(57)【要約】  本発明は、ＩＡＰポリペプチドの発現を阻害する核酸塩基オリゴマーおよび核酸塩基オリゴマー複合体、ならびにそれらを細胞内でのアポトーシス誘導に使用する方法を提供する。本発明の核酸塩基オリゴマーおよび核酸塩基オリゴマー複合体は、医薬組成物の形成にも使用できる。本発明は、本発明の核酸塩基オリゴマーおよび核酸塩基オリゴマー複合体を、化学療法剤または化学増感剤と併用して投与することにより、細胞内でアポトーシスを誘導する方法を提供することも特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＸＩＡＰ（配列番号２１）、ＨＩＡＰ−１（配列番号５３）、またはＨＩＡＰ−２（配列番号４７）に対応する少なくとも８個であり３０個を超えない連続的核酸塩基を含む二本鎖であって、細胞内でのＩＡＰポリプチドの発現を低減できる該二本鎖を含む実質的に純粋な核酸塩基オリゴマー。
【請求項２】
前記二本鎖が２１個から２９個までの核酸塩基を含む第一の領域と、生理学的条件下で該第一の領域と対合する第二の領域とを含み、該第一の領域と該第二の領域とは一本鎖ループで結合されている、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項３】
前記ループが６個から１２個までの核酸塩基からなる、請求項２に記載のオリゴマー。
【請求項４】
前記ループが８個の核酸塩基からなる、請求項２に記載のオリゴマー。
【請求項５】
前記二本鎖が配列番号３２〜３６からなる群から選択され、前記オリゴマーがＸＩＡＰの発現を低減させる、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項６】
前記二本鎖が配列番号４２〜４６からなる群から選択され、前記オリゴマーがＨＩＡＰ−２の発現を低減させる、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項７】
対合したセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む核酸塩基オリゴマー複合体であって、ＸＩＡＰ（配列番号２１）、ＨＩＡＰ−１（配列番号５３）、およびＨＩＡＰ−２（配列番号４７）のいずれか一つの配列に対応する８個から３０個までの連続的核酸塩基を含み、細胞内でのＩＡＰポリプチドの発現を低減できる複合体。
【請求項８】
前記複合体が配列番号１〜３１のいずれか一つを含む、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
前記複合体が配列番号３７〜４１および配列番号５４〜６３のいずれか一つを含む、請求項７に記載の複合体。
【請求項１０】
前記複合体がｄｓＲＮＡである、請求項８に記載の複合体。
【請求項１１】
前記複合体が修飾を少なくとも一つ有する、請求項８に記載の複合体。
【請求項１２】
前記複合体が修飾を少なくとも二つ有する、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
前記修飾が糖部、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合を改変したものである、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１４】
前記修飾が、チオリン酸エステル結合、メチルホスホン酸エステル結合、リン酸三エステル結合、ジチオリン酸エステル結合、およびセレンリン酸エステル結合からなる群から選択されるヌクレオシド間結合を改変したものである、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
前記修飾が糖部を改変したものである、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１６】
前記改変された糖部が２’−Ｏ−メチル基または２’−Ｏ−メトキシエチルである、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１７】
前記修飾が核酸塩基を改変したものである、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１８】
前記改変された核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項１７に記載の複合体。
【請求項１９】
前記改変された核酸塩基がキメラ核酸塩基オリゴマーである、請求項１７に記載の複合体。
【請求項２０】
前記キメラ核酸塩基オリゴマーが複数のＲＮＡ残基を含む、請求項１９に記載の複合体。
【請求項２１】
前記ＲＮＡ残基がチオリン酸エステル結合で互いに結合している、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の核酸塩基オリゴマーまたは核酸塩基オリゴマー複合体をコードする発現ベクター。
【請求項２３】
前記核酸塩基オリゴマーまたは核酸塩基オリゴマー複合体をコードする核酸配列が、プロモーターに稼動可能に結合している、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
前記プロモーターがＵ６ＰｏｌＩＩＩプロモーターまたはポリメラーゼＩＩＩＨ１プロモーターである、請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２１に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項２６】
前記細胞が前記発現ベクターを安定して発現する形質転換ヒト細胞である、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで形質転換される、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２８】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
前記細胞が新生細胞である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記細胞がヒトに存在する、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３１】
細胞内のアポトーシスを促進させる方法であって、細胞内のアポトーシスを促進させるのに十分な量の請求項１に記載の核酸塩基オリゴマーまたは請求項８に記載の核酸塩基オリゴマー複合体を、該細胞に対し接触させることを含む方法。
【請求項３２】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで接触させられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が癌細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞がヒト由来である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
細胞内のアポトーシスを促進させる方法であって、（ｉ）請求項１に記載の核酸塩基オリゴマーまたは請求項８に記載の核酸塩基オリゴマー複合体、および（ｉｉ）化学療法剤を併用して細胞内のアポトーシスを促進させるのに十分な量だけ該細胞に対し接触させることを含む方法。
【請求項３８】
前記化学療法剤が表５に示す薬剤から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
細胞内のアポトーシスを促進させる方法であって、（ｉ）請求項１に記載の核酸塩基オリゴマーまたは請求項８に記載の核酸塩基オリゴマー複合体、および（ｉｉ）化学増感剤を併用して細胞内のアポトーシスを促進させるのに十分な量だけ該細胞に対し接触させることを含む方法。
【請求項４０】
治療を必要とする個体内における増殖性疾患を治療する方法であって、請求項１に記載の核酸塩基オリゴマーまたは請求項８に記載の核酸塩基オリゴマー複合体を、該個体を治療するのに有効な量だけ該個体に投与することを含む方法。
【請求項４１】
治療を必要とする個体内における増殖性疾患を治療する方法であって、（ｉ）請求項１に記載の核酸塩基オリゴマーまたは請求項８に記載の核酸塩基オリゴマー複合体、および（ｉｉ）化学療法剤を、該個体を治療するのに十分な量だけ該個体に投与することを含む方法。
【請求項４２】
治療を必要とする個体内における増殖性疾患を治療する方法であって、（ｉ）請求項１に記載の核酸塩基オリゴマーまたは請求項８に記載の核酸塩基オリゴマー複合体、および（ｉｉ）化学増感剤を、該個体を治療するのに十分な量だけ該個体に投与することを含む方法。
【請求項４３】
前記動物がヒトである、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記増殖性疾患が癌である、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記癌が、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、ホジキン病、非ホジキン病、ヴァルデンシュトレームマクログロブリン血症、H鎖病、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、軟骨腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状膠細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、稀突起膠腫、神経線維腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
（ｉ）請求項１に記載の核酸塩基オリゴマーまたは請求項８に記載の核酸塩基オリゴマー複合体、および
（ｉｉ）該核酸塩基オリゴマーまたは核酸塩基オリゴマー複合体を、増殖性疾患を有する個体に該増殖性疾患を治療するのに十分な量だけ投与するための使用説明書
を含むキット。
【請求項４７】
（ｉ）請求項１に記載の核酸塩基オリゴマーまたは請求項８に記載の核酸塩基オリゴマー複合体、および
（ｉｉ）該核酸塩基オリゴマーまたは核酸塩基オリゴマー複合体、および化学療法剤を、増殖性疾患を有する個体に該増殖性疾患を治療するのに十分な量だけ投与するための使用説明書
を含むキット。
【請求項４８】
（ｉ）請求項１に記載の核酸塩基オリゴマーまたは請求項８に記載の核酸塩基オリゴマー複合体、および
（ｉｉ）該核酸塩基オリゴマーまたは核酸塩基オリゴマー複合体、および化学増感剤を、増殖性疾患を有する個体に該増殖性疾患を治療するのに十分な量だけ投与するための使用説明書
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＡＰ核酸塩基オリゴマーおよび核酸塩基オリゴマー複合体ならびにアポトーシスの誘起にそれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の死に方の一つはアポトーシスまたはプログラム細胞死と呼ばれている。アポトーシスは、発育の正常な一部として、また、健常な組織の維持のために、頻繁に生じている。アポトーシスの過程は非常に早いため、検知はむずかしい。
【０００３】
アポトーシスが、胚発生、ウイルス発病、癌、自己免疫疾患、神経変性病、さらには他の事象において非常に重要な役割を担っていることがわかっている。アポトーシス応答の障害は、癌、赤斑性狼瘡および多発性硬化症等の自己免疫疾患、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノウイルスが関係するものを含めウイルス感染の発生に影響する。
【０００４】
癌におけるアポトーシスの重要性は近年明らかになってきている。１９７０年代後半の発癌遺伝子による癌成長促進の発見により、長年癌生物学の研究において主流であった細胞の増殖にほぼ世界中が注目した。長年ドグマがはびこり、「正常な」細胞よりは早く分裂する癌細胞を優先的に標的とする抗癌治療がおこなわれてきた。いくつかの成長が遅い腫瘍は治療が容易であり、一方多くの早急に分裂する腫瘍種は抗癌治療に対し極端に耐性が高いために、必ずしも満足できるものではなかった。研究の進展により、腫瘍形成はプログラム細胞死が障害され正常に実施されなかった結果であるという新しい考え方が今や癌生物学にもたらされた。正常な細胞はさまざまな成長因子を介して周囲から常時フィードバックを受け、この状況が失われると「自殺する」。癌細胞は、何らかの方法でこれらの指令を回避し、不適切な増殖を持続する。以前は癌細胞を傷害することにより機能すると考えられていた、放射線療法および多種の化学療法を含め、多くの癌療法は実際にはアポトーシスを誘発することによって機能すると現在では考えられている。
【０００５】
正常な細胞種も癌細胞種もアポトーシス誘発に対して幅広い感受性を示すが、アポトーシス誘発に対する抵抗の決定要因は未だ不明である。正常な細胞種の多くは、半致死量の放射線または細胞毒性化学物質に対して一時的成長停止に陥る一方、周辺の癌細胞はアポトーシスを開始する。投与用量におけるこの差別化効果が、抗癌治療を成功に導く治療上の決定的な鍵となる。したがって、癌治療失敗の主要要因として腫瘍細胞のアポトーシス抵抗性が挙げられるのは意外なことではない。
【０００６】
哺乳類におけるＢｃｌ−２タンパク質ファミリーおよびＩＡＰタンパク質ファミリーを含め、いくつかの有効な内在性タンパク質がアポトーシスを阻害することが確認されている。ＩＡＰファミリーの内のいくつかは、細胞死を実施する、末端エフェクター・カスパーゼ、すなわちｃａｓｐ−３およびｃａｓｐ−７、ならびに癌化学療法が誘起する細胞死の媒介に重要な、キーとなるミトコンドリア・イニシエーター・カスパーゼ、すなわちｃａｓｐ−９を直接阻害する。ＩＡＰは、唯一の既知の内在性カスパーゼ阻害体であって、アポトーシス制御において中心的な役割を果たす。
【０００７】
ＩＡＰはいくつかの種類の癌の成長に寄与すると考えられており、ＭＡＬＴリンパ腫において特定の一つのＩＡＰ（ｃＩＡＰ２／ＨＩＡＰ１）が関与し原因となる染色体転座が確認されている。最近、急性骨髄性白血病患者において、ＸＩＡＰのレベル上昇と予後不良、および短い生存期間とが関係することが明らかになった。また、ＮＣＩ（米国国立癌研究所）のパネル内の多くの腫瘍細胞系において、ＸＩＡＰは高度に過剰発現されていた。
【０００８】
改善された癌治療剤、特に癌細胞を誘導してアポトーシスに向かわせることができ、癌細胞内で生じる抗アポトーシス信号を無効にできる治療剤が必要とされている。
【非特許文献１】Ａｇｒａｗａｌ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ  ＥＲ．  （２０００）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  ｉｓ  ｉｔ  ａｓ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｓ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｂａｓｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ？  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ．  ６，  ７２−８１．
【非特許文献２】Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  Ｇ，  Ａｄｉｄａ  Ｃ，  Ｓｉｒｕｇｏ  Ｇ，  ａｎｄ  Ａｌｔｉｅｒｉ  ＤＣ．  （１９９８）  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，  １１１７７−１１１８２．
【非特許文献３】Ａｏｋｉ  Ｙ，  Ｃｉｏｃａ  ＤＰ，  Ｏｉｄａｉｒａ  Ｈ，  ａｎｄ  Ｋｉｙｏｓａｗａ  Ｋ  （２００３）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｙ  ｂｅ  ｍｏｒｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｔｈａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３０，  ９６−１０２．
【非特許文献４】Ａｓｓｅｌｉｎ  Ｅ，  Ｍｉｌｌｓ  ＧＢ，  ａｎｄ  Ｔｓａｎｇ  ＢＫ．  （２００１ａ）  ＸＩＡＰ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ａｋｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１，  １８６２−１８６８．
【非特許文献５】Ａｓｓｅｌｉｎ  Ｅ，  Ｗａｎｇ  Ｙ，  ａｎｄ  Ｔｓａｎｇ  ＢＫ．  （２００１ｂ）  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ／Ａｋｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｇｒａｎｕｌｏｓａ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．  １４２，  ２４５１−２４５７．
【非特許文献６】Ｂａｒｔｏｎ  ＧＭ，  ａｎｄ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ  （２００２）  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｉｎｔｏ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：  １４９４３−１４９４５．
【非特許文献７】Ｂｅｎｉｍｅｔｓｋａｙａ  Ｌ，  Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎ  ＣＡ．  （２０００）  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３，  ２８７−２９７．
【非特許文献８】Ｂｅｒｔｒａｎｄ  ＪＲ，  Ｐｏｔｔｉｅｒ  Ｍ，  Ｖｅｋｒｉｓ  Ａ，  Ｏｐｏｌｏｎ  Ｐ，  Ｍａｋｓｉｍｅｎｋｏ  Ａ，  ａｎｄ  Ｍａｌｖｙ  Ｃ．  （２００２）  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２９６，  １０００−１００４．
【非特許文献９】Ｂｉｌｉｍ  Ｖ，  Ｋａｓａｈａｒａ  Ｔ，  Ｈａｒａ  Ｎ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ．  （２００３）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＸＩＡＰ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ  （ＴＣＣ）  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＸＩＡＰ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＴＣＣ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  １０３，  ２９−３７．
【非特許文献１０】Ｂｏｈｕｌａ  ＥＡ，  Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  ＡＪ，  Ｓｏｈａｉｌ  Ｍ，  Ｐｌａｙｆｏｒｄ  ＭＰ，  Ｒｉｅｄｅｍａｎｎ  Ｊ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＥＭ，  ａｎｄ  Ｍａｃａｕｌａｙ  ＶＭ  （２００３）  Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ  １  ＩＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｂｙ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＩＧＦ１Ｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （ｍｉｓｓｉｎｇ  ｖｏｌ  ａｎｄ  ｐａｇｅ  ｉｎｆｏ，  ｅｐｕｂ  ｏｎ  Ｆｅｂ  ２４）．
【非特許文献１１】Ｂｒａａｓｃｈ  ＤＡ，  Ｊｅｎｓｅｎ  Ｓ，  Ｌｉｕ  Ｙ，  Ｋａｕｒ  Ｋ，  Ａｒａｒ  Ｋ，  Ｗｈｉｔｅ  ＭＡ，  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ  ＤＲ．  （２００３）  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ４２，  ７９６７−７９７５．
【非特許文献１２】Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ＴＲ，  Ｂｅｒｎａｒｄｓ  Ｒ，  ａｎｄ  Ａｇａｍｉ  Ｒ．  （２００２）  Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２９６，  ５５０−５５３．
【非特許文献１３】Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ＴＲ，  Ｂｅｒｎａｒｄｓ  Ｒ，  ａｎｄ  Ａｇａｍｉ  Ｒ．  （２００２）  Ｓｔａｂｌｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ２，  ２４３−２４７．
【非特許文献１４】Ｃａｒｍｅｌｌ  ＭＡ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  Ｃｏｎｋｌｉｎ  ＤＳ，  Ｈａｒｎｎｏｎ  ＧＪ，  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ  ＴＡ．  （２００３）  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．１０，  ９１−９２．
【非特許文献１５】Ｃａｒｖａｌｈｏ  Ａ，  Ｃａｒｍｅｎａ  Ｍ，  Ｓａｍｂａｄｅ  Ｃ，  Ｅａｒｎｓｈａｗ  ＷＣ，  ａｎｄ  Ｗｈｅａｔｌｅｙ  ＳＰ．  （２００３）  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔａｘｏｌ−ｔｒｅａｔｅｄ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１６，  ２９８７−２９９８．
【非特許文献１６】Ｃｈｅｎ  Ｚ，  Ｎａｉｔｏ  Ｍ，  Ｈｏｒｉ  Ｓ，  Ｍａｓｈｉｍａ  Ｔ，  Ｙａｍｏｒｉ  Ｔ，  ａｎｄ  Ｔｓｕｒｕｏ  Ｔ．  （１９９９）  Ａ  ｈｕｍａｎ  ＩＡＰ−ｆａｍｉｌｙ  ｇｅｎｅ，  ａｐｏｌｌｏｎ，  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２６４，  ８４７−８５４．
【非特許文献１７】Ｃｈｅｎ  Ｊ，  Ｗｕ  Ｗ，  Ｔａｈｉｒ  ＳＫ，  Ｋｒｏｅｇｅｒ  ＰＥ，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＨ，  Ｃｏｗｓｅｒｔ  ＬＭ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｆ，  Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ  Ｓ，  Ｋｒａｊｅｗｓｋａ  Ｍ，  Ｗｅｌｓｈ  Ｋ，  Ｒｅｅｄ  ＪＣ，  ａｎｄ  Ｎｇ  ＳＣ．  （２０００）  Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ．  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．  ２，  ２３５−２４１．
【非特許文献１８】Ｃｈｅｎ  Ｊ，  Ｊｉｎ  Ｓ，  Ｔａｈｉｒ  ＳＫ，  Ｚｈａｎｇ  Ｈ，  Ｌｉｕ  Ｘ，  Ｓａｒｔｈｙ  ＡＶ，  ＭｃＧｏｎｉｇａｌ  ＴＰ，  Ｌｉｕ  Ｚ，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＨ，  ａｎｄ  Ｎｇ  ＳＣ．  （２００３）  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ａｕｒｏｒａ−Ｂ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚｅｓ  Ａｕｒｏｒａ−Ｂ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７８，  ４８６−４９０．
【非特許文献１９】Ｃｈｏｉ  ＫＳ，  Ｌｅｅ  ＴＨ，  ａｎｄ  Ｊｕｎｇ  ＭＨ．  （２００３）  Ｒｉｂｏｚｙｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｎ  ＭＣＦ−７  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０，  ８７−９５．
【非特許文献２０】Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  Ｆ，  Ｆｅｃｈｔｎｅｒ  Ｍ，  Ｄａｍｅｓ  Ｓ，  Ａｙｇｕｎ  Ｈ，  ＫｌｉｐｐｅＩＡＰｒｏｎｋ  ＧＪ，  Ｇｉｅｓｅ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｊ．  （２００３）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｓｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，  ２７０５−２７１６．  Ｄａｉ  Ｚ，  Ｚｈｕ  ＷＧ，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＣＤ，  Ｂｒｅｎａ  ＲＭ，  Ｓｍｉｒａｇｌｉａ  ＤＪ，  Ｒａｖａｌ  Ａ，  Ｗｕ  ＹＺ，  Ｒｕｓｈ  ＬＪ，  Ｒｏｓｓ  Ｐ，  Ｍｏｌｉｎａ  ＪＲ，  Ｏｔｔｅｒｓｏｎ  ＧＡ，  ａｎｄ  Ｐｌａｓｓ  Ｃ．  （２００３）  Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｃＩＡＰ  １  ａｎｄ  ｃＩＡＰ２  ａｓ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ．  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  １２，  ７９１−８０１．
【非特許文献２１】Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ＱＬ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｒ，  Ｓａｌｖｅｓｅｎ  ＧＳ，  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ  ＪＣ．  （１９９７）．  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ＩＡＰ  ｉｓ  ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３８８，  ３００−３０４．
【非特許文献２２】Ｄｉｅｒｌａｍｍ  Ｊ，  Ｂａｅｎｓ  Ｍ，  Ｗｌｏｄａｒｓｋａ  Ｉ，  Ｓｔｅｆａｎｏｖａ−Ｏｕｚｏｕｎｏｖａ  Ｍ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ＪＭ，  Ｈｏｓｓｆｅｌｄ  ＤＫ，  Ｄｅ  Ｗｏｌｆ−Ｐｅｅｔｅｒｓ  Ｃ，  Ｈａｇｅｍｅｉｊｅｒ  Ａ，  Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅ  Ｈ，  ａｎｄ  Ｍａｒｙｎｅｎ  Ｐ．  （１９９９）  Ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ＡＰＩ２  ａｎｄ  ａ  ｎｏｖｅｌ  １８ｑ  ｇｅｎｅ，  ＭＬＴ，  ａｒｅ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｌｙ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔ（１  １、  １  ８）（ｑ２  １  、ｑ２１）  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｕｃｏｓａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．  Ｂｌｏｏｄ．  ９３，  ３６０１−３６０９．
【非特許文献２３】Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ  ＤＭ，  Ｎｏｖｉｎａ  ＣＤ，  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  ＰＡ  （２００３）  Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ：  ｓｈｏｒｔ  ＲＮＡｓ  ｔｈａｔ  ｓｉｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４，  ４５７−４６７．  Ｅａｒｎｓｈａｗ  ＷＣ，  Ｍａｒｔｉｎｓ  ＬＭ，  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＳＨ．  （１９９９）  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃａｓｐａｓｅｓ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６８，  ３８３−４２４．
【非特許文献２４】Ｅｒｌ  Ｗ，  Ｈａｎｓｓｏｎ  ＧＫ，  ｄｅ  Ｍａｒｔｉｎ  Ｒ，  Ｄｒａｕｄｅ  Ｇ，  Ｗｅｂｅｒ  ＫＳ，  ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ  Ｃ．  （１９９９）  Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  ８４，  ６６８−６７７．
【非特許文献２５】Ｆｒａｓｅｒ  ＡＧ，  Ｊａｍｅｓ  Ｃ，  Ｅｖａｎ  ＧＩ，  ａｎｄ  Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ  ＭＯ．  （１９９９）  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＩＡＰ）  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ＢＩＲ−１  ｐｌａｙｓ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．  ９，  ２９２−３０１．
【非特許文献２６】Ｇｏｒｄｏｎ  ＧＪ，  Ａｐｐａｓａｎｉ  Ｋ，  Ｐａｒｃｅｌｌｓ  ＪＰ，  Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ＮＫ，  Ｊａｋｌｉｔｓｃｈ  ＭＴ，  Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ＷＧ，  Ｓｕｇａｒｂａｋｅｒ  ＤＪ，  ａｎｄ  Ｂｕｅｎｏ  Ｒ．  （２００２）  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．  ２３，  １０１７−１０２４．
【非特許文献２７】Ｇｒｏｓｓｍａｎ  Ｄ，  ＭｃＮｉｆｆ  ＪＭ，  Ｌｉ  Ｆ，  ａｎｄ  Ａｌｔｉｅｒｉ  ＤＣ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  ｓｕｒｖｉｖｉｎ，  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１３，  １０７６−１０８１．
【非特許文献２８】Ｇｒｏｓｓｍａｎ  Ｄ，  ＭｃＮｉｆ’ｆ  ＪＭ，  Ｌｉ  Ｆ，  ａｎｄ  Ａｌｔｉｅｒｉ  ＤＣ．  （１９９９）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  ｓｕｒｖｉｖｉｎ，  ｉｎ  ｎｏｎｍｅｌａｎｏｍａ  ｓｋｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７９，  １１２１−１１２６．
【非特許文献２９】Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ  Ａ，  Ｗｙｓｚｋｏ  Ｅ，  Ｂｉｅｂｅｒ  Ｂ，  Ｊａｈｎｅｌ  Ｒ，  Ｅｒｄｍａｎｎ  ＶＡ，  ａｎｄ  Ｋｕｒｒｅｃｋ  Ｊ．  （２００３）  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ，  ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ＲＮＡ，  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１，  ３１８５−３１９３．
【非特許文献３０】Ｈａｍａｄａ  Ｍ，  Ｏｈｔｓｕｋａ  Ｔ，  Ｋａｗａｉｄａ  Ｒ，  Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｍ，  Ｍｏｒｉｔａ  Ｋ，  Ｆｕｒｕｋａｗａ  Ｈ，  Ｉｍａｎｉｓｈｉ  Ｔ，  Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ  Ｋ．  （２００２）  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  （ＲＮＡｉ）  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ３´−ｅｎｄｓ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ．  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  １２，  ３０１−３０９．
【非特許文献３１】Ｈｅｍａｎｎ  ＭＴ，  Ｆｒｉｄｍａｎ  ＪＳ，  Ｚｉｌｆｏｕ  ＪＴ，  Ｈｅｒｎａｎｄｏ  Ｅ，  Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ，  Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ  Ｃ，  Ｈａｎｎｏｎ  ＧＪ，  ａｎｄ  Ｌｏｗｅ  ＳＷ．  （２００３）  Ａｎ  ｅｐｉ−ａｌｌｅｌｉｃ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｐ５３  ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｓ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｔａｂｌｅ  ＲＮＡｉ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｕｍｏｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ３３，  ３９６−４００．
【非特許文献３２】Ｈｏｌｏｉｋ  Ｍ，  Ｙｅｈ  Ｃ，  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ，  ａｎｄ  Ｃｈｏｗ  Ｔ．  （２０００）  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  （ＸＩＡＰ）  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １９，  ４１７４−４１７７．
【非特許文献３３】Ｈｏｌｃｉｋ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ．  （２００１）  ＸＩＡＰ，  ｔｈｅ  ｇｕａｒｄｉａｎ  ａｎｇｅｌ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２，  ５５０−５５６．
【非特許文献３４】Ｈｏｌｅｎ  Ｔ，  Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  Ｍ，  Ｂａｂａｉｅ  Ｅ，  ａｎｄ  Ｐｒｙｄｚ  Ｈ  （２００３）  Ｓｉｍｉｌａｒ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ａｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｂｄ  ｓｉ  ＲＮＡｓ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ｔｈｅｙ  ａｃｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ＲＮＡｉ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１，  ２４０１−２４０７．
【非特許文献３５】Ｈｏｕｇｈ  ＳＲ，  Ｗｉｅｄｅｒｈｏｌｔ  ＫＡ，  Ｂｕｒｒｉｅｒ  ＡＣ，  Ｗｏｏｌｆ  ＴＭ，  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ  ＭＦ．  （２００３）  Ｗｈｙ  ＲＮＡｉ  ｍａｋｅｓ  ｓｅｎｓｅ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１，  ７３１−７３２
【非特許文献３６】Ｈｕ  Ｙ，  Ｃｈｅｒｔｏｎ−Ｈｏｒｖａｔ  Ｇ，  Ｄｒａｇｏｗｓｋａ  Ｖ，  Ｂａｉｒｄ  Ｓ，  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ，  Ｄｕｒｋｉｎ  ＪＰ，  Ｍａｙｅｒ  ＬＤ，  ａｎｄ  ＬａＣａｓｓｅ  ＥＣ．  （２００３）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＸＩＡＰ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９，  ２８２６−３６．
【非特許文献３７】Ｉｍｏｔｏ  Ｉ，  Ｙａｎｇ  ＺＱ，  Ｐｉｍｋｈａｏｋｈａｍ  Ａ，  Ｔｓｕｄａ  Ｈ，  Ｓｈｉｍａｄａ  Ｙ，  Ｉｍａｍｕｒａ  Ｍ，  Ｏｈｋｉ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｉｎａｚａｗａ  Ｊ．  （２００１）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＩＡＰ１  ａｓ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ａｎ  ａｍｐｌｉｃｏｎ  ａｔ  １１  ｑ２２  ｉｎ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１，  ６６２９−６６３４．
【非特許文献３８】Ｉｍｏｔｏ  Ｉ，  Ｔｓｕｄａ  Ｈ，  Ｈｉｒａｓａｗａ  Ａ，  Ｍｉｕｒａ  Ｍ，  Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｉｎａｚａｗａ  Ｊ．  （２００２）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃＩＡＰ１，  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  １１ｑ２２  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｔｏ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６２，  ４８６０−４８６６．
【非特許文献３９】Ｊａｎｓｅｎ  Ｂ，  ａｎｄ  Ｚａｎｇｅｍｅｉｓｔｅｒ−Ｗｉｔｔｋｅ  Ｕ．  （２００２）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ−−ｔｈｅ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｔｒｕｔｈ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．  ３，  ６７２−６８３．
【非特許文献４０】Ｋａｌｌｉｏ  ＭＪ，  Ｎｉｅｍｉｎｅｎ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ＪＥ．  （２００１）  Ｈｕｍａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＩＡＰ）  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｅｘｉｔ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １５，  ２７２１−２７２３．
【非特許文献４１】Ｋａｎｗａｒ  ＪＲ，  Ｓｈｅｎ  ＷＰ，  Ｋａｎｗａｒ  ＲＫ，  Ｂｅｒｇ  ＲＷ，  ａｎｄ  Ｋｒｉｓｓａｎｓｅｎ  ＧＷ．  （２００１）  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂ７−１  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９３，  １５４１−１５５２．
【非特許文献４２】Ｋａｓｏｆ  ＧＭ，  ａｎｄ  Ｇｏｍｅｓ  ＢＣ．  （２００１）  Ｌｉｖｉｎ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ３２３８−３２４６．
【非特許文献４３】Ｋｕｎａｔｈ  Ｔ，  Ｇｉｓｈ  Ｇ，  Ｌｉｃｋｅｒｔ  Ｈ，  Ｊｏｎｅｓ  Ｎ，  Ｐａｗｓｏｎ  Ｔ，  ａｎｄ  Ｒｏｓｓａｎｔ  Ｊ．  （２００３）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｎｕｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１，  ５５９−５６１．
【非特許文献４４】ＬａＣａｓｓｅ  ＢＣ，  Ｂａｉｒｄ  Ｓ，  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ，  ａｎｄ  ＭａｃＫｅｎｚｉｅ  ＡＥ．  （１９９８）  Ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  （ＩＡＰｓ）  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １７，  ３２４７−３２５９．
【非特許文献４５】Ｌｅｎｓ  ＳＭ，  Ｗｏｌｔｈｕｉｓ  ＲＭ，  Ｋｌｏｍｐｍａｋｅｒ  Ｒ，  Ｋａｕｗ  Ｊ，  Ａｇａｍｉ  Ｒ，  Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  Ｔ，  Ｋｏｐｓ  Ｇ，  ａｎｄ  Ｍｅｄｅｍａ  ＲＨ．  （２００３）  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ａｒｒｅｓｔ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｌａｃｋ  ｏｆ  ｔｅｎｓｉｏｎ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２２，  ２９３４−２９４７．  Ｌｅｗｉｓ  ＤＬ，  Ｈａｇｓｔｒｏｍ  ＪＥ，  Ｌｏｏｍｉｓ  ＡＧ，  Ｗｏｌｆｆ  ＪＡ，  ａｎｄ  Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒ  Ｈ．  （２００２）  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ３２，  １０７−１０８．
【非特許文献４６】Ｆ，  Ａｃｋｅｒｍａｎｎ  ＥＪ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＣＦ，  Ｒｏｔｈｅｒｍｅｌ  ＡＬ，  Ｐｌｅｓｃｉａ  Ｊ，  Ｔｏｇｎｉｎ  Ｓ，  Ｖｉｌｌａ  Ａ，  Ｍａｒｃｈｉｓｉｏ  ＰＣ，  ａｎｄ  Ａｌｔｉｅｒｉ  ＤＣ．  （１９９９）  Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｃｅｌｌ−ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １，  ４６１−４６６．
【非特許文献４７】Ｌｉ  Ｊ，  Ｆｅｎｇ  Ｑ，  Ｋｉｍ  ＪＭ，  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｍａｎ  Ｄ，  Ｌｉｓｔｏｎ  Ｐ，  Ｌｉ  Ｍ，  Ｖａｎｄｅｒｈｙｄｅｎ  Ｂ，  Ｆａｕｇｈｔ  Ｗ，  Ｆｕｎｇ  ＭＦ，  Ｓｅｎｔｅｒｍａｎ  Ｍ，  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ，  ａｎｄ  Ｔｓａｎｇ  ＢＫ．  （２００１）  Ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．  １４２，  ３７０−３８０．
【非特許文献４８】Ｌｉｎ  Ｈ，  Ｃｈｅｎ  Ｃ，  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ  ＢＤ．  （２００１）  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３５３，  ２９９−３０６．
【非特許文献４９】Ｌｉｓｔｏｎ  Ｐ，  Ｒｏｙ  Ｎ，  Ｔａｍａｉ  Ｋ，  Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｃ，  Ｂａｉｒｄ  Ｓ，  Ｃｈｅｒｔｏｎ−Ｈｏｒｖａｔ  Ｇ，  Ｆａｒａｈａｎｉ  Ｒ，  ＭｃＬｅａｎ  Ｍ，  Ｉｋｅｄａ  ＪＥ，  ＭａｃＫｅｎｚｉｅ  Ａ，  ａｎｄ  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ．  （１９９６）  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＮＡＩＩＰ  ａｎｄ  ａ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ＩＡＰ  ｇｅｎｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３７９，  ３４９−３５３．
【非特許文献５０】Ｌｉｓｔｏｎ  Ｐ，  Ｆｏｎｇ  ＷＧ，  Ｋｅｌｌｙ  ＮＬ，  Ｔｏｊｉ  Ｓ，  Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｔ，  Ｃｏｎｔｅ  Ｄ，  Ｔａｍａｉ  Ｋ，  Ｃｒａｉｇ  ＣＧ，  ＭｃＢｕｒｎｅｙ  ＭＷ，  ａｎｄ  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ．  （２００１）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＸＡＦ１  ａｓ  ａｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ＸＩＡＰ  ａｎｔｉ−Ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３，  １２８−１３３．
【非特許文献５１】Ｌｉｕ  Ｈ，  Ｒｕｓｋｏｎ−Ｆｏｕｒｍｅｓｔｒａｕｘ  Ａ，  Ｌａｖｅｒｇｎｅ−Ｓｌｏｖｅ  Ａ，  Ｙｅ  Ｈ，  Ｍｏｌｉｎａ  Ｔ，  Ｂｏｕｈｎｉｋ  Ｙ，  Ｈａｍｏｕｄｉ  ＲＡ，  Ｄｉｓｓ  ＴＣ，  Ｄｏｇａｎ  Ａ，  Ｍｅｇｒａｕｄ  Ｆ，  Ｒａｍｂａｕｄ  ＪＣ，  Ｄｕ  ＭＱ，  ａｎｄ  Ｉｓａａｃｓｏｎ  ＰＧ．  （２００１）  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔ（１１、１８）  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｔｏ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｌａｎｃｅｔ．  ３５７，  ３９−４０．
【非特許文献５２】Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＬＡ，  Ｎａｇｕｉｂｎｅｖａ  Ｉ，  Ｌｅｈｒｍａｎｎ  Ｈ，  Ｖｅｒｖｉｓｃｈ  Ａ，  Ｔｃｈｅｎｉｏ  Ｔ，  Ｌｏｚａｎｏ  Ｇ，  ａｎｄ  Ｈａｒｅｌ−Ｂｅｌｌａｎ  Ａ  （２００２）  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＲＮＡｓ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏｏｌｓ  ｔｏ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｏｒｅ  ｐ５３  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：  １４８４９−１４８５４．
【非特許文献５３】ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ＡＰ，  Ｍｅｕｓｅ  Ｌ，  Ｐｈａｍ  ＴＴ，  Ｃｏｎｋｌｉｎ  ＤＳ，  Ｈａｎｎｏｎ  ＧＪ，  ａｎｄ  Ｋａｙ  ＭＡ．  （２００２）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１８，  ３８−３９．
【非特許文献５４】ＭｃＭａｎｕｓ  ＭＴ，  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  ＰＡ  （２００２）  Ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ３，  ７３７−７４７．
【非特許文献５５】Ｍｅｓｒｉ  Ｍ，  Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｒｕｉｚ  Ｍ，  Ａｃｋｅｒｍａｎｎ  ＥＪ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＣＦ，  Ｐｏｂｅｒ  ＪＳ，  Ｓｅｓｓａ  ＷＣ，  ａｎｄ  Ａｌｔｉｅｒｉ  ＤＣ．  （２００１）  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  １５８，  １７５７−１７６５．
【非特許文献５６】Ｍｉｌｌｅｒ  ＶＭ，  Ｘｉａ  Ｈ，  Ｍａｒｒｓ  ＧＬ，  Ｇｏｕｖｉｏｎ  ＣＭ，  Ｌｅｅ  Ｇ，  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＢＬ，  ａｎｄ  Ｐａｕｌｓｏｎ  ＨＬ．  （２００３）  Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｇｅｎｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １００，  ７１９５−７２００．
【非特許文献５７】Ｍｉｒａｎｄａ  ＭＢ，  Ｄｙｅｒ  ＫＦ，  Ｇｒａｎｄｉｓ  ＪＲ，  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＥ．  （２００３）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｖｓ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：  ａ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｂｃｌ−Ｘ（Ｌ）ａｎｄ  ＸＩＡＰ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．  １７，  ３９０−４００．
【非特許文献５８】Ｈｙｂｒｉｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｅｇｅｒａ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｅ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｄｒｕｇ．  （２００２）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ２，４８３−４８４．
【非特許文献５９】Ｏｌｉｅ  ＲＡ，  Ｓｉｍｏｅｓ−Ｗｕｓｔ  ＡＰ，  Ｂａｕｍａｎｎ  Ｂ，  Ｌｅｅｃｈ  ＳＨ，  Ｆａｂｂｒｏ  Ｄ，  Ｓｔａｈｅｌ  ＲＡ，  ａｎｄ  Ｚａｎｇｅｍｅｉｓｔｅｒ−Ｗｉｔｔｋｅ  Ｕ．  （２０００）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０，  ２８０５−２８０９．
【非特許文献６０】Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ，  Ｃａｕｄｙ  ＡＡ，  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｅ，  Ｈａｎｎｏｎ  ＧＪ，  ａｎｄ  Ｃｏｎｋｌｉｎ  ＤＳ．  （２００２ａ）  Ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡｓ  （ｓｈＲＮＡｓ）  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １６，  ９４８−９５８．
【非特許文献６１】Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ，  Ｃａｎｄｙ  ＡＡ，  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ  ＧＪ．  （２００２ｂ）  Ｓｔａｂｌｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９９，  １４４３−１４４８．
【非特許文献６２】Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ，  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ  ＧＪ．  （２００２）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ？  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ２，  １７−２３．  Ｐｅｎｎａｔｉ  Ｍ，  Ｃｏｌｅｌｌａ  Ｇ，  Ｆｏｌｉｎｉ  Ｍ，  Ｃｉｔｔｉ  Ｌ，  Ｄａｉｄｏｎｅ  ＭＧ，  ａｎｄ  Ｚａｆｆａｒｏｎｉ  Ｎ．  （２００２）  Ｒｉｂｏｚｙｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０９，  ２８５−２８６．
【非特許文献６３】Ｐｅｒｒｅｌｅｔ  Ｄ，  Ｆｅｒｒｉ  Ａ，  Ｌｉｓｔｏｎ  Ｐ，  Ｍｕｚｚｉｎ  Ｐ，  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ  ＲＧ，  ａｎｄ  Ｋａｔｏ  ＡＣ．  （２００２）  ＩＡＰｓ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ＧＤＮＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ４，  １７５−１７９．
【非特許文献６４】Ｐｉｒｏｌｌｏ  ＫＦ，  Ｒａｉｔ  Ａ，  Ｓｌｅｅｒ  ＬＳ，  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ  ＥＨ  （２００３）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  ｆｒｏｍ  ｔｈｅｏｒｙ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ  ９９，  ５５−７７．
【非特許文献６５】Ｒｏｙ  Ｎ，  Ｍａｈａｄｅｖａｎ  ＭＳ，  ＭｃＬｅａｎ  Ｍ，  Ｓｈｕｔｌｅｒ  Ｇ，  Ｙａｒａｇｈｉ  Ｚ，  Ｆａｒａｈａｎｉ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ  （１９９５）  Ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｎａＩＡＰｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ．  Ｃｅｌｌ  ８０，  １６７−１７８．
【非特許文献６６】Ｒｏｙ  Ｎ，  Ｍａｈａｄｅｖａｎ  ＭＳ，  ＭｃＬｅａｎ  Ｍ，  Ｓｈｕｔｌｅｒ  Ｇ，  Ｙａｒａｇｈｉ  Ｚ，  Ｆａｒａｈａｎｉ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ  （１９９５）  Ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｎａＩＡＰｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ．  Ｃｅｌｌ  ８０，  １６７−１７８．
【非特許文献６７】Ｒｏｙ  Ｎ，  Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ＱＬ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｒ，  Ｓａｌｖｅｓｅｎ  ＧＳ，  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ  ＪＣ．  （１９９７）  Ｔｈｅ  ｃ−ＩＡＰ−１  ａｎｄ  ｃ−ＩＡＰ−２  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｒｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃａｓｐａｓｅｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６，  ６９１４−６９２５．
【非特許文献６８】Ｒｕｂｉｎｓｏｎ  ＤＡ，  Ｄｉｌｌｏｎ  ＣＰ，  Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ  ＡＶ，  Ｓｉｅｖｅｒｓ  Ｃ，  Ｙａｎｇ  Ｌ，  Ｋｏｐｉｎｊａ  Ｊ，  Ｒｏｏｎｅｙ  ＤＬ，  Ｉｈｒｉｇ  ＭＭ，  ＭｃＭａｎｕｓ  ＭＴ，  Ｇｅｒｔｌｅｒ  ＦＢ，  Ｓｃｏｔｔ  ＭＬ，  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｐａｒｉｊｓ  Ｌ．  （２００３）  Ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｉｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ３３，  ４０１−４０６．
【非特許文献６９】Ｓａｌｖｅｓｅｎ  ＧＳ，  ａｎｄ  Ｄｕｃｋｅｔｔ  ＣＳ．  （２００２）  ＩＡＰ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏａｄ  ｔｏ  ｄｅａｔｈ’ｓ  ｄｏｏｒ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３，  ４０１−４１０．
【非特許文献７０】Ｓａｓａｋｉ  Ｈ，  Ｓｈｅｎｇ  Ｙ，  Ｋｏｔｓｕｊｉ  Ｆ，  ａｎｄ  Ｔｓａｎｇ  ＢＫ．  （２０００）  Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０，  ５６５９−５６６６．
【非特許文献７１】Ｓｈａｎｋａｒ  ＳＬ，  Ｍａｎｉ  Ｓ，  Ｏ’Ｇｕｉｎ  ＫＮ，  Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ  ＥＲ，  Ａｇｒａｗａｌ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｓｈａｆｉｔ−Ｚａｇａｒｄｏ  Ｂ．  （２００１）  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃａｓｐａｓｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ７９，  ４２６−４３６．
【非特許文献７２】Ｓｈｅｎ  Ｃ，  Ｂｕｃｋ  Ａ，  Ｐｏｌａｔ  Ｂ，  Ｓｃｈｍｉｄ−Ｋｏｔｓａｓ  Ａ，  Ｍａｔｕｓｃｈｅｋ  Ｃ，  Ｇｒｏｓｓ  ＨＪ，  Ｂａｃｈｅｍ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｒｅｓｋｅ  ＳＮ．  （２００３）  Ｔｒｉｐｌｅｘ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １０，  ４０３−４１０．
【非特許文献７３】Ｓｈｕｅｙ  ＤＪ，  ＭｃＣａｌｌｕｓ  ＤＥ，  ａｎｄ  Ｇｉｏｒｄａｎｏ  Ｔ  （２００２）  ＲＮＡｉ：  ｇｅｎｅ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ７，  １０４０−１０４６．
【非特許文献７４】Ｓｏｈａｉｌ  Ｍ，  Ｄｏｒａｎ  Ｇ，  Ｒｉｅｄｅｍａｎｎ  Ｊ，  Ｍａｃａｕｌａｙ  Ｖ，  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＥＭ．  （２００３）  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１，  ｅ３８．
【非特許文献７５】Ｓｏｍｍｅｒ  ＫＷ，  Ｓｃｈａｍｂｅｒｇｅｒ  ＣＪ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＧＥ，  Ｓａｓｇａｒｙ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｃｅｒｎｉ  Ｃ．  （２００３）  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＩＡＰ）  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｃ−Ｈ−Ｒａｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２２，  ４２６６−４２８０．
【非特許文献７６】Ｓｏｎｇ  Ｅ，  Ｌｅｅ  ＳＫ，  Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｉｎｃｅ  Ｎ，  Ｏｕｙａｎｇ  Ｎ，  Ｍｉｎ  Ｊ，  Ｃｈｅｎ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｓｈａｎｋａｒ  Ｐ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  Ｊ．  （２００３）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｆａｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｆｕｌｍｉｎａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ９，  ３４７−３５１．
【非特許文献７７】Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＤＲ，  Ｌｅｉｒｄａｌ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｓｉｏｕｄ  Ｍ．  （２００３）  Ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ３２７，  ７６１−７６６．
【非特許文献７８】Ｓｐａｌｄｉｎｇ  ＡＣ，  Ｊｏｔｔｅ  ＲＭ，  Ｓｃｈｅｉｎｍａｎ  ＲＩ，  Ｇｅｒａｃｉ  ＭＷ，  Ｃｌａｒｋｅ  Ｐ，  Ｔｙｌｅｒ  ＫＬ，  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＧＬ．  （２００２）  ＴＲＡＩＬ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｒｅ  ｏｐｐｏｓｉｎｇ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｆｏｒ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，  ｇｅｎｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２１，  ２６０−２７１．
【非特許文献７９】Ｓｐｅｌｉｏｔｅｓ  ＥＫ，  Ｕｒｅｎ  Ａ，  Ｖａｕｘ  Ｄ，  ａｎｄ  Ｈｏｒｖｉｔｚ  ＨＲ．  （２０００）  Ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ＢＩＲ−１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ａｕｒｏｒａ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  ＡＩＲ−２  ｔｏ  ａｆｆｅｃｔ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｍｉｄｚｏｎｅ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ６，２１１−２２３．
【非特許文献８０】Ｓｔｅｉｎ  ＣＡ．  （２００１）  Ｔｈｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｅｒｐｌｅｘｅｄ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０８，  ６４１−６４４．
【非特許文献８１】Ｓｔｅｉｎ  Ｐ，  Ｓｖｏｂｏｄａ  Ｐ，  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＲＭ．  （２００３）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｏｏｃｙｔｅｓ：  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｆａｓｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．  ２５６，  １８７−１９３．
【非特許文献８２】Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ  ＨＲ，  Ｒｙａｎ  ＣＡ，  ａｎｄ  Ｓａｌｖｅｓｅｎ  ＧＳ  （２００２）  Ｒｅｐｒｉｅｖａｌ  ｆｒｏｍ  ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ：  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２７，  ９４−１０１．
【非特許文献８３】Ｓｔｅｗａｒｔ  ＳＡ，  Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ  ＤＭ，  Ｐａｌｌｉｓｅｒ  Ｄ，  Ｍｉｚｕｎｏ  Ｈ，  Ｙｕ  ＥＹ，  Ａｎ  ＤＳ，  Ｓａｂａｔｉｎｉ  ＤＭ，  Ｃｈｅｎ  ＩＳ，  Ｈａｈｎ  ＷＣ，  Ｓｈａｒｐ  ＰＡ，  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＡ，  ａｎｄ  Ｎｏｖｉｎａ  ＣＤ．  （２００３）  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．  ＲＮＡ．  ９，  ４９３−５０１．
【非特許文献８４】Ｔａｍｍ  Ｉ，  Ｋｏｒｎｂｌａｕ  ＳＭ，  Ｓｅｇａｌｌ  Ｈ，  Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ  Ｓ，  Ｗｅｌｓｈ  Ｋ，  Ｋｉｔａｄａ  Ｓ，  Ｓｃｕｄｉｅｒｏ  ＤＡ，  Ｔｕｄｏｒ  Ｇ，  Ｑｕｉ  ＹＨ，  Ｍｏｎｋｓ  Ａ，  Ａｎｄｒｅｅｆｆ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ  ＪＣ．  （２０００）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ＩＡＰ−ｆａｍｉｌｙ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６，  １７９６−１８０３．
【非特許文献８５】Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ  ＮＡ，  ａｎｄ  Ｌａｚｅｂｎｉｋ  Ｙ．  （１９９８）  Ｃａｓｐａｓｅｓ：  ｅｎｅｍｉｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２８１，  １３１２−１３１６．
【非特許文献８６】Ｔｉｓｃｏｒｎｉａ  Ｇ，  Ｓｉｎｇｅｒ  Ｏ，  Ｉｋａｗａ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｖｅｒｍａ  ＩＭ．  （２００３）  Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１００，  １８４４−１８４８．
【非特許文献８７】Ｔｒｏｙ  ＣＭ，  Ｒａｂａｃｃｈｉ  ＳＡ，  Ｈｏｈｌ  ＪＢ，  Ａｎｇｅｌａｓｔｒｏ  ＪＭ，  Ｇｒｅｅｎｅ  ＬＡ，  ａｎｄ  Ｓｈｅｌａｎｓｋｉ  ＭＬ．  （２００１）  Ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ：  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｓｐａｓｅ−２  ａｎｄ  −９  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２１，  ５００７−５０１６．
【非特許文献８８】Ｕｒｅｎ  ＡＧ，  Ｗｏｎｇ  Ｌ，  Ｐａｋｕｓｃｈ  Ｍ，  Ｆｏｗｌｅｒ  ＫＪ，  Ｂｕｒｒｏｗｓ  ＦＪ，  Ｖａｕｘ  ＤＬ，  ａｎｄ  Ｃｈｏｏ  ＫＨ．  （２０００）  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｎｅｒ  ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＮＣＥＮＰ  ｓｈｏｗ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．  １０，  １３１９−１３２８．
【非特許文献８９】ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ  Ｍ，  Ｏｖｉｎｇ  Ｉ，  Ｍｕｎｃａｎ  Ｖ，  Ｐｏｎ  Ｆｏｎｇ  ＭＴ，  Ｂｒａｎｔｊｅｓ  Ｈ，  ｖａｎ  Ｌｅｅｎｅｎ  Ｄ，  Ｈｏｌｓｔｅｇｅ  ＰＣ，  Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ＴＲ，  Ａｇａｍｉ  Ｒ，  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｒｓ  Ｈ．  （２００３）  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｔａｂｌｙ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ，  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｓｍａｌｌ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ−ＲＮＡ  ｖｅｃｔｏｒ．  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．  ４，  ６０９−６１５．
【非特許文献９０】Ｖｉｃｋｅｒｓ  ＴＡ，  Ｋｏｏ  Ｓ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＣＦ，  Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴ，  Ｄｅａｎ  ＮＭ，  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ  ＢＦ．  （２００３）  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ＲＮＡｓ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡｓｅ  Ｈ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｇｅｎｔｓ．  Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７８，  ７１０８−７１１８．
【非特許文献９１】Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｔｅｋｌｅ  Ｅ，  Ｏｕｂｒａｈｉｍ  Ｈ，  Ｍｉｅｙａｌ  ＪＪ，  Ｓｔａｄｔｍａｎ  ＥＲ，  ａｎｄ  Ｃｈｏｃｋ  ＰＢ．  （２００３）  Ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｅｄ  ａｃｔｉｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １００，  ５１０３−５１０６．
【非特許文献９２】Ｗｉｅｓｅ  Ｓ，  Ｄｉｇｂｙ  ＭＲ，  Ｇｕｎｎｅｒｓｅｎ  ＪＭ，  Ｇｏｔｚ  Ｒ，  Ｐｅｉ  Ｇ，  Ｈｏｌｔｍａｎｎ  Ｂ，  Ｌｏｗｅｎｔｈａｌ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｓｅｎｄｔｎｅｒ  Ｍ．  （１９９９）  Ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＴＡ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ＮＧＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃｈｉｃｋ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２，  ９７８−９８３．
【非特許文献９３】Ｗｉｌｄａ  Ｍ，  Ｆｕｃｈｓ  Ｕ，  Ｗｏｓｓｍａｎｎ  Ｗ，  ａｎｄ  Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ  Ａ  （２００２）  Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ＢＣＲ／ＡＢＬ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  （ＲＮＡｉ）．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１，  ５７１６−５７２４．
【非特許文献９４】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＮＳ，  Ｇａｙｎｏｒ  ＲＢ，  Ｓｃｏｇｇｉｎ  Ｓ，  Ｖｅｒｍａ  Ｕ，  Ｇｏｋａｓｌａｎ  Ｔ，  Ｓｉｍｍａｎｇ  Ｃ，  Ｆｌｅｍｉｎｇ  Ｊ，  Ｔａｖａｎａ  Ｄ，  Ｆｒｅｎｋｅｌ  Ｅ，  ａｎｄ  Ｂｅｃｅｒｒａ  Ｃ．  （２００３）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９，  ９３１−９４６．
【非特許文献９５】Ｘｉａ  Ｃ，  Ｘｕ  Ｚ，  Ｙｕａｎ  Ｘ，  Ｕｅｍａｔｓｕ  Ｋ，  Ｙｏｕ  Ｌ，  Ｌｉ  Ｋ，  Ｌｉ  Ｌ，  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  Ｆ，  ａｎｄ  Ｊａｂｌｏｎｓ  ＤＭ．  （２００２）  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  １，  ６８７−６９４．
【非特許文献９６】Ｘｉａ  Ｈ，  Ｍａｏ  Ｑ，  Ｐａｕｌｓｏｎ  ＨＬ，  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＢＬ．  （２００２）  ｓｉＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０，  １００６−１０１０．
【非特許文献９７】Ｘｕ  Ｙ，  Ｚｈａｎｇ  ＨＹ，  Ｔｈｏｒｍｅｙｅｒ  Ｄ，  Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｏ，  Ｄｕ  Ｑ，  Ｅｌｍｅｎ  Ｊ，  Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  Ｃ，  ａｎｄ  Ｌｉａｎｇ  Ｚ．  （２００３）  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＤＮＡｓ  ｈａｖｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｍＲＮＡｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３０６，  ７１２−７１７．
【非特許文献９８】Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｍａｎｏｍｅ  Ｙ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｔａｎｉｇａｗａ  Ｎ．  （２００２）  Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ３８，  ２３１６−２３２４．
【非特許文献９９】Ｙｕ  Ｄ，  Ｚｈｕ  Ｆ−Ｇ，  Ｂｈａｇａｔ  Ｌ，  Ｗａｎｇ  Ｈ，  Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ  ＥＫ，  Ｚｈａｎｇ  Ｒ，  ａｎｄ  Ａｇｒａｗａｌ  Ｓ  （２００２）  Ｐｏｔｅｎｔ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ  ｌｉｎｋａｇｅｓ：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９７，  ８３−９０．
【非特許文献１００】Ｙｕ  Ｄ，  Ｚｈｕ  Ｆ−Ｇ，  Ｂｈａｇａｔ  Ｌ，  Ｗａｎｇ  Ｈ，  Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ  ＥＫ，  Ｚｈａｎｇ  Ｒ，  ａｎｄ  Ａｇｒａｗａｌ  Ｓ  （２００２）  Ｐｏｔｅｎｔ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ  ｌｉｎｋａｇｅｓ：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９７，  ８３−９０．
【非特許文献１０１】Ｙｕ  ＪＹ，  ＤｅＲｕｉｔｅｒ  ＳＬ，  ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ  ＤＬ  （２００２）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９９，  ６０４７−６０５２．
【非特許文献１０２】Ｚｅｎｄｅｒ  Ｌ，  Ｈｕｔｋｅｒ  Ｓ，  Ｌｉｅｄｔｋｅ  Ｃ，  Ｔｉｌｌｍａｎｎ  ＨＬ，  Ｚｅｎｄｅｒ  Ｓ，  Ｍｕｎｄｔ  Ｂ，  Ｗａｌｔｅｍａｔｈｅ  Ｍ，  Ｇｏｓｌｉｎｇ  Ｔ，  Ｆｌｅｍｍｉｎｇ  Ｐ，  Ｍａｌｅｋ  ＮＰ，  Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ  Ｃ，  Ｍａｎｎｓ  ＭＰ，  Ｋｕｈｎｅｌ  Ｆ，  ａｎｄ  Ｋｕｂｉｃｋａ  Ｓ．  （２００３）  Ｃａｓｐａｓｅ  ８  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ａｃｕｔｅ  ｌｉｖｅｒ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １００，  ７７９７−７８０２．
【非特許文献１０３】Ｚｈａｎｇ  ＨＧ，  Ｈｕａｎｇ  Ｎ，  Ｌｉｕ  Ｄ，  Ｂｉｌｂａｏ  Ｌ，  Ｚｈａｎｇ  Ｘ，  Ｙａｎｇ  Ｐ，  Ｚｈｏｕ  Ｔ，  Ｃｕｒｉｅｌ  ＤＴ，  ａｎｄ  Ｍｏｕｎｔｚ  ＪＤ．  （２０００）  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａＢ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ４３，  １０９４−１１０５．
【非特許文献１０４】Ｚｈｏｕ  Ｗ，  ａｎｄ  Ａｇｒａｗａｌ  Ｓ．  （１９９８）  Ｍｉｘｅｄ−ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｔｉ  ｓｅｎｓｅａｇｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｉｄｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ．  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．  ８，  ３２６９−３２７４．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＩＡＰ核酸塩基オリゴマーおよび核酸塩基オリゴマー複合体ならびにアポトーシスの誘起にそれらを使用する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一つの態様において、本発明は一般に、ＸＩＡＰ（配列番号２１）、ＨＩＡＰ−１（配列番号５３）、またはＨＩＡＰ−２（配列番号４７）の少なくとも８個であり３０個を超えない連続的核酸塩基を含む二本鎖であって、ＩＡＰの発現を低減させる二本鎖を含む、実質的に純粋な核酸塩基オリゴマーを提供することを特徴とする。一つの実施形態において、前記二本鎖は、２１個から２９個までの核酸塩基を含む第一の領域と、生理学的条件下で第一の領域と対合する第二の領域とを含み、第一の領域と第二の領域とは一本鎖ループで結合されている。他の実施形態において、前記ループには６個から１２個までの核酸塩基が含まれる。一つの実施形態において、前記ループには８個の核酸塩基が含まれる。前記二本鎖は、例えば、配列番号３２〜３６からなる群から選択することができ、ＸＩＡＰの発現を低減させることができる。他の好ましい実施形態において、前記二本鎖は、配列番号４２〜４６からなる群から選択され、ＨＩＡＰ−２の発現を低減させる。
【００１１】
他の態様において、本発明は、一対のセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む核酸塩基オリゴマー複合体であって、該複合体が、ＸＩＡＰ（配列番号２１）、ＨＩＡＰ−１（配列番号５３）、またはＨＩＡＰ−２（配列番号４７）のいずれか一つの配列に相当する８個から３０個までの連続的核酸塩基を含み、該複合体はＩＡＰの発現を低減する、核酸塩基オリゴマー複合体を提供することを特徴とする。一つの実施形態において、前記複合体は、配列番号１〜３１、配列番号３７〜４１、および配列番号５４〜６５のいずれか一つを含む。他の実施形態において、核酸分子はｄｓＲＮＡである。他の実施形態において、前記複合体は、修飾（例えば、改変された糖部、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合）を少なくとも一つまたは二つ有する。他の実施形態において、修飾は、チオリン酸エステル結合、メチルホスホン酸エステル結合、リン酸三エステル結合、ジチオリン酸エステル結合、およびセレンリン酸エステル結合からなる群から選択される、ヌクレオシド間結合を改変したものである。さらに別の実施形態において、前記複合体は改変された糖部（例えば、２’−Ｏ−メチル基または２’−Ｏ−メトキシエチル基）を少なくとも一つ含む。他の実施形態において、前記複合体は改変された核酸塩基（例えば、５−メチルシトシン、キメラ核酸塩基オリゴマー、ＲＮＡ残基、またはチオリン酸エステル結合で互いに結合されたＲＮＡ残基）を少なくとも一つ含む。
【００１２】
他の態様において、本発明は、前記態様のいずれか一つの核酸塩基オリゴマーまたは核酸塩基オリゴマー複合体をコードする発現ベクターを提供することを特徴とする。一つの実施形態において、前記核酸塩基オリゴマーまたは核酸塩基オリゴマー複合体をコードする核酸配列は、プロモーターに稼動可能に結合している。他の実施形態において、前記プロモーターはＵ６ ＰｏｌIIIプロモーター、またはポリメラーゼIII Ｈ１プロモーターである。
【００１３】
他の態様において、本発明は、前記態様の発現ベクターを含む細胞を提供することを特徴とする。一つの実施形態において、前記細胞は、前記発現ベクターを安定して発現するように形質転換されたヒト細胞である。他の実施形態において、前記細胞はｉｎ  ｖｉｖｏで形質転換される。さらに別の実施形態において、前記細胞はヒト細胞（例えば、新生細胞）である。
【００１４】
「生物応答修飾剤」は、疾患と戦う免疫系の能力を刺激し、または修復する薬剤を意味する。生物応答修飾剤のいくつかは癌細胞の増殖を遅らせることができ、化学療法剤であるとも考えられるが、生物応答修飾剤のすべてがこうではない。生物応答修飾剤の例には、インターフェロン（α型、β型、γ型）、インターロイキン−２、リツキシマブ、およびトラスツズマブが挙げられる。
【００１５】
「細胞」は、単細胞生物、多細胞生物からの細胞を意味し、多細胞生物内に含まれる細胞であってもよい。
【００１６】
「化学増感剤」は、化学療法の効果に対する腫瘍細胞の感度を高める薬剤を意味する。一例として、ＴＲＡＩＬは化学増感剤である。
【００１７】
「化学療法剤」は、癌細胞を殺し、またはその増殖を遅らせるのに使用される薬剤（例えば、表５に列挙したもの）を意味する。したがって、細胞傷害剤も静細胞剤も化学療法剤と考えられる。
【００１８】
対照配列に「相当する」連続的核酸塩基は、核酸塩基を結合する骨格または結合に関係なく、対照配列における核酸塩基の順序に等しい核酸塩基の順序を意味する。
【００１９】
「二本鎖ＲＮＡ」は、長さに関係なく、センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖との相補的対合を意味する。一つの実施形態において、これらの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は個体の細胞、組織、器官、または動物全体に導入される。例えば、血流を介してｄｓＲＮＡを全身に導入することができる。前記二本鎖ＲＮＡが核酸配列またはアミノ酸配列の発現または生物学的活性を低減できることが望ましい。一つの実施形態において、対照と比較した発現または生物学的活性の低減は少なくとも１０％であり、より望ましくは２５％であり、最も望ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。アンチセンス核酸は、改変された骨格、例えば、ホスホロチオエート骨格、ホスホロジチオエート骨格、または当分野で既知の改変された骨格を含むことができ、あるいは人工のヌクレオシド間結合を含むことができる。
【００２０】
「二本鎖」は、対合したセンス部とアンチセンス部を含む一つの単位を意味する。例えば、２９個の核酸塩基を「含む」二本鎖は、対合したセンス鎖とアンチセンス鎖にそれぞれ２９個の核酸塩基を含んでいる。
【００２１】
「有効量」は、治療を受けない患者に比べ、疾患の症状を改善し、標的細胞の増殖を阻害し、腫瘍の大きさおよび数を低減し、ＩＡＰの発現を阻害し、あるいは標的細胞のアポトーシスを促進させるのに必要な化合物（例えば、核酸塩基オリゴマー）の量を意味する。異常増殖（すなわち癌）の治療のために本発明を実施する際に使用する活性化合物の有効量は、投与方式、対象の年齢、体重、および全体的な健康状態により変わる。結局、担当の医師または獣医が好適な量および投与方式を決定する。このような量が「有効な」量と呼ばれる。
【００２２】
「アポトーシス促進」は、所定の細胞集団（例えば、癌細胞、リンパ球、線維芽細胞、または他のいずれかの細胞）においてアポトーシスする細胞の数が増加することを意味する。所定のアッセイにおけるアポトーシス促進化合物によるアポトーシス促進の程度は変動するが、当業者なら、核酸塩基オリゴマーの投与がなければＩＡＰにより制限されるアポトーシスを核酸塩基オリゴマーが促進することを示す、アポトーシスのレベルにおける統計的に有意な変化を測定することができる。「アポトーシス促進」は、本発明の核酸塩基オリゴマーは投与されないがそれ以外は実質的に同様な治療を受けた細胞に比べ、アポトーシスする細胞数の増加が少なくとも１０％、より好ましくは増加が２５％、さらには５０％、最も好ましくは増加が少なくとも１００％であることを意味することが好ましい。モニターするサンプルは、通常アポトーシスが不十分な細胞（すなわち癌細胞）のサンプルであることが好ましい。アポトーシスのレベルにおける変化（すなわち促進または低減）を検知する方法は、本明細書に記載する。
【００２３】
「対合」は、相補的に対合した核酸塩基配列またはその部分を含む二本鎖または二本鎖複合体を形成するためのペアを意味する。対合は生理学的条件下、または様々な条件下で厳密におこなわれることが好ましい（例えば、Ｗａｈｌ，  Ｇ．  Ｍ．およびＳ．  Ｌ．  Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５２：３９９、  Ｋｉｍｍｅｌ，  Ａ．  Ｒ．（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５２：５０７を参照されたい）。例えば、厳密な対合のための塩濃度は、通常、ＮａＣｌがおよそ７５０ｍＭ未満であってクエン酸三ナトリウムがおよそ７５ｍM未満であり、好ましくはＮａＣｌがおよそ５００ｍＭ未満であってクエン酸三ナトリウムがおよそ５０ｍM未満であり、最も好ましくはＮａＣｌがおよそ２５０ｍM未満であってクエン酸三ナトリウムがおよそ２５ｍＭ未満である。有機溶剤、例えばフォルムアミドの非存在下では厳密度の低い対合がおこなわれる一方、フォルムアミドの少なくともおよそ３５％、最も好ましくは少なくともおよそ５０％存在下では厳密度の高い対合がおこなわれる。厳密な対合のための温度条件には、通常少なくともおよそ３０℃、より好ましくは少なくともおよそ３７℃、最も好ましくは少なくともおよそ４２℃の温度が含まれる。対合時間、洗浄剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、およびキャリヤーＤＮＡを含む・含まない等の様々な付加的なパラメーターは、当業者にとって公知である。これらの様々な条件を適宜組み合わせることによって、様々なレベルで厳密性を達成できる。好ましい実施形態において、対合は３０℃で７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍMのクエン酸三ナトリウム、および１％ＳＤＳの存在下でおこなわれる。より好ましい実施形態において、対合は３７℃で５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％フォルムアミド、および１００μｇ／ｍLの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の存在下でおこなわれる。最も好ましい実施形態において、対合は４２℃で２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％フォルムアミド、および２００μｇ／ｍLのｓｓＤＮＡの存在下でおこなわれる。当業者なら、これらの条件の有用な変形例を容易に考えられよう。
【００２４】
ほとんどの用途で、対合の後の洗浄においても厳密性に幅がある。洗浄条件の厳密性は塩濃度および温度によって規定することができる。上記と同様に、塩濃度を下げることにより、または温度を上げることにより、洗浄の厳密度を上げることができる。例えば、洗浄のための厳密な塩濃度は、好ましくはＮａＣｌがおよそ３０ｍＭ未満であってクエン酸三ナトリウムがおよそ３ｍＭ未満であり、最も好ましくはＮａＣｌがおよそ１５ｍＭ未満であってクエン酸三ナトリウムがおよそ１．５ｍＭ未満である。洗浄のための厳密な温度条件には、通常少なくともおよそ２５℃、より好ましくは少なくともおよそ４２℃、最も好ましくは少なくともおよそ６８℃の温度が含まれる。好ましい実施形態において、洗浄は２５℃で３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳの存在下でおこなわれる。より好ましい実施形態において、洗浄は４２℃で１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳの存在下でおこなわれる。最も好ましい実施形態において、洗浄は６８℃で１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳの存在下でおこなわれる。当業者なら、これらの条件とは別の変形例を容易に考えられよう。対合技術は当業者に公知であり、例えば、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓの文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，  １９７７年）、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓの文献（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ７２：３９６１，  １９７５年）、Ａｕｓｕｂｅｌらの成書（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１年）、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌの成書（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １９８７年，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＳａｍｂｒｏｏｋらの成書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。一般に、相補的な核酸塩基は、水素結合、すなわち相補的な核酸塩基間のワトソン・クリック型水素結合、フーグスティーン型水素結合、または逆フーグスティーン型水素結合を介して対合する。例えば、アデニンとチミンは水素結合を形成して対合する相補的核酸塩基である。
【００２５】
「ＩＡＰの生物学的活性」は、ＩＡＰポリペプチドによりｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで引き起こされることが知られているすべての活性を意味する。
【００２６】
「ＩＡＰ遺伝子」は、他の細胞内または細胞外送達方法（例えば、米国特許第５，９１９，９１２号を参照されたい）により送達されると、細胞内または組織内においてアポトーシスを変調（阻害または促進）でき、ＢＩＲドメインを少なくとも一つ有するポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。好ましい実施形態において、ＩＡＰ遺伝子は、ヒトまたはマウスのＸＩＡＰ、ＨＩＡＰ−１、またはＨＩＡＰ−２（それぞれは米国特許第６，１５６，５３５号に記載されている）の少なくとも一つに対し、およそ５０％またはそれ以上（例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％）のヌクレオチド配列相同性を有する遺伝子である。相同性が認められるヌクレオチド配列の領域は、ＢＩＲドメインの少なくとも一つおよびリングジンクフィンガードメインをコードする領域であることが好ましい。哺乳類のＩＡＰ遺伝子にはどの哺乳類からも単離されるヌクレオチド配列が含まれている。前記哺乳類はヒトであることが好ましい。
【００２７】
「ＩＡＰタンパク質」または「ＩＡＰポリペプチド」は、ＩＡＰ遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはその断片を意味する。
【００２８】
「単離されたポリヌクレオチド」は、本発明の核酸分子が由来する生物の天然ゲノムにおいて当該遺伝子に隣接する遺伝子が存在しない核酸（例えば、ＤＮＡ）を意味する。したがって、この術語には、例えば、ベクター内に、自律的に複製をおこなうプラスミドもしくはウイルス内に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に取り込まれた、あるいは他の配列から独立した別の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限酵素の消化によって産生されたｃＤＮＡまたはゲノム断片もしくはｃＤＮＡ断片）として存在する、組換えＤＮＡが含まれる。また、この術語には、ＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子、さらには付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡが含まれる。
【００２９】
「単離されたポリペプチド」は、天然に本発明のポリペプチドを含む成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。一般に、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを天然に含むタンパク質および天然の有機分子から、少なくとも６０重量％の純度で単離される。この調製物は、好ましくは少なくとも７５重量％の純度で、より好ましくは少なくとも９０重量％の純度で、最も好ましくは少なくとも９９重量％の本発明のポリペプチドの純度で単離される。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然源からの抽出により、本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸を発現させることにより、またはタンパク質を化学的に合成することにより、得ることができる。純度は、好適な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定できる。
【００３０】
「リンパ組織増殖性疾患」は、リンパ系の細胞（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞）が異常に増殖する疾患を意味する。
【００３１】
「核酸塩基オリゴマー」はすべての核酸鎖または核酸擬似体の鎖を意味する。
【００３２】
「核酸塩基オリゴマー複合体」は、一対のアンチセンス核酸塩基オリゴマーとセンス核酸塩基オリゴマーを意味する。
【００３３】
標的タンパク質（例えば、ＩＡＰポリペプチド）の「発現を低減させる」核酸塩基オリゴマーは、未処理の対照に比べ、標的タンパク質の量を少なくともおよそ５％、より望ましくは少なくともおよそ１０％、２５％、さらには５０％低減させる核酸塩基オリゴマーを意味する。タンパク質レベルの測定方法は当技術分野で公知であり、本明細書には例示的方法のみを記載する。本発明の核酸塩基オリゴマーは、通常、十分なアポトーシスをおこなわない細胞に導入された際、アポトーシスを促進すること、および／またはＩＡＰタンパク質レベルを低減させることができることが好ましい。アポトーシスの増加は、対照に比べ、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは２５％、最も好ましくは１００％またはそれ以上である。本発明の核酸塩基オリゴマーにはおよそ８個から３０個までの核酸塩基が含まれることが好ましい。本発明の核酸塩基オリゴマーは、ＩＡＰポリヌクレオチドに相補的な、例えば、さらに２０個、４０個、６０個、８５個、１２０個またはそれ以上の連続的な核酸塩基も含むことができる。本発明の核酸塩基オリゴマー（またはその一部）は、改変された骨格を含むことができる。ホスホロチオエート骨格、ホスホロジチオエート骨格、および他の改変された骨格は当技術分野で公知である。本発明の核酸塩基オリゴマーは、一つまたはそれ以上の非天然結合をも含むことができる。
【００３４】
「稼動可能に結合する」とは、適当な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が第二のポリヌクレオチドに結合した際に、第一のポリヌクレオチドの転写を指示する第二のポリヌクレオチドに隣接して第一のポリヌクレオチドが配置されていることを意味する。
【００３５】
「部分」は、対照タンパク質または核酸に実質的に相同であって、本明細書に記載するアッセイ法で測定して、対照タンパク質または核酸の生物学的活性を少なくとも５０％または７５％、より好ましくは８０％、９０％、または９５％、さらには９９％保持する、タンパク質または核酸の断片を意味する。
【００３６】
「発現のために配置される」とは、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ分子）が、該配列の転写および翻訳を指示するＤＮＡ配列に隣接して配置される（すなわち、本発明の組換えポリペプチドまたはＲＮＡ分子の産生を容易にする）ことを意味する。
【００３７】
「プロモーター」は転写の指示をおこなうことのできるポリヌクレオチドを意味する。在来遺伝子の３’側領域に存在する。例えば、遺伝子転写の指示をおこなうことのできる、遺伝子上流の任意のポリヌクレオチド領域またはｍＲＮＡ領域のことである。
【００３８】
「ポリペプチド」は、長さや翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはホスホリル化）に関係なく、任意のアミノ酸鎖を意味する。
【００３９】
「増殖性疾患」は、不適切に高レベルの細胞分裂、不適切に低レベルのアポトーシス、またはその両方に誘発され、あるいはその結果である疾患を意味する。例えば、癌は増殖性疾患の一例である。癌の例には、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ヴァルデンシュトレームマクログロブリン血症、H鎖病、ならびに肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、軟骨腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状膠細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、稀突起膠腫、神経線維腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）等の充実性腫瘍が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
「レポーター遺伝子」は、その発現をアッセイできるポリペプチドをコードする遺伝子を意味し、そのようなポリペプチドには、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
「ｓｉＲＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補性の領域を有する二本鎖ＲＮＡを意味する。最も望ましくは、ｓｉＲＮＡは長さが１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のヌクレオチドであり、任意選択で、３’端の一箇所に二つの塩基の突出部を有する。ｓｉＲＮＡを個々の細胞、組織、器官、または動物全体に導入することができる。最も好ましくは、ｓｉＲＮＡは長さが２１から２９までのヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡは血流を介して全身に導入することができる。このようなｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡレベルまたはプロモーター活性のダウンレギュレーションに使用される。ｓｉＲＮＡは核酸またはアミノ酸配列の発現または生物学的活性を低減できることが望ましい。一つの実施形態において、発現または生物学的活性の低減は、対照に比べ、少なくとも１０％、より望ましくは２５％、最も望ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。ｓｉＲＮＡは、改変された骨格、例えば、ホスホロチオエート骨格、ホスホロジチオエート骨格、または当技術分野で公知の他の改変された骨格を含むことができ、あるいは非天然のヌクレオシド間結合を含むことができる。
【００４２】
「ｓｈＲＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補性の二本鎖領域を有するＲＮＡを意味する。例えば、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）はヌクレオシド塩基を含む二本鎖領域を有することができ、その二本鎖は長さが１９から２９までの塩基であり、その鎖は、一本鎖の４、５、６、７、８、９、または１０塩基のリンカー領域により分離されている。任意選択で、リンカー領域は長さが６〜８塩基である。
【００４３】
「形質転換細胞」は、組換えＤＮＡ技術により、細胞内に（あるいはその細胞の祖先内に）（本明細書に定義の）本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子が導入された細胞を意味する。
【００４４】
「導入遺伝子」は、巧みな手段で細胞内に挿入され、通常はその細胞から発生する生物のゲノムの一部となる、ＤＮＡの断片を意味する。このような導入遺伝子は、トランスジェニック生物に対し一部または全部が異種の（すなわち、外来の）遺伝子、またはその生物の内因性遺伝子と相同な遺伝子を含むことができる。
【００４５】
「トランスジェニック」とは、巧みな手段で細胞内に挿入され、その細胞から発生する生物のゲノムの一部となる、ＤＮＡ配列を含む細胞を意味する。本明細書に記載のように、トランスジェニック生物は、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ヤギ、またはウマ）、マウス、またはネズミ等のトランスジェニック脊椎動物であっても、昆虫または線虫等のトランスジェニック無脊椎生物でも、あるいはトランスジェニック植物であってもよい。
【００４６】
本発明は、細胞内にアポトーシスを誘発するための方法および組成物を提供することを特徴とする。本発明の他の特徴および利点は、本発明の詳細な説明から、ならびに本発明の請求項から、明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明は、ＩＡＰの発現を阻害する核酸塩基オリゴマーおよび核酸塩基オリゴマー複合体、ならびにそれらを細胞内でのアポトーシス誘発に使用する方法を提供する。本発明の核酸塩基オリゴマーおよび核酸塩基オリゴマー複合体は、医薬用組成物の製造に使用することもできる。本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを細胞傷害剤、静細胞剤、または生物応答修飾剤（例えば、アドリアマイシン、ビノレルビン、エトポシド、タキソール、シスプラチン、インターフェロン、インターロイキン−２、モノクローナル抗体）等の化学療法剤の一つまたはそれ以上と併用して投与することにより、細胞内でアポトーシスを促進させる方法を提供することも特徴とする。望ましい場合には、化学増感剤（すなわち、増殖中の細胞の化学療法への感度を高める薬剤）も投与できる。前記薬剤のいかなる組合せも医薬用組成物の製造に使用可能である。これらの医薬用組成物は、増殖性疾患、例えば、癌またはリンパ組織増殖性疾患、あるいは増殖性疾患の症状の治療に使用することができる。例えば、医薬用組成物はｅｘ  ｖｉｖｏ療法において有用である。本発明の組成物は、癌または他の増殖性疾患の治療のための放射線療法と併用して使用することもできる。
【００４８】
癌細胞内でのアポトーシスの活性化は、従来型化学療法または放射線療法に対する患者応答を改善するための新規で有用となる可能性のある方法を提供する。直接カスパーゼを阻害し、アポトーシスを抑圧する能力において、ＩＡＰ遺伝子ファミリーの内でＸＩＡＰが最も強力である。
【００４９】
（ＩＡＰはアポトーシスを阻害）
細胞を死亡させる制御された「正常な」生理学的プロセスは、アポトーシスまたはプログラム細胞死と呼ばれる。アポトーシスは、別の生理学的細胞死の形態であって、このような状況で誘発される炎症性応答を伴う二次的組織損傷のために異常であり、または「偶発的で」望ましくないと考えられる、ネクローシスとは区別される。アポトーシスは、成長および健常な組織の維持の正常な一部として生起する。このプロセスは確率的に生起し、アポトーシスした細胞はしばしばその過程の検知が困難なほど速やかに除去される。制御されないアポトーシスは、癌および神経性疾患等の病態生理学的環境下で生起するが、化学療法および放射線療法が新生細胞を殺す手段もアポトーシスである。アポトーシス回路が誘発されると、カスパーゼ（システインを活性中心とするプロテアーゼまたはアスパラギン酸プロテアーゼ）と呼ばれ、指定された基質内のアスパラギン残基の位置でタンパク質を切断する、一群のプロテアーゼが活性化される。これらのプロテアーゼは、アポトーシスの主要なエフェクターであり、アポトーシスに伴うモルフォロジー特性および生化学的特性の大部分の発現の原因となる（ＴｈｏｒｎｂｅｒｒｙおよびＬａｚｅｂｎｉｋ、１９９８年、Ｅａｒｎｓｈａｗら、１９９９年）。カスパーゼは、ＩＡＰと呼ばれアポトーシスの阻害因子である内在性阻害因子を有している（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、１９９７年、Ｒｏｙら、１９９７年、Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅら、２００２年）。ＩＡＰは、そのＮ末端にＢＩＲドメインが１〜３個存在することを特徴とする。ＢＩＲモチーフは、元々バキュロウイルス内で宿主細胞のアポトーシスを抑圧するドメインとして記載された、新規なジンクフィンガーの折りたたまれたドメインである（ＬａＣａｓｓｅら、１９９８年、Ｍｉｌｌｅｒ、１９９９年、ＳａｌｖｅｓｅｎおよびＤｕｃｋｅｔｔ、２００２年）。遺伝子のノックアウト研究から、これらの遺伝子が酵母菌、Ｃ．  エレガンス、およびキイロショウジョウバエ属において極めて重要な役割を果たしていることが明らかになった（Ｆｒａｓｅｒら、１９９９年、Ｓｐｅｌｉｏｔｅｓら、２０００年、Ｕｒｅｎら、２０００年）。ＩＡＰは高等生物内にも存在し、この場合はＩＡＰの重複性および複雑性が高く、各ＩＡＰが正常な生理機能および疾患状態で果たすそれぞれの役割の解明を複雑にしている。表１に、元々はニューロンのアポトーシス阻害性タンパク質（ＮＡＩＰ）として発見され（Ｒｏｙら、１９９５年）、過去１０年間に発見された８種類のヒトＩＡＰを示す。
【００５０】
【表１】
2007510408.tif 000002
【００５１】
ＩＡＰが癌の成長において重要な役割を果たしていることが確認されている（ＬａＣａｓｓｅら、１９９８年、Ａｌｔｉｅｒｉ、２００３年）。多くの研究から、癌においてはＩＡＰレベルが増大すること、ＩＡＰ発現レベルが増大した患者は予後不良の可能性が高いことがわかった。さらに、ＭＡＬＴ（粘膜関連リンパ組織）型辺縁帯リンパ腫において、ｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ２を伴う遺伝子増幅（Ｉｍｏｔｏら、２００１年、Ｉｍｏｔｏら、２００２年、Ｄａｉら、２００３年）、さらにはｃＩＡＰ２を伴う、原因となる転座が確認されている（Ｄｉｅｒｌａｍｍら、１９９９年、Ｌｉｕら、２００１年）。いくつかの証拠から、ＩＡＰの内最も強力なＸＩＡＰは癌に関与している（Ｔａｍｍら、２０００年、ＨｏｌｃｉｋおよびＫｏｒｎｅｌｕｋ、２００１年、Ｌｉｓｔｏｎら、２００１年）。アンチセンス法およびＲＮＡ干渉法は、ＩＡＰ発現をダウンレギュレートし、アポトーシスを誘発する上で有望な手段である。
【００５２】
（遺伝子をダウンレギュレートするための核酸塩基オリゴマー法）
アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、標的ｍＲＮＡ転写物と特異的に対合する、合成した核酸塩基オリゴマーである。この対合は、ＲＮＡｓｅＨ（リボヌクレアーゼＨ）がヘテロ二本鎖を認識し、ｍＲＮＡを分解することにより、ｍＲＮＡを分解するためのものである。アンチセンス鎖が機能する主要な作用機序はＲＮＡｓｅＨによるものであるが、タンパク質翻訳の阻害およびイントロンのスプライシングの変化も報告されている（ＡｇｒａｗａｌおよびＫａｎｄｉｍａｌｌａ、２０００年）。アンチセンス核酸塩基オリゴマーは、数個の核酸塩基、通常は１８〜２４個からなって結合基で互いに結合された鎖を含む化合物である。核酸塩基オリゴマーは、天然または非天然のオリゴヌクレオチドであって、修飾おおよび非修飾オリゴヌクレオチドを含むことができ、さらには、チオリン酸エステルおよびアミドリン酸エステルモルホリノ、タンパク質核酸（ＰＮＡ）、固定された核酸（ＬＮＡ）、およびアラビノ核酸（ＡＮＡ）等のオリゴヌクレオチド模倣剤といった改変された骨格結合を含むことができる。
【００５３】
チオリン酸エステルＯＤＮは開発が進み、内在性ヌクレアーゼに対する安定性が上昇したＯＤＮが提供されている。このように安定性が上昇したことによってＡＳＯを臨床現場で用いることが可能になったが、チオリン酸エステルＯＤＮはポリアニオン性が高いため用途が限定される。チオリン酸エステルＡＳＯは、第一世代ＡＳＯと呼ばれることが多い。このような化合物の一つが限定された接眼用途で上市されている一方、ｂｃｌ−２を標的とするチオリン酸エステルＯＤＮ、すなわちＧｅｎａｓｅｎｓｅ／Ｇ３１３９についてはいくつかの第３相臨床試験の終了が真近である（Ｐｉｒｏｌｌｏら、２００３年）。一般に第二世代のＡＳＯは、混合骨格オリゴヌクレオチド（ＭＢＯ）またはキメラＡＳＯと呼ばれるものの中に、ＲＮＡ塩基の２’位のアルコキシ置換基、すなわち２’Ｏ−メチル基（Ｏｍｅ）または２’Ｏ−メトキシエチル基（ＭＯＥ）、およびチオリン酸エステルＤＮＡ残基を有している。このようなＡＳＯは、動物モデルにおいてまたヒトにおいて、改善された安全性および薬物動態学的特性を示す（ＺｈｏｕおよびＡｇｒａｗａｌ、１９９８年）。修飾されたＲＮＡ塩基は対合するとＲＮＡｓｅＨを活性化せず、一方チオリン酸エステルＤＮＡは対合してもＲＮＡｓｅＨを活性化するという事実により、修飾されたＲＮＡ塩基と修飾されたＤＮＡ塩基とを「混合する」ことが必要である。したがって、チオリン酸エステルＤＮＡ残基のコアに隣接する修飾されたＲＮＡ塩基を有するハイブリッド分子は有効なＡＳＯである。これらのハイブリッド分子は、ウィングマー、あるいは２個または４個の隣接する２’Ｏ−メチルＲＮＡ塩基を両側に有するものはそれぞれ２×２ＭＢＯまたは４×４ＭＢＯと呼ばれる。これらの第二世代ＭＢＯ化合物の内のいくつかは、現在第１相臨床試験または第２相臨床試験がおこなわれている。
【００５４】
ＲＮＡｉオリゴマーは一般に、２１〜２３のヌクレオチド（ｎｔｓ）の相補的モノマーから合成され、それぞれ二つのヌクレオチド３’位の突出部を有する、ＲＮＡ二本鎖（二本鎖ＲＮＡすなわちｄｓＲＮＡ）である。あるいは、ＲＮＡｉオリゴマーは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって産生される３’ＵＵ突出部を任意選択で含むステムループ構造の一部である、２１〜２９の塩基対の二重領域を有するおよそ５０〜７５のヌクレオチドのショートヘアピン分子である（表２参照）。これらの分子はそれぞれ、小干渉性ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と呼ばれ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる転写後の遺伝子サイレンシング機序を介して哺乳類細胞における遺伝子発現の配列特異的阻害を媒介することが最近示され、まとめて単純にＲＮＡｉと呼ばれることが多い（ＰａｄｄｉｓｏｎおよびＨａｎｎｏｎによる総説、２００２年、Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら、２００３年、Ｓｈｉ、２００３年）。表２に、本明細書に記載したいくつかのＡＳＯ化合物およびＲＮＡｉ化合物の構造を例示する。
【００５５】
【表２】
2007510408.tif 000003
【００５６】
細胞内でｓｈＲＮＡを発現させるため、プラスミドベクターまたはウイルスベクターは、例えば、ポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ  Ｈ１、Ｕ６、ＢＬ、ＳＭＫ、７ＳＫ、ｔＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ、ｔＲＮＡ（ｍｅｔ）由来およびＴ７プロモーターを含むがこれらに限定されないプロモーター、ステムループＲＮＡコード化挿入断片のクローニング部位、ならびに４−５−チミジン転写終結シグナルを含むことができる。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは一般によく規定された開始部位および停止部位を有し、その転写物はポリ（Ａ）尾部を欠く。これらのプロモーター用の終結シグナルはポリチミジン領域で規定され、転写物は一般に二番目のウリジンの後で切断される。この位置で切断されるため、発現されたｓｈＲＮＡ内に、合成ｓｉＲＮＡの３’突出部と同様の３’ＵＵ突出部が形成される。
【００５７】
（ＲＮＡｉ配列の選択と同定）
ＲＮＡｉ法は幅広く認められ使用されつつあり、ゆくゆくは有効なツールとしてアンチセンス法に取って代わると思われる。ＲＮＡｉをおこなうやり方の一つは、ｓｉＲＮＡと呼ばれる、化学的に合成された二本鎖ＲＮＡ（天然の塩基、あるいはより好ましくは安定性を高めるために修飾された塩基からなる）を使用することである。これらの二本鎖はＡＳＯの場合とほぼ同様にトランスフェクトされ、スクリーニングし最適化するプロセスは上記の通りである。ＲＮＡ開鎖構造等のアンチセンス鎖が機能するための原則のいくつかはＲＮＡｉ法に同様に適用される（Ｂｏｈｕｌａら、２００３年）が、ＲＮＡｉ配列をＡＳＯ配列より効果的にする多くの違いが明らかに存在し、その逆もまた存在する（Ｂｅｒｔｒａｎｄら、２００２年、Ａｏｋｉら、２００３年、Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒら、２００３年、Ｈｏｌｅｎら、２００３年、Ｈｏｕｇｈら、２００３年、Ｖｉｃｋｅｒｓら、２００３年、Ｘｕら、２００３年）。設計および選択のための非常に参考になるステップがＤｙｋｘｈｏｏｒｎらの総説（２００３年）に記載されており、その他の方法は当技術分野で公知である（Ｙｕら、２００２年、Ｓｏｈａｉｌら、２００３年）。
【００５８】
（ｓｉＲＮＡの設計）
以下の基準にしたがえば、好ましいｓｉＲＮＡを選択できる。
【００５９】
（標的配列のＧＣ（グアニン−シトシン）比）
第一に、２１個または２３個のヌクレオチドを有する好ましいｓｉＲＮＡは、５０％に近いＧＣ比を有する対象ｍＲＮＡコード領域の中から選択される。最も望ましくは、ＧＣ比が４５％と５５％の間である。好ましさのやや低いｓｉＲＮＡは６０％から７０％までのＧＣ含量を有する。一般に、７０％を超えるＧＣ含量を有するｓｉＲＮＡは、好ましいレベルのＧＣ含量を有するｓｉＲＮＡに比べ、誘発する遺伝子スライシングレベルが低下するため、好ましくない。
【００６０】
（標的配列の位置）
第二に、好ましいｓｉＲＮＡは、ＡＵＧ開始コドンから５０〜１００ヌクレオチド以内ではなく、または終止コドンから５０〜１００ヌクレオチド以内ではない領域から選択される。
【００６１】
（標的配列の塩基含量）
第三に、好ましいｓｉＲＮＡは、二つのアデノシンで始まる標的配列から選択される。ＡＡで始まる標的配列を選択すれば、ｄＴｄＴ突出部を有するｓｉＲＮＡを産生できる。このようなｓｉＲＮＡは、合成が容易で低コストであり、一般にヌクレアーゼに対して改善された抵抗性を示す。また、標的配列は３個またはそれ以上の連続したグアノシンを含まないことが好ましい。このようなポリＧ配列は高度に重層して凝集体を形成することができ、凝集体はｓｉＲＮＡのサイレンシング機序に干渉する可能性がある。
【００６２】
（標的配列の特異性）
第四に、好ましいｓｉＲＮＡは、ＩＡＰに無関係な他の遺伝子と相同ではない標的配列から選択される。有望な標的配列をＢＬＡＳＴで検索し、対象遺伝子以外の核酸配列に対し相同性の低い標的配列を選択する。これにより、高い特異性を有するｓｉＲＮＡの選択が可能になり、標的配列と相同な遺伝子のサイレンシングを防止する。
【００６３】
要約すると、最も好ましい標的配列は、長さが２３ヌクレオチドであり、対象遺伝子のコード配列内にあり、ＡＡで始まり、５０％のＧＣ含量を有し、開始コドンまたは終止コドンから５０〜１００ヌクレオチド以内になく、非ＩＡＰ遺伝子とは相同でない。好ましさのやや低い標的配列は、長さが２３ヌクレオチドであり、ＧＣ含量が４５％から５５％までのコード配列の領域内にあって、３個を超える連続的グアノシンを含まず、非ＩＡＰ遺伝子とは相同でない。これらの基準をすべて満たす標的配列をｓｉＲＮＡ標的配列の設計に使用すると、ＲＮＡｉは標的遺伝子の８０％以上を効果的にサイレンシングする。少なくとも二つの標的配列をｓｉＲＮＡ設計用に選択すると、成功率はさらに改善される。
【００６４】
（ＲＮＡｉの標的の選択と決定）
有望なＲＮＡｉの標的は様々なパラメーターを用いて同定されるが、最も効力のあるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの候補配列は経験的な試験により同定される。このような試験のための一つのやり方は、５’および３’のＵＴＲ（非翻訳領域）部分配列を含む対象遺伝子の最大配列ｃＤＮＡに基づいて、対象のＩＡＰ（例えば、ＸＩＡＰ、ＨＩＡＰ−１、またはＨＩＡＰ−２）遺伝子を十分カバーし、合成ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを重複なくコードするベクターの大きなライブラリーを構築することである。ＩＡＰのイントロン−エクソン構造の知識ならびにＴａｑｍａｎ式定量的ＲＴ−ＰＣＲ法およびＥＬＩＳＡアッセイ法等の標的のノックダウンを感度良く測定する手段を備え、トランスフェクションおよび標的測定の条件を最適化できれば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの選択方法は比較的単純明快である。本明細書に記載する選択方法に加えて、他の選択方法も存在し、例えば、Ｘｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３０６：  ７１２〜７１７、２００３年、Ｚｈａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：  ｅ７２、２００３年、およびＳｏｍｍｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２２：  ４２６６〜４２８０、２００３年に記載されている。
【００６５】
（ＸＩＡＰ  ＲＮＡｉの標的配列）
表３にＸＩＡＰ  ＲＮＡｉの例示的標的配列（配列番号１〜２０）を示す。
【００６６】
【表３】
2007510408.tif 000004
【００６７】
ＸＩＡＰコード領域（配列番号２１）に対する、これらの標的配列の内の１０個の位置を図１に示す。ヌクレアーゼ耐性を上げるには、修飾ＲＮＡ残基を使用することが有益である。いくつかのガイダンスが、Ｈａｍａｄａら（２００２年）、Ｂｒａａｓｃｈら（２００３年）、およびＣｚａｕｄｅｒｎａら（２００３年）の文献に記載されている。
【００６８】
（安定したＲＮＡｉ）
阻害性核酸塩基オリゴマーをコードするベクターを用いて（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）細胞を安定してトランスフェクトすることによってもＲＮＡｉを実施できる。手法の一つには、Ｈ１（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら（２０００年）がｐＳＵＰＥＲベクターに用いた）およびＵ６（ＰａｄｄｉｓｏｎおよびＨａｎｎｏｎ（２００２年）ならびにＰａｄｄｉｓｏｎら（２００２年）がＰＣＲ「シャギング」法で使用した）等のｐｏｌＩＩＩプロモーターからのｓｈＲＮＡ転写物の産生が含まれる。このＲＮＡｉ二本鎖分子産生のための分子生物学的手法には、魅力的な利点がいくつかある。第一に、ｐｏｌＩＩＩプロモーターＲＮＡｉベクターを使用し細胞内に導入することにより、ＲＮＡｉ転写物の持続した産生が可能になる。第二に、レトロウイルスまたはアデノウイルスＲＮＡｉベクターを使用することにより、プラスミド導入効率に関する制限が解消される。第三に、ｐｏｌＩＩＩＲＮＡｉベクターは、機能喪失または無表現型を再現する、安定した細胞系およびトランスジェニック動物の産生を可能にする（ＢａｒｔｏｎおよびＭｅｄｚｈｉｔｏｖ、２００２年、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、２００２年、Ｃａｒｍｅｌｌら、２００３年、Ｈｅｍａｎｎら、２００３年、Ｋｕｎａｔｈら、２００３年、Ｐａｄｄｉｓｏｎら、２００２年ｂ、Ｒｕｂｉｎｓｏｎら、２００３年、Ｓｔｅｉｎら、２００３年、Ｓｔｅｗａｒｔら、２００３年、Ｔｉｓｃｏｒｎｉａら、２００３年）。このような細胞および動物は、遺伝子ノックアウト細胞系または動物より容易に産生される。本明細書に記載する分子生物学的手法は、遺伝子特異的ＲＮＡｉの大きなライブラリーでの表現型スクリーニング実施において有用である。さらに、Ｔｅｔ−リプレッサーを用いるｐｏｌＩＩＩベクターは、細胞または動物におけるＲＮＡｉ産生の抗生物質による制御を可能にする（ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇら、２００３年、Ｗａｎｇら、２００３年）。
【００６９】
完全長ＲＮＡｉは、Ｃ．エレガンスおよびキイロショウジョウバエ属においては有用であるが、ＰＫＲ（タンパク質キナーゼＲ）が活性化されるため、哺乳類でおこなうのは困難である。ｄｓＲＮＡがインターフェロン経路またはタンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）経路を活性化すると、二重鎖ＲＮＡウイルスがＰＫＲを活性化するのと同様に、ＰＫＲが活性化される。ＰＫＲが活性化されると、タンパク質合成が停止され、細胞死が誘導される。インターフェロンの活性化も細胞死につながる。３１未満の二本鎖ヌクレオチドを有するＲＮＡｉ分子はＰＫＲを活性化しないため、２９ヌクレオチド以下の二本鎖をコードするＲＮＡｉベクターが好ましい（ＰａｄｄｉｓｏｎおよびＨａｎｎｏｎ、２００２年）。
【００７０】
（ＲＮＡｉヘアピン配列（ｓｈＲＮＡ）およびｐｏｌＩＩＩベクターの設計）
ｓｈＲＮＡおよびｐｏｌＩＩＩベクターを同定するための手法をＰａｄｄｉｓｏｎおよびＨａｎｎｏｎが記載しており（Ｐａｄｄｉｓｏｎら、２００２年ａ）、ＰＣＲシャギング法と呼ばれる。その詳細なプロトコルおよび配列選択ツールは当技術分野で公知である。ＸＩＡＰを標的とする典型的なｓｈＲＮＡ配列を図２に、ＸＩＡＰコード領域内のｓｈＲＮＡ標的配列の位置を図３に示し、ＨＩＡＰ−２を標的とする典型的なｓｈＲＮＡ配列を図４に、ＨＩＡＰ−２コード領域内のｓｈＲＮＡ標的配列の位置を図５に示す。図６に示すように、典型的なｓｈＲＮＡ配列はＨＩＡＰ−１コード領域内のＨＩＡＰ−１を標的としている。
【００７１】
ＲＮＡｉベクターを産生する典型的な方法において、ＲＮＡｉのためにステムループ構造を形成するように設計された短いＲＮＡ転写物の産生には、ヒトＵ６ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）ｐｏｌＩＩＩプロモーターが使用される。この方法では、“Ｇ”残基で始まるＵ６転写物が保持され、したがってＲＮＡｉ転写物はすべて“Ｇ”で始まる。このため、ＲＮＡｉ標的配列はセンス鎖の３’位に“Ｃ”を含む配列に限定される。転写物は、ＰＣＲプライマーによってヘアピンの末端に取り込まれたＴ領域で終止する。ＰａｄｄｉｓｏｎおよびＨａｎｎｏｎは、二本鎖またはステム内に２７〜２９ヌクレオチドを有するヘアピンが１９〜２１ヌクレオチドのステムより有効であることを見出した。ｄｓＲＮＡαヘリックス内で可能な、少数のＧ−Ｕ塩基による対合がステムのセンス鎖内に含まれていることが望ましい。これらのＧ−Ｕ塩基による対合は、細菌が増殖する間にヘアピンを安定化する。ＰＣＲに基づく手法では、およそ９３ヌクレオチドにも上り、内２１ヌクレオチドがＵ６プロモーターの増幅に使用される、大きなＰＣＲプライマー内に多数の異なるＲＮＡｉ配列を取り込み、これらの配列を急速に産生することが可能である。最終的なＰＣＲ産物は次に、ＰＣＲ産物のプラスミドベクター内での急速なクローン化を可能にする、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニング法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンジエゴ市、カリフォルニア州）を用いてサブクローニングされる。ＴＯＰＯクローニング法で得られ、それ自体のプロモーターを有するＲＮＡｉカセットを含む、ＤＮＡは容易に切除され、数多くの他のベクター内にサブクローニングされる。実際のヘアピンＰＣＲプライマーは意図する転写物の逆補体であって、その上にＵ６プロモーターに対する２１ヌクレオチドの相同体が付加される。図７に、最終的なｓｈＲＮＡプラスミドベクターおよび産生されるヘアピン転写物を図示する。大きなプライマーのＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製は、収率を下げコストを上げるため、不要である。最後に分析的スクリーニングおよび機能的スクリーニング、ならびにＤＮＡ配列決定ををおこない、ＲＮＡｉベクターの配列の完全性を確認する。およそ３００ヌクレオチドからなるＵ６プロモーターをコードするプラスミドがテンプレートとして使用される。ＰＣＲ条件には、ヘアピンが誘導する二次構造を破壊するための４％ＤＭＳＯを含めることができる。クローニングの選別および確認を容易にするため、診断用の制限部位が取り込まれることが好ましい。
【００７２】
（実験条件の最適化）
ＲＮＡｉの標的の選択に先立って、トランスフェクション条件を確立し、細胞系列が高い導入効率および測定可能な標的レベル（例えば、蛍光標識したオリゴマーを使用することによる）を有すると考えられるようにする。細胞をトランスフェクトする多くの方法（例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔法）が存在するが、高効率で細胞毒性の低いリポソームトランスフェクション剤（例えば、リポフェクチン、リポフェクトアミン  ＰＬＵＳ、リポフェクトアミン２０００）は開発が進みＲＮＡｉのスクリーニングに適するものとなった。これは、そのダウンレギュレーションがアポトーシスを誘発するＩＡＰ遺伝子を標的にしてＲＮＡｉを使用する場合、特に有用である。ＲＮＡｉの効果は、トランスフェクション剤に関連する非特異的細胞毒性から明確に区別されなければならない。図８Ａ〜８Ｄに、リポソームトランスフェクション剤のリポフェクトアミン２０００を２種類の異なる用量で２種類の異なる濃度のＡＳＯと共に使用して得られた、最適化の結果を図示する。ＲＮＡｉについてのトランスフェクション最適化の結果は、ＡＳＯから得られた最適化の結果と一致すると考えられる。顕微鏡写真から、細胞の大部分が強く蛍光標識される条件を識別できることが示され、さらにこの方法で多くの条件およびトランスフェクション剤を比較し、対象の細胞系にとって最適なトランスフェクション剤および条件を見出すことができる。この手法の詳細はＳｔｅｉｎらの文献（Ｂｅｎｉｍｅｔｓｋａｙａら、２０００年）に記載されている。
【００７３】
最適なトランスフェクション条件を決定する際には、ＲＮＡｉにおいて成功裏に使用されているｓｈＲＮＡをコードするベクターなどの陽性対照を使用することが有益である。次に、この遺伝子のためのトランスフェクション条件は、スクリーニング法で提示したのと同様の条件下で測定する。これにより、実験条件の最適化および実験方法に伴ういくつかの技術的難点の明確化が可能になる。このような過程から得られた知識は、次に新しい標的配列に対するＲＮＡｉのためのスクリーニング法に活用される。
【００７４】
（ＲＮＡｉ選択のためのスクリーニング方法）
我々はｓｈＲＮＡ活性の確認に、空のＵ６プロモータープラスミドと比較して、トランスフェクション後のプラスミドベクターのＩＡＰ用ｍＲＮＡのノックダウンを測定する、機能的スクリーニングを採用した。我々はクローンおよび挿入断片の確認に、従来型のＤＮＡ消化およびゲルサイズ分析も採用した。図９Ａおよび９Ｂから、所定のＰＣＲ反応で得られたクローンがすべてＸＩＡＰ用伝達暗号をノックダウンするものではないことがわかる。この結果は、ＸＩＡＰを有効に標的とするクローンがアガロースゲル上で大きな分子量も示し、機能しないクローンは「空の」Ｕ６プロモーター構築体であることを示唆すること、一方、活性を示さない他の大きな挿入ベクターは有効なＲＮＡｉ配列でない可能性がある（例えば、間違って挿入され、あるいはＲＮＡｉ領域にＲＮＡｉがアクセスできない可能性がある）ことも示している。ポジティブクローンはその完全性を確認するためのＤＮＡ配列である。経験から、この手法により短期間（通常は２週間未満）内にｓｈＲＮＡのポジティブクローンを得られることがわかった。したがって、この方法により、多数の遺伝子用の候補ＲＮＡｉ配列を合理的な時間枠内で確認できる、比較的迅速で、効率的で、しかも容易な手法が提供される。
【００７５】
（ｓｈＲＮＡ配列の選択）
可能性のあるＸＩＡＰ用ＲＮＡｉクローンを、ＥｃｏＲＩで消化させ、得られた消化物をアガロースゲル上で分画して、スクリーニングした（図９Ａ）。異なる大きさのＥｃｏＲＩ消化断片が認められ、そのいくつかはＵ６プロモーターの対照親ベクターを示した。図９Ａに示したクローンは、一時的にＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションから２４時間後に、ＸＩＡＰ用ｍＲＮＡのレベルをＴａｑｍａｎ（登録商標）分析法で測定した。有意にＸＩＡＰ発現レベルをノックダウンさせたクローンは、図９Ａで同定された最大の挿入断片と一致した。
【００７６】
図９Ａで同定されたポジティブクローンは、プラスミドｓｈＲＮＡベクターを細胞にトランスフェクトし、図９Ｂに示すように、トランスフェクションから４８時間後に特異的なＸＩＡＰタンパク質のダウンレギュレーションを測定してさらに確認した。図１０Ａは、ＸＩＡＰ用ＲＮＡＩｐＣＲ（登録商標）２．１ＴＯＰＯプラスミドを一時的にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞内のＸＩＡＰタンパク質レベルをＧＡＰＤＨレベルと比較して示すウェスタンブロットであり、対照親ベクターをトランスフェクトされた細胞に比べると、ＸＩＡＰタンパク質レベルが実質的に失われていることを示している。図１０Ｂは、一時的にトランスフェクトされた細胞内のＸＩＡＰ発現の濃度測定結果を示すヒストグラムである。図１０Ｂは、図１０Ａで同定されたそれぞれが２種類の異なるＲＮＡｉ配列を有する２種類の異なるクローンについての結果を示している。すべてのクローンが活性を示し、一組のクローンが他の組のクローンより活性がわずかに勝っている。ＨＩＡＰ−１用ＲＮＡｉベクターの結果から、ＲＮＡｉがＸＩＡＰに対し特異的であることがわかった。ＸＩＡＰ用ｓｈＲＮＡの結果を他のＩＡＰ、すなわちＨＩＡＰ−１／ｃＩＡＰ２用のｓｈＲＮＡベクターおよび空のＵ６ベクターと比較した。クローン２Ｅを配列し、安定した細胞系の生成に使用した。
【００７７】
（ＲＮＡｉの対照）
対象となる標的遺伝子に対するＲＮＡｉの効果の判定においては、好適な対照を使用することが重要である。ホタルのルシフェラーゼまたはクラゲの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の無関係な遺伝子に対してｓｈＲＮＡを産生するベクターが有用な対照である。他の好適な対照には、ｓｈＲＮＡミスマッチをコードするベクター、および認められるＲＮＡｉ表現型がｓｈＲＮＡ発現の効果よりは対象遺伝子のサイレンシングに関係することを確認するため、対象遺伝子以外の遺伝子を標的とするベクターが含まれる。こうすることにより、認められる効果はＰＫＲまたはインターフェロンに関係しない。
【００７８】
認められる表現型が特異的標的遺伝子のサイレンシングによるものであることを確認するためには、対象遺伝子内の様々な配列を標的とする多型ＲＮＡｉ構築体を選択することが有用である。多型ＲＮＡｉが単一遺伝子を標的として使用され、同じ表現型が異なるＲＮＡｉのそれぞれから誘導される場合は、同じ表現型が特異的標的遺伝子のサイレンシングにより発現すると思われる。哺乳類の全長転写物に対する多型ＲＮＡｉをｉｎ  ｖｉｖｏで蓄えるための一つの手法は、単一標的に対する多型ＲＮＡｉを産生するダイサータンパク質を使用することである。
【００７９】
（アデノウイルスまたはレンチウイルスのＲＮＡｉベクター）
分子生物学研究者にとって、ｓｈＲＮＡカセットを、アデノウイルスおよびレトロウイルス等の他の遺伝子ベクターにクローン化する方法は自明である。ｓｈＲＮＡカセットがそれ自体のｐｏｌＩＩＩプロモーターを有する場合は、サブクローニング法はｐｏｌＩＩＩプロモーター下流のクローニングに依存する必要はない。標準的なシャトルベクターをカスタム化する方法は当業者に公知であり、アデノウイルスＲＮＡｉのカスタム化についてはＸｉａらが記載している（２００２年）。
【００８０】
（一過性または安定性トランスフェクション実験における、あるいはウイルストランスダクションにおける、遺伝子機能のｉｎ  Ｖｉｔｒｏ分析）
ＸＩＡＰ用ｓｈＲＮＡカセット（図３に記載のＲＮＡｉ２）を、ＣＭＶプロモーターを除去したｐＣＤＮＡ３内でサブクローニングした。これは、新しいベクターが、阻害性核酸を発現する安定細胞系創出のための選択可能なマーカー（例えば、ネオマイシン耐性）を含むようにおこなった。乳癌細胞系のＭＤＡ−ＭＢ−２３１に線状化ＤＮＡをトランスフェクトし、回収後、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ／Ｇ４１８内で選択してクローン集団を得て、ウェスタンブロットでＸＩＡＰタンパク質のノックダウンをスクリーニングした。図１１Ａおよび１１Ｂは、試験した１５クローンの内、３クローンがＸＩＡＰタンパク質を実質的に（４０％、８０％、および９０％）ダウンレギュレーションしたことを示している。興味深いことに、実際にはポジティブクローンは成長の遅いコロニーの内のいくつかであった。したがって、安定細胞系を創出すること、およびさらなる研究に適した細胞系内でＲＮＡｉ分子を連続して発現させることが可能である。ＲＮＡｉの安定細胞系の創出により、アポトーシス制御の分析において有用な新たなツールが提供されよう。
【００８１】
（ＸＩＡＰ用ＲＮＡｉ）
現在までに同定されているすべてのＩＡＰの内で、ＸＩＡＰが最も強力なアポトーシス阻害体であり、ＸＩＡＰは、放射線療法、化学療法、および免疫療法の細胞傷害性効果に対して最も幅広い防御をおこなう。ストレス下でＸＩＡＰの翻訳が誘発されることは、細胞が生存するための重要な要因である。ＸＩＡＰの発現レベルは、米国国立癌研究所の６０のヒト腫瘍細胞系スクリーニングパネル、すなわち、乳癌、前立腺癌、白血病、結腸癌、中枢神経系癌、卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、および非小細胞肺癌を含め、様々な組織および器官に影響する新生物に由来するヒト細胞系の多様な群の中でアップレギュレートされる。ＸＩＡＰのレベルは、正常な肝臓内のＸＩＡＰのレベルに比べ、上記パネル中のすべての腫瘍細胞系内では上昇する。ＸＩＡＰのレベルは、膵臓癌内でも周囲組織のレベルに比べて上昇する。様々な癌においてＸＩＡＰレベルが上昇し、ＸＩＡＰの喪失がアポトーシスによる細胞死の前提条件であるため、ＲＮＡｉにとってＸＩＡＰは有望な臨床的標的である。
【００８２】
ＸＩＡＰレベル低減の効果は、本明細書に記載するように、ＸＩＡＰ用ＲＮＡｉベクターを安定してトランスフェクトされる乳癌細胞系のＭＤＡ−ＭＢ−２３１内で、別の癌治療剤であるＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド）の投与と組み合わせて評価した。増大しつつあるＴＮＦ上科の一つであるＴＲＡＩＬは、その受容体に結合すると、急速なアポトーシスを誘発する。ＴＲＡＩＬを、ＸＩＡＰ用ＲＮＡｉベクターを安定してトランスフェクトされた細胞系に投与すると、細胞の生存率は、空の親ベクターをトランスフェクトされた対照細胞に比べて、有意に低下した（図１２）。図１３に示すように、タンパク質が介在する細胞死のレベルは、ＸＩＡＰ用ＲＮＡｉ発現細胞をＴＲＡＩＬで処理した後に、対照細胞に比べて有意に変化した。ＸＩＡＰ用ＲＮＡｉ発現細胞に対するＴＲＡＩＬ処理の効果はレーン４に示される。ＴＲＡＩＬ処置に対応して活性カスパーゼ３、８、および９のレベルは上昇したが、ＸＩＡＰ用ＲＮＡｉ発現細胞における不活性な酵素のレベルは対照細胞に比べて低下した。さらに、ＴＲＡＩＬ処置されたＸＩＡＰ用ＲＮＡｉ発現細胞においては、ＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ）全長の開裂は対照細胞に比べて増大した（図１３）。
【００８３】
ＸＩＡＰレベル低減の効果を、ＸＩＡＰ用ＲＮＡｉベクターを安定してトランスフェクトされる乳癌細胞系のＭＤＡ−ＭＢ−２３１内で、２種類の化学療法剤であるタキソール（ドセタキセル）およびタキソテール（パクリタキセル）の投与と組み合わせて評価した。ＸＩＡＰ用ＲＮＡｉベクターを発現する細胞は、化学療法剤処理に対応して細胞生存率が空の親ベクターをトランスフェクトされた対照細胞に比べ有意な低下を示した。したがって、乳癌細胞においてＲＮＡｉによりＸＩＡＰが安定して失われると、標準的な化学療法剤に対する感度が上昇する。
【００８４】
（腫瘍異種移植片に対するＲＮＡｉの効果、またはトランスジェニック動物における遺伝視機能のｉｎ  ｖｉｖｏ分析）
対象遺伝子を成功裏に標的にする検証済みのｓｈＲＮＡ構築体はｉｎ  ｖｉｖｏ試験に有用である。例えば、腫瘍異種移植モデルにおいて細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトすなわち形質導入し、その後免疫不全症の宿主内に移植して、腫瘍増殖効果を分析できる。あるいは、皮下腫瘍に原位置でアデノウイルスのｓｈＲＮＡベクターを注射することができる。異種移植片研究のためにｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの全身投与もおこなうことができる（Ｌｅｗｉｓら、２００２年、ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、２００２年、Ｓｏｎｇら、２００３年、Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、２００３年、Ｚｅｎｄｅｒら、２００３年）。
【００８５】
ＲＮＡｉベクターは、ノックアウト発生の面倒さもコストもいらずに無表現型を反復発生させるトランスジェニック動物の産生を可能にする（Ｋｕｎａｔｈら、２００３年）。一つの手法において、必須遺伝子がＲＮＡｉの「ノックダウン」の標的となり、遺伝子発現の全部ではないがほとんどをノックダウンする。そのような手法により、その完全なノックアウトが胎児の死亡をまねく必須遺伝子の分析が可能になる。他の手法においては、テトラサイクリンで誘導可能なＲＮＡｉシステムによって、トランスジェニック動物におけるＲＮＡｉ発現のファインチューニングが可能になり、マウスのゲノム内のすべての遺伝子およびスプライスバリアントの分析が可能になる。このような手法によって、特定の転写物を一つずつ標的化できる可能性もある。このようなＲＮＡｉ手法は当技術分野で公知であり（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００２年、Ｗｉｌｄａら、２００２年、Ｈｅｍａｎｎら、２００３年、Ｍｉｌｌｅｒら、２００３年）、マウスまたはヒト細胞における遺伝子機能分析のための強力なツールを提供できる。
【００８６】
（結果および結論）
アンチセンス法（例えば、ＡＳＯ）およびＲＮＡ干渉法（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）は、癌および多発性硬化症等の疾患を治療するための小分子スクリーニング計画に着手する前に、臨床的標的として特定のＩＡＰの妥当性検証において有用である。これらの方法は新規治療剤の開発においても有用である。
【００８７】
ＩＡＰの妥当性検証のための手法を表４に短くまとめた。ＡＳＯおよびＲＮＡｉは利用した手法の内の二つにすぎない。別の手法には、全長アンチセンスのアデノウイルスによる送達、全長アンチセンスを発現する安定細胞系、リボザイム、および三本鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）が含まれる。
【００８８】
【表４ａ】
2007510408.tif 000005
【表４ｂ】
2007510408.tif 000006
【００８９】
（オリゴヌクレオチドおよび他の核酸塩基オリゴマー）
少なくとも二種類のオリゴヌクレオチド、すなわちリン酸ジエステル（ＰＯ）結合またはチオリン酸エステル（ＰＳ）結合を有するポリデオキシヌクレオチド、がリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）によるＲＮＡの開裂を誘導する。２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ配列は標的ＲＮＡに対し高い親和性を示すが、これらの配列はＲＮａｓｅ  Ｈの基質ではない。望ましいオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性のために、ヌクレオチド間のいくつかのまたはすべての結合がチオリン酸エステルで修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドのギャップを含む２’−修飾オリゴヌクレオチドに基づくものである。メチルホスホン酸エステル修飾が存在することにより、オリゴヌクレオチドの標的ＲＮＡに対する親和性は向上し、ＩＣ５０は低下する。この修飾により、修飾されたオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性も向上する。本発明の方法および試薬は、共有結合的に閉じた多アンチセンス（ＣＭＡＳ）オリゴヌクレオチド（Ｍｏｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３４６：２９５〜３０３、２０００年、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／６１５９５）、リボン型アンチセンス（ＲｉＡＳ）オリゴヌクレオチド（Ｍｏｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７５：４６４７〜４６５３、２０００年、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／６１５９５）、および大環状アンチセンスオリゴヌクレオチド（米国特許出願公開番号ＵＳ２００２／０１６８６３１  Ａ１）を含め、開発されるいかなる技術と組み合わせて使用することができる。
【００９０】
当技術分野で公知であるように、ヌクレオシドは核酸塩基と糖が結合したものである。ヌクレオシドの塩基部分は通常ヘテロ環塩基である。このようなヘテロ環塩基で最も普通の２種類はプリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、リン酸エステル基がヌクレオシドの糖部分と共有結合しているヌクレオシドである。五員環五炭糖を含むヌクレオシドの場合には、リン酸エステル基は２’位、３’位、または５’位の糖の水酸基部分と結合できる。オリゴヌクレオチドの形成においては、リン酸エステル基が隣接するヌクレオシドを互いに共有結合して直鎖状の高分子化合物が形成される。次に、この直鎖状高分子化合物の両末端がさらに結合して環状構造を形成できるが、開いた直鎖状が一般に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸エステル基は一般にオリゴヌクレオチドの骨格形成と呼ばれる。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合すなわち骨格は、３’位と５’位のリン酸ジエステル結合である。
【００９１】
本発明において有用な好ましい核酸塩基オリゴマーの具体的な例には、修飾された骨格または非天然のヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書で規定するように、修飾された骨格を有する核酸塩基オリゴマーには、骨格内にリン原子を保持するものと骨格内にリン原子を保持しないものとが含まれる。本明細書の目的から、そのヌクレオシド間骨格内にリン原子を保持しない修飾されたオリゴヌクレオチドも核酸塩基オリゴマーであるとする。
【００９２】
核酸塩基オリゴマーが有する修飾されたオリゴヌクレオチド骨格には、例えば、通常の３’−５’結合を有し、その２’−５’結合同族体であり、隣接するヌクレオシド単位のペアが３’−５’と５’− ３’または２’−５’と５’− ２’とで結合している逆極性を有する、チオリン酸エステル、鏡像異性チオリン酸エステル、ジチオリン酸エステル、リン酸トリエステル、アミノアルキル−リン酸トリエステル、３’−アルキレンホスホン酸エステルおよび鏡像異性ホスホン酸エステルを含むメチルや他のアルキルのホスホン酸エステル、ホスフィン酸エステル、３’−アミノアミドリン酸エステルおよびアミノアルキルアミドリン酸エステルを含むアミドリン酸エステル、チオノアミドリン酸エステル、チオノアルキルホスホン酸エステル、チオノアルキルリン酸トリエステル、およびボラノリン酸エステルが含まれる。様々な塩、混合塩および遊離酸型も含まれる。上記のリン含有結合の調製法を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、および第５，６２５，０５０号が含まれるが、これらに限定されるものではなく、上記特許はそれぞれ本明細書中に参照して組み込まれる。
【００９３】
その中にリン原子を含まない修飾されたオリゴヌクレオチド骨格を有する核酸塩基オリゴマーは、短鎖のアルキル基またはシクロアルキル基ヌクレオシド間結合、混合型ヘテロ原子およびアルキル基またはシクロアルキル基ヌクレオシド間結合、あるいは一つまたはそれ以上の短鎖のヘテロ原子またはヘテロ環ヌクレオシド間結合で形成される骨格を有している。上記オリゴマーには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部が形成される）、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格、およびスルホン骨格、ホルムアセチル基およびチオノホルムアセチル基骨格、メチレンホルムアセチル基およびチオノホルムアセチル基骨格、アルキレン基含有骨格、スルファミン酸エステル骨格、メチレンイミノ基およびメチレンヒドラジノ基骨格、スルホン酸エステルおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合型Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２成分を有する他の骨格を有するオリゴマーが含まれる。上記オリゴヌクレオチドの調製法を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が含まれるが、これらに限定されるものではなく、上記特許はそれぞれ本明細書中に参照して組み込まれる。
【００９４】
他の核酸塩基オリゴマーにおいては、糖部もヌクレオシド間結合も、すなわち骨格は新規な基に置き換わっている。核酸塩基単位は、ＩＡＰとの対合のため、そのままである。そのような核酸塩基オリゴマーの一つはペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−骨格は、アミド結合を含む骨格、特にアミノエチルグリシン骨格に置き換えられている。核酸塩基はそのままであり、骨格のアミド部の窒素原子と直接的にまたは間接的に結合する。これらの核酸塩基オリゴマーの調製方法および使用方法は、例えば、「ペプチド核酸：プトロコルおよび適用」、Ｐ．  Ｅ．  Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ノーフォーク、英国、１９９９年に記載されている。ＰＮＡの調製方法を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号が含まれるが、これらに限定されるものではなく、上記特許はそれぞれ本明細書中に参照して組み込まれる。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示をＮｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年、２５４、１４９７〜１５００に見出すことができる。
【００９５】
本発明の特定の実施形態において、核酸塩基オリゴマーは、チオリン酸エステル骨格、およびヘテロ原子骨格を有するヌクレオシド、特に−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）すなわちＭＭＩ骨格として知られる）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−を含むヌクレオシドを有する。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号に記載されているモルホリノ骨格構造を有する。
【００９６】
核酸塩基オリゴマーは、一箇所またはそれ以上を置換された糖部を含むこともできる。核酸塩基オリゴマーはその２’位に、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル基、Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル基、Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル基、あるいはＯ−アルキル基−Ｏ−アルキル基の内の一つを含み、式中、アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ１０のアルキル基あるいはＣ２〜Ｃ１０のアルケニル基およびアルキニル基である。特に好ましいのは、Ｏ[（ＣＨ２）ｎＯ]ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ[（ＣＨ２）ｎＣＨ３]２であって、式中、ｎおよびｍは１からおよそ１０までである。他の好ましい核酸塩基オリゴマーはその２’位に、Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル基、置換低級アルキル基、アルカリル基、アラルキル基、Ｏ−アルカリル基またはＯ−アラルキル基、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアルカリル基、アミノアルキルアミノ基、ポリアルキルアミノ基、置換シリル基、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、挿入基、核酸塩基オリゴマーの薬物動態学的特性を改善する基または核酸塩基オリゴマーの薬物力学的特性を改善する基、および同様な特性を有する他の置換基の内の一つを含む。好ましい修飾は、２’−Ｏ−メチル基および２’−メトキシエトキシ基（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている）である。他の望ましい修飾は、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ基（すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２）である。他の修飾には、２’−アミノプロポキシ基（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ基（２’−Ｆ）が含まれる。同様な修飾は、オリゴヌクレオチド上または他の核酸塩基オリゴマー上の他の部位、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’結合したオリゴヌクレオチドの糖の３’位あるいは５’末端ヌクレオチドの５’位でもおこなうことができる。核酸塩基オリゴマーは、五員環五炭糖の糖をシクロブチル部分等で置き換えた糖擬似体を有することもできる。上記のように修飾された糖構造体の調製方法を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号が含まれるが、これらに限定されるものではなく、上記各特許はその全体が本明細書中に参照して組み込まれる。
【００９７】
核酸塩基オリゴマーは、核酸塩基修飾体または置換体も含むことができる。本明細書で使用する「非修飾の」または「天然の」核酸塩基には、プリン型塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン型塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、他の合成核酸塩基および天然核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ハイポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル基および他のアルキル基誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル基および他のアルキル基誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、アデニンおよびグアニンの８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換体、ウラシルおよびシトシンの５−ハロ（例えば、５−ブロモ）、５−トリフルオロメチル、および他の５−置換体、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン等が含まれる。他の核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，  Ｊ．  Ｉ．  編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０年に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１年、３０、６１３に開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．  、第１５章、アンチセンスの研究および応用、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．  Ｔ．  およびＬｅｂｌｅｕ，  Ｂ．  編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、1993年に開示されているものが含まれる。これらの核酸塩基の内のいくつかは、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの結合親和性増大に特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換体は核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃分向上させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．、Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．  Ｔ．  およびＬｅｂｌｅｕ，  Ｂ．  編、アンチセンスの研究および応用、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９３年、２７６〜２７８頁）、特に２’−Ｏ−メトキシエチル基または２’−Ｏ−メチル基で修飾した糖と組み合わせると、望ましい塩基置換体となる。上記引用の修飾核酸塩基および他の修飾核酸塩基のいくつかの調製方法を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１��４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６８１，９４１号、および第５，７５０，６９２号が含まれ、上記特許はそれぞれ本明細書中に参照して組み込まれる。
【００９８】
本発明の核酸塩基オリゴマーの別の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、または細胞内取込みを増強する、一つまたはそれ以上の成分または接合体を核酸塩基オリゴマーに化学的に結合させることも含まれる。そのような成分には、コレステロール成分等の脂質成分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６：６５５３〜６５５６、１９８９年）コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔ．、４：１０５３〜１０６０、１９９４年）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、６６０：３０６〜３０９、１９９２年、Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔ．、３：２７６５〜２７７０、１９９３年）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０：５３３〜５３８、１９９２年）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：１１１１〜１１１８、１９９１年、Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２５９：３２７〜３３０、１９９０年、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、７５：４９〜５４、１９９３年）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ラセミ−グリセロールまたは１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ラセミ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム塩（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、３６：３６５１〜３６５４、１９９５年、Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８：３７７７〜３７８３、１９９０年）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１４：９６９〜９７３、１９９５年）、アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、３６：３６５１〜３６５４、１９９５年）、パルミチル成分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、１２６４：２２９〜２３７、１９９５年）、あるいはオクタデシルアミン成分またはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．、２７７：９２３〜９３７、１９９６年）が含まれる。これらの核酸塩基オリゴマー接合体の調製法を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８２８，９７９号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９４８，８８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１０９，１２４号、第５，１１２，９６３号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，２１４，１３６号、第５，２１８，１０５号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、��５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１４，０７７号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，４８６，６０３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，４３９号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５７８，７１７号、第５，５７８，７１８号、第５，５８０，７３１号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９１，５８４号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、第５，６０８，０４６号、および第５，６８８，９４１号が含まれ、上記特許はそれぞれ本明細書中に参照して組み込まれる。
【００９９】
本発明には、キメラ化合物である核酸塩基オリゴマーも含まれる。「キメラ」核酸塩基オリゴマーは、そのそれぞれが少なくとも一つのモノマー単位、すなわちオリゴヌクレオチドの場合にはヌクレオチドからなる、二つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を含む核酸塩基オリゴマー、特にオリゴヌクレオチドである。これらの核酸塩基オリゴマーは通常、核酸塩基オリゴマーに、ヌクレアーゼによる分解に対する向上した耐性、向上した細胞内取込み、および／または標的核酸に対する向上した結合親和性を付与するため、核酸塩基オリゴマーが修飾された少なくとも一つの領域を有している。核酸塩基オリゴマーに付加された領域は、酵素がＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断するための基体をして働く。例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞内のエンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅ  Ｈが活性化されると、標的ＲＮＡが切断され、核酸塩基オリゴマーによる遺伝子発現の阻害効率が大幅に増強される。それゆえに、キメラ核酸塩基オリゴマーを使用した場合には、同じ標的領域に対してチオリン酸エステルがデオキシオリゴヌクレオチドと対合する場合に比べて、短い核酸塩基オリゴマーとほぼ同様な結果がしばしば得られる。
【０１００】
本発明のキメラ核酸塩基オリゴマーは、上記のように、二つまたはそれ以上の核酸塩基オリゴマーの複合構造体として形成できる。このような核酸塩基オリゴマーは、オリゴヌクレオチドの場合、当技術分野ではハイブリッドまたはギャップマーと呼ばれている。このようなハイブリッド構造体の調製法を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，０１３，８３０号、第５，１４９，７９７号、第５，２２０，００７号、第５，２５６，７７５号、第５，３６６，８７８号、第５，４０３，７１１号、第５，４９１，１３３号、第５，５６５，３５０号、第５，６２３，０６５号、第５，６５２，３５５号、第５，６５２，３５６号、および第５，７００，９２２号が含まれ、上記特許はそれぞれその全体が本明細書中に参照して組み込まれる。
【０１０１】
本発明に従って使用される核酸塩基オリゴマーは、公知の技術である固相合成法で簡便かつ日常的に製造できる。この合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（フォスター市、カリフォルニア州）を含め、いくつかのメーカーが販売している。当技術分野で公知である他のいかなる合成手段も付加的にまたは代替として使用できる。チオリン酸エステルおよびそのアルキル化誘導体等のオリゴヌクレオチドを調製するために類似した技術を使用することは、当技術分野でよく知られている。
【０１０２】
本発明の核酸塩基オリゴマーは、摂取、分布、および／または吸収を助けるために、他の分子、分子構造体、または化合物の混合物、例えば、リポソーム、受容体を標的とする分子、経口組成物、浣腸組成物、局所用組成物、または他の組成物と、混合し、カプセル封入し、接合し、あるいは結合することができる。このような摂取、分布、および／または吸収を助けるための組成物の調製法を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，１０８，９２１号、第５，３５４，８４４号、第５，４１６，０１６号、第５，４５９，１２７号、第５，５２１，２９１号、第５，５４３，１５８号、第５，５４７，９３２号、第５，５８３，０２０号、第５，５９１，７２１号、第４，４２６，３３０号、第４，５３４，８９９号、第５，０１３，５５６号、第５，１０８，９２１号、第５，２１３，８０４号、第５，２２７，１７０号、第５，２６４，２２１号、第５，３５６，６３３号、第５，３９５，６１９号、第５，４１６，０１６号、第５，４１７，９７８号、第５，４６２，８５４号、第５，４６９，８５４号、第５，５１２，２９５号、第５，５２７，５２８号、第５，５３４，２５９号、第５，５４３，１５２号、第５，５５６，９４８号、第５，５８０，５７５号、および第５，５９５，７５６号が含まれ、上記特許はそれぞれ本明細書中に参照して組み込まれる。
【０１０３】
本発明の核酸塩基オリゴマーは、動物に投与した際に、生物学的に活性な代謝産物またはその残渣を（直接的にまたは間接的に）提供できる、薬剤として許容される塩、エステル、そのようなエステルの塩、または他の任意の化合物を含む。したがって、本発明の開示には、例えば、薬剤前駆体および本発明の化合物の薬剤として許容される塩、そのような薬剤前駆体の薬剤として許容される塩、ならびに他の生物学的同等物も含まれる。
【０１０４】
用語の「薬剤前駆体」は、不活性な形態で調製され、内在性酵素あるいは他の化学物質および／または条件によって体内またはその細胞内で活性型（すなわち、薬剤）に変換される治療剤を意味する。具体的には、本発明のオリゴヌクレオチドの薬剤前駆体は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２４５１０またはＷＯ９４／２６７６４号に開示されている方法に従って、ＳＡＴＥ（（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）リン酸エステル）誘導体として調製することができる。
【０１０５】
用語の「薬剤として許容される塩」は、原化合物の望ましい生物学的活性を保持し、望ましくない毒性を示さない塩を意味する。薬剤として許容される塩基付加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミン等の金属またはアミンによって形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。好適なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカイン（例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．  Ｐｈａｒｍａ．  Ｓｃｉ．、６６：１〜１９、１９７７年）である。酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸を十分量の所望する塩基と接触させて塩を調製する、従来からのやり方で調製される。遊離酸は、その塩を酸に接触させて遊離酸を単離する、従来からのやり方で調製できる。遊離酸とその塩とは、極性溶媒への溶解性等の物理的特性のいくつかで幾分異なるが、それを除けば、塩はそれぞれの遊離酸と本発明の目的において等価である。本明細書で用いるように、「薬学的付加塩」には、本発明組成物の成分の一つである酸の薬剤として許容される塩が含まれる。薬学的付加塩には、有機酸または無機酸のアミン塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩、およびリン酸塩である。他の好適な薬剤として許容される塩は当業者に公知であり、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、またはリン酸等の無機酸、有機カルボン酸、有機スルホン酸、スルホ基またはホスホ基を有する酸、またはＮ−置換スルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、蓚酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸、またはイソニコチン酸、自然界でタンパク質合成に関与する２０種のα−アミノ酸等のアミノ酸、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−または３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（チクロ形成に使用される）、あるいはアスコルビン酸等の他の有機酸性化合物等の様々な無機酸および有機酸の塩基塩が含まれる。化合物の薬剤として許容される塩は、薬剤として許容されるカチオンからも調製できる。好適な薬剤として許容されるカチオンは、当業者に公知であり、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、および第四級アンモニウム等のカチオンが含まれる。炭酸塩または水素化炭酸塩も可能である。
【０１０６】
オリゴヌクレオチドおよび他の核酸塩基オリゴマーにとって好適な薬剤として許容される塩には、（ｉ）ナトリウム、カリウム、アンモニア、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジン等のポリアミンなどのカチオンから形成された塩、（ｉｉ）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などで形成された酸付加塩、（ｉｉｉ）例えば、酢酸、蓚酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの有機酸から形成された塩、および（ｉｖ）塩素、臭素、およびヨウ素等の元素アニオンから形成された塩が含まれる。
【０１０７】
本発明には、本発明の核酸塩基オリゴマーを含む薬剤組成物および製剤も含まれる。本発明の薬剤組成物は、局所治療または全身治療が望ましいか、さらには治療部位によって、多くの方法で投与することができる。投与は、局所（眼ならびに膣および直腸を含めた粘膜への送達を含め）投与、例えば、噴霧器投与、気管内投与、鼻腔内投与、表皮投与、および経皮的投与を含め）、粉末またはエーロゾルの吸入または吹入による肺への投与、経口投与または非経口投与であってよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹膜組織内、または筋肉内の注射もしくは注入、あるいは頭蓋内投与、例えば、クモ膜下投与または脳室内投与が含まれる。
【０１０８】
（固定核酸）
固定核酸（ＬＮＡ）は、本発明で使用可能な核酸塩基オリゴマーである。ＬＮＡは、ヌクレオチドのリビフラノース環の可撓性を制限し、ヌクレオチドを剛直な二環のＮ型高次構造に固定する、２’−Ｏと４’−Ｃ間のメチレン結合を有する。ＬＮＡは、いくつかのエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対して改善された耐性を示し、ＲＮａｓｅ  Ｈを活性化し、ほとんどすべての核酸塩基オリゴマーに導入可能である。さらに、ＬＮＡ含有核酸塩基オリゴマーは、標準的なアミドリン酸エステル合成プロトコルで調製可能である。ＬＮＡの詳細は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／１４２２６および米国特許出願公開番号ＵＳ２００２／００９４５５５  Ａ１に記載されており、上記はそれぞれ本明細書中に参照して組み込まれる。
【０１０９】
（アラビノ核酸）
アラビノ核酸（ＡＮＡ）も本発明の方法および試薬において使用可能である。ＡＮＡは、天然のＤ−２’−デオキシリボース糖の代わりにＤ−アラビノース糖に基づく核酸塩基オリゴマーである。非誘導型ＡＮＡ類似体は、ＲＮＡに対してチオリン酸エステルと同様な結合親和性を有する。アラビノース糖をフッ素で誘導すると（２’−Ｆ−ＡＮＡ）、結合親和性が向上し、生成されたＡＮＡ／ＲＮＡ二本鎖およびＦ−ＡＮＡ／ＲＮＡ二本鎖内で結合ＲＮＡの選択的加水分解が効率的に発生する。その末端において単純なＬ糖で誘導することによって、このＡＮＡ類似体を細胞培地内で安定化できる。ＡＮＡの治療適用については、例えば、Ｄａｍｈａら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２０：４２９〜４４０、２００１年で検討されている。
【０１１０】
（核酸塩基オリゴマーおよびオリゴマー複合体の送達）
我々は本明細書において裸のオリゴヌクレオチドが腫瘍細胞に侵入し、ＩＡＰ発現を阻害できることを示した。そうであっても、オリゴヌクレオチドや他の核酸塩基オリゴマーまたはオリゴマー複合体の細胞への送達を助ける製剤を使用することが望ましい（例えば、そのそれぞれが本明細書中に参照して組み込まれる、米国特許第５，６５６，６１１号、第５，７５３，６１３号、第５，７８５，９９２号、第６，１２０，７９８号、第６，２２１，９５９号、第６，３４６，６１３号、および第６，３５３，０５５号を参照されたい）。
【０１１１】
（治療）
治療は、癌治療がおこなわれている場所ならどこでも可能で、例えば、家庭、診察室、診療所、病院の外来部門、または病院が挙げられる。医師が治療の効果を真近に見て、必要な調節をおこなえるように、治療は一般に病院で始められる。治療期間は、治療対象の癌の種類、患者の年齢および病態、患者の疾患のステージおよび種類、ならびに治療への患者の身体的応答によって決まる。薬剤投与は異なる間隔で（例えば、毎日、毎週、または毎月）おこなわれる。治療は、患者の身体に健常で新しい細胞を作り強さを取り戻すチャンスを与えるため、休止期間を含むオン／オフサイクルでおこなうことができる。
【０１１２】
癌の種類および進行段階によっては、癌の拡散を遅らせるために、癌の増殖を遅らせるために、原発性腫瘍から体内の別の場所に広がった癌細胞を殺すまたは押さえ込むために、癌による症状を緩和するために、または癌を最初から防止するために、治療をおこなうことができる。
【０１１３】
本明細書で用いるように、用語の「癌」または「新生物」または「新生細胞」は、異常に増殖する細胞の集団を意味する。癌の増殖は制御できず、進行性であって、正常細胞の増殖を惹起しない条件またはその増殖の停止を引き起こす条件下で生じる。
【０１１４】
本発明の核酸塩基オリゴマー、すなわちＩＡＰの抗アポトーシス経路の負の制御剤は、薬剤として許容される希釈剤、キャリヤー、または賦形剤内で、単位用量形で投与することができる。本発明の化合物を過剰な細胞増殖に起因する疾患の患者に投与するために、好適な製剤または組成物を提供する従来からの薬学的手法を採用できる。症状が出る前に投与を始めることができる。好適ないかなる投与経路も採用でき、例えば、投与は、非経口投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、眼窩内投与、眼投与、脳室内投与、肝臓内投与、嚢内投与、クモ膜下投与、小脳延髄槽内投与、腹膜組織内投与、鼻腔内投与、エアゾール投与、坐薬投与、または経口投与であってよい。例えば、治療製剤は液状溶液または懸濁液の形状であることができ、経口投与のために治療製剤は錠剤またはカプセルの形状であることができ、鼻腔内投与のために治療製剤は粉体、点鼻剤、またはエアゾールの形状であることができる。
【０１１５】
当技術分野でよく知られている製剤調製法は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：薬剤の科学と実践」、Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｕｒｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ社、フィアデルフィア市、ペンシルバニア州、２０００年に記載されている。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水もしくは生理食塩水、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール、野菜由来の油、または水素化ナフタレンを含むことができる。化合物の放出を制御するため、生体適合性、生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を使用することができる。他の有用である可能性のあるＩＡＰ修飾化合物の非経口投与送達系には、エチレン−酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み可能輸液システム、およびリポソームが含まれる。吸入用製剤は、賦形剤、例えば、乳糖を含むことができ、あるいは、例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩、およびデオキシコール酸塩を含む水溶液であってよく、あるいは点鼻剤のしての投与のため油性溶液であってよく、ゲルであってもよい。
【０１１６】
該製剤は疾患または病状の治療のために、治療上有効な量（例えば、病状を予防、完治、あるいは緩和する量）で患者に投与することができる。本発明の核酸塩基オリゴマーの好ましい用量は、疾患の種類および程度、患者の全般的健康状態、化合賦型剤の製剤形、およびその投与経路等の変動要因によって変わると思われる。
【０１１７】
上記のように、所望する場合には、本発明の核酸塩基オリゴマーによる治療は、放射線療法、手術、または化学療法等の増殖性疾患を治療するための療法と併用することができる。ＩＡＰ  ＲＮＡｉ化合物と共に投与できる化学療法剤を表５に示す。
【０１１８】
【表５ａ】
2007510408.tif 000007
【表５ｂ】
2007510408.tif 000008
【表５ｃ】
2007510408.tif 000009
【表５ｄ】
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【表５ｅ】
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【表５ｆ】
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【表５ｇ】
2007510408.tif 000013
【表５ｈ】
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【表５ｉ】
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【０１１９】
上記適用法のいずれにおいても、本発明の核酸塩基オリゴマーは、好ましくは静脈内投与され、あるいはアポトーシスが必要な部位に（例えば、注射により）適用される。
【０１２０】
（他の実施形態）
上記から、本発明を様々な用途および条件に適合させるために、本明細書に記載した本発明の変形例および改変例を実施できることが理解されよう。そのような実施形態も請求項の範囲に含まれる。
【０１２１】
本明細書内で引用した文献はすべて、各独立した文献が特異的かつ個別に参照して組み込まれることが示唆されるように、本明細書中に同程度に参照して組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】配列番号２１のＸＩＡＰのコード領域の核酸配列を示す図である。１０個のｓｉＲＮＡの標的配列（配列番号２２〜３１）は太字または下線で示す。
【図２】ＸＩＡＰを標的とする５個のｓｈＲＮＡ（配列番号３２〜３６）のセンス鎖配列を示す図である。
【図３】ＸＩＡＰコード領域の核酸配列を示す図である。図２に示すｓｈＲＮＡの５個の標的配列（配列番号３７〜４１）の位置を示す。核酸配列５および２を標的とするＲＮＡｉ配列が最も好ましく、ＸＩＡＰ発現のサイレンシングに使用して成功している。５個のＲＮＡｉ配列を決定し、次に一時的にＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトションの２４時間後に、定量的なＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）分析）を用いてＲＮＡレベルを決定した。配列２および５からのｓｈＲＮＡはＸＩＡＰのｍＲＮＡレベルをそれぞれ８５％および７０％だけ低減させた（図９）。トランスフェクトションの４８時間後に、ＸＩＡＰタンパク質の低減を解析した。トランスフェクトション条件を最適化し、導入効率を少なくとも９０％とすると、ＲＮＡｉ２によるＸＩＡＰタンパク質の低減はおよそ８０％、ＲＮＡｉ５によるＸＩＡＰタンパク質の低減はおよそ７０％となった（図１０）。ＲＮＡｉ配列１、３、および４ではＸＩＡＰタンパク質レベルは判定されなかった。ＢＩＲドメイン１、２、および３を示す領域を強調するとともに、候補としたｓｈＲＮＡ標的配列を下線で示した（図３）。
【図４】５個のｓｈＲＮＡ  ＨＩＡＰ−２標的配列（配列番号４２〜４６）のセンス鎖配列を示す図である。
【図５】ＨＩＡＰ−２コード領域（配列番号４７）の核酸配列を示す図である。５個のＨＩＡＰ−２  ＲＮＡｉ標的配列（配列番号４８〜５２）を下線で示す。ＨＩＡＰ−２の場合、ＲＮＡｉ標的配列４がＨＩＡＰ−２発現のサイレンシングに最も成功した。ＢＩＲドメイン１、２、および３を強調して示している。
【図６】Ｌｉｓｔｏｎらが記載したｍＲＮＡ配列中に存在し（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ４５８７８）、４４９から２２６３までのヌクレオチドを含むＨＩＡＰ１コード配列（配列番号５３）を示す図である。下線の配列（配列番号５４〜６５）は、ＲＮＡｉベクターがコードするｓｈＲＮＡが標的とする配列の位置を示す。ＨＩＡＰ−１のサイレンシングにおいては、配列１（配列番号５４）を標的とするＲＮＡｉが最も成功した一方、配列５（配列番号５８）を標的とするＲＮＡｉもＨＩＡＰ−１発現を有意に低減させた。他の候補とした標的配列に対するＲＮＡｉはＨＩＡＰ−１発現を有意に低減させなかった。ＲＮＡｉ配列１１（配列番号６４）および１２（配列番号６５）はＨＩＡＰ−１およびＨＩＡＰ−２の両方を標的にできる可能性があるが、ＨＩＡＰ−１およびＨＩＡＰ−２の発現の低減はいずれも認められなかった。
【図７Ａ】図７Ａは、ショートヘアピンＲＮＡｉ（ｓｈＲＮＡｉ）ベクターの形成法を図示する概念図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ショートヘアピンＲＮＡｉ（ｓｈＲＮＡｉ）ベクターの形成法を図示する概念図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、Ｕ６ＰｏｌＩＩＩプロモーターからのｓｈＲＮＡｉ転写物の産生を図示する概念図である。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、５’位をフルオレセインで標識した２×２検定ＭＢＯおよびリポフェクトアミン２０００でトランスフェクトした、Ｈ４６０ヒト非小細胞肺癌細胞の顕微鏡写真である。形質転換効率の顕微鏡評価は導入の２４時間後におこなった。最適化のため、一定量（１μL）のリポフェクトアミン２０００を増大量の２×２ＭＢＯ（２００ｎＭ−図１０Ａ、１．２μM−図１０Ｂ）と組み合わせ、あるいは一定量（１μM）の２×２ＭＢＯを増大量のリポフェクトアミン２０００（０．６μL−図１０Ｃ、１．０μL−図１０Ｄ）と組み合わせた。
【図９】図９Ａは、２．５％アガロースゲル上で電気泳動したＸＩＡＰ  ＲＮＡｉ配列産物の大きさを示す図である。  図９Ｂは、図９Ａに示すＸＩＡＰ  ＲＮＡｉ配列を一時的にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞内のｍＲＮＡレベルを示すヒストグラムである。ＸＩＡＰ発現が有意にノックダウンされたクローンを星印（＊）で示す。これらは９Ａにおける大きなＥｃｏＲＩ挿入断片に対応する。
【図１０】図１０Ａは、一時的にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞内に存在する、ＸＩＡＰタンパク質のレベルをＧＡＰＤＨタンパク質のレベルと比較して示すウェスタンブロットの図である。  図１０Ｂは、一時的にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞内のＸＩＡＰタンパク質レベルの量を示すヒストグラムである。ＸＩＡＰレベルは、ＸＩＡＰ  ＲＮＡｉクローン２Ｃ、２Ｅ、５Ｅ、および５Ｆをトランスフェクトされた細胞において低減したが、トランスフェクションに空の親対照ベクターを使用した細胞においては低減されなかった。トランスフェクションにＨＩＡＰ−１  ＲＮＡｉベクターを使用したものでもＸＩＡＰレベルは低減されなかった。このように、ＸＩＡＰレベルの低減が認められたのはＸＩＡＰ  ＲＮＡｉクローンに限定されることが明らかになった。
【図１１】図１１Ａは、３種類の安定してトランスフェクトされた乳癌細胞系クローンにおいて、ＸＩＡＰタンパク質のレベルが低減することを示すウェスタンブロットの図である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系は、直鎖状ＤＮＡをトランスフェクトし、可能性のあるＸＩＡＰ  ＲＮＡｉクローンを増幅し、ウェスタンブロット分析法でスクリーニングした。比較のため、ＧＡＰＤＨタンパク質レベルも加えて示した。ＸＩＡＰレベルは、Ｘ−Ｇ４、Ｘ−Ｈ３、およびＸ−Ａ４のクローンにおいて有意に低減した。  図１１Ｂは、クローンＸ−Ｇ４、Ｘ−Ｈ３、およびＸ−Ａ４におけるＸＩＡＰタンパク質低減の程度を示すヒストグラムであり、ＸＩＡＰタンパク質がそれぞれおよそ９０％、８０％、および４０％だけ低減していることを示している。
【図１２】増大するＴＲＡＩＬ（腫瘍ネクローシス因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘発性リガンド）の量で処置して１６時間後に、ＸＩＡＰ  ＲＮＡｉを安定してトランスフェクトされた乳癌細胞系における細胞生存率の低下を示すグラフである。
【図１３】ＸＩＡＰ  ＲＮＡｉベクターを安定してトランスフェクトされ、ＴＲＡＩＬ処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における死を媒介するタンパク質ならびに対照細胞に対するＸＩＡＰの抑制効果を図示するウェスタンブロットの図である。レーン１はＵ６Ｅ１（対照ベクター）でＴＲＡＩＬ処置なし、レーン２はＵ６Ｅ１でＴＲＡＩＬ処置なし、レーン３はＸ−Ｇ４（ＸＩＡＰ  ＲＮＡｉ）でＴＲＡＩＬ処置なし、レーン４はＸ−Ｇ４（ＸＩＡＰ  ＲＮＡｉ）でＴＲＡＩＬ処置がある。ＴＲＡＩＬ処置がある条件においては、細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＴＲＡＩＬで７時間処置した後に、回収してウェスタンブロット分析をおこなった。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、ＸＩＡＰ  ＲＮＡｉベクターを安定してトランスフェクトされ、タキソール（パクリタキセル）およびタキソテール（ドセタキセル）で処置された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の生存率におけるＸＩＡＰの抑制効果を示すグラフである。Ｕ６−Ｅ１は空のＵ６プロモーターベクターである。Ｘ−Ｈ３、Ｘ−Ａ４、およびＸ−Ｇ４は、ＸＩＡＰ  ＲＮＡｉベクターをトランスフェクトされたクローンである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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