【手続補正書】
【提出日】平成27年12月25日(2015.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のエキソヌクレアーゼドメイン、Ｎ末端ドメイン、および親指ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である配列を有する第１のドメイン；および
Ｐｆｕポリメラーゼ（配列番号９）の掌ドメインおよび指ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である配列を有する第２のドメイン
を含み、
忠実度が高く、プロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性が高い特徴を有する、キメラポリメラーゼ。
【請求項２】
前記ＫＯＤポリメラーゼの前記エキソヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列が、ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基１５６〜３０１に対応する、請求項１に記載のキメラポリメラーゼ。
【請求項３】
前記ＫＯＤポリメラーゼのＮ末端ドメインのアミノ酸配列が、ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基２６〜１０５に対応する、請求項１に記載のキメラポリメラーゼ。
【請求項４】
前記ＫＯＤポリメラーゼの親指ドメインのアミノ酸配列が、ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基６１２〜７４９に対応する、請求項１に記載のキメラポリメラーゼ。
【請求項５】
Ｐｆｕポリメラーゼの掌ドメインおよび指ドメインのアミノ酸配列が、Ｐｆｕポリメラーゼ（配列番号９）のアミノ酸残基３９４〜５６３に対応する、請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼ。
【請求項６】
配列番号１６（Ｋｏｆｕのアミノ酸配列）と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、キメラポリメラーゼ。
【請求項７】
前記アミノ酸配列が、
【化２９】
2015154787.tif 000001
（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
のコンセンサス配列を含む、請求項６に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
前記アミノ酸配列が配列番号１６（Ｋｏｆｕのアミノ酸配列）と同一である、請求項６に記載のキメラポリメラーゼ。
【請求項９】
【化３０】
2015154787.tif 000002
（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
のアミノ酸コンセンサス配列を含み、
ＫＯＤの忠実度よりも高い忠実度を有し、Ｐｆｕのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性よりも高いプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性を有する、請求項６に記載のキメラポリメラーゼ。
【請求項１０】
前記アミノ酸コンセンサス配列が、
【化３１】
2015154787.tif 000003
（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
である、請求項９に記載のキメラポリメラーゼ。
【請求項１１】
ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のエキソヌクレアーゼドメイン、Ｎ末端ドメイン、および親指ドメインに見られるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である配列を有する第１のドメイン；および
Ｐｆｕポリメラーゼ（配列番号９）の掌および指ドメインに見られるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である配列を有する第２のドメイン
を含み、
前記Ｐｆｕポリメラーゼのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性よりも高いプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性を有し、前記ＫＯＤポリメラーゼの忠実度よりも高い忠実度を有する、キメラポリメラーゼ。
【請求項１２】
配列番号１５（Ｐｏｄのアミノ酸配列）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、キメラポリメラーゼ。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼをコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸を含む細胞。
【請求項１６】
ａ）配列番号１１のエキソヌクレアーゼドメインと少なくとも９０％同一であるエキソヌクレアーゼドメイン；
ｂ）配列番号１１のＮ末端ドメインと少なくとも９０％同一であるＮ末端ドメイン；
ｃ）配列番号９の掌ドメインおよび指ドメインと少なくとも９０％同一である掌ドメインおよび指ドメイン；および
ｄ）配列番号１１の親指ドメインと少なくとも９０％同一である親指ドメイン
を含むアミノ酸配列を有する、設計製作されたポリメラーゼ。
【請求項１７】
前記エキソヌクレアーゼドメインが配列番号１１のアミノ酸残基１５６〜３０１に対応する、請求項１６に記載の設計製作されたポリメラーゼ。
【請求項１８】
前記Ｎ末端ドメインが配列番号１１のアミノ酸残基２６〜１０５に対応する、請求項１６に記載の設計製作されたポリメラーゼ。
【請求項１９】
前記親指ドメインが配列番号１１のアミノ酸残基６１２〜７４９に対応する、請求項１６に記載の設計製作されたポリメラーゼ。
【請求項２０】
前記掌ドメインおよび指ドメインのアミノ酸配列が配列番号９のアミノ酸残基３９４〜５６３に対応する、請求項１６に記載の設計製作されたポリメラーゼ。
【請求項２１】
ａ）配列番号９の１〜３３５位および５６７〜７７８位に対応するアミノ酸残基；および
ｂ）配列番号１１の３３６〜５６５位に対応するアミノ酸残基
から構成される配列と９０％の同一性を有する、設計製作されたポリメラーゼ。
【請求項２２】
ａ）配列番号１１の１〜３３５位および５６６〜７７８位に対応するアミノ酸残基；および
ｂ）配列番号９の３３６〜５６６位に対応するアミノ酸残基
から構成される配列と９０％の同一性を有する、設計製作されたポリメラーゼ。
【請求項２３】
配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載の設計製作されたポリメラーゼ。
【請求項２４】
ａ）配列番号１１のエキソヌクレアーゼドメインと少なくとも９０％同一であるエキソヌクレアーゼドメイン；
ｂ）配列番号１１のＮ末端ドメインと少なくとも９０％同一であるＮ末端ドメイン；
ｃ）配列番号９の掌ドメインおよび指ドメインと少なくとも９０％同一である掌ドメインおよび指ドメイン；および
ｄ）配列番号１１の親指ドメインと少なくとも９０％同一である親指ドメイン
を含むアミノ酸配列を有し、配列番号９のプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性よりも高いプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性を有し、配列番号１１の忠実度よりも高い忠実度を有する、設計製作されたポリメラーゼ。
【請求項２５】
請求項１から２４のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼを含むキット。
【請求項２６】
請求項１から２４のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼを使用してＤＮＡを合成する方法。
【請求項２７】
請求項１から２４のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼを使用してＤＮＡ断片を増幅する方法。
【請求項２８】
キメラポリメラーゼを設計製作する方法であって、
（ａ）ＫＯＤポリメラーゼ(配列番号１１)に基づくＮ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメイン、および親指ドメインを提供する工程；
（ｂ）Ｐｆｕポリメラーゼ(配列番号９)に基づく掌および指ドメインを提供する工程；（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）からのドメインを組み合わせて、キメラポリメラーゼを形成する工程、を含み、
前記キメラポリメラーゼが、前記Ｐｆｕポリメラーゼのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性よりも高いプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性を有し、前記ＫＯＤポリメラーゼの忠実度よりも高い忠実度を有する、方法。
【請求項２９】
ＫＯＤポリメラーゼ(配列番号１１)の忠実度を改善する方法であって、前記ＫＯＤポリメラーゼの掌および指ドメイン内の配列を、忠実度がより高い特徴を有するＰｆｕポリメラーゼ(配列番号９)からの対応する配列で置き換える工程を含む方法。
【請求項３０】
Ｐｆｕポリメラーゼ(配列番号９)のプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性を改善する方法であって、前記ＰｆｕポリメラーゼのＮ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメインおよび親指ドメイン内の配列を、プロセシビティー、延長速度、塩抵抗性またはＰＣＲエンハンサー抵抗性が高い特徴を有するＫＯＤポリメラーゼ(配列番号１１)からの対応する配列で置き換える工程を含む方法。