(57)【要約】寄生生物に使用されるウシ胎仔血清を含まない細胞培養物成長培地を提供する。培地は、塩化カルシウム、重炭酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸モノナトリウム、グルコース、ＨＥＰＥＳ、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、トリシン、ｄ−リボース、２−デオキシリボース、アデノシン−５−三リン酸（ＡＴＰ）、２−デオキシアデニル酸（ｄ−ＡＭＰ）、５’−チミジル酸（ＴＭＰ）、２’−デオキシシチジン−５−一リン酸（ｄ，２’−デオキシウリジン−５−一リン酸（ｄ，２’−デオキシグアニル酸（ｄ−ＧＭＰ）、アスパラギン酸、グルタミン酸、Ｌ−アラニン、アルギニン、カルノシン、システイン、シスチン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスコルビン酸、ビオチン（Ｈ）、カルニチン、コレカルシフェロール、塩化コリン、シアノコバラミン（Ｂ１２）、エルゴカルシフェロール、葉酸、ミオイノシトール、メナジオン、ニコチンアミド、ＰＡＢＡ、パントテナート、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン、レチノール（Ａ）、リボフラビン（Ｂ２）、チアミン（Ｂ１）、６，８チオクト酸(Thiotic acid)、アルファ−トコフェロール、３−フィチルメナジオン（Ｋ１）、テトラヒドロ葉酸、プロシン由来のへミン、及びナノ純水を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄生生物で使用される成長培地であって、ウシ血清を含まない、成長培地。
【請求項２】
塩化カルシウム、重炭酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸モノナトリウム、グルコース、ＨＥＰＥＳ、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、トリシン、ｄ−リボース、２−デオキシリボース、アデノシン−５−三リン酸（ＡＴＰ）、２−デオキシアデニル酸（ｄ−ＡＭＰ）、５’−チミジル酸（ＴＭＰ）、２’−デオキシシチジン−５−一リン酸（ｄ，２’−デオキシウリジン−５−一リン酸（ｄ，２’−デオキシグアニル酸（ｄ−ＧＭＰ）、アスパラギン酸、グルタミン酸、Ｌ−アラニン、アルギニン、カルノシン、システイン、シスチン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスコルビン酸、ビオチン（Ｈ）、カルニチン、コレカルシフェロール、塩化コリン、シアノコバラミン（Ｂ１２）、エルゴカルシフェロール、葉酸、ミオイノシトール、メナジオン、ニコチンアミド、ＰＡＢＡ、パントテナート、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン、レチノール（Ａ）、リボフラビン（Ｂ２）、チアミン（Ｂ１）、６，８チオクト酸(Thiotic acid)、アルファ−トコフェロール、３−フィチルメナジオン(phytylmenadione)（Ｋ１）、テトラヒドロ葉酸、プロシン由来のヘミン、及びナノ純水(nanopure water)を含む、請求項１に記載の成長培地。
【請求項３】
無鞭毛ステージのリーシュマニア属(Leishmania genus)の培養において使用される成長培地であって、ウシ血清を含まない、成長培地。
【請求項４】
塩化カルシウム、重炭酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸モノナトリウム、グルコース、ＨＥＰＥＳ、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、トリシン、ｄ−リボース、２−デオキシリボース、アデノシン−５−三リン酸（ＡＴＰ）、２−デオキシアデニル酸（ｄ−ＡＭＰ）、５’−チミジル酸（ＴＭＰ）、２’−デオキシシチジン−５−一リン酸（ｄ，２’−デオキシウリジン−５−一リン酸（ｄ，２’−デオキシグアニル酸（ｄ−ＧＭＰ）、アスパラギン酸、グルタミン酸、Ｌ−アラニン、アルギニン、カルノシン、システイン、シスチン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスコルビン酸、ビオチン（Ｈ）、カルニチン、コレカルシフェロール、塩化コリン、シアノコバラミン（Ｂ１２）、エルゴカルシフェロール、葉酸、ミオイノシトール、メナジオン、ニコチンアミド、ＰＡＢＡ、パントテナート、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン、レチノール（Ａ）、リボフラビン（Ｂ２）、チアミン（Ｂ１）、６，８チオクト酸、アルファ−トコフェロール、３−フィチルメナジオン（Ｋ１）、テトラヒドロ葉酸、プロシン由来のへミン、及びナノ純水を含む、請求項３に記載の成長培地。
【請求項５】
寄生生物を含む培養物を、ウシ血清を含まない培地と接触させることを含み構成される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで寄生生物を維持する方法。
【請求項６】
前記培養物を含まない培地が塩化カルシウム、重炭酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸モノナトリウム、グルコース、ＨＥＰＥＳ、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、トリシン、ｄ−リボース、２−デオキシリボース、アデノシン−５−三リン酸（ＡＴＰ）、２−デオキシアデニル酸（ｄ−ＡＭＰ）、５’−チミジル酸（ＴＭＰ）、２’−デオキシシチジン−５−一リン酸（ｄ，２’−デオキシウリジン−５−一リン酸（ｄ，２’−デオキシグアニル酸（ｄ−ＧＭＰ）、アスパラギン酸、グルタミン酸、Ｌ−アラニン、アルギニン、カルノシン、システイン、シスチン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスコルビン酸、ビオチン（Ｈ）、カルニチン、コレカルシフェロール、塩化コリン、シアノコバラミン（Ｂ１２）、エルゴカルシフェロール、葉酸、ミオイノシトール、メナジオン、ニコチンアミド、ＰＡＢＡ、パントテナート、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン、レチノール（Ａ）、リボフラビン（Ｂ２）、チアミン（Ｂ１）、６，８チオクト酸、アルファ−トコフェロール、３−フィチルメナジオン（Ｋ１）、テトラヒドロ葉酸、プロシン由来のヘミン、及びナノ純水を含む、請求項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで寄生生物を維持する方法。
【請求項７】
前記寄生生物が、無鞭毛ステージのリーシュマニア属に属するものである、請求項５記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで寄生生物を維持する方法。
【請求項８】
前記培地が塩化カルシウム、重炭酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸モノナトリウム、グルコース、ＨＥＰＥＳ、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、トリシン、ｄ−リボース、２−デオキシリボース、アデノシン−５−三リン酸（ＡＴＰ）、２−デオキシアデニル酸（ｄ−ＡＭＰ）、５’−チミジル酸（ＴＭＰ）、２’−デオキシシチジン−５−一リン酸（ｄ，２’−デオキシウリジン−５−一リン酸（ｄ，２’−デオキシグアニル酸（ｄ−ＧＭＰ）、アスパラギン酸、グルタミン酸、Ｌ−アラニン、アルギニン、カルノシン、システイン、シスチン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスコルビン酸、ビオチン（Ｈ）、カルニチン、コレカルシフェロール、塩化コリン、シアノコバラミン（Ｂ１２）、エルゴカルシフェロール、葉酸、ミオイノシトール、メナジオン、ニコチンアミド、ＰＡＢＡ、パントテナート、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン、レチノール（Ａ）、リボフラビン（Ｂ２）、チアミン（Ｂ１）、６，８チオクト酸、アルファ−トコフェロール、３−フィチルメナジオン（Ｋ１）、テトラヒドロ葉酸、プロシン由来のヘミン、及びナノ純水を含む、請求項７に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで寄生生物を維持する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、包括的に生物製剤のための成長培地に関する。より詳しくは、本発明はウシ胎仔血清を含まず、寄生生物の成長のために用いられる成長培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
［背景］
科学者や研究者は、異なった型の細胞株の培養を助けるために、様々な種類の培地を利用してきた。その細胞成長培地の組成は、細胞の生存及び多くの影響に対する細胞応答に影響を与えるため、重要である。ウシ由来の血清は、細胞培地の栄養素及びホルモン源として利用されてきた。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、組成、ホルモン含量、及び混入物が変化し得る。最近のウシ海綿状脳症すなわち狂牛病の問題から、多くの細胞成長培地においてＦＢＳの使用に対する代替物の開発の必要性が増している。
【０００３】
幾つかの種類の成長培地において、ＦＢＳの使用に対して、代替物が提案されている。しかし、血清を含まない培地は、特定の細胞型に高い特異性があるか、又は血清から抽出された成分を含有する。そのような一例が、軟骨細胞の軟骨性表現型の培養に有用な血清を含まない細胞成長培地について記述している、Luyten他に対する米国特許第６，６１７，１６１号が見い出される。
【０００４】
多くの場合、科学者は様々な特有の型の生物製剤の成長を助けるための成長培地を必要とする。特に関心の高い一領域としては、寄生生物の成長におけるものがあり、この例として、リーシュマニア属の無鞭毛ステージにおける培養が挙げられる。これは、乾癬、リーシュマニア症、及び場合により他の免疫不全に対する処置のための組成物の生成において特に重要である。リーシュマニア属の無鞭毛期における免疫治療剤の製造方法はO'Dalyに対する米国特許第６，６７３，３５１号に記載されている。寄生生物に使用されるＦＢＳを含まない成長培地が、特に必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
［発明の概要］
本発明は、寄生生物に使用されるＦＢＳを含まない成長培地を提供する。この培地は、塩化カルシウム、重炭酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸モノナトリウム、グルコース、ＨＥＰＥＳ、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、トリシン、ｄ−リボース、２−デオキシリボース、アデノシン−５−三リン酸（ＡＴＰ）、２−デオキシアデニル酸（ｄ−ＡＭＰ）、５’−チミジル酸（ＴＭＰ）、２’−デオキシシチジン−５−一リン酸（ｄ，２’−デオキシウリジン−５−一リン酸（ｄ，２’−デオキシグアニル酸（ｄ−ＧＭＰ）、アスパラギン酸、グルタミン酸、Ｌ−アラニン、アルギニン、カルノシン、システイン、シスチン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスコルビン酸、ビオチン（Ｈ）、カルニチン、コレカルシフェロール、塩化コリン、シアノコバラミン（Ｂ１２）、エルゴカルシフェロール、葉酸、ミオイノシトール、メナジオン、ニコチンアミド、ＰＡＢＡ、パントテナート、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン、レチノール（Ａ）、リボフラビン（Ｂ２）、チアミン（Ｂ１）、６，８チオクト酸(thiotic acid)、アルファ−トコフェロール、３−フィチルメナジオン（Ｋ１）、テトラヒドロ葉酸、プロシン由来のヘミン、及びナノ純水を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
［発明の詳細な説明］
本発明は、寄生生物の培養のための成長培地として利用される新規の組成物に関する。本明細書中に記載されている好ましい実施形態は、温血動物における免疫反応を引き出すことができ、したがって、乾癬、アトピー性(atoptic)皮膚炎、及び他の関連した免疫病の臨床的寛解を引き起こす免疫原性ポリペプチド又はそれらをコードする核酸を含む組成物の生成に関する。当業者は、本発明は任意の寄生生物に利用することができ、以下の説明は例示を意図するものであり、本発明の特許請求の範囲を限定するものではないということを理解するであろう。
【０００７】
好ましい実施形態の対象となるポリペプチドは、リーシュマニア原虫(Leishmania protozoa)由来、好ましくは死滅リーシュマニア無鞭毛原虫(Leishmania amastigote protozoa)由来である。本発明のポリペプチドは、当該技術分野において既知の標準タンパク単離方法を用いてリーシュマニア属の原虫より得られる。第一世代の多価免疫治療剤が提供され、複数のリーシュマニア種の混合物のポリペプチド分離株を含む。このようなリーシュマニア種としては、Ｌ．（Ｌ）アマゾネンシス(L.(L)amazonensis)、Ｌ．（Ｌ）べネズエレンシス(L.(L)venezuelensis)、Ｌ．（Ｖ）ブラシリエンシス（L.(V)brasiliensis）、Ｌ．（Ｌ）カガシ(L.(L)chagasi)、Ｌ．（Ｌ）ドノバニ(L.(L)donovani)、Ｌ．（Ｌ）インファンタム(L.(L)infantum)、Ｌ．（Ｌ）メジャー(L.(L)major)、Ｌ．（Ｌ）パナメンシス(L.(L)panamensis)、Ｌ．（Ｌ）トロピカ(L.(L)tropica)、及びＬ．（Ｌ）グヤネンシス(L.(L)guyanensis)が挙げられる。好ましくは、上記混合物は、Ｌ．（Ｌ）アマゾネンシス、Ｌ．（Ｌ）ベンズエレンシス、Ｌ．（Ｖ）ブラシリエンシス、及びＬ．（Ｌ）カガシを含む。最も好ましくは、上記混合物はこれら４つの種から成る。
【０００８】
従来技術では、生物を表１に明記される合成培地において、５％のウシ胎仔血清を補い、一般的には約３０℃〜３４℃で、無鞭毛ステージにおいて培養した。引き続いて、成長停止期の間に無鞭毛体を、細胞を死滅させるのに効果的な量のＮ−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）又は薬理学的に受容可能なそれらの塩を含む培地に付する。その後、死滅した細胞を単離し、非イオン洗浄剤Ｎｏｎｉｄｅｔ  ｐ−４０（ＮＰ４０）で処理して、表面抗原を可溶化したのちに廃棄する。本発明の免疫原生ポリペプチドを含有する粒子抗原は遠心分離とその後の細胞破壊によって、回集することができる。これらポリペプチドをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、引き続きアルミナを含むＰＢＳ中で５分間、４℃で超音波処理を行い再懸濁する。
【０００９】
分子生物学分野における当業者は、ポリペプチドをコードする核酸を得ることができる。例えば、第一世代の免疫治療剤であるポリペプチドは、リーシュマニア属の原虫から単離精製され、８つのバンドを含む。この８つのバンドはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定され、それぞれ２１、３３、４４、５０、５５、５８、６５、７７ｋＤａの明らかな分子量を有する８つの異なったポリペプチドを表す。これらの各バンドは、標準的なアミノ酸シーケンス方法に従って単離、シーケンスされ得る別個のポリペプチドを表す。第二世代の各免疫治療剤のポリペプチドは、８つのポリペプチドの混合したものを含む第一世代の免疫治療剤に対しジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｄｅｘでクロマトグラフィを行うことによって、精製した。乾癬を治療するための活性を全て有する二つの分画が単離され、完全に還元されて、標準的な方法によってアルキル化された。これらの分画はアクリルアミドゲルで電気泳動を行うことで、構成ポリペプチドが分離された。各ポリペプチドのアミノ酸配列は標準的なタンパク質シーケンス方法によって得られた。これらの各ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は遺伝暗号の付与によってシーケンスされるこれらアミノ酸由来であり得る。
【００１０】
【表１】
2007521027.tif 000002
【００１１】
本発明は、ウシ胎仔血清を含まない培養培地で、無鞭毛期のリーシュマニアの培養を可能にする。その後、培養された無鞭毛体は免疫治療剤又は治療剤の作製において上記と同じ方法で使用され得る。本発明の培地の好ましい実施形態については、表２に記載されている。培地の構成成分は室温にて、適した容器で混合される。ブタヘミンは０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で水中に入れ、その後、濃ＮａＯＨを数滴加え完全に溶解させて０．２ｍｕフィルターで濾過した。
【００１２】
【表２】
2007521027.tif 000003
【００１３】
前述の特定の実施形態に関する説明は例示にすぎず、本発明の精神及び範囲から逸脱しなければ、様々な変更を行ってもよく、本発明の精神及び範囲は、以下の特許請求の範囲にのみ限定される。
【国際調査報告】
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