＫＯベクター、及び＃６９３９ゲノムＤＮＡの混合物）であり、ＩｇμＵ−／−胎仔細胞系（＃４６５８）及びＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／＋細胞系（＃８４４３）を示す。細胞系＃８４５４、８４００及び６３９７は、３つのホモ接合性二重ＫＯ（ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／−）胎仔である。これらは、ＰｒＰ遺伝子のアレルＣ（ｎｅｏターゲティング）及びアレルＤ（ｐｕｒｏターゲティング）における３回目及び４回目のターゲティング事象が陽性であったが、野生型アレルについては陰性であった。
【００９４】
図６Ｃは、ホモ接合性二重ＫＯ（ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／−）胎仔に対するＲＴ−ＰＣＲ分析を示す写真である。ＰｒＰ  ｍＲＮＡを検出するために、ＰｒＰｍＦ３×ＰｒＰｍＲ３プライマーを用いた。＃４６５８（ＩｇμＵ−／−）及び＃８４４３（ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／＋）胎仔からの明瞭な発現が観察されたが、ホモ接合性二重ＫＯ（ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／−）胎仔からの発現は観察されなかった。
【００９５】
図７は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６３６３７のポリヌクレオチド配列を示す。
【００９６】
図８は、Bos taurus  ＩｇμＵ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６３６３７２．２）のポリヌクレオチド配列を示す。
【００９７】
図９は、Bos taurus  ＩｇμＡＹ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２２１０９９）の部分ポリヌクレオチド配列を示す。
【００９８】
図１０は、ＩｇμＡＹがＩｇμＵ−／−細胞におけるＰＣＲにより検出されうることを示す概略図である。
【００９９】
図１１は、ＩｇμＡＹ及びＩｇμＵの両方がＶＤＪ再配列を受けて発現されることを示す配列のトレースの図である。
【０１００】
図１２は、ＩｇμＡＹのゲノム構成を示す概略図である。
【０１０１】
図１３は、ＩｇμＡＹのＡＹアレル及びａｙアレルの配列を示す。
【０１０２】
図１４は、ＡＹ  ＫＯベクター及びａｙ  ＫＯベクターを示す概略図である。
【０１０３】
図１５は、同時に出生したＰｒＰ＋／＋仔ウシ、ＰｒＰ−／＋（３４１）仔ウシ、ＰｒＰ−／−（３４２）仔ウシを示す。
【０１０４】
図１６Ａ〜Ｄは、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２の遺伝子型決定を示す。図１６Ａは、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２の耳生検から樹立された線維芽細胞系を示す。図１６Ｂは、ゲノムＰＣＲによる耳生検線維芽細胞におけるＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−遺伝子型の確証を示す。Ｐ、ポジティブコントロール；Ｎ、ネガティブコントロール。示すように、ｐｕｒｏＦ１４×ｐｕｒｏＲ１４プライマー及びｎｅｏＦ７×ｎｅｏＲ７プライマーを用いて、仔ウシ３４２がＰｒＰ遺伝子の両方のアレルにおけるターゲティングマーカーについてＰＣＲ陽性であることが示された。図１６Ｃは、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシにおけるＰｒＰ野生型由来のアレルの不在を示す。仔ウシ３４２は、ＢＰｒＰｅｘ３Ｆ×ＢＰｒＰｅｘ３Ｒプライマーを用いたＰｒＰ遺伝子の野生型アレルについてＰＣＲ陰性であった。図１６Ｄは、ＢＣμｆ×ＢＣμｒプライマーを用いて、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシにおけるＩｇμＵ野生型に由来するアレルのさらなる不在を示す。
【０１０５】
図１７Ａ及び１７Ｂは、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２におけるＰｒＰ遺伝子の機能的不活性化を示す。図１７Ａは、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２由来の線維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現の破壊を示す。ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２に対するＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＰｒＰ  ｍＲＮＡを検出するために、ＰｒＰｍＦ３×ＰｒＰｍＲ３プライマーを用いた。ＰｒＰ＋／＋ＩｇμＵ−／−仔ウシ及びＰｒＰ−／＋ＩｇμＵ−／−仔ウシ（仔ウシ３４１）において明瞭な発現が検出されたが、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２において発現は検出されなかった。内部ポジティブコントロールとして、プライマー対ｂＢＡＦ×ｂＢＡＲを用いてウシβアクチンｍＲＮＡ発現もまた評価した。図１７Ｂは、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２の線維芽細胞におけるＰｒＰタンパク質の不在を示す。ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２に対するウエスタンブロット分析を実施した。ポジティブコントロールとしてＰｒＰ＋／＋ＩｇμＵ−／−仔ウシを分析した。ネガティブコントロールとして、マウス線維芽細胞からのタンパク質抽出物を、この分析がウシＰｒＰタンパク質について特異的であると言及するために用いるモノクローナル抗体として用いた。ＰｒＰ＋／＋ＩｇμＵ−／−仔ウシ及びＰｒＰ−／＋ＩｇμＵ−／−仔ウシからのタンパク質抽出物において３３〜３５ｋＤａのタンパク質バンド（ウシＰｒＰのサイズ）の存在が検出されたが、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２からのタンパク質抽出物において陽性バンドは検出されなかった。抗ＣＤＣ２モノクローナル抗体を内部ポジティブコントロールとして用いて同じブロットを染色した。
【０１０６】
図１８は、ＰｒＰ−／−仔ウシの脳幹におけるＰｒＰタンパク質の不在を示す。ＰｒＰ−／−仔ウシ３５４及び２８２の脳幹に対するウエスタンブロット分析は本明細書に記載のように実施した。ＰｒＰ−／−仔ウシにおけるＰｒＰタンパク質についてのバンドは検出されなかった。
【０１０７】
図１９は、異なるＰｒＰ−／−線維芽細胞系からクローニングされた例であるＰｒＰ−／−仔ウシ３５２の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）におけるＰｒＰタンパク質の不在を示す。ＰｒＰ−／−仔ウシ３５２由来のＰＢＬのウエスタンブロット分析を実施した。３３〜３５ｋＤａのウシＰｒＰタンパク質について陽性バンドは検出されなかった。
【０１０８】
詳細な説明
概して、本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えばウシ及び他の有蹄動物）、及びこれらの哺乳動物の作製方法に関する。特に本発明は、内因性ＩｇＭ重鎖及び／又はプリオンタンパク質のレベルが低減したトランスジェニック有蹄動物に関する。本発明を以下にさらに詳細に説明する。
【０１０９】
多重アレル又は多重遺伝子突然変異を含有する非ヒト哺乳動物及び細胞の作製方法
本発明は、ウシ類（例えばウシ）などの非ヒト哺乳動物において転写がサイレントな遺伝子及び転写活性を有する遺伝子を逐次的にターゲティングするための迅速な方法を提供する。より具体的には、本発明者は、最初にサイレント遺伝子であるウシ免疫グロブリンμＵ（ＩｇμＵ）遺伝子の両方のアレルをノックアウトして、ヘテロ接合性及びホモ接合性ノックアウト仔ウシを作製するために用いた逐次的遺伝子ターゲティング系を見出した。ＩｇμＵターゲティングの後、ＩｇμＵ−／−細胞系において線維芽細胞における転写活性を有する遺伝子であるウシプリオンタンパク質（ＰｒＰ）遺伝子の両方のアレルを逐次的にノックアウトターゲティングし、ホモ接合性二重ノックアウト胎仔を作製した。本発明の方法を用いることにより、体細胞において遺伝子ターゲティングを逐次的に行うことができ、その結果多重アレル又は多重遺伝子非ヒト哺乳動物を作製することができる。本発明はさらに、米国特許出願公開第２００３−００４６７２２号（参照により本明細書に組み入れる）に記載されているように、各回のターゲティングの後に細胞系を再生するクローニング方法を利用する。
【０１１０】
目的遺伝子の破壊においては最初にヘミ接合性遺伝子ノックアウト細胞の作製及び胚クローニングによる胎仔の作製を行う。次に得られた胎仔から遺伝子ターゲティング細胞を在胎期間の任意の時点で回収する。ウシにおいては、そのような細胞の回収は、望ましくは在胎２５〜９０日、在胎３５〜６０日、在胎３５〜５０日、好ましくは在胎３５〜４５日、より好ましくは在胎３８〜４３日、最も好ましくは在胎約４０日に行う。続いて、回収した細胞において、同じ遺伝子座の第２アレル、あるいは異なる内因性遺伝子のアレルをターゲティングする。次にこれらの細胞を用いて胎仔を誘導し、それから体細胞（例えば線維芽細胞）をさらに単離し、さらなる回のクローニングに用いる。次いで、上記のステップを、所望の多重アレル又は多重遺伝子突然変異を含む細胞が作製されるまで繰り返して行う。所望であれば、これらの細胞を用いて非ヒト哺乳動物（有蹄動物など）を作製しうる。
【０１１１】
本発明者は、本発明の方法を用いて、各ターゲティング事象にはトランスフェクションから再生細胞系の樹立までに約２．５ヶ月が必要であり、それによりホモ接合性単一遺伝子改変を仔ウシに１４ヶ月で（２つのアレルのターゲティングに５ヶ月及び９ヶ月の在胎期間を含む）行うことができ、ホモ接合性二重改変を１９ヶ月で行うことができることを示す。対照的に、ホモ接合性仔ウシを作製するためのヘテロ接合性初代動物の育種には約５年を要し、２頭のヘテロ接合性初代動物からの二重ホモ接合性仔ウシの作製は実用的ではない。本明細書に記載の逐次的ターゲティング手順を用いることにより、大型動物種における複雑な遺伝子改変が可能になるだけではなく、簡便であり、多くの用途に有用である。
【０１１２】
遺伝子改変された大型動物は、多くの場合、マウスよりもヒトの疾患の研究のため、例えばヒト嚢胞性線維症の研究のためのモデルとして好適である（例えば、Harris (1997) Hum. Mol. Genet. 6:2191-2194）。ホモ接合性ノックアウトターゲティングはまた、遺伝子改変ウシにおいてヒトポリクローナル抗体を産生する試みにおいて、例えばウシ抗体の排除のためにも有用でありうる（Kuroiwa (2002) Nature Biotechnol. 20:889-894）。さらに、ＩｇμＵ遺伝子の不活性化は、例えばウシの免疫学の研究、例えばヒト又はマウスとは実質的に異なることが知られるＢ細胞発達機構の研究に有用でありうる（Butler (1997) Rev. Sci. Tech. 17:43-70）。α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子（Phelpsら(2003) Science 299:411-414）だけではなく、他の遺伝子（主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子など）についても複数のＫＯを有するブタはまた、異種移植のための器官及び組織のより好適な供与源となりうる。農業分野においては、ホモ接合性ノックアウトターゲティングは、動物の安全性及び疾患抵抗性を改善するため、例えばウシプリオン遺伝子の不活性化及び「狂牛病」の脅威の排除などに有用である。従って、本発明の方法は、生殖系列伝達の必要がなく、遺伝子機能分析、並びに生物医学的及び農業的用途のための動物の複雑な遺伝子改変に有用である。
【０１１３】
ＩｇＭ重鎖タンパク質が低減したトランスジェニック有蹄動物
従って本発明者は、ウシＩｇＭ重鎖をコードする２つの遺伝子を決定した。ウシＩｇＭをコードすると報告された最初の公開配列を図７に示す。この配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６３６３７（ｇｉ：１５７５４８９）として、Hammarstrom及び共同研究者により１９９６年に最初に公表され、その後それがImmunology (93: 581-588, 1998)に記載された。Ｕ６３６３７は、２００３年２月２７日に２つ目の配列に置き換えられた（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６３６３７．２；ｇｉ：２８５９２０９；図８）。その後、Hammarstrom及び共同研究者はBos taurus重鎖定常領域をコードする３つ目の配列を登録した（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２２１０９９；ｇｉ：３３４１３９０１；図９）。この３つ目の登録に関連する論文（Zhaoら(2003) J. Biol. Chem. 278:35024-35032）において、著者は、２つ目の配列と３つ目の配列には多型による相違があることを結論付けている（１つ目は撤回されている）。
【０１１４】
今回、本発明者は、ウシが２つのＩｇμ遺伝子（ＩｇμＵ及びＩｇμＡＹと称する）を有し発現することを証明した。両方の遺伝子が発現されるため、ＩｇＭ重鎖タンパク質を有しないウシを作製するためには、両方の遺伝子の突然変異が必要である。
【０１１５】
他の有蹄動物では１つのＩｇＭコード遺伝子しか同定されていないが、本発明者のウシにおける２つのＩｇμ遺伝子の知見から、そのようなさらなる遺伝子が存在する可能性がある。これらのさらなる遺伝子は、本明細書に記載するような標準的な技法を用いて同定することができる。
【０１１６】
他の有蹄動物の免疫グロブリン遺伝子を改変するために、３つの主要領域を含むようにターゲティングベクターを設計する。第１の領域は、ターゲティングしようとする遺伝子座に相同である。第２の領域は、そのターゲティング遺伝子座の一部と特異的に置き換わる薬剤選択マーカーである。第３の領域は、第１の領域と同様にターゲティング遺伝子座に相同であるが、野生型ゲノムにおいて第１の領域と隣接していない。ターゲティングベクターと所望の野生型遺伝子座との相同組換えにより、ターゲティングベクター中で相当する２つの相同性領域間の遺伝子座配列が欠失され、該配列が薬剤耐性マーカーで置き換えられる。好適な実施形態では、２つの相同性領域の合計の大きさが約６キロベースであり、ターゲティング遺伝子座の一部と置き換わる第２の領域の大きさは約２キロベースである。このターゲティング法は、原核細胞からヒト細胞まで幅広い種に対して概して有用である。使用する各ベクターの特異性は、遺伝子ターゲティング手順のために選択される遺伝子座、及びこの方法で使用する配列にある。この手法は、全ての有蹄動物（ヤギ（Capra hircus）、ヒツジ（Ovis aries）及びブタ（Sus scrufa）、並びにウシ（Bos taurus及びBos indicus）が挙げられるがこれらに限定されない）に使用できる。
【０１１７】
有蹄動物の細胞中の特定の遺伝子をターゲティングするためにエレクトロポレーションを使用することも、有蹄動物において広く使用され得る。本明細書に記載する一般的な手順は、他の有蹄動物のゲノムにターゲティング突然変異を導入するために適応できる。エレクトロポレーション条件（電圧及び電気容量）を変更して、他の有蹄動物から得られるトランスフェクタントの数を最適化することも可能である。
【０１１８】
さらに、ウシ類における重鎖遺伝子座をターゲティングするために本発明で使用した方法（すなわち、除去されるエキソンと直接隣接する領域に相同な領域を含むベクターを用いて、全てのコードエキソン及び介在配列を除去すること）は、他の有蹄動物においても同等に使用できる。例えば、ヒツジ（Ovis aries）の免疫グロブリン重鎖遺伝子座に対して広範な配列分析が行われており、ヒツジ遺伝子座は構造及び配列の両方の点でウシ遺伝子座と極めて類似性が高い（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ７１５７２、Ｚ４９１８０〜Ｚ４９１８８、Ｍ６０４４１、Ｍ６０４４０、ＡＦ１７２６５９〜ＡＦ１７２７０３）。再配列ヒツジ免疫グロブリン鎖について報告された多数のｃＤＮＡ配列に加えて、重鎖５’エンハンサー（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ９８２０７）、３’μスイッチ領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ９８６８０）及び５’μスイッチ領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ９８６８１）を含めて重鎖遺伝子座についてのゲノム配列情報が報告されている。重鎖のヒツジ分泌形態についての完全ｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５９９９４として登録されている。この登録配列は、対応するウシ配列と非常に類似した４つのコードエキソンの配列全体を含んでいる。
【０１１９】
従って、本発明は、内因性ＩｇＭ発現が２又はそれ以上のＩｇμ遺伝子の突然変異により低減又は排除されているトランスジェニック有蹄動物、好ましくはトランスジェニックウシの作製に関する。場合により、別の種（好ましくはヒト）の機能性抗体の産生に十分な遺伝子を含む核酸（例えば人工染色体）が安定に導入されていてもよい。
【０１２０】
プリオンタンパク質が低減したトランスジェニック有蹄動物
本明細書に記載のように、逐次的遺伝子ターゲティングによって、健常なＰｒＰ欠損仔ウシの作出に成功した。かかる動物は、ＢＳＥの危険のないウシに由来する農業製品及び生物医学製品、例えば乳汁、ゼラチン、コラーゲン及び血清の製造のための改善された集団、並びにヒトの治療のためのヒト組換えタンパク質産生及びヒトにおける異種移植のための医療材料のための改善された供与源を提供する。本発明のウシ又はウシ胎仔は、一般的にそのような動物に農業的に由来する任意の産物を製造するために用いることができる。また、例えば米国特許出願公開第２００３−００３７３４７号、第２００４−００６８７６０号及び第２００３−００５６２３７号、又はＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０４４１５６号（全て参照により本明細書に組み入れる）に記載されている方法のいずれかによって、任意の組換えタンパク質、例えば限定されるものではないが、ヒト抗体を製造するために用いることができる。
【０１２１】
非ヒト哺乳動物細胞
本明細書で説明するように、本発明の方法は、非ヒト哺乳動物体細胞（有蹄動物体細胞など）への突然変異の導入を含む。好適な体細胞としては、胚、胎仔、仔動物又は成体動物に由来する細胞が含まれる。遺伝子ターゲティングに好ましい細胞としては、分化細胞、例えば線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、胎盤細胞及び筋細胞が挙げられる。好ましい細胞としてはまた、任意の器官、例えば膀胱、脳、食道、卵管、心臓、腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道及び子宮に由来するものが挙げられる。好ましくは、ドナー細胞、ドナー核、ドナークロマチン塊、又は再構成卵母細胞は４倍体ではない。
【０１２２】
細胞は、非ヒト哺乳動物、例えば有蹄動物、ウサギ、マウス、ラット又は霊長類などの任意のものに由来しうる。有蹄動物としては、ウマ目（奇蹄類Ｐｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）及びウシ目（偶蹄類Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）のメンバー（ウシ（Ｂｏｓ）属のあらゆるメンバー等）が挙げられる。他の好適な有蹄動物としては、ヒツジ、オオツノヒツジ、ヤギ、バッファロー、アンテロープ、雄ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、カリブー、スイギュウ、ラクダ、ラマ、アルパカ、ブタ及びゾウが挙げられる。最も好ましくは、非ヒト哺乳動物はウシ（例えばBos taurus又はBos indicus）である。
【０１２３】
遺伝子ターゲティングを行う細胞が胚又は胎仔に由来する場合には、該細胞は遺伝子改変非ヒト哺乳動物の出生までの在胎期間の任意の時点で単離することができる。上述したように、ウシ細胞は、望ましくは在胎２５〜９０日、在胎３５〜６０日、在胎３５〜５０日、好ましくは在胎３５〜４５日、より好ましくは在胎３８〜４３日、最も好ましくは在胎約４０日に単離される。ヒツジ細胞は、望ましくは在胎２５〜１５０日、在胎３０〜１００日、好ましくは在胎３５〜８０日、より好ましくは在胎３５〜６０日、最も好ましくは在胎約４０日に単離される。ウマ細胞は、望ましくは在胎２５〜３００日、在胎３０〜１００日、好ましくは在胎３５〜８０日、より好ましくは在胎３５〜６０日、最も好ましくは在胎約４０日に単離される。ブタ細胞は、望ましくは在胎２５〜１１０日、在胎３０〜９０日、好ましくは在胎３０〜７０日、より好ましくは在胎３０〜５０日、最も好ましくは在胎約３５日に単離される。ヤギ細胞は、望ましくは在胎２５〜１５０日、在胎３０〜１００日、好ましくは在胎３５〜８０日、より好ましくは在胎３５〜６０日、最も好ましくは在胎約４０日に単離される。霊長類細胞は、望ましくは在胎２５〜１５０日、在胎３０〜１００日、好ましくは在胎３５〜８０日、より好ましくは在胎３５〜６０日、最も好ましくは在胎約４０日に単離される。げっ歯類細胞は、望ましくは在胎６〜１８日、在胎８〜１６日、好ましくは在胎１０〜１６日、より好ましくは在胎１２〜１６日、最も好ましくは在胎約１４日に単離される。
【０１２４】
レシピエント細胞は、好ましくは卵母細胞、受精接合体又は２細胞期胚であり、それらは全て脱核されていてもよいし又はされていなくてもよい。典型的には、ドナー細胞及びレシピエント細胞は同じ種に由来するものである。しかしながら、異なる種に由来するドナー細胞とレシピエント細胞を用いて再構成された胚からの発育を達成した成功例が報告されている。
【０１２５】
遺伝子ターゲティング
概して、本発明の遺伝子ターゲティング事象としては、遺伝子の不活性化、除去又は改変；遺伝子のアップレギュレーション；遺伝子置換；あるいは予め決定した遺伝子座におけるトランスジーン置換が挙げられる。ターゲティングを行って不活性化、除去又は改変を生じさせうる遺伝子の例は、ヒトに対して異種反応性の抗原（例えばα−１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子、抗体コード遺伝子、プリオンタンパク質の産生に寄与するＰｒＰ遺伝子座の遺伝子及び非ヒト動物におけるその正常な対応物、遺伝疾患に寄与し、その改変型、不活性型又は欠失型が動物の疾患モデルとなるヒトの遺伝子（例えば嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子遺伝子）、食物不耐性又はアレルギーを引き起こす物質に寄与する遺伝子、糖タンパク質上の特定の糖残基の存在に寄与する遺伝子（例えば非ヒト動物におけるシチジンモノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子）、並びに免疫グロブリン遺伝子の体細胞再配列に寄与する遺伝子（例えばＲＡＧ１及びＲＡＧ２など）である。
【０１２６】
アップレギュレーションを生じるターゲティングを行うことができる遺伝子の中には、補体媒介性溶解の抑制に寄与する遺伝子（例えばブタＣＤ５９、ＤＡＦ及びＭＣＰなど）がある。さらに、また以下に記載するように、遺伝子の置換を行ってもよい。置換しうる遺伝子としては、血液成分（例えば血清アルブミン）の産生に寄与する遺伝子、食物不耐性又はアレルギーを引き起こす物質に寄与する遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、及び表面抗原に寄与する遺伝子が挙げられる。
【０１２７】
本発明の方法を用いることにより、ターゲティング事象を有する一次細胞クローンの同定、単離、分析及び発現に必要な時間が有意に最小化される。これは、培養時間の低減によって核ドナーとして用いられる細胞が生存可能で正常な正倍数体となる可能性が高まるために、本発明の重要な態様である。
【０１２８】
ターゲティング構築物
ターゲティング遺伝子突然変異には、目的の遺伝子におけるターゲティングアレルと相同な領域を有する核酸構築物を作製し、それにより該構築物がゲノムアレルに組み込まれてその発現を破壊することが必要である。従って、遺伝子を改変するために、３つの主要領域を含むようにターゲティングベクターを設計する。第１の領域は、ターゲティング対象の遺伝子座に相同である。第２の領域は、そのターゲティング遺伝子座の一部と特異的に置き換わるポリヌクレオチド配列（例えば抗生物質耐性タンパク質などの選択マーカーをコードする）である。第３の領域は、第１の領域と同様にターゲティング遺伝子座に相同であるが、野生型ゲノムにおいて第１の領域と隣接していない。ターゲティングベクターと所望の野生型遺伝子座との相同組換えにより、ターゲティングベクター中で相当する２つの相同性領域間の遺伝子座配列が欠失され、該配列が例えば薬剤耐性マーカーで置き換えられる。使用する各ベクターの特異性は、遺伝子ターゲティング手順のために選択される遺伝子座、及びこの方法で使用する配列にある。この手法は、全ての哺乳動物、例えば有蹄動物（ヤギ（Capra hircus）、ヒツジ（Ovis aries）、ブタ（Sus scrufa）、及びウシ類（Bos taurus又はBos indicus）など）に使用できる。上記のようなターゲティング突然変異を実施するための例示的なベクターを本明細書に記載する。他のターゲティング部位において相同組換えを行うためのベクターの構築方法は当業者に周知である。さらに、好適なベクターの構築は当業者の技術の範囲内である。
【０１２９】
相同組換えを容易にするために、目的遺伝子の相同組換え及び不活性化を生じるのに使用するベクターはそれぞれ、ターゲティング対象の遺伝子と実質的な配列同一性を示すＤＮＡの部分を含む。これらの配列は、相同組換えを容易にするために、ターゲティング遺伝子座と、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、さらに好ましくは１００％の配列同一性を有する。好ましい実施形態において、２つの相同領域の合計サイズは約９〜９．５キロベースであり、ターゲティング遺伝子座の一部と置き換わる第２領域のサイズは約２キロベースである。
【０１３０】
典型的には、構築物は、所望の相同組換体（例えば、目的遺伝子が相同組換えにより破壊された細胞）の選択に役立つマーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子としては、数ある中で、抗生物質耐性マーカー、薬剤耐性マーカー及び緑色蛍光タンパク質が挙げられる。１つのネオマイシン耐性構築物は、以下のように組み立てた。「ｐＳＴｎｅｏＢ」と称される構築物（Katohら(1987) Cell Struct. Funct. 12:575；Japanese Collection of Research Biologicals (JCRB) 受託番号VE039）は、コード領域の上流にあるＳＶ４０プロモーター及びＴＫエンハンサーの制御下でネオマイシン耐性遺伝子を含むように設計された。コード領域の下流には、ＳＶ４０ターミネーター配列が存在する。ｎｅｏカセットを、ＸｈｏＩ断片として、「ｐＳＴｎｅｏＢ」から切り出した。標準的な分子生物学技術を用いて断片の端部を平滑末端に変換した後、平滑末端断片を、ベクターｐＢＳ２４６（Gibco/Life Technologies）中のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。この部位は、ｌｏｘＰ部位に挟まれている。「ｐＬｏｘＰ−ＳＴＮｅｏＲ」と称した新しい構築物を、μノックアウトＤＮＡ構築物を作製するために使用した。この構築物の所望の断片は、元々ｐＢＳ２４６クローニングベクター中に存在していたｌｏｘＰ部位及びＮｏｔＩ部位に挟まれている。ｌｏｘＰ−ｎｅｏ−ｌｏｘＰを含む所望のＮｏｔＩ断片を、免疫グロブリンμ定常領域エキソンを置き換えるために使用した。ネオマイシン耐性遺伝子に機能的に連結したＳＶ４０プロモーターはネオマイシン耐性遺伝子の転写を活性化し、所望のＮｏｔＩ断片がμ定常領域エキソンと置き替わった細胞を、それらの獲得した抗生物質耐性に基づいて選択することができる。
【０１３１】
さらに、仔ウシ中の遺伝子をターゲティングするために本発明で使用した方法（すなわち、除去されるエキソンと直接隣接する領域に相同な領域を含むベクターを用いて、コード領域の一部及び介在配列を除去すること）は、他の哺乳動物においても使用できる。例えば、ヒツジ（Ovis aries）の１つの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に対して広範な配列解析が行われており、ヒツジ遺伝子座は構造及び配列の両方の点でウシ遺伝子座と極めて類似性が高い（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ７１５７２、Ｚ４９１８０〜Ｚ４９１８８、Ｍ６０４４１、Ｍ６０４４０、ＡＦ１７２６５９〜ＡＦ１７２７０３）。再配列ヒツジ免疫グロブリン鎖について報告された多数のｃＤＮＡ配列に加えて、重鎖５’エンハンサー（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ９８２０７）、３’μスイッチ領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ９８６８０）及び５’μスイッチ領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ９８６８１）を含めて重鎖遺伝子座についてのゲノム配列情報が報告されている。重鎖のヒツジ分泌形態についての完全ｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５９９９４として登録されている。この登録配列は、対応するウシ配列と非常に類似した４つのコードエキソンの配列全体を含んでいる。従って、ＧｅｎＢａｎｋ配列は、ＰＣＲプライマー設計のためにウシＩｇμＵ配列と高い相同性を有する領域を決定するために使用することができる。非同質遺伝子型ＤＮＡを用いてウシ細胞をターゲティングしたため、ヒツジ配列と高い相同性を有する領域の発見を、ウシ品種間で類似の配列保存性が存在する可能性が高いことの指標として用いた。ウシ及びヒツジ免疫グロブリン遺伝子座の配列及び構造が類似していることから、ウシ免疫グロブリン遺伝子座を除去するために本明細書で使用したターゲティング法は、ヒツジの系に上手く適用できることが予想され得る。さらに、ブタ（Sus scrofa、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ４２８８１）及びヤギ（Capra hircus、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１４０６０３）についての既存の情報は、これらの種の両方の免疫グロブリン遺伝子座も、本ターゲティング法を利用するのに十分な程度のウシ遺伝子座に対する類似性を有することを示している。
【０１３２】
１つの細胞ターゲティング方法において、ターゲティング構築物は、マーカー遺伝子の発現を駆動するための調節発現、並びにポリアデニル化シグナル配列を含む。そのような構築物によって、突然変異を受けた遺伝子の発現とは独立して挿入配列を検出することができ、従ってサイレント遺伝子（すなわち線維芽細胞において発現されない遺伝子）の組換え体を同定することができる。マーカー遺伝子が、ランダム挿入ではなく相同組換えによりゲノムに組み込まれたか否かを確認するため、サザンブロッティング、ＰＣＲ又はＤＮＡ配列決定などの標準的な分子生物学技術を用いることができる。
【０１３３】
ターゲティング細胞の選択
一般的に、ターゲティング細胞は通常選択マーカーを用いて同定する。しかしながら、細胞が既に選択マーカーを含有する場合には、異なる選択マーカーを含有する新たなターゲティング構築物が必要な場合もある。あるいは同じ選択マーカーを用いる場合には、薬剤濃度を上昇させる（例えば薬剤濃度を２倍にする）ことにより２回目のターゲティングにおいて細胞を選択する。
【０１３４】
ターゲティング構築物はまた、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系を用いて選択マーカーの効率的な除去を行うためにｌｏｘＰ部位により挟まれた選択マーカーを含有してもよい。従って、遺伝子ターゲティング事象後のある時点において、好ましくは任意の胚クローニングの前に、そのような切除を行って、細胞から遺伝物質の一部を除去してもよい。この物質は、選択マーカー又は導入される遺伝子転写活性化因子でありうる。この除去は、本明細書で後述する手法により、又は当技術分野で周知の他の手法により行いうる。
【０１３５】
一実施形態において、ターゲティングベクターを担持する胎仔線維芽細胞を、エレクトロポレーションによってＣｒｅ含有プラスミド（例えば、Gagnetenら(1997) Nucleic Acids Res. 25:3326-3331に記載のようなＧＦＰｃｒｅ融合遺伝子を含むＣｒｅプラスミド）でトランスフェクトする。これにより、Ｃｒｅタンパク質を含む全てのクローンの迅速な選択が可能になる。これに関し、細胞は、ＦＡＣＳソーティング、又は顕微鏡操作による緑色蛍光発光細胞の手操作による回収のいずれかにより、選択される。緑色の細胞は、活発に転写されるＣｒｅリコンビナーゼを担持し、つまり、薬剤耐性マーカーを欠失していることが期待される。Ｃｒｅ発現について選択した細胞をクローニングし、ＰＣＲ分析によって薬剤耐性マーカーの欠失についてクローンを分析する。このような確認を行った後、かかる細胞を次の回の遺伝子ターゲティング又はクローニングに使用する。
【０１３６】
異種核酸の導入
所望であれば、所望のポリペプチドをコードする異種核酸分子を、導入される突然変異の一部として内因性遺伝子に挿入してもよい。例えば、特定の種の抗体をコードする遺伝子を内因性遺伝子に導入しうる。好ましくは、例えばＰＣＴ公開ＷＯ９７／０７６７１号及びＷＯ００／１０３８３号（参照により本明細書に組み入れる）に開示されているものなどのヒト人工染色体をこの目的のために用いる。これらのヒト人工染色体はまた、対応の発行されている日本国特許第３０３０００９２号にも記載されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有し発現するヒト人工染色体の構築は、Shenら(1997) Hum. Mol. Genet. 6:1375-1382；Kuroiwaら(2000) Nature Biotechnol. 18:1086-1090；及びLoupertら(1998) Chromosome 107:255-259に開示されている。人工染色体の安定な挿入後、細胞系（例えばウシ胎仔線維芽細胞）をさらなる遺伝子ターゲティングのためのドナー細胞として用いうる。
【０１３７】
ヒト人工染色体を使用する代わりに、目的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、ＹＡＣベクター、ＢＡＣベクター又はコスミドベクターを用いて染色体に組み込んでもよい。そのようなベクターは、エレクトロポレーション、リポフェクション、ＹＡＣベクターを含む酵母スフェロプラストとの融合等の公知方法を用いて、細胞（例えば胎仔線維芽細胞）に導入することができる。所望であれば、目的遺伝子を含むベクターを、細胞（例えば胎仔線維芽細胞）の対応する内因性遺伝子座にターゲティングさせて、目的遺伝子の導入及び内因性遺伝子の突然変異を同時に行うことができる。
【０１３８】
目的遺伝子をコードする核酸の組込みは、Lonbergらによる特許（米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、第５，７５０，１７２号、第５，７７０，４２９号、第５，７８９，６５０号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９号、第５，８７７，３９７号、及び第６，３００，１２９号、全て参照により本明細書に組み入れる）に記載されているように行うこともできる。目的遺伝子を宿主哺乳動物の染色体に挿入するために使用する「ノックイン」構築物では、１つ以上の遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子が、構築物でトランスフェクトされる細胞型において活性なプロモーターと機能的に連結され得る。例えば、構成的に活性な、誘導可能な、又は組織特異的なプロモーターを使用して、組み込まれた抗生物質耐性遺伝子の転写を活性化して、トランスフェクトされた細胞をその獲得した抗生物質耐性に基づいて選択することができる。あるいはまた、目的遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子を含むノックインカセットがプロモーターに機能的に連結していないノックイン構築物を使用してもよい。この場合、ノックインカセットが内因性プロモーターの下流に組み込まれた細胞は、内因性プロモーターの制御下で生じる抗生物質耐性マーカーの発現に基づいて選択することができる。これらの選択された細胞を、本明細書に記載の胚クローニング法に使用して、目的遺伝子が宿主染色体に組み込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することができる。あるいは、目的の外因性遺伝子を含有する動物を内因性遺伝子が不活性化されている動物と交配することも可能である。
【０１３９】
遺伝子突然変異の例
本方法を用いて任意の数の例示的な遺伝子突然変異を哺乳動物に導入することができる。例えば、内因性有蹄動物ＩｇＪ鎖遺伝子をノックアウトして、ヒトに投与する本発明の抗体中の有蹄動物ＩｇＪ鎖の潜在的な抗原性を抑制することができる。ターゲティングベクターの構築のためには、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ０２３０１に見られるウシＩｇＪ鎖領域のｃＤＮＡ配列を使用することができる。このｃＤＮＡ配列をプローブとして用いて、ＲＰＣ１−４２（Oakland, CAのBACPAC）等のＢＡＣライブラリからウシＩｇＪ鎖のゲノム配列を単離するか、又は任意の他の有蹄動物からＪ鎖のゲノム配列を単離してもよい。さらに、ヒトＪ鎖コード配列を、ヒトＩｇＡ及びＩｇＭ分子を機能性発現させるために本発明の有蹄動物に導入してもよい。ヒトＪ鎖のｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＨ００２８３６、Ｍ１２７５９及びＭ１２３７８として入手可能である。この配列は、本明細書に記載するような標準的な方法を用いて有蹄動物胎仔線維芽細胞に挿入し得る。例えば、ＨＡＣ、ＹＡＣベクター、ＢＡＣベクター、コスミドベクター又はノックイン構築物中のヒトＪ鎖核酸を、内因性有蹄動物染色体に組み込むか、又は内因性有蹄動物染色体から独立して維持させてもよい。得られたトランスジェニック有蹄動物細胞を、本明細書に記載する胚クローニング法に使用して、機能性有蹄動物Ｊ鎖の発現を低減するか又は排除する突然変異を有し、かつヒトＪ鎖を発現する異種核酸を含む所望の有蹄動物を作製してもよい。
【０１４０】
別の例において、非ヒト哺乳動物（有蹄動物など）がヒト抗体を産生するように遺伝的に操作されている場合には、有蹄動物α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子（ガラクトシル（α１，３）ガラクトースエピトープを生成する酵素をコードする遺伝子）の発現を低減又は排除することが望ましい。この糖鎖エピトープにより修飾されるグリコシル化ヒト抗体は、治療薬としてヒトに投与された場合、このエピトープと反応するレシピエント中の抗体により不活性化されるか又は除去されることがある。この可能性ある免疫応答を排除するためには、ウシα−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の配列を用いて、ノックアウト構築物を設計し、この遺伝子を不活性化するとよい。このウシ配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０４９８９；Joziasseら(1989) J. Biol. Chem. 264: 14290-14297）、又はブタα−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ配列（米国特許第５，８２１，１１７号及び第６，１５３，４２８号に開示されている）を用いて、これらの種における該遺伝子を不活性化するか、あるいは様々な他の有蹄動物からゲノムα−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ配列を得てエピトープの発現が低減するか又は排除された哺乳動物を作製することができる。
【０１４１】
有蹄動物ＰｒＰ遺伝子（プリオンタンパク質をコードする）はまた、感染症（ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）など）の可能性あるリスクを低減するために突然変異又は不活性化しうる。ウシＰｒＰ遺伝子の突然変異について以下に説明する。
【０１４２】
様々な方法論を用いて、上述したさらなる突然変異又は遺伝子不活性化を本発明の有蹄動物に組み込むことができる。各々所望の突然変異についてトランスジェニック有蹄動物細胞系を作製した後、交雑育種を用いて、これらのさらなる突然変異を本発明の有蹄動物に組み込むことができる。あるいはまた、これらの追加の突然変異を有する胎仔線維芽細胞を、内因性免疫グロブリン遺伝子をノックアウトするため、及び／又は異種免疫グロブリン遺伝子を導入するための出発材料として用いてもよい。また、本明細書に記載するように、内因性免疫グロブリン遺伝子中にノックアウト突然変異を有する、及び／又は異種免疫グロブリン遺伝子を含む胎仔線維芽細胞を、これらの追加の突然変異又は不活性化のための出発材料として使用することができる。
【０１４３】
クローン化非ヒト哺乳動物の作出
本発明者は、ＩｇＭ重鎖をコードする遺伝子における１又は複数の突然変異を有する哺乳動物をクローニングするために用いることができる、哺乳動物（例えばウシなどの有蹄動物）のをクローニングするための多様な方法を既に開示している（例えば、米国特許出願公開第２００２−００４６７２２号及びＰＣＴ公開ＷＯ０２／０５１９９７号参照）。これらの方法のいくつかにおいては、透過性化細胞を再プログラム培地（例えば細胞抽出物）を用いてインキュベートし、細胞からの因子の付加又は除去を可能にし、その後、透過性化細胞の細胞膜を再度封入して所望の因子を取り囲み、細胞の膜の完全性を回復する。またこれらのいくつかの方法で、核移植胚の生存子孫への発育に望ましくない遺伝子の転写を促進する可能性のある核成分（例えば転写因子）の放出を可能にする、ドナー核（例えば、単離された核又はドナー細胞内の核）のクロマチン塊への凝縮を行う。所望であれば、これらの方法のいずれかのステップを、１回以上繰り返して行ってもよいし、又は異なる再プログラム方法を連続して実施して、再プログラムの程度を増大させ、クローン化胎仔の生存率を高めてもよい。
【０１４４】
クローン化哺乳動物（例えばウシ）及びクローン化トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製のための他の方法は当技術分野で公知であり、例えば米国特許第５，９９５，５７７号（University of Massachusettsに付与）、及びＰＣＴ公開ＷＯ９５／１６６７０号、ＷＯ９６／０７７３２号、ＷＯ９７／０６６９号及びＷＯ９７／０６６８号（まとめてロスリン法という）に記載されている。ロスリン法は、University of Massachusettsの技法とは異なり、増殖中のドナー細胞ではなく、静止期のドナー細胞を用いる。これらの特許はその全体を参照により本明細書に組み入れる。これらの技術は、トランスジェニックウシの作製のための使用に限定されるものではなく、上記の技術は他の非ヒト哺乳動物（有蹄動物など）の胚クローニングにも用いることができる。
【０１４５】
胚クローニングの後、有蹄動物の交配により、又は既に記載された相同ターゲティングベクターを用いた２回目の遺伝子ターゲティングにより、所望の動物の作製を行うことができる。
【０１４６】
薬剤耐性マーカーのＣｒｅ／Ｌｏｘ切除
本発明の一実施形態において、以下のようにＣｒｅ／ｌｏｘ系を用いてマーカーを効率的に欠失し易くすることができる。ターゲティングベクターを担持する胎仔線維芽細胞を、エレクトロポレーションによってＣｒｅ含有プラスミドでトランスフェクトする。ＧＦＰｃｒｅ融合遺伝子を含むＣｒｅプラスミド（Gagnetenら(1997) Nucleic Acids Res. 25:3326-3331）を使用することができる。これにより、Ｃｒｅタンパク質を含む全てのクローンの迅速な選択が可能になる。これらの細胞は、ＦＡＣＳソーティング、又は顕微鏡操作による緑色蛍光発光細胞の手操作による回収のいずれかにより、選択される。緑色の細胞は、活発に転写されるＣｒｅリコンビナーゼを担持し、つまり、薬剤耐性マーカーを欠失していることが期待される。Ｃｒｅ発現について選択した細胞をクローニングし、ＰＣＲ分析によって薬剤耐性マーカーの欠失についてクローンを分析する。切除されたと判断された細胞を小さいクローンにまで増殖させ、２つに分割し、１つのアリコートを選択培地中で試験して、薬剤耐性遺伝子が確実に欠失されたことを確認する。他のアリコートは、次の回のターゲティング欠失に使用する。
【０１４７】
有蹄動物の交配方法
有蹄動物又は有蹄動物細胞の作製のための上記方法のいずれかの好ましい実施形態において、本発明の有蹄動物を別の有蹄動物と交配させて、２以上の遺伝子改変を有する胚、胎仔又は生存子孫を作出する。好ましくは、１以上の細胞を胚、胎仔又は子孫から単離し、１以上のさらなる遺伝子改変をその単離細胞に導入する。
【０１４８】
抗体の作製方法
本発明はまた、異種抗体（例えばヒト抗体）を発現する本発明の有蹄動物を用いた抗体の製造方法を提供する。このような方法の１つでは、１以上の目的の抗原を、異種抗体遺伝子座をコードする核酸を有する本発明の有蹄動物に投与する。該遺伝子座における核酸セグメントは、再配列を経て、その抗原に特異的な抗体を生成する。その抗体を有蹄動物から回収する。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、目的の抗原と反応することが好ましい。好ましくは、抗体は有蹄動物の血清又は乳汁から回収される。
【０１４９】
関連する態様において、本発明は、別の抗体製造方法を提供し、該方法では、異種抗体遺伝子座をコードする核酸を有する本発明の有蹄動物から異種抗体を回収する。該遺伝子座における核酸セグメントは、再配列を経て、異種抗体を産生する。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、目的の抗原と反応することが好ましい。好ましくは、抗体は有蹄動物の血清又は乳汁から回収される。好ましくは、有蹄動物の抗血清又は乳汁はポリクローナルヒト免疫グロブリンを有する。好ましくは、抗血清又は乳汁は、ウシ、ヒツジ、ブタ又はヤギから得られる。別の好ましい実施形態において、免疫グロブリンは所望の抗原に対して生起されたものである。好ましい実施形態において、抗血清は、ヒトにおける疾患の治療又は予防のための静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）として用いられる。別の好ましい実施形態において、上記有蹄動物に目的の抗原を投与し、該有蹄動物において該抗原に対して生起された免疫グロブリンを産生させる。好ましくは、異種免疫グロブリン遺伝子座における核酸セグメントが再配列して、目的の抗原と反応性を有する異種抗体が産生される。好ましくは、抗血清及び／又は乳汁は、内因性抗体と比べて少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍若しくは５０倍以上の異種抗体を含有し、又は内因性抗体を含有しない。所望であれば、上述したトランスジェニック有蹄動物（例えばトランスジェニックウシ）に由来する異種Ｂ細胞を用いてハイブリドーマ及びモノクローナル抗体を作製することができる。また、有蹄動物から単離された異種抗体（例えばヒト抗体）を続いて、それらがトキシン、治療用活性化合物、酵素、サイトカイン、放射性標識、蛍光標識又はアフィニティタグと共有結合するように化学修飾することも想定している。所望であれば、蛍光又は放射性標識を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体のイメージングのために用いうる。
【０１５０】
有蹄動物及びドナー細胞
有蹄動物の例として、ウマ目（奇蹄類Ｐｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）及びウシ目（偶蹄類Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）のメンバー（ウシ（Ｂｏｓ）属のあらゆるメンバー等）が挙げられる。他の好適な有蹄動物としては、ヒツジ、オオツノヒツジ、ヤギ、バッファロー、アンテロープ、雄ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、カリブー、スイギュウ、ラクダ、ラマ、アルパカ、ブタ及びゾウが挙げられる。
【０１５１】
遺伝子ターゲティングに好ましい細胞としては、分化細胞、例えば、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、線維芽細胞、及び筋細胞、並びに未分化細胞、例えば胚性細胞（幹細胞、胚性生殖細胞など）が含まれる。別の好ましい実施形態において、細胞は、雌性生殖系、例えば乳腺、卵丘、顆粒膜又は卵管細胞に由来するものである。また好ましい細胞には、任意の器官、例えば膀胱、脳、食道、卵管、心臓、腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、尿管、尿道及び子宮に由来するものがある。好ましくは、ドナー細胞、ドナー核、ドナークロマチン塊、又は再構成された卵母細胞は４倍体ではない。
【０１５２】
トランスジェニック有蹄動物細胞
一態様において、本発明は、ＩｇＭ重鎖をコードする少なくとも２つの遺伝子の一方又は両方のアレルに突然変異（例えば、最初のＡＴＣコドンの後の突然変異、例としてこのコドンの１０、２０、５０又は１００塩基内の突然変異など）を有する有蹄動物細胞（例えばウシ細胞）を提供する。好ましくは、この突然変異は、機能性ＩｇＭタンパク質の発現を低減する又は実質的に排除する。好ましい実施形態において、機能性又は総ＩｇＭタンパク質の発現は、少なくとも１０、２０、４０、６０、８０、９０、９５又は１００％低減する。突然変異は、ヘミ接合性又はホモ接合性でありうる。いくつかの実施形態において、突然変異には、ポジティブセレクションマーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）の核酸への挿入が含まれる。好ましくは、ポジティブセレクションマーカーは、異種プロモーターに機能的に連結される。ＩｇＭ重鎖をコードする遺伝子の両方のアレルに抗生物質耐性遺伝子が挿入された有蹄動物又は有蹄動物細胞に関して、各アレルは、同じ又は異なる抗生物質耐性遺伝子を含有しうる。好ましい実施形態において、ネガティブセレクションマーカー（例えばＤＴ−Ａ又はＴｋ）が異種プロモーターと機能的に連結され、内因性アレルを破壊するために使用されるベクター中に存在する。突然変異は、遺伝子中に１以上のヌクレオチド（例えば連続するヌクレオチド）の欠失を含んでもよいし、又は含まなくてもよい。
【０１５３】
上記態様の好ましい実施形態において、有蹄動物（例えばウシ）又は有蹄動物細胞（例えばウシ細胞）は、１以上のトランスジーンを有し、該トランスジーンによりコードされるｍＲＮＡ又はタンパク質（例えば抗体）を発現する。好ましい有蹄動物は、天然に配列されたヒト染色体のセグメント（例えばヒト染色体断片）又は人工的に操作されたヒト染色体断片を含む人工染色体（すなわち、この断片はヒトゲノムに関して再配列されうる）を含有する。いくつかの実施形態において、異種核酸は、染色体断片内に含まれる。核酸は、有蹄動物の染色体に組み込まれているか、又は宿主の染色体とは独立して有蹄動物細胞内に維持される。種々の実施形態において、核酸は、染色体断片（ΔＨＡＣ、ΔΔＨＡＣ、又はκＨＡＣなど）内に含まれる。他の実施形態において、異種抗体は、別の属に由来する抗体、例えばヒト抗体である。
【０１５４】
好ましい有蹄動物及び有蹄動物細胞は、１以上のＢ細胞中に異種抗体遺伝子座を有する１以上の核酸（例えば、再配列を経て少なくとも１つの異種免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を発現する異種Ｉｇ遺伝子の全部又はその一部をコードする核酸）を有する。好ましくは、核酸は、Ｖ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体がＪ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体と１以上のヌクレオチドにより分離されている、未再配列抗体軽鎖核酸セグメントを有する。他の好ましい核酸は、（ｉ）Ｖ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体がＤ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体と１以上のヌクレオチドにより分離されている、及び／又は（ｉｉ）Ｄ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体がＪ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体と１以上のヌクレオチドにより分離されている、未再配列抗体重鎖核酸セグメントを有する。他の好ましい有蹄動物は、少なくとも１つの異種免疫グロブリンを発現する、再配列された異種免疫グロブリン遺伝子の全部又は一部をコードする１以上の核酸を有する。
【０１５５】
他の好ましい実施形態において、異種抗体の軽鎖及び／又は重鎖は、ヒト核酸によりコードされる。好ましい実施形態において、重鎖は、重鎖の任意のクラス、例えばμ、γ、δ、ε又はαなどであり、軽鎖はλ又はκ軽鎖である。他の好ましい実施形態において、異種免疫グロブリン鎖又は抗体をコードする核酸は、その未再配列形態である。他の好ましい実施形態において、１を超えるクラスの異種抗体が有蹄動物により産生される。種々の実施形態において、１を超える異なる異種Ｉｇ又は抗体が有蹄動物により産生される。異種抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体でありうる。
【０１５６】
好ましくは、有蹄動物はまた、プリオンタンパク質、α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ及び／又はＪ鎖をコードする内因性核酸の一方又は両方のアレルに突然変異を有する。好ましくは、突然変異は、内因性α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素、ガラクトシルα（１，３）ガラクトースエピトープ、及び／又はＪ鎖の発現を低減又は排除するものである。好ましくは、有蹄動物はヒトＪ鎖を含有するヒトＩｇＡ又はＩｇＭ分子を産生する。好ましい有蹄動物細胞（例えばウシ細胞）には、体細胞、例えば胎仔線維芽細胞又はＢ細胞が含まれる。
【０１５７】
本発明のトランスジェニック有蹄動物の作製方法は、少なくとも２つのＩｇＭ重鎖遺伝子（例えばウシＩｇμＵ及びＩｇμＡＹ遺伝子）の一方又は両方のアレルの突然変異（例えば相同組換えにより行う）を含む。遺伝子突然変異は、相同組換えにより実施することができる。好ましい実施形態において、胎仔線維芽細胞は、好適な相同組換えベクターを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでターゲティングされる。胎仔線維芽細胞は容易に増殖させ、組織培養において遺伝子操作できることから、他のいくつかの体細胞よりも胎仔線維芽細胞の使用が好ましい。しかしながら、本発明には胎仔線維芽細胞の使用が必須であるわけではなく、他の細胞を代わりに用いて同等の結果が得られうる。好適な体細胞としては、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（Ｂ細胞及びＴ細胞）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋細胞、顆粒膜細胞、卵丘細胞、胎盤細胞及び表皮細胞が挙げられる。
【０１５８】
ターゲティング遺伝子突然変異には、ターゲティングＩｇＭ重鎖アレルと相同な領域を有するＤＮＡ構築物を構築して、この構築物が有蹄動物ゲノム中のＩｇＭ重鎖アレルへ組み込まれた際にその発現を破壊するようにすることが必要である。このようなウシＩｇμＵ及びＩｇμＡＹのターゲティング突然変異を行うためのベクターの例は、以下の実施例に記載する。他のターゲティング部位において相同組換えをもたらすベクターの構築方法は、当業者に周知である。さらに、この場合、適切なベクターの構築は、特に、他の有蹄動物（例えばヒツジ及びヤギ）由来のＩｇμ遺伝子の配列が既知である（下記参照）ということを考慮すると、当該分野の技術範囲内にある。相同組換えを容易にするために、ＩｇＭ遺伝子の相同組換え及び不活性化を生じるのに使用するベクターはそれぞれ、有蹄動物ＩｇＭ重鎖及びＩｇ軽鎖遺伝子と実質的な配列同一性を示すＤＮＡの部分を含む。これらの配列は、相同組換え及びターゲティング欠失又は不活性化を容易にするために、ターゲティング遺伝子座と、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、さらに好ましくは同遺伝子型である。
【０１５９】
通常、構築物は、ＩｇＭ重鎖遺伝子が相同組換えにより破壊された所望の相同組換体（例えば、線維芽細胞）の選択に役立つマーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子の例としては、数ある中で、抗生物質耐性マーカー、薬剤耐性マーカー及び緑色蛍光タンパク質が挙げられる。
【０１６０】
ネオマイシン耐性構築物の１つは、以下のように組み立てた。「ｐＳＴｎｅｏＢ」と称される構築物（Katohら(1987) Cell Struct. Funct. 12:575；Japanese Collection of Research Biologicals (JCRB) 受託番号VE039）は、コード領域の上流にあるＳＶ４０プロモーター及びＴＫエンハンサーの制御下でネオマイシン耐性遺伝子を含むように設計した。コード領域の下流には、ＳＶ４０ターミネーター配列が存在する。ｎｅｏカセットを、ＸｈｏＩ断片として、「ｐＳＴｎｅｏＢ」から切り出した。標準的な分子生物学技術を用いて断片の端部を平滑末端に変換した後、平滑末端断片を、ベクターｐＢＳ２４６（Gibco/Life Technologies）中のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。この部位は、ｌｏｘＰ部位に挟まれている。「ｐＬｏｘＰ−ＳＴＮｅｏＲ」と称した新しい構築物を、μノックアウトＤＮＡ構築物を作製するために使用した。この構築物の所望の断片は、元々ｐＢＳ２４６クローニングベクター中に存在していたｌｏｘＰ部位及びＮｏｔＩ部位に挟まれている。ｌｏｘＰ−ｎｅｏ−ｌｏｘＰを含む所望のＮｏｔＩ断片を、免疫グロブリンμ定常領域エキソンを置き換えるために使用した。ネオマイシン耐性遺伝子に機能的に連結したＳＶ４０プロモーターはネオマイシン耐性遺伝子の転写を活性化し、所望のＮｏｔＩ断片がμ定常領域エキソンと置き替わった細胞を、それらの獲得した抗生物質耐性に基づいて選択することができる。
【０１６１】
ＩｇＭ重鎖アレルが有効に破壊された細胞系を得た後、これをドナー細胞として使用して、クローン化有蹄動物胎仔（例えば、クローン化ウシ胎仔）を作製し、最終的に、一方のＩｇＭ重鎖アレルが破壊された胎仔又は動物を作製する。その後、該胎仔又は動物から誘導された体細胞（例えば、線維芽細胞）を用いて２回目の遺伝子ターゲティング突然変異を実施することができ、第２のＩｇＭ重鎖アレルが破壊された細胞を作製する。
【０１６２】
以下の実施例は本発明の例示を意図するものである。これらは本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【０１６３】
ＩｇμＵ遺伝子のターゲティング
本発明者らは、複数の遺伝子ターゲティング事象を起こすための幅広く適用できる迅速な方法を開発した。上述したように、高効率なターゲティング系の逐次的な適用、及びクローン胎仔の作製（図１）による細胞系の再生（rejuvenation）を採用した。本発明者らは、線維芽細胞において転写的にサイレントなＩｇμＵ遺伝子をターゲティングすることを選んだ。この遺伝子を、雄ホルスタイン胎仔線維芽細胞系（＃６９３９）中で特徴決定して、２つのアレル（図２Ａ；表示のアレルＡ及びアレルＢ）を区別するのに使用できる多型マーカーＤＮＡ配列をＫＯベクター配列の外側で同定した。細胞系＃６９３９に由来する胎仔線維芽細胞に第１のＫＯベクター（ｐＢＣμΔＫＯｐｕｒｏ；図２Ａ）をエレクトロポレーションして、ピューロマイシン耐性を有する４４６のウエルを作製した。ウエルを１４日目に分割し、細胞の半分をＰＣＲによるスクリーニングに使用して（プライマー対；ｐｕｒｏＦ２×ｐｕｒｏＲ２、図２Ａ）、正しくターゲティングされている細胞を含むウエルを同定した。初めは、６つのウエルがＰＣＲで陽性であった。偽陽性ウエルを除外するために、全てのＰＣＲ産物を、ｐｕｒｏＦ２及びｐｕｒｏＲ２プライマーを用いた二方向配列決定分析に供した。２つのウエル（０．４５％；＃１４７、＃３８４）が正しくターゲティングされていると同定された。配列分析により同定された多型の相違点に基づき、ＫＯベクターをウエル＃３８４中のアレルＡ及びウエル＃１４７中のアレルＢに導入した。２つのウエルの残った細胞を胚クローニングに使用して、胎仔を作製し、細胞系を再生させた。在胎４０日目の妊娠率は５０％であり（１５／３０；１レシピエントあたり２つの胚）、在胎６０日目に６匹の胎仔を回収し、線維芽細胞を再度樹立した。
【０１６４】
６匹の胎仔のうち３匹（＃２１８４−１、＃２１８４−２及び＃３２８７）は、ＰＣＲ（プライマー対；ｐｕｒｏＦ２×ｐｕｒｏＲ２）及び配列分析で確認したところヘテロ接合性ＫＯ（ＩｇμＵ−／＋；図２Ｂ）であった。
【０１６５】
非ターゲティング胎仔は、ターゲティング細胞とウエル中で共存していた非ターゲティング細胞から生じた可能性が高い。＃２１８４−１及び＃２１８４−２の両方はＫＯベクターがアレルＡに導入されたウエル＃３８４から誘導され、胎仔＃３２８７はＫＯベクターがアレルＢに導入されたウエル＃１４７から誘導された。３つの再生細胞系全てから作製したクローンＩｇμＵ−／＋胚を１５３のレシピエントに移入し、ＰＣＲ（図２Ｃ）及び配列分析で確認したところ１３匹（８％）の健康なＩｇμＵ−／＋仔ウシが作製された。
【０１６６】
３つのＩｇμＵ−／＋細胞系全て（アレルＡにおいてターゲティングされた＃２１８４−１及び＃２１８４−２；アレルＢにおいてターゲティングされた＃３２８７）を、第２のＫＯベクター（ｐＢＣμΔＫＯｎｅｏ；図３Ａ）（短い相同腕を＃６９３９細胞系のアレルＡから直接増幅したＰＣＲ誘導型配列と置き換えた）でのターゲティングに使用した。＃２１８４−１及び＃２１８４−２細胞系において、Ｇ４１８耐性を有する合計１，２１１ウエルをＰＣＲ（プライマー対；ｎｅｏＦ３×ｎｅｏＲ３；図３Ａ）でスクリーニングした後、配列分析を行った。５つのウエルが陽性であり、２つにおいてはベクターが無傷のアレルＢに導入されてホモ接合性ＫＯ（ＩｇμＵ−／−）細胞が生じ、３つのウエルにおいてはアレルＡにおいてターゲティングベクターが置き換えられていた。＃３２８７細胞系において、Ｇ４１８耐性を有する５６９のウエルをＰＣＲ（プライマー対；ｎｅｏＦ３×ｎｅｏＲ３；図３Ａ）でスクリーニングした後、配列分析を行った。７つのウエルが陽性であり、６つにおいてはベクターが無傷のアレルＡに導入されてＩｇμＵ−／−細胞が生じ、１つのウエルにおいてはアレルＢにおいてターゲティングベクターが置き換えられていた。総体的に、ベクターは、アレルＡに関しては細胞系＃３２８７と使用された場合に３：１の偏りがあり、予想通りホモ接合性ターゲティングについてはより効率的であった（２／１２１１（０．１７％）と比較して６／５６９（１．１％））。
【０１６７】
細胞系＃３２８７から誘導した２つのＩｇμＵ−／−ウエル（＃７６、＃９１）を、胚クローニングのために選択し、胎仔を作製して細胞系を再生させた。総体的に、在胎４０〜５０日目のＩｇμＵ−／−胎仔の妊娠率は４５％（４０／８９）であった。在胎４５日目に、ウエル＃７６から誘導した５匹の胎仔及びウエル＃９１から誘導した１５匹の胎仔を回収し、評価した。ウエル＃７６（図３Ｂ）からの５匹全て及びウエル＃９１からの１５匹のうち３匹がＰＣＲ（プライマー対；ｐｕｒｏＦ２×ｐｕｒｏＲ２及びｎｅｏＦ３×ｎｅｏＲ３）で確認したところ陽性であった。ＰＣＲの結果を、配列分析、及び野生型アレル（図３Ｂ）についてのネガティブＰＣＲ（プライマー対；ｂＣμｆ×ｂＣμｒ；図３Ａ）で確認した。再生ＩｇμＵ−／−線維芽細胞由来の９０日胎仔の作製、及び脾臓細胞におけるＩｇμＵ遺伝子発現の評価により機能的ＫＯを確認した。発現の不在は、ＲＴ−ＰＣＲ（プライマー対；ｂＣμｆ×ｂＣμｒ、図３Ｃ）で確認した。クローン胚を５つのＩｇμＵ−／−細胞系から作製し、レシピエントに移入して満期まで発育させた。
【０１６８】
この群から２匹の仔ウシが最近産まれ、ＰＣＲ（図３Ｄ）及び配列分析によりＩｇμＵ−／−であることが確認され、逐次的な遺伝子ターゲティング及び一連の回数の細胞再生が健康な仔ウシの満期発育に適合することを立証した。
【実施例２】
【０１６９】
Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ系を使用した選択マーカーの除去
逐次的なターゲティングは、１又は複数の抗生物質選択マーカーを既に含む細胞系において新しく導入されたターゲティングベクターの抗生物質選択のための戦略を必要とする。最も単純な方法は、ターゲティング事象それぞれに異なる選択マーカー遺伝子を使用することである。しかし、この方法では、細胞系において実施することができるターゲティング事象の回数が制限される。別の方法は、マウス胚性幹細胞で行われているように（Abuin及びBradley(1996) Mol. Cell Biol. 16:1851-1856）、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系を使用して選択マーカーを除去することである。本発明者らの再生ＩｇμＵターゲティング線維芽細胞では、選択マーカー遺伝子は発現されなかった。これは、線維芽細胞においてＩｇμＵ遺伝子座がサイレントであるためと考えられる。選択マーカー除去は、本発明者らのＩｇμＵ−／−線維芽細胞におけるさらなるターゲティングのために必要ではなかったが、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現プラスミドでのトランスフェクションによって選択マーカーを除去する可能性を評価した。Ｃｒｅリコンビナーゼの一過性発現を意図したため、閉環プラスミドを使用し、抗生物質選択を培養の最初の３日間に限定した。ウシＩｇμＵ−／−細胞系＃４６５８をトランスフェクションに使用し、選択した２４のウエルを、ターゲティングアレルからの抗生物質選択遺伝子の切除についてＰＣＲで評価した（図４Ａ）。複数のウエルがｐｕｒｏ及びｎｅｏ遺伝子の両方の切除の形跡を示し、１つを胎仔クローニング及び細胞系の再生のために選択した。在胎４０〜５０日の妊娠率は３５％（２１／６０）であった。
【０１７０】
５匹の胎仔を回収したところ、全てから両方の選択マーカーが除去されていた（図４Ｂ）。＃１４０４以外の全ての胎仔において、Ｃｒｅリコンビナーゼプラスミドがゲノムに組み込まれていた。これらの結果は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換えを使用して、体細胞中の選択マーカーを除去することができるということを示している。この系において常用するためには、Ｃｒｅ発現プラスミドの組込み頻度を低減する改善が必要である。
【実施例３】
【０１７１】
ＰｒＰ遺伝子のターゲティング
第２の遺伝子を逐次的にターゲティングする可能性を評価するために、Ｃｒｅ切除ＩｇμＵ−／−（Ｃｒｅ／ＩｇμＵ−／−）線維芽細胞（細胞系＃１４０４）を３回目のターゲティングに供してＰｒＰ遺伝子を破壊した。この遺伝子をまず特徴決定してＫＯベクター配列の外側にある多型配列を同定して、２つのアレルを区別した（図５Ａ；表示したアレルＣ及びアレルＤ）。細胞を第３のＫＯベクター（ｐＢＰｒＰ（Ｈ）ＫＯｎｅｏ、図５Ａ）でトランスフェクトし、２０３のＧ４１８耐性ウエルをＰＣＲでスクリーニングした。
【０１７２】
Ｃｒｅ／ＩｇμＵ−／−バックグラウンド（Ｃｒｅ／ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／＋）においてヘテロ接合性ＫＯ  ＰｒＰを示す細胞を有する１３（６．４％）のウエルを同定した（プライマー対；ｎｅｏＦ７×ｎｅｏＲ７；図５Ａ）。配列分析は、第３のＫＯベクターが、全ての陽性ウエルにおいてＰｒＰ遺伝子のアレルＣに組み込まれたことを示した。一部のウエルをクローニングに使用して、在胎４５日で２８の妊娠を生じた（７１％；表１）。５匹の胎仔を回収し、ＰＣＲ（図５Ｂ；プライマー対；ｎｅｏＦ７×ｎｅｏＲ７）及び配列決定分析により、ＰｒＰ遺伝子のアレルＣへのターゲティングについて全てが陽性であることが示された。
【表１】
2007533328.tif 000002
【０１７３】
【表２】
2007533328.tif 000003
【０１７４】
ネガティブＩｇμＵ  ＰＣＲの後、予想通り増幅は検出されなかった（図４Ｂ；プライマー対；ｂＣμｆ×ｂＣμｒ）。表２に示すように、ウシ線維芽細胞において活性な遺伝子であるＰｒＰについてのターゲティング効率は、線維芽細胞で発現されない遺伝子であるＩｇμＵについてよりも実質的に高かった（それぞれ６．４％対０．６３％）。
【０１７５】
ホモ接合性二重ＫＯ胎仔及び細胞系を作製するための四重ターゲティングの実行可能性を検証するために、三重ターゲティング細胞系（＃８４４３、Ｃｒｅ／ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／＋）を、第４のＫＯベクターで、ＰｒＰ遺伝子の残ったアレルについてトランスフェクトした。第１のアレルに使用したＰｒＰターゲティングベクター中のｎｅｏ遺伝子をｐｕｒｏ遺伝子（ｐＢＰｒＰ（Ｈ）ＫＯｐｕｒｏ、図６Ａ）で置き換えることによりベクターを構築した。選択及びＰＣＲスクリーニング（プライマー対；ｐｕｒｏＦ１４×ｐｕｒｏＲ１４、図６Ａ）の結果、１７（５．２％）のウエルが、Ｃｒｅ／ＩｇμＵ−／−バックグラウンドにおいてホモ接合性ＫＯ  ＰｒＰを示す細胞（Ｃｒｅ／ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／−）を含むことが分かった。配列分析によって、アレルＣ中のターゲティング配列が置き換えられた１つ以外の全ての陽性ウエルにおいて第４のＫＯベクターがＰｒＰ遺伝子のアレルＤに組み込まれたことが示された。Ｃｒｅ／ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／−陽性ウエルからの細胞をクローニングに使用して胎仔を作製した。在胎４５日で妊娠率が７１％（２８／３９）であった。回収した１８匹の胎仔全てがＣｒｅ／ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／−であることが、ターゲティング事象に特異的なプライマー対であるｐｕｒｏＦ１４×ｐｕｒｏＲ１４及びｎｅｏＦ７×ｎｅｏＲ７（図６Ｂ）を用いたポジティブＰＣＲ分析により示された。配列決定分析により、アレルＣ及びＤそれぞれへの第３（ｎｅｏ）及び第４（ｐｕｒｏ）のＰｒＰターゲティングベクターの組込みを確認した。さらに、ネガティブＰＣＲ分析を行って野生型ＰｒＰアレル（プライマー対；ＢＰｒＰｅｘ３Ｆ×ＢＰｒＰｅｘ３Ｒ、図６Ｂ）及びＩｇμＵアレル（プライマー対；ｂＣμｆ×ｂＣμｒ）の不在を確認し、予想通り４つのＫＯ全てを確認した。ＰｒＰ  ｍＲＮＡ発現を評価するために、ＩｇμＵ−／−、ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／＋、及びＣｒｅ／ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／−細胞系由来の線維芽細胞をＲＴ−ＰＣＲで検査した。ＰｒＰ遺伝子発現の機能的破壊を確認した（図６Ｃ）。表３はＣｒｅ／ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／−細胞系＃８０１８における四重ターゲティングの頻度を示す。
【表３】
2007533328.tif 000004
【０１７６】
本発明者らの結果は、活性遺伝子及びサイレント遺伝子の両方について、細胞再生方法を用いて複数回の遺伝子ターゲティングを体細胞において簡単に達成できることを示す。この系は、転写的にサイレントな及び活性な遺伝子の両方のターゲティングに有効であることを証明して幅広い用途を実証し、少なくとも２回のターゲティングによって健康な仔ウシの発育に適合可能であった。さらに、さらなる回数のターゲティングによってクローン胚の発育が低下することは示されなかった。
【０１７７】
方法
実施例１〜３に記載の結果は、以下の方法を用いて得た。
【０１７８】
ＫＯベクターの構築
ＩｇμＵ定常領域遺伝子座のエキソン２周辺のウシゲノム断片を、プライマー対（5'-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3'（配列番号１）及び5'-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3'（配列番号２））で増幅した３２Ｐ標識ＰＣＲ断片をプローブとして用いて非同系ホルスタインゲノムライブラリから得た。１つのゲノムクローンを、制限マッピングでさらに分析した。エキソン２周辺の７．２ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩゲノム断片（５’側相同腕）及び２．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片（３’側相同腕）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Stratagene）にサブクローニングし、その後ｐｕｒｏ、ＳＴＯＰカセット（ｐＢＳ３０２、Stratagene）及びＤＴ−Ａ（ジフテリアトキシンＡ）遺伝子を挿入した（ｐＢＣμΔＫｏｐｕｒｏ）。第２のターゲティングベクターの構築のために、＃６９３９から、プライマー対5'-GCAATAGCAAGTCCAGCCTCATCTG-3'（配列番号３）及び5'-CATCCTGTCTCTGGTGGTTTGAGGTC-3'（配列番号４）を用いてゲノムＰＣＲを行った。ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩでの消化後、断片をｐＢＣμΔＫＯｐｕｒｏベクターの３’側の短い腕と置き換えた。配列決定により、ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片が「アレルＡ」から増幅されたことを確認した。
【０１７９】
ｐｕｒｏ遺伝子をｎｅｏ遺伝子（ｐＢＣμΔＫＯｎｅｏベクター）で置き換えた。ＰｒＰ遺伝子座のエキソン３周辺のウシゲノム断片を、ＰＣＲプライマー対（5'-GATTGAATGGTCTCCAGGATGCC-3'（配列番号５）及び5'-GACAAGCTTAATATCCGCAGG-3'（配列番号６））で増幅した３２Ｐ標識ＤＮＡ断片を用いて同じホルスタインゲノムλファージライブラリをスクリーニングすることにより得た。１つのゲノムクローンを制限マッピングによりさらに分析した。エキソン３を含む８．３ｋｂのＢａｍＨＩゲノム断片（３’側相同腕）及び１．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片（５’側相同腕）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）にサブクローニングし、その後ｎｅｏ及びＳＴＯＰカセットの両方を最初のＡＴＧコドンの後ろにあるＢａｍＨＩ部位に挿入した。ＤＴ−Ａ遺伝子もサブクローニングした（ｐＢＰｒＰ（Ｈ）ＫＯｎｅｏベクター）。同様に、ｐｕｒｏ遺伝子を含む別のＫＯベクターを構築した（ｐＢＰｒＰ（Ｈ）ＫＯｐｕｒｏベクター）。
【０１８０】
細胞培養及びトランスフェクション
ホルスタイン胎仔雄線維芽細胞を先に記載されるように培養し（Kuroiwaら、前掲）、それに、５５０Ｖ及び５０μＦにてＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Bio-rad）を用いて３０μｇの各ターゲティングベクターをエレクトロポレーションした。４８時間後、２週間の５００μｇ／ｍｌのＧ４１８又は１μｇ／ｍｌのピューロマイシンの下で細胞を選択し、薬剤耐性コロニーを採取し、複製プレートに移した。ここで、一方はゲノムＤＮＡ抽出用（２４ウエルプレート）、他方は胚クローニング用（４８ウエルプレート）に移した。
【０１８１】
ゲノムＰＣＲ分析
２４ウエル複製プレートから、胎仔、又は仔ウシ由来耳生検のゲノムＤＮＡを、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ抽出キット（GentraSystem）を用いて抽出した。ＩｇμＵターゲティングの際に生じた各相同組換え事象を同定するために、ｐｕｒｏＦ２（5'-GAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGC-3'、配列番号７）、ｐｕｒｏＲ２（5'-ATGTACCTCCCAGCTGAGACAGAGGG-3'、配列番号８）、ｎｅｏＦ３（5'-TTTGGTCCTGTAGTTTGCTAACACACCC-3'、配列番号９）、及びｎｅｏＲ３（5'-GGATCAGTGCCTATCACTCCAGGTTG-3'、配列番号１０）プライマー対を使用した。ＰＣＲを９８℃にて１０秒間、６８℃にて８分間を含む３０サイクルで行った。ネガティブＰＣＲについては、ＢＣμｆ（5'-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3'、配列番号１１）及びＢＣμｒ（5'-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3'、配列番号１２）を、９８℃にて１０秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて１分間から構成される４０サイクルのＰＣＲに使用した。ＰｒＰ遺伝子座の場合、ｎｅｏＦ７（5'-TGTCAAAGAGACACTCCTCATTTGTCTTCC-3'、配列番号１３）、ｎｅｏＲ７（5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCC-3'、配列番号１４）、ｐｕｒｏＦ１４（5'-TTGCTCCACCTTCCGTCTTCTGTC-3'、配列番号１５）、及びｐｕｒｏＲ１４（5'-GTTGGCGCCTACCGGTGGATGTTTG-3'、配列番号１６）プライマー対を使用した。ＰＣＲを、９８℃にて１０秒間、６８℃にて５分間を含む３０サイクルにて行った。ネガティブＰＣＲについては、ＢＰｒＰｅｘＦ（5'-CCACATAGGCAGTTGGATCC-3'、配列番号１７）、及びＢＰｒＰｅｘＲ（5'-ATAAGAGGCCTGCTCATGGC-3'、配列番号１８）プライマー対を、９８℃にて１０秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて１分間から構成される４０サイクルのＰＣＲで使用した。Ｃｒｅ媒介型切除を検出するために、ＣｒｅＥｘＦ（5'-CAATAGCAAGTCCAGCCTCATCTGC-3'、配列番号１９）、及びＣｒｅＥｘＲ（5'-GTGGTTTCTTCGGTGGAAACAACG-3'、配列番号２０）プライマー対を、９８℃にて１０秒間、６８℃にて７分間で構成される４０サイクルのＰＣＲで使用してＰＣＲを行った。全てのＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで泳動させた。
【０１８２】
ＰＣＲ産物の配列決定
各ターゲティングステップで相同組換えが正しく起きたかを確認するために、上記増幅したＰＣＲ産物を配列決定した。ＰＣＲ産物をＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−ＴＥ４００カラム（BD Biosciences Clontech）に通して精製し、ACGT Inc.（Wheeling, IL）に送って配列決定した。ＰＣＲにフォワード及びリバースプライマーの両方を使用して二方向で配列決定した。各ＫＯベクターが組み込まれたアレルを、ＰＣＲ産物の配列における多型性により決定した。
【０１８３】
透過性化細胞の移入
クローン胎仔及び仔ウシを、先に記載されている透過性化細胞移入手順を使用して作製した（Sullivanら(2004) Biol. Reprod. 70:146-153）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞を成熟の２０時間後に脱核した。約５０，０００〜１００，０００の細胞を３１．２ＵストレプトリシンＯ（ＳＬＯ；Sigma）含有ＨＢＳＳ１００μｌに懸濁させ、３７℃のＨ２Ｏ浴において３０分間インキュベートして、正しくターゲティングされたクローンを透過性化した。
【０１８４】
透過性化細胞を沈降させ、洗浄し、ＡＴＰ生成系（１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭリン酸クレアチン、及び２５μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ）を含む４０μｌ有糸分裂抽出物と３８℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーション終了後、反応混合物を希釈し、沈降させ、洗浄した。
【０１８５】
これらの細胞を脱核卵母細胞と融合させ、成熟の２８時間後に５μＭカルシウムイオノフォアで４分間、その後１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド及び２．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＤで５時間かけて活性化した。活性化後、胚を洗浄し、胚盤胞段階になるまでｉｎ  ｖｉｔｒｏでマウス胎仔線維芽細胞と共培養した。グレード１及び２の胚盤胞を選択し、同調レシピエントに移入した。全ての動物に関する作業はTransova Genetics Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認されたプロトコールに従って行った。
【０１８６】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて野生型（＃６９３９）及びＩｇμＵ−／−胎仔の脾臓からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ第１鎖合成系（Invitrogen）を用いて第１鎖ｃＤＮＡ合成を行った。ＢＣμｆ（5'-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3'、配列番号２１）及びＢＣμｒ（5'-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3'、配列番号２２）プライマーを、９８℃にて１０秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて１分間で構成される４０サイクルのＰＣＲに使用してＰＣＲを行った。ＲＮＡを＃４６５８（ＩｇμＵ−／−）、＃８４４３（ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／＋）及びホモ接合性二重ＫＯ（ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／−）線維芽細胞からも抽出し、第１鎖ｃＤＮＡ合成を上述したように行った。ＰｒＰｍＦ３（5'-CAAAACCTGGAGGAGGATGG-3'、配列番号２３）及びＰｒＰｍＲ３（5'-ATAAGAGGCCTGCTCATGGC-3'、配列番号２４）プライマーを、９８℃にて１０秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて１分間の４０サイクルで用いてＰＣＲを行った。ウシα−アクチンｍＲＮＡ発現の検出のために、ｂＢＡＦ（5'-ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3'、配列番号２５）及びｂＢＡＲ（5'-AACCGACTGCTGTCACCTTC-3'、配列番号２６）プライマーを同じＰＣＲ条件において用いた。ゲノムＤＮＡ混入の可能性を排除するために、逆転写酵素を用いないで別のＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルにおいて泳動させた。
【実施例４】
【０１８７】
ＩｇμＡＹの同定
ＩｇμＵ−／−線維芽細胞の分析の間、ＩｇμＵ−／−を増幅するように設計されたプライマーにより検出可能な転写産物の発現を同定した。この転写産物の内容を決定するために、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（QIAGEN）を用いて在胎９０日目で回収したＩｇμＵ−／−胎仔の脾臓から総ＲＮＡを抽出した。１マイクロリットルの総ＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡ合成（ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ第１鎖合成系, Invitrogen）に供した後、ＲＴ−ＰＣＲを以下に記載するように行った。使用したプライマー対は、5'-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3'（ＢＣμｆ；配列番号２７）及び5'-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3'（ＢＣμｒ；配列番号２８）であった。ＰＣＲ反応混合物は、３２．５μｌの水、５μｌの１０ＸＥｘ  Ｔａｑバッファー（TAKARA）、８μｌのｄＮＴＰ混合物、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、２μｌの第１鎖ｃＤＮＡ、及び０．５μｌのＥｘ  Ｔａｑ（TAKARA）を含んでいた。以下の条件で反応混合物をインキュベートして３５サイクルのＰＣＲを行った。すなわち８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、６２℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分間。ＰＣＲ後、反応混合物を電気泳動により分析した。ＩｇμＵ−／−胎仔には陽性ＰＣＲ産物は無かった。しかし、別のプライマー対である5'-TCTCTGGTGACGGCAATAGC-3'（ＢＣμｆ２；配列番号３０）及び5'-CTTCGTGAGGAAGATGTCGG-3'（ＢＣμｒ２；配列番号３１）をＲＴ−ＰＣＲに使用した場合、ＩｇμＵ−／−胎仔において陽性ＰＣＲ産物が検出された（図１０）。この矛盾の原因を決定するために、各プライマー配列をＢＬＡＳＴにより分析した。その結果から、ＢＣμｆプライマー配列がＵ６３６３７．２に相当するウシＩｇμ配列に特異的であることが示された。他方で、ＢＣμｆ２及びＢＣμｒ２配列は、Ｕ６３６３７．２、及びＵ６３６３７．２の多型変異体として先に報告されている別の配列ＡＹ２３０２０７と一致した。本発明者らは、Ｕ６３６３７．２及びＡＹ２３０２０７が、同じ遺伝子の多型変異体ではなく、ウシの異なるＩｇμ遺伝子であると結論付けた。本発明者らは、Ｕ６３６３７．２のＩｇμ遺伝子をＩｇμＵ、そしてＡＹ２３０２０７をＩｇμＡＹと称する。
【０１８８】
ＩｇμＡＹ及びＩｇμＵ遺伝子の両方がＶＤＪ再配列の後に発現されるか否かを決定するために、＃６９３９（最初の細胞系）から誘導された胎仔及びＩｇμＵ−／−胎仔の脾臓からｍＲＮＡを同様に抽出した。5'-CCCTCCTCTTTGTGCTGTCA-3'（ＢＬ１７；配列番号３２）及び5'-GTTCAGGCCATCATAGGAGG-3'（ｍＢＣμ−Ｒ２；配列番号３３）を、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、６２℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分間の条件で構成される３５サイクルに使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  ＴＥ−１００カラム（ＢＤ）に通して精製し、ACGT Inc.に送り、ｍＢＣμ−Ｒ２プライマーを用いて直接配列決定した。配列ピークチャートによれば、＃６９３９胎仔において非常に少量のＩｇμＵの転写産物に加えてＩｇμＡＹ転写産物が主に発現されたが、これによりＩｇμＡＹ及びＩｇμＵの両方がＶＤＪ再配列を経て発現したこと、並びに両方とも転写の点で機能的であることが明らかになった（図１１）。しかし、ＩｇμＵ  ＫＯ胎仔においては、ＶＤＪ再配列の後に発現されるのはＩｇμＡＹである（図１１）。
【実施例５】
【０１８９】
ＩｇμＡＹの突然変異
ＩｇμＡＹ  ＫＯベクターを以下の通りに作製した。ＩｇμＡＹ遺伝子のエキソン２周辺のゲノムＤＮＡを単離するために、5'-TCTCTGGTGACGGCAATAGC-3'（配列番号３４）及び5'-CTTCGTGAGGAAGATGTCGG-3'（配列番号３５）（ＢＣμ−ｆ２及びＢＣμ−ｒ２）を用いたＰＣＲによりＤＮＡプローブを増幅した。このプローブを用いて、＃４６５８  ＩｇμＵホモ接合性ＫＯ細胞系由来のウシ（ホルスタイン）ゲノムλファージライブラリをスクリーニングし、８３の陽性λファージクローンを同定した。これらのクローンは、無傷ＩｇμＡＹ遺伝子の両方のアレル、及びターゲティングＩｇμＵ遺伝子の両方のアレルを含んでいるはずである。無傷ＩｇμＡＹクローンとターゲティングＩｇμＵクローンとを区別するために、各クローンから単離したλＤＮＡを、プライマー対ＢＣμ−ｆ２及びＢＣμ−ｒ２を用いたＰＣＲに供した。ターゲティングＩｇμＵ遺伝子を含むクローンの場合、エキソン２に組み込まれたＫＯカセットが存在するためにＰＣＲ産物は増幅されない。一方、ＰＣＲ産物は無傷ＩｇμＡＹ遺伝子座からは増幅される。ＰＣＲ産物を生成するクローンは無傷ＩｇμＡＹ遺伝子を含むものであるが、ＰＣＲ産物を生成しないクローンはターゲティングＩｇμＵ遺伝子を含むものでなければならない。８３のλファージクローンのうち、２６がＰＣＲ産物を生成し、これらは無傷ＩｇμＡＹ遺伝子を含むクローンであることを配列決定により確認した（プライマーＡＹＵ−Ｆ２；5'-GGCTGACTCCCTACCTCCCCTACAC-3'（配列番号３６））。ＰＣＲ産物を生成しなかった少なくとも１０の他のクローンは、配列決定（プライマーＡＹＵ−Ｆ２）で確認したところターゲティングＩｇμＵ遺伝子を含むことが証明された。上の記載から、ウシにおいて少なくとも２つのＩｇμ遺伝子があること、及び一方の遺伝子（ＩｇμＵと称するもの）が本発明者らのＫＯ細胞系（＃４６５８）において破壊されたが、他方の遺伝子（ＩｇμＡＹ）は無傷のままであったことが実証された（図１２）。
【０１９０】
ＩｇμＡＹの両方のアレルを区別するために、プライマーＡＹＵ５’（5'-CGGAGCCCCTGGAGATGAGC-3'）（配列番号３７）を用いて全てのλファージＤＮＡを配列決定した。この配列決定により、ＩｇμＡＹ遺伝子のアレルを区別する多型配列を見出した。これらのアレルを、ＡＹアレル及びａｙアレルと称した（図１３）。２６クローンのうち５クローンがＡＹアレルを含み、２１クローンがａｙアレルを含んでいた。ＡＹ特異的又はａｙ特異的ＫＯベクターを構築するために、ＡＹ用に＃３７クローンを、ａｙ用に＃４９を選択した。＃３７及び＃４９をそれぞれ、制限マッピングによりさらに分析した。全てのＣμＡＹエキソンを含む９キロベースのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩゲノム断片を、ＫｐｎＩ部位が既にＳｒｆＩ部位と置き換えられているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）にサブクローニングした。次いで、ｂｓｒ及びＳＴＯＰカセットの両方を、Ｃμのエキソン２にちょうど位置するＢｇｌＩＩ部位に挿入した。ｂｓｒ及びＳＴＯＰカセットの両方が、ＩｇμＡＹ遺伝子に関してセンス鎖方向にあった。次いで、ジフテリアトキシン遺伝子（ＤＴ−Ａ, Gibco）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）中のＮｏｔＩ部位に付加した。ＤＴ−Ａを、ターゲティングカセット中のｂｓｒ遺伝子に関して順方向に挿入して、ターゲティングカセット（ｐＢＣμＡＹＫＯｂｓｒベクター；図１４）がランダムにゲノムに組み込まれた細胞を死滅させた。同様に、ｈｙｇ遺伝子を含むａｙアレル用の別のＫＯベクターを構築した（ｐＢＣμａｙＫＯｈｙｇベクター；図１４）。
【０１９１】
ＩｇμＡＹ  ＫＯベクターでのＩｇμＵホモ接合性ＫＯ細胞系のトランスフェクションを、以下の標準エレクトロポレーションプロトコールを採用して行った。ウシ胎仔線維芽細胞を培養するのに使用した培地は、５００ｍｌαＭＥＭ（Gibco, 12561-049)、５０ｍｌウシ胎仔血清（Hyclone #ABL13080）、５ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（SIGMA）、及び１ｍｌ  ２−メルカプトエタノール（Gibco/BRL #21985-023）を含んでいた。トランスフェクションの前日、細胞を８０〜１００％の密集度（顕微鏡検査で測定）でＴ１７５組織培養フラスコに播種した。トランスフェクション当日、約１０７のウシ線維芽細胞をトリプシン処理し、αＭＥＭ培地で１回洗浄した。細胞を８００μｌのαＭＥＭに再懸濁させた後、１ｍＭスペルミジン含有ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）に溶解した３０μｇのＳｒｆＩ消化ＫＯベクター（ｐＢＣμＡＹＫＯｂｓｒベクター）を細胞懸濁液に添加し、ピペッティングによりよく混合した。細胞−ＤＮＡ懸濁液をエレクトロポレーションキュベットに移し、５５０Ｖ及び５０μＦにてエレクトロポレーションを行った。その後、エレクトロポレーションした細胞を、血清を添加したαＭＥＭ培地の入った３０枚の４８ウエルプレートに播いた。４８時間の培養後、培地を１０μｇ／ｍｌのブラスチシジンを含む培地と置き換え、細胞を２〜３週間培養してブラスチシジン耐性細胞を選択した。選択後、１００％近くの密集度に達した全てのコロニーを２枚の複製プレート（２４ウエル及び４８ウエルプレート）に分けた（一方はゲノムＤＮＡ抽出用、他方のプレートは胚クローニング用）。ゲノムＤＮＡをコロニーから抽出して、所望の相同組換え事象をＰＣＲによってスクリーニングした。
【０１９２】
ＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ単離キット（Gentra SYSTEMS）を製造元のプロトコールに従って使用して、ゲノムＤＮＡを各２４ウエルから個々に抽出した。各ゲノムＤＮＡサンプルを２０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ）に再懸濁した。プライマー対ＡＹＫＯｂｓｒＦ２（5'-GGTAGTGCAGTTTCGAATGGACAAAAGG-3'；配列番号３８）及びＡＹＫＯｂｓｒＲ２（5'-TCAGGATTTGCAGCACACAGGAGTG-3'；配列番号３９）を用いてＰＣＲによるスクリーニングを行った。一方のプライマーの配列はＫＯベクターに位置し、他方のプライマーの配列はターゲティング内因性遺伝子座中の組込みベクターのすぐ外側に位置していた。従って、予想されたＰＣＲ産物は、ＫＯベクターが相同組換えによりターゲティング遺伝子座に組み込まれた場合にのみ検出される。ＰＣＲ反応混合物は、１７．９μｌの水、３μｌの１０ＸＬＡ  ＰＣＲバッファーＩＩ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、４．８μｌのｄＮＴＰ混合物、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、２μｌのゲノムＤＮＡ、及び０．３μｌのＬＡ  Ｔａｑを含んでいた。反応混合物を以下の条件下でインキュベートして４０サイクルのＰＣＲを行った：すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、及び６８℃にて８分間。ＰＣＲの後、反応混合物を電気泳動により分析した。スクリーニングした３２２のクローンのうち２２のクローンが予想したＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物の配列決定の結果、ＡＹアレルをターゲティングするように設計したＫＯベクターのみが全てのクローンにおいてＡＹアレルに組み込まれていた。
【０１９３】
ｐＢＣμａｙＫＯｈｙｇベクターも、エレクトロポレーション前にベクターをＳａｌＩで消化したこと以外は同様にＩｇμＵホモ接合性ＫＯ細胞系にトランスフェクトした。４５３のハイグロマイシン耐性コロニーのスクリーニングの結果、２９のクローンが、プライマー対ａｙＫＯｈｙｇＦ２（5'-TGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGAC-3'；配列番号４０）及びａｙＫＯｈｙｇＲ２（5'-TAGGATATGCAGCACACAGGAGTGTGG-3'；配列番号４１）を用いたＰＣＲにより陽性であると同定された。ＰＣＲ産物の配列決定により、ａｙアレルをターゲティングするように設計したＫＯベクターのみがａｙアレルに組み込まれることが実証された。上記結果から判断して、ＡＹ及びａｙ  ＫＯベクターの両方がそれぞれのアレルをアレル特異的にターゲティングし、７〜８％の頻度で正しいターゲティングクローンを生成するといえる。クロマチン移植を以下のように行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟した卵母細胞を２０ｈｐｍにて脱核した。ウシＩｇμＵノックアウト線維芽細胞をトリプシン処理し、Ｃａ／Ｍｇハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で洗浄し、５０，０００〜１００，０００の細胞を３１．２５ユニットのストレプトリシンＯ（ＳＬＯ；Sigma, St. Louis, MO）と１００μｌで３７℃のＨ２Ｏ浴において３０分間インキュベートすることにより透過性化した。細胞サンプルをヨウ化プロピジウムとインキュベートし、蛍光顕微鏡で観察して透過性化を色素の取り込みに基づいてモニタリングした。透過性化線維芽細胞を洗浄し、ペレット化し、ＡＴＰ生成系（１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭリン酸クレアチン、及び２５μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ）を含むＭＤＢＫ細胞から調製した４０μｌの有糸分裂抽出物中で３７℃のＨ２Ｏ浴において３０分間インキュベートした。細胞サンプルをＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色し、蛍光顕微鏡で観察してクロマチン凝縮をモニタリングした。インキュベーションの終了後、反応混合物を５００μｌ細胞培養培地（１０％ＦＢＳ含有αＭＥＭ）に希釈した。これらの細胞をペレット化し、ＴＬ  ＨＥＰＥＳに再懸濁し、脱核した卵母細胞へのクロマチン移植に使用した。１２の胎仔が、ｂｓｒＫＯベクターがＩｇμＡＹ遺伝子のＡＹアレルに組み込まれたヘミ接合性ＩｇμＡＹ  ＫＯ胎仔であると決定された。同様に、１１の胎仔が、ｈｙｇＫＯベクターがＩｇμＡＹ遺伝子のａｙアレルに組み込まれたヘミ接合性ＩｇμＡＹ  ＫＯ胎仔であると決定された。これらの胎仔はまたＩｇμＵ−／−でもあった。ＩｇμＡＹ−／＋／ＩｇμＵ−／−細胞系の１つ（Ａ２２７、ＡＹアレルにおいてターゲティング）を使用して、ｐＢＣμａｙＫＯｈｙｇでの第２のターゲティング実験を行った。１９７のハイグロマイシン耐性コロニーのスクリーニングの結果、１８のクローンがプライマー対（ａｙＫＯｈｙｇＦ２及びａｙＫＯｈｙｇＲ２）を用いたＰＣＲにより陽性であると同定された。ＰＣＲ産物の配列決定から、ａｙアレルをターゲティングするように設計されたＫＯベクターのみがａｙアレルに組み込まれ、ホモ接合性二重ノックアウト（ＩｇμＡＹ−／−／ＩｇμＵ−／−）細胞を生成したことが実証された。
【０１９４】
本発明者らは、本明細書に記載する方法を用いてＩｇμＡＹ−／−／ＩｇμＵ−／−胎仔を作製した。これらの胎仔がＢ細胞を欠損しているか否かを検査するために、在胎１８０日目にＩｇμＡＹ−／−／ＩｇμＵ−／−胎仔を回収した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（QIAGEN）を用いて脾臓から総ＲＮＡを抽出した。１マイクロリットルの総ＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡ合成（ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ第１鎖合成系, Invitrogen）に供した後、ＲＴ−ＰＣＲに供した。１回のＲＴ−ＰＣＲ反応は以下の通りに実施した。使用したプライマー対（5'-CCCTCCTCTTTGTGCTGTCA-3'（ＢＬ１７；配列番号４２）及び5'-GTTCAGGCCATCATAGGAGG-3'（ｍＢＣμＲ２；配列番号４３））は、ＩｇμＡＹ及びＩｇμＵの両方の増幅に適合する。ＰＣＲ反応混合物は、３２．５μｌの水、５μｌの１０ＸＥｘＴａｑバッファー（TAKARA）、８μｌのｄＮＴＰ混合物、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、２μｌの第１鎖ｃＤＮＡ、及び０．５μｌのＥｘＴａｑ（TAKARA）を含んでいた。反応混合物を以下の条件下でインキュベートすることにより３５サイクルのＰＣＲを行った。すなわち８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、６２℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分間。ＰＣＲ後、反応混合物を電気泳動により分析した。ＩｇμＡＹ−／−／ＩｇμＵ−／−胎仔には陽性ＰＣＲ産物は無かった。ＰＣＲ後、反応混合物を電気泳動により分析した。ＩｇμＡＹ又はＩｇμＵの発現は検出されなかった。ＩｇＭ重鎖タンパク質の存在を検出するためのフローサイトメトリー分析も行った。そのようなタンパク質は検出されなかった。
【０１９５】
ＩｇμＵ遺伝子がそれ自体でＢ細胞発達を支持できるかを決定するために、ｐｂＣμａｙＫＯｈｙｇ及びｐｂＣμＡＹＫＯｂｓｒベクターを用いて上述したのと同様にＩｇμＡＹノックアウトを作製した。１つのＩｇμＡＹ−／−細胞系から、１８０日の胎仔を作製し、ＶＤＪ再配列ＩｇμＵ転写産物を検出するために脾臓組織に対してＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列は、ＩｇμＵ転写産物についてだけＶＤＪ再配列された配列を示し、ＩｇμＡＹ遺伝子発現の破壊を確認した。配列分析から、対応するＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３及びＣＤＲ３領域を含むＪＨ−ＣμＬセグメントに関連する、可能性のあるＶＨ及びＤＨセグメントの存在を確認した。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ産物の直接配列決定により、ＩｇμＡＹと同様ＩｇμＵ転写産物のＣＤＲ３領域において多様な配列が明確に示された。ＩｇμＵ  ｃＤＮＡの配列は、機能的ＩｇＭ様ポリペプチドをコードすると思われ、これは特にＦＲ４及び定常領域においてＩｇμＡＹとわずかに異なる。これらのデータは、ＣＤＲ３の多様化を含み、機能的ＶＤＪ再配列の後にＩｇμＵ遺伝子がＩｇμＡＹ発現とは無関係に発現され得ることを実証する。
【０１９６】
ＩｇμＵの機能的発現が、ＩｇμＡＹを介した古典経路とは無関係にＢ細胞発達を十分に達成できるかを調査するために、ＩｇμＡＹ−／−１８０日胎仔においてフローサイトメトリー分析を行った。コントロールに匹敵する有意な発達中Ｂ細胞（ＩｇＭ＋Ｂ２２０＋）の集合を認めた。この結果は、ＩｇμＵタンパク質がＢ細胞表面上で提示され得ることを示す。次に、未成熟Ｂ細胞（ＩｇＭ＋Ｉｇλ＋）の生成を調査するために、抗ウシＩｇＭポリクローナル抗体及び抗ウシＩｇλモノクローナル抗体の両方を用いて染色を行った。二重陽性Ｂ細胞が検出され、ＩｇμＵ重鎖がＩｇλ軽鎖と結合してＢ細胞受容体を形成した未成熟Ｂ細胞の存在が示唆された。さらに、抗ＣＤ２１抗体により認識される成熟Ｂ細胞の生成を検出し、ＲＴ−ＰＣＲによりＶＤＪ再配列ｂＩｇＤ遺伝子の遺伝子発現を確認した。この観察結果は、ＩｇμＵが成熟Ｂ細胞発達を支持し、ＶＤＪ−Ｃδ遺伝子の発現を誘導できることを示唆している。さらに、γ定常領域セグメントがＩｇμＵ遺伝子クラスターの一部として同定されていないにも関わらず、ＶＤＪ再配列ｂＩｇＧのクラススイッチ及び発現の発生を検出した。興味深いことに、ＩｇμＡＹ−／−胎仔由来のｂＩｇＧ転写産物におけるＣＤＲ３の多様化の程度は、ＩｇμＵ−／−胎仔で検出されたものよりも有意に少なかった。しかし、ＩｇμＡＹ−／−胎仔におけるＩｇμＵ転写産物中のＣＤＲ３は、ＩｇμＵ−／−胎仔中のＩｇμＡＹ転写産物のＣＤＲ３に匹敵するレベルで多様であった。この結果は、おそらくＩｇμＵ遺伝子座がｂＩｇＧ定常領域とシスで結合しないため、古典的なＩｇμＡＹ遺伝子座と比べてＩｇμＵが十分に多様なＩｇＧを生成する効率が低い可能性があることを示唆する。これらのデータは、ＩｇμＵが、Ｂ細胞発達を促進するためのＩｇμＡＹ機能の欠如に大きく取って代わることができるが、なんらかのトランス（ｔｒａｎｓ）クラススイッチメカニズムによりＩｇμＡＹ遺伝子座からγ定常領域セグメントをリクルートし易いことを強く示唆している。
【０１９７】
これらの結果から、ウシには２つの機能的ＩｇＭ遺伝子座（すなわち、ＩｇμＡＹ及びＩｇμＵ）があること、及びホモ接合性二重ノックアウトＩｇμＡＹ−／−／ＩｇμＵ−／−がＢ細胞欠損に有用であることが実証された。
【実施例６】
【０１９８】
プリオンタンパク質発現を欠損しているウシの作製
本発明は、プリオンタンパク質発現を欠損しているウシの作製を特徴とする。ＰｒＰ−／−マウスは生存能力があり健康に見えるにも関わらず、ウシ類において遺伝子をノックアウトする効果は未だに決定されていない。ＰｒＰ−／−ウシ類を作製するために、上述したウシ線維芽細胞のための逐次的遺伝子ターゲティング系を利用した。雄ホルスタイン線維芽細胞（細胞系４６８５、同じくＩｇμＵ−／−である）を、ノックアウトベクター（ｐＢＰｒＰ（Ｈ）ＫＯｎｅｏ）でトランスフェクトし、正しくターゲティングされた細胞をクローニングして在胎４０日のＰｒＰ−／＋胎仔を作製し、これらを使用してＰｒＰ−／＋細胞系を樹立した。胎仔細胞系を評価してＰＣＲ遺伝子型決定により正しいターゲティングを確認した。次いで、ＰｒＰ−／＋細胞系を第２のノックアウトベクター（ｐＢＰｒＰ（Ｈ）ＫＯｐｕｒｏ）でトランスフェクトした後、選択及びクローニングを行ってＰｒＰ−／−胎仔及び細胞系を作製した。細胞系における正しいターゲティングを、ＰＣＲ遺伝子型決定により検証した。野生型ＰｒＰ＋／＋／ＩｇμＵ−／−（細胞系５１１２）、ヘテロ接合性ノックアウトＰｒＰ−／＋ＩｇμＵ−／−（細胞系８０１８）、及びホモ接合性ノックアウトＰｒＰ−／−／ＩｇμＵ−／−（細胞系１７１８）線維芽細胞を胚クローニングに使用して仔ウシを作製した（表４）。第１シリーズのクローニングでは、ＰｒＰ＋／＋／ＩｇμＵ−／−（仔ウシ３４７；５．９％）、ＰｒＰ−／＋／ＩｇμＵ−／−（仔ウシ３４１；４．３％）及びＰｒＰ−／−／ＩｇμＵ−／−（仔ウシ３４２；３．２％）細胞系（図１５）からそれぞれ１匹ずつ仔ウシを得た。
【表４】
2007533328.tif 000005
【０１９９】
仔ウシ３４１及び３４２の遺伝子型を検証するために、それぞれの仔ウシから小さい生検用皮膚を回収し、線維芽細胞系を樹立した（図１６Ａ）。２つのノックアウト遺伝子型由来の線維芽細胞及びコントロール線維芽細胞の形態又は増殖速度において差は見とめられなかった。各ターゲティングＰｒＰ遺伝子アレルに特異的なプライマー対（プライマー対；ｎｅｏＦ７×ｎｅｏＲ７及びｐｕｒｏＦ１４×ｐｕｒｏＲ１４；図１６Ｂ）を用いたＰＣＲにより遺伝子型決定を行った後、確認のために配列分析を行った。さらに、第２のＰＣＲ（Kuroiwaら、前掲）を行って、野生型ＰｒＰアレルの不在を確認した（プライマー対；ＢＰｒＰｅｘ３Ｆ×ＢＰｒＰｅｘ３Ｒ、図１６Ｃ）。結果から、仔ウシ３４１がヘテロ接合性ＰｒＰノックアウト、及び仔ウシ３４２がホモ接合性ＰｒＰノックアウトであることを確認した。さらに、プライマー対ｂＣμｆ×ｂＣμｒ（図１６Ｄ）を仔ウシ３４１及び３４２において用いて同様のＰＣＲ分析を行って、野生型ＩｇμＵアレルの不在を確認し、予想通り４つ全てのターゲティング事象（ＰｒＰ−／−／ＩｇμＵ−／−）を確認した。これは、ホモ接合性二重ノックアウト（ＰｒＰ−／−／ＩｇμＵ−／−）仔ウシの１回目の作製を表し、一次体細胞における４回の遺伝子ターゲティングとその後の胚クローニングが生存仔ウシの作製に適合することを実証した。
【０２００】
仔ウシ３４２におけるＰｒＰ遺伝子の機能的不活性化を実証するために、ｍＲＮＡ及び総タンパク質を線維芽細胞から抽出した。コントロールとして、ＰｒＰ＋／＋／ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４７及びＰｒＰ−／＋／ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４１を分析した。ｍＲＮＡ発現分析のために、ＲＴ−ＰＣＲ（プライマー対；ＰｒＰｍＦ３×ＰｒＰｍＲ３、図１７Ａ）を行い、その後ＰｒＰ−／−／ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２においてＰｒＰ  ｍＲＮＡ発現の破壊を確認した一方で、ＰｒＰ＋／＋／ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４７及びＰｒＰ−／＋／ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４１において明確な発現を検出した。タンパク質発現分析のために、マウス抗ウシＰｒＰモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットを行った。ＰｒＰ＋／＋／ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４７及びＰｒＰ−／＋／ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４１の正しいバンドは検出したが、ＰｒＰ−／−／ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２又は陰性コントロールマウス線維芽細胞についてはバンドが見とめられなかった（図１７Ｂ）。さらに、産後一週間以内に死んだ２匹のＰｒＰ−／−仔ウシから脳サンプルを回収し、サンプルに対してウェスタンブロット分析を行った。脳サンプルからＰｒＰ陽性バンドは検出されなかった（図１８）。この結果を、別の研究室で異なるマウス抗ウシＰｒＰモノクローナル抗体（６Ｈ４、Prionics）でも確認した。これらのデータは、ＰｒＰ遺伝子がＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−及びＰｒＰ−／−仔ウシにおいて機能的に不活性化されたことを明確に実証する。
【０２０１】
全ての仔ウシが、認可された獣医又は訓練を受けた動物管理技術者の一方の評価を受けた。１週間及び１ヶ月目に、仔ウシ３４１及び３４２をコントロールと共に、以下のパラメーターの評価を含めて所定の身体検査を行った：すなわち、体重、体温、心拍数、心音、頸静脈拡張、呼吸数、呼吸音、咳、鼻漏又は眼の異常の有無、食欲、一般行動（機敏及び活動的、活動的でない、活動過多）、歩行、姿勢、間接、足、糞（下痢、便秘）、生殖器、並びに臍帯（乾燥、膨張、炎症、感染）。さらに、血液サンプルを標準血液学及び血清化学検査のために採取した。ここまで、仔ウシ３４１及び３４２についての全てのパラメーターはこれらの日齢グループにおいて正常であった。
【０２０２】
追加の検証のために、ＰｒＰ−／−のみでその他の遺伝子改変を全く含まないクローン化ＰｒＰ−／−胚の第２のセットを作製し、５１のレシピエントに移入した。これらの移入から、７匹の仔ウシ（１４％）が産まれた（表５）。これらの仔ウシを、血液生検から単離した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のＰＣＲ遺伝子型決定及びウェスタンブロット分析により（図１９）、ＰｒＰ−／−であることを確かめた。１週間目の仔ウシの身体検査では明白な異常は見とめられず、これまでＰｒＰ−／−／ＩｇμＵ−／−仔ウシとＰｒＰ−／−仔ウシとの間に表現型の明白な差はない。
【表５】
2007533328.tif 000006
【０２０３】
方法
実施例６に記載の結果は、以下の方法を採用して得た。
【０２０４】
胚クローニング
クロマチン移植手順を採用してクローン仔ウシを作製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟卵母細胞を成熟の２０時間後に脱核した。約５０，０００〜１００，０００の細胞を３１．２ＵストレプトリシンＯ（ＳＬＯ；Sigma）と懸濁させながら１００μｌのＨＢＳＳ中３７℃のＨ２Ｏ浴において３０分間インキュベートすることにより、正しくターゲティングされたクローンを透過性化した。透過性化細胞を沈降させ、洗浄し、ＡＴＰ生成系（１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭリン酸クレアチン、及び２５μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ）を含む４０μｌ有糸分裂抽出物と３８℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーションの終了後、反応混合物を希釈し、沈降させ、洗浄した。これらの細胞を脱核した卵母細胞と融合させ、成熟化してから２８時間後に５μＭカルシウムイオノフォアで４分間、その後１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド及び２．５μｇサイトカラシンＤで５時間かけて活性化させた。活性化の後、ＣＴ胚を洗浄し、胚盤胞段階になるまでｉｎ  ｖｉｔｒｏでマウス胎仔線維芽細胞と共培養した。グレード１及び２の胚盤胞を選択し、同調レシピエントに移入した。本節に記載した全ての動物に関わる作業は、Transova Genetics Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認されたプロトコールに従って行った。
【０２０５】
細胞培養及びトランスフェクション
ホルスタイン胎仔雄線維芽細胞を培養し、３０μｇの各ノックアウトベクターで５５０Ｖ及び５０μＦにてＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Bio-Rad）を用いてエレクトロポレーションした。４８時間後、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８又は１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを２週間用いて細胞を選択し、薬剤耐性コロニーを採取し、複製プレートに移した。一方はゲノムＤＮＡ抽出用（２４ウエルプレート）に、他方は胚クローニング用（４８ウエルプレート）に移した。
【０２０６】
ゲノムＰＣＲ分析
ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ単離キット（Gentra SYSTEMS）及び製造元のプロトコールを用いて、ＰｒＰ−／−ホモ接合性ＫＯ仔ウシの耳生検又は血液のいずれか由来の線維芽細胞から抽出した。各ゲノムＤＮＡサンプルを、５０〜１００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ）に再懸濁した。プライマー対ｎｅｏＦ７；5'-TGTCAAAGAGACACTCCTCATTTGTCTTCC-3'（配列番号４４）及びｎｅｏＲ７；5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCC-3'（配列番号４５）を第１のターゲティングアレルを検出するために、並びにｐｕｒｏＦ１４；5'-TTGCTCCACCTTCCGTCTTCTGTC-3'（配列番号４６）及びｐｕｒｏＲ１４；5'-GTTGGCGCCTACCGGTGGATGTG-3'（配列番号４７）を第２のターゲティングアレルを検出するために用いてＰＣＲによる確認を行った。ＰＣＲ反応混合物は、１７．９μｌの水、３μｌの１０ＸＬＡ  ＰＣＲバッファーＩＩ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、４．８μｌのｄＮＴＰ混合物、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、２μｌのゲノムＤＮＡ、及び０．３μｌのＬＡ  Ｔａｑを含んでいた。反応混合物を以下の条件下でインキュベートすることにより３０サイクルのＰＣＲを行った：すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、及び６８℃にて５分間。さらに、別のＰＣＲを行って、（ｉ）野生型ＰｒＰアレル（以下のプライマー対を使用：ＢＰｒＰｅｘ３Ｆ；5'-CCACATAGGCAGTTGGATCC-3'（配列番号４８）及びＢＰｒＰｅｘ３Ｒ；5'-ATAAGAGGCCTGCTCATGGC-3'（配列番号４９））、並びに（ｉｉ）ＩｇμＵアレル（ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシについてのみ）（以下のプライマー対を使用：ＢＣμｆ；5'-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3'（配列番号５０）及びＢＣμｒ；5'-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3'（配列番号５１））の不在を確認した。ＰＣＲ反応混合物は、１７．９μｌの水、３μｌの１０ＸＥｘ  Ｔａｑバッファー、４．８μｌのｄＮＴＰ混合物、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプラ
イマー、２μｌのゲノムＤＮＡ、及び０．３μｌのＥｘ  Ｔａｑを含んでいた。反応混合物を以下の条件下でインキュベートすることにより３０サイクルのＰＣＲを行った：すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、６０〜６２℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分間。ＰＣＲの後、電気泳動により反応混合物を分析した。
【０２０７】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（QIAGEN）を用いて生検サンプルから総ＲＮＡを抽出した。１マイクロリットルの総ＲＮＡを、第１鎖ｃＤＮＡ合成（ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ第１鎖合成系、Invitrogen）、そしてその後ＲＴ−ＰＣＲに供した。以下のプライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った：すなわち、5'-AAGAAGCGACCAAAACCTGG-3'（配列番号５２）及び5'-GTAACGGTGCATGTTTTCACG-3'（配列番号５３）。ＰＣＲ反応混合物は、３２．５μｌの水、５μｌの１０ＸＥｘ  Ｔａｑバッファー（TAKARA）、８μｌのｄＮＴＰ混合物、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、２μｌの第１鎖ｃＤＮＡ、及び０．５μｌのＥｘ  Ｔａｑ（TAKARA）を含んでいた。反応混合物を以下の条件下でインキュベートして３５サイクルのＰＣＲを行った：すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、６２℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分間。ウシβアクチンｍＲＮＡ発現の検出のために、プライマーｂＢＡＦ（5'-ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3'；配列番号５４）及びｂＢＡＲ（5'-AACCGACTGCTGTCACCTTC-3'；配列番号５５）を同じＰＣＲ条件下で使用した。ゲノムＤＮＡ混入の可能性を排除するために、逆転写酵素を用いないで別のＲＴ−ＰＣＲ反応セットを行った。ＰＣＲの後、電気泳動により反応混合物を分析した。ＰｒＰ−／−仔ウシ又はＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−ＫＯ仔ウシから調製されたどの生検サンプルにも陽性ＰＣＲ産物は無かった。この結果は、仔ウシにおけるプリオン遺伝子発現の完全な不在を実証している。
【０２０８】
ウェスタンブロッティング
生存仔ウシの生検若しくは血液サンプル又は死滅仔ウシの脳サンプルから、総タンパク質を抽出し、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬を用いてタンパク質含量を定量した。約７５μｇのタンパク質サンプルを、１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにおいて非還元条件下で泳動させてウェスタンブロット分析を行った。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、抗ウシプリオンタンパク質モノクローナル抗体（Ｆ８９／１６０．１．５；Alexis Biochemicals）を一次抗体として用いて膜を染色し、マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識されたアフィニティ精製抗体で二次的に染色した。染色した膜を、ＥＣＬ  ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出システム（Amersham Bioscience）を用いて現像し、フィルム現像機によりＢｉｏｍａｘ露光（light）フィルムに露光した。陽性コントロールとして、組換えウシＰｒＰタンパク質（Alexis Biochemicals）を使用した。陰性コントロールとして、マウス線維芽細胞由来タンパク質抽出物を分析した。内部陽性コントロールとして、同じブロットを抗ＣＤＣ２モノクローナル抗体で同様に染色した。ＰｒＰ−／−仔ウシ又はＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−ＫＯ仔ウシから調製されたどの生検サンプルにおいてもプリオンタンパク質バンドは検出されなかった。この結果は、仔ウシにおけるプリオンタンパク質発現の完全な不在を実証した。
【実施例７】
【０２０９】
プリオンタンパク質を欠損しているウシの作製、及びＩｇＭ重鎖発現
ｐＢＣμＡＹＫＯｂｓｒベクターでのＩｇμＵ−／−ＰｒＰ−／−細胞系８４５４のトランスフェクションを、以下の標準エレクトロポレーションプロトコールを用いて行った。ウシ胎仔線維芽細胞を培養するために使用した培地は、５００ｍｌαＭＥＭ（Gibco, 12561-049）、５０ｍｌウシ胎仔血清（Hy-Clone #ABL13080）、５ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（SIGMA）、及び１ｍｌ  ２−メルカプトエタノール（Gibco/BRL #21985-023）を含んでいた。トランスフェクションの前日、細胞をＴ１７５組織培養フラスコに８０〜１００％の密集度（顕微鏡検査で判断）で播種した。トランスフェクション当日、約１０７のウシ線維芽細胞をトリプシン処理し、αＭＥＭ培地で１回洗浄した。８００μｌのαＭＥＭへの細胞の再懸濁の後、１ｍＭスペルミジン含有ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）に溶解した３０μｇのＳｒｆＩ消化ＫＯベクター（ｐＢＣμＡＹＫＯｂｓｒベクター）を、細胞懸濁液に添加し、ピペッティングによりよく混ぜた。細胞−ＤＮＡ懸濁液をエレクトロポレーションキュベットに移し、５５０Ｖ及び５０μＦにてエレクトロポレーションを行った。その後、エレクトロポレーションした細胞を、血清を添加したαＭＥＭ培地の入った３０枚の４８ウエルプレート上に播いた。４８時間の培養後、培地を１０μｇ／ｍｌのブラスチシジンを含む培地と置き換え、細胞を２〜３週間培養して、ブラスチシジン耐性細胞を選択した。選択後、１００％に近い密集度に達した全てのコロニーを、２つの複製プレート（２４ウエル及び４８ウエルプレート）に分けた。すなわち、一方はゲノムＤＮＡ抽出用、他方のプレートは核移植用とした。コロニーからゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲにより所望の相同組換え事象についてスクリーニングした。
【０２１０】
上述したように、ＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ単離キット（Gentra SYSTEMS）を製造元のプロトコールに従って用いて、ゲノムＤＮＡを各２４ウエルから別々に抽出した。各ゲノムＤＮＡサンプルを２０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ）に再懸濁させた。ＰＣＲによるスクリーニングは、以下のプライマー対を用いて行った：すなわち、ＡＹＫＯｂｓｒＦ２（5'-GGTAGTGCAGTTTCGAATGGACAAAAGG-3'；配列番号５６）及びＡＹＫＯｂｓｒＲ２（5'-TCAGGATTTGCAGCACACAGGAGTG-3'；配列番号５７）。一方のプライマーの配列はＫＯベクターに位置し、他方のプライマーの配列はターゲティング内因性遺伝子座における組込みベクターのすぐ外側に位置している。従って、予想されたＰＣＲ産物は、相同組換えによりＫＯベクターがターゲティング遺伝子座に組み込まれている場合にのみ検出された。ＰＣＲ反応混合物は、１７．９μｌの水、３μｌの１０ＸＬＡ  ＰＣＲバッファーＩＩ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、４．８μｌのｄＮＴＰ混合物、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、２μｌのゲノムＤＮＡ、及び０．３μｌのＬＡ  Ｔａｑを含んでいた。反応混合物を以下の条件下でインキュベートすることにより４０サイクルのＰＣＲを行った：すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、及び６８℃にて８分間。ＰＣＲの後、反応混合物を電気泳動により分析した。１９８のスクリーニングしたクローンのうち、１４のクローンが予想したＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物の配列決定の結果、ＡＹアレルをターゲティングするように設計されたＫＯベクターのみが全てのクローンのＡＹアレルに組み込まれた。
【０２１１】
上記ノックアウト（ＩｇμＡＹ−／＋ＩｇμＵ−／−ＰｒＰ−／−）細胞又はこれらの細胞由来の核を、本明細書に記載の任意の核移植方法に使用してＩｇμＡＹ−／＋ＩｇμＵ−／−ＰｒＰ−／−ノックアウト有蹄動物（例えば、ノックアウト仔ウシ）を作製した。所望であれば、ノックアウト胎仔又は生存有蹄動物由来の細胞を以下に記載するように使用して、ホモ接合性プリオンノックアウト細胞を作製してもよい。１つの具体的な方法では、線維芽細胞（例えば、ウシ初代胎仔線維芽細胞）を、１μｇ／ｍｌノコダゾールで１８時間有糸分裂同調させ、有糸分裂シェイクオフ（shake-off）で回収し、リン酸緩衝生理食塩水中で２回、及び細胞溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ及びプロテアーゼ阻害剤）中で１回洗浄した。沈降した細胞を１容量（volume）の氷冷細胞溶解バッファー中に再懸濁し、氷上で１時間膨張させ、ぴったりとしたガラス乳棒を用いて加圧細胞粉砕（Dounce-homogenized）した。溶解物を１５，０００×ｇ、４℃にて１５分間遠心分離し、上清（有糸分裂抽出物）をアリコートし、液体窒素中で冷凍し、−８０℃にて保存した。新鮮又は冷凍抽出物を使用した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞を２０ｈｐｍにて脱核した。選択したコロニーから得たトランスフェクトしたウシ胎仔線維芽細胞をＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含まないハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で洗浄し、細胞を３１．２ＵストレプトリシンＯ（ＳＬＯ；Sigma）含有１００μｌＨＢＳＳと懸濁させて約３７℃の水浴において３０分間インキュベートすることにより透過性化した。透過性化は、膜非透過性ＤＮＡ色素であるヨウ化プロピジウム（０．１μｇ／ｍｌ）の取り込みにより評価した。透過性化線維芽細胞を沈降させ、洗浄し、ＡＴＰ生成系（１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭリン酸クレアチン、及び２５μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ）を含む４０μｌ有糸分裂抽出物において約３７℃にて３０〜４５分間インキュベートした。アリコートを０．１μｇ／ｍｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で標識して、クロマチン凝縮をモニタリングした。インキュベーション終了後、反応混合物を５００μｌαＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清（Hyclone）に希釈した。細胞を脱核卵母細胞に融合させ、卵母細胞を２８ｈｐｍにて活性化し、胚盤胞段階になるまで胚をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。２つの胚を各レシピエント雌に移入した。超音波検査で妊娠をモニタリングし、レシピエントに対して帝王切開を行って胎仔を回収し、細胞系を作製した。
【０２１２】
エレクトロポレーションの前にベクターをＳａｌＩで消化したこと以外は同様にｐＢＣμａｙＫＯｈｙｇベクターを上記ＩｇμＡＹ−／＋ＩｇμＵ−／−ＰｒＰ−／−細胞系にトランスフェクトした。１１９のハイグロマイシン耐性コロニーのスクリーニングの結果、プライマー対ａｙＫＯｈｙｇＦ２（5'-TGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGAC-3'；配列番号５８）及びａｙＫＯｈｙｇＲ２（5'-TAGGATATGCAGCACACAGGAGTGTGG-3'；配列番号５９）を用いたＰＣＲにより４つのクローンが陽性であると同定された。ＰＣＲ産物の配列決定の結果は、ａｙアレルをターゲティングするように設計されたＫＯベクターのみがａｙアレルに組み込まれたことを実証した。上記結果から、ＡＹ及びａｙ  ＫＯベクターの両方が、アレル特異的に各アレルをターゲティングし、正しいターゲティングクローンを作製できると結論付けた。
【０２１３】
本明細書に記載の方法を用いて、同定したＩｇμＡＹ−／−ＩｇμＵ−／−ＰｒＰ−／−コロニーからクロマチン移植を行い、最終的に４つのＩｇμＡＹ−／−ＩｇμＵ−／−ＰｒＰ−／−胎仔を作製し、それぞれから４つの細胞系を樹立した。さらに、１匹のＩｇμＡＹ−／−ＩｇμＵ−／−ＰｒＰ−／−仔ウシを得た。遺伝子型決定を以下の通りに行った。ＩｇμＡＹ−／−ＩｇμＵ−／−ＰｒＰ−／−ホモ接合性三重ＫＯ仔ウシの耳生検又は血液に由来する線維芽細胞から、ＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ単離キット（Gentra SYSTEMS）を製造元のプロトコールに従って用いてゲノムＤＮＡを抽出した。各ゲノムＤＮＡサンプルを５０〜１００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ）に再懸濁した。ＩｇμＡＹ及びＩｇμＵ増幅の両方に適合するプライマー対5'-TCTCTGGTGACGGCAATAGC-3'（ＢＣμｆ２；配列番号６０）及び5'-CTTCGTGAGGAAGATGTCGG-3'（ＢＣμｒ２；配列番号６１）を用いてＰＣＲによる確認を行い、ＩｇμＡＹ及びＩｇμＵ遺伝子の野生型アレルの不在を確認し、別のプライマー対ＢＰｒＰｅｘ３Ｆ（5'-CCACATAGGCAGTTGGATCC-3'（配列番号６２９））及びＢＰｒＰｅｘ３Ｒ（5'-ATAAGAGGCCTGCTCATGGC-3'（配列番号６３））を用いてＰｒＰ遺伝子の野生型アレルの不在を確認した。ＰＣＲ反応混合物は、１７．９μｌの水、３μｌの１０ＸＥｘ  Ｔａｑバッファー、４．８μｌのｄＮＴＰ混合物、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、２μｌのゲノムＤＮＡ、及び０．３μｌのＥｘ  Ｔａｑを含んでいた。反応混合物を以下の条件でインキュベートすることにより３０サイクルのＰＣＲを行った：すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、６０〜６２℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分間。ＰＣＲ後、反応混合物を電気泳動により分析した。結果は、産まれた仔ウシがＩｇμＡＹ−／−ＩｇμＵ−／−ＰｒＰ−／−であることを実証した。
【実施例８】
【０２１４】
ＩｇμＡＹ−／−ＩｇμＵ／−ＰｒＰ−／−ホモ接合性三重ＫＯ仔ウシにおけるプリオンタンパク質発現の不在の検証
ＩｇμＡＹ−／−ＩｇμＵ−／−ＰｒＰ−／−ホモ接合性三重ＫＯ仔ウシから採取した血液サンプルから、総タンパク質を抽出し、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬を用いてタンパク質含量を定量した。約７５μｇのタンパク質サンプルを１２％ＳＤＳｐａｇｅゲルにおいて非還元条件下で泳動させることにより、ウェスタンブロット分析を行った。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、抗ウシプリオンタンパク質モノクローナル抗体（Ｆ  ８９／１６０．１．５，Alexis Biochemicals製）を一次抗体として、その後マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製二次抗体で膜を染色した。染色した膜を、ＥＣＬ  ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出系（Amersham Bioscience）を用いて現像し、フィルム現像機によりＢｉｏｍａｘ露光フィルムに露光した。陽性コントロールとして、組換えウシＰｒＰタンパク質（Alexis Biochemicals）を使用した。陰性コントロールとして、マウス線維芽細胞由来のタンパク質抽出物を使用した。
【０２１５】
ＩｇμＡＹ−／−ＩｇμＵ−／−ＰｒＰ−／−ホモ接合性三重ＫＯ仔ウシから調製した生検サンプルにおいて、抗体で染色されたバンドは無かった。この結果は、仔ウシにおけるプリオンタンパク質発現の完全な不在を実証する。
【実施例９】
【０２１６】
ＩｇμＡＹ−／−ＩｇμＵ／−ＰｒＰ−／−ホモ接合性三重ＫＯ仔ウシにおけるＩｇＭタンパク質発現の不在の検証
ＩｇμＡＹ−／−ＩｇμＵ−／−ＰｒＰ−／−ホモ接合性三重ＫＯ仔ウシがＩｇＭタンパク質を欠損することを確認するため、フローサイトメトリー分析を以下に記載するように行った。末梢血液を新生仔ウシから頸静脈穿刺によりヘパリン添加チューブに回収した。ＲＢＣ溶解バッファー（Sigma, St. Louis, MO）を用いた赤血球溶解によりヘパリン添加血液から全白血球（ロイコサイト（leukocytes））を回収し、滅菌ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Sigma, St. Louis, MO）で２回洗浄した。細胞をＦＡＣＳ染色培地（４％ウマ血清又はヤギ血清、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．２％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水）に再懸濁し、非特異的結合をブロックするために室温にて３０分間インキュベートした。ヒツジ抗ウシＩｇＭ−ＦＩＴＣ（Bethyl Laboratories, Mongomery, TX）又はロバ抗ヒツジ／ウシＩｇ−ビオチン抗体（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)、その後ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ又はストレプトアビジン−ＰＥ二次抗体（Caltag Laboratories, Burlingame, CA）を使用してＢ細胞上のウシ表面ＩｇＭ（ｓＩｇＭ）を標識化した。発達中のウシＢ細胞上の表面Ｂ２２０マーカーを標識化するために、マウス抗ウシＢ２２０（ＣＤ４５Ｒ）抗体クローンＧＳ５Ａ（VMRD, Pullman, WA）、その後抗マウスＩｇＧ１−ＰＥ二次抗体（Caltag Laboratories, Burlingame, CA）を使用した。Serotec Inc.（Raleigh, NC）から得たマウス抗ウシＣＤ２１クローンＭＣＡ１４２４及びマウス抗反すう類ＣＤ４３クローン１０９６の抗体、その後抗マウスＩｇＧ１−ＰＥ二次抗体（Caltag Laboratories, Burlingame, CA）を使用して、ウシＢ細胞上の表面ＣＤ２１及びＣＤ４３マーカーを標識化した。１０６細胞（ＷＢＣ）含有ＦＡＣＳ染色培地を含む５０マイクロリットルの細胞懸濁液を単独で又はＶ字底マイクロタイターウエル又はチューブと組合せて、各表面マーカー抗体での染色に使用した。細胞を一次抗体と室温暗所にて２０〜３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ洗浄バッファー（２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．２％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水）で遠心分離により２回洗浄した。細胞を５０μｌのＦＡＣＳ染色培地にもう一度再懸濁し、適切な蛍光標識二次抗体と１５〜２０分間室温暗所にてインキュベートした。最後に、細胞をＦＡＣＳ洗浄バッファーで２回洗浄し、２〜４％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳで固定した。次いで、表面標識された固定細胞を分析し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（BD Biosciences, San Diego, CA）でデータを取得した。リストモードファイルデータを単色又は二色プロファイル用のＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いて最終的に分析した。ＦＡＣＳの結果は、ホモ接合性三重ＫＯ仔ウシにおけるあらゆる発達中のＢ細胞の完全な不在を実証した。
【実施例１０】
【０２１７】
ＩｇμＡＹ−／−／ＩｇμＵ−／−細胞系へのＨＡＣ移入
ＩｇＭレベルが低減した動物の用途の１つは、異種抗体の作製である。異種抗体の作製方法の１つは、抗体重鎖及び／又は軽鎖を発現する１以上のヒト人工染色体を有する動物を作製することである。このために、ΔΔＨＡＣ（λＨＡＣ）及びκＨＡＣをミクロセル媒介型染色体移入法（ＭＭＣＴ）（Kuroiwaら(2000) Nature Biotech. 18:1086-1090）を用いてＤＴ４０細胞ハイブリッドからチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に移した。λＨＡＣ（「ΔΔＣ１０クローン」）を含むＣＨＯクローンを、１０％ＦＢＳ（Gibco）、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、及び０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを添加したＦ１２（Gibco）培地中で３７℃及び５％ＣＯ２にて培養した。ΔΔＣ１０クローンを１２のＴ２５フラスコまで増殖させた。密集度が８０〜９０％に到達したら、コルセミド（Sigma）を０．１μｇ／ｍｌの最終濃度となるよう培地に添加した。３日後、培地を、１０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ（Sigma）を添加したＤＭＥＭ（Gibco）と交換した。フラスコを８，０００ｒｐｍにて６０分間遠心分離してミクロセルを回収した。ミクロセルを８μｍ、５μｍ及び３μｍフィルター（Costar）を通して精製し、その後ＤＭＥＭ培地に再懸濁させた。以下に記載するように、ミクロセルをウシ線維芽細胞との融合に使用した。
【０２１８】
ウシ胎仔線維芽細胞を、１０％ＦＢＳ（Gibco）を添加したαＭＥＭ（Gibco）培地で３７℃及び５％ＣＯ２にて培養した。線維芽細胞をＴ１７５フラスコで増殖させた。密集度が７０〜８０％に到達したら、０．０５％トリプシンで細胞をフラスコから分離した。線維芽細胞をＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、その後ミクロセル懸濁液の上に積層した。ミクロセル−線維芽細胞懸濁液を１，５００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、ＰＥＧ１５００（Roche）を製造元のプロトコールに従ってペレットに添加して、ミクロセルをウシ線維芽細胞と融合させた。融合後、融合細胞を６つの２４ウエルプレートに播き、１０％ＦＢＳを添加したαＭＥＭ培地中で２４時間培養した。次いで、培地を、０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地と交換した。Ｇ４１８抗生物質の存在下での約２週間の増殖後、Ｇ４１８耐性の融合細胞を選択した。これらのＧ４１８耐性クローンを、本明細書に記載したクロマチン移植に使用した。
【実施例１１】
【０２１９】
在胎１８０日目のＨＡＣ／ＩｇμＡＹ−／−／ＩｇμＵ−／−胎仔におけるヒトＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇλの発現
ＨＡＣ／ＩｇμＡＹ−／−／ＩｇμＵ−／−胎仔が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、Ｉｇλ及びＩｇκ等のヒト免疫グロブリンを発現できるか否かを検証するため、在胎１８０日のＨＡＣ／ＩｇμＡＹ−／−／ＩｇμＵ−／−胎仔を回収した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（QIAGEN）を用いて総ＲＮＡを脾臓から抽出した。１マイクロリットルの総ＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡ合成（ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ第１鎖合成系, Invitrogen）、その後ＲＴ−ＰＣＲに供した。ヒトＩｇＭ発現を検出するため、以下のプライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行った；すなわち、5'-AGGCCAGCATCTGCGAGGAT-3'（ＣＨ３−Ｆ３；配列番号６４）及び5'-GTGGCAGCAAGTAGACATCG-3'（ＣＨ４−Ｒ２；配列番号６５）。ヒトＩｇＧ発現のために、プライマー5'-CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3'（配列番号６６）、5'-CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGG-3'（配列番号６７）、5'-GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3'（配列番号６８）、5'-CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG-3'（配列番号６９）、5'-GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3'、5'-CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3'（配列番号７０）、及び5'-CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3'（配列番号７１）（ＶＨ  Ａｌｌ  Ｍｉｘ）を、5'-CACCACGCTGCTGAGGGAGTAGAGT-3'（ｈＣｇ１Ｒ２；配列番号７２）と組み合わせて使用した。ヒトＩｇλ発現のために、以下のプライマー対を使用した：すなわち、5'-TCCTCTGAGGAGCTTCAAGC-3'（ｈＣＬ−Ｆ２；配列番号７３）及び5'-AGGGTTTATTGAGTGCAGGG-3'（ｈＣＬ−Ｒ２；配列番号７４）。ＰＣＲ反応混合物は、３２．５μｌの水、５μｌの１０ＸＥｘ  Ｔａｑバッファー（TAKARA）、８μｌのｄＮＴＰ混合物、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、２μｌの第１鎖ｃＤＮＡ、及び０．５μｌのＥｘ  Ｔａｑ（TAKARA）を含んでいた。反応混合物を以下の条件下でインキュベートすることにより３５サイクルのＰＣＲを行った：すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、６０〜６２℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分間。ＰＣＲ後、反応混合物を電気泳動により分析した。λＨＡＣ／ＩｇμＡＹ−／−／ＩｇμＵ−／−胎仔から、ＲＴ−ＰＣＲによりヒトＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇλ発現が検出された。
【０２２０】
ヒト免疫グロブリンの細胞表面発現をタンパク質レベルで確認するため、フローサイトメトリー分析も上述したように行った。ヤギ抗ヒトＩｇＭ−ＦＩＴＣ（Bethyl Laboratories, Mongomery, TX）、ヤギ抗ヒトＩｇＭ−ＦＩＴＣ（Serotec Inc., Raleigh, NC）、又はヤギ抗ヒトＩｇＭ−ＰＥ（Serotec Inc., Raleigh, NC）抗体を使用して、１８０日以上のＨＡＣ胎仔の末梢血Ｂ細胞上で発現するヒトｓＩｇＭを標識化した。Ｂ細胞上で発現した軽鎖を検出するため、ヤギ抗ヒトλ−ＦＩＴＣ抗体（Bethyl Laboratories）又はヤギ抗ヒトλ−ＰＥ抗体（Serotec Inc）を使用した。二色分析のため、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＭ抗体及びＰＥ標識軽鎖抗体の組合せを使用した。抗ヒトＩｇＭ及び軽鎖抗体で陽性であった細胞集合を検出した。さらに、サンドウィッチＥＬＩＳＡ分析を行い、アフィニティ精製した捕捉抗体及び適切なＨＲＰ酵素標識検出抗体を用いて、λＨＡＣ／ＩｇμＡＹ−／−／ＩｇμＵ−／−仔ウシにおいて分泌ヒトＩｇＧを検出した。各アッセイについての捕捉抗体及び検出抗体の詳細は、以下の表６に示す。
【表６】
2007533328.tif 000007
【０２２１】
コーティングバッファー（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム，ｐＨ９．６）に希釈した捕捉抗体を、室温にて１．５時間インキュベートすることによりマイクロタイタープレート（Nunc ImmunoMaxiSorp Elisaプレート）をコーティングした。捕捉抗体をコーティングした後、自動プレート洗浄器を用いてプレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ２０バッファーで３〜５回洗浄した。標準曲線を用いた定量化のために適切な標準（較正）を段階希釈で添加した。陽性コントロール及び陰性コントロールをＱＣチェックのために全てのアッセイに含めた。次いで、λＨＡＣ／ＩｇμＡＹ−／−／ＩｇμＵ−／−仔ウシ由来の血清サンプルを二重のウエルに４回の段階希釈で添加し、室温にて１時間インキュベートした。血清免疫グロブリンを捕捉した後、自動プレート洗浄器を用いてプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎバッファーで再度３〜５回洗浄した。適切なＨＲＰ酵素標識された検出抗体を全てのウエルに添加し、室温にて１時間インキュベートした。インキュベーション終了後、自動プレート洗浄器を用いてプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファーで再度３〜５回洗浄した。ＴＭＢ基質溶液（KPL Inc, Gaithersburg, MA）を添加し、室温にて１０〜２０分間インキュベートすることにより結合した抗体を検出した。１０％リン酸を添加して反応を止めた。次いで、プレートをマイクロタイタープレートリーダー上でＫＣ４ソフトウェアを用いて読み取った。データをＫＣ４ソフトウェアにより分析し、４パラメーター標準曲線上の補間により値を決定した。出生後１４日目に回収した血液サンプルでは、７．１μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧがＥＬＩＳＡにより検出された。
【０２２２】
他の実施形態
本明細書で引用した全ての文献及び特許は、個々の文献又は特許を具体的かつ個々に参照により組み入れられると記載するのと同等に参照により本明細書に組み入れられる。本発明を、明確に理解してもらうために例示及び実施例によりある程度詳細に説明したが、本発明の教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の思想又は範囲から逸脱することなくそれに対して特定の変更及び改変を行うことができることは当業者であれば容易に理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】図１は、ウシ一次線維芽細胞における逐次的遺伝子ターゲティングを説明する概略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、＃６９３９におけるＩｇμＵ定常領域遺伝子座の構造、第１ラウンドのターゲティングに用いられるｐｕｒｏベクター、及びターゲティング事象に用いられるゲノムＰＣＲアッセイを表す概略図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｐｕｒｏＦ２×ｐｕｒｏＲ２プライマーを用いたゲノムＰＣＲによるＩｇμＵ−／＋胎仔の同定を表す写真である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ｐｕｒｏＦ２×ｐｕｒｏＲ２プライマーを用いたゲノムＰＣＲによるＩｇμＵ−／＋仔ウシの遺伝子型決定を表す写真である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＩｇμＵ−／＋＃３２８７アレルの構造、第２アレルのターゲティングに用いられるｎｅｏベクター、及びターゲティング事象のためのゲノムＰＣＲアッセイを説明する概略図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｐｕｒｏＦ２×ｐｕｒｏＲ２、ｎｅｏＦ３×ｎｅｏＲ３、及びＢＣμｆ×ＢＣμｒプライマーを用いたゲノムＰＣＲによるＩｇμＵ−／−胎仔及び線維芽細胞の同定を示す一連の写真である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、９０日目の胎仔における脾臓から抽出したｍＲＮＡにおけるＩｇμＵ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す写真である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ｐｕｒｏＦ２×ｐｕｒｏＲ２、ｎｅｏＦ３×ｎｅｏＲ３及びＢＣμｆ×ＢＣμｒプライマーを用いたゲノムＰＣＲによるＩｇμＵ−／−仔ウシの遺伝子型決定を示す一連の写真である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＩｇμＵ−／−＃４６５８アレルの構造、及び選択マーカー遺伝子のＣｒｅ−ｌｏｘＰ媒介除去についてのゲノムＰＣＲアッセイを説明する概略図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＣｒｅＥｘＦ×ＣｒｅＥｘＲプライマーを用いたゲノムＰＣＲによるＣｒｅ／ＩｇμＵ−／−胎仔及び線維芽細胞の同定を示す写真である。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｃｒｅ／ＩｇμＵ−／−＃１４０４細胞系におけるＰｒＰ遺伝子座の構造、ＰｒＰ遺伝子のためのターゲティングベクター、及びターゲティング事象のためのゲノムＰＣＲアッセイを説明する概略図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、陽性ＰｒＰプライマー対であるｎｅｏＦ７×ｎｅｏＲ７及び陰性ＩｇμＵプライマー対であるＢＣμｆ×ＢＣμｒを用いたゲノムＰＣＲによる、三重ターゲティング胎仔及び線維芽細胞系（ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／＋）の同定を示す一連の写真である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／＋＃８４４３アレルの構造、第２アレルのターゲティングに用いられるｐｕｒｏベクター、及びターゲティング事象のためのゲノムＰＣＲアッセイを説明する概略図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ｐｕｒｏＦ１４×ｐｕｒｏＲ１４、ｎｅｏＦ７×ｎｅｏＲ７及びＢＰｒＰｅｘ３Ｆ×ＢＰｒＰｅｘ３Ｒプライマーを用いたゲノムＰＣＲによる、ホモ接合性二重ＫＯ（ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／−）胎仔及び線維芽細胞の同定を示す一連の写真である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ホモ接合性二重ＫＯ（ＩｇμＵ−／−／ＰｒＰ−／−）胎仔に対するＲＴ−ＰＣＲ分析を示す写真である。
【図７−１】図７は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６３６３７のポリヌクレオチド配列を示す。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図８−１】図８は、Bos taurus  ＩｇμＵ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６３６３７２．２）のポリヌクレオチド配列を示す。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図９】図９は、Bos taurus  ＩｇμＡＹ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２２１０９９）の部分ポリヌクレオチド配列を示す。
【図１０】図１０は、ＩｇμＡＹがＩｇμＵ−／−細胞におけるＰＣＲにより検出されうることを示す概略図である。
【図１１】図１１は、ＩｇμＡＹ及びＩｇμＵの両方がＶＤＪ再配列を受けて発現されることを示す配列のトレースの図である。
【図１２】図１２は、ＩｇμＡＹのゲノム構成を示す概略図である。
【図１３】図１３は、ＩｇμＡＹのＡＹアレル及びａｙアレルの配列を示す。
【図１４】図１４は、ＡＹ  ＫＯベクター及びａｙ  ＫＯベクターを示す概略図である。
【図１５】図１５は、同時に出生したＰｒＰ＋／＋仔ウシ、ＰｒＰ−／＋（３４１）仔ウシ、ＰｒＰ−／−（３４２）仔ウシを示す。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜Ｄは、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２の遺伝子型決定を示す。図１６Ａは、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２の耳生検から樹立された線維芽細胞系を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ゲノムＰＣＲによる耳生検線維芽細胞におけるＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−遺伝子型の確証を示す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシにおけるＰｒＰ野生型由来のアレルの不在を示す。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、ＢＣμｆ×ＢＣμｒプライマーを用いて、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシにおけるＩｇμＵ野生型に由来するアレルのさらなる不在を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａ及び１７Ｂは、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２におけるＰｒＰ遺伝子の機能的不活性化を示す。図１７Ａは、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２由来の線維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現の破壊を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＰｒＰ−／−ＩｇμＵ−／−仔ウシ３４２の線維芽細胞におけるＰｒＰタンパク質の不在を示す。
【図１８】図１８は、ＰｒＰ−／−仔ウシの脳幹におけるＰｒＰタンパク質の不在を示す。
【図１９】図１９は、異なるＰｒＰ−／−線維芽細胞系からクローニングされた例であるＰｒＰ−／−仔ウシ３５２の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）におけるＰｒＰタンパク質の不在を示す。
【図１】
2007533328.tif 000008
【図２Ａ】
2007533328.tif 000009
【図２Ｂ】
2007533328.tif 000010
【図２Ｃ】
2007533328.tif 000011
【図３Ａ】
2007533328.tif 000012
【図３Ｂ】
2007533328.tif 000013
【図３Ｃ】
2007533328.tif 000014
【図３Ｄ】
2007533328.tif 000015
【図４Ａ】
2007533328.tif 000016
【図４Ｂ】
2007533328.tif 000017
【図５Ａ】
2007533328.tif 000018
【図５Ｂ】
2007533328.tif 000019
【図６Ａ】
2007533328.tif 000020
【図６Ｂ】
2007533328.tif 000021
【図６Ｃ】
2007533328.tif 000022
【図７−１】
2007533328.tif 000023
【図７−２】
2007533328.tif 000024
【図８−１】
2007533328.tif 000025
【図８−２】
2007533328.tif 000026
【図９】
2007533328.tif 000027
【図１０】
2007533328.tif 000028
【図１１】
2007533328.tif 000029
【図１２】
2007533328.tif 000030
【図１３】
2007533328.tif 000031
【図１４】
2007533328.tif 000032
【図１５】
2007533328.tif 000033
【図１６Ａ】
2007533328.tif 000034
【図１６Ｂ】
2007533328.tif 000035
【図１６Ｃ】
2007533328.tif 000036
【図１６Ｄ】
2007533328.tif 000037
【図１７Ａ】
2007533328.tif 000038
【図１７Ｂ】
2007533328.tif 000039
【図１８】
2007533328.tif 000040
【図１９】
2007533328.tif 000041
【国際調査報告】
2007533328.tif 000042
2007533328.tif 000043
2007533328.tif 000044
2007533328.tif 000045