【手続補正書】
【提出日】平成28年10月14日(2016.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数の内胚葉系統に分化することができる単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞であって、前記細胞が哺乳動物の胆樹組織から得られ、かつ前記細胞が、
（ｉ）少なくとも１つの幹細胞表面マーカー；
（ｉｉ）肝細胞系統を示す少なくとも１つのマーカー；
（ｉｉｉ）膵細胞系統を示す少なくとも１つのマーカー；および
（ｉｖ）内胚葉幹細胞／前駆細胞の少なくとも１つのマーカー；
に関して陽性である、細胞。
【請求項２】
前記幹細胞表面マーカーが、ＥｐＣＡＭ、Ｎ−ＣＡＭ、ＣＸＣＲ４およびＣＤ１３３からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項３】
前記多能性幹細胞／前駆細胞が多能性幹細胞である、請求項１に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項４】
前記内胚葉系統が、肝臓系統、胆管系統、膵臓系統またはそれらの組合せである、請求項１に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項５】
前記胆樹組織が、門、総肝管、胆嚢管、総胆管、総肝膵管および胆嚢を含む、前記胆樹のいずれかの部分である、請求項１に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項７】
前記ヒトが、胎児、新生児、小児、成体または死後７２時間以内の死亡者である、請求項６に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項８】
前記ヒトが、死後１０時間以内の死亡者である、請求項６に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項９】
前記胆樹組織が、胆管周囲腺、または胆管周囲腺に由来する前駆細胞もしくは幹細胞、または胆嚢を含む、請求項１に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項１０】
前記胆樹組織が、前記胆樹が分岐する位置を含む、請求項１に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項１１】
前記多能性細胞が、
（ｉ）肝細胞系統を示す少なくとも１つのマーカー；
（ｉｉ）膵細胞系統を示す少なくとも１つのマーカー；
ならびにカテゴリー（ａ）または（ｂ）から選択される少なくとも１つのマーカー：
（ａ）少なくとも１つの内胚葉幹細胞／前駆細胞表面マーカー；
（ｂ）内胚葉幹細胞／前駆細胞を示す少なくとも１つの転写因子；
を発現する、請求項１に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項１２】
前記肝細胞系統を示すマーカーが、ＨＮＦ６、ＨＥＳ１、ＣＫ１９、アルブミンおよびＡＦＰからなる群から選択される、請求項１１に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項１３】
前記膵細胞系統を示すマーカーが、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＮＧＮ３およびインスリンからなる群から選択される、請求項１１に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項１４】
前記内胚葉幹細胞／前駆細胞表面マーカーが、ＣＤ１３３（プロミニン）、Ｎ−ＣＡＭ、ＣＸＣＲ４およびＥｐＣＡＭからなる群から選択される、請求項１１に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項１５】
前記内胚葉幹細胞／前駆細胞を示す転写因子が、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２からなる群から選択される、請求項１１に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項１６】
（ｉ）テロメラーゼタンパク質の核発現；
（ｉｉ）多能性遺伝子の低から中等度レベルの発現；
（ｉｉｉ）古典的内胚葉転写因子の核または核周囲発現；
（ｉｖ）内胚葉幹細胞／前駆細胞表面マーカーの発現；
（ｖ）成熟肝、成熟胆管または成熟膵臓内分泌部の系統マーカーの発現の欠如または低および可変レベルの発現；ならびに
（ｖｉ）間葉細胞、内皮細胞または造血細胞についてのマーカーの発現の欠如
の少なくとも１つを発現する、単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項１７】
前記成熟肝が肝細胞を含み、前記成熟胆管が胆管細胞を含み、前記成熟膵臓内分泌部が膵島細胞を含むものである、請求項１６に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項１８】
前記内胚葉幹細胞／前駆細胞表面マーカーが、ＣＤ３２６／上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ５６／神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３（プロミニン）、ＣＸＣＲ４、またはそれらの組合せを含むか；または
前記内胚葉転写因子が、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ９、ＦＯＸＡ２、ＨＥＳ１、ＨＮＦ６、ＰＲＯＸ１、ＨＮＦ３Ｂ（肝細胞核内因子３Ｂ）、ＰＤＸ１、ＮＧＮ３、またはそれらの組合せを含むか；または
肝細胞等の成熟肝の前記系統マーカーがＰ４５０を含み；成熟胆管の前記系統マーカーがセクレチン受容体、アクアポリン、またはそれらの組合せを含み；ならびに成熟膵の前記系統マーカーが高レベルのインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、アミラーゼまたはそれらの組合せを含むか；または
間葉細胞についての前記マーカーがデスミンであり、内皮細胞についての前記マーカーがＶＥＧＦ受容体であり、および造血細胞についての前記マーカーがＣＤ４５である、請求項１６に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項１９】
前記Ｐ４５０がＰ４５０−３Ａ４である、請求項１８に記載の単離された哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞を含む細胞集団を含むか、または、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の多能性幹細胞／前駆細胞が富化された哺乳動物細胞の集団を含む、組成物。
【請求項２１】
多数の内胚葉系統に分化することができる哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞を得る方法であって、前記細胞が哺乳動物の胆樹組織から得られ、胆樹組織を得ることならびに連続的に任意の順序でまたは実質的に同時に、
（ｉ）少なくとも１つの幹細胞表面マーカー；
（ｉｉ）肝細胞系統段階を示す少なくとも１つのマーカー；
（ｉｉｉ）膵細胞系統段階を示す少なくとも１つのマーカー；および
（ｉｖ）内胚葉幹細胞／前駆細胞の少なくとも１つのマーカー；
に関して陽性である細胞を得ることを含む、方法。
【請求項２２】
前記幹細胞表面マーカーが、ＥｐＣＡＭ、Ｎ−ＣＡＭ、ＣＸＣＲ４およびＣＤ１３３からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物多能性幹細胞／前駆細胞が、免疫選択技術および／または選択培養条件によって得られる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫選択技術が、パニング、磁気ビーズ選択、フローサイトメトリー、またはそれらの組合せを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫選択技術が、フローサイトメトリーである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記選択培養条件が、前記細胞をプラスチックまたはヒアルロナンにプレートすることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記プラスチックが、ＩＶ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ラミニン、ヒアルロナン、胚もしくは胎児もしくは新生児組織からの他の基質成分、またはそれらの組合せで被覆されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
低カルシウムを含み、銅を含まず、インスリン、トランスフェリン／Ｆｅ、セレン、亜鉛、および血清アルブミンに結合した遊離脂肪酸を添加した基礎培地を含む無血清培地中で前記細胞をインキュベートすることをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記無血清培地が、高密度リポタンパク質をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記基礎培地がＲＰＭＩ１６４０を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記基礎培地が０．５ｍＭ未満のカルシウムを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞を７〜２１日間またはそれより長く培養する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記胆樹組織が、門、総肝管、胆嚢管、総胆管、総肝膵管および胆嚢、またはそれらの組合せを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記胆樹組織が、前記胆樹が分岐するまたは多数の胆管周囲腺を含む部位に由来する、請求項２１に記載の方法。