(57)【要約】【課題】植物のアセトヒドロキシ酸シンターゼラージサブユニット（ＡＨＡＳＬ）遺伝子を分析するための方法を提供する。【解決手段】本発明は、植物のＡＨＡＳＬ遺伝子の分析方法及び分析用組成物に関し、特に、野生型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子とイミダゾリノン耐性ＡＨＡＳＬタンパクをコードする変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子とを検出する方法に関する。この方法はＰＣＲ増幅の使用を含み、植物の個々のＡＨＡＳＬ遺伝子における変異型対立遺伝子及び／又は野生型対立遺伝子の存在を検出するために、対立遺伝子特異的プライマーと遺伝子特異的プライマーを含む新規な組成物を使用する。本発明の方法及び組成物は特に、コムギ属のＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍの３種のＡＨＡＳＬ遺伝子及びＴｒｉｔｉｃｕｍ  ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍの２種のＡＨＡＳＬ遺伝子の分析のために有用である。【選択図】図１
2007529233.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小麦植物にイミダゾリノン系除草剤耐性を与える小麦アセトヒドロキシ酸シンターゼラージサブユニット（ＡＨＡＳＬ）遺伝子の変異型対立遺伝子を検出する方法であって、
（ａ）小麦植物からゲノムＤＮＡを得る段階、
（ｂ）前記ＤＮＡを鋳型として使用して、前記ＤＮＡと、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーと、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーと、５´末端と３´末端を有し、配列番号１２の３〜２３番目のヌクレオチドの補体にアニーリングすることができ、３´末端がシチジンであるヌクレオチド配列を有する変異型対立遺伝子特異的プライマーとを含むＰＣＲ増幅を行う段階、及び、
（ｃ）前記ＰＣＲ増幅の生成物を検出する段階、
を含み、
前記変異型対立遺伝子特異的プライマーが、ＡＨＡＳＬ遺伝子における前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトと前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトの内側の領域にアニーリングすることができるプライマーであることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡが、（ｂ）段階の前に、前記ＤＮＡと、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、ＡＨＡＳＬフォワードプライマーと、ＡＨＡＳＬリバースプライマーとを含む予備増幅に付され、
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーと前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーが、ＡＨＡＳＬ遺伝子における前記ＡＨＡＳＬフォワードプライマーのアニーリングサイトと前記ＡＨＡＳＬリバースプライマーのアニーリングサイトの内側の領域にアニーリングすることができるプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記予備増幅後、(ｂ)段階前に、前記ＤＮＡがエクソヌクレアーゼで分解される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＨＡＳＬフォワードプライマーと前記ＡＨＡＳＬリバースプライマーが、ＡＨＡＳＬ１Ａ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ｄにアニーリングするように設計されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＨＡＳＬフォワードプライマーが配列番号１のヌクレオチド配列を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ＡＨＡＳＬリバースプライマーが配列番号２のヌクレオチド配列を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記変異型対立遺伝子特異的プライマーが配列番号３のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子がＡＨＡＳＬ１Ｄである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーが配列番号５の配列を有し、前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーが配列番号７の配列を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子がＡＨＡＳＬ１Ｂである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーが配列番号６の配列を有し、前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーが配列番号８の配列を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子がＡＨＡＳＬ１Ａである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーが配列番号５の配列を有し、前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーが配列番号９の配列を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出段階がゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子の分析方法であって、
（ａ）小麦植物からゲノムＤＮＡを得る段階、
（ｂ）前記ＤＮＡを鋳型として使用して、前記ＤＮＡと、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーと、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーと、５´末端と３´末端を有し、配列番号１２の３〜２３番目のヌクレオチドの補体にアニーリングすることができ、３´末端がシチジンである第１のヌクレオチド配列を有する変異型対立遺伝子特異的プライマーとを含む第１のＰＣＲ増幅を行う段階、
（ｃ）前記ＤＮＡを鋳型として使用して、前記ＤＮＡと、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーと、前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーと、５´末端と３´末端を有し、配列番号１０の４〜２３番目のヌクレオチドの補体にアニーリングすることができ、３´末端がグアノシンである第２のヌクレオチド配列を有する野生型対立遺伝子特異的プライマーとを含む第２のＰＣＲ増幅を行う段階、及び、
（ｄ）第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅の生成物を検出する段階、
を含み、
前記野生型対立遺伝子特異的プライマーと前記変異型対立遺伝子特異的プライマーが、ＡＨＡＳＬ遺伝子における前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトと前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトの内側の領域にアニーリングすることができるプライマーであることを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡが、（ｂ）段階の前に、前記ＤＮＡと、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、ＡＨＡＳＬフォワードプライマーと、ＡＨＡＳＬリバースプライマーとを含む予備増幅に付され、
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーと前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーが、ＡＨＡＳＬ遺伝子における前記ＡＨＡＳＬフォワードプライマーのアニーリングサイトと前記ＡＨＡＳＬリバースプライマーのアニーリングサイトの内側の領域にアニーリングすることができるプライマーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記予備増幅後、(ｂ)段階前に、前記ＤＮＡがエクソヌクレアーゼで分解される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＡＨＡＳＬフォワードプライマーと前記ＡＨＡＳＬリバースプライマーが、ＡＨＡＳＬ１Ａ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ｄにアニーリングするように設計されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＡＨＡＳＬフォワードプライマーが配列番号１のヌクレオチド配列を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＨＡＳＬリバースプライマーが配列番号２のヌクレオチド配列を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記変異型対立遺伝子特異的プライマーが配列番号３のヌクレオチド配列を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記野生型対立遺伝子特異的プライマーが配列番号４のヌクレオチド配列を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子がＡＨＡＳＬ１Ｄである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーが配列番号５の配列を有し、前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーが配列番号７の配列を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子がＡＨＡＳＬ１Ｂである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーが配列番号６の配列を有し、前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーが配列番号８の配列を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子がＡＨＡＳＬ１Ａである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーが配列番号５の配列を有し、前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーが配列番号９の配列を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出段階がゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子の分析方法であって、
（ａ）小麦植物からゲノムＤＮＡを得る段階、
（ｂ）前記ＤＮＡを鋳型として使用して、予備増幅ＤＮＡを製造するために、前記ＤＮＡと、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、ＡＨＡＳＬフォワードプライマーと、ＡＨＡＳＬリバースプライマーとを含む予備増幅を行う段階、
（ｃ）前記予備増幅ＤＮＡを鋳型として使用して、前記予備増幅ＤＮＡと、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーと、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーと、５´末端と３´末端を有し、配列番号１２の３〜２３番目のヌクレオチドの補体にアニーリングすることができ、３´末端がシチジンである第１のヌクレオチド配列を有する変異型対立遺伝子特異的プライマーとを含む第１のＰＣＲ増幅を行う段階、
（ｄ）前記予備増幅ＤＮＡを鋳型として使用して、前記予備増幅ＤＮＡと、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーと、前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーと、５´末端と３´末端を有し、配列番号１０の４〜２３番目のヌクレオチドの補体にアニーリングすることができ、３´末端がグアノシンである第２のヌクレオチド配列を有する野生型対立遺伝子特異的プライマーとを含む第２のＰＣＲ増幅を行う段階、及び、
（ｅ）第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅の生成物を検出する段階、
を含み、
前記野生型対立遺伝子特異的プライマーと前記変異型対立遺伝子特異的プライマーが、ＡＨＡＳＬ遺伝子における前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトと前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトの内側の領域にアニーリングすることができるプライマーであることを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記予備増幅ＤＮＡが（ｃ）段階の前にエクソヌクレアーゼで分解される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＡＨＡＳＬ遺伝子の対立遺伝子のフラグメントをＰＣＲ増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号３又は配列番号４のヌクレオチド配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３３】
小麦植物がゲノム内に小麦植物にイミダゾリノン系除草剤耐性を与える小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子の変異型対立遺伝子を含んでいるかどうかを検知するためのキットであって、
（ａ）ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマー、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマー、及び、５´末端と３´末端を有し、配列番号１２の３〜２３番目のヌクレオチドの補体にアニーリングすることができ、３´末端がシチジンであるヌクレオチド配列を有しており、ＡＨＡＳＬ遺伝子における前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトと前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトの内側の領域にアニーリングすることができる変異型対立遺伝子特異的プライマー、及び、
（ｂ）前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトと前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトの内側に存在する小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子の第１のフラグメントのＰＣＲ増幅と、前記変異型対立遺伝子特異的プライマーのアニーリングサイトと前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトの内側に存在する小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子の第２のフラグメントのＰＣＲ増幅とを触媒することができるポリメラーゼ酵素、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項３４】
前記変異型対立遺伝子特異的プライマーが配列番号３のヌクレオチド配列を有する、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子がＡＨＡＳＬ１Ｄである、請求項３３に記載のキット。
【請求項３６】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーが配列番号５の配列を有し、前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーが配列番号７の配列を有する、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子がＡＨＡＳＬ１Ｂである、請求項３３に記載のキット。
【請求項３８】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーが配列番号６の配列を有し、前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーが配列番号８の配列を有する、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子がＡＨＡＳＬ１Ａである、請求項３３に記載のキット。
【請求項４０】
前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーが配列番号５の配列を有し、前記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーが配列番号９の配列を有する、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
さらにＡＨＡＳＬフォワードプライマーとＡＨＡＳＬリバースプライマーとを含む、請求項３３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子分析の分野に関し、特に、植物のアセトヒドロキシ酸シンターゼラージサブユニット（ＡＨＡＳＬ）遺伝子における野生型対立遺伝子及び除草剤耐性対立遺伝子に対する新規な同定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ；ＥＣ４．１．３．１８：アセト乳酸シンターゼ(ＡＬＳ）とも言われる)は、分枝鎖型アミノ酸であるバリン、ロイシン及びイソロイシンの生化学的合成を触媒する最初の酵素である（Ｓｉｎｇｈによる“Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｌｉｎｅ，  ｌｅｕｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ”，（Ｐｌａｎｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｓｉｎｇｈ，Ｂ．Ｋ．ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｌｌｅｒ  Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２２７−２４７（１９９９））参照）。ＡＨＡＳは、スルホニル尿素類（ＬａＲｏｓｓａとＦａｌｃｏによるＴｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：１５８−１６１（１９８４））、イミダゾリノン類（ＳｈａｎｅｒらによるＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７６：５４５−５４６（１９８４））、トリアゾロピリミジン類（ＳｕｂｒａｍａｎｉａｎとＧｅｒｗｉｃｋによる“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｂｙ  ｔｒｉａｚｏｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ”（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｗｈｉｔａｋｅｒ，Ｊ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｓｏｎｎｅｔ，Ｐ．Ｅ．ｅｄｓ．，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．２７７−２８８（１９８９）））、及びピリミジルオキシベンゾアート類（ＳｕｂｒａｍａｎｉａｎらによるＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４：２３９−２４４（１９９０））を含む４群の構造的に異なる除草剤の作用点である。イミダゾリノン系除草剤とスルホニル尿素系除草剤は、散布量が極めて少量でも効果があり、動物に対する毒性が比較的少ないため、最近の農業において広範に使用されている。これらの群の除草剤は、ＡＨＡＳの活性を抑制することによって、多くの雑草種を含む感受性の強い植物のさらなる生育を阻害する。市販のイミダゾリノン系除草剤の例としては、ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）（イマゼタピル）、ＳＣＥＰＴＥＲ（登録商標）（イマザキン）、ＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）（イマザピル）が挙げられる。スルホニル尿素系除草剤の例としては、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメトスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、及びハロスルフロンが挙げられる。
【０００３】
イミダゾリノン除草剤は、その優れた効能と低い毒性のため、広範囲の植物の上部から噴霧することにより施与するのが好ましい。広範囲の植物の上部から除草剤を噴霧することができれば、農園の開設及び維持のための費用が低減し、またこのような化学品を使用する前に現場で調合する必要性が低下する。目的の耐性種の上部から噴霧すると、競合種が存在しなくなるため、目的の耐性種の生産力を最大に高めることになる。しかしながら、このような噴霧法を使用できるかどうかは、噴霧領域における目的の植物の中にイミダゾリノン耐性種が存在するかどうかに依存する。
【０００４】
多くの農作物の中で、大豆のような数種のマメ科の植物種は、イミダゾリノン系除草剤化合物を迅速に代謝することができるため、イミダゾリノン系除草剤に対して天然でも耐性を有する（ＳｈａｎｅｒとＲｏｂｉｎｓｏｎによるＷｅｅｄ  Ｓｃｉ．３３：４６９−４７１（１９８５））。しかしながら、トウモロコシ（ＮｅｗｈｏｕｓｅらによるＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２−８８６（１９９２））及びコメ（ＢａｒｒｅｔｔらによるＣｒｏｐ  Ｓａｆｅｎｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．１９５−２２０（１９８５））のような他の作物は、イミダゾリノン系除草剤に幾分影響を受ける。イミダゾリノン系除草剤に対する感受性差は、特別な除草剤の化学的性質と、各植物における化合物の有毒形態から無毒形態への代謝の差に依存する（ＳｈａｎｅｒらによるＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７６：５４５−５４６（１９８４）；ＢｒｏｗｎらによるＰｅｓｔｉｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７：２４−２９（１９８７））。植物の他の生理作用の差、例えば吸収と転置の差も、感受性に重要な影響を及ぼす（ＳｈａｎｅｒとＲｏｂｉｎｓｏｎによるＷｅｅｄ  Ｓｃｉ．３３：４６９−４７１（１９８５））。
【０００５】
イミダゾリノン類、スルホニル尿素類、及びトリアゾロピリミジン類に耐性を有する植物の製造は、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ダイズ（Ｇｌｕｃｉｎｅ  ｍａｘ）及びタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）において、種子、小胞子、花粉、及びカルスの変異誘発を用いて成功している（ＳｅｂａｓｔｉａｎらによるＣｒｏｐ  Ｓｃｉ．２９：１４０３−１４０８（１９８９）；ＳｗａｎｓｏｎらによるＴｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．７８：５２５−５３０（１９８９）；ＮｅｗｈｏｕｓｅらによるＴｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．８３：６５−７０（１９９１）；ＳａｔｈａｓｉｖａｎらによるＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：１０４４−１０５０（１９９１）；ＭｏｕｒａｎｄらによるＪ．  Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  ８４：９１−９６（１９９３））。全てのケースにおいて、唯一の部分優勢の核遺伝子が耐性を与えていた。また、既に４種のイミダゾリノン耐性小麦植物が、コムギ属のＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．ｃｖ．Ｆｉｄｅｌの種子の変異誘発に続いて分離されている（ＮｅｗｈｏｕｓｅらによるＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２−８８６（１９９２））。遺伝的形質の研究から、唯一の部分優勢の遺伝子が耐性を与えていることがわかっている。著者は、対立遺伝子の研究から、４種の同定された系統の突然変異が同じ遺伝子座に位置していると結論付けた。このＦｉｄｅｌ種の耐性遺伝子の１種は、ＦＳ−４と命名された（ＮｅｗｈｏｕｓｅらによるＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２−８８６（１９９２））。ＡＨＡＳ抑制錯体のコンピュータによる三次元構造解析によると、上記抑制剤のいくつかのアミノ酸が、誘発突然変異がイミダゾリノンに選択的に耐性を与えるだろうと思われる部位のポケットに結合すると予測されている（ＯｔｔらによるＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：３５９−３６８（１９９６））。実際に、ＡＨＡＳ酵素の上記結合部位にこれらの合理的に設計された突然変異をいくつか有する小麦植物は、ある除草剤群に特別な耐性を示す（ＯｔｔらによるＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：３５９−３６８（１９９６））。
【０００６】
イミダゾリノン系除草剤に対する植物の耐性は、多くの特許文献においても報告されている。米国特許第４７６１３７３号、第５３３１１０７号、第５３０４７３２号、第６２１１４３８号、第６２１１４３９号、及び第６２２２１００号公報は、植物の除草剤耐性を発現させるために変性ＡＨＡＳ遺伝子を使用することを一般的に記載しており、ある種のイミダゾリノン耐性トウモロコシ系統を特に開示している。米国特許第５０１３６５９号公報は、１箇所以上の保存領域における少なくとも１個のアミノ酸の変異により除草剤耐性を発現させた植物を開示している。この文献に記載された変異は、イミダゾリノン類とスルホニル尿素類への交差耐性又はスルホニル尿素類に特異的な耐性をコードするが、イミダゾリノン類に特異的な耐性は記載されていない。さらに、米国特許第５７３１１８０号及び第５７６７３６１号公報は、単子葉植物の野生型ＡＨＡＳアミノ酸配列のうちの１個のアミノ酸が置換されているイミダゾリノンに特異的な耐性をもたらす遺伝子の分離を報告している。
【０００７】
植物では、調査された他の全ての生命体と同様に、ＡＨＡＳ酵素は２つのサブユニット、すなわち、ラージサブユニット（触媒的な役割）とスモールサブユニット（調節的な役割）から構成されている（ＤｕｇｇｌｅｂｙとＰａｎｇによるＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：１−３６（２０００））。ラージサブユニット（以下、「ＡＨＡＳＬ」と表す）は、シロイヌナズナ及びコメの場合のように単一の遺伝子でコードされることもあり、トウモロコシ、カノーラ及びワタのように複数の遺伝子ファミリーでコードされることもある。ラージサブユニットの特異的な単一のヌクレオチドの置換により、この酵素の１群以上の除草剤に対する感受性を低下させることができる（ＣｈａｎｇとＤｕｇｇｌｅｂｙによるＢｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３３３：７６５−７７７（１９９８））。
【０００８】
ＡＨＡＳＬをコードする遺伝子（本明細書において、「ＡＨＡＳＬ遺伝子」とも表す）における変異は、イミダゾリノン系除草剤に対する耐性を増加させたＣＬＥＡＲＦＩＥＬＤ（登録商標）作物における除草剤耐性の分子基盤である。これらの変異のそれぞれが半優勢の表現型をもたらすため、ヘテロ接合状態における１個の変異で、多くの作物の生産のために充分な程度の除草剤耐性を与えるには十分であろう。しかしながら、特別な除草剤の用途では、また小麦のような複数のＡＨＡＳＬ遺伝子を有する作物用植物の場合には、除草剤に対する耐性の程度を向上させるために、変異を組み合わせるのが望ましい。例えば、パン小麦のＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．は３種の同祖のＡＨＡＳＬ遺伝子を有する。それぞれの遺伝子の除草剤応答と３種の遺伝子のそれぞれにおける変異からの生化学的データに関しては、詳細に報告されている（ＡｓｃｅｎｚｉらによるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ，Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｓ１０−１７（２００３））。３種の遺伝子全てのコード配列が、ヌクレオチドのレベルでは、広範囲の相同性を有する（ＷＯ第０３／１４３５７号パンフレット）。
【０００９】
Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍのいくつかの変種から得たＡＨＡＳＬ遺伝子の配列付けを通して、ほとんどのイミダゾリノン（ＩＭＩ）耐性系統における除草剤耐性の分子基盤は変異Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎであることがわかっている。この変異は、シロイヌナズナにおける６５３番目のアミノ酸のセリンに相当する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換を示している（ＷＯ第０３／１４３５６、０３／１４３５７号パンフレット参照）。図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃにおいて、それぞれの遺伝子におけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異に影を付けている。この変異は、ＡＨＡＳＬタンパクをコードするＤＮＡ配列における一塩基変異多型(ＳＮＰ)に起因する。
【００１０】
植物生産業者の１つの目標は、現在の系統にＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異を導入することによって、又はＩＭＩ非耐性系統にＩＭＩ耐性系統を交配した後イミダゾリノン耐性のための戻し交配及び選定を行うことによって、現在の小麦植物にイミダゾリノン耐性を導入することである。植物生産業者のさらなる目標は、単一の小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子に単一のＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異を有する小麦植物に認められる耐性の程度を超える、向上したイミダゾリノン耐性を有する小麦植物を生産することである。すなわち、２種以上のＡＨＡＳＬ遺伝子にＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異の組み合わせを有する小麦植物を生育するのが望ましい。さらにまた、１種以上のＡＨＡＳＬ遺伝子でＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異型対立遺伝子のホモ接合体である小麦植物を生育するのが望ましい。しかしながら、目的の小麦植物を開発するためには、目的の植物を同定するために迅速な方法が必要である。現在のイミダゾリノン耐性を有する小麦植物を検出するための方法は、単一のＡＨＡＳＬ遺伝子に２個以上のＳ６５３（Ａｔ）Ｎ対立遺伝子を有する植物の開発に使用するのには適していない。強化されたイミダゾリノン耐性を有する植物を同定するための現在の方法は、除草剤の野外散布実験又は温室散布実験と、ＡＨＡＳ活性に対する生化学的分析を含む。しかしながら、このような方法の実施には時間がかかり、一般に、多数の個々の植物の中から２番目のＳ６５３（Ａｔ）Ｎ対立遺伝子が小麦植物に導入された際に認められるイミダゾリノン耐性の微妙な増加を識別するのに適していない。
【００１１】
目的の植物を同定するための代替的な方法には、ＤＮＡを基礎とした方法が含まれる。例えば、ＡＨＡＳＬ遺伝子又はその一部をゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅し、得られた増幅ＡＨＡＳＬ遺伝子又はその一部を植物中に存在するＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異型対立遺伝子及び特別なＡＨＡＳＬ遺伝子の同定のために配列解析することができる。しかしながら、このようなＤＮＡ配列解析を基礎とした方法は、多数のサンプルに対しては実用的でない。他の方法には、ゲノムＤＮＡ又はＰＣＲ増幅ＤＮＡのドットブロットのプローブとして、放射性物質で標識化した又は同位体とは異なる方法で標識化した対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯｓ）を使用する方法が含まれる（ＣｏｎｎｏｒらによるＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：２７８−２８２（１９８３）；ＯｒｋｉｎらによるＪ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７１：７７５−７７９（１９８３）；ＢｒｕｎらによるＮｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３５２（１９８８）；及びＢｕｇａｗａｎらによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９４３−９４７（１９８８））。このような方法は単一の遺伝子座における２種の対立遺伝子を区別するのには有用であるけれども、小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子にとっては有用ではない。というのは３種のＡＨＡＳＬ遺伝子におけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異型ＡＨＡＳＬタンパクを発生させるＳＮＰの近接領域がほとんど等しい（図１参照）からである。そのため、３種の小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子のそれぞれにおける野生型対立遺伝子と変異型対立遺伝子を区別することができる６個のオリゴヌクレオチドプローブのセットを開発することができない。
【００１２】
ＳＮＰ分析のために多くの個々の植物を迅速にスクリーニングするために採用しうる方法の１つとして、ＡＲＭＳ法（ＮｅｗｔｏｎらによるＮｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：２５０３−２５１６（１９８９））がある。このＰＣＲを基礎とした方法は、単一のヌクレオチドが異なる遺伝子の２種の対立遺伝子を区別するために使用することができ、ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動と臭化エチジウム染色の後に検査することにより、一方の対立遺伝子のホモ接合体からヘテロ接合体を区別するために使用することができる。このＡＲＭＳ法は、不適合な３´末端残基を有するオリゴヌクレオチドは一定条件下ではＰＣＲのプライマーとして作用しないという前提に基づいている（ＮｅｗｔｏｎらによるＮｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：２５０３−２５１６（１９８９））。この方法は単一の遺伝子におけるＳＮＰの分析のためには有用であることがわかっているが、この方法あるいは他のＰＣＲを基礎とする方法で、３種の小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子のそれぞれにＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異を発現させるＳＮＰの分析に使用できるかどうかは、いまだ報告されていない。
【００１３】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：２７８−２８２（１９８３）
【非特許文献２】Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７１：７７５−７７９（１９８３）
【非特許文献３】Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７１：７７５−７７９（１９８３）
【非特許文献４】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９４３−９４７（１９８８）
【非特許文献５】Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：２５０３−２５１６（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
そこで、本発明の目的は、植物のＡＨＡＳＬ遺伝子を分析するための方法を提供することである。本発明は、植物のゲノムＤＮＡを含むサンプルについて、植物のゲノムのそれぞれのＡＨＡＳＬ遺伝子における野生型対立遺伝子及び／又は変異型対立遺伝子の存在を検出することを目的とする。本発明における変異型ＡＨＡＳＬ遺伝子は、Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎ置換を含むイミダゾリノン耐性ＡＨＡＳＬタンパクをコードする。ＤＮＡレベルでは、変異型対立遺伝子は、ＥＭＢＬ登録番号Ｘ５１５１４に記載のシロイヌナズナのＡＨＡＳＬヌクレオチド配列の１９５８番目のヌクレオチドに対応する位置でのＧ→Ａ転置に起因する。この方法は特に、限定的ではないが、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ及びＴｒｉｔｉｃｕｍ  ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍを含む２種以上のＡＨＡＳＬ遺伝子を有する植物のＡＨＡＳＬ遺伝子を分析することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の方法は、植物にイミダゾリノン除草剤耐性を与えるＡＨＡＳＬ遺伝子の変異型遺伝子の検出方法を提供する。この方法は、（ａ）植物、特に小麦植物からゲノムＤＮＡを得る段階、（ｂ）上記ＤＮＡを鋳型として使用して、上記ＤＮＡと、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーと、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーと、変異型対立遺伝子特異的プライマーとを含むＰＣＲ増幅を行う段階、及び、（ｃ）上記ＰＣＲ増幅の生成物を検出する段階、を含む。上記変異型対立遺伝子特異的プライマーは、５´末端と３´末端を有し、ＡＨＡＳＬ遺伝子のコード鎖に対応するヌクレオチド配列を有する。ただし、この配列の３´末端のヌクレオチドは、Ｇ→Ａの点変異のサイトに対応し、３´末端のヌクレオチドはシチジンである。さらに、上記変異型対立遺伝子特異的プライマーは、ＡＨＡＳＬ遺伝子における上記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトと上記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトの内側の領域にアニーリングすることができるプライマーである。本発明の一形態において、上記変異型対立遺伝子特異的プライマーは、５´末端と３´末端を有し、配列番号１２の３〜２３番目番目のヌクレオチドの補体にアニーリングすることができ、３´末端がシチジンであるヌクレオチド配列を有する。
【００１６】
本発明の第２の方法は、植物のＡＨＡＳＬ遺伝子、特にＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａ、及びＴｒｉｔｉｃｕｍ  ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａから成る群から選択されたＡＨＡＳＬ遺伝子の分析方法を提供する。この方法は、（ａ）植物、特に小麦植物からゲノムＤＮＡを得る段階、（ｂ）上記ＤＮＡを鋳型として使用して、上記ＤＮＡと、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーと、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーと、上述の変異型対立遺伝子特異的プライマーとを含む第１のＰＣＲ増幅を行う段階、（ｃ）上記ＤＮＡを鋳型として使用して、上記ＤＮＡと、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、上記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーと、上記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーと、野生型対立遺伝子特異的プライマーとを含む第２のＰＣＲ増幅を行う段階、及び、（ｄ）第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅の生成物を検出する段階、を含む。上記野生型対立遺伝子特異的プライマーは、５´末端と３´末端を有し、ＡＨＡＳＬ遺伝子のコード鎖に対応するヌクレオチド配列を有する。ただし、３´末端のヌクレオチドは、Ｇ→Ａの点変異のサイトに対応し、３´末端のヌクレオチドはグアノシンである。本発明の上記野生型対立遺伝子特異的プライマーは、ＡＨＡＳＬ遺伝子における上記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトと上記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトの内側の領域にアニーリングすることができるプライマーである。本発明の他の形態では、上記野生型対立遺伝子特異的プライマーは、５´末端と３´末端を有し、配列番号１０の４〜２３番目のヌクレオチドの補体にアニーリングすることができ、３´末端がグアノシンである第２のヌクレオチド配列を有する。
【００１７】
本発明の第３の方法は、植物のそれぞれのＡＨＡＳＬ遺伝子又はそのフラグメントに対するゲノムＤＮＡのサンプルを濃縮するために、それぞれのＡＨＡＳＬ遺伝子の少なくともフラグメントを初期にＰＣＲ増幅する段階を含む、ＡＨＡＳＬ遺伝子の分析方法を提供する。この方法は、（ａ）植物、特に小麦植物からゲノムＤＮＡを得る段階、（ｂ）上記ＤＮＡを鋳型として使用して、予備増幅ＤＮＡを製造するために、上記ＤＮＡと、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、ＡＨＡＳＬフォワードプライマーと、ＡＨＡＳＬリバースプライマーとを含む予備増幅を行う段階、（ｃ）上記予備増幅ＤＮＡを鋳型として使用して、上記予備増幅ＤＮＡと、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーと、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーと、上述の変異型対立遺伝子特異的プライマーとを含む第１のＰＣＲ増幅を行う段階、（ｄ）上記予備増幅ＤＮＡを鋳型として使用して、上記予備増幅ＤＮＡと、ポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、上記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーと、上記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーと、上述の野生型対立遺伝子特異的プライマーとを含む第２のＰＣＲ増幅を行う段階、及び、（ｅ）第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅の生成物を検出する段階、を含む。上記野生型対立遺伝子特異的プライマーと上記変異型対立遺伝子特異的プライマーは、ＡＨＡＳＬ遺伝子における上記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトと上記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトの内側の領域にアニーリングすることができ、さらに、上記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーと上記ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーとは、上記ＡＨＡＳＬフォワードプライマーのアニーリングサイトと上記ＡＨＡＳＬリバースプライマーのアニーリングサイトの内側にアニーリングすることができる。
【００１８】
本発明は、上述のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。これらのプライマーは、限定的ではないが、配列番号３のヌクレオチド配列を有する変異型対立遺伝子特異的プライマー、配列番号４のヌクレオチド配列を有する野生型対立遺伝子特異的プライマー、配列番号５及び６のヌクレオチド配列を有するＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマー、配列番号７、８、９のヌクレオチド配列を有するＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマー、配列番号１のヌクレオチド配列を有するＡＨＡＳＬフォワードプライマー、配列番号２のヌクレオチド配列を有するＡＨＡＳＬリバースプライマーを含む。
【００１９】
本発明はまた、上述の本発明の方法を実施するためのキットを提供する。このようなキットは、少なくとも１種のＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマー、少なくとも１種のＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマー、変異型対立遺伝子特異的プライマー、及び、小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子の第１のフラグメントのＰＣＲ増幅と小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子における第２のフラグメントのＰＣＲ増幅とを触媒することができる少なくとも１種のポリメラーゼ酵素を含む。本発明のキットは、さらに、本明細書に示す本発明の方法を実施するために必要な他の成分を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
図１Ａは、野生型（ＷＴ）ＡＨＡＳＬ１Ｄのヌクレオチド（配列番号１０）とアミノ酸（配列番号１１）の配列と、変異型（ＭＵＴ）ＡＨＡＳＬ１Ｄのヌクレオチド（配列番号１２）とアミノ酸（配列番号１３）の配列を示している。影を付けた領域は、変異型配列の変異サイトを示している。
【００２１】
図１Ｂは、野生型（ＷＴ）ＡＨＡＳＬ１Ｂのヌクレオチド（配列番号１４）とアミノ酸（配列番号１５）の配列と、変異型（ＭＵＴ）ＡＨＡＳＬ１Ｂのヌクレオチド（配列番号１６）とアミノ酸（配列番号１７）の配列を示している。影を付けた領域は、変異型配列の変異サイトを示している。
【００２２】
図１Ｃは、野生型（ＷＴ）ＡＨＡＳＬ１Ａのヌクレオチド（配列番号１８）とアミノ酸（配列番号１９）の配列と、変異型（ＭＵＴ）ＡＨＡＳＬ１Ａのヌクレオチド（配列番号２０）とアミノ酸（配列番号２１）の配列を示している。影を付けた領域は、変異型配列の変異サイトを示している。
【００２３】
図２は、本発明の一実施形態の概略的な説明図である。
【００２４】
図３は、ＡＨＡＳＬフォワードプライマーとＡＨＡＳＬリバースプライマー（影付き）を有する３種の小麦ＡＨＡＳＬのｃＤＮＡ配列の部分的な配列を示している。
【００２５】
図４は、野生型対立遺伝子特異的プライマー、変異型対立遺伝子特異的プライマー、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマー、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーを有する３種の小麦ＡＨＡＳＬのｃＤＮＡ配列の部分的な配列を示している。
【００２６】
図５は、単色ＵＶ光を照射した臭化エチジウムで処理したアガロースゲルのネガ画像である。４種の小麦の遺伝子型が、例３に記載の６個の分析法の全てによって分析された。試験された小麦の遺伝子型は、Ｋｉｒｓｃｈａｕｆｆ（図５では、「野生型」と表記）、ＣＶ９８０４、Ｇ−２０８及びＫ−４２である。４種の遺伝子型のうち、ＣＶ９８０４、Ｇ−２０８及びＫ−４２はＩＭＩ耐性の特質を有している。各バンドの上には、パネルの上の大文字とパネル内の小文字で反応が示されている。例えば、各パネルの最も左にある一対のバンドは、ＡＨＡＳＬ１Ｄ（Ｄ）の野生型対立遺伝子（ｗ）の反応の分析結果を示しており、最も右側の列には、ＡＨＡＳＬ１Ａ（Ａ）の変異型対立遺伝子（ｍ）の反応の分析結果を示している。各パネルの中央の列は、ＡＨＡＳＬ１Ｂ（Ｂ）の野生型対立遺伝子（ｗ）と変異型対立遺伝子（ｍ）の分析の結果を示している。各列で、対照用バンドが上方のバンド（長い方のフラグメント）であり、診断用バンドが下方のバンド（短い方のフラグメント）である。
【００２７】
図６は、小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子コード配列の対比較から得られたヌクレオチド配列の同一性(パーセント)を示す表である。６倍体ＬＩＤ、６倍体ＬＩＢ、及び６倍体ＬＩＡは、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍから得たＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ、及びＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子をそれぞれ示している。４倍体Ｌ１Ｂ及び４倍体Ｌ１Ａは、Ｔ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍ．から得たＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子をそれぞれ示している。
【００２８】
配列表の核酸及びアミノ酸の配列は、ヌクレオチド塩基に対する標準的な略号及びアミノ酸に対する３文字のコードを使用して示されている。核酸配列は、配列の５´末端から開始して３´末端へと（ラインごとに左から右へ）進行する標準的な様式に従って示している。それぞれの核酸配列の１本の鎖のみを示しているが、相補鎖は表示した鎖から理解できるであろう。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端からカルボキシ末端へと（ラインごとに左から右へ）進行する標準的な様式に従って示している。
【００２９】
配列番号１は、ＡＨＡＳＬフォワードプライマー（「ＣＭ−Ｆ」とも表す）のヌクレオチド配列を示している。
【００３０】
配列番号２は、ＡＨＡＳＬリバースプライマー（「ＣＭ−Ｒ」とも表す）のヌクレオチド配列を示している。
【００３１】
配列番号３は、変異型対立遺伝子特異的プライマー（「ＭＵ−Ｆ」とも表す）のヌクレオチド配列を示している。
【００３２】
配列番号４は、野生型対立遺伝子特異的プライマー（「ＷＴ−Ｆ」とも表す）のヌクレオチド配列を示している。
【００３３】
配列番号５は、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマー（「１Ａ，Ｄ−Ｆ」とも表す）のヌクレオチド配列を示している。
【００３４】
配列番号６は、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマー（「１Ｂ−Ｆ」とも表す）のヌクレオチド配列を示している。
【００３５】
配列番号７は、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマー（「１Ｄ−Ｒ」とも表す）のヌクレオチド配列を示している。
【００３６】
配列番号８は、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマー（「１Ｂ−Ｒ」とも表す）のヌクレオチド配列を示している。  
配列番号９は、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマー（「１Ａ−Ｒ」とも表す）のヌクレオチド配列を示している。
【００３７】
配列番号１０は、図１Ａに示されているＡＨＡＳＬ１Ｄの野生型対立遺伝子の一部のヌクレオチド配列を示している。
【００３８】
配列番号１１は、図１Ａに示されているＡＨＡＳＬ１Ｄの野生型対立遺伝子のヌクレオチド配列の一部によってコードされるアミノ酸配列を示している。
【００３９】
配列番号１２は、図１Ａに示されているＡＨＡＳＬ１Ｄの変異型対立遺伝子の一部のヌクレオチド配列を示している。
【００４０】
配列番号１３は、図１Ａに示されているＡＨＡＳＬ１Ｄの野生型対立遺伝子のヌクレオチド配列の一部によってコードされるアミノ酸配列を示している。
【００４１】
配列番号１４は、図１Ｂに示されているＡＨＡＳＬ１Ｂの野生型対立遺伝子の一部のヌクレオチド配列を示している。
【００４２】
配列番号１５は、図１Ｂに示されているＡＨＡＳＬ１Ｂの野生型対立遺伝子のヌクレオチド配列の一部によってコードされるアミノ酸配列を示している。
【００４３】
配列番号１６は、図１Ｂに示されているＡＨＡＳＬ１Ｂの変異型対立遺伝子の一部のヌクレオチド配列を示している。
【００４４】
配列番号１７は、図１Ｂに示されているＡＨＡＳＬ１Ｂの野生型対立遺伝子のヌクレオチド配列の一部によってコードされるアミノ酸配列を示している。
【００４５】
配列番号１８は、図１Ｃに示されているＡＨＡＳＬ１Ａの野生型対立遺伝子の一部のヌクレオチド配列を示している。
【００４６】
配列番号１９は、図１Ｃに示されているＡＨＡＳＬ１Ａの野生型対立遺伝子のヌクレオチド配列の一部によってコードされるアミノ酸配列を示している。
【００４７】
配列番号２０は、図１Ｃに示されているＡＨＡＳＬ１Ａの変異型対立遺伝子の一部のヌクレオチド配列を示している。
【００４８】
配列番号２１は、図１Ｃに示されているＡＨＡＳＬ１Ａの野生型対立遺伝子のヌクレオチド配列の一部によってコードされるアミノ酸配列を示している。
【００４９】
本発明は、植物のゲノムを分析する迅速な方法、特に、植物のゲノムにおけるＡＨＡＳＬ遺伝子を分析する方法に関する。本発明の方法は、例えばパン小麦のＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．及び、デュラム小麦のＴ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍのような複数のＡＨＡＳＬ遺伝子を有する植物のＡＨＡＳＬ遺伝子を分析するのに特に有用である。Ｔ．  ａｅｓｔｉｖｕｍは、その６倍体のゲノムに、３種の高度に類似しているがはっきりと区別できるＡＨＡＳＬ遺伝子、すなわち、ＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａ、を含んでいる。これに対し、Ｔ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍは、その４倍体のゲノムに、２種の高度に類似しているがはっきりと区別できるＡＨＡＳＬ遺伝子、すなわち、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子、を含んでいる。Ｔ．  ａｅｓｔｉｖｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａは、配列及び配列の同一性（％）の計算から明らかなように、Ｔ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａと、同一ではないものの密接な関係がある。図６は、Ｔ．  ａｅｓｔｉｖｕｍ及びＴ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍのＡＨＡＳＬ遺伝子コード配列の対比較から得たヌクレオチド配列の同一性(パーセント)を示している。
【００５０】
本発明の方法は、植物のゲノムにおける１種以上のＡＨＡＳＬ遺伝子に変異型対立遺伝子が存在するかどうかを決定することを含む。変異型対立遺伝子は、Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎ置換を含むイミダゾリノン耐性ＡＨＡＳＬタンパクをコードするヌクレオチド配列を有する。本発明の方法はさらに、１種以上のＡＨＡＳＬ遺伝子に野生型のＡＨＡＳＬ対立遺伝子が存在するかどうかを決定することを含む。実際に、本発明の方法により、植物のそれぞれのＨＡＳＬ遺伝子の接合型を決定することができる。例えば、本発明の方法は、小麦植物の３種のＡＨＡＳＬ遺伝子（又はデュラム小麦の場合には２種のＡＨＡＳＬ遺伝子）のそれぞれについて、小麦植物が変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子のホモ接合体であるか、野生型対立遺伝子のヘテロ接合体であるかホモ接合体であるかを迅速に決定するために使用することができる。従って、本発明の方法は、ゲノムに１、２、３、４、５又は６個の変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子を有するイミダゾリノン耐性小麦植物を生産するための品種改良プログラムにおいて有用である。
【００５１】
本明細書において使用される語句について、以下に説明する。
【００５２】
“プライマー”とは、３´末端と５´末端を有し、目的のＤＮＡ鎖上の所定のアニーリングサイトにアニーリングすることができる単一鎖のオリゴヌクレオチドであり、プライマーは、特にＰＣＲ増幅において、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の開始点として機能する。このようなプライマーは、目的のＤＮＡ上のアニーリングサイトに完全に相補的であってもなくても良い。
【００５３】
目的のＤＮＡ鎖上の“アニーリング”サイトとは、プライマーが本発明の方法においてアニーリングすることができるサイトである。
【００５４】
一般にＰＣＲにより遺伝子のフラグメントを増幅する際は、二重鎖ＤＮＡ分子の逆鎖にアニーリングする一対のプライマーが使用される。標準的な様式では、フォワードプライマーが遺伝子の非コード鎖にアニーリングし、リバースプライマーがコード鎖にアニーリングする。
【００５５】
ネステッドプライマーとは、ある一対のフォワードプライマーとリバースプライマーによって増幅されたＤＮＡ領域の内側に存在するアニーリングサイトを有するプライマーである。
【００５６】
ネステッドＰＣＲとは、ＰＣＲにより増幅された又は増幅されるより長いフラグメントの一部に相当するより短いフラグメントの増幅である。一般的に、第１のＰＣＲが、第１のフラグメントを製造するために、ある一対のフォワードプライマーとリバースプライマーとを用いて行われる。次いで、第２のＰＣＲが、ネステッドフォワードプライマーとネステッドリバースプライマーとを用い、第１のフラグメントを鋳型として用いて、第２のフラグメントが製造されるように行われる。しかしながら、本発明のいくつかの形態では、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びネステッドプライマーが同じＰＣＲ増幅において使用される。フォワードプライマーとネステッドプライマーがＤＮＡの同じ鎖上にアニーリングし、ＰＣＲの過程で２種のフラグメントの増幅が起こりうる。すなわち、より長いフラグメントが、ＤＮＡ鋳型におけるフォワードプライマーのアニーリングサイトとリバースプライマーのアニーリングサイトの間の領域の増幅から得られ、より短いフラグメントが、ＤＮＡ鋳型におけるネステッドプライマーのアニーリングサイトとリバースプライマーのアニーリングサイトの間の領域の増幅から得られる。
【００５７】
本明細書の全体を通して、“変異型対立遺伝子”、“変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子”、又は“変異型ＡＨＡＳＬ遺伝子”という語が使用されるが、特に示さない限り、これらの語はＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換を含むイミダゾリノン耐性ＡＨＡＳＬタンパクをコードするポリヌクレオチドを意味する。このアミノ酸の置換は、ＥＭＢＬ登録番号Ｘ５１５１４（参考として、本明細書に組み入れられる）に記載のシロイヌナズナのＡＨＡＳＬヌクレオチド配列の１９５８番目のヌクレオチドに対応する位置でのＧ→Ａの点変異の結果である。この点に関しては、やはり参考として組み入れられるＳａｔｈａｓｉｖａｎらによるＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２１１８（１９９０）が参照される。
【００５８】
これに対して、特に示さない限り、“野生型対立遺伝子”、“野生型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子”、又は“野生型ＡＨＡＳＬ遺伝子”とは、Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎ置換を欠くＡＨＡＳＬタンパクをコードするポリヌクレオチドを意味する。このような“野生型対立遺伝子”、“野生型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子”、又は“野生型ＡＨＡＳＬ遺伝子”は、Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎ置換を引き起こす変異以外の変異を含んでいてもいなくても良い。
【００５９】
本発明では、ＰＣＲ増幅のために多くのプライマーを使用する。これらのプライマーについて、以下に詳細に説明する。
【００６０】
“変異型対立遺伝子特異的プライマー”とは、本発明の方法において、変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子のフラグメントのＰＣＲ増幅のために使用することができるプライマーであるが、野生型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子又はその一部はほとんど増幅しないか又は全く増幅しないプライマーである。
【００６１】
“野生型対立遺伝子特異的プライマー”とは、本発明の方法において、野生型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子のフラグメントのＰＣＲ増幅のために使用することができるプライマーであるが、変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子又はその一部はほとんど増幅しないか又は全く増幅しないプライマーである。
【００６２】
本発明における“ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマー”と“ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマー”は、例えばＴ．  ａｅｓｔｉｖｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａ、及びＴ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１ＡのようなあるＡＨＡＳＬ遺伝子のフラグメントの増幅において、プライマー対として使用される。変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子を発現させるＳＮＰのサイトを含む遺伝子特異的増幅生成物又はフラグメントを製造するために使用することができるプライマー対でありさえすれば、本発明における“ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマー”と“ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマー”に含まれる。例えば、配列番号６（ＡＨＡＳＬ１Ｂ特異的フォワードプライマー）と配列番号８（ＡＨＡＳＬ１Ｂ特異的リバースプライマー）のプライマー対を、本発明で使用すると、特異的に小麦ＡＨＡＳＬ１Ｂのフラグメントを増幅することができるが、小麦ＡＨＡＳＬ１Ｄ又はＡＨＡＳＬ１Ａのフラグメントを増幅することはできない。従って、本発明は、特別なＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマー又はＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーには依存しない。むしろ、特別なＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーと特別なＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーからなるプライマー対は、植物からの唯一の特異的なＡＨＡＳＬ遺伝子のフラグメントを増幅することができる。多くのＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーを本発明の方法で使用するために設計できることは、当業者には理解されるであろう。本発明の方法は、このようなＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーの全ての使用を包含する。
【００６３】
さらに、本発明のＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーは、本発明の野生型対立遺伝子特異的プライマー又は本発明の変異型対立遺伝子特異的プライマーと共にＰＣＲ増幅において使用すると、植物からの唯一の特異的なＡＨＡＳＬ遺伝子のフラグメントを増幅することができる。例えば、配列番号３（変異型対立遺伝子特異的プライマー）及び配列番号８（ＡＨＡＳＬ１Ｂ特異的リバースプライマー）のプライマー対を、本発明で使用すると、特異的に小麦ＡＨＡＳＬ１Ｂ遺伝子のフラグメントを増幅することができるが、小麦ＡＨＡＳＬ１Ｄ又はＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子のフラグメントを増幅することができない。同様に、配列番号４（野生型対立遺伝子特異的プライマー）及び配列番号８（ＡＨＡＳＬ１Ｂ特異的リバースプライマー）のプライマー対を、本発明の方法で使用すると、特異的に小麦ＡＨＡＳＬ１Ｂ遺伝子のフラグメントを増幅することができるが、小麦ＡＨＡＳＬ１Ｄ又はＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子のフラグメントを増幅することができない。
【００６４】
Ｔ．  ａｅｓｔｉｖｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｄ遺伝子のフラグメントの増幅のためには、好ましいＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーは、配列番号５のヌクレオチド配列を有し、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーは、配列番号７のヌクレオチド配列を有する。
【００６５】
Ｔ．  ａｅｓｔｉｖｕｍ及びＴ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｂ遺伝子のフラグメントの増幅のためには、好ましいＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーは、配列番号６のヌクレオチド配列を有し、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーは、配列番号８のヌクレオチド配列を有する。
【００６６】
Ｔ．  ａｅｓｔｉｖｕｍ及びＴ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍのＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子のフラグメントの増幅のためには、好ましいＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーは、配列番号５のヌクレオチド配列を有し、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーは、配列番号９のヌクレオチドを配列を有する。
【００６７】
これらのゲノムに２種以上のＡＨＡＳＬ遺伝子を有する植物の場合には、本発明の“ＡＨＡＳＬフォワードプライマー”及び本発明の“ＡＨＡＳＬリバースプライマー”は、植物のそれぞれのＡＨＡＳＬ遺伝子のフラグメントの増幅におけるプライマー対として使用される。すなわち、ＡＨＡＳＬフォワードプライマーとＡＨＡＳＬリバースプライマーの対は、植物の異なるＡＨＡＳＬ遺伝子を区別しないように設計されており、従って、目的の植物種のための包括的なＡＨＡＳＬプライマーである。ゲノムＤＮＡのＡＨＡＳＬフォワードプライマー及びＡＨＡＳＬリバースプライマーを用いたＰＣＲ増幅から得られる増幅生成物又はフラグメントは、上述のＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトを含む。
【００６８】
ＡＨＡＳＬフォワードプライマーとＡＨＡＳＬリバースプライマーとの使用を含む本発明における特別なＰＣＲ増幅は、本明細書では増幅段階と表わされる。本発明のいくつかの形態では、次の本発明のＰＣＲ増幅において使用するために、ＡＨＡＳＬ遺伝子を含むフラグメントでゲノムＤＮＡを増量する予備増幅段階を使用する。予備増幅段階の生成物を、本明細書では予備増幅ＤＮＡと表わす。
【００６９】
本明細書において別に示さない限り、“ポリメラーゼ”とはＤＮＡポリメラーゼを意味し、特に本発明の１回以上のＰＣＲ増幅において使用するのに適するＤＮＡポリメラーゼを意味する。
【００７０】
本発明は、３つの方法を含む。本発明の第１の方法は、植物から得た変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子を検出するための、ゲノムＤＮＡ又は予備増幅ＤＮＡの第１のＰＣＲ増幅を含む。第２の方法は、第１の方法における第１のＰＣＲ増幅に加えて、植物から得た野生型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子を検出するためのゲノムＤＮＡ又は予備増幅ＤＮＡの第２のＰＣＲ増幅を含む。第３の方法は、第１の方法における第１のＰＣＲ増幅と、第２の方法における第２のＰＣＲ増幅と、ゲノムＤＮＡを使用して鋳型源としてのＡＨＡＳＬ遺伝子又はそのフラグメントを増幅するための第３のＰＣＲ増幅を含む。この第３のＰＣＲ増幅は、本明細書では予備増幅とも言われるが、第１のＰＣＲ増幅及び第２のＰＣＲ増幅に先立って行われる。第３のＰＣＲ増幅の生成物は、本明細書では予備増幅ＤＮＡとも言われるが、第１のＰＣＲ増幅及び第２のＰＣＲ増幅のためのＤＮＡ鋳型源として使用される。
【００７１】
本発明の第１の方法は、植物にイミダゾリノン系除草剤耐性を与えるＡＨＡＳＬ遺伝子の変異型対立遺伝子を検出する方法である。本発明の変異型対立遺伝子は、Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎ置換を含むイミダゾリノン耐性ＡＨＡＳＬタンパクをコードする。この方法は、植物の特異的なＡＨＡＳＬ遺伝子に変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子が存在するかどうかを検出することに関する。本発明の一形態では、植物はＴ．  ａｅｓｔｉｖｕｍ又はＴ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍであり、ＡＨＡＳＬ遺伝子は、Ｔ．  ａｅｓｔ 奄魔浮高フＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａ、及びＴ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａから成る群から選択される。
【００７２】
本発明の第１の方法における重要な特徴は、配列番号３のヌクレオチド配列を有する変異型対立遺伝子特異的プライマーを、本発明のＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーと共に、ＰＣＲによって変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子の一部を選択的に増幅するために使用することができるものの、野生型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子の対応する領域の増幅はほとんど起こらないか又は全く起こらないという点を発見したことである。典型的には、唯一のヌクレオチド置換のみが異なる２種の対立遺伝子を区別するために開発されたＰＣＲ法用プライマーは、プライマーがその３´末端で同じ多型を反映するように設計されている。このプライマー設計は、適合しない３´末端残基を有するオリゴヌクレオチドは一定の条件ではＰＣＲにおけるプライマーとして機能しないという前提に基づいている（ＮｅｗｔｏｎらによるＮｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：２５０３−２５１６（１９８９）；ＷｕらによるＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：２７５７−２７６０（１９８９））。一方、変異型対立遺伝子特異的プライマーの３´末端のヌクレオチドは、ＳＮＰのサイトで変異型対立遺伝子と野生型対立遺伝子の両方と適合しない。ＳＮＰのサイトで変異型対立遺伝子と適合するが、野生型の小麦ＡＨＡＳＬ対立遺伝子とは適合しない３´末端ヌクレオチドを有するように設計されたプライマーは、意外にも、変異型対立遺伝子と野生型対立遺伝子の両方を増幅できることがわかっている。そのため、他のプライマーの設計が検討された。驚くべきことに、３´末端残基がＳＮＰのサイトで野生型対立遺伝子と変異型対立遺伝子の両方に適合しない配列番号３のヌクレオチド配列を有する変異型対立遺伝子特異的プライマーのようなプライマーは、変異型の小麦ＡＨＡＳＬ対立遺伝子を増幅することができたが、野生型の小麦ＡＨＡＳＬ対立遺伝子をほとんど又は全く増幅することができなかった。
【００７３】
本発明の変異型対立遺伝子特異的プライマーは、目的の少なくとも１種のＡＨＡＳＬ遺伝子の非コード鎖の、ＡＨＡＳＬタンパクにおけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換を与えるＧ→Ａ点変異の領域にアニーリングするように設計されている。特に、本発明の変異型対立遺伝子特異的プライマーは、５´末端と３´末端を有しかつＡＨＡＳＬ遺伝子のコード鎖に対応しているヌクレオチド配列を有し、この配列の３´末端のヌクレオチドはＧ→Ａ点変異のサイトに対応し、３´末端のヌクレオチドはシチジンである。従って、このようなプライマーは目的のＡＨＡＳＬ遺伝子のコード鎖の対応する領域とは異なる少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
【００７４】
小麦のＡＨＡＳＬ遺伝子を分析するために、本発明はそれぞれの小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子の変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子にアニーリングすることができる変異型対立遺伝子特異的プライマーを提供する。本発明の変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子を与えるＤＮＡのＳＮＰ近接領域は、Ｔ．  ａｅｓｔｉｖｕｍの３種のＡＨＡＳＬ遺伝子とＴ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍの２種のＡＨＡＳＬ遺伝子を通じてほとんど等しい。従って、本発明の変異型対立遺伝子特異的プライマーは、Ｔ．  ａｅｓｔｉｖｕｍの３種のＡＨＡＳＬ遺伝子とＴ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍの２種のＡＨＡＳＬ遺伝子のそれぞれの変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子にアニーリングすることができる。このような本発明の変異型対立遺伝子特異的プライマーは、５´末端と３´末端を有し、配列番号１２の３〜２３番目のヌクレオチドの補体にアニーリングすることができ、３´末端がシチジンであるヌクレオチド配列を含み、ＡＨＡＳＬ遺伝子における本発明のＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトの内側の領域にアニーリングすることができる。本発明の好ましい変異型対立遺伝子特異的プライマーは、配列番号３のヌクレオチド配列を有する。
【００７５】
第１のＰＣＲ増幅は３種のプライマー、すなわち、植物の特異的なＡＨＡＳＬ遺伝子を選択的に増幅するように設計された一対のプライマーと変異型対立遺伝子特異的プライマーとを含む。このプライマー対は、植物から得た唯一の特異的なＡＨＡＳＬ遺伝子のフラグメントの選択的なＰＣＲ増幅のために設計された、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーとを含む。
【００７６】
本発明の方法を使用すると、植物から得たゲノムＤＮＡの第１のＰＣＲ増幅から２種の生成物が得られる。これらの生成物は、例えば、ＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動及びこれに続くゲル中のＤＮＡの臭化エチジウム染色とＵＶ光を照射しての視認によって検出することができる。特異的なＡＨＡＳＬ遺伝子が少なくとも１個の変異型対立遺伝子を含む場合には、第１のＰＣＲ増幅は２種のＤＮＡフラグメントを生成し、長い方のフラグメントは、ＡＨＡＳＬ遺伝子におけるＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトに結合した領域の増幅から生成し、短い方のフラグメントは、ＡＨＡＳＬ遺伝子における変異型対立遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトに結合した領域の増幅から生成する。しかしながら、特異的なＡＨＡＳＬ遺伝子が少なくとも１個の変異型対立遺伝子を含まない場合には、第１のＰＣＲ増幅は長い方のフラグメントのみを生成する。
【００７７】
本発明の第２の方法は、ＡＨＡＳＬ遺伝子の分析方法である。本発明は、植物の特異的なＡＨＡＳＬ遺伝子に野生型対立遺伝子、変異型対立遺伝子、又はその両方が存在するか否かを決定することに関する。本発明の一形態では、植物はＴ．  ａｅｓｔｉｖｕｍ又はＴ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍであり、ＡＨＡＳＬ遺伝子は、Ｔ．  ａｅｓｔｉｖｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａ、及びＴ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａから成る群から選択される。
【００７８】
本発明の第２の方法では、上述の第１の方法の第１のＰＣＲ増幅に加えて野生型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子の一部の増幅を含む第２のＰＣＲ増幅が行われる。第２のＰＣＲは野生型対立遺伝子特異的プライマーを含む。本発明の第２の方法は、本発明の野生型対立遺伝子特異的プライマーの使用を含む。本発明の野生型対立遺伝子特異的プライマーは、本発明のＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーと共に、野生型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子の一部をＰＣＲによって選択的に増幅するために使用することができるが、変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子の対応する領域をほとんど又は全く増幅することができない。
【００７９】
本発明の野生型対立遺伝子特異的プライマーは、目的の少なくとも１個のＡＨＡＳＬ遺伝子のコード鎖におけるＡＨＡＳＬタンパクにＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換を与えるＧ→Ａ点変異領域にアニーリングするように設計されている。野生型対立遺伝子特異的プライマーは、５´末端と３´末端を有しかつＡＨＡＳＬ遺伝子のコード鎖に対応しているヌクレオチド配列を有し、この配列の３´末端のヌクレオチドはＧ→Ａ点変異のサイトに対応し、３´末端のヌクレオチドはグアノシンである。
【００８０】
小麦のＡＨＡＳＬ遺伝子を分析するために、本発明はそれぞれの小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子の野生型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子にアニーリングすることができる野生型対立遺伝子特異的プライマーを提供する。本発明の変異型対立遺伝子特異的プライマーと同様に、本発明の野生型対立遺伝子特異的プライマーは個々の小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子を区別するように設計されておらず、従って、Ｔ．  ａｅｓｔｉｖｕｍの３種のＡＨＡＳＬ遺伝子とＴ．  Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．  ｄｕｒｕｍの２種のＡＨＡＳＬ遺伝子のそれぞれの野生型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子にアニーリングすることができる。このような本発明の野生型対立遺伝子特異的プライマーは、５´末端と３´末端を有し、配列番号１０の４〜２３番目のヌクレオチドの補体にアニーリングすることができ、３´末端がグアノシンであるヌクレオチド配列を有し、ＡＨＡＳＬ遺伝子における本発明のＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトの内側の領域にアニーリングすることができる。本発明の好ましい野生型対立遺伝子特異的プライマーは、配列番号４のヌクレオチド配列を有する。
【００８１】
典型的には、本発明の第２の方法において、第２のＰＣＲ増幅において使用されるゲノムＤＮＡは、第１のＰＣＲ増幅において使用されたゲノムＤＮＡと同じ植物から得られる。好ましくは、第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅とはそれぞれ、同一の分離ゲノムＤＮＡサンプルの一部の使用を含み、このようなゲノムＤＮＡサンプルを本明細書に示す予備増幅に付し、ＡＨＡＳＬ遺伝子配列又はそのフラグメント用のゲノムＤＮＡを増量することができる。しかしながら、第２の方法は、第１の植物と第２の植物とが遺伝的に同一であることがわかっているならば、第１のＰＣＲ増幅のための第１の植物から分離したゲノムＤＮＡの使用と、第２のＰＣＲ増幅のための第２の小麦植物から分離したゲノムＤＮＡの使用とを含むこともできる。
【００８２】
第２のＰＣＲ増幅は３種のプライマー、すなわち、植物の特異的なＡＨＡＳＬ遺伝子を選択的に増幅するように設計された一対のプライマーと野生型対立遺伝子特異的プライマーとを含む。このプライマー対は、植物から得た唯一の特異的なＡＨＡＳＬ遺伝子のフラグメントの選択的なＰＣＲ増幅のために設計された、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーとを含む。この特異的なＡＨＡＳＬ遺伝子は、第１のＰＣＲ増幅におけるＡＨＡＳＬ遺伝子と同一である。好ましくは、第２のＰＣＲ増幅のためのＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーは、第１のＰＣＲ増幅において使用されたものと同一である。しかしながら、本発明の方法は、第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅の両方に同一のＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーを使用することには依存しない。
【００８３】
植物から得たゲノムＤＮＡの第２のＰＣＲ増幅から２種の生成物が得られる。第２のＰＣＲ増幅の生成物は、第１のＰＣＲ増幅の生成物の検出のために上述した方法又は他の公知のＰＣＲ生成物を検出する方法により検出することができる。特異的なＡＨＡＳＬ遺伝子が少なくとも１個の野生型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子を含む場合には、第２のＰＣＲ増幅は２種のＤＮＡフラグメントを生成し、長い方のフラグメントは、ＡＨＡＳＬ遺伝子におけるＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトに結合した領域の増幅から生成し、短い方のフラグメントは、ＡＨＡＳＬ遺伝子における野生型対立遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトに結合した領域の増幅から生成する。しかしながら、特異的なＡＨＡＳＬ遺伝子が少なくとも１個の野生型対立遺伝子を含まない場合には、第２のＰＣＲ増幅は長い方のフラグメントのみを生成する。
【００８４】
第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅の両方において、長い方のフラグメントは短い方のフラグメントが生成したか否かに関わらず生成する。従って、長い方のフラグメントは第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅が成功したことを示す内部標準となる。第１のＰＣＲ増幅及び／又は第２のＰＣＲ増幅が長い方のフラグメントを生成しない場合には、ＰＣＲが成功しなかったということであり、ＰＣＲを繰り返さなければならない。
【００８５】
本発明の方法では、第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅を同時に同じ熱循環器で行うことに依存しない。しかしながら、典型的には、ある植物のゲノムＤＮＡの第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅は、同時に同じ熱循環器で行われる。また、ある植物の２個。３個、又はそれ以上のＡＨＡＳＬの分析を行いたい場合には、それぞれのＡＨＡＳＬ遺伝子の第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅を同時に同じ熱循環器で行うことができる。その上、２種以上の植物の１個以上のＡＨＡＳＬ遺伝子の分析を行いたい場合には、それぞれの小麦植物の第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅を、熱循環器の容量に依存して、同時に同じ熱循環器で行うことができる。複数の小麦植物を高い処理量で分析するのに適した本発明の一形態では、標準的な３８４ウェルＰＣＲプレートを収容した熱循環器で第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅が行われる。このような熱循環器とＰＣＲプレートを使用すると、６４種までの小麦植物における３種のＡＨＡＳＬ遺伝子のそれぞれの第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅を同時に行うことができる。
【００８６】
本発明の第３の方法は、第２の方法に加えてさらに予備増幅段階を含む。予備増幅段階は、第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅の前に行われる第３のＰＣＲ増幅を含む。予備増幅により、それぞれのＡＨＡＳＬ遺伝子の少なくともフラグメントを増幅し、ＡＨＡＳＬ遺伝子又はそのフラグメント用のゲノムＤＮＡを増量することができる。例えば、小麦の場合には、３種のＡＨＡＳＬ遺伝子（デュラム小麦の場合には２種）のそれぞれの少なくともフラグメントを増幅し、３種のＡＨＡＳＬ遺伝子又はそのフラグメント用のゲノムＤＮＡを増量することができる。ＡＨＡＳＬ遺伝子又はそのフラグメント用のゲノムＤＮＡを増量することにより、第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅によって生成する生成物の質と量を改善することができる。本発明の方法は特別なメカニズムに依存しないが、予備増幅段階により第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅が改良されるのは、予備増幅ゲノムＤＮＡにおいてＡＨＡＳＬ鋳型の量が増加した結果であると思われる。
【００８７】
予備増幅段階は、ＰＣＲ増幅のためのＡＨＡＳＬフォワードプライマーとＡＨＡＳＬリバースプライマーの使用を含む。ゲノムに２種以上のＡＨＡＳＬ遺伝子を有する植物の場合には、ＡＨＡＳＬフォワードプライマーとＡＨＡＳＬリバースプライマーは、その植物の２種以上のＡＨＡＳＬ遺伝子を区別しない包括的なＡＨＡＳＬプライマーである。プライマー対がＰＣＲにおいて植物の全てのＡＨＡＳＬ遺伝子の同じ領域からフラグメントを増幅することができ、このフラグメントが上述のＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトを含むのであれば、いずれのＡＨＡＳＬフォワードプライマーとＡＨＡＳＬリバースプライマーの対も本発明において使用することができる。
【００８８】
所望により、予備増幅段階の生成物を公知のいずれかの方法によりエクソヌクレアーゼで分解し、単一鎖ＤＮＡを減少させ又は除去することができ、特に予備増幅後に残っているＡＨＡＳＬフォワードプライマー及び／又はＡＨＡＳＬリバースプライマーは役割を終了する。第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅の前に予備増幅したゲノムＤＮＡをエクソヌクレアーゼで分解すると、第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅がさらに改善される。例えば、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｔ（ＲＮａｓｅ  Ｔ）、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｏｒｙｚａｅ）から得たＳ１ヌクレアーゼ、緑豆ヌクレアーゼ、又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉを、予備増幅生成物から単一鎖ＤＮＡを除去するために使用することができる。代わりに、予備増幅段階の生成物を精製して、ＡＨＡＳＬフォワードプライマー及びＡＨＡＳＬリバースプライマーを除去することができる。この精製のために、限定的ではないが、Ｗｉｚａｒｄ  ＭａｇｎｅＳｉｌ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国ウィスコンシン州マディソン）のような市販のＰＣＲ精製法を含むいずれかの方法を使用することができる。
【００８９】
一形態では、本発明の方法は、個々の小麦植物の１種、２種又は３種のＡＨＡＳＬ遺伝子、すなわちＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ、及びＡＨＡＳＬ１Ａの接合生を決定するために使用することができる。特に、本発明の第２の方法及び第３の方法は、ＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ、及びＡＨＡＳＬ１Ａの１種以上のＡＨＡＳＬ遺伝子の接合性を決定するために使用することができる。この決定は、第２の方法及び第３の方法を１回、２回、又は３回繰り返し、毎回第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅のために異なるＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーの対を使用し、このときそれぞれのプライマー対を３種の小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子のうちの１種のＡＨＡＳＬ遺伝子のフラグメントを選択的に増幅するように設計することにより行われる。
【００９０】
本発明の好ましい形態では、単一の小麦植物のＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ、及びＡＨＡＳＬ１Ａの接合性が決定される。ある小麦植物から得たゲノムＤＮＡを配列番号１のヌクレオチド配列を有するＡＨＡＳＬフォワードプライマーと、配列番号２のヌクレオチド配列を有するＡＨＡＳＬリバースプライマーとを使用して予備増幅する。予備増幅したゲノムＤＮＡをＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉで分解する。次いで、３回の第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅の組み合わせを行う。１回目のＰＣＲ増幅の組み合わせでは、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーをＡＨＡＳＬ１Ｄを選択的に増幅するように、そしてそれぞれ配列番号５と７のヌクレオチド配列を有するように設計する。２回目のＰＣＲ増幅の組み合わせでは、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーをＡＨＡＳＬ１Ｂを選択的に増幅するように、そしてそれぞれ配列番号６と８のヌクレオチド配列を有するように設計する。３回目のＰＣＲ増幅の組み合わせでは、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーをＡＨＡＳＬ１Ａを選択的に増幅するように、そしてそれぞれ配列番号５と９のヌクレオチド配列を有するように設計する。それぞれの組み合わせにおいて、変異型対立遺伝子特異的プライマーは配列番号３のものであり、野生型対立遺伝子特異的プライマーは配列番号４のものである。次いで、６回のＰＣＲ増幅の生成物をアガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色により検出する。
【００９１】
本発明はまた、本明細書に示す本発明の方法を実施するためのキットを提供する。このキットは、少なくとも１種のＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマー、少なくとも１種のＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマー、変異型対立遺伝子特異的プライマー、小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子の第１のフラグメントのＰＣＲ増幅と小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子の第２のフラグメントのＰＣＲ増幅を触媒することができる少なくとも１種のポリメラーゼを含む。この第１のフラグメントは、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマーのアニーリングサイトとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトの間のフラグメントであり、第２のフラグメントは、変異型対立遺伝子特異的プライマーのアニーリングサイトとＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーのアニーリングサイトの間のフラグメントである。本発明のキットは、さらに、野生型対立遺伝子特異的プライマー、ＡＨＡＳＬフォワードプライマー、ＡＨＡＳＬリバースプライマー、他のポリメラーゼ酵素、濃緩衝液、ＭｇＣｌ2溶液、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、及びＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉからなる群から選択された少なくとも１種の追加成分を含むことができる。
【００９２】
本発明の方法は、ＤＮＡを増幅するためのＰＣＲの使用を含む。オリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲ反応において目的の生命体から抽出したゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するために使用することができるように設計することができる。ＰＣＲプライマーを設計する方法は当業者に公知であり、ＳａｍｂｒｏｏｋらによるＭｏｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）(１９８９)に記載されており、この文献は参考として本明細書に組み入れられる。また、Ｉｎｎｉｓらの編集によるＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９０））、Ｉｎｎｉｓ及びＧｅｌｆａｎｄの編集によるＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９５））、Ｉｎｎｉｓ及びＧｅｌｆａｎｄの編集によるＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９９））、Ｄｉｅｔｍａｌｅｒらの編集による“Ｒａｐｉｄ  Ｃｙｃｌｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｓｐｒｉｎｇｌｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（２００２））、Ｔｈｅｏｐｈｉｌｕｓ及びＲａｐｈｌｅｙの編集によるＰＣＲ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（２００２））を参照することができ、これらの文献も参考として本明細書に組み入れられる。本発明において使用することができる他の公知のＰＣＲ法には、限定的ではないが、対プライマー、ネステッドプライマー、単不対特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、混合ＲＮＡ／ＤＮＡプライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマー等を使用する方法が含まれる。
【００９３】
本発明はＰＣＲプライマーのヌクレオチドの数には依存しないが、鋳型のＤＮＡの相補ターゲットにアニーリングするＰＣＲプライマーの部分は、一般には約１０〜５０個の連続的なヌクレオチド、好ましくは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上の連続的なヌクレオチドである。しかしながら、本発明のＰＣＲプライマーはさらに、５´末端に、１個以上の制限酵素の認識サイトを含むＤＮＡ配列のようなターゲットにアニーリングしない追加のヌクレオチドを含むことができる。
【００９４】
本発明の方法は、ＤＮＡのＰＣＲ増幅のためのＤＮＡポリメラーゼの使用を含む。ＰＣＲにより目的のＤＮＡを増幅することができる公知のＤＮＡポリメラーゼであれば、いずれのＤＮＡポリメラーゼも本発明で使用することができる。本発明の方法はＤＮＡのＰＣＲ増幅のためのＤＮＡポリメラーゼの種類に依存せず、１種以上の植物のＡＨＡＳＬ遺伝子又はそのフラグメントを増幅することができるポリメラーゼでありさえすれば良い。好ましくは、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、限定的ではないが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＴｇｏＤＮＡポリメラーゼとも言われるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｏｕｓから得た熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｌｅｒ，ＦらによるＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，５５７７（１９９２））のようなＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｌｉｔｏｒａｉｌｓから得た熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｘｕ，ＭらによるＣｅｌｌ  ７５，１３７１−１３７７（１９９３））のようなＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−Ｄから得た熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、これらの修飾物及びこれらの混合物を含む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。
【００９５】
本発明の一形態では、上述の本発明の第１の方法及び第２の方法のＰＣＲ増幅がホットスタートＰＣＲを含む。このようなホットスタートＰＣＲには公知の方法が含まれ、ホットスタートＰＣＲは一般に非特異的な増幅生成物を減少させるために使用される。典型的には、ホットスタートＰＣＲ法は、鋳型のＤＮＡ、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ以外の他の反応成分を組み合わせる段階、次いでＤＮＡポリメラーゼを導入する前に鋳型へのプライマーの非特異的な結合が起こる閾値温度より高い温度に所定時間反応混合物を保持する段階、次いで反応混合物を上述の閾値温度より高い温度に維持しつつこの反応混合物にＤＮＡポリメラーゼを添加する段階を含む。
【００９６】
本発明の方法はホットスタートＰＣＲを行うこと又は特別な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することには依存しないが、本発明の第１の方法及び第２の方法のＰＣＲ増幅のために好ましいＤＮＡポリメラーゼは、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ社製、米国カリフォルニア州バレンシア）である。ＨｏｔＳｔａｒ  ＤＮＡポリメラーゼは、周囲温度でＤＮＡポリメラーゼ活性を有していない不活性状態で製造業者から供給されるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの変性形である。周囲温度で不活性であるため、非特異的にアニーリングしたプライマー及びＰＣＲ反応混合物の準備段階及び反応管を加熱して初期変性温度に到達させる間に低温で形成されるプライマーの二量体からの伸長が防止される。ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、現在の熱循環器プログラムに組み入れることができる９５℃１５分の温置で活性化させられる。従って、反応混合物を閾値温度を越える温度に加熱する間に、ＨｏｔＳｔａｒ  ＤＮＡポリメラーゼをホットスタートＰＣＲのために反応混合物の他の成分から物理的に分離しておく必要はない。
【００９７】
本発明の別の実施形態では、本明細書において予備増幅とも表わされる本発明の第３の方法におけるＰＣＲ増幅は、３´→５´エクソヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１種のプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを含む。このようなプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼには、限定的ではないが、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、上述のＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。本発明の好ましい形態では、予備増幅はＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、米国インディアナ州インディアナポリス）を含む。このＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと、非相補的ヌクレオチドが偶然に誤って組み込まれることにより発生する変異を最小化するプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼのＴｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼとを含む。このようなＰＣＲが誘発する変異は、本明細書に示した本発明の第１の方法及び第２の方法のＰＣＲ増幅を妨害しうる。そのため、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ増幅により得られるような高忠実度の増幅が、予備増幅のためには好ましい。
【００９８】
本発明の方法は、ＰＣＲによる目的のＤＮＡ配列の増幅を含む。本発明の一実施形態では、目的のＤＮＡ配列は、少なくとも１種の植物又はその一部、器官、組織又は細胞から分離したゲノムＤＮＡを含むサンプルから直接増幅される。当業者は、ゲノムＤＮＡの濃度が、限定的ではないが、ＰＣＲ条件（例えば、アニーリング温度、変性温度、サイクル数、プライマー濃度、ｄＮＴＰ濃度等）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの配列、目的のＤＮＡの配列を含む多くの因子に依存することを理解しているだろう。典型的には、本明細書に示す本発明の一形態では、ゲノムＤＮＡの濃度は少なくとも約５ｎｇ／μＬから約１００ｎｇ／μＬの範囲である。ＰＣＲ増幅に加えて、本発明の方法は、分子生物学における様々な技法、例えば、ＤＮＡ分離、特別なゲノムＤＮＡの分離、制限酵素及びヌクレアーゼによるＤＮＡの分解、ＤＮＡ連結、ＤＮＡ配列解析、アガロースゲル電気泳動、臭化エチジウム染色によるＤＮＡの検出など、を含むことができる。このような技法は当業者に公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｒｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ  Ｎｏｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８９）に記載されている。
【００９９】
本発明の方法は、植物から分離されたゲノムＤＮＡの使用を含む。本発明の方法は、ゲノムＤＮＡの分離方法に依存しない。植物から上述のＰＣＲ増幅のための鋳型ＤＮＡ源として使用しうるゲノムＤＮＡを分離し、精製できる方法であれば、いずれの方法でも本発明において使用することができる。例えば、ＳｔｅｉｎらによるＰｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，１２：３５４−３５６（２００１）、ＣｌａｒｋらによるＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ３−１５，（１９９７）、ＭｉｌｌｅｒらによるＮｕｃｌｅｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：１２１５（１９８８）を参照することができ、これらの全てが本発明において参考として組み入れられる。好ましくは、このような植物のゲノムＤＮＡを分離するための方法が、植物の比較的多量の組織サンプルからゲノムＤＮＡを分離するために適しており、当業者に選択されうる。本発明の一形態では、ゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｏｎ社製、米国カリフォルニア州バレンシア）を使用して、製造業者の取扱説明書に従って小麦植物から分離する。他の形態では、ゲノムＤＮＡは、ＭａｇｎｅＳｉｌ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して、製造業者の取扱説明書に従って小麦植物から分離する。
【０１００】
本発明の方法では、ゲノムＤＮＡは、植物全体又はその一部、器官、組織、又は細胞から分離することができる。例えば、ゲノムＤＮＡは、苗、葉、茎、根、花、種、胚、ひこばえ、子葉鞘、葯、柱頭、培養細胞などから分離することができる。その上、本発明は、どの発達段階の植物又はその一部、器官、組織、又は細胞からゲノムＤＮＡを分離したかに依存しない。本発明では、例えば苗又は成熟した植物、その一部、器官、組織、又は細胞から分離したゲノムＤＮＡを使用することができる。その上、本発明は、どのような特別な条件で成長した植物であるかに依存しない。植物は、例えば、農園、温室又は栽培箱、培地で成長させても良く、又は温室又は栽培箱で水耕栽培しても良い。典型的には、植物は、その植物の生育に適した光、温度、養分、及び湿度の条件で栽培される。
【０１０１】
本発明の方法は、ＰＣＲ増幅、特に第１のＰＣＲ増幅と第２のＰＣＲ増幅の生成物の検出を含む。典型的には、ＰＣＲ生成物は、まず生成物を基板で分子量を基礎として分離し、次いでその基板で分離したＰＣＲ生成物のそれぞれを検出することによって検出される。本発明の好ましい形態では、ＰＣＲ生成物は、ＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動、及び、そのゲルでのＤＮＡの臭化エチジウム染色、ＵＶ光の存在下での蛍光による視認によって検出される。しかしながら、ポリヌクレオチドを分離するのに適したどの検出方法でも、本発明のＰＣＲ生成物の検出のために使用することができ、限定的ではないが、ゲル電気泳動、高分解能液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動などを使用することができる。このような方法のための基板には、例えば、アガロース、ポリアクリルアミド、ジエチルアミノエチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セファロース、ポリオキシエチレンなどが含まれる。本発明のＰＣＲ増幅は、放射性物質、蛍光染料、発光識別、常磁性識別、又は核酸の検出のために適した他の識別等の方法で識別化された１種以上のプライマーの使用を含むことができる。ＰＣＲ増幅がこのようなラベリングされたプライマーを１種以上含む場合には、検出段階は、放射性、蛍光、発光、常磁性又は他の識別手段を、当業者に公知のこのような識別手段を検出する方法により検出する段階を含む。
【０１０２】
本明細書に示した本発明の方法は、目的の植物種のＡＨＡＳＬ遺伝子を分析するために使用することができる。目的の植物種の例としては、限定的ではないが、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、カンザキハナナ（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に菜種油の原料として有用なカンザキハナナ種、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、キビ類（例えば、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔ．Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．ｄｕｒｕｍ）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ，Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、カッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ  ｓｐｐ．）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、かんきつ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｓｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｓｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチヂク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、砂糖大根（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｓｐ．）、オートムギ、オオムギ、野菜、装飾花、及び針葉樹が含まれる。好ましくは、本発明における植物は、作物用植物（例えば、小麦、トウモロコシ、コメ、オオムギ、オートムギ、砂糖大根、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、大豆、綿、ベニバナ、ピーナツ、モロコシ、キビ、タバコなど）、より好ましくは、穀類（例えば、小麦、トウモロコシ、コメ、オオムギ、モロコシ、ライムギ、ライ小麦など）、特に好ましくは小麦である。
【実施例】
【０１０３】
以下、実施例を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
【０１０４】
例１：小麦のＡＨＡＳＬ遺伝子
３種のＡＨＡＳＬ配列変異体を小麦ｃＤＮＡの配列解析により同定した。これらの変異体に対応する遺伝子をそれぞれのゲノムと染色体腕（６Ｌ）上に位置付けし、これらが存在するゲノムを基礎として命名した（例えば、ゲノムＡ上のＡＨＡＳＬ＝ＡＨＡＳＬ１Ａ）。Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍの複数の変異体ＡＨＡＳＬ１Ａ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ、及びＡＨＡＳＬ１Ｄ転写物に対するヌクレオチド配列が得られた。これらの配列は、成熟ポリペプチドに対する完全なコード配列を含んでいる。この点については、本出願と同時に出願された発明の名称が“イミダゾリノン耐性植物を発現させる成熟ＡＨＡＳＬタンパクをコードするポリヌクレオチド”であるＵＳ出願を参照することができ、このＵＳ出願の全体が本明細書に参考として組み入れられる。
【０１０５】
イミダゾリノン（ＩＭＩ）耐性変異体を野生型原体と比較したところ、最も多く認められる変異は、Ｇ→Ａ転置であり、この転置はモデルタクソンのシロイヌナズナのＳ６５３に対応する位置におけるセリン（Ｓ）からアスパラギン（Ｎ）への置換を発現させる（ＳａｔｈａｓｉｖａｎらによるＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９７：１０４４−１０５０（１９９１）、ＨａｔｔｏｒｉらによるＭｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２３２：１６７−１７３（１９９２））。Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎといわれる半優勢の変異は、他のＩＭＩ耐性作物においても発見されている。例えば、米国特許第５７３１１８０号明細書及び２００３年１０月２８日に出願されたＵＳ出願番号１０／６９５０８９号を参照することができる。
【０１０６】
例２：小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子及びこの遺伝子のそれぞれの対立遺伝子を迅速に区別する方法
小麦におけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異の迅速な同定を容易に行うために、３種のＡＨＡＳＬ遺伝子のそれぞれの変異に関する対立遺伝子特異的ＰＣＲ分析法を開発した。分析法の開発のために使用されたＩＭＩ耐性変異体を表１に示す。
【０１０７】
【表１】
2007529233.tif 000003
【０１０８】
変異型小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子と野生型小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子のヌクレオチド配列から、高処理量でＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異を含むパン小麦系統とデュラム小麦系統の遺伝子型を解析するために、６個の対立遺伝子特異的ＰＣＲ分析法のセットを含む方法を開発した。この分析法は一対のプライマーを使用する対立遺伝子特異的ＰＣＲ法として設計され、一対のプライマーのうちの一方は対立遺伝子（変異型又は野生型）に特異的であり、他方のプライマーは遺伝子（ＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ、ＡＨＡＳＬ１Ａ）に特異的である。２番目の遺伝子特異的プライマーを対立遺伝子特異的プライマーの上流に添加すると、各反応がＤＮＡ品質／量のための内部標準を含むようになるため、精度が向上した。それぞれの反応は２種の生成物を形成することができた。診断用バンドは対立遺伝子特異的プライマーと遺伝子特異的プライマーの対の生成物であり、より大きな分子量の対照用バンドは遺伝子特異的プライマーどうしの生成物である。診断用バンドが存在せず対照用バンドが存在するということは、反応が成功しており、サンプルに問題の対立遺伝子が存在しないことを表わしている。最終的に、予備ＤＮＡ増幅段階を、対立遺伝子特異的ＰＣＲ段階における鋳型の質と量を向上させるために追加し、様々な質と量のＤＮＡサンプルからの均質な増幅を確保した。図２は、本実施の形態の概略的な説明図である。
【０１０９】
この方法の重要な点は、変異型対立遺伝子特異的プライマーＭＵ−Ｆ（配列番号３）の開発である。典型的には、ＰＣＲ法において唯一のヌクレオチド置換のみが異なる２種の対立遺伝子を区別するために開発されたプライマーは、このようなプライマーが３´末端で同じ多型を反映するように設計されている。このプライマーの設計は、適合していない３´末端残基を有するオリゴヌクレオチドは一定の条件でのＰＣＲにおいてプライマーとして機能しないという前提に基づいている（ＮｅｗｔｏｎらによるＮｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２５０３−２５１６（１９８９）、ＷｕらによるＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：２７５７−２７６０（１９８９））。一方、ＭＵ−Ｆの３´末端のヌクレオチドはＳＮＰのサイトで変異型対立遺伝子と野生型対立遺伝子の両方に適合しない。ＳＮＰのサイトで野生型対立遺伝子には適合しないが変異型対立遺伝子には適合する３´末端ヌクレオチドを有するように設計されたプライマーは、意外にも、野生型対立遺伝子を増幅することができることがわかっている。そのため、他のプライマーの設計が試された。予想外にも、ＭＵ−ＦのようなＳＮＰのサイトで野生型対立遺伝子と変異型対立遺伝子の両方に適合しない３´末端残基を有するプライマーにより、本発明の方法において、変異型対立遺伝子を増幅することができるが野生型対立遺伝子を増幅することができないことがわかった。
【０１１０】
ＭＵ−ＦプライマーはＭＵ−Ｆに正確に相補的なＤＮＡ配列にアニーリングすることができるが、このようなＤＮＡ配列を含む小麦ＡＨＡＳＬの変異型対立遺伝子は極めて少ないと思われ、自然には検出されていなかった。このような変異型対立遺伝子は、Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎ変異を与えるＳＮＰのサイトと同じヌクレオチドにシチジンを有する。一般に、Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎ変異を有する小麦植物は、エタンメチルスルホナート（ＥＭＳ）による変異誘発によって生ずる。ＥＭＳは主としてＧ・Ｃ→Ａ・Ｔの転置を発生させる。Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎ変異は、このようなＧ・Ｃ→Ａ・Ｔの転置から生ずる。図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ参照。
【０１１１】
図２は、ＡＨＡＬＬ１Ｂの接合性を決定し、Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎを検出するために２回のＰＣＲ反応を使用する本発明の一実施形態を概略的に説明する図である。用途に応じた数（１〜６）の反応を使用することができる。例えば、ＡＨＡＳＬ１Ａ及びＡＨＡＳＬ１ＢのみにおけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異の存在のみが調査対象であり、変異がホモ接合体か否かは調査対象でない場合には、２回の反応のみが必要である。
【０１１２】
このゲルを基礎としたＰＣＲ試験では、共通のプライマー（ＣＭ−Ｆ、ＣＭ−Ｒ）の単一の反応からなる第１ラウンドの工程と、単一又は複数の個々の反応、すなわち、変異型（ＩＭＩ耐性）対立遺伝子に対しては３種（ＡＨＡＳＬ１Ａ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ、ＡＨＡＳＬ１Ｄ）まで、野生型（敏感性）対立遺伝子に対しては１種の反応からなる第２ラウンドの工程とを有するネステッドＰＣＲから成る。これらの第２ラウンドの反応のそれぞれは、３種のプライマー、すなわち、遺伝子特異的ネステッドフォワードプライマーと遺伝子特異的ネステッドリバースプライマー（例えば、１Ｂ−Ｆ、１Ｂ−Ｒ）、及び、耐性／敏感性遺伝子座の増幅のためにそれぞれプライマーの３´末端に変異型／野生型塩基を有する対立遺伝子特異的プライマー（すなわち、ＷＴ−Ｆ又はＭＵ−Ｆ）を含む。長い方のＰＣＲ生成物（遺伝子特異的フォワードプライマーと遺伝子特異的リバースプライマーの間の増幅から生じる生成物）は、全ての試験で生成すると考えられ、従って、このＰＣＲ生成物は、ＰＣＲ反応のための陽性対照（対照用バンド）として機能する。短い方のＰＣＲ生成物（対立遺伝子特異的プライマーと遺伝子特異的リバースプライマーの間の増幅から生じる生成物）は、対立遺伝子に特異的なＰＣＲ生成物（診断用バンド）である。それぞれのＰＣＲ反応において、短い方のＰＣＲ生成物は目的の特別なＡＨＡＳＬ遺伝子がＰＣＲ反応混合物中に含まれていたＡＨＡＳＬ対立遺伝子特異的プライマー（すなわち、ＷＴ−Ｆ又はＭＵ−Ｆ）に対応する少なくとも１個のＡＨＡＳＬ遺伝子を含む場合にのみ生成すると考えられる。反応生成物は、３．５％アガロース−１０００ゲル上で分離される。アガロース−１０００は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国カリフォルニア州カールスバッド）から市販されている架橋型のアガロースである。
【０１１３】
例３：４つの小麦遺伝子型のＡＨＡＳＬ遺伝子の分析
小麦ゲノムＤＮＡを含むサンプルを、植物組織、特に小麦からゲノムＤＮＡを精製する公知の方法によって得た。しかしながら、２種以上の小麦植物を比較する場合には、同量の各植物の組織をゲノムＤＮＡの精製のために使用し、各植物から得たサンプルが同程度の濃度のゲノムＤＮＡを含むようにすべきである。
【０１１４】
典型的には、サンプルのＤＮＡ濃度は、１μＬ当たり約１００ｎｇである。ＤＮＡ濃度がこの範囲より濃い場合には、サンプルを１μＬ当たり約５０ｎｇになるように希釈するのが望ましい。本発明の方法では特別なＤＮＡ濃度である必要はないが、サンプルのＤＮＡ濃度は、１μＬ当たり約５〜約１００ｎｇであるのが好ましい。
【０１１５】
第１ラウンドのＰＣＲ増幅は、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、米国インディアナ州インディアナポリス）を使用して行った。表２に記載した成分を含む第１ラウンドのＰＣＲ反応を準備した。Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍは、このシステムが、Ｔａｑポリメラーゼに加えて、非相補性ヌクレオチドが不慮に組み込まれるために生ずる変異を最小化するプルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（ＴｇｏＤＮＡポリメラーゼ）を含むからである。このようなＰＣＲが誘発する変異は、以下の第２ラウンドのＰＣＲ増幅に影響を与えうる。従って、高忠実度の増幅が、第１ラウンドのＰＣＲにおいては望ましい。従って、プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲシステム、例えばＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、が第１ラウンドの増幅のために使用された。
【０１１６】
【表２】
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【０１１７】
第１ラウンドのＰＣＲ増幅（上述したように「予備増幅」とも言われる）は、ＴＧｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社、ドイツゲッティンゲン）を使用して行った。以下に示す熱循環条件を連続的に使用した。（１）９４℃で３分、（２）９４℃で３０秒、５６℃で１分、７２℃で４５秒のサイクルを２５サイクル、（３）７２℃で７分。
【０１１８】
第１ラウンドのＰＣＲ増幅を終了した後、ＰＣＲ生成溶液の一部を、以下のようなＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国ニュージーランド州ピスカタウェイ）を用いた分解に付した。ＰＣＲ生成溶液のうちの２μＬに、０．０５μＬのＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（１０ユニット／μＬ）と４．９５μＬの水とを添加した。得られた混合物を３７℃で１時間温置し、次いで７２℃で１５分間温置した。２回目の温置に続いて、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉの反応混合物を連続的に希釈した。まず、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉの反応混合物に水１００μＬを添加して混合した。次いで、希釈したＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ反応液の１０μＬを取り、さらに水を１９０μＬ添加して希釈した。得られた希釈溶液の１μＬをそれぞれの第２ラウンドのＰＣＲのためのＤＮＡ含有サンプルとして使用した。
【０１１９】
第２ラウンドのＰＣＲ増幅は、目的に応じて、３種のＡＨＡＳＬ遺伝子、すなわち、ＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａのそれぞれの変異型対立遺伝子及び野生型対立遺伝子の存在を検出するために使用することができる。代わりに、単一のＡＨＡＳＬ遺伝子又は２種のＡＨＡＳＬ遺伝子の野生型対立遺伝子又は変異型対立遺伝子のいずれかの存在を検出することができる。目的に応じて、第２ラウンドのＰＣＲ増幅は、表３の６個のプライマーの組み合わせを使用した１、２、３、４、５又は６回の分離した増幅を含むことができる。
【０１２０】
【表３】
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【０１２１】
第２ラウンドのＰＣＲ増幅は、ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ社、米国カリフォルニア州バレンシア）を使用して行った。表４の成分を含む第２ラウンドのＰＣＲ反応を、それぞれの３種のプライマーの群のために準備した。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼは、第２ラウンドのＰＣＲにおいて目的の配列のみを増幅することができるように選択された。
【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
第２ラウンドのＰＣＲ増幅は、ＴＧｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社、ドイツゲッティンゲン）を使用して行った。以下に示す熱循環条件を連続的に使用した。（１）９５℃で１５分、（２）アニーリング温度を１℃ずつ低下させて連続的に行った８サイクル、１サイクル目は９４℃で１分、６８℃（アニーリング温度）で１分、７２℃で１分、２〜８サイクル目のアニーリング温度はそれぞれ６７℃、６６℃、６５℃、６４℃、６３℃、６２℃、６１℃で１分、（３）９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分のサイクルを２６サイクル（４）最終伸長７２℃で１０分。
【０１２４】
第２ラウンドのＰＣＲ増幅に続いて、第２ラウンドのＰＣＲ生成物を当業者に公知の方法で直立型装置内でアガロースゲル電気泳動に付した。電気泳動に続いて、ゲルを臭化エチジウムで染色処理し、ＰＣＲ生成物をＵＶ光の存在下で蛍光により検出した。
【０１２５】
図５は、４種の小麦の遺伝子型“野生種”、ＣＶ９８０４、Ｇ−２０８及びＫ−４２に関する、本発明の方法を使用して得られた結果の例を示している。それぞれの遺伝子型のために、６回の第２ラウンドのＰＣＲ増幅を行い、３種のＡＨＡＳＬ対立遺伝子のそれぞれの接合性を決定することができた。例えば、各パネルにおける最も左側のバンド対は、ＡＨＡＳＬ１Ｄの野生型対立遺伝子に対する分析であり、各パネルにおける最も右側のバンド対は、ＡＨＡＳＬ１Ａの変異型対立遺伝子に対する分析である。各列において、対照用バンドが上方のバンド（ＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ａに対して約７５０ｂｐ、ＡＨＡＳＬ１Ｂに対して約５８０ｐ）であり、診断用バンドが下方のバンド（ＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ａに対して約２７０ｂｐ、ＡＨＡＳＬ１Ｂに対して約１５０ｐ）である。得られた対照用バンドは、フォワードプライマー１とリバースプライマーの間の増幅により得られた（表３参照）。診断用バンドは、フォワードプライマー２（ＷＴ−Ｆ又はＭＵ−Ｆ）とリバースプライマーとの間の増幅により得られた。図５から、ＣＶ９８０４はＡＨＡＳＬ１Ｄの変異型対立遺伝子のホモ接合体であり、Ｇ−２０８はＡＨＡＳＬ１Ｂの変異型対立遺伝子のホモ接合体であり、Ｋ−４２はＡＨＡＳＬ１Ａの変異型対立遺伝子のホモ接合体であることがわかる。これらの結果は、標準的な遺伝子解析（データは示していない）から決定された遺伝子型に一致している。
【０１２６】
上述の方法を使用して、小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子における変異型対立遺伝子のホモ接合体であることが知られている小麦植物、野生型対立遺伝子のホモ接合体又はヘテロ接合体であることが知られている小麦植物について試験した。これらの試験の結果（データは示していない）から、本明細書に示す方法が小麦植物のゲノムの迅速な分析のために使用することができることが確認された。従って、本発明の方法は、ある小麦植物がその植物のＡＨＡＳＬ遺伝子のそれぞれの変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子のホモ接合体であるのか、又は野生型対立遺伝子のホモ接合体であるのかヘテロ接合体であるのかを迅速に決定するために使用することができる。従って、本発明は、植物の生産業者によるゲノム内に１、２、３、４、５、又は６個の変異型ＡＨＡＳＬ対立遺伝子を有するイミダゾリノン耐性小麦植物の生産において使用することができる方法を提供する。
【０１２７】
本明細書において示した全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する技術分野の技術水準を示している。同様に、全ての刊行物及び特許出願は、本明細書に参考として組み入れられることが明示されていれば、それぞれ本明細書に参考として組み入れられる。
【０１２８】
以上、理解の容易のために例と図面を使用して本発明を詳細に説明したが、発明の趣旨を逸脱しない範囲での変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】野生型及び変異型ＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ、ＡＨＡＳＬ１Ａのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態の概略的な説明図である。
【図３】ＡＨＡＳＬフォワードプライマーとＡＨＡＳＬリバースプライマー（影付き）を有する３種の小麦ＡＨＡＳＬのｃＤＮＡ配列における部分的な配列を示す図である。
【図４】野生型対立遺伝子特異的プライマー、変異型対立遺伝子特異的プライマー、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的フォワードプライマー、ＡＨＡＳＬ遺伝子特異的リバースプライマーを有する３種の小麦ＡＨＡＳＬのｃＤＮＡ配列における部分的な配列を示す図である。
【図５】単色ＵＶ光を照射した臭化エチジウムで処理したアガロースゲルのネガ画像である。
【図６】小麦ＡＨＡＳＬ遺伝子コード配列の対比較から得られたヌクレオチド配列の同一性(パーセント)を示す表である。
【図１】
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【図２】
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【図３．１】
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【図３．２】
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【図３．３】
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【図４．１】
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【図４．２】
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【図４．３】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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