(57)【要約】フェンレチニドすなわちＮ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（４−ＨＰＲ）の代謝物、特に４−オキソ−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（４−オキソ−４−ＨＰＲ）基づく薬剤は、異なる種類の腫瘍の治療、特に、卵巣がん、乳がんおよび神経芽細胞腫の治療に使用される。この薬剤はフェンレチニド単剤と比べてより強力であり、フェンレチニドと併用投与されるとフェンレチニドの効果を増強する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェンレチニドすなわちＮ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（４−ＨＰＲ）の代謝物、特に以下の化学式から成る４−オキソ−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（４−オキソ−４−ＨＰＲ）から成る薬剤。
【請求項２】
フェンレチニドすなわちＮ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（４−ＨＰＲ）をさらに含有する請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
治療を必要とする患者に対する過剰増殖症の治療方法であって、フェンレチニドすなわちＮ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（４−ＨＰＲ）の代謝物、特に以下の化学式から成る４−オキソ−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（４−オキソ−４−ＨＰＲ）から成る薬剤を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項４】
前記患者に対して、４−オキソ−４−ＨＰＲと４−ＨＰＲを併用して投与することを含む請求項３記載の方法。
【請求項５】
卵巣がんの治療における請求項３および４いずれか記載の方法。
【請求項６】
乳がんの治療における請求項３および４いずれか記載の方法。
【請求項７】
神経芽細胞腫の治療における請求項３および４いずれか記載の方法。
【請求項８】
薬剤卵巣がんの治療における請求項１および２いずれか記載の薬剤の用途。
【請求項９】
乳がんの治療における請求項１および２いずれか記載の薬剤の用途。
【請求項１０】
神経芽細胞腫の治療における請求項１および２いずれか記載の薬剤の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍特性を有することが知られている合成レチノイドフェンレチニドの一代謝物の臨床使用に関する。特に本発明は、がんの予防および治療のための代謝物である４−オキソ−フェンレチニドの使用、および、フェンレチニド活性を増大しおよび／またはフェンレチニド耐性を克服するための該代謝物とフェンレチニドとの併用に関する。
【背景技術】
【０００２】
レチノイド類は、ビタミンＡ（レチノール）の天然誘導体および合成誘導体であり、増殖、分化、アポトーシス等、異なる細胞過程を調節する。これらレチノイド類は、種々の腫瘍に対する治療および予防のために臨床的な関心の高い化合物である。フェンレチニド、すなわちＮ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（４−ＨＰＲ）は合成レチノイド（オールトランス型レチノイン酸のアミド）であり、前臨床モデルにおいて、他の多くのレチノイド類よりも毒性が低い一方、有意な生物活性を維持することが証明されている（Ｍｏｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９７９年、３９：１３３９−１３４６）。動物モデルにおいて４−ＨＰＲは、乳房、前立腺、結腸の発がん、およびリンパ腫生成に対する予防効果、および神経芽細胞腫、乳房、卵巣の腫瘍およびカポジ腫瘍に対する治療効果を有した（Ｆｏｒｍｅｌｌｉら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９９６年、１０：１０１４−１０２４、Ｆｅｒｒａｒｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３年、９：６０２０−６０２９）。成人（Ｖｅｒｏｎｅｓｉら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９９年、９１：１８４７−５６）および小児（Ｇａｒａｖｅｎｔａら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３年、９：２０３２−２０３９）を対象とする臨床試験では、４−ＨＰＲは良好な毒性プロフィールを示し、他のレチノイド類よりも良好な耐性を示した。４−ＨＰＲの主な副作用は、血漿中のレチノール濃度の低下に起因する暗順応の低下であった（Ｆｏｒｍｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８９年、４９：６１４９−６１５２）。４−ＨＰＲはヒトにおいて、例えば口腔白板症（Ｃｈｉｅｓａら、Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９２年、２８Ｂ（２）：９７−１０２）、扁平苔癬（Ｔｒａｄａｔｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１９９４年、７６：１０９−１１１）、紫外線角膜炎（Ｍｏｇｌｉａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１９９６年、１１０：８７−９１）等の前がん病変に対して効果を示し、乳房および卵巣の腫瘍に対する予防に有望な結果を示した（Ｖｅｒｏｎｅｓｉら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９９年、９１：１８４７−５６、Ｄｅ  Ｐａｌｏら、Ｇｙｎｅｃｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．２００２年、８６：２４−２７）。早期乳がんの外科手術施行後に４−ＨＰＲで治療した女性に対する臨床試験では、４−ＨＰＲは閉経前女性の新たな乳がんの発生率を低下させた（Ｖｅｒｏｎｅｓｉら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９９年、９１：１８４７−５６）。同じ試験では、卵巣がんの発生率の有意な低下もまた治療期間中にみとめられた（Ｄｅ  Ｐａｌｏら、Ｇｙｎｅｃｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．２００２年、８６：２４−２７）。実際、このレチノイドは神経芽細胞腫、および乳房および卵巣の腫瘍に対する予防および治療薬として研究中である。
【０００３】
４−ＨＰＲの腫瘍に対する予防および治療活性は、アポトーシスの誘導に関連したその強力な増殖抑制効果に起因している。この抑制効果は、乳房、前立腺、卵巣、頭部および頸部、神経芽細胞腫および白血病等、異なる組織学的種類の腫瘍細胞においてみとめられてきた（Ｆｏｒｍｅｌｌｉら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９９６年、１０：１０１４−１０２４）。このレチノイドの作用機序を理解することにこれまで大きな注目が集められており、また種々の分子標的がこのレチノイドの増殖抑制活性に関与してきた。
【０００４】
４−ＨＰＲの生物学的効果に寄与しうる重要な側面は、その代謝である。４−ＨＰＲが生体内で広範に代謝されることが知られている（Ｈｕｌｔｉｎら、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｐｏｓ．１９８６年、１４：７１４−７１７、Ｆｏｒｍｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８９年、４９：６１４９−６１５２、Ｍｅｈｔａら、Ｅｕｒ．Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、１９９１年、２７：１３８−１４１）。しかし、４−ＨＰＲまたはその一代謝物が活性物質か否か、およびこれらがどのように相互反応するかはわかっていない。さらに腫瘍細胞中の４−ＨＰＲの代謝に関しては何もわかっていない。今日までに同定された唯一の４−ＨＰＲ代謝物はＮ−（４−メトキシフェニル）レチナミド（４−ＭＰＲ）であるが、この物質は親薬物よりも極性が低く、およびマウス、ラットおよびヒトのすべての生体内試験においてみとめられてきた。４−ＭＰＲには異なる腫瘍細胞系における増殖抑制効果がないため、４−ＭＰＲの腫瘍増殖抑制効果には寄与しないように思われる（Ａｐｐｉｅｒｔｏら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００１年、８４：１５２８−１５３４、Ｍｅｔｈａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９８年、３４：９０２−  ９０７）。さらに、担ヒト卵巣がんマウスでは、４−ＭＰＲは抗腫瘍効果を示さず、４−ＨＰＲ活性も増加しなかった（Ｆｏｒｍｅｌｌｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２０００年、３６：２４１１−２４１９）。４−ＭＰＲに加えて、記載した試験はすべて、親薬物よりも極性が高い未確認代謝物の存在を公表している。これら試験のうち一つでは、４−ＨＰＲで治療した女性の正常組織および乳房の腫瘍組織では、４−ＭＰＲは主に脂肪組織に限局していたが、一方、４−ＨＰＲおよび未確認極性代謝物は上皮細胞、すなわち４−ＭＰＲが奏功すると考えられている細胞に集中していたことがみとめられた（Ｍｅｔｈａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９１年、２７：１３８−１４１）。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、フェンレチニドすなわちＮ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（４−ＨＰＲ）の代謝物、具体的には以下の化学式の４−オキソ−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（４−オキソ−４−ＨＰＲ）を、がんの治療および予防のため、およびフェンレチニド耐性の向上および／または克服のために提供する。
化学式：Ｃ２６Ｈ３１ＮＯ３
分子量：４０５
【０００６】
４−ＨＰＲの極性代謝物である４−オキソ−４−ＨＰＲは、レチノイドで治療した腫瘍細胞および４−ＨＰＲの臨床試験に登録した患者から採集した血漿検体中で同定された。
【０００７】
この分子４−オキソ−ＨＰＲは合成物であり、また生体外で増殖した腫瘍細胞中では、４−ＨＰＲ−感受性細胞および４−ＨＰＲ−耐性細胞中で強い増殖抑制活性を示し、４−ＨＰＲよりもより強力であり、４−ＨＰＲと相乗効果を有した。
【０００８】
４−オキソ−ＨＰＲはマウスに投与されると、血漿中のレチノール濃度がわずかに低下し、該レチノール濃度は４−ＨＰＲによって得られる濃度よりも低かった。したがって本発明は、４−ＨＰＲに耐性を有する腫瘍細胞を含めた腫瘍細胞中で奏功するとともに対レチノール効果が４−ＨＰＲによる効果よりも小さく、悪性病変の進展を予防および治療することを目的とした４−オキソ−４−ＨＰＲを提供することを目的とする。さらに、このレチノイド二剤の併用結果は、４−ＨＰＲ活性を向上させおよび／または４−ＨＰＲ耐性を克服する方法を示唆している。
【発明の詳細な説明】
【０００９】
本発明は、がんの予防および治療のために使用可能な薬剤、すなわち抗腫瘍剤４−ＨＰＲの代謝物、より具体的には４−オキソ−ＨＰＲであり、親薬物よりもより強力であり、より広範な範囲の腫瘍細胞増殖抑制活性を有する薬剤を提供する。
【００１０】
この化合物は、４−ＨＰＲで治療した患者の腫瘍細胞または血液検体中で同定してもよく、以下の実施例にしたがって合成してもよい。
（４−オキソ−４−ＨＰＲの同定）
（実施例１）
【００１１】
出願人らは、４−ＨＰＲで治療した患者の血漿中（Ｆｏｒｍｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８９年、４９：６１４９−６１５２）、および５μＭの４−ＨＰＲにＡ２７８０細胞を連続被曝させた後に得たＡ２７８０／ＨＰＲヒト卵巣がん細胞中（Ａｐｐｉｅｒｔｏら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００１年、８４：１５２８−１５３４）において、親薬物４−ＨＰＲおよびその代謝物４−ＭＰＲの他に、親薬物よりも極性が高いもう一つの代謝物が存在したことをすでに公表した。本実施例では、代謝物を同定可能な方法について記載する。
【００１２】
血漿、培地および腫瘍細胞抽出物中に４−ＨＰＲおよびその代謝物が存在するか否かを、既述のとおり（Ｆｏｒｍｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８９年、４９：６１４９−６１５２）高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって評価した。簡単に述べると、血漿検体は、乳がん予防臨床試験に参加した患者から、４−ＨＰＲの連日投与の最後の服用時から１２時間後に採取することによって入手した（Ｆｏｒｍｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８９年、４９：６１４９−６１５２）。Ａ２７８０／ＨＰＲ−細胞ペレットおよびＡ２７８０／ＨＰＲ培地は、５μＭの４−ＨＰＲで治療してから７２時間後に入手した（Ａｐｐｉｅｒｔｏら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００１年、８４：１５２８−１５３４）。すべての手順は、検体を遮光して実施した。細胞ペレットを、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）（Ｓｉｇｍａ）１２５μｇ／ｍｌを抗酸化剤として含有する蒸留水１ｍｌ中に再懸濁し、超音波分解した。血漿、細胞および培地検体それぞれのアリコット２００μｌを、ＢＨＴ１２５μｇ／ｍｌを含有するＣＨ３ＣＮ４００μｌ中に添加し、混合物を、渦巻き形成し、遠心分離によって沈降タンパク質を小球形にした。回収した上清を、Ｃ１８（５μｍ）逆送カラム（１５０×４．６ｍｍ）およびＣ１８プレカラム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ミラノ、イタリア）を装着した液体クロマトグラフ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ノルウォール、コネチカット州）で解析した。移動相は、流速２ｍｌ／分で送達されるＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＯＯＨ（７５：２３：２、体積／体積／体積）から構成された。検出は、Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒのＬＣ９５吸光度検出器を使用して３４０ｎｍで実施した。参照標準品の４−ＨＰＲは、Ｒ．Ｗ．Ｊｏｈｎｓｏｎ医薬研究所（スプリングハウス、ペンシルバニア州、米国）から供給された。
【００１３】
極性代謝物の同定は、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）解析法によってポジティブモードで実施した。ＡＰＣＩ質量スペクトルを、大気圧化学イオン源およびＸｃａｌｉｂｕｒデータシステムを備え、ＨＰＬＣシステムに接続されたＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ  ＬＣＱＤｅｃａ質量分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｍａｔ、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）を使用することによって得た。ＨＰＬＣ分離の条件は、上記と同じであるが、移動相の流速が１ｍｌ／分、Ｃ１８カラムの大きさが１２５×３ｍｍという点が変更された。ＡＰＣＩ−ＭＳインタフェースの作動パラメータは、ＨＰＬＣ分離に流速１０μｌ／分で使用される移動相中の４−ＨＰＲのフローインジェクションを使用して最適化した。最適条件は、シースガス流量：８０任意単位、蒸発温度：３００°Ｃ、放電電流：６μＡ、キャピラリ電圧：３Ｖ、キャピラリ温度：２５０°Ｃ、フラグメント電圧（衝突誘起解離に使用）：３０％等である。ｍ／ｚが２００〜６００の範囲で質量スペクトルを得た。
【００１４】
ポジティブモードでの質量スペクトル解析の結果を図１に公表する。該極性代謝物はｍ／ｚ４０６に、正の分子イオン［Ｍ＋Ｈ］＋を有する化合物であった。アミノ−フェニル−ヒドロキシ基の損失によって、ｍ／ｚ４０６における正の分子イオンを断片化することによって、ｍ／ｚ２９７にフラグメントイオン［Ｍ＋Ｈ］＋−（ＮＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＯＨ）を産出した。これは、４−ＨＰＲのｍｓ２に記録されたフラグメントイオンよりも１４単位大きい。続いて起こるこのイオンの断片化によって、主な断片が４−ＨＰＲのｍｓ３スペクトル中に記録されたパターン中に存在する断片とは、ここでも１４単位だけ異なる断片化パターンを有するms３スペクトルを記録することが可能となった。このことは、４−ＨＰＲがレチノールの環中で酸化されたことを示唆している。したがって、ｍｓ２およびｍｓ３によってこの化合物は、４−オキソ−４−ＨＰＲであると特徴づけられた。
（４−オキソ−４−ＨＰＲの合成）
（実施例２）
【００１５】
４−オキソ−４−ＨＰＲを合成するため、メチル４−オキソレチノール酸塩をすでに記載したとおりに調製した（ＣｕｒｌｅｙおよびＣａｒｓｏｎ、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  Ｄｅｌ．１９８７年、１：２１９−２２４）が、わずかな変更を加えた。すなわち、不安定なメチル４−ブロモレチノール酸塩を上述のとおり調製し、次に、メチル４−ヒドロキシレチノール酸塩を直接生成するために、以前使用した酢酸カリウムの代わりに炭酸カリウムを１．５当量含有する９：１のアセトン／水で処理した。次に該化合物メチル４−ヒドロキシレチノール酸塩を既述のとおり４−オキソレチノイン酸に変換した。４−オキソレチノイン酸（１３ｍｇ）を塩酸化物として活性化し、ＶｉｌｌｅｎｅｕｖｅおよびＣｈａｎのＴｅｔ．  Ｌｅｔｔ．１９９７年、３８：６４８９−６４９２による方法によって４−アミノフェノールで処理した。
【００１６】
結果生じた４−オキソ−４−ＨＰＲをシリカゲル予備調製薄層クロマトグラフィによって精製すると（酢酸エチル／ヘキサン比１：１）、以下の特性を持つ黄色の油として２８％収量の生成物（４．６ｍｇ）を産出した：ＵＶ（メタノール）：λｍａｘ３７１ｎｍ（ε６３，２１０）。１Ｈ  ＮＭＲ（アセトン−ｄ６）：δ１．２６（ｓ、６、（ＣＨ３）２），１．８２（ｓ、３、５−ＣＨ３）、１．８４（ｔ、２、２−ＣＨ２）、６．０１（ｓ、１、１３−Ｈ）、６．３５〜６．４２（ｍ、４、ビニル類）、６．７４（ｄ、２、Ａｒ、Ｊ＝８．９Ｈｚ）、７．０６（ｄｄ、１、１１−Ｈ）、７．５２（ｄ、２、Ａｒ、Ｊ＝８．９Ｈｚ）、８．１２（ｓ、１、Ｏ／Ｎ−Ｈ）、９．０３（ｓ、１、Ｏ／Ｎ−Ｈ）。ＨＰＬＣ：Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（サンラモン、カリフォルニア州、米国）製のモデル１２７ポンプをモデル１６６の検出器とともに、２５０×４．６ｍｍのＵｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳカラムを８５％メタノール／水で１ｍｌ／分で使用して、ｔＲ＝４．８分（純度＞９５％）。Ｃ２６Ｈ３１ＮＯ３＋Ｎａに対するＭＳ（電気スプレイ）：計算値が４２８．２２０２、観察値が４２８．２１９８。ＵＶスペクトルはＢｅｃｋｍａｎ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＤＵ−４０に記録したが、一方１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは４００ＭＨｚでＢｒｕｋｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ビルリカ、マサチューセッツ州、米国）製の分光計に記録した。合成物質に対するＭＳはＭｉｃｒｏｍａｓｓ（ミルフォード、マサチューセッツ州、米国）製のＱＴＯＦ電気スプレイ質量分析計に記録した。
（４−オキソ−４ＨＰＲの生物学的効果）
（腫瘍細胞の増殖抑制）
【００１７】
ヒトの卵巣、乳房および神経芽細胞腫の腫瘍細胞系における４−オキソ−４−ＨＰＲの増殖抑制活性を求め、４−ＨＰＲの増殖抑制活性と比較した。
【００１８】
以下のヒト卵巣がん細胞系に対して試験を行った：Ａ２７８０はＲ．Ｆ．Ｏｚｏｌｓ博士（国立がん研究所、ベテスダ、メリーランド州、米国）から入手した。ＩＧＲＯＶ−１はＤｒ．Ｊ．Ｂｅｎａｒｄ（ビルジュイフ、フランス）から入手した。ＯＶＣＡ４３２はＲ．Ｃ．Ｋｎａｐｐ博士（ボストン、マサチューセッツ州、米国）から入手した。ＯＡＷ４２およびＳＫＯＶ−３はＡＴＣＣ（ロックビル、メリーランド州、米国）から購入した。４−ＨＰＲ耐性卵巣がん細胞系であるＡ２７８０／ＨＰＲは、Ａ２７８０細胞を出願人らの研究室において既述のとおり高濃度の４−ＨＰＲに連続被曝させることによって入手した（Ａｐｐｉｅｒｔｏら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００１年、８４：１５２８−１５３４、Ｐｒｉｎｅｔｔｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３年、２７８：５５７４−５５８３）。簡単に述べると、４−ＨＰＲ含有培地中で６０回移植を行った後も生存していた細胞（１μＭで移植３回、２μＭで移植１１回、３μＭで移植８回、および５μＭで移植３８回）を、希釈を制限して複製した。うち一つのクローンであるＡ２７８０／ＨＰＲを拡大し、４−ＨＰＲに対する感度の試験を行ったところ、４−ＨＰＲの１０倍の耐性を示し、感度は、移植５回ごとに薬剤除去することによって若干可逆性がみられた。したがってＡ２７８０／ＨＰＲ細胞は、絶えず５μＭ中の４−ＨＰＲ中に保持され、対４−オキソ−４−ＨＰＲ感度の試験のために実施した全実験において、４−ＨＰＲの非存在下で播種された。
【００１９】
Ｒ．Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ博士（Ｇａｒｖａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、シドニー、オーストラリア）から入手したヒト乳がん細胞系Ｔ−４７Ｄ、ＢＴ−２０およびＭＣＦ−７について試験を行った。ＡＴＣＣから購入したヒト神経芽細胞腫細胞系ＳＫ−Ｎ−ＢＥ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＭＣおよびＧＩ−ＬＩ−Ｎについて試験を行った。全細胞系は、ＣＯ２５％中に１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する培地中で単層で３７°Ｃで検査した。Ａ２７８０、Ａ２７８０／ＨＰＲ、ＩＧＲＯＶ−１、ＯＶＣＡ４３２、ＳＫＯＶ−３、Ｔ−４７Ｄ、ＢＴ−２０、ＭＣＦ−７、ＧＩ−ＬＩ−ＮおよびＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞の培地はＲＰＭＩ１６４０（Ｃａｍｂｒｅｘ、ベルビエ、ベルギー）であり、ＯＡＷ４２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣおよびＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の培地はＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ）であった。
【００２０】
増殖抑制アッセイでは、細胞を、９６枚のクラスタ組織培地皿中で、細胞３５００個／ウェルの密度で播種し、異なる濃度の４−オキソ−４−ＨＰＲまたは４−ＨＰＲを播種した後２４時間処理した。４−オキソ−４−ＨＰＲを無水エタノール中に溶解し、４−ＨＰＲ（Ｊ．Ａ．Ｃｒｏｗｅｌｌ博士：ＮＣＩベテスダ、メリーランド州、米国から入手）をＭｅ２ＳＯ中に溶解した。４−オキソ−４−ＨＰＲおよび４−ＨＰＲを、濃度１０ｍＭで溶解し、Ｎ２下で−８０°で暗所で保存し、その後培地中でさらに希釈し最終濃度範囲０．３〜１０μＭとした結果、エタノールおよびＭｅ２ＳＯの濃度は０．１％を超えなかった。対照培地には、処理済培地として同量のエタノールまたはＭｅ２ＳＯを添加した。処理から７２時間後の細胞数を、Ｍｏｎｋｓら（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９１年、１１：７５７−７６６）によるスルホローダミンＢアッセイを使用して求めた。種々の薬剤濃度に対する処理済細胞の生存率を、対照細胞の生存率に対するパーセントとして計算した。各細胞系における４−オキソ−４−ＨＰＲおよび４−ＨＰＲの増殖抑制活性を三つの個別の実験で試験し、平均値±標準偏差を図２、３および４に公表する。
【００２１】
種々の濃度の４−オキソ−４−ＨＰＲまたは４−ＨＰＲで７２時間処理した後の、卵巣がん細胞系５個の生存率を図２に公表する。すべての試験細胞系において４−オキソ−４−ＨＰＲのほうが４−ＨＰＲよりも、腫瘍細胞生存率の低下により有効であった。４−オキソ−４−ＨＰＲは、４−ＨＰＲに対して耐性が誘発されたＡ２７８０／ＨＰＲ細胞においても高い有効性を示したことから、親薬物４−ＨＰＲとの交差耐性は示さなかった。４−オキソ−４−ＨＰＲは、乳がん細胞系中で試験すると（図３）、４−ＨＰＲよりもＢＴ−２０およびＭＣＦ−７中ではより強力であり、Ｔ−４７Ｄ中の４−ＨＰＲとはほぼ同じ有効性であった。試験を実施した神経芽細胞腫細胞系４個のうち（図４）、ＳＫ−Ｎ−ＢＥおよびＳＫ−Ｎ−ＳＨは、４−オキソ−ＨＰＲに対する感度のほうが４−ＨＰＲに対する感度よりも高く、ＳＫ−Ｎ−ＭＣは低濃度（０．３μＭ）で試験した場合のみより感度が高く、ＧＩ−ＬＩ−Ｎは感度に差がなかった。図２、３および４に公表したグラフから計算した４−オキソ−４−ＨＰＲおよび４−ＨＰＲの５０％抑制濃度（ＩＣ５０）を表１に公表する。
【００２２】
全試験細胞系において、４−オキソ−４−ＨＰＲのＩＣ５０は４−ＨＰＲのＩＣ５０よりも低かった。
（アポトーシスの誘導）
【００２３】
４−ＨＰＲの作用機序はよく理解されていないものの、４−ＨＰＲの腫瘍増殖抑制効果はアポトーシスの誘導が原因であった（Ｓｕｐｉｎｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９６年、６５：４９１−４９７）。ヒト卵巣がん細胞系Ａ２７８０中、および対照である４−ＨＰＲに対する耐性が誘導されたＡ２７８０／ＨＰＲ中で、４−オキソ−４−ＨＰＲのアポトーシス誘導効果を、４−ＨＰＲの効果と比較した。アポトーシスは、細胞死検出ＥＬＩＳＡプラスアッセイキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＧｍｂＨ、ドイツ）によって、製造業者の指示にしたがって評価した。このアッセイは、アポトーシス中に増加する細胞質ヒストン関連ＤＮＡ断片の量を定量する。細胞を９６ウェル細胞培地皿中に播種し、翌日、５μＭの４−オキソ−４−ＨＰＲまたは４−ＨＰＲで２４時間処理した。処理済細胞におけるＤＮＡ断片化を、対照細胞におけるＤＮＡ断片化の倍数として表し、図５に公表する。Ａ２７８０細胞では、４−オキソ−４−ＨＰＲによるアポトーシスの誘導は４−ＨＰＲによる誘導よりもより効果が高かった。また４−オキソ−４−ＨＰＲは、Ａ２７８０／ＨＰＲ細胞中でアポトーシスも誘導したが、一方４−ＨＰＲは効果を示さなかった。
（４−オキソ−４−ＨＰＲと４−ＨＰＲの併用処理による増殖抑制活性）
【００２４】
４−オキソ−４−ＨＰＲが４−ＨＰＲの腫瘍増殖抑制効果を増強するか否かを評価するため、試験を実施した。Ａ２７８０細胞を、４−ＨＰＲおよび４−オキソ−４−ＨＰＲに、種々の範囲の濃度で単剤、および両剤に三つの異なる濃度すなわち１：０．３、１：１、１：３で被曝させた。３日間処理した後の断片生存率（ｆ）を実験条件ごとに計算した。次に、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙによってＡｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．１９８４年、２２：２７−５５に記載された、５０％有効解析に基づいたＣａｌｃｕｎＳｙｎのソフトウェアを使用して、この２薬剤の併用効果を求めた。それぞれの断片生存率（ｆ＝０．８０、０．７０、．．．．、０．２０、０．１０）に対して、以下の式にしたがって併用指数（ＣＩ）を計算した。
【００２５】
ＣＩ＝（Ｄ）１／（Ｄｆ）１  ＋  （Ｄ）２／（Ｄｆ）２  ＋  α［（Ｄ）１（Ｄｆ）２／（Ｄｆ）１（Ｄｆ）２］、ここで（Ｄ）１および（Ｄ）２は断片生存率ｆを生成するために必要な併用薬剤の濃度であり、（Ｄｆ）１および（Ｄｆ）２はｆを生成するために必要な個々の薬剤の濃度であり、両薬剤の作用機序が相互排他的である場合はα＝０、および非相互排他的である場合はα＝１である。ＣＩ＜１．０は、相乗効果を示し、ＣＩ＝１．０は相加効果を示し、ＣＩ＞１．０は拮抗作用を示す。４−オキソ−４−ＨＰＲと４−ＨＰＲの併用による実験結果を図６に示す。試験を行った三つの比率では、この２薬剤の併用によって、この２薬剤から単剤で得られるよりもより大きな増殖抑制がみとめられた。相互排他的であると仮定すると、全濃度においてＣＩ値は１未満であり、この２薬剤の相乗的相互反応を示唆している。この２薬剤の併用の１回の単回投与による増殖抑制活性の試験も、他の卵巣がん細胞系および乳がん細胞系で実施した。４−ＨＰＲと４−オキソ−４−ＨＰＲとの相互反応の種類を、ＤｒｅｖｉｎｋｏらによるＣａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９７６年、１：１８７−１９５に記載の方法で評価した。この評価の場合、この２薬剤は独立して奏効すると仮定した。併用指数（ＣＩ）は、４−ＨＰＲと４−オキソ−４−ＨＰＲの併用による生存断片（ＳＦ）を（ＳＦ  ４−ＨＰＲ  ×  ＳＦ  ４−オキソ−４−ＨＰＲ）で除することによって計算した。ＣＩに対する結果は、ＣＩ＝１は相加効果を示し、ＣＩ＜１は相乗効果を示し、ＣＩ＞１は亜相加的効果を示すと定義される。単剤による実験の結果を表２に示す。４−ＨＰＲと増殖抑制効果のほとんどない４−オキソ−４−ＨＰＲとの投与を併用すると、一つの細胞系を除く全細胞系で相乗効果を示した。これは、４−オキソ−４−ＨＰＲが４−ＨＰＲの腫瘍増殖抑制効果の増強能を有することを確認するものである。
（血漿レチノールに対する効果）
【００２６】
４−ＨＰＲによる主要な副作用の一つは、暗順応の低下すなわち夜盲症（Ｆｏｒｍｅｌｌｉら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９９６年、１０：１０１４−１０２４）であり、これは血漿中のレチノール濃度の低下を原因とする（Ｆｏｒｍｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：６１４９−６１５２）。マウスにおいて、血漿中のレチノール濃度に対する４−オキソ−４−ＨＰＲの影響を評価し、４−ＨＰＲによる影響と比較した。動物実験が、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｚｉｏｎａｌｅ  Ｔｕｍｏｒｉ（ミラノ、イタリア）の倫理委員会に承認され、国家および国際ガイドライン（１９９２年１月２７日付イタリア準拠法、政令１１６、および腫瘍実験における動物の福祉に関するＵＫＣＣＣＲガイドライン。Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９８８年、５８：１０９−１１３）にしたがって実施された。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（カルコ、イタリア）からメスのＳｗｉｓｓ系ヌードマウス（７〜９週齢）の供給を受け、床敷、食餌、酸性水溶液を備えた殺菌済みケージ内で飼育した。４−ＨＰＲはＪ．Ａ．Ｃｒｏｗｅｌｌ博士−ＮＣＩ、ベテスダ、メリーランド州、米国から入手した。４−オキソ−４−ＨＰＲおよび４−ＨＰＲを無水エタノール中に溶解し、牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州、米国）１．６５ｍｇ／ｍｌを含有する０．９％（重量／体積）ＮａＣｌ滅菌溶液中で希釈し、最終エタノール濃度を１０％（体積／体積）とした。新鮮な薬剤溶液を週に１度調製し、遮光状態で４°Ｃで保管した。マウスは、４−オキソ−４−ＨＰＲまたは４−ＨＰＲを１２０ｍｇ／ｋｇ腹腔内に４日間投与した。この２薬剤を、体重に対する体積比１０ｍｌ／ｋｇで送達した。対照マウスは、４−オキソ−４ＨＰＲおよび４−ＨＰＲの同一の溶媒を投与した。各群３匹のマウスを使用した。薬剤およびレチノールの測定のために、麻酔をかけたマウスの後眼窩叢から、血液検体を、最終投与前および最終投与から５時間後に採取し、ヘパリン入り試験管に収集し、アルミフォイルに入れて遮光した。血漿中のレチノールおよび薬剤の濃度のアッセイを、すでに記載し（Ｆｏｒｍｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８９年、４９：６１４９−６１５２）、上記に公表した（実施例１を参照）ＨＰＬＣによって実施し、表３に公表した。４−ＨＰＲは、血漿中のレチノール濃度を著明に低下（５６％）させたが、一方４−オキソ−４−ＨＰＲは効果が低く、対照マウスにみとめられた濃度と比較してわずかに低下したのみであった。
【００２７】
同量だけ投与した後で求めた血漿中の平均薬剤濃度は、両剤の間にほとんど差はなかった（４−オキソ−４−ＨＰＲが７８３ｎｇ／ｍｌ、４−ＨＰＲが８４７ｎｇ／ｍｌ）。４−ＨＰＲで治療したマウスでは、ヒトでみられたように（実施例１参照）、４−ＨＰＲが４−オキソ−４−ＨＰＲへと代謝された。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
図１は、極性代謝物を同定するためのポジティブモードでの質量スペクトル解析の結果を示す。
【００２９】
図２は、卵巣がん細胞系における４−オキソ−４−ＨＰＲおよび４−ＨＰＲの増殖抑制活性に関する一連の実験の平均値±標準偏差を公表する。
【００３０】
図３は、乳がん細胞系における４−オキソ−４−ＨＰＲおよび４−ＨＰＲの増殖抑制活性に関する一連の実験の平均値±標準偏差を公表する。
【００３１】
図４は、神経芽細胞腫瘍細胞系における４−オキソ−４−ＨＰＲおよび４−ＨＰＲの増殖抑制活性に関する一連の実験の平均値±標準偏差を公表する。
【００３２】
図５は、アポトーシスアッセイの結果を公表し、治療された細胞におけるＤＮＡ断片化は対照細胞中のＤＮＡ断片化の倍数表示として表される。
【００３３】
図６は、４−オキソ−４−ＨＰＲおよび４−ＨＰＲを併用して実施した実験結果を公表し、該併用療法の増殖抑制効果を示す。
【符号の説明】
【００３４】
１／表１
２／腫瘍増殖抑制効果
３／７２時間後の５０％抑制濃度（ＩＣ５０）
４／腫瘍細胞系
５／卵巣
６／乳房
７／神経芽細胞腫
１／表２
２／７２時間後の４−ＨＰＲおよび４−オキソ−４−ＨＰＲの単一剤および併用による増殖抑制活性
３／生存率（対照細胞に対する％）
４／腫瘍細胞系
５／卵巣
６／乳房
７／ＣＩ＝以下のように計算される併用指数：生存断片（ＳＦ）４−ＨＰＲ  ＋  ４−オキソ−４−ＨＰＲ／（ＳＦ  ４−ＨＰＲ  ×  ＳＦ  ４−オキソ−４−ＨＰＲ）。ＣＩ＝１は相加効果、ＣＩ＜１は相乗効果または増強効果、Ｃｌ＞１は亜相加的効果である。
１／表３
２／４−オキソ−４−ＨＰＲおよび４−ＨＰＲａ治療マウスにおける薬剤およびレチノール濃度の低下
３／レチノール
４／治療群
５／ベースライン時
６／治療後
７／低下率（％）
８／対照
９／Ｓｗｉｓｓ系ヌードマウスのメスに対し、４−オキソ−４−ＨＰＫまたは４−ＨＰＲを１２０ｍｇ腹腔投与した。対照マウスには、４−オキソ−４−ＨＰＲおよび４−ＨＰＲに使用された溶媒と同じ溶媒で治療した。各群３例のマウスを使用した。血液検体を、ベースライン時および最終投与時から５時間後に採取した。値は平均標準偏差として表す。
１／図１
２／相対存在量
１／図２
２／卵巣がん細胞系
３／生存率（対照細胞に対する％）
１／図３
２／乳がん細胞系
３／生存率（対照細胞に対する％）
１／図４
２／神経芽細胞腫細胞系
３／生存率（対照細胞に対する％）
１／図５
２／アポトーシスアッセイ
３／ＤＮＡ断片（対照と比較した倍数で表示）
１／図６
２／生存率（対照細胞に対する％）
３／併用指数（ＣＩ）
４／排他的
５／非排他的
６／影響を受けた断片
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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