(57)【要約】  炭水化物、詳細にはマンノース含有炭水化物は、細胞増殖の促進剤として使用される。具体的には、多糖加水分解物が、記載されるマンノース含有炭水化物及び多糖加水分解物を含むシンバイオティック食品、プレバイオティクス、及び薬剤組成物において、細胞の増殖を促進する際に優れた効能を有することが示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の増殖を促進するマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項２】
前記マンノース含有炭水化物が、多糖である、請求項１に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項３】
前記炭水化物が、多糖加水分解物である、請求項１に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項４】
前記多糖加水分解物が、酵素加水分解物である、請求項３に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項５】
前記多糖加水分解物が、化学的又は物理的な加水分解物である、請求項３に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項６】
前記多糖加水分解物が、マンナンである、請求項３から５までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項７】
前記マンナンが、グルコマンナンである、請求項６に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項８】
前記グルコマンナンが、コンニャクグルコマンナンである、請求項７に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項９】
前記マンナンが、ガラクトマンナン又は任意の他のタイプのマンナンである、請求項６に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項１０】
前記マンナンが、生物によって合成される、請求項６から９までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項１１】
前記マンナンが、合成によるものである、請求項６から９までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項１２】
前記マンナンが、マンノースのシロップ、粉末、又は粉の形である、請求項６から１１までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項１３】
グルコース又は任意の他の炭水化物が、添加される、請求項１から１２までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項１４】
前記細胞が、微生物である、請求項１から１３までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項１５】
前記細胞が、細菌である、請求項１から１４までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項１６】
前記細菌が、乳酸菌である、請求項１５に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項１７】
ヒト及び動物の腸内における、請求項１から１６までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項１８】
ヒト及び動物の体腔中における、請求項１から１６までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項１９】
ヒト及び動物の皮膚上における、請求項１から１６までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項２０】
膣内における、請求項１から１６までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項２１】
動物及びヒトの食品中における、請求項１から１７までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項２２】
前記食品が、機能性食品である、請求項２１に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項２３】
前記食品が、ヨーグルトなどの発酵中又は発酵済製品である、請求項２１から２２に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項２４】
前記食品／材料が、腸及び体腔内の細胞の増殖を促進する、請求項２１から２３までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項２５】
前記食品／材料が、病原生物を減らして腸にやさしい細胞の増殖を促進する、請求項２１から２４までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項２６】
１種又は複数のプロバイオティック細菌及びマンノース含有炭水化物を含む、シンバイオティック食物又は飼料。
【請求項２７】
プレバイオティックである、請求項２６に記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項２８】
プロバイオティックである、請求項２６に記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項２９】
プレバイオティックとプロバイオティックの混合物である、請求項２６に記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３０】
前記マンノース含有炭水化物が、多糖である、請求項２６から２９までに記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３１】
前記炭水化物が、多糖加水分解物である、請求項２６から２９までに記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３２】
前記多糖加水分解物が、酵素加水分解物である、請求項３１に記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３３】
前記多糖加水分解物が、化学的又は物理的な加水分解物である、請求項３１に記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３４】
前記多糖加水分解物が、マンナンである、請求項３１から３３までに記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３５】
前記マンナンが、グルコマンナンである、請求項３４に記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３６】
前記グルコマンナンが、コンニャクグルコマンナンである、請求項３５に記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３７】
前記マンナンが、ガラクトマンナン又は任意の他のタイプのマンナンである、請求項３４に記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３８】
前記細胞が、微生物である、請求項２６から３７までに記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３９】
前記微生物が、乳酸菌である、請求項３８に記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項４０】
ヒト及び動物中で微生物の増殖を促進させる炭素源としてのマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項４１】
ヒト及び動物中で微生物の増殖を促進させるプレバイオティックとしてのマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項４２】
前記マンノース含有炭水化物が、多糖である、請求項４０から４１までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項４３】
前記マンノース含有炭水化物が、任意の多糖加水分解物である、請求項４０から４１までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項４４】
前記多糖加水分解物が、酵素加水分解物である、請求項４３に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項４５】
前記多糖加水分解物が、化学的又は物理的な加水分解物である、請求項４３に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項４６】
前記多糖加水分解物が、マンナンである、請求項４３から４５までに記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項４７】
前記マンナンが、グルコマンナンである、請求項４６に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項４８】
前記グルコマンナンが、コンニャクグルコマンナンである、請求項４７に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項４９】
前記マンナンが、ガラクトマンナン又は任意の他のタイプのマンナンである、請求項４６に記載のマンノース含有炭水化物の使用。
【請求項５０】
ヒト及び動物中で微生物の増殖を促進させるプレバイオティックであって、炭水化物を含む、該プレバイオティック。
【請求項５１】
前記炭水化物が、マンノース含有炭水化物である、請求項５０に記載のプレバイオティック。
【請求項５２】
前記炭水化物が、多糖である、請求項５０から５１までに記載のプレバイオティック。
【請求項５３】
前記炭水化物が、多糖加水分解物である、請求項５０から５１までに記載のプレバイオティック。
【請求項５４】
前記多糖加水分解物が、酵素加水分解物である、請求項５３に記載のプレバイオティック。
【請求項５５】
前記多糖加水分解物が、化学的又は物理的な加水分解物である、請求項５３に記載のプレバイオティック。
【請求項５６】
前記多糖加水分解物が、マンナンである、請求項５３から５５までに記載のプレバイオティック。
【請求項５７】
前記マンナンが、グルコマンナンである、請求項５６に記載のプレバイオティック。
【請求項５８】
前記グルコマンナンが、コンニャクグルコマンナンである、請求項５７に記載のプレバイオティック。
【請求項５９】
前記マンナンが、ガラクトマンナン又は任意の他のタイプのマンナンである、請求項５６に記載のプレバイオティック。
【請求項６０】
任意の物理的形態の膣坐薬の形態の、請求項５０から５９までに記載のプレバイオティック。
【請求項６１】
クリームの形態の、請求項５０から５９までに記載のプレバイオティック。
【請求項６２】
坐薬の形態の、請求項５０から５９までに記載のプレバイオティック。
【請求項６３】
１種又は複数のプロバイオティック細菌及び炭水化物を含む、薬剤組成物。
【請求項６４】
前記炭水化物が、マンノース含有炭水化物である、請求項６３に記載の薬剤組成物。
【請求項６５】
前記炭水化物が、多糖である、請求項６３から６４までに記載の薬剤組成物。
【請求項６６】
前記炭水化物が、多糖加水分解物である、請求項６３から６４までに記載の薬剤組成物。
【請求項６７】
前記多糖加水分解物が、酵素加水分解物である、請求項６６に記載の薬剤組成物。
【請求項６８】
前記多糖加水分解物が、化学的又は物理的な加水分解物である、請求項６６に記載の薬剤組成物。
【請求項６９】
前記多糖加水分解物が、マンナンである、請求項６６から６７に記載の薬剤組成物。
【請求項７０】
前記マンナンが、グルコマンナンである、請求項６９に記載の薬剤組成物。
【請求項７１】
前記グルコマンナンが、コンニャクグルコマンナンである、請求項７０に記載の薬剤組成物。
【請求項７２】
前記マンナンが、ガラクトマンナン又は任意の他の形態のマンナンである、請求項６９に記載の薬剤組成物。
【請求項７３】
任意の物理的形態の膣坐薬の形態の、請求項６３から７２までに記載の薬剤組成物。
【請求項７４】
坐薬の形態の、請求項６３から７２までに記載の薬剤組成物。
【請求項７５】
クリームの形態の、請求項６３から７２までに記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プレバイオティクス、具体的には、栄養素プレート上、並びに飲食物中、飼料中、並びにヘルスケア及び製薬用途においてある種の細菌の増殖を促進させるために改良されたプレバイオティックに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｊｏｎｅｓ（２００２）によれば、機能性食品は、「単一の栄養より多くのものを提供する食品、即ち、これらは消費者にさらなる生理的利益を供給するもの」として広く定義されている。プレバイオティクスは、特定のクラスの機能性食品である。Ｊｏｎｅｓ（２００２）によれば、それらを、「大腸中の１種の細菌又は限られた数の細菌の増殖若しくは活性又は両方を選択的に刺激し、したがって宿主の健康を改善させることによって宿主に有益な影響を及ぼす消化しにくい食品成分」として定義することができる。例としては、ネオシュガー、イヌリン、大豆加水分解物、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、ラクツロース、ラフィノース、ソルビトール、キシリトール、パラチノース、及びラクトスクロースが挙げられる。
【０００３】
プレバイオティック細菌は、ヒトの腸において明確で有益な効果を有する。これらの例は、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）種及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）種である。より詳細なことを最近の報告に見ることができる（Ｌｏｏら、１９９９年；Ｔｏｐｐｉｎｇ及びＣｌｉｆｔｏｎ、２００１年；Ｔｏｍａｓｉｋ及びＴｏｍａｓｉｋ、２００３年）。プレバイオティック食品とプロバイオティック食品を共に一緒に消費して、腸内のプロバイオティック細菌のコロニー形成を促進させることができる。
【０００４】
グルコマンナンは、多くの植物によって生産される中性の多糖であり、そこでエネルギー貯蔵及び場合によっては構造的役割として働く。これらの多糖は、大抵の場合、主としてマンノース残基を第２の糖としてのグルコースと共に含む。これらの多糖は、いくつかのアセチル化された残基を含み、いくつかのガラクトース側鎖を含んでいてもよい（Ｋｈａｎｎａ、２００３年）。グルコマンナンの供給源を表１に示す。
【０００５】
表１：様々な供給源からのグルコマンナン
【表１】
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【０００６】
表１から、グルコマンナンを、分子量及びマンノースとグルコースの比に多様性がある広範囲の様々な植物供給源から抽出できることは明らかである。
【０００７】
コンニャクグルコマンナンは、それ自体サトイモ属のメンバーであるアモルフォファルスコンニャク植物（又は植物グループ）から抽出される多糖である。コンニャクの球茎は、アジアで何世紀もの間食物として育てられ、そこで非常に興味深い物理的特性を有する食物源を提供している（Ｔｈｏｍａｓ、１９９７年；Ｋｈａｎｎａ、２００３年）。コンニャクの球茎から製造された粉は、ゲル化剤及び増粘剤として使用され、許可された食物成分（欧州、Ｅ４２５）である。コンニャクの球茎の主要な多糖成分は、水和したとき非常に高い膨潤特性を有するグルコマンナンである。この粉は世界中でガムにおいて使用されてきたが、この目的での使用は、窒息の結果１８人が死亡したため最近禁止された（例えば、欧州）。この粉のその他の栄養学的利益には、コレステロールの低下、減量用の嵩まし、及び便秘のリスクの低下が挙げられる（Ｋｈａｎｎａ、２００３年）。食物使用とは別に、この粉は、フィルム成形材料として、製薬用賦形剤として、身体ケア製品中で、およびクロマトグラフィー媒体として使用できる（Ｋｈａｎｎａ、２００３年）。
【０００８】
コンニャク粉の商業用途には様々な純度の粉が必要とされ、グルコマンナン含有量が最も高いとコストも最も高くなる。精製は、通常、酵素自体（非グルコマンナン成分を除去するアミラーゼ、プロテアーゼ、及びリパーゼ）で処理するのではなく、ふるい分け法及びアルコール洗浄法で実施される（Ｋｈａｎｎａ、２００３年）。
【０００９】
コンニャクグルコマンナンは、分子量が一般に１×１０６Ｄを超える高分子量のポリマーである（Ｋｈａｎｎａ、２００３年）。これらの糖は、一般に多糖内のマンノースとグルコース残基が１．６：１であるβ−（１−４）結合したマンノース及びグルコース残基のブロックで配列されている。この線状構造には、約１０個目ごとのヘキソースユニットの糖残基のＣ３上に枝分れが散在しており、約１９個目ごとの残基に１個のエステル化されたアセチル基を有する（Ｋｈａｎｎａ、２００３年）。
【００１０】
人体では、いくつかの多糖は、例えば、「デンプン質の」、「消化しやすい」、又は「利用可能な」ものとして定義されるが、その他は、例えば、「消化しにくい」、「非消化性の」、「食物繊維性の」、又は「非デンプン質の」ものとして定義される。デンプン質の多糖は、非晶質である場合、ヒトの小腸中の消化酵素によって消化することができる。デンプン質ポリマーが結晶の場合、それらは、大腸に搬送され、そこで発酵され、「難消化性デンプン」として記述される。非デンプン質の多糖は、ヒトの小腸で消化することができず、常に大腸に搬送され、そこで発酵される。非デンプン質多糖及び難消化性デンプンは一緒に食物繊維を形成する。食物繊維は、食物の腸の通過を促進し、嵩まし及び満腹感をもたらし、結腸中に発酵基質を提供するので、ダイエットの明らかに重用な成分である。この発酵により、血流に吸収されることができる短鎖脂肪酸が放出され、これは腸癌に対して有益な効果があることが報告されている。したがって、グルコマンナン多糖は、ヒトの大腸で発酵される。腸での多糖の発酵に関するより詳細については、Ｔｏｐｐｉｎｇ及びＣｌｉｆｔｏｎによる最近の報告（２００１年）を参照されたい。
【００１１】
本出願では、加水分解物という用語は、親多糖より低い分子量の材料を意味し、オリゴ糖及び糖が挙げられるが、それだけに限らない。
【００１２】
多糖からの加水分解物の生産は、例えば酸加水分解又は酵素加水分解によって実現できる。マンナン（グルコマンナン、特にコンニャクグルコマンナンを含めた）に関しては、これはまた適切な条件下で実現できる。酸加水分解は、無作為に起こる傾向があるが、酵素加水分解は、特定の結合に向けてより焦点を合わせられる。コンニャク（及び非コンニャク）グルコマンナンを、酸、マンナナーゼ、及びセルラーゼによって加水分解することができる（Ｋａｔｏ及びＭａｔｓｕｄａ、１９６９年；Ｋａｔｏら、１９７０年；Ｓｈｉｍａｈａｒａ、１９７５年；Ｃｈｉｕら、１９９１年；Ｏｈｙａら、１９９４年；Ｂｅｈｒ、１９９８年；Ｃｈｉｕら、１９９８年；Ｅｄａｓｈｉｇｅ及びＩｓｈｉｉら、１９９８年；Ｋｕｒａｋａｋｅ及びＫｏｍａｋｉ、２００１年；Ｃｅｓｃｕｔｔｉら、２００２年；Ｃｈｉｕら、２００２年；Ｑｉら、２００３年）。したがって、コンニャクグルコマンナン加水分解のためのセルラーゼ及びその他の酵素の使用については、１９８０年以前に十分に確立されている。Ｃｈｉｕらによって記載された特許（１９９１年、２００２年）が認められたことは、おそらく例外的なことである。これは、セルラーゼを使用してコンニャクグルコマンナンを加水分解すること、及び食品中の潜在的な非消化性充填剤としてのそれらの使用に関する。
【００１３】
水溶性コンニャク（透析）抽出物は、Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｍａｎｚｏ  Ｓｈｏｔｅｎ株式会社（１９７４年）、並びにＳｕｇｉｙａｍａ及びＳｈｉｍａｈａｒａ（１９７６年）によって研究され発表された。コンニャクとデンプンの組合せに基づいたゲル系は、Ｔｙｅらによって論じられた（１９９０年、１９９４年）。Ｃｈｉｕら（１９９１年、１９９８年、２００２年）は、セルラーゼを使用してコンニャクグルコマンナンをオリゴ糖に変換すること、及び糖置換物／充填剤としてのそれらの使用について論じた。Ｋｉｎｇら（１９９４年）及びＷｈｅａｔｌｅｙら（１９９６年）は、徐放性賦形剤としてコンニャクグルコマンナンを使用した。その他の健康促進成分を添加した又は添加していないコンニャクを含むヘルスケア飲料／組成物が、記載されている（Ｚｈｏｕ、１９９５年；Ｖｕｋｓａｎ、２００１年；Ｓｕｎ、２００３年）。
【００１４】
マンノース含有炭水化物、具体的には、グルコマンナン及びガラクトマンナンなどのマンナンの使用が、細胞及び微生物の増殖の優れた促進剤及び刺激剤であることを示す開発が、本明細書に記載されている。本発明では、具体的には多糖加水分解物、特にマンナン加水分解物が、細胞の増殖を促進する際に思いがけず優れた効果を有することが分かった。グルコマンナン加水分解物（特にコンニャクグルコマンナンが挙げられるがこれだけに限らない）は、特に有効である。その結果、培養物（例えば寒天プレート）、機能性及び発酵食品（例えば、ヨーグルト、チーズ、及びサラミソーセージ）、並びにヘルスケア／医薬製品における支援生物のより商業上実現可能な製造方法を開発し、本明細書に記載している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の態様によれば、マンノース含有炭水化物を使用して細胞の増殖を促進させることが提供される。
【００１６】
好ましくは、こうしたマンノース含有炭水化物は、天然に存在する多糖又はより低い分子量の材料である。
【００１７】
最も好ましくは、こうしたマンノース含有炭水化物は、天然に存在する多糖の分子量より低い分子量を有する多糖加水分解物、その誘導体、又はマンノース含有材料である。
【００１８】
場合によっては、これらの多糖加水分解物は、酵素加水分解物である。
【００１９】
場合によっては、これらの多糖加水分解物は、化学的又は物理的な加水分解物である。
【００２０】
好ましくは、これらの多糖加水分解物は、マンナンである。
【００２１】
場合によっては、これらのマンナンは、グルコマンナンである。或いは、これらのマンナンは、ガラクトマンナンである。或いは、これらのマンナンは、その他のタイプのマンナンである。
【００２２】
これらのマンナンは、天然のものでも合成のものでもよい。
【００２３】
これらのマンナンは、マンノースのシロップ、粉末、又は粉の形とすることができる。
【００２４】
このグルコマンナンは、場合によってはコンニャクグルコマンナンである。
【００２５】
場合によっては、その他の炭水化物も細胞に添加することができる。
【００２６】
これらの細胞は、場合によっては微生物である。
【００２７】
これらの細胞は、乳酸桿菌種やビフィドバクテリウム種などの細菌とすることができる。
【００２８】
或いは、これらの細胞は、その他の細菌、イースト菌、糸状菌、又は真菌でもよい。
【００２９】
こうしたマンノース含有炭水化物を、動物及びヒトの食品内の炭素源として使用して、製品中又は摂取後の細胞の増殖を促進させることができる。
【００３０】
これらの細胞は、一般に微生物である。
【００３１】
これらの細胞は、乳酸桿菌種やビフィドバクテリウム種などの細菌とすることができる。或いは、これらの細胞は、イースト菌、糸状菌、又は真菌でもよい。
【００３２】
動物及びヒトの食品は、栄養上又は製薬上の食物又は飲料、飼料、又は製品とすることができる。
【００３３】
この食品は、ヨーグルトなど、発酵中又は発酵済製品とすることができる。この食品は、機能性食品でもよい。
【００３４】
これらのマンノース含有炭水化物は、腸及び体腔内の細胞の増殖を促進する。
【００３５】
一般には、これらのマンノース含有炭水化物は、病原生物を減らして腸にやさしい細胞の増殖を促進させる。
【００３６】
本発明の第２の態様によれば、１種又は複数のプロバイオティック細菌及びマンノース含有炭水化物を含むシンバイオティック食品又は飼料が提供される。
【００３７】
このシンバイオティック食品又は飼料は、プレバイオティックでもよい。
【００３８】
このシンバイオティック食品又は飼料は、プロバイオティックでもよい。
【００３９】
このシンバイオティック食品又は飼料は、プレバイオティックとプロバイオティックの混合物でもよい。
【００４０】
好ましくは、これらのマンノース含有炭水化物（マンナン）は、天然に存在する多糖又はより低い分子量の材料（及びその誘導体）である。
【００４１】
最も好ましくは、これらの炭水化物は、天然に存在する多糖の分子量より低い分子量を有する多糖加水分解物（その誘導体を含めた）又はマンノース含有材料である。
【００４２】
場合によっては、これらの多糖加水分解物は、酵素加水分解物である。
【００４３】
場合によっては、これらの多糖加水分解物は、化学的又は物理的な加水分解物である。
【００４４】
好ましくは、これらの多糖加水分解物は、マンナンである。場合によっては、これらのマンナンは、グルコマンナンである。或いは、これらのマンナンは、ガラクトマンナン、又はその他のタイプのマンナンである。
【００４５】
これらのマンナンは、天然のものでも合成のものでもよい。
【００４６】
これらのマンナンは、マンノースのシロップ、粉末、又は粉の形とすることができる。
【００４７】
このグルコマンナンは、場合によってはコンニャクグルコマンナンである。
【００４８】
任意の適切なプロバイオティック細菌を使用することができる。例としては、乳酸桿菌種及びビフィドバクテリウム種が挙げられる。
【００４９】
本発明の第３の態様は、ヒト及び動物中で微生物の増殖を促進させる炭素源としてのマンノース含有炭水化物の使用を提供する。
【００５０】
この炭素源は、ヒト及び動物の腸内で増殖を促進させることができる。
【００５１】
本発明の第４の態様は、ヒト及び動物中で微生物の増殖を促進させるプレバイオティックとしてのマンノース含有炭水化物の使用を提供する。
【００５２】
このプロバイオティックは、ヒト及び動物の腸内で増殖を促進させることができる。
【００５３】
好ましくは、これらのマンノース含有炭水化物は、天然に存在する多糖又はより低い分子量の材料である。
【００５４】
最も好ましくは、これらの炭水化物は、天然に存在する多糖の分子量より低い分子量を有する多糖加水分解物、その誘導体、又はマンノース含有材料である。
【００５５】
場合によっては、これらの多糖加水分解物は、酵素加水分解物である。
【００５６】
場合によっては、これらの多糖加水分解物は、化学的又は物理的な加水分解物である。
【００５７】
好ましくは、これらの多糖加水分解物は、マンナンである。
【００５８】
場合によっては、これらのマンナンは、グルコマンナンである。或いは、これらのマンナンは、ガラクトマンナン又はその他のタイプのマンナンである。
【００５９】
これらのマンナンは、天然のものでも合成のものでもよい。
【００６０】
これらのマンナンは、マンノースのシロップ、粉末、又は粉の形とすることができる。
【００６１】
これらのグルコマンナンは、場合によってはコンニャクグルコマンナンである。
【００６２】
本発明の第５の態様によれば、ヒト及び動物中で微生物の増殖を促進させる炭素源、即ち、天然に存在するマンナン含有多糖より低い分子量を有するマンノース含有多糖加水分解物又はその合成誘導体を含むプレバイオティックが提供される。
【００６３】
この炭素源は、ヒト及び動物の腸内で増殖を促進させることができる。
【００６４】
本発明の第６の態様によれば、ヒト及び動物中で微生物の増殖を促進させるプレバイオティック、即ち、天然に存在するマンナン含有多糖より低い分子量を有するマンノース含有多糖加水分解物又はその合成誘導体を含むプレバイオティックが提供される。
【００６５】
この炭素源は、ヒト及び動物の腸内で増殖を促進させることができる。
【００６６】
好ましくは、これらのマンノース含有炭水化物は、多糖に由来するが、天然に存在するより低い分子量の材料でもよい。
【００６７】
最も好ましくは、これらの炭水化物は、天然に存在する多糖の分子量より低い分子量を有する多糖加水分解物、その誘導体、又はマンノース含有材料である。
【００６８】
場合によっては、これらの多糖加水分解物は、酵素加水分解物である。
【００６９】
場合によっては、これらの多糖加水分解物は、化学的又は物理的な加水分解物である。
【００７０】
好ましくは、これらの多糖加水分解物は、マンナンである。
【００７１】
場合によっては、これらのマンナンは、グルコマンナンである。或いは、これらのマンナンは、ガラクトマンナン又は任意の他のタイプのマンナンである。
【００７２】
これらのマンナンは、天然のものでも合成のものでもよい。
【００７３】
これらのマンナンは、マンノースのシロップ、粉末、又は粉の形とすることができる。
【００７４】
これらのグルコマンナンは、好ましくはコンニャクグルコマンナンである（しかしこれだけに限らない）。
【００７５】
このプレバイオティック又は加水分解物は、局所、経口、膣内、又は肛門投与に適切であり得る。
【００７６】
場合によっては、このプレバイオティック又は加水分解物は、錠剤、カプセル、潅注液などの液剤など、任意の物理的形態の膣坐薬である。
【００７７】
或いは、この加水分解物又はプレバイオティックは、クリーム（消費者用及びヘルスケア用の製品）である。
【００７８】
或いは、この加水分解物又はプレバイオティックは、坐薬（消費者用及びヘルスケア用の製品）である。
【００７９】
これらの微生物は、一般に天然のミクロフローラである。
【００８０】
本発明の第７の態様によれば、１種又は複数のプロバイオティック細菌及び炭水化物を含むことができる薬剤組成物が提供される。
【００８１】
これらの炭水化物は、好ましくはマンノース含有炭水化物である。
【００８２】
好ましくは、これらのマンノース含有炭水化物は、天然に存在する多糖又はより低い分子量の材料である。
【００８３】
最も好ましくは、これらの炭水化物は、天然に存在する多糖の分子量より低い分子量を有する多糖加水分解物、その誘導体、又はマンノース含有材料である。
【００８４】
場合によっては、これらの多糖加水分解物は、酵素加水分解物である。
【００８５】
場合によっては、これらの多糖加水分解物は、化学的又は物理的な加水分解物である。
【００８６】
好ましくは、これらの多糖加水分解物は、マンナンである。
【００８７】
場合によっては、これらのマンナンは、グルコマンナンである。或いは、これらのマンナンは、ガラクトマンナン又はその他のタイプのマンナンである。
【００８８】
これらのマンナンは、天然のものでも合成のものでもよい。
【００８９】
これらのマンナンは、マンノースのシロップ、粉末、又は粉の形とすることができる。
【００９０】
これらのグルコマンナンは、場合によってはコンニャクグルコマンナンである。
【００９１】
この薬剤組成物は、膣坐薬、坐薬、若しくはクリーム、又は任意のヘルスケア製品とすることができる。
【００９２】
次に、本発明を以下の図を参照しながら説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９３】
以下に詳細に論じる実施例によって、マンノース含有炭水化物、具体的には、グルコマンナンやガラクトマンナンなどのマンナンは、細菌の増殖の優れた促進剤であることが分かった。具体的には、本出願人は、コンニャクグルコマンナン及びガラクトマンナンの加水分解物を含む多糖加水分解物が、既存の商業上周知のプレバイオティック物質に比べて、細胞及び微生物の増殖の優れた促進剤であり、この増殖を促進する際に思いがけず優れた効果を有することを示した。詳細には、グルコマンナン加水分解物は、乳酸桿菌種及びビフィドバクテリウム種のような腸にやさしい細菌の増殖を促進し、動物及びヒトの食品及び飼料中で使用できる。マンノース含有炭水化物を含めた炭水化物がまた、非経口投与、例えば、膣内、局所、又は肛門投与によって与えられたとき、細胞及び微生物の増殖の優れたプレバイオティクス及び促進剤であることも分かった。マンノース含有グルコマンナン、ガラクトマンナン、さらにその他のタイプのマンナンなどの炭水化物は、局所用クリーム、坐薬、潅注液、膣坐薬など、消費者用及びヘルスケア用の製品中で使用されることがここに予想される。
【００９４】
本出願人は、マンナン、特に、グルコマンナン加水分解物やガラクトマンナン加水分解物などのマンナン加水分解物が、以下のことに対する可能性を有することを想定している。
・  栄養素プレート上で細胞（特に細菌のだがこれだけに限らない）増殖を促進させること。それはまた、この状況では、これらの細胞の乾燥中に凍結防御物質の利点を提供することもできる。
・  この材料が非発酵／発酵中／発酵済食品内の生物に炭素源を提供することができる飼料、飲食物、及びヘルスケア系において補助剤として機能すること。
・  この材料が腸に搬送された生物及び腸内に存在する生物に炭素源を提供することができる飼料、飲食物、及びヘルスケア系において補助剤として機能すること。
・  飼料、飲料、食品、ヘルスケア製品、薬剤、生物学的製剤、及びその他の関連する製品において、ある種の微生物の増殖を他のものより選択的に支援すること。
【００９５】
本発明によって提供される商業的利点に対する重要な態様は、化学的（酸による）加水分解物、生化学的加水分解物、酵素による加水分解物、物理的加水分解物などの多糖加水分解物が、任意の適切な手段によって生成され得、分子量又は分散に関わらず有効であるということにある。
【００９６】
マンナンは、純粋なマンナンでも別の物質（例えば糖）と組み合わせてもよい。合成マンナンを使用してもよい。
【００９７】
方法１  コンニャク粉のセルラーゼ加水分解
コンニャク粉（Ｌｕｘａｒａ  ５８６７、Ａｒｔｈｕｒ  Ｂｒａｎｗｅｌｌ  ＆  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）のセルラーゼ１３Ｐ−ＣＯ１３Ｐ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  Ｌｔｄ．、ウェールズ、英国）加水分解の範囲を決定するために、様々な酵素濃度を使用して実験を行った。コンニャク粉を、２５０ｍｌ容のＤｕｒａｎガラス製スクリューネック型フラスコにおいて様々なセルラーゼ濃度で酢酸緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ４．５）に溶解した。サンプルを振盪水槽において６０℃で２又は４時間インキュベートした。コンニャクを含まないセルラーゼを加えた対照もインキュベートした。アリコート（１ｍｌ）をピペットできれいな１０ｍｌ容スクリュートップ型チューブに移動させ、密閉し、次いで沸騰した水槽に１５分間配置して、酵素を不活性化させた。次に、それらを３０００ｒｐｍ（１５００ｘｇ）で１５分間遠心分離機にかけた。上澄液のアリコート（１ｍｌ）をピペットで２５０ｍｌ容量フラスコに移動させた。脱イオン水約１００ｍｌを硫酸亜鉛１０ｍｌ及び１Ｍ水酸化ナトリウム６ｍｌと共にこのフラスコに添加した後、それらを脱イオン水で容量調整した。内容物をＷｈａｔｍａｎのＮｏ．１ろ紙（直径１８．５ｃｍ）を通して２５０ｍｌ容の三角フラスコ中にろ過した。次いで、還元力（Ｎｅｌｓｏｎ、１９４４年）を決定するために、各フラスコの透明なろ液のアリコート（１ｍｌ）を、ピペットで１０ｍｌ容のスクリューキャップ型パイレックス（登録商標）チューブ中に移した。
【００９８】
また、上澄液分画（約０．２５ｍｌ）を標準糖及び加水分解物に対して薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で分離して、鎖長の指標を得た。ＴＬＣ（Ｗｈａｔｍａｎ  ＫＳシリカゲル１５０°Ａ、厚さ２５０μｍ）に使用した標準糖は、グルコース（ＡＣＲＯＳ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ−４１０９５５０００）、マンノース（Ｓｉｇｍａ−Ｍ−４６２５）、セロビオース（Ｆｌｕｋａ−２２１５０）、マルトトリオース（ＡＣＲＯＳ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ−２２５９４００１０）、及びマルトヘキソース（Ｓｉｇｍａ−Ｍ９１５３）とした。ＴＬＣプレートに使用する移動相を、プロパン−２−オール、アセトン、及び１Ｍ乳酸（それぞれ４：４：２）で構成した。様々の糖をジフェニルアミン（アニリン、ジフェニルアミン、及び８５％オルトリン酸の割合はそれぞれ５：５：１）を使用して視覚化した。
【００９９】
この方法の結果を図１に示す。酵素濃度、温度、及び時間が増加すると、酵素加水分解が増加した。酵素濃度、温度、又は時間が増加するにつれて、低分子量材料の割合が予想通り増加した。加水分解物の最適収量のために、以下の条件を最適化し、ほとんどの実験で選択した（但しこれだけに限らない）、即ち、図２に示すように、固体と緩衝液の比を１：１０とし、緩衝液１ｍｌにつきセルラーゼ１５ｍｇで６０℃で２時間加水分解した。
【０１００】
方法２−コンニャク加水分解物の抽出物
コンニャク加水分解物を、２つの異なる方法において所望の条件で抽出した、即ち、（ａ）糖を含まず、上澄液を９０％無水エタノールで沈澱させた場合、或いは（ｂ）糖を含み、上澄液を凍結乾燥させた場合である。２種のコンニャク加水分解調製物分画を、機能性（特に微生物の増殖に対する基質）に関して比較した。これを以下の通りに実施した。
【０１０１】
いくつかの乳酸細菌を様々な供給源から得た。これらには、以下のものが挙げられる。
ラクトバチルスカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）種カゼイ（ｃａｓｅｉ）                                    ＮＣＦＢ１６１
ラクトバチルスデルブルツキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ）種ブルガリカス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）  ＮＣＦＢ１４８９
ラクトバチルスアシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）                                      ＮＣＦＢ１７４８
ラクトバチルスガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）
ＮＣＦＢ２２３３
ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）
ＤＳＭ１２０２８
ラクトコッカスラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）種ラクティス
ＮＣＩＭＢ６６８１
ビフィドバクテリウムアドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）                      ＮＣＩＭＢ７０２２０４
ビフィドバクテリウムブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）
ＮＣＩＭＢ７０２２５８
ビフィドバクテリウムビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）                                        ＮＣＩＭＢ７００７９５
【０１０２】
これらの細菌株の増殖を、２種のコンニャク加水分解調製物分画を使用して検査した。この検査をバクトメーター（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ベイジングストーク、ハンプシャー州）を使用して行い、そこで段階希釈物を各微生物について無菌脱イオン水で調製し、改変ＭＲＳブロス１ｍｌを使い捨てバクトメーターモジュールの各ウェル中に移した。バクトメーターモジュールの各ウェルに各希釈物のアリコート０．１ｍｌを接種し、次いで嫌気条件を得るために無菌の鉱油で被覆した。次いで、モジュールを、Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ  ４２０５  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ベイジングストーク、ハンプシャー州）で駆動させたＢａｃｔｏｍｅｔｅｒ  １２８  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ベイジングストーク、ハンプシャー州）において３７℃で４８時間インキュベートした。また、乳酸菌の増殖を、改変ＭＲＳ寒天プレートで菌株を成長させることによって検査した。
【０１０３】
この結果は、使用したすべての乳酸菌株が、両方のコンニャク加水分解調製物分画で増殖することができたことを示した。バクトメーターでは、増殖は、バクトメーターモジュールに示される検出時間（微生物の初期濃度がバクトメーターの閾値レベルに達するのに必要な時間）によって実証された。２種の加水分解物分画の間に有意差が存在しないことも示され、その結果、この用途では糖を含有するコンニャク加水分解物を使用することが経済的理由から決定されたが、こうした用途は、糖を含んでも含まなくても行うことができる。
【実施例】
【０１０４】
（実施例１）
培地上の細菌増殖を支援するグルコマンナン／コンニャク加水分解物の使用
バクトメーターにおけるコンニャク加水分解物：
生成したコンニャク加水分解物を炭素源として使用して、バクトメーターにおいて一連の乳酸菌を増殖させた。Ｄｅ  Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、及びＳｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）ブロスを最初の処方に従って調製し、ＭＲＳ改変ブロスを、最初の処方のグルコース（グルコース２０ｍｇ／ｍｌ）の代りに１００％マンノース：グルコース（１．６：１）、糖を含む１００％可溶性加水分解物、及び糖を含まない１００％可溶性加水分解物を使用して調製した。段階希釈物を各微生物について無菌脱イオン水で調製した。微生物をインキュベートし、微生物モニターシステムで増殖速度を決定するためにブロス１ｍｌを使い捨てバクトメーターモジュール（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ベイジングストーク、ハンプシャー州）の各ウェルに移した。モジュール中の各ウェルに各希釈物のアリコート０．１ｍｌを接種し、次いで嫌気条件を得るために無菌の鉱油で被覆した。次いで、モジュールを、Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ  ４２０５  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ベイジングストーク、ハンプシャー州）で駆動させたＢａｃｔｏｍｅｔｅｒ  １２８  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ベイジングストーク、ハンプシャー州）において３７℃で４８時間インキュベートした。
【０１０５】
この結果は、乳酸桿菌及びビフィドバクテリウムを含めた検査されたすべての乳酸菌が、使用されたすべての炭素源上で増殖したことを示した。これは、バクトメーターモジュールに示される検出時間（微生物の初期濃度がバクトメーターの閾値レベルに達するのに必要な時間）によって実証された。
【０１０６】
（実施例２）
ＭＲＳ寒天におけるコンニャク加水分解物及びイヌリン
コンニャク加水分解物を含む培地と確立したプレバイオティックであるイヌリンを含む別の培地との間で乳酸菌の増殖の比較を行った。この場合、炭素源を、最初の処方のグルコース（グルコース２０ｍｇ／ｍｌ）の代りに使用してＭＲＳ培地に混合した。炭素源を含まないＭＲＳ培地、コンニャク加水分解物を含むＭＲＳ培地、及びイヌリンを含むＭＲＳ培地を調製した。マキシマムリカバリー希釈液で段階希釈を行い、各微生物の各希釈物のアリコート０．１ｍｌをスプレッドプレート法を使用して播いた。次いで、プレートを５％ＣＯ２条件下で３７℃で４８時間インキュベートし、その後コロニー形成単位（Ｃ．Ｆ．Ｕ．）を得た。
【０１０７】
コロニーの数は、両方の炭素源で同じ範囲（１０７〜１０８）にあった。しかし、非常に大きなコロニー（５ｍｍ）が、コンニャク加水分解物を含むＭＲＳプレート上で増殖した。一方、非常に小さなコロニー（０．５〜１ｍｍ）が、炭素源としてイヌリンを含むＭＲＳプレート上で得られた。これらの結果を図３及び４に示す。
【０１０８】
（実施例３）
ＭＲＳ寒天におけるコンニャク加水分解物及びイヌロ（ｉｎｕｌｏ−）加水分解物
乳酸菌の増殖を、コンニャク加水分解物を含む培地及びイヌロ加水分解物を含む別の培地上で比較した。コンニャク粉及びイヌリンを、適切な濃度のセルラーゼ及びイヌリナーゼをそれぞれ使用して加水分解した。生成したコンニャク加水分解物及びイヌロ加水分解物を、最初の処方のグルコース（グルコース２０ｍｇ／ｍｌ）の代りに使用してＭＲＳ寒天に添加した。マキシマムリカバリー希釈液で段階希釈を行い、３種の乳酸桿菌及び３種のビフィドバクテリウムを含めた乳酸菌を継代培養し、５％ＣＯ２条件下で３７℃で４８時間インキュベートした。
【０１０９】
表２：コンニャク加水分解物（ＫＯＳ）及びイヌロ加水分解物（ＩＯＳ）を含む培地上の乳酸菌のコロニー形成単位及びコロニーサイズ。
【表２】
2007537224.tif 000003
【０１１０】
表２に示されるように、両方の炭素源によるＣ．Ｆ．Ｕ．は、８×１０７を示したＢ．ビフィダムＮＣＩＭＢ（７００７９５）以外は２．４〜４．４×１０８の範囲にあった。しかし、コンニャク加水分解物を含む培地上のコロニーサイズ（５ｍｍ）は、イヌロ加水分解物を含む培地上で増殖したもの（１ｍｍ）よりはるかに大きかった。これは、コンニャク加水分解物が、乳酸菌の増殖を支援しており、したがって、世代時間が、イヌロ加水分解物を含む培地上で増殖したものより速かったことを示唆している。
【０１１１】
（実施例４）
ＭＲＳ寒天中にペクチン加水分解物及びキシロ加水分解物を含むコンニャク加水分解物
また、乳酸菌の増殖を、コンニャク加水分解物を含む培地、並びに確立したプレバイオティクスであるペクチン加水分解物及びキシロ加水分解物を含む他の培地上で比較した。コンニャク粉、ペクチン、及びキシランを、適切な濃度のセルラーゼ、ペクチナーゼ、及びキシラナーゼをそれぞれ使用して加水分解した。生成した加水分解物を、最初の処方のグルコースの代りに使用してＭＲＳ寒天に添加した。マキシマムリカバリー希釈液で段階希釈を行い、乳酸菌を継代培養し、５％ＣＯ２条件下で３７℃で４０時間インキュベートした。
【０１１２】
表３：ＭＲＳ寒天、コンニャク加水分解物（ＫＯＳ）を含むＭＲＳ、ペクチン加水分解物（ＰＯＳ）を含むＭＲＳ、及びキシロ加水分解物（ＸＯＳ）を含むＭＲＳ上で増殖した乳酸桿菌及びビフィドバクテリウムのコロニー形成単位及びコロニーサイズ（ｍｍ）。
【表３】
2007537224.tif 000004
【０１１３】
表３に示されるように、すべての炭素源によるＣ．Ｆ．Ｕ．の結果は、コンニャク及びペクチン加水分解物が利用可能である、より高い数（１．０×１０８）を示したＢ．ブレーベＮＣＩＭＢ（７０２２５８）を除いて類似していた。しかし、図５に示すように、コンニャク加水分解物を含む培地上のコロニーサイズは、ＭＲＳ寒天、ペクチン加水分解物、及びキシロ加水分解物上で増殖したものより大きかった。
【０１１４】
（実施例５）
非発酵／発酵中／発酵済食品におけるグルコマンナン／コンニャク加水分解物の使用
ＵＨＴミルク中のコンニャク加水分解物及びイヌリン
コンニャク加水分解物及び商業用加水分解物としてのイヌリン上での乳酸菌の増殖について比較を行った。ＵＨＴミルクを購入し、炭素源として組込み済み加水分解物を使用することによって乳酸菌の増殖に関して検査した。ミルク（対照）、２％コンニャク加水分解物を含むミルク、及び２％イヌリンを含むミルクのサンプルを、５％ＣＯ２条件下で３７℃で２４時間インキュベートした。マキシマムリカバリー希釈液で段階希釈を行い、各微生物の各希釈物のアリコート０．１ｍｌをスプレッドプレート法を使用して播いた。次いで、プレートを５％ＣＯ２条件下で３７℃で４８時間インキュベートし、その後コロニー形成単位（Ｃ．Ｆ．Ｕ．）を得た。
【０１１５】
表４：ＭＲＳ寒天上で継代培養された、ミルク、イヌリンを含むミルク、及びコンニャク加水分解物（ＫＯＳ）を含むミルク１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（Ｃ．Ｆ．Ｕ．）の差。
【表４】
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【０１１６】
表４及び図６に示される結果は、コンニャク加水分解物を含むミルクでのコロニー形成単位（４．３×１０８〜１．６×１０９）が、イヌリンを含むミルクでのもの（３．７×１０７〜７．６×１０８）より高く、また、これはミルクのみと非常に類似していたことを示している。さらに、ビフィドバクテリウムのコロニー形成単位は、すべてのサンプルにおいて乳酸桿菌より高かった。
【０１１７】
コンニャク加水分解物及び天然ヨーグルト
乳酸菌の増殖に対するコンニャク加水分解物の影響を、この製品を天然ヨーグルトに加えることによってさらに試験した。天然ヨーグルトのフローラを直ちに決定し、３７℃で４８時間インキュベートしたヨーグルト中に０、１、２、及び５％のコンニャク加水分解物を添加した。マキシマムリカバリー希釈液で段階希釈を行い、各希釈物のアリコート０．１ｍｌをスプレッドプレート法を使用して播いた。次いで、プレートを５％ＣＯ２条件下で３７℃で４８時間インキュベートし、その後コロニー形成単位（Ｃ．Ｆ．Ｕ．）を得た。
【０１１８】
表５：様々な濃度のコンニャク加水分解物を含むヨーグルト１ｇ当たりのコロニー形成単位（Ｃ．Ｆ．Ｕ．）。
【表５】
2007537224.tif 000006
【０１１９】
表５に示される結果は、増殖を制限した非常に多くの酸を形成した５％増加の加水分解物を除いて、コンニャク加水分解物の濃度が増加するにつれてコロニーの数も極僅か増加することを示した（１．３×１０７、１．８×１０７、及び２．０×１０７）。
【０１２０】
（実施例６）
飼料／食品中並びに腸及び身体内での増殖を促進するグルコマンナン／コンニャク加水分解物の可能性
飼料／食品中での増殖を促進し、腸内の病原細菌を含めたその他の微生物の増殖を阻害することによってヒトの健康に有益な影響を及ぼすグルコマンナン／コンニャク加水分解物の潜在的な効果を調べるための研究を行った。鶏肉が通常カンピロバクターやリステリアなどの病原細菌によって腐敗することはよく知られているので、したがって、鶏ムネ肉２５ｇを、ストマッカーを使用してホモジナイズし、５０ｍｌ容の三角フラスコ中のＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎブロス（ｏｘｏｉｄ）２０ｍｌに２００μｌを接種するのに使用した。これをオービタルシェーカー上で３７℃で一晩インキュベートした。これを作製したのと同じ日に、増殖スポットを、最初の処方のグルコース（グルコース２０ｍｇ／ｍｌ）の代りに炭素源としてコンニャク加水分解物を含むＭＲＳ寒天の中心に、一晩インキュベートしたプロバイオティック細菌（Ｌ．カゼイ、Ｌ．アシドフィルス、及びＢ．アドレスセンティス）の培養物を一白金耳量接種することによって作出した。プレートを５％ＣＯ２条件下で３７℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした鶏肉混合物を含むＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎブロス２００μｌの量を、各微生物のＭＨ寒天１５ｍｌに添加した。追加の培養物を溶解寒天と一緒にやさしく混合し、次いでペトリ皿に注ぎ、固化させた。次いで、寒天をやさしく持ち上げてプレートから無菌的に取り出し、それを他の寒天プレート上のプロバイオティック増殖スポット上にゆっくりと下ろした。サンドイッチ型の寒天を含むプレートを好気性条件下で３７℃でインキュベートした。一晩インキュベートした後、プロバイオティックスポット上で細菌増殖が認められなかった阻害領域を測定し、各菌株に対するプロバイオティックスポットの直径をこの数から差し引いた。この実験研究を３回繰り返し、ばらつきなく結果がもたらされた。
【０１２１】
上記の手順をまた、病原性のリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の２個の純粋培養、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の１個の培養、及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の１個の培養に適用した。最初にミルクからのリステリア菌Ｌ８５０及びヒト供給源からのリステリア菌Ｓｃｏｔｔ  ＡをＴＳＢ中で継代培養し、次いで、プロバイオティック細菌のＬ．アシドフィルスＮＣＦＢ１７４８、Ｌ．プランタラムＤＳＭ１２０２８、Ｌ．カゼイ種カゼイＮＣＦＢ１６１、及びラクトコッカスラクティス種ラクティスＮＣＩＭＢ６６８１（Ｈａｎｎａｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、エア、スコットランド）によるそれらの阻害を調べた。
【０１２２】
大腸菌をＬｕｒｉａブロスで増殖させた後、その阻害を、ＭＲＳ及びグルコマンナンを補充したＭＲＳ上のプロバイオティック細菌のＬ．カゼイ種カゼイＮＣＦＢ１６１及びＬ．アシドフィルスＮＣＦＢ１７４８に対して試験した。黄色ブドウ球菌をＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎブロスで増殖させた後、Ｌ．アシドフィルスＮＣＦＢ１７４８、Ｌ．カゼイ種カゼイＮＣＦＢ１６１、Ｌ．ガセリＮＣＦＢ２２３３、及びラクトコッカスラクティス種ラクティスＮＣＩＭＢ６６８１によってその阻害を調べた。
【０１２３】
今回発明されたプレバイオティックは、食品、飼料、及びヘルスケア／薬剤用途を含めた幅広い技術において普遍的に価値のある特有のプロフィルを有するので、このプレバイオティックを生物療法剤として、特にカンジダ症及び膣疾患の制御及び治療のために適用することは非常に有益である。したがって、予備的試験を、酵母のカンジダアルビカンスを使用して行った。
【０１２４】
増殖スポットを、ＭＲＳ寒天及びコンニャク加水分解物を補充したＭＲＳ寒天の中心に、一晩インキュベートしたプレバイオティック細菌（Ｌ．アシドフィルスＮＣＦＢ１７４８、Ｌ．カゼイＮＣＦＢ１６１、Ｌ．ガセリＮＣＦＢ  ２２３３、Ｌ．プランタラムＤＳＭ１２０２８、及びラクトコッカスラクティスＮＣＩＭＢ６６８１）の培養物を一白金耳量接種することによって作出した。プレートを５％ＣＯ２条件下で３７℃で一晩インキュベートした。５０℃に維持したＳａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天（Ｏｘｏｉｄ（軟寒天０．７％））１０ｍｌの量に、３０℃で一晩増殖させたカンジダアルビカンス１００μｌを接種した。追加した量を溶解寒天と十分に混合し、次いでプロバイオティックスポットを含む固化した寒天に被せた。プレートを、酵母が増殖する３０℃の好気性条件下でインキュベートした。一晩インキュベートした後、プレバイオティックスポット上で酵母増殖が認められなかった阻害領域を測定し、各菌株に対するプレバイオティックスポットの直径をこの数から差し引いた。
【０１２５】
ＭＲＳ寒天又はコンニャク加水分解物を含む改変ＭＲＳ寒天上に接種したとき、乳酸菌が鶏肉抽出物からの混合培養物に阻害領域をもたらしたことが示された。これは、改変ＭＲＳ寒天上で、特に１８ｍｍの阻害領域を示した菌株ラクトバチルスアシドフィルスによって十分に実証された。他の２種の菌株（Ｌ．カゼイ及びＢ．アドレスセンティス）は、１５ｍｍの阻害領域を示した。しかし、ＭＲＳ寒天上に接種した菌株は、１１ｍｍの阻害領域しか示さなかった。
【０１２６】
表６：ＭＲＳ培地上の乳酸菌によるリステリア菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、及びカンジダアルビカンスの阻害領域。ＫＯＳ＝コンニャク加水分解物
【表６】
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【０１２７】
これらの結果（表６）はまた、リステリア菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、及びカンジダアルビカンスが、グルコマンナン加水分解物の存在下で乳酸菌によって阻害されたことを阻害領域の形で示した（それぞれ図９、１０、１１、及び１２）。この阻害は、プロバイオティック菌株及び炭素源に依存していると思われる。グルコマンナン（プレバイオティック）の存在下で病原体に対して乳酸菌が示した阻害は、非常に重要である。特に、これは、膣疾患症状の治療法を見出し、健康な膣ミクロフローラを回復させる重要な手法であるので、カンジダアルビカンスに対して重要である。この手法により、本発明者らは、投与用のプレバイオティック又は／及びプロバイオティックを、膣感染症の制御及び治療用に、膣坐薬、クリーム、ゲルなど任意の形で導入することによって、生物療法剤の定義及びその使用をさらに拡張することが可能になる。
【０１２８】
本出願人によって行われた研究は、グルコマンナン加水分解物、特にコンニャクグルコマンナン加水分解物が、優れたプロバイオティック物質として働き、細菌細胞の増殖を促進する際に予想外により大きな効果を有することを示している。一般に、これらの細胞が、より短い世代時間を有し、他の確立したプロバイオティック物質によってよりもグルコマンナン加水分解物の存在下で非常に急速に増殖したことが分かった。
【０１２９】
さらなる修正形態及び代替形態を、本明細書に記載の本発明の範囲内で行うことができる。
（参考文献）
2007537224.tif 000008
2007537224.tif 000009
2007537224.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】コンニャク粉のセルラーゼ加水分解に対する時間、温度、及び酵素濃度の影響を示す図である。
【図２】コンニャク粉のセルラーゼ加水分解に対する時間、温度、及び酵素濃度の影響を示す図である。
【図３】コンニャク加水分解物を含む培地（下側）及びイヌリンを含む培地（上側）において乳酸菌の増殖を比較した結果を示す図である。
【図４】コンニャク加水分解物を含む培地（左側）及びイヌリンを含む培地（右側）において乳酸桿菌（上側）及びビフィドバクテリウム（下側）の増殖を比較した結果を示す図である。
【図５】コンニャク加水分解物を含む培地（左上）、ＭＲＳ寒天を含む培地（右上）、ＭＲＳ及びキシロ加水分解物（ｘｙｌｏｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）を含む培地（右下）、並びにＭＲＳ及びペクチン加水分解物を含む培地（左下）において乳酸菌の増殖を比較した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年1月16日(2007.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコマンナン加水分解物を含む、ヒト及び動物中で微生物の増殖を促進させるプレバイオティック。
【請求項２】
前記グルコマンナンが、コンニャクグルコマンナンである、請求項１に記載のプレバイオティック。
【請求項３】
前記グルコマンナン加水分解物が、酵素加水分解物である、請求項１から２までに記載のプレバイオティック。
【請求項４】
前記グルコマンナン加水分解物が、化学的又は物理的な加水分解物である、請求項１から２までに記載のプレバイオティック。
【請求項５】
膣坐薬の形態の、請求項１から４までに記載のプレバイオティック。
【請求項６】
クリームの形態の、請求項１から４までに記載のプレバイオティック。
【請求項７】
坐薬の形態の、請求項１から４までに記載のプレバイオティック。
【請求項８】
ヒト及び動物中で微生物の増殖を促進させるプレバイオティックの製造方法であって、
ａ）マンナン含有粉を水溶液に溶解させるステップ、
ｂ）適切な酵素を添加するステップ、
ｃ）グルコマンナン加水分解物分画を抽出するステップ
を含み、
前記グルコマンナン加水分解物分画をプレバイオティックとして使用できる方法。
【請求項９】
前記グルコマンナン粉が、コンニャクグルコマンナン粉である、請求項８に記載のプレバイオティックの製造方法。
【請求項１０】
細胞の増殖を促進するグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項１１】
前記グルコマンナンが、コンニャクグルコマンナンである、請求項１０に記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項１２】
前記グルコマンナンが、粉である、請求項１０から１１までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項１３】
前記加水分解物が、酵素加水分解物である、請求項１０から１２までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項１４】
前記加水分解物が、化学的又は物理的な加水分解物である、請求項１０から１２までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項１５】
前記グルコマンナンが、生物によって合成される、請求項１０から１４までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項１６】
前記マンナンが、合成によるものである、請求項１０から１４までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項１７】
前記細胞が、微生物である、請求項１０から１６までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項１８】
前記細胞が、細菌である、請求項１０から１７までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項１９】
前記細菌が、乳酸菌である、請求項１８に記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項２０】
動物及びヒトの食品中における、請求項１０から１９までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項２１】
前記食品が、機能性食品である、請求項２０に記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項２２】
前記食品が、ヨーグルトなどの発酵中又は発酵済製品である、請求項２０から２１に記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項２３】
前記食品が、腸及び体腔内の細胞の増殖を促進する、請求項２０から２２までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項２４】
前記食品が、病原生物を減らして腸にやさしい細胞の増殖を促進する、請求項２０から２３までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項２５】
ヒト及び動物の腸内における、請求項１０から２４までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項２６】
ヒト及び動物の体腔中における、請求項１０から１９までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項２７】
膣内における、請求項２６に記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項２８】
ヒト及び動物の皮膚上における、請求項１０から１９までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項２９】
１種又は複数のプロバイオティック細菌及びグルコマンナン加水分解物を含む、シンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３０】
前記グルコマンナンが、コンニャクグルコマンナンである、請求項２９に記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３１】
前記加水分解物が、酵素加水分解物である、請求項２９から３０までに記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３２】
前記加水分解物が、化学的又は物理的な加水分解物である、請求項２９から３０までに記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３３】
前記細菌が、乳酸菌である、請求項２９から３２までに記載のシンバイオティック食物又は飼料。
【請求項３４】
ヒト及び動物中で微生物の増殖を促進させる炭素源としてのグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項３５】
前記グルコマンナンが、コンニャクグルコマンナンである、請求項３４に記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項３６】
前記グルコマンナンが、粉である、請求項３２に記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項３７】
前記加水分解物が、酵素加水分解物である、請求項３４から３６までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項３８】
前記多糖加水分解物が、化学的又は物理的な加水分解物である、請求項３４から３６までに記載のグルコマンナン加水分解物の使用。
【請求項３９】
１種又は複数のプロバイオティック細菌及びグルコマンナン加水分解物を含む、薬剤組成物。
【請求項４０】
前記グルコマンナンが、コンニャクグルコマンナンである、請求項３９に記載の薬剤組成物。
【請求項４１】
前記加水分解物が、酵素加水分解物である、請求項３９から４０までに記載の薬剤組成物。
【請求項４２】
前記多糖加水分解物が、化学的又は物理的な加水分解物である、請求項３９から４２までに記載の薬剤組成物。
【請求項４３】
膣坐薬の形態の、請求項３９から４２までに記載の薬剤組成物。
【請求項４４】
坐薬の形態の、請求項３９から４２までに記載の薬剤組成物。
【請求項４５】
クリームの形態の、請求項３９から４２までに記載の薬剤組成物。
【国際調査報告】
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