(57)【要約】  本発明は、少なくとも２つの異なるマウス系統由来の対立遺伝子を含み、高い発生能を有する非近交系マウス胚性幹（ＥＳ）細胞を提供する。ＥＳ細胞は、場合により導入遺伝子のための導入部位を含む。また、ＥＳ細胞の作製方法も開示する。さらに、本発明は、非近交系ＥＳ細胞由来のキメラマウスおよびトランスジェニックマウス、ならびにそのようなマウスの作製方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つの異なる近交型マウス系統由来の対立遺伝子を有する非近交系マウス胚性幹（ＥＳ）細胞の調製物であって、
前記ＥＳ細胞は、良好な発生能を有する、
非近交系マウス胚性幹（ＥＳ）細胞の調製物。
【請求項２】
前記ＥＳ細胞は、さらに導入遺伝子導入部位を有する請求項１記載の非近交系ＥＳ細胞の調製物。
【請求項３】
少なくとも２つの異なる近交型マウス系統由来の対立遺伝子および導入遺伝子導入部位を有する非近交系マウス胚性幹（ＥＳ）細胞の調製物であって、
前記ＥＳ細胞は、良好な発生能を有する、
非近交系マウス胚性幹（ＥＳ）細胞の調製物。
【請求項４】
前記導入遺伝子導入部位は、Ｘ連鎖性のヒポキサンチンホスホリボシル基転移酵素（ＨＰＲＴ）遺伝子の欠失変異体である、請求項２または請求項３に記載の非近交系ＥＳ細胞の調製物。
【請求項５】
前記導入遺伝子導入部位は、ｌｏｘＰ部位を含む、請求項２または請求項３に記載の非近交系ＥＳ細胞の調製物。
【請求項６】
前記ＥＳ細胞由来のキメラは、５０％を超えるＥＳ細胞の寄与を示す、請求項１から請求項５のいずれかに記載の非近交系ＥＳ細胞の調製物。
【請求項７】
前記ＥＳ細胞由来のキメラは、９０％を超えるＥＳ細胞の寄与を示す、請求項６記載の非近交系ＥＳ細胞の調製物。
【請求項８】
前記ＥＳ細胞由来のキメラは、約１００％のＥＳ細胞の寄与を示す、請求項７記載の非近交系ＥＳ細胞の調製物。
【請求項９】
（ａ）少なくとも１つの胚が生産される結果となる条件下で、請求項１から請求項７のいずれかに記載の非近交系マウスＥＳ細胞の調製物をマウス胚盤胞中に導入するステップと、
（ｂ）作製した胚を適切な養母の体内に移植するステップと、
（ｃ）生きた子が発生する結果となる条件下に前記養母を維持するステップと、
を有するＥＳ細胞由来マウスの作製方法。
【請求項１０】
（ａ）１つ以上の導入遺伝子配列を、請求項２または請求項４から請求項７のいずれかに記載のＥＳ細胞の調製物の非近交系マウスＥＳ細胞に導入するステップと、
（ｂ）１つ以上の前記導入遺伝子配列が前記ＥＳ細胞のゲノムに組込まれるように、導入遺伝子導入部位で相同的組換えが生じる結果となるような条件下にＥＳ細胞を維持するステップと、
（ｃ）少なくとも１つの胚が生産される結果となる条件下で、生成した組換え体ＥＳ細胞を胚盤胞中に導入するステップと、
（ｄ）作製した胚を適切な養母の体内に移植するステップと、生きた子が発生する結果となるような条件下に前記養母を維持するステップと、
を有するトランスジェニックマウスの作製方法であって、
前記ＥＳ細胞は良好な発生潜在性を有する、
トランスジェニックマウスの作製方法。
【請求項１１】
前記適切な養母は、偽妊娠の雌のマウスである、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項９または請求項１１に記載の方法により作製されたＥＳ細胞由来マウス。
【請求項１３】
請求項１０または請求項１１に記載の方法により作製されたトランスジェニックマウス。
【請求項１４】
（ａ）第一の近交系マウス系統の雌のマウスを第二の近交系マウス系統の雄のマウスに交配させるステップであって、前記第一のマウス系統と前記第二のマウス系統は異なる、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）における前記雌のマウスと前記雄のマウスとの間の交配から得られる子から、交配および戻し交配の組み合わせを含む多数世代の交配を実行するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において実行された多数世代の交配で得られたマウスから、胚盤胞を回収するステップと、
を有する、良好な発生能を有するマウス胚性幹細胞の調製方法。
【請求項１５】
（ａ）第一の近交系マウス系統の雌のマウスを第二の近交系マウス系統の雄のマウスに交配させるステップであって、第一のマウス系統と第二のマウス系統は異なる、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）における交配の子を、第三の近交系マウス系統のマウスと交配させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）における交配から得られる子から、交配および戻し交配の組み合わせを含む多数世代の交配を実行するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において実行された多数世代の交配で得られたマウスから、胚盤胞を回収するステップと、
を有する、良好な発生能を有するマウス胚性幹細胞の調製方法。
【請求項１６】
前記多数世代の交配は、５または６の交配および戻し交配の組み合わせを含む、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記近交系マウス系統のうちの少なくとも１つは、導入遺伝子導入部位を含む、請求項１４から請求項１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
導入遺伝子導入部位は、Ｘ連鎖性のヒポキサンチンホスホリボシル基転移酵素（ＨＰＲＴ）遺伝子の欠失変異体である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
導入遺伝子導入部位は、ｌｏｘＰ部位を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
請求項１４から請求項１９のいずれかに記載の方法により得られる非近交系胚性幹（ＥＳ）細胞の調製物。
【請求項２１】
ＥＳ細胞由来マウスを作製するための、請求項１から請求項８のいずれかまたは請求項２０に記載のＥＳ細胞の調製物の使用。
【請求項２２】
ＥＳ細胞由来トランスジェニックマウスを生産するための、請求項１から請求項８のいずれかまたは請求項２０に記載のＥＳ細胞の調製物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の遺伝的特性を有するマウスの作製、特に胚性幹細胞を用いたトランスジェニックマウスの作製に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、マウスなどのヒト以外の哺乳類のトランスジェニック動物の作製に多くの力が注がれてきた。そして、この間に様々な方法が開発されてきた。
【０００３】
外来の遺伝物質を動物に導入する１つの方法は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の能力を利用してキメラ動物を作製するものである。胚性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から得られる。これらの細胞は、二倍体の胚盤胞中への注入によりまたは桑実胚と凝集させることにより胚に導入されると、生殖細胞を含む全細胞系譜に発生することのできる全能性細胞である（Robertson, (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A practical approach, ed. Robertson, E. J. (IRL Press, Oxford Washington D.C.), pp. 71-112; Bradley, (1987) in Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cells: A practical approach, ed. Robertson, E. J. (IRL Press, Oxford Washington D.C.), 113-151; Beddingtonand Robertson, (1989) Development 105,733-737; Nagy et al., (1990) Development 110: 815-821）。ＥＳ細胞は、胚盤胞から分離され、細胞が付着できる詳細に定められた培養条件下で培養されることで恒久的な細胞系統として樹立され、さらに遺伝子操作をされうる。このような能力を有することから、この細胞は、この後動物に移植されるＥＳ細胞内において制御下での突然変異またはその他の遺伝子改変を行うことによって哺乳類、特にマウスのゲノムを改変するのに効果的なツールとなっている。
【０００４】
近年、ＥＳ細胞のような全能性細胞由来の動物を作製するために、様々な実験方法が開発されている。ＥＳ細胞の場合、これらの方法の主な目的は、ＥＳ細胞の完全な発生能をインビトロ（in vitro）で維持すること、および、生殖系列を伝達できるキメラの割合を増大させるために、発生能力が制限されるように選択または操作されたホスト細胞をキメラの形成に用いることであった（Nagy, et al. (1990) Development 110: 815-821; Kaufman and Webb, (1990) Development 110,1121-1132）。
【０００５】
初期の研究においては、完全にＥＳ細胞由来の胎児（以下、完全にＥＳ細胞由来の生物をＥＳ動物と呼ぶ。例えば、ＥＳマウスやＥＳ胎児など。）を作製するために、種々の系統のＥＳ細胞と桑実胚との凝集塊が作製された。しかし、得られたＥＳ胎児は死産であった（Nagy, et al. (1990) Development 110: 815-821）。さらなる研究により、継代初期の野生型Ｒ１細胞（Nagy, et al., (1993) in Gene Targeting: A practical approach, ed, Joyner, A. L. (IRL Press, Oxford N.Y. Tokyo), pp. 147-180）またはＴＴ２細胞系統（Ueda et al., (1995) 実験動物 44,205-210）が四倍体桑実胚との凝集に用いられた場合、生存能および繁殖能を有する、排他的にＥＳ細胞由来のＥＳマウスが得られることが示された。
【０００６】
大部分のマウスＥＳ細胞系統は、近交系マウス由来である。残念ながら、これらのＥＳ細胞をクローンマウスの作製に使用することは、クローン動物が先天性異常を患い生後間もなく死亡することから困難なものであった。胚および胎児の死亡率は極度に高く、一般的に操作された胚のうち１％未満の胚が生きて産まれた動物となる。最近、近交系マウス系統間のＦ１交雑種由来のマウスＥＳ細胞が、近交系系統由来のＥＳ細胞に比べて優れた発生能または雑種強勢を有することから、ＥＳ細胞中の遺伝的不均一性がそれらの発生能に寄与しているのではないかという仮説が立てられている。これらのＦ１交雑系ＥＳ細胞は、四倍体桑実胚を用いるＥＳマウスの作製方法で用いられてきた（米国特許出願公開第２００２／００７８４７０号明細書）。
【０００７】
Ｒ１と命名されたＥＳ細胞系統は、１９９３年に導入されてから、遺伝子ターゲッティング、キメラおよびクローン作製の様々な実験において、丈夫な細胞系統として幅広く用いられてきた（Nagy, et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: pp 8424-8428）。Ｒ１細胞は、２つの１２９亜系統、１２９／Ｓｖと１２９／Ｓｖ−ＣＰとの間の交雑種から得られた胚盤胞に由来している。ネイギー（Nagy）の原著論文では、Ｒ１細胞が継代初期から得られたものから、または継代後期の５つのサブクローン（継代１２）のうちの１つから得られたものであれば、そのＲ１細胞は四倍体胚と凝集させると完全にＥＳ細胞由来のマウスを作製する能力を有することが示された。それらのマウスは生存能および繁殖能を有することがわかった。
【０００８】
続いて、１２９亜系統の関係に関する徹底的な試験が２つの研究室にて行われた（Simpson, et al., Nat Genet. 1997 May; 16(1): 19-27; Threadgill, et al. Mamm. Genome. 1997 Jun; 8 (6): 390-3）。いずれの研究も、広範な遺伝的差異が１２９亜系統間に存在することを明らかにした。特に、ゲノム配列の多型によって明らかとなった亜系統間の差異の程度から、１２９／ＳｖＪ系統は、１２９／Ｓｖと未知の系統とに由来するコンジェニック系統（１２９ｃＸ／Ｓｖ）として説明されるべきであるという提案が導き出された。さらに、広範な遺伝的変異が全ての１２９亜系統間で見つかった。この変異は、遺伝子混入または様々な戻し交配プログラムによる残留異型接合性（residual heterozygosity）として明確に導き出されるものである。この結果、１２９系統マウスに対する命名法が、マウス遺伝的命名法標準化委員会（the Committee on Standardized Genetic Nomenclature for Mice）によって完全に改訂されることとなった（Festing et al., Mamm Genome. 1999 Aug; 10(8): 836）。
【０００９】
このように、Ｒ１細胞系統、１２９／Ｓｖおよび１２９／Ｓｖ−ＣＰは、外皮外観（１２９／Ｓｖ−ＣＰはアグーチであるのに対し、１２９／Ｓｖマウスはチンチラの毛色である）における明らかな差異を示す以上に、広範な対立遺伝子の差異を有する。この広範な異型接合性を実験的に利用して、同型標的遺伝子破壊で選択したＲ１ ＥＳ細胞内で染色体断片を追跡することが可能となった（Lefebvre, et al. , Nat Genet. 2001 Mar; 27(3): 257-8）。Ｒ１細胞中に見られる異型接合の程度は、典型的な近交系系統間の接合から得られるＦ１細胞中に期待されるものと近似しているまたは同等であるので、交雑系Ｒ１細胞は、重要な雑種強勢を実証するものと期待され、その特性は、キメラにおける交雑系Ｒ１細胞の発生能に寄与する主な要因であると思われる。特に、交雑系Ｒ１細胞の異型接合の割合を増やす性質（雑種強勢）は、キメラを発生させるために四倍体移植前胚中に導入したときに１００％ＥＳ細胞由来マウスの作製をサポートするという交雑系Ｒ１細胞が示す能力に寄与する。同様に、Ｒ１ ＥＳ細胞の核が、クローンマウスとして出産されるまで発生できること（Gao S, et al., Biol Reprod. 2003 Feb; 68(2): 595-603）および十分成長できること（Wakayama T, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999 Dec 21; 96(26): 14984-9）も示されている。
【００１０】
しかしながら、最大の雑種強勢およびそれに関連する発生能を有するＥＳ細胞に対する１つの要求が残っている。都合のよいことに、ＥＳ細胞は、１つの導入遺伝子または複数の導入遺伝子の組み合わせを含むように容易に改変されうる能力も有する。
【００１１】
この背景情報は、本発明に対して関連があるものと出願人が信じる情報を公開する目的で提供される。先行情報のいずれかが本発明に対立する従来技術を構成するということは、必ずしも承認されるものではないだけでなく、そのように解釈されるべきでない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の１つの目的は、良好な発生能を有し、場合により導入遺伝子導入部位（transgene docking site）を有する非近交系マウス胚性幹細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一態様によれば、少なくとも２つの異なる近交系マウス系統由来の対立遺伝子を含み、場合により導入遺伝子導入部位を含む非近交系マウス胚性幹（ＥＳ）細胞であって、前記幹細胞は良好な発生能を有する、非近交系マウス胚性幹細胞を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様によれば、少なくとも３つの異なる近交系マウス系統由来の対立遺伝子を含み、場合により導入遺伝子導入部位を含む非近交系マウス胚性幹（ＥＳ）細胞であって、前記幹細胞は良好な発生能を有する、非近交系マウス胚性幹細胞を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、複数のステップ：非近交系マウスＥＳ細胞を少なくとも１つの胚が作製される結果となる条件下でマウス胚盤胞中に導入するステップ;作製した胚を偽妊娠の雌のマウスのような適切な養母の体内に移植するステップ；および養母を生きた出生児の発生に繋がる条件下で維持するステップ；から成り、ＥＳ細胞が良好な発生能を有し、場合により導入遺伝子導入部位を有する、ＥＳ細胞由来マウスを作製する方法を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、複数のステップ：トランスフェクトされたコンストラクト配列を導入遺伝子導入部位および少なくとも２つの異なる近交系マウス系統由来の対立遺伝子を含む非近交系マウスＥＳ細胞に導入するステップ；トランスフェクトされたコンストラクト配列がＥＳ細胞のゲノムに組込まれるように導入遺伝子導入部位で相同組換えが生じる条件下でＥＳ細胞を維持するステップ;作製した組換え体ＥＳ細胞を少なくとも１つの胚が作製される結果となる条件下で胚盤胞に導入するステップ；作製した胚を偽妊娠の雌のような適切な養母の体内に移植するステップ；および養母を生きた出生児の発生に繋がる結果となる条件下に維持するステップ；から成り、ＥＳ細胞が良好な発生能を有する、トランスジェニックマウスを作製する方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、少なくとも２つの異なる種類の近交系マウス系統由来の対立遺伝子を含み、場合により導入遺伝子導入部位を含む非近交系マウスＥＳ細胞から得られるＥＳ細胞由来マウスであって、前記ＥＳ細胞が良好な発生能を有する、ＥＳ細胞由来マウスを提供する。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、少なくとも２つの異なる種類の近交系マウス系統由来の対立遺伝子を含む非近交系マウスＥＳ細胞から得られるトランスジェニックマウスまたは突然変異マウスであって、前記ＥＳ細胞が良好な発生能を有する、トランスジェニックマウスまたは突然変異マウスを提供する。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、少なくとも２つの異なる種類の近交系マウス系統由来の対立遺伝子および導入遺伝子導入部位を含む非近交系マウスＥＳ細胞から得られるトランスジェニックマウスであって、前記ＥＳ細胞が良好な発生能を有し、導入遺伝子が導入遺伝子導入部位に導入された、トランスジェニックマウスを提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は改善された発生能または雑種強勢を有し、場合により導入遺伝子導入部位を含む多数の非近交系マウス胚性幹細胞（ＥＳ）を提供する。本明細書に記載されるＥＳ細胞系統は、顕著な雑種強勢を示し、それによって導入遺伝子導入部位を含む従来利用可能であった細胞系統の多くの実用上の限界を克服する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
ＥＳ細胞系統の雑種強勢および関連する発生能を最大限にするために、多数の近交系マウス系統間に存在する対立遺伝子の差異を胚盤胞に導入するように交配を設計した。
【００２２】
本発明の一態様によれば、非近交系ＥＳ細胞は、マウスの２つの異なる近交系系統由来の対立遺伝子を有し、それら２つの系統の内少なくとも１つは、近交化における遺伝的背景に導入遺伝子導入部位を含む。そのような細胞の例としては、ＢＰＥＳ−１、ＢＰＥＳ−２およびＢＰＥＳ−３と命名された細胞が挙げられるが、これについては実施例でさらに詳述する。これら細胞系統のサンプルは、２００４年６月２９日、カナダ国際寄託当局（International Depositary Authority of Canada）に寄託され、各々受け入れ番号２９０６０４−０１、２９０６０４−０２および２９０６０４−０３を付して登録された。これらのＥＳ細胞は、多数（５〜６）の継代（Ｃ５７Ｂｌ／６雌とＢＫ４を含むキメラとの間の最初の交配から、交配と戻し交配を組み合わせたもの（交配プログラムはＨＰＲＴヌル対立遺伝子を有するマウスで雑種強勢を維持するように設計したものである））の後、回収した胚盤胞から得られたものである。
【００２３】
都合の良いことに、本発明のＥＳ細胞は、マウスの３つの異なる近交系系統由来の対立遺伝子を含む非近交系ＥＳ細胞であって、それら３つの系統の内少なくとも１つは、近交化における遺伝的背景に導入遺伝子導入部位を含む。これらの細胞の例はＢＰＥＳ−４、ＢＰＥＳ−５、ＢＰＥＳ−６、ＢＰＥＳ−７、ＢＰＥＳ−８、ＢＰＥＳ−９、ＢＰＥＳ−１０、ＢＰＥＳ−１１およびＢＰＥＳ−１２と命名されており、実施例でさらに詳述する。これら細胞系統のサンプルは２００４年６月２９日、カナダ国際寄託当局に寄託され、各々受け入れ番号２９０６０４−０４、２９０６０４−０５、２９０６０４−０６、２９０６０４−０７、２９０６０４−０８、２９０６０４−０９、２９０６０４−１０、２９０６０４−１１および２９０６０４−１２を付して登録された。
【００２４】
本発明の特定の態様において、第１回目の交配は、野生型Ｃ５７Ｂｌ／６雌と、ＢＫ４細胞（ＨＰＲＴヌル）およびＣ５７Ｂｌ／６細胞を有する雄のキメラとの間で行った。その後、作製したＢ６１２９Ｆ１ＨＰＲＴ＋／−雌を、野生型Ｃ５７Ｂｌ／６雄またはＢＣ１雄と戻し交配させた。このとき、交配プログラムは、ＨＰＲＴヌル対立遺伝子を有するマウスにおける雑種強勢を維持し、さらにマウスの１２９ＳＶＰＡＳＬＣＯＣＲＬＢＲ系統との交配によって異型接合性（雑種強勢）を導入するように設計した。
【００２５】
本発明の非近交系ＥＳ細胞は、ＥＳ細胞を得るのに用いられる胚盤胞に到達するように、戻し交配（backcrosses）、異系交配（intercrosses）および外部交配（outcrosses）を組み合わせることによって得られたものである。これは本明細書に記載した通り、各世代において自然選択が生じるように多くの世代に渡って実行された。この方法は、２つの近交系系統間の交配から直接得られるＦ１胚盤胞に関する従来技術とは異なる。
【００２６】
本明細書で用いられているように、非近交系ＥＳ細胞という用語は、本明細書に記載されている非近交系ＥＳ細胞および細胞系統のいずれかまたは全部を含む。当業者によく知られている標準的な技術を、上記の系統またはストックを作製するのに用いることができる。
【００２７】
非近交系マウス系統またはストックからＥＳ細胞系統を得ることは、例えば、本明細書中に参考文献として組み込まれている、"E. J. Robertson (1987) Embryo-derived stem cell lines In Teratocarcinoma and embryonic stem cells: a Practical Approach Ed. by E. J. Robertson. IRL Press, Oxford"および"S. J. Abbondazo, I. Gadi, C. L. Stewart (1993) Derivation of Embryonic Stem cell lines In Methods in Enzymology v. 225 Guide to Techniques in Mouse Development"に記載されているような（これらに限定されないが）標準的な技術をを用いることによって達成することができる。本発明に係る非近交系マウスＥＳ細胞の典型的な作製方法を、実施例１で詳述する。
【００２８】
本発明の非近交系ＥＳ細胞は、近交系系統から得られるＥＳ細胞と比較して、雑種強勢（heterosis）または改善された雑種強勢（hybrid vigour）を示す。本発明によって得られる非近交系ＥＳ細胞は、系統や遺伝的構成の面から同一ではないが、それらはすべて良好な発生能を発揮する。「良好な発生能」という用語は、本明細書で用いられているように、ＥＳ細胞から作製されたキメラの細胞に高い割合で寄与するＥＳ細胞の能力のことをいう。特定の用途には、キメラの細胞のほぼ１００％がＥＳ細胞由来のものであることが望ましいが、９０％以上であればインサイチュー（in situ）レベルまたはＦＡＣＳ（これに限らないが）のような細胞レベルの定量分析の用途を含む大部分の用途に対して十分に高い割合であるといえる。当業者が認めるように、発生におけるおよび／または細胞におけるレポーターコンストラクトの発現形質の特異性を確立するといったような特定の用途に用いる場合、ＥＳ細胞から作製されるキメラにおいて、５０％未満の割合であっても十分である。本発明のＥＳ細胞から得られるキメラは、通常５０％を超えるＥＳ細胞寄与を示す。より一般的には、キメラ中のＥＳ細胞寄与は、１００％かそれに近いものである。
【００２９】
本発明の非近交系ＥＳ細胞は、四倍体細胞（凝集または胚盤胞注入による）との競争におけるＥＳ細胞を連想させる程度まで、通常の二倍体胚盤胞細胞と競争する能力を有する。本発明の非近交系ＥＳ細胞および野生型Ｃ５７Ｂｌ／６二倍体胚盤胞を用いたキメラ動物の作製において、一腹あたり数匹のキメラは、少なくとも９０％はＥＳ細胞由来のものであること、および、少なくとも１匹のキメラは頻繁に、ほぼ１００％ＥＳ細胞由来のものであることがわかった。同様の結果は、凝集によって得られたキメラにおいても得られる。
【００３０】
本明細書で用いられるように、ＥＳ細胞寄与の割合は、毛色、生殖系列伝達の割合および導入遺伝子発現細胞のキメラ内における分布を含む判定基準を用いた、作製されたキメラの分析に基づいている。ＥＳ細胞寄与を測定するのに様々な方法を用いることができることは、当業者には容易にわかることである。測定されるＥＳ細胞寄与の実際の割合は、ホスト細胞由来の細胞であるかＥＳ細胞由来の細胞であるかを識別するのに用いられるアッセイの感度によりいくらか違ってくる。
【００３１】
本発明のＥＳ細胞は、標準的な技術を用いて導入される導入遺伝子またはその他の遺伝的修飾を含むように改変できる。本発明の一態様において、ＥＳ細胞は、１つ以上の遺伝子の標的破壊により改変される。そのような細胞は「ノックアウト」マウスの作製に有用である。
【００３２】
本発明の非近交系ＥＳ細胞のいくつかの系統は、良好な発生能を示すことに加えて、１つの導入遺伝子または導入遺伝子の組み合わせを含むことによってそれらの系統を容易に改変することができるように導入遺伝子導入部位を含むように設計されている。ＥＳ細胞は、導入遺伝子導入部位（導入遺伝子が導入されている、またはされていない）と組換え技術によって導入されるその他の変異との組み合わせを含んでいてもよい。
【００３３】
本明細書に用いられている「導入遺伝子導入部位」とは、相同組換えあるいはその他の酵素媒介または酵素補助による挿入の各種形態による導入遺伝子の単一コピー導入のために用いることのできる、ヒト以外の哺乳類のゲノム中の予め特定された部位のことをいう。導入遺伝子導入部位は、ゲノムの内在性の遺伝子または遺伝子座の変異体もしくは改変体であっても良いし、あるいは組換え技術を用いてゲノムに付加された外来性の配列であっても良い。導入遺伝子導入部位を用いることは、形質転換細胞ごとに非相同性遺伝子の発現レベルがバラバラになるという導入遺伝子のランダムな組込みに対して、いくつかの有利な点がある。さらに、ゲノム中に非相同性のＤＮＡをランダムに組込むと、細胞または生物の成熟、分化および／または生存に必要な内在性の遺伝子を破壊することになるかもしれない。導入遺伝子をランダムに組込むことによって得られるトランスジェニック動物において、導入遺伝子の組込みによって全体的な異常がしばしば発生し、導入遺伝子および／または内在性ＤＮＡの全体的な再編成が挿入部位においてしばしば起こる。これとは対照的に、導入遺伝子導入部位は、内在性遺伝子を破壊しない方法で容易に導入遺伝子の単一コピーを挿入するのに用いられる。
【００３４】
都合の良いことに、本発明のＥＳ細胞は、Ｘ連鎖性のヒポキサンチンホスホリボシル転移酵素（hypoxanthine phosphoribosyl transferase：ＨＰＲＴ）遺伝子の欠失変異体を導入遺伝子導入部位として含むことができる（S. K. Bronson, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9067-9072）。ＨＰＲＴ欠失変異体は効果的な導入遺伝子導入部位であり、その理由の概要は以下の通りである。
【００３５】
−ＨＰＲＴ導入部位は、強いエンハンサー活性とは関連していない。３００ｂｐの「エンハンサートラップ」ｈｓｐ６８プロモーターによって促進された（promoted）中立性のレポーター遺伝子（ｌａｃＺ）は、子宮外マウスの内皮細胞および心筋細胞でのみ発現が見られた（図１）。
【００３６】
−ＨＰＲＴ導入部位は、許容的（permissive）である。例えば、この導入部位は、著しく弱いＭＢＰプロモーター配列によって引き起こされるｌａｃＺレポーター遺伝子の検出可能な発現を許容する（Foran and Peterson (1992) J. Neurosci. 12 (12): 4890-4897に記載）。
【００３７】
−ＨＰＲＴ導入部位は、導入遺伝子産物の蓄積レベルの違いによって種々のプロモーターの強度を明らかにすることができる（約２５倍の範囲が実証された）（Farhadi et al, J. Neursci. 2003; Denarier, et al. 投稿中）。
【００３８】
−ＨＰＲＴ導入部位は、コンストラクトの調節機能を忠実に報告する。同じコンストラクトは、トランスジェニック系統中で質および量が同様の結果を生み出すことが、多数の独立したＥＳクローン（トランスフェクション、選択、キメラ作製、生殖系列継代）において示された（未発表データ）。
【００３９】
本発明の別の態様において、ＥＳ細胞のゲノムに組込まれた導入遺伝子導入部位は、１つ以上のｌｏｘＰ部位を含む。ｌｏｘＰ部位は、部位特異的リコンビナーゼＣｒｅによって認識される（Fukushige, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7905-7909; Kolb and Siddel (1997) Gene 209: 209-216）。この部位には、両側にｌｏｘＰ配列を有する導入遺伝子を挿入することができる。組換えＤＮＡ技術の熟練技術者に知られている標準的な方法を用いて、両側にｌｏｘＰ配列を含むように対象となる導入遺伝子を改変することができる。
【００４０】
本発明の関連する態様において、Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムの導入部位は、相同組換えによって導入遺伝子を導入することができる導入部位をＥＳ細胞に組込むのに用いられる（Zhao, et al. (2001) BMC Devel. Bio. 1: 10）。この場合、ｌｏｘＰに挟まれたホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ｐｇｋ）プロモーターによって発現するネオマイシンリン酸転移酵素（Ｎｅｏ）コード配列を含むカセットが、相同組換えによる標的となった。Ｎｅｏカセットを含む細胞は薬理学的阻害剤Ｇ４１８に対して耐性があるので、Ｇ４１８存在下での成長により選択することができる。Ｃｒｅリコンビナーゼの一過性の導入、例えばＣｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミドの一過性の導入、によるＰｇｋプロモーターの除去により、Ｇ４１８の感受性は回復する。生成した部位は、導入遺伝子が相同組換えにより導入される導入遺伝子導入部位として用いるのに適している。導入遺伝子は、リン酸転移酵素活性を欠いている、部分除去された（truncated）Ｎｅｏ遺伝子の上流に位置し、Ｐｇｋプロモーターによって発現できるように操作される。この操作の結果、導入遺伝子を含む細胞で、Ｇ４１８耐性が再生する。
【００４１】
本発明の別の態様では、ストレプトマイセス（Streptoomyces）ファージ由来のφＣ３１インテグラーゼ系を利用して導入遺伝子導入部位を設計する（Belteki, et al. (2003) Nature 21: 321-324）。
【００４２】
当業者には容易に認められるように、本発明のＥＳ細胞は、ＥＳ細胞のゲノムへの導入遺伝子の部位特異的挿入を促進するいかなる導入遺伝子導入部位を含むことができる。導入部位の選択は、挿入される導入遺伝子の型に一部依存する。特に、コンストラクトの制御下での挿入を促進すること以上に、染色質環境、特に導入部位の付近の染色質から発せられる調節効果が、導入部位の選択に関係する。例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座はレポーター遺伝子を広範に発現させる（Zambrowicz BP et al, Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Apr 15; 94(8): 3789-94）。細胞特異的調節配列の活性を評価するときは中立部位が有利であるが、多くの場合は導入遺伝子の転写を許容する許容部位が望ましい。
【００４３】
本発明の非近交系マウスＥＳ細胞は、場合により１つ以上の付加的な遺伝的改変または変異（例えば、導入遺伝子導入部位の組込みに加えて）を含む。また、用いられる非近交系ＥＳ細胞は、非変異体（得られた後、遺伝的改変または変異を含むように改変されてはいない）であってもよい。非近交系ＥＳ細胞中に存在することのできる付加的な遺伝的改変または変異には、遺伝子導入（ｃＤＮＡ、遺伝子またはその一部）、変異（標的にされたまたはランダムな）、条件付変異、外来遺伝子の標的挿入（targeted insertion）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）やバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）の大きさの遺伝子導入、染色体の全部または一部、が含まれ（これらに限定されない）、また、これらは、胚と同じ種またはヒトのようなその他の種由来のものであってもよい。それらには、遺伝子の全部または一部の物理的ノックアウト、遺伝子の機能的ノックアウト、機能的遺伝子の導入、およびＥＳ細胞中に存在する遺伝子の発現の機能/発現レベルを変化させるようなＤＮＡまたは遺伝子の一部分（例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、または転写後発現を妨害するアンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡ（interfering RNA）をコード化する遺伝子の一部分）の導入が含まれる。非近交系ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡで行われる改変は、他の種（例えばヒト）で生じるような条件に類似した（よく似た）表現型を生成するように選択することができ、その結果、変異動物がそのような条件のモデルを提供することができる。
【００４４】
本発明のＥＳ細胞系統の作製に用いられる交配の仕方によって、それらの系統は、それらの由来となる多数の系統の間で共通のものもあれば異なるものもある対立遺伝子について、同型接合性のものもあれば異型接合性のものもある。そのようなＥＳ細胞のパネル（panel）中の様々な対立遺伝子の分布を確定した後、系統特異的な遺伝子型のマーカーを用いて、この技術は、挿入された導入遺伝子の発現特性または表現型結果への改変遺伝子座の効果を明らかにし評価する機会を提供することができる。
【００４５】
非近交系ＥＳ細胞の使用
本明細書に記載の本発明はさらに、トランスジェニックマウスの作製方法およびそれにより作製されるトランスジェニックマウスに関する。そのようなマウスは、求めるトランスジェニック哺乳動物を作製するために繁殖させるキメラ動物を作製する中間ステップを伴っても伴わなくても作製する事ができる。
【００４６】
一態様において、ＥＳ細胞由来マウスを作製する方法は、本発明のＥＳ細胞を胚（少なくとも１つの胚／１つ以上の胚）が作製される結果となる条件下でマウス胚盤胞に導入すること、および作製した胚を偽妊娠の雌のマウスのような適切な養母に移植することを含む。養母はその後、生きた出生児の発生に繋がる条件下に維持され、マウスが作製される。作製されるマウスは、単一接合体（ＥＳ細胞を発生させたもの）由来となる。そのようなマウスを本明細書では「ＥＳマウス」または「ＥＳ細胞由来マウス」と呼ぶ。
【００４７】
キメラの多くは、１００％またはほぼ１００％ＥＳ細胞由来と思われる。この結論は、複数の観察に基づいて導き出される：i）レポーターコンストラクトによる均一な標識により明らかになる導入遺伝子発現組織の観察、ii）１００％アグーチにより明らかになる外皮の起源の観察、およびiii）１００％ＥＳ細胞由来の子により明らかになる配偶子起源の観察。用意したキメラの全てが非近交系ＥＳ細胞系列により占められているわけではないが、一腹の子にはこの記載に適合するキメラが通常１体以上含まれる。したがって、発生に関して減弱された（例えば、四倍体）胚をホストまたはパートナーとして用いてトランスジェニックマウスを作製するというさらなる困難を伴わずに、トランスジェニックマウスへ早期に到達することができる。
【００４８】
二倍体および四倍体の胚盤胞を含む胚盤胞中へ非近交系ＥＳ細胞を導入するには、様々な方法を用いることができる。非近交系ＥＳ細胞と二倍体胚盤胞とから得られたキメラにおいて、本発明のＥＳ細胞は、他の細胞（例えばＦｌ細胞）が四倍体の胚とともにキメラを作製するときに用いられたとき観察されるものと幾分近い挙動を示すことがわかった。したがって、本発明のＥＳ細胞は、四倍体のパートナーと共に用いることができるが、それはＥＳ細胞キメラの作製には必ずしも必要ではない。むしろ、四倍体のパートナーを作製するステップを完全に回避することができる。
【００４９】
一態様において、非近交系マウスＥＳ細胞は、非近交系ＥＳ細胞を胚盤胞中に注入することにより、例えばマイクロインジェクションにより、胚盤胞中に導入される。一方、胚盤胞へのＥＳ細胞の導入を容易にするその他のいかなる方法をも用いることができる。
【００５０】
四倍体胚盤胞を用いる場合、公知の方法、例えばジェームス（James）およびその共同研究者らが記載している方法により四倍体胚盤胞を作製することができる（James, R. M. et al. (1992) Genet. Res. Camb., 60: 185.）。Wang, Z-Q et al, Mech. Dev., 62: 137 (1997)およびその中に引用されている参照文献も参照。
【００５１】
本発明の別の態様において、キメラの胚を作製するために、ＥＳ細胞を１つ以上の移植前胚、通常は桑実胚、とインビトロで凝集させることができる。胚はその後養母としての役割を果たす偽妊娠マウスに移植される。得られるキメラの子は、その組織中に元の胚からおよびＥＳ細胞から由来する互いに異なる数の細胞を有する。本発明のＥＳ細胞を用いてこの方法を実行すると、キメラマウスを作製するのに効果的であることが証明された。
【００５２】
一例として、ｌａｃＺレポーターコンストラクト（導入遺伝子）を含む２つの異なる種類のＨＰＲＴ（ＮＦＨｉ−４および１３１ｂｐ−５と命名されている）のいずれか１つを有するＢＰＥＳ−５クローンは、Ｃ５７Ｂｌ／６桑実胚との凝集、胚盤胞までの培養、および偽妊娠の雌への移植の後、両方共に１００％アグーチ毛色の雄のキメラを生み出した。この結果は、ＢＰＥＳ−５細胞は、トランスフェクション、ＨＰＲＴ遺伝子座における相同組換え、引き続くＨＡＴ培地での選択、桑実胚との共培養（凝集）、および移植の前の少なくともさらに１日間の培養（胚盤胞が形成されるまで）に耐えることができること、および、この胚盤胞注入法以外の方法を用いて作製したキメラにおいて優勢であるのに十分な発生能を維持していることを示している。
【００５３】
雄の野生型ＨＰＲＴ ＥＳ細胞系統ＢＰＥＳ−７およびＢＰＥＳ−９は、共に１００％アグーチ外皮を有する雄のキメラ（２００３年６月１４日、帝王切開により誕生）を生み出した。この結果は、本発明による非近交系ＥＳ細胞は、ＨＰＲＴの欠失が無くても、Ｃ５７Ｂｌ／６近交系系統からの桑実胚を用いて、インビトロで凝集させることによって得られたキメラの中で優勢であり得るほど優れた発生能を維持していることを示している。
【００５４】
別の態様において、本発明は、（i）１つ以上のＤＮＡコンストラクト配列をＥＳ細胞に導入すること、（ii）１つ以上のＤＮＡコンストラクト配列がＥＳ細胞のゲノム中に組込まれるように、導入遺伝子導入部位での相同組換が生じる条件下でＥＳ細胞を維持すること、（iii）作製した遺伝子組換えＥＳ細胞を、胚（少なくとも１つ／１つ以上の胚）が作製される結果となる条件下で胚盤胞に導入すること、および（iv）作製した胚を、適切な養母、例えば偽妊娠の雌に移植すること、によってトランスジェニックマウスを作製する方法である。移植された雌を生きた出生児の発生に繋がる条件下に維持し、トランスジェニックＥＳマウスを作製する。
【００５５】
コンストラクトは、標準的なトランスフェクションの技術を用いて本発明の非近交系ＥＳ細胞中に導入される。本発明の特定の態様において、トランスフェクションはエレクトロポレーションによって実行される。本発明による非近交系マウスＥＳ細胞中にＤＮＡを導入するためのエレクトロポレーションの使用については、ｌａｃＺレポーター遺伝子を含むマウスＥＳ細胞の作製に詳しく言及しながら、実施例３で詳述する。
【００５６】
トランスフェクションのその他の方法としては、リン酸カルシウムおよび様々な脂質が媒介する方法がある。加えて、多数のウィルスベクターが、導入遺伝子または導入遺伝子の組み合わせの導入に効果的であると知られている。実際の挿入現象（相同組換えまたはランダム挿入）は、さらなる実験的介入が無くても起こる。
【００５７】
本発明による非近交系ＥＳ細胞を用いてトランスジェニックマウスを繁殖可能に生み出すことができ、これらのトランスジェニックマウスは、動物の病気モデルとして、遺伝子機能の研究用、調節ゲノム科学（regulatory genomics）の研究用、タンパク質の生産用などに用いることができる。本発明による非近交系ＥＳ細胞および方法により、変異マウスを迅速かつ経済的に生産できる可能性、および変異胎児や変異動物に迅速に到達できる可能性が提供され、このことは哺乳類生物学の分野の研究にとって大きな利益となる。
【００５８】
調節ゲノム科学では、本発明のＥＳ細胞を、異なるコンストラクトを直接比較できるようなレポーターコンストラクトに、推定される調節配列を含むように制御されたつくり（fashion）に適合させることができる（Denarier, et al. 投稿中）。そのような研究の結果を以下の実施例１０に示す。
【００５９】
特に定義がない限り、本明細書に用いられている全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術者によって普通に理解されているものと同じ意味を持つ。本発明で参照した全ての文献は、本明細書中に参照文献として全て組み込まれている。
【００６０】
本明細書に記載されている本発明のより良好な理解を得るために、以下の実施例が提示される。これらの実施例は例示する目的だけのためのものであることが理解されねばならない。したがって、実施例は決して本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６１】
実施例１：ＥＳ細胞系列の誘導の過程
道具と材料：
交尾後３.５日（３.５ｄｐｃ）妊娠マウス
解剖顕微鏡
Ｍ２およびＭ１６培地
引き伸ばしたパスツールピペット、ギルソンＰ２００ピペット用チップ
ＭＥＦ（マウス胎児繊維芽細胞）フィーダーで被覆された組織培養プレート（４ウェル、９６ウェル、４８ウェル、２４ウェル、１２ウェル、６ウェル、１００ｍｍ）
ＣａおよびＭｇを含まないＰＢＳ（リン酸緩衝液）
０.２５％トリプシン／０.１％ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液
高濃度グルコース、Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）
ＥＳ細胞用２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）
１００μＭ非必須アミノ酸
１ｍＭピルビン酸ナトリウム
１００μＭ β−メルカプトエタノール
ゲンタマイシン
ＬＩＦ（白血病阻害因子） ２,０００Ｕ／ｍＬ
【００６２】
手順
−０日
４ウェルプレートの培養用ウェルの培地を、調製したばかりのＥＳ培地と交換した。Ｍ２培地を用いて３.５ｄｐｃ胚を子宮角から抜き取った。Ｍ２培地で胚盤胞を数回洗浄した。胚がまだ桑実胚期であれば、それを数時間または一晩Ｍ１６培地中で胚盤胞期に到達するまで培養した。１ウェルにつき１個の胚盤胞を、引き伸ばしたパスツールピペットを用いて、好ましくは穴の中央に移し入れた。今後の作業を無菌状態で行うため、層流フード内に、またはベンチ内でブンゼン／エタノールバーナーの隣に解剖顕微鏡を設置した。
【００６３】
胚盤胞を、最初の４８〜７２時間は３７℃、５％ＣＯ２で静かに培養した。この間、胚盤胞は、透明帯から孵化し、付着し、成長した。
【００６４】
−３〜７日
４８〜７２時間後、最初の解離処理（通常、プレーティング後５〜７日）に適したＩＣＭの正確な発生段階を判断するため、培養物を毎日観察した。ＩＣＭ由来凝集塊のサイズは異なる胚の間で常にばらつきがあるので、これらの凝集塊は別々の日に解離させる必要が時々あった。解離に適したＩＣＭの発生段階は、十分に大きいが、未分化でなくてはならない。新鮮なフィーダー付きの９６ウェルプレートを、あらかじめ２４時間前に準備した。
【００６５】
各ウェルを別々に作業し、一度に行う作業も４ウェル以下にした。これは、トリプシン中で長時間インキュベートするのを避けるためである。
【００６６】
胚盤胞がフィーダー付のウェルに置かれている場合、以下の手順を実行した。
１．４つのウェルから培地を吸引した；
２．各ウェルを０.５ｍＬのＰＢＳで洗浄した；
３．各ウェルに３０μＬの０.２５％トリプシン／０.１％ＥＤＴＡ溶液を加えた９６ウェルＵ底プレートを準備した；
４．細く引き伸ばしたパスツールピペットを用いて、ＩＣＭ凝集塊の周りをゆっくりと回し、それを栄養膜細胞から取り除き、トリプシン中に入れた；
５．３７℃で１０分間インキュベートした；
６．各ウェルに３０μＬの培地を加え、トリプシン活性を停止させた；
７．容量２００μＬの毛管ピペットを用いて、ＩＣＭをより小さい凝集塊（１凝集塊に細胞約３〜４個）に分解した；
８．ＥＳ培地を含む９６ウェルプレートの新しいフィーダー付のウェルに細胞懸濁液を移した；
９．残りの胚についても上記手順を繰り返した；
１０．一晩インキュベートした後、培地を交換した。
【００６７】
−８〜１４日
ＥＳ細胞様のコロニーができているかについて、フィーダー付のウェルを観察した。コロニーにマークを付け、その成長を毎日監視した。次の手順に従って、ＥＳ細胞様コロニーをトリプシン処理し、新たなフィーダー上に置いた。
１．ウェルから培地を吸引した；
２．５０μＬのＰＢＳで洗浄した；
３．５０μＬのトリプシンを加え、３７℃で１０分間インキュベートした；
４．各ウェルに５０μＬの培地を加え、トリプシン活性を停止させた；
５．細胞の凝集塊をピペッティングによって分解した；
６．各ウェルの全内容物を４８ウェルプレートの新しいフィーダー付のウェルに移した；
７．一晩インキュベートした後、培地を交換した。
【００６８】
−１５〜２１日
上記の手順を、ウェルのサイズを徐々に大きくしながら必要な回数繰り返した。ＥＳ細胞は、滑らかな輝く縁と、複数の核を持つ見分けのつかない細胞とを有する周密なコロニーを形成した。それらはしばしばウェルの周辺部に形成された。ＥＳ細胞がウェルの中でコンフルエントに近づいたとき、ＥＳ細胞を６ウェルプレートの新しいフィーダー付のウェルに移し、それを「継代１」の段階であるとした。毎日培地を交換し、必要なときは細胞をより大きなプレートへ移した。各細胞系統を特徴付けし、標準的なＥＳ細胞凍結方法によって凍結バイアル中で凍結した。
【００６９】
実施例２：ＥＳ細胞系統の誘導
雑種強勢を最大限にし、それによって生じるＥＳ細胞系統の発生能を最大限にするために、多数の近交系マウス系統間に存在する対立遺伝子の差異を胚盤胞中に導入するように、交配を設計した。具体的には、１２９亜系統およびＣ５７Ｂｌ／６近交系系統である。リコンビナント近交（ＲＩ）系を得るときに大きな損失があるため、系統間対立遺伝子の全ての組み合わせが存続するわけではないことが、何十年も前から知られている。したがって、ＥＳ細胞の発生能を促進する対立遺伝子の組み合わせか、減弱する対立遺伝子の組み合わせかを選択するために、ＢＰＥＳ細胞系統を樹立する胚盤胞を数世代繁殖した。多数の世代に渡って交配することにより、配偶子形成および受精能力のレベルでの生存能力および適応度、それに引き続く胚の生存能力、子宮外での（ex utero）成長、および成長したマウスの繁殖力などに対する生物学的選択の多数の機会を導入した。
【００７０】
以下のことが認められた。
１）「１２９」系統の胚盤胞からＥＳ細胞を比較的容易に得ることができる。
２）初期継代ＥＳ細胞系統の一般的特性はキメラに強く寄与できる能力である。
３）交雑細胞系統（例えば、Ｒ１）は、二倍体胚盤胞へ注入した場合、または二倍体細胞との凝集キメラにした場合、良好な発生能を示す。
４）交雑細胞系統（例えば、Ｒ１）は、四倍体胚盤胞へ注入した場合、または四倍体細胞との凝集キメラにした場合、良好な発生能を示す。
５）交雑細胞系統（例えば、Ｒ１）は、核クローニングを行った場合、近交系系統（例えば、１２９／Ｏｌａ）から誘導されるＥＳ細胞系統より、発生をサポートする。
【００７１】
ＥＳ細胞は、繁殖によって広範な異型接合性が導入された胚盤胞から得られたもので、ＨＰＲＴ遺伝子座における既存の欠失を含んでいる。１９９６年にブロンソン（Bronson）らは、優れた発生能を有するＨＰＲＴ欠失ＥＳ細胞を得ることによって、制御下における遺伝子導入方法に新しいレベルの効率が導入されると報告している（Bronson et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9067-9072）。そのように異型接合性の細胞を増殖させることで、キメラを得ること、および導入遺伝子を含むＨＰＲＴを有する系統を樹立することが、より迅速でより低コストなものとなる。
【００７２】
ＢＫ４と命名された既存のＨＰＲＴ欠失ＥＳ細胞系統は、Ｅ１４ＴＧ２ａのサブクローンである（Hooper et al., Nature 1987 Mar 19-25; 326 (6110): 292-5）。Ｅ１４ＴＧ２ａ細胞は、１２９系統マウスの１２９／Ｏｌａ亜系統から得られたものである。ＢＫ４細胞をマイクロインジェクションによってＣ５７Ｂｌ／６胚盤胞中に導入し、得られた雄のキメラを雌のＣ５７Ｂｌ／６と交配させた。ＥＳ系統の精子により受精させたＣ５７Ｂｌ／６の卵子から雌の子を得た。そのようにして得られたＢ６１２９Ｆ１マウスを、毛色がアグーチであることで識別し、Ｃ５７Ｂｌ／６または１２９／Ｊ近交系系統の雄のマウスに戻し交配した。続く世代（およびＨＰＲＴ欠失の組込み）へ繋がる交配の模式図の概要を図２に示す。
【００７３】
ＨＰＲＴ欠失を有する５つの雄のＥＳ細胞系統（ＢＰＥＳ−４、−５、−８、−１０および−１２と命名されている）を、異なる１２９亜系統１２９ＳＶＰＡＳＬＣＯＣＲＬＢＲの精子で受精させた卵子から回収した。したがって、これらのＥＳ細胞系列は、３つの近交系の系統（すなわち、Ｃ５７Ｂｌ／６、１２９／Ｏｌａおよび１２９ＳＶＰＡＳＬＣＯＣＲＬＢＲ）由来の対立遺伝子を特異な組み合わせで保有する。引き続く調査によって、この方法で得られた系統のいくつかは、上記のような細胞を野生型Ｃ５７Ｂｌ／６胚盤胞中に注入するかまたは野生型Ｃ５７Ｂｌ／６桑実胚と凝集させることによって作製したキメラにおいて、前例のない発生能を示すことが明らかとなった。特に、このような細胞を標準的な胚盤胞への注入方法に用いた場合に発生するキメラの内のいくつかは、四倍体の胚とＦ１ＥＳ細胞とを凝集させることで得られたキメラ、または四倍体の胚盤胞中に注入されたＦ１ＥＳ細胞から得られたキメラについての報告とＥＳ系列の構成が類似しており、このようにして作製・研究されたキメラでは、その毛色は、多くの場合は優勢であるかまたはＥＳ系列から排他的に得られるものである（ＥＳ寄与は、Ｃ５７Ｂｌ／６胚盤胞からの黒色すなわち非アグーチ色に対するアグーチ色である）。そのようなキメラのいくつかはＥＳ系列の精子由来の子だけを生む。また、Ｔａ１またはＭＢＰによって調節されるｌａｃＺレポーター遺伝子から成る導入遺伝子を有するキメラ中で観察される導入遺伝子の発現パターンは、ニューロンまたはオリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞の（各々の）系列が、ほぼ１００％または１００％ＥＳ細胞由来であることと一致している。このように、これら多数の異型接合性のＥＳ細胞系統は、同等の成功のレベルを有する野生型Ｃ５７Ｂｌ／６二倍体細胞に匹敵する能力があり、または四倍体胚（桑実胚または胚盤胞）と組み合わせて用いられたＦ１交雑細胞についての報告に匹敵する。毛色のキメラ化を示すいくつかのＢＰＥＳ−Ｃ５７Ｂｌ／６キメラによって明らかなように、キメラ組織に対する排他的なまたは１００％に近い寄与は、全てのキメラにおいて観察されるわけではない。また、胚盤胞注入により作製したいくつかの四倍体−ＥＳキメラにおいても、いくつかの組織は四倍体胚盤胞からの検出可能な寄与を含むことは注目すべきである（Wang, et al. (1997) Mech. Dev. 62: 137-145）。
【００７４】
多数のＢＰＥＳ細胞によって示された雑種強勢は、近交系系統１２９／Ｏｌａ、１２９ＳｖＰＡＳ、１２９／ＪおよびＣ５７Ｂｌ／６Ｊの内の２つまたは３つを含む交配プログラムおよび複数世代に渡る交配を用いることによって達成される。ＨＰＲＴ導入部位を有する雄のＢＰＥＳ細胞系統（系統４、５、８、１０、１２）を生じさせる胚盤胞の一方の親が、１２９ＰＡＳ近交系系統の雄であったのに対し、その他の親は、Ｃ５７Ｂｌ／６、１２９／Ｏｌａおよび図２にその概要が示されるそれらの派生動物の間で多数世代に渡る交配の結果得られる異型接合性を増加させた雌であった。３つの近交系系統を含む交配プログラムによって得られる、さらなるＢＰＥＳ細胞は、野生型の雄の系統６、７および９である。ＨＰＲＴ導入部位に対して異型接合性である雌の系統１および３、ならびに導入部位を有する雄系統＃２は、２つの近交系系統、１２９／ＯＬＡおよびＣ５７Ｂｌ／６を含む交配プログラムから回収された胚盤胞から得られた。本明細書に記載の発生能の大部分の特徴づけは系統４〜１０を用いてなされた。導入遺伝子を導入したＨＰＲＴを有する上記系統の全ての評価は、系統５に対して行われたものである。
【００７５】
実施例３：ＥＳ細胞系統の特徴づけと使用
本明細書の態様による様々なＥＳ細胞系統は、上述のように得られ、それぞれＣ５７Ｂｌ／６の対立遺伝子と１２９の対立遺伝子とを独自の組み合わせで有する。ＢＰＥＳ−１〜ＢＰＥＳ−１２と命名されたこれらの細胞系統は、Ｃ５７Ｂｌ／６胚盤胞中へのＥＳ細胞の注入により作製したキメラにおいて優れた発生能を示した。作製したキメラは、しばしば１００％ＥＳ細胞由来の毛色を示した。同様に、そのようなキメラの生殖系列は、ＥＳ系列により占められているように思われた。４つのＢＰＥＳ−２を含むキメラからおよび２つのＢＰＥＳ−５を含むキメラから最初の交配で得られた新生児または胎児５８匹のうち、５６匹がＥＳ系列の配偶子由来のものであった（図３）。
【００７６】
これらのＥＳ細胞を得るために、Ｘ連鎖性のＨＰＲＴ遺伝子座の欠失を含むストックを、Ｂ６／１２９または１２９近交系の隔離した遺伝的背景上で発生させた。ＨＰＲＴ欠失は、コンストラクトを単一コピーかつＨＰＲＴのコード配列の５’側の正確な位置に公知の向き（known orientation）で挿入するという遺伝子導入を制御する方法をサポートする（Bronson et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9067-9072）。Ｃ５７Ｂｌ／６および１２９の対立遺伝子の混ぜ合わせ（mix）を有する胚盤胞を得るために、多数の交配計画が用いられた。これらの交配計画は、図２に示し、実施例２に記載した。
【００７７】
「混ぜ合わされた（mixed）」遺伝的背景のＥＳ細胞の系統は、全て培養で良好に成長する（図４）。この細胞は、確実にトランスフェクトすることができ、凍結・解凍しても、そして（導入遺伝子挿入に至る相同組換えによって）ＨＰＲＴ遺伝子座の回復に引き続くヒポキサンチン/アミノプテリン/チミジン（ＨＡＴ）培地中でのクローン選択後でも頑強な発生能を維持できる（図５）。
【００７８】
トランスジェニック作製にこれらの細胞を適用することは、次のような複数の実用的利点を提供すると思われる。
【００７９】
１）標準的なトランスフェクションのプロトコールにより、多数のクローンが回収される（標準的なトランスフェクションの条件は次の通り：回収の２〜４時間前に対数増殖中のＥＳ細胞の培養物（〜８０％コンフルエント）を仕込む（feed）。細胞をＰＢＳで２度洗浄する。細胞を８〜１０分間トリプシン処理し、トリプシンの活動を抑制するために培地を添加し、細胞をピペット中で上下させて単一細胞懸濁液を作製する。細胞を１１００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかける。上清をアスピレータで吸引し、細胞を８×１０６細胞個/ｍＬ（この数字は研究室によって異なる）の密度で冷ＰＢＳに再懸濁する。注釈：通常の収率は３×１０７細胞個/１０ｃｍ皿である。直鎖ＤＮＡ４０μｇをエレクトロポレーション用キュベット（バイオ・ラッド、カタログナンバー １６５−２０８８）中の細胞懸濁液０.８ｍＬに混合する。バイオ・ラッド製ジーンパルサー（GenePulser）を２４０Ｖ、５００μＦに設定する。キュベットをエレクトロポレーションチャンバーに入れ、パルスを出力する。パルスを掛けた後、キュベットを氷上に２０分間放置する。各キュベットの全内容物をフィーダー付きの１０ｃｍ皿上に移す（いくつかの研究室ではフィーダーなしの皿を好んで選択している）。フィーダー皿上の培地を予熱された非選択性ＥＳ培地に変換しなければならない）。
２）この細胞の頑強な発生能は、迅速で優れたトランスジェニック作製計画をサポートする。
３）ＥＳ由来精子で卵子を受精させることによってＥＳ遺伝子型を１つ以上伝達するためには、少数のキメラを作製すれば良い。
４）キメラにおけるＥＳ細胞の優勢は、直接キメラの組織からの有意義な定性的研究（例えば、ｌａｃＺレポーター遺伝子の分析）および定量分析（例えば、蛍光レポーター遺伝子発現に基づくＦＡＣＳ分析）をサポートする（図６）。
【００８０】
導入遺伝子発現の特徴づけ
９.４ｋｂのＭＢＰの５’側フランキング配列を改変型緑色蛍光レポーター遺伝子とライゲートし、ＨＰＲＴターゲッティングベクター中に導入し、ＢＫ４ ＥＳ細胞にトランスフェクトした。ＨＡＴ選択培地耐性のクローンを回収し、Ｃ５７Ｂｌ／６胚盤胞に注入してキメラを作製した。そのようなキメラを偽妊娠の雌に移植し、続いて成熟させた。
【００８１】
麻酔性の「アベルチン」を致死的に注射することによって１匹のキメラを犠牲にし、平衡塩類溶液で経心的に灌流した。続いて、神経系を回収し、脳を組織破壊およびパーコール密度勾配遠心することでオリゴデンドロサイト濃縮細胞懸濁液を回収した（Afshari et al. J. Neurosci Res. 2002 Jan 15; 67(2): 174-84に記載の手順）。この懸濁液をｅＧＦＰタンパク質からの蛍光を検出し記録するＦＡＣＳ装置を用いて分析した。野生型マウスから同様に調製した細胞懸濁液と比較すると、キメラのｅＧＦＰ発現細胞から記録される特定のシグナルを示す右側領域へ、シグナルが広く拡張していた。同じキメラからの脊髄をスライドガラス上にマウントし、ｅＧＦＰからの蛍光を検出できる蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ミエリンを有するオリゴデンドロサイトに典型的な明瞭な標識像が観察された。このキメラはブロンソン（Bronson）らが１９９６年に記載したＢＫ４ ＥＳ細胞系統で作製しており（Ｃ５７Ｂｌ／６胚盤胞に注入）、ＥＳ細胞系列の外皮（毛色で判断）、オリゴデンドロサイト系列（ｅＧＦＰ発現オリゴデンドロサイトの発見頻度の低さで判断）および生殖系列（キメラがＥＳ由来精子を伝達できないことで判断）への寄与が低かったことは注目すべきである。
【００８２】
導入遺伝子作製の日程
原理実験の総合的検証を２００３年１月〜３月に行い、その際、ＤＮＡのトランスフェクションからＥＳ細胞が優勢なキメラの誕生までの日程を３２日以下で達成した（図７）。系統５のＢＰＥＳ細胞を、図中に指摘し、上述したようなＨＰＲＴターゲッティングコンストラクトの１つでトランスフェクトした。通常の培養培地で１日培養した後、ＨＰＲＴ遺伝子座が修復した細胞を、ＨＡＴ培地を用いて選択した。トランスフェクションから９日または１１日後、クローンを回収し、拡げた。そして、トランスフェクションから１２日または１４日後、回収したクローンからの細胞を胚盤胞に注入してキメラ胚を作製し、作製したキメラの胚を子宮内（in utero）で発生させるために偽妊娠の雌に移植した。導入遺伝子を有するＥＳ細胞が優勢な新生出生児を、ＨＰＲＴターゲッティングコンストラクトＤＮＡのトランスフェクション後２９日〜３２日の間に回収した。
【００８３】
実施例４：導入遺伝子の再ターゲッティング
ＢＰＥＳ−６細胞中の野生型ＨＰＲＴ遺伝子座を再ターゲッティングし、ＨＰＲＴに対する６チオ-グアニン（６Ｔ−Ｇ）選択の後、１つのクローンを回収した。このクローンの派生物を注入したＣ５７Ｂｌ／６胚盤胞から生まれたマウスは、２００３年５月２６日に生まれた。生きて生まれた１１匹の内、８匹は排他的にＣ５７Ｂｌ／６由来であることを示す黒色であった。残り３匹がキメラであった。１匹は雌で５０％アグーチ毛色を有し、１匹は雄で９５％アグーチ毛色を有し、１匹は雄で１００％アグーチ毛色を有していた。この結果は、野生型ＨＰＲＴ対立遺伝子を含む雄のＢＰＥＳ−６細胞を、６Ｔ−Ｇ含有培地を用いることでＨＰＲＴ酵素活性の欠失について選択できること、および、生き残ったクローンは、Ｃ５７Ｂｌ／６胚盤胞中へのＥＳ注入から得られるキメラにおいて、頑強な発生能を有することを示している。
【００８４】
実施例５：桑実胚凝集
胚盤胞にＥＳ細胞を注入する方法は、ＥＳ細胞をキメラ中に導入してＥＳ細胞をその後の胚や出生後のキメラで優勢にさせる方法として、桑実胚とＥＳ細胞とを凝集させる方法より効果的であると広く考えられている（１００％ＥＳ細胞キメラを得るための「四倍体胚盤胞注入」対「四倍体桑実胚との凝集」の適用参照）。したがって、従来、一定の環境下において、そのようなマウスを凝集法を用いて得ることができなかったので、１００％ＥＳ細胞由来マウスの作製はしばしば胚盤胞注入法に依存してきた。
【００８５】
ｌａｃＺレポーターコンストラクトを有する２つの異なるＨＰＲＴ（ＮＦＨｉ−４および１３１ｂｐ−５と呼ぶ）のいずれかを有するＢＰＥＳ−５クローンは共に、Ｃ５７Ｂｌ／６桑実胚と凝集させ、胚盤胞まで培養し、移植することで、１００％アグーチ毛色を有する雄のキメラを生み出した。この結果により、ＢＰＥＳ−５細胞は、トランスフェクション、ＨＰＲＴ遺伝子座における相同的組換え、引き続くＨＡＴ培地における選択、桑実胚との共培養（凝集）および移植前に少なくともさらに１日間の培養（胚盤胞形成まで）に耐えることができ、この胚盤胞注入法ではない方法で作製されたキメラで優勢であるための十分な発生能を維持できることが示された。
【００８６】
雄の野生型ＨＰＲＴ ＥＳ細胞系統のＢＰＥＳ−７およびＢＰＥＳ−９もまた共に、上記凝集法を用いて１００％アグーチ毛色の雄キメラを生み出した（帝王切開により２００３年６月１４日出生）。この結果により、多数のＢＰＥＳ細胞系統は、Ｃ５７Ｂｌ／６近交系系統の桑実胚とのインビトロ凝集法により得られたキメラの中で優勢であり得るような優れた発生能を維持すること、およびＨＰＲＴの欠失（導入遺伝子導入部位）はこの発生能には必要でないことが示された。
【００８７】
実施例６：導入遺伝子の発現
ＭＢＰおよびｔａ１をプロモーターとするｌａｃＺレポーターコンストラクトの発現パターンを１００％アグーチ毛色のキメラで分析した。導入遺伝子を発現する細胞の分布は、主として（より適切には、排他的に）ＥＳ細胞系列由来のそのようなマウス中のオリゴデンドロサイト、シュワン細胞および神経細胞の細胞群と一致する。このことは類似のキメラにおける外皮および生殖系列のＥＳ起源と一致する。
【００８８】
ｌａｃＺレポーターコンストラクトを結合したＨＰＲＴを有するＥＳ細胞を含むキメラにおけるβ−ガラクトシダーゼ活性の組織化学的検出。組織化学的染色は以前記載したように行った（Forghani et al (2001) J. Neuroscience）。手短に言えば、マウスを麻酔し、０.５％パラホルムアルデヒド溶液および２.５％グルタルアルデヒド（０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.４））を経心的に灌流した。１時間の後固定に続き、ホールマウント標本または組織切片を、５ｍｍフェリシアン化カリウム、５ｍｍフェロシアン化カリウム、２ｍｍ塩化マグネシウム、０.０２％ノニデットＰ−４０および０.４ｍｇ／ｍＬブルオーガル（シグマ）を含む染色溶液中で、３７℃でインキュベートした。染色したホールマウント標本および組織切片をワイルドＭ５Ａ実体顕微鏡（wild M5A stereomicroscope）で観察した。
【００８９】
実施例７：比較研究
図９に表される表は、ＢＫ４細胞を用いて７つのコンストラクトをトランスジェニック系統中に配置しようと、およびＢＰＥＳ−５細胞を用いて７つのコンストラクトをトランスジェニック系統中に配置しようと試みた研究の結果を要約したものである。
【００９０】
ＢＫ４細胞の場合、生殖系列を継代させる機会を最大限にしようと努力する場合、１コンストラクトあたり平均して３つの独立したＨＡＴ耐性のＢＫ４クローンをキメラを作製するために用いた。対照的に、ＢＰＥＳ−５細胞を用いるときは、１コンストラクトあたり、わずか１つのコンストラクト保有クローンを用いた。生殖系列を継代させる機会を最大限にしようという試みにおいてもまた、可能な限り多くのＢＫ４由来キメラを交配させた。対照的に、ＢＰＥＳ細胞由来の１匹の優れたキメラ（毛色に基づく）は、導入遺伝子を子（通常最初の一腹）に伝えるのに１匹で十分であった。加えて、交配させたキメラの４４％（１００％ＥＳ由来のものから選択されたものが全てではない）が完全にＥＳ系統に由来する精子由来の最初の一腹の子を産んだ。
【００９１】
相対的労力（時間と費用）の大雑把な見積もりを細胞の２つの型の比較の下に示す。唯一または優勢にＥＳ細胞を含むキメラの分析への迅速な到達およびＤＮＡからトランスジェニック系統まで行くのに必要な時間の短縮などの、本発明のＥＳ細胞によって提供される付加的な利点についてはこの見積もりに反映していない。
【００９２】
実施例８：キメラの作製
１３１の異なるクローンから４７７匹のキメラを得た。ＥＳ細胞系列の高い寄与を示すように、キメラは、典型的に１００％アグーチの毛色（図１０）、標的細胞群の大部分におけるレポーターコンストラクトの発現（例えば、Farhadi et al. (2003) J. Neuroscience 23(32): 10214-10223の図６）、最初の一腹の子のうち８９.４％で見られた生殖系列の伝達、および、移植を受けた雌の胚盤胞の６０％で性転換が生じると予測される通りのキメラの性別比、を有していた。。
【００９３】
本発明のＥＳ細胞からの高いＥＳ細胞系列寄与は、本明細書記載のＢＰＥＳ細胞を用いて商業的トランスジェニック作製事業を行っているニュークライス有限会社（Nucleis, SA）が報告した生産業務中にも観察されている。
【００９４】
実施例９：ＨＰＲＴ以外の遺伝子座における相同遺伝子組換え
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子座の５’側フランキング配列中の調節モジュール（Ｍｏｄ３）を標的とするために、ＨＰＲＴ欠失を欠くＢＰＥＳ−６細胞を用いた。Ｍｏｄ３ターゲッティングベクターは、相同な４.６Ｋｂ右腕および３.７Ｋｂ左腕を有していた。
構造：左腕、ＬｏｘＰ−モジュール−ＬｏｘＰ、ｐｇｋＮｅｏＬｏｘＰ、右腕、ｐｇｋＴＫ
【００９５】
ベクターをエレクトロポレーションのために直鎖化し、４０μｇ（０.４５μｇ／μＬ）のＤＮＡを、２４０Ｖ；５００μＦ；４ｍｍのキュベットおよび８×１０６個の細胞を用いてエレクトロポレーションにより導入した。選択はトランスフェクション後２日目に、２５０μｇ／ｍＬのＧ４１８＋２×１０−６Ｍのガンシクロビルを用いて始めた。３５のクローンを選択８日目に回収した。
【００９６】
診断用サザンブロット分析の結果、３つのクローンが期待されたターゲッティング現象（targeting event）陽性であった。標的ＥＳクローンを有するキメラが得られた。
【００９７】
この研究は、本発明のＥＳ細胞は、内在性の部位、この場合はＭＢＰ５’側フランキング配列、における相同組換えをサポートできることを示している。
【００９８】
実施例１０：ＥＳ細胞の適用
方法：
導入遺伝子を有するＨＰＲＴのコンストラクトの作製：
ＭＢＰ−９.５ｋｂおよび−９.０ｋｂは、"Farhadi 2003"に記載されている。クローン−８.９ｋｂのＳａｃII部位の上流にＰＣＲ産物８０ｂｐを付加してコンストラクト−９.０８ｋｂを作製した（図１Ｂ参照）。まず、Ｍｏｄ４サブフラグメントをクローニングするために、ｈｓｐ−ＬａｃＺをｐＥｎｔｒｙ１ａベクター（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、ｈｓｐ−ＬａｃＺ ＸＳエントリーベクターを作製した。ＳＣＥ１サブドメインをｈｓｐプロモーターの上流に内在性ＭＢＰとは逆向きにライゲートした。エントリーベクターは、ＬＲ組換え反応キット（ストラタジーン社）を用いて行われる、ＨＰＲＴ遺伝子座の相同腕（homology arm）を含むＨＰＲＴデスティネーションベクターにおけるインビトロの組換えに用いられる。最終デスティネーションベクターを増幅し、イントロンを超えて配列決定し、ＡｇｅＩによって直鎖化したもの２５〜４０μｇを、ＥＳ細胞をトランスフェクトするのに用いる。
【００９９】
トランスジェニックマウスの獲得：
ＨＰＲＴ導入部位中にコンストラクトを有するトランスジェニック動物を、ＨＰＲＴターゲッティングカセットを有するデスティネーションコンストラクトをＢＰＥＳ−５細胞にトランスフェクトすることにより作製した。相同組換えにより、細胞内の欠失していたＨＰＲＴ遺伝子座が回復すると同時に、レポーターコンストラクトの単一コピーがＨＰＲＴの５’側フランキング領域に挿入される。ＨＰＲＴの発現が回復することにより、ＨＡＴ選択への耐性が与えられ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン；Bronson et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 9067-72）、求める相同組換え現象（recombination event）が生じたクローンを正の選択（positive selection）により選択することができるようになる。選択およびＰＣＲスクリーニングを行った後、細胞をＥ３（胎生３日目）Ｃ５７Ｂｌ／６胚盤胞に移植し、この胚盤胞を精管切除された雄と交配させて偽妊娠にさせたＥ２（胎生２日目）Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスの子宮に移植した。キメラは、１６日後に自然に産み出された。
【０１００】
β−ガラクトシダーゼ活性の組織化学的検出
組織化学的染色は、以前記載したように行った（Forghani et al. (2001) J Neurosci 21: 3780-7）。手短に言えば、マウスを麻酔し、０.５％パラホルムアルデヒド溶液および２.５％グルタルアルデヒド溶液（０.１Ｍリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７.４））を経心的に灌流した。１時間の後固定に続き、切り出された器官のホールマウント標本または組織切片を、５ｍｍフェリシアン化カリウム、５ｍｍフェロシアン化カリウム、２ｍｍ塩化マグネシウム、０.０２％ノニデットＰ−４０および０.４ｍｇ／ｍＬブルオ-ガル（シグマ）（組織切片の場合は０.８ｍｇ／ｍＬ Ｘ−ガル）を含む染色溶液中で、３７℃でインキュベートした。
【０１０１】
β−ガラクトシダーゼ活性の定量分析
坐骨神経を雄のマウスから切り出し、即座に液体窒素中で凍結した。ミキサーミル装置（キアゲン社）を用いて、４８サンプルを２５０μＬの溶解緩衝液中で２分間の粉砕によりホモゲナイズした。すべて抽出物について、ＢＳＡ標準曲線を用いたブラッドフォード法（バイオ・ラッド社）によりタンパク質濃度を３回測定した。ＭＬＸルミノメーター（ダイネックス・テクノロジー社、シャンティリー、バージニア州）上で製造者の説明書に従ってガラクト−スター（Galacto-Star）ケミルミネッセントシステム（アプライドバイオシステムズ社）を用いることにより、β−ガラクトシダーゼ活性を検出した。
【０１０２】
結果：
種間の配列比較によりＭｏｄ４内に保存された要素が多数あることが明らかになった
ＭＢＰの５’側フランキング配列には、広く間隔が開いた４つのヒト／マウスで保存されているモジュール（７５％の相同性で１００塩基対以上）が含まれている（Farhadi et al. (2003) J Neurosci 23: 10214-23）。シュワン細胞エンハンサー活性を有するＭｏｄ４は、マウスＭＢＰ遺伝子のＡＴＧの９ｋｂ上流に位置する。この研究のために、Ｍｏｄ４の比較をラットおよびニワトリの配列まで拡張し、保存されたＭｏｄ４配列４００塩基対以内で比較したところ、マウス／ラット、マウス／ヒトおよびマウス／ニワトリ間で観察される相同性は、各々、９１％、７６％および５６％であった。３種の哺乳動物について、６塩基対以上の不変モチーフ（Ｍ）が２２個発見された（図１Ｂ、Ｍ１〜Ｍ２２）。これらは合計２１３塩基対になる。この比較をニワトリまで拡張すると、合計５４塩基対となる７個の不変モチーフが、哺乳類で保存された配列のうち、核となる２４１塩基対内のものと同一であった。
【０１０３】
ヒトおよびニワトリのＭｏｄ４配列がマウスの転写調節因子によって認識されるかどうかを決定するために、そのようなＭｏｄ４配列をｈｓｐ最小プロモーターおよびＬａｃＺレポーター遺伝子にライゲートした。これらのコンストラクトを、単一コピーでかつ所定の方向で、ＨＰＲＴ遺伝子座の５’側フランキング配列に結合させた（Bronson et al. 1996; Farhadi et al. 2003）。それらの多様性にもかかわらず、両方の種のＭｏｄ４配列は、シュワン細胞のレポーター遺伝子の発現を駆り立てた（図１１）。内在性ＭＢＰ遺伝子座およびヒトとマウスのＭｏｄ４レポーターの両方の発現が高い、離乳期前のミエリン生成期において、ニワトリのＭｏｄ４レポーターは、無活性であった（図１１）。
【０１０４】
発生の調節およびＳＡエンハンサー
発生中のマウスで、モチ−フＭ１０〜Ｍ２２を含むＭｏｄ４の２１３塩基対の配列（「ＳＡ」と呼ぶ）によって与えられる表現型を調べるために、Ｅ１５.５（胎生１５.５日目）およびＥ１８.５（胎生１８.５日目）の胎児をβ−ガラクトシダーゼ活性について分析した。坐骨神経および脊髄根は、両方の胎児で強く標識された（図１２Ａ）。しかしながら、胎児の発生の間、個々のシュワン細胞は多数の軸索と結合したが、ミエリンの生成は始まらず、ＭＢＰのアップレギュレートは起こらなかった。このように、ＳＡ調節レポーターコンストラクトは早期の発生プログラムを示し、このことは、ＳＡの外側に位置する調節配列がシュワン細胞成熟の初期の段階のＭＢＰ発現を制限していることを示唆している。
【０１０５】
ＳＡ調節レポーターコンストラクトの出生後の発現を評価するために、ホールマウント標本を、Ｐ０（出生後０日）、Ｐ１０（出生後１０日）、Ｐ２１（出生後２１日）、３ヶ月齢および１歳のマウスから得た。ミエリンを生成する期間（Ｐ０〜Ｐ１０）は全ての歳において、顕著に増大する染色強度によって、発現を明確に検出することができた（図１２Ｂ）。坐骨神経抽出物におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の定量分析により、β−ガラクトシダーゼ活性は、Ｐ２からＰ１０の間に６倍蓄積され、その後３ヶ月齢までに活性のピークレベルの１／３まで減少することが明らかになった（図１２Ｂ）。
【０１０６】
軸索接触の一過性の損失後におけるＳＡ導入遺伝子の発現の調節
坐骨神経挫滅障害の後、挫滅部位より遠位の軸索分節（axon segment）およびミエリン鞘は、ウォーラー変性と呼ばれる過程で崩壊する。遠位スタンプ中のシュワン細胞は、それまでに作り上げたミエリン鞘から解離し、ミエリン遺伝子の発現をダウンレギュレートし、脱分化する。軸索接触が、近位のスタンプから伸びる軸索で再び確立される場合、シュワン細胞は、新たに出現した軸索を再びミエリン鞘で覆い、一次発生の特徴を繰り返す（Gupta et al. (1988) Brain Res 464: 133-41; Trapp et al. (1988) J Neurosci 8: 3515-21; Lamperth et al. (1990) J Neurocytol19: 756-64; LeBlanc and Poduslo (1990). J Neurosci Res 26: 317-26; Stahl et al. (1990) Brain Res Mol Brain Res8: 209-12）。この実験例を再ミエリン化中の神経におけるＳＡ機能の調査に適用した。ＳＡコンストラクトを有するマウスの坐骨神経の遠位部および近位部を、損傷後１、２および４週間後のβ−ガラクトシダーゼ活性について分析した（図１２Ｃ）。１週間後では、β−ガラクトシダーゼ活性は、損傷していない反対側の神経が示す発現レベルの１／３に低下していた。損傷後２週間では、挫滅部位の遠位部のシュワン細胞は軸索接触を再確立しており、アップレギュレートされた発現が観察された。損傷後４週間では、再生および再ミエリン化がほとんど完成しており、遠位部における発現レベルは、損傷していない神経と区別がつかなかった（図１２Ｃ）。
【０１０７】
Ｍｏｄ４サブドメインにより与えられる定量的表現型
シュワン細胞のターゲッティングには必要でないＭｏｄ４要素が発現レベルを調節するかどうかを決定するために、様々なＭｏｄ４レポーターコンストラクトを有するマウスの坐骨神経において、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。ＳＡコンストラクトおよび１３５塩基対コンストラクトによる発現レベル表現型が、一番であると評価された。これら２つの配列は、幼若マウスおよび成熟マウスのシュワン細胞で発現させ、活発なミエリン形成が始まり、ＭＢＰの発現がピークになったとき、若い動物中で観察されるβ−ガラクトシダーゼの蓄積が最高レベルになる（図１３Ａ）。両方のコンストラクトにおいて、離乳前のマウスで測定した活性は、成体マウスのものより３倍高かった。このように、活発な髄鞘形成とミエリンの維持とを区別する因子の結合部位は、内在する転写因子の相違による定性的または定量的性質とは無関係に、両方の配列中に存在する。しかし、ＳＡコンストラクトは、１３５塩基対配列に比べて３倍の活性を有する。
【０１０８】
次に、２２個の哺乳類動物不変モチーフの内の９個を含むＭｏｄ４の５’側に位置する、Ｍｏｄ４配列の調節活性を評価した。近接するＭＢＰ ５’側フランキング配列を有し、−９.５ｋｂ、−９.０８ｋｂおよび−９.０ｋｂで終結している、３つの異なるコンストラクトを分析した。Ｍｏｄ４配列が−９.０ｋｂから−９.０８ｋｂに拡張したとき、シュワン細胞での発現レベルに顕著な増大が観察された（図１３Ａ）。これは、重要な定量的情報がこの８０塩基対中に位置する１つまたは全部の要素によって与えられることを示唆している。−９.０８ｋｂ配列および−９.４ｋｂ配列によって与えられる発現レベルは、成熟マウスにおいては類似しているが、ミエリン形成の間９.０８ｋｂ配列によるレベルは顕著に低いものとなる。
【０１０９】
上述した研究は、調節配列の定量分析を実行するための本発明によるＥＳ細胞の使用を示している。
【０１１０】
本明細書中に記されている全ての文献、特許および特許出願明細書は、本発明が属する技術における当業者の技術のレベルを示したものであり、あたかも各個々の文献、特許または特許出願明細書は特定的におよび個別的に参照文献として組込まれているかのように本明細書中に参照文献として組込まれている。
【０１１１】
本発明はこのように記述されており、同じことが様々に変化できることは明らかである。そのような変化は、本発明の精神および領域から逸脱しているとみなされるべきでなく、その技術の当業者には明白であるような改変のすべてが、特許請求の範囲内に含まれるように意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１Ａは、感受性エンハンサートラップを構成するｈｓｐ６８プロモーターにより促進される（promoted）ｌａｃＺレポーター遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトの模式図を示す。図１Ｂは、ＨＰＲＴ導入部位に導入遺伝子として上記コンストラクトを有するマウスから採取した腰部脊髄およびそれに付随する根を示す。このサンプルは、これらの細胞がｌａｃＺレポーター遺伝子を発現することを明らかにするために感受性組織化学的染色法に付された。中央の大きな血管を除いては、脊髄または脊髄根の他のどの細胞も標識されておらず、これはＨＰＲＴ導入部位が中立であることを示している。
【図２】本発明の一態様により得られるＢＰＥＳ細胞系統の系図。
【図３】ＢＰＥＳ−２またはＢＰＥＳ−５を含む雄のキメラと野生型Ｃ５７Ｂｌ／６の雌のキメラとの交配によって、ＥＳ細胞由来精子およびＣ５７Ｂｌ／６由来精子により受精させた卵子から得られた最初の一腹の子における子の比率を示すグラフ。
【図４】本発明の１２のＢＰＥＳ細胞系統の培養時の成長を示すグラフであって、全ての細胞系統が極めて類似した成長率を有することを示している。
【図５】本発明の一態様により作製されたトランスジェニックマウスの写真。これらのＥＳトランスジェニックマウスは、Ｃ５７Ｂｌ／６胚盤胞中に注入された、ミエリン塩基性タンパク質によって調節された導入遺伝子を含むＢＰＥＳ−５細胞から得られる。５匹のマウスの内３匹は、アグーチ毛色が優勢な外皮を有し、１匹は１００％ＥＳ細胞由来の毛色を示す排他的にアグーチである外皮を有する。
【図６】導入遺伝子を含むＨＰＲＴを有するＢＫ４細胞（Bronson 1994により記載されたようなもの）および野生型Ｃ５７Ｂｌ／６細胞から得られるキメラにおける、ＭＢＰ−ｅＧＦＰ導入遺伝子の単一コピーからの緑色蛍光タンパク質の発現に基づくＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図７】ＭＢＰプロモーター/エンハンサーによって調節されたｌａｃＺレポーター遺伝子コンストラクトを有するＢＰＥＳ−５細胞を注入した、通常のＣ５７Ｂｌ／６胚盤胞由来のキメラの腰部脊髄およびそれに付随する根を示す。この導入遺伝子は、オリゴデンドロサイト（中枢神経系）およびミエリンを形成するシュワン細胞（末梢神経系）中に発現すると予想された。脊髄神経節は、導入遺伝子を発現しない、したがって標識されない神経細胞や衛星細胞を含む。対照的に、脊髄根中のミエリンを形成するシュワン細胞および脊髄中のオリゴデンドロサイトは、強く標識される。これらの組織が均一に染色されることは、ＥＳ系列の細胞がキメラ中のシュワン細胞およびオリゴデンドロサイトの細胞群の大部分を含むほど、導入遺伝子を有するＢＰＥＳ細胞はキメラの発生において優勢であったことを示している。
【図８】本発明の一態様によるトランスジェニックマウスを作製する方法を用いた場合の、ＤＮＡのトランスフェクションからＥＳ細胞が優勢なキメラの誕生までの日程を示す表。左端の欄は、トランスフェクトし、続いて導入遺伝子としてＨＰＲＴ導入部位中に挿入した様々なコンストラクトを示す。ＮＦＨ−１−１は、マウスＮＦＨ遺伝子座のイントロン配列を図１に示すｈｓｐｌａｃＺ配列に付加したコンストラクトである。残り４つのコンストラクトは、同じｈｓｐｌａｃＺ配列に基づくが、マウスのミエリン塩基性タンパク質の遺伝子座由来の様々な推定上の調節配列を有している。
【図９】ＢＫ４細胞およびＢＰＥＳ−５細胞を用いたトランスジェニックマウス作製の比較結果を要約した表。この結果は、ＢＰＥＳ−５細胞は、ＢＫ４細胞を用いた場合の労力と費用の２０％未満で構造／機能分析をサポートすること、およびスループットが１００匹／年であることを示している。加速させること（acceleration）は、繰り返し（iteration）をサポートする（新生キメラ：３０日および系統中の新生児：９０日）。
【図１０】Ｃ５７Ｂｌ／６胚盤胞中に注入されたＢＰＥＳ細胞由来のキメラの典型的な同腹の子を示す。マウスの中には時々、ＥＳ系列からの寄与を示さない黒色外皮を有するものがいる。しかしながら、対照的に、大部分のキメラは、１００％アグーチ外皮を示し、１００％ＥＳ細胞由来であると考えられる。
【図１１】ヒトおよびニワトリのモジュール４（Ｍｏｄ４）の発生中の発現を示す。Ａ：トランスジェニック系統から採取した脊髄の組織化学的染色。ヒトおよびニワトリのＭｏｄ４の配列（図１）をｈｓｐ／ＬａｃＺレポーター遺伝子にライゲートし、標的遺伝子導入に用いた。ｈＭ４は、髄鞘形成の間のＰ１１において脊髄根中で高い発現を促し、成体になっても発現する。ニワトリのコンストラクトは、髄鞘形成（Ｐ１１）の間は検出可能な発現を生じさせないが、特に成体の末梢神経系に発現する。Ｂ：坐骨神経のβ−ガラクトシダーゼ活性アッセイ（ｍＵ／ｍｇタンパク質）は、ｈＭ４は髄鞘形成（Ｐ２１）の間、成体マウスよりも高いレベルの発現を促すことを示している。対照的に、ニワトリのコンストラクトは、高いレベルで成体に発現する。
【図１２】図１２Ａは、発生過程を通してのシュワン細胞におけるＳＡレポーターコンストラクトの発現を示す。ＳＡにより促されたＬａｃＺの発現は、初めＥ１５.５胚中に観察される。ここに示すのは脊髄根および坐骨神経で、発生過程を通しておよび成体のマウスにおいて維持される。図１２Ｂ：坐骨神経におけるβ−ガラクトシダーゼ活性アッセイの結果、ＳＡレポーターコンストラクトは、髄鞘形成（Ｐ２）の前では低レベルで発現し、髄鞘形成（Ｐ１０、Ｐ２１）の間は高く誘発され、成熟マウス（３ｍｏ）では低下することが示される。図１２Ｃ：坐骨神経損傷後のＳＡコンストラクトの発現。β−ガラクトシダーゼ活性を神経挫滅の１週間後と２週間後に損傷末端部において測定し、損傷していない部分の発現と比較した。
【図１３】β−ガラクトシダーゼ定量分析により分析されたように、要素中の異なる保存ブロックは異なる機能を示すことを示す。坐骨神経中のβ−ガラクトシダーゼ活性の定量分析をマウスの異なる系統についてＰ２１またはＰ９０において行った。エラーバーは標準偏差を示す。ｔ−検定によるＰ値は、有意であるときのみ記した。
【図１】
2007533291.tif 000002
【図２】
2007533291.tif 000003
2007533291.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月6日(2005.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つの異なる近交型マウス系統由来の対立遺伝子を有する非近交系マウス胚性幹（ＥＳ）細胞の調製物であって、
前記ＥＳ細胞は、良好な発生能を有し、通常の胚盤胞中に注入されたとき、前から存在する内部細胞塊の細胞およびその誘導体と首尾よく競争する、
非近交系マウス胚性幹（ＥＳ）細胞の調製物。
【請求項２】
前記ＥＳ細胞は、さらに導入遺伝子導入部位を有する請求項１記載の非近交系ＥＳ細胞の調製物。
【請求項３】
少なくとも２つの異なる近交型マウス系統由来の対立遺伝子および導入遺伝子導入部位を有する非近交系マウス胚性幹（ＥＳ）細胞の調製物であって、
前記ＥＳ細胞は、良好な発生能を有し、通常の胚盤胞中に注入されたとき、前から存在する内部細胞塊の細胞およびその誘導体と首尾よく競争する、
非近交系マウス胚性幹（ＥＳ）細胞の調製物。
【請求項４】
前記導入遺伝子導入部位は、ヒポキサンチンホスホリボシル基転移酵素（ＨＰＲＴ）遺伝子の欠失変異体である、請求項２または請求項３に記載の非近交系ＥＳ細胞の調製物。
【請求項５】
前記導入遺伝子導入部位は、ｌｏｘＰ部位を含む、請求項２または請求項３に記載の非近交系ＥＳ細胞の調製物。
【請求項６】
前記ＥＳ細胞由来のキメラは、５０％を超えるＥＳ細胞の寄与を示す、請求項１から請求項５のいずれかに記載の非近交系ＥＳ細胞の調製物。
【請求項７】
前記ＥＳ細胞由来のキメラは、９０％を超えるＥＳ細胞の寄与を示す、請求項６記載の非近交系ＥＳ細胞の調製物。
【請求項８】
前記ＥＳ細胞由来のキメラは、約１００％のＥＳ細胞の寄与を示す、請求項７記載の非近交系ＥＳ細胞の調製物。
【請求項９】
（ａ）少なくとも１つの胚が生産される結果となる条件下で、請求項１から請求項８のいずれかに記載の非近交系マウスＥＳ細胞の調製物を通常のマウス胚盤胞または四倍体マウス胚盤胞の中に導入する、あるいは、少なくとも１つの胚が生産される結果となる条件下で、請求項１から請求項８のいずれかに記載の非近交系マウスＥＳ細胞の調製物と１つ以上の移植前胚とを凝集させるステップと、
（ｂ）作製した胚を適切な養母の体内に移植するステップと、
（ｃ）生きた子が発生する結果となる条件下に前記養母を維持するステップと、
を有するＥＳ細胞由来マウスの作製方法。
【請求項１０】
（ａ）１つ以上の導入遺伝子配列を、請求項２または請求項４から請求項８のいずれかに記載のＥＳ細胞の調製物の非近交系マウスＥＳ細胞に導入するステップと、
（ｂ）１つ以上の前記導入遺伝子配列が前記ＥＳ細胞のゲノムに組込まれるように、導入遺伝子導入部位で相同的組換えが生じる結果となるような条件下にＥＳ細胞を維持するステップと、
（ｃ）少なくとも１つの胚が生産される結果となる条件下で、生成した組換え体ＥＳ細胞を通常の胚盤胞または四倍体胚盤胞の中に導入する、あるいは、少なくとも１つの胚が生産される結果となる条件下で、１つ以上の移植前胚とステップと、
（ｄ）作製した胚を適切な養母の体内に移植するステップと、
（ｅ）生きた子が発生する結果となるような条件下に前記養母を維持するステップと、
を有するＥＳ細胞由来トランスジェニックマウスの作製方法であって、
前記ＥＳ細胞は良好な発生潜在性を有する、
ＥＳ細胞由来トランスジェニックマウスの作製方法。
【請求項１１】
（ａ）請求項１から請求項８のいずれかに記載のＥＳ細胞の調製物の非近交系マウスＥＳ細胞中の１つ以上の遺伝子または遺伝子の一部に対して遺伝的改変または変異を実行するステップと、
（ｂ）ノックアウトが前記ＥＳ細胞のゲノムに組込まれるような相同的遺伝子組換えの結果となる条件下にＥＳ細胞を維持するステップと、
（ｃ）少なくとも１つの胚が生産される結果となる条件下で、生成した組換え体ＥＳ細胞を通常の胚盤胞または四倍体胚盤胞の中に導入する、あるいは、少なくとも１つの胚が生産される結果となる条件下で、１つ以上の移植前胚とステップと、
（ｄ）作製した胚を適切な養母の体内に移植するステップと、
（ｅ）生きた子が発生する結果となるような条件下に前記養母を維持するステップと、
を有するＥＳ細胞由来遺伝子ターゲッティングマウスの作製方法であって、
前記ＥＳ細胞は良好な発生潜在性を有する、
ＥＳ細胞由来遺伝子ターゲッティングマウスの作製方法。
【請求項１２】
前記適切な養母は、偽妊娠の雌のマウスである、請求項９から請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
請求項９から請求項１２のいずれかに記載の方法により作製されたＥＳ細胞由来マウス。
【請求項１４】
前記マウスは、導入遺伝子を有するマウスである、請求項１３記載のマウス。
【請求項１５】
前記マウスは、遺伝的に改変または変異されたマウスである、請求項１３記載のマウス。
【請求項１６】
（ａ）第一の近交系マウス系統の雌のマウスを第二の近交系マウス系統の雄のマウスに交配させるステップであって、前記第一のマウス系統と前記第二のマウス系統は異なる、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）における前記雌のマウスと前記雄のマウスとの間の交配から得られる子から、少なくとも１回の交配と少なくとも１回の戻し交配との組み合わせを含む多数世代の交配を実行するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において実行された多数世代の交配で得られたマウスから、胚盤胞を回収するステップと、
（ｄ）前記胚盤胞の内部細胞塊から胚性幹細胞を得るステップと、
を有する、良好な発生能を有するマウス胚性幹細胞の調製方法。
【請求項１７】
（ａ）第一の近交系マウス系統の雌のマウスを第二の近交系マウス系統の雄のマウスに交配させるステップであって、第一のマウス系統と第二のマウス系統は異なる、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）における交配の子またはそれに続く世代の子を、第三の近交系マウス系統のマウスと交配させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）における交配から得られる子から、少なくとも１回の交配と少なくとも１回の戻し交配との組み合わせを含む多数世代の交配を実行するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において実行された多数世代の交配で得られたマウスから、胚盤胞を回収するステップと、
（ｅ）前記胚盤胞の内部細胞塊から胚性幹細胞を得るステップと、
を有する、良好な発生能を有するマウス胚性幹細胞の調製方法。
【請求項１８】
前記多数世代の交配は、５または６の交配および戻し交配の組み合わせを含む、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記近交系マウス系統のうちの少なくとも１つは、導入遺伝子導入部位を含む、請求項１６から請求項１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
導入遺伝子導入部位は、ヒポキサンチンホスホリボシル基転移酵素（ＨＰＲＴ）遺伝子の欠失変異体である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
導入遺伝子導入部位は、ｌｏｘＰ部位を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
請求項１６から請求項２１のいずれかに記載の方法により得られる非近交系胚性幹（ＥＳ）細胞の調製物。
【請求項２３】
ＥＳ細胞由来マウスを作製するための、請求項１から請求項８のいずれかまたは請求項２２に記載のＥＳ細胞の調製物の使用。
【請求項２４】
ＥＳ細胞由来遺伝子改変マウスを生産するための、請求項１から請求項８のいずれかまたは請求項２２に記載のＥＳ細胞の調製物の使用。
【請求項２５】
前記遺伝子改変マウスは、トランスジェニックマウスである、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
前記遺伝子改変マウスは、遺伝的改変または変異を含む、請求項２４記載の使用。
【国際調査報告】
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