(57)【要約】  本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞、それを単離する方法及びそれを使用する方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有糸分裂の能力があり、そしてＶａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ及び任意の胚性期特異的な抗原を発現する、単離された細胞。
【請求項２】
細胞が、宿主への移植後、少なくとも１週、１〜約２週、約２〜約３週、約３〜約４週又は約５週以上経過した後に、卵母細胞を産生することが可能である、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項３】
細胞が、宿主へに移植された後、１週未満で卵母細胞を産生することが可能である、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項４】
細胞が、宿主に移植された後、約２４〜約４８時間未満で、卵母細胞を産生することが可能である、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項５】
細胞が、雌性の生殖細胞系列幹細胞である、請求項２に記載の単離された細胞。
【請求項６】
細胞が、雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞である、請求項３に記載の単離された細胞。
【請求項７】
細胞が哺乳動物の細胞である、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項８】
細胞がヒトの細胞である、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項９】
細胞が非胚性の細胞である、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項１０】
胚性期特異的な抗原が、胚性期特異的な抗原−１型である、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項１１】
細胞が胚性期特異的な抗原である、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項１２】
細胞が、雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞である、請求項１１に記載の単離された細胞。
【請求項１３】
胚性期特異的な抗原が、胚性期特異的な抗原−１型である、請求項１１に記載の単離された細胞。
【請求項１４】
ａ）請求項１に記載の単離された細胞を、細胞を卵母細胞へ分化させる薬剤の存在下で培養することにより、卵母細胞を産生すること、
ｂ）インビトロで前記卵母細胞を受精させて接合体を形成すること、及び、
ｃ）対象である雌の子宮に前記接合体を着床すること、
の工程からなる、対象である雌をインビトロで受精させる方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の単離された細胞を、細胞を卵母細胞へ分化させる薬剤の存在下で培養し、それにより卵母細胞を産生することを包含する、卵母細胞を産生する方法。
【請求項１６】
薬剤が、形質転換増殖因子、骨形成タンパク質、Ｗｎｔファミリータンパク質、ｋｉｔ−リガンド、白血病抑制因子、減数分裂活性化ステロール、Ｉｄタンパク質機能の調節因子及びＳｎａｉｌ／Ｓｌｕｇ転写因子機能の調節因子からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
有糸分裂の能力があり、そしてＶａｓａ、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ及び任意の胚性期特異的な抗原を発現する精製された細胞集団、並びに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
胚性期特異的な抗原が、胚性期特異的な抗原−１型である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
細胞が哺乳動物の細胞である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
細胞がヒトの細胞である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
精製された細胞集団が、前記組成物中に、約５０〜約５５％、約５５〜約６０％、約６５〜約７０％、約７０〜約７５％、約７５〜約８０％、約８０〜約８５％、約８５〜約９０％、約９０〜約９５％又は約９５〜約１００％の細胞で存在する、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１７に記載の医薬組成物を対象の組織に提供し、
前記細胞が前記組織へ生着して卵母細胞へと分化し、それにより前記対象において卵母細胞を産生する、
ことを含む、対象に於いて卵母細胞を産生する方法。
【請求項２３】
前記組織が卵巣組織である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１７に記載の医薬組成物を対象に提供し、
前記細胞が前記対象の組織へ生着して卵胞内で卵母細胞へと分化し、それにより前記対象において卵胞形成を誘導する、
ことを含む、対象に於いて卵胞形成を誘導する方法。
【請求項２５】
前記組織が卵巣組織である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１７に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、
前記細胞が卵巣に生着して卵母細胞へ分化し、それにより不妊を治療する、
ことを含む、不妊治療を必要とする対象である雌において不妊を治療する方法。
【請求項２７】
請求項１７に記載の医薬組成物の治療有効量を組織に提供し、
前記細胞が前記組織へ生着し卵母細胞へと分化し、それにより対象に於いて傷害を受けた組織を修復する、
ことを含む、対象に於いて傷害を受けた卵巣組織を修復する方法。
【請求項２８】
前記傷害が、化学療法剤又は放射線照射に曝露された結果である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記化学療法剤が、ブスルファン、シクロホスファミド、５−ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、エトポシド、シスプラチン、メトトレキセート及びドキソルビシンからなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記傷害が、癌、多嚢胞性卵巣疾患、遺伝性疾患、免疫不全又は代謝性疾患の結果である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１４に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、
前記細胞が卵巣に生着して卵母細胞へと分化し、それにより対象に於いて卵巣機能を回復させる、
ことを含む、閉経期にある対象の雌において卵巣機能を回復させる方法。
【請求項３２】
閉経期にある対象の雌が、閉経前又は閉経後のいずれかの段階にある、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
対象の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を卵母細胞に分化させる薬剤と接触させ、それにより対象において卵母細胞を産生することを含む、対象に於いて卵母細胞を産生する方法。
【請求項３４】
薬剤が、形質転換増殖因子、骨形成タンパク質、Ｗｎｔファミリータンパク質、ｋｉｔ−リガンド、白血病抑制因子、減数分裂活性化ステロール、Ｉｄタンパク質機能の調節因子及びＳｎａｉｌ／Ｓｌｕｇ転写因子機能の調節因子からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の薬剤、及び雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を卵母細胞に分化させる薬剤の使用に関する説明書を含み、それにより卵母細胞を産生する、卵母細胞を産生するためのキット。
【請求項３６】
雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増加させる薬剤と接触させ、それにより当該の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を増大（expand）させることを含む、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞をインビボ、エクスビボ又はインビトロで増大（expand）させる方法。
【請求項３７】
雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を、細胞の増殖又は生存を促進する薬剤で増加させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
薬剤が、インスリン様成長因子、形質転換増殖因子、骨形成タンパク質、Ｗｎｔタンパク質、線維芽細胞成長因子、スフィンゴシン−１−リン酸、レチノイン酸、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３の阻害剤、Ｂａｘ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、一酸化窒素産生の阻害剤及びヒストン脱アセチル化酵素活性の阻害剤からなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の薬剤、及び雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増加させる薬剤の使用に関する説明書を含み、それにより当該の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を増大（expand）させる、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を増大（expand）させるためのキット。
【請求項４０】
対象の卵巣組織を、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増加させる薬剤と接触させ、それにより対象において卵母細胞を産生することを含む、当該対象に於いて卵母細胞を産生する方法。
【請求項４１】
薬剤が、細胞の生存又は増殖を増加させ、それにより細胞の量を増加させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
細胞の生存又は増殖を増加させる薬剤が、インスリン様成長因子、形質転換増殖因子、骨形成タンパク質、Ｗｎｔタンパク質、線維芽細胞成長因子、スフィンゴシン−１−リン酸、レチノイン酸、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３の阻害剤、Ｂａｘ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、一酸化窒素産生の阻害剤及びヒストン脱アセチル化酵素活性の阻害剤からなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
対象の卵巣組織を、雌性の生殖細胞系列幹細胞又は雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の前駆細胞の卵母細胞への分化を増加させる薬剤と接触させ、それにより当該対象の不妊を治療することを含む、不妊治療を必要とする対象である雌において不妊を治療する方法。
【請求項４３】
対象の卵巣組織を、雌性の生殖細胞系列幹細胞又は雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の前駆細胞を卵母細胞へ分化を増加させる薬剤と接触させ、それにより当該対象の不妊を治療することを含む、不妊治療を必要とする対象である雌において不妊を治療する方法。
【請求項４４】
対象の卵巣組織を、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を増加させる薬剤と接触させ、それにより当該対象の不妊を治療することを含む、不妊治療を必要とする対象である雌において不妊を治療する方法。
【請求項４５】
薬剤が、細胞の生存又は増殖を増加させ、それにより細胞の量を増加させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
対象の卵巣組織を、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を増加させる薬剤と接触させ、それにより当該対象において卵巣機能を回復することを含む、閉経期にある対象である雌において卵巣機能を回復する方法。
【請求項４７】
薬剤が、細胞の生存又は増殖を増加させ、それにより細胞の量を増加させる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
対象の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を、細胞増殖を減少させる薬剤と接触させ、それにより当該の対象において雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させることを含む、対象における雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させる方法。
【請求項４９】
薬剤が、形質転換増殖因子−β、骨形成タンパク質の拮抗剤、ＤＡＮ及びＣｅｒｂｅｒｕｓ関連タンパク質、及びＧｒｅｍｌｉｎからなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
対象の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を、細胞の生存を阻害する薬剤と接触させ、それにより当該の対象において雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させることを含む、対象における雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させる方法。
【請求項５１】
生存を阻害する薬剤が、アポトーシス促進性の腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバー、 生存促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの機能の拮抗剤及びセラミドからなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
アポトーシス促進性の腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーが、腫瘍壊死因子−α、Ｆａｓ−リガンド及びＴＲＡＩＬからなる群より選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５３】
生存促進性のＢｃｌ−２ファミリーメンバーが、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｍｃｌ−１及びＡ１からなる群より選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
請求項５１に記載の薬剤、及び雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の細胞の生存を阻害する薬剤の使用に関する説明書を含み、それにより雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させることを含む、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させるためのキット。
【請求項５５】
対象の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を、細胞死を促進する薬剤と接触させ、それにより対象において雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させることを含む、対象における雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させる方法。
【請求項５６】
細胞死を促進する薬剤が、アポトーシス促進性の腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバー、 アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの機能の拮抗剤、及びセラミドからなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
アポトーシス促進性の腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーが、ＴＮＦα、Ｆａｓ−リガンド及びＴＲＡＩＬからなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーが、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＤ、ＨＲＫ、ＢＯＤ、ＢＩＭ、Ｎｏｘａ、ｐｕｍａ、ＢＯＫ及びＢＣＬ−ＸＳからなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
請求項５６に記載の薬剤、及び雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の細胞死を促進する薬剤の使用に関する説明書を含み、それにより雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させることを含む、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させるためのキット。
【請求項６０】
対象が、前癌性の又は癌性の状態にある、請求項４８、５０又は５５に記載の方法。
【請求項６１】
癌性の状態が、生殖細胞の腫瘍、卵巣の癌又は奇形腫である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
対象の卵巣組織を、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させる薬剤と接触させ、それにより当該対象に対して避妊を提供することを含む、対象である雌において避妊を提供する方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の薬剤、及び雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させる薬剤の使用に関する説明書を含み、それにより当該対象に対して避妊を提供することを含む、対象に対して避妊を提供するためのキット。
【請求項６４】
ａ）卵巣組織をホモジナイズすること、
ｂ）前記組織を、胚性期特異的な抗原に結合する薬剤と接触させること、及び、
ｃ）雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を単離すること、
からなる工程である、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を単離する方法。
【請求項６５】
胚性期特異的な抗原が、胚性期特異的な抗原−１型である、請求項６４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願／特許及び参照による取り込み）
本出願は、代理人整理番号第９１００００−３０７３号として２００４年５月１７日に出願された米国特許出願第６０／５７２，２２２号、代理人整理番号第９１００００−３０７４号として２００４年５月２４日に出願された米国特許出願第６０／５７４，１８７号及び代理人整理番号第９１００００−３０７６号として２００４年７月９日に出願された米国特許出願第６０／５８６，６４１号に係る優先権を主張する。これら出願のそれぞれの内容を参照して本明細書に取り込む。
本明細書中に引用された出願及び特許；またその各々（特許された出願の係属中に「本出願で引用された文献」として引用された文献も含む）で引用した文献又は参照；これらの出願及び特許の何れかに対応するＰＣＴ及び外国出願又は特許、及び／又はこれらの出願及び特許の何れかの優先権を主張する出願及び特許；及び、特許出願に於いて引用された文献中で引用又は参照された文献はそれぞれ、参照して本明細書に取り込み、本発明の実施に用いてもよい。より一般的には、本明細書中に引用される文献又は参照は、明細書の末尾に参考文献リストとして又は明細書中の何れかに引用される。そして、これらの文献又は参照（「本明細書で引用された文献」）のそれぞれは、及び本明細書で引用された各々の文献で引用された文献及び参照（製造者の仕様書、説明書等の何れをも含む）と同様に、参照して本明細書に取り込むものとする。
【０００２】
（政府が保有する利益に関する記載）
米国政府は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の加齢医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ）から出されたグラント番号Ｒ０１−ＡＧ１２２７９及びＲ０１−ＡＧ２４９９９に基づいて、この発明に関する特定の権利を有するものである。
【背景技術】
【０００３】
ヒトを含む殆どの哺乳動物種の雌性の生殖腺が、原始卵胞内に囲まれた減数分裂に拘束される限定された数の生殖細胞（卵胞）を内蔵し、この生殖細胞（卵胞）は各月経サイクルの間に卵巣で放出される備蓄の卵を供給している（Gougeon, A. et al, (1996) Endocr Rev. 17: 121-55; Morita, Y. & Tilly, J.L., (1999) Dev. Biol. 213: 1-17）。出生後の生涯でアポトーシスを含むメカニズム（Tilly, J.L., (2001) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 838-848）で、卵胞細胞が減少するが、これは最終的に生殖細胞の卵巣不妊になると広く信じられている（Faddy, M.J. et al., (1976) J. Exp. Zool. 197: 173-186; Faddy, M.J. et al., (2000) Mol. Cell. Endocrinol. 163: 43-48）。ヒトにおいて、卵胞の蓄えの枯渇が、通常人生の４０代（during the fifth decade）に起こり、閉経となる（Richardson, S.J. et al. (1987) J. Clin. Endocrinol. Metab. 65: 1231-1237）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この生殖生物学の基本的な学説では、一旦枯渇した卵巣の生殖細胞のプールは補充されることはないと更に信じられている（Zuckerman, S. (1951) Recent Prog. Horm. Res. 6: 63-108; Borum, K., (1961) Exp. Cell Res. 24; 495-507; Peters, H., (1970) Phil. Trans. R. Soc. Lond. B, 259: 91-101; McLaren, A., (1984) Symp. Soc. Exp. Biol. 38: 7-23; Anderson, L.D. and Hirshfield, A.N. (1992) Md. Med. J. 41: 614-620）。卵胞細胞の喪失を加速するような如何なる治療も受胎能力を減少させ、予想より早い閉経となる要因になる。例えば、化学療法剤及び放射線治療のような卵巣にダメージを与える広い範囲の薬剤に曝されると、一般に早すぎる閉経及び元に戻せない不妊となる。現時点では、受胎能力及び通常の卵巣機能を、様々な不都合な状態下で維持するための限られた選択肢の治療は、例えば卵巣組織片及び単一卵胞細胞の低温保存のように侵襲性であり、そして、ホルモン反応の腫瘍をもつ多くの女性に対して、医療的に不適切となるホルモン治療を必要とする（Waxman, J. (1983) J. R. Soc. Med. 76: 144-8; Familiari, G. et al., (1993) Hum. Reprod. 8: 2080-7; Ried, H.L. & Jaffe, N., (1994) Semin. Roentgenol. 29: 6-14; Reichman, B.S. & Green, K.B. (1994) J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 16: 125-9）。更に、閉経という通常の卵巣障害を先送りする治療の選択肢は、現在のところ全くない。それで、当該技術分野においては、女性の損なわれた卵巣機能及び不妊を回復するための、新しい又はより侵襲性が少ない治療を行うことの発見及び発展が大いに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要約）
哺乳動物の雌は、出生後の生涯にわたり生殖細胞を更新する能力を失っていないことが示される。哺乳動物の卵巣は、有糸分裂の能力を有する雌性の生殖細胞系列幹細胞及び雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞を保有し、これらの細胞が、出生後の哺乳動物の卵巣において卵胞の退化及び一掃の速度をベースに、卵母細胞及び卵胞の産生を維持している。
雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞は、本明細書に記載のように特定化される。従って、本発明の方法は、雌の受胎率を高める又は回復させる、そして更年期の症状及びその結果の改善を図る手段として、卵胞の蓄えを増大させる（expand）ために、雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞を使用すること等に関する。
【０００６】
一態様に於いて、本発明は雌性の生殖細胞系列幹細胞含んでなる組成物を提供する。
ある態様に於いて、本発明は、細胞が有糸分裂の能力を有し、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ及び任意の胚性期特異的な抗原（ＳＳＥＡ）を発現する、雌性の生殖細胞系列幹細胞を含んで成る組成物を提供する。好ましくは、ＳＳＥＡはＳＳＥＡ−１である。本発明の雌性の生殖細胞系列幹細胞は、それらの有糸分裂能の表現型と一致して、成長／分化因子９（ＧＤＦ−９）、透明帯タンパク質（例えば、透明帯タンパク質３（ＺＰ３））、ヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）及びシナプトネマ複合体タンパク質（ＳＣＰ３）を発現しない。宿主に移植されると、本発明の雌性の生殖細胞系列幹細胞は、移植後少なくとも１週、より好ましくは１〜約２週、約２〜約３週、約３〜約４週又は約５週以上の期間の後、卵母細胞を産生する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞から派生した前駆細胞を含む組成物を提供する。本発明の雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞（前駆細胞）は、卵巣に存在し、雌性の生殖細胞系列幹細胞と共通の特徴を有している。従って一態様では、本発明は、細胞がＳＳＥＡ、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ及びＳｔｅｌｌａを発現するが、ＧＤＦ−９、透明帯タンパク質（例えば、ＺＰ３）、ＨＤＡＣ６及びＳＣＰ３は発現しない、雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞を含む組成物を提供する。好ましくは、ＳＳＥＡはＳＳＥＡ−１である。本発明の、雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞は、宿主に移植されると、移植後１週より短い期間後に、好ましくは約２４〜約４８時間で卵母細胞を産生する。
【０００８】
一態様では、本発明は、細胞が有糸分裂の能力を有し、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ及び任意のＳＳＥＡを発現する、単離された細胞を提供する。特異的な様態では、単離された細胞は雌性の生殖細胞系列幹細胞であり、別の特異的な様態では、単離された細胞は、ＳＳＥＡを発現する雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞である。好ましくは、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞は、非胚性（non-embryonic)の、哺乳動物の、そしてより好ましくはヒトのものである。
【０００９】
別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞及び／又はその前駆細胞の精製された集団を提供する。特定の態様では、精製された細胞集団は、組成物中に約５０〜約５５％、約５５〜約６０％、約６５〜約７０％、約７０〜約７５％、約７５〜約８０％、約８０〜約８５％、約８５〜約９０％、約９０〜約９５％又は約９５〜約１００％の細胞が存在する。
【００１０】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞及び／又はそれらの前駆細胞並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、雌性の生殖細胞系列幹細胞及び／又はそれらの前駆細胞の精製された集団を含むことができる。
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞及び／又は雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞の組成物を単離する方法を提供し、当該方法は、
ａ）卵巣組織をホモジナイズすること、
ｂ）前記組織を、ＳＳＥＡに結合する薬剤と接触させること、そして、
ｃ）雌性の生殖細胞系列幹細胞又は雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞を単離すること、
からなる工程である。
好ましくは、胚性期特異的な抗原はＳＳＥＡ−１である。
【００１１】
ある態様において、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞及び／又は雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞を単離する方法を提供し、当該方法は、
ａ）卵巣組織を区分化すること、
ｂ）前記組織内の雌性の生殖細胞系列幹細胞及び／又は雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞の周辺を、識別マーカーでラベルすること、
ｃ）雌性の生殖細胞系列幹細胞及び／又は雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞の周辺に、レーザーパルスをあてること、そして、
ｄ）雌性の生殖細胞系列幹細胞又は雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞を、捕捉基質に付着させること、
からなる工程である。
卵巣組織は、区分化する前には、新鮮なもの、冷凍されたもの、又は固定化されているものである。細胞は、望ましい細胞型と望ましくないものの対比を強めるために、組織学的、免疫組織化学的、又はその他の相当する技法を用いて識別マーカーでラベルされる。
【００１２】
更に別の態様では、本発明は、本明細書で以下に記載されるように、インビボ、エクスビボ又はインビトロで雌性の生殖細胞系列幹細胞又は雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞を操作する方法を提供する。
【００１３】
ある態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を、細胞の増殖又は生存を促進させて雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増加させる薬剤と接触させ、それにより雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を増大させることからなる、インビボ、エクスビボ又はインビトロで雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を増大させる方法を提供する。好ましい態様では、薬剤は、ホルモン若しくは成長因子（例えば、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、Ｗｎｔタンパク質、又は線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ））、細胞シグナル伝達分子（例えば、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）又はレチノイン酸 （ＲＡ））、又は薬理学若しくは医薬品化合物（例えば、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）阻害剤、Ｂａｘ阻害剤若しくはカスパーゼ阻害剤等のアポトーシス阻害剤、一酸化窒素産生の阻害剤、又はＨＤＡＣ活性阻害剤）を含むが、それらに限定されない。
【００１４】
別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞をテスト薬剤と接触させ、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の数の増加を検出し、それにより雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の、増殖又は生存を促進する薬剤を同定することを含む、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の、増殖又は生存を促進する薬剤を同定する方法を提供する。
【００１５】
更に別の態様では、対象となる集団から雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を単離し、複数の培養細胞を確立するために培養液中で当該細胞を増大（expand）させること、任意で当該細胞を望ましい系統に分化させること、細胞培養物を１つ又はそれ以上の生物学的又は薬理学的な薬剤に接触させること、１つ又はそれ以上の生物学的又は薬理学的な薬剤に対して１つ又はそれ以上の細胞応答を同定すること、及び、異なる対象由来の細胞培養物の細胞応答を比較することを含む、生物学的又は薬理学的な薬剤に対する薬理学的な細胞応答を特徴付けるために、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を使用する方法を提供する。
【００１６】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を系列の拘束された細胞に分化させる薬剤と接触させて、系列の拘束された細胞を産生する方法を提供する。好ましい様態において、薬剤には、これらに限定はされないが、血管内皮増殖因子、ソニックヘッジホッグ、インスリン様成長因子ＩＩ、オステオゲニン（Osteogenin）、細胞障害性Ｔ細胞分化因子、βカテニン、骨形成タンパク質２、インターロイキン２、形質転換増殖因子β、神経成長因子、インターロイキン１、線維芽細胞増殖因子２、レチノイン酸及びＷｎｔ３を含む。
【００１７】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を、細胞増殖を減少させる薬剤と接触させ、それにより雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させることを含む、インビボ、エクスビボ又はインビトロで雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させる方法を提供する。好ましい態様では、薬剤は、ホルモン若しくは成長因子（例えば、ＴＧＦ−β）、有糸分裂促進的なホルモン若しくは成長因子のペプチド拮抗剤（例えば、ＢＭＰ拮抗剤、ＤＡＮ及びＣｅｒｂｅｒｕｓ関連タンパク質（ＰＲＤＣ）及びＧｒｅｍｌｉｎ）、又は薬理学若しくは医薬品化合物（例えば、細胞周期阻害剤又は成長因子シグナル伝達の阻害剤）を含むが、それらに限定されない。
【００１８】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を、細胞の生存を阻害する又は細胞死を促進する薬剤と接触させ、それにより雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させることを含む、インビボ、エクスビボ又はインビトロで雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を減少させるための方法を提供する。好ましい態様では、細胞の生存を阻害する薬剤は、ホルモン、成長因子若しくはサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）及びＴＲＡＩＬ等のアポトーシス促進性の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバー）、 生存促進性のＢｃｌ−２ファミリーメンバーの機能の拮抗剤、シグナル伝達分子（例えば、セラミド）、又は薬理学若しくは医薬品化合物（例えば、成長因子シグナル伝達の阻害剤）を含むが、それらに限定されない。好ましい態様では、細胞死を促進する薬剤は、アポトーシス促進性の腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＮＦ−α、ＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬ）、生存促進性のＢｃｌ−２ファミリーメンバーの機能の作用剤及びセラミドを含むが、それらに限定されない。
【００１９】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞をテスト薬剤と接触させ、そして雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の数の減少を検出し、それにより雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の増殖若しくは生存を減少させる、又は細胞死を促進する薬剤を同定することを含む、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の増殖若しくは生存を減少させる、又は細胞死を促進する薬剤を同定する方法を提供する。
【００２０】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を卵母細胞へ分化させる薬剤の存在下で、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を培養し、それにより卵母細胞を産生することを含む、卵母細胞を産生するための方法を提供する。好ましい態様では、薬剤は、ホルモン若しくは成長因子（例えば、ＴＧＦ、ＢＭＰ又はＷｎｔファミリータンパク質、ｋｉｔ−リガンド（ＳＣＦ）、又は白血病抑制因子（ＬＩＦ））、シグナル伝達分子（例えば、減数分裂活性化ステロール（ＦＦ−ＭＡＳ））、又は薬理学若しくは医薬品化合物（例えば、Ｉｄタンパク質の機能又はＳｎａｉｌ／Ｓｌｕｇ転写因子の機能の調節因子）を含むが、それらに限定されない。
【００２１】
更に別の態様では、本発明は、対象となる雌をインビトロで受精する方法を提供し、当該方法は、
ａ）雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を、当該細胞を卵母細胞へ分化させる薬剤の存在下で培養することにより、卵母細胞を産生すること、
ｂ）前記卵母細胞をインビトロで受精させて、接合体を形成すること、そして、
ｃ）前記接合体を対象である雌の子宮に着床すること、
からなる工程を含む。
【００２２】
更に別の態様では、本発明は、対象である雌をインビトロで受精する方法を提供し、当該方法は、
ａ）雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を、当該細胞を卵母細胞に分化させる薬剤と接触させることによって、卵母細胞を産生すること、
ｂ）前記卵母細胞をインビトロで受精させて、接合体を形成すること、そして、
ｃ）前記接合体を対象である雌の子宮に着床すること、
からなる工程を含む。
【００２３】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞をテスト薬剤と接触させ、そして卵母細胞の数の増加を検出し、それにより雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の分化を誘導する薬剤を同定することを含む、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の卵母細胞への分化を誘導する薬剤を同定する方法を提供する。
【００２４】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を、組織、好ましくは卵巣に提供して、当該細胞が組織に生着して卵母細胞に分化し、それにより卵母細胞を産生することを含む、卵母細胞を産生する方法を提供する。
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を、組織、好ましくは卵巣に提供して、当該細胞が組織に生着して卵胞内で卵母細胞に分化し、それにより卵胞形成を誘導することを含む、卵胞形成を誘導する方法を提供する。
【００２５】
更に別の態様では、本発明は、卵巣組織を雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の量を増加させる薬剤と接触させて、増殖又は生存を促進することにより、卵母細胞を産生する方法を提供する。好ましい態様において、薬剤は、ホルモン若しくは成長因子（例えば、ＩＧＦ、ＴＧＦ、ＢＭＰ、Ｗｎｔタンパク質又はＦＧＦ）、細胞シグナル伝達分子（例えば、ＳＩＰ又はＲＡ）、又は薬理学若しくは医薬品化合物（例えば、ＧＳＫ−３の阻害剤、Ｂａｘ阻害剤又はカスパーゼ阻害剤のようなアポトーシスの阻害剤、一酸化窒素産生の阻害剤、又はＨＤＡＣ活性の阻害剤）を含むが、それらに限定されない。
【００２６】
更に別の態様では、本発明は、卵巣組織をテスト薬剤と接触させ、そして雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の数の増加を検出し、それにより雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の、増殖又は生存を促進することを含む、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の、増殖又は生存を促進する薬剤を同定する方法を提供する。
更に別の態様では、本発明は、卵巣組織を雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を卵母細胞に分化させる薬剤と接触させて、それにより卵母細胞を産生する方法を提供する。好ましい態様において、薬剤は、ホルモン若しくは成長因子（例えば、ＴＧＦ、ＢＭＰ、Ｗｎｔファミリータンパク質、ＳＣＦ又はＬＩＦ）、又は薬理学若しくは医薬の薬剤（例えば、Ｉｄ蛋白質機能の調節因子又はＳｎａｉｌ／ＳｌｕｇＩｄ転写因子機能の調節因子）を含むが、それらに限定されない。
【００２７】
更に別の態様では、本発明は、卵巣組織をテスト薬剤と接触させ、そして卵巣組織の卵母細胞の数の増加を検出し、それにより雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の、増殖又は生存を促進することを含む、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の卵母細胞への分化を誘導する薬剤を同定する方法を提供する。
更に別の態様では、本発明は、卵巣組織を雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を卵母細胞に分化させる薬剤と接触させて、それにより卵母細胞を産生する方法を提供する。好ましい態様において、薬剤は、ホルモン若しくは成長因子（例えば、ＴＧＦ、ＢＭＰ、Ｗｎｔファミリータンパク質、ＳＣＦ又はＬＩＦ）、又は薬理学若しくは医薬の薬剤（例えば、Ｉｄ蛋白質機能の調節因子又はＳｎａｉｌ／ＳｌｕｇＩｄ転写因子機能の調節因子）を含むが、それらに限定されない。
【００２８】
更に別の態様では、本発明は、対象の卵巣組織を雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増加させる薬剤と接触させて、増殖又は生存を促進することにより、対象の不妊を治療する、不妊治療を必要とする対象である雌において不妊を治療するための方法を提供する。
更に別の態様では、本発明は、対象の卵巣組織を雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を卵母細胞に分化させる薬剤と接触させて、それにより対象の不妊を治療する、不妊治療を必要とする対象である雌において不妊を治療するための方法を提供する。
【００２９】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を含む治療有効量の組成物を組織に提供して、当該細胞が組織に生着して卵母細胞に分化し、それにより損傷した組織を修復することを含む、損傷した卵巣組織を修復する方法を提供する。損傷は、例えば、細胞傷害性因子、化学療法剤、放射線、ホルモンの欠乏、サイトカインの欠乏、細胞レセプター抗体等への曝露によって、引き起こされるかもしれない。化学療法剤には、ブスフルファン（busulfan）シクロホスファミド、５−ＦＵ、ビンブラスチン（vinblastine）、アクチノマイシン（actinomycin）Ｄ、エトポシド（etoposide）、シスプラチン（cisplatin）、メトトレキサート（methotrexate）、ドキソルビシン（doxorubicin）等を含む。損傷は、また、癌、多嚢胞性卵巣疾患、遺伝性疾患、免疫障害、代謝性疾患等の卵巣機能に影響を与える疾患によっても引き起こされるかもしれないが、それらに限定はされない。
【００３０】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を含む治療有効量の組成物を対象に投与して、当該細胞を卵巣に生着して卵母細胞に分化し、それにより卵巣機能を回復することからなる、閉経期にある対象である雌の卵巣機能を回復するための方法を提供する。閉経期にある雌の対象は、閉経前又は閉経後の段階であってもよく、当該閉経は正常（例えば、加齢）又は病理学的過程（例えば、手術、疾患、卵巣損傷）により引き起こされるものである。
更に別の態様では、本発明は、対象の卵巣組織を雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増加させる薬剤と接触させて、増殖又は生存を促進することにより、対象の卵巣機能を回復することからなる、閉経後の段階にある対象である雌の卵巣機能を回復するための方法を提供する。
【００３１】
更に別の態様では、本発明は、対象の卵巣組織を雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を卵母細胞に分化させる薬剤と接触させて、それにより対象の卵巣機能を回復することからなる、閉経後の段階にある対象である雌の卵巣機能を回復するための方法を提供する。
卵巣機能の回復は、これらに限定はされないが、骨粗鬆症、循環器系の疾患、体細胞性の性機能障害、のぼせ、膣部の乾燥、睡眠障害、うつ病、刺激過敏症、性欲の喪失、ホルモンのアンバランス等の体細胞性の疾患、同様に記憶の喪失、情緒障害、うつ病等の認知性疾患を含む更年期障害に伴う有害な症状及び合併症を軽減することができる。
【００３２】
更に別の態様では、本発明は、対象の卵巣組織を、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の増殖、機能又は生存を減少させる、又は、当該細胞の新たに卵母細胞又は受精に必要とされる他の体細胞性の細胞種を産生する能力を減少させる薬剤と接触させ、それにより対象に避妊を提供することを含む、対象である雄又は雌において避妊するための方法を提供する。
【００３３】
更に別の態様では、本発明は、本発明の様々な薬剤を利用する際に使用するためのキットを提供する。
ある態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の細胞増殖又は生存を促進する薬剤、及び雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の細胞増殖又は生存を促進する薬剤の使用に関する説明書を含み、それにより本発明の方法に従って雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を増大させる、インビボ、エクスビボ又はインビトロで雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を増大させるキットを提供する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、細胞の生存を阻害する又は細胞死を促進する薬剤、及び雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の細胞の生存を阻害する又は細胞死を促進する薬剤の使用に関する説明書を含み、それにより本発明の方法に従って雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させる、インビボ、エクスビボ又はインビトロで雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を減少させるためのキットを提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を卵母細胞へ分化させる薬剤、及び本発明の方法に従って雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を卵母細胞へ分化させる薬剤の使用に関する説明書を含む、卵母細胞を産生するキットを提供する。
【００３６】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増殖又は生存を促進することにより増加させる薬剤、及び雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増加させる薬剤の使用に関する説明書を含み、それにより本発明の方法に従って卵母細胞を産生する、卵母細胞を産生するためのキットを提供する。
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を卵母細胞に分化させる薬剤、及び雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を卵母細胞に分化させる薬剤の使用に関する説明書を含み、それにより本発明の方法に従って卵母細胞を産生する、卵母細胞を産生するためのキットを提供する。
【００３７】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増殖又は生存を促進することにより増加させる薬剤、及び雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増加させる薬剤の使用に関する説明書を含み、それにより本発明の方法に従って対象の不妊を治療する、不妊治療を必要とする対象の雌の不妊を治療するためのキットを提供する。
【００３８】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を卵母細胞に分化させる薬剤、及び雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を卵母細胞に分化させる薬剤の使用に関する説明書を含み、それにより本発明の方法に従って対象の不妊を治療する、不妊治療を必要とする対象の雌の不妊を治療するためのキットを提供する。
【００３９】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増殖又は生存を促進することにより増加させる薬剤、及び雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増加させる薬剤の使用に関する説明書を含み、それにより本発明の方法に従って対象の卵巣機能を回復する、対象となる閉経後の雌において卵巣機能を回復するためのキットを提供する。
【００４０】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を卵母細胞に分化させる薬剤、及び雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を卵母細胞に分化させる薬剤の使用に関する説明書を含み、それにより本発明の方法に従って対象の卵巣機能を回復する、対象となる閉経後の雌において卵巣機能を回復するためのキットを提供する。
【００４１】
更に別の態様では、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の増殖、機能又は生存を減少させる、又は、当該細胞の新たに卵母細胞又は受精に必要とされる他の体細胞性の細胞種を産生する能力を減少させる薬剤、及び雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の増殖、機能又は生存を減少させる、又は、当該細胞の新たに卵母細胞、精細胞又は受精に必要とされる他の体細胞性の細胞種を産生する能力を減少させる薬剤の使用に関する説明書を含み、それにより本発明の方法に従って対象に避妊を提供する、対象である雌において避妊するためのキットを提供する。
【００４２】
（発明の詳細な説明）
定義
「増大（expansion)」は、最終的な分化をすることなく、１つ又は複数の細胞が増殖することを示す。「単離表現型」は、単離された雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の構造的及び機能的な特徴を示す。「増大表現型」は、増大中の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の構造的及び機能的な特徴を示す。増大表現型は単離表現型と同一であってもよいし、又は増大表現型は単離表現型と比べてより分化したものであってもよい。
【００４３】
「分化」は、細胞系列に関係付けられた発生過程を示す。「細胞系列」は、細胞の発生経路を示し、細胞の発生においては、前駆体（precursor）又は「前駆細胞（progenitor）」の細胞は、進行性の生理学的な変化を経て特徴的な機能を有する特定の細胞種（例えば、神経細胞、筋細胞又は内皮細胞）になる。分化はいくつかの段階で起こり、「最終的な分化」とも呼ばれる十分な成熟に達するまで、細胞は段階を経て次第により特異的となっていく。「最終的に分化した細胞」は、特異的な細胞系列に関係付けられた細胞であり、分化の最後の段階（すなわち、十分に成熟した細胞）に達している。卵母細胞は、最終的に分化した細胞種の一例である。
【００４４】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、天然には生じない状態の（例えば、生体から又は生体からの生物学的なサンプルから単離された）雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を示す。
本明細書で使用される「前駆細胞」は、１）一群の共通マーカー遺伝子を含むような子孫細胞（progeny）として、本発明の生殖細胞系列幹細胞から派生し、２）分化の一次（early）段階にあり、３）有糸分裂能を保持している、生殖細胞系列の細胞である。
【００４５】
本明細書で使用される「子孫細胞（progeny）」は、前駆細胞、分化した細胞及び最終的に分化した細胞を含む、本発明の雌性の生殖細胞系列幹細胞から派生した全ての娘細胞である。
本明細書で使用される「由来の／から派生した（derived from）」は、娘細胞を得る過程を示す。
「生着する(engraft）」は、細胞接触の過程及びインビボで目的の既存組織（例えば、卵巣）への細胞の取り込みの過程を示す。
【００４６】
「薬剤（agent）」は、細胞の（例えば、生物学的な）及び医薬品としての因子、好ましくは成長因子、サイトカイン、ホルモン若しくは小分子を示し、又は細胞機能を調節する（例えば、細胞系列への関係づけを誘導する、増大を増加させる、細胞の成長及び生存を阻害又は促進する）遺伝的にコードされた産生物を示す。例えば、「増大剤（expansion agent）」は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の増殖及び／又は生存を増加させる薬剤である。「分化剤(differentiation agent)」は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を誘導して、卵母細胞のように関係づけられた細胞系列に分化させる薬剤である。
【００４７】
「卵胞（follicle）」は、体細胞（卵胞膜間質のない又は卵胞膜間質を有する顆粒膜）によって囲まれた単一の卵母細胞からなる卵巣構造を示す。生殖腺の体細胞は、個々の卵母細胞を包み込み、卵胞を形成する。十分に形成された卵胞の各々は、完全な基底膜に包まれる。新たに形成されたこれらの卵胞のいくつかは、ほぼ即時に成長を開始するが、それらの殆どは、退化するか又は何らかのシグナルがそれらを活性化し成長過程へ導くまで休止期の状態を保っている。卵巣の構造、機能及び生理学についての概説としては、「Gougeon, A., (1996) Endocr Rev. 17:121-55; Anderson, L.D., and Hirshfield, A.N. (1992) Md Med J. 41: 614-20」及び「Hirshfield, A.N. (1991) Int Rev Cytol. 124: 43-101」を参照されたい。
【００４８】
「有糸分裂能がある」とは、１つの細胞が分裂し、１つの親細胞から２つの娘細胞を生じる過程である、有糸分裂が可能である細胞を示す。
「非胚性の」細胞は、出生後の源（post-natal source）（例えば、乳児、小児及び成人の組織）から得た細胞を示す。
「対象（subject）」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、そしてより一層好ましくはヒトである。哺乳動物には、霊長類、ヒト、家畜、競技用動物及びペットを含まれるが、それらに限定されない。
【００４９】
「薬剤を得る」といった「得ること」という用語は、購入すること、合成すること、又は、他の方法で薬剤（又は指示された物質又は材料）を取得することを含むことを意図している。
「含む（comprises）」及び「含んでいる（comprising）」という用語は、米国特許法で規定されているように広い意味を持つよう意図されており、「含む（includes）」「含んでいる（including)」等を意味する。
【００５０】
発明の具体化
本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞及び又は雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞を含む組成物を提供する。
雌性の生殖細胞系列幹細胞は、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ及び任意のＳＳＥＡを含む、マーカーを発現する。雌性の生殖細胞系列幹細胞は、有糸分裂能（つまり、有糸分裂ができる）があり、従って成長／分化因子−９（ＧＤＦ−９）、透明帯タンパク質（例えば、透明帯タンパク質−３（ＺＰ３））、ヒストン脱アセチル化酵素−６（ＨＤＡＣ６）又はシナプトネマ複合体タンパク質−３（ＳＣＰ３）を発現しない。追加の詳細については、代理人整理番号第５１５８８−６２０６０号として２００４年５月１７日に出願された米国特許出願第１１／１３１，１５３号、及び代理人整理番号第５１５８８−６２０６５号として２００５年５月１７日に出願された同第１１／１３１，１５２号を参照願う。またそれらの内容を、骨髄及び末梢血における雌性の生殖細胞系列幹細胞の記述に参照して本明細書に取り込む。
【００５１】
本発明は、また、雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の前駆細胞も提供する。本発明の雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞は、体内を循環することができ、より好ましくは骨髄、末梢血及び卵巣に局在することができる。本発明の前駆細胞は、ＳＳＥＡ、Ｏｃｔ−４、Ｖａｓａ、Ｄａｚｌ及びＳｔｅｌｌａを発現するが、ＨＤＡＣ６、ＧＤＦ−９及び透明帯タンパク質（例えば、ＺＰ３）又はＳＣＰ３を発現しない。好ましくは、ＳＳＥＡはＳＳＥＡ−１である。
【００５２】
雌性の生殖細胞系列幹細胞及び雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞は、機能的な差異を有する。宿主へ移植されると、本発明の雌性の生殖細胞系列幹細胞は、移植後少なくとも１週、より好ましくは１〜約２週、約２〜約３週、約３〜約４週又は約５週以上の期間の後、卵母細胞を産生できる。雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞は、雌性の生殖細胞系列幹細胞よりも速く卵母細胞を生じる能力を有する。宿主へ移植されると、本発明の雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞は、移植後１週間未満で、好ましくは約２４〜約４８時間で、卵母細胞を産生できる。追加の詳細については、代理人整理番号第５１５８８−６２０６０号として２００４年５月１７日に出願された米国特許出願第１１／１３１，１５３号を参照願う。またそれらの内容を、移植後についての記述に参照して本明細書に取り込む。
【００５３】
Ｏｃｔ−４は、雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞で発現する遺伝子である。Ｏｃｔ−４遺伝子は、哺乳動物の生殖系列の確立に関わり、初期の生殖細胞の特異化（「Scholer (1991), Trends Genet. 7(10): 323-329」に概説されている）に重要な役割を果たす、転写因子をコードする。哺乳動物の胚の成長において、Ｏｃｔ−４は、胚盤葉上層の分化の間、刺激に対する反応を抑制し、最終的に生殖細胞の系列に限定されるようになる。生殖系列において、Ｏｃｔ−４の発現は、胚盤葉上層の発現とは別に制御される。Ｏｃｔ−４の発現は、全能性の表現型マーカーである（Yeom et al. (1996), Development 122: 881-888）。
【００５４】
Ｓｔｅｌｌａは、雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞で発現する遺伝子である。Ｓｔｅｌｌａは、卵母細胞を含む原始生殖細胞及びそれらの子孫細胞で特異的に発現する新規の遺伝子である（Bortvin et al. (2004) BMC Developmental Biology 4(2): 1-5）。Ｓｔｅｌｌａは、ＳＡＰ様ドメイン及びスプライシング因子モチーフ様構造を有するタンパク質をコードする。Ｓｔｅｌｌａの発現を欠く胚は、着床前の発生に欠陥があり、殆ど胚盤胞期に達しない。このように、Ｓｔｅｌｌａは初期胚発生に関係する母系性の因子である。
【００５５】
Ｄａｚｌは、雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞で発現する遺伝子である。常染色体の遺伝子のＤａｚｌは、ＲＮＡ結合ドメイン共通配列を含む遺伝子ファミリーのメンバーであり、生殖細胞で発現する。マウスでの無傷のＤａｚｌタンパク質の発現欠失は、生殖細胞における減数分裂前期の完了の失敗に関連している。特に、Ｄａｚｌ遺伝子を持たない雌マウスでは、胎生期に、生殖細胞が減数分裂前期へ進行するのと同じ時期に、生殖細胞の消失が起こる。Ｄａｚｌ遺伝子を持たない雄マウスでは、生殖細胞は、減数分裂前期Ｉの細糸期（レプトテン期）を越えて進行できなかった。このように、Ｄａｚｌの不在では、減数分裂前期への進行が中断される（Saunders et al. (2003), Reproduction, 126: 589-597）。
【００５６】
Ｖａｓａは、雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞で発現する遺伝子である。Ｖａｓａは、ＤＥＡＤファミリーのＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼをコードする、生殖質の構成成分である（Liang et al. (1994) Development, 120: 1201-1211; Lasko et al. (1988) Nature, 335: 611-167）。Ｖａｓａの分子機能は、生殖細胞の確立（例えば、Oskar and Nanos）、卵形成（例えば、Gruken）及び翻訳開始（Gavis et al. (1996) Development, 110: 521-528）に関与する標的ｍＲＮＡへの結合を指向している。Ｖａｓａは極細胞の形成に必要とされ、発生全体を通じてもっぱら生殖細胞系列に限定的なものとなっている。このように、Ｖａｓａは殆どの動物種において生殖細胞系列についての分子マーカーである（Toshiaki et al. (2001) Cell Structure and Function 26: 131-136）。
【００５７】
胚性期特異的な抗原は、本発明の雌性の生殖細胞系列幹細胞で発現してもよく、雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞で発現してもよい。胚性期特異的な抗原−１（ＳＳＥＡ−１）は、細胞の付着、移動、分化と関連する機能をもつ細胞表面の胚性の抗原である。胚盤葉下層の形成時に、ＳＳＥＡ−１の陽性細胞が、胞胚腔及び胚盤葉下層において同定でき、その後生殖三日月環において同定できる。ＳＳＥＡ−１は、初期の生殖細胞及び中性の細胞成長において機能する（D'Costa et al. (1999) Int J. Dev. Biol. 43(4): 349-356; Henderson et al. (2002) Stem Cells 20: 329-337）。特異的な様態では、雌性の生殖細胞系列幹細胞でのＳＳＥＡ類の発現は、細胞が分化するときに生じる。
【００５８】
雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞は、すでに卵母細胞へと分化を開始した細胞で発現する遺伝子ＧＤＦ−９を発現しない。成長／分化因子９（ＧＤＦ−９）は、形質転換増殖因子βスーパーファミリーのメンバーで、卵巣で特異的に発現する。ＧＤＦ−９のｍＲＮＡは、一層の一次卵胞期から排卵後まで、新生児及び成人の卵母細胞で見出すことができる（Dong, J. et al. (1996) Nature 383: 531-5）。ＧＤＦ−９欠損マウスの解析により、原始及び一層の一次卵胞のみが形成され、卵胞の発生に於いて一層の一次卵胞期より先に進行することができず、完全に不妊という結果となることが明らかになった。
【００５９】
雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞は、卵母細胞の透明帯（ＺＤ）を構成する遺伝子産物である、ＺＰ１、ＺＰ２及びＺＰ３を発現しない。それらの発現は、ベーシックへリックス−ループ−へリックス（ｂＨＬＨ）転写因子ＦＩＧαによって制御されている。ＦＩＧα遺伝子を持たないマウスは、Ｚｐ遺伝子を発現せず、原始卵胞を形成しない（Soyal, S.M. et al. (2000) Development 127: 4645-4654）。ＺＰ遺伝子を個別にノックアウトすると、透明帯の異常又は欠損となり、受胎率の減少（ＺＰｌ；Rankin T. et al. (1999) Development 126: 3847-55)又は不妊(ＺＰ２；Rankin TL. et al. (2001) Development 128: 1119-26;ＺＰ３、Rankin T. et al. (1996) Development 122: 2903-10）となる。ＺＰタンパク質産物はグリコシル化され、その後分泌されて、インビボでの受精及び着床前の発生のために重要な細胞外マトリックスを形成する。ＺＰタンパク質の発現は正確に制御されており、卵形成に於ける成長期の２週間に限定されている。ＺｐのｍＲＮＡ転写物は、休止期の卵母細胞では発現しないが、ひとたび卵母細胞が成長を開始すると、３つ全てのＺｐ転写物の蓄積が開始される。
【００６０】
雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞は、ＨＤＡＣ６を発現しない。ＨＤＡＣ、すなわちヒストン脱アセチル化酵素は卵巣での卵胞の発生に関与している。とりわけＨＤＡＣ６は、休止している胚胞期（原始）卵母細胞で検出される（Verdel, A. et al. (2003) Zygote 11: 323-8；図１６）。ＨＤＡＣ６は、クラスＩＩのヒストン脱アセチル化酵素で、微小管に関連した脱アセチル化酵素とされている（Hubbert, C. et al. (2002) Nature 417: 455-8）。ＨＤＡＣは、トリコスタチンＡ及びトラポキシンには限定はされないが、それら阻害剤の標的であり、両阻害剤は、細胞分化、細胞周期停止及び形質転換された細胞形態の回復を誘導する微生物代謝産物である。
【００６１】
雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞は、それらの細胞が減数分裂前の幹細胞である（すなわち、二倍体）という観察に一致して、ＳＣＰ３を発現しない。シナプトネマ複合体タンパク質ＳＣＰ３は、相同染色体のシナプシスにとって重要であり減数分裂に特異的なタンパク質構造である、シナプトネマ複合体の側方要素の一部である。シナプトネマ複合体は、相同染色体の対合と分離を促進し、クロスオーバーの数と相対的な分布に影響を与え、クロスオーバーをキアズマに変換する。ＳＣＰ３は減数分裂に特異的であり、多重鎖で交差した筋のある繊維を形成することができ、側方要素に秩序ある繊維性のコアを形成する（Yuan, L. et al. (1998) J. Cell. Biol. 142: 331-339）。マウスにおけるＳＣＰ３の欠損は、雌性の生殖細胞での異数性及び細胞死を引き起こすが、恐らくそれは減数分裂している染色体の構造的な整合性が欠けることによるものである（Yuan, L. et al. (2002) Science 296: 1115-8）。
【００６２】
雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞は、胚性期特異的な抗原−１の抗体（ａｎｔｉ−ＳＳＥＡ−１）を用いる免疫親和性の分離法により卵巣のホモジネートから単離することができる(市販されており、例えば、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（ＭＡＢ４３０１）から入手できる）。
【００６３】
当該技術分野で一般に公知の抗体の基本的な分離及び単離の方法は、卵巣のホモジネートからＳＳＥＡ−１の陽性生殖細胞を得るのに用いることができる。ある一様態では、磁気ビーズが分離方法に用いられる。例えば、セルエクチオン（ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ）・ビオチン結合材キット及びダイナル・ビオテック（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の磁気装置がＳＳＥＡ−１の陽性の生殖細胞を単離するのに用いることができる。ビオチン化のａｎｔｉ−ＳＳＥＡ−１抗体を磁気ビーズに被膜付着させ、そして細胞のホモジネートと混ぜ合わせると、その後、結合物が磁気ビーズによって分画される。単離後、親和性のビーズが取り除かれる。単離された細胞のアリコートが、追加して採取され、フローサイトメトリー（flow cytometry）で分離される。多段階の細胞単離法により、その後の培養、及び操作、凍結及び／又は移植のための、生きている細胞の調製が最大限にできる。
【００６４】
生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞は、レーザー捕獲の顕微解剖を用いて、卵巣のホモジネートから単離することができる。この方法を用いて、雌性の生殖細胞系列幹細胞が、区分された卵巣組織から得られる。卵巣組織は、区分する前には、新鮮なもの、冷凍されたもの、又は固定化されているものである。レーザー捕獲の顕微解剖を実施して、雌性の生殖細胞系列幹細胞を単離する。レーザー捕獲の顕微解剖の手順は、当該技術分野ではよく知られており、「Eltoum IA et al., (2002) Adv. Anat. Pathol. 9: 316-322」を参照願いたい。
【００６５】
レーザー捕獲の顕微解剖は、特別に適応された顕微鏡及びリアルタイムに可視化するコンピューターシステムを組み合わせたレーザー・パルス装置を利用する。最初に、組織学的スライド上の不均一状の組織内にある標的の細胞又は細胞型を同定化し、コンピーター・インターフェイスを介して、それらの周辺を標識するためにマークする。これらの細胞は、望ましい細胞型と望ましくないものの対比を強めるために、組織学的、免疫組織化学的、又はその他の相当する技法を用いて、特別に識別される。その後、特別に捕獲されるべき細胞の周辺に、レーザーパルスが適用される。レーザーパルスの結果、殆どの望ましい「マークされた」細胞が専用の捕獲基質に付着させ、一方、望ましくない細胞は除き、組織学的スライド上に留める。その後、捕獲基質に付着した細胞は、後の分析（たとえば、組織内の特別な細胞型における遺伝子発現の分析）のために処置される。
【００６６】
雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞は、血液及び骨髄から幹細胞を分離する、当該技術分野公知の標準的な方法（例えば、セルソーティング）で単離される。好ましくは、単離プロトコールは、造血性細胞が枯渇した、ｋｉｔ＋／ｌｉｎ−分画の生成を包含する。遺伝子発現（例えば、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ及びＳｔｅｌｌａ）の特徴的なプロファイルに基づく更なる選別手段は、雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞を含む細胞集団の精製に利用できる。雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞を含む組成物は、単離され、引き続いて、それらが得られた生物学的サンプル（例えば、臍帯血を含む、末梢血）が実質的に取り除かれる程度まで精製される。
【００６７】
雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞は、雌性の生殖細胞系列幹細胞から、例えば培地で増大することにより、得ることができる。このように、前駆細胞は、「増大（expansion）表現型」を有する細胞であってもよい。
【００６８】
ＩＩ．投与
本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を含む組成物を提供する。その組成物は、雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【００６９】
雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を含む組成物は、卵巣組織のような組織に直接提供することができる。移植又は着床に続いて、細胞は生着し、卵母細胞へ分化できる。「生着（engraft）」は、細胞接触の過程及びインビボで目的の既存組織（例えば、卵巣）への細胞の取り込みの過程を示す。増大剤（expansion agnets）及び分化剤は、投与の前、間及び後に、インビボで卵母細胞の量を増加させるために供与することができる。
自己のもの又は異種のもの（例えば、異種遺伝子型）を投与してもよい。例えば、雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞は、１つの対象から得ることができ、そして自己に又は異なった対象に投与することができる。
【００７０】
好ましくは、生着した細胞は、卵形成し、当該細胞が卵胞内で卵母細胞へと分化する卵胞形成工程を経る。卵胞形成は、単一の卵母細胞からなる卵巣構造が体細胞（卵胞膜間質のない又は卵胞膜間質を有する顆粒膜）によって囲まれる工程である。生殖腺の体細胞は、個々の卵母細胞を取り囲み、卵胞を形成する。充分形成された卵胞の各々は、完全な基底膜で包まれる。これらの新しく形成された卵胞の幾つかはほぼ即時に成長を開始するが、殆どの卵胞は退化するか又は活性化して成長工程に導入するシグナルを受けるまで、休止期に留まる。
【００７１】
本発明の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの子孫細胞（例えば、前駆細胞、分化した子孫細胞及び末期の分化した子孫細胞）は、カテーテル投与、全身注入、局所的な注入、静脈内注入、子宮内注入又は非経口の投与を含む、局所的な注入を介して投与することができる。本発明の治療用組成物（例えば、医薬組成物）を投与するときは、一般的に、注入可能な単位用量の形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で処方されるであろう。
【００７２】
本発明の組成物は、例えば、水性等張液、懸濁液、エマルジョン、分散液又は粘性の組成物等の、選択されたｐＨの緩衝液である無菌の液体調製物として簡便に提供される。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物及び固体組成物と比べて調製するのがより容易である。更に、液体組成物は、投与、とりわけ注入による投与において更に多少簡便である。一方で、特定の組織でより長い接触期間を提供するために、粘性組成物を適切な粘性範囲内で処方することもできる。液体又は粘性組成物は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状のポリエチレングリコール等）及びそれらの適した混合物を含有する、溶媒又は分散培地であってもよい担体を含むことが可能である。
【００７３】
無菌の注入可能な溶液は、必要に応じて他の成分を様々な量で含有する、必要とされる量の適した溶媒に、本発明を実施するのに利用される細胞を取り込んで調製することができる。このような組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース等の適した担体、希釈液又は賦形剤との混合物であってもよい。組成物は、また、凍結乾燥することもできる。組成物は、望ましい投与経路及び調製物によって、湿潤剤、分散剤又は乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル又は増粘性添加剤、保存剤、香料、色素等の補助的な物質を含むことができる。「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ」第１７版１９８５年等の標準的なテキストは、参照して本明細書に取り込むが、過度の実験なしに適した調製物を調製する助けとなるであろう。
【００７４】
抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート剤及び緩衝剤を含む、組成物の安定性と無菌状態を促進する様々な添加剤を添加することができる。例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の様々な抗菌剤及び抗真菌剤によって、微生物の活動の防止を確実なものとすることができる。注入可能な医薬品形態の吸収を延長することは、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅らせる薬剤の使用によって達成できる。しかしながら、本発明に従って使用される担体、希釈剤又は添加剤はいずれも、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞に適合性を有するものでなければならない。
【００７５】
組成物は、等張、すなわち、それらが血液及び涙液と同じ浸透圧を有していてもよい。本発明の組成物に望まれる等張性は、塩化ナトリウム又はその他に、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール又はその他の無機若しくは有機溶質等の薬学的に許容される薬剤を使用することにより達成できるであろう。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含む緩衝液として特に好まれる。
【００７６】
組成物の粘性は、必要に応じて、薬学的に許容される肥厚剤を使用することにより、選択されたレベルで維持可能である。メチルセルロースは、容易且つ経済的に入手可能であり、取り扱いが容易であるので好まれる。その他の好適な肥厚剤として、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー等が挙げられる。肥厚剤の好ましい濃度は、選んだ薬剤によるであろう。重要な点は、選択した粘性が達成できる量で使用することである。好適な担体及びその他の添加剤の選択は、実際の投与経路と特定の剤形の性質、例えば、液体製剤の形態（例えば、組成物が溶液、懸濁液、ゲル、又は、時間により放出される形態又は液体で満たされた形態等のその他の液状形態で処方されるかどうか）に依存するであろう。
【００７７】
必要に応じて対象に細胞を導入する際に、細胞の生存を潜在的に増加させる方法は、目的の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの子孫細胞（例えば、インビボ、エクスビボ又はインビトロで派生された）を、生体高分子又は合成ポリマーに取り込むことである。対象の症状によっては、傷跡又はその他の障害により、注入部位が細胞を蒔いたり成長させたりするのに適していないかもしれない。生体高分子としては、限定はされないが例えば、フィブロネクチン、フィブリン、フィブリノーゲン、トロンビン、コラーゲン及びプロテオグリカンの何れかと混合した細胞が挙げられる。これは増大因子（exponsion factors）又は分化因子を含んで又は含まずに構築してもよい。更に、これらは懸濁液の状態であってもよいが、流出までの各部位での滞在時間は、通常の範囲が好ましい。別の代替物としては、細胞と生体高分子の混合物の間隙に封入した、細胞を含んだ三次元ゲルが挙げられる。更に、増大因子又は増殖因子を細胞とともに含んでいてもよい。これらは本明細書に記載の多様な経路を通して注入により配備される。
【００７８】
組成物の構成成分として、本発明に記載のように、生殖細胞系列幹細胞又はそれら前駆細胞の生存性又は有効性に影響しないように、化学的に不活性なもの選択すべきであることは、当業者には認識されているところである。これは、化学及び医薬の原理に精通した者にとって問題とはならないだろうし、また、問題が起きたとしても、標準のテキストを参照することにより又は簡便な実験により（過度の実験を要することなく）、当該明細書の開示及び引用文献から容易に回避できるであろう。
【００７９】
本発明の生殖細胞系列幹細胞の治療用途に関して考慮すべきことの一つは、最適な効果を実現するために必要な細胞の量である。自己の単核骨髄細胞に関するヒトに於ける最近の研究では、経験的な用量である細胞数１〜４×１０７個の範囲で使用した場合に有望な結果が得られた。しかしながら、筋書き如何によっては、卵巣組織のような目的の組織に注入する細胞量の最適化が求められるかもしれない。このように、細胞の投与量は、治療される対象によって変化する。好ましいは、本発明の幹細胞の１０２〜１０６個、より好ましくは１０３〜１０５個、そして更に好ましくは１０４個を、ヒト対象に投与することができる。しかしながら、効果的とみなされる正確な用量は、身長、年齢、性別、体重及び症状を含むそれぞれの患者に個別の因子に依存して決定されるものである。特定の望ましい適用として選択された患者に、１００〜１０００個といった少ない数の細胞を投与してもよい。従って、当業者であれば、本明細書の開示と当該技術分野における知識から用量を確認するのは容易であろう。
【００８０】
本発明の生殖細胞系列幹細胞又はそれら前駆細胞の使用に関して更に考慮すべきことは、細胞集団の純度である。例えば、卵巣細胞は混ざった細胞集団からなり、望ましい効果を産生するのに充分な程度まで純度を上げることができる。当業者は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）等の様々な周知の方法を使用して、集団に含まれる生殖細胞系列幹細胞又はそれら前駆細胞の割合を容易に決定することができる。生殖細胞系列幹細胞又はそれら前駆細胞を含む集団において、好ましい純度の範囲は、約５０〜約５５％、約５５〜約６０％、及び約６５〜約７０％である。より好ましくは、純度は、約７０〜約７５％、約７５〜約０％、約８０〜約８５％であり、より一層好ましくは、純度は、約８５〜約９０％、約９０〜約９５％、及び約９５〜約１００％である。生殖細胞系列幹細胞又はそれら前駆細胞の純度は、集団内の遺伝子マーカーのプロファイルに従って決定することができる。当業者であれば、用量を容易に調整することができる（例えば、純度が低ければ用量を増やす必要がある）。
【００８１】
当業者であれば、本発明の方法で投与される、本発明の組成物中の細胞及び任意の添加剤、賦形剤及び／又は担体の量を、容易に決定することができる。一般的に、どのような添加剤（活性化された幹細胞及び／又は薬剤に加えて）も、リン酸緩衝生理食塩水中に０．００１〜５０％（重量）の量で存在し、有効成分は、約０．０００１〜約５重量％、好ましくは約０．０００１〜約１重量％、より一層好ましくは約０．０００１〜約０．０５重量％、又は、約０．００１〜約２０重量％、好ましくは約０．０１〜約１０重量％、そしてより一層好ましくは約０．０５〜約５重量％等のマイクログラムからミリグラムのオーダーで存在する。当然ながら、動物又はヒトに投与される如何なる組成物に対しても、また如何なる特定の投与方法に対しても、適するモデル動物、例えばマウス等の齧歯類における致死量（ＬＤ）及びＬＤ５０を決定すること等によって毒性を決定し、また、適した応答を誘導する、組成物の用量、組成物含まれる構成成分の濃度及び組成物を投与する時期を決定するのがよしとされる。このような決定には、当業者の知識、本明細書に於ける開示及びその引用文献に鑑みて過度の実験を要しない。また、逐次投与の時期の決定も過度の実験を要することなく確認できる。
【００８２】
ＩＩＩ．生殖細胞系列幹細胞の調節及び卵母細胞の産生
本発明は、インビボ、インビトロ及びエクスビボで卵母細胞の産生の方法を提供する。卵母細胞の産生は、雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の数を増加させることによって大きくできる。雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の数は、現存する雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の生存又は増殖を促進することにより増加させることができる。
【００８３】
雌性の生殖細胞系列幹細胞、又は雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の前駆細胞の増殖と生存を増加させる薬剤（例えば、増大剤）は、ホルモン若しくは成長因子（例えば、ＩＧＦ、ＴＧＦ、ＢＭＰ、Ｗｎｔタンパク質又はＦＧＦ）、細胞シグナル伝達分子（例えば、Ｓ１Ｐ又はＲＡ）、又は薬理学若しくは医薬品化合物（例えば、ＧＳＫ−３阻害剤、Ｂａｘ阻害剤又はカスパーゼ阻害剤等のアポトーシス阻害剤、一酸化窒素産生の阻害剤、又はＨＤＡＣ活性阻害剤）を含むが、それらに限定されるものではない。
【００８４】
成長因子を含む薬剤が、幹細胞の増殖又は生存を増加させることは当該技術分野公知である。例えば、米国特許第５，７５０，３７６号及び第５，８５１，８３２号は、ＴＧＦを使用した、神経性幹細胞のインビトロでの培養と増殖のための方法を記載している。幹細胞の増大と増殖における能動的な役割は、ＢＭＰ類（Zhu, G. et al., (1999) Dev. Biol. 215: 118-29、 Kawase, E. et al., (2001) Development 131: 1365）及びＷｎｔタンパク質（Pazianos, G. et al., (2003) Biotechniques 35: 1240、 Constantinescu, S. (2003) J. Cell Mol. Med. 7: 103）についても記載されている。米国特許第５，４５３，３５７号及び第５，８５１，８３２号は、ＦＧＦを利用した増殖性の幹細胞培養システムを記載している。特にこれら参考文献の各々の内容について、当該技術分野公知の増大剤についての記載を参照して、本明細書に取り込む。
【００８５】
細胞シグナル伝達分子を含む薬剤も、幹細胞の増殖又は生存を増加させることは当該技術分野では公知である。例えば、スフィンゴシン−１−リン酸は、神経性の前駆細胞の増殖を誘導することが知られている（Harada, J. et al., (2004) J. Neurochem. 88: 1026）。米国特許出願第２００３０１１３９１３号は、培地中での幹細胞の自己再生におけるレチノイン酸の使用を記載している。特にこれら参考文献の各々の内容について、当該技術分野公知の増大剤についての記載を参照して、本明細書に取り込む。
【００８６】
薬理学又は医薬品化合物を含む薬剤も、幹細胞の増殖又は生存を増加させることは当該技術分野では公知である。例えば、グリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤は、Ｗｎｔシグナル伝達による活性化を介して胚性幹細胞の多分化能を維持する（Sato, N. et al., (2004) Nat. Med. 10: 55）。アポトーシス阻害剤（Wang, Y. et al., (2004) Mol. Cell. Endocrinol. 218: 165）、一酸化窒素／一酸化窒素合成酵素の阻害剤（Matarredona, E.R. et al., (2004) Brain Res. 995: 274）及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（Lee, J.H. et al., (2004) Genesis 38: 32）は、増殖及び／又は多分化能を増加させることが知られている。例えば、ヒューマニンペプチドは、アポトーシスを抑制するＢａｘ機能の阻害剤である（Guo, B. et al., (2003) Nature 423: 456）。特にこれら参考文献の各々の内容について、当該技術分野公知の増大剤についての記載を参照して、本明細書に取り込む。
【００８７】
雌性の生殖細胞系列幹細胞、又は雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の前駆細胞を含む組成物を、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を卵母細胞へ分化させる薬剤（例えば、分化剤）と接触させることによって、卵母細胞の産生を更に増加させることができる。このような分化剤は、ホルモン若しくは成長因子（例えば、ＴＧＦ、ＢＭＰ、Ｗｎｔタンパク質、ＳＣＦ又はＬＩＦ）、シグナル伝達分子（例えば、減数分裂活性化ステロール（ＦＦ−ＭＡＳ））、又は薬理学若しくは医薬品製剤（例えば、Ｉｄタンパク質の機能又はＳｎａｉｌ／Ｓｌｕｇ転写因子の機能の調節因子）を含むが、それらに限定されるものではない。
【００８８】
成長因子を含む薬剤が幹細胞を分化させることは、当該技術分野では公知である。例えば、ＴＧＦ−βは、造血性幹細胞の分化を誘導できる（Ruscetti, F.W. et al., (2001) Int. J. Hematol. 74: 18）。米国特許出願第２００２１４２４５７号には、ＢＭＰを使用して心筋細胞を分化させるための方法が記載されている。Ｐｅｒａらは、ＢＭＰ−２を使用したヒト胚性幹細胞の分化を記載している（Pera, M.F. et al., (2004) J. Cell Sci. 117: 1269）。米国特許出願第２００４００１４２１０号及び米国特許第６，５８６，２４３号には、ＳＣＦの存在下、樹状細胞の分化が記載されている。米国特許第６，３９５，５４６号には、ＬＩＦを使用した胚性及び成体中枢神経系細胞からインビトロでドーパミン作動性ニューロンを発生させるための方法が記載されている。これら参考文献の各々の内容は、当該技術分野公知の分化剤についての記述に関する参考文献として、本明細書に特に取り込まれる。
【００８９】
シグナル伝達分子を含む薬剤は、卵母細胞の分化を誘発することも、当該技術分野公知である。ＦＦ−Ｍａｓは、卵母細胞の成熟を促進することが知られる（Marin Bivens, C.L. et al., (2004) BOR papers、印刷中）。特にこれら参考文献の各々の内容について、当該技術分野公知の分化剤についての記載を参照して、本明細書に取り込む。
【００９０】
薬理学又は医薬品化合物を含む薬剤が、幹細胞を分化を誘導することも当該技術分野では公知である。例えば、Ｉｄの調節因子は、造血系の分化に関与しているし（Nogueria, M.M. et al., (2000) 276: 803）、Ｓｎａｉｌ／Ｓｌｕｇの調節因子は、幹細胞の分化を誘導することが知られている（Le Douarin, N.M. et al., (1994) Curr. Opin. Genet. Dev. 4: 685-695; Plescia, C. et al., (2001) Differentiation 68: 254）。特にこれら参考文献の各々の内容について、当該技術分野公知の分化剤についての記載を参照して、本明細書に取り込む。
【００９１】
本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を、細胞増殖を減少させる、細胞の生存を阻害する又は細胞死を促進する薬剤と接触させることを含む、インビボ、エクスビボ又はインビトロで雌性の生殖細胞系列幹細胞又は雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の前駆細胞を減少させる方法も提供する。本発明の細胞の望まれない増殖とは、癌性及び前癌性の表現型（例えば、生殖細胞腫瘍、卵巣癌）を生じることである。このような方法は、生殖細胞系列幹細胞及び任意でそれらの前駆細胞又は卵母細胞の数を減少させることにより、望まれない増殖（例えば、癌）を制御するために又は避妊処置のために使用することができる。
【００９２】
細胞増殖を減少させる薬剤は、ホルモン若しくは成長因子（例えば、ＴＧＦ−β）、分裂促進ホルモン若しくは成長因子のペプチド拮抗剤（例えば、ＢＭＰ拮抗剤、ＰＲＤＣ及びＧｒｅｍｌｉｎ）、又は薬理学若しくは医薬品化合物（例えば、細胞周期阻害剤又は成長因子シグナル伝達の阻害剤）を含むが、それらに限定されない。
【００９３】
細胞の生存を阻害する薬剤は、ホルモン、成長因子若しくはサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬ等のアポトーシス促進性のＴＮＦスーパーファミリーメンバー）、生存促進性のＢｃｌ−２ファミリーメンバーの機能の拮抗剤、シグナル伝達分子（例えば、セラミド）、又は薬理学若しくは医薬品化合物（例えば、成長因子シグナル伝達の阻害剤）を含むが、それらに限定されない。生存促進性のＢｃｌ−２ファミリーのメンバーは、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘｌ（Cory, S. and Adams, J.M. (2000) Nat Rev  Cancer 2(9): 647-656; Lutz, R.J. (2000) Cell Survival Apoptosis 28: 51-56）、Ｂｃｌ−Ｗ（Gibson, L. et al., (1996) Oncogene 13 665-675; Cory, S. and Adams, J.M. (2000) Nat Rev Cancer 2(9): 647-656）、Ｍｃｌ−１（Kozopas, K.M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 3516-3520; Reynolds, J.E. et al. (1994) Cancer Res. 54: 6348-6352; Cory, S. and Adams, J.M. (2000) Nat Rev Cancer 2(9): 647-656）及びＡ１（Cory, S. and Adams, J.M. (2000) Nat Rev Cancer 2(9): 647-656; Gonzales, J. et al. (2003) Blood 101(7): 2679-2685; Reed, J.C. (1997) Nature 387: 773-776）を含む。
【００９４】
細胞死を促進する薬剤は、アポトーシス促進性の腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＮＦ−α、ＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬ）、アポトーシス促進性のＢｃｌ−２ファミリーメンバーの機能の作用剤及びセラミドを含むが、それらに限定されるものではない。アポトーシス促進性のＢｃｌ−２ファミリーメンバーは、Ｂａｘ（Oltvai, ZN. te al. (1993) Cell 74: 609-619）、Ｂａｋ（Chittenden, T. et al. (1995) Nature 374: 733-736）、Ｂｉｄ（Luo, X., et al. (1998) Cell 94: 481-490）、Ｈｒｋ（Inohara, N. et al. (1997) EMBO J 16(7): 1686-1694）、Ｂｏｄ（Hsu et al. (1998) Mol Endocrinol. 12(9): 1432-1440）、Ｂｉｍ（O'Connor, L. et al. (1998) EMBO J. 17(2): 385-395）、Ｎｏｘａ（Oda, E. et al. (2000) Science 288, 1053-1058; Yakovlev, A.G. et al. (2004) J Biol Chem 279(27): 28367-28374）、Ｐｕｍａ（Nakano, K. and Vousden, K.H. (2001) Mol Cell 7(3): 683-694）、Ｂｏｋ（Yakovlev, A.G. et al. (2004) J Biol Chem 279(27): 28367-28374; Hsu SY. et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA. 94(23): 12401-6）及びＢｃｌ−ｘｓ（Boise, L.H. et al. (1993) Cell 74: 597-608）を含む。
【００９５】
ＰＲＤＣ（Sudo et al., (2004) J. Biol. Chem.、出版進行中）、ＴＮＦ（Wong, G. te al, (2004) Exp. Neurol. 187: 171）、ＦａｓＬ（Sakata, S. et al, (2003) Cell Death Differ. 10: 676）、及びＴＲＡＩＬ（Pitti, RM et al. (1996) J Biol Chem 271: 12687-12690; Wiley, SR. et al. (1995) Immunity 3: 673-682）を含む、いくつかの薬剤が、細胞増殖若しくは生存を阻害する又は細胞死を促進することは当該技術分野では公知である。セラミドは、原始的なヒト造血性細胞に対する腫瘍壊死因子の機能を仲介する（Maguer-Satta, V. et al, (2000) Blood 96: 4118-23）。Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｄ、Ｈｒｋ、Ｂｏｄ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｏｋ及びＢｃｌ−ｘｓ等のＢｃｌ−２ファミリーメンバーの作用剤／拮抗剤は、幹細胞の生存を阻害することが知られている（Lindsten, T. et al, (2003) J. Neurosci. 23: 11112-9）。薬理学又は医薬品化合物を含む薬剤は、細胞の生存を阻害することも、当該技術分野では公知である。例えば、繊維芽細胞成長因子のシグナル伝達を阻害するヘパラン硫酸６−Ｏ−エンドスルファターゼ、ＱＳｕｌｆｌ等の成長因子シグナル伝達の阻害剤は、幹細胞の生存を阻害できる（Wang, S. et al, (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 4833）。特にこれら参考文献の各々の内容について、細胞の生存を阻害することが当該技術分野で公知となっている薬剤についての記載を参照して、本明細書に取り込む。
【００９６】
薬剤は、多様な投与経路により必要に応じて対象に投与できる。投与方法は、一般に、医学的に許容できる何れの投与形態、すなわち臨床上許容できない副作用を有することなく効果的なレベルの活性な化合物を生じる如何なる形態、で実施されてもよい。このような投与形態は、経口の、直腸の、局所的な、眼内の、頬側の、膣内の、大槽内の、脳室内の、気管内の、経鼻の、経皮の（例えば、コラーゲン等の繊維、浸透圧ポンプ若しくは適切に形質転換された細胞を含んだ移植片等の移植物（implants）内／上の）、又は非経口の経路を含む。「非経口の」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は生殖腺内への注入を含む。静脈内又は筋肉内の経路は、長期の治療及び予防法として特に適しているわけではない。特定の投与方法は、コラーゲン繊維、タンパク質ポリマー等の治療用タンパク質とともに被覆した、包埋した又は誘導体化した繊維を含む。他の有用なアプローチは、「Otto, D. et al., J. Neurosci. Res. 22: 83-91」及び「Otto, D. and Unsicker, K., J. Neurosci. 10: 1912-1921」に記載されている。
【００９７】
インビトロ及びエクスビボでの適用は、望ましい結果を実現するために、選択された薬剤とともに、生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を培養することを含んでいてもよい。  本発明の薬剤は、キットに付随した試薬と共に供給されてもよい。キットは、治療手順若しくは試験（assay）、試薬、装置（試験管、反応容器、針、シリンジ等）、及び較正又は治療若しくは試験を実施するための標準物質に関する説明書を含むことができる。本発明のキットに供給される説明書は、ラベル又は別個の挿入形式で適切な操作パラメータを示していてもよい。キットは、一定の結果が達成されたかどうかを確認するために、更に標準又は対照情報を含み、それによりテストサンプルが標準又は対照情報と比較できる。
【００９８】
ＩＩＩ  培養
本発明の生殖細胞系列幹細胞及び生殖細胞系列幹細胞由来の前駆細胞は、本明細書に開示される疾患の治療と同様、これに限定はされないが、毒性学的又は遺伝学的スクリーニング方法における実験の使用を含む、多くの多様な臨床的及び前臨床的応用に用いられる。
【００９９】
本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞を、インビトロで細胞増殖又は生存を促進する薬剤と接触させることを含む、雌性の生殖細胞系列幹細胞又は雌性生殖系列幹細胞由来の前駆細胞を増大させる方法を提供する。増大薬剤は、インビボ及びエクスビボで用いられるのと同じものであり、これらに限定はされないが、ホルモン又は成長因子（例えば、ａＩＧＦ、ＴＧＦ、ＢＭＰ、Ｗｎｔタンパク質又はＦＧＦ）、細胞シグナル伝達分子（例えば、ＳＩＰ又はＲＡ）、又は薬理学又は医薬品化合物（例えば、ＧＳＫ−３阻害剤、Ｂａｘ阻害剤又はカスパーゼ阻害剤のようなアポトーシス阻害剤、一酸化窒素産生の阻害剤、又はＨＤＡＣ活性の阻害剤）である。
【０１００】
雌性の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの前駆細胞は、治療の用途と同様に、ハイスループット毒性学的又は遺伝学的スクリーニングのための分化及び未分化の培養細胞種を提供できる。細胞は、例えば、標的のサイトカイン、ケモカイン、成長因子、又は薬理ゲノム学又は薬理遺伝学の医薬品組成物のスケールアップ又はハイスループットスクリーニングのためのシステムを提供するために、例えば、９６ウェル又は他のマルチウェル培養プレート内で培養できる。従って、例えば、サイトカイン、ホルモン、医薬品組成物及び成長因子を、それらの効果をより確実に明らかにする、時間的にまたコスト的に効果的な方法でスクリーニングすることができる。
【０１０１】
本発明の生殖細胞系列幹細胞、又は生殖細胞系列幹細胞由来の前駆細胞は、細胞が特異的な細胞系列（例えば、卵母細胞）を形成するように分化できる独特のシステムを更に提供する。（同一の個体由来及び異種個体由来の）細胞の培養は、多様な治療的応用（例えば、インビトロでの受精、体細胞核移植）に用いられる卵母細胞の産生を活性化するように、目的の分化剤で処理することができる。
【０１０２】
雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の、増殖の割合、細胞死の割合、卵母細胞又はその他の細胞型への分化、寿命、取扱の適合性、移植、培養、保存、又はその他の特性ような、特性の調節を、培養で評価できる。単離された細胞は、細胞培養に適した培地の範囲で培養できる。添加物は、これらに限定はされないが、血清、抗生物質（必要なら）、及びＬＩＦ、Ｋｉｔリガンド、βＦＧＦ、Ｆｉｔリガンド等のような生物活性分子を含む。
【０１０３】
減数分裂の開始及び卵母細胞の成長、又は体細胞を含むその他の細胞系列への成長によって代表される、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の分化は、当該技術分野で公知の標準的な方法を用いて実現することができる。その他の未分化な又は部分的に分化した前駆細胞と同様、生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞は、当該技術分野で公知の薬剤を含む培地での培養により、特定の成長過程をたどるように誘導される。このような薬剤は、このような因子を分泌する細胞が、生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の成長を導くように、生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞と共に培養される、“共培養”計画に基づいて提供される。
【０１０４】
これらの薬剤は、これらに限定はされないが、以下のものを含む（生物学的シグナル伝達の過程に関して、薬理的又は生物学的拮抗剤、作用剤、又はその他の機能調節因子が、各々の場合に含まれる）：Ｗｎｔ経路分子、ＴＧＦβ及び／又はＢＭＰ経路分子、ヒストン調節過程を含む非遺伝子的メカニズムの調節因子（これらに限定はされないが、アセチル化、メチル化等）、性腺刺激ホルモン、ステロイドホルモン（これらに限定はされないが、エストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲン等）、ＩＧＦ及び／又はインスリンシグナル伝達分子、レプチン及び関連シグナル伝達分子、スフィンゴ脂質ファミリーメンバー（これらに限定はされないが、スフィンゴシン−１−リン酸、セラミド等）、アポトーシス制御因子（これらに限定はされないが、カスパーゼ阻害剤、Ｂａｘ阻害剤のヒューマニン等）、Ｎｏｔｃｈ経路分子、いわゆる細胞老化経路を含む細胞周期制御因子（これらに限定はされないが、Ｂｍｉ−１、Ｉｎｋ４ａ遺伝子座等）、受容体キナーゼ及び細胞内キナーゼカスケードの制御因子、並びに遺伝子発現妨害を介して遺伝子発現を調節する方法（これらに限定はされないが、様々なＲＮＡ干渉、モルホリノ技術、又はアンチセンスＲＮＡ分子等）。前駆細胞／前駆体上で働くそのような因子のいくつかの特異的な例、及び結果として形成された細胞種を表１に示す。
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
本発明の細胞は、多数の標的の生物学的又は薬理的薬剤を同定するために使用されるハイスループットスクリーニング技術のために、最終分化した又は未分化の細胞種を含む、様々な細胞種を提供できる。重要なことに、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞は、生物学的及び薬理的薬剤に対し異なって応答する、遺伝的に多様な様々な対象から、培養細胞の源を提供する。
【０１０７】
本発明は、生物学的又は薬理的薬剤に対する薬理遺伝子学的な細胞応答を特定化するために、本明細書に記載された生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を使用する方法を提供する。生物学的又は薬理的薬剤、又はそのような薬剤のコンビナトリアルライブラリーに対する薬理遺伝子学的な細胞応答を特定化するために、生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を用いる方法において、生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を好ましくは対象の統計的に有意な集団から単離し、培養で増大させ、１つ又はそれ以上の生物学的又は薬理的薬剤に接触させる。本発明の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞は、培養増大の前又は後のいずれかで、分化した細胞がある特定の種の生物学的又は薬理的薬剤の望ましい標的であるように、分化誘導されるものであってもよい。統計的に有意な集団の対象からの培養物の１つ又はそれ以上の細胞応答と比較することにより、生物学的又は薬理的薬剤の効果が決定される。生物学的又は薬理的薬剤の効果には、アポトーシスの誘導、遺伝子発現の変化、染色体損傷、及び卵巣機能に関わるホルモンの低下又は増加がある。
【０１０８】
他方、遺伝子的に同一な生殖細胞系列幹細胞、それらの前駆細胞又はそれらの子孫細胞が、コンビナトリアルライブラリーの化合物のような別々の化合物群をスクリーニングするために用いられる。細胞に基づいたハイスループットスクリーニングと組み合わせて用いるための遺伝子発現系は、「Jayawickreme, C. and Kost, T., (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8: 629-634」に記載されている。
【０１０９】
本発明はまた、組織操作された構造体（例えば、卵巣）、部分、その特異的切片、又は目的の組織及び、サイトカイン、ホルモン、成長因子又は分化誘導因子からなる組織操作する装置を想定しており、この分化誘導因子は、これに限定されないが、卵巣組織を含む組織を産生するために用いられる本発明の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を望ましい細胞種に分化誘導する。組織操作された構造体は、３次元構造に細胞増殖するのを支援するための、生分解される生体適合性のある骨格と共に用いることができる。本発明の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞から産生される組織操作された構造体を、移植用臓器、部分、又はその特異的な切片の必要な対象に移植することができる。
【０１１０】
本発明の生殖細胞系列幹細胞又は前駆細胞の培養物由来の同種の器官、部分、又は個別の細胞を、宿主に移植することができる。同様に、多様な組織種に分化誘導された、生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞由来の異種の器官、部分、又は切片を、それを必要とする対象に移植することができる。器官又は器官単位が由来する幹細胞のドナーが、組織操作された組織のレシピエントであるような自己への移植ができる。器官又は器官単位が由来する幹細胞のドナーが、組織操作された組織のレシピエントのものでないような異種への移植ができる。
【０１１１】
一旦宿主に移されると、組織操作された構造体は、自然の宿主組織の機能及び構造を繰り返し続けることができる。組織操作された構造体は、本明細書に開示される癌及び他の疾患、先天的な不具合、又は外科的な切除による障害への治療を含む、多種多様な適用で対象に利益をもたらすであろう。
【０１１２】
本発明の生殖細胞系列幹細胞由来の組織操作された構造体の発達に用いられるポリマー骨格は、結合組織の骨格又はマトリックスの代わりに機能し、拡散により、ガス、栄養素、及び廃棄物の交換を最適化するように設計される。ポリマー骨格は、例えば、繊維からなる多孔質で不織のアレイを含むことができる。そのポリマー骨格は、栄養素又は成長因子が細胞に適切に拡散できるように、表面積を最大化するように形成することができる。これらのパラメータを考慮に入れて、当業者は、当該分野における公知技術を使用することにより、操作された組織（engineered-tissue）が移植されて新たな血管と互いに嵌合するまでの間、細胞が拡散により栄養を得るのに十分な表面積を有するポリマー骨格を形成するであろう。ポリマー骨格は、繊維状の構造を含むことができる。その繊維は、丸いか、波を打っているか、平らか、星型か、孤立しているか、又は他の繊維と絡み合っているかである。分岐した繊維を用いると、容量に比例して表面積を増加できる。
【０１１３】
他に特定しない限り、「ポリマー」という用語には、重合し又は接着して全体のユニットを形成するモノマー及びポリマーが含まれる。当該ポリマーは、具体的には加水分解又は酵素開裂による、非生物分解性又は生物分解性である。「生分解性」という用語は、必要とされる構造的な全体の状態を維持しながら、生吸収性がある、及び／又は分単位から３年までの期間、好ましくは１年未満の期間を掛けて、生理学的環境との相互作用での機械的分解により、代謝又は排出される成分に分解する及び／又は破壊される物質を示す。ポリマーに関して使用されているような「分解する」という用語は、分子量がオリゴマーレベルでほぼ一定であり、ポリマー微粒子を残して分解するようなポリマー鎖の開裂を示す。
【０１１４】
ポリマー骨格製造に適した材料は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリＤ−乳酸（ＰＬＤＡ）、ポリグリコシド、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリラクチド−コ−グリコシド（ＰＬＧＡ）、ポリジオキサン、ポリグルコン酸、ポリ乳酸−ポリエチレンオキシドコポリマー、修飾セルロース、コラーゲン、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシプロピオン酸、ポリリン酸エステル、ポリ（αヒドロキシ酸）、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、分解性ウレタン、脂肪族のポリエステルポリアクリレート、ポリメタクリレート、アシル置換酢酸セルロース、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリビニルイミダゾール、クロルスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、テフロンＲＴＭ、ナイロンシリコン、及びポリ（スチレン−ブロック−ブタジエン）、ポリノルボルネン、ヒドロゲル、金属合金及び切り替え区域としてのオリゴ（ε−カプロラクトン）ジオール／物理的な架橋としてのオリゴ（ｐ−ジオキサノン）ジオール等のような形状記憶材を含む。他の適切なポリマーは、「The Polymer Handbook 第３版（Wiley, N.Y., 1989）」を参照して得られる。
【０１１５】
栄養素、成長因子、分化又は脱分化の誘導剤、分泌産生物、免疫調節因子、炎症阻害剤、退行性因子、ホルモン、又は他の生物学的に活性な化合物を含むが、これらに限定はされない因子が、ポリマー骨格に取り込まれるか、又はポリマー骨格と連結して提供されてもよい。
【０１１６】
Ｖ．スクリーニング、アッセイ
本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を調節する調節因子、すなわち、候補物又はテスト化合物、又は薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、ｐｅｐｔｏｉｄｓ、小分子又は他の薬剤）の同定のための方法を提供する。このように、薬剤は、例えば治療上のプロトコールにおいて、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆細胞の、例えば、増殖、生存及び分化を調節するために使用することができる。
【０１１７】
本発明のテスト薬剤は、単独で得られるか、又は当該技術分野公知のコンビナトリアルライブラリー法による多数のアプローチの何れかを使用して得ることができる。当該技術分野公知のコンビナトリアルライブラリー法は、生物学的ライブラリー、ペプチドライブラリー（ペプチドの機能性は有するが、酵素消化に抵抗性であり、それにもかかわらず生物活性を保持している新規な非ペプチド骨格を有する分子からなるライブラリー、例えば、「Zuckermann, R.N. et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678-85」を参照願いたい。）、空間的に位置づけできる平行固相又は液層ライブラリー、逆重畳が要求される合成ライブラリー法、「１粒子１化合物」ライブラリー法、及び、アフィニティークロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリー法を含む。生物学的ライブラリー及びペプチドライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに制限される一方、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物からなる小分子ライブラリーに適用できる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145）。
【０１１８】
分子ライブラリーの合成に関する方法の例は、当該技術分野で見出すことができる。例えば、「DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909」、「Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422」、「Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678」、「Cho et al. (1993) Science 261:1303」、「Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059」、「Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061」、及び「Gallop te al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233」。 
【０１１９】
化合物ライブラリーは、溶液中に（例えば、Houghten (1992), Biotechniques 13:412-421）、又は粒子上に（Lam (1991), Nature 354:82-84）、チップに（Fodor (1993) Nature 364:555-556）、細菌に（Ｌａｄｎｅｒ，米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子に（Ｌａｄｎｅｒ，米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミドに（Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869）又はファージ上に（Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner 上記と同じ）提示されるかもしれない。
【０１２０】
テスト薬剤として使用される化学的な化合物（すなわち、潜在的な阻害剤、拮抗剤、作用剤）は、商業的な供給源から得ることもできるし、簡単に入手できる出発物質から標準的な合成手法及び当業者に公知の方法論を用いて合成することもできる。本明細書に記載の方法によって同定される化合物を合成する際に有用な合成化学での変換及び保護基の方法論（保護及び脱保護）は、当該技術分野公知であり、例えば、「R. Larock (1989) Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers; T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); 及び L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)」及びそれらの続版に記載されるような方法論を含む。
【０１２１】
ある側面では、化合物は、有機的な小分子、すなわち、１，０００ａｍｕより少ないか、又は３５０−７５０ａｍｕの間である分子量有する化合物である。他の側面では、化合物は、（ｉ）非ペプチド性の化合物であり、（ｉｉ）さらなる置換基を有してもよい、ヘテロシクリル、ヘテロアリール環基を含めた１から５の間の官能基を有する化合物であり、（ｉｉｉ）それらそれぞれの薬学的に許容される塩形態である化合物、又は（ｉｖ）ペプチド性の化合物である。
【０１２２】
「ヘテロシクリル」という用語は、単環ならば１〜３ヘテロ原子、二環なら１〜６ヘテロ原子、又は三環なら１〜９ヘテロ原子を有する、非芳香族の３〜８員からなる単環性の、８〜１２員からなる二環性の、又は１１〜１４員からなる三環性の環状系を示し、当該ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ又はＳから選択され（例えば、単環、二環又は三環ならば、それぞれ炭素原子及び１〜３個、１〜６個又は１〜９個のＯ、Ｎ又はＳヘテロ原子）、そこでは、それぞれの環で０、１、２又は３原子が置換基によって置換されていてもよい。
【０１２３】
「ヘテロアリール」という用語は、単環ならば１〜３ヘテロ原子、二環なら１〜６ヘテロ原子、又は三環なら１〜９ヘテロ原子を有する、芳香族の５〜８員からなる単環性の、８〜１２員からなる二環性の、又は１１〜１４員からなる三環性の環状系を示し、当該ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ又はＳから選択され（例えば、単環、二環又は三環ならば、それぞれ炭素原子及び１〜３個、１〜６個又は１〜９個のＯ、Ｎ又はＳヘテロ原子）、そこでは、それぞれの環で０、１、２、３又は４原子が置換基によって置換されていてもよい。
【０１２４】
「置換基」という用語は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル又はヘテロアリール基上の何れかの原子で「置換された」官能基を示す。適した置換基は、限定されることなく、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、ＳＯ３Ｈ、ペルフルオロアルキル、ペルフルオロアルコキシ、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、カルボキシル、オキソ、チオキソ、イミノ（アルキル、アリール、アラルキル）、Ｓ（Ｏ）ｎアルキル（ｎ＝０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎアリール（ｎ＝０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロアリール（ｎ＝０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロシクリル（ｎ＝０〜２）、アミン（モノ−、ジ−、アルキル−、シクロアルキル−、アラルキル−、ヘテロアラルキル−、及びそれらの組合せ）、エステル（アルキル−、アラルキル−、ヘテロアラルキル−）、アミド（モノ−、ジ−、アルキル−、アラルキル−、ヘテロアラルキル−、及びそれらの組合せ）、スルホンアミド（モノ−、ジ−、アルキル−、アラルキル−、ヘテロアラルキル−、及びそれらの組合せ）、置換されていないアリール、置換されていないヘテロアリール、置換されていないヘテロシクリル、置換されていないシクロアルキルを含む。ある側面では、官能基の置換は、独立して、上述の置換基のうち何れか１つ又は何れかのサブセットである。
【０１２５】
本発明として思い描かれる化合物において置換基とその数の組合せは、安定な化合物の形成に帰するもののみである。本明細書で使用されるように「安定な」という用語は、製造することができる程に十分な安定性を有し、本明細書で述べる目的（輸送、貯蔵、アッセイ、対象への治療上の投与）に対して有用である十分な期間、化合物の完全性が維持される化合物を示す。
【０１２６】
本明細書に記載の化合物は、１つ又はそれ以上の不斉中心を有していてもよく、これによりラセミ体、及び、ラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマー及びジアステレオマー混合物として生じる。これらの化合物のこのような全ての異性体は、特に本発明に包含される。本明細書に記載の化合物は、複数の互変異体で表すこともでき、互変異体の全ては本明細書に包含される。化合物は、シス−又はトランス−、又は、Ｅ−又はＺ−二重結合異性体も生じることができる。このような化合物のこのような全ての異性体は、特に本発明に包含される。
【０１２７】
本発明のテスト薬剤は、ペプチドであってもよい（例えば、成長因子、サイトカイン、レセプターリガンド）。
本発明のスクリーニング方法は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又は雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞の増殖又は生存を増加させる薬剤の同定を包含することができる。このような方法は、通常、生殖細胞系列幹細胞又は前駆細胞の集団を培養中でテスト薬剤と接触させ、結果として産生された新たな幹細胞又は前駆細胞の数を定量化することを含むだろう。未処理のコントロールとの比較が、同時に評価されてもよい。幹細胞又は前駆細胞の数の増加がコントロ−ルと比較して検出される場合には、テスト薬剤は望ましい活性を有すると判定される。
【０１２８】
本発明の方法を実施する際に、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の精製された集団が使用されることが望まれるかもしれない。雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の精製された集団は、約５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％及び６５〜７０％の純度を有する。より好ましくは、純度は約７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、そしてより一層好ましくは、純度は約８５〜９０％、９０〜９５％及び９５〜１００％である。
【０１２９】
その他の方法では、テスト薬剤は、幹細胞又は前駆細胞の精製された集団よりもむしろ生物学的サンプルを用いて試験される。「生物学的サンプル」という用語には、組織、細胞及び対象から単離された生物学的液体が含まれ、更に対象内にある組織、細胞及び液体も含まれる。好ましい生物学的サンプルには、骨髄、末梢血及び卵巣組織が含まれる。
【０１３０】
雌性の生殖細胞系列幹細胞又は雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞の増加した量は、ＳＳＥＡ（例えば、ＳＳＥＡ−１）、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ及びＶａｓａを含む遺伝的マーカーの遺伝子発現の増加によって検出することもできる。発現レベルは、遺伝的マーカーによってコードされるｍＲＮＡを測定すること、遺伝的マーカーによってコードされるタンパク質の量を測定すること、又は遺伝的マーカーによってコードされるタンパク質の活性を測定することを含み、それらに限定はされないが、多くの方法で測定することができる。
【０１３１】
遺伝的マーカに対応するｍＲＮＡのレベルは、ｉｎ  ｓｉｔｕで及びインビトロで測定することができる。単離されたｍＲＮＡは、サザン分析又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応及びプローブアレイを含み、それらに限定はされないが、ハイブリダイゼーション又は増幅アッセイで使用することができる。ｍＲＮＡレベルの検出に関する診断方法の１つは、単離されたｍＲＮＡを、検出すべき遺伝子によりコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズ可能な核酸分子（プローブ）と接触させることを包含する。核酸プローブは、ストリンジェントな条件下で十分に、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする。プローブは、アレイ、例えば以下に記載するアレイの、ある位置に置くことができる。診断アッセイに使用するその他の好適なプローブも、本明細書に記載する。
【０１３２】
ある形式では、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で泳動し、ゲルからニトロセルロース等の膜へｍＲＮＡを転写することによって、ｍＲＮＡ（又はｃＤＮＡ）を、表面に固定化され、プローブと接触させる。それに代わる形式、例えば、以下に記載の二次元遺伝子チップアレイでは、プローブを表面に固定化し、ｍＲＮＡ（又はｃＤＮＡ）をプローブと接触させる。当業者であれば、公知のｍＲＮＡ検出方法を応用して、本明細書に記載の遺伝的マーカーによってコードされるｍＲＮＡレベルを検出することができる。
【０１３３】
サンプル中のｍＲＮＡレベルは、例えば、ｒｔＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193）、ｓｅｌｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）、Ｑ−βレプリカーゼ（Lizardi eu al. (1988) Bio/Technology 6:1197）、ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｌｉｚａｒｄｉら米国特許第５，８５４，０３３号）又は他のいずれかの核酸増幅法によって核酸を増幅し、当該技術分野公知の手法を用いて増幅した分子を検出することによって、評価することができる。本明細書で使用されるように、増幅プライマーは、遺伝子の５’又は３’領域にアニールでき（＋鎖及び−鎖それぞれに、又は逆も同じ）、その間に短い領域を含む、一組の核酸分子であるとして定義される。一般に、増幅プライマーは、約１０〜３０ヌクレオチド長であり、約５０〜２００ヌクレオチド長の領域の両端に隣接する。このようなプライマーは、適した条件下及び適した試薬を用いることにより、プライマーに隣接されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を増幅させることができる。
【０１３４】
ｉｎ  ｓｉｔｕでの方法用に、細胞又は組織サンプルを、調製／処理し、支持体、典型的にはスライドガラス上に固相化し、次いで、解析すべき遺伝的マーカーをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズすることが可能なプローブと接触させる。
本発明のスクリーニング方法は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又は雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞の卵母細胞への分化を増加させる薬剤の同定を包含する。このような方法は、通常、幹細胞又は前駆細胞の集団を培養中にテスト薬剤と接触させること、及び、結果として産生された新たな卵母細胞の数を定量化すること、を包含する。未処理の対照との比較評価を同時に行ってもよい。対照と比較して、卵母細胞の数の増加が検出されれば、テスト薬剤は、望ましい活性を有していると判定される。テスト薬剤は、生物学的なサンプル（例えば、卵巣組織）を使用して試験してもよいし、試験の結果があいまいな場合には、幹細胞又は前駆細胞の集団を使用して、引き続き薬剤の機能的な活性（例えば、増殖又は生存の増加よりむしろ分化）を識別する試験を行ってもよい。
【０１３５】
卵母細胞の増加量は、ＳＳＥＡ（例えば、ＳＳＥＡ−１）、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ及びＶａｓａを含む幹細胞又は前駆細胞の遺伝的マーカーの遺伝子発現の減少、又はＨＤＡＣ６、ＧＤＦ９及びＺＰ３等の卵母細胞マーカーの増加によって検出される。
本発明のスクリーニング方法は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又は雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞の増殖又は生存を減少させる薬剤の同定を包含することもできる。このような方法は、通常、幹細胞又は前駆細胞の集団又は生物学的なサンプル（例えば、卵巣組織）を、培養中にテスト薬剤と接触させること、及び結果として失われた幹細胞又は前駆細胞の数を定量化することを包含するであろう。未処理の対照との比較評価を同時に行ってもよい。対照と比較して、幹細胞又は前駆細胞の数の減少が検出されれば、テスト薬剤は望ましい活性を有すると判定される。
【０１３６】
ＶＩ．治療及び診断の方法
本発明の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞は、さまざまな治療上の応用に使用することができる（例えば、インビトロ受精及び体細胞核移植を含むエクスビボでの操作又はインビボでの治療のための卵母細胞の産生）。従って、本発明の方法は、雌の受胎率を高める又は回復させる、そして更年期の症状及びその結果の改善を図る手段としての卵胞の蓄積を増大させる等のために、雌性の生殖細胞系列幹細胞又は雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の前駆細胞を使用することに関する。
【０１３７】
このように、本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆体を、それを必要とする対象の雌に提供することを含む、不妊治療のための方法を提供し、そこでは、当該細胞は組織に生着し、後に受精のために提供することができる（例えば、対象の排卵又はインビトロ受精に続いて）卵母細胞へ分化する。好ましくは、組織は卵巣組織であるが、体内の他の組織が、後に卵母細胞を生じる生着した細胞を宿してもよい。卵巣以外の組織に宿った卵母細胞は、インビトロ受精を含む操作のために回収され、使用することができる。
【０１３８】
本発明は、それを必要とする対象の雌の卵巣組織を、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆体の産生又は生存を増加させる薬剤と接触させることからなる、不妊を治療する方法を提供する。前述のように、卵母細胞の産生は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆体の量（つまり、増殖）又は寿命（つまり、生存）を増加させることにより、更に雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆体を卵母細胞に分化させることにより、増やすことができる。このような卵母細胞は、対象における受胎、引き続く排卵のために後で提供することができる。
【０１３９】
本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆体を、当該細胞を組織に生着し、卵母細胞に分化するところの組織に提供することを含む、損傷を受けた卵巣組織を修復するための方法も提供する。損傷は、例えば、細胞傷害性因子への曝露、化学療法剤、放射線、ホルモンの欠乏、成長因子の欠乏、サイトカインの欠乏、細胞レセプター抗体等によって、引き起こされるかもしれない。化学療法剤には、これらに限定はされないが、５−ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、エトポシド、シスプラチン、メトトレキサート、ドキソルビシン及びその他を含む。損傷は、また、癌、多嚢胞性卵巣疾患、遺伝性疾患、免疫障害、代謝性疾患等の卵巣機能に影響を与える疾患によっても引き起こされるかもしれないが、それらに限定はされない。
【０１４０】
本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆体を、当該細胞が卵巣に生着し卵母細胞へ分化するところの、対象に提供することを含む、閉経期にある対象である雌の卵巣機能を回復するための方法を提供する。対象である閉経期の雌は、閉経前又は閉経後の段階であってもよく、当該閉経は正常に（例えば、加齢）又は病理学的過程（例えば、手術、疾患、卵巣損傷）により引き起こされたものであってもよい。
【０１４１】
閉経後の雌における卵巣機能は、対象の卵巣組織を、（例えば、雌性の生殖細胞系列幹細胞の数又は寿命を増加することにより、又は、雌性の生殖細胞系列幹細胞が卵母細胞へ分化するのを増加させることにより）雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆体の量を増加する薬剤と接触させることにより、回復することもできる。
【０１４２】
卵巣機能の回復により、それらに限定されないが、骨粗鬆症、循環器系の疾患、体細胞性の性機能障害、のぼせ、膣部の乾燥、睡眠障害、うつ病、刺激過敏症、性欲の喪失、ホルモンのアンバランス等の体細胞性の疾患を含む更年期障害に伴う有害な症状及び合併症、更に記憶の喪失、情緒障害、うつ病等の認知性疾患も同様に、軽減することができる。
【０１４３】
本発明は、対象の卵巣組織を、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆体の増殖、機能又は生存を減少させる薬剤と接触させることを含む、対象である雌の避妊の方法を更に提供する。
【０１４４】
本発明の生殖細胞系列幹細胞、それらの前駆体又はそれらのインビトロ由来の子孫細胞は、前述のように投与できる。本明細書に記載の生殖細胞系列幹細胞、それらの前駆体又はそれらのインビトロ由来の子孫細胞は、投与前に、当業者に公知の様々な組換え法を用いて、細胞に異種のＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質を導入することにより、任意にインビトロ、インビボ又はエクスビボで遺伝的に修飾することもできる。これらの方法は、一般に４つの主なカテゴリーに分類される。（１）例えば、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、サル・ウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、シンドビスウイルス及びウシ・パピローマウイルス等のＤＮＡ又はＲＮＡウイルスベクターの使用を含む、ウイルスによる移入、（２）カルシウムリン酸トランスフェクション法及びＤＥＡＥデキストラン・トランスフェクション法を含む、化学的な移入、（３）例えば、リポソーム、赤血球ゴースト及びプロトプラスト等のＤＮＡが負荷された膜状担体を使用する、膜融合による移入、及び（４）マイクロインジェクション、エレクトロポレーション又は直接「裸の」ＤＮＡを移入する等の物理的な移入手法、である。
【０１４５】
本発明の生殖細胞系列幹細胞、それらの前駆体又はそれらのインビトロ由来の子孫細胞は、あらかじめ選択して単離したＤＮＡの挿入により、あらかじめ選択して単離したＤＮＡで細胞のゲノムの一部を置換することにより、又は、細胞のゲノムの少なくとも一部を欠失又は不活化させることにより、遺伝的に改変することができる。細胞のゲノムの少なくとも一部を欠失又は不活化させるのは、例えば、アンチセンス手法（ペプチド核酸、すなわちＰＮＡｓの使用を含むことができる）又はリボザイム手法による遺伝的な組換えを含むがそれに限定されない様々な手段により可能となる。改変されたゲノムは、選択可能な又はスクリーニング可能なマーカー遺伝子の遺伝的な配列を有し、その発現により、ゲノムが改変された細胞又はその子孫細胞を、ゲノムが改変されていない細胞から識別することができる。例えば、このようなマーカーは、緑色、赤色、黄色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又はハイグロマイシンあってもよいが、これらの例に限定されるものではない。
【０１４６】
病理状態の根底にある欠陥は、代謝系タンパク質等のタンパク質をコードするＤＮＡの変異ある場合がある。異種のＤＮＡによってコードされるポリペプチドは、病理状態に関連する変異がないものが好ましい。病理状態がタンパク質発現の減少に関連している場合もある。遺伝的に改変された雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその子孫細胞は、組換えタンパク質の強力な発現を司るプロモーターにより、このようなタンパク質をコードするＤＮＡを含んでいるかもしれない。
【０１４７】
あるいは、タンパク質、酵素又はその他の細胞産生物の発現の制御又は時期を高度に制御する必要がある場合には、細胞は、誘導性のプロモーター又はその他の制御機構により制御できる遺伝子を発現する場合がある。このような幹細胞を、タンパク質の発現が異常に低い対象に移植すると、タンパク質が高レベルで産生されるので、治療上有効である。例えば、本発明の生殖細胞系列幹細胞、それらの前駆体又はそれらのインビトロ由来の子孫細胞は、例えば遺伝子治療に於いて発現する遺伝子をコードする異種のＤＮＡを含むことができる。本発明の生殖細胞系列幹細胞、それらの前駆体又はそれらのインビトロ由来の子孫細胞は、受胎率を悪化させるヒトの疾患である毛細血管拡張性運動失調症に関与する遺伝子、Ａｔｍをコードする異種のＤＮＡを含むことができる。生殖細胞系列幹細胞、それらの前駆体又はそれらのインビトロ由来の子孫細胞を介してＡｔｍを提供することにより、卵巣機能の欠陥を更に軽減することができる。生殖細胞系列幹細胞の機能的な特徴を改変するような遺伝子産物をコードするＤＮＡで疾患状態のまったくないものも想定されている。例えば、アポトーシスを阻害したり、分化を抑制する遺伝子の送達は、有益であろう。
【０１４８】
相同組換え又はウイルスによる組込みにより、宿主となる細胞のゲノムへ、１つ又はそれ以上のあらかじめ選択されたＤＮＡ配列を挿入することが可能である。望ましい遺伝子配列は、プラスミド発現ベクター及び核移行配列を使用することによって、細胞、特にその核へ取り込ませることができる。ポリヌクレオチド配列を核へ方向付ける方法は、当該技術分野では公知である。遺伝的な物質は、ある化学物質／薬剤を使用して目的の遺伝子を積極的に又は消極的に誘導可能なプロモーター、又は、与えられた薬剤／化学物質の投与後に目的の遺伝子を排除可能なプロモーターを使用して導入することもできるし、特定の細胞区画（細胞膜を含むがそれに限定されない）で化学物質（タモキシフェン応答性の変異を有するエストロゲンレセプターを含むがそれに限定されない）による発現を誘導できるようにタグを付けることもできる。
【０１４９】
カルシウムリン酸トランスフェクションは、単離された又は培養された生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆体に、標的の遺伝子又はポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡを導入するのに使用することができ、これは当業者には、ＤＮＡ移入の標準的な方法である。ＤＥＡＥデキストラントランスフェクションは、これも当業者には公知であるが、一過性の移入が望まれる場合には、効率的である場合が多いので、カルシウムリン酸トランスフェクションに較べて好まれるであろう。本発明の細胞は単離された細胞であるので、マイクロインジェクションは細胞へ遺伝的な物質を移入するために特に効果的であるかもしれない。この方法は、注入するポリペプチドの細胞質及びリソソームの分解を回避して、望ましい遺伝物質を核に直接送達できるため好都合である。この手法は、トランスジェニック動物において、生殖細胞系列の修飾に効果的に使用されてきた。本発明の細胞は、エレクトロポレーションを使用して遺伝的に修飾することも可能である。
【０１５０】
細胞を遺伝的に修飾するための、リポソームによるＤＮＡ又はＲＮＡの送達は、ポリヌクレオチドと安定な複合体を形成する陽イオン性のリポソームを用いて実施することができる。リポソーム複合体の安定化のために、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又はジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＱ）を添加することができる。リポソームによる移入のために商業的に入手可能な試薬には、リポフェクチン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が含まれる。例えば、リポフェクチンは、陽イオン性の脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−トリメチルアンモニアクロリドとＤＯＰＥの混合物である。リポソームはより大きなＤＮＡ断片を運ぶことができ、一般的にポリヌクレオチドが分解するのを防止し、特定の細胞又は組織へ標的化することができる。陽イオン性の脂質で仲介される遺伝子の移入効率は、精製された水庖性口内炎ウイルスエンベロープのＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）等の精製されたウイルス又は細胞性のエンベロープ構成要素を取り込むことで増強される。リポポリアミン被覆ＤＮＡを使用することによって初代又は確立された哺乳動物の培養細胞株へＤＮＡを送達することに関して効果が示されてきた遺伝子移入の手法を用いて、本明細書に記載の生殖細胞系列幹細胞に標的のＤＮＡを導入することができる。
【０１５１】
裸のプラスミドＤＮＡは、単離された生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆体から分化した細胞で形成された組織（tissue mass）へ直接的に注入することができる。この手法では、１回の筋肉内注入でマウス骨格筋に於ける発現が１９ヶ月間以上観察されており、骨格筋組織へプラスミドＤＮＡを移入する場合に効果的であることが明らかにされている。より急速に分裂する細胞は、より効果的に裸のプラスミドＤＮＡを取り込む。それゆえに、プラスミドＤＮＡで処理する前に、細胞分裂を刺激することは好都合である。微粒子銃による遺伝子移入も、インビトロ又はインビボ何れにおいても幹細胞へ遺伝子を移入するのに使用することができる。微粒子銃による遺伝子移入に関する基本的な手順は、「J.Wolff in Gene Therapeutics (1994), page 195」に記載されている。同様に、微粒子を注入する手法は、既に開示されており、方法は当業者には公知である。シグナルペプチドをプラスミドＤＮＡに付加してＤＮＡを核に方向付けることにより、更に効率的な発現が可能となる。
【０１５２】
本発明の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの子孫細胞を遺伝的に改変するためにウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターを用いて、上記の物理的な方法による場合と同様に、例えば、１つ又はそれ以上の標的遺伝子、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子又はリボザイム配列を細胞へ送達する。ウイルスベクター及び細胞へＤＮＡを送達するためにそれらを使用する方法は、当業者には周知である。本発明の細胞を遺伝的に改変するのに使用可能なウイルスベクターの例として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、アルファウイルスベクター（例えば、シンドビスベクター）及びヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０１５３】
本発明の生殖細胞系列幹細胞及びそれらの子孫細胞を遺伝的に改変するためのその他の方法として、ペプチド又はタンパク質のトランスフェクションが用いられる。限定はされないが、Ｐｅｐ−１（ＣｈａｒｉｏｔＴＭとして商業的に入手可能）及びＭＰＧを含むがペプチドは、約６０％から約９５％の効率で生物学的に活性なタンパク質、ペプチド、抗体及び核酸を細胞に直接、迅速かつ効率的に輸送することができる（Morris, M.C. et al., (2001) Nat. Biotech. 19:1173-1176）。理論に縛られることを望むものではないが、ペプチドは、目的の巨大分子（すなわち、タンパク質、核酸）と非共有結合を形成する。結合反応はタンパク質を安定化させ、その分解を防止する。本発明の幹細胞等の目的の細胞へ送達されると、ペプチド−巨大分子複合体は解離し、巨大分子は生物学的に活性な状態を維持して標的のオルガネラへ進む。送達は、血清の存在下又は非在下で行われる。取り込み及び送達を４℃で行うことにより、侵入してくる巨大分子に対するエンドゾームでのプロセッシングを排除できる。エンドゾーム経路を介した巨大分子の移動は、取り込み時の巨大分子を修飾できる。Ｐｅｐ−１等のペプチドは、目的のタンパク質、抗体又はペプチドを直接送達することにより、転写−翻訳過程を回避する。
【０１５４】
本発明の方法は、体細胞核移植等のエクスビボ手順で使用する卵母細胞の貯蔵を提供する。核移植前に、組換え手法を使用すれば、カスタマイズされた卵母細胞の設計が可能となり、最終的に胚性幹細胞を派生することが可能な胚を産生する。更に、核移植前にドナーＤＮＡを遺伝的に操作すれば、望ましい修飾又は遺伝的な形質を有する胚を生じさせることが可能である。
【０１５５】
体細胞核移植の方法は、当該技術分野に於いては周知である。２００４年３月２４日に出願され第２００５００６４５８６号として公報発行された米国特許出願第１０／４９４０７４号、「Wilmut et al. (1997) Nature, 385, 810-813」、「Wakayama et al. (1998) Nature 394:369-374」及び「Teruhiko et al., (1999) PNAS 96:14984-14989」を参照されたい。核移植は、ドナー細胞又は細胞核を除核された卵母細胞へ移植することを含む。卵母細胞の除核は、当業者に周知の多数の方法で実施することができる。再構成（reconstituted）された細胞を形成するために、除核された卵母細胞へのドナー細胞又は核の挿入は、通常、融合する前に透明帯の下にドナー細胞へマイクロインジェクションすることにより実施する。融合は、接触／融合面を超えてＤＣ電気的なパルスを適用すること（電気融合）により、ポリエチレングリコール等の融合を促進する化学物質に細胞を曝すことにより、又はセンダイウイルス等の不活性なウイルスの方法により誘導してもよい。再構成された細胞は、通常、核ドナーとレシピエント卵母細胞の融合前、融合中及び／又は融合後に、電気的な及び／又は非電気的な手段で活性化される。活性化の方法は、電気的なパルス、化学的に誘導された衝撃、精子の侵入、卵母細胞内の二価陽イオンレベルの上昇及び卵母細胞内に存在する細胞タンパク質のリン酸化の減少（キナーゼ阻害剤の方法によるように）を含む。活性化された再構成された細胞又は胚は、通常、当業者に周知の培地で培養し、その後動物胎内へ移入する。
【０１５６】
胚から胚性幹細胞を生成することに関する方法も、当該技術分野で周知である。「Evans et al. (1981) Nature, 29:154-156」、「Martinet al. (1981) PNAS, 78:7634-7638」、「Smith et al. (1987) Development Biology, 121:1-9」、「Notarianni et al. (1991) J. Reprod. Fert., Suppl. 43:255-260」、「ChenRL et al. (1997) Biology of Reproduction, 57(4):756-764」、「Wianny et al. (1999) Theriogenology, 52(2):195-212」、「Stekelenburg-Hamers et al. (1995) Mol. Reprod. 40:444-454」、「Thomson et al. (1995)PNAS, 92(17): 7844-8」及び「Thomson (1998) Science, 282(6):1145-1147」を参照されたい。従って、望ましい遺伝的形質を有する胚を産生するために、受精前にインビトロで卵母細胞の操作をするか、又は、除核された卵母細胞へ核移入する前にドナーＤＮＡを操作することにより、本発明の卵母細胞から産生された胚を遺伝的に修飾することができる。
【０１５７】
ＶＩＩ．インビトロ受精
本明細書に記載されるように、本発明の雌性の生殖細胞系列幹細胞から、又は本発明の雌性の生殖細胞系列幹細胞由来の前駆体から生じる卵母細胞も、インビトロ受精の方法に使用することができる。従って、本発明は、対象である雌のインビトロ受精に関する方法を提供する。本発明は、
雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆体を、卵母細胞への分化剤の存在下で培養することによって卵母細胞を産生するか、又は雌性の生殖細胞系列幹細胞又はその前駆体をインビボにて分化させるかのどちらかを実施して、卵母細胞を得ること、
前記卵母細胞をインビトロで受精させて、接合体を形成すること、そして
前記接合体を対象となる雌の子宮に着床すること、
からなる工程を含む。
【０１５８】
インビトロ受精の方法は、当該技術分野で周知であり、今や急激に一般的なことになりつつある。男女のカップルは、彼らに特有の不妊の原因を診断するために、通常先ず検査される。これらは、パートナー両者に関する説明がつかない不妊から女性側（例えば、不規則な月経周期を伴う卵管閉塞を生じる子宮内膜症又は多嚢胞性の卵巣疾患）又は男性側（例えば、形態学的な異常を伴う精子数の低下、又は、脊髄周辺の病変、逆行性射精又は精管切除後再疎通を伴うことによる正常な射精が不可能であること）の重篤な問題にまで及ぶかもしれない。これらの検査結果からも、カップル毎に特異的な施術手順が決定される。
【０１５９】
手順は、しばしば、視床下部／下垂体系を負に制御する薬剤（ＬＨＲＨ作用剤）の投与から始められる。この工程はゴナドトロピンの血清濃度を減少させるので、発生している卵巣の卵胞が退化し、それにより発生のより初期の段階に一組の新しい卵胞を提供する。これは、視床下部−下垂体軸による影響の非存在下で外因性のゴナドトロピンを投与することによって、新たな卵胞の成熟をより的確にコントロールできる。成熟の進行と成長過程の卵胞の数（通常卵巣当たり４から１０個刺激される）は、超音波及び血清エストラジオールの測定を用いた日々の観察によってモニターされる。当該卵胞が排卵前の大きさ（１８〜２１ｍｍ）に達し、エストラジオール濃度の直線的な上昇が継続している時に、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を外部から投与することによって排卵性の応答が開始される。
【０１６０】
本明細書で上に記載したように、卵母細胞は、生殖細胞系列幹細胞から又は生殖細胞系列幹細胞由来の前駆体から得ることができる。生殖細胞系列幹細胞又は生殖細胞系列幹細胞由来の前駆細胞は、卵母細胞への分化を誘導する卵母細胞分化剤の存在下で、培養することができる。分化剤は、外因的に（例えば、培養培地に添加することで）、又は自系の又は異種の卵巣組織と共培養中に内因性の供給源から供給することができる。本発明の雌性の生殖細胞系列幹細胞は、分化剤が外因性又は内因性に供給され、組織操作された構造体と共に培養され、卵母細胞を得る。
【０１６１】
個々の卵母細胞を、形態学的に評価し、培養培地及び熱で不活化された血清を含むペトリ皿へ移す。精液サンプルは、雄のパートナーから提供され、最も活発な、運動性の精子が精子注入のために得られるように「ｓｗｉｍ  ｕｐ」手順を使用して処理する。雌に卵管が存在するならば、ＧＩＦＴ（配偶子卵管内移入）と呼ばれる手順をこの段階で実施することができる。このアプローチにより、精子で囲まれた卵母細胞−卵丘複合体が腹腔鏡手術により直接、卵管に置かれる。この手順は、正常な一連の現象を最も活性化させるものであり、卵管内での受精を可能にする。驚くべきことではないが、ＧＩＦＴは、１９９０年に卵細胞回収（ova retrieval）により出産した３７５０患者のうち２２％という最も高い成功率を有している。代替法としてのＺＩＦＴ（接合体卵管内移入）は、卵細胞回収（ova retrieval）の翌日に、インビトロで受精された接合体のうち選択されたものを、卵管へ移植する。余分な接合体は、将来の移植のため又は雌性の配偶子を持てないカップルに提供するためにこの段階で凍結保存することができる。しかしながら、より深刻な不妊の問題を抱える多くの患者は、初期の卵割期にある前胚を子宮への移入のために選択することができるように、培養で更に１日から２日のインキュベーションする必要がある。このＩＶＦ−ＵＴ（インビトロ受精子宮移入）は、２〜６細胞（２日目）又は８〜１６細胞（３日目）のいくつかの前胚を子宮の基底へ経頸管的に移入することを必要とする（４〜５前胚が最適な成功を提供する）。
【０１６２】
インビトロ受精のための手順は、米国特許第６，６１０，５４３号、第６，５８５，９８２号、第６，５４４，１６６号、第６，３５２，９９７号、第６，２８１，０１３号、第６，１９６，９６５号、第６，１３０，０８６号、第６，１１０，７４１号、第６，０４０，３４０号、第６，０１１，０１５号、第６，０１０，４４８号、第５，９６１，４４４号、第５，８８２，９２８号、第５，８２７，１７４号、第５，７６０，０２４号、第５，７４４，３６６号、第５，６３５，３６６号、第５，６９１，１９４号、第５，６２７，０６６号、第５，５６３，０５９号、第５，５４１，０８１号、第５，５３８，９４８号、第５，５３２，１５５号、第５，５１２，４７６号、第５，３６０，３８９号、第５，２９６，３７５号、第５，１６０，３１２号、第５，１４７，３１５号、第５，０８４，００４号、第４，９０２，２８６号、第４，８６５，５８９号、第４，８４６，７８５号、第４，８４５，０７７号、第４，８３２，６８１号、第４，７９０，８１４号、第４，７２５，５７９号、第４，７０１，１６１号、第４，６５４，０２５号、第４，６４２，０９４号、第４，５８９，４０２号、第４，３３９，４３４号、第４，３２６，５０５号、第４，１９３，３９２号、第４，０６２，９４２号及び第３，８５４，４７０号にも記載されているが、これらの手順に関する記載を参照してその内容を特に本明細書に取り込む。
以下の例は、説明の目的にのみ記載されており、発明者等が発明とみなしている範囲を何ら制限するものではない。
実施例
【実施例１】
【０１６３】
出生後卵巣生殖細胞動態
雌性のマウス卵巣の健常（非閉鎖）及び退化（閉鎖）卵胞の数が、雌性の哺乳動物の生殖細胞動態を評価するために数えられた。特に、新しい卵母細胞の産生がない状態で卵母細胞（すなわち卵胞）貯蔵の消耗が発生する推定年齢を決定するために、退化速度が計算された。
【０１６４】
ＡＫＲ／Ｊマウスはジャクソン・ラボラトリから得たが、年齢特異的又は時期限定妊娠の野生型Ｃ５７ＢＬ／６及びＣＤ１雌性マウスは、チャールズリバーラボラトリから得た。卵巣は、０．３４Ｎの氷酢酸、１０％のホルマリン及び２８％のエタノール中で固定し、パラフィン包埋し、連続的に切片化（８μｍ）した。切片は、顕微鏡ガラススライド上に順に並べ、ヘマトキシリン及びピクリン酸メチルブルーで染色した。その後、非閉鎖又は閉鎖の原始（primordial）、一次（primary）、及び前卵胞（preantral）の卵胞の数を決定した。原始卵胞（primordial follicle）は、単一層の平らな顆粒膜細胞に囲まれたコンパクトな卵母細胞を持つものとして同定され、また一次卵胞（primary follicle）は、単一層の立方形の顆粒膜細胞に囲まれ肥大した卵母細胞を持つものとして同定された。中間期の卵胞（平らな顆粒膜細胞と立方形の顆粒膜細胞が混在する単一層を有しているコンパクトな又は肥大した卵母細胞）は、一次（primary）としてカウントした。前卵胞（preantral follicles）は、少なくとも部分的又は完全な第二の層の立方形の顆粒膜細胞により囲まれて肥大した卵母細胞を持つものとして同定されたが、４つの完全な立方形の顆粒膜細胞の層に囲まれるまでには至っていない。
【０１６５】
はっきり見える核を持つ卵母細胞を含む卵胞だけをカウントした。発達の原始、一次及び前卵胞（未成熟）段階の卵胞は、もしその卵母細胞が退化している（入り組んでいる（convoluted）、凝縮している（condensed））又は断片化されている場合は、閉鎖としてカウントした。卵母細胞の残遺物を欠いているひどく閉鎖した卵胞は、解析に含めなかった。この手順が全卵巣容積の５分の１を試料とする場合、卵巣（健常又は閉鎖）当たりの全卵胞数は、それぞれの卵巣の累積カウント数に補正因子の５を掛けることにより評価した（Zuckerman, S. (1951) Recent Prog. Horm. Res. 6: 63-108; Tilly, J. L. (2003). Reprod. Biol. Endocrinol. 1:1-11）。盲検状態で単一の訓練された卵巣組織研究者がすべての数を数え、グループの他の二人のメンバーが、データの正確さと再現性を検証するために、周期的にランダム試料を評価した。
【０１６６】
非閉鎖の休止状態（原始）及び一次発達中（一次、前卵胞）の卵胞数の解析は、マウスにおける卵胞発達についての以前の研究と一致して、未成熟卵胞の最大数の約３分の１が、若年の成熟体に発達する過程（図１ａ参照）で失われた。最初の２０日齢を通して、閉鎖現象が、低いが一定の速度で発生する（図１ｂ）が、この期間には非閉鎖卵胞数も比例して減少する（図１ａ）。しかしながら閉鎖現象の発生は、３０日まで顕著に、更に４０日まで増大し、生殖可能な状態がよく維持される４２日目に、卵巣当たり１２００個以上の卵胞が死ぬという最大レベルに達した（図１ｂ）。
【０１６７】
インビボにおけるアポトーシス細胞の一掃が、３〜１８時間以内に起こる（Wyllie, A. H. et al, (1980) Int. Rev. Cytol. 68: 251-306; Iijiri, K. and Potten, C. S. (1983) Br. J. Cancer 47: 175-185; Bursch, W. et al, (1990) Carcinogenesis 11: 847-853）。それでもなお、成熟動物に観察される大きな閉鎖卵胞集団が、より早い週に退化していた卵胞内の卵母細胞の残骸の蓄積を単に表しているという可能性を除去するために、実験を実施した。莫大なレベルの卵母細胞アポトーシスが、卵胞形成と同時に新生児マウス卵巣で起きていることを証明している過去の研究に基づいて、最初の実験は、４日目の退化卵母細胞の数と比較して、分娩後１〜４日の非閉鎖の卵母細胞の数の変化を評価した。１日目に卵巣当たり８０００個以上の非閉鎖の卵母細胞が存在し、このプールは４日目にほぼ５０％に減少した。しかしながら、卵巣当たり２１８個の退化卵母細胞だけが４日目に見出されていることは、３０００個以上の卵母細胞が死に、それらが分娩後１〜４日に卵巣から一掃されたことを示唆している。表２は、発達期の退化及び新生児マウス卵巣中の卵母細胞の一掃を測定したデータを含む。
【０１６８】
【表２】
2007537754.tif 000003
【０１６９】
退化卵母細胞の一掃速度を評価するための第２のアプローチを、原始及び一次卵胞の閉鎖を同調させる化学物質９，１０−ジメチルベンズ［ａ］アントラセン（ＤＭＢＡ）を用いて実施した。過去の研究では、発達期の卵母細胞死と形態学的に類似する様式で、ＤＭＢＡが未成熟卵母細胞の退化を誘導することを示している。これらの実験のために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、分娩後２５日目に対照媒体（Vehicle）（コーン油）又はＤＭＢＡ（体重ｋｇ当たり８０ｍｇ；コーン油中に再縣濁）を単回腹腔内注入され、注入前及び注入後２４時間間隔で９６時間後まで、卵巣が回収された。ＤＭＢＡを単回注入された雌性のマウスでは、卵胞閉鎖の発生は注入後２４〜４８時間に顕著に増大し、注入後４８〜７２時間は卵巣当たり約８５０個の閉鎖卵胞のレベルで維持された（図１ｃ）。注入後９６時間まで、卵巣に残存する健常な原始又は一次卵胞は無かった（図１ｃ）。従って、出生後１〜４日での退化卵母細胞の一掃の速度と同様に、ＤＭＢＡで誘発された閉鎖の同調作用で、原始及び一次卵胞内に含まれていた３５００個以上の卵母細胞が、アポトーシスを開始し、３日間の間に卵巣から一掃されたことが明らかになった。
【０１７０】
未成熟卵胞プールの１％（８、１２、２０日目）から、１６％（４０日目）程度又はそれ以上（３３％、４２日目；図１ｄ参照）が、正常条件下の何れの時点においても退化しているという発見により、若年成熟体までに蓄積された卵胞の完全な消耗が予想されるであろう。しかしながら、非閉鎖の卵胞プールは、１２日目の最高レベルから、４０日目までに３６％だけが減少した（図１ａ）。このことは、非閉鎖の卵胞数の変化を評価して決定された、出生後の寿命とされる間の卵胞枯渇速度が、同じ時間枠内の閉鎖によって卵巣から実際に除去される卵胞の数と全く釣り合わないことを示している。
【０１７１】
これらの知見がＣ５７ＢＬ／６マウスのみに関連した現象ではないことを確認するために、誕生から成熟体になるまでの卵胞数の変化を、他の系統のマウスで分析し、Ｃ５７ＢＬ／６雌性マウスの対応データと比較した。ＣＤ１マウスにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６雌性マウスでの観察に比べて、閉鎖の発生率が比較的高いにもかかわらず、非閉鎖の卵胞プールが分娩後４〜４２日で４％しか減少しなかった（図１ｄ）。ＡＫＲ／Ｊマウスの非閉鎖の卵胞集団は、この場合も閉鎖の発生率が顕著にもかかわらず、４日目よりも４２日目で２０％大きかった（図１ｄ）。これらのデータから、出生後の哺乳動物の卵巣における非閉鎖の卵胞数の変化と対応する閉鎖の発生率の間には、明確な不一致があることが明らかになった。
【０１７２】
同様の研究を、赤毛猿においても実施した。以前の解析では、出生後の卵母細胞の喪失は単純な指数関数的減衰である、と説明されてきた（Olesen, C. et al, (2004) Mol. Reprod. Dev. 67(1): 116-26）。ある期間後の卵母細胞の喪失は、次の式を用いて推定されてきた：ｔｎ＝ａ（１−ｒ）ｎ；ここでｔｎ＝ｎの期間後に残存する卵母細胞の計算値であり、死んでいく卵胞の一定の割合は、ｒで表される。赤毛猿の卵巣における健常及び死んでいる卵胞の数を用いてこの式を適用すると、霊長類の出生後新しい卵胞が形成されないという考えと一致しなかった。むしろ、これらのデータは、雌性の霊長類は、雌性マウスと同様、青年期及び成熟期に、新しい卵母細胞を産生するに違いないことを主張している。
【０１７３】
青年期及び成熟した雌性の赤毛猿由来卵巣を用いて、Ｖｅｒｎａｎｄｅ−Ｖａｎ  Ｅｃｋにより、卵巣から死んでいる卵母細胞を一掃する速度（１４日が最大）と、あらゆる時期の死んでいる卵母細胞の割合（４．５％）の両方を測定した。これらの値を用いると、卵母細胞の指数関数的崩壊は、２年間だけの間に卵母細胞プールのおよそ９５％減少となる（図２参照）。死んでいる卵胞の発生率は、幼少期及び成熟期の両方で安定していた。このように、そのような崩壊が開始される年齢に関わらず、赤毛猿の卵巣はたった２年の間に閉経状態に入る危険性を示している。しかしながら、赤毛猿の卵巣は思春期の始まり（およそ４歳年齢で）から閉経開始の前の約２０年、機能することが知られている（Schramm, R. D. et al, (2002) Hum. Reprod. 17: 1597-1603）。しかし、指数関数的崩壊曲線で与えられたＶｅｒｍａｎｄｅ  Ｖａｎ−Ｅｃｋのパラメータを７．７年に見積もると、６個だけの卵母細胞が残存することになる。
【０１７４】
マウスで行われた実験と同様、赤毛猿での知見は、雌性の霊長類の出生時の卵母細胞プールが固定されるという概念と一致しない。本明細書に記述したモデルは、出生後の卵巣の卵胞が再生を続けるというメカニズムを示す。
【実施例２】
【０１７５】
出生後の卵巣における減数分裂開始遺伝子及び幹細胞機能に関与する遺伝子の発現
出生後に卵胞形成のために卵母細胞を産生する生殖細胞が複製するには、減数分裂の開始に関わる遺伝子の発現を必要とするであろう。このように、シナプトネマ構造のタンパク質の軸側方要素の形成に必要な減数分裂の特異的タンパク質である、シナプトネマ構造のタンパク質３（ＳＣＰ３）の発現が、幼若期及び若年の成熟マウスの卵巣で検討された。４％中性ホルマリン緩衝液中で固定し、パラフィン包埋した後、６μｍ組織切片を卵巣から切り出し、スライド上にマウントした。これらの切片は、キシレンで脱蝋し、再水和し、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム中で電子レンジを用いて５分間煮沸した。
【０１７６】
その後、ＳＣＰ３に特異的な一次抗体を、供給業者の提案により、免疫組織化学的解析のために用いた。正常ロバ血清を、ブロッキングのためＴＮＫ溶液に用い、ヤギの抗ＳＣＰ３抗体（Walpita, D. et al, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 5622-5627; Russell, L. B. et al, (2000) Mutat. Res. 464: 201-212）の３００倍希釈液をその切片に適用し、続いて、ジアミノベンジジンを発色化の基質とするストレプトアビジン−パーオキシダーゼ系を用いて検出するために、ビオチン化のロバの抗ヤギＩｇＧ（Santa Cruz Biotechnology）を用いた。重要な色素により免疫反応シグナルがマスキングされるのを防ぐため、切片の顕微鏡写真を対比染色なしの状態でＨｏｆｆｍａｎ光学で撮影した。ＳＣＰ３の免疫組織化学的な局在は、個々の免疫反応性の細胞が卵巣表面に又は近傍にいることを明らかにした（図３ａ及び３ｂ）。ＳＣＰ３が、周産期の間に形成される卵母細胞の安定したタンパク質生成物として単純に持ち越されたという可能性は、未成熟卵胞内に含まれる卵母細胞が免疫反応性を示さないという知見によって排除される（図３ｃ及び３ｄ）。
【０１７７】
出生後卵巣のＳＣＰ３発現を、メッセンジャーＲＮＡレベルで確認し、また哺乳動物における減数分裂の開始に必要とされる、エンドヌクレアーゼＳＰＯ１１及びリコンビナーゼＤＭＣ１（図３ｅ）の両方も発現も確認した。更に、ｐｕｍ１、ｐｕｍ２、ヌクレオステミン及びｍｉｌｉのような、幹細胞機能に関連した遺伝子の発現レベルもまた検討した。ｐｉｗｉ及びｐｕｍｉｌｉｏによってコードされるＲＮＡ結合のタンパク質のように、卵巣における生殖細胞系列幹細胞機能の維持に中心的なものとして、オルソロガス遺伝子がショウジョウバエにおいて同定された（Lin, H. (1997) Annu. Rev. Genet. 31: 455-491; Spradling, A. H. et al, (2001) Nature 414: 98-104; Lin, H. (2002) Nature Rev. Genet. 3: 931-940）。C.エレガンスにおいては、ｐｉｗｉオルソログ（ｐｒｇ−１及びｐｒｇ−２）又はｐｕｍｉｌｉｏオルソログ（ｆｂｆ−１及びｆｂｆ−２）のいずれかの機能の喪失が、生殖細胞系列幹細胞を枯渇させ、ｐｉｗｉ（ｍｉｗｉ／ｈｉｗｉ及びｍｉｌｉ）及びｐｕｍｉｌｉｏ（ｐｕｍｉｌｉｏ−１及びｐｕｍｉｌｉｏ−２）の哺乳動物のオルソログが存在することが知られている（Cox, D. N. et al. (1998) Genes Dev. 12: 3715-3727; Crittenden, S. L. et al. (2002) Nature 417: 660-663; Kuramochi-Miyagawa, S. et al. (2001) Mech. Dev. 108: 121-133; Spassov, D. S. & Jurecic, R. (2002) Gene 299: 195-204）。
【０１７８】
それぞれの時点で回収された卵巣及び対照組織において、全ＲＮＡが抽出され、全ＲＮＡの１μｇを、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）した。２８周期のＰＣＲによる増幅が、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーセット（表３参照）を有するＴａｑポリメラーゼ及び緩衝液Ｄ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて実施した。リボソーム遺伝子Ｌ７は共増幅され、それぞれの試料の負荷対照として用いられ、２８周期は各実験のプライマーセットの増幅の線形範囲内にあることが分かった。
【０１７９】
【表３】
2007537754.tif 000004
【０１８０】
全てのＰＣＲ産物を単離し、サブクローン化し、そして確定のために配列解析した。プライマーセット当たり１本より多い増幅産物を示している試料において、各々のバンドを単離し、サブクローン化し、配列解析した。これらの付加的なバンドは、標的遺伝子のスプライスバリアントとして知られていることを確定した（すなわち、Ｄｍｃ−１／Ｄｍｃ−１ｄ；Ｓｐｏ１１ａ／Ｓｐｏ１１ｂ）。
【０１８１】
過去に実施した仕事で、生殖細胞におけるＳＣＰ３及びＤＭＣ１の発現は、減数分裂の接合期又は太糸期に限定されることを証明してきた。これらの段階は、卵母細胞に初めての減数分裂拘束が観察される後期複糸期より早い時期である。従って、ＳＣＰ３タンパク質のような前複糸期のｍＲＮＡ転写物の存在は、現に減数分裂で拘束される卵母細胞以外の細胞内の発現を反映する。ＳＣＰ３、ＳＰＯ１１及びＤＭＣ１の発現レベルは、成熟精巣に観察されるレベルの６％（ＳＰＯ１１及びＤＭＣ１）から２５％（ＳＣＰ３）の幅にあり（図３ｆ）、このことは、精巣における出生後の生殖細胞の毎日の産出が卵巣に対して推測される量をはるかに超えていると考えられ、重大である。３つの全ての減数分裂関連遺伝子の卵巣内発現は、年齢（日齢）と共に減衰し（図３ｅ）、これらの遺伝子発現は、生殖腺ではない組織においては、全く又は最小限にしか観察されなかった（図３ｇ）。
【０１８２】
出生後、幼若期及び成熟期の様々な時点でマウスから回収される卵巣の解析では、年齢（日齢）に関連した発現量の減衰を示しているｍｉｌｉと共に、ｍｉｌｉ、ｐｕｍｉｌｉｏ−１及びｐｕｍｉｌｉｏ−２の発現を明らかにした（図４）。更に、最近哺乳動物の幹細胞の再生に関与する遺伝子（Tsai, R. Y. L. and McKay, R. D. G. (2002) Genes Dev. 16: 2991-3003）、ヌクレオステミンの発現もまた、出生後、幼若期及び成熟期のマウス卵巣にて同定した（図４）。
【実施例３】
【０１８３】
出生後の卵巣の卵胞再生
出生後の卵胞プールの補充に関する生殖細胞の増殖の重要性が、雄性のマウスの精原幹細胞の特定化に広く用いられる生殖細胞の毒性物質である、ブスルファンの使用により更に確かめた。精巣において、ブスルファンは減数分裂後の生殖細胞を標的にしないが、生殖細胞系列幹細胞及び精原細胞を特異的に標的にし、精子形成不全をもたらす。生殖細胞増殖が停止した後に子宮内でブスルファンに曝された雌性マウスは、対照媒体（Vehicle)に曝されたマウス卵巣と組織学的かつ機能的に同様の卵巣を持って生まれてくるが、当該化学物質を胎児の卵巣の生殖細胞増殖期に与えた場合のみ、子宮内で曝された雌性ネズミは、ブスルファンに応答して同様の配偶子形成不全を示す。
【０１８４】
雌性マウスは、対照媒体（ＤＭＳＯ）又はブスルファン（２０ｍｇ／ｋｇ体重；ＤＭＳＯ中に懸濁）を分娩後２５日目、そして３５日目に再び注入され、２回目の注入後の１０日目にで非閉鎖の原始卵胞数の変化を分析するために卵巣を回収した。ブスルファン処置された雌性マウスの卵巣は、実験開始後２０日の対照媒体処置した対照に存在する原始卵胞プールの５％より少ない量しか保持していなかった（図５ａ）。しかしながら、ブスルファンに曝された卵巣は、その他の点では、排卵の兆候を示す黄体同様、非退化卵母細胞を持つ健常成熟中の卵胞の存在することを含めて、正常な組織学的外見を保持していた（図５ｂ〜５ｅ）。
【０１８５】
ブスルファン処置された雌性マウスに観察される原始卵胞の喪失が、存在する卵母細胞に対する毒性の結果かどうかを確認するため、上記のブスルファン投与計画の間及びその後の多数の時点で、雌性マウスから卵巣を回収し、原始卵胞の閉鎖の発生について分析した。ブスルファンは、最初の注入後５日目で卵巣当たり４６個だけの閉鎖のレベルを示し、その後すぐに基礎レベルに減衰させて、閉鎖の原始卵胞の数を少しの間一過的に増大させた（図５ａ、差込図）。ブスルファンに対するこの比較的軽微で急性な閉鎖性の応答は、対照媒体を処置した対照と比較して２０００個を超える原始卵胞がブスルファンに曝された卵巣に存在しないことを考えると、無視してもよいものあった（図５ａ）。これらのデータから、増殖性の生殖細胞が出生後の卵巣内に生き残るだけでなく、卵胞プールが日常的に再生されることが必要であるという考え方が強化された。
【０１８６】
出生後のマウス卵巣の原始卵胞の再生速度を決定するために、これらの結果を雌性マウスの卵胞成熟化の速度論についての過去の研究に照らして評価した。以前の分析では、分娩後１４〜４２日に、退化又は発達の一次段階の増殖活性化のいずれかのため、原始卵胞プールが平均一日当たり８９卵胞減少することが示された（Faddy, M. J. et al, Cell Tissue Kinet. (1987) 20: 551-560）。本明細書に述べられる比較可能な時期において（分娩後１６〜４０日；図１ａ参照）、この死の速度では、原始卵胞集団で２４日間掛けて２１３６個の卵胞が減弱すると予想される。しかしながら、原始卵胞の数は、分娩後１６〜４０日に２９４個しか減弱しなかった（図１ａ）。
【０１８７】
これら２つの値の違い、すなわち１８４２個の原始卵胞は、この２４日間での原始卵胞の再生速度を表しており、卵巣当たり１日に平均７７個の新しい原始卵胞を産生していることになる。この計算によれば、１日当たりの原始卵胞の枯渇速度は、以前の解析で与えられた１日当たりの死の速度（８９個の卵胞）と、１日当たりの再生速度（７７個の卵胞）との差異であるはずで、１日当たり卵巣当たり１２個の原始卵胞のネット損失となるはずである。この値を用いると、原始卵胞プールは、分娩後１６日と４０日の間で総計２８８個の卵胞の減弱となると予想され、この値は１６日対４０日で比較される非閉鎖原始卵胞の実際のカウントに由来する数（２３３４対２０４０で、すなわちネットで２９４個の原始卵胞の損失；図１ａ）にとても近い数である。
【０１８８】
このように、合わせて考えると、ブスルファン処置は、３週間内に雌性マウスの休止（原始）卵母細胞プールの９５％の減少を引き起こすが、この効果は原始卵母細胞プールの閉鎖を促進することによるものではない。
原始卵胞の成長活性化を誘発するブスルファンに関しての文献はなく、そのような結果の形態学的証拠は観察されていないが、その期間の（成長が活性化された）一次卵胞の数を決定して、その期間での一次卵胞に対する原始卵胞の平均的な比率を計算した。ブスルファン及び対照媒体処置の間では、一次卵胞に対する原始の比率に有意な変化は見られなかった（図６）。このことは、ブスルファン処置が卵胞の成長活性化を増加させることによって原始プールを減少させた、のではないことを示している。これらのデータは更に、卵巣内の卵母細胞の産生に対する生殖細胞系列幹細胞の支援をブスルファンが特異的に激減させ、その結果、卵母細胞又は卵胞の再生のない状態で原始卵胞プールの段階的な喪失をもたらした、という結論を支持している。
【０１８９】
ヒトの女性の卵巣機能に対する長期間の抗がん治療の結果もまた、研究されている。ブスルファンを含む化学療法計画は、組み合わせ療法において用いられるほかの薬物に関係なく、結果として、ほぼ全てに前成熟卵巣障害（ＰＯＦ）の発生をもたらす。例えば、３つの研究から合わせた臨床データは、ブスルファンを含む化学療法計画で治療された２１人中２０人の思春期の女子（平均年齢＝１１．５歳）は、ＰＯＦを指標とする性腺機能低下症を経験したことを示し、一方、ブスルファンを欠く比較されうる治療では、３７人中２２人の女子（平均年齢＝８．７歳）だけにＰＯＦを引き起こした（Thibaud, E. et al, (1998) Bone Marrow Transplant. 21: 287-290; Teinturier, C. et al, (1998) Bone Marrow Transplant. 22: 989-994; Afify, Z. et al, (2000) Bone Marrow Transplant 25: 1087-1092）。同様に、組み合わせ療法においてブスルファンで治療された思春期の女子４人中４人は、ホルモン交換を必要とする卵巣障害を示した（Legault, L. and Bonny, Y. (1999) Pediatric Transplant 3: 60-66）。他の研究においては、１６〜４０歳の女性（中央値年齢＝３０歳）におけるブスルファン治療は、１９例中１９例にＰＯＦを引き起こした（Sanders J. E. et al, (1996) Blood 87 3045-3052）。更には、ブスルファンとシクロホスファミドの組み合わせ療法が、シクロホスファミド単独と比較された研究において、両方の薬剤を治療された７３患者中７２人（１４〜５７歳、中央値＝３８歳）がＰＯＦを示したのに対し、シクロホスファミド単独では１０３患者中４７人（１３〜５８歳、中央値＝２８歳）にＰＯＦをもたらしただけであった（Grigg, A. P. et al, (2000) Bone Marrow Transplant 26: 1089-1095）。
【０１９０】
ブスルファンに対する曝露は、１１７患者中１１５人にＰＯＦをもたらした。一方、ブスルファンを欠く比較可能な化学療法治療では、１４０例中６９例しかＰＯＦを伴わなかった。ブスルファン治療は、雌性マウスにおけるブスルファンを用いた知見に基づくと、卵母細胞の喪失（死）を加速することによりヒトにＰＯＦを引き起こすかもしれないが、これらのブスルファンを用いた臨床試験結果はまた、ヒト雌性の生殖細胞系列幹細胞の不可逆的な破壊がＰＯＦをもたらすことを示している。
【０１９１】
哺乳動物の雌性の生殖細胞系列幹細胞の存在は、制御された様式で休止（原始）卵母細胞を含む卵胞の産生又は再産生、その結果として新しい備蓄をする卵巣の生来の能力を意味する。この問題を直接解明するために、成熟の雌性マウスは、卵母細胞死を同調するドキソルビシンを注入され（Perez, G. I. et al, (1997) Nature Med. 3, 1228-32）、そして生殖細胞動態を評価するために、薬物曝露後に複数の間隔で卵巣を回収した。予想したように、原始及び早期に成育している卵胞（卵母細胞）の急激で大規模な喪失が、ドキソルビシン処置後の最初の２４時間以内に起きた（図７ａ、ｂ）。しかしながら、原始及び全未成熟卵胞プールの両方の自発的な再生産は、処置後２４〜３６時間に観察され、卵母細胞を含む未成熟卵胞の数は、その後安定していた（図７ａ、ｂ）。
【０１９２】
成熟哺乳動物の卵巣が新規の卵母細胞を十分に産生できることを更に示すために、ヒストン脱アセチル化阻害が造血幹細胞を急激に増大させることを示す最近の報告（Milhem, M. et al. (2004) Blood 103, 4102-4110）をベースとして用い、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）活性のインビボでの強烈な抑制が、同様に生殖細胞系列幹細胞機能を促進するかどうかをテストした。思春期前の雌性マウスは、広い範囲のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ；１０ｍｇ／ｋｇ・体重、ＤＭＳＯ中に再懸濁）又は対照媒体（ＤＭＳＯ）を、単回腹腔内投与された。動物は投与後２４時間で犠牲にされ、卵巣の組織学的調製が準備され、標準的な研究室の手順により卵母細胞を含む卵胞が数えられた（実施例１参照）。ＴＳＡ処置では、対照媒体処置された対照マウスの卵巣と比較して、卵巣当たり全健常の未成熟卵母細胞を含む卵胞の数を５３％増大させた。休止（原始）卵胞プールを４２％増加させただけでなく、早期に成育している（一次の）卵胞の数も増大させた（図７ｃ）。
【０１９３】
ＴＳＡでの処置は、成熟卵胞の喪失（死又は閉鎖）の発生を減少、又は生殖細胞系列幹細胞による新しい卵母細胞及び卵胞産生を増大させた。未処置の１３日齢マウスの未成熟卵胞閉鎖の平均的基準レベルは１６±４個（ｎ＝４）であるので、閉鎖速度の減少は、健常の未成熟卵胞の大きな増加（１６００個以上）を説明できない。新しい卵母細胞の産生無しには、原始卵母細胞を含む卵胞数を増加させることは不可能である。特に、新しい卵母細胞の産生が起こらないならば、一次卵胞の増加分がそれらの源、すなわち原始卵胞の数から差し引かれなければならない。原始卵胞の数は減少しないで代わりに増大するので、ＴＳＡ曝露後の卵母細胞又は卵胞の数が劇的に増加することに対する唯一の説明は、生殖細胞系列幹細胞から未成熟卵母細胞が有意に新しく産生することである。
【０１９４】
ＴＳＡが２４０日齢の雌性マウスにおける原始卵胞数を２４時間以内に８９％まで増加させるという、かなり注目に値する結果が、成熟体で得られた。観察された増加は、発達の一次段階に対する原始卵胞の増殖活性化の比率が減少する（図７ｃ、ｄ）、又は閉鎖発生率が減少する（図７ｅ）の何れの原因にもならないことから、これらのデータは、卵母細胞産生及び卵胞形成が哺乳動物の雌性個体の成熟期の間持続するという、追加の証拠を提供する。
【実施例４】
【０１９５】
出生後卵巣の卵胞形成の証拠
ＧＦＰを普遍的に発現する遺伝子導入のマウス（ジャクソン・ラボラトリから得られた、ストレインＳＴＯＣＫ  ＴｇＮ（ＧＦＰＵ）５Ｎａｇｙ）が、出生後に進行中の卵胞形成に対する追加の証拠を提供するために用いた。ＧＦＰを普遍的に発現するヘテロ接合性の遺伝子導入の雄性及び雌性マウスは、滑液嚢内の卵巣移植のための野生型及び遺伝子導入の雌性の子孫マウスを産生するために交配させた。簡潔には、若年の成熟（分娩後５８〜６９日）の遺伝子導入の雌性マウスを、麻酔処置し（アバーチン、２００ｍｇ／ｋｇ、静脈内）、背側の切開を通して各々のマウスの２つの卵巣のうちのひとつが曝された。各々の動物に対し、門部に近い嚢側部の卵巣に小さな穴をカットし、移植の準備のため宿主卵巣のほぼ半分を取り除いた。
【０１９６】
ドナー（野生型の同腹子）の雌性マウスから回収された卵巣を等分し、野生型卵巣の半分を遺伝子導入のレシピエントの嚢腔内に残存する宿主の卵巣組織に接触して置いた。生殖器官をその後、腹腔内に収め、切開部を閉じた。６匹の遺伝子導入の宿主は全てこの実験に用いられ、そのうち４匹は片側に野生型卵巣移植を受け、残る２匹は両側に野生型卵巣移植を受けた。外科手術後の３〜４週間に、卵巣組織を取り除き、ＧＦＰの可視化のために、ヨウ化プロピジウムによる対比染色後、共焦点レーザー顕微鏡により加工した。移植された卵巣断片は、総合的な視覚検査で、血管新生及び宿主の卵巣組織へ接着していることの証拠を示した（図８）。共焦点顕微鏡解析は、宿主の卵巣組織の卵胞に囲まれた卵母細胞と区別できない野生型卵巣断片内に、卵胞に囲まれたＧＦＰ陽性の卵母細胞があることを明らかにした（図９及び１０）。更には、移植片にＧＦＰ陽性の卵母細胞を封入する顆粒膜細胞は、ＧＦＰ陰性であり、そして遺伝子導入の生殖細胞が移植組織に浸透し、移植の野生型の体細胞と共に卵胞産生を開始したことを示している。
【０１９７】
幼若期及び成熟期に新しい原始卵胞を追加するのを維持するため、マウス卵巣は非対称に分裂する生殖系列幹細胞の小さなプールか、又は対称に分裂後、卵母細胞を産生する、非再生の前減数分裂の生殖細胞の大きなプールのいずれかを保持していなければならない。分娩後３０日における組織形態学的な研究は、非対称分裂する生殖細胞の小さなプールに対して推定される数字に近い、卵巣当たり６３±８個（平均±標準誤差、ｎ＝４匹マウス）のそのような細胞が存在することを明らかにした。
【実施例５】
【０１９８】
遺伝子導入のマウスモデルにおける卵母細胞の動態
Ｂａｘノックアウトマウスにおける卵母細胞の動態解析の公表されたデータ（Perez et al., (1999) Nature Genetics 21: 200-203）、及びカスパーゼ−６ノックアウトマウスの未公開の最新のデータを再評価し、本明細書に挙げられた出生後の卵母細胞の卵胞産生を実証する観点から結果を比較した。本明細書に示されたデータは、生殖細胞系列幹細胞の機能の追加的な証拠を示し、生殖細胞系列幹細胞が新しい卵母細胞を産生することに対するこれらのアポトーシス制御遺伝子のノックアウトマウスの効果を初めて明らかにした。卵巣の組織学的な調製を準備し、卵母細胞を含む卵胞を標準的な研究室の手順によりカウントした（Tilly, J. L. (2003) Reprod Biol Endocrinol 1:11；実施例１参照）。Ｂａｘタンパク質が、卵巣及び卵母細胞の体細胞内の重要なアポトーシス誘導分子であることが示される（Tilly, J. L. (1996) Rev Reprod 1: 162-172; Perez, G. I. et al., (1997) Nature Med. 3: 1228-1232）。
【０１９９】
Ｂａｘノックアウトマウスでは、２０〜２２月齢の野生型の対照において非閉鎖卵胞が実質的にゼロであるのと比べて、月齢が対応する雌性マウスの卵巣に２００〜３００個の非閉鎖卵胞が存在し、卵巣機能を大きく拡大することが示された。早期出生後（４日目）及び早期繁殖成熟期の未成熟卵胞数を比較するデータが、上記に示されている。早期卵母細胞の素質は、Ｂａｘ欠損及び野生型マウスの間で比較可能で、Ｂａｘ欠損マウスは４２日目で野生型より約２．５倍多い原始卵胞を、及び同様に一次卵胞数を有意に多く持っている（図１１）。４２日目のこれらマウスの閉鎖又は死んでいる原始卵胞の同時測定は、原始卵胞閉鎖の重大な減少を明らかにした。このようにＢａｘ欠損マウスは、野生型マウスと比べて、正常な数の原始卵胞を除去することができない。
【０２００】
カスパーゼ−６はまた、アポトーシス開始期に細胞内標的の構造を切断するタンパク質分解酵素として機能するアポトーシス誘導性分子である（Ruchaud, S. et al. (2002) EMBO J. 21: 1967-1977）。カスパーゼ−６のノックアウトマウスは、明白な表現型を示さない。しかしながら最近、４日目にほぼ同数の未成熟卵胞がカスパーゼ−６欠損卵巣及び野生型マウス卵巣にも存在するという、カスパーゼ−６欠損マウスがＢａｘ欠損マウスに類似した卵巣の表現型をもつことが実証された（図１２）。カスパーゼ−６欠損マウスはまた、生後４２日目に原始卵胞数の重大な増加及び全未成熟卵胞数の大きな増大を示す。しかしながら、未成熟卵胞の閉鎖を４２日目のこれらのマウスで測定したとき、Ｂａｘ欠損マウスとは異なり、カスパーゼ−６欠損マウスは、閉鎖の量に変化を示さない。閉鎖の量の減少が見られないので、カスパーゼ−６欠損マウスの卵胞数の増大に対しては、カスパーゼ−６欠損のために新しい卵母細胞の産生が増加する、との他の説明となる。カスパーゼ−６は、それゆえ、生殖細胞系列幹細胞のアポトーシス制御因子である。
【０２０１】
本明細書に示すように、Ｂａｘは卵母細胞死の制御因子である。原始卵胞閉鎖がＢａｘ欠損マウスで半分にしかならないこと、またＢａｘ欠損卵巣が野生型卵巣より１０から１４ヶ月ほど長く卵母細胞を含むことより、Ｂａｘは生殖細胞系列幹細胞のアポトーシスを制御する。対照的に、カスパーゼ−６は直接的に、生殖細胞系列幹細胞の機能／死を調節するように見えるが、卵母細胞死は調節しない。このように、カスパーゼ−６及びＢａｘは、卵母細胞前駆体の生殖細胞系列幹細胞のレベルでの卵母細胞産生の調節因子である。インビボでキーとなるアポトーシス調節因子の機能を調節することにより、生殖細胞系列幹細胞の機能を調節することは、このように哺乳動物の卵巣機能の拡大のために重要な方法である。
【０２０２】
更に出生後の雌性の生殖細胞系列幹細胞の存在を実証するために、野生型マウスの卵巣を、毛細血管拡張性運動失調症変異（Ａｔｍ）遺伝子欠損マウスの卵巣と比較した。Ａｔｍ欠損雄性及び雌性マウスは、成熟配偶子、例えば、精子及び卵母細胞の産生の完全な欠如のため、不妊であることが示されていた（Barlow, C. et al. (1996) Cell 86: 159-171）。Ａｔｍ欠損は、レプトテン期と同じ早い時期に検出され、発達中の配偶子のアポトーシスを増加させ（Barlow, C. et al. (1998) Development 125: 4007-17）、それにより全配偶子の欠如となる、減数分裂の一次段階で異常をもたらすことが示された。Ａｔｍ欠損の雌性マウスの卵巣は、１１日齢で卵母細胞及び卵胞の完全な不妊であることが示された（Barlow, C. et al. (1998) Development 125: 4007-17）。
【０２０３】
分娩後４日目の野生型（図１３Ａ、Ｃに拡大図）及びＡｔｍ欠損（図１３Ｂ、Ｄ）の卵巣の代表的な組織を、図１３に示した。このように、もし全ての卵母細胞の産生が出生前に起き、そして誕生時に原始卵胞内の複糸期卵母細胞のプールが固定され、そしてＡｔｍ欠損の結果として卵母細胞の完全な欠如になるならば、生殖細胞系列又は卵母細胞のマーカー遺伝子発現は、これらの「不妊」の卵巣内に起こるはずがない。しかしながら、出生後の雌性卵巣における生殖細胞系列幹細胞の検出によれば、減数分裂前の生殖細胞系列幹細胞が存在することができ、そして自己再生できる、しかし、Ａｔｍ欠損での減数分裂開始により卵母細胞の産生の進行は不可能である。Ａｔｍ欠損の卵巣と野生型の対照の対比における生殖細胞系列のマーカーの発現を、逆転写に続くＰＣＲにより実施し、代表的なデータ（ｎ＝３）を、図１３の右パネルに示す。予想通り、多能性マーカーＯｃｔ−４（Brehm, A. et al. (1998) APMIS 106: 114-126）、生殖細胞系列マーカーＤａｚｌ（McNeilly, J. R. et al. (2000) Endocrinology 141: 4284-4294; Nishi, S. et al. (1999) Mol Hum Reprod 5: 495-497）及びＳｔｅｌｌａ（Bortvin, A. et al. (2004) BMC Dev Biol 23: 2）は、出生後７１日目のＡｔｍ欠損の卵巣の全てに発現する。
【０２０４】
負荷対照Ｌ７の試験によるこれら遺伝子の相対的なレベルの半定量的比較は、予想通り、これらの遺伝子が、卵母細胞を含む野生型卵巣に較べて非常に低いレベルで発現していることを示す。ＲＴ−ＰＣＲ解析に用いられる各々の動物の対側の卵巣を、組織学的な調製を行い、Ａｔｍ欠損マウスの組織切片のサンプリング及び検討を実施しても、予想通り、卵母細胞も卵胞に類似した構造も見出せなかった。このように、Ａｔｍ欠損では、生殖細胞系列幹細胞のプールが、成熟期（７１日目）の少なくとも数週間まで再生するかもしれないが、報告されているように、配偶子の死をもたらす減数分裂障害のため生きた卵母細胞を産生しない、結果をもたらす。
【実施例６】
【０２０５】
成熟マウス卵巣からの細胞の単離と特定化
胚性期特異的な抗原−１（ＳＳＥＡ−１）は、特化された哺乳動物の細胞、特に胚性幹細胞（Henderson, J. K. et al., (2002) Stem Cells 20: 329-37; Furusawa, T. et al., (2004) Biol Reprod. 70: 1452-7）、及び原始生殖細胞（ＰＧＣ）（Matsui, Y. et al., (1992) Cell 70: 841-7; Gomperts, M. et al., (1994) Development. 120: 135-41）の表面を修飾することが示されてきた。このように、ＳＳＥＡ−１は雌性の生殖細胞系列幹細胞及びその前駆体のマーカーとして可能性がある。更にＳＳＥＡ−１の幼若期のＰＧＣ発現は、生殖細胞（雌性及び雄性）が減数分裂前であり分裂可能である、発達が充分確立された時期と関連する。拡大により、減数分裂前で分裂可能である出生後雌性の生殖細胞系列幹細胞はまた、ＳＳＥＡ−１を発現できた。
【０２０６】
マウス卵巣（成熟体及び思春期前）におけるＳＳＥＡ−１の免疫組織化学的な検出は、卵巣の中心又は髄質領域にＳＳＥＡ−１陽性細胞の中心となる小さい集団を明らかにした（図１４）。しかしながら、いくつかの散在する顆粒膜細胞の中に時折観察される免疫反応性の低いレベルの外側には、ＳＳＥＡ−１の発現は、卵巣の他のどの領域にも、また卵母細胞を含む既知の源のあらゆる細胞種にも見出せなかった。これらの細胞は、間質の外見を共有する近隣の細胞と形態学的に比べたとき、それ以外に特に目立ったところがない；ＳＳＥＡ−１の免疫反応性で、直ちにそれらの幹細胞特性が明らかにされる。それにより、ＳＳＥＡ−１が、出生後の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆体であると推定される細胞集団の単離に用いるマーカーとして選択される。
【０２０７】
単離の方法は、図１５に図式的に示した。成熟卵巣（出生後５１日）を除去し、次のようにホモジナイズした。各々の卵巣は、２５０μｌのＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ番号１１９９５−０６）内に置き、３７℃であらかじめ温めた、シリンジ針及び鉗子で引き裂いた。成育している卵胞を注意を払って肉眼で無傷のまま離し、髄質／間質構造の最大限の破壊を試みた。２５０μｌのあらかじめ温められた２倍濃縮ホモジナイズ培地（ＤＭＥＭ＋１ｍｇ／ｍｌ・コラゲナーゼ［Ｇｉｂｃｏ番号１７１００−０１７］）をバラバラにした卵巣を含む皿に加え、組織／培地を１５ｍｌのコニカル試験管に移した。ホモジナイズ培地中の組織を、３７℃にて４５分間撹拌してインキュベートした。消化された組織及び細胞を、１０００ｘｇにて１０分間４０ミクロンの細胞ろ過器を通して回転した。培地が除かれ、ホモジナイズされた各々の卵巣からペレットの細胞を、５００μｌの０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）に再縣濁し、続けて実施する免疫磁気分離の前に４℃に冷やした。
【０２０８】
５０μｌのビーズアリコート毎に３μｇの抗ＳＳＥＡ−１抗体を加え、揺らしながら４℃にて１５分インキュベートして前もって被覆した、抗マウスＩｇＭビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  Ｒａｔ  抗マウスＩｇＭ；Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、卵巣ホモジネートから細胞を単離した。被覆されたビーズは、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣを用いて沈殿し、その後、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中に再縣濁した。その後、１２．５μｌの被覆ビーズを、卵巣細胞の各々５００μｌのアリコートに加えた。細胞及びビーズを、穏やかに揺らしながら４℃にて３０分インキュベートした。ビーズに結合した細胞を、Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣでペレットにした後、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で３回洗浄し単離した。最後の分離後、上清を除き、結合した細胞を含むビーズを、２５０μｌのＴｒｉ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｔ９４２４）中に再縣濁し、撹拌し、そしてＲＮＡ単離まで−８０℃で貯蔵した。
【０２０９】
ＳＳＥＡ−１陽性の単離した細胞画分を、メッセンジャーＲＮＡの逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）に用いて、遺伝子発現のプロファイルを決定した。全ＲＮＡを各々の試料から抽出し、オリゴｄＴプライマーを用いて１μｇを逆転写した（Superscript II RT; Invitrogen）。その後、２８〜３５周期のＰＣＲ増幅をＴａｑポリメラーゼ及び緩衝液Ｄ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて、各々の遺伝子に特異的なプライマーセット（表４ａ，ｂ）と共に実施した。各々の試料に対して、リボソーム遺伝子Ｌ７によってコードしたＲＮＡを増幅し、負荷対照（「ハウスキーピング」遺伝子）として用いた。すべてのＰＣＲ産物を単離し、サブクローン化し、確定のために配列解析した。
【０２１０】
【表４ａ】
2007537754.tif 000005
【０２１１】
図１６に示したＳＳＥＡ−１の単離画分は、多能性を意味し（Ｏｃｔ−４: Brehm, A. et al., (1998) APMIS 106: 114-126）、それらの系列を生殖系列細胞内に置く（Ｄａｚｌ: McNeilly, J. R. et al., (2000) Endocrinology 141: 4284-4294, Nishi, S. et al., (1999) Mol Hum Reprod 5: 495-497; Ｓｔｅｌｌａ: Bortvin, A. et al., (2004) BMC Dev Biol 23: 2; and the mouse Vasa homologue, Mvh: Fujiwara, Y. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12258-12262）遺伝子を発現する細胞の画分である。この画分は、成長している卵母細胞（例えばＧＤＦ−９: Dong, J. et al., (1996) Nature 383: 531-535; 及びＺＰ３: Dean, J. (2002) J. Reprod. Immunol. 51(1-2) 171-80）又は休止原始卵母細胞（例えば、ＨＤＡＣ６）の何れにも見られる遺伝子を発現しない（図１６）。予想通り、この画分が卵母細胞を含むと、これらの遺伝子はＳＳＥＡ−１枯渇細胞画分の全てで発現する。更に、ＳＳＥＡ−１単離細胞画分は、休止原始卵母細胞又は成長している卵母細胞の何れにも見られる遺伝子を発現していないので、この画分は卵母細胞で汚染されてはいない。加えて、これらの細胞は、減数分裂開始マーカーであるシナプトネマ構造のタンパク質ＳＣＰ３、（Yuan, L. et al., 2000 Mol Cell 5: 73-83; Johnson, J. et al., 2004 Nature 428: 145-150）を発現しないので、雌性の生殖細胞系列幹細胞及び／又はその前駆体であるとの同定が支持される。
【０２１２】
別途、生きた雌性の生殖細胞系列幹細胞及び／又はその前駆体が、前述の卵巣ホモジネート（上記参照）から、少し変更した上記の方法を用いて単離した。この場合、抗ＳＳＥＡ−１抗体は、一級アミンの反応性（ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン）でビオチンの長鎖Ｎ−ヒドロキシスクシイミドエステルを通してビオチン化される。ビオチン化の手順の全体の概観として、Ｐｉｅｒｃｅカタログ及びハンドブックを参照されたい（Pierce, Rockford, USA）。
【０２１３】
ダイナル・ビオテック（Dynal Biotech）のセルエクチオン（CELLection）・ビオチン結合材キットを、その後のＳＳＥＡ−１陽性細胞を単離するために用いた。セルエクチオンビーズは、細胞から親和性ビーズを単離後除去することが望ましい場合に好ましい。方法は、次に簡潔に記載する。セルエクチオンビーズを完全に再縣濁し、５０μｌのアリコートをダイナル・ＭＰＣ用の適切な試験管に移す。試験管をダイナル・ＭＰＣに１分間置き、除去し、そして１〜２ｍｌの緩衝液（例えば０．１％トゥイーン２０（Tween-20）を含むＰＢＳ）を再縣濁のために加えた。
【０２１４】
ビーズをビオチン化抗ＳＳＥＡ−１抗体で被覆するために、２〜３μｇのビオチン化抗体と５０μｌのビーズを試験管内で混ぜ合わせ、３０分間室温にて回転した。試験管をその後、抗ＳＳＥＡ−１抗体で被覆されたビーズをペレットにするためにダイナル・ＭＰＣ内に１分間置いた。ビーズは３回、０．１％トゥイーン２０を含むＰＢＳの１ｍＬで洗浄し、ダイナル・ＭＰＣを用いてペレットにした。被覆されたビーズは、元の量の０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳに再縣濁し、最終濃度を４ｘ１０８ビーズ／ｍｌ（０．０２％のアジ化ナトリウムが保存剤として加えられることがあることに注意）とした。
【０２１５】
上記に詳しく記載したように、１つの卵巣の細胞を、５００μｌのＰＢＳ（０．１％のＢＳＡを含む）中に再縣濁し、４℃に冷やし、その後１２．５μｌの抗ＳＳＥＡ−１被覆ビーズを各々の０．５ｍｌの卵巣ホモジネート試料に混ぜ合わせた。細胞とビーズを穏やかに揺らしながら４℃にて３０分インキュベートした。ビーズに結合した細胞は、ダイナル・ＭＰＣでペレットにした後、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、単離した。試験管をダイナル・ＭＰＣから取り外し、ロゼット状の細胞をＲＰＭＩ１６４０（１％ＦＣＳを含む）で混ぜ合わせた。ロゼット状の細胞を、ピペッティングで再縣濁し、新しいバイアルに移し、そしてダイナル・ＭＰＣに１分間置いた。試験管をダイナル・ＭＰＣから取り外し、ロゼット状の細胞を最低５００μｌのＲＰＭＩ（１％のＦＣＳを含む）中にピペッティングで再縣濁した。この段階を２回繰り返し、最後の洗浄後、流動体は除かれ、ロゼット状の細胞を、３７℃にあらかじめ温められたＲＰＭＩ（１％のＦＣＳ）中に再縣濁した。解放用の（releasing）緩衝液を加えて２μｌとし、混合物を穏やかに傾斜をつけて回転し、室温にて１５分間インキュベートした。ロゼット状の細胞を８回のピペッティングで激しく活性化して、その後１分間ダイナル・ＭＰＣに置いた。解放された（released）細胞を含む上清を、２００μｌのＲＰＭＩ（１０％のＦＣＳと共に）を含む新しい試験管にピペットにて移した。細胞のアリコート（例えば、５０〜１００μｌ）を回収し、将来のインビトロ培養及びレシピエントへの移植のために貯蔵した。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１−１】図１−１は、出生後の卵巣生殖細胞の動態を表すグラフを示す。パネル（a）は、非閉鎖の卵胞の数、一方（b）は出生後の発達中のマウス卵巣における閉鎖、休止（原始）及び全未成熟（原始、一次、小さな前卵胞）卵胞の数を示す。
【図１−２】図１−２は、出生後の卵巣生殖細胞の動態を表すグラフを示す。パネル（c）は、分娩後２５日目に９，１０−ジメチルベンズ［ａ］アントラセン（ＤＭＢＡ）に曝された卵巣における原始及び一次卵胞閉鎖の発生を表す。パネル（d）は、Ｃ５７Ｂｌ／６、ＣＤ１及びＡＫＲ／Ｊ系統のマウスにおける非閉鎖及び閉鎖の未成熟卵胞数の比較を示す。
【図２】図２は、赤毛猿に残存する非閉鎖の卵母細胞の数を示す。
【図３】図３は、出生後のマウス卵巣における減数分裂期の遺伝子発現の免疫組織化学的及びＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。パネル（a）から（d）は、単一細胞のＳＰＣ３免疫染色を表す。パネル（e）から（g）は、若年の成熟マウスから回収された、卵巣対精巣又は様々な組織におけるＳｃｐ３、Ｓｐｏ１１及びＤｍｃ１発現を示す。
【図４】図４は、幹細胞関連遺伝子の出生後の卵巣内発現を示す。左のパネルは、示された日齢又は分娩後８ヶ月（８ｍ）に回収されたマウス卵巣におけるｍｉｌｉ、ｐｕｍｉｌｉｏ−１（ｐｕｍ１）、ｐｕｍｉｌｉｏ−２（ｐｕｍ２）及びヌクレオステミン（nucleostemin）発現のＲＴ−ＰＣＲ解析を表す。右のパネルは、分娩後４０〜４２日齢の雌性マウスの卵巣、脳、心臓、腎臓、肺及び脾臓から調製されたＲＮＡ試料における遺伝子の組織分布の分析を示す。
【図５】図５は、成熟の雌性マウスにおける原始卵胞貯蔵のブスルファン仲介の除去を表す。（a）のグラフは、対照媒体又はブスルファン処置マウスの卵巣に存在する非閉鎖及び閉鎖原始卵胞の数を示す。差し込み図は、原始卵胞閉鎖の結果を示す。パネル（b）から（e）は、対照媒体処置又はブスルファン処置マウスの卵巣の組織学的外見を表す。
【図６】図６は、マウスの卵巣機能に及ぼす抗がん処置（ブスルファン）の長期の評価結果における一次卵胞に対する原始卵胞の比率を示しているグラフである。この比率の計算は、増殖活性化を介して原始卵胞の喪失速度の評価を可能にする。
【図７】図７は、新しい原始卵母細胞の産生を表す。図７ａ、ｂは、ドキソルビシン注入後の様々な時点での成熟雌性マウスの卵巣における非閉鎖の原始卵胞（a）又は全未成熟（b；原始、一次及び小さな前卵胞）卵胞の数を表す（平均値±標準誤差、処置群あたりｎ＝５匹マウス）。図７ｃは、１３日目における雌性マウス卵巣当たりの非閉鎖の未成熟卵胞の数に及ぼす広い範囲のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）の効果を表すグラフを示す。右のパネルは休止（原始）及び早期成育（一次及び前卵胞）卵胞の数を定量しているのに対し、左のパネルは、対照媒体又はＴＳＡに応答する非閉鎖の未成熟卵胞の数を示す。図７ｄは、分娩後２４１日目（d）、対照媒体又はＴＳＡ注入後２４時間における雌性マウス卵巣の非閉鎖の原始、一次及び前卵胞、卵胞の数を示す（平均値±標準誤差、処置群あたりｎ＝３〜５匹マウス）。図７ｅは、対照媒体又はＴＳＡのどちらかを注入した後２４時間での若年の雌性マウス卵巣における閉鎖の原始、一次及び前卵胞の卵胞の数を示すことによりマウスの卵胞閉鎖の発生をＴＳＡが減弱しないことを示す（平均値±標準誤差、処置群あたりｎ＝５匹マウス）。
【図８】図８は、野生型卵巣組織が緑色の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子導入の宿主の卵巣組織に結合し血管新生化されていることを示す。（a、b）外科手術後３〜４週間での嚢腔からの除去前（a）、及び除去後（b）における代表的な卵巣移植片の全体の形態。パネル（c）から（f）は、外科手術後３〜４週での顕微鏡下で光学（c、e）及び蛍光（ＧＦＰ；d、ｆ）で見られる代表的な卵巣移植片の全体の組織学的外見（白い点線）を示す。
【図９】図９は、ＧＦＰ遺伝子導入の生殖細胞が野生型卵巣における卵胞内の卵母細胞を形成することを示している顕微鏡写真である。パネル（a）及び（b）は、ヨウ化プロピジウムで対比染色された宿主（ＧＦＰ遺伝子導入の）及び移植された（野生型）卵巣組織の切片におけるＧＦＰ発現を示す。（a）ＧＦＰ陰性の顆粒膜細胞内に囲まれたＧＦＰ陽性の卵母細胞を含む移植された卵巣組織における卵胞。（b）。ＧＦＰ陰性の顆粒膜細胞内に囲まれたＧＦＰ陽性の卵母細胞を含む移植された卵巣組織における一次卵胞（白い点線）。
【図１０】図１０は、移植された卵巣組織における卵胞産生の追加例である。ＧＦＰ遺伝子導入のレシピエントの雌性個体の卵巣嚢腔に移植後４週目での野生型（ｗｔ）卵巣組織内に存在するＧＦＰ遺伝子導入の卵母細胞及び野生型顆粒膜細胞を含むふたつの隣り合う未成熟卵胞（ＰＩ、ヨウ化プロピジウム対比染色）。
【図１１】図１１は、出生後の初期（分娩後４日）と初期の生殖成熟体（分娩後４２日）の間のＢａｘ欠損の雌性マウス（遺伝子ノックアウト、ＫＯ）における卵母細胞の動態を表すグラフを示す。
【図１２】図１２は、出生後初期（分娩後４日）及び初期繁殖成熟体（分娩後４２日）の間のカスパーゼ-６欠損雌性マウス（遺伝子ノックアウト、ＫＯ）における卵母細胞の動態を表すグラフを示す。
【図１３】図１３は、分娩後４日の野生型（Ａ、Ｃに拡大図）及びＡｔｍ（毛細血管拡張性運動失調症遺伝子変異）の欠損（Ｂ、Ｄ）の卵巣の代表的組織を表す。ＲＴ−ＰＣＲ解析は、野生型及びＡｔｍ欠損卵巣両方に生殖細胞系列マーカーの存在を示す（Ｅ）。
【図１４】図１４は、成熟マウス卵巣（Ｂ、Ａに示されるＳＳＥＡ１陽性細胞のより大きな拡大図；Ａ及びＣ、異なるマウス由来の卵巣；Ｄ、抗原の細胞表面発現を示している成熟卵巣における単一のＳＳＥＡ１陽性細胞）におけるＳＳＥＡ１発現（赤、ヨウ化プロピジウムにより青く強調された核と共に）の免疫組織化学的解析を表す。
【図１５】図１５は、雌性の生殖細胞系列幹細胞及び／又はその前駆体の単離のための１つの方法を図式的に示す。
【図１６】図１６は、ＳＳＥＡ−１単離（免疫精製）画分が、多分化能を意味する遺伝子（ＳＳＥＡ−１、Ｏｃｔ−４）、及びその系列細胞を生殖細胞系列に配置する遺伝子（Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｍｖｈ／Ｖａｓａ）を発現する細胞集団であるが、減数分裂進行中の生殖細胞（ＳＣＰ３）又は卵母細胞（ＧＤＦ９、ＺＰ３、ＨＤＡＣ６）で発現する遺伝子を欠如している細胞集団であることを表している。残存する卵巣組織は、成育卵母細胞及び休止原始卵母細胞を含み、このように全てのマーカー遺伝子はこの画分で発現している。
【０２１７】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年12月15日(2005.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
発明の具体化
本発明は、雌性の生殖細胞系列幹細胞及び又は雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞を含む組成物を提供する。
雌性の生殖細胞系列幹細胞は、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ及び任意のＳＳＥＡを含む、マーカーを発現する。雌性の生殖細胞系列幹細胞は、有糸分裂能（つまり、有糸分裂ができる）があり、従って成長／分化因子−９（ＧＤＦ−９）、透明帯タンパク質（例えば、透明帯タンパク質−３（ＺＰ３））、ヒストン脱アセチル化酵素−６（ＨＤＡＣ６）又はシナプトネマ複合体タンパク質−３（ＳＣＰ３）を発現しない。追加の詳細については、代理人整理番号第５１５８８−６２０６０号として２００４年５月１７日に出願された米国特許出願第１１／１３１，１５３号、及び代理人整理番号第５１５８８−６２０６５号として２００５年５月１７日に出願された同第１１／１３１，１５２号を参照願う。またそれらの内容を、骨髄及び末梢血における雌性の生殖細胞系列幹細胞の記述に参照して本明細書に取り込む。
【国際調査報告】
2007537754.tif 000023