(57)【要約】  式（Ｉ）の化合物または二量体チルホスチン、生理的に許容できるその塩またはプロドラッグの有効量により細胞を処理することを含んでなる細胞内のダイナミン依存のエンドサイトーシスを阻害する方法を開示する。記載されている方法に有用である化合物もまた提供される。細胞のダイナミン依存エンドサイトーシスの阻害は、てんかんおよび神経学的疾患および病態の治療に提供できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のダイナミン依存のエンドサイトーシスを阻害する方法であって、式Ｉ
Ｍ−Ｓｐ−Ｍ'                            式Ｉ
［式中、ＭおよびＭ'は、各々独立して式II
2007515399.tif 000018
（Ｖが、ＣまたはＣＨであり；
Ｗが、ＣＨまたはリンカー基であり；
Ｙが、水素、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、硫黄、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基であるか；または
Ｗ、ＶおよびＹが、５員または６員の置換または非置換の、Ｚと縮合した炭素環式環またはヘテロ環式環を形成し、ここで前記ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子を含み、置換された場合の前記ヘテロ環式環または前記炭素環式環は、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、硫黄、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基から選択される少なくとも１つの置換基を有し；
Ｒが、ＣＨ2Ｒ'、ＣＸＲ'またはＣＨＸ'Ｒ'であり；
Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ｘ'が、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基であり；
Ｒ'が、スペーサーに結合しているＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｚは：
（ａ）Ｏ、ＮおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなる非置換ヘテロ環式基；
（ｂ）５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなる非置換炭素環式基；
（ｃ）Ｏ、ＮおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなるヘテロ環式基であって、
（ｉ）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシル；および
（ii）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから選択される少なくとも１つの置換基を有するＣ1〜Ｃ2アルキル基またはＣ1〜Ｃ2アルケニル基、から独立して選択される１つ以上の置換基を有するヘテロ環式基；および
（ｄ）５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環、および、
（ｉ）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシル；および
（ii）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから選択される少なくとも１つの置換基を有するＣ1〜Ｃ2アルキル基またはＣ1〜Ｃ2アルケニル基、から独立して選択される、
ＷがＣＨまたはリンカー基であるか、またはＷ、ＶおよびＹが、非置換炭素環式基を形成する場合には、少なくとも２つの置換基、またはＷ、ＶおよびＹが、ヘテロ環式基を形成する場合には、少なくとも１つの置換基からなる炭素環式基、
から選択され、
ここでＭまたはＭ'のうちの１つのＺが、（ｂ）から選択され、ＭまたはＭ'の他方のＺが、（ａ）、（ｃ）または（ｄ）から選択される）
の部分であって、同一か、または異なっており、Ｓｐがスペーサーである］
の化合物、または生理的に許容できるその塩の有効量により細胞を処理することを含んでなる方法。
【請求項２】
Ｖが、Ｃであり；
Ｗが、ＣＨであり；
Ｙが、水素、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換Ｃ1〜Ｃ2基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基であるか；または
Ｗ、ＶおよびＹが、５員または６員の置換または非置換の、Ｚと縮合した炭素環式環またはヘテロ環式環を形成し、ここで前記ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子を含み、置換された場合の前記ヘテロ環式環または前記炭素環式環は、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から選択される少なくとも１つの置換基、または非置換Ｃ1〜Ｃ2基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基を有し；
Ｒが、ＣＨ2Ｒ'、ＣＸＲ'またはＣＨＸ'Ｒ'であり；
Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ｘ'が、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換Ｃ1〜Ｃ2基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｙが、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、チオカルボキシ、またはシアノ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシおよびチオカルボキシから選択される１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基であり；
Ｗ、ＶおよびＹが、５員または６員の置換または非置換の、Ｚと縮合した炭素環式環またはヘテロ環式環を形成し、ここで前記ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子を含み、置換された場合の前記ヘテロ環式環または前記炭素環式環は、シアノ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシおよびチオカルボキシから選択される少なくとも１つの置換基、またはシアノ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシおよびチオカルボキシから選択される１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基を有し；
Ｒが、ＣＸＲ'である、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｚが、
（ｉ）Ｏ、ＮおよびＳから独立して選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなるヘテロ環式基；
（ii）Ｏ、ＮおよびＳから独立して選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなるヘテロ環式基であって、ニトロ、ＮＨ、ハロ、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、およびＣ1〜Ｃ2アルコキシから独立して選択される１つ以上の置換基を有するヘテロ環式基；
（iii）５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環、およびニトロ、ＮＨ、アミノ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄およびＣ1〜Ｃ2アルコキシから独立して選択される少なくとも２つの置換基からなる炭素環式基、
から選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＭおよびＭ'のうちの少なくとも１つのＺが、２,３−ニ置換炭素環式基以外のものである請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＭおよびＭ'のうちの少なくとも１つのＺは：
前記Ｚ基が（ｄ）から選択され、ＷがＣＨまたはＣ1〜Ｃ3リンカー基である場合、互いにオルト位の関係か、または隣接置換位置にある少なくとも２つの置換基；または
前記Ｚ基が（ｃ）から選択されるヘテロ環式基である場合、ヘテロ原子または複数のヘテロ原子の１つに隣接した炭素原子上の置換基または複数置換基のうちの１つ；または
Ｗ、ＶおよびＹが環化してＺと縮合したヘテロ環式環を形成する場合、前記ヘテロ環式環から少なくとも１つの結合長で離れた炭素原子上の置換基または複数置換基のうちの１つ、
を含んでなる請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＭまたはＭ'のうちの１つのＹ置換基が水素である場合、ＭおよびＭ'の他方のＹ置換基が、水素以外のものである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｗ、ＶおよびＹが、Ｚと縮合した５員または６員のヘテロ環式環を形成する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｚと縮合した前記ヘテロ環式環が、２つの環のへテロ環式基を形成する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｚが、５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環、およびニトロ、ＮＨ、アミノ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、およびＣ1〜Ｃ2アルコキシから独立して選択される少なくとも２つの置換基からなるアリール基を含んでなる請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｚが、６員環を有する１つの環、およびニトロ、アミノ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、カルボキシおよびＣ1〜Ｃ2アルコキシから独立して選択される少なくとも２つの置換基からなるアリール基を含んでなる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アリール基が、ニトロ、アミノ、およびヒドロキシから独立して選択される少なくとも２つの置換基を有する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｚが、Ｏ、ＮおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環を有するヘテロ環式基であって、ニトロ、ＮＨ、ハロ、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、およびＣ1〜Ｃ2アルコキシから独立して選択される１つ以上の置換基を有するヘテロ環式基を含んでなる請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヘテロ環式基が、ニトロ、アミノおよびヒドロキシから独立して選択される１つ以上の置換基を有する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＭおよびＭ'は、各々独立して以下の部分：
2007515399.tif 000019
式中：
Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ｙが、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、またはチオカルボキシであるか；または
Ｒ1およびＹが、環化して５員または６員の置換または非置換ヘテロ環式環または炭素環式環を形成し、ここで前記ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個または２個のヘテロ原子を含み、置換された場合の前記炭素環式環または前記ヘテロ環式環は、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から選択される少なくとも１つの置換基を有し；
Ｒ2からＲ5までは、独立して水素、またはニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、スルフヒドリル、チオカルボキシ、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから独立して選択される置換基であるか；または
Ｒ1からＲ5までは、独立して水素、またはニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、スルフヒドリル、チオカルボキシ、ハロ、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから独立して選択される置換基であり；
Ｒは、ＮＨであり、ＯはスペーサーＳｐに結合しているＳであり；
ここでＭおよびＭ'のうち少なくとも１つは、Ｒ1からＲ5までの少なくとも２つが水素以外であり、Ｒ1からＲ2までが水素以外である場合、Ｒ3からＲ5までの少なくとも１つもまた、水素以外であるか、またはＲ1およびＹが環化する場合、Ｒ1およびＹが非置換炭素環式基を形成している場合には、Ｒ2からＲ5までの少なくとも２つは、水素以外であるか、またはＹおよびＲ1がヘテロ環式基を形成している場合には、Ｒ2からＲ5までの少なくとも１つは水素以外であることを特徴とする、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ1からＲ3までが、水素以外である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ1からＲ5までの少なくとも２つが、互いにオルト位の関係にある請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＭおよびＭ'のうち少なくとも１つが、３つの置換基を有し、前記置換基が互いに隣接している請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ1からＲ3までが水素以外であるか、またはＲ2からＲ5までが水素以外であるかのいずれかである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ1からＲ5まで、またはＲ2からＲ5までの少なくとも１つが、ハロ、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシまたはＣ1〜Ｃ2アシルである場合、Ｒ1およびＹが環化し、ヘテロ環式環を形成している場合には、少なくとも１つの他の置換基は、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシおよびチオカルボキシから選択されるか、またはＲ1およびＹが環化していないか、または非置換炭素環式環を形成している場合には、少なくとも２つの他の置換基は、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシおよびチオカルボキシから選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
Ｙがシアノであり、ＸがＯであり、ＲがＮＨである請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＭおよびＭ'が同一である請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記スペーサーＳｐにより、前記化合物がヘアピンコンホメーションを採ることが可能になる請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記スペーサーＳｐが、以下の非置換アルカン鎖：
−ＣＨ2(ＣＨ2)nＣＨ2−
（式中、ｎは、１から５までの整数である）
を含んでなる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記式Ｉの化合物が、二量体チルホスチンである請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ダイナミン依存のエンドサイトーシスにより媒介される哺乳動物における疾患または病態の予防処置または治療処置をする方法であって、
Ｍ−Ｓｐ−Ｍ'                            式Ｉ
［式中、ＭおよびＭ'が、各々独立して式II
2007515399.tif 000020
（Ｖが、ＣまたはＣＨであり；
Ｗが、ＣＨまたはリンカー基であり；
Ｙが、水素、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、硫黄、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基であるか；または
Ｗ、ＶおよびＹが、５員または６員の置換または非置換の、Ｚと縮合した炭素環式環またはヘテロ環式環を形成し、ここで前記ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子を含み、置換された場合の前記ヘテロ環式環または前記炭素環式環は、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、硫黄、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基から選択される少なくとも１つの置換基を有し；
Ｒが、ＣＨ2Ｒ'、ＣＸＲ'またはＣＨＸ'Ｒ'であり；
Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ｘ'が、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基であり；
Ｒ'が、スペーサーに結合しているＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｚは：
（ａ）Ｏ、ＮおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなる非置換ヘテロ環式基；
（ｂ）５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなる非置換炭素環式基；
（ｃ）Ｏ、ＮおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなるヘテロ環式基であって、
（ｉ）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシル；および
（ii）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから選択される少なくとも１つの置換基を有するＣ1〜Ｃ2アルキル基またはＣ1〜Ｃ2アルケニル基、から独立して選択される１つ以上の置換基を有するヘテロ環式基；および
（ｄ）５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環、および、
（ｉ）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシル；および
（ii）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから選択される少なくとも１つの置換基を有するＣ1〜Ｃ2アルキル基またはＣ1〜Ｃ2アルケニル基、から独立して選択される、
ＷがＣＨまたはリンカー基であるか、またはＷ、ＶおよびＹが、非置換炭素環式基を形成する場合には、少なくとも２つの置換基、またはＷ、ＶおよびＹが、ヘテロ環式基を形成する場合には、少なくとも１つの置換基からなる炭素環式基、
から選択され、
ここでＭまたはＭ'のうちの１つのＺ基が（ｂ）から選択され、ＭまたはＭ'の他方のＺ基が（ａ）、（ｃ）または（ｄ）から選択される）
の部分であって、同一か、または異なっており、Ｓｐがスペーサーである］
の化合物、または生理的に許容できるその塩、またはプロドラッグの有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる方法。
【請求項２７】
Ｖが、Ｃであり；
Ｗが、ＣＨであり；
Ｙが、水素、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換Ｃ1〜Ｃ2基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基であるか；または
Ｗ、ＶおよびＹが、５員または６員の置換または非置換の、Ｚと縮合した炭素環式環またはヘテロ環式環を形成し、ここで前記ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子を含み、置換された場合の前記ヘテロ環式環または前記炭素環式環は、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から選択される少なくとも１つの置換基、または非置換Ｃ1〜Ｃ2基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基、を有し；
Ｒが、ＣＨ2Ｒ'、ＣＸＲ'またはＣＨＸ'Ｒ'であり；
Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ｘ'が、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換Ｃ1〜Ｃ2基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基であり；
Ｒ'が、スペーサーに結合されているＮＨ、ＯまたはＳである、
請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ｙが、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、チオカルボキシ、またはシアノ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシおよびチオカルボキシから選択される１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基であり；
Ｗ、ＶおよびＹが、５員または６員の置換または非置換の、Ｚと縮合した炭素環式環またはヘテロ環式環を形成し、ここで前記ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子を含み、置換された場合の前記ヘテロ環式環または前記炭素環式環は、シアノ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシおよびチオカルボキシから選択される少なくとも１つの置換基、またはシアノ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシおよびチオカルボキシから選択される１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基を有し；
Ｒが、ＣＸＲ'である、
請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＭおよびＭ'のうちの少なくとも１つのＺが、２,３−ニ置換炭素環式基以外のものである請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＭおよびＭ'のうちの少なくとも１つのＺは：
前記Ｚ基が（ｄ）から選択され、ＷがＣＨまたはＣ1〜Ｃ3リンカー基である場合、互いにオルト位の関係か、または隣接置換位置にある少なくとも２つの置換基；または
前記Ｚ基が（ｃ）から選択されるヘテロ環式基である場合、ヘテロ原子または複数のヘテロ原子のうち１つに隣接した炭素原子上の置換基または複数置換基のうちの１つ；または
Ｗ、ＶおよびＹが環化してＺと縮合されたヘテロ環式環を形成する場合、前記ヘテロ環式環から少なくとも１つの結合長で離れたＺの炭素原子上の置換基または複数置換基のうちの１つ、
を含んでなる請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＭまたはＭ'のうちの１つのＹ置換基が水素であり、ＭおよびＭ'の他方のＹ置換基が水素以外である請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＭおよびＭ'は、各々独立して以下の部分：
2007515399.tif 000021
（式中：
Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ｙが、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、またはチオカルボキシであるか；または
Ｒ1およびＹが、環化して５員または６員の置換または非置換ヘテロ環式環または炭素環式環を形成し、ここで前記ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個または２個のヘテロ原子を含み、置換された場合の前記炭素環式環または前記ヘテロ環式環は、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から選択される少なくとも１つの置換基を有し；
Ｒ2からＲ5までは、独立して水素、またはニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、スルフヒドリル、チオカルボキシ、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから独立して選択される置換基であるか；または
Ｒ1からＲ5までは、独立して水素、またはニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、スルフヒドリル、チオカルボキシ、ハロ、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから独立して選択される置換基であり；
Ｒは、ＮＨであり、ＯはスペーサーＳｐに結合しているＳであり；
ここでＭおよびＭ'のうち少なくとも１つは、Ｒ1からＲ5までの少なくとも２つが水素以外であり、Ｒ1からＲ2までが水素以外である場合、Ｒ3からＲ5までの少なくとも１つもまた、水素以外であるか、またはＲ1およびＹが環化する場合、Ｒ1およびＹが非置換炭素環式基を形成している場合には、Ｒ2からＲ5までの少なくとも２つは、水素以外であるか、またはＹおよびＲ1がヘテロ環式基を形成している場合には、Ｒ2からＲ5までの少なくとも１つは水素以外であることを特徴とする）
である、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ1からＲ3までが、水素以外である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｒ1からＲ5までの少なくとも２つが、互いにオルト位の関係にある請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ＭおよびＭ'のうち少なくとも１つが、３つの置換基を有し、前記置換基が互いに隣接している請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
Ｒ1からＲ3までが水素以外であるか、またはＲ2からＲ5までが水素以外であるかのいずれかである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
Ｒ1からＲ5まで、またはＲ2からＲ5までの少なくとも１つは、ハロ、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシまたはＣ1〜Ｃ2アシルである場合、Ｒ1およびＹが環化し、ヘテロ環式環を形成している場合には、少なくとも１つの他の置換基は、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシおよびチオカルボキシから選択されるか、またはＲ1およびＹが環化していないか、または非置換炭素環式環を形成している場合には、少なくとも２つの他の置換基は、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシおよびチオカルボキシから選択される請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
Ｙがシアノであり、ＸがＯであり、ＲがＮＨである請求項２６〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ＭおよびＭ'が同一である請求項２６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記スペーサーＳｐにより、前記化合物がヘアピンコンホメーションを採ることが可能になる請求項２６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記式Ｉの化合物が、二量体チルホスチンである請求項２６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記疾患または病態が、癌、眼科疾患、免疫不全疾患、胃腸疾患、病原性感染症、腎臓病、てんかん、および神経学的疾患、神経変性疾患ならびに神経系疾患および病態よりなる群から選択される請求項２６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記神経学的疾患、神経変性疾患ならびに神経系疾患および病態が、脱髄疾患、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病およびレビー小体病よりなる群から選択される請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患または病態が、てんかんである請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ダイナミン依存のエンドサイトーシスにより媒介される哺乳動物における疾患または病態の予防または治療をする方法であって、ダイナミンのＧＴＰアーゼ活性を阻害する二量体チルホスチン、または二量体チルホスチンの類縁体、生理的に許容できる塩、またはプロドラッグの有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる方法。
【請求項４６】
前記二量体チルホスチンは、スペーサー部分によって共に結合されている２つのチルホスチン部分を含んでなり、前記チルホスチン部分の少なくとも１つがベンジリデンマロニトリル部分である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記チルホスチン部分の双方が、ベンジリデンマロニトリル部分である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記チルホスチン部分が、同一である請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記二量体チルホスチンが、ビス−トリホスチンを含んでなる請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記疾患または病態が、癌、眼科疾患、免疫不全疾患、胃腸疾患、病原性感染症、腎臓病、てんかん、および神経学的疾患、神経変性疾患ならびに神経系疾患および病態よりなる群から選択される請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記神経学的疾患、神経変性疾患ならびに神経系疾患および病態が、脱髄疾患、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病およびレビー小体病よりなる群から選択される請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患または病態が、てんかんである請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
ダイナミンのＧＴＰアーゼ活性を阻害する能力を有する二量体チルホスチンまたはその類縁体を同定する方法であって：
試験データを提供するために、二量体チルホスチンまたはその類縁体を、ダイナミンまたはダイナミンＧＴＰアーゼ活性を有する分子と共に温置すること、および
前記試験データに基づいて、二量体チルホスチンまたはその類縁体がダイナミンのＧＴＰアーゼ活性を阻害するかどうかを判定すること、
を含んでなる方法。
【請求項５４】
細胞内のダイナミン依存のエンドサイトーシスを阻害するための請求項５３に定義されている方法により同定される二量体チルホスチンまたはその類縁体の使用。
【請求項５５】
式III
Ｍ−Ｓｐ−Ｍ'                            式III
［式中、ＭおよびＭ'が、各々独立して式IV
2007515399.tif 000022
（Ｖが、ＣまたはＣＨであり；
Ｗが、ＣＨまたはリンカー基であり；
Ｙが、水素、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、硫黄、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基であるか；または
Ｗ、ＶおよびＹが、５員または６員の置換または非置換の、Ｚと縮合した炭素環式環またはヘテロ環式環を形成し、ここで前記ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子を含み、置換された場合の前記ヘテロ環式環または前記炭素環式環は、シアノ、ＮＨ、ニトロ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、硫黄、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基から選択される少なくとも１つの置換基を有し；
Ｒが、ＣＨ2Ｒ'、ＣＸＲ'またはＣＨＸ'Ｒ'であり；
Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ｘ'が、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基であり；
Ｒ'が、スペーサーに結合しているＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｚは：
（ａ）Ｏ、ＮおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなる非置換ヘテロ環式基；
（ｂ）５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなる非置換炭素環式基；
（ｃ）Ｏ、ＮおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなるヘテロ環式基であって、
（ｉ）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシル；および
（ii）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから選択される少なくとも１つの置換基を有するＣ1〜Ｃ2アルキル基またはＣ1〜Ｃ2アルケニル基、から独立して選択される１つ以上の置換基を有するヘテロ環式基；および
（ｄ）５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環、および、
（ｉ）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシル；および
（ii）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから選択される少なくとも１つの置換基を有するＣ1〜Ｃ2アルキル基またはＣ1〜Ｃ2アルケニル基、から独立して選択される、
ＷがＣＨまたはリンカー基であるか、またはＷ、ＶおよびＹが、非置換炭素環式基を形成する場合には、少なくとも２つの置換基、またはＷ、ＶおよびＹが、ヘテロ環式基を形成する場合には、少なくとも１つの置換基からなる炭素環式基、
から選択され、
ここでＭまたはＭ'のうちの１つのＺが、（ｂ）から選択される場合、ＭまたはＭ'の他方のＺが、ＲがＣＸＲ'であり、ＸがＯであり、Ｒ'がスペーサーに結合されているＮＨであり、ＶがＣであり、ＷがＣＨであり、Ｙがシアノである場合、ＭおよびＭ'の少なくとも１つのＺは、式IVａのベンジル基以外であるという条件で、（ａ）、（ｃ）または（ｄ）から選択され、および
2007515399.tif 000023
Ｒ1、Ｒ2およびＲ5がＨであり、およびＲ3ならびにＲ4がヒドロキシであるか；または
Ｒ1およびＲ5がＨであり、およびＳｐがＣ2〜Ｃ4アルキルスペーサーである場合、Ｒ2からＲ4までがヒドロキシであり；
ここでＺ'がＷに結合されている炭素原子である）
の部分であって、同一か、または異なっており、Ｓｐがスペーサーである］
の化合物または生理学的に許容できるその塩、またはプロドラッグ。
【請求項５６】
Ｖが、Ｃであり；
Ｗが、ＣＨであり；
Ｙが、水素、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換Ｃ1〜Ｃ2基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基であるか；または
Ｗ、ＶおよびＹが、５員または６員の置換または非置換の、Ｚと縮合した炭素環式環またはヘテロ環式環を形成し、ここで前記ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子を含み、置換された場合の前記ヘテロ環式環または前記炭素環式環は、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から選択される少なくとも１つの置換基、または非置換Ｃ1〜Ｃ2基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基を有し；
Ｒが、ＣＨ2Ｒ'、ＣＸＲ'またはＣＨＸ'Ｒ'であり；
Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ｘ'が、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換Ｃ1〜Ｃ2基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基である、
請求項５５に記載の化合物。
【請求項５７】
Ｙが、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、チオカルボキシ、またはシアノ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシおよびチオカルボキシから選択される１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基であり；
Ｗ、ＶおよびＹが、５員または６員の置換または非置換の、Ｚと縮合した炭素環式環またはヘテロ環式環を形成し、前記ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子を含み、置換された場合の前記ヘテロ環式環または前記炭素環式環は、シアノ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシおよびチオカルボキシから選択される少なくとも１つの置換基、またはシアノ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシおよびチオカルボキシから選択される１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基を有し；
Ｒが、ＣＸＲ'である、
請求項５６に記載の化合物。
【請求項５８】
Ｚが、
（ｉ）Ｏ、ＮおよびＳから独立して選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなるヘテロ環式基；
（ii）Ｏ、ＮおよびＳから独立して選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなるヘテロ環式基であって、ニトロ、ＮＨ、ハロ、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、およびＣ1〜Ｃ2アルコキシから独立して選択される１つ以上の置換基を有するヘテロ環式基；
（iii）５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環、およびニトロ、ＮＨ、アミノ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、およびＣ1〜Ｃ2アルコキシから独立して選択される少なくとも２つの置換基からなる炭素環式基、
から選択される請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５９】
ＭおよびＭ'のうちの少なくとも１つのＺが、２,３−ニ置換炭素環式基以外のものである請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６０】
ＭおよびＭ'のうちの少なくとも１つのＺは：
前記Ｚ基が（ｄ）から選択され、ＷがＣＨまたはＣ1〜Ｃ3リンカー基である場合、互いにオルト位の関係か、または隣接置換位置にある少なくとも２つの置換基；または
前記Ｚ基が、（ｃ）から選択されるヘテロ環式基である場合、ヘテロ原子または複数のヘテロ原子のうち１つに隣接した炭素原子上の置換基または複数置換基のうちの１つ；または
Ｗ、ＶおよびＹが環化してＺと縮合したヘテロ環式環を形成する場合、前記ヘテロ環式環から少なくとも１つの結合長で離れた炭素原子上の置換基または複数置換基のうちの１つ、
を含んでなる請求項５５〜５９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６１】
ＭまたはＭ'のうちの１つのＹ置換基が水素である場合、ＭおよびＭ'の他方のＹ置換基が水素以外である請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６２】
Ｗ、ＶおよびＹが、Ｚと縮合した５員または６員のヘテロ環式環を形成する請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６３】
Ｚと縮合した前記ヘテロ環式環が、２つの環のへテロ環式基を形成する請求項６２に記載の化合物。
【請求項６４】
Ｚが、５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環、およびニトロ、ＮＨ、アミノ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、およびＣ1〜Ｃ2アルコキシから独立して選択される少なくとも２つの置換基からなるアリール基を含んでなる請求項５５〜６３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６５】
Ｚが、６員環を有する１つの環、およびニトロ、アミノ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、カルボキシおよびＣ1〜Ｃ2アルコキシから独立して選択される少なくとも２つの置換基からなるアリール基を含んでなる請求項６４に記載の化合物。
【請求項６６】
前記アリール基が、ニトロ、アミノ、およびヒドロキシから独立して選択される少なくとも２つの置換基を有する請求項６５に記載の化合物。
【請求項６７】
Ｚが、Ｏ、ＮおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環を有するヘテロ環式基であって、ニトロ、ＮＨ、ハロ、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄およびＣ1〜Ｃ2アルコキシから独立して選択される１つ以上の置換基を有するヘテロ環式基を含んでなる請求項５５〜６２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６８】
前記ヘテロ環式基が、ニトロ、アミノおよびヒドロキシから独立して選択される１つ以上の置換基を有する請求項６７に記載の化合物。
【請求項６９】
ＭおよびＭ'は、各々独立して以下の部分：
2007515399.tif 000024
（式中：
Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ｙが、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、またはチオカルボキシであるか；または
Ｒ1およびＹが、環化して５員または６員の置換または非置換ヘテロ環式環または炭素環式環を形成し、ここで前記ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個または２個のヘテロ原子を含み、置換された場合の前記炭素環式環または前記ヘテロ環式環は、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から選択される少なくとも１つの置換基を有し；
Ｒ2からＲ5までは、独立して水素、またはニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、スルフヒドリル、チオカルボキシ、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから独立して選択される置換基であるか；または
Ｒ1からＲ5までは、独立して水素、またはニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、スルフヒドリル、チオカルボキシ、ハロ、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから独立して選択される置換基であり；
Ｒは、ＮＨであり、ＯはスペーサーＳｐに結合されているＳであり；
ここでＭおよびＭ'のうち少なくとも１つは、Ｒ1からＲ5までの少なくとも２つが水素以外であり、Ｒ1からＲ2までが水素以外である場合、Ｒ3からＲ5までの少なくとも１つもまた、水素以外であるか、またはＲ1およびＹが環化する場合、Ｒ1およびＹが非置換炭素環式基を形成している場合には、Ｒ2からＲ5までの少なくとも２つは、水素以外であるか、またはＹおよびＲ1がヘテロ環式基を形成している場合には、Ｒ2からＲ5までの少なくとも１つは水素以外であることを特徴とする）
である、請求項５５〜５９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７０】
Ｒ1からＲ3までが、水素以外である請求項６９に記載の化合物。
【請求項７１】
Ｒ1からＲ5までの少なくとも２つが、互いにオルト位の関係にある請求項６９に記載の化合物。
【請求項７２】
ＭおよびＭ'の少なくとも１つが、３つの置換基を有し、前記置換基が互いに隣接している請求項６９に記載の化合物。
【請求項７３】
Ｒ1からＲ3までが水素以外であるか、またはＲ2からＲ5までが水素以外であるかのいずれかである請求項７２に記載の化合物。
【請求項７４】
Ｒ1からＲ5までまたはＲ2からＲ5までの少なくとも１つが、ハロ、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシまたはＣ1〜Ｃ2アシルである場合、Ｒ1およびＹが環化し、ヘテロ環式環を形成している場合には、少なくとも１つの他の置換基は、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシおよびチオカルボキシから選択されるか、またはＲ1およびＹが環化していないか、または非置換炭素環式環を形成している場合には、少なくとも２つの他の置換基は、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシおよびチオカルボキシから選択される請求項６９に記載の化合物。
【請求項７５】
Ｙがシアノであり、ＸがＯであり、ＲがＮＨである請求項６９〜７４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７６】
ＭおよびＭ'が同一である請求項５５〜７５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７７】
前記スペーサーＳｐにより、前記化合物がヘアピンコンホメーションを採ることが可能になる請求項５５〜７６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７８】
前記スペーサーＳｐが、以下の非置換アルカン鎖：
−ＣＨ2(ＣＨ2)nＣＨ2−
（式中、ｎは、１から５までの整数である）
を含んでなる、請求項５５〜７７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７９】
前記式IIIの化合物が、二量体チルホスチンである請求項１〜７８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８０】
生理的に許容できる賦形剤、担体または希釈剤と共に請求項５５〜５８のいずれか一項に定義されている化合物を含んでなる製薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイナミン依存エンドサイトーシスを阻害する薬剤およびダイナミン依存エンドサイトーシスにより媒介される疾患または病態の予防または治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞は、細胞外の物質を吸収し、形質膜における多数の膜小胞の形成を含むエンドサイトーシスによりそれらの膜をリサイクルする。該小胞は、大型食胞、より小型のクラスリンコーティング小胞から、小さなシナプス小胞（ＳＶ）の範囲の種々のサイズで生じる。エンドサイトーシスの機構は、細胞外栄養物の取り込み、細胞表面受容体発現およびシグナリングの調節、抗原提示およびシナプス伝達の維持などの多数の細胞機能に役立っている。
【０００３】
種々のエンドサイトーシス経路の中には、生化学的に十分に特性化されているものは２つである。第１は、神経末端における小胞エキソサイトーシスに続く迅速なシナプス小胞エンドサイトーシス（ＳＶＥ）である。ＳＶＥは、受容体活性化に特に関連しているわけではないが、後で再補充するために空のＳＶ類を回収するのに役立っており、酵素ダイナミン(dynamin)Ｉの活性を必要とする。第２は、細胞表面の受容体に対するリガンド結合時に開始され、神経末端など、全ての細胞内のクラスリンコーティングピットを介して生じる受容体媒介エンドサイトーシス（ＲＭＥ）である。ＲＭＥは、形質膜成分（受容体リガンド複合体類および膜脂質類など）または細胞外体液に対して細胞への主要な入口点を提供し、ダイナミンIIの作用を含む。ＲＭＥおよびＳＶＥは双方とも、同じニューロン内で共に作動するが、互いに異なる機能的役割を果たす。
【０００４】
ＲＭＥおよびＳＶＥは、同様の基礎的蛋白質機構を有しているが、それらは、同じ蛋白質の異なるイソ型を利用する。ＲＭＥおよびＳＶＥ双方の複数のサブ形体が存在する。例えば、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の内在化およびトランスフェリン受容体は、ＲＭＥにより媒介され、ダイナミンの活性化に依存するが、前者のみが、チロシンキナーゼ（ＴＫ）阻害剤に感受性であることから、これら２つの活性化受容体のＲＭＥに関して異なる生化学的要件が示唆される。エンドサイトーシスは、ニューロン障害などのヒトの病的状態において複数の役割を演じ、エンドサイトーシスを制御する方法についてのより良い理解は、臨床的に重要である。
【０００５】
ダイナミンは、エンドサイトーシスの最終段階を媒介する重要な酵素である（ブロジン(Brodin)ら、２０００年）。ダイナミンならびに、エンドサイトーシスの分子機構は、多くの蛋白質およびダイナミンの補充およびその活性化をもたらす脂質補因子に関係している（カジンおよびロビンソン(Cousin
and Robinson)、２００１年）。エンドサイトーシス蛋白質は、少なくとも４つの形態学的および生化学的分類に入る段階でエンドサイトーシスにおいて連続的に作用するが、幾つかの蛋白質は、該経路において２つ以上の段階で関与している。これらの形態学的および生物学的分類は：
１.核形成：ＳＶ上のシナプス前部末端のシナプトタグミンは、エキソサイトーシスの部位における核形成点に対してＡＰ−２アダプター蛋白質複合体を補充することによりエキソサイトーシスとエンドサイトーシスとの間の結合として機能する。ＡＰ−２は、クラスリンを補充して小胞コート、次いでアンフィフィシン(amphiphysin)を形成する。
２.陥入：アンフィフィシンは、小胞の陥入に必要とされる残りのエンドサイトーシス蛋白質類（ダイナミン、エンドフィリンおよびシナプトジャニン）の大部分を補充するドッキング分子である。
３.分裂：組立てられたダイナミン、アンフィフィシンおよび／またはエンドフィリンの環が、陥入小胞の頸部周囲に螺旋状環として形成する。これら３種の蛋白質は全て、インビトロで環内に自己組織化できる。小胞の放出を導く小胞頸部の分裂には、ダイナミンのＧＴＰアーゼ活性を必要とする。ＧＴＰ加水分解は、形質膜から小胞を押し出す螺旋体の急激な拡張を生じるか、あるいは、環収縮を引き起こす。ショウジョウバエ(Drosophila)株シビレ(shibire)において、ダイナミンのＧＴＰアーゼドメインにおける変異（ＧＴＰ結合をブロックしないが、ＧＴＰ加水分解をブロックする）は、ダイナミン螺旋体の組立てを可能にし、さらにそれらが形成した後のＳＶ分裂をブロックする（ケーニッヒおよびイケダ(Koenig
and Ikeda)、１９８９年）。これにより、ＧＴＰ結合とダイナミンの反応サイクルのＧＴＰ加水分解ステップとの間が識別され、ＧＴＰ加水分解すなわち、ＧＴＰアーゼ活性が、小胞分裂前の最終ステップであることが示される。ＧＴＰアーゼ欠損のダイナミン変異体の過剰発現により、ＲＭＥおよびＳＶＥの双方が阻害される（ブロジン(Brodin)ら、２０００年）。
４.脱コーティング：ＳＶは脱コーティングされ、神経伝達物質で満たされてからエキソサイトーシスに利用できる。
【０００６】
したがって、ダイナミンは、エキソサイトーシス後のシナプス小胞の回収に必要なＧＴＰアーゼ酵素であり、陥入するシナプス小胞の頸部周囲の螺旋体としての組立てを刺激することによりエンドサイトーシスにおいて機能する（ブロジン(Brodin)ら、２０００年；カジンおよびロビンソン(Cousin
and Robinson)、２００１年）。ダイナミンはまた、リン蛋白質であり、インビトロで蛋白キナーゼＣ（ＰＫＣ）により、またインビボでサイクリン依存蛋白キナーゼ（Ｃｄｋ５）によりリン酸化される。それは、脱分極およびカルシウム流入によるエンドサイトーシスの刺激でカルシニューリンにより迅速に脱リン酸化されるが、脱リン酸化のブロッキングにより、神経末端におけるエンドサイトーシスが防止される。それは、大部分の小胞のエンドサイトーシス時に脱リン酸化されたままであり、エンドサイトーシスの完了時に再度リン酸化される。それ故、ダイナミンの脱リン酸化は、エンドサイトーシス時に役割を演じている可能性は低く、恐らくエンドサイトーシス前のプライミングステップであると考えられる。
【０００７】
３種のダイナミン遺伝子があり、ダイナミンＩはニューロンに発現し、一方、ダイナミンIIは、発現が偏在性である。ダイナミンIIIは、ニューロンに発現し、精巣に非常に多い。ダイナミン類は全て、４種の主要ドメイン、すなわち、ＧＴＰアーゼドメイン、プレクストリン(pleckstrin)相同性（ＰＨ）ドメイン、ＧＴＰアーゼエフェクタードメイン（ＧＥＤ）、およびプロリンリッチドメイン（ＰＲＤ）を有する。
【０００８】
ＧＴＰアーゼドメインは、他のＧＴＰアーゼ類と比較して、ＧＴＰ（１０〜２５μｍ）に対する異常に低い親和性および極めて高い回転率を有する。それは、小胞分裂に必要とされる。タマホコリカビ(Dictyostelium)由来のダイナミンのこのドメインの結晶構造が最近解明された（ニーマン(Niemann)ら、２００１年）。この球状構造は、Ｇ−蛋白コア折りたたみを含有するが、通常の６枚のストランドβ−シートは、ユニークな５５のアミノ酸挿入により８枚のストランドシートに拡張される。
【０００９】
プレクストリン相同性（ＰＨ）ドメインは、目標ドメインであり、かつ潜在的ＧＴＰアーゼ阻害モジュールであり、エンドサイトーシスに必須である。ダイナミンは、このドメインを介して脂質類と相互作用し、ホスファチジルイノシトールビスホスフェート（ＰｔｄＩｎｓ（４,５）Ｐ2）を含有するナノ小管へのダイナミン結合により、ＧＴＰアーゼ活性が大いに刺激される（ストーウェル(Stowell)ら、１９９９年）。このＰＨドメインは、自己組織化またはＧＴＰアーゼ活性に必要ではなく、それ（デルタ−ＰＨドメイン）の除去により、固有のＧＴＰアーゼ活性を最大に増加する。
【００１０】
ＧＴＰアーゼエフェクタードメイン（ＧＥＤ）は、ダイナミン−ダイナミン相互作用およびテトラマー構造へのダイナミン組立てを制御する。約２８〜３２のテトラマーが、協同して単環として、またはＰｔｄＩｎｓ（４,５）Ｐ2含有脂質混合物周囲の螺旋体として自己組織化する。ＧＥＤは、ＧＴＰアーゼメインとの結合によるテトラマー自己組織化の原因となる。ＧＥＤにおける変異は、細胞内におけるエンドサイトーシスに影響を及ぼし、エンドサイトーシスを減少させるものもあり、（驚くべきことに）増加させるものもある。ＧＥＤは、ＧＴＰアーゼ活性化蛋白質のように作用してＧＴＰアーゼ活性化を刺激する。
【００１１】
ダイナミンのＣ末端におけるプロリンリッチドメイン（ＰＲＤ）は、多くのＳＨ３ドメイン含有蛋白質およびカルシニューリンと相互作用し、インビボダイナミンリン酸化の部位である。
【００１２】
カチオン性両親媒性薬物（例えば、クロルプロマジン）、コンカナバリンＡ、フェニルアルシンオキシド、ダンシルカダベリン、細胞内カリウム枯渇、細胞内酸化および媒体温度を４℃に減少させることなど、複数のエンドサイトーシス阻害剤およびエンドサイトーシスを阻害する方法が、が存在する。各々は、特異性に乏しく、有用性に限界がある。それにもかかわらず、それらの使用は、エンドサイトーシスのより良い理解に役立っている。幾つかは、エンドサイトーシスのブロッキングが、ヒトに対して臨床的な意味を有することを立証するために使用されている（アトウッド(Atwood)、２００１年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
１つ以上の実施形態において、本発明は、ダイナミンのＧＴＰアーゼ活性を阻害できる化合物およびダイナミン依存のエンドサイトーシスを阻害するような化合物の使用に関する。特に、少なくとも幾つかの二量体チルホスチン(tyrphostin)類は、ダイナミンにより媒介されるエンドサイトーシスを阻害できることが分かった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明の一態様において、細胞内のダイナミン依存のエンドサイトーシスを阻害する方法であって、式Ｉ
Ｍ−Ｓｐ−Ｍ'                            式Ｉ
［式中、ＭおよびＭ'は、各々独立して式II
【化１】
2007515399.tif 000002
（Ｖが、ＣまたはＣＨであり；
Ｗが、ＣＨまたはリンカー基であり；
Ｙが、水素、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、硫黄、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基であるか；または
Ｗ、ＶおよびＹが、５員または６員の置換または非置換の、Ｚと縮合した炭素環式環またはヘテロ環式環を形成し、ここで該ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子を含み、置換された場合の該ヘテロ環式環または該炭素環式環は、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、硫黄、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基から選択される少なくとも１つの置換基を有し；
Ｒが、ＣＨ2Ｒ'、ＣＸＲ'またはＣＨＸ'Ｒ'であり；
Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ｘ'が、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基であり；
Ｒ'が、スペーサーに結合されているＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｚは：
（ａ）Ｏ、ＮおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなる非置換ヘテロ環式基；
（ｂ）５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなる非置換炭素環式基；
（ｃ）Ｏ、ＮおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなるヘテロ環式基であって、
（ｉ）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシル；および
（ii）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから選択される少なくとも１つの置換基を有するＣ1〜Ｃ2アルキル基またはＣ1〜Ｃ2アルケニル基、から独立して選択される１つ以上の置換基を有するヘテロ環式基；および
（ｄ）５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環、および、
（ｉ）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシル；および
（ii）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから選択される少なくとも１つの置換基を有するＣ1〜Ｃ2アルキル基またはＣ1〜Ｃ2アルケニル基、から独立して選択される、
ＷがＣＨまたはリンカー基であるか、またはＷ、ＶおよびＹが、非置換炭素環式基を形成する場合には、少なくとも２つの置換基、またはＷ、ＶおよびＹが、ヘテロ環式基を形成する場合には、少なくとも１つの置換基からなる炭素環式基、
から選択され、
ここでＭまたはＭ'のうちの１つのＺが、（ｂ）から選択され、ＭまたはＭ'の他方のＺが、（ａ）、（ｃ）または（ｄ）から選択される）
の部分であって、同一か、または異なっており、Ｓｐがスペーサーである］
の化合物、または生理的に許容できるその塩の有効量により細胞を処理することを含んでなる方法を提供する。
【００１５】
式Ｉの化合物は、二量体チルホスチンであることが好ましい。
【００１６】
本発明はまた、ダイナミン依存のエンドサイトーシス阻害に応答性の疾患または病態の予防処置または治療処置に関する。それ故、本発明の他の態様において、ダイナミン依存のエンドサイトーシスによって媒介される哺乳動物における疾患または病態の予防または治療方法であって、式Ｉの化合物、または生理的に許容できるその塩またはプロドラッグの有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらに他の態様において、ダイナミン依存のエンドサイトーシスによって媒介される哺乳動物における疾患または病態の予防または治療方法であって、ダイナミンに結合することによって、ダイナミンのＧＴＰアーゼ活性を阻害する二量体チルホスチン、または生理的に許容できるその塩、または類縁体、またはプロドラッグの有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる方法を提供する。
【００１８】
式Ｉの化合物、または二量体チルホスチンまたはその類縁体による細胞または哺乳動物の処置は、式Ｉの化合物、または蛋白質のＧＴＰアーゼ活性を阻害するダイナミンに結合する二量体チルホスチンまたはその類縁体をインビボで産生するために二量化する化合物、および式Ｉの化合物、または蛋白質のＧＴＰアーゼ活性を阻害するダイナミンに結合する二量体チルホスチンまたはその類縁体をインビボで生じるかまたは産生するために加工されるプロドラッグ類の投与が包含されている。
【００１９】
本発明のさらなる態様において、ダイナミン依存のエンドサイトーシスによって媒介される哺乳動物における疾患または病態の予防または治療用の医薬品製造において、式Ｉの化合物または生理的に許容できるその塩の使用を提供する。
【００２０】
本発明のさらなる他の態様において、ダイナミン依存のエンドサイトーシスによって媒介される哺乳動物における疾患または病態の予防または治療用の医薬品製造において、二量体チルホスチン、生理的に許容できるその塩、または類縁体、またはプロドラッグの使用を提供し、該二量体チルホスチンまたは類縁体は、ダイナミンのＧＴＰアーゼ活性を阻害するダイナミンに結合する。
【００２１】
本発明のさらに他の態様において、式III
Ｍ−Ｓｐ−Ｍ'                            式III
［式中、ＭおよびＭ'は、各々独立して式IV
【化２】
2007515399.tif 000003
（Ｖが、ＣまたはＣＨであり；
Ｗが、ＣＨまたはリンカー基であり；および
Ｙが、水素、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、硫黄、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基であるか；または
Ｗ、ＶおよびＹが、５員または６員の置換または非置換の、Ｚと縮合した炭素環式環またはヘテロ環式環を形成し、ここで該ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子を含み、置換された場合の該ヘテロ環式環または該炭素環式環は、シアノ、ＮＨ、ニトロ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、硫黄、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基から選択される少なくとも１つの置換基を有し；
Ｒが、ＣＨ2Ｒ'、ＣＸＲ'またはＣＨＸ'Ｒ'であり；
Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ｘ'が、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換Ｃ1〜Ｃ3基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ3基であり；
Ｒ'が、スペーサーに結合しているＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｚは：
（ａ）Ｏ、ＮおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなる非置換ヘテロ環式基；
（ｂ）５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなる非置換炭素環式基；
（ｃ）Ｏ、ＮおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなるヘテロ環式基であって、
（ｉ）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシル；および
（ii）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから選択される少なくとも１つの置換基を有するＣ1〜Ｃ2アルキル基またはＣ1〜Ｃ2アルケニル基、から独立して選択される１つ以上の置換基を有するヘテロ環式基；および
（ｄ）５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環、および、
（ｉ）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシル；および
（ii）ニトロ、ＮＨ、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから選択される少なくとも１つの置換基を有するＣ1〜Ｃ2アルキル基またはＣ1〜Ｃ2アルケニル基、から独立して選択される、
ＷがＣＨまたはリンカー基であるか、またはＷ、ＶおよびＹが、非置換炭素環式基を形成する場合には、少なくとも２つの置換基、またはＷ、ＶおよびＹが、ヘテロ環式基を形成する場合には、少なくとも１つの置換基からなる炭素環式基、
から選択され、
ここでＭまたはＭ'のうちの１つのＺが、（ｂ）から選択される場合、ＭまたはＭ'の他方のＺが、ＲがＣＸＲ'であり、ＸがＯであり、Ｒ'がスペーサーに結合されているＮＨであり、ＶがＣであり、ＷがＣＨであり、Ｙがシアノである場合、ＭおよびＭ'の少なくとも１つのＺは、式IVａのベンジル基以外であるという条件で、（ａ）、（ｃ）または（ｄ）から選択され、および
【化３】
2007515399.tif 000004
Ｒ1、Ｒ2およびＲ5がＨであり、およびＲ3ならびにＲ4がヒドロキシであるか；または
Ｒ1およびＲ5がＨであり、およびＳｐがＣ2〜Ｃ4アルキルスペーサーである場合、Ｒ2からＲ4までがヒドロキシであり；
ここでＺ'がＷに結合されている炭素原子である）
の部分であって、同一か、または異なっており、Ｓｐがスペーサーである］
の化合物、または生理的に許容できるその塩を提供する。
【００２２】
本発明の化合物または本発明により投与される化合物のＭまたはＭ'の１つのうちのＹ置換基が水素である場合、ＭまたはＭ'の他方のＹ置換基は水素以外であることが好ましい。典型的には、ＭおよびＭ'の少なくとも１つのＺは、２,３−ニ置換炭素環式基以外である。好ましくは、ＭまたはＭ'の少なくとも１つのＺは：
Ｚ基が、（ｄ）から選択され、ＷがＣＨまたはＣ1〜Ｃ3リンカー基である場合、互いにオルト位の関係か、または隣接置換位置にある少なくとも２つの置換基；または
Ｚ基が、（ｃ）から選択されるヘテロ環式基である場合、ヘテロ原子または複数のヘテロ原子の１つに隣接した炭素原子上の置換基または複数置換基のうちの１つ；または
Ｗ、ＶおよびＹが環化してＺと縮合されたヘテロ環式環を形成する場合、ヘテロ環式環から少なくとも１つの結合長で離れたＺの炭素原子上の置換基または複数置換基のうちの１つを含んでなる。
【００２３】
本発明の他の態様において、式Ｉ、または式IIIの化合物のプロドラッグを提供する。
【００２４】
本発明のさらなる他の態様において、生理的に許容できる賦形剤、担体または希釈剤と共に、式IIIの化合物、または生理的に許容できるその塩、またはプロドラッグを含んでなる製薬組成物を提供する。
【００２５】
本発明のさらに他の態様において、ダイナミンに結合してダイナミンのＧＴＰアーゼ活性を阻害する能力に関して二量体チルホスチンまたはその類縁体をスクリーニングする方法であって：
試験データを提供するために、二量体チルホスチンまたはその類縁体を、ダイナミンまたはダイナミンのＧＴＰアーゼ活性を有する分子と共に温置すること；および
試験データに基づいて、二量体チルホスチンまたはその類縁体がダイナミンのＧＴＰアーゼ活性を阻害するかどうかを判定すること、
を含んでなる方法を提供する。
【００２６】
ダイナミンのＧＴＰアーゼ活性を有する分子は、ＧＴＰアーゼ活性を保持するダイナミンの断片、または例えば、アッセイにおいてダイナミンの代替物として作用するダイナミンの同族体、誘導体または類縁体であり得る。
【００２７】
本明細書に記載された全ての刊行物は、参照として本明細書に組み込まれている。文献の考察のいずれも、本明細書に含まれている材料、装置、製品などを扱っており、本発明の背景を提供する目的のためだけである。これらの事柄のいずれかまたは全ては、先行技術の基礎の一部を形成しているか、またはこの出願の優先日以前にオーストラリアまたは他国に存在している本発明に関連する分野において共通の一般的知識であったことは、認められていないはずである。
【００２８】
本明細書を通して用語の「含んでなる」、または「含む」または「含んでなること」などの変化は、記載された要素、整数またはステップ、または要素群、複数の整数または複数のステップを含むことを意味するが、他のいずれの要素、整数またはステップ、または要素群、複数の整数または複数のステップを除外しないことを意味するためと解される。
【００２９】
本発明の特徴と利点は、添付の図面と共に以下の本発明の好ましい実施形態の説明からさらに明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本明細書に用いられる用語の「アルキル」は、直鎖または分枝鎖飽和脂肪族基を包含する。「Ｃ1〜Ｃ2アルキル」とは、アルキル鎖の長さを意味する。このようなアルキル基としては、メチル基、エチル基、１−メチル−エチル基および１,１−ジメチル−エチル基が挙げられる。
【００３１】
本明細書に用いられる用語の「Ｃ1〜Ｃ2基」または「Ｃ1〜Ｃ3基」は、長さが特定の炭素原子数で分枝鎖または非分枝鎖であってもよい飽和または不飽和脂肪族基を包含する。このような基としては、アルキル基およびアルケニル基が挙げられる。アルケニル基には、少なくとも１つの二重結合を含む。Ｃ1〜Ｃ3基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、１,３−ジメチルプロピル、１−メチル−３−エチルプロピル、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニルおよび２−メチル−１−プロペニルが挙げられる。
【００３２】
本明細書に用いられる用語の「Ｃ1〜Ｃ2」アルケニル基は、二重結合によりＺのヘテロ環式基または炭素環式基に結合されているＣ1基を包含する。
【００３３】
本明細書に用いられる用語の「Ｃ1〜Ｃ2アルコキシ」は、長さが特定の炭素原子数のアルコキシ基を包含する。該アルコキシ基には、炭素−炭素二重結合を含むことができる。
【００３４】
本明細書に用いられる用語の「炭素環式基」は、炭素原子の１つ以上の環を含んでなる基を包含する。該炭素環式基の環、または環の少なくとも１つは、１つ以上の複数結合を有することができる。Ｗ、ＶおよびＹが、式ＩまたはIIIの化合物に環化される場合に形成された炭素環式基は、１つ以上の二重結合を含むことが好ましいであろう。
【００３５】
本明細書に用いられる用語の「ヘテロ環式基」は、該環、または該環の少なくとも１つが、Ｏ、ＮおよびＳから選択されるヘテロ原子を含む原子の１つ以上の環を含んでなる基を包含する。該環、または該環の少なくとも１つはまた、１つ以上の複数結合を有することができる。
【００３６】
用語の「二量体チルホスチン」とは、該チルホスチン部分が同じであるか、または異なるスペーサー部分により一緒に結合されている２つのチルホスチン部分を含んでなる化合物を意味する。典型的に各チルホスチン部分は、同じである。各チルホスチン部分はベンジリデンマロニトリル部分であることが最も好ましいであろう。ビス−チルホスチンは、驚くべきことに、ダイナミンに結合でき、蛋白質のＧＴＰアーゼ活性を阻害できることが現在分かっている１つのこのような二量体チルホスチンである。
【００３７】
好ましくは、式ＩまたはIIIの化合物のＭおよびＭ'は、各々独立して式Ｖ
【化４】
2007515399.tif 000005
Ｖは、Ｃであり；
Ｗは、ＣＨであり；
Ｙは、水素、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換Ｃ1〜Ｃ2基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基であるか；または
Ｗ、ＶおよびＹは、５員または６員の置換または非置換の、Ｚと縮合した炭素環式環またはヘテロ環式環を形成し、ここで前記ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子を含み、置換された場合の前記ヘテロ環式環または前記炭素環式環は、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から選択される少なくとも１つの置換基、または非置換Ｃ1〜Ｃ2基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基を有し；
Ｒは、ＣＨ2Ｒ'、ＣＸＲ'またはＣＨＸ'Ｒ'であり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｘ'は、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換Ｃ1〜Ｃ2基あるいはシアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも１つの基により置換されているＣ1〜Ｃ2基であり；
Ｒ'は、スペーサーに結合されているＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｚは、式IIにおけるとおりの基である）
の部分である。
【００３８】
Ｗ、ＶおよびＹが環化されない場合、Ｙは、シアノ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシまたはチオカルボキシであることが好ましいであろう。Ｙはシアノであることが最も好ましいであろう。
【００３９】
Ｒは、ＣＸＲ'（ＸがＯまたはＳであり、Ｒ'がＮＨ、ＯまたはＳである）であることが好ましい。Ｘは、ＯまたはＳであり、Ｒ'はＮＨであることが好ましいであろう。
【００４０】
Ｚが炭素環式基である場合、それは１つ以上の二重結合を含むことができる。該炭素環式基は、例えば、シクロアルカニル基、フェニル基またはナフチル基などのアリール基、またはビ−フェニルなどのポリフェニル基であり得る。該炭素環式基が２つの環を含んでなる場合、Ｗに対し直接結合されている環は、全ての置換基を有するか、またはＷがＣＨまたはリンカー基である場合、少なくとも２つの置換基を有し、あるいはＷ、ＶおよびＹが環化されている場合、該置換基、または該置換基の少なくとも１つを有することが好ましいであろう。好ましくは、Ｚが：
（ｉ）Ｏ、ＮおよびＳから独立して選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなるヘテロ環式基；
（ii）Ｏ、ＮおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環からなるヘテロ環式基であって、ニトロ、ＮＨ、ハロ、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、およびＣ1〜Ｃ2アルコキシから独立して選択される１つ以上の置換基を有するヘテロ環式基；および
（iii）５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環、およびニトロ、ＮＨ、アミノ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄およびＣ1〜Ｃ2アルコキシから独立して選択される少なくとも２つの置換基からなる炭素環式基、
から選択される基である。
【００４１】
好ましくは、Ｚ基が炭素環式基であり、ハロ、シアノ、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシまたはＣ1〜Ｃ2アシル置換基を有する場合、Ｚ基は、好ましくはニトロ、ＮＨ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソおよび硫黄から、最も好ましくは、ニトロ、ＮＨ、アミノ、ヒドロキシおよびカルボキシから独立して選択される少なくとも２つの他の置換基を一般に有する。カルボキシ環式基は、好ましくは、アリール基、最も好ましくは、置換ベンジル基である。
【００４２】
好ましくは、Ｚ基がヘテロ環式基である場合、それはＯ、ＮおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含む５員環または６員環を独立して有する１つまたは２つの環を有し、ここで該ヘテロ環式基は、ニトロ、ＮＨ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシおよびオキソから独立して選択される１つ以上の置換基を有するか、または５員環または６員環の単環およびニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシおよびカルボキシから独立して選択される少なくとも２つの置換基を有するアリール基を有する。該アリール基は、置換フェニル基であることが好ましいであろう。
【００４３】
該へテロ環式基は、置換または非置換イマダゾリル基、ピラニル基、イソベンジルフラニル基、フリル基、クロメニル基、ピロリル基、２Ｈ−ピロリル基、ピラゾリル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、インドリジニル基、イソインドリル基、３Ｈ−インドリル基、インドリル基、インダゾリル基、プリニル基、キノリジニル基、イソキノリル基、キノリル基、プタラジニル（ｐｔｈａｌａｚｉｎｙｌ）基、ナフチリジニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、シンノリニル基、プテリジニル基、チエニル基、またはベンゾチエニル基であることが好ましいであろう。該へテロ環式基は、このような置換基であることが最も好ましいであろう。
【００４４】
Ｗ、ＶおよびＹが、５員または６員のＺと縮合したヘテロ環式環を形成している例において、Ｚが組み込まれて生じた基は、典型的に置換または非置換の２つの環のヘテロ環式基であり得る。この生じた基は、例えば、イマダゾリル、クロメニル、インドリジニル、イソインドリル、インドリル、インダゾリル、プリニル、キノリジニル、イソキノリル、キノリル、プタラジニル、ナフチリジニル(napthyridinyl)、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、ベンゾチエニルおよびイソベンゾフラニルから選択される置換または非置換ヘテロ環式基であることが好ましいであろう。この生じた基は、置換または非置換クロメニル、インドリル、またはイソキノリンであることが好ましいであろう。さらにＷ、ＶおよびＹの環化により形成されたヘテロ環式基は、置換基であることが好ましいであろう。
【００４５】
本発明の化合物または本発明の方法により哺乳動物に投与される化合物は：
ＭおよびＭ'は、各々独立して式VIの化合物であり、同じか、または異なっており、
【化５】
2007515399.tif 000006
（Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ｙが、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、またはチオカルボキシであるか；または
Ｒ1およびＹが、環化して５員または６員の置換または非置換ヘテロ環式環または炭素環式環を形成し、ここで前記ヘテロ環式環は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個または２個のヘテロ原子を含み、置換された場合の該炭素環式環または該ヘテロ環式環は、シアノ、ニトロ、ＮＨ、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から選択される少なくとも１つの基を有し；
Ｒ2からＲ5までは、独立して水素、またはニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、スルフヒドリル、チオカルボキシ、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから独立して選択される置換基であるか；または
Ｒ1からＲ5までは、独立して水素、またはニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、スルフヒドリル、チオカルボキシ、ハロ、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシおよびＣ1〜Ｃ2アシルから独立して選択される置換基であり；
Ｒが、ＮＨであり、ＯがスペーサーＳｐに結合されているＳであり；
ここでＭおよびＭ'のうち少なくとも１つは、Ｒ1からＲ5までの少なくとも２つが水素以外であり、Ｒ1からＲ2までが水素以外である場合、Ｒ3からＲ5までの少なくとも１つもまた、水素以外であるか、またはＲ1およびＹが環化する場合、Ｒ1およびＹが非置換炭素環式基を形成している場合には、Ｒ2からＲ5までの少なくとも２つは、水素以外であるか、またはＹおよびＲ1がヘテロ環式基を形成している場合には、Ｒ2からＲ5までの少なくとも１つは水素以外であることを特徴とする）
の化合物であることが最も好ましいであろう。
【００４６】
好ましくは、ＹおよびＲ1が環化せず、Ｒ1およびＲ2が水素以外である場合、Ｒ3もまた水素以外である。典型的に、Ｒ1からＲ5までの少なくとも２つの置換基は、互いにオルト位の関係にある。化合物が３つの置換基を有する場合、該置換基が互いに隣接していることが好ましい。好ましくは、この場合、Ｒ1からＲ3までが水素以外であるか、またはＲ2からＲ5までが水素以外であるかのいずれかである。
【００４７】
典型的に、Ｒ1からＲ5までまたはＲ2からＲ5までの少なくとも１つが、ハロ、Ｃ1〜Ｃ2アルコキシまたはＣ1〜Ｃ2アシルである場合、Ｒ1およびＹが環化して、ヘテロ環式環を形成する場合には、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシおよびチオカルボキシから選択される少なくとも１つの他の置換基があるか、またはＲ1およびＹが環化しないか、あるいは非置換炭素環式環を形成する場合には、これらの置換基から選択される少なくとも２つの他の置換基がある。
【００４８】
ハロ置換基は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードから典型的に選択される。ハロ置換基は、フルオロおよびクロロから選択されるのが好ましい。
【００４９】
好ましくは、式ＩまたはIIIの部分のリンカー基は、単独の原子か、または１個以上の原子が、Ｎ、ＯまたはＳなどの炭素以外の原子であり得る、長さが３個までの原子鎖を含んでなる。リンカー基は、Ｃ1〜Ｃ3リンカー基であることが好ましいであろう。リンカー基は、置換または非置換であってもよく、１つ以上の二重結合を含むことができる。置換基は、例えば、ヒドロキシ、アミノ、ハロ、ニトロ、または化合物の活性に本質的に悪影響を及ぼさない基から選択できる。リンカー基は、非置換であることが最も好ましいであろう。
【００５０】
本発明の化合物または本発明により哺乳動物に投与される化合物のスペーサー部分Ｓｐは、該化合物がヘアピンコンホメーションを採用し得ることが好ましいであろう。スペーサー部分は、Ｎ、ＯまたはＳなどの炭素以外の１個以上の原子、および１つ以上の二重結合を含み得る置換または非置換の１個から７個の原子鎖であることが最も好ましいであろう。しかしながら、該化合物によってダイナミン依存のエンドサイトーシスの阻害を可能にする任意の好適なスペーサーを利用し得る。スペーサーは、例えば、ヒドロキシ、アミノ、ハロ、ニトロ、または鎖の可撓性またはコンホメーションに本質的に影響を及ぼさない他の基から独立して選択される１つ以上の基で置換できる。スペーサー部分は、置換または非置換アルカン鎖であることが最も好ましいであろう。典型的にスペーサーは、構造：
−ＣＨ2(ＣＨ2)nＣＨ2−
（式中ｎは、１から５、より通常には２または３の整数である）
を有する非置換アルカン鎖である。
【００５１】
製薬的に許容できる好適な塩類としては、妥当な有益性／危険性比の範囲内にあり、生理的に有効であり、過度の毒性、刺激またはアレルギー反応がなく動物組織と接触する上で適切である、酸およびアミノ酸の付加塩類、エステル類およびアミド類が挙げられる。代表的な塩類としては、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リン酸塩、蓚酸塩およびホウ酸塩が挙げられる。このような塩類は、例えば、対応する酸と、式Ｉの化合物、または二量体チルホスチンまたはその類縁体とを混合することにより調製できる。これらの塩類としては、ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびカリウムなどのアルカリ金属およびアルカリ土類金属ならびにアンモニウムカチオンおよびアミンカチオンを挙げることができる。好適な製薬用塩類は、例えば、Ｓ.Ｍ  バージ(S.M
Berge)ら、J.Pharmaceutical Sciences（１９９７年）、６６：１−１９頁に例示されており、その内容は、相互参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。代表的なエステル類としては、Ｃ1〜Ｃ７アルキル、フェニルおよびフェニル（Ｃ1〜６）アルキルエステル類が挙げられる。好ましいエステル類としては、メチルエステル類が挙げられる。
【００５２】
式ＩおよびIIIの化合物、または二量体チルホスチンまたはそれらの類縁体のプロドラッグとしては、カーボネート類、カルバメート類、アミド類およびアルキルエステル類から選択される基が、該化合物、二量体チルホスチンおよびそれらの類縁体の遊離アミノ基、アミド基、ヒドロキシ基またはカルボン酸基に共有結合しているものが挙げられる。好適なプロドラッグとしてはまた、リン−酸素結合を介して、遊離ヒドロキシル基、は式ＩおよびIIIの化合物、または二量体チルホスチンまたはそれらの類縁体の他の適切な基に結合した酸類、酸の塩類、またはエステル類などのホスフェート誘導体が挙げられる。プロドラッグは、例えば、投与時に不活性であるが、投与後に結合の開裂または加水分解または他の形体の結合修飾の結果、蛋白質のＧＴＰアーゼ活性が阻害されるように、ダイナミンに結合する活性化合物へとインビボ修飾を受けることができる。活性化合物のプロドラッグ形体は、活性化合物よりも細胞膜透過性が大きく、それによって活性化合物の効力が増強されることが好ましい。プロドラッグはまた、該化合物の細胞に対する最適利用度および全身的利用のためにプロドラッグの細胞膜透過特性が維持されるように、細胞外におけるプロドラッグの早期のインビボ加水分解を最少にするようにデザインできる。
【００５３】
エンドサイトーシスは、多様なヒト疾患の主要な一因または直接原因である。小胞輸送特異的疾患のリストは公表されており、例えば、アリドールおよびハンナン(Aridor
and Hannan)２０００年、Traffic 1：８３６−８５１頁およびアリドールおよびハンナン(Aridor and Hannan)２００２年、３：７８１−７９０頁を参照されたく、それらの内容は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。したがって、本発明の方法は、例えば、癌、眼科疾患、免疫不全疾患、胃腸疾患、ウィルス性および細菌性感染症、他の病原性感染症、神経変性疾患、神経学的疾患、腎臓病および病態、ならびにダイナミン依存エンドサイトーシスに関与する他の障害、または他にダイナミン依存エンドサイトーシスの阻害に感受性のある他の障害の予防と治療に有用であり得る。
【００５４】
例えば、ヒトポリオーマウィルスＪＣＶは、進行的多巣性白質脳症、致命的中枢神経系（ＣＮＳ）脱髄疾患の病因物質であり、ニューロンへのその侵入が、クロルプロマジンなどのエンドサイトーシス阻害剤によりブロックされることは公知である（アトウッド  Ｗ.(Atwood
W.)、２００１年）。同様に、ＨIV（ワイス  Ｓ.(Wyss S.)ら、２００１年）、インフルエンザウィルス（ロイ  Ａ.(Roy A.)ら、２０００年）およびアデノ関連ウィルス（デュアン  Ｄ.(Duan
D.)ら、１９９９年）による感染は、エンドサイトーシスによるか、またはその阻害剤に感受性がある。
【００５５】
さらに、成長因子受容体（例えば、ＥＧＦ−Ｒ）は、シグナリングから細胞増殖まで、細胞活性の内在化および維持のためにダイナミンを必要とする（セト  Ｅ.(Seto
E.)ら、２００２年）。ダイナミン構成要素によるエンドサイトーシスのブロッキングは、これらの多くの例において細胞増殖を防止し（グリーブ  Ｔ.(Grieb
T.)ら、２０００年）、ダイナミンII（非ニューロン形態）阻害剤が抗癌活性を有し得る証拠を提供している。デント病（多発性嚢胞腎症）もまた、塩化ＣｌＣ−５チャネルのエンドサイトーシスに関係しており、エンドサイトーシスブロッカーは、その内在化を防止する（シュウェーク  Ｍ.(Schwake
M.)ら、２００１年）。
【００５６】
ダイナミンは、細胞表面、ゴルジ体、エンドソームおよびミトコンドリアからのエンドサイトーシス輸送全ての中心である。幾つかの神経変性疾患は、これらの輸送経路に関連している。２つ、すなわちエンドサイトーシス経路および分泌経路がβ−アミロイドの産生に関係がある（アリドールおよびハンナン(Aridor
and Hannan)２０００年）。脳において、エンドサイトーシスが役割を演じている疾患および病態としては、アルツハイマー病、ハンチントン病（ＨＤ）、強直性ヒト症候群(stiff-person
syndrome)、レビー小体ジメンチアス(Lewy body dimentias)、およびニーマン−ピックＣ型病が挙げられる（カテルド(Cateldo)ら、２００１年；メツラー(Metzler)ら、２００１年；オング(Ong)ら、２００１年；スミス(Smith)ら、２０００年）。
【００５７】
アルツハイマー病において、β−アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）は、クラスリン被覆小胞の軸索細胞表面から内在化され、リサイクルしているシナプス小胞から区分されて、エンドソームおよび細胞体に輸送される（マルキーズ−スターリング  Ｎ.(Marquez-Sterling
N.)ら、１９９７年）。エンドソームは、ＡＰＰまたはＡｐｏＥの内在化後のダイナミン依存エンドサイトーシス経路における第１のコンパートメントであり（スマイシーズ  Ｊ.(Smythies
J.)、２０００年）、エンドソームの変質は、アルツハイマー脳における垂体神経において明白である（カタルド  Ａ.(Cataldo A.)ら、１９９７年）。エンドサイトーシス経路活性化は、ＡＰＰ処理およびβ−アミロイド形成において顕著であり、散発性アルツハイマー病の脳の脆弱性領域におけるニューロンの初期の特徴である（カタルド  Ａ.(Cataldo
A.)ら、２００１年）。
【００５８】
ハンチントン病（ＨＤ）は、主として線条体ニューロンに影響を及ぼす神経変性障害であり、さらに変異遺伝子産物のハンチンチンは脳特異的ではない。ハンチンチンは、ハンチンチン相互作用蛋白質１（ＨＩＰ１）ファミリーのメンバーと強力に相互作用する。ハンチンチン−ＨＩＰ１相互作用は脳に限定されており、ハンチンチンのポリグルタミンの長さに逆相関している。通常のハンチンチン−ＨＩＰ１相互作用の喪失は、脳における膜−細胞骨格完全性の欠損に寄与し得る。ＨＩＰ１は、ダイナミン媒介エンドサイトーシス機構の基本的構成要素である（メッツラー  Ｍ.(Metzler
M.)ら、２００１年）。それ故、多数の報告は、ＨＤにおける神経学的欠損をエンドサイトーシスの異常性と関連づけている（アリドールおよびハンナン(Aridor
& Hannan)、２０００年；メッツラー  Ｍ.(Metzler M.)ら、２００１年）。
【００５９】
他の例は、パーキンソン病、レビー小体認知症およびＡＤのレビー小体変異体など、レビー小体疾患に寄与する主要な候補物であるシナプス前シヌクレイン蛋白質である。外因性シヌクレインは、そのエンドサイトーシスおよび細胞質内包含物形成のため、ニューロン細胞死を引き起こす。細胞死およびα−シヌクレイン凝集体は、ヒトの神経芽腫細胞におけるそのエンドサイトーシスの直接的結果である（スング  Ｊ.(Sung
T.)ら、２００１年）。エンドサイトーシスはまた、てんかんに関係があるとされている。例えば、２つのエンドサイトーシス蛋白質シナプトジャニン(synaptojanin)（ＳＪ）またはアンフィフィシン(amphiphysin)のいずれかを目的として破壊されたマウスは、ＳＶＥを減じ、彼らの生存中にランダムなてんかん発作により死亡し（ジパオロ(Di
Paolo)ら、２００２年）、ニューロン興奮性における役割およびてんかんへの関連を示している。
【００６０】
エンドサイトーシス経路はまた、細胞への侵入口を得るためにウィルス、毒素および共生微生物により利用される。例えば、ボツリヌス神経毒および破傷風神経毒は、異なるシナプスにおいて伝達物質放出を阻害する細菌性蛋白質であり、２つの重篤な神経麻痺性疾患、破傷風およびボツリヌス中毒を引き起こす。それらの作用は、エンドサイトーシスを経て神経末端への内在化に依る（フミュー(Humeau)ら、２０００年）。それ故、阻害剤によるエンドサイトーシスを標的とすることは、臨床的に有用な方法として適用される。
【００６１】
したがって、本発明の方法が予防または治療に有用と考えられる具体的な疾患および病態の例としては、限定はしないが、多巣性白質脳症、多発性嚢胞腎疾患、β−アミロイド関連疾患、アルツハイマー病、ハンチントン病、強直性ヒト症候群、レビー小体疾患、レビー小体ジメンチアス、パーキンソン病、てんかん、破傷風、ボツリヌス中毒、ＨIV感染、インフルエンザおよびムコ脂質症が挙げられる。
【００６２】
本発明により哺乳動物に投与される式Ｉの化合物は、二量体ベンジリデンマロニトリルチルホスチンまたはそのプロドラッグであることが好ましい。二量体チルホスチンは、ビス−チルホスチンまたはその類縁体であることが最も好ましい。ダイナミンに結合する能力を提供し、ダイナミン活性を阻害するビス−チルホスチンまたは二量体チルホスチンの機能および／または基の知識を用いて、構造が異なるにもかかわらずこの能力を保持する類縁体、特に模倣物をデザインできる。本明細書に記載された方法における二量体チルホスチン類縁体、特にビス−チルホスチン類縁体の使用は、本発明に包含されることは明白である。
【００６３】
用語の「類縁体」は、二量体チルホスチンとは異なるが、二量体チルホスチンの生物学的機能または活性特性を提供する１つ以上の特徴の類似性を保持する分子を包含する。類縁体は、二量体チルホスチンと実質的に全体的類似性を有してもよいし、または生物学的機能または生物学的活性の提供源となるか、あるいはそうでなければ、生物学的機能または生物学的活性の提供に関与する二量体チルホスチンの１つ以上の領域を有する構造的類似性のみを有してもよい。ビス−チルホスチンの類縁体は、例えば、化合物の１つまたは双方の芳香族基の１つまたは双方のヒドロキシ置換基を、別の好適な基または上記の多くの異なる好適な基で置換することにより提供され得る。あるいは、なおその上、化合物の１つ以上の他の基を除去、修飾または置換してもよい。
【００６４】
類縁体のデザインは、典型的にサイズ、荷電分布ならびに三次構造などの元の化合物の物性の判定および／または化合物のどの特徴が、ダイナミンに結合する能力を保持するために必要かを確認することを含む。特に、元の化合物は、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴および商品として入手できるコンピュータモデリングソフトウェアを利用して化合物の立体化学および物性を考慮に入れて作成され得る。このアプローチの好ましい変法において、化合物とダイナミン自体との相互作用から生じるコンホメーションの変化が、類縁体のデザインに考慮され得るように、モデリングに前記相互作用を考慮に入れる。このようなモデリング技法は、当業界に周知であり、熟練者の範囲内に十分に入る。好適なモデリングアプローチとしては、Accelrys
Catalyst（登録商標）Pharmacore DevelopmentおよびAccelrys Cerius 4.8 LigandFit（登録商標）プロトコル（Accelrys社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）の使用が挙げられる。さらなる好適なモデリングアプローチとしては、Mac
Spartan Pro Version 1.1プロトコル（Wave Function社、アーバイン、カリフォルニア州、米国）の使用が挙げられる。
【００６５】
類縁体の提供はまた、必要な物理的および化学的特性を提供するために、または必要な物理的および化学的特性を得るためのさらなる化学反応を促進するために、化学基を付加するテンプレート分子の選択、または誘導を含むことができる。テンプレート分子および化学基の選択は、合成の容易性、インビボ分解可能性の危険性、安定性および投与時の生物学的活性の維持に基づく。生理的許容性などもまた、当技術者により解されるようなデザインを考慮に入れる。
【００６６】
化合物は、本発明に従って１つ以上の他の化合物または薬物と共に投与され得る。例えば、化合物は、化学療法薬または哺乳動物が治療を受けている特定の疾患または病態の予防または治療処置に従来から用いられる薬物と併用するか、または関連させて対象哺乳動物に共投与され得る。「共投与される」とは、同じかまたは異なる経路による同一製剤または２つの異なる製剤の同時投与、または同じかまたは異なる経路による連続投与を意味する。「連続」投与とは、非常に短い時間から数時間または数日の範囲で、該化合物と他の薬物または複数薬物との投与間の時間遅延を含んで次々に投与することを意味する。
【００６７】
好適な製薬組成物としては、注射に好適な液剤が挙げられる。このような注射用組成物は、注射可能性が存在する程度の流体であり、典型的に、製造後に少なくとも数ヵ月間の貯蔵を可能にする安定がある。担体は、界面活性剤、生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、およびそれらの混液の１種以上を含有する溶媒または分散媒体であり得る。
【００６８】
経口投与用に、該化合物は、経口的に許容できる不活性希釈剤、同化できる食用担体と共に製剤化できるか、または例えば、硬シェルまたは軟シェルゼラチンカプセルに封入できる。あるいは、それを食物に直接添加できる。さらに、該化合物は、リン酸二カルシウムなどの１種以上の賦形剤、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、またはアルギン酸などの崩壊剤と共に組み込むことができ、経口摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤およびシロップ剤の形態で使用できる。
【００６９】
錠剤、丸剤などもまた、トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシ澱粉またはゼラチンなどの結合剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ショ糖、乳糖、サッカリンなどの甘味剤、および風味剤の１種以上を含有することができる。この剤形が、カプセル剤である場合、１種以上の上記成分に加えて液体担体を含有することができる。種々の他の成分が、コーティング剤として存在し得る。さらに、該化合物は、任意の好適な徐放性調製剤または製剤に組み込むことができる。
【００７０】
該化合物は、典型的に、意図された対象への投与のために、製薬的に許容できる担体または賦形剤と共に製薬組成物中に製剤化される。好適と思われる従来から公知のこのような担体、希釈剤および賦形剤を使用できる。好適な製薬的に許容できる担体および賦形剤としては、任意の公知の適切な溶媒、分散媒体および等張製剤または液剤が挙げられる。製薬的活性物質のためのこのような成分および媒体の使用は周知である。典型的に、本発明の組成物にはまた、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチメルサールなどの１種以上の保存剤が組み込まれる。好適な製薬的に許容できる担体および本発明の組成物に有用な製剤は、例えば、その内容が参照としてその全体が本明細書に組み込まれている、「レミングトン(Remington):The
Science and Practice of Pharmacy（Mack Publishing社、１９９５年）」など、熟練者に周知のハンドブックおよびテキストに記載されている。
【００７１】
投与の容易性および投与量の均一性のために単位剤形で非経口組成物を製剤化することが特に好ましい。本明細書に用いられる単位剤形は、治療を受ける対象に対する単位用量として適している物理的に考慮された単位を意味するものであり、各単位は、選択された担体および／または賦形剤と組み合わせて所望の予防効果または治療効果を生じるように算出された活性剤の予め決められた量を含有する。
【００７２】
投与される化合物の用量は、該化合物が予防的使用のために投与されるか、それとも治療的使用のために投与されるのか、薬剤の投与が意図される病態、病態の重症度、対象の年齢、ならびに体重および対象の全身の健康状態などの関連因子など、認められた規準に従って医師または医療担当者により判断し得る多くの因子に依存する。例えば、最初に低用量を投与し、引き続き対象の応答評価後に増量できる。同様に、投与回数は、同様の方法、すなわち各用量間での対象の応答を継続的にモニタリングすることにより判断でき、必要ならば投与回数の増加、あるいは投与回数を減少させて行うことができる。
【００７３】
製薬組成物の投与経路もまた、組成物が投与されるべき疾患または病態の性質に依存する。投与の好適な経路としては、限定はしないが、気道、気管内、鼻咽頭、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、筋肉内、点滴、経口、直腸、局所および徐放性インプラントを挙げることができる。静脈内経路の場合、特に好適な経路は、治療を受ける腫瘍または特定の臓器に供給する血管内への注入を介するものである。化合物はまた、例えば、胸腔または腹腔などの腔内に送達できるか、または腫瘍または疾患組織に直接注入できる。
【００７４】
本発明の性質が、より明確に理解できるように、ここでその好ましい形態を、以下の非限定例を参照として記載する。
【実施例】
【００７５】
実施例１  ダイナミンＧＴＰアーゼ活性のチルホスチン阻害剤の確認
１.１  材料とアッセイ
ホスファチジルセリン、１,２−ジオレイン、カルモジュリン、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ロイペプチン、フェニルメチルスルホニルフルオリド、ツウィーン８０、ビス（スルホスクシニミジル）スベレート（ＢＳ３）およびグルタチオンアガロースは、Sigmaから入手した。パパインおよび二塩酸アンチパインは、Boehringer
Mannheim（ドイツ連邦共和国）から入手した。ゲル電気泳動の試薬および装置は、Ｂｉｏ−Ｒａｄから供給された。［δ−32Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／mmol）および［δ−32Ｐ］ＧＴＰ（２５μＣｉ／mmol）は、Amersham
plc、英国から得た。蛋白質分子量マーカーはおよびクロマトグラフィ樹脂は、Pharmaciaから供給された。全て他の試薬は、分析試薬グレードまたはより良質のものであった。
【００７６】
１.１.１  蛋白質製品
ＧＳＴ−Ａｍｐｈ２−ＳＨ３（筋肉Ａｍｐｈ２）に関するプラスミド（バットラー(Butler)ら、１９９７年）は、ｐＧＥＸ２ＴベクターにおいてPieto
DeCamilli、エール、コネチカット州、米国により供給された。プラスミドは、大腸菌(E.coli)中で増殖させ、ＧＳＴ−Ａｍｐｈ２−ＳＨ３融合蛋白質は、２０mＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５中、１０mＭ減少ＧＳＨでの溶出によるグルタチオン（ＧＳＨ）−セファロース上で精製し、ＧＳＨなしの同じ緩衝液に対して透析し、４℃で保存した。ダイナミンは、ヒツジ脳の全脳の周辺膜フラクションからの抽出により精製し（ロビンソン(Robinson)ら、１９９３年）、先に記載したＧＳＴ−Ａｍｐｈ２−ＳＨ３−セファロース上でアフィニティー精製し（マークスおよびマクマホン(Marks
and McMahon)、１９９８年）、２５０ｇのヒツジ脳から８mgの蛋白質を得た。組換えダイナミンIIは、昆虫細胞内で発現するが、サンドラ・シュミット(Sandra
Schmid)博士（Scripps、サンディエゴ、カリフォルニア州）から恵与された。ＰＨドメインを欠失する組換えダイナミンII（ダイナミンＰＨ、ロビン・スカイフェ(Robin
Scaife)により提供）は、バキュロウィルス感染を用いて昆虫細胞内で発現させた（サリム(Salim)ら、１９９６年）。
【００７７】
１.１.２  ＧＴＰアーゼアッセイ
ダイナミンＧＴＰアーゼ活性は、先に記載された方法を修正した方法（ロビンソン(Robinson)ら、１９９３年）によって［δ−32Ｐ］ＧＴＰの加水分解により測定された。要約すると、精製ダイナミンＩまたはダイナミンII（０.２μｇ／チューブ）を、ＧＴＰアーゼ緩衝液（１０mＭトリス、１０mＭ  ＮａＣｌ、２mＭ  Ｍｇ2+、０.０５％ツウィーン８０、ｐＨ７.４、１μｇ／mlロイペプチンおよび０.１mＭ  ＰＭＳＦ）および０.３mＭ  ＧＴＰと１.３μＣｉ［δ−32Ｐ］−ＧＴＰを含有するＧＴＰカクテル中、種々の濃度の阻害剤またはＤＭＳＯ媒体の存在下または不在下で、３０℃で１０分間温置した。最終アッセイ容量は、４０μｌであった。ダイナミン活性は、ベースとしてまたは５μｇ／ml  Ｌ−ホスファチジルセリンの添加により刺激されたリン脂質として測定された。この反応は、１００μｌのＧＴＰアーゼ停止用緩衝液（２％ギ酸、８％酢酸、ｐＨ１.９）、次いで６００μｌの酸洗浄用木炭溶液（酸性溶液７％（ｗ／ｖ）木炭溶液）および１００μｌのＢＳＡ（５mg／ml）で終了させた。５分間の遠心分離（室温で１３,０００rpm）後、２００μｌの各上澄液を、［δ−32Ｐ］−ＧＴＰから32Ｐｉの放出に関する−カウンターでカウントした。
【００７８】
１.１.３  ［α−32Ｐ］−ＧＴＰ結合アッセイ
［α−32Ｐ］−ＧＴＰ結合アッセイを、９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェル内で実施した。ダイナミン（０.２μｇ／ウェル）をＧＴＰアーゼ緩衝液に加え、４℃の暗所で１０分間温置した。次に［α−32Ｐ］−ＧＴＰ（２μＣｉ／チューブ）を前記反応物に加え、さらに４℃の暗所で１０分間温置した。次いでマイクロタイタープレートを、３１５nmの短波長紫外線ランプにより８cmの距離で３０分間照射した。光標識の特異性は、１mＭの冷ＧＴＰの存在下および不在下で標識を比較することにより判定された。次いでサンプルを、２４ウェルのスロットブロッターのウェルを介す吸引によりニトロセルロース膜に添加した。該ニトロセルロース膜をＰＢＳで３回洗浄して乾燥した。結合ヌクレオチドを、ホスホリメージャー(phosphorimager)(Molecular
Dynamics)により検出した。
【００７９】
１.１.４  リン脂質結合およびヘリックス組立て
ヒツジ全脳から精製されたダイナミンＩ（５０μｇ／ml）を、１００μｌの組立て用緩衝液（１mＭ  ＥＧＴＡ、３０mＭトリス、１００mＭ  ＮａＣｌ、１mＭ  ＤＴＴ、１mＭ  ＰＭＳＦ、および完全プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Roche)）中、１mＭ  Ｍｇ／ＧＴＰの存在下または不在下で、ホスファチジルセリンリポソーム類（８０μｇ／ml、３０mＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７.４中で超音波処理）と共に２５℃で１時間温置した。サンプルを、１４,０００rpmで１５分間遠心分離し、脂質結合（Ｐ）および遊離（Ｓ）ダイナミンを分離し、これらのフラクションを１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上でゲル電気泳動により分析された。存在する場合、当該薬物（１０μＭおよび１００μＭ）を予めリン脂質と混合してからダイナミンＩと共に温置した。
【００８０】
１.１.５  テキサスレッド−トランスフェリンの細胞内への取り込み
トランスフェリン（Ｔｆ）の取り込みを、先に記載した方法（ファンデル・ブリーク(van der Bliek)ら、１９９３年）に基づいてＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞およびＨＥＲ１４細胞内で分析した。手短に言うと、細胞を、ＤＭＥＭ培地プラス１０％子ウシ胎仔血清中、６０％集密性まで平板培養し、その後、細胞をＤＭＥＭマイナス子ウシ胎仔血清中、一晩（８〜１０時間）温置した。テキサスレッド−トランスフェリン（Ｔｆ−ＴｘＲ、Molecular
Probes、オレゴン州）を、５μｇ／mlの最終濃度まで加え、細胞を３７℃で１０分間温置した。細胞を氷冷酸洗浄溶液（０.２Ｍ酢酸＋０.５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ２.８）中、１５分間温置することにより、細胞表面染色を除去した。細胞を直ちに、４％パラホルムアルデヒドにより１０分間固定してから、ＰＢＳにより３回洗浄した。核は、ＤＡＰＩ（Molecular
Probes、オレゴン州）を用いて染色した。スライドは、ＤＡＢＣＯを用いて取り付け、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＬＢ明視野顕微鏡およびＳＰＯＴデジタルカメラを用いて蛍光をモニターした。阻害剤との実験において、Ｔｆ−ＴｘＲの添加１５分前または６０分前にＤＭＥＭにビス−チルホスチンを補足した。
【００８１】
１.１.６  エンドサイトーシス
単離された神経末端（シナプトソーム）は、ラット大脳皮質から不連続パーコール勾配の遠心分離により調製された（ダンクレイ(Dunkley)ら、１９８６年）。フラクション３および４を集めて、全ての実験に用いた。エンドサイトーシスは、先に記載された（カズンおよびロビンソン(Cousin
and Robinson)２０００年ａ）蛍光染色剤ＦＭ２−１０の取り込みを用いて測定された。シナプトソーム（２ml中０.６mg）を、プラスまたはマイナスＣａ2+クレブス様溶液中、３７℃で５分間温置した。３０mＭ  ＫＣｌ（Ｓ１）による刺激１分前にＦＭ２−１０（１００Ｍ）を加えた。刺激のＳ１相におけるエンドサイトーシスを介して小胞によりＦＭ２−１０が吸収されるため、シナプトソームを、この相中のアンタゴニストと温置した。具体的に言うと、シナプトソームを、刺激５分前にチルホスチンＡ４７またはビス−チルホスチンと温置した。刺激２分後、シナプトソームを１mg／mlのウシ血清アルブミンを含有するプラスＣａ2+溶液中で２回洗浄した。洗浄ステップにより、非内部移行のＦＭ２−１０およびチルホスチン類が除去される。洗浄されたシナプトソームを、プラスＣａ2+溶液中、３７℃で再懸濁し、蛍光計キュベットに移し、３０mＭ  ＫＣｌ（Ｓ２）の標準的添加により刺激した。標準的Ｓ２刺激により、蓄積された全てのＦＭ２−１０が放出され、溶液中への染色剤放出によるＦＭ２−１０蛍光の減少としてエンドサイトーシスを測定できる（励起４８８nm、発光５４０nm）。
【００８２】
エンドサイトーシスは、Ｓ２における３０mＭ  ＫＣｌにより刺激された絶対蛍光の減少として算出された。ディスプレイされたトレースは、Ｃａ2+の不在下でＦＭ２−１０で装填されたシナプトソームから獲得されたバックグランドトレースを差し引いた後のシナプトソームからのＦＭ２−１０平均放出を表す。回復効率は、事前のエキソサイトーシス量を考慮に入れることから、エンドサイトーシスのより正確な測定値である。回復効率はエンドサイトーシス／エキソサイトーシスとして算出され、エンドサイトーシスは上記のとおり定義され、エキソサイトーシスは、刺激２分後のＣａ2+−依存グルタメート放出として定義される。回復効率値は、３０mＭ  ＫＣｌに対して１.０の比に対して正規化された。
【００８３】
１.１.７  グルタメート放出アッセイ
グルタメート放出アッセイは、放出されたグルタメートの酵素結合蛍光検出を用いて実施された（カズンおよびロビンソン(Cousin and Robinson)２０００年ａ、ｂ）。手短に言うと、シナプトソーム（２ml中０.６mg）を、プラス（１.２mＭ  ＣａＣｌ2）またはマイナス（１mＭ  ＥＧＴＡ）Ｃａ2+クレブス様溶液（１１８.５mＭ  ＮａＣｌ、４.７mＭ  ＫＣｌ、１.１８mＭ  ＭｇＣｌ2、０.１mＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、２０mＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０mＭグルコース、ｐＨ７.４）に３７℃で再懸濁した。１mＭ  ＮＡＤＰ+の添加後実験を開始した。１分後、５０Ｕのグルタメートデヒドロゲナーゼを加え、シナプトソーム懸濁液を、４分後３０mＭ  ＫＣｌにより刺激した。ＮＡＤＰＨの産生による蛍光増加は、３４０nmの励起および４６０nmの発光においてPerkin-Elmer
LS-50B蛍光光度計でモニターされた。実験は、４nmｏｌのグルタメートの添加により正規化された。データは、同一の刺激条件に対してプラスＣａ2+とマイナスＣａ2+溶液間の放出差として算出されたＣａ2+−依存グルタメート放出として提供される。阻害剤を用いる実験では、シナプトソームは、ＫＣｌによる刺激前にチルホスチンＡ４７またはビス−チルホスチンのいずれかと共に５分間、前温置した。
【００８４】
１.１.８  電子顕微鏡
シナプトソームを、１.２mＭ  Ｃａ2+を含有するクレブス様溶液中、５分間温置してから、３０mＭ  ＫＣｌにより２分間刺激した。示されているＫＣｌ添加５分前にシナプトソームを、１００μＭのビス−チルホスチンと共に前温置した。刺激後、シナプトソームを、室温で１分間微量遠心管中でペレット化してから、５％グルタルアルデヒドで補足された氷冷リン酸緩衝生理食塩水中で静かに再懸濁して固定化した。１時間後、それらを低スピード（２５００rpm）において室温で５分間遠心分離してシナプトソームをゆるいペレットにした。ペレットを低スピン（２５００rpm）で７分間ＭＯＰｓ緩衝液により静かに３回洗浄してから、１０％水中ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で静かに再懸濁して、室温で２０分間放置した。次にシナプトソームを、低スピード（２５００rpm）において室温で７分間再度遠心分離し、カルノフスキー(Karnovsky)の固定剤を上塗りし、４℃で一晩温置した。引き続きペレットをすすぎ、四酸化オスミウムの緩衝液中で３時間固定した。次いでシナプトソームをすすいで、２％酢酸ウラニル水中１時間着色してから、一連の連続的な１０分間の洗浄：５０％エタノールプラス０.１％ＮａＣｌ、７０％エタノールプラス０.１％ＮａＣｌ、９５％エタノールプラス０.１％ＮａＣｌ、１００％エタノールプラス０.１％ＮａＣｌで２回および１００％アセトンで２回、により乾燥した。次に、アセトン／樹脂混合物（１：１）で１時間浸潤し、スパー(Spur)のエポキシ樹脂中、７０℃で１０分間３回洗浄してから、スパー(Spur)のエポキシ樹脂で満たされた平押し金型内で、それらを７０℃で１０時間埋め込んだ。
【００８５】
ウルトラミクロトームUltracut-E（Reichert、ドイツ国）を用いて、樹脂ブロックから０.５ｍエポキシ切片を得た。この切片を、ダイヤモンドナイフ（Diatome、スイス国）で切断し、水滴上に浮かべ、電子顕微鏡グリッド上に置き、最初にエタノール中２％酢酸ウラニルを１５分間、次いでレイノルド(Reynold)のクエン酸鉛を４分間用いて二重染色した。グリッドを水で洗浄し、吸収性ろ紙を用いて接触乾燥し、電子顕微鏡による分析まで保存した。分析は、Phillips
1L-BioTwin（Einhoven、オランダ国）電子顕微鏡で実施し、撮られた写真を、電子顕微鏡プレートフィルム（Kodak、４４８９、８.３cm×１０.２cm）上でプリントした。
【００８６】
１.２  結果
１.２.１  ビス−チルホスチンは、ダイナミンＩおよびダイナミンII双方のＧＴＰアーゼ活性を阻害する
ダイナミンのＧＴＰアーゼ活性は、エンドサイトーシス時に形質膜から成長する小胞の能力において本質的な役割を演じる。最初に神経特異的なダイナミンＩの阻害剤を見出すために、極めて強力なＡＴＰアーゼ活性部位関連阻害剤である多数の蛋白キナーゼ阻害剤および幾つかの脂質キナーゼ阻害剤を試験した。これらの化合物は、ＡＴＰアーゼ活性部位がＧＴＰ活性部位と同様であり、したがって幾つかのＡＴＰアーゼ阻害剤もまたダイナミンを標的にすることができるという仮説に基づいて選択された。得られた結果は、低い効力のダイナミンＩ  ＧＴＰアーゼ活性阻害を有してある程度の成功を示した。
【００８７】
次いで一連のチルホスチン類を評価し、２つが阻害を示すことが判明した。すなわち、チルホスチンＡ４７（ＩＣ50＝１００μＭ）および２μＭのＩＣ50を示したこのサンプリングの最も強力な阻害剤のビス−チルホスチンである（図１ｃおよび１ｄを参照）。
【００８８】
観察された阻害がダイナミンＩに特異的であるかどうか、または偏在性ダイナミンIIにも影響を及ぼすかどうかを評価する目的で引き続きチルホスチンＡ４７およびビス−チルホスチンを試験した。両薬物とも、ダイナミンIIに対し、より強力であることが証明された（図１ｅおよび１ｆを参照）。より具体的には、チルホスチンＡ４７は、ダイナミンIIに対し９ＭのＩＣ50を示したが、ビス−チルホスチンは、丁度０.５μＭのＩＣ50を示した。これにより、各ダイナミン遺伝子産物に特異的な薬物をデザインでき、それによってエンドサイトーシスの種々の形態の薬剤による制御が可能になることが示されている。
【００８９】
１.２.２  ビス−チルホスチンおよびチルホスチンＡ４７は、ダイナミンＩまたはダイナミンIIに対するＧＴＰ結合を阻止しない
ダイナミンによるＧＴＰ加水分解を防ぐ上でビス−チルホスチンおよびチルホスチンＡ４７の作用機序を評価するために、該薬物が、ダイナミンの活性部位でＧＴＰと競合するかどうかを見るために試験した。［α−32Ｐ］−ＧＴＰ結合アッセイを完了して、ビス−チルホスチン、チルホスチンＡ４７またはＢＩＭ  Ｉの存在下または不在下でダイナミンに対する放射標識ＧＴＰ結合を可視化した（図２ａ〜ｄ）。対照（薬物なし）は、［α−32Ｐ］−ＧＴＰがダイナミンに結合しなかったことを示した。ビス−チルホスチンおよびチルホスチンＡ４７の存在下、ＧＴＰ結合の減少は見られなかったが、高濃度では実際に増強するのが見られた。これは特に高濃度でダイナミンIIに対するＧＴＰ結合が非常に増加するチルホスチンＡ４７の場合にはそうである。ＧＴＰアーゼ阻害剤ＢＩＭ  Ｉもまた、［α−32Ｐ］−ＧＴＰ結合の減少によって見られるように、ダイナミンに対する結合に関してＧＴＰとの競合が見られた。
【００９０】
４種の小型Ｇ蛋白質（Ｒａｂ３Ａ、Ｒａｓ、Ａｒｆ２、ＲａｌＡ）の活性部位に関して、これらの薬物とＧＴＰとの競合もまた試験した。いずれの薬物も、これらの蛋白質に対する［α−32Ｐ］−ＧＴＰ結合に影響を及ぼさないことが判明した（データは示していない）。このことは、ビス−チルホスチンおよびチルホスチンＡ４７は、神経末端または神経細胞に存在し得る他のＧ蛋白質ではなくてダイナミンに対してそれらの作用が特異的である可能性が高いことを示している。
【００９１】
１.２.３ ビス−チルホスチンは、ダイナミンＩのＰＨドメインにおいて作用しない
ビス−チルホスチンが、そのＰＨドメインを介してダイナミンＩを阻害するかどうかを判定するために、ＰＨドメインを欠いているダイナミンＩの組換え型変種（ダイナミンＩのΔＰＨドメイン）に対するビス−チルホスチンの効果を、野生型ダイナミンに対するその効果と比較した（図３ａ）。ダイナミンＩのＰＨドメインは、ＧＴＰアーゼ活性の負の調節剤として働き、ダイナミンＩのΔＰＨドメインは、構成的に活性であり、リン脂質により影響を受けない。この結果により、ビス−チルホスチンが、ダイナミンＩのΔＰＨドメインのＧＴＰ加水分解を１０μＭで５０％超、依然として阻害できたことが示されている。このことは、ＰＨドメインが、ダイナミンＩに対するビス−チルホスチンの作用部位でないことを示しており、ビス−チルホスチンは、ダイナミンＩ分子上のアロステリック部位において阻害しているに違いないということを意味している。しかしながら、ＢＩＭ  Ｉは、ＰＨドメインの除去によって、ダイナミンＩのＧＴＰアーゼ活性を阻害する能力を喪失し、この薬物が、ＰＨドメインを介してＧＴＰ加水分解を防止することを示している。
【００９２】
リン脂質とダイナミンとの相互作用は、協同的ダイナミンヘリックス組立てを誘導することによってＧＴＰアーゼ活性を刺激する。組立てダイナミンは、簡単な沈降アッセイにより容易に検出され、この特性が、ビス−チルホスチンが、ダイナミンヘリックス組立てまたはリン脂質相互作用を調節するかどうかを判定するために使用された。ダイナミン単独では、このアッセイにおいて沈殿せず、上澄液が保持されているが（図３ｂ、レーン１〜２）、ＰＳリポソームの存在下ではペレットにおいて大部分が見られる（レーン３〜４）。リン脂質結合、それゆえのダイナミンヘリックス組立ては、１０μＭまたは１００μＭのビス−チルホスチンによる影響を完全に受けなかった（レーン５〜１２）。Ｍｇ／ＧＴＰをこのアッセイに添加したが、その結果は変わらなかった。これは、ビス−チルホスチンが、リン脂質とのダイナミン結合体も、またその協同的組立ても阻止しないことを示している。それ故、ビス−チルホスチンは、アロステリック部位におけるダイナミンのＧＴＰアーゼ活性を阻害し、また、ヘリックス組立て後に阻害する。
【００９３】
１.２.４  チルホスチンＡ４７ではなくてビス−チルホスチンが、ダイナミンＩ媒介シナプス小胞回復を阻害し、その過程でダイナミンＩ環を形成する
ラット神経末端集団中のＳＶＥに対するビス−チルホスチンおよびチルホスチンＡ４７の効果を確認するために蛍光測定法を用いた（シナプトソーム、図４）。ビス−チルホスチンおよびＡ４７は、エキソサイトーシスに対する効果がなかった（Ｃａ2+−依存グルタメート放出、図４ａおよび４ｂ）。ビス−チルホスチン（１００μＭ１０分間）は、ＳＶＥを有意に阻害したが、一方、Ａ４７（１００μＭ）は阻害しなかった（図４ｃおよび４ｄ）。このアッセイで検出されたＳＶＥ量は、事前のエキソサイトーシスの程度に依存することから、エンドサイトーシスの阻害は、回復効率を算出することにより定量化された。このパラメータは、各薬物に関してエキソサイトーシス量で割られたエンドサイトーシス量の比である（カズン(Cousin)ら、２００１年）。回復効率１は、エンドサイトーシスに対する薬物効果を示さない。チルホスチンＡ４７は、０.９５（±０.０５）の回復効率およびビス−チルホスチンが０.７（±０.０５、図４ｅ）の回復効率を示した。このことは、ビス−チルホスチンによるＳＶＥの有意な減少を示している。
【００９４】
ビス−チルホスチンは、ＧＴＰ結合ではなくて（図２）ダイナミンＩのＧＴＰアーゼ活性を阻害することから（図１）、ビス−チルホスチンもまた、成長するシナプス小胞の頸部周囲に環として組み立てられるＳＶＥの特定の段階でダイナミンを捕捉できるかどうかを判定するために、試験を行った。休止時または４１mＭ  ＫＣｌ（Ｓ１）中１０秒間で１回脱分極されたシナプトソームは、電子顕微鏡（ＥＭ）により正常な形態を示した（図５ａ〜ｂ）。神経末端は：ｉ）平滑な、密封された形質膜、ii）小型のシナプス小胞で完全に満たされ、およびiii）殆ど常に１つから３つの正常なミトコンドリアプロフィルを含み、時にはシナプスおよび関連シナプス後密度を含有することを特徴とした。非刺激シナプトームが、ビス−チルホスチンで処理された場合、それらの形態に及ぼす影響はなかった（図５ａ）。しかしながら、脱分極されると、シナプス小胞の大量の枯渇があった（図５ｂ）。少数の形質膜陥入もまた検出され（図５ｅ〜ｆ）、エンドサイトーシスがないことを示唆した。ＧＴＰ結合ではなくてＧＴＰ加水分解のブロッカーに予測されるように、明らかに高密度カラーに取り囲まれた小胞頸部を有する多数の巻かれたピットが見られた（図５ｃ、ｄ、ｇおよびｈ）
【００９５】
１.２.５  ビス−チルホスチンは、トランスフェリンのＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞およびＨＥＲ１４細胞内へのダイナミンII−媒介受容体−媒介エンドサイトーシスをブロックする
トランスフェリンは、ダイナミンIIにより媒介されている受容体媒介エンドサイトーシスの過程により細胞内に輸送される。非ニューロン細胞へのトランスフェリン内在化に対するビス−チルホスチンおよびチルホスチンＡ４７双方の効果を試験した（図６）。対照細胞は、高い程度で細胞質染色（パネルａおよびｅ）を示し、トランスフェリンが細胞内に内在化されていることを示した。細胞核は、ＤＡＰＩにより青色に共染色され、細胞体の所在を示した（パネルｂ、ｄ、ｆおよびｈ）。ビス−チルホスチンの添加の際、トランスフェリン染色の非常に大きな減少が見られた。チルホスチンＡ４７もまた、ビス−チルホスチンほど劇的ではないが、この効果を生じさせた（示していない）。この阻害もまた、濃度依存性であることが判明した。媒体ＤＭＳＯは、トランスフェリン内在化に対する効果は無かった。
【００９６】
１.３  考察
最初にショウジョウバエの変異株シビレ(shibire)で立証されたとおり、神経末端におけるダイナミンおよびエキソサイトーシスのブロッキングは、大部分のＳＶ類の劇的な枯渇をもたらす。多数のＳＶ類は、神経末端の最も明確な形態的特徴の１つであることから、それらの喪失は、視覚的に容易に明白である。さらに、形質膜の生じた形態は、ブロックが生じているエンドサイトーシス点の強い表示を提供することが知られている。ビス−チルホスチンは、多くのＳＶ類の神経末端を枯渇させ、形質膜上に捕捉された頸部周囲の透明なダイナミンのカラーまたは環を有する極めて少数の小胞を生じた。ビス−チルホスチンの作用部位は、環組立て後の頸部開裂前であることが、この劇的な結果により明らかになった。しかしながら、驚くべきことに、ダイナミンのカラーは稀であった。この驚くべき複雑性はビス−チルホスチンが、環組立て前に第２の点でブロックすることを示唆しており、ダイナミンＧＴＰアーゼ活性は、ＳＶＥの機構における２つの異なる点において重要であることが支持されている。
【００９７】
３種のダイナミン遺伝子産物は、少なくとも３つの形態のエンドサイトーシスを媒介できる。ダイナミンＩは、ＳＶＥを媒介し、ダイナミンIIはＲＭＥを媒介し、ダイナミンIIIは、シナプス後棘におけるエンドサイトーシスを媒介する（グレイ(Gray)ら、２００３年）。機構のさらに微妙な点もまた公知である。ダイナミン類の分化抑制により、これら細胞の役割間を識別する能力が提供される。特に、選択的阻害剤は、種々のエンドサイトーシス間を区別するための重要な手段であり、種々の形態のエンドサイトーシスに基づく病状の標的化に対して臨床的関心が持たれている。
【００９８】
さらにこれらの結果により、ビス−チルホスチン（ＢｉｓＴまたはＡＧ５３７）は、ダイナミンＩおよびIIのＧＴＰアーゼ活性を阻害し、神経末端（シナプトソーム）におけるＳＶＥ、および３Ｔ３細胞またはＨＥＲ１４細胞におけるトランスフェリンのＲＭＥ双方をブロックすることが示されている。その作用部位は、ＧＴＰ結合部位でもなく、またはＰＨドメインでもなく、したがってそれはアロステリック阻害剤である。ＧＴＰ結合部位に影響を与えないことから、それは、環内のダイナミン組立てにも影響を与えないはずである。このことは、組立て後のダイナミンを標的とするユニークな手段を提供する。ビス−チルホスチンは、ＥＧＦＲ−ＴＫ（ＩＣ50＝０.４Ｍ）およびＥＧＦ−依存細胞増殖（ＩＣ50＝３Ｍ）を阻害することが以前に見出されている（ガジト(Gazit)ら、１９９６年）。したがって、ダイナミン阻害を保持するが、ＥＧＦＲ−チロシンキナーゼに対するそれらの効果を低下させる類縁体がデザインされた（チロシンキナーゼ特異性の決定因子が周知であることから）（ガジト(Gazit)ら、１９９６年）。
【００９９】
実施例２  チルホスチン類縁体の開発
【化６】
2007515399.tif 000007
【０１００】
２.１  類縁体の開発
ビス−チルホスチンおよびチルホスチンＡ４７の構造は、上記に示されている。３,４−ジヒドロキシベンゼンのこれらの化合物間の構造的類似性およびシアノアミドまたはチオアミドの存在は、これらの基がダイナミン阻害に重要であり得ることを示唆している。これらの特徴は、ライブラリー開発に対して液相平行合成アプローチを高度に受けることができ、活性に重要な芳香族置換基のタイプおよび数、対称システム（１対２）の必要性、およびビス−チルホスチンに存在する２つのアミド部分間の中心アルカンスペーサーアームの長さの重要性を判定するために２つのライブラリーが合成された。これらのライブラリーは、ライブラリー１（二量体化合物）およびライブラリー２（非対称性、単量体化合物）と称された。
【０１０１】
２.２  類縁体ライブラリーの合成
クネーベナーゲル化学および一連の適切なα,ｗ−ビスアミン類の簡単な適用により、所望のライブラリー（スキーム１）を良好から優れた収率で迅速に得られた。
【化７】
2007515399.tif 000008
【０１０２】
このアプローチの有用性により、ｎ＝１〜５を有するアルカンスペーサーアームの長さに基づいて、ライブラリー１内に５つの考慮されたサブライブラリーの迅速な生成が可能であった。ダイナミンＩ  ＧＴＰアーゼ活性に関する最初の生物学的スクリーンは、１００μＭで実施された。次いでより有望な類縁体のＩＣ50値を決定するためにある濃度範囲にわたってそれらをスクリーンした（表２）。合成された８０の類縁体の中で多くの化合物は、１００μＭ以下のＩＣ50を有することが判明し、また著しい阻害を示した。Ｒ1からＲ5置換基は下表１で確認される。
【０１０３】
２.３  二量体チルホスチン類の合成
２.３.１  一般
全ての出発物質は、Aldrich Chemical社およびLancaster Synthesisから購入された。１Ｈおよび１３Ｃスペクトルは、Bruker
Advance AMX 300 MHz分光計上で、それぞれ３００.１３１５および７５.４７６２  ＭＨｚで記録された。化学シフトは、内部基準としてのＴＭＳに相対的である。
【０１０４】
２.３.２  合成法
化合物５ａ：２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−エチル］−アセトアミド
エチレンジアミン（３ａ）（１.５ｇ、２５mmol）およびメチルシアノアセテート（５ｇ、５０mmol）を、室温で２時間撹拌した。次に生じた白色固体を１０mLのエタノールと混合し、ろ過により採取した。エタノールからの再結晶により白色固体を得た、６.３ｇ（８１％）。ｍｐ１８２℃（文献値１８３℃）29。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.２５（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、３.５６（４Ｈ,ｓ）、３.１３（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６２.３１、１１５.９６、３８.４１、２５.２５。
【０１０５】
化合物５ｂ：２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−プロピル］−アセトアミド
プロパンジアミン（３ｂ）（２.２ｇ、３０mmol）およびメチルシアノアセテート（６.４ｇ、６５mmol）を、室温で２時間撹拌した。次に生じた白色固体を２０mLのエタノールと混合し、ろ過により採取した。エタノールからの再結晶により４.９９５ｇ（８１％）の白色固体を得た。ｍｐ１４６℃（文献値１４８℃）29。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.２１（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、３.５９（４Ｈ,ｓ）、３.０７（４Ｈ,ｑ,Ｊ＝６.７Ｈｚ）、１.５３（２Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝６.７Ｈｚ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６２.４５、１１６.６４、３９.２８、２８.９０、２５.６７。
【０１０６】
化合物５ｃ：２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−ブチル］−アセトアミド
１,４−ジアミノブタン（３ｃ）（３ｇ、３４mmol）およびメチルシアノアセテート（７ｇ、７０mmol）を、室温で２時間撹拌し、その時間後に白色固体を形成した。次にこの固体をエタノール（１０mL）と混合し、ろ過により採取した。エタノールからの再結晶により白色固体を得た、５.９９５ｇ（７８％）。ｍｐ１４５℃（文献値１４５℃）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.１５（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、３.５６（４Ｈ,ｓ）、３.０５（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）、１.３８（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.８４、１１６.０９、３８.６３、２６.０７、２５.１７。
【０１０７】
化合物５ｄ：２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−ペンチル］−アセトアミド
１,５−ジアミノペンタン（３ｄ）（２ｇ、２０mmol）およびメチルシアノアセテート（３.９ｇ、４０mmol）を、室温で２時間撹拌し、その時間後に白色固体を形成した。次にこの固体をエタノール（１０mL）と混合し、ろ過により採取した。エタノールからの再結晶により白色固体を得た、４.６２ｇ（９８％）。ｍｐ１２５℃（文献値１２５℃）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.１４（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.４Ｈｚ）、３.５５（ｓ,４Ｈ）、３.０３（４Ｈ,ｑ,Ｊ＝６.４Ｈｚ）、１.３９（４Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝７Ｈｚ）、１.２３（２Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝７Ｈｚ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.７９、１１６.１１、３８.８４、２８.２６、２５.１７、２３.４３。
【０１０８】
化合物５ｅ：２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−ヘキシル］−アセトアミド
１,６−ジアミノヘキサン（３ｅ）（３ｇ、２６mmol）およびメチルシアノアセテート（６ｇ、６０mmol）を、室温で２時間撹拌し、その時間後に白色固体を形成した。次にこの固体をエタノール（１０mL）と混合し、ろ過により採取した。エタノールからの再結晶により白色固体を得た、６.２ｇ（９５％）。ｍｐ１４１℃（文献値１４０℃）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.１５（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、３.５６（４Ｈ,ｓ）、３.０４（４Ｈ,ｑ,Ｊ＝６.１Ｈｚ）、１.３７（４Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝５.９Ｈｚ）、１.２４（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.７６、１１６.１２、３８.８５、２８.５８、２５.１６。
【０１０９】
化合物９：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−エチル｝−３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノ−アセチルアミノ）−エチル］−アセトアミド（５ａ）（０.３ｇ、１.５mmol）、３,４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（０.４２ｇ、３mmol）、３滴のピペリジンおよびエタノール（１０mL）を、２時間還流した。冷却、ろ過および冷エーテル（１０mL）で洗浄することにより、黄緑色固体を得た、０.５４ｇ（８１％）。ｍｐ２９０℃（文献値２９５℃）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.３２（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、７.９２（２Ｈ,ｓ）、７.５３（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝２.１Ｈｚ）、７.２５（２Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝８.２,２.１Ｈｚ）、６.８５（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝２.１Ｈｚ）、３.４５（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６２.５０、１５１.６３、１６１.６１、１４６.２２、１２５.７６、１２３.４５、１１７.６５、１１６.５３、１１６.３１、１００.８５、３９.６０。
【０１１０】
化合物１０：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４,５−トリヒドロキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−エチル｝−３−（３,４,５−トリヒドロキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノ−アセチルアミノ）−エチル］−アセトアミド（５ａ）（０.０５６ｇ、０.３mmol）、３,４,５−トリヒドロキシベンズアルデヒド（０.１ｇ、０.６５mmol）および１滴のピペリジンおよびエタノール（２mL）を、１時間還流した。冷却、ろ過および冷エタノール（１０mL）で洗浄することにより、橙色固体を得た、０.１１ｇ（８２％）。ｍｐ＞３００℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.２９（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、７.７９（２Ｈ,ｓ）、６.９９（４Ｈ,ｓ）、３.３２（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６２.１５、１５０.７、１４５.９６、１４０.２４、１２１.２６、１１７.３０、１０９.９７、９９.７６、３９.４０。
【０１１１】
化合物１１：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４−ジヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−エチル｝−３−（３,４−ジヒドロキシ−５−メトキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノ−アセチルアミノ）−エチル］−アセトアミド（５ａ）（０.０６ｇ、３mmol）、３,４−ジヒドロキシ−５−メトキシベンズアルデヒド（０.１ｇ、０.６mmol）、１滴のピペリジンおよび２mLのエタノールを、２時間還流した。冷却、ろ過および冷エタノール（５mL）で洗浄することにより、橙色固体を得た、０.１０１ｇ（６６％）。ｍｐ２７４℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.３４（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、７.９３（１Ｈ,ｓ）、７.２０（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝１.９２Ｈｚ）、７.１３（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝１.９２Ｈｚ）、３.７７（６Ｈ,ｓ）、３.３５（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.９０、１５０.８５、１４８.０３、１４５.８３、１３９.９０、１２１.７６、１１７.２０、１１１.０９、１０７.２０、１００.８３。
【０１１２】
化合物２２：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−プロピル｝−３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノ−アセチルアミノ）−プロピル］−アセトアミド（５ｂ）（０.３ｇ、１.４mmol）、（０.４ｇ、２.８mmol）３,４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、３滴のピペリジンおよび１０mLのエタノールを、２時間還流した。冷却、ろ過および冷エーテル（１０mL）で洗浄することにより、黄緑色固体を得た、０.５５ｇ（８５％）。ｍｐ２７４℃（文献値２７７℃）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.２４（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、７.９２（ｓ,２Ｈ）、７.５２（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝２.１Ｈｚ）、７.２６（２Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝８.２,２.１Ｈｚ）、６.８５（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝８.２Ｈｚ）、３.２３（４Ｈ,ｑ,Ｊ＝６Ｈｚ）、１.７０（２Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝６.７Ｈｚ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.５０、１５０.６０、１５０.５０、１２５.１０、１２３.２１、１１７.１０、１１６.００、１１５.８０、１００.５０、３７.２７、２８.８２。
【０１１３】
化合物２３：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４,５−トリヒドロキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−プロピル｝−３−（３,４,５−トリヒドロキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−プロピル］−アセトアミド（５ｂ）（０.０６ｇ、０.２９mmol）、３,４,５−トリヒドロキシベンズアルデヒド（０.１ｇ、０.５８mmol）、１滴のピペリジンおよびエタノール（１０mL）を、２時間還流した。冷却、ろ過および冷エタノール（１０mL）で洗浄することにより、橙色固体を得た、０.０９７ｇ（７０％）。ｍｐ＞３００℃（文献値＞３００℃）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.１８（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、７.７８（２Ｈ,ｓ）、６.９９（４Ｈ,ｓ）、３.２１（４Ｈ,ｑ,Ｊ＝６.８Ｈｚ）、１.６８（２Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝６.８Ｈｚ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.８０、１５０.７０、１４５.９５、１４０.３０、１２１.２２、１１７.３０、１０９.９０、９９.５０、３８.２０、２８.９０。
【０１１４】
化合物２４：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４−ジヒドロキシ−５−メトキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−プロピル｝−３−（３,４−ジヒドロキシ−５−メトキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−プロピル］−アセトアミド（５ｂ）（０.３ｇ、１.４mmol）、０.４４ｇの３,４−ジヒドロキシ−４−メトキシベンズアルデヒド、３滴のピペリジンおよびエタノール（１０mL）を、２時間還流した。冷却、ろ過および冷エタノール（５mL）で洗浄することにより、橙色固体を得た、０.３１ｇ（４２％）。ｍｐ＞３００℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.３５（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.４Ｈｚ）、７.９５（２Ｈ,ｓ）、７.２１（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝１.９Ｈｚ）、７.１２（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝１.９Ｈｚ）、３.２１（４Ｈ,ｑ,Ｊ＝６.８Ｈｚ）、１.７１（２Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝６.８Ｈｚ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.３０、１５０.６１、１４７.２０、１４５.３０、１２１.０４、１１７.６０、１１０.６０、１０７.６５、９８.７１、３８.３５、２８.８８。
【０１１５】
化合物３５：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−ブチル｝−３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−ブチル］−アセトアミド（５ｃ）（０.３ｇ、１.３５mmol）、３,４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（０.３７ｇ、２.７mmol）、３滴のピペリジンおよびエタノール（１０mL）を、２時間還流した。冷却、ろ過および冷エーテル（１０mL）で洗浄することにより、黄色固体を得た、０.６１ｇ（９７％）。ｍｐ２８１℃（文献値２８３℃）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.２５（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、７.９１（２Ｈ,ｓ）、７.５３（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝１.９Ｈｚ）、７.２６（２Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝８.３,１.９Ｈｚ）、６.８５（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝８.３Ｈｚ）、３.２０（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）、１.４９（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.５２、１５０.８６、１５０.４２、１４５.６５、１２５.２３、１２３.０９、１１７.２０、１１５.８１、１００.５１、３９.３１。
【０１１６】
化合物３６：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４,５−トリヒドロキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−ブチル｝−３−（３,４,５−トリヒドロキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−ブチル］−アセトアミド（５ｃ）（０.０６５ｇ、０.３mmol）、３,４,５−トリヒドロキシベンズアルデヒド（０.１ｇ、０.６mmol）、１滴のピペリジンおよびエタノール（２mL）を、１時間還流した。冷却、ろ過および冷エーテル（５mL）で洗浄することにより、２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４,５−トリヒドロキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−ブチル｝−３−（３,４,５−トリヒドロキシフェニル）−アクリルアミドを黄色固体として得た、０.１２１ｇ（８２％）。ｍｐ＞３００℃（文献値＞３００℃）29。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.１６（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、７.７８（２Ｈ,ｓ）、６.９８（４Ｈ,ｓ）、３.１９（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）、１.４８（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.７０、１５０.５６、１４５.９０、１４０.２０、１２１.３０、１１７.３０、１０９.９０、９９.８０、３９.２６、２６.３７。
【０１１７】
化合物３７：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４−ジヒドロキシ−５−メトキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−ブチル｝−３−（３,４−ジヒドロキシ−５−メトキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−ブチル］−アセトアミド（５ｃ）（０.０６５ｇ、０.３mmol）、３,４−ジヒドロキシ−５−メトキシベンズアルデヒド（０.１ｇ、０.６mmol）、１滴のピペリジンおよびエタノール（２mL）を、１時間還流した。冷却、ろ過および冷エーテル（５mL）で洗浄することにより、黄色固体を得た、０.１１０ｇ（７０％）。ｍｐ＞３００℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.０９（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、７.８６（２Ｈ,ｓ）、７.１８（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝１.９Ｈｚ）、７.１０（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝１.９Ｈｚ）、３.７５（６Ｈ,ｓ）、３.１９（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）、１.４８（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.７１、１５０.２３、１４８.７０、１４６.２４、１２０.２５、１１７.５１、１０９.５０、１０６.８０、９８.８１、５５.７６、３９.３１、２６.６４。
【０１１８】
化合物４８：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−ペンチル｝−３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−ペンチル］−アセトアミド（５ｄ）（０.２ｇ、０.８５mmol）、３,４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（０.２３ｇ、１.７mmol）、３滴のピペリジンおよび７mLのエタノールを、２時間還流した。冷却、ろ過および冷エーテル（１０mL）で洗浄することにより、黄色固体を得た、０.３６ｇ（９０％）。ｍｐ２５２℃（文献値２４８℃）29。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.１５（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、７.８５（２Ｈ,ｓ）、７.５０（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝２.１Ｈｚ）、７.２０（２Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝８.５Ｈｚ,２Ｈｚ）、６.７５（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝８.５Ｈｚ）、３.１６（４Ｈ,ｑ,Ｊ＝６.２Ｈｚ）、１.５０（４Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝７.１Ｈｚ）、１.２８（２Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝６.９Ｈｚ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.８５、１５３.８８、１５０.３４、１４６.２８、１２６.１６、１２１.４７、１１７.７０、１１５.７１、１１４.６５、９８.４０、３９.４６、２８.６３、２３.７３。
【０１１９】
化合物４９：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４,５−トリヒドロキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−ペンチル｝−３−（３,４,５−トリヒドロキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−ペンチル］−アセトアミド（５ｄ）（０.０６８ｇ、０.２９mmol）、（０.１ｇ、０５８mmol）３,４,５−トリヒドロキシベンズアルデヒド（０.１ｇ、０.５８mmol）、１滴のピペリジンおよびエタノール（２mL）を、１時間還流した。冷却、ろ過および冷エーテル（５mL）で洗浄することにより、黄色固体を得た、０.１２３ｇ（８３％）。ｍｐ＞３００℃32。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.１２（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、７.７６（２Ｈ,ｓ）、６.９８（４Ｈ,ｓ）、３.１６（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）、１.５０（４Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝６.８Ｈｚ）、１.２８（２Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝６.７Ｈｚ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.８０、１５０.４９、１４６.１１、１４６.０１、１４１.２５、１２０.６９、１１７.５３、１０９.９０、９９.１２、３９.４７、２８.６２、２２.３０。
【０１２０】
化合物５０：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４−ジヒドロキシ−５−メトキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−ペンチル｝−３−（３,４−ジヒドロキシ−５−メトキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−ペンチル］−アセトアミド（５ｄ）（０.０６９ｇ、０.２９mmol）、３,４−ジヒドロキシ−５−メトキシベンズアルデヒド（０.１ｇ、０.５８mmol）、１滴のピペリジンおよびエタノール（２mL）を、１時間還流した。冷却、ろ過および冷エーテル（５mL）で洗浄することにより、黄色固体を得た、０.１２６ｇ（８１％）。ｍｐ２５６℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.０９（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、７.８６（２Ｈ,ｓ）、７.１８（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝２Ｈｚ）、７.１０（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝２Ｈｚ）、３.７５（６Ｈ,ｓ）、３.１７（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）、１.５０（４Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝６.８Ｈｚ）、１.２８（４Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝６.９Ｈｚ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.８１、１５０.５０、１４８.００、１４６.２０、１２０.０５、１１７.８１、１１０.５０、１０７.８０、９８.７１、５５.７１、３９.４１、２８.６４,２２.４７。
【０１２１】
化合物６１：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−ヘキシル｝−３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−ヘキシル］−アセトアミド（５ｅ）（０.３ｇ、１.２mmol）、３,４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（０.３３ｇ、０.２４mmol）、３滴のピペリジンおよび１０mLのエタノールを、２時間還流した。冷却、ろ過および冷エーテル（１０mL）で洗浄することにより、黄色固体を得た、０.５２ｇ（８９％）。ｍｐ２６３℃（文献値２６０℃）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.１８（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、７.８９（２Ｈ,ｓ）、７.５１（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝２Ｈｚ）、７.２４（２Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝２Ｈｚ,８.３Ｈｚ）、６.８３（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝８.３Ｈｚ）、３.１７（４Ｈ、ｑ,Ｊ＝６.１Ｈｚ）、１.４７（４Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝６.１Ｈｚ）、１.２８（４Ｈ,ｓ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.５２、１５１.１８、１５０.３０、１４５.７２、１２５.２２、１２２.９１、１１７.２４、１１５.８０、１１５.７２、１００.３８、３９.４８、２８.７８,２５.９８。
【０１２２】
化合物６２：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４,５−トリヒドロキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−ヘキシル｝−３−（３,４,５−トリヒドロキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−ヘキシル］−アセトアミド（５ｅ）（０.０７３ｇ、０.２９mmol）、３,４,５−トリヒドロキシベンズアルデヒド（０.１ｇ、０.５８mmol）、１滴のピペリジンおよびエタノール（２mL）を、１時間還流した。冷却、ろ過および冷エーテル（５mL）で洗浄することにより、黄色固体を得た、０.１ｇ（６７％）。ｍｐ＞３００℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.１１（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、７.７６（２Ｈ,ｓ）、６.９８（４Ｈ,ｓ）、３.１６（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）、１.４７（４Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝６.１Ｈｚ）、１.２８（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.８０、１５０.４６、１４５.９９、１４１.１９、１２０.７１、１１７.５３、１０９.８９、９９.１５、３９.６８、２８.８４、２６.０１。
【０１２３】
化合物６３：２−シアノ−Ｎ−｛３−［２−シアノ−３−（３,４−ジヒドロキシ−５−メトキシフェニル）−アクリロイルアミノ］−ヘキシル｝−３−（３,４−ジヒドロキシ−５−メトキシフェニル）−アクリルアミド
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−シアノアセチルアミノ）−ヘキシル］−アセトアミド（５ｅ）（０.０６９ｇ、０.２８mmol）、３,４−ジヒドロキシ−５−メトキシベンズアルデヒド（０.１ｇ、０.５６mmol）、１滴のピペリジンおよびエタノール（２mL）を、１時間還流した。冷却、ろ過および冷エーテル（５mL）で洗浄することにより、黄色固体を得た、０.１３２ｇ（８６％）。ｍｐ２４３℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８.１７（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝５.５Ｈｚ）、７.８９（２Ｈ,ｓ）、７.１９（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝１.６Ｈｚ）、７.１３（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝１.６Ｈｚ）、３.７７（６Ｈ,ｓ）、３.１７（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）、１.４８（４Ｈ,ｑｕｉｎ,Ｊ＝６.１Ｈｚ）、１.２９（４Ｈ,ｂｒ  ｓ）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６１.８０、１５０.４９、１４６.１１、１４６.０１、１４１.２５、１２０.６９、１１７.５３、１０９.９０、９９.１２、３９.４７、２８.６２,２２.３０。
【０１２４】
２.３.２  二量体チルホスチン類の活性
【０１２５】
【表１】
2007515399.tif 000009
【０１２６】
置換基を含有しないか、または単一の−ＯＨ（例えば、Ｒ1またはＲ2がＯＨである）、−Ｃｌ（Ｒ2またはＲ4がＣｌである）、−ＯＭｅ（Ｒ2またはＲ3がＯＭｅである）、または−ＣＯＯＨ（Ｒ3がＣＯＯＨである）などの単一の置換基を含有するモノ置換芳香族化合物は、ダイナミン阻害を示さなかった。第２の酸素含有置換基の導入は、明白な効果を有した。３,４−ジ−ＯＨ（１１、ＩＣ50＝５.１±０.６μＭ）は、化合物１、すなわちビス−チルホスチン（２,３−ジ−ＯＨ）と同様の効力を示した。３,４,５−トリ−置換芳香族化合物（１０）もまた、１と等しい効力を有した。種々の鎖長化合物の各シリーズで本質的に同じ傾向が見られた。
【０１２７】
アルカンスペーサー鎖の延長は、ｎ＞３までは、効力に対して殆ど効果がなかった。例えば、９（ｎ＝０）の鎖延長類縁体、すなわち２２（ｎ＝１）、３５（ｎ＝２）、４８（ｎ＝３）、および６１（ｎ＝４）は、それぞれ５.１±０.６、１.７±０.２、３.２±１、５±１.４および２６±１.５μＭのＩＣ50値を示した。チロシンキナーゼ阻害に関して本質的に反対の傾向が以前に報告されていた。ポリ−ＧＡＴ基質のＥＧＦ受容体チロシンキナーゼリン酸化に対する化合物を調べる限りで、ガジト(Gazit)らは、阻害が鎖長に依存していることを観察した（ガジト(Gazit)ら、１９９６年）。
【０１２８】
Ｒ1およびシアニル基（ＣＮ）により占められた位置が環化している類縁体もまた提供できる。例えば、Ｒ1がヒドロキシである場合、該ヒドロキシ基は、シアニル基と反応して、下記のスキーム２に示すイミノクロメンを形成できる。
【化８】
2007515399.tif 000010
スキーム２：ビス−チルホスチンのイミノクロメン類縁体の合成
【０１２９】
９の鎖延長類縁体に関する阻害値の類似性の説明を意図して、５つ全てのアルカンスペーサー類縁体のモデリング分析を実施し、生じたMacSpartanProの低エネルギーコンホーマーモデルが下記に示している。見られように、５つ全ての類縁体の低エネルギーコンホーマーは、比較可能なヘアピンコンホメーションを採り、末端フェニル環の間のパイ−パイ相互作用を最大にする。その結果、スペーサー長の増加は、エントロフィ効果が、ヘアピンコンホメーションの相対的安定性に影響を及ぼし始めるまで（ｎ≧５）限定された影響を与える。これは、延長された構造に存するチロシンキナーゼ効力に対する二量体チルホスチン類の効果と対比的であり、したがってそれらをＥＧＦＲチロシンキナーゼ類の二量体中間体に適合させることができる。
【化９】
2007515399.tif 000011
ａ表２において、ビス−チルホスチン（１）はまた、スキーム１に従って合成された化合物９として同定される。したがって化合物１と９は同一である。
【０１３０】
１と会合する潜在的Ｈ−結合効果を調べるために、化合物７１を開発した。この化合物は、全体サイズが１と同様の比較的非可撓性のピペラジンリンカーを有する。しかしながら、それは、≦１００μＭでダイナミン阻害を示さなかった。同様に、１のアルカンスペーサーをＮ−メチル化してＮ−メチル類縁体７２を生成した後、阻害効果は見られなかった。これらの観察により、二量体チルホスチン類(tryphostins)のヘアピンコンホメーションは阻害作用に望ましく、モデリング観察（延長鎖よりもヘアピンコンホメーション）を支持しており、アミド置換基もまた、ダイナミンへの結合において重要な役割を演じることが示唆されている。
【化１０】
2007515399.tif 000012
【０１３１】
ビス−チルホスチンに基づく多数のμＭ効力の対称類縁体を首尾よく開発し、ダイナミン阻害における芳香族核の１つの修飾の役割を判定するためにそれらを調べた。したがって、チルホスチンＡ４７（２）に基づく他の化合物ライブラリーが、スキーム３に示されているとおり、開発され、ダイナミンＩ  ＧＴＰアーゼ活性を阻害する類縁体の能力を調べた。
【化１１】
2007515399.tif 000013
スキーム３.ライブラリー２の合成
【０１３２】
驚くべきことに、ライブラリー２の化合物のスクリーニングは、≦１００μＭのダイナミン阻害を有するものを示さなかった。より驚くべきことに、チルホスチンＡ４７（２）がダイナミンＩＣ50＝７０μＭを示すことを、元のスクリーニングデータが示した。
【０１３３】
チルホスチンＡ４７のより綿密な試験により、ライブラリー２において阻害活性を検出できない説明の可能性を得た。すなわち、単独−Ｓが、対応する二量体構造への溶液中の酸化に利用できる可能性があった。単純な互変異性に次いで酸化により、対応するジスルフィド種（１２１）が生成する（スキーム４を参照）。新鮮に調製された２の溶液は、阻害活性を示さなかったが、室温で２４時間維持された保存液は、弱い効力を示した。還元剤ジチオトレイトール（２mＭ）が、ダイナミンアッセイ培地に含まれる場合、１２１のＩＣ50は＞３００μＭまでに減少した。ジチオトレイトール単独では、ダイナミンＧＴＰアーゼ活性に対して効果がなかった（データは示していない）。二量体１２１のインサイチュ生成により、良好なダイナミン阻害を確保する上で適切に処理された必要で重要な官能基を有する類似の低エネルギーコンホメーションが得られる。同様の連続事象が、酸化の際の活性増加を示したＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるチオインドール類に見られている（トンプソン(Thompson)ら、１９９３年）。
【化１２】
2007515399.tif 000014
スキーム４
【０１３４】
２.４  考察
ＧＴＰアーゼ酵素ダイナミンに対する二量体チルホスチン類の構造−活性相関を、リード化合物ビス−チルホスチンおよびチルホスチンＡ４７に基づいて化合物の合成およびライブラリーのスクリーニングによって評価した。得られた結果から、強力な阻害活性は、３,４位にヒドロキシ基を有する２つの芳香族環を含有する二量体チルホスチン化合物に見られた。これらの化合物に対する修飾は、官能基がスペーサーを形成するために用いられる改変により容易に作製することができる。
【０１３５】
実施例３  プロドラッグの開発
細胞膜の透過性特性を増加させることによって細胞内の効力を増加させるためにビス−チルホスチンおよびその類縁体のプロドラッグが開発された。二量体チルホスチン化合物のプロドラッグを提供するための好適な反応は、スキーム５に図示されている。ビス−チルホスチンは、出発薬剤として例示されている。二量体チルホスチン化合物を、ピリジン／Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの適切な触媒存在下、適切な無水物または酸クロリド（過剰モルで）と共に撹拌する。幾つかの場合において、反応を完結させるために該溶液を還流する必要があり得る。反応が完結したら、エステル化された生成物を、再結晶またはクロマトグラフィにより精製する。開発されたプロドラッグの例は、表２および表３に示している。
【化１３】
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スキーム５.プロドラッグの合成
【０１３６】
【表２】
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【０１３７】
【表３】
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【０１３８】
プロドラッグＰｒｏ−ＢｉｓＴは、ビス−チルホスチン上に存在する４つのヒドロキシル基の代りに４つのアセチルエステル基を有し、細胞の細胞外膜を交差する能力について評価された。Ｐｒｏ−ＢｉｓＴは、細胞内で活性な化合物ビス−チルホスチンに変換されてから、ダイナミンに結合し、それによってエンドサイトーシスを阻害できる。Ｐｒｏ−ＢｉｓＴは、細胞系Ｈｅｌａ、ＨＥＲ１４、ＣＯＳ７、Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３、Ａ４３１、Ｂ１０４およびＢ３５においてトランスフェリンまたはＥＧＦの受容体媒介エンドサイトーシス（ＲＭＥ）を阻害することが判明した。Ｐｒｏ−ＢｉｓＴは、ビス−チルホスチン（約３０ｘ）よりも有意に効力があり、１０〜２０μＭ間の濃度で試験された細胞系においてＲＭＥを効率的にブロックし、ビス−チルホスチンと比較して細胞に侵入する能力が大いに改善されたことを示している。
【０１３９】
プロドラッグ８０−１は、Ｐｒｏ−ＢｉｓＴ（１０〜２０μＭ）と同様の濃度でＲＭＥを阻害することが判明し、細胞内への通過前の細胞外環境におけるプロドラッグの早期加水分解を減少させるために開発された。このプロドラッグは、Ｐｒｏ−ＢｉｓＴと比較して粉末形態で貯蔵される場合、貯蔵期限が改善されている。
【０１４０】
具体的な実施形態に示されるように、多数の変化および／または修飾が、広く記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく本発明に対してなし得ることは当業者により認識されるであろう。したがって、本発明の実施形態は、全ての点で例証であって限定ではないものとして考慮されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】ビス−チルホスチンおよびチルホスチンＡ４７（ａ、ｂ）は、ダイナミンＩおよびダイナミンII双方のＧＴＰアーゼ活性を阻害することを示しているグラフである。０.２μｇのダイナミンＩ（ｃ、ｄ）およびダイナミンII（ｅ、ｆ）のＧＴＰアーゼ活性が、ビス−チルホスチン（ｃ、ｅ）またはチルホスチンＡ４７（ｄ、ｆ）の存在下または不在下で１.３Ｃｉ［δ−32Ｐ］−ＧＴＰを用いて測定された。基礎的活性（白丸）とリン脂質刺激活性（黒丸）が比較されている。
【図２】ダイナミンＩおよびダイナミンIIに対する［α−32Ｐ］−ＧＴＰの結合は、ビス−チルホスチンまたはチルホスチンＡ４７（ａ、ｂ）の添加によって影響を受けないことを示しているニトロセルロース膜のオートラジオグラフである。定量的データは、パネル（ｃ）および（ｄ）に示している。
【図３】（ａ）化合物が、このドメイン（「ダイナミンＩ−デルタＰＨ」）を欠失する組換えダイナミンの変異体のＧＴＰアーゼ活性をなお阻害することから、ビス−チルホスチンはダイナミンＩのＰＨドメインにおいて作用しないことを示すグラフであり；（ｂ）ビス−チルホスチンが、脂質に結合しているダイナミンをブロックせず、ダイナミンは上澄液（Ｓ）よりもペレット（Ｐ）に保持されていることを示す、クーマシーブルーで染色したＳＤＳゲルの写真である。
【図４】単離神経末端（シナプトソーム）におけるエキソサイトーシス（ａ、ｃ）およびエンドサイトーシス（ｂ、ｄ）の蛍光定量的アッセイにより、Ａ４７ではなくてビス−チルホスチンが特異的にエンドサイトーシスを減少させることが示されている。回復効率は、前述のエキソサイトーシス量に関連した、より正確なエンドサイトーシスの測定値であり、ビス−チルホスチンは、回復効率（ｅ）において有意なブロックを生じた。
【図５】単離ラット脳神経末端（シナプトソーム）の電子顕微鏡写真により、ビス−チルホスチン添加時のシナプトソームにおけるシナプス小胞の欠損に次いで、脱分極（ａ、ｂ）および小胞陥入ならびに環化ピットの蓄積（ｃ〜ｈ）による刺激が示されている。
【図６】テキサスレッド標識トランスフェリンのＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞（ａ〜ｄ）またはＨＥＲ１４細胞（ｅ〜ｄ）への内在化が、１００μＭのビス−チルホスチンによる１５分の前温置により阻害されていることを示す写真である。ＤＡＰＩ（青色）染色は、細胞核を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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