(57)【要約】  単純な携帯型機器を使用して、無傷の被験体において蛍光タンパク質をイメージングする方法について記述する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無傷の被験体の皮膚を通して蛍光タンパク質を視覚化する方法であって、第1フィルターを取り付けた携帯型光源から該被験体に励起光を当て、第2フィルターを通して該タンパク質からの発光を観察することを含んでなる、上記方法。
【請求項２】
携帯型光源がLEDフラッシュライトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第2フィルターがゴーグルとして提供される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
蛍光タンパク質が腫瘍細胞内で発現される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍細胞が免疫無防備状態の動物または同系の動物に同所移植されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
蛍光タンパク質が感染性病原体によって発現される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
蛍光タンパク質が、発現を研究すべき遺伝子の制御系と機能的に連結されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
2つ以上の蛍光タンパク質の観察を行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
無傷の被験体において腫瘍の成長をモニタリングする方法であって、
蛍光タンパク質で標識された腫瘍細胞を含む被験体に、第1フィルターを取り付けた携帯型励起光源から励起光を当て、
第2フィルターを使用して、無傷の被験体内の該腫瘍細胞の位置を観察する、
ことを含んでなる、上記方法。
【請求項１０】
前記励起光を当てて観察することが、時間の関数として行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体を候補プロトコルで治療し、該プロトコルで治療した該被験体内の腫瘍細胞の1以上の位置を、該プロトコルで治療しなかった被験体内の腫瘍細胞の1以上の位置と比較することをさらに含む、請求項９または10に記載の方法。
【請求項１２】
無傷の被験体において遺伝子発現をモニタリングする方法であって、
発現をモニタリングすべき遺伝子に関連した制御配列と機能的に連結された、蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む被験体に、第1フィルターを取り付けた携帯型励起光源から励起光を当て、
第2フィルターを使用して、該被験体内の蛍光タンパク質の存在または量を観察する、
ことを含んでなる、上記方法。
【請求項１３】
前記励起光を当てて観察することが、時間の関数として行われる、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験体に刺激を与え、該刺激を与えた被験体が発する蛍光のレベルを、刺激を与えなかった被験体が発する蛍光のレベルと比較することをさらに含む、請求項12または13に記載の方法。
【請求項１５】
被験体内での感染の進行をモニタリングする方法であって、
蛍光タンパク質で標識した感染性病原体を含む被験体に、第1フィルターを取り付けた携帯型励起光源から励起光を当て、
第2フィルターを使用して、該無傷の被験体内の該感染性病原体の1以上の位置を観察する、
ことを含んでなる、上記方法。
【請求項１６】
前記励起光を当てて観察することが、時間の関数として行われる、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体を候補プロトコルで治療し、該プロトコルで治療した該被験体内の感染性病原体の1以上の位置を、該プロトコルで治療しなかった被験体内の感染性病原体の1以上の位置と比較することをさらに含む、請求項15または16に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、携帯型機器を用いた生体内での蛍光タンパク質の発光に基づくイメージングの方法に関する。蛍光タンパク質を含む細胞は、単純な外部イメージング技術によって被験体内で観察される。携帯型の観察装置は、蛍光タンパク質を含む多数の被験体をスクリーニングするように構成することができる。
【背景技術】
【０００２】
全身イメージング技術は、無傷の身体内の「トレーサー分子」を監視するために使用されてきた。例えば、Brennerらは、転移性悪性メラノーマの患者に対して、タリウム-201 シンチグラフィーと比較する形でヨウ素-123-2-ヒドロキシ-3-ヨード-6-メトキシ-N-[(1-エチル-2-ピロリジニル)メチル]ベンズアミド (IBZM) による全身イメージングの診断的価値についての研究を行った (Brennerら, Eur. J. Nucl. Med., (1999) 26:1567-1571)。Benardらは、全身PETイメージングにおいて137Csによる減衰補正のための処理技術の臨床的評価を行った (Benardら, J. Nucl. Med., (1999) 40:1257-1263)。Jerusalemらは、ホジキン病および非ホジキンリンパ腫の治療後評価に18F-フルオロデオキシグルコースを用いた全身陽電子断層撮影法が、従来のコンピュータによる断層撮影スキャンイメージングよりも診断および予後上の価値が高いことを明らかにした (Jerusalemら, Blood, (1999) 94:429-433)。Eustaceらは、全身MRイメージングの実際上の問題、臨床応用、将来の方向性について論じた (Eustaceら, Magn. Reson. Imaging Clin. (N. Am.) (1999) 7:209-236)。Engelsonらは、HIV 感染者の脂肪分布について研究を行い、全身磁気共鳴イメージングによって数量化した体幹の肥大について報告した (Engelsonら, Am. J. Clin. Nutr. (1999) 69:1162-1169)。Valkらは、再発性の結腸直腸癌の管理において、[18F]フルオロデオキシグルコースによる全身陽電子断層撮影 (PET) イメージングを使用した (Valk, Arch. Surg. (1999) 134:503-511)。Saundersらは、肺癌の病期分類において18F-フルオロデオキシグルコースによる全身陽電子断層撮影イメージングの評価を行った (Saundersら, Ann. Thorac. Surg. (1999) 67:790-797)。
【０００３】
生体内の遺伝子発現、感染、腫瘍転移を視覚化することができれば、そのような技術は、明らかに、固有の続発症の進行を理解し、その進行を変化させるためのメカニズムを考案するうえで役に立つ、価値ある技術となる。上記のような比較的複雑なシステムとは対照的に、放出された光の検出を用いたこの技術の初期の形式は侵襲的であり、組織の切除や半透明の材料を用いた皮下窓を用意するなどが必要であった。
【０００４】
比較的最近になり、無傷の動物において腫瘍細胞または関心のある他の細胞の内部挙動を観察するために、光の放出を用いる技術が考案された。例えば、PCT公開WO 97/18841には、サルモネラ病原菌が生物発光性となるようにluxオペロンを使用してサルモネラを改変することが記述されている。感染の過程は、蛍光の外部励起を必要とすることなく無傷の動物において追跡することができた。しかし、十分な画像強度を得るために、観察には被験体の固定が必要となる。このため、動物を、光を透さないボックス内に固定し、CCD（charge-coupled device：電荷結合素子）カメラ（2段階マイクロチャネル増幅器ヘッドをArgus 50画像プロセッサに装着したもの）で画像を撮る必要がある。この方法は、被験体を固定した状態で維持し、被験体内に局在化した発光成分から放出される光子を、光子放出の画像が作成されるまで光検出装置で測定し、哺乳動物の不透明な組織を通して画像を検出することが必要である。それなりに意味のある画像を取得するには、複雑な技術が必要とされる。
【０００５】
PCT公開WO 98/49336には、緑色蛍光タンパク質 (GFP) をマーカーとして用いる転移モデルが記述されている。この公開公報に記述されているとおり、GFPは、緑色以外にも、様々な色を発生する蛍光タンパク質の普通に用いられる名称である。このタンパク質は強い蛍光を発するため、被験体を固定する必要なしに、移植された腫瘍からの転移をリアルタイムで観察することができた。無傷の動物での観察が、この場合には、蛍光顕微鏡検査を使って行われたが、やはり観察にはかなり複雑な技術が必要とされた。同様の技術が、後続のPCT公開WO 00/40274にも記述されている。これらの技術は、緑色蛍光タンパク質を使用した遺伝子発現の観察 (WO 01/71009)、ならびに感染の進行の観察 (WO 2004/016766) へと応用された。
【０００６】
Yangら (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (2000) 97:1206-1211) はこのアプローチを詳細に記述しており、マウスの体内で成長し転移している蛍光腫瘍のリアルタイム画像を開示している。全身光学イメージングシステムは外部的で、かつ非侵襲性である。これは、無傷動物の体内での悪性腫瘍の成長と広がりの、先例のない連続的視覚的モニタリングを可能とする。Yangらは、高レベルのオワンクラゲ（Aequorea victoria）由来緑色蛍光タンパク質 (GFP) を安定的に発現する新しいヒトおよび齧歯類腫瘍を樹立し、これらを適当な動物に移植した。全身光学イメージングは、原発性結腸腫瘍の成長と、肝臓および骨格におけるその転移病巣をリアルタイムで示した。イメージングは透光型エピ蛍光顕微鏡、または蛍光ライトボックスと熱電冷却カラーCCDカメラとの組み合わせのいずれかによって行われた。転移と微小転移巣がどの深さまで画像化されるかは、そのサイズに左右される。しかし、観察に用いられた装置は複雑であった。
【０００７】
高倍率で視覚化するために、Leica蛍光立体顕微鏡（50W 水銀ランプを装備したモデル LZ12）が使用された。GFPの選択的な励起は、D425/60バンド-パスフィルターと470 DCXR 二色性ミラーによって発生させた。放出された蛍光は、Hamamatsu C5810-3 チップ冷却カラーCCDカメラ（Hamamatsu Photonics Systems 、ニュージャージー州ブリッジウォーター）上のロングパスフィルター GG475（Chroma Technology 、バーモント州ブラトルバラ）を介して収集された。画像にコントラストと輝度の処理を施してから、IMAGE PRO PLUS 3.1ソフトウェア（Media Cybernetics 、メリーランド州シルバースプリングス）を用いて画像を解析した。1,024 x 724 ピクセルの画像が直接 IBM PCにより取得されるか、または高解像度Sony VCRモデルSLV-R-1000（ソニー、東京）でビデオ出力を介して連続的に取得された。
【０００８】
動物全体を低倍率で視覚化するイメージングは、青色光ファイバーオプチクス（Lightools Research、カリフォルニア州エンシニタス）によって照射されたライトボックス内で実施され、上記のように、熱電冷却カラーCCDカメラを用いて画像を撮った。
【０００９】
さらに、時間につれて、また、イメージングの領域にわたって変わる励起照度の変動を説明するために、GFP蛍光の強度を測定する。これらの係数は、マウス皮膚の固有の赤色蛍光をベースラインとして用いて、GFPに起因する固有の緑色蛍光に対する増加を修正することによって、補正される。これは、GFP放射輝度中に赤色輝度が比較的少ししか存在しないために可能となる。その結果、皮膚画像の赤色チャネルと緑色チャネルの組成に基づいて、赤色に対して緑色の蛍光を算出した。緑色チャネルと赤色チャネルの比（γ）を、GFPの不在下および存在下で、皮膚の画像の各ピクセルにつき決定した。GFPの不在下での画像全体におけるマウス皮膚のγ値は、0.7と1.0の間で変化するという、かなり一定したものであった。動物内部からGFP蛍光が発せられると、赤色に対して緑色成分が増加し、これはより高いγ値をもたらした。GFP蛍光の合計量は、γ値が1よりも高かったピクセルの数に各ピクセルのγ値を掛けて概算した。このような積は、GFPの不在下での皮膚の最大γ値を超える積分GFP蛍光 [I’GFP] におおよそ一致している。GFPの不在下でγ値＞1.0であるマウス皮膚画像のピクセル数は0.02％未満であったが、これはGFPの発現とともに増加した。[I’GFP] の値は、脳（図1A）および肝臓（図1B）へのウイルス注入後の時間の関数として示されている。
【００１０】
生きている無傷動物、または死亡後の解剖によって直接観察した様々な器官を高倍率で撮影して、各種器官の画像を比較した。これらの画像は、様々な器官における遺伝子発現の分布を示す。全ての場合において、外部的に作成された画像は、露出した器官の画像と類似している。
【００１１】
生きている動物をライトボックス内で観察する場合には、遺伝子の発現をモニタリングすることも可能であり、こうして、その生存動物と、発現がその動物において起こるときは発現とをリアルタイムで観察することができる。例えば、72時間で得られたヌードマウス肝臓におけるGFPのライトボックス測定は明確にこの結果を示す。同様の結果が、遺伝子を送達してから24時間後のヌードマウスの脳においても観察された。
【００１２】
Weisslederらは、腫瘍がある動物に、プロテアーゼ活性によって活性化されると赤外振動数で蛍光を発するプローブを注入した (Nat. Biotechnol. (1999) 17:375-378)。適切なプロテアーゼを含む腫瘍はそのプローブを活性化し、外部から見ることができた。このシステムは非常に高い肝臓対腫瘍バックグラウンド蛍光によって制限され、このことは、最も重要な転移箇所の一つである肝臓への転移については研究できないことを意味する。さらに、研究の制限時間は96時間であるため、成長および効力の研究は不可能であった。検出可能であるためには腫瘍が適当なプロテアーゼ活性をもつ必要があり、また、プローブが選択的に腫瘍へと到達されねばならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
これらの先行技術は、有用であるものの、複雑な装置を必要とし、しかも短期間で多数の被験体を迅速に評価できないことが明らかである。本発明は、複数の観察に容易に適合しうる携帯型機器を利用することで、これらの問題を解決するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、携帯型機器を使用することによる蛍光タンパク質のイメージング法に関する。蛍光タンパク質は、外部イメージング技術を用いて被験体内で観察される。励起光源用の第1フィルターを取り付けた携帯型励起光源（フラッシュライトなど）および放出された光を受け取るように調整された第2フィルターを用いることにより、1個体または多数の被験体に対してリアルタイムの観察を行うことができる。
【００１５】
この観察技術は複数の状況に応用することができる。例えば、腫瘍の成長や転移を追跡する場合、感染の進行を追跡する場合、遺伝子発現を追跡する場合、これらのプロセスのそれぞれに影響を与える要因を特定する場合などである。そのため、かかる観察は、腫瘍モデルまたは感染モデルとなる実験動物に対して行うことができ、これらは、治療プロトコルを評価するためのシステムとしてだけでなく、代謝機能に及ぼす各種刺激の影響を観察するためのシステムとしても使用することができる。
【００１６】
携帯型機器の励起フィルターと観察フィルターが適切に合致すると、蛍光シグナルを観察する状況に関係なく、情報量の多いイメージングが可能となる。
【００１７】
そのため、一形態において、本発明は無傷の被験体の皮膚を通して蛍光タンパク質を視覚化する方法に関し、この方法は、第1フィルターを取り付けた携帯型光源を用いて該被験体に励起光を当て、第2フィルターを通して該タンパク質からの発光を観察することを含んでなる。特定の形態では、この視覚化方法を利用して、腫瘍の進行と転移をモニタリングしたり、その進行と転移に及ぼす各種プロトコルの効果を観察したり、遺伝子発現を監視して発現に対する各種刺激の影響を観察したり、また、感染をモニタリングして様々な治療とプロトコルが該感染の進行にどのような影響を及ぼすのかを観察したりしうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、励起に携帯型の光源を、そして検出に携帯型フィルターを使用した、トレーサーとして蛍光タンパク質を用いる生体内または全身イメージング方法に関する。
【００１９】
幾つかの適切な蛍光タンパク質が入手可能であり、当該技術分野で周知である。例えば、生物発光クラゲであるAequorea Victoria (Anticancer Res. (1994) 14:85-92) からクローニングされた緑色蛍光タンパク質 (GFP) 遺伝子は、細胞マーカーとして実用性が高いため、これらの要件を満たすものとして選択された (Science (1994) 263:802-805; Nat. Biotechnol. (1996) 14:606-609)。GFP cDNAは283アミノ酸の単量体ポリペプチドをコードしており、その分子量は27kDaである (Gene (1992) 111:229-233; Nat. Biotechnol. (1996) 14:1252-1256)。また、このGFPポリペプチドは蛍光を発するうえで他のAequoreaタンパク質、基質、または補因子を必要としない (Biochemistry (1993) 32:1212-1218)。近年では、GFP遺伝子を発現する機能獲得型（gain-of-function）の明るい変異体が様々な技術によって作製されており (Nature (1995) 373:663-664; Biotechnology (1995) 13:151-154; Gene (1996) 173:33-38; Nat Biotechnol. (1996) 14:315-319; Nat Biotechnol. (1996) 14:315-319)、高度の発現およびシグナルのためにヒト化されている (J. Virol. (1996) 70:4646-4654)。サンゴ（Discosoma coral）由来の赤色蛍光タンパク質 (RFP) も記載されており、生体内イメージング研究に有用であることが立証されている (PNAS USA (2000) 97:11990-11995; FEBS Lett. (2000) 479:127-130; Nat Biotechnol. (1999) 17:969-973)。
【００２０】
幾つかのグループは、in vitroおよびin vivoの両方でGFPを高レベルで安定的に発現させるために、腫瘍細胞系を選択した。これらの細胞を動物に移植して、新鮮な組織においてin situで視覚化した (PNAS USA (1997) 94:11573-11576)。さらに、GFPを発現している腫瘍細胞は、肝臓、肺、脳、脊髄、中軸骨格、リンパ節を含む全ての主要器官で、コロニー化の有無にかかわらず視覚化されている。転移性疾患のGFPモデルは、肺癌 (Clin Exp Metastasis. (1997) 15:547-552)、前立腺癌 (Cancer Res. (1999) 59:781-786)、メラノーマ (Clin Cancer Res. (1999) 5:3549-3559)、大腸癌 (PNAS USA (2000) 97:1206-1211)、膵臓癌 (Clin Exp Metastasis (2000) 18:213-218)、乳癌 (Clin Exp Metastasis (1999) 17:537-544)、卵巣癌 (Clin Exp Metastasis (1999) 17:417-422)、および脳腫瘍 (Neurosurgery (1998) 43:1437-1442) 用に開発されている。この報告は、GFP遺伝子でトランスフェクションされた腫瘍細胞が、腫瘍の成長、血管新生、活動停止、散在、侵襲、転移をin vivo視覚化するための強力なツールであることを示す。
【００２１】
下記の表１は、幾つかの公知の蛍光タンパク質と、これらのタンパク質の適切な励起および発光特性を示す。
【表１】
2007519495.tif 000002
【００２２】
無傷の被験体内のこれらのタンパク質の位置は、適切なフィルターを取り付けた単純な励起光源（状況に応じて手持ち型）を用いて追跡し、発生した光を伝えるように調整されたフィルター使用して（状況に応じて単に肉眼で）直接観察することができる。例えば、Biological Laboratory Equipment, Ltd（ハンガリー、ブダペスト、ウェブサイト: bls-ltd.com）は、本発明の方法と共に使用するのに適している軽量の携帯型装置を幾つか製作している。
【００２３】
一般的に、前記装置は励起光源、1つ以上の励起フィルター、および1つ以上のバリアフィルターから構成されている。意図される装置の励起光源および検出用部品は、同一構造体の一部であってもよいし、別個の構成部品に分離されていてもよい。
【００２４】
励起光源は、通常は極端に明るい青色発光ダイオード (LED) から構成される。励起周波数は通常は400〜600nmの範囲であり、特定のカットオフ周波数を有する励起フィルターを使用することで達成される。バリアフィルターのカットオフ周波数は通常500nmよりも小さい。
【００２５】
開示した方法と共に使用するための装置の1つとして、鉱夫ランプに似たゴーグル・アセンブリがある。この装置を用いると、ユーザーは、実験を行いながら自由に動き回ることができる。この装置は、光源（通常は明るい青色LED）とアイピースの上のバリアフィルターから構成される。このような装置のワイドパス（wide path）バリアフィルターは、蛍光タンパク質の発光の観察に適している。異なるフィルターを使用して、異なる蛍光タンパク質からの発光を観察することもできる。
【００２６】
本発明との使用が考えられる他の好ましい装置として、複数のサンプルを通過させることができる固定型の装置がある。好ましい実施形態では、この装置は複数の個別の携帯型で交換可能な光源から光を発する。必要に応じて、これらの光源は個別に目標を定めることができる。
【００２７】
本発明の方法に有用な装置は、目視観察が可能になるよう設計される。あるいは、バリアフィルターをカメラに連結して、画像をモニターに表示させ、かつデジタル保存することができる。画像を標準的なソフトウェアで処理することができ、また、動物を傷つけることなくイメージング手順を必要なだけ繰り返すことができる。
【００２８】
一般的に、励起光発生装置および観察を可能にするバリアフィルターは、「携帯型」（portable）であることによって特徴づけられる。すなわち、手に持って歩き回ることができるくらい十分に小型かつ単純ということである。励起光発生装置は、通常の懐中電灯と同程度のサイズならびに全体的形状であり、適切な励起波長を被験体に到達させるのに適したフィルターを備えている。ビームの幅は、観察される被験体の部位のサイズによって決まる。観察用の第2フィルターも手で持てるくらい小型であるべきであり、利便性を高めるように構成することができる。例えば、それをゴーグルに取り付けたり、フレーム（拡大鏡に類似）内に配置したり、または支持体に固定させたりできる。最後に述べた選択肢は、画像を記録する場合に特に好ましい。
【００２９】
携帯型の励起および観察ツールは手で持てるほど十分に単純で小型だが、使用に際して1つまたは複数の支持体上に取り付けて、固定した様式で使用してもよい。これは特に、多数の観測を行ったり、多数の被験体を使用したりする場合に望ましい。
【００３０】
好ましい用途の1つとして、腫瘍の進行および転移のモニタリングがある。蛍光タンパク質を発現する大腸、前立腺、乳房、脳、肝臓、リンパ節、肺、膵臓、骨、ならびに他の器官の腫瘍は、携帯型の定量的経皮的全身蛍光イメージング装置の使用によって外部的に視覚化することができる。in vivo腫瘍細胞形質導入と結びついたこの技術はまた、腫瘍細胞に対する有効性について化合物をスクリーニングするために、腫瘍細胞のリアルタイムのイメージングおよびターゲティングに使用される。蛍光タンパク質をマーカーとして用いる腫瘍／転移モデルの詳細な説明は、上記のWO 00/40274に見出すことができ、これは参照することで本明細書に援用するものとする。特に、一実施形態では、腫瘍細胞への指向性を有するウイルスを利用して、1つ以上の外因性核酸配列（蛍光タンパク質の発現系を含む）を標的腫瘍細胞に送達させる。Russellらによる米国特許第5,998,192号（参照することで本明細書に援用する）に記載されるようなレトロウイルスベクターが好ましい例である。この特許では、組換えＣ型マウス白血病ウイルス (MLV) の使用について述べている。Hendersonらによる米国特許第6,676,935号（参照することで本明細書に援用する）に記述されるようなアデノウイルスベクターもまた使用できる。1種類以上の癌細胞に対して天然のまたは遺伝子操作された指向性を有するウイルスはどれも、外因性核酸を標的腫瘍細胞に送達するために使用することができる。「指向性」（tropism）とは、正常細胞よりも腫瘍細胞に選択的に感染するウイルス、ならびに正常細胞と腫瘍細胞の両方に感染するが、腫瘍細胞においてのみ転写活性のあるウイルスを説明するために用いられる。
【００３１】
それゆえ、腫瘍特異的ウイルスは蛍光タンパク質を腫瘍細胞に送達することができる。ウイルスゲノムが標的腫瘍細胞に導入されると、蛍光タンパク質をコードする遺伝子（類）が細胞機構によって転写され、蛍光タンパク質が産生される。ウイルスの特異性のため、腫瘍細胞が標識されることが好ましい。
【００３２】
腫瘍細胞への核酸の直接適用またはリポソームのような他の送達システムも、本発明との使用のために考えられる。本明細書に記載の方法を使用して、研究用に被験体に外科手術で腫瘍を移植（同所移植を含む）することもできる。
【００３３】
他の用途としては、上記のWO 2004/016766（参照することで本明細書に援用する）に記述されるような、標識された感染性病原体を用いて、感染の進行およびその影響をモニタリングすることがある。また、上記のWO 01/71009（参照することで本明細書に援用する）に記述されるように、特に様々な外部刺激に対する応答に関して、遺伝子発現をモニタリングすることも、本発明の方法の応用として有用である。
【００３４】
前述の全ての場合において、様々なプロトコル、治療、または刺激の効果は、候補プロトコルもしくは刺激の存在下および不在下で、腫瘍の成長と転移、または遺伝子発現、または感染の進行を比較することによって、監視することができる。本発明の観察方法は単純かつ直接的であるので、多数のプロトコルおよび刺激の有効性と安全性を迅速に評価することができる。
【００３５】
どのような性質を有する被験体が本発明において有用であるかは、用途に応じて異なる。例えば腫瘍の進行をモニタリングするためには、免疫無防備状態の齧歯動物または視覚化すべき腫瘍と同系の齧歯動物を使用するのが最も実用的である。感染のモデルには、トリを含む幅広い実験動物が含まれる。遺伝子発現の評価には、齧歯動物、ウサギ、大きな家畜（ウシやブタなど）、ニワトリ、通常は野生である動物をも含めて、実質的にはあらゆる動物を被験体として使用することができる。被験体に対する制限は、観察対象となる代謝活動または細胞活動の性質に関係しており、特に本明細書に記載する観察システムに関係するものではない。
【００３６】
以下の実施例は本発明を説明するためのもので、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１
腫瘍細胞のin vitro蛍光タンパク質標識付け
Hasegawaらの方法（「将来的な転移の発生を調べるための緑色蛍光タンパク質のin vivo腫瘍送達」 Cancer Gene Therapy (2000) 7:1336-1340）に従って、GFPレトロウイルス上清を調製した。ヒトの胃腫瘍が腹腔内で成長しているヌードマウスを準備するが、これもHasegawaらによって記述されるように行った。癌細胞をマウスに移植してから4〜10日後に、レトロウイルス上清を腹腔内に注射する。
【００３８】
鉱夫ランプに類似したGFsP-5 イメージング装置を使用して、外部からマウスを撮像する。GFP発現によって腫瘍の成長と転移形成が視覚化できるように、隔週ごとに検査を行った。正常な組織はGFPレトロウイルスによって形質導入されることはない。レトロウイルスGFP送達から2週間後に、GFPを発現している腫瘍細胞が生殖腺の脂肪、大網、および腸に認められ、これは、腫瘍がGFP遺伝子によって効率的に形質導入され、その発現によって検出され得ることを示している。外部から行った観察を検証するために開腹を行う。
【００３９】
実施例２
卵巣腫瘍断片を有する被験体のハイスループット外部スクリーニング
30匹のヌードマウスに、GFPを発現しているチャイニーズハムスター卵巣腫瘍断片（CHO-K1-GFP）を1mm3ほど移植し、可能性のある抗腫瘍化合物を腫瘍組織に対する有効性についてスクリーニングした。外科的同所移植 (SOI) によってヌードマウスの卵巣漿膜に腫瘍断片を移植すると、卵巣腫瘍が発生した（Chishimaら, Cancer Res. (1997) 57:2042-2047を参照のこと）。
【００４０】
個々のケージに入れた動物を回転テーブルに置き、標準的なデジタルビデオカメラに取り付けた光源から構成されるGFP-Vid-187（Biological Laboratory Equipment, Ltd 、ハンガリー、ブダペスト）の前を通過させた。強い蛍光を発する腫瘍は、カメラで撮った映像によって観察できる。カメラで撮った画像を視覚的に解析し、更なる解析のためにコンピュータに送る。
【００４１】
実験動物には各種の候補化合物を投与し、対照動物には生理食塩水を投与した。研究の間、腫瘍細胞に有効な候補化合物を投与された動物は、対照動物よりも少ない蛍光を示す。対照動物の蛍光は、大腸、盲腸、小腸、脾臓、腹腔壁を含む、腹腔全域に広がっていることが観察された。GFP蛍光を用いて腫瘍の広がりを追跡する。多数の微小転移巣が全ての対照マウスの肺で検出され、肝臓、腎臓、対側卵巣、副腎、大動脈周囲リンパ節、胸膜でも複数の微小転移巣が検出された。
【００４２】
関連出願の相互参照
本出願は、米国法典第35編119(e)項に基づいて、米国出願第60/539,464号（2004年1月26日出願）および米国出願第60/540,599号（2004年1月29日出願）に対する優先権の利益を主張するものである。これらの文書の内容は参照することにより本明細書に援用するものとする。
【国際調査報告】
2007519495.tif 000003