(57)【要約】  本発明は、T-カドヘリンポリペプチドのそのモジュレーターをスクリーニングするための使用、及び代謝性疾患、婦人科疾患、慢性炎症性疾患及び肝臓また腎臓疾患からなる群から選択された疾患を治療するための前記モジュレーターの使用に関連する。本発明のモジュレーターを使用することで良い代謝性疾患としては、肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症、X症候群、悪液質及び拒食症が挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝性疾患、婦人科疾患、慢性炎症性疾患及び肝臓又は腎臓疾患からなる群から選択される疾患の治療のための候補薬物のための候補モジュレーターをスクリーニングするための標的としてのT-カドヘリンポリペプチドの使用であって、ここで前記候補薬物がT-カドヘリンモジュレーターである使用。
【請求項２】
前記候補モジュレーターが、天然リガンド、小分子、アプタマー、アンチセンスmRNA、小干渉RNA、T-カドヘリンの可溶性形態及び抗体から選択される、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
前記疾患が、肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症及びX症候群から成る群から選択される、請求項1又は2に記載の使用。
【請求項４】
前記疾患が肥満症である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
【請求項５】
前記疾患がII型の糖尿病である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
【請求項６】
前記疾患がX症候群である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
【請求項７】
前記モジュレーターがアゴニストである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用。
【請求項８】
前記候補モジュレーターが、天然リガンド、小分子及びアプタマーからなる群から選択される、請求項7に記載の使用。
【請求項９】
前記疾患が、拒食症及び悪液質からなる群から選択される代謝性疾患である、請求項1又は2に記載の使用。
【請求項１０】
前記モジュレーターがアンタゴニストである、請求項1、2又は9のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１１】
前記T-カドヘリンポリペプチドの活性が、T-カドヘリンポリペプチドのAcrp30への結合を測定することによって評価される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１２】
前記Acrp30がAcrp30の六量体種である、請求項11に記載の使用。
【請求項１３】
前記Acrp30がAcrp30の高分子量種である、請求項11に記載の使用。
【請求項１４】
代謝性疾患、婦人科疾患、慢性炎症性疾患及び肝臓又は腎臓疾患からなる群から選択される疾患の治療のための医薬の調製のためのT-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターの使用。
【請求項１５】
前記疾患が、肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症、X症候群、拒食症及び悪液質からなる群から選択される疾患である、請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
前記モジュレーターが、前記疾患の治療のための公知の薬物との組み合わせにおいて使用される、請求項15に記載の使用。
【請求項１７】
前記疾患が、肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症及びX症候群からなる群から選択される、請求項15又は16に記載の使用。
【請求項１８】
前記モジュレーターがアゴニストである、請求項17に記載の使用。
【請求項１９】
前記疾患が、拒食症及び悪液質からなる群から選択される代謝性疾患である、請求項15又は16に記載の使用。
【請求項２０】
前記モジュレーターがアンタゴニストである、請求項19に記載の使用。
【請求項２１】
天然結合パートナーをスクリーニングするための標的としてのT-カドヘリンポリペプチドの使用であって、ここで当該天然結合パートナーが、代謝性疾患、婦人科疾患、慢性炎症性疾患及び肝臓又は腎臓疾患からなる群から選択される疾患の治療のための候補薬物である使用。
【請求項２２】
前記疾患が、肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症、X症候群、拒食症及び悪液質からなる群から選択される代謝性疾患である、請求項21に記載の使用。
【請求項２３】
前記T-カドヘリンポリペプチドが、ヒトT-カドヘリンである、請求項1〜22のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２４】
前記T-カドヘリンポリペプチドが:
a)配列番号:1を含んで成るポリペプチド;
b)配列番号:1のアミノ酸23〜713を含んで成るポリペプチド;
c)配列番号:1のアミノ酸23〜693を含んで成るポリペプチド;
d)配列番号:1のアミノ酸140〜713を含んで成るポリペプチド;
e)配列番号:1のアミノ酸140〜693を含んで成るポリペプチド;
f)(a)〜(e)のいずれかのムテインであって、ここで当該アミノ酸配列が(a)〜(e)の配列の少なくとも1つと80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%以上の同一性を有するムテイン;
g)(a)〜(e)のいずれかのムテインであって、高ストリンジェント条件下で(a)〜(e)のいずれかをコードするDNAは配列の相補体とハイブリダイズする核酸によってコードされるムテイン;並びに
h)(a)〜(e)のいずれかのムテインであって、アミノ酸配列における任意の変化が、(a)〜(e)におけるアミノ酸の保存的アミノ酸置換であるムテイン、
からなる群から選択される、請求項23に記載の使用。
【請求項２５】
医薬としてのT-カドヘリンの可溶性形態の使用。
【請求項２６】
代謝性疾患、婦人科疾患、慢性炎症性疾患及び肝臓又は腎臓疾患からなる群から選択される疾患の治療のための医薬の調製のためのT-カドヘリンの可溶性形態の使用。
【請求項２７】
前記疾患が、肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症、X症候群、拒食症及び悪液質からなる群から選択される代謝性疾患である、請求項26に記載の使用。
【請求項２８】
前記T-カドヘリンの可溶性形態が、ヒトT-カドヘリンの可溶性形態である、請求項25〜27のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２９】
前記可溶性形態が:
a)配列番号:1のアミノ酸23〜692からなるポリペプチド;
b)配列番号：1のアミノ酸23〜692からなるポリペプチド;
c)(a)又は(b)の少なくとも50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600又は650アミノ酸の断片からなるポリペプチド;
d)(a)〜(c)のいずれかのムテインであって、ここで当該アミノ酸配列が(a)〜(c)の配列の少なくとも1つと80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%以上の同一性を有し;
e)(a)〜(c)のいずれかのムテインであって、高ストリンジェント条件下で(a)〜(c)のいずれかをコードするDNA配列の相補体とハイブリダイズする核酸によってコードされるムテイン;並びに
f)(a)〜(c)のいずれかのムテインであって、アミノ酸配列における任意の変化が、(a)〜(c)のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換であるムテイン、
からなる群から選択される、請求項28に記載の使用。
【請求項３０】
肥満症の治療のためのT-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターの効果を評価する方法であって、当該方法は、当該モジュレーターを肥満症の動物モデルへ投与することを含んで成り、ここで当該モジュレーターが当該動物モデルにおける肥満症の代表的な特徴を改善することを特定することは、当該モジュレーターが肥満症の治療のための薬物であることを示唆する方法。
【請求項３１】
前記動物モデルが、fa/faラット、ob/obマウス、db/dbマウス、レプチン欠損マウス及びレプチンレセプター欠損マウスからなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記代表的な特徴が、ボディーマスインデックス(BMI)、体重及び％体脂肪からなる群から選択される、請求項30又は31に記載の方法。
【請求項３３】
体重の10%以上の減少は、前記モジュレーターが肥満症の治療のための薬物でることを示す、請求項30〜32のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３４】
II型の糖尿病の治療のためのT-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターの効果を評価する方法であって、当該方法は、前記モジュレーターをII型の糖尿病の動物モデルへ投与することを含んで成り、ここで当該モジュレーターが、当該動物モデルにおけるII型の糖尿病の代表的な特徴を改善することを特定することは、前記モジュレーターがII型の糖尿病の治療のための薬物であることを示す方法。
【請求項３５】
前記動物モデルが、C57/BLKsJ糖尿病マウス、KKA(y)マウス、Nagoya-Shibata-Yasuda (NSY)マウス及びdb/dbマウスからなる群から選択される、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記代表的な特徴が、空腹時血しょうグルコース(FPG)レベル、食後グルコースレベル、フルクトサミン及び糖化ヘモグロビン(HbA1c)レベル、総コレステロールレベル、HDLコレステロールレベル、LDLコレステロールレベル及びトリグリセリドレベルから成る群から選択される、請求項34又は35に記載の方法。
【請求項３７】
前記代表的な特徴がHbA1cレベルである、請求項34〜36のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３８】
HbA1cレベルがプラセボに対して0.5%以上減少することは、前記モジュレーターがII型の糖尿病の治療のための薬物であることを示唆する、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
前記モジュレーターがアゴニストである、請求項30〜38のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４０】
前記T-カドヘリンポリペプチドがヒトT-カドヘリンポリペプチドである、請求項30〜39のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４１】
前記T-カドヘリンポリペプチドが:
a)配列番号:1を含んで成るポリペプチド;
b)配列番号:1のアミノ酸23〜713を含んで成るポリペプチド;
c)配列番号:1のアミノ酸23〜693を含んで成るポリペプチド;
d)配列番号:1のアミノ酸140〜713を含んで成るポリペプチド;
e)配列番号:1のアミノ酸140〜693を含んで成るポリペプチド;
f)(a)〜(e)のいずれかのムテインであって、ここで当該アミノ酸配列が(a)〜(e)の配列の少なくとも1つと80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%以上の同一性を有するムテイン;
g)(a)〜(e)のいずれかのムテインであって、高ストリンジェント条件下で(a)〜(e)のいずれかをコードするDNA配列の相補体とハイブリダイズする核酸によってコードされるムテイン;並びに
h)(a)〜(e)のいずれかのムテインであって、アミノ酸配列における任意の変化が、(a)〜(e)におけるアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換であるムテイン、
からなる群から選択される、請求項40に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願の特許請求の範囲は、2003年12月3日に提出された米国仮出願第60/526,956号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、T-カドヘリンポリペプチドのそのモジュレーターをスクリーニングするための使用、及び代謝性疾患、婦人科疾患、慢性炎症性疾患及び肝臓また腎臓疾患からなる群から選択された疾患を治療するための前記モジュレーターの使用に関連する。本発明のモジュレーターを使用することで治療されて良い代謝性疾患としては、肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症、X症候群、悪液質及び拒食症が挙げられる。
【０００３】
発明の背景
1.T-カドヘリン
T-カドヘリンはカルシウム介在型細胞間相互作用及びシグナル伝達に関わる細胞表層タンパク質の巨大なファミリーを含んで成る。カドヘリンは、細胞型及び発現における発生特異性を示し且ついくつかのヒト腫瘍においては異常に制御されている(例えば、Conacci-Sorrellら2002を参照のこと)。
【０００４】
T-カドヘリンはまた、C-末端においてGPIアンカーを介して膜へ結合するH-カドヘリン又はカドヘリン-13として知られている(Taniharaら,1994)。カドヘリンファミリーの他のメンバーと比較して、T-カドヘリンは膜貫通ドメインを欠き且つフォスファチジルイノシトールフォスフォリパーゼC.により細胞を処理することで細胞表層から放出される。T-カドヘリンは神経系で最初に発現されるが、その組織分布は一層広く、そして心臓血管系における発現が最高であり且つ筋における発現量はより低くなる。血管系において、脈管内膜及び媒体に存在し且つ内皮細胞及び平滑筋細胞に局在する(Ivanovら、2001)。
【０００５】
T-カドヘリンの2種類の形態が細胞表層上で発見される。そのひとつは、135 kDaのポリペプチドであり、N-末端付近で解裂して第2の105kDa形態(Tkachukら1998)を生じる。このタンパク質の両方形態は細胞表層上で発見され、ここでそれらはGPIアンカーとリポタンパク質の結合を介してLDL粒子へ結合することができる(Inanovら、2000)。
【０００６】
T-カドヘリンが関わるシグナル伝達経路は知られていないが、T-カドヘリンは、膜タンパク質との結合及び細胞膜の特異的脂質ドメインへの導入によりシグナル伝達に参加することが示唆されている(Doyleら、1998)。T-カドヘリンは、神経系の細胞の成長をコントロールできることも示されている(Takeuchiら、2000)。更に、T-カドヘリンは、星状体の増殖を抑制し且つグリア芽腫細胞系統を減少させる(Huangら、2003)。T-カドヘリンは、正常な血管の建築及びそのアテローム発生の間の再モデリングのコントロールに関わりうることが示唆されている(Ivanovら、2001)。
【０００７】
2.肥満症
2.1.症状
肥満症は、過剰な脂肪の蓄積である。肥満症の症度は身長と体重を測定することによって決定される。往々にして、これらの測定は、体格指数(BMI):体重(kg)÷(身長(m))2に転換される。25〜29.9の値は、体重過多又は軽い肥満症であり、そして30以上は肥満症を示し、そして治療が必要になる。米国において、体重過多及び肥満症は、成人の50%超に影響を与え、急速に増加する有病率を反映する。
【０００８】
肥満症は、体が使用するよりも多いカロリーを消費することによりもたらされる。遺伝的及び環境的な因子が体重に影響を及ぼすが、正確にはそれらがどのようにして特定のヒトの体重を決定するように働くのかは依然として不明である。最近の研究では、平均して、遺伝的影響は体重の約33％に寄与することが示唆されている。脂肪細胞のサイズもしくは数又はその両方の増加は、体に貯蔵される所定量脂肪を加える。肥満体の人々であって、特に子供の間に肥満になる人々は、通常の体重の人々より最大で５倍超の脂肪細胞を有しうる。多くの細胞を減らすことができないので、体重は、各細胞における脂肪の量を減らすことによってのみなくすことができうる。
【０００９】
横隔膜下及び胸部における過剰な脂肪の蓄積は肺に圧力を加え、最も少なく動いただけでも、呼吸を困難にし且つ呼吸を短くする。呼吸における困難は、睡眠に深刻な妨げとなり、呼吸の一時的な中断(睡眠時無呼吸)を生じ、日中の眠気及び他の合併症をもたらす。肥満症はまた様々な整形外科的な問題、皮膚疾患及び足及び足首の問題をも生じうる。肥満症の深刻な合併症としては、冠状動脈疾患の非常により高い危険性及びその主要な危険因子のII型の糖尿病、高脂血症及び高血圧症の増加の危険性が挙げられる。肥満症に関連した多くの病的状態はII型の糖尿病に関連し、何故なら、コントロールに乏しい糖尿病及び肥満症は、まとめてX症候群とされる一群の症状、又は代謝性症候群をもたらすからだ(例えば、Rothら2002)。
【００１０】
2.2.治療
大抵の体重管理プログラムは行動修正に基づいている。食事療法をすることは、食事及び運動の習慣を恒常的に変化させることよりも通常重要度が低いと考えられている。次第に、ドクターは、体重を下げるためにオルリスタット又はシブトラミンなどの薬物を処方する。かかる薬物は、体重を6月以内に約10重量％下げ且つ薬物が続く限り維持する。しかし、それが中断された場合、体重が急速に増え、そして肥満症のための現在の長期効果は失念される。多くの進展が人々の体重を下げる手助けにおいてなされてきたが、彼らは通常、体重を3年以内で取り戻してしまう。肥満症の多くの深刻な合併症により、治療することが重要なものになり、そして手術による治療が重度肥満症の場合にますます一般的になっている。
【００１１】
3.糖尿病
3.1.症状
糖尿病は、体がインスリンを十分に放出又は使用することができないので血中グルコースのレベルが異常に高い疾患である。糖尿病は、体が、血糖レベルを正常に保つ十分なインスリンを生産できない場合又は細胞がインスリンに適切に反応しない場合にもたらされる。
【００１２】
I型の糖尿病(インスリン依存性糖尿病)を伴う人々はインスリンを殆ど又は全く生産しない。米国民の約6％が何らかの糖尿病の形態を有するが、全糖尿病患者の約10％のみがI型の疾患を有する。I型の糖尿病を有する人々の大部分は、30歳前に疾患を発生していた。I型糖尿病では、膵臓のインスリン生産細胞(β細胞)の90％超が恒常的に破壊されている。生じるインスリン欠損は重度であり、そして生きるためにI型糖尿病を有するヒトは規則的にインスリンを注射しなければならない。
【００１３】
II型の糖尿病(非インスリン依存性糖尿病)において、膵臓はインスリンを作り続け、時には通常レベルよりも高く作る。しかし、体はその効果に耐性を有するように発達し、結果的に相対インスリン欠損に至る。II型の糖尿病は、子供及び思春期に生じうるが、通常30歳後に生じ且つ進行して年齢的に共通するようになる：70歳を超えた約15％の人々はII型の糖尿病を有する。肥満症はII型の糖尿病の危険因子であり、そしてこの疾患を有する人々の80〜90％は肥満症である。
【００１４】
糖尿病の他の共通性が少ない原因は、コルチコステロイドが異常に高いレベルにあること、妊娠(妊娠糖尿病)、薬物、及びインスリンの生産又は効果に干渉して、その結果、高い血糖レベルをもたらす毒素が挙げられる。
【００１５】
II型の糖尿病を有する人々は、何年又は何十年となんら症状を有し得ない。インスリン欠損が進行した場合、症状も進行しうる。排尿及び口渇の増加は、最初は穏やかであり且つ何週又は何月に渡り次第に悪化する。血糖値が非常に高くなり(通常1,000mg/dlを超える)、その人は、精神錯乱、眠気、セイズル(seizures)、及び非ケトン高コレステロール血症-高浸透圧昏睡をもたらしうる重度の脱水症を進行する。
【００１６】
時間が経てば、上昇した血糖値により血管、神経及び他の内部構造が傷害される。小血管の壁で構築された複雑な糖ベース物質は、それらを厚くして漏れを生じさせる。それらが厚くなるにつれ、それらが供給する血液がより少なくなり、特に、皮膚及び神経への血液が少なくなる。血糖レベルのコントロールが乏しいことで、脂肪性物質の血液レベルが上昇し、アテローム性動脈硬化症(血管中のプラークの構築)が進行する。アテローム性動脈硬化症は、糖尿病の患者に共通して非糖尿病患者の2〜6倍多く、そして男女両方で生じる。大血管及び小血管を介する循環が乏しいことは、心臓、脳、脚、目、腎臓、神経、及び皮膚に悪影響を与えたえ且つけがの治癒を緩慢にする。
【００１７】
これらの全ての理由のため、糖尿病を有する患者は、多くの深刻な長期合併症を経験しうる。発作及び動機が一層共通する。目の血管に対する傷害は、視界の低下を生じる(糖尿病性レチノパシー)。腎臓が機能異常になり、透析を必要とする腎臓疾患を生じうる。神経に対する傷害は様々な方法で明らかになりうる。もし単一の神経が機能異常になったら(モノニューロパチー)、腕又は脚が突然弱くなりうる。もし手、脚、及び足に対する神経が障害を受けたら(糖尿病性ニューロパチー)、感覚が異常になり且つ腕及び脚のチクチク及び焼けるような痛み及び脱力が生じうる。皮膚の神経に対する障害は、その人が圧力又は温度の変化を感じることができないので、繰り返し一層傷害を生じさせる傾向にある。皮膚に対する血液の供給が乏しいことは、潰瘍につながり、そして全ての創傷治癒が緩慢になる。足潰瘍は、切断される必要がある脚の部分が非常に深く且つ感染しそして治癒に乏しくなりうる。
【００１８】
3.2治療
糖尿病治療の目標は、血液糖レベルを可能な限り正常な範囲内に維持することである。完全に正常なレベルを維持することは難しいが、一時的又は長期合併症が発生するだろうことを少なくし、正常な範囲に一層近くそれらを維持することができる。血液糖レベルをしっかりとコントロールすることに伴う主たる問題は、低血液糖レベル(低血糖症)をもたらす、オーバーシュートの機会が増えることである。
【００１９】
糖尿病の治療には、体重コントロール、運動、及び食事に注意を払うことが必要になる。II型の糖尿病を伴う多くの肥満患者は、もし彼らが体重を落とし且つ運動を規則的に行えば、治療は必要ないだろう。しかし、上記の通り、体重を減らすことは困難である。従って、インスリン代替療法又は経口血糖降下療法が往々にして必要となっている。
【００２０】
経口血糖降下薬の例えば、グリピジド、グリブライド、トルブタミド、及びクロルプロパミドはII型の糖尿病を有する患者の血糖レベルを適切に、インスリンを放出させるために膵臓を刺激することによって及びその効果を増加させることによって下げる。他の型の経口薬物のメトフォルミンは、体が自身のインスリンに対して反応することを増加させる。更なる他の薬物、アカルボースは、腸のグルコースの吸収を遅らせることによって働く。もし、これら経口血糖降下薬が血液糖を十分にコントロールできなければ、インスリン代替療法が必要となる。
【００２１】
インスリン代替療法は、日々の注射によってのみ達成され、従って重い治療である。インスリンの新しい形態、例えば、鼻腔スプレーが試験されている。現在まで、これらの新しい形態は十分に働かず、何故なら吸収速度のばらつきが投与量を決定する上での問題をもたらすからである。
【００２２】
4. Acrp30
脂肪組織は、脂肪を貯めるその能力が長期に渡り知られている一方で、ホルモン及びパラクリン介在物質の例えば、レジスチン、アジプシン、レプチン、及びTNF-αのための源として重要な役割を果たす。総称して、これらの分子は、それらのホルモンとして且つ合成の部位における役割を強調してアジポカインとよばれる。アジポネクチン又はApM-1とも呼ばれるAcrp30はアジポカインであり且つ脂肪組織によってのみ生産されているものである。
【００２３】
マウスAcrp30は、1995(Schererら、1995)に最初同定され、そして脂肪細胞分化の間に100倍上方制御されることが示されている。ヒト類似物は1996年(Maedaら、1996)に同定された。Acrp30は、アミノ末端シグナル配列、しかる後にコラーゲンリピートを含んで成る中心領域、及び球状補体因子C1qに相同性を有するカルボキシル末端ドメインを含む。本明細書中、用語「Acrp30」は、ヒト及びマウスのタンパク質の両方を意味し、そして任意の他の種におけるそれらの類似物を意味する。
【００２４】
4.1.肥満症及びII型糖尿病におけるAcrp30の役割
いくつかの研究によりAcrp30は、肥満症及びII型の糖尿病に関連することが証明されている。遺伝子データは、日本人集団患者におけるAcrp30遺伝子内に位置する非コーディング単一ヌクレオチド多形(SNP)とII型の糖尿病との関連を示している(Haraら、2002)。球状頭部に影響を与えるミスセンス突然変異は更にAcrp30の血清レベルと相関関係が有ることが示されている(Kondoら、2002)。
【００２５】
加えて、Acrp30の血清レベルは、肥満症のいくつかのモデル、例えば、レプチン欠損マウス、レプチンレセプター欠損マウス、及びサルモデルにおいて減少している(例えば、Huら、1996;Yamauchiら, 2001を参照のこと)。ヒトの研究において、Acrp30レベルは、糖尿病及び肥満症の両方と逆に相関し、そしてそれらは更に冠状動脈疾患を有する患者では減少する(Aritaら、1999)。Acrp30のレベル減少とインスリン耐性及びII型の糖尿病の進行の因果関係に関する更なる証拠は、Lindsayら(2002)によって確認されており、彼らはAcrp30の血清レベルがより低いピーマインディアン集団は高レベルを有するものよりもII型の糖尿病を発症しやすいことを示した。
【００２６】
遺伝子中断実験は、肥満症及びII型の糖尿病においてAcrp30が関連する証拠を裏付けるに至った。Maedaら(2002)により、ホモ接合体Acrp30-欠損マウスは正常な食事により維持した場合にはコレステロール血症ではなかったが、血清遊離脂肪酸のクリアランスの減少を示した。高脂肪、高スクロース食に切り替えた場合、それらは重度のインスリン耐性を示し且つコントロール動物に比べて体重増を示した。
【００２７】
Acrp30は、その肥満症及び糖尿病における軸となる働きに加え、多嚢胞性卵巣症候群(Panidisら、2003)、子宮内膜癌(Petridouら、2003)、子癇前症(Ramsayら、2003)、脂肪肝(Xuら、2003)及びネフローゼ症候群(Zoccaliら、2003)などの他の疾患において役割を果たすことが示されている。Acrp30はまた抗炎症性特性を示すことも示されている(Yokotaら、2000).
【００２８】
上記研究の観点において、外性Acrp30は、代謝性疾患の例えば、肥満症及びII型の糖尿病、婦人科疾患、肝疾患及び慢性炎症性疾患などの様々な疾患を治療するための有望な療法である。
【００２９】
4.2.様々なAcrp30種
Acrp30は、高濃度(5〜10μg/ml)で血しょう中に存在し且つ様々な見かけ上の分子量の多数のプールとして存在する(Schererら1995)。
【００３０】
様々な見かけの分子量のこれらの種の構造は、Tsaoら(2002,2003)によって発見された。完全長融合タンパク質として細菌中で発現され、そしてゲルろ過クロマトグラフィーにより分離された場合、Acrp30の3つの種:六量体種及び2つの三量体の種が発見される。真核細胞発現研究は、3つのAcrp30種:高分子量(HMW)物質(それは細菌が生産したタンパク質中では発見されない)、及び六量体に対応する種及び三量体の1つの種を生じた。
【００３１】
いくつかの研究では、Acrp30の球状頭部(本明細書中、以後gAcrp30とよぶ)を含んで成るペプチドに焦点が当てられている。Acrp30とgAcrp30の2つのポリペプチドは、いくつかの類似性を共有するが、in vivo活性に違いが有る。組換えタンパク質による長期治療後、Acrp30と比較して、食物接種に違いはないにもかかわらず、gAcrp30の注射による体重の減少はより大きい(Fruebisら、2001)。他方、Acrp30は、インスリンと相乗的にグルコース生産を減らし、その一方で、gAcrp30はこのアッセイでは活性を有さなかった(Bergら、2001)。
【００３２】
これらの様々な物質の潜在的活性を測定するために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を駆動する多くの転写反応エレメントをC2C12有糸分裂、Acrp30に対応することが知られている細胞においてアッセイされた(Tsaoら、2003)。NF-κB反応性E-セレクチンプロモーターは、Acrp30の添加に反応して活性の増加を示した。断片化した六量体及びHMW種のみが活性があって、他方gAcrp30及び三量体はこのアッセイにおいて不活性であった。IL-6(発現がC2C12筋管のNF-κBによって増加される)は、運動の間に骨格筋によって高レベルで生産され、そして脂肪組織及び肝臓から脂肪酸及びグルコース生産を増加させる引き金であると考えられ、従って、筋肉による使用のための循環する燃料の増加を提供する(Febbraioら, 2002; Kosmidouら, 2002)。従って、Acpr30の六量体及びHMW種は、骨格筋からのIL-6のNF-κB誘導された放出を介して脂肪組織からの脂肪分解を間接的に刺激しうる(Tsaoら、2003)。
【００３３】
Acrp30は肥満症及びII型の糖尿病に関連し、Acrp30シグナル伝達経路のタンパク質の修飾は、代謝性疾患の例えば、肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症、X症候群、拒食症及び悪液質に対する治療手段である。しかし、Acrp30レセプターの単離により、見つけにくいことが証明された。Acrp30のコラーゲン及びヒト大動脈内皮細胞(HAEC)に対する結合は、in vitroで記載されている(Okamotoら2000)。最近、公知の機能の球状及び完全長のAcrp30のための2種類のレセプター、Adipo R1及びAdipoR2が記載された(Yamauchiら2003)。これら2つのAcrp30レセプターはいくつかのドメインを含むことが予想されるが、構造的及び機能的にG-タンパク質結合レセプターとは異なる。Acrp30の六量体及びHMW種のためのレセプターは、科学的文献に記載がなされていない。
【発明の開示】
【００３４】
発明の概要
本発明は、新規Acrp30レセプターの発見に関連する。詳細には、本発明の概要において、T-カドヘリンは、Acrp30の六量体及び高分子量(HMW)種のレセプターであることが示されている。
【００３５】
従って、本発明の第1の観点は、代謝性疾患, 婦人科疾患、慢性炎症性疾患及び肝臓また腎臓疾患から成る群から選択された疾患を治療するための候補薬物をスクリーニングするための標的としてのT-カドヘリンポリペプチドの使用に関連し、ここで前記候補薬物はT-カドヘリンモジュレーターである。
【００３６】
第2の観点は、代謝性疾患、婦人科疾患、慢性炎症性疾患及び肝臓また腎臓疾患からなる群から選択された疾患を治療するための医薬を調製するためのT-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターの使用に関連する。
【００３７】
第3の観点は、天然結合パートナーをスクリーニングするための標的としてのT-カドヘリンポリペプチドの使用に関連し、ここで前記天然結合パートナーは、代謝性疾患、婦人科疾患、慢性炎症性疾患及び肝臓また腎臓疾患から成る群から選択される疾患の治療のための候補薬物である。
【００３８】
第4の観点は、医薬としてのT-カドヘリンの可溶性形態の使用に関連する。
【００３９】
第5の観点は、代謝性疾患、婦人科疾患、慢性炎症性疾患及び肝臓又は腎臓疾患からなる群から選択された疾患を治療するための医薬の調製のためのT-カドヘリンの可溶性形態の使用に関連する。
【００４０】
第6の観点は、肥満症の治療のためのT-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターの効果を評価する方法に関連し、当該方法は当該モジュレーターを肥満症のための動物モデルへ投与することを含んで成り、ここで前記モジュレーターが、前記動物モデルにおける肥満症の代表的な特徴を改善することを特定することは、当該モジュレーターが肥満症の治療のための薬物であることを示す。
【００４１】
第７の観点は、II型の糖尿病の治療のためのT-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターの効率を評価する方法に関連し、前記方法は、前記モジュレーターをII型の糖尿病のために動物モデルへ投与することを含んで成り、ここで前記モジュレーターが、当該モジュレーターが、前記動物モデルにおけるII型の糖尿病の代表的な特長を改善することを特定することは、前記モジュレーターが、II型の糖尿病の治療のための薬物であることを示す。
【００４２】
配列の簡単な説明
配列番号:1は、ヒトT-カドヘリン完全長前駆体に対応する。
配列番号:2は、ヒトAcrp30完全長前駆体に対応する。
配列番号:3は、マウスAcrp30カドヘリン完全長前駆体に対応する。
配列番号:4は、マウスT-カドヘリン完全長前駆体に対応する。
配列番号:5〜18は、プライマー配列に対応する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明は、新規Acrp30レセプターの発見に関連する。詳細には、本発明の範囲において、T-カドヘリンがAcrp30の六量体及び高分子量(HMW)種のためのレセプターであることが示されている。T-カドヘリン過剰発現がAcrp30-誘導NF-κB介在転写を抑制することを示すデータが更に提供されている。従って、本発明は、代謝性疾患の例えば、肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症、X症候群、拒食症及び悪液質の治療において有用である化合物を同定する手段を提供する。詳細に、本発明は、T-カドヘリンポリペプチドの、モジュレーターをスクリーニングするための標的としての使用に関連する。代謝性疾患を治療するための前記モジュレーターの使用は本発明の更なる観点である。
【００４４】
本発明の第一の観点は、代謝性疾患、婦人科疾患、慢性炎症性疾患及び肝臓また腎臓疾患からなる群から選択される疾患の治療のための候補薬物のための候補モジュレーターをスクリーニングするための標的としてのT-カドヘリンポリペプチドの使用に関連し、ここで前記候補薬物はT-カドヘリンモジュレーターである。
【００４５】
本願明細書の全体に渡り使用されている場合、用語「T-カドヘリン ポリペプチド」とは、完全長T-カドヘリンタンパク質及び生物学的に活性を有するその断片を意味する。T-カドヘリンポリペプチドは、ヒト又は動物起源であって良い。好適に、T-カドヘリンポリペプチドはヒト起源である。
【００４６】
最も好適に、ヒトT-カドヘリンポリペプチドは：
a)配列番号:1を含んで成るポリペプチド;
b)配列番号:1のアミノ酸23〜713を含んで成るポリペプチド;
c)配列番号:1のアミノ酸23〜693を含んで成るポリペプチド;
d)配列番号:1のアミノ酸140〜713を含んで成るポリペプチド;
e)配列番号:1のアミノ酸140〜693を含んで成るポリペプチド;
f)(a)〜(e)のいずれかのムテインであって、ここでアミノ酸配列は、(a)〜(e)における配列の少なくとも1つと少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%以上の同一性を有する変異体;
g)高ストリンジェント条件下で(a)〜(e)のいずれかをコードするDNA配列の鋳型にハイブリダイズする核酸によってコードされる(a)〜(e)のいずれかのムテイン;並びに
h)(a)〜(e)のいずれかのムテインであって、アミノ酸配列における任意の変化は、(a)〜(e)のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換であるムテイン、
から成る群から選択される。
【００４７】
用語「T-カドヘリンポリペプチド」は、天然に生じる、組換え、キメラ、合成及び化学合成ポリプチドを包含する。用語「T-カドヘリンポリペプチド」は更に、Tカドヘリンの少なくとも50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600又は650アミノ酸の断片を包含する。ポリペプチドは、T-カドヘリンの突然変異を更に包含する。本明細書中、用語「ムテイン」とは、T-カドヘリンの類似物を意味し、ここで天然T-カドヘリンの１又は数個のアミノ酸残基は、野生型と比較した場合、生じる産物の活性が非常に低下することなく異なるアミノ酸残基によって置換されている、もしくは欠失している、もしくは1又は数個のアミノ酸残基がT-カドヘリンの天然配列へ加えられている。これらムテインは、公知の合成及び/又は部位特異的突然変異誘発技術によって調製されている、又は任意の他の適切な公知技術によって調製されている。
【００４８】
本発明に従い使用されて良いTカドヘリンのムテインとしては、当業者によって、実験をせずに、本願明細書中に提示された教示及び案内及び当業者に公知の方法により慣用に獲得されて良い、置換ペプチド又はポリヌクレオチドと実質的に対応する配列の規定の組が挙げられる。
【００４９】
本発明のT-カドヘリンポリペプチドとしては、本発明に従い、穏和又は高ストリンジェント条件下で、T-カドヘリンをコードする、DNA又はRNAとハイブリダイズする、核酸の例えばDNA又はRNAによってコードされるタンパク質が含まれる。用語「ストリンジェント条件」とは、ハイブリダイゼーション及びその後の洗浄条件を意味し、それは当業界で常用に「ストリンジェント」と呼ばれる(例えばSambrookら、1989を参照のこと)。
【００５０】
ストリンジェント条件の例としては、限定はされないが、例えば、2×SSC及び0.5%SDSで5分、2×SSC及び0.1% SDSで15分;0.1×SSC及び0.5%SDSで37℃で30〜60分、次いで0.1％×SSC及び0.5%SDSで68℃で30〜60分における研究下でのハイブリッドの計算されたTmより下での洗浄条件12〜20℃を含む。当業者は、ストリンジェンシー条件は、DNA配列、オリゴヌクレオチドプローブの長さ(例えば、10〜40塩基)又は混合プローブの長さにも依存することを理解する。もし混合プローブが使用されれば、SSCの代わりにテトラメチル塩化アンモニウム(TTMC)が使用されることが好適である。
【００５１】
本発明に従い使用されて良いT-カドヘリンポリペプチドとしては、配列番号:1又は配列番号:4のT-カドヘリン又はその断片と、50%以上同一、一層好適には60%以上同一、そして更に一層好適には70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一なアミノ酸配列を有するムテインが挙げられる。本発明の件のアミノ酸配列に、例えば95％以上「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、対象のポリペプチド配列が、最大で5アミノ酸変化/件のアミノ酸において各100アミノ酸を含みうることを除いて、件のアミノ酸配列に同一であることを意味する。換言すれば、件のアミノ酸配列に95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を獲得するために、対象配列において最大で5%(5〜100)のアミノ酸残基が、他のアミノ酸で挿入、欠失、又は置換されていて良い。
【００５２】
正確な対応関係がない配列に関して、「%同一性」が決定されて良い。一般に、比較される2つの配列は、当該配列間で最大の相関を与えるように並べられる。これは、アライメントの程度を高めるために、「ギャップ」を配列の片方又は両方に入れることを含む。%同一性は、比較される各配列の全長に渡り決定されて良く(いわゆるグローバルアライメント)、それは同じ又は非常に類似する長さ、又はより短い、規定の長さの配列(いわゆるローカルアライメント)に有効であり、同等の長さの配列のために一層適切である。
【００５３】
本発明に従い使用されて良い突然変異体のための好適な変化は、「保存的置換」として知られているものである。T-カドヘリンポリペプチドの保存的アミノ酸置換は、集団の群内での置換が分子の生物学的機能を保存するだろう十分に類似する薬理化学特性を有する群内での同義アミノ酸を含みうる(Grantham, 1974)。アミノ酸の挿入及び欠失も、特に、当該欠失又は挿入が数個のアミノ酸のみ、例えば13個以下、及び好適には10個以下のアミノ酸を伴い、そして機能的構造に重要なアミノ酸の例えばシステイン残基の除去又は置換を伴わない場合に、上記配列においてそれらの機能を変化させることなく行われて良いことも明らかである。かかる欠失及び/又は挿入によって生産されたタンパク質及びムテインは、本発明の範囲内である。
【００５４】
好適に、同義アミノ酸基は、表Iに規定されたものである。一層好適に、同義アミノ酸基は表IIに規定されたものであり;そして最も好適に同義アミノ酸基は、表IIIに規定された集団である。
【００５５】
【表１】
2007519894.tif 000002
【００５６】
【表２】
2007519894.tif 000003
【００５７】
【表３】
2007519894.tif 000004
【００５８】
本発明において使用するためのT-カドヘリンポリペプチドのムテインを獲得するために使用されて良いタンパク質におけるアミノ酸置換の生産には、公知の方段階が含まれ、それは例えば、US特許第4,959,314、4,588,585及び4,737,462号(Markら);第5,116,943号(Kothsら)、第4,965,195号(Namenら);第4,879,111号(Chongら);及び第5,017,691号(Leeら);US特許第4,904,584号(Shawら)において示されたリジン置換タンパク質が含まれる。
【００５９】
好適に、本発明のムテインは、それが対応するT-カドヘリンポリペプチドと実質上同じ生物活性を示す。最も好適に、本発明のムテインは、それが対応するT-カドヘリンポリペプチドよりも増強された生物活性を示す。
【００６０】
本明細書中で使用された場合、用語「モジュレーター」とは、T-カドヘリンポリペプチドの活性を増加又は減少させる化合物を意味する。本明細書中、「T-カドヘリンモジュレーター」とは、T-カドヘリンポリペプチドの活性を増加又は減少させる化合物並びに/又は当該T-カドヘリンmRNAの転写レベルを増加又は減少させる化合物を意味する。用語「モジュレーター」とはアゴニスト及びアンタゴニストの両方を包含する。
【００６１】
本明細書中で使用された場合、「T-カドヘリンアゴニスト」とは、Acrp30と同じ方向においてT-カドヘリン活性に対する効果を有する化合物を意味する。T-カドヘリン活性に対してAcrp30と「同じ方向の効果」を有する化合物とは、(i)Acrp30が活性を増強するアッセイにおいて試験された場合、前記化合物がT-カドヘリン活性を増強する；及び/又は(i)Acrp30がT-カドヘリン活性を低下させるアッセイにおいて試験された場合、前記化合物がT-カドヘリン活性を低下させる化合物を意味する。用語「アゴニスト」及び「活性化物質」は、同義であると考えられ且つ本明細書全体に渡り交互に使用されて良い。
【００６２】
本明細書中、「T-カドヘリンアンタゴニスト」とは、Acrp30に比べてT-カドヘリン活性に対して反対の効果を有する化合物を意味する。T-カドヘリン活性に対するAcrp30と「反対の効果」を有する化合物とは、(i)Acrp30がT-カドヘリン活性を増強するアッセイにおいて試験された場合、前記化合物がT-カドヘリン活性を低下させ；及び/又は(i)Acrp30がT-カドヘリン活性を低下させるアッセイにおいて試験された場合、前記化合物がT-カドヘリン活性を増大する化合物を意味する。用語「アゴニスト」及び「阻害物質」は、同義であると考えられ且つ本明細書全体に渡り交互に使用されて良い。
【００６３】
あるモジュレーターが、T-カドヘリン活性に対してAcrp30と同じ方向における効果又反対の効果を有するかどうかを特定するための方法が更に下に記載されている。
【００６４】
T-カドヘリンポリペプチドの活性を増加もしくは減少させるそれらの能力又はT-カドヘリンmRNAの発現を増加もしくは減少させるそれらの能力についてモジュレーターを試験するために使用されて良い方法は周知であり且つ更に下に詳説されている。これらのアッセイは、in vitro又はin vivoのいずれかにおいて行われて良い。
【００６５】
本発明の候補分子には、天然に生じる化合物及び合成化合物が含まれる。かかる化合物には、例えば、天然リガンド、小分子、アプタマー、アンチセンスmRNA、小干渉RNA、T-カドヘリン及び抗体の可溶性形態が含まれる。かかる化合物は、本明細書中、「候補化合物」又は「候補モジュレーター」に記される。好適な候補アゴニストには、天然リガンド、小分子及びアプタマーが含まれる。好適な、候補アンタゴニストには天然リガンド、小分子、アプタマー、アンチセンスmRNA、小干渉RNA、T-カドヘリン及び抗体の小分子可溶性形態が含まれる。最も好適な候補アンタゴニストは、T-カドヘリンの可溶性形態である。
【００６６】
本明細書中で使用された場合、「天然リガンド」とは、T-カドヘリンへin vivoで結合する任意のシグナル伝達分子を意味し且つ分子の例えば、脂質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭化水素及び無機分子が含まれる。
【００６７】
本明細書中で使用された場合、用語「小分子」とは比較的重量の低い有機分子を意味する。好適に、小分子は、200未満の原子を含んで成る。最も好適に、小分子は、約50原子〜80原子を含んで成る。
【００６８】
本明細書中で使用された場合、「抗体」とは、免疫系の細胞によって生産されたタンパク質又は抗原に対して結合するその断片を意味する。本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体であって良く、又は一層完全にヒト抗体であって良い。組換え抗体及びその断片は、in vivoでのT-カドヘリンポリペプチドに対する強力な結合及び低い毒性を特徴とする。本発明において使用できうる抗体は、病原性症状もしくは任意の症状もしくは病的症状に関連した症状の集団の優れた改善もしくは緩和するために十分な期間に渡り患者を治療するそれらの能力、並びに低毒性を特徴とする。中和抗体は、動物の例えば、ウサギ、ヒツジ、又はマウスなどの動物中、T-カドヘリンポリペプチドによる免疫化によって容易に生じさせられて良い。免疫化されたマウスは、ハイブリドーマの製造のためにB細胞の源を提供するための特に有用であり、それは順番に、培養されて多量の抗T-カドヘリンモノクローナル抗体を生産する。キメラ抗体は、様々な動物種に由来する2以上のセグメント又は部分を特徴とする免疫グロブリン分子である。一般に、キメラ抗体の可変領域は、非ヒト哺乳類抗体の例えば、マウスモノクローナル抗体に由来し、そして免疫グロブリン定常領域は、ヒト免疫グロブリン分子に由来する。好適に、両方の領域及び組み合わせは、通常決定されるように低免疫源性を有する(Elliottら, 1994)。ヒト化抗体は、遺伝子操作技術によって製造された免疫グロブリンであり、この方法において、マウス定常領域は、マウス抗原結合領域は維持される一方で、ヒトカウンターパートで置換されている。生じるマウス-ヒトキメラ抗体は好適に、ヒトにおける動態薬理学が低下及び改善されている(Knightら、1993)。抗体は、完全ヒト抗体であって良い。ヒト抗体を生産するための技術は、例えば、WO 99/53049、US6,162,963及びAU5,336,100に記載されている。完全ヒト抗体を調製するための一つの方法は、マウス体液性免疫系のヒト化、即ち、内生Ig遺伝子が不活性化されているマウスへヒト免疫グロブリン(Ig)座を導入することによって、ヒトIgを生産できるマウス系統(ゼノマウス)を生産することからなる。Ig座は、最終的に広範な免疫反応を生み出すために必要な物理的構造及び遺伝子再配置及び発現プロセスの両方の観点における複合である。抗体の多様性は、主にIg座における様々なV、D、及びJ遺伝子の間での組み合わせ再配置によって生じる。これらの座はまた、散在した調節エレメントをも含み、そのエレメントは抗体発現、対立遺伝子排除、クラススイッチング及び親和性成熟をコントロールする。未再配置ヒトIgトランス遺伝子のマウスへの導入は、ヒト遺伝子と適合するマウス組換え機構がヒト遺伝子と適合することを証明した。更に、様々なイソ型の特異的hu-mbs抗原を分泌するハイブリドーマは、ゼノマウスを抗原で免疫化することにより獲得されて良い。完全ヒト抗体及びそれらの生産の方法は、当業者に公知である(例えば、WO 98/24893を参照のこと)。
【００６９】
本明細書中で使用された場合、用語「アンチセンスmRNA」とは、アンチセンス通常、プロセッシングされてmRNAになりそして翻訳される鎖に相補的なRNA分子、又はその領域に相補的なRNA分子を意味する。
【００７０】
本明細書中で使用された場合、用語「アプタマー」とは、人工核酸リガンドを意味する(例えば、Ellington and Szostak,1990を参照のこと)。
【００７１】
本明細書中で使用された場合、用語「小干渉RNA」とは、配列特異的翻訳後遺伝子サイレンシングを誘導する二本鎖RNAを意味する(例えば、Elbashirら、2001を参照のこと)。
【００７２】
本明細書中で使用された場合、用語「T-カドヘリンの可溶性形態」とは、膜に結合していないT-カドヘリンポリペプチドを意味する。膜に結合していないT-カドヘリンポリペプチドは、T-カドヘリンポリペプチドのGPIアンカー部位を成熟させることによって当業者により容易に生じさせられて良い。例えば、配列番号:1の位置693におけるグリシンは、他のアミノ酸へ変更されて良い。代替的に、可溶性形態は、GPIアンカー部位を欠くTカドヘリンの断片であって良い。好適に、T-カドヘリンの可溶性形態は、
a)配列番号:1のアミノ酸23〜692からなるポリペプチド;
b)配列番号:1のアミノ酸23〜692からなるポリペプチド;
c)(a)又は(b)の少なくとも50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600又は650アミノ酸の断片からなるポリペプチド；
d)(a)〜(c)のいずれかのムテインであって、(a)〜(c)の配列の少なくとも1つに対してアミノ酸配列が80％、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するムテイン;
e)高ストリンジェント条件下で(a)〜(c)のいずれかをコードするDNA配列の鋳型にハイブリダイズする核酸によってコードされる(a)〜(c)のいずれかのムテイン;及び
f)(a)〜(c)のいずれかのムテインであって、アミノ酸配列における任意の変化が(a)〜(c)のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換であるムテイン、
から成る群から選択されている。
【００７３】
好適に、T-カドヘリンの前記可溶性形態はAcrp30を結合する。好適に、前記T-カドヘリンの可溶性形態は、Acrp30の六量体及び/又はHMW種を結合する。
【００７４】
本明細書中で使用された場合、用語「Acrp30のHMW種」は、6個超のAcrp30ポリペプチドを含んで成るAcrp30ポリペプチドの複合体を意味する。Acrp30のマウスHMW種の見かけ上の分子量は約630kDaである。本明細書中で使用された場合、「Acrp30の六量体種」とは、6個のAcrp30ポリペプチドの複合体を意味する。マウス六量体種の見かけの分子量は約410kDaである。かかる多量体又は六量体複合体は、Tsaoら(2002)において記載されたゲルろ過などによって精製及び/又は分離されて良い。
【００７５】
T-カドヘリンの可溶性形態は更に、異種ポリペプチドに融合したT-カドヘリン又その断片を含んで成るキメラT-カドヘリンポリペプチドを含む。
【００７６】
1つの実施態様において、T-カドヘリンの前記可溶性形態は、免疫グロブリンの全部又は一部へ融合したT-カドヘリン又はその断片を含んで成る。免疫グロブリン融合タンパク質を調製するための方法は当業界で周知であり、それは例えば、WO 01/03737に記載されたものが挙げられる。当業者は、本発明の生じる融合タンパク質がT-カドヘリンの生物活性、特にAcrp30の六量体及び/又はHMW種に結合することを維持していることを理解するだろう。この融合は、直接、又は長さ1〜3アミノ酸でありうるかあるいはそれより長く、長さ13アミノ酸残基のリンカーペプチドを介して良い。前記リンカーは、例えば、配列E-F-M (Glu-Phe-Met)のトリペプチドであって良い、又はT-カドヘリンと免疫グロブリン配列の間に導入される配列Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Metを含んで成る13アミノ酸リンカーであって良い。生じる融合タンパク質は、改良された特性の、例えば、生体流体流の長期滞留時間(半減期)、増加した特異的活性、発現レベルの増加を有し、又は当該融合タンパク質の精製が促されている。好適に、T-カドヘリン又はその断片は、Ig分子の定常領域に融合されている。好適に、それは、重鎖領域の例えば、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインに融合している。他のIg分子のイソ型も本発明の融合タンパク質の生成に適切であり、例えばイソ型の、IgG2又はIgG4が挙げられ、又は他のIgクラスの例えば、IgM又はIgAが挙げられる。融合タンパク質は、単量体又は多量体、ヘテロ又はホモ多量体であって良い。
【００７７】
他の実施態様において、T-カドヘリンの可溶性形態は、T-カドヘリン及びAcrp30の全部又は一部の可溶性領域を結合するキメラ分子である。かかるキメラはIL-6及びそのレセプターIL-6R(Chebathら,1997,WO 99/02552及びWO 97/32891)について記載されている。IL-6R/IL-6キメラは、in vitroにおいて、IL-6と可溶性IL-6Rの混合物がその細胞性レセプターに結合するよりも高い効率で結合する(Kolletら1999)。T-カドヘリンは例えば、完全長Acrp30へ融合して良い。代替的に、T-カドヘリンは、コラーゲンリピートを含んで成るAcrp30の中心領域へ融合しうる。かかるキメラは、六量体及びHMW可溶性キメラ分子を形成するように期待されている。
【００７８】
候補薬物は、例えば、生物ライブラリー、空間アドレス可能パラレル(spatially addressable parallel)固相又は液相ライブラリー、及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法などの当業界で公知の組み合わせライブラリー法における多くの任意の方法を使用することで獲得することができうる。生物学的ライブラリー法は、一般にペプチドライブラリーをともない使用されて良く、しかも他の4つの方法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、アプタマー又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能である。
【００７９】
モジュレーターのための候補化合物をスクリーニングするために使用されて良い方法の一つの例は：
a)T-カドヘリンポリペプチドと候補化合物を接触させ;そして
b)前記T-カドヘリンポリペプチドの活性を候補化合物の存在下で試験する;
段階を含んで成り、
ここで前記化合物の存在下での前記T-カドヘリンポリペプチドの活性における違い又は変化は、当該化合物が当該T-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターであることを示す方法である。好適に、かかる方法は更に、前記化合物の存在下での前記T-カドヘリンポリペプチドの活性と前記化合物の不在下での前記T-カドヘリンポリペプチドの活性を比較する段階を含んで成る。そしてまた好適に、かかる方法は前記候補化合物の不在下での前記T-カドヘリンポリペプチドの活性を試験する段階をも含んで成る。
【００８０】
代替的に、前記アッセイは：
a)T-カドヘリンポリペプチドを発現する細胞と候補化合物を接触させ;そして
b)前記T-カドヘリンポリペプチドの活性を候補化合物の存在下で試験する;
段階を含んで成り、
ここで前記化合物の存在下での前記T-カドヘリンポリペプチドの活性における違い又は変化は、当該化合物が当該T-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターであることを示す方法である。好適に、かかる方法は更に、前記化合物の存在下での前記T-カドヘリンポリペプチドの活性と前記化合物の不在下での前記T-カドヘリンポリペプチドの活性を比較する段階を含んで成る細胞ベースのアッセイであって良い。そしてまた好適に、かかる方法は前記候補化合物の不在下での前記T-カドヘリンポリペプチドの活性を試験する段階をも含んで成る。
【００８１】
モジュレーターは阻害物質又は活性化物質でありうる。阻害物質は、当該阻害物質の不在下でのT-カドヘリン活性に比較して、T-カドヘリン活性を例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、95%又は100%減少しうる。活性化物質は当該活性物質の不在下でのT-カドヘリン活性に比較して、T-カドヘリン活性を例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60％、70%、80%、90%、95%又は100%増加させうる。
【００８２】
前記モジュレーターは、前記T-カドヘリンポリペプチドの全ての活性を調節しうる。モジュレーターは、細胞内のT-カドヘリンmRNA発現を調節し、T-カドヘリンポリペプチドが天然結合パートナーの例えば、Acrp30に結合することを調節する、又は細胞増殖を調節する。
【００８３】
好適な実施態様において、T-カドヘリンポリペプチドの活性は、当該T-カドヘリンポリペプチドがAcrp30へ結合することを測定することによって評価されて良い。T-カドヘリンポリペプチドのAcrp30への結合を測定するためのアッセイは当業者に周知である。例えば、本願明細書の実施例4.2.に記載のFACSアッセイ又は実施例4.3.に記載のELISAアッセイが使用されて良い。かかるアッセイは例えば：
a)T-カドヘリンポリペプチドを発現する細胞と候補化合物及びAcrp30を接触させ;そして
b)前記T-カドヘリンポリペプチドのAcrp30への結合を候補化合物の存在下で試験する;
段階を含んで成り、
ここで前記化合物の存在下での前記T-カドヘリンポリペプチドのAcrp30への結合における違い又は変化は、当該化合物が当該T-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターであることを示す方法である。好適に、かかる方法は更に、前記化合物の存在下での前記T-カドヘリンポリペプチドのAcrp30への結合と前記化合物の不在下での前記T-カドヘリンポリペプチドのAcrp30への結合を比較する段階を含んで成る。そしてまた好適に、かかる方法は：
a)T-カドヘリンポリペプチドを発現する細胞とAcrp30を接触させ;そして
b)前記T-カドヘリンポリペプチドのAcrp30への結合を候補化合物の存在下で試験する、
段階を含んで成る。
【００８４】
1つの実施態様において、Acrp30はAcrp30の六量体種である。他の実施態様において、Acrp30はAcrp30のHMW種である。
【００８５】
更に好適な実施態様において、T-カドヘリンポリペプチドの活性は、細胞内のT-カドヘリンmRNAレベルを測定することによって評価される。この実施態様において、活性は例えば、T-カドヘリンmRNAに特異的なプローブを伴いノーザンブロット、RT-PCR、定量的RT-PCRを使用することによって測定されて良い。代替的に、T-カドヘリンmRNAの発現は、ポリペプチドレベルを、免疫アッセイの例えばELISAアッセイ、又はRIAアッセイ、ウェスタンブロット又は免疫組織化学アッセイにおいてT-カドヘリンポリペプチドに特異的に結合する標識抗体を使用することによって、ポリペプチド量が測定される。
【００８６】
更に好適な実施態様において、T-カドヘリンポリペプチドの活性は、細胞増殖の調節を測定することによって評価される。好適な細胞は、星状細胞などの神経系における細胞である。他の好適な細胞は、C2C12筋管細胞である。かかるアッセイは、例えば、Takeuchら(2000)又はHuangら(2003)に記載されている。
【００８７】
本願明細書の全体を通じて、用語「代謝性疾患」には肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、異常脂質血症、X症候群、アテローム性動脈硬化症、拒食症および悪液質が挙げられる。用語「肥満症」、「II型糖尿病」、「インスリン耐性」、「高コレステロール血症」、「高脂血症」、「異常脂質血症」及び「アテローム性動脈硬化症」は、"The Merck Manual-- Second Home Edition" (Publisher: Merck & Co)に記載の症状を意味する。用語「X症候群」とは、アテローム性動脈硬化症リスク因子、例えば、インスリン耐性、高インスリン血症、異常脂質血症、高血圧症及び肥満症(例えば、Rothら2002を参照のこと)の一群を意味する。用語「悪液質」とは、脂肪の減少を特徴とする症状を意味する。本明細書中で使用された場合、用語「悪液質」とは、AIDS及びガンに関連した萎縮を含むことを意味する。用語「拒食症」とは、歪んだボディー・イメージ、肥満症の恐れ、及び正常体重を最小に維持することが不可能なことを特徴とする症状をいう。
【００８８】
本願明細書の全体に渡り、用語「妊娠疾患」とは女性の生殖系に影響を与える疾患及び/又は妊娠に関連した疾患を意味する。かかる疾患としては、例えば、多嚢胞性卵巣症候群、乳ガン、子癇前症及び子癇が挙げられる。本願明細書全体に渡り使用された場合、用語「肝臓又は腎疾患」には、脂肪肝、ネフローゼ症候群及び慢性腎症候群が挙げられる。本願明細書全体に渡り使用された場合、用語「慢性炎症性疾患」とは、個体の組織又は器官の慢性病源性炎症を意味する。慢性炎症性疾患には、乾癬、関節炎、リューマチ性関節炎、喘息、炎症性腸疾患及び多発性硬化症が挙げられる。上記疾患の全ては、"The Manual--Second Home Edition" (Publisher: & Co)に規定された疾患を意味する。本発明のモジュレーター及びT-カドヘリンの可溶性形態を使用することで治療されて良い他の疾患は、本発明の肥満症及び/又はインスリン耐性に関連した任意のガンの例えば、子宮内膜ガンである。
【００８９】
好適な実施態様において、疾患は代謝性疾患である。
【００９０】
更に好適な実施態様において、疾患は、肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症及びX症候群から成る群から選択された代謝性疾患である。1つの好適な実施態様は、肥満症の治療のための候補薬物のための候補モジュレーターをスクリーニングするための標的としてのT-カドヘリンポリペプチドの使用に関連し、ここで当該候補薬物はT-カドヘリンモジュレーターである。更に好適な実施態様は、II型の糖尿病の治療のための候補薬物のための候補モジュレーターをスクリーニングするための標的としてのT-カドヘリンポリペプチドの使用に関連し、ここで当該候補薬物は、T-カドヘリンモジュレーターである。更に好適な実施態様は、X症候群の治療のための候補薬物のための候補モジュレーターをスクリーニングするための標的としてのT-カドヘリンポリペプチドの使用にも関連し、ここで当該候補薬物は、T-カドヘリンモジュレーターである。
【００９１】
肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症及びX症候群から成る群から選択される疾患を治療するための好適な候補薬物は、T-カドヘリンアゴニストである。従って、本発明の好適な実施態様は、肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症及びX症候群から成る群から選択された疾患を治療するための候補薬物のための候補化合物をスクリーニングするための標的としてのT-カドヘリンポリペプチドの使用に関連し、ここで当該候補薬物は、T-カドヘリンアゴニストである。好適に、前記候補化合物は、天然リガンド、小分子及びアプタマーから成る群から選択される。
【００９２】
T-カドヘリンモジュレーターがT-カドヘリンアゴニスト又はT-カドヘリンアンタゴニストであるかどうかを特定することは、例えば、実施例5に記載のアッセイを使用することで評価されて良い。かかるアッセイは：
a)T-カドヘリンポリペプチドを発現する細胞とモジュレーターを接触させ;そして
b)前記モジュレーターの存在下でNF-κB介在転写を試験する;
段階を含んで成り、
ここで前記モジュレーターがNF-κB介在転写にAcrp30と同じ方向の効果を有することの特定は、当該化合物がT-カドヘリンポリペプチドのアゴニストであることを示唆し、そしてここで当該モジュレーターがNF-κB介在転写にAcrp30と逆の効果を有することの特定は、当該化合物がT-カドヘリンポリペプチドのアンタゴニストであることを示唆する。好適に、かかる方法は更に：
c)T-カドヘリンポリペプチドを発現する細胞とAcrp30ポリペプチドを接触させ;そして
d)Acrp30の存在下及び前記モジュレーターの不在下でNF-κB介在転写を試験する、
段階を含んで成る。
【００９３】
かかるアッセイにおいて、Acrp30は好適に、Acrp30の六量体種又はHMW種である。かかるアッセイにおいて、T-カドヘリンポリペプチドを発現する細胞は、C2C12細胞系統又はT-カドヘリンを過剰に発現するC2C12細胞でありうる。かかるアッセイは、T-カドヘリンアゴニスト又はT-カドヘリンアンタゴニストをスクリーニングするための候補化合物で行われても良い。
【００９４】
運動の間に骨格筋によって高レベルで生産されるIL-6は、脂肪組織から生産される脂肪酸及びグルコース生産の増加を誘発する。Acrp30は、NF-κB活性化により骨格筋からIL-6を放出させる役割を果たすと考えられる(Tsaoら,2003を参照のこと)。従って、T-カドヘリンモジュレーターがT-カドヘリンアゴニストであるかあるいはT-カドヘリンアンタゴニストであるかどうかを特定することは、IL-6遺伝子発現及び/又はIL-6の骨格筋からの放出を測定することによって評価されて良い。かかるアッセイは、例えば：
a)T-カドヘリンポリペプチドを発現する細胞とモジュレーターを接触させ;そして
b)前記のモジュレーターの存在下でIL-6遺伝子発現及び/又は骨格筋からのIL-6放出を試験する;
段階を含んで成り、
ここで前記モジュレーターがIL-6遺伝子発現及び/又は骨格筋からのIL-6放出にAcrp30と同じ方向の効果を有することの特定は、当該化合物がT-カドヘリンポリペプチドのアゴニストであることを示唆し、そして当該モジュレーターがIL-6遺伝子発現及び/又は骨格筋からのIL-6放出にAcrp30と逆の効果を有することの特定は、当該化合物がT-カドヘリンポリペプチドのアンタゴニストであることを示唆する。好適に、かかる方法は更に：
c)T-カドヘリンポリペプチドを発現する細胞とAcrp30ポリペプチドを接触させ;そして
d)Acrp30の存在下及び前記モジュレーターの不在下でIL-6遺伝子発現及び/又は骨格筋からのIL-6放出を試験する、
段階を含んで成る。
【００９５】
かかるアッセイにおいて、Acrp30は好適に、Acrp30の六量体種又はHMW種である。
【００９６】
代替的に、T-カドヘリンモジュレーターがT-カドヘリンアゴニストであるかあるいはT-カドヘリンアンタゴニストで有るかどうかを特定することは、Acrp30活性を評価するための公知の任意のin vivoアッセイによって評価されて良い。
【００９７】
更に好適な実施態様において、疾患は、拒食症又は悪液質である。従って、好適な実施態様は、拒食症又は悪液質の治療のための候補薬物のための候補モジュレーターをスクリーニングするための標的としてT-カドヘリンポリペプチドを使用することに向けられており、ここで当該候補薬物はT-カドヘリンモジュレーターである。悪液質又は拒食症の治療のための好適な候補薬物はT-カドヘリンアンタゴニストである。
【００９８】
更に好適な実施態様において、疾患は婦人科疾患、慢性炎症性疾患もしくは肝臓もしくは腎臓疾患である。悪液質又は拒食症の治療のための好適な候補薬物は、T-カドヘリンアゴニストである。
【００９９】
本発明の更なる観点は、代謝性疾患, 婦人科疾患, 慢性炎症性疾患及び肝臓又は腎臓疾患から成る群から選択された疾患を治療するための医薬を調製するためのT-カドヘリンモジュレーターの使用に関連する。好適に、前記疾患は代謝性疾患である。かかる医薬は、薬理学的に許容できる担体との組み合わせにおけるT-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターを含んで成る。薬理学的に許容できる担体は、当業者に公知の方法によって調製されて良い。生理学的に許容できる担体は限定されないが、Remington's Pharmaceutical Sciences Publishing Company, Easton, USA, 1985に記載されているものである。T-カドヘリンポリペプチドのモジュレーター及び生理的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物は、例えば、静脈内、局所(local)、直腸、局所(topical)、吸入抗原、舌下、皮内、筋内、経口、大脳内及びクモ膜下使用が含まれて良い。組成物は、液体(例えば、溶液、懸濁)、固体(例えば、ピル、錠剤、座薬)又は半固体(例えば、クリーム、ゲル)形態であって良い。投与される投与量は、個体の要請、所望の効果及び選定の投与経路に依存して投与されて良い。
【０１００】
T-カドヘリンモジュレーターを含んで成るかかる医薬は、前記疾患の治療のための任意の公知の薬物との組み合わせにおいて使用されて良い。例えば、肥満症を治療する場合、モジュレーターは、Orlistat, Sibutramine、Rimonabant、Axokine、Fluasterone及び/又はFamoxinとの組み合わせにおいて投与されて良い。II型の糖尿病を治療する場合、モジュレーターは、例えば、Acarbose、Acetohexamide、Chlorpropamide、Glimepiride、Glipizide、Glyburide、Tolazamide、Tolbutamide、Nateglinide、Insulin glargine、Insulin Aspart、Iinsulin glargine、Miglitol、V-411、Repaglinide、Repaglinide, Rosiglitazone及び/又はPioglitazoneとの組み合わせにおいて投与されて良い。T-カドヘリンモジュレーターを含んで成る医薬は、食事の枠において投与されて良い。
【０１０１】
1つの好適な実施態様は、肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症及びX症候群から成る群から選択される代謝性疾患を治療するための医薬を調製するためのT-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターの使用に関連する。この実施態様において、前記モジュレーターは好適にアゴニストである。
【０１０２】
更に好適な実施態様は、悪液質又は拒食症の治療をするための医薬を調製するためのT-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターの使用に関連する。この実施態様において、前記モジュレーターは、好適にアンタゴニストである。
【０１０３】
更に好適な実施態様は、婦人科疾患、慢性炎症性疾患もしくは肝臓もしくは腎臓疾患の治療のための医薬を調製するためのT-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターの使用に関連する。この実施態様において、前記モジュレーターは、好適にアゴニストである。
【０１０４】
本発明の更なる観点は、天然結合パートナーをスクリーニングするための標的としてのポリペプチドの使用に関連し、ここで当該結合パートナーは、代謝性疾患、婦人科疾患、慢性炎症性疾患及び肝臓もしくは腎臓疾患からなる群から選択されている疾患の治療のための候補薬物である。前記疾患は、好適に代謝性疾患である。前記代謝性疾患は、好適に、肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症、X症候群、拒食症及び悪液質からなる群から選択されている。T-カドヘリンポリペプチドを標的として使用することは、代謝性疾患に関わるタンパク質を同定するため且つかかる疾患の治療における新規介入点を提供するための大きな有効性を有する。T-カドヘリンポリペプチドの天然結合パートナーのスクリーニングをするためのかかる方法は、当業界で公知である。
【０１０５】
本発明のT-カドヘリンポリペプチドと反応する候補ポリペプチドをスクリーニングするための一つの方法は以下の：
a)T-カドヘリンポリペプチドからなるポリペプチドを提供し;
b)候補ポリペプチドを獲得し;
c)当該ポリペプチドと当該候補ポリペプチドを接触させ;そして
d)前記ポリペプチドと前記候補ポリペプチド間で形成される複合体を検出する、
段階を含んで成る。
【０１０６】
上記スクリーニング方法の一つの実施態様において、ポリペプチドと前記候補ポリペプチドの間で形成される複合体は、当該T-カドヘリンポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の存在下で更にインキュベートされる。代替的に、当該ポリペプチドと当該候補ポリペプチド間で形成される複合体は、FACS結合アッセイを行うことによって検出される。
【０１０７】
スクリーニング方法の更に特定の実施態様において、前記候補は、ベクター中に含まれたDNA挿入体の発現産物である。例えば、かかるスクリーニング方法は、本願明細書の実施例1及び2に記載のように行われて良い。
【０１０８】
スクリーニング方法の更に特定の実施態様において、結合パートナーはツーハイブリッドスクリーニングアッセイにより同定される。酵母ツーハイブリッドシステムは、タンパク質間相互作用-タンパク質を研究するために設計されており(Fields及びSong)、そしておとりタンパク質が酵母Gal4タンパク質のDNA結合ドメインへ融合することに依存する。この技術は、米国特許第5,667,973号及び5,283,173号に記載されている。ツーハイブリッドアッセイによるライブラリースクリーングの一般手順は、例えば、Fromont-Racineら(1997)により記載されたように行われて良く、当該おとりポリペプチドはT-カドヘリンポリペプチドからなる。一層正確に、T-カドヘリンポリヌクレオチドは、GAL4タンパク質のDNA結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに対してインフレームで融合しており、この融合したヌクレオチド配列は適切な発現ベクター、例えばpAS2又はpM3中へ挿入されている。
【０１０９】
スクリーニング方法の更に特定の実施態様において、結合パートナーは、アフィニティークロマトグラフィーにより同定されている。T-カドヘリンポリペプチドは、適切なカラムマトリクス(例えば、アガロース、AFFI GELなど)へ化学結合させるなどの技術を使用することで結合させられて良い。本方法のいくつかの実施態様において、アフィニティーカラムはキメラタンパク質を含み、ここでT-カドヘリンポリペプチド、またはその断片がグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)と融合する。上記のように細胞タンパク質の混合物又は発現したタンパク質プールは、アフィニティーカラムへ適用される。次いで、当該カラムへ結合したT-カドヘリンポリペプチドと反応するポリペプチドは単離され且つRasmunsen(1997)に記載のように、2次元電気泳動ゲル上で分析される。代替的に、アフィニティーカラム上に維持されたタンパク質は、電気泳動ベースの方法により精製されてシークエンシングされて良い。
【０１１０】
スクリーニング方法の更に特定の実施態様において、結合パートナーは、光学バイオセンサー法(例えば、Edwards及びLeatherbarrow,1997を参照のこと)を介して同定される。この技術は、分子間の反応の検出をリアルタイムで、標識分子を必要とせずに可能にする。
【０１１１】
好適に、T-カドヘリンポリペプチドの候補化合物、候補モジュレーター又は候補天然結合パートナーへ結合することを試験する段階を含んで成る全てのアッセイは、2価カチオンの存在下で行われる。最も好適に、かかるアッセイはCa2+の存在下で行われる。
【０１１２】
本発明の更なる観点は、T-カドヘリンの可溶性形態の使用に関連する。
【０１１３】
本発明の更なる観点は、代謝性疾患、婦人科疾患、慢性炎症性疾患及び肝臓また腎臓疾患からなる群から選択された疾患を治療するための医薬を調製するためのT-カドヘリンの可溶性形態の使用に関連する。T-カドヘリンの可溶性形態は、上記のように容易に生じさせられて良い。好適な実施態様において、T-カドヘリンの可溶性形態は、T-カドヘリンアゴニストとして作用する。
【０１１４】
本発明の更なる観点は、代謝性疾患、婦人科疾患、慢性炎症性疾患及び肝臓また腎臓疾患からなる群から選択された疾患を治療するためのポリペプチドのモジュレーターの効率を評価する方法に関連し、当該方法は、前記モジュレーターを当該疾患の動物モデルへ投与することを含んで成り、ここで当該モジュレーターが、当該動物モデルにおける疾患の代表的特長を緩和することを特定することは、当該モジュレーターが当該疾患の治療のための薬物であることを示唆する。前記疾患は好適に代謝性疾患である。前記代謝性疾患は、好適に肥満症、II型の糖尿病、インスリン耐性、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症、X症候群、拒食症及び悪液質から成る群から選択される。
【０１１５】
更に好適な実施態様において、前記疾患は肥満症である。肥満症の治療のための薬物のスクリーニングのためそして/又は肥満症の治療のためのT-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターの効果を評価するための薬物をスクリーニングするために使用されて良い一つの方法の例は、肥満症の動物モデルに対してモジュレーターを投与することを含んで成り、ここで当該モジュレーターが動物モデルにおける肥満症の代表的な特徴を改善することを特定することは、前記モジュレーターが肥満症の治療のための薬物であることを示唆する。
【０１１６】
肥満症の動物モデル及びある化合物がかかるモデルにおける肥満症の代表的特長を改善するかどうかを特定するためのアッセイは、当業者に周知である。好適な、肥満症のための動物モデルとしては、fa/faラット、ob/obマウス、db/dbマウス、レプチン欠損マウス及びレプチンレセプター欠損マウスが挙げられる(例えば、Pelleymounterら 1995; Ogawaら, 1995; Huら, 1996; Piercy 2000; Yamauchiら, 2001を参照のこと)。
【０１１７】
肥満症を研究する場合、代表的な特徴は、ボディー・マスインデックス(BMI)であって良く、体重、及び/又は％体脂肪である。好適に、代表的な特徴は、ボディー・マスインデックスである。これらの特徴を測定するための方法は、当業者に周知である。更なる実施態様において、T-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターが肥満症の動物モデルの体重を減らすことを特定することは、前記モジュレーターが肥満症の治療のための薬物であることを示唆する。好適に、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%以上の体重の減少は、モジュレーターが乾癬の治療のための薬物であることを示唆する。最も好適に、体重の10%以上の減少は、モジュレーターが肥満症の治療のための薬物であることを示唆する。
【０１１８】
更に好適な実施態様において、疾患はII型の糖尿病である。II型の糖尿病の治療のための薬物をスクリーニングするためにそして/又はII型の糖尿病の治療のためのT-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターの効率を評価するために使用されて良い一つの例は、当該モジュレーターをII型の糖尿病の動物モデルへ投与する段階を含んで成り、ここでモジュレーターが動物モデルにおけるII型の糖尿病の代表的特長を緩和することを特定することは、当該モジュレーターがII型の糖尿病の治療のための薬物であることを示唆する。
【０１１９】
II型の糖尿病の動物モデル及びある化合物が、かかる動物モデルにおけるII型の糖尿病の代表的特長を改善するかどうかを特定するためのアッセイは、当業者周知である。II型の糖尿病のための好適な動物モデルには、C57/BLKsJ糖尿病マウス、KKAマウス、Nagoya-Shibata-Yasuda(NSY)マウス、及び肥満糖尿病(db/db)マウス(例えば、Castleら1993;Piercyら1998;Piercyら2000; Uedaら, 2000を参照のこと)が含まれる。
【０１２０】
モジュレーターが糖尿病の代表的特長を緩和するかどうかを特定することは、当業界で使用可能ないくつかの方法を使用することで行われて良い。例えば、代表的な特徴は、グルコースの血しょう、血清又は血液レベルである。1つの実施態様において、代表的な特徴は、空腹時血しょうグルコース(FPG)レベルである。他の実施態様において、代表的な特徴は食後のグルコースレベルである。代表的な特徴はまた、フルクトサミン及び糖化ヘモグロビン(HbA1c)のレベルである。HbA1cレベル及びFPGレベルがII型の糖尿病治療のための臨床トライアルにおいて使用されている。HbA1cレベル及びFPGレベルは、II型の糖尿病治療のための臨床トライアルの測定において共通して使用されている(例えば、Holmanら1999を参照のこと)。代替的に、代表的な特徴は、総コレステロール、HDLコレステロール、LDLコレステロール及び/又はトリグリセリドのレベルである(例えば、Feinglos 1997を参照のこと)。上記代表的な特徴を測定するための方法は、当業者に公知である。
【０１２１】
更に好適な実施態様において、T-カドヘリンポリペプチドのモジュレーターがプラセボに対して0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、5%、10%、15%、20%以上HbA1cレベルを下げることを特定することは、前記モジュレーターがII型の糖尿病の治療のための薬物であることを示す。本明細書中で使用された場合、用語「プラセボ」とは、T-カドヘリンポリペプチドの前記モジュレーターが投与されていない動物モデルに言及される。
【０１２２】
本発明は完全に記載されており、当業者が本発明の範囲と精神を逸脱することなくそして実験を行わずとも、同等の範囲内のパラメーターにより行われて良いことを理解するだろう。
【０１２３】
本発明は、特定の実施態様との関連において記載されているが、更なる変更ができることも理解されるだろう。本願は、一般に、本発明の原理に従い任意のバリエーション、使用又は適用を網羅することを意図し、そして例えば、かかる出発は当業者が通常行うように開示されたことを含み、以下の添付の特許請求の範囲に開示されるように本質的特徴へ適用されて良い。
【０１２４】
明細書中引用された全ての文献、例えば、ジャーナル記事又はアブストラクト、刊行又は未刊行特許出願、交付済み特許又は他の刊行物は、例えば、全データ、表、図及び文書、全データは全体を参照により組み込まれている。更に、本願明細書中で引用された内容全体も参照によって組み込まれている。
【０１２５】
公知の方法段階を参照すれば、常用の方法段階、公知の方法又は常用の方法は、本発明の実施態様の任意の観点、記載を対応する技術において開示、教示又は示唆していない。
【０１２６】
特異的な実施態様の前記記載は、当業界の公知の技術(例えば、本明細書中に引用された参考文献の内容)を適用することによって本発明の一般的性質を完全に明らかにし、かかる特異的な実施態様の様々な適用のために容易に、実験を伴わず、本発明の一般的な概念から出発することなく変更及び又は適合されて良い。従って、かかる適用及び変更は、本明細書中に提示した教示及び案内に基づいて、開示された実施態様と同等の意味及び範囲内である。本明細書中のフレーズ及び用語は説明する目的であり限定する意味はなく、従って、当該用語又はフレーズは、本願明細書中に記載の案内及び教示の観点から当業者の知識との組み合わせにおいて解釈される。
【実施例】
【０１２７】
実施例1:標識Acrp30の構築及び発現
マウスAcrp30 (配列番号:3)の全体コード配列をpCDNA3.1ベクター中に挿入した。pcDNA3.1ベクターをInvitrogen(Carlsbad, CA)から獲得した。pCDNA3.1ベクターは、クローン化された遺伝子の発現を制御するCMVプロモーターを含む。
【０１２８】
Flag エピトープ のコーティング配列(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)を、PCR突然変異誘発によってAcrp30の予測シグナル配列解裂部位(配列番号:3の位置17におけるアミノ酸)とアミノ末端領域の間に挿入した。この構造体を5'Flag Acrp30エピトープと命名した。PCR突然変異誘発を配列番号:5〜8のプライマーを使用することで行った。配列番号:6及び7のプライマーは、Flag エピトープ及びAcrp30配列をコードする配列を含み、そしてオーバーラップPCRにおいて、シグナル配列の後に標識を導入するために、使用した。配列番号5及び8は、遺伝子の5'及び3'末端においてAcrp30配列をそれぞれ含み、そしてまたpCDNA3.1中へサブクローニングするために使用されるEcoRI部位を含む。
【０１２９】
3'Flag-Acrp30と命名された第二構築体も、PCR突然変異誘発によって、Flag エピトープのためのコーディング配列をAcrp30 cDNAのストップコドンの直前に挿入してカルボキシル末端標識タンパク質を生じさせるために、構築した。PCR突然変異誘発を配列番号:9(EcoRI部位が先導するAcrp30-5'配列を含み)、及び配列番号:10(ストップコドンを欠くAcrp30-3'配列を含み、当該ストップコドンは、直後にストップコドン及びEcoRI部位が続くFlagエピトープをコードする配列で置換されている)のプライマーを使用することで行った。
【０１３０】
これら2つのFlag-Acrp30構築体を配列決定してPCRにより導入されたエラーが生じていないことを確かめた。
【０１３１】
組換えFlag-Acrp30 タンパク質を生成するために、HEK細胞を一過的にこれらの構築体でトランスフェクションした。細胞を血清フリー培地に移した後、上清を回収した。タンパク質の濃度をウェスタンブロットアッセイによって、既知量の精製した細菌発現Flag-標識Acrp30融合タンパク質との比較によって特定した。上清は約5μg/mlの分泌された標識Acrp30を含んだ。
【０１３２】
これらの上清を更に、硫酸アンモニウム沈殿、しかる後の再懸濁タンパク質のFPLC-アニオン交換クロマトグラフィー(HiQ, Bio-Rad)によって精製した。アニオンクロマトグラフィーの後、Flagエピトープのために天然ゲル電気泳動及び免疫ブロッティングは、タンパク質が2種類で発現される解像度を示した。即ち、第一のものは主に三量体5'Flag-Acrp30を含み、他方第二のものは、六量体及びより高分子量5'Flag-Acrp30を含んだ。これらの調製物の精度を約50％SDS-PAGE及びクマジエ染色によって判断した。
【０１３３】
実施例2:Flag-Acrp30 ポリペプチドのC2C12筋細胞、CHO細胞及びBa/F3細胞に対する結合
上記上清から成るFlag-Acrp30ポリペプチドの未分化C2C12筋細胞、CHO細胞及びBa/F3細胞に対する結合を、蛍光-活性化細胞ソーター(FACS)結合アッセイにより行った。
【０１３４】
接着細胞(C2C12及びCHO)又は懸濁細胞(Ba/F3)を2時間に渡り血清フリー培地に移し、次いで30分に渡りエンドサイトーシスを遮断するために4℃でインキュベートした。細胞を1% BSA(PBS中、0.9mM CaCl2 及びMgCl2(PBS++)を含む)中で30分に渡り4℃でインキュベートし、非特異的結合部位を遮断した。残り全ての段階を4℃で行った。この細胞を1:1条件培地(HEK)の溶液中でインキュベートし、そしてブロッキング溶液中で2時間に渡りインキュベートし、PBS++中で2回洗浄し、そして蛍光色素APC(Phyco Link)に接合したFlagエピトープを認識するモノクローナル抗体と1時間に渡りインキュベートした。Flagエピトープを認識する抗体をSigma(St. Louis, MO)から購入した。PBS++中で2度洗浄した後、接着細胞を剥がしてPBS (10% FBS及び5μg/mlのヨウ化プロピジューム(PI)、細胞透過性のマーカーを含む)中で再懸濁して、FACSによって分析した。生存するPI陰性細胞の中央値蛍光を測定した。
【０１３５】
図1は、FACS結合アッセイの結果を示す。各細胞型に関する細胞蛍光中央値を示している。レーン1-3は、バッファーコントロールで行った結合アッセイに対応する。レーン4〜6は、pCDNA3.1ベクター単独(任意の挿入体を欠く(コントロール細胞))でトランスフェクションしたHEK細胞に由来する馴らし培地で行った結合アッセイに対応する。レーン7〜9は、5'Flag-Acrp30トランスフェクションHEK 細胞に由来する馴らし培地で行った結合アッセイに対応する。レーン10〜12は、3'Flag-Acrp30トランスフェクションHEK細胞に由来する馴らし培地で行った。2つの独立実験を行った。馴らし培地とは、実施例1に記載のようにして生成した未精製上清を意味する。
【０１３６】
図1に示すように、Ba/F3細胞は、5'FlagAcrp30(レーン9)又は3'FlagAcrp30(レーン12)のいずれかに実質上結合しなかった。獲得したシグナルは、コントロールトランスフェクション上清(レーン6)、又はブロッキング溶液のみ(レーン3)を加えた場合のいずれかにより獲得されたものと類似した。CHO細胞は、5'Flag-標識Acrp30(レーン8)又は3'Flag-標識Acrp30(レーン11)含有培地のいずれかを含む馴らし培地中でインキュベートした場合に僅かに高いシグナルを、ブロッキングタンパク質のみのコントロール(レーン3)又はコントロールトランスフェクション上清(レーン5)に比べて、生じた。しかし、C2C12細胞は、細胞を5'Flag-Acrp30(レーン7)又は3'Flag-Acrp30(レーン10)のいずれかを含有する馴らし培地中でインキュベートした場合、ブロッキング溶液(レーン1)又はコントロールトランスフェクション上清(レーン4)よりも、シグナルの2倍増加が示された。
【０１３７】
これらの結果は、C2C12細胞(しかしBa/F3細胞ではない)は特異的にAcrp30を結合することを示唆する。
【０１３８】
実施例3:新規Acrp30レセプターのクローニング
3.1.C2C12cDNAライブラリー構築
C2C12細胞系統をcDNA発現ライブラリーの構築のために、それがFlag-Acrp30 ポリペプチドを結合し且つ従来示されている(Fruebisら, 2001)ようにAcrp30に反応して脂肪酸酸化の増加を示すよう選択した。
【０１３９】
未分化C2C12 cDNA発現ライブラリーを2シストロン性レトロウィルスベクターpBI-GFP中で調製した。このベクターは侵入部位(IRES)のコントロール下で緑色蛍光タンパク質(GFP)のコーディング配列を含む(Boganら2001)。クローン化遺伝子又はcDNA挿入体の発現は、個々の細胞におけるGFPの発現に比例する。
【０１４０】
mRNAの量をβ-アクチン遺伝子のノーザンブロット分析によって評価した。逆転写cDNAをレトロウィルスベクターへライゲーションした後、未増幅ライブラリーの特性決定により、約0.5〜1×107個の独立する形質転換体が明らかになった。一次ライブラリーの個々のクローンから調製したプラスミドの制限消化によって、含まれた挿入体の95％は、平均サイズ1.5kbを伴う。感染性cDNAウィルス粒子は、プラスミドをパッケージング細胞系統へ入れることによって生産された(Naviaux 1996)。生じるウィルス含有上清を、およそ5％の2×108ナイーブBa/F3細胞の集団を感染させるために使用した。
【０１４１】
3.2.磁性ビーズの調製
トシル反応基を含有する磁性ビーズ(M280 Dynalビーズ, Dynal)を抗-Flag抗体(M2, Sigma)とインキュベートし、当該ビーズへ抗体を結合させた。結合後、ビーズを1%BSAを含むPBS++の溶液中で1時間に渡りブロッキングし、5'Flag-Acrp30でトランスフェクションしたHEK細胞に由来する馴らし培地40mlを加え、そして一晩4℃でインキュベートした。コントロールビーズを空ベクターpCDNA3でトランスフェクションしたHEK細胞の上清とインキュベートした。ビーズを、上清に結合させた後、2度、0.1%BSAを含むPBS++中で洗浄して同じバッファー中、無菌条件下で保存した。
【０１４２】
3.3磁性ビーズのパニング
C2C12 cDNA発現ライブラリーをインフェクションしたBa/F3細胞を、磁性ビーズへの結合へ委ねる2日前に増大(expand)させた。細胞を調整し且つ実施例2(0.1mg/mlのマウスIgG(Sigma)をブロッキング段階で含んだこと以外は)に記載のようにしてブロッキングした。全ての残りの段階を、ビーズの内在化を避けるために4℃で行った。
【０１４３】
30μlのコントロール磁性ビーズと30mlの細胞(2.4×107/ml)を1時間に渡りインキュベートすることによって非特異的に結合した細胞を除去するために細胞を予め洗浄した。結合した細胞を、磁石の使用により分離し、そして非接着細胞を再度、コントロールビーズに対する結合の2回のラウンドに委ねた。非接着細胞を75μlの5'Flag-Acrp30ビーズで1時間に渡りインキュベートし、その後接着細胞を磁石により分離して3回洗浄(0.1％BSAを伴う10mlのPBS++中5分)した。結合した細胞をこの培養において増大させ;その後のラウンドの結合において、前洗いを、30μlの5'Flag-Acrp30ビーズを加える前に15μlのコントロールビーズで2度行った。結合及び増大の各ラウンドの後、細胞のアリコートをFACS によって、統合されたレトロウィルスを含有する細胞を増やす後のGFP発現のために分析した。
【０１４４】
統合されたレトロウィルスベクターのIRESからのGFP発現は、個々の細胞中のクローン化cDNA挿入体の発現に比例するので (Liuら, 2000)、5'Flag-Acrp30に結合する後の細胞集団のGFP発現の増加は、クローン化されたcDNA付与結合の増加に結びつく。
【０１４５】
3.4.増加させた細胞プールのFACS分析
ビーズに対する結合の1ラウンドの後、コントロールビーズ上の2.4％の細胞、及び5'Flag-Acrp30ビーズ上で精製した1.6％の細胞は、インフェクションしていない細胞に対してGFP-陽性であった。
【０１４６】
結合の2ラウンドの後、コントロールビーズ上で精製した1.7％の細胞及び5'Flag-Acrp30ビーズ上で精製した7.8％細胞は、GFP-陽性であった。
【０１４７】
第3のソーティングによって、コントロールビーズへ結合する細胞結合は、第1のソーティングに比べて増加しておらず、何故なら2.3%がGFP-陽性であった。他方、5'Flag-ビーズへ結合した細胞の73%がGFP陽性であり、当該集団は、統合されたレトロウィルスcDNAクローンを含む細胞について増加をしたことが示された。
【０１４８】
第3のソーティングの間、コントロールビーズに結合した細胞はGFPについて増加をしなかったので、5'Flag-Acrp30ビーズへ結合した細胞の増加による後生効果を除く。従って、増加した細胞集団はAcrp30のレセプターをコードするcDNAを含むようだ。
【０１４９】
3.5.増加させたcDNA挿入体の増幅
ゲノムDNAを、第3の分離後に獲得した異なる細胞プールから調製しそしてレトロウィルスベクターpBI-GFPのcDNAクローニング部位に隣接するレトロウィルス特異的プライマーを使用することで、PCR増幅に委ねた。これら異なる細胞プールはナイーブBa/F3細胞又はcDNAライブラリーをインフェクションしたBa/F3細胞に対応し且つ(i) pcDNA3.1ベクター単独でトランスフェクションしたHEK細胞;(ii)5'Flag-Acrp30発現HEK細胞; 又は(ii)5'Flag-Acrp30発現HEK細胞、の上清と共にインキュベートした磁性ビーズに結合する。5'Flag-Acrp30含有HEK細胞と共にインキュベートした細胞において、コントロール細胞またはナイーブBa/F細胞においてはないが、2.5kbの単一の、特異的なバンドが確認された。
【０１５０】
このバンドをベクターpCRII-Topo中へとサブクローニングして、ベクター特異的プライマーを使用することで末端の配列決定をした。この配列は、マウスT-カドヘリンと同一であった(Gen Bank アクセスNo.BC021628)。挿入体全体の配列決定を可能にするために、配列番号:11〜18のプライマーをT-カドヘリンの公知の配列から設計した。このことにより、完全長T-カドヘリンとして増幅クローンの同一性を確認した。
【０１５１】
従って、T-カドヘリンは、潜在的なAcrp30レセプターである。T-カドヘリンがAcrp30レセプターであるという事実は、更に以下において詳細に確認した。
【０１５２】
実施例4:Acrp30のT-カドヘリンに対する結合
4.1.細胞中でのT-カドヘリンの過剰発現
完全長マウスT-カドヘリンを、発現した配列の標識(IMAGEクローンID 3987627)として獲得し且つpCDNA-Tcad構築体を生じさせるためにpCDNA3.1ベクター中へクローン化した。T-カドヘリンを過剰に発現する3種の細胞系統を生じさせた。
【０１５３】
CHO細胞をpCDNA-Tcadで一過的にトランスフェクションさせた。これら一過的トランスフェクションしたCHO細胞は、先に記載のFACS結合アッセイを使用することでコントロール組織培養上清に比較して5'Flag-Acrp30への結合増加を示した。
【０１５４】
全体T-カドヘリンコーディング配列をpBI-GFP-Tcad構築体を生じさせるためにレトロウィルスpBI-GFPベクター中へとクローン化した。ナイーブBa/F3及びCHO-ER細胞の両方をpBI-GFP-Tcadでトランスフェクションした。CHO-ER細胞系統は、安定にレトロウィルスベクターレセプターを発現し且つエコトロピックウィルスによってインフェクションさせられて良い(Dr. M. MITの贈呈物)。
【０１５５】
4.2.FACSによるT-カドヘリンに対するAcpr30結合の分析
上記全ての細胞系統を、図2に示すように、FACS結合アッセイのために後に使った。パネル1〜3は、コントロールBa/F3細胞のFACS結合アッセイに対応する。パネル4〜9は、レトロウィルスインフェクションT-カドヘリン(pBI-GFB-Tcad)発現Ba/F3細胞のFACS結合アッセイに対応する。結合を:
-0nM(パネル1及び4)、6nM(パネル2及び5、7〜9)、又は60nM(パネル3及び6)の5'Flag-Acrp30六量体;
-60nMのAcrp30六量体(パネル7);
-10mMのEDTA(パネル8);及び
-10μg/mlC1q(パネル9)
について研究した。
【０１５６】
コントロール、未インフェクションBa/F3細胞は、6nM(パネル2)又は60(パネル3)の5'Flag-Acrp30六量体に対して低い結合を示した一方で、Tカドヘリンを発現するBa/F3細胞は、6nM(パネル5、及びパネル7〜9)又は60nM(パネル6)の5'Flag-Acrp30六量体(三量体当量としての濃度)との結合増加を示した。リガンドの不在におけるバックグランド結合は低かった(パネル4)。60nMの真核細胞生産を含む、未標識Acrp30六量体などは6nMの5'Flag-Acrp30の結合(パネル7)を阻害し、Acrp30とT-カドヘリンの間の特異的結合を示す。結合のための2価陽イオンの必要性を調べるために、10mMのEDTAを結合反応に加えた。これは完全に結合を遮断し(パネル8)、2価陽イオンが結合のために必要であることを示す。Acrp30と相同性を共有する分子のC1qは、6nMの5'Flag-Acrp30六量体(パネル9)とインキュベートした場合、20倍過剰(重量で)において結合に影響を及ぼさず、C1qは、Acrp30と同じレセプターには結合しないことを示唆する。
【０１５７】
平行実験において、細菌発現gAcrp30の有意な結合は、T-カドヘリン発現細胞系統、又は三量体哺乳類細胞生産5'Flag-Acrp30の調製物のいずれに対しても確認されなかった。
【０１５８】
この実験は、T-カドヘリンはFlagエピトープへ結合することがなく、従って、5'Flag-Acrp30に対する結合に関しての自明な説明となることを証明する。更に、この結果は、T-カドヘリンがAcrp30の完全長六量体及びAcrp30のHMW種の特異的レセプターであるが、Acrp30の球状又は三量体種に結合しないことを示唆する。
【０１５９】
4.3.ELISAによるT-カドヘリンに対するAcrp30結合の分析
ALISAアッセイを、Acrp30がT-カドヘリンを発現する細胞へ直接結合することを示すために行った。
【０１６０】
2シストロン性レトロウィルス構築体pBI-GFP-TcadをインフェクションしたCHO-ER細胞系統(CHO-T-カドヘリンに言及される)及びpBI-GFPをインフェクションしたコントロール細胞(CHO-GFPに言及される)を各々96ウェルプレートにおいて増殖させた。プレーティング(1.5×104/ウェル)の1日後、細胞を1時間に渡り無血清培地でインキュベートして、4℃に30分に渡り置き、そして4%粉乳ミルクを含むPBS++中で30分に渡りブロッキングした。細菌が発現したFlag-標識球状Acrp30、細菌が発現したFlag-標識完全長、又は精製三量体又は六量体及びHEK細胞中で生産されたHMW5'Flag-Acrp30を指示濃度でブロッキングバッファー中1時間に渡り細胞と共にインキュベートした。HEK発現ポリペプチドを生産し且つ硫酸アンモニウム沈殿及びアニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。三量体を含む又は六量体とHMW 5'Flag-Acrp30の組み合わせを含むプールを天然ゲル電気泳道によって同定しそしてFlag抗体で免疫ブロッティングした。これらの調製物の純度をクマジエPAGE分析によって約50％であると判断した。タンパク質濃度をBCA アッセイによって特定した(Pierce)。精製した細菌発現タンパク質の濃度を280nmの吸光度で測定しそして一次アミノ酸配列から誘導される吸光係数を計算した(Protean; DNAStar)。PBS++中で2度洗浄した後、Flag エピトープ(M2;4μg/ml)に対するモノクローナル抗体を1時間に渡り加え;戦場を繰り返し、しかる後にセイヨウワサビペルオキシダーゼへ結合した第二抗体(ロバ-抗マウス;Jackson)中でインキュベートして、着色TMB基質(Pierce)で呈色した。450nmにおける吸光度をプレートリーダーで測定した。
【０１６１】
結果を図3A及び3Bに示す。図3Aは、CHO-GFP コントロールに対するAcrp30のいくつかの調製物の結合のELISA分析を示す。図3Bは、CHO-T-カドヘリン発現細胞系統を示す。gAcrpは、細菌発現3'Flag-gAcrp30に言及する。完全長Acrpとは、細菌発現3'Flag-gAcrp30に言及する。TRIとはHEK生産三量体5'FlagAcrp30に言及する。HEX及びHMWは、HEK生産六量体及び高分子量5'FlagAcrp30に言及する。4つの独立実験を行った。
【０１６２】
図3Aから確認されるように、コントロール細胞は、試験したタンパク質のいずれにも結合しなかった。図3Bにおいて確認されるように、T-カドヘリンを発現するCHO細胞は、六量体及びHMWに対してのみの結合を示し、しかし5'FlagAcrp30の三量体、オリゴマーの結合に対しての結合は示さなかった。見積もった半分最大結合濃度は、25〜50nM(三量体当量として表した濃度)であった。球状又は完全長細菌生産タンパク質のいずれもT-カドヘリンを発現するCHO 細胞に対する結合がなく、T-カドヘリンによるAcrp30の認識にはAcrpに対する転写後修飾が必要であり且つ球状ドメインが関与しないことを示唆する。従って、T-カドヘリンは、Acrp30の六量体及びHMW 種へ結合することができるが、球状又は三量体種へ結合しない。
【０１６３】
実施例5:T-カドヘリンのNF-κB介在転写に対する効果
T-カドヘリンを過剰に発現する細胞が、Acrp30刺激に対するNF-κB反応を変化したかどうか確かめるために、コントロールpCDNA3.1プラスミド又はpCDNA-T-カドヘリンプラスミド(pCDNA-Tcad)のいずれかを一過的にトランスフェクションした細胞中でのNF-κB介在転写をTsaoら(2002)において記載されたようにして試験した。
【０１６４】
NF-κB活性についてアッセイするために、pCDNA-Tcadを、NF-κB応答エレメントをコードするE-セレクチンプロモーターのコントロール下でルシフェラーゼコーディング配列を含むプラスミドをコトランスフェクションした。E-セレクチンルシフェラーゼ構築体を、Schindler 及びBaichwal(1994)に記載のように、ルシフェラーゼ遺伝子を含むpGL2-基本ベクター(Promega)中へ挿入することによって生じさせた。CMVプロモーターのコントロール下でβ-ガラクトシダーゼを発現する第3のプラスミドもまたコトランスフェクションさせて発現を正常レベルにするために使用した。プラスミドを細胞24ウェルプレート中の細胞へトランスフェクションした。翌日、細胞を指示化合物を含む培地中で6時間に渡りインキュベートした。細胞溶解物のルシフェラーゼ及びβ-ガラクトシダーゼ酵素活性を照度計ベースのアッセイ(promega)で特定した。ルシフェラーゼシグナルをβ-ガラクトシダーゼ活性に対して標準化し且つ同一の構築体でトランスフェクションした未刺激の細胞に対する倍刺激(fold-stimulation)としてプロットした。
【０１６５】
図4は、未分化C2C12筋細胞のNF-κB介在転写の倍刺激を示す。ルシフェラーゼ活性を測定した。カラム1は、 培地単独での6時間処理後の倍刺激を示す。カラム2は、2μg/mlの六量体Acrp30の添加による倍刺激を示す。カラム3は、300ng/mlのLPSの添加による倍刺激を示す。カラム4は、50ng/mlのTNF-αの添加による倍刺激を示す。3つの独立実験を行った。
【０１６６】
カラム1は、T-カドヘリン発現が、コントロール細胞におけるNF-κB介在転写の37％へ基本NF-κB介在転写を抑制することを示す。Acrp30六量体(カラム2)は、2μg/mlの濃度においてNF-κB介在転写を1.8倍刺激する。T-カドヘリン発現細胞において、この刺激は完全に抑制され、何故ならこのNF-κB介在転写は未処理のT-カドヘリン発現細胞と同じ転写レベルを有するからである。カラム3及び4は、300ng/mlのLPS(カラム3)又は50ng/mlのTNF-α(カラム4)のいずれかにより処理されたC2C12細胞を示す。両方の場合、コントロールトランスフェクション細胞において類似する4倍の刺激があり、そして両方場合において、刺激がT-カドヘリン発現によって減少した。しかし、T-カドヘリンはコントロールトランスフェクション細胞の基底レベルに対する刺激を減らした。六量体Acrp30で処理した細胞におけるより更なる抑制はなかった。β-ガラクトシダーゼ発現は、pCDNA及びT-カドヘリントランスフェクション細胞系統の間では変化なく、T-カドヘリンの過剰発現は、非特異的転写抑制をもたらさなかったことを示す。
【０１６７】
まとめると、T-カドヘリンの過剰発現は、いくつかの異なる刺激物が介在するNB-κB介在転写、例えばAcrp30によって開始されるNF-κB介在転写を抑制する。
【０１６８】
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】実施例2で説明したC2C12、CHO及びBa/F3細胞の蛍光活性細胞ソーター結合アッセイの結果を示す。
【図２】実施例4.2で説明したコントロールBa/F3細胞及びT-カドヘリン発現Ba/F3細胞の蛍光活性細胞ソーター結合アッセイの結果を示す。
【図３Ａ】実施例4.3に説明したような、CHO-GFP細胞に対するAcrp30の異なる種の結合のELISA分析を示す。
【図３Ｂ】実施例4.3に説明したような、CHO細胞を発現するT-カドヘリンに対するAcrp30の異なる種の結合のELISA分析を示す。
【図４】実施例5に説明したような、C2C12細胞におけるNF-κBの活性化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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