(57)【要約】例えば、細胞ベースのアッセイにおいて、ＩＧＦアンタゴニストとして有用な、そしてファージディスプレイにより同定される、他の分子（例えば、野生型ＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦアゴニストのペプチド）上のＩＧＦ−Ｉ結合部位およびＩＧＦ−ＩＩ結合部位のマッピングの際に有用な、ＩＧＦＢＰ−３融合タンパク質が提供される。このような融合タンパク質を作製するための方法もまた提供される。一つの実施形態において、この融合タンパク質は、ファージ上にディスプレイされる。
2007537711.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、該融合タンパク質は、配列番号１０に連結されている、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１）の残基４７〜残基９９からなる、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）のフラグメントを含む、融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の融合タンパク質であって、ファージ上にあらわにされた、融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の融合タンパク質であって、ここで、前記フラグメントは、切断可能な連結ペプチドを介して配列番号１０に連結されている、融合タンパク質。
【請求項４】
請求項３に記載の融合タンパク質であって、ここで、前記連結ペプチドが、配列ＤＬＶＤ（配列番号２）、ＤＥＭＤ（配列番号３）、ＤＡＶＤ（配列番号４）、ＥＦＧＧＤＤＤＫ（配列番号５）、ＥＦＧＧＬＶＰＲＧＳ（配列番号６）、ＥＦＧＧＤＬＶＤ（配列番号７）、ＥＦＧＧＤＥＭＤ（配列番号８）またはＥＦＧＧＤＡＶＤ（配列番号９）を含む、融合タンパク質。
【請求項５】
請求項３に記載の融合タンパク質であって、ここで、前記連結ペプチドが、ＥＦＧＧＤＬＶＤ（配列番号７）である、融合タンパク質。
【請求項６】
請求項３に記載の融合タンパク質であって、ここで、前記配列番号１０のＮ末端が、配列ＡＳＡである、融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１に記載の融合タンパク質であって、ここで、前記フラグメントが、アフィニティーマチュレーションされた、融合タンパク質。
【請求項８】
前記請求項１に記載の融合タンパク質を、キャリア中に含有する、組成物。
【請求項９】
前記請求項１に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項１０】
前記請求項９に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１１】
前記請求項９に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１２】
ＩＧＦＢＰ−３融合タンパク質を生み出す方法であって、該方法は、前記請求項１１の宿主細胞を、該融合タンパク質を発現させるのに適切な条件下で培養する工程、および該融合タンパク質を、該宿主細胞培養物から回収する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記宿主細胞が、原核細胞である、方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記宿主細胞が、細菌である、方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、方法。
【請求項１６】
ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３の生物学的活性、ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉの生物学的活性、もしくはネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩＩの生物学的活性、または該ＩＧＦ−Ｉもしくは該ＩＧＦ−ＩＩのアゴニストの生物学的活性を細胞ベースのアッセイにおいて決定し、そしてネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３、ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉ、またはネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩＩ、または該ＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩのアゴニストに寄与し得る生物学的活性が観察されるかを決定するための方法であって、該アッセイは、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３ではなく、ＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩに結合するＩＧＦＢＰ−３フラグメントに連結したペプチドを含む融合タンパク質と細胞とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記融合タンパク質のペプチドが、配列番号１０である、方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦＢＰ−３フラグメントが、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１）の残基４７〜残基９９のフラグメントである、方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記生物学的活性が、ＩＧＦ−Ｉとは無関係なネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３のアポトーシスである、方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記方法は、ＩＧＦ−依存的なＫＩＲＡリン酸化方法である、方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記生物学的活性が、放射標識したＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの前記細胞への結合の阻害である、方法。
【請求項２２】
アポトーシスの増強を決定するための方法であって、該方法は、乳癌細胞をアポトーシス因子で処理する前に少なくとも約２４時間、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩに結合する、ＩＧＦＢＰ−３フラグメントまたはその融合タンパク質、およびネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３もしくは該ＩＧＦＢＰ−３フラグメントもしくは融合タンパク質で乳癌細胞を前処理する工程、および該前処理または処理が、該アポトーシス因子を用いた処理により誘導されるアポトーシスを増強するか、あるいは該量の前処理または処理がその目的に対して有効であるかを決定する工程、を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記アポトーシス因子が、デキソルビシンまたはパクリタキセルである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国特許法施行規則１．５３（ｂ）（１）のもとに出願された非仮出願であり、米国特許法１１９（ｅ）のもとで、２００３年１０月３日に出願された仮出願番号６０／５０８，３４５に対して優先権を主張し、この内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＩＧＦＢＰ−３の最小の機能的領域を決定するのに有用で、かつ、ＩＧＦ−Ｉ活性もしくはＩＧＦ−ＩＩ活性をアンタゴナイズするのに有用な分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術および関連技術の説明）
インスリン様増殖因子Ｉおよびインスリン様増殖因子ＩＩ（それぞれ、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）は、複数の効果（このような効果としては、細胞増殖、細胞分化、細胞死の阻害、およびインスリン様活性が挙げられる）をインビボで媒介する（非特許文献１；非特許文献２に概説されている）。これらのマイトジェンの応答および代謝応答のほとんどは、ＩＧＦ−Ｉレセプターであるα２β２−ヘテロテトラマー（これは、インスリンレセプターに密接に関連している）の活性化により開始される（非特許文献３；非特許文献４）。このＩＧＦ−Ｉレセプターおよびインスリンレセプターは、その特異的リガンドにナノモルの親和性で結合する。ＩＧＦ−Ｉおよびインスリンは、親和性が１０００分の１〜１００分の１であるにも関わらず、各々の非同系レセプターと交差反応し得る（非特許文献２（前出））。ＩＧＦ−Ｉレセプターの細胞外部分の一部を記載する結晶構造が報告されている（非特許文献５）。
【０００４】
インスリンとは異なり、ＩＧＦ−Ｉの活性および半減期は、６種のＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ  １−６）により調節され、そしておそらく、さらに遠縁のクラスのタンパク質によりさらに調節される（非特許文献２（前出）；非特許文献６）。ＩＧＦＢＰは、これらが可溶性であるかまたは細胞膜結合型であるかに依存して、ＩＧＦ活性を阻害するかまたは増強するかのいずれかをなし得る（非特許文献７）。このＩＧＦＢＰは、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを結合し、その親和性および特異性は、様々である（非特許文献２（前出）；非特許文献７（前出））。例えば、ＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを同程度の親和性で結合し、その一方で、ＩＧＦＢＰ−２およびＩＧＦＢＰ−６は、ＩＧＦ−ＩＩを、これらがＩＧＦ−Ｉを結合するよりはるかに高い親和性で結合する（非特許文献７（前出）；非特許文献８）。特許文献１は、さらなるヒト分泌型ＩＧＦＢＰ様ポリペプチドを開示し、そのヒト分泌型ＩＧＦＢＰ様ポリペプチドは、副腎のｍＲＮＡおよび胸腺のｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーより単離される核酸配列によりコードされている。
【０００５】
構造的には、ＩＧＦ−Ｉは、一本鎖の、７０アミノ酸タンパク質であり、これは、プロインスリンと高い相同性を有する。インスリンスーパーファミリーの他のメンバーとは異なり、ＩＧＦのＣ領域は、翻訳後にタンパク分解性に除去されない。ＩＧＦ−Ｉの溶液ＮＭＲ構造（非特許文献９；非特許文献１０）、ミニ−ＩＧＦ−Ｉ（Ｃ−鎖を欠く、遺伝子操作された改変体；非特許文献１１）およびＩＧＦ−ＩＩ（非特許文献１２；非特許文献１３）が報告されている。ＩＧＦ−Ｉ上の特有のエピトープが、レセプターおよび結合タンパク質を結合するために使用されることが、一般に容認されている。レセプター不活性ＩＧＦ変異体が内因性ＩＧＦ−Ｉを結合タンパク質から置換し得、これによって、純ＩＧＦ−Ｉ効果をインビボで生成し得ることが、動物モデルで実証されている（非特許文献１４；非特許文献１５；特許文献２および特許文献３）。残基Ｙ２４、Ｙ２９、Ｙ３１およびＹ６０が、レセプターの結合に関与するが、そのＩＧＦ変異体は、さらにＩＧＦＢＰに結合する（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１５（前出））。
【０００６】
さらに、設計された改変体（１−２７、ｇｌｙ４、３８−７０）−ｈＩＧＦ−Ｉ（ここで、ヒトＩＧＦ−ＩのＣ領域の残基２８−残基３７は、４残基のグリシンブリッジにより置換される）は、ＩＧＦＢＰのレセプターに結合するが、ＩＧＦのレセプターには結合しないことが発見されている（非特許文献１９）。
【０００７】
突然変異誘発の規模の研究は、ＩＧＦ−Ｉ上のＩＧＦＢＰ−結合エピトープの特徴づけに取り組んでいる（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２；非特許文献２４；非特許文献８（前出））。要約すれば、Ｎ末端残基３およびＮ末端残基４、ならびに、残基８〜残基１７を含むヘリカル領域が、ＩＧＦＢＰに結合するために重要であると見出された。さらに、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２およびＩＧＦＢＰ−５に結合する残基４９〜残基５１に関するエピトープが同定されている（非特許文献２（前出））。さらに、最初の３つのＮ末端アミノ酸を欠く天然に存在する短縮型形態のＩＧＦ−Ｉ（ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉと呼ばれる）は、２５分の１の親和性でＩＧＦＢＰ−３を結合することが実証された（非特許文献２５；特許文献４；特許文献５；および特許文献６）。
【０００８】
Ｎ末端のへリックスにおける露出されたアミノ酸残基の結合の寄与を特徴付けようとして、数個のＩＧＦ−Ｉアラニン変異体が構築された（非特許文献２６）。しかし、これらの変異体タンパク質の円偏光二色性スペクトルは、野生型ＩＧＦ−Ｉと比して、構造的な変化を示し、ＩＧＦＢＰ−結合の寄与を上記変異した側鎖が明らかに原因にする。異なるアプローチが非常に最近の研究でとられ、その最近の研究では、ＩＧＦ−Ｉ上のＩＧＦＢＰ−１結合エピトープは、ヘテロ核ＮＭＲスペクトル分光学により確認された（非特許文献２７）。著者らは、ＩＧＦＢＰ−１への結合に機能的に関与する、残基Ｒ３６、残基Ｒ３７、および残基Ｒ５０をさらに同定した。
【０００９】
他のＩＧＦ−Ｉ改変体が開示されている。例えば、特許文献の特許文献７は、真正のＩＧＦ−Ｉの残基１〜残基６９を有する短縮型改変体を記載する。特許文献８は、省略されたＣドメインを有する、天然に存在する一本鎖ＩＧＦ−Ｉの誘導体である２本鎖ＩＧＦ−Ｉスーパーアゴニストを開示する。このＩＧＦ−Ｉアナログは、式：ＢＣｎ、Ａ（ここで、Ｂは、ＩＧＦ−ＩのＢドメインであるか、またはその機能的なアナログであり、Ｃは、ＩＧＦ−ＩのＣドメインであるかまたはその機能的アナログであり、ｎは、Ｃドメインにおけるアミノ酸の数であり、約６〜約１２であり、そしてＡは、ＩＧＦ−ＩのＡドメインまたはその機能的アナログである）である。
【００１０】
さらに、非特許文献２７は、ＩＧＦ−Ｉの４種の変異体を開示し、これらのうちの３つは、１型ＩＧＦレセプターに対する親和性が低減している。これらの変異体は、（Ｐｈｅ２３、Ｐｈｅ２４、Ｔｙｒ２５）ＩＧＦ−Ｉである（これは、１型および２型のＩＧＦレセプターおよびインスリンレセプターに対する効力が、ヒトＩＧＦ−１と等しい）、（Ｌｅｕ２４）ＩＧＦ−Ｉおよび（Ｓｅｒ２４）ＩＧＦ−Ｉ（これは、ヒトの胎盤の１型ＩＧＦレセプターまたは胎盤のインスリンレセプターならびにラットおよびマウスの細胞の１型ＩＧＦレセプターに対するＩＧＦ−Ｉよりも親和性が低い）、ならびにデスオクタペプチド（Ｌｅｕ２４）ＩＧＦ−Ｉ（これにおいて、位置２４の芳香族性の損失が、ｈＩＧＦ−Ｉのカルボキシ末端のＤ領域の欠失と組み合わされ、これは、１型レセプターについて、（Ｌｅｕ２４）ＩＧＦ−Ｉよりも低い親和性を有し、そしてインスリンレセプターについて、（Ｌｅｕ２４）ＩＧＦ−Ｉよりも高い親和性を有する）。これら４種の変異体は、ヒト血清結合タンパク質に対して正常な親和性を有する。
【００１１】
非特許文献２９は、ＩＧＦ−Ｉの３つの構造アナログ（（１−６２）ＩＧＦ−Ｉ（これは、ＩＧＦ−Ｉのカルボキシ末端の８アミノ酸Ｄ領域を欠く）、（１−２７、Ｇｌｙ４、３８−７０）ＩＧＦ−Ｉ（これにおいては、ＩＧＦ−ＩのＣ領域の残基２８−残基３７が、４残基グリシンブリッジにより置き換えられている）および（１−２７、Ｇｌｙ４、３８−６２）ＩＧＦ−Ｉ（Ｃ領域にグリシンの置換を有し、そしてＤ領域に欠失を有する）を開示する。非特許文献２９は、非特許文献１７の上記Ｇｌｙ４変異体を用いて、データを開示する。特許文献９は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−Ｉの活性濃度を増加させる化合物を使用して、神経損傷を処置することに言及する。
【００１２】
非特許文献３１は、ＩＧＦ−Ｉの３つのアナログを開示し、このアナログでは、ＩＧＦ−ＩのＡ領域の特定の残基が、インスリンのＡ鎖における、対応する残基で置き換えられる。これらのアナログは、（Ｉｌｅ４１、Ｇｌｕ４５、Ｇｌｎ４６、Ｔｈｒ４９、Ｓｅｒ５０、Ｉｌｅ５１、Ｓｅｒ５３、Ｔｙｒ５５、Ｇｌｎ５６）ＩＧＦ−Ｉ（残基４１がスレオニンからイソロイシンへと変更されており、そしてＡ領域の残基４２〜残基５６が置換されているＡ鎖変異体）；（Ｔｈｒ４９、Ｓｅｒ５０、Ｉｌｅ５１）ＩＧＦ−１；ならびに（Ｔｙｒ５５、Ｇｌｎ５６）ＩＧＦ−Ｉである。
【００１３】
非特許文献３２は、種々のＩＧＦおよびインスリン改変体のＩＧＦＢＰ、ＩＧＦレセプター、およびインスリンレセプターへの結合の結合親和性を記載する。
【００１４】
ＩＧＦＢＰは、培養物中の細胞により分泌され、そしてＩＧＦ−刺激された機能を阻害または増強するかのいずれかである（非特許文献３３）。ＩＧＦＢＰの公知の形態としては、ＩＧＦＢＰ−１が挙げられ、これは、ヒトにおいては、約３０ｋＤａ〜約４０ｋＤａの分子量を有する。例えば、特許文献１０（１９９０年１０月公開、ＩＧＦＢＰ−１およびＩＧＦＢＰ−２のｃＤＮＡ配列およびクローニングベクターに関する）；特許文献１１（１９８９年９月２１日公開、ＩＧＦＢＰ−１のアミノ酸配列に関する）；および特許文献１２（１９８９年１０月５日公開、ＩＧＦＢＰ−１のｃＤＮＡ配列およびＩＧＦＢＰ−１の発現の方法に関する））を参照のこと。
【００１５】
ＩＧＦＢＰ−２は、約３３−３６ｋＤａの分子量を有する。例えば、非特許文献３４（ＩＧＦＢＰ−２のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列に関する）を参照のこと。
【００１６】
ＩＧＦＢＰ−３は、約２８ｋＤａの非グリコシル化分子量を有する。例えば、非特許文献３５（ヒト血清より精製された、５３ｋＤａのグリコシル化されたＩＧＦＢＰ−３のサブユニットに関する）；非特許文献３６（ＩＧＦＢＰ−３の全長アミノ酸配列および哺乳動物組織培養物細胞における、クローン化されたＩＧＦＢＰ−３  ＣＤＮＡの細胞性発現に関する）；特許文献１３（１９９０年１月２５日公開、ヒトの血漿からＩＧＦＢＰ複合体の酸不安定性サブユニット（ＡＬＳ）の単離およびこのＩＧＦＢＰ−３のサブユニットに関するＡＬＳについての特定のアミノ酸配列に関する）；および非特許文献３７（２種の異なる骨芽細胞株上に対する、全長ＩＧＦＢＰ−３および短縮型ＩＧＦＢＰ−３の影響に関する）を参照のこと。
【００１７】
最初のうちは、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、およびＩＧＦＢＰ−６に対する命名における矛盾が、いくつか存在したが、１９９１年に第二回国際ＩＧＦシンポジウムの参加者が認知されたＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５およびＩＧＦＢＰ−６の命名について同意した。一般に認められた専門用語を用いて、非特許文献３８は、ヒトの骨肉種細胞により調製された培地から単離されたＩＧＦＢＰ−４のＮ末端アミノ酸配列に関し、そして非特許文献３９は、ラットおよびヒト由来のＩＧＦＢＰ−４をコードするＩＧＦＢＰのｃＤＮＡに関する。特許文献１４（１９９２年３月５日公開）は、ＩＧＦＢＰ−４（その文献中では、もともとＩＧＦＢＰ−５として表記されている）に関し；そして特許文献１５（１９９２年３月５日公開）は、ＩＧＦＢＰ−４（その文献中では、もともとＩＧＦＢＰ−５と表記されている）をコードする遺伝性物質に関する。
【００１８】
１９９２年７月２３日に公開された特許文献１６は、ＩＧＦＢＰ−５（これは、もともと、その文献中では、ＩＧＦＢＰ−６として表記された）に関する。非特許文献４０は、（Ｕ−２−細胞条件培地から、アフィニティー精製されたＩＧＦＢＰの混合物のＩＧＦに対する細胞性作用の調節に関する。１９９２年３月５日に公開された特許文献１７は、ＩＧＦＢＰ−６（これは、もともと、その文献中ではＩＧＦＢＰ−４として表記されている）をコードする遺伝性物質に関し；そして１９９２年３月５日に公開された特許文献１８は、ＩＧＦＢＰ−６（これは、もともと、その文献中ではＩＧＦＢＰ−４として表記されている）に関する。特許文献１９および特許文献２０および特許文献２１もまた参照のこと。これらは、ＩＧＦＢＰ−６およびそのフラグメントを開示する。
【００１９】
非特許文献４１は、４種のＩＧＦＢＰ（ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、短縮形態のＩＧＦＢＰ−３、およびＩＧＦＢＰ−４）に関し、これらのＩＧＦＢＰは、成人ヒト血清から、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）のアフィニティークロマトグラフィーおよび高性能液体クロマトグラフィーにより単離される。非特許文献４２は、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５およびＩＧＦＢＰ−６のアミノ末端アミノ酸を論じている。
【００２０】
単独で投与された場合（すなわち、ＩＧＦなしで投与された場合）、上記ＩＧＦＢＰはまた、ＩＧＦの副作用（例えば、ＩＧＦが過剰に産生された場合に生ずる副作用（例えば、特定の癌細胞（例えば、ホルモン産生癌細胞（例えば、乳癌細胞または腎臓癌細胞））により分泌される遊離のＩＧＦ））をブロックするのに治療上有用であり得る。さらに最近では、Ｕ−２ヒト骨肉種細胞がＩＧＦＢＰ−５およびＩＧＦＢＰ−６を分泌することが実証された（非特許文献４０（前出）；非特許文献４３；非特許文献４４）。Ｕ−２条件培地に由来する、アフィニティー精製されたＩＧＦ結合タンパク質は、ＩＧＦ−Ｉ刺激された有糸分裂誘発を明確に増強した（非特許文献４０、前出）が、これらの研究からはどのタンパク質がこの作用の原因であるのかが不明確であった。非特許文献３８は、ＩＧＦＢＰ−４（これは、ＴＥ−８９ヒト骨肉種細胞から精製された）が、ＩＧＦ−刺激骨芽細胞有糸分裂誘発を阻害することを実証した（非特許文献４５；また、非特許文献４６を参照のこと）。特許文献２２は、腫瘍の増殖を阻害するためのＩＧＦＢＰ−３の使用を開示する。特許文献２３は、癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法を開示し、この方法は、この細胞によるＩＧＦＢＰ−５の発現をアポトーシス誘導量まで増加させる工程を包含する。癌細胞を殺す方法、アポトーシスを誘導する薬剤に癌細胞を感作させる方法、および患者における癌を処置する方法もまた記載される。特許文献２４は、前立腺癌のリスクを予測する方法を開示し、そして２００１年８月３０日に公開された特許文献２５は、前立腺癌を、特にＩＧＦＢＰ（ＩＧＦＢＰ−３を含む）で処置する方法を開示する。特許文献２６および特許文献２７は、ＩＧＦＢＰ−３またはＩＧＦＢＰ−３の発現もしくは活性をアップレギュレートするＩＧＦＢＰ−３の調節因子を投与することにより、ｐ５３関連の腫瘍の増殖を阻害する方法を開示する。特許文献２８は、炎症性疾患（腫瘍の新脈管形成を包含する）を処置するためのＩＧＦＢＰ−６の使用を開示する。特許文献２９は、癌（前立腺癌を含む）を処置するための任意のＩＧＦＢＰ−３の使用を開示する。特許文献３０は、ラットの血清から単離された２種のＩＧＦＢＰ（一方は、癌を処置するのに有用なＩＧＦＢＰ−５として同定されている）を開示する。
【００２１】
しかし、疾患をスクリーニングするか、予防するか、または処置する際の、ＩＧＦとＩＧＦＢＰとの間の相互作用の利用は、特異的アンタゴニストの不在のために、制限されている。ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２アンタゴニストの、癌の処置における潜在的治療上の補助剤としての適用は、非特許文献４７により記載されている。その報告では、ＩＧＦ−１のＤ領域と一致するペプチドは、ＩＧＦ−１／２アンタゴニストとして使用するために合成された。このペプチドは、ＩＧＦ−１に対して、疑わしい阻害活性を示した。観測された阻害についての基本原理は、明らかではない。なぜなら、上記Ｄ領域は、ＩＧＦ−１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）結合においてではなく、インスリンレセプターに対するＩＧＦ−１結合において有意な役割を果たすからである（非特許文献４８；非特許文献４９；非特許文献５０）。ＩＧＦアンタゴニスト（この作用機序は、ＩＧＦ−１レセプター界面における相互作用の遮断を介する）はまた、インスリンレセプターにおけるインスリン作用を著しく変更し得、このことは、このようなアンタゴニストの短所である。
【００２２】
特定のＩＧＦ−１アンタゴニストはまた、特許文献３１により記載されており、これは、ＩＧＦＢＰおよびＩＧＦペプチドの一部を開示し、これらが、ＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰ（すなわち、少なくとも全長ＩＧＦＢＰと同程度の結合親和性でＩＧＦを結合する、ＩＧＦＢＰまたはこれらの修飾体の、単離されたＩＧＦ結合ドメイン）の結合を説明する。特許文献はまた、ＩＧＦのＩＧＦレセプターへの結合を低減し、そして／またはＩＧＦＢＰの結合ドメインへ結合するＩＧＦアンタゴニストを開示する。
【００２３】
さらに、特許文献３２は、薬学的組成物を開示し、この組成物は、ＩＧＦ−１レセプターアンタゴニストとして機能する小ペプチド（ｓｈｏｒｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む。薬学的組成物において使用されるペプチドは、２５未満のアミノ酸からなり、ＩＧＦ−１のＣ領域またはＤ領域の少なくとも一部を含み、そしてＩＧＦ−１レセプターのＩＧＦ−１誘導型自己リン酸化を阻害する。細胞増殖を阻害する方法および望ましくない細胞増殖（例えば、癌、再狭窄、および喘息）と関連する疾患に罹患している疑いのある個体またはこの疾患に罹患しやすい個体を処置する方法が開示される。
【００２４】
ＩＧＦおよびＩＧＦＢＰの構造を研究することが困難であるために、特異的なＩＧＦ−１アンタゴニストの生成が、少なくとも部分的に制限される。回析研究に適したＩＧＦ−１の結晶を得ることができないために、例えば、ブタのインスリンの結晶構造に基づくＩＧＦ構造の推定は、入手可能なＩＧＦ−１の最も重要な構造ロードマップであった（非特許文献５１）。また、非特許文献５２（これは、ＩＧＦの、三次構造、レセプター結合、および抗原性を開示する）を参照のこと。化学的に修飾され、そして変異されたＩＧＦ−１の研究に基づき、ＩＧＦ−１とインスリンとの間の多くの共通の残基が、ＩＧＦ−１Ｒインスリンレセプター接触部位の一部（特に、２３位〜２５位での芳香族残基）として同定されている。ＮＭＲおよび制限された分子動力学を用いて、ＩＧＦ−１の溶液構造は、最近報告された（非特許文献４８、前出）。生じた最小化構造は、改変されたＩＧＦ−１についての実験上の知見、およびインスリンの構造−活性研究からなされた推定に、よりよく一致することが示された。さらには、非特許文献５３は、ミニＩＧＦ−１の溶液構造を開示する。非特許文献５４は、１Ｈ−ＮＭＲおよびディスタンスジオメトリー法により決定されるＩＧＦ−１の三次元構造を開示する。非特許文献５５は、ヒトＩＧＦ−２の溶液構造、およびヒトＩＧＦ−２とレセプターとの関係、および結合タンパク質相互作用を開示する。非特許文献５６は、長（Ａｒｇ（３））ＩＧＦ−１の溶液構造およびバックボーン力学（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ）を開示する。
【００２５】
アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性のいずれかを有する、インスリンおよび／またはインスリン様増殖因子レセプターに結合し得るペプチド配列、ならびに種々のペプチドライブラリーから同定されたペプチド配列は、２００１年１０月４日に公開された特許文献３３において記載される。
【００２６】
２００３年５月１５日に公開された特許文献３４は、ＩＧＦ−１と、結合タンパク質、インスリンレセプター、およびＩＧＦレセプターとの相互作用をアンタゴナイズするペプチドを開示する。これらのＩＧＦアンタゴニストペプチドは、原因因子としてＩＧＦ−１が関与する障害（例えば、種々の癌）を処置するのに有用である。
【００２７】
古典的なＩＧＦＢＰに基づく構造的な情報に関して、ＩＧＦＢＰは、２２ｋＤａ〜３１ｋＤａの範囲の分子量を有し、そして保存されたアミノ末端ドメインまたは保存されたカルボキシ末端ドメインに、全部で１６−２０個のシステインを含む（非特許文献７、前出；非特許文献５７；非特許文献５８）。システインリッチな両領域をつなぐ中心ドメインは、非常に弱く保存されていて、そしてＩＧＦＢＰ特異的なプロテアーゼの切断部位を含む（非特許文献５９；非特許文献５７（前出）；非特許文献６０）。ＩＧＦＢＰのさらなる調節は、リン酸化およびグリコシル化により達成され得る（非特許文献７（前出）；非特許文献５７（前出））。ＩＧＦＢＰファミリーの任意のインタクトなメンバーにとって利用可能な高分解能構造はない。特許文献３５は、ＩＧＦＢＰ−５およびその改変体を開示する。特許文献３６および特許文献３７は、短縮型のＣ末端ＩＧＦＢＰ−５フラグメントを開示し、このフラグメントは、全長ＩＧＦＢＰ−５と比較して、ＩＧＦ−Ｉに対して親和性が低減している。特許文献３８は、Ｃ末端短縮化ＩＧＦＢＰ−５を用いて、骨形成を刺激する工程を開示する。これらの化合物は、骨細胞の増殖を刺激するために、骨障害を処置するために、またはマイトジェンの活性を刺激するために、使用され得る。
【００２８】
ＩＧＦ−結合活性を保持するＩＧＦＢＰ−５からの２種のＮ末端フラグメントのＮＭＲ構造が、最近報告され、ＩＧＦＢＰ−５の残基４０〜残基９２が、このタンパク質のＮ−末端ドメインのＩＧＦ結合部位を含むことを示した（非特許文献６１）。他の研究により、ＩＧＦＢＰ−３のＮ−末端フラグメント（残基１−残基８８、および残基１−残基９７）はまた、ＩＧＦを結合することが見出されている（非特許文献６２；非特許文献６３）。
【００２９】
特に、非特許文献６２は、ヒトＩＧＦＢＰ−３のアミノ末端（残基１−残基８８；Ｎ−８８）およびカルボキシ末端（残基１６５−２６４；Ｃ−１６５）の両ドメインを、カルボキシ末端ＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として、細菌中で合成した。溶液結合アッセイにより、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩへの結合を示したのはＣ−１６５だけだった。しかし、バイオセンサー分析により、全長ＩＧＦＢＰ−３と比較して親和性が低減しているにもかかわらず、Ｎ−８８およびＣ−１６５の両方が、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩへの結合を示した。カルボキシ末端フラグメント（Ｃ−１６５）のみが、ＩＧＦ−Ｉと酸不安定性サブユニット（ＡＬＳ）とのヘテロトリマー複合体を形成し得た。
【００３０】
非特許文献６３は、バイオセンサー分析を用いて、組み換えヒトＮ−末端（残基１−残基９７；Ｎ−９７）ＩＧＦＢＰ−３フラグメントおよび組み換えヒトＣ−末端（残基９８−残基２６４；Ｃ９８）ＩＧＦＢＰ−３フラグメントに対するＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの結合を測定し、それを、ＩＧＦとインタクトなＩＧＦＢＰ−３との結合と比較した。結合タンパク質もしくはフラグメントを固定化するか、またはＩＧＦを固定化するかのいずれかで、実験が行われた。これらの実験は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩが、４×１０−９Ｍ〜５×１０−９Ｍの親和性で、そして同程度の速度論で、ＩＧＦＢＰ−３に結合することを示した。ＩＧＦタンパク質に対するＮ−９７およびＣ−９８の両方の親和性は、全長ＩＧＦＢＰ−３の親和性よりも３桁低かった。
【００３１】
２００３年８月２８日に公開された特許文献３９および特許文献４０は、免疫不全によってではなく免疫刺激により特徴付けられる状態を処置するための、ＩＧＦ−Ｉを結合しないＩＧＦＢＰ−３のフラグメントを開示する。このペプチドは、ＩＧＦＢＰ−３のＣ末端のＣＤ７４ホモロジードメイン配列およびこの領域（独特の抗原性を有する）に局在化する活性を標的化する。この領域の配列に合わせて作製されたペプチドは、ＩＧＦＢＰ−３と多くの公知のリガンド（このようなリガンドとしては、ＲＸＲ−α、トランスフェリン、ＡＬＳ、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、およびプレカリクレインが挙げられる）との結合を妨害することが以前に示されている（非特許文献６４；非特許文献６５；非特許文献６６；非特許文献６７；非特許文献６８）。
【００３２】
ＩＧＦＢＰ−３由来の金属結合ドメインペプチドは、以前に開示されたＩＧＦＢＰ−３由来の分子（これは、ＩＧＦ−Ｉを結合し得ないこと、独特の抗原性、およびＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦＢＰ−３推定デスレセプター（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（Ｐ４．３３）相互作用ドメイン（いわゆる「中間領域（ｍｉｄ−ｒｅｇｉｏｎ）」、アミノ酸８８−１４８）が存在しないという点で）とは異なる。上記Ｐ４．３３の推定上のデスレセプターは、特許文献４１に記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＣ０３１２１７；ｇｉ；２１４１１４７７）。例えば、特許文献４２は、ＩＧＦＢＰ−３の点変異の使用を教える（ＩＧＦＢＰ−３の点変異では、ＩＧＦ−Ｉに対する結合が弱化されている）。しかし、記載された分子は、ＩＧＦＢＰ−３の中間領域を含み、そしてＰ４．３３推定レセプターと相互作用することにより、生物学的効果を発揮することが予想されている。特許文献４３は、疾患を処置するためのＰ４．３３調節因子の使用を教示する。上記金属結合ペプチドは、Ｐ４．３３推定相互作用ドメイン（ＩＧＦＢＰ−３の中間領域）を含まない。
【００３３】
特許文献４４、特許文献４５および特許文献４６は、加水分解に耐性であるように修飾されたＩＧＦＢＰ−３改変体を開示する。また、ネイティブなＩＧＦＢＰ−３における核局在化シグナル（ＮＬＳ）が変更された改変体ＩＧＦＢＰ−３も開示される。さらに、アミノ末端が伸張されたＩＧＦＢＰ−３が開示され、これとしては、種々のＮ−末端伸張（ペプチドおよびヌクレオチド結合ドメインを含む）、特定の結合メンバー（例えば、レセプターからのリガンド結合ドメインまたは免疫グロブリンからの抗原結合ドメイン）、ならびにペプチドホルモンおよびタンパク質ホルモンおよび増殖因子が挙げられる。Ｎ−末端伸張型ＩＧＦＢＰ−３は、加水分解耐性のＩＧＦＢＰ−３またはＮＬＳ改変体ＩＧＦＢＰ−３を包含し得る。
【００３４】
最近の刊行物のいくつかは、培養物中の細胞を処理するためのＩＧＦＢＰ−３ペプチドの使用を記載する。乳癌細胞に対して活性であることが見出されている唯一のペプチドは、ＩＧＦＢＰ−３の中間領域に由来する（非特許文献６９；非特許文献７０）。
【００３５】
２００３年３月２７日に公開された特許文献４７は、上記のＩＧＦ結合タンパク質由来のペプチド（ＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインから１２アミノ酸〜２２アミノ酸のみを含む小ペプチドを含む）が、全長分子の、コ−アポトーシス特性、細胞貫通特性、および金属を結合する特性を模倣し得ることを開示する。
【００３６】
特許文献４８は、ＩＧＦＢＰ−３の変異体を開示し、このＩＧＦＢＰ−３の変異体は、ＤＮＡ合成を阻害し得、アポトーシスを誘導し得、そしてヒトＩＧＦ−ＩにもヒトＩＧＦ−ＩＩにも結合せず、そしてＹ５７にて変異を含み得る。
【００３７】
特許文献４９は、Ｘ線回折に適した結晶（この結晶は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、またはＩＧＦＢＰ−５の少なくとも第９番目〜第１２番目のシステインまたはＩＧＦＢＰ−６の少なくとも第７番目〜第１０番目のシステインを含む、ＩＧＦＢＰ−１のアミノ酸３９−９１、ＩＧＦＢＰ−２のアミノ酸５５−１０７、ＩＧＦＢＰ−３のアミノ酸４７−９９、ＩＧＦＢＰ−４のアミノ酸３９−９１、ＩＧＦＶＰ−５のアミノ酸４０−９２もしくはＩＧＦＢＰ−６のアミノ酸４０−９２またはこれらのフラグメントとからなるポリペプチドとの複合体を含む）；このような結晶の原子上の座標の決定のための方法；ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対する結合親和性が増強されたＩＧＦＢＰ変異体、ならびにＩＧＦを結合タンパク質から置換する低分子を同定および最適化する方法を開示する。
【００３８】
特許文献５０は、ＩＧＦに対する結合がまったくないかまたは結合が低減した変異体ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドおよびこれらのフラグメントを開示し、ヒトＩＧＦＢＰ−３レセプター（「Ｐ４．３３」）に対して結合する能力を保持する。このフラグメントは、８７アミノ酸〜２６４アミノ酸を有するＮ欠失フラグメントである。フラグメント１−８７は、ＩＧＦ−Ｉにわずかに結合し、そして他のフラグメント（１−４６、１−７５および１−８０）は、まったく結合しない。
【００３９】
特許文献５１は、ＩＧＦ−ＩＧＦＢＰ結合の原因となるＩＧＦＢＰフラグメントを開示する。それは、ＩＧＦＢＰまたはこの修飾体の単離されたＩＧＦ結合ドメイン（これは、全長ＩＧＦＢＰと少なくとも同程度の結合親和性でＩＧＦを結合する）を提供する。それはまた、ＩＧＦレセプターに対するＩＧＦの結合を低減するＩＧＦアンタゴニストを提供する。それは、ＩＧＦＢＰ−２フラグメントに特に関連するが、またＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、およびＩＧＦＢＰ−６の単離されたＩＧＦ結合ドメインを提供する。ＩＧＦＢＰ−２のＩＧＦ結合ドメインに関し、他のＩＧＦＢＰのＩＧＦ結合ドメインを含むアミノ酸配列は、結合ドメインの結合親和性が比較上のネイティブ全長ＩＧＦＢＰの結合親和性とほぼ同一である限り、修飾された形態を含み得る。
【００４０】
特許文献５２は、ＩＧＦＢＰフラグメントおよびその使用（すなわち、そのアミノ酸配列部分において特徴づけられるペプチドは、ＩＧＦＢＰのアミノ酸配列と一致する）を開示する。本発明はまた、環状誘導体、グリコシル化誘導体、リン酸化誘導体、アセチル化誘導体、アミド化誘導体および／または硫酸化誘導体に関する。これらは、ＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインを含む。
【００４１】
遺伝子融合体（ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ）の使用（これは、必要不可欠ではない）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種ペプチドの発現およびその後の遺伝子産物の精製を促進し得る（Ｈａｒｒｉｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｒ．編（非特許文献７１；非特許文献７２；および非特許文献７３）。プロテインＡ融合体がしばしば使用される。なぜなら、プロテインＡのＩｇＧに対する結合、より具体的にはプロテインＡのＺドメインのＩｇＧに対する結合は、上記融合タンパク質の精製のための「親和性ハンドル（ａｆｆｎｉｔｙ  ｈａｎｄｌｅ）」を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉ内で直接的に発現された場合、多くの異種タンパク質が分解されるが、融合タンパク質として発現された場合には、安定であることもまた示されている（非特許文献７４）。
【００４２】
融合タンパク質は、メチオニンまたはヒドロキシルアミンにて切断し、Ａｓｎ残基とＧｌｙ残基との間を切断する化学薬品（例えば、臭化シアン）を用いて切断され得る。標準的な組み換えＤＮＡ方法論を用いて、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基対は、所望のペプチドをコードする遺伝子の５’末端の前に挿入され得る。
【００４３】
あるいは、融合タンパク質のタンパク質分解性の切断が使用され得る（非特許文献７５）。
【００４４】
エピトープをＩＧＦＢＰ−３または他のリガンドの上に結合させる工程を解明するために使用され得、治療上または診断上の用途のためにＩＧＦアンタゴニストとして作用して循環型ＩＧＦおよびレセプター応答のレベルを制御し、そして他の治療上、診断上、またはアッセイの目的で使用され得る分子が、当該分野においてずっと必要とされている。
【特許文献１】国際公開第０１／７５０６４号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６，１２１，４１６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，２５１，８６５号明細書
【特許文献４】米国特許第５，０７７，２７６号明細書
【特許文献５】米国特許第５，１６４，３７０号明細書
【特許文献６】米国特許第５，４７０，８２８号明細書
【特許文献７】国際公開第９６／３３２１６号パンフレット
【特許文献８】欧州特許第７４２，２２８号明細書
【特許文献９】米国特許第５，７１４，４６０号明細書
【特許文献１０】国際公開第９７９２号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第８９／０８６６７号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第８９／０９２６８号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第９０／００５６９号パンフレット
【特許文献１４】国際公開第９２／０３４７１号パンフレット
【特許文献１５】国際公開第９２／０３４７０号パンフレット
【特許文献１６】国際公開第９２／１２２４３号パンフレット
【特許文献１７】国際公開第９２／０３４６９号パンフレット
【特許文献１８】国際公開第９２／０３１５２号パンフレット
【特許文献１９】米国特許出願公開第２００３／００８２７４４号明細書
【特許文献２０】米国特許第６，０２５，４６５号明細書
【特許文献２１】米国特許第５，２１２，０７４号明細書
【特許文献２２】国際公開第０３／０６８１６０号パンフレット
【特許文献２３】国際公開第０３／００６０２９号パンフレット
【特許文献２４】米国特許第６，４１０，３３５号明細書
【特許文献２５】米国特許出願公開第２００１／００１８１９０号明細書
【特許文献２６】米国特許第５，８４０，６７３号明細書
【特許文献２７】欧州特許第８７１，４７５号明細書
【特許文献２８】国際公開第００／３５４７３号パンフレット
【特許文献２９】国際公開第９４／２２４６６号パンフレット
【特許文献３０】国際公開第９２／１４８３４号パンフレット
【特許文献３１】国際公開第００／２３４６９号パンフレット
【特許文献３２】欧州特許第６３９９８１号明細書
【特許文献３３】国際公開第０１／７２７７１号パンフレット
【特許文献３４】米国特許出願公開第２００３／００９２６３１号明細書
【特許文献３５】米国特許第６，５００，６３５号明細書
【特許文献３６】米国特許第６，３９１，５８８号明細書
【特許文献３７】米国特許第６，４８９，２９４号明細書
【特許文献３８】米国特許第６，３６９，０２９号明細書
【特許文献３９】米国特許出願公開第２００３／０１６１８２９Ａ１号明細書
【特許文献４０】国際公開第０３／０２５１２１号パンフレット
【特許文献４１】国際公開第０１／８７２３８号パンフレット
【特許文献４２】国際公開第０２／３４９１６号パンフレット
【特許文献４３】国際公開第０１／８７２３８号パンフレット
【特許文献４４】米国特許第６，４１７，３３０号明細書
【特許文献４５】国際公開第９９／６３０８６号パンフレット
【特許文献４６】米国特許出願公開第２００２／００７２５８９号明細書
【特許文献４７】米国特許出願公開第２００３／００５９４３０号明細書
【特許文献４８】国際公開第０３／０５２０７９号パンフレット
【特許文献４９】国際公開第０２／０９８９１４号パンフレット
【特許文献５０】国際公開第０２／３４９１６号パンフレット
【特許文献５１】国際公開第００／２３４６９号パンフレット
【特許文献５２】国際公開第９９／３２６２０号パンフレット
【非特許文献１】ＣｌａｒｋおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．，７：６５−８０（１９９６）
【非特許文献２】ＪｏｎｅｓおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，１６：３−３４（１９９５）
【非特許文献３】ＭｃＩｎｎｅｓおよびＳｙｋｅｓ，Ｂｉｏｐｏｌｙ．，４３：３３９−３６６（１９９８）
【非特許文献４】Ｕｌｌｒｉｃｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，５：２５０３−２５１２（１９８６）
【非特許文献５】Ｇａｒｒｅｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ，３９４：３９５−３９９（１９９８）
【非特許文献６】Ｂａｘｔｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３９：４０３６（１９９８）
【非特許文献７】ＢａｃｈおよびＲｅｃｈｌｅｒ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，３：３８−６１（１９９５）
【非特許文献８】Ｏｈら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３２：１３３７−１３４４（１９９３）
【非特許文献９】Ｃｏｏｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：５４８４−５４９１（１９９１）
【非特許文献１０】Ｈｕａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５９：２９７−３１３（１９９６）
【非特許文献１１】ＤｅＷｏｌｆら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５：２１９３−２２０２（１９９６）
【非特許文献１２】Ｔｅｒａｓａｗａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：５５９０−５５９７（１９９４）
【非特許文献１３】Ｔｏｒｒｅｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：３８５−４０１（１９９５）
【非特許文献１４】Ｌｏｄｄｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１８９４−１８９８（１９９８）
【非特許文献１５】Ｌｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：８８７０−８８７８（１９９８）
【非特許文献１６】Ｂａｙｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５６４８−１５６５２（１９９０）
【非特許文献１７】Ｂａｙｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１１００４−１１００８（１９８９）
【非特許文献１８】Ｃａｓｃｉｅｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：３２２９−３２３３（１９８８）
【非特許文献１９】Ｂａｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７：３２４３−３２４５（１９９０）
【非特許文献２０】Ｂａｇｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５９：６６５−６７１（１９８９）
【非特許文献２１】Ｂａｘｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：６０−６５（１９９２）
【非特許文献２２】Ｂａｙｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：６２３３−６２３９（１９８８）
【非特許文献２３】Ｃｌｅｍｏｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２２１０−１２２１６（１９９０）
【非特許文献２４】Ｃｌｅｍｍｏｎｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３１：８９０−８９５（１９９２）
【非特許文献２５】Ｈｅｄｉｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１３９４８−１３９５２（１９９６）
【非特許文献２６】Ｊａｎｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ，３６：４１０８−４１１７（１９９７）
【非特許文献２７】Ｊａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２４７０１−２４７０７（１９９８）
【非特許文献２８】Ｃａｓｃｉｅｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：３２２９−３２３３（１９８８）
【非特許文献２９】Ｂａｙｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１１００４−１１００８（１９８８）
【非特許文献３０】Ｐｅｔｅｒｋｏｆｓｋｙら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１２８：１７６９−１７７９（１９９１）
【非特許文献３１】Ｃａｓｃｉｅｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：２１９９−２２０２（１９８９）
【非特許文献３２】Ｓｌｉｅｃｋｅｒら、Ａｄｖ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３４３：２５−３２（１９９４））
【非特許文献３３】Ｃｌｅｍｍｏｎｓら、（１９９１）Ｍｏｄｅｒｎ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｅ．Ｍ．Ｓｐｅｎｃｅｒ（編）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．４７５−４８６
【非特許文献３４】Ｂｉｎｋｅｒｔら、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，８：２４９７−２５０２（１９８９）
【非特許文献３５】Ｂａｘｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，１３９：１２５６−１２６１（１９８６）
【非特許文献３６】Ｗｏｏｄら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，２：１１７６−１１８５（１９８８）
【非特許文献３７】Ｓｃｈｍｉｄら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ  Ｃｏｍ．，１７９：５７９−５８５（１９９１）
【非特許文献３８】Ｍｏｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：８３３８−８３４２（１９８９）
【非特許文献３９】Ｓｈｉｍａｓａｋｉら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｏｇｙ，４：１４５１−１４５８（１９９０）
【非特許文献４０】ＡｎｄｒｅｓｓおよびＢｉｒｎｂａｕｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ  Ｃｏｍ．，１７６：２１３−２１８（１９９１）
【非特許文献４１】Ｚａｐｆら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１４８９２〜１４８９８（１９９０）
【非特許文献４２】Ｓｈｉｍａｓａｋｉら、第２回国際ＩＧＦシンポジウムのアブストラクト（１９９１年１月）
【非特許文献４３】Ｓｈｉｍａｓａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１０６４６−１０６５３（１９９１）
【非特許文献４４】Ｓｈｉｍａｓａｋｉら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，５：９３８−９４８（１９９１）
【非特許文献４５】Ｍｏｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８６：８３３８−８３４２（１９８９）
【非特許文献４６】ＬａＴｏｕｒら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４：１８０６−１８１４（１９９０）
【非特許文献４７】Ｐｉｅｔｚｋｏｗｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：６４４７−６４５１（１９９２）
【非特許文献４８】Ｃｏｏｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０：５４８４−５４９１（１９９１）
【非特許文献４９】Ｂａｙｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１１００４−１１００８（１９８８）
【非特許文献５０】Ｙｅｅら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．，５：７３−７７（１９９４）
【非特許文献５１】Ｂｌｕｎｄｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：１８０−１８４（１９７８）
【非特許文献５２】Ｂｌｕｎｄｅｌｌら、Ｆｅｄ  Ｐｒｏｃ．，４２：２５９２（１９８３）
【非特許文献５３】Ｄｅ  Ｗｏｌｆら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，５：２１９３（１９９６）
【非特許文献５４】Ｓａｔｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．４１：４３３（１９９３）
【非特許文献５５】Ｔｏｒｒｅｓら、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：３８５（１９９５）
【非特許文献５６】Ｌａａｊｏｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１０００９（２０００）
【非特許文献５７】Ｃｌｅｍｍｏｎｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．８：４５−６２（１９９７）
【非特許文献５８】ＭａｒｔｉｎおよびＢａｘｔｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｄｉａｂ．１６−２１（１９９４）
【非特許文献５９】Ｃｈｅｒｎａｕｓｅｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１３７７−１１３８２（１９９５）
【非特許文献６０】Ｃｏｎｏｖｅｒ，Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．，６：３０１−３０９（１９９５）
【非特許文献６１】Ｋａｌｕｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：６５５８〜６５７２（１９９８）
【非特許文献６２】Ｇａｌａｎｉｓら、Ｊｏｕｎｒａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１６９（１）：１２３−１３３（２００１）
【非特許文献６３】Ｖｏｒｗｅｒｋら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４３（５）：１６７７−１６８５（２００２）
【非特許文献６４】Ｌｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：３３６０７〜３３６１３（２０００）
【非特許文献６５】Ｗｅｉｎｚｅｉｍｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８６：１８０６−１３（２００１）
【非特許文献６６】Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７５：Ｅ３２１−Ｅ２３１（１９９８）
【非特許文献６７】Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３０３１５−３０２２１（１９９９）
【非特許文献６８】Ｆｉｒｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２６３１−２６３８（１９９８）
【非特許文献６９】ＭｃＣａｉｇら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８６：１９６３−１９６９（２００２）
【非特許文献７０】Ｐｅｒｋｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２９４：９８８−９９４（２００２）
【非特許文献７１】Ｈａｒｒｉｓ，Ｇｅｎｅｎｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｒ．（編）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，第４巻、１９８３），ｐ１２７
【非特許文献７２】Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８６：５５７−５６１（１９８９）
【非特許文献７３】Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８６：５６３−５６９（１９８９）
【非特許文献７４】Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２４０：１（１９８６）
【非特許文献７５】Ｃａｒｔｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｔｏ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ｌａｄｉｓｃｈら、編（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｎｏ．４２７，１９９０）、Ｃｈ１３、１８１頁〜１９３頁
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００４５】
（発明の要旨）
従って、本発明は、請求される通りである。一つの実施形態において、本発明は、融合タンパク質（すなわち、ヒトＩＧＦＢＰ−３）を提供し、この融合タンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓからのプロテインＡの合成されたＺドメインに連結されたネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３フラグメントの残基４７〜残基９９からなるＩＧＦＢＰ−３フラグメント（以下の配列番号１）（すなわち、短縮型ＩＧＦＢＰ−３）を含み、これは、以下の配列：
ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号１０）
を有する。
【００４６】
このような一つの実施形態において、この融合タンパク質は、ファージ上にディスプレイされる。別の実施形態では、このフラグメントは、切断可能なリンカーペプチドを用いて、Ｚドメインに連結される。このような切断可能なリンカーペプチドは、好ましくは、以下の配列のうちの一つを含む：ＤＬＶＤ（配列番号２）、ＤＥＭＤ（配列番号３）、ＤＡＶＤ（配列番号４）、ＥＦＧＧＧＤＤＤＫ（配列番号５）、ＥＦＧＧＬＶＰＲＧＳ（配列番号６）、ＥＦＧＧＤＬＶＤ（配列番号７）、ＥＦＧＧＤＥＭＤ（配列番号８）、またはＥＦＧＧＤＡＶＤ（配列番号９）。別の実施形態では、ＡＳＡ配列は、ＺドメインのＮ末端に存在する。なお別の実施形態では、このフラグメントは、アフィニティーマチュレーションされる。
【００４７】
本明細書中でまた提供されるのは、キャリア（好ましくは薬学的に受容可能なキャリア）中に上記融合タンパク質を含有する組成物である。好ましくは、この組成物は、滅菌されている。
【００４８】
さらに提供されるのは、融合タンパク質をコードする核酸分子、上記核酸を含むベクター、上記核酸を含む宿主細胞、ならびにＩＧＦＢＰ−３融合タンパク質を産生する方法であって、この方法は、上記宿主細胞を適切な条件下で培養し、上記融合タンパク質を発現させる工程、およびこの融合タンパク質を宿主細胞培養物から回収する工程を包含する。上記宿主が原核生物であり、より好ましくは、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）であることが望ましい。
【００４９】
これらの融合タンパク質は、リガンドがＩＧＦＢＰ−３結合部位を有するかを決定するためのアッセイを包含する多くの適用において使用され得る。ＩＧＦ−Ｉ結合部位またはＩＧＦ−ＩＩ結合部位を含む、本明細書中の融合タンパク質は、構造的なデータがない場合に、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３上の、ＩＧＦ結合部位およびＩＧＦ−Ｉ以外のＩＧＦ−ＩアゴニストリガンドＩＧＦ結合部位およびＩＧＦ−Ｉ以外のＩＧＦ−Ｉアゴニストリガンド（例えば、ファージパニング実験により単離されたペプチド（例えば、Ｌｏｗｍａｎら（前出）中に記載されたｂｐ１５）の結合部位の解明およびマッピングのためにさらに有用である。
【００５０】
なお別の実施形態では、本発明は、細胞ベースのアッセイにおける、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３、ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉ、もしくはネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩＩ、または上記ＩＧＦ−Ｉもしくは上記ＩＧＦ−ＩＩのアゴニストの生物学的活性を決定するための方法を提供し、この方法は、細胞と、融合タンパク質（これは、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３ではなくＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩに結合するＩＧＦＢＰ−３フラグメントに連結されたペプチドを含む）とを接触させる工程、ならびにネイティブ配列ヒトＩＧＢＰ−３、ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉ、またはネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩＩ、または上記ＩＧＦ−Ｉもしくは上記ＩＧＦ−ＩＩのアゴニストに起因し得る生物学的活性が観察されるか否かを決定する工程を包含する。
【００５１】
一つの実施形態では、この生物学的活性は、ＩＧＦ−Ｉとは独立した、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３のアポトーシスである。
【００５２】
別の実施形態では、このアッセイは、ＩＧＦ依存性のＫＩＲＡリン酸化アッセイである。このアッセイは、ヒト１型レセプターの直接的な活性のアッセイである。チロシンキナーゼファミリーのレセプター（例えば、１型ＩＧＦ−１レセプター）が活性化される場合、これは、チロシン残基上でリン酸化される。このアッセイにおいて、１型ＩＧＦレセプターを含む細胞は、インビトロで活性化され、次いで、崩壊（ｄｉｓｒｕｐｔ）され、そしてこのレセプターに対する抗体が使用され、ＩＧＦレセプターを沈殿せしめる。次に、抗ホスホチロシン抗体を使用し、リン酸化された１型ＩＧＦレセプターの量をアッセイする。固定数の細胞が使用される場合、リン酸化されたレセプターの量は、１型ＩＧＦレセプター上の分子の活性の直接的な基準である。このＫＩＲＡアッセイにおいて、細胞（例えば、乳癌細胞株）は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩプラス上記融合タンパク質で処理され、そしてこの融合タンパク質の生物学的活性は、リン酸化されたレセプターの量により決定される。
【００５３】
なお別の実施形態では、生物学的活性は、放射標識したＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの細胞への結合の阻害である。
【００５４】
さらなる局面では、本発明は、アポトーシスの増強を決定するための方法を提供し、この方法は、乳癌細胞を、細胞をアポトーシス因子（例えば、パクリタキセルまたはドキソルビシン）で処理する前にＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを結合するＩＧＦＢＰ−３フラグメントまたはその融合タンパク質、およびネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３または上記ＩＧＦＢＰ−３フラグメントもしくはその融合タンパク質で少なくとも２４時間処理する工程、ならびに、この前処理もしくは処理が、アポトーシス因子を用いた処理により誘導されるアポトーシスを増強するか、または前処理もしくは処理がその目的に対して有効である量を決定する工程を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
（発明の詳細な説明）
（Ａ．定義）
本明細書中で使用される場合、「ＩＧＦ」とは、ネイティブなインスリン様増殖因子Ｉおよびネイティブなインスリン様増殖因子ＩＩ、ならびにこれらの天然に存在する改変体（例えば、脳ＩＧＦ、別名デス（１−３）ＩＧＦ−Ｉとして公知）をいう。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「ＩＧＦ−Ｉ」とは、任意の種（このような種としては、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびヒトが挙げられるが、好ましくは、ヒト）からのインスリン様増殖因子Ｉならびに任意の供給源からのインスリン様増殖因子Ｉ（天然インスリン様増殖因子Ｉ、合成インスリン様増殖因子Ｉ、または組み換えインスリン様増殖因子Ｉ）をいう。これは、例えば、１９８７年８月５日に公開されたＥＰ２３０，８６９；１９８４年１２月１９日に公開されたＥＰ１２８，７３３；または１９８８年１０月２６日に公開されたＥＰ２８８，４５１に記載されるプロセスにより調製され得る。「ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉ」または「野生型ＩＧＦ−Ｉ」は、野生型のヒトＩＧＦ−Ｉである。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「ＩＧＦ−ＩＩ」とは、任意の種（このような種としては、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびヒトが挙げられるが、好ましくはヒト）からのインスリン様増殖因子ＩＩならびに任意の供給源からのインスリン様増殖因子ＩＩ（天然インスリン様増殖因子ＩＩ、合成インスリン様増殖因子ＩＩ、または組み換えインスリン様増殖因子ＩＩ）をいう。ＩＧＦ−ＩＩは、例えば、ＥＰ１２８，７３３において記載される方法により調製され得る。「ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩＩ」または「野生型ＩＧＦ−ＩＩ」は、野生型のヒトＩＧＦ−ＩＩである。
【００５８】
「ＩＧＦＢＰ」または「ＩＧＦ結合タンパク質」とは、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩが循環性（すなわち、血清中または組織中）であるか否かに関わらず、通常ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと会合するか、結合するか、または複合体形成するタンパク質またはポリペプチドをいう。このような結合タンパク質は、レセプターを含まない。この定義は、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＧＦＢＰ−６、Ｍａｃ２５（ＩＧＦＢＰ−７）、およびプロスタサイクリン刺激因子（ＰＳＦ）、または内皮細胞特異的分子（ＥＳＭ−１）、ならびにＩＧＦＢＰに対して高い相同性を有する他のタンパク質を包含する。Ｍａｃ２５は、例えば、Ｓｗｉｓｓｈｅｌｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：４４７２−４４７６（１９９５）およびＯｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：３０３２２〜３０３２５（１９９６）に記載される。ＰＳＦは、Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３０３：５９１−５９８（１９９４）に記載されている。ＥＳＭ−１は、Ｌａｓｓａｌｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２０４５８−２０４６４（１９９６）に記載されている。他の同定されたＩＧＦＢＰとしては、例えば、１９９０年６月２７日に公開されたＥＰ３７５，４３８；１９９０年５月２３日に公開されたＥＰ  ３６９，９４３；１９８９年１０月５日に公開されたＷＯ  ８９／０９２６８；Ｗｏｏｄら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２：１１７６−１１８５（１９８８）；Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．７：２４１７−２４２３（１９８８）；Ｌｅｅら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，２：４０４−４１１（１９８８）；Ｂｒｅｗｅｒら、ＢＢＲＣ，１５２：１２８９−１２９７（１９８８）；１９８８年１２月７日に公開されたＥＰ２９４，０２１；Ｂａｘｔｅｒら、ＢＢＲＣ、１４７：４０８−４１５（１９８７）；Ｌｅｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５３７−５４３（１９８７）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：８７５４−８７６０（１９８６）；Ｂａｘｔｅｒら、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１Ｂ：２２９−２３５（１９８８）；１９８９年９月２１日に公開されたＷＯ  ８９／０８６６７；１９８９年１０月１９日に公開されたＷＯ  ８９／０９７９２；Ｂｉｎｋｅｒｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，８：２４９７−２５０２（１９８９）；ＥＰ  ３６９，９４３Ｂ１；米国特許第５，９７３，１１５号；ＥＰ１，２９５、９３９；および米国特許第６，００４，７７５号およびＥＰ５４６０５３を参照のこと。
【００５９】
「ＩＧＦＢＰ−３」すなわち「インスリン様増殖因子結合タンパク質−３」とは、任意の種（このような種としては、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびヒトが挙げられるが、好ましくは、ヒト）からのＩＧＦＢＰ−３もしくはＢＰ５３、または任意の供給源（天然、合成または組み換え）からのＩＧＦＢＰ−３もしくはＢＰ５３をいい、米国特許第５，２５８，２８７号および同第５，３２８，８９１号に記載される。「ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３」「野生型ＩＧＦＢＰ−３」および「全長ＩＧＦＢＰ−３」は、米国特許第５，２５８，２８７号および同第５，３２８，８９１号に記載された、５位にグリシンを有する野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３もしくはＢＰ−５３（すなわち、配列番号１）または５位にアラニンを有する野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３もしくはＢＰ−５３（すなわち、配列番号１２）である。
【００６０】
配列番号１は、以下の配列：
【００６１】
【化１】
2007537711.tif 000003
である。
【００６２】
配列番号１２は、以下の配列：
【００６３】
【化２】
2007537711.tif 000004
である。
【００６４】
「ＩＧＦＢＰ−３フラグメント」とは、少なくとも１つのアミノ酸を欠くネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１または配列番号１２）である。好ましくは、このフラグメントは、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１または配列番号１２）のＮ末端フラグメント（例えば、残基１−残基４６、残基１−残基８８、残基１−残基８９、残基１−残基９０、残基１−残基９１、残基１−残基９２、残基１−残基９３、残基１−残基９４、残基１−残基９５、残基１−残基９６、残基１−残基９７、残基１−残基９８、残基１−残基９９、残基１−残基１８５、または残基４７−残基９９を有する（もしくはこれと一致する）ペプチド）あるいはネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１）のＣ末端フラグメント（例えば、残基９８−残基２６４、残基１００−残基２６４、残基１６５−残基２６４、残基１８５−残基２６４を有するペプチド）である。より好ましくは、ＩＧＦＢＰ−３フラグメントは、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１または配列番号１２）の残基１−残基４６、残基１−残基８８、残基１−残基９７、残基１−残基９９、残基４７−残基９９、残基１−残基１８５、残基９８−残基２６４、残基１００−残基２６４、残基１６５−残基２６４および残基１８５−残基２６４を有するペプチドからなる群より選択され、そして最も好ましくは、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１）の残基４７−残基９９を有するペプチドである。
【００６５】
「融合タンパク質」は、直接的にかまたはリンカー（すなわち、「リンカーペプチド」または「連結ペプチド（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」）を介してのいずれか（好ましくは、このようなリンカーを介して）で、一緒に連結された２個の別個のペプチドを有するタンパク質である。例えば、１種の融合タンパク質は、ＩＧＦＢＰ−３フラグメントに融合されたプロテインＡのＺドメインを含むタンパク質であり、Ｚドメインおよびフラグメントは、切断が所望されない場合に直接的に連結され得るか、または切断が所望され得る場合に切断部位（例えば、カスパーゼ−３タンパク質分解部位）を介して連結され得る。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「プロテインＡのＺドメイン」とは、例えばＥＰ２３０，８６９  Ｂ１に図３の合成Ｚ領域として、そしてＳａｍｕｅｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：３６３（１９９１）およびＮｉｌｓｓｏｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１（２）：１０７−１１３（１９８７）に記載されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインをいう。
【００６７】
「ペプチド」は、少なくとも２個のアミノ酸を有する分子であり、そして少なくとも約５０アミノ酸を有するポリペプチドを包含する。この定義としては、ペプチドフラグメント、誘導体、その塩、または光学異性体、ならびにリンカーが挙げられる。好ましくは、本明細書中のペプチドは、約３５アミノ酸〜２００アミノ酸、より好ましくは、約４０アミノ酸〜１７０アミノ酸を有する。
【００６８】
本明細書中に記載される場合、「アポトーシス因子」は、アポトーシスまたは細胞死を誘導する分子である。このような分子としては、化学療法剤、抗ホルモン剤、細胞傷害性因子および他の薬剤（細胞死を誘導するこれらのいくつかは、以下に定義される）が挙げられる。好ましくは、このような因子は、化学療法剤であり、より好ましくは、ドキソルビシンまたはパクリタキセルであり、最も好ましくは、パクリタキセルである。
【００６９】
「アフィニティーマチュレーションされた」ＩＧＦＢＰ−３ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質は、このペプチドフラグメントまたは融合タンパク質内に１以上の変更を有し、これらの変更を保有しない対応する親ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質と比較して、上記ペプチドフラグメント融合タンパク質のＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩに対する親和性を改良する。アフィニティーマチュレーションされた好ましいＩＧＦＢＰ−３ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質は、標的ＩＧＦに対して、ナノモル濃度の親和性を有するか、または、ピコモル濃度の親和性さえを有する。アフィニティーマチュレーションされたペプチドフラグメントおよび融合タンパク質は、当該分野で公知の手順（ファージディスプレイ（ＬｏｗｍａｎおよびＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３４（３）：５６４−５７８（１９９３）；Ｌｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｉｍｓｔｒｙ，３０（４５）：１０８３２−１０８３８（１９９１））；合理的な突然変異誘発（Ｌｏｗｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１（１７）：１０９８２〜１０９８８（１９９１）；Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３４（４）：９５８−９６４（１９９３））；ランダムな突然変異誘発（Ｆｉｅｄｌｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１５（１１）：９３１−９４１（２００２））ならびにＤＮＡシャッフリングおよびファージディスプレイ（Ｈｕｌｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０（３）：１６３−１７１（２００１）；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｕｃｋｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３１０（３）：５９１−６０１（２００１））が挙げられる）により生み出される。
【００７０】
本明細書中で用いられる場合、処置目的の「哺乳動物」とは、哺乳動物として分類される任意の動物（このような動物としては、ヒト、家畜、および農場動物、ならびに動物園の動物、スポーツ用動物、もしくはペットの動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、牝牛などが挙げられる）をいう。本明細書中での好ましい哺乳動物は、ヒトである。用語「非成体」とは、周産期（例えば、生誕時の体重が軽い乳児）から思春期までの哺乳動物をいい、ここで、思春期は、十分な増殖可能性にまだ到達していないものである。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、用語「処置すること」とは、治療上の処置および予防上（ｐｒｏｐｈａｌｙｔｉｃ）もしくは予防上（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）の手段の両方をいう。処置を必要とする人々としては、すでに障害を有する人々ならびに障害を有する傾向があるか、または障害を有すると診断された人々または上記障害が予防されるべき人々が挙げられる。継続性の処置または投与とは、１日以上処置が中断されることのない少なくとも１日単位での処置をいう。間欠性の処置もしくは投与、または間欠性の様式での処置もしくは投与とは、継続的ではないが、むしろ周期的な性質の処置をいう。本明細書中での処置レジームは、継続性であるかまたは間欠性のいずれかであり得る。
【００７２】
本明細書中で用いられる場合、「ＩＧＦアンタゴニスト」とは、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの１種以上の生物学的活性（例えば、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの同化作用）を遮断または阻害するペプチドをいう。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、内因性ＩＧＦの血清レベルまたは組織レベルが変化する状況での「活性な」ＩＧＦまたは「生物学的に活性な」ＩＧＦとは、ＩＧＦのレセプターに結合するか、または別のやり方で生物学的活性（例えば、同化作用）を生ぜしめるＩＧＦをいう。
【００７４】
用語「有効量」とは、哺乳動物内において疾患または障害を処置するのに有効なペプチドの量をいう。癌の場合、有効量のペプチドは、癌細胞の数を減少し得；腫瘍の大きさを小さくし得；癌細胞の末梢器官への浸潤を阻害（すなわち、ある程度遅延させ、そして好ましくは停止）し得；腫瘍の転移を阻害（すなわち、ある程度遅延させ、そして好ましくは停止）し得；ある程度腫瘍の増殖を阻害し得；そして／またはこの障害に関連する１種以上の症状をある程度緩解し得る。ペプチドが増殖を妨害し、そして／または存在する癌細胞を殺傷し得る程度に、このペプチドは、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。癌治療としては、例えば、疾患の進行までの時間（ＴＴＰ）を評価し、そして／または応答速度（ＲＲ）を決定することにより、インビボでの効能が測定され得る。
【００７５】
用語「癌」および「癌の」とは、代表的には、制御されない細胞増殖により特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態をいい、これを描写する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌の、より詳細な例としては、扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ））、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒまたはｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）（胃腸癌を含む）、膵臓癌、多形性グリア芽腫、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌もしくは子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒもしくはｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝癌および種々の型の頭部癌および頚部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低グレード／小胞の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中グレード／小胞ＮＨＬ；中グレード拡散性ＮＨＬ；高グレードの免疫芽球性ＮＨＬ；高グレードのリンパ芽球性ＮＨＬ；高グレ−ドの小非切断性細胞ＮＨＬ；大きな腫瘍ＮＨＬ；皮膜細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；へアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；ならびに移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ）が挙げられる。好ましくは、上記癌は、ＩＧＦレセプターを発現する腫瘍を包含し、より好ましくは、乳癌、肺癌、直腸結腸癌、または前立腺癌を包含し、最も好ましくは、乳癌および前立腺癌を包含する。
【００７６】
本明細書中に使用される場合、用語「細胞傷害性因子」とは、細胞の機能を阻害もしくは予防し、そして／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射活性な異性体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ  １８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびルテチウムの放射活性な異性体）、化学療法剤、および毒素（例えば、細菌、菌類、植物、または動物が起源の、低分子毒素または酵素的に活性な毒素（これらのフラグメントおよび／もしくは改変体を含む）を包含することが意図される。
【００７７】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用である化学化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド）；アルキルスルホン酸塩（ブスルファン、イムプロスルファン、ピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ））；エチレンイミンおよびメチルアメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｍｅｌａｍｉｎｅ）、トリエチレンホスホロアミド、トリエチレンチオホスホロアミド、およびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎ）およびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（これのアドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）およびビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）の合成アナログを含む）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）；ズオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウセロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラティスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロラナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）およびウラシルマスタード）；ニトロソ尿素類（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン）；エネジイン（ｅｎｅｄｙｉｎｅ）抗生物質のような抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンγＩＩおよびカリケアミシンωＩＩ（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照のこと））；ジネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）（ジネミシンＡを含む）；ビスホスホネート（例えば、クロドロネート）；エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；ならびにネオカルチノスタチン、クロモフォアおよび関連するクロモプロテインエネジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン）；抗代謝剤（例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ））；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール（ｃａｒｍｏｆｕｒ）、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキリフルリジン、エノシタビン、フルオキシウリジン（ｆｌｕｏｘｕｒｉｄｉｎｅ））；アンドロゲン（例えば、カルステロン（ｃａｌｕｓｕｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｌｏｎｅ）、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ））；抗副腎ステロイド（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）（例えば、アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタン）；葉酸補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）（例えば、フロリニック酸（ｆｌｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ））；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルラシル（ｅｎｉｌｕｒａｃｉｌ）；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウルム（ｅｌｉｐｔｉｎｕｒｍ）；エポチロン；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド（例えば、メイタシン）およびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）ポリサッカライド複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，���ｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）（特に、Ｔ−２トキシン、ベラキュリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド（例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭクレモフォールフリー（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ）、パクリタキセルのアルブミン操作したナノ粒子形成（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）、クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲンシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６））；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレブリン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド（例えば、レチン酸）；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；および上記のものの薬学的に受容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。
【００７８】
この定義にまた包含されるのは、腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するために作用する抗ホルモン剤（例えば、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲンレセプター調節因子（ＳＥＲＭ）（例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンが挙げられる）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮトレミフェン；酵素アロマターゼ（この酵素は、副腎におけるエストロゲン産生を調節する）を阻害するアロマターゼインヒビターが挙げられ、このインヒビターは、副腎においてエストロゲンの産生を調節する（例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、フォルメスタニエ（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール（ｆａｄｒｏｚｏｌｅ）、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）；ならびに抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ロイプロリド、およびゴセレリン；ならびにトロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド（特に、不粘着性の細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路中の遺伝子の発現を阻害するもの（例えば、ＰＫＣ−α、ＲａｌｆおよびＨ−Ｒａｓ））；リボザイム（例えば、ＶＥＧＦ発現インヒビター（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）およびＨＥＲ２発現インヒビター）；ワクチン（例えば、遺伝子治療ワクチン（例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン））；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ）；ならびに、上記のものの任意の薬学的に受容可能な塩、酸または誘導体である。
【００７９】
本明細書中で用いられる場合、「増殖阻害因子」とは、インビトロおよび／またはインビボでの細胞の増殖を阻害する化合物または組成物をいう。従って、上記増殖阻害因子は、Ｓ期における細胞の百分率を有意に減少させるものであり得る。増殖阻害因子の例としては、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の場所で）遮断する因子（例えば、ＧＩ停止およびＭ期停止を誘導する因子）が挙げられる。古典的なＭ期のブロッカーとしては、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル、およびトポＩＩインヒビター（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシン）が挙げられる。ＧＩで停止させるこれらの因子（例えば、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、タノキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−Ｃ）はまた、Ｓ期の停止に波及する。さらなる情報が、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＩｓｒａｅｌ編、第１章、題名「Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｅｉｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」（Ｍｕｒａｋａｉｎｉら）（Ｗ  Ｂ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）特にｐ．１３に見出され得る。
【００８０】
「増殖阻害性」抗ＨＥＲ２抗体の例は、ＨＥＲ２に結合し、そしてＨＥＲ２を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害するものである。好ましい増殖阻害性抗ＨＥＲ２抗体は、約０．５〜３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、２０％より多く、そして好ましくは、５０％より多く（例えば、約５０％〜約１００％）、細胞培養物中のＳＫＢＲ３乳癌細胞の増殖を阻害する。ここで、増殖阻害は、ＳＫＢＲ３細胞を抗体へ曝した６日後に決定される（１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号を参照のこと）。
【００８１】
「細胞死を誘導する」抗体は、生存可能な細胞を生存できなくする抗体をいう。この細胞は、一般的には、抗原を発現する細胞であり、特に上記細胞が抗原を過剰発現する場合に、この抗原に抗体が結合する。好ましくは、上記細胞は、癌細胞であり、例えば、胸部、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓または膀胱の細胞である。インビトロでは、上記細胞は、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１またはＳＫＯＶ３細胞であり得る。インビトロでの細胞死は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）により誘導される細胞死を識別するために、補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で決定され得る。従って、細胞死のアッセイは、熱不活性化血清を用いて（すなわち、補体の非存在下で、そして免疫エフェクター細胞の非存在下で）使用され得る。この抗体が細胞死を誘導し得るか否かを決定するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７：１−１１（１９９５）を参照のこと）または７ＡＡＤの取り込みにより評価される膜の完全性の損失が未処理の細胞に対して評価され得る。
【００８２】
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞の断片化、および／または膜小胞の形成（アポトーシス体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｂｏｄｙ）と呼ばれる）により決定されるプログラム化された細胞死を誘導する抗体である。この細胞は、抗体が結合する抗原を発現する細胞であり、そして抗原を過剰発現する細胞であり得る。この細胞は、腫瘍細胞（例えば、胸部、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓または膀胱の細胞）であり得る。インビトロでは、上記細胞は、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、またはＳＫＯＶ３細胞であり得る。アポトーシスに関連する細胞性事象を評価するための種々の方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）のトランスロケーションは、アネキシンの結合により評価され得；ＤＮＡの断片化は、ＤＮＡのラダリング（ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）を通して評価され得；そして核／クロマチンの凝縮は、ＤＮＡ断片化とともに、低二倍体の細胞の増加により評価され得る。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、上記抗体が結合する抗原を発現する細胞を用いて、未処理の細胞に対して、アネキシン結合アッセイにおいて、約２倍〜５０倍（好ましくは、約５倍〜５０倍、そして最も好ましくは、約１０倍〜５０倍）の、アネキシン結合を誘導する抗体である。
【００８３】
アポトーシスを誘導する抗体の例としては、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体７Ｆ３（ＡＴＣＣ  ＨＢ１２２１６）、および７Ｃ２（ＡＴＣＣ  ＨＢ１２２１５）が挙げられ、これらとしては、これらのヒト化され、そして／またはアフィニティーマチュレーションされた改変体が含まれる；抗ＤＲ５抗体３Ｆ１１．３９．７（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２４５６）；３Ｈ３．１４．５（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２５３４）；３Ｄ５．１．１０（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２５３６）；および３Ｈ３．１４．５（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２５３４）（これとしては、これらのヒト化され、そして／またはアフィニティーマチュレーションされた改変体が含まれる）；ヒト抗ＤＲ５レセプター抗体１６Ｅ２および２０Ｅ６（これらとしては、これらのアフィニティーマチュレーションされた改変体が含まれる）（ＷＯ９８／５１７９３、参考として明示的に本明細書中に援用される）；ならびに抗ＤＲ−４抗体４Ｅ７．２４．３（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２４５４）；４Ｈ６．１７．８（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２４５５）；１Ｈ５．２５．９（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２６９５）；４Ｇ７．１８．８（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９９）；および５ＧＩ１．１７．１（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２６９４）（これのヒト化され、そして／またはアフィニティーマチュレーションされた改変体を含む）が挙げられる。
【００８４】
目的の抗体により結合される抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、慣用的な交差遮断アッセイ（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｓｓａｙ）（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に記載されるようなもの）が実行され得る。
【００８５】
（Ｂ．本発明を実行するための様式）
本明細書中の発明は、一局面では、ＩＧＦＢＰ−３ペプチドフラグメントを含む融合タンパク質に関し、このＩＧＦＢＰ−ペプチドフラグメントは、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１）の残基４７−残基９９のみを含む（これは、本明細書中でミニＢＰ−３と呼ばれ、直接的に連結されるのであれリンカーを介して連結されるのであれ、プロテインＡのＺドメインに連結され、このリンカーは、上記フラグメントを放出することができるように、酵素により切断され得る）。このようなリンカーまたは連結ペプチドは、例えば、切断可能リンカー（例えば、タンパク分解性部位のＤＬＶＤ（配列番号２）、ＤＥＭＤ（配列番号３）またはＤＡＶＤ（配列番号４）を含むカスパーゼ−３切断可能リンカー）であり得る。このような連結ペプチドの例は、ＥＦＧＧＤＬＶＤ（配列番号７）、ＥＦＧＧＤＥＭＤ（配列番号８）、またはＥＦＧＧＤＡＶＤ（配列番号９）である。連結ペプチドの他の例は、エンテロキナーゼ−切断可能リンカー（ＥＦＧＧＤＤＤＫ（配列番号５））およびトロンビン−切断可能リンカー（ＥＦＧＧＬＶＰＲＧＳ（配列番号６））である。
【００８６】
（１．調製）
本発明の融合ペプチドは、化学合成または組み換え技術を用いることにより作製され得る。これらの方法は、当該分野において公知である。小ペプチド（例えば、５０残基未満のペプチド）または不自然もしくは異常なアミノ酸（例えば、Ｄ−Ｔｙｒ、オルニチン、アミノアジピン酸など）を含むものに対しては、化学合成（特に固相合成）が好まれる。より長いポリペプチドに対しては、組み換え技術が好まれる。組み換え手順が選択される場合、合成遺伝子が、デノボで構築され得るか、または天然の遺伝子は、例えば、カセット式変異誘発により変異され得る。以下に記載されるのは、例示的で一般的な組み換え手順である。
【００８７】
（ａ．組み換え調製）
融合ペプチドは、組み換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る。これらの技術は、簡便化された形態で、上記ペプチドをコードする上記遺伝子（天然の遺伝子または合成の遺伝子のいずれか）を、獲得する工程；この獲得した遺伝子を適切なベクター中に挿入する工程；このベクターを適切な宿主細胞へと挿入する工程；この宿主細胞を培養し、この遺伝子の発現を引き起こす工程；およびこれにより生産されたペプチドを回収または単離する工程を企図する。好ましくは、この回収されたペプチドは、次いで、適切な程度にまで精製される。
【００８８】
多少より詳しくは、ＩＧＦＢＰ−３融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列がクローニングおよび操作され、その結果、簡便な宿主においてＩＧＦＢＰ−３融合タンパク質が発現され得る。親ポリペプチドをコードするＤＮＡは、遺伝子ライブラリーより、このペプチドを発現する細胞のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡより、またはこのＤＮＡ配列を合成的に構築する工程より取得され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。
【００８９】
次いで、親ＤＮＡは、適切なプラスミドまたはベクター（このベクターは、宿主細胞を形質転換するために使用される）へと挿入される。一般的に、宿主細胞に適合性の種に由来する複製配列および調節配列を含むプラスミドベクターは、これらの宿主と組み合わせて使用される。上記ベクターは、通常、複製部位、および形質転換された細胞に表現型の選別を付与し得るタンパク質またはペプチドをコードする配列を保持する。
【００９０】
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ種由来のプラスミド）を用いて形質転換され得る（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３  ：１５４（１９７０））。プラスミドｐＢＲ３２２は、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、従って、選別のための簡単な手段を提供する。他のベクターは、様々な特徴（例えば、様々なプロモーター（これは、発現においてしばしば重要である））を包含する。例えば、プラスミドｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ７２０、およびｐＰＬ−λは、現在入手可能（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）な、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、またはＰＬプロモーターを有する発現ベクターを表す。
【００９１】
好ましいベクターは、ｐＥＴ２１ａである。このベクターは、Ｔ７プロモーターにより制御され、そしてＮｏｖａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．から入手可能であり、そしてＳｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８５：６０−８９（１９９０）に記載されている。他の好ましいベクターは、ｐＲ１Ｔ５およびｐＲ１Ｔ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）である。これらのベクターは、適切なプロモーターを含み、このプロモーターに、プロテインＡのＺドメインが続き、このことにより、遺伝子がこのベクター中に挿入され、融合タンパク質として発現されるのが可能になっている。別の適切なベクターは、ｐＢ０４７５であり、これは、ファージおよびＥ．ｃｏｌｉの複製起点を含み、このために、このベクターがこのような宿主間でシャトルされることが可能になり、これにより、突然変異誘発および発現の両方を促進する（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：１３３０−１３３６（１９８９）；米国特許第５，５８０，７２３号）。
【００９２】
他の好ましいベクターは、上に記載されたベクターの関連する特徴を組み合わせることにより、標準的な技術を用いて構築され得る。関連する特徴としては、プロモーター、リボソーム結合部位、デコルシン遺伝子もしくはオルナチン遺伝子または遺伝子融合（プロテインＡのＺドメインと、デコルシンもしくはオルナチンと、そのリンカー）、抗生物質耐性マーカー、および適切な複製起点が挙げられる。
【００９３】
宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。ＤＮＡ配列をクローニングおよび発現させ、その融合タンパク質を産生するための原核生物が好まれる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ番号３１４４６）ならびにＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ  ｃ６００およびｃ６００ｈｆｌ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（Ｆ−、γ−、原栄養菌／ＡＴＣＣ番号２７３２５）、バシラス属（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および他の腸内細菌科（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍもしくはＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓａｎｓ）および種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種が使用され得る。好ましい原核細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）であり、これは、ＯｍｐＴおよびロンプロテアーゼ（これらが、インタクトな組み換えタンパク質の単離を妨害し得る）が欠損しており、そしてＴ７プロモーターがドライブされたベクター（例えば、ｐＥＴベクター）があれば有用である。別の適切な原核細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号２７３２５）である。原核細胞により発現された場合、このペプチドは、代表的には、Ｎ末端メチオニンまたはホルミルメチオニンを含み、そしてグリコシル化されない。融合タンパク質の場合、Ｎ末端メチオニンまたはホルミルメチオニン残基は、この融合タンパク質のアミノ末端またはこの融合タンパク質のシグナル配列のアミノ末端に存在する。これらの例は、当然、限定的であることを意図されるのではなく、例示的であることを意図される。
【００９４】
原核細胞に加えて、真核微生物（例えば、糸状菌または酵母）は、融合タンパク質をコードするベクターの適切なクローニングのための宿主または適切な発現のための宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般に使用された低級の真核細胞宿主微生物である。他としては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０（１９８１））；ＥＰ  １３９，３８３、１９８５年５月２日公開）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４（２）：７３７−７４２（１９８３））、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  番号１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  番号２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  番号５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  番号３６，９０６；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０））、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ  ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ  １８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：２６５−２７８（１９８８））；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ  ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３（１９７９））；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（ＥＰ  ３９４，５３８、１９９０年１０月３１日公開））；および糸状菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ，Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（１９９１年１月１０日公開、ＷＯ  ９１／００３５７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９（１９８３）；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１（１９８３）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：１４７０−１４７４（１９８４））およびＡ．ｎｉｇｅｒ（ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：４７５−４７９（１９８５））。本明細書中では、メチロトローフの酵母は適切であり、そしてこれとしては、メタノールに依存して増殖し得る酵母（これは、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、およびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａからなる属より選択される）が挙げられるが、これらに限定されない。酵母のこの網の例示である特定の種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｔｒｏｐｈｓ、２６９（１９８２）において見出され得る。
【００９５】
融合タンパク質の発現に適した他の適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９）ならびに植物細胞が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、チャニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。より具体的な例としては、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）；２９３細胞またはヒト胚腎臓株（懸濁培養物における増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；およびマウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ５１）が挙げられる。適切な宿主細胞の選別は、当該技術の範囲内であると考えられる。
【００９６】
好ましくは、融合タンパク質のＺドメイン部分は、細胞（例えば、シグナル配列を有する）により分泌され、この融合タンパク質を培養物培地から単離および精製することを可能にし、そして所望のペプチドが細胞内に残存している場合に生じる、この宿主細胞を破壊する必要性を排除する。あるいは、この融合タンパク質は、細胞内に発現され得る。高度に発現された融合タンパク質を使用することが有用である。
【００９７】
このペプチドは、融合タンパク質として発現された場合、適切にフォールディングされてもよいし、フォールディングされなくてもよい。また、上記切断部位を含む特異的なペプチドリンカーは、プロテアーゼに接近可能であってもよいし、接近不可能であってもよい。これらの因子は、この融合タンパク質が変性されなければならないか、または再度フォールディングを受けなければならないかを決定し、そしてその場合、これらの手順が切断前または切断後に用いられるかを決定する。
【００９８】
変性および再度のフォールディングが必要とされる場合、代表的には、このペプチドがカロトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）（例えば、グアニジンＨＣｌ）で処理され、次いで、酸化還元緩衝液（例えば、還元されたジチオトレイロールおよび酸化されたジチオトレイロール、または還元されたグルタチオンおよび酸化されたグルタチオンを適切な比率、ｐＨ、および温度で含有する）で処理され、その結果、このペプチドは、そのネイティブな構造になるように再度フォールディングされる。
【００９９】
（ｂ．合成上の調製）
当該分野で公知の他の均等の化学合成は、使用価値がある（ｅｍｐｌｏｙａｂｌｅ）が、ペプチドが組み換えＤＮＡ技術を用いて調製されない場合、ペプチドは、好ましくは、固相合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３）に全体的に記載されるような固相合成）を用いて調製されるが、当該分野で公知の他の同等の化学合成も使用可能である。固相合成は、保護されたα−アミノ酸を適切な樹脂に結合させることにより、ペプチドのＣ末端より開始される。このような出発物質は、エステル結合により、α−アミノ−保護アミノ酸と、クロロメチル化樹脂もしくはヒドロキシメチル樹脂とを結合することにより、またはＢＨＡ樹脂もしくはＭＢＨＡ樹脂とのアミド結合により、調製され得る。ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Ｂｏｄａｎｓｋｙら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．（Ｌｏｎｄｏｎ）、３８：１５９７−１５９８（１９６６）により記載される。クロロメチル化樹脂は、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡおよびＬａｂ．Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。このような樹脂の調製は、Ｓｔｅｗａｒｔら、（Ｆｒｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  １９６９）「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第１章、ｐｐ１〜６により記載されている。ＢＨＡおよびＭＢＨＡ樹脂支持体は、市販されており、そして一般的に、合成される所望のポリペプチドが、Ｃ末端にて非置換のアミドを有する場合にのみ使用される。
【０１００】
アミノ酸は、ペプチド結合の形成のための周知の技術を用いてペプチド鎖に結合される。一つの方法は、アミノ酸を誘導体に転換する工程を包含し、この誘導体は、カルボキシル基を融合タンパク質の遊離Ｎ末端アミノ基を用いた反応により感受性にする。例えば、このアミノ酸は、保護されたアミノ酸とエチルクロロギ酸、フェニルクロロギ酸、ｓｅｃ−ブチルクロロギ酸、イソブチルクロロギ酸、塩化ピバロイルまたは酸塩化物との反応により、混合された無水物に転換され得る。あるいは、アミノ酸は、活性なエステル（例えば、２，４，５−トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシルコハク酸エステル、または１−ヒドロキシベンゾトリアゾールから形成されるエステルへと転換され得る。
【０１０１】
別のカップリングの方法は、適切なカップリング剤（例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミドまたはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）の使用を必要とする。他の適切なカップリング剤（当業者に公知のもの）は、Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｙ；第Ｉ巻：Ｍａｊｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）中に開示されている。
【０１０２】
このペプチド合成において使用される各アミノ酸のα−アミノ基は、カップリング反応の間、活性なα−アミノ官能を伴う副反応を防止するために、保護されなければならないことが認識されるべきである。最初のカップリング反応の間およびその後のカップリング反応の間の両方で、その部位で化学反応が生ずるのを防止するために、特定のアミノ酸が、反応性の側鎖官能基（例えば、スルフヒドリル、アミノ、カルボキシル、およびヒドロキシル）を含むこと、ならびにこのような官能基もまた、適切な保護基で保護されなければならないこともまた認識されるべきである。当該分野で公知の適切な保護基は、ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３巻：「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）に記載されている。
【０１０３】
ペプチド合成において使用される特定の側鎖保護基の選択において、以下の一般的な規則が遵守される。αアミノ保護基は、（ａ）このアミノ酸の機能を、このカップリング反応において使用される条件下で、不活性化しなければならない、（ｂ）側鎖保護基を除去せず、そして融合タンパク質の構造を変更させない条件下で、カップリング反応後に容易に除去可能でなければならず、そして（ｃ）カップリングのまさに直前の活性化の際に、ラセミ化の可能性を排除しなければならない。側鎖保護基は、（ａ）カップリング反応において使用される条件下で、上記側鎖官能基を不活性にしなければならない、（ｂ）上記αアミノ保護基を除去する際に使用される条件下で安定化していなければならない、そして（ｃ）上記ペプチド鎖の構造を変更しない反応条件下で、所望のアミノ酸ペプチドが完了するとすぐに、容易に除去可能でなければならない。
【０１０４】
ペプチド合成のために有用であることが公知の保護基が、除去のために使用される薬剤との反応性において変動することが当業者に明らかである。例えば、特定の保護基（例えば、トリフェニルメチルおよび２−（ｐ−ビフェニリル）イソプロピルオキシカルボニルは、非常に不安定であり、そして穏やかな酸条件下で切断され得る。他の保護基（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ｔ−アミロキシカルボニル、アダマンチル−オキシカルボニル、およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル）は、より安定（ｌｅｓｓ  ｌａｂｉｌｅ）であり、適度に強い酸（例えば、トリフルオロ酢酸、塩酸、または、酢酸中の三フッ化ホウ素）を保護基の除去のために必要とする。さらに他の保護基（例えば、ベンジルカルボニル（ＣＢＺまたはＺ）、ハロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニルおよびイソプロピルオキシカルボニル）は、より一層安定（ｅｖｅｎ  ｌｅｓｓ  ｌａｂｉｌｅ）であり、より強度の酸（例えば、フッ化水素、臭化水素、またはトリフルオロ酢酸中のトリフルオロ酢酸ホウ素）を、保護基の除去のために必要とする。有用なアミノ酸保護基の部類としては、以下：
（１）αアミノ基に対して、（ａ）芳香族ウレタン型の保護基（例えば、フルオレニルメキシチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ））ＣＢＺ、および置換されたＣＢＺ（例えば、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−６−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジルオキシカルボニルなど）；（ｂ）脂肪族ウレタン型保護基（例えば、ＢＯＣ、ｔ−アミロキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２−（ｐ−ビフェニリル）−イソプロピルオキシカルボニル、アリ−ルオキシカルボニルなど）；（ｃ）シクロアルキルウレタン型保護基（例えば、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびシクロへキシルオキシカルボニル）；ならびに（ｄ）アリールオキシカルボニル、が挙げられる。好ましいαアミノ保護基は、ＢＯＣまたはＦＭＯＣである。
（２）Ｌｙｓに存在する側鎖アミノ基に対して、保護が、上記（１）に言及される基（例えば、ＢＯＣ、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニルなど）の任意の基であり得る。
（３）Ａｒｇのグアニジノ基に対して、保護は、ニトロ、トシル、ＣＢＺ、アダマンチルオキシカルボニル、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニルまたは２，３，６−トリメチル−４−メトキシフェニルスルホニル、またはＢＯＣによるものであり得る。
（４）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒのヒドロキシル基に対して、保護は、例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル（例えば、ｔ−ブチル）；ベンジル（ＢＺＬ）；置換されたＢＺＬ（例えば、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−クロロベンジル、ｏ−クロロベンジル、および２，６−ジクロロベンジル）によるものであり得る。
（５）ＡｓｐまたはＧｌｕのカルボキシル基に対して、保護は、例えば、基（例えば、ＢＺＬ、ｔ−ブチル、シクロへキシル、シクロペンチルなど）を用いたエステル化によるものであり得る。
（６）Ｈｉｓのイミダゾール窒素に対しては、トシル部分が適切に使用され得る。
（７）Ｔｙｒのフェノール性ヒドロキシル基に対しては、保護基（例えば、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリチル、ＢＺＬ、クロロベンジル、４−ブロモベンジル、または２，６−ジクロロベンジルは、適切に使用される。好ましい保護基は、２，６−ジクロロベンジルである。
（８）ＡｓｎまたはＧｌｎの側鎖アミノ基に対しては、好ましくは、キサンチル（Ｘａｎ）が使用される。
（９）Ｍｅｔに対しては、好ましくは、アミノ酸が保護されないままである。
（１０）Ｃｙｓのチオ基に対しては、代表的には、ｐ−メトキシベンジルが、使用される。
【０１０５】
適切に選択された保護基（Ｌｙｓの場合、ＢＯＣ）は、Ｃ末端のアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ）のＮ−アミノ位を保護する。ＢＯＣ−Ｌｙｓ−ＯＨは、Ｈｏｒｉｋｉら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１６５−１６８（１９７８）に記載される手順に従って、または約２５℃で２時間攪拌しながらイソプロピルカルボジイミドを用いて、最初にベンジヒドリルアミンまたはクロロメチル化樹脂にカップリングされる。ＢＯＣ−保護されたアミノ酸の樹脂支持体へのカップリングに続き、α−アミノ保護基が、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはＴＦＡのみを用いて、除去される。この脱保護は、約０℃〜室温の温度で実行される。他の標準的な切断用試薬（例えば、ジオキサン中のＨＣｌ）、および特定のα−アミノ保護基の除去のための保護基は、文献中に記載される。
【０１０６】
αアミノ保護基の除去後、残存するαアミノおよび側鎖保護アミノ酸は、同様に所望の順序でカップリングされる。合成において各アミノ酸を別々に添加する工程の代替として、いくつかは、お互いにカップリングされ、その後、固相合成機へと添加される。適切なカップリング剤の選択は、当該分野の範囲内である。カップリング剤として特別に適切なのは、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドである。
【０１０７】
保護された各アミノ酸またはアミノ酸配列は、固相反応器中に過剰に導入され、そして上記カップリングは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）もしくはＣＨ２Ｃｌ２またはこれらの混合物の媒質（ｍｅｄｉｕｍ）中で適切に実行される。不完全なカップリングが生じると、カップリングの手順が反復され、その後、Ｎ−アミノ保護基が除去され、その後、次のアミノ酸がカップリングされる。各合成段階でのカップリング反応の成功が、モニタリングされ得る。合成をモニタリングする好ましい方法は、Ｋｌａｉｓｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，３４：５９５（１９７０）に記載されるようなニンヒドリン反応による。このカップリング反応は、周知の方法（例えば、ＢＩＯＳＥＡＲＣＨ  ９５００ＴＭペプチド合成機）を用いて、自動的に行われ得る。
【０１０８】
所望のペプチド配列が完成するとすぐ、保護されたペプチドは、樹脂支持体から切断され得、そしてすべての保護基が除去され得る。この切断反応および保護基の除去は、同時にまたは段階式に、適切に完遂される。この樹脂支持体が、クロロメチル化ポリスチレン樹脂である場合、このペプチドを樹脂に係留（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）する結合は、Ｃ末端残基の遊離のカルボキシル基と、樹脂マトリックス上に存在する多くのクロロメチル基の内の一つとの間に形成されるエステル結合である。エステル結合を破壊し、そして上記樹脂マトリックスを貫通し得ることが公知の試薬は、係留結合を切断し得ることが理解される。
【０１０９】
特に便利な一つの方法は、液体の無水フッ化水素を用いた処理によるものである。この試薬は、このペプチドを樹脂から切断するだけではなく、すべての保護基を除去する。従って、この試薬の使用は、十分に脱保護されたペプチドを直接的に産出する。クロロメチル化された樹脂が使用される場合、フッ化水素の処理により、遊離ペプチド酸が形成される。ベンズヒドリルアミン樹脂が使用される場合、フッ化水素処理により、遊離ペプチドアミンが直接的に生じる。アニソールおよびジメチルスルフィドの存在下、０℃、１時間での、フッ化水素との反応により、同時に側鎖保護基が除去され、この樹脂からペプチドが放出される。
【０１１０】
保護基を除去することなくこのペプチドを切断することが望まれる場合、保護されたペプチド樹脂は、メタン分解（ｍｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓ）を経て、Ｃ末端のカルボキシ基がメチル化された、保護されたペプチドを得得る。次いで、このメチルエステルは、穏やかなアルカリ条件下で加水分解され、遊離のＣ末端カルボキシル基が生じる。次いで、ペプチド鎖上の保護基は、強酸（例えば、液体フッ化水素）を用いた処理により除去される。メタン分解のために特に有用な技術は、Ｍｏｏｒｅら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｆｉｆｔｈ  Ａｍｅｒ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ．，Ｍ．ＧｏｏｄｍａｎおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｏｈｏｆｅｒ編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．，１９７７）、ｐ５１８−ｐ５２１に記載される技術であり、この技術では、保護されたペプチド−樹脂は、クラウンエーテルの存在下で、メタノールおよびシアニドカリウムで処理される。
【０１１１】
クロロメチル化された樹脂が使用される場合に、保護されたペプチドを、この樹脂から切断するための別の方法は、アンモニア分解またはヒドラジンを用いた処理による。所望の場合、生じたＣ末端アミドまたはヒドラジドは、遊離のＣ末端カルボキシ部分に加水分解され得、そして上記脱保護基は、便宜上除去され得る。
【０１１２】
Ｎ末端αアミノ基上に存在する保護基は、この保護されたペプチドが支持体から切断される前またはその後のいずれかに、優先的に除去され得ることもまた認識される。
【０１１３】
本発明のポリペプチドの精製は、代表的には、従来の手順（例えば、分取ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣを含む）もしくは他の公知のクロマトグラフィー技術（例えば、ゲルパーミエーション、イオン交換、分画クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（モノクローナル抗体カラムを含む）または向流分配を用いて達成される。
【０１１４】
本発明のペプチドは、重合により安定化され得る。これは、モノマー鎖を、多官能性架橋剤を用いて、直接的にまたは間接的にのいずれかで、多官能性ポリマーを介して、架橋することにより達成され得る。通常は、２種の実質的に同一のポリペプチドが、二官能性架橋剤を用いて、Ｃ末端またはＮ末端にて架橋される。この薬剤は、末端アミノ基および／または末端カルボキシル基を架橋するために使用される。一般的に、両末端カルボキシル基または両末端アミノ基は、お互いに架橋されるが、適切な架橋剤の選択により、一方のポリペプチドのαアミノ基は、もう一方のポリペプチドの末端カルボキシル基に架橋される。好ましくは、このポリペプチドは、システインを用いて、Ｃ末端にて置換される。当該分野で周知の条件下で、ジスルフィド結合は、末端システイン間で形成され得、これにより、このポリペプチド鎖を架橋する。例えば、ジスルフィドブリッジは、便宜上、遊離システインの金属触媒化酸化により、または適切に修飾されたシステイン残基の求核性置換により形成される。架橋剤の選択は、ポリペプチドに存在する、アミノ酸の反応性側鎖の同一性に依存する。例えば、ジスルフィド架橋は、システインがＣ末端以外のさらなる部位のポリペプチドに存在した場合には、好ましくない。本明細書中の範囲内にあるのは、メチレンブリッジで架橋されたペプチドである。
【０１１５】
上記ペプチド上の適切な架橋部位としては、Ｎ末端アミノ基およびＣ末端カルボキシル基を除き、リジン残基上に見出されるεアミノ基、ならびにアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基およびヒドロキシル基が挙げられ、これらは、フランキング配列中に導入されるペプチドまたは残基の内側残基の側鎖上に位置する。外部から架橋剤を添加することを介して、架橋は、例えば、当業者に公知の多くの試薬のいずれかを使用して（例えば、ポリペプチドのカルボジイミド処理を介して）、適切に達成される。多官能性（通常は二官能性）架橋剤の他の適切な例は、文献中に見出される。
【０１１６】
本発明のペプチドはまた、環化により、高次構造的に安定化され得る。このペプチドは、通常は、あるペプチドのＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインを、２種以上の反復ペプチド配列を含むシクロオリゴマー（各内部ペプチドは、実質的に同一の配列を有する）を形成するように、本発明の別のペプチドの対応するドメインに共有結合することにより環化される。さらに、環化ペプチド（シクロオリゴマーまたはシクロモノマー）は、架橋され、その中に２ペプチド〜６ペプチドを有する１−３の環状構造を形成する。上記ペプチドは、好ましくは、αアミノ基および主鎖カルボキシル基（頭部から尾部まで）を介して共有結合されず、Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ドメインに位置する残基の側鎖を介して架橋される。従って、架橋部位は、一般的に、残基の側鎖間に存在する。
【０１１７】
本明細書中で企図されるような、モノ環化ペプチドまたはポリ環化ペプチドを調製するための多くの適切な方法それ自体は、公知である。Ｌｙｓ／Ａｓｐの環化は、Ｆｍｏｃ／９−フルオレニルメチル（ＯＦｍ）側鎖保護作用（Ｌｙｓ／Ａｓｐに対する）を有する固相支持体上のナトリウム−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｎａ−Ｂｏｃ）−アミノ酸を用いて達成され；このプロセスは、ピペリジン処理、これに続く環化により完了される。
【０１１８】
ＧｌｕおよびＬｙｓ側鎖はまた、環式ペプチドまたは二環式環式ペプチドを調製する際に架橋される：上記ペプチドは、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂上の固相化学反応（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）により合成される。このペプチドは、樹脂から切断され、そして脱保護される。この環式ペプチドは、希釈されたメチルホルムアミド中のジフェニルホスホリルアジドを用いて形成される。代替的な手順については、Ｓｃｈｉｌｌｅｒら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，２５：１７１−１７７（１９８５）を参照のこと。また、米国特許第４，５４７，４８９号を参照のこと。
【０１１９】
ジスルフィド架橋されたペプチドまたは環化されたペプチドは、従来の方法により生成される。Ｐｅｌｔｏｎらの方法（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２９：２３７０−２３７５（１９８６））が適切である（Ｐｅｌｔｏｎらに記載される希釈反応混合物（シクロモノマーの生成について）より濃縮された溶液で反応を行うことにより、より大きな部分のシクロオリゴマーが生み出される場合を除く）。同一の化学的性質は、ダイマーまたはシクロオリゴマーまたはシアノモノマーの合成にとって有用である。また有用なのは、チオメチレンブリッジである。ＬｅｂｌおよびＨｒｕｂｙ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２５：２０６７−２０６８（１９８４）。また、Ｃｏｄｙら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８：５８３（１９８５）を参照のこと。
【０１２０】
所望の環式ペプチドまたは重合ペプチドは、ゲル濾過、これに続く逆相高圧液体クロマトグラフィーまたは他の従来の手順により、精製される。このペプチドは、滅菌濾過され、そして薬学的に受容可能な従来のビヒクルへと処方される。
【０１２１】
本明細書中に記載のプロセスに必要とされる出発物質は、文献中で公知であるか、または公知の方法および公知の出発物質を用いて調製され得る。
【０１２２】
作製されるペプチドにおいて、４個の非同一の置換基に結合された炭素原子が非対称性である場合、このペプチドは、ジアステレオ異性体、エナンチオマー、またはこれらの混合物として存在し得る。上記の合成は、ラセミ体、エナンチオマーまたはジアステレオマーを出発物質または中間体として使用し得る。例えば、このような合成物から生じるジアステレオマー生成物は、クロマトグラフィーの方法または結晶化の方法により分離され得る。同様に、エナンチオマー生成物の混合物は、同一の技術または当該分野で公知の他の方法により分離され得る。各不斉炭素原子は、存在する場合、２種の立体配置Ｒ）またはＳ）のうちの一方であり得、そして両方が、本発明の範囲内である。
【０１２３】
別の実施形態では、本明細書中の融合タンパク質のフラグメントは、アフィニティーマチュレーションされ得、その結果、上記フラグメントは、ＩＧＦ−Ｉおよび／またはＩＧＦ−ＩＩに対して、親フラグメントより十分な親和性を有する。このようなアフィニティーマチュレーションは、例えば、ファージディスプレイ、合理的な突然変異誘発、ランダムな突然変異誘発、またはＤＮＡシャッフリング（ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）およびファージディスプレイ、またはこの変化を達成するための、当該分野で公知のこのような他の任意の手段を介して、行われ得る。定義の節に述べられた参考文献を参照のこと。
【０１２４】
（２．用途）
本明細書中に開示された適用に関して、融合タンパク質を用いることには、多くの利点がある。例えば、哺乳動物の系は、野生型ＩＧＦＢＰ−３の工業上の生産について費用がかかる。他方では、ペプチド融合体は、当業者に周知の合成化学的方法または非常に効率的な生物学的産生系を用いれば、野生型ＩＧＦＢＰ−３よりも廉価で生産しやすいことが予想される。
【０１２５】
本明細書中のペプチドは、診断用アッセイ（例えば、特定の細胞中、組織中、または血清中の、ＩＧＦ−１の発現を検出するためのアッセイ）において有用であり得る。
【０１２６】
診断上の適用に関して、上記ペプチドは、代表的には、検出可能な部分で標識される。多くの標識が、利用可能であり、これらは、一般的に以下のカテゴリーへと分類され得る：
（ａ）放射性同位元素（例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２１Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉ）が利用可能である。このペプチドは、放射性同位元素を用いて、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻および第２巻、Ｃｏｌｉｇｅｎら、編（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）に記載される技術を用いて標識され得、そして放射活性は、シンチレーション計数を用いて測定され得る。
（ｂ）蛍光標識（例えば、希土類キレート（ユーロピウムキレート）またはフルオロセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリンおよびテキサスレッド）が利用可能である。蛍光標識は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（前出）に開示されるような技術を用いて、ペプチドに結合体化され得る。蛍光は、蛍光計を用いて定量化され得る。
（ｃ）種々の酵素−基質標識が利用可能であり、そして米国特許第４，２７５，１４９号は、これらのいくつかの概説（ｒｅｖｉｅｗ）を提供する。この酵素は、一般的には、種々の技術を用いて測定され得る発色体基質の化学変化（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を触媒する。例えば、この酵素は、基質の色彩の変化を触媒し得、この色彩の変化は、分光光度法で測定され得る。あるいは、この酵素は、基質の蛍光または化学発光を変更し得る。蛍光の変化を定量するための技術は、上に記載されている。上記化学発光基質は、化学反応により電気的に励起され、次いで、（例えば、化学照度計を用いて）測定され得る光を放出するか、またはエネルギーを蛍光受容器に付与し得る。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌性ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸ジヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＰＲＯ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体に結合体化するための技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．ＬａｎｇｏｎｅおよびＨ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ編），７３：１４７−１６６（Ａｃａｄｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）に記載されている。
【０１２７】
酵素−基質の組み合わせの例としては、例えば：
（ｉ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と（基質としての）過酸化水素の組み合わせ（ここで、過酸化水素は、色素前躯体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、または塩酸３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を酸化する）；
（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と（色素体形成基質としての）パラニトロフェニルホスフェートとの組み合わせ；そして
（ｉｉｉ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と色素形成基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生的基質（４−メチルウンベリフリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）との組み合わせ
が挙げられる。
【０１２８】
多くの他の酵素−基質の組み合わせが、当業者に利用可能である。これらの全体的な概説としては、米国特許第４，２７５，１４９号および同第４，３１８，９８０号を参照のこと。
【０１２９】
時として、この標識がペプチドに間接的に結合される場合がある。当業者は、これを達成するための種々の技術を知っている。例えば、上記ペプチドは、ビオチンと結合体化され得、そして上に言及される任意の３種の広汎なカテゴリーの標識のいずれかは、アビジンと結合体化され得、逆も成り立つ。ビオチンは、選択的にアビジンに結合体化する。従って、この標識は、この間接的な様式でペプチドと結合体化され得る。あるいは、この標識とペプチドとの間接的な結合体化を達成するために、このペプチドは、低分子のハプテン（例えば、ジゴキシン）と結合体化され、上に言及される異なる型の標識の一つは、抗ハプテンペプチド（例えば、抗ジオキシン抗体）と結合される。このようにして、上記標識と上記ペプチドとの間接的な結合体化が、達成され得る。
【０１３０】
本発明の別の局面では、このペプチドは、標識される必要がなく、そしてこのペプチドの存在は、このペプチドに結合する標識化抗体を用いて検出され得る。
【０１３１】
本発明のペプチドは、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合的な結合アッセイ、直接的なサンドウィッチアッセイおよび間接的なサンドウィッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ）において使用され得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。
【０１３２】
このペプチドはまた、インビボの診断用アッセイのために使用され得る。一般的に、このペプチドは、放射性核種（例えば、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ、または３５Ｓ）で標識され、その結果、抗原または抗原を発現する細胞は、イムノシンチノグラフィーを用いて局在化され得る。
【０１３３】
他の用途としては、ｂｐ１５およびＩＧＦＢＰ−３および他のＩＧＦペプチドアゴニストの結合エピトープのマッピングが挙げられる。さらに、ＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩまたはこれらを含む融合タンパク質に結合するＩＧＦＢＰ−３フラグメントは、細胞ベースのアッセイにおいて使用され得る。このような特定のアッセイは、細胞とネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３とではなく、細胞と上記融合タンパク質とを接触させる工程、およびネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３、ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉもしくはネイティブ配列ＩＧＦ−ＩＩに起因する生物学的活性、または上記ＩＧＦ−Ｉもしくは上記ＩＧＦ−ＩＩのアゴニストの生物学的活性が観察されるか否かを決定する工程を包含する。一つの実施形態では、この生物学的活性は、ＩＧＦ−Ｉとは無関係のネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３のアポトーシスである。別の例では、このアッセイは、ＩＧＦ−依存性ＫＩＲＡリン酸化アッセイである。このアッセイは、ＩＧＦ−Ｉキナーゼレセプター活性化アッセイであり、そしてこれは、ヒト１型レセプターの直接的な活性アッセイである。チロシンキナーゼファミリーにおけるレセプター（例えば、１型ＩＧＦレセプター）が活性化される場合、このレセプターは、チロシン残基上でリン酸化される。このアッセイにおいて、１型ＩＧＦレセプターを含む細胞は、インビトロで活性化され、次いで、崩壊され、そして、レセプターに対する抗体が使用され、ＩＧＦレセプターを沈殿させる。次に、抗ホスホチロシン抗体が、リン酸化された１型ＩＧＦレセプターの量をアッセイするために使用される。固定数の細胞が使用される場合、リン酸化されるレセプターの量は、１型ＩＧＦレセプター上の分子の活性の直接的な基準である。このＫＩＲＡアッセイにおいて、細胞（例えば、乳癌細胞株）は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩプラス融合タンパク質で処理され、そして融合タンパク質の生物学的活性が、リン酸化されたレセプターの量により決定される。ＫＩＲＡアッセイは、米国特許第６，２５１，８６５号（ここでは、ＭＣＦ−７乳癌細胞が一実施形態として用いられる）およびＣｈｅｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，２８４：Ｅ１１４９−Ｅ１１５５（２００３）において、さらに記載される。
【０１３４】
なお別の実施形態では、上記生物学的活性は、放射標識されたＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの上記細胞への結合の阻害である。
【０１３５】
さらなる例は、乳癌細胞を、ＩＧＦＢＰ−３フラグメントまたはその融合タンパク質で前処理する工程を包含する方法であり、このＩＧＦＢＰ−３フラグメントまたはその融合タンパク質は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを、少なくとも約２４時間結合し、その後、この細胞を、アポトーシス因子（例えば、化学療法剤（例えば、ドキソルビシンもしくはパクリタキセル）およびネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３もしくは上記ＩＧＦＢＰ−３フラグメントまたは融合タンパク質で処理する工程、ならびに上記前処理または処理が、アポトーシス因子を用いた処理により誘導されるアポトーシスを増強するか否か、または前処理もしくは処理の量がこの目的に有効であるか否かを決定する工程を包含する。
【０１３６】
キットはまた、本発明の目的のために企図される。このキットは、一般的に、上記融合タンパク質を含有する組成物およびその使用（例えば、アッセイにおける使用）のための説明書を含む容器を含む。代表的なキットは、上記融合タンパク質を緩衝液中に含有する融合タンパク質処方物のための容器（好ましくは、バイアル）、および使用者に（例えば、エピトープをマッピングするためもしくは細胞ベースのアッセイのための）処方物を利用するように指示する説明書（例えば、製品挿入物またはラベル）を含む。このキットは、必要に応じて、融合タンパク質と一緒に使用される薬剤のために、容器（好ましくは、バイアル）を含む。
【０１３７】
本発明は、以下の実施例を、参照することにより、より十分に理解される。しかし、これらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書中に言及されるすべての文献、特許の引用は、参考として明白に援用される。
【実施例】
【０１３８】
（実施例１）
（ＩＧＦＢＰ−３およびミニＢＰ−３融合タンパク質の産生）
（イントロダクション）
ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３およびミニＢＰ−３融合タンパク質を調製し、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭアッセイにおけるネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの直接的な結合を評価した。
【０１３９】
以下に記載されるミニＢＰ−３融合タンパク質を用いた実験の結果に基づき、本明細書中で特許請求されるこの型の分子が、活性なＩＧＦのレベルを低減することが予想される。
【０１４０】
（材料と方法）
（野生型のＩＧＦＢＰ−３およびミニＢＰ−３融合体および切断されたミニＢＰ−３の発現と精製）
野生型ＩＧＦＢＰ−３およびミニＢＰ−３を、ベクターｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）を用いて、以下のようにしてＥ．ｃｏｌｉ中で生産した：
慣用的な化学試薬をすべて、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ）より購入した。制限酵素およびＴ４  ＤＮＡリガーゼを、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ）より取得した。オリゴヌクレオチド合成試薬、ＤＮＡ配列決定キット、およびＰＣＲのキットを、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）より取得した。ｄＮＴＰ、ＩＰＴＧ、およびＡＴＰを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）より購入した。ＤＮＡポリメラーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）より購入した。
【０１４１】
プラスミドｐＥＴ２１ａを、Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）より購入した。アフィニティーカラムを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から得た。ＬＢ培地を、標準的処方に従って調製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。ＨＥＰＥＳ緩衝液およびＣＨＡＰＳ緩衝液ならびにＤＴＴは、以下に示される供給源より取得可能である。周辺質の抽出緩衝液は、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５および１ｍＭのＥＤＴＡを含んだ。ＴＥ緩衝液は、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ。
【０１４２】
オリゴデオキシリボヌクレオチドを、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの３９４自動化ＤＮＡ合成機を用いて合成した。ＰＣＲおよび配列決定用プライマーを、エタノール沈殿により精製し、そしてＴＥ緩衝液中に溶解した。上記Ｚドメインを、プライマー
【０１４３】
【化３】
2007537711.tif 000005
および
【０１４４】
【化４】
2007537711.tif 000006
を用いた、ベクターｐＡ−１００−Ｚ（これは、Ｄｅｎｎｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０：９５１３（２００１）に記載される構築物に由来する）のＰＣＲにより増幅した。増幅したＺドメインを、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして同一対の制限酵素で処理したクローニングベクターｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に連結し、そしてｐＥＴ２１ａ−Ｚドメイン融合体を生成した。Ｚドメインの挿入を、配列決定により確認した。
【０１４５】
ミニＢＰ−３融合体のコード領域を、Ｓｔｅｍｍｅｒら、Ｇｅｎｅ，１６４：４９−５３（１９９５）の遺伝子組み立て方法を用いてＰＣＲにより合成した。遺伝子組み立てのために使用されたオリゴヌクレオチドは、以下の配列：
【０１４６】
【化５】
2007537711.tif 000007
【０１４７】
【化６】
2007537711.tif 000008
【０１４８】
【化７】
2007537711.tif 000009
および
【０１４９】
【化８】
2007537711.tif 000010
を有した。組み立てられた遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチド：
【０１５０】
【化９】
2007537711.tif 000011
および
【０１５１】
【化１０】
2007537711.tif 000012
を用いて増幅した。
【０１５２】
全長の融合ミニＢＰ−３タンパク質をコードする遺伝子を、ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００ＴＭサーモサイクラー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃａｏら、Ｇｅｎｅ，１９７：２０５−２１４（１９９７）に記載の通りに、プライマーを用いて増幅した。増幅産物を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして同一対の制限酵素で処理したｐＥＴ２１ａ−Ｚ−ドメイン含有ベクターへと連結し、ｐＥＴ２１ａ−ミニＢＰ−３融合体を生成した。ミニＢＰ−３フラグメントの挿入を、配列決定により確認した。エンテロキナーゼ切断部位ＥＦＧＧＤＤＤＤＫ（配列番号４）を、後に、ＱＵＩＣＫＣＨＡＮＧＥＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いて、カスパーゼ−３切断部位のＥＦＧＧＤＬＶＤ（配列番号７）と置換した。これらの２種の突然変異誘発プライマーは、配列：
【０１５３】
【化１１】
2007537711.tif 000013
および
【０１５４】
【化１２】
2007537711.tif 000014
を有した。上記変異体を、配列決定により確認した。
【０１５５】
このベクターで、Ｅ．ｃｏｌｉのＢＬ２１株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。ｐＥＴ発現ベクター中の挿入物を、両方向に配列決定し、上記プラスミド構築物にＰＣＲのエラーまたはライゲーションのエラーがないことを確かめた。
【０１５６】
この細胞を、３７℃で一晩、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ＹＴ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）で増殖させた。一晩培養した培養物を、同一の倍地中に１００倍希釈し、培養物の６００ｎｍでの光学密度が０．５に達するまで培養し、次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が５０μＭになるまで添加することにより誘導し、そして同一の条件下でさらに４時間増殖させた。細胞を、遠心分離により収集し、周辺質抽出緩衝液（−２０℃／４℃）中で凍結／解凍し、そしてＣａｏら（前出）に記載されるように、遠心分離により浄化した。
【０１５７】
ＩｇＧ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭイオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、Ｎｉｌｓｓｓｅｎら（前出）に記載されるように、遠心分離からの周辺質の抽出物を、クロマトグラフィーに供した。簡単に、このカラムを、５容積の５０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％  ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ緩衝液（ＴＳＴ））で洗浄し、次いで、代替的に０．５Ｍの酢酸（ＨＡｃ）、ｐＨ３．４およびＴＳＴで２回洗浄した。このカラムを、ＴＳＴで平衡化し、そして融合タンパク質をカラム上で捕捉した（Ｎｉｌｓｓｏｎら、前出に記載されるように）。このカラムを、１０の総容積（ｂｅｄ）のＴＳＴおよび２の総容積の酢酸アンモニウム（５ｍＭ）（溶出前はｐＨ５．０）で洗浄した。
【０１５８】
上記融合タンパク質を４の総容積の０．５ＭのＨＡｃで溶出した後、これを、１２５ｎＭのカスパーゼ−３（これは、親切にも、Ｔｈｅ  Ｂｕｒｎｈａｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡのＤｒ．Ｇｕｙ  Ｓａｌｖｅｓｅｎが提供してくれた）と一緒に、１００ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ＰｒｏＳｃｉＴｅｃｈ）、０．１％のＣＨＡＰＳ溶解緩衝液（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、０．５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）中で、ｐＨ７．５、４℃で一晩インキュベートした。切断されたミニＢＰ−３を、遠心分離後の反応の上清から回収した。この融合タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、これに続いて、過剰負荷されたゲルを慣用的なクマシーブルーＲ染色で視覚化したことにより立証した。図２を参照のこと。図２は、種々の段階のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【０１５９】
野生型ＩＧＦＢＰ−３を発現するＢＬ２１細胞を培養し、そしてミニＢＰ−３の場合と同様に発現を誘導した。野生型ＩＧＦＢＰ−３を、封入体から抽出し、そして標準的条件を用いて、インビトロで再度フォールディングさせた。ＱおよびＳの両方のＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムによるイオン交換クロマトグラフィーおよびフェニルＳＵＰＥＲＯＳＥＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムによる疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、精製を達成した。
【０１６０】
（バイオセンサー反応速度測定）
野生型ＩＧＦＢＰ−３およびミニＢＰ３融合タンパク質のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対する結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００リアルタイム速度相互作用分析系（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて決定し、会合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）を測定した。２種の型のチップを、この目的で調製した。
【０１６１】
（ＣＭ５チップ調製）
カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、業者の説明書に従ってＥＤＣ（塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸）で活性化した。固定化のため、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４）において、野生型ＩＧＦＢＰ−３および変異体をバイオセンサーチップ上に、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で注入し、約４５０−７００ＲＵ（共鳴反応の単位）の共有結合されたタンパク質を得た。未反応の基を、１Ｍのエタノールアミンの注入により遮断した。
【０１６２】
反応速度測定を、２０μｌ／分または５０μｌ／分の流速を用いて、２５℃のＰＢＳＴランニング緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％  ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ緩衝液、０．０１％のアジ化ナトリウム）中のＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの２倍での段階希釈物の注入により行った。ＩＧＦＢＰ−３に関しては、ＩＧＦ濃度の範囲は、０．４ｎＭ〜５０ｎＭの間であり、ミニＢＰ−３融合体に関しては、１００ｎＭ〜２５μＭの間であった。両タンパク質に関しては、結合速度および解離速度を１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ会合モデルを用いて、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ評価ソフトウェアにおいて計算した。野生型ＩＧＦＢＰ−３に関しては、平衡解離定数を、ｋｄ／ｋａとして計算した。ミニＢＰ−３融合体に関しては、平衡解離定数を、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍＴＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）中の平衡結合データをプロットし、一部位結合モデルにあてはめることにより計算した。
【０１６３】
（ＳＡチップ調製）
ストレプタビジンで被覆したチップを、製造業者（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）の説明書に従って調整し、その後、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４）中の０．０２ｍｇ／ｍｌのビオチニル化したＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを注入した。ビオチニル化したＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを、製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ）の説明書に従って、ＥＺ−Ｌｉｎｋビオチニル化試薬を用いて調製した。１００ＲＵ〜１０００ＲＵを、チップ上に固定した。
【０１６４】
反応速度測定を、ミニＢＰ−３融合タンパク質の２倍での段階希釈物を、ＰＢＳＴランニング緩衝液中に、５０μｌ／分で注入することにより行った。濃度は、２５０ｎＭ〜３２μＭであった。
【０１６５】
競合結合実験を、以下のようにして行った。１５ｎＭ〜１００μＭのｂｐ１５ペプチドおよび２０ｎＭのＩＧＦＢＰ−３を、１時間室温でインキュベートし、その後、ＰＢＳＴ中に、固定化したビオチン化ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ上を、２０μｌ／分で注入した。平衡結合データを、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍＴＭソフトウェアでプロットし、そして一部位競合結合モデルにあてはめた。
【０１６６】
（結果）
野生型ＩＧＦＢＰ−３およびミニＢＰ−３融合タンパク質を、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭの器機を用いた反応速度分析のために提示し、そしてＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの結合親和性を試験した。この結果を、野生型ＩＧＦＢＰ−３については表Ｉに、そしてミニＢＰ−３融合タンパク質については表ＩＩに示す。
【０１６７】
【表１】
2007537711.tif 000015
【０１６８】
【表２】
2007537711.tif 000016
表Ｉの結果（図３および図４もまた参照のこと）は、ＩＧＦＢＰ−３がＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対して高い親和性を有し、これらが文献中の他の測定値に有利に匹敵することを示す。表Ｉと比較した場合、表ＩＩの結果（図５および図６もまた参照のこと）は、ミニＢＰ−３融合タンパク質が、野生型ＩＧＦＢＰ−３と比較してＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対して、親和性が低いことを示す。任意の一つの理論に限定されることなく、これが主としてオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の増加に起因すると考えられている。ＩＧＦＢＰ−３の他のフラグメントに関する研究は、表ＩＩＩに示されるような同様の知見を示す。
【０１６９】
【表３】
2007537711.tif 000017
（実施例２  ミニＢＰ−３融合体へのペプチドｂｐ１５の結合）
ペプチドｂｐ１５（ＳＥＥＶＣＷＰＶＡＥＷＹＬＣＮ）（配列番号１１）を、ファージディスプレイにより同定した（Ｌｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８、前出）。実施例Ｉに記載されるように、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ分析により決定される場合、ｂｐ１５は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩと、ＩＧＦＢＰ−３に対する結合について競合する。従って、ｂｐ１５がミニＢＰ−３融合体に結合するかを調べるために、ｂｐ１５を試験した。図７および図８（それぞれ、ｂｐ１５とＩＧＦＢＰ−３の競合的結合データおよびｂｐ１５とミニＢＰ−３融合体の競合的結合データに関する）を比較のこと。
【０１７０】
ペプチドｂｐ１５は、ミニＢＰ融合を結合するが、野生型ＩＧＦＢＰ−３と比較すると、親和性が低減していることがわかり得る。正確な親和性は、飽和の欠如のために、決定されないかもしれない。
【０１７１】
（考察）
上記ミニＢＰ−３融合体は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対して結合親和性を有する。この親和性は、他のＩＧＦＢＰ−３のＮ末端フラグメントの親和性に比して低減している。それにもかかわらず、上記ミニＢＰ−３融合体は、少なくとも一部のｂｐ１５ペプチド結合部位を含む。ＩＧＦＢＰ−３のＮ−末端フラグメントはまた、ＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦ−非依存性作用と関連している。例えば、Ａｎｇｅｌｌｏｚ−Ｎｉｃｏｕｄら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ＆  ＩＧＦ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８：７１−７５（１９９０）；Ｌａｌｏｕら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７（８）：３２０６−３２１２（１９９６）；Ｙａｍａｎａｋａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０（３）：１３１９−１３２８（１９９９）；Ｍａｉｌｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０（９）：４０４０−４０４５（１９９９）；Ｓａｌａｈｉｆａｒら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ＆  ＩＧＦ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０：３６７−３７７（２０００）；およびＢｅｒｎａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２９３：５５−６０（２００２）を参照のこと。
【０１７２】
ミニＢＰ−３またはＩＧＦＢＰ−３フラグメントを含む融合タンパク質を用いる細胞ベースのアッセイは、これらのＩＧＦ非依存性の事象を検出するために開発され得る。従って、Ｇｉｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５６０２−２５６０７（１９９７）およびＦｏｗｌｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８８：４４８−４５３（２０００）により実行された実験において、乳癌細胞は、ＩＧＦＢＰ−３を用いて２４時間処理され、その後、パクリタキセル（およびＩＧＦＢＰ−３）を添加した。ＩＧＦＢＰ−３のみを用いた細胞の処理では、アポトーシスを誘導するのに十分ではないが、ＩＧＦＢＰ−３で前処理を行うと、パクリタキセル処理により誘導されるアポトーシスが増強される。ミニＢＰ−３融合タンパク質、ＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩおよびこれらの融合体タンパク質に結合するＩＧＦＢＰ−３のフラグメントは、これらが細胞死の増強の原因である活性を含む場合、このアッセイにおいて、野生型ＩＧＦＢＰ−３に代わって有用であると予想されている。この融合タンパク質またはフラグメントを使用する利点は、これらが上に述べられたようなインタクトなＩＧＦＢＰ−３に比べて、大量に作製しやすいことにある。
【０１７３】
これらのアポトーシスアッセイに加えて、細胞ベースのアッセイが、ＩＧＦ依存性ＫＩＲＡアッセイおよび放射標識されたＩＧＦ結合阻害のために使用され得る。なぜなら、野生型のＩＧＦＢＰ−３は、任意の一つの理論に限定されることはないが、恐らくは、その固有のレセプターに対する結合のためにいくつかの細胞上の結合を阻害しない。例示的な細胞ベースのＩＧＦ−１  ＫＩＲＡアッセイにおいて、ヒト１型ＩＧＦ−１レセプターの活性化を測定するためのＫＩＲＡは、ヒトＭＣＦ−７細胞を用いて行われる。細胞を、一晩９６ウェルプレート中で、培地（５０：５０の  Ｆ１２／ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）を用いて培養（ｇｒｏｗ）する。上清を、デカントし、そしてコントロール（野生型ＩＧＦＢＰ−１もしくは野生型ＩＧＦＢＰ−３で前培養した２ｎＭのＩＧＦ−１）または実験サンプル（３０分間２ｎＭのＩＧＦ−１で前培養したミニＢＰ−３を含む融合タンパク質）のいずれかを含む刺激培地（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ）（２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２．０％のＢＳＡを含有する５０：５０のＦ１２／ＤＭＥＭ）が添加される。１５分の刺激の後、この細胞を溶解し、そしてイムノソルベントプレートに一晩被覆したポリクローナル抗ＩＧＦ−１Ｒ（３Ｂ７；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加えた。検出ＥＬＩＳＡを行い、そしてＫＩＲＡの結果は、野生型ＩＧＦＢＰ−３の阻害とほぼ同程度の、ミニＢＰ−３を含む融合タンパク質の阻害、またはＩＧＦ−Ｉレセプター結合よりも恐らく大きな阻害を示すことが予想され、そしてこの阻害は、ミニＢＰ−３フラグメントがファージディスプレイもしくは当業者に公知の他の手段によりアフィニティーマチュレーションされる場合、改善される可能性がある。
【０１７４】
本発明は、特定の方法および材料を参照することにより、本明細書中でやむを得ず考察される。これらの特定の方法および材料の考察が、本発明の範囲を限定するものとは決して解釈されず、これは、本発明の目的を達成するのに適した、いずれかおよびすべての代替の物質および方法に拡張することが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】図１は、ミニＢＰ−３融合タンパク質の概略図を示す。これは、配列番号７（これは、カスパーゼ３切断部位（配列番号２）を含み、これには下線が引かれている）を有する切断可能なリンカーを用いた、Ｚドメイン（配列番号１０）のミニＢＰ−３（ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３の残基４７−残基９９（配列番号１））への融合体である。
【図２】図２は、ミニＢＰ−３融合タンパク質および切断されたタンパク質ミニＢＰ−３の、種々のクロマトグラフィーの画分のクマシーブルー染色を用いた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図３】図３は、固定化されたネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３へのネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉ結合のバイオセンサー分析を示す。
【図４】図４は、固定化されたネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３へのネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩＩ結合のバイオセンサー分析を示す。
【図５】図５は、固定化されたミニＢＰ−３融合タンパク質へのネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉ結合の分析を示す。
【図６】図６は、固定化されたミニＢＰ−３融合タンパク質へのネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩＩ結合の分析を示す。
【図７】図７は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ分析機で行われたペプチドｂｐ１５（ＳＥＥＶＣＷＰＶＡＥＷＹＬＣＮ）（配列番号１１）の競合実験の結果を示す。全部で１５ｎＭ〜１００μＭのｂｐ１５ペプチドおよび２０ｎＭのネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３を、１時間室温でインキュベートし、その後、固定化されたビオチン化ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ上に注入した。
【図８】図８は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ分析機で行われたペプチドｂｐ１５（配列番号１１）の競合実験の結果を示す。全部で１．１７μＭ〜３００μＭのｂｐ１５ペプチドおよび１μＭのミニＢＰ−３融合タンパク質を、１時間室温でインキュベートし、その後、固定化されたビオチン化ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉ上に注入した。
【図１】
2007537711.tif 000018
【図２】
2007537711.tif 000019
【図３】
2007537711.tif 000020
【図４】
2007537711.tif 000021
【図５】
2007537711.tif 000022
【図６】
2007537711.tif 000023
【図７】
2007537711.tif 000024
【図８】
2007537711.tif 000025
【配列表】
2007537711000001.app
【国際調査報告】
2007537711.tif 000026
2007537711.tif 000027
2007537711.tif 000028
2007537711.tif 000029
2007537711.tif 000030
2007537711.tif 000031