(57)【要約】  血清及び卵胞液又は卵胞液の成分の存在下に細胞を培養することにより体細胞の老化及び死を防止する方法を提供する。in vitroで限定された寿命を有する体細胞は幹細胞の性質を獲得し、そして卵胞液又はその成分の連続した存在下にのみ連続的に継体されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清を含有し、そして更に卵胞液又はその成分を含有する培養培地又はその同等物中で体細胞を培養することを含む体細胞の老化及び死を防止する方法。
【請求項２】
血清を含有し、そして更に卵胞液又はその成分を含有する培養培地又はその同等物中で細胞を培養することを含む、細胞の成功した増殖及び細胞の分化能の維持をもたらす方式で細胞を脱分化させる方法。
【請求項３】
細胞を血清含有培地中で培養する工程、
培養培地に卵胞液又はその成分を導入する工程、そして
繰り返し継体培養において細胞の無限の増殖を可能とする工程、
を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
卵胞液を部分的に精製する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
卵胞液を活性炭ろ過する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
卵胞液が、ろ過されていない卵胞液と活性炭ろ過された卵胞液との約１：１混合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
卵胞液の成分が、＞３０kDaの分子サイズ画分である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
卵胞液の成分が、＞５０kDa及び＜3kDaの組み合わせた分子サイズ画分である、請求項１又は２に記載の方法  
【請求項９】
卵胞液の成分が、ヒトα−２−マクログロブリン前駆体のアミノ酸配列及び他の種の相同体に相当するペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
卵胞液が、ブタ、ウシ、ヒツジ及びウマ卵胞液の群より選ばれる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
卵胞液がブタ卵胞液である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が、顆粒膜細胞、皮膚繊維芽細胞、ニューロン、角化細胞又は肝細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、顆粒膜細胞、皮膚繊維芽細胞、ニューロン又は肝細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
卵胞液を精製し、そして増殖促進活性及びマトリックス特性を有する高分子質量の画分を単離することを含む、組織工学で使用するための卵胞液を提供する方法。
【請求項１５】
卵胞液を精製し、そして細胞生存活性を有する低分子質量の画分を単離することを含む、組織工学で使用するための卵胞液を提供する方法。
【請求項１６】
卵胞液がブタ卵胞液である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
体細胞の老化及び死を防止するため並びに、体細胞の成功した増殖及び体細胞の分化能の維持をもたらす方式で体細胞を脱分化させるための卵胞液又はその成分の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
組織工学は、組織機能を回復、維持又は改良するための生物学的代替物の開発である。特に、組織工学は、新しい生きている組織を実験室で創生して、疾患に罹った組織又は傷つけられた組織を置き換える方法である。
【０００２】
発明の背景
組織を再生するための１つのストラテジーは、特定の細胞を組織から単離し、単離された細胞をin vitroで増大させ（expand）、増大させた細胞を疾患に罹った組織又は傷つけられた組織に移植し、それにより移植した細胞はin vivoで増殖し、結局組織欠陥を置き換えるか又は修復する。この技術は、多様な細胞型及び組織欠陥に適用される。単離された細胞は、特定の組織からの分化した細胞又は未分化前駆細胞（幹細胞）であることができる。両方の場合に、細胞増大（cell expansion）のための適切な培養条件の確立は、構造的及び機能的組織同等物を再生するべき細胞の潜在力を維持又は改良するために極めて重要である。
【０００３】
組織再生技術の開発のための特に焦点となる分野は、軟骨性組織（cartilaginous tissue）における欠陥の矯正である。他の組織と違って、軟骨は、外傷、疾患後に又は老齢の結果としてそれ自体を再生する能力が殆どない。これは、正常な関節軟骨の無血管の性質による。表面軟骨板（superficial chondral plate）への損傷は一般に治癒しないけれども、軟骨下の骨（subchondral bone）は血管が分布しており、それ故、この位置に対する損傷は、限られた程度に治癒する。損傷された関節軟骨の代わりに増殖する新規な軟骨は、繊維軟骨と呼ばれる。繊維軟骨は、元の硝子軟骨の耐久性及びより望ましい機械的性質に欠けている。故に関節損傷を受けたヒトは、その後関節炎変性（arthritic degeneration）にかかりやすい。
【０００４】
軟骨シェイビング（chondral shaving）、軟骨下の穿孔（subchondral drilling）及び組織自己移植片／同種移植片を含むいくつかの異なるアプローチが軟骨組織を修復するために採用された。関節軟骨修復のための他の実験的アプローチは、軟骨生検（cartilage biopsy）から軟骨細胞を採取しそして軟骨細胞を三次元移植マトリックス材料上に播種し、次いで損傷された区域に移植片を移植することからなる。この技術は、一旦再生が完了すると高品質軟骨を生じるが、患者から採取されるべき大量の出発材料を必要とし、そのため患者の外傷を増大させる。
【０００５】
他のアプローチでは、軟骨細胞を生検から単離し、十分な数の細胞が得られるまで単層培養において増大させ、そして損傷した組織の区域に移植する。これらの場合にも、移植は、細胞をゲルに埋め込むか又は生物分解性ポリマー骨格と会合させることを先ず必要とする。これらのマトリックスの三次元的性質は、移植片に構造的統合性を付与しそして軟骨細胞の軟骨組織への成長のための硬質支持体を与える。このシステムは出発物質としてより少ない細胞を必要とするという利点を有するけれども、この方法により得られた軟骨は、もし細胞が骨格的に成熟した供与者（成人）から採取されるか又は得られるならば、しばしば劣った性質を有する。
【０００６】
組織工学における他の主要な問題は、生きている細胞を培養において保って成長及び増殖させるのに適切な技術である。細胞老化は、正常な二倍体哺乳動物細胞が培養において無限に成長する（増殖する）のを阻止するプロセスである。
【０００７】
今日、大多数の変形性疾患（degenerative diseases）は、入手可能な患者に適合性の細胞又は組織、例えば、該組織が損傷した組織に置き換わることができるか又は与えられた疾患により誘発された外傷を修復することができる上記した方法の１つにより発生させた細胞又は組織の欠如により、薬剤又は対症治療により処置される。
【０００８】
包含される他の最近の細胞をベースとする治療的アプローチは、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞に由来する同種細胞又はブタに由来する異種細胞である。パーキンソン病のためのこれらのアプローチの例は、分化したヒトニューロン（Geron）及びブタ胎児神経細胞（Diacrin/GenVec）である。これらのストラテジーは科学的有望性を保持するが、大きな制限を受ける。第一に、ヒトＥＳ細胞は、実質的な倫理的問題を提起する。何故ならば、ＥＳ細胞を発生させるためにヒト胚を破壊しなければならないからである。第二に、ブタ細胞の使用は、ブタ生まれの病原体のヒトへの伝達を包含する潜在的に未知の問題に悩まされる。第三に、これらのストラテジーの両方共、免疫抑制の使用を必要とする。
【０００９】
現在、患者自身の体細胞から多能的幹様細胞（multi-potential stem-like cells）を誘導するのに有効な方法に対する要求がある。
【００１０】
ますます、動物、特に家畜種は、体細胞から除核した卵母細胞への核の核移動によりクローニングされる。この方法は、低い効率に悩まされる。
【００１１】
本発明の要約
本発明の目的は、１つのタイプの高度に特殊化された体細胞、例えば顆粒膜細胞（granulosa cells）の核機能を、新規な多能性中間体を経由して、他のタイプの核機能に変える技術である。本発明は、機能の変化を達成するために胚又は胎児組織を利用せずそして個々の患者のために彼ら自身の細胞を使用してデザインされうる。
【００１２】
驚くべきことに、卵胞液（follicular fluid）又は卵胞液の成分を含有する血清の存在下の体細胞の培養は、細胞の老化を防止することが見出された。更に、該成分又は該卵胞液の存在下にin vitroで培養される限定された寿命を有する体細胞は、幹細胞のいくらかの性質を獲得しそして卵胞液又は卵胞液からの成分の連続した存在下においてのみ、連続的に継体されうる。
【００１３】
本発明は、血清を含有し、そして更に卵胞液又はその成分を含有する培養培地又はその同等物中で体細胞を培養することを含む体細胞の老化及び死を防止する方法に関する。本発明は、血清を含有し、そして更に卵胞液又はその成分を含有する培養培地又はその同等物中で細胞を培養することを含む、細胞の成功した増殖及び細胞の分化能（differentiation potential）の維持をもたらす方式で細胞を脱分化させる方法に関する。
【００１４】
特に、本発明は、
細胞を血清含有培地中で培養し、
培養培地に卵胞液又はその成分を導入し、そして
繰り返し継体培養において細胞の無限の増殖を可能とする、
工程を含む該方法に関する。
【００１５】
血清含有培養培地は当該技術分野で広く使用されている。典型的には、血清は、ウシ胎仔血清である。体細胞のタイプに依存して、血清を含まないが十分に同等である培養培地を使用し、それにより完全には理解されていないウシ胎仔血清の副作用を回避することも可能である。このような同等な血清不含有培養培地も当該技術分野で周知であり、そして適切な濃度の無機塩の中に、通常成長ホルモン、例えば、ウシ成長ホルモン、又は他の成長支持生化学的因子及びホルモンを含有する。
【００１６】
卵胞液は、卵巣から得られ、そして大量に容易に入手可能である。考慮される特定の卵胞液は、ブタ、ウシ、ヒツジ及びウマ卵胞液である。ブタ卵胞液が好ましい。
【００１７】
卵胞液は、標準精製方法、例えば、遠心及び不活性フィルターでのろ過を使用して精製するか又は部分的に精製することができる。更なる精製は、低分子成分及び不純物を保持することが知られている活性炭（charcoal）でのろ過により達成することができる。成分は、分子質量及び／又は極性に従う分別により得ることができる。
【００１８】
活性炭ろ過された卵胞液は、正常なヒト二倍体繊維芽細胞の寿命を延長するのに好ましく使用されるが、これに対して未処理卵胞液は、好ましくは、顆粒膜細胞系（granulosa cell lines）を確立及び維持するのに使用される。活性炭ろ過された卵胞液は、好ましくは約１対１の割合で未処理卵胞液と混合することができ、そして混合物は初代顆粒膜細胞系の確立及び初代顆粒膜細胞系の増殖で示されたとおり、未処理卵胞液よりも活性が優れている。未ろ過卵胞液と活性炭ろ過された卵胞液の約１対１混合物は本発明の方法において特に有効であり、それゆえ好ましい。
【００１９】
本発明の方法における卵胞液の成分として更なる好ましいものは、＞３０kDaの分子サイズ画分並びに＞５０kDa及び＜３kDaの組み合わせた分子サイズ画分である。好ましい高い分子サイズ画分は、ヒトα−２−マクログロブリン前駆体のアミノ酸配列及び他の種の相同体に対応するペプチドを含有し、そしてこれらは本発明の方法において好ましい。タンパク質のこのファミリーのメンバーは、ジスルフィド連結された鎖の２つの対からなるホモ四量体の形態にある。増殖促進活性及びマトリックス特性を有する卵胞液の高い分子質量成分は好ましい。同様に細胞生存活性を有する卵胞液の低分子質量成分は好ましい。
【００２０】
老化及び死から救出されることができそして細胞の成功した増殖及び細胞の分化能の維持をもたらす方式で脱分化されることができる哺乳動物体細胞は、例えば、顆粒膜細胞（granulosa cells）、皮膚繊維芽細胞、ニューロン、角化細胞又は肝細胞、特に、顆粒膜細胞、皮膚繊維芽細胞及びニューロンである。しかしながら、本発明は、これらの特定の体細胞に限定されなくて、いかなるタイプの体細胞にも適用可能である。本発明に従えば、前駆体型（又は幹細胞様）細胞を発生させ、次いでこれを使用して新しい組織を発生させることができる。単離することができそして増大させることができるいかなる細胞型も、新しい組織を発生させるのに使用可能である。非限定的例は、内皮細胞、筋肉細胞、軟骨細胞及びメラノサイトも含む。
【００２１】
体細胞の老化は、このような細胞が凍結され、貯蔵されそして後に培養のために使用されるとき、特に問題である。培養効率は、凍結及び貯蔵すると多くのタイプの体細胞において劇的に減少する。本発明の方法の有効性はこのような解凍した細胞に関して容易に証明することができる。
【００２２】
本発明は、更に、体細胞の老化及び死を防止するため並びに 体細胞の成功した増殖及び体細胞の分化能の維持をもたらす方式で体細胞を脱分化させるための卵胞液又はその成分の使用に関する。
【００２３】
該使用に基づいて、本発明は、成熟した体細胞の無限の増殖能を維持する新規な方法も提供する。これらの細胞は、「治療クローニング」による変形性疾患の処置のための医学的用途を有する分化性細胞の供給源として使用することができる。
【００２４】
本発明は、多能性に向けて再プログラムされる無制限の量の細胞を提供することにより核移行の効率を増加させることもできる。
【００２５】
体細胞の不死化は、テロメラーゼ酵素のための発現ベクターによる培養された細胞のトランスフェクションにより通常得られる。本発明は、無限の増殖のための適切な環境を細胞に与えることにより該トランスフェクション法を回避する。本発明の方法は可逆性であり、これは、本発明の方法で得られる無限の増殖能力を有する細胞が腫瘍細胞ではないことを意味する。
【００２６】
本発明は、個体のすべての体細胞がいかなるタイプの細胞にもなるのに必要な遺伝子情報を含有し、そして促す環境（coducive environment）に置かれると、最終的に分化した細胞の運命は、多能性へと再指向されうるという事実を利用する。この事実は、非ヒト哺乳動物における体細胞核移行実験の成功により説明された。正常な発達が進行するにつれて、細胞の遺伝子発現プロフィルは制限され、そしてゲノムの領域は、正常な条件下で細胞が若返ることができないように安定に不活性化される。本発明は、核機能の変化を誘発し、その結果として細胞のアイデンティティーを変化させる方法を提供する。体細胞、例えば顆粒膜細胞は、卵胞液又はその成分で処理されるとき無限に増大されうるが、卵胞液が除去されると、たとえ血清含有培養培地の存在下においてさえそれらは死ぬであろう。
【００２７】
本発明を実施する際に、いかなる種の胚又は胎児もこれまで創生又は使用されておらずそしてヒト及び非ヒトミトコンドリア又はゲノムＤＮＡの混合はこれまで起こっていない。本発明のすべての方法は、in vitroで行なうことができる。若返り／再プログラミング卵胞液は、地方の食肉処理場から大量に容易に入手可能である。
【００２８】
体細胞核移行の成功により示されたとおり、成熟した分化した体細胞のメモリーを消去しそしてそれをその長く忘れられていた胚のメモリーで置き換えることができる能力は、細胞内及び細胞外環境を操作することができる能力によってのみ限定される。成熟した細胞に卵胞液又はその成分を与えることにより、本発明は、核メモリーを変えそして多能性幹細胞において普通に観察される核変化を誘発する。本発明の利益及び利点は下記のこと、即ち、
倫理的問題を排除する（ヒト胚又は胎児組織の必要はなく、胚が使用され、創生され又は破壊される必要はない）、
ミトコンドリア不適合性がない（徐核された卵母細胞への核移行はない）、
ということを含む。
【００２９】
本発明に従う方法は、成人組織から予め単離された細胞集団を提供し、該細胞を増大条件下に脱分化させる工程を含む。脱分化された後、細胞は種々の体細胞型に再分化するように誘導されうる。その目的で、本発明に従って発生させた細胞及び／又は組織は、細胞の再分化を誘導及び／又は加速及び／又は促進する少なくとも１種の因子の存在下に第２細胞培養培地において再分化させることができる。
【００３０】
細胞の分化を増大させるいかなる多様な因子も細胞再分化の方法において使用することができる。再分化に使用することができる因子の非限定的例は、デキサメタゾン及び成長因子のような、追加のホルモン／コルチコイドを伴なうか又は伴わない、アラキドン酸、プロスタグランジンＡ、プロスタグランジンＢ、プロスタグランジンＥ、プロスタグランジンＦ及びヒスタミンである。
【００３１】
当業者は、細胞増大及び脱分化の本発明の方法を適用することができる様々な細胞型を認識するであろう。組織工学技術は、無数の異なる細胞型を使用することにより欠陥を矯正するのに使用されてきた。組織工学は、硬質組織欠陥、例えば、疾患又は外傷から生じる軟骨又は骨の欠陥の矯正に適用することができる。組織工学は、軟質組織構造の矯正にも適用された。例として、最近の発明で使用された細胞は、代謝器官（肝臓又は膵臓）、表皮組織（例えば、火傷の被災者の組織）を再生するのに又は胸組織を再構成又は増強するのに使用することができる（例えば、乳癌に悩む婦人の胸、先天的欠陥又は外傷から生じる損傷を再構成するのに筋肉細胞を使用することができる。例えばUS PatentNo.5, 512, 600及びWO96/18424参照。これらの両方共参照により本明細書に組み込まれる）。更に、先天性欠陥、例えば、膀胱尿管逆流又は失禁は、尿の通過に対して必要な制御を与えるか又はその外に欠陥を矯正する筋肉区域を生じさせるのに有効な量の筋肉細胞を播種したゲル又は骨格マトリックスの移植により矯正することができる。（US Patent No.5, 667, 778、これは参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３２】
本発明に従って脱分化した細胞及び上記したとおりに再分化した細胞を、適当な生物分解性ポリマーマトリックスと共に移植して新しい組織を形成することができる。使用することができる種々の形態のマトリックスがある。非限定的例は、細胞をその中に懸濁させたアルギネート、約１００〜３００μmの間質性空間（interstitial spacing）を有する繊維マトリックス及び三次元発泡体の如き材料から形成されたポリマーゲルを含む。マトリックスは、天然に存在するポリマー（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン等）又は合成ポリマー（例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸等）又は両方に基づくことができる。ヒドロゲルポリマー溶液及びポリマーマトリックス及び他の移植の方法の詳細な説明については、US Patent5, 716, 404を参照されたい。代謝器官及び他の組織を再生させるのに生物分解性ポリマーを使用する他の方法については、Cima et al., Biotech.Bioeng., 38, 145-158, 1991;Langer et al., Biomaterials, 11, 738-745, 1990;Vacanti et al., J.Pediatr.Surg., 23, 3-9, 1988;and Vacarti et al., Arch.Surg., 123, 545-549, 1988.を参照されたい。
【００３３】
ある態様では、細胞マトリックス構造体は組織エキスパンダー装置（tissue expander devices）と組み合わせて移植することができる。細胞マトリックスが移植されるにつれて、又は細胞が増殖しそして新しい組織を形成するにつれて、エキスパンダーサイズは、それを除去することができそして所望の再構成又は増強が得られるまで、減少する。
【００３４】
本発明を今や下記の実施例により更に詳細に説明する。該実施例は本発明の範囲を限定することを意味しない。これらの実施例は図面を参照して説明される。
【００３５】
好ましい態様の説明
Ａ  卵胞液の調製
卵巣の収集
地方の食肉処理場において少なくとも４ヶ月齢の解体処理されたブタから卵巣を得る。卵巣を殺したばかりの動物から集めそして直ちにサーモボトル中の約３９℃の温度の無菌の０．９%ＮａＣｌ（重量／容積）中に入れる。それらは、回収から２時間以内に実験室に輸送する。到着時のコンテナーの温度は約３３℃である。
【００３６】
卵胞液の収集
卵巣を３９℃で予め加温した７０%エタノール中に１０〜２０秒間消毒し、次いで脂肪及び周囲の組織から切り離し、直ちに磁性攪拌機を有するサーモプレート上で３９℃で平衡化された無菌のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ：０．２g／l  ＫＣｌ、０．２g／l  ＫＨ２ＰＯ４、８g／l  ＮａＣｌ、１．１５g／l  Ｎａ２ＨＰＯ４）中に入れる。
【００３７】
卵胞液を、低真空下の吸引ポンプ及び１８ゲージの針を使用して５０mlの円錐形遠心管（Orange Scientific, Belgium）中の直径３〜８mmの末梢胞状卵胞（peripheral antral follicles）から吸引する。細胞集合体、卵丘細胞−卵母細胞−複合体（ＣＯＣ’ｓ）及び細胞残がいを遠心力を加えることなく３９℃で沈降させる。上澄液を集めそして更に進めるまで−２０℃に冷凍保存する。ペレットを細胞培養のための顆粒膜細胞の供給源として使用する。
【００３８】
細胞培養のための卵胞液の調製
−２０℃で保存された卵胞液を解凍しそして室温で２０分間１６００×gで遠心する。透明な上澄液を除去しそして０．２μm細孔サイズフィルター（Sartorius, Germany, Cat. No 16534）に通すことにより無菌ろ過する。無菌の卵胞液を４℃又は−２０℃で貯蔵する。
【００３９】
細胞培養のための活性炭ろ過した卵胞液の調製
活性炭１g（３０〜５０メッシュASTM, Merck Cat.No.1.09631）をPolyPrep（登録商標）カラム１０ml（BioRad, Cat. No.731-1550）に入れる。活性炭を０．２NＨＣｌ１０ml、無水エタノール１０ml、メタノール１０ml及び０．２NＮａＯＨ１０mlにより順次に洗浄する。各新しい溶液を適用する前に、活性炭を蒸留水で完全に洗浄する。
【００４０】
１６００×gで２０分間遠心により清澄化された卵胞液を重力により活性炭カラムを４回通過させる。最後のフロースルー（flow-through）を、上記したとおりに無菌ろ過しそして４℃又は−２０℃で貯蔵する。
【００４１】
Ｂ  ブタ顆粒膜細胞の培養
少なくとも１ヶ月齢の解体処理されたブタから卵巣胞状卵胞（ovarian antral follicules）（直径３〜８mm）を吸引することにより集められた顆粒膜細胞から初代細胞系を確立した。集めた細胞を遠心力をかけないで沈降させる。底部の細胞ペレットは、卵丘細胞−卵母細胞複合体を手で除去した後の顆粒膜細胞の供給源である。細胞集合体をＰＢＳ中で１回洗浄し、次いでそれらを顆粒膜細胞培地中に再懸濁させる。細胞懸濁液を直径１５cmの組織培養皿に分配する（Orange Scientific, Belgium）。培養物を５%ＣＯ２雰囲気中で３９℃でインキュベーションする。培養物が集蜜状態（confluency）に達すると、細胞を下記するとおり継体する。
【００４２】
顆粒膜細胞培地は、下記の成分：８９%（容積／容積）ＤＭＥＭ（ダルベッコの修正イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle'medium）、低グルコース、BioConcept 1-25F50-1）、１０%（容積／容積）ＦＣＳ（ウシ胎仔血清、BioConcept 1-01F00-1）、０．１mM  ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸、BioConcept 5-13K00）、２．５ng/ml  ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞成長因子、Sigma Product No. F0291, ｂＦＧＦを欠く顆粒膜細胞培地１ml中に再構成された２５μg、使用まで−２０℃で凍結された）及び６μg/mlゲンタマイシン（BioConcept 4-07F00-H）からなる。
【００４３】
継体培養 
培養皿を室温で無菌ＰＢＳで２回洗浄する。ＰＢＳ中の０．０５%重量／容積トリプシン（BioConcept, Switzerland）及び０．０２%重量／容積エチレンジニトリロ四酢酸四ナトリウム二水塩（Sigma E-611）を含む酵素溶液を使用して細胞を継体する。細胞を脱離させた後、ＦＣＳ（２%最終濃度）の添加により酵素活性を停止させる。細胞を１８０×gで室温で５分間遠心する。細胞ペレットを適切な容積の培養培地中に再懸濁させる。計数のためにアリコートを採取する。
【００４４】
細胞計数
細胞懸濁液のアリコートをＰＢＳ中の０．０５%トリパンブルー（Bio Concept, Switzerland ）中に希釈しそしてNeubauer血球計数器を使用して計数する。生きている細胞（トリパンブルー染料を排除する）を計数する。
【００４５】
細胞培養物からの顆粒膜細胞の凍結保存（cryopreservation）
培養中の顆粒膜細胞をトリプシン処理しそして７２%ＤＭＥＭ低グルコース（BioCobcept, Switzerland）、２０%ＦＣＳ及び８%ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Sigma）を含有する培地中に懸濁させる。細胞を極低温バイアル（１ml）中に０５〜３．０×１０６細胞／mlの濃度で分配する。それらを２５分間位置３に（−１８℃まで）、次いで１０分間位置１０に（−６０℃まで）調節された制御された速度のフリーザー（Nicool LM, 10, France）中で凍結する。次いで極低温バイアルを液体窒素タンク中に直ちに移しそして貯蔵する。
【００４６】
Ｃ  顆粒膜細胞の増殖老化及び卵胞液による救出
顆粒膜初代細胞系の確立
８００個の卵丘細胞−卵母細胞複合体（cumulus-oocyte complexes）を集めそして０．１%（重量／容積）ヒアルロニダーゼ（Sigma製品No.H-3884）を含有するタイロード液をベースとする溶液０．４ml中に懸濁させる。卵丘細胞−卵母細胞複合体を、室温で１分間上下に穏やかにピペッティングすること（１mlチップ）により破壊する。細胞を遠心（１８０×gで５分間）によりペレット化しそしてタイロッド液をベースとする溶液２ml中に再懸濁させる。卵母細胞を、顕微鏡下に懸濁液からピペットで機械的に除去する。残りの細胞懸濁液を顆粒膜細胞培地１０mlと共に混合し、直径１０cmのプレートに入れそして５%ＣＯ２インキュベーター中で３９℃でインキュベーションする。集密状態の単層（confluent monolayers）を継体し、細胞を各継体において計数しそして細胞の累積数を表１に記録する。
【００４７】
【表１】
2007503821.tif 000002
【００４８】
この代表的実験において、顆粒膜初代細胞系は、in vitroで４〜５継体の後増殖老化に入る有限の寿命を有する。
【００４９】
卵胞液は老化から救出する
０．０５５７×１０６個の顆粒膜細胞を継体５から採取し、直径１０cmの培養皿において卵胞液（５%容積／容積）を補充された顆粒膜細胞培地１０ml中で培養する。老化性顆粒膜細胞に対する卵胞液の救出効果（resquing effect）を表２に示す。
【００５０】
【表２】
2007503821.tif 000003
【００５１】
卵胞液は、増殖老化性細胞を救出し、該細胞はその後約１．５日の集団倍加時間（population doubling time）で増殖する。この顆粒膜細胞系はin vitroで５０継体後も依然として増殖している（１５０より大きい集団倍加（population doubling））。
【００５２】
救出効果の可逆性
１．０７×１０６個の顆粒膜細胞を継体７から採取し、そして、直径１０cmの培養皿において、卵胞液なしの顆粒膜細胞培地１０ml又は卵胞液を補充した（５%容積／容積）顆粒膜細胞培地１０ml中で培養する。卵胞液の効果の可逆性を表３に示す。
【００５３】
【表３】
2007503821.tif 000004
【００５４】
卵胞液の救出効果は可逆性である。何故ならば、卵胞液が除去されると細胞系は増殖を停止しそして細胞は死ぬからである。これは、顆粒膜細胞系が腫瘍細胞系の性質を獲得してもいなければウイルス感染等により不死化されてもいないことを意味する。
【００５５】
卵胞液を使用して確立されそして維持された顆粒膜細胞系の特徴付け
卵胞液を使用して顆粒膜細胞に由来する細胞系のいくつかの特徴は、迅速に分裂するけれども、細胞は顆粒膜細胞のいくらかの特徴を保持していることを示す。
形態：種々のサイズの微絨毛（microvilli）又はブレブ（blebs）に富んだ細胞が二次培養、早期継体（培養における１０継体未満）及び後期継体（培養における７０継体より多い）において観察される。この特徴は、顆粒膜細胞について記載されている（Motta P et al., 2003. Int. Rev. Cytology 223:178-288）。
【００５６】
ステロイド合成活性：顆粒膜細胞分化の進行は、プロゲステロンの産生を伴なう（Motta P et al., loc. cit）。顆粒膜細胞系によるプロゲステロンの産生は低い（表４）。細胞分化の早期段階で細胞は脱分化されそして停止されるようである。
【００５７】
【表４】
2007503821.tif 000005
【００５８】
アポトーシス細胞死：アポトーシス細胞死に特徴的な核凝縮細胞（picnotic cells）の急速な蓄積及びＤＮＡ断片化の自発的開始が、血清欠如（serum deprivation）後２４時間以内に、顆粒膜細胞系において起こる。血清除去は、顆粒膜細胞の初代培養において起こるアポトーシス細胞死の自発的開始を促進することが示された。（Hu C-L et al., 2001. Biol Reprod 64:518-526）。
【００５９】
接触阻止：in vivoと同様に、確立された細胞系からの顆粒膜細胞は、接触阻止なしにin vitroで分裂する。それらは交差パターン（criss-cross pattern）において細胞と多層を形成する。
【００６０】
Ｄ  凍結保存後の卵胞液による顆粒膜細胞系の救出
初代顆粒膜細胞系は有限回数継体させることができ、次いでそれらは不可逆的に停止した成長及び死の状態に入る。停止した成長は顆粒膜細胞系の凍結保存により促進される。下記の実験は、卵胞液は凍結保存及び解凍後の顆粒膜細胞を救出することを示す。
【００６１】
ブタ顆粒膜細胞の初代培養物を、直径１５cmの培養皿において増殖させて集密状態とする。細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ処理により脱離させ、計数しそして凍結保存のために培地１ml当り２．２×１０６個の細胞の濃度で懸濁させる（「Ｂ  ブタ顆粒膜細胞の培養」参照）。
【００６２】
次いで、顆粒膜細胞を解凍しそして０．６×１０６個の細胞の２つのアリコートを、顆粒膜細胞のための普通の培地（regular medium）１０mlを含有する直径１０cmの培養皿中に分配する。１つの皿は卵胞液１０%（容積／容積）を補充される。両方の皿をＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃でインキュベーションする。培養７日後に、細胞を計数しそして同じ培養条件を保ちながら、新しい更に継体培養する。細胞を培養８日の追加の期間後に計数する（表５）。
【００６３】
【表５】
2007503821.tif 000006
【００６４】
細胞培養培地への補充として加えた卵胞液は、解凍した顆粒膜細胞が正常に成長し、そして卵胞液を補充されなかった顆粒膜細胞培地で観察された停止した成長及び死を防止することを可能とする。
【００６５】
Ｅ  卵胞液は血清の代替物ではない
卵胞液４%を補充した顆粒膜細胞培地において１１継体維持された初代顆粒膜細胞系を２つの直径１５cmの培養皿中に継体培養する。各皿に顆粒膜培養培地３０ml中の５×１０６個の細胞を播種し、１つの皿には卵胞液４%（容積／容積）を補充する。ＣＯ２インキュベーター中３７℃で３日間のインキュベーションの後に、細胞をトリプシン処理しそして計数する。
【００６６】
培養培地に卵胞液を補充しない場合：０．２集団倍加／日に相当する総計７．４×１０６個の細胞。これらの細胞は「老化性」と呼ばれる。
培養培地に卵胞液４%（容積／容積）を補充した場合：０．５集団倍加／日に相当する総計１４．５×１０６個の細胞。これらの細胞は「救出された」と呼ばれる。
【００６７】
両タイプの細胞集団（「老化性」及び「救出された」）を、血清を含まない顆粒膜細胞培中に０．０４×１０６個／mlの細胞の濃度で懸濁させそして２４ウエルプレートのウエル（ウエル当り０．７５ml、ウエル当り３０’０００個の細胞）又は１２ウエルプレートのウエル（ウエル当り２ml、ウエル当り８０’０００個の細胞）に分配する。付着の９０分後に、血清を含まない培地を除去しそしてそれぞれ、表６に示されたとおりに構成された培地成分０．７５ml及び２mlで置き換える。
【００６８】
プレートをＣＯ２インキュベーター中で３７℃で７日間インキュベーションする。細胞を計数するためには１２ウエルプレートを使用し、結果を表に示す。クリスタルバイオレットで染色するためには２４ウエルプレートを使用し、そして「救出された」細胞についての結果を下表６に示す。
【００６９】
細胞培養物のクリスタルバイオレット染色
培地を吸引し、細胞層をＰＢＳで１回洗浄し、そしてクリスタルバイオレット０．５%（重量／容積）（エタノール３０%（容積／容積）及びグルタルアルデヒド０．５%（容積／容積中の）により約１０分間染色する。クリスタルバイオレット溶液をデカンテーションした後、プレートを水道水ですすぎ、次いで空気中で乾燥する。
【００７０】
【表６】
2007503821.tif 000007
【００７１】
ＦＣＳ、好ましくは１０%（容積／容積）は、初代顆粒膜細胞系の増殖停止及び死を阻止するのに必要であるが十分ではない。卵胞液は、初代顆粒膜細胞系の増殖停止及び死を阻止するのに必要であるが十分ではない。卵胞液（１種又は複数）は、初代顆粒膜細胞系の生存に必要なそしてＦＣＳ中には存在しない因子（１種又は複数）を含有する。
【００７２】
Ｆ  顆粒膜細胞の増殖及び維持に対する活性炭ろ過した卵胞液の効果
顆粒膜細胞系を、７継体の間卵胞液４%を補充された顆粒膜細胞培地中に維持する。０．４×１０６個の細胞を継体７から採取しそして、直径１０cmの培養皿において、卵胞液４%を補充された顆粒膜細胞培地１０ml若しくは活性炭ろ過された卵胞液４%を補充された顆粒膜細胞培地１０ml又は卵胞液を欠いた顆粒膜細胞培地１０ml中で培養する。各週に細胞を計数し、そして同じ培養条件を保ちながら、新しい皿に継体培養する。細胞の累積数を表７に示す。
【００７３】
【表７】
2007503821.tif 000008
【００７４】
活性炭ろ過した卵胞液は、長期間の時間顆粒膜細胞の増殖を支えることができない。
【００７５】
卵胞液及び活性炭ろ過した卵胞液を含有する混合物は、卵胞液単独よりも生物学的活性が優れている：凍結保存された細胞
ブタ顆粒膜細胞の初代培養からの細胞を凍結保存する。それらを使用して、卵胞液の効果を、１容積の卵胞液及び１容積の活性炭ろ過された卵胞液からなる混合物の効果と比較する。１．３×１０６個の解凍した細胞を、直径１０cmの培養皿において、卵胞液４%を補充された顆粒膜細胞培地１０ml若しくは上記した卵胞液１：１混合物４%を補充された顆粒膜細胞培養培地１０ml又は卵胞液なしの顆粒膜細胞培地１０ml中で培養する。各継体において細胞を計数し、そして同じ培養条件を保ちながら新しい皿に播種する。細胞の累積数を表８に示す。
【００７６】
【表８】
2007503821.tif 000009
【００７７】
大多数の凍結保存された顆粒膜細胞は、試験したすべての培養条件において、解凍後速やかに死ぬ。卵胞液と活性炭ろ過された卵胞液の１：１混合物は、卵胞液が欠けている場合に救出しなければ死ぬ顆粒膜細胞を培養において救出するという点で、卵胞液単独よりは優れている。老化からの救出はより早く起こる。
【００７８】
卵胞液と活性炭ろ過された卵胞液を含有する混合物は、卵胞液単独よりも生物学的活性において優れている：顆粒膜細胞系の増殖及び成長。
顆粒膜細胞系を、卵胞液４%を補充された顆粒膜細胞培地中に８継体の間維持する。
０．４×１０６個の細胞を継体８から採取し、そして直径１０cmの培養皿において、卵胞液４%を補充された顆粒膜細胞培地１０ml若しくは卵胞液と活性炭ろ過した卵胞液の１：１混合物４%を補充された顆粒膜細胞培地１０ml、又は卵胞液を欠いた顆粒膜細胞培地１０ml中で培養する。培養物が集密状態になると、細胞を計数し、そして同じ培養条件を保ちながら新しい皿に継体培養する。細胞の累積数を表９に示す。
【００７９】
【表９】
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【００８０】
結果は、顆粒膜細胞系が、卵胞液単独を含有する培地中よりも卵胞液と活性炭ろ過した卵胞液の１：１混合物を補充した培地中でより速く増殖することを示す。この実験では、各継体において細胞数の２５%の平均増加がある。
【００８１】
Ｇ  卵胞液は培養における初代ヒト繊維芽細胞の寿命を延長させる。
正常な体細胞は、有限の数の分裂の後、必ず、不可逆的に増殖が停止した状態及び機能が変化した状態に入る。このプロセスは複製老化と呼ばれる。繊維芽細胞は、年代学的時間によるよりもむしろ集団倍加（ＰＤｓ）数により決定される限定されたin vitro寿命を示す。外植の後、細胞は初期の期間の速い分裂を経、その後増殖活性が遅くなる（老化前状態）。次いで、細胞は、形態の変化、例えば、サイズの増加及び不規則な形状により特徴付けられる老化の状態に達し、そしてそれらは、多数か月間生きているが増殖はしない状態のままである（Cristofalo VJ and Pignolo RJ , 1993. Physiol. Reviews 73:617-638）。
【００８２】
卵胞液を補充された培養培地は、老化の開始を遅延させそして細胞が１５〜２０ＰＤｓ過剰に分裂することを保つことを可能とし、それは正常よりも５０%の増加を表す。
【００８３】
卵胞液の添加を伴なうか又は伴なわない正常なヒト皮膚繊維芽（ＮＨＤＦ）細胞の老化関連β−ガラクトシダーゼ染色
ｐＨ６で組織学的に検出可能なβ−ガラクトシダーゼは、培養における老化性ヒト繊維芽細胞を同定する生物マーカーである（Dimini et al., 1995.Proc. Nat Acad. Sci. 92-9363-9367）。包皮に由来する正常なヒト皮膚繊維芽細胞（NHDF, Cat. No. C-10351, PromoCell GmbH, Heiderberg, Germany）を、PromoCell Fibroblast増殖培地（Cat. No. C-23010）中で増殖させる。PromoCell Supplement Mix/Fibroblast増殖培地（cat. No. C-39315）を加えた後、完全培地中の成長因子の濃度は下記のとおりである：インシュリン５μg/ml、塩基性繊維芽細胞因子１ng/ml、アムホテリシンＢ５０ng/ml、ゲンタマイシン５０μg/ml。PromoCell Fibroblast増殖培地は、繊維芽細胞を培養するための無菌液体培養培地であり、そして血清を含まない。支持細胞層（feeder-layer）、マトリックス基材又は他の物質は必要ではない。培養及び新しい培養容器への継体培養を、製造者の指示に従って行なう。
【００８４】
PromoCell Fibroblast増殖培地を使用する５継体の後の１３’５００ＮＨＤＦ細胞を、２４ウエルプレートの１つのウエルにおいて培地０．７５ml中に播種する。卵胞液４%（容積／容積）を補充されたPromoCell Fibroblast増殖培地を使用する６継体後の１３’５００ＮＨＤＦ細胞を、２４ウエルプレートの他のウエルにおいて卵胞液を補充された培地０．７５ml中に播種する。３７℃でＣＯ２インキュベーターにおける３日のインキュベーションの後、細胞を固定しそして老化関連β−ガラクトシダーゼ活性について染色する。
【００８５】
細胞の老化関連β−ガラクトシダーゼ染色
培地を吸引しそして細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで室温でＰＢＳ中の０．５%グルタルアルデヒド（２５%溶液、Sigma）で処理する。５分後、細胞を、ＰＢＳ中の１mM  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．２で洗浄する。細胞を、１mg/mlＸ−ｇａｌ（４%しもとらストック溶液からの、Fermentas No.R04019）、０．１２mM  Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６３Ｈ２Ｏ、０．１２mM  Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、ＰＢＳｐＨ６．０（酢酸の添加によりｐＨ６．０に調節されたＰＢＳ）中の１mM  ＭｇＣｌ２を含有する溶液中で染色する。細胞を室温又は３７℃でインキュベーションし、Ｈ２Ｏで１回洗浄し、次いで４℃でＨ２Ｏ中に貯蔵する。
【００８６】
卵胞液の不存在下に維持されたすべての繊維芽細胞は老化前又は老化状態にある。卵胞液を補充した培地中に維持された繊維芽細胞の１０%未満は老化前又は老化状態にある。
【００８７】
正常なヒト皮膚繊維芽細胞の培養
包皮に由来する正常なヒト皮膚繊維芽細胞（NHDF, Cat.-No.:-C-10351, PromoCell GmbH, Heiderberg, Germany）をＮＨＤＦ培地（８９%（容積／容積）ＤＭＥＭ、１０%（容積／容積）ＦＣＳ、０．１mM  ＮＥＡＡ及び６μg/mlゲンタマイシン）中で培養する。培養皿を無菌のＰＢＳにより室温で２回洗浄する。ＰＢＳ中の０．０５%重量／容積トリプシン及び０．０２%重量／容積エチレンジニトリロ四酢酸四ナトリウム二水塩を含む酵素溶液を使用して細胞を継体する。細胞を脱離させた後、ＦＣＳ（２%最終濃度）の添加により酵素活性を停止させる。細胞を１８０×gで室温で５分間遠心する。細胞ペレットを適切な容積の培養培地中に再懸濁させる。アリコートを採取して計数する。
【００８８】
細胞を計数しそして顆粒膜細胞について記載のとおりに（ブタ顆粒膜細胞のＢ培養物）凍結保存する。
【００８９】
卵胞液はＮＨＤＦの寿命を延長する
各継体において培養により達成される集団倍加数を、式
集団倍加＝（ｌｏｇＮｔ−ｌｏｇＮｏ）／ｌｏｇ２．０
（式中、Ｎｔ＝時間ｔにおける採取において回収された細胞の数であり、そしてＮｏ＝最初に平板培養された細胞の数である）
から計算する。
【００９０】
１０%血清を含有する培地又は血清１０%及び卵胞液４%を含有する培地中で培養されたＮＨＤＦ細胞の集団倍加（ＰＤｓ）を比較した。結果を図４に示す。これらの細胞の増殖寿命は、それらの片方のそれと比較して約１５〜２０倍集団倍加延長される（通常を越えて集団倍加で５０%の増加）。１０%の代わりに培養培地中の５%血清濃度で、同様な結果が得られる。
【００９１】
卵胞液の効果の可逆性
４%卵胞液を含有するＮＨＤＦ培地中で連続的に増殖させた細胞０．４５×１０６個のＮＨＤＦ細胞を継体２１（３５集団倍加）で採取し、そして直径１０cmの培養皿において、卵胞液なしのＮＨＤＦ培地１０ml又は卵胞液（４%容積／容積）を補充したＮＨＤＦ培地１０ml又は活性炭ろ過された卵胞液（４%容積／容積）を補充した培養培地１０ml中で培養する。卵胞液の効果は表１０に示されたとおりに可逆性である。
【００９２】
【表１０】
2007503821.tif 000011
【００９３】
卵胞液の存在下に連続的に増殖させたＮＨＤＦからの卵胞液の取り出しは、細胞を老化性にする。活性炭ろ過された卵胞液は、ＮＨＤＦ細胞の老化を防止するという点で未処理卵胞液より優れている。
【００９４】
老化前ＮＨＤＦ細胞に対する卵胞液の若返り効果
卵胞液は、老化前状態に達する成熟した（aged）ＮＨＤＦ細胞培養に添加した後、それらの増殖能力を回復させることができる。
【００９５】
卵胞液の不存在下に２６ＰＤ’ｓにわたって継体されたＮＨＤＦ細胞を、補充物として卵胞液４%を含有するＮＨＤＦ培地中で更に継体する。同様に、卵胞液の不存在下の２８ＰＤ’ｓにわたって継体されたＮＨＤＦ細胞を、活性炭ろ過された卵胞液４%を含有する培地中で更に継体する。ＮＨＤＦ細胞を各継体で計数する。結果を図５に示す。
【００９６】
老化は卵胞液の添加により遅らされる。活性炭ろ過した卵胞液はこの効果を誘発するという点で未処理卵胞液よりも優れている。
【００９７】
Ｈ  卵胞液は初代培養における脳ニューロンを細胞死から保護する
胚ラット大脳皮質からの初代ニューロンの調製
胚（１８日）ラット大脳からの皮質を切り取りそして総計３０分間パパイン溶液で処理する。トリプシン阻害剤を加えた後、皮質ニューロンをピペットによる穏やかな粉砕により解離させる。次いで初代ニューロンを計数しそしてポリ−Ｄリシンでコーティングされた標準組織倍養プレートで平板培養する。
【００９８】
初代ニューロンの培養
初代ニューロンの２時間の平板培養の後、平板培養培地を卵胞液４%を伴なう又は伴なわない５%ＦＣＳ／ＤＭＥＭ（高グルコース４５００mg/ml）からなる増殖培地により置き換える。初代ニューロン培養をＣＯ２インキュベーター中で３７℃に２４〜４８時間維持しそして光学顕微鏡を使用して検査する。
【００９９】
卵胞液の不存在下に培養された初代ニューロン培養物は神経突起伸長（neurite extension）をほとんど又は全然伴なわずに広範な細胞死を受ける。卵胞液の存在下に維持された初代ニューロン培養物は、既に２４時間のインキュベーションの後に、広範な神経突起成長を伴なうニューロンの生存を示す。
【０１００】
卵胞液は、神経細胞死に対する保護作用を与え、in vitro条件において初代ニューロン細胞を変性から救出し、そして神経突起の成長を促進しそして神経ネットワークの広範な形成を可能とする。
【０１０１】
Ｉ  卵胞液成分は初代培養における肝細胞を細胞死から保護する
胚ラット肝臓からの肝細胞の調製
ラット胚（１８日）からの肝臓を切り離しそして肝細胞をピペットによる穏やかな粉砕により解離させる。初代肝細胞を標準組織培養プレートで平板培養する。増殖培地は、活性炭ろ過された卵胞液４%又は卵胞液と活性炭ろ過された卵胞液の１：１混合物４%を伴なうか若しくは伴なわない５%ＦＣＳ／ＤＭＥＭからなる。
【０１０２】
初代肝細胞の培養
初代肝細胞培養物をＣＯ２インキュベーター中で３７℃に維持しそして光学顕微鏡を使用して検査する。単層が集密状態になると、ＰＢＳ中の０．０５%重量／容積トリプシン（BioConcept, Switzerland）及び０．０２%重量／容積エチレンジニトリロ四酢酸四ナトリウム二水塩（Sigma E-611）を含む酵素溶液を使用して細胞を継体する。細胞を脱離させた後、ＦＣＳ（２%最終濃度）の添加により酵素活性を停止させる。細胞を１８０×gで室温で５分間遠心する。細胞ペレットを適切な容積の培養培地中に再懸濁させる。アリコートを採取して計数する。卵胞液成分の効果を表１１に示す。
【０１０３】
【表１１】
2007503821.tif 000012
【０１０４】
卵胞液成分の不存在下に培養された初代胚肝細胞培養物は、長期間の時間は生存しない。卵胞液と活性炭ろ過された卵胞液の１：１混合物は、肝細胞の細胞死に対する保護作用を与えそしてin vitro条件において初代肝細胞を変性から救出する。
【０１０５】
Ｊ卵胞液の分別
ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ（登録商標）遠心ろ過装置ＹＭ−３（CENTRIPREP R  Centrifugal Filter Devices YM-3）（公称分子量限界３’０００）、ＹＭ−１０（ＭＷ  １０’０００）、ＹＭ−３０（ＭＷ  ３０’０００）及びＹＭ−５０（５０’０００）（Millipore Corporation, 製品番号、それぞれ、４３２０、４３２１，４３２２及び４３２３）を、生物学的サンプルを精製、濃縮及び脱塩するための限外ろ過装置として使用する。ろ過プロセス自体は、穏やかであり、サンプル変性及び緩衝剤塩の濃縮の如き潜在的問題を回避する。清澄化した卵胞液３２mlをスイングバケットロータ（swinging-bucket rotor）  中で室温で１５００×gで遠心する。分子サイズ画分のＰＢＳによる濃縮及び透析を製造者の指示に従って行なう。ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ（登録商標）ＹＭ−５０装置で出発して、卵胞液を順次に分別しそして濃縮する。
【０１０６】
卵胞液からの画分の生物活性
２４ウエルプレートのウエル当り顆粒膜細胞培地０．７５ml中の０．０３×１０６個の老化性顆粒膜細胞（継体１１）を播種する。最初の４%容積／容積の卵胞液を回復するように計算された容積を、個々のウエルに加える。１つのウエルは補充を受けない（ネガティブコントロール）。１つのウエルは原液の卵胞液３０μlを受け取る（ポジティブコントロール）。
【０１０７】
３７℃でＣＯ２インキュベーター中でのインキュベーション８日後の顕微鏡検査の結果を表１２に示す。
【０１０８】
【表１２】
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【０１０９】
画分＜３kDa及び＞５０kDa間の相乗性及びコーティング後の画分＞５０kDaの活性の試験
２４ウエルプレートのウエル当り顆粒膜細胞培地０．７５ml中の０．０３×１０６個の老化性顆粒膜細胞（継体１５の期間中卵胞液を欠如させた、継体１６）を播種する。最初の４%容積／容積の各画分の卵胞液を回復するように計算された）容積を、個々のウエルに加える。１つのウエルは補充を受けない（ネガティブコントロール）。１つのウエルは原液の卵胞液３０μlを受け取る（ポジティブコントロール）。
【０１１０】
コーティングは下記の方法で行なう：ＰＢＳ中の濃縮された画分＞５０kDaの１%（容積／容積）溶液３５０μlをコーティングされるべき空のウエルに加え、３７℃で１時間インキュベーションする。水による速い洗浄の後、ウエルを乾燥する。
【０１１１】
３７℃でＣＯ２インキュベーター中でのインキュベーション８日後の顕微鏡検査の結果を表１３に与えそして図１に示す。
【０１１２】
【表１３】
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【０１１３】
Ｋ  卵胞液の高分子量因子の精製
サイズクロマトグラフィー
卵胞液からの画分＞５０kDa（タンパク質濃度約１００mg/ml）０．５mlを１２０滴／画分（６〜７mlに相当する）のＰＢＳ緩衝液を使用して長さ1ｍ及び直径２６mmのカラムにおいてSephadex(登録商標）G200 super fineを通すゲルろ過によりクロマトグラフィーにかける。
【０１１４】
図２は、集めた画分（水平軸）の２８０nmにおける光学濃度（鉛直軸）のグラフを示す。３つの主ピークを分離する。画分を下記のとおり生物学的活性及びタンパク質特性について試験する。
【０１１５】
バイオアッセイ
２４ウエルプレートのウエル当り顆粒膜培養培地７５０μl中の０．０２×１０６個の顆粒膜老化性細胞（継体３０）を播種する。平板培養の６時間後、培地３５０μlを除去しそして、試験されるべき画分１００μl並びに、２０%ＦＣＳ、０．２mM  ＮＥＡＡ及び１２μg/mlゲンタマイシンを含有するＤＭＥＭ１００μlからなる混合物２００μlにより置き換える。ポジティブコントロール：最初のウエルにおいて、培地３５０μlを除去しそして、ＰＢＳ１００μl、２０%ＦＣＳ、０．２mM  ＮＥＡＡ及び１２μg/mlゲンタマイシンを含有するＤＭＥＭ１００μl  並びに卵胞液３０μlからなる混合物２３０μlにより置き換える。ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で４日間のインキュベーションの後、プレートをクリスタルバイオレットで染色する。
【０１１６】
結果を図３に示す。この図において、上部左ウエルはポジテイブコントロールである。右の次のウエルは画分２２〜４４である。
【０１１７】
顆粒膜細胞を救出するための活性を画分２３、２４及び２５において検出する。活性はクロマトグラフィーにおける最も高いサイズのピークに対応する。
【０１１８】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によるタンパク質分析
プレキャストポリアクリルアミドゲル４〜１２%Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ、１．０mm×１２ウエル（Invitrogen Cat No.NP0322）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液（Invitrogen Cat No.NP0002）を使用して、ミニゲル（Invitrogen Cat Nos:EI0001、EI00020、EI0002）の電気泳動のためのXCell SureLock（登録商標）Mini-Cellで、製造者の指示書に従ってNuPAGE（登録商標）Novex Bis-TrisGelシステムを使用して、分析を行った。
【０１１９】
５μl  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプル緩衝液（4Ｘ）及び場合により２μlＮｕＰＡＧＥ（登録商標）還元剤（１０Ｘ）を、分析されるべき画分の１５μlサンプルに加え、それぞれ、全容積２０μl及び２２μlを得る。サンプルを７０℃で１０分間加熱する。電気泳動の後、ゲルをCoomassie Blue（Coomassie（登録商標）Brillant Blue R250, Fluka Cat.No.27816）０．１２５%（重量／容積）、メタノール５０%及び酢酸１０%の溶液で振とう機上で１５分間染色する。ゲルをメタノール５%及び酢酸７%中で脱染色する。
【０１２０】
画分２３〜２５の主要タンパク質成分は、変性、非還元条件下に＞＞２２０kDaの見かけのＭＷ並びに変性及び還元条件下に約１７０kDaの見かけのＭＷを有する。それは、ジスルフィド橋（１つ又は複数）により連結された２つの１６０kDaサブユニットの二量体からなるらしい。画分３０〜３２のタンパク質及び画分３８〜４１のタンパク質は、それぞれ、免疫グロブリン及びアルブミンに対応する。
【０１２１】
カチオン交換クロマトグラフィー
サイズクロマトグラフィーからの画分２３〜２５のプールをＣＥＮＴＲＥＰＲＥＰ（登録商標）上で濃縮しそしてＮａＮ３０．０２%を含有する２５mM酢酸塩緩衝液ｐＨ５．０に対して透析する。ＮａＮ３０．０２%を含有する２５mM酢酸塩ｐＨ５．０の出発緩衝液を使用して０．５mlの床容積上でのＣＭセルロースイオン交換体によりクロマトグラフィーを行う。集めた画分を表１４に示す。
【０１２２】
【表１４】
2007503821.tif 000015
【０１２３】
バイオアッセイ：サンプルはＮａＮ３（生きている細胞にとって毒性の）０．０２%を含有するので、活性はウエルへの成分のコーティングの後に試験する。ＣＭカラムからのサンプル１００μl（画分番号１、３及び５）をＰＢＳ１００μlと混合しそして全容積を２４ウエルプレートのウエルに移す。プレートを３７℃で２時間インキュベーションし、次いで４℃で一夜インキュベーションする。サンプルを除去する。ウエルを無菌水で洗浄しそして乾燥する。
【０１２４】
０．０２×１０６個の老化性顆粒膜細胞を顆粒膜細胞用の培地０．７５ml中に各ウエルに播種する。ポジティブコントロール：コーティングなし、培養培地への卵胞液３０μlの添加。ネガティブコントロール：コーティングなし、添加なし。ＣＯ２インキュベーター中での３７℃の４日間のインキュベーションの後、プレートをクリスタルバイオレットで染色する。
【０１２５】
タンパク質のバルク及び活性因子はカチオン交換クロマトグラフィーの「フロースルー」画分内にある。
【０１２６】
ペプチド質量フィンガープリンティングによるタンパク質同定
「フロースルー」画分のアリコートをポリアクリルアミド電気泳動により分離し、１つのサンプルは還元条件下に変性されそして１つのサンプルは非還元条件下に変性された。
【０１２７】
ゲルを、高純度水中、０．１５%（重量／容積）のCoomassie Blue G-250、酢酸０．５%（容積／容積）及びメタノール１０%中で振とう機上で室温で３分間染色する。次いでゲルをタンパク質バンドが見られるまで、高純度水中の酢酸０．５%（容積／容積）及びメタノール１０%（容積／容積）中で振とう機上で室温で脱染色する。
【０１２８】
非還元条件下に相対的ＭＷ＞２２０kDaを有するバンド及び還元条件下のバンド１６０kDaを切り取り、そして別々の０．５mlセーフロック管（safe-lock tubes）に移す。高純度水２００μlを加えそしてサンプルを質量分光法のために使用するまで−２０℃で凍結する。
【０１２９】
ヒトα−２−マクログロブリン前駆体のアミノ酸配列[Ａ２ＭＧ＿ヒト；Ｐ０１０２３；質量（平均）１６３２７８]及び他の種（モルモット及びマウス）の相同体に対応する８つのペプチドを検出する。ブタタンパク質は、SwissProt/Tremblデータベースにはない。サンプルは、α−２−マクログロブリン前駆体のファミリーに属する新規なブタタンパク質を含有する。
【０１３０】
検出されたペプチドは、
【表１５】
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である。
【０１３１】
このタンパク質のファミリーのメンバーは、ジスルフィド連結された鎖の２つの対からなるホモ四量体の形態にある。この性質は、ブタタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に合致する。
【０１３２】
核型分析（karyotyping）
有糸分裂スプレッド（mitotic spreads）の調製
Colcemid（登録商標）（Fluka Cat.No.27645、蒸留水中のストック溶液５μg/ml、−２０℃で貯蔵された）を増殖している細胞の６cmプレートに０．０５μg/mlの最終濃度となるように加える。細胞を３７℃で２．５時間インキュベーションする。細胞をトリプシン処理しそして０．５６%（蒸留／容積）ＫＣｌ溶液１０ml中に再懸濁させる。細胞を総計２０分間（以下の遠心時間を含めて）室温で放置する。細胞を穏やかな遠心（５００rpm、５分）によりペレット化する。できるだけ多くのＫＣｌ溶液を吸引する。Carnoyの固定剤（３：１容積／容積無水メタノール／氷酢酸）１mlを加える。室温で５分の後、細胞をペレット化しそして固定剤を変える。これを１回繰り返し、そして細胞をＣａｒｎｏｙの固定剤１ml中に懸濁させる。細胞懸濁液の小さな１滴を予め洗浄化したガラス顕微鏡スライド上にのせる。スライドをＰＢＳ中の３００nMＤＡＰＩ（４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール、Sigma-Aldrich）ストック溶液で３０分間染色し、次いでＰＢＳ中で洗浄する。蛍光顕微鏡を使用して写真を撮り、そして染色体を写真上で計数する。
【０１３３】
卵胞液中に長期の時間維持された細胞は、正常な相補体の染色体を有する。各調製物におけるいくつかの有糸分裂スプレッドを計数した結果を表１５に示す。
【０１３４】
【表１６】
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【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】卵胞液分子サイズ画分の存在下に３７℃でのＣＯ２インキュベーターにおける８日間のインキュベーションの後の顆粒膜細胞の顕微鏡検査の結果を示す（表１２、実施例Ｊ、卵胞液の分別）。数はウエルの番号を示す。  １：＞５０kDa、２：３０〜５０kDa、３：１０〜３０kDa、４：３〜１０kDa：５：＜３kDa、６：完全な卵胞液、７：卵胞液なし、８：＞５０及び＜３kDa、９：＞５０kDaでコーティングされたウエル、１０：＞５０及び＜３kDaでコーティングされたウエル。
【図２】Sephadex（登録商標）G200 super fineを通す卵胞液からの画分＞５０kDaのサイズクロマトグラフィーの集められた画分（水平軸）の番号に対する２８０nmにおける光学濃度（ＯＤ）（鉛直軸）のグラフを示す（実施例Ｋ、卵胞液の高分子量因子の精製）。
【図３】顆粒膜老化性細胞における図２のサイズクロマトグラフィー画分のバイオアッセイの結果を示す（実施例Ｋ、卵胞液の高分子量因子の精製）。ＣＯ＋：ポジティブコントロール。画分２３、２４及び２５のみが活性な物質を含有する。
【図４】ウシ胎仔血清１０%を含有する培地（Ａ）又はウシ胎仔血清１０%及び卵胞液４%含有する培地（Ｂ）で培養されたＮＨＤＦ細胞の培養日数（ｄ）の関数としての集団倍加数（number of population doublings）（ｎ）を示す。これらの細胞の増殖寿命は、卵胞液により約１５〜２０集団倍加延長される（実施例Ｇ、卵胞液は培養における初代ヒト繊維芽細胞の寿命を延長する）。
【図５】ウシ胎仔血清１０%を含有する培地（Ａ）、ウシ胎仔血清１０%及び卵胞液４%を含有する培地（Ｂ）並びにウシ胎仔血清１０%及び活性炭ろ過された卵胞液４%を含有する培地（Ｃ）中で培養されたＮＨＤＦ細胞の関数としての集団倍加数（ｎ）を比較する。活性炭ろ過した卵胞液は、老化を遅らせるという点で未処理卵胞液より優れている（実施例Ｇ、卵胞液は培養における初代ヒト繊維芽細胞の寿命を延長する）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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