(57)【要約】【課題】本発明は、トランスジェニックセルラインを使用する、非通常型伝達性因子（ＮＣＴＡ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定のための方法に関する。本発明はまた：生物学的産物の有効性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価及び／またはモニタリングのための方法または処理方法への前述のｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定方法の、あるいは、ＮＣＴＡの除去のためのこのような方法への一つ以上の工程の適用、ならびに、汚染除去手順のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価及び／またはモニタリングのための方法へのその適用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非通常型伝達性因子（ＮＣＴＡ）の複製に耐性である安定したトランスジェニック細胞が生物学的産物に接触され、次いで、前記ＮＣＴＡの複製により前記生物学的産物に存在するＮＣＴＡの量を増幅するために一つ以上継代で培養することを特徴とする、生物学的産物内の非通常型伝達性因子（ＮＣＴＡ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定方法。
【請求項２】
安定したトランスジェニック細胞が、生物学的に許容される水溶液中の該生物学的産物の少なくとも一つの希釈物存在下で培養されることを特徴とする、請求項１に記載の滴定方法。
【請求項３】
該ＮＣＴＡが各継代で検出されることを特徴とする、請求項１または２に記載の滴定方法。
【請求項４】
該ＮＣＴＡが免疫化学方法により各継代で検出されることを特徴とする、請求項３に記載の滴定方法。
【請求項５】
該ＮＣＴＡがウエスタンブロットにより各継代で検出されることを特徴とする、請求項４に記載の滴定方法。
【請求項６】
該ＮＣＴＡがＥＬＩＳＡにより各継代で検出されることを特徴とする、請求項４に記載の滴定方法。
【請求項７】
該ＮＣＴＡがプリオンタンパク質ＰｒＰｓｃの病原形態に一致することを特徴とする、請求項１から６のいずれかひとつに記載の滴定方法。
【請求項８】
該安定したトランスジェニック細胞がウサギ上皮細胞であることを特徴とする、請求項１から７のいずれかひとつに記載の滴定方法。
【請求項９】
該安定したトランスジェニック細胞が、Ｒｏｖ９セルライン由来のウサギ上皮細胞であることを特徴とする、請求項７または８に記載の滴定方法。
【請求項１０】
該安定したトランスジェニック細胞がマウスのグリア細胞であることを特徴とする、請求項１から７のいずれかひとつに記載の滴定方法。
【請求項１１】
該安定したトランスジェニック細胞が、ＭｏｖＳ６セルライン由来のマウスグリア細胞であることを特徴とする、請求項７および１０に記載の滴定方法。
【請求項１２】
該生物学的産物が、血液産物及びそれらの製剤、食料、化粧品及び環境に害となる製品からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から１１のいずれかひとつに記載の滴定方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかひとつに記載の滴定方法が、プロセスの上流及び下流で、前記生物学的産物に適用されること、及び、両者の得られた力価の値を比較することを特徴とする、ＮＣＴＡで汚染されやすい生物学的産物を得る、または、処理するプロセスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価及び／または制御方法。
【請求項１４】
血液産物及びそれらの製剤の精製プロセスへの、請求項１３に記載の評価及び／または制御方法の適用。
【請求項１５】
該精製プロセスがクロマトグラフィーまたはナノ濾過であることを特徴とする、請求項１４に記載の適用。
【請求項１６】
材料の汚染除去手順のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価及び／または制御方法であって、汚染除去されるべき材料がＮＣＴＡを含有する生物学的産物と接触すること、及び、請求項１から１２のいずれかひとつに記載の滴定方法を、前記手順の上流及び下流で、前記生物学的産物に適用すること、及び、両者の得られた力価の値を比較することを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニックセルラインを使用する非通常型伝達性因子（ＮＣＴＡ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定方法、生物学的産物を得るまたは処理するプロセスの、あるいは、ＮＣＴＡを除去するプロセスの一つ以上の工程の有効性のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの評価及び／または制御へのその適用、ならびに、汚染除去手順のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価及び／または制御方法へのその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の変性により特徴付けられる遺伝的または後天的疾患の群であり、ヒトに、とりわけ、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）として知られ、また、多数の哺乳動物、より詳細には羊及び牛に影響を及ぼす（スクレイピー及びウシ海綿状脳症）。この特性のために、これらの疾患の病原体は、いわゆる「非通常型伝達性因子(non-conventional transmissible agents) 」（ＮＣＴＡ）の群に分類される。病因は知られていない。しかし、該病気の特徴は、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）と呼ばれる細胞外タンパク質の存在であり、これは疾患の過程で、プロテイナーゼＫのようなプロテアーゼに耐性を有する、不溶性形態にトランスフォームされ、そして、細胞に蓄積し、そして、それらの死を誘導する。ＰｒＰｓｃと呼ばれる、ＰｒＰのこの異常な病原形態は、プリオンタンパク質ＰｒＰのコンフォーメーション変化の結果である。ＰｒＰをコードする遺伝子発現変化の、また翻訳改変の証拠も示さなかった（P. Brown, Transfusion, 41, 4333-436, 2001 et D. Volkel et al., Transfusion, 41, 441-448, 2001）。
【０００３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのトランスジェネシスは、ＴＳＥの理解に非常に貢献する。ＰｒＰｓｃをコードする遺伝子が不活化された、このようなマウスは、実験感染に対して高い耐性を有する。反対に、家族性ＴＳＥを患う個体のＰｒＰ遺伝子から、または、外来遺伝子からクローンとして作成された病原性トランスジーンを発現する（または過剰発現する）マウス及び細胞培養物は、対応する遺伝性疾患を模倣しており、該トランスジーンと同じ種に属する感染対象由来の接種物に敏感である。トランスジェニックセルラインはまた、ＰｒＰｓｃへのＰｒＰのトランスコンフォメーションと影響しあう分子の研究のための、ｖｉｔｒｏでのモデルとしても使用される。
【０００４】
現在利用可能なデータは、ＴＳＥの原因である伝達性因子が、感染形態で血中及び血液産物中に存在するということの実証を許容しない（上記参考文献P. Brownを参照）。しかし、この不確定さは、一方で、血中のおそらく非常に低い濃度が、他方で、いったん確立された疾患の非常に長い培養期間が原因で、それが存在しないという結論を下すことはできない。
【０００５】
さらに、ＮＣＴＡの驚くべき耐性は、血漿由来の寒冷沈降性タンパク質（Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ，Ｆａｃｔｏｒ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄなど）のような、血液製剤のウイルス負荷の減少に有効であることが立証されている、溶剤／界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−ＴＮＢＰ処理のような、古典的に行われる不活化プロセスの使用を妨げる。実際、これらは、例えばＮａＯＨ  １Ｍ存在下で、感染の減少のための既知のプロセスにより完全に分解され得る。
【０００６】
凝固血漿タンパク質のような、生物学的産物の製造または処理が、それらの治療的な使用を考慮して、ウイルス不活化／除去工程を取り入れるべきである場合、血漿製剤製造工業は、血漿由来産物を介するＣＪＤ変異型の伝達の理論上のリスクを評価することを試みる。
【０００７】
ゆえに、敏感な、特異的な及び迅速な滴定方法の開発が必要であり、これはＮＣＴＡの除去程度の評価のために使用され得、これは、生物学的産物精製プロセスの目的において、または、材料の汚染除去手順（特に再利用可能な材料の）目的で行われる、一つの工程、または連続した工程に由来する。
【０００８】
現在、通常に行われているプロセスは、病原性プリオンを負荷した試験される産物の種々の希釈物の脳内注入による、ゴールデンハムスターの感受性セルラインによるｉｎ  ｖｉｖｏでの滴定方法を使用する。実施した希釈物に応じた異なる群において、影響を受けた動物の数によって、感染価が計算され得、そして、与えられたプロセスの減少ファクターは、非処理標準から設定される。しかし、この方法の欠点は、長期間、高コスト及び、プリオン除去効果の迅速な理解が要求される工業規模における開発との低い適合性である。
【０００９】
さらに、滴定方法の感度の向上について、感染因子の濃縮工程を導入することが、しばしば必要である。現在、ＴＳＥの原因である感染因子の全てのこれらの濃縮手順は、ＰｒＰｓｃとの共−精製である。
【００１０】
さらに、広く知られた方法は、ＴＳＥｓの感染因子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの滴定に利用できる。これらは、ウエスタン−ブロットによる（Ironside J.W. et al., J. of  Thrombosis及びHaemostasis, 1, 1479-1486, 2003）またはＥＬＩＳＡによるＰｒＰｓｃの検出からなる。これらの技術は、病原性タンパク質（ＰｒＰｓｃ）と正常タンパク質（ＰｒＰ）との区別のために、分析されるサンプルのプロテイナーゼＫによる予備消化、または、カオトロピック剤による変性を必要とする。さらに最近開発された滴定方法は、ＰｒＰを認識しないＰｒＰｓｃに特異的な抗体の使用に基づく。
【００１１】
ＮＣＴＡに結合した感染物の滴定は、他の動物種に感染しているＴＳＥの系統にあらかじめ適応することを許容する、齧歯動物のような、実験動物への、または、感染物の起源と同じ種のＰｒＰを発現するトランスジェニックマウスへの脳内接種により行われる。
【００１２】
数人の著者は、診断に使用されることを目的として、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術（トランスジェニック細胞培養物の接種）を伴う、免疫−化学技術によるＰｒＰｓｃによる検出限界を比較した。標識されたエピトープＰｒＰを発現するトランスジェニック動物について論じる、米国特許第６  １５０  ５８３号が、例として引用され得る。
【００１３】
古典的なウイルスの場合、感染因子の検出技術は、感染物のｉｎ  ｖｉｔｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの滴定のような、直接法により、及び、ポリメラーゼ連鎖反応によるウイルスゲノムの増幅、ｉｎ  ｖｉｖｏ接種とそれに続く特徴的なウイルス因子と比較したセロコンバージョンの明示、及び、関連する病理学関連マーカーの免疫−化学または分子検出による間接法により行われ得る。
【００１４】
間接技術に対する直接技術の評価は、レギュレーションを設定するために、それらの実験的な使用のあらかじめ必要な部分である。このように、関連のあるウイルス間で区別され、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染物の滴定が立証され（継続的に感受性で、ウイルスの系統に適合する許容状態のセルライン）、モデルウイルスは病原因子と近縁の先祖であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖は再現可能でない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
現在まで、生物学的産物を獲得する及び精製するプロセスにおいて組み込まれたウイルスの不活化工程、または、材料の汚染除去工程について、ＮＣＴＡｓに関する実験検証は、例えば、実験齧歯動物またはトランスジェニックマウスへの脳内接種によりｉｎ  ｖｉｖｏで直接的に、または、ＰｒＰｓｃのｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫−化学検出により間接的に、行われ得ない。実際、核酸は感染材料に存在せず、そして、ＰＣＲは適用され得ない。さらに、異常タンパク質は、特異的な抗体形成をｉｎ  ｖｉｖｏで生じない。ゆえに、モノクローナル抗体を用いる必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
生物学的産物におけるＮＣＴＡの先の検出及び滴定方法の欠点を克服するために、本出願人は驚くべきことに、ＮＣＴＡ挙動の未だ大部分の理解の欠如にもかかわらず、ＮＣＴＡの複製に耐性であるトランスジェニックセルラインの使用が、このＮＣＴＡの滴定方法の開発を許容するということを示した。特に、この適定方法は、想定されるＮＣＴＡの除去に関して、例えば、血漿画分由来のタンパク質、食料、化粧品、または、さらに一般的には環境に有害であるような任意の産物（例えば、動物ミール）のような、生物学的産物を得るまたは処理するプロセスの、有効性の確認の目的のために使用され得る。それはまた、材料の汚染除去手順、例えば、クロマトグラフィーカラムの有効性の評価に適用され得る。
【００１７】
本発明に従うＮＣＴＡの滴定方法の適用は、生物学的マトリクスに存在するＮＣＴＡの絶対力価を測定することを許容する。
【００１８】
本発明の範囲において、表現「ＮＣＴＡ」は、ヒトにおける家族性または弧発性ＣＪＤ、クールー疾患または若年層にみられるＣＪＤ変異型の原因であるもの、あるいはまた、羊もしくはウシのスクレーピーまたはネコ科動物の海綿状脳症の原因であるもののような、任意のＮＣＴＡとして理解されるべきである。
【００１９】
それゆえ、本発明は、このＮＣＴＡによる感染されやすい生物学的産物におけるＮＣＴＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定方法に関し、前記ＮＣＴＡの複製に耐性の安定したトランスジェニックセルラインが生物学的試料と接触し、そして、前記ＮＣＴＡの複製により、前記生物学的産物に存在する、ＮＣＴＡ量を増幅するために、１以上の継代において培養されることを特徴とする。
【００２０】
本発明の実施を可能にする、また、以降で定義される要求及び基準を満たす、特定のトランシジェニックセルラインの選択は、約４ログのスケールで、すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、１から１００００感染ユニットで、ＮＣＴＡに結合される感染物の定量のための要求を満たすことを許容する。これは、例えば、ＮＣＴＡｓの除去のための生物学的産物を得るプロセスの有効性の検証基準を満たすことを可能にし得る。
【００２１】
本発明の滴定方法におけるこのようなトランスジェニックセルラインの使用は、複数の利点、特に、生物学的産物に存在するＮＣＴＡの定量期間のかなりの減少の利点を有し、本発明の滴定方法の結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの参照方法と良好な相間関係がある。典型的に、滴定結果は、約１及び１／２ヶ月以内に得られ、一方、ゴールデンハムスターへの脳内ｉｎ  ｖｉｖｏ接種による先行技術のそれらは、最も好ましい場合に、一年以内に、そして動物の（感染された／非感染の）状態を明らかにするために、退屈で補足的な組織病理学検査という犠牲を払って、もたらされる。さらに、これらのセルラインは、滴定測定の増幅可能で、再現可能な応答、及び、免疫−化学により明らかにされないＮＣＴＡの感染力の実証を提供する。非常に多数の動物を使用する実験及びそれらの安楽死を回避するという利点も有する。
【００２２】
本発明の実施を許容するこのような安定したトランスジェニック細胞は、以下の要求及び基準を満たす。
【００２３】
神経細胞（ニューロン、樹状細胞）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養へのそれらの低い適応のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定の目的において、必ずしも、トランスジェネシスのための最良の材料ではなく、トランスジェニックセルラインは、既知の技術により、ＮＣＴＡの複製のための理想的な環境を提供するために必要な、特定のタイプの細胞と特定のトランスジーンの組み合わせにより作られる。
【００２４】
Vilette et al.（PNAS, March 2001, 98(7), 4055-4059）は、羊のＰｒＰ（トランスジーン）を発現するトランスジェニック及び安定ウサギ上皮細胞が、羊のＰｒＰｓｃを含む抽出物による感染によって、羊ＰｒＰｓｃを複製でき得るということを示した。これらの著者は細胞モデル、Ｒｏｖ９ラインを設計し、これは誘導様式で外来性ＰｒＰを発現し、感染材料と接触したこれらの細胞内でのＰｒＰｓｃの蓄積に必要な培養期間中、その保存を確実にする。ＮＣＴＡの複製に耐性のこのような安定したトランスジェニック細胞は、本発明の滴定方法において使用可能である。
【００２５】
Archer et al.,（Journal of Virology, Jan. 2004, p. 482-490）は、ＰｒＰｓｃの複製に耐性である安定したセルラインの種々のタイプを設計した。これらのモデルは、羊ＰｒＰを発現し、そして、羊ＰｒＰｓｃの複製に耐性のマウスグリア細胞、ＭｏｖＳ細胞からなる。これらの細胞は、本発明の滴定方法に特に好適であると証明された。
【００２６】
あるものはまた、ＮＣＴＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定のための基質（substrate）として有利に使用されるトランスジェニックセルラインのほかの基準を要求する。これらの基準は、以下である：
−  細胞の複製または増殖速度と、感染された細胞におけるＰｒＰｓｃの増加を示すために必要な培養期間との間の妥当性；
−  感染因子と接触された後の細胞の安定性、これは、該細胞内のＰｒＰｓｃの蓄積の細胞毒性の欠如により示され得る；
−  感染に対するそれらの良好な感受性、例えば、感染因子に暴露された細胞内のＰｒＰｓｃの蓄積を得るための弱い感染重複。
【００２７】
本発明に従うと、ＮＣＴＡの複製に耐性の安定したトランスジェニック細胞は、このＮＣＴＡで、または、標準材料として該ＮＣＴＡを含む感染材料で、感染されることが可能な生物学的産物と、それ自体既知の方法により、接触させる。本発明の範囲において、感染材料が、ＮＣＴＡで感染させた、特に、羊または牛のような、動物の脳抽出物由来の生物学的感染材料である。
【００２８】
のちに、該細胞は、該ＮＣＴＡの複製を可能にするために、１以上の継代で培養される。一つの「継代」は、一つの培養ディッシュから得られる細胞画分の、新鮮な培養メディウムを含む別の培養ディッシュへのプレーティングからなる。ゆえに、各継代は、さらなる分裂のスペースのない細胞の、他のディッシュへの希釈を可能にし、そして、１つのディッシュにおける培養期間は、ＮＣＴＡの複製を可能にする。
【００２９】
有利に及び本発明に従うと、トランスジェニック細胞は、生物学的に許容可能な水溶液において、該ＮＣＴＡによる感染されることが可能な生物学的産物の少なくとも一つの希釈物、詳細には幾つかの希釈物、最も詳細には一連の、または、連続した希釈物に接触され得る。このような希釈物は、試験される試料における感染物の定量をさらに正確に行うことを可能にする。トランスジェニック細胞の数回の複製物は、生物学的産物の同じ希釈物と接触され得る。
【００３０】
有利には、ＮＣＴＡは、詳細には当業者に知られた免疫化学方法により、特にウエスタン−ブロットまたはＥＬＩＳＡにより、各希釈物について検出される。当業者に知られた任意の技術による、生物学的産物で潜在的に感染させた安定したトランスジェニック細胞の培養工程は、ＮＣＴＡの複製のために、すなわち、ＮＣＴＡ量の増幅のために必要とされており、これは古典的な方法（ＥＬＩＳＡ、ウエスタン−ブロット）により検出されるには不十分である。
【００３１】
特に、本発明の方法により滴定されたＮＣＴＡは、病原性の羊、牛またはヒトのプリオンタンパク質ＰｒＰｓｃである。
【００３２】
異なる希釈物及び異なる複製物についてのウエスタン−ブロットの全体的な結果は、例えば、スピアマンカルバ（Ｓｐｅａｒｍａｎ  Ｋａｒｂｅｒ）（Schmidt N. J., Emmous R. W., Diagnostic Procedures for viral, rickettsial and chlaveydial Infection, 1989, 6th Edition）のような、感染力価を確立することを可能にする当業者に知られた統計方法により分析され得る。
【００３３】
有利には、安定したトランスジェニック細胞は、ウサギ上皮細胞、特にＲｏｖ９ラインのウサギ上皮細胞（Viletta et al.）またはマウスグリア細胞、特に、ＭｏｖＳ６ラインのマウスグリア細胞（Archer et al.）である。
【００３４】
有利には、ＮＣＴＡにより汚染されることが可能な生物学的産物は、血液産物及びそれらの製剤、食料、化粧品、及び、環境に害をもたらす任意の産物からなる群から選択される。
【００３５】
本発明はまた、伝達性非通常型因子（ＮＣＴＡ）で汚染されることが可能な生物学的産物を得る及び処理するプロセスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価及び／または制御方法への、本発明の滴定方法の適用に関する。この評価及び／または制御方法は、生物学的産物が、あらかじめ記載したような、本発明の滴定方法を、前記プロセスの上流及び下流で受け、及び、二つの得られた力価の値を比較するという特徴を有する。二つの測定結果の比較により、ＮＣＴＡの除去程度または減少ファクターが決定される。
【００３６】
特に、本発明の滴定方法は、例えば、クロマトグラフィーまたはナノ濾過、特に特許ＥＰ  ０  ３５９  ５９３及び特許出願ＷＯ  ０２０９２６３２に記載されるクロマトグラフィーを使用して、生物学的産物、特に、血液製剤のような血液産物を得るまたは精製するための任意のタイプのプロセスに容易に適用される能力を有する。
【００３７】
このように、本発明に従う滴定方法を実施することは、試験されるＮＣＴＡを含む感染性のまたは潜在的に感染性の材料と接触したＮＣＴＡの複製を高める特定のトランスジェニックセルラインを使用する滴定のおかげで、ＮＣＴＡの除去のための、ＮＣＴＡで汚染さることが可能な任意の生物学的産物の製造または処理または精製のプロセス（またはプロセスの一部分）の有効性を評価すること及び／または制御することを可能にする。ＮＣＴＡの量は、該プロセス（またはプロセスの一部分）の上流及び下流で測定され、ＮＣＴＡに関するその有効性が評価される。両者の測定値を比較することにより、病原因子除去の程度が決定される。このように、本方法は、生物学的産物を得るプロセスのうちに、または、生物学的産物を得ることが続くＮＣＴＡの除去処理の範囲において、行われ得る。
【００３８】
本発明はまた、本発明の滴定方法の、材料汚染除去手順のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価及び／または制御方法への適用に関する。この場合、ＮＣＴＡを含む生物学的産物のＮＣＴＡ力価は、本発明の滴定方法により測定される。続いて、この感染された生物学的産物は、汚染除去される該材料と接触させ、そして、この材料は汚染除去手順を受ける。最終的に、生物学的産物の力価が（これは汚染除去手順に供された）、再度測定される。汚染除去手順の上流及び下流で行われた両者の力価測定値は、汚染除去手順の有効性を評価するために比較される。
【００３９】
ＮＣＴＡを含む生物学的産物は、例えば、牛または羊のような、ＮＣＴＡで感染された動物の脳の抽出物に由来する。
【００４０】
該材料は、精製のため、特に、クロマトグラフィー用のカラムに使用される材料であり得る。
【００４１】
該汚染除去手順は、例えば、ソーダでクロマトグラフィー用のカラムを清浄にすることであり得る。
【実施例】
【００４２】
実施例１：細胞培養物によりＮＣＴＡｓに結合される感染性の滴定
ＭＣＴＡｓに結合される感染性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定システムの実行可能性試験のために、ＭｏｖＳ６細胞（Archer F. et al. 2004）は、ＮＣＴＡｓの複製に耐性の細胞として選択され、トランスジェニックマウスＴｇ３０１に適する系統スクレーピーＰＧ１２７は、感染源として使用した（Vilotte JL et al.. Journal of Virology, Vol. 75, n○13, p. 5977-5984, 2001）。生物学的に許容される接種物は、１００ｍｇ／ｍｌに感染されたマウスの脳ホモジネートであった。該細胞は、グルタミン及びウシ胎児血清で補完したＤＭＥＭ＋ＥａｍＦ−１２メディウムで培養した。滴定プレートは、接種前２４時間に調製した。該細胞は、９６ウェルのサイズにおいては、ウェルあたり４０．０００細胞の（実験ｎ○１）、２４ウェルのプレートにおいて１００．０００細胞の（実験ｎ○２及び３）の割合で接種した。マウスの脳ホモジネートの連続的な希釈物は培養メディウムで調製し、希釈工程は、１０において１０（実験ｎ○１及びｎ○２）、または、５において５（実験ｎ○３）であった。接種物の各希釈物において、培養プレートの５ウェルに感染させた。該細胞は、１２時間から４日間の期間、特定量の接種物（５０から１５０μｌ）と接触させた。表１に、実験毎に特異的な接種及び拡大の実験条件を要約する。感染させた細胞の半分（実験ｎ○１）または全部（実験ｎ○２及び３）を維持するために、プレートサイズを変化させる間、該接種物を捨て、そして、新鮮な培養メディウムで置き換え、その後、該細胞は最初の継代まで培養物中で維持する。細胞培養の続行において、培養メディウムは週に１回変え、そして、各継代で細胞の９０％を分析することを可能にするように、該細胞を１から１０の割合でプレートアウトした。各継代で回収した細胞は、細胞ペレットの形態で凍結し、ＰｒＰｓｃを検出するためにウエスタンブロット法による分析にかけるまで、−８０℃で保持した。各細胞ペレットを、５０μｌの量ベンゾナーゼ（Benzonase）（２５０ユニット）で、３７℃で２時間処理した。そして、細胞溶解物をプロテイナーゼＫで処理し、変性させ、そして、変性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。ゲル中で移動したタンパク質を、エレクトロトランスファーにより、ニトロセルロース膜上に移した。該膜上に存在するＰｒＰｓｃは、抗体６Ｈ４と（Prionocs）、そして、二次標識抗体（マウス抗体を標的とするヤギ抗体）とインキュベートすることにより検出する。標識された膜は、化学発光により現される。グリコシル化ＰｒＰｓｃの３つの形態の電気泳動プロフィールがオートラジオグラフィーでみられる時、試料は陽性と考える。ウエスタンブロットによる各分析において、陰性コントロール（ＭｏｖＳ６細胞を感染させていない）は、試料で処理した。各細胞継代について、培養プレートの全体のウェルを試験した。作成した接種物の希釈物を接種した細胞培養物の全部の複製物が、２つの連続的な継代の間のＰｒＰｓｃにおいて陽性である場合、これらの培養物は、次の継代でそれ以上試験しなかった。試料の力価は、スピアマンカルバ法により、最後の細胞培養物で算出した（Schmidt NJ and Emmons R.W. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infection 1989, 6th Edition）。
【００４３】
【表１】
2007503209.tif 000002
【００４４】
結果
実験ｎ○１
系統スクレイピーＰＧ１２７で感染させた試験したマウス脳ホモジネートの希釈は、１０−１から１０−６であった。継代ｎ○３において、細胞培養ウェルにＰｒＰｓｃの存在はみられなかった。継代ｎ○４において、接種物の１０−１から１０−３からの希釈で感染させたウェルの１００％がＰｒＰｓｃについて陽性であり、そして、接種物の１０−４の希釈で感染させた培養物の７５％が陽性であった。継代ｎ○５において、１０−５の希釈で感染させたウェルの２５％は陽性であり、スピアマンカルバ法に従う１ｍｌあたりの５０％（ＴＣＩＤ５０）感染用量の６，０５ログの力価を確立することに成功した。続く細胞継代において、ストック力価の増加は示さなかった。
実験ｎ○２
表２は、実験ｎ○２において得られた結果の要約であり、そして、接種物の各希釈（１０−３から１０−７）で感染させた各培養複製物の陽性比率の変化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を再び示すことができる。培養物におけるＰｒＰｓｃの出現の時間は、該培養物が接種された感染用量に反比例するということを示し得る。このように、接種物の１０−３の希釈で接種された培養物は継代ｎ○２からＰｒＰｓｃを示し、一方、さらなる継代は、希釈１０−４を受けた培養物の１００％が陽性であるということを観察するためのに待つ必要があった。この実験における接種物の算出した力価は、５，５ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００４５】
【表２】
2007503209.tif 000003
【００４６】
実験ｎ○３
表３は、実験ｎ○３において得られた結果の要約である。この実験において、接種物の希釈工程は、１／５に減少され、そして、試験した希釈は、１０−４から１０−６，８であった。最も高い力価は、継代ｎ○６において得られ、そして、算出力価は６，４３ＴＣＤＩ５０／ｍｌであった。
【００４７】
【表３】
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【００４８】
３つの実験の結果は、ＴＣＩＤ５０で表されるＮＣＴＡに結合された感染性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定の実行可能性を実証した。細胞培養物を感染することによる通常型のウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定と同様に、細胞ＭｏｖＳ６は、感染させた細胞におけるＰｒＰｓｃの蓄積を明らかにすること、及び、該細胞の増幅前の接種物において免疫化学技術により検出されないＰｒＰｓｃの量を検出することが可能である。滴定システムの設計された作動条件は、良好な感度を得るために最適化され、ウエスタンブロット技術による接種物における直接ＰｒＰｓｃ検出のものより高く、そして、これは、４ログより大きいか同等の定量領域を確実にする。異なる実験において得られる結果を比較する場合、細胞の感染様態は、接種物の算出力価へのわずかな影響を与えるが、しかし、一般的に、これらの力価は明瞭であるということに気付き得る。実際、実験ｎ○２の細胞をカバーする培養メディウムの１ｍｌにおける接種物の希釈（１００μｌ）を考慮すると、この滴定は最初の培養物のそれより１０倍低い希釈物で行われたということが考えられる。
【００４９】
これらの実験は、古典的なｉｎ  ｖｉｖｏ滴定システム（これは、結果に有意な多数の実験齧歯動物の脳内接種、結果を得るための数ヶ月の期間、及び一般的に、それらの脳の病理学的試験による、または、ウエスタンブロット技術による、接種された動物の感染状態の確認を必要とする）と比較して、ＮＣＴＡｓに結合された感染性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定の卓越を実証する。さらに、該システムは実験動物の経験数を例えば細胞培養物に関する代わりの方法の利益に制限する実際のガイダンスに従う。最終的に、提案した方法は、より高価及びより複雑な、Ｐ３実験室における限定を要する動物実験とは対照的に、Ｐ２実験室において行われ得る。
実施例２：ＮＣＴＡで汚染されることが可能な生物学的薬剤の精製工程に関連する減少ファクターの算出
この実験において、生物学的産物製造プロセス工程の例として、ナノ濾過工程を選択した。選択されたフィルターは、１５ｎｍの多孔度及び０，０１ｍ２の表面のＰＬＡＮＯＶＡ  １５  Ｎ（ＡＳＡＨＩ  ＫＡＳＥＩ）フィルターであった。濾過するために選択した産物は、クエン酸三ナトリウム二水和物緩衝液０，０１Ｍ、グリシン０，１２Ｍ、Ｌ−リシン（モノクロライド）０，０１６Ｍ、塩化カルシウム二水和物０，００１Ｍ、塩化ナトリウム０，１７Ｍ、容量オスモル濃度４９０−５１０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ、ｐＨ６，９０−７，１０中の、ヒトアルブミン０，２ｇ／ｌであった。ナノ濾過は、５００±１００ｍｂａｒの圧力下、２５℃で行った。ヒトアルブミン希釈緩衝液４０ｍｌで、該産物のナノ濾過の前に、該フィルターを平衡にした。系統スクレイピーＰＧ１２７で感染させたマウス脳のホモジネート４％に実験用に添加した、濾過される産物３０ｍｌの１容量を濾過し、そして、フィルターから該産物を除くために、１０ｍｌ量の平衡緩衝液を濾過した。工程の再現性を高めるために、２回のナノ濾過実験を行った。実験用に加えた濾過される産物は、ナノ濾過前に該産物における感染性定量のためのアリコートフラクションを得るに十分な量で調製した。全量４０ｍｌをナノ濾過の上流で回収し、そして、ナノ濾過後の該産物における感染物の量を測定するために滴定した。実験用に添加した出発材料及び濾過産物もなお、それらの滴定を予測して−８０℃で維持する前に、培養メディウムに１／３に希釈した。試料は、最初の実施例に記載した実験ｎ○３の実験条件に従って滴定した。残余感染物が見られない、または、このうえなく非常に低いと予測される濾過物の試料に関しては、非細胞毒性試料の最も低い希釈物を１０の複製物に、そして続く希釈物を５の複製物同じ物に、あらかじめ上述したように、接種した。
【００５０】
表４は、このナノ濾過実験で生じた４つの試料の滴定結果の要約である。
【００５１】
添加した出発材料の試料は、試験１及び２において、４，６７ログＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価を示した。濾過物サンプルにおいて、残余感染物は検出されなかった。これらの試料の負荷は、ポアソンの法則に従い、接種された試料の最も高い希釈物の体積から０，２８ログＴＣＩＤ５０／ｍｌで算出した。試料に存在する全負荷量は、それらの負荷に、それらのそれぞれの体積を乗じることにより算出し、そして、減少ファクターは、ナノ濾過前の、出発材料または初期試料に存在する荷重を、濾過物に存在するそれで割ることにより算出した。実験用の添加物に加えた算出した感染物量から、クリアランスファクターを算出した。クリアランスファクターと減少ファクターにおける差は、１ログより大きい時、該出発産物の、この産物における感染物を検出するための滴定システムの性能への干渉を示すことを許容する。表５は、これらの算出値の要約である。出発材料に添加するために使用した該脳ホモジネートに存在する感染物の除去に関する減少ファクターは、実験１及び２のそれぞれにおいて、≧４，２４及び≧４，２２ログであった。クリアランスファクターの算出は、出発材料のいかなる干渉も示さなかった。
【００５２】
【表４】
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【００５３】
【表５】
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【国際調査報告】
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