(57)【要約】  本発明は、新しいアントラサイクリン誘導体と、癌の治療および診断へのそれらの使用に関する。これらのアントラサイクリン誘導体を放射性標識し、癌の診断での造影剤として使用できる。放射性標識されたアントラサイクリン誘導体は、固形腫瘍および播種性腫瘍を治療するための、特に二段階ターゲッティング戦略を含む薬物送達システムと共に使用することもできる。これらの薬物送達システムを乳癌の治療および診断に有利に使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉを有するアントラサイクリン誘導体（薬物前駆体）
【化１】
2007533736.tif 000008
［式中、Ｒは、二重結合酸素原子または両方の立体異性体のヒドロキシル基のいずれかであり、または
Ｒ１は、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨのいずれかである。
Ｒ２はＹ−Ａｒ−Ｚ基であり、
ここで、Ｙは、−（ＣＨ２）ｎ−等のスペーサー分子または式−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ここで、ｎは１〜８である）を有するポリエチレングリコール鎖のいずれかであり；
Ａｒは、通常の単環式芳香族基または安定な芳香族ホウ素ケージ（boron cage）化合物であり、ここで、前記通常の芳香族残基は、求電子芳香族置換を用いて直接放射性標識できる（水素原子等の）置換基または活性化基（例えばトリメチルスタニルまたはトリブチルスタニル基等のトリアルキルスタニル基）を含み、ここで、前記活性化基は、放射性核種に交換できるか、または前記芳香族残基がハロゲン−ハロゲン交換反応を受けることができるようにハロゲン（例えばＢｒまたはＩ）を含み；かつ
Ｚは、任意に糖基等の親水性を増加させる化学基である］
およびその塩。
【請求項２】
前記通常の単環式芳香族基がフェニルまたはピリジン基であり、前記安定な芳香族ホウ素ケージ化合物が、Ｃ２Ｈ１２Ｂ１０等の安定なcloso-カルボランである、請求項１に記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項３】
前記誘導体が、
【化２】
2007533736.tif 000009
2007533736.tif 000010
である、請求項１〜２のいずれかに記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のアントラサイクリン誘導体を含む放射性治療薬であって、前記アントラサイクリン誘導体が、放射性核種か、または中性子もしくは光子を用いた外部照射によって活性化できる安定核種を含む、放射性治療薬。
【請求項５】
前記放射性核種が１２３−１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８Ｆ、７６−７７Ｂｒ、２１１Ａｔ、９０Ｙ、３２Ｐ、６７Ｃｕ、および１８９Ｒｅからなる群から選択され、前記安定核種が１０Ｂおよび１５７Ｇｄからなる群から選択される、請求項４に記載の放射性治療薬。
【請求項６】
癌診断のための造影剤としての、請求項４〜５のいずれかに記載の放射性治療薬の使用。
【請求項７】
ＤＮＡターゲッティング剤、すなわちＤＮＡ相互作用剤としての、請求項１〜３のいずれかに記載のアントラサイクリン誘導体または請求項４〜５のいずれかに記載の放射性治療薬の使用。
【請求項８】
ＤＮＡ相互作用剤を含む薬物送達システムであって、前記ＤＮＡ相互作用剤が請求項１〜３のいずれかに記載のアントラサイクリン誘導体または請求項４〜５のいずれかに記載の放射性治療薬である薬物送達システム。
【請求項９】
前記ＤＮＡ相互作用剤を含めた薬学的に活性な薬剤を包有または結合できる担体を含む、請求項８に記載の薬物送達システム。
【請求項１０】
前記担体がリポソーム等の脂質担体、ミクロゲル等の高分子担体、または脂質／高分子複合材料粒子である、請求項９に記載の薬物送達システム。
【請求項１１】
（ａ）担体上に用意されて、特異的な細胞または組織に標的を定める細胞ターゲッティング剤と、
（ｂ）細胞核に放射性核種の標的を定めるために、前記担体の内部に用意されたか、または前記担体に結合したＤＮＡターゲッティング剤（ＤＮＡ相互作用剤）と
を含む二段階ターゲッティングを含む、請求項１０に記載の薬物送達システム。
【請求項１２】
前記細胞ターゲッティング剤が、リガンド、抗体、および抗体断片からなる群から選択される、請求項１１に記載の薬物送達システム。
【請求項１３】
前記細胞ターゲッティング剤が、上皮成長因子（ＥＧＦ）を含むか、または腫瘍特異的な突然変異ＥＧＦ受容体に結合する分子を含む、請求項１２に記載の薬物送達システム。
【請求項１４】
癌の治療および／または診断のための方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の請求項８〜１３のいずれかに記載の薬物送達システムを投与する段階と、腫瘍が局在しているときは続いて前記腫瘍の領域を任意に照射する段階とを含む方法。
【請求項１５】
乳癌の治療のための方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の請求項８〜１３のいずれかに記載の薬物送達システムを投与する段階と、腫瘍が局在しているときは続いて前記腫瘍の領域を任意に照射する段階とを含む方法。
【請求項１６】
播種性癌の癌治療のための方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の請求項８〜１３のいずれかに記載の薬物送達システムを投与する段階と、腫瘍が局在しているときは続いて前記腫瘍の領域を任意に照射する段階とを含む方法。
【請求項１７】
Ｐ−糖タンパク質（ＰＧＰ）を過剰発現している多剤耐性（ＭＤＲ）腫瘍の癌治療のための方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の請求項８〜１３のいずれかに記載の薬物送達システムを投与する段階と、前記腫瘍が局在しているときは続いて前記腫瘍の領域を任意に照射する段階とを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新しいアントラサイクリン誘導体ならびに癌の治療および癌の診断へのそれらの使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＯＸと省略され、アドリアマイシンまたはアドリアブラスチン等の他の名前でも公知であるドキソルビシン（Ｃ２７Ｈ２９ＮＯ１１；ＭＷ：５４３．５３）は抗生物質であり、アントラサイクリンファミリーの抗腫瘍薬である（構造は下記参照）。ＤＯＸは、もともと水中細菌ストレプトミセスペウセティウス変種コエシウス（streptomyces peucetius var. coesius）から単離され、１９７０年代前半以来、アントラサイクリン、特にドキソルビシンおよびダウノルビシンならびにアルキル化剤（シクロホスファミド、メルファラン等）が、今日臨床で最も多方面で最も頻繁に使用されている化学療法剤である［１］。アントラサイクリンは、キノン−ヒドロキノン官能基および親水性アミノ糖部分を有する疎水性アグリコン複素環からなる両親媒性分子である［２，３］。
【０００３】
ダウノルビシンおよびドキソルビシンの化学構造
【化１】
2007533736.tif 000002
【０００４】
ドキソルビシンは骨肉腫および軟部組織肉腫ならびに肺、乳房、甲状腺、膀胱、卵巣、精巣、頭部、および頚部の癌腫の治療に広く使用されている［１、４］。ドキソルビシンは、白血病およびリンパ腫に対しても使用されるが、ダウノルビシンは急性白血病に対する一次治療である。ドキソルビシンに関する全奏効率は、甲状腺癌では４５％、リンパ腫では４１％、膀胱癌では３３％、肉腫では２６％、卵巣癌では２５％、白血病では２４％である［５］。
【０００５】
ドキソルビシンは多様な作用機序を有するが、ドキソルビシンおよび他のアントラサイクリンの主な抗腫瘍活性は、それらがＤＮＡにインターカレートする結果として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質の合成の遮断を招く能力に由来する。アントラサイクリンはトポイソメラーゼＩＩも阻害し、ＤＮＡ修復を障害する［１、５］。キノン−ヒドロキノン官能基が原因で、アントラサイクリンはＤＮＡ損傷に至るフリーラジカルの発生に関与すると考えられている［２］。アントラサイクリンは、心ミトコンドリアおよび悪性細胞の膜に高濃度にみられるリン脂質であるカルジオリピンに特異的に結合し、これによって、ドキソルビシンの心毒性副作用を説明できる［１］。用量が少なすぎると、アントラサイクリンは効果を有さず、用量が多すぎると、重度の副作用が起こるおそれがあることから、この薬物は狭い治療指数を有する。すなわち、投与量は狭い範囲内に入らなければならない。ドキソルビシンの急性の用量制限毒性は、骨髄抑制、白血球減少、および投与患者の８０％で起こる口内炎である。他の副作用には、脱毛（１００％）、悪心、嘔吐（２０〜５５％）、心毒性、すなわち上室性不整脈、心ブロック、心室頻拍、および患者の１〜１０％で生じるうっ血性心不全さえある。
【０００６】
アントラサイクリン誘導体は、以前に例えばPribe（2003）Chemico-Biological Interactions １４５：３４９〜３５８、ＵＳ−４９４８８８０、ＵＳ−６６７３９０７、およびＷＯ００／５６２６７に開示された。これらの誘導体は、癌の治療で細胞毒性作用を有する。
【０００７】
放射性核種治療は、癌の治療に比較的小さいが重要な役割を有し、現在ますます大きな注目を集めている。放射性核種治療は、核放射線を使用して悪性細胞を根絶させる。その放射線は、中性子活性化の後の安定核種、例えば１０Ｂおよび１５７Ｇによって、または放射性核種によって発生させることができる。特に甲状腺癌に対する最も一般に使用されている治療用放射性核種は、中距離（８００μｍ）β照射体の１３１Ｉであるが、１３１Ｉの投与は健常組織にかなりの照射損傷を引き起こす［６］。しかし、これらの副作用により、１２５Ｉ等の短距離低エネルギーオージェ電子放射体の治療上の潜在能力が広く認められてきている。抗癌治療に有効であるためには、１２５Ｉは直接的かつ選択的に腫瘍細胞の核に送達しなければならない。それは、１２５ＩがＤＮＡから数ナノメーター以内に入らない限り毒性ではないからである［７］。このように、１２５Ｉによる治療は核への特異的な送達法を必要とし、その方法は、１２５Ｉで標識したヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ステロイドホルモン、および成長因子を用いて以前は実現されたが、改善の必要が認識されていた［７］。
【０００８】
Murali D.およびDeJesus.O，Bioorganic&Medicinal Chemistry letters 8 (1998) 3419〜3422は、ドキソルビシンに比べて改善された細胞毒性を有する放射性標識ダウノルビシン誘導体を記載している。この論文に結果は提示されておらず、この研究の継続は発表されていない。
【０００９】
リポソームを介した標的を定めた薬物送達は、膜結合型小胞（リポソーム）に細胞毒性剤を封入することおよびリポソーム膜に腫瘍特異的抗体を結合すること（標的を定めたリポソーム）によって、骨髄抑制、粘膜炎、心毒性、神経毒性、および腎毒性等の通常の癌化学療法の用量規制副作用を最小にする［１］。血中にある標的を定めたリポソームは、標的となる表面マーカーを過剰発現している腫瘍細胞によって能動的かつ選択的に取り込まれる。しかし、いくらか前進したにもかかわらず、この戦略は化学療法の大きな進歩を今のところもたらしていない［８］。
【００１０】
このように、より強力な治療剤および治療戦略の大きな必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、ＤＮＡにインターカレートする性質を有し、核種を結合させることができる診断剤および治療剤に関する。本発明はさらに、これらの診断剤または治療剤に関する薬物送達システムならびに前記薬剤または薬物送達システムを使用した治療法および診断法に関する。本発明は、癌の診断および治療を意図する。本発明の目的は、核種を腫瘍細胞の核に特異的に送達することであり、したがって、健常組織での細胞毒性副作用を最小にする単一の二段階ターゲッティング法で、放射性核種治療、化学療法、および標的を定めたリポソーム薬物送達の利益を合せることである。このように、本発明は新薬を用いた新しい治療戦略を提供し、その新薬は以前より公知であった化学療法薬よりも潜在的に強力である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
アントラサイクリンはそれ自体で強力な抗癌薬である。本出願において、本発明者らは、ダウノルビシンのアミノ−ベンジル誘導体（薬物前駆体）を合成した。ダウノルビシンは、商業的に成功しているアントラサイクリンであるドキソルビシンおよびダウノルビシンに類似した細胞毒性プロフィールを有する。本発明者らがこの薬物前駆体を１２５Ｉでヨウ化したとき、培養腫瘍細胞に対してさらに有効な放射性治療剤が得られた。健常組織を保護し、悪性癌細胞に放射性核種を選択的に送達するために、標的を定めたリポソームに１２５Ｉと結合したダウノルビシン誘導体を封入することができ、そのリポソームは腫瘍細胞に対する特異的薬物送達小胞として働く。
【００１３】
本明細書に記載した実験の結果は、標的を定めたリポソームに本発明による治療剤をうまく封入することができ、その薬物が実験の調製条件およびアッセイ条件で十分に保持されることを確認する。腫瘍細胞と共にインキュベートした後で、上に挙げた薬剤は細胞核に達して、ドキソルビシンと同様の親和性で結合する。ＤＮＡ結合すると、その放射性治療剤はＤＮＡの断片化を引き起こし、今日臨床で最も成功した化学療法剤の２つであるドキソルビシンおよびダウノルビシンによって起こるよりも数桁高い腫瘍細胞成長阻害に導く。
【００１４】
本発明による薬物前駆体または放射性治療薬のどれも、先行技術で以前に記載されていない。
【００１５】
本発明の一態様によると、放射性治療剤の前駆分子として働き、以下に薬物前駆体と呼ぶアントラサイクリン誘導体が提供される。これらの薬物前駆体は、ＤＮＡにインターカレートし、細胞分裂抑制性を有する。このように、これらの薬物前駆体は、細胞または組織に標的を定めた癌治療に単独で使用することができる。アントラサイクリン誘導体（薬物前駆体）は請求項１〜３に定義する。
【００１６】
本発明のさらなる態様によると、細胞または組織に標的を定めた放射性治療に使用できる放射性治療薬が提供される。これらの放射性治療剤は、核種または核種を含む化学基に薬物前駆体を結合することによって、それらの前駆体から生成する。そのような核種は、放射性核種、安定核種、または中性子もしくは光子に曝露することによって活性化できる核種、例えば（closo-カルボランであるｏ−、ｍ−またはｐ−Ｃ２Ｈ１２Ｂ１０等のホウ素リッチケージ（boron-rich cage）化合物の一部としての）１０Ｂであってよく、以下に核種と呼ぶ。放射性治療薬は請求項４から５に定義する。
【００１７】
本発明のさらなる態様によると、癌診断の画像化ツールとしてこれらの放射性治療薬を使用することもできる。画像化ツールとしての使用は請求項６に定義する。
【００１８】
本発明のさらなる態様によると、薬物前駆体または放射性治療薬をＤＮＡターゲッティング剤、すなわち請求項７に定義するようなＤＮＡ相互作用剤として使用することもできる。
【００１９】
本発明のさらなる態様によると、薬物送達システムも提供される。前記システムは、（ＤＮＡにインターカレートする性質を有する）薬物前駆体または放射性治療薬を封入することができる担体を含み、標的となる細胞集団に特異的または優先的に薬物を案内する。結果として、細胞および組織を損傷する作用は、標的となる細胞および組織に優先的に影響することになる。そのような薬物送達システムは、一段階または多段階ターゲッティング戦略を含むことがある。薬物前駆体がＤＮＡにインターカレートする性質は、それらの細胞毒性効果を核に向けるか、または、それらの核種が薬物前駆体に結合しているときは、それらの核種から放出された放射能を細胞核に局在化するＤＮＡターゲッティング段階の基本である。以下にＤＮＡターゲッティング段階と呼ぶこのターゲッティング段階は、このように放射性治療薬の治療効果を劇的に増やし、健康な細胞および組織に対する損傷を減少させる。
【００２０】
悪性組織と健常組織とを区別するために、放射性治療薬は、二段階ターゲッティング戦略における細胞ターゲッティング段階として、表面に腫瘍細胞特異的ターゲッティング剤を示す薬物送達システムを使用して癌細胞または癌組織に向けられる。その段階は以下に、細胞ターゲッティング段階と呼ぶ。薬物担体は、放射性治療薬を包有または結合し、全身投与後に、その放射性治療薬の標的細胞の膜への、好ましくはその膜を通過する輸送を指令できる。放射性治療薬の細胞毒性および／または放射性毒性作用は、結果として標的となる細胞集団に局在化するであろう。薬物送達システムは請求項８から１３に定義されている。
【００２１】
本発明のさらなる態様によると、癌を診断または治療する方法も提供され、その方法は、それを必要とする患者に前駆体薬物または放射性治療薬を含む前記薬物送達システムを投与することを含む。固形腫瘍に対する治療としての使用に加え、本発明は、原発腫瘍除去後の全身循環における転移腫瘍細胞に対する治療としても予想される。その治療は、播種性乳癌だけではなく、播種性卵巣癌、前立腺癌、および結腸直腸癌にも特に有益であり得る。
【００２２】
腫瘍の位置が分かっている場合は、前記治療法をそれに続く腫瘍照射と組み合わせて使用することもできる。安定核種と、中性子または光子を用いた外部照射による活性化とを使用することによって、局所放射線治療を実現できる。
【００２３】
本発明は、生体異物に対する膜結合型外向き排出ポンプであるＰ−糖タンパク質（ＰＧＰ）を過剰発現している多剤耐性（ＭＤＲ）腫瘍の有効な治療でもあり得る。この場合、放射性治療薬はアントラサイクリンと結合することが知られているＰ−糖タンパク質を標的として放射性損傷するであろう。この治療法を請求項１４から１７に定義する。
【発明の効果】
【００２４】
本明細書に記載する薬物送達は、強力な抗癌放射性治療薬または診断用画像化ツールとしての、薬物前駆体の形態または核種と結合した形態の癌治療としての使用を意図する。
【００２５】
しかし、それらの有用性は、健常組織に対する無差別の細胞毒性によって損なわれるおそれがある。この問題は、リポソームまたは代替の薬物担体に薬物を封入して、リポソームまたは代替の薬物担体の表面に腫瘍特異的標的薬剤を加えることにより腫瘍細胞を選択的に標的とすることによって最小となるであろう。このように、これらの薬物前駆体または放射性治療薬は、米国特許第６５６２３１６号に開示されたような、標的を定めた二段階薬物送達システムと組み合わせた使用を意図する。そのような薬物送達システムは、細胞ターゲッティング段階において薬物送達システムを標的となる細胞集団または組織に特異的に向けるための、細胞ターゲッティング剤と結合した担体を含む。ＤＮＡターゲッティング段階では、封入された核種は、ＤＮＡにインターカレートする性質を有する分子に結合することによって細胞核に向けられるであろう。本明細書に記載した、薬物前駆体または放射性治療薬は、ＤＮＡにインターカレートする性質を有するそのようなＤＮＡターゲッティング剤として働くであろう。
【００２６】
記載された二段階ターゲッティングシステムは、健常組織での核種、薬物前駆体、または放射性治療薬の細胞毒性を最小にするであろう。二段階ターゲッティングシステムのさらなる利点は、転移および／または多剤耐性腫瘍細胞の治療に潜在能力を有することである。
【００２７】
薬物担体は、薬学的に活性な薬剤、すなわち薬物前駆体または放射性治療薬を結合または包有できる分子、凝集体、または粒子であり得る。リポソームは現在好ましい薬物担体であるが、ミクロゲル、または脂質／高分子複合材料粒子等の高分子薬物担体も、ある種の適用に等しく、またはそれ以上に適することがある。
【００２８】
二段階ターゲッティング戦略の細胞ターゲッティング段階のためのターゲッティング剤は、腫瘍細胞に選択的に高親和性で結合する。理想的には、腫瘍特異的標的は、腫瘍細胞表面にのみ存在する分子である。しかし、全ての癌細胞に存在するが、正常細胞に存在しない一般的な腫瘍特異的細胞マーカーはまだ発見されておらず、腫瘍細胞と正常細胞との間の類似性は、それらの細胞の相違よりもはるかに数が多い。しかし、ある種の腫瘍細胞で特異的に過剰発現するいくつかの細胞表面マーカーが存在している。ＥＧＦ（上皮成長因子）受容体は、例えば正常細胞に比べて脳、膀胱、乳房、および肺の腫瘍細胞で過剰発現する。このように、腫瘍中のＥＧＦ受容体を標的に定めて、ＥＧＦと結合した放射性核種または安定核種について高い選択性を達成することができる。標的腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体は、腫瘍のターゲッティングに有効であることも実証された。
【００２９】
細胞ターゲッティング段階のための薬剤は、このようにリガンド、抗体、または抗体断片を含む群から好ましくは選択され、上皮成長因子（ＥＧＦ）、腫瘍特異的突然変異ＥＧＦ受容体に結合する分子も含むことがある。
【００３０】
リポソーム薬物送達システム、第１段階のターゲッティング剤、およびそれらそれぞれの調製は、上に挙げた米国特許第６５６２３１６号に記載されている。高分子担体または脂質／高分子担体の調製は本特許に開示されていないが、当業者は文献から関連する調製プロトコールを容易に入手するであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
薬物前駆体（ＤＮＡターゲッティング剤）
ＤＮＡターゲッティング剤として使用されるアントラサイクリン誘導体（薬物前駆体）は、ＤＮＡと相互作用する性質または静電結合性を有しなければならない。ＤＮＡインターカレーターはＤＮＡターゲッティング剤として特に適する。それは、その分子のＤＮＡへの挿入自体によって、治療活性が生じるからである。
【００３２】
本発明による一般式Ｉのアントラサイクリン誘導体は、下記：
【化２】
2007533736.tif 000003
［式中、Ｒは、二重結合酸素原子または両方の立体異性体のヒドロキシル基のいずれかであり、また
Ｒ１は、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨのいずれかである、
Ｒ２は、Ｙ−Ａｒ−Ｚ基であり、ここで、
Ｙは、−（ＣＨ２）ｎ−等のスペーサー分子または式−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ここで、ｎは１〜８である）を有するポリエチレングリコール鎖のいずれかであり；
Ａｒは、通常の単環式芳香族基または安定な芳香族ホウ素ケージ化合物であり、ここで、その通常の芳香族残基は、求電子芳香族置換を用いて直接放射性標識できる（水素原子等の）置換基または活性化基（例えば、トリメチルスタニルまたはトリブチルスタニル基等のトリアルキルスタニル基）を含み、その活性化基は、放射性核種に交換できるか、または、その芳香族残基がハロゲン−ハロゲン交換反応を受けることができるようにハロゲン（例えばＢｒまたはＩ）を含み；かつ
Ｚは、任意に、糖基等の親水性を増加させるための化学基である］
およびその塩である。
【００３３】
塩の例は、塩酸塩、臭化水素塩、ギ酸塩、および他のカルボン酸塩等の塩である。
【００３４】
通常の単環式芳香族基は、好ましくはフェニルまたはピリジン基であり、安定な芳香族ホウ素ケージ化合物は、好ましくはＣ２Ｈ１２Ｂ１０等の安定なcloso-カルボランである。
【００３５】
本発明は、（放射性治療薬の基本となる）前記薬物前駆体の立体異性体混合物および個別の立体異性体に関する。
【００３６】
ＤＮＡターゲッティング段階のための薬剤は、
・核ＤＮＡに対して高い親和性を有し、
・担体への効率的な負荷を許容する性質を有し、
・担体に包有（または結合）された場合に、生理的なｐＨおよびイオン強度で最小の漏出（または放出）を示し、
・担体からの放出後に薬剤を核ＤＮＡに到達させて結合できるようにする性質を有する。
【００３７】
本発明による薬物前駆体および放射性治療薬は、これらの特性を表す。
【００３８】
薬物前駆体の具体的な例を下式に示す：
【化３】
2007533736.tif 000004
2007533736.tif 000005
【００３９】
薬物前駆体の合成
薬物前駆体の合成は標準法に従い、当業者はこれを行うことができる。薬物前駆体の合成は、意図した保護範囲の一部ではない。
【００４０】
放射性治療薬
本発明による放射性治療薬、すなわち核種と結合した薬物前駆体を使用する場合、多量の核種が腫瘍細胞に送達され、これらの核種は核ＤＮＡに到達および結合するであろう。各放射性崩壊は、核ＤＮＡの損傷を招くであろう。このように、放射性治療薬は、同濃度の薬物前駆体よりも強力であろう。放射性核種が細胞核外側に存在する状況に比べて、放射性核種が細胞核内部に局在する場合、ＤＮＡ損傷の量は少なくとも１０倍高いであろう。よって、腫瘍細胞への多量の放射性核種の送達は、姑息的から治癒的に治療の範囲を広げることができる。（ＤＮＡのインターカレートなしの）通常の細胞一段階ターゲッティング戦略が使用されるならば、姑息的治療だけが可能と思われる。
【００４１】
各放射性核種は、半減期等の別個のセットの性質と、別個の種類の放出された放射線とを有する。本発明は、特定の種類の癌または特定の臨床問題に適した核種を選択的に選ぶことを可能にする。選ばれた放射性核種の物理半減期を薬物前駆体の生物学的半減期と合致させなければならない。したがって、放射性核種の放射性質が特定の腫瘍の大きさおよび位置と合致することが重要である。９０Ｙ等の高エネルギーベータ放射体は、大きな腫瘍の治療に適することがある。１３１Ｉ等の他の核種は、低エネルギーベータ粒子を放出し、結果としてより短距離の放射線を有し、それによってこれらの核種はより小さい腫瘍または単一の腫瘍細胞にさえもさらに適するようになる。１２５Ｉおよび１２３Ｉ等のオージェ電子放射体は、約１〜２μｍしか進行しない粒子を放出し、よって、ＤＮＡ損傷を引き起こすには癌細胞の核内に局在しなければならない。アルファ粒子放射体の飛程は概して５０から７０μｍの間であり、多量のエネルギーの局所蓄積を引き起こす。
【００４２】
放射性ハロゲンは、広範囲の物理的半減期および何種類かの放出された放射線を有し、これは放射性ハロゲンの適用の範囲を広げている。ベータ放射体である１３１Ｉは、核種治療で最も一般的に使用されている放射性核種の１つである。陽電子放出トモグラフィー（ＰＥＴ）では、１８Ｆ、７６Ｂｒ、および１２４Ｉ等の陽電子を放出する放射性ハロゲンを診断目的に使用できる。それらの放射性ハロゲンは組織の放射線量測定およびＰＥＴスキャンを介した腫瘍体積の変化の監視を可能にする。
【００４３】
放射性ハロゲンである２１１Ａｔは比較的短い半減期（７．２時間）を有し、α粒子の放射によって崩壊する。これは、極めて細胞毒性が高く、よって標的となる細胞集団に特異的に送達されるならば有効な治療剤であり得る。
【００４４】
オージェ電子放射体は、細胞核に組み入れられると細胞を効果的に殺滅する。１２５Ｉ（半減期６０日）、１２３Ｉ（半減期１３．２時間）、および７７Ｂｒ（半減期５６時間）は電子捕獲によって崩壊し、それに続いてオージェ電子が放射される。本特許出願で論じる放射性治療薬は、１２５Ｉとの結合に特によく適する。１２５Ｉは比較的安価であり、商業的に広く入手でき、その相対的に長い半減期はｉｎ  ｖｉｔｒｏ適用に適する。１２５Ｉは物理的半減期が短く、特にオージェ電子以外に画像化を可能にするガンマ線も放出することから、治療応用への魅力的な候補でもあり得る。
【００４５】
短い放射飛程を有する放射性核種、例えば１２５Ｉ（オージェ放射）および２１１Ａｔ（アルファ粒子）は高い局所イオン化密度を発生し、単一細胞に標的を定めるために現在最も適すると思われ、周囲の健康な細胞または組織に最小の損傷しか起こさないであろう。
【００４６】
放射性治療薬には、中性子または光子によって活性化できる安定核種が含まれ得る。安定核種である１０Ｂは細胞毒性を示さない。しかし、１０Ｂに富む化合物が腫瘍細胞に選択的に局在化するならば、細胞は次に無毒低エネルギー中性子を外部照射されることがある。これらの中性子は、１０Ｂ原子に捕捉され、励起状態の１１Ｂ原子を発生し、その原子は２つの高細胞毒性粒子であるα粒子および７Ｌｉ３＋イオンに即座に瞬間的に解体する。組織中のこれらのイオンの飛程は、それぞれ約９および５μｍであり、これは細胞１個の直径に近い。１５７Ｇｄも中性子活性化に供することができる。他の代替物は、ヨウ素または臭素の安定同位体であり、これらの同位体を光子によって活性化することができる。さらに、これらの同位体を長距離β放出放射性核種、すなわち１３１Ｉ、３２Ｐ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、または１８９Ｒｅと組み合わせて、大きな腫瘍細胞凝集体に適した十字砲火放射を生み出すことができる。これらの中性子または光子で活性化された核種を、例えば閉じたカルボラン、例えばcloso-カルボランであるｏ−、ｍ−、またはｐ−Ｃ２Ｈ１２Ｂ１０等のホウ素リッチケージ化合物を使用して安定化できる。
【００４７】
本特許出願に記載した放射性薬物中の放射性核種は、好ましくは１２３−１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８Ｆ、７６−７７Ｂｒ、２１１Ａｔ、９０Ｙ、３２Ｐ、６７Ｃｕ、または１８９Ｒｅであり、１２５Ｉが特に好ましく、安定核種は好ましくは１０Ｂおよび１５７Ｇｄである。
【００４８】
薬物前駆体の放射性標識
放射性ヨウ化のための全ての薬物前駆体は、芳香族残基を含み、クロラミンＴ法等の通常法を使用して１２５Ｉで標識される。芳香環の直接求電子置換または芳香環内のトリアルキルスタニル、例えばトリメチルスタニルまたはトリブチルスタニル基等の活性化基の交換のいずれかによって放射性標識を行った。これらの方法は標準法に従い、当業者は実施することができる。
【実施例】
【００４９】
本発明による薬物前駆体または放射性治療薬を薬物送達システムに使用できるかどうかを試験するために以下の実験を行った。
【００５０】
実施例１．リポソームの薬物保持
リポソームの調製
リポソームは、モル比５７：４０：３の、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンーＮ−［（メトキシ）−（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）から構成された。脂質薄膜水和法によってリポソームを調製した［９］。簡潔には、コレステロールおよび脂質をクロロホルムに溶解させた。溶媒を穏やかな窒素気流下で蒸発させ、得られた脂質薄膜を減圧下で一晩乾燥させた。その脂質薄膜を脂質濃度２０ｍＭ、温度６０℃で３００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４）で１時間、途中でボルテックスミキサーで混合して水和させた。リポソームを液体窒素中で凍結させ、温度６０℃で解凍することを５回繰り返してから押出した。Avanti Mini押出機（Avanti Polar Lipids Inc.、Alabaster、アラバマ州）を使用して、リポソームに孔径１００ｎｍを有する２枚の重層したポリカーボネート濾紙（Whatman Inc.Nucleopore、Newton、マサチューセッツ州）を室温で１０回通過させた。
【００５１】
薬物の封入
化合物１（３’−Ｎ−（４−ヒドロキシ−３−ヨードベンジル）−１３−（Ｒ／Ｓ）−ジヒドロダウノルビシン、立体異性体混合物）および化合物２（３’−Ｎ−（４−ヒドロキシ−３−ヨードベンジル）ダウノルビシン）（構造は下記）、またはドキソルビシン（Sigma Aldrich、St Louis、ミズーリ州、米国）をMayerらによるｐＨ勾配駆動負荷プロトコールを使用してリポソームに封入した。Sephadex Ｇ−５０カラムで小胞外の３００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４）を２０ｍＭ  Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）緩衝１５０ｍＭ食塩水（ＨＢＳ）（ｐＨ７．５）に交換することによって、リポソーム膜を介したｐＨ勾配を発生させた。ドキソルビシンを１ｍＭの濃度でＨＢＳに溶かした。化合物１を０．５ｍＭの濃度で１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロース溶液に溶かした。化合物２は１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロース溶液に０．５ｍＭの濃度で完全には溶解しなかったが、リポソームを加えてその薬物をリポソームに封入すると溶解した。予熱した薬物溶液を薬物対脂質のモル比０．２でリポソームに加えた。ボルテックス装置を使用して時々混合しながら、得られた混合物を温度６０℃で１５分間インキュベートした結果、１００％の薬物封入がもたらされた。
【００５２】
化合物１および２の化学構造
【化４】
2007533736.tif 000006
【００５３】
薬物負荷リポソームに対するターゲッティングリガンドであるトラスツズマブの添付
ａ）ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００に対する１２５Ｉ−トラスツズマブの結合
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−３４００のＮ−ヒドロキシスクリンイミジルエステル（ＮＨＳ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００）を１２５Ｉ−トラスツズマブ溶液と共にモル比０．１：６で温度６０℃で５分間水和させた。放射性標識トラスツズマブを使用してリポソームを追跡した。ＮＨＳ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００の濃度は約０．２ｍＭであった。得られた混合物を撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。ＨＢＳ（ｐＨ７．４）を用いたSephacryl Ｓ−３００カラムのゲル濾過によって、未結合のトラスツズマブを１２５Ｉ−トラスツズマブ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００から除いた。
【００５４】
ｂ）リポソームへの１２５Ｉ−トラスツズマブ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００の移行
１２５Ｉ−トラスツズマブ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００を薬物負荷リポソームと１：３３のモル比で温度６０℃で１時間混合した。ＨＢＳ（ｐＨ７．４）を用いたSepharose ＣＬ−４Ｂカラムのゲル濾過によって、取り込まれていない１２５Ｉ−トラスツズマブ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００をリポソームから除いた。
【００５５】
薬物保持の決定
リポソームを温度３７℃または６０℃でインキュベートした。選択した時間間隔で、３分取分の部分試料を回収し、ＨＢＳ（ｐＨ７．５）を用いてSephadex  Ｇ−５０ミニカラムで６８０ｇの遠心場で２分間封入されていない薬物を除いた。溶出液の体積をＨＢＳで１ｍｌに調整し、１％Triton Ｘ−１００溶液１ｍｌを加えた。試料を温度９０℃に加熱し、室温に冷却した。試料の蛍光強度を励起波長４６８ｎｍおよび発光波長５８９ｎｍで決定した。インキュベーション前に封入された薬物の量に対するインキュベーション後に封入された薬物の率を決定した。
【００５６】
負荷されたリポソームの極低温透過型電子顕微鏡観察（Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）
簡潔には、注文製造した環境チャンバーの中で制御した温度（２５℃）で水の蒸発を最小にする湿度条件で、有孔高分子薄膜を被覆した銅格子上にリポソーム試料を移行させた。濾紙に吸引することによって過剰の試料を除いた。薄い（１００〜５００ｎｍ）試料薄膜を温度−１６５℃で液体エタンに沈めることによってガラス化し、窒素雰囲気で温度−１６５℃でZeiss ＥＭ９２０Ａ透過型電子顕微鏡（Carl Zeiss Inc.、Oberkochen、ドイツ）に移行させた。試料を電子密度５〜１５ｅ−／Å２に曝露し、ゼロロス明視野モードで加速電圧８０ｋＶで画像を取得した。
【００５７】
結果および考察
温度３７℃で２４時間培地中でインキュベートしたとき、約８０％のドキソルビシンおよび９０％を超える化合物１がリポソームに封入されたままであった（図１）。これらの結果は、リポソーム調製および細胞培養に関して記載された条件で、ドキソルビシンおよび化合物１はリポソームからあまり放出されないであろうことを示している。
【００５８】
１２５Ｉ−トラスツズマブ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００を含有し、化合物１を負荷したリポソームのｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像（図２）から、化合物１がリポソーム内で結晶状態であることが確認される。
【００５９】
実施例２．ＤＮＡの結合
実施例２ａ
細胞培養
過剰発現しているヒト培養腫瘍細胞を１０％ウシ胎仔血清、グルタミン（２ｍＭ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、およびペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）を含有するハムのＦ−１０培地（Biochrom AG、Berlin、ドイツ）を用いて温度３７℃で加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で単層培養として成長させた。
【００６０】
ＤＮＡの結合
培養ヒト腫瘍Ａ４３１細胞（扁平上皮癌）をスライドガラス上に成長させ、温度４℃に冷却し、リン酸緩衝液で洗浄した。細胞を温度−２０℃で１５分間メタノールに入れて不活性化させてから、温度４℃でリン酸緩衝液で速やかに洗浄した。次に、温度４℃で１０秒間アセトン処理することによって細胞を透過性にした。乾燥させてから細胞を室温で１時間１２５Ｉ−化合物１と共にインキュベートし、洗浄し、ガンマカウンター（１４８０  Wallac Wizard、Perkin Elmer、Wellesley、マサチューセッツ州、米国）を用いて放射能について分析した。さらに、細胞を蛍光顕微鏡で検査した。
【００６１】
結果および考察
透過性にした培養ヒト腫瘍Ａ４３１細胞（扁平上皮癌）を１２５Ｉ−化合物１と共に室温で１時間インキュベートしたとき、細胞に結合した化合物の比放射能は、バックグラウンドを減算した後で細胞１０５個あたり２１．１±３．７×１０３ｃｐｍと決定された。過剰のドキソルビシンを使用することによって結合を遮断できた。
【００６２】
蛍光顕微鏡観察から、化合物１が細胞核に結合して細胞質内部に局在しなかったことが明らかとなった。ヒト膀胱癌Ｔ２４細胞およびヒト神経膠腫Ｕ３４３細胞を用いて蛍光顕微鏡実験を繰り返し、同様の結果を得た。
【００６３】
実施例２ｂ
アガロースプラグ
ＩｎＣｅｒｔアガロース（BioWhittaker Molecular Applications、Rockland、メイン州）を無血清培地に終濃度１％になるように溶かした。アガロース溶液１ｍｌをＵ−３４３細胞１．５×１０６個と混合し、プラグ２０μｌをプラスチックの型で固めて温度４℃で３０分間冷却した。プラグを溶解緩衝液（１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、０．５Ｍ  Ｎａ３−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０ｍｌに溶かした２％サルコシル）に温度５０℃で一晩沈め、純粋なＤＮＡを得た。溶解後にプラグを０．５Ｍ  Ｎａ３−ＥＤＴＡで２回洗浄して細胞の破片を除いた。プラグを０．５Ｍ  Ｎａ３−ＥＤＴＡに入れて温度４℃で保存した。ＤＮＡを有さないプラグを対照として供した。アガロースプラグを１２５Ｉ−化合物１を含有する溶液６００μｌと共に２回の繰り返しで氷上で３時間インキュベートした。対照プラグは濃度３×１０−５Ｍの過剰量のドキソルビシンを含有した。１２５Ｉ−化合物１の終濃度は４×１０−７Ｍ（ｄＨ２Ｏ溶液）であった。インキュベーションの後、氷上で洗浄することによってプラグに残った放射能をガンマカウンターを使用して決定した。
【００６４】
オートラジオグラフィー
培養ＳＫＢＲ−３乳癌細胞を培地１ｍｌあたり０．１μｇの濃度の１２５Ｉ−化合物１（０．３ｋＢｑ／ｎｇ）と共に温度３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後に細胞を無血清培地で６回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（ＰＢＳ溶液で０．２５％／０．０２％、Biochrome、Berlin、ドイツ）１ｍｌを用いて１０分間剥離させた。細胞を培地１４ｍｌで再懸濁して遠心分離管に移した。細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞ペレットを得た。細胞ペレットをホルマリン緩衝液（０．０１Ｍリン酸緩衝ホルムアルデヒド（４％）、Histolab Products AB, Goteborg, スウェーデン）で４℃で１週間固定した。その後、ペレットを以下の手順で脱水した：７０％ＥｔＯＨ  ２×１５分、９０％ＥｔＯＨ  ３０分、９５％ＥｔＯＨ  ２×１５分、９９％ＥｔＯＨ  ２×１５分、およびHistoresin浸透液（Leica Instruments Gmbh、Heidelberg、ドイツ）３×２０分。活性化剤を用いてHistoresinに一晩包埋した後で、ペレットの４μｍ切片を切り出し、スライドガラスに移行させた。スライドガラスを暗条件でKodak NTB感光乳剤（Eastman Kodak Company、Rochester、ニュ−ヨーク州、米国）に浸し、乾燥してから４℃で３日保存した。そのスライドガラスをKodak Ｄ１９液を用いて３分間現像してから、０．１％酢酸に１０秒間移行させ、Kodak固定液を用いて５分間固定した。これら全てを暗条件で行った。水で大規模に洗浄した後で、細胞核をマイアーヘマトキシリン（Histolab Products AB、Goteborg、スウェーデン）で３分間染色した。Pertex（Histolab Products AB、Goteborg、スウェーデン）でマウントする前に、スライドガラスを水で５分間洗浄して風乾させた。細胞を顕微鏡で検査して、代表的な細胞の画像を取得した。
【００６５】
結果および考察
１２５Ｉの染色パターンがヘマトキシリン染色細胞核と共局在していることから、細胞核に対する化合物１の結合を１２５Ｉ−化合物１のオートラジオグラフィーによって確認できた（図３）。
【００６６】
Ｕ−３４３細胞ＤＮＡを含有するアガロースプラグを１２５Ｉ−化合物１溶液と共に氷上で３時間インキュベートすると、１２５Ｉ−化合物１はアガロースプラグ中に蓄積された。ＤＮＡに対する１２５Ｉ−化合物１の蓄積と、よって結合とを過剰量のドキソルビシンによって遮断された。結果は、ＤＮＡに対する化合物１の親和性を確認している。ＤＮＡに対する１２５Ｉ−化合物１の結合をドキソルビシンによって置換できたという事実（図４）は、化合物１とドキソルビシンとの両方が同じＤＮＡ結合部位を占有することを示唆している。
【００６７】
実施例２ｃ
パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）
１２５Ｉ−化合物１がＤＮＡ損傷を誘導する効率を検討するために、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ、Pharmacia Biotech、Uppsala、スウェーデン）で二本鎖切断（ｄｓｂ）の誘導を分析した。上記のようにアガロースプラグを１２５Ｉ−化合物１と共にインキュベートした。洗浄後に、プラグを温度４℃で８日間保持した。次にプラグを０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（Seakem Gold粉末アガロース、Cambrex Bio Science Rockland Inc.、Rockland、メイン州、米国）に負荷した。ＤＮＡの断片化を以下のプロトコールにより２Ｖ／ｃｍで４５時間のパルスフィールドゲル電気泳動で分析した：１０分のパルス（すなわち１０分ごとに場にパルスを与える）３時間、２０分のパルス５時間２０分、３０分のパルス８時間、４０分のパルス９時間２０分、および１時間のパルス２０時間。ゲルを泳動させた後で臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）で８時間染色してから、ｄＨ２Ｏで一晩脱色させた。分子量マーカーとして、シゾサッカロミセス  ポンベ（Scizosaccharomyces pombe）メガ塩基ＤＮＡ標準（Cambrex Bio Science Rockland Inc.、Rockland、メイン州、米国）を使用した。各レーンを、それぞれ５．７Ｍｂｐ以下および５．７Ｍｂｐ以上のサイズを有するＤＮＡ断片に対応する２つのブロックに切り出した。各ブロックをバイアルに入れ、以前に挙げた自動ガンマカウンターで放射能を測定した。５．７Ｍｂｐ未満のＤＮＡの割合を決定して、次にBlocherの式を用いた計算に使用した：
Ｆ＜ｋ＝１−ｅ−ｒｋ／ｎ（１＋ｒｋ／ｎ（１−ｋ／ｎ））  （Int J Rad Biol 57, 7〜12、1990）
Ｆ＜ｋはｋ塩基対よりも小さいＤＮＡの割合であり、ｒはｄｓｂ／染色体の平均数であり、ｎは平均サイズの染色体１本に存在する塩基対の総数である。ｋ＝このアッセイでは５．７Ｍｂｐを使用した。平均的なヒト染色体ではｎ＝１３０Ｍｂｐである。
【００６８】
二本鎖切断数（ｒ）を得るためには、式が数値的に解かれなければならない。
【００６９】
結果および考察
１２５Ｉ−化合物１を神経膠腫細胞ＤＮＡと共にインキュベートした後の二本鎖切断（ｄｓｂ）の数（図５）を崩壊１回あたり約０．４ｄｓｂと決定した。このように、化合物Ｉと結合すると、１２５ＩはＤＮＡに十分近く位置してＤＮＡの断片化を引き起こす。それは、ＤＮＡに結合していない１２５ＩはＤＮＡの断片化をもたらさないと思われるからである。比較として、ＤＮＡ鎖への核種の直接組み入れを招く１２５Ｉ標識ＤＮＡ前駆分子の使用は、崩壊１回あたり約１ｄｓｂのｄｓｂ値を与える。ｄｓｂ値の差は比較的小さく、これは、（放射線が作用を有するために）その核種がＤＮＡから非常に短い距離内に入らなければならず、ＤＮＡのインターカレーションが起こったことを示している。
【００７０】
実施例２ｄ
１型ウシ胸腺ＤＮＡナトリウム塩（Sigma Aldrich Co.、St Louis、ミズーリ州、米国）を約２ｍｇ／ｍｌの濃度でＢＰＥＳ緩衝液（６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１８５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）で水和させ、ＭＳＥ  Soniprep１５０超音波粉砕機（Integrated Services TCP Inc.、Palisades Park、ニュージャージー州、米国）に入れて氷冷した水浴中で３０分間約８μＡで超音波処理した。次に、Slide-A-Lyzer（登録商標）透析カセット（１００００ＭＷＣＯ）（Pierce、Rockford、イリノイ州、米国）を使用してＢＰＥＳに対して試料を４８時間透析した。ＨＰ８４５３分光光度計（Hewlett-Packard Company、Houston、テキサス州、米国）で吸光係数１２８２４Ｍ（ｂｐ）−１ｃｍ−１を用いて波長２６０ｎｍでの吸光度定量により、ＤＮＡの終濃度を決定した。
【００７１】
SPEX1680 Fluorolog蛍光光度計（SPEX Industries Inc.、Edison、ニュージャージー州、米国）で室温でλｅｘ＝４８０ｎｍ（スリッド(slid)幅２．５ｍｍ）およびλｅｍ＝５９２ｎｍ（スリッド幅２．５ｍｍ）で蛍光滴定実験を行った。初発遊離薬物濃度は１μＭであった。次式により、ＤＮＡの不在下（Ｉ０）および存在下（Ｉ）で被験化合物の蛍光強度比を決定することによって遊離薬物濃度（Ｃｆ（Ｍ））が計算した：
Ｃｆ＝ＣＴ（Ｉ／Ｉ０−Ｐ）／（１−Ｐ）    （Biopolymers 6、1225〜1235、1968）
式中、ＣＴ（Ｍ）は初発薬物濃度であり、Ｐは完全に結合した薬物の蛍光強度の観察された量子収量（Ｉｍｉｎ）と、遊離薬物の量子収量との間の比である（Ｐ＝Ｉｍｉｎ／Ｉ０）。ＣＴとＣｆとの間の差によって、結合した薬物の濃度を計算した。ｒに対してｒ／Ｃｆをプロットすること（スキャッチャードプロット、Scatchard plot）によって結合定数（Ｋｉ）および排除パラメータ（ｎ）を計算した。ここで、ｒはＤＮＡ塩基対１モルあたり結合した薬物のモル数である。隣接排除モデルに関する理論曲線を次のアルゴリズムを使用して計算した：
ｒ／Ｃｆ＝Ｋｉ（１−ｎｒ）［（１−ｎｒ）／［１−（ｎ−１）ｒ］］ｎ−１    （J.Mol.Biol. 86、469〜489、1974）
式中、Ｋｉ（Ｍ−１）は固有の結合定数であり、ｎ（塩基対）は排除パラメータである。実験データに最も適合する理論曲線を発生するように、パラメータＫｉおよびｎを変動させた。
【００７２】
表１（下記）は、ウシ胸腺ＤＮＡ（ＣＴ  ＤＮＡ）に対するダウノルビシン、ドキソルビシン、化合物１、および化合物２の結合定数（Ｋｉ）および排除パラメータ（ｎ）を示す。カッコ内の値は、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）（ｎ＝３）を示す。ａ＝ダウノルビシンに対してｐ＜０．０５。ｂ＝化合物２に対してｐ＜０．０５。平均値の間の差を一元配置分散分析の後にStudent Newman-Keuls検定により検定した。
【００７３】
文献値
ダウノルビシンのＫｉ：０．７×１０６Ｍ−１±０．０７、ｎ：３．５塩基対±０．３５（Chairesら（1982）Biochemistry 21、3933〜3940）。ドキソルビシンのＫｉ：３．３×１０６Ｍ−１、ｎ：３．８塩基対（Messoriら（2001）Bioorg.Med.Chem. 9、1815〜1825）。
【００７４】
表１：ドキソルビシン、ダウノルビシン、化合物１、および化合物２の、結合定数および排除パラメータ
【表１】
2007533736.tif 000007
【００７５】
結果および考察
化合物１および化合物２のＣＴ  ＤＮＡとの結合定数および排除パラメータがドキソルビシンの場合と類似していることから、ダウノルビシンの誘導体化がＤＮＡ結合性の喪失を起こさなかったことが確認される（表１）。逆に、化合物１および化合物２の結合定数は親化合物のダウノルビシンの結合定数よりも高い値であった？。
【００７６】
実施例３．毒性
成長曲線１２５Ｉ−化合物１、化合物１、ドキソルビシン、またはダウノルビシンを０．５ｎｇ／ｍｌの濃度に培地に溶解させた。１２５Ｉ−化合物１の比放射能は１００ｋＢｑ／ｎｇであった。ＳＫＢＲ−３細胞を、６０ｍｍプラスチックペトリ皿中で３回の繰り返しで２．５時間薬物と共にインキュベートした。対照細胞を通常の培地と共にインキュベートした。インキュベートの後で、培地を全ての皿から除き、細胞を無血清培地で６回洗浄した。トリプシン／ＥＤＴＡ０．５ｍｌを温度３７℃で１０分間加えることによって細胞を皿から剥離させた。培地１ｍｌに再懸濁した後で、細胞をコールターカウンター（Ｚ２コールターカウンター、Beckman Coulter）を使用して計数し、細胞１０５個まで継代培養して成長曲線を作製した。継代培養毎に細胞の損失に関して成長曲線を補正した。
【００７７】
結果および考察
培養ＳＫＢＲ−３細胞単層の成長曲線は、濃度わずか０．５ｎｇ／ｍｌの１２５Ｉ−化合物１の細胞毒性作用が化合物１、ドキソルビシン、またはダウノルビシンとインキュベートした後に比べて数桁大きかったことを明らかにした（図６）。後者の化合物類のどれも有意な細胞毒性作用を有さなかった。よって、１２５Ｉ−化合物１によって表された細胞毒性作用は化合物１に結合した核種１２５Ｉ単独によって引き起こされる。
【００７８】
参照文献
［１］B.A.Chabner,C.E.Meyers(1982) ”Cancer: Principles and practice of oncology” (DeVita Jr.V.T., S.HellmanおよびS.A.Rosenberg編), 156〜197頁, J.B.Lippincott Company, Philadelphia, Toronto.
［２］H.G.Keizer, H.M.Pinedo, G.J.Schuurhuis, H.Joenje, ドキソルビシン（アドリアマイシン）：細胞毒性の遊離ラジカル依存性メカニズムの決定的な総説、Pharmaceutics and Therapeutics 47(1990)219〜231.
［３］J.Bouma, J.H.Beijnen, A.Bult, W.J.M.Underberg, アントラサイクリン系抗腫瘍剤、Pharmaceutisch Weekblad Scientific Edition 8(1986)109〜133.
［４］C.P.Association, Compendium of pharmaceuticals and specialities, 第１３巻、CK Productions, Toronto、1995.
［５］R.H.Blum, S.K.Carter, アドリアマイシン。重大な臨床活性を有する新しい抗癌薬，Ann Intern Med 80(1974)249〜59.
［６］M.N.Gaze, 臨床業務における標的を定めた放射線治療の現状，Phys Med Biol 41(1996)1895〜903.
［７］J.A.O’Donoghue, T.E.Wheldon, オージェ電子放射体を用いた標的を定めた放射線治療、Phys Med Biol 41(1996)1973〜92.
［８］S.Kim, 癌化学療法の担体としてのリポソーム。現状と将来展望、Drugs46(1993)618〜38.
［９］(M.J.Hope, M.B.Bally, G.Webb, およびP.R.Cullis (1985) Biochim. Biophys. Acta 812: 55〜65).
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】温度３７℃での緩衝液または培地中のドキソルビシンと、緩衝液中の化合物１との保持を示す図である。
【図２】化合物１を負荷したリポソームの極低温透過型顕微鏡画像を示す図である。球体はリポソームを表し、リポソーム内部の斑点は結晶状の化合物１を表す。
【図３】腫瘍細胞と共に３７℃で１時間インキュベートした後の１２５Ｉ−化合物１のオートラジオグラフィーを示す図である。
【図４】氷上で２．５時間インキュベートした後の遊離ＤＮＡに対する１２５Ｉ−化合物１の結合を示す図である。
【図５】Ｕ−３４３ＭＧａＣ１２：６神経膠腫細胞ＤＮＡを含有するプラグを負荷したアガロースゲルでの１２５Ｉ−化合物１の結合後のＤＮＡ断片化を示す図である。図中、ａ）分子量マーカー（シゾサッカロミセスポンベ、メガ塩基ＤＮＡ標準）、ｂ）１２５Ｉ−化合物１と共にインキュベートしたＤＮＡ、ｃ）１２５Ｉ−化合物１および過剰のドキソルビシンと共にインキュベートしたＤＮＡ、ならびにｄ）１２５Ｉ−化合物１不在下でインキュベートしたＤＮＡを有する対照。
【図６】０．５ｎｇ／ｍｌドキソルビシン、ダウノルビシン、化合物１、または１２５Ｉ−化合物１で処理した腫瘍細胞の成長曲線を示す図である。
【図１】
2007533736.tif 000011
【図２】
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【図３】
2007533736.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
2007533736.tif 000016
【国際調査報告】
2007533736.tif 000017
2007533736.tif 000018
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