(57)【要約】  本発明は、微生物工学研究所の微生物系統保存機関（MTCC）（チャンディーガル、インド）に受入番号MTCC 5102として寄託された、アスペルギルス属菌による、様々な工業、特に「酵素洗浄剤」のためのアルカリプロテアーゼの製造に関する。そして、前記菌は、室温(28℃±2℃)でpH 7.0の蒸留水を用いる商業的ブランドの粉末ミルクを含む慣用的培地で生育することができるが、前記菌は、海水培地でも更に5℃でも良好に生育する。更に、当該菌によって産生される当該プロテアーゼ酵素は、6〜11のpH範囲で同様に良好に作用し、42〜47℃の温度で100 %活性を示すが、活性のほとんど90 %は、30℃に存在し、活性の50 %は15℃及び60℃に存在する。当該酵素は45℃で45分間まで熱安定性である。【選択図】図２、３
2007515923.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物工学研究所の微生物系統保存機関（MTCC）及びジーンバンク（チャンディーガル、インド）に受入番号MTCC 5102として寄託されたアスペルギルス属（Aspergillus sp.）菌。
【請求項２】
a) 不完全菌類であり；
b) 麦芽抽出物のアガープレートにおいて、顆粒状の薄黄緑色〜深黄緑色を示し；
c) 分生胞子柄は一列細胞であり、分生胞子頭部は球状で小さな棘があり；並びに
d) 7.0〜9.0のpH範囲及び5〜30℃の温度範囲で、炭素源及び窒素源を含む海水及び蒸留水中で生育する、
請求項１記載の菌。
【請求項３】
約7.0のpH及び約30℃の温度で、炭素源及び窒素源を含む蒸留水中で生育することができる、請求項１記載の菌。
【請求項４】
約9.0のpH及び約5℃の温度で、炭素源及び窒素源を含む海水中で生育することができる、請求項１記載の菌。
【請求項５】
低温活性アルカリプロテアーゼ酵素。
【請求項６】
6.0〜11.0のpH範囲で活性である、請求項５記載のプロテアーゼ酵素。
【請求項７】
最も好ましいpHが約10である、請求項６記載のプロテアーゼ酵素。
【請求項８】
15℃〜60℃の範囲内で活性を示す、請求項５記載のプロテアーゼ酵素。
【請求項９】
約42〜47℃で100 %活性を示す、請求項５記載のプロテアーゼ酵素。
【請求項１０】
40℃〜50℃の温度範囲で熱安定性である、請求項５記載のプロテアーゼ酵素。
【請求項１１】
前記最大の熱安定性が約43〜47℃で得られる、請求項５記載のプロテアーゼ酵素。
【請求項１２】
30〜60分のインキュベーション時間内に最大活性を示す、請求項５記載のプロテアーゼ酵素。
【請求項１３】
酵素濃度の増加に伴って活性の増加を示す、請求項５記載のプロテアーゼ酵素。
【請求項１４】
1.5 %〜2.0 %の基質濃度で最大活性を示す、請求項５記載のプロテアーゼ酵素。
【請求項１５】
前記菌によって製造される酵素が、セリンプロテアーゼである、請求項５記載のプロテアーゼ酵素。
【請求項１６】
菌株MTCC 5102由来の低温アルカリプロテアーゼ酵素を製造する方法であって、以下のステップ：
a) 麦芽抽出物及び窒素源を含む培地としての水中でMTCC 5102を生育させ、菌マットを得るステップ；
b) 当該菌マットを浸軟して（macerating）スターター培養物を得るステップ；
c) 7.0〜9.0のpH範囲を有する実験培地に当該スターター培養物を添加するステップ；
d) 浅い静置培養として当該培養物を4〜6日間生育させるステップ；及び
e) ステップd)から得られた無細胞透明上清溶液を濾過して、アルカリプロテアーゼを得るステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１７】
国際寄託番号MTCC 5102を有する前記アスペルギルス属菌が以下：
a) 不完全菌類であり；
b) 麦芽抽出物のアガープレートにおいて、顆粒状の薄黄緑色〜深黄緑色を示し；
c) 分生胞子柄は一列細胞であり、分生胞子頭部は球状で小さな棘があり；並びに
d) 7.0〜9.0のpH範囲及び5〜30℃の温度範囲で、炭素源及び窒素源を含む海水及び蒸留水中で生育する、
の特徴を有する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記菌が、約7.0のpH及び約30℃の温度で、炭素源及び窒素源を含む蒸留水中で生育することができる、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記菌が、約9.0のpH及び約5℃の温度で、炭素源及び窒素源を含む海水中で生育することができる、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記培地が、約0.3 %のペプトン及び約2.0 %の麦芽抽出物と混合された水である、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
前記実験培地が、1% (w/v)濃度のグルコース又はセルロース、各1 %のカゼイン、噴霧乾燥酪農用漂白剤、大豆ミール、糖液又はコーンスティープリカーを添加したCzapek Doxブロスを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
食品産業において皮を剥ぐための、廃棄羽毛を加工するための、ゼラチンで被覆したX線フィルムからの銀の回収のための、工業廃棄物及び家庭廃棄物の処理のための、並びに繊維、皮、食材、羽毛、X線フィルム、及び工業廃棄物及び家庭廃棄物に当該アルカリプロテアーゼを適用/これらを当該アルカリプロテアーゼで処理することが必要とされるどんなその他の類似の適用のための、低温活性アルカリプロテアーゼの洗浄剤添加物としての使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、中央インド海盆の約5000mの深さで収集した深海沈殿物から単離され、微生物工学研究所の微生物系統保存機関（MTCC）（チャンディーガル、インド）に受入番号MTCC 5102として寄託された、アスペルギルス属（Aspergillus sp.）菌の海洋株を用いる、プロテアーゼ酵素の製造法に関する。更に、当該アスペルギルス属MTCC 5102によって産生されるプロテアーゼは、pH 6〜11及び15℃〜60℃の温度、至適には45℃で活性である。42〜47℃で約30分間酵素をインキュベーションした後では、100 %の酵素活性が維持され、45℃で約45分間のインキュベーション後には、約90 %の活性が維持される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
アルカリプロテアーゼの主な適用の1つは、洗濯用洗浄剤である。「酵素洗浄剤」は、しみ由来のプロテイナーゼ物質を除くことができる。環境的にやさしい非リン酸系洗浄剤は、その調合物中のこのような活性酵素の存在により、効果的である。アルカリプロテアーゼは、食器洗浄用洗浄剤、限外濾過法のクリーニング、及び現代の酪農及び食品工業における逆浸透膜法にも用いられる。更に、コンタクトレンズ洗浄液もアルカリプロテアーゼを含む。アルカリプロテアーゼは、皮膚及び皮を剥ぐためにも使用される。典型的な方法は、この目的に、製皮排水中の100 %のスルフィド及び約80 %の懸濁固体の原因となる亜硫酸アトリウムを使用する。アルカリプロテアーゼは、ゼラチン被覆X線フィルムから回収される銀にその適用を見出している。銀は、燃焼によりX線フィルムから慣用的に回収され、環境汚染の原因となる。そのため、アルカリプロテアーゼを用いるゼラチンの加水分解は、環境的にやさしい方法である。アルアリプロテアーゼは、植物、魚類及び動物材料の加水分解のための食品工業にも用いられる。アルカリプロテアーゼは、工業的及び家庭的廃棄物の処理、及び家禽屠殺場からの廃棄羽毛の加工に使用を見出している。
【０００３】
菌、又は菌及び細菌由来のプロテアーゼ系の、上記の様々な適用への使用の試みは、文献に報告されている。微生物アルカリプロテアーゼ(サブチリシン（subtilisins）：E.C.3.4.21.14)は、洗浄剤工業用の酵素の市販的に重要な群である。理想的には、洗浄剤工業に使用されるプロテアーゼは、幅広いpH及び温度での高い活性及び安定性を有する必要がある。
【０００４】
従って、様々な生物が、洗浄剤工業での使用のためのアルカリプロテアーゼの製造に使用されていきた(Takami, H., Akiba, T. and Horikoshi, K., 1990. Characterization of an alkaline protease from Bacillus sp. No. AH 101. Applied Microbiology and Biotechnology 33: 519-523)。
【０００５】
(i) 国際公開第WO 8803948号パンフレットを参照されたい。すなわち、好適な炭素源及び窒素源を含み、pHが9.2に調整された培地で生育したペシロミセス・マルカンディー（Paecilomyces marquandii(NRRL 18048)）菌は、45℃及び7〜10.5のpH範囲で最大活性を示すアルカリプロテアーゼを産生した(Beck他, 1988. ペシロミセス属マルカンディー由来の低温活性アルカリプロテアーゼ、及びその調製物。特許番号第 WO 8803948)。我々の培養物は、45℃で最大活性を示したが、30℃では最大活性に近く(90 %)、15℃及び60℃では50 %の活性を示し、活性の90〜100 %は、6〜11のpH範囲で見られる。pH 7.0又は8.5で培養された菌は、pH 6〜11でプロテアーゼ活性を示す。菌は、蒸留水の代わりに海水を用いても培養することができ、生育に5℃でも培養することができる。
【０００６】
(ii) 国際公開第WO8803947号パンフレットを参照されたい。すなわち、低温活性アルカリプロテアーゼを調製するために、放線菌培養物、Nocardiopsis dassonvillei株N58-1を使用した。放線菌は、アルカリpH値で、20〜30℃の温度範囲で、8〜10 %濃度の好適な炭素源及び窒素源で生育した。しかしながら、プロテアーゼ活性の至適温度は60℃で、pHが8〜9であった(Liu他 1988, Nocardiopsis dassonvillei由来の低温活性アルカリプロテアーゼ、及びその調製物。特許番号第 WO 8803947)。我々の培養物は45℃で最大活性を示したが、30℃でほぼ最大活性(90 %)、15℃及び60℃で50 %活性を示し、活性の90〜100 %は、6〜11のpH範囲で見られる。pH 7.0又は8.5で培養される当該菌は、pH 6〜11でプロテアーゼ活性を示す。当該菌は、蒸留水の代わりに海水を用いて培養することができ、5℃でもかなり良好である。
【０００７】
(iii) 以下の文献を参照されたい。すなわち、海洋細菌アルテロモナス・ハロプランクティス(Alteronmonas haloplanktis sp.）株S5bは、pH 8〜9で最大活性を示し、活性の至適温度は20℃であった(Suzuki and Odagami. 1997. 海洋細菌アルテロモナス・ハロプランクティス由来の低温活性チオールプロテアーゼ, Journal of Marine Biotechnology, 5: 230-233)。しかしながら、当該プロテアーゼは、非常に狭い温度範囲で活性を示す。その最大活性は20℃においてであり、30℃では20 %未満に低下し、極端に熱不安定である。我々の培養物NIOCC 20でのプロテアーゼ活性は、30℃及び45℃でほぼ同様な活性を示す（各々、90 % and 100 %）。
【０００８】
(iv) 以下の文献を参照されたい。すなわち、リゾパス・オリザエ（Rhizopus oryzae sp.）株RO IIT KGPは、30℃で至適pH 5、37℃で至適pH 10を有する細胞外アルカリセリンプロテアーゼを産生した。当該酵素は、pH 3〜11で安定であり、至適温度は60℃であった(Banerjee and Bhattacharya, 1992. 新規単離リゾパス・オリザエの細胞外アルカリプロテアーゼ, Biotechnology Letters, 14: 301-304)。我々の培養物は、30〜45℃、6〜11の広pH範囲で、最大活性を示した。
【０００９】
(v) 以下の文献を参照されたい。すなわち、韓国の山の土試料から単離されたアゾスピリラム属（Azospirillum sp.）が8.5付近の広いpH範囲、45℃までの温度でプロテアーゼ活性を示したC (Kun-Hee他, 1999. 低温アゾスピリラム属の単離及び細胞外プロテアーゼの特徴， FEMS Microbiology Letters, 174: 173- 178)。プロテアーゼは、30℃未満の低温で活性かつ安定であるが、EDTAの存在下で阻害された。しかしながら、我々の培養物NIOCC 20によって産生されるこのプロテアーゼは、EDTAの存在下で阻害されなかった。
【００１０】
(vi) 以下の文献を参照されたい。すなわち、深海沈殿物試料から単離されたビブリオ属(Vibrio sp.）株5709は、0℃で生育し、pH 5で活性であるプロテアーゼを産生することができた。活性の至適温度は40℃であり、最大活性の45 %は、20℃で得られた(Hamamato他, 1995. 低温ビブリオ属株5709由来のプロテアーゼの特徴, Journal of Marine Biotechnology, 2: 219-222)。
【００１１】
しかしながら、この単離物の至適生育温度は、20℃であり、熱帯国でのエネルギー消費及び実際の適用の点から、高価である。我々の培養物は30℃で生育し、45℃で最大活性を示すが、30℃でその活性の90 %、15℃及び60℃で50 %の活性を保持する。
【発明の開示】
【００１２】
発明の目的
本発明の目的は、中央インド海盆の約5000 mの深さで収集した深海沈殿物から、アスペルギルス属菌の新規海洋株を単離することである。
【００１３】
本発明の別の主な目的は、上記の欠点を未然に防ぐ、プロテアーゼが必要とされる工業で使用できるための、アスペルギルス属菌MTCC 5102の海洋株を用いてプロテアーゼの製造方法を提供することである。
【００１４】
本発明の更に別の目的は、pH 7又は8.5の蒸留水又は海水で調製した培地中に、窒素源として安価な一般的に入手可能な噴霧乾燥酪農用漂白剤、及び炭素源としてグルコースを使用する、大規模に前記菌を生育させる方法を提供することである。
【００１５】
本発明の更に別の目的は、6〜11の広範囲pHでプロテアーゼ活性を有する培養物を提供することである。
【００１６】
本発明の更に別の目的は、15〜45℃の広い温度範囲で活性であるアルカリプロテアーゼを提供することである。
【００１７】
本発明の更に別の目的は、5℃又は30℃で生育する培養物を提供することである。
【００１８】
本発明の更にもう1つの目的は、培養上清中のリパーゼ活性を示す培養物を提供することである。
【００１９】
発明の概要
従って、本発明は、特に、様々な工業用、特に微生物工学研究所の微生物系統保存機関（MTCC）（チャンディーガル、インド）に受入番号MTCC 5102として寄託された新規アスペルギルス属菌による「酵素洗浄剤」のためのアルカリプロテアーゼの製造に関する。前記菌は、室温（28℃±2℃）でpH 7.0の蒸留水を用いる商業的ブランドの粉末ミルクを含む慣用的培地で生育することができる。しかしながら、前記菌は、海水培地中でも、5℃でも良く生育する。更に、この菌によって産生されるプロテアーゼ酵素は、6〜11のpH範囲でも同様に良く作用する。45℃で至適温度を示すが、活性のほとんど90 %は、30℃で存在し、活性の50 %は15℃及び60℃で存在する。当該酵素は45℃で45分まで熱安定性である。当該酵素はEDTAによって阻害されず、メタロプロテアーゼではない。その活性はフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)の存在下で総合的に阻害され、これは、プロテアーゼ酵素がセリンプロテアーゼであることを示唆する。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、特に、様々な工業用、特に微生物工学研究所の微生物系統保存機関（MTCC）（チャンディーガル、インド）に受入番号MTCC 5102として寄託された新規アスペルギルス属菌による「酵素洗浄剤」のためのアルカリプロテアーゼの製造に関する。前記菌は、室温（28℃±2℃）でpH 7.0の蒸留水を用いる商業的ブランドの粉末ミルクを含む慣用的培地で生育することができる。しかしながら、前記菌は、海水培地中でも、5℃でも良く生育する。更に、この菌によって産生されるプロテアーゼ酵素は、6〜11のpH範囲でも同様に良く生育する。45℃で至適温度を示すが、活性のほとんど90 %は、30℃で存在し、活性の50 %は15℃及び60℃で存在する。当該酵素は45℃で45分まで熱安定性である。
【００２１】
プロテアーゼ酵素の製造法は、プロテアーゼを得るために、4〜6日間の期間、炭素源及び窒素源、及び追加の有機窒素源を含む慣用的培地中で、アスペルギルス属菌MTCC 5102の海洋株を生育するステップを含む。
【００２２】
本発明の更に別の実施態様では、前記菌は、pH 6〜11で最大活性を示すプロテアーゼを産生する。
【００２３】
本発明の更に別の実施態様では、当該アルカリプロテアーゼは、42〜47℃で最大活性を示すが、最大活性の約90 %は、30℃で存在し、活性の約50 %は15℃及び60℃で見られる。
【００２４】
本発明の更に別の実施態様では、前記菌によって産生される当該アルカリプロテアーゼは、少なくとも10分間、45℃で安定であり、100 %の活性を示し、最大活性の約50 %は60℃での酵素処理の10分後に保持される。
【００２５】
本発明の更に別の実施態様では、前記菌によって産生される当該アルカリプロテアーゼは、45分間、45℃で安定である。
【００２６】
本発明の更に別の実施態様では、前記菌によって産生される当該アルカリプロテアーゼは、メタロプロテアーゼではない。
【００２７】
本発明の更に別の実施態様では、このようにして得られた上記の特徴を有する低温活性アルカリプロテアーゼは、洗浄剤添加剤として、食品工業において皮を剥ぐために、廃棄羽毛の処理に、ゼラチン被覆X線フィルムからの銀の回収のために、工業的及び家庭的廃棄物の処理のために、及び必要とされる場合にはどんな他の類似の適用のために使用することができる。
【００２８】
添付表の簡単な説明
表1は、異なった温度での酵素活性を示す。表2は、様々な洗浄剤の存在下でのプロテアーゼ活性を示す。表3は、酵素活性に与えるEDTAの効果を示す。表4は、公知の酵素に比べた酵素活性の比較データを示す。
【００２９】
本発明で使用される生物は、中央インド海盆の5494mの深さから回収した深海沈殿物から単離された不完全菌類の菌であり、受入番号MTCC 5102を有するアスペルギルス属と同定され、微生物工学研究所（チャンディーガル、インド）に寄託されている。菌のコロニーは粒状で、薄黄緑色〜深黄緑色で、分生胞子柄は一列細胞であり、分生胞子頭部は球状で小さな棘があるようである。この菌は、麦芽抽出物及びペプトンを含む麦芽抽出物ブロス中で生育することができる。このようにして成長した菌マットを浸軟し、グルコースを1 % (w/v)の濃度で含む実験培養物のスターター接種材料として用いた。1 %濃度のカゼイン、噴霧乾燥酪農用漂白剤、大豆ミール、糖液又はコーンスティープリカーが窒素源として用いることができる。培地のpHは、7.0又は9.0に調整すればよい。この培地は、蒸留水又は海水で調製することができる。培養物は、5℃又は30℃で生育することができる。培養物は、浅い静置培養として4〜6日間生育される。無細胞上清は、アルカリプロテアーゼ源として用いられる。プロテアーゼ活性は、基質としてアゾカゼイン(Sigma Chemicals, Mo, USA)を用いて測定される。
【００３０】
前記スペルギルス属菌MTCC 5102は、炭素源としてグルコース、有機窒素源として噴霧乾燥酪農用漂白剤、及び無機窒素源として硝酸ナトリウムを含む簡単で安価な培地中にプロテアーゼ酵素を生育及び産生することができる。培養物は生育が早く、以下の我々の接種法により、6日目までに最大酵素産生が得られる。前記菌は、5℃でも生育する。前記菌は、6〜11の広いpH、及び45℃の至適温度で活性を示すプロテアーゼを産生する。市販のアルカリプロテアーゼ、例えばAlcalase（登録商標）、Esperase（登録商標）及びSavinase（登録商標）は、60℃の至適温度を有する。我々の培養物は、30℃で最大プロテアーゼ活性の90 %、15℃及び60℃で最大活性の約50 %を示す。プロテアーゼ酵素は、45℃で45分間インキュベーションした後は、その最大活性の90 %を保持する。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例は、本発明の例示として示すものであり、従って本発明の範囲を制限するものと解釈するべきではない。
【００３２】
実施例 1
前記菌、アスペルギルス属MTCC 5102は、海水に2 %の麦芽抽出物及び0.3 %のペプトンを含む麦芽抽出ブロスで生育した。このようにして得られた7日目の菌マットを浸軟し、グルコール又はセルロースを1 % (w/v)濃度で含む実験的培養物用のスターター接種として使用した。1 %濃度のカゼイン、噴霧乾燥酪農用漂白剤、大豆ミール、糖液又はコーンスティープリカーを有機窒素源として使用した。上記の窒素含有基質を各々添加したCzapek Doxブロスは、10 g グルコース、2g NaN03、1g K2HP04、0.5g MgS04、0.5 g KCl及び0.01 g Fe2S04/L 培地を含んだ。培地のpHを7.0又は9.0に調整した。この培地を蒸留水又は海水で調製した。培養物を4〜6日間、浅い静置培養で生育した。GF/Fフィルターに続いて0.22 μm Nucleporeフィルターで濾過した後に得られた無細胞の透明上清をアルカリプロテアーゼ源として使用した。2 %濃度のアゾカゼイン(Sigma Chemicals, Mo, USA)を用いてプロテアーゼ活性を測定した。様々な温度及びpHの組み合わせで放出されたアゾカゼイン・ユニット(ACU)を、440 nmで測定し、1分間の0.001の吸光度の増加として示した(Alfredsson, G. A, Gudmundsson H. M., Xiang J. Y., Kristjansson M. M. 1995, 低温海洋細菌由来の Subtilisin-様セリンプロテアーゼ, J. Mar. Biotech. 3: 71-72)。基質及び酵素ブランクは全てのアッセイで維持した。全てのアッセイを三点で行った。
【００３３】
従って、本明細書に添付の図面の図1Aは、様々な炭素源及び窒素源を含む培地中のプロテアーゼの比較産生を示す。プロテアーゼ産生は、蒸留水及び海水を用いて調製した培地におけるものに匹敵する、ことをこの結果は示す。コーンスティープリカーは、プロテアーゼ産生の最適の基質であるようである。しかし、培養物の濾液に濃茶色を与えるため、更なる実験には使用しなかった。
【００３４】
従って、本明細書に添付の図面の図1Bは、蒸留水又は海水のいずれかで調製し、様々なpHに調整した培地中で、噴霧乾燥酪農用漂白剤を用いるプロテアーゼの比較産生を示す。プロテアーゼ活性を同一のpHでアッセイした。生育及び酵素アッセイに用いた場合に、最pH 9.0で最大活性を観察した。
【００３５】
従って、本明細書に添付の図面の図1Cは、噴霧乾燥酪農用漂白剤を用いて、様々な時間間隔で4℃及び30℃でインキュベートしたプロテアーゼの比較産生を示す。
【００３６】
実施例 2
前記菌、アスペルギルス属MTCC 5102を実施例1に記載のようにして生育し、基質としてアゾカゼインを用いる、30℃でのプロテアーゼ活性の至適pHを評価するために、透明な上清を使用した。反応に対するpHの影響は、pH 6〜8のリン酸緩衝液、pH 8.5〜9.5のホウ酸ナトリウム緩衝液又はpH 10〜12の重炭酸ナトリウム緩衝液を含む反応混合物をインキュベートすることにより評価した。プロテアーゼ活性を実施例1に記載のようにして測定した。
【００３７】
従って、本明細書に添付の図面の図2は、pH 6〜11での90〜100 %の活性を示す。最大活性の約80 %はpH 12で見られた。
【００３８】
実施例 3
前記菌、アスペルギルス属MTCC 5102を実施例1に記載のようにして生育し、基質としてアゾカゼインを用いる、pH 10でのプロテアーゼ活性の至適温度を評価するために、透明な上清を使用した。反応に対する温度の影響は、5℃〜75℃の範囲の様々な温度で反応混合物をインキュベートすることにより評価した。プロテアーゼ活性を実施例1に記載のようにして測定した。
【００３９】
従って、本明細書に添付の図面の図3は、45℃でのプロテアーゼの最大活性を示すが、その最大活性の約90 %は30℃で観察され、活性の約50 %は15℃及び60℃で保持された。表1は、異なった温度での酵素活性を示す。
【００４０】
【表１】
2007515923.tif 000003
【００４１】
実施例 4
前記菌、アスペルギルス属MTCC 5102を実施例1に記載のようにして生育し、酵素調製物の熱安定性を試験するために、透明な上清を使用した。これを、様々な温度（30、40、50、60、70、80及び90℃）で10分間酵素をインキュベートすることにより評価し、その後、氷で直ちに冷却し、実施例1に記載のようにして30℃で活性測定を行った。
【００４２】
従って、本明細書に添付の図面の図4Aは、少なくとも10分間、40℃で活性の約90 %、50度で活性の78 %が維持された酵素を示す。
【００４３】
従って、本明細書に添付の図面の図4Bは、当該酵素が45℃で少なくとも45分間、安定であることを示す。
【００４４】
実施例 5 
前記菌、アスペルギルス属MTCC 5102を実施例1に記載のようにして生育し、インキュベーションの最適時間を試験するために透明な上清を使用し、プロテアーゼ活性をアッセイするための酵素及び基質濃度は30〜60分間で記録した。これを、様々な温度（30、40、50、60、70、80及び90℃）で10分間酵素をインキュベートすることにより評価し、その後、氷で直ちに冷却し、実施例1に記載のようにして30℃で活性測定を行った。45℃の至適温度及び至適pHで、30〜120分の範囲の様々な時間間隔で、酵素及び基質を含む反応混合物をインキュベーションすることにより、インキュベーション時間を評価した。
【００４５】
従って、本明細書に添付の図面の図5Aは、当該酵素が30〜60分に最大活性を示した、ことを示す。
【００４６】
従って、本明細書に添付の図面の図5Bは、当該酵素が酵素濃度の増加と共に活性が増加した、ことを示す。
【００４７】
従って、本明細書に添付の図面の図5Cは、当該酵素が1.5 %及び上記の基質濃度で最大活性を示した、ことを示す。
【００４８】
実施例 6 
前記菌、アスペルギルス属MTCC 5102を実施例1に記載のようにして生育し、プロテアーゼの分解活性（cleaning ability）を実行するために、透明な上清を使用した。綿織物上の新鮮及び45時間後の血のしみを、室温（30℃）で、培養液濾液で30分間処理した。85 ACU/mlの酵素量を本目的に使用した。
【００４９】
従って、本明細書に添付の図面の図6は、新鮮及び古い血のしみが培養濾液で処理すると全体的に除かれた、ことを示す。酵素インキュベーションなしの対照処理でのしみは、消えなかった。
【００５０】
実施例 7 
前記菌、アスペルギルス属MTCC 5102を実施例1に記載のようにして生育し、商業的に入手可能な洗浄剤の存在下にプロテアーゼ活性の安定性を試験するために、透明上清を使用した。当該酵素を洗浄剤への添加物として使用した場合に、酵素の活性が残存するはずであり、それ故この試験を行った。45℃の至適温度及び室温(30℃)で酵素をアッセイした。
【００５１】
従って、本明細書に添付の表2は、室温でアッセイした場合に、活性のほとんどが保持されるのに対し、45℃では、酵素活性が減少する場合があった、ことを示す。
【００５２】
【表２】
2007515923.tif 000004
【００５３】
実施例 8
前記菌、アスペルギルス属MTCC 5102を実施例1に記載のようにして生育し、プロテアーゼ酵素がセリン又はメタロプロテアーゼであるか否かを試験するために、透明上清を使用した。この目的のために、50 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、2 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)及び200 μM 塩化水銀(HgCl2)の存在下に当該酵素をアッセイした。
【００５４】
従って、本明細書に添付の表3は、EDTAの存在下でアッセイした場合に、活性の阻害が起こらなかった、ことを示す。これは、当該酵素がメタロプロテアーゼではないことを示すが、PMSF存在下での活性の阻害が、当該酵素がセリンプロテアーゼである、ことを示す。当該酵素は、HgCl2の存在下では活性を阻害されなかった。
【００５５】
【表３】
2007515923.tif 000005
【００５６】
様々な先行技術の欠点が提示されているが、本出願人は、表1に記載の様々な株によって産生される酵素活性の概略を提供することにより、先行技術を越える本発明の利点を実証する。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
【表５】
2007515923.tif 000007
【００５９】
本発明の主な利点は以下の通りである：
1.  スペルギルス属菌MTCC 102の海洋単離物が、プロテアーゼ産生を誘導するために、培地中に追加の窒素源として、安価で容易に入手可能な原材料、すなわち噴霧乾燥酪農用漂白剤を用いて大規模に生育することができる。培地は蒸留水又は海水を用いて調製することができる。
2.  前記菌はまた、コーンスティープリカー及び大豆ミール等の他の有機窒素源の存在下で、アルカリプロテアーゼを産生することができる。
3.  培地のpHは、プロテアーゼ産生のため、7又は8.5のいずれかに調整すればよい。
4.  培養物は、プロテアーゼ酵素の産生のため、30℃又は5℃で静置培養としてインキュベートすることができる。
5.  前記菌は、4〜6日内に最大のプロテアーゼ量を産生する。
6.  このようにして産生したプロテアーゼは、pH 10で最大活性を示すが、最大活性の約90〜95 %がpH 6〜11で観察される。
7.  前記菌により産生されるアルカリプロテアーゼは、45℃で100 %の活性を示すが、最大活性の約90 %は30℃で存在し、活性の約50 %は15℃及び60℃で見られる。
8.  前記菌のアルカリプロテアーゼは、活性の100 %を保持することにより45℃まで10分間熱安定であり、活性の約50 %は60℃で保持される。
9.  前記菌のアルカリプロテアーゼは、45℃で45分まで熱安定である。
10.  前記菌のアルカリプロテアーゼ活性は、EDTAによって阻害されず、よってメタロプロテアーゼではなく、このことは洗浄剤工業により望ましくさせる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１Ａ】図1Aは、異なった窒素源及び炭素源を用いるMTCC 5102によるアルカリプロテアーゼの産生を示す。
【図１Ｂ】図1Bは、様々なpHに調整した蒸留水及び海水を用いて調製した培地中のプロテアーゼ産生を示す。プロテアーゼ活性は、単離物が生育したpHと同一のpHで測定した。
【図１Ｃ】図1Cは、様々な間隔での4℃及び30℃での培養によるプロテアーゼ産生を示す。
【図２】図2は、基質としてアゾカゼインを用いる、6〜12の範囲の様々なpHでのプロテアーゼ活性を示す。
【図３】図3は、5〜75℃の温度範囲でのプロテアーゼ活性を示す。
【図４Ａ】図4Aは、様々な温度でインキュベートした時の、10分間のプロテアーゼ酵素の熱安定性を示す。
【図４Ｂ】図4Bは、様々な時間間隔での、45℃でのプロテアーゼ酵素の安定性を示す。
【図５Ａ】図5Aは、アッセイ時間に関するプロテアーゼ活性を示す。
【図５Ｂ】図5Bは、様々な濃度の酵素タンパク質の活性を示す。
【図５Ｃ】図5Cは、様々な濃度の基質アゾカゼインの酵素活性を示す。
【図６】図6は、プロテアーゼ活性を有する培養濾液を用いる、綿織物上の新鮮血のしみ及び48時間後の血のしみの除去を示す。
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年1月13日(2006.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物工学研究所の微生物系統保存機関（MTCC）及びジーンバンク（チャンディーガル、インド）に受入番号MTCC 5102として寄託されたアスペルギルス属（Aspergillus sp.）菌。
【請求項２】
a) 不完全菌類であり；
b) 麦芽抽出物のアガープレートにおいて、顆粒状の薄黄色〜深黄緑色を示し；
c) 分生胞子柄は一列細胞であり、分生胞子頭部は球状で小さな棘があり；並びに
d) 7.0〜9.0のpH範囲及び5〜30℃の温度範囲で、炭素源及び窒素源を含む海水及び蒸留水中で生育する、
請求項１記載の菌。
【請求項３】
約7.0のpH及び約30℃の温度で、炭素源及び窒素源を含む蒸留水中で生育することができる、請求項１記載の菌。
【請求項４】
約9.0のpH及び約5℃の温度で、炭素源及び窒素源を含む海水中で生育することができる、請求項１記載の菌。
【請求項５】
プロテアーゼ酵素を製造する方法であって、以下のステップ：
a) 麦芽抽出物及び窒素源を含む培地としての水中でMTCC 5102を生育させ、菌マットを得るステップ；
b) 菌マットを浸軟して（macerating）スターター培養物を得るステップ；
c) 7.0〜9.0のpH範囲を有する実験培地に当該スターター培養物を添加するステップ；
d) 浅い静置培養として当該培養物を4〜6日間生育させるステップ；及び
f) ステップd)から得られた無細胞透明上清溶液を濾過して、アルカリプロテアーゼを得るステップ、
を含む、前記方法。
【請求項６】
国際寄託番号MTCC 5102を有する前記アスペルギルス属菌が以下：
a) 不完全菌類であり；
b) 麦芽抽出物のアガープレートにおいて、顆粒状の薄黄色〜深黄色−緑色を示し；
c) 分生胞子柄は一列細胞であり、分生胞子頭部は球状で小さな棘があり；並びに
d) 7.0〜9.0のpH範囲及び5〜30℃の温度範囲で、炭素源及び窒素源を含む海水及び蒸留水中で生育する、
の特徴を有する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記菌が、約7.0のpH及び約30℃の温度で、炭素源及び窒素源を含む蒸留水中で生育することができる、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記菌が、約9.0のpH及び約5℃の温度で、炭素源及び窒素源を含む海水中で生育することができる、請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記培地が、約0.3 %のペプトン及び約2.0 %の麦芽抽出物と混合された水である、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
前記実験培地が、1% (w/v)濃度のグルコース又はセルロース、各1 %のカゼイン、噴霧乾燥酪農用漂白剤、大豆ミール、糖液又はコーンスティープリカーを添加したCzapek Doxブロスを含む、請求項５記載の方法。
【請求項１１】
請求項５記載の方法から得られるプロテアーゼ酵素。
【請求項１２】
食品産業において皮を剥ぐための、廃棄羽毛を加工するための、ゼラチンで被覆したX線フィルムからの銀の回収のための、工業廃棄物及び家庭廃棄物の処理のための、並びに繊維、皮、食材、羽毛、X線フィルム、及び工業廃棄物及び家庭廃棄物に当該アルカリプロテアーゼを適用/これらを当該アルカリプロテアーゼで処理することが必要とされるどんなその他の類似の適用のための、請求項５記載の方法から得られる低温活性アルカリプロテアーゼの洗浄剤添加物としての使用。
【国際調査報告】
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