【手続補正書】
【提出日】平成28年1月26日(2016.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
＜２＞製造例
水素化リチウムアルミニウム１４．７３ｇにＴＨＦ２００ｍｌを加え、氷冷下撹拌した。化合物（（２Ｒ３Ｒ）−３，４−Ｏ−イソプロピリデン−２，３，４−トリヒドロキシブタン酸エチル）４８．２７ｇをＴＨＦ１００ｍｌに溶かし、徐々に反応液中に滴下した。滴下には約３時間を要した。滴下後室温にて１時間撹拌し、更に１時間加熱還流した。放冷後、反応液の様子を見ながらＨ２Ｏ  ２５ｍｌを徐々に加えた。その後、ＮａＯＨａｑ．２５ｍｌ、Ｈ２Ｏ  ７０ｍｌを加えた。反応液を吸引濾過し、濾液を濃縮した。固体は熱エタノール（３００ｍｌ×５回）で抽出した。オイル状物質が得られた。
オイル状物質にピリジン３００ｍｌを加え溶解し、氷冷下撹拌した。その中に、塩化ベンゾイル１０６．５０ｇを徐々に滴下した。ＴＬＣ上原料がなくなったところでエタノール２００ｍｌを加え濃縮した。酢酸エチルーベンゼン（５：２）７００ｍｌを加え、Ｈ２Ｏ（２００ｍｌ×２回）、ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３  ａｑ．（２００ｍｌ×１回）、Ｈ２Ｏ（２００ｍｌ×１回）、ｓａｔ．ＮａＣｌａｑ．（２００ｍｌ×１回）で洗浄した。無水Ｎａ２ＳＯ４にて乾燥後、濾過、溶媒留去し、オイルを得た。しばらく放置したら、結晶化したのでこれを濾取した。濾液はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎーヘキサンー酢酸エチル）にて精製した。濾取した物とあわせて、６３．０２ｇ（収率７２．０％）の白色結晶を得た。（（２Ｓ３Ｒ）−１，２−ジベンゾイル−３，４−Ｏ−イソプロピリデン−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；δ１．３８（ｓ  ３Ｈ）δ１．４４（ｓ  ３Ｈ）δ４．０４（ｄｄ  １Ｈ）
δ４．１６（ｄｄ  １Ｈ）δ４．４６（ｑ  １Ｈ）δ４．５６（ｄｄ  １Ｈ）
δ４．７８（ｄｄ  １Ｈ）δ５．４７〜５．５３（ｍ  １Ｈ）
δ７．３８〜７．４６（ｍ  ４Ｈ）δ７．５１〜７．５９（ｍ  ２Ｈ）
δ７．９８〜８．０６（ｍ  ４Ｈ）
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
得られた化合物（（２Ｓ３Ｒ）−１，２−ジベンゾイル−３，４−Ｏ−イソプロピリデン−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン）６２．１５ｇにＴＨＦを加えて溶かし、そこへ８０％酢酸水溶液を加えた。ＴＬＣで反応の進行状態を見ながら、酢酸水溶液を追加した。このとき、反応を速く進行させるために６０℃位に加熱した。ＴＬＣ上原料がほとんど消失したところで反応溶液を濃縮し、酢酸エチルーベンゼン（５：２）７００ｍｌで希釈し、Ｈ２Ｏ（１００ｍｌ×１回）、ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３  ａｑ．（１００ｍｌ×１回）、Ｈ２Ｏ（１００ｍｌ×１回）、ｓａｔ．ＮａＣｌａｑ．（１００ｍｌ×１回）で洗浄した。無水Ｎａ２ＳＯ４にて乾燥後、濾過、溶媒留去し、オイルを６２．１８ｇ得た。得られたオイルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎーヘキサンー酢酸エチル）にて精製し、微黄色オイル５３．３６ｇ（収率９６．３％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；δ２．５３（ｄｄ  １Ｈ）δ３．１１（ｄ  １Ｈ）
δ３．６９（ｄｄｄ  １Ｈ）δ３．８０（ｄｄｄ  １Ｈ）
δ３．９１〜３．９９（ｍ  １Ｈ）δ４．７８（ｄｄ  １Ｈ）
δ４．８５（ｄｄ  １Ｈ）δ５．３４〜５．４０（ｍ  １Ｈ）
δ７．４０〜７．４８（ｍ  ４Ｈ）δ７．５３〜７．６３（ｍ  ２Ｈ）
δ８．０１〜８．０９（ｍ  ４Ｈ）
得られたジオール５．０７ｇにピリジン５０ｍｌを加えて溶かし、氷冷下撹拌した。塩化ベンゾイル２．３９ｇをジエチルエーテル５ｍｌに溶かしたものを反応容器中に徐々に滴下した。約３．５時間後、エタノール５ｍｌを加えて反応を終了させてから濃縮した。酢酸エチルーベンゼン（４：１）５００ｍｌで希釈し、Ｈ２Ｏ（１００ｍｌ×１回）、ｄ−ＨＣｌ（１００ｍｌ×１回）、ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３  ａｑ．（１００ｍｌ×１回）、Ｈ２Ｏ（１００ｍｌ×１回）、ｓａｔ．ＮａＣｌａｑ．（１００ｍｌ×１回）で洗浄した。無水Ｎａ２ＳＯ４にて乾燥後、濾過、溶媒留去し、白色固体を６．４９ｇ（収率９７．３％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；δ３．１５（ｄ  １Ｈ）δ４．３２〜４．４２（ｍ  １Ｈ）
δ４．４８（ｄｄ  １Ｈ）δ４．６７（ｄｄ  １Ｈ）
δ４．７６〜４．８７（ｍ  ２Ｈ）δ５．５３〜５．５９（ｍ  １Ｈ）
δ７．４０〜７．４５（ｍ  ６Ｈ）δ７．５３〜７．５９（ｍ  ３Ｈ）
δ７．９９〜８．０５（ｍ  ６Ｈ）
上記で得られたベンゾエート６．４９ｇにベンゼン１０ｍｌを加えて溶かし、そこへジメトキシメタン３０ｍｌを加え、室温にて撹拌した。五酸化二リンを適当量加えた。ＴＬＣ上の原料が消失したところで撹拌を止め、酢酸エチルーベンゼン（４：１）５００ｍｌで希釈し、ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３ａｑ．（１００ｍｌ×１回）、Ｈ２Ｏ（１００ｍｌ×１回）、ｓａｔ．ＮａＣｌａｑ．（１００ｍｌ×１回）で洗浄した。無水Ｎａ２ＳＯ４にて乾燥後、濾過、溶媒留去し、黄色オイルを得た。しばらく放置したら結晶化し、６．５３ｇの固体を得た。（収率９１．４％；（２Ｓ３Ｒ）−１，２，４−トリベンゾイルオキシ−３−メトキシメトキシブタン）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；δ３．３９（ｓ  ３Ｈ）δ４．３７〜４．５１（ｍ  ２Ｈ）
δ４．６１〜４．８７（ｍ  ５Ｈ）δ５．７２〜５．７８（ｍ  １Ｈ）
δ７．３８〜７．４６（ｍ  ６Ｈ）δ７．５１〜７．５８（ｍ  ３Ｈ）
δ７．９９〜８．０７（ｍ  ６Ｈ）
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
（２Ｓ３Ｒ）−１，２，４−トリベンゾイルオキシ−３−メトキシメトキシブタン６．５３ｇにベンゼン２０ｍｌを加えて溶かし、そこへ無水酢酸１．５ｍｌを加えて氷冷下で撹拌した。三ふっ化ほう素ジエチルエーテル錯体１ｍｌを加えた。添加と同時に、（２Ｓ３Ｒ）−３−アセトキシメトキシ−１，２，４−ベンゾイルオキシブタンが生成し、反応液は黒色へと変化した。この（２Ｓ３Ｒ）−３−アセトキシメトキシ−１，２，４−ベンゾイルオキシブタンを取り出すことなく、６０分後、ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３  ａｑ．１００ｍｌと氷を反応液へ加えた。酢酸エチルーベンゼン（４：１）５００ｍｌで抽出し、Ｈ２Ｏ（１００ｍｌ×１回）、ｓａｔ．ＮａＣｌａｑ．（１００ｍｌ×１回）で洗浄した。無水Ｎａ２ＳＯ４にて乾燥後、濾過、溶媒留去し、茶色オイル７．４２ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；δ１．９１（ｓ  ３Ｈ）  δ４．４３〜４．５２（ｍ  ２Ｈ）
δ４．６６（ｄｄ  １Ｈ）  δ４．７２〜５．２７（ｍ  ２Ｈ）
δ５．３９（ｄ  １Ｈ）  δ５．４８（ｄ  １Ｈ）
δ５．６７〜５．７２（ｍ  １Ｈ）  δ７．３７〜７．４６（ｍ  ６Ｈ）
δ７．５１〜７．６０（ｍ  ３Ｈ）  δ７．９７〜８．０７（ｍ  ６Ｈ）
２ーニトロイミダゾール１．８６ｇにＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセタミド７ｍｌを加え室温にて撹拌した。反応液が黄色澄明液になったのを確認してから濃縮した。
ベンゾエート７．４２ｇをベンゼン１０ｍｌで溶かして、２ーニトロイミダゾールに加えた。更に、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート１ｍｌを加え室温にて撹拌した。ＴＬＣ上原料の消失が認められたところで撹拌を止めた。酢酸エチルーベンゼン（４：１）５００ｍｌで希釈し、  ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３  ａｑ．（１００ｍｌ×１０回）で洗浄し、未反応の２ーニトロイミダゾールを除いた。更に、Ｈ２Ｏ（１００ｍｌ×１回）、ｓａｔ．ＮａＣｌａｑ．（１００ｍｌ×１回）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４にて乾燥後、濾過、溶媒留去し、茶色オイルを得た。少量のエタノールを加えて結晶化させ、５．０６ｇの白色結晶を得た。（収率６６．３％；（２Ｓ３Ｒ）−３−（２−ニトロイミダゾール−１−イルメトキシ）−１，２，４−トリベンゾイルオキシブタン）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；δ４．４４〜４．５１（ｍ  ２Ｈ）  δ４．６０（ｄｄ  １Ｈ）
δ４．７５（ｄｄ  １Ｈ）  δ４．８１〜４．８５（ｍ  １Ｈ）
δ５．６９〜５．７２（ｍ  １Ｈ）  δ５．９７（ｄ  １Ｈ）
δ６．０７（ｄ  １Ｈ）  δ７．００（ｓ  １Ｈ）  δ７．２８（ｓ  １Ｈ）
δ７．４０〜７．４９（ｍ  ６Ｈ）  δ７．５４〜７．６３（ｍ  ３Ｈ）
δ７．９３〜８．０５（ｍ  ６Ｈ）
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
細胞腫を、種々変えて、コロニー法（ｃｏｌｏｎｙ  ａｓｓａｙ）を用いて、低酸素性細胞放射線増感作用を調べた。即ち、細胞をトリプシン処理し、浮遊細胞とし、２０分間９５％Ｎ２＋５％ＣＯ２で通気し低酸素状態にした後、ＰＢＳ及び検体のＰＢＳ溶液の存在下で、Ｘ線（０、１、２、３Ｇｙ）を照射した。その後５％ＦＢＳ加ＭＥＭ培地で７２時間培養し、形成したコロニー数を計数し、線量・生存率曲線を引き、この線量−生存率曲線より被験化合物無添加時の低酸素性細胞の生存率を１％下げる放射線量を、被験化合物添加時の低酸素性細胞の生存率を１％下げさせる放射線量で除した値を求めて増感係数を求めた。ここで、ＳＣＣＶＩＩはＢａｌｂ／ｃに自然発生した扁平上皮癌から樹立された細胞であり、Ｖ７９はチャイニーズハムスターの肺由来のフィブロブラスト様細胞であり、Ｌ５１７８Ｙはリンパ種由来のガン細胞である。結果を表２に示す。これより、（２Ｒ３Ｓ）−２−（２−ニトロイミダゾール−１−イルメトキシ）−１，３，４−トリヒドロキシブタン）は特異的に、肺癌、リンパ腫に優れた増感効果を示すことが判る。