(57)【要約】  本発明は、卵胞刺激ホルモンとＰＥＧ部分のコンジュゲートを提供する。コンジュゲートは、間に介在する完全なグリコシル結合基を介して結合し、その基は、ペプチドおよび修飾基と共有結合する。コンジュゲートは、グリコシルトランスフェラーゼの作用により、グリコシル化ペプチドからも非グリコシル化ペプチドからも形成される。グリコシルトランスフェラーゼは、ペプチド上のアミノ酸またはグリコシル残基上に被修飾糖部分を連結する。コンジュゲートを含む薬剤製剤も提供される。コンジュゲートを調製する方法も、本発明の範囲内にある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の部分
【化１】
2007515410.tif 000050
［式中、
Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖または分枝ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である］
を含む卵胞刺激ホルモンペプチド。
【請求項２】
Ｌ−Ｒ１が次式
【化２】
2007515410.tif 000051
［式中、
ａは０〜２０の整数である］
で表される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｒ１が、次式
【化３】
2007515410.tif 000052
［式中、
ｅおよびｆは、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑは０〜２０の整数である］
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｒ１が、次式
【化４】
2007515410.tif 000053
［式中、
ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑおよびｑ’は１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である］
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｒ１が、次式
【化５】
2007515410.tif 000054
［式中、
ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑ、ｑ’およびｑ’’は１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である］
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
Ｒ１が、次式
【化６】
2007515410.tif 000055
［式中、
ｅおよびｆは、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数である］
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
前記部分が次式
【化７】
2007515410.tif 000056
で表される、請求項１に記載のＦＳＨペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが配列番号１および配列番号２から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
前記部分が、次式
【化８】
2007515410.tif 000057
［式中、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｉ、ｒ、ｓ、ｔ、およびｕは、０および１からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑは１であり、
ｅ、ｆ、ｇ、およびｈは、０〜６の整数からそれぞれ独立に選択されるメンバーであり、
ｊ、ｋ、ｌ、およびｍは、０および１００の整数からそれぞれ独立に選択されるメンバーであり、
ｖ、ｗ、ｘ、およびｙは０および１からそれぞれ独立に選択され、ｖ、ｗ、ｘおよびｙの少なくとも１つは１であり、
ＡＡは、前記ＦＳＨペプチドのアミノ酸残基であり、
Ｓｉａ−（Ｒ）は、次式
【化９】
2007515410.tif 000058
（式中、
Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖または分枝ポリ（エチレングリコール）残基から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である）を有する］
で表される、請求項１に記載のＦＳＨペプチド。
【請求項１０】
前記アミノ酸残基がアスパラギン残基である、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記アミノ酸残基が、配列番号２のＮ７、配列番号２のＮ２４、配列番号１のＮ５２、配列番号１のＮ７８、およびそれらの組合せから選択されるメンバーであるアスパラギン残基である、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドが、生物活性のある卵胞刺激ホルモンペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１３】
次式の部分
【化１０】
2007515410.tif 000059
［式中、
Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖または分枝ポリ（エチレングリコール）残基から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である］
を含むＦＳＨペプチドコンジュゲートを作製する方法であって、
（ａ）基質ＦＳＨペプチドを、次式
【化１１】
2007515410.tif 000060
で表されるＰＥＧ−シアル酸供与部分と、および前記ＰＥＧ−シアル酸を前記ＦＳＨペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基上に転移する酵素とを、転移に適した条件下で接触させる工程を含む方法。
【請求項１４】
Ｌ−Ｒ１が次式
【化１２】
2007515410.tif 000061
［式中、
ａは０〜２０の整数である］
で表される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ１が、次式
【化１３】
2007515410.tif 000062
［式中、
ｅおよびｆは、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑは０〜２０の整数である］
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ１が、次式
【化１４】
2007515410.tif 000063
［式中、
ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑおよびｑ’は１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である］
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ１が、次式
【化１５】
2007515410.tif 000064
［式中、
ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑ、ｑ’およびｑ’’は１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である］
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ１が、次式
【化１６】
2007515410.tif 000065
［式中、
ｅおよびｆは、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数である］
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ａ）の前に、
（ｂ）適切な宿主中で前記基質卵胞刺激ホルモンペプチドを発現させる工程
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主が、昆虫細胞および哺乳動物細胞から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物において卵胞を刺激する方法であって、請求項１に記載のペプチドを前記哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項２２】
治療を必要とする対象における状態を治療する方法であって、前記状態が生殖上の不妊を特徴とし、前記対象に、請求項１に記載のペプチドを、前記対象における前記状態の改善に有効な量投与する工程を含む、方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の卵胞刺激ホルモンペプチドと、製剤上許容される担体とを含む医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００３年１２月３日出願の米国仮特許出願第６０／５２７０８２号、２００４年１月２６日出願の米国仮特許出願第６０／５３９３８７号、２００４年７月２９日出願の米国仮特許出願第６０／５９２７４４号、２００４年９月２９日出願の米国仮特許出願第６０／６１４５１８号、２００４年１０月２９日出願の米国仮特許出願第６０／６２３３８７号に基づく優先権を主張するものであり、これらはそれぞれ、すべての目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、典型的な治療用ペプチドであるが、理想的な薬理学的特性を満たさないので、現在十分に利用されていない。ＦＳＨは、性腺機能の重要な制御因子である。男性では、このホルモンは精子形成に重要であり（例えば、Ｓｉｍｏｎｉ，Ｍ．ら、（１９９９）Ａｎｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）６０：１０２を参照）、女性では、ＦＳＨは卵胞の発育および成熟の役割を担う（例えば、Ｒｏｂｋｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら、（１９９８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６１：２５を参照）。ＦＳＨは、胚発生にも重要である。新生児中の一次卵母細胞は、第一減数分裂の前期段階で停止し、厚さが細胞１〜２個の卵胞細胞の層によって取り囲まれ、原始卵胞と呼ばれる構造を構成している。他の因子と協調して、ＦＳＨによる原始卵胞の刺激により、発育および胞状卵胞と称する、より複雑な構造へのその進行が開始される（Ｕｅｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：８２８２〜８２８６（１９８７）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４９：７４４〜７４９（１９８７））。
【０００３】
ＦＳＨは、多嚢胞性卵巣症候群を含めた様々な無排卵状態を治療する補助生殖技術、および例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精に関連する複数の卵胞の刺激に使用される。今日入手可能なＦＳＨ製品は、ヒト尿から精製され、または組換えにより産生された野生型ＦＳＨであり、したがって、天然に存在するＦＳＨと極めて類似したものである。
【０００４】
尿から抽出され、または組換えＤＮＡ技術により産生された卵胞刺激ホルモンは、非経口投与されるタンパク質製品であり、排卵誘発（ＯＩ）および過排卵誘起（ＣＯＨ）の専門家によって使用される。ＯＩは、単一の卵胞に排卵させることを対象とするが、ＣＯＨは、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏ補助生殖技術で使用する（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精用の）複数の卵母細胞を採取することを対象とする。ＦＳＨを含む製剤の臨床使用は、１９６０年代に始まった。
【０００５】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、下垂体由来のヘテロダイマー糖タンパク質であり、αおよびβと呼ばれる２種のサブユニットからなる。ＦＳＨのα−サブユニットは、他の糖タンパク質ホルモン［例えば、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、ＬＨ、およびＴＳＨ］のα−サブユニットと同一であるが、β−サブユニットは独特であり、受容体結合特異性を付与する。α鎖は、９２アミノ酸残基からなり、アスパラギン残基Ｎ５２およびＮ７８に位置する２つのＮ−グリコシル化部位を有する。それは、１１１アミノ酸からなるＦＳＨβ鎖と非共有結合する。β鎖も、残基Ｎ７およびＮ２４に位置する２つのＮ−グリコシル化部位を含む（例えば、Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅ  Ａ、（１９９８）Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｕｐｄａｔｅ  ４：２６０を参照）。
【０００６】
これらのホルモンの細胞受容体は、Ｇタンパク質共役型の分類の膜結合型受容体のメンバーであり、活性化したとき、アデニル酸シクラーゼの活性の増大を刺激する。この糖タンパク質ホルモン受容体ファミリーは、ホルモン結合に関与する親水性のアミノ末端ドメインのサイズが大きいことにより、β−２−アドレナリン作動性、ロドプシン、およびサブスタンスＫの受容体など他のＧタンパク質共役型受容体と区別される。
【０００７】
現在のところ、そのホルモンが迅速に排除されるので、ＦＳＨで治療を受けている患者は、毎日の注射で治療を受けることが必要である。したがって、当技術分野で必要なものは、均一なバッチで、経済的にかつ産業規模で生成することができる、長続きする治療用ＦＳＨペプチドである。
【０００８】
費用効率のよい糖ペプチド治療薬を提供する問題の解決法の１つは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が長いペプチドを提供することであった。一部の例では、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が長くなった突然変異ＦＳＨペプチドが生成されている（例えば、Ｐｅｒｌｍａｎ，Ｓ．、（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ８８，：３２２７を参照）。あるいは、一般に、合成ポリマーをペプチド骨格に結合することにより、薬物動態特性が向上した糖ペプチド治療薬が生成されている。ペプチドと結合している例示的なポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）である。ＰＥＧを使用してペプチド治療薬を誘導体化することにより、ペプチドの免疫原性が低下することが実証されている。例えば、米国特許第４１７９３３７号（Ｄａｖｉｓら）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールと結合した、酵素やペプチドホルモンなどの非免疫原性ポリペプチドを開示している。免疫原性の低下に加えて、問題となるポリペプチドのＰＥＧコンジュゲートのサイズが大きいので、循環中での排除時間は延長している。
【０００９】
ＰＥＧおよびその誘導体をペプチドに結合する主な形態は、ペプチドのアミノ酸残基を介する非特異的な結合である（例えば、米国特許第４０８８５３８号、米国特許第４４９６６８９号、米国特許第４４１４１４７号、米国特許第４０５５６３５号、およびＰＣＴ  ＷＯ８７／０００５６を参照）。ＰＥＧをペプチドに結合する他の形態は、糖ペプチド上のグリコシル残基の非特異的な酸化を介するものである（例えば、ＷＯ９４／０５３３２を参照）。
【００１０】
これらの非特異的な方法では、無作為なかつ非特異的な形で、ペプチド骨格上の反応性残基にポリ（エチレングリコール）を添加する。もちろん、ＰＥＧ分子の無作為な添加には、最終産物の均一性の欠如を含めた欠点があり、ペプチドの生物活性または酵素活性が低下する可能性がある。したがって、治療用ペプチドの生成には、特異的に標識され、特徴付けが容易であり、基本的に均一な産物が形成される誘導体化の戦略が優れている。そのような方法が開発されている。
【００１１】
特異的に標識された均一なペプチド治療薬を、酵素の作用を介してｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成することができる。合成ポリマーまたは他の標識をペプチドに結合する典型的な非特異的方法と異なり、酵素に基づく合成は、位置選択性および立体選択性の利点を有する。標識ペプチドの合成で使用する主な２種類の酵素は、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼ）、およびグリコシダーゼである。治療的部分を含むように引き続き修飾することができる糖の特異的な結合にこれらの酵素を使用することができる。あるいは、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾されたグリコシダーゼを使用して、被修飾糖をペプチド骨格に直接転移することができる（米国特許第６３９９３３６号、ならびに米国特許出願公報第２００３００４００３７号、第２００４０１３２６４０号、第２００４０１３７５５７号、第２００４０１２６８３８号、および第２００４０１４２８５６号、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれている）。化学的な合成の要素と酵素的な合成の要素をどちらも組み合わせた方法も知られている（例えば、参照により本明細書に組み込まれているＹａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０５：４１５〜４２２（１９９８）および米国特許出願公報第２００４０１３７５５７号を参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
改良された治療用ＦＳＨの必要性を受けて、本発明は、治療上活性があり、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化されていない同一の、または密接に類似したＦＳＨペプチドと比較して薬動力学的なパラメーターおよび特性が向上したＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＦＳＨを提供する。さらに、本発明は、本発明の改良ＦＳＨペプチドを費用効率よく産業規模で生成する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
これまでに、１個または複数個のポリ（エチレングリコール）部分で卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を調節しながら修飾すると、対応する天然の（非ＰＥＧ化）ＦＳＨと比較して薬物動態特性が向上した新規のＦＳＨ誘導体をもたらす（図３）ことが見出された。さらに、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＦＳＨのバイオアベイラビリティーは、天然のＦＳＨと同等またはそれより良好である（図４）。
【００１４】
例示的な実施形態では、本発明の「ＧｌｙｃｏＰＥＧ化」ＦＳＨ分子は、グリコシル化または非グリコシル化ＦＳＨペプチドと、その構造内にポリ（エチレングリコール）部分を含む、酵素により転移可能なサッカリル部分の間での酵素媒介性のコンジュゲート形成によって産生される。ＰＥＧ部分は、サッカリル部分と直接（すなわち２つの反応性基の反応によって形成される単一の基を介して）またはリンカー部分、例えば置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルなどを介して結合している。例示的な、転移可能なＰＥＧ−サッカリル構造を図５に示す。
【００１５】
したがって、一態様では、本発明は、ＰＥＧ部分、例えばＰＥＧと、当技術分野で認められるＦＳＨと同様の、または類似したｉｎ  ｖｉｖｏ活性を有するペプチドとのコンジュゲートを提供する。本発明のコンジュゲートでは、ＰＥＧ部分は、完全なグリコシル結合基を介してペプチドと共有結合している。例示的な、完全なグリコシル結合基には、ＰＥＧで誘導体化されたシアル酸部分がある。
【００１６】
例示的な一態様では、本発明は、次式：
【００１７】
【化１】
2007515410.tif 000002
を含むＦＳＨペプチドを提供する。上式で、Ｄは−ＯＨまたはＲ１−Ｌ−ＨＮ−である。記号Ｇは、Ｒ１−Ｌ−または−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルを表す。Ｒ１は、直鎖または分枝ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分であり、Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーである。一般に、ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。
【００１８】
他の態様では、本発明は、上記の部分を含むＰＥＧ化ＦＳＨを作製する方法を提供する。本発明の方法は、（ａ）基質ＦＳＨペプチドを、ＰＥＧ−シアル酸供与体と、ＦＳＨのアミノ酸またはグリコシル残基上にＰＥＧ−シアル酸を転移する酵素と、転移に適した条件下で接触させる工程を含む。例示的なＰＥＧ−シアル酸供与部分は次式：
【００１９】
【化２】
2007515410.tif 000003
で表される。
【００２０】
一実施形態では、宿主は哺乳動物細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞、植物細胞、細菌または真菌である。
【００２１】
本発明の化合物の薬物動態特性は、そのペプチドの（複数の）グリコシル化部位の構造、数または位置を変更することにより、変化させることが容易である。したがって、Ｏ−またはＮ−結合グリコシル化部位をＦＳＨペプチド中に挿入する、野生型には存在しない１個または複数個の突然変異を加えることは、本願の範囲内である。これらの突然変異体に対する抗体ならびにそのグリコシル化最終産物および中間生成物も、本発明の範囲内にある。
【００２２】
他の態様では、本発明は、完全なグリコシル結合基を介してそれに共有結合したＰＥＧ部分、例えばＰＥＧの集団を有するＦＳＨコンジュゲートを提供する。本発明のコンジュゲートでは、その集団の基本的にそれぞれのメンバーは、グリコシル結合基を介してそのペプチドのグリコシル残基と結合し、各グリコシル残基は同じ構造を有する。
【００２３】
例示的な実施形態では、本発明は、完全なグリコシル結合基を介して共有結合したＰＥＧ部分、例えばＰＥＧの集団を有するＦＳＨコンジュゲートを提供する。本発明のコンジュゲートでは、その集団の基本的にそれぞれのメンバーは、そのペプチドのアミノ酸残基と結合し、そのポリマーが結合する各アミノ酸残基は同じ構造を有する。例えば、あるペプチドがＡｓｎ結合グリコシル残基を含む場合、その集団中で少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、またはより好ましくは９９．８％のペプチドが、同じＡｓｎ残基と共有結合した同じグリコシル残基を有する。上記の論述は、Ｏ−グリコシル化部位とＮ−グリコシル化部位のどちらにも同様に関連する。
【００２４】
薬剤組成物も提供される。その組成物は、製剤上許容される担体、および天然に存在しないＰＥＧ部分とグリコシル化または非グリコシル化ＦＳＨペプチドとの共有コンジュゲートを含む。
【００２５】
本発明の他の目的および利点は、下記の詳細な説明から当業者に明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
略語
ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ、ポリ（プロピレングリコール）；Ａｒａ、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、酢酸マンノサミニル；Ｘｙｌ、キシロシル；およびＮｅｕＡｃ、シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）；Ｍ６Ｐ、マンノース−６−リン酸。Ｓｉａ、シアル酸、Ｎ−アセチルノイラミニル、ならびにその誘導体および類似体。
【００２７】
定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術および科学用語は一般に、本発明が属する技術分野の技術者に共通して理解されているものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用する用語体系、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は周知のものであり、当技術分野で一般に使用される。核酸およびペプチドの合成に標準的な技術が使用されている。本書全体にわたって示されている技術および手順は一般に、当技術分野における従来の方法、および様々な一般の参照文献（一般には、参照により本明細書に組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨークを参照のこと）に従って実施されている。本明細書で使用する用語体系、ならびに下記に記載の分析化学および有機合成化学における実験手順は周知のものであり、当技術分野で一般に使用される。標準的な技術、またはその改変が化学合成および化学分析に使用される。
【００２８】
本明細書に記載のオリゴ糖はすべて、非還元サッカリドの名称または略語（すなわちＧａｌ）、続いてグリコシド結合の配置（αまたはβ）、環結合（１または２）、その結合に関与する還元サッカリドの環の位置（２、３、４、６または８）、次いで還元サッカリドの名称または略語（すなわちＧｌｃＮＡｃ）で記載されている。各サッカリドは、好ましくはピラノースである。標準的な糖鎖生物学の用語体系の総説については、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖａｒｋｉら編、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。
【００２９】
オリゴ糖は、還元末端にあるサッカリドが実際に還元糖であってもそうでなくとも、還元末端および非還元末端を有すると考えられる。受け入れられている用語体系に従って、オリゴ糖は、本明細書において左側に非還元末端、右側に還元末端で表される。
【００３０】
「シアル酸」という用語は、炭素が９個のカルボキシル化された糖のファミリーの任意のメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース−１−オン酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略される））である。そのファミリーの第２のメンバーは、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基が水酸化されたものである。シアル酸ファミリーの第３のメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏら、（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０〜１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１〜２１８１９（１９９０））。９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃなど、９位が置換されたシアル酸も含まれる。シアル酸ファミリーの総説については、例えば、Ｖａｒｋｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２５〜４０（１９９２）；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９２）を参照されたい。シアル化の手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日に公開された国際出願ＷＯ９２／１６６４０で開示されている。
【００３１】
「卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）」または「卵胞刺激ホルモンペプチド」、あるいは「ＦＳＨ」または「ＦＳＨペプチド」という用語は、αおよびβ鎖サブユニットを含むヘテロダイマー卵胞刺激ホルモンタンパク質を指し、そのアミノ酸配列は、配列番号１および配列番号２としてそれぞれ開示されている。同様に「卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）」または「卵胞刺激ホルモンペプチド」、あるいは「ＦＳＨ」または「ＦＳＨペプチド」という用語は、単独のαまたはβ鎖サブユニットどちらかを、また天然ＦＳＨのまたはそれを模擬する活性を有するαまたはβ鎖サブユニットの任意の組換えまたは天然の野生型または突然変異ペプチドあるいは任意の断片を指す。この用語はまた、一般に非ペプチドＦＳＨ模倣物質をも包含する。
【００３２】
「卵胞刺激ホルモン活性」という用語は、それだけに限らないが、受容体の結合および活性化、受容体の結合の抑制、あるいは野生型卵胞刺激ホルモンの作用によって通常影響を受ける任意の生化学的または生理的反応を含めた任意の活性を指す。上記で定義したように、卵胞刺激ホルモン活性は、任意の卵胞刺激ホルモンペプチドの作用から生じ得る。
【００３３】
「ペプチド」とは、そのモノマーがアミノ酸であり、それがアミド結合を介して結合したポリマーを指し、あるいはポリペプチドとも呼ばれる。さらに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンも含まれる。遺伝子によりコードされていないアミノ酸も、本発明で使用することができる。さらに、反応性基、グリコシル化部位、ポリマー、治療的部分、生体分子などを含むように修飾されているアミノ酸を本発明で使用することもできる。本発明で使用するアミノ酸はすべて、Ｄ−異性体またはＬ−異性体である。Ｌ−異性体が一般に好ましい。さらに、他のペプチド模倣物質も本発明に有用である。本明細書において、「ペプチド」とは、グリコシル化ペプチドと非グリコシル化ペプチドの両方を指す。ペプチドを発現させる系によって不完全にグリコシル化されているペプチドも含まれる。一般的な総説については、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク（１９８３）のＳｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、ｐ．２６７を参照されたい。
【００３４】
「ペプチドコンジュゲート」という用語は、本明細書で示すようにペプチドが被修飾糖と結合した本発明の種を指す。
【００３５】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物質を指す。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝コードによってコードされるアミノ酸、ならびにその後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合したα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣物質とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なるが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する構造を有する化合物を指す。本明細書において、「アミノ酸」とは、それがペプチド配列のリンカー内にあっても構成成分内にあっても、アミノ酸のＤ−異性体とＬ−異性体の両方、ならびにこの異性体２つの混合物を指す。
【００３６】
本明細書において、「被修飾糖」という用語は、本発明の方法でペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基上に酵素により付加された、天然に存在するまたは存在しない炭化水素を指す。被修飾糖は、それだけに限らないが、糖ヌクレオチド（１、２および３リン酸）、活性化糖（例えば、グリコシルハロゲン化物、グリコシルメシル酸）、および活性化されておらずヌクレオチドでもない糖を含めたいくつかの酵素基質から選択される。「被修飾糖」は、「修飾基」で、共有結合により官能化されている。有用な修飾基には、それだけに限らないが、ＰＥＧ部分、治療的部分、診断用部分、生体分子などがある。修飾基は、天然に存在しない、または修飾されていない炭化水素であることが好ましい。修飾基での官能化の位置は、「被修飾糖」が酵素によりペプチドに付加されるのをそれが妨げないように選択される。
【００３７】
「水溶性の」という用語は、検出可能なある程度の溶解性を水中で有する部分を指す。水溶性を検出および／または定量する方法は、当業者に周知である。例示的なＰＥＧ部分には、ペプチド、サッカリド、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などがある。ペプチドは、混成の配列を有するものでもよく、あるいは単一のアミノ酸からなるもの、例えばポリ（リシン）でもよい。同様に、サッカリドは、混成の配列からなるものでもよく、あるいは単一のサッカリドサブユニットからなるもの、例えばデキストラン、アミロース、キトサン、およびポリ（シアル酸）でもよい。例示的なポリ（エーテル）はポリ（エチレングリコール）である。ポリ（エチレンイミン）は例示的なポリアミンであり、ポリ（アクリル）酸は代表的なポリ（カルボン酸）である。
【００３８】
本明細書において「グリコシル結合基」という用語は、作用物質（例えば、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子）が共有結合したグリコシル残基を指す。本発明の方法では、「グリコシル結合基」は、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドと共有結合し、それによって作用物質がペプチド上のアミノ酸および／またはグリコシル残基と結合する。「グリコシル結合基」は一般に、「被修飾糖」がペプチドのアミノ酸および／またはグリコシル残基と酵素により結合することによって、「被修飾糖」から誘導される。「完全なグリコシル結合基」とは、コンジュゲートと結合する個々のサッカリドモノマーが変性、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化を受けていないグリコシル部分から誘導される結合基を指す。本発明の「完全なグリコシル結合基」は、（複数の）グリコシル単位を付加し、あるいは親のサッカリド構造から１個または複数個のグリコシル単位を除去することにより、天然に存在するオリゴ糖から誘導されるものでもよい。
【００３９】
本明細書において「標的導入部分」という用語は、身体の特定の組織または領域に選択的に局在する種を指す。その局在化は、分子決定基、標的導入作用物質またはコンジュゲートの分子サイズ、イオン性相互作用、疎水性相互作用などの特異的認識によって媒介される。作用物質を特定の組織または領域に標的導入する他の機構は、当業者に知られている。例示的な標的導入部分には、抗体、抗体断片、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯなどがある。
【００４０】
本明細書において、「製剤上許容される担体」には、コンジュゲートと混合したときそのコンジュゲートの活性を保持し、対象の免疫系に反応しない任意の物質が含まれる。例としては、それだけに限らないが、リン酸緩衝食塩水溶液、水、水／油型乳剤などの乳剤や、様々な種類の湿潤剤など、製剤上の標準的な任意の担体がある。他の担体には、滅菌溶液、被覆錠剤および被覆カプセル剤を含めた錠剤も含まれることがある。通常、そのような担体は、デンプン、乳、糖、特定の種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、滑石、植物性の脂肪または油、ゴム、グリコールなどの添加剤または他の既知の添加剤を含有する。そのような担体には、香味添加物および着色添加物または他の成分も含まれることがある。そのような担体を含む組成物は、周知である従来の方法によって製剤される。
【００４１】
本明細書において、「投与」とは、対象に対する経口投与、坐剤としての投与、局所接触、静脈内、腹腔内、筋内、病変内、鼻内または皮下投与、あるいは徐放装置、例えば微小浸透圧ポンプの植え込みを意味する。投与は、非経口、および経粘膜（例えば、経口、経鼻、経膣、経直腸、または経皮）を含めた任意の経路によって行われる。非経口投与には、例えば、静脈内、筋内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、および頭蓋内がある。さらに、注射が腫瘍を治療するため、例えばアポトーシスを誘導するためである場合、投与は、腫瘍および／または腫瘍の周囲組織に直接行ってもよい。送達の他の形態には、それだけに限らないが、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、経皮貼付剤などがある。
【００４２】
「改善」または「改善する」という用語は、寛解、緩解、症状の減弱や、患者の身体的なまたは精神的な生活状態の改善など、任意の客観的なまたは主観的なパラメーターを含めた病変または容態の治療が成功した任意の徴候を指す。症状の改善は、身体的な検査および／または精神医学的な評価の結果を含めた客観的なまたは主観的なパラメーターを基礎とし得る。
【００４３】
「療法」という用語は、疾患に罹りやすい可能性があるが、その疾患の症状をまだ経験していないかまたは示していない動物でその疾患または容態が生じることを予防し（予防的治療）、疾患を抑制し（その発症の遅延または停止）、疾患の症状または副作用を緩和し（姑息療法を含む）、疾患を緩和する（疾患の退行を引き起こす）ことを含めた、疾患または容態を「治療すること」またはその「治療」を指す。
【００４４】
「有効量」または「に有効な量」または「治療上有効な量」という用語あるいは文法上同等な任意の用語は、動物に投与して疾患を治療するとき、その疾患の治療効果をもたらすのに十分な量を意味する。
【００４５】
「単離された」という用語は、その物質を生成するのに用いた構成成分を実質的にまたは基本的に含まない物質を指す。本発明のペプチドコンジュゲートでは、「単離された」という用語は、そのペプチドコンジュゲートを調製するのに用いた混合物中で通常その物質に伴う構成成分を実質的にまたは基本的に含まない物質を指す。「単離された」と「純粋な」は、同義的に使用される。通常、本発明の単離されたペプチドコンジュゲートは、好ましくは範囲として表される純度を有する。ペプチドコンジュゲートについて、純度の範囲の下端は、約６０％、約７０％または約８０％であり、純度の範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％であり、または約９０％を超える。
【００４６】
ペプチドコンジュゲートが約９０％を超えて純粋であるとき、その純度も、好ましくは範囲として表される。純度の範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の純度である。
【００４７】
純度は、当技術分野で認められる任意の分析方法（例えば、銀染色したゲルのバンドの強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または同様の手段）によって決定する。
【００４８】
本明細書において「その集団の基本的にそれぞれのメンバー」とは、ペプチドに付加された、選択された百分率の被修飾糖がペプチド上の複数の同一受容部位に付加されている、本発明のペプチドコンジュゲートの集団の特徴を示している。「その集団の基本的にそれぞれのメンバー」とは、被修飾糖と結合したペプチド上の部位の均一性を述べるものであり、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％均一である本発明のコンジュゲートを指す。
【００４９】
「均一性」とは、被修飾糖が結合した受容部分の集団全体にわたっての構造の一致を指す。したがって、各被修飾糖部分が、他の各被修飾糖と結合した受容部位と同じ構造を有する受容部位と結合している本発明のペプチドコンジュゲートにおいて、そのペプチドコンジュゲートは、約１００％均一であるといえる。通常、均一性は範囲として表される。ペプチドコンジュゲートの均一性の範囲の下端は、約６０％、約７０％または約８０％であり、純度の範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％であり、または約９０％を超える。
【００５０】
ペプチドコンジュゲートが約９０％以上均一であるとき、その均一性も、好ましくは範囲として表される。均一性の範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の均一性である。ペプチドコンジュゲートの純度は通常、当業者に知られている１種または複数種の方法、例えば液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動などによって決定する。
【００５１】
糖ペプチド種を指すとき、「実質的に均一な糖鎖型」または「実質的に均一なグリコシル化パターン」とは、対象とするグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）によってグリコシル化された受容部分の百分率を指す。例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼの場合、実質的に均一なフコシル化パターンは、本発明のペプチドコンジュゲート中で、（下記に定義するように）実質的にすべてのＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそのシアリル化類似体がフコシル化された場合に存在する。開始物質が、グリコシル化された受容部分（例えばフコシル化されたＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を含んでもよいことが当業者に理解されるであろう。したがって、算出されたグリコシル化の百分率は、本発明の方法によってグリコシル化された受容部分、ならびに開始物質中ですでにグリコシル化されていた受容部分を含む。
【００５２】
上記の定義の「実質的に均一な」における「実質的に」という用語は、特定のグリコシルトランスフェラーゼの受容部分の少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはより好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％がグリコシル化されたことを一般に意味する。
【００５３】
置換基が、左から右へと記されるその慣習的な化学式で明記される場合、それは、右から左へと構造を記す結果生じる化学的に同一な置換基も等しく包含し、例えば、−ＣＨ２Ｏ−には、−ＯＣＨ２−も挙げられていることが意図される。
【００５４】
「アルキル」という用語は、それ自体または他の置換基の一部として、別段の記載がない限り、直鎖または分枝鎖、または環状炭化水素基、あるいはその組合せを意味し、それは完全に飽和されていてもよく、一不飽和またはポリ不飽和でもよく、二価および多価の基を含んでもよく、示された数の炭素原子を有する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）。飽和炭化水素基の例としては、それだけに限らないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの同族体および異性体などの基がある。不飽和アルキル基とは、１個または複数個の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、それだけに限らないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにその高級な同族体および異性体がある。「アルキル」という用語は、別段の記載がない限り、「ヘテロアルキル」など、下記でより詳細に定義するアルキルの誘導体が含まれることも意図されている。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と呼ばれる。
【００５５】
「アルキレン」という用語は、それ自体または他の置換基の一部として、それだけに限らないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−で例示される、アルカンに由来する二価の基を意味し、それには「ヘテロアルキレン」として下記に記載する基がさらに含まれる。通常、アルキル（またはアルキレン）基は１〜２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有するそれらの基が本発明では好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」とは、短鎖のアルキル基またはアルキレン基であり、一般に８個以下の炭素原子を有する。
【００５６】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語は、その慣習的な意味で使用され、それぞれ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介してその分子の残部と結合したアルキル基を指す。
【００５７】
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体または他の用語との組合せで、別段の記載がない限り、安定した直鎖または分枝鎖、または環状炭化水素基、あるいはその組合せを意味し、示された数の炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子からなり、窒素原子および硫黄原子は任意選択で酸化されていてもよく、窒素へテロ原子は任意選択で４個１組でもよい。（複数の）ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、ＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基内部の任意の位置にあってもよく、あるいはアルキル基がその分子の残部と結合する位置にあってもよい。例としては、それだけに限らないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３がある。例えば−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３や−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３など、最大２個のヘテロ原子が連続してもよい。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体または他の置換基の一部として、それだけに限らないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−で例示される、ヘテロアルキルに由来する二価の基を意味する。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子はまた、鎖の末端の一方または両方を占めてもよい（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン結合基では、結合基の配向は、その結合基の式が記された向きによって暗示されるものではない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−と−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−のどちらも表す。
【００５８】
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それ自体または他の用語との組合せで、別段の記載がない限り、それぞれ環状型の「アルキル」および「ヘテロアルキル」を表すものである。さらに、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子は、ヘテロ環がその分子の残部と結合した位置を占めてもよい。シクロアルキルの例としては、それだけに限らないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどがある。ヘテロシクロアルキルの例としては、それだけに限らないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｔｈｉｅｎ）−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどがある。
【００５９】
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、それ自体または他の置換基の一部として、別段の記載がない限り、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルが含まれることが意図されている。例えば、「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」という用語は、それだけに限らないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むことを意味する。
【００６０】
「アリール」という用語は、別段の記載がない限り、ポリ不飽和の芳香族置換基を意味し、互いに縮合し、または共有結合した単一の環または複数の環（好ましくは１〜３個の環）となることができる。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含むアリール基（または環）を指し、窒素原子および硫黄原子は任意選択で酸化され、（複数の）窒素原子は任意選択で４個１組である。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介してその分子の残部と結合することができる。アリール基およびヘテロアリール基の非限定的な例には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルおよび６−キノリルがある。上記に示したアリールおよびヘテロアリール環系のそれぞれについての置換基は、下記に記載の許容される置換基の群から選択される。
【００６１】
簡潔にするため、「アリール」という用語には、他の用語（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と組み合わせて使用するとき、上記で定義したアリール環もヘテロアリール環も含まれる。したがって、「アリールアルキル」という用語は、炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）によって置換されているアルキル基を含めたアルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）とアリール基が結合した基が含まれることが意図されている。
【００６２】
上記の各用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、示した基の置換型も非置換型も含まれることが意図されている。各型の基について好ましい置換基を下記に示す。
【００６３】
アルキル基およびヘテロアルキル基（しばしばアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと呼ばれる基を含む）の置換基は、一般に「アルキル基置換基」と呼ばれ、それは、０〜（２ｍ’＋１）（ｍ’はそのような基中の炭素原子の合計数）の範囲の数で、それだけに限らないが、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から選択される１種または複数種の様々な基でもよい。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、好ましくはそれぞれ独立に水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、例えば１〜３個のハロゲンで置換したアリール、置換または非置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、あるいはアリールアルキル基を指す。例えば、本発明の化合物が複数のＲ基を含むとき、各Ｒ基はそれぞれ独立に、この基が複数存在しているときそれぞれＲ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基となるように選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子と結合するとき、それらをその窒素原子と組み合わせて５、６、または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’には、それだけに限らないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルが含まれることが意図されている。置換基についての上記の論述から、当業者は、「アルキル」という用語には、ハロアルキル（例えば−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）やアシル（例えば−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）など、水素基以外の基と結合した炭素原子を含む基が含まれることが意図されていることを理解するであろう。
【００６４】
アルキル基について記載した置換基と同様に、アリール基およびヘテロアリール基の置換基は一般に「アリール基置換基」と呼ばれる。その置換基は、０〜芳香族環系上で解放されている合計価数の範囲の数で、例えば、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択され、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、好ましくはそれぞれ独立に水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される。例えば、本発明の化合物が複数のＲ基を含むとき、各Ｒ基はそれぞれ独立に、この基が複数存在しているときそれぞれＲ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基となるように選択される。下記の理論体系では、記号Ｘは上記に記載の「Ｒ」を表すものである。
【００６５】
アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の２個の置換基は、任意選択で式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−（式中、ＴおよびＵはそれぞれ独立に−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または一重結合であり、ｑは０〜３の整数である）の置換基に置換することができる。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の２個の置換基は、任意選択で式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−（式中、ＡおよびＢはそれぞれ独立に−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または一重結合であり、ｒは１〜４の整数である）の置換基に置換することもできる。そのように形成された新たな環の一重結合の１つは、任意選択で二重結合に置換することができる。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の２個の置換基は、任意選択で式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−（式中、ｓおよびｄはそれぞれ独立に０〜３の整数であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である）の置換基に置換することもできる。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、好ましくはそれぞれ独立に、水素、あるいは置換または非置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択される。
【００６６】
本明細書において、「ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）が含まれることが意図されている。
【００６７】
序論
本発明は、糖タンパク質ホルモンである卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のコンジュゲートを提供する（総説については、例えば、Ｓａｎｅｙｏｓｈｉら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、６５：１６８６〜１６９０（２００１）；Ｈａｋｏｌａら、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１５８：４４１〜４４８（１９９８）；Ｓｔａｎｔｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１２５：１３３〜１４１（１９９６）；Ｗａｌｔｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、８６（８）：３６７５〜３６８５（０８／２００１）；Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ、１１（３）：２０５〜２１５（１２／１９９９）；Ｃａｓｔｒｏ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍａｔａｂ．、８５（１２）：４６０３〜４６１０（２０００）；Ｐｒｅｖｏｓｔ，Ｒｅｂｅｃｃａ  Ｒ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ、１８（５）：１００１〜１０１０（１９９８）；Ｌｉｎｓｋｅｎｓら、Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１３：６３９〜６４５（０４／１９９９）；Ｂｕｔｎｅｖら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、５８：４５８〜４６９（１９９８）；Ｍｕｙａｎら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．，１２（５）：７６６〜７７２（１９９８）；Ｍｉｎら、Ｅｎｄｏ．Ｊ．、４３（５）：５８５〜５９３（１９９６）；Ｂｏｉｍｅら、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３４：２７１〜２８９（１９９９）；およびＲａｆｆｅｒｔｙら、Ｊ．Ｅｎｄｏ．、１４５：５２７〜５３３（１９９５）を参照されたい）。したがって、本発明は、卵胞刺激ホルモン活性を有するグリコシル化ペプチドおよび非グリコシル化ペプチドのコンジュゲートを提供する。治療的部分、診断用部分、標的導入部分などの多様な種とさらに結合させることによって、そのコンジュゲートをさらに修飾することができる。
【００６８】
ヒトの生殖機能は、ヘテロダイマーヒト糖タンパク質ホルモンのファミリーによって部分的に調節され、そのファミリーには、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、サイロトロピンまたは甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）が含まれる。これらの各糖タンパク質ホルモンは、共通する９２アミノ酸の糖タンパク質α−サブユニット、および受容体結合特異性を付与する独特のβ−サブユニットを有する。
【００６９】
ヒトＦＳＨおよびＬＨは、ヒト女性において生殖に関係する代謝の様々な面を制御するのに治療上使用される。例えば、尿から部分的に精製したＦＳＨを臨床的に使用して、無排卵症候群であり、または黄体期の欠失した無排卵女性の卵胞成熟を刺激する。あるいは、黄体形成ホルモン（ＬＨ）とＦＳＨを組み合わせて使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精用の卵胞の発生を刺激する。
【００７０】
生殖周期でのＦＳＨの役割は治療上の使用を可能にするほど十分に周知であるが、一部では、その半減期が短いため患者が頻繁な注射を必要とする困難に遭遇している。それにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精にも、ｉｎ  ｖｉｖｏでの受精の刺激にもＦＳＨは有益な手段である。したがって、均一なバッチでより長続きする治療用ペプチドを生成するＦＳＨの再構築の方法は、生殖科学にとって大きな利益となる。
【００７１】
そのような治療を必要とする患者、例えば子宮内人工授精（ＩＵＩ）を受けている患者、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）を受けている患者、または不妊患者に、本発明のＦＳＨペプチドコンジュゲートを投与することができる。再構築ＦＳＨペプチドを投与して、患者の排卵を誘導または促進し、患者の卵胞の発生を刺激し、患者の配偶子形成卵胞の成長を誘導し、患者の卵胞の発生およびその後の排卵を刺激、誘導または促進し、あるいは患者の不妊を治療することもできる。一般に、患者はヒト女性患者である。しかし、下垂体不全である患者または思春期の患者に再構築ＦＳＨペプチドを投与することもでき、その場合、患者はヒト男性患者である。
【００７２】
ＦＳＨはクローン化され、その配列が決定されている。活性な野生型の（天然の）タンパク質は、２種のペプチドサブユニット；α鎖サブユニットとβ鎖サブユニットからなるヘテロダイマーであり、それらはそれぞれ配列番号１および配列番号２として本明細書で開示されている。ＦＳＨの変異体は当技術分野で周知であるので、当業者なら、本発明が本明細書に示す配列に限られないことを容易に理解するであろう。非限定的な例として、米国特許第５６３９６４０号は、２種の異なるアミノ酸配列を含むβサブユニットを記載し、米国特許第５３３８８３５号は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットに由来する約２７アミノ酸のさらなるアミノ酸配列を含むβサブユニットを記載している。
【００７３】
細胞内でＦＳＨを発現させる方法は、原核細胞でも真核細胞でも、当技術分野で周知であり、文献中に豊富に記載されている（米国特許第４８４０８９６号、第４９２３８０５号、第５１５６９５７号）。さらに、本発明の再構築ＦＳＨ分子の生物活性を評価する方法も当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第４５８９４０２号中に記載されており、それには、非ヒト霊長類とヒト対象の両方において、受精率、卵子産生、および妊娠率に対するＦＳＨの効果を判定する方法が記載されている。
【００７４】
上記で論じたように、被修飾糖がグリコシル化または非グリコシル化ＦＳＨペプチドと酵素により結合することによって、本発明のコンジュゲートが形成される。被修飾糖は、ＦＳＨペプチドと糖上の修飾基の間に介在するときに、例えば「完全なグリコシル結合基」と本明細書で呼ぶことができるものとなる。グリコシルトランスフェラーゼなどの酵素の精巧な選択性を用いて、本方法は、１個または複数個の特定の位置に所望の基を有するペプチドを提供する。このように、本発明に従って、被修飾糖をＦＳＨペプチド鎖上の選択された位置に直接結合し、あるいは、被修飾糖を糖ペプチドの炭化水素部分上に付加する。被修飾糖が糖ペプチドの炭化水素にも結合し、ＦＳＨペプチド骨格のアミノ酸残基にも直接結合しているペプチドも、本発明の範囲内にある。
【００７５】
既知の化学的酵素的ペプチド生成戦略と異なり、本発明の方法は、実質的に均一な誘導体化のパターンを有するペプチドおよび糖ペプチドを集めることを可能にする；本発明で使用する酵素は、ＦＳＨペプチドの特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基の組合せに一般に選択的である。この方法は、修飾されたペプチドおよび糖ペプチドの大規模生成にも実用的である。したがって、本発明の方法は、予め選択された均一な誘導体化のパターンを有する糖ペプチドの大規模調製に実用的な手段を提供する。この方法は、それだけに限らないが、細胞培養細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、または原核細胞）内、あるいはトランスジェニック植物または動物内での産生の間に不完全にグリコシル化された糖ペプチドを含めた治療用ペプチドの修飾に特によく適している。
【００７６】
本発明はまた、例えば、排除速度が低下し、あるいは免疫系または細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込みの速度が低下することにより治療半減期が長くなったグリコシル化および非グリコシル化ＦＳＨペプチドのコンジュゲートも提供する。さらに、本発明の方法は、ペプチド上の抗原決定基を覆う手段を提供し、それによってペプチドに対する宿主の免疫応答が低下または消失する。標的導入作用物質の選択的な結合を用いて、特定の標的導入作用物質に特異的な特定の組織または細胞表面受容体にペプチドを標的導入することもできる。
【００７７】
コンジュゲート
第１の態様では、本発明は、選択された修飾基とＦＳＨペプチドのコンジュゲートを提供する。
【００７８】
ＦＳＨペプチドと選択された部分の間の結合には、ペプチドと選択された部分の間に介在する完全なグリコシル結合基がある。本明細書で論じるように、選択された部分は基本的に、サッカリド単位と結合することができる任意の種であり、それにより、適当なトランスフェラーゼ酵素によって認識される「被修飾糖」が生じ、その酵素はＦＳＨペプチド上に被修飾糖を付加する。被修飾糖のサッカリド成分は、ＦＳＨペプチドと選択された部分の間に介在するとき、「完全なグリコシル結合基」となる。グリコシル結合基は、選択された部分で修飾した後、適当なトランスフェラーゼの基質となる任意のモノサッカリドまたはオリゴサッカリドから形成される。
【００７９】
本発明のコンジュゲートは通常、次式の一般構造に対応する。
【００８０】
【化３】
2007515410.tif 000004
（式中、記号ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｓは０でない正の整数を表し、ｔは０または正の整数である）。「作用物質」は、通常は水溶性の部分、例えばＰＥＧ部分である。リンカーは、下記の多様な結合基のいずれかでよい。あるいは、リンカーは一重結合でもよく、あるいは「ゼロ次リンカー」でもよい。
【００８１】
例示的な実施形態では、選択された修飾基は水溶性ポリマー、例えばｍ−ＰＥＧである。水溶性ポリマーは、グリコシル結合基を介してＦＳＨペプチドと共有結合し、その基はＦＳＨペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基と共有結合する。本発明はまた、アミノ酸残基およびグリコシル残基がグリコシル結合基で修飾されたコンジュゲートをも提供する。
【００８２】
例示的な水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）である。本発明で使用するポリ（エチレングリコール）は、任意の特定の形態または分子量の範囲に限られない。分枝のないポリ（エチレングリコール）分子では、分子量は、好ましくは５００〜１００，０００である。２，０００〜６０，０００の分子量が使用に好ましく、より好ましくは約５，０００〜約３０，０００である。
【００８３】
他の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）は分枝ＰＥＧであり、複数のＰＥＧ部分が結合している。分枝ＰＥＧの例は、米国特許第５９３２４６２号；米国特許第５３４２９４０号；米国特許第５６４３５７５号；米国特許第５９１９４５５号；米国特許第６１１３９０６号；米国特許第５１８３６６０号；ＷＯ０２／０９７６６；Ｋｏｄｅｒａ  Ｙ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：２８３〜２８８（１９９４）；およびＹａｍａｓａｋｉら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５２：２１２５〜２１２７、１９９８に記載されている。他の有用な分枝ＰＥＧ構造は、本明細書で開示されている。
【００８４】
例示的な実施形態では、分枝ＰＥＧの各ポリ（エチレングリコール）の分子量は、約２，０００、５，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、４０，０００または６０，０００ダルトン以上である。
【００８５】
酵素により付加されたグリコシル結合基により形成されたコンジュゲートを提供することに加えて、本発明は、その置換パターンにおいて高度に均一であるコンジュゲートを提供する。本発明の方法を用いて、本発明のコンジュゲートの集団全体にわたって基本的にすべての被修飾糖部分が、複数コピーの構造的に同一なアミノ酸またはグリコシル残基と結合したペプチドコンジュゲートを形成することができる。したがって、第２の態様では、本発明は、水溶性ポリマー部分の集団を有するペプチドコンジュゲートを提供し、その集団は、完全なグリコシル結合基を介してＦＳＨペプチドと共有結合する。本発明の好ましいコンジュゲートでは、その集団の基本的にそれぞれのメンバーがグリコシル結合基を介してＦＳＨペプチドのグリコシル残基と結合し、グリコシル結合基と結合したＦＳＨペプチドの各グリコシル残基は同じ構造を有する。
【００８６】
グリコシル結合基を介して水溶性ポリマー部分の集団が共有結合したペプチドコンジュゲートも提供される。好ましい実施形態では、水溶性ポリマー部分の集団の基本的にそれぞれのメンバーがグリコシル結合基を介してＦＳＨペプチドのアミノ酸残基と結合し、グリコシル結合基と結合した各アミノ酸残基は同じ構造を有する。
【００８７】
本発明はまた、ＦＳＨペプチドが完全なグリコシル結合基を介して治療的部分、診断用部分、標的導入部分、毒素部分などと結合した上記に記載したものと類似したコンジュゲートをも提供する。上記に挙げたそれぞれの部分は、小分子、天然ポリマー（例えば、ポリペプチド）または合成ポリマーでもよい。
【００８８】
任意の配列を有する基本的に任意の卵胞刺激ホルモンまたは作用物質は、本発明のコンジュゲートのペプチド成分として役立つ。卵胞刺激ホルモンの成熟したα鎖およびβ鎖はクローン化され、その配列が決定されている。例示的な実施形態では、ＦＳＨは、α鎖およびβ鎖からなるヘテロダイマーである。
【００８９】
他の例示的な実施形態では、ＦＳＨペプチドは、配列番号１および／または配列番号２の一方または両方で示される配列を有する。
【数１】
2007515410.tif 000005
（配列番号１）
【数２】
2007515410.tif 000006
（配列番号２）
【００９０】
図１に、ダイマーＦＳＨペプチドの三次元構造を、同定されたグリコシル化部位とともに示す。
【００９１】
本発明は、本明細書で示す配列に限定されるものでは全くない。例えば、Ｆｌａｃｋ，Ｍ．Ｒ．ら、（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６９：１４０１５；Ｖｉｃｅｎｔａ  Ｇａｒｃｉａ−ＣａｍｐａｙｏおよびＩｒｖｉｎｇ  Ｂｏｉｍｅ（２００１）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２：５２０３；ならびにＺａｍｂｒａｎｏ  Ｅ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ．（１９９９）２：１１３〜２１に記載されているように、ＦＳＨ変異体は当技術分野で周知である。
【００９２】
例示的な実施形態では、本発明のＦＳＨペプチドは少なくとも１個のＮ−結合グリコシル化部位を含み、それはＰＥＧ部分を含むグリコシル残基でグリコシル化される。ＰＥＧは、完全なグリコシル結合基を介してＦＳＨペプチドと共有結合する。グリコシル結合基は、ＦＳＨペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基と共有結合する。あるいは、グリコシル結合基は、糖ペプチドの１個または複数個のグリコシル単位と結合する。本発明はまた、グリコシル結合基がアミノ酸残基ともグリコシル残基とも結合したコンジュゲートをも提供する。
【００９３】
ＰＥＧ部分は、完全なグリコシル結合基と直接結合し、または非グリコシルリンカー、例えば、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルを介して結合する。
【００９４】
好ましい実施形態では、ＦＳＨペプチドは式Ｉを有する部分を含む。
式Ｉ
【００９５】
【化４】
2007515410.tif 000007
（式中、Ｄは−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、ＧはＲ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ１は直鎖または分枝ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分から選択されるメンバーを含む部分であり、Ｌは、ＤがＯＨであるときＧがＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるときＤがＲ１−Ｌ−ＮＨ−であるように、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーである）。当業者には理解されるであろうが、本明細書で示す修飾されたシアル酸種のＣＯＯＨ部分はまた、ＣＯＯ−および／またはその塩をも表す。
【００９６】
好ましい実施形態では、ＦＳＨβ鎖のＮ７およびＮ２４、ならびにα鎖のＮ５２およびＮ７８にあるアスパラギン残基から選択される少なくとも１個のアスパラギン残基が、完全なグリコシル結合基を介して、式Ｉで示すシアル酸−ＰＥＧ部分で誘導体化される。
【００９７】
他の好ましい実施形態では、少なくとも２個、より好ましくは３個、またはより好ましくは４個の上記アスパラギン残基が、式Ｉのシアル酸−ＰＥＧ部分と結合する。
【００９８】
他の例示的な実施形態では、本発明は、次式
【００９９】
【化５】
2007515410.tif 000008
（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｉ、ｒ、ｓ、ｔ、およびｕは、０および１からそれぞれ独立に選択される整数である）を有するグリコシル残基を含むＦＳＨコンジュゲートを提供する。指数ｑは１である。指数ｅ、ｆ、ｇ、およびｈは０〜６の整数からそれぞれ独立に選択される。指数ｊ、ｋ、ｌ、およびｍは、０および１００の整数からそれぞれ独立に選択される。指数ｖ、ｗ、ｘ、およびｙは０および１からそれぞれ独立に選択され、ｖ、ｗ、ｘおよびｙの少なくとも１つは１である。記号ＡＡは、第ＩＸ因子ペプチドのアミノ酸残基を表す。
【０１００】
記号Ｓｉａ−（Ｒ）は、次式
【０１０１】
【化６】
2007515410.tif 000009
（式中、諸部分は上記で論じた通りである）を有する基を表す。
【０１０２】
他の例示的な実施形態では、本発明のコンジュゲートにおけるＰＥＧで修飾されたシアル酸部分は次式
【０１０３】
【化７】
2007515410.tif 000010
（式中、指数「ｓ」は０〜２０の整数を表し、ｎは１〜２５００の整数である）を有する。例示的な実施形態では、ｓは１であり、ｍ−ＰＥＧ部分は分子量が約２０ｋＤである。
【０１０４】
さらなる例示的な実施形態では、ＰＥＧで修飾されたシアル酸部分は次式
【０１０５】
【化８】
2007515410.tif 000011
（式中、Ｌは、シアル酸部分とＰＥＧ部分を結合する置換または非置換アルキルあるいは置換または非置換ヘテロアルキルのリンカーである）を有する。
【０１０６】
好ましい実施形態では、少なくとも２個、より好ましくは３個、より好ましくは４個の上記アスパラギン残基が、上記に示したＮ−結合グリカン鎖で官能化される。
【０１０７】
本発明のコンジュゲートは、一価または多価（例えば、アンテナ構造）の完全なグリコシル結合基を含む。したがって、本発明のコンジュゲートは、選択された部分が一価のグリコシル結合基を介してペプチドと結合した種も多価の結合基を介して結合した種も含む。複数の選択された部分が多価の結合基を介してペプチドと結合したコンジュゲートも本発明の中に含まれる。
【０１０８】
被修飾糖
本発明は、被修飾糖、被修飾糖ヌクレオチドおよび被修飾糖のコンジュゲートを提供する。本発明の被修飾糖化合物では、糖部分は、好ましくはサッカリド、デオキシサッカリド、アミノサッカリド、またはＮ−アシルサッカリドである。「サッカリド」という用語およびその同義語の「サッカリル」、「糖」および「グリコシル」は、モノマー、ダイマー、オリゴマーおよびポリマーを指す。糖部分はまた、修飾基でも官能化される。修飾基は、通常は糖上のアミン、スルフヒドリルまたはヒドロキシル部分、例えば第一級ヒドロキシル部分との結合により糖部分と結合する。例示的な実施形態では、修飾基は、糖上のアミン部分を介して、例えば修飾基の反応性誘導体とのアミンの反応を介して形成されるアミド、ウレタンまたは尿素を介して結合する。
【０１０９】
本発明のコンジュゲートの糖中心（ｓｕｇａｒ  ｃｏｒｅ）として、どんな糖も利用することができる。本発明の組成物の形成に有用である例示的な糖中心には、それだけに限らないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、およびシアル酸がある。他の有用な糖には、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、シアル酸の５−アミン類似体などのアミノ糖がある。糖中心は、自然界で認められる構造でもよく、あるいは修飾基と結合する部位をもたらすようにそれを修飾することもできる。例えば、一実施形態では、本発明は、９−ヒドロキシ部分がアミンに置換されたシアル酸誘導体を含むペプチドコンジュゲートを提供する。アミンは、選択された修飾基の活性化類似体で容易に誘導体化される。
【０１１０】
下記の論述では、選択されたシアル酸誘導体の使用を参照することによって本発明を説明する。当業者なら、その論述の焦点が説明を明確にするためであり、示した構造および組成物が一般に、サッカリドの群、被修飾サッカリドの群、活性化被修飾サッカリドの群および被修飾サッカリドのコンジュゲートの群の種類全体に適用可能であることを理解するであろう。
【０１１１】
例示的な実施形態では、本発明は、次式
【０１１２】
【化９】
2007515410.tif 000012
（式中、Ｇはグリコシル部分であり、Ｌは結合またはリンカーであり、Ｒ１は修飾基である）を有する被修飾糖アミンを含むペプチドコンジュゲートを提供する。例示的な結合は、グリコシル部分上のＮＨ２と、修飾基上の相補的な反応性のある基との間に形成されるものである。したがって、例示的な結合には、それだけに限らないが、ＮＨＲ１、ＯＲ１、ＳＲ１などがある。例えば、Ｒ１がカルボン酸部分を含むとき、この部分を活性化し、グリコシル残基上のＮＨ２部分と結合させて、構造ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１を有する結合をもたらすことができる。同様に、ＯＨ基およびＳＨ基は、それぞれ対応するエーテル誘導体またはチオエーテル誘導体に転換することができる。
【０１１３】
例示的なリンカーには、アルキル部分およびヘテロアルキル部分がある。リンカーには、結合基、例えばアシルに基づく結合基、例えば−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−などがある。結合基とは、本発明の種の構成成分間に、例えばグリコシル部分とリンカー（Ｌ）の間に、またはリンカーと修飾基（Ｒ１）の間に形成される結合である。他の結合基は、エーテル、チオエーテルおよびアミンである。例えば、一実施形態では、リンカーはグリシン残基などのアミノ酸残基である。グリシンのカルボン酸部分は、グリコシル残基上のアミンとの反応により、対応するアミドに転換され、グリシンのアミンは、活性化カルボン酸、または修飾基のカーボネートとの反応により、対応するアミドまたはウレタンに転換される。
【０１１４】
他の例示的なリンカーは、ＰＥＧ部分、またはアミノ酸残基で官能化されたＰＥＧ部分である。ＰＥＧは、一方のＰＥＧ末端でアミノ酸残基を介してグリコシル基と結合し、他方のＰＥＧ末端を介してＲ１と結合する。あるいは、アミノ酸残基はＲ１と結合し、アミノ酸と結合しないＰＥＧ末端はグリコシル基と結合する。
【０１１５】
ＮＨ−Ｌ−Ｒ１の例示的な種は、式：−ＮＨ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨ｝ｓ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨ｝ｔＲ１（式中、指数ｓおよびｔはそれぞれ独立に０または１である）を有する。指数ａ、ｂおよびｄは、それぞれ独立に０〜２０の整数であり、ｃは、１〜２５００の整数である。他の類似したリンカーは、ＮＨ部分が、例えば−Ｓ、−Ｏおよび−ＣＨ２によって置換された種に基づいている。
【０１１６】
より具体的には、本発明は、ＮＨ−Ｌ−Ｒ１が、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨ（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＲ１、ＮＨ（ＣＨ２）ａＮＨＲ１、およびＮＨＲ１である化合物を含むペプチドコンジュゲートを提供する。これらの式中、指数ａ、ｂおよびｄは、それぞれ独立に０〜２０の整数から、好ましくは１〜５から選択される。指数ｃは、１〜２５００の整数である。
【０１１７】
例示的な実施形態では、Ｇはシアル酸であり、本発明の選択された化合物は、次式
【０１１８】
【化１０】
2007515410.tif 000013
を有する。当業者なら理解するであろうが、上記の例示的な化合物中のシアル酸部分は、それだけに限らないが、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、それらのＮ−アセチル誘導体などを含めた他の任意のアミノサッカリドで置換することができる。
【０１１９】
他の例示的な実施形態では、糖の第一級ヒドロキシル部分が修飾基で官能化される。例えば、シアル酸の９−ヒドロキシルを対応するアミンに転換し官能化して、本発明に従った化合物をもたらすことができる。この実施形態に従った式には、
【０１２０】
【化１１】
2007515410.tif 000014
がある。
【０１２１】
さらなる例示的な実施形態では、本発明は、６−ヒドロキシル位が、上記に示すものなどのリンカーと修飾基のカセットを有する、対応するアミン部分に転換される被修飾糖を含むペプチドコンジュゲートを提供する。これらの被修飾糖の中心として使用することができる例示的なサッカリル基には、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、Ｍａｎなどがある。この実施形態に従った代表的な被修飾糖は、次式
【０１２２】
【化１２】
2007515410.tif 000015
（式中、Ｒ３〜Ｒ５およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ＮＨ、およびＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３からそれぞれ独立に選択されるメンバーである）を有する。Ｒ６は、ＯＲ１、ＮＨＲ１またはＮＨ−Ｌ−Ｒ１であり、上記に記載の通りである。
【０１２３】
本発明の選択されたコンジュゲートは、マンノース、ガラクトースまたはグルコースに、あるいはマンノース、ガラクトースまたはグルコースの立体化学構造を有する種に基づいている。これらのコンジュゲートの一般式は、
【０１２４】
【化１３】
2007515410.tif 000016
である。
【０１２５】
他の例示的な実施形態では、本発明は、対応するヌクレオチド糖として活性化される上記に示した化合物を提供する。その修飾された形態で本発明において使用する例示的な糖ヌクレオチドには、ヌクレオチド１リン酸、２リン酸または３リン酸あるいはその類似体がある。好ましい実施形態では、被修飾糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシド、またはＧＤＰ−グリコシドから選択される。さらに好ましくは、被修飾糖ヌクレオチドの糖ヌクレオチド部分は、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸、またはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。例示的な実施形態では、ヌクレオチドリン酸は、Ｃ−１と結合する。
【０１２６】
したがって、グリコシル部分がシアル酸である例示的な実施形態では、本発明は、次式
【０１２７】
【化１４】
2007515410.tif 000017
（式中、Ｌ−Ｒ１は上記で論じた通りであり、Ｌ１−Ｒ１は修飾基に結合したリンカーを表す）を有する化合物を用いて形成されるペプチドコンジュゲートを提供する。Ｌの場合と同様に、Ｌ１に従った例示的なリンカー種には、結合、アルキルまたはヘテロアルキル部分がある。これらの実施形態に従った例示的な被修飾糖ヌクレオチド化合物を、図１および図２に示す。
【０１２８】
他の例示的な実施形態では、本発明は、本発明の被修飾糖と、基質、例えばペプチド、脂質、アグリコンなどとの間に、より具体的には、被修飾糖と、糖ペプチドまたは糖脂質のグリコシル残基との間に形成されたコンジュゲートを提供する。この実施形態では、被修飾糖の糖部分は、基質と修飾基の間に介在するグリコシル結合基となる。例示的なグリコシル結合基は、完全なグリコシル結合基であり、結合基を形成するグリコシル部分または複数のグリコシル部分は、化学的プロセス（例えば、メタ過ヨウ素酸ナトリウム）または酵素的プロセス（例えば、オキシダーゼ）によって分解されない。本発明の選択されたコンジュゲートは、アミノサッカリド、例えばマンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸などのアミン部分と結合した修飾基を含む。このモチーフに従った、修飾基と完全なグリコシル結合基の例示的なカセットは、次式
【０１２９】
【化１５】
2007515410.tif 000018
を有するものなどのシアル酸構造に基づいている。上記の式で、Ｒ１、Ｌ１およびＬ２は、上記に記載の通りである。
【０１３０】
さらに例示的な実施形態では、基質と、修飾基がリンカーを介して６位の炭素の位置で結合するサッカリル部分の１位との間にコンジュゲートが形成される。したがって、この実施形態に従った例示的なコンジュゲートは、次式
【０１３１】
【化１６】
2007515410.tif 000019
（式中、各基は上記で論じた通りである）を有する。当業者なら、上記に示した被修飾サッカリル部分を、２位、３位、４位、または５位の炭素原子の位置で、基質と結合することもできることを理解するであろう。
【０１３２】
この実施形態に従った例示的な化合物には、次式
【０１３３】
【化１７】
2007515410.tif 000020
（式中、Ｒ基および指数は上記に記載の通りである）を有する化合物がある。
【０１３４】
本発明はまた、６位の炭素の位置で、Ｌ−Ｒ１で修飾された糖ヌクレオチドをも提供する。この実施形態に従った例示的な種には、次式
【０１３５】
【化１８】
2007515410.tif 000021
（式中、Ｒ基およびＬは上記で論じた部分を表す）がある。指数「ｙ」は０、１または２である。
【０１３６】
本発明のさらなる例示的なヌクレオチド糖は、ＧＤＰマンノースの立体化学構造を有する種に基づいている。この実施形態に従った例示的な種は、次の構造
【０１３７】
【化１９】
2007515410.tif 000022
を有する。
【０１３８】
さらなる例示的な実施形態では、本発明は、ＵＤＰガラクトースの立体化学構造に基づくコンジュゲートを提供する。この実施形態に従った例示的な化合物は、次の構造
【０１３９】
【化２０】
2007515410.tif 000023
を有する。
【０１４０】
他の例示的な実施形態では、ヌクレオチド糖は、グルコースの立体化学構造に基づいている。この実施形態に従った例示的な種は、次式
【０１４１】
【化２１】
2007515410.tif 000024
2007515410.tif 000025
を有する。
【０１４２】
修飾基Ｒ１は、それだけに限らないが、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療用作用物質、診断用作用物質などを含めたいくつかの種のいずれかである。例示的な修飾基の性質について、以下により詳細に論じる。
【０１４３】
修飾基
水溶性ポリマー
多数の水溶性ポリマーが当業者に知られ、それらは本発明の実施に有用である。水溶性ポリマーという用語は、サッカリド（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリ（アミノ酸）、例えばポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、例えば、ポリ（エチレングリコール））；ペプチド、タンパク質などの種を包含する。コンジュゲートの残部が結合できる場所を含んでいなければならないことのみ制限のある任意の水溶性ポリマーを用いて、本発明を実施することができる。
【０１４４】
ポリマーの活性化の方法は、ＷＯ９４／１７０３９、米国特許第５３２４８４４号、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／０４１９３、米国特許第５２１９５６４号、米国特許第５１２２６１４号、ＷＯ９０／１３５４０、米国特許第５２８１６９８号、さらにＷＯ９３／１５１８９中に認めることもでき、活性化ポリマーと、ペプチド、例えば凝固第ＶＩＩＩ因子（ＷＯ９４／１５６２５）、ヘモグロビン（ＷＯ９４／０９０２７）、酸素輸送分子（米国特許第４４１２９８９号）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１〜４５（１９８５））との間の結合の方法を認めることもできる。
【０１４５】
好ましい水溶性ポリマーは、ポリマーの試料中で十分な割合のポリマー分子がおおよそ同じ分子量であるものである；そのようなポリマーは、「ホモ分散（ｈｏｍｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）」している。
【０１４６】
ポリ（エチレングリコール）コンジュゲートを参照することにより、本発明をさらに説明する。ＰＥＧの機能付与および結合におけるいくつかの総説およびモノグラフが利用可能である。例えば、Ｈａｒｒｉｓ、Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５〜３７３（１９８５）；Ｓｃｏｕｔｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：３０〜６５（１９８７）；Ｗｏｎｇら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６〜８７４（１９９２）；Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：２４９〜３０４（１９９２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：１５０〜１６５（１９９５）；およびＢｈａｄｒａら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５７：５〜２９（２００２）を参照されたい。反応性ＰＥＧ分子を調製し、反応性分子を用いてコンジュゲートを形成する経路は、当技術分野で知られている。例えば、米国特許第５６７２６６２号は、直鎖または分枝ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、およびポリ（アクリロモルホリン）から選択されるポリマー酸の活性エステルの、水溶性で単離可能なコンジュゲートを開示している。
【０１４７】
米国特許第６３７６６０４号は、有機溶媒中でポリマーの末端ヒドロキシルをジ（１−ベンゾトリアゾイル）カーボネートと反応させることによって水溶性非ペプチドポリマーの水溶性１−ベンゾトリアゾリルカーボネートエステルを調製する方法を示している。活性エステルを使用して、タンパク質やペプチドなどの生物学的に活性な作用物質とのコンジュゲートを形成する。
【０１４８】
ＷＯ９９／４５９６４は、生物学的に活性な作用物質と、少なくとも一方の末端が安定な結合を介してポリマー骨格と結合したポリマー骨格を含む活性化された水溶性ポリマーとを含むコンジュゲートを記載し、少なくとも一方の末端は、近位の反応性基が結合した分枝部分を含み、生物学的に活性な作用物質は、少なくとも１個の近位の反応性基と結合している。他の分枝ポリ（エチレングリコール）はＷＯ９６／２１４６９中に記載され、米国特許第５９３２４６２号は、反応性官能基を含む分枝した末端を含む分枝ＰＥＧ分子を用いて形成されたコンジュゲートを記載している。遊離反応性基は、タンパク質やペプチドなど生物学的に活性な種との反応に利用可能であり、それによってポリ（エチレングリコール）と生物学的に活性な種の間にコンジュゲートが形成される。米国特許第５４４６０９０号は、二官能ＰＥＧリンカー、および各ＰＥＧリンカー末端にペプチドを有するコンジュゲートを形成する際のその使用について記載している。
【０１４９】
分解可能なＰＥＧ結合を含むコンジュゲートは、ＷＯ９９／３４８３３；およびＷＯ９９／１４２５９、ならびに米国特許第６３４８５５８号中に記載されている。そのような分解可能な結合は、本発明に適用可能である。
【０１５０】
上記に示した、当技術分野で認められるポリマー活性化の方法は、本発明との関連において、本明細書で示す分枝ポリマーの形成の際に、また他の種、例えば、糖、糖ヌクレオチドなどとのこの分枝ポリマーの結合にも役立つ。
【０１５１】
本発明で使用する例示的なポリ（エチレングリコール）分子には、それだけに限らないが、次式
【０１５２】
【化２２】
2007515410.tif 000026
（式中、Ｒ８はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換へテロシクロアルキル、置換または非置換へテロアルキル、例えば、アセタール、ＯＨＣ−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｑ−、ＨＳ−（ＣＨ２）ｑ、あるいは−（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ）Ｚ１である）を有するものがある。指数「ｅ」は、１〜２５００の整数を表す。指数ｂ、ｄ、およびｑは、それぞれ独立に０〜２０の整数を表す。記号ＺおよびＺ１はそれぞれ独立に、ＯＨ、ＮＨ２、脱離基、例えば、イミダゾール、ｐ−ニトロフェニル、ＨＯＢＴ、テトラゾール、ハロゲン化物、Ｓ−Ｒ９、活性化されたエステルのアルコール部分；−（ＣＨ２）ｐＣ（Ｙ１）Ｖ、または−（ＣＨ２）ｐＵ（ＣＨ２）ｓＣ（Ｙ１）ｖを表す。記号Ｙは、Ｈ（２）、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ１０を表す。記号Ｘ、Ｙ、Ｙ１、Ａ１、およびＵはそれぞれ独立に、部分Ｏ、Ｓ、Ｎ−Ｒ１１を表す。記号Ｖは、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ１２、活性化されたエステルのアルコール成分、活性化されたアミドのアミン成分、糖ヌクレオチド、およびタンパク質を表す。指数ｐ、ｑ、ｓおよびｖは、０〜２０の整数からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。記号Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立に、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換へテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換へテロシクロアルキルおよび置換または非置換ヘテロアリールを表す。
【０１５３】
他の例示的な実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、下記の式
【０１５４】
【化２３】
2007515410.tif 000027
から選択される。
【０１５５】
本発明のコンジュゲートの形成に有用なポリ（エチレングリコール）は、直鎖状または分枝状である。本発明での使用に適した分枝ポリ（エチレングリコール）分子には、それだけに限らないが、下記の式
【０１５６】
【化２４】
2007515410.tif 000028
（式中、Ｒ８およびＲ８’は、上記のＲ８について定義される群からそれぞれ独立に選択されるメンバーである）によって示されるものがある。Ａ１およびＡ２は、上記のＡ１について定義される群からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。指数ｅ、ｆ、ｏおよびｑは、上記に記載の通りである。ＺおよびＹは、上記に記載の通りである。Ｘ１およびＸ１’は、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨからそれぞれ独立に選択されるメンバーである。
【０１５７】
他の例示的な実施形態では、分枝ＰＥＧはシステイン、セリンまたはジリシンの中心に基づいている。したがって、さらなる例示的な分枝ＰＥＧには、
【０１５８】
【化２５】
2007515410.tif 000029
が含まれる。
【０１５９】
さらに他の実施形態では、分枝ＰＥＧ部分は、トリリシンペプチドに基づいている。トリリシンは、モノ、ジ、トリまたはテトラＰＥＧ化することができる。この実施形態に従った例示的な種は、次式
【０１６０】
【化２６】
2007515410.tif 000030
（式中、ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００のそれぞれ独立に選択された整数であり、ｑ、ｑ’およびｑ’’は、１〜２０のそれぞれ独立に選択された整数である）を有する。
【０１６１】
本発明の例示的な実施形態では、ＰＥＧはｍ−ＰＥＧ（２ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤ、または２０ｋＤ）である。例示的な分枝ＰＥＧ種は、セリン−またはシステイン−（ｍ−ＰＥＧ）２（式中、ｍ−ＰＥＧは２０ｋＤのｍ−ＰＥＧである）である。
【０１６２】
当業者には明らかであろうが、本発明に役立つ分枝ポリマーには、上記に示したテーマに対する変形形態が含まれる。例えば、上記に示したジリシン−ＰＥＧコンジュゲートは、３種のポリマーサブユニットを含む可能性があり、その第３のものは、上記の構造では修飾されないものとして示したα−アミンと結合する。同様に、３または４種のポリマーサブユニットで官能化されたトリリシンの使用は、本発明の範囲内である。
【０１６３】
本発明に従った特定の実施形態には、
【０１６４】
【化２７】
2007515410.tif 000031
ならびに
【０１６５】
【化２８】
2007515410.tif 000032
など、これらの種のカーボネートおよび活性化エステルがある。
【０１６６】
本明細書で示す化合物の調製に役立つ直鎖ＰＥＧの活性化に適した他の活性化基または脱離基には、それだけに限らないが、次の種
【０１６７】
【化２９】
2007515410.tif 000033
が含まれる。これらおよび他の種で活性化されるＰＥＧ分子、および活性化ＰＥＧを作製する方法は、ＷＯ０４／０８３２５９中に示されている。
【０１６８】
分枝ポリマーの１個または複数個のｍ−ＰＥＧの腕を、異なる末端、例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、Ｃ２〜Ｃ１０−アルキルなどを有するＰＥＧ部分で置換することができることを当業者なら理解するであろう。さらに、上記の構造は、α−炭素原子と側鎖の官能基との間にアルキルリンカーを挿入する（または炭素原子を除去する）ことによって容易に修飾される。したがって、「ホモ」誘導体および高級同族体、ならびに低級同族体は、本発明に役立つ分枝ＰＥＧの中心の範囲内にある。
【０１６９】
本明細書で示す分枝ＰＥＧ種は、下記のスキーム
【０１７０】
【化３０】
2007515410.tif 000034
（式中、ＸａはＯまたはＳであり、ｒは１〜５の整数である）で示すものなどの方法によって容易に調製される。指数ｅおよびｆは、１〜２５００のそれぞれ独立に選択される整数である。
【０１７１】
したがって、このスキームによれば、天然または非天然アミノ酸を、活性化ｍ−ＰＥＧ誘導体、この場合ではトシレートと接触させ、側鎖のヘテロ原子Ｘａをアルキル化することによって１を形成する。単官能化ｍ−ＰＥＧアミノ酸を、反応性ｍ−ＰＥＧ誘導体とともにＮ−アセチル化条件にさらし、それによって分枝ｍ−ＰＥＧである２が構築される。当業者なら、トシレート脱離基を、任意の適切な脱離基、例えばハロゲン、メシレート、トリフレートなどに置換することができることを理解するであろう。同様に、アミンのアシル化に利用する反応性カーボネートを、活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどに置換することができ、またはジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾールなどの脱水剤を用いてｉｎ  ｓｉｔｕで酸を活性化することができる。
【０１７２】
例示的な実施形態では、修飾基はＰＥＧ部分であるが、任意の修飾基、例えば水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療的部分などを、適当な結合を介してグリコシル部分中に組み込むことができる。酵素的手段、化学的手段またはその組合せにより被修飾糖が形成され、それによって被修飾糖が生成する。例示的な実施形態では、糖は任意の位置で活性アミンに置換され、それによって修飾部分の結合が可能となるが、糖は依然として、被修飾糖をＦＳＨペプチドに結合することができる酵素の基質として機能することが可能である。例示的な実施形態では、ガラクトサミンが被修飾糖であるとき、アミン部分は６位の炭素原子と結合する。
【０１７３】
水溶性ポリマー被修飾種
糖部分が水溶性ポリマーで修飾されている水溶性ポリマー被修飾ヌクレオチド糖種は本発明に役立つ。例示的な被修飾糖ヌクレオチドは、糖上のアミン部分を介して修飾される糖基を有する。被修飾糖ヌクレオチド、例えば、糖ヌクレオチドのサッカリルアミン誘導体も、本発明の方法に役立つ。例えば、（修飾基を有さない）サッカリルアミンは、酵素によりペプチド（または他の種）と結合することができ、遊離したサッカリルアミン部分はその後所望の修飾基と結合する。あるいは、被修飾糖ヌクレオチドは、基質、例えばペプチド、糖ペプチド、脂質、アグリコン、糖脂質などの上にあるサッカリル受容体に被修飾糖を転移させる酵素の基質として機能することもできる。
【０１７４】
サッカリド中心がガラクトースまたはグルコースである一実施形態では、Ｒ５はＮＨＣ（Ｏ）Ｙである。
【０１７５】
例示的な実施形態では、被修飾糖は、６−アミノ−Ｎ−アセチル−グリコシル部分に基づいている。Ｎ−アセチルガラクトサミンについて下記で示すように、６−アミノ−糖部分は、標準的な方法により容易に調製される。
【０１７６】
【化３１】
2007515410.tif 000035
【０１７７】
上記のスキームで、指数ｎは１〜２５００の、好ましくは１０〜１５００の、より好ましくは１０〜１２００の整数を表す。記号「Ａ」は活性化基、例えばハロ、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の構成成分、カーボネート（例えば、ｐ−ニトロフェニルカーボネート）の構成成分などを表す。当業者なら、他のＰＥＧ−アミドヌクレオチド糖が、この方法および類似の方法によって容易に調製されることを理解するであろう。
【０１７８】
他の例示的な実施形態では、アミド部分はウレタンまたは尿素などの基で置換される。
【０１７９】
さらなる実施形態では、Ｒ１は分枝ＰＥＧ、例えば上記で示したその種の１つである。この実施形態に従った例示的な化合物には、
【０１８０】
【化３２】
2007515410.tif 000036
（式中、Ｘ４は結合またはＯである）がある。
【０１８１】
さらに、上記で論じたように、本発明は、直鎖または分枝状の水溶性ポリマーで修飾されたヌクレオチド糖を用いて形成されたペプチドコンジュゲートを提供する。例えば、下記に示す式
【０１８２】
【化３３】
2007515410.tif 000037
（式中、Ｘ４はＯまたは結合である）を有する化合物は、本発明の範囲内にある。
【０１８３】
同様に、本発明は、６位の炭素が修飾された被修飾糖種のヌクレオチド糖を用いて形成されたペプチドコンジュゲートを提供する：
【０１８４】
【化３４】
2007515410.tif 000038
（式中、Ｘ４は結合またはＯである）。
【０１８５】
本発明の組成物を含むペプチドおよび糖ペプチド、脂質および糖脂質のコンジュゲートも提供される。例えば、本発明は、下記の式
【０１８６】
【化３５】
2007515410.tif 000039
を有するコンジュゲートを提供する。
【０１８７】
水不溶性ポリマー
他の実施形態では、上記で論じたものと類似して、被修飾糖は、水溶性ポリマーではなく水不溶性ポリマーを含む。本発明のコンジュゲートはまた、１つまたは複数の水不溶性ポリマーを含んでもよい。本発明のこの実施形態は、制御された形で治療用ペプチドを送達する媒体としてのそのコンジュゲートの使用によって説明される。ポリマー薬物送達系は、当技術分野で既知である。例えば、Ｄｕｎｎら編、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  第４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．１９９１を参照されたい。当業者なら、実質的にどんな既知の薬物送達系も、本発明のコンジュゲートに適用可能であることを理解するであろう。
【０１８８】
代表的な水不溶性ポリマーには、それだけに限らないが、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）およびポリビニルフェノール、ならびにそのコポリマーがある。
【０１８９】
本発明のコンジュゲートに役立つ、合成により修飾された天然ポリマーには、それだけに限らないが、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、およびニトロセルロースがある。広範な種類の、合成により修飾された天然ポリマーのうち特に好ましいメンバーには、それだけに限らないが、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、硫酸セルロースナトリウム塩、ならびにアクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルおよびアルギン酸のポリマーがある。
【０１９０】
本明細書で論じるこれらのポリマーおよび他のポリマーは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（ペンシルバニア州Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、Ｆｌｕｋａ（ニューヨーク州Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ）およびＢｉｏＲａｄ（カリフォルニア州Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）などの商業的供給元から容易に入手することもでき、あるいはこれらの供給業者から入手したモノマーから標準的な技術を用いて合成することもできる。
【０１９１】
本発明のコンジュゲートに役立つ代表的な生体分解性ポリマーには、それだけに限らないが、ポリラクチド、ポリグリコリドおよびそのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、その混合物およびコポリマーがある。コラーゲン、プルロニックなどを含むものなど、ゲルを形成する組成物が特に役立つ。
【０１９２】
本発明に役立つポリマーには、その構造の少なくとも一部の中に生体吸収性分子を有する水不溶性物質を含む「ハイブリッド」ポリマーがある。そのようなポリマーの例は、ポリマー鎖１個当たりに、生体吸収性領域、親水性領域および複数の架橋可能な官能基を有する水不溶性コポリマーを含むものである。
【０１９３】
本発明の目的で、「水不溶性物質」には、水または水を含む環境の中で実質的に不溶性である物質が含まれる。したがって、コポリマーの特定の領域または部分は親水性であり、または水溶性でさえある可能性があるが、ポリマー分子は、全体として、実質的に水に溶解しない。
【０１９４】
本発明の目的で、「生体吸収性分子」という用語には、身体により代謝または分解され、吸収されかつ／または正常な排泄経路を介して排除されることが可能な領域が含まれる。そのような代謝物または分解産物は、好ましくは身体に対して実質的に非毒性である。
【０１９５】
生体吸収性領域は、そのコポリマー組成物が全体として水溶性とならない限り、疎水性でも親水性でもよい。したがって、生体吸収性領域は、ポリマーが全体として水不溶性のままであるという優先性に基づいて選択される。したがって、有用な生体吸収性組成物が確実に水不溶性のままであるように、相対的な特性、すなわち含まれる官能基の種類、ならびに生体吸収性領域および親水性領域の相対的な割合を選択する。
【０１９６】
例示的な吸収性ポリマーには、例えば、合成により生成される、ポリ（α−ヒドロキシカルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン）の吸収性ブロックコポリマーがある（Ｃｏｈｎら、米国特許第４８２６９４５号を参照）。これらのコポリマーは架橋せず、水溶性であり、その結果、身体は分解されたブロックコポリマー組成物を排泄できる。Ｙｏｕｎｅｓら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１３０１〜１３１６（１９８７）；およびＣｏｈｎら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：９９３〜１００９（１９８８）を参照されたい。
【０１９７】
現在好ましい生体吸収性ポリマーは、ポリ（エステル）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミド）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（リン酸エステル）、ポリ（チオエステル）、ポリサッカリドおよびその混合物から選択される１つまたは複数の構成成分を含む。さらに好ましくは、生体吸収性ポリマーは、ポリ（ヒドロキシ）酸の構成成分を含む。ポリ（ヒドロキシ）酸のうち、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、ならびにそのコポリマーおよび混合物が好ましい。
【０１９８】
ｉｎ  ｖｉｖｏで吸収（生体吸収）される断片の形成に加えて、本発明の方法に役立つ好ましいポリマー被覆はまた、排泄可能なかつ／または代謝可能な断片を形成することができる。
【０１９９】
本発明で高級コポリマーを使用することもできる。例えば、１９８４年３月２０日発行のＣａｓｅｙら、米国特許第４４３８２５３号は、ポリ（グリコール酸）とヒドロキシル末端のあるポリ（アルキレングリコール）のエステル交換から生成されるトリブロックコポリマーを開示している。吸収性の単繊維の縫合糸としての使用について、そのような組成物が開示されている。そのような組成物の柔軟性は、コポリマー構造中への、テトラ−ｐ−トリルオルトカーボネートなどの芳香族オルトカーボネートの組み込みによって調節される。
【０２００】
乳酸および／またはグリコール酸に基づく他のポリマーを利用することもできる。例えば、１９９３年４月１３日発行のＳｐｉｎｕ、米国特許第５２０２４１３号は、オリゴマージオールまたはジアミン残基上へのラクチドおよび／またはグリコリドの開環ポリマー化を行い、その後、ジイソシアネート、ジアシルクロリドやジクロロシランなどの二官能性化合物での鎖伸長を行うことによって生成される、ポリラクチドおよび／またはポリグリコリドのブロックが順次並んだ生体分解性の多ブロックコポリマーを開示している。
【０２０１】
本発明で有用な被覆の生体吸収性領域は、加水分解によりかつ／または酵素により切断可能であるように設計することができる。本発明の目的で、「加水分解により切断可能」とは、水または水を含む環境中での加水分解に対する、コポリマーの、特に生体吸収性領域の感受性を指す。同様に、本明細書において「酵素により切断可能」とは、内因性または外因性酵素による切断に対する、コポリマーの、特に生体吸収性領域の感受性を指す。
【０２０２】
身体内に入ったとき、親水性領域は、排泄可能なかつ／または代謝可能な断片へと分解することができる。したがって、親水性領域には、例えば、ポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリオール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキルオキサゾリン）、ポリサッカリド、炭化水素、ペプチド、タンパク質、ならびにそのコポリマーおよび混合物があり得る。さらに、親水性領域はまた、例えば、ポリ（アルキレン）オキシドでもよい。そのようなポリ（アルキレン）オキシドには、例えば、ポリ（エチレン）オキシド、ポリ（プロピレン）オキシド、ならびにその混合物およびコポリマーがあり得る。
【０２０３】
ヒドロゲルの構成成分であるポリマーも、本発明で有用である。ヒドロゲルとは、比較的大量の水を吸収できるポリマー物質である。ヒドロゲル形成化合物の例としては、それだけに限らないが、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、カラギナンおよび他のポリサッカリド、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＨＥＭＡ）、ならびにその誘導体などがある。安定であり、生体分解性であり、生体吸収性であるヒドロゲルを生成することができる。さらに、ヒドロゲル組成物は、１つまたは複数のこれらの特徴を示すサブユニットを含んでよい。
【０２０４】
その全体性を架橋により調節することができる生体適合性ヒドロゲル組成物が知られており、現在のところ、本発明の方法での使用に好ましい。例えば、Ｈｕｂｂｅｌｌらの、１９９５年４月２５日発行の米国特許第５４１００１６号、および１９９６年６月２５日発行の第５５２９９１４号は、水溶性の中心ブロック部分が加水分解に不安定な２つの伸長部分に挟まれた架橋ブロックコポリマーである水溶性の系を開示している。光重合性アクリレートの官能性で、そのようなコポリマーの末端をさらに覆う。架橋したとき、これらの系はヒドロゲルとなる。そのようなコポリマーの水溶性中心ブロックには、ポリ（エチレングリコール）があり得、一方、加水分解に不安定な伸長部分は、ポリグリコール酸やポリ乳酸などのポリ（α−ヒドロキシ酸）でよい。Ｓａｗｈｎｅｙら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８１〜５８７（１９９３）を参照されたい。
【０２０５】
他の好ましい実施形態では、ゲルは温度可逆性ゲルである。プルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアロウロン酸、ポリサッカリド、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン−尿素ヒドロゲル、およびその組合せなどの構成成分を含む温度可逆性ゲルが現在のところ好ましい。
【０２０６】
さらに他の例示的な実施形態では、本発明のコンジュゲートはリポソームの構成成分を含む。当業者に知られている方法、例えば、１９８５年６月１１日発行のＥｐｐｓｔｅｉｎら、米国特許第４５２２８１１号に記載の方法に従ってリポソームを調製することができる。例えば、無機溶媒中で適当な（複数の）脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイル（ａｒａｃｈａｄｏｙｌ）ホスファチジルコリンやコレステロールなど）を溶解し、次いでそれを蒸発させ、容器の表面上に乾燥脂質の薄膜を残すことによってリポソーム製剤を調製することができる。次いで、活性な化合物の水溶液またはその薬剤として許容される塩をその容器中に導入する。次いでその容器を手動で回旋して、容器の側面から脂質を遊離させ、脂質の凝集を拡散させ、それによってリポソーム懸濁液を形成させる。
【０２０７】
上記に挙げた微小粒子およびその微小粒子の調製方法は、一例として示すものであり、本発明に役立つ微小粒子の範囲を限定するものではない。異なる方法で作られた一連の微小粒子が本発明に役立つことは、当業者には明らかであろう。
【０２０８】
一般に、水溶性ポリマーの関係において上記で論じた構造の型は、直鎖状も分枝状も、水不溶性ポリマーに関しても同様に適用可能である。したがって、例えば、システイン、セリン、ジリシン、トリリシンの分枝している中心を２つの水不溶性ポリマー部分で官能化することができる。一般に、これらの種の生成に用いる方法は、水溶性ポリマーの生成に用いるものと密接に類似している。
【０２０９】
治療用糖ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのＰＥＧ部分を用いて長くすることもできる。例えば、タンパク質をＰＥＧで化学修飾（ＰＥＧ化）すると、その分子サイズが増大し、その表面および官能基への到達性が低下するが、そのそれぞれは、タンパク質と結合するＰＥＧのサイズに依存する。この結果、血漿半減期が向上し、タンパク質分解が安定し、免疫原性および肝での取り込みが低下する（Ｃｈａｆｆｅｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１６４３〜１６５１（１９９２）；Ｐｙａｔａｋら、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：１１３〜１２７（１９８０））。インターロイキン−２のＰＥＧ化によって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその抗腫瘍効果が亢進することが報告されており（Ｋａｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：１４８７〜１４９１（１９８７））、モノクローナル抗体Ａ７由来のＦ（ａｂ’）２のＰＥＧ化によって、その腫瘍局在化が向上した（Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８：１３８７〜１３９４（１９９０））。したがって、他の好ましい実施形態では、本発明の方法によりＰＥＧ部分で誘導体化されたペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、非誘導体化ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に関して増大する。
【０２１０】
ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期の増大は、この量の％増大の範囲で最もよく表される。％増大の範囲の下端は、約４０％、約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％または約２００％である。その範囲の上端は、約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％であり、または約２５０％を超える。
【０２１１】
例示的な実施形態では、本発明は、ＰＥＧ化ＦＳＨを提供する（図１、図２および図５）。
【０２１２】
方法
上記で論じたコンジュゲートに加えて、本発明は、これらのコンジュゲートおよび他のコンジュゲートを調製する方法を提供する。したがって、さらなる態様では、本発明は、選択された部分とＦＳＨペプチドとの間に共有コンジュゲートを形成する方法を提供する。さらに、本発明は、身体の特定の組織または領域に本発明のコンジュゲートを標的導入する方法を提供する。
【０２１３】
例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分（またはＰＥＧ部分を含む、酵素により転移可能なグリコシル部分）と、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間にコンジュゲートが形成される。ＰＥＧは、間に介在する完全なグリコシル結合基を介してＦＳＨペプチドと結合し、その基は、ＦＳＨペプチドとＰＥＧ部分の両方と、またはＰＥＧ−非グリコシルリンカー（例えば、置換または非置換アルキル、置換または非置換へテロアルキル）構築物と共有結合する。この方法は、ＦＳＨペプチドを、被修飾糖、およびその被修飾糖が基質であるグリコシルトランスフェラーゼを含有する混合物と接触させる工程を含む。被修飾糖とＦＳＨペプチドの間で共有結合が形成するのに十分な条件下でその反応を行う。被修飾糖の糖部分は、好ましくは、ヌクレオチド糖、活性化糖、およびヌクレオチドでもなく活性化されてもいない糖から選択される。
【０２１４】
通常、受容ペプチド（グリコシル化または非グリコシル化）をｄｅ  ｎｏｖｏで合成し、あるいは原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞）内で、または哺乳動物、酵母、昆虫、真菌や植物の細胞などの真核細胞内で組換えにより発現させる。ＦＳＨペプチドは、完全長タンパク質でもよく、あるいは断片でもよい。さらに、ＦＳＨペプチドは野生型ペプチドでもよく、あるいは突然変異型ペプチドでもよい。例示的な実施形態では、ＦＳＨペプチドは、１個または複数個のＮ−またはＯ−結合グリコシル化部位をペプチド配列に付加する突然変異を含む。
【０２１５】
例示的な実施形態では、下記のように、ＦＳＨをＯ−グリコシル化し、水溶性ポリマーで官能化する。利用可能なアミノ酸グリコシル化部位の付いたペプチドを生成し、または、グリコシル化されている場合、グリコシル部分を削除してアミノ酸を露出する。例えば、セリンまたはスレオニンをα−１  Ｎ−アセチルアミノガラクトシル（ＧａｌＮＡｃ）化し、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＴ１を用いてそのＮＡｃガラクトシル化ペプチドをシアル酸修飾基カセットでシアル化する。あるいは、Ｃｏｒｅ−１−ＧａｌＴ−１を用いてそのＮＡｃガラクトシル化ペプチドをガラクトシル化し、ＳＴ３ＧａｌＴ１を用いてその産物をシアル酸修飾基カセットでシアル化する。この方法に従った例示的なコンジュゲートは、下記の結合を有する：Ｔｈｒ−α−１−ＧａｌＮＡｃ−β−１，３−Ｇａｌ−α２，３−Ｓｉａ＊（Ｓｉａ＊はシアル酸修飾基カセット）。
【０２１６】
上記に示したような本発明の方法では、複数の酵素およびサッカリル供与体を用いて、個々のグリコシル化工程を別々に行うこともでき、あるいは「単一ポット」の反応で一緒に行うこともできる。例えば、上記に示した３つの酵素反応で、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧａｌＴおよびＳｉａＴ、並びにその供与体を、単一の容器中で混合することができる。あるいは、ＧａｌＮＡｃ反応を単独で行い、単一工程として、ＧａｌＴとＳｉａＴの両方、およびその適当なサッカリル供与体を添加することもできる。反応実施の他の形態では、各酵素および適当な供与体を順次添加し、「単一ポット」のモチーフで反応を行う。上記に示した各方法の組合せは、本発明の化合物の調製に役立つ。
【０２１７】
本発明の方法では、組換えにより生成されたペプチドを修飾する。組換えにより生成された糖タンパク質の多くは、グリコシル化が不完全である。本発明の方法で被修飾糖を使用して、ＦＳＨペプチドを同時にさらにグリコシル化し、例えばＰＥＧ部分、治療用作用物質などで誘導体化することができる。被修飾糖の糖部分は、完全にグリコシル化されたペプチド内の受容体と適切に結合する残基でもよく、あるいは所望の特性を有する他の糖部分でもよい。
【０２１８】
本発明の方法によって修飾されるＦＳＨペプチドは、合成または野生型ペプチドでもよく、あるいは部位特異的突然変異生成など当技術分野で知られている方法によって生成される突然変異ペプチドでもよい。ペプチドのグリコシル化は通常、Ｎ−結合またはＯ−結合である。例示的なＮ−結合は、アスパラギン残基の側鎖への被修飾糖の結合である。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘはプロリンを除いた任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭化水素部分の酵素的結合についての認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のどちらかの存在により、潜在的なグリコシル化部位がもたらされる。Ｏ−結合グリコシル化とは、１つの糖（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコースまたはキシロース）が、ヒドロキシアミノ酸、好ましくはセリンまたはスレオニンのヒドロキシ側鎖に結合することを指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを使用することもできる。
【０２１９】
例えば、一実施形態では、哺乳動物の系でＦＳＨを発現させ、シアリダーゼで処理して末端のシアル酸残基を切断し、その後ＳＴ３Ｇａｌ３および図５に示すものなどのＰＥＧ−シアル酸の供与体を用いてＰＥＧ化することによってそれを修飾する。この説明に従った例示的なスキームを図２Ａに示す。この方法に従ったＦＳＨペプチドのＧｌｙｃｏＰＥＧ化を示しているＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを図２Ｂに示す。
【０２２０】
他の例示的な実施形態では、哺乳動物細胞で発現されたＦＳＨを最初にシアリダーゼで処理して末端のシアル酸残基を切断し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を用いてＰＥＧ化し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を用いてシアル化する。
【０２２１】
哺乳動物の系で発現されたＦＳＨは、シアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してそのシアル酸残基およびガラクトース残基を切断し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを用いてガラクトシル化し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を用いてＰＥＧ化することもできる。
【０２２２】
さらに他の実施形態では、シアリダーゼでシアル酸部分を切断することは不要であり、その代わりにＳＴ３Ｇａｌ３を用いて修飾基−シアル酸カセットとシアル酸の交換を行う。
【０２２３】
さらなる例示的な実施形態では、昆虫細胞でＦＳＨを発現させ、下記の手順でそれを修飾する：最初に適当なＮ−アセチルグルコサミン供与体、ならびに１つまたは複数のＧｎＴ−Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、およびＶを用いてＮ−アセチルグルコサミンをＦＳＨに付加する；次いでＰＥＧ−ガラクトースの供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを用いてＦＳＨをＰＥＧ化する。
【０２２４】
酵母で産生されたＦＳＨをＧｌｙｃｏＰＥＧ化することもできる。例えば、最初にＦＳＨをエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基を切断し、ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを用いてガラクトシル化し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体でＰＥＧ化する。
【０２２５】
都合のよいことに、ペプチドまたは他の構造へのグリコシル化部位の付加は、それが１個または複数個のグリコシル化部位を含むようにアミノ酸配列を変更することによって実現される。付加は、−ＯＨ基を提示している１個または複数個の種、好ましくはセリンまたはスレオニン残基をＦＳＨペプチドの配列内に（Ｏ−結合グリコシル化部位用に）組み込むことによって行うこともできる。付加は、ＦＳＨペプチドの突然変異または完全化学合成によって行うことができる。ＦＳＨペプチドのアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化を介して、具体的には、所望のアミノ酸へと翻訳されるコドンが生じるように、ペプチドをコードするＤＮＡの予め選択された塩基に突然変異を引き起こすことによって変更する。（複数の）ＤＮＡ突然変異は、好ましくは当技術分野で知られている方法を用いて行う。
【０２２６】
例示的な実施形態では、ポリヌクレオチドをシャッフルすることによってグリコシル化部位を付加する。候補ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＤＮＡシャッフリングのプロトコールを用いて変化させることができる。ＤＮＡシャッフリングは、回帰的な組換えおよび突然変異の方法であり、関連遺伝子のプールを無作為に断片化し、その後ポリメラーゼ連鎖反応様の方法でその断片を再構築することによって行われる。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７〜１０７５１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９〜３９１（１９９４）；ならびに米国特許第５６０５７９３号、第５８３７４５８号、第５８３０７２１号および第５８１１２３８号を参照されたい。
【０２２７】
本発明はまた、１個または複数個の選択されたグリコシル残基をペプチドに付加する（または除去する）手段をも提供し、その後ペプチドの少なくとも１個の選択されたグリコシル残基と被修飾糖を結合する。この実施形態は、例えば、ペプチド上に存在せず、または望ましい量で存在しない選択されたグリコシル残基と被修飾糖を結合することが望ましいとき有用である。したがって、被修飾糖をペプチドと結合する前に、酵素的または化学的結合により、選択されたグリコシル残基をＦＳＨペプチドと結合する。他の実施形態では、糖ペプチドのグリコシル化パターンを変更した後、その糖ペプチドから炭化水素残基を除去することによって被修飾糖を結合する。例えば、ＷＯ９８／３１８２６を参照されたい。
【０２２８】
糖ペプチド上に存在する任意の炭化水素部分の付加または除去は、化学的にまたは酵素により実現される。化学的な脱グリコシル化は、好ましくは、ポリペプチド変異体を化合物トリフルオロメタンスルホン酸、またはそれと同等な化合物にさらすことによって生じる。この処理により、ペプチドは無傷のままであるが、結合糖（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｓｕｇａｒ）（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の糖のほとんどまたはすべてが切断される。化学的な脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１）に記載されている。酵素によるポリペプチド変異体上の炭化水素部分の切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）に記載のように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用することによって実現することができる。
【０２２９】
グリコシル部分の化学的付加は、当技術分野で認められる任意の方法によって実施される。糖部分の酵素による付加は、好ましくは本明細書で示す方法の改変を用いて実現され、天然のグリコシル単位を本発明で用いる被修飾糖に置換する。糖部分を付加する他の方法は、米国特許第５８７６９８０号、第６０３０８１５号、第５７２８５５４号、および第５９２２５７７号に開示されている。
【０２３０】
選択されたグリコシル残基の例示的な結合の場所には、それだけに限らないが、（ａ）Ｎ−グリコシル化とＯ−グリコシル化のコンセンサス部位、（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼの受容体である末端グリコシル部分、（ｃ）アルギニン、アスパラギンおよびヒスチジン、（ｄ）遊離カルボキシル基、（ｅ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｆ）セリン、スレオニンやヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｇ）フェニルアラニン、チロシンやトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｈ）グルタミンのアミド基がある。本発明に役立つ例示的な方法は、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０、ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ  ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，ｐｐ．２５９〜３０６（１９８１）に記載されている。
【０２３１】
方法
上記で論じたコンジュゲートに加えて、本発明は、これらのコンジュゲートおよび他のコンジュゲートを調製する方法を提供する。さらに、本発明は、疾患を発症する危険がある対象またはその疾患に罹患している対象に本発明のコンジュゲートを投与することにより、その疾患状態を予防し、治療しまたは改善する方法を提供する。
【０２３２】
したがって、本発明は、選択された部分とＦＳＨペプチドとの間に共有コンジュゲートを形成する方法を提供する。
【０２３３】
例示的な実施形態では、水溶性ポリマー、治療的部分、標的導入部分または生体分子と、グリコシル化または非グリコシル化ＦＳＨペプチドとの間にコンジュゲートを形成する。ポリマー、治療的部分または生体分子は、間に介在するグリコシル結合基を介してＦＳＨペプチドと結合し、その基は、ペプチドとも修飾基（例えば、水溶性ポリマー）とも共有結合する。この方法は、被修飾糖、および被修飾糖を基質（例えばペプチド、アグリコン、糖脂質）と結合させる酵素、例えばグリコシルトランスフェラーゼを含む混合物とＦＳＨペプチドを接触させる工程を含む。被修飾糖とＦＳＨペプチドの間で共有結合が形成するのに適した条件下でその反応を行う。
【０２３４】
通常、受容ＦＳＨペプチドをｄｅ  ｎｏｖｏで合成し、あるいは原核細胞（例えば、大腸菌などの細菌細胞）内で、または哺乳動物、酵母、昆虫、真菌や植物の細胞などの真核細胞内で組換えにより発現させる。ＦＳＨペプチドは、完全長タンパク質でもよく、あるいは断片でもよい。さらに、ＦＳＨペプチドは野生型ペプチドでもよく、あるいは突然変異型ペプチドでもよい。例示的な実施形態では、ＦＳＨペプチドは、１個または複数個のＮ−またはＯ−結合グリコシル化部位をペプチド配列に付加する突然変異を含む。
【０２３５】
本発明の方法では、組換えにより生成された、不完全にグリコシル化されたＦＳＨペプチドを修飾する。組換えにより生成された糖タンパク質の多くはグリコシル化が不完全であり、望ましくない特性、例えば免疫原性、ＲＥＳによる認識性を有する可能性がある炭化水素残基が露出している。本発明の方法で被修飾糖を使用して、ペプチドを同時にさらにグリコシル化し、例えば水溶性ポリマー、治療用作用物質などで誘導体化することができる。被修飾糖の糖部分は、完全にグリコシル化されたペプチド内の受容体と正しく結合する残基でもよく、あるいは所望の特性を有する他の糖部分でもよい。
【０２３６】
本発明に役立つペプチド修飾の例示的な方法は、ＷＯ０４／０９９２３１、ＷＯ０３／０３１４６４およびその中に示される参照文献中に示されている。
【０２３７】
例示的な実施形態では、本発明は、次の部分
【０２３８】
【化３６】
2007515410.tif 000040
（式中、Ｄは−ＯＨまたはＲ１−Ｌ−ＨＮ−である）を含むＰＥＧ化ＦＳＨを作製する方法を提供する。記号Ｇは、Ｒ１−Ｌ−または−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルを表す。Ｒ１は、直鎖または分枝ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分である。記号Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーである。一般に、ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。本発明の方法は、（ａ）基質ＦＳＨペプチドを、ＰＥＧ−シアル酸供与体、およびその供与体から基質ＦＳＨペプチドにＰＥＧ−シアル酸部分を転移することができる酵素と接触させる工程を含む。
【０２３９】
例示的なＰＥＧ−シアル酸供与体は、次式
【０２４０】
【化３７】
2007515410.tif 000041
を有するものなどのヌクレオチド糖、および転移に適した条件下でＦＳＨペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基上にＰＥＧ−シアル酸を転移する酵素である。
【０２４１】
一実施形態では、基質ＦＳＨペプチドを宿主細胞で発現させた後、本発明のコンジュゲートを形成する。例示的な宿主細胞は哺乳動物細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞、植物細胞、細菌または真菌である。
【０２４２】
本明細書で示す方法は、上記の項で示した各ＦＳＨコンジュゲートに適用可能である。
【０２４３】
本発明の方法によって修飾されるＦＳＨペプチドは、合成または野生型ペプチドでもよく、あるいは部位特異的突然変異生成など当技術分野で知られている方法によって生成される突然変異ペプチドでもよい。ペプチドのグリコシル化は通常、Ｎ−結合またはＯ−結合である。例示的なＮ−結合は、アスパラギン残基の側鎖への被修飾糖の結合である。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘはプロリンを除いた任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭化水素部分の酵素的結合についての認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のどちらかの存在により、潜在的なグリコシル化部位がもたらされる。Ｏ−結合グリコシル化とは、１つの糖（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコースまたはキシロース）が、ヒドロキシアミノ酸、好ましくはセリンまたはスレオニンのヒドロキシ側鎖に結合することを指すが、通常と異なるまたは非天然のアミノ酸、例えば５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを使用することもできる。
【０２４４】
都合のよいことに、ペプチドまたは他の構造へのグリコシル化部位の付加は、それが１個または複数個のグリコシル化部位を含むようにアミノ酸配列を変更することによって実現される。付加は、−ＯＨ基を提示している１個または複数個の種、好ましくはセリンまたはスレオニン残基をペプチドの配列内に（Ｏ−結合グリコシル化部位用に）組み込むことによって行うこともできる。付加は、ペプチドの突然変異または完全化学合成によって行うことができる。ペプチドのアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化を介して、具体的には、所望のアミノ酸へと翻訳されるコドンが生じるように、ペプチドをコードするＤＮＡの予め選択された塩基に突然変異を引き起こすことによって変更する。（複数の）ＤＮＡ突然変異は、好ましくは当技術分野で知られている方法を用いて行う。
【０２４５】
例示的な実施形態では、ポリヌクレオチドをシャッフルすることによってグリコシル化部位を付加する。候補ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＤＮＡシャッフリングのプロトコールを用いて変化させることができる。ＤＮＡシャッフリングは、回帰的な組換えおよび突然変異の方法であり、関連遺伝子のプールを無作為に断片化し、その後ポリメラーゼ連鎖反応様の方法でその断片を再構築することによって行われる。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７〜１０７５１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９〜３９１（１９９４）；ならびに米国特許第５６０５７９３号、第５８３７４５８号、第５８３０７２１号および第５８１１２３８号を参照されたい。
【０２４６】
グリコシル化部位を付加または除去し、グリコシル構造または部分構造を付加または除去する例示的な方法は、ＷＯ０４／０９９２３１、ＷＯ０３／０３１４６４ならびに関連する米国およびＰＣＴ出願に詳細に記載されている。
【０２４７】
本発明はまた、１個または複数個の選択されたグリコシル残基をＦＳＨペプチドに付加する（または除去する）手段も利用し、その後ペプチドの少なくとも１個の選択されたグリコシル残基と被修飾糖を結合する。そのような技術は、例えば、ＦＳＨペプチド上に存在せず、または望ましい量で存在しない選択されたグリコシル残基と被修飾糖を結合することが望ましいとき有用である。したがって、被修飾糖をペプチドと結合する前に、酵素的または化学的結合により、選択されたグリコシル残基をＦＳＨペプチドと結合する。他の実施形態では、糖ペプチドのグリコシル化パターンを変更した後、その糖ペプチドから炭化水素残基を除去することによって被修飾糖を結合する。例えば、ＷＯ９８／３１８２６を参照されたい。
【０２４８】
選択されたグリコシル残基の例示的な結合の場所には、それだけに限らないが、（ａ）Ｎ−結合グリコシル化のコンセンサス部位、およびＯ−結合グリコシル化の部位（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼの受容体である末端グリコシル部分、（ｃ）アルギニン、アスパラギンおよびヒスチジン、（ｄ）遊離カルボキシル基、（ｅ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｆ）セリン、スレオニンやヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｇ）フェニルアラニン、チロシンやトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｈ）グルタミンのアミド基がある。本発明に役立つ例示的な方法は、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０、ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ  ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，ｐｐ．２５９〜３０６（１９８１）に記載されている。
【０２４９】
結合の媒介に適当な酵素を使用して、ＰＥＧ被修飾糖をグリコシル化または非グリコシル化ペプチドと結合する。好ましくは、望ましい程度の修飾が実現するまでグリコシル化が進行するように、（複数の）被修飾供与糖、（複数の）酵素および（複数の）受容ペプチドの濃度を選択する。下記で論じる考察は、シアリルトランスフェラーゼとの関係で示すが、他のグリコシルトランスフェラーゼの反応にも一般に適用可能である。
【０２５０】
グリコシルトランスフェラーゼを用いて所望のオリゴ糖の構造を合成するいくつかの方法が知られ、本発明に一般に適用可能である。例示的な方法は、例えば、ＷＯ９６／３２４９１、Ｉｔｏら、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３（１９９３）、米国特許第５３５２６７０号、第５３７４５４１号、第５５４５５５３号、ならびに本願権利者が所有する米国特許第６３９９３３６号および第６４４０７０３号に記載され、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５１】
単一のグリコシルトランスフェラーゼ、またはグリコシルトランスフェラーゼの組合せを用いて本発明を実施する。例えば、シアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼの組合せを用いることができる。複数の酵素を使用する実施形態では、好ましくは酵素および基質を最初の反応混合物中で混合し、あるいは２番目の酵素反応の酵素および試薬を、最初の酵素反応が完了しまたはほぼ完了となった後に反応液に添加する。２つの酵素反応を単一の容器で順次行うことによって、中間生成種が単離される手順にわたって全体的な収率が向上する。さらに、余分な溶媒および副産物の清掃および廃棄は減る。
【０２５２】
好ましい実施形態では、第１および第２の酵素はそれぞれグリコシルトランスフェラーゼである。他の好ましい実施形態では、酵素の１つはエンドグリコシダーゼである。さらなる好ましい実施形態では、２種を超える酵素を用いて、本発明の被修飾糖タンパク質を構築する。被修飾糖をペプチドに付加する前後で、酵素を用いて任意の場所でＦＳＨペプチド上のサッカリド構造を変更する。
【０２５３】
他の実施形態では、その方法は１種または複数種のエキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼを利用する。そのグリコシダーゼは通常は突然変異体であり、それを破裂させるのではなくグリコシル結合を形成するように工学的に作製される。突然変異グリカナーゼでは通常、アミノ酸残基が活性部位の酸性アミノ酸残基に置換されている。例えば、エンドグリカナーゼがｅｎｄｏ−Ｈであるとき、置換された活性部位の残基は通常、１３０位でのＡｓｐ、１３２位でのＧｌｕまたはその組合せとなる。アミノ酸は一般にセリン、アラニン、アスパラギン、またはグルタミンに置換される。
【０２５４】
突然変異酵素は、通常はエンドグリカナーゼの加水分解工程の逆反応と類似した合成工程により反応を触媒する。これらの実施形態では、グリコシル供与分子（例えば、所望のオリゴサッカリド構造またはモノサッカリド構造）は脱離基を含み、タンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基にその供与分子を付加するとともに反応が進行する。例えば、脱離基はフッ化物などのハロゲンでよい。他の実施形態では、脱離基はＡｓｎ、またはＡｓｎ−ペプチド部分である。さらに他の実施形態では、グリコシル供与分子上のＧｌｃＮＡｃ残基を修飾する。例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基は、１，２オキサゾリン部分を含んでよい。
【０２５５】
好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートの生成に利用する各酵素は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度、ならびに温度、時間やｐＨ値などの反応条件に従って変わる。予め選択された基質濃度および反応条件下で所与の酵素について触媒量を決定する手段は、当業者に周知である。
【０２５６】
上記の方法を実施する温度は、凍結するよりわずかに高い温度から、最も感受性のある酵素が変性する温度までの範囲でよい。好ましい温度範囲は、約０℃〜約５５℃であり、より好ましくは約２０℃〜約３７℃である。他の例示的な実施形態では、高熱性の酵素を使用して、高い温度で本方法の１つまたは複数のメンバーを行う。
【０２５７】
反応混合物を受容体のグリコシル化に十分な時間維持し、それによって所望のコンジュゲートが形成される。一部のコンジュゲートはしばしば数時間後に検出することができ、２４時間以内に回収可能な量が通常得られる。当業者なら、反応の速度がいくつかの変動因子（例えば、酵素濃度、供与体濃度、受容体濃度、温度、溶媒体積）に依存し、それらは選択された系に対して最適化されることを理解する。
【０２５８】
本発明は、修飾されたペプチドの産業規模での生成をも提供する。本明細書において、産業規模では一般に完成された精製コンジュゲートを少なくとも１ｇ生成する。
【０２５９】
下記の論述では、グリコシル化されたペプチドへの修飾されたシアル酸部分の結合によって本発明を例示する。例示的な修飾されたシアル酸部分はＰＥＧで標識されている。ＰＥＧで修飾されたシアル酸およびグリコシル化されたペプチドの使用に対する下記の論述の焦点は、説明を明確にするためであり、本発明がこれら２つのパートナーの結合に限定されることを意味するものではない。当業者なら、その論述がシアル酸以外の被修飾グリコシル部分の付加にも一般に適用可能であることを理解する。さらに、その論述は、他のＰＥＧ部分、治療的部分、および生体分子を含めたＰＥＧ以外の作用物質でのグリコシル単位の修飾にも等しく適用可能である。
【０２６０】
酵素による手法を使用して、ペプチドまたは糖ペプチド上にＰＥＧ化またはＰＰＧ化された炭化水素を選択的に導入することができる。この方法は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはマスクされた反応性官能基を含む被修飾糖を利用し、それを適当なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと組み合わせる。所望の炭化水素の結合を作るグリコシルトランスフェラーゼを選択し、供与基質として被修飾糖を利用することによって、ＦＳＨペプチド骨格上に、糖ペプチドの既存の糖残基上に、またはペプチドに付加された糖残基上にＰＥＧまたはＰＰＧを直接導入することができる。
【０２６１】
シアリルトランスフェラーゼの受容体は、天然に存在する構造として、あるいは組換えにより、酵素によりまたは化学的にそこに配置されたものとして、本発明の方法により修飾されるＦＳＨペプチド上に存在する。適切な受容体には、例えば、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）などのガラクトシル受容体、および当業者に知られている他の受容体がある（例えば、Ｐａｕｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７〜５６２４（１９７８）を参照）。
【０２６２】
一実施形態では、シアリルトランスフェラーゼの受容体は、糖ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ合成後に修飾される糖ペプチド上に存在する。特許請求の範囲に係る方法を用いて、糖ペプチドのグリコシル化パターンを先に改変することなくそのような糖ペプチドをシアル化することができる。あるいは、本発明の方法を用いて、適切な受容体を含まないペプチドをシアル化することもでき、最初に、当業者に知られている方法により、受容体を含むようにＦＳＨペプチドを修飾する。例示的な実施形態では、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用によってＧａｌＮＡｃ残基を付加する。
【０２６３】
例示的な実施形態では、ガラクトシル受容体は、ＦＳＨペプチドと結合した適当な受容体、例えばＧｌｃＮＡｃとガラクトース残基を結合することによって構築される。この方法は、修飾されるＦＳＨペプチドを、適切な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｇａｌβ１，３またはＧａｌβ１，４）、および適切なガラクトシル供与体（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）を含む反応混合物とともにインキュベートする工程を含む。実質的に完了するまで反応を進行させ、あるいは、予め選択された量のガラクトース残基が付加されたときに反応を終結する。選択されたサッカリド受容体を構築する他の方法は、当業者には明らかであろう。
【０２６４】
さらに他の実施形態では、糖ペプチドと結合したオリゴ糖の全部または一部を最初に「削除」して、シアリルトランスフェラーゼの受容体、または適切な受容体を得るために１個または複数個の適当な残基を付加することができる部分を露出する。グリコシルトランスフェラーゼやエンドグリコシダーゼなどの酵素（例えば、米国特許第５７１６８１２号を参照）は、結合および削除反応に有用である。
【０２６５】
下記の論述では、ＰＥＧ部分が結合した被修飾糖の使用によって本発明による方法を例示する。その論述の焦点は、説明を明確にするためである。当業者なら、その論述が、被修飾糖が治療的部分、生体分子などを有する実施形態にも等しく関係することを理解するであろう。
【０２６６】
炭化水素残基を「削除」した後に被修飾糖を付加する本発明の例示的な実施形態では、高次のマンノースを切断して、元の二分岐構造にする。ＰＥＧ部分を有する被修飾糖は、「切断」によって露出された１個または複数個の糖残基と結合する。一例では、ＰＥＧ部分と結合したＧｌｃＮＡｃ部分を介してＰＥＧ部分を付加する。被修飾ＧｌｃＮＡｃは、二分岐構造の末端マンノース残基の一方または両方と結合する。あるいは、修飾されていないＧｌｃＮＡｃをその分枝種の末端の一方または両方と結合することもできる。
【０２６７】
他の例示的な実施形態では、末端マンノース残基上に付加されたＧｌｃＮＡｃ残基と結合したガラクトース残基を有する被修飾糖を介して、ＰＥＧ部分を二分岐構造の末端マンノース残基の一方または両方に付加する。あるいは、修飾されていないＧａｌを、末端ＧｌｃＮＡｃ残基の一方または両方に付加することもできる。
【０２６８】
さらなる例では、修飾されたシアル酸を用いて、Ｇａｌ残基上にＰＥＧ部分を付加する。
【０２６９】
他の例示的な実施形態では、高次マンノース構造を「切断」して、二分岐構造が分岐しているマンノースにする。一例では、ポリマーで修飾されたＧｌｃＮＡｃを介してＰＥＧ部分を付加する。あるいは、修飾されていないＧｌｃＮＡｃをマンノースに付加し、その後ＰＥＧ部分が結合したＧａｌを付加する。さらに他の実施形態では、修飾されていないＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ残基を順次マンノースに付加し、その後ＰＥＧ部分で修飾されたシアル酸部分を付加する。
【０２７０】
さらなる例示的な実施形態では、高次マンノースを「切断」して、最初のマンノースが結合したＧｌｃＮＡｃにする。ＰＥＧ部分を有するＧａｌ残基とＧｌｃＮＡｃを結合する。あるいは、修飾されていないＧａｌをＧｌｃＮＡｃに付加し、その後水溶性の糖で修飾されたシアル酸を付加する。さらなる例では、末端ＧｌｃＮＡｃをＧａｌと結合し、その後ＰＥＧ部分を有する被修飾フコースでそのＧｌｃＮＡｃをフコシル化する。
【０２７１】
高次マンノースを切断して、ペプチドのＡｓｎと結合した最初のＧｌｃＮＡｃにすることもできる。一例では、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃを、水溶性ポリマーを有するＧｌｃＮＡｃと結合する。他の例では、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃを、水溶性ポリマーを有するＧａｌで修飾する。さらなる実施形態では、ＧｌｃＮＡｃをＧａｌで修飾し、その後ＰＥＧ部分で修飾されたシアル酸のＧａｌと結合する。
【０２７２】
本願権利者が所有する米国特許出願公開第２００４０１３２６４０号、第２００４００６３９１１号、第２００４０１３７５５７号、米国特許出願第１０／３６９９７９号、第１０／４１０９１３号、第１０／３６０７７０号、第１０／４１０９４５号、およびＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６３に他の例示的な実施形態が示され、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７３】
上記に示した例から、本明細書で示す方法の効力が説明される。本明細書に記載の方法を用いて、実質的にどんな所望される構造の炭化水素残基も「切断」し構築することが可能である。上記に示したように炭化水素部分の末端に被修飾糖を付加することもでき、あるいはそれはペプチド中心と炭化水素の末端の間に介在することもできる。
【０２７４】
例示的な実施形態では、シアリダーゼを用いてＦＳＨ糖ペプチドから既存のシアル酸を除去し、それによってすべてのまたはほとんどの潜在するガラクトシル残基の覆いが外される。あるいは、ガラクトース残基、またはガラクトース単位が末端にあるオリゴ糖残基でペプチドまたは糖ペプチドを標識する。ガラクトース残基が露出または付加された後、適当なシアリルトランスフェラーゼを用いて修飾されたシアル酸を付加する。スキーム１にこの手法の概要を示す。
【０２７５】
【化３８】
2007515410.tif 000042
【０２７６】
スキーム２に概要を示すさらなる手法では、マスクされた反応性官能基がシアル酸上に存在する。マスクされた反応性基は、好ましくは、ＦＳＨと修飾されたシアル酸の結合に使用する条件により影響を及ぼされない。修飾されたシアル酸がＦＳＨペプチドと共有結合した後、その覆いは除去され、ＦＳＨペプチドがＰＥＧなどの作用物質と結合する。作用物質は、被修飾糖残基上の覆いが外された反応性基との反応により、特異的な形でペプチドと結合する。
【０２７７】
【化３９】
2007515410.tif 000043
【０２７８】
糖ペプチドのオリゴ糖側鎖の末端の糖に応じて、本明細書で示すどんな被修飾糖もその適当なグリコシルトランスフェラーゼとともに使用することができる（表１）。上記で論じたように、ＰＥＧ化構造の導入に必要とする糖ペプチドの末端の糖は、発現の間に自然に導入することもでき、あるいは適当な（複数の）グリコシダーゼ、（複数の）グリコシルトランスフェラーゼ、または（複数の）グリコシダーゼと（複数の）グリコシルトランスフェラーゼの混合物を用いて発現後に生成することもできる。
【０２７９】
【表１】
2007515410.tif 000044
【０２８０】
さらなる例示的な実施形態では、ＵＤＰ−ガラクトース−ＰＥＧはウシ乳β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと反応し、それによって被修飾ガラクトースが適当な末端Ｎ−アセチルグルコサミン構造へと転移する。哺乳動物、昆虫、植物や真菌などの発現系で行うことができるように、糖ペプチド上の末端ＧｌｃＮＡｃ残基を発現の間に生成することができるが、必要に応じてシアリダーゼおよび／またはグリコシダーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼで糖ペプチドを処理することにより、それを生成することもできる。
【０２８１】
他の例示的な実施形態では、ＧＮＴ１〜５などのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを利用して、ＰＥＧ化ＧｌｃＮを糖ペプチド上の末端マンノース残基に転移する。さらなる例示的な実施形態では、糖ペプチドからＮ−結合グリカン構造および／またはＯ−結合グリカン構造を酵素により除去して、アミノ酸または末端グリコシル残基を露出し、その後被修飾糖とそれを結合する。例えば、エンドグリカナーゼを使用して、糖ペプチドのＮ−結合構造を除去して、糖ペプチド上のＧｌｃＮＡｃ結合Ａｓｎである末端ＧｌｃＮＡｃを露出する。ＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧおよび適当なガラクトシルトランスフェラーゼを使用して、露出したＧｌｃＮＡｃ上にＰＥＧ−ガラクトース官能基を導入する。
【０２８２】
代替の実施形態では、糖残基をペプチド骨格に転移することが知られているグリコシルトランスフェラーゼを用いて被修飾糖を直接ＦＳＨペプチドに付加する。この例示的な実施形態をスキーム３に示す。本発明の実施に有用な例示的なグリコシルトランスフェラーゼには、それだけに限らないが、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ１〜１４）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼなどがある。この手法を使用すると、炭化水素を欠くペプチド上に、あるいは既存の糖ペプチド上に被修飾糖を直接付加することが可能となる。どちらの場合でも、被修飾糖の付加は、グリコシルトランスフェラーゼの基質特異性によって定義される、ペプチド骨格上の特定の位置で行われ、化学的方法を使用した、タンパク質のペプチド骨格の修飾の間に行われる無作為な形では行われない。ポリペプチド鎖中に適当なアミノ酸配列を工学的に作製することにより、グリコシルトランスフェラーゼ基質ペプチド配列を欠くタンパク質または糖ペプチド中に一連の作用物質を導入することができる。
【０２８３】
【化４０】
2007515410.tif 000045
【０２８４】
上記に示した例示的な各実施形態では、被修飾糖がペプチドと結合した後に、１回または複数回のさらなる化学的または酵素的修飾工程を利用することができる。例示的な実施形態では、酵素（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）を使用して、グリコシル単位（例えば、フコース）を、ＦＳＨペプチドと結合した末端被修飾糖上に付加する。他の例では、酵素反応を利用して、被修飾糖が結合できない部位に「ふたをする」。あるいは、化学反応を利用して、結合した被修飾糖の構造を変更する。例えば、結合した被修飾糖を、被修飾糖が結合したペプチド構成成分との結合を安定化または不安定化する作用物質と反応させる。他の例では、ペプチドとの結合後、被修飾糖の構成成分を脱保護する。当業者なら、被修飾糖がＦＳＨペプチドと結合した後の段階で本発明の方法に有用である一連の酵素的化学的手順が存在することを理解するであろう。被修飾糖とペプチドのコンジュゲートのさらなる生成は、本発明の範囲内にある。
【０２８５】
酵素
アシルと結合したコンジュゲートの形成との関連で上記に論じた酵素に加えて、他の酵素を利用する方法により、グリコシル化パターンのコンジュゲートおよび開始基質（例えば、ペプチド、脂質）を生成し、切断し、またはその他の形で修飾することができる。糖供与体を受容体に転移する酵素を用いてペプチドおよび脂質を再構築する方法は、２００３年４月１７日公開のＤｅＦｒｅｅｓ、ＷＯ０３／０３１４６４Ａ２に極めて詳細に論じられている。本方法に役立つ選択した酵素の簡潔な概要を以下に示す。
【０２８６】
グリコシルトランスフェラーゼ
グリコシルトランスフェラーゼは、タンパク質、糖ペプチド、脂質または糖脂質への、あるいは成長中の（ｇｒｏｗｉｎｇ）オリゴ糖の非還元末端への活性化糖（供与ＮＤＰ−またはＮＭＰ−糖）の段階的な付加を触媒する。トランスフェラーゼを介してＮ−結合糖ペプチドを合成し、脂質結合オリゴ糖供与体Ｄｏｌ−ＰＰ−ＮＡＧ２Ｇｌｃ３Ｍａｎ９を一括して転移しその後その中心を削除する。この場合、「中心」のサッカリドの性質は、それに続く結合物と多少異なる。非常に多数のグリコシルトランスフェラーゼが当技術分野で知られている。
【０２８７】
本発明で使用するグリコシルトランスフェラーゼは、それが被修飾糖を糖供与体として利用できる限りどんなものでもよい。そのような酵素の例としては、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルクロノニルトランスフェラーゼなど、Ｌｅｌｏｉｒの経路のグリコシルトランスフェラーゼがある。
【０２８８】
グリコシルトランスフェラーゼ反応が関与する、酵素によるサッカリド合成では、グリコシルトランスフェラーゼをクローン化し、または任意の供給源から単離することができる。そのポリヌクレオチド配列と同様に、多数のクローン化されたグリコシルトランスフェラーゼが知られている。例えば、Ｔｈｅ  ＷＷＷ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｉ．ｃｏ．ｕｋ／ＴＧＮ／ｇｔ  ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍ）を参照されたい。グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列、およびアミノ酸配列から推定できるグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、ジェンバンク、スイスプロット、ＥＭＢＬ他を含めた公的に利用可能な様々なデータベース中でも見つけられる。
【０２８９】
本発明の方法で使用することができるグリコシルトランスフェラーゼには、それだけに限らないが、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼがある。適切なグリコシルトランスフェラーゼには、真核生物ならびに原核生物から得られるものがある。
【０２９０】
化学合成により、適当な細胞または細胞系統培養物に由来するｍＲＮＡの逆転写物のスクリーニングにより、適当な細胞に由来するゲノムライブラリーのスクリーニングにより、またはこれらの手順の組合せにより、グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを得ることができる。グリコシルトランスフェラーゼの遺伝子配列から生成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングを実施することができる。蛍光基、放射性原子や化学発光基などの検出可能な基で、既知の手順に従ってプローブを標識し、従来のハイブリダイゼーションアッセイで使用することができる。代替方法では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の手順を、グリコシルトランスフェラーゼの遺伝子配列から作製されたＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーとともに使用することによってグリコシルトランスフェラーゼの遺伝子配列を得ることができる。例えば、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４６８３１９５号、およびＭｕｌｌｉｓの米国特許第４６８３２０２号を参照されたい。
【０２９１】
グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換された宿主細胞中でグリコシルトランスフェラーゼを合成することができる。ベクターを使用して、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを増幅し、かつ／またはグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを発現させる。発現ベクターとは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を、適切な宿主中でグリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現を実施することができる適切な調節配列に作動的に連結した複製可能なＤＮＡ構築物である。そのような調節配列の必要性は、選択した宿主および選択した形質転換法に応じて様々である。一般に、調節配列は、転写プロモーター、転写を調節する任意選択のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を調節する配列を含む。増幅ベクターは、発現調節ドメインを必要としない。必要なものは、通常は複製起点によって付与される宿主中での複製能、および形質転換体の認識を促進する選択遺伝子だけである。
【０２９２】
例示的な実施形態では、本発明は原核生物の酵素を利用する。そのようなグリコシルトランスフェラーゼには、多数のグラム陰性細菌によって産生されるリポオリゴ糖（ＬＯＳ）の合成に関与する酵素がある（Ｐｒｅｓｔｏｎら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２３（３）：１３９〜１８０（１９９６））。そのような酵素には、それだけに限らないが、大腸菌やネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの種のｒｆａオペロンのタンパク質があり、それにはβ１，６ガラクトシルトランスフェラーゼおよびβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ＥＭＢＬアクセッション番号Ｍ８０５９９およびＭ８６９３５（大腸菌）；ＥＭＢＬアクセッション番号Ｓ５６３６１（ネズミチフス菌）を参照、）、グルコシルトランスフェラーゼ（スイスプロットアクセッション番号Ｐ２５７４０（大腸菌））、β１，２−グルコシルトランスフェラーゼ（ｒｆａＪ）（スイスプロットアクセッション番号Ｐ２７１２９（大腸菌）およびスイスプロットアクセッション番号Ｐ１９８１７（ネズミチフス菌））、およびβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｒｆａＫ）（ＥＭＢＬアクセッション番号Ｕ０００３９（大腸菌））がある。アミノ酸配列が知られている他のグリコシルトランスフェラーゼには、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌、ネズミチフス菌、サルモネラエンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、エルシニアエンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、マイコバクテリウムレプロサム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒｏｓｕｍ）などの生物中で特徴付けられているｒｆａＢなどのオペロンによってコードされるもの、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のｒｈ１オペロンがある。
【０２９３】
粘膜の病原体である淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｎｏｒｈｏｅａｅ）および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬＯＳ中で同定された、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｄ−ガラクトシル−β―１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−β−１，３−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコース、およびＰｋ血液型のトリサッカリド配列のＤ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコースを含む構造の形成に関与するグリコシルトランスフェラーゼも本発明での使用に適する（Ｓｃｈｏｌｔｅｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２３６〜２４３（１９９４））。これらの構造の生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼをコードする髄膜炎菌および淋菌の遺伝子は、髄膜炎菌の免疫型Ｌ３およびＬ１（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：７２９〜７４０（１９９５））および淋菌の突然変異体Ｆ６２（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２１８１〜２１９０（１９９４））から同定されている。髄膜炎菌では、ｌｇｔＡ、ｌｇｔＢおよびｌｇＥの３種の遺伝子からなる座位は、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース鎖における最後の糖３個の付加に必要なグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９１６６〜７３（１９９６））。最近、ｌｇｔＢおよびｌｇｔＡ遺伝子産物の酵素活性が実証され、提唱されていたそのグリコシルトランスフェラーゼ機能についての最初の直接的な証拠が提供されている（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４５）：２８２７１〜２７６（１９９６））。淋菌では、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース構造の末端ガラクトースの３位にβ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃを付加するｌｇｔＤ、および切断ＬＯＳのラクトース成分に末端α−Ｄ−Ｇａｌを付加し、それによってＰｋ血液型抗原構造を作り出すｌｇｔＣという２種のさらなる遺伝子がある（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ（１９９４）、上記）。髄膜炎菌では、独立した免疫型Ｌ１もＰｋ血液型抗原を発現し、ｌｇｔＣ遺伝子を有することが示されている（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、（１９９５）、上記）。ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）グリコシルトランスフェラーゼおよびその関連遺伝子は、米国特許第５５４５５５３号（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ）にも記載されている。ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）由来のα１，２−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子も特徴付けられている（Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１３４９〜２１３５６（１９９７））。カンピロバクタージュジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）のグリコシルトランスフェラーゼも本発明に役立つ（例えば、ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／〜Ｐｅｄｒｏ／ＣＡＺＹ／ｇｔｆ＿４２．ｈｔｍｌを参照）。
【０２９４】
フコシルトランスフェラーゼ
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用するグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは、当業者に知られている。例示的なフコシルトランスフェラーゼには、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースから受容糖のヒドロキシ位に転移する酵素がある。非ヌクレオチド糖を受容体に転移するフコシルトランスフェラーゼも、本発明に役立つ。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、受容糖は、例えば、オリゴ糖グリコシド中のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ基中のＧｌｃＮＡｃである。この反応に適したフコシルトランスフェラーゼには、ヒト乳から最初に特徴付けられたＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ１−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩ  Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）がある（Ｐａｌｃｉｃら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９０：１〜１１（１９８９）；Ｐｒｉｅｅｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６〜１０４６３（１９８１）；およびＮｕｎｅｚら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６〜２０９５（１９８１）を参照）、およびヒト血清中で認められるＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ−αフコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ）がある。ＦＴＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）のシアリルα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮＡｃβフコシルトランスフェラーゼも特徴付けられている。組換え型のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼも特徴付けられている（Ｄｕｍａｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １：４２５〜４２８（１９９１）およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：１２８８〜１３０３（１９９０）を参照）。他の例示的なフコシルトランスフェラーゼには、例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６９）がある。酵素によるフコシル化は、Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９〜１７６（１９９０）または米国特許第５３７４６５５号に記載の方法によって実施することができる。フコシルトランスフェラーゼの生成に使用する細胞も、ＧＤＰ−フコースを合成する酵素の系を含む。
【０２９６】
ガラクトシルトランスフェラーゼ
他の群の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼである。例示的なガラクトシルトランスフェラーゼには、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．１５１、例えば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３）およびＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：２２９〜２３３（１９９０）を参照、ウシ由来（ジェンバンクｊ０４９８９、Ｊｏｚｉａｓｓｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０〜１４２９７（１９８９））、ネズミ由来（ジェンバンクｍ２６９２５；Ｌａｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２２７〜８２３１（１９８９））、ブタ由来（ジェンバンクＬ３６１５２；Ｓｔｒａｈａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１０１〜１０５（１９９５）））がある。他の適切なα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液型Ｂ抗原の合成に関与するものである（ＥＣ  ２．４．１．３７、Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１４６〜１１５１（１９９０）（ヒト））。さらなる例示的なガラクトシルトランスフェラーゼは中心Ｇａｌ−Ｔ１である。
【０２９７】
β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼも本発明の方法での使用に適しており、それには、例えば、ＥＣ  ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃシンターゼ）およびＥＣ  ２．４．１．２２（ラクトースシンターゼ）（ウシ由来（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１〜２１７（１９８９））、ヒト由来（Ｍａｓｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：６５７〜６６３（１９８８））、ネズミ由来（Ｎａｋａｚａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：１６５〜１６８（１９８８））、ならびにＥ．Ｃ．２．４．１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．４５、Ｓｔａｈｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３８：２３４〜２４２（１９９４））が含まれる。他の適切なガラクトシルトランスフェラーゼには、例えば、α１，２ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）由来、Ｃｈａｐｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５：５１９〜５２８（１９９４））がある。
【０２９８】
シアリルトランスフェラーゼ
シアリルトランスフェラーゼは別の型のグリコシルトランスフェラーゼであり、本発明の組換え細胞および反応混合物に有用である。組換えシアリルトランスフェラーゼを産生する細胞はＣＭＰ−シアル酸も産生するが、これはシアリルトランスフェラーゼのシアル酸供与体である。本発明での使用に適したシアリルトランスフェラーゼの例として、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（例えば、ラットまたはヒトＳＴ３ＧａｌＩＩＩ）、ＳＴ３ＧａｌＩＶ、ＳＴ３ＧａｌＩ、ＳＴ３ＧａｌＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＩ、ＳＴ３ＧａｌＶ、ＳＴ６ＧａｌＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩ、およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩがある（本明細書で使用するシアリルトランスフェラーゼの用語体系は、Ｔｓｕｊｉら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：ｖ〜ｘｉｖ（１９９６）に記載の通りである）。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．６）と呼ばれる例示的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、Ｇａｌβ１→３Ｇｌｃジサッカリドまたはグリコシドの非還元末端Ｇａｌにシアル酸を転移する。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５（１９８２）およびＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２）を参照されたい。他の例示的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．４）は、ジサッカリドまたはグリコシドの非還元末端Ｇａｌにシアル酸を転移する。Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：４４４４（１９７９）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１００４（１９９２）を参照されたい。さらなる例示的な酵素には、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃα−２，６シアリルトランスフェラーゼ（Ｋｕｒｏｓａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５〜３８１（１９９４）を参照）がある。
【０２９９】
好ましくは、糖ペプチドの炭化水素のグリコシル化では、シアリルトランスフェラーゼは、完全にシアル化された炭化水素構造上の末端シアル酸の基礎をなす最も一般的な最後から２番目の配列である、配列Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−にシアル酸を転移することができる（表２を参照）。
【０３００】
【表２】
2007515410.tif 000046
１）Ｇｏｏｃｈｅｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３４７〜１３５５
（１９９１）
２）Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：１０４〜１１０（１９９６）
３）Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２７１〜２８２７６
（１９９６）
【０３０１】
特許請求の範囲に係る方法に有用なシアリルトランスフェラーゼの例は、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩであり、それはα（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．６）とも呼ばれる。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアル酸の転移を触媒し（例えば、Ｗｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２）；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９９１）を参照）、糖ペプチド中のアスパラギン結合オリゴ糖をシアル化する役割を果たす。シアル酸はＧａｌと結合し、２つの糖の間にα−結合を形成する。その糖の間の結合（Ｂｏｎｄｉｎｇ（ｌｉｎｋａｇｅ））は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位の間にある。ラット肝からこの特定の酵素を単離することができる（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５（１９８２））。ヒトｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２〜２２７８７；Ｋｉｔａｇａｗａ＆Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４〜１４０１）およびゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１〜９３８）ＤＮＡ配列が知られており、組換え発現によってこの酵素の生成が促進される。好ましい実施形態では、特許請求の範囲に係るシアル化の方法は、ラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩを使用する。
【０３０２】
本発明に役立つ他の例示的なシアリルトランスフェラーゼには、α（２，３）を含めて、カンピロバクタージュジュニから単離されたものが含まれる。例えば、ＷＯ９９／４９０５１を参照されたい。
【０３０３】
表２に列挙した他のシアリルトランスフェラーゼも、商業的に重要な糖ペプチドの、経済的であり効率のよい大規模なシアル化の方法に有用である。これらの他の酵素の有用性を見出す簡単な試験として、様々な量の各酵素（タンパク質１ｍｇ当たり１〜１００ｍＵ）を、アシアロ−α１ＡＧＰ（１〜１０ｍｇ／ｍｌ）と反応させて、ウシＳＴ６ＧａｌＩ、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩまたはその両方のシアリルトランスフェラーゼと比較した、対象とするシアリルトランスフェラーゼの糖ペプチドシアル化能を比較する。あるいは、ペプチド骨格から酵素により放出された他の糖ペプチドもしくは糖ペプチド、またはＮ−結合オリゴ糖を、この評価でアシアロ−α１ＡＧＰの代わりに使用することができる。ＳＴ６ＧａｌＩより効率よく糖ペプチドのＮ−結合オリゴ糖をシアル化できるシアリルトランスフェラーゼは、実用的な大規模ペプチドシアル化の方法に有用である。
【０３０４】
ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ
Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、本発明の実施に、特にペプチドのＯ−結合グリコシル化部位のアミノ酸へのＧａｌＮＡｃ部分の結合に役立つ。適切なＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼには、それだけに限らないが、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２〜１２０８９（１９９２）およびＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４））およびポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３））がある。
【０３０５】
遺伝子工学技術によるクローン化遺伝子からの酵素ＧａｌＮＡｃＴＩ〜ＸＸなどのタンパク質の産生は周知である。例えば、米国特許第４７６１３７１号を参照されたい。１つの方法では、十分な試料を収集し、次いでＮ末端の配列決定により酵素のアミノ酸配列を決定する。次いでこの情報を使用して全長（膜結合型）トランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡクローンを単離し、昆虫細胞系統Ｓｆ９で発現させると、完全に活性な酵素が合成される。次いで、１６種の異なるタンパク質で既知のグリコシル化部位の周囲にあるアミノ酸の半定量分析を用いて酵素の受容体特異性を決定し、その後合成ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのグリコシル化の検討を行う。この作業により、特定のアミノ酸残基が、グリコシル化されたペプチドセグメント中で過剰提示され、グリコシル化されたセリンおよびスレオニン残基の周囲にある特定の位置の残基が、受容体の効率に対して他のアミノ酸残基より著明に影響する可能性があることが示されている。
【０３０６】
細胞結合型グリコシルトランスフェラーゼ
他の実施形態では、本発明の方法で利用する酵素は細胞結合型グリコシルトランスフェラーゼである。多数の可溶性グリコシルトランスフェラーゼが知られている（例えば、米国特許第５０３２５１９号）が、グリコシルトランスフェラーゼは一般に、細胞と結合しているときは膜結合型である。これまでに研究されている膜結合型酵素の多くは、内在タンパク質であると考えられている。すなわち、それらは超音波処理では膜から放出されず、可溶化用の界面活性剤を必要とする。表面グリコシルトランスフェラーゼは、脊椎動物および無脊椎動物の細胞表面上で同定され、これらの表面トランスフェラーゼが生理的条件下で触媒活性を維持することも認識されている。しかし、細胞表面グリコシルトランスフェラーゼでより認識されている機能は、細胞間の認識についてである（Ｒｏｔｈ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ  ｔｏ  ＳＵＰＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＨＥＮＯＭＥＮＡ、１９９０）。
【０３０７】
細胞によって発現されたグリコシルトランスフェラーゼを改変する方法が開発されている。例えば、Ｌａｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２２７〜８２３１（１９８９）では、細胞表面オリゴ糖構造およびその同族のグリコシルトランスフェラーゼの発現を決定するクローン化されたｃＤＮＡ配列を単離する遺伝的手法が報告されている。ＵＤＰ−ガラクトース：β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現することが知られているネズミの細胞系統から単離したｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。次いでトランスフェクトした細胞を培養し、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ活性があるかどうかアッセイを行った。
【０３０８】
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２７１３〜２７１７（１９９２）では、大腸菌の外部表面にβ−ラクタマーゼを固定する方法が開示されている。（ｉ）外膜タンパク質のシグナル配列、（ｉｉ）外膜タンパク質の膜貫通部分、および（ｉｉｉ）完全な成熟β−ラクタマーゼ配列からなる３つの部分の融合体を作製すると、活性な表面結合型β−ラクタマーゼ分子が得られる。しかし、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏの方法は、原核細胞の系だけに限定され、著者らも認識しているように、適切に機能するのに完全な３つの部分の融合体を必要とする。
【０３０９】
スルホトランスフェラーゼ
本発明はまた、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、カラゲネン（ｃａｒｒａｇｅｎｅｎ）などの硫酸化ポリサッカリド、およびその関連化合物を含めた硫酸化分子を含むペプチドを生成する方法をも提供する。適切なスルホトランスフェラーゼには、例えば、コンドロイチン−６−スルホトランスフェラーゼ（ニワトリｃＤＮＡがＦｕｋｕｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１８５７５〜１８５８０（１９９５）に記載されている；ジェンバンクアクセッション番号Ｄ４９９１５）、グリコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ１（Ｄｉｘｏｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６：２３９〜２４１（１９９５）；ＵＬ１８９１８）、およびグリコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（ネズミｃＤＮＡがＯｒｅｌｌａｎａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２７０〜２２７６（１９９４）およびＥｒｉｋｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４３８〜１０４４３（１９９４）に記載されている；ヒトｃＤＮＡがジェンバンクアクセッション番号Ｕ２３０４に記載されている）がある。
【０３１０】
グリコシダーゼ
本発明はまた、野生型および突然変異のグリコシダーゼの使用をも包含する。突然変異β−ガラクトシダーゼ酵素は、ガラクトシル受容分子とα−グリコシルフッ化物の結合を介してジサッカリドの形成を触媒することが示されている（Ｗｉｔｈｅｒｓ、米国特許第６２８４４９４号；２００１年９月４日発行）。本発明に役立つ他のグリコシダーゼには、例えば、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−アセチルグルコサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−キシロシダーゼ、β−フコシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼ、α−キシロシダーゼ、α−フコシダーゼ、およびノイラミニダーゼ／シアリダーゼがある。
【０３１１】
固定化酵素
本発明はまた、固体および／または可溶性の支持体上に固定化された酵素の使用をも提供する。例示的な実施形態では、本発明の方法に従って完全なグリコシルリンカーを介してＰＥＧと結合したグリコシルトランスフェラーゼが提供される。ＰＥＧ−リンカー−酵素コンジュゲートは固体支持体に場合により結合している。本発明の方法において固体で支持された酵素を使用すると、反応混合物の用意、および反応産物の精製が単純化され、酵素の回収も容易に行うことができる。本発明の方法ではグリコシルトランスフェラーゼコンジュゲートを利用する。酵素と支持体の他の組合せは、当業者には明らかであろう。
【０３１２】
融合タンパク質
他の例示的な実施形態では、本発明の方法は、所望の糖ペプチドコンジュゲートの合成に関与する複数の酵素活性を有する融合タンパク質を利用する。融合ポリペプチドは、例えば、補助酵素の触媒活性ドメインと結合したグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインからなるものでもよい。補助酵素の触媒ドメインは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼの供与体であるヌクレオチド糖の形成における工程を触媒し、またはグリコシルトランスフェラーゼのサイクルに関与する反応を触媒する。例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを、ヌクレオチド糖合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドとインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で結合することができる。次いで、得られた融合タンパク質は、ヌクレオチド糖の合成だけでなく、受容分子への糖部分の転移をも触媒することができる。融合タンパク質は、１個の発現可能なヌクレオチド配列と結合した２種以上のサイクル酵素（ｃｙｃｌｅ  ｅｎｚｙｍｅ）でもよい。他の実施形態では、融合タンパク質は、２種以上のグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインを含む。例えば、米国特許第５６４１６６８号を参照されたい。本発明の修飾された糖ペプチドは、種々の適切な融合タンパク質を利用して容易に設計し作製することができる（例えば、１９９９年６月２４日にＷＯ９９／３１２２４として公開されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９８／０１１８０を参照）。
【０３１３】
被修飾糖の調製
一般に、糖部分または糖部分リンカーカセット、およびＰＥＧまたはＰＥＧリンカーカセット基を反応基の使用により一緒に結合し、それらは通常、結合プロセスによって新たな有機官能基または非反応性種に変換される。糖の（複数の）反応性官能基は、糖部分上の任意の位置にある。本発明の実施に有用な反応性基および反応の種類は一般に、生体結合化学の分野で周知のものである。反応性糖部分で利用可能な、現在好ましい種類の反応は、比較的穏やかな条件下で進行するものである。これには、求核置換（例えば、アシルハロゲン化物、活性エステルとアミンおよびアルコールの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子の多重結合への付加（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ反応、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加）があるが、それだけに限らない。これらの、また他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ、ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９８５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９６；およびＦｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、第１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．、１９８２中に論じられている。
【０３１４】
糖核（ｓｕｇａｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ）または修飾基から懸垂している有用な反応性官能基には、それだけに限らないが、
（ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシゼンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、および芳香族エステルを含むがそれだけに限らないカルボキシル基およびその様々な誘導体、
（ｂ）例えば、エステル、エーテル、アルデヒドなどに転換することができるヒドロキシル基、
（ｃ）例えばアミン、カルボン酸陰イオン、チオール陰イオン、カルバニオンやアルコキシドイオンなどの求核基とハロゲン化物を後に置換することができ、それによってハロゲン原子の官能基で新たな基の共有結合が生じるハロアルキル基、
（ｄ）例えばマレイミド基などの、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応に関与することができる求ジエン基、
（ｅ）例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンやオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、またはＧｒｉｇｎａｒｄ付加やアルキルリチウム付加などの機構を介して引き続き誘導体化が可能であるようなアルデヒドまたはケトン基、
（ｆ）例えば、アミンと引き続き反応してスルホンアミドを形成するためのハロゲン化スルホニル基、
（ｇ）例えば、ジスルフィドに転換することもでき、アシルハロゲン化物と反応することもできるチオール基、
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化または酸化することができるアミンまたはスルフヒドリル基、
（ｉ）例えば、環付加、アシル化、Ｍｉｃｈａｅｌ付加などを受けることができるアルケン、ならびに
（ｊ）例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシドがある。
【０３１５】
反応性官能基は、反応性糖核または修飾基の構築に必要な反応に関与または干渉しないように選択することができる。あるいは、保護基の存在により、反応への関与から反応性官能基を保護することもできる。当業者なら、選択した一連の反応条件に干渉しないように特定の官能基を保護する方法を理解している。有用な保護基の例には、例えばＧｒｅｅｎｅら、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９１を参照されたい。
【０３１６】
下記の論述で、本発明の実施に有用な被修飾糖の特定の例をいくつか示す。例示的な実施形態では、修飾基が結合する糖核としてシアル酸誘導体を利用する。シアル酸誘導体に対する論述の焦点は、説明を明確にするために過ぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。当業者なら、一例としてシアル酸を使用して示すものと類似した形で様々な他の糖部分を活性化および誘導体化できることを理解するであろう。例えば、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびフコースを修飾して少量の糖基質にするのに多数の方法が利用可能であり、それらの方法は、当技術分野で認められる方法によって容易に改変される。例えば、Ｅｌｈａｌａｂｉら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：９３（１９９９）；およびＳｃｈａｆｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：２４（２０００）を参照されたい。
【０３１７】
例示的な実施形態では、本発明の方法によって修飾されるＦＳＨペプチドは、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）中で、またはトランスジェニック動物中で産生される糖ペプチドであり、したがって、不完全にシアリル化されたＮおよび／またはＯ−結合オリゴ糖鎖を含む。シアル酸を欠き、末端ガラクトース残基を含む糖ペプチドのオリゴ糖鎖を、修飾されたシアル酸で、ＰＥＧ化、ＰＰＧ化またはその他の形で修飾することができる。
【０３１８】
スキーム４では、アミノグリコシド１は、保護されたアミノ酸（例えば、グリシン）誘導体の活性エステルで処理され、糖アミン残基が、対応する保護されたアミノ酸アミド付加物に転換される。その付加物をアルドラーゼで処理すると、α−ヒドロキシカルボン酸塩２が形成される。化合物２を、ＣＭＰ−ＳＡシンテターゼの作用により対応するＣＭＰ誘導体に転換し、その後ＣＭＰ誘導体の接触水素化を行って化合物３を生成する。グリシン付加物の形成を介して導入されたアミンを、化合物３と活性化ＰＥＧまたはＰＰＧ誘導体（例えば、ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ、ＰＥＧ−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ｐ−ニトロフェニル）の反応によりＰＥＧが結合する場所として利用し、それによって、それぞれ４や５などの種が生成される。
【０３１９】
【化４１】
2007515410.tif 000047
【０３２０】
表３は、ＰＥＧ部分で誘導体化された糖１リン酸の代表例を示すものである。表３の特定の化合物は、スキーム４の方法によって調製される。他の誘導体は、当技術分野で認められる方法によって調製される。例えば、Ｋｅｐｐｌｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１：１１Ｒ（２００１）；およびＣｈａｒｔｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１０４９（２０００）を参照されたい。他のアミン反応性ＰＥＧおよびＰＰＧ類似体は市販され、または当業者に容易に利用できる方法によって調製することもできる。
【０３２１】
【表３】
2007515410.tif 000048
【０３２２】
本発明の実施に役立つ被修飾糖のリン酸塩は、上記に示したものだけでなく他の位置でも置換することができる。現在のところ好ましいシアル酸の置換体を下記の式に示す：
【０３２３】
【化４２】
2007515410.tif 000049
（式中、Ｘは結合基であり、好ましくは−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｓ、ＣＨ２−、および−Ｎ（Ｒ）２から選択され、各Ｒは、Ｒ１〜Ｒ５からそれぞれ独立に選択されるメンバーである）。記号Ｙ、Ｚ、ＡおよびＢはそれぞれ、Ｘの正体について上記に示す基から選択される基を表す。Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＡおよびＢはそれぞれ独立に選択され、したがって、それらは同じものでもよく、あるいは異なるものでもよい。記号Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子または他の部分を表す。あるいは、これらの記号は、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子または他の部分と結合したリンカーを表す。
【０３２４】
本明細書で開示されるコンジュゲートと結合する例示的な部分には、それだけに限らないが、ＰＥＧ誘導体（例えば、アシル−ＰＥＧ、アシル−アルキル−ＰＥＧ、アルキル−アシル−ＰＥＧ、カルバモイル−ＰＥＧ、アリール−ＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（例えば、アシル−ＰＰＧ、アシル−アルキル−ＰＰＧ、アルキル−アシル−ＰＰＧ、カルバモイル−ＰＰＧ、アリール−ＰＰＧ）、治療的部分、診断用部分、マンノース−６−リン酸、ヘパリン、ヘパラン、ＳＬｅｘ、マンノース、マンノース−６−リン酸、シアリルルイス（Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ）Ｘ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、アンテナ様オリゴ糖、ペプチドなどがある。種々の修飾基をサッカリド部分と結合する方法は、当業者にとって容易に利用可能である（ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．、１９９２；ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ編、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  第６８０号、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９７；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９６；およびＤｕｎｎら編、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  第４６９号、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．１９９１）。
【０３２５】
リンカー基（架橋基）
本発明の方法で使用する被修飾糖の調製は、ＰＥＧ部分と糖残基の結合と、好ましくはグリコシルトランスフェラーゼの基質となる安定な付加物の形成とを含む。したがって、リンカー、例えばＰＥＧと糖を結合する架橋剤でＰＥＧと糖部分を反応させることにより形成されるものを使用することがしばしば好ましい。修飾基を炭化水素部分と結合するのに使用することができる例示的な二官能性化合物には、それだけに限らないが、二官能性のポリ（エチレングリコール）、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステルなどがある。炭化水素を他の分子と結合する一般的な手法は、文献中で知られている。例えば、Ｌｅｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：１８５６（１９８９）；Ｂｈａｔｉａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８：４０８（１９８９）；Ｊａｎｄａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：８８８６（１９９０）およびＢｅｄｎａｒｓｋｉら、ＷＯ９２／１８１３５を参照されたい。下記の論述では、反応性基は、新生の被修飾糖の糖部分上で良性として扱う。その論述の焦点は説明を明確にするためである。当業者なら、その論述が修飾基上の反応性基にも同様に関連することを理解するであろう。
【０３２６】
様々な試薬を使用して、分子内の化学的架橋で被修飾糖の構成成分を修飾する（架橋用の試薬および架橋の手順の総説については、Ｗｏｌｄ，Ｆ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５：６２３〜６５１、１９７２；Ｗｅｅｔａｌｌ，Ｈ．Ｈ．、およびＣｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ａ．、ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＳ  ＤＲＵＧＳ．（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ、およびＲｏｂｅｒｔｓ編）ｐｐ．３９５〜４４２、Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク、１９８１；Ｊｉ，Ｔ．Ｈ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５８０〜６０９、１９８３；Ｍａｔｔｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１６７〜１８３、１９９３を参照のこと、これらの文献はすべて参照により本明細書に組み込まれる）。好ましい架橋用試薬は、ゼロ長、ホモ二官能性、およびヘテロ二官能性の試薬に由来する。ゼロ長の架橋用試薬は、外来物質を導入せずに内在の化学基２つを直接結合する。ジスルフィド結合の形成を触媒する作用物質は、この種類に属する。他の例は、カルボキシルと第一級アミノ基の縮合を誘導して、カルボジイミド、エチルクロロホルメート、Ｗｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋ（２−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート）やカルボニルジイミダゾールなどのアミド結合を形成する試薬である。これらの化学的な試薬に加えて、酵素トランスグルタミナーゼ（グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３．２．１３）をゼロ長の架橋用試薬として使用することができる。この酵素は、タンパク質と結合したグルタミニル残基のカルボキサミド基で、通常第一級アミノ基を基質として用いてアシル転移反応を触媒する。好ましいホモおよびヘテロ二官能性の試薬は、それぞれ２個の同一のまたは異なる部位を含み、その部位はアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、または非特異的な基に反応性のものでよい。
【０３２７】
ＦＳＨコンジュゲートの精製
上記の方法によって生成された産物は、精製せずに使用することができる。しかし、その産物を回収することが通常好ましい。薄層または厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーや膜濾過など、グリコシル化サッカリドの回収の標準的な周知の技術を使用することができる。膜濾過を使用することが好ましく、逆浸透膜、あるいは以下で論じる、また本明細書で引用した文献中にある、回収についての１種または複数種のカラムクロマトグラフィー技術を利用することがより好ましい。例えば、膜の分子量の遮断値が約３０００〜約１０，０００である膜濾過を使用して、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質を除去する。次いでナノ濾過または逆浸透を使用して、塩を除去しかつ／または産物のサッカリドを精製する（例えば、ＷＯ９８／１５５８１を参照）。ナノ濾過膜は、一価の塩を通過させるが、使用する膜に応じて約１００〜約２，０００ダルトンの多価の塩および非帯電の溶質を保持する種類の逆浸透膜である。したがって、典型的な適用例では、本発明の方法によって調製されたサッカリドは膜中に保持され、混入している塩は通過する。
【０３２８】
修飾された糖タンパク質が細胞内で産生される場合、第１の工程として、例えば、遠心分離または限外濾過によって粒状の細片、宿主細胞または溶解した断片を除去する。場合によっては、市販されているタンパク質濃縮フィルターでタンパク質を濃縮し、その後、イムノアフィニティークロマトグラフィー；（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）あるいはカルボキシメチル基またはスルホプロピル基を含むマトリックス上での）イオン交換カラム分画化；ブルーセファロース（Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、ＣＭブルーセファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチンセファロース、ＷＧＡセファロース、ＣｏｎＡセファロース、エーテルトヨパール（Ｅｔｈｅｒ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、ブチルトヨパール、フェニルトヨパール、またはプロテインＡセファロース上でのクロマトグラフィー；ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー；シリカクロマトグラフィー；等電点電気泳動；逆相ＨＰＬＣ（例えば、脂肪族基が付加されたシリカゲル）；例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）分子篩またはサイズ排除クロマトグラフィーを用いたゲル濾過；ポリペプチドと選択的に結合するカラム上でのクロマトグラフィー；およびエタノール沈殿または硫酸アンモニウム沈殿から選択される１つまたは複数の工程によって他の不純物からポリペプチド変異体を分離することもできる。
【０３２９】
培養で産生される修飾された糖ペプチドは、細胞、酵素などからの最初の抽出、その後の１つまたは複数の濃縮、脱塩、水性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィーの工程により通常単離される。さらに、修飾された糖タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。最後に、ＨＰＬＣを最後の精製工程に使用することができる。
【０３３０】
プロテアーゼ阻害剤、例えばメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）を前記工程のいずれかで使用して、タンパク質分解を阻害することができ、抗生物質を使用して、外来混入物の増殖を防止することができる。
【０３３１】
他の実施形態の中では、本発明の修飾された糖ペプチドを生成する系の上清を、市販されているタンパク濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過ユニットを用いて最初に濃縮する。濃縮工程の後、濃縮物を適切な精製マトリックスにかける。例えば、適切なアフィニティーマトリックスは、適切な支持体に結合した、ペプチドに対するリガンド、レクチンまたは抗体分子を含んでよい。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えば、ＤＥＡＥ基の付いたマトリックスまたは基質を使用することもできる。適切なマトリックスには、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製で通常使用される他の型が含まれる。あるいは、陽イオン交換工程を使用することもできる。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性のマトリックスがある。スルホプロピル基が特に好ましい。
【０３３２】
最後に、疎水性のＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えばメチル基または他の脂肪族基の付いたシリカゲルを使用する１つまたは複数のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を使用して、ポリペプチド変異体組成物をさらに精製することができる。様々な組合せで前記の精製工程の一部または全部を使用して、均一な修飾された糖タンパク質をもたらすこともできる。
【０３３３】
大規模な発酵から得られた、本発明の修飾された糖ペプチドは、Ｕｒｄａｌら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１（１９８４）に開示されているものと類似した方法によって精製することができる。この参照文献は、分離用ＨＰＬＣカラム上で組換えヒトＩＬ−２を精製する２つの連続したＲＰ−ＨＰＬＣ工程について記載している。あるいは、アフィニティークロマトグラフィーなどの技術を利用して、修飾された糖タンパク質を精製することもできる。
【０３３４】
薬剤組成物
他の態様では、本発明は薬剤組成物を提供する。薬剤組成物は、製剤上許容される希釈剤、および天然に存在しないＰＥＧ部分、治療的部分または生体分子と、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの共有コンジュゲートを含む。ポリマー、治療的部分または生体分子は、間に介在し、ＦＳＨペプチドとも、ポリマー、治療的部分または生体分子とも共有結合する完全なグリコシル結合基を介してＦＳＨペプチドと結合している。
【０３３５】
本発明の薬剤組成物は、様々な薬物送達系での使用に適している。本発明での使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、第１７版（１９８５）中に認められる。薬物送達方法の簡潔な総説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３（１９９０）を参照されたい。
【０３３６】
例えば、局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、経皮または筋内投与を含めた任意の適当な投与方法用に、薬剤組成物を製剤することができる。経皮注射などの非経口投与では、担体は、好ましくは水、食塩水、アルコール、脂肪、蝋または緩衝液を含む。経口投与では、上記の担体のいずれか、またはマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石粉、セルロース、グルコース、スクロースや炭酸マグネシウムなどの固体の担体を使用することができる。本発明の薬剤組成物の担体として、生体分解性微粒子（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸）を使用することもできる。適切な生体分解性微粒子は、例えば、米国特許第４８９７２６８号および第５０７５１０９号で開示されている。
【０３３７】
一般に、薬剤組成物は、非経口で、例えば静脈内に投与する。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは水性の担体、例えば水、緩衝化水（ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｗａｔｅｒ）、食塩水、ＰＢＳなどの中に溶解または懸濁した化合物を含む非経口投与用の組成物を提供する。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、等張化剤、湿潤剤、界面活性剤など、生理的条件に近づけるのに必要となる製剤上許容される補助物質を含んでよい。
【０３３８】
これらの組成物は、従来の滅菌技術により滅菌することもでき、あるいは滅菌濾過することもできる。得られた水溶液は、そのままで使用するために包装することもでき、あるいは凍結乾燥することもでき、その凍結乾燥製剤は投与前に滅菌水性担体と混合する。製剤のｐＨは、通常は３〜１１であり、より好ましくは５〜９であり、最も好ましくは７〜８である。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、本発明の糖ペプチドは、標準的な小胞形成脂質から形成されたリポソーム中に組み込むことができる。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４２３５８７１号、第４５０１７２８号および第４８３７０２８号に記載のように、様々な方法がリポソームの調製に利用できる。様々な標的導入作用物質（例えば、本発明のシアリルガラクトシド）を用いたリポソームの標的導入は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第４９５７７７３号および第４６０３０４４号を参照）。
【０３４０】
標的導入作用物質をリポソームと結合する標準的な方法を使用することができる。これらの方法では一般に、標的導入作用物質の結合のために活性化することができるホスファチジルエタノールアミンなどの脂質の構成成分、または本発明の脂質誘導体化糖ペプチドなどの誘導体化親油性化合物をリポソーム中に組み込む。
【０３４１】
標的導入の機構は一般に、標的導入部分が標的、例えば細胞表面受容体との相互作用に利用できる形で、標的導入作用物質がリポソームの表面上に位置することを必要とする。本発明の炭化水素は、当業者に知られている方法（例えば、それぞれ長鎖アルキルハロゲン化物または脂肪酸での、炭化水素上に存在するヒドロキシル基のアルキル化またはアシル化）を用いてリポソームを形成する前に、脂質分子と結合することができる。あるいは、膜の形成時に連結部分が膜中に最初に組み込まれるようにリポソームを作製することもできる。連結部分は、膜中にしっかりと埋め込まれ固定される親油性の部分を有さなければならない。それは、リポソームの水性表面上で化学的に利用可能な反応性の部分も有さなければならない。反応性の部分は、後に付加される標的導入作用物質または炭化水素との安定な化学結合の形成に化学的に適切となるように選択される。一部の場合では、標的の作用物質を連結分子と直接結合することが可能であるが、ほとんどの場合では、橋（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｒｉｄｇｅ）として作用する第３の分子を使用することがより適切であり、それによって膜中にある連結分子が小胞の表面から離れて三次元的に伸長している標的の作用物質または炭化水素と結合する。
【０３４２】
本発明の方法によって調製される化合物は、診断用試薬としての使用も見出すことができる。例えば、標識化合物を使用して、炎症があると疑われる患者で炎症または腫瘍転移の領域を特定することができる。この使用では、１２５Ｉ、１４Ｃ、またはトリチウムで化合物を標識することができる。
【０３４３】
本発明の薬剤組成物中で使用する有効成分は、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＦＳＨ、および卵胞刺激ホルモンの例えば排卵を促進する生物学的特性を有するその誘導体である。好ましくは、本発明のＦＳＨ組成物を非経口（例えば、ＩＶ、ＩＭ、ＳＣまたはＩＰ）投与する。有効投与量は、治療条件および投与経路に応じて著しく異なると予想されるが、体重１ｋｇ当たり有効物質約０．１μｇ（約７Ｕ）〜１００μｇ（約７０００Ｕ）であると予想される。貧血状態の治療で好ましい投与量は、約５０〜約３００単位／ｋｇで１週間当たり３回である。本発明がｉｎ  ｖｉｖｏでの滞留時間が延長したＦＳＨを提供するので、本発明の組成物を投与するとき、記載した投与量は場合によっては少なくなる。
【０３４４】
下記の実施例は、特許請求の範囲に係る発明を限定するためではなく本発明のコンジュゲートおよび方法を説明するために提供する。
【実施例】
【０３４５】
＜実施例１＞
この実施例は、本発明のコンジュゲートの構築を説明するものである。卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を脱シアル酸化し、次いでＣＭＰ−（シアル酸）−ＰＥＧと結合する。
【０３４６】
卵胞刺激ホルモンの脱シアル酸化
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）（ヒト下垂体、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号８６９００１）１ｍｇを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２５００μＬ中に溶解した。この溶液３７５μＬを小プラスチック管に移し、それにノイラミニダーゼＩＩ（コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ））２６３ｍＵを添加した。反応混合物を３２℃で１５時間穏やかに振盪した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％ＮａＮ３で予め平衡化したＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサミド酸−アガロースコンジュゲート６００μＬに反応混合物を添加し、４℃で６．５時間穏やかに回転させた。その懸濁液を１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、その上清を収集した。ビーズを緩衝液０．５ｍＬで５回洗浄し、上清をすべて貯留した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３を含む溶液２Ｌを用いて４℃で１５時間酵素溶液を透析（７０００ＭＷＣＯ）し、次いで５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３中への４℃、４時間の透析を２回行った。Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃでその溶液を２μｇ／μＬに濃縮し、−２０℃で保存した。反応試料は、ＩＥＦゲル（ｐＨ３〜７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分析した。
【０３４７】
ヒト下垂体由来ＳＡ−ＦＳＨおよびＰＥＧ−ＳＡ−卵胞刺激ホルモンの調製
脱シアル酸化ＦＳＨ（１００μｇ、５０μＬ）およびＣＭＰ−シアル酸またはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａまたは１０ｋＤａ）（０．０５μｍｏｌ）を、０．５ｍＬプラスチック管中のＨ２Ｏ（ＮａＯＨでｐＨ８に調整）１３．５μＬで溶解した。その管に短時間ボルテックスをかけ、４０ｍＵのＳＴ３Ｇａｌ３（３６．５μＬ）を添加した（総体積１００μＬ）。その管に再度ボルテックスをかけ、３２℃で２４時間穏やかに振盪した。−８０℃で凍結することによって反応を停止した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＩＥＦゲルおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより反応試料１５μｇを分析した。天然のＦＳＨもＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０３４８】
反応産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦゲルの分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用のＮｏｖｅｘトリス−グリシン８〜１６％  １ｍｍゲルをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＦＳＨ反応試料７．５μＬ（１５μｇ）を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３緩衝液５μＬで希釈し、試料添加用緩衝液１５μＬおよび９Ｍのμ−メルカプトエタノール１μＬと混合し、８５℃で６分間加熱した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示の通りにゲルを泳動し、コロイダルブルー染色液（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。
【０３４９】
ＦＳＨ試料（１５μｇ）をトリス緩衝液５μＬで希釈し、試料添加用緩衝液１５μＬと混合した。次いで試料を等電点電気泳動ゲル（Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｇｅｌ）（ｐＨ３〜７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示の通りにゲルを泳動および固定し、次いでコロイダルブルー染色液で染色した。
＜実施例２＞
【０３５０】
ＣＨＯ細胞中で組換えにより産生された組換えＦＳＨのＧｌｙｃｏＰＥＧ化
この実施例は、本発明のコンジュゲートの構築を説明するものである。脱シアル酸化ＦＳＨをＣＭＰ−（シアル酸）−ＰＥＧと結合した。
【０３５１】
組換えアシアロ−卵胞刺激ホルモンの調製
ＣＨＯから産生された組換え卵胞刺激ホルモン（ｒＦＳＨ）をこの研究で使用した。７，５００ＩＵのｒＦＳＨを水８ｍＬ中に溶解した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２でＦＳＨ溶液を透析し、セントリコンプラス（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ）２０遠心分離用フィルターで５００μＬに濃縮した。この溶液の一部（４００μＬ）（ＦＳＨ約０．８ｍｇ）を小プラスチック管に移し、それにノイラミニダーゼＩＩ（コレラ菌）２７５ｍＵを添加した。その反応混合物を３２℃で１６時間混合した。予め洗浄したＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサミド酸−アガロースコンジュゲート（８００μＬ）に反応混合物を添加し、４℃で２４時間穏やかに回転させた。その混合物を１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、その上清を収集した。ビーズをトリス−ＥＤＴＡ緩衝液０．６ｍＬで３回、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液０．４ｍＬで１回、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液０．２ｍＬで１回洗浄し、上清をすべて貯留した。２Ｌの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３に対して４℃でその上清を透析し、次いで５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３に対してさらに２回透析した。次いでセントリコンプラス２０遠心分離用フィルターで透析溶液を４２０μＬに濃縮し、−２０℃で保存した。
【０３５２】
天然のｒＦＳＨ試料および脱シアル酸化ｒＦＳＨ試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦによって分析した。Ｎｏｖｅｘトリス−グリシン８〜１６％  １ｍｍゲルをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。試料（７．５μＬ、１５μｇ）を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３緩衝液５μＬで希釈し、試料添加用緩衝液１５μＬおよび９Ｍのβ−メルカプトエタノール１μＬと混合し、８５℃で６分間加熱した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示の通りにゲルを泳動し、コロイダルブルー染色液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。等電点電気泳動ゲル（ｐＨ３〜７）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。試料（７．５μＬ、１５μｇ）を、トリス緩衝液５μＬで希釈し、試料添加用緩衝液１５μＬと混合した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示の通りにゲルを添加し、泳動し固定した。コロイダルブルー染色液でゲルを染色した。天然のＦＳＨ試料および脱シアル酸化ＦＳＨ試料はまた、水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析した。
【０３５３】
組換え卵胞刺激ホルモンのシアリル−ＰＥＧ化
脱シアル酸化ＦＳＨ（１００μｇ、５４μＬ）およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａまたは１０ｋＤａ）（０．０５μｍｏｌ）を、０．５ｍＬプラスチック管中の２８μＬの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．２で溶解した。その管に短時間ボルテックスをかけ、２０ｍＵのＳＴ３Ｇａｌ３を添加した（総体積１００μＬ）。その管に再度ボルテックスをかけ、３２℃で２４時間穏やかに混合し、−８０℃で凍結することによって反応を停止した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、ＩＥＦゲルおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより上記に記載の通りにこの反応の試料を分析した。
【０３５４】
ＰＥＧ化ｒＦＳＨに対してＭＡＬＤＩも行った。イオン化の間に、ＳＡ−ＰＥＧは、糖タンパク質のＮ−グリカン構造から除去された。天然のＦＳＨは１３９２８でピークを示した；ＡＳ−ｒＦＳＨ（１３２８２）；再シアル酸化（ｒｅｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）ｒ−ＦＳＨ（１３３３２）；ＰＥＧ１０００−ｒＦＳＨ（１３５１５；１４９６０（１）；１６４５５（２）；１７７９６（３）；１９３２１（４））；およびＰＥＧ１００００（２３５６０（１）；３４７９０（２）；４５６７０（３）；および５６７６０（４））であった。
＜実施例３＞
【０３５５】
ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＦＳＨの薬物動態の検討
この実施例は、本発明の方法に従って調製したＧｌｙｃｏＰＥＧ化卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の薬物動態的特性を、非ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＦＳＨと比較したｉｎ  ｖｉｖｏ試験を示すものである。
【０３５６】
ＦＳＨ、ＦＳＨ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）およびＦＳＨ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）を、標準的な条件を用いて放射性ヨウ素標識し（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、イリノイ州Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ）、ＢＳＡを０．１％含むリン酸緩衝食塩水で製剤した。リン酸緩衝液で適当な濃度に希釈した後、雌Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００ｇ）に各試験ＦＳＨタンパク質（各０．４μｇ）を静脈内注射し、０から８０時間までの時点で採血した。γ計数器を用いて血液試料中の放射活性を分析し、標準的な方法を用いて薬物動態を分析した。ＦＳＨは、ＦＳＨ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）よりはるかに速く血液から排除され、ＦＳＨ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）より多少速く排除された。
＜実施例４＞
【０３５７】
ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＦＳＨのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性に関するセルトリ細胞バイオアッセイ
この実施例は、培養したセルトリ細胞に基づく、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）活性に関するバイオアッセイを示すものである。このアッセイは、糖結合を含めた、グリカンの再構築後のＦＳＨ生物活性を決定するのに有用である。
【０３５８】
このバイオアッセイは、黄体形成ホルモン（ＬＨ）でなくＦＳＨを、未熟な齢数のラットから得られた培養セルトリ細胞に添加したときに産生されたエストラジオールの量の間に存在する用量−反応関係に基づくものである。外因性テストステロンは、ＦＳＨの存在下で１７β−エストラジオールに転換される。
【０３５９】
７〜１０日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用してセルトリ細胞を得た。屠殺後、精巣を被膜剥離し、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）、トリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）、ヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ（５μｇ／ｍｌ）中で５〜１０分間インキュベートすることにより組織を分散させた。小管の断片をフラスコの底に入れ、ＰＢＳ（１×）で洗浄した。同じ酵素：コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）、トリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）、ヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ（５μｇ／ｍｌ）を含む培養液とともに小管の断片を２０分間再度インキュベートした。
【０３６０】
小管の断片をホモジナイズし、それを無血清培地の入った２４穴プレート中に播いた。細胞を１穴当たりに５×１０５個播いた。３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間インキュベートした後、新鮮な培地を細胞に添加した。無血清培地の組成：ＤＭＥＭ（１容）、ハムＦ１０栄養混合物（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ）（１容）、インスリン１μｇ／ｍｌ、トランスフェリン５μｇ／ｍｌ、ＥＧＦ１０ｎｇ／ｍｌ、Ｔ４  ２０ｐｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン１０−８Ｍ、レチノイン酸１０−６Ｍ。
【０３６１】
刺激実験は、３７℃、５％ＣＯ２下、２４時間の標準ＦＳＨまたは試料とのインキュベーションからなる。アッセイ内の平均変動係数は９％であり、アッセイ間の平均変動係数は１１％である。
【０３６２】
１７Ｂ−エストラジオールＥｌｉｓａキットＤＥ２０００（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）を使用して、ＦＳＨ、ＦＳＨ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）およびＦＳＨ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）とのインキュベーション後のエストラジオールのレベルを定量した。
【０３６３】
手順は下記の通りであった：（キットとともに供給され、キットに添付の説明書の通りに調製した）エストラジオール標準試料または試料１００μｌを（複数の）１７Ｂ−エストラジオールＥｌｉｓａプレートの穴にピペットで入れた；（キットとともに供給され、キットに添付の説明書の通りに調製した）１７Ｂ−エストラジオールコンジュゲート５０μｌを各穴に添加した；（キットとともに供給され、キットに添付の説明書の通りに調製した）１７Ｂ−エストラジオール抗体液５０μｌを各穴に添加した；プレートを室温、２００ｒｐｍで２時間インキュベートした；液体を各穴から吸引した；洗浄溶液を使用して穴を４回洗浄した；液体すべてを各穴から吸引した；（キットとともに供給され、キットに添付の説明書の通りに調製した）ｐＮＰＰ基質２００μｌをすべての穴に添加し、４５分間インキュベートした；（キットとともに供給され、キットに添付の説明書の通りに調製した）停止溶液５０μｌを添加し、プレートを４０５ｎｍで読み取った。ＦＳＨ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）は１μｇ／ｍｌでセルトリ細胞のわずかな刺激が示されたが、ＦＳＨ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）は、非ＰＥＧ化ＦＳＨより最大で５０％高くセルトリ細胞を刺激した。
＜実施例５＞
【０３６４】
ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＦＳＨのｉｎ  ｖｉｖｏ活性のＳｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙバイオアッセイ
この実施例では、Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙバイオアッセイ（ＳｔｅｅｌｍａｎおよびＰｏｈｌｅｙ、１９５３、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ５３：６０４〜６１５）を使用して、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＦＳＨのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を決定した。Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙアッセイは、ラット卵巣の重量変化を使用して、ヒト絨毛性ゴナドトロピンと同時に注射したＦＳＨのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を測定する。
【０３６５】
Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙバイオアッセイは、Ｃｈｒｉｓｔｉｎ−Ｍａｉｔｒｅら（２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１：５１〜５７）に記載のプロトコールに従って行った。２１〜２２日齢の雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）７０匹をアッセイ手順の開始前に少なくとも５日間試験施設で飼育した。その手順全体にわたって、動物室の気候は、１８〜２６℃、相対湿度３０〜７０％、人工的な明期１２時間／暗期１２時間に管理されていた。すべての動物は、認可済げっ歯類用飼料（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ）（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）またはその同等物、および水を任意に与えられた。動物の処置は、Ｃａｌｖｅｒｔ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．（ペンシルバニア州Ｏｌｙｐｈａｎｔ）で行われた。
【０３６６】
組換えＦＳＨをＣＨＯ細胞中で発現させ、標準的な技術により精製し、ＰＥＧ（１ｋＤａ）でＧｌｙｃｏＰＥＧ化した。ラットを１群当たり動物１０匹の７試験群に分割した。−１日目および０日目に、０．９％ＮａＣｌ０．５ｍｌ中２０Ｉ．Ｕ．のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）を全群の動物に皮下注射した。１、２および３日目に、０．９％ＮａＣｌ０．５ｍｌ中にＨＣＧを２０Ｉ．Ｕ．含む用量で対照動物に皮下注射し、その一方で、他の群では、ＨＣＧ用量を増大させ、１用量当たりにｒＦＳＨまたはｒＦＳＨ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）を０．１４μｇ、０．４μｇまたは１．２μｇにした。４日目に、ＣＯ２吸入によって動物を安楽死させた。卵巣を取り出し、切り取りその重量を測定した。各群で平均卵巣重量を決定した。
【０３６７】
ＨＣＧを単独で投与した（対照）群あるいはｒＦＳＨまたはｒＦＳＨ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）を低用量（０．１４μｇ）投与した群では、卵巣の重量はおおよそ同等であった。ｒＦＳＨまたはｒＦＳＨ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）を中用量（０．４μｇ）または高用量（１．２μｇ）投与した群では、卵巣の重量は対照群のおおよそ２倍であった。中用量（０．４μｇ）では、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ｒＦＳＨは、非ＰＥＧ化ｒＦＳＨとおおよそ同じ（卵巣の重量により決定される）ｉｎ  ｖｉｖｏ活性を有していた。高用量（１．２μｇ）では、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ｒＦＳＨは、非ＰＥＧ化ｒＦＳＨより多少高いｉｎ  ｖｉｖｏ活性を有していた。
【０３６８】
本明細書に記載した実施例および実施形態が例示的な目的のものに過ぎず、それに照らした様々な改変または変化が当業者に示唆され、それらが本願の趣旨および範囲、ならびに添付した特許請求の範囲の中に含まれるべきであることが理解されよう。本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、すべての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０３６９】
【図１】ＦＳＨの構造を示す図であり、β鎖サブユニットのＡｓｎ７およびＡｓｎ２４、ならびにα鎖サブユニットのＡｓｎ５２およびＡｓｎ７８での潜在的なグリコシル化部位の存在および位置を示している。
【図２Ａ】シアル酸部分を２つの各サッカリル残基から除去した後、ＰＥＧで誘導体化されたサッカリル残基を付加することによってＦＳＨペプチド上で炭化水素残基が再構築される、本発明の例示的な実施形態を示すスキームである。
【図２Ｂ】天然のＦＳＨ、アシアロ−ＦＳＨ、および１キロダルトンのＰＥＧでＧｌｙｃｏＰＥＧ化されたＦＳＨの相対的な分子サイズを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図３】天然のＦＳＨとＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＦＳＨのｉｎ  ｖｉｖｏでの滞留時間を比較したプロットである。
【図４】選択した用量での天然のＦＳＨとＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＦＳＨの生物活性を比較したプロットである。
【図５】本発明のコンジュゲートの調製に役立つ例示的なＰＥＧ−グリコシル結合基前駆体（被修飾糖）を生成する合成のスキームである。
【図６】ＦＳＨの成熟したα−サブユニット、およびＦＳＨの成熟したβ−サブユニットのアミノ酸配列を示す図である。
【図７】本発明の実施に有用ないくつかの例示的な被修飾糖ヌクレオチドを示す図である。
【図８】本発明の実施に有用なさらなる例示的な被修飾糖ヌクレオチドを示す図である。
【図９】受容体上への、本明細書で示すものなどの修飾されたシアル酸部分、および修飾されていないシアル酸部分の転移に役立つシアリルトランスフェラーゼの表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図９Ｋ】
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【図９Ｌ】
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【図９Ｍ】
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【図９Ｎ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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