(57)【要約】  本発明は、対照核酸用の固相支持体に関する。本発明はまた、その製造方法およびその使用方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類の対照核酸を参照することにより少なくとも１種類の標的核酸の存在または不在を決定する方法であって、この方法は、前記標的核酸をその検出が可能となるように処理し、前記対照核酸を同等な処理条件に付し、前記標的核酸で得られた検出結果を、前記対照核酸で得られた検出結果と比較することにより、前記標的核酸で得られた検出結果を有効または無効とすることを含み、
ここで、前記対照核酸は、固相支持体により提供され、前記対照核酸はその上に吸着されており、そこからその一定量が脱着し、これにより、前記の同等な処理条件にかけるための実質的に量的に再現可能で制御された量の前記対照核酸が提供される、前記方法。
【請求項２】
方法が、
−  その上に吸着している少なくとも１種類の対照核酸を含む固相支持体を提供し、前記固相支持体を液体媒体と接触させ、前記対照核酸の一次配列に実質的に影響を及ぼすことなく、一定量の前記対照核酸が前記固相支持体から前記液体媒体中に脱着するようにするステップ；
−  場合により、前記対照核酸を含む得られた液体媒体をさらに処理するステップ；
−  前記の得られた、場合によりさらに処理された液体媒体に含まれるかまたはそれを起源とする前記対照核酸を、同等な処理条件に付して、これにより、前記標的核酸の処理と参照することによる処理対照を構築するステップ；
−  前記標的核酸が検出されているか否かを決定し、前記対照核酸が検出されているか否かを決定するステップ；
−  前記標的核酸検出結果を、前記対照核酸の１つと比較し、前記標的核酸検出結果を有効または無効とするステップ
を含み、
ここで、前記処理は、ＰＣＲ増幅を含む増幅、ゲル電気泳動、サザン解析、ノザン解析、プローブにより媒介されるハイブリダイゼーションを含むハイブリダイゼーション、およびそれらの組合せにより構成される群から選択された少なくとも１つの処理ステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固相支持体が、少なくとも１つの膜を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
膜材料が、セルロース、化学的に処理したセルロースを含むセルロースに由来する材料、ガラスファイバー、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、織られた多孔性ポリマー、不織多孔性ポリマー、ＰＴＦＥ、多孔性ガラス、およびＰＶＤＦにより構成された群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
膜材料が、セルロース、化学的に処理したセルロースを含むセルロースに由来する材料、ガラスファイバー、ナイロン、ポリエーテルスルホン、およびポリプロピレンにより構成される群から選択され、好ましくはセルロース、セルロースに由来する材料およびナイロンにより構成される群から選択される、請求項３〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
膜が、５０〜３０００ミクロン、好ましくは１００〜１５００ミクロン、より好ましくは１５０〜１０００ミクロンの範囲の厚さを有する、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
膜が、円盤、正方形、長方形、または細長い一片の形状を有する、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
固相支持体が、更に、その上に吸着されている少なくとも１種類の担体剤を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
担体剤が、
−  対照核酸の検出処理を実質的に妨害しないように、前記対照核酸とは無関係または異質である核酸；
−  アルブミン
により構成される群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
担体剤が、対照核酸および標的核酸の検出処理を実質的に妨害しないように、前記対照核酸とは無関係または異質であり、また前記標的核酸とも無関係または異質である核酸である、請求項８〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
担体剤が、ポリＡ、ポリＧ、ポリＣ、ポリＴ、ポリｄＡ、ポリｄＧ、ポリｄＣ、ポリｄＴ、ポリｄＵ、ホモポリデオキシリボヌクレオチド、ホモポリリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドのブロックポリマー、リボヌクレオチドのブロックポリマー、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのブロックポリマー、並びにそれらの混合物により構成される群から選択される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
担体剤が、
−  魚ＤＮＡ、例えばニシンＤＮＡ、特にニシン精子ＤＮＡ、およびサケＤＮＡ、特にサケ精子ＤＮＡ、並びにそれらの混合物；
−  アルブミン、特にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
により構成される群から選択される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
担体剤が、
−  ホモポリデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドのブロックポリマー、およびそれらの混合物；
−  アルブミン、特にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
により構成される群から選択される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対照核酸が、陽性対照、陰性対照、内部対照、外部対照、定性的対照、半定量的対照、定量的対照、リアルタイム増幅対照、およびそれらの組合せにより構成される群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
検出のための核酸処理が、核酸検出ステップの前に、少なくとも１回の核酸の抽出および／または精製ステップを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
処理が、少なくとも１回のハイブリダイゼーションステップを含む検出ステップを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
処理が、少なくとも１回のＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ、特にリアルタイムおよび定量的ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを含む検出ステップを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
標的核酸検出が、定量的検出、好ましくはリアルタイム定量的検出である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
対照核酸検出が、定量的検出、好ましくはリアルタイム定量的検出である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１種類の対照核酸のための固相支持体であって、前記固相支持体は、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の少なくとも１種類の対照核酸と参照することにより、少なくとも１種類の標的核酸の存在または不在を決定する方法を実施するために特別に適合されており、前記固相支持体は、
前記対照核酸の前記固相支持体への非共有結合的な吸着が可能となるような組成および構造を有し、酵素活性を実質的に全く有さないように熱処理および／または化学処理しているまたは熱処理および／または化学処理された材料からなる少なくとも１つの吸着支持体；
前記対照核酸の一次配列に実質的に影響を及ぼすことなく、前記対照核酸の前記固相支持体への吸着を容易にし、および／または前記固相支持体からの前記対照核酸の脱着および／または特に保存の経過中に、前記固相支持体上の前記対照核酸の安定性の促進を容易にする、その上に吸着されている少なくとも１種類の担体剤；
−  場合により、その上に吸着されている前記対照核酸
を含み、
−  前記担体剤は、アルブミンの群より選択されるか；または
−  前記固相支持体は、その上に吸着されている前記対照核酸を含み、前記担体剤は、一般に検出法において妨害しないように、前記対照核酸および／または前記標的核酸に無関係または異質である核酸により構成される群から選択される、
前記固相支持体。
【請求項２１】
担体剤が、あらゆる天然に存在するヒト核酸に無関係な核酸である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項２２】
担体剤が、哺乳動物、特にヒトに対して病原体である天然に存在する物質から派生した核酸から派生したあらゆる核酸に無関係な核酸である、請求項２０〜２１のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項２３】
担体剤が、
−  ポリＡ、ポリＧ、ポリＣ、ポリＴ、ポリｄＡ、ポリｄＧ、ポリｄＣ、ポリｄＴ、ポリｄＵ、ホモポリデオキシリボヌクレオチド、ホモポリリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドのブロックポリマー、リボヌクレオチドのブロックポリマー、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのブロックポリマー、並びにそれらの混合物；
−  魚ＤＮＡ；
−  アルブミン
により構成される群から選択される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項２４】
担体剤が、
−  ホモポリデオキシリボヌクレオチド、例えばポリｄＡ、デオキシリボヌクレオチドのブロックポリマー、およびそれらの混合物；
−  ニシンＤＮＡ、特にニシン精子ＤＮＡ、およびサケＤＮＡ、特にサケ精子ＤＮＡ、並びにそれらの混合物；
−  アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
により構成される群から選択される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項２５】
担体剤が、
−  ホモポリデオキシリボヌクレオチド、例えばポリｄＡ、デオキシリボヌクレオチドのブロックポリマー、およびそれらの混合物；
−  アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
により構成される群から選択される、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項２６】
担体剤が、
−  ０．１〜５０μｇ、好ましくは１〜１０μｇ、より好ましくは４〜８μｇ、さらにより好ましくは５〜６μｇの核酸、または
−  ２〜１００μｇ、好ましくは５〜５０μｇ、より好ましくは１０〜３０μｇ、さらにより好ましくは１５〜２０μｇのアルブミン（例えばＢＳＡ）
を含む、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項２７】
支持体が、少なくとも１つの膜を含む、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項２８】
膜材料が、セルロース、化学的に処理したセルロースを含むセルロースに由来する材料、ガラスファイバー、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、織られた多孔性ポリマー、不織多孔性ポリマー、ＰＴＦＥ、多孔性ガラス、およびＰＶＤＦの群より選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項２９】
膜材料が、セルロース、化学的に処理したセルロースを含むセルロース由来材料、ガラスファイバー、ナイロン、ポリエーテルスルホン、およびポリプロピレンにより構成される群から選択される、請求項２７〜２８のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項３０】
膜材料が、セルロース、セルロース由来材料、およびナイロンの群より選択される、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項３１】
膜が、５０〜３０００ミクロン、好ましくは１００〜１５００ミクロン、より好ましくは１５０〜１０００ミクロンの範囲の厚さを有する、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項３２】
膜が、円盤、正方形、長方形、または細長い一片の形状を有する、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項３３】
膜が、１０〜５００ｍｍ２、好ましくは２０〜２５０ｍｍ２、より好ましくは３０〜２００ｍｍ２の範囲の表面を有する、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項３４】
酵素活性が、ＤＮＡｓｅおよび／またはＲＮａｓｅ活性を含むヌクレアーゼ活性を含む、請求項２０〜３３のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項３５】
固相支持体が、更に、その上に吸着されている少なくとも１種類の対照核酸を含む、請求項２０〜３４のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項３６】
対照核酸が、陽性対照、陰性対照、内部対照、外部対照、定性的対照、半定量的対照、定量的対照、リアルタイム増幅対照、およびそれらの組合せにより構成される群から選択される、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項３７】
対照核酸が、１０〜１０８個のコピー、好ましくは１０２〜１０５個のコピーの範囲の量で吸着されている、請求項３５〜３６のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項３８】
対照核酸が、１０〜１０００個のコピー、好ましくは２０〜５００個のコピー、より好ましくは５０〜１００個のコピーの範囲の量で吸着されている、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項３９】
一連の支持体が、好ましくは１０〜１０８個のコピー、より好ましくは１０２〜１０５個のコピー、さらにより好ましくは２０〜５００個のコピー、最も好ましくは５０〜１００個のコピーの範囲の対照核酸の検量範囲を提供するように、支持体の各々が、その上に吸着されている異なる標準的な量の同じ対照核酸を有する、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の複数の支持体を含む一連の支持体。
【請求項４０】
方法が、
−  吸着支持材料を提供するステップ；
−  全てのヌクレアーゼ活性を実質的に除去するように、前記支持体を熱処理および／または化学処理するステップ；
−  少なくとも１種類の担体剤を前記支持材料上に堆積させるステップ；
−  場合により、少なくとも１種類の対照核酸を前記支持体材料上に堆積させて、所望の量の前記対照核酸を前記支持体に吸着させるステップ
を含む、請求項２０〜３８のいずれか一項に記載の固相支持体の製造方法。
【請求項４１】
熱処理を、１００℃〜１８０℃の範囲の温度で行なう、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
化学的処理が、ＤＥＰＣ（ジエチル−ピロカーボネート）処理を含む、請求項４０〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
堆積ステップが、少なくとも１回のスポットするステップを含む、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
堆積ステップが、少なくとも１回の乾燥ステップを含む、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
乾燥ステップを、４５℃〜７０℃の範囲の、好ましくは６０℃付近の温度で行なう、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
−  請求項２０〜３８に記載の少なくとも１つの固相支持体および／または請求項３９に記載の少なくとも１つの一連の固相支持体；
−  場合により、前記固相支持体を容器に分配するための分配器；および
−  その使用説明書、
を含むキット。
【請求項４７】
キットが、
−  核酸抽出および／または精製のためのキット；
−  核酸検出のためのキット；
−  ＰＣＲ増幅、ＲＴ−ＰＣＲ増幅、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲを含む核酸増幅のためのキット；
−  疾患または症状の診断のためのキット
により構成される群から選択される、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、核酸検出の分野に関する。より正確には、本発明は、核酸検出のための固相支持体に関する。これらの固相支持体は、ＰＣＲなどの増幅反応における核酸対照鋳型に特に適合している。
【０００２】
背景技術
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＰＣＲをベースとした方法が、当該技術分野において知られている（Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Maniatis、Fritsch、およびSambrook、CSHLプレス；Molecular Biology of the Cell、Albertsら）。
【０００３】
これらの方法は、分子生物学者にとって非常に強力なツールである。ＰＣＲおよびＰＣＲをベースとした方法は、分子クローニング、ＤＮＡ断片調製、複雑な試料の解析、特に所与の配列の検出に使用できる。
【０００４】
ＰＣＲ法の特に重要な態様は、対照の使用である。大半の場合において、対照は、以下に詳述したように、ＰＣＲ条件の妥当性確認を可能とする。ＰＣＲは、一般に、平行して数個の別々のチューブ中で行なう。これらの各チューブは、典型的には、試料鋳型を、特定量のいわゆるＰＣＲ試薬混液と共に含む。前記ＰＣＲ試薬混液は、通常、増幅する鋳型を除く、ＰＣＲ反応に必要な試薬の大半を含む。陽性対照は、一般に、全ての所望の条件が実際に満たされれば、所望のＰＣＲ条件で増幅産物を生じることが知られ予期される既知の鋳型の使用を含む。陽性対照の使用を通じて、結果として、通常、ＰＣＲ条件が所与の実験において適切であるかどうか、例えば、マグネシウム濃度を含む塩条件がＰＣＲ反応が起こるのに適しているかどうか、または、ポリメラーゼが適切な量で存在するかどうかを評価することが可能である。換言すると、陽性対照の使用は、典型的には、ＰＣＲ条件の妥当性確認としての役目を果たし：陽性対照が全く増幅産物を生じない場合、通常、平行ＰＣＲチューブにおける他の結果は不適格である。なぜなら、他の陰性結果を妥当に解釈できないからである。
【０００５】
当業者には既知であるように、陽性対照はまた、一般に、リアルタイムＰＣＲ実験および定量的ＰＣＲ実験においても必須である。
【０００６】
しかし、実験における他の鋳型と同様に、陽性対照に使用される鋳型も、典型的には、液状形で溶液中に提供される。さらに、このような鋳型溶液のために調剤される容量は、非常に少量で、数マイクロリットルの範囲であることが極めて多い。従って、所望の鋳型が反応チューブに導入されたか否かを容量測定に基づいて評価することは困難であることが時にある。これは、ＰＣＲサイクルの前でさえそうである。
【０００７】
しかし、チューブ内で陽性対照の増幅が全くなされていない場合には、一般に、陽性鋳型対照が実際に添加されたかを確認する必要がある。増幅産物を得るためにどのパラメータを改変しなければならないかを同定するために、この仮説をチェックする必要があることが多い。
【０００８】
従って、所与の試料中の対照鋳型の存在について迅速で簡単で絶対的で明白で信頼性のあるチェックを可能とする装置および方法が必要である。
【０００９】
さらに、特に複雑な媒体中で使用するために、定性的対照固相支持体だけでなく、定量的対照固相支持体も必要である。
【００１０】
核酸鋳型用の固相支持体は、当該技術分野において既知であるが、本発明により今回解決されている問題に取り組む目的で設計されているものは全くなかった。事実、このような従来技術の支持体はそれに取り組むことができず；本発明に照らしても、このような従来技術の支持体は、吸着した核酸鋳型を再現的に放出する能力に関しては満足のいくものではないことが判明している。この点において、特に尿または血漿などの複雑な液体中の定量的対照鋳型用の支持体の機能を全く想定することができない。逆に、このような従来技術の支持体は、ＤＮＡ保存用に最適化されている。
【００１１】
例えば、米国特許第５９３９２５９号および米国特許第６１６８９２２号は、核酸保存用の固相支持体を記載し、これから前記核酸を放出することができる。しかし、これらの支持体は、カオトロピック塩を含んでいる。
【００１２】
米国特許第５８０７７２７号は、ＤＮＡ保存用の固体媒体を記載しているが、この従来技術の媒体は、必然的に、分解に対する防御効果を有する化合物、典型的には洗浄剤を含んでいる。
【００１３】
本発明者らは、それ故、定性的対照および定量的対照の両方の機能を想定することができる固相支持体を設計および製造した。顕著な特徴として、その機能を想定するために、本発明に記載の固相支持体は、カオトロピック塩の存在も、洗浄剤のような任意の他の化合物の存在も必要としない。
【００１４】
非常に顕著なことには、本発明に記載の支持体により、対照鋳型は、液体と接触した時に再現可能な様式で脱着することが可能となる。顕著には、この特徴は、複雑な液体および媒体（特にヒトまたは動物の生物学的試料、例えば尿、血液、血漿など）でさえ保存されているが、従来技術の支持体は、膜対照支持体として例えばＰＣＲ増幅に使用するのに必要とされる再現レベルを満たさないことが観察されている。
【００１５】
さらに、その構造、材料および寸法により、本発明に記載の固相支持体は、極めて取扱い易いという利点がある。特に、それらは十分に剛性で実質的に静電作用がないので、手動、半自動、または自動分配器を使用して容易に迅速に分配でき、これにより、実験規模およびより大規模の両方の多くの分子生物学的実験に有用となっている。
【００１６】
発明の記載
本発明の目的は、少なくとも１種類の対照核酸を参照することにより、少なくとも１種類の標的核酸の存在または不在を決定する方法を提供することである。
【００１７】
本発明によれば、少なくとも１種類の対照核酸を参照することにより少なくとも１種類の標的核酸の存在または不在を決定する方法が提供され、この方法は、前記標的核酸をその検出が可能となるように処理すること、前記対照核酸を同等な処理条件に付すこと、前記標的核酸で得られた検出結果を、前記対照核酸で得られた検出結果と比較することにより、前記標的核酸で得られた検出結果を有効または無効とすることを含み、
ここで、前記対照核酸は、固相支持体により提供され、前記対照核酸はその上に吸着されており、これからその一定量が脱着し、これにより、前記の同等な処理条件にかけるための実質的に量的に再現可能で制御された量の前記対照核酸が提供される。
【００１８】
我々は、本明細書で、項目の検出とは、前記項目の存在の決定（適用可能な場合）および／または量の決定（適用可能な場合）を実質的に可能とする任意の処理と理解する。
【００１９】
我々は、本明細書で、核酸とは、あらゆる核酸と理解し；それは合成であっても合成でなくても、組換えであっても天然に存在するものであっても、線状であっても環状であってもよい。これはＤＮＡおよびＲＮＡを含む。前記核酸は、一本鎖または二本鎖またはさらには三本鎖であってもよい。微生物（細菌、酵母など）または高等生物、例えば哺乳動物細胞などの様々な生物学的起源から派生していてもよい。前記核酸は、また、ウイルス性、例えばレトロウイルス性、例えばＨＩＶであってもよい。前記核酸はまた、全ＤＮＡ、全ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＢＡＣ  ＤＮＡ、およびそれらの混合物を含んでいてもよい。さらに、前記核酸は、様々な純度の状態を想定できる。
【００２０】
我々は、本明細書で、標的核酸とは、その存在（適用可能な場合）および／または量（適用可能な場合）を検出すべき任意の核酸と理解する。
【００２１】
１つの実施形態において、少なくとも１種類の標的核酸の検出法が提供され、この方法は、
−  その上に吸着されている前記の少なくとも１種類の対照核酸を含む前記固相支持体を提供し、前記対照核酸の一次配列に実質的に影響を及ぼすことなく、前記固相支持体を液体媒体と接触させて一定量の前記対照核酸が前記固相支持体から前記液体媒体中に脱着するようにするステップ；
−  場合により、前記対照核酸を含む得られた液体媒体をさらに処理するステップ；
−  前記の得られた、場合によりさらに処理された液体媒体に含まれるかまたはそれを起源とする前記対照核酸を、同等な処理条件に付して、これにより、前記標的核酸の処理と参照することによる処理対照を構築するステップ；
−  前記標的核酸が検出されているか否かを決定し、前記対照核酸が検出されているか否かを決定するステップ；
−  前記標的核酸検出結果を、前記対照核酸の１つと比較し、前記標的核酸検出結果を有効または無効とするステップ
を含む。
【００２２】
我々は、本明細書で、固相支持体とは、０℃〜１１０℃の温度範囲で固体状態を想定する任意の材料と理解する。特に、固相支持体は、０〜５０℃、好ましくは１５〜３０℃の温度範囲で、より好ましくは室温付近（２５℃）で、厚さおよび剛性により取扱いが簡単になる支持体を含む。
【００２３】
「対照」なる語句は、当業者には明白である。特に、前記処理の一般条件の有効または無効に寄与する、処理における任意の要素を意味する。「液体媒体」なる語句は、当業者には既知である。特に、４〜７０℃の範囲、より特定すると室温（２５℃）からヒト体温（３７℃）の温度で液体状態を想定できる、任意の媒体を包含するものと解釈される。このような液体媒体は、当業者に既知の様々な溶液、例えば、水溶液、緩衝液、水、注射等級の水などを含む。液体媒体は、体液、尿、血漿、血液、脳脊髄液などのいくつかの液体を含む。従って、液体媒体は、液体生物学的媒体も含む。前記液体媒体は、試料、例えば生物学的試料であってもよい。
【００２４】
我々は、本明細書で、一次配列とは、以下と理解する。核酸の場合、一次配列は、１本の核酸分子鎖に沿った塩基配列を含む。
【００２５】
本発明によれば、前記処理ステップは、一般に当該技術分野において知られている任意の処理ステップの少なくとも１つを含む。特に、前記処理ステップは、検出のための任意の処理ステップの少なくとも１つを含む。本明細書で理解されているように、検出は、核酸の存在もしくは不在または量を評価するための任意の検出処理または方法を含む（定性的および／または定量的検出）。特に、検出は、前記試料中の前記核酸の存在もしくは不在または量の測定を目的とした、少なくとも１種類の核酸を含むことのできる試料に適用された任意の処理または方法を含む。このような検出法および処理は、当該技術分野において既知である。その例は、ＰＣＲ増幅を含む増幅、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動、およびキャピラリー電気泳動などのゲル電気泳動を含む電気泳動、サザン解析、ノザン解析、プローブにより媒介されるハイブリダイゼーションを含むハイブリダイゼーション、ブロットハイブリダイゼーション、並びにそれらの組合せを非限定的に含む。このような技術は、当業者に既知である（Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Maniatis、Fritsch、およびSambrook、CSHLプレス）。
【００２６】
我々は、本明細書で、増幅とは、当該技術分野で知られているような増幅ステップを含む任意の種類の工程と理解する。これは、例えば、ＰＣＲ増幅、または任意の他の増幅、ＰＣＲをベースとしたものまたはそうでないものであってもよい。
【００２７】
我々は、本明細書で、ＰＣＲまたはＰＣＲ反応とは、任意のＰＣＲをベースとした反応と理解する。これは、標準的なＰＣＲ、定量的および半定量的ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、例えば二本鎖または三本鎖ＰＣＲ、並びにＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲなどを含む。
【００２８】
検出が、ＰＣＲ増幅などの増幅を含む場合、前記対照核酸は、対照核酸鋳型（または、本明細書では同義語として使用されている対照鋳型）として作用でき、従って、前記標的核酸は、おそらく、標的核酸鋳型（または、本明細書では同義語として使用されている標的鋳型）である。
【００２９】
「鋳型」または「増幅反応中の鋳型」または「対照鋳型」なる語句は、当業者には明白である。特に、これは、増幅反応において少なくとも部分的には増幅される、任意の核酸または分子を含むと理解される。前記鋳型は、様々な長さ、典型的には０．０５０〜１００ｋｂ、好ましくは０．０５０〜１０ｋｂ、より好ましくは０．１〜５．０ｋｂを有していてもよい。前記鋳型は、増幅反応の経過中にアンプリコンを生成する場合がある。
【００３０】
我々は、本明細書で、ハイブリダイゼーションとは、所与のストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションによる検出を含む任意の方法と理解する。当該技術分野で知られているように、ハイブリダイゼーションは、一般に、標的核酸の検出のためのプローブの使用を含む。
【００３１】
有利には本発明によると、これにより、対照核酸と参照することにより、標的核酸を検出する方法が提供される。前記方法は、多くの観点で応用を見出し、特に生物学的試料などの試料中の核酸の検出に応用を見出す。
【００３２】
本明細書で、生物学的試料とは、任意の生物学的材料と理解する。生物学的試料の例は、血清、血液、尿、脊髄液、糞便、血漿、頬側細胞、組織培養試料、細胞培養試料、植物試料、微生物培養液、細菌培養液などを含む試料または液体を含む。他の例は、当該技術分野で知られている任意の溶媒中の核酸溶液を含む。このような溶媒の例は、水、蒸留水、注射等級の水、ヌクレアーゼ非含有水、ＴＥなどを含む（Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Maniatis、Fritsch、およびSambrook、CSHLプレス）。
【００３３】
有利には前記方法によれば、対照の存在についての簡単で迅速で絶対的で明白で信頼性のあるチェックのための手段が提供され、これにより、実験データをより簡単に有効または無効と判断できる。
【００３４】
その上に吸着されている前記対照核酸を有する前記支持体は、直接、実験チューブに入れることができる。その結果、前記対照鋳型の存在を、視覚によるチェックにより迅速に簡単に絶対的に明白に信頼性をもって評価できる：前記チューブ中の前記対照核酸の存在（あまたは不在）は、有利には、前記チューブ中の前記支持体の存在（または不在）により表され、逆もそうである。液体媒体を前記チューブに添加した場合、支持体上に吸着されている任意の対照核酸は、制御的な様式で、実質的に量的に再現的に脱着する。従って、例えば水または緩衝液を単に添加することにより、前記対照核酸は、脱着により溶液中へと移動する。これにより、前記鋳型の存在は、前記固相支持体の存在により確認される。その後、前記固相支持体を取り出し廃棄することが可能であるか、または、単に液体媒体中に残すことが可能である。さらに、このような支持体は、核酸回収および／または精製手順中の対照として使用し得る。本発明によれば、前記液体媒体により、液体媒体と接触した時に、前記対照核酸は、制御的な様式で、実質的に量的に再現的に脱着することが可能となる。これは、有利には、前記鋳型の一次配列の実質的な変化を伴うことなく起こる。従って、その上に吸着されている対照核酸を有する前記支持体を、単に、解析する試料に添加してもよい。対照核酸が脱着した後、得られた液体媒体で処理ステップ、例えば核酸精製および／または抽出（回収）を行なうことが可能である。処理後の前記対照核酸の存在により、処理ステップの妥当性確認が可能となる。その一次配列は実質的に未変化であるので、その後、前記対照鋳型を、有利には、検出のために、例えばＰＣＲのような増幅反応において更に処理できる。検出のための処理の実際の性質は、それ自体限定されていないので、本発明に記載の前記方法は、有利には、対照核酸が関与する全てではないが大半の核酸検出法において有用である。
【００３５】
本発明に記載の方法の特に好ましい実施形態は、増幅の分野に関する。
【００３６】
特に、検出のための前記処理は、少なくとも１回の増幅ステップ、好ましくはＰＣＲ増幅ステップを含むことができる。
【００３７】
本発明に記載の方法は、ＰＣＲを介した検出（分析ＰＣＲ）の分野において特に有利であり、ここでは対照核酸の使用が重要な問題である。これは特に定量的ＰＣＲに当てはまり、ここでは定性的対照だけでなく定量的対照も必要とされる。
【００３８】
有利には本発明によれば、前記支持体により、液体媒体と接触するように配置した場合、前記対照核酸は、制御的な様式で再現的に脱着することが可能となる。これは、半定量的または定量的ＰＣＲの場合に特に重要である。対照核酸の出発量は、有利には正確に制御されている。従って、チューブ中への不正確なピペッティングに起因する誤差はない。本発明によれば、対照核酸は、支持体材料から再現的に定量的に放出されることができる。鋳型の存在は、また、増幅のためのさらなる処理が開始される前に容易にチェックされる（視覚によるチェック）。
【００３９】
当業者は、このようなＰＣＲ増幅ステップをどのように行なうか、特に、適切な増幅反応条件をどのように選択するかを知っているだろう。当業者はまた、適切な対照をどのように選択し、どのようにその結果を解釈するか（前記検出結果の有効または無効）を知っているだろう。
【００４０】
我々は、本明細書で、ＰＣＲ増幅反応条件とは、ＰＣＲ反応を通常行なう全ての条件を意味する。これは、一般的な塩（イオン強度、マグネシウム濃度範囲）、温度、ストリンジェンシー、酵素条件およびサイクリング条件を含む。
【００４１】
本発明によれば、その後、前記方法は、前記増幅のために必要な試薬を提供するステップを含む。有利には、前記の必要な試薬の少なくともいくつかが、適切なＰＣＲ試薬混液の形で提供される。当業者は、このようなＰＣＲ試薬混液中に存在する成分を知っている（Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Maniatis、Fritsch、およびSambrook、CSHLプレス）。ＰＣＲ試薬混液の成分の例は、蒸留水または滅菌水またはＤＮＡｓｅ非含有水またはＲＮａｓｅ非含有水、マグネシウムイオン、Ｔａｑ、Ｖｅｎｔのような少なくとも１つのポリメラーゼ、マグネシウムのような様々な塩、ポリＴを含むＰＣＲ反応用のプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド、サイバーグリーン（SyberGreen）（登録商標）などの色素、Ｔａｑｍａｎプローブまたは分子ビーコンプローブのような内部プローブ（ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＥＴ、ＶＩＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＬＣ６４０、ＬＣ７０５などの当該技術分野において知られている色素、およびダブシル、ブラックホールクエンチャー、エクリプスダーククエンチャーなどの当該技術分野において知られているクエンチャーを使用）、デオキシヌクレオチド、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、ｄＮＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびその誘導体、例えばフルオロフォアでタグ化したものを含む。当業者は、前記成分のための適切な最終濃度と共に、適切なプライマーおよびプローブをどのように選択するかを知っているだろう（Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Maniatis、Fritsch、およびSambrook、CSHLプレス）。
【００４２】
本発明に記載の好ましい実施形態において、前記ＰＣＲ試薬混液は、鋳型を除く、ＰＣＲ反応に必要な全ての反応物を含む。例えば、ＰＣＲ試薬マスター混液を使用することが可能である。当業者は、このような試薬マスター混液をどのように調製するかを知っている。有利には、前記試薬マスター混液は、全ての所望の反応チューブ中に分配するに十分な容量の、ＰＣＲ反応に必要な共通の成分を含む。このように、反応条件は、前記の共通した成分が、同じＰＣＲ試薬マスター混液から派生しているので可能な限り同等であることができる。
【００４３】
本発明に記載の前記方法において、前記固相支持体は、任意の形状または任意の形態で提供することができる。好ましく特に有利な実施形態において、前記固相支持体は、少なくとも１つの膜を含む。前記膜のための好ましい材料は、セルロース、化学的に処理したセルロースを含むセルロース由来材料、ガラスファイバー、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、織られた多孔性ポリマー、不織多孔性ポリマー、ＰＴＦＥ、多孔性ガラス、およびＰＶＤＦにより構成される群から選択される材料を含む。これらの材料の中で、特に好ましい材料は、セルロース、化学的に処理したセルロースを含むセルロース由来材料、ガラスファイバー、ナイロン、ポリエーテルスルホン、およびポリプロピレンにより構成される群から選択される材料を含む。最も好ましい材料は、セルロース、セルロース由来材料、およびナイロンにより構成される群から選択される。
【００４４】
本発明に記載の前記方法において、前記膜の形状および寸法に関する制限は殆どない。１つの実施形態において、前記膜は、５０〜３０００ミクロン、好ましくは１００〜１５００ミクロン、より好ましくは１５０〜１０００ミクロンの範囲の厚さを有する。別の実施形態において、前記膜は、円盤、正方形、長方形、または細長い一片の形状を有する。
【００４５】
本発明に記載の前記方法において、前記固相支持体は、有利には、更に、その上に吸着されている少なくとも１種類の担体剤を含む。前記担体剤は、有利には、前記の同等な処理条件に付すための、実質的に量的に再現可能で制御された量の前記対照核酸を提供することに寄与する。前記担体剤は、当業者により判断できるように、核酸に対して担体効果を有する作用物質である。前記対照核酸の検出処理および／または前記標的核酸の検出を妨害しない限り、どのような担体剤であってもよい。１つの実施形態において、前記担体剤は、
前記対照核酸の検出処理を有利には実質的に妨害しないように、前記対照核酸と無関係または異質である核酸；
タンパク質
により構成される群から選択される。
【００４６】
本発明に記載の前記方法において、前記担体剤は、好ましくは、特にＰＣＲなどの増幅の場合に、前記対照核酸および前記標的核酸の検出処理を実質的に妨害しないように、前記対照核酸とは無関係または異質で、また前記標的核酸とも無関係または異質である核酸であってもよい。前記担体剤の例は、ポリＡ、ポリＧ、ポリＣ、ポリＴ、ポリｄＡ、ポリｄＧ、ポリｄＣ、ポリｄＴ、ポリｄＵ、ホモポリデオキシリボヌクレオチド、ホモポリリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドのブロックポリマー、リボヌクレオチドのブロックポリマー、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのブロックポリマー、並びにそれらの混合物により構成される群から選択される。別の実施形態において、前記担体剤は、
魚ＤＮＡ、例えばニシンＤＮＡ、特にニシン精子ＤＮＡ、およびサケＤＮＡ、特にサケ精子ＤＮＡ、並びにそれらの混合物；
アルブミン、特にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により構成される群から選択される。
【００４７】
本明細書で、アルブミンとは、任意の種類のアルブミン、例えば動物アルブミン（哺乳動物およびサルのアルブミンを含む）と理解する。非制限的な例は、ヒツジ、ヤギ、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒト、イヌ、ラット、ネコ、マウス、サル、ロバ、ハムスター、ウマ、ニワトリ、七面鳥を含む。
【００４８】
本発明に記載の好ましい実施形態において、前記担体剤は、
ホモポリデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドのブロックポリマー、およびその混合物；
アルブミン、特にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により構成される群から選択される。
【００４９】
有利には本発明に記載の方法において、このような担体剤は、検出のための大半の処理ステップにおいて、特にＰＣＲ、定量的ＰＣＲおよび／またはリアルタイムＰＣＲの枠組み内で、一般に、高度な性能を有することが証明されている。
【００５０】
他の仮想的な担体剤候補も出願人により試験されたが、前記の対照核酸を前記固相支持体から再現可能な様式で放出する能力において不満足であることが明らかとなった。例えば、出願人は、担体剤として糖、特にサッカロースを試験した（Merck、参考文献１．０７６８７．１０００）。しかし、サッカロースの使用により、固相支持体からの対照核酸の放出の再現性は低かった。
【００５１】
従って、本発明は、対照核酸を含む方法を提供する。前記対照核酸は、当業者に知られているように、様々な種類が存在し得る。有利には本発明によれば、前記対照核酸は、陽性対照、陰性対照、内部対照、外部対照、定性的対照、半定量的対照、定量的対照、リアルタイム増幅対照、およびそれらの組合せにより構成される群から選択できる。従って、前記方法は、対照核酸が関与する全てではなくても多くの場合において有用である。
【００５２】
本発明に記載の前記方法はまた、さらなるステップを含んでいてもよい。特に、検出のための前記の核酸処理は、複数および／または更なるステップを含むことが可能である。
【００５３】
１つの実施形態において、前記処理ステップは、前記の核酸検出ステップの前に、少なくとも１回の核酸抽出および／または精製ステップを含む。
【００５４】
別の実施形態において、前記処理ステップは、少なくとも１回のハイブリダイゼーションステップを含む検出ステップを含む。
【００５５】
更に別の実施形態において、前記処理は、少なくとも１回のＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ、特にリアルタイムおよび定量的ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを含む検出ステップを含む。
【００５６】
好ましくは本発明によれば、前記標的核酸検出は、定量的検出、好ましくはリアルタイム定量的検出である。
【００５７】
また好ましくは本発明によれば、前記対照核酸検出は、定量的検出、好ましくはリアルタイム定量的検出である。全てのこのようなステップは、当業者に既知である（Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Maniatis、Fritsch、およびSambrook、CSHLプレス）。
【００５８】
好ましくは、本発明に記載の検出法は、ヌクレアーゼ非含有条件下で行なう。
【００５９】
別の態様において、本発明の更なる目的は、核酸用の固相支持体を提供することである。
【００６０】
特に、本発明は、少なくとも１種類の対照核酸用の固相支持体を提供し、前記固相支持体は、先に記載したように、本発明に記載の少なくとも１種類の対照核酸と参照することにより、少なくとも１種類の標的核酸の存在または不在を決定する方法を行なうために特別に適合されている。
【００６１】
本発明によれば、本発明に記載の少なくとも１種類の対照核酸と参照することにより、少なくとも１種類の標的核酸の存在または不在を決定する方法を行なうに特別に適合した固相支持体が提供され、前記固相支持体は、
前記対照核酸の前記固相支持体への非共有結合的な吸着が可能となるような組成および構造を有し、酵素活性を実質的に全く有さないように熱処理および／または化学処理しているまたは熱処理および／または化学処理された材料からなる少なくとも１つの吸着支持体；
前記対照核酸の一次配列に実質的に影響を及ぼすことなく、前記対照核酸の前記固相支持体への吸着を容易にし、および／または前記固相支持体からの前記対照核酸の脱着および／または特に保存の経過中に、前記固相支持体上の前記対照核酸の安定性の促進を容易にする、その上に吸着されている少なくとも１種類の担体剤を含む。
【００６２】
前記支持体材料は、疎水性でなくても疎水性であってもよい。本発明に記載の固相支持体にはあらゆるサイズおよび形状が可能である。
【００６３】
吸着剤とは、我々は、全く特別な化学的な前処理をしなくても溶液を実質的に即座に吸収することができるくらい、水溶液に対する十分に高い親和性を有する任意の材料と理解する。
【００６４】
構造とは、我々は、材料を特徴づける任意の構造特徴と理解する。これは、マクロ構造（例えば、層、亜部分、複合構造などの存在）並びにミクロ構造（例えば架橋レベル、孔密度、平均孔サイズなど）を含む。
【００６５】
我々は、本明細書で、非共有結合的な吸着とは、厳密には共有結合ではない、任意の種類の化学結合と理解する。これは、イオン結合、水素結合、例えばファンデアワールス力、双極性相互作用を通した静電結合を含む。
【００６６】
我々は、本明細書で、酵素活性とは、酵素から生じる任意の触媒活性と理解する。これは、プロテアーゼ活性、ヌクレアーゼ活性、特にエンドおよびエキソヌクレアーゼ活性、並びにＤＮＡｓｅ（ＤＮＡｓｅＩ、制限酵素など）およびＲＮａｓｅ活性（例えばＲＮａｓｅＩ）を含む。好ましくは、前記酵素活性は、ＤＮＡｓｅおよび／またはＲＮａｓｅ活性を含むヌクレアーゼ活性を含む。
【００６７】
我々は、本明細書で、担体剤とは、当業者により判断できるように、核酸に対する担体効果を有する任意の作用物質と理解する。それはここで、前記対照核酸の一次配列に実質的に影響を及ぼすことなく、前記対照核酸の前記固相支持体上への吸着を容易にし、および／または前記対照核酸の前記固相支持体からの脱着および／または特に保存の経過中に、前記固相支持体上の前記対照核酸の安定性の促進を容易にする任意の作用物質であってもよい。１つの実施形態において、前記担体剤は、
−  検出法を一般に妨害しないように、前記対照核酸および／または前記標的核酸に無関係または異質である核酸；
−  タンパク質性の担体剤、
により構成される群から選択される。
【００６８】
当業者は、このような担体剤をどのように選択するかを知っているだろう。前記担体は、有利には、前記標的核酸に無関係であるか、または、前記対照核酸に無関係であるか、または両方に無関係である。
【００６９】
好ましい実施形態において、前記担体剤は、任意の天然のヒト核酸に無関係な核酸である。従って、前記担体剤は、有利には、実質的に、（対照および／または標的としての）ヒト核酸の検出を妨害しない。
【００７０】
別の好ましい実施形態において、前記担体剤は、哺乳動物、特にヒトに対して病原体である任意の天然に存在する物質から派生した核酸から派生したあらゆる核酸に無関係な核酸である。従って、前記担体剤は、有利には一般に、酵母、真菌、細菌、ウイルスなどの病原体および微生物から派生した（対照および／または標的としての）核酸の検出を妨害しないだろう。
【００７１】
好ましい実施形態において、前記担体剤は、
ポリＡ、ポリＧ、ポリＣ、ポリＴ、ポリｄＡ、ポリｄＧ、ポリｄＣ、ポリｄＴ、ポリｄＵ、ホモポリデオキシリボヌクレオチド、ホモポリリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドのブロックポリマー、リボヌクレオチドのブロックポリマー、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのブロックポリマー、並びにそれらの混合物；
魚ＤＮＡ；
タンパク質、例えばアルブミン
により構成される群から選択される。
【００７２】
アルブミンにより、これにより、任意の種類のアルブミン、例えば動物アルブミン（哺乳動物およびサルアルブミンを含む）と理解する。非制限的な例は、ヒツジ、ヤギ、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒト、イヌ、ラット、ネコ、マウス、サル、ロバ、ハムスター、ウマ、ニワトリ、七面鳥を含む。
【００７３】
好ましくは、前記担体剤は、
ホモポリデオキシリボヌクレオチド、例えばポリｄＡ、デオキシリボヌクレオチドのブロックポリマー、およびそれらの混合物；
ニシンＤＮＡ、特にニシン精子ＤＮＡ、およびサケＤＮＡ、特にサケ精子ＤＮＡ、並びにそれらの混合物；
アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
により構成される群から選択される。
【００７４】
最も好ましい実施形態において、前記担体剤は、
ホモポリデオキシリボヌクレオチド、例えばポリｄＡ、デオキシリボヌクレオチドのブロックポリマー、およびそれらの混合物；
アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
により構成される群から選択される。
【００７５】
他の仮想的な担体剤候補も出願人により試験されたが、前記の対照核酸を前記固相支持体から再現可能な様式で放出する能力において不満足であることが明らかになった。例えば、出願人は、担体剤として糖、特にサッカロースを試験した（Merck、参考文献１．０７６８７．１０００）。しかし、サッカロースの使用により、固相支持体からの対照核酸の放出の再現性は低かった。
【００７６】
前記ポリＡ、ポリＧ、ポリＣ、ポリＴ、ポリｄＡ、ポリｄＧ、ポリｄＣ、ポリｄＴ、ポリｄＵ、ホモポリデオキシリボヌクレオチド、ホモポリリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドのブロックポリマー、リボヌクレオチドのブロックポリマー、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのブロックポリマーの長さ（キロベース、ｋｂ）は、本発明内では重要ではない。
【００７７】
本発明に記載の前記固相支持体上の担体剤の量は、前記対照核酸の実質的に量的に再現可能で制御された脱着に寄与するに十分な量で存在する限り、限定されない。１つの実施形態において、前記担体剤は、６ｍｍ×６ｍｍ四角の膜固相支持体あたり、０．１〜５０μｇ、好ましくは１〜１０μｇ、より好ましくは５〜６μｇ、さらにより好ましくは４〜８μｇの核酸を含む。当業者は、前記固相支持体のサイズおよび寸法に応じて、前記核酸担体剤の量をどのように適合させるかを知っているだろう。
【００７８】
別の実施形態において、前記担体剤は、６ｍｍ×６ｍｍ四角の膜固相支持体あたり、２〜１００μｇ、好ましくは５〜５０μｇ、より好ましくは１０〜３０μｇ、さらにより好ましくは１５〜２０μｇのＢＳＡを含む。ここでも、当業者は、前記固相支持体のサイズおよび寸法に応じてタンパク質の量をどのように適合させるかを知っているだろう。
【００７９】
有利には本発明によれば、前記固相支持体は、特に取扱い易く、かなり剛性であり、静電作用を受けない。これにより、一般的な実験操作に特に有用となる。
【００８０】
１つの実施形態において、本発明に記載の前記固相支持体は、更に、その上に吸着されている対照核酸を含む。前記対照核酸は、当該技術分野において知られている任意の種類の対照核酸であってもよい。好ましい実施形態において、前記対照核酸は、陽性対照、陰性対照、内部対照、外部対照、定性的対照、半定量的対照、定量的対照、リアルタイム増幅対照、およびそれらの組合せにより構成される群から選択される。検出する標的核酸に応じて、当業者は、このような対照をどのように選択するか、検出工程におけるその関連性を知っているだろう。例えば、陰性対照の場合、通常、前記標的核酸の検出により検出されない対照核酸を選択することが有用である。同様に、陽性対照の場合、当業者は、検出でシグナルを発生する傾向のある対照核酸を選択するだろう。前記固相支持体上に吸着されている前記対照核酸は、様々な量で存在することができる。必要性および検出の性質に応じて、当業者は、どのくらいの量が適切または望ましいかを知っているだろう。例えば、前記対照核酸は、１０〜１０８個のコピー、好ましくは１０２〜１０５個のコピーの範囲の量で吸着されている。また、前記対照核酸は、１０〜１０００個のコピー、好ましくは２０〜５００個のコピー、より好ましくは５０〜１００個のコピーの範囲の量で吸着されると予想される。有利には本発明によれば、前記固相支持体上に吸着されている対照核酸の量は、既知であり決定されている。この可能性は、定量的検出、例えば定量的ＰＣＲに特に適合する。
【００８１】
非常に有利には本発明によれば、前記支持体は、上に吸着されている非常に少量の対照核酸と一緒に再現可能な様式で使用するように設計されている。これは確かに、ＰＣＲ、特にリアルタイムおよび定量的ＰＣＲの場合には有用である。従来技術の支持体は、このような少量の核酸用には設計されていなかった。
【００８２】
本発明に記載の前記固相支持体は、その実質的な特徴を保持している限り、任意の形状を有することができる。好ましい実施形態において、前記固相支持体は、有利には、少なくとも１つの膜を含む。本発明によれば、前記膜は、セルロース、化学的に処理したセルロースを含むセルロース由来材料、ガラスファイバー、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、織られた多孔性ポリマー、不織多孔性ポリマー、ＰＴＦＥ、多孔性ガラス、およびＰＶＤＦの群より選択できる。他の適切な材料も、おそらく、前記膜に使用できるが、ただし、前記対照核酸の非共有結合的な吸着が可能となるような組成および構造を有し、実質的に全く酵素活性を有さないように熱処理および／または化学処理しているまたは熱処理および／または化学処理された吸着材料である。当業者は、このような材料を知っているだろう。好ましい実施形態において、前記膜材料は、セルロース、化学的に処理したセルロースを含むセルロース由来材料、ガラスファイバー、ナイロン、ポリエーテルスルホン、およびポリプロピレンにより構成される群から選択される。より好ましくは、前記膜材料は、セルロース、セルロース由来材料、およびナイロンの群より選択される。本発明に記載の好ましい材料は、セルロースおよびナイロンであり、その中でセルロースが最も好ましい。
【００８３】
前記膜は、おそらく取扱い易さを維持する限り、当業者により判断できるように、様々な厚さを有することができる。特に好ましいのは、その厚さのために、分配器の助けにより分配することのできる膜である。好ましい実施形態において、前記膜は、５０〜３０００ミクロン、好ましくは１００〜１５００ミクロン、より好ましくは１５０〜１０００ミクロンの範囲の厚さを有する。
【００８４】
本発明に記載の固相支持体には任意のサイズおよび形状が可能である。好ましい実施形態において、前記固相支持体は、膜の形状である。最も好ましくは、前記膜は、円盤、正方形、長方形、または細長い一片の形状を有する。別の好ましい実施形態において、前記膜は、直径６ｍｍの円盤形状または６ｍｍ四角を有する。更に別の実施形態において、前記膜は、１０〜５００ｍｍ２、好ましくは２０〜２５０ｍｍ２、より好ましくは３０〜２００ｍｍ２の表面を有する。他のサイズおよび形状も可能である。当業者は、どのサイズおよび形状が前記膜に適しているかを知っているだろう。有利には本発明によれば、その後、前記支持体は、分子生物学で知られている全てではなくても大半の通常の容器およびチューブにフィットするだろう。例えば、前記支持体は、１．５ｍＬのエッペンドルフ（登録商標）チューブ、並びに、例えば溶血チューブなどの殆どの体液用の収集チューブにフィットするだろう。
【００８５】
従って、本発明は、少なくとも１種類の対照核酸のための固相支持体に関し、前記固相支持体は、本発明に記載の少なくとも１種類の標的核酸の検出法を実施するのに特別に適合されており、前記固相支持体は、
−  前記対照核酸の前記固相支持体への非共有結合的な吸着が可能となるような組成および構造を有し、酵素活性を実質的に全く有さないように熱処理および／または化学処理しているまたは熱処理および／または化学処理された材料からなる少なくとも１つの吸着支持体；
−  前記対照核酸の一次配列に実質的に影響を及ぼすことなく、前記対照核酸の前記固相支持体への吸着を容易にし、および／または前記固相支持体からの前記対照核酸の脱着および／または特に保存の経過中に、前記固相支持体上の前記対照核酸の安定性の促進を容易にする、その上に吸着されている少なくとも１種類の担体剤；
−  場合により、その上に吸着されている前記対照核酸を含み、
ここで、前記担体剤は、
−  検出法を一般に妨害しないように、前記対照核酸および／または前記標的核酸とは無関係または異質である核酸；
−  タンパク質性の担体剤
により構成される群から選択される。
【００８６】
本発明の別の目的は、本発明に記載の複数の支持体を含む、一連の支持体を提供することであり、これにより、前記の一連の支持体が有利には前記対照核酸の検量範囲を提供する。
【００８７】
複数により、少なくとも３、好ましくは少なくとも５または１０を意味する。
【００８８】
好ましい実施形態において、前記の一連の前記支持体の各々が、その上に吸着されている異なる標準的な量の同じ対照核酸を有し、これにより、前記の一連の支持体が、前記対照核酸の検量範囲を提供する。このような範囲は、本発明に記載の検出法には特に有用であり、従って、検出が定量を含む場合には特に使用できる検量範囲を提供する。当業者は、前記対照核酸の性質および行なう検出に応じて、どのように前記の標準的な量を選択するのかを知っているだろう。本発明に記載の１つの実施形態において、前記の一連の固相支持体は、１０〜１０８個のコピー、好ましくは１０２〜１０６個のコピー、より好ましくは１０２〜１０５個の範囲の標準的なコピーの量を提供する。別の実施形態において、前記範囲は、好ましくは、２０〜５００個のコピー、より好ましくは５０〜１００個のコピーである。このような範囲は、定量的ＰＣＲを含む標準的な核酸検出法に特に適合されている。
【００８９】
本発明の更なる目的は、本発明に記載の固相支持体の製造工程を提供することである。
【００９０】
好ましい実施形態において、前記工程の少なくとも一部、好ましくは全体を、ヌクレアーゼ非含有条件下で行なう。
【００９１】
本発明によれば、本発明に記載の固相支持体の製造工程が提供され、前記工程は、
−  吸着支持材料を提供するステップ；
−  全てのヌクレアーゼ活性を実質的に除去するように、前記支持体を熱処理および／または化学的処理するステップ；
−  少なくとも１種類の担体剤を、前記支持材料上に堆積させるステップ；
−  場合により、少なくとも１種類の対照核酸を前記支持材料上に堆積し、所望の量の前記対照核酸を前記支持体上に吸着させるステップ
を含む。
【００９２】
当業者は、どの熱処理および／または化学処理ステップが、全てのヌクレアーゼ活性を実質的に除去するのに適しているかを知っているだろう。これは、通常、ヌクレアーゼを阻害、失活、または分解するための物理的および／または化学的作用を含む。好ましい実施形態において、前記の熱処理は、１００℃以上の温度で行なう。例えば、前記の熱処理ステップは、１００℃〜１２１℃または１００℃〜１９０℃、好ましくは１００℃〜１８０℃で行なうことができる。別の好ましい実施形態において、前記の化学処理ステップは、少なくとも１回のＲＮａｓｅ阻害剤処理、例えばＤＥＰＣ（ジエチル−ピロカーボネート）処理を含んでいてもよい。
【００９３】
堆積ステップは、当業者に既知である。好ましい実施形態において、前記担体剤（それぞれの対照核酸）は溶液として提供される。好ましくは、その濃度は既知である。溶媒は、当業者には知られているように、その適切な溶媒から選択できる。このような溶媒の例は、水、蒸留水、ヌクレアーゼ非含有水、ＴＥなどを含む（Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Maniatis、Fritsch、およびSambrook、CSHLプレス）。最も好ましい実施形態において、前記堆積ステップは、スポットするステップを含む。前記のスポットするステップは、例えば、ピペット、マイクロピペット、マルチチャネルピペット、自動ピペッティング装置などまたはそれらの組合せを用いて、当該技術分野において知られている任意の適切なスポットする装置を用いて行なうことができる。当業者は、前記のスポットするステップに使用するに適した装置を知っている。スポットする容量は、所望の量のスポットする前記担体剤（それぞれの対照核酸）溶液および前記溶液の濃度に応じて、当業者が選択することができる。好ましい実施形態において、前記堆積ステップは、少なくとも１回の乾燥ステップを含む。前記ステップは、当業者には既知であるように、いくつかの方法で遂行することができる。特に、好ましい実施形態において、乾燥ステップは、４０℃を超える、好ましくは５０℃を超える、より好ましくは６０℃を超える温度で行なう。別の好ましい実施形態において、乾燥ステップは、４５℃〜７０℃の範囲、好ましくは６０℃付近の温度で行なう。有利には本発明によれば、前記の吸着した対照核酸は、乾燥条件下で保存できることから、非常に安定である。この保存様態により安定性が向上し、液体保存と比べて取扱いが簡単になる。更に、本発明によれば、前記対照核酸は、一般に、少なくとも一年間室温で保存できるが、液体保存には、典型的には、冷却手段（例えば、冷蔵庫、冷凍庫）が必要である。
【００９４】
本発明のまた更なる目的は、キットを提供することである。
【００９５】
本発明によれば、
−  先に記載したような、本発明に記載の少なくとも１つの固相支持体および／または少なくとも１つの一連の固相支持体；
−  場合により、前記固相支持体を容器に分配するための分配器；および
−  その使用説明書、
を含むキットが提供される。
【００９６】
有利には本発明によれば、前記キットは、その使用説明書を含む。前記説明書は、有利には、小冊子、カードまたは類似物であってもよい。前記説明書はまた、以下の２つの形であってもよい：キットおよびその使用に関する網羅的な情報を集めた詳細なもの；および、その使用に必要とされる実質的な情報を集めたクイックガイド形またはメモ。
【００９７】
本発明によれば、前記キットは、前記固相支持体を容器に、例えばチューブに、特にＰＣＲ反応チューブまたはＰＣＲプレートに分配するための分配器を含んでいてもよい。前記分配器の可能な実施形態を、図１および２に示す。前記分配器により、操作者が直接接触する必要なく、前記支持体を容易に取り扱うことが可能となり、前記支持体の操作または接触による汚染のリスクは有利に低減する。汚染は、特にＰＣＲ反応の場合にはできる限り避けるべきである。前記分配器は、有利には、前記固相支持体を前記容器に直接分配するための半自動分配器であってもよい。
【００９８】
前記キットは、様々な目的に役立つことができる。いくつかの好ましい実施形態において、前記キットは、
−  核酸抽出および／または精製のためのキット；
−  核酸検出のためのキット；
−  ＰＣＲ増幅、ＲＴ−ＰＣＲ増幅、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲを含む、核酸増幅のためのキット；
−  疾患または症状の診断のためのキット、
により構成される群から選択される。
【００９９】
有利には本発明によれば、前記キットは、更に、核酸抽出および／または核酸精製および／または核酸の更なる検出および／または核酸増幅を遂行するのに有用な追加の試薬を含んでいてもよい。
【０１００】
好ましい実施形態において、本発明に記載の前記キットは、ＰＣＲ増幅のためのキットである。その場合、前記キットは、増幅反応に必要とされる試薬の少なくともいくつかを含む、ＰＣＲ試薬混液を含んでいてもよい。より好ましい実施形態において、前記キットは、定量的ＰＣＲまたは診断キットとして設計されている。このような診断キットは、試料中の核酸標的鋳型の検出による、および／または前記試料中のこのような標的鋳型の量の測定による、疾患または症状の診断に適している。
【０１０１】
従って、本発明は、少なくとも１種類の標的核酸の検出のための、方法、装置（固相支持体）、およびキットを提供する。
【０１０２】
この点において、本出願は、環境、農業、品質制御などのような多くの分野に関する。特に、本発明は、診断の分野および診断法に関する。先に述べた支持体、処理、方法、およびキットは、診断手順の枠内で使用できる。例えば、適用には、例えば患者の生物学的試料中の、病原体の核酸配列の検出および／または用量が含まれる。
【０１０３】
診断により、我々は、その段階に関係なく、疾患、症状、または病的状態もしくは非病的状態の決定または評価に寄与する任意の方法と理解する。
【０１０４】
本発明に記載の産物、工程、および方法の利点は、以下の実施例から明らかとなり、この実施例は、単なる実例として以下に示し制限的なものではない。
【０１０５】
実施例
実施例１：本発明に記載の固相支持体の調製
試薬：
−  膜ホワットマン９２０μｍ（参照番号ホワットマン：３０１７９１５；参照番号ＶＷＲ：Ａ７１９９００６）（グレード１７ｃｈｒ、滑らかなセルロース、４１３ｇ／ｍ２）
−  水＋オートクレーブにかけた０．１％ＤＥＰＣ
−  担体剤：
・ＢＳＡインビトロジェン・ライフ・バイオテクノロジーズ（BSA Invitrogen Life biotechnologies）（参照番号１５５５６１−０２０）、または
・ポリｄＡアマシャム・バイオサイエンシーズ（Amersham Biosciences）（参照番号２７−７８３６−０１）。
【０１０６】
膜を、ＲＮａｓｅ非含有条件下で、ＲＮａｓｅ非含有ツール（はさみ、外科用メス、鉛筆、定規を、ＲＮａｓｅ・アウェイ（RNase Away）（登録商標）を用いて清浄した）を用いて正方形の片（６ｍｍ×６ｍｍ）に切断した。
【０１０７】
ＲＮａｓｅ非含有条件下で（ＲＮａｓｅ・アウェイ（登録商標）で拭いたクリーンベンチおよびフード）：
−  膜を、水＋ＤＥＰＣ０．１％（ジエチルピロカーボネート）（「水＋ＤＥＰＣ」）で湿らせた；
−  膜を密閉ボックスに入れ、乾燥するまで１００℃で３０分間滅菌し（このステップはまた、その後に膜を使用するためにＤＥＰＣを失活させるという利点も与える）；膜を、ここで、数日間室温で保存することができた；
−  ６０℃で１０分間乾燥させた；
−  所望の担体剤を含む溶液をスポットし、所望の量（例えば、６μｇのポリｄＡまたは２０μｇのＢＳＡ）を吸着するように適切な容量をスポットした；
−  ポリｄＡ溶液を、適切な濃度で、水＋ＤＥＰＣ中にアリコートとして保存できた；
−  ＢＳＡを、水ＤＥＰＣを用いてストック溶液から即時に希釈した；
−  フードの下で、１つの膜当たり５μＬ（有利には、スポットするコピー数を制御した。例えば、コピー数は、１０μＬ当たり１０〜１０８コピーの範囲であってもよい）の二本鎖または一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを（対照核酸として）含む溶液をスポットした；
−  ６０℃で１０分間乾燥させた。
【０１０８】
ここで、膜の使用準備が整った。あるいは、膜を、４℃で、例えばエッペンドルフチューブ（登録商標）に一晩保持してもよい。
【０１０９】
実施例２：支持体材料の比較
様々な膜の種類を、固相支持体として試験した。好ましい材料群を以下に要約した：
【０１１０】
【表１】
2007515181.tif 000002
【０１１１】
特に良好な結果が、以下の材料で得られた：
−  セルロース膜、例えばホワットマン・グレード１、参照番号１００１９１７
−  ナイロン膜、例えばバイオラッド・ゼータ・プローブ、参照番号１６２０１５３。
【０１１２】
有利には、本発明に記載の膜および支持体は、以下の特徴を示した：
−  それらは取扱い易く、かなり剛性であり、静電作用を受けなかった。
−  それらは、再現性のある核酸脱着を可能とした。
−  それらは、水媒体中で抽出後に高い放出速度を遂行した。
−  放出は、膜を水中に再懸濁した後および抽出後に再現性があった。
−  それらは、実質的に、抽出の経過中も影響を受けず、特にそれらは化学的処理、例えばエタノールおよび溶解緩衝液による処理に抵抗性であった。特に、その構造および機械的特性は、このような処理の後にも実質的に未変化であり続けた。
−  それらは、その構造および機械的特性が、特に１５、２０、または３０分間を超える時間の１００℃以上での熱処理後にも実質的に未変化であり続けるという意味で、熱抵抗性であった。
【０１１３】
実施例３：水中への対照核酸の再懸濁
−  膜を、実施例１に従って調製した。
−  膜を、エッペンドルフチューブ（登録商標）（１．５ｍＬ）に入れた（１つのチューブ当たり１つの膜）。
−  ３００μＬの水＋ＤＥＰＣを加え、チューブを閉じた。
−  チューブを１回ひっくり返し、１５秒間フル速度でボルテックスにかけた。
−  室温で１時間インキュベートし、確かに膜が水＋ＤＥＰＣ中に浸漬するようにした。このステップは、対照核酸の、水＋ＤＥＰＣ中への再現性のある脱着を可能とした。
−  ＲＮａｓｅ・アウェイ（登録商標）で処理したピンセットを使用して膜を廃棄した。
−  毎回ピンセットを清浄した。
−  得られた試料（溶出液）を−８０℃で保存した。
【０１１４】
実施例４：本発明に記載の固相支持体を使用する核酸抽出
本発明に記載の固相支持体を、以下に詳述したように、内部定量対照として使用できた：
核酸抽出（クイアンプ（QIAamp）（登録商標）ミンエルート（MinElute）（登録商標）バキューム（Vacuum）キット、キアゲン製、参照番号５７７１４を使用）：
−  実施例１のように、本発明に記載の固相支持体（膜）を調製した。
−  出発材料：２ｍｌのチューブ中の５００μｌの血清および／または血漿。
−  ７５μｌのプロテアーゼを加え（製造業者の指示に従って）、簡潔にボルテックスにかけた。
−  ５００μｌの溶解緩衝液を加え（製造業者の指示に従って）、簡潔にボルテックスにかけた。
−  膜を加えた。
−  簡潔にボルテックスにかけた。
−  核酸を回収および精製した（製造業者の指示に従って）。
−  最後に６０μｌ中に溶出。
【０１１５】
得られた溶出液は、以下の実施例に詳述したように、ＰＣＲ反応にまたはＲＴ−ＰＣＲ反応に使用できた。
【０１１６】
実施例５：外部対照によるＰＣＲ増幅
−  実施例３で得られた２５μｌの溶出液を、特定のプライマーおよび蛍光プローブと共に、使用準備の整ったＰＣＲ混液（プラチニウム（Platinium）（登録商標）定量的ＰＣＲスーパーミックスＵＤＧ、インビトロジェン製、参照番号１１７３０−０１７）に入れた。
−  軽く叩いて穏やかに混合した。
−  リアルタイムＰＣＲを実行した。
【０１１７】
結果の解釈：各アッセイについて、増幅の初期サイクル中に測定した蛍光バックグラウンドレベルを有意に超えると考えられる蛍光レベルである閾値サイクル（Ｃｔ）を決定した。Ｃｔ値は、対照鋳型の濃度に反比例していた。よってＣｔが高くなればなる程、対照鋳型の濃度は低くなった。
【０１１８】
水中への膜の再懸濁後に得られたＰＣＲ実行の結果を、表２（各曲線に関するＣｔ値および最大蛍光値を含む表）および図３（曲線の表示）に表した。
【０１１９】
表２
１つの膜当たり１２００個のコピーのＤＮＡ増幅断片（対照鋳型）をスポットし、３００μｌの水に再懸濁した、膜（その上に吸着されている担体剤としてのポリｄＡまたはＢＳＡを含むまたは含まない）を使用したリアルタイムＰＣＲの結果
【０１２０】
【表２】
2007515181.tif 000003
2007515181.tif 000004
【０１２１】
その上に吸着されている担体剤としてのポリｄＡまたはＢＳＡを含むまたは含まない膜に、実施例１に記載したように、１つの膜当たり１２００個のコピーの対照核酸（ここではＤＮＡ断片）をスポットし、実施例３に記載のように３００μｌの水に再懸濁した。その後、２５μｌのこの再懸濁液／溶出液をＰＣＲ増幅反応に使用し、１００個のコピーの同じ対照核酸を含む２５μｌをＰＣＲ混液中に直接添加したものと比較した（「非含有」実行、すなわち、本発明に記載の固相支持体を含まない非含有条件、すなわち「非含有」条件下では、対照核酸は溶液から供給されるが、固相支持体からは供給されない）。非含有条件では、８つのＰＣＲ複製物を試験した。その上に吸着されている担体剤を含むまたは含まない膜では、１つの膜当たり１つのＰＣＲ重複物を含む８つの膜を試験した。
【０１２２】
結論
−  膜上にスポットした対照核酸の量を検量し、非含有条件で得られたＣｔ値に近いＣｔ値を得た。
−  全く担体剤を含まない膜で得られた平均Ｃｔは、非含有条件で得られた平均Ｃｔに近く、本発明に記載の膜を使用した場合、より良好な再現性をもっていた。
−  担体を含む膜上で得られた平均Ｃｔは、あらゆる担体剤を含まない膜で得られた平均Ｃｔよりも僅かに低く、これは、担体剤を使用した場合には対照核酸がより良好に放出されることに対応する。
−  本発明に記載の固相支持体は、ＰＣＲ増幅反応における、外部対照、定性的対照、定量的対照、外部定量的対照に使用できる。
【０１２３】
実施例６：内部対照によるＰＣＲ増幅
−  実施例４で得られた２５μｌの溶出液を、特定のプライマーおよび蛍光プローブと共に、使用準備の整ったＰＣＲ混液（プラチニウム（登録商標）定量的ＰＣＲスーパーミックスＵＤＧ、インビトロジェン社、参照番号１１７３０−０１７）に入れた。
−  軽く叩いて穏やかに混合した。
−  リアルタイムＰＣＲを実行した。
【０１２４】
結果の解釈：各アッセイについて、増幅の初期サイクル中に測定した蛍光バックグラウンドレベルを有意に超えると考えられる蛍光レベルである閾値サイクル（Ｃｔ）を決定した。Ｃｔ値は、対照鋳型の濃度に反比例していた。よってＣｔが高くなればなる程、対照鋳型の濃度は低くなった。
【０１２５】
実施例４に記載のように本発明に記載の膜を使用して核酸抽出した後に得られたＰＣＲ実行の結果を、表３（各曲線に関するＣｔ値および最大蛍光値を含む表）および図４（曲線の表示）に表した。
【０１２６】
表３：
５００個のコピーのＤＮＡ断片（対照鋳型）をスポットしクイアンプ・ミンエルート・バキューム（QIAamp MinElute Vacuum）キット、キアゲン製を使用して抽出した膜（担体剤としてのポリｄＡまたはＢＳＡを含むまたは含まない）を使用したリアルタイムＰＣＲの結果
【０１２７】
【表３】
2007515181.tif 000005
【０１２８】
担体剤としてのポリｄＡまたはＢＳＡを含むまたは含まない膜に、実施例１に記載したように、１つの膜当たり５００個のコピーの対照核酸（ここではＤＮＡ断片）をスポットした。実施例４に記載のように核酸抽出した後、２５μｌの溶出容量（最終容量＝６０μｌ）を、次いで、ＰＣＲ増幅反応に使用し、１００個のコピーの同じ対照核酸をＰＣＲ混液中に直接添加したものと比較した（「非含有」実行、すなわち溶液に由来する本発明に記載の固相支持体を含まない非含有条件）。非含有条件では、４つのＰＣＲ複製物を試験した。その上に吸着されている担体剤を含むまたは含まない膜では、１つの膜当たり２重のＰＣＲで３つの膜を試験した。
【０１２９】
結論：
−  膜上にスポットした対照核酸の量を検量し、非含有条件で得られたＣｔ値に近いＣｔ値を得た。
−  より良好なＣｔ値が、その上に吸着されているポリｄＡ担体剤を有する膜により得られたが、より良好なＣｔ再現性は、その上に吸着されているＢＳＡ担体剤を有する膜により得られた。
−  図４で観察されたように、担体剤としてのＢＳＡで得られた最大蛍光値が、最も均一であった。
【０１３０】
従って、本発明によれば、対照の増幅に対して、血清／血漿試料に由来する標的鋳型の増幅をＰＣＲにより検出および定量することが可能である。従って、対照は、２つのステップ、すなわち抽出および増幅に役立つ。
【０１３１】
実施例７：外部対照によるＲＴ−ＰＣＲ増幅
−  実施例３で得られた１０μｌの溶出液を、特定のプライマーおよび蛍光プローブと共に、使用準備の整ったＲＴ−ＰＣＲ混液（クアンティテクト（QuantiTect）（登録商標）プローブＲＴ−ＰＣＲキット、キアゲン製、参照番号２０４４４３）に入れた。
−  軽く叩いて穏やかに混合した。
−  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実行した。
【０１３２】
結果の解釈：各アッセイについて、増幅の初期サイクル中に測定した蛍光バックグラウンドレベルを有意に超えると考えられる蛍光レベルである閾値サイクル（Ｃｔ）を決定した。Ｃｔ値は、対照鋳型の濃度に反比例していた。よってＣｔが高くなればなる程、対照鋳型の濃度は低くなった。
【０１３３】
本発明に記載の膜を水中に再懸濁した後に得られたＲＴ−ＰＣＲ実行の結果を、表４（各曲線に関するＣｔ値および最大蛍光値を含む表）および図５（曲線の表示）に表した。
【０１３４】
表４
１つの膜当たり１．２×１０７個のコピーのＲＮＡ転写物（対照鋳型）をスポットし３００μｌの水に再懸濁した膜（担体剤としてのＢＳＡを含むまたは含まない）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果
【０１３５】
【表４】
2007515181.tif 000006
【０１３６】
担体ＢＳＡを含むまたは含まない膜に、実施例１に記載のように、１つの膜当たり対照核酸としての１．２×１０７個のコピーのＲＮＡ転写物をスポットし、実施例３に記載のように３００μｌの水に再懸濁した。その後、１０μｌのこの懸濁液を、ＲＴ−ＰＣＲに使用し、１０５個のコピーの同じ対照核酸（溶液に由来、「非含有」実行）をＲＴ−ＰＣＲ混液中に直接添加したものと比較した。非含有条件では、４つの複製物を試験した。担体剤を含むまたは含まない膜では、１つの膜当たり２重のＰＣＲで２つの膜を試験した。
【０１３７】
結論：
−  膜上にスポットしたＲＮＡ転写物（対照核酸）の量を検量し、非含有条件で得られたＣｔ値に近いＣｔ値を得た。
−  担体剤を含むまたは含まない膜上で得られた平均Ｃｔは、非含有条件で得られた平均Ｃｔに近く、ＢＳＡを担体剤として使用した場合には得られた対照核酸のより良好な放出がなされた。
【０１３８】
実施例８：内部対照によるＲＴ−ＰＣＲ増幅
−  実施例３で得られた１０μｌの溶出液を、特定のプライマーおよび蛍光プローブと共に、使用準備の整ったＲＴ−ＰＣＲ混液（クアンティテクト（登録商標）プローブＲＴ−ＰＣＲキット、キアゲン製、参照番号２０４４４３）に入れた。
−  軽く叩いて穏やかに混合した。
−  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実行した。
【０１３９】
結果の解釈：各アッセイについて、増幅の初期サイクル中に測定した蛍光バックグラウンドレベルを有意に超えると考えられる蛍光レベルである閾値サイクル（Ｃｔ）を決定した。Ｃｔ値は、対照鋳型の濃度に反比例していた。よってＣｔが高くなればなる程、対照鋳型の濃度は低くなった。
【０１４０】
膜を使用した核酸抽出後に得られた実行の結果を、表５（各曲線に関するＣｔ値および最大蛍光値を含む表）および図６（曲線の表示）に表した。
【０１４１】
表５
１つの膜当たり１．２×１０７個のコピーのＲＮＡ転写物（対照鋳型）をスポットしクイアンプ・ミンエルート・バキューム（QIAamp MinElute Vacuum）キット、キアゲン製を使用して抽出した膜（担体剤としてのＢＳＡを含むまたは含まない）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果
【０１４２】
【表５】
2007515181.tif 000007
【０１４３】
担体ＢＳＡを含むまたは含まない膜に、実施例１に記載のように、１つの膜当たり１．２×１０７個のコピーのＲＮＡ転写物（対照核酸）をスポットした。実施例４に記載のように核酸抽出した後、１０μｌの溶出容量（最終容量＝６０μｌ）を、次いで、ＲＴ−ＰＣＲに使用し、１０５個のコピーの同じ対照核酸（溶液に由来、「非含有」実行）をＲＴ−ＰＣＲ混液中に直接添加したものと比較した。非含有条件では、４つの複製物を試験した。担体剤を含むまたは含まない膜では、１つの膜当たり２重のＲＴ−ＰＣＲで３つの膜を試験した。
【０１４４】
結論：
−  膜上にスポットしたＲＮＡ転写物（対照核酸）の量を検量し、非含有条件で得られたＣｔ値と近いＣｔ値を得た。
−  担体剤としてのＢＳＡを含むまたは含まない膜で得られた平均Ｃｔは、非含有条件で得られた平均Ｃｔと近かった。
−  曲線で観察されたように、担体剤としてのＢＳＡで得られた最大蛍光値が、最も均一であった。
【０１４５】
従って、本発明によれば、対照の増幅に対して、血清／血漿試料に由来する標的鋳型の増幅をＰＣＲにより検出および定量することが可能であった。従って、対照は、２つのステップ、すなわち抽出および増幅に役立った。
【０１４６】
当業者には、本発明が、先に記載した任意の数の好ましい特徴を取り込むことができることを理解できるだろう。本明細書で述べた全ての引用は、全体を引用例として本明細書に取り込む。本発明の他の実施形態は、ここに提示しないが、これは当業者には明白であり、従って、それらは本発明の範囲内および精神内である。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、本発明に記載の固相支持体用の半自動分配器の２部分を示す。
【図２】図２は、本発明に記載の２つの固相支持体を伴った同じ分配器を示す。
【図３】図３は、非含有条件下で（「非含有」）、または担体を含まない膜を使用して（「担体なし」）、またはその上に吸着されている担体剤としてのＢＳＡ（「担体ＢＳＡ」）もしくはポリｄＡ（「担体ポリｄＡ」）を含む本発明に記載の膜を使用して水中に再懸濁した後に（対照核酸はＤＮＡ断片である）得られた、サイクル数に対する蛍光シグナル（ＲＦＵ、相対蛍光単位）をプロットしている、リアルタイムＰＣＲ蛍光曲線を示す。
【図４】図４は、担体を含まない膜を使用して（「担体なし」）、またはその上に吸着されている担体剤としてのＢＳＡ（「担体ＢＳＡ」）もしくはポリｄＡ（「担体ポリｄＡ」）を含む本発明に記載の膜を使用して核酸抽出後に（対照核酸はＤＮＡ断片である）得られた、サイクル数に対する蛍光シグナル（ＲＦＵ、相対蛍光単位）をプロットしている、リアルタイムＰＣＲ蛍光曲線を示す。
【図５】図５は、非含有条件下で（「非含有」）、または担体を含まない膜を使用して（「担体なし」）、またはその上に吸着されている担体剤としてのＢＳＡを含む本発明に記載の膜を使用して（「担体ＢＳＡ」）水中に再懸濁した後に（対照核酸はＲＮＡ断片である）得られた、サイクル数に対する蛍光シグナル（ＲＦＵ、相対蛍光単位）をプロットしている、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ蛍光曲線を示す。
【図６】図６は、非含有条件下で（「非含有」）、または担体を含まない膜を使用して（「担体なし」）、またはその上に吸着されている担体剤としてのＢＳＡを含む本発明に記載の膜を使用して（「担体ＢＳＡ」）核酸抽出後に（対照核酸はＲＮＡ断片である）得られた、サイクル数に対する蛍光シグナル（ＲＦＵ、相対蛍光単位）をプロットしている、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ蛍光曲線を示す。
【図１】
2007515181.tif 000008
【図２】
2007515181.tif 000009
【図３】
2007515181.tif 000010
【図４】
2007515181.tif 000011
【図５】
2007515181.tif 000012
【図６】
2007515181.tif 000013
【国際調査報告】
2007515181.tif 000014
2007515181.tif 000015
2007515181.tif 000016
2007515181.tif 000017