(57)【要約】  パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）およびケイ皮酸（ＣＡ）の微生物生成方法が提供される。チロシンまたはフェニルアラニンのいずれかを生成する微生物が、それぞれチロシンアンモニウムリアーゼまたはフェニルアラニンアンモニウムリアーゼいずれかの存在下で生育され、発酵の一部はアルカリ性ｐＨで達成される。本方法は、生理的ｐＨのみでの発酵と比較して、パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）およびケイ皮酸（ＣＡ）生成のより大きな収量およびより高い速度をもたらす。
2007533329.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ａ）発酵性炭素基質と共に生育させるとチロシンを作り、
ｂ）適切な調節配列に作動的に結合した、チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含んでなる
微生物生産宿主細胞を提供し、
（ｉｉ）生理的ｐＨの増殖培地中で（ｉ）の宿主細胞と発酵性炭素基質とを増殖培地中にチロシンを蓄積させるのに十分な時間接触させ、
（ｉｉｉ）増殖培地のｐＨを、パラ−ヒドロキシケイ皮酸を蓄積させるのに十分な時間約８．０〜約１１．０のｐＨに上昇させ、そして
（ｉｖ）場合により該パラ−ヒドロキシケイ皮酸を回収する、
ことを含んでなる、パラ−ヒドロキシケイ皮酸の生成方法。
【請求項２】
（ｉ）ａ）発酵性炭素基質と共に生育させるとフェニルアラニンを作り、
ｂ）適切な調節配列に作動的に結合した、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含んでなる
微生物生産宿主細胞を提供し、
（ｉｉ）生理的ｐＨの増殖培地中で（ｉ）の宿主細胞と発酵性炭素基質とを増殖培地中にフェニルアラニンを蓄積させるのに十分な時間接触させ、
（ｉｉｉ）増殖培地のｐＨを、ケイ皮酸を蓄積させるのに十分な時間約８．０〜約１１．０のｐＨに上昇させ、そして
（ｉｖ）場合により該ケイ皮酸を回収する、
ことを含んでなる、ケイ皮酸の生成方法。
【請求項３】
チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子が、微生物生産宿主細胞にとって外来性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子が、微生物生産宿主にとって外来性である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、誘導可能プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、誘導可能プロモーターの制御下にある、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｉｉｉ）において、チロシンアンモニアリアーゼが増殖培地に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｉｉｉ）において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼが増殖培地に添加される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
チロシンアンモニアリアーゼが活性チロシンアンモニアリアーゼを含んでなる細胞の形態で提供される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼが活性フェニルアラニンアンモニアリアーゼを含んでなる細胞の形態で提供される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）発酵性炭素基質と共に生育させるとチロシンを作る微生物生産宿主細胞を提供し、
（ｉｉ）生理的ｐＨの増殖培地中で（ｉ）の生産宿主細胞と発酵性炭素基質とを増殖培地中にチロシンを蓄積させるのに十分な時間接触させ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の増殖培地をチロシンアンモニアリアーゼと接触させ、
（ｉｖ）増殖培地のｐＨを、増殖培地中にパラ−ヒドロキシケイ皮酸を蓄積させるのに十分な時間約８．０〜約１１．０のｐＨに上昇させ、そして
（ｖ）場合により該パラ−ヒドロキシケイ皮酸を回収する、
逐次ステップを含んでなる、パラ−ヒドロキシケイ皮酸の生成方法。
【請求項１２】
（ｉ）発酵性炭素基質と共に生育させるとフェニルアラニンを作る微生物生産宿主細胞を提供し、
（ｉｉ）生理的ｐＨの増殖培地中で（ｉ）の生産宿主細胞と発酵性炭素基質とを増殖培地中にフェニルアラニンを蓄積させるのに十分な時間接触させ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の増殖培地をフェニルアラニンアンモニアリアーゼと接触させ、
（ｉｖ）増殖培地のｐＨを、増殖培地中にケイ皮酸を蓄積させるのに十分な時間約８．０〜約１１．０のｐＨに上昇させ、そして
（ｖ）場合により該ケイ皮酸を回収する、
逐次ステップを含んでなる、ケイ皮酸の生成方法。
【請求項１３】
（ｉ）発酵性炭素基質と共に生育させるとチロシンを作る微生物生産宿主細胞を提供し、
（ｉｉ）生理的ｐＨの増殖培地中で（ｉ）の生産宿主細胞と発酵性炭素基質とを増殖培地中にチロシンを蓄積させるのに十分な時間接触させ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で生成されたチロシンを増殖培地から単離し、
（ｉｖ）約８．０〜約１１．０のｐＨを有する溶液中で（ｉｉｉ）の単離されたチロシンとチロシンアンモニアリアーゼ源とをパラ−ヒドロキシケイ皮酸を蓄積させるのに十分な時間接触させ、そして
（ｖ）場合により該パラ−ヒドロキシケイ皮酸を回収する、
逐次ステップを含んでなる、パラ−ヒドロキシケイ皮酸の生成方法。
【請求項１４】
（ｉ）発酵性炭素基質と共に生育させるとフェニルアラニンを作る微生物生産宿主細胞を提供し、
（ｉｉ）生理的ｐＨの増殖培地中で（ｉ）の生産宿主細胞と発酵性炭素基質とを増殖培地中にフェニルアラニンを蓄積させるのに十分な時間接触させ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で生成されたフェニルアラニンを増殖培地から単離し、
（ｉｖ）約８．０〜約１１．０のｐＨを有する溶液中で（ｉｉｉ）の単離されたフェニルアラニンとフェニルアラニンアンモニアリアーゼ源とを増殖培地中からケイ皮酸を蓄積させるのに十分な時間接触させ、そして
（ｖ）場合により該ケイ皮酸を回収する、
逐次ステップを含んでなる、ケイ皮酸の生成方法。
【請求項１５】
増殖培地のｐＨが約９．５〜約１０．５のｐＨに上昇される、請求項１、２、１１、１２、１３または１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
該発酵性炭素基質が、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルメート、および炭素含有アミンよりなる群から選択される、請求項１、２、１１、１２、１３または１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
該発酵性炭素基質がグルコースである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アンモニアが増殖培地から除去される、請求項１、２、１１、１２、１３または１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
該微生物生産宿主が細菌、酵母、糸状菌類、および藻類よりなる群から選択される、請求項１、２、１１、１２、１３または１４に記載の方法。
【請求項２０】
該微生物生産宿主細胞が、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、およびロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）よりなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
該微生物生産宿主細胞がチロシン過剰生産株である、請求項１、１１、または１３に記載の方法。
【請求項２２】
該微生物生産宿主細胞がフェニルアラニン過剰生産株である、請求項２、１２、または１４に記載の方法。
【請求項２３】
チロシン過剰生産細胞が、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１０１５５、コリネバクテリウム・イリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｌｌｉｕｍ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２２４３、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２３１１、アルスロバクター・シトレアス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｔｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ１１６２４、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ＳＤ−２０、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＹ１よりなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
フェニルアラニン過剰生産細胞が、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１０１５５、コリネバクテリウム・イリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｌｌｉｕｍ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２２４３、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２３１１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＳＴ７４、およびアルスロバクター・シトレアス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｔｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ１１６２４よりなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする該遺伝子が、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、トリコスポロン・クタニウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、およびロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）よりなる群から選択される属から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする該遺伝子が、配列番号２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性をコードする該遺伝子が、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）種ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種、ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、およびスポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）種よりなる群から選択される属から単離される、請求項２に記載の方法。
【請求項２８】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性をコードする該遺伝子が、配列番号２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
（ｉ）チロシンアンモニウムリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現する微生物生産宿主を提供し、そして
（ｉｉ）約８．０〜約１１．０のｐＨで（ｉ）の該微生物生産宿主とチロシンとを接触させて、パラ−ヒドロキシケイ皮酸が生成する
逐次ステップを含んでなるパラ−ヒドロキシケイ皮酸の生成方法。
【請求項３０】
（ｉ）フェニルアラニンアンモニウムリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現する微生物生産宿主を提供し、そして
（ｉｉ）約８．０〜約１１．０のｐＨで（ｉ）の該微生物生産宿主とフェニルアラニンとを接触させて、ケイ皮酸が生成する、
逐次ステップを含んでなるケイ皮酸の生成方法。
【請求項３１】
（ｉｉ）の接触させるステップが約３０℃〜約６０℃で実施される、請求項２９または３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願明細書は、２００４年４月２０日に出願された米国特許仮出願第６０／５６３６３３号の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、工業微生物学分野に関する。より具体的には、パラ−ヒドロキシケイ皮酸およびケイ皮酸などの芳香族カルボン酸の収量および生成速度の増進のための方法が開示される。
【背景技術】
【０００３】
パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）およびケイ皮酸（ＣＡ）は、多種多様な産業上の利用において潜在的有用性を有する多官能性芳香族化合物である。例えばこれらの芳香族化合物は、液晶ポリマー生成用モノマーとして、および樹脂、エラストマー、コーティング、接着剤、自動車仕上げおよびインクの生成において用途を有する。
【０００４】
これらの芳香族化合物を生成する化学合成法が知られている。しかしこれらの化学的方法は出発原料の高額さ、および生成物の高度な精製が必要とされることから高価である。さらにこれらの方法は、多量の望まれない副産物を発生させる。そのためこれらの芳香族化合物の生物学的生成方法が開発されている。例えばゲートンビー（Ｇａｔｅｎｂｙ）らは特許文献１で、遺伝子操作微生物を使用してグルコースからｐＨＣＡを生成するいくつかの方法について述べる。さらにキ（Ｑｉ）らは、同時係属中および同一譲受人の特許文献２および特許文献３で、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性をコードする少なくとも１つの遺伝子、およびフェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）活性をコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる組換え微生物を使用してＣＡおよびｐＨＣＡを生成する方法について述べる。しかしこれらの芳香族化合物の生物学的生成において遭遇する問題が最終生成物阻害であり、それは生成物の収量を制限する。さらに発酵は典型的に、チロシンをｐＨＣＡに転換するのに必要とされるチロシンアンモニウムリアーゼ活性、またはフェニルアラニンをＣＡに転換するのに必要とされるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性に最適でないｐＨで実施される。これらの酵素に最適なｐＨは、典型的に約ｐＨ８．５であるアルカリ性ｐＨ範囲である（例えば非特許文献１を参照されたい）。
【０００５】
非特許文献２、非特許文献３、および非特許文献４は、９．０〜１２．０のｐＨにおいて、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有するそのままの酵母細胞を使用した、トランス−ケイ皮酸からフェニルアラニンへの生体内変換の方法について述べる。しかしこれらの開示は、発酵の第２段階中にｐＨがアルカリ性の値に上昇される二段階発酵でのｐＨＣＡまたはＣＡの生物生産について述べてはいない。
【０００６】
最終生成物阻害を軽減する１つのアプローチは、ベン・バサット（Ｂｅｎ  Ｂａｓｓａｔ）らによって同時係属中および同一譲受人の特許文献４で述べられるように、組換え生産宿主によって生成されるｐＨＣＡまたはＣＡが阻害的または限界濃度に達しないように、それを発酵中に非混合性有機相中に抽出する二相抽出発酵を使用することである。その開示で述べられる方法は、ｐＨＣＡおよびＣＡに改善された収量をもたらす。しかし商業用途ではさらに高い収量が必要とされる。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，３６８，８３７号明細書
【特許文献２】米国特許出願第１０／１３８９７０号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／００７９２５号明細書
【特許文献４】米国特許出願第１０／８２４２３７号明細書
【非特許文献１】ホジンズ（Ｈｏｄｇｉｎｓ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：２９７７〜２９８５（１９７１）
【非特許文献２】エバンス（Ｅｖａｎｓ）ら、Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：４１７〜４２１（１９８７）
【非特許文献３】エバンス（Ｅｖａｎｓ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：３９９〜４０５（１９８７）
【非特許文献４】エバンス（Ｅｖａｎｓ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２：５３〜５８（１９８７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがってパラ−ヒドロキシケイ皮酸およびケイ皮酸を商業用途のために高収率で生成する方法に対する必要性が存在する。
【０００９】
出願人らは、発酵の第２の段階中にｐＨがアルカリ性の値に増大される二段階発酵を使用して、高収率でパラ−ヒドロキシケイ皮酸およびケイ皮酸を生成する方法を発見することで既述の問題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、チロシンアンモニアリアーゼまたはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素影響下での発酵による、ｐＨＣＡおよびＣＡなどの芳香族カルボン酸の増進された生成方法を提供し、そこでは触媒作用がアルカリ性ｐＨで起きる。
【００１１】
したがって本発明は、
（ｉ）ａ）発酵性炭素基質と共に生育させるとチロシンを作り、
ｂ）適切な調節配列に作動的に結合した、チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含んでなる
微生物生産宿主細胞を提供し、
（ｉｉ）生理的ｐＨの増殖培地中で（ｉ）の宿主細胞と発酵性炭素基質とを増殖培地中にチロシンを蓄積させるのに十分な時間接触させ、
（ｉｉｉ）増殖培地のｐＨを、パラ−ヒドロキシケイ皮酸を蓄積させるのに十分な時間約８．０〜約１１．０のｐＨに上昇させ、そして
（ｉｖ）場合により該パラ−ヒドロキシケイ皮酸を回収する、
ことを含んでなる、パラ−ヒドロキシケイ皮酸の生成方法を提供する。
【００１２】
関連した実施態様において本発明は、
（ｉ）ａ）発酵性炭素基質と共に生育させるとフェニルアラニンを作り、
ｂ）適切な調節配列に作動的に結合した、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含んでなる
微生物生産宿主細胞を提供し、
（ｉｉ）生理的ｐＨの増殖培地中で（ｉ）の宿主細胞と発酵性炭素基質とを増殖培地中にフェニルアラニンを蓄積させるのに十分な時間接触させ、
（ｉｉｉ）増殖培地のｐＨを、ケイ皮酸を蓄積させるのに十分な時間約８．０〜約１１．０のｐＨに上昇させ、そして
（ｉｖ）場合により該ケイ皮酸を回収する、
ことを含んでなる、ケイ皮酸の生成方法を提供する。
【００１３】
同様に本発明は、
（ｉ）発酵性炭素基質と共に生育させるとチロシンを作る微生物生産宿主細胞を提供し、
（ｉｉ）生理的ｐＨの増殖培地中で（ｉ）の生産宿主細胞と発酵性炭素基質とを増殖培地中にチロシンを蓄積させるのに十分な時間接触させ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の増殖培地をチロシンアンモニアリアーゼと接触させ、
（ｉｖ）増殖培地のｐＨを、増殖培地中にパラ−ヒドロキシケイ皮酸を蓄積させるのに十分な時間約８．０〜約１１．０のｐＨに上昇させ、そして
（ｖ）場合により該パラ−ヒドロキシケイ皮酸を回収する、
逐次ステップを含んでなる、パラ−ヒドロキシケイ皮酸の生成方法を提供する。
【００１４】
別の実施態様では本発明は、
（ｉ）発酵性炭素基質と共に生育させるとフェニルアラニンを作る微生物生産宿主細胞を提供し、
（ｉｉ）生理的ｐＨの増殖培地中で（ｉ）の生産宿主細胞と発酵性炭素基質とを増殖培地中にフェニルアラニンを蓄積させるのに十分な時間接触させ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の増殖培地をフェニルアラニンアンモニアリアーゼと接触させ、
（ｉｖ）増殖培地のｐＨを、増殖培地中にケイ皮酸を蓄積させるのに十分な時間約８．０〜約１１．０のｐＨに上昇させ、そして
（ｖ）場合により該ケイ皮酸を回収する、
逐次ステップを含んでなる、ケイ皮酸の生成方法を提供する。
【００１５】
代案として本発明は、
（ｉ）発酵性炭素基質と共に生育させるとチロシンを作る微生物生産宿主細胞を提供し、
（ｉｉ）生理的ｐＨの増殖培地中で（ｉ）の生産宿主細胞と発酵性炭素基質とを増殖培地中にチロシンを蓄積させるのに十分な時間接触させ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で生成されたチロシンを増殖培地から単離し、
（ｉｖ）約８．０〜約１１．０のｐＨを有する溶液中で（ｉｉｉ）の単離されたチロシンとチロシンアンモニアリアーゼ源とをパラ−ヒドロキシケイ皮酸を蓄積させるのに十分な時間接触させ、そして
（ｖ）場合により該パラ−ヒドロキシケイ皮酸を回収する、
逐次ステップを含んでなる、パラ−ヒドロキシケイ皮酸の生成方法を提供する。
【００１６】
同様にして本発明は、
（ｉ）発酵性炭素基質と共に生育させるとフェニルアラニンを作る微生物生産宿主細胞を提供し、
（ｉｉ）生理的ｐＨの増殖培地中で（ｉ）の生産宿主細胞と発酵性炭素基質とを増殖培地中にフェニルアラニンを蓄積させるのに十分な時間接触させ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で生成されたフェニルアラニンを増殖培地から単離し、
（ｉｖ）約８．０〜約１１．０のｐＨを有する溶液中で（ｉｉｉ）の単離されたフェニルアラニンとフェニルアラニンアンモニアリアーゼ源とを増殖培地中にケイ皮酸を蓄積させるのに十分な時間接触させ、そして
（ｖ）場合により該ケイ皮酸を回収する、
逐次ステップを含んでなる、ケイ皮酸の生成方法を提供する。
【００１７】
別の実施態様では本発明は、
（ｉ）チロシンアンモニウムリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現する微生物生産宿主を提供し、そして
（ｉｉ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸が生成する約８．０〜約１１．０のｐＨで（ｉ）の該微生物生産宿主とチロシンとを接触させる、
逐次ステップを含んでなる、パラ−ヒドロキシケイ皮酸の生成方法を提供する。
【００１８】
代案の実施態様では本発明は、
（ｉ）フェニルアラニンアンモニウムリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現する微生物生産宿主を提供し、そして
（ｉｉ）ケイ皮酸が生成する約８．０〜約１１．０のｐＨで（ｉ）の該微生物生産宿主とフェニルアラニンとを接触させる、
逐次ステップを含んでなる、ケイ皮酸の生成方法を提供する。
【００１９】
本願明細書の一部をなす以下の詳細な説明、図面、および添付の配列説明から、本発明をより完全に理解できる。
【００２０】
配列説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  −  ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に合致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００２１】
配列番号１は、ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）からのフェニルアラニン−チロシンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ／ＴＡＬ）酵素をコードする遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号２は、ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）からのフェニルアラニン−チロシンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ／ＴＡＬ）酵素のアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号３〜６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４００９株を構築するのに使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号７および８は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＳ１５８株の成功した構築を確認するのに使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号９および１０は、ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）からのｐａｌ遺伝子を増幅するのに使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号１１および１２は、プラスミドｐＬＨ２７６を構築するのに使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）およびケイ皮酸（ＣＡ）の生成の収量および速度を改善する方法に関する。パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）およびケイ皮酸（ＣＡ）の生成のために、それぞれチロシンまたはフェニルアラニンのいずれかを生成する能力を有する微生物をチロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性またはフェニルアラニンアンモニウムリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する酵素の存在下で生育させる。芳香族カルボン酸生成物の生成収量および速度は、約８．０〜約１１．０のｐＨで増進される。
【００２８】
パラ−ヒドロキシケイ皮酸およびケイ皮酸の生成は、樹脂、エラストマー、コーティング、接着剤、自動車仕上げおよびインクの生成をはじめとするいくつかの産業上の利用においてモノマーとして有用である。例えばパラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）およびケイ皮酸（ＣＡ）を液晶ポリマー（ＬＣＰ）生成のためのモノマーとして使用してもよい。ＬＣＰは、対して、ガラス−遷移温度と等方性液体への遷移温度の間で中間またはメソ相を示す、または特定の範囲の濃度および温度において少なくとも１つのメソ相を有するポリマーである。これらのメソ相中の分子は液体のように挙動して流れるが、また結晶の異方性特性も示す。ＬＣＰは、液晶ディスプレーで、および電子、電気通信、および航空宇宙用途のための高速コネクタおよびフレキシブル回路で使用される。それらの滅菌放射線抵抗性、およびそれらの高酸素および水蒸気バリア特性のために、ＬＣＰは医療装置で、および化学および食物包装で使用される。
【００２９】
明細書および特許請求の範囲の解釈のために、以下の略語および定義が使用される。
【００３０】
「フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ」はＰＡＬと略される。
【００３１】
「チロシンアンモニア−リアーゼ」は、ＴＡＬと略される。
【００３２】
「パラ−ヒドロキシケイ皮酸」は、ｐＨＣＡと略される。
【００３３】
ここでの用法では「ケイ皮酸」および「シンナマート」という用語は区別なく使用され、ＣＡと略される。
【００３４】
「ＴＡＬ活性」という用語は、タンパク質がチロシンからｐＨＣＡへの直接転換を触媒する能力を指す。
【００３５】
「ＰＡＬ活性」という用語は、タンパク質がフェニルアラニンからケイ皮酸への転換を触媒する能力を指す。
【００３６】
「ｐａｌ」はＰＡＬ活性がある酵素をコードする遺伝子を表す。
【００３７】
「ｔａｌ」はＴＡＬ活性がある酵素をコードする遺伝子を表す。
【００３８】
「ＰＡＬ／ＴＡＬ活性」または「ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素」という用語は、ＰＡＬおよびＴＡＬ活性の双方を含有するタンパク質を指す。このようなタンパク質は、酵素基質として、チロシンおよびフェニルアラニンの双方に対して少なくともいくらかの特異性を有する。
【００３９】
ここでの用法では「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、区別なく使用される。
【００４０】
「遺伝子」とは、コード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）およびその後ろの調節配列（３’非コード配列）を含めた特異性タンパクを発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」または「野生型遺伝子」とは、それ自体の調節配列を有して自然界に見いだされる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界には一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される調節配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列された調節配列およびコード配列を含んでなっても良い。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中の自然な部位にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、常態では宿主生物に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。
【００４１】
「形質転換」は、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物体ゲノム中への核酸断片の転移を指す。形質転換核酸断片を含有する宿主生物体は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物体と称される。
【００４２】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」という用語は、多くは細胞の中心的代謝の一部でない遺伝子を保有して、通常環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源から誘導される、自律的複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直線または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、その中でいくつかのヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のため細胞中に適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を導入できるユニークな構造に、結合されまたは組換えられている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、異種宿主におけるその遺伝子の増強された発現を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。
【００４３】
「適切な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含んでも良い。
【００４４】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。概してコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、そっくりそのまま天然遺伝子から誘導されても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなっても良く、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえ良い。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発達段階において、あるいは異なる環境条件に呼応して、遺伝子の発現を導いても良いことが当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構築プロモーター」と称される。誘導刺激に応えてのみ作動するプロモーターは、「誘導可能プロモーター」と称される。誘導刺激としては、化学物質、一般的な代謝最終産物の存在、ならびに熱などの理学的刺激をはじめとする多様な作用因子が挙げられる。ほとんどの場合、調節配列のはっきりした境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しても良いこともさらに認識される。
【００４５】
「作動可能に連結した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターはコード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動可能に連結する（すなわちコード配列がプロモーターの転写制御の下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで調節配列に作動可能に連結できる。
【００４６】
「発現」という用語は、ここでの用法では、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子から遺伝子産物への転写および翻訳を意味することが意図される。発現において、遺伝子産物の配列をコードするＤＮＡ鎖は、最初に、メッセンジャーＲＮＡであることが多い相補的ＲＮＡに転写され、次に遺伝子産物がタンパク質であれば、このようにして転写されたメッセンジャーＲＮＡは、上述の遺伝子産物に翻訳される。
【００４７】
「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物体が代謝できる炭素源、特に単糖類、オリゴ糖類、多糖類、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルメート、および炭素含有アミンよりなる群から選択される炭素源および／またはそれらの混合物を指す。
【００４８】
「生産宿主」という用語は、高レベルでチロシンまたはフェニルアラニンを生成する能力を有する微生物（過剰生産株）を指す。さらに本発明の生産宿主は、ＴＡＬまたはＰＡＬ活性のいずれかを有する酵素をコードする遺伝子を含んでなってもよい。
【００４９】
「過剰生産株」とは、正常なまたは形質転換されていない微生物における生成レベルを超えるレベルで遺伝子産物を生成する組換え微生物を指す。過剰生産株という用語は、ここでの用法では、典型的にチロシンまたはフェニルアラニンのいずれかを過剰生産する微生物株を指す。
【００５０】
ここでの用法では「蓄積する」という用語は、芳香族アミノ酸に適用される場合、増殖培地内の芳香族酸濃度が経時的に増大することを意味する。
【００５１】
ここでの用法では「速度」という用語は、単位時間あたりに作られる生成物の量を意味し、生成物の量は例えばｇ／Ｌ、またはｍＭのような濃度で表される。
【００５２】
「収量」という用語は、発酵操作終了時における生成物の最終力価または生成物の最終濃度として定義されてもよい。
【００５３】
「生理的ｐＨ」または「生理的条件」という用語は、生産宿主が良好な生育と活性代謝を保持するｐＨ範囲を指す。ほとんどの細菌生産宿主は、約６．５〜約７．５のｐＨで最適に機能するが、その範囲外で最適に機能するものがあり、それらの「生理的ｐＨ」はそれらの主観的条件に対応する。例えば多くの酵母は３．５〜約７．５などの比較的低いｐＨで機能し、それはこれらの生物体の「生理的条件」に相当する。
【００５４】
ここでの用法では「アルカリ性ｐＨ」という用語は、８．０以上のｐＨを意味する。
【００５５】
ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローン化：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）、およびシルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７）で述べられている。
【００５６】
本発明は、発酵プロセスにおけるｐＨＣＡまたはＣＡの生成方法に関する。ケイ皮酸の生成は、フェニルアラニンとＰＡＬ活性を有する酵素との接触に続く。
［ＰＡＬ］
フェニルアラニン  →  ケイ皮酸
ｐＨＣＡの生成は、チロシンとＴＡＬ活性を有する酵素との接触に続く。
［ＴＡＬ］
チロシン  →  ｐＨＣＡ
【００５７】
典型的に本発明のプロセスは、二段階で進行する。一実施態様では、第１段階は、芳香族アミノ酸のチロシンまたはフェニルアラニンを生成する増大した能力を有する微生物生産宿主（過剰生産株）を提供することを含んでなる。これらの細胞を増殖培地中にアミノ酸が蓄積する時点まで生理的ｐＨで生育させる。この時点でさらに処理する前に、生育培地からチロシンまたはフェニルアラニンを単離することが最適かもしれないが、必ずしもそうしなくてもよい。発酵の第２段階では、約８．０〜約１１．０のｐＨで、細胞とＴＡＬ（チロシン生産細胞の場合）またはＰＡＬ（フェニルアラニン生産細胞の場合）のいずれかの供給源とを接触させる。この段階において、アミノ酸が比較的高い速度と収量で、対応する芳香族カルボン酸に転換される。
【００５８】
代案の実施態様でも、プロセスは二段階を含んでなる。しかしここでは、微生物生産宿主は芳香族カルボン酸を生成する能力と共に提供される。ここで過剰生産生産宿主は、ＴＡＬまたはＰＡＬのいずれかを発現する能力をさらに有する。第１段階では細胞を生理的ｐＨで生育させて芳香族アミノ酸蓄積させ、第２段階ではｐＨを約８．０〜約１１．０に増大させて、芳香族アミノ酸基質から対応する芳香族カルボン酸生成物への転換を最大化する。
【００５９】
ＴＡＬおよびＰＡＬ供給源
本発明は、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性またはフェニルアラニンアンモニウムリアーゼ（ＰＡＬ）活性のいずれかを有する酵素を利用する。これらの活性を有する酵素は遍在性であり、当業者によって容易に得られる。
【００６０】
フェニルアラニンアンモニウムリアーゼ（ＰＡＬ）、およびチロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）
ＰＡＬをコードする遺伝子は技術分野で知られており、いくつかは植物および微生物双方の供給源から配列決定されている（例えばＥＰ３２１４８８号明細書［Ｒ．トルロイデス（ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）］；国際公開第９８１１２０５号パンフレット［グランディスユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）およびラジアータマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ）］；国際公開第９７３２０２３号パンフレット［ペチュニア］；特開平０５１５３９７８号公報［エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）］；国際公開第９３０７２７９号パンフレット［ジャガイモ、イネ］を参照されたい）。ＰＡＬ遺伝子の配列は入手できる（例えばジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＡＪ０１０１４３およびＸ７５９６７を参照されたい）。ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）からのＰＡＬ酵素をコードする遺伝子は配列番号１で示される。
【００６１】
組換え宿主中での野生型ＰＡＬ遺伝子の発現が所望される場合、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）種、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種およびスポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）種などの酵母、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの細菌生物体、およびエンドウマメ、ジャガイモ、イネ、ユーカリ、マツ、トウモロコシ、ペチュニア、シロイヌナズナ、タバコ、およびパセリなどの植物をはじめとするがこれに限定されるものではない、あらゆる供給源から野生型遺伝子を得てもよい。本発明の文脈では、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）種、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種、ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、およびスポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）種の生物体から単離される遺伝子が好ましい。
【００６２】
ＴＡＬ活性だけを有する酵素、すなわちｐＨＣＡ生成のための基質としてチロシンのみを使用するものをコードする既知の遺伝子はない。上述のＰＡＬ酵素のいくつかは、チロシンに対していくらかの基質親和力を有する。したがってＴＡＬ活性をコードする遺伝子を上述のＰＡＬ遺伝子と同時に同定し、単離してもよい。例えばパセリ（アペール（Ａｐｐｅｒｔ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２５：４９１（１９９４））およびトウモロコシ（ハヴィア（Ｈａｖｉｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４８：１３０（１９７１））から単離されたＰＡＬ酵素は、どちらもチロシンを基質として使用する能力を実証する。同様に配列番号２で示されるロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）（ホジンズ（Ｈｏｄｇｉｎｓ）ＤＳ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：２９７７（１９７１））から単離されたＰＡＬ酵素もまた、チロシンを基質として使用するかもしれない。このような酵素は、ここではＰＡＬ／ＴＡＬ酵素または活性と称される。ＰＡＬ／ＴＡＬ活性をコードする野生型遺伝子を発現する組換え生物体を作り出すことが所望されるならば、ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）およびハヴィア（Ｈａｖｉｒ）、植物の生化学（Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ）；Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８１；第７巻、５７７〜６２５頁で述べられるように、トウモロコシ、コムギ、パセリ、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、スポロボロマイセス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）、およびロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）から単離された遺伝子を使用してもよく、そこではロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、トリコスポロン・クタニウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドバクター・スファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、およびロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）から単離された遺伝子が好ましい。
【００６３】
配列依存プロトコルを使用して、これらのまたは相同的な野生型遺伝子を得る方法は、技術分野でよく知られている。配列依存プロトコルの例としては、核酸ハイブリダイゼーション法、および核酸増幅技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））の様々な使用によって例証されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
例えば当業者によく知られている方法論を使用して、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして知られている配列の全部または一部を使用して、言及される活性（ＰＡＬ、またはＴＡＬ）のいずれかの相同体をコードする遺伝子を直接に単離し、あらゆる所望の植物、真菌、酵母、または細菌からのライブラリーをスクリーンできる。文献の核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、技術分野で知られている方法（前出のマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））によってデザインし合成できる。さらに配列全体を直接使用して、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニック翻訳、または末端−標識技術、またはＲＮＡプローブなどの当業者に知られている方法によって、利用できる生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転写システムを使用して、ＤＮＡプローブを合成できる。さらに特定のプライマーをデザインして、本配列の一部または全長を増幅するのに使用できる。得られた増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、プローブとして使用し、適切なストリンジェンシー条件下で全長ｃＤＮＡまたはゲノム断片を単離できる。
【００６５】
さらに文献配列の２本の短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応プロトコル中で使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同的な遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローンされた核酸断片のライブラリーにおいて実施してもよく、そこでは１つのプライマーの配列が文献配列から誘導され、その他のプライマーの配列は、細菌遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆物質の３’末端にトラクトするポリアデニル酸の存在を利用する。代案としては、第２のプライマー配列は、クローニングベクターから誘導される配列に基づいてもよい。例えば当業者はＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：８９９８（１９８８））に従って、ＰＣＲを使用して、転写物中の一点と３’または５’末端間の領域のコピーを増幅させ、ｃＤＮＡｓを生成できる。３’および５’方向を向いたプライマーは、文献配列からデザインできる。カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））から市販される３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステムを使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：５６７３（１９８９）；ロー（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：２１７（１９８９））。
【００６６】
一実施態様では、微生物生産宿主中で、または別の微生物細胞中で発現されるＴＡＬまたはＰＡＬ酵素を本発明で使用してもよい。適切な遺伝子による宿主細胞の形質転換方法については下で述べる。代案としてはｐＨがアルカリ性範囲にある時点で、発酵培養物に部分的に精製されたまたは精製された酵素を添加して、それによって所望の芳香族カルボン酸生成物の生成をもたらしてもよい。
【００６７】
精製されたまたは部分的に精製された酵素を得る方法は一般的であり、よく知られている。例えば以下の様にして、ＴＡＬまたはＰＡＬを微生物細胞から単離してもよい。細胞は、遠心分離または濾過をはじめとするが、これに限定されるものではない既知の方法を使用して培養液から分離される。細胞を洗浄し次にフレンチプレス、超音波破壊装置、ホモジナイザー、ダイノーミル（Ｄｙｎｏ  Ｍｉｌｌ）、またはその他の技術分野で既知の手段を使用して破壊し、無細胞抽出物を得る。無細胞抽出物を遠心分離して、細胞破片を除去する。一実施態様では、酵素活性源として無細胞抽出物を使用する。
【００６８】
場合により、硫酸アンモニウム沈殿、アニオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、粒径排除クロマトグラフィー、電気泳動法などをはじめとするがこれに限定されるものではない、技術分野で既知の方法を使用して、無細胞抽出物からＴＡＬまたはＰＡＬ酵素を精製する。ＴＡＬまたはＰＡＬ酵素が細胞外で生成される場合、無細胞抽出物について述べられるのと同様にして培養液を処理し、精製された酵素を得てもよい。
【００６９】
代案としては、使用に先だって酵素を固定化してもよい。細胞および酵素固定化の方法は、技術分野でよく知られている（例えばヴィータル（Ｗｅｅｔａｌ）、酵素学技法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第ＸＬＩＶ巻、Ｋ．モスバック（Ｍｏｓｂａｃｈ）編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７６）、ビカースタッフ（Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ）、酵素と細胞の固定化（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ）、生化学技法シリーズ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（１９９７）、およびテイラー（Ｔａｙｌｏｒ）、タンパク質固定化：基礎と応用（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、バイオプロセス技術（ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１４巻、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）を参照されたい）。例えばポリマーゲル内への捕捉、固体担体上への吸着、二官能性試薬を使用した共有架橋結合、またはガラス、ポリスチレン、ナイロン、またはポリアクリル酸誘導体などの不溶性マトリックスへの共有結合によって、ＴＡＬまたはＰＡＬ活性を有する酵素源を固定化してもよい。一実施態様では、無細胞抽出物または精製された酵素は、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手できるオキシランアクリルビーズへの共有結合によって固定化される。別の実施態様では、前出のビカースタッフ（Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ）によって述べられるように、アルギン酸カルシウムビーズ内への捕捉によって、野生型または組換え宿主細胞が固定化される。場合により、技術分野で既知のポリエチレンイミンおよびグルタルアルデヒドまたはその他の適切な架橋剤によって、捕捉された細胞を架橋してもよい。
【００７０】
微生物生産宿主
本発明は、芳香族アミノ酸、チロシン、およびフェニルアラニンを生成する能力を有する微生物生産宿主を提供する。この目的のためには、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）をはじめとするが、これに限定されるものではないいくつかの微生物宿主細胞が適切である。本発明の好ましい宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）である。
【００７１】
本発明の最も好ましい宿主細胞は、フェニルアラニンまたはチロシンのいずれかを過剰生産する細菌の変異株である。ＴＡＬ活性を有する酵素を使用したｐＨＣＡ生成では、チロシン過剰生産株が好ましい。代案としては、ＰＡＬ活性を有する酵素を使用したＣＡ生成では、フェニルアラニン過剰生産株が好ましい。
【００７２】
チロシン過剰生産株は知られており、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、ブレビバクテリア（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）が挙げられるがこれに限定されるものではない。特に有用なチロシン過剰生産株としては、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１０１５５、コリネバクテリウム・イリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｒｉｕｍ  ｌｉｌｌｉｕｍ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２２４３、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２３１１、アルスロバクター・シトレアス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｔｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ１１６２４、およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ＳＤ−２０が挙げられるが、これに限定されるものではない。その他の適切なチロシン過剰生産株は技術分野で知られており、例えばＬ−チロシンの微生物生産：レビュー（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ）、Ｔ．Ｋ．マイティ（Ｍａｉｔｉ）ら、Ｈｉｎｄｕｓｔａｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、第３７巻、５１〜６５、１９９５を参照されたい。さらに使用してもよいエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）チロシン過剰生産株の例は、マサチューセッツ州ケンブリッジのオムニジェン・バイオプロダクツ（ＯｍｎｉＧｅｎｅ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））から入手できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＹ１である。
【００７３】
フェニルアラニン過剰生産株は既知であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびブレビバクテリア（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）が挙げられるがこれに限定されるものではない。特に有用なフェニルアラニン過剰生産株としては、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１０１５５、コリネバクテリウム・イリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｒｉｕｍ  ｌｉｌｌｉｕｍ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２２４３、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２３１１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＳＴ７４、およびアルスロバクター・シトレアス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｔｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ１１６２４が挙げられるがこれに限定されるものではない。その他の適切なフェニルアラニン過剰生産株は既知であり、レビューが前出のマイティ（Ｍａｉｔｉ）ら、芳香族アミノ酸および誘導化合物の微生物生成の代謝工学（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、およびＪ．ボンガーテ（Ｂｏｎｇａｅｒｔｅｓ）ら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  第３巻、２８９〜３００、２００１にある。さらに使用してもよいフェニルアラニン過剰生産株の例は、バージニア州マナッサスの米国微生物系統保存機関からＡＴＣＣ株Ｎｏ．３１８８４として入手できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＳＴ７４である。
【００７４】
一実施態様では、生産宿主はＴＡＬまたはＰＡＬ活性を有する酵素をコードする遺伝子をさらに含有してもよい。代案の実施態様では、ＴＡＬおよびＰＡＬ酵素は、生産宿主でないが、これらの酵素の発現に単に適切である宿主中で発現させてもよい。どちらの場合も適切なベクターおよび形質転換技術を使用して、適切な宿主細胞中に遺伝子を導入する方法はよく知られており、プロトコルは一般に入手できる（前出のマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）参照）。
【００７５】
適切な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターまたはカセットは、技術分野で周知である。典型的にベクターまたはカセットは、関連性のある遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択可能マーカー、および自律的複製または染色体組み込みができるようにする配列を含有する。適切なベクターは、転写イニシエーション制御を含む遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。双方の制御領域が形質転換宿主細胞に相同的な遺伝子から誘導されることが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも産生宿主として選択された特定種に固有の遺伝子から誘導されなくて良いものと理解される。
【００７６】
所望の宿主細胞において本ＴＡＬまたはＰＡＬ遺伝子の発現を駆動させるのに有用なイニシエーション制御領域、またはプロモーターは多数有り、当業者には良く知られている。実質的にこれらの遺伝子を駆動できる、以下をはじめとするがこれに限定されるものではないあらゆるプロモーターが、本発明において適切である。ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）、およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現に有用）、ならびに例えばバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび様々なファージプロモーター。
【００７７】
終結制御領域はまた、好ましい宿主に固有の様々な遺伝子から誘導されても良い。場合により終結部位は必要ないかもしれないが、含まれることが最も好ましい。
【００７８】
一実施態様では、誘導可能プロモーター制御下にあるＴＡＬまたはＰＡＬ遺伝子のどちらかを含有するように、過剰生産株を操作することが有用かもしれない。このような実施態様では、増殖培地中に芳香族アミノ酸を蓄積するのに十分な時間、細胞を生理的ｐＨで生育させる。引き続いて誘導物質を培養に添加して、ｐＨをアルカリ性範囲に上昇させるのと同時にＴＡＬまたはＰＡＬ遺伝子の発現を刺激できる。この様にして単一細胞は、芳香族アミノ酸ならびに酵素の双方の供給源の役割を果たすことができる。誘導可能プロモーターは一般的であり、技術分野でよく知られている（前出のマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）参照）。
【００７９】
ひとたびベクターが構築されると、電気穿孔または接合などの一般的な技術によって宿主細胞を形質転換してもよい（前出のマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）参照）。
【００８０】
発酵条件
ひとたび所望の生産宿主が構築または選択されると、高レベルのｐＨＣＡまたはＣＡ生成のために本二段階法で使用してもよい。好ましい一実施態様では、チロシンまたはフェニルアラニンを過剰生産する能力を有する生産宿主を芳香族アミノ酸の蓄積を可能にするのに十分な時間、生理的ｐＨ（典型的に約６．５〜約７．５）で生育させる。典型的にこの段階の細胞は生育して静止相になる。芳香族アミノ酸の蓄積に続いて、宿主細胞によって生成される芳香族アミノ酸性質次第で、ＴＡＬまたはＰＡＬ活性のいずれかを有する酵素源に培養物を接触させる。この発酵の第２段階でシステムのｐＨは約８．０〜約１１．０のｐＨに上昇され、約９．５〜約１０．５のｐＨが好ましい。典型的にこれらの条件下で生産宿主は生存できなくなるが、芳香族カルボン酸生成物の生成速度と収量はこのｐＨで増進される。ｐＨが生理的条件に維持される一段培養において、収量の約４倍の改善が見られた。
【００８１】
代案の実施態様では、本発明は二段階で実施されてもよく、そこでは第１段階では生産宿主は、ＴＡＬまたはＰＡＬ活性のいずれかを有する酵素をコードする遺伝子を含んでなる。この実施態様では、生産宿主は適切な芳香族アミノ酸を過剰生産する能力を有するだけでなく、所望の芳香族カルボキシル生成物への転換に適した酵素も有する。したがってチロシン過剰生産宿主はＴＡＬ活性を有する酵素をコードする遺伝子によって形質転換され、フェニルアラニン宿主はＰＡＬ活性を有する酵素をコードする遺伝子によって形質転換される。第１段階の下で、生産宿主を生理条件（約６．５〜約７．５、工業的に有用な細菌および酵母では約３．５〜約７．５のｐＨ）下で生育させる。第２の段階では、ｐＨを約８．０〜約１１．０に上昇させて、ｐＨＣＡまたはＣＡ生成の増進した速度および収量をもたらす。
【００８２】
好ましい一実施態様では、発酵培養中のアンモニアのレベルを制御することが有用かもしれない。例えば培養中のアンモニアの存在は、ＴＡＬまたはＰＡＬが触媒する反応の速度および収量に対して阻害効果を有するかもしれない。したがって好ましくは発酵中での形成と同時のアンモニアの除去は、この反応の速度および収量を増強するかもしれない。アンモニアの除去は、技術分野でよく知られている手段によって達成してもよい。例えば曝気または鉱物クリノプチロライトなどの特定の吸着剤の添加、またはイオン交換樹脂が典型的に適切な手段である。
【００８３】
大規模商業的生成では、発酵は発酵槽内で行われることが期待される。撹拌タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、気泡発酵槽をはじめとするあらゆる適切な発酵槽またはそれらのあらゆる組み合わせを使用してもよい。微生物培養の維持と生育のための材料と方法については、微生物学または発酵科学当業者によく知られている（例えばベイリー（Ｂａｉｌｅｙ）ら、生化学工学基礎（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ）、第二版、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８６参照）。
【００８４】
特定の遺伝子発現のための微生物の特定の要件次第で、適切な増殖培地、ｐＨ、温度、および好気性、微好気性、または嫌気気性条件のための要件に考慮しなくてはならない。使用される増殖培地は重要でないが、使用する微生物の生育をサポートし、所望の生成物を生成するのに必要な酵素的経路を促進しなくてはならない。酵母抽出物またはペプトンなどの有機窒素源および発酵性炭素源を含有する天然培地と、最少培地と、合成培地をはじめとするがこれに限定されるものではない、従来の増殖培地を使用してもよい。
【００８５】
適切な発酵性炭素源としては、グルコースまたはフルクトースなどの単糖類、ラクトースまたはスクロースなどの二糖類、デンプンまたはセルロースなどのオリゴ糖類および多糖類、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルメートなどの一炭素基質、および炭素含有アミン、および／またはそれらの混合物が挙げられるがこれに限定されるものではない。適切な炭素源に加えて増殖培地は、アンモニウム塩、酵母抽出物またはペプトンなどの適切な窒素源、ミネラル、塩、補助因子、緩衝液、および当業者に知られているその他の構成要素を含有しなくてはならない（前出のベイリー（Ｂａｉｌｅｙ）ら）。
【００８６】
ｐＨＣＡおよびＣＡの回収
増殖培地からのｐＨＣＡまたはＣＡ回収方法が利用できる。好ましい一方法は、参照によってここに編入する同時係属中および同一譲受人の米国特許出願第１０／８２４２３７号明細書で教示される。簡単に述べると、方法は最初にｐＨＣＡまたはＣＡのいずれかを含有する発酵液体培地を約４．０以下のｐＨに酸性化して、次に抽出剤を添加することを伴う。この目的で有用な抽出剤は水非混合性有機溶剤であり、ジイソペンチルエーテル、安息香酸ｎ−プロピル、２−ウンデカノン、ジベンジルエーテル、２−トリデカノン、２−デカノン、１−ペンタノン１−フェニル、デカン酸メチル、１−ウンデカノール、ジイソブチルＤＢＥ−ＩＢ、およびそれらの混合物が挙げられるがこれに限定されるものではない。ｐＨＣＡまたはＣＡは抽出剤に溶解され、培養液から除去される。次に蒸留、樹脂による吸着、または分子ふるいによる分離などのよく知られている手段によって、抽出剤からｐＨＣＡまたはＣＡを回収してもよい。代案としては増殖培地の２．０未満のｐＨへの酸性化と続く結晶化によって、ｐＨＣＡまたはＣＡを回収してもよい。
【実施例】
【００８７】
以下の実施例で本発明をさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証のためにのみ提供されるものと理解されるべきである。上の考察とこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特性を確認でき、それを様々な用途と条件に適合させるために、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更と修正が出来る。
【００８８】
使用される略語の意味は次のとおり。「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｒｐｍ」は分あたり回転数を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学濃度を意味し、「ＯＤ５５０」は波長５５０ｎｍで測定された光学濃度を意味し、「ＯＤ６００」は波長６００ｎｍで測定された測定された光学濃度を意味し、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味し、「ｋＶ」はキロボルトを意味し、「μＦ」はマイクロファラッドを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＰａ」はキロパスカルを意味し、「ＳＬＰＭ」は分あたり標準リットルを意味し、「Ｆｅｒｍ．ｗｔ．」は液体発酵培地の重量を意味し、「％ｗ／ｗ」は重量％を意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／容量％を意味する。
【００８９】
一般方法：
細菌培養の維持および生育させるに適した材料および方法は、技術分野で良く知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、以下で述べられる。「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、フィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）。特に断りのない限りあらゆる化学薬品は試薬等級であり、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ））または同様の供給業者から得られた。酵母抽出物は、ニュージャージー州カールシュタットのマルコー・デベロップメント社（Ｍａｒｃｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｔａｄｔ，ＮＪ）から得られた。マズ（Ｍａｚｕ）ＤＦ２０４脱泡剤はニュージャージー州マウントオリブのＢＡＳＦ社（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．（Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ））から得られた。
【００９０】
実施例で使用したＬＢ培地は、１リットルの培地あたり以下を含有する。バクト−トリプトン（１０ｇ）、バクト酵母抽出物（５ｇ）、およびＮａＣｌ（１０ｇ）。
【００９１】
組換え細菌株の構築：
実施例で使用した組換え細菌株は、技術分野でよく知られており、前出のマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、前出のシルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ），Ｔ．Ｊ．、ベナン（Ｂｅｎｎａｎ），Ｍ．Ｌ．、およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ），Ｌ．Ｗ．、および前出のオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．らで述べられる標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用して構築された。
【００９２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４００９株の構築：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４００９株は、チロシン過剰生産性プラスミド非含有フェニルアラニン栄養要求株であり、マサチューセッツ州ケンブリッジのオムニジェン・バイオプロダクツ（ＯｍｎｉＧｅｎｅ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））から得られたチロシン過剰生産株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＹ１（ＤＧＬ４３０）からいくつかのステップで誘導された。最初にＴＹ１からそれが保有するプラスミドを除去して、ＴＳ５と称されるテトラサイクリン−感応性株を得た。引き続いてＴＳ５は、ｐｈｅＡ１８：：Ｔｎ１０を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＣＡＧ１２１５８（エール大学大腸菌遺伝子保存センター（Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）♯７４２１）を供与体として使用したＰ１−媒介形質導入の受容体であった。１つのテトラサイクリン抵抗性被形質導入体はＢＮＴ５６５．２と称された。
【００９３】
ここに参照として組み込んだ同時係属中および同一譲受人の米国特許出願第１０／７３４９３６号明細書でシュー（Ｓｕｈ）が述べる２個のＰＣＲ断片の組み込み法を使用して、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステムを通じて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＳ１５８株を構築した。部位特異的リコンビナーゼ標的配列（ＦＲＴ）に挟まれた、カナマイシン選択可能マーカーを含有する第１の線状ＤＮＡ断片（１５８１ｂｐ）をＰＣＲによって、プラスミドｐＫＤ４（ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびヴァナー（Ｗａｎｎｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：６６４０〜６６４５（２０００））から、ａｒｏＦ停止コドン上流領域の配列と一致するように選択された相同性アーム（下線４６ｂｐ）とプライミング配列（２０ｂｐ）を含有するＴ−ｋａｎ（ｔｙｒＡ）（５’−ＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＣＧＴＧＧＣＴＴＡＡＣＧＴＣＴＴＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧ−３’）（配列番号３）、およびＰｔｒｃプロモーターＤＮＡ断片の５’−末端領域中の配列と一致するように選択された相同性アーム（下線４２ｂｐ）、およびプライミング配列（２２ｂｐ）を含有するＢ−ｋａｎ（ｔｒｃ）（５’−ＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＧＧＡＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＧＡＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＴＣＣ−３’）（配列番号４）のプライマー対で合成した。−１０および−３５共通配列、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）、およびリボソーム結合部位（ｒｂｓ）を含んでなるＰｔｒｃプロモーターを含有する第２の線状ＤＮＡ断片（１６３ｂｐ）をＰＣＲによって、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））から得られるプラスミドｐＴｒｃ９９Ａから、ｋａｎ読み取り枠下流領域中の配列と一致するように選択された相同性アーム（下線１８ｂｐ）とプライミング配列（２２ｂｐ）を含有するＴ−ｔｒｃ（ｋａｎ）（５’−ＣＴＡＡＧＧＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＴＡＴＴＣＧＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＴ−３’）（配列番号５）、およびｔｙｒＡ開始コドン下流領域中の配列と一致するように選択された相同性アーム（下線４６ｂｐ）とプライミング配列（２０ｂｐ）を含有するＢ−ｔｒｃ（ｔｙｒＡ）（５’−ＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＴＧＡＴＣＧＣＧＴＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡ−３’）（配列番号６）のプライマー対で合成した。下線の配列はそれぞれの相同性アームを示し、一方残りは、ＰＣＲ反応のためにテンプレートＤＮＡ上の相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションするためのプライミング配列である。
【００９４】
標準ＰＣＲ条件を使用し、ウィスコンシン州マディソンのエピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのマスターアンプ（ＭａｓｔｅｒＡｍｐ）ＴＭ極長ＰＣＲキットを使用して、線状ＤＮＡ断片を次のようにして増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、１μＬのプラスミドＤＮＡ、２５μＬの２×ＰＣＲ緩衝液♯１、１μＬの５’−プライマー（２０μＭ）、１μＬの３’−プライマー（２０μＭ）、０．５μＬのマスターアンプ（ＭａｓｔｅｒＡｍｐ）ＴＭ極長ＤＮＡポリメラーゼ、および２１．５μＬの滅菌脱イオンＨ２Ｏを含有した。ＰＣＲ反応条件は次のとおり：９４℃で３ｍｉｎ、９３℃で３０ｓｅｃを２５サイクル、５５℃で１ｍｉｎ、および７２℃で３ｍｉｎ、続いて７２℃で５ｍｉｎ。ＰＣＲ反応完了後、カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのミニエリュート・キアクイック（Ｍｉｎｉ−ｅｌｕｔｅ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キットＴＭを使用して、ＰＣＲ生成物を精製した。高速での２回の遠心処理によって、ＤＮＡを１０μＬの蒸留水で溶出した。単離されたＰＣＲ生成物の濃度は約０．５〜１．０μｇ／μＬであった。
【００９５】
ＰＣＲ断片の遺伝子組み換えのために、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ発現プラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１株を宿主株として使用した。この株は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１８株（エール大学大腸菌遺伝子保存センター（Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）♯６６４９）中へのλ−Ｒｅｄリコンビナーゼ発現プラスミド、ｐＫＤ４６（ａｍｐＲ）（前出のダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびヴァナー（Ｗａｎｎｅｒ））の形質転換によって構築された。ｐＫＤ４６中のλ−Ｒｅｄリコンビナーゼは、アラビノース−誘導可能プロモーターの制御下で発現されるｅｘｏ、ｂｅｔ、およびｇａｍの３つの遺伝子を含んでなる。形質転換体は、３０℃で１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢプレート上で選択された。ｐＫＤ４６を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１株のエレクトロコンピテント細胞は次のようにして調製した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭＬ−アラビノース添加ＳＯＢ培地内で、ｐＫＤ４６を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１細胞をＯＤ６００が０．５になるまで３０℃で生育させ（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）、ＤＮＡクローニング：実用的アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、Ｄ．Ｍ．グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、１９８５、１０９〜１２５頁）、続いて氷上で２０ｍｉｎ冷却した。コネチカット州ニュートンのケンドロ・ラボラトリー（Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｎｅｗｔｏｎ，ＣＴ））からのソルヴァール（登録商標）ＲＴ７プラス（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）ＲＴ７  ＰＬＵＳ）を使用して、４℃で１０ｍｉｎ細菌細胞を４，５００ｒｐｍで遠心分離した。上清をデカントした後、ペレットを氷冷水に再懸濁し、再度遠心分離した。このプロセスを２回繰り返し、細胞ペレットを１／１００容量の氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。
【００９６】
カナマイシンマーカーＰＣＲ生成物（約１μｇ）およびＰｔｒｃプロモーターＰＣＲ生成物（約１μｇ）の双方を５０μＬのコンピテント細胞に混合し、氷上の予冷電気穿孔キュベット（０．１ｃｍ）にピペットで入れた。パルサーコントローラーを２００Ωに設定し、１．８ｋＶ、２５μＦに設定したカリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））からの遺伝子パルサーシステム（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して電気穿孔を実施した。電気穿孔後にＳＯＣ培地（１ｍＬ）を添加した。細胞を３７℃で１ｈ培養した。２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレートに、細胞のおよそ半分を広げた。プレートを３７℃で一晩培養した後、６個のカナマイシン抵抗性形質転換体を選択した。
【００９７】
ｔｙｒＡ遺伝子前のカナマイシン選択可能マーカーおよびＰｔｒｃプロモーター双方の染色体組み込みをＰＣＲ分析によって確認した。２３μＬのスーパーミックス（ＳｕｐｅｒＭｉｘ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、１μＬの５’−プライマーＴ−ｔｙ（ｔｅｓｔ）（５’−ＣＡＡＣＣＧＣＧＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＴＡＣＧＧ−３’）（配列番号７）、および１μＬの３’−プライマーＢ−ｔｙ（ｔｅｓｔ）（５’−ＧＣＧＣＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＣ−３’）（配列番号８）を含有する２５μＬのＰＣＲ反応混合物に、形質転換体のコロニーを再懸濁した。組み込み領域の近辺に位置する領域を増幅するように、試験プライマーを選択した。Ｔ−ｔｙ（ｔｅｓｔ）およびＢ−ｔｙ（ｔｅｓｔ）プライマー対によるＰＣＲ分析からは、予期されたサイズ、すなわち１％アガロース・ゲル上で１，９２８ｂｐの断片が明らかにされた。得られた組換え体を、ここでは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＳ１５８と称する。
【００９８】
次に強力なｔｒｃプロモーター駆動ｔｙｒＡ発現をもたらす染色体の修飾であるＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ［ＫａｎＲ］を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＳ１５８株上で生育したファージによる別のＰ１−媒介形質導入における受容体として、上述のようにして調製されたＢＮＴ５６５．２株を使用した。ｐｈｅＡおよびｔｙｒＡ遺伝子は染色体上で密接に連結しているので、テトラサイクリンおよびカナマイシンの双方に抵抗性の稀な被形質導入体について選択した。このような１つの被形質導入体はＤＰＤ４００９と称され、生育にフェニルアラニンを必要としチロシンを排出することが示された。
【００９９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４５１２株の構築：
ｐＫＫ２２３−３プラスミド中のロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ｐａｌ遺伝子を保有するプラスミドｐＣＡ１６を使用した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４００９株の形質転換、およびアンピシリン抵抗性に対する選択によって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４５１２株を構築した。プラスミドｐＣＡ１６を次のようにして調製した。フェニルアラニンを含有する天然培地で生育させた対数期細胞から精製した逆転写されたＲＮＡから、ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）（ＡＴＣＣＮｏ．１０７８８）ｐａｌ遺伝子、配列番号１（ジェンバンク登録番号Ｍ１８２６１）を増幅した。ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）としても知られているロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）をはじめとする様々な供給源からのｐａｌの遺伝子配列が決定され公開されている（エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ８２：６７３１〜６７３５（１９８５）；クレーマー（Ｃｒａｍｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３６７〜３８３（１９８９）；ロイス（Ｌｏｉｓ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：１６４１〜１６４８（１９８９）；ミナミ（Ｍｉｎａｍｉ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５：１９〜２５（１９８９）；アンソン（Ａｎｓｏｎ）ら、Ｇｅｎｅ  ５８：１８９〜１９９（１９８７）；ラスムセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）およびエーラム（Ｏｅｒｕｍ）、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、１：２０７〜２１１（１９９１））。
【０１００】
コネチカット州ノーウィッチのパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＣＴ））からのジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）キットの使用説明書に従って、ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理水なしで、ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ｍＲＮＡを逆転写した。使用したプライマーは、キットと共に提供されたランダム六量体であった。ｐａｌ遺伝子を増幅するのに使用したプライマーは、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ｐａｌ遺伝子をベースとして合成された、ＥｃｏＲＩ制限部位を含有する上流プライマー５’−ＡＴＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧＣＴＣＧＡＣＴＣＧＡ−３’（配列番号９）、およびＰｓｔＩ制限部位を含有する下流ＰＣＲプライマー５’−ＧＡＧＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＡＡＣＧ−３’（配列番号１０）を含んだ。ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩでＰＣＲ断片を消化し、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩであらかじめ切断したｐＫＫ２２３−３にライゲートしてｐＣＡ１６を形成した。
【０１０１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４５１５株の構築：
オランダ国バールンの真菌カルチャー中央事務局（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））から得られたｐＣＬ１９２０中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒｏＥＡＣＢＬ遺伝子を保有するプラスミドｐＣＬ１０１ＥＡを使用した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４００９株の形質転換、およびスペクチノマイシン抵抗性に対する選択によって、チロシン生成大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４５１５株を構築した。ここに参照として組み込んだバレ（Ｖａｌｌｅ）らに付与された米国特許出願公報第２００２／０１５５５２１号明細書（特に実施例７）で述べられるようにして、ｐＣＬ１０１  ＥＡプラスミドを構築した。
【０１０２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０４０株の構築：
プラスミドｐＣＡ１６を使用した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４５１５株の形質転換、およびアンピシリン抵抗性に対する選択によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０４０株を構築した。
【０１０３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０１３株の構築：
ｐＣＬ．ＰＡＬでの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４００９株の形質転換によって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０１３株を構築した。ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化を通じてｐＣＡ１６プラスミドからＰｔａｃプロモーター−Ｒ．グルティニス（ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＰＡＬ遺伝子カセットを単離し、プラスミドｐＣＬ１９２０のポリリンカー中のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位中にサブクローニングして、プラスミドｐＣＬ．ＰＡＬを構築した。ｐＣＬ．ＰＡＬはスペクチノマイシン抵抗性遺伝子を保有し、低コピープラスミド上でのＲ．グルティニス（ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＰＡＬ遺伝子の発現を可能にする。
【０１０４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０４１株の構築：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）チロシン生産株ＤＰＤ４５１５をプラスミドｐＬＨ２７６で形質転換して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０４１株を構築した。プラスミドｐＬＨ２７３からプラスミドｐＬＨ２７６を次のようにして構築した。プラスミドｐＬＨ２７３は、マサチューセッツ州ベバリーのニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））から入手できるプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録番号Ｘ０６４０３）中にクローンされたバクテリオファージＴ５プロモーターカセットを含有する。ＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ消化によってカリフォルニア州バレンシアのキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））から得られるｐＱＥ７０からＴ５プロモーターカセットを単離した。複数クローニング部位が続くＴ５プロモーターを含有するこのＤＮＡ断片を適合性ＳａｌＩおよびＸｂａＩ制限酵素によって消化されたプラスミドｐＡＣＹＣ１８４にライゲートし、プラスミドｐＬＨ２７３を得る。プラスミドｐＬＨ２７３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質発現のためのｐ１５Ａ複製起源がある低コピー安定発現ベクターである。
【０１０５】
カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのＰｆｘＤＮＡポリメラーゼにより、５’−ＣＴＣＧＣＴＣＧＡＣＴＣＧＡＴＣＴＣＧＣＡＣＴＣＧＴＴＣＧＣＡＡＡＣＧ−３’（配列番号１１）の５’ＰＣＲプライマー、および５’−ＴＴＧＡＡＣＴＣＧＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧＣＧＣＧＣＡＡＧＴＣＧ−３’（配列番号１２）の３’ＰＣＲプライマーを使用して、ｐＣＡ１６からのｐａｌ遺伝子のＰＣＲ増幅によってプラスミドｐＬＨ２７６を生成した。ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素によってこのＰＣＲ断片を消化し、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＬＨ２７３ベクター中にライゲートして、ｐＬＨ２７６を得た。プラスミドｐＬＨ２７６は、強力なＴ５プロモーター下のＲ．グルティニス（ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＰＡＬ酵素の発現ベクターである。
【０１０６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０４７株の構築：
ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））から得られた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株［遺伝子型：ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｈｓｄＲ１７  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１  ｆ８０ｌａｃＺ  ｄＭ１５  ｄ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９（ＤＥ３）］を上述のプラスミドｐＣＡ１６で形質転換して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０４７株を構築した。この株は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ宿主中のＲ．グルティニス（ｇｌｕｔｉｎｉｓ）からのＰＡＬ酵素を発現する。
【０１０７】
チロシン、フェニルアラニン、ＣＡ、およびｐＨＣＡのＨＰＬＣ判定：
自動サンプルラー、ダイオードアレイ検出器、およびデータ取得と処理のためのケムステーション（ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ）を装着した、デラウェア州ウィルミントンのアジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））からのアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）ＨＰ１１００  ＨＰＬＣシステムで、逆相クロマトグラフィーを使用して、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ＣＡ、およびｐＨＣＡについてサンプルを分析した。３５℃に温度自動調節した、アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）から得られた４．６ｍｍ×１５ｃｍのゾルバック（Ｚｏｒｂａｘ）ＳＢ−Ｃ１８カラム（３．５μｍ粒度）を使用して分析を行った。１．０ｍＬ／ｍｉｎの流速を使用して、０．１％トリフルオロ酢酸含有５％アセトニトリル／水から、０．１％トリフルオロ酢酸含有８０％アセトニトリル／水への８分間の溶剤勾配で、サンプルを流した。２１０、２６０、および２８０ｎｍに設定したダイオードアレイ検出器を使用して、様々な化合物をそれらの最適吸光度波長で検出した。
【０１０８】
ＨＰＬＣへの５０μＬのサンプルの注入前に、水性サンプルを水で１：３に希釈した。それぞれ１ｍｇ／ｍＬ濃度の個々の構成要素の等分の溶液を混合して、分析物の標準混合物を調製した。
【０１０９】
ＰＡＬおよびＴＡＬ活性の分光光度分析：
チロシンアンモニアリアーゼ活性およびフェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を判定するのに使用される方法は、アベル（Ａｂｅｌｌ）およびシェン（Ｓｈｅｎ）によって報告される方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４２：２４２〜２４８（１９８７））に基づく。ＰＡＬ活性を判定するために、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液中に１ｍＭＬ−フェニルアラニンを含有する溶液に無細胞抽出物を添加して、反応を開始させる。モル吸光係数９０００ｃｍ−１を使用して、２９０ｎｍで生成物シンナマートの吸光度をモニタリングして、反応を分光光度的に追跡した。０．００７５〜０．０１８／ｍｉｎの範囲で吸光度に変化を生じる酵素量を使用して、３分間にわたりアッセイを実施した。活性の１単位は、毎分１μｍｏｌのフェニルアラニンを脱アミノしてシンナマートにする酵素量として定義される。
【０１１０】
反応溶液中のフェニルアラニンを置換するチロシンによって、ＴＡＬ活性を同様に測定した。吸光係数１０，０００ｃｍ−１で、生成したパラ−ヒドロキシシンナマートの吸光度を３１５ｎｍで追跡した。活性の１単位は、毎分１μｍｏｌのチロシンを脱アミノしてパラ−ヒドロキシシンナマートにする酵素量として定義される。Ｒ．グルティニス（ｇｌｕｔｉｎｉｓ）酵素では、本発明者らはＴＡＬ活性がＰＡＬ活性の１／６であることを見いだし、多くの場合、ＰＡＬ活性測定からＴＡＬ活性を推定した。
【０１１１】
実施例１〜１２
二段階発酵におけるｐＨＣＡ生成に対するｐＨの効果
これらの実施例の目的は、様々な組換え株によるｐＨＣＡ生成に対して、発酵中にｐＨを増大させることの効果を実証することであった。これらの実施例では、初期ｐＨ６．５〜７．０で発酵を実施し、発酵中にｐＨをｐＨ６．１〜９．７に一度に変化させた。
【０１１２】
これらの実施例で使用された株は、上述のようにして構築した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０１３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４５１２、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０４０であった。これらの株はＲ．グルティニス（ｇｌｕｔｉｎｉｓ）からのｐａｌ遺伝子の組み込みによって、チロシン過剰生産、および生成チロシンのｐＨＣＡへの転換のためにデザインされた組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。これらの試行においてフェニルアラニンが副産物として生成され、ＰＡＬ活性によりＣＡに転換された。
【０１１３】
発酵プロトコル：
前種培養は所望の組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の凍結培養物であった。種培養をニュージャージー州エディソンのニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ））からのジャイロトリー（ｇｙｒｏｔｏｒｙ）振盪機内で３００ｒｐｍおよび３５℃でインキュベートし、５００ｍＬの種培地と共に２Ｌフラスコ内でおよそ１５ｈ生育させた。種培地は、ＫＨ２ＰＯ４（１ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（３ｇ／Ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（３ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．３ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（１ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ（１５．７ｇ／Ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン（１０ｍｇ／Ｌ）から成った。ＮａＯＨを使用してｐＨを６．８に調節した。グルコースおよびスペクチノマイシンを無菌的に添加して、それぞれ１０ｇ／Ｌおよび５０ｍｇ／Ｌの最終濃度を得た。
【０１１４】
発酵をドイツ国メレサンゲンのブラウン・バイオテック・インターナショナル（Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｍｅｌｅｓｕｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））からの１４Ｌブラウン（Ｂｒａｕｎ）発酵槽バイオスタット（Ｂｉｏｓｔａｔ）Ｃ．Ｂ．内で行った。発酵培地は以下から成った。７．５Ｌ容量中にＫＨ２ＰＯ４（７ｇ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（１７ｇ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（４ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（８ｇ）、チアミン（８ｍｇ）、フェニルアラニン（３２０ｍｇ）、およびマズ（Ｍａｚｕ）ＤＦ２０４脱泡剤（８ｍＬ）、ｐＨ６．５に調節。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４５１２およびＤＰＤ５０４０株では、５ｇ／Ｌの酵母抽出物を発酵培地に添加して、初期ｐＨは７．０であった。発酵培地の滅菌後、２６７ｇのグルコース溶液（６０％ｗ／ｗ）、１６０ｍＬの微量元素、および８ｍＬのスペクチノマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を無菌的に添加した。微量元素溶液の組成を表１に示す。
【０１１５】
【表１】
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【０１１６】
４００から１５００ｒｐｍへの撹拌カスケードと、それに続く２〜１０ＳＬＰＭの曝気で、溶存酸素濃度を空気飽和の２５％に調節した。温度を３５℃に調節し、頭部圧力は５０ｋＰａであった。２０％ｗ／ｖのＨ３ＰＯ４および４０％ｗ／ｖのＮＨ４ＯＨによってｐＨを６．５または７に調節した。グルコース（６０％ｗ／ｗ）を添加して、発酵を流加様式で行った。濃度が４ｇ／Ｌ未満に低下したらグルコース供給を開始した。以下の式を使用してグルコース供給速度をｇ／ｍｉｎで計算した。ＯＤ５５０×Ｆｅｒｍ．ｗｔ．×０．００１７６２。グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌを超えたらグルコース供給速度を低下させ、グルコース濃度を０．５ｇ／Ｌ未満に保った。培養密度が８〜１０のＯＤ５５０に達したら、ＩＰＴＧを１ｍＭの濃度に添加した。
【０１１７】
特定時間後、ｐＨを表２に示すように変化させた。ｐＨ変化が０．４単位を超える場合は常に、２ｈ毎に０．４ｐＨ単位の変化で、数段階の変化で断続的に行った。５０％ｗ／ｖのＫＯＨの添加によってｐＨを変化させた。サンプルを様々な時点で採取し、上述のようにＨＰＬＣを使用して、培養中のｐＨＣＡ、ＣＡ、Ｐｈｅ、およびＴｙｒ濃度を判定した。７２ｈ後に判定したｐＨＣＡ濃度を表２に示す。
【０１１８】
【表２】
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【０１１９】
表２に示す結果から分かるように、試行中のｐＨの変化は、ｐＨＣＡ生成に対して顕著な効果を有した。ｐＨ変化なしのｐＨＣＡ生成の例を図１に示す。ｐＨＣＡおよびＴｙｒの生成は９〜７２ｈの間でほとんど一定であり、１．３ｇ／ＬのｐＨＣＡおよび７ｇ／ＬのＴｙｒ濃度で終了した。８．４へのｐＨ変化で得られた結果の例を図２に示す。ｐＨ変化時に、ｐＨＣＡ生成の急激な増大およびＴｙｒ濃度の急激な減少が観察され、１．７ｇ／ＬのｐＨＣＡおよび０．３ｇ／ＬのＴｙｒ濃度で終了した。より高いｐＨにおけるｐＨＣＡ生成の改良は、ｐＨ６．１〜７．５でのｐＨＣＡ毒性の緩和、および７．８を超えるｐＨでのＴＡＬ活性の改良および改善されたＴｙｒの酵素への接触性に起因するかもしれない。
【０１２０】
これらの結果は、ｐＨが発酵中にアルカリ性値に増大する二段階発酵における、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え株によるｐＨＣＡの増進された生成を実証する。
【０１２１】
実施例１３〜１７
チロシンからｐＨＣＡへの生体触媒転換に対するｐＨの効果（研究♯ＦＬ−２００３−１６）
これらの実施例の目的は、ＴＡＬ酵素活性を含有する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を使用したチロシンからｐＨＣＡへの生体触媒転換に対するｐＨの効果を実証することであった。ＴＡＬ活性を有する培養物を生成するのに使用されるプロトコルについては、実施例１〜１２で述べられている。
【０１２２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＤ４５１２株を含有する実施例８からの細胞培養液のサンプル（１０ｍＬ部分）を１２５ｍＬバッフル付フラスコに分配し、Ｌ−Ｔｙｒを１０ｇ／Ｌの濃度に添加して、濃ＫＯＨまたはＨ２ＳＯ４によってｐＨを様々な値に調節した。
【０１２３】
ニュー・ブランズウィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｃｏ．）からの培養振盪機（イノバ（Ｉｎｎｏｖａ）４０００）内で、３５℃および３００ｒｐｍでフラスコをインキュベートした。様々な時点でサンプルを採取し、上述のようにＨＰＬＣを使用してｐＨＣＡについて分析した。ｐＨ条件および生成したｐＨＣＡ濃度を表３に要約する（参照番号ＦＬ−２００３−１６）。
【０１２４】
【表３】
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【０１２５】
表３の結果から分かるように、ｐＨをアルカリ性値に上昇させることで、ｐＨＣＡ生成速度は顕著に増大する。生体触媒転換の最適ｐＨは９．５〜１０．５であると推定される。
【０１２６】
４５℃までの様々な温度で同様の研究を実施した。転換の初期速度は４０〜４５℃の温度で増進した。しかしより高い温度では、ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素が時間と共に活性を失った。したがってｐＨＣＡ収量はこれらの温度では改善されなかった。
【０１２７】
実施例１８〜２０
チロシンへの発酵およびｐＨＣＡへの生体触媒転換から成る二段階プロセスにおけるｐＨＣＡ生成
これらの実施例の目的は、異なる細胞量を使用した、チロシンを生成する発酵、および引き続くチロシンからｐＨＣＡへの生体触媒転換から成る二段階プロセスを通じたｐＨＣＡの生成を実証することであった。チロシンへの発酵後、ＴＡＬ活性を有する細胞を発酵培地に添加してｐＨを１０．０に調節した。
【０１２８】
チロシンを生成する発酵
この実施例で使用される株は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４５１５であった。種培養の生成および発酵のプロトコルは、実施例１〜１２で述べたのと同様であった。
【０１２９】
発酵中、撹拌カスケードと続く曝気で溶存酸素濃度を空気飽和の２５％に調節した。撹拌は５００〜１５００ｒｐｍ、そして曝気は２〜８ＳＬＰＭで変化させた。頭部圧力を５０ｋＰａに調節した。最初にＮＨ４ＯＨ（４０％ｗ／ｖ）、４５ｈ後にＫＯＨ（５０％ｗ／ｖ）の添加、およびＨ３ＰＯ４（２０％ｗ／ｖ）での酸滴定によってｐＨを６．８に維持した。濃度が４ｇ／Ｌ未満に低下したら、６０％ｗ／ｗグルコース溶液でグルコース供給を開始した。最初の４０ｈについて、以下の式を使用してグルコース供給速度を計算した。供給速度ｇ／ｍｉｎ＝ＯＤ５５０×Ｆｅｒｍ．ｗｔ．×０．００３０８４。４０ｈ後は以下の式を使用した。供給速度ｇ／ｍｉｎ＝ＯＤ５５０×Ｆｅｒｍ．ｗｔ．×０．００１７６２。０．５ｇ／Ｌを超えてグルコースが蓄積した場合、より低いグルコース供給速度を使用した。培養密度が８〜１０のＯＤ５５０に達したら、ＩＰＴＧを１．０ｍＭの濃度に添加した。発酵は７２ｈで終結した。上述のように行った３回の発酵を、同時に行った（ｐＨＣＡ２１２、−２１３、および−２１４）。サンプルを発酵中に様々な時点で取り出して、上述のようにＨＰＬＣを使用して、チロシン（Ｔｙｒ）およびフェニルアラニン（Ｐｈｅ）濃度を判定した。このような１回の試行の結果を表４に示す（試行番号ｐＨＣＡ２１２）。
【０１３０】
【表４】
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【０１３１】
７２ｈ後、ＴｙｒおよびＰｈｅはそれぞれ１９．３および１．６ｇ／Ｌの濃度に蓄積した。
【０１３２】
チロシンからｐＨＣＡへの生体触媒転換：
発酵液をそれらの元の発酵槽内で容量を５Ｌに減少させた。実施例１１で述べられるようにして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０４０の発酵から得た凍結細胞ペーストを解凍し、２７６ｇ、９２ｇ、および２７．６ｇの３つの画分に分配した。ｐＨ１０．０の０．５Ｌの冷０．０５Ｍカリウムリン酸緩衝液中で各画分を均一に懸濁し、各懸濁液を対応する発酵槽にポンプで入れた。ＫＯＨ（５０％ｗ／ｖ）およびＨ３ＰＯ４（２０％ｗ／ｖ）の添加によってｐＨを１０．０に調節した。上述のようなＨＰＬＣを使用したＴｙｒ、Ｐｈｅ、ｐＨＣＡ、およびＣＡの判定のために、様々な時点でサンプルを採取した。３回の試行の結果を表５に示す。
【０１３３】
【表５】
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【０１３４】
結果は、生成したｐＨＣＡおよびＣＡの量が時間と共に増大し、ＰＡＬ／ＴＡＬ活性を保有する細胞の量がより多ければ、生物転換速度がより早いことを示す。
【０１３５】
様々な株と適切な抗生物質に関する生体触媒研究のためにＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を生成するのに、同様の手順が使用される。典型的なプロセスでは、細胞は５５〜６５ｈで回収され、４００〜６００ｇの湿潤細胞のペーストが得られる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０４０中の典型的な活性は、タンパク質1グラムあたり１２０〜６００単位のＰＡＬ、およびタンパク質1グラムあたり２０〜１００単位のＴＡＬである。同一条件で生育させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０４１中の活性は、タンパク質1グラムあたり１２〜３６単位のＰＡＬ、およびタンパク質1グラムあたり２〜６単位のＴＡＬであり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０４７中では、活性はタンパク質1グラムあたり１２０単位のＰＡＬ、およびタンパク質1グラムあたり２０単位のＴＡＬである。ＴｙｒからｐＨＣＡへの生体触媒転換は１０〜５００単位／ＬのＴＡＬで都合良く実施でき、ＰｈｅからＣＡへの転換は６０〜３０００単位／ＬのＰＡＬで都合良く実施できる。
【０１３６】
実施例２１〜２７
フェニルアラニンからケイ皮酸への生体触媒転換に対するｐＨの効果（実験♯ＦＬ−２００４−１２）
これらの実施例の目的は、ＰＡＬ酵素活性を含有する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を使用した、フェニルアラニンからＣＡへの転換に対するｐＨの効果を実証することである。
【０１３７】
これらの研究は、表６で特定するように、２５０ｍＬのバッフル付フラスコ内に、０．０７５ＭのＣＡＰＳ緩衝液、２１ｇ／Ｌの湿潤細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０４７）、シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）から得られた７ｇ／Ｌのフェニルアラニンを含有するｐＨ８〜１１の５０ｍＬの反応混合物を使用して実施した。
【０１３８】
ニュー・ブランズウィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｃｏ．）からの培養振盪機（イノバ（Ｉｎｎｏｖａ）４０００）内で、３５℃および３００ｒｐｍでフラスコをインキュベートした。１．５ｈにおいてサンプルを採取し、上述のようにＨＰＬＣを使用してＣＡについて分析した。ｐＨ条件および生成したｐＨＣＡ濃度を表６に要約する。結果はＰｈｅからＣＡへの転換の最適ｐＨが９．５〜１０．５であることを示唆する。
【０１３９】
【表６】
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【０１４０】
実施例２８
チロシンからｐＨＣＡへの転換に対するアンモニウムイオンの効果（実験♯ＦＬ−２００４−１１）
この実施例の目的は、チロシンからｐＨＣＡへの生体触媒転換に対するアンモニウムイオン濃度の阻害効果を実証することであった。
【０１４１】
これらの研究は、２５０ｍＬのバッフル付フラスコ内の５０ｍＬの反応混合物を使用して実施した。反応混合物は、０．１ＭのＣＡＰＳ緩衝液、６１ｇ／Ｌの湿潤細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０４７）、シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）またはニュージャージー州フィリップスバーグのＪ．Ｔ．ベーカー（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ））から得られた４６．５ｇ／Ｌのチロシン、および様々な濃度のＮＨ４Ｃｌを含有した。ＫＯＨでｐＨを１０．０に調節した。ニュー・ブランズウィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｃｏ．）からの培養振盪機（イノバ（Ｉｎｎｏｖａ）４０００）内で、３５℃および３００ｒｐｍでフラスコをインキュベートした。反応混合物内のｐＨをＫＯＨで毎日ｐＨ１０．０に調節した。２４および７２ｈにおいてサンプルを採取し、上述のようにＨＰＬＣを使用してｐＨＣＡ濃度を判定した。
【０１４２】
結果を表７に要約する。表のデータから分かるように、アンモニウムイオンは約１００ｍＭを超える濃度で阻害性であり、４００ｍＭのアンモニウムイオン濃度で２０％のｐＨＣＡ生成の減少が観察された。
【０１４３】
【表７】
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【０１４４】
実施例２９
チロシンへの発酵およびｐＨＣＡへの生体触媒転換から成る二段階プロセスにおけるｐＨＣＡの生成
この予言的実施例の目的は、次に増殖培地から単離されるチロシンを生成する発酵、および単離されたチロシンのｐＨＣＡへの引き続く生体触媒転換から成る二段階プロセスを通じたｐＨＣＡの生成について述べることである。
【０１４５】
チロシンは、実施例１８〜２０で述べられるようにして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４５１５を使用した発酵によって生成される。７２ｈ後に発酵を停止させ、低速遠心分離を使用して発酵液からチロシンを分離する。得られる沈殿物を水に懸濁し、低速遠心分離を使用して再度分離する。次にチロシンを発酵槽に戻し、それを約７．５ｋｇの水で満たし、５０％ｗ／ｗの水酸化ナトリウムを使用してｐＨを１０．０に調節する。実施例１１で述べられる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ５０４０の発酵からの凍結細胞ペーストを解凍し、２５０ｇをｐＨ１０．０の０．５Ｌの冷０．０５Ｍカリウムリン酸緩衝液に均一に懸濁する。細胞懸濁液を発酵槽にポンプで入れる。発酵槽を３５℃および６００ｒｐｍで作動させ、水酸化ナトリウム（５０％ｗ／ｗ）およびＨ３ＰＯ４（２０％ｗ／ｖ）の添加によってｐＨを１０．０に調節する。生体触媒反応を１６ｈ進行させてｐＨＣＡを生成し、それは反応培地内に蓄積する。ｐＨＣＡ含有する培地を遠心分離して、固形物を廃棄する。上清を３５℃および６００ｒｐｍで作動する発酵槽に移す。２０％ｗ／ｖの硫酸を使用して溶液のｐＨを９．０に調節する。次にデンマーク国２８８０バグスバード、クログスホエイフェイ３６のノボザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｋｒｏｇｓｈｏｅｊｖｅｊ  ３６，２８８０  Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から得られる０．２５４ｍＬのアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）（登録商標）、およびペンシルベニア州ピッツバーグのフィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ））から得られる０．１３４ｇのアクロス・オルガニックス（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）ブロメライン（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）を添加する。１ｈのインキュベーション後、溶液を２０％ｗ／ｖでｐＨ２．２に滴定し、ｐＨＣＡを沈殿させる。得られる懸濁液を遠心分離し、ｐＨＣＡを湿潤ケークとして回収する。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】ｐＨ変化がない発酵中の生育およびｐＨＣＡ生成を示す。
【図２】２４時間後にｐＨを８．４に変化させた発酵中の生育およびｐＨＣＡ生成を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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