(57)【要約】本発明は、マイコバクテリア（Mycobacterium ulcerans）病原性プラスミド、pMUM001に関し、特にはこのプラスミドが担持する、マイコラクトン生合成にとって必要かつ十分なポリケチド合成酵素（PKS）およびポリケチド修飾酵素をコードしている遺伝子のクラスターに関する。より具体的には、本発明は、精製または単離された新規なポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリペプチドを産生する工程、これらのポリペプチドに対し生成された抗体、診断方法、キット、ワクチン、治療におけるこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、およびコンビナトリアル合成によるマイコラクトン誘導物または新規ポリケチドの製造のための使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のポリヌクレオチドを含む群から選択される、単離または精製されたポリヌクレオチド：
a）配列番号：1〜6の配列のいずれか一つと少なくとも80％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチド、または配列番号：1〜6の配列の少なくとも15連続ヌクレオチドを有するその断片；
b）配列番号：1〜6のDNA配列を含むポリヌクレオチド；
c）配列番号：7〜12のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
d）配列番号：1〜6の核酸配列を有する変性二本鎖DNAのどちらかの鎖と、高厳密条件下でハイブリダイゼーションする、少なくとも15ヌクレオチドを有するポリヌクレオチド；
e）配列番号：1〜6からインビトロ突然変異により得たポリヌクレオチドである、d）の該ポリヌクレオチド；
f）遺伝コードの結果として、配列番号：1〜6由来の縮重ポリヌクレオチド；
g）a）のポリヌクレオチドの対立遺伝子変異または相同体であるポリヌクレオチド。
【請求項２】
細菌の人工染色体である、請求項1記載の単離または精製されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが、マイコバクテリア（Mycobacterium ulcerans）から抽出された、GC含有量が62.8％であり、81CDSを担持している約174kbを含むプラスミドである、請求項1記載の単離または精製されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
マイコラクトン産生に必要な酵素をコードしている、請求項1記載の単離または精製されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項1記載のポリヌクレオチドがコードする単離または精製されたポリペプチド。
【請求項６】
配列番号：7〜12の配列のいずれか一つと少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項5記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項７】
配列番号：7〜12のアミノ酸配列を含む、請求項5または6記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項８】
マイコラクトンの産生に必要とされる、請求項6記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項９】
非グリコシル化形態の請求項5〜8記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項１０】
請求項1〜4記載のポリヌクレオチドの発現を指示する組換えベクター。
【請求項１１】
請求項10記載のベクターでトランスフェクションまたは形質導入された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項1〜4のいずれか一項に定義されたポリヌクレオチドを含有する、形質転換またはトランスフェクションされた細胞。
【請求項１３】
宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞からなる群より選択される、請求項11または12記載の細胞。
【請求項１４】
大腸菌（Escherichia coli）からなる、請求項13記載の細胞。
【請求項１５】
大腸菌が、登録番号CNCM I-3121またはCNCM I-3122によって、2003年11月3日にInstitut Pasteur（フランス）のCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（C.N.C.M.）に寄託された細胞である、請求項14記載の細胞。
【請求項１６】
発現および培地からのポリペプチドの回収を促進する条件下で請求項11〜15記載の宿主細胞を培養する段階を含む、ポリペプチド産生するための方法。
【請求項１７】
請求項5〜9記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１８】
モノクローナル抗体である、請求項17記載の抗体。
【請求項１９】
MUのMLSポリペプチドおよび該ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む免疫学的複合体。
【請求項２０】
MU感染を検出するための方法であって、MU感染が疑われる生物材料を含む組成物提供する段階、およびMUのMLSポリペプチドの存在をアッセイする段階を含む、方法。
【請求項２１】
MLSポリペプチドを、MLSポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を用いた電気泳動または免疫アッセイによりアッセイする、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
MLSポリペプチドを含む抗原に結合する抗体の有無を検出するためのインビトロ診断法であって、抗原を生物材料と、抗原が生物材料中の抗体と抗原−抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件下で接触させる段階、および複合体の形成を検出する段階を含む、方法。
【請求項２３】
抗原−抗体複合体の形成を測定する段階をさらに含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
抗原−抗体複合体の形成を、ウエスタンブロット技術、ELISA、間接免疫蛍光アッセイまたは免疫沈降アッセイに基づく免疫アッセイにより検出する、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
MLSポリペプチドまたはその混合物に結合する抗体の有無を検出するための診断キットであって、MLSポリペプチドまたはMLSポリペプチドの混合物を含む抗原、および抗原と抗体の間の免疫複合体の形成を検出するための手段を含み、該手段が該検出を実施するのに十分な量存在している、キット。
【請求項２６】
インビボで免疫原性または防御反応を誘導するのに十分な量の、少なくとも一つのMLSポリペプチド、およびそのための薬学的に許容される担体を含む、免疫原性組成物。
【請求項２７】
組成物が少なくとも一つのMLSポリペプチドを中和する量を含む、請求項26記載の免疫原生組成物。
【請求項２８】
MUの有無を検出するための方法であって：
（1）MUの遺伝物質を含有することが疑われるサンプルを、少なくとも一つのヌクレオチドプローブと接触させる段階、および
（2）ヌクレオチドプローブとサンプル中の遺伝物質との間のハイブリダイゼーションを検出する段階
を含み、
該ヌクレオチドプローブが請求項1d）記載のポリヌクレオチドである、方法。
【請求項２９】
以下の段階を含む、マイコラクトンの変種を産生する工程：
a）請求項1a）記載の単離または精製されたポリヌクレオチドの突然変異を誘発する段階、
b）マイコバクテリア株（Mycobacterium strain）での該変異ポリヌクレオチドの発現段階、
c）DNAシーケンシングおよび質量分析法による、マイコラクトン産生が変化したマイコバクテリア突然変異体を選択する段階、
d）選択された、トランスフェクションされたマイコバクテリアの培養段階、ならびに
e）該培養の培養物からマイコラクトン変種抽出段階。
【請求項３０】
単離または精製されたポリヌクレオチドが配列番号：4の配列またはその断片に対し少なくとも80％同一である核酸配列を有する、請求項29記載の工程。
【請求項３１】
以下の段階を含む、成長の速いマイコバクテリアにマイコラクトンを産生させる工程：
a）成長の速いマイコバクテリアの中に配列番号：1、2および3のDNA配列を含む少なくとも三種類の単離されたポリヌクレオチド、または配列番号：1、2および3のヌクレオチド配列を含む、変性した、二本鎖DNAのいずれかの鎖にハイブリダイゼーションする三種類の単離されたポリヌクレオチドをクローニングする段階、
b）適当な培養条件で組換えマイコバクテリアを増殖させることによって単離されたポリヌクレオチドを発現させる段階、および
c）産生したマイコラクトンを精製する段階。
【請求項３２】
単離されたポリヌクレオチドが、配列番号：1〜6のDNA配列か、または配列番号：1〜6のヌクレオチド配列を含む変性した、二本鎖DNAのいずれかの鎖とハイブリダイゼーションする、少なくとも15ヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチドを含む、請求項31記載の工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコバクテリア（Mycobacterium ulcerans）病原性プラスミド、pMUM001、特にこのプラスミドが担持するマイコラクトン生合成のために必要かつ十分であるポリケチド合成酵素（PKS）およびポリケチド修飾酵素をコードする遺伝子クラスターに関する。より具体的には、この発明は、精製または単離された新規ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このようなポリペプチドの製造工程、これらポリペプチドに対し生成された抗体、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの診断方法、キット、ワクチン、治療、およびコンビナトリアル合成によるマイコラクトン誘導体もしくは新規ポリケチドの製造のための使用を目的とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細菌における複合ポリケチドの生合成は、脂肪酸合成酵素関連活性の各セットまたはモジュールがポリケチド鎖伸長の単一な特異的サイクルを支配している分子アッセンブリーラインを構成する、いわゆるモジュラーポリケチド合成酵素（PKS）と呼ばれる巨大なマルチ酵素によってなし遂げられる（Rawlings BJ: Biosynthesis of polyketides (other than actinomycete macrolides). Nat. Prod. Rep. (1999) 16:425-84. Rawlings BJ: Type I polyketide biosynthesis in bacteria (Part A-erythromycin biosynthesis). Nat. Prod. Rep. (2001) 18:190-227; Rawlings BJ: Type I polyketide biosynthesis in bacteria (Part B). Nat. Prod. Rep. (2001) 18:231-281; Staunton J, Weissman KJ: Polyketide biosynthesis: a millenium review. Nat. Prod. Rep. (2001) 18:380-416）。
【０００３】
古典的なモジュラーPKSの典型例はエリスロマイシンPKSまたはDEBSであり、これはエリスロマイシン生産菌（Saccaropolyspora erythreae）において、抗生物質のエリスロマイシンAのアグリコン核である6-デオキシエリスロノリドB（DEB）を合成する。（Cortes J. et al.: An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea. Nature (1990) 348:176-178; Donadio S. et al.: Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis. Science (1991) 252:675-679。
【０００４】
この典型例は、1995年にStreptomyces hygroscopicus由来のラパマイシンPKSが開示されたことで拡大し、これはシキメート由来の始動ユニットを利用し、ポリケチド鎖伸長のサイクルを14回触媒し、次に非リボソームペプチド合成酵素（NRPS）の伸長モジュールを利用してアミノ酸単位を挿入する（Schwecke T, et al.: The biosynthetic cluster for the polyketide immunosuppressant rapamycin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92:7839-7843.）。したがって、ポリケチドおよびペプチドアッセンブリーの分子的理論により、混合ポリケチドポリペプチドの生合成が可能となり、またその後、ブレオマイシン、エポチロン、ミクサルアミドおよびレイナマイシンを含むその他の例も開示された（Du L, Shen, B: Biosynthesis of hybrid peptide-polyketide natural products. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. (2001) 4:215-28; Staunton J, Wilkinson B: Combinatorial biosynthesis of polyketides and nonribosomal peptides. Curr. Opin. Chem. Biol. 2001 5:159-164）。
【０００５】
非古典的なモジュラーPKSは、枯草菌（Bacillus subtilis）に由来する、ゲノム配列決定から同定され、そのポリケチド産物は不明である、いわゆるPksX（Albertini AM, et al.: Sequence around the 159 degrees region of the Bacillus subtilis genome: the pksX locus spans 33.6kb. Microbiology 1995, 141:299-309）；土壌粘液細菌（Myxococcus xanthus）由来のTA抗生物質（Paitan Y, et al.: The first gene in the biosynthesis of the polyketide antibiotic TA of Myxococcus xanthus codes for a unique PKS module coupled to a peptide synthetase. J. Mol. Biol. 1999, 286:465-474）；アオバアリガタハネカクシ（Paederus）の細菌性共生生物由来のペデリン（Piel J：A polyketide synhtase-peptide synthetase gene cluster from an uncultured bacterial symbiont of Paederus beetles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99:14002-14007）；土壌細菌（Pseudomonas sp.）由来の抗生物質ムピロシン（El-Sayed AK et al: Characterization of the mupirocin biosynthesis gene cluster from Pseudomonas fluorescens NCIMB 10586. Chem. Biol. 2003, 10:419-430）；および放線菌類（Streptomyces sp.）由来のレイナマイシン（Cheng YG, et al.: Type I polyketide synthase requiring a discrete acyltransferase for polyketide biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100:3149-3154）によって例示される。これらPKS遺伝子クラスターの場合、コードされているモジュールの構成は、古典的なモジュラーPKSマルチ酵素のように規則的でないか、またはよく分かっていない；また特にATドメインを含むモジュールは存在しない。むしろAT活性は、マロニル-CoA:ACPトランスフェラーゼ活性を有する別個のAT酵素によって、イントランスに供給される；またポリケチドの側鎖の多様性は、特定の伸長モジュールの伸長因子ユニットとしてマロニルCo-Aよりはむしろメチルマロニル-CoAを選択することによってではなく、むしろ特定の伸長モジュールにS-アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインを含めることによって獲得される。
【０００６】
モジュールの数が実施された伸長サイクルの観察回数よりも小さい、別の非古典的モジュラーPKSが知られており、合成が、一つのモジュールが「断続(stuttering)」すること、即ち通常の一回の鎖伸長サイクルではなく、二回または三回のサイクルを実施し、伸長した鎖をPKSの次の伸長モジュールに送ることによって成されることが証明されている。ランカサイジン（landkacidin）PKSの例では、マルチ酵素アッセンブリーの中で、1コピーより多い特定のモジュールが用いられていると考えられている（Mochizuki S et al.: The large linear plasmid pSLA2-L of streptomyces rochei has an unusually condensed gene organization for secondary metabolism. Mol. Microbiol. 2003, 48:1501-1510）。
【０００７】
これら酵素系の全てに関して、ポリケチドアッセンブリーの実質的部分に、開始および鎖伸長の各サイクルついて異なる酵素群を特徴的に用いるということは、古典的なモジュラーPKSを遺伝子工学的に操作するために既に確立された方法を用いることで、それらを遺伝的に操作して変更を加えた産物を創り出せることを意味している。
【０００８】
ハイブリッドを創り出すモジュラーPKSの遺伝子工学的方法は、1996年に開示された（国際公開公報第9801546号；国際公開公報第9801571号；米国特許第5876991号；その後の出版物、Met al.: A hybrid modular polyketide synthase obtained by domain swapping. Chem. Biol. (1996) 3:833-839）。この方法の核心は、一または複数の連続するドメインまたは天然PKSに由来する一または複数の連続するモジュールを第二の天然PKS内に、接合部位または連結がドメイン間のリンカー領域内またはドメイン端部の保存アミノ酸配列内に作られるように接合することである。この方法は、ここ数年の間に広く例証されており（国際公開公報第9849315号）、続いてこれら同一技術を用いてエリスロマイシンPKSに基づくハイブリッドPKSの集団が作られ、それらは組換え細胞に様々に変化が加えられた14員環マクロライドを生成する（たとえば国際公開公報第0024907号を参照）。この組換え体の集団は、モジュラーPKSの小型ライブラリーを構成する。これら組換え株の生産性は、合理的なものから実質的にゼロまで変わることが確定している（McDaniel R, et al: Multiple genetic modifications of the erythromycin polyketide synthase to produce a library of novel 'unnatural' natural products. Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1999) 96:1846-1851.）。多くのその他改良が発表または開示されているが、一般的にこのように作られたハイブリッドマルチ酵素は、ポリケチド生合成に関して、親PKSよりも活性が低い（Yoon, YJ et al. Generation of multiple bioactive macrolides by hybrid modular polyketide synthases in Streptomyces venezuelae Chem Biol. (2002) 9:203-14）。
【０００９】
このようなハイブリッドPKSの生産性が低い理由については、広く検討および考察されている。役割を果たすと思われる主要要因がいくつか在る。一つの要因は、存在する酵素のレベルに関係する：選択された組換え細胞でのハイブリッドPKSの発現は最適条件に及ばないことがあり、および／またはタンパク質が正しく折りたたまれないか、または二量体化に失敗し活性型酵素を形成できないこともある。ハイブリッドPKSの構築に関する局面は、多くの通常の方法によって取り扱われており、本明細書はこれ以上考究しない。同様に、組換え細胞に存在する、必要とされる化学的前駆体分子のレベルが最適ではない場合もあるが、またこれらを最適化する明瞭なルートは当技術分野では良く確立している（Roberts GA, et al: Heterologous expression in Escherichia coli of an intact multienzyme component of the erythromycin-producing polyketide synthase. Eur. J. Biochem. (1993) 214:305-311; Kao CM, et al.: Engineered biosynthesis of a complete macrolactone in a heterologous host. Science (1994) 265:509-512. Pfeifer BA, et al.: Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science (2001) 291:1790-1792）。
【００１０】
第二の要因は、遺伝子工学を用いて並置された異種ドメインの間に必然的に生じた、局所的な不都合なタンパク質：タンパク質相互作用によって、構造が活性、特にこれらマルチ酵素合成酵素の必須機能である成長中の基質鎖を一つの活性部位から次の活性部位に渡す活性にとって必要な高次構造からずれることである。たとえばラパマイシンPKSは、産物を放出する前に、別々の活性部位で合計約80の反応を触媒するが、これら個別反応のいずれか一つが失敗すると、全体のプロセスが失敗する。任意のモジュラーPKSについて詳細な構造情報がない場合には、この要因の関与を定量化することは困難であるが、当業者はこのことが成功にとって真の障害になることを良く承知しているだろう。
【００１１】
第三の要因は、各伸長モジュールにおける重要酵素、成長中のポリケチドケト鎖と入ってくる伸長ユニットとの間にC-C結合を形成する反応を触媒するケト合成酵素（KS）は、両反応パートナーに関して限定された基質特異性および立体特異性を示すように進化していると考えられている。そのためにモジュラーPKSの伸長モジュールNのKSは、ACPが担持するポリケチドアシル鎖が適当なレベルにまで減少したときのみ、上流の伸長モジュールN-1のACPドメインにあるポリケチド鎖の自分自身への輸送を触媒すると信じられている。時期尚早の輸送は、一般には起こらない生成物の混合を招くと考えられる。同様に、ポリケチドアシル鎖の立体化学が不適当、またはその置換のパターンが不適当な場合も、KSはそのアシル基のローディングを識別すると信じられている。識別の第二段階は、縮合反応そのものに対して起こり、また伸長ユニットまたはポリケチドアシル単位の構造が、モジュールNのKSドメインによって、天然に処理されたものと異なる場合には、それにより反応速度が低下するだろう。公表されている、精製されたモジュラーPKSドメインのインビトロ研究は、このような基質特異性および立体特異性が、研究されている範囲において、DEBSおよびピクロマイシンPKSを含め、実際にこれらPKSの重要な特性である証拠を提供している（Chen S, et al.: Mechanisms of molecular recognition in the pikromycin polyketide synthase. Chem. Biol. 2000, 7:907-918; Beck, BJ et al.: Substrate recognition and channeling of monomodules from the pikromycin polyketide synthase. J Am Chem Soc. (2003) 125:12551-7）。
【００１２】
同様の考察は、モジュール内の別の酵素にも当てはまるだろう：ケト還元酵素（KR）、デヒドラーゼ（DH）およびエノイル還元酵素（ER）は全て、それらの基質に対し特異性および選択性を持つと信じられている。しかしながら、KS-ACP相互作用が、効率的なモジュール間輸送と中間体処理における重要決定因子と信じられている（Ranganathan A, et al.: Knowledge-based design of bimodular and trimodular polyketide synthases based on domain and module swaps: a route to simple statin analogues. Chem. Biol. (1999) 6:731-741; Wu N, et al.: Quantitative analysis of the relative contributions of donor acyl carrier proteins, acceptor ketosynthases, and linker regions to intermodular transfer of intermediates in hybrid polyketide synthases. Biochemistry 2002, 41:5056-5066）。
【００１３】
当業者は、遺伝子シャッフリングおよびアレー技術を介した強制的または定方向的に変化させることにより酵素活性を改良する方法が複数あることを承知している。このような方法は、次の改良段階のための「成功した」変種酵素を同定し、単離することを可能にするアッセイまたはスクリーニングの存在に絶対的に依存している。しかしながら、このような方法が、過度の実験なしに、高い触媒活性を有するハイブリッドモジュラーPKSのコンビナトリアルライブラリーを提供するとは考えにくいが、なぜならそれは極めて広い特性について、20もの重要なKSドメインを一時に最適化すると同時に、さらに互いに異種でもよい20ものモジュールについて、モジュール間タンパク質：タンパク質接触を最適化することは困難であるからである。
【００１４】
当業者はまた、この方法が、全てのドメインを交換してハイブリッドPKSを作る場合に起こる不都合なタンパク質：タンパク質相互作用の影響を減じることを目的とする、モジュラーPKS中の個々の活性部位への部位特異的突然変異誘発のためにも取り入れられていることに気づくだろう。したがって、部位特異的突然変異誘発によってDEBSのATドメインの活性部位を変更し、伸長ユニットに対する特異性または開始ユニットに対する特異性を変えることができることは開示されている（国際公開公報第0214482号 (2002; 国際公開公報第0314312号 (2003).）。同様に、モジュラーPKSのKRドメインは、トロピノン還元酵素と同様に、短鎖デヒドロゲナーゼと同一の酵素ファミリーに属することが知られており、またトロピノン還元の立体特異性が、部位指定突然変異誘発により切り替えられることが示されており（Nakajima, K et al.: Site-directed mutagenesis of putative substrate-binding residues reveals a mechanism controlling the different stereospecificities of two tropinone reductases. J Biol Chem. (1999) Jun 4;274:16563-8.）、今日では、このような方法をモジュラーPKSに用いることができることは、当業者にとって明らかであろう。しかしながら、このような方法が、過度の実験を行うことなしに、所望のハイブリッドモジュラーPKSのコンビナトリアルライブラリーを提供すること、そして個々のハイブリッドPKSを改良し、所望産物を合成することについてより適していることはないと考えられている。
【００１５】
まとめると、先行技術には、現在利用可能なモジュラーPKSの機能的コンビナトリアルライブラリーを構築する方法に付随する重大な問題があることは認識されてはいるが、このようなPKSをどのように発見または開発するかについての考案を持つものはいなかった。いずれも、このような特性を本質的に持つ天然のモジュラーPKSが発見されることは予想されていなかった。
【００１６】
換言すると、適当な設定（インビボまたはインビトロ）において、それ自体が生物学的に活性であるか、または周知のポストPKS酵素修飾により価値ある生物活性物質に変形できる（糖化工学およびその他ポストPKS段階に関する刊行物を参照せよ）ポリケチド化合物を効率的に生ずる、機能的モジュラーPKSのこのようなコンビナトリアルライブラリーを生成する効率的な方法を開発することは、いまも差し迫って求められている。モジュラーPKSとは、本明細書では、古典的なモジュラーPKSだけでなく、非古典的モジュラーPKSおよび混合PKS-NRPSモジュラーシステムも意味する。
【００１７】
本発明は、マイコバクテリア（Mycobacterium ulcerans）（MU）由来のポリケチド毒素であるマイコラクトンの生合成を支配している、生合成遺伝子クラスター全体の存在および、その詳細な構造構成を開示する。マイコバクテリアは、水性昆虫に潜伏している新興ヒト病原菌であり、中央および西アフリカ全体に蔓延し、甚大な被害を与えている皮膚疾患のブルーリー潰瘍の原因菌である。単一のブルーリー潰瘍は、ヒト皮膚表面の15％以上を覆うこともあり、極めて多数の細胞外細菌が内在する。その多数および広範囲な組織損傷にもかかわらず、細菌に対する急性炎症反応は驚くほど無く、また病変も無痛なことが多い(1)。この特異的な病理は、細胞障害性、鎮痛性および免疫抑制活性を有すると思われる、12員環核に結合したポリケチド側鎖からなるマクロライド毒素のマイコラクトンに拠るものである。作用様式は不明であるが、モルモットの疾患モデルでは、皮下注射された精製マイコラクトンは、自然の病理を再現し、マイコラクトン陰性変種は非病原性であり、病理における毒素の重要な役割を暗示している(2)。
【発明の開示】
【００１８】
発明の概要
本発明は、マイコラクトンの生合成を支配し、またマイコバクテリアプラスミドpMUM001によって担持されている遺伝子クラスターの特徴付けに関する。
【００１９】
より正確には、本発明は配列番号：1〜6のDNA配列を含む精製または単離されたポリヌクレオチド、および配列番号：7〜12のアミノ酸配列のポリペプチドをコードする精製または単離されたポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、これら配列に相補的なポリヌクレオチド、配列番号：1〜6のDNA配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドおよび配列番号：7〜12のアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのDNA配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドも包含する。単鎖および二本鎖RNAおよびDNAポリヌクレオチドは共に、本発明に包含される。これら分子は、配列番号：7〜12のアミノ酸配列のポリペプチドをコードする単鎖および二本鎖RNAおよびDNA変種の両方を検出するプローブとして用いることができる。二本鎖DNAプローブは、いずれの鎖のDNAプローブに対しても均等であるポリヌクレオチドの検出を可能にする。
【００２０】
配列番号：1〜6のDNA配列を含む、変性された二本鎖DNA、または配列番号7〜12のアミノ酸配列のポリペプチドをコードする精製または単離されたポリヌクレオチドと、高厳密条件下でハイブリダイゼーションする精製または単離されたポリヌクレオチドは、本発明に包含される。
【００２１】
本発明は、配列番号：1〜6の配列のポリヌクレオチドからインビトロ突然変異誘発により派生した、精製または単離されたポリヌクレオチドも包含する。インビトロ突然変異誘発としては、部位指定突然変異誘発、無作為突然変異誘発、およびインビトロ核酸合成を含むが、これに限定されるものではない当技術分野公知の様々な技術が挙げられる。
【００２２】
本発明はまた、遺伝コード、精製または単離されたポリヌクレオチドの結果として、配列番号：1〜6から縮重した配列の精製または単離されたポリヌクレオチドを包含するが、これらは配列番号：1〜6の配列のポリヌクレオチドの対立遺伝子変異またはその種-相同物である。
【００２３】
本発明の精製または単離されたポリヌクレオチドは、DNAおよびRNAを含めて、本明細書では「MLSポリヌクレオチド」と呼ぶ。
【００２４】
本発明はまた、これらMLSポリヌクレオチドの発現を監督する組換えベクター、およびこれらベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を包含する。
【００２５】
本発明の目的は、上記MLSポリヌクレオチドによりコードされているアミノ酸配列を含む単離または精製されたポリペプチド、および／またはその生物活性断片を提供することである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、配列番号：7〜12のアミノ酸配列に対し少なくとも80％の配列同一性を有する単離または精製されたポリペプチドを提供することである。
【００２７】
本発明の精製または単離されたポリペプチドは、本明細書では「MLSポリペプチド」と呼ぶ。
【００２８】
本発明はまた、標識化されたMLSポリペプチドも提供する。好ましくは、標識化ポリペプチドは、精製された形状である。また、非標識または標識化ポリペプチドが、MUに対する抗体を含有するヒト体液によって免疫学的に認識できることも好ましい。ポリペプチドは、たとえば、放射活性、酵素、蛍光、化学発光標識、および発色団からなる群より選択される免疫アッセイ標識で標識できる。
【００２９】
本発明は、発現を促進する条件下で宿主細胞を培養すること、および培地からポリペプチドを回収することを含む、MLSポリペプチドの製造方法をさらに包含する。特に、細菌、酵母、植物および動物細胞でのMLSポリペプチドの発現は、本発明に包含される。
【００３０】
MLSポリペプチドに結合する精製されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、本発明に包含される。
【００３１】
本発明のMLSポリペプチドとポリペプチドを認識する抗体との間の免疫学的複合体も提供される。免疫学的複合体は、放射活性、酵素、蛍光、化学発光標識、および発色団からなる群より選択される免疫アッセイ標識で標識できる。
【００３２】
さらに、本発明はMUによる感染を検出するための方法を提供する。方法は、MUによる感染が疑われる生物材料を含む組成物を提供する段階、MUのMLSポリペプチドの存在についてアッセイする段階を含む。ポリペプチドは、一般的には、本発明のMLSポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を用いた電気泳動または免疫アッセイによってアッセイされる。
【００３３】
本発明はまた、MLSポリペプチドまたはMLSポリペプチドの混合物を含む抗原に結合する抗体の有無を検出するためのインビトロ診断法も提供する。方法は、抗原を生物学的液体と、抗原と抗体が生物学的液体中で抗原−抗体複合体を形成するのに十分な時間と条件で接触させること、およびその後免疫学的複合体の形成を検出することを含む。検出段階はさらに、抗原−抗体複合体の形成を測定することを含むこともできる。抗原−抗体複合体の形成は、ウエスタンブロット技術、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、間接免疫蛍光アッセイまたは免疫沈降アッセイにより測定するのが好ましい。
【００３４】
MLSポリペプチドまたはMLSポリペプチドの混合物と結合する抗体の有無を検出するための診断キットは、MLSポリペプチドを含む抗原、またはMLSポリペプチドの混合物、および抗原と抗体との間での免疫複合体の形成を検出するための手段を含む。抗原および手段は、検出を実施するのに十分な量存在する。
【００３５】
本発明はまた、インビボにて免疫原性または防御反応を誘導するのに十分な量のMLSポリペプチドまたはその混合物を、そのための薬学的に許容される担体と共に含む、免疫原性組成物も提供する。本発明のワクチン組成物は、防御量のMLSポリペプチドまたはその混合物、およびそのための薬学的に許容される担体を含む。
【００３６】
したがって本発明のポリペプチドは、MUに関係する抗原性タンパク質に対する抗体の存在を検出するための、診断用組成物の一部として有用である。
【００３７】
これに加えて、MLSポリペプチドは、MUに関係する抗原性タンパク質の存在を検出するための抗体を産生させるのに用いることができる。
【００３８】
本発明のポリペプチドはまた、インビボでMUを不活性化するか、MUの生存率を下げるか、または細菌の複製を抑制もしくは阻止する中和抗体を産生させるのにも用いることができる。MU中和抗体の誘導能力は、本発明のポリペプチドを免疫感作またはワクチン接種組成物中に用いて、免疫応答のB細胞群を活性化するか、またはレシピエント宿主に細胞障害性T細胞反応（CTL）を誘導する場合、特に重要である。
【００３９】
本発明は、MUの有無を検出するための方法であって：
（1）MUの細菌性遺伝物質を含むことが疑われるサンプルを、少なくとも一つのヌクレオチドプローブと接触させる段階、および
（2）ヌクレオチドプローブとサンプル中の細菌遺伝物質との間のハイブリダイゼーションを検出する段階、
を含み、
該ヌクレオチドプローブが本発明の精製または単離されたポリヌクレオチドの配列あるいはその一部に対し相補的な配列を有する方法を提供する。
【００４０】
これに加えて本発明は、以下の段階を含む、マイコラクトンの変種を産生する工程を提供する：
a）配列番号：1〜6のいずれか一つの単離または精製されたポリヌクレオチドの突然変異誘発段階、
b）マイコバクテリア株での該突然変異ポリヌクレオチドの発現段階、
c）DNAシーケンシングおよび質量分析法による、マイコラクトン産生が変化したマイコバクテリア突然変異体の選択段階、
d）選択された、トランスフェクションされたマイコバクテリアの培養段階、ならびに
e）該培養の培養物からのマイコラクトン変種抽出段階。好ましい態様では、単離または精製されたポリヌクレオチドは、配列番号：4の配列またはその断片と少なくとも80％同一である核酸配列を有する。
【００４１】
さらに、本発明は、以下の段階を含む、成長の速いマイコバクテリアにマイコラクトンを産生させる工程を提供する：
a）成長の速いマイコバクテリアの中に配列番号：1、2および3のDNA配列を含む、少なくとも三種類の単離されたポリヌクレオチド、または配列番号：1、2および3のヌクレオチド配列を含む、変性した、二本鎖DNAのいずれかの鎖にハイブリダイゼーションする三種類の単離されたポリヌクレオチドをクローニングする段階、
b）適当な培養条件で組換えマイコバクテリアを増殖させることによって単離されたポリヌクレオチドを発現させる段階、および
c）産生したマイコラクトンを精製する段階。好ましい態様では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：1〜6のDNA配列か、または配列番号：1〜6のヌクレオチド配列を含む変性した、二本鎖DNAのいずれかの鎖とハイブリダイゼーションする、単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列は、図面に示されている。配列番号およびその配列番号の配列が含まれる対応する図は次の通りである：
2007511218.tif 000002
【００４３】
発明の詳細な説明
1.  ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
第一の態様では、本発明は、マイコラクトンの生合成に関係するマイコバクテリア酵素、すなわちポリケチド合成酵素およびポリケチド修飾酵素をコードする単離または精製されたポリヌクレオチドに関する。用語「MLSポリヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合には、一般的には本発明の単離または精製されたポリヌクレオチドを指す。
【００４４】
したがって本発明の単離または精製ポリヌクレオチドは、配列番号：1〜6の一部または全てに対し少なくとも80％の同一性を有する配列、あるいは配列番号：7〜12のアミノ酸配列のポリペプチドをコードする核酸配列から選択される核酸配列を少なくとも一つ含む。
【００４５】
本明細書で用いる「単離または精製された」は、その自然な状態から「ヒトの手によって」変えられたこと、即ち、それが自然界で生ずる場合、それがその元の環境から変更もしくは動かされた、またはその両方を意味する。たとえば生物中に自然に存在しているポリヌクレオチドまたはタンパク質／ペプチドは、「単離」も精製もされていないが、クローニング、増幅および／または化学合成によって得られる、その自然状態の共存物質から分離された同一のポリヌクレオチドは、本明細書で使用する用語として「単離」されている。さらにまた、形質転換、遺伝操作により、またはその他組換え法によって生物体内に導入されたポリヌクレオチドまたはタンパク質／ペプチドは、それが該生物体内にまだ存在していても、「単離」されている。本明細書で用いる用語「精製された」は、たとえば組換え宿主細胞培養物の精製産物または非組換え体供給源からの精製産物のように、本発明のポリペプチドが他のタンパク質またはポリペプチドを本質的に伴わないことを意味する。本明細書で用いる用語「実質的に精製された」は、MLSポリペプチドを含み、且つ他のタンパク質またはポリペプチドを本質的に伴わないが、特異的抗体を用いて除去できる公知タンパク質が存在しており、また実質的に精製されたMLSペプチドを抗原として使用できる混合物を指す。
【００４６】
アミノ酸または核酸配列の「同一性」および「類似性」は、比較する二配列間の最適な全体アラインメントから決定される。最適な全体アラインメントは、たとえばNeedleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を用いて遂行される。「同一性」は、第一ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの中の特定位置にあるアミノ酸または核酸が、第一ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと最適な全体アラインメントにある第二ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの対応するアミノ酸または核酸と全く同じであることを意味する。同一性と対照的に「類似性」は、保存的置換であるアミノ酸を包含する。「保存的」置換は、blosum62置換マトリックス（Hentikoff and Hentikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919）で正のスコアを持つ任意の置換である。「配列Aは、配列Bに対しn％類似している」という記述は、配列AとB間の最適な全体アラインメントのn％の位置が、同一残基またはヌクレオチド、および保存的置換からなることを意味する。「配列Aは配列Bとn％同一である」という記述は、配列AとB間の最適な全体アラインメントのn％の位置が、同一残基またはヌクレオチドからなることを意味する。
【００４７】
本明細書で用いる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、一般的にはポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、それらは無修飾RNAまたはDNA、あるいは修飾RNAまたはDNAでよい。この定義は、単鎖および二本鎖DNA、単鎖および二本鎖領域、または単鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるDNA、単鎖および二本鎖RNA、ならびに単鎖、二本鎖領域の混合物であるRNA、単鎖または、より一般的には二本鎖、または三本鎖領域、あるいは単鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子を包含するが、これらに限定されるものではない。これに加えて、本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」は、RNAまたはDNA、あるいはRNAとDNAの両方を含む三本鎖領域を指す。このような領域の鎖は、同一分子または異なる分子に由来するものでよい。この領域は、一または複数の分子の全てを含んでよいが、より一般的には分子のいくつかの領域のみを含む。本明細書に用いる用語「ポリヌクレオチド」はまた、一または複数の修飾塩基を含有する上記DNAまたはRNAを含む。したがって、安定性またはその他の理由から修飾を加えられた主鎖を持つDNAまたはRNAは、本明細書で用語が意図する「ポリヌクレオチド」である。さらにまた、二つの例を挙げると、イノシンのような稀な塩基またはトリチル化された塩基のような修飾塩基を含む、DNAまたはRNAは、本明細書で用いる用語としてのポリヌクレオチドである。当業者公知の多くの有益な目的に役立つ、極めて多様な修飾がDNAおよびRNAに加えられることが認められるだろう。「ポリヌクレオチド」は、短いポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い断片を包含する。本明細書で用いる用語「ポリヌクレオチド」は、したがって、そのような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形状のポリヌクレオチド、ならびに、たとえば、配列番号：1〜6にコードされるポリペプチドと同一の生物学的機能を示す、単純および複雑な細胞を含むウイルスおよび細胞に特徴的な化学的形態のDNAおよびRNAを包含する。用語「ポリヌクレオチド」はまた、突然変異誘発によって100％同一ではないが、それにもかかわらず同じアミノ酸配列をコードしている、「オリゴヌクレオチド」と呼ばれることの多い短いヌクレオチドまたは断片も包含する。
【００４８】
配列番号：1〜6の配列の断片、または配列番号：7〜12の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列の断片とは、配列番号：1〜6の配列の一つ、または配列番号7〜12の配列を有するポリペプチドの一つをコードする核酸配列の少なくとも10、12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、65、70、75または100の連続ヌクレオチドを有する断片を指すことを意図する。好ましくは、これら断片とは、特異的プライマーまたはプローブとして用いることができるか、あるいはポリペプチドの生物活性断片に関して以下定義するように、配列番号7〜12の配列を有するポリペプチドの一つの生物活性断片をコードしている断片を意図する。
【００４９】
それゆえに、配列番号：1〜6から選択された配列および配列番号：1〜6の相補的配列を含む単離または精製された単鎖ポリヌクレオチド、ならびにその一本鎖が配列番号：1〜6から選択された配列を含む単離または精製された複数鎖ポリヌクレオチドも、本発明の一部を形作る。
【００５０】
本発明の範囲内のポリヌクレオチドは、上記開示のMLSポリヌクレオチドと、適度または厳格な厳密度条件の下でハイブリダイゼーションし、且つMLSポリペプチドをコードする、単離または精製されたポリヌクレオチドを包含する。本明細書で用いる場合、適度な厳密度条件とは、当業者に公知であり、またSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ed. Vol. 1, pp.1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)に定義されるように、ニトロセルロースフィルター用プレハイブリダイゼーション液、5×SSC、0.5％ SDS、1.0mM EDTA（pH8.0）、ハイブリダイゼーション条件：50％ホルムアミド、6×SSC、42℃（またはStarkの溶液のようなその他同様のハイブリダイゼーション液、50％ホルムアミド内、42℃）、および約60℃、0.5×SSC、0.1％ SDSの洗浄条件の使用を含む。高厳密度条件は、上記のハイブリダイゼーション条件に、68℃、0.2×SSC、0.1％ SDSの洗浄を組み合わせたものとして定義される。熟練技術者は、温度および洗浄液の塩濃度は、プローブの長さのような要因に従って、必要に応じて調整できることを認識するだろう。適度または厳格な厳密度の条件下でMLSポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションするこれらポリヌクレオチドは、少なくとも10、12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、65、70、75または100ヌクレオチド。
【００５１】
本発明は、遺伝コードの結果として縮重したMLSポリペプチドをコードする、配列番号：1〜6の配列の核酸に均等である単離または精製されたポリヌクレオチドを提供する。均等ポリヌクレオチドは、サイレント突然変異（たとえばPCR増幅中に起こる）から生じることもあり、または配列番号：1〜6の配列の計画的突然変異誘発産物でもよい。これら均等ポリヌクレオチドは全て、やはり配列番号7〜12のアミノ酸配列を有するMLSポリペプチドをコードしており、従って本発明に包含される。
【００５２】
本発明はさらに、上記のMLSポリヌクレオチドから誘導された、単離または精製された断片およびオリゴヌクレオチドを包含する。これらの断片およびオリゴヌクレオチドは、たとえばMU感染診断のためのプローブまたはプライマーとして用いることができる。
【００５３】
好ましい態様では、本発明のポリヌクレオチドは、環状または直鎖状の形態をした単離または精製されたpMUM001、MUのプラスミドである。pMUM001の配列は、図18に記載されている。プラスミドpMUM001は、以下に参照する次のORFを含む（表1）：
【００５４】
（表１）
2007511218.tif 000003
2007511218.tif 000004
2007511218.tif 000005
【００５５】
用語「相補体」とは、CDSが図18に示す鎖に対し相補的な鎖上に在ることを意味する。
【００５６】
第二の態様では、本発明は前に定義されたポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を有する単離または精製されたポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは、配列番号：7〜12の一部または全てに対し、少なくとも80％の相同性、またはより好ましくは85％の相同性を有するアミノ酸配列を含むのが好ましい。よりさらに好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：7〜12の配列およびその生物活性断片から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列と実質的に同一であるか、または100％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５７】
本明細書で用いる「生物活性」という表現は、ポリペプチド由来の酵素能力を実質的に維持しているポリペプチドまたはその断片を指す。
【００５８】
別の好ましい態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号：1〜6の相補体、またはその断片に、厳密条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を含む。このようなポリペプチドは、マイコラクトン生合成中にポリペプチド由来の酵素を実質的に保持している。本明細書で用いる場合、指定した厳密条件でハイブリダイゼーションさせるということは、二本の単鎖DNA断片の間に形成されるハイブリッドの安定性を表し、このようなハイブリッドを洗浄し、それに続く洗浄段階よりも低いかまたは同等の厳密度条件下で行うアニーリング時のイオン強度および温度の条件を指す。一般的には、高、中および低厳密度は、次の条件およびそれに均等な条件を包含する：
1）高厳密度：0.1×SSPEまたはSSC、0.1％ SDS、65℃
2）中厳密度：0.2×SSPEまたはSSC、0.1％ SDS、50℃
3）低厳密度：1.0×SSPEまたはSSC、0.1％ SDS、50℃
【００５９】
本明細書で用いる用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに連結した、二またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと呼ばれる短い鎖と、一般にタンパク質と呼ばれるより長い鎖の両方を指す。本発明のペプチドは、好ましくは2〜20アミノ酸を、より好ましくは2〜10アミノ酸を、最も好ましくは2〜5アミノ酸を含む。ポリペプチドは、20種類の、遺伝子がコードするアミノ酸以外のアミノ酸を含有してもよい。「ポリペプチド」は、プロセッシングおよびその他翻訳後修飾のような天然のプロセスによって修飾されたものだけでなく、化学的修飾技術によって修飾されたものも包含する。このような修飾は、基本的な教科書およびより詳しいモノグラフならびに多数の研究文献に詳しく記載されており、また当業者に周知である。所与のポリペプチドの複数の箇所に、同型の修飾が、同じ程度または程度を変えて存在してもよいことが理解されるであろう。また、所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含んでもよい。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシル末端を含むポリペプチドのあらゆる場所で起こり得る。修飾には、たとえば、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋結晶化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、システイン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、ヒドロキシル化、セレノイル化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の硫化および転移RNA介在付加、およびユビキチン化が挙げられる。たとえば：PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993); Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); およびRattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N. Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)を参照せよ。ポリペプチドは、枝分かれ、または枝分かれの有無の環式でよい。環式、枝分かれ、および枝分かれした環式ポリペプチドは、翻訳後の自然の工程から生じても良く、また同様に完全な合成方法によって作ってもよい。
【００６０】
ポリペプチドの相同性パーセンテージは、たとえば、Deveruxらが記載し（Nucl. Acids Res. 12:387, 1984）、University of Wisconsin Genetics Computer Group（UWGCG）より入手できるGAPコンピュータプログラム、バージョン6.0を用いて、配列情報を比較することによって決定できる。GAPプログラムは、SmithとWaterman（Adv. Appl. Math 2:482, 1981）によって改訂されたNeedlemanとWunsch（J. Mol. Biol. 48:443, 1970）のアラインメント法を利用している。GAPプログラムにとって好ましい初期設定パラメータは：（1）ヌクレオチドに関する単一要素比較マトリックス（一致を表す数値1と不一致を表す数値０を含む）、およびSchwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358, 1979に記載のようなGribskovとBurgessの荷重比較マトリックス、Nucl. Acids Res, 14:6745, 1986；（2）各ギャップに対するペナルティー3.0および各ギャップの各シンボルについての追加ペナルティー0.10；ならびに（3）末端ギャップに対してはペナルティーなし、である。
【００６１】
相同的ポリペプチドは、保存的に置換された配列を含むことができ、即ち所与のアミノ酸残基を、類似の物理化学的特性を有する残基と置換できる。保存的置換の例としては、Ile、Val、LeuまたはAla同士のような、ある脂肪族残基の別の残基での置換、あるいはLysとArg；GluとAsp；またはGlnとAsn間のような、ある極性残基の別の極性残基での置換が挙げられる。別のこのような保存的置換は、たとえば類似の疎水特性を有する領域全体の置換も周知である。自然界に生ずる相同的MLSポリペプチドもまた、本発明に包含される。このような相同的ポリペプチドの例は、別のmRNAスプラシング現象を受けるか、またはMLSポリペプチドのタンパク質分解切断から生じたポリペプチドである。タンパク質分解が関与する変形としては、たとえば、タンパク質分解によるMLSポリペプチドからの、一または複数の末端アミノ酸の除去による、異なるタイプの宿主細胞での発現による末端の違いが挙げられる。フレームシフトが関与する変動としては、たとえばアミノ酸の違いによる、異なるタイプの宿主細胞での発現による末端の違いが挙げられる。相同的MLSポリペプチドは、配列番号：7〜12の配列のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異によって得ることもできる。アミノ酸配列中の変更は、数多くある通常の任意の方法によって遂行される。突然変異は、突然変異配列を含有し、ナイティブな配列の断片に連結できる制限部位がフランキングしているオリゴヌクレオチドを合成することで特定の座に導入できる。連結後、生じた再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する相同ポリペプチドをコードする。または、オリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発法を用いて変更されたポリヌクレオチド提供でき、この場合前もって決められたコドンを置換、欠失または挿入によって変更できる。上記の変更を行う例示的方法はWalderら (Gene 42:133,1986); Bauerら (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smithら (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkelら (Methods in Enzymol. 154:367, 1987)；および米国特許第4,518,584号および第4,737,462号に開示されており、それら全てが参考として本明細書に組み込まれる。
【００６２】
本発明はまた、配列番号：1〜6のヌクレオチド配列より誘導される断片およびオリゴヌクレオチドがコードするポリペプチドを包含する。
【００６３】
また本発明は、実質的に同一の生物学的および免疫学的特性を有する、均等タンパク質も包含すると考えられる。したがって、本発明は、本発明のタンパク質の血清型変種も包含する。
【００６４】
本発明のMLSポリペプチドを用いた使用によっては、それを標識することが望ましい場合がある。適した標識の例は、放射活性標識、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識および発色団である。本発明のポリペプチドを標識する方法は、免疫グロブリンを標識するのに広く用いられている方法と実質異ならない。または間接マーカーとして、本発明のポリペプチド、またはポリペプチドに対する抗体に対する抗免疫グロブリンに対する標識抗体を用いることによって、標識の必要性を無くすことができる。
【００６５】
2.  ベクターおよび細胞
第三の態様では、本発明はさらに、上記定義のポリヌクレオチドを含むクローニングもしくは発現ベクターを目的とし、より具体的にはベクター含有細胞内のポリヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドの発現を指示できるクローニングまたは発現ベクターを目的とする。
【００６６】
本明細書で用いる用語「ベクター」は、一またはそれ以上のタイプの細胞を形質導入／トランスフェクションするために設計されたポリヌクレオチド構築体を指す。ベクターは、たとえば、挿入したヌクレオチドの単離、継代および複製を目的に設計された「クローニングベクター」、宿主細胞内でのヌクレオチド配列の発現を目的に設計された「発現ベクター」、または組換えウイルスもしくはウイルス様粒子を産生を目的に設計された「ウイルスベクター」、あるいは二種類以上のベクターの属性を含む「シャトルベクター」がある。
【００６７】
細胞および細菌の安定なトランスフェクションに適した多くのベクターが、このような細胞株の構築方法と同様、公的に利用できる（たとえばプラスミド、アデノウイルス、バキュロウイルス、酵母バキュロウイルス、植物ウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アルファウイルス、レンチウイルス）。本発明は、本発明の任意のポリヌクレオチド分子を含む任意のタイプのベクターも包含すると考えられる。
【００６８】
MLSポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターは、周知の方法を用いて調製できる。発現ベクターは、哺乳動物、細菌、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来するような、適当な転写または翻訳制御配列と作動可能に連結しているMLSポリヌクレオチドを含む。制御配列の例としては、転写プロモータ、オペレータまたはエンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳の開始ならびに終止を制御する適当な配列が挙げられる。用語「作動可能に連結している」とは、制御配列がMLSのDNAと機能的に関係していることを意味する。したがって、プロモータがMLSポリヌクレオチドの転写を制御していれば、プロモータはMLSポリヌクレオチドに作動可能に連結している。一般的には複製起点によって付与される所望の宿主細胞での複製能力、および形質転換体が識別できる選択遺伝子は、発現ベクターの中に追加的に組入れることができる。
【００６９】
これに加えて、本来はMLSポリヌクレオチドと関連していない適当なシグナルペプチドをコードする核酸も発現ベクターに組入れることができる。たとえば、シグナルペプチド（分泌リーダー）をコードする核酸は、MLSポリペプチドとインフレームに融合でき、MLSポリペプチドを、シグナルペプチドを含む融合タンパク質として最初に翻訳できる。目的の宿主細胞内で機能するシグナルペプチドは、MLSポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、細胞からのMLSポリペプチドの分泌によって、MLSポリペプチドから切り出される。
【００７０】
原核生物宿主細胞で使用する発現ベクターは、一般的には、一または複数の表現形選択マーカー遺伝子を含む。表現形選択マーカー遺伝子は、たとえば、抗菌耐性を付与する、または独立栄養要求を供給するタンパク質をコードしている遺伝子である。原核生物宿主細胞にとって有用な発現ベクターの例としては、市販されているプラスミドに由来するものが挙げられる。市販されているベクターには、タンパク質の発現のために特別に設計されたものが含まれる。それらには、pMAL-p2およびpMAL-c2ベクターが含まれるが、これらはマルトース結合タンパク質に融合したタンパク質の発現に用いられる（New England Biolabs, Beverly, MA, USA）。
【００７１】
組換え原核生物宿主細胞発現ベクターに一般的に用いられるプロモータとしては、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモータシステム（Chang et al., Nature 275:615, 1978; and Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), tryptophan (trp) promoter system (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; and EP-A-36776), and tac promoter (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p.412, 1982）が挙げられる。
【００７２】
第四の態様では、本発明はまた、遺伝的に修飾が加えられた細胞のような、本発明のいずれかのポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主、より好ましくは、このポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現できる宿主を目的とする。
【００７３】
宿主細胞は、いずれのタイプの細胞でもよい（一過的にトランスフェクションされた哺乳動物細胞株、単離された一次細胞、または昆虫細胞、酵母（Saccharomyces cerevisiae、Ktuyveromyces lactis、Pichia pastoris）、植物細胞、微生物または細菌（大腸菌のような）。より好ましくは、大腸菌である。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞の宿主との使用に適当なクローニングおよび発現ベクターは、たとえば、Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)に記載されている。本明細書に開示したMSLポリヌクレオチドに由来するRNAを用いたMLSポリペプチドの産生には、無細胞翻訳系も用いることができる。
【００７４】
BACベクターpMU0022B04およびpMU022D03をそれぞれ含む大腸菌に関係する、MU0022B04およびMU022D03と命名された次の生物寄託物は、the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), of Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris, Cedex 15, Franceに、2003年11月3日に、次の登録番号で登録された：
組換え大腸菌 登録番号
MU0022B04                I-3121
MU022D03                 I-3122
【００７５】
対応する寄託証明書に含まれるこの株の科学的記載は、参照として組み入れられる。
【００７６】
BACベクターpMU0022B04は、位置71,846にあるHind III部位（図2ではH4と呼ばれている）から位置152,732のHind III位置（図2ではH9と呼ばれている）までよりクローン化され、mup038、mlsA2、mlsA1、mup045およびmup053遺伝子を含んでいるMUのプラスミドpMUM001の80kbpの断片を含む。
【００７７】
BACベクターpMU022B03は、位置173,190にあるHindIII部位（図2では位置H11と呼ばれている）でクローン化されたMUのプラスミドpMUM001の109kbpの断片を含み、この断片はプラスミドpMUM001の全配列に対応するが、位置73,953（図2ではH5と呼ばれている）と位置138,778のHindIII位置（図2ではH8と呼ばれている）の間の65kbpの領域を欠失している。したがって、109kbpの断片は、mup045、mup053およびmlsB遺伝子を含んでいる。
【００７８】
3.  抗体
五番目の態様では、本発明は、上記の単離または精製されたポリペプチド、より具体的には配列番号：7〜12のアミノ酸配列のポリペプチドあるいはその断片に特異的に結合する、精製された抗体を特徴とする。本発明の抗体は、上記MLSポリペプチドを用いて、様々な方法によって調製できる。たとえば、MLSポリペプチドまたはその抗原性断片は、ポリクローナル抗体の産生を誘導するために、動物（たとえばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラット）に投与できる。宿主動物を免疫化する技術は、当技術分野で周知である。このような技術は、通常は接種を含むが、別の投与形態を含んでもよい。十分な量のポリペプチドを投与し、宿主動物に免疫応答を創出する。本発明の抗原に対する抗体を産生するいずれの宿主も用いることができる。動物を免疫化し、動物が抗原に対する抗体を産生し始めるのに十分な時間が経過したら、ポリクローナル抗体を回収できる。一般的な方法は、動物から血液を取り出すこと、および血液から血清を分離することを含む。抗原に対する抗体を含んでいる血清は、抗原に対する抗血清として用いることができる。または、抗体は血清から回収できる。血清から、抗原に対する精製ポリクローナル抗体を回収するには、アフィニティー精製が好ましい技術である。
【００７９】
または、本明細書に記載のように用いる抗体は、モノクローナル抗体でよく、それはハイブリドーマ技術（たとえば、Hammerling et al., In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, NY, 1981を参照）を用いて調製できる。
【００８０】
上記のように、本発明は、好ましくはMLSポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体を目的とする。特に、本発明は「中和」抗体を特徴とする。「中和」抗体とは、任意のMLSポリペプチドの任意の生物活性、特にマイコラクトンを合成し、皮膚感染を誘導するMUの能力を妨害する抗体を意味する。当業者に公知の標準的アッセイを用い、潜在的中和抗体を評価できる。ひとたび産生されたら、モノクローナルおよびポリクローナル抗体は、ウエスタンブロット、免疫沈降分析または任意のその他適当な方法によって、特異的MLSポリペプチド認識について試験するのが好ましい。
【００８１】
本明細書に記載されているような、MLSポリペプチド発現細胞を認識する抗体およびMLSポリペプチドを特異的に認識する抗体は、本発明にとって有用と考えられる。このような抗体は、ナイティブなMLSポリペプチドの検出、定量化および精製のための標準的免疫検出法に用いることができる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体でもよく、診断目的のために変更してもよい。本発明の抗体は、たとえば、MLSポリペプチドの発現レベルをモニタリングする、MLSポリペプチドまたはその断片の生物サンプル中の量を測定する、ならびにマイコバクテリアの有無を評価するのに用いてもよい。これに加えて、抗体は、画像化および治療のために、金粒子、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼのような診断および／または治療使用のための化合物に結合してもよい。抗体はまた、検出を容易にするために標識（たとえば免疫蛍光）してもよい。
【００８２】
本発明の抗体に関しては、用語「特異的に結合する」は、関心対象のタンパク質の、一または複数のエピトープに対し比較的高い親和性で結合するが、関心対象以外の分子へは実質的に認識も結合もしない抗体を指す。本明細書で使用する用語「比較的高い親和性」は、抗体と関心対象タンパク質との間の結合親和性が少なくとも106M-1、好ましくは少なくとも約107M-1、さらにより好ましくは108M-1〜1010M-1であることを意味する。このような親和性の測定は、当業者にとって一般的知識である標準的な競合結合免疫アッセイ条件（たとえば、Scatchard et al., Ann. N.Y Acad. Sci., 51:660 (1949)）の下で行うのが好ましい。
【００８３】
本明細書で用いる「抗体」は、以下に記載する全ての可能性を包含する：精製、タンパク質分解処理、または遺伝子工学により得た抗体またはその断片、抗体またはその断片を含む人工構築物、ならびに抗体またはその断片の結合を模擬するように設計された人工構築物。Such antibodies are discussed in Colcher et al. (Q J Nucl Med 1998; 42:225-241)。それらは、完全抗体、F(ab')2断片、Fab断片、Fv断片、scFv断片、他の断片、CDRペプチドおよび模擬物を包含する。当業者は、それらを容易に得ること、および調製することができる。たとえば、酵素消化法を用いて、IgG分子をそれぞれペプシンまたはパパイン切断にかけることによって、F(ab')2断片およびFab断片が得られる。組換え体抗体もまた、本発明の範囲内である。
【００８４】
または、本発明の抗体は、抗体誘導物でもよい。このような抗体は、非免疫グロブリン領域に連結した、または連結していない抗原結合領域を含んでもよい。抗原結合領域は、抗体軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインである。一般的には、抗体は軽鎖と重鎖の可変領域を両方含み、それは単鎖Fv(scFV)断片、ジスルフィド安定化Fv(dsFv)断片、多量体scFv断片、ダイアボディイ(diabody)、ミニボディイ（minibody）またはその他関連形状物のような構築体に挿入できる（Colcher et al. Q J Nucl Med 1998; 42:225-241）。免疫系の複数のエフェクターと結合でき、ヒトまたは動物に投与したときに免疫応答を誘発するこがある天然抗体のFc部分を欠くことから、このような誘導化抗体が好ましい場合もある。実際、誘導化抗体は通常、免疫複合疾患および補体活性化（III型過敏症反応）を起こさない。
【００８５】
または、非免疫グロブリン領域は、本発明の抗体の抗原結合領域に融合する。非免疫グロブリン領域は、一般的には非免疫グロブリン成分であり、酵素、公知結合特異性を有するタンパク質に由来する領域、タンパク質毒素もしくは実際には遺伝子が発現するタンパク質に由来する領域、またはMUマイコラクトン生合成関連ポリペプチドに対する阻害もしくは阻止活性を示す化学成分でよい。修飾された抗体の二箇所の領域を、切断可能または永続的リンカー配列を介して接続してもよい。
【００８６】
好ましくは、本発明の抗体は、ラットもしくはマウスの可変領域（キメラ）またはCDR（ヒト化もしくは「動物化」した）を担持するIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgEまたはIgDのようなヒトもしくは動物の免疫グロブリンである。よりさらには、本発明の抗体に、たとえば標的局在領域内または全身投与のための抗体の特異的送達性および長期保持性を与えることを目的として、当業者公知の好適担体を結合してもよい。
【００８７】
用語「ヒト化抗体」は、ヒト以外の抗体、一般的にはマウスに由来する抗体であって、親抗体の抗原結合特性を保持もしくは実質的に保持するが、ヒトでの免疫原性は少ない抗体を指す。これは、（a）非ヒトCDRをヒトのフレームワークおよび定常領域に、重要フレームワーク残基を保持したまま、または保持せずに移植すること、あるいは（b）非ヒト可変領域全体を移植するが、表面残基を置換することによってそれらをヒト類似部分で「覆う」ことを含む、様々な方法によって遂行できるだろう。このような方法は、当業者に周知である。
【００８８】
上記のように、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドおよびその免疫学的誘導物に対し免疫学的に特異的である。本明細書で用いる用語「免疫学的誘導物」とは、全ポリペプチドの免疫活性に実質的に類似している免疫活性を有するポリペプチドを指し、またこのような免疫活性は、MUマイコラクトン生合成関連ポリペプチドまたはその誘導物に対し免疫学的に特異的な抗体の産生を促進する能力を指す。それゆえに、用語「免疫学的誘導物」は、ポリペプチドの「断片」、「分節」、「変種」または「類似物」を包含する。
【００８９】
用語「抗原」は、たとえばTリンパ細胞反応またはBリンパ細胞反応のような免疫応答を誘発するか、または免疫系が認識できる分子を指す。これに関しては、抗原は、免疫適格動物に導入され、細胞伝達反応の産生または抗原に結合できる特異抗体の産生を刺激する任意の作用物質を包含する。
【００９０】
4.  組成物およびワクチン
本発明のポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、および本発明に従い産生されたポリクローナルまたはポリクローナル抗体は、マイコバクテリア関連疾患、特にブルーリ潰瘍の診断、治療または予防のための多くの方法に用いることができる。
【００９１】
第六の態様では、本発明は、マイコバクテリアに対する免疫応答または防御免疫を誘発するための組成物に関する。関連する局面によれば、本発明はマイコバクテリア関連疾患を予防する、および／または治療するためのワクチンに関する。本明細書で用いる用語「治療する」は、ブルーリ潰瘍の症状が軽減するか、または完全に取り除かれるプロセスを指す。本明細書で用いる用語「予防する」は、マイコバクテリア関連疾患を防御または遅らせるプロセスを指す。本発明の組成物またはワクチンは、上記のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または抗体、ならびに許容される担体を含む。
【００９２】
本明細書で用いる「許容される担体」という表現は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または抗体を含有するための、有害作用なしに哺乳動物宿主に注入できるビークルを意味する。当技術分野公知の適当な担体としては、金粒子、滅菌水、食塩水、グルコース、デキストロースまたは緩衝化溶液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。担体は、希釈剤、安定化剤（即ち糖およびアミノ酸）、保存剤、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝化剤、増粘添加物、着色材糖を含む補助剤を含んでよいが、これらに限定されるものではない。
【００９３】
本発明の組成物およびワクチンには、更なる作用物質を加えることができる。たとえば、本発明の組成物は、薬物、免疫刺激剤（α-インターフェロン、β-インターフェロン、γ-インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、インターロイキン2(IL2)、インターロイキン12(IL12)、CpGオリゴヌクレオチド、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムゲルまたはMcCluskie et Weeratna, Current Drug Targets-Infectious Disorders, 2001, 1, 263-271に記載のその他補助剤）、抗酸化剤、界面活性剤、芳香剤、揮発油、緩衝化剤、分散剤、噴射剤、保存剤のような作用物質も含むことができる。宿主での免疫応答を高めるために、MLSポリペプチドを脂質膜に結合するか、または脂質膜内に取り込ませてリポソームを形作らせることができる。この目的のために、非発熱性の無脂質性核酸およびその他外来性物質を使用することができる。このような組成物を調製するため、当技術分野周知の方法を用いることができる。
【００９４】
本発明の組成物またはワクチンの中に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または抗体の量は、治療有効量であることが好ましい。ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または抗体の治療有効量とは、組成物が投与される宿主に過度の悪影響を引き起こすことなしにその免疫学的役割を果すことができるのに必要な量である。用いるポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または抗体、および投与する組成物／ワクチンの正確な量は、処置対象の疾患のタイプ、投与の形態、ならびに組成物中の他成分といった要因によって変わるだろう。
【００９５】
5.  使用方法
マイコバクテリア関連疾患を治療および／または防御するための方法
七番目の態様では、本発明は、哺乳動物でのブルーリ潰瘍のようなMU関連疾患を治療および／または予防するための方法を提供することに関する。
【００９６】
これらの方法は、遊離MUを不活性化し、病原菌を放出する可能性を持つMU感染細胞を排除するために、MU感染哺乳動物に免疫応答を誘発または強化するという主要目的を持つ。免疫応答のB細胞群は、遊離MUの不活性化を主に担う。これを遂行する主な手法は、感染性の中和である。MU感染細胞を破壊する別の主要メカニズムは、細胞表面にクラスI組織適合性抗原と組み合わさって発現しているMLS抗原を認識する細胞障害性Tリンパ細胞（CTL）が提供する。CTLは、たとえば感染細胞によって産生された、または貪食細胞によって内部に取り込まれたMLSタンパク質から、細胞内で処理されたMLSポリペプチドを認識する。したがって、本発明は、MLSポリペプチドに対するB細胞応答、ならびにMU感染後のCTL応答が仲介する免疫を刺激するのに用いることができる。CTL応答は、一次MU感染からの回復の仲介、および続く感染期間中の回復促進に重要な役割を果たすことができる。
【００９７】
これらの方法は、哺乳動物に有効量の単離または精製されたMLSポリヌクレオチド、単離または精製されたMLSポリペプチド、上記定義の組成物および／または上記定義のワクチンを投与する段階を含む。
【００９８】
本発明のワクチン、抗体および組成物は、様々な投与経路から個体に与えることができる。態様では、個体は動物であり、好ましくは哺乳動物である。より好ましくは、哺乳動物はヒトである。たとえば、組成物は、無菌注射水または油性懸濁液のような、無菌の注射可能な調製物の形で投与できる。これら懸濁液は、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて、当技術分野で公知の技術に従って製剤化できる。無菌の注射可能な調製物は、無毒な、非経口的に許容される希釈液または溶媒を用いた無菌の注射液または懸濁液でよい。それらは、非経口的、たとえば注射、注入によって静脈内、筋肉内または皮下に、あるいは経口的に与えることができる。本発明のワクチンおよび組成物は、局所投与向けに、クリーム、軟膏、ローション、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体またはパウダーのように製剤化することもできる。それらはまた、加圧した噴霧器、鼻内スプレー、ネブライザー、定量吸入器、ドライパウダー吸入器、またはカプセルを利用して、対象の気道に投与することもできる。
【００９９】
好適な用量は、組成物中の各成分の量、所望する効果（短期または長期）、投与経路、処置を受ける哺乳動物の年齢および体重といった要因によって変わるだろう。いずれにしても、投与する量は、MU感染を完全に阻止できないまでも、少なくとも、実質的な免疫抑制から宿主を保護するのに十分なものでなければならない。免疫原応答は、約0.1〜約5000マイクログラム抗原／kg体重、好ましくは約0.1〜約1000マイクログラム抗原／kg体重、そしてより好ましくは約0.1〜約100マイクログラム抗原／kg体重の量の本発明のポリペプチドを宿主に投与することによって獲得できる。一般的スケジュールの例としては、本発明のワクチンを単回用量宿主に投与でき、または間隔をあけて複数用量を投与する免疫感作の一次コースによってもよい。一次コース後に、必要に応じて投与を継続し、ブースターとして用いても良い。本発明のワクチン、抗体および組成物の投与には、当技術分野に周知な任意の別の方法を用いてもよい。
【０１００】
MLSポリヌクレオチドを含む免疫原組成物を投与することによる治療方法については、当業者は、核酸ワクチン（たとえばDNAワクチン）および核酸ワクチン技術の概念、応用および効果について認識している。核酸をベースとした技術は、投与前にコードされているタンパク質を生成する必要なしに、MLSポリヌクレオチドを、裸の状態または封入された状態で組織および細胞に直接送り込むことを可能にする。この技術は、これら核酸の持つ、レシピエント生物の細胞によって取り込まれ、発現してレシピエントの免疫系が応答する免疫原決定因子を産生する能力に基づいている。一般的には、発現した抗原は、核酸を取り込みそして発現した細胞の表面に提示されるが、発現した後レシピエント個体の循環系に出される、コードされている抗原もまた本発明の範囲内である。このような核酸ワクチン技術としては、裸のDNAおよびRNAの送達、MLSポリペプチドをコードする発現ベクターの送達を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。この技術は「ワクチン」と称されるが、それは防御反応を生じない免疫原組成物にも等しく用いられる。このような非防御誘導組成物および方法も、本発明に包含される。
【０１０１】
MLS核酸およ担体分子を裸の核酸として送達することも本発明の範囲内であるが、本発明はまたより大型またはより複雑な組成物の一部として核酸を送達することも包含する。この送達システムに含まれるもとのしては、MLS核酸を含有するウイルス、ウイルス様粒子または細菌が挙げられる。また、本発明の核酸および担体分子と、リポソームのような細胞透過性化合物との複合体も本発明の範囲内に含まれる。分子ベクター（欧州特許第696,191号、Samain et al.）のようなその他化合物、および核酸ワクチンのための送達システムは、当業者に公知であり、また参照として本明細書に組み入れられており、たとえば、国際公開公報第93 06223号および国際公開公報第90 11092号、米国特許第5,580,859号および米国特許第5,589,466号（Vical's patents）)に例示されており、過度もしくは過大な実験なしに実施および用いることができる。
【０１０２】
インビトロ診断法
MLSポリペプチドは、生物物質内にあるMUに対する抗体を同定するため、およびこの生物材料内の抗体の濃度を測定するための抗原として用いることができる。したがって、MLSポリペプチドは、生物材料中のMUの定性的および定量的測定に用いることができる。このような生物材料は、当然ヒト組織およびヒト細胞、ならびにヒト血清を含むヒトの体液のような生物学的液体を包含する。
【０１０３】
より具体的には、本発明は、上記定義のMLSポリペプチドに結合して免疫複合体を形成する、MUに対する抗体の有無を検出するためのインビトロ診断法を目的とする。このような方法は次の段階を含む：
a)本発明のポリペプチドを生物材料と、免疫複合体を形成するのに十分な時間と条件で接触させる段階；
b）a）で形成した免疫複合体の有無を検出する段階；および場合によって、
c）形成された免疫複合体を測定する段階。
【０１０４】
より具体的には、MLSポリペプチドは、液体中の液性成分の検出または定量化への使用に関して周知である免疫アッセイ手段を用いた、MUの検出に使用できる。したがって、抗原−抗体相互作用は、沈降または凝集といった二次反応によって直接観察または判定できる。これに加え、免疫電気泳動技術も用いることができる。たとえば、寒天を用いた電気泳動と、続く抗血清との反応の古典的組合せだけでなく、二次元電気泳動、ロケット電気泳動およびポリアクリルアミドゲルパターンの免疫ラベリング（ウエスタンブロットまたは免疫ブロット）も利用できる。MLSポリペプチドが利用できるその他免疫アッセイとしては、放射免疫アッセイ、競合免疫沈降アッセイ、酵素免疫アッセイ、および免疫蛍光アッセイが挙げられるが、これらに限定されるものではない。濁度測定、発色測定および比濁測定技術は使用できることが理解されるだろう。ウエスタンブロット技術に基づく免疫アッセイが好ましい。
【０１０５】
免疫アッセイは、免疫試薬の一つ、本発明の抗原または抗原に対する本発明の抗体を、試薬の免疫応答性を保持しながら、担体表面に固定化することで実施できる。相手方の免疫試薬は未標識でもよく、または免疫活性も同様に保持した形で標識することができる。これらの技術は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）および競合阻害酵素免疫アッセイ（CIEIA）のような酵素免疫アッセイでの使用に特に適している。
【０１０６】
MLSポリペプチドまたはMLSポリペプチドに対する抗体のいずれかを個体支持体に結合する時は、支持体は通常ガラスまたはプラスチック材料である。プレート、チューブ、ビーズまたはディスクの形に成形されたプラスチック材料が好ましい。好適なプラスチック材料の例は、ポリスチレンおよびポリ塩化ビニルである。免疫試薬が個体支持体に容易に結合しない場合は、試薬と支持体との間に担体材料を挿入することができる。好適な担体材料の例は、ウシ血清アルブミンのようなタンパク質、またはグルタルアルデヒドもしくは尿素のような化学試薬である。固相のコーティングは、通常技術を用いて実施できる。
【０１０７】
さらなる態様では、MUの指標となる抗体の有無を検出するための診断キットが提供される。したがって、キットは以下：
−上記定義のポリペプチド；
−ポリペプチド−抗体免疫複合体を検出するための試薬；
−ポリペプチドに免疫学的に結合する抗体を欠く生物参照サンプル；および
−ポリペプチドに特異的に結合できる抗体を含む比較サンプル
を含み、このときポリペプチド、試薬、生物参照サンプルおよび比較サンプルは、検出を実施するのに十分な量存在する。
【０１０８】
本発明はまた、本発明の抗体と結合して免疫複合体を形成する、MUの指標となるポリペプチドの有無を検出するためのインビトロ診断法を提案し、以下の段階を含む：
a）本発明の抗体を生物材料と、免疫複合体を形成するのに十分な時間と条件で接触させる段階；
b）a）で形成した免疫複合体の有無を検出する段階；および場合によって、
c）形成された免疫複合体を測定する段階。
【０１０９】
さらなる態様では、MUの指標となるポリペプチドの有無を検出するための診断キットが提供される。したがって、キットは以下：
−上記定義の抗体；
−ポリペプチド−抗体免疫複合体を検出するための試薬；
−抗体に免疫学的に結合するポリペプチドを欠く生物参照サンプル；および
−抗体に特異的に結合できるポリペプチドを含む比較サンプル
を含み、このとき抗体、試薬、生物参照サンプルおよび比較サンプルは、検出を実施するのに十分な量存在する。
【０１１０】
本発明の目標を達成するため、および目的に従って達成するために、MUの指標となる、ポリヌクレオチドの有無を検出するためのインビトロ診断法を提供する。したがって、方法は以下の段階を含む：
a）少なくとも一つの上記定義のプローブを生物材料と、該プローブが該ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするのに十分な時間と条件で接触させる段階；および
b）プローブとポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションの有無を検出する段階。
【０１１１】
用いることのできる鑑別診断技術としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：（1）制限酵素で消化しても、またはしなくともよい、細胞DNAを同定するためのサザンブロット法；（2）細胞から抽出されたRNAを同定するためのノーザンブロット技術；（3）ドットブロット技術、即ちサンプルを、アガロースゲルで事前に分離せずに、ニトロセルロースまたはナイロンのような特製メンブレンに通して直接濾過する技術、および（4）核酸を増幅するためのPCR技術。
【０１１２】
さらに、さらなる態様は、MUの指標となるポリヌクレオチドの有無を検出するための診断キットを提供する。それゆえに、キットは以下：
−上記定義のプローブ；
−ポリヌクレオチド−プローブハイブリダイゼーション複合体を検出するための試薬；
−プローブにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを欠く生物参照サンプル；および
−プローブに特異的にハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチドを含む比較サンプル
を含み、このとき前記プローブ、試薬、生物参照サンプルおよび比較サンプルは、検出を実施するのに十分な量存在する。
【０１１３】
本発明は、次の実施例を参照することにより、より容易に理解できるだろう。これらの実施例は、本発明の広範囲な応用性を例示したものであり、その範囲を限定するものではない。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、これを変更および変形が可能である。本発明を試験する作業には、本明細書に記載の方法および材料に類似または均等なものを用いることができるが、好ましい方法および材料は記載されている。
【０１１４】
実施例1
プラスミドpMUM001の同定
MUとMycobacterium marinum（MM）は、98％を超えるDNA配列同一性を有しており、それらは水環境に存在し、共に皮膚感染症を起こす（3）。しかしながら、MMは、病原性マイコバクテリアに典型的な肉芽性細胞内傷害を生ずるが、MUが主に細胞外で見出されるブルーリ潰瘍とは全く別のものである。MMがマイコラクトンを産生しないという事実は、MUとMMの間でゲノムのサブトラクション実験を行うことでマイコラクトン合成に関する遺伝子を同定できる可能性があることを示唆している。これらの実験から、MU特異的PKS遺伝子の断片を同定した（4）。これらの配列についておこなったその後の研究から、MU病原性プラスミド、pMUM001、ならびにそれがコードする異常なPKS遺伝子座が発見された。
【０１１５】
材料および方法
細菌株および増殖条件
MU株Agy99は、西アフリカの流行に由来する、最近の臨床分離株である。MU1615（ATCC 35840）は、元々はマーレーシア人患者から分離されたが、トルドーコレクション（Trudeau Collection）より得た。株はMiddlebrook 7H9ブロス（Difco）およびMiddlebrook 7H10（Difco）を用いて、32℃で培養した。
【０１１６】
プラスミド配列の決定
細菌人工染色体（BAC）ライブラリーを、ベクターpBeloBAC11を用いてマイコバクテリア株から作製し、既に記載したようにしてヌクレオチドの末端配列を決定した（5）。次に、このライブラリーを、PCRを使って、MUとMMの間のサブトラクションハイブイリダイゼーション実験で同定されたMU特異的PKS配列についてスクリーニングした（4）。選択したBACクローンの完全配列は、前に記載したようにして、ショットガンサブクローニングと配列決定から得た（6）。頻繁な反復PKS配列に伴う困難を克服するために、二つの、追加のBACサブクローンライブラリーを、インサートサイズ6〜10kbの（i）全PstI消化、および（ii）部分Sau3AIサブクローンから作製した。次に単一のモジュール（即ち単一の、非反復性ユニット）を示すSau3AIサブクローンを、プライマーウォーキングにかけた。配列は、Gap4（6,7）を用いて組み立てた。プラスミドの注釈付けのためには、ARTEMISツール（www.sanger.ac.uk/Software）を用い、公開データベースと自前のデータベースとの比較はBLAST総合パッケージおよびFASTAを用いて行った。PFGEおよびサザンハイブリダイゼーションの条件は、前に記載した（3,5）。
【０１１７】
結果
ゲノムのサブトラクション実験は、MU特異的ポリケチド合成酵素（PKS）遺伝子の複数の断片を同定した（4）。本研究では、未消化のMUゲノムDNAをパルスフィールドゲル電気泳動で分析したところ、約170kbのバンドが一本検出され（図1A）、それがMU特異的PKSプローブとハイブリダイゼーションしたことから、PKS遺伝子がプラスミドにコードされていることが示唆された（図1B）。流行性MU株Agy99の細菌人工染色体（BAC）ライブラリーから、正のハイブリダイゼーションを示すいくつかのクローンを単離し、BAC末端の配列決定、インサートの大きさおよび制限断片プロフィールから特徴付けを行なった。三つのBACは、引き続きショットガンシーケンスにかけられ、得られた合成列が、174,155bpを含み、GC含有量が62.6％であり、81個のCDSを担持する、pMUM001と名付けられたMUの環状プラスミド内に存在していることが確認された（図2）。これら三つのBACのうち、pM0022B04と名付けられた一つのBACは、長さ80kbpのpMUM001 DNAのインサートを有しており、またはpM0022D03と名付けられた一つのBACは、長さ110kbpのpMUM001 DNAのインサートを有している。これら二つのBAC、pM0022B04およびpM0022D03のDNAインサートは、一部重複し、また相補的であり、図2に示すプラスミドpMUM001の全体配列を再構築している。
【０１１８】
ある意味では、プラスミドは極めて単純であり、識別可能な転移もしくは維持遺伝子を持たない。複製は、潜在性Mycobacterium fortuitumプラスミド、pJAZ38からのRepAに対し68.3％aaの同一性を有するrepAの推定産物によって開始されると考えられている（10）。二つの、異なるダイレクトリピート領域が、repAの上流500bp〜1000bpに同定されており、複製開始点（ori）の可能性が示唆される。先導と遅延DNA鎖間の構成の偏りを強調するGCスキュープロット[(G-C/(G+C))は、ランダムパターンを示し、oriの可能性のある場所の特定には役立たなかった（図2）。repAの約2kb下流は、細胞分裂時にプラスミドの分離に必要な、染色体分配タンパク質をコードしている遺伝子、parAである。この領域にはまた、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（mup008）、機能不明のタンパク質をコードするが、多くの制御タンパク質に見出されているドメインである（11）リン酸ペプチド認識ドメインを含む遺伝子（mup018）、ならびにWhiB様転写制御遺伝子（mup021）から構成された潜在的制御遺伝子クラスターが在る。この配置は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（MTB）H37RvゲノムのoriC近傍の領域とシンテニーを分けあっている。repAのさらに上流には、機能の分かっていない保存されたタンパク質をコードする5kbの領域があり、ここにもMTBのoriC領域とのシンテニーが在る。機能は分かっていないが、膜関連ドメインを持つと推測される産物の遺伝子が六つある。この中に、MMPL（12）のような脂質搬出に関わる、またはその他の任意の搬出系に関わるタンパク質と類似性を示すものはない。プラスミドは挿入配列（IS）に富んでおり、たとえばIS2404の4コピー、そしてIS2606の8コピーを含め26個ある（13）。しかしながら、pMUM001の主要な機能は、毒素産生と思われる。これは、マイコバクテリアの毒性を媒介するプラスミドの最初の報告である。
【０１１９】
ほとんどのpMUM001（約105kb）は、マイコラクトン合成に関係するタンパク質をコードしている六つの遺伝子からなる（図2）。マイコラクトンコア産生PKSは、mlsA1（50,973bp）およびmlsA2（7,233bp）にコードされており、また側鎖酵素はmlsB（42,393bp）にコードされている。これら三種類のPKSは強く関連しており、ほぼ同一な（99.7％）ヌクレオチド配列が27kbにも及んでいる。全105kbのマイコラクトン遺伝子座は、実質的には、9.5kbの固有の非反復DNA配列からのみ成っている。MLS遺伝子座の反復、組換え体および新しい性質は、これら遺伝子がコードする二つのローディングモジュールと16個の伸長モジュールそれぞれの始まりから終わりまで辿ったとき（図3および以下の項を参照せよ）、GCスキュースポットに強く表れている（図2）。mlsAおよびmlsBの祖先遺伝子は、明らかに複製され、次にインフレーム欠失を受けて、拡散が限定された。おそらく側鎖の炭素12のヒドロキシル化を担うP450モノオキシゲナーゼ（mup053）；およびFabH様III型ケト合成酵素に類似の酵素（mup045）を含む、潜在的なポリケチド修飾酵素をコードする遺伝子も三つある。後者は、KS活性にとって重要な三つのアミノ酸のそれぞれに突然変異がある。同様の変更は、C-O結合形成を触媒するKS様酵素に見出されている（14）。Mup045の産物も同様に、マイコラクトンコアと側鎖の間のエステル結合形成を触媒する。または、側鎖の結合は、C末端チオエステラーゼ（TE）により直接MLSBにもたらされるかもしれない。興味深いことに、mup045遺伝子は52.8％のGC含有量を有しているが、これは他のプラスミドに比べ有意に低く、これが最近の水平方向の転移によって獲得されたことを示唆している。mlsA2の3’近くには、PKSローディングモジュールから、異常な脱カルボキシル化によって生じた短いアシル鎖を除去するために必要であろうII型チオエステラーゼをコードする遺伝子である、mup037がある(15)。
【０１２０】
実施例2
マイコラクトンPKSクラスターの分析
マイコラクトンPKSのモジュラー配置は、「アッセンブリーライン」マルチ酵素に関して確立されている範例とほぼ同じである（16,17）。マイコラクトンのコアはMLSA1とMLSA2によって産生される。MLSA1は脱カルボキシル化ローディングモジュール（18）と8個の伸長モジュールを含むのに対し、MLSA2は9番目および最後の伸長モジュール、ならびに12員ラクトン環を形作ることで産物を放出する役割を果たす一体化C-末端チオエステラーゼ／シクラーゼ（TE）ドメインを担持している（図3）。各モジュールにおけるアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメインの配列分析から推測されたマロネートおよびメチルマロネート取り込みのパターンは、マイコラクトンに見出されたものと正確に一致する（19）。同様に、鎖伸長の各段階で生ずる酸化状態は、ほぼ完全にマイコラクトン構造を基本に推測されたものに対応する（16,17）。例外は伸長モジュール2であり、このモジュールについては、配列比較からはデヒドラターゼ（DH）およびエノイル還元酵素（ER）ドメインが活性であると思われるが、産物の構造はこの段階を必要としない。しかしながら、これまでに特徴付けが行われたPKS遺伝子クラスターから、このように利用されない還元ドメインは推測されている（19）。同様に、マイコラクトンの側鎖は、脱カルボキシル化ローディングモジュールおよび7個の伸長モジュールを含み、さらに一体化TEドメインが加わったMLSBにより産生されるが、この場合の伸長ユニットの取り込みパターン、酸化状態およびケト還元酵素（KR）還元の立体化学（20）は、完全に予想通りである。
【０１２１】
しかしながらよく見ると、マイコラクトンPKSは、このようなマルチ酵素上でのポリケチド鎖伸長特異性の構造的基礎に関する我々の見解にとって重要な、極めて特異的な特徴をいくつか示す。第一は、PKSタンパク質は、MLSAは8個の連続する伸長モジュールからなる多酵素を一つ含む（MLSA1）先例のないサイズおよび推定分子量（1.8MDa）を有する；第二（MLSA2、0.26MDa）は、最後の伸長モジュールとTEを収納していることである。MLSA1とMLSA2の間の認識プロセスは、一部は、他のモジュラーPKS同様、特有の「ドッキングドメイン」によって媒介されている（21）。一方では、MLSBはその7個の連続伸長モジュールすべてを単一の多酵素内に含んでいる（1.2MDa）。これらは、任意の生細胞に存在が推測される最も大型のタンパク質の一つである。マイコラクトンPKSの最も驚くべき特徴は、16個の伸長モジュールすべてにある類似ドメインの間にある、極めて共通性の高い配列類似性である（図3）。モジュラーPKSは、通常同一PKSのドメインを比較したときに40〜70％の配列同一性を示し、異なるPKSのドメインを比較すると同一性はさらに低くなるが（19）、マイコラクトン遺伝子座のDH、ER、AタイプおよびBタイプのKRドメインの同一性スコアは、98.7〜100％の範囲であった。
【０１２２】
ATドメインには三種類の異なるタイプの配列がある；二つはマロネート特異性が推測されており、三番目はメチルマロネート特異性が推測されている。三つのタイプのATドメインは、それぞれの中では同一性スコアは100％であった（図3）が、配列タイプ間の同一性は34％であった。興味深いことに、マロネートATドメインタイプの一つは、常にAタイプのKRドメインに連結していた。この発散性のドメインの組合せは、MLSA1のモジュール5およびMLSBのモジュール1および2に見出され（図3）、またそのaaおよびDNA配列は共に100％同一であった。最も妥当と思われる説明は、重複後の水平転移によって最近獲得されたというものである。この考えは、このブロックのGC含有量が、周囲の配列に比べ顕著に低いことから支持される（58％対63％、図2）。
【０１２３】
重要なC-C結合形成段階を触媒するKSドメインについては、全MLSモジュール内の、相互の配列同一性は97％以上である。420残基中11残基のみが変動性を示すが、この変動性には規則性は認められない。他のモジュラーPKSの示すKSドメイン間の配列同一性は、32〜67％の範囲内である（表1）。
【０１２４】
(表２)   共通パーセンテージで表した四種類のPKSのKSドメイン間のアミノ酸同一性
2007511218.tif 000006
*伸長モジュールの数を示す
【０１２５】
マイコラクトンPKSの各種KSドメインによって触媒される合成作業は、成長中のポリケチド鎖および入ってくるエクステンダーユニットの両方について、顕著な構造的変動がある。MUのマイコラクトン含有抽出物について行った質量分析（LC-MS）実験からは、しかしながら、MLSAが明らかに一つの産物のみを産生すること、一方MLSBは7モジュールのうち2〜3が軽微な変動だけ示すことが確認された（22）。
【０１２６】
これらのデータから、このPKSの中のKSドメインは、ポリケチド鎖伸長の特異性決定において重要な役割を果たしていないという予想外の結論が導かれた。
【０１２７】
この所見については、実際的見地から、マイコラクトンPKSモジュールは、将来コンビトナトリアル生合成と関係する可能性のある、遺伝子工学で作られたハイブリッドモジュラーPKSの一揃いの「共通」伸長ユニットの基礎を整えたと結論できる（実施例6を参照）。
【０１２８】
結論すると、極めて高レベルのDNA配列相同性は、マイコラクトン系がごく最近、複数の組換えと重複によって生じ、進化したことを示している。またそれは、高いレベルの遺伝的安定性も示唆している。実際、異なる地域で分離されるMUが産生するマイコラクトンは、構造および細胞障害性の両方に不均一性が報告されている（9）。いくつかの株は、特定の水性昆虫の唾液腺といった環境ニッチに有利な適合を付与するマイコラクトンを産生することから、突然のブルーリ潰瘍の流行発生は、高い変異性によって説明できるかもしれない（23）。これに伴って、ヒトに対する病原性または伝染性が高まったのかもしれない。これらの事象には、pMUM001の消失または獲得も関与しているかもしれない（24）。いずれにしても、マイコラクトン生合成経路を解き明かすことで、マイコバクテリア感染症を予防し、これに対処するための新たな方法が可能になるだろう。
【０１２９】
実施例3
マイコラクトン陰性突然変異体の構築および分析
材料および方法
ファージMycoMarT7は、恥垢菌（M. smegmatis）mc2155を用いて継代した。このファージは、海性トランスポゾンC9 Himar1およびカナマイシンカセットを含むファージTM4の温度感受性突然変異体である（8）。約109個の細菌を含んだMU 1615の細胞浮遊液に、1010個のファージを4時間、37℃で感染させ、次にカナマイシン含有固形培地に直接接種して32℃で培養した。無着色のコロニーを精製し、個々の突然変異体をブロスでサブ培養し、5週間増殖させた。菌、培地濾過物、および脂質抽出物を、既述のように（9）L929マウス繊維芽細胞を用い、細胞障害性についてアッセイした。脂質はさらに、質量分析装置を用い、マイコラクトンに特徴的なイオン：分子イオン[M+Na]＋（m/z 765.5）およびコアイオン[M+Na]+mlz447（9）の有無について分析した。
【０１３０】
結果
マイコラクトン遺伝子とDNA配列についての構造に基づく予想がよく一致したことから、これがマイコラクトン遺伝子座であることが強く示唆されたが、遺伝子破壊実験を用いて確定的な証拠を探った。遺伝的に追跡可能なMU株1615はAgy99とより密接な関係にあり、また両株ともマイコラクトン生合成遺伝子はプラスミドにコードされており、その利用可能なDNA配列は同一である。MU 1615由来のプラスミドは、MUAgy99より3〜4kb小さい。この差は、pMUM001のRKS領域以外の、挿入配列に富む領域によるものである（図2）。海性トランスポゾンを担持するマイコバクテリオファージを用いてMU 1615の転移ライブラリーを作成し（8）、毒素によって付与される黄色（2）を失うことを目安にしてマイコラクトン陰性突然変異を同定した。突然変異体候補をDNA配列決定によって特徴付けし、それらがマイコラクトンを産生できないことを、細胞障害性アッセイおよび脂質抽出物の質量分析から評価した（9）（図4および図5）。ヌクレオチド配列は、色素を持たない、細胞変性ではない突然変異体であるMU1615::Tn141のトランスポゾン挿入部位から、mlsAのモジュール7のDHドメインにあることが確認された。MLSBが産生する側鎖は、コアラクトン非存在下では極めて不安定であり、その前駆体を検出することはできない（9）。質量分析からは、MU1615::Tn141には、コアラクトンならびに無傷のマイコラクトンの両方が存在しないことが確認された（図5を参照）。同様に、MU1615::Tn104は、mlsBではローディングモジュールのKSドメインにあることが確認された。質量分析からは、m/z 447のラクトンコアイオンが存在するが、m/z 765.3のマイコラクトンイオンが無いことから証明されるように、突然変異体は依然コアラクトンを産生し続けるていることから、挿入がmlsBにあることが確認された（図5）。これら突然変異体の特徴付けから、マイコラクトンの産生にはMLSAおよびMLSBが必要であることが、最終的に証明された。
【０１３１】
実施例4、5および6
序
本開示以前に、マイコラクトンPKS伸長モジュールに、価値あるレベルの、相互の配列類似性／同一性（詳しくは実施例2を参照）を予想した当業者はいないだろう。KSには、基質の選択が必要であると予想されることから、マイコラクトンに見られるポリケチド鎖に多様性を創り出すには、配列差が最小になることが必須であると考えられた。第二に、時間の経過に伴ってマイコラクトンPKSのDNAにはランダム突然変異が蓄積し、モジュール間に配列の発散を生じさせ；また変種は進化を通じて選択され、活性部位の間の伸びていくポリケチド鎖の転移を最適化するように、個々のKSとACPドメインペア間（および異なるモジュール内の他のドメイン間）のタンパク質：タンパク質相互作用が最適化されたと推測されている。最後に、このような先例のない、DNAレベルでの極めて高い配列類似性は、生産生物においてこのようなDNAを、すべての細胞で機能している組換えの細胞内メカニズムが存在する状態で維持し続けることと相容れないと考えられる。
【０１３２】
マイコラクトンの新規変種の製造およびポリケチドのコンビナトリアル生合成の両方に関する本開示の重要性は、これら従来の予想すべてを覆すことにある。この自然例では、KSドメインが構造に関しては実質的に同一であり、それゆえに上流の伸長モジュールから送られ、そこを通過する「正しくない」基質を拒絶する校正の役割を負うことができず、従って忠実に処理する、換言すれば通過させてしまうことは明らかである。同じ事は、マイコラクトンPKSの他のドメインにも当てはまる。
【０１３３】
マイコラクトンPKSの先例のない、且つ予想外の特性を認識すれば、当業者は直ぐにPKS遺伝子またはその一部を利用して、好適な組換え宿主株においてポリケチドの新規コンビナトリアルライブラリーを産生する、ドメインおよびモジュールの新規コンビナトリアル配置を発現する遺伝子を構築するだろう。同様に、当業者は、こうして発現させた、精製した形態の遺伝子産物を利用して、インビトロでのポリケチドライブラリーの産生を触媒することを直ぐにでも思いつくだろう。当業者は、モジュール間、特にあらゆるKS、ATおよびACPドメイン間の高い配列同一性／類似性が、マイコラクトンPKSドメインおよび／またはモジュールのこのようなコンビナトリアルなあらゆる組合せでは、任意のドメインとその隣接ドメインとの間のタンパク質：タンパク質相互作用が適合的になる確率が極めて高く、モジュラーまたはドメインを欠失、付加、または置換することによって、あるいは、ドッキングドメイン内に変更を加えるかまたは加えないまま、異なるPKSマルチ酵素を一つに結合することによって構築されている既に産生されたハイブリッドモジュラーPKSと好対照をなすことに容易に気づくであろう（Gokhale RS et al.: Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases. Science 1999, 284:482-485; Tsuji SY, et al.: Intermodular communication in polyketide syntheses: Comparing the role of protein-protein interactions to those in other multidomain proteins. Biochemistiy 2001, 40:2317-2325.; Broadhurst RW, Nietlispach D, Wheatcroft MP, Leadlay PF, Weissman KJ: The structure of docking domains in modular polyketide synthases. Chem. Biol. 2003, 10:723-731）。
【０１３４】
たとえ従来の方法が、タンパク質：タンパク質相互作用を攪乱しないことを主張している場合でも、それを実証する直接の証拠は提示されておらず、また近い関係にある動物の脂肪酸合成酵素では、単一のアミノ酸を変更する点突然変異でさえ、活性ホモダイマー酵素を不活性なモノマーに解離させることがあることを示している（Rangan VS, Joshi AK, Smith S: Mapping the functional topology of the animal fatty acid synthase by mutant complementation in vitro. Biochemistry 2001, 40:10792-10799）。
【０１３５】
さらには、KSドメインとその他ドメインが本質的に同一であることによって、それらが、それらと共に在る「非天然」アシル基質を忠実に処理することも起こり得るだろう。それゆえに、本発明は、複数の従来利用できなかった、コンビナトリアルモジュラーPKSラブラリーの生成および開発への道を提供する。当業者は、本発明の多くの異なる態様および応用を想起するだろう。本発明者らは、以下の実施例にいくつかの例を記載するが、それらにより限定する意図はない。
【０１３６】
マイコラクトンPKS遺伝子およびその一部は、ハイブリッドPKS-NRPSシステムから生じた混合ポリケチド-ペプチド産物、およびポリ不飽和脂肪酸のような脂肪酸も含め、これまでにモジュラーPKS遺伝子を用いて新規ポリケチド産物を発現するハイブリッド遺伝子を作成したあらゆるすべての応用に利用できることは明らかであろう（Kaulmann U, Hertweck C: Biosynthesis of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthases. Angew. Chem.. Int. Ed. 2002 41:1866-1869.）。それらを利用し、海綿のような、現時点では持続不可能な天然供給源からのみ得ることができる産物；またはその供給が限られている産物を合成できるデザイナーPKSを創ることができる。それらは、コンビナトリアル生合成の鋳型を提供することによって、またはそのような化学合成物を基質として利用することによって、ポリケチドおよびポリケチドライブラリーの化学合成と組み合わせることができる。それらは、インビボまたはインビトロにおいて、ポストPKS修飾を行う酵素と組合せ、これら新規鋳型に各種修飾（とりわけヒドロキシル化／メチル化／グリコシル化／酸化およびアミノ化を含む）を新たに加えることによって、より複雑なライブラリーを産生することもできる。それらは、ハイブリッド内のある天然PKSから別のPKSへのポリケチド鎖の転移を円滑にするためのハイブリッドPKS成分として利用できる。それらは、定方向進化実験に利用してPKSの効率を改良し、結果として一連の確立技術を用い、所望産物の収率を上げることができる。標準的な方法を用いてマイコラクトンPKS遺伝子のヌクレオチド配列を変更し、モジュール間の配列同一性を下げ、不要な相同的組換えに対する遺伝子の安定性を改良できること；または大腸菌、シアノバクテリア、シュードモナス、ストレプトマイセス、酵母、植物ならびにその他原核および真核発現系のような宿主株での異種発現；ならびにインビトロ発現系に用いられるコドンを最適化できることも同様に明らかである。
【０１３７】
以下に、どのようにして、このようなハイブリッド遺伝子およびハイブリッド遺伝子ライブラリーの構築し、好適宿主株へ導入し、そして発現させ、コードされたハイブリッドPKSタンパク質が、新規かつ有用な医薬品の開発にとって潜在的な先駆けとして価値あるポリケチド産物を産生するかについての例を記載する。
【０１３８】
当業者にとって、これらの例に記載したもの以外の、価値あるポリケチド化合物の遺伝子工学的（コンビナトリアル）生合成に関する本発明の課題であるマイコラクトン生合成遺伝子の開発のために利用できる方法が多くあることは容易に思い浮かぶだろう。たとえば、遺伝子は、PKSが本来創ることが知られていない分子を含め、所望の標的分子を産生できる好適な宿主株の内部にデザイナーPKSを創り出すのに用いることができる（Ranganathan et al.: Knowledge-based design of bimodular and trimodular polyketide synthases based on domain and module swaps: a route to simple statin analogues. Chem. Biol. (1999) 6:731-741.）。この同じ取り組み方を用いて、現在自然供給源からの入手が限定されており、そして／またはその完全化学合成が困難であるか、コストがかかる天然ポリケチド、たとえば抗癌化合物のジスコデルモライドのような海起源の天然ポリケチドを手に入れることもできる。
【０１３９】
この場合も、ハイブリッドPKS遺伝子の遺伝子ライブラリー構築方法は多様であろう。たとえば、PKS遺伝子の、モジュール毎の、デヌボの段階的構築は、適合する末端を作る二種類の固有の制限酵素を利用した定方向クローニングを用いるか、または国際公開公報第01/79520号および本明細書の参考資料中に記載されているXba/メチル化Xba技術を用いて実施できる。生じたハイブリッドPKSは、マイコラクトンPKSモジュールまたはドメインをすべて、または一部含んでよく；一つのみ、あるいは必要とされる伸長モジュールがその中に分配されている二またはそれ以上のタンパク質から成ってもよい。ローディングモジュールは、同一ポリペプチド上に伸長モジュールとして配置されてもよく、または第一伸長モジュールを含むタンパク質のN-末端と特異的に連結するよう適当に作られた別々のPKSポリペプチド上に配置されてもよく、そしてたとえばエリスロマイシン、アベルメクチン、ラパマイシン、リファマイシン、ソラフェン、ボレリジン、モネンシン、エポチロン、ホスホラクトマイシンおよびコンカナマイシンのPKSの各ローディングモジュールを含む当技術分野公知の多数のモジュールの任意の一つから選ぶことができ、あるいはローディングモジュールはランカシジン中のアミノ酸によって鎖開始を指定しているNRPSモジュールからなってもよい。
【０１４０】
ハイブリッドPKSからのポリケチド鎖放出のための酵素も同様に、同一ポリペプチドの上に、または最後の伸長モジュールのPKSに特異的に結合するように適切に作られた別のポリペプチドの上に、最後のPKS伸長モジュールとして存在してもよい。鎖放出酵素は、エリスロマイシン、ピクロマイシン、タイロシン、スピラマイシン、オレアンドマイシンおよびソラフェンクラスター由来のもののようなチオエステラーゼ／シクラーゼ；エライオフィリン（elaiophylin）に関するようなジオリドチオエステラーゼ／シクラーゼ；ノナクチンPKSに見出されるようにマクロテトロリド形成酵素；ラパマイシンとリファマイシンPKSに見出されるようなアミド合成酵素；あるいはモネンシンPKSに見出されるようなヒドロラーゼ系を含む当技術分野公知の多数ある鎖終止酵素のいずれか一つから選択できる。このリストは、あらゆる可能性を掲載したのものではない。マイコラクトン生合成遺伝子クラスター（Stinearらによるms）または数あるPKS遺伝子クラスターの任意の一つに由来するチオエステラーゼII酵素の遺伝子を同時クローニングすることもまた有利だろう。このようなチオエステラーゼは、インビボでPKSの効率を高めることが分かっている。
【０１４１】
別の応用は、MLS”ACP-KS”領域を、他の天然PKSを含むハイブリッドPKSを橋渡しする仲介役として用いて、MLS KSドメインの基質耐性を開発する。これは、既存の特異性障害を解消し、特定ポリケチド産物の収率を高めるだろう。
【０１４２】
病原性であるか否かに関わらず、任意のマイコラクトンの合成に関するPKS遺伝子を含有するマイコバクテリアの、他のすべての株から得たマイコラクトンPKS伸長モジュールは、同様に、遺伝子工学を利用したハイブリッドPKS、およびそのようなハイブリッドPKSのコンビナトリアルライブラリーの作成、ならびにそれからの新規マイコラクトン（および一般的に新規および有用なポリケチド）の製造のために極めて好適な材料として用いられることは、当業者にとって明らかであり、また本発明を認識している。同様に、他のマイコバクテリア株に由来するそのようなクラスターのその他生合成遺伝子は、チトクロームP450、チオエステラーゼIIおよびFabH様酵素を含め、本明細書に記載されているものに対し、同等に使用でき、そして同等の価値がある。
【０１４３】
同様に、天然もしくはハイブリッドPKSの修飾に関する当技術分野公知の方法は、個々の酵素機能の欠損、付加、または置換を目的とするか；各ケチド単位内の酸化状態を変更して、ケトアシルもしくはヒドロキシアシル機能、炭素-炭素二重結合もしくは完全に飽和したアシルを産生するか、または立体化学の変更を目的とするか；産生されるポリケチド鎖の短縮または延長することを目的とするかにかかわらず、すべてマイコラクトン遺伝子に有益に応用できることも明らかであろう。
【０１４４】
同じく当技術分野では、伸長のための前駆体としてマロニル−チオエステルまたはメチルマロニル−チオエステルまたは置換メチルマロニル−チオエステルをそれぞれ使用してもたらされる水素またはメチルまたは置換型メチルの側鎖を標的に、他のアルキルもしくは置換アルキル基、または水素で置換する多くの方法が知られている。これらの方法はすべて、マイコラクトンPKS遺伝子を使用して得たコンビナトリアルライブラリーをさらに多様化するのに用いることができる。たとえば、メトキシマロニル−チオエステルの遺伝子は一つにして供給でき、またメトキシマロニルチオエステルを選択するアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメインを用いて、マイコラクトンPKS由来ユニットに基づくPKS中の既存ATドメインの一つを置換えることができる。さらに、このような変更は、ドメインの交換だけでなく、複数ドメインの交換、選択性を変えるための部位指定突然変異誘発、または全モジュールの交換によっても行うことができるが、後者の場合、得られるハイブリッドPKSが効率性を失うリスクが高くなる。
【０１４５】
同様に、マイコラクトンPKSタンパク質のこの特性が、個々のマイコラクトンPKSに由来するACPおよびKSドメインを用いて置換することによるハイブリッドモジュラーPKSの構築においてより一般的に用いることができることは明らかであり、それによって異なる天然PKSに由来するハイブリッドPKSの部分間での重要なモジュラー間移動が容易になり、マイコラクトンドメインは「スーパーリンカー」として機能し、また重要なACPとKSドメインの間の好ましくないタンパク質：タンパク質接触が無いという利点を獲得し；そしてマイコラクトンPKS由来KSドメインの化学的選択性が無くなることが期待される。
【０１４６】
同様に、マイコラクトンPKS由来ドメインまたはモジュールを含む任意のハイブリッドPKSを収納した組換え細胞を、当技術分野周知の、モジュラーPKSのポリケチド産物を修飾する酵素をコードする他の遺伝子と組み合わせることができることも明らかである。これら酵素としては、ヒドロキシラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、オキシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような付加的「ポストPKS」遺伝子の開発は、単一の新規ポリケチドを加工した分子のコンビナトリアルライブラリーにさらに変換し、本発明の結果として多様性をさらに増加させ、したがって利用可能なライブラリーの有用性をさらに増加させる可能性がある。方法は既に、様々な抗生物質を生合成している放線菌に由来する、活性化したデオキシ糖、グリコシルトランスフェラーゼおよびその他補助的酵素の全生合成経路に関する遺伝子の組換え細胞の開発に利用可能である（たとえば国際公開公報第01/79520号を参照）。
【０１４７】
マイコラクトンPKS遺伝子は、好適な異種細胞において高レベルで発現できること、またそれらがコードする、インビトロでのポリケチド産生に用いることができる、組換えPKSタンパク質の産生および精製に使用できることも明らかである。この産生方法によって、PKSに渡される基質全体をより完全に制御できるようになり、たとえば、細胞壁にまつわる限界を取り払うことができる。現在まで、このようなインビトロの産生は、単純なトリ−およびテトラケチド合成を除いては天然のPKSについてさえ十分に示されておらず、そのような理由から本発明がなされた。異なる精製タンパク質が一または複数のPKS伸長モジュールを、モジュール：モジュール相互作用に特異性を付与するための好適ドッキングドメインと共に含んでいる場合は、これによりポリケチド産物ライブラリーのコンビナトリアルインビトロ生合成が可能となり、化学または生物学的手段によるハイスループットスクリーニングに都合良く結びつけることができる。
【０１４８】
実施例4
恥垢菌（Mycobacterium smegmatis）およびMycobacterium marinumでのマイコラクトン生合成遺伝子の異種発現およびマイコラクトンの産生
MUは極めて増殖の遅いマイコバクテリアであり、分子を詳細に研究することができる十分な量のマイコラクトンを産生することは、非常に難しい。恥垢菌株Mc2155は、増殖が早く、また遺伝的に追跡可能なマイコバクテリアである。M. marinumは、MUと遺伝的に非常に近い関係にあるが、より迅速に増殖し、マイコラクトンを産生しない株である。ここに紹介する方法は、どのようにしてMUプラスミド（pMUM001）のマイコラクトン遺伝子を恥垢菌Mc2155またはM. marinum（M23株）に移し、その結果、数週間から数ヶ月とは対照的に、わずか数日間の発酵期間後に簡単にマイコラクトンが産生できるようになるか記載する。
【０１４９】
本例の別の変形としては、潜在的または高められた治療特性を持つ、修飾インビボ活性を示す修飾マイコラクトンの異種発現が挙げられる。
【０１５０】
方法は以下の二段階を含む：
第1段階
マイコラクトンコア構造の合成を担う酵素をコードする遺伝子（mlsA1、mlsA2、mup038）の恥垢菌およびM. marinumへの転移。
【０１５１】
細菌人工染色体（BAC）クローンMu0022B04は、以後コア断片と呼ぶmlsA1、mlsA2およびmup038を包含するpMUM001の80kbpの断片を含む。この80kbpのコア断片を、マイコバクテリアファージL5付着部位（attP）、L5インテグラーゼ遺伝子、および抗生物質アプラマイシンに対する耐性をコードしている遺伝子を含むように変更されたハイブリッド細菌人工染色体（BAC）ベクターにサブクローニングする。このpBeL5と呼ばれるハイブリッドBACは、したがって、シャトルベクターとして機能し、大腸菌での大型DNA断片のクローニングを可能にし、次にそれによって、その後のファージインテグラーゼの作用を通したマイコバクテリアへのこれら断片の安定な組み込みを容易にする。形質転換に成功した細胞は、それらがアプラマイシンに対する耐性をマイコバクテリア宿主細胞に付与することから選別される。
【０１５２】
コア断片は、以下の操作によって、Mu0022B04から80kbpのHindIII断片としてサブクローニングされる：
−MU0022B04のHindIII制限酵素部分消化
−パルスフィールドゲル電気泳動を用いた得られた80kb断片の精製
−この断片の、唯一のpBeL5のHindIII部位への連結。
【０１５３】
得られたクローンを、次にDNA末端配列決定と挿入DNAのサイズ決定とを組み合わせたスクリーニングにかけ、正しいサブクローンが得られたか確認する。次に、正しいことが確認されたクローンからDNAを調製し、このDNAを用い、標準的な方法に従ってエレクトロポレーションし、恥垢菌およびM. marinumを形質転換する。次にアプラマイシン耐性クローンを二次培養し、様々な時点でサンプルを取り、アセトン可溶性脂質を抽出して、質量分析装置に連結した液体クロマトグラフィー（LC-MS）を用いてマイコラクトンコア分子の存在についてスクリーニングする。マイコラクトンコアの存在試験が陽性であった培養物を、それぞれ恥垢菌::コア、およびM. marinum::コアと命名した。
【０１５４】
第2段階
マイコラクトン側鎖構造の合成および付着を行う酵素をコードする遺伝子（mlsB、mup045、mup053）の、恥垢菌::コア、およびM. marinum::コア株それぞれへの移入。
【０１５５】
BACクローンMu0022D03は、mlsB、mup045およびmup053をすべて包含する110kbのpMUM001断片を含む。このクローンはまた、pMUM001の自律的複製に必要な遺伝子をすべて含んでいる。したがってMu0022D03は、それに適当な抗生物質耐性遺伝子カセットを具備し、マイコバクテリアバックグランドでの選択を可能にすれば、大腸菌およびマイコバクテリアの両方の中で複製できるシャトルプラスミドとなるだろう。このプラスミドを抱えたマイコバクテリアは、側鎖合成に必要な遺伝子をすべて含むことから、活性型のマイコバクテリア側鎖を産生するだろう。
【０１５６】
これを達成するために、Mu0022D03を、プラスミドにカナマイシン耐性カセットを無秩序に挿入するEZ：TNシステムを用いたランダムトランスポゾン突然変異誘発にかける。次に、このようにして得たカナマイシン耐性突然変異のトランスポゾン挿入部位を、DNA配列決定から決定する。マイコラクトンの生合成にとって必須でない遺伝子にトランスポゾン挿入を含んでいる突然変異体を選択する。次にこのカナマイシン耐性のMU0022D03突然変異体からDNAを調製し、これを用いてエレクトロコンピテントな恥垢菌::コアおよびM. marinum::コアを形質転換した。次に、アプラマイシンとカナマイシンの両方に耐性である形質転換体を、マイコラクトンおよびその共存代謝物の存在についてスクリーニングにかけた。
【０１５７】
実施例5
放線菌（Streptomyces coelicolor）でのマイコラクトンの発現
放線菌の繊維状細菌、特にストレプトミセスは、様々なポリケチドの天然供給源であり、長い間ポリケチド合成酵素遺伝子の異種発現に用いられてきた。以下の方法は、放線菌によってマイコラクトンを産生するように修飾できる手段を記載している。方法は三段階で記載される。
【０１５８】
段階1
マイコラクトンコア構造の合成を担う酵素をコードする遺伝子（mlsA1、mlsA2、mup038）の放線菌A095への転移。
【０１５９】
コア断片は、BACクローンMu0022B04から、60kbのPacI断片として単離する。PacI部位は、好都合なことに、mlsA1開始コドンのすぐ上流に位置している。この断片をパルスフィールドゲル電気泳動で精製し、次に、すべてベクターpCJR133（Wilkinson CJ et al. Increasing the efficiency of heterologous promoters in actinomycetes J Mol Microbiol Biotechnol. 2002 Jul;4(4):417-26）から6kbのapaLI断片として得た、ストレプトマイセスファージphiC31 attP配列、ファージphiC31インテグラーゼ遺伝子およびアプラマイシン耐性遺伝子を含むように変更されたハイブリッドBACベクターにサブクローニングする。このハイブリッドベクターは、pTPS001と名付けられている。次にPacIコア断片を、ストレプトマイセスactIプロモータの直ぐ下流に位置する、pTPS001唯一のPacI部位にクローニングする。次に、クロラムフェニコールとアプラマイシンの両方に耐性なクローンを、PCRを用いて、コア断片がpTPS0011のactIプロモータに対し正しい方向に在るかスクリーニングにかける。次に、PCR陽性のクローンからDNAを単離し、これを用いて、エレクトロポレーションによってメチル化欠損大腸菌株ET12567を形質転換する。続いて標準的方法に従って形質転換体を放線菌A095に接合した。次にアプラマイシン耐性接合完了体を二次培養し、PCRおよび制限酵素（RE）分析にかけて試験し、コア断片が存在することを確認する。陽性の接合完了体を、放線菌::コアで表す。
【０１６０】
段階2
宿主コドンレパートリーの変更およびマイコラクトン修飾酵素（mup038、mup045およびmup053）をコードする遺伝子の付加。
【０１６１】
この段階では、四つの遺伝子が構成的ストレプトマイセスプロモータの制御下にある人工オペロンを、XbaI技術を用いて構築する。このシステムは、重複するdamメチル化に対するXbaIの感受性を利用して、単一オペロン内にある遺伝子を、鎖状につながったNdeI/XbaI断片として連結するものである（たとえば国際公開公報第01/79520号を参照せよ）。
【０１６２】
ストレプトマイセスではTTAコドンは稀であり、それに対応する転移RNA遺伝子（bldA）は胞子形成中のみ発現するように厳密に制御されている。マイコラクトン遺伝子は、比較的TTAコドンに富み、したがって効率的な翻訳のために同起源のtRNAの適当な供給を確保するために、構成的プロモータの制御下にあるbldA遺伝子を含むプラスミドを導入することで宿主の放線菌A095を修飾することは有益である。上記概要を示したXbaIシステムを用いて、bldA、mup038、mup045およびmup053を含むオペロンを構築した。この作業は、PCR増幅を行い、次にこれら遺伝子を、ストレプトマイセス発現ベクターpCJW160（Wilkinson CJ et al. Increasing the efficiency of heterologous promoters in actinomycetes J Mol Microbiol Biotechnol. 2002 Jul;4(4):417-26）の中、構成的ermEプロモータの直ぐ下流にクローニングすることで実施する。このベクターは、チオストレプトン耐性カセットを含む。この構築体（pCJW160:ポリと呼ぶ）を、接合によって放線菌::コアに移す。アプラマイシンおよびチオストレプトンに耐性な接合完了体を二次培養し、PCRおよびRE分析を用いてコア断片およびpCJW160::ポリの存在について試験する。陽性の培養物を再度二次培養し、様々な時点で副サンプルを抜き取り、アセトン可溶性脂質を抽出して、次にLC-MSを用いてマイコラクトンコア分子の存在についてスクリーニングする。マイコラクトンコア試験陽性の培養物を放線菌::コア::ポリで表す。
【０１６３】
段階3
マイコラクトン側鎖(mlsB)の合成を担う酵素をコードする遺伝子の、放線菌::コア::ポリへの転移
遺伝子mlsBは、BACクローンMu0022D03由来の45kbのPacI/SspI断片として単離された。mlsA1の場合は、PacI部位は開始コドンの直ぐ上流に位置している。この45kbの断片を、PFGEにより精製し、次にストレプトマイセスファージVWB attp配列、ファージVWBインテグラーゼ、遺伝子actII-ORF4、actIプロモータ領域、ストレプトマイセスoriT配列、唯一のPacI部位の下流にある唯一のSwaI部位、およびヒグロマイシン耐性遺伝子を含むように修飾が加えられたハイブリッドBACベクター内にサブクローニングする。このハイブリッドベクターをpTPS006と名付けた。次に、mlsBを含む45kbのPacI/SspI断片を、PacIおよびSwaIでRE消化して準備した、ベクターpTPS006にクローニングする。次に、クロラムフェニコールおよびヒグロマイシンに耐性であるクローンを、PCRにかけてmlsBの存在についてスクリーニングする。次にPCR陽性クローンからDNAを単離し、これを用いて、エレクトロポレーションによってメチル化欠損大腸菌株ET12567を形質転換する。次に、標準的方法を用いて形質転換体を放線菌A095::コア::ポリに接合する。次にアプラマイシン、チオストレプトン、ヒグロマイシン耐性接合完了体を二次培養し、PCRおよびRE分析にかけて試験し、すべてのマイクロラクトン遺伝子が存在することを確認する。陽性の接合完了体を、放線菌::mlsで表す。陽性の培養物を再度二次培養し、様々な時点で副サンプルを抜き取り、アセトン可溶性脂質を抽出して、次にLC-MSを用いて真正マイコラクトンの存在についてスクリーニングする。
【０１６４】
実施例6
大腸菌のコンビナトリアルポリケチドライブラリー構築
以下に、機能的ドメイン間のヌクレオチド配列類似性が高いことを活用して、新規の治療上有用なポリケチドが合成できるモジュラーポリケチド合成酵素のライブラリーを構築する、マイコラクトン生合成遺伝子（mls；対応するタンパク質はMLSで表される）を用いる方法の一つを記載する。方法は四段階にわけて記載する：
1.  従来技術に多くの先行例がある、ポリケチドの合成を支える大腸菌の修飾
2.  新規MLSモジュールの構築
3.  大腸菌コスミッド発現ベクターの調製
4.  大腸菌感染のためのコスミッド粒子のパッケージング要件により選択された各ハイブリッドPKSに存在する複数の伸長モジュールを用いる、直線的に配置されたモジュールの組合せの構築
5.  大腸菌のコンビナトリアルポリケチド分子ライブラリーの産生。
【０１６５】
段階1
ポリケチド合成を支援する大腸菌の変更
コンビナトリアルライブラリーの発現に使用する大腸菌株は、PKSモジュールを翻訳後に修飾する、好適な4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ホロACP合成酵素、PPTアーゼ）を発現するように遺伝子工学により作られている。好適PPTアーゼは、マイコバクテリアそれ自体から、または枯草菌（Bacillus subtilis）のサーファクチン（srf）遺伝子クラスターから入手できる。同様に大腸菌は、マロニルおよびメチルマロニルCoA伸長ユニットを両方確実に供給するために同時発現しているストレプトマイセス種に由来する、適当な経路遺伝子も含むように遺伝子工学によって作られている。これは、既に記載されている方法（たとえばPfeifer, BA, et al.: Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science (2001) 291:1790-1792を参照）を用いて行うことができる。このようにして、放線菌またはマイコバクテリア、またはエリスロマイシン生産菌（Saccharopolyspora erythraea）のプロイオニルCoAカルボキシラーゼ（PCC）を用いて、メチルマロニルCoAのレベルを上げることができる。大腸菌細胞の中に、伸長ユニットとして別の前駆体分子、たとえばフェニルCoA、シクロヘキサンカルボン酸、CoAエステルもしくはメトキシマロニルACPを確実に存在させる必要がある場合には、標準的な方法を用いて他の経路遺伝子を同時発現させる。
【０１６６】
段階2
新規MLSモジュールの構築
MLS遺伝子の分析から、それらがSpeIもXbaIのRE認識配列も含んでいないことが示されている。これに加え、同一機能を持つモジュールで配列相同性が高いということは、このようなモジュールの間では、同一パターンのRE消化が得られることを意味している。これらの事実を活用して、ATおよび「還元」ドメイン（KR、DH、ER）を単純な「切断と貼付」のクローニング手法によって交換可能な「ユニバーサルモジュール」を構築する。一つの例を図36に示すが、ここではモジュールは適度の特異性と完全な還元ループを持つATドメインを含むように作られている。
【０１６７】
この同じ方法を用い、それらのAT-KR全体にまたがるBamHI-EcoRV断片を図36に描いたベクター領域のクローニング部位にクローニングすることによって、別のユニバーサルモジュールを構築することができる。この制限酵素部位の組合せからは、少なくとも5種類の機能的モジュールが作られる。別の制限酵素を用いれば、さらに別のモジュールを構築できる。
【０１６８】
段階3
修飾コスミッド大腸菌発現ベクターの調製
標準の大腸菌コスミッドベクターを、効率的な大腸菌プロモータ、アラビノース誘導性araBADプロモータを、エバメクチン生産菌（Streptomyces avermitilis）のアベルメクチン産生PKSローディングモジュールの直ぐ上流に含むように修飾した。avePKSローディングドメイン配列をコードしているDNAは、遺伝子工学を用いて3'XbaI部位をただ一つ含むように作られ、その後すぐに、5'SpeI配列が前にある、エリスロマイシン生産菌のDEBS PKSに由来する一体化TEを持つオフローディングモジュールが続く（図37）。SpeIおよびXbaIは、相互に適合している付着端を持つ。図37は、大腸菌でのコンビナトリアルポリケチドライブラリーの発現を支持する、修飾コスミッドベクターの配置を描いている。
【０１６９】
段階4
異なるモジュールの組合構成を持つ直線配置DNA分子の構築
別個の単一モジュールをコードするDNA分子は、上記段階2で調製するクローンをXbaIおよびSpeIの両方で消化して得る。DNAをプールし、XbaIおよびSpeI存在下に自己連結し、得られた連結産物が正しい方向にクローニングされていることを確認する。このようにして連結されたモジュールを、次に、修飾コスミッドベクターに、ここでもXbaIとSpeI存在下にクローニングを行う。得られたすべての連結産物は、正しい向きと様々な組合せで存在し、また伸長モジュールの数が異なっている構成的PKSモジュールを有していた。連結混合物は、標準的なファージラムダパッケージング法を用いて、パッケージングする。パッケージングによってサイズは強制的に選択され、約45kbのインサートが生じるため、生成された組換え大腸菌のサイズ選択ライブラリーは、大部分が7〜9個の伸長モジュールを含んでいる。
【０１７０】
段階5
大腸菌でのコンビナトリアルポリケチド分子ライブラリーの産生
段階1の大腸菌株を段階4で得たファージ粒子でトランスフェクションし、たとえばPfeifer, BA, et al.,: Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science (2001) 291:1790-1792）に記載のような好適培養条件の下で新規ポリケチドを発現する組変え大腸菌クローンを得る。ポリケチド産物をLC-MSで分析するか、または標的活性の生物スクリーニングに用いる。
【０１７１】
マイコバクテリア（MU）内のpMUM001と呼ばれる174kbのプラスミドの存在は、病原性決定因子をコードするマイコバクテリアプラスミドの最初の例である。pMUM001の半分以上は六つの遺伝子に占められており、その内の三つがMUが産生する異常な細胞障害性脂質であるマイコラクトンを産生する巨大ポリケチド合成酵素（PKS）をコードしている。本発明は、残り75の非PKS関連タンパク質のコード配列（CDS）を分析することを包含する。pMUM001は、Mycobacterium marinumでは、複製を支える機能的oriを持つ低コピー数要素であるが、迅速に増殖するマイコバクテリアである恥垢菌およびM. fortuitumではそうではないことが発見された。配列分析は、他の大型プラスミドを想起させる高度なモザイクプラスミド遺伝子構造を示した。そのいくつかは従来報告されていないものであった挿入配列（IS）およびISの断片は、機能的遺伝子クラスターの中に散在しており、それら遺伝子はプラスミドの複製、マイコラクトンの合成および潜在的なホスホリレーシグナル伝達系に関係している。pMUM001に存在するISのいくつかは、高コピー数MU要素、IS2404およびIS2606の多重コピーであった。プラスミド転移システムが同定されないことから、可動化にはトランス作用因子が必要なことが示唆された。
【０１７２】
pMUM001と呼ばれる174kbの環状プラスミドがMU中に存在することが発見されている。このプラスミドの半分以上は、マイコラクトン合成に必要な、非常に異常な、三つのポリケチド合成酵素遺伝子によって構成されている。二次代謝物生合成に関係するプラスミド担持遺伝子には先例がある。Streptomyces rocheiのpSLA2-Lプラスミドは、I型およびII型PKSクラスターおよび非リボソーマルペプチド合成酵素をコードする遺伝子に富んでいる。Mochizuki, S., Hiratsu, K., Suwa, M., Ishii, T., Sugino, F., Yamada, K. & Kinashi, H. (2003)。大きな、直線状プラスミドであるStreptomycer rocheiのpSLA2-Lは、二次代謝に関し、異常に圧縮された遺伝子構成を有している。Mol Microbiol 48, 1501-1510。しかし、三つのマイコラクトンPKS遺伝子（mlsA1、mlsA2およびmlsB）は、二つの点で突出している。第一は、それらが報告されている中で最も大型のいくつかのタンパク質をコードしており（MLSA1：1.8 MDa、MLSA2：0.26 MDaおよびMLSB 1.2 MDa）；また、第二には、この三つの合成酵素を含む18のモジュールの様々な機能的ドメインでは、最高レベルのヌクレオチドおよびアミノ酸配列保存性（>97％nt同一率）が認められる。この配列保存性レベルは、先例のないものであり、この遺伝子座が極めて最近進化したことを示している。
【０１７３】
プラスミドは、多くのマイコバクテリア種で広く報告されている。Pashley, C. & Stoker, N. G. (2000). Plasmids in Mycobacteria. In Molecular Genetics of Mycobacteria, pp. 55-67. Edited by G. F. Hatfull & W. R. Jacobs, Jr. Washington D.C.: ASM Press. しかしながら、pMUM001が発見されるまでは、マイコバクテリアのプラスミドは、病原性と直接結びつけられることはなく、結核菌（MTB）のメンバーにプラスミドが無いことから、研究者は、マイコバクテリアの病因にとって、プラスミドを介した水平方向の遺伝子転移は重要な因子ではないと信じていた。極わずかなマイコバクテリアプラスミドだけが、利用可能な三種類のマイコバクテリアエピゾーム：M. fortuitumに由来する4.8kbの環状エレメントであるpAL5000、Rauzier, J., Moniz-Pereira, J. & Gicquel-Sanzey, B. (1988). Complete nucleotide sequence of pAL5000, a plasmid from Mycobacterium fortuitum. Gene 71, 315-321、M. celatum由来の23kbの直線状エレメントであるpCLP、Le Dantec, C., Winter, N., Gicquel, B., Vincent, V. & Picardeau, M. (2001). Genomic sequence and transcriptional analysis of a 23-kilobase mycobacterial linear plasmid: evidence for horizontal transfer and identification of plasmid maintenance systems. J Bacteriol 183, 2157-2164、および抗酸菌（M. avium）由来の12.9kbエレメントであるpVT2 a、Kirby, C., Waring, A., Griffin, T.J., Falkinham, J. O., 3rd, Grindley, N. D. & Derbyshire, K. M. (2002)。Cryptic plasmids of Mycobacterium avium: Tn552 to the rescue. Mol Microbiol 43, 173-186の完全DNA配列だけを用いて特徴付けがなされている。いくつかの研究が、様々な形の炭化水素代謝に関係する遺伝子がプラスミドで運ばれることを示唆しているが、マイコバクテリアプラスミドに認められる機能に関する報告は極めて少ない。Coleman, N. V. & Spain, J. C. (2003). Distribution of the coenzyme M pathway of epoxide metabolism among ethene- and vinyl chloride-degrading Mycobacterium strains. Appl Environ Microbiol 69, 6041-6046; Guerin, W. F. & Jones, G. E. (1988). Mineralization of phenanthrene by a Mycobacterium sp. Appl Environ Microbiol 54, 937-944; Waterhouse, K. V., Swain, A. & Venables, W. A. (1991). Physical characterisation of plasmids in a morpholine-degrading mycobacterium. FEMS Microbiol Lett 64, 305-309.
【０１７４】
pMUM001には81の予想CDSがある。マイコラクトン合成に関係する六つのCDSについて記載されている。本発明では、残りの75のCDSについて、プラスミド複製領域の機能的研究と合わせて記載する。
【０１７５】
実施例7
細菌株および培養条件
本発明に用いた細菌株は大腸菌株XL2 Blue（Stratagene）およびDH10B（Invitrogen）、マイコバクテリア株Agy99、恥垢菌mc2155、およびMycobacterium fortuitim（NCTC 10394）、ならびにMycobacterium marinum（M株）であった。大腸菌誘導株は、必要に応じて抗生物質（100μgアンピシリン/mlおよび50μgアプラマイシン/ml）を追加したLuria-Bertani寒天プレートおよびブロスで培養した。マイコバクテリアは、7H9ブロスおよび7H10寒天培地（Becton Dickinson）を用い、恥垢菌については37℃で、M. marinumについては32℃で培養した。pMUDNA2.1で形質転換したマイコバクテリアの選択には、アプラマイシンを50μg/mlの濃度で使用した。
【０１７６】
実施例8
核酸技術
DNA操作の一般的方法は、記載されている。Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning. A laboratory Manual.: Cold Sping Harbour Laboratory Press。サザンハイブリダイゼーション実験については、DNAは記載通りにマイコバクテリアから抽出した。Boddinghaus, B., Rogall, T., Flohr, T., Blocker, H. & Bottger, E. C. (1990). Detection and identification of mycobacteria by amplification of rRNA. J Clin Microbiol 28, 1751-1759. 約1μgのDNAをSpeIで消化し、得られた断片をアガロースゲル電気泳動で分離した。次にDNAをHybond N+メンブレンに、0.4MのNaOH存在下でアルカリキャピラリー転移を行い移した。repA遺伝子に基づくDNAプローブは、ジゴキシゲニンdUTPを、PCR媒介により413bpのrepA増幅産物内に取り込ませて調製した。この産物は、次のプライマー配列を用いて得た：
2007511218.tif 000007
（位置665〜684）および
2007511218.tif 000008
（位置1077〜1058）。MUAgy99由来のゲノムDNAを鋳型とした。サザンハイブリダイゼーションの条件は前に記載し通りである。Stinear, T., Ross, B. C., Davies, J. K., Marino, L., Robins-Browne, R. M., Oppedisano, F., Sievers, A. & Johnson, P. D. (1999a). Identification and characterization of IS2404 and IS2606: two distinct repeated sequences for detection of Mycobacterium ulcerans by PCR. J Clin Microbiol 37, 1018-1023.
【０１７７】
実施例9
シャトルプラスミドpMUDNA2.1の構築
MUゲノムシーケンシングプロジェクト（http://genopole.pasteur.fr/Mulc/BuruList.html）の一環として、MU株Agy99の全ゲノムショットガンクローンライブラリーを、ベクターpCDNA2.1（Invitrogen）を用いて大腸菌の中に調製した。大腸菌プラスミドDNAを抽出し、次に高処理能力自動化末端配列決定にかけた。Cole, S. T., Brosch, R., Parkhill, J. & other authors (1998). Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393, 537-544. 配列はGap4を用いて組み立てた。Bonfield, J. K., Smith, K. F. & Staden, R. (1995). A new DNA sequence assembly program. Nucleic Acids Res 24, 4992-4999、またその結果42,239シーケンスリードを含む1597のコンティグのドラフトアッセンブリーデータベースを得た。これまでの、MUとM. marinum間で行われたゲノムサブトラクティブハイブリダイゼーション実験から、MU特異的PKS配列が同定されている、Jenkin, G. A., Stinear, T. P., Johnson, P. D. & Davies, J. K. (2003)。サブトラクティブハイブリダイゼーションは、Mycobacterium ulceransに特異的なI型ポリケチド合成酵素遺伝子座を示しており、J Bacteriol 185, 6870-6882、またこれら配列を用いてMU PKS（したがってプラスミド関連）コンティグをスクリーニングした。その結果、pMUM001の推定複製開始点（ori）に重なるMU配列を含んだ、複数の大腸菌ショットガンクローンが同定された。以後の研究のために、6kbの挿入体を持つmu0260E04と呼ばれるこのクローンを選択した。マイコバクテリアバックグランドでの選択が可能になるように、アプラマイシン耐性遺伝子aac(3)-IVをmu0260E04にクローニングした。Paget, E. & Davies, J. (1996). Apramycin resistance as a selective marker for gene transfer in mycobacteria. J Bacteriol 178, 6357-6360. これは、オリゴヌクレオチド
2007511218.tif 000009
および
2007511218.tif 000010
を用いたaac(3)-IVカセットのPCR増幅および修飾により達成され、フランキングSpeI部位（下線の付いた）を組み入れた。得られたPCR産物をSpeIで消化し、次にmu0260E4の唯一のXbaI部位にクローニングしてハイブリッドベクターpMUDNA2.1を得た（図21参照）。欠失構築体pMUDNA2.1-1およびpMUDNA2.1-3は、それぞれHpaI/SpeIおよびEcoRV/SpeIでpMUDNA2.1を二重RE消化して調製した。
【０１７８】
各処理から二つのRE断片を得た。いずれの場合も、より高分子量のバンドをアガロースゲルから切り出し、精製し、T4ポリメラーゼで処理してから再連結した。次に、各連結産物を用いてE coli DH10Bを形質転換した。形質転換物を二次培養し、プラスミドDNAを抽出した。二つの二重消化物それぞれから四つのプラスミドをRE消化にかけ試験し、得られた欠失構築物の完全性および同一性を確認した。
【０１７９】
次に、確認された欠失プラスミドそれぞれから一つを、マイコバクテリア形質転換実験に用いた。すべての形質転換実験では、マイコバクテリア／大腸菌シャトルベクターpMV261−pAL5000レプリコンに基づく−を陽性コントロールとして用いた。Snapper, S. B., Melton, R. E., Mustafa, S., Kieser, T. & Jacobs, W. R., Jr. (1990). 恥垢菌の調製およびエレクトロポレーションの条件については、既に報告した。Snapper, S. B., Melton, R. E., Mustafa, S., Kieser, T. & Jacobs, W. R., Jr. (1990). Isolation and characterization of efficient plasmid transformation mutants of Mycobacterium smegmatis.  Mol Microbiol 4, 1911-1919.
【０１８０】
他のマイコバクテリアのエレクトロポレーションについては、後期対数期の培養物から室温で細胞を集め、無菌水で二回洗浄後、一度無菌の10％グリセロールで洗浄し、最後に0.01容積の10％グリセロールに懸濁した。すべての実験で、各エレクトロポレーションについて、新たに調製した細胞の200μlアリコットを使用し、BTXエレクトロポレータ（Genetronics）、2.5kV、25μFおよび1000Ωを用いた。パルス処理後、Middlebrook 7H9培地1mlを細胞に加え、それらを一晩、30℃で、浸透しながらインキュベーションしてから、適当な抗生物質を含んだMiddlebrook 7H10寒天培地に接種した。各形質転換について、以下の量のプラスミドDNAを最終容積5μlにして用いた：pAL5000：150 ng；pMUDNA2.1：780 ng；pMUDNA2.1-1：560 ng；pMUDNA2.1-3：430 ng。形質転換実験は三回行った（即ち、適格細胞の同一調製物を用いた三回の生物学的反復）。形質転換効率（EOT）は、1μgのプラスミドDNA当たりの平均形質転換体数±sdで表した。
【０１８１】
実施例10
pMUDNA2.1の安定性試験
アプラマイシン存在下で増殖させたpMUDNA2.1を含むM. marinum後期対数期培養物を、アプラマイシンを含まない三つの新鮮培地50mlに1:100に希釈し、32℃で12日間インキュベーションを続けた。次に、三日毎に各培養物から一部を取り出し、適当に希釈してから、アプラマイシンを含む培地と含まない固体培地に接種した。十日後にコロニー数を計測した。各時点で、総細胞数（コロニー形成単位で表した）および抗生物質耐性を維持している総細胞集団の割合を計算した。
【０１８２】
実施例11
バイオインフォマティック分析
プラスミドの配列分析および注釈付けは、ARTEMIS、リリース5（http://www.sanger.ac.uk/Software）を用いて行った。適当なG+C含有量、相関スコアおよびコドン利用を持った潜在的CDSを、FASTA, Pearson, W. R. & Lipman, D. J. (1988)を用いて、公開データベース内の配列と比較した。 Improved tools for biological sequence comparison.  Proc Natl Acad Sci U S A 85, 2444-2448, BLAST Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J. (1990).  Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215, 403-410, and Clustal W. , Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acid Res 22, 4673-4680. 追加の機能情報はProsite, Hulo, N., Sigrist, C. J., Le Saux, V., Langendijk-Genevaux, P. S., Bordoli, L., Gattiker, A., De Castro, E., Bucher, P. & Bairoch, A. (2004)を用いて集めた。Recent improvements to the PROSITE database. Nucleic Acids Res 32 Database issue, D134-137, and Pfam, Bateman, A., Birney, E. , Cerruti, L. & other authors (2002). The Pfam protein families database. Nucleic Acids Res 30, 276-280, databases, and the TMHMM program, Sonnhammer, E. L. , von Heijne, G. & Krogh, A. (1998). A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences.  Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol 6, 175-182を用いて、膜貫通へリックスを推測した。挿入配列（IS）ファミリーの命名は、ISデータベース（http://www-is.biotoul.fr/）を参照して行った。pMUM001の配列およびその注釈付けは、EMBL/DDJ/Genebankデータベースに、登録番号BX649209で既に寄託されている。
【０１８３】
実施例12
pMUM001の一般的特徴
プラスミドpMUM001は、174,155bpの、81個の予想CDSと62.7％のG+C含有率を持つ、環状エレメントである。これらCDSの配置および主な特徴を図19に示し、表3にまとめた。
【０１８４】
（表３）  pMUM001の81個の予想CDSのまとめ
2007511218.tif 000011
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【０１８５】
六つの遺伝子がマイコラクトン生合成に関係すると推測され、それらは全プラスミド配列の60％に相当する。これら遺伝子は他所に記載されているが、それらは以下のものをコードする：三つのI型モジュールPKS（MUP032、MUP039、MUP040）、II型チオエステラーゼ（MUP038）、FabH様III型ケト合成酵素（MUP045）、およびP450ヒドロキシラーゼ（MUP053）である。Stinear, T. P., Mve-Obiang, A., Small, P. L & other authors (2004). Giant plasmid-encoded polyketide synthases produce the macrolide toxin of Mycobacterium ulcerans. Proc Natl Acad Sci USA 101, 1345-1349.
【０１８６】
これまでに報告されていない14のエレメントを含む、種々ISまたは断片が26コピー在った。他細菌でのオーソロゴス遺伝子の存在から、複製、分配といったプラスミド機能およびプラスミドの場合、若干普通ではないが、セリン−スレオニンタンパク質キナーゼ（STPK）を含む潜在的制御クラスターに関係するCDSを同定できた。プラスミド転移機能をコードするCDSはなかった。11個のCDSが、それらが膜関連タンパク質をコードしていることを示唆する特徴を有していたが、STPKを除いて、他に機能が同定できるものはなかった。仮想タンパク質をコードするCDSが26あったが、その内11は公開データベース中の他の配列と相同性がなく、15は、MTB（9）、M. leprae、Rhizobium loti（1）、Agrobacterium tumafaciens（1）、バクテリオファージT7（1）、S. coelicolor（2）およびS. avermitilis（1）の仮想タンパク質といくらかの相同性を有していたことから、保存仮想タンパク質に分類された。pMUM001の全体構造は、ISが散在する分離遺伝子カセットからなる高度のモザイクである。プラスミドコピー数は、MUゲノムアッセンブリーデータベース（http://genopole.pasteur.fr/Mulc/BuruList.html）の染色体に対する、pMUM001、1kb当たりの、ショットガン配列の平均数の割合から細胞当たり1.9コピーと算定された。
【０１８７】
複製起点
368 aaのRepAをコードしているrepA遺伝子は、複製開始を担っており、M. fortuitumプラスミドpJAZ38のRepA、Gavigan, J. A., Ainsa, J. A., Perez, E., Otal, I. & Martin, C. (1997) に対し366 aa中68.3％のaa同一性を共有しており配列比較から容易に同定された。Isolation by genetic labeling of a new mycobacterial plasmid, pJAZ38, from Mycobacterium fortuitum. J Bacteriol 179, 4115-4122、そしてM. aviumプラスミドpVT2のRepA、Kirby, C., Waring, A., Griffin, T. J., Falkinham, J. O., 3rd, Grindley, N. D. & Derbyshire, K. M. (2002)とは55.6％のaa同一性を示した。Cryptic plasmids of Mycobacterium avium: Tn552 to the rescue. Mol Microbiol 43, 173-186. 無関係と思われるpAL5000を除く、多くのマイコバクテリアプラスミドから予想RepAタンパク質が同定された。RhodococcusプラスミドのpSOXのRepAタンパク質とも、顕著な同一性があった。Denis-Larose, C., Bergeron, H., Labbe, D.,Greer, C. W., Hawari, J., Grossman, M. J., Sankey, B. M. & Lau, P.C. (1988). Characterization of the basic replicon of Rhodococcus plasmid pSOX and development of a Rhodococcus-Escherichia coli shuttle vector. Appl Environ Microbiol 64, 4363-4367.
【０１８８】
repAの1〜600bp上流配列の分析は、イテロンを含む複製起点を示唆するいくつかの特徴を明らかにした。イテロンは、RepAに結合しプラスミド複製を制御するダイレクトリピート配列である。repA開始コドンの180bpから550bp上流の領域に、一対の16bpのイテロンが見つかった（図20）。イテロン間の間隔は、通常は11の倍数、即ちds DNAの螺旋周期を表す距離である；RepAの結合部位がDNAの同じ向きにあることを暗示している。del Solar, G., Giraldo, R., Ruiz-Echevarria, M. J., Espinosa, M. & Diaz-Orejas, R. (1998). Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiol Mol Biol Rev 62, 434-464. pMUM001に同定されたイテロンの間隔は11の倍数の143bpである。低いプラスミドコピー数はイテロンプラスミドの特徴である。コピー数が増加すると、一つの起点のイテロンに結合しているRepA分子は、別の起点上に作られた同様の複合体と相互に作用し始め、複製を抑制する、いわゆる「拘束」状態を作り出す。del Solar, G., Giraldo, R., Ruiz-Echevarria, M. J., Espinosa, M. & Diaz-Orejas, R. (1998). Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiol Mol Biol Rev 62, 434-464. インテロン−含有レプリコンに一般に関連する別の特徴は、部分イテロン配列の、複数の逆転リピート（IR）である。これらは、一般的には、repAプロモータ領域内のrepA開始コドンの直ぐ上流にある。del Solar, G., Giraldo, R., Ruiz-Echevarria, M. J., Espinosa, M. & Diaz-Orejas, R. (1998). Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiol Mol Biol Rev 62, 434-464.
【０１８９】
pMUM001では、状況は若干異なっている。単一の12bpのイテロン配列の部分IRが、イテロン間の領域に見つかった。これら上流配列には明瞭なプロモータエレメントは見出されていないが、repA ATGの1〜261bp上流領域は、pJAZ38（75％nt同一率）の同一領域と極めて高い同一性を有しており、またこの領域の69bpのサブセクションは、マイコバクテリアプラスミド間でよく保存されており（Picardeau et al., 2000）（図20）、この領域がプラスミドの複製にとって重要ではあるが、まだ同定されていない役割を果たしていることを示唆している。
【０１９０】
細菌集団内に低コピー数プラスミドを確実に維持するための方策がいくつか開発されている。プラスミドがコードしている毒素／抗毒素座によって無プラスミドの分離体を殺すことが一つの方法であり、直鎖状マイコバクテリアプラスミドpCLPについて報告されており、Le Dantec, C., Winter, N., Gicquel, B., Vincent, V. & Picardeau, M. (2001). Genomic sequence and transcriptional analysis of a 23-kilobase mycobacterial linear plasmid: evidence for horizontal transfer and identification of plasmid maintenance systems. J Bacteriol 183, 2157-2164、別の広く用いられている維持システムは、プラスミドコピーを嬢細胞への積極的な分割および分配を利用する。「殺滅」遺伝子座の候補は見出されなかったが、repAの約2kb下流は、326 aaの推定染色体分割タンパク質をコードしている遺伝子のparAであった。Par遺伝子座は、一般的に、シス作用性のセントロメア部位（ParS）を結合する核タンパク質分割複合体を形成している二つのタンパク質（ParAおよびParB）を含む。Gerdes, K., Moller-Jensen, J. & Bugge Jensen, R. (2000). Plasmid and chromosome partitioning; surprises from phylogeny. Mol Microbiol 37, 455-466. Parタンパク質は、複製装置とは独立に作用し、また細胞分裂前のプラスミドおよび染色体の能動的分離に関係している。Parタンパク質は、宿主因子と共に、新たに複製されたプラスミドの方向付けおよび配置に必要である。ParAはATPaseドメインを含んでおり、特にParBによって刺激を受ける。Par遺伝子座は、異なる細菌間に共通する特徴を有しているが、それらは極めて異質であり、非相同レプリコンを安定化するのに必要と思われている。Gerdes, K., Moller-Jensen, J. & Bugge Jensen, R. (2000). Plasmid and chromosome partitioning; surprises from phylogeny. Mol Microbiol 37, 455-466.
【０１９１】
pMUM001のParAは、アルスロバクター・ニコチノヴォランス（Arthrobacter nicotinovorans）の様な非マイコバクテリア種のParAと最も類似しているが（308 aaで35.1％同一性）、pCLPのParAのような他のマイコバクテリアのParAとのその相同性は限られている（41 aaで48％）。pMUM001のparAのG+C含有率は58％であり、これはプラスミド（62.7％）またはマイコバクテリア染色体（65.5％）の平均値に比べ有意に低く、その起源がマイコバクテリアでないという意見を支持している。Par遺伝子座は、一般には、オペロンとして配置されている。pMUM001では、parB候補（MUP004）が、parAのすぐ下流に同定された。MUP004は、204 aaの推定タンパク質をコードしている。BLASTPおよびPSI-BLASTデータベース検索からは、既知のParBタンパク質またはその他タンパク質に類似していないことが示されている。シンテニー性のPar遺伝子座が、M. aviumのpVT12に、仮想タンパク質をコードしている遺伝子と共に、parAオルトログの直ぐ下流に存在している。ParBタンパク質間の異質性が報告されている。Gerdes, K., Moller-Jensen, J. & Bugge Jensen, R. (2000). Plasmid and chromosome partitioning; surprises from phylogeny. Mol Microbiol 37, 455-466. pMUM001には候補ParS配列は同定されていなかった；しかしながら、位置5314〜5410の間のParA上流の非コーディング配列の中に、18bpの配列
2007511218.tif 000015
の3つのダイレクトリピートが発見された。このようなインテロン様配列は、Parオペロンのプロモータ領域に報告されており、ParBへの結合部位として機能できる。Moller-Jensen, J., Jensen, R. B. & Gerdes, K. (2000). Plasmid and chromosome segregation in prokaryotes. Trends Microbiol 8, 313-320。
【０１９２】
この領域が機能的な複製起源を含むという仮説を検証するために、pMUM001の小型挿入体（3〜6kb）大腸菌ショットガンライブラリーをスクリーニングし、6kb断片を持つクローンを選択した。この断片は、MUP081の5’末端、推定ori、repAおよびparA遺伝子を包含する位置172,467〜4.190の領域にまたがっていた。pmu0260E04と命名されたこのクローンを、アプラマイシン耐性を付与し、結果としてマイコバクテリア背景の中での選択を可能にするaac(3)-IVを挿入することで修飾した。Paget, E. & Davies, J. (1996). Apramycin resistance as a selective marker for gene transfer in mycobacteria. J Bacteriol 178, 6357-6360。このpMUDNA2.1と命名された構築体を用いて、恥垢菌、M. foruitumおよびM. marinumの形質転換を試みた。形質転換体は、M. marinumについてのみ得た。この種でのpMUDNA2.1の自律的複製は、repA PCRおよびrepA由来プローブを用いたサザンハイブリダイゼーションによって確認された（図22）。pMUDNA2.1によって形質転換されたM. marinumの形質転換効率（EOT、三回のエレクトロポレーション実験の平均形質転換体数±sd/プラスミドDNAμgとして表した）は、1.0±0.1×105であった；pAL5000をベースとしたシャトルプラスミドpMV261を用いて得たEOTと同等であった（2.7±0.9×105）。
【０１９３】
次に欠失研究を実施し、複製に必要なpMUM001の最小領域の画定を試み、画定した。pMUDNA2.1の二種類の欠失構築体を作製した。最初の構築体（pMUDNA2.1-1）は、唯一のSpeIとHpaI部位の間の、1300bpの領域を除去することによって作られた。この領域は、全parA遺伝子と372bpの上流配列にまたがるものである（図21）。第二構築体（pMUDNA2.1-3）は、唯一のSpeIとEcoRV部位の間の、2610bpを欠失することで作られた。この2610bpのセグメントは、pMUDNA2.1-1欠失全体と推定orfのMUP003およびMUP004に広がった。これら構築体は共に、pMUDNA2.1のそれと同等に、EOTを持つM. marinumを形質転換でき（データ未提示）、複製を支えるには、MUP002、repA、oriMおよびMUP081の一部配列に広がるpMUM001配列の3327bpで十分であることを実証した。
【０１９４】
pMUDNA2.1の安定性を試験するために、pMUDNA2.1を含むM. marinumの、アプラマイシン存在下で増殖させた後期定常期培養物を、アプラマイシンを含まない培地に移し、抗生物質あり、またはなしでの培地上のプレートカウントを測定し、連続的に時間を追ってモニタリングした。この実験の結果は、図23にまとめられおり、そしてpMUDNA2.1が安定して維持されないこと、および抗生物質選択なしでは、細胞集団から急速に消失することを示した。この結果は、pMUM001の推定par遺伝子座がM. marinumでは機能していないか、またはプラスミドを維持するためには、pMUMDNA2.1の構築に使用したpMUM001由来の6kb断片以外の、別の配列が必要なことを示唆している。このような領域は、上記候補parS部位とした18bpインテロン配列であるかもしれない。これらリピートはpMUDNA2.1の中では、parAの1.4kb上流、クローン化されたpMUM001領域の1.2kb外側に在る。
【０１９５】
制御エレメント
MUP006およびMUP021の間、ISの破壊がない領域には、潜在的な制御および膜関連タンパク質をコードするCDSの興味深い配置がある（図19）。MUP011は明らかに、保存触媒キナーゼドメインを持つSTPKである。これは、MTBのPknJと最も密接な関係にある（523 aa中43％aaが同一）。
【０１９６】
STPKは膜貫通シグナル伝達タンパク質であり、原核生物では、病原性、ストレス応答および細胞膜生合成を含む多くの細胞プロセスの制御に関与していることが知られている。Boitel, B., Ortiz-Lombardia, M., Duran, R., Pompeo, F., Cole, S. T., Cervenansky, C. & Alzari, P. M. (2003). PknB kinase activity is regulated by phosporylation in two Thr residues and dephosphorylation by PstP, the cognate phospho-Ser/Thr phosphatase, in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol 49, 1493-1508.  MUP011の約3.5kb下流は、MUP011のリン酸化の基質となりえるCDS（MUP018）である。MUP018は、N末端フォークヘッド関連（FHA）ドメイン、2-ケト-3-デオキシグルコネートペルメラーゼ（分解したペクチン産物を細胞内に輸送するために細菌性植物病原菌によって用いられる酵素）にいくらか類似しているC末端ドメイン、およびその二つの領域の間にある、へリックス−ターン−へリックスモチーフを含む、仮想膜貫通タンパク質をコードしている。FHAドメインは、リン酸化依存的タンパク質−タンパク質相互作用を促進する。ホスホペプチド認識配列である。Durocher, D. & Jackson, S. P. (2002). The FHA domain. FEBS Lett 513, 58-66. 細菌でのFHA含有タンパク質に関する研究は始まったばかりの分野であるが、最近の報告は、MTBのABCトランスポータ（Rv1747）の二重FHAドメインがSTPK PknFと同起源のパートナーであることを示唆している。Moller-Jensen, J., Jensen, R. B. & Gerdes, K. (2000). Plasmid and chromosome segregation in prokaryotes. Trends Microbiol 8, 313-320. 極めて憶測的であるが、MUP018の構造全体を考えたとき、それが細胞内への基質輸送、おそらくは植物分解産物の輸送にも関係する可能性もある。これは、水棲植物からの粗抽出物がMUの増殖を刺激したという最近の発見を考えると、魅力的な仮説である。Marsollier, L., Stinear, T., Aubry, J. & other authors (2004). Aquatic plants stimulate the growth of and biofilm formation by Mycobacterium ulcerans in axenic culture and harbor these bacteria in the environment. Appl. Environ Microbiol 70, 1097-1103. このクラスターの最終CDSは、MTBの仮想転写制御因子WhiB6のオルトログである、MUP021である。MTBでは、WhiB6の直ぐ上流は、発散性に転写される、保存仮想遺伝子Rv3863である。同様の関係はpMUM001にも見られ、MUP018はRv3863のオルトログである。これらすべての関係の意義は、まだ検証対象として残されているが、この領域の連続性、IS破壊が無いことは、これら遺伝子が重要な制御的役割を果たすという考えを強固にしている。pMUM001同様に、いくつかのマイコバクテリアファージがモザイク機構を示していること、そしてそのうちの一つ、Bxz1はSTPK遺伝子を担持していることも記載に値する。Pedulla, M. L., Ford, M. E., Houtz, J. M. & other authors (2003). Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes. Cell 113, 171-182. マイコバクテリアによるSTPKの水平獲得によって、別のシグナル伝達経路が生じてもよい。
【０１９７】
膜関連タンパク質
MU培養上清にかなり大量のマイコラクトンが検出できることは、細菌細胞からの分子の能動輸送があることを示唆している。他のマイコバクテリアでの脂質搬出は、MMPLのような大型の膜貫通タンパク質を含むことが知られている。Tekaia, F., Gordon, S. V., Garnier, T., Brosch, R., Barrell, B. G. & Cole, S. T. (1999). Analysis of the proteome of Mycobacterium tuberculosis in silico. Tuber Lung Dis 79, 329-342. MTBでは、MMPLをコードする遺伝子は、I型ポリケチド合成酵素を含む脂質代謝に関係する遺伝子とクラスターを形成していることが分かっている。Tekaia, F., Gordon, S. V., Garnier, T., Brosch, R., Barrell, B. G. & Cole, S. T. (1999). Analysis of the proteome of Mycobacterium tuberculosis in silico. Tuber Lung Dis 79, 329-342. pMUM001配列の分析からは、mmpL様遺伝子がないことが示された。膜貫通ドメイン、シグナル配列、リポタンパク質接着部位、または疎水性N末端配列のいずれかを持つことから、搬出に役割を持つ可能性のある10の仮想タンパク質が同定された（表3）。しかしながら、これらCDSのどれもがマイコラクトンの搬出に関係しないこと、およびこの役割は染色体によってコードされた因子によってなされる、または、恐らくは分子（747Da）が十分小さく、能動的核酸によって出ていくことも考えられる。それらの機能をとわず、表3に掲げた10のCDSは、表面に露出した抗原をコードしている可能性があり、利用可能なデータベースにオルトログがないことを考えると、それらは、血清診断またはワクチン開発への潜在的応用についてMU-特異抗原を試験するための興味深い候補になる。
【０１９８】
挿入配列
特徴的なトランスポゾン配列があることに基づいて、pMUM001に、26コピーの各種挿入配列（IS）またはIS様配列を同定した。それらはpMUM001全体に分布し、特定機能のCDSクラスター（たとえば複製、維持、毒素産生）の間に挿入されていた。12のISは、公知MUエレメント、IS2404およびIS2606のコピーであり、Stinear, T., Ross, B. C., Davies, J. K., Marino, L., Robins-Browne, R. M., Oppedisano, F., Sievers, A. & Johnson, P. D. R. (1999b) Identification and characterization of IS2404 and IS2606; Two distinct repeated sequences for detection of Mycobacterium ulcerans by PCR. Journal of Clinical Microbiology 37, 1018-1023 、そして残りの14はこれまで報告されていなかった（図19、表4）。
【０１９９】
（表４）  pMUM001に検出された26の推定ISエレメントのまとめ
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1内部停止コドンを含む
2フレームシフト突然変異を含む
3端部切断型
【０２００】
トランスポーゼス配列の比較から、他の放線菌およびより遠い属の関連タンパク質が明らかになった。IS4ファミリーに属する3コピーの推定IS（MUP025、MUP028、MUP037）が存在した。しかしながら、このエレメントの各コピーは、別のエレメント（MUP028についてはIS2404およびMUP025とMUP037についてはIS2606）の挿入により破壊されており、その結果このISの描写を妨害している。mlsA1およびmlsBのローディングモジュールドメインの端部に結合し、MUP035からMUP043まで伸びる配列は、8kbの同一ヌクレオチド配列を表す（図19）。この領域はまた、三種類の推定ISのペア（MUP033とMUP041、MUP034とMUP042、MUP035とMUP043）を含む。これらISのフランキング配列も同一であることから、ISの境界を決定することはできなかった。PKS遺伝子mlsBとmlsA1の開始コドンと、それらのそれぞれに先行するトランスポーゼス遺伝子（MUP033およびMUP041）の間の距離はほとんど無い（90bp）。これによって、二つのPKS遺伝子のプロモータ領域は、これらISエレメント内にある可能性が生ずる。
【０２０１】
MUP051、MUP052およびIS2606は、ゴム分解性放線菌のGordonia westfalicaの101kbプラスミドpKB1に見出されたトランスポーゼスに対し、高いaa同一性を共有している。Broker, D., Arenskotter, M., Legatzki, A., Nies, D. H. & Steinbuchel, A. (2004). Characterization of the 101-kilobase-pair megaplasmid pKB1, isolated from the rubber-degrading bacterium Gordonia westfalica Kb1. J Bacteriol 186, 212-225. この関係の直接の意義は分かっていないが、それは放線菌の多様な集団の間に重要な遺伝的ダイナミズムが存在するという考えを補強している。ドラフトMUゲノム配列に対する26種類のIS配列のBLASTN分析は、MU染色体について、IS2404およびIS2606以外のパラロガス（paralogous）エレメントを示さなかった。IS2404およびIS2606は、MUと関連する高コピー数エレメントとして以前に報告されている。Stinear, T., Ross, B. C., Davies, J. K., Marino, L., Robins-Browne, R. M., Oppedisano, F., Sievers, A. & Johnson, P. D. R. (1999b). Identification and characterization of IS2404 and IS2606: two distinct repeated sequences for detection of Mycobacterium ulcerans by PCR. Journal of Clinical Microbiolgy 37, 1018-1023. pMUM001には、IS2404のコピーが四つ同定された。IS2404の最初の記載は、12bpの逆転リピートを持つ、348 aaの推定トランスポザーゼをコードし、そして6bpの標的部位重複を生ずる1274bpのエレメントを報告した。現在は、IS2404は、少なくとも二つの形で存在すること、両方の形ともこれまでの報告に比べ94bp長いことが分かっている。41bpの完全逆転リピート
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および10bpの標的部位重複を含む1368bpのエレメントであるIS2402aが1コピー存在していた。これらの特徴を確かめるために、ドラフトMUゲノム配列を入手し、完全IS2404配列およびそれらのフランキング領域を無作為に選択して分析を行った（図23）。これにより、伸長した形態が確認された。
【０２０２】
最初に記載されたように、IS2404aは、348 aaの単一のトランスポーゼスをコードすると推測される。IS2404bには三つのコピーが存在した。この形は、内部停止コドンを含むこと、そして結果として234 aaおよび113 aaの推定トランスポーゼス断片を生じることを除いて、あらゆる局面に関しIS2404aに同じである。しかしながら、三種類のIS2404bのコピーがあることから、おそらくこの停止コドンは通読され、このエレメントがまだ転位できることを示唆している。
【０２０３】
エレメントIS2606も8コピー同定されている。これも、最初に報告された1406bpよりも大きいことが見出された。Stinear, T., Ross, B. C., Davies, J. K., Marino, L., Robins-Browne, R. M., Oppedisano, F., Sievers, A. & Johnson, P. D. (1999a). Identification and characterization of IS2404 and IS2606: two distinct repeated sequences for detection of Mycobacterium ulcerans by PCR. J Clin Microbiol 37, 1018-1023. それは1438bpのサイズを持ち、31bpの不完全な逆転リピートを持ち、7bpの標的部位重複を生じ、444 aaの推定トランスポーゼスをコードしている。1コピーがトランスポーゼス領域内にフレームシフト突然変異（MUP060およびMUP061）を含んでいた。
【０２０４】
結論では、メガプラスミド（50〜500kb）は、多くの細菌属にまたがって広く存在しており、細菌社会内での横方向の遺伝子転位の大きな資源である。遺伝的モザイクは、これらエレメントに共通する構造上の課題となっており、Molbak, L., Tett, A., Ussery, D. W., Wall, K., Turner, S., Bailey, M. & Field, D. (2003). The plasmid genome database. Microbiology 149, 3043-3045、特にpMUM001では、同様にモザイク配置を示すBxz1のようなある種のマイコバクテリオファージに大きさが近いことが明らかである。Pedulla, M. L., Ford, M. E., Houtz, J. M. & other authors (2003). Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes. Cell 113, 171-182. 一部、モザイク配置は、pMUM001が担持する数多くあるISエレメントに由来するかもしれない。これらは、正逆両方向に存在しており、これらリピート間の組換えがプラスミドの大きさおよび機能の両方に多様性をもたらすと推測される。その一例が既に報告されている、Stinear, T. P., Mve-Obiang, A., Small, P. L. & other authors (2004)。Giant plasmid-encoded polyketide synthases produce the macrolide toxin of Mycobacterium ulcerans. Proc Natl Acad Sci USA 101, 1345-1349. 本発明では、Rep遺伝子座は、複製に必要であり、それが示す機能性が明らかにされている。得られたシャトルプラスミドpMUDNA2.1は、M. marinumおよびMUの両方の遺伝分析に有用である。さらにまた、pMUM001のレプリコンは、異種宿主でのマイコラクトンの産生を容易にする。異種発現は、マイコラクトン生合成の機能分析を前進させる重要なステップであり、BUを阻止するためのあらたな予防の道筋すら開くものである。
【０２０５】
マイコバクテリア（MU）病原菌株Agy99の174kbの病原性プラスミド（pMUM001）には、脂質毒素、マイコラクトの合成を担う、巨大なポリケチド合成酵素（PKS）をコードする三つの非常に大きな、相同遺伝子が在る。本発明の別の局面では、MUAgy99をより深く研究し、無傷プラスミドも含む細胞集団内に、二種類のpMUM001の自然欠失変種を同定した。これら変種は、二つの、8kbの同一プラスミド配列区分間の組換えによって生じ、結果として三つあるマイコラクトンPKS遺伝子のうち二つを担持する65kbの領域を失っている。
【０２０６】
八つのpMUM001遺伝子配列について、PCRおよびサザンハイブリダイゼーションを用いた九株のMU変種の研究から、すべてのMU株にpMUM001様エレメント（まとめてpMUMと呼ぶ）の存在が確認された。これらプラスミドの物理地図作製からは、MUAgy99同様に、三つの株で大きな欠失がそのマイコラクトンPKS遺伝子座内に起こっていることが示された。脂質抽出物のオンラインLC-MS/MS分析からは、PKS欠失株は、マイコラクトンまたは任意の関連共代謝物を産生できないことが確認された。
【０２０７】
プラスミド遺伝子配列の株間比較からは、98％を超えるヌクレオチド同一性とこれら配列から推論された系統が、染色体にコードされている遺伝子座を用いた、これまでの多遺伝子座配列タイピング研究の系統に非常によく似ていること：MUが、pMUMを獲得することで、密接な関係にあるMycobacterium marinumから分岐したとする仮説に一致する結果が示された。本発明は、pMUMがMUを規定する特徴であることを示し、また純化淘汰がない状態で、プラスミド配列の欠失とそれに対応するマイコラクトン産生の消失が容易に起こることを示している。
【０２０８】
より具体的には、世界中のMU株について、極めて限定されたマイコラクトンのレパートリーを産生することが示されている。世界中から集められた34のMU分離株の研究は、それらがすべて、アシル側鎖が僅かに変動するだけの、同一のラクトンコアを作ることを示した（Mve-Obiang, A., R. E. Lee, F. Portaels, and P. L. Small. 2003. Heterogeneity of mycolactones produced by clinical isolates of Mycobacterium ulcerans: implications for virulence. Infect Immun 71:774-783.）。この変動は、側鎖のC12’の酸化の大きさの変動に大きく関わっており（Hong. H., P.J. Gates, J. Staunton, T. Stinear, S. T. Cole, P. F. Leadlay, and J. B. Spencer. 2003. Identification using LC-MSn of co-metabolites in the biosynthesis of the polyketide toxin mycolactone by a clinical isolate of Mycobacterium ulcerans. Chem Commun 21:2822-2823. Mve-Obiang, A., R. E. Lee, F. Portaels, and P. L. Small. 2003. Heterogeneity of mycolactones produced by clinical isolates of Mycobacterium ulcerans; implications for virulence.  Infect Immun 71:774-783.）、またこれが特異的P450モノオキシゲナーゼ（プラスミド遺伝子MUP053がコードする）の活性（または活性消失）によるものであると提案されている（Hong. H., P. Gates, J. Staunton, T. Stinear, S. T. Cole, P. F. Leadlay, and J. B. Spencer. 2003. Identification using LC-MSn of co-metabolites in the biosynthesis of the polyketide toxin mycolactone by a clinical isolate of Mycobacterium ulcerans. Chem Commun 21:2822-2823. Stinear, T. P., A. Mve-Obiang, P. L. Small, W. Frigui, M. J. Pryor, R. Brosch, G. A. Jenkin, P. D. Johnson, J. K. Davies, R. E. Lee, S. Adusumilli, T. Garnier, S. F. Haydock, P. F. Leadlay, and S. T. Cole. 2004. Giant plasmid-encoded polyketide synthases produce the macrolide toxin of Mycobacterium ulcerans. Proc Natl Acad Sci U S A 101:1345-1349）。本発明は、大型インサートのMU DNAクローンライブラリーを用いて、pMUM001の安定性を試験することを包含する。他のMU株でのこのプラスミドの分布および構造を、PCR、DNA配列決定、PFGEおよびサザンハイブリダイゼーションを用い、次の実施例に従って調べた。
【０２０９】
実施例13
細菌株および培養条件
大腸菌株DH10B（F- mcrA. (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80dlacZ.M15.lacX74 deoR recA1 araD139. (ara, leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG）およびXL2-Blue（recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44relA1 lac[F'proAB lacI qZ.]は、Luria-Bertaniブロス、37℃で培養した。Mycobacterium marinum（M株）は、32℃で、OADC（Difco）を補充した7H9 Middlebrook培地（Becton Dickenson）で培養した。次の十株のマイコバクテリア臨床分離株を用い、以下のように同定した：Agy99（起源：ガーナ 1999；この株はMUゲノム配列決定プロジェクトに用いられた）；Kob（起源：象牙海岸 2001）；1615（起源 マレーシア 1963）；Chant（起源 南東オーストラリア 1993）；IP105425（Institut Pasteurのリファレンスコレクションからのもので、リファレンス株ATCC 19428に由来する；起源：南東オーストラリア 1948）；01G897（起源：仏領ギアナ 1991）；ITM-5114（起源：メキシコ 1958）；ITM-941331（起源：パプアニューギニア 1994）；ITM-98912（起源：中国 1977）：ITM-941328（起源：マレーシア 1994）。MU分離株は、M. marinumについて記載した通りに増殖させた。ITMと冠したMU分離株は、好意によりFrancoise Portaels（Belgian Institute for Tropical Medicine）より提供されたものであった。
【０２１０】
実施例14
マイコラクトンのLS-MS/MS分析
MUの脂質分画を抽出し、以前記したようにしてマイコラクトンについて分析した（George, K. M., L. P. Barker, D. M. Welty, and P. L. Small. 1998. Partial purification and characterization of biological effects of a lipid toxin produced by Mycobacterium ulcerans. Infection & Immunity 66:587-593.. Hong, H., P. J. Gates, J. Staunton, T. Stinear, S. T. Cole, P. F. Leadlay, and J. B. Spencer. 2003. Identification using LC-MSn of co-metabolites in the biosynthesis of the polyketide toxin mycolactone by a clinical isolate of Mycobacterium ulcerans. Chem Commun 21:2822-2823.）。
【０２１１】
実施例15
オリゴヌクレオチドおよびDNA法
本発明に用いたオリゴヌクレオチドを表5に示す。
【０２１２】
（表５）  本研究で用いたオリゴヌクレオチド
2007511218.tif 000018
【０２１３】
サブクローニング、PCRおよび自動DNA配列決定には、標準的な方法を用いた。DNA配列は、Gap4およびArtemisをそれぞれ用い、組み立て、注釈付けした（Bonfield, J. K., K. F. Smith, and R. Staden. 1995. A new DNA sequence assembly program. Nucleic Acids Res 24:4992-4999. Rutherford, K., J. Parkhill, J. Crook, T. Horsnell, P. Rice, M. A. Rajandream, and B. Barrell. 2000. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics 16:944-945.）。
【０２１４】
実施例16
PFGEおよびサザンハイブリダイゼーション
マイコバクテリアDNAは、次のようにしてアガロースプラグに調製した：細菌細胞を7H9 Middlebrook培地で対数中期まで増殖させ、遠心分離により集めた。70％エタノール液800μlを加え、30分間、22℃で細胞を不活性化した。次にエタノールを除去し、細胞沈査を一回、1％Triton X-100で洗い、細胞10mg（湿重量）当たり150μlのTEバッファー（10mM トリス、1mM EDTA [pH8.0]）を用いて、TEバッファーに再浮遊した。細胞と等量の2％（w/v）低融解温度アガロース（BioRad）を45℃で混合し、すぐにプラグ型（BioRad）に流し込んだ。
【０２１５】
次に、スライス（4mm×7mm）十枚までを18時間、37℃で、0.5M EDTA[pH8.0]、0.5％サルコシル、60mgデオキシコール酸および100mgのリゾチームを含む溶液30mlの中でインキュベーションした。プラグを1×TEで一回洗浄し、さらに48時間、50℃で、0.5M EDTA[pH8.0]、0.5％サルコシルおよび30mgのプロテネーズKを含む溶液30mlの中でインキュベーションした。次にプラグを4℃で、1×TEでよく洗った。制限酵素（RE）消化前に、各プラグスライスを30分間、室温で、400μlのREバッファーで平衡化した。次に各プラグを、18時間、37℃で、1％（w/v）BSAおよび40UのXbaIを含む、300μlのREバッファーの中でインキュベーションした。
【０２１６】
PFGEは、0.5xTBEの1.0％のアガロースを用いた、BioRad CHEF DRIIシステム（BioRad）で、200V、3〜15秒のスイッチ時間で15時間行った。DNAは0.5μg/mlのエチジウムブロミドで染色して、視覚化した。
【０２１７】
サザンハイブリダイゼーション分析は、次のようにして実施した：上記のPFGEで分離したMUゲノムDNAは、一晩、0.4M NaOHを用いたアルカリ転移法によってHybond N+ナイロンメンブレンに移した。ゲルは、転移前に1200mジュールのUV処理にかけた。クロスリンキング処理（1200mジュールUV）によってナイロンメンブレンにDNAを固定し、次にプレハイブリダイゼーションバッファー（5×SSC、0.1％ SDS、1％スキムミルク）の中で、最低2時間、68℃でインキュベーションした。
【０２１８】
DNAプローブは、HighPrimeランダムラベリングキット（Stratagene）を用いてPCR産物のランダムプライム標識および[.-32P]dCTPの取り込みによって調製した。プローブは、100℃に加熱することで変性し、次にハイブリダイゼーションバッファー（5×SSC、0.1％ SDS、1％スキムミルク）に加え、最終濃度を約10ng/mLとした。ハイブリダイゼーションは68℃で18時間行った。次にハイブリダイゼーション溶液を取り除き、三回厳密洗浄を実施した：2×SSC、0.1％ SDS、室温で5分間を一回、次に0.1×SSC、0.1％ SDS、68℃で10分間を二回。次にメンブレンを2×SSCで洗浄し、Stormホスフォイメージャー（Molecular Dynamics）を用いる前に、透明なプラスチックフィルム内に密封した。プローブのストリッピングは、メンブレンを0.1％ SDS、0.2M NaOHで二回、20分間、68℃洗浄することで行った。DNA制限断片のサイズは、Lambda低域DNAサイズラダー（NEB）を用いて、Sigmagelソフトウエアー（Jandel Scientific）で推定し、ゲルおよびブロットイメージを較正した。
【０２１９】
実施例17
細菌人工染色体（BAC）ライブラリーの構築
全ゲノムMU BACライブラリーは、前に結核菌について記載されている様にして構築した（Brosch, R., S. V. Gordon, A. Billault, T. Garnier, K. Eiglmeier, C. Soravito, B. G. Barrell, and S. Cole. 1998. Use of a Mycobacterium tuberculosis H37Rv bacterial artificial chromosome library for genome mapping, sequencing, and comparative genomics. Infect Immun 66:2221-2229.）。簡単に述べると、MU株Agy99のゲノムDNAを上記のようにアガロースプラグの形で調製し、HindIIIの部分消化にかけた。DNAをPFGE条件下で分離した。サイズ域40〜120kbの部分消化されたDNAをベクターpBeloBAC11の、唯一のHindIII部位にクローニングし、次にこれを用い、エレクトロポーレーションによって大腸菌 DH10Bを形質転換した。得られたクローンは、15％グリセロールを含むLBブロス中に、96ウエルの形式、-80℃で保存した。
【０２２０】
実施例18
BACプラスミドDNAの調製
自動配列決定のためのBAC DNAは、Broschらの方法を用いて抽出した（Brosch, R., S. V. Gordon, A. Billault, T. Garnier, K. Eiglmeier, C. Soravito, B. G. Barrell, and S. Cole. 1998. Use of a Mycobacterium tuberculosis H37Rv bacterial artificial chromosome library for genome mapping, sequencing, and comparative genomics. Infect Immun 66:2221-2229.）。BACをサブクローニングするために、DNAを一晩培養した40mlの大腸菌から調製し、前に記したようにしてプラスミドDNAを調製した（Brosch, R., S. V. Gordon, A. Billault, T. Garnier, K. Eiglmeier, C. Soravito, B. G. Barrell, and S. Cole. 1998. Use of a Mycobacterium tuberculosis H37Rv bacterial artificial chromosome library for genome mapping, sequencing, and comparative genomics. Infect Immun 66:2221-2229.）。
【０２２１】
実施例19
系統分析
十株のMU株すべてに存在した四種類のプラスミド遺伝子座（repA、parA、mls、MUP045）の配列をインフレームに連結し、それぞれの株について1266bpのセマンチド（semantide：意味体系）を生成した。次にこれら配列をCLUSTALW（Thompson, J. D., D. G. Higgins, and T. J. Gibson. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 22:4673-4680）とアラインメントを取った。同様にして、次の七つの遺伝子座を含んだ七株のMU株から得たプラスミド配列をフレーム内に連結して、repA、parA、MUP011、mls load、mlsAT（II）、MUP038およびMUP045からなる2208bpのセマンチドを生成した。
【０２２２】
系統分析は、MEGAソフトウエアー、バージョン2.1（Kumar, S., K. Tamura, I. B. Jakobsen, and M. Nei. 2001. MEGA2: molecular evolutionary genetics analysis software. Bioinformatics 17:1244-1245.）を用いて実施した。配列の分岐の全体レベルが小さいため、「P」距離を用いて処理した。同義（dS）および非同義（dN）突然変異頻度の値は、NeiとGojoboriの方法（Nei, M., and T. Gojobori. 1986. Simple methods for estimating the numbers of synonymous and nonsynonymous nucleotide substitutions. Mol Biol Evol 3:418-426.）を用いて計算し、そしてこれらの値の平均値の標準誤差はNeiとJinの方法（Nei, M., and L. Jin. 1989. Variances of the average numbers of nucleotide substitutions within and between populations. Mol Biol Evol 6:290-300.）によって見積もった。dSとdNの計算は、dSdNqwプログラム（da Silva, J., and A. L. Hughes. 1998. dSdNqw, 1.0 ed. Pennsylvania State University, University Park, PA.）を用いて行った。
【０２２３】
MUプラスミドpMUM001はMU株Agy99内では不安定である
マイコラクトンポリケチド合成酵素遺伝子（mlsA、mlsA2およびmlsB）の11の異なる機能のドメインには、先例のないレベルのドメイン間ヌクレオチド同一性（>97％）がある。遺伝子座内にある高レベルの配列反復を、図26に示すドッタープロットに示す。このDNAの相同性は、MU株内および株間において組換えの基質として機能し、またmls遺伝子座のもつ生来の不安定性および変動性という形で顕在化するという仮説が立てられている。
【０２２４】
これが真実であるという最初の証拠は、MU Agy99の単一DNA調製物に由来する複数のMU BACクローンについて、二種類の欠失変種の174kbプラスミドが存在することを見出し、pMUM001の全配列を決定する過程で得た。これら変種は、クローン22A01および22D03で表され、またそれらは176クローンのMUゲノムBACライブラリーのDNA末端シーケンシングによって発見された。配列分析から、22のクローンがpMUM関連配列を含んでいることが明らかにされた。次に、これら22クローンはさらに二つのサブファミリーに、二つの異なるタイプのPstI REプロフィールに基づいてグループ化された。各サブファミリー内のいくつかのクローンは、それらがpBeloBAC11に、単一の（しかし変化する）Mu HindIII部位にクローニングされたことを示す末端配列を有しており、全MUプラスミドがクローン化された可能性が出てきた。しかしながら、この仮説は、これらクローンの挿入体のサイズが65kbまたは110kbと、予想された174kbよりはるかに小さいことから、度外視された。興味深いことに、これら二種類のBACクローンを合計すると175kbであり、これらクローンがpMUM001の欠失変種である可能性が出てきた。
【０２２５】
各ファミリーの代表クローンを全配列決定し、注釈付けした。各クローンの全配列をpMUM001の全配列と比較したところ、これらが実際、mlsA1とmlsBの開始部位に重複する、二つの、8237bpの同一配列の間で組換えが起こったことにより生ずる欠失誘導体であることが示された（図26、図27AおよびB）。この配置は、MUプラスミド配列を含む全BACクローンのPstI RE消化、およびサザンハイブリダイゼーションにより確認された（図27CおよびD）。これら変化したプラスミドの形態は、PFGEとMUゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーションでは検出されず（図28A）、またおそらくは主要174kbプラスミド形態の中のサブ集団であろう。それらが、大腸菌内での組換えにより生じた欠失変種である可能性もあるが、別のHindIII部位でクローニングされた同一の変異の例が複数存在すること（図27C）および自然発生MUマイコラクトン突然変異体に同様の変種が存在すること（図28）はこの考えに異を唱えるものであり、これが遺伝子座の生来の不安定さを反映した現象であるとする考えを支持している。
【０２２６】
すべてのMU株は関連プラスミドを含む。
株間のプラスミドの変異を探るために、地理的に起源が異なる九株のMU臨床分離株のパネルを、八種類のMUプラスミドマーカーの存在について、PCRを用いスクリーニングした。この分析の結果は、表6にまとめる。
【０２２７】
（表６)  八種類のプラスミド関連遺伝子の存在についての、十種類のMU株のPCR分析
2007511218.tif 000019
【０２２８】
すべての分離株に重要なプラスミド複製および維持遺伝子（repAおよびparA）ならびにマイコラクトン生合成遺伝子の区画（mlsローディングドメインおよびMUP045）が存在することは、これらがすべてpMUM001と密接に関連したエレメントを含むことを示した。
【０２２９】
株間のプラスミド変動
いくつかの分離株間では、他のプラスミドマーカーのいくつかを欠くことから、プラスミド変動に注意が向けられた。最も注目すべきものは、三つの分離株では、MUP038（II型チオエステラーゼをコードしている）のような重要なマイコラクトン補助遺伝子やmlsアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメインの一つが存在しないことであり、後者の配列がないことは、これら分離株がマイコラクトンを産生できないことを示した。
【０２３０】
PFGEおよびサザンハイブリダイゼーションを用いて、十株のMU株の七株について、プラスミドの構造をより詳しく研究した。MU DNAはPFGEで分離した。つぎにこのDNAを、表6に記載したプラスミドマーカーのうちの五つから作製したプローブのプールとハイブリダイゼーションした。結果を図28に示すが、それは分離株の間でプラスミドのサイズに、59kb〜174kbの範囲の大きな差があることを実証した。110kb未満のプラスミドを有するMU株は、Mls生合成クラスターが約110kbのDNAを包含する遺伝子によってコードされていることから、マイコラクトンを産生できないと推測される。七つの分離株から得た脂質抽出物をLC-MSでスクリーニングしてこの予想を確認し、そのPCR分析では、MU Kob（101kbのプラスミドを持つ最近の西アフリカMU分離株）、MU 5114（59kbプラスミドを持つメキシコMU分離株）およびMU 105425（76kbプラスミドを持つ、リファレンス株ATCC 19428に由来するIPの培養コレクションからの分離株）からの抽出物については、マイコラクトンまたはその共代謝物のいずれも検出されなかった。
【０２３１】
XbaIによる消化と五種類のプールしたプラスミドマーカーとのハイブリダイゼーションからは、二本、三本または四本のバンドのプロフィールが得られた。各株とも、そのXbaI断片の合計は、XbaI消化をしない場合の直線形態のプラスミドのサイズに等しかった（図28）。このことは、プラスミドには新たに加わっXbaI断片がないことを実証している。
【０２３２】
次に個別プローブを使ったハイブリダイゼーション実験から、プラスミドマーカーと特定のXbaI断片とを結びつけ、低解像度の地図を作製した（図28B）。三種類のマイコラクトン欠失株には、75kb、98kbおよび115kbの大きな欠失があった。MUP038（II型チオエステラーゼをコードしている）がないことを示すハイブリダイゼーションデータと、mlsA1のモジュール5にATドメインがないこと、およびmlsBのモジュール1および2にATドメインがないことを示すPCRデータとを合わせると、これら欠失が、それぞれのmls遺伝子座の中で、少なくとも部分的に起こったことが確認される。
【０２３３】
四つのXbaI断片を持つ株（MUAgy99、MU1616、MUChantおよびMU941331）だけがマイコラクトンを産生したことから、定義に従い、それらはすべて無傷のmlsA遺伝子座を含まなければならない。この事実は、mlsA遺伝子およびMUP038を収納する遺伝子座に相当する、保存された54kbおよび13kbの断片が存在することから支持された。したがって、これら四株の間に検出されたサイズの変異は、mls遺伝子に隣接する領域で起こった。
【０２３４】
プラスミドの変異は、異なるマイコラクトン共代謝物の存在と相関する
MU ChantおよびMU 941331株について、それらのプラスミドサイズの変異のいくつかが、遺伝子MUP053（P450ヒドロキシラーゼをコードする）を含む領域が無いことに関係している可能性があった。MUP053の産物は、マイコラクトンのC12’にある側鎖をヒドロキシル化し、m/z 765に[M+Na]+の質量を持つマイコラクトンA/Bを産生すると考えられている（Stinear, T. P., A. Mve-Obiang, P. L. Small, W. Frigui, M. J. Pryor, R. Brosch, G. A. Jenkin, P. D. Johnson, J. K. Davies, R. E. Lee, S. Adusumilli, T. Garnier, S. F. Haydock, P. F. Leadlay, and S. T. Cole. 2004. Giant plasmid-encoded polyketide synthases produce the macrolide toxin of Mycobacterium ulcerans. Proc Natl Acad Sci U S A 101:1345-1349.）。C12'のヒドロキシル基を欠く株は、m/z 749に[M+Na]+の質量を持つ。この代謝物は、マイコラクトンCと呼ばれており（Mve-Obiang, A., R. E. Lee, F. Portaels, and P. L. Small. 2003. Heterogeneity of mycolactones produced by clinical isolates of Mycobacterium ulcerans: implications for virulence. Infect Immun 71:774-783）、それはオーストラリア株の特徴である。オーストラリア株MU ChantにMUP053がないことは、マイコラクトンCが存在すること、およびマイコラクトンA/Bが存在しないこととよく相関する（図29）。しかしながら、MU941331もMUP053を欠くが、この株はMUAgy99と同じマイコラクトンプロフィールを産生する（Hong, H., P. J. Gates, J. Staunton, T. Stinear, S. T. Cole, P. F. Leadlay, and J. B. Spencer. 2003. Identification using LC-MSn of co-metabolites in the biosynthesis of the polyketide toxin mycolactone by a clinical isolate of Mycobacterium ulcerans. Chem Commun 21:2822-2823.）（データ未提示）。
【０２３５】
配列分析はpMUMの共通の起源を示す
全MU株に共通する四つのプラスミドマーカーから得たDNA配列の比較からは、＞98％のヌクレオチド同一性スコアを共有することが示された。それぞれの株について、得られた四つの配列をrepA、parA、MUP045およびmlsローディングドメインの順番にインフレームに連結し、422コドンのセマンチドを産生した。シークエンスのアラインメントを取り、この分析で見つかった16箇所の可変部位のまとめを図30Aに示す。次に、これら配列から系統関係を推論し、その結果、これまでのMLST研究で染色体にコードされた七つの遺伝子を対象とする同じ分析から得られたトポロジーによく似たトポロジーを持つ系統樹が得られた（図30Cおよび30Eおよび（Stinear, T. P., G. A. Jenkin, P. D. R. Johnson, and J. K. Davies. 2000. Comparative Genetic Analysis of Mycobacterium ulcerans and Mycobacterium marinum Reveals Evidence of Recent Divergence. J Bacteriol. 182:6322-6330.)）。これら系統樹の一致は、pMUMが単一事象として獲得されたこと、およびその宿主と共に進化したことを示唆している。コーディング配列内での同義置換の頻度比較は、ある配列が他の配列に対し存在した時間を表す（Hughes, A. L., R. Friedman, and M. Murray. 2002. Genomewide pattern of synonymous nucleotide substitution in two complete genomes of Mycobacterium tuberculosis. Emerg Infect Dis 8:1342-1346.）。したがって、プラスミド担持遺伝子配列と染色体コード遺伝子配列の同義置換頻度が類似していることは、プラスミドの獲得が共通祖先からのMUの発散と同時に起こったという考えに一致する。
【０２３６】
プラスミドと染色体配列の両方に関するdSの計算（ここで、dSは100箇所の同義部位当たりの同義置換の数である）に有意差はなかった（プラスミド担持遺伝子配列：平均dS＝0.59、se=0.24；染色体遺伝子配列：平均dS=0.54、se=0.17）。十株中七株が、八つのプラズミドマーカーのうちの七つを有していた。従って、さらなる識別を試みて得るために、これらの株の配列を上記のように処理した。たとえば、所与の株については、七つの配列をrepA、parA、MUP011、mlsロード、mlsAT（II）、MUP038およびMUP045の順番にインフレームに連結して、736コドンのセマンチドを産生した。これらの配列のアラインメントを取ったところ、99％を超えるヌクレオチド同一性を共有した（図30B）。推論された系統は、四つのプラスミドマーカーおよびMLSTから得たものと完全に一致した（図30D）。
【０２３７】
マイコラクトンの修飾に役割を担う可能性のある推定P450モノオキシゲナーゼをコードするMUP053は、株間に不均一に分布した。しかしながら、MUP053は、アフリカ、マレーシア、中国およびメキシコ由来の株に存在しており、またこれらの株は種においても遺伝的多様性があることが知られている。これらの株の間での、MUP053に関する共有するDNAおよびaaの同一性はそれぞれ98％および96％であった；他のプラスミド配列に等しい（図30F）。このことは、MUP053が先祖のMUに存在し、種が進化する際にいくつかの株から失われたことを示唆している。
【０２３８】
MUはマイコバクテリアにおける病原性の進化に於ける、遺伝子消失だけでなくLGTの重要性に関する最初の直接証拠を提供する。MUは、病原性表現形を付与するプラスミド（pMUM）を獲得することで、そして、おそらくは生体にとってより重要な、特定のニッチ環境に対する適合優位性を獲得することで進化した新興マイコバクテリア病原菌の例である。これまでの多遺伝子座配列タイピング（MLST）研究は、ヌクレオチドレベルでMUがMycobacterium marinumと強く関係していることを示したが、後者は魚の自然病原菌であり、表現形はMUと極めて異なっている。しかしながら、この二種は、七つの連鎖していない遺伝子全体および40の多種株の間で98％を超えるDNA同一性を有していることが分かっている（Stinear, T. P., G. A. Jenkin, P. D. R. Johnson, and J. K. Davies. 2000. Comparative Genetic Analysis of Mycobacterium ulcerans and Mycobacterium marinum Reveals Evidence of Recent Divergence. J Bacteriol. 182:6322-6330.）。系統遺伝学分析は、MUが共通のM. marinumの祖先から進化したものであることを強く示唆しており、この結果から、外来DNAの獲得によって助けられて、個別クローンのグループ化という形でMUが分岐したという仮説が立てられた。その後の研究から、MUに病原性プラスミドpMUMが存在することが示され、本発明はpMUMがMUの重要な属性であること、またそれが世界中から得たMU株に広く存在していることを示した。これら株のpMUM遺伝子配列と染色体遺伝子配列との比較から、分岐トポロジーの一致、および同義置換の頻度が等しいことが明らかとなり、pMUMの獲得が単一の、M. marinumの祖先から種が分岐したことの痕跡であることを強く示唆した。プラスミドの獲得に続いて、地域別にMU株内に別の独立したゲノム変更が起こり、今見られる地域特異的な表現形および遺伝子型が生じた（Chemlal, K., K. De Ridder, P. A. Fonteyne, W. M. Meyers, J. Swings, and F. Portaels. 2001. The use of IS2404 restriction fragment length polymorphisms suggests the diversity of Mycobacterium ulcerans from different geographical areas. Am J Trop Med Hyg 64:270-273. Stinear, T., J. K. Davies, G. A. Jenkin, F. Portaels, B. C. Ross, F. Oppedisano, M. Purcell, J. A. Hayman, and P. D. R. Johnson. 2000. A simple PCR method for rapid genotype analysis of Mycobacterium ulcerans. J Clin Microbiol 38:1482-1487. Stinear, T. P., G. A. Jenkin, P. D. R. Johnson, and J. K. Davies. 2000. Comparative Genetic Analysis of Mycobacterium ulcerans and Mycobacterium marinum Reveals Evidence of Recent Divergence. J Bacteriol. 182:6322-6330.）。
【０２３９】
pMUM001の珍しい特徴の一つは、mls遺伝子の機能ドメイン間の、先例のないDNA相同性である。mls遺伝子はpMUM001の105kbを占めているが、この領域のユニーク配列は10kbに満たない（Stinear, T. P., A. Mve-Obiang, P. L. Small, W. Frigui, M. J. Pryor, R. Brosch, G. A. Jenkin, P. D. Johnson, J. K. Davies, R. E. Lee, S. Adusumilli, T. Garnier, S. F. Haydock, P. F. Leadlay, and S. T. Cole. 2004. Giant plasmid-encoded polyketide synthases produce the macrolide toxin of Mycobacterium ulcerans. Proc Natl Acad Sci U S A 101:1345-1349）。この配列の異常な秩序は図2に反映されており、mls遺伝子が、インフレーム重複のような連続的な組換え、およびPKS配列のコアセットからの欠失によって、デヌボに創り出されたことを示唆している。このようなコア遺伝子セットの正確な起源は、DNAデータエースの検索でオルトログ遺伝子が見つかっていないことから不明のままであるが、マイコバクテリアやストレプトマイセスの他の種のPKS配列と有意なaa同一性を示すことから、アクチノマイセス属に起源が在ると思われている。マイコラクトン生合成の進化的な最近の起源が示唆されていることに加えて、伸長DNA配列の相同性からも、このような配置が本来不安定であり、一般的な組換えの基質になることが暗示される。本発明は、MUAgy99では、pMUM001が不安定であること、および二つの相同配列間の組換えで二つの欠失変種が生じることを示している。BACクローン22D03が示す、大きなほうの109kbの変種は、無傷の複製起源を含んでおり、従って細胞手段内に維持されると考えられる。22D03変種を持つ細胞は、マイコラクトンを産生できないが、理論的にはアシル側鎖はまだ産生できる。しかしながら、BACクローン22A01が示す、小さいほうの65kb欠失変種は、マイコラクトンコアの合成に必要な遺伝子は有しているものの、自律的複製ができないため細胞分裂によって集団から失われるだろう。
【０２４０】
自然発生した、マイコラクトン陰性、無病原性MU突然変異体は、Georgeらによって最初に報告され（George, K. M., D. Chatterjee, G. Gunawardana, D. Welty, J. Hayman, R. Lee, and P. L. Small. 1999. Mycolactone: a polyketide toxin from Mycobacterium ulcerans required for virulence. Science 283:854-857.）、これを用いて、病原性におけるマイコラクトンの重要な役割が実証された。マイコラクトンは、コロニーを淡い黄色にするため、マイコラクトン陰性突然変異体は、Lowenstein-Jensen（LJ）培地で増殖したときに、白色のコロニー変種として容易に観察できる。pMUM001の109kb欠失型を同定するために、MUAgy99の白色コロニーの変種を分離することを試みた。LJ培地では、白色コロニーは容易に見つけられるが、二次培養でのそれらの増殖速度は大きく損なわれ、PFGEといった追加研究に必要なバイオマスを創り出すことは不可能であった。しかしながら、他のMU株の研究は、MUAgy99（特にMUKob）に同定されたものに似たpMUMの欠失型を明らかにし、これら欠失型は対応する毒素陰性の表現形を示した。試験したそれぞれの株は、異なるプラスミドサイズを持ち、地図データは、欠失が様々な大きさ、およびpMUMの異なる領域で起こることを示した。相同配列間の組換えは、この多様性の一つ説明であるが、pMUMの非常に多くの挿入配列を考えると（Stinear, T. P., A. Mve-Obiang, P. L. Small, W. Frigui, M. J. Pryor, R. Brosch, G. A. Jenkin, P. D. Johnson, J. K. Davies, R. E. Lee, S. Adusumilli, T. Garnier, S. F. Haydock, P. F. Leadlay, and S. T. Cole. 2004. Giant plasmid-encoded polyketide synthases produce the macrolide toxin of Mycobacterium ulcerans. Proc Natl Acad Sci U S A 101:1345-1349.）、別の可能性として、ISがこれらプラスミドの再配置のいくつかを媒介することも考えられる。
【０２４１】
pMUM陰性MU株が見いだせないことは、たぶん重要であろう。このような突然変異体は存在するが、pMUMが活動的な分割（par）遺伝子座を含んでいるという最近の発見（Stinear et al. submitted）は、自然治癒が稀な事象であることを意味している。Par遺伝子座は、細胞分裂中に娘細胞がエピソームのコピーを受け取ることを確実にするように機能するシス作用性エレメントである。
【０２４２】
本発明で使用した臨床分離株は、もともと熟達したマイコラクトンを持つものであり、従って無傷のpHUMを含んでいたと仮定すると、MUプラスミドDNA合成の欠失によって生じた自然発生毒素陰性突然変異体は、一般的な出来事である。突然変異が生ずる頻度はまだ計算されていないが、いくつかの株については、極めて高いと思われている。MUAgy99およびMUKobは、西アフリカの最近の臨床分離株であり、研究室での継代回数も少ない。MUAgy99 BACライブラリーに用いたDNAは、一次分離から4回継代された液体培地より調製され、MUKobはその三回目の継代である。本発明の成果は、研究者が、その研究に用いるMU株のプラスミドおよびマイコラクトンの状態について引き続き試験しなければならないことに光を当てたことである。
【０２４３】
プラスミドの不安定性は、世界中の様々な地理的場所から回収されたMU分離株が、比較的相同的な範囲のマイコラクトンを産生するという事実と、際だった対照をなす（Mve-Obiang, A., R. E. Lee, F. Portaels, and P. L. Small. 2003. Heterogeneity of mycolactones produced by clinical isolates of Mycobacterium ulcerans: implications for virulence. Infect Immun 71:774-783.）。この見かけ上の矛盾は、おそらくは、マイコラクトンは環境の中でMUにとって重要な機能を果たしていることから、熟達型のpMUMマイコラクトンを維持する強力な純化淘汰が存在するという考えを受け入れざるを得ない。ヒト細胞に対するマイコラクトンの細胞毒性作用は、細菌にとっては、一次的な生存的役割の一部であるこということは、おそらくはありえないだろう。しかしながら、MU感染の波が急速に出現し、そしてある地域から消え去ったブルーリ潰瘍の極めて挿間的で、地理的にコンパクトな流行を考えると、欠失性の組換えとプラスミド機能の消失が、ある時点で伝染の鎖を断ち切ったとする一つの可能性がある。おそらくは、マイコラクトンは、昆虫の唾液腺の中でコロニーを形成するか、または残存するために（Marsollier, L., R. Robert, J. Aubry, J. P. Saint Andre, H. Kouakou, P. Legras, A. L. Manceau, C. Mahaza, and B. Carbonnelle. 2002. Aquatic Insects as a Vector for Mycobacterium ulcerans. Appl Environ Microbiol 68;4623-4628.)、または植物表粘のバイオフィルムの確立に（Marsollier, L., T. Stinear, J. Aubry, J. P. Saint Andre, R. Robert, P. Legras, A. L. Manceau, C. Audrain, S. Bourdon, H. Kouakou, and B. Carbonnelle. 2004. Aquatic plants stimulate the growth of and biofilm formation by Mycobacterium ulcerans in axenic culture and harbor these bacteria in the environment. Appl Environ Microbiol 70:1097-1103.）必要な因子である。他のYersinia pestisのような純系病原菌では、より少ない遺伝的変化によって、伝染経路と病原形態を、それらの先祖に比べ大きく変化させる。実際、それらの疾患病理は根本的に異なるにも関わらず、Y. pestisとMUの間には多くの相似点があり、ペスト病原菌の場合、遺伝子ymtをコードするプラスミドの獲得、およびhmsは、それぞれノミの中腸での消化に対する耐性能力と前胃内部を裏打ちする脊椎の表面での残存能力を付与し、それにより節足動物に結びついた伝染機序を容易にしている（Hinnebusch, B. J., A. E. Rudolph, P. Cherepanov, J. E. Dixon, T. G. Schwan, and A. Forsberg. 2002. Role of Yersinia murine toxin in survival of Yersinia pestis in the midgut of the flea vector. Science 296:733-735. Jarrett, C. O., E. Deak, K. E. Isherwood, P. C. Oyston, E. R. Fischer, A. R. Whitney, S. D. Kobayashi, F. R. DeLeo, and B. J. Hinnebusch. 2004. Transmission of Yersinia pestis from an infectious biofilm in the flea vector. J Infect Dis 190:783-792.）。
【０２４４】
mls遺伝子座の反復性は、マイコラクトンに不均一性をまねくものではないが、本発明で同定された一つのDNAは、変種毒素の産生に結びつけることができる。プラスミド遺伝子MUP053は、脂肪酸側鎖の位置C’12でマイコラクトンをヒドロキシル化し、マイコラクトンA/B（m/z 765）を産生するのに必要と考えられている酵素の推定P450モノオキシゲナーゼをコードしている。予想通り、オーストラリア株MU ChantはMUP053を欠いており、ヒドロキシル基のない、m/z 749の質量の小さな代謝物（マイコラクトンC）を産生する。PNG由来のMU 941331もまたMUP053を欠くが、それでも酸化型のマイクロラクトンを産生するという事実は、いくつかの株では、分子に対するヒドロキシラーゼ活性をコードする染色体P450遺伝子が存在している可能性を示唆している。
【０２４５】
本発明は、pMUMに重要な突然変異のダイナミズムがあることを示している。Mls遺伝子内には、常に遺伝的な流動があり、新しいマイコラクトンが、所与のMU集団の中に常に作られている。しかしながら、新規代謝物が適合優位性を付与しない場合、そのような変化を持つ細胞は存続しないだろう。
【０２４６】
マイコラクトン生合成の遺伝的基礎が最近明らかにされ、T. Stinear, Mve-Obiang, A., Small, P. L., Frigui, W., Pryor, M.J., Brosch, R., Jenkin, G.A., Johnson, P.D., Davies, J.K., Lee, R.E., Adusumilli, S., Garnier, T., Haydock, S.F., Leadlay, P.F., S.T. Cole, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101, 1345-1349：マイコバクテリアは、174kbの巨大プラスミドを含んでおり、それは、数多くの補助遺伝子に加えて、エリスロマイシン、ラパマイシンおよびその他の大環状ポリケチドの生合成を支配している放線菌類PKSによく似たI型モジュラーポリケチド合成酵素をコードし、各モジュールの脂肪酸合成酵素関連酵素活性は、ポリペプチド鎖伸長の特異的サイクルを触媒している、複数の非常に大きな遺伝子を収納している。L. Katz, S. Donadio, Annu. Rev. Microbiol. 1993 1993, 47, 875-912; J. Staunton, K.J. Weissman, Nat. Prod, Rep. 2001, 18, 380-416. 遺伝子のmlsA1（51kbp）およびmlsA2（7kbp）は、12員環コアラクトンの産生に関するPKSをコードしているが、一方mlsB（42kbp）は側鎖PKSをコードしている。
【０２４７】
この配列が利用できることが、アフリカ分離株（MUAgy99）由来のマイコラクトンA/Bとマイコバクテリアの別の病原菌株が産生したマイコラクトンとの構造上の違いの研究、後者の株の変種マイコラクトンが処理段階の変化ではなく、むしろPKS内の変化によるものであるかを調べ研究を導いた。マイコラクトン代謝物を特徴付するために、最近報告されたLC-連続質量分析（LC-MSn）が用いられ、イオントラップ質量分析計で実施された。H. Hong, P.J. Gates, J. Staunton, T. Stinear, S.T. Cole, P.F. Leadlay, J.B. Spencer, Chem. Commun. 2003, 2822-2823. イオントラップ質量分析（FTICRまたは四重極イオントラップを用いる）は、標的分子の多段階的な衝突断片化を可能にし、これによって詳細な構造情報が得られる。中国由来のマイコバクテリアの病原性株（MU98192）のマイコラクトンはすべて、マイコラクトンAに比べC2’に一つ多くメチル基を有しており（図31を参照）、これは明らかにマイコラクトンPKS内に特異的変化した単一触媒ドメインが加わった結果である。
【０２４８】
マイコバクテリア株の増殖および代謝物の抽出の詳細については、実施例20〜21を参照せよ。細胞抽出物の予備的LC-MS分析は、中国株、MU98912がm/z 765、763、749および747の特徴的値を持つ正常マイコラクトンを産生しないことを示した。しかしながら、少なくともm/z 779、777および761で三つの新規成分が検出された。オンラインLC-MS/MS分析をこれらイオンに実施したところ、それらは正常マイコラクトンA/Bに驚くほどよく似た断片化パターンを示した（図32を参照）。MU98912由来のマイコラクトンの、すべてのMS/MSスペクトルは、AおよびBに対応する断片イオンを含んでいたが、これらはそれぞれコアラクトンおよびポリケチド側鎖に対応するマイコラクトンに特徴的なイオンである。H.Hong, P.J. Gates, J. Staunton, T. Stinear, S.T. Cole, P.F. Leadlay, J.B. Spencer, Chem. Commun. 2003, 2822-2823. 断片イオンAは、すべてのスペクトルで保存されていたが、一方断片イオンBは、前駆体イオンの質量の変異に従って正確に変化した。それゆえに、コアラクトンはMUAgy99およびMU98912のマイコラクトンで同一であり、構造上の変異はポリケチド側鎖によるものと思われる。
【０２４９】
このような構造の変異についてさらに情報を得るため、これら新規に同定されたマイコラクトンについてオフラインアキュレート質量分析および重水素交換実験を行った。結果は、MUAgy99の古典的マイコラクトンのものに比べ（表7）、MU98912のマイコラクトンは交換可能なプロトンを同数有しているが、それらのMUAgy99対応物に比べると、メチル基が一つ多いことを明瞭に示した。
【０２５０】
（表７）  アフリカおよび中国株由来マイコラクトンの分子式、および交換可能プロトンの数の比較
2007511218.tif 000020
*MUAgy99由来マイコラクトンのデータは、参考資料[10]より得た。
【０２５１】
これらの結果は、MU98912由来の、すべてのマイコラクトンの側鎖に余分なC-またはO-結合メチル置換基があるとすれば納得できる。
【０２５２】
この考えを検証し、このような余分なメチル基の側鎖内での正確な位置を特定するために、二株のマイコラクトンのMS/MSスペクトルを詳しく比較した。MUAgy99由来のマイコラクトンのM/Mスペクトルにおいて、（（m/z 765の）MS/MSスペクトルの代表例は図32に示す）、m/z 565の断片イオンが常に観察される。この断片イオンCと命名することが提案されている、保存断片は、H. Hong, P.J. Gates, J. Staunton, T. Stinear, S.T. Cole, P.F. Leadlay, J.B. Spencer, Chem. Commun. 2003, 2822-2823、C6'-C7'結合の劈開の結果生じる。断片イオンCに加え、m/z 579（イオンD）および631（イオンE）の保存断片イオンは、MUAgy99由来のマイコラクトンから生じ、また重水素化MS/MS分析により（データ未提示）、それぞれC7'-C8'とC10'-C11'の劈開の結果であることが突き止められている（図33を参照）。比較では、MU98912由来のマイコラクトンのMS/MSスペクトルでは、重水素化MS/MS分析はイオンE（m/z 631）の対応物がm/z 645に14質量単位増加することを示し、一つ余分なメチルがあること、そしてそれがC2'〜C10'の間に在ることを示唆している。しかしながら、断片イオンD（m/z 579）より14質量単位増加した断片は見られなかった。イオンC（m/z 565）およびイオンD（m/z 579）の両方に代わって、m/z 579の断片イオン（断片Cより14質量単位が高い）のみが観察された。この重要な情報は、余分なC-結合メチル基が、C2’位置にあることの強い証拠を提供している。
【０２５３】
MUAgy99とMU98912のマイコラクトン間の特異的な構造の差に注目し、それぞれ、マイコラクトン生合成遺伝子の適当な部分についてヌクレオチド配列分析を行った。マイコラクトン生合成遺伝子を担持するマイコバクテリア巨大プラスミドの予備的制限地図分析は、MUAgy99とMU98912の間に（予想通り）明瞭な差を示さなかった。最後のポリケチド伸長ユニットの挿入を支配して側鎖の炭素C1'およびC2'を提供する、PKS MlsBの伸長モジュール7をコードするDNAを、PCRで増幅し、配列決定した。このモジュールのバルクについては、二株の間に顕著なアミノ酸配列の差はなかった（全体のDNA配列同一性 >99.3％）。しかしながら、アシルトランスフェラーゼドメインAT7は、図34に示すように顕著な差を示した。MU98912のAT7の配列は、MlsBの伸長モジュール6のように、マイコラクトンPKS内の、別の場所にある典型的なメチルマロニル-CoA特異的ATドメインと同一であり、T. Stinear, Mve-Obiang, A., Small, P.L. Frigui, W., Pryor, M.J., Brosch, R., Jenkin, G.A., Johnson, P.D., Davies, J.K., Lee, R.F., Adusumilli, S., Garnier, T., Haydock, S. F., Leadlay, P.F., S. T. Cole, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2004, 101, 1345-1349、その長さの多くにわたりMUAgy99の（マロニル-CoA特異的）AT7の配列と顕著に異なっている。具体的には、顕著な配列モチーフは、それぞれメチルマロニル−またはマロニル-CoAに対する基質特性について、すべて極めて診断的に異なっている。S.F. Haydock. J.F. Aparicio, I. Molnar, T. Schwecke, L.E. Khaw, A. Konig, A.F.A. Marsden, I.S. Galloway, J. Staunton, P.F. Leadlay, FEBS Lett. 1995, 374, 246-248; Biotica, patent; Kosan, biochemistry; F. Del Vecchio, H. Petkovic, S.G. Kendrew, L. Low, B. Wilkinson, R. Lill, J. Cortes, B.A. Rudd, J. Staunton, P.F. Leadlay, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2003, 30, 489-494.
【０２５４】
最近、極めて少数の、重要な活性部位残基を特異的に変更することによって、モジュラーPKS内のアシルトランスフェラーゼドメインの基質特異性を広げ、メチルマロニル-CoAおよびマロニル-CoAに適応できることが実証されている。Biotica, patent; Kosan, biochemistry; F. Del Vecchio, H. Petkovic, S.G. Kendrew, L. Low, B. Wilkinson, R. Lill, J. Cortes, B.A. Rudd, J. Staunton, P.F. Leadlay, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2003, 30, 489-494.  図35は、マロニル-およびメチルマロニル-CoAにそれぞれ特異的なマイコラクトンPKS内のATドメインは、より根本的な差を示すこと、そしてそれらのN末端とそして（特に）それらのC末端の配列でのみ相互が同一であることを示している。したがって、比較したマイコバクテリア株の一つの側鎖PKSモジュール7ATドメインの大部分は、明らかに他に交換されている。これら変化が生ずる進化の道筋はまだ明らかにされていないが、この自然界での差が発見されることは、モジュラーPKSの化学的特異性の切り替えに広く用いられているAT「ドメイン交換」のストラテジーから予想されるものである。M. Oliynyk, M.J. Brown, J. Cortes, J. Staunton, P.F. Leadlay, Chem. Biol. 1996, 3, 833-939. R. McDaniel, A. Thamchaipenet, C. Gustafsson, H. Fu, M. Betlach, G. Ashley, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999, 96, 1846-1851.
【０２５５】
実施例20
微生物学的方法
本発明に用いた二種類のマイコバクテリア臨床分離株、MUAgy99およびMU98912は、それぞれガーナおよび中国の患者から得た。W.R. Faber, L.M. Arias-Bouda, J.E. Zeegelaar, A.H. Kolk, P.A. Fonteyne, T.J., P.F., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2000, 94, 277-279.  MU98912は、好意によりF. Portaelsから提供された。株の増殖および細胞抽出物の調製は、前記のとおりにおこなった。H. Hong. P.J. Gates, J. Staunton, T. Stinear, S.T. Cole, P.F. Leadlay, J.B. Spencer, Chem. Commun. 2003, 2822-2823. DNA配列分析については、PKS MlsBのモジュール７をコードしているDNAは、フォワードプライマー
2007511218.tif 000021
（MlsBのKS7ドメインのC末端に対応する）およびリバースプライマー
2007511218.tif 000022
（図34に示すmlsB停止コドン直ぐ下流の位置に対応する）を用い、ゲノムDNAを鋳型に使用して各株からPCR増幅した。両方の例で5kbpの産物が得られ、これをプライマーウォーキングにより、両鎖について全配列を決定した。MU98912から得たDNA配列は、Genbankに、登録番号AY743331で寄託した。
【０２５６】
実施例21
LC-MS分析
LC-MSおよびLC-MS/MS分析を、Finnigan LCQ装置を使い、本質的に前に記載した通りに実施した。H. Hong. P.J. Gates, J. Staunton, T. Stinear, S.T. Cole, P.F. Leadlay, J.B. Spencer, Chem. Commun. 2003, 2822-2823。正確な質量分析は、API QSTARパルサー（Applied Biosystems）を用いて行った。重水素交換実験は、前に記載したように実施した。H. Hong. P.J. Gates, J. Staunton, T. Stinear, S.T. Cole, P.F. Leadlay, J.B. Spencer, Chem. Commun. 2003, 2822-2823.
【０２５７】
まとめると、本発明は、マイコバクテリアの病原性中国株に同定された毒素マイコラクトンの新規類似物も提供し、それは、以下に示すように、特異的に変更された単一触媒ドメインをマイコラクトンPKS内に収納した結果として、マイコラクトンA（図参照）に比べてC2'に一つ余計なメチル基を有している。
2007511218.tif 000023
【０２５８】
前記参考文献および以下の各参考文献は、本明細書に引用される。各参考文献の開示全体を信頼し、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５９】
参考文献
2007511218.tif 000024
2007511218.tif 000025
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
図面の概要
本発明は、以下の図面を参照しながら記載されている：
【図１】マイコラクトンプラスミドの図（A）パルスフィールドゲル電気泳動；（B）MU Agy99（レーン1と2）およびMU1615（レーン3と4）のサザンハイブリダイゼーション分析であり、消化されていない（レーン1と3）およびXbaI消化後（レーン2と4）のゲノムDNAに直線化された形のプラスミドが存在すること、mlsA、mlsB、mup038およびmup045由来の複合プローブとハイブリダイゼーションすることを示す。レーンMは、ラムダ低分子域DNAサイズラダーである（NEB）。
【図２】pMUM001の環状表示スケールは、外側の黒のサークルによりキロベース単位で表している。外側から内側に向かって、次の二つのサークルはそれぞれ、ホワードおよびリバース鎖CDSを、色別に機能分類して表している（赤、複製；ライトブルー、制御；ライトグリーン、仮想タンパク質；ダークグリーン、細胞壁および細胞プロセス；オレンジ、保存的仮想タンパク質；シアン、ISエレメント；黄色、中間代謝；グレー、脂質代謝）。これに続けてGCスキュー(G-C)/(G+C)、そして最後に1kbの幅でG+C含有量を示している。マイコラクトン生合成クラスターの配置（mup053、mup045、mlsAl、mlsA2、mup038およびmlsB）は強調されており、すべてのXbaI部位の場所を示している。Hind III制限部位は（H1: 1289、H2: 5209、H3: 71532、H4: 71846、H5: 73953、H6: 136357、H7: 136671、H8: 138778、H9: 152732、H10: 168846およびH11: 173190）で示している。
【図３】マイコラクトンPKS遺伝子のドメインおよびモジュール構成三つの遺伝子（mlsA1、mlsA2およびmlsB）それぞれの中では、異なるドメインは、番号の付いたブロックで表されている。ドメインの名称はキーに記載されている。白色ブロックは、100％同一性のドメイン内領域を表している。モジュール配置は、各遺伝子の下に示し、モジュールには、機能および配列の両方が同一（>98％）であることを示す番号コードが付けられており、たとえば、MLSA1のモジュール5は、MLSBのモジュール1および2と同一である。DHの四つのドメイン全体を通して、それらは、活性部位配列にある点突然変異に基づき、不活性であると推測される。マイコラクトンの構造にも、特定の鎖の伸長を担うモジュールへの一致を表す番号が付けられている。
【図４】マイコラクトントランスポゾン突然変異体マイコラクトン陰性突然変異体は、無色のコロニーとして同定された（挿入体）。細胞障害性を検出するために、1×107個の細菌と培養濾過液50μlを、L929繊維芽細胞の準コンフルエント単層に加えた。24時間目の処理細胞を示す。（図4A）mlsBに挿入を含むMU1615：Tn104、（図4B）WT MU 1615、（図4C）未処理コントロール細胞、（図4D）mlsAに挿入を含むMU 1615::Tn141（20×）。
【図５】マイコラクトントランスポゾン突然変異体の質量分光分析図5A：mlsBに挿入を含むMU1615::Tn104は、マイコラクトンイオンm/z 765が存在しないこと、およびm/z 447のラクトンコアイオンの存在を示している。図5B：WT MU 1615は、マイコラクトンイオンm/z 765の存在を示している。図5C：非MLS挿入を含むMU 1615::Tn99は、マイコラクトンイオンm/z 765の存在を示している。図5D：mlsAに挿入を含むMU1615::Tn141は、マイコラクトンイオンm/z 765およびm/z 447のラクトンコアイオンが共に存在しないことを示している。
【図６】mlsAl遺伝子のコード配列の核酸配列
【図７】mlsA2遺伝子のコード配列の核酸配列
【図８】mlsB遺伝子のコード配列の核酸配列
【図９】mup045遺伝子のコード配列の核酸配列
【図１０】mup053遺伝子のコード配列の核酸配列
【図１１】mup038遺伝子のコード配列の核酸配列
【図１２】mlsAl遺伝子によりコードするタンパク質のアミノ酸配列
【図１３】mlsA2遺伝子によりコードするタンパク質のアミノ酸配列
【図１４】mlsB遺伝子によりコードするタンパク質のアミノ酸配列
【図１５】mup045遺伝子によりコードするタンパク質のアミノ酸配列
【図１６】mup053遺伝子によりコードするタンパク質のアミノ酸配列
【図１７】mup038遺伝子によりコードするタンパク質のアミノ酸配列
【図１８】マイコバクテリアプラスミドpMUM001の完全配列
【図１９】pMUM001の直線地図．81予測タンパク質コーディングDNA配列（CDS）の位置は、異なる色のブロックで表し、MUP001(repA)からMUP081のように連続して表示している。ホワードまたはリバース鎖CDSは、それぞれ黒線の上下に示し、異なる機能分類を色別に表している（赤、複製；ライトブルー、制御；ライトグリーン、仮想タンパク質；ダークグリーン、細胞壁および細胞プロセス；オレンジ、保存的仮想タンパク質；シアン、挿入配列エレメント；黄色、中間代謝；グレー、脂質代謝）。黒の矢印は、シャトルベクターpMUDNA2.1を産生するためにpCDNA2.1内にクローニングされた領域を示している。淡いグレーの陰が付けられたボックスで覆われている領域は、マイコラクトンPKS遺伝子の開始点、mlsA1およびmlsBを包含する、8kbの同一ヌクレオチド配列を示している。スケールはbpで示しており、各小区切りは1000bpを表している。
【図２０】pMUM001の複製起点repAおよびMUP081遺伝子の開始点には青色の大文字で印を付け、転写方向は矢印で示す。下線を付けた配列（小文字および大文字）は、pMUM001とM. fortuitumプラスミドpJAZ38の間の、高保存ヌクレオチド配列領域を指す。この領域内にある、緑の陰が付けられた70bpの配列は、複数のマイコバクテリアプラスミドで保存されている（Picardeau et al., 2000）。16bpのイテロン配列は赤で、またイテロンの部分的な逆向き反復配列は黄色で示す。
【図２１】方法の段落の記載に従い構築された、マイコバクテリア／大腸菌シャトルベクターpMUDNA2.1の概略図破線はpMUM001の推定oriに重複する6kb断片とpCDNA2.1との間の結合輪郭を表す。固有の制限酵素部位に印を付けている。グレーの内側の区分は、二つの欠失構築体pMUDNA2.1-1およびpMUDNA2.1-3から取り出された領域を表す。
【図２２】M. marinum M株（レーン1）およびpMUDNA2.1で形質転換したM. marinum M株（レーン2）のSpeI消化DNAのアガロースゲル電気泳動（図22A）およびサザンハイブリダイゼーション分析（図22B）の結果精製されたSpeI消化pMUDNA2.1を陽性コントロールとして加えた（レーン3）。プローブは、pMUM001の413bpの内部領域、repA遺伝子に由来した。
【図２３】アプラマイシンなしで増殖させたM. marinum M株でのpMUDNA2.1の安定性連続する時点の組換えプラスミド含有CFUのパーセンテージは、アプラマイシン耐性細胞の残存率を表している；アプラマイシン非存在時のCFU総数に対するパーセンテージとして表している。総CFU数は、いずれの時点も、三回の生物学的繰り返しの平均値±標準誤差である。
【図２４】マイコバクテリア株Agy99についての、10コピーのIS2404のフランキング配列の分析41bpの完全な逆向き繰り返し配列の区画をボックスに入れ、また逆向きのIS2404配列はボックス領域内の三つの連続点で表した。異なる標的部位複製には、下線を付けた太字体で印を付けた。
【図２５】マイコラクトンA(Z-,4',5')およびB（）(m/z 765で [M+Na]+)の構造
【図２６】繰り返しDNA配列領域を強調するpMUM001 DNA配列のドッター分析。同方向繰り返し配列は主対角線と平行に走る線で示し、これに対し逆向きの繰り返し配列は、直交方向の線として示す。プラスミド欠失誘導体を創り出す、mlsA1およびmlsBの開始点付近の相同的組換え部位には、陰の付いた円を付けて強調している。
【図２７】pMUM001の欠失変種の遺伝子地図図27A：pMUM001および組換え介在欠失の提案モデルである二種類の欠失誘導体の、スケール付き環状地図。すべてのHindIII部位の位置に印が付いている。外側の環の黒の矢印は、複数の重要遺伝子を示している。組換え体の部位は、交差する破線によって囲み示している。内側のグレーの環は、BACクローンを例に表した配列を示す。欠失誘導体については、ベクターpBeloBAC11をクローニングしたHindIII部位も示した。図27B：欠失変種を生ずる、mlsA1およびmlsBの開始点にあるローディングモジュールを囲むpMUM001内の組換え体領域の拡大図。すべてのHindIIIおよびPstIに印が付いている。破線の間にあるグレーの陰が付いたブロックは、組換え体の対象となった100％ヌクレオチド同一性を示すゾーンを表している。プローブ74にハイブリダイゼーションする200bpの配列も示す。図27C：それぞれmlsBおよびmlsA遺伝子に及ぶ二つのサブファミリーの存在を示している、21 MUAgy99 BACクローンのPstI RE消化の結果を示すゲル電気泳動。図27D：（C）のサザンハイブリダイゼーション分析からは、pMUM001内にはmlsローディングモジュール配列のコピーが二つあること、そして欠失変種にはコピーが一つだけであることが確認されている。ハイブリダイゼーションしたバンドの30の異なるサイズは、pBeloBAC11へクローニングした部位の違いによるものであり、pBeloBAC11にはPstI部位が三カ所ある。
【図２８】七個のMU株についてのpMUMマッピングの結果図28A：MUおよびM.marinumから抽出した未消化、およびXbaI消化したDNAに対する、pMUM001から選択した五種類のPCR由来プローブを用いたPFGEおよびサザンハイブリダイゼーション。レーンの識別は次の通りである：レーン1：MUAgy99；レーン2：MUKob；レーン3：MU1615；レーン4：MUChant；レーン5：MU105425；レーン6：MU5114；レーン7：MU941331；レーン8：M. marinum M株。図28B：(A)に示したサザンハイブリダイゼーション実験から演繹された７種類のMUに関する、プラスミドサイズ、すべてのXbaI部位の位置、およびLC-MS/MSによって決定されたそれぞれの株の毒素の状態を示す、pMUMの物理学的地図。
【図２９】マイコラクトンが無いこと（[M+Na]+；765.5）および非ヒドロキシル化マイコラクトンの存在（[M+Na]＋：749.5）を示す、オーストラリア分離株MUChant由来脂質抽出物のLC-MS分析の結果図29A：m/z=765.5に関するイオントレース；図29B：m/z=749.5に関するイオントレース。
【図３０】選択したプラスミドマーカーを用いた十種類のMU株の系統分析図30A：十個のMU株すべてに存在した、四連続pMUMタンパク質をコードする遺伝子座から得られた1266bp配列のアラインメント。変化しているヌクレオチドのみを示した。ピリオドは株MU94133と同一であることを示している。図30B：六個のMU株に存在した、七連続pMUMタンパク質をコードする遺伝子座から得られた2208bp配列のアラインメント。図30C：1266bp配列の比較から推測した、十個のMU株間の系統学的関係を表す近接結合樹。図30D：2208bp配列の比較から推測した、六個のMU株間の系統学的関係を表す近接結合樹。図30E：十八個のMU分離株と二十二個のM. marinum分離株間について以前行われた、七種類の染色体コード化タンパク質をコードする遺伝子座に関する配列分析によって示された(28)、六種類のMUと五種類のM. marinum遺伝子型の間の系統学的関係を表す近接結合樹。図30F：この遺伝子が陽性であった五個のMU株間の、MUP053の348bp領域の推定aa配列のクラスターWアラインメント。
【図３１】アフリカ株MUAgy99（図31A）および中国株MU98912（図31B）由来のマイコラクトンＡ（Z-Δ4',5'）およびＢ（E-Δ4',5'）の構造。
【図３２】m/z 765（MUAgy99由来）およびm/z 779、777および761（MU98912由来）のマイコラクトン前駆体イオンのMS/MSスペクトル。
【図３３】MUAgy99由来の断片イオンC、DおよびE、ならびにMU98912由来の対応する断片イオンについて提案されている構造。
【図３４】PCRに用いたオリゴヌクレオチドの位置、ならびにMU98912株のPCR産物のDNA配列をMUAgy99株と比較することによって特異的に同定された、変更されたAT7ドメイン基質を示す、MUAgy99のMlsB内にある伸長モジュール6および7の、ならびにMU98912のモジュール7のドメイン構造概略図。
【図３５】MUAgy99のAT6およびAT7ドメインとMU98912のAT7ドメインとの間のアミノ酸配列比較濃いグレーの陰を付けた領域は、ATドメインを示す。ボックス内の配列は、AT基質特異性にとって重要であることが知られている残基である。明るいグレーの陰は、DHドメインの開始点を示す。
【図３６】ベクター領域のクローニングサイト内の、AT-KRに及ぶBamHI-EcoRV断片の概略図。
【図３７】コンビナトリアルポリケチドライブラリーの大腸菌での発現を支える修飾コスミッドベクターの概略図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図６−１８】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−９】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−４】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−４】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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