(57)【要約】本発明は、Ｗｎｔ／β−カテニンの経路により標的とされる遺伝子の選択的抑制等の、β−カテニン／ＴＣＦ活性化転写の調節を行うための化合物及び方法を提供する。
2007503816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物を薬剤と接触させることを含む、β−カテニンにより誘導される標的遺伝子の発現を調節する方法であって、前記組成物はβ−カテニン、ＣＢＰおよびｐ３００を含み、前記β−カテニンはｐ３００に対するＣＢＰへの結合可能性を有し、前記薬剤はβ−カテニンがｐ３００に対するＣＢＰへの結合可能性を変化させるのに有効な量で組成物と接触する方法。
【請求項２】
前記薬剤がβ−カテニンに対するＣＢＰの結合を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤がβ−カテニンに対するｐ３００の結合を減少させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤がβ−カテニンに対するｐ３００の結合を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤がβ−カテニンに対するＣＢＰの結合を減少させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が生体外(ex vivo)に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が幹細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が細胞または哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物が癌に罹患し、前記量が前記癌の治療に有効な量である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が大腸癌（colon cancer）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が前立腺癌および乳房癌から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物は細胞であり、前記薬剤は前記細胞が増殖ではなく分化する可能性を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は細胞であり、前記薬剤は前記細胞が分化ではなく増殖する可能性を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造を有する、請求項１に記載の方法：
【化１】
2007503816.tif 000037
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基(side chain moiety)、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項１５】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、アミノＣ2-5アルキル、グアニジノＣ2-5アルキル、Ｃ1-4アルキルグアニジノＣ2-5アルキル、ジＣ1-4アルキルグアニジノＣ2-5アルキル、アミジノＣ2-5アルキル、Ｃ1-4アルキルアミジノＣ2-5アルキル、ジＣ1-4アルキルアミジノＣ2-5アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、フェニル、置換フェニル（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ベンジル、置換ベンジル（ここで、ベンジル上の置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ナフチル、置換ナフチル（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ビス−フェニルメチル、置換ビス−フェニルメチル（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリジル、置換ピリジル、（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリジルＣ1-4アルキル、置換ピリジルＣ1-4アルキル（ここで、ピリジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリミジルＣ1-4アルキル、置換ピリミジルＣ1-4アルキル（ここで、ピリミジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、または、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、トリアジン−２−イル−Ｃ1-4アルキル、置換トリアジン−２−イル−Ｃ1-4アルキル（ここで、トリアジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、イミダゾールＣ1-4アルキル、置換イミダゾールＣ1-4アルキル（ここで、イミダゾール置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、イミダゾリニルＣ1-4アルキル、Ｎ−アミノピペラジニル−Ｎ−Ｃ0-4アルキル、ヒドロキシＣ2-5アルキル、Ｃ1-5アルキルアミノＣ2-5アルキル、ヒドロキシＣ2-5アルキル、Ｃ1-5アルキルアミノＣ2-5アルキル、Ｃ1-5ジアルキルアミノＣ2-5アルキル、Ｎ−アミジノピペリジニルＣ1-4アルキルおよび４−アミノシクロヘキシルＣ0-2アルキルから独立に選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ａが−（ＣＨＲ3）−であり、Ｂが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄが−（ＣＨＲ5）−であり、Ｅが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇが−（ＸＲ7）n−であり、前記化合物が下記一般式（II）を有する、請求項１４に記載の方法：
【化２】
2007503816.tif 000038
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ5、Ｒ7、Ｗ、Ｘおよびｎは、請求項１の定義と同様である。
【請求項１７】
Ａが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが−（ＣＨＲ4）−であり、Ｄが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅが−（ＺＲ6）−であり、Ｇが−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−であり、前記化合物が下記一般式（III）を有する、請求項１４に記載の方法：
【化３】
2007503816.tif 000039
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ9、ＷおよびＸは、請求項１の定義と同様であり、Ｚは、窒素またはＣＨであり、但しＺがＣＨであれば、Ｘは窒素である。
【請求項１８】
Ａが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが−（ＣＨＲ4）−であり、Ｄが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅが−（ＺＲ6）−であり、Ｇが（ＸＲ7）n−であり、前記化合物は下記一般式（IV）を有する、請求項１４に記載の化合物：
【化４】
2007503816.tif 000040
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｗ、Ｘ及びｎは、請求項１の定義と同様であり、Ｚは、窒素またはＣＨであり、但し、Ｚが窒素であれば、ｎは０であり、またＺがＣＨであれば、Ｘは窒素であり、ｎは０ではない。
【請求項１９】
前記化合物は、下記一般式（VI）を有する、請求項１８に記載の方法：
【化５】
2007503816.tif 000041
式中、Ｒaは、窒素、酸素または硫黄から選択される１〜３個のヘテロ原子を持つことが可能な８〜１１員環の二環式(bicyclic)アリール基であり、Ｒbは、窒素、酸素または硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を持つことが可能な５〜７員環の単環式アリール基であり、化合物中のアリール環がハロゲン化物、ヒドロキシ、シアノ、低級アルキル、及び低級アルコキシ基からなる群から選択される少なくとも一つの置換基を持つことができる。
【請求項２０】
Ｒaはナフチル、キノリニルまたはイソキノリニル基であり、Ｒbはフェニル、ピリジルまたはピペリジルであり、これらすべてはハロゲン化合物、ヒドロキシ、シアノ、低級アルキル、および低級アルコキシ基からなる群から選択される少なくとも一つの置換基で置換できる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒaはナフチルであり、Ｒbはフェニルであり、これらはハロゲン化物、ヒドロキシ、シアノ、低級アルキル、及び低級アルコキシ基からなる群から選択される少なくとも一つの置換基で置換できる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤が化合物１である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
薬剤、β−カテニン、ＣＢＰおよびｐ３００を含む組成物であって、β−カテニンはｐ３００に対するＣＢＰへの結合可能性を有し、前記薬剤はβ−カテニンがｐ３００に対するＣＢＰへの結合可能性を変化させるのに有効な量で組成物内に存在する、組成物。
【請求項２４】
前記薬剤がβ−カテニンに対するＣＢＰの結合を増加させる、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記薬剤がβ−カテニンに対するｐ３００の結合を減少させる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記薬剤がβ−カテニンに対するｐ３００の結合を増加させる、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記薬剤がβ−カテニンに対するＣＢＰの結合を減少させる、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が生体外(ex vivo)状態にある、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物が幹細胞をさらに含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記薬剤は、細胞が増殖ではなく分化する可能性を増加させる、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記薬剤は、細胞が分化ではなく増殖する可能性を増加させる、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記薬剤が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造を持つ、請求項２３に記載の組成物：
【化６】
2007503816.tif 000042
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項３３】
前記薬剤が化合物１である、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
（ａ）Ｗｎｔ経路の構成要素を含む組成物（ｉ）を、Ｗｎｔ経路を活性化させる化合物（ii）と接触させ、活性化されたＷｎｔ経路を提供し、
（ｂ）ｐ３００およびβ−カテニン間の結合を完全にまたは実質的に妨げるが、ＣＢＰおよびβ−カテニン間の結合は殆どまたは全く妨げない化学薬剤でＷｎｔ経路の活性を調節することを含む、Ｗｎｔ経路の活性を調節する方法。
【請求項３５】
前記組成物が細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
生体外(ex vivo)で行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物がＬｉＣｌまたはＧＳＫ３抑制剤である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記化学薬剤が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造を持つ、請求項３４に記載の方法：
【化７】
2007503816.tif 000043
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項３９】
（ａ）細胞集団を、集団の一部は増殖し、一部は分化する条件下とし、
（ｂ）前記集団に化学薬剤を添加し、前記薬剤が、分化する細胞の割合に対して増殖する細胞の割合を増加させることを含む、細胞増殖を調節する方法。
【請求項４０】
前記化合物はｐ３００及びカテニン間の結合を妨げる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
Ｗｎｔ経路を活性化させる薬剤を集団に添加することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞集団は幹細胞の集団である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
生体外(ex vivo)で行われる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
細胞集団の分化を引き起こす薬剤を添加することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
集団内の細胞が分化して血液細胞を形成する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
集団内の細胞が分化して神経細胞、筋肉細胞、骨細胞または膵臓ベータ細胞(pancreatic beta-cells)を形成する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記化学薬剤が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造を持つ、請求項４４に記載の方法：
【化８】
2007503816.tif 000044
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項４８】
β−カテニン／ｐ３００相互作用に対してβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用を選択的に抑制する方法であって、前記方法は化合物を組成物に投与することを含み、前記組成物はβ−カテニン、ＣＢＰ及びｐ３００を含み、前記化合物はβ−カテニン／ｐ３００相互作用に対してβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用を選択的に抑制する方法。
【請求項４９】
前記化合物が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造を持つ、請求項４８に記載の方法：
【化９】
2007503816.tif 000045
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項５０】
β−カテニン／ＣＢＰ相互作用に対してβ−カテニン／ｐ３００相互作用を選択的に抑制する方法であって、前記方法は化合物を組成物に投与することを含み、前記組成物はβ−カテニン、ＣＢＰ及びｐ３００を含み、前記化合物はβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用に対してβ−カテニン／ｐ３００相互作用を選択的に抑制する方法。
【請求項５１】
前記化合物が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造を持つ、請求項５０に記載の方法：
【化１０】
2007503816.tif 000046
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項５２】
核から細胞質へのβ−カテニンの転位(translocation)を促進させる方法であって、前記方法は化合物を細胞に投与することを含み、前記細胞は核及び細胞質を含み、前記核はβ−カテニンを含み、前記化合物は核から細胞質へのβ−カテニンの転位を起こす方法。
【請求項５３】
前記化合物が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造を持つ、請求項５２に記載の方法：
【化１１】
2007503816.tif 000047
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項５４】
ＷＮＴ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子の発現を選択的に抑制する方法であって、前記方法は化合物を組成物に投与することを含み、前記組成物はＷＮＴ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子を含み、前記化合物はＷＮＴ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子の発現の変化を起こす方法。
【請求項５５】
前記化合物が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造を持つ、請求項５４に記載の方法：
【化１２】
2007503816.tif 000048
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項５６】
幹細胞を未分化状態に維持させる方法であって、細胞の分化を抑制しまたは細胞の増殖を促進させる薬剤と、幹細胞を未分化状態に維持するのに有効な量で幹細胞を接触させることを含む方法。
【請求項５７】
前記薬剤は、β−カテニン／ＣＢＰ相互作用に対してβ−カテニン／ｐ３００相互作用を選択的に抑制する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
β−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を同定する方法であって、
（ａ）推定のβ−カテニン：ＣＢＰ小分子抑制剤を、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と接触させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、β−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のβ−カテニンを含む部分（moiety）と前記工程（ａ）のＣＢＰ １−１１１を含む部分（moiety）との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分（moiety）と前記β−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するとの決定によって、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の抑制剤として同定する工程とを含む方法。
【請求項５９】
（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)（１）及びβ−カテニン（２）を含む混合物に接触させる工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の前記分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分（moiety）とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程とをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
β−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を同定する方法であって、
（ａ）推定のβ−カテニン：ＣＢＰの小分子抑制剤を、β−カテニンを含む部分と接触させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と接触させる工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と前記工程（ａ）のβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、β−カテニンを含む部分(moiety)とＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するか否かの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の抑制剤として同定する工程とを含む方法。
【請求項６１】
（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)（１）およびβ−カテニン（２）を含む混合物と接触させる工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の前記分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程とをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
β−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を同定する方法であって、
（ａ）推定のβ−カテニン：ＣＢＰ小分子抑制剤を、ＣＢＰ １−１１１と結合した(associated)β−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の前記分子が、β−カテニンからＣＢＰ １−１１０を分離させるかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）の前記小分子が、ＣＢＰ １−１１１からβ−カテニンの結合を分離させるとの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の抑制剤として同定する工程とを含む方法。
【請求項６３】
（ｄ）前記工程（ｃ）で同定されたβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)（１）およびβ−カテニン（２）を含む混合物に接触させる工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の前記分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｆ）前記工程（ｄ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程とをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
β−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を同定する方法であって、
（ａ）推定のβ−カテニン：ｐ３００小分子抑制剤を、ｐ３００ １−１１１を含む部分と接触させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、β−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のβ−カテニンを含む部分(moiety)と前記工程（ａ）のｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するとの決定によって、前記工程（ａ）の前記小分子をβ−カテニン：ｐ３００相互作用の抑制剤として同定する工程とを含む方法。
【請求項６５】
（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)（１）およびβ−カテニン（２）を含む混合物に接触させる工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の前記分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と前記β−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ｐ３００相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程とをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
β−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を同定する方法であって、
（ａ）推定のβ−カテニン：ｐ３００小分子抑制剤を、β−カテニンを含む部分と接触させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)と接触させる工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のｐ３００ １−１１１と含む部分(moiety)が前記工程（ａ）のβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、前記β−カテニンを含む部分(moiety)とｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するとの決定によって、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ｐ３００相互作用の抑制剤として同定する工程とを含む、方法。
【請求項６７】
（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)（１）およびβ−カテニン（２）を含む混合物に接触させる工程と、
（ｆ）工程（ｅ）の前記分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と前記β−カテニンとの結合を抑制しないことの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ｐ３００相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程とをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
β−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を同定する方法であって、
（ａ）推定のβ−カテニン：ｐ３００小分子抑制剤を、ｐ３００ １−１１１と結合したβ−カテニン（１）を含む部分(moiety)と接触させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の前記分子が、β−カテニンからｐ３００ １−１１１を分離させるかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）の前記小分子が、ｐ３００ １−１１１からβ−カテニンの結合を分離させるとの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ｐ３００相互作用の抑制剤として同定する工程とを含む方法。
【請求項６９】
（ｄ）前記工程（ｃ）で同定されたβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)（１）およびβ−カテニン（２）を含む混合物に接触させる工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の前記分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｆ）前記工程（ｄ）の前記小分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と前記β−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ｐ３００相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程とをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
配列番号：１または配列番号：１と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列（但し、前記配列は全長のＣＢＰタンパク質をコードしない）を含む、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項７１】
前記核酸分子は、前記配列番号：１と少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項７０に記載の核酸分子。
【請求項７２】
前記核酸分子は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項７０に記載の核酸分子。
【請求項７３】
前記核酸分子が、ＣＢＰタンパク質内に存在する、２００個以下の連続したアミノ酸残基を含むペプチドをコードする、請求項７０に記載の核酸分子。
【請求項７４】
前記核酸分子が、ＣＢＰタンパク質内に存在する、１５０個以下の連続したアミノ酸残基を含むペプチドをコードする、請求項７０に記載の核酸分子。
【請求項７５】
前記ペプチドが、配列番号：２または配列番号：５を含む、請求項７４に記載の核酸分子。
【請求項７６】
配列番号：１の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列（但し、前記配列は全長のＣＢＰタンパク質をコードしない）を含む、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項７７】
前記断片が９０〜３００核酸を有する、請求項７６に記載の核酸分子。
【請求項７８】
前記核酸分子が前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項７６に記載の核酸分子。
【請求項７９】
前記断片が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項７６に記載の核酸分子。
【請求項８０】
配列番号：２または配列番号：２と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドを含む、実質的に精製単離されたペプチド（但し、ペプチドは全長のＣＢＰタンパク質ではない）。
【請求項８１】
前記ペプチドが配列番号：２と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項８０に記載のペプチド。
【請求項８２】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項８０に記載のペプチド。
【請求項８３】
前記ペプチドが、ＣＢＰタンパク質内に存在する、連続したアミノ酸２００残基以下を含む、請求項８０に記載のペプチド。
【請求項８４】
前記ペプチドが、ＣＢＰタンパク質内に存在する、連続したアミノ酸１５０残基以下を含む、請求項８０に記載のペプチド。
【請求項８５】
前記ペプチドが配列番号：２または配列番号：４を含む、請求項８４に記載のペプチド。
【請求項８６】
配列番号：２の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む、実質的に精製単離されたペプチド（但し、前記ペプチドは全長のＣＢＰタンパク質ではない）。
【請求項８７】
前記断片が３０〜１００アミノ酸を有する、請求項８６に記載のペプチド。
【請求項８８】
前記ペプチドが前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項８６に記載のペプチド。
【請求項８９】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項８６に記載のペプチド。
【請求項９０】
配列番号：１または配列番号：１と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列（但し、前記配列は全長のＣＢＰタンパク質をコードしない）から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項９１】
前記核酸分子は配列番号：１と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項９０に記載の核酸分子。
【請求項９２】
前記核酸分子が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項９０に記載の核酸分子。
【請求項９３】
配列番号：１の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項９４】
前記断片は９０〜３００ヌクレオチドを有する、請求項９３に記載の核酸分子。
【請求項９５】
前記核酸分子が、前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項９３に記載の核酸分子。
【請求項９６】
前記断片が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項９３に記載の核酸分子。
【請求項９７】
配列番号：２または配列番号：２と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから本質的に構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項９８】
前記ペプチドが配列番号：２と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項９７に記載のペプチド。
【請求項９９】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項９７に記載のペプチド。
【請求項１００】
配列番号：２の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項１０１】
前記断片は３０〜１００アミノ酸を有する、請求項１００に記載のペプチド。
【請求項１０２】
前記ペプチドは前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１００に記載のペプチド。
【請求項１０３】
前記ペプチドはβ−カテニンに結合する、請求項１００に記載のペプチド。
【請求項１０４】
配列番号：１または配列番号：１と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項１０５】
前記核酸分子は配列番号：１と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１０４に記載の核酸分子。
【請求項１０６】
前記核酸分子がβ−カテニンに結合する、請求項１０４に記載の核酸分子。
【請求項１０７】
配列番号：１の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項１０８】
前記断片は９０〜３００ヌクレオチドを有する、請求項１０７に記載の核酸分子。
【請求項１０９】
前記核酸分子が前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１０７に記載の核酸分子。
【請求項１１０】
前記断片が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項１０７に記載の核酸分子。
【請求項１１１】
配列番号：２または配列番号：２と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項１１２】
前記ペプチドが配列番号：２と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１１１に記載のペプチド。
【請求項１１３】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項１１１に記載のペプチド。
【請求項１１４】
配列番号：２の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項１１５】
前記断片は３０〜１００アミノ酸を有する、請求項１１４に記載のペプチド。
【請求項１１６】
前記ペプチドは前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１１４に記載のペプチド。
【請求項１１７】
前記ペプチドはβ−カテニンに結合する、請求項１１４に記載のペプチド。
【請求項１１８】
配列番号：３または配列番号：３と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列（但し、前記配列は全長のｐ３００タンパク質をコードしない）を含む、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項１１９】
前記核酸分子は配列番号：３と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１１８に記載の核酸分子。
【請求項１２０】
前記核酸分子が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項１１８に記載の核酸分子。
【請求項１２１】
前記核酸分子が、ｐ３００タンパク質内に存在する、２００個以下の連続したアミノ酸残基を含むペプチドをコードする、請求項１１８に記載の核酸分子。
【請求項１２２】
前記核酸分子が、ｐ３００タンパク質内に存在する、１５０個以下の連続したアミノ酸残基を含むペプチドをコードする、請求項１１８に記載の核酸分子。
【請求項１２３】
前記ペプチドが配列番号：４を含む、請求項１２２に記載の核酸分子。
【請求項１２４】
配列番号：３の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列（但し、前記配列は全長のｐ３００タンパク質をコードしない）を含む、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項１２５】
前記断片は９０〜３００ヌクレオチドを有する、請求項１２４に記載の核酸分子。
【請求項１２６】
前記核酸分子は、前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１２４に記載の核酸分子。
【請求項１２７】
前記断片は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項１２４に記載の核酸分子。
【請求項１２８】
配列番号：４または配列番号：４と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドを含む、実質的に精製単離されたペプチド（但し、ペプチドは全長のｐ３００タンパク質ではない）。
【請求項１２９】
前記ペプチドが配列番号：４と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１２８に記載のペプチド。
【請求項１３０】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項１２８に記載のペプチド。
【請求項１３１】
前記ペプチドが、ｐ３００タンパク質内に存在する、連続したアミノ酸２００残基以下を含む、請求項１２８に記載のペプチド。
【請求項１３２】
前記ペプチドが、ｐ３００タンパク質内に存在する、連続したアミノ酸１５０残基以下を含む、請求項１２８に記載のペプチド。
【請求項１３３】
前記ペプチドが配列番号：４を含む、請求項１３２に記載のペプチド。
【請求項１３４】
配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む、実質的に精製単離されたペプチド（但し、ペプチドは全長のｐ３００タンパク質ではない）。
【請求項１３５】
前記断片が３０〜１００アミノ酸を有する、請求項１３４に記載のペプチド。
【請求項１３６】
前記ペプチドが前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１３４に記載のペプチド。
【請求項１３７】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項１３４に記載のペプチド。
【請求項１３８】
配列番号：３または配列番号：３と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項１３９】
前記核酸分子が配列番号：３と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１３８に記載の核酸分子。
【請求項１４０】
前記核酸分子が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項１３８に記載の核酸分子。
【請求項１４１】
配列番号：３の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製分離された核酸分子。
【請求項１４２】
前記断片が９０〜３００ヌクレオチドを有する、請求項１４１に記載の核酸分子。
【請求項１４３】
前記核酸分子が前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１４１に記載の核酸分子。
【請求項１４４】
前記断片が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項１４１に記載の核酸分子。
【請求項１４５】
配列番号：４または配列番号：４と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから本質的に構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項１４６】
前記ペプチドが配列番号：４と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１４５に記載のペプチド。
【請求項１４７】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項１４５に記載のペプチド。
【請求項１４８】
配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項１４９】
前記断片は３０〜１００アミノ酸を有する、請求項１４８に記載のペプチド。
【請求項１５０】
前記ペプチドは前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１４８に記載のペプチド。
【請求項１５１】
前記ペプチドはβ−カテニンに結合する、請求項１４８に記載のペプチド。
【請求項１５２】
配列番号：３または配列番号：３と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項１５３】
前記核酸分子が、配列番号：３と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１５２に記載の核酸分子。
【請求項１５４】
前記核酸分子が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項１５２に記載の核酸分子。
【請求項１５５】
配列番号：３の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項１５６】
前記断片が９０〜３００ヌクレオチドを有する、請求項１５５に記載の核酸分子。
【請求項１５７】
前記核酸分子が前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１５５に記載の核酸分子。
【請求項１５８】
前記断片が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項１５５に記載の核酸分子。
【請求項１５９】
配列番号：４または配列番号：４と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項１６０】
前記ペプチドが配列番号：４と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１５９に記載のペプチド。
【請求項１６１】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項１５９に記載のペプチド。
【請求項１６２】
配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項１６３】
前記断片は３０〜１００アミノ酸を有する、請求項１６２に記載のペプチド。
【請求項１６４】
前記ペプチドは前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１６２に記載のペプチド。
【請求項１６５】
前記ペプチドはβ−カテニンに結合する、請求項１６２に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−カテニン／ＴＣＦ活性化転写の調節、例えばＷｎｔ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子の選択的抑制のための化合物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、正常発達ならびに癌の開始及び進行の双方において重要な情報伝達増幅経路を開始させる(非特許文献１〜４：Wodarz et al., "Mechanisms of Wnt signaling in development," Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14:59-88 (1998); Morin, P.J., "Beta-catenin signaling and cancer," Bioessays 21:1021-30 (1999); Moon et al., "The promise and perils of Wnt signaling through beta-catenin," Science 296:1644-46 (2002); Oving et al., "Molecular causes of colon cancer," Eur. J. Clin. Invest. 32:448-57 (2002))。この経路の特徴は、多機能タンパク質であるβ−カテニンの転写における役割を活性化させることにある。正常細胞において、β−カテニンの大多数は、細胞接着において重要な役割を担うカドヘリン(cadherin)に結合した状態細胞膜で発見される。β−カテニンの別のプール(pool)は、転写を調節する細胞質及び核で発見される(非特許文献５：Gottardi et al., "Adhesion signaling: how beta-catenin interacts with its partners," Curr. Biol. 11:R792-4 (2001))。形質膜(plasma membrane)で細胞接着のメディエータとしておよび転写活性因子としての様々な役割において、β−カテニンは多数のタンパク質と相互作用し、それらの大部分は相当な配列相同性が欠如しているにも拘わらず、β−カテニンの同じアルマジロリピート(armadillo-repeats)に対して競合する。突然変異の研究と共に、結晶構造は多様なアルマジロリピートに対する様々なタンパク質のβ−カテニン結合部位をマッピング(mapping)した(非特許文献６および７：Gottardi et al., "Adhesion signaling: how beta-catenin interacts with its partners," Curr. Biol. 11:R792-4 (2001); Huber et al., "The structure of the beta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverse ligand recognition by beta-catenin," Cell 105:391-402 (2001)) 。
【０００３】
β−カテニンの細胞質プールは、例えば、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）、カゼインキナーゼ−１α（ＣＫ−１α）、骨格タンパク質(scaffold protein)、アキシン(Axin)、および腫瘍抑制因子、大腸腺腫症（ＡＰＣ）を含む「分解複合体(destruction complex)」によるリン酸化によって調節される(非特許文献８：Behrens J., "Control of beta-catenin signaling in tumor development," Ann. N. Y. Acad. Sci. 910:21-33 (2000); discussion 33-5)。Ｗｎｔ情報伝達がなければ、リン酸化は、細胞質のβ−カテニンをＳｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ−Ｆボックス（ＳＣＦ）−指向ユビキチン化(ubiquitination)及びプロテオソームの分解するためのしるしとなる。Ｗｎｔ経路の活性化は、ＧＳＫ−３βの機能を不活化し、β−カテニンのリン酸化を妨げ、その結果β−カテニンが細胞質に蓄積され、次いで転写活性複合体を形成し且つ標的遺伝子の発現を生じさせる核に移動される。標的遺伝子を活性化させる重要な段階は、β−カテニン及び転写因子のＴ細胞因子（ＴＣＦ）／リンパ系増強因子（ＬＥＦ−１）ファミリーの構成員との複合体の形成である(非特許文献９：Brantjes et al., "TCF: Lady Justice casting the final verdict on the outcome of Wnt signaling," Biol. Chem. 383:255-61 (2002))。転写活性複合体を発生させるために、β−カテニンは、基本的な転写機構類の別の構成要素とともに、転写コアクチベーターであるＣＲＥＢ−結合タンパク質（ＣＢＰ）またはその密接に関連している相同体(homolog)ｐ３００ (非特許文献１０および１１：Hecht et al., "The p300/CBP acetyltransferases function as transcriptional coactivators of beta-catenin in vertebrates," EMBO J. 19:1839-50 (2000); Takemaru et al., "The transcriptional coactivator CBP interacts with beta-catenin to activate gene expression," J. Cell Biol. 149:249-54 (2000))を補充する。
【０００４】
β−カテニン／ＴＣＦ複合体がＷｎｔ反応遺伝子の転写を活性化させる正確なメカニズムは不明であるが、転写活性作用に関与するβ−カテニンドメインはＮＨ2−及びＣＯＯＨ−の末端にマッピングされている(非特許文献１２：Staal et al., "Wnt signals are transmitted through N-terminally dephosphorylated beta-catenin," EMBO 3:63-68 (2002))。β−カテニンのＣＯＯＨ−末端領域は、約１００アミノ酸からなり、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）と相互作用することが知られている(非特許文献１３：Hecht et al., "Functional characterization of multiple transactivating elements in beta-catenin, some of which interact with the TATA-binding protein in vitro," J. Biol. Chem. 274:18017-25 (1999))。ＬＥＦ−１に融合させるとき、ＣＯＯＨ−末端は、転写活性作用(transactivation)を促進させるのに十分である(非特許文献１４：Vleminckx et al., "The C-terminal transactivation domain of beta-catenin is necessary and sufficient for signaling by the LEF-1/beta-catenin complex in Xenopus laevis," Mech. Dev. 81:65-74 (1999))。β−カテニンのＮＨ2−末端部分(portion)は、プロテオソームの分解(degradation)に必要なＧＳＫ−３βリン酸化部位を含む約１３０アミノ酸から構成される。
【０００５】
Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、通常、増殖及び分化の増進に関与する各種遺伝子の発現を調節する。しかし、大腸癌の８５％以上で、分解複合体の構成成分の一つであるＡＰＣ及び／またはβ−カテニン自体が突然変異して、核のβ−カテニン及び標的遺伝子の構造的活性(constitutive activation)の増加をもたらす(非特許文献１５：Fearnhead et al., "Genetics of colorectal cancer: hereditary aspects and overview of colorectal tumorigenesis," Br. Med. Bull. 64:27-43 (2002))。細胞の増殖、増殖及び分化に重要な役割を担うｃｙｃｌｉｎ Ｄ１(非特許文献１６および１７Shtutman et al., "The cyclin D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5522-27 (1999); Tetsu et al., "Beta-catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells," Nature 398:422-26 (1999))およびｃ−ｍｙｃ(非特許文献１８：He et al., "Identification of c-MYC as a target of the APC pathway," Science 281:1509-12 (1998))を含むこれら多くの遺伝子は、ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ(非特許文献１９：Crawford et al., "The metalloproteinase matrilysin is a target of beta-catenin transactivation in intestinal tumors," Oncogene 18:2883-91 (1999))、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ(非特許文献２０：Gradl et al., "The Wnt/Wg signal transducer beta-catenin controls fibronectin expression," Mol. Cell. Biol. 19:5576-87 (1999))、ＣＤ４４(非特許文献２１：Wielenga et al., "Expression of CD44 in Apc and Tcf mutant mice implies regulation by the WNT pathway," Am. J. Pathol. 154:515-23 (1999))、及びμＰＡＲ(非特許文献２２：Mann et al., "Target genes of beta-catenin-T cell-factor/lymphoid-enhancer-factor signaling in human colorectal carcinomas," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1603-08 (1999))などの浸潤性(invasive)増殖に必要な遺伝子と共に不適当に活性化される。
【非特許文献１】Wodarz et al., "Mechanisms of Wnt signaling in development," Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14:59-88 (1998)
【非特許文献２】Morin, P.J., "Beta-catenin signaling and cancer," Bioessays 21:1021-30 (1999)
【非特許文献３】Moon et al., "The promise and perils of Wnt signaling through beta-catenin," Science 296:1644-46 (2002)
【非特許文献４】Oving et al., "Molecular causes of colon cancer," Eur. J. Clin. Invest. 32:448-57 (2002)
【非特許文献５】Gottardi et al., "Adhesion signaling: how beta-catenin interacts with its partners," Curr. Biol. 11:R792-4 (2001)
【非特許文献６】Gottardi et al., "Adhesion signaling: how beta-catenin interacts with its partners," Curr. Biol. 11:R792-4 (2001)
【非特許文献７】Huber et al., "The structure of the beta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverse ligand recognition by beta-catenin," Cell 105:391-402 (2001)
【非特許文献８】Behrens J., "Control of beta-catenin signaling in tumor development," Ann. N. Y. Acad. Sci. 910:21-33 (2000); discussion 33-5)
【非特許文献９】Brantjes et al., "TCF: Lady Justice casting the final verdict on the outcome of Wnt signaling," Biol. Chem. 383:255-61 (2002)
【非特許文献１０】Hecht et al., "The p300/CBP acetyltransferases function as transcriptional coactivators of beta-catenin in vertebrates," EMBO J. 19:1839-50 (2000)
【非特許文献１１】Takemaru et al., "The transcriptional coactivator CBP interacts with beta-catenin to activate gene expression," J. Cell Biol. 149:249-54 (2000)
【非特許文献１２】Staal et al., "Wnt signals are transmitted through N-terminally dephosphorylated beta-catenin," EMBO 3:63-68 (2002)
【非特許文献１３】Hecht et al., "Functional characterization of multiple transactivating elements in beta-catenin, some of which interact with the TATA-binding protein in vitro," J. Biol. Chem. 274:18017-25 (1999)
【非特許文献１４】Vleminckx et al., "The C-terminal transactivation domain of beta-catenin is necessary and sufficient for signaling by the LEF-1/beta-catenin complex in Xenopus laevis," Mech. Dev. 81:65-74 (1999)
【非特許文献１５】Fearnhead et al., "Genetics of colorectal cancer: hereditary aspects and overview of colorectal tumorigenesis," Br. Med. Bull. 64:27-43 (2002)
【非特許文献１６】Shtutman et al., "The cyclin D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5522-27 (1999)
【非特許文献１７】Tetsu et al., "Beta-catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells," Nature 398:422-26 (1999)
【非特許文献１８】He et al., "Identification of c-MYC as a target of the APC pathway," Science 281:1509-12 (1998)
【非特許文献１９】Crawford et al., "The metalloproteinase matrilysin is a target of beta-catenin transactivation in intestinal tumors," Oncogene 18:2883-91 (1999)
【非特許文献２０】Gradl et al., "The Wnt/Wg signal transducer beta-catenin controls fibronectin expression," Mol. Cell. Biol. 19:5576-87 (1999)
【非特許文献２１】Wielenga et al., "Expression of CD44 in Apc and Tcf mutant mice implies regulation by the WNT pathway," Am. J. Pathol. 154:515-23 (1999)
【非特許文献２２】Mann et al., "Target genes of beta-catenin-T cell-factor/lymphoid-enhancer-factor signaling in human colorectal carcinomas," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1603-08 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
結腸直腸癌の大部分がβ−カテニン情報伝達経路の活性に関与しており、複数の突然変異がこの活性をもたらすということから、β−カテニンの核における機能を遅延させる薬物に対する明確な必要性がある。本発明は、β−カテニン／ＴＣＦ媒介転写に拮抗する(antagonize)薬剤を提供し、後述の関連した利点をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要約すると、本発明は、β−カテニン／ＴＣＦ媒介転写に拮抗する薬剤およびそれらの使用方法を提供する。一形態において、本発明は、β−カテニン／ＴＣＦ―反応性遺伝子のサブセットが特異的に下方制御される方法を提供し、一方、関連形態において、本発明は、前記方法に有用な化合物を提供する。別の形態において、本発明は、ＣＢＰおよびβ−カテニン間の結合が破壊されるが、構造的に関連したコアクチベーター(coactivator)であるｐ３００およびβ−カテニン間の結合は破壊されない方法を提供し、一方、関連した形態において、前記方法に有用な化合物を提供する。別の形態において、本発明は、ＣＢＰによって促進(promoted)されるがｐ３００によっては促進されない遺伝子を選択的に活性化させる方法を提供し、関連形態では、本発明は、この方法に有用な化合物を提供する。また、本発明は、ｐ３００によって促進されるがＣＢＰによっては促進されない遺伝子を選択的に活性化させる方法を提供し、関連形態において、本発明は、この方法に有用な化合物を提供する。別の形態において、本発明は、細胞周期のＧ1−期で発達を停止させるために、癌腫(carcinoma)細胞を化学薬剤(chemical agent)で処理する方法を提供する。この化学薬剤による長期処理は、正常大腸細胞では検出されないアポトーシス(apoptosis)を誘導する。癌腫細胞は、例えば大腸、乳房、前立腺などである。
【０００８】
例えば、一形態において、本発明は、β−カテニンにより誘導される遺伝子の発現を調節する方法を提供する。前記方法は、組成物を薬剤と接触させることを含み、前記組成物は、β−カテニン、ＣＢＰおよびｐ３００を含み、前記β−カテニンは、ｐ３００に対するＣＢＰへの結合可能性が高い。前記薬剤は、ｐ３００に対するＣＢＰへのβ−カテニンの結合可能性を変化させるために有効な量で組成物内に存在する。言い換えれば、前記薬剤がなければ、β−カテニンは、薬剤が存在するときと比較して異なる割合でＣＢＰおよびｐ３００に結合する。例えば、化学構造に応じて、前記薬剤は、下記のことを行うことができる：β−カテニンに対するＣＢＰの結合を増加させること、この際、任意にβ−カテニンに対するｐ３００の結合を減少させる；またはβ−カテニンに対するｐ３００の結合を増加させること、この際、任意にβ−カテニンに対するＣＢＰの結合を減少させる。前記方法は、生体内または生体外で行われる。一形態において、前記方法は生体外で行われ、その組成物は幹細胞を含む。別の形態において、前記方法は生体内で行われ、その組成物は哺乳動物内にある。本発明の方法は、様々な病状の治療に使用できる。例えば、本発明の様々な形態において：哺乳動物が癌に罹患し、その量が癌の治療に有効であり；組成物が細胞内にあり、その薬剤は細胞分化する可能性を増加させ；組成物が細胞内にあり、その薬剤は細胞が増殖する可能性を増加させる。
【０００９】
別の形態において、本発明は、β−カテニン、ＣＢＰ、ｐ３００および薬剤を含む組成物を提供する。β−カテニンは、ｐ３００に対するＣＢＰへの結合可能性が高く、前記薬剤は、ｐ３００に対するＣＢＰへのβカテニンの結合可能性を変更し得るために有効な量で組成物内に存在する。言い換えれば、前記薬剤がなければ、β−カテニンは、薬剤が存在するときに観察される割合とは異なる割合でＣＢＰおよびｐ３００に結合する。例えば、化学構造に応じて、前記薬剤は、下記のことを行うことができる：β−カテニンに対するＣＢＰの結合を増加させ、この際、任意にβ−カテニンに対するｐ３００の結合を減少させる；またはβ−カテニンに対するｐ３００の結合を増加させること、この際、任意にΒ−カテニンに対するＣＢＰの結合を減少させる。前記組成物は、生体内または生体外に存在することができる。一形態において、前記組成物は生体外に存在し、その組成物は幹細胞をさらに含む。別の形態において、前記組成物は生体内に存在し、その組成物は哺乳動物、例えばマウスの内部にある。
【００１０】
別の形態において、本発明は、以下の工程を含むＷｎｔ経路の活性を調節する方法を提供する：（ａ）Ｗｎｔ経路の構成成分を、Ｗｎｔ経路を活性化させる化合物と接触させ、活性化されたＷｎｔ経路とする工程、および（ｂ）前記活性化されたＷｎｔ経路を、ｐ３００およびカテニン間の結合を完全にまたは実質的に妨げるが、ＣＢＰおよびカテニン間の結合は殆どまたは全く妨げない化学薬剤と接触させる工程。任意に、前記Ｗｎｔ経路は細胞内に存在する。任意に、前記方法は生体外で行われる。任意に、Ｗｎｔ経路を活性化させる前記化合物は、ＬｉＣｌおよびＧＳＫ抑制剤から選択される。
【００１１】
別の形態において、本発明は、下記の工程を含む細胞増殖を調節する方法を提供する：（ａ）細胞集団(cell population)を、集団の一部は増殖し、一部は分化する条件下とし、および（ｂ）集団に化学薬剤を添加し、この際、前記薬剤は、分化する細胞の割合に対して増殖する細胞の割合を増加させる。前記方法の様々な任意の実施態様において：前記化合物はｐ３００及びカテニン間の結合を妨げる；前記方法はＷｎｔ経路を活性化させる薬剤を集団に添加することを含む；細胞集団は幹細胞の集団である；前記方法は生体外で行われる；前記方法は、例えば、集団内の細胞が分化して血液細胞を形成するか、または集団内の細胞が分化して神経細胞を形成する細胞集団の分化を起こす薬剤を添加することをさらに含む。
【００１２】
別の形態において、本発明は、未分化状態の幹細胞を維持させる方法であって、幹細胞を、細胞分化を抑制するか、または細胞増殖を増進させる薬剤と、未分化状態の幹細胞を維持するために有効な量で接触させることを含む方法を提供する。ある実施態様において、前記方法で使用される薬剤は、β−カテニン／ＣＢＰ相互作用に対してβ−カテニン／ｐ３００相互作用を選択的に抑制する。
【００１３】
つまり、別の形態において、本発明は下記の方法を提供する：
β−カテニン／ｐ３００相互作用に対してβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用を選択的に抑制する方法であって、前記方法は、化合物を組成物に投与することを含み、前記組成物はβ−カテニン、ＣＢＰ及びｐ３００を含み、前記化合物はβ−カテニン／ｐ３００相互作用に対してβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用を選択的に抑制する方法；
β−カテニン／ＣＢＰ相互作用に対してβ−カテニン／ｐ３００相互作用を選択的に抑制する方法であって、前記方法は化合物を組成物に投与することを含み、その組成物はβ−カテニン、ＣＢＰ及びｐ３００を含み、その化合物はβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用に対してβ−カテニン／ｐ３００相互作用を選択的に抑制する方法；
核から細胞質へβ−カテニンの転位(translocation)を促進させる方法であって、前記方法は化合物を細胞に投与することを含み、前記細胞は核及び細胞質を含み、前記核はβ−カテニンを含み、前記化合物は核から細胞質へのβ−カテニンの転位を起こす方法；
ＷＮＴ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子の発現を選択的に抑制する方法であって、前記方法は化合物を組成物に投与することを含み、前記組成物はＷＮＴ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子を含み、前記化合物はＷＮＴ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子の発現の変化させる方法。
【００１４】
本発明の方法及び組成物において、前記化学薬剤は、式（I）の化合物及びその立体異性体から任意に選択される：
【００１５】
【化１】
2007503816.tif 000003
【００１６】
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；そしてＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、アミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基からそれぞれ独立に選択される。
【００１７】
ある実施態様において、式（Ｉ）のＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、アミノＣ2-5アルキル、グアニジノＣ2-5アルキル、Ｃ1-4アルキルグアニジノＣ2-5アルキル、ジＣ1-4アルキルグアニジノＣ2-5アルキル、アミジノＣ2-5アルキル、Ｃ1-4アルキルアミジノＣ2-5アルキル、ジＣ1-4アルキルアミジノＣ2-5アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、フェニル、置換フェニル（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ベンジル、置換ベンジル（ここで、ベンジル上の置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ナフチル、置換ナフチル（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ビス−フェニルメチル、置換ビス−フェニルメチル（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリジル、置換ピリジル、（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリジルＣ1-4アルキル、置換ピリジルＣ1-4アルキル（ここで、ピリジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリミジルＣ1-4アルキル、置換ピリミジルＣ1-4アルキル（ここで、ピリミジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ又はニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、トリアジン−２−イル−Ｃ1-4アルキル、置換トリアジン−２−イル−Ｃ1-4アルキル（ここで、トリアジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、イミダゾールＣ1-4アルキル、置換イミダゾールＣ1-4アルキル（ここで、イミダゾール置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、イミダゾリニルＣ1-4アルキル、Ｎ−アミジノピペラジニル−Ｎ−Ｃ0-4アルキル、ヒドロキシＣ2-5アルキル、Ｃ1-5アルキルアミノＣ2-5アルキル、ヒドロキシＣ2-5アルキル、Ｃ1-5アルキルアミノＣ2-5アルキル、Ｃ1-5ジアルキルアミノＣ2-5アルキル、Ｎ−アミジノピペリジニルＣ1-4アルキルおよび４−アミノシクロヘキシルＣ0-2アルキルから独立に選択される。
【００１８】
ある実施態様において、Ａが−（ＣＨＲ3）−であり、Ｂが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄが−（ＣＨＲ5）−であり、Ｅが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇが−（ＸＲ7）n−であり、前記化合物は下記一般式（II）を有する：
【００１９】
【化２】
2007503816.tif 000004
【００２０】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ7、Ｗ、Ｘおよびｎは、式（I）で定義したとおりである。
【００２１】
ある実施態様において、Ａが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが−（ＣＨＲ4）−であり、Ｄが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅが−（ＺＲ6）−であり、Ｇが−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−であり、前記化合物は下記一般式（III）を有する：
【００２２】
【化３】
2007503816.tif 000005
【００２３】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ9、ＷおよびＸは、式（I）で定義したとおりであり、Ｚは窒素またはＣＨ（ＺがＣＨであれば、Ｘは窒素である）である。
【００２４】
ある実施態様において、Ａが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが−（ＣＨＲ4）−であり、Ｄが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅが−（ＺＲ6）−であり、Ｇが（ＸＲ7）n−であり、前記化合物は下記一般式（IV）を有する：
【００２５】
【化４】
2007503816.tif 000006
【００２６】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｗ、Ｘ及びｎは、式（I）で定義したとおりであり、Ｚは窒素またはＣＨ（Ｚが窒素であれば、ｎは０であり、またＺがＣＨであれば、Ｘは窒素であり、ｎは０ではない）である。
【００２７】
ある実施態様において、前記化合物は下記一般式（VI）を有する：
【００２８】
【化５】
2007503816.tif 000007
【００２９】
式中、Ｒaは、窒素、酸素または硫黄から選択される１〜３個のヘテロ原子を持つことが可能な８〜１１員環の二環式(bicyclic)アリール基であり、Ｒbは、５〜７員環の単環式アリール基であって、窒素、酸素または硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を持つことができ、化合物中のアリール環がハロゲン化物、ヒドロキシ、シアノ、低級アルキル、及び低級アルコキシ基からなる群から選択される1以上の置換基を有してもよい。任意に、Ｒaはナフチル、キノリニルまたはイソキノリニル基であり、Ｒbはフェニル、ピリジルまたはピペリジルであり、これらすべてはハロゲン化合物、ヒドロキシ、シアノ、低級アルキル、および低級アルコキシ基からなる群から選択される少なくとも一つの置換基で置換されてもよい。ある実施態様において、Ｒaはナフチルであり、Ｒbはフェニルであり、ハロゲン化物、ヒドロキシ、シアノ、低級アルキル、及び低級アルコキシ基からなる群から選択される1以上の置換基で置換されてもよい。
【００３０】
ある実施態様において、前記化合物は化合物１、３、４及び５から選択される。
【００３１】
別の実施態様において、本発明は、スクリーニングする方法、すなわち、生物学的に活性な化合物が同定される方法及び／またはそれらの効用が評価できる方法を提供する。例えば、本発明は、下記の工程を含むβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を同定する方法を提供する、：（ａ）推定のβ−カテニン：ＣＢＰの小分子抑制剤を、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と接触させる工程；（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、β−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程；（ｃ）分析手段によって、前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のβ−カテニンを含む部分（moiety）と工程（ａ）のＣＢＰ １−１１１を含む部分（moiety）との結合を抑制するかどうかを決定する工程、および、（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子がＣＢＰ １−１１１を含む部分（moiety）とβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するとの決定によって、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の抑制剤として同定する工程。
【００３２】
任意に、前記方法は、下記の工程をさらに含むことができる：（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、（１）ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)及び（２）β−カテニンを含む混合物に接触させる工程と、（ｆ）分析手段によって、前記工程（ｅ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを決定する工程と、及び（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分（moiety）と前記β−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程。
【００３３】
本発明は、また、下記の工程を含む、β−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤の同定方法を提供する：（ａ）推定のβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、β−カテニンを含む部分と接触させる工程と；（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と接触させる工程と；（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と前記工程（ａ）のβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程と、（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、β−カテニンを含む部分(moiety)とＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するとの決定によって、前記工程（ａ）の小分子がβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の抑制剤であるか否かを同定する工程。
【００３４】
任意に、前記方法は、下記の工程をさらに含むことができる：（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、（１）ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)および（２）β−カテニンを含む混合物と接触させる工程；（ｆ）前記工程（ｅ）の前記分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程。
【００３５】
本発明は、また、下記の工程を含むβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を同定する方法を提供する：（ａ）推定のβ−カテニン：ＣＢＰ小分子抑制剤を、（１）ＣＢＰ １−１１１と結合した(associated)β−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程；（ｂ）前記工程（ａ）の前記分子が、β−カテニンからＣＢＰ １−１１１を分離させるかどうかを分析手段によって決定する工程；及び（ｃ）前記工程（ａ）の前記小分子がＣＢＰ １−１１１とβ−カテニンの結合を分離させるとの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の抑制剤として同定する工程。
【００３６】
任意に、前記方法は、下記の工程をさらに含むことができる：（ｄ）前記工程（ｃ）で同定されたβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、（１）ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)および（２）β−カテニンを含む混合物と接触させる工程；（ｅ）前記工程（ｄ）の前記分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｆ）前記工程（ｄ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程。
【００３７】
本発明は、また、下記の工程を含むβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を同定する方法を提供する：（ａ）推定のβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、ｐ３００ １−１１１を含む部分と接触させる工程；（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、β−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程；（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のβ−カテニンを含む部分(moiety)と前記工程（ａ）のｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するかの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ｐ３００相互作用の抑制剤として同定する工程。
【００３８】
任意に、前記方法は、下記の工程をさらに含むことができる：（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、（１）ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)および（２）β−カテニンを含む混合物と接触させる工程；（ｆ）前記工程（ｅ）の前記分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ｐ３００相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程。
【００３９】
本発明は、また、下記の工程を含むβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を同定する方法を提供する：（ａ）推定のβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、β−カテニンを含む部分と接触させる工程；（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)と接触させる工程；（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)と前記工程（ａ）のβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、β−カテニンを含む部分(moiety)とｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するとの決定によって、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ｐ３００相互作用の抑制剤として同定する工程。
【００４０】
任意に、前記方法は、下記の工程をさらに含むことができる：（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、（１）ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)および（２）β−カテニンを含む混合物に接触させる工程；（ｆ）前記工程（ｅ）の前記分子が、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、ＣＢＰ １−１１１を含む部分とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ｐ３００相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程。
【００４１】
本発明は、また、下記の工程を含むβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を同定する方法を提供する：（ａ）推定のβ−カテニン：ｐ３００小分子抑制剤を、（１）ｐ３００ １−１１１と結合したβ−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程；（ｂ）前記工程（ａ）の前記分子が、β−カテニンからｐ３００ １−１１１を分離させるかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、β−カテニンからｐ３００ １−１１１を分離させるとの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ｐ３００相互作用の抑制剤として同定する工程。
【００４２】
任意に、前記方法は、下記の工程をさらに含むことができる：（ｄ）前記工程（ｃ）で同定されたβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、（１）ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)および（２）β−カテニンを含む混合物に接触させる工程；（ｅ）前記工程（ｄ）の前記分子が、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｆ）前記工程（ｄ）の前記小分子が、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ｐ３００相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程。
【００４３】
別の形態において、本発明は、核酸およびペプチド配列を提供し、これらの配列は、例えば、治療剤としてまたはスクリーニング方法において有用である。したがって、様々な代表的形態において、本発明は、下記のものを提供する：
配列番号：１または配列番号：１と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はＣＢＰタンパク質をコードしない；
配列番号：１の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はＣＢＰタンパク質をコードしない；
配列番号：２または配列番号：２と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドを含む実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはＣＢＰタンパク質ではない；
配列番号：２の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはＣＢＰタンパク質ではない；
配列番号：１または配列番号：１と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はＣＢＰタンパク質をコードしない；
配列番号：１の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はＣＢＰタンパク質をコードしない；
配列番号：２または配列番号：２と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから本質的に構成される、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはＣＢＰタンパク質ではない；
配列番号：２の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成されるペプチド、実質的に精製単離された配列、但し前記ペプチドはＣＢＰタンパク質ではない；
配列番号：１または配列番号：１と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はＣＢＰタンパク質をコードしない；
配列番号：１の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はＣＢＰタンパク質をコードしない；
配列番号：２または配列番号：２と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから構成される、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはＣＢＰタンパク質ではない；
配列番号：２の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはＣＢＰタンパク質ではない；
配列番号：３または配列番号：１と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はｐ３００タンパク質をコードしない；
配列番号：３の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はｐ３００タンパク質をコードしない；
配列番号：４または配列番号：４と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドを含む、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはｐ３００タンパク質ではない；
配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはｐ３００タンパク質ではない；
配列番号：３または配列番号：３と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はｐ３００タンパク質をコードしない；
配列番号：３の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はｐ３００タンパク質をコードしない；
配列番号：４または配列番号：２と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから本質的に構成される、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはｐ３００タンパク質ではない；
配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはｐ３００タンパク質ではない；
配列番号：３または配列番号：３と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はｐ３００タンパク質をコードしない；
配列番号：３の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はｐ３００タンパク質をコードしない；
配列番号：４または配列番号：２と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから構成される、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはｐ３００タンパク質ではない；
配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはｐ３００タンパク質ではない；
これらおよび本発明の関連した形態は、下記にさらに詳しく述べられる。
【００４４】
（図面の簡単な説明）
図１．化合物１はβ−カテニン／ＴＣＦ転写を抑制する。
【００４５】
Ａ（ｉ）およびＡ（ii）．化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、および化合物５の構造。
【００４６】
Ｂ（ｉ）およびＢ（ii）．化合物１はβ−カテニン／ＴＣＦレポーター遺伝子構築物(reporter gene construct)を５μＭのＩＣ50で選択的に抑制する。ＳＷ４８０細胞（１０5）（図１Ｂ（ｉ））は、β−カテニン／ＴＣＦルシフェラーゼ構築物でトランスフェクションされた。細胞は、化合物１（１〜６４μＭ）で処理された。処理２４時間後に溶解質(lysate)が調製され、デュアルルシフェラーゼ分析(dual luciferase assay)を行った。データを図１Ｂ（ii）に相異なる形で示す。
【００４７】
Ｃ．化合物１はＮＦＡＴレポーター構築物に影響を及ぼさない。ＮＦＡＴレポーター構築物で安定的にトランスフェクションされたＪｕｒｋａｔ細胞（右側パネル）は、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）／イオノマイシン(Ionomycin)（１μｇ／ｍＬ）で刺激され、化合物１（０．７８１〜５０μＭ）で処理された。処理２４時間後、溶解質(lysate)が調製され、デュアルルシフェラーゼ分析が行われた。全ての実験は２回ずつ行われ、その値は平均＋／−標準偏差で示した。
【００４８】
Ｄ．ＣＢＰは化合物１の分子標的である。ＳＷ４８０の核抽出物は、化合物２（２５μｍ）でコートされたストレプトアビジン−アガロースビーズと共に培養された。ビーズは３回洗浄され、溶離されたものは抗−ＣＢＰ抗体と共にゲル電気泳動および免疫ブロットを行った。矢印は、ＣＢＰに対する免疫活性により、大きさが対応するバンドを示す。
【００４９】
Ｅ．14Ｃ標識化合物１はＣＢＰに結合する。化合物１は、14Ｃ標識チロシンの挿入によって調製された。ＳＷ４８０細胞は、全長のＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ β−カテニンを発現するベクター（２．２μｇ）または全長のマウスＣＢＰを発現するベクター（１．１μｇ）でトランスフェクションされた。５０μｇの核溶解質（ＮＥ−ＰＥＲ ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）が２０μＭの14Ｃ標識化合物１（７．１６×１０4ＣＰＭ）でＤＭＳＯ（０．５％）または１００μＭおよび２００μＭの冷化合物１で処理された。結合していない14Ｃ標識化合物１を除去するために、溶解質は、Ｇ−２５ １ｃｃカラム（Pharmacia）を用いて脱塩(desalt)され、14Ｃ標識化合物１の挿入が測定された。
【００５０】
図２．ＣＢＰの最初の１１１アミノ酸は化合物１に特異的に結合するが、ｐ３００には結合しない。
【００５１】
Ａ．ＣＢＰの野生型およびＣＢＰの欠損(deletion)構築物の模式図。
【００５２】
Ｂ．ＣＢＰ（１−１１１）は、化合物１の最小結合ドメインを含む。ＳＷ４８０細胞内におけるＣＢＰ欠損構築物の発現レベルが示される（上部パネル）。１０μｇの総タンパク質は、電気泳動され、抗−Ｈｉｓ抗体を用いて免疫ブロットされた。ＣＢＰ欠損構築物を発現するＳＷ４８０細胞の細胞溶解質全体は、１００μＭの化合物２でコートされたストレプトアビジン−アガロースビーズに結合した。結合した分画(fraction)は、電気泳動及び抗−Ｈｉｓ抗体を用いて免疫ブロットされた（下部パネル）。矢印は、化合物２でコートされたビーズに結合したままで残っている構築物を示す。
【００５３】
Ｃ．過剰の化合物１は、ＣＢＰ（１−１１１）を競合して除去するが、ｐ３００（１−１１１）は競合しない。ＣＢＰ欠損構築物であるＣＢＰ（１−１１１）、ＣＢＰ（１−２１１）およびＣＢＰ（１―３５１）、およびｐ３００欠損構築物であるｐ３００（１−１１１）、ｐ３００（１−２１１）、およびｐ３００（１−３５１）は、ＳＷ４８０細胞にトランスフェクションされた。細胞溶解質全体は、ストレプトアビジン−アガロースビーズまたは１００μＭの化合物２でコートされたストレプトアビジン−アガロースビーズと共に培養された（下部パネル）。ＣＢＰ構築物（１−１１１、１−２１１および１−３５１）及びｐ３００構築物（１−１１１、１−２１１および１−３５１）のビーズへの結合は、過剰の化合物１（１５０μＭ）でテストされる(challenged)。
【００５４】
Ｄ．ＣＢＰ（１−１１１）は、自由な方法のリン酸化反応で化合物１に結合する。ＣＢＰ（１−１１１）またはｐ３００（１−１１１）は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現され，Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロース（クマシーブルー染色されたゲル）によって精製された。ＣＢＰ（１−１１１）が示される（上部、右側）。１および３μＬの精製されたタンパク質は、抗−Ｈｉｓ抗体を用いて免疫ブロットを行された。矢印は、それらの適当な抗体によって認識される組み換えタンパク質を示す。増加する量の精製されたＣＢＰ（１−１１１）（０．５、１及び３μＬ）およびｐ３００（１−１１１）（１、３、および５μＬ）が１００μＭの化合物２でコートされたストレプトアビジン−アガロースビーズと共に培養された。そのビーズは洗浄された。その溶離されたタンパク質は抗−Ｈｉｓ抗体を用いて電気泳動および免疫ブロットされた。矢印は、ＰＶＤＦ膜上のタンパク質を示す。特異的結合相互作用は、過剰の化合物１（３００μＭ）を用いてテストされた（challenged）。
【００５５】
Ｅ．ＣＢＰのΔ１-１１１＋ＮＬＳ構築物は、化合物１によって抑制されるβ−カテニン／ＴＣＦ転写を救う(rescuing)ことができない。ＳＷ４８０細胞は、全長またはＣＢＰ（Δ１−１１１＋ＮＬＳ）のいずれか一つを発現する発現ベクター（０．１〜１）μｇでトランスフェクションされた。トランスフェクション２４時間後、細胞は化合物１（２５μＭ）または対照群（０．５％ＤＭＳＯ）で処理された。処理２４時間後、溶解質が調製され、デュアルルシフェラーゼ分析が行われた。
【００５６】
図３．化合物１は、β−カテニン／ＣＢＰ複合体を分裂させるが、ｐ３００／β−カテニン複合体は分裂させない。
【００５７】
Ａ．全長のＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ β−カテニン（１．１、２．２、および３．３μｇ）またはマウス(murine)のＣＢＰ（０．１４、０．２８、０．５５、１．１および２．２μｇ）プラスミドがβ−カテニン／ＴＣＦ（１．１μｇ）レポーター遺伝子構築物と共にＳＷ４８０細胞内にコトランスフェクションされた。空(empty)ｐｃＤＮＡ３ベクターが、各反応に使用されるＤＮＡの量を同等にするために用いられた。デュアルルシフェラーゼ分析が化合物１の処理２４時間後に行われた。全ての実験は２回ずつ行われ、その値は平均＋／−標準偏差として示した。
【００５８】
Ｂ．化合物１はＣＢＰに対してβ−カテニンと競合する。ＳＷ４８０細胞は、５または１０μＭの化合物１または対照群（０．５％ＤＭＳＯ）で処理された。処理２４時間後、溶解質は、対照群抗体または抗−ＣＢＰ若しくは抗−ｐ３００抗体でコートされたビーズと共に培養された。共免疫沈澱されたタンパク質は、ゲル電気泳動および抗−β−カテニン抗体を用いて免疫ブロットされた。矢印は、免疫沈澱されたβ−カテニンを示す（二重線）。
【００５９】
Ｃ．ＣＢＰ（１−１１１）は、β−カテニンと相互作用の最小領域(region)である。ＣＢＰ欠損シリーズでトランスフェクションされたＳＷ４８０細胞は、タンパク質Ａ−アガロースビーズ上にコートされた抗−β−カテニン抗体を用いて免疫沈澱された。免疫複合体は洗浄され、ゲル電気泳動された後、続いて抗−Ｈｉｓ抗体を用いて免疫ブロットされた。矢印は、ビーズに結合して残っている構築物を示す。
【００６０】
Ｄ．化合物１は、ＣＢＰに対してβ−カテニンと競合するが、ｐ３００構築物に対しては競合しない。ＣＢＰ（１−１１１、１−２１１、および１−３５１）およびｐ３００（１−１１１、１−２１１、および１−３５１）構築物がＳＷ４８０細胞にトランスフェクションされた（下部パネル）。トランスフェクション４８時間後、全ての細胞溶解質が調製され、前述したタンパク質Ａ−アガロース−抗−β−カテニン抗体を用いて免疫沈澱された（中央パネル）。免疫複合体は洗浄され、ゲル電気泳動及び抗−Ｈｉｓ抗体を用いて免疫ブロットされた。矢印は、結合したタンパク質（上部パネル）を示す。競合分析のために、ビーズ上の免疫複合体は５０μＭの化合物１でテストされた。
【００６１】
Ｅ．共通β−カテニン結合モチーフを有するＣＢＰ及びｐ３００の配列アライメント（配列番号：４７〜５５）。共通配列は囲まれている。アライメント(alignment)は、ＮＣＢＩデータベース内のタンパク質配列のためのプログラムＢＬＡＳＴを用いて行われた。
【００６２】
Ｆ．ＣＢＰ １−１１１（ＣＢＰ Ｍ１、配列番号：２）およびｐ３００ １−１１１（ｐ３００ Ｍ１、配列番号：４）の配列アライメント。
【００６３】
図４．化合物１は核のβ−カテニンを減少させる。
【００６４】
Ａ．β−カテニン免疫蛍光顕微鏡検査。ＳＷ４８０のログ期(log phase)（左）およびＨＣＴ１１６（右）細胞が固定され、抗−β−カテニンレッド(red)（上部パネル、Ａ）または抗−ＣＢＰグリーン(green) （上部パネル、Ｂ）で染色された。中央パネルは、ＳＷ４８０（左）およびＨＣＴ１１６（右）細胞内で重ね合わせた(superimposed)β−カテニンおよびＣＢＰを示す。下部パネルは、化合物１（２５μＭ）で２４時間処理したβ−カテニンをＳＷ４８０の細胞質（左）およびＨＣＴ１１６細胞の細胞質膜（右）の再分配を示す。
【００６５】
Ｂ．β−カテニンのウェスタンブロット分析。化合物１の２４時間処理の有無に関らずＳＷ４８０細胞の細胞抽出物からの２５μｇの総タンパク質が細胞質及び核のβ−カテニンの検出のために使用された。
【００６６】
図５．化合物１はｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現を抑制する。
【００６７】
Ａ．ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１レベルは、化合物１の処理で減少する。ウェスタンブロット分析が２５μＭの化合物１または対照群（０．５％ＤＭＳＯ）のいずれか一つで４、８、または２４時間処理された２５μｇのＳＷ４８０細胞溶解質全体に対して行われた。免疫ブロットが抗Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を用いて行われた。
【００６８】
Ｂ．ＣＢＰ及びｐ３００によるｃｙｃｌｉｎ Ｄ１およびｃ−ｍｙｃプロモータの生体内占有。ＣｈＩＰ（材料及び方法参照）は、化合物１処理時のｃ−ｍｙｃプロモータのＣＢＰ及びｐ３００占有を示す。ＣｈＩＰ分析が化合物１（２５μＭ）または対照群（０．５％ＤＭＳＯ）で８時間処理されたＳＷ８４０細胞からのｃ−ｍｙｃプロモータに対して行われた。ＣＢＰ（ＡＣ−２６、マサチューセッツ州ボストンのハーバード大学のデビッドリビングストン博士からの寛大なギフト）またはｐ３００（Ｃ−２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）特異性抗体が化合物１または対照群（ＤＭＳＯ）処理の存在下でＣＢＰまたはｐ３００によるプロモータ占有を評価するために使用された。
【００６９】
図６．
Ａ．化合物１は細胞をＧ1で停止させる。ＦＡＣＳ分析は、化合物１（２５μＭ）（右）または対照群（０．５％ＤＭＳＯ）（左）で２４時間処理されたＳＷ４８０（下部パネル）及びＨＣＴ１１６（上部パネル）細胞に対して行った。５．５×１０6細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で固着および染色させた。Ｇ0／Ｇ1、Ｓ、およびＧ2／Ｍは、矢印によって示される。
【００７０】
Ｂ．化合物１は、大腸癌腫細胞株においてカスパーゼを選択的に活性化させる。正常な大腸細胞ＣＣＤ１８Ｃｏ（右グラフ）と共にＳＷ４８０及びＨＣＴ１１６（左グラフ）細胞（１０5）は、対照群（０．５％ＤＭＳＯ）または化合物１（２５μＭ）で処理された。処理２４時間後、細胞は溶解され(lysed)、カスパーゼ−３／７酵素活性を測定した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、処理されたサンプル（化合物１または対照群）からブランク（対照群、細胞なし）の単位値を差し引いて計算した後、プロットした。
【００７１】
図７．化合物１は用量依存方法によって軟寒天におけるコロニー増殖を減少させる。
【００７２】
Ａ．増加濃度の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（０．５〜３２μＭ）および化合物１（０．２５〜５μＭ）は、三重のウェルのＳＷ４８０（５０００細胞／ウェル）に添加した。細胞は洗浄され、軟寒天増殖培地に懸濁された。８日後、コロニーの数（直径６０μＭ以上のコロニー）を数え、化合物の濃度に対してプロットした。３個の測定の平均±ＳＥが示される。化合物の不在下で、対照群のコロニー数は１，６３７±７１であった。
【００７３】
Ｂ．化合物１の効果の模式図。それらの理論に束縛される意図なしに、出願人は、β−カテニン／ＴＣＦ複合体がコアクチベーター(coactivator)依存方法で、下方制御標的遺伝子の発現を調節することを提案する。さらに詳しくは、核のβ−カテニン／ＴＣＦは、ＣＢＰまたはＰ３００と異なるように(differentially)結合されること、およびその三量体複合体がβ−カテニン／ＴＣＦ反応遺伝子のサブセットの発現を促進することを示す。化合物１は、特異的に且つ選択的にβ−カテニン／ＴＣＦ／ＣＢＰを標的とするが、β−カテニン／ＴＣＦ／ｐ３００複合体を標的とせずに、ＣＢＰ依存性のｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ａｘｉｎ２、およびｈｎｋｄなどの遺伝子の発現を下方制御する。化合物１の処理は、β−カテニン／ＣＢＰ相互作用の遮断により、プロモータがコアクチベーターを利用することが可能な遺伝子（ｃ−ｍｙｃ）または好ましくはコアクチベーターとしてｐ３００を利用することが可能な遺伝子（ｃ−ｊｕｎ及びｆｒａ−１）の発現に利用可能なβ−カテニン／ＴＣＦ複合体を増加させる。
【００７４】
図８は本発明の実施に有用な化学薬剤を調製するための一般的な合成スキームを提供する。
【００７５】
図９は本発明の実施に有用な化学薬剤を調製するための一般的な合成スキームを提供する。
【００７６】
図１０．化合物３の代謝分析。
【００７７】
Ａ．ラットにおける化合物３およびその代謝物に対するダイオードアレイトレース(diode Array trace)（上部パネル）及び総イオン電流（下部パネル）。
【００７８】
Ｂ．ヒトにおける化合物３及びその代謝物に対するダイオードアレイトレース（上部パネル）及び総イオン電流（下部パネル）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７９】
本発明は、β−カテニン／ＴＣＦ媒介転写を拮抗(antagonize)する薬剤およびそれに関連した方法を提供する。一つの形態において、本発明は、β−カテニン／ＴＣＦ反応性遺伝子のサブセットが特異的に下方制御される方法を提供し、関連形態において、本発明は、この方法に有用な化合物を提供する。別の形態において、本発明は、ＣＢＰ及びβ−カテニン間の結合が破壊されるが、構造的に連関したコアクチベーターｐ３００及びβ−カテニン間の結合は破壊されない方法を提供し、関連形態において、本発明は、この方法に有用な化合物を提供する。別の形態において、本発明は、ＣＢＰによって促進されるがｐ３００によっては促進されない遺伝子を選択的に活性化させる方法を提供し、関連形態において、本発明は、この方法に有用な化合物を提供する。また、本発明は、ｐ３００によって促進されるがＣＢＰによっては促進されない遺伝子を選択的に活性化させる方法を提供し、関連形態において、本発明は、この方法に有用な化合物を提供する。別の形態において、本発明は、細胞周期のＧ1期(phase)で発達を停止させるために、大腸癌腫細胞が化学薬剤で処理される方法を提供し、化学薬剤の長期処理が、正常結腸細胞では見られないアポトーシスを誘導する。
【００８０】
これらの方法および薬剤のより詳細を下記に示す。まず、これらの詳細を提供する前に、下記定義を、読者の本技術に対する理解に役に立つために提供する。
【００８１】
定義
配列番号：１は核酸配列である：tgaggaatca acagccgcca tcttgtcgcg gacccgaccg gggcttcgag cgcgatctac tcggccccgc cggtcccggg ccccacaacc gcccgcgctc gctcctctcc ctcgcagccg gcagggcccc cgacccccgt ccgggccctc gccggcccgg ccgcccgtgc ccggggctgt tttcgcgagc aggtgaaaat ggctgagaac ttgctggacg gaccgcccaa ccccaaaaga gccaaactca gctcgcccgg tttctcggcg aatgacagca cagattttgg atcattgttt gacttggaaa atgatcttcc tgatgagctg。
【００８２】
配列番号：２はアミノ酸配列である：MAENLLDGPPNPKRAKLSSPGFSANDSTDFGSLFDL
ENDLPDELIPNGGELGLLNSGNLVPDAASKHKQLSELLRGGSGSSINPGIGNVSASSPVQQGLGGQAQGQPNSAN。
【００８３】
配列番号：３は核酸配列である：ccttgtttgt gtgctaggct gggggggaga gagggcgaga gagagcgggc gagagtgggc aagcaggacg ccgggctgag tgctaactgc gggacgcaga gagtgcggag gggagtcggg tcggagagag gcggcagggg ccagaacagt ggcagggggc ccggggcgca cgggctgagg cgacccccag ccccctcccg tccgcacaca cccccaccgc ggtccagcag ccgggccggc gtcgacgcta ggggggacca ttacataacc cgcgccccgg ccgtcttctc ccgccgccgc ggcgcccgaa ctgagcccgg ggcgggcgct ccagcactgg。
【００８４】
配列番号：４はアミノ酸配列である：MAENVVEPGPPSAKRPKLSSPALSASASDGTDFGSL
FDLEHDLPDELINSTELGLTNGGDINQLQTSLGMVQDAASKHKQLSELLRSGSSPNLNMGVGGPGQVMASQAQQSSPGLGL。
【００８５】
小分子抑制剤：用語「小分子」は、約５０００ｇ／ｍｏl未満の式量(formular weight)を有する化学化合物を意味する。前記化合物は有機または無機であってもよく、合成または天然固有であってもよく、例えばペプチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド類似体(mimetic)、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴ糖、オリゴ糖類似体、天然産物同族体(analog)または誘導体、または例えば少なくとも１つの非環基、環基、炭素環基、ヘテロ環基、多環基、及び／又は芳香族基を挿入することができる純粋な合成化合物に分類できる。用語「抑制剤」は、統計的に意味のある程度で、本願明細書に記述された２つのポリペプチド、例えばβ−カテニンおよびＣＢＰ、またはβ−カテニンおよびｐ３００間の結合を抑制する化合物を意味する。言い換えれば、抑制剤の存在下で、２つのポリペプチド間の結合は、抑制剤が存在しない場合の結合に対して、統計的に意味のある程度に減少する。好ましくは、前記抑制は、細胞特性への影響、例えば小分子抑制剤を投与した患者における治療反応を達成するのに十分なものである。
【００８６】
β−カテニン：ＣＢＰ相互作用：β−カテニンおよびＣＢＰは、それぞれよく知られているポリペプチドである。例えば、Morin, P.J., Bioessays 21:1021-30 (1999)およびHecht et al. EMBO J. 19:1839-50 (2000)を参照されたい。β−カテニンとＣＢＰ相互作用は、文書化され、測定されている。例えば、Takemaru et al. J. Cell. Biol. 149:249-54 (2000)を参照されたい。用語β−カテニン：ＣＢＰ相互作用は、これら２つのタンパク質間に生じる結合を意味する。
【００８７】
推定(putative)：小分子が、例えばβ−カテニン／ＴＣＦ活性化転写の調節因子として活性をテストされる前、前記小分子は、推定調節因子として見なされる。その小分子が調節活性を示したときには、それはβ−カテニン／ＴＣＦ活性化転写の調節因子とも呼ばれる。同様に、小分子がタンパク質−タンパク質相互作用、例えばβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の抑制剤としてテストされる前には、その小分子は推定β−カテニン：ＣＢＰ相互作用の抑制剤と呼ばれる。
【００８８】
接触する(contacting)：２つの物質、例えば化学化合物、タンパク質、オリゴヌクレオチドなどが両方とも液体培地、例えば水または緩衝液に置かれ、その培地内にそれらの動きに対する障害が置かれない場合、それら２つの物質は互いに接触する。また、２つの物質が接触し合うことができるように互いに隣接して置かれると、それらの物質は互いに接触する。分析を行うとき、例えばそれらが測定培地に両方とも置かれると、２つの物質は接触する。
【００８９】
β−カテニンは、当該分野によく知られているタンパク質をいう。Morin, P.J., Bioessays 21:1021-30 (1999); Gottardi et al., Curr. Biol. 11:R792-4 (2001); Huber et al., Cell 105:391-402 (2001)を参照されたい。β−カテニンは、血漿膜における細胞接着のメディエータとして且つ転写活性因子として同定された。
【００９０】
用語「分析(assay)」は、様々な物質（例えば、化学物質、酵素など）が検出可能な事象を生み出すか、又は生み出さない選択条件下で互いに接触し合う間の処理または手段を意味する。前記事象が検出されるか否かは、様々な物質および／または選択条件に関する情報を明らかする。
【００９１】
用語「結合を抑制」、「相互作用を抑制」、「複合体の形成を抑制」などは、それぞれ２つのタンパク質間の結合を、統計的に意味のある度合いに、強度または度数（degree）または程度(extent)を減少させることを意味する。強い結合は、例えば２つのタンパク質が、複合されていない形に対して複合された形で相当さらに安定しているときに起こり得る。定量および定性によるタンパク質−タンパク質結合の研究は、当該分野によく知られている。β−カテニン結合に関連した例は、次の文献に記述されている：Brantjes et al., Biol. Chem. 383:255-61 (2002, for β-catenin binding with members of the T-cell factor (TCF)); Gottardi et al., Curr. Biol. 11:R792-4 (2001), for describing structural elements of β-catenin that interact with binding partners); and Takemaru et al., J. Cell Biol. 149:249-54 (2000, describing β-catenin interaction with CBP)。
【００９２】
用語「ＣＢＰタンパク質」は、ＣＲＥＢ−結合タンパク質としても知られているタンパク質を意味しており、ＣＲＥＢは、「ｃＡＭＰ−応答配列結合」の略語である。このタンパク質は、当分野によく知られている。例えば、Takemaru et al., J. Cell Biol. 149:249-54 (2000)および米国特許第６，０６３，５８３号を参照されたい。
【００９３】
ＣＢＰ １−１１１は、ＣＢＰのＮ−末端から同定されたタンパク質ＣＢＰの最初の１１１アミノ酸を意味する。ヒトから単離されたＣＢＰのアミノ酸１−１１１は、配列番号：２として上述されている。それに対応する核酸配列は、配列番号：１として上述されている。マウスから単離されたＣＢＰのアミノ酸１−１１１は、配列番号：５であって、下記のとおりである：MAENLLDGPPNPKRAKLSSPGFSANDNTDFGSLFDLENDLPDELIPNGELSLLNSGNLVPDAASKHKQLSELLRGGSGSSINPGIGNVSASSPVQQGLGGQAQGQPNSTN。マウスからの対応する核酸配列は、配列番号：６であって、下記のとおりである：atggccgaga acttgctgga cggaccgccc aaccccaaac gagccaaact cagctcgccc ggcttctccg cgaatgacaa cacagatttt ggatcattgt ttgacttgga aaatgacctt cctgatgagc tgatccccaa tggagaatta agccttttaa acagtgggaa ccttgttcca gatgctgcgt ccaaacataa acaactgtca gagcttctta gaggaggcag cggctctagc atcaacccag ggataggcaa tgtgagtgcc agcagccctg tgcaacaggg ccttggtggc caggctcagg ggcagccgaa cagtacaaac。
【００９４】
ｐ３００ １−１１１は、ｐ３００のＮ−末端から同定され、タンパク質ｐ３００の最初の１１１アミノ酸を意味する。ヒトから単離されたｐ３００のアミノ酸１−１１１は、配列番号：４として上述されている。それに対応する核酸配列は、配列番号：３として上述されている。
【００９５】
β−カテニンは、ｐ３００およびＣＢＰを含む多数の異なるタンパク質と自然的に相互作用する、すなわち複合体を形成するものと知られている（例えば、Hecht et al. EMBO J. 19:1839-50 (2000)を参照されたい）。複数の異なる潜在的結合パートナーが存在するときは、β−カテニンは、β−カテニンとそれらの潜在的結合パートナー間の結合強度に応じて、それらの潜在的結合パートナーと様々な範囲で結合する。β−カテニン結合の選択的抑制は、β−カテニンと少なくとも一つの結合パートナーの（第１結合パートナー）間の結合程度が、β−カテニンと少なくとももう一つの結合パートナーの（第２結合パートナー）間の結合程度に対して減少するときに発生する。このような結合の相対的な減少は、β−カテニンと第２結合パートナー間の結合に影響を及ぼさず、β−カテニンと第１結合パートナー間の結合を減少させたと判断でき；またはβ−カテニンと第２結合パートナー間の結合が増加し、β−カテニンと第１結合パートナー間の結合を減少させたと判断でき；またはそれはβ−カテニンと第１結合パートナー間の結合の減少がβ−カテニンと第２結合パートナー間の結合の減少より大きいものであれば、β−カテニンと第２結合パートナー間の結合を減少させるとともに、β−カテニンと第１結合パートナー間の結合を減少させたと判断できる。
【００９６】
用語「ｐ３００タンパク質」は、当該分野によく知られているタンパク質を意味する。Gusterson, R.J. et al., J Biol Chem. 2003 Feb 28;278(9):6838-47; An and Roeder, J Biol Chem. 2003 Jan 17;278(3):1504-10; Rebel, V.I. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 12;99(23):14789-94;および米国特許第５，６５８，７８４号、そしてその中に引用された参証を参照されたい。
【００９７】
実質的に精製されるというのは、核酸またはポリペプチドが単離され、本質的に他の核酸またはポリペプチドがないことを意味する。すなわち、核酸またはポリペプチドは、主な活性構成成分である。本願明細書に使用される用語「単離された(isolated)」は、本来の状態で、通常それと結合される他の全ての分子から実質的に単離された分子をいう。実質的に精製され、単離された分子は、製剤に存在する主な種をいう。実質的に精製された分子は、自然混合物に存在する他の分子が６０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上ない（溶媒を除く）ものである。用語「単離された」は、それらの本来の状態で存在する分子を含むことは意図しない。
【００９８】
「ｐ３００に対するＣＢＰへの結合可能性」という語句は、ｐ３００に対してＣＢＰに結合するβ−カテニン分子の可能性をいう。このような可能性は、特定の条件下でＣＢＰに結合するβ−カテニン分子の数とｐ３００に結合するβ−カテニンの分子の数の比率により表現および／または測定される。同様に、「ｐ３００に対するＣＢＰへのβ−カテニンの結合可能性を変化させる」薬剤は、反応混合物に化合物が存在しないときの比率に対して、反応混合物内に化合物が存在するときに上述したような比率を変化させる化合物をいう。
【００９９】
「細胞が増殖ではなく分化する可能性」という語句は、細胞が増殖ではなく分化する可能性をいう。このような可能性は、特定の条件下で分化する細胞の数と増殖する細胞の数の比率により表現および／または測定される。「細胞が増殖ではなく分化する可能性を増加させる」薬剤は、化合物が存在しないときの比率と比較し、化合物が存在するときに分化する細胞の数：増殖する細胞の数の比率を増加させる化合物をいう。同様に「細胞が分化ではなく増殖する可能性を増加させる」薬剤は、化合物が存在しないときの比率と比較して、化合物が存在するときに、増殖する細胞の数と分化する細胞の数の比率を増加させる化合物をいう。
【０１００】
「Ｗｎｔ経路」という語句は、フリズル(frizzled)された７回膜貫通−スパンレセプター(seven-transmembrane-span receptors)へのＷｎｔタンパク質（分泌された糖蛋白質(glycoproteins)）の結合により開始される情報伝達カスケードを意味する。この経路は、当該分野に知られており、特徴付けられ、多くの論文およびレビューの対象となった（例えば、Huelsken and Behrens, J. Cell Sci. 115: 3977-8, 2002; Wodarz et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14:59-88 (1998); Morin, P.J., Bioessays 21:1021-30 (1999); Moon et al., Science 296:1644-46 (2002); Oving et al., Eur. J. Clin. Invest. 32:448-57 (2002); Sakanaka et al., Recent Prog. Horm. Res. 55: 225-36, 2000参照）。
【０１０１】
「Ｗｎｔ経路の活性」という語句は、その経路の少なくとも一つの構成成分の活性をいう。例えば、Ｗｎｔ経路の活性は、ある実施態様において、標的遺伝子の発現を誘導するβ−カテニンの活性を意味する。Ｗｎｔ経路の多くの構成成分が当該分野に知られており、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ（Ｃｅｒ）、ＦｒｚＢ、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（ＤＫＫ）、ＬＲＰ、ヘテロトリメリック(heterotrimeric)Ｇタンパク質、Ｄｓｈ、カゼインキナーゼIａ（ＣＫＩａ）、ＧＳＫ３β、(ＴｒＣＰ、ＡＣＰ、Ａｘｉｎ、ＣＢＰ、ｐ３００、β−カテニン、ＴＣＦ、Ｆｒｏｕｃｈｏなどを含み、しかしこれらに制限されるものではない。
【０１０２】
「Ｗｎｔ経路を活性化させる」化合物は、Ｗｎｔ経路を有するシステムに存在するとき、β−カテニンが標的遺伝子の発現を誘導するように導く化合物をいう。β−カテニンによって発現が誘導される多くの標的遺伝子が、当該分野に知られており、Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎ、Ｍｙｃ、Ｔｗｉｎ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、Ｎｋｄ、Ｕｂｘ、Ｅｎ−２、ＰＰＡＲδ、Ｘｂｒａ、ＩＤ２、Ｓｉａｍｏｉｓ、Ｘｎｒ３、ＭＭＰ７、ＴＣＦ−１、Ｓｕｒｖｉｖｉｎなどを含み、これらに制限されるものではない。このような遺伝子は、「Ｗｎｔ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子」として言及されることもある。
【０１０３】
「Ｗｎｔ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子の発現の選択的抑制」という語句は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子の一部の発現を抑制するが、Ｗｎｔ／β−カテニン経路により標的とされる残りの他の遺伝子(the other genes)の発現は抑制しないことを意味する。任意の特定のメカニズムに束縛されることを所望しないが、本発明者らは、遺伝子発現の選択的抑制がβ−カテニンおよびその潜在的結合パートナーの全部ではなく一部間の相互作用を妨げることにより達成できるということを熟考した。
【０１０４】
薬剤
一形態において、本発明は、上述した方法に使用できる薬剤を提供する。化合物１以外に、本発明の方法に有用な他の薬剤が、一般式（I）の化合物およびそれらの立体異性体をスクリーニングすることにより同定できる。
【０１０５】
【化６】
2007503816.tif 000008
【０１０６】
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；、そしてＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、アミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基からそれぞれ独立に選択される。
【０１０７】
一つの実施態様において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、アミノＣ2-5アルキル、グアニジノＣ2-5アルキル、Ｃ1-4アルキルグアニジノＣ2-5アルキル、ジＣ1-4アルキルグアニジノＣ2-5アルキル、アミジノＣ2-5アルキル、Ｃ1-4アルキルアミジノＣ2-5アルキル、ジＣ1-4アルキルアミジノＣ2-5アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、フェニル、置換フェニル（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ベンジル、置換ベンジル（ここで、ベンジル上の置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ナフチル、置換ナフチル（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ビス−フェニルメチル、置換ビス−フェニルメチル（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリジル、置換ピリジル、（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリジルＣ1-4アルキル、置換ピリジルＣ1-4アルキル（ここで、ピリジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリミジルＣ1-4アルキル、置換ピリミジルＣ1-4アルキル（ここで、ピリミジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、トリアジン−２−イル−Ｃ1-4アルキル、置換トリアジン−２−イル−Ｃ1-4アルキル（ここで、トリアジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、イミダゾールＣ1-4アルキル、置換イミダゾールＣ1-4アルキル（ここで、イミダゾール置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、イミダゾリニルＣ1-4アルキル、Ｎ−アミノピペラジニル−Ｎ−Ｃ0-4アルキル、ヒドロキシＣ2-5アルキル、Ｃ1-5アルキルアミノＣ2-5アルキル、ヒドロキシＣ2-5アルキル、Ｃ1-5ジアルキルアミノＣ2-5アルキル、Ｎ−アミジノピペリジニルＣ1-4アルキル、および４−アミノシクロヘキシルＣ0-2アルキルから独立に選択される。
【０１０８】
一つの実施態様において、ＥのＲ1、Ｒ2、Ｒ6、そしてＧのＲ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、化合物の残基を示す。ＡのＲ3、ＢのＲ4、またはＤのＲ5はアミノ酸側鎖基またはその誘導体から選択される。
【０１０９】
別の実施態様において、ＡのＲ3、ＤのＲ5、ＥのＲ6およびＧのＲ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、１以上の化合物の残基を示し、、また一つの態様において、ＢのＲ1、Ｒ2およびＲ4の全てはアミノ酸側鎖を示す。この場合、用語「化合物の残基」は、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8および／またはＲ9の位置でリバース−ターン類似体構造に共有的に結合される任意の部分(moiety)、薬剤、化合物、支持体、分子、リンカー(linker)、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質を意味する。この用語は、また、アミノ酸側鎖基とその誘導体を含む。
【０１１０】
本願明細書で使用される用語「化合物の残基」は、リバース−ターン類似体構造に共有的に結合される任意の基、薬剤、化合物、支持体、分子、リンカー、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質を意味する。この用語は、また、アミノ酸側鎖基およびその誘導体を含む。本発明の一態様において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8および／またはＲ9の任意の１以上は、化合物の残基を示すことができる。本発明の一態様において、Ｒ1、Ｒ2およびＲ4の少なくとも一つは、アミノ酸残基またはその誘導体を示すことができる。
【０１１１】
本願明細書で使用される用語「アミノ酸側鎖基」は、表Ａに分類された天然アミノ酸側鎖基を含む（これに制限されない）、天然タンパク質に存在する任意のアミノ酸側鎖基を示す。本発明の他の天然アミノ酸側鎖基は、３，５−ジブロモチロシン、３，５−ジヨードチロシン、ヒドロキシリジン、γ−カルボキシグルタメート、ホスホチロシンおよびホスホセリンの側鎖基を含むが、これらに制限されるものではない。その他に、グリコシル化トレオニン、セリンおよびアスパラギンを含む（ところが、これらに制限されない）グリコシル化アミノ酸の側鎖基が本発明の実施に使用されることもある。
【０１１２】
【表１】
2007503816.tif 000009
【０１１３】
天然アミノ酸の側鎖基以外に、本発明のアミノ酸側鎖基は、それらの様々な誘導体をさらに含む。本願明細書で使用されるアミノ酸側鎖基の「誘導体」は、天然アミノ酸側鎖基に対する変形および／または変異体を含む。例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンのアミノ酸側鎖基は、通常、低級アルキル、アリール、アリールアルキル基に分類することができる。アミノ酸側鎖基の誘導体は、他の直鎖または分岐鎖、環式または非環式、置換または非置換、飽和または非飽和の低級アルキル、アリールまたはアリールアルキル基を含む。
【０１１４】
本願明細書で使用される「低級アルキル基」は炭素原子を１〜１２個含み、「低級アリール基」は炭素原子を６〜１２個含み、「低級アリールアルキル基」は炭素原子を７〜１２個含む。したがって、一つの実施態様において、アミノ酸側鎖誘導体は、Ｃ1-12アルキル、Ｃ6-12アリールおよびＣ7-12アリールアルキルから選択される。さらに好ましい実施態様では、アミノ酸側鎖誘導体は、Ｃ1-7アルキル、Ｃ6-10アリールおよびＣ7-11アリールアルキルから選択される。
【０１１５】
本発明のアミノ酸側鎖誘導体は、また、低級アルキル、アリールおよびアリールアルキル基の置換誘導体を含み、ここで、置換基は、下記の以上の化学基：−ＯＨ、−ＯＲ、−ＣＯＯＨ、-ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨ2、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−ＳＨ、−ＳＲ、−ＳＯ2Ｒ、−ＳＯ2Ｈ、−ＳＯＲおよびハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩを含む）から選択される（これらに制限されない）。ここで、前記Ｒは、それぞれ独立に直鎖または分岐鎖、環式または非環式、置換または非置換、飽和または不飽和の低級アルキル、アリールおよびアラルキル基から選択される。さらに、本発明の環式低級アルキル、アリールおよびアリールアルキル基は、ナフタレンだけでなく、チオフェン、ピロール、フラン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、３−ピロリン、ピロリジン、ピリジン、ピリミジン、プリン、キノリン、イソキノリンおよびカルバゾールなどのヘテロ環化合物を含む。アミノ酸側鎖誘導体は、また、アルキルおよびアラルキルホスホネートおよびシランを含む（これらに制限されない）、低級アルキルおよびアラルキル基のアルキル基のヘテロアルキル誘導体を含む。
【０１１６】
代表的なＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9基は、特に（これらに制限されないが）−ＯＨ、−ＯＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮＲ、−ＣＯＮＲＲ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−ＳＯ2Ｒおよび−ＣＯＳＲを含み、ここで、Ｒは、上述の定義と同様である。
【０１１７】
別の実施態様において、アミノ酸側鎖基またはその誘導体（またはＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9の場合に化合物の残基）以外にも、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8またはＲ9は、別の基または化合物に対する結合を容易にするリンカーであってもよい。例えば、本発明の化合物は、診断またはスクリーニング分析に使用するためのビオチンのような公知の１以上の化合物に連結できる。また、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8またはＲ９9は、固体支持体（例えば、固相ペプチドの合成に使用される支持体）に化合物を結合させるリンカーであってもよい。この実施態様において、別の基または化合物へのまたは固体支持体(solid supporter)への結合がＲ1、Ｒ2、Ｒ7またはＲ8またはＲ9の位置で行われることが好ましく、さらに好ましくはＲ1またはＲ2の位置である。
【０１１８】
Ａが−（ＣＨＲ3）−であり、Ｂが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄが−（ＣＨＲ5）−であり、Ｅが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇが−（ＸＲ7）n−である実施態様において、本発明のリバース−ターン類似化合物は、下記式（II）を有する：
【０１１９】
【化７】
2007503816.tif 000010
【０１２０】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ7、Ｗ、Ｘおよびｎは、上述の定義と同様である。好ましい実施態様において、Ｒ1、Ｒ2およびＲ7は化合物の残基を示し、Ｒ3またはＲ5はアミノ酸側鎖基から選択される。
【０１２１】
Ａが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが−（ＣＨＲ4）−であり、Ｄが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅが−（ＺＲ6）−であり、Ｇが−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−である一つの実施態様において、本発明のリバース−ターン類似化合物は下記一般式（III）を有する：
【０１２２】
【化８】
2007503816.tif 000011
【０１２３】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ9、ＷおよびＸは、上述の定義と同様であり、Ｚは窒素またはＣＨ（ＺがＣＨであれば、Ｘは窒素である）である。好ましい実施態様において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ6およびＲ9は化合物の残基を示し、Ｒ4はアミノ酸側鎖基から選択される。
【０１２４】
Ａが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが−（ＣＨＲ4）−であり、Ｄが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅが−（ＺＲ6）−であり、Ｇが（ＸＲ7）n−であるさらに詳細な実施態様において、本発明のリバースターン類似化合物は下記式（IV）を有する：
【０１２５】
【化９】
2007503816.tif 000012
【０１２６】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｗ、Ｘ及びｎは、上述の定義と同様であり、Ｚは窒素またはＣＨである（但し、Ｚが窒素であれば、ｎは０であり、ＺがＣＨであれば、Ｘは窒素であり、ｎは０ではない）。好ましい実施態様において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ6およびＲ7は、化合物の残基を示し、Ｒ4はアミノ酸側鎖基から選択される。一つの態様において、Ｒ6またはＲ7は、ＺおよびＸが両方ともＣＨであれば、アミノ酸側鎖基から選択される。
【０１２７】
これらの化合物は、適当な出発構成分子（以下、「構成片」いう）を用いて調製することができる。要するに、式（I）の構造を有するリバース−ターン類似体の合成において、第１および第２構成片をカップリングさせて結合された第１−第２中間体を形成し、必要に応じて、第３および／または第４構成片をカップリングさせて結合された第３−第４中間体（または、市販される場合、単一の第３中間体が使用できる）を形成し、結合された第１−第２中間体および第３−第４中間体（または第３中間体）をカップリングさせて第１−第２−第３−第４中間体（または、第１−第２−第３中間体）を形成し、これを閉環させて本発明のリバース−ターン類似体を得る。別の方法としては、式（I）のリバース−ターン類似体は、溶液中で段階的に個々の構成片を連続的にカップリングさせ、または固相ペプチド合成で通常実施される固相合成によって連続的にカップリングさせることにより、調製することができる。
【０１２８】
本発明の化合物を調製するための具体的な構成片およびそのアセンブリは、図８に示されている。例えば、「第１構成片」は、次の式Ｓ１の構造を持つことができる：
【０１２９】
【化１０】
2007503816.tif 000013
【０１３０】
式中、Ｒ2は、上述の定義と同様であり、Ｒは、ペプチド合成への使用に適した保護基である。この保護基は、固相合成を可能にするために、高分子支持体に結合できる。適当なＲ基は、アルキル基を含み、好ましい実施態様において、Ｒはメチル基である。図８において、Ｒ基中の一つは高分子（固体）支持体であり、「Ｐｏｌ」で表わす。このような第１構成片は、Ｈ2Ｎ−Ｒ2のＣＨ（ＯＲ）2−ＣＨＯでの還元性アミン化(amination)によって、またはＨ2Ｎ−Ｒ2とＣＨ（ＯＲ）2−ＣＨ2−ＬＧ（ここで、ＬＧは離脱基、例えばハロゲン（Ｈａｌ）基を意味する）間の置換反応によって容易に合成することができる。
【０１３１】
「第２構成片」は、次の式Ｓ２の構造を持つことができる。
【０１３２】
【化１１】
2007503816.tif 000014
【０１３３】
式中、Ｐはペプチド合成の使用に適したアミノ保護基であり、Ｌ1はヒドロキシルまたはカルボキシル−活性化基であり、Ｒ4は、上述の定義と同様である。好ましい保護基は、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、メチルオキシカルボニル（ＭＯＣ）、９Ｈ−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、およびアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）を含む。Ｎ−保護アミノ酸は、市販されており、例えば、ＦＭＯＣアミノ酸は、様々な供給源から市販されている。第２構成片を第１構成片と反応させるために、Ｌ1はカルボキシル−活性化基であり、またカルボキシル基の活性化カルボキシル基への転換は、カルボキシ基の活性化について当該分野で公知の方法で容易に達成することができる。適当な活性化カルボキシル酸基は、酸ハロゲン化物(acid halide)（ここで、Ｌ1は塩素またはブロムなどのハロゲン化物である）、酸無水物（ここで、Ｌ1はアセチルなどのアシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルやペンタフルオロフェニルエステルなどの反応性エステル）、およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などのカルボジイミドを用いてカップリング反応で形成された活性中間体などの活性化中間体を含む。したがって、市販されるＮ−保護アミノ酸は、当業者に知られている手段によってカルボキシル活性化形態に転換することができる。
【０１３４】
第２構成片として作用するアミノ酸のアジド(azido)誘導体の場合、このような化合物は、Ｚａｌｏｏｍなど(J. Org. Chem. 46:5173-76, 1981)により開示された反応によって対応するアミノ酸から調製できる。
【０１３５】
別の方法として、本発明の第１構成片は、次の一般式Ｓ１’を持つことができる：
【０１３６】
【化１２】
2007503816.tif 000015
【０１３７】
式中、Ｒは前記に定義したとおりであり、Ｌ2はハロゲン原子またはトシル基などの離脱基であり、本発明の第２構成片は次の式Ｓ２’の構造を持つことができる：
【０１３８】
【化１３】
2007503816.tif 000016
【０１３９】
式中、Ｒ2、Ｒ4およびＰは、上述の定義と同様である。
【０１４０】
本発明の「第３構成片」は、次の式Ｓ３の構造を持つことができる：
【０１４１】
【化１４】
2007503816.tif 000017
【０１４２】
式中、Ｇ、Ｅ、Ｌ1およびＬ2は、上述の定義と同様である。適当な第３構成片は、様々な供給源から市販されているものか、あるいは有機化学でよく知られている方法によって調製することができる。
【０１４３】
図８において、式（１）の化合物は、Ａが−（Ｃ＝０）−、Ｂが−（ＣＨＲ4）−、Ｄが−（Ｃ＝Ｏ）−、そしてＥが−（ＣＲ6）−である。カルボニル基が位置Ｂにあり、Ｒ基が位置Ｂにある式（１）の化合物、すなわちＡが−（ＣＨＲ3）−であり、Ｂが−（Ｃ＝Ｏ）−である化合物は、図９に示したように、図８の図示と同様の方法で調製することができる。図９は、また、第１−第２中間体片と反応する前に、第４構成片を第３構成片に結合させるのではなく第１−第２−第３構成中間体に第４成分を添加することを示している。その他に、図９は、Ｄが−（ＣＨＲ5）−（図８と同様の−（Ｃ＝Ｏ）ではない）であり、Ｅが−（Ｃ＝Ｏ）（図８と同様の−（ＣＨＲ6）−ではない）である本発明の化合物の調製を示している。最終的に、図９は、ＧがＮＲ7である化合物の調製を示する。
【０１４４】
したがって、前記示したように、式（Ｉ）のリバースターン類似体化合物は、第１構成片を第２構成片と反応させて結合された第１−第２中間体を生成させた後、結合された第１−第２中間体を第３構成片と連続的に反応させて結合された第１−第２−第３−第４中間体を生成させた後、この中間体を閉環させてリバース−ターン類似体を得ることにより合成できる。
【０１４５】
式（III）および（IV）の構造を持つリバース−ターン類似体は、上述したモジュール構成成分合成法と同様の技術であって、その構成片に適当な変形を加える技術によって調製することができ、構成片に応じて適当な変形が可能である。
【０１４６】
例えば、本発明に有用な化合物は、下記一般式によって記述できる：
【０１４７】
【化１５】
2007503816.tif 000018
【０１４８】
式中、Ｒ1は、窒素、酸素または硫黄から選択される１〜３個のへテロ原子を持つことが可能な、８〜１１員環の二環式(bicyclic)アリール基であり、Ｒ2は、５〜７員環の単環式アリール基であって、窒素、酸素または硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を持つことができると、化合物中のアリール環がハロゲン化物、ヒドロキシ、シアノ、低級アルキル及び低級アルコキシ基からなる群から選ばれる１つ以上の置換基を持つことができる。
【０１４９】
好ましくは、Ｒ1はナフチル、キノリニルまたはイソキノリニル基であり、Ｒ2はフェニル、ピリジルまたはピペリジルであり、さらに好ましくは、Ｒ1はナフチルであり、Ｒ2はフェニルである。
【０１５０】
別の好ましい実施態様において、前記化合物は、下記のような（６Ｓ、１０Ｒ）−構造(configuration)を持つ：
【０１５１】
【化１６】
2007503816.tif 000019
【０１５２】
式中、Ｒ1およびＲ2は、上述の定義と同様である。別の好ましい実施態様において、一般式（Ｉ）の化合物は、図１Ａに示した化学構造を有し、その化合物はここで化合物１と呼ぶ。一般式（I）を有する化合物は、Ｍｏｌｅｃｕｍｅｔｉｃｓ Ｌｔｄ．に譲渡された米国特許第６，１８４，２２３号に開示されているとおりに調製できる。前記の論議は化合物１の活性によって示されたが、式（１）の別の化合物は、本方法で活性をスクリーニングできる。
【０１５３】
本発明に有用な追加の例示的な薬剤は、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ０３／０３１４４８、米国出願公開番号ＵＳ２００４００７２８３１、米国出願番号１０／８０３，１７９および１０／８２６，９７２で見出すことができるが、この米国出願の両方ともは「リバース−ターン類似体およびそれに関連した方法」という題目を持つ。
【０１５４】
核酸分子
一つの形態において、本発明は、β−カテニンとｐ３００間の相互作用に対してβ−カテニンとＣＢＰ間の相互作用を選択的に抑制する薬剤のスクリーニングに有用なポリペプチドをコードする様々な核酸分子を提供する。
【０１５５】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：１（または配列番号：６）または配列番号：１（または配列番号：６）に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％以上の同一性を有する配列を含む実質的に精製単離された核酸分子を提供する（但し、その配列は全長のヒト（またはマウス）ＣＢＰタンパク質をコードしない）。本願明細書に使用される２つの核酸の百分率の同一性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．(J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990)のＢＬＡＳＴプログラムをそれらの基本変数と共に用いて測定された。これらのプログラムをＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7, 1993)で変形されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-8, 1990)のアルゴリズムを行う。ＢＬＡＳＴプログラムは、例えばＷｅｂサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.govで利用可能である。好ましい実施態様において、前記核酸配列は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする。
【０１５６】
ある実施態様において、前記核酸分子は、自然発生のＣＢＰ配列（例えば、ヒトＣＢＰ又はマウスＣＢＰ）内に存在する１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０または３００個以下の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、前記核酸分子は、配列番号：１または配列番号：６を含む。
【０１５７】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：１（または配列番号：６）の断片、または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む実質的に精製単離された核酸配列を提供する（但し、前記配列はＣＢＰタンパク質をコードしない）。様々な任意の実施態様において、前記断片は、少なくとも３０、または少なくとも６０、または少なくとも９０、または少なくとも１２０、または少なくとも１５０、または少なくとも１８０、または少なくとも２１０、または少なくとも２４０、または少なくとも２７０、または少なくとも３００核酸を有し、前記断片は、独立に、３００、または２７０、または２４０、または２１０、または１８０、または１５０、または１２０、または９０、または６０核酸の長さ（可能であれば、断片の最小長さに基づいて）を持つ。独立にかつ任意に、核酸配列内の前記断片は、配列番号：１（または配列番号：６）の断片に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、核酸の配列は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする。
【０１５８】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：１（または配列番号：６）または配列番号：１（または配列番号：６）と少なくとも８０％の同一性を有する配列から本質的に構成される実質的に精製単離された核酸を提供する。様々な任意の実施態様において、前記配列は、配列番号：１（または配列番号：６）に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、核酸配列は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする。
【０１５９】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：１（または配列番号：６）の断片または前記断片と少なくとも８０％の同一性を有する配列から本質的に構成される実質的に精製単離された核酸を提供する。様々な任意の実施態様において、前記断片は、少なくとも３０、または少なくとも６０、または少なくとも９０、または少なくとも１２０、または少なくとも１５０、または少なくとも１８０、または少なくとも２１０、または少なくとも２４０、または少なくとも２７０、または少なくとも３００核酸を有し、前記断片は、独立に（可能であれば、断片の最小長さに基づいて）３００、または２７０、または２４０、または２１０、または１８０、または１５０、または１２０、または９０、または６０核酸の長さを持つ。独立にかつ任意に、核酸配列内の前記断片は、配列番号：１（または配列番号：６）の断片に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、核酸の配列は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする。
【０１６０】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：１（または配列番号：６）または配列番号：１（または配列番号：６）と少なくとも８０％の同一性を有する配列から構成される実質的に精製単離された核酸を提供する。様々な任意の実施態様において、前記配列は、配列番号：１（または配列番号：６）に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、核酸配列は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする。
【０１６１】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：１（または配列番号：６）の断片または前記断片と少なくとも８０％の同一性を有する配列から構成される実質的に精製単離された核酸を提供する。様々な任意の実施態様において、前記断片は、少なくとも３０、または少なくとも６０、または少なくとも９０、または少なくとも１２０、または少なくとも１５０、または少なくとも１８０、または少なくとも２１０、または少なくとも２４０、または少なくとも２７０、または少なくとも３００核酸を有し、前記断片は、独立に（可能であれば、断片の最小長さに基づいて）３００、または２７０、または２４０、または２１０、または１８０、または１５０、または１２０、または９０、または６０核酸の長さを持つ。独立にかつ任意に、核酸配列内の前記断片は、配列番号：１（または配列番号：６）の断片に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、核酸の配列は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする。
【０１６２】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：３または配列番号：３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む実質的に精製単離された核酸分子を提供する（但し、前記配列は全長のヒトｐ３００タンパク質をコードしない）。ある実施態様において、前記核酸配列は、自然的に発生するｐ３００配列（例えばヒトｐ３００またはマウスｐ３００）内に存在する、酸残基１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０または３００個未満の連続したアミノを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、前記核酸分子は、配列番号：３を含む。
【０１６３】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：３の断片、または前記断片と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む実質的に精製単離された核酸配列を提供する（但し、前記断片は全長のｐ３００タンパク質をコードしない）。様々な任意の実施態様において、前記断片は、少なくとも３０、または少なくとも６０、または少なくとも９０、または少なくとも１２０、または少なくとも１５０、または少なくとも１８０、または少なくとも２１０、または少なくとも２４０、または少なくとも２７０、または少なくとも３００核酸を有し、前記断片は、独立に（可能であれば、断片の最小長さに基づいて）３００、または２７０、または２４０、または２１０、または１８０、または１５０、または１２０、または９０、または６０核酸の長さを持つ。独立にかつ任意に、核酸配列内の前記断片は、配列番号：３の断片に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、核酸の配列は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする。
【０１６４】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：３または配列番号：３と少なくとも８０％の同一性を有する配列から本質的に構成される実質的に精製単離された核酸を提供する。様々な任意の実施態様において、前記配列は、配列番号：３に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、核酸配列は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする。
【０１６５】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：３の断片または前記断片と少なくとも８０％の同一性を有する配列から本質的に構成される実質的に精製単離された核酸配列を提供する。様々な任意の実施態様において、前記断片は、少なくとも３０、または少なくとも６０、または少なくとも９０、または少なくとも１２０、または少なくとも１５０、または少なくとも１８０、または少なくとも２１０、または少なくとも２４０、または少なくとも２７０、または少なくとも３００核酸を有し、前記断片は、独立に（可能であれば、断片の最小長さに基づいて）３００、または２７０、または２４０、または２１０、または１８０、または１５０、または１２０、または９０、または６０核酸の長さを持つ。独立にかつ任意に、核酸配列内の前記断片は、配列番号：３の断片に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、核酸分子は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする。
【０１６６】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：３または配列番号：３と少なくとも８０％の同一性を有する配列から構成される実質的に精製単離された核酸配列を提供する。様々な任意の実施態様において、前記配列は、配列番号：３に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、核酸配列は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする。
【０１６７】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：３の断片、または前記断片と少なくとも８０％の同一性を有する配列から構成される実質的に精製単離された核酸配列を提供する。様々な任意の実施態様において、前記断片は、少なくとも３０、または少なくとも６０、または少なくとも９０、または少なくとも１２０、または少なくとも１５０、または少なくとも１８０、または少なくとも２１０、または少なくとも２４０、または少なくとも２７０、または少なくとも３００核酸を有し、前記断片は、独立に（可能であれば、断片の最小長さに基づいて）３００、または２７０、または２４０、または２１０、または１８０、または１５０、または１２０、または９０、または６０核酸の長さを持つ。独立にかつ任意に、核酸配列内の前記断片は、配列番号：３の断片に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、核酸の配列は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする。
【０１６８】
本発明に係る核酸分子は、全長のＣＢＰおよびｐ３００タンパク質をコードする核酸分子を制限酵素または他の核酸分解酵素で切断することにより得られる。全長のＣＢＰおよびｐ３００タンパク質をコードする核酸分子は、当該分野に知られている方法でゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから単離できる(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2001参照)。配列番号：１、３または６の領域に対応する核酸のプローブは、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに使用できる。ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに適したオリゴヌクレオチドは、通常、長さが２０〜４０塩基であり、検出を容易にする様々な分子で標識できる（例えば、放射性核種(radionuclide)、酵素的標識、タンパク質標識、蛍光標識またはビオチン）。ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリは、多様な適当なベクターで調製できるが、このベクターにはプラスミド、バクテリオファージ、酵母人工染色体およびコスミドベクターが含まれる。別の方法として、ライブラリは、市販の供給源から購入することができる（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）。
【０１６９】
別の方法が本発明に係る核酸分子を得るのに使用できる。一つの好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＣＢＰおよびｐ３００タンパク質をコードする核酸分子の所望の領域（例えば、ＣＢＰまたはｐ３００の最初１１１アミノ酸を含むポリペプチドをコードする領域）を増幅させることである。ＰＣＲ増幅の詳細な方法は、例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, NY 1995に出ている。
【０１７０】
核酸分子を得る別の方法は、ＣＢＰ １−１１１またはｐ３００ １−１１１に結合できるポリペプチドのプローブを用いた発現クローニングによる。そのプローブは、ＣＢＰ １−１１１、ｐ３００ １−１１１、またはその断片に対する抗体を含むことができる。発現クローニングの方法は、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, NY 1995; ・ Blackwood and Eisenman, Methods in Enzymology 254: 229-40, 1995に記述されている。
【０１７１】
本発明のポリヌクレオチドは、また、本願明細書に開示されている配列がえられる合成化学技法を用いて調製できる。遺伝コードの縮重(degeneracy)は、配列番号：１、３、または６に記載のアミノ酸配列をコードする交互(alternate)のヌクレオチド配列を許容する。このような全てのヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。
【０１７２】
ＣＢＰまたはｐ３００断片をコードする核酸配列は、例えば親和性タグ（例えば、ＧＳＴおよびＨｉｓ−ｔａｇ）コードするものおよび分泌シグナルをコードするものなど多様な異種由来(heterologous)の配列と融合できる。親和性タグをコードする配列との融合は、融合したタグを介しての親和性精製の使用を許容することにより、コードされたポリペプチドの精製を容易にする。分泌シグナルをコードする配列との融合は、また、細胞溶解物、原形質周囲空間、篩管部(phloem)、または成長または発酵培地からポリペプチドの回収を許容することにより、コードされたポリペプチドの精製を容易にする。使用に適した分泌シグナルは、広く用いられており、当該分野によく知られている（例えば、von Heijne, J. Mol. Biol. 184:99-105, 1985）。
【０１７３】
上述したように、本発明の核酸分子は、配列番号：１、３または６に記載の固有の核酸分子の変異（対立遺伝子を含む）もまた含むことができる。このような変異は、自然変異（例えば、変性(degenerate)型、多型性(polymorphism)、スプライス変異または突然変異）および当該分野に知られている遺伝工学によって生産されたものを含む。
【０１７４】
ポリペプチド配列
一つの形態において、本発明は、β−カテニンとｐ３００間の相互作用に対してβ−カテニンとＣＢＰ間の相互作用を選択的に抑制する薬剤のスクリーニングに有用な様々なポリペプチド分子を供給する。
【０１７５】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：２（または配列番号：５）または配列番号：２（または配列番号：５）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列を含む実質的に精製単離されたペプチドを提供する（但し、前記ペプチドは全長のＣＢＰタンパク質（例えば、ヒトまたはマウス）ではない）。本願明細書に使用される２つのペプチドの百分率同一性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．(J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990)のＢＬＡＳＴプログラムをそれらの基本変数と共に用いて測定された。これらのプログラムをＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7, 1993)で変形されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-8, 1990)のアルゴリズムを行う。ＢＬＡＳＴプログラムは、例えばＷｅｂサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.govで利用可能である。好ましい実施態様において、前記ペプチドは、β−カテニンに結合する。
【０１７６】
ある実施態様において、本発明のポリペプチド分子は、自然的に発生するＣＢＰ配列（例えば、ヒトＣＢＰ又はマウスＣＢＰ）内に存在する１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０または３００個以下の連続したアミノ酸残基を持つアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチド分子は、配列番号：２または配列番号：５を含む。
【０１７７】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：２の断片、または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む実質的に精製単離されたペプチドを提供する（但し、前記ペプチドは全長のＣＢＰタンパク質ではない）。様々な任意の実施態様において、前記断片は、少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、または少なくとも６０、または少なくとも７０、または少なくとも８０、または少なくとも９０アミノ酸（残基）を有し、前記断片は、独立に（可能であれば、断片の最小長さに基づいて）１００、または９０、または８０、または７０、または６０、または５０、または４０、または３０、または２０アミノ酸（残基）の長さを持つ。独立にかつ任意に、ペプチド内の前記断片は、配列番号：２の断片に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、前記ペプチドは、β−カテニンに結合する。
【０１７８】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：２または配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有するペプチドから本質的に構成される実質的に精製単離されたペプチドを提供する。様々な任意の実施態様において、前記ペプチドは、配列番号：２に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、前記ペプチドはβ−カテニンに結合する。
【０１７９】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：２の断片または前記断片と少なくとも８０％の同一性を有する配列から本質的に構成される実質的に精製単離されたペプチドを提供する。様々な任意の実施態様において、前記断片は、少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、または少なくとも６０、または少なくとも７０、または少なくとも８０、または少なくとも９０アミノ酸（残基）を有し、前記断片は、独立に（可能であれば、断片の最小長さに基づいて）１００、または９０、または８０、または７０、または６０、または５０、または４０、または３０、または２０アミノ酸（残基）の長さを持つ。独立にかつ任意に、ペプチド内の前記断片は、配列番号：２の断片に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、前記ペプチドは、β−カテニンに結合する。
【０１８０】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：２または配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有するペプチドから構成される実質的に精製単離されたペプチドを提供する（但し、前記ペプチドはＣＢＰタンパク質ではない）。様々な任意の実施態様において、前記ペプチドは、配列番号：２に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、前記ペプチドは、β−カテニンに結合する。
【０１８１】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：２の断片または前記断片と少なくとも８０％の同一性を有する配列から構成される実質的に精製単離されたペプチドを提供する。様々な任意の実施態様において、前記断片は、少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、または少なくとも６０、または少なくとも７０、または少なくとも８０、または少なくとも９０アミノ酸（残基）を有し、前記断片は、独立に（可能であれば、断片の最小長さに基づいて）１００、または９０、または８０、または７０、または６０、または５０、または４０、または３０、または２０アミノ酸（残基）の長さを持つ。独立にかつ任意に、ペプチド内の前記断片は、配列番号：２の断片に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、前記ペプチドは、β−カテニンに結合する。
【０１８２】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：４または配列番号：３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む実質的に精製単離された核酸分子を提供する（但し、前記ペプチドが全長のヒトｐ３００タンパク質をコードしない）。ある実施態様において、そのポリペプチドは、自然的に発生するｐ３００配列（例えばヒトｐ３００またはマウスｐ３００）内に存在する、連続したアミノ酸残基１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０または３００個以下を含むアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、配列番号：４を含む。
【０１８３】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む実質的に精製単離されたペプチドを提供する（但し、前記ペプチドは全長のｐ３００タンパク質ではない）。様々な任意の実施態様において、前記断片は、少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、または少なくとも６０、または少なくとも７０、または少なくとも８０、または少なくとも９０アミノ酸（残基）を有し、前記断片は、独立に（可能であれば、断片の最小長さに基づいて）１００、または９０、または８０、または７０、または６０、または５０、または４０、または３０、または２０アミノ酸（残基）の長さを持つ。独立にかつ任意に、前記ペプチド内の前記断片は、配列番号：４の断片に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、ペプチドは、β−カテニンに結合する。
【０１８４】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：４または配列番号：４と少なくとも８０％の同一性を有する配列から本質的に構成される実質的に精製単離されたペプチドを提供する。様々な任意の実施態様において、前記配列は、配列番号：４に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、前記ペプチドは、β−カテニンに結合する。
【０１８５】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％の同一性を有する配列から本質的に構成される実質的に精製単離されたペプチドを提供する。様々な任意の実施態様において、前記断片は、少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、または少なくとも６０、または少なくとも７０、または少なくとも８０、または少なくとも９０アミノ酸（残基）を有し、前記断片は、独立に（可能であれば、断片の最小長さに基づいて）１００、または９０、または８０、または７０、または６０、または５０、または４０、または３０、または２０アミノ酸（残基）の長さを持つ。独立にかつ任意に、前記ペプチド内の前記断片は、配列番号：４の断片に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、前記ペプチドは、β−カテニンに結合する。
【０１８６】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：４または配列番号：４と少なくとも８０％の同一性を有するペプチドから構成される実質的に精製単離されたペプチドを提供する（但し、前記ペプチドはＣＢＰタンパク質ではない）。様々な任意の実施態様において、前記配列は、配列番号：４に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、前記ペプチドは、β−カテニンに結合する。
【０１８７】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％の同一性を有する配列から構成される実質的に精製単離されたペプチドを提供する。様々な任意の実施態様において、前記断片は、少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、または少なくとも６０、または少なくとも７０、または少なくとも８０、または少なくとも９０アミノ酸（残基）を有し、前記断片は、独立に（可能であれば、断片の最小長さに基づいて）１００、または９０、または８０、または７０、または６０、または５０、または４０、または３０、または２０アミノ酸（残基）の長さを持つ。独立にかつ任意に、ペプチド内の前記断片は、配列番号：４の断片に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。好ましい実施態様において、前記ペプチドは、β−カテニンに結合する。
【０１８８】
ある実施態様において、本発明のポリペプチドは、保存的アミノ酸変更、すなわち配列番号：２または４の同様に荷電或いは非荷電アミノ酸の置換を含む。保存的アミノ酸変更は、一つのアミン酸を、構造的に関連した側鎖を有するアミノ酸ファミリーの他のアミノ酸に置換することを伴う。自然的に発生するアミノ酸は、通常、４つのファミリーに区分される：酸性アミノ酸（アスパラギン酸塩(aspartate)、グルタミン酸塩）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、非荷電極性(uncharged polar)アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）、フェニルアラニン、トリプトパン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として分類されることもある。自然的に発生しないアミノ酸も、また、本発明のポリペプチドの形成に使用できる。
【０１８９】
本発明は、また、一つ以上の異種由来(heterologous)のポリペプチドを含むアミノ酸配列に融合したＣＢＰまたはｐ３００断片またはこれらの同族体を含むＣＢＰまたはｐ３００融合タンパク質を提供する。このような異種由来のポリペプチドは、任意の供給源の自然発生ポリペプチドに使用でき、あるいはアミノ酸配列に組み換え設計できる。融合タンパク質は、精製、アミノ酸配列に対する抗体の生成、および多様な分析システムで有用である。融合タンパク質構造でよく使用されるタンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自動蛍光タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含む。さらに、エピトープタグが融合タンパク質構造に使用できるが、このエピトープタグには、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを挙げることができる。他の融合構造は、麦芽糖結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合、および単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合を含むことができる。
【０１９０】
本発明のポリペプチドは、当該分野に知られている様々な方法によって得られる。例えば、配列番号：２（または配列番号：４）を含むＣＢＰ（またはｐ３００）断片が生化学的方法、例えば親和性クロマトグラフィによって単離できる。ＣＢＰまたはｐ３００ポリペプチドに使用できる親和マトリックスは、配列番号：２（または配列番号：４）またはその断片に対して準備された抗−ＣＢＰまたは抗−ｐ３００モノクローナルまたはポリクローナル抗体を結合させた固相であってもよい。別の方法としては、ＣＢＰまたはｐ３００に結合するものと知られているポリペプチド（例えば、β−カテニン）は、ＣＢＰまたはｐ３００ポリペプチドまたはその断片を単離するための親和マトリックスとして使用できる。
【０１９１】
ＣＢＰ、ｐ３００またはその断片を単離するための別の生化学的方法は、分取クロマト電気泳動、ゲル濾過、親和性クロマトグラフィ、イオン交換および逆相クロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、等電圧フォーカシング、および蔗糖またはグリセロール密度勾配を含む(Deutscher, Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification, Vol. 182, Academic Press, Inc., San Diego, Chapter 38, 1990; Balch et al., Methods in Enzymology, Vol. 257, Academic Press, Inc., San Diego, Chapter 8, 1995)。
【０１９２】
本発明に係るポリペプチドは、また、化学合成、例えば固相ペプチド合成方法(Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1964)によって合成できる。当該分野によく知られている標準溶液方法が、また、配列番号：２または４もしくはその同族体の合成に使用できる(Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin, 1984; Bodanszky, Peptide Chemistry, SpringerVerlag, Berlin, 1993)。新規合成されたポリペプチドは、例えば、高性能液体クロマトグラフィによって単離でき、質量分光法またはアミノ酸配列分析を用いて特徴付けることができる。
【０１９３】
本発明に係るポリペプチドは、また、組み換えＤＮＡ方法によって生産できる。本発明に提供される配列番号：２または４もしくはその同族体をコードする核酸は、適当な発現ベクターにクローニングできる。この種のベクターは、市販されており或いは当業者によって構築でき、転写および解読に必要な発現要素を含んでいる。選択されたベクターは、適当な起源の発現および調節要素が提供される場合、原核または真核宿主システムで使用できる。宿主細胞で生産されたポリペプチドまたはその細胞から分泌された組み換えポリペプチドは、例えば、配列番号：２または４またはその断片に対する抗体で親和クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィ、硫酸アンモニウム結晶化、焦点電気泳動、または分取クロマト電気泳動を用いて単離できる（(Ausubel et al., supra; Sambrook et al., supra一般参照。単離精製されたタンパク質は、通常、クマシーブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の単一バンドとして確認される。
【０１９４】
本発明は、また、配列番号：２または４もしくはその同族体および異種由来のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。この種の融合タンパク質は、２つのタンパク質断片(segment)を共有結合させ、または分子生物学分野の標準的な手段によって調製できる。例えば、組み換えＤＮＡ方法は、当該分野に知られているように、適当な第２タンパク質断片をコードするヌクレオチドを有するリードフレーム内の配列番号：２または４から選択されるコード配列を含むＤＮＡ構築物を作るり、前記ＤＮＡ構築物を宿主細胞で発現させることにより、融合タンパク質を調製することに使用できる。融合タンパク質を構成する多くのキットは、研究実験室に実験道具を供給する会社、例えばＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）、およびＱｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ；１−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）から入手できる。
【０１９５】
使用方法
本発明は、β−カテニン／ＴＣＦ誘導転写の一部を抑制する式（I）の化合物を提供する。例えば、実施例に詳細に記述されているように、化合物１は、ＣＢＰと密接に関係があるｐ３００とβ−カテニンの相互作用を妨げることなく、ＣＢＰとβ−カテニンの相互作用を選択的に遮断する。化合物１の処理は、核から細胞質へのβ−カテニンの再配置をもたらし、ある標的遺伝子（例えば、ｃ−ｍｙｃおよびｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１）のプロモータとのＣＢＰの結合を抑制し、これによりこれら遺伝子の発現を抑制する。また、化合物１は、形質転換され、正常でない大腸細胞におけるアポトーシス性カスパーゼを選択的に活性化させ、癌細胞のＧ１／Ｓ−期を停止させ、形質転換された直腸結腸細胞の増殖を減少させる。したがって、本発明の化合物は、癌の治療、腫瘍増殖の減少、アポトーシスの増加、β−カテニン誘導の遺伝子発現の調節などといった様々な有用性を持つことができる。
【０１９６】
一つの形態において、本発明は、β−カテニン／ｐ３００相互作用に対してβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用を選択的に抑制する方法を提供し、前記方法は、β−カテニン、ＣＢＰ、およびｐ３００を含む組成物に化合物を投与することを含み、前記化合物は、β−カテニン／ｐ３００相互作用に対してβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用を選択的に抑制する。
【０１９７】
別の形態において、本発明は、β−カテニン／ＣＢＰ相互作用に対してβ−カテニン／ｐ３００相互作用を選択的に抑制する方法を提供し、前記方法は、β−カテニン、ＣＢＰ、およびｐ３００を含む組成物に化合物を投与することを含み、前記化合物は、β−カテニン／ＣＢＰ相互作用に対してβ−カテニン／ｐ３００相互作用を選択的に抑制する。化合物１の特定の類似物は、β−カテニン／ｐ３００タンパク質複合体に対して選択的である。
【０１９８】
タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、β−カテニンとｐ３００間の相互作用、およびβ−カテニンとＣＢＰ間の相互作用）のみならず、タンパク質−タンパク質相互作用への薬剤の効果は、当該分野に知られている任意の方法によって特徴付けおよび／または測定できる。このような方法は、親和精製された組み換えβ−カテニン、ＣＢＰおよびｐ３００タンパク質またはこれらの断片を用いた試験管内結合分析を含む。ある実施態様において、一つのタンパク質構成成分は、固体支持体（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）にまず固定され、タンパク質−タンパク質相互作用の検出および測定を容易してもよい。タンパク質−タンパク質相互作用は、また、実施例に記述された免疫沈澱やウェスタンブロット分析などの生体内結合分析を用いて特性化できる。
【０１９９】
別の形態において、本発明は、核から細胞質へのβ−カテニンの転位(translocation)促進させる方法を提供し、前記方法は化合物を細胞に投与することを含み、前記細胞は核及び細胞質を含み、前記核はβ−カテニンを含み、前記化合物は核から細胞質へのβ−カテニンの転位を起こす。核から細胞質へのβ−カテニンの転位は、実施例に記述されているとおりに、免疫蛍光分析を用いて検出できる。
【０２００】
別の形態において、本発明は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子の発現を選択的に抑制する方法を提供し、前記方法は組成物に化合物を投与することを含み、前記組成物はＷｎｔ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子を含み、前記化合物はＷｎｔ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子の発現の変化を起こす。
【０２０１】
前述したように、本発明は、ＣＢＰによって促進(poromoted)された遺伝子発現に影響を与えるための方法を提供し、好ましい実施態様では、ｐ３００促進遺伝子発現への影響よりはむしろ、ＣＢＰ促進遺伝子発現に影響を与えるための方法を提供する。本発明は、また、ＣＢＰ促進遺伝子発現への影響よりはむしろ、ｐ３００促進遺伝子発現に影響を与えるための方法を提供する。本発明は、特にＣＢＰおよびｐ３００間の構造的類似性、および多くの当業者がＣＢＰおよびｐ３００を本質的に同等な(equivalent)生物学的機能を持つという事実からみて特に顕著である。この効能は、例えばｓｕｒｖｉｖｉｎの発現に影響を与えることに適用できる。
【０２０２】
一つの形態において、本発明は、組成物を薬剤と接触させることを含む、β−カテニン誘導遺伝子発現を調節する方法を提供し、この際、前記組成物はβ−カテニン、ＣＢＰおよびｐ３００を含み、β−カテニンはｐ３００に対してＣＢＰに結合する可能性を有し、前記薬剤はｐ３００に対してＣＢＰに結合するβ−カテニンの可能性を変化させるために有効な量の組成物と接触させる。例示的な形態において、前記調節は、β−カテニンに対するＣＢＰの結合を増加させる形を取ることができ、この際、選択的にβ−カテニンに対するｐ３００の結合を減少させる形であってもよい。または、前記調節は、β−カテニンに対するｐ３００の結合を増加させる形を取ることができ、この際、選択的にβ−カテニンに対するＣＢＰの結合を減少させることができる。前記組成物は、細胞であってもよい。
【０２０３】
対象遺伝子の発現およびこれら遺伝子の発現への薬剤の影響は、当該分野に知られている任意の適当な方法によって行われる。このような方法は、ｃＤＮＡマイクロアレイ、対象遺伝子の増幅のためのプライマーを用いたＲＴ−ＰＲＣ、および対象遺伝子のプロモータにより推進されるレポータ活性の測定およびＣｈｌＰ分析の使用を含むことができる。
【０２０４】
別の形態において、本発明は、下記のことを含むＷｎｔ経路の活性を調節する方法を提供する：
（ａ）Ｗｎｔ経路の構成成分を含む組成物（ｉ）を、Ｗｎｔ経路を活性化させる化合物（ii）と接触させ、活性化されたＷｎｔ経路を準備し、および
（ｂ）ｐ３００およびβ―カテニン間の結合を完全にまたは実質的に妨げるが、ＣＢＰおよびβ−カテニン間の結合は殆どまたは全く妨げない化学薬剤と接触させてＷｎｔ経路の活性を調節する。
【０２０５】
別の形態において、本発明は、、下記のことを含む細胞増殖を促進させる方法を提供する：
（ａ）細胞集団(cell population)を、集団の一部は増殖し、一部は分化する条件下とし、および
（ｂ）前記集団に化学薬剤を添加し、前記薬剤は分化する細胞の割合に対して増殖する細胞の割合を増加させる。
【０２０６】
細胞増殖および細胞分化は、当該分野に知られている任意の適当な方法によって特徴付けられる。このような方法は、実施例に記述されている流動細胞測定法および軟寒天分析を含む。
【０２０７】
別の形態において、本発明は、未分化状態の幹細胞を維持させる方法であって、未分化状態の幹細胞の維持に有効な量の細胞分化を抑制し或いは細胞増殖を増進させる薬剤と幹細胞を接触させることを含む方法を提供する。ある実施態様において、前記薬剤は、β−カテニンとＣＢＰの相互作用を妨げることなく、β−カテニンとｐ３００の相互作用を減少させることができる。
【０２０８】
幹細胞治療法は、特定細胞タイプの機能不良の未成熟死亡およびその体の代替または回復の失敗によって引き起こされる多くの退行性疾患を治療する機会を提供する。幹細胞の可能な治療的用途は、臓器移植のための患者の免疫的条件化(conditioning)、筋肉退行萎縮、多発硬化症および関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療、脳卒中、脊椎損傷および火傷などの損傷した組織の回復、ルーゲーリック病、およびパーキンスン病やハンチントン病、アルツハイマー病などといった神経系症状などの神経退行性疾患の治療、白血病、鎌状赤血球貧血、心臓疾患および糖尿の治療を含む。大部分の幹細胞治療法のために、胚幹細胞または成体幹細胞は、試験管内での培養、所望する細胞への分化誘導および患者への利殖が可能である。幹細胞の成功的な培養のために、幹細胞は、未分化条件に維持されなければならない。
【０２０９】
幹細胞を未分化条件に維持させるために、本発明に係る化合物、例えば細胞増殖を促進するか、または細胞分化を抑制する化合物は、幹細胞培養の様々な段階で使用できる。例えば、このような化合物は、幹細胞がそれらの源泉組織から単離されるときに使用できる。他の方法として、それは培養の特定の培養期間後に培養培地に添加してもよい。それは、また、幹細胞を未分化状態に維持するために培養培地に持続的に存在させてもよい。前記化合物の濃度は、幹細胞が未分化状態に維持される、または幹細胞の分化が化合物のないときに培養された幹細胞の場合と比較して減少し、細胞培養物の他の特徴（例えば、細胞生存率および細胞増殖率）が悪影響をうけないレベルに化合物の量を調整することにより、最適化できる。
【０２１０】
本発明のこれらおよび他の方法は、化学薬剤、例えば化合物１およびその同族体としてここに識別された化学薬剤で実行できる。
【０２１１】
スクリーニング分析
式（I）の化合物および他の薬剤は、本願明細書に記載されているように、および下記方法によって活性のためにスクリーニングできる。
【０２１２】
例えば、一つの形態において、本発明は、下記の工程を含む、β−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を同定する方法を提供する：（ａ）推定のβ−カテニン：ＣＢＰ小分子抑制剤を、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と接触させる工程；（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、β−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程；（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のβ−カテニンを含む部分（moiety）と前記工程（ａ）のＣＢＰ １−１１１を含む部分（moiety）との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程、および、（ｄ）前記工程（ａ）の前記分子が、ＣＢＰ １−１１１を含む部分（moiety）とβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するとの決定によって、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の抑制剤として同定する工程。任意で、前記方法は、下記の工程をさらに含むことができる：（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、（１）ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)及び（２）β−カテニンを含む混合物と接触させる工程と、（ｆ）前記工程（ｅ）の前記分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程、および、（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分（moiety）とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程。
【０２１３】
別の形態において、本発明は、下記の工程を含む、β−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を同定する方法を提供する：（ａ）推定のβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、β−カテニンを含む部分と接触させる工程と；（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と接触させる工程と；（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と前記工程（ａ）のβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、β−カテニンを含む部分(moiety)とＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するとの決定によって、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の抑制剤として同定する工程。任意で、本方法は、下記の工程をさらに含むことができる：（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、（１）ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)および（２）β−カテニンを含む混合物と接触させる工程；（ｆ）前記工程（ｅ）の前記分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程。
【０２１４】
別の形態において、本発明は、下記の工程を含むβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を同定する方法を提供する：（ａ）推定のβ−カテニン：ＣＢＰ小分子抑制剤を、ＣＢＰ １−１１１と結合した(associated)β−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程；（ｂ）前記工程（ａ）の前記分子が、β−カテニンからＣＢＰ １−１１１を分離させるかどうかを分析手段によって決定する工程；及び（ｃ）前記工程（ａ）の前記小分子がＣＢＰ １−１１１からβ−カテニンの結合を分離させるとの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の抑制剤として同定する工程。任意で、前記方法は、下記の工程をさらに含むことができる：（ｄ）同定されたβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、（１）ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)および（２）β−カテニンを含む混合物と接触させる工程；（ｅ）前記工程（ｄ）の前記分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)と前記β−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｆ）前記工程（ｄ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程。
【０２１５】
別の形態において、本発明は、下記の工程を含むβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を同定する方法を提供する：（ａ）推定のβ−カテニン：ｐ３００小分子抑制剤を、ｐ３００ １−１１１を含む部分と接触させる工程；（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、β−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程；（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のβ−カテニンを含む部分(moiety)と前記工程（ａ）のｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するかの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：CBP相互作用の抑制剤として同定する工程。任意で、本方法は、下記の工程をさらに含むことができる：（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、（１）ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)および（２）β−カテニンを含む混合物と接触させる工程；（ｆ）前記工程（ｅ）の前記分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ｐ３００相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程。
【０２１６】
別の形態において、本発明は、下記の工程を含むβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を同定する方法を提供する：（ａ）推定のβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、β−カテニンを含む部分と接触させる工程；（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)と接触させる工程；（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ａ）のβ−カテニンを含む部分(moiety)と前記工程（ｂ）のｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、β−カテニンを含む部分(moiety)とｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するかの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ｐ３００相互作用の抑制剤として同定する工程。任意で、本方法は、下記の工程をさらに含むことができる：（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、（１）ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)および（２）β−カテニンを含む混合物と接触させる工程；（ｆ）前記工程（ｅ）の前記分子が、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、ＣＢＰ １−１１１を含む部分と前記β−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ｐ３００相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程。
【０２１７】
別の形態において、本発明は、下記の工程を含むβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を同定する方法を提供する：（ａ）推定のβ−カテニン：ｐ３００小分子抑制剤を、（１）ｐ３００ １−１１１と結合したβ−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程；（ｂ）前記工程（ａ）の前記分子が、β−カテニンからｐ３００ １−１１１を分離させるかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子がβ−カテニンからｐ３００ １−１１１を分離させるとの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ｐ３００相互作用の抑制剤として同定する工程。任意で、本方法は、下記の工程をさらに含むことができる：（ｄ）前記工程（ｃ）で同定されたβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、（１）ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)および（２）β−カテニンを含む混合物と接触させる工程；（ｅ）前記工程（ｄ）の前記分子が、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｆ）前記工程（ｄ）の前記小分子が、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ｐ３００相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程。
【０２１８】
タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、β−カテニンとｐ３００間の相互作用、およびβ−カテニンとＣＢＰ間の相互作用）およびタンパク質−タンパク質相互作用への薬剤の効果は、当該分野に知られている任意の適当な方法によって特徴付けされおよび／または測定できる。例えば、本発明の適当な分析手段としては、等温滴定カロリー分析（ＩＴＣ）がある。ＩＴＣ実験は、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＭＳＣ等温滴定熱量測定（ＭｉｃｒｏＣａｌ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ ＭＡ）を製作者の推奨とおりに本質的に用いて行われる。つまり、ＣＢＰ Ｃ１断片は、５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．５）および０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む透析緩衝液に対して広範囲に透析される。希釈薬物サンプルに対応させるために、ＤＭＳＯをタンパク質サンプルに最終濃度が０．０５％となるように添加する。タンパク質濃度は、牛血漿ガンマグロブリンを標準として使用するＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質分析（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定される。可溶性抑制のため、ＩＴＣ実験は、５〜１５μＬのＣＢＰ Ｃ１［２２３μＭ］を２３．３μＭの推定小分子抑制剤で充填されたサンプル細胞に注入することにより行われる。希釈熱は、サンプル細胞内の推定小分子抑制剤の飽和後に算定され、熱力学的変数は、Ｏｒｉｇｉｎ ５．０ソフトウェアパッケージ（ＭｉｃｒｏＣａｌ）を用いて計算される。さらに高い希釈熱は、推定の小分子抑制剤およびＣＢＰ断片間のより強い結合を示す。推定の小分子抑制剤およびＣＢＰ断片間のより強い結合は、ＣＢＰ結合、例えばβ−カテニンへのＣＢＰ結合の分解にさらに効果的でありうる小分子を同定する。
【０２１９】
薬学組成物および投与
本発明に係る核酸分子、ペプチドおよび化合物は、投与に適した薬学組成物に含まれることが可能である。このような組成物は、典型的に、核酸分子、ペプチド、または化合物および薬学的に許容可能な担体を含む。「薬学的に許容可能な担体」とは、薬学投与に利用可能な溶媒や分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などをいう。このような薬学活性成分のための媒質または薬剤の利用は、当該分野によく知られている。補助活性化合物は、また、その組成物に含有できる。
【０２２０】
本発明の薬学組成物は、治療的処置のために非経口的、局所的、経口的または局部的に投与できる。例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシンなどの様々な水性担体を使用でき、アルブミン、脂質タンパク、グロブリンなどの安定性を強化する他のタンパク質を含むことができる。得られる組成物は、既存の公知の滅菌技法によって滅菌されてもよい。その溶液は、使用のために包装し、無菌条件で濾過および冷凍乾燥し、前記冷凍乾燥した生成物は、投与の前に滅菌溶液と結合されてもよい。
【０２２１】
経口組成物は、通常、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封じ込まれており、あるいは錠剤に圧縮されている。経口治療的投与の目的のために、前記活性化合物は、賦形剤と共に含まれて錠剤、トローチまたはカプセルの形で使用できる。薬学的に利用可能な結合剤、および／またはアジュバント物質は前記組成物の一部として含有できる。前記錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、下記成分のいずれか一つまたは類似な属性の化合物を含むことができる：バインダー（例えば、微晶質のセルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、澱粉または乳糖）、崩壊剤(disintegrating agent)（例えば、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス）、流動促進剤(glidant)（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、蔗糖またはサッカリン）；または香味剤（例えば、ペパーミント、メチルサリチル酸、またはオレンジ香）。
【０２２２】
吸入による投与のために、前記化合物は、例えば二酸化炭素のようなガスまたはネブライザ(nebulizer)などの適当な噴射剤を含む圧縮容器または分配器からエアロゾルスプレーの形で伝達される。
【０２２３】
全身投与は、また、経粘膜的または経皮的な手段によることができる。経粘膜的または経皮的な投与のために染み込むべき障壁に適した浸透剤が調製に使用される。このような浸透剤は、当該分野に通常知られており、例えば経粘膜な投与のために、洗剤、胆汁塩およびフシジン酸(fusidic acid)誘導体を含む。経粘膜投与のためには、鼻スプレーまたは座剤の使用によって達成できる。経皮的な投与のために、活性化合物は、当該分野に通常知られている軟膏(ointments)、膏薬(salves)、ゲルまたはクリームとして調製できる。
【０２２４】
一つの実施態様において、その活性化合物は、例えば移植およびマイクロカプセル化された運搬システムを含む制御された放出剤形など、前記化合物が体内からの急速除去されることを保護する担体と共に調製される。生分解可能な、生利用可能なポリマーが使用できるが、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などがある。このような剤形を調製する方法は、当業者には明らかなことであろう。その物質は、また、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。
【０２２５】
投与の便宜性および服用量の単一性のために、服用量単位形態で経口または非経口組成物を調製することが特に有利である。本願明細書で使用される服用量単位形態は、処置される患者に対する単一服用量として適当である物理的に区別された単位をいう；各単位は、必要な薬学担体と結合して所望の治療効果を引き起こすように計算された活性成分の所定の量を含む。本発明の服用量単位形態の詳細は、活性成分の独特な特徴、並びに達成しようとする特定治療効果および各個人の治療のための活性化合物を調製する技術に固有な制限に直接依存し、それにより示される。
【０２２６】
このような化合物の毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物、例えばＬＤ５０（集団の５０％が死亡する致死量）、およびＥＤ５０（集団の５０％が反応する治療的有効量）の決定のための実験動物における標準薬学手段によって決定できる。毒性と治療効果間の線量率（dose rate）は治療指標であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０で表現できる。大きい治療指標を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用できるが、、感染していない細胞への潜在的損傷を最小化し、これにより副作用を減らすために、このような化合物が影響される組織の部位に到達するようにする運搬システムを設計すべきである。
【０２２７】
細胞培養分析および動物研究から得たデータは、ヒトに使用するための服用量の範囲を公式化することに使用できる。このような化合物の服用量は、好ましくは毒性が殆どまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内でなければならない。服用量は、使用される服用形態および用いられる投与経路に応じてこの範囲内で変化できる。本発明の方法で使用される任意の化合物に対して、治療的有効量は、最初は細胞培養分析で算定できる。その量は、細胞培養物で決定されたＩＣ５０（症状の最大値の２分の１の抑制を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するため動物モデルにおいて公式化できる。このような情報は、ヒトに有用な量をさらに正確に決定することに使用できる。血漿内のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィによって測定できる。
【実施例】
【０２２８】
下記実施例は、本発明を説明するために提供されるもので、本発明を制限するものと解釈されてはならない。
【０２２９】
調製例
調製例１
（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−Ｒ3−ヒドラジノ）−酢酸の調製
（１）Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチルヒドラジンの調製
【０２３０】
【化１７】
2007503816.tif 000020
【０２３１】
２Ｌの二口丸底フラスコをガラスストッパーおよびカルシウムチューブと共に設置した。ＴＨＦ（３００ｍＬ）中のメチルヒドラジン硫酸（２０ｇ、１３９ｍｍｏｌ、Ｒ3はメチル）溶液を添加し、ＴＨＦ中のＤｉＢｏｃ溶液（３３ｇ、１５３ｍｍｏｌ）を添加した。激烈に攪拌しながら、重炭酸ナトリウム飽和水溶液（５００ｍＬ）を一滴ずつ添加漏斗を介して２時間添加した。６時間後、ＴＨＦ中のＦｍｏｃ−Ｃｌ（３９ｇ、１５３ｍｍｏｌ）溶液を徐々に添加した。得られる懸濁液を６時間０℃で攪拌した。その混合物を酢酸エチル（ＥＡ、５００ｍＬ）で抽出し、有機層を保持した。その溶液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で蒸発させた。次の工程は精製過程なしに進行した。
【０２３２】
１Ｌの二口丸底フラスコをガラスストッパーおよびカルシウムチューブと共に設置した。前工程の生成物溶液をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に入れ、氷浴でマグネチック攪拌しながら、濃ＨＣｌ（３０ｍＬ、１２Ｎ）を添加漏斗を介してゆっくり添加し、一晩中攪拌した。前記混合物をＥＡ（１０００ｍＬ）で抽出し、有機層を保持した。その溶液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で蒸発させた。その残渣をｎ−ヘキサンおよびＥＡと共に再結晶化によって精製し、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチルヒドラジン（３２．２ｇ、８３％）を得た。1HNMR (DMSO-D6) δ 7.90〜7.88 (d, J=6 Hz, 2H,),δ 7.73〜7.70 (d, J=9 Hz, 2H,), 7.44〜7.31 (m, 4H), 4.52〜4.50 (d, J=6 Hz, 2H), 4.31〜4.26 (t, J=6 Hz, 1H), 2.69 (s, 1H)。
【０２３３】
（２）（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ）−酢酸ｔ−ブチルエステルの調製
【０２３４】
【化１８】
2007503816.tif 000021
【０２３５】
１Ｌの二口丸底フラスコをガラスストッパーおよびカルシウムチューブに連結された還流冷却器(reflux condenser)と共に設置した。トルエン中のＮ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチル−ヒドラジン（２０ｇ、７５ｍｍｏｌ）溶液（３００ｍＬ）を添加した。トルエン中のｔ−ブチルブロモアセテート（２２ｇ、１１１ｍｍｏｌ）溶液（５０ｍＬ）をゆっくり添加した。Ｃｓ2ＣＯ3（４９ｇ、１４９ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。激烈に攪拌しながら、ＮａＩ（１１ｇ、７４ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。反応混合物を１日以上還流(reflux)温度で攪拌した。生成混合物を濾過し、ＥＡ（５００ｍＬ）で抽出した。その溶液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で蒸発させた。生成物をヘキサン：ＥＡ＝２：１の溶液でクロマトグラフィによって精製し、（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ）−酢酸ｔ−ブチルエステル（１９．８ｇ、７０％）を得た。1H-NMR (CDCl3-d) δ 7.78〜7.75 (d, J=9 Hz, 2H,),δ 7.61〜7.59 (d, J=6 Hz, 2H,), 7.43〜7.26 (m, 4H), 4.42〜4.40 (d, J=6 Hz, 2H), 4.23 (b, 1H), 3.57 (s, 2H), 2.78 (s, 3H), 1.50 (s, 9H)。
【０２３６】
（３）（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチルヒドラジノ）−酢酸の調製
【０２３７】
【化１９】
2007503816.tif 000022
【０２３８】
１Ｌの二口丸底フラスコをガラスストッパーおよびカルシウムチューブに連結された還流冷却器と共に設置した。（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチルヒドラジノ）−酢酸ｔ−ブチルエステル（２０ｇ、５２ｍｍｏｌ）を添加した。激烈に攪拌しながら、ＨＣｌ溶液（１５０ｍＬ、ジオキサン中の４Ｍ溶液）を氷浴内でゆっくり添加した。前記反応混合物は、室温で１日以上攪拌した。前記溶液は減圧下で４０℃で完全に濃縮した。飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（１００ｍＬ）を添加し、その水層(aqueous layer)をジエチルエーテル（１００ｍＬ）で洗浄した。濃ＨＣｌを０℃（ｐＨ２〜３）で一滴ずつゆっくり添加した。前記混合物を抽出し、有機物層を保持した（５００ｍＬ、ＭＣ）。前記溶液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で蒸発させた。その残渣をｎ−へキサンおよび酢酸エチルで再結晶化によって精製し、（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチルヒドラジノ）−酢酸（１２ｇ、７２％）を得た。1H-NMR (DMSO-d6) δ 12.38 (s, 1H), 8.56 (b, 1H), 7.89〜7.86 (d, J=9 Hz, 2H,), 7.70〜7.67 (d, J=9 Hz, 2H,), 7.43〜7.29 (m, 4H), 4.29〜4.27 (d, J=6 Hz, 2H), 4.25〜4.20 (t, J=6 Hz, 1H), 3.47 (s, 2H), 2.56 (s, 3H)。
【０２３９】
調製例２
（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−Ｒ7−ヒドラジノ）−酢酸の調製
（１）（Ｎ’−メトキシカルボニル−ヒドラジノ）−酢酸エチルエステルの調製
【０２４０】
【化２０】
2007503816.tif 000023
【０２４１】
ＭＯＣ−ＮＨ−ＮＨ2（５０ｇ、０．５５ｍｏＬ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に溶解し、ついでエチルブロモアセテート（６８ｍＬ、０．５５５ｍｏＬ）および炭酸カリウム（７７ｇ、０．５５５ｍｏＬ）を反応槽に添加した。前記混合物は５時間５０℃に維持した。反応が終わった後、混合物を濾過し、ＥｔＯＡｃで希釈した後、塩水で洗浄した（３回）。粗生成物をカラム（溶離液：Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ＝４／１）で精製し、７２の無色オイルを得た。
【０２４２】
（２）［Ｎ−Ｒ7−Ｎ’−メトキシカルボニル−ヒドラジノ］−酢酸エチルエステル
【０２４３】
【化２１】
2007503816.tif 000024
【０２４４】
エチルエステル（１０ｇ、０．０５ｍｏＬ）、炭酸カリウム（６．９ｇ、０．０５ｍｏＬ）およびＲ7−臭化物（１４．１ｇ、０．０６ｍｏＬ）をＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解し、その混合物は５時間５０℃に維持した。反応が終わった後、混合物を濾過し、ＥｔＯＡｃで希釈した後、塩水で洗浄した（３回）。粗生成物をカラム（溶離液：Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ＝４／１）で精製した。
【０２４５】
（３）［Ｎ−Ｒ7−Ｎ’−メトキシカルボニル−ヒドラジノ］−酢酸
【０２４６】
【化２２】
2007503816.tif 000025
【０２４７】
アルキル化されたエチルエステル（９．５ｇ、０．０３ｍｏＬ）をＴＨＦ／水（１／１、ｍＬ）に溶解し、２Ｎ ＮａＯＨ（２８．３ｍＬ）溶液を０℃で添加した。その混合物は室温で２時間攪拌した。出発エステルがＵＶで検出されなかった後、前記溶液をＥＡで希釈し、分離した。水層を１Ｎ ＨＣｌによってｐＨ３〜４に酸性化し、その化合物をＤＣＭによって抽出した（３回）。合わせた有機層をＭｇＳＯ4で乾燥させ、蒸発させて黄色の固体を得た
調製例３
【０２４８】
【化２３】
2007503816.tif 000026
【０２４９】
（１）Ｎβ−Ｍｏｃ−Ｎα−ベンジル−ヒドラジノグリシンの調製
【０２５０】
【化２４】
2007503816.tif 000027
【０２５１】
この化合物は、文献の手段によって調製された(Cheguillaume et. al., Synlett 2000, 3, 331)。
【０２５２】
（２）１−メトキシカルボニル−２，８−ジベンジル−６−メチル−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジンの調製
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ（２．５ｍＬ、２Ｍ）中のベンジルアミン溶液をねじ口ガラス瓶に入れた。その反応混合物を回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を用いて６０℃で１２時間振とうした。樹脂は、濾過によって収集し、ＤＭＦで洗浄した後、ＤＣＭで洗浄して第１構成片を得た。
【０２５３】
ＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）中の、Ｆｍｏｃ−アラニン（４当量、市販、第２構成片）、ＨＡＴＵ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４当量）、およびＤＩＥＡ（４当量）の溶液を樹脂に添加した。反応混合物を室温で４時間振とうした後、樹脂は濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＤＭＦで洗浄した。
【０２５４】
樹脂にＤＭＦ中の２０％ピペリジンを添加した。反応混合物を室温で８分間振とうした後、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＤＭＦで洗浄した。
【０２５５】
ＤＭＦ中のＮβ−Ｍｏｃ−Ｎα−ベンジル−ヒドラジノグリシン（４当量、調製例２の化合物（３）、なお、Ｒ7はベンジル、第３構成片）、ＨＯＢＴ［Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ］（４当量）、およびＤＩＣ（４当量）の溶液を前記調製された樹脂に添加した。反応混合物を室温で３時間振とうした後、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＭｅＯＨで洗浄した。樹脂は室温で真空下で乾燥させた。
【０２５６】
前記樹脂を室温で１８時間蟻酸（２．５ｍＬ）で処理した。樹脂を濾過によって除去した後、濾過液を減圧下で濃縮し、その生産物をオイルとして得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm; 1.51 (d, 3H), 2.99 (m, 1H), 3.39 (d, 1H), 3.69 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 4.02 (d, 1H), 4.24 (d, 1H), 4.39 (d, 1H), 4.75 (d, 1H), 5.14 (q, 1H), 5.58 (dd, 1H), 7.10〜7.38 (m, 10H)。
【０２５７】
調製例４
【０２５８】
【化２５】
2007503816.tif 000028
【０２５９】
（１）Ｎ’−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−ヒドラジノカルボニルクロライドの調製
【０２６０】
【化２６】
2007503816.tif 000029
【０２６１】
トルエン中の１．９３Ｍホスゲン（１．０３ｍＬ、２ｍｍｏｌ）が一つの部分として添加される間、１５ｍＬＣＨ2Ｃｌ2および１５ｍＬのＮａＨＣＯ3飽和水溶液中のＮ−メチルヒドラジンカルボン酸９Ｈ−フルオロ−９−イルメチルエステル（１０７ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）の氷冷した二相性混合物を急激に攪拌した。前記反応混合物を３０分間攪拌し、有機相を収集し、水相をＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。組み合わせられた有機層はＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して１２８ｍｇ（９７％）の塩化カルバモイルを泡状(foamy)固形物として得た。［注意：ホスゲン蒸気は毒性が強い。フードで使用されない］。この生産物はそれ以上の精製なしに下記の固相合成に使用した。
【０２６２】
（２）２，５−ジメチル−７−ベンジル−３，６−ジオキソ−ヘキサヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，５−ａ］ピラジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの調製
ブロモアセタール樹脂（３０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ中のベンジルアミン溶液（１．５ｍＬ、２Ｍ）をねじ口ガラス瓶に入れた。その反応混合物を回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を用いて６０℃で１２時間振とうした。樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦで洗浄した後、ＤＣＭで洗浄して第１構成片を得た。
【０２６３】
ＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）中のＦｍｏｃ−アラニン（３当量、商業的に利用可能、第２構成片）、ＨＡＴＵ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、３当量）、およびＤＩＥＡ（３当量）の溶液を樹脂に添加した。反応混合物を室温で４時間振とうした後、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＤＭＦで洗浄した。それにより第２構成片を第１構成片に添加した。
【０２６４】
樹脂にＤＭＦ中の２０％ピペリジンを添加した。反応混合物を室温で８分間振とうした後、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＤＭＦで洗浄した。
【０２６５】
ＤＣＭ中の前記工程（１）で得られたＮ’−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−ヒドラジノカルボニルクロライド（５当量、第３および第４構成片をあわせたもの）、およびＤＩＥＡ（５当量）の溶液を前記調製された樹脂に添加した。反応混合物を室温で４時間振とうした後、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＤＭＦで洗浄した。
【０２６６】
前記樹脂にＤＭＦ中の２０％ピペリジンを添加した（１ｇの樹脂当たり１０ｍＬ）。反応混合物を室温で８分間振とうした後、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＤＭＦで洗浄した。
【０２６７】
前記樹脂を室温で４時間ＤＣＭ中のイソシアン酸ベンジル（４当量）およびＤＩＥＡ（４当量）の混合物で処理した。ついで樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＭｅＯＨで洗浄した。樹脂を室温で真空乾燥させた。
【０２６８】
前記樹脂を室温で１４時間蟻酸で処理した。樹脂を濾過によって除去した後、濾過液を減圧下で濃縮し、その生産物をオイルとして得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm; 1.48 (d, 3H), 2.98 (s, 3H), 3.18 (m, 1H), 3.46 (m, 1H), 4.37〜4.74 (m, 5H), 5.66 (dd, 1H), 6.18 (m, 1H), 7.10〜7.40 (m, 10H)。
【０２６９】
調製例５
２，５，７−トリメチル−３，６−ジオキソ−ヘキサヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，５−Ａ］ピラジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの調製
標題化合物は、ブロモアセタール樹脂をベンジルアミンに代えてメチルアミン溶液と反応させる以外は、調製例４と同様にして調製される。
【０２７０】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm; 1.48 (d, 3H), 2.99 (s, 3H), 3.03 (s, 3H), 3.38 (m, 1H), 3.53 (dd, 1H), 4.36 (dd, 1H), 4.52 (q, 1H), 4.59 (dd, 1H), 5.72 (dd, 1H), 6.19 (br.t, 1H), 7.10〜7.38 (m, 5H)。
【０２７１】
調製例６
２−メチル−５−（ｐ−ヒドロキシフェニルメチル）−７−ナフチルメチル−３，６−ジオキソ−ヘキサヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，５−Ａ］ピラジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの調製
ブロモアセタール樹脂（３０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ中のナフチルメチルアミン溶液（１．５ｍＬ、２Ｍ）をねじ口ガラス瓶に入れた。その反応混合物を回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を用いて６０℃で１２時間振とうした。樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦで洗浄した後、ＤＣＭで洗浄して第１構成片を得た。
【０２７２】
ＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）中の、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ（３当量）、ＨＡＴＵ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、３当量）、およびＤＩＥＡ（３当量）の溶液を樹脂に添加した。反応混合物を室温で４時間振とうした後、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＤＭＦで洗浄した。それにより第２構成片を第１構成片に添加した。
【０２７３】
樹脂にＤＭＦ中の２０％ピペリジンを添加した。反応混合物を室温で８分間振とうした後、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＤＭＦで洗浄した。
【０２７４】
ＤＣＭ中のＮ’−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−ヒドラジノカルボニルクロライド（５当量）およびＤＩＥＡ（５当量）の溶液を前記調製された樹脂に添加した。反応混合物を室温で４時間振とうした後、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＤＭＦで洗浄した。
【０２７５】
前記樹脂にＤＭＦ中の２０％ピペリジンを添加した（１ｇの樹脂当たり１０ｍＬ）。反応混合物を室温で８分間振とうした後、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＤＭＦで洗浄した。
【０２７６】
前記樹脂を室温で４時間ＤＣＭ中のイソシアン酸ベンジル（４当量）およびＤＩＥＡ（４当量）の混合物で処理した。ついで、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＭｅＯＨで洗浄した。樹脂は室温で真空乾燥させた。
【０２７７】
前記樹脂を室温で１４時間蟻酸で処理した。樹脂を濾過によって除去した後、その濾過液を減圧下で濃縮し、その生産物をオイルとして得た。
【０２７８】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm; 2.80〜2.98 (m, 5H), 3.21〜3.37 (m, 2H), 4.22〜4.52 (m, 2H), 4.59 (t, 1H), 4.71 (d, 1H), 5.02 (dd, 1H), 5.35 (d, 1H), 5.51 (d, 1H), 6.66 (t, 2H), 6.94 (dd, 2H), 7.21〜8.21 (m, 12H)。
【０２７９】
調製例７
２−メチル−６−（ｐ−ヒドロキシフェニルメチル）−８−ナフチル−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの調製
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＭＳＯ中のナフチルメチルアミン溶液（２．５ｍＬ、２Ｍ）をねじ口ガラス瓶に入れた。その反応混合物を回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を用いて６０℃で１２時間振とうした。樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦで洗浄した後、ＤＣＭで洗浄した。
【０２８０】
ＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）中の、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ（４当量）、ＨＡＴＵ［ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］（４当量）、およびＤＩＥＡ（４当量）の溶液を樹脂に添加した。反応混合物を室温で４時間振とうした後、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＤＭＦで洗浄した。
【０２８１】
樹脂にＤＭＦ中の２０％ピペリジンを添加した。反応混合物を室温で８分間振とうした後、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＤＭＦで洗浄した。
【０２８２】
ＤＭＦ中のＮβ−Ｆｍｏｃ−Ｎα−ベンジル−ヒドラジノグリシン（４当量）、ＨＯＢＴ［Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ］（４当量）、およびＤＩＣ（４当量）の溶液を前記調製された樹脂に添加した。反応混合物を室温で３時間振とうした後、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦで洗浄した後、ＤＣＭで洗浄した。前記樹脂にＤＭＦ中の２０％ピペリジンを添加した（１ｇの樹脂当たり１０ｍＬ）。反応混合物を室温で８分間振とうした後、樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＤＭＦで洗浄した。
【０２８３】
前記樹脂を室温で４時間ＤＣＭ中のイソシアン酸ベンジル（４当量）およびＤＩＥＡ（４当量）の混合物で処理した。樹脂を濾過によって収集し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、ＭｅＯＨで洗浄した。ついで樹脂を室温で真空乾燥し、室温で１８時間蟻酸（２．５ｍＬ）で処理した。この樹脂を濾過によって除去した後、濾過液を減圧下で濃縮し、その生産物をオイルとして得た。
【０２８４】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm; 2.73 (s, 3H), 3.13 (d, 1H), 3.21〜3.38 (m, 3H), 3.55 (d, 1H), 3.75 (t, 1H), 4.22 (dd, 1H), 4.36 (dd, 1H), 4.79 (d, 1H), 5.22 (t, 1H), 5.47 (m, 2H), 6.68 (d, 2H), 6.99 (d, 2H), 7.21〜8.21 (m, 12H);
MS (m/z, ESI) 564.1 (MH+) 586.3 (MNa+) 
【０２８５】
実施例
プラスミド
ＣＢＰおよびｐ３００の欠損構築物が市販のｐＴｒｉＥｘ−３ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で発現された。マウスのＣＢＰの欠損シリーズが全長のマウスＣＢＰプラスミド（オレゴン州ポトランドのＶｏｌｌｕｍ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＲｉｃｈａｒｄ Ｇｏｏｄｍａｎ博士からの譲与）からＰＣＲによって生成された。増幅された領域は、５’−末端にＢａｍＨI部位を、３’−末端にＮｏｔI部位を持っているため、発現ベクターｐＴｒｉＥｘ−３のＡＴＧを有するフレームをクローニングできる。プラスミドを認識し精製するために、プラズミドは、また、ＣＯＯＨ−末端に６Ｘ−ヒスチジンおよび単純へスペルウィルス(Herpes Simplex Viral)（ＨＳＶ）タグを有するフレームをクローニングさせた。ＣＢＰのＣ−末端側が切断された構築物のクローニングに使用された順方向プライマー(forward primers)は、５’−GATATCTGAGCTCGTGGATCCGATGGCCGAGAACTTGCTG−３’（配列番号：７）である。ＣＢＰ−Ｃ１（１−３３４）、−Ｃ２（１−６３４）、−Ｃ３（１−１５９４）、−Ｃ４（１−２０６２）、−Ｃ５（１−２６２３）、−Ｃ６（１−３０９４）、−Ｃ７（１−３６９４）に使用された逆方向プライマー(reverse primers)は：Ｃ１：５’−CGTGTATACAGCTGTGCGGCC-GCGTTTGTACTGTTCGGCTG−３’（配列番号：８）、Ｃ２：５’−CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCTCC-ATTCATGACTTGAGC−３’（配列番号：９）、Ｃ３：５’−CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCGCGTTTTT-CAGGGTCTGC−３’（配列番号：１０）、Ｃ４：５’−CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGC AGCTGGTAAAGC-TGGCTG−３’（配列番号：１１）、Ｃ５：５’−CGTGTATACAGCTGTG CGGCCGCATGTTGGAGAGAGGGC−３’（配列番号：１２）、Ｃ６：５’−CGTGTATA CAGCTGTGCGGCCGCAGAACCTTGTAAATCCTC−３’（配列番号：１３）、Ｃ７：５’−CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCGCTGTAGTAGGCTGCATC−３’（配列番号：１４）である。ＣＢＰのＮ−末端側が切断された構築物は、以下の逆方向プライマーで生成された：５’−GTATACAGCTGTGCGGCCGCCAAACCCTCCACAA ACTTTTC−３’（配列番号：１５）。ＣＢＰ−Ｃ８（４０８１−７３２４）、−Ｃ９（４５３４−７３２４）、−Ｃ１０（５０７４−７３２４）、−Ｃ１１（５６７４−７３２４）、−Ｃ１２（６２８６−７３２４）、−Ｃ３（６７５４−７３２４）のための順方向プライマーは：、Ｃ８：５’−GATATCTGAGCTCG-TGGATCCGGAAGCTGGGGAGGTTT TT−３’（配列番号：１６）、Ｃ９：５’−GATATCTGAGCTCGTGGAT-CCGAAGAAGATGC TGGACAAG−３’（配列番号：１７）、Ｃ１０：５’−GATATCTGAGCTCGTGGATCCGT-CC AAATGGTCCACTCTG−３’（配列番号：１８）、Ｃ１１：５’−GATATCTGAGCTCGTGGAT CCGTCTCCT-ACCTCAGCACCA−３’（配列番号：１９）、Ｃ１２：５’−GATATCTGAGCTC GTGGATCCGAACATCCTTAA-ATCAAAC−３’（配列番号：２０）、Ｃ１３：５’−GATATCTGAGCTCGTGGATCCGCAGCAGCAACGCATGGATATCT GAGCCGTGGATCCGCAGCAGCAACGCATG-CAA−３’（配列番号：２１）である。Ｃ−末端が切断された構築物の順方向プライマー、およびＮ−末端が切断された構築物の逆方向プライマーを用いて、全長のマウスＣＢＰは増幅され、ｐＴｒｉＥｘ−３ベクターにクローニングされた。ＣＢＰ（Δ１−１１１：ＮＬＳ）は、下記の順方向プライマーを用いて、全長のＣＢＰのＰＣＲによって生成された。前記プライマーは、ＣＢＰのＮＬＳ配列（下線）の上流のＢａｍＨI部位を含むプライマーであり、ＰＡＧＥによって精製されたプライマー：５’−ATCTGAGCTCGTGGATCCGGGACCGCCCAACCCCAAACGAGCCAAACTCCAGCCGAACAGTACAAACATGGCCAGCTTA−３’（配列番号：２２）、使用した逆方向プライマーは、前述したＮ−末端が切断されたＣＢＰの構築物を生成するプライマーを使用した。挿入体は、ｐＴｒｉＥｘ−３プラスミドのＢａｍＨI−ＮｏｔI部位にクローニングされた。
【０２８６】
ｐ３００の欠損構築物は、Ｄａｖｉｄ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ博士（Ｈａｒｖａｒｄ、ＭＡ）が寄贈したヒトｐ３００プラスミド（ＣＭＶβ−ｐ３００−ＣＨＡ）のＰＣＲによって生成された。前記ＰＣＲ生成物は、ｐＴｒｉＥｘ−３ベクターのＨｉｎｄIII−ＮｏｔI部位にクローニングされた。Ｃ末端が切断されたｐ３００構築物に対する順方向プライマー：５’−GACGGTACCGGTTCGAAGCTTA-TGGCCGAGAATGTGGT-G−３’（配列番号：２３）であった。ｐ３００−Ｐ１（１−３３４）、ｐ３００−Ｐ２（１−６３４）およびｐ３００−Ｐ３’（１−１０５４）に対する逆方向プライマーは、次のとおりである：Ｐ１：５’−CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGC-CAAACCTAATC CAGGACT−３’（配列番号：２４）、Ｐ２：CGTG-TATACAGCTGTGCGGCCGCGTTGC CAGCACTTCCCAT−３’（配列番号：２５）、Ｐ３:CGTGTATACA-GCTGTGCGGCCG CGGCCTGTTCCCGGCGCTG−３’（配列番号：２６）。
【０２８７】
β−カテニン／ＴＣＦレポータプラスミドは、４タンデム(tandem)ＴＣＦ４結合部位（CCAACCTTTGATCTTACCCCCTTTGATCTTACCCCCTTTGATCAG-GAATTCGGTTGGAAACTAGAATGGGGGAAACTAGAATGGGGGAAACTAGTCCTTAAG）（配列番号：２７）を、下流のルシフェラーゼ遺伝子の発現を起こすＳＶ４０プロモータの上流にｐＧＬ３プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｈｏI−ＫｐｎI部位に挿入して生成された。
【０２８８】
全てのプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入した。クローニングに使用される制限酵素は下線し、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡから購入した。
【０２８９】
細胞培養
ヒト大腸癌腫細胞株ＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６、並びに正常的な大腸細胞ＣＣＤ１８Ｃｏ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で１０％胎児小牛血清が補充された、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）で増殖させた。
【０２９０】
トランスフェクション
幾何級数的に増殖するＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６細胞（１０5）は２４−ウェルプレートまたは１００−ｍｍディッシュで培養され、０．５μｇのβ−カテニン／ＴＣＦレポータおよびエフェクター(effector)プラスミドの増加濃度または１０μｇの発現ベクターでそれぞれトランスフェクションされた。細胞は、示したとおりに、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）でトランスフェクションされた。核抽出物は、ＮＥ−ＰＥＲキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に記載の方法によって調製された。
【０２９１】
ルシフェラーゼ分析
様々なグループについてのルシフェラーゼ分析は、デュアルルシフェラーゼ分析（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、トランスフェクション１６〜２４時間後、示されたとおりに２０μＬの細胞溶解物に対して行われた。空発現ベクターであるｐＴｒｉＥｘ−３の増加濃度が標準化(normalization)のために使用された。
【０２９２】
軟寒天分析
軟寒天コロニー形成分析は、前記方法（Ｍｏｏｄｙ ｅｔ ａｌ．，「血管作用の腸内ペプチド拮抗剤は、小さくない細胞肺癌生長を抑制する」Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:4345-49 (1993)）を少し修正して、ＳＷ４８０細胞で実施した。
【０２９３】
６−ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、 Ｒｏｓｋｉｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の各ウェル（３５ｍｍ）は、１０％の胎児牛血清を含有するＤＭＥＭ培地内の０．８％の底寒天１ｍＬでコートされた。凝固した後、０．４％の上層寒天、１０％の胎児牛血清、２倍濃縮された化合物、および５，０００個の単一生細胞を含むＤＭＥＭ培地１ｍＬを各ウェルに添加した。前記培養は、３７℃で湿度のある５％ＣＯ2インキュベータでインキュベーションした。軟寒天培地におけるコロニーを、毎日観察し、８日間のインキュベーション後に写真を取った。直径６０μｍを超過するコロニーの数を数えた。
【０２９４】
免疫沈澱
細胞は、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．９、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール(Mercaptoethanol)、およびＣｏｍｐｌｅｔｅTMタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｃａｌｓ）の１錠を含む溶解(lysis)緩衝液で氷浴上で３０分間溶解され、遠心分離により澄ませた（ｃｌｅａｒｅｄ）。全ての細胞溶解質(lysate)は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．からのＣＢＰ−Ｃ１、Ａ−２２抗体に対する特異的抗体、ｐ３００−Ｐ１、Ｎ−１５抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）に対する特異的抗体、および全長の内因性β−カテニン特異的抗体、タンパク質Ａ−アガロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に予備結合させたモノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）と室温で１時間インキュベーションした。免疫複合体は、ＨＢＳ（１００〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ（示すとおり）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．９、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、およびＣｏｍｐｌｅｔｅTMタンパク質分解酵素阻害剤カクテル１錠）で数回洗浄し、ウェスタンブロットを行った（下記参照）。その後、前記ビーズ(beads)は（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．９、５００ｍＭ ＮａＣｌ、およびＣｏｍｐｌｅｔｅTMタンパク質分解酵素阻害剤カクテルの１錠を含む５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）を含む緩衝液で７回洗浄した。
【０２９５】
プルダウン分析
２５〜１００μＭのビオチニル化された化合物２は、５０％ＤＭＳＯおよび５０％タンパク質結合緩衝液のＰＢＢ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．９、２０％グリセロール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、およびＣｏｍｐｌｅｔｅTMタンパク質分解酵素阻害剤カクテル１錠）を含む緩衝液中の１００μＬのストレプトアビジン−アガロースビーズの５０％スラリー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）に、一晩室温で結合させた。前記ビーズは、ＰＢＢで３回洗浄し、結合していない化合物２を除去した。過剰発現させたプラスミドを含む１００〜２００μＬの全体細胞溶解質を（免疫沈澱部分参照）、室温で３〜４時間、または４℃で一晩ビーズとインキュベーションした。前記ビーズは、さらにＰＢＢ緩衝液で３回洗浄し、その溶離したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびウェスタンブロットした（下記参照）。競合分析において、過剰の化合物１は、各実験で示されたように、室温で１時間、溶解質と前インキュベーションされた。
【０２９６】
ＣｈＩＰ分析
ＳＷ４８０細胞のホルムアルデヒド架橋およびクロマチン免疫沈澱分析は、前述のとおりに行った(Barlev et al., "Acetylation of p53 activates transcription through recruitment of coactivators/histone acetyltransferases," Mol. Cell 8:1243-54 (2001); El-Osta et al., "Analysis of chromatin-immunopurified MeCP2-associated fragments," Biochem. Biophys. Res. Commun. 289:733-37 (2001); Shang et al., "Formation of the androgen receptor transcription Complex," Mol. Cell 9:601-10 (2002))。ｃ−ｍｙｃおよびｃｙｃｌｉｎ Ｄ１プロモータのＰＣＲに使用されるプライマーは、下記のとおりである：ｃ−ｍｙｃ順方向プライマー：５’−TGGTAGGCGCGCGTAGTTA−３’（配列番号：２８）および逆方向プライマー：５’−GGGCGGAGATTAGCGAGAG−３’（配列番号：２９）。Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１順方向プライマー：５’−TGCTTAACAACA-GTAACGT−３’（配列番号：３０）および逆方向プライマー：５’−GGGGCTCTTCCTGGGCAGC−３’（配列番号：３１）。これらのＣｈＩＰプライマーは、転写開始部位近くのプロモータ領域内のＴＣＦ４結合ドメインの下流の約２０〜３０塩基対を設計した。ＰＣＲ生成物は、サイズが約２００の塩基対である。抗−ＣＢＰ、ＡＣ−２６、抗体は、Ｄａｖｉｄ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ博士からの親切なギフトであった。
【０２９７】
ウェスタンブロット分析
前記免疫複合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離された後、（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）からのイモビロン−Ｐ膜（ＰＶＤＦ）に送られた。前記膜は、ＴＢＳＴ（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．９％ ＮａＣｌ、および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％無脂肪乾燥牛乳で遮断された後、特異的抗体でブロットされた。Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．からの抗−Ｈｉｓ抗体が、ｐＴｒｉＥｘ−３で作られたタンパク質の検出に使用された。ホースラディッシュペルオキサイドに結合された２次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）が検出に使用された。免疫ブロットは、ＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて分析された。
【０２９８】
免疫蛍光
化合物１（２５μＭ）または対照群（０．５％ＤＭＳＯ）で処理されたＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６内のＣＢＰおよびβ−カテニンの位置を調査するために、免疫蛍光が使用された。ログ期の細胞が播種され、２４時間後、前記細胞は化合物１または対照群で処理された。処理２４時間後、細胞は固定された。カバースリップは、それぞれＣＢＰ（Ａ−２２）に対する抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびβ−カテニンに対する抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でインキュベーションされた。スライドは、ＦＩＴＣまたはＴＲＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、ＰＡ）に接合された２次抗体が適用された後、Ｎｉｋｏｎ ＰＣＭ２０００ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを用いて検査された。
【０２９９】
流動細胞測定法（ＦＡＣＳ）
ＦＡＣＳ分析のために、ＰＮＲＩ−処理された細胞または媒体−処理された約５×１０6細胞は、７０％冷却エタノールで固定され、少なくとも３０分間−２０℃に保管された。細胞は、１×ＰＢＳで１回洗浄され、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液（８５μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム、０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１０ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡｓｅ）と共に３０分間室温でインキュベーションされた。各サンプルで１０，０００個の染色された細胞がＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＥＰＩＣＳ ＸＬ−ＭＣＬ流動細胞計測器を用いて得られた。細胞サイクルの別の時期にある細胞の百分率は、Ｅｘｐｏ３２ ＡＤＣソフトウェア（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉａｍｉ、Ｆｌｏｒｉｄａ、３３１９６）によって決定された。
【０３００】
タンパク質の精製
ＣＢＰ（１−１１１）およびｐ３００（１−１１１）は、６Ｘ−Ｈｉｓタグと共に融合タンパク質として発現され、それらの６Ｘ−Ｈｉｓ−タグを用いてバクテリアの溶解質から親和精製(affinity-purified)された。形質転換されたバクテリアのペレット（１Ｌ培養液）は、５〜１０ｍＬの溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．９、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、およびＣｏｍｐｌｅｔｅTMタンパク質分解酵素阻害剤カクテル１錠）にさらに懸濁された。細胞は、超音波破砕によって溶解された。透明の溶解質は、５００μＬのＮｉ−ＮＴＡ−アガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）で１時間４℃でインキュベーションされた。結合したタンパク質は、５００μＬの溶離緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．９および１５０ｍＭ ＮａＣｌ、タンパク質分解酵素阻害剤カクテル１錠、５ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび２５０ｍＭイミダゾール）で溶離した。溶離したタンパク質は、少量の部分ずつに分けて冷凍された。
【０３０１】
リアルタイム逆転写−ＰＣＲ分析
ＲＮＡ抽出のためにＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）が使用され、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＳｈｅｌｔｏｎｍＣＴ）に提供されたプロトコルによってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲが行われた。ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ａｘｉｎ２、ｈｎｋｄ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、およびｆｒａ−１増幅のために使用されたプライマーは：ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１順方向プライマー：５’−AGATCGAAGC-CCTGCTG−３’（配列番号：３２）逆方向プライマー：約３００ｂｐサイズの生産物をもたらす５’−AGGGGGAAAGAGCAAAGG−３’（配列番号：３３）；ａｘｉｎ２順方向プライマー：５’−GTGTGAGGTCCAC GGAAA-CT−３’（配列番号：３４）および逆方向プライマー：５’−CTCGGGAAATGAGGTA-GAGA−３’（配列番号：３５）；ｈｎｋｄ順方向プライマー：５’−CTGGCTGCTGCTACCACCA TTGCGT−３’（配列番号：３６）および逆方向プライマー：５’−CCAGGCCCAAATTGGG ACGT−３’（配列番号：３７）；ｃ−ｍｙｃ順方向プライマー：５’−GAA-GAAATTCGAGCTG CTGC−３’（配列番号：３８）および逆方向プライマー：５’−CACATACAGTCCTGGATGAT-G−３’（配列番号：３９）；ｃ−ｊｕｎ順方向プライマー：５’−AGATGCCCGGCGAGACACCG−３’（配列番号：４０）および逆方向プライマー：５’−AGCCCCCGACGGTCTCTTT−３’(配列番号：４１)；ｆｒａ−１順方向プライマー：５’−ACC-CCGGCCAGGAG-TCATCCGGGCCC−３’（配列番号：４２）および逆方向プライマー：５’−AGGCGCCTCACAAAGCGAGGAGGG-TT−３’（配列番号：４３）である。β−ａｃｔｉｎが標準化のために使用された。β−ａｃｔｉｎのためのプライマーは：順方向プライマー：５’−ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG−３’（配列番号：４４）および逆方向プライマー５’−CGTCATACTCCTCCTTGCYGATCCACA TCTGC−３’（配列番号：４５）である。各プライマーセットは、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間４０サイクル、６０℃で１分間増幅された。
【０３０２】
カスパーゼ−３活性分析
ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、およびＣＣＤ１８Ｃｏ細胞が、処理前２４時間の間ウェル当たり１０5細胞で播種された（９６−ウェルプレート）。２５μＭの化合物１または対照群（０．５％ＤＭＳＯ）が各ウェルに添加された。処置２４時間後に、細胞は融解され、カスパーゼ−３／７活性キット（Ａｐｏ−ｏｎｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｃａｓｐａｓｅ−３／７ａｓｓａｙ、＃Ｇ７７９０５、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてカスパーゼ活性が測定された。相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、実験測定値からブランク（対照群、細胞なし）の単位値を差し引いて得た。
【０３０３】
表１は、化合物１（２５μ）または対照群（０．５％ＤＭＳＯ）で４、８または２４時間処置されたＳＷ４８０細胞の定量的リアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＴ）分析の結果を示す。各時点についてのｍＲＮＡ１μｇがリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行われた。内因性ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ｃ−ｍｙｃ、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ｈｎｋｄ、ａｘｉｎ２、ｃ−ｊｕｎおよびＢＭＰ−４は、β−ａｃｔｉｎに対して測定された。Δしきい値周期（ＣＴ）値の定量は、各セットの平均値からβ−ａｃｔｉｎに対して得た対応平均値を差し引いて決定した。全ての実験は２回ずつ行った。
【０３０４】
化合物１はＣＢＰを標的することによりβ−カテニン／ＴＣＦ転写に拮抗する
ＡＰＣ内の突然変異のため、ＴＯＰＦＬＡＳＨレポータシステムによる評価によれば、ＳＷ４８０大腸癌腫細胞は、核へのβ−カテニンの構成性(constitutive)転位(translocation)、すなわち高い基礎(basal)β−カテニン／ＴＣＦ転写を示す(Korinek et al., "Constitutive transcriptional activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/- colon carcinoma," Science 275:1784-87 (1997))。関連したレポータは、β−カテニン／ＴＣＦ媒介転写の抑制剤のための２次構造−鋳型小分子ライブラリのスクリーニングに使用された(Ogbu et al., "Highly efficient and versatile synthesis of libraries of constrained b-strand mimetics," Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:2321-26 (1998); Eguchi et al., "Solid-phase synthesis and structural analysis of Bicyclic β-Turn mimetics incorporating fnctionality at the i to i+3' positions," Amer. Chem. Soci. 102:22031-32 (1999))。この最初のスクリーニングから、われわれは５μＭのＩＣ50（図１Ｂ）、並びにＮＦＡＴ（図１Ｃ）、ＣＲＥおよびＡＰ−１（図示せず）を含む多くの他のＣＢＰ−依存性レポータに比べて非常に良い選択性を持つ化合物１（図１Ａ）を選別した。β−カテニンリン酸化部位が欠乏するが、野性型ＡＰＣを発現するＨＣＴ１１６細胞で、化合物１は同様の活性を示した（図示せず）。
【０３０５】
化合物１の分子標的を決定するために、われわれは、親和試薬として使用するために化合物１を誘導して化合物２（図１Ａ）を得た。核抽出物は、化合物１または媒体で前処理した後、４８０細胞から調製し、その後化合物２と培養した。ついで、その複合体は、ストレプトアビジン−アガロースビーズで分離し、ゲル電気泳動を実施した。化合物２親和カラム上のでＳＷ４８０核抽出物から得られた主バンドは、見掛け分子量２２５ＫＤａを有し、免疫ブロットによってＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）と特定された（図１Ｄ）。化合物１は、化合物２に結合したＣＢＰを特異的に溶離させ（図１Ｄ、レイン７をレイン８と比較する）、親和クロマトグラフィの前の化合物１（２０μＭ）との核抽出物の前インキュベーションにより、ＣＢＰの結合を遮断させた（図１Ｄ、レイン９）。使用された抗体は、ＣＢＰに特異的であり、ｐ３００と交差反応しない。したがって、これらのデータは、化合物１がＣＢＰと結合するということを示す。
【０３０６】
さらなる一連の調査は、化合物１がＣＢＰに結合するということを確認するために行われた。14Ｃ標識化合物１は、14Ｃ標識チロシンを合成の際に挿入させることにより合成された。β−カテニンまたはＣＢＰ発現ベクターでトランスフェクションされていないまたはトランスフェクションされたＳＷ４８０細胞の核溶解質は、ＤＭＳＯまたは冷化合物１と一晩14Ｃ標識化合物１で処理された。その後、細胞溶解質は、結合していない14Ｃ標識化合物１を除去するために、Ｇ−２５カラムを用いて除塩され、放射性の挿入が測定された。図１Ｅに示すように、ＣＢＰでトランスフェクションされた核溶解質は、対照群に比べて約４〜６倍の14Ｃ標識化合物１の挿入増加を示したが（図１Ｅ、レイン２をレイン６と比較する）、それは冷化合物１によって用量依存様式で競合排除された（図１Ｅ、レイン６をレイン７および８と比較する）。
【０３０７】
この証拠に基づき、化合物１はＣＢＰに結合すると結論付けられた。したがって、本発明の一つの特徴は、ＣＢＰ含有組成物を薬剤と結合させることを含む方法を提供し、前記薬剤はＣＢＰに結合する。ＣＢＰへの前記結合は、ＣＢＰがその他に行う任意の他の結合反応を妨げる。よって、本発明は、ＣＰＢに結合することにより患者を治療する方法であって、薬剤の有効量を必要とする患者に投与する方法を提供する。
【０３０８】
化合物１はＣＢＰの最初の１１１アミノ酸と特異的に相互作用する
ビオチン化された同族体(analog)としての化合物２（図１Ａ）は、化合物１を結合するために必要なＣＢＰの最小領域の輪郭を描くのに使用された。過剰発現されたＣＢＰ断片を含む細胞溶解質（図２Ｂ、上部パネル）は、数時間化合物２と予備結合したストレプトアビジン−アガロースビーズと培養された。その後、前記結合したタンパク質は、ビーズから溶離され、結合したＣＢＰ断片を検出するために、抗−Ｈｉｓ抗体を用いてゲル電気泳動および免疫ブロットされた。図示の如く（図２Ｂ、下部パネル）、化合物２が特異的に結合する最小部位は、ＣＢＰのＮＨ2−末端のアミノ酸１−１１１であった（レイン２、３および４を他のものと比較する）。共同−免疫沈澱実験から予想されたように、ＳＷ４８０細胞で過剰発現されたｐ３００断片のいずれとも結合が検出されなかった（図示せず。下記参照）。ｐ３００（１−１１１）、ｐ３００（１−２１１）およびｐ３００（１−３５１）と共に、ＣＢＰ（１−１１１）、ＣＢＰ（１−２１１）およびＣＢＰ（１−３５１）がＳＷ４８０細胞で過剰発現されると（図２Ｃ、下部パネル）、過剰の化合物１は、ＣＢＰ断片の結合を強く競合したが（図２Ｃ、上部パネル、レイン４〜６をレイン７〜９と比較する）、ｐ３００断片の結合に対して何らの影響を与えることができなかった（図２Ｃ、上部パネル、レイン１０〜１２をレイン１３〜１５と比較する）。したがって、化合物１がＣＢＰの最初１１１アミノ酸に結合するが、関連タンパク質であるｐ３００には結合しないものと判断された。
【０３０９】
他の細胞構成成分によって媒介されるＣＢＰおよび化合物１の間接的な結合の可能性を排除するために、かつ直接結合をテストするために、われわれは、６Ｘ−Ｈｉｓ−タグされたＥ．ｃｏｌｉ発現タンパク質を用いてＣＢＰ（１−１１１）およびｐ３００（１−１１１）を親和−精製した（図２Ｄ、右）。ストレプトアビジン−アガロースビーズに結合する化合物２を用いて、われわれは、ｐ３００（１−１１１）には結合せず、化合物２に対するＣＢＰ（１−１１１）の特異結合を示した。それは、過剰の化合物１（図２Ｄ、右側、レイン３〜５をレイン６〜８と比較する）によって競合排除された。このデータは、試験管内でＣＢＰ（１−１１１）と化合物１間の直接結合を確認させる。化合物１がＥ．ｃｏｌｉで発現されたＣＢＰに結合するから、これは、ＣＢＰが化合物１に結合するための哺乳動物キナーゼによるリン酸化を必要とする可能性を減少させる。
【０３１０】
ＣＢＰのアミノ末端による重要な役割のさらなる確認が構築物ＣＢＰ（Δ１−１１１＋ＮＬＳ）を用いて得られた。全長のＣＢＰの発現が用量依存様式で化合物１（２５μＭ）のβ−カテニン／ＴＣＦプロモータ活性抑制を救済するが、ＣＢＰ（Δ１−１１１＋ＮＬＳ）の発現は影響を及ぼさなかった（図２Ｅ）。
【０３１１】
したがって、本発明の一つの特徴は、組成物を薬剤と接触させることを含むβ−カテニンによって誘導された遺伝子発現の調節方法であって、組成物を薬剤と接触させ、前記組成物はβ−カテニン、ＣＢＰおよびｐ３００を含み、前記薬剤はｐ３００に対するβ−カテニンの結合には全くまたは殆ど影響せず、ＣＢＰに対するβ−カテニンの結合を減少させる有効な量の組成物と接触するという方法を提供する。
【０３１２】
化合物１はＣＢＰに対してβ−カテニンと競合する
ＣＢＰは、多くの転写事象において律速因子である。図３Ａに示すように、ＣＢＰの濃度を増加させながらトランスフェクションさせると、化合物１（１２．５μＭ）のＩＣ50は用量依存方式で増加するが、β−カテニンはそうではない。化合物１がＣＢＰに対するβ−カテニンの結合を破壊するかを決定するために、ＳＷ４８０細胞で免疫沈降分析が行われた。ＣＢＰでのβ−カテニンの免疫沈降は、濃度依存方式で化合物１によって抑制された（図３Ｂ、レイン２、３、および４を比較する。レイン１は対照群であって、抗体が添加されなかった）。ＣＢＰに対する化合物１の結合は非常に特異的であり、前記化合物はＣＢＰとｐ３００が非常に同種由来的であるにも拘わらず、ｐ３００に対するβ−カテニンの結合を妨げない（図３Ｂ、下部パネル、レイン２〜４を比較する）。
【０３１３】
前記β−カテニン／ＣＢＰ相互作用をさらに確認するために、ＳＷ４８０細胞が前述したＣＢＰおよびｐ３００欠損構築物でトランスフェクションされた（図２Ａ）。ビーズの洗浄後、ｐ３００（１−１１１）、ｐ３００（１−２１１）およびｐ３００（１−３５１）のみならず、ＣＢＰ（１−１１１）、ＣＢＰ（１−２１１）およびＣＢＰ（１−３５１）は、免疫沈降したβ−カテニンに特異的に結合したままで残っていた（図３Ｃ、レイン２〜４をレイン５〜１５と比較する）。これらの結合研究は、ＣＢＰおよびｐ３００の両方とものＮＨ2−末端の最初１１１アミノ酸がβ−カテニンに結合することを強調した。この部位が化合物１のＣＢＰ結合部位と重畳することを確認するために、われわれは、過剰の化合物１の存在下で、β−カテニンに対する、ＣＢＰ（１−１１１）、ＣＢＰ（１−２１１）およびＣＢＰ（１−３５１）、並びにｐ３００（１−１１１）、ｐ３００（１−２１１）およびｐ３００（１−３５１）の結合を評価した。図３Ｄ、下部パネルは、ＳＷ４８０細胞内でこれらの断片の発現レベルの比較を示す。過剰の化合物１に露出させると、前記断片のβ−カテニンに対する結合を急激に競合排除させる（図３Ｄ、上部パネル、レイン４〜９をレイン１０〜１５と比較する）。示されたデータから、化合物１は、ＣＢＰ（１−１１１アミノ酸）のアミノ末端に特異的に結合して、２つの非常に同種由来のコアクチベーターであるＣＢＰとｐ３００間で区別し、β−カテニンがＣＢＰと相互作用することを競合排除する。
【０３１４】
これらの結合研究は、ＣＢＰおよびｐ３００の両方ともの最初１１１アミノ酸をβ−カテニンとの相互作用の最小領域として強調した。これら領域の配列アライメントは、以前出版されたＴＣＦ、ＡＰＣおよびＥ−カドヘリン(cadherin)内で発見されたβ−カテニン結合モチーフと顕著な類似性を示す。配列アライメントデータは、他のβ−カテニン相互作用タンパク質と同様に、ＣＢＰが、β−カテニン結合に必要な陰電荷を帯びたアミノ酸の保存伸張部分(conserved stretch)に潜伏することを強く暗示する。
【０３１５】
化合物１は核のβ−カテニンを減少させる
２つの中のいずれか一つの位置が化合物１によって影響されるかを決定するために、β−カテニンとＣＢＰの細胞内分布が調査された。ＳＷ４８０細胞内の内因性β−カテニンの多くは、ＣＢＰと同様に核内で発見された（図４Ａ）。化合物１での処理は、ＳＷ４８０細胞の細胞質へのβ−カテニンの転位を引き起こし、ここで内因性Ｅ−カドヘリンの発現は制限される（図４Ａ、対照群（上部）を処理された細胞（下部パネル）と比較する）(de Vries et al., "In vivo and in vitro invasion in relation to phenotypic characteristics of human colorectal carcinoma cells," Br. J. Cancer 71:271-77 (1995))。核伝送抑制剤レプトマイシンＢでの処理は、化合物１によって誘導されるβ−カテニンの細胞質伝送を除去するが、これは、図４Ａから観察されるβ−カテニンの核放出はβ−カテニン／ＣＢＰ複合体の破壊に起因することを示唆する（図示せず）。したがって、われわれは、ＣＢＰに対するβ−カテニンの結合の破壊がβ−カテニンの核レベルを減少させると結論付けた。化合物１によって誘導されるＳＷ４８０細胞の核から細胞質へのβ−カテニンの転位は、ウェスタンブロット分析によって観察された（図４Ｂ）。
【０３１６】
β−カテニン標的遺伝子による分別の調節およびコアクチベーターの利用
ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１遺伝子は、多くの相異なる腫瘍タイプで不適切に発現され、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の直接的標的として知られている(Shtutman et al., "The cyclin D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5522-27 (1999); Tetsu et al., "Beta-catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells," Nature 398:422-26 (1999))。このβ−カテニン／ＴＣＦ経路の直接的標的の発現における化合物１の効果を決定するために、リアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が化合物１（２５μＭ）または対照群で処理された細胞から抽出されたｍＲＮＡに対し、処理後４、８または２４時間で行われた（表１）。表１は、化合物１（２５μＭ）または対照群（０．５％ＤＭＳＯ）で４、８または２４時間処理されたＳＷ４８０細胞の定量的リアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示す。各時間地点に対し、１μｇのｍＲＮＡがリアルタイムＲＴ−ＰＣＲされた。内因性ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ｃ−ｍｙｃ、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ｈｎｋｄ、ａｘｉｎ２、ｃ−ｊｕｎ、およびＢＭＰ−４の発現レベルがβ−アクチンに対して相対的に測定された。Δしきい値周期（ＣＴ）値の定量は、各セットの平均値から、β−アクチンに対して得られた対応する平均値を差し引くことにより決定された。全ての実験は２回ずつ行われた。
【０３１７】
【表２】
2007503816.tif 000030
【０３１８】
β−アクチン遺伝子は、データを標準化するために使用された。Δしきい値周期（ＣＴ）値は、各セットの平均値から、β−アクチン遺伝子に対して得られた対応する平均値を差し引くことにより決定された。細胞内にｍＲＮＡの量が少なければ少ないほど、対応するΔＣＴ値が増加する。表１に示すように、対照群と比較し、ΔＣＴ値が時間−依存性方法により、化合物１が処理された細胞内にｃｙｃｌｉｎ Ｄ１指標に対する増加が観察された。細胞内のｃｙｃｌｉｎ Ｄ１タンパク質レベルも評価された。処理されたＳＷ４８０細胞の全ての細胞溶解質は、ゲル電気泳動およびウェスタンブロットが行われた。図５Ａに示すように、化合物１（２５μＭ）で処理するとき、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１レベルの明白な減少があった。これは、処理後４時間から始まって２４時間に増加した（レイン１をレイン２と、レイン３をレイン４と、そしてレイン５をレイン６と比較する）。
【０３１９】
さらに、遺伝子のサブセットが選択されたが、これは、以前、文献からリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに対してβ-カテニン／ＴＣＦの直接的な標的であることが報告されたものである。これらのセットの中で、ａｘｉｎ２の指標レベルおよびｈｕｍａｎ ｎａｋｅｄ ｃｕｔｉｃｅｌ（ｈｎｋｄ）(Yan et al., "Elevated expression of axin2 and hnkd mRNA provides evidence that Wnt/beta-catenin signaling is activated in human colon tumors," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:14973-78 (2001))が予見とおりに下方制御された（表１）。ところが、様々なβ−カテニン／ＴＣＦによって制御される遺伝子に対する指標レベルが相当増加した。例えば、ｃ−ｍｙｃ(He et al., "Identification of c-MYC as a target of the APC pathway," Science 281:1509-12 (1998))、ｃ−ｊｕｎおよびｆｒａ−１（表１）(Mann et al., "Target genes of beta-catenin-T cell-factor/lymphoid-enhancer-factor signaling in human colorectal carcinomas," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1603-08 (1999))が挙げられる。したがって、化合物１はβ−カテニン標的遺伝子のサ一部の発現のみを抑制する。
【０３２０】
化合物１が、β−カテニン情報伝達の２つの標的遺伝子である、ｃ−ｍｙｃは抑制せず、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１のみを抑制するという事実は、化合物１がＣＢＰに対してのみ特異性を有し、ｐ３００にはそうではないことと、ｃ−ｍｙｃプロモータによるｐ３００の選択的利用が化合物１による抑圧(repression)を回避させることができることを示唆する。内因性ｃ−ｍｙｃプロモータのコアクチベーターの使用を評価するために、化合物１（２５μＭ）または対照群（０．５％ＤＭＳＯ）で処理されたＳＷ４８０細胞でのクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析が行われた。図５Ｂに示すように、ｃ−ｍｙｃプロモータは、対照群処理細胞においてコアクチベーターＣＢＰおよびｐ３００の両方ともによって占有され、大部分はＣＢＰによって占有される。化合物１で処理すると、ＣＢＰがｃ−ｍｙｃプロモータに結合することが完全に且つ選択的に遮断されると同時に、結合したｐ３００レベルが減少する。ｃ−ｍｙｃプロモータと同様に、化合物１で処理すると、ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１プロモータでＣＢＰの結合を完全に且つ選択的に遮断する（図５Ｂ、下部パネル）。これとは際立って対照的に、ｐ３００はｃｙｃｌｉｎ Ｄ１遺伝子のプロモータに結合させるためにＣＢＰの代わりに使用できない。これは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析（表１および図５Ａ）から得たデータと関連している。したがって、化合物１は、ＣＢＰのβ−カテニンにより調節されるプロモータの一部で、ｐ３００ではなくＣＢＰとの結合を選択的に減少させる。
【０３２１】
化合物１の選択性をさらに研究するために、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ａｔｌａｓ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ １．２ Ａｒｒａｙ（＃７８５１−１）を用いたｃＤＮＡマイクロアレイ分析が行われた。データは、化合物１が全体遺伝子転写に対して非常に選択的な効果を持つことを示した（表２〜５）。ＳＷ４８０細胞を２５μＭの化合物１で処理した８時間後、分析された遺伝子の〜２％が２倍以上上方制御され、これに対し遺伝子の〜−０．３％が５０％以上下方制御された（表２〜３）。
【０３２２】
【表３】
2007503816.tif 000031
【０３２３】
【表４】
2007503816.tif 000032
【０３２４】
【表５】
2007503816.tif 000033
【０３２５】
【表６】
2007503816.tif 000034
【０３２６】
化合物１はＧ1／Ｓ期の停止を起こし、カスパーゼ活性を活性化させる
ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１遺伝子の発現の抑制は、細胞周期のＧ1／Ｓ期における停止を起こすことと知られてきた（Shintani et al., 「唾液腺の腺様嚢胞癌におけるＲＢ経路（Ｒｂ−ｐ１６ＩＮＫ４Ａ−ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１）の稀な変更」、Anticancer Res. 20:2169-75 (2000)）。ＨＣＴ１１６（図６Ａ、上部パネル）およびＳＷ４８０（図６Ａ、下部パネル）細胞は、２４時間化合物１（２５μＭ）（図６Ａ、右側パネル）または対照群（０．５％ＤＭＳＯ）（図６Ａ、左側パネル）で処置された。次いで、細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色され、ＦＡＣＳ細胞蛍光計数器(cytofluorometry)でＤＮＡ含量が分析された。予想とおりに、対照群細胞（図６Ａ、左）は正常的にサイクリングする反面、化合物１で処置された細胞（図６Ａ、右側）は細胞周期のＧ1／Ｓ期における蓄積が増加することを示した。したがって、化合物１がＧ1期で細胞停止を起こすことが分かる。
【０３２７】
カスパーゼは、システインタンパク質分解酵素であって、通常アポトーシス刺激により誘発される細胞の与えられた個体群で活性化される。ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６および野性型大腸細胞(colonocytes)（ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞）でアポトーシス誘導を評価するために、細胞を化合物（２５μＭ）または対照群（０．５％ＤＭＳＯ）で２４時間処理した後、カスパーゼ−３／７活性度を分析した。図６Ｂに示すように、化合物１は。ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞に対してＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６細胞でカスパーゼ−３／７経路を特異的に且つ相当に活性化させる。
【０３２８】
化合物１はトランスフェクションされた直腸結腸細胞(Colorectal Cells)の増殖を減少させる
軟寒天コロニー形成分析は、化合物１（０．２５〜５μＭ）および５−フルオロウラシル（０．５〜３２μＭ）で処置されたＳＷ４８０細胞を用いて行われた。図７Ａに示すように、化合物１は、コロニー形成数において用量依存減少を示す。化合物１および５−ＦＵのＩＣ50数値は、それぞれ０．８７±０．１１μＭおよび１．９８±０．１７μｍであった。したがって、化合物１は、カスパーゼ活性度を増加させ、β−カテニン情報伝達を活性化させる突然変異によってトランスフェクションされた直腸結腸細胞の試験管内における増殖を減少させた。
【０３２９】
化合物４および化合物５はＭＩｎマウスモデルで腫瘍増殖を増殖させる
化合物４、化合物５、またはベクターが野性型およびＭｉｎマウスに投与された。化合物４は、また、化合物１の同族体(analog)である（図１Ａ）。各種処置後、これらマウスの小腸および大腸に形成されるポリプの数を測定した（表６）。データは、化合物４および化合物５の両方ともで、約３００ｍｐｋで投与される場合、ベクターのみで処置された対照マウスに比べてＭｉｎマウスでポリプの数が減少することを示す。
【０３３０】
【表７】
2007503816.tif 000035
【０３３１】
化合物３の細胞毒性
化合物３（化合物１の同族体、図１Ａ）の細胞毒性および他の抗癌治療剤は、様々な起源の癌細胞を用いて測定された。その結果によれば、化合物３は、他の抗癌治療剤（すなわち、シスプラチン、５−ＦＵ、ＡＤＲ（アドリアマイシン）に対する濃度と同様であり或いはより少ない濃度における癌細胞の死亡を起こすことを示す（表７）。
【０３３２】
【表８】
2007503816.tif 000036
【０３３３】
ラットおよびヒトにおける化合物３の代謝
化合物３の代謝は、その化合物をラットまたはヒトの肝ミクロソームと共に５分〜１時間インキュベーションし、ＨＰＬＣを介して処置ミクロソームの分画抽出を行い、その分画に対してＭＳ分析を行うことにより分析された。その結果は、図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。いろいろの代謝物（例えば、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）が２つのシステムともから観察された。
【０３３４】
化合物３、化合物４および化合物５の生体利用効率研究
化合物３、化合物４および化合物５の生体利用効率がマウスおよびラットで研究された。これら化合物の構造は図１Ａに示す。これら全ての化合物は、同一のベクター（例えば、２０％Ｔｗｅｅｎ８０）を用いて投与された（ｉ．ｖおよびｐ．ｏ、１０ｍｇ／ｋｇ）。化合物３、４および５のマウスにおける生体利用効率はそれぞれ２％未満、２％未満、略０％であった。ラットにおける化合物３の生体利用効率は約２４％である。
【０３３５】
論議
Ｗｎｔ/β−カテニン経路の誤調節が癌の発達および進行に関与するという山のような強力な証拠がある(Morin, P.J., "Beta-catenin signaling and cancer," Bioessays 21:1021-30 (1999); Moon et al., "The promise and perils of Wnt signaling through beta-catenin," Science 296:1644-46 (2002); Oving et al., "Molecular causes of colon cancer," Eur. J. Clin. Invest. 32:448-57 (2002))。ここで、われわれは式（I）の化合物がβ−カテニン／ＴＣＦ転写のサブセットを抑制するという発見を記述した。構成的に上昇したβ−カテニン／ＴＣＦ転写をもたらすＡＰＣ遺伝子における突然変異を有するＳＷ４８０大腸癌腫細胞内の２次構造−鋳型の化学ライブラリを利用するレポータ遺伝子スクリーニングを用いてこれらの少ない分子量抑制剤の生活性の特性を明らかにした。ビオチンが挿入された同族体（化合物２）を用いた親和性クロマトグラフィは、コアクチベータータンパク質ＣＢＰを化合物１の分子標的として同定した。
【０３３６】
ＣＢＰのトランスフェクションは、14Ｃ標識化合物１のＳＷ４８０核溶解質への結合を相当増加させ、これに対し、β−カテニンのトランスフェクションはそうでなかった。ＣＢＰを化合物１の分子標的として確認するために、ＣＢＰ発現ベクターのトランスフェクションが化合物１によるβ−カテニン／ＴＣＦレポータ遺伝子構築物の抑制を効力なしにすることができる。しかも、化合物１は、β−カテニンおよびＣＢＰの相互作用を選択的に遮断し、この際、β−カテニンが密接に関連しているコアクチベーターｐ３００と相互作用をすることは妨げなかった。また、化合物１は、ＳＷ４８０細胞内で核から細胞質へのβ−カテニンの再分布を引き起こした。最後に、化合物１によって媒介されるｃｙｃｌｉｎ Ｄ１発現の抑制がＧ1／Ｓ細胞周期の停止をもたらし、長期間の処理は、ＳＷ４８０細胞（またはＨＣＴ１１６）細胞でカスパーゼ活性を引き起こしたが、正常大腸細胞ではそうでなかった。トランスフェクションされた大腸癌腫細胞株のアポトーシスを招いた。したがって、化合物１はβ−カテニン経路の抑制剤であり、ＣＢＰはその細胞標的である。
【０３３７】
化合物１の選択性をさらに研究するために、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ａｔｌａｓ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ １．２Ａｒｒａｙ（＃７８５１−１）を用いたｃＤＮＡマイクロアレイ分析が行われた。そのデータは、化合物１が全体遺伝子転写に非常に選択的な影響を及ぼすことを示した（表２〜５）。ＳＷ４８０細胞を２５μＭの化合物１で処理した８時間後、〜２％の分析された遺伝子が２倍以上上方制御され、これに対し、〜０．３％遺伝子が５０％下方制御された（表２〜３）。
【０３３８】
プロモータ依存性コアクチベーター選択性は、β−カテニン／ＴＣＦ経路の複雑性に加える。予見とおりに、化合物１は、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ｈｎｋｄ、およびａｘｉｎ２遺伝子の発現を抑制する(Yan et al., "Elevated expression of axin2 and hnkd mRNA provides evidence that Wnt/beta-catenin signaling is activated in human colon tumors," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:14973-78 (2001))。それとは異なり、ｃ−ｍｙｃ (He et al., "Identification of c-MYC as a target of the APC pathway," Science 281:1509-12 (1998)) およびｃ−ｊｕｎ(Mann et al., "Target genes of beta-catenin-T cell-factor/lymphoid-enhancer-factor signaling in human colorectal carcinomas," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1603-08 (1999)) の発現は、β−カテニン／ＴＣＦ経路における差別的コアクチベーターの使用のために増加する（表１および図７Ｂ）。ＣｈＩＰ分析を用いて、化合物１は、ＣＢＰが内因性ｃ−ｍｙｃおよびｃｙｃｌｉｎ Ｄ１プロモータと結合することを抑制し、処理された細胞でｃ−ｍｙｃプロモータに対してはｐ３００によるプロモータ占有が増加し、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１プロモータに対してはそうではなかった。これは、β−カテニンｃｏ−ＩＰ実験から得られたデータおよびｃｙｃｌｉｎ Ｄ１に対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータと非常に関連している。β−カテニン／ＣＢＰ相互作用を抑制するのに選択的な化合物１およびβ−カテニン／ｐ３００に対して選択的に関連している同族体（Ｋａｈｎ等、出版されていないデータ）は、β−カテニン／ＴＣＦ複合体がプロモータ依存性およびコアクチベーター−特異的方式（図７Ｂ）で遺伝子転写を活性化させるメカニズムを叙述するための新しいケモゲノミクスツールを提供する。
【０３３９】
β−カテニンとコアクチベータータンパク質であるＣＢＰおよびｐ３００間の相互作用の特異的接触部位に関する文献には相当な矛盾がある。これは、多分ＣＢＰおよびｐ３００のβ−カテニンに多い標的タンパク質に不規則な、そして一般に低いまたは適度な(moderate)親和結合と関係がある。われわれは、この状況を明確にするために、ＣＢＰに対する化合物１の結合特異性を使用することができると予想した。化合物１のＣＢＰ断片との結合研究は、ＣＢＰのＮＨ2−末端（アミノ酸１−１１１）における相互作用最小部位の発見を誘導した。しかも、化合物１は、ｐ３００内の同族配列には結合しない。化合物１は、ｐ３００（１−１１１）／β−カテニンの相互作用を妨げず、細胞内のＣＢＰ（１−１１１）およびβ−カテニン間の相互作用を選択的に遮断する。この部位の配列アライメントは、ＴＣＦ、ＡＰＣおよびＥ−カドヘリンから発見された既存出版されたβ−カテニン結合モチーフと顕著な類似性がある（図５Ａ）(Huber et al., "The structure of the beta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverse ligand recognition by beta-catenin," Cell 105:391-402 (2001)) 。ＣＢＰ（１−１１１）およびｐ３００（１−１１１）の両方ともは、β−カテニンと相互作用をするための重要な陰性電荷を帯びたボタン（ＤＥＬＩＸＸＸＸＥ）を含む(Graham et al., "Tcf4 can specifically recognize beta-catenin using alternative conformations," Nat. Struct. Biol. 8:1048-52 (2001))。ＡＰＣおよびＥ−カドヘリンから発見される、Ｘが非極性脂肪族Ｒ基を有するアミノ酸であるＳＸＳＳＸＳモチーフは、また、ＣＢＰ、ＳＡＳＳＰ（アミノ酸８９〜９３）から発見されるが、ｐ３００にはない。たとえＳＷ４８０細胞内で化合物１がｐ３００（１−１１１）に対してＣＢＰ（１−１１１）に差別的に結合することは主に差別的なリン酸化に起因するが、知られている抑制剤ＧＳＫ−３β(Nikoulina et al., "Inhibition of glycogen synthase kinase 3' improves insulin action and glucose metabolism in human skeletal muscle," Diabetes 51:2190-98 (2002))またはＰＫＣ(Bollag et al., "Effects of the selective protein kinase C inhibitor, Ro 31-7549, on the proliferation of cultured mouse epidermal keratinocytes," J. Invest. Dermatol. 100:240-46 (1993))の使用は、化合物１の結合（図示せず）に対しては効果がない。しかも、Ｅ．ｃｏｌｉで発現された、精製された組み換えＣＢＰ（１−１１１）は、化合物１に結合でき、コアクチベーター依存性リン酸化に対して差別的因子としてさらに争う。したがって、化合物１を道具として用いて、われわれはＣＢＰのβ−カテニンとの相互作用の最小部位をＣＢＰの最初１１１アミノ酸に具体的にマッピングした。
【０３４０】
われわれのマッピング研究に関する追加の支援は、ＣＢＰ上のβ−カテニン結合モチーフに非常に近接した、レチノイン酸（ＲＡ）受容体ＲＸＲ／ＲＡＲに対するＣＢＰ上の結合部位の存在から出る（図３Ｆ）。以前、ＲＡ処理がβ−カテニン／ＴＣＦ情報伝達を抑制すると見なされた(Earswaran et al., "Cross-regulation of beta-catenin-LEF/TCF and retinoid signaling pathways," Curr. Biol. 9:1415-18 (1999))。共通（ＬＸＸＬＬ）（配列番号：４６）ＲＸＲ／ＲＡＲ結合部位（ＬＳＥＬＬ）は、ＣＢＰおよびｐ３００の両方とものわれわれ提案のβ−カテニン結合部位内のアミノ酸残基７０〜７４に位置する(Minucci et al., "Retinoid receptors in health and disease: co-regulators and the chromatin connection. Semin," Cell Dev. Biol. 10:215-25 (1999))。
【０３４１】
化合物１は、また、われわれが、β−カテニン情報伝達経路であるプロモータ−依存性コアクチベーター−選択性のイッシュを言及可能にする。化合物１の処理は、ｐ３００がβ−カテニンと相互作用することを抑制せず（図３Ｄ）、処理された細胞で実際にβ−カテニン／ｐ３００複合体の形成を増加させる（図３Ｂ）。配列アライメントから分かるように、マッピングされたβ−カテニン結合モチーフ内で類似であるが、これら２つのコアクチベーター間には化合物１のＣＢＰに対する、ｐ３００に対してはそうでない観察された特異性を説明する。この研究に基づき、ＣＢＰ／ｐ３００のＮ末端１１１アミノ酸およびβ−カテニンの相互作用がβ−カテニン／ＴＣＦ転写活性化に必要であると判断される。
【０３４２】
β−カテニン／ＴＣＦ転写の選択的小分子抑制剤の発見における集中的な興味にも拘わらず、われわれの知見によれば、化合物１は、この経路の直接的小分子抑制剤の最初例を示す。β−カテニンおよびＴＣＦ間の精密な構造研究(Graham et al., "Crystal structure of a beta-catenin/Tcf complex," Cell 103:885-96 (2000); Graham et al., "Tcf4 can specifically recognize beta-catenin using alternative conformations," Nat. Struct. Biol. 8:1048-52 (2001); Poy et al., "Structure of a human Tcf4-beta-catenin complex," Nat. Struct. Biol. 8:1053-57 (2001))、この経路の抑制の演繹的な魅力的モードにも拘わらず、β−カテニンの中央Ａｒｍ反復にまた結合する、ＴＣＦ（例えば、ＡＰＣおよびＥ−カドヘリン）以外の様々なパートナーに起因した特異的抑制剤の発達に関する関心が起こる(Huber et al., "The structure of the beta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverse ligand recognition by beta-catenin," Cell 105:391-402 (2001))。化合物１の精密な選択性は、非常に相同のコアクチベーターｐ３００（ＣＢＰとアミノ酸レベルで９６％までの同一性を有する）とは異なり、それのβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用の特異的抑制を介して、β−カテニン／ＴＣＦ媒介の転写を調査するための独特なケモゲノミクスツール(chemogenomics tool)を提供した。化合物１の特異性、その選択的にトランスフェクションされたが正常ではない大腸細胞でアポトーシス性カスパーゼを活性化させる能力、およびその軟寒天コロニー分析における効用は、それの大腸癌における潜在的有用性を高める情報伝達である。また、化合物１の同族体は、マウスの癌モデルにおいて制限された毒性で生体内効用を示してきた（ＳＷ４８０細胞に注射されたヌードマウスおよびＭｉｎマウスモデル；Moser et al., "ApcMin: a mouse model for intestinal and mammary tumorigenesis," Eur. J. Cancer A:1061-64 (1995); Kahn et al., 出版されていないデータ）。これは、他の超増殖障害および癌化学治療における潜在的使用に対するβ−カテニン／ＴＣＦ／ＣＢＰ転写の選択的抑制剤の用途を確認させる。
【０３４３】
この明細書および／または出願データシートに記録された前記全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国出願、外国特許出願および特許ではない出版らは、本願明細書にその全体が引用として挿入される。
【０３４４】
以上、本発明の特定の実施態様について説明したが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、各種変形例に想到することができ、よって、本発明は、特許請求の範囲による例外を除いては制限されない。
【図面の簡単な説明】
【０３４５】
【図１Ａ（ｉ）】図１Ａ（ｉ）は、化合物１及び化合物２の構造を示す図である。
【図１Ａ（ｉｉ）】図１Ａ（ｉｉ）は、化合物３、化合物４及び化合物５の構造を示す図である。
【図１Ｂ（ｉ）】図１Ｂ（ｉ）は、化合物１が、βカテニン／ＴＣＦレポーター遺伝子構造体を抑制することを示す一例の図である。
【図１Ｂ（ｉｉ）】図１Ｂ（ｉｉ）は、化合物１が、βカテニン／ＴＣＦレポーター遺伝子構造体を抑制することを示すその他の例の図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、化合物１の、ＮＦＡＴレポーター遺伝子構造体への影響を及ぼさないこと示す一例の図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＣＢＰが化合物１の分子標的であることを示す一例の図である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、１４Ｃ標識化合物１の取り込みを測定した結果の一例を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＣＢＰの野生型及び欠失構造体を説明する図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＣＢＰ欠失構造体と化合物２との結合を示す一例の図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、化合物１のＣＢＰへの競合を示す一例の図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、化合物１のＣＢＰへの競合を示すその他の例の図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、化合物１のＣＢＰ（Δ１−１１１＋ＮＬＳ）への影響を示す一例の図である。
【図３Ａ】図３Ａは、化合物１の結合破壊に対するＣＢＰ及びβ−カテニンの容量依存性の一例を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、化合物１がＣＢＰに対してβ−カテニンと競合する一例を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＣＢＰ（１−１１１）が、β−カテニンと相互作用する最小部位であることを示す一例の図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、化合物１が、ＣＢＰに対してβ−カテニンと競合するが、ｐ３００構造体とは競合しないことを示す一例の図である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、β−カテニン結合モチーフのアライメントの一例を示す図である。
【図３Ｆ】図３Ｆは、ＣＢＰ１−１１１とｐ３００１−１１１とのアライメントの一例を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、β−カテニン及びＣＢＰの免疫蛍光顕微鏡観察の一例を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、β−カテニンのウエスタンロット分析の一例を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、サイクリンＤ１のウエスタンロット分析の一例を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｃ−ｍｙｃプロモーター及びサイクリンＤ１プロモーターを用いたＣｈＩＰ測定法の結果の一例を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、化合物1を作用させた細胞のＦＡＣＳ分析の結果の一例を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、化合物１の大腸癌細胞におけるカスパーゼ活性化作用の一例を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、化合物１がトランスフェクションされた直腸結腸細胞の増殖を減少させることの一例を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、化合物１の効果の概略図である。
【図８】図８は、本発明の実施に有用な化学薬剤の製造するための一般的な合成概略を示す一例の図である。
【図９】図９は、本発明の実施に有用な化学薬剤の製造するための一般的な合成概略を示すその他の例の図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、化合物３のラットにおける代謝分析の結果の一例を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、化合物３のヒトにおける代謝分析の結果の一例を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０３４６】
配列番号７、１６〜２３、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４：フォワードプライマー
配列番号８〜１５、２４〜２６、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５：リバースプライマー
配列番号２７：４タンデム(tandem)ＴＣＦ４結合部位
配列番号４６：ＲＸＲ／ＲＡＲ結合部位
【図１Ａ（ｉ）】
2007503816.tif 000049
【図１Ａ（ｉｉ）】
2007503816.tif 000050
【図１Ｂ（ｉ）】
2007503816.tif 000051
【図１Ｂ（ｉｉ）】
2007503816.tif 000052
【図１Ｃ】
2007503816.tif 000053
【図１Ｄ】
2007503816.tif 000054
【図１Ｅ】
2007503816.tif 000055
【図２Ａ】
2007503816.tif 000056
【図２Ｂ】
2007503816.tif 000057
【図２Ｃ】
2007503816.tif 000058
【図２Ｄ】
2007503816.tif 000059
【図２Ｅ】
2007503816.tif 000060
【図３Ａ】
2007503816.tif 000061
【図３Ｂ】
2007503816.tif 000062
【図３Ｃ】
2007503816.tif 000063
【図３Ｄ】
2007503816.tif 000064
【図３Ｅ】
2007503816.tif 000065
【図３Ｆ】
2007503816.tif 000066
【図４Ａ】
2007503816.tif 000067
【図４Ｂ】
2007503816.tif 000068
【図５Ａ】
2007503816.tif 000069
【図５Ｂ】
2007503816.tif 000070
【図６Ａ】
2007503816.tif 000071
【図６Ｂ】
2007503816.tif 000072
【図７Ａ】
2007503816.tif 000073
【図７Ｂ】
2007503816.tif 000074
【図８】
2007503816.tif 000075
【図９】
2007503816.tif 000076
【図１０Ａ】
2007503816.tif 000077
【図１０Ｂ】
2007503816.tif 000078
【配列表】
2007503816000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月16日(2006.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物を薬剤と接触させることを含む、β−カテニンにより誘導される標的遺伝子の発現を調節する方法であって、前記組成物はβ−カテニン、ＣＢＰおよびｐ３００を含み、前記β−カテニンはｐ３００に対するＣＢＰへの結合可能性を有し、前記薬剤はβ−カテニンがｐ３００に対するＣＢＰへの結合可能性を変化させるのに有効な量で組成物と接触する方法。
【請求項２】
前記薬剤がβ−カテニンに対するＣＢＰの結合を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤がβ−カテニンに対するｐ３００の結合を減少させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤がβ−カテニンに対するｐ３００の結合を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤がβ−カテニンに対するＣＢＰの結合を減少させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が生体外(ex vivo)に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が幹細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が細胞または哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物が癌に罹患し、前記量が前記癌の治療に有効な量である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が大腸癌（colon cancer）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が前立腺癌および乳房癌から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物は細胞であり、前記薬剤は前記細胞が増殖ではなく分化する可能性を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は細胞であり、前記薬剤は前記細胞が分化ではなく増殖する可能性を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造の化合物を有する、請求項１に記載の方法：
【化１】
2007503816.tif 000079
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基(side chain moiety)、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項１５】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、アミノＣ2-5アルキル、グアニジノＣ2-5アルキル、Ｃ1-4アルキルグアニジノＣ2-5アルキル、ジＣ1-4アルキルグアニジノＣ2-5アルキル、アミジノＣ2-5アルキル、Ｃ1-4アルキルアミジノＣ2-5アルキル、ジＣ1-4アルキルアミジノＣ2-5アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、フェニル、置換フェニル（ここで、フェニル上の置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ベンジル、置換ベンジル（ここで、ベンジル上の置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ナフチル、置換ナフチル（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ビス−フェニルメチル、置換ビス−フェニルメチル（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリジル、置換ピリジル、（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリジルＣ1-4アルキル、置換ピリジルＣ1-4アルキル（ここで、ピリジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリミジルＣ1-4アルキル、置換ピリミジルＣ1-4アルキル（ここで、ピリミジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、トリアジン−２−イル−Ｃ1-4アルキル、置換トリアジン−２−イル−Ｃ1-4アルキル（ここで、トリアジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、イミダゾールＣ1-4アルキル、置換イミダゾールＣ1-4アルキル（ここで、イミダゾール置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、イミダゾリニルＣ1-4アルキル、Ｎ−アミノピペラジニル−Ｎ−Ｃ0-4アルキル、ヒドロキシＣ2-5アルキル、Ｃ1-5アルキルアミノＣ2-5アルキル、Ｃ1-5ジアルキルアミノＣ2-5アルキル、Ｎ−アミジノピペリジニルＣ1-4アルキルおよび４−アミノシクロヘキシルＣ0-2アルキルから独立に選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ａが−（ＣＨＲ3）−であり、Ｂが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄが−（ＣＨＲ5）−であり、Ｅが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇが−（ＸＲ7）n−であり、前記化合物が下記一般式（II）を有する、請求項１４に記載の方法：
【化２】
2007503816.tif 000080
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｗ、Ｘおよびｎは、請求項１４の定義と同様である。
【請求項１７】
Ａが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが−（ＣＨＲ4）−であり、Ｄが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅが−（ＺＲ6）−であり、Ｇが−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−であり、前記化合物が下記一般式（III）を有する、請求項１４に記載の方法：
【化３】
2007503816.tif 000081
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ9、ＷおよびＸは、請求項１４の定義と同様であり、Ｚは、窒素またはＣＨであり、但しＺがＣＨであれば、Ｘは窒素である。
【請求項１８】
Ａが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが−（ＣＨＲ4）−であり、Ｄが−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅが−（ＺＲ6）−であり、Ｇが（ＸＲ7）n−であり、前記化合物は下記一般式（IV）を有する、請求項１４に記載の方法：
【化４】
2007503816.tif 000082
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｗ、Ｘ及びｎは、請求項１４の定義と同様であり、Ｚは、窒素またはＣＨであり、但し、Ｚが窒素であれば、ｎは０であり、またＺがＣＨであれば、Ｘは窒素であり、ｎは０ではない。
【請求項１９】
前記化合物は、下記一般式（VI）を有する、請求項１８に記載の方法：
【化５】
2007503816.tif 000083
式中、Ｒaは、窒素、酸素または硫黄から選択される１〜３個のヘテロ原子を持つことが可能な８〜１１員環の二環式(bicyclic)アリール基であり、Ｒbは、窒素、酸素または硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を持つことが可能な５〜７員環の単環式アリール基であり、化合物中のアリール環がハロゲン化物、ヒドロキシ、シアノ、低級アルキル、及び低級アルコキシ基からなる群から選択される少なくとも一つの置換基を持つことができる。
【請求項２０】
Ｒaはナフチル、キノリニルまたはイソキノリニル基であり、Ｒbはフェニル、ピリジルまたはピペリジルであり、これらすべてはハロゲン化合物、ヒドロキシ、シアノ、低級アルキル、および低級アルコキシ基からなる群から選択される少なくとも一つの置換基で置換できる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒaはナフチルであり、Ｒbはフェニルであり、これらはハロゲン化物、ヒドロキシ、シアノ、低級アルキル、及び低級アルコキシ基からなる群から選択される少なくとも一つの置換基で置換できる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤が化合物１である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
薬剤、β−カテニン、ＣＢＰおよびｐ３００を含む組成物であって、β−カテニンはｐ３００に対するＣＢＰへの結合可能性を有し、前記薬剤はβ−カテニンがｐ３００に対するＣＢＰへの結合可能性を変化させるのに有効な量で組成物内に存在する、組成物。
【請求項２４】
前記薬剤がβ−カテニンに対するＣＢＰの結合を増加させる、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記薬剤がβ−カテニンに対するｐ３００の結合を減少させる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記薬剤がβ−カテニンに対するｐ３００の結合を増加させる、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記薬剤がβ−カテニンに対するＣＢＰの結合を減少させる、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が生体外(ex vivo)状態にある、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物が幹細胞をさらに含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記薬剤は、細胞が増殖ではなく分化する可能性を増加させる、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記薬剤は、細胞が分化ではなく増殖する可能性を増加させる、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記薬剤が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造の化合物を持つ、請求項２３に記載の組成物：
【化６】
2007503816.tif 000084
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項３３】
前記薬剤が化合物１である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
（ａ）Ｗｎｔ経路の構成要素を含む組成物（ｉ）を、Ｗｎｔ経路を活性化させる化合物（ii）と接触させ、活性化されたＷｎｔ経路を提供し、
（ｂ）ｐ３００およびβ−カテニン間の結合を完全にまたは実質的に妨げるが、ＣＢＰおよびβ−カテニン間の結合は殆どまたは全く妨げない化学薬剤でＷｎｔ経路の活性を調節することを含む、Ｗｎｔ経路の活性を調節する方法。
【請求項３５】
前記組成物が細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
生体外(ex vivo)で行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物がＬｉＣｌまたはＧＳＫ３抑制剤である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記化学薬剤が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造の化合物を持つ、請求項３４に記載の方法：
【化７】
2007503816.tif 000085
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項３９】
（ａ）細胞集団を、集団の一部は増殖し、一部は分化する条件下とし、
（ｂ）前記集団に化学薬剤を添加し、前記薬剤が、分化する細胞の割合に対して増殖する細胞の割合を増加させることを含む、細胞増殖を調節する方法。
【請求項４０】
前記薬剤はｐ３００及びカテニン間の結合を妨げる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
Ｗｎｔ経路を活性化させる薬剤を集団に添加することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞集団は幹細胞の集団である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
生体外(ex vivo)で行われる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
細胞集団の分化を引き起こす薬剤を添加することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
集団内の細胞が分化して血液細胞を形成する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
集団内の細胞が分化して神経細胞、筋肉細胞、骨細胞または膵臓ベータ細胞(pancreatic beta-cells)を形成する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記化学薬剤が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造の化合物を持つ、請求項４４に記載の方法：
【化８】
2007503816.tif 000086
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項４８】
β−カテニン／ｐ３００相互作用に対してβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用を選択的に抑制する方法であって、前記方法は化合物を組成物に投与することを含み、前記組成物はβ−カテニン、ＣＢＰ及びｐ３００を含み、前記化合物はβ−カテニン／ｐ３００相互作用
に対してβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用を選択的に抑制する方法。
【請求項４９】
前記化合物が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造を持つ、請求項４８に記載の方法：
【化９】
2007503816.tif 000087
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項５０】
β−カテニン／ＣＢＰ相互作用に対してβ−カテニン／ｐ３００相互作用を選択的に抑制する方法であって、前記方法は化合物を組成物に投与することを含み、前記組成物はβ−カテニン、ＣＢＰ及びｐ３００を含み、前記化合物はβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用に対してβ−カテニン／ｐ３００相互作用を選択的に抑制する方法。
【請求項５１】
前記化合物が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造を持つ、請求項５０に記載の方法：
【化１０】
2007503816.tif 000088
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項５２】
核から細胞質へのβ−カテニンの転位(translocation)を促進させる方法であって、前記方法は化合物を細胞に投与することを含み、前記細胞は核及び細胞質を含み、前記核はβ−カテニンを含み、前記化合物は核から細胞質へのβ−カテニンの転位を起こす方法。
【請求項５３】
前記化合物が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造を持つ、請求項５２に記載の方法：
【化１１】
2007503816.tif 000089
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項５４】
ＷＮＴ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子の発現を選択的に抑制する方法であって、前記方法は化合物を組成物に投与することを含み、前記組成物はＷＮＴ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子を含み、前記化合物はＷＮＴ／β−カテニン経路により標的とされる遺伝子の発現の変化を起こす方法。
【請求項５５】
前記化合物が、下記式（I）およびその異性体から選択される構造を持つ、請求項５４に記載の方法：
【化１２】
2007503816.tif 000090
式中、Ａは−（ＣＨＲ3）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは−（ＣＨＲ4）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは−（ＣＨＲ5）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは−（ＺＲ6）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは−（ＸＲ7）n−、−（ＣＨＲ7）−（ＮＲ8）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ9）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ2）−、または存在せず、Ｙは酸素または硫黄であり、ＸおよびＺは独立に窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１であり；およびＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は同一または異なり、それぞれアミノ酸側鎖基、アミノ酸側鎖基の誘導体、または分子の残基から独立に選択される。
【請求項５６】
幹細胞を未分化状態に維持させる方法であって、細胞の分化を抑制しまたは細胞の増殖を促進させる薬剤と、幹細胞を未分化状態に維持するのに有効な量で幹細胞を接触させることを含む方法。
【請求項５７】
前記薬剤は、β−カテニン／ＣＢＰ相互作用に対してβ−カテニン／ｐ３００相互作用を選択的に抑制する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
β−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を同定する方法であって、
（ａ）推定のβ−カテニン：ＣＢＰ小分子抑制剤を、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と接触させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、β−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のβ−カテニンを含む部分（moiety）と前記工程（ａ）のＣＢＰ １−１１１を含む部分（moiety）との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分（moiety）と前記β−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するとの決定によって、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の抑制剤として同定する工程とを含む方法。
【請求項５９】
（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)（１）及びβ−カテニン（２）を含む混合物に接触させる工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の前記分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分（moiety）とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程とをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
β−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を同定する方法であって、
（ａ）推定のβ−カテニン：ＣＢＰの小分子抑制剤を、β−カテニンを含む部分と接触させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と接触させる工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と前記工程（ａ）のβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、β−カテニンを含む部分(moiety)とＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するか否かの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の抑制剤として同定する工程とを含む方法。
【請求項６１】
（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)（１）およびβ−カテニン（２）を含む混合物と接触させる工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の前記分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程とをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
β−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を同定する方法であって、
（ａ）推定のβ−カテニン：ＣＢＰ小分子抑制剤を、ＣＢＰ １−１１１と結合した(associated)β−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の前記分子が、β−カテニンからＣＢＰ １−１１１を分離させるかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）の前記小分子が、ＣＢＰ １−１１１からβ−カテニンの結合を分離させるとの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の抑制剤として同定する工程とを含む方法。
【請求項６３】
（ｄ）前記工程（ｃ）で同定されたβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤を、ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)（１）およびβ−カテニン（２）を含む混合物に接触させる工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の前記分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｆ）前記工程（ｄ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ＣＢＰ相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程とをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
β−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を同定する方法であって、
（ａ）推定のβ−カテニン：ｐ３００小分子抑制剤を、ｐ３００ １−１１１を含む部分と接触させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、β−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のβ−カテニンを含む部分(moiety)と前記工程（ａ）のｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、前記ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するとの決定によって、前記工程（ａ）の前記小分子をβ−カテニン：ｐ３００相互作用の抑制剤として同定する工程とを含む方法。
【請求項６５】
（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)（１）およびβ−カテニン（２）を含む混合物に接触させる工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の前記分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と前記β−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ｐ３００相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程とをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
β−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を同定する方法であって、
（ａ）推定のβ−カテニン：ｐ３００小分子抑制剤を、β−カテニンを含む部分と接触させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)と接触させる工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のｐ３００ １−１１１と含む部分(moiety)が前記工程（ａ）のβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、前記β−カテニンを含む部分(moiety)とｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するとの決定によって、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ｐ３００相互作用の抑制剤として同定する工程とを含む、方法。
【請求項６７】
（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)（１）およびβ−カテニン（２）を含む混合物に接触させる工程と、
（ｆ）工程（ｅ）の前記分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と前記β−カテニンとの結合を抑制しないことの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ｐ３００相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程とをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
β−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を同定する方法であって、
（ａ）推定のβ−カテニン：ｐ３００小分子抑制剤を、ｐ３００ １−１１１と結合したβ−カテニン（１）を含む部分(moiety)と接触させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の前記分子が、β−カテニンからｐ３００ １−１１１を分離させるかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）の前記小分子が、ｐ３００ １−１１１からβ−カテニンの結合を分離させるとの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ｐ３００相互作用の抑制剤として同定する工程とを含む方法。
【請求項６９】
（ｄ）前記工程（ｃ）で同定されたβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)（１）およびβ−カテニン（２）を含む混合物に接触させる工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の前記分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程と、
（ｆ）前記工程（ｄ）の前記小分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)と前記β−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ｐ３００相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程とをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
配列番号：１または配列番号：１と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列（但し、前記配列は全長のＣＢＰタンパク質をコードしない）を含む、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項７１】
前記核酸分子は、前記配列番号：１と少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項７０に記載の核酸分子。
【請求項７２】
前記核酸分子は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項７０に記載の核酸分子。
【請求項７３】
前記核酸分子が、ＣＢＰタンパク質内に存在する、２００個以下の連続したアミノ酸残基を含むペプチドをコードする、請求項７０に記載の核酸分子。
【請求項７４】
前記核酸分子が、ＣＢＰタンパク質内に存在する、１５０個以下の連続したアミノ酸残基を含むペプチドをコードする、請求項７０に記載の核酸分子。
【請求項７５】
前記ペプチドが、配列番号：２または配列番号：５を含む、請求項７４に記載の核酸分子。
【請求項７６】
配列番号：１の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列（但し、前記配列は全長のＣＢＰタンパク質をコードしない）を含む、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項７７】
前記断片が９０〜３００核酸を有する、請求項７６に記載の核酸分子。
【請求項７８】
前記核酸分子が前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項７６に記載の核酸分子。
【請求項７９】
前記断片が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項７６に記載の核酸分子。
【請求項８０】
配列番号：２または配列番号：２と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドを含む、実質的に精製単離されたペプチド（但し、ペプチドは全長のＣＢＰタンパク質ではない）。
【請求項８１】
前記ペプチドが配列番号：２と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項８０に記載のペプチド。
【請求項８２】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項８０に記載のペプチド。
【請求項８３】
前記ペプチドが、ＣＢＰタンパク質内に存在する、連続したアミノ酸２００残基以下を含む、請求項８０に記載のペプチド。
【請求項８４】
前記ペプチドが、ＣＢＰタンパク質内に存在する、連続したアミノ酸１５０残基以下を含む、請求項８０に記載のペプチド。
【請求項８５】
前記ペプチドが配列番号：２または配列番号：４を含む、請求項８４に記載のペプチド。
【請求項８６】
配列番号：２の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む、実質的に精製単離されたペプチド（但し、前記ペプチドは全長のＣＢＰタンパク質ではない）。
【請求項８７】
前記断片が３０〜１００アミノ酸を有する、請求項８６に記載のペプチド。
【請求項８８】
前記ペプチドが前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項８６に記載のペプチド。
【請求項８９】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項８６に記載のペプチド。
【請求項９０】
配列番号：１または配列番号：１と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列（但し、前記配列は全長のＣＢＰタンパク質をコードしない）から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項９１】
前記核酸分子は配列番号：１と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項９０に記載の核酸分子。
【請求項９２】
前記核酸分子が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項９０に記載の核酸分子。
【請求項９３】
配列番号：１の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項９４】
前記断片は９０〜３００ヌクレオチドを有する、請求項９３に記載の核酸分子。
【請求項９５】
前記核酸分子が、前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項９３に記載の核酸分子。
【請求項９６】
前記断片が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項９３に記載の核酸分子。
【請求項９７】
配列番号：２または配列番号：２と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから本質的に構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項９８】
前記ペプチドが配列番号：２と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項９７に記載のペプチド。
【請求項９９】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項９７に記載のペプチド。
【請求項１００】
配列番号：２の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項１０１】
前記断片は３０〜１００アミノ酸を有する、請求項１００に記載のペプチド。
【請求項１０２】
前記ペプチドは前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１００に記載のペプチド。
【請求項１０３】
前記ペプチドはβ−カテニンに結合する、請求項１００に記載のペプチド。
【請求項１０４】
配列番号：１または配列番号：１と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項１０５】
前記核酸分子は配列番号：１と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１０４に記載の核酸分子。
【請求項１０６】
前記核酸分子がβ−カテニンに結合する、請求項１０４に記載の核酸分子。
【請求項１０７】
配列番号：１の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項１０８】
前記断片は９０〜３００ヌクレオチドを有する、請求項１０７に記載の核酸分子。
【請求項１０９】
前記核酸分子が前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１０７に記載の核酸分子。
【請求項１１０】
前記断片が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項１０７に記載の核酸分子。
【請求項１１１】
配列番号：２または配列番号：２と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項１１２】
前記ペプチドが配列番号：２と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１１１に記載のペプチド。
【請求項１１３】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項１１１に記載のペプチド。
【請求項１１４】
配列番号：２の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項１１５】
前記断片は３０〜１００アミノ酸を有する、請求項１１４に記載のペプチド。
【請求項１１６】
前記ペプチドは前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１１４に記載のペプチド。
【請求項１１７】
前記ペプチドはβ−カテニンに結合する、請求項１１４に記載のペプチド。
【請求項１１８】
配列番号：３または配列番号：３と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列（但し、前記配列は全長のｐ３００タンパク質をコードしない）を含む、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項１１９】
前記核酸分子は配列番号：３と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１１８に記載の核酸分子。
【請求項１２０】
前記核酸分子が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項１１８に記載の核酸分子。
【請求項１２１】
前記核酸分子が、ｐ３００タンパク質内に存在する、２００個以下の連続したアミノ酸残基を含むペプチドをコードする、請求項１１８に記載の核酸分子。
【請求項１２２】
前記核酸分子が、ｐ３００タンパク質内に存在する、１５０個以下の連続したアミノ酸残基を含むペプチドをコードする、請求項１１８に記載の核酸分子。
【請求項１２３】
前記ペプチドが配列番号：４を含む、請求項１２２に記載の核酸分子。
【請求項１２４】
配列番号：３の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列（但し、前記配列は全長のｐ３００タンパク質をコードしない）を含む、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項１２５】
前記断片は９０〜３００ヌクレオチドを有する、請求項１２４に記載の核酸分子。
【請求項１２６】
前記核酸分子は、前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１２４に記載の核酸分子。
【請求項１２７】
前記断片は、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項１２４に記載の核酸分子。
【請求項１２８】
配列番号：４または配列番号：４と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドを含む、実質的に精製単離されたペプチド（但し、ペプチドは全長のｐ３００タンパク質ではない）。
【請求項１２９】
前記ペプチドが配列番号：４と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１２８に記載のペプチド。
【請求項１３０】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項１２８に記載のペプチド。
【請求項１３１】
前記ペプチドが、ｐ３００タンパク質内に存在する、連続したアミノ酸２００残基以下を含む、請求項１２８に記載のペプチド。
【請求項１３２】
前記ペプチドが、ｐ３００タンパク質内に存在する、連続したアミノ酸１５０残基以下を含む、請求項１２８に記載のペプチド。
【請求項１３３】
前記ペプチドが配列番号：４を含む、請求項１３２に記載のペプチド。
【請求項１３４】
配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む、実質的に精製単離されたペプチド（但し、ペプチドは全長のｐ３００タンパク質ではない）。
【請求項１３５】
前記断片が３０〜１００アミノ酸を有する、請求項１３４に記載のペプチド。
【請求項１３６】
前記ペプチドが前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１３４に記載のペプチド。
【請求項１３７】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項１３４に記載のペプチド。
【請求項１３８】
配列番号：３または配列番号：３と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項１３９】
前記核酸分子が配列番号：３と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１３８に記載の核酸分子。
【請求項１４０】
前記核酸分子が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項１３８に記載の核酸分子。
【請求項１４１】
配列番号：３の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製分離された核酸分子。
【請求項１４２】
前記断片が９０〜３００ヌクレオチドを有する、請求項１４１に記載の核酸分子。
【請求項１４３】
前記核酸分子が前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１４１に記載の核酸分子。
【請求項１４４】
前記断片が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項１４１に記載の核酸分子。
【請求項１４５】
配列番号：４または配列番号：４と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから本質的に構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項１４６】
前記ペプチドが配列番号：４と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１４５に記載のペプチド。
【請求項１４７】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項１４５に記載のペプチド。
【請求項１４８】
配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項１４９】
前記断片は３０〜１００アミノ酸を有する、請求項１４８に記載のペプチド。
【請求項１５０】
前記ペプチドは前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１４８に記載のペプチド。
【請求項１５１】
前記ペプチドはβ−カテニンに結合する、請求項１４８に記載のペプチド。
【請求項１５２】
配列番号：３または配列番号：３と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項１５３】
前記核酸分子が、配列番号：３と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１５２に記載の核酸分子。
【請求項１５４】
前記核酸分子が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項１５２に記載の核酸分子。
【請求項１５５】
配列番号：３の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸分子。
【請求項１５６】
前記断片が９０〜３００ヌクレオチドを有する、請求項１５５に記載の核酸分子。
【請求項１５７】
前記核酸分子が前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１５５に記載の核酸分子。
【請求項１５８】
前記断片が、β−カテニンに結合するペプチドをコードする、請求項１５５に記載の核酸分子。
【請求項１５９】
配列番号：４または配列番号：４と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項１６０】
前記ペプチドが配列番号：４と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１５９に記載のペプチド。
【請求項１６１】
前記ペプチドがβ−カテニンに結合する、請求項１５９に記載のペプチド。
【請求項１６２】
配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離されたペプチド。
【請求項１６３】
前記断片は３０〜１００アミノ酸を有する、請求項１６２に記載のペプチド。
【請求項１６４】
前記ペプチドは前記断片と少なくとも９０％以上の同一性を有する、請求項１６２に記載のペプチド。
【請求項１６５】
前記ペプチドはβ−カテニンに結合する、請求項１６２に記載のペプチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
ある実施態様において、式（Ｉ）のＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、アミノＣ2-5アルキル、グアニジノＣ2-5アルキル、Ｃ1-4アルキルグアニジノＣ2-5アルキル、ジＣ1-4アルキルグアニジノＣ2-5アルキル、アミジノＣ2-5アルキル、1-4アルキルアミジノＣ2-5アルキル、ジＣ1-4アルキルアミジノＣ2-5アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、フェニル、置換フェニル（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ベンジル、置換ベンジル（ここで、ベンジル上の置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ナフチル、置換ナフチル（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ビス−フェニルメチル、置換ビス−フェニルメチル（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリジル、置換ピリジル、（ここで、置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリジルＣ1-4アルキル、置換ピリジルＣ1-4アルキル（ここで、ピリジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、ピリミジルＣ1-4アルキル、置換ピリミジルＣ1-4アルキル（ここで、ピリミジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ又はニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、トリアジン−２−イル−Ｃ1-4アルキル、置換トリアジン−２−イル−Ｃ1-4アルキル（ここで、トリアジン置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、イミダゾールＣ1-4アルキル、置換イミダゾールＣ1-4アルキル（ここで、イミダゾール置換基はアミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ1-4アルキルアミノ、Ｃ1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの少なくとも一つから独立に選択される）、イミダゾリニルＣ1-4アルキル、Ｎ−アミジノピペラジニル−Ｎ−Ｃ0-4アルキル、ヒドロキシＣ2-5アルキル、Ｃ1-5アルキルアミノＣ2-5アルキル、Ｃ1-5ジアルキルアミノＣ2-5アルキル、Ｎ−アミジノピペリジニルＣ1-4アルキルおよび４−アミノシクロヘキシルＣ0-2アルキルから独立に選択される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明は、また、下記の工程を含むβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を同定する方法を提供する：（ａ）推定のβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、ｐ３００ １−１１１を含む部分と接触させる工程；（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、β−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程；（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のβ−カテニンを含む部分(moiety)と前記工程（ａ）のｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するかの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ｐ３００相互作用の抑制剤として同定する工程。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
別の形態において、本発明は、核酸およびペプチド配列を提供し、これらの配列は、例えば、治療剤としてまたはスクリーニング方法において有用である。したがって、様々な代表的形態において、本発明は、下記のものを提供する：
配列番号：１または配列番号：１と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はＣＢＰタンパク質をコードしない；
配列番号：１の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はＣＢＰタンパク質をコードしない；
配列番号：２または配列番号：２と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドを含む実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはＣＢＰタンパク質ではない；
配列番号：２の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはＣＢＰタンパク質ではない；
配列番号：１または配列番号：１と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はＣＢＰタンパク質をコードしない；
配列番号：１の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はＣＢＰタンパク質をコードしない；
配列番号：２または配列番号：２と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから本質的に構成される、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはＣＢＰタンパク質ではない；
配列番号：２の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成されるペプチド、実質的に精製単離された配列、但し前記ペプチドはＣＢＰタンパク質ではない；
配列番号：１または配列番号：１と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はＣＢＰタンパク質をコードしない；
配列番号：１の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はＣＢＰタンパク質をコードしない；
配列番号：２または配列番号：２と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから構成される、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはＣＢＰタンパク質ではない；
配列番号：２の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはＣＢＰタンパク質ではない；
配列番号：３または配列番号：３と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はｐ３００タンパク質をコードしない；
配列番号：３の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はｐ３００タンパク質をコードしない；
配列番号：４または配列番号：４と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドを含む、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはｐ３００タンパク質ではない；
配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列を含む、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはｐ３００タンパク質ではない；
配列番号：３または配列番号：３と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はｐ３００タンパク質をコードしない；
配列番号：３の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はｐ３００タンパク質をコードしない；
配列番号：４または配列番号：４と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから本質的に構成される、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはｐ３００タンパク質ではない；
配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から本質的に構成される、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはｐ３００タンパク質ではない；
配列番号：３または配列番号：３と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はｐ３００タンパク質をコードしない；
配列番号：３の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離された核酸配列、但し前記配列はｐ３００タンパク質をコードしない；
配列番号：４または配列番号：４と少なくとも８０％以上の同一性を有するペプチドから構成される、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはｐ３００タンパク質ではない；
配列番号：４の断片または前記断片と少なくとも８０％以上の同一性を有する配列から構成される、実質的に精製単離されたペプチド、但し前記ペプチドはｐ３００タンパク質ではない；
これらおよび本発明の関連した形態は、下記にさらに詳しく述べられる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
Ｂ．化合物１はＣＢＰに対してβ−カテニンと競合する。ＳＷ４８０細胞は、５または１０μＭの化合物１または対照群（０．５％ＤＭＳＯ）で処理された。処理２４時間後、溶解質は、対照群抗体または抗−ＣＢＰ若しくは抗−ｐ３００抗体でコートされたビーズと共に培養された。共免疫沈澱されたタンパク質は、ゲル電気泳動および抗−β−カテニン抗体を用いて免疫ブロットされた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
図６．
Ａ．化合物１は細胞をＧ1で停止させる。ＦＡＣＳ分析は、化合物１（２５μＭ）（右）または対照群（０．５％ＤＭＳＯ）（左）で２４時間処理されたＳＷ４８０（下部パネル）及びＨＣＴ１１６（上部パネル）細胞に対して行った。５．５×１０6細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で固着および染色させた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８２】
ある実施態様において、本発明は、配列番号：４または配列番号：４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するペプチドを含む実質的に精製単離されたペプチドを提供する（但し、前記ペプチドが全長のヒトｐ３００タンパク質をコードしない）。ある実施態様において、そのポリペプチドは、自然的に発生するｐ３００配列（例えばヒトｐ３００またはマウスｐ３００）内に存在する、連続したアミノ酸残基１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０または３００個以下を含むアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、配列番号：４を含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
別の形態において、本発明は、下記の工程を含むβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を同定する方法を提供する：（ａ）推定のβ−カテニン：ｐ３００小分子抑制剤を、ｐ３００ １−１１１を含む部分と接触させる工程；（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、β−カテニンを含む部分(moiety)と接触させる工程；（ｃ）前記工程（ａ）の前記分子が、前記工程（ｂ）のβ−カテニンを含む部分(moiety)と前記工程（ａ）のｐ３００１−１１１を含む部分(moiety)との結合を抑制するかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｄ）前記工程（ａ）の前記小分子が、ｐ３００ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンを含む部分(moiety)との結合を抑制するかの決定により、前記工程（ａ）の小分子をβ−カテニン：ｐ３００相互作用の抑制剤として同定する工程。任意で、本方法は、下記の工程をさらに含むことができる：（ｅ）前記工程（ｄ）の同定されたβ−カテニン：ｐ３００相互作用の小分子抑制剤を、（１）ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)および（２）β−カテニンを含む混合物と接触させる工程；（ｆ）前記工程（ｅ）の前記分子が、前記ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないかどうかを分析手段によって決定する工程；および（ｇ）前記工程（ｅ）の前記小分子が、ＣＢＰ １−１１１を含む部分(moiety)とβ−カテニンとの結合を抑制しないとの決定により、前記小分子がβ−カテニン：ｐ３００相互作用の選択的抑制剤であることを確認する工程。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８６】
ｐ３００の欠損構築物は、Ｄａｖｉｄ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ博士（Ｈａｒｖａｒｄ、ＭＡ）が寄贈したヒトｐ３００プラスミド（ＣＭＶβ−ｐ３００−ＣＨＡ）のＰＣＲによって生成された。前記ＰＣＲ生成物は、ｐＴｒｉＥｘ−３ベクターのＨｉｎｄIII−ＮｏｔI部位にクローニングされた。Ｃ末端が切断されたｐ３００構築物に対する順方向プライマー：５’−GACGGTACCGGTTCGAAGCTTA-TGGCCGAGAATGTGGT-G−３’（配列番号：２３）であった。ｐ３００−Ｐ１（１−３３４）、ｐ３００−Ｐ２（１−６３４）およびｐ３００−Ｐ３’（１−１０５４）に対する逆方向プライマーは、次のとおりである：Ｐ１：５’−CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGC-CAAACCTAATC CAGGACT−３’（配列番号：２４）、Ｐ２：５’−CGTG-TATACAGCTGTGCGGCCGCGTTGC CAGCACTTCCCAT−３’（配列番号：２５）、Ｐ３：５’−CGTGTATACA-GCTGTGCGGCCG CGGCCTGTTCCCGGCGCTG−３’（配列番号：２６）。
【国際調査報告】
2007503816.tif 000091
2007503816.tif 000092
2007503816.tif 000093
2007503816.tif 000094
2007503816.tif 000095
2007503816.tif 000096
2007503816.tif 000097
2007503816.tif 000098
2007503816.tif 000099
2007503816.tif 000100
2007503816.tif 000101