(57)【要約】内皮性コロニー形成細胞（ＥＰＣ）の階層は、哺乳動物の臍帯血、臍静脈、および大動脈から同定された。高増殖能内皮性コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＥＣＦＣ）と名付けられた新規に単離された細胞が、単離され、そして特徴付けられた。臍帯血に由来する内皮細胞か、またはＨＵＶＥＣおよびＨＡＥＣに由来する内皮細胞の増殖能およびクローン原性能を試験する単一細胞アッセイが開発された。ＥＰＣは、脈管壁中に常在することが判明している。ヒト臍帯血に由来する高増殖能内皮性コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＥＣＰＣＳ）に由来する細胞の支持細胞層の使用は、再増殖性の造血幹細胞および造血前駆細胞の成長および生存を刺激する。成長および生存の刺激は、インビトロ培養における前駆細胞の数の増加、およびＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウス移植系におけるヒト細胞移植のレベルの増加によって決定される。
2007521817.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された内皮性コロニー形成細胞であって、以下の特徴：
（ａ）内皮細胞に特有の細胞表面抗原を発現する；
（ｂ）造血細胞に特有の細胞表面抗原を発現しない；
（ｃ）アセチル化ＬＤＬを取り込む；および
（ｄ）マトリゲルにおいて、毛細管様の管を形成する、
を有する、単離された内皮性コロニー形成細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の単離された細胞であって、ここで、前記内皮細胞に特有の細胞表面抗原は、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４、およびＣＤ１４６である、細胞。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された細胞であって、ここで、前記造血細胞に特有の細胞表面抗原は、ＣＤ１４およびＣＤ４５である、細胞。
【請求項４】
請求項１に記載の単離された細胞であって、以下：
（ａ）単一細胞からプレートされた場合、少なくとも約２０００個の細胞の、少なくとも二次コロニーへと再プレートする；
（ｂ）高増殖性を示す；
（ｃ）単一細胞から増殖する；および
（ｄ）高レベルのテロメラーゼを発現する、
としてさらに定義される、細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞であって、ここで、高レベルのテロメラーゼ発現は、ＨｅＬａ細胞によって発現されるテロメラーゼ発現の、少なくとも約３４％である、細胞。
【請求項６】
請求項４に記載の単離された細胞であって、＞０．８である、高い核  対  細胞質比を示すものとしてさらに定義される、細胞。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、少なくとも１０７個の子孫が単一細胞に由来する、方法。
【請求項８】
請求項４に記載の単離された細胞であって、＜２２ミクロンの細胞直径を有するものとしてさらに定義される、細胞。
【請求項９】
請求項１に記載の細胞を単離するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）細胞外マトリックスタンパク質でコートされた支持体上で、生物学的試料に由来する細胞を培養する工程；
（ｂ）該支持体に接着し、かつ再プレート可能なコロニーを形成する細胞を選択する工程；および
（ｃ）該コロニーから単一細胞を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記生物学的試料は、哺乳動物の血液である、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記生物学的試料は、哺乳動物の血管である、方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法によって単離される、細胞。
【請求項１３】
内皮細胞の型に関する単一細胞アッセイであって、以下の工程：
（ａ）特定の分類方法を使用し、生物学的試料の細胞を分類する工程；
（ｂ）規定された条件下で、細胞外マトリックスタンパク質上で該単一分類の細胞を培養する工程；および
（ｃ）特定のコロニーのサイズ、形態、および増殖能を列挙し、該内皮細胞の型を決定する工程
を包含する、単一細胞アッセイ。
【請求項１４】
請求項１３に記載の単一細胞アッセイであって、ここで、前記内皮細胞の型は、ＨＰＰ−ＥＣＦＣを含む、単一細胞アッセイ。
【請求項１５】
請求項１２に記載の細胞を富化するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）特定の分類方法を使用し、生物学的試料の細胞を分類する工程；および
（ｂ）規定された条件下で、細胞外マトリックスタンパク質上で単一分類の細胞を培養する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
エキソビボにおいて造血幹細胞を増殖させるための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）コラーゲンコートされた固体支持体上で、ＨＰＰ−ＥＣＦＣ細胞を培養する工程；および
（ｂ）ＨＰＰ−ＥＣＦＣ細胞とともに共培養することによって、造血幹細胞（ＨＳＣ）を増殖させる工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、ヒト臍帯血細胞由来であり、そして前記ＨＳＣ細胞は、ヒト骨髄由来である、方法。
【請求項１８】
哺乳動物中の移植片における、造血幹細胞の百分率を改善するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）ヒト骨髄細胞を臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣとともに共培養し、生成物を形成させる工程；および
（ｂ）適切な量の該生成物を、該哺乳動物中に移植する工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記細胞は、ヒト骨髄由来であるＣＤ４５＋細胞であり、そして前記哺乳動物は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスである、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
内皮細胞および造血細胞を生じる幹細胞分化に関するモデルは、幹細胞およびその子孫の臨床的価値のため、関心のあるものである。幹細胞および前駆細胞の特徴は、それらの増殖する能力および機能的子孫を生じる能力であり、そして前駆細胞は、そのクローン原性能によって同定される。以前に使用されていた方法は、前駆体を同定するために、一種類の内皮細胞が単離および特徴付けされていたことを保証しない。
【０００２】
ほとんどの哺乳動物において、正常な、成熟動脈、静脈、および毛細管におけるインビボでの内皮細胞増殖は、存在していたとしても、非常に遅いことが報告されている。いくつかの実験動物（例えば、ブタおよびイヌ）において、放射標識研究は、０．６％〜３．０％の内皮細胞が、特定の脈管の限局された範囲に限られた分裂細胞によって毎日ターンオーバーすることを実証した。これらの分裂内皮細胞が独特であり、そして他の成熟した内皮に欠けている増殖能を有するかどうかは、未確定のままである。
【０００３】
好対照なことに、インビトロにおいて、ヒト脈管由来または動物脈管由来である内皮細胞のプレーティングは、最初に、活発な内皮細胞増殖を伴う。例えば、臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）は、内皮細胞機能のインビトロ分析のための、２つの一般に研究されるモデルである。ＨＵＶＥＣ細胞およびＢＡＥＣ細胞の両方は、培養の初期においては良く増殖するが、経時的に細胞分裂は弱々しくなり、そして細胞は老化して１５継代〜２０継代の後、分裂できなくなる。脈管由来である各々の内皮細胞が同様の増殖能を有するのか否か、または細胞の一部のみが増殖し得るのか否かは、不明である。
【０００４】
脈管新生（新脈管形成）は、既存の脈管からの新規の脈管の形成のプロセスである；これは、成体被験体において、新規の脈管を生じると報告されているプロセスである。最近、骨髄由来循環内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が記載され、そして、これらの細胞はまた、少なくともいくつかの実験的マウスの虚血モデルまたは腫瘍モデルにおいて、新規の脈管の形成に役割を果たすことが報告されている。相反する証拠は、発生の間の骨髄由来（ＥＰＣ）が正常動脈、静脈、および毛細管の内皮の内張り（ｌｉｎｉｎｇ）に寄与せず、そして新脈管形成において軽微な役割のみを果たすことを示す。循環ＥＰＣと正常脈管に存在する増殖能を有する上記内皮細胞との間の関係は、不明である。
【０００５】
脈管新生治療のためのＥＰＣの使用、または患者の心臓血管疾患の危険および進行を評価するためのバイオマーカーとしてのＥＰＣの使用を支持する新たな証拠は、蓄積し、そして興味をかきたてている。しかしながら、ＥＰＣの一様な定義は無く、このことは、これらの研究の解釈を問題のあるものとし、そして臨床使用のために適切な細胞型の再現を妨げる。（例えば、造血、腸、神経細胞の）幹細胞および前駆細胞の特徴は、それらの増殖する能力、および機能的な子孫を生じる能力であるが、ＥＰＣは、選択された細胞表面抗原の発現によって第一に規定される。分子の細胞表面発現に唯一依存することは、その発現が上記細胞の生理学的状態によって変化し得るので、問題となり得る。個々の内皮細胞またはＥＰＣにおける増殖能（内因性応答）を評価するためのアッセイは報告されておらず、したがって、比較分析は利用不可能である。
【０００６】
以前の研究は、「内皮前駆細胞」と名付けられた細胞の集団が、細胞表面抗原ＣＤ３４を発現する分類された細胞か、または単核細胞のいずれかを、規定された培養条件において培養することによって、ヒト臍帯血からか、または成体末梢血から単離され得ることを報告した。
【０００７】
造血前駆細胞および内皮前駆細胞は、卵黄嚢および胚の発生において、多くの細胞表面マーカーを共有し、そして多数の遺伝子の遺伝子破壊が、造血細胞および内皮細胞の両方の発達に影響する。したがって、これらの系統は、共通の前駆体（血管芽細胞）から起こると仮定される。造血細胞の発達における幹細胞および前駆細胞の階層が、報告された。上記階層内の造血前駆細胞は、それらのクローン原性および増殖能によって同定される。遺伝的研究が、内皮細胞の起源が造血細胞の発達に密接に関連することを明白に示しているにもかかわらず、増殖能の違いに基づいて幹細胞および前駆細胞の同様の階層を支持する証拠は確立されていない。すなわち、造血細胞系に類似する個々の細胞のクローン原性および増殖能によって区別され得るＥＰＣの階層は、報告されていない。
【０００８】
造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ／Ｐｓ）の両方は、成体の末梢血と比較して、臍帯において豊富である。現在、臍帯血は、種々の血液学的な障害および悪性疾患を有する患者の移植のための、造血幹細胞の代替的な資源として使用されている。
【０００９】
毎年、何千もの患者が造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植を必要としている。この患者のほぼ２／３が、移植のためのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性一致を見出せ得ずにいる。これは、特に、多くの民族集団および代表的でない少数派（ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｍｉｎｏｒｉｔｙ）に関してあてはまる。白人患者の１／３のみが、適切に一致した同胞の移植片（最低限の対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）合併症を伴う、最も適合性のある供給源）を見出す。
【００１０】
ヒト臍帯血は、臨床移植のためのＨＳＣの代替的な供給源であることが知られている。ドナー臍帯血が、レシピエントに対して完全に主要組織適合性が一致するか、または不一致かにより、種々の先天性または後天性の血液学的障害のための処置として、臍帯血細胞は、調整された（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）宿主に移植され、そして再増殖する。たとえこの臍帯血移植片が上記レシピエントにとって２つ以上の座で不一致であったとしても、ＧＶＨＤの発生率および重症度は、同様の不一致の成体の骨髄移植片または動員（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）末梢血移植片の移植に関して観察されるＧＶＨＤの発生率および重症度と比較して、有意に小さい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
移植に関する臍帯血のより広範な使用に対する制限するものとしては、限られた数のＨＳＣおよび前駆細胞のみしか移植片中に存在しないという事実が挙げられる。ほとんどの患者が、一致した同胞のドナーを有さないので、ほとんどの臍帯血移植片は、不一致のレシピエントへと移植される。多くの研究が、移植片中の臍帯血の用量は、上記移植片が血縁関係の無いドナーに由来する場合、患者の生存に対して重要であることを報告する。移植に関連する死亡率は、１．７×１０５個のＣＤ３４＋細胞／ｋｇの臍帯血移植片を受けたレシピエントにおいて２０％、これに対して移植片中のより少量のＣＤ３４＋細胞を受けたレシピエントにおいて７５％と報告されている。エキソビボで臍帯血ＨＳＣを効率的に増殖させ、移植片中の細胞数を増加させるための方法を発見することは、臨床的移植のための大きな進歩であり、そして大きな商業的市場を有する。
【００１２】
臍帯血ＨＳＣ増殖のためのアプローチは、目覚しいものではない。ほとんどの研究において、臍帯血単核細胞または単離されたＣＤ３４＋細胞に対する種々の成長因子の添加は、総細胞数における増加、コロニー形成単位細胞（ＣＦＣ）数における増加、および免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスまたはヤギ胎仔における短期間の前駆細胞移植における増加と、相関している。しかしながら、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＳＣＩＤ再増殖細胞（ＳＲＣ）頻度、またはヤギ胎仔における長期間の移植によって測定されるようなＨＳＣの数の増加については、ほとんどのアプローチが効果的でない。ヒト患者における増殖された臍帯血ＨＳＣの使用の結果は、失望すべきものであった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
単一細胞コロニーアッセイは、末梢血および臍帯血から、ならびに臍帯または成体血管から単離された内皮細胞から単離された、哺乳動物の内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の間での新規の階層を説明するために開発された。ヒト、ウシ、ブタおよびラットの生物学的試料に由来する前駆細胞の異なる集団は、クローン原性および増殖能に基づいて同定された。
【００１４】
内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は、成体末梢血および臍帯血から単離され、そしてエキソビボで指数関数的に増殖された。対照的に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）または血管壁に由来するヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）は、広義には、分化した成熟内皮細胞（ＥＣ）としてみなされ、そしてそれらは、ＥＰＣ研究のための「コントロール」として利用される。しかしながら、成体および臍帯血由来のＥＰＣと同様に、血管壁由来であるＨＵＶＥＣおよびＨＡＥＣは、インビトロにおいて少なくとも４０集団倍加の間継代され得る。ＥＰＣを、それらの増殖能およびクローン原性能に基づいて識別する、新規の単一細胞析出（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）アッセイの利用は、ＨＵＶＥＣまたはＨＡＥＣ中に、ＥＰＣが常在することを見出した。単一細胞クローン原性アッセイは、ＥＰＣの増殖能およびクローン原性能に基づいて、ＥＰＣの新規の階層を明確にするために開発された。ＥＰＣの完全な階層は、血管壁由来のＨＵＶＥＣおよびＨＡＥＣにおいて同定され、そしてそれらのクローン原性能および増殖能によって識別された。ＥＰＣの多様性がヒト脈管において存在し、そして、脈管の一体の維持におけるＥＰＣの起源および機能の両方を決定するための、概念的な枠組みを提供する。したがって、ＥＰＣは、臨床的使用（例えば、移植片）のために、末梢血またはヒト脈管の生検のいずれかから容易に得られる。
【００１５】
単離された内皮コロニー形成細胞は、以下の特徴を有する：
（ａ）内皮細胞の特有の細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、およびＣＤ１４４）を発現する；
（ｂ）造血細胞に特有の細胞表面抗原（例えば、ＣＤ４５、およびＣＤ１４）を発現しない；
（ｃ）アセチル化ＬＤＬを取り込む；および
（ｄ）マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）において、毛細管様の管を形成する。
【００１６】
ＨＰＰ−ＥＣＦＣとして分類される、単離された細胞はまた、
（ａ）単一細胞からプレートされた場合、少なくとも約２０００細胞の、少なくとも二次コロニーへと再プレートする；
（ｂ）高増殖性を示す；
（ｃ）単一細胞から増殖する；および
（ｄ）高レベルのテロメラーゼ（ＨｅＬａ細胞によって発現されるテロメラーゼレベルの、少なくとも３４％）を発現する。ＨＰＰ−ＥＣＦＣはまた、＞０．８である、高い核  対  細胞質比を示し、細胞直径は、＜２２ミクロンであり、そして少なくとも１０７個の子孫が、単一細胞に由来する。
【００１７】
内皮コロニー形成細胞を単離するための方法は、以下の工程：
（ａ）細胞外マトリックスタンパク質でコートされた支持体上で、生物学的試料からの細胞を培養する工程；
（ｂ）上記支持体に接着する細胞を選択し、そして再プレート可能なコロニーを形成する工程；および
（ｃ）上記コロニーから単一細胞を選択する工程
を包含する。
【００１８】
上記生物学的試料は、哺乳動物の臍帯血、または血管であり得る。ヒト供給源、ウシ供給源、ブタ供給源、およびラット供給源が、適切である。内皮細胞の型に関する単一細胞アッセイは、以下の工程：
（ａ）特定の分類方法を使用し、生物学的試料の細胞を分類する工程；
（ｂ）規定された条件下で、細胞外マトリックスタンパク質上で、この単一分類の細胞を培養する工程；および
（ｃ）特定のコロニーのサイズ、形態、および増殖能を列挙し、上記内皮細胞の型（例えば、ＨＰＰＰ−ＥＣＦＣ）を決定する工程
を包含する。
【００１９】
ＨＰＰ−ＥＣＦＣを富化する方法は、以下の工程：
（ａ）特定の分類方法を使用し、生物学的試料の細胞を分類する工程；および
（ｂ）規定された条件下で、細胞外マトリックスタンパク質上で単一分類の細胞を培養する工程
を包含する。
【００２０】
エキソビボにおいて造血幹細胞を増殖させるための方法は、以下の工程：
（ａ）コラーゲンコートされた固体支持体上で、ＨＰＰ−ＥＣＦＣ細胞を培養する工程；および
（ｂ）ＨＰＰ−ＥＣＦＣ細胞とともに共培養することによって、造血幹細胞（ＨＳＣ）を増殖させる工程であって、ここで、上記ＨＰＰ−ＥＣＦＣはヒト臍帯血細胞由来であり、かつ上記ＨＳＣ細胞はヒト骨髄由来である、工程
を包含する。
【００２１】
哺乳動物中の移植片における、造血幹細胞の百分率を改善するための方法は、以下の工程：
（ａ）ヒト骨髄細胞を臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣとともに共培養し、生成物を形成させる工程；および
（ｂ）適切な量の上記生成物を、上記哺乳動物中に移植する工程であって、ここで、上記細胞は、ヒト骨髄由来であるＣＤ４５＋細胞であり、かつ上記哺乳動物は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスである、工程
を包含する。
【００２２】
自己の臍帯血もしくは血縁関係の無い臍帯血、動員成体末梢血、または骨髄由来ＨＳＣとの共培養における、臍帯血の高増殖能内皮コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＥＣＦＣ）は、ＨＳＣ細胞の数を増加させ、そして結果としてＨＳＣの増加、およびＨＳＣ再増殖活性の増大をもたらし、レシピエント被験体におけるより高いレベルの移植につながる。
【００２３】
ヒト臍帯血からの高増殖能内皮コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＥＣＦＣ）由来の細胞の支持細胞層（ｆｅｅｄｅｒ  ｌａｙｅｒ）の使用は、再増殖性の造血幹細胞および造血前駆細胞の成長および生存を刺激する。成長および生存の刺激は、インビトロ培養中の前駆細胞の数の増加、およびＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウス移植系におけるヒト細胞移植レベルの増加によって決定された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
高増殖能内皮コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＥＣＦＣ）と名付けられた新規の内皮細胞前駆体は、成体血液ＥＰＣにおける２０〜３０倍加と比較して、高増殖能（１００集団倍加まで）を示す。ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、臍帯血のみからではなく、臍帯および成体血管からも単離される。ＨＰＰ−ＥＣＦＣ細胞は、単一細胞レベルで再プレートされ得、そして細胞の大多数は、少なくとも二次ＨＰＰ−ＥＣＦＣの再生を伴って増幅する（図７）。予想外なことに、ＨＰＰ−ＥＣＦＣコロニー形成は、臍帯血においては存在するが、成体末梢血においては存在しない（図５ｄ）。さらに、単層のＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の臍帯血内皮細胞は、成体ＬＰＰ−ＥＣＦＣと比較（エキソビボ培養の同じ期間の間）して、集団倍加時間（ＰＤＴ）において２．５倍の減少を示し、そして累積的集団倍加レベル（ＣＰＤＬ）において少なくとも２倍の増加を示した。異なった方法論を利用して臍帯血から単離された内皮前駆細胞の他の集団とは対照的に、臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ子孫は、内皮細胞抗原を均一に発現し、かつ造血特異的細胞抗原を発現しない。したがって、ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、ヒト臍帯血において富化されており、成体末梢血においては見出されなかった。ＨＰＰ−ＥＣＦＣはまた、哺乳動物の血管（例えば、臍静脈管およびヒト大動脈管）由来である内皮細胞において見出された（図１１）。これらのＨＰＰ−ＥＣＦＣは、プレートした新鮮な臍帯血単核細胞の培養物において、１０日間以内に出現するのに対し、成体血液のＬＰＰ−ＥＣＦＣでは、プレート後１４日間前に、ほとんど出現しない。
【００２５】
さらに、臍帯血コロニーは、成体コロニーと比較して、一貫してより大きく出現する（図１）。成体内皮細胞コロニーと臍帯血内皮細胞コロニーとの間には、そのサイズ、頻度、および出現の時期において、明瞭な差異が存在する（図１、図３、図１０）。これらの知見は、臍帯血ＥＰＣは、ＨＰＰ−ＥＣＦＣ、ＬＬＰ−ＥＣＦＣ、およびクラスターからなるのに対し、成体血液ＥＰＣは、ＬＰＰ−ＥＣＦＣおよびクラスターからなることを示す。
【００２６】
ＨＰＰ−ＥＣＦＣ、ＬＰＰ−ＥＣＦＣ、クラスター、および成熟内皮細胞の完全な階層は、生きている哺乳動物のドナー中の任意の血管から単離され得る。
【００２７】
ＥＰＣは、造血細胞前駆体の規定のために利用された技術と同様の用語法を使用して、同定され得る（図７）。ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、二次ＨＰＰ−ＥＣＦＣへの再プレートに加えて、内皮前駆体の全てのその後の段階を生じる。単一細胞から生じる低い増殖能の内皮コロニー形成細胞（ＬＰＰ−ＥＣＦＣ）は、コロニーを形成し、それは５０個より多くの細胞を含むが、再プレートにおいて、二次ＬＰＰ−ＥＣＦＣコロニーさえも形成しない。それらは、内皮細胞クラスター（５０個未満の細胞）を生じる。後に、内皮細胞クラスターは、単一細胞から生じ得るが、５０個未満の細胞を含み得、かつコロニーまたはクラスターへと再プレートし得ない。
【００２８】
造血幹細胞および造血前駆細胞は、成体末梢血と比較して、臍帯血において富化されている。１つの興味深い知見は、成体末梢血と比較して、ＥＰＣはまた、臍帯血において富化されている。さらに、臍帯血由来のＥＰＣは高レベルのテロメラーゼ活性を含み、このことは、これらの細胞が、細胞老化の明白な徴候を伴わずに、少なくとも１００集団倍加の間増殖し得ることを説明し得る。単一細胞のレベルで、いくつかの臍帯血ＥＰＣ由来の細胞は、１０７倍〜１０１２倍増殖し得る。本発明者らの知る限りでは、他の一次哺乳動物内皮前駆細胞または成熟細胞は、同様の成長特性能力またはクローン原性能力を有すると同定されていない。
【００２９】
（ヒト臍帯血から単離された内皮細胞コロニー（ＥＰＣ）の特徴付け）
細胞は、培養物中で増殖した同時に、内皮細胞表現型を維持していた。前記した臍帯血から単離された内皮前駆細胞に対して、本発明は、ヒト臍帯血から単離した細胞（すなわち、臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ）および前駆体が、単一細胞を用いて開始した場合でさえ、少なくとも１００集団倍加の間培養され得、そして指数関数的に増殖し得ることに関する。さらに、これらの細胞は、造血細胞特異的表面抗原を発現せず（ＣＤ４５およびＣＤ１４もまたほとんど発現しない）、そしてメチセルロース（ｍｅｔｈｙｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）アッセイにおいて造血細胞コロニーを形成しない。さらに、上記ＨＰＰ−ＥＣＦＣ前駆体は、マトリゲル中で迅速に脈管を形成し、ＩＬ−１刺激またはＴＮＦ−α刺激のいずれかに応答してＶＣＡＭ−１を上方制御し、そしてそれらの内皮細胞アイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を確認する内皮細胞特異的抗原を発現する。これらの細胞は、高増殖能内皮コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＥＣＦＣ）と命名された。
【００３０】
臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、成体血液（これは、ＬＰＰ−ＥＣＦＣ、クラスター、および成熟内皮細胞からなる）と比較して、より大きな複製動態を示す。内皮前駆体は、ＡＣ１３３、ＣＤ３４、およびＦｌｋ１を発現すると報告される一方で、ＨＰＰ−ＥＣＦＣ子孫およびＥＯＣ子孫は、ＡＣ１３３抗原、ＣＤ３４抗原、およびＦｌｋ１抗原を発現する細胞の同様の頻度を示す。したがって、これらの細胞表面マーカーは、異なる増殖能を有する細胞を区別し得ない。
【００３１】
内皮増殖細胞は、成体末梢血から単離したＭＮＣの培養の２週間〜４週間後に出現し、そして内皮増殖細胞は、それらのインビトロにおける指数関数的な成長によって特徴付けられる（しかしながら、ＥＯＣは、より低いレベルのテロメラーゼ示し、二次ＬＰＰ−ＥＣＦＣへと再プレートされず、そしてＴＰＰ−ＥＣＦＣよりずっと前に複製的老化に達する）。対照的に、ヒト臍帯血ＭＮＣ由来のＨＰＰ−ＥＣＦＣは、Ｉ型コラーゲンでコートされた組織培養プレート上の完全ＥＧＭ−２培地中において、臍帯血ＭＮＣの培養の５日後〜１０日後に出現した。分散した接着細胞コロニーが出現し、そして「丸石」形態の内皮細胞を示した（図１）。この形態および上記コロニーの出現は、前述した成体末梢血由来のＥＯＣコロニーに関する形態および出現と似通っているが、区別されるものであり、かつ接着循環内皮細胞またはマクロファージと明白に区別される。上記ＨＰＰ−ＥＣＦＣコロニーは大きくて、そして小さくて円い細胞、長くて薄い細胞、および大きくて平らな円い細胞の混合物からなる一方で、上記ＥＯＣは、ほぼ均一に長くて薄い細胞から構成される。このコロニー由来の細胞は継代培養され、そしてこれらのコロニー由来の増殖した細胞は、免疫表現型決定（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）、機能的試験、および成長動態の測定のために使用された。最初の継代の後、上記細胞は、「丸石」形態を有する紡錘体形状の細胞の単層を形成した。免疫表現型決定は、上記細胞が、内皮細胞表面抗原（ＣＤ３１、ＣＤ１４１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４４、ｖＷＦ、およびｆｌｋ−１）を一様に発現することを明らかにした（図２ａ、図２ｂ）。上記細胞は、造血細胞表面特有の抗原（ＣＤ４５およびＣＤ１４）を発現せず、このことは、上記単層が、造血細胞を混入していないことを確証した（図１、図３、図１０）。
【００３２】
上記細胞が、アセチル化低密度リポタンパク質（Ａｃ−ＬＤＬ）または（Ｄｉｌ−ＡＣ−ＬＤＬ）を取り込んだことで、接着コロニーに由来する上記単層が内皮細胞であったことを確認した。これらの細胞機能は、内皮細胞に特有である。上記接着コロニーから継代培養された細胞は、Ａｃ−ＬＤＬを均一に取り込み、異なる数の細胞を播種した後マトリゲル中で脈管を形成し、そしてｒｈＴＮＦ−α刺激またはｒｈＩＬ−１刺激の両方に応答してＶＣＡＭ−１を上方制御した（図２ｃ〜図２ｅ）。
【００３３】
臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣおよび子孫の成長動態は、時間の関数として測定された。特筆すべきことに、臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣおよび子孫は、培養において、少なくとも１００集団倍加の間、老化の徴候を伴わずに指数関数的に増殖し得、そして細胞数は、培養物中で、１００日間の期間にわたって１０２０倍に増加した。臍帯血内皮細胞の代表的な成長曲線は、インビトロにおける、これらの細胞の増殖能を例証する。したがって、免疫表現型決定、機能的試験、および成長動態の分析に基づいて、内皮細胞（ＨＰＰ−ＥＣＦＣと命名される）のコロニーは、臍帯血ＭＮＣから独自に培養され得、そして指数関数的に増殖可能な内皮細胞の集密的単層になるまで継代され得ることが示される。
【００３４】
（ＨＰＰ−ＥＣＦＣコロニーはヒト臍帯血中に存在するが、成体末梢血中には存在しない）
５０ｍＬ〜１００ｍＬの末梢血が、健康な成体ドナーまたは正常期胎児の臍帯から集められ、そしてＭＮＣが単離された。細胞は、細胞外成熟分子でコートされた組織培養プレート上で、完全ＥＧＭ−２培地中に播種され、そして次の１週間〜６週間にわたってコロニー形成が観察された。等容積の血液あたりのコロニーの数は、成体末梢血と比較して、臍帯血において１５倍増加していた（表Ｉ、図１ａ、図１ｂ）。同数の臍帯ＭＮＣおよび成体ＭＮＣがプレートされた場合、コロニー形成における類似の相違がまた認められた。成体ＥＯＣコロニーは、代表的には、培養の開始の２週間後〜４週間後に形成されるが、臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣコロニーは、５日間〜１０日間以内に出現する。最終的に、臍帯血および成体末梢血に由来する内皮細胞からフローサイトメトリーによって単離された細胞の免疫表現型決定は、コロニー細胞が、内皮細胞表面抗原（ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４４、ｖＷＦ、およびｆｌｋ−１）を一様に発現し、そして造血細胞表面抗原（ＣＤ４５およびＣＤ１４）を発現しないことを明らかにした。このことは、それらの内皮細胞アイデンティティを確証した。上記成体ＥＯＣの免疫表現型決定は、以前に公表された研究と一致した。したがって、内皮コロニー形成細胞ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、臍帯血中に存在し、成体末梢血ＥＯＣ（これは、ＬＰＰ−ＥＣＦＣを表す）と比較して異なる細胞型を表す。
【００３５】
（臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣの増殖速度は、成体血液ＥＯＣよりも速い）
成体末梢血と比較して、臍帯血由来の細胞のコロニー形成の出現の頻度および時期における相違を考慮するとき、１つの疑問は、成体血および臍帯血の増殖動態における相違が存在するのかしないのか、であった。ＨＰＰ−ＥＣＦＣの初期継代単層は、臍帯血から樹立され、そしてＥＯＣは成体末梢血から樹立され、そして細胞は、Ｉ型コラーゲンコートされたプレート上で完全ＥＧＭ−２培地中で培養された。長期培養における集団倍加時間（ＰＤＴ）および累積集団倍加レベル（ＣＰＤＬ）を決定するために、投入細胞数を計数した（これらは、臍帯血および成体血液由来の細胞の増殖動態を、定量化および比較するために使用される測定である）。上記ＰＤＴおよびＣＰＤＬを正確に定量化するために、細胞を、少なくとも１０継代の間培養した。異なるドナーに由来する複数の細胞株の試験の結果は、成体ＥＯＣコントロールと比較して、臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣのＰＤＴにおいて２．５倍の減少が存在したことを示した。さらに、ＰＤＴにおける減少と一致して、臍帯血細胞の培養は、成体ＥＯＣの連続的な継代と比較して、ＣＰＤＬにおいて有意な増加を示した。したがって、臍帯細胞および成体細胞の両方は、培養において増殖し得るが、臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣおよび子孫の増殖能は、成体ＥＯＣと比較してより大きい。臍帯血由来のＨＰＰ−ＥＣＦＣはまた、成体血液ＥＯＣと比較して、単一細胞レベルでより大きい増殖能を示す。
【００３６】
臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の内皮細胞または成体ＥＯＣの、単一細胞レベルでの、個々の増殖能力およびクローン原性能力が決定された。新規の実験方法が、単一臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の内皮細胞および成体ＥＯＣの増殖能力およびクローン原性能力を定量化するために設計された。
【００３７】
初期継代臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来または成体ＥＯＣ由来の内皮細胞の子孫は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするレトロウイルスを用いて最初に形質導入され、そしてＧＦＰの発現に関して選択された。臍帯内皮細胞および成体内皮細胞の両方の形質導入効率は、９５％より高かった。その後の選択は、１つのＧＦＰを発現するＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来内皮細胞または成体ＥＯＣ由来の内皮細胞は、（＞直径１００ミクロンおよび＜９ポンド／平方インチのシーズフロー圧（ｓｈｅａｔｈ  ｆｌｏｗ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を有するソートノズル（ｓｏｒｔｉｎｇ  ｎｏｚｚｌｅ）を使用して）蛍光サイトメトリー分類によって、Ｉ型コラーゲンでコートされ、そして２００μｌのＥＧＭ−２培地で満たされた９６ウェル組織培養プレートの１つのウェル中にプレートされた。直後に、個々のウェルは試験され、１つの内皮細胞のみが各ウェル中に置かれたことを確実にされた。次いで、内皮細胞は１４日間培養され、そしてその培地の２分の１は、４日間毎に新鮮なＥＧＭ−２培地を用いて交換された。１４日間の終わりに、ＧＦＰを発現する内皮細胞の数が計算された。
【００３８】
少なくとも１回の細胞分裂を起こしている単一細胞の数は、成体ＥＯＣ由来の内皮細胞と比較して、臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の内皮細胞について有意に多かった。１４日間の終了の後、各々のウェル中の細胞の数のスコアリングにおいて、単一臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の内皮細胞は、成体ＥＯＣ由来の内皮細胞と比較して、より多く分裂し、そしてより大きなコロニーを生成したことが明らかであった。成体ＥＯＣ由来の内皮細胞と比較した、単一臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の内皮細胞の、分裂およびコロニーを形成する能力における差異に起因して、各ウェル中の（少なくとも１回の細胞分裂を示した）細胞の数が計数された。ほとんどの単一成体ＥＯＣ由来の（分裂した）内皮細胞は、２個と５０個の間の細胞のクラスターを生成したが、一部は、５００細胞までの二次コロニーを生じた。しかし、ただ１つの＞２０００細胞のコロニーが、任意の単一に分類された成体ＥＯＣ由来の内皮細胞から生じた。しかしながら、６０％を超える臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の（分裂した）内皮細胞は、少なくとも２０００細胞からなる、良好に限局性の二次コロニーを形成し、そして多数の単一に分類された細胞が、＞１０，０００細胞からなるコロニーを生じた（本発明者らの知る限りでは、成体ＥＯＣ由来の内皮細胞は、このようなコロニーを生成することは決して無かった）。
【００３９】
これらの細胞がさらなるコロニーを形成し得るかどうかを決定するために、単一成体ＥＯＣ由来の内皮細胞または単一臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の内皮細胞のいずれかに由来する二次細胞コロニーが、連続的に再プレートされた。複数の独立した実験において、単一成体ＥＯＣ由来の内皮細胞に由来する二次コロニーは、２４ウェルまたは６ウェルのＩ型コラーゲンコートされた組織培養プレート中に再プレートされた後は、三次コロニーを生じることは決して無い。プレートされた単一細胞は静止状態のまま残り、かつ増殖しなかった。しかしながら、単一臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の内皮細胞（２０００細胞より多くを生じた）に由来する二次コロニーのほとんどは、同じ実験条件下において再プレートされ、三次内皮コロニーを形成し得た。単一一次臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の内皮細胞は、二次コロニーを生成し得、これは、引き続いて連続的に継代され、１０７個〜１０１２個の内皮細胞を生成し得る。
【００４０】
造血高増殖能コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ；インビトロにおけるクローン原性アッセイにおいて培養され得る、最も初期の多分化能の造血前駆体）に対する、臍帯血由来の内皮コロニー形成細胞の独特かつ新規に同定された集団の類似性を考慮して、これらの細胞は、「高増殖能内皮コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＥＣＦＣ）」と名付けられる。要約すれば、これらの細胞は、以下の点で前記の成体ＥＯＣと異なる：
（１）成体ＥＯＣと同一の実験条件下において培養した場合、ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、より高い増殖動態を有する、
（２）プレートされた成体末梢ＭＮＣ由来の成体ＥＯＣと比較して、ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、臍帯血ＭＮＣからの培養において、より早い時点で出現する、
（３）成体ＥＯＣと比較して、ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、単一細胞レベルにおいてより高いクローン原性能を有する、
（４）ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、連続的に再プレートされ、少なくとも二次ＨＰＰ−ＥＣＦＣコロニーを形成し得る一方で／他方では、成体ＥＯＣは、この潜在力を示さず、かつＨＰＰ−ＥＣＦＣは高いレベルのテロメラーゼを示す。
【００４１】
（ＥＰＣ由来の臍帯血内皮細胞および成体内皮細胞の増殖動態）
異なる系統の前駆細胞は、それらのクローン原性能および増殖能によって規定および区別される。臍帯血のコロニー形成および成体ＥＰＣのコロニー形成における相違に起因して、ＥＰＣ由来の臍帯血内皮細胞および成体内皮細胞の増殖動態が比較された。最初に、この細胞が二次コロニーを形成し、集密まで成長するか否かを試験するために、限界細胞希釈で、臍帯血内皮細胞コロニーおよび生体内皮細胞コロニーに由来する細胞がプレートされた。興味深いことに、成体ＥＰＣコロニーおよび臍帯血ＥＰＣコロニーの両方に由来する細胞子孫は、集密にまで成長する前に、種々のサイズの二次細胞コロニーを形成した（図３）。しかしながら、臍帯血ＥＰＣ由来の細胞子孫に由来するコロニーは、成体のコロニーと比較して、一貫してより大きく、そしてより小さい細胞を含んだ（図３）。
【００４２】
細胞単層は、ＥＰＣ由来の臍帯血内皮細胞および生体内皮細胞の増殖能を決定するために連続的に継代された。特筆すべきことに、臍帯血ＥＰＣ由来の細胞は、明白な老化の徴候を伴わずに、少なくとも１００集団倍加の間増殖し得た。対照的に、成体ＥＰＣ由来の細胞は、２０〜３０集団倍加の間のみ継代され得た（図４ａ）。臍帯血ＥＰＣ由来細胞および成体ＥＰＣ由来細胞の増殖動態を定量化および比較するために、培養において規定された期間（６０日間）の間に、集団倍加時間（ＰＤＴ）および累積集団倍加レベル（ＣＰＤＬ）が計算された。成体ＥＰＣ由来の細胞と比較して、臍帯血ＥＰＣ由来の細胞の、ＰＤＴにおいて２．５倍の減少、およびＣＤＰＬにおいて１．５倍の増加があった（図４ｂ、図４ｃ）。成体ＥＰＣのＰＤＴおよびＣＤＰＬは、健康な成体ドナーから単離したＥＰＣ由来の細胞の増殖動態を試験した、２つの最近の報告と同様であった。
【００４３】
ｒｈＶＥＧＦ刺激またはｒｈｂＦＧＦ刺激（これらは、２つの内皮細胞分裂促進因子）のいずれかに応答する、臍帯血ＥＰＣ由来の細胞および成体ＥＰＣ由来の細胞の増殖が比較された。臍帯血ＥＰＣ由来の細胞および成体ＥＰＣ由来の細胞は、血清飢餓にされ、次いで、ｒｈＶＥＧＦまたはｒｈｂＦＧＦの存在下かまた非存在下において培養された。細胞は１６時間培養され、そしてＤＮＡ合成を測定するために収集する前にトリチウム化チミジンでパルス（ｐｕｌｓｅ）された。臍帯血ＥＰＣ由来の細胞は、成体ＥＰＣ由来の細胞と比較して、ｒｈＶＥＧＦ刺激またはｒｈｂＦＧＦ刺激のいずれかに応答して、より大きなＤＮＡ合成を示した（図４ｄ）。まとめると（ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）、これらの結果は、短期間アッセイおよび長期間アッセイの両方において、臍帯血ＥＰＣ由来の細胞の増殖速度および増殖能力は、成体ＥＰＣ由来の細胞よりも大きいことを示す。さらに、臍帯血ＥＰＣ由来の内皮細胞および成体ＥＰＣ由来の内皮細胞は、限界希釈でプレートされた場合、種々のサイズおよび形態の別個の細胞コロニーを形成する。
【００４４】
（ＥＰＣコロニー由来の単一臍帯血内皮細胞および成体内皮細胞のクローン原性能および増殖能の定量化）
臍帯血ＥＰＣコロニーおよび成体ＥＰＣコロニーは、異なる増殖能およびクローン原性能を有する細胞を生じる。しかしながら、前駆細胞のクローン原性能についての厳密な試験は、単一細胞が、他の細胞の非存在下において分裂し、そしてコロニーを形成するか否かを決定するものである。したがって、ＥＰＣコロニー由来の単一臍帯血内皮細胞および単一生体内皮細胞の増殖能およびクローン原性能を定量化するために、アッセイが開発された。
【００４５】
最初のＥＰＣコロニーに由来する臍帯血内皮細胞および成体内皮細胞は、ＥＧＦＰをコードするレトロウイルスを用いて形質導入され、そしてＥＧＦＰ発現について選択される。選択に続き、１つのＥＧＦＰを発現する内皮細胞が、Ｉ型コラーゲンでコートされた９６ウェル組織培養プレートの１ウェル中にＦＡＣＳによってプレートされ、そして完全ＥＧＭ−２培地で満たされた。内皮細胞は培養され、そして１４日目の終わりにＥＧＦＰを発現する内皮細胞の数が本明細書中に記載されるように計数された。この方法は、図５ａに図示される。
【００４６】
特筆すべきことに、少なくとも１回の細胞分裂を起こした単一細胞の百分率は、臍帯血内皮細胞について、成体細胞と比較して５倍増加した（図５ｂ）。さらに、単一臍帯血内皮細胞に由来する細胞子孫の平均数は、個々の成体細胞に由来する細胞の数と比較して１００倍大きかった（図５ｃ）。分裂した単一成体内皮細胞の８０％超は、２〜５０細胞の数の範囲におよぶ細胞の小さなコロニーまたはクラスターを生じた（図５ｄ）。しかしながら、いくつかの単一成体内皮細胞は、５００個を超える細胞を含むコロニーを形成しなかった（図５ｄ）。対照的に、少なくとも６０％の単一でプレートされた分裂した臍帯血内皮細胞は、１４日間の培養期間において、２，０００個と１０，０００個の間の細胞を含む良好に限局したコロニーを形成する（図５ｄ）。単一臍帯血細胞または単一成体細胞に由来する細胞の、種々の内皮細胞のコロニーおよびクラスターのサイズおよび形態の顕微鏡写真は、図５ｅに示される。これらの単一細胞の研究は、臍帯のＥＰＣおよび成体のＥＰＣの異なる型が存在することを示し（これは、それらの増殖能およびクローン原性能によって区別され得る）、そしてＥＰＣは、造血前駆細胞の階層と類似した増殖能の階層を示す。
【００４７】
（単一臍帯血内皮細胞の細胞子孫は、連続的に再プレートされ得、そして長期間培養において指数関数的に増殖され得る）
造血細胞系において、最も増殖性の細胞型は、高増殖能コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＥＣＦＣ）と名付けられた。このＨＰＰ−ＥＣＦＣは、大きな細胞コロニーを形成するその能力によって規定され、連続的なプレーティングにおいて、少なくとも二次コロニーを形成する潜在性を有する個々の細胞を生じる。単一のプレートされた臍帯血ＥＰＣ由来細胞または成体ＥＰＣ由来細胞に由来するクローン性子孫は、トリプシン処理され、再プレートされ、そして２４ウェル組織培養プレート中で７日間培養された。１０００個を超える単一成体ＥＰＣ由来の細胞のクローン性子孫を、２４ウェルプレート中にプレーティングした後、１４日間の培養の後、上記ウェル中で二次コロニー１個のみが検出された（図６ａ）。対照的に、単一でプレートされた臍帯血ＥＰＣ由来の細胞のクローン性子孫の約２分の１（４２１のうちの２０５）は、２４ウェルプレート中で、二次コロニーを形成したか、または集密まで急速に成長した（図６ａ）。単一臍帯血内皮細胞の上記子孫に由来する二次内皮細胞コロニーまたは集密細胞単層の代表的な顕微鏡写真は、図６ｂに示される。５日以内に集密まで急速に成長したこれらのウェル中では、二次コロニーは検出されなかったので、限界希釈分析を、この集密単層上で実施した。この単層由来のプレートされた単一細胞のうちの少なくとも９パーセントは、１００細胞より多くを含む内皮細胞コロニーを形成した。この結果は、臍帯血ＥＰＣに由来する個々の細胞が、二次コロニーを形成し得ることを実証した。
【００４８】
単一でプレートされた臍帯血ＥＰＣ由来内皮細胞の、長期増殖能が試験された。単一臍帯血内皮細胞に由来する二次コロニーまたは集密細胞単層は、組織培養プレートを徐々に大きくして連続的に継代された。もともと３つの異なる臍帯血ドナーに由来する、１１の単一内皮細胞の細胞子孫が試験された。長期間の培養において、単一臍帯血内皮細胞は、少なくとも１０７細胞を生じた（図６ｃ）。試験された上記１１の単一臍帯血内皮細胞の平均ＣＰＤＬは、３０．８であった。したがって、臍帯血中の高増殖性ＥＰＣの集団は、二次コロニーおよび三次コロニーを形成する。
【００４９】
（ＥＰＣ由来の臍帯血内皮細胞は、高レベルのテロメラーゼ活性を含む）
臍帯血ＥＰＣに由来する内皮細胞は、ヘーフリック限度を超えて、少なくとも１００集団倍加の間、連続的に継代される（図４ａ）。唯一他に報告されている同様の成長動態を有する一次内皮細胞は、テロメラーゼを過剰発現するように遺伝的に操作された内皮細胞のみである。したがって、臍帯血ＥＰＣ由来の細胞および成体ＥＰＣ由来の細胞において、テロメラーゼ活性を、それらの成長動態における相違についての可能性のある分子的説明として測定した。初期継代臍帯血ＥＰＣ由来の子孫および後期継代臍帯血ＥＰＣ由来の子孫の両方は、成体ＥＰＣ由来の細胞と比較して、有意に上昇したレベルのテロメラーゼ活性を示し、テロメラーゼを過剰発現する上記の一次内皮細胞株を連想させる（図６ｄ〜図６ｅ）。したがって、臍帯血ＥＰＣ由来の細胞は、大きな増殖能と一致して、培養における連続的な継代に伴って高レベルのテロメラーゼ活性（同数のＨｅＬａ細胞のテロメラーゼ活性の３４±１０％）を保持する。
【００５０】
（エキソビボにおける、再増殖性の幹細胞および前駆細胞の増殖）
自己の臍帯血もしくは血縁関係の無い臍帯血、動員成体末梢血、または骨髄由来のＨＳＣとともに共培養される、臍帯血の高増殖能内皮コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＥＣＦＣ）は、ＨＳＣ細胞の数を拡大させ、そして結果として、レシピエント被験体における、より高いレベルの移植につながるＨＳＣの増加、およびＨＳＣ再増殖活性の増加をもたらす。
【００５１】
臍帯血由来のＨＰＰ−ＥＣＦＣとヒトＨＳＣの共培養は、造血前駆細胞数を増加させ、そしてＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるヒト造血細胞の移植（インビボにおけるヒトＨＳＣ機能の測定のためのアッセイ）を増強した。
【００５２】
ヒト臍帯血ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞または動員成体末梢血ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞（ＨＳＣ活性に富む）と、７日間まで（サイトカイン添加有りで）共培養されたヒト臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の内皮細胞は、結果として、準致死的照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、＞１００倍ヒトＣＤ４５＋細胞移植を増強する（図１２）。
【００５３】
上記ＨＰＰ−ＥＣＦＣの収集、単離、および増殖の方法、ならびに上記ＨＰＰ−ＥＣＦＣとヒト幹細胞との共培養のための特定の方法は、新規である。ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、任意の臍帯血試料から収集され得、増殖され、凍結され、そして保存される。これらの細胞は、次いで、ヒト臍帯血細胞試料、骨髄由来細胞試料、または動員成体末梢血幹細胞試料および動員成体末梢血前駆細胞試料を増殖させるために、解凍され、増殖され、そして共培養において使用され得る。この増殖生成物は、次いで、（規制当局の承認後に）移植目的のために使用され得る。
【実施例】
【００５４】
（材料と方法）
（成体末梢血試料および臍帯血試料）
健康なヒトボランティア（２２歳と５０歳との間の年齢の男性および女性）から、新鮮な血液試料（５０ｍｌ〜１００ｍｌ）を、静脈穿刺によって収集し、そしてクエン酸リン酸デキストロース（ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）溶液中で抗凝血化した。健康な新生児（３８週在胎齢〜４０週在胎齢、男児および女児）からのヒト臍帯血試料（２０ｍｌ〜７０ｍｌ）を、抗血液凝固剤としてクエン酸リン酸デキストロース溶液を含む滅菌シリンジ中で収集した。分娩および出産の前に、全ての母親から書面によるインフォームドコンセントを得た。Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの施設内倫理委員会は、全てのプロトコールを承認した。
【００５５】
（バフィコート細胞の調製）
ヒト単核細胞（ＭＮＣ）を、成体末梢血または臍帯血のいずれかから得た。手短に言えば、２０ｍｌ〜１００ｍｌの新鮮な血液を、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で１対１に希釈し、そして等容積のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（フィコール密度勾配物質）上にオーバーレイした。細胞を、室温で、１８００ｒｐｍ（７４０×ｇ）で３０分間遠心した。ＭＮＣを、単離し、そして１０％〜２０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、２％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および０．２５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＥＢＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）（完全ＥＧＭ−２培地）を用いて３回洗浄した。
【００５６】
（内皮成長細胞の培養および定量分析）
バフィコートＭＮＣを、最初に、１０％ウシ胎仔血清、２％ペニシリン／ストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを補充した、１２ｍｌのＥＧＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）（完全ＥＧＭ−２培地）中に再懸濁した。次いで、前もって細胞外マトリックスタンパク質（例えば、Ｉ型ラット尾部コラーゲン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ビトロネクチン、フィブロネクチン、１０型コラーゲン、ポリリジン）でコートした６ウェル組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）の３つの別々のウェル上に、４ｍｌの細胞を播種した。このプレートを、加湿インキュベーター中で、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。２４時間の培養後、非接着細胞および残屑を慎重に吸引し、そして残存する接着細胞を、２ｍｌのＥＧＭ−２培地で１回洗浄した。洗浄後、各ウェルに４ｍｌのＥＧＭ−２培地を添加した。培養の７日目までＥＧＭ−２培地を毎日交換し、次いで最初の継代まで隔日で交換した。
【００５７】
細胞のコロニーは、培養の５日目と２２日目との間に最初に出現し、そして、良好に限局された丸石の様に見える細胞の単層として同定された（図１ｃ）。倒立顕微鏡を使用して、４０×拡大率で、目視検査によってコロニーを数えた。
【００５８】
継代のために、上記のオリジナルのコラーゲンコートした組織培養プレートから、０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞を取り出し、１０ｍｌのＥＧＭ−２培地中に再懸濁し、そしてＩ型ラット尾部コラーゲンでコートされた７５ｃｍ２組織培養フラスコ上にプレートした。内皮細胞の単層を、続いて、９０％〜１００％の集密に達した後に継代した。
【００５９】
（ＨＵＶＥＣおよびＨＡＥＣの培養）
動脈管または静脈管から内皮細胞を直接単離するために、２つのアプローチを使用した。第１の手段において、切断された脈管の一端中に２０Ｇ平滑末端針を挿入し、そして滅菌生理食塩水を使用して脈管含有物（血液細胞を有する血漿）を反対の末端に流し出した。次いで、上記脈管（長さ３ｃｍ〜５ｃｍ）の各末端を分離するために、脈管鉗子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｌａｍｐ）を適用した。２３Ｇ針によって、脈管壁を介してハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中の０．１％コラゲナーゼの溶液を注入し、そしてこの脈管セグメントを、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、この脈管の一端から上記脈管鉗子を取り除き、そして細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）の注入（上記脈管の「開放」末端の反対の、上記脈管の遠位末端を通して注入した）によって上記内皮細胞を放出した。この脈管セグメントを、最小限の（ａ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｏｆ）１０ｍＬの細胞解離緩衝液を通して注入した。この懸濁された細胞を、３５０×ｇで遠心分離し、そして１０％  ＦＢＳを含むＥＢＭ−２培地中で洗浄し、計数し、そしてトリパンブルー排除を使用して生存度を調べた。
【００６０】
第２のアプローチは、直径のより大きな脈管（＞１ｃｍ）について最も適切である。この脈管を、全長に沿って切開し、そして内皮管腔が露出するように開いた。残存するあらゆる血液細胞および血漿を、ＨＢＳＳで洗い流した。この内皮を、ラバーポリスマン（ｒｕｂｂｅｒ  ｐｏｌｉｃｅｍｅｎ）を用いたフィルムスクレーピング（ｆｉｒｍ  ｓｃｒａｐｉｎｇ）によって、一方の端から端まで動かして取り出した。上記ラバーポリスマンに付着している細胞を、１０％  ＦＢＳを含むＥＢＭ−２の溶液中でこのラバーポリスマンを回旋することによって、（細胞外マトリックスタンパク質で予めコートした）６ｃｍ組織培養ウェル中に洗い落とした。毎日、目視検査を実施しながら細胞を培養した。内皮のコロニーは、３日間〜１０日間のうちに出現する。この接着内皮コロニーを、トリプシン−ＥＤＴＡによって取り出し、そして細胞外マトリックスタンパク質でコートしたＴ  ２５フラスコに移した。３回継代され、凍結保存されたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）を、Ｃａｍｂｒｅｘから得た。継代のために、Ｉ型ラット尾部コラーゲンでプレコートされた７５ｃｍ２組織培養フラスコの中の完全ＥＧＭ−２培地中に細胞を播種した。
【００６１】
（ＥＰＣの成長動態および複製能の評価）
第一継代時の細胞を、トリパンブルー排除アッセイ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）よって数えた。次いで、細胞の単層を９０％集密まで成長させ、そして継代した。各継代において、成長動態曲線、集団倍加時間（ＰＤＴ）、および累積集団倍加レベル（ＣＰＤＬ）の計算のために、細胞を数えた。
【００６２】
継代の間に生じた集団倍加（ＰＤ）数を、以下の方程式に従って計算した：
ＰＤ＝ｌｏｇ２（ＣＨ／ＣＳ）
ここで、ＣＨは、収集のときの生存細胞の数であり、そしてＣＳは、播種した細胞の数である。全ての以前のＰＤの和は、各継代におけるＣＰＤＬを決定した。その継代に関するＰＤの数で割った細胞の播種と収集との間の時間間隔を使用することによって、ＰＤＴを導き出した。
【００６３】
（マトリゲルアッセイおよびアセチル化低密度リポタンパク質（Ａｃ−ＬＤＬまたはＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ）の取り込み）
マトリゲルアッセイを実施した。手短に言うと、初期継代（２代〜３代）の、ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の内皮細胞またはＥＰＣ由来の内皮細胞を、前もって３０μｌのマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコートした９６ウェル組織培養プレート上に、ウェルあたり５０００〜２０，０００細胞の細胞密度で播種した。キャピラリー様の管の形成について、細胞を２時間毎に観察した。
【００６４】
接着したＨＰＰ−ＥＣＦＣおよび子孫またはＥＰＣおよび子孫の、Ａｃ−ＬＤＬまたはＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬを取り込む能力を評価するために、６ウェルのＩ型ラット尾部コラーゲンコートされた組織培養プレート中で培養された細胞の培地中に、１０μｇ／ｍｌのＡｃ−ＬＤＬ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、ＭＡ）を添加した。３７℃で、３０分間または４時間、細胞をインキュベートし、次いで１．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で染色されたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて３回洗浄し、そしてＡｃ−ＬＤＬまたはＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの取り込みを、蛍光顕微鏡を使用することによって試験した。
【００６５】
（蛍光サイトメトリーによる内皮細胞の免疫表現型決定）
初期継代（１代〜２代または３代〜４代）の、ＨＰＰ−ＥＣＦＣおよび子孫、またはＥＰＣおよび子孫（５×１０５個）を、１００μｌのＰＢＳおよび２％ＦＢＳ中で、以下に概説されるように、異なる濃度の一次抗体またはアイソタイプコントロール抗体とともに４℃で３０分間〜６０分間インキュベートした。２％  ＦＢＳを含むＰＢＳで、細胞を３回洗浄し、そして蛍光活性細胞ソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ（著作権））（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって分析した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に結合したヒトＣＤ３１に対して直接的に結合した一次マウスモノクローナル抗体を１：２０希釈で、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に結合したヒトＣＤ３４を１：２５希釈で、ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に結合したヒトＣＤ１４を１：１０希釈で、ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に結合したヒトＣＤ４５を１：１０希釈で、ＡＰＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に結合したヒトＣＤ１１７を１：１００希釈で、フィコエリトリン（ＰＥ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に結合したＣＤ１４６を１：１０希釈で、ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）に結合したヒトＡＣ１３３を１：５希釈で、ＦＩＴＣ（Ｃｙｍｂｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈａｎｄｌｅｒｓ  Ｆｏｒｄ、ＵＫ）に結合したヒトＣＤ１４１を１：１０希釈で、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７モノクローナル抗体標識キット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）に結合したヒトＣＤ１０５（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１：１００希釈で、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７に結合したヒトＣＤ１４４を１：１００希釈で使用した。
【００６６】
細胞アゴニストによる活性化後、脈管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）の細胞表面発現について試験するために、血清飢餓内皮細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトインターロイキン−１（ＩＬ−１）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）か、または１０ｎｇ／ｍｌの組み換えヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）のいずれかを用いて、３７℃で４時間刺激した。刺激の後、ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に結合したヒトＶＣＡＭ−１に対する一次抗体を１：２０希釈で利用して、ＶＣＡＭ−１の細胞表面発現を試験した。免疫表現型決定（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｒｏｔｙｐｉｎｇ）およびＵＣＡＭ−１発現に対する全てのアイソタイプコントロールに関して、以下の抗体を使用した：ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に結合したマウスＩｇＧ２ａ，κ、ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に結合したマウスＩｇＧ１，κ、ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に結合したマウスＩｇＧ１，κ、およびＡＰＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に結合したマウスＩｇＧ１，κ。
【００６７】
フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）およびｆｌｋ−１の細胞表面発現の検出のために、室温で１０分間、アセトン中で細胞を固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＰＢＳ、３％脱脂粉乳、および０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）を用いて、３０分間ブロックおよび浸透させた。本発明者らは、２μｇ／ｍｌのヒトｖＷＦに対する一次抗体（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）、および２μｇ／ｍｌのヒトｆｌｋ−１に対するビオチン化一次抗体（Ｓｉｇｍａ）を、１：２０希釈で使用した。ｖＷＦに対して使用された二次抗体は、１：１００希釈でのＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に結合したヤギ抗ウサギ抗体であり、そしてｆｌｋ−１に対して使用された二次抗体は、１：１００希釈でのＡＰＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に結合したストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）であった。ｖＷＦに対するアイソタイプコントロールについては、本発明者らは、ウサギＩｇ一次抗体（Ｄａｋｏ）を１：１００希釈で、１：１００希釈でのＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に結合した抗ウサギＩｇ二次抗体とともに使用した。ｆｌｋ−１に対するアイソタイプコントロールついては、本発明者らは、ビオチン化マウスＩｇＧ１，κ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）一次抗体を１：１００希釈で、１：１００希釈でのストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）ＡＰＣ二次抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）ともに使用した。
【００６８】
（テロメラーゼ活性アッセイ）
テロメラーゼ活性の検出のために、ＴＲＡＰ−ｅｚｅテロメラーゼ検出キット（Ｏｎｃｏｒ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の形式で、テロメア反復増幅プロトコール（ＴＲＡＰ）を利用した。手短に言うと、培養した１０００個のＨＰＰ−ＥＣＦＣコロニーまたはＥＰＣコロニーを、濾紙上に吸着させ、そしてＴＲＡＰアッセイ緩衝液中に溶解した。この溶解した材料をＰＣＲ増幅に供し、そしてそのＰＣＲ生成物（６ｂｐ増分のラダー）を非変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてＤＮＡ染色または３２Ｐを用いた放射標識によって可視化した。ＰＣＲ生成物を、そのままでか、または１／１０希釈でか、もしくは１／１００希釈でロードし、そして染色強度のレベルをＨＥＬＡ細胞株（１０００細胞）ポジティブコントロールと比較した。
【００６９】
（チミジン取り込みアッセイ）
内皮コロニー由来の内皮細胞を、成長因子を欠乏させ、そして５％  ＦＢＳを補充したＥＢＭ−２培地中で２４時間培養した。次に、３×１０４個の細胞を、Ｉ型コラーゲンで予めコートした６ウェル組織培養皿の各ウェル中にプレートし、１％  ＦＢＳを補充したＥＢＭ−２培地中で１６時間培養した。次いで、細胞を、血清を含まないＥＢＭ−２培地中でさらに８時間培養し、静止状態を確実にした。１０％  ＦＢＳを補充したＥＢＭ−２培地中で、２５ｎｇ／ｍｌの組み換えヒト脈管内皮成長因子（ｒｈＶＥＧＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２５ｎｇ／ｍｌの組み換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｒｈｂＦＧＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、または成長因子無し（図示されるように）で、３７℃、５％  ＣＯ２の加湿インキュベーター中で細胞を刺激した。成長因子またはＦＢＳを含まないＥＧＭ−２培地中で、いくつかの細胞を培養した。細胞を１６時間培養し、そして収集の５時間前に、１μＣｉのトリチウム化チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を添加した。細胞を、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで１時間溶解した。溶解物を５ｍｌの液体シンチラント（ｌｉｑｕｉｄ  ｓｃｉｎｔｉｌａｎｔ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に収集し、そしてβ放射を測定した。アッセイを、三つ組み（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行った。
【００７０】
（ＧＡＬＶ偽型ＭＦＧ−ＥＧＦＰの生成）
ＭＦＧ−ＥＧＦＰレトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）の制御の下で増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現する。そしてこれは、Ｐｏｌｌｏｋら（２００１）によって以前に記載されている。ＧＡＬＶ偽型ベクターの生成のための、アンホトロピック（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）なＭＦＧ−ＥＧＦＰクローンからの上清を使用し、ＰＧ１３パッケージング株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を感染させ、そして感染した細胞を、単一細胞クローニングによって単離した。個々のクローンを、５×１０５個のヒト赤白血球病細胞（ＨＥＬ）（ＡＴＣＣ）を感染させ、そして上清の終点希釈後４８時間の百分率ＥＧＦＰ発現を決定することによって、力価についてスクリーニングした。ＭＦＧ−ＥＧＦＰクローン５は、０．５×１０６感染単位／ｍｌ〜１×１０６感染単位／ｍｌの力価を有し、そしてこれを実験に使用した。
【００７１】
（内皮細胞のレトロウイルス形質導入）
初期継代（１代〜２代）内皮コロニー由来の内皮細胞を、等量の出発の力価のＭＧＦ−ＥＧＦＰ上清を用いて形質導入した。６ウェル非組織培養プレートを、５μｇ／ｃｍ２フィブロネクチンＣＨ−２９６（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）を用いて、室温で２時間かまたは４℃で一晩コートした。プレートをＰＢＳで１回洗浄し、そして形質導入のために内皮細胞を５×１０４細胞／ｃｍ２でプレートした。完全ＥＧＭ−２培地で１：１に希釈したレトロウイルス上清を用いて細胞を、一晩の培養の間完全ＥＧＭ−２培地の交換を行い、連続２日間４時間感染させた。第２ラウンドの感染の後、細胞を収集し、計数し、そして蛍光サイトメトリーによってＥＧＦＰ発現について分析した。
【００７２】
（単一細胞アッセイ）
上記ＭＦＧ−ＥＧＦＰレトロウイルスで形質導入した初期継代（１代〜４代）内皮コロニー由来の内皮細胞を、蛍光サイトメトリーによって、ＥＧＦＰ発現について分類した。ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  Ｓｏｒｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）（≦９ポンド／平方インチのシーズフロー圧で≧１００ミクロンのソートノズル）を使用し、２００μｌの完全ＥＧＭ−２培地を含んだＩ型コラーゲンで予めコートした９６ウェル平底組織培養プレートの各ウェル中に、ＥＧＦＰを発現する１つの単一内皮細胞を置いた。５０×拡大率の蛍光顕微鏡下で個々のウェルを検査し、１個の細胞のみが各ウェル中に置かれていることを確実にした。加湿インキュベーター中で、３７℃、５％ＣＯ２で細胞を培養した。培地を、１００μｌ取り出し、それを１００μｌの新鮮な完全ＥＧＭ−２培地で置き換えることによって、４日間毎に交換した。第１４日目に、プレートした１個の細胞からの内皮細胞の成長について、各ウェルを検査した。単一内皮細胞の分裂の頻度を定量化するために、１００×拡大率の蛍光顕微鏡を用いて２個以上の内皮細胞を有する細胞の数を計数した。ウェルあたりの細胞の数を数えるために、１００×拡大率の蛍光顕微鏡を用いた目視検査によって、上記細胞を計数するか（ウェルあたり５０細胞未満）、または上記細胞をトリプシン処理し、そしてトリパンブルー排除アッセイを利用して血球計を用いてそれらを計数した（ウェルあたり５０細胞超）。
【００７３】
単一細胞に由来する内皮細胞の長期間増殖能および長期間複製能を、決定した。培養の開始の１４日後、５０細胞より多くを含む個々のウェルを、トリプシン処理し、５００μｌの完全ＥＧＭ−２培地中に収集し、そしてＩ型コラーゲンでコートした２４ウェル組織培養皿に継代培養した。この細胞の継代培養の４日後、その培地を吸引し、そして５００μｌの新鮮な完全ＥＧＭ−２培地で置き換えた。７日目に、５０×拡大率の蛍光顕微鏡を用いた目視検査によって、コロニー成長または細胞集密についてウェルを検査した。次いで、細胞をトリプシン処理し、計数し、そしてＩ型コラーゲンで予めコートした６ウェル組織培養プレート中に継代培養した。６ウェルプレートにおける培養の７日後、本明細書中で開示される条件下で、長期間培養について、集密な細胞単層を含んだ１０ウェル〜１２ウェルを選択した。各試料について、ＰＤＴおよびＣＰＤＬを計算した。
【００７４】
（ＣＤマーカー）
ＣＤ１４（リポ多糖レセプター）
ＣＤ３１（血小板内皮細胞接着分子）
ＣＤ３４（シアロムチン）
ＣＤ４５（共通白血球抗原）
ＣＤ１０５（エンドグリン）
ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔレセプター）
ＣＤ１３３（プロミニン１）
ＣＤ１４１（トロンボモジュリン）
ＣＤ１４４（脈管内皮カドヘリン）
ＣＤ１４６（内皮関連抗原、Ｓ−エンド−１）
ｆｌｋ−１（胎児肝臓キナーゼ−１、脈管内皮成長因子２に対するレセプター）。
【００７５】
（ＥＰＣの共焦点画像化）
１０％  ＦＢＳを添加したＥＢＭ−２培地を使用し、Ｔ７５フラスコ中で４日間、３代〜５代継代したＥＰＣを成長させた。細胞が集密に達した場合、培地を吸引し、上記フラスコに５ｍｌの滅菌ＰＢＳを添加し、次いで吸引し、トリプシン−ＥＤＴＡを添加し、そしてこのフラスコを３７℃で５分間インキュベートした。このトリプシンをクエンチするために、５ｍＬの１０％  ＦＢＳを含むＥＢＭ−２培地を添加し、そして遊離したＥＰＣを３５０×Ｇで１０分間遠心分離した。ペレット化した細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで１０％  ＦＢＳを含むＥＢＭ−２培地中に再懸濁した。
【００７６】
ガラス製チャンバースライド（４チャンバー構造；Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、４℃で一晩、細胞外マトリックスタンパク質（例えば、１型コラーゲンもしくは４型コラーゲン、フィブロネクチン、またはビトロネクチン）でコートし、次いで翌朝に（ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｒｎｉｎｇ）滅菌ＰＢＳで洗浄した。このＰＢＳを吸引し、そして１０％  ＦＢＳを含むＥＢＭ−２培地中の細胞を、チャンバーあたり５０細胞で添加し、そして５％ＣＯ２中で、３７℃で７日間インキュベートした。
【００７７】
ＥＰＣを含むスライドをＰＢＳで２回洗浄し、そしてアセトン中で１０分間室温で細胞を固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＰＢＳ、３％脱脂粉乳、および０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を用いて、３０分間、ブロックおよび浸透させた。この細胞の細胞膜を強調するために、核染色のための１．５ｍｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩとともに、フィコエリトリン（ＰＥ）に結合したＣＤ１４６に対する一次抗体（１□ｇ／ｍＬ）を、上記固定した細胞に添加した。３０分間のインキュベーション後、ＰＢＳ中で細胞を２回洗浄し、そしてＺｅｉｓｓ  ５１０共焦点顕微鏡を使用して蛍光について検査した。７×拡大率で倍率を保持したまま、４０×水浸対物レンズを介して、紫外レーザー（３５１／３６４ｎｍ励起）およびヘリウム−ネオンレーザー（５４３ｎｍ励起）を使用して上記ＤＡＰＩおよびＰＥ−標識した細胞を励起した。画像を一平面中に取り込み、そして提示のための単色画像として表示した。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用し、種々のＥＰＣコロニー型に由来する細胞の、核の直径および細胞質の直径を定量化した。
【００７８】
（表１）
成体末梢血単核細胞および臍帯血単核細胞から単離した内皮前駆細胞コロニーの、出現の数および時期の一覧表。
【００７９】
【表１】
2007521817.tif 000003
。
【００８０】
（ＨＰＰ−ＥＣＦＣおよびＣＤ３４＋細胞の共培養は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ再増殖細胞を増殖させる）
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける骨髄（ｍａｒｒｏｗ）再増殖細胞（ＳＲＣ）を有する（ｈａｒｂｏｒ）ことが以前に示された、ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞を単離した。代表的には、５％〜５０％のヒトＣＤ４５＋キメラ現象のレベルを達成するために、０．５×１０６個〜１．０×１０６個のヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス中に注入する。最初に、ヒト骨髄からの収集の日に、９×１０３個のＣＤ３４＋細胞のみをコントロールとしてＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス中に注入した。ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、およびＦｌｔ−３の存在下で、９×１０３個のＣＤ３４＋細胞を７日間培養した。これらは、エキソビボにおいてＨＳＣを最大に増殖させるために現在使用されている成長因子である。成長因子の不在下で、臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の子孫の単層とともに９×１０３個のＣＤ３４＋細胞を７日間共培養した。培養の７日後、この培養したＣＤ３４細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス中に注入し、そしてヒト細胞の存在下で、移植の４週間後、移植されたマウスの末梢血を試験した。ＣＤ３４＋細胞の成長因子との７日間の共培養は、ヒト骨髄から単離した直後に注入したＣＤ３４＋と比較して、移植の８週間後のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス中で検出されたヒト細胞の百分率を１０倍増大させた（図１２）。以前の研究と比較して、非常に限られた数の細胞の注入にもかかわらず、臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の細胞とのＣＤ３４＋細胞の共培養は、移植の８週間後のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて検出されたヒト細胞の百分率を２６０倍増大させた（図１２）。ヒト骨髄系統およびリンパ系統の両方が移植の８週間後に検出された。このことは、造血系の多系統の再構成が、臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣとのＣＤ３４＋細胞の共培養によって達成されたことを示した。
【００８１】
ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の細胞の集密な単層の２つのＴ７５フラスコを用いて開始して、カルシウムまたはマグネシウムを欠いたハンクス平衡塩溶液（ＨＢＢＳ）で最初に細胞を洗浄し、次いで各フラスコに１分間１．５ｍＬのトリプシンＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した。次に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含む８．５ｍＬの内皮基礎培地２（ＥＢＭ２）（Ｃａｍｂｒｅｘ）を添加し、そして懸濁した細胞を収集し、そして血球計上でトリパンブルー排除を介して計数した。
【００８２】
コラーゲン１で予めコートした６ウェル組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に、ＨＰＰ−ＥＣＦＣ由来の細胞を、３×１０５細胞／ウェルでプレートした。１０％  ＦＢＳを補充した内皮成長培地２（ＥＧＭ２）（Ｃａｍｂｒｅｘ）を用いて細胞を培養し、そして一晩培養した。翌朝、その集密細胞単層をＥＢＭ２＋１０％  ＦＢＳで２回洗浄し、次いで、蛍光活性化細胞分類によって収集し、４ｍＬのＥＢＭ２＋１０％  ＦＢＳ＋ヒト巨核球成長由来因子（ＭＧＤＦ）（１００ｎｇ／ｍＬ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（１００ｎｇ／ｍＬ）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）（１００ｎｇ／ｍＬ）、ならびにｆｌｔ−３リガンド（１００ｎｇ／ｍＬ）中に再懸濁した９，０００個のＣＤ３４＋ＣＤ３８ｄｉｍＬｉｎ−（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ２４、ＣＤ３１、ＣＤ３３、およびグリコホリンＡ）成体ヒト骨髄由来細胞とともに共培養した。３７℃、５％  ＣＯ２加湿インキュベーター中で７日間、障害無しに細胞を培養した。いくつかの培養物において、ＥＢＭ２＋１０％  ＦＢＳ中でＨＰＰ−ＥＣＦＣとともに、そして成長因子無添加で、ＣＤ３４＋細胞を共培養した。
【００８３】
７日間の共培養の後、５ｍＬのピペットを使用して非接着細胞および培地（４ｍＬ）を吸引した。２ｍＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回ウェルを洗浄し、そして最初の吸引物にそのＰＢＳとともに非接着細胞を添加した。同じウェルに対して、１ｍＬの細胞分離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を室温で４分間添加し、次いで、吸引および上記最初の吸引物への添加の前に、この細胞分離緩衝液およびバラバラになった細胞をそのウェル中で穏徐に滴定した。最後に、上記ＨＰＰ−ＥＣＦＣ単層を２ｍＬのＰＢＳで最後に１回洗浄し、そして上記最初の吸引物中に、わずかな細胞を含むこの溶液を添加した。培地および細胞の最終容積は、９ｍＬであった。
【００８４】
この細胞懸濁物を、室温で１５００ｒｐｍ（５１４×ｇ）で１０分間遠心分離した。溶液を取り除き、細胞ペレットを機械的に取り出し（ｄｉｓｌｏｄｇｅ）、次いで１／２ｍＬ〜１ｍＬのＥＢＭ２＋１０％  ＦＢＳ中に再懸濁した。血球計上において、トリパンブルー中で細胞を計数した。回収した細胞を、前駆体アッセイにおいてプレートするか、またはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス中に静脈内注入した。
【００８５】
上記に概説された方法は、ヒト移植のための移植片を提供するために改変され得る。この場合には、ＨＰＰ−ＥＣＦＣ子孫は、臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣの存在下で、大数の（自己または同種異系のヒト臍帯血由来、動員末梢血由来、または骨髄由来の）ＣＤ３４＋造血幹細胞が増殖し得るように、Ｔ７５フラスコ中または灌流チャンバー系にプレートされる。細胞に直接触れることなくドナーＣＤ３４＋細胞がＨＰＰ−ＥＣＦＣ子孫とともに培養され得るような系が使用され、したがって、上記ドナーＣＤ３４＋細胞は増殖され得、回収され得、そして臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣ子孫の「混入」したドナー細胞無しで、ヒト患者中に移植され得る。
【００８６】
（文献）
以下の文献は、開示される方法および組成物が本発明の実施において使用される程度に、参考として本発明の範囲中に援用される。
【００８７】
【表２】
2007521817.tif 000004
【００８８】
【表３】
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【００８９】
【表４】
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【００９０】
【表５】
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【００９１】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１−１】成体末梢血および臍帯血に由来する、内皮前駆細胞コロニーの単離。図１ａは、成体末梢血（ＡＢ）および臍帯血（ＣＢ）２０ｍｌあたりの単離されたＥＰＣコロニーの数。結果は、成体ドナーについての１８の独立した実験および臍帯血についての１３の独立した実験についての、ＥＰＣコロニーの平均数±ＳＥＭの平均数を示す。＊対応のあるスチューデントｔ検定によって、Ｐ＜０．０００１。図１ｂは、等容積の成体末梢血（ＡＢ）および臍帯血（ＣＢ）からの培養開始後の、初期ＥＰＣコロニー出現の時間である。結果は、成体ドナーについての１８の独立した実験および臍帯血についての１３の独立した実験についての、初期ＥＰＣコロニー出現の前の平均日数±ＳＥＭの前の平均日数を示す。＊対応のあるスチューデントｔ検定によって、Ｐ＜０．０００１。
【図１−２】成体末梢血および臍帯血に由来する、内皮前駆細胞コロニーの単離。図１ｃは、成体血液に由来する内皮コロニーの、代表的な低分解能顕微鏡写真および高分解能顕微鏡写真である。図１ｄは、ＣＢに由来する内皮細胞コロニーの、代表的な低分解能顕微鏡写真および高分解能顕微鏡写真である。図１ｅは、低分解能拡大率および高分解能拡大率での、成体内皮細胞コロニーに由来する内皮細胞単層である。図１ｆは、低拡大率および高拡大率での、ＣＢ内皮細胞コロニーに由来する、内皮細胞単層である。写真中のスケールバーは、１００μｍ（ｃ、ｄ、ｅ、ｆの左側カラム）、および１０μｍ（ｃ、ｄ、ｅ、ｆの右側カラム）を表す。
【図２】成体ＥＰＣ由来および臍帯血ＥＰＣ由来の内皮細胞の、表現型分析および機能分析。図２ａ〜図２ｂは、蛍光サイトメトリーによる、成体ＥＰＣコロニー（図２ａ）または臍帯血ＥＰＣコロニー（図２ｂ）のいずれかに由来する細胞単層の免疫表現型決定である。臍帯血ＥＰＣ由来の細胞および成体ＥＰＣ由来の細胞の両方は、ＣＤ３１、ＣＤ１４１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４４、ｖＷＦ、およびＦｌｋ−１を発現するが、ＣＤ４５およびＣＤ１４を発現しない。いくつかの臍帯血細胞および成体細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、およびＣＤ１１７を発現する。示されているものは、同様の結果を有する、異なる成体細胞単層を利用した１８の独立した実験および異なる臍帯血細胞単層を使用した１３の独立した実験からの、代表的なデータである。アイソタイプコントロールは、試験した各表面抗原についての各ヒストグラム上にグレーでオーバーレイされる。（図２ｃ）成体ＥＰＣ由来の内皮細胞および臍帯血ＥＰＣ由来の内皮細胞は、ＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬを取り込む（５０×拡大率）。ＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬを取り込み（赤色）、かつＤＡＰＩで染色された（青色）、成体ＥＰＣ由来の内皮細胞および臍帯血ＥＰＣ由来の内皮細胞についての代表的な写真が示される。示されているものは、同様の結果を有する、異なる成体細胞単層を利用した１８の独立した実験および異なる臍帯血細胞単層を使用した１３の独立した実験からの、代表的なデータである。写真中のスケールバーは、１００μｍを表す。（図２ｄ）毛細管様の構造の形成のためにマトリゲル中にプレートされた、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現するように遺伝的に操作された成体ＥＰＣ由来の内皮細胞および臍帯血ＥＰＣ由来の内皮細胞（５０×拡大率）。示されているものは、同様の結果を有する、異なる成体細胞単層を利用した１８の独立した実験および異なる臍帯血細胞単層を使用した１３の独立した実験からの、代表的なデータである。写真中のスケールバーは、１００μｍを表す。（図２ｅ）成体ＥＰＣ由来の内皮細胞および臍帯血ＥＰＣ由来の内皮細胞は、ｒｈＴＮＦ−αか、またはｒｈＩＬ−１のいずれかに応答して、脈管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）の細胞表面発現を上方制御する。示されているものは、同様の結果を有する、異なる成体細胞単層を利用した１８の独立した実験および異なる臍帯血細胞単層を使用した１３の独立した実験からの、代表的なデータである。ＶＣＡＭ−１に関するアイソタイプコントロールは、各ヒストグラム上にグレーでオーバーレイされる。
【図３】成体ＥＰＣ由来の内皮細胞および臍帯血ＥＰＣ由来の内皮細胞を、低い細胞密度で再プレートした７日後に形成された、形態学的に明確に異なる二次コロニーの代表的な写真。
【図４】臍帯血内皮前駆細胞コロニーおよび成体内皮前駆細胞コロニーに由来する内皮細胞子孫の成長動態。（図４ａ）単核細胞から収集された、成体血液（ＡＢ）ＥＰＣ由来の内皮細胞および臍帯血（ＣＢ）ＥＰＣ由来の内皮細胞のエキソビボ増殖。黒色の四角（ｂｏｘ）は、各継代における総細胞数を表す。各継代において、細胞は上で示した内皮細胞表面抗原（図２ａ〜図２ｂ）を均一に発現したが、造血細胞特異的抗原（ＣＤ４５およびＣＤ１４）を発現しなかった。臍帯血ＥＰＣ由来の内皮細胞および成体ＥＰＣ由来の内皮細胞についての代表的な成長曲線を示す。異なるドナーに由来する、１１の他の臍帯血内皮細胞単層および成体内皮細胞単層は、同様の成長動態を示した。（図４ｂ〜図４ｃ）６０日間の培養の間の、臍帯血（ＣＢ）ＥＰＣ由来の内皮細胞および成体血液（ＡＢ）ＥＰＣ由来の内皮細胞の集団倍加時間（ＰＤＴ）および累積集団倍加レベル（ＣＰＤＬ）。結果は、６つの独立した実験のＰＤＴの平均数±ＳＥＭの平均数およびＣＰＤＬの平均数±ＳＥＭの平均数を表す。＊対応のあるスチューデントｔ検定によって、Ｐ＜０．０１。（図４ｄ）臍帯血（ＣＢ）ＥＰＣ由来の内皮細胞および成体血液（ＡＢ）ＥＰＣ由来の内皮細胞のＤＮＡ合成。初期継代（１代〜２代）の臍帯血ＥＰＣ由来の内皮細胞は、１０％  ＦＢＳ、ｒｈＶＥＧＦ、およびｒｈｂＦＧＦに応答して、成体細胞と比較して増大したＤＮＡ合成を示す。結果は、異なるドナーに由来する内皮細胞を利用した４つの独立した実験の平均を表す。＊対応のあるスチューデントｔ検定によって、Ｐ＜０．０１。
【図５】ＥＰＣコロニーに由来する、単一臍帯血内皮細胞および単一成体内皮細胞のクローン原性能および増殖能の定量化。（図５ａ）成体ＥＰＣコロニーか、または臍帯ＥＰＣコロニーのいずれかに由来する内皮細胞を使用した単一細胞アッセイの概略図。（図５ｂ）培養の１４日後、少なくとも１回の細胞分裂を起こした成体血液（ＡＢ）ＥＰＣ由来の内皮細胞または臍帯血（ＣＢ）ＥＰＣ由来の内皮細胞の百分率。結果は、異なるドナーに由来する単一内皮細胞を使用した５つの独立した実験の平均を表す。＊対応のあるスチューデントｔ検定によって、Ｐ＜０．０１。（図５ｃ）培養の１４日後の、単一成体血液（ＡＢ）ＥＰＣ由来の内皮細胞または単一臍帯血（ＣＢ）ＥＰＣ由来の内皮細胞に由来する細胞子孫の平均数。結果は、異なるドナーに由来する単一内皮細胞を使用した５つの独立した実験の平均を表す。＊対応のあるスチューデントｔ検定によって、Ｐ＜０．０１。（図５ｄ）定量可能な範囲を示す細胞数を有するコロニーを生じる、分裂する単一細胞の百分率（ＨＰＰ、ＬＰＰ、クラスター）。（図５ｅ）単一臍帯血ＥＰＣ由来の内皮細胞または単一成体ＥＰＣ由来の内皮細胞に由来する、種々の内皮細胞クラスター（＜５０細胞）、ＬＰＰ（約５１細胞〜２０００細胞）、およびＨＰＰ（約２０００細胞〜＞１０，０００細胞）の代表的な写真（５０×拡大率）。結果は、異なるドナーに由来する細胞を利用した４つの他の独立した実験を表す。写真中のスケールバーは、１００μｍを表す。ＬＰＰ−ＥＣＦＣ（５１細胞〜２０００細胞）およびＨＰＰ−ＥＣＦＣ（２０００細胞＞１０，０００細胞）の範囲は、概算値である。
【図６】単一臍帯血ＥＰＣ由来の内皮細胞または単一成体ＥＰＣ由来の内皮細胞に由来する細胞子孫の、再プレート能および長期間培養。（図６ａ）２４ウェル組織培養プレートにおいて、培養の７日後に二次コロニーを形成するか、または細胞集密まで急速に成長する単一臍帯血（ＣＢ）ＥＰＣ由来の内皮細胞または単一成体（ＡＢ）ＥＰＣ由来の内皮細胞に由来する細胞子孫の百分率。結果は、４人の異なるドナーに由来する細胞を使用した４つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。＊対応のあるスチューデントｔ検定によって、Ｐ＜０．０１。（図６ｂ）培養の７日後における、２４ウェルプレート中の、単一のプレートされた臍帯血由来の内皮細胞の細胞子孫に由来する、二次内皮細胞コロニーまたは集密細胞単層の代表的な写真（５０×拡大率）。写真中のスケールバーは、１００μｍを表す。（図６ｃ）長期間培養における、１１の単一のプレートされた、３人の異なる臍帯血ドナーから単離された内皮細胞の細胞子孫の成長動態。黒色の四角は、各継代における細胞の総数を表す。（図６ｄ）異なるドナーから単離された、１０００個の初期継代の成体血ＥＰＣ由来の内皮細胞（レーン１〜レーン４）および臍帯血ＥＰＣ由来の内皮細胞（レーン５〜レーン８）のテロメラーゼ活性。１５のＣＤＰＬで、成体細胞および臍帯細胞を試験した。Ｐは、ポジティブコントロールとして使用した１０００個のＨｅＬａ細胞におけるテロメラーゼ活性を示し、そしてＮは、ネガティブコントロールを示す。成体試料におけるテロメラーゼ活性の平均レベルは、ＨｅＬａ細胞のテロメラーゼ活性の４±４％であり、そして臍帯血試料のテロメラーゼ活性の平均レベルは、ＨｅＬａ細胞のテロメラーゼ活性の３４±１０％であった。（図６ｅ）初期継代および後期継代の成体ＥＰＣ由来の内皮細胞（ａ）および臍帯血ＥＰＣ由来の内皮細胞（ｃ）のテロメラーゼ活性の比較。ＰＤは、試験した細胞の累積集団倍加レベルを示す。Ｐは、ポジティブコントロールとして使用したＨｅＬａ細胞におけるテロメラーゼ活性を示す。Ｎは、ネガティブコントロールを示す。３人の異なるドナーに由来する初期継代および後期継代の臍帯血ＥＰＣ由来の内皮細胞および成体ＥＰＣ由来の内皮細胞を利用した３つの他の実験は、同様の結果を示した。
【図７】前駆細胞の別個の集団の増殖能およびクローン原性能に基づく、内皮前駆細胞階層のモデル。高増殖能内皮コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＥＣＦＣ）は、再プレートによって少なくとも二次コロニーを形成する、１つの細胞から生じる大きなコロニーである。ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、全てのその後の段階の内皮前駆体を生じ、さらに二次ＨＰＰ−ＥＣＦＣへと再プレートされる。単一細胞から生じた低増殖能内皮コロニー形成細胞（ＬＰＰ−ＥＣＦＣ）は、５０細胞より多くを含むコロニーを形成するが、再プレートによってＬＰＰ−ＥＣＦＣの二次コロニーを形成しない。内皮細胞クラスター（ＥＣ−クラスター）は、１つの細胞から生じ得るが、５０細胞未満しか含まない。これは、ＨＰＰ−ＥＣＦＣコロニーおよびＬＰＰ−ＥＣＦＣコロニーにおいて見出されるより小さな細胞と比較して、代表的にはより大きい（図１０を参照のこと）。成熟した末期分化内皮細胞は、分裂しない。
【図８】臍帯血ＥＰＣ、ＨＵＶＥＣ、およびＨＡＥＣ由来の内皮細胞の免疫表現型分析。（図８ａ〜図８ｂ）臍帯血ＥＰＣ（ａ）、臍静脈（ｂ）、またはヒト大動脈（ｃ）に由来する細胞単層の、蛍光サイトメトリーによる免疫表現形決定。臍帯血ＥＰＣ由来のＥＣ、ＨＵＶＥＣ、およびＨＡＥＣは、ＣＤ３１、ＣＤ１４１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４４、ｖＷＦ、およびＦｌｋ−１を発現するが、ＣＤ４５およびＣＤ１４を発現しない。５つの異なる臍帯血ＥＣ単層、５つの異なるＨＵＶＥＣ試料、および５つの異なるＨＡＥＣ試料を用いた５つの独立した実験からの代表的なデータは、同様の結果を示した。アイソタイプコントロールは、試験した各表面抗原について、各ヒストグラムに白色でオーバーレイされる。
【図９】臍帯血ＥＰＣコロニー、ＨＵＶＥＣ、およびＨＡＥＣに由来する単一内皮細胞のクローン原性能および増殖能の定量化。（図９ａ）培養の１４日後に、少なくとも１回の細胞分裂を起こす単一臍帯血（ＣＢ）ＥＰＣ由来のＥＣ、ＨＵＶＥＣ、またはＨＡＥＣの百分率。結果は、異なるドナーに由来する単一ＥＣを使用した５つの独立した実験の平均を表す。（図９ｂ）個々のウェル中において分裂する単一細胞の百分率（図５を参照のこと）。培養の１４日後に、個々のウェル中において（分類されたような）細胞のコロニーを生じる、単一ＣＢ  ＥＰＣ由来のＥＣ、ＨＵＶＥＣ、またはＨＡＥＣの百分率。＊単一ＣＢ由来のＥＣ  対  単一ＨＵＶＥＣまたは単一ＨＡＥＣのいずれかの比較のための、対応のあるスチューデントｔ検定によって、Ｐ＜０．０１。（図９ｃ）単一臍帯血ＥＰＣ由来のＥＣ、ＨＵＶＥＣ、またはＨＡＥＣに由来する、種々のＥＣクラスター（＜５０細胞）またはコロニー（＞５０細胞）の代表的な写真（５０×拡大率）。結果は、異なるドナーからの細胞を利用した４つの他の独立した実験の代表的なものである。写真中のスケールバーは、１００μｍを表す。（図９ｄ）２４ウェル組織培養プレートにおいて、培養の７日後に、二次コロニーを形成するかまたは細胞集密まで急速に成長した、単一臍帯血ＥＰＣ由来のＥＣ、ＨＵＶＥＣ、またはＨＡＥＣに由来する細胞子孫の百分率。結果は、４人の異なるドナーに由来する細胞を使用した、４つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。＊単一ＣＢ由来のＥＣ  対  単一ＨＵＶＥＣまたは単一ＨＡＥＣのいずれかの比較のための、対応のあるスチューデントｔ検定によって、Ｐ＜０．０１。（図９ｅ）培養の７日後における２４ウェルプレート中の、単一のプレートされた臍帯血ＥＰＣ由来のＥＣ、ＨＵＶＥＣ、またはＨＡＥＣの細胞子孫に由来する二次ＥＣコロニーまたは集密細胞単層の代表的な写真（５０×拡大率）。写真中のスケールバーは、１００μｍを表す。（図９ｆ）ＨＵＶＥＣに由来するＨＰＰ−ＥＣＦＣコロニー（ＨＰＰ）およびＬＰＰ−ＥＣＦＣコロニー（ＬＰＰ）におけるテロメラーゼ活性。Ｐｏｓ．は、ポジティブコントロールとして使用したＨｅＬａ細胞におけるテロメラーゼ活性を示し、そしてＮｅｇ．は、ネガティブコントロールを示す。結果は、４つの他の独立した実験の代表的なものである。臍帯血ＥＣおよび臍帯血ＨＡＥＣから単離された、ＨＰＰ−ＥＣＦＣコロニーとＬＰＰ−ＥＣＦＣコロニーとの間において、テロメラーゼ活性における、同様の相違を観察した。
【図１０】ＨＰＰ−ＥＣＦＣの単色画像（図１０ａ）、ＬＰＰ−ＥＣＦＣの単色画像（図１０ｂ）、内皮クラスターの単色画像（図１０ｃ）、および成熟した分化内皮細胞の単色画像（図１０ｄ）。ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、最小の細胞質拡散（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）（直径は１２ミクロン〜２２ミクロンで変化）を有し、＞０．８の核  対  細胞質比を有する小さな細胞（核直径８ミクロン〜１０ミクロン）である。ＬＰＰ−ＥＣＦＣは、サイズに関してより不均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）であるが、ＨＰＰ−ＥＣＦＣと比較して、より大きい。ＬＰＰ−ＥＣＦＣ核は、１０．５ミクロン〜１２．５ミクロンでサイズが変化し、そして＞０．４の比を有するが、＜０．５であるより大きな細胞質拡散（２５ミクロン〜６０ミクロンで変化）を有する。内皮クラスターは、１３．０ミクロン〜１６．５ミクロンで変化する核を有する、ほぼ成熟した内皮細胞であり、そして＞０．２であるが、＜０．３である核  対  細胞質比を有する、６５ミクロン〜８０ミクロンで変化する細胞質直径を有する。成熟した分化内皮細胞は、大きくて非常に良好に拡散した細胞であり、１７．０ミクロン〜２２．０ミクロンの範囲の核直径および８５ミクロン〜１０５ミクロンの細胞質直径を有し、そして内皮クラスターと同様の核  対  細胞質比を有する。したがって、ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、任意の他のＥＰＣよりも非常に明確に小さく、そして成熟内皮細胞よりもかなり小さい。
【図１１】明確に分類されたサイズのコロニーを生じる、分裂した単一のプレートされたウシ、ブタ、およびラットの大動脈内皮細胞の百分率。
【図１２】（Ａ）単離の同日に注入したヒト骨髄由来のＣＤ３４＋細胞の移植；（Ｂ）最大刺激濃度のＧ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、またはＦｌｔ−３を用いた７日間の培養；または（Ｃ）臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣとの７日間の共培養（ここで、同期（ｇａｔｅｄ）細胞は、ヒトＣＤ４５抗原についてポジティブに染色されている）の、８週間後のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの末梢血において、フローサイトメトリーによって検出されたヒト細胞（ＣＤ４５ポジティブ）のキメラ現象の百分率；グラフは、同様の結果を有する３つの独立した実験の代表的なものである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０（ａ−ｂ）】
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【図１０（ｃ−ｄ）】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月28日(2006.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された内皮性コロニー形成細胞であって、以下の特徴：
（ａ）内皮細胞に特有の細胞表面抗原を発現する；
（ｂ）造血細胞に特有の細胞表面抗原を発現しない；
（ｃ）アセチル化ＬＤＬを取り込む；および
（ｄ）マトリゲルにおいて、毛細管様の管を形成する、
を有する、単離された内皮性コロニー形成細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の単離された細胞であって、ここで、前記内皮細胞に特有の細胞表面抗原は、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４、およびＣＤ１４６である、細胞。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された細胞であって、ここで、前記造血細胞に特有の細胞表面抗原は、ＣＤ１４およびＣＤ４５である、細胞。
【請求項４】
請求項１に記載の単離された細胞であって、以下：
（ａ）単一細胞からプレートされた場合、少なくとも約２０００個の細胞の、少なくとも二次コロニーへと再プレートする；
（ｂ）高増殖性を示す；
（ｃ）単一細胞から増殖する；および
（ｄ）高レベルのテロメラーゼを発現する、
としてさらに定義される、細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞であって、ここで、高レベルのテロメラーゼ発現は、ＨｅＬａ細胞によって発現されるテロメラーゼ発現の、少なくとも３４％である、細胞。
【請求項６】
請求項４に記載の単離された細胞であって、＞０．８である、高い核  対  細胞質比を示すものとしてさらに定義される、細胞。
【請求項７】
請求項４に記載の単離された細胞であって、少なくとも１０７個の子孫が単一細胞に由来する、方法。
【請求項８】
請求項４に記載の単離された細胞であって、＜２２ミクロンの細胞直径を有するものとしてさらに定義される、細胞。
【請求項９】
請求項１に記載の細胞を単離する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）細胞外マトリックスタンパク質でコートされた支持体上で、生物学的試料に由来する細胞を培養する工程；
（ｂ）該支持体に接着し、かつ再プレート可能なコロニーを形成する細胞を選択する工程；および
（ｃ）該コロニーから単一細胞を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記生物学的試料は、哺乳動物の血液である、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記生物学的試料は、哺乳動物の血管である、方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法によって単離される、細胞。
【請求項１３】
内皮細胞の型に関する単一細胞アッセイであって、以下の工程：
（ａ）特定の分類方法を使用し、生物学的試料の細胞を分類する工程；
（ｂ）規定された条件下で、細胞外マトリックスタンパク質上で該単一分類の細胞を培養する工程；および
（ｃ）特定のコロニーのサイズ、形態、および増殖能を列挙し、該内皮細胞の型を決定する工程
を包含する、単一細胞アッセイ。
【請求項１４】
請求項１３に記載の単一細胞アッセイであって、ここで、前記内皮細胞の型は、ＨＰＰ−ＥＣＦＣを含む、単一細胞アッセイ。
【請求項１５】
請求項１２に記載の細胞を富化するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）特定の分類方法を使用し、生物学的試料の細胞を分類する工程；および
（ｂ）規定された条件下で、細胞外マトリックスタンパク質上で単一分類の細胞を培養する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
エキソビボにおいて造血幹細胞を増殖させるための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）コラーゲンコートされた固体支持体上で、ＨＰＰ−ＥＣＦＣ細胞を培養する工程；および
（ｂ）ＨＰＰ−ＥＣＦＣ細胞とともに共培養することによって、造血幹細胞（ＨＳＣ）を増殖させる工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の単離方法であって、ここで、前記ＨＰＰ−ＥＣＦＣは、ヒト臍帯血細胞由来であり、そして前記ＨＳＣ細胞は、ヒト骨髄由来である、方法。
【請求項１８】
移植片における、造血幹細胞の百分率を改善するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）ヒト骨髄細胞を臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣとともに共培養する工程；
（ｂ）該細胞を移植片に加える工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記細胞は、ヒト骨髄由来であるＣＤ４５＋細胞であり、そして前記哺乳動物は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスである、方法。
【請求項２０】
哺乳動物中の移植片における造血幹細胞の百分率を改善するための組成物であって、ヒト骨髄細胞を臍帯血ＨＰＰ−ＥＣＦＣとともに共培養することによって作られる生成物を含有する、組成物。
【国際調査報告】
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