(57)【要約】本発明は、細胞増殖性疾患を治療、予防または安定化する化合物(例えば、ペプチド模倣物および非ペプチド)、およびこのような疾患を治療、予防または安定化する方法に関する。本発明はまた、BRCTドメイン-BACH1ホスホペプチド複合体の三次元構造も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メモリと通信下にあるプロセッサを含むコンピュータであって、該メモリが、
(a)以下の残基：BACH1ホスホペプチドと複合体を形成したBRCA1タンデムBRCTドメインの塩基性ポケットのSer1655、Gly1656およびLys1702、もしくは該タンデムBRCTドメインの疎水性ポケットの残基Phe1704、Met1775およびLeu1839、のそれぞれに関する表2からの少なくとも1つの原子座標もしくはその代用物、または座標の二乗平均平方根偏差が3Å未満である原子座標；および
(b)座標の三次元モデルを生成するためのプログラム、
を内部に保存している、コンピュータ。
【請求項２】
BRCA1タンデムBRCTドメインまたはBRCA1タンデムBRCTドメインの断片もしくは類似体および、BACH1ホスホペプチドとを含む複合体。
【請求項３】
以下の段階を含む、BRCA1タンデムBRCTドメインに対するホスホペプチド結合のモジュレーターでありうるペプチド模倣化合物を同定するための方法：
a)BACH1ホスホペプチドおよび該タンデムBRCTドメインを、該ホスホペプチドと該タンデムBRCTドメインとの複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階；
b)上記のa)の組み合わせを候補化合物と接触させる段階；ならびに
c)該タンデムBRCTドメインからの該ホスホペプチドの排除を測定する段階であって、該タンデムBRCTドメインからの該ホスホペプチドの排除によって、該候補化合物がタンデムBRCTドメインに対するホスホペプチド結合をモジュレートするペプチド模倣化合物であることが示される段階。
【請求項４】
候補化合物が合理的薬物設計を用いて同定される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
メモリと通信下にあるプロセッサを含むコンピュータであって、該メモリがタンデムBRCTドメインと結合するホスホペプチドのファーマコフォアモデルおよび該モデルを表示するためのプログラムを内部に保存しており、該モデルが以下のもののうち少なくとも1つを含むコンピュータ：
(a)少なくとも1つの水素結合性相互作用に関与する、該ホスホペプチドのリン酸化残基上にあるリン酸基；および
(b)該ホスホペプチドの+3位にあるフェニルアラニンまたはチロシン残基であって、該フェニルアラニンまたはチロシンの側鎖が該タンデムBRCTドメインの表面を向いている残基。
【請求項６】
タンデムBRCTドメインがBRCA1タンデムBRCTドメインである、請求項5記載のコンピュータ。
【請求項７】
タンデムBRCTドメインがPTIPタンデムBRCTドメインである、請求項5記載のコンピュータ。
【請求項８】
BRCA1タンデムBRCTドメインのリガンドのファーマコフォアモデルおよび該モデルを表示するためのプログラムを内部に保存しているメモリと電気的通信下にあるプロセッサを含むコンピュータであって、該モデルが以下のパラメーターのうち少なくとも3つを含むコンピュータ：
(a)該BRCA1タンデムBRCTドメインのSer1655の側鎖ヒドロキシル基と水素結合を形成する水素結合受容基であって、該ヒドロキシル基の水素と該受容基との間の距離が4オングストローム未満である受容基；
(b)該BRCA1タンデムBRCTドメインのGly1656の骨格アミド基と水素結合を形成する水素結合受容基であって、該アミド基の水素と該受容基との間の距離が4オングストローム未満である受容基；
(c)該BRCA1タンデムBRCTドメインのLys1702の側鎖アミン基と水素結合を形成する水素結合受容基であって、該アミン基の水素と該受容基との間の距離が4オングストローム未満である受容基；
(d)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、該水分子が次々に該BRCA1タンデムBRCTドメインのLeu1657の骨格アミド基と水素結合を形成し、該アミド基の水素と該受容基との間の距離が6オングストローム未満である受容基；
(e)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、該水分子が次々に第2の水分子と水素結合を形成し、該第2の水分子が次々に該BRCA1タンデムBRCTドメインのLeu1701の骨格アミド基と水素結合を形成し、該アミド基の水素と該受容基との間の距離が8オングストローム未満である受容基；
(f)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、該水分子が次々に第2の水分子と水素結合を形成し、該第2の水分子が次々に第3の水分子と水素結合を形成し、該第3の水分子が次々にAsn1774の骨格カルボニル基と水素結合を形成し、該カルボニル基の酸素と該受容基との間の距離が11オングストローム未満である受容基；
(g)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、該水分子が次々に第2の水分子と水素結合を形成し、該第2の水分子が次々に第3の水分子と水素結合を形成し、該第3の水分子が次々に第4の水分子と水素結合を形成し、該第4の水分子が次々に該BRCA1タンデムBRCTドメインのIle1680の骨格アミド基と水素結合を形成し、該アミド基の水素と該受容基との間の距離が10オングストローム未満である受容基；
(h)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、該水分子が次々に第2の水分子と水素結合を形成し、該第2の水分子が次々に第3の水分子と水素結合を形成し、該第3の水分子が次々に第4の水分子と水素結合を形成し、該第4の水分子が次々に該BRCA1タンデムBRCTドメインのGln1779の側鎖アミド基と水素結合を形成し、該アミド基の水素と該受容基との間の距離が14オングストローム未満である受容基；
(i)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、該水分子が次々に該BRCA1タンデムBRCTドメインのArg1699の骨格アミド基と水素結合を形成し、該アミド基の水素と該受容基との間の距離が7オングストローム未満である受容基；
(j)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、該水分子が次々に該BRCA1タンデムBRCTドメインのGlu1698の側鎖カルボキシル基と水素結合を形成し、該カルボキシル基の酸素と該受容基との間の距離が6オングストローム未満である受容基；
(k)該BRCA1タンデムBRCTドメインのArg1699の側鎖グアニジニウム基と水素結合を形成する水素結合受容基であって、該側鎖グアニジニウム基の水素と該受容基との間の距離が4オングストローム未満である受容基；
(l)該BRCA1タンデムBRCTドメインのArg1699の側鎖カルボニル基と水素結合を形成する水素結合供与基であって、該供与基の水素と該カルボニル酸素との間の距離が4オングストローム未満である供与基；
(m)該BRCA1タンデムBRCTドメインのPhe1704、Met1775またはLeu1839の原子から5オングストローム未満離れている疎水基；
(n)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、該水分子が次々に該BRCA1タンデムBRCTドメインのGlu1836の側鎖カルボキシル基と水素結合を形成し、該カルボキシル基の酸素と該受容基との間の距離が6オングストローム未満である受容基；または
(o)該BRCA1タンデムBRCTドメインのAsp1840の側鎖カルボキシル基と水素結合を形成する水素結合供与基であって、該供与基の水素と該カルボキシル酸素との間の距離が4オングストローム未満である供与基。
【請求項９】
以下の段階を含む、BRCA1タンデムBRCTドメインに対する候補化合物に関する構造を生成する方法：
(a)以下の残基：BRCA1タンデムBRCTドメインの塩基性ポケットのSer1655、Gly1656およびLys1702、もしくは該タンデムBRCTドメインの疎水性ポケットの残基Phe1704、Met1775およびLeu1839、のそれぞれに関する表2からの少なくとも1つの原子座標もしくはその代用物を有する、または座標の二乗平均平方根偏差が3Å未満である原子座標を有する、該タンデムBRCTドメインの三次元構造を提供する段階；および
(b)構造が、水溶液中で該タンデムBRCTドメインと結合するために該タンデムBRCTドメイン構造に対して十分に相補的な表面を有する分子を規定する、候補化合物に関する構造を生成する段階。
【請求項１０】
候補化合物がペプチド模倣物である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
ペプチド模倣物がリン酸部分(phosphate moiety)を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ペプチド模倣物がホスホネート部分を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
請求項9記載の方法によって作られた化合物。
【請求項１４】
以下の段階を含む方法によって生成された構造を有する化合物：
(a)以下の残基：BRCA1タンデムBRCTドメインの塩基性ポケットのSer1655、Gly1656およびLys1702、もしくは該タンデムBRCTドメインの疎水性ポケットの残基Phe1704、Met1775およびLeu1839、のそれぞれに関する表2からの少なくとも1つの原子座標もしくはその代用物を有する、または座標の二乗平均平方根偏差が3Å未満である原子座標を有する、タンデムBRCTドメインの三次元構造を提供する段階；および
(b)構造が、水溶液中で該タンデムBRCTドメインと結合するために該タンデムBRCTドメイン構造に対して十分に相補的な表面を有する分子を規定する、候補化合物に関する構造を生成する段階。
【請求項１５】
ホスホペプチドと結合したタンデムBRCTドメインを含む複合体の結晶。
【請求項１６】
タンデムBRCTドメインがBRCA1タンデムBRCTドメインである、請求項15記載の結晶。
【請求項１７】
タンデムBRCTドメインがBRCA11646-1859である、請求項16記載の結晶。
【請求項１８】
タンデムBRCTドメインがBRCA11646-1863またはBRCA11633-1863である、請求項16記載の結晶。
【請求項１９】
P3221の空間群を有し、単位格子寸法がa＝b＝65.8Åおよびc＝93.1Åである、請求項16記載の結晶。
【請求項２０】
タンデムBRCTドメインがPTIPタンデムBRCTドメインである、請求項15記載の結晶。
【請求項２１】
ホスホペプチドがアミノ酸配列[pSer/pThr]-X-X-[Phe/Tyr]を含む、請求項15記載の結晶。
【請求項２２】
ホスホペプチドの+1位がプロリンである、請求項21記載の結晶。
【請求項２３】
ホスホペプチドがアミノ酸配列Ser-Arg-Ser-Thr-pSer-Pro-Thr-Phe-Asn-Lysを含む、請求項21記載の結晶。
【請求項２４】
アミノ酸配列[pSer/pThr]-X-X-[Phe/Tyr]を含むホスホペプチド。
【請求項２５】
+1位がプロリンである、請求項24記載のホスホペプチド。
【請求項２６】
アミノ酸配列Ser-Arg-Ser-Thr-pSer-Pro-Thr-Phe-Asn-Lysを含む、請求項24記載のホスホペプチド。
【請求項２７】
タンデムBRCTドメインと結合する、請求項14記載の化合物または請求項24記載のホスホペプチド。
【請求項２８】
請求項3記載の方法により、タンデムBRCTドメインに対するホスホペプチド結合をモジュレートする、請求項24記載の化合物。
【請求項２９】
対象における細胞増殖を治療または抑制するための方法であって、請求項14記載の化合物または請求項24記載のホスホペプチドを投与する段階を含み、該化合物または該ホスホペプチドが対象における細胞増殖性疾患を治療または抑制するのに十分な量である方法。
【請求項３０】
細胞増殖性疾患を有する対象の治療を目的とする、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
化学療法薬を投与する段階をさらに含み、ホスホペプチドおよび化学療法薬が、対象における細胞増殖性疾患を抑制するのに十分な量として投与され、該化学療法薬が該ホスホペプチドの投与と同時またはその28日以内に投与される、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
化学療法薬が、表3に列記された薬剤の1つまたは複数より選択される、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
放射線療法をさらに含み、ホスホペプチドおよび該放射線療法が対象における細胞増殖性疾患を治療または抑制するのに十分な量として投与され、該放射線療法が該ホスホペプチドの投与と同時またはその28日以内に施される、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
細胞増殖性疾患が新生物である、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
新生物が癌である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
癌が、聴神経腫、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性単球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性赤白血病、腺癌、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、慢性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、結腸癌腫、頭蓋咽頭腫、嚢胞腺癌、胎児性癌、内皮肉腫、上衣細胞腫、上皮癌、ユーイング腫瘍、神経膠腫、重鎖病、血管芽細胞腫、肝癌、ホジキン病、大細胞癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肺癌、肺癌腫、リンパ管内皮肉腫、リンパ管肉腫、マクログロブリン血症、髄様癌、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、粘液肉腫、神経芽細胞種、非ホジキン病、乏突起神経膠腫、骨原性肉腫、卵巣癌、膵癌、乳頭状腺癌、乳頭状癌、松果体腫、真性赤血球増加症、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、神経鞘腫、皮脂腺癌、精上皮腫、小細胞肺癌、扁平上皮癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、子宮癌、ワルデンシュトレーム線維肉腫およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
請求項14記載の化合物または請求項24記載のホスホペプチドのプロドラッグであって、インビボで該化合物または該ホスホペプチドに変換されるプロドラッグ。
【請求項３８】
エステル基を含む、請求項37記載のプロドラッグ。
【請求項３９】
エステルがメチルエステルである、請求項38記載のプロドラッグ。
【請求項４０】
スルホネート基を含む、請求項37記載のプロドラッグ。
【請求項４１】
化合物またはホスホペプチドの荷電基をマスキングする、請求項37記載のプロドラッグ。
【請求項４２】
ケージド化合物を含む、請求項37記載のプロドラッグ。
【請求項４３】
請求項14記載の化合物または請求項24記載のホスホペプチドを含む医薬製剤。
【請求項４４】
請求項38記載のプロドラッグを含む医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
連邦政府による資金援助を受けた研究に関する申告
本研究は、米国国立衛生研究所-国立一般医学研究所(NIH-NTGMS；助成金番号GM60594号)からの助成金による支援を受けた。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
本発明は、タンデムBRCTドメインを有するタンパク質が関与する細胞増殖を阻害する化合物(例えば、ペプチド模倣物)および増殖性疾患を治療する方法に関する。このような化合物の設計および発見の方法も提供される。本出願者らは、BRCTドメイン-BACH1ホスホペプチド複合体の三次元構造を見いだした。
【０００３】
乳癌感受性タンパク質BRCA1は、細胞周期の制御、転写調節、クロマチンの再構築、およびDNA損傷に対する応答に重要な役割を果たしている。BRCA1は、N末端RINGドメイン、SQ/TQジペプチド対に富む中央領域、およびタンデムBRCT(BRCA'1 C末端)ドメインを含む、1,863個アミノ酸残基の大型モジュール式タンパク質である。BRCA1は、細胞周期のさまざまな段階、および遺伝毒性ストレス後に非常に多くのタンパク質パートナーと相互作用する。例えば、BRCA1は正常周期にある細胞でS期およびG2期にDNAヘリカーゼBACH1と相互作用する一方で、BRCA1はDNA損傷に応答してATM/ATR基質のサブセットとも相互作用する。S期の細胞および放射線照射／変異原処理を受けた細胞のいずれにおいても、BRCA1はDNA損傷の部位を表すと考えられている別々の核内フォーカスに局在しており、BRCA1はこの箇所で、少なくとも部分的には、DNA修復複合体の集成のための足場として機能すると考えられている。
【０００４】
BRCA1における変異は、遺伝性乳癌の女性の50％に存在し、乳癌と卵巣癌を併発している女性では90％にも達する。ほとんどのフレームシフト変異体および欠失変異体ではBRCTリピートのすべてまたは一部が切断されており、70種を上回るミスセンス変異はBRCTドメインそれ自体の内部に位置する。BRCTドメインは、BRCA1のほか、細胞周期調節およびDNA損傷応答に関与するいくつものタンパク質に単一または多数のリピートとして存在するα/β構造である。BRCTドメインは80〜100アミノ酸で構成され、タンパク質-タンパク質認識モジュールとして機能すると一般に考えられている。
【０００５】
BRCA1経路における欠陥が癌を媒介する機序をさらによく解明するという需要、および、その結果起こる癌を予防または治療するために提供することのできる治療法に対する需要は存在する。特に、BRCA1のBRCTドメインがこのプロセスにおいて果たす機能をさらによく解明することに対しては需要が存在する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明者らは最近、BRCA1のものを含むタンデムBRCTドメインのサブセットが、ホスホセリン／ホスホトレオニン(pSer/pThr)結合モジュールとして機能することを見いだしたが、このことはBRCTにより媒介されるDNA損傷および細胞周期制御に関与するタンパク質とのいくつかの相互作用がタンパク質リン酸化によって調節されることを示している。タンデムBRCTドメインの指向性ペプチドライブラリースクリーニングにより、pSer/pThr+1位からpSer/pThr+5位までにわたるリン酸特異的結合特異性が判明しており、特にpSer/pThr+3位に芳香族または芳香族／脂肪族残基に対する強い選択性がみられる。インビトロでの指向性ライブラリースクリーニングによって選択された高親和性ホスホペプチドは、BRCA1のタンデムBRCTドメインおよび転写調節因子PTIPとATM/ATRリン酸化基質との相互作用を阻止することができた。本発明者らは、その阻害によってDNA損傷後のG2-Mチェックポイントが十分に無効化されることから、BRCA1の腫瘍抑制機能はこの相互作用に直接依存すると結論した。
【０００７】
ホスホペプチド結合およびホスホペプチド-モチーフの選択に関する構造的基盤を明らかにするため、ならびにBRCA1 BRCT変異および癌素因の基礎をなす代替的な構造的機構について調べるために、本発明者らは、BACH1ホスホペプチドと結合したBRCA1タンデムBRCTリピートの高分解能X線結晶構造を解明した。本発明者らは今回、リン酸特異的結合に関する分子的根拠を提供するとともに、癌に関連したBRCA1 BRCT変異のセットがインビトロでのホスホペプチド結合およびインビボでのBACH1リンタンパク質結合を行えなくすること、またはBRCA1タンデムBRCTドメインに対するホスホペプチド認識モチーフを変化させることを示す。本発明者らの知見は、変異に伴うBRCA1機能の喪失に関する構造的基盤を明らかにした。この発見により、本発明者らが、BRCA1と関連性のある増殖性疾患の治療のための化合物を設計すること、ならびにそのほかの化合物を設計および同定するための方法を設計することが可能となった。
【０００８】
したがって、第1の局面において、本発明は、(a)BACH1ホスホペプチドと複合体を形成したBRCA1タンデムBRCTドメインのSer1655、Gly1656およびLys1702を含む第1の残基群のそれぞれからの、表2に列記された非水素原子のすべてに関する少なくとも1つの原子座標もしくはその代用物、またはタンデムBRCTドメインのPhe1704、Met1775およびLeu1839を含む第2の残基群のそれぞれからの、表2に列記された非水素原子のすべてに関する少なくとも1つの原子座標またはその代用物、または第1もしくは第2の残基群のいずれかの座標からの二乗平均平方根偏差が3Å未満である原子座標；および(b)座標の三次元モデルを生成するためのプログラム、を内部に保存しているメモリと通信下にあるプロセッサを含むコンピュータを特徴とする。1つの態様において、メモリは、第1もしくは第2の残基群のいずれかの非水素原子のすべてに関する原子座標もしくはその代用物、または第1もしくは第2の残基群のいずれかの座標からの二乗平均平方根偏差が3Å未満である原子座標を内部に保存している。
【０００９】
もう1つの局面において、本発明は、タンデムBRCTドメインと結合する化合物のファーマコフォアモデル、およびモデルを表示するためのプログラムを内部に保存しているメモリと通信下にあるプロセッサを含むコンピュータであって、モデルが以下のうち少なくとも1つを含んでいるコンピュータを特徴とする：(a)少なくとも1つの水素結合性相互作用に関与する、ホスホペプチドのリン酸化残基上にあるリン酸基；および(b)フェニルアラニンまたはチロシンの側鎖がタンデムBRCTドメインの表面を向いている、ホスホペプチドの+3位にあるフェニルアラニンまたはチロシン残基。1つの態様において、タンデムBRCTドメインはBRCA1タンデムBRCTドメインである。もう1つの態様において、タンデムBRCTドメインはPTIPタンデムBRCTドメインである。
【００１０】
もう1つの局面において、本発明は、BRCA1タンデムBRCTドメインのリガンドのファーマコフォアモデルおよびそのモデルを表示するためのプログラムを内部に保存しているメモリと電気通信下にあるプロセッサを含むコンピュータであって、モデルが以下のパラメーターのうち少なくとも3つを含むようなコンピュータを特徴とする：
(a)BRCA1タンデムBRCTドメインのSer1655の側鎖ヒドロキシル基と水素結合を形成する水素結合受容基であって、ヒドロキシル基の水素と受容基との間の距離が4オングストローム未満である受容基；
(b)BRCA1タンデムBRCTドメインのGly1656の骨格アミド基と水素結合を形成する水素結合受容基であって、アミド基の水素と受容基との間の距離が4オングストローム未満である受容基；
(c)BRCA1タンデムBRCTドメインのLys1702の側鎖アミン基と水素結合を形成する水素結合受容基であって、アミン基の水素と受容基との間の距離が4オングストローム未満である受容基；
(d)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、その水分子が次々にBRCA1タンデムBRCTドメインのLeu1657の骨格アミド基と水素結合を形成し、アミド基の水素と受容基との間の距離が6オングストローム未満である受容基；
(e)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、その水分子が次々に第2の水分子と水素結合を形成し、第2の水分子が次々にBRCA1タンデムBRCTドメインのLeu1701の骨格アミド基と水素結合を形成し、アミド基の水素と受容基との間の距離が8オングストローム未満である受容基；
(f)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、その水分子が次々に第2の水分子と水素結合を形成し、第2の水分子が次々に第3の水分子と水素結合を形成し、第3の水分子が次々にAsn1774の骨格カルボニル基と水素結合を形成し、カルボニル基の酸素と受容基との間の距離が11オングストローム未満である受容基；
(g)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、その水分子が次々に第2の水分子と水素結合を形成し、第2の水分子が次々に第3の水分子と水素結合を形成し、第3の水分子が次々に第4の水分子と水素結合を形成し、第4の水分子が次々にBRCA1タンデムBRCTドメインのIle1680の骨格アミド基と水素結合を形成し、アミド基の水素と受容基との間の距離が10オングストローム未満である受容基；
(h)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、その水分子が次々に第2の水分子と水素結合を形成し、第2の水分子が次々に第3の水分子と水素結合を形成し、第3の水分子が次々に第4の水分子と水素結合を形成し、第4の水分子が次々にBRCA1タンデムBRCTドメインのGln1779の側鎖アミド基と水素結合を形成し、アミド基の水素と受容基との間の距離が14オングストローム未満である受容基；
(i)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、その水分子が次々にBRCA1タンデムBRCTドメインのArg1699の骨格アミド基と水素結合を形成し、アミド基の水素と受容基との間の距離が7オングストローム未満である受容基；
(j)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、その水分子が次々にBRCA1タンデムBRCTドメインのGlu1698の側鎖カルボキシル基と水素結合を形成し、カルボキシル基の酸素と受容基との間の距離が6オングストローム未満である受容基；
(k)BRCA1タンデムBRCTドメインのArg1699の側鎖グアニジニウム基と水素結合を形成する水素結合受容基であって、側鎖グアニジニウム基の水素と受容基との間の距離が4オングストローム未満である受容基；
(l)BRCA1タンデムBRCTドメインのArg1699の側鎖カルボニル基と水素結合を形成する水素結合供与基であって、供与基の水素とカルボニル酸素との間の距離が4オングストローム未満である供与基；
(m)BRCA1タンデムBRCTドメインのPhe1704、Met1775またはLeu1839の原子から5オングストローム未満離れている疎水基；
(n)水分子と水素結合を形成する水素結合受容基であって、その水分子が次々にBRCA1タンデムBRCTドメインのGlu1836の側鎖カルボキシル基と水素結合を形成し、カルボキシル基の酸素と受容基との間の距離が6オングストローム未満である受容基；または
(o)BRCA1タンデムBRCTドメインのAsp1840の側鎖カルボキシル基と水素結合を形成する水素結合供与基であって、供与基の水素とカルボキシル酸素との間の距離が4オングストローム未満である供与基。
【００１１】
もう1つの局面において、本発明は、以下の段階を含む、BRCA1タンデムBRCTドメインに対する候補化合物に関する構造を生成する方法を特徴とする：
(a)BACH1ホスホペプチドと複合体を形成したBRCA1タンデムBRCTドメインのSer1655、Gly1656およびLys1702を含む第1の残基群のそれぞれからの、表2に列記された非水素原子のすべてに関する少なくとも1つの原子座標もしくはその代用物、またはタンデムBRCTドメインのPhe1704、Met1775およびLeu1839を含む第2の残基群のそれぞれからの、表2に列記された非水素原子のすべてに関する少なくとも1つの原子座標またはその代用物、または第1もしくは第2の残基群のいずれかの座標からの二乗平均平方根偏差が3Å未満である原子座標を有する、タンデムBRCTドメインの三次元構造を提供する段階；および
(b)構造が、水溶液中でタンデムBRCTドメインと結合するためにタンデムBRCTドメイン構造に対して十分に相補的な表面を有する分子を規定する、候補化合物に関する構造を生成する段階。
【００１２】
1つの態様において、メモリは、第1もしくは第2の残基群のいずれかの非水素原子のすべてに関する原子座標もしくはその代用物、または第1もしくは第2の残基群のいずれかの座標からの二乗平均平方根偏差が3Å未満である原子座標を内部に保存している。
【００１３】
もう1つの態様において、候補化合物はペプチド模倣化合物である。ペプチド模倣化合物の望ましい例には、リン酸部分またはホスホネート部分を含むものが含まれる。もう1つの態様において、化合物はタンデムBRCTドメインと結合する。
【００１４】
もう1つの局面において、本発明は、以下の段階を含む方法によって生成された構造を有する化合物を特徴とする：
(a)BACH1ホスホペプチドと複合体を形成したBRCA1タンデムBRCTドメインのSer1655、Gly1656およびLys1702を含む第1の残基群のそれぞれからの、表2に列記された非水素原子のすべてに関する少なくとも1つの原子座標もしくはその代用物、またはタンデムBRCTドメインのPhe1704、Met1775およびLeu1839を含む第2の残基群のそれぞれからの、表2に列記された非水素原子のすべてに関する少なくとも1つの原子座標もしくはその代用物、または第1もしくは第2の残基群のいずれかの座標からの二乗平均平方根偏差が3Å未満である原子座標を有する、タンデムBRCTドメインの三次元構造を提供する段階；および
(b)構造が、水溶液中でタンデムBRCTドメインと結合するためにタンデムBRCTドメイン構造に対して十分に相補的な表面を有する分子を規定する、候補化合物に関する構造を生成する段階。
【００１５】
1つの態様において、メモリは、第1もしくは第2の残基群のいずれかの非水素原子のすべてに関する原子座標もしくはその代用物、または第1もしくは第2の残基群のいずれかの座標からの二乗平均平方根偏差が3Å未満である原子座標を内部に保存している。
【００１６】
もう1つの局面において、本発明は、ホスホペプチドと結合したタンデムBRCTドメインを含む複合体の結晶を特徴とする。1つの態様において、タンデムBRCTドメインはPTIPタンデムBRCTドメインである。もう1つの態様において、ホスホペプチドは、アミノ酸配列[pSer/pThr]-X-X-[Phe/Tyr]を含む。
【００１７】
1つの例において、ホスホペプチドの+1位はプロリンでありうる。もう1つの例において、ホスホペプチドはアミノ酸配列Ser-Arg-Ser-Thr-pSer-Pro-Thr-Phe-Asn-Lysを含む。もう1つの態様において、タンデムBRCTドメインはBRCA1タンデムBRCTドメインである。1つの例において、タンデムBRCTドメインはBRCA11646-1859である。また別の例において、タンデムBRCTドメインはBRCA11646-1863またはBRCA11633-1863でありうる。さらにもう1つの態様において、結晶はP3221の空間群を有し、単位格子寸法はa＝b＝65.8Åおよびc＝93.1Åである。
【００１８】
もう1つの局面において、本発明は、以下の段階を含む、BRCA1タンデムBRCTドメインに対するホスホペプチド結合のモジュレーターである化合物を選択または同定するための方法を特徴とする：
a)BACH1ホスホペプチドおよびタンデムBRCTドメインを、ホスホペプチドとタンデムBRCTドメインとの複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階；
b)段階(a)の複合体を候補化合物と接触させる段階；ならびに
c)タンデムBRCTドメインからのホスホペプチドの排除を測定する段階であって、タンデムBRCTドメインからのホスホペプチドの排除によって、候補化合物がタンデムBRCTドメインに対するホスホペプチド結合をモジュレートするペプチド模倣化合物であることが示される段階。
【００１９】
1つの態様において、候補化合物は合理的薬物設計を用いて同定される。もう1つの態様において、化合物はタンデムBRCTドメインに対するホスホペプチド結合をモジュレートする。
【００２０】
もう1つの局面において、本発明は、対象における細胞増殖を治療または抑制するための方法であって、本発明の化合物のいずれかを、対象における細胞増殖性疾患を治療または抑制するのに十分な量として投与する段階を含む方法を特徴とする。1つの態様において、本方法は、化学療法薬を投与する段階をさらに含み、この際、ホスホペプチドおよび化学療法薬は対象における細胞増殖性疾患を抑制するのに十分な量として投与され、化学療法薬はホスホペプチドの投与と同時またはその28日以内に投与される。有用な化学療法薬の例は表3に列記されている。
【００２１】
もう1つの態様において、本方法は放射線療法をさらに含み、この際、ホスホペプチドおよび放射線療法は対象における細胞増殖性疾患を治療または抑制するのに十分な量として投与され、放射線療法はホスホペプチドの投与と同時またはその28日以内に施される。
【００２２】
細胞増殖性疾患は新生物または癌であってよく、これには例えば、聴神経腫、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性単球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性赤白血病、腺癌、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、慢性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、結腸癌腫、頭蓋咽頭腫、嚢胞腺癌、胎児性癌、内皮肉腫、上衣細胞腫、上皮癌、ユーイング腫瘍、神経膠腫、重鎖病、血管芽細胞腫、肝癌、ホジキン病、大細胞癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肺癌、肺癌腫、リンパ管内皮肉腫、リンパ管肉腫、マクログロブリン血症、髄様癌、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、粘液肉腫、神経芽細胞種、非ホジキン病、乏突起神経膠腫、骨原性肉腫、卵巣癌、膵癌、乳頭状腺癌、乳頭状癌、松果体腫、真性赤血球増加症、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、神経鞘腫、皮脂腺癌、精上皮腫、小細胞肺癌、扁平上皮癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、子宮癌、ワルデンシュトレーム線維肉腫およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される癌がある。
【００２３】
本発明の化合物はいずれもプロドラッグの形態であることができ、これには例えば、加水分解性エステル(例えば、メチルエステル)またはスルホネート基を含むプロドラッグなどがある。本発明の化合物のその他の有用なプロドラッグには、化合物の荷電基がマスキングされているもの、またはプロドラッグがケージド化合物であるものがある。
【００２４】
本発明はまた、本発明の化合物のいずれかまたはそのプロドラッグと、薬学的に許容される添加剤とを含む薬学的組成物も特徴とする。
【００２５】
定義
本明細書および添付された特許請求の範囲の全体にわたる使用に関して、以下の用語は指定された意味を有する。
【００２６】
本明細書で用いる場合、用語「アルキル」および接頭辞「アルク-(alk-)」は、直鎖状および分枝鎖状の基、ならびに環式基、すなわちシクロアルキル基およびシクロアルケニル基の両方を含む。環式基は単環式であっても多環式であってもよく、好ましくは3個から8個までの環状炭素原子を有する。環式基の例には、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基およびアダマンチル基が含まれる。
【００２７】
「アミノ酸断片」とは、そのαカルボキシル、そのα窒素またはその両方を介してペプチド鎖中に組み入れられているアミノ酸残基のことを意味する。末端アミノ酸とは、アミノ末端またはカルボキシ末端にある任意の天然または非天然のアミノ酸残基のことである。内部アミノ酸とは、末端アミノ酸ではない任意の天然または非天然のアミノ酸残基のことである。
【００２８】
「類似体」とは、同一ではないが、類似の特徴を有する分子のことを意味する。例えば、ポリペプチド類似体は、対応する天然のポリペプチドの生物活性を保持しているが、天然のポリペプチドに対して類似体の機能を強化するある種の生化学的修飾を有する。このような生化学的修飾は、例えばリガンド結合性を変化させることなしに、類似体のプロテアーゼ抵抗性、膜透過性または半減期を増大させうると考えられる。類似体が非天然のアミノ酸を含んでもよい。
【００２９】
「抗原性」とは、物質が免疫応答を誘発する能力のことを意味する。一例として、化合物は抗体との相互作用を介して免疫応答を誘発しうる。
【００３０】
「アポトーシス」とは、死滅しつつある細胞が、細胞膜ブレブ形成、細胞体縮小、クロマチン濃縮またはDNAラダリングを含む、十分に特徴付けられている生物学的特質のセットのうち少なくとも1つを示す、細胞死のプロセスのことを意味する。
【００３１】
「芳香族残基」とは、共役π電子を伴う環系を有する芳香族基(例えば、フェニルまたはイミダゾール)のことを意味する。アリール基の環は好ましくは5〜6原子である。芳香族環はもっぱら炭素原子で構成されてもよく、または炭素原子およびヘテロ原子の混合物で構成されてもよい。好ましいヘテロ原子には、窒素、酸素、イオウおよびリンが含まれる。アリール基は任意で単環式、二環式または三環式の環を含んでよく、それぞれの環は五員性または六員性であることが好ましい。アリール基は置換型でも非置換型でもよい。例示的な置換基には、アルキル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、スルフヒドリル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ハロ基、フルオロアルキル基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、アミノ基、アミノアルキル基、一置換アミノ基、二置換アミノ基および第四級アミノ基が含まれる。
【００３２】
「アリール」とは、炭素環式芳香族環または環系のことを意味する。別に指定する場合を除き、アリール基は6〜18個の炭素に由来する。アリール基の例には、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基、フルオレニル基およびインデニル基が含まれる。
【００３３】
アリール基、ヘテロアリール基およびヘテロシクリル基は、置換されていなくてもよく、または、C1-5アルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、C1-5アルコキシ、C1-5アルキルチオ、トリハロメチル、C1-5アシル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ニトリル、C1-5アルコキシカルボニル、オキソ、アリールアルキル(アルキル基が1〜5個の炭素原子を有する)およびヘテロアリールアルキル(アルキル基が1〜5個の炭素原子を有する)からなる群より選択される1つもしくは複数の置換基によって置換されていてもよい。
【００３４】
「原子座標」(または「構造座標」)とは、結晶性材料の原子(X線散乱中心)によるX線の回折で得られたパターンと関連づけられる、数学的な計算式によって得られる結晶性材料中の原子の数理的な三次元座標のことを意味する。回折データは結晶の単位格子の電子密度地図を計算するために用いられる。これらの電子密度地図は、結晶の単位格子内部における個々の原子の位置を確定するために用いられる。当業者には公知であるように、原子座標は、原子の相対位置には影響を及ぼさずに異なる座標系(すなわち、代用的な系)に変換することができる。
【００３５】
「BACH1核酸」とは、BACH1ポリペプチドの全体もしくは一部分をコードする、またはGenbankアクセッション番号13661818の核酸配列の全体もしくは一部分と実質的に同一である、核酸またはその類似体のことを意味する。
【００３６】
「BACH1ポリペプチド」とは、Genbankアクセッション番号13661819のポリペプチド配列の全体または一部分と実質的に同一なポリペプチドまたはその類似体のことを意味する。
【００３７】
「BACH1ホスホペプチド」とは、Genbankアクセッション番号13661819のポリペプチド配列の全体または一部分と実質的に同一なリン酸化ポリペプチドまたはその類似体であって、BRCA1タンデムBRCTドメインに対する結合活性を有するもののことを意味する。
【００３８】
「塩基性ポケット」とは、pH 7.0で正味の正電荷を有する、分子の個別的な領域のことを意味する。このような領域は、相補的な形態、電荷または他の特徴を備えた第2の分子、例えば治療用の候補化合物と相互作用することができる。1つの態様において、このような領域は、リガンドのリン酸部分などの負の荷電基と相互作用することができる。BRCA1タンデムBRCTドメインの塩基性ポケットは、BRCA1タンデムBRCTドメイン残基Ser1655、Gly1656およびLys1702によって最小限に規定される。
【００３９】
「バイアス化(biased)ホスホペプチドライブラリー」とは、ホスホペプチドの特定のアミノ酸残基がその特定のライブラリー中のすべてのホスホペプチドで発現されるように調整されている、ホスホセリン、ホスホトレオニンおよび／またはホスホチロシンの縮重ペプチドライブラリーのことを意味する。例えば、バイアス化ホスホペプチドライブラリーが、コア配列Ser-pSer-ProまたはSer-pThr-Proを含むように合成することができる。1つの望ましい態様においては、ホスホセリン、ホスホトレオニンまたはホスホチロシン残基に隣接するアミノ酸残基も調整される。
【００４０】
「BRCA1との結合」とは、BRCA1に対する物理化学的親和性を有することを意味する。結合は、本発明の任意の方法により、例えばインビトロ翻訳結合アッセイを用いて測定することができる。
【００４１】
「生物活性」とは、天然に存在する分子の構造的、調節的または生化学的な機能を有するポリペプチドまたは他の化合物のことを意味する。例えば、BRCA1タンデムBRCTドメインの1つの生物活性はホスホペプチドとの結合であり、これはインビボまたはインビトロ結合アッセイを用いて測定することができる。
【００４２】
「BRCA1の生物活性」とは、以下のうち少なくとも1つを意味する：DNA損傷応答経路、細胞周期制御、転写調節、クロマチンの再構築またはホスホペプチド結合における機能。BRCA1の生物活性に関する1つのアッセイでは、BRCA1、またはタンデムBRCTドメインを含むその断片もしくは変異体が、BACH1ホスホペプチドと結合する能力を測定する。
【００４３】
「BRCA1核酸」とは、BRCA1の全体もしくは一部分をコードする、またはGenbankアクセッション番号30039658の核酸配列の全体もしくは一部分と実質的に同一な核酸またはその類似体のことを意味する。
【００４４】
「BRCA1ポリペプチド」とは、Genbankアクセッション番号30039659のポリペプチド配列の全体または一部分と実質的に同一なポリペプチドまたはその類似体であって、BRCA1生物活性を有するもののことを意味する。
【００４５】
「BRCTドメイン」とは、第2のBRCTドメインと合わせて、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含むポリペプチドと結合するように機能する、少なくとも80アミノ酸のポリペプチドのことを意味する。1つの態様において、BRCTドメインは、少なくとも3つのαヘリックスおよび4つのβ鎖を含む三次元構造をとるポリペプチド配列である。
【００４６】
「BRCT核酸」とは、少なくとも1つのタンデムBRCTドメインをコードする核酸またはその類似体のことを意味する。例えば、PTIP BC033781[21707457]またはNM_007349(PAX転写活性化ドメイン相互作用タンパク質1のmRNA)またはGene Bankアクセッション番号：AY273801[30039658]と実質的に同一な核酸は、BRCT核酸である。
【００４７】
「BRCA1タンデムBRCTドメイン変異体」とは、少なくとも1つの変異のあるBRCA1核酸によってコードされるポリペプチドのことを意味する。
【００４８】
「ケージド化合物」とは、結果的に生じる連結化合物が、その部分が結合したままである限りは生物活性を持たないように、切断可能な部分と連結している生物活性分子のことを意味する。このような部分は、分子の1つまたは複数の化学基を立体配置的に遮蔽することによって生物作用を妨げる。この部分は、酵素的、化学的または光分解的なものを含む任意の手段によって除去することができる；この部分の除去は分子の生物活性の回復をもたらす。
【００４９】
「候補化合物」とは、本明細書に記載したアッセイ方法の1つを用いることによって、遺伝子もしくはタンパク質の発現レベル、または遺伝子もしくはタンパク質の生物活性を変化させる能力に関してアッセイされる、任意の核酸分子、ポリペプチドまたは他の低分子のことを意味する。候補化合物には、例えば、ペプチド、ポリペプチド、合成された有機分子、天然に存在する有機分子、核酸分子およびそれらの構成要素が含まれる。
【００５０】
「細胞増殖性疾患」または「不適切な細胞周期調節を特徴とする疾患もしくは障害」とは、細胞増殖に異常な増加または減少がみられるあらゆる病的状態のことを意味する。例示的な細胞増殖性疾患には、癌または新生物、炎症性疾患または過形成(例えば、何らかの形態の高血圧、前立腺肥大症など)が含まれる。
【００５１】
「化学療法薬」とは、癌を含む増殖性疾患の治療またはコントロールに用いられる1つまたは複数の化学物質のことを意味する。化学療法薬には、細胞傷害性薬剤および細胞増殖抑制薬が含まれる。化学療法薬の例には、アレムツズマブ、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、2-クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、サイトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、リン酸エストラムスチン、エトドラク、エトポシド、エキセメスタン、フロクスウリジン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、フルタミド、フォルメスタン、ゲムシタビン、ゲンツズマブ(gentuzumab)、ゴセレリン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、ヒペリシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、レトロゾール、ロイポレリン(leuporelin)、ロムスチン、メクロルエタミン、メルファレン、メルカプトプリン、6-メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトーテン(mitotane)、ミトキサントロン、ニルタミド、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ロフェコキシブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、6-チオグアニン、トポテカン、トレモフィン(toremofine)、トラツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン、またはこれらの任意の組み合わせなどの細胞傷害性薬剤および細胞増殖抑制薬が含まれる。その他の化学療法薬には、表3に列記されたものが非制限的に含まれる。
【００５２】
「三次元モデル」とは、分子の構造の三次元表現のことを意味する。コンピュータモデル化は、このようなモデルを構造データとともに作成するために用いることができる。これらのデータには、分子または分子の複合体のモデルを作成するために有用な、X線結晶学データ、核磁気共鳴データ、電子顕微鏡データ、または実験的もしくは理論的なデータの任意のその他の源が含まれうる。
【００５３】
「複合体」とは、2つまたはそれ以上の分子の化学的会合物のことを意味する。複合体には、分子の会合を維持する弱い静電結合のネットワークも含まれうる。複合体の構成要素の間に、静電結合の代わりにまたはそれに加えて、共有結合、イオン結合、水素結合、疎水性またはファンデルワールス性相互作用などの他の型の相互作用が存在してもよい。
【００５４】
「コンピュータモデル化」とは、以下のうち1つまたは複数を決定するための計算プログラムの適用のことを意味する：リガンドと結合部分との位置および結合近接性、結合したリガンドの占有空間、結合部分とリガンドとの間の相補的な接触面の量、所定のリガンドと結合部分との結合の変形エネルギー、ならびに、リガンドと結合部分との水素結合の強度、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用および／または静電相互作用のエネルギーの何らかの推定値。また、コンピュータモデル化は、モデル系および候補化合物の特徴間の比較を提供することもできる。例えば、コンピュータモデル化実験は、候補化合物のモデルとの適合性を評価するために、本発明のファーマコフォアモデルを候補化合物と比較することができる。上記の評価において有用な手法の例には、以下のものが含まれる：量子力学、分子力学、分子動力学、モンテカルロサンプリング法、体系的検索およびディスタンスジオメトリー法。コンピュータモデル化プログラムのさらなる記述は、本明細書の他の箇所に提示されている。
【００５５】
「検出可能なように標識された」とは、BRCA1タンデムBRCTドメインと相互作用する分子、例えばホスホペプチドまたはペプチド模倣性低分子の存在を表示および同定するための任意の手段のことを意味する。分子を検出可能なように標識するための方法は当技術分野で周知であり、これには放射性核種(例えば、32P、33P、125Iまたは35Sなどの同位体を用いる)または非放射性標識(例えば、化学発光性標識またはフルオレセイン標識)およびエピトープタグが非制限的に含まれる。
【００５６】
必要であれば、多様に異なる分子の存在を識別しうるマーカーを用いて、分子を区別して標識することができる。例えば、PBDドメインと相互作用するホスホペプチドをフルオレセインで標識し、PBDドメインポリペプチドをテキサスレッドで標識することができる。ホスホペプチドの存在を、PBDの存在下で同時にモニターすることができる。
【００５７】
「薬物」とは、適切な医学的判断の範囲に含まれていて、ヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適しており、過度の毒性、刺激性、アレルギー応答などを伴わず、妥当な利益対危険比に見合い、しかもその意図した用途に対して有効である本発明の化合物、ならびに本発明の化合物の両性イオン形態(可能であれば)のことを意味する。
【００５８】
「断片」とは、対照標準タンパク質または核酸の一部分に対して実質的に同一な領域を有し、対照標準タンパク質または核酸の少なくとも1つの生物活性の少なくとも50％または75％、より好ましくは80％、90％または95％、またはさらには99％を保っている、ポリペプチドまたは核酸の一部分のことを意味する。
【００５９】
「阻害性断片」とは、対照標準タンパク質または核酸の一部分に対して実質的に同一な領域を有し、対照標準タンパク質または核酸の生物活性を少なくとも5％、より望ましくは少なくとも10％、さらにより望ましくは少なくとも25％、50％または75％、最も望ましくは90％またはそれ以上阻害する、ポリペプチドまたは核酸の一部分のことを意味する。
【００６０】
「ハロゲン化合物」または「ハロゲン」または「ハロ」とは、臭素、塩素、ヨウ素またはフッ素のことを意味する。
【００６１】
「ヘテロアリール」とは、少なくとも1つの環ヘテロ原子(例えば、O、S、N)を含む芳香族環または環系のことを意味する。別に指定する場合を除き、ヘテロアリール基は1〜9個の炭素に由来する。ヘテロアリール基には、フラニル基、チエニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、イソキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、トリアゾリル基、オキサジアゾリル基、オキサトリアゾリル基、ピリジル基、ピリダジル基、ピリミジル基、ピラジル基、トリアジル基、ベンゾフラニル基、イソベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、インドール基、インダゾリル基、インドリジニル基、ベンズイソキサゾリル基、キノリニル基、イソキノリニル基、シンノリニル基、キナゾニリル基、ナフチリジニル基、フタラジニル基、フェナントロリニル基、プリニル基およびカルバゾリル基が含まれる。
【００６２】
「複素環」とは、少なくとも1つの環ヘテロ原子(例えば、O、S、N)を含む、非芳香族環または環系のことを意味する。別に指定する場合を除き、複素環基は1〜9個の炭素に由来する。複素環基には、例えば、ジヒドロピロリル基、テトラヒドロピロリル基、ピペラジニル基、ピラニル基、ジヒドロピラニル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロフラニル基、ジヒドロチオフェン基、テトラヒドロチオフェン基およびモルホリニル基が含まれる。
【００６３】
「疎水性ポケット」とは、疎水性の性質を有する、分子の個別的な領域のことを意味する。このような領域は、相補的な形態、電荷または他の特徴を備えた第2の分子、例えば治療用の候補化合物と相互作用することができる。1つの態様において、このような領域は、リガンドの芳香族側鎖などの疎水基と相互作用することができる。BRCA1タンデムBRCTドメインの疎水性ポケットは、BRCA1タンデムBRCTドメイン残基Phe1704、Met1775およびLeu1839によって最小限に規定される。
【００６４】
「水素結合受容体(HBA)」とは、水素原子との相互作用を行える電子の孤立電子対を有する任意の原子のことを意味する。典型的な水素結合受容体には、酸素、イオウまたは窒素原子が含まれ、これにはSP2混成状態にある酸素または窒素原子が含まれる。
【００６５】
「水素結合供与体(HBD)」とは、例えば、水素を備えている酸素、イオウまたは窒素などのヘテロ原子のことを意味する。
【００６６】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子の由来となった生物の天然に存在するゲノム中の、その遺伝子に隣接する遺伝子とは離れている、核酸(例えば、DNA)のことを意味する。この用語はしたがって、例えば、ベクター中；自律複製性のプラスミドもしくはウイルス中；または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み入れられた組換えDNA；または、他の配列とは独立して存在している別個の分子(例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じたcDNAまたはゲノム断片もしくはcDNA断片)に組み入れられる組換えDNAを含む。さらに、この用語は、DNA分子から転写されたRNA分子、ならびに付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えDNAも含む。
【００６７】
「主鎖原子」または「主鎖基」とは、アミノ酸のC1カルボキシル基またはカルボニル基の炭素および酸素原子；アミノ酸のC2炭素およびC2炭素と結合した任意の水素原子；ならびにアミノ酸のα-アミンおよびαアミンと結合した任意の水素原子を含む、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質中の原子のことを意味する。
【００６８】
「モジュレートする」とは、減少または増加などの変化のことを意味する。例えば、変化が生物活性のことを指すこともできる。望ましくは、変化は、対照標準または対照発現もしくは活性、例えば天然に存在するBRCA1ポリペプチドの発現または生物活性と比較した、発現または生物活性の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または95％の増加または減少のいずれかである。
【００６９】
「変異」とは、天然に存在するまたは対照標準の核酸配列における、挿入、欠失、置換またはフレームシフト変異などの変化のことを意味する。望ましくは、核酸配列は、天然に存在する配列からの少なくとも1つの塩基対変化を有する。
【００７０】
「新生物」とは、細胞または組織の病的増殖、およびそれに引き続く他の組織または臓器への移行または浸潤を特徴とする疾患のことを意味する。新生物の成長は制御不能で進行性であることが典型的であり、正常細胞の増殖を誘発しないかその停止を引き起こすと考えられる条件下で起こる。新生物はさまざまな細胞種、組織または臓器を冒しうり、これには、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮および膣からなる群より選択される臓器、またはそれらの組織もしくは細胞種が非制限的に含まれる。新生物には、聴神経腫、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性単球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性赤白血病、腺癌、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、慢性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、結腸癌腫、頭蓋咽頭腫、嚢胞腺癌、胎児性癌、内皮肉腫、上衣細胞腫、上皮癌、ユーイング腫瘍、神経膠腫、重鎖病、血管芽細胞腫、肝癌、ホジキン病、大細胞癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肺癌、肺癌腫、リンパ管内皮肉腫、リンパ管肉腫、マクログロブリン血症、髄様癌、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、粘液肉腫、神経芽細胞種、非ホジキン病、乏突起神経膠腫、骨原性肉腫、卵巣癌、膵癌、乳頭状腺癌、乳頭状癌、松果体腫、真性赤血球増加症、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、神経鞘腫、皮脂腺癌、精上皮腫、小細胞肺癌、扁平上皮癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、子宮癌、ワルデンシュトレーム線維肉腫およびウィルムス腫瘍などの癌が含まれる。
【００７１】
「核酸」とは、リボ核酸もしくはデオキシリボ核酸またはそれらの類似体のオリゴマーまたはポリマーのことを意味する。この用語は、天然に存在する塩基、糖および糖間(骨格)結合からなるオリゴマー、ならびに同様に機能する天然には存在しない部分を有するオリゴマーを含む。このような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取込みの増加およびヌクレアーゼの存在下での安定性の向上といった特性などのため、天然型よりも往々にして好ましい。
【００７２】
いくつかの好ましい核酸の具体的な例は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子または複素環糖間結合を含みうる。最も好ましいのは、CH2-NH-O-CH2、CH2-N(CH3)-O-CH2、CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2およびO-N(CH3)-CH2-CH2骨格を有するものである(ホスホジエステルはO-P-O-CH2である)。同じく好ましいのは、モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドである(Summerton, J.E. and Weller, D.D., 米国特許第5,034,506号)。タンパク質-核酸(PNA)骨格などの他の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格によって置換され、塩基がポリアミド骨格のアザ窒素原子と直接的または間接的に結合している(P.E. Nielsen et al. Science 199: 254, 1997)。また別の好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下のうち1つを含む、アルキルおよびハロゲンにより置換された糖部分を含みうる：OH、SH、SCH3、F、OCN、O(CH2)nNH2またはO(CH2)nCH3(式中、nは1〜約10である)；C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-またはN-アルキル；O-、S-またはN-アルケニル；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；RNA切断基；結合体；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基、および同様の特性を有する他の置換基。オリゴヌクレオチドが、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣物などを有してもよい。
【００７３】
他の好ましい態様には、少なくとも1つの修飾塩基形態が含まれる。このような修飾塩基のいくつかの具体例には、2-(アミノ)アデニン、2-(メチルアミノ)アデニン、2-(イミダゾリルアルキル)アデニン、2-(アミノアルキルアミノ)アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニンが含まれる。
【００７４】
「OE1」、「OE2」、「OD1」および「OD2」は、以下のものを意味する。「OE1」は、側鎖原子CB(β炭素)、CD(δ炭素)、CG(γ炭素)およびOE1によって形成されるねじれ角が-90゜〜90゜の間であるようなグルタミン酸残基の側鎖酸素を意味する。
【００７５】
「OE2」とは、側鎖原子CB(β炭素)、CD(δ炭素)、CG(γ炭素)およびOE2によって形成されるねじれ角が-90゜〜90゜の間でないようなグルタミン酸残基の側鎖酸素のことを意味する。
【００７６】
「OD1」とは、側鎖原子CA(α炭素)、CB、CGおよびOD1によって形成されるねじれ角が-90゜〜90゜の間であるようなアスパラギン酸残基の側鎖酸素のことを意味する。
【００７７】
「OD2」とは、側鎖原子CA、CB、CGおよびOD2によって形成されるねじれ角が-90゜〜90゜の間でないようなアスパラギン酸残基の側鎖酸素のことを意味する。
【００７８】
他のアミノ酸残基側鎖原子も同様に定義され、この際、当該原子のねじれ角を、当該原子を主鎖カルボキシル基と連結する最も近傍にある3つの原子と併せて測定し、ねじれ角が-90゜〜90゜の間にあれば当該原子に「1」の指定を与え、ねじれ角が-90゜〜90゜の間でなければ「2」の指定を与える。チロシンおよびフェニルアラニン残基における対称的な側鎖環原子に関しては、2つの当該環原子を含むか最も近くに連結している環原子に対して、CA、CB、CGおよびCD1によって形成されるねじれ角が-90゜〜90゜の間であれば「CD1」の指定を与え、CA、CB、CGおよびCD2によって形成されるねじれ角が-90゜〜90゜の間でなければ「CD2」の指定を与える。
【００７９】
「ペプチド」とは、化学的に一体として結合したアミノ酸、アミノ酸類似体から構成される任意の化合物のことを意味する。一般に、アミノ酸はアミド結合(CONH)を介して化学的に一体として結合している；しかし、アミノ酸を当技術分野で公知の他の化学結合によって一体として結合することもできる。例えば、アミノ酸をアミン結合によって結合させてもよい。本明細書で用いるペプチドには、ポリペプチドを含め、アミノ酸、アミノ酸類似体または低分子もしくは高分子のペプチドのオリゴマーが含まれる。
【００８０】
「ペプチド模倣物」とは、天然の親ペプチドの生物作用を模倣しうる、またはそれに拮抗しうる化合物のことを意味する。ペプチド模倣物には、非ペプチド性の構造エレメント、非天然のペプチド、合成有機分子、天然に存在する有機分子、核酸分子およびそれらの構成要素が含まれうる。ペプチド模倣物の同定は、結合対を取り入れて、結合対を排除させる化合物を同定するスクリーニング方法によって達成されうる。または、既知のタンパク質-タンパク質相互作用の、例えば本発明のホスホペプチドとPBDとの相互作用の分子モデル化により、ペプチド模倣物をコンピュータ内で設計することもできる。望ましくは、ペプチド模倣物は、結合対の1つのメンバーを、同じ結合界面を占有することによって排除させると考えられる。より望ましくは、ペプチド模倣物は結合界面に対してより高い結合親和性を有すると考えられる。
【００８１】
「薬学的に許容される添加剤」とは、それが投与される対象にとって生理的に許容され、それとともに投与される化合物の治療特性を維持させる担体のことを意味する。1つの例示的な薬学的に許容される添加剤は、生理食塩水である。他の生理的に許容される添加剤およびそれらの処方は当業者に公知であり、例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」(20th ed., ed. A.R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins)に記載されている。
【００８２】
「ファーマコフォア」または「ファーマコフォアモデル」とは、特定の生物的標的構造との超分子相互作用を最適化し、その生物的応答を誘発(または阻止)するために用いられる、立体配置的および電子的な特徴の集合物のことを意味する。ファーマコフォアは、活性分子のセットによって共有される最大の共通点であるとみなすことができる。ファーマコフォアモデルは薬物設計において特に有用である。
【００８３】
いくつかの態様において、分子を、類似体をプロドラッグへと変換させるもののような有用な薬力学的特性を導入する基によって誘導体化することもできる。このような基は当業者に公知であり、その例は、参照として本明細書に組み入れられる、Vch. Verlagsgesellschaft Mbh.により刊行されたTesta and Mayer,「Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism: Chemistry, Biochemistry and Enzymology」(2003)に見いだすことができる。
【００８４】
「ホスホペプチド」または「リンタンパク質」とは、1つまたは複数のリン酸部分がセリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、ヒスチジンアミノ酸残基またはアミノ酸類似体と共有結合しているポリペプチドのことを意味する。ペプチドは、存在するセリン、トレオニン、チロシンまたはヒスチジンアミノ酸残基の数の程度までリン酸化されうる。ホスホペプチドは、4つの独立したSer/Thr/Tyr残基で、3つの独立したSer/Thr/Tyr残基で、または2つの独立したSer/Thr/Tyr残基でリン酸化されることが望ましい。ホスホペプチドは、多数のSer、ThrまたはTyr残基の存在にかかわらず1つのSer/Thr/Tyr残基でリン酸化されることが最も望ましい。
【００８５】
典型的には、ホスホペプチドは、適切な条件下での原核細胞もしくは真核細胞における、またはその後にペプチドが単離され、適切なキナーゼを用いてリン酸化される翻訳抽出物における発現によって生成される。または、例えばN-α-FMOCにより保護されたアミノ酸(適切なホスホアミノ酸を含む)を用いて、ホスホペプチドを標準的な化学的方法によって合成することもできる。1つの望ましい態様においては、非加水分解性ホスホペプチドを生成するために、非加水分解性リン酸類似体の使用を取り入れることができる(Jenkins et al., J. Am. Chem. Soc., 124: 6584-6593, 2002；これは参照として本明細書に組み入れられる)。このようなタンパク質合成の方法は一般的に用いられており、分子生物学およびタンパク質生化学における標準的な方法によって実施される(Ausubel et al., 「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons, New York, NY, 1994, J. Sambrook and D. Russel, 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury NY, 2000)。本発明に用いられるホスホペプチドは一般に長さとして100アミノ酸残基長よりも長くないことが望ましく、望ましくは50残基未満、より望ましくは25残基未満、20残基未満、15残基未満である。最も望ましくは、ホスホペプチドは2、3、4、5、6、7、8、9または10アミノ酸残基長である。
【００８６】
「Polo様キナーゼ」(Plk)とは、Polo様キナーゼのアミノ酸配列と実質的に同一であり、セリン／トレオニンキナーゼ活性を有し、かつ2つのPoloボックスからなる少なくとも1つのPoloボックスドメインを有する、ポリペプチドのことを意味する。例示的なPolo様キナーゼポリペプチドには、Plk-1(GenBankアクセッション番号NP_005021)；Plk-2(GenBankアクセッション番号NP_006613)；およびPlk-3(GenBankアクセッション番号NP_004064)が含まれる。さらなるPolo様キナーゼポリペプチドには、GenBankアクセッション番号P53350およびQ07832が含まれる。
【００８７】
構造的には、PoloキナーゼまたはPolo様キナーゼは、特有のアミノ末端に続いて、セリン／トレオニンキナーゼドメイン、リンカー領域、Poloボックス(PB1)、リンカー配列、第2のPoloボックス(PB2)およびカルボキシ末端にある12〜20アミノ酸の短い伸長を有する。
【００８８】
望ましい態様において、Polo様キナーゼには、サッカロミセス セレビシエ(Saccaromyces cereviseae)、Cdc5、分裂酵母(Schizosaccaromyces pombe)、Plo-1、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、Polo、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)、Plx(Plx-1、-2、-3)ならびに哺乳動物のP1k-1、Prk/Fnk、SnkおよびCnkが含まれる。Poloボックスの長さは約70アミノ酸である。
【００８９】
「Polo様キナーゼ生物活性」とは、セリン／トレオニンキナーゼ活性などの、Polo様キナーゼに付随する任意の生物活性のことを意味する。
【００９０】
Polo様キナーゼの他の生物活性には、キナーゼの中心体、紡錘体装置および微小管形成中心(MOC)への局在が含まれる。
【００９１】
「Polo様キナーゼ(PLK)核酸分子」とは、Polo様キナーゼポリペプチドをコードする核酸または核酸類似体のことを意味する。例えば、Plk-1核酸分子は、GenBankアクセッション番号X73458またはNM_005030の核酸配列と実質的に同一である；Plk-2/SNK核酸分子は、NM_006622と実質的に同一である；Plk-3核酸分子はNM_004073と実質的に同一である；Plx-1ヌクレオチド配列は、GenBankアクセッション番号U58205の核酸配列と実質的に同一である；Polo核酸分子は、GenBankアクセッション番号AY095028またはNM_079455の核酸配列と実質的に同一である。
【００９２】
「ポリペプチド」とは、本明細書に記載したような天然に存在するまたは非天然のポリペプチドまたはペプチドの全体または部分を構成する、翻訳後修飾(例えば、グリコシル化またはリン酸化)の有無を問わない、少なくとも2つの天然に存在するアミノ酸または非天然のアミノ酸(例えば、自然界に存在しないアミノ酸)による任意の鎖のことを意味する。天然に存在するアミノ酸には、以下のもののうちいずれかが含まれる：アラニン(AまたはAla)、システイン(CまたはCys)、アスパラギン酸(DまたはAsp)、グルタミン酸(EまたはGlu)、フェニルアラニン(FまたはPhe)、グリシン(GまたはGly)、ヒスチジン(HまたはHis)、イソロイシン(IまたはIle)、リジン(KまたはLys)、ロイシン(LまたはLeu)、メチオニン(MまたはMet)、アスパラギン(NまたはAsn)、プロリン(PまたはPro)、ヒドロキシプロリン(Hyp)、グルタミン(QまたはGln)、アルギニン(RまたはArg)、セリン(SまたはSer)、トレオニン(TまたはThr)、バリン(VまたはVal)、トリプトファン(WまたはTrp)およびチロシン(YまたはTyr)。ポリペプチド中に同じく組み入れてよい他のアミノ酸には、オルニチン(OまたはOrn)およびヒドロキシプロリン(Hyp)が含まれる。
【００９３】
ポリペプチドまたはその誘導体を、例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合ポリペプチドとして、別のタンパク質またはペプチドと融合または結合させてもよい。他のよく用いられる融合ポリペプチドには、マルトース結合タンパク質、黄色ブドウ球菌プロテインA、Flagタグ、HAタグ、緑色蛍光タンパク質(例えば、eGFP、eYFP、eCFP、GFP、YFP、CFP)、赤色蛍光タンパク質、ポリヒスチジン(6×His)およびセルロース結合タンパク質が非制限的に含まれる。
【００９４】
「プロドラッグ」とは、例えば血中での加水分解により、インビボで改変されて生物活性のある薬物化合物の形成をもたらす化合物のことを意味する。プロドラッグ修飾に関する十分な考察は、それぞれが参照として本明細書に組み入れられる、T. Higuchi and V. Stella,「Pro-drugs as Novel Delivery Systems」, Vol.14 of the A.C.S. Symposium Series, Edward B. Roche, ed.,「Bioreversible Carriers in Drug Design」, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987、およびJudkins et al., Synthetic Communications 26(23): 4351-4367, 1996に提示されている。
【００９５】
「PTIP」または「Pax2トランス活性化ドメイン相互作用タンパク質」とは、Genebankアクセッション番号：AAH33781.1またはNP_031375と実質的に同一であって、PTIP生物活性を有する、ポリペプチドまたはその類似体のことを意味する。
【００９６】
「PTIP生物活性」とは、DNA損傷応答経路またはホスホペプチド結合における機能のことを意味する。PTIP生物活性に関する1つのアッセイでは、PTIP、またはタンデムBRCTドメインを含むその断片もしくは変異体が、ホスホペプチドと結合する能力を測定する。
【００９７】
「PTIP生物活性」とは、DNA損傷応答経路またはホスホペプチド結合における機能のことを意味する。
【００９８】
「PTIP核酸」とは、Genebankアクセッション番号：21707457またはNM_007349と実質的に同一な核酸またはその類似体のことを意味する。
【００９９】
「精製された」とは、それに自然下で付随する他の成分から分離されていることを意味する。典型的には、因子は、それが、それに天然下で結合するタンパク質、抗体および天然に存在する有機分子の重量比にして少なくとも50％を含まない場合に実質的に純粋である。望ましくは、因子は重量比で少なくとも75％、より望ましくは少なくとも90％、最も望ましくは少なくとも99％純粋である。実質的に純粋な因子は、化学合成、天然の源からの因子の分離、またはその因子を自然下では産生しない組換え宿主細胞における因子の産生によって入手しうる。タンパク質、小胞およびオルガネラは、当業者により、Coligan et al. (「Current Protocols in Protein Science」, John Wiley & Sons, New York, 2000)によって記載されたもののような標準的な手法を用いて単離されうる。因子は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはカラムクロマトグラフィー(HPLCを含む)分析を用いた測定で(Coligan et al., 前記)、出発材料の少なくとも2倍、5倍または10倍純粋であることが望ましい。精製の例示的な方法には、(i)塩析、すなわち(NH4)2SO4沈殿；(ii)従来のクロマトグラフィー、例えばイオン交換、サイズ排除、疎水性相互作用または逆相；(iii)アフィニティークロマトグラフィー、例えばイムノアフィニティー、活性部位アフィニティー、色素アフィニティーまたは固定化金属アフィニティー；および(iv)調製用電気泳動、例えば、等電点電気泳動または非変性PAGEが含まれる。
【０１００】
「合理的薬物設計」とは、設計または選択の根拠として薬物のタンパク質標的の構造に関する情報を用いた薬物の設計または選択のことを意味する。
【０１０１】
「塩橋」とは、水素結合供与基のイオン化水素と水素結合受容基のヘテロ原子との間の非共有相互作用の形成をもたらす、タンパク質構造中の複数の基の間の静電相互作用のことを意味する。典型的には、塩橋は、アスパラギン酸またはグルタミン酸の側鎖カルボキシル基の水素原子とリジン、オルニチン、アルギニン、ヒスチジンまたはトリプトファン中に存在する側鎖窒素原子との間に形成される。
【０１０２】
「側鎖原子」または「側鎖基」とは、アミノ酸のC1カルボキシル基またはカルボニル基の炭素および酸素原子；アミノ酸のC2炭素およびC2炭素と結合した任意の水素原子；ならびにアミノ酸のα-アミンおよびαアミンと結合した任意の水素原子を含まない、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質中の原子のことを意味する。
【０１０３】
「空間群」とは、結晶の単位格子の対称要素の集合のことを意味する。
【０１０４】
「対象」とは、任意の動物(例えば、ヒト)のことを意味する。本発明の方法、組成物およびキットを用いて治療しうる他の動物には、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、サル、モルモット、ラット、マウス、トカゲ、ヘビ、ヒツジ、ウシ、魚類および鳥類が含まれる。
【０１０５】
「実質的に同一な」とは、対照標準のアミノ酸または核酸配列に対して少なくとも75％、しかし好ましくは85％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％またはさらには99％の同一性を示す、ポリペプチドまたは核酸のことを意味する。ポリペプチドに関しては、比較される配列の長さは一般に少なくとも35アミノ酸、好ましくは少なくとも45アミノ酸、より好ましくは少なくとも55アミノ酸および最も好ましくは70アミノ酸であると考えられる。核酸に関しては、比較される配列の長さは一般に少なくとも60ヌクレオチド、好ましくは少なくとも90ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも120ヌクレオチドであると考えられる。
【０１０６】
配列の同一性は、典型的には、配列解析ソフトウエア(例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705のSequence Analysis Software Package)をそこで指定されたデフォルトのパラメーターで用いて測定される。このソフトウエアプログラムは、種々の置換、欠失および他の修飾に関して相同性の程度を割り当てることにより、類似した配列のマッチングを行う。保存的置換には、典型的には、以下の群の中での置換が含まれる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【０１０７】
原子座標の文脈における「代用物」とは、座標の間の相対的関係を保っている、座標の任意の変更物(例えば、数理的な変更または倍率変更)のことを意味する。
【０１０８】
「タンデムBRCTドメイン」とは、少なくとも2つのタンデムBRCTドメインを有するタンパク質のことを意味する。例えば、AAH33781、NP_031375またはGenbankアクセッション番号30039659のポリペプチド配列と実質的に同一なタンパク質。
【０１０９】
疾患、障害または状態を「治療する」、「安定化する」または「予防する」とは、疾患、障害または状態の最初もしくはその後の発生を予防もしくは遅延すること；状態の消失とその再発との間の無病生存期間を延長すること；状態に付随する有害症状を安定化もしくは軽減すること；または状態の進行を抑制、緩徐化もしくは安定化することを意味する。治療された対象の少なくとも20、40、60、80、90または95％で、疾患のすべての所見が消失する完全寛解が得られることが望ましい。もう1つの望ましい態様において、患者がある状態と診断されて本発明の化合物による治療を受けた後の患者の生存期間は、(i)治療を受けていない患者が生存する平均期間、または(ii)別の治療を受けた患者が生存する平均期間よりも、少なくとも20、40、60、80、100, 200またはさらには500％長い。
【０１１０】
「単位格子」とは、結晶の基本的な反復単位のことを意味する。
【０１１１】
「非天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸と類似した構造を有し、天然のアミノ酸の構造および反応性を模倣している有機化合物のことを意味する。本明細書に定義した非天然のアミノ酸は一般に、非天然のアミノ酸が天然のアミノ酸と置換された場合、またはペプチドに組み入れられた場合に、ペプチドの特性(例えば、選択性、安定性、結合親和性)を向上または増強させる。
【０１１２】
非天然のアミノ酸およびこのようなアミノ酸を含むペプチドは、米国特許第6,566,330号および第6,555,522号に記載されている。
【０１１３】
本発明のその他の特徴および利点は、その望ましい態様に関する以下の説明および特許請求の範囲から明らかになると考えられる。
【０１１４】
発明の説明
BRCA1 BRCTの構造：BACH1ホスホペプチド複合体
BRCA1タンデムBRCTドメインがBACH1由来の相互作用性ホスホペプチド(残基986位〜995位)と結合したものを結晶化し、その構造をX線回折により1.85Åの分解能で解明した(図1Aおよび図1B)。リガンドを伴わないBRCA1タンデムBRCTドメイン(PDB ID 1JNX)の以前に決定された構造を検索モデル(表1参照)として用いる分子置換によって相を決定した。差フーリエマップにより、ホスホペプチドに関する輪郭明瞭な電子密度が明らかにされ、それによってBACH1のSer988-Lys995に対応する8つの残基のモデル化が可能となった。それぞれのBRCTリピート形態は、中央の四本鎖βシートが一側面で2つのヘリックスα1およびα3に対向して、もう一方で単一のヘリックスα2に対向してパッキングされた密集ドメイン(図1A)を形成する。この2つのドメインは、BRCT1のα2とBRCT2のα1'/α3'対との相互作用によって一緒にパッキングされる。2つのBRCTドメインを連結するリンカー領域は、β-ヘアピン様構造βLおよび短いらせん状領域αL(これはBRCT1のα2とBRCT2からのα3'のN末端との相互作用を通じて界面の一部を形成する)を含む。全体的にみて、タンデムBRCTドメインの構造：ホスホペプチド複合体は、リガンドを伴わないドメイン(すべてのCα原子に関してrmsdは約0.4Å)の構造と類似している。しかし、個々のBRCTリピートの重ね合わせによって、ホスホペプチド結合が、各BRCTドメインのある程度の相対的回転およびドメイン間のクレフトに向かってのBRCT1ヘリックスα1の並進を伴うことが判明している。
【０１１５】
BACH1ホスホペプチドは、伸長したコンフォメーションで、N末端およびC末端のBRCTドメイン間の高度に保存された界面に位置する溝と結合する(図1Aおよび図2A)が、これは効率的なホスホペプチド結合のための両ドメインの要求条件に一致する。この結合様式は、主としてリンカー領域を介して起こる、p53と53BP-1のタンデムBRCTドメインとの間のリン酸非依存的相互作用について観察されているものとは異なる。本発明者らの構造は、BACH1/BRCA1複合体の形成のために必要かつ十分であるリン酸化依存的相互作用が、p53：53BP-1相互作用に関与するものとは反対側のBRCT-BRCT界面に生じることを明らかに示している。
【０１１６】
BRCA1 BRCT：ホスホペプチドの特異性
インビトロでライブラリーにより選択したペプチドと結合し、インビボでリン酸化BACH1と結合するBRCA1タンデムBRCTドメインは、ホスホセリン／トレオニンおよびフェニルアラニンの3つの残基(Phe+3)がそのC末端に存在することによって優位を占める。このことは今回、BACH1 pSer990リン酸部分が、Ser1655およびLys1702の側鎖ならびにGly1656の主鎖NHがかかわる3つの直接的な水素結合形成相互作用を介して塩基性ポケットと結合することを示す本発明者らの構造によって裏づけられた(図3A)。これらの3つの残基はすべてBRCT1に位置し、そのすべてがBRCA1相同体で完全に保存されている。Ser1655およびGly1656はα1の前にあるループの内部にあり、ホスホペプチド結合によって起こるコンフォメーション変化の結果としてリン酸部分と近接するようになる。興味深いことに、S1655F変異は一人の乳癌患者で同定されているが、疾患との連鎖は確かめられていない。これらの直接的な相互作用に加えて、リン酸およびいくつかのペプチド主鎖原子も水分子のネットワークによってつながれており、その多くは四面体的に水素結合している(図3A)。間接的なタンパク質-溶媒のリン酸接触はリン酸化依存的なタンパク質-タンパク質相互作用では稀であるが、ヒトPlk1のPoloボックスドメインのホスホペプチド複合体の構造で以前に観察されている。
【０１１７】
Phe+3ペプチド側鎖は、両方のBRCTドメインから与えられたPhe1704、Met1775およびLeu1839の側鎖からなるBRCT界面にある疎水性ポケットに当てはまる(図3Aおよび図4A)。この知見は、ペプチドライブラリー実験で認められた結合モチーフの+3位における芳香族アミノ酸に対する強い選択性、ならびにPhe993のAlaへの変異によってBRCA1：BACH1結合がなくなるというYuらの観察所見を正当化するものである。Phe+3の主鎖N原子およびC=O原子とのさらなる水素結合は、同じく癌素因と関連づけられる変異の部位であるArg1699からの主鎖原子および側鎖原子によって与えられる。BACH1のリン酸化Ser990の前には1つのArg残基が-3位にあり、後には1つのプロリン残基が+1位にあり、このことはSer990リン酸化が好塩基性および／またはプロリン指向性キナーゼのいずれかによって起こる可能性を示唆する。BRCA1タンデムBRCTドメインは、ATMおよびATRなどのPI3-キナーゼ様キナーゼに特徴的なpSQ含有モチーフと相互作用することも知られている。タンデムBRCT：BACH1ホスホペプチド共結晶構造において、+1Pro側鎖とBRCTドメインとの間には直接的な相互作用はみられない。実際には、この残基はそのカルボニル酸素が関与する水媒介性の単一の水素結合のみに加わり(図3A)、これはさまざまなタイプのプロテインキナーゼがタンデムBRCTのリン酸結合モチーフを生成しうるという見解と一致する。Lys+5側鎖はBRCT2中の残基と2つの塩橋相互作用を行い(図3A)、このことはスポットブロッティングおよびペプチドライブラリー実験によってこの位置に観察されたLys選択と一致する。
【０１１８】
癌に関連したBRCA1 BRCT変異
ホスホペプチド結合表面およびドメイン-ドメイン界面を形成または安定化する残基は、ヒト、霊長動物、ラットおよびマウスからのBRCA1オルソログ中の分子の最も高度に保存された部分である(図2B)。興味深いことに、これらの領域は癌に関連した変異の位置と強く相関する(図2A)。癌に関連した変異のいくつかはBRCTの全体的なフォールディングを乱す可能性があり、また別のものはリガンド結合を特異的に妨げる可能性がより高い。BRCA1タンデムBRCTドメインの内部には約80種の腫瘍由来変異が同定されているが、これらのうち、癌素因をもたらすことが後に確認されたものは、D1692Y、C1697R、R1699W、A1708E、S1715R、G1738E、P1749R、M1775R、5382InsC(1829位に終止コドンを生じさせるフレームシフト変異)およびY1853X(最後の11残基が切断)を含め、わずかに過ぎない。これらのクラスターのほとんどはホスホペプチド相互作用表面の箇所または近傍にある(図2A)。これらの変異残基のうち2つであるArg1699およびMet1775は、ホスホペプチド中の残基と直接相互作用する(図3A)。Pro1749およびGly1738という他の2つはBRCT1/BRCT2界面の分子表面の下方に位置し、それらの作用は、本発明者らの構造がパートナータンパク質とのリン酸化依存的相互作用のために必要なことを示唆している、タンデムBRCTモチーフの相対的な向きの変化によって媒介される可能性が高い。
【０１１９】
X線構造で観察されたホスホセリン-リン酸相互作用を検証するため、および最も一般的な腫瘍由来点変異の影響について調べるために、本発明者らは、一群の部位特異的変異型のBRCA1タンデムBRCTドメインとBACH1の相互作用領域との結合について調べた。結合は、インビトロで転写および翻訳されたタンパク質がリン酸化および非リン酸化ビオチン化ペプチドのいずれかと結合する能力の測定によって判定した(図3B)。野生型BRCA1タンデムBRCTドメインはリン酸化ペプチドとは明確に結合するが非リン酸化ペプチドとはそうでなく、一方、保存されているSer1655およびLys1702の変異は、単独でも組み合わせでも、この相互作用を完全に無効にした。真に癌と連鎖性のある5種類の変異、P1749R、G1738E、M1775R、Y1853Xおよび5382InsCはすべて、ホスホペプチド結合の完全な消失をもたらす。変異R1699Wは癌と連鎖性があり、第2の変異であるR1699Qは乳癌患者で検出されているものの疾患素因とはまだ直接には関連づけられていない。本発明者らは、このグルタミン側鎖がペプチドとの主鎖水素結合になお関与していると推測したが、これは実際、本発明者らのアッセイでわずかな程度の結合性を保っていた唯一のBRCA1タンデムBRCTドメイン変異体である。しかし、若干驚いたことに、R1699Q変異体はリン酸特異性の多くを失っており、代わりにリン酸化ペプチドおよび非リン酸化ペプチドの両方と結合する。
【０１２０】
癌の素因となる変異型BRCA1タンデムBRCTドメインと内因性BACH1とのインビボ結合について調べるために、本発明者らは、U2OS細胞に対して、Chenらによる記載の通りに、mycタグおよびSV40核局在配列を含むBRCA1のC末端550アミノ酸をコードするベクターをトランスフェクトした。図3Cに示されているように、野生型BRCA1タンデムBRCTドメインと完全長BACH1との相互作用は容易に観察された。これに対して、BACH1と変異型BRCA1タンデムBRCTドメインとの間には、リン酸結合性を妨げるか、または乳癌および卵巣癌に対する素因となるようなインビボでの相互作用は全く観察されなかった。これらの癌に関連した変異型タンパク質はすべて、哺乳動物細胞にトランスフェクトされた場合に同等なレベルで発現され(図3C)、このことは全体的な構造的不安定化がそれらの癌に対する傾向の理由になる可能性は低いことを示唆している。
【０１２１】
M1775R変異の構造的影響の解釈は、M1775RタンデムBRCTドメイン変異体のX線結晶構造が決定されており(PDB ID 1N50)、すべてのCα原子に関して平均rmsdが0.35Åという野生型タンパク質とほぼ同一な構造が判明しているために容易となる。この変異体構造と本発明者らのBACH1複合体のものとの重ね合わせにより、置換基アルギニン側鎖のグアニジン部分がタンデムBRCTクレフトの中に突出し、そこでホスホペプチドの必須Phe+3の結合部位を占有することが示されている(図4Aおよび図4B)。このケースでは、インビトロでのホスホペプチド結合およびインビボでのBACH1結合の喪失は、ホスホリガンドの特異性および親和性の重要な決定因子であるArg1775側鎖の重大な立体配置上の対立に起因しうるように思われる。しかし、M1775R変異型タンパク質は、+3 PheがAspまたはGluに変異したBACH1ホスホペプチドと弱く結合する(図4C)。これは、pSer+3結合部位への塩基性残基の導入に一致し、この変異がM1175R結晶構造に新たな陰イオン結合部位を作り出すという観察所見にも一致する。したがって、本来のBRCA1：BACH1相互作用を乱すことに加えて、この変異は不適切なBRCA1 BRCT相互作用の形成ももたらす可能性がある。
【０１２２】
ホスホペプチド結合および核内フォーカス形成
野生型、S1655A/K1702Mホスホペプチド結合変異型および癌に関連したM1775R変異型のBRCA1 BRCTドメインの細胞内局在およびそれらによる核内フォーカス形成を、非同期U2OS細胞においてDNA損傷の前および後に調べた(図5Aおよび図5B)。核内フォーカスが最大限に可視化されるように、0.5％Triton X-100を含む緩衝液によって細胞を透過化し、その後に固定および免疫染色を行った。非抽出細胞では、野生型BRCTドメインおよび両方の変異型BRCTタンパク質が等しくびまん性の核内局在を示した。固定の前に非照射細胞を抽出したところ、すべての場合でBRCTドメイン染色がほぼ完全に失われた(図5A)。これらの条件下で、5つまたはそれ以上の核内フォーカスを示したのは野生型およびM1775R型のタンデムBRCT含有細胞の5％未満であり、S1655A/K1702M二重変異体ではフォーカスが全く観察されなかった。細胞に10Gyのγ線を照射し、2時間後に透過化処理、固定および染色を行ったところ、野生型のBRCA1タンデムBRCTドメインを含む細胞のほぼすべてが、ATMおよびATRによりリン酸化された基質を認識する抗pSer/pThr-Glnエピトープ抗体の染色パターンと大部分が共局在する、鮮明な点状の核内フォーカスを示した(図5B)。これに対して、S1655A/K1702M変異型タンパク質は、pSer/pThr-Gln染色とまったく共局在しない、極めて微細な顆粒状パターンを有するごくわずかな染色しか示さなかった。このようにフォーカス形成およびpSer/pThr-Glnとの共局在がみられなかったことは、BRCA1タンデムBRCTドメインのリン酸結合機能はDNA損傷後の正常な細胞内局在のために極めて決定的であることの強い証拠である。野生型BRCA1 BRCTドメインとは異なる特異性でホスホペプチドと弱く結合するM1775R変異型タンパク質も点状の核内フォーカスを形成したが、これらは野生型タンパク質よりも数が幾分少なく、pSer/pThr-Gln染色フォーカスとの共局在の程度も低かった。この局在は、他のホスホペプチド結合ドメイン相互作用に関しても観察されているように、DNA損傷後に核内フォーカス中に大量に存在する代替的で最適でないリン酸化リガンドとの相乗作用的な弱い結合に起因する可能性が考えられる。
【０１２３】
BRCA1タンデムBRCTドメイン-BACH1ホスホペプチド構造の分析
本明細書に記載された1.85ÅBRCA1タンデムBRCTドメイン：ホスホペプチド構造は、今日までに解明されたあらゆるBRCTドメイン構造の中で最も分解能の高いX線構造であり、乳癌および卵巣癌の分子的基盤をさらに調べることを可能にする強化された構造フレームワークを提供する。この構造は、モチーフ認識がドメイン-ドメイン界面の両側のドメインから与えられた残基によって媒介されることから、なぜ単一のBRCTドメインではなくタンデムBRCTリピートが、pSerまたはpThrを含むホスホペプチドと高い親和性および特異性で結合するために必要であるかを明らかにする。さらに、この構造は、リン酸認識ポケットはかさの大きいフェニル環を収容するには浅すぎるように思われることから、BRCA1 BRCTドメインがpTyrを含む配列とは結合しないという観察所見を正当化する。必ずしもすべてのタンデムBRCTドメインがホスホペプチドと結合するようには思われないという事実にもかかわらず、結合に関与するいくつかの残基は比較的保存されている。結合の負の決定因子をより良く理解するためには、別のBRCTの構造：ホスホペプチド複合体が必要であると考えられる。
【０１２４】
BRCA1タンデムBRCT：ホスホペプチド構造を生化学的および細胞生物学的な分析と組み合わせることにより、BRCA1 C末端ドメインにおけるいくつかの発癌誘発性変異がホスホペプチド結合を直接的に妨げること、またはリン酸化依存的結合表面を形成するBRCT界面を乱すことが示されている。同様の結論は、指向性ペプチドライブラリースクリーニングによって決定された別のホスホペプチドと結合したBRCA1タンデムBRCTドメインの構造ならびにリガンドを伴わないM1775RおよびV1809F変異体の構造を報告したWilliamsらによっても導き出されている。
【０１２５】
PTIP中のBRCTドメインと同じように、BRCA1中のBRCTドメインもDNA損傷に応答して核内フォーカス形成を行うのに十分であり、この現象にはそのリン酸結合機能が関与するように思われる。真に癌と連鎖性のある4つの変異、P1749R、G1738E、5382InsCおよびY1853Xはすべて、ホスホペプチド結合の消失をもたらす。5つ目の変異であるM1775Rは、モチーフ特異性の変化を伴ってホスホペプチドと弱く結合し、依然としてDNA損傷後に核内フォーカスを形成することはできるが、野生型BACH1と相互作用する能力は完全に失っている。Pro1749およびMet1775の損傷によるこれらの影響は、これらの変異はインビボでのBRCA1-BACH1相互作用を無効化するのに十分であるという以前の観察所見を裏づけるものである。BACH1変異は癌の発生とも関連性のあることが示されているため、これらの所見は、この決定的なBRCA1 M1775R：BACH1相互作用の喪失が癌素因の一因となる決定的な事象であることを示唆する。
【０１２６】
BRCA1における変異が女性に対して最終的には癌の素因を与えるという事実にもかかわらず、野生型BRCA1は逆説的に抗癌療法の標的を構成する。相同組換えおよびDNA修復におけるBRCA1の重要性を考えると、pSer結合機能の阻害は、BRCA1ヌル型のマウス胚性幹細胞で観察されているように、化学療法および放射線照射に対する感受性増大をもたらすと考えられる。pSer結合表面の構造の描写は合理的薬物設計のための新たな標的を提供する。
【０１２７】
タンパク質のクローニング、発現および精製
結晶化実験のために、ヒトBRCA1 BRCT(残基1646位〜1859位)を、pGEX-4T1(Amersham Pharmacia Biotech)中にあるグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合体として大腸菌BL21において18℃で発現させた。GSTをトロンビンによる48時間の処理によって除去し、その後にゲル濾過を行った。N末端MycタグおよびSV40核局在配列を含むpcDNA3中の1つのBRCA1 BRCTクローン(残基1313位-1863位)を免疫沈降および免疫蛍光アッセイのために用いた。変異はStratagene Quick Change Mutagenesis Kitを用いて作製し、シークエンシングによって検証した。pGEX-BRCA1 BRCTクローン(残基1633位-1863位)は以前に記載されており、これをペプチドフィルターアレイに用いた。組換えGST-BRCA1 BRCTドメインタンパク質の誘導は、0.4mM IPTGの存在下にて37℃で3時間かけて行った。グルタチオンアガロースを用いて細菌可溶化液からGST-BRCA1 BRCTドメインを単離し、続いて40mMグルタチオン、50mM Tris/HCl(pH 8.1)で溶出させた上で、50mM Tris/HCl(pH 8.1)、300mM NaClに対して透析した。
【０１２８】
結晶化および構造の決定
結晶をマイクロバッチ方法により18℃で成長させた。BACH1ホスホペプチド(SRSTpS990PTFNK)をBRCA1 BRCTに対して1.5：1という化学量論的な過剰量として混合し、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.4M NaClおよび3mM DTTを含む緩衝液中にて0.35mMに濃縮した。結晶を、50mMのMES(pH 6.5)、0.1Mの(NH4)2SO4および13％PEG 8K(w/v)から成長させた。結晶は三方晶空間群P3221(a＝b＝65.8Å、c＝93.1Å、α＝β＝90.0゜、γ＝120.0゜)に属し、非対称性単位内に1つの複合体が存在した。データは、100Kでの急速凍結結晶から、Rigaku RU200発生装置に装着したRaxis-II検出装置を用いて収集した。回折データはDENZOおよびSCALEPACKを用いて集積およびスケーリングされた。構造は、座標1JNX.brkをモデルとし、AMORE(CCP4 1994)を用いた分子置換によって解明した。その後の精密化は、REFMAC5(CCP4 1994)およびOにおける手作業によるモデル構築を用いて行った。図はPymolを用いて作成した。
【０１２９】
ペプチド結合
BRCA1 BRCTに対する結合に関して最適なホスホペプチドを、以前に記載した指向性ペプチドライブラリースクリーニングによって決定した。N-α-FMOCで保護したアミノ酸および標準的なBOP/HOBtカップリング化学の手法を用いて、このペプチドを、ビオチン基をN末端に有するリン酸化型および非リン酸化型の両方として合成した。これらのペプチドを、ストレプトアビジンをコーティングしたビーズ(Sigma-Aldrich)と結合させた。野生型および変異型のBRCA1 BRCTドメインを含む構築物(残基1313位-1863位)をTNTキット(Promega)を用いて[35S]-メチオニンの存在下でインビトロで転写および翻訳した。ビーズに固定化されたペプチド(ビーズ10μL)を、150μLの結合バッファー(50mM Tris-HCl(pH7.6)、150mM NaCl、0.5％NP-40、1mM EDTA、2mM DTT、8μg/mLペプスタチン、8μg mL-1アプロチニン、8μg mL-1ロイペプチン、800μM Na3VO4、25mM NaF)中にある、インビトロ翻訳させた10μLの[35S]標識タンパク質プールに添加した。4℃で3時間のインキュベーションの後に、200μLの結合バッファーでビーズを3回洗浄し、その後にSDS-PAGE(12.5％(w/v))およびオートラジオグラフィーによる分析を行った。
【０１３０】
ペプチドフィルターアレイ
コンピュータ制御されたGilson希釈器および液体操作用ロボットを備えたABIMEDペプチドアレイヤーを用い、N-α-FMOCで保護したアミノ酸およびDIC/HOBTカップリング化学の手法を用いてアミノ-PEGセルロース膜上にペプチドを合成した。膜を、0.1％(v/v)Tween-20(TBS-T)を含むTris緩衝生理食塩水中にある5％(w/v)ミルク中で室温にて1時間かけてブロックした上で、5％(w/v)ミルク、50mM Tris-HCl(pH 7.6)、150mM NaCl、2mM EDTA、2mM DTT中で0.025μMのGST-BRCA1 BRCTまたは0.25μMのGST-BRCA1 BRCT M1775R(残基1633位-1863位)とともに室温で1時間インキュベートし、TBS-Tにより4回洗浄した。続いて膜を5％(w/v)ミルク/TBS-T中で抗GST結合HRP(Amersham)とともに室温で1時間インキュベートし、TBS-Tで5回洗浄した上で、ECL(Perkin-Elmer)により結合について分析した。
【０１３１】
BRCA1 BRCTおよびBACH1の免疫共沈降
U2OS細胞を100cm2培養皿の中で集密度50％となるまで増殖させ、mycタグを付加した野生型または変異型BRCA1 BRCT構築物(残基1313位-1863位)を、FuGene6トランスフェクション試薬(Roche)を製造元のプロトコールに従って用いてトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションの30時間後に収集し、溶解バッファー(50mM Tris-HCl(pH7.6)、150mM NaCl、1.0％NP-40、5mM EDTA、2mM DTT、8μg/mL AEBSF、8μg mL-1アプロチニン、8μg mL-1ロイペプチン、2mM Na3VO4、10mM NaF、ならびにホスファターゼ阻害剤であるミクロシスチンおよびオカダ酸)中で溶解させた。等量のタンパク質(3mg)を含む可溶化液を、3μLのマウス抗myc抗体(Cell Signaling)とともに4℃で2時間インキュベートし、続いて10μLのプロテインG-セファロースビーズ(Sigma-Aldrich)を添加して、試料を4℃でさらに2時間インキュベートした。ビーズを溶解バッファーで4回洗浄し、結合したタンパク質をSDS-PAGEサンプルバッファーで溶出させて、6％ポリアクリルアミドゲル上で分析し、PVDF膜に移行させた上で、ウサギ抗BACH1抗体によりブロッティングすることにより検出した。タンパク質の投入量が等しいことを確かめるために、可溶化液の一部分も泳動させ、抗BACH1抗体および抗myc抗体によるブロッティングを行った。
【０１３２】
免疫蛍光検査法および顕微鏡検査法
U2OS細胞を18mm2のカバーガラス上に播き、これに対して、BRCA1 BRCT構築物(残基1313位-1863位)および種々の変異体を、FuGene6トランスフェクション試薬(Roche)を製造元のプロトコールに従って用いてトランスフェクトした。
【０１３３】
トランスフェクションの30時間後に、細胞に10Gyの電離放射線照射または擬似照射のいずれかによる処理を行い、120分間かけて回復させた。細胞を3％(v/v)パラホルムアルデヒド/2％(w/v)スクロース中で室温で15分間固定し、20mM Tris-HCl(pH 7.8)、75mM NaCl、300mMスクロースおよび3mM MgCl2を含む0.5％(v/v)Triton X-100溶液により室温で15分間にわたり透過化させた。必要に応じて、タンパク質を以前の記載の通りにIR処理後に抽出した。手短に述べると、細胞を抽出バッファー(10mM PIPES pH6.8、100mM NaCl、300mMスクロース、3mM MgCl2、1mM EGTA、0.5％(v/v)Triton X-100)とともに氷上で5分間インキュベートし、その後に抽出ストリッピングバッファー(10mM Tris-HCl pH 7.4、10mM NaCl、3mM MgCl2、0.5％(v/v)Triton X-100)とのインキュベーションを氷上で5分間行い、その後に氷冷PBSでさらに連続洗浄した。スライドを以上のようにして固定し、一次抗体により37℃で20分間染色した上で、抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体(Molecular Probes)により37℃で20分間染色した。用いた一次抗体は、マウス抗myc抗体(Cell Signaling)およびウサギ抗(pSer/pThr)Gln抗体(Cell Signaling)とした。画像はAxioplan2顕微鏡(Carl Zeiss)で収集し、OpenLabソフトウエア(Improvision)を用いて処理した。
【０１３４】
座標
原子座標および構造因子はProtein Data Bankに寄託されている(アクセッションコード1T15)。この情報は表2に示されている。
【０１３５】
(表１)結晶学的解析の概要。結晶化および構造決定の詳細は補足情報の項に提示されている。*RSym=Σj│<I>−Ij│/Σ<I>、式中、Ijはj番目の反射の強度であり、<I>は平均強度である。§Rwork=Σhkl│Fobs−Fcalc│/ΣhklFobs、式中、RfreeはRworkと等しいが、精密化プロセスから除外された反射のうちランダムに選択された5％に関して計算されている。
2007537164.tif 000002
【０１３６】
（表２）
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【０１３７】
ペプチドライブラリーのスクリーニング
当業者は、BRCA1タンデムBRCTドメインまたは他の生物学的に関連性のある結合標的と結合するペプチドを同定するためにペプチドライブラリーのスクリーニングを利用することができると考えられる。このようなスクリーニングによって同定されたペプチドまたは関連化合物は、BRCA1の生物活性をモジュレートする能力のため、治療的恩恵を有する可能性があると考えられる。
【０１３８】
以下の配列からなる、ホスホセリンおよびホスホトレオニン指向性の縮重ペプチドライブラリー：
2007537164.tif 000045
式中、pSはホスホセリンであり、pTはホスホトレオニンである；XはCysを除くすべてのアミノ酸を指す。(pSer/pThr)-Glnライブラリーにおいて、Bはアミノ酸A、I、L、M、N、P、S、T、Vのバイアス化混合物であり、Jは25％がEで75％がXというバイアス化混合物を表し、XはArg、Cys、His、Lysを除くすべてのアミノ酸を指す。ペプチドは、N-α-FMOCで保護したアミノ酸および標準的なBOP/HOBtカップリング化学の手法を用いて合成した。ペプチドライブラリーのスクリーニングは、YaffeおよびCantley(Methods Enzymol 328: 157-70, 2000)によって記載されたように、飽和量のGST-PTIP BRCTまたはGST-BRCA1 BRCTドメイン(1〜1.5mg)を含む125μlのグルタチオンビーズを用いて行った。ビーズを1mLカラム中に充填し、0.45mgのペプチドライブラリー混合物とともに、PBS(150mM NaCl、3mM KCl、10mM Na2HPO4、2mm KH2PO4、pH 7.6)中にて室温で10分間インキュベートした。非結合性ペプチドは、1.0％NP-40を含むPBSで2回洗浄し、続いてPBSで2回洗浄することによってカラムから除去した。結合したペプチドは、30％酢酸により室温で10分間溶出させ、凍結乾燥して、H2O中に再懸濁させた上で、PROCISEタンパク質マイクロシークエンサー(Perkin-Elmer Corporation, Norwalk CT)を用いた自動エドマン分解法によって配列を決定した。各アミノ酸に対する選択性の値は、特定のシークエンシングサイクルで回収したペプチドの各アミノ酸の相対的存在度(モル百分率)を、元のペプチドライブラリー混合物における同じ位置での各アミノ酸のそれと比較することによって決定した。
【０１３９】
プロドラッグ
BRCA1-BACH1相互作用の阻害は、化学療法および放射線療法に対する細胞の感受性増大を促進させるために用いることができる。BRCA1と関連性のある疾患または障害の治療、安定化または予防を、化合物、ペプチドまたは核酸分子を投与することによって媒介することができる。しかし、場合によっては、BRCA1-BACH1相互作用をインビトロで阻害するのに有効な化合物は、インビボでは有効な治療薬でない。例えば、これは化合物の生物学的利用能が低いために起こる。この問題を回避するための一つのやり方は、投与後に元の化合物へと自然に転換する、生物学的利用能が改善された修飾薬物またはプロドラッグを投与することである。このようなプロドラッグは、十分な薬理学的効果を示す前に変換を受けなければならない。プロドラッグは、親分子における望ましくない特性を改変または除去するように特に設計された1つまたは複数の特化した保護基を含む。ひとたび投与されると、プロドラッグはインビボで代謝されて活性化合物となる。
【０１４０】
プロドラッグは、薬物の以下の特徴のうち1つまたは複数を改良するために有用でありうる：溶解性、吸収、分布、代謝、排出、部位特異性、安定性、患者の忍容性、軽減された毒性または製剤化の問題。例えば、活性化合物の経口的な生物学的利用能が低いものの、体内で代謝される適切に選択された共有結合を付け加えることにより、体内での親化合物の活性に有害な影響を及ぼすことなしにプロドラッグを経口投与することが十分に可能になる程度に経口的な生物学的利用能を改善することができる。
【０１４１】
プロドラッグを担体と結合させることもでき、これはそれが酵素的に除去しうるエステルなどの基を含むことを意味する。付加的な化学基は薬理学的活性をほとんどまたは全く持たないこと、およびこの基を親化合物と結び付ける結合は効率的なインビボでの活性化が可能となるように変化しやすいことが最適である。このような担体基は親化合物へ直接結合させてもよく(二部性(bipartate))、またはそれがリンカー領域を介して結合してもよい(三部性(tripartate))。プロドラッグを形成するために親化合物と結合させる化学基の一般的な例には、エステル、硫酸、リン酸、アルコール、アミド、イミン、フェニルカルバメートおよびカルボニルが含まれる。
【０１４２】
一例として、メチルプレドニゾロンは水にほとんど溶けないコルチコステロイド薬物である。水溶性の注射または眼への投与に役立てるためには、この薬物を溶解性が向上したプロドラッグに変換しなければならない。メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウムエステルは親化合物よりもはるかに溶解性が高く、これはインビボでコリンエステラーゼによって急速かつ高度に加水分解されて遊離メチルプレドニゾロンとなる。
【０１４３】
また、ケージド化合物をプロドラッグとして用いることもできる。ケージド化合物には、化合物を生物学的に不活性にする光分解性化学基が結合している。閃光分解により、空間的または時間的に制御された様式でケージ基が遊離する(そして化合物が活性化される)。
【０１４４】
プロドラッグの設計および使用に関するさらなる記述については、Testa and Mayer, 「Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism：Chemistry、Biochemistry and Enzymology」, Vch. Verlagsgesellschaft Mbhにより刊行(2003)を参照されたい。
【０１４５】
ペプチド模倣物
ペプチド誘導体(例えば、ペプチド模倣物)には、環状ペプチド、天然のアミノ酸残基を対応するD-立体異性体または非天然のアミノ酸残基で置換することによって得られるペプチド、ペプチドの化学的誘導体、デュアルペプチド(dual peptide)、ペプチドの多量体、および他のタンパク質または担体と融合させたペプチドが含まれる。本発明のペプチドの環状誘導体は、環状化のために適した2つまたはそれ以上の付加的なアミノ酸残基を有するものである。これらの残基は多くの場合、カルボキシル末端およびアミノ末端に付加される。ペプチド誘導体が、対応するD-アミノ酸残基によって置換された1つまたは複数のアミノ酸残基を有してもよい。1つの例において、本発明のペプチドまたはペプチド誘導体は、全L-ペプチド、全D-ペプチド、またはD,L-混合ペプチドである。もう1つの例では、アミノ酸残基が非天然のアミノ酸残基によって置換される。非天然のアミノ酸または誘導体化された非天然のアミノ酸の例には、Nα-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸およびβ-メチルアミノ酸が含まれる。
【０１４６】
本発明のペプチドの化学的誘導体には、通常はペプチドの一部ではない付加的な化学的部分を含む誘導体が非制限的に含まれる。このような誘導体の例には以下のものが含まれる：(a)アミノ末端または別の遊離アミノ基のN-アシル誘導体(この際、アシル基はアルカノイル基(例えば、アセチル基、ヘキサノイル基、オクタノイル基)、アロイル基(例えば、ベンゾイル基)またはFmoc(フルオレニルメチルO--CO--)などのブロッキング基、カルボベンゾキシ(ベンジル-O--CO--)、モノメトキシサクシニル、ナフチル-NH--CO--、アセチルアミノ-カプロイル、アダマンチル-NH--CO--などのいずれでもよい)；(b)カルボキシル末端または別の遊離カルボキシル基もしくはヒドロキシ基のエステル；(c)アンモニアまたは適したアミンとの反応によって生じるカルボキシル末端または別の遊離カルボキシル基のアミド；(d)グリコシル化誘導体；(e)リン酸化誘導体；(f)親油性部分、例えばカプロイル、ラウリル、ステアロイルと結合した誘導体；および(g)抗体または他の生物リガンドと結合した誘導体。同じく化学的誘導体に含まれるものには、例えば：(a)--CH2--NH--への還元；(b)--CO--N(アルキル)--へのアルキル化；および(c)--NH--CO--への変換によるペプチド結合--CO--NH--の修飾によって得られる誘導体がある。また、ペプチド模倣物がホスホネート部分またはスルホネート部分を含んでもよい。
【０１４７】
本発明のデュアルペプチドは、2つの同一な、または2つの異なる本発明のペプチドが、直接的に、またはスペーサーを介して、互いに共有結合したものからなる。
【０１４８】
本発明の多量体は、多数の同一または異なるペプチドまたはその誘導体から形成されたポリマー分子からなる。
【０１４９】
1つの例において、ペプチド誘導体は、対応する非誘導体化ペプチドよりもタンパク質分解に対する抵抗性が高い。例えば、1つまたは複数のL-アミノ酸残基の代わりにD-アミノ酸置換を有するペプチド誘導体は、タンパク質分解切断に抵抗する。
【０１５０】
もう1つの例において、ペプチド誘導体は、対応する非誘導体化ペプチドと比べて細胞膜を通過する透過性が高い。例えば、ペプチド誘導体は、アミノ末端および／またはカルボキシル末端および／または内部部位に結合した親油性部分を有してもよい。このような誘導体は、それらが所望の機能的活性を保っているならば、細胞内タンパク質-タンパク質相互作用のターゲティングを行う場合に非常に好ましい。
【０１５１】
もう1つの例において、ペプチド誘導体は、リガンド(例えば、タンデムBRCTドメイン)とより高い親和性で結合する。
【０１５２】
本発明のペプチドまたはペプチド誘導体は、合成法および組換え技術を含む、当業者に公知の任意のペプチド合成方法によって得られる。例えば、ペプチドまたはペプチド誘導体を、手短に述べると、C末端アミノ酸のカルボキシル基を樹脂と結合させ、N-α保護アミノ酸を続けて付加することからなる固相ペプチド合成によって得ることができる。保護基は当技術分野で公知の任意のこのような基であってよい。それぞれの新たなアミノ酸を成長中の鎖に付加する前に、鎖に付加された以前のアミノ酸の保護基を除去する。適切な樹脂に対するアミノ酸の結合に関しては、Rivierら(米国特許第4,244,946号)に記載されている。このような固相合成は、例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1964；Vale et al., Science 213: 1394-1397, 1984；Marki et al., J. Am. Chem. Soc. 10：3178, 1981ならびに米国特許第4,305,872号および第4,316,891号に記載されている。1つの好ましい局面では、自動化ペプチド合成装置を用いる。
【０１５３】
合成されたペプチドまたはペプチド誘導体の精製は、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解性、疎水性の差異を含む標準的な方法によって、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な手法によって行われる。1つの態様では、薄層クロマトグラフィーを用いる。もう1つの態様では、逆相HPLC(高速液体クロマトグラフィー)を用いる。
【０１５４】
最終的に、本発明のペプチド、ペプチド誘導体および他の低分子から決定された構造-機能関係を、同様の特性を有する類似の分子構造を作成するために利用することもできる。したがって、本発明は、明示的に開示されたものに加えて、本明細書中に例示した具体的な態様と共通の構造、疎水性、荷電特性および側鎖性状を共有する分子も含むことを想定している。
【０１５５】
1つの例においては、所望の結合活性を有するこのような誘導体または類似体を、任意のタンデムBRCTドメインといった関心対象の分子または他の標的に対する結合のために用いることができる。関心対象の所望の特性(例えば、タンデムBRCTの天然のリガンドに対する結合を阻害する)を保っている、または代替的には欠くもしくは阻害する、誘導体または類似体を、タンデムBRCTドメイン(例えば、BRCA1またはPTIPからのもの)の生物活性を阻害するために用いることができる。
【０１５６】
特に、ペプチド誘導体は、必要に応じて機能的に等価な分子または機能的に強化もしくは低下した分子をもたらす、置換、付加または欠失によってアミノ酸配列を改変することによって作製される。遺伝暗号の縮重性のため、実質的に同じアミノ酸配列をコードする他の核酸配列を組換えペプチドの生産のために用いることもできる。これらには、配列内部に機能的に等価なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって改変され、このためサイレントな変化を生じる、本発明のペプチドの全体または一部分を含むヌクレオチド配列が非制限的に含まれる。
【０１５７】
本発明の誘導体および類似体は、当技術分野で公知のさまざまな方法によって生産しうる。それらの生産をもたらす操作は、遺伝子またはタンパク質のレベルで行われうる。例えば、クローン化核酸配列を、当技術分野で公知の任意の多数の戦略によって修飾することができる(Sambrook et al., 1989, 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。インビトロで制限エンドヌクレアーゼを用いて配列を適切な部位で切断し、その後に必要に応じてさらに酵素的修飾を行い、単離し、連結することもできる。
【０１５８】
修飾ホスホペプチド
本発明のホスホペプチドには、式(III)
2007537164.tif 000046
の非天然のN末端アミノ酸が非制限的に含まれ、
式中、A1はアミノ酸、またはα-アミノ基を介して連結したペプチド鎖である；R1およびR3は独立に水素、C1-5分枝状または直鎖状C1-5アルキル、C1-5アルカリール、ヘテロアリールおよびアリールであり、そのそれぞれは非置換型であるか以下のものより選択される置換基により置換されている：1〜3個のC1-5アルキル、1〜3個のハロゲン、1〜2個の-OR5、N(R5)(R6)、SR5、N-C(NR5)NR6R7、メチレンジオキシ、-S(O)mR5、1〜2個の-CF3、-OCF3、ニトロ、-N(R5)C(O)(R6)、-C(O)OR5、C(O)N(R5)(R6)、-1H-テトラゾール-5-イル、-SO2N(R5)(R6)、-N(R5)SO2アリール、またはN(R5)SO2R6；R5、R6およびR7は水素、C1-5直鎖状または分枝状アルキル、C1-5アルカリール、アリール、ヘテロアリールおよびC3-7シクロアルキルより独立に選択され、ここで2つのC1-5アルキル基が1つの原子上に存在する場合にはそれらは任意で連結してC3-8環式環を形成してもよく、これは任意で酸素、イオウまたはNR7を含んでもよく、式中、R7は水素またはC1-5アルキル(ヒドロキシルで置換されてもよい)である；R2は水素、F、C1-5直鎖状または分枝状アルキル、C1-5アルカリールである；またはR2およびR1は連結してC3-8環式環を形成し、これは任意で酸素、イオウまたはNR7を含んでもよく、式中、R7は水素またはC1-5アルキル(ヒドロキシルで置換されてもよい)である；またはR2およびR3は連結してC3-8環式環(ヒドロキシルで置換されてもよい)を形成し、これは任意で酸素、イオウまたはNR7を含んでもよく、式中、R7は水素またはC1-5アルキルである；R2は水素、F、C1-5直鎖状または分枝状アルキル、C1-5アルカリールである；およびR4は水素、C1-5分枝状または直鎖状C1-5アルキル、C1-5アルカリール、ヘテロアリールおよびアリールであり、そのそれぞれは非置換型であるか以下のものより選択される置換基により置換されている：1〜3個のC1-5アルキル、1〜3個のハロゲン、1〜2個の-OR5、N(R5)(R6)、N-C(NR5)NR6R7、メチレンジオキシ、-S(O)mR5(式中、mは0〜2である)、1〜2個のCF3、-OCF3、ニトロ、-N(R5)C(O)(R6)、-N(R5)C(O)(OR6)、-C(O)OR5、-C(O)N(R5)(R6)、-1H-テトラゾール-5-イル、-SO2N(R5)(R6)、-N(R5)SO2アリールまたは-N(R5)SO2R6；R5、R6およびR7は水素、C1-5直鎖状または分枝状アルキル、C1-5アルカリール、アリール、ヘテロアリールおよびC3-7シクロアルキルより独立に選択され、ここで2つのC1-5アルキル基が1つの原子上に存在する場合にはそれらは任意で連結してC3-8環式環を形成してもよく、これは任意で酸素、イオウまたはNR7を含んでもよく、式中、R7は水素またはC1-5アルキル(ヒドロキシルで置換されてもよい)である。
【０１５９】
また、本発明のホスホペプチドには、式
2007537164.tif 000047
の非天然の内部アミノ酸も含まれ、
式中、A2はアミノ酸、またはα-カルボキシ基を介して連結したペプチド鎖である；A1はアミノ酸、またはα-アミノ基を介して連結したペプチド鎖である；R1およびR3は独立に水素、C1-5分枝状または直鎖状C1-5アルキル、C1-5アルカリール、ヘテロアリールおよびアリールであり、そのそれぞれは非置換型であるか以下のものより選択される置換基により置換されている：1〜3個のC1-5アルキル、1〜3個のハロゲン、1〜2個の-OR5、N(R5)(R6)、SR5、N-C(NR5)NR6R7、メチレンジオキシ、-S(O)mR5(mは1〜2)、1〜2個の-CF3、-OCF3、ニトロ、-N(R5)C(O)(R6)、-C(O)OR5、C(O)N(R5)(R6)、-1H-テトラゾール-5-イル、-SO2N(R5)(R6)、-N(R5)SO2アリール、または-N(R5)SO2R6；R5、R6およびR7は水素、C1-5直鎖状または分枝状アルキル、C1-5アルカリール、アリール、ヘテロアリールおよびC3-7シクロアルキルより独立に選択され、ここで2つのC1-5アルキル基が1つの原子上に存在する場合にはそれらは任意で連結してC3-8環式環を形成してもよく、これは任意で酸素、イオウまたはNR7を含んでもよく、式中、R7は水素またはC1-5アルキル(ヒドロキシルで置換されてもよい)である；およびR2は水素、F、C1-5直鎖状または分枝状アルキル、C1-5アルカリールである；またはR2およびR1は連結してC3-8環式環を形成し、これは任意で酸素、イオウまたはNR7を含んでもよく、式中、R7は水素またはC1-5アルキル(ヒドロキシルで置換されてもよい)である；またはR2およびR3は連結してC3-8環式環(ヒドロキシルで置換されてもよい)を形成し、これは任意で酸素、イオウまたはNR7を含んでもよく、式中、R7は水素またはC1-5アルキルである。
【０１６０】
本発明はまた、式
2007537164.tif 000048
の非天然の内部アミノ酸が存在する、本発明のホスホペプチドの修飾物も含み、
式中、A2はアミノ酸、またはα-カルボキシ基を介して連結したペプチド鎖である；A1はアミノ酸、またはα-アミノ基を介して連結したペプチド鎖である；R1およびR3は独立に水素、C1-5分枝状または直鎖状C1-5アルキルおよびC1-5アルカリールである；R2は水素、F、C1-5直鎖状または分枝状アルキル、C1-5アルカリールである；またはR2およびR1は連結してC3-8環式環を形成し、これは任意で酸素、イオウまたはNR7を含んでもよく、式中、R7は水素またはC1-5アルキル(ヒドロキシルで置換されてもよい)である；XはOまたはSである；ならびにR5およびR6は水素、C1-5直鎖状または分枝状アルキル、C1-5アルカリール、アリール、ヘテロアリールおよびC3-7シクロアルキルより独立に選択され、ここで2つのC1-5アルキル基が1つの原子上に存在する場合にはそれらは任意で連結してC3-8環式環を形成してもよく、これは任意で酸素、イオウまたはNR7を含んでもよく、式中、R7は水素またはC1-5アルキル(ヒドロキシルで置換されてもよい)である；またはR5およびR6は連結してC3-8環式環を形成し、これは任意で酸素、イオウまたはNR7を含んでもよく、式中、R7は水素またはC1-5アルキル(ヒドロキシルで置換されてもよい)である。
【０１６１】
また、本発明のホスホペプチドには、式
2007537164.tif 000049
のC末端の非天然の内部アミノ酸も含まれ、
式中、A2はアミノ酸、またはα-カルボキシ基を介して連結したペプチド鎖である；R1およびR3は独立に水素、C1-5分枝状または直鎖状C1-5アルキル、C1-5アルカリール、ヘテロアリールおよびアリールであり、そのそれぞれは非置換型であるか以下のものより選択される置換基により置換されている：1〜3個のC1-5アルキル、1〜3個のハロゲン、1〜2個の-OR5、N(R5)(R6)、SR5、N-C(NR5)NR6R7、メチレンジオキシ、-S(O)mR5、1〜2個の-CF3、-OCF3、ニトロ、-N(R5)C(O)(R6)、-C(O)OR5、C(O)N(R5)(R6)、-1H-テトラゾール-5-イル、-SO2N(R5)(R6)、-N(R5)SO2アリール、またはN(R5)SO2R6；R5、R6およびR7は水素、C1-5直鎖状または分枝状アルキル、C1-5アルカリール、アリール、ヘテロアリールおよびC3-7シクロアルキルより独立に選択され、ここで2つのC1-5アルキル基が1つの原子上に存在する場合にはそれらは任意で連結してC3-8環式環を形成してもよく、これは任意で酸素、イオウまたはNR7を含んでもよく、式中、R7は水素またはC1-5アルキル(ヒドロキシルで置換されてもよい)である；R2は水素、F、C1-5直鎖状または分枝状アルキル、C1-5アルカリールである；またはR2およびR1は連結してC3-8環式環を形成し、これは任意で酸素、イオウまたはNR7を含んでもよく、式中、R7は水素またはC1-5アルキル(ヒドロキシルで置換されてもよい)である；またはR2およびR3は連結してC3-8環式環(ヒドロキシルで置換されてもよい)を形成し、これは任意で酸素、イオウまたはNR7を含んでもよく、式中、R7は水素またはC1-5アルキルである；R2は水素、F、C1-5直鎖状または分枝状アルキル、C1-5アルカリールである；ならびにQはOH、OR5またはNR5R6であり、式中、R5、R6は水素、C1-5直鎖状または分枝状アルキル、C1-5アルカリール、アリール、ヘテロアリールおよびC3-7シクロアルキルより独立に選択され、ここで2つのC1-5アルキル基が1つの原子上に存在する場合にはそれらは任意で連結してC3-8環式環を形成してもよく、これは任意で酸素、イオウまたはNR7を含んでもよく、式中、R7は水素またはC1-5アルキル(ヒドロキシルで置換されてもよい)である。ペプチドを修飾するための当技術分野で周知の方法は、例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」(20th ed., ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia)に見いだされる。
【０１６２】
治療的用途
ペプチドの合成および結合
本発明のホスホペプチドは、以上に詳述したようにして調製される。または、ホスホペプチドを、塩化2-クロロトリチル樹脂上での標準的なFMOC化学の手法を用いて調製することもできる(Int. J. Pept. Prot. Res. 38, 1991, 555-61)。樹脂からの切断はジクロロメタン(DCM)中20％酢酸を用いて行い、この際、側鎖はブロックされたままに保たれる。続いて、遊離末端カルボキシル化ペプチドを、過剰量のジメチルホルムアミド(DMF)中ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を用いて、4'(アミノメチル)-フルオレセイン(Molecular Probes, A-1351；Eugene, OR)と室温で結合させる。この蛍光性N-Cブロック型ペプチドをシリカゲルクロマトグラフィー(10％メタノール、DCM中)で精製する。続いて、N末端FMOC基をDMF中ピペリジン(20％)を用いて除去し、N遊離ペプチドをシリカゲルクロマトグラフィー(DCM、0.5％HOAc中20％メタノール)によって精製する。最後に、すべてのt-ブチル側鎖保護基を、水2.5％およびトリイソプロピルシラン2.5％を含む95％トリフルオロ酢酸を用いて除去する。このような方法で得られたペプチドはHPLCによって単一のピークを示すはずであり、下記のアッセイを行える程度に十分に純粋である。
【０１６３】
ホスホペプチドの修飾
ホスホペプチドの治療的有効性および／または生物学的利用能を向上または長期化させるために、本発明のホスホペプチドのアミノ酸残基に対して修飾を加えうることは理解されている。したがって、以下の一般式(I)
2007537164.tif 000050
を有するα-アミノ酸にさまざまな修飾を施すことができ、式中、Rは特定のアミノ酸残基を規定している。α-アミノ酸の例示的な修飾物には、以下の式(II)
2007537164.tif 000051
が非制限的に含まれ、
式中、R1、R2、R3、R4およびR5は独立に水素、ヒドロキシ、ニトロ、ハロ、C1-5分枝状または直鎖状アルキル、C1-5アルカリール、ヘテロアリールおよびアリールである；この際、アルキル、アルカリール、ヘテロアリールおよびアリールは非置換型でもよく、または、C1-5アルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、C1-5アルコキシ、C1-5アルキルチオ、トリハロメチル、C1-5アシル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ニトリル、C1-5アルコキシカルボニル、オキソ、アリールアルキル(アルキル基が1〜5個の炭素原子を有する)およびヘテロアリールアルキル(アルキル基が1〜5個の炭素原子を有する)からなる群より選択される1つもしくは複数の置換基によって置換されていてもよい；または、R1およびR2は連結してC3-8環式環を形成し、これは任意で酸素、イオウまたは水素またはC1-5アルキル(ヒドロキシルで置換されてもよい)を含む；または、R2およびR3は連結してC3-8環式環を形成し、これはヒドロキシルで置換されてもよく、任意で酸素、イオウ、C1-5アミノアルキルまたはC1-5アルキルを含む。修飾を加えるための当技術分野で周知の方法は、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」(20th ed., ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins)に見いだされる。
【０１６４】
アッセイおよびハイスループットアッセイ
蛍光偏光アッセイを、低分子ペプチド模倣物を同定するための排除アッセイにおいて用いることができる。以下は、蛍光偏光を用いるための1つの例示的な方法であり、いかなる場合でも制限的なものとみなされるべきではない。スクリーニングのためには、すべての試薬を適切な濃度で希釈し、作業溶液を氷上に保つ。GSTおよびGST融合タンパク質に関する作業用貯蔵液の濃度は約4ng/μLとし、フルオレセイン標識ホスホペプチドは1.56fmo1/Lの濃度で、一方、冷却ホスホペプチドおよびペプチドは25pmol/μLで用いることができる。試料を黒い平底プレート、Biocoat, #359135低結合性(BD BioSciences；Bedford, MA)中で1ウェル当たり総容積200μLとしてインンキュベートする。アッセイは、Labsystem Multi-Drop 96/384装置(Labsystem；Franklin, MA)を用いて、10％DMSOで希釈した50μLの被験化合物(平均濃度28μM)、50μLの50mM MES-pH 6.5、50μLのフルオレセインホスホペプチド、50μLのGST-BRCA1タンデムBRCTドメイン融合体を連続添加することで開始し、50μLの非標識ホスホペプチドまたは非リン酸化ペプチドを陰性対照として用いることができる。ひとたび添加した上で、すべてのプレートを4℃下に置く。4℃で一晩インキュベートした後に、蛍光偏光をPolarionプレートリーダー(Tecan, Research Triangle Park, NC)を用いて測定する。キセノンフラッシュランプには485nmの励起用フィルターおよび535nmの発光フィルターが装備される。フラッシュの数は30に設定する。続いて生データを全体的な相互作用のパーセンテージに変換することができる。すべてのさらなる分析はSPOTFIREデータ解析ソフトウエア(SPOTFIRE, Somerville, MA)を用いて行うことができる。
【０１６５】
活性化合物が選択されれば、該当物(hit)の自己蛍光ならびにフルオレセインクエンチング効果を測定するが、測定値が2000単位またはそれ以上であれば自己蛍光が示され、測定値が50単位であればクエンチング効果が示される。続いて、確認された該当物を、再確認のために用量反応曲線(IC50)で分析することができる。用量反応における最適な該当物を、続いて、GST-BRCA1タンデムBRCTドメイン融合体を用いて等温滴定熱量測定により評価することができる。
【０１６６】
代替的な結合および排除アッセイ
蛍光偏光アッセイは、スクリーニング戦略においてホスホペプチド-タンパク質相互作用を測定するための1つの手段に過ぎない。ホスホペプチド-タンパク質相互作用を測定するための代替的な方法が当業者には公知である。このような方法には、質量分析(Nelson and Krone, J. Mol. Recognit., 12: 77-93, 1999)、表面プラスモン共鳴(Spiga et al., FEBS Lett., 511: 33-35, 2002；Rich and Mizka, J. Mol. Recognit., 14: 223-8, 2001；Abrantes et al., Anal. Chem., 73: 2828-35, 2001)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)(Bader et al., J. Biomol. Screen, 6: 255-64, 2001；Song et al., Anal. Biochem. 291: 133-41, 2001；Brockhoff et al., Cytometry, 44: 338-48, 2001)、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)(Angers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 3684-9, 2000；Xu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 151-6, 1999)、蛍光クエンチング(Engelborghs, Spectrochim. Acta A. Mol. Biomol. Spectrosc., 57: 2255-70, 70；Geoghegan et al., Bioconjug. Chem. 11: 71-7, 2000)、蛍光活性化細胞スキャニング／ソーティング(Barth et al., J. Mol. Biol., 301: 751-7, 2000)、ELISAおよびラジオイムノアッセイ(RIA)が非制限的に含まれる。
【０１６７】
被験抽出物および化合物
一般に、ホスホペプチド-タンパク質相互作用に影響を及ぼすペプチド模倣化合物は、当技術分野で知られた方法による、天然物および合成(または半合成)抽出物の両方の大規模ライブラリーまたは化学物質ライブラリーから同定される。
【０１６８】
当業者は、被験抽出物または化合物の厳密な源は本発明のスクリーニング手順にとって特に重要ではないことを理解すると考えられる。したがって、事実上あらゆる数の化学抽出物または化合物を、本明細書に記載の例示的な方法を用いてスクリーニングすることが可能である。このような抽出物または化合物の例には、植物、真菌、原核生物または動物を基にした抽出物、発酵培地および合成化合物、ならびに既存の化合物の修飾物が非制限的に含まれる。糖類、脂質、ペプチドおよび核酸を基にした化合物を非制限的に含む、任意の多くの化学化合物のランダム合成または定方向合成(例えば、半合成または全合成)を生じるための方法も数多く利用可能である。合成化合物ライブラリーは、例えば、Brandon Associates(Merrimack, NH)およびAldrich Chemical(Milwaukee, WI)から市販されている。
【０１６９】
または、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態にある天然化合物のライブラリーも、Biotics(Sussex, UK)、Xenova(Slough, UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft. Pierce, FL)およびPharmaMar, U.S.A.(Cambridge、MA)を非制限的に含む、数多くの供給元から市販されている。加えて、必要に応じて、天然および合成的に作成されたライブラリーが、当技術分野で公知の方法、例えば、コンビナトリアルケミストリー法または標準的な抽出法および分画法によって作製される。さらに、必要に応じて、標準的な化学的、物理的または生化学的な方法を用いて、任意のライブラリーまたは化合物を容易に修飾することもできる。
【０１７０】
治療用化合物の投与
リンタンパク質がその結合部位を介してその天然のパートナーと結合するのを選択的に阻害または防止することにより、本発明のホスホペプチドまたはその誘導体もしくはペプチド模倣物は、タンデムBRCTドメインの生物活性または生物的機能を著しく変化させることができる。このため、本発明のホスホペプチドまたはその誘導体は、不適切な細胞周期調節またはアポトーシスを特徴とする疾患または障害の治療のために用いることができる。
【０１７１】
不適切な細胞周期調節を特徴とする疾患または障害には、新生物などの過剰増殖性疾患が含まれる。新生物の例には、聴神経腫、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性単球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性赤白血病、腺癌、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、慢性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、結腸癌腫、頭蓋咽頭腫、嚢胞腺癌、胎児性癌、内皮肉腫、上衣細胞腫、上皮癌、ユーイング腫瘍、神経膠腫、重鎖病、血管芽細胞腫、肝癌、ホジキン病、大細胞癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肺癌、肺癌腫、リンパ管内皮肉腫、リンパ管肉腫、マクログロブリン血症、髄様癌、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、粘液肉腫、神経芽細胞種、非ホジキン病、乏突起神経膠腫、骨原性肉腫、卵巣癌、膵癌、乳頭状腺癌、乳頭状癌、松果体腫、真性赤血球増加症、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、神経鞘腫、皮脂腺癌、精上皮腫、小細胞肺癌、扁平上皮癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、子宮癌、ワルデンシュトレーム線維肉腫およびウィルムス腫瘍が非制限的に含まれる。
【０１７２】
タンデムBRCTドメインと結合するホスホペプチドまたはペプチド模倣性低分子は、薬学的に許容される希釈剤、担体または添加剤の中にある状態で、単位用量剤形として投与することができる。過剰な細胞増殖によって引き起こされる疾患に罹患している患者に化合物を投与するのに適した製剤または組成物を提供するためには、従来の薬学的手法を用いることができる。投与は患者が発症する前に開始してもよい。任意の適切な投与経路を用いることができ、例えば、投与は非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼部、脳室内、関節内、髄腔内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、坐薬または経口投与などであってよい。例えば、治療用製剤は液性溶液または懸濁液の形態であってよく；経口投与用の製剤は錠剤またはカプセル剤の形態であってよく；鼻腔内投与用の製剤は粉剤、点鼻薬またはエアロゾルの形態であってよい。
【０１７３】
医薬製剤
本発明の薬学的組成物は、例えば、従来の溶解、凍結乾燥、混合、顆粒化または糖衣化の手段により、それ自体が公知である様式で調製される。製剤を作るための当技術分野の周知の方法は、例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」(20th ed., ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia)に見いだされる。
【０１７４】
活性成分の溶液、同じく懸濁液、特に等張水溶液または懸濁液を用いることが好ましく、例えば、活性成分を単独でまたはマンニトールなどの担体とともに含む凍結乾燥組成物の場合には、このような溶液または懸濁液を使用前に作る必要があるため、このことが想定される。薬学的組成物は滅菌されていてよく、ならびに／または添加剤、例えば保存料、安定化剤、湿潤剤および／もしくは乳化剤、溶解補助剤、浸透圧を調節するための塩および／もしくは緩衝液を含んでもよく、例えば、従来の溶解または凍結乾燥工程の手段により、それ自体が知られた様式で調製される。この溶液または懸濁液が、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンなどの粘性増強物質を含んでいてもよい。
【０１７５】
油中懸濁液は、油成分として、注射目的用に慣例化している植物油、合成油または半合成油を含む。このようなものとして特に、8〜22個、特に12〜22個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸、例えば、ラウリン酸、トリデシル(tridecylic)酸、ミリスチン酸、ペンタデシル(pentadecylic)酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸または対応する不飽和酸、例えばオレイン酸、エライジン酸、エルカ酸、ブラシジン(brasidic)酸またはリノール酸の酸成分を含む液体脂肪酸エステルを挙げることができ、これに必要に応じて抗酸化物質、例えば、ビタミンE、β-カロテンまたは3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシトルエンを添加してもよい。このような脂肪酸エステルのアルコール成分は最大6個の炭素原子を有し、モノ-またはポリ-ヒドロキシ、例えば、モノ-、ジ-またはトリ-ヒドロキシアルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールもしくはペンタノールまたはそれらの異性体であるが、特にグリコールおよびグリセロールである。このため、脂肪酸エステルの以下の例に言及しておく必要がある：オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、「Labrafil M 2375」(ポリオキシエチレングリコールトリオレエート、Gattefoss, Paris)、「Miglyol 812」(鎖の長さがC8〜C12であるトリグリセリド飽和脂肪酸、Huls AG, Germany)、しかし、特に、植物油、綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ひまし油、ゴマ油、大豆油、さらに特にラッカセイ油など。
【０１７６】
注射用組成物は、無菌条件下で慣例的な様式で調製される；これと同じことが、組成物をアンプルまたはバイアルに投入して容器を密封することに対しても当てはまる。
【０１７７】
経口投与用の薬学的組成物は、活性成分を固体担体と混合し、その結果生じた混合物を必要に応じて顆粒化し、所望であればまたは必要に応じて、適切な添加剤の添加後に、混合物を錠剤、糖剤コアまたはカプセル剤として加工することによって得ることができる。また、それらを、活性成分を調整された量として拡散または放出させることを可能にするプラスチック担体中に組み入れることもできる。
【０１７８】
適した担体には特に、糖(例えばラクトース、サッカロース、マンニトールまたはソルビトール、セルロース調製物)および／またはリン酸カルシウム(例えばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム)などの増量剤、ならびに結合剤(例えば、トウモロコシ、コムギ、イネまたはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／もしくはポリビニルピロリドン)、ならびに／または必要に応じて崩壊剤(例えば、上記のデンプン、同じくカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩(例えばアルギン酸ナトリウム)がある。添加剤には特に、流動調節剤および潤滑剤、例えばケイ酸、タルク、ステアリン酸またはそれらの塩(例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム)および／またはポリエチレングリコールがある。糖剤コアには、適した、任意には腸溶性のコーティングが施され、これにはとりわけ、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび／もしくは二酸化チタンを含んでもよい濃縮糖溶液、または適した有機溶媒中にあるか腸溶コーティングの調製のためのコーティング用溶液、適したセルロース調製物(例えばエチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート)の溶液が用いられる。カプセルには、ゼラチンで構成された乾燥充填カプセル、およびゼラチンおよび可塑剤(グリセロールまたはソルビトールなど)で構成された軟密封カプセルがある。乾燥充填カプセルは、顆粒の形態にある活性成分を、例えばラクトースなどの増量剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの流動促進剤、必要に応じて安定化剤などとともに含みうる。軟カプセル中の活性成分は、脂肪油、パラフィン油または液体ポリエチレングリコールなどの適した油性添加剤中に溶解または懸濁化させることが好ましく、これに安定化剤および／または抗菌薬を添加することもできる。例えば識別目的のため、または活性成分の用量の違いを示すために、染料または色素を錠剤または糖剤コーティングまたはカプセル外被に添加してもよい。
【０１７９】
薬学的組成物は、活性成分を約1％〜約95％、好ましくは約20％〜約90％含む。本発明による薬学的組成物は、例えば、アンプル、バイアル、坐薬、糖剤、錠剤またはカプセル剤などの形態にある単位用量剤形にあってよい。
【０１８０】
製剤は、ヒト患者に対して、治療的有効量(例えば、宿主真核生物における疾患、障害または感染のの発生または進行を低下、抑制、減衰、減弱、停止または安定化する量)として投与することができる。投与される治療薬の好ましい投与量は、障害の種類および程度、個々の患者の全般的な健康状態、化合物の添加剤の製剤形態およびその投与経路といったといった変数に依存すると考えられる。
【０１８１】
上記の適用方法のいずれについても、タンデムBRCTドメインと相互作用する化合物は、必要な治療的事象の部位に対して(例えば、注射により)、または予想される治療的事象の近傍の組織に対して、または強化治療を必要とすると予想される細胞への供給路である血管に対して適用することができる。
【０１８２】
タンデムBRCTドメインと相互作用する化合物の投与量は、個々の患者の体格および健康状態を含む、さまざまな要因に依存するが、一般的には、薬学的に許容される製剤中にある状態で、1日に0.1mgから1000mgまでの範囲で投与される。さらに、本明細書中に記載したアプローチの任意のものによる治療を、より慣習的な治療法と併用することもできる。
【０１８３】
併用療法
上記のように、タンデムBRCTドメインと相互作用する化合物による治療を、必要に応じて、放射線療法、外科手術または化学療法といった増殖性疾患の治療のための治療法と併用することもできる。タンデムBRCTドメインと相互作用する化合物とともに投与しうると思われる化学療法薬を表3に列記している。
【０１８４】
（表３）
2007537164.tif 000052
表3(続き)
2007537164.tif 000053
表3(続き)
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表3(続き)
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表3(続き)
2007537164.tif 000056
【０１８５】
遺伝子治療
本発明のもう1つの態様において、BRCA1遺伝子、または本発明のペプチドをコードする別の遺伝子を、遺伝子治療の手法を用いて対象に投与することもできる。概論については、Morgan et al., Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217, 1993；Culver et al., Trends Genet. 10: 174-178, 1994；および米国特許第5,399,346号(French et al.)を参照されたい。一般的な原則は、BRCA1遺伝子が発現されて、内因性、欠陥性または欠如性のBRCA1ポリペプチドの活性を補うことができるBRCA1ポリペプチドまたはその生物活性断片が産生されるように、BRCA1遺伝子を例えば患者の癌細胞に導入することである。
【０１８６】
遺伝子治療の1つの望ましい様式は、BRCA1ポリヌクレオチドを、それが細胞内で複製し、それによって干渉効果が増強または持続するような方法で提供することである。このため、BRCA1ポリヌクレオチドを、対応する遺伝子の天然のプロモーター、癌細胞において本質的に活性のある異種プロモーター、または適した作用因子によって誘導されうる異種プロモーターといった適したプロモーターと機能的に結合させることができる。
【０１８７】
本発明による遺伝子治療のもう1つの局面においては、ポリヌクレオチドがBRCA1関連遺伝子、例えば、細胞周期調節に関与する遺伝子(例えば、cdk2)の発現を干渉するように、ポリヌクレオチドを癌細胞に導入する。投与されたポリヌクレオチドは、BRCA1関連遺伝子と直接的と複合体を形成することにより、またはBRCA1関連遺伝子から転写されたRNAと複合体を形成することにより、BRCA1関連遺伝子の発現を阻止する。構築物は、そのポリヌクレオチド配列がBRCA1関連遺伝子の配列に対して相補的であるように設計することが望ましい。このため、細胞ゲノム中にひとたび組み込まれると、投与されたポリヌクレオチドの転写物はBRCA1関連遺伝子の転写物に対して相補的となり、そのため、このポリヌクレオチドはBRCA1関連遺伝子の転写物とハイブリダイズ可能であると考えられる。このアプローチはアンチセンス療法またはRNAiとして知られている。例えば、Culver et al., 前記；およびRoth, Ann. Surg. Oncol. 1: 79-86, 1994を参照されたい。
【０１８８】
例示的な疾患標的には、前立腺癌、卵巣癌、大腸癌、胃癌、肺癌、食道癌、頭部癌、頸部癌、膀胱癌、扁平上皮癌、乳癌、子宮頸癌および子宮内膜癌が非制限的に含まれる。
【０１８９】
遺伝子治療の方法に関する全般的な総説については、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12: 488-505, 1993；Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95, 1991；Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596, 1993；Mulligan, Science 260: 926-932, 1993；およびMorgan and Anderson, 前記を参照されたい。  
【０１９０】
用いることのできる、組換えDNA技術の分野で一般に公知な方法は、Ausubel et al. 前記；およびKriegler, 1990,「Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual」, Stockton Press, NYに記載されている。
【０１９１】
癌関連病態を有すると診断された、またはそれを発症する性向を有する患者に対して、BRCA1遺伝子が患者の1つまたは複数の細胞に取り込まれ、細胞および／または細胞の子孫によって発現可能であるように、当技術分野で公知で本明細書中に記載された適した方法を用いてBRCA1遺伝子を投与することができることが構想される。本方法は適した組成物中にあるBRCA1遺伝子のインビボ投与を含むことができ、または本方法には、患者の1つもしくは複数の細胞を取り出して、BRCA1遺伝子により形質転換し、任意には増殖させた上で、患者に再び投与するというエクスビボ療法も含まれうる。形質転換細胞におけるBRCA1遺伝子の発現は、患者におけるBRCA1活性を再び活性化し、以上に考察したようにそれによって細胞周期の調節(したがって癌関連病態の抑制)を促し、このため患者が罹患している病態の改善をもたらすと考えられる。
【０１９２】
BRCA1核酸分子による標的細胞の形質転換は、BRCA1核酸分子を適したベクター中にある形態で提供すること、またはBRCA1核酸分子のリポソーム中への封入といった当技術分野で公知の適した手法によって容易に行われる。核酸分子は、抗原特異的なホーミング機構により、または直接的な注入により、癌の部位に与えることができる。1つのアプローチでは、核酸分子をプロモーターと機能的に結合させ、それを発現ベクター中に含める。もう1つのアプローチでは、核酸分子を、組換えウイルスベクター中、例えば、アデノウイルスベクター(例えば、Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503, 1993；Rosenfeld et al., Science 252: 431-434, 1991；Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155, 1992；およびMastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91: 225-234, 1993を参照のこと)、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV；例えば、Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300, 1993を参照のこと)、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター(例えば、Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599；Boesen et al., Biotherapy 6: 291-302, 1994；Clowes et al., J. Clin. Invest. 93: 644-651, 1994；Kiem et al., Blood 83: 1467-1473, 1994；Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129-141, 1993；およびGrossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114, 1993を参照のこと)、ポックスウイルスベクターまたはバキュロウイルスベクター中に含める。
【０１９３】
非ウイルス性ベクターを遺伝子治療のために用いることもできる。例えば、裸のDNAを、リポソーム、受容体を介した送達、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔法、微粒子銃(遺伝子銃)、微量注入、細胞融合、染色体を介した遺伝子導入、マイクロセルを介した遺伝子導入、スフェロプラスト融合または加圧を介した遺伝子送達によって送達することができる。外来性遺伝子の細胞内への導入のための手法は多数のものが当技術分野において公知であり(例えば、Loeffler and Behr, Meth. Enzymol. 217: 599-618, 1993；Cohen et al., Meth. Enzymol. 217: 618-644, 1993；Cline, Pharmac. Ther. 29: 69-92, 1985を参照のこと)、レシピエント細胞の必要な発生上および生理的な機能が妨げられない限り、本発明に従って用いることができる。通常、導入の方法は、細胞に対する選択マーカーの導入を含む。続いて細胞を、導入遺伝子を取り込んで発現している細胞を単離するための選択下に置く。続いて、形質転換細胞を患者に送達する。この手法は、細胞への遺伝子の安定的な導入をもたらすはずであり、このため、遺伝子は細胞によって発現され、好ましくは細胞の子孫へと遺伝してそれらによっても発現される。
【０１９４】
所望の遺伝子を細胞内に導入し、相同組換えによって、宿主前駆細胞のDNA中に発現のために組み入れることが好ましい(例えば、Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935, 1989；Zijlstra et al., Nature 342: 435-438, 1989を参照のこと)。
【０１９５】
BRCA1遺伝子またはその断片を含むベクターは、本発明のペプチド薬剤または候補化合物の投与のために、上記のようにして、例えば、腫瘍細胞または他の癌性細胞の部位にある動脈に対して投与することができる。
【０１９６】
単一遺伝子性疾患、早期腫瘍および心血管疾患の治療に対する遺伝子治療の有効性に関してはさまざまな報告が提示されている(例えば、Blaese et al., Science 270: 475-480, 1995；Wingo et al., Cancer 82: 1197-1207, 1998；Dzao, Keystone Symposium Molecular and Cellular Biology of Gene Therapy, Keystone, Co. January 19-25, 1998；およびIsner, Keystone Symposium Molecular and Cellular Biology of Gene Therapy, Keystone, Co. January 19-25, 1998.を参照のこと)。
【０１９７】
1つの好ましい態様においては、前立腺癌、卵巣癌、大腸癌(例えば、大腸腺癌)、胃癌、肺癌、食道癌、頭部癌、頸部癌、膀胱癌(例えば、膀胱移行上皮癌)、扁平上皮癌、乳癌、子宮頸癌または子宮内膜癌と診断された患者を、腫瘍細胞における発現用のプロモーター(例えば、前立腺、卵巣、大腸、胃、肺、食道、頭部、頸部、膀胱、扁平上皮細胞、乳房、子宮頸部または子宮内膜に対して特異的なプロモーター)の制御下にあるBRCA1 cDNAを含む組換えレトロウイルスの投与からなるインビボ方法を用いて治療することができる。インビボ療法は、患者から細胞をあらかじめ取り出す必要のない、患者の細胞へのBRCA1核酸分子の直接的なトランスフェクションを含む。
【０１９８】
インビボ送達は、(1)組換えレトロウイルスベクター構築物を、腫瘍に灌流している血管内に注入すること、または(2)組換えレトロウイルスベクター構築物を腫瘍内に直接注射すること、によって達成することが望ましい。特に望ましい1つのインビボ態様では、カテーテルを生物体の頸部の血管内に挿入し、X線透視下で、留置カテーテルの先端を腫瘍の一部分に灌流している動脈の位置へと進める。留置カテーテルの先端は、細胞が直接標的となってトランスフェクトされるように、腫瘍領域の近傍に配置することが望ましい。また、癌細胞特異的表面抗原を用いてレトロウイルス構築物を癌細胞に直接向かわせることもできるが、これは必要とはされない。組換えレトロウイルスは、ボーラスとして、または一定の期間にわたる持続注入のいずれかとして、任意の適した薬理学的組成物中にある状態で静脈投与によって患者に投与されることが望ましい。腫瘍内への、または腫瘍に灌流している血管内への直接的な組換えレトロウイルスの注射は、腫瘍細胞へのBRCA1 cDNAの取り込みを促し、それによって腫瘍の細胞増殖を抑制するとともにそれ以上の腫瘍形成を防止すると考えられる。
【０１９９】
腫瘍の細胞への組換えレトロウイルスベクター構築物の送達後には、レトロウイルスベクター構築物が癌細胞に感染し、その構築物中に含まれるBRCA1ポリペプチドが細胞で発現されるのに十分な期間にわたって細胞を生理的条件下に保つ。癌細胞におけるBRCA1ポリペプチドの発現のために十分な期間は、当技術分野で周知であるように、用いるレトロウイルスベクターの種類および送達の方法によって異なる。また、用いるレトロウイルスベクターは複製能欠損性であるために、それが最終的に感染させた細胞内で複製を行えないであろうことにも注目すべきであろう。
【０２００】
レトロウイルスベクター構築物は、典型的には、生理的に許容される担体およびレトロウイルスベクター構築物を含む薬理学的組成物の形態で送達される。レトロウイルスベクター構築物の有効量が送達されるが、これは1pfu/細胞、5pfu/細胞、10pfl/細胞もしくは20pfu/細胞、または標的癌細胞におけるBRCA1ポリペプチドの発現を促すのに有効な任意の他の量からなる。レトロウイルスベクター構築物の有効量を決定するための手段は当技術分野で周知である。
【０２０１】
同じく当技術分野で周知であるように、任意の特定の対象に対する具体的な投与レベルは、レトロウイルスベクターの感染性、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事内容、投与時間、投与経路、排出速度および患者の状態の重症度を含む、さまざまな要因に依存する。
【０２０２】
BRCA1をコードするもの以外の遺伝子、例えば、本発明のBRCA1結合性ペプチドをコードするもの(例えば、BACH1ポリペプチドをコードする遺伝子)などを、代替的に、前記の遺伝子治療に用いることもできる。
【０２０３】
参照としての組み入れ
以下の文書は参照として組み入れられる：2002年11月14日に提出された第60/426,132号；2003年7月8日に提出された第60/485,641号；2003年7月17日に提出された第60/487,899号；および2003年11月14日に提出された第10/713,978号。
【０２０４】
本明細書において言及されたすべての特許および刊行物は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が参照として組み入れられるように特定的および個別に示されている場合と同程度に、参照として本明細書に組み入れられる。
【０２０５】
その他の態様
以上の説明から、本発明を種々の用法および条件に適合させるために、本明細書において記載した本発明に種々の変更および修正を加えうることは明らかである。このような態様も以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】図1Aおよび図1Bは、BACH1ホスホペプチドと複合体を形成したBRCA1タンデムBRCTドメインの構造を示している。図1Aは、棒状表示として示したpSer含有BACH1ペプチドと複合体を形成したBRCA1タンデムBRCTドメインのリボン表示である。BACH1ホスホペプチドは2つのBRCTリピートの界面で結合している。BRCT2中の二次構造エレメントには、それらをBRCT1中の二次構造エレメントと区別するために「プライム」印を付している。310ヘリックスの領域には印を付していない。図1Bは、BACH1ホスホペプチドの範囲をカバーする電子密度地図(2F0-Fc)である。
【図２】図2Aおよび図2Bは、BACH1ホスホペプチド結合部位に関連したBRCA1 BRCT癌連鎖性変異および配列保存性を示している。図2Aは、BRCA1タンデムBRCTドメインの分子表面表示であり、癌に関連した変異S1655F、D1692Y、C1697R、R1699Q、S1715R、M1775RおよびY1853Xがホスホペプチド結合部位に対してどのようにクラスターを形成するかを示している。図2Bは、分子表面の正面図および背面図の比較であり、ヒト、チンパンジー、マウス、ラット、ニワトリおよびアフリカツメガエルのBRCA1タンデムBRCTドメインで保存されている残基のクラスター化を示している。BACH1ペプチドは保存されたホスホペプチド結合溝に結合している。
【図３】図3A、図3Bおよび図3Cは、タンデムBRCTドメイン変異の機能的影響を示している。図3Aは、BRCA1タンデムBRCTドメインとBACH1ホスホペプチドとの間のタンパク質-ペプチド接触の概略図である。水素結合、ファンデルワールス相互作用および水分子がそれぞれ破線、半月印および円印によって示されている。図3Bでは、指示された変異を含む野生型および変異型のmycタグ付加BRCA1タンデムBRCTドメイン構築物を、ビーズ固定した最適なタンデムBRCTドメイン相互作用ホスホペプチドYDIpSQVFPFまたはその非リン酸化対応物に対する結合に関して分析した。R1699Q変異体の弱いリン酸化非依存的結合が、他のレーンに用いたものの10倍の試料投入量を用いて観察された。図3Cでは、野生型および変異型のmycタグ付加BRCA1タンデムBRCTドメイン構築物をトランスフェクトしたU2OS細胞を、内因性BACH1との会合に関して分析した。
【図４】図4A、図4Bおよび図4Cは、BACH1ホスホペプチドのPhe+3位が、BRCA1タンデムBRCTドメインの結合特異性のために必須であることを明示している。図4Aは、BRCA1タンデムBRCTドメインからの残基Phe1704、Met1775およびLeu1704が、BACH1ホスホペプチドのPhe+3位を収容する疎水性ポケットを形成することを示している。図4Bでは、BRCA1 M1775RタンデムBRCTドメイン変異体と野生型：BACH1ホスホペプチド複合体との結晶構造の重ね合わせにより、この変異がBACH1のPhe+3位を塞ぐことが明示されている。図4Cは、BACH1ホスホペプチドスポットアレイに対するBRCA1野生型タンデムBRCTドメインおよびM1775R変異体の結合を示している。M1175R変異体スポットのブロッティングは10倍量のタンパク質を用いて行い、野生型タンパク質よりもはるかに長い時間をかけてフィルムに露出させた。
【図５】図5Aおよび図5Bは、BRCA1 BRCTドメインの核内リンタンパク質への局在を示している。図5Aは、Triton X-100を含む緩衝液を用いた抽出の前(左のパネル)または後(右のパネル)の非照射U2OS細胞における、mycタグ付加BRCA1タンデムBRCTドメインの野生型、M1775R型またはK1702M/S1655A型の局在を示している。バーは25μmを表している。図5Bは、細胞に対する10Gyのγ線照射から2時間後の、図5Aと同様のTriton X-100抽出後の局在を示している。抽出した細胞の、DNA損傷応答キナーゼATMおよびATRによって生じるリン酸化モチーフを認識する抗pSer/pThr-Glnエピトープ抗体を用いた染色も行った。バーは10μmを表している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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