(57)【要約】標的配列に相補的な配列エレメントを含み、かつタギング配列としての役割を果たす配列エレメントを含む、プライマーの1セットを用いるPCR反応を行うための方法。異なる温度における増幅反応を実施することにより、以前の反応の増幅産物から生じる混入（contamination）の存在を決定することができ、反応の信頼性を改善し、かつ対照反応および反応再現の必要性を軽減することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、核酸配列を増幅するための方法：
・該核酸配列上の配列エレメントに相補的であり該核酸配列にハイブリダイズする相補的配列エレメントBを含み、かつ該核酸配列に相補的ではなく該相補的プライマー配列エレメントの上流に位置する配列エレメントAを含み、それぞれBエレメントならびにAおよびBエレメント合一のそれぞれの相補的DNA配列におけるアニーリング温度の間の差が5℃よりも大きい、順方向プライマーを選択する段階、および
・順方向プライマーとは異なる該核酸配列上の下流の配列エレメントに逆相補的であり該核酸配列の相補鎖にハイブリダイズする相補的配列エレメントBを含み、かつ該核酸配列に相補的ではなく該相補的プライマー配列エレメントの上流に位置する配列エレメントAを含み、それぞれBエレメントならびにAおよびBエレメント合一のそれぞれの相補的DNA配列におけるアニーリング温度の間の差が5℃よりも大きい、逆方向プライマーを選択する段階、および
・1つまたはいくつかのアニーリング段階、その後の1つまたはいくつかの重合段階を含み、順方向および逆方向プライマーは、熱安定性DNAポリメラーゼ、バッファー、デオキシリボヌクレオチド、およびポリメラーゼ連鎖反応において一般的に使用されるすべての成分の存在下で増幅されるDNAと接触させ、アニーリング段階のアニーリング温度は、AおよびB配列がその相補的DNA配列にアニールしかつ安定二重らせん構造を形成すると思われるがB配列エレメント単独ではその相補的配列にアニールせずかつ安定二重らせん構造を形成しないと思われるアニーリング温度で選択される、混入（contamination）検出反応を実施する段階、および
・1つまたはいくつかのアニーリング段階、その後の1つまたはいくつかの重合段階を含み、順方向および逆方向プライマーは、熱安定性DNAポリメラーゼ、バッファー、デオキシヌクレオチド、およびポリメラーゼ連鎖反応において一般的に使用されるすべての成分の存在下で増幅されるDNAと接触させ、アニーリング段階のアニーリング温度は、B配列エレメント単独がその相補的配列にアニールしかつ安定二重らせん構造を形成すると思われるアニーリング温度で選択される、標的増幅反応を実施する段階、および
・混入検出反応の後の増幅産物の非存在または存在それぞれによって、同様のプライマーを用いての以前のポリメラーゼ連鎖増幅反応に由来するアンプリコンによる混入の非存在または存在を決定する段階。
【請求項２】
プライマーがオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
混入検出反応が標的増幅反応に先行して実施され、かつ両方の反応が同じ容器における配列において実施される、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
混入検出反応が標的増幅反応に並行して（と同時に）実施され、かつ/または増幅前の標的DNAの存在量が決定される、請求項1または2記載の方法。
【請求項５】
エレメントBにおける相補的配列が、標的核酸配列における配列エレメントに少なくとも70％相補的である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
エレメントBにおける相補的配列が、核酸配列における配列エレメントに完全に相補的である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
逆方向プライマーを使用する代わりに、エレメントBを含むがエレメントAを含まない、核酸配列上の配列エレメントに相補的な、逆方向プライマーが使用され、混入検出反応および標的増幅反応の両方において、逆方向プライマーがその相補的配列にアニールしかつ安定二重らせん構造を形成する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
混入検出反応において、任意でAエレメントに相補的である付加的なプライマー対が使用される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
請求項1記載のプライマーがラベルで標識され、任意で請求項8記載のプライマーが別の（異なる）ラベルで標識される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも1つのAエレメントが、正常なヌクレオチドよりも高い自由結合エネルギーを有する改変ヌクレオチド（PNAまたはLNAなど）を含み、かつ/または混入検出反応混合物が、少なくとも1つのAエレメントに結合するDNA配列特異的もしくは非特異的結合分子を含み、それによって、プライマーのアニーリング温度を上昇させ、かつ/または少なくとも1つのAエレメントが、標的増幅反応のアニーリング温度においてヘアピンを形成するが、混入検出反応の（より高い）アニーリング温度においてはヘアピンを形成しない配列を有する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
標的増幅反応において増幅される配列が
発現される、および/または
ベクターに取り込まれ、任意で複製され、次いで任意で発現される、および/または
シークエンスされる、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記請求項のいずれか一項記載の順方向および逆方向プライマーを含み、任意で、熱安定性DNAポリメラーゼおよび/またはバッファーおよび/またはデオキシリボヌクレオチドおよび/またはサーマルサイクラーおよび/または増幅が行われる前の標的DNAの存在量を定量するための手段も含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法を実行するためのキット。
【請求項１３】
請求項1、2、5、6、7、または10のいずれか一項記載の方法を実行するために使用することのできるPCRプライマーを提供する方法であって、該請求項に記載の順方向および逆方向プライマーを合成する段階を含む方法。
【請求項１４】
混入検出反応および/または標的増幅反応が生じる液体を含むことがそれぞれ可能で、PCRが生じるのに必要とされる様式で液体の温度を変えることが可能な1つまたは複数のチャンバーを含み、混入検出反応のアニーリング温度が標的増幅反応に対するアニーリング温度よりも高い、前記請求項のいずれか一項記載の方法を実行するためのマイクロフルイディクスPCRデバイス。
【請求項１５】
チャンバーにおいてPCR反応が生じることを可能にするために温度を変えることのできる2つの別々のチャンバーを含み、第一のチャンバーにおいては混入検出反応が生じ、第二のチャンバーにおいては標的増幅反応が生じる、請求項14記載のデバイス。
【請求項１６】
液体がデバイスの異なる区域に流れるようにデバイスを配置し、各々の区域は異なる温度であり、それによってPCR反応が生じるのに必要とされる様式で液体の温度を変える、PCR反応が生じる液体が流れる流路を含むチャンバーを含む請求項14記載のデバイス。
【請求項１７】
請求項1、2、5、6、7、または10のいずれか一項記載の順方向および逆方向プライマー、熱安定性DNAポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオチドを含むPCR反応混合物を、各々のチャンバーに含む、請求項14〜16のいずれか一項記載のデバイス。
【請求項１８】
2つ以上の異なるロケーションにおいて、各々のロケーションにおいて異なるAエレメントを有するプライマーを使用して前記請求項のいずれか一項記載の方法が実行される場合の、PCR混入の源を検出する方法であって、どのAエレメント配列がPCR混入に存在するのかを決定する段階を含み、それによってPCR混入がどのロケーションに由来するのかを決定する、方法。
【請求項１９】
2つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、各々のオリゴヌクレオチドは、請求項18記載の異なるAエレメントにハイブリダイズすることが可能であり、それによってPCR混入におけるAエレメントの存在を検出する、請求項18記載の方法を実行するためのキット。
【請求項２０】
異なるAエレメントの同一性または配列に関係する情報および各々のAエレメントが使用されているロケーションに関係する情報を含むデータベース。
【請求項２１】
以下の段階を含む、アンプリコン混入の源を決定するための方法：
（i）請求項18に記載されるように任意で得られている、1つまたは複数のAエレメントのデータを入力する段階；
（ii）データを、異なるAエレメントの同一性または配列に関係する情報および各々のAエレメントが使用されているロケーションに関係する情報を含むコンピューターデータベースと比較する段階；および
（iii）比較に基づいて、アンプリコン混入の源を決定する段階。
【請求項２２】
コンピューター上で実行される場合、請求項21記載のすべての段階を行うためのプログラムコード手段を含む、コンピュータープログラム。
【請求項２３】
コンピューター上で実行される場合、請求項21記載の方法を行うためのコンピューター可読媒体に保存されたプログラムコード手段を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２４】
コンピューターシステム上で遂行されると請求項21記載の方法を行うためにコンピューターシステムを指示するプログラムコード手段を搬送波に含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２５】
（i）請求項18に記載されるように任意で得られている、1つまたは複数のAエレメントのデータを受け取るための手段；
（ii）データを、異なるAエレメントの同一性または配列に関係する情報および各々のAエレメントが使用されているロケーションに関係する情報を含むデータベースと比較するためのモジュール；および
（iii）該比較に基づいて、アンプリコン混入の源を決定するための手段
を含む、請求項21記載の方法を行うために配置されるコンピューターシステム。
【請求項２６】
PCR混入を検出するための、1つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応における、請求項1、2、5、6、または10記載の少なくとも1つの順方向プライマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分子診断的方法の分野、具体的にはポリメラーゼ連鎖反応を使用する方法に関連する。より具体的には、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応におけるアンプリコン混入（amplicon contamination）の存在を検出するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、選択的にDNAを増幅する方法である。方法は、DNAの逆鎖にハイブリダイズし、増幅される配列のリミットを定義する、オリゴヌクレオチドの対のセットを使用する。オリゴヌクレオチドは、熱安定性DNAポリメラーゼによって触媒されるDNA合成の複数の連続ラウンドをプライムする。合成の各々のラウンドは、融解および再アニーリング段階によって正常に先行される。方法は、事実上任意のDNA配列を迅速に増幅し得る（Saiki et al., Science 239:487, 1988 (非特許文献1)）。
【０００３】
PCRは、個々の生物体におけるユニーク配列の遺伝的同定に対して広く使用される。使用は、以下を含む：法医学的分析（Gill, (2002) Biotechniques 32, 366-372 (非特許文献2)）、遺伝的障害および疾患感受性、腫瘍性疾患の診断（Raj, (1998) Cancer 82, 1419-1442 (非特許文献3)）、感染性疾患の検出（Daxboeck (2003) Clinical Microbiology and Infection 9, 263-273 (非特許文献4)）および食品検査（Malorne (2003) International Journal of Food Microbiology 83, 39-48 (非特許文献5)）。対象となるDNAは、典型的には、ゲノムDNA、ウィルスDNAから、またはRNAから逆転写されるcDNAから増幅される。
【０００４】
その他のアッセイと共通して、PCRは、「偽陰性」および「偽陽性」結果の両方を生じやすい。偽陰性結果は、反応の失敗による。偽陽性結果は、プライマーが真の認識配列以外の配列にアニールして偽性産物の増幅をもたらすことによって、またはプライマーが、診断される試料以外の源に由来する混入DNAに存在する真の認識配列にアニールすることによって、引き起こされ得る。診断される試料に含まれる真の認識配列は、以下では「標的」と呼ばれるだろう。混入DNAに含まれる真の認識配列は、標的DNAとして分類されない。
【０００５】
偽陽性を引き起こす混入DNAの最も頻繁でかつ有力な源は、使用されているプライマーの認識配列と同一の認識配列をもつ、以前に増幅されたPCR産物（アンプリコンと呼ばれる）である（Rolfs et al., (1992) PCR: clinical diagnostics and research. Springer-Verlag, Berlin (非特許文献6)）。混入の確率は、診断的PCRが1つのDNA配列に対して何回も実行される場合に、およびPCR技術が少数のDNAの分子を検出するようにデザインされている場合に、増加する。以前のPCR産物による混入は、それをその他の源に由来するDNAによる混入から区別するために、「キャリーオーバー」と呼ばれる。
【０００６】
増幅前試薬または試料とのアンプリコンの任意の接触を避けることを目的とした良好な実験の実習およびプロトコールを厳守しても、アンプリコン混入による偽陽性の非存在を保証できない。結果として、診断的または法医学的PCRアッセイのコストのかなりの部分は、混入のわずかな兆候が見出される場合に、比較的多数の陰性対照を含む必要性および複数のアッセイを繰り返す必要性によって引き起こされる。
【０００７】
したがって、任意の反応においてアンプリコン混入の非存在を個々に確実にするための方法は、非常に望ましい。
【０００８】
アンプリコン混入によってもたらされる一般的な問題を解決するために、2つのアプローチが想定され得る：アンプリコンが、任意のその後の反応に混入するのを避けるために、その検出の後で崩壊され得る、またはアンプリコン混入ではなくてDNAから生じる増幅産物を識別するために、方法が見出されなければならない。前者のアイデアは、dUTP取り込みおよびその後のウラシル-N-グリコシラーゼによるアンプリコンの破壊の方法において実施されており（欧州特許第0401037号 (特許文献1) および本明細書において含まれる参照；Longo et al. (1990), Gene 93, 125-128 (非特許文献7) を参照されたい）、今日、広く採用されている方法である。同様の原理に従うその他の方法が、考案されている（Cimino et al. (1991), Nucleic Acids Research 19, 773-774 (非特許文献8); Walder et al. (1993), Nucleic Acids Research 21, 4339-434 (非特許文献9)）。
【０００９】
Richards（米国特許第5650302号 (特許文献2)）は、増幅に先行して相当するヌクレアーゼで分解を行う際に、アンプリコン混入物質を増幅不可能にするために、制限酵素認識部位をプライマーに取り込む方法を開示する。
【００１０】
その存在または量の決定の後のアンプリコンの破壊は、後工程での混入の可能性を軽減すると思われるが、アンプリコン破壊そのものは、起こり得る失敗が生じやすいプロセスなので、アンプリコン混入による偽陽性結果を積極的に除外することはできない。
【００１１】
Shuber（米国特許第6,207,372号 (特許文献3)）は、複数二重鎖プライマーPCR法を開示し、様々なプライマー対の5'末端におけるユニバーサルプライマー配列が、複数の標的に対する均一な増幅条件を可能にする。
【００１２】
Shuldiner（国際公開公報第9115601号 (特許文献4)）は、第一段階がRNA鋳型上のDNAプライマーの伸張であるRT-PCR反応が、起こり得るDNA混入物質配列のバックグラウンド上で、より具体的になり得る方法を開示する。この方法は、2つのプライマーを採用し、そのうちの1つは、標的RNA特異的配列トラクト（tract）およびタギングトラクトを含むハイブリッド配列である。識別は、DNA-DNA対RNA-DNA二重鎖の異なるハイブリダイゼーション温度に基づいて、標的RNAと起こり得る混入ゲノムまたは混入プラスミドDNAとの間で達成される。RNA-DNA二重鎖はより安定であり、故にDNA-DNA二重鎖よりも高い融解またはアニーリング温度を有するので、反応温度は、標的特異的プライマー部分がRNA標的にのみアニールするように、選択され得る。ハイブリッドプライマーから生成されるこの第一のDNA転写のその後の複製は、ハイブリッドプライマーがすべてのその後の増幅段階において高い温度でアニールすると思われる相補的タギング配列を伴ってその3'末端で伸張されるDNA鎖をもたらすと思われる。これは、国際公開公報第9115601号 (特許文献4) において開示される方法が、ゲノムDNA混入からの増幅を排除するための有用なツールであり得るが、同じプライマーセットを使用する以前の反応において産生されたDNAアンプリコンを識別できない、または増幅されることから排除することができないことを意味する。
【００１３】
混入の発生を軽減するための任意の努力に並行して、試料内の標的配列から生じる増幅産物（真の陽性結果）とアンプリコン混入から生じる偽陽性結果とを見分けることができることが望ましい。
【００１４】
Shuber（国際公開公報第9920798号 (特許文献5)）は、2つの異なる増幅反応における2つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーセットの使用に依拠する、アンプリコン配列による混入を検出する方法を開示した。プライマーの5'末端に付加される、標的検出配列および混入検出配列を含むプライマーの第一セットが、オリジナルの試料における標的配列の存在を検出するために採用され、「第一増幅反応」と呼ばれる反応である。第二反応混合物において、以前の反応において産生されたアンプリコン分子による試料の混入を検出するために、混入検出配列のみを含むプライマーの第二セットが、オリジナルの試料上で使用される。
【００１５】
国際公開公報第9920798号 (特許文献5) において開示される方法は、オリジナルの試料におけるアンプリコン混入の検出を達成するが、しかしながら、「第一」（国際公開公報第9920798号 (特許文献5) の用語に従って）増幅反応に特異的であり得る、任意の段階におけるアンプリコン混入の存在を積極的に除外しない。1つの例として、その2つの反応が、採用されるプライマーの点で異なり、したがって、第一反応に対するオリゴヌクレオチドプライマーを含む溶液中の任意のアンプリコン混入は、検出されないと考えられる。
【００１６】
改善され得る国際公開公報第9920798号 (特許文献5) の開示の別の局面は、2つの反応容器の使用である。いくつかの例において耐えられるが、反応調製および試薬に対する時間および材料における費用の倍増は、偽陽性を軽減することからの節約における利点を相殺し得る。したがって、2つの別々の反応を実施しなければならないという費用なしに、真および偽陽性の識別を可能にする方法が、非常に望ましいと考えられる。
【００１７】
【特許文献１】欧州特許第0401037号
【特許文献２】米国特許第5,650,302号
【特許文献３】米国特許第6,207,372号
【特許文献４】国際公開公報第9115601号
【特許文献５】国際公開公報第9920798号
【非特許文献１】Saiki et al. (1988) Science 239:487
【非特許文献２】Gill (2002) Biotechniques 32, 366-372
【非特許文献３】Raj (1998) Cancer 82, 1419-1442
【非特許文献４】Daxboeck (2003) Clinical Microbiology and Infection 9, 263-273
【非特許文献５】Malorne (2003) International Journal of Food Microbiology 83, 39-48
【非特許文献６】Rolfs et al. (1992) PCR: clinical diagnostics and research. Springer-Verlag, Berlin
【非特許文献７】Longo et al. (1990) Gene 93, 125-128
【非特許文献８】Cimino et al. (1991) Nucleic Acids Research 19, 773-774
【非特許文献９】Walder et al. (1993) Nucleic Acids Research 21, 4339-434
【発明の開示】
【００１８】
発明の概要
当技術の状態を考慮して、試料に含まれる標的配列から生じる増幅シグナル（真の陽性）と以前の増幅反応において産生されたアンプリコン産物による混入から生じる増幅シグナルとを識別すると思われる増幅反応を可能にするために、方法および適したオリゴヌクレオチドプライマーを提供することが、本発明の目的である。
【００１９】
従って、本発明は、核酸配列を増幅する方法を提供し、方法は以下の段階を含む：
・該核酸配列上の配列エレメントに相補的であり該核酸配列にハイブリダイズする相補的配列エレメントBを含み、かつ該核酸配列に相補的ではなく該相補的プライマー配列エレメントの上流に位置する配列エレメントAを含み、それぞれBエレメントならびにAおよびBエレメント合一のそれぞれの相補的DNA配列におけるアニーリング温度の間の差が5℃よりも大きい、順方向プライマーを選択する段階、および
・典型的には、順方向プライマーとは異なる該核酸配列上の下流の配列エレメントに逆相補的であり該核酸配列の相補鎖にハイブリダイズする相補的配列エレメントBを含み、かつ該核酸配列に相補的ではなく該相補的プライマー配列エレメントの上流に位置する配列エレメントAを含み、BエレメントならびにそれぞれAおよびBエレメント合一のそれぞれの相補的DNA配列におけるアニーリング温度の間の差が5℃よりも大きい、逆方向プライマーを選択する段階、および
・1つまたはいくつかのアニーリング段階、その後の1つまたはいくつかの重合段階を含み、順方向および逆方向プライマーは、熱安定性DNAポリメラーゼ、バッファー、およびデオキシリボヌクレオチドの存在下で増幅されるDNAと接触させ、アニーリング段階のアニーリング温度は、AおよびB配列がその相補的DNA配列にアニールしかつ安定二重らせん構造を形成すると思われるがB配列エレメント単独ではその相補的配列にアニールせずかつ安定二重らせん構造を形成しないと思われるアニーリング温度で選択される、反応の混入検出フェーズを実施する段階、および
・1つまたはいくつかのアニーリング段階、その後の1つまたはいくつかの重合段階を含み、順方向および逆方向プライマーは、熱安定性DNAポリメラーゼ、バッファー、およびデオキシヌクレオチドの存在下で増幅されるDNAと接触させ、アニーリング段階のアニーリング温度は、B配列エレメント単独がその相補的配列にアニールしかつ安定二重らせん構造を形成すると思われるアニーリング温度で選択される、反応の標的増幅フェーズを実施する段階、および
反応の混入検出フェーズの後の増幅産物の非存在または存在それぞれによって、同様のプライマーを用いての以前のポリメラーゼ連鎖増幅反応に由来するアンプリコンによる混入の非存在または存在を決定する段階。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明に従って、PCR反応は、標的配列の増幅のための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを使用して行われ、両方のプライマーは、それらの3'末端に標的特異的配列エレメントB、およびそれらの5'末端に非標的特異的アンプリコン特異的タグ配列Aを含む。全プライマー配列は、以前の反応におけるこれらのプライマーの使用に起因するすべてのアンプリコン産物に含まれ、かつハイブリダイズすると思われるが、標的特異的3'配列トラクトのみが、オリジナルの試料標的配列に含まれ、かつハイブリダイズすると思われる。
【００２１】
ハイブリダイゼーション可能な配列トラクトの長さにおける差により、プライマーは、アンプリコン混入および真の試料標的におけるアニーリング温度の点で異なると思われ、後者のアニーリング温度が実質的にはより低い。本発明に従って、上に定義されるようなAおよびB配列エレメントを含むプライマー対は、PCR反応において普通に存在するすべてのその他の成分、最も顕著なのは耐熱性ポリメラーゼ、反応バッファー、およびデオキシリボヌクレオチドと一緒に、試料上で使用される。次いで、PCR反応は、ABプライマーが以前のPCR産物（アンプリコン）による混入にのみアニールすると思われる高い温度において数サイクル実施され、かつライマーのB配列が試料に含まれる標的配列にアニールし得るより低い温度において数サイクル実施される。
【００２２】
本発明の方法は、任意の適したPCR機（サーマルサイクラー）を使用して行われ得る。方法を行うために使用される装置は、反応の混入検出フェーズおよび/または反応の標的増幅フェーズにおける増幅産物の産生をモニターすることが可能であってもよい。増幅産物の検出は、任意の適した手段によってなされ得るが、好ましくは、蛍光によってなされる。方法の際は、1回または複数回の検出を実行することができ、一般に、反応の混入検出フェーズの後に少なくとも1回の検出、および反応の標的増幅フェーズの後に1回の検出が、実行される。
【００２３】
本発明の方法は、好ましくは、反応中、産物が蛍光によって検出され得るように、リアルタイムPCR機において行われる。例えば、第一の30サイクルは、72℃のアニーリング温度において行われ、サイクルの第二のセットは<58℃において行われる。一般に、少なくとも10サイクル、例えば少なくとも15、20、25、またはそれ以上のサイクルが、より低いアニーリング温度において行われ、一般に少なくとも15、20、25、またはそれ以上のサイクルが、より高い温度において行われる。
【００２４】
PCR反応ミックスに、以前にタグ付けされたアンプリコンが混入している場合は、72℃のアニーリング温度における第一の30サイクルの後に産物が獲得される。
【００２５】
好ましい態様において、本発明の方法は、PCRに対する最適なプライマー構造の利用、および最初により高い、次いでより低いアニーリング温度において行われる単一のPCR増幅反応を含む。従って、非常に好ましい態様において、方法は、標的DNAに対する実質的な配列類似性を有し、かつ標的DNAに相補的な3'B領域、および標的DNAとは関係なく、標的DNAに非相補的な5'A領域またはタグを有する2つのキメラプライマーを使用する。プライマーは、標的DNAの増幅が、より低いアニーリング温度において生じるが、より高いアニーリング温度においては生じず、一方で、より低いアニーリング温度において生成される産物は、より高いアニーリング温度において増幅されるようにデザインされる。次いで、PCR増幅は、最初はより高い、次いでより低いアニーリング温度において、単一の密閉反応容器において行われる。より高いおよびより低いアニーリング温度が、少なくとも5℃、例えば少なくとも8、10、12℃またはそれ以上異なることが好ましい。
【００２６】
より高いアニーリング温度における増幅は、典型的には、より低いアニーリング温度における増幅の前に行われるので、高温アニーリング増幅後の産物の存在は、以前増幅された産物がPCRに混入していたことを示し（キャリーオーバー混入）、結果は放棄されるべきである。高温アニーリング増幅後の増幅された産物の欠如は、以前増幅された産物がPCRに混入していなかったことを示す。高温アニーリングサイクルではなく低温アニーリングの後のPCR産物の存在は、キャリーオーバー混入によるものではいない、試料に対する陽性結果を示す。
【００２７】
標的DNAに非相補的な5'Aまたはタグ領域は、ストリンジェントな条件下（特異的相補的塩基対によってDNA配列の実質的な長さに結合しているものを除く、すべてのプライマーDNAを除去する条件）では、所与の標的DNA配列にハイブリダイズしない、（長さに関係なく）任意の配列であり得る。
【００２８】
好ましい態様の変形としては、1つのキメラプライマーおよびその全長にわたって標的DNAに完全に相補的な１つの非キメラプライマーが使用される。前述のように、キメラプライマーは、3'B領域と標的DNA上のその相補体との間のハイブリッドの融解温度が、全長キメラプライマーとその相補体との間のハイブリッドの融解温度よりも低いようにデザインされる。非キメラプライマーは、キメラプライマーの3'B領域とその相補体との間のハイブリッドの融解温度よりも高い（好ましくは、5℃またはそれ以上の量）、それ自身と標的DNA上のその相補体との間の融解温度を有する。多数のサイクルに対するプライマーを伴う増幅は、最初により高い、次いでより低いアニーリング温度で行われる。
【００２９】
好ましい態様のさらなる変形としては、2つのキメラプライマーおよびキメラプライマーの5'A領域またはタグに相補的な2つの付加的なプライマーが使用される。キメラプライマーは、標的DNAに対する実質的な配列類似性を有し標的DNAに相補的な3'B領域と、標的DNAとは関係なく標的DNAに非相補的な5'A領域（またはタグ）とを含む。プライマーは、3'B領域と標的DNA上のその相補体との間のハイブリッドの融解温度が、5'A領域とその相補的配列との間のハイブリッドの融解温度よりも低い（好ましくは、5℃またはそれ以上の量）ようにデザインされる。4つのプライマーを用いる増幅は、最初により高い、次いでより低いアニーリング温度で行われ、2つのアニーリング温度の間の差は、5℃に等しいか5℃よりも大きい。より低いアニーリング温度において、プライマーの標的DNA特異的3'A領域と標的DNA配列との間のハイブリダイゼーションは、増幅産物を生成する。この反応の産物は、非相補的5'Aタグを含む全長キメラプライマー（AB）を取り込む。より高いアニーリング温度において、2つのキメラプライマーおよびキメラプライマーの5'A領域に相補的な2つのプライマーのハイブリダイゼーションならびに結果として生じるDNA増幅は、キメラプライマーを取り込む以前に形成された産物が存在する場合にのみ生じると思われる。より高いアニーリング温度における増幅は、より低いアニーリング温度における増幅の前に行われるので、高温アニーリング増幅サイクルの後の産物の存在は、以前増幅された産物がPCRに混入していたことを示す（キャリーオーバー混入）。
【００３０】
好ましい態様のさらなる変形としては、2つのキメラプライマーおよびキメラプライマーの1つの5'A領域に相補的な1つの付加的なプライマーが使用される。キメラプライマーは、標的DNAに対する実質的な配列類似性を有し標的DNAに相補的な3'B領域と、標的DNAとは関係なく標的DNAに非相補的な5'A領域（またはタグ）とを含む。1つのキメラプライマーは、3'B領域と標的DNA上のその相補体との間のハイブリッドの融解温度が、5'A領域とその相補的配列との間のハイブリッドの融解温度よりも5℃低いまたは5℃よりも低いようにデザインされる。もう一方のキメラプライマーは、3'B領域と標的DNA上のその相補体との間のハイブリッドの融解温度が、全長キメラプライマーとその相補体との間のハイブリッドの融解温度よりも5℃低いまたは5℃よりも低いようにデザインされる。3つのプライマーを用いる増幅は、最初により高い、次いでより低いアニーリング温度で行われ、2つのアニーリング温度の間の差は、5℃に等しいか5℃よりも大きい。産物形成の反応および解釈は、先行する代替物において述べられる1つに類似する。
【００３１】
前述の態様の各々において、異なるアニーリング温度におけるサイクルの数は、変化してもよく、個々のアッセイに対する最適化を必要とすると思われる。例えば、より低いアニーリング温度における25サイクルが後に続く、より高いアニーリング温度における数増幅サイクルは、真の陽性とキャリーオーバー混入による偽陽性との間の識別を可能にし得る。
【００３２】
標的DNAの最大濃度およびリアルタイムPCRによってそれを観察するために必要なPCRサイクルの最小数（例えば、15）が公知の場合、より高い温度における増幅サイクルは、より低い温度の増幅が開始するポイントまで行われ得ると考えられ、産物がより少ないサイクル（例えばこの場合、10サイクル）の後に観察される場合、これはアンプリコン混入によるのみである可能性があると考えられる。
【００３３】
プライマーアニーリング温度ならびに高および低温サイクルの数の両方は、個々のアッセイに対する最適化を必要とすると思われる。2つより多い異なるアニーリング温度が、所与の反応において使用され得る。一般に、単一の高アニーリング温度および単一の低アニーリング温度が使用されると思われるが、異なる高アニーリング温度および異なる低アニーリング温度が使用される方法が、本発明に含まれる。
【００３４】
本発明の方法は、典型的にはストリンジェントな条件下（例えば、約50℃〜約60℃における、0.03M塩化ナトリウムおよび0.003Mクエン酸ナトリウムなどの条件）では所与の標的DNA配列にハイブリダイズしない、（長さに関係なく）任意の配列であり得る、標的DNAに非相補的な5'A領域またはタグを有するPCRプライマーを含む。
【００３５】
プライマーの3'B領域は、ストリンジェントな条件下（前述のストリンジェントな条件など）で標的DNAにハイブリダイズしなければならないが、標的配列に対して完全に適合する必要はない。キメラ順方向および逆方向プライマーの5'A非相補的領域は、同一であってもまたは異なっていてもよい。
【００３６】
好ましい態様において、増幅反応は、逆転写酵素PCRまたはqPCR（定量的PCR）またはマイクロチップ使用（chip based）PCR（下記を参照されたい）のいずれかのPCRである。増幅される核酸（DNAなど）を含む試料は、生物学的物質を含む任意の源に由来し得る。方法は、適切にデザインされたタグが、複数のDNA標的の増幅を正常化するのに役立ち得るので（米国特許第6207372号）、マルチプレックスPCRとの関連で特に有用であり得る。
【００３７】
別の好ましい態様において、本発明に従う方法は、低温および高温反応を同時に実施しながら行われる。従来のPCR機は、1つの温度が反応容器に対して任意の1回において選択されることを可能にするだけなので、反応は、2つの異なる容器において行われなければならないと考えられ、それは本発明の1つの起こり得る態様である。マイクロチップ使用マイクロフルイディクス技術の到来により、同じ試料上の同じPCR反応ミックスからの2つの反応を、2つの異なる温度において同時に実施することを可能にする、反応チャンバーをデザインすることが可能であると考えられる。
【００３８】
従来のハイスループットPCRにおいて、散発的なキャリーオーバー混入を検出する可能性は、含まれる陰性対照の割合に依存する。本発明の方法において、すべての試料は、キャリーオーバー混入に対する陰性対照として作用する。それ故に、本発明は、キャリーオーバー混入の頻度をモニターすることを可能にし、そのような混入を軽減するために取られる適切な改善措置を可能にすると思われる。本発明は、PCRのどの構成要素に以前のアンプリコンが混入しているのかという手軽な同定をも可能にすると思われる。
【００３９】
本発明は、非限定的に以下を含むその他のPCR技術と互換性がある：ネストPCR、マルチプレックスPCR、ホットスタートPCR、タッチダウンPCR、擬似鋳型（mimic templates）、dUTP/UNG、分子ビーコン/LUX蛍光性プライマー、PCRのためのマイクロフルイディクスマイクロチップ使用デバイス、およびELISA PCR。さらに、アンプリコン混入を制御するためのその他の方法と異なり、本発明は、G＋C含有量またはアンプリコンの長さに関わらず、効果的に機能し、クローニングまたはシークエンシングなどの後工程の応用と互換性がないような手法ではDNAを改変しない。
【００４０】
付加的な態様は、5'Aタグ領域にハイブリダイズする、または3'B領域および標的DNAに適合するある配列を含むプライマーを使用する。
【００４１】
本発明において使用されるプライマーは、当業者に周知の手段によって化学的に改変され得ると考えられ、非限定的に以下の手段を含む（i）フルオロフォア、ビオチン、酵素、消光剤、ジゴキシゲニン、マイナーグルーブバインダーなどのタンパク質などの、ラベルまたはその他の部分への結合、（ii）非標準的DNA塩基、例えば、3'末端リボース残基またはdUTPなどの導入。プライマーは、制限酵素部位またはT7プロモーターなどのプロモーターを（好ましくはAエレメント配列内に）含み得る。
【００４２】
好ましい態様において、方法において使用されるプライマーは、自己相補性および/または反応混合物に存在する任意のその他のプライマーに対する相補性を欠く。
【００４３】
試料および標的
本発明は、特定の標的DNA分子（既定の標的であり得る）を含み得る任意の試料、特に生物医学的試料を伴う使用に適している。方法が行われる試料は、50より少ないまたは20より少ないなどの、100より少ない増幅されるDNAのコピー（すなわち、非アンプリコンDNA）を含み得る。
【００４４】
本発明の方法は、非限定的に、遺伝性疾患、感染性疾患、および例えば癌検出のための臨床的アッセイに対する、ハイスループットの応用および診断的キットに特に適している。したがって、方法は、感染性因子の検出、遺伝的スクリーニング、科学捜査、親子鑑定、食品安全性、農業診断、および獣医学において使用され得る。
【００４５】
方法が行われる試料は、典型的には、ウィルス、真核生物、原核生物、植物、動物、鳥、哺乳類、またはヒトなどの生物体（例えば、疾患原因生物体）に由来する。試料は、典型的には、体液または生物体の一部を含む。試料は、血液、尿、唾液、骨、精液、皮膚、頬細胞、または毛根試料であり得る。試料は、食品試料であり得る。試料は、典型的には、方法が実行される前に処理され、例えば、DNA抽出が実行され得る。試料中のポリヌクレオチドは、（例えば、適した酵素を使用して）物理的にまたは化学的に切断され得る。
【００４６】
好ましい態様において、試料はヒトDNAを含み、かつ方法はヒト遺伝子を増幅するために使用される。
【００４７】
増幅される遺伝子は、BRCA（癌）、p53およびkRAS（多くのその他の癌）、またはH因子（加齢性黄斑変性）などの特定の疾患を、引き起こし得る、生じやすくし得る、またはそれらから守り得る。
【００４８】
1つの態様において、増幅が行われる前の標的核酸の存在量が、決定される。
【００４９】
方法は、以下の生物体に由来する遺伝子を増幅するために使用され得る（例えば、生物体の存在を検出する目的のために）：結核、髄膜炎菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、淋病、クラミジア、リステリア菌、マイコプラズマ、大腸菌（E.coli）157、カンピロバクター、HIV、HBV（B型肝炎ウィルス）、HCV（B型肝炎ウィルス）、HPV（ヒトパピローマウィルス）、パルボウィルスB19、SARS、またはインフルエンザ。
【００５０】
本発明の方法において使用される構成要素
本発明の方法は、PCR反応における構成要素の任意の適したセットを使用して行われ得る。したがって、例えば、任意の適した熱安定性DNAポリメラーゼが使用され得る。PCR反応混合物は、プライマーダイマー形成を軽減する化合物、特に熱安定性または耐性リーディングポリメラーゼなどの、増幅の精度またはレベルを高める試薬を含み得る。
【００５１】
1つの態様において、本発明は、本明細書において定義されるような順方向および逆方向プライマーを合成することを含む、本発明の方法における使用に適したプライマーを作成する方法も提供する。合成の任意の適した方法が使用され得る。
【００５２】
相補的配列
相補的配列の使用は、プライマーのエレメントB内など、本明細書において記載される。そのような場合、配列は、部分的にまたは完全に相補的であり得る。したがって、部分的相補的配列の場合、エレメントBの配列は、完全相補的配列のホモログである。配列は、典型的には、例えば、少なくとも15またはそれ以上の隣接ヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも70％相同性を有し、好ましくは少なくとも80、90％、95％、97％、または99％相同性を有する。相同性は、ヌクレオチド同一性（時には「ハード（hard）相同性」と呼ばれる）に基づいて計算され得る。
【００５３】
例えば、UWGCG Packageは、相同性を計算するために使用され得る（例えば、そのデフォルト設定上で使用される）BESTFITプログラムを提供する（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。PILEUPおよびBLASTアルゴリズムは、相同性を計算するまたは配列を並べるために使用され得る（例えばAltschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10において記載される、（典型的にはそれらのデフォルト設定上で）等価または対応配列を同定することなど）。
【００５４】
BLAST解析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を介して公的に利用できる。このアルゴリズムは、第一に、データベース配列における同じ長さのワードと整列させされる場合に、ある正値閾値スコアTに適合するまたはそれを満たす照会配列における長さWの短いワードを同定することによって、ハイスコア配列ペア（HSP）を同定することに関与する。Tは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al, 前記）。これらの初期の近隣ワードヒットは、それらを含むHSPを見出すための検索を開始するための種として作用する。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各々の配列に沿って両方の方向に拡張される。各々の方向におけるワードヒットに対する拡張は、以下の場合に停止される：累積アライメントスコアが、その最大達成値から量Xだけ低下する；累積スコアが、1つまたは複数の負スコア残基アライメントの蓄積によって、ゼロまたはそれ以下になる；または、両配列の端が到達される。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXは、アライメントの感度およびスピードを決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして、11のワード長（W）、BLOSUM62スコア行列（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919を参照されたい）50のアライメント（B）、10の期待値（E）、M=5、N=4、および両方の鎖の比較を使用する。
【００５５】
BLASTアルゴリズムは、2つの配列の間の類似性の統計的分析を行う；例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照されたい。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、2つのポリヌクレオチド配列の間の一致が偶然生じると考えられる確率の指標を提供する、最小和（smallest sum）確率（P(N)）である。例えば、第二の配列に対する第一の配列の比較において、最小和確率が約1よりも小さい場合、好ましくは約0.1よりも小さい場合、より好ましくは約0.01よりも小さい場合、および最も好ましくは約0.001よりも小さい場合、配列は、別の配列に類似していると考えられる。
【００５６】
相同配列は、典型的には、少なくとも1、2、3、4、5、6、またはそれ以上の置換（ミスマッチ）によって、完全相補的配列とは異なる。
【００５７】
PCRデバイス
本発明は、本発明の方法を実行するためにデザインされるPCRデバイスを提供する。したがって、デバイスは、PCR反応が生じる液体を適切な温度まで加熱することが可能であると思われ、PCR反応が異なるアニーリング温度を有することを可能にするように特にデザインされる。デバイスは、混入検出反応および/または標的増幅反応が生じる液体を含むことが各々可能な1つまたは複数のチャンバーを含むマイクロフルイディクスPCRデバイスであり、チャンバーは、PCRが生じるのに必要とされる様式で、液体の温度を変えることが可能である。
【００５８】
1つの態様において、デバイスは、PCR反応がチャンバーにおいて生じることを可能にするために、温度を独立に変えることのできる2つの別々のチャンバーを含み、第一のチャンバーにおいては、混入検出反応が生じ、第二のチャンバーにおいては、標的増幅反応が生じる。
【００５９】
1つの態様において、デバイスは、PCR反応が生じる液体が流れる流路を含むチャンバーを含み、デバイスは、液体がデバイスの異なる区域に流れるように配置され、各々の区域は異なる温度であり、それによってPCR反応が生じるのに必要とされる様式で、液体の温度を変える。
【００６０】
デバイスは、各々のチャンバーにおいてPCR反応混合物を含むことができ、PCR反応混合物は、本明細書において定義されるような順方向および逆方向プライマー、熱安定性DNAポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオチドを含む。
【００６１】
マイクロフルイディクスPCRデバイスは、当技術分野において公知であり、好ましい態様は、Liao et al (2005) Biosensors and Bioelectronics 20, 1341-48, Biotechniques (2004) 37:20-21, Anal. Chem. (2004) 76: 6434-6439、およびAnal. Chem. (2003) 75: 4591-4598において記載される。PCRデバイスは、加熱/センサー要素として統合薄膜プラチナ抵抗を有するガラス基質で作られ得る。典型的には、PCRデバイスは、微小電気機械システム（MEMS）技術を使用して作られる。好ましい態様において、マイクロヒーターおよび温度センサーが、反応チャンバー内に設置される。
【００６２】
PCRデバイスの制御システムは、プログラム可能なマイクロプロセッサーに基づいていてもよく、デバイスは、制御方法および電気的シグナルを測定するために必要とされる重大な電気的構成要素を伴って実施される、単一のマイクロチップを含み得る。したがって、デバイスは、本発明の方法を行うことを可能にするために、前述のような温度サイクルを実行するようにプログラムされ得る。
【００６３】
本発明の方法は、本明細書において記載される任意の適したPCRデバイス上で実行され得る。
【００６４】
PCR混入の源の検出
1つの局面において、本発明は、PCR混入の源を検出するために使用され得る方法を提供する。これは、例えば1 kmよりも遠く離れた、異なる実験室などの異なる場所（すなわち、異なる物理的なロケーション）において、PCR増幅が実行されている状況において使用され得る。異なる場所におけるPCR反応は、一般に、同じまたは類似した標的配列を増幅している。方法は、異なる場所におけるPCR反応が、本明細書において記載されるような順方向および逆方向プライマーを使用して実行されるが、各々の場所は、別の場所において使用されるものとは異なるAエレメントを有するプライマーを使用するという事実に基づいている。したがって、異なる場所で形成されるPCR産物は、それら独自のユニークなAエレメント配列を取り込むと思われ、別の場所において形成されるPCR産物から区別され得る。したがって、本発明は、上記のセクションにおいて定義されるような増幅の方法が各々のロケーションにおいて異なるAエレメントを伴うプライマーを使用して2つ以上の異なるロケーションにおいて実行される場合、PCR混入の源を検出する方法を提供し、該方法は、どのAエレメント配列がPCR混入に存在するのかを決定することを含み、それによってPCR混入がどのロケーションに由来するのかを決定する。
【００６５】
典型的には、PCR反応は、少なくとも2、5、10、20、50、またはそれ以上の場所で行われてもよく、したがって少なくとも2、5、10、20、50、またはそれ以上の異なるプライマーセットが使用され得ると考えられる。
【００６６】
Aエレメント配列の検出は、シークエンシング、特異的オリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションなどの任意の適した技術を使用して、またはPCRによって（例えば、特定のAエレメントの存在下でPCR反応が生じることを引き起こすプライマーを使用して）行われる。検出時は、一般にAエレメントは1本鎖型である。
【００６７】
本発明によって提供されるキット
本発明は、本明細書において定義されるような順方向および逆方向プライマーを含み、かつ任意で熱安定性DNAポリメラーゼおよび/またはバッファーおよび/またはデオキシリボヌクレオチドおよび/またはサーマルサイクラーも含む、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。本発明は、2つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、混入の源が決定されることを可能にする前述の方法を実行するためのキットも提供し、各々のオリゴヌクレオチドは、異なるAエレメント（異なるロケーションにおいて使用されているプライマーの異なるセットに相当する）にハイブリダイズすることが可能であり、それによってPCR混入におけるAエレメントの存在を検出する。キットは、少なくとも2、5、10、20、50、またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００６８】
キットは、以下の1つまたは複数を付加的に含み得る：エレメントAへのオリゴヌクレオチドの結合を検出する手段、検出可能なラベル（蛍光ラベルなど）、ポリヌクレオチドに作用することが可能な酵素（典型的には、ポリメラーゼ、制限酵素、リガーゼ、RNA分解酵素H、またはラベルをポリヌクレオチドに付着させ得る酵素）、PCR反応または酵素試薬に適したバッファー（水性溶液）、陽性および/または陰性対照、試料からDNAを単離する手段、生物体から試料を獲得する手段（綿棒または針を含む道具など）、ならびに検出反応が行われ得るウェルを含む基底材。
【００６９】
本発明は、以下の実施例によって説明される。
【００７０】
実施例1
1.0 材料
1.1. オリゴヌクレオチド
順方向（pET24 F）および逆方向（pET24 R）プライマーをMWG Biotech AGから購入した（標準的HPSF精製、0.01μMスケール）。プライマー配列を以下のF1に示し、関連特性を表1および表2にまとめる。Tm値およびプライマーに存在する相補的残基の数はhttp://www.operon.com/oligos/toolkitにおいて利用できるソフトウェアおよびRoche LightCycler Probe Designソフトウェア、バージョン2.0を使用して計算した。標的DNAに相補的な15塩基対（bp）領域のTmは、pET24 FおよびRプライマーに対して、それぞれ〜42.7℃および〜45.1℃と計算された。プライマーストックは100μMに希釈した。
【００７１】
F1
プライマーは、標的DNAに相補的ではない21bp 5'領域（下線部）および標的DNAに相補的な15bp 3'領域（非下線部）を有する。
2007537746.tif 000002
【００７２】
（表１）単一プライマーの特性
2007537746.tif 000003
【００７３】
（表２）プライマー対の特性
2007537746.tif 000004
【００７４】
1.2. 標的DNA
NovagenのpET 24d(+)と呼ばれる5307塩基対（bp）環状発現プラスミド（カタログ番号69752-3）を標的DNAとして使用した（〜5.87×10-18g/分子）。プラスミドのストック溶液は、2.37ng/μL（4.03×108分子/μL）の濃度で保存した（-70℃）。プライマーがアニールするプラスミドDNAの領域をF2に示す。
【００７５】
F2
順方向および逆方向プライマーを使用してPCRによって増幅される領域におけるpET 24d(+)のヌクレオチド配列。下線部の配列は、プライマーの最後の15塩基対に相補的である。順方向および逆方向プライマーは、イタリック体で示されるpET24d(+)マルチクローニング部位の両側にアニールする。pET 24d(+)ヌクレオチドのナンバリングは、図中の最初および最後の塩基に対して示される。
2007537746.tif 000005
【００７６】
1.3. アンプリコンDNA
アンプリコン（〜1.38×10-19g/分子）は、プライマー対pET F / pET R（以下を参照されたい）を用いて標的DNAに対して行われた最初のPCR反応に由来した。アンプリコンDNAの濃度は、260および280nm波長における分光分析によって決定し、PCR混合物から直接調製したストック溶液は、6.85ng/μL（4.96×1010分子/μL）の濃度に調節した。
【００７７】
1.4. PCRプレミックス
Bioline LtdのImmolase 2×プレミックス（カタログ番号BIO-25019）を使用した。プレミックスにおけるポリメラーゼは、7分間95℃においてインキュベートすることによって活性化される。
【００７８】
1.5 サーモサイクラー
PCRは、MJ DNA Engine(登録商標)（PTC-200(商標)）Peltier Thermal Cyclerを使用して行った。
【００７９】
2.0 方法
2.1. PCR混合物
25μLのPCR混合物は、以下を含んだ。
・12.5μL Immolase 2×プレミックス（酵素、dNTP、バッファーミックス）
・2μMのpET24 F（すなわち、100μMストックから0.5μL）
・2μMのpET24 R
【００８０】
アンプリコン/鋳型の添加の後、混合物には、ヌクレアーゼを含まない水を最終容量まで追加した。
【００８１】
2.1. サーモサイクリング条件
アンプリコンを獲得するための標的DNAの低アニーリング温度増幅（図3）に対するサイクリング条件は以下であった。
酵素活性化。以下の1サイクル：
95℃、7分
増幅。以下の28サイクル：
95℃、50秒
45℃、30秒
72℃、30秒
【００８２】
アンプリコンDNAの高アニーリング温度増幅（図4）に対するサイクリング条件は以下であった。
酵素活性化。以下の1サイクル：
95℃、7分
増幅。以下の28サイクル：
95℃、50秒
72℃、40秒
【００８３】
高アニーリング温度次いで低アニーリング温度におけるアンプリコンおよび標的DNAの増幅（図5）に対するサイクリング条件は以下であった。
酵素活性化。以下の1サイクル：
95℃、7分
高温アニーリング増幅。以下の10サイクル：
95℃、50秒
72℃、40秒
低温アニーリング増幅。以下の28サイクル：
95℃、50秒
50℃、30秒
72℃、30秒
【００８４】
3.0 結果
pET24 FおよびRを用いて行った最初のPCRは、標的DNAからアンプリコンを特異的に生成した（図3）。アンプリコンの濃度は、分光分析によって決定した。ストック溶液は-70℃で保存し、すべてのその後の実験において、段階希釈ストックを使用した。
【００８５】
pET24 FおよびRプライマー対は、連続して2つより多いヌクレオチドに相補的な塩基を有しない。プライマーは、42〜56℃の間のアニーリング温度において標的DNAを特異的に増幅したが、>60℃のアニーリング温度においては標的DNAを増幅しなかった（データ示さず）。72℃のアニーリング温度において、プライマーは、高濃度においてさえも、アンプリコンを特異的に増幅したが、標的DNAを増幅しなかった（図4）。プライマー対は、72℃のアニーリング温度において30サイクル、次いで41℃において30サイクル行った反応において、プライマーダイマーを生成した（データ示さず）。反応においてプライマーダイマーがいつ問題になるのかを理解するために、鋳型なしの対照を、45℃において全部で60サイクル実行した。プライマーダイマーは、45よりも多いサイクルの後にのみ出現した（データ示さず）。
【００８６】
サイクル数を最小に保つために、FW3/REV3を使用する反応を、52℃の28サイクルにシフトする前に、72℃のアニーリング温度において10サイクル行った。これらのサイクリングパラメータは、プライマーダイマーの形成なしに、21サイクル後に標的DNAではなくアンプリコンの特異的な検出を可能にし、38サイクル後に標的DNAの特異的な検出を可能にした（図5）。リアルタイムPCRを使用する同様の実験を、実施例2に記載する。
【００８７】
4.0. 結論
2T-TA方法論は、アンプリコン混入の検出を特異的に可能にする。タグ付けされたアンプリコンは、高アニーリング温度（ここでは72℃）において増幅されるが、標的DNAは増幅されない。増幅反応の第二段階中に、アニーリング温度が下げられ、標的DNAに相補的なプライマー配列がアニールし、標的DNAが増幅される。
【００８８】
方法論は、リアルタイムPCR設定に適しており、PCR産物の蓄積が継続的に検出され得、サイクリング条件が迅速で、かつ使用されるプライマー濃度が低く、ポリメラーゼ活性の損失の率およびプライマーダイマーの生成率を軽減する。
【００８９】
実施例2：リアルタイムPCRを使用した2T-TA方法論の実証
1.0 材料
1.1. オリゴヌクレオチド
順方向（pET24 F）および逆方向（pET24 R）プライマーは、実施例1に記載したものと同じであった。プライマーストックは5μMに希釈された。
【００９０】
1.2. アンプリコンおよび標的DNA
アンプリコンおよび標的DNAのストックを実施例1に記載する。図7〜13に提示するリアルタイムPCRデータにおいて、アンプリコンDNAは-対照として表示し、標的DNAは+対照として表示し、かつ標的および鋳型の混合物は+/-として表示する。
【００９１】
1.4. PCRプレミックス
Roche Applied ScienceのLightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I（カタログ番号3 003 230）を使用した。プレミックスにおけるポリメラーゼは、10分間95℃においてインキュベートすることによって活性化される。
【００９２】
1.5 サーモサイクラー
PCRは、Roche LightCycler(商標)を使用して行った。
【００９３】
2.0 方法
2.1. PCR混合物
20μLのPCR混合物は、以下を含んだ。
・2μL LightCycler FastStart DNA Master Mix
・2mM MgCl2（LightCycler Kit Instructionsあたり）
・0.5μMのpET24 F（すなわち、5μMストックから2μL）
・0.5μMのpET24 R
【００９４】
アンプリコン/標的DNAの添加の後、混合物には、ヌクレアーゼを含まない水を最終容量まで追加した。
【００９５】
2.1. サーモサイクリング条件
サーマルサイクリング条件は以下のとおりであった。
酵素活性化：以下の1サイクル：
95℃、10分、20℃/秒の勾配
高温アニーリング：以下の10または30サイクル：
95℃、10秒、20℃/秒の勾配
72℃、30秒、20℃/秒の勾配（取得/サイクル）
低温アニーリング：以下の30または45サイクル：
95℃、10秒、20℃/秒の勾配
42℃、15秒、20℃/秒の勾配
72℃、30秒、20℃/秒の勾配（取得/サイクル）
【００９６】
鋳型の増幅直後の融解曲線分析：
融解曲線：以下の1サイクル：
95℃、10秒、20℃/秒の勾配
50℃、10秒、20℃/秒の勾配（単一取得）
97℃、0秒、0.2℃/秒の勾配（継続的取得）
【００９７】
3.0 結果
実験A：アンプリコンDNAのみ、標的DNAのみ、ならびにミックスしたアンプリコンおよび標的DNA両方の低濃度等モル反応。
〜1600コピー（0.23 fg）アンプリコンDNA
〜1200コピー（6.76 fg）標的DNA
【００９８】
試料セットアップ：
2007537746.tif 000006
NTC：鋳型なし（水）対照
【００９９】
サーマルサイクリングパラメータ：
高温アニーリング：10サイクル
低温アニーリング：45サイクル
【０１００】
図7は、試料（鋳型DNAとミックスされたものを含む）を含むアンプリコンDNAに対するクロッシング閾値（Ct）値が、鋳型DNA試料（38サイクル）よりも10サイクル早い（28サイクル）ということを示す。これらの試料の融解曲線分析は（図8）、NTC試料における予期せぬ増幅を除いて（番号9）、単一増幅産物の形成（89℃においてピーク）を確認する。PCR産物のサイズは、アガロースゲル電気泳動によって、〜300bp（期待されたサイズ309bp）であることが確認された（図11）。
【０１０１】
この技術の実用性は、以下に記載するように、以前のアッセイよりも10000倍高い濃度の開始DNAを用いて検査した。
【０１０２】
実験B：アンプリコンDNAのみ、鋳型DNAのみ、ならびにミックスしたアンプリコンおよび標的DNA両方の高濃度反応。
〜1.6×107コピー（2.3pg）アンプリコンDNA
〜1.2×107コピー（67.6pg）標的DNA
【０１０３】
試料ナンバリングおよびサーマルサイクリングパラメータは、実験Aと同じである。以前の2つの実験（AおよびB）と対照的に、現実の応用において、PCR反応に混入するアンプリコンの濃度は、標的DNAの量と比較して通常はごくわずかであると思われる。したがって、実際問題として、アンプリコン混入の検出は、より低温のアニーリングサイクリングに切り替える前に、高温アニーリングサイクリングの10より多いサイクルを必要とすると思われる。
【０１０４】
以下の実験（C）は、より高い濃度の標的DNAの存在下で、少数のアンプリコンが検出され得るかどうかを決定するために行った。高温アニーリングのサイクル数を40に増加し、低温アニーリングの35サイクルを後に続けた。
【０１０５】
実験C：アンプリコンDNAのみ、高濃度標的DNAのみ、ならびに低アンプリコンおよび高標的DNAの混合物。
〜1600コピー（0.23fg）アンプリコンDNA
〜1.2×107コピー（67.6pg）標的DNA
【０１０６】
試料セットアップ：
2007537746.tif 000007
【０１０７】
サーマルサイクリングパラメータ：
高温アニーリング：40サイクル
低温アニーリング：35サイクル
【０１０８】
アンプリコンを含む試料のみが、高温アニーリングサイクリング中に増幅するが（図12）、標的DNAとの反応ミックスは、その後の2T-TA PCRの低温アニーリングサイクリングフェーズ中にのみ増幅される（図13）ことが、この実験から明らかである。これらの試料に対する融解曲線データ（89℃においてピーク）は、図8および10に示す結果と非常に類似していた。
【０１０９】
概要
本発明は、標的配列に相補的な配列エレメントを含み、かつタギング配列としての役割を果たす配列エレメントを含む、プライマーの1セットを用いるPCR反応を行うための方法を開示する。異なる温度における増幅反応を実施することにより、以前の反応の増幅産物から生じる混入の存在を決定することができ、反応の信頼性を改善し、かつ対照反応および反応再現の必要性を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】キメラプライマーの略図。B領域は標的DNAに相補的であるが、B領域は標的DNAに相補的ではない。
【図２】キメラプライマーを使用する方法論ならびにキャリーオーバー混入を伴うおよび伴わない結果の略図。
【図３】45℃のアニーリング温度においてpET FおよびRプライマーを使用したpET 24d(+)標的DNAからのアンプリコンの形成。2.5％アガロースゲルはエチジウムブロマイドを用いて染色した。マーカーサイズ（塩基対）は図の左側に示す。各々の反応に添加した鋳型DNAのコピーのおよその数を示す。
【図４】45℃および72℃のアニーリング温度（ゲルの下に示す）においてpET FおよびRプライマーを使用したアンプリコンおよびpET 24d(+)標的の増幅。図1に対する説明文も参照されたい。
【図５】高温次いでより低温のアニーリングサイクルを含むサーモサイクリングプログラムを使用した標的DNA（〜3×106コピー）の前のアンプリコン（〜104コピー）ウェルの検出。反応のアリコートは、21、29、および38サイクル後に除去した（ゲルの上に示す）。図1に対する説明文も参照されたい。
【図６】リアルタイムSYBR Green I 2T-TAサーマルサイクリングに対する増幅プロトコールの概観（温度対時間）。SYBR Green Iシグナルの取得が示される。10分Taqポリメラーゼ活性化段階、その後の高温サーマルサイクリングの10サイクル、その後の低温サーマルサイクリングの45サイクル、その後の融解曲線分析。
【図７】2T-TA技術を用いた増幅、低コピー数（蛍光対サイクル）。アンプリコン（〜1600コピー、0.23 fg）、および標的（〜1200コピー、6.76 fg）。アンプリコンDNAは-対照として表示し、標的DNAは+対照として表示し、かつ標的および鋳型の混合物は「両方」として表示する。高アニーリング温度（72℃）PCRの10サイクルは、この増幅データを生成することに先行して行われた。シグナル増幅は、これらの最初の10サイクル時は検出できなかったため、それ故に、この図には示されていない。
【図８】鋳型およびアンプリコンDNAの低コピー数を使用した2T-TA技術からの産物の融解曲線分析（蛍光対温度）。アンプリコンおよび標的DNAの識別に対しては、図7に対する説明文を参照されたい。
【図９】2T-TA技術を用いた増幅、高コピー数（蛍光対サイクル）。アンプリコン（〜1.6×107コピー、2.3 pg）、および標的（〜1.2×107コピー、67.6 pg）。アンプリコンDNAは-対照として表示し、標的DNAは+対照として表示し、かつ標的および鋳型の混合物は+/-として表示する。高温アニーリングPCRの10サイクルは、この増幅データを生成することに先行して行われた。試料を含むアンプリコンは、標的DNAのみの試料の12サイクル前で検出された。
【図１０】高コピー数アンプリコンおよび標的DNAを使用した2T-TA技術からのPCR産物の融解曲線分析（蛍光対温度）。アンプリコンおよび標的DNAの識別に対しては、図9に対する説明文を参照されたい。
【図１１】低コピー数および高コピー数増幅アッセイからの増幅産物の2％TBE（アガロースゲル電気泳動）。上段：実験A。低コピー数（左から）：1〜3 アンプリコンDNA、4〜6 アンプリコンおよび標的DNA、7〜9 標的DNA、10〜12 NTC。下段：実験B。高コピー数（左から）：1〜3 アンプリコンDNA、4〜6 アンプリコンおよび標的DNA、7〜9 標的DNA、10〜12 NTC。
【図１２】高温アニーリングサイクリング（蛍光対サイクル）。アンプリコンを含む試料のみが、反応のこのフェーズ中に増幅する。アンプリコンDNAは-対照として表示し、標的DNAは+対照として表示し、かつ標的および鋳型の混合物は+/-として表示する。
【図１３】低温アニーリングサイクリング（蛍光対サイクル）。標的DNAを伴う反応ミックスが、反応のこのフェーズ中にのみ増幅する。アンプリコンおよび標的DNAの識別に対しては、図12に対する説明文を参照されたい。
【図１４】本発明のマイクロフルイディクスデバイスの1つの態様の平面図。
【図１】
2007537746.tif 000008
【図２】
2007537746.tif 000009
【図３】
2007537746.tif 000010
【図４】
2007537746.tif 000011
【図５】
2007537746.tif 000012
【図６】
2007537746.tif 000013
【図７】
2007537746.tif 000014
【図８Ａ】
2007537746.tif 000015
【図８Ｂ】
2007537746.tif 000016
【図９】
2007537746.tif 000017
【図１０Ａ】
2007537746.tif 000018
【図１０Ｂ】
2007537746.tif 000019
【図１１】
2007537746.tif 000020
【図１２】
2007537746.tif 000021
【図１３】
2007537746.tif 000022
【図１４】
2007537746.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月24日(2007.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007537746000001.app
【国際調査報告】
2007537746.tif 000024
2007537746.tif 000025
2007537746.tif 000026
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