(57)【要約】  プロテインキナーゼＣシータ（ＰＫＣθ）の三次元構造は、ＰＫＣθと相互作用する物質の設計方法において使用できる。該物質はＰＫＣθ活性の阻害剤であり得る。
2007533309.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＫＣθポリペプチドを含む結晶を含有する組成物。
【請求項２】
ＰＫＣθポリペプチドがＰＫＣθの触媒ドメインを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ＰＫＣθポリペプチドが本質的にＰＫＣθの触媒ドメインからなる、請求項１または２いずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
ＰＫＣθポリペプチドが配列番号１の残基３７７〜６９６を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
ＰＫＣθに結合した物質をさらに含む、請求項１〜５いずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
該物質がＰＫＣθ基質である、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
該物質がＰＫＣθ阻害剤である、請求項５または６いずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
ＰＫＣθ阻害剤がスタウロスポリンである、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
結晶が少なくとも３．５Åの分解能でＸ線を回折し得る、請求項１〜８いずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
結晶構造が表２の構造座標を含み、アルファ炭素についての±標準偏差が最大１．５Åである、請求項１〜９いずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＰＫＣθと相互作用する物質の設計方法であって、ＰＫＣθの三次元モデルを作成することを含む、方法。
【請求項１２】
ＰＫＣθの三次元モデルがＰＫＣθの触媒ドメインの三次元モデルである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
三次元モデルがＰＫＣθの原子の構造座標を含む、請求項１１または１２いずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
構造座標が実験的に決定される座標である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
原子がＰＫＣθの活性部位の原子である、請求項１３または１４いずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
構造座標が表２に記載のものであり、アルファ炭素原子についての±標準偏差が最大１．５Åである、請求項１３〜１５いずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
三次元モデルが物質の原子の構造座標を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
三次元モデルの物質の構造を改変することをさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
三次元モデルの物質の構造座標を改変することをさらに含む、請求項１７または１８いずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
三次元モデルが、ＰＣＫθの残基Ｌｅｕ３８６、Ｇｌｙ３８７、Ｇｌｙ３８９、Ｖａｌ３９４、Ａｌａ４０７、Ｌｙｓ４０９、Ｖａｌ４２２、Ｍｅｔ４５８、Ｇｌｕ４５９、Ｔｙｒ４６０、Ｌｅｕ４６１、Ｇｌｙ４６４、Ｌｅｕ４６６、Ａｓｐ５０８、Ａｓｎ５０９、Ｌｅｕ５１１、Ａｌａ５２１およびＡｓｐ５２２の原子からなる群より選択される原子の構造座標を含む、請求項１１〜１９いずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
三次元モデルが、ＰＣＫθの残基Ｇｌｕ４２８、Ａｒｇ５０３、Ａｓｐ５０４、Ｌｙｓ５２７、Ｔｈｒ５３６およびＴｈｒ５３８の原子からなる群より選択される原子の構造座標を含む、請求項１１〜２０いずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
三次元モデルが、ＰＣＫθの残基Ｌｙｓ４１３、Ｖａｌ４１６、Ｌｅｕ４１７、Ｖａｌ４２２、Ｍｅｔ４２６、Ｌｙｓ４２９、Ｔｈｒ４４７、Ｇｌｎ４４９、Ｌｅｕ４５４、Ｐｈｅ４５６、Ｐｈｅ６９１、Ａｒｇ６９２、Ａｓｎ６９３、Ｐｈｅ６９４およびＳｅｒ６９５の原子からなる群より選択される原子の構造座標を含む、請求項１１〜２１いずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＫＣθおよび物質間の適合を測定することをさらに含む、請求項１１〜２２いずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
適合の測定がＰＫＣθの原子および物質の原子間の距離を計算することを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＰＫＣθの原子および物質の原子間の距離を計算することをさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２６】
物質の三次元モデルをＰＫＣθの三次元モデルにドッキングさせることをさらに含む、請求項１１〜１６いずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＫＣθポリペプチドを含有する組成物を提供することをさらに含む、請求項１１〜２６いずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ＰＫＣθポリペプチドが結晶性である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
組成物がＰＫＣθと相互作用する物質を含有する、請求項２７または２８いずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ＰＫＣθの触媒活性を測定することをさらに含む、請求項２７〜２９いずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ＰＣＫθの触媒活性を測定し、次いで、物質の存在下で測定したＰＣＫθの触媒活性を物質の不存在下で測定したＰＣＫθの触媒活性と比較することをさらに含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
ＰＫＣθと相互作用する物質の設計方法であって、ＰＫＣθの原子の構造座標を含むＰＫＣθの三次元モデルを作成することを含む、方法。
【請求項３３】
三次元モデルが、残基Ｌｅｕ３８６、Ｇｌｙ３８７、Ｇｌｙ３８９、Ｖａｌ３９４、Ａｌａ４０７、Ｌｙｓ４０９、Ｖａｌ４２２、Ｍｅｔ４５８、Ｇｌｕ４５９、Ｔｙｒ４６０、Ｌｅｕ４６１、Ｇｌｙ４６４、Ｌｅｕ４６６、Ａｓｐ５０８、Ａｓｎ５０９、Ｌｅｕ５１１、Ａｌａ５２１およびＡｓｐ５２２の原子からなる群より選択される原子の構造座標を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
三次元モデルが、残基Ｇｌｕ４２８、Ａｒｇ５０３、Ａｓｐ５０４、Ｌｙｓ５２７、Ｔｈｒ５３６およびＴｈｒ５３８の原子からなる群より選択される原子の構造座標を含む、請求項３２または３３いずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
三次元モデルが、残基Ｌｙｓ４１３、Ｖａｌ４１６、Ｌｅｕ４１７、Ｖａｌ４２２、Ｍｅｔ４２６、Ｌｙｓ４２９、Ｔｈｒ４４７、Ｇｌｕ４４９、Ｌｅｕ４５４、Ｐｈｅ４５６、Ｐｈｅ６９１、Ａｒｇ６９２、Ａｓｎ６９３、Ｐｈｅ６９４およびＳｅｒ６９５の原子からなる群より選択される原子の構造座標を含む、請求項３２〜３４いずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
構造座標が表２に記載のものであり、アルファ炭素原子についての±標準偏差が最大１．５Åである、請求項３２〜３５いずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ＰＫＣθの触媒ドメインの原子の構造座標を含むＰＫＣθの三次元モデルの作成を含む、ＰＫＣθと相互作用する物質の設計方法。
【請求項３８】
三次元モデルが、残基Ｌｅｕ３８６、Ｇｌｙ３８７、Ｇｌｙ３８９、Ｖａｌ３９４、Ａｌａ４０７、Ｌｙｓ４０９、Ｖａｌ４２２、Ｍｅｔ４５８、Ｇｌｕ４５９、Ｔｙｒ４６０、Ｌｅｕ４６１、Ｇｌｙ４６４、Ｌｅｕ４６６、Ａｓｐ５０８、Ａｓｎ５０９、Ｌｅｕ５１１、Ａｌａ５２１およびＡｓｐ５２２の原子からなる群より選択される原子の構造座標を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
三次元モデルが、Ｇｌｕ４２８、Ａｒｇ５０３、Ａｓｐ５０４、Ｌｙｓ５２７、Ｔｈｒ５３６およびＴｈｒ５３８残基の原子からなる群より選択される原子の構造座標を含む、請求項３７または３８いずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
三次元モデルが、残基Ｌｙｓ４１３、Ｖａｌ４１６、Ｌｅｕ４１７、Ｖａｌ４２２、Ｍｅｔ４２６、Ｌｙｓ４２９、Ｔｈｒ４４７、Ｇｌｕ４４９、Ｌｅｕ４５４、Ｐｈｅ４５６、Ｐｈｅ６９１、Ａｒｇ６９２、Ａｓｎ６９３、Ｐｈｅ６９４およびＳｅｒ６９５の原子からなる群より選択される原子の構造座標を含む、請求項３７〜３９いずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
構造座標が表２に記載のものであり、アルファ炭素原子についての±標準偏差が最大１．５Åである、請求項３７〜４０いずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
リガンドに結合したＰＫＣθの三次元モデルの作成を含む、ＰＫＣθと相互作用する物質の設計方法。
【請求項４３】
ＰＫＣθの触媒活性の改変能を有する物質を同定する方法であって、
ＰＫＣθの三次元モデルを提供し；次いで、
第一候補物質とＰＫＣθの三次元モデルの相互作用を調べる：
ことを含む、方法。
【請求項４４】
三次元モデルがＰＫＣθの原子の構造座標を含む、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
構造座標が表２に記載のものであり、アルファ炭素原子についての±標準偏差が最大１．５Åである、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
第二候補物質とＰＫＣθの三次元モデルの相互作用を調べることをさらに含む、請求項４３〜４５いずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
第一候補物質の存在下でＰＫＣθの触媒活性を測定することをさらに含む、請求項４３〜４６いずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
第二候補物質の存在下でＰＫＣθの触媒活性を測定することをさらに含む、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
ＰＫＣθの触媒活性の改変能を有する物質を同定する方法であって、
ＰＫＣθの原子の構造座標を含むＰＫＣθの三次元モデルを提供し；
複数の候補物質とＰＫＣθの三次元モデルの相互作用を調べ；次いで
複数の候補物質から、ＰＫＣθの触媒活性を改変すると予測される物質を選択する：
ことを含む、方法。
【請求項５０】
結晶複合体の三次元構造を用いて、合理的な薬剤設計を行うことにより物質を選択し、ここで、複合体はＰＫＣθポリペプチドを含むものであり；
その物質をＰＫＣθポリペプチドと接触させ；次いで
ＰＫＣθポリペプチドに結合する物質の能力を検出する：
ことを含む、方法。
【請求項５１】
ＰＫＣθポリペプチドをリガンドに接触させて、組成物を形成し；次いで
その組成物を結晶化させて、リガンドがＰＫＣθポリペプチドに結合している結晶複合体を形成する：
ことを含み、ここで、該結晶複合体は少なくとも約３．５Åの分解能でＸ線を回折し得るものである、方法。
【請求項５２】
コンピュータシステムに、
リガンドに結合しているＰＫＣθポリペプチドの構造に関する情報を受容させ；
候補物質に関する情報を受容させ；次いで
リガンドに結合しているＰＫＣθポリペプチドの構造に関する情報および候補物質に関する情報に基づいて、候補物質のＰＫＣθポリペプチドに対する結合特性を決定させる：
ための命令を含む、ソフトウェアシステム。
【請求項５３】
１またはそれ以上のプロセッサにより実行される場合、１またはそれ以上のプロセッサに、
リガンドに結合しているＰＫＣθポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受容させ；
候補物質に関する情報を受容させ；次いで
ＰＫＣθポリペプチドの構造に関する情報および候補物質に関する情報に基づいて、候補物質のＰＫＣθポリペプチドに対する結合特性を決定させる：
ための複数の命令が格納された、コンピュータ可読媒体上のコンピュータプログラム。
【請求項５４】
リガンドに結合しているＰＫＣθを含む複合体の構造に関する情報を受容させ；次いで
ＰＫＣθおよび候補物質の結合特性をモデリングする：
ことを含む、ソフトウェアシステムにより実行される、方法。
【請求項５５】
リガンドに結合しているＰＫＣθを含む複合体の構造に関する情報を受容させ；次いで
ＰＫＣθおよび候補物質の結合特性をモデリングする：
のための命令を含む、コンピュータシステムにて実行される、ソフトウェア。
【請求項５６】
コンピュータ可読媒体に組み込まれている、請求項５５記載のソフトウェア。
【請求項５７】
１またはそれ以上のプロセッサにより実行される場合、１またはそれ以上のプロセッサに、
リガンドに結合しているＰＫＣθポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受容させ；次いで
ＰＫＣθポリペプチドおよび候補物質の結合特性をモデリングする：
ための複数の命令が格納された、コンピュータ可読媒体上のコンピュータプログラム。
【請求項５８】
コンピュータシステムに、
リガンドに結合しているＰＫＣθポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受容させ；次いで
ＰＫＣθポリペプチドおよび候補物質の結合特性をモデリングする：
ための命令を含む、ソフトウェアシステム。
【請求項５９】
合理的な薬剤設計を用いて、ＰＫＣθ活性の調節能を有する物質を選択し；次いで
治療上有効量の物質を対象へ投与する：
ことを含む、対象においてＰＫＣθ活性を調節する方法。
【請求項６０】
該物質がインビボにおいてＰＫＣθキナーゼ活性を阻害または軽減し得る、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
合理的な薬剤設計が、ＰＫＣθポリペプチドを含む結晶複合体の三次元構造を利用することを含む、請求項５９または６０いずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
結晶複合体がリガンドをさらに含む、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
リガンドがスタウロスポリンである、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
ＰＫＣθ活性に付随する症状を有する対象の処置方法であって、
合理的な薬剤設計を用いて、ＰＫＣθ活性の作用能を有する物質を選択し；次いで
治療上有効量の該物質をその必要のある対象へ投与する：
ことを含む、方法。
【請求項６５】
該物質がＰＫＣθ活性を阻害し得る、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
該物質がインビボにおいてＰＫＣθキナーゼ活性を阻害し得る、請求項６４または６５いずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
症状がＴ細胞介在疾患である、請求項６４〜６６いずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
Ｔ細胞介在疾患が白血病または自己免疫疾患である、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
ＰＫＣθ活性に付随する症状に罹り易い対象を予防的処置する方法であって、
対象がＰＫＣθ活性に付随する症状に罹り易いことを決定し；
合理的な薬剤設計を用いて、ＰＫＣθ活性の作用能を有する物質を選択し；次いで
治療上有効量の該物質を対象へ投与する：
ことを含む、方法。
【請求項７０】
該物質がインビボにおいてＰＫＣθキナーゼ活性を阻害し得る、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
症状がＴ細胞介在疾患である、請求項６９または７０いずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
Ｔ細胞介在疾患が白血病または自己免疫疾患である、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
ＰＫＣθ活性に付随する症状を予防または処置するための医薬の製造における、請求項４２〜５１いずれか１項に従って設計または特定される物質の使用。
【請求項７４】
該物質がＰＫＣθ活性を阻害し得る、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
該物質がインビボにおいてＰＫＣθキナーゼ活性を阻害し得る、請求項７４記載の使用。
【請求項７６】
症状がＴ細胞介在疾患である、請求項７３、７４または７５いずれか１項に記載の使用。
【請求項７７】
Ｔ細胞介在疾患が白血病または自己免疫疾患である、請求項７６記載の使用。
【請求項７８】
ＰＫＣθ活性に付随する症状の予防または処置における使用のための、請求項４３〜５２いずれか１項に従って同定もしくは設計される物質。
【請求項７９】
該物質がＰＫＣθ活性を阻害し得る、請求項７８記載の物質。
【請求項８０】
該物質がインビボにおいてＰＫＣθキナーゼ活性を阻害し得る、請求項７８記載の物質。
【請求項８１】
症状がＴ細胞介在疾患である、請求項７８、７９または８０いずれか１項に記載の物質。
【請求項８２】
Ｔ細胞介在疾患が白血病または自己免疫疾患である、請求項８１記載の物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインキナーゼＣシータの三次元構造に関する。
【０００２】
（関連出願）
本出願は、２００４年４月７日出願の米国仮出願第６０／５６０，４４１号の優先権を主張する。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
【背景技術】
【０００３】
プロテインキナーゼは、生物学的過程、発達およびホメオスタシスにおいて主要な役割を担う、真核細胞におけるシグナル伝達のメディエーターである。調節が解除されたキナーゼは、異常な細胞生理機能および癌のごとき疾患に存在する。そのようなものとして、プロテインキナーゼは、疾患病変を調節するための魅力的な標的である。セリン／スレオニンキナーゼは、真核生物のプロテインキナーゼの重要な部分であり、およびＡＧＣ、ＣＡＭＫ、ＣＭＧＣ、ＴＫＬ、ＳＴＥおよびＣＫ１と呼ばれる６つの主要なクラスに大別される。プロテインキナーゼＣサブファミリーは、ＡＧＣファミリーのＡＫＴキナーゼサブファミリーに属する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
プロテインキナーゼＣシータ（ＰＫＣθ）の三次元モデルは、ＰＫＣθと相互作用し得る物質の設計において役立ち得る。特に、該三次元モデルは、ＰＫＣθの原子の構造座標を含み得る。構造座標を含むモデルは、ＰＫＣθと相互作用する阻害剤もしくは基質のごとき物質をその構造に基づいて設計または選択するのに用いられ得る。ＰＫＣθの三次元モデルを他のプロテインキナーゼのモデルと比較することにより、ＰＫＣθと選択的に相互作用する物質の設計が容易になり得る。
【０００５】
一の態様において、組成物は、ＰＫＣθポリペプチドを含む結晶を含有する。ＰＫＣθポリペプチドは、ＰＫＣθの触媒ドメインを含み得る。ＰＫＣθポリペプチドは、配列番号１の残基３７７〜６９６を含み得る。組成物は、ＰＫＣθに結合した物質を含み得る。物質は、ＰＫＣθ基質またはＰＫＣθ阻害剤であり得る。ＰＫＣθ阻害剤はスタウロスポリンであり得る。結晶は、少なくとも２．５Åまたは少なくとも２．２Åの分解能でＸ線を回折し得る。
【０００６】
別の態様において、ＰＫＣθと相互作用する物質の設計方法は、ＰＫＣθの三次元モデルの作成を含む。三次元モデルは、ＰＫＣθの原子の構造座標を含み得る。ＰＫＣθの三次元モデルは、ＰＫＣθの触媒ドメインの三次元モデルであり得る。構造座標は、実験的に決定される座標であり得る。原子は、ＰＫＣθの活性部位の原子であり得る。構造座標は、表２に記載のものであり得、アルファ炭素原子についての±標準偏差は最大１．５Åである。三次元モデルは、物質の原子の構造座標を含み得る。該方法は、モデルの物質の構造を改変することを含み得る。該方法は、モデルの物質の構造座標を改変することを含み得る。
【０００７】
三次元モデルは、残基Ｌｅｕ３８６、Ｇｌｙ３８７、Ｇｌｙ３８９、Ｖａｌ３９４、Ａｌａ４０７、Ｌｙｓ４０９、Ｖａｌ４２２、Ｍｅｔ４５８、Ｇｌｕ４５９、Ｔｙｒ４６０、Ｌｅｕ４６１、Ｇｌｙ４６４、Ｌｅｕ４６６、Ａｓｐ５０８、Ａｓｎ５０９、Ｌｅｕ５１１、Ａｌａ５２１およびＡｓｐ５２２の原子からなる群より選択される原子の構造座標を含み得る。三次元モデルは、残基Ｇｌｕ４２８、Ａｒｇ５０３、Ａｓｐ５０４、Ｌｙｓ５２７、Ｔｈｒ５３６およびＴｈｒ５３８の原子からなる群より選択される原子の構造座標を含み得る。三次元モデルは、残基Ｌｙｓ４１３、Ｖａｌ４１６、Ｌｅｕ４１７、Ｖａｌ４２２、Ｍｅｔ４２６、Ｌｙｓ４２９、Ｔｈｒ４４７、Ｇｌｎ４４９、Ｌｅｕ４５４、Ｐｈｅ４５６、Ｐｈｅ６９１、Ａｒｇ６９２、Ａｓｎ６９３、Ｐｈｅ６９４およびＳｅｒ６９５の原子からなる群より選択される原子の構造座標を含み得る。
【０００８】
該方法は、ＰＫＣθと物質の間の適合を測定することを含み得る。該方法は、ＰＫＣθの原子と物質の原子の間の距離を算出することを含み得る。該方法は、物質の三次元モデルをＰＫＣθの三次元モデルにドッキングさせることを含み得る。該方法は、ＰＫＣθポリペプチドを含有する組成物を提供することを含み得る。ＰＫＣθポリペプチドは結晶であり得る。組成物は、ＰＫＣθと相互作用する物質を含み得る。該方法は、ＰＫＣθの触媒活性、例えば、ＰＫＣθのキナーゼ活性を測定することを含み得る。該物質の存在下で測定されたＰＫＣθの触媒活性は、該物質の不在下で測定されたＰＫＣθの触媒活性と比較され得る。
【０００９】
別の態様において、ＰＫＣθの触媒活性の改変能を有する物質の同定方法は、ＰＫＣθの三次元モデルを提供し、次いで、ＰＫＣθの三次元モデルと候補物質の相互作用を調べることを含む。さらなる別の態様において、ＰＫＣθの触媒活性の改変能を有する物質の同定方法は、ＰＫＣθの原子の構造座標を含むＰＫＣθの三次元モデルを提供し、ＰＫＣθの三次元モデルと複数の候補物質の相互作用を調べ、次いで、複数の候補物質から、ＰＫＣθの触媒活性を改変することが予測される物質を選択することを含む。
【００１０】
ＰＫＣθの三次元モデルと第二候補物質の相互作用が調べられ得る。該方法は、ＰＫＣθの触媒活性を改変することが予測される候補物質を選択することを含む。ＰＫＣθの触媒活性は、選択された物質の存在下で測定され得る。
【００１１】
別の態様において、本発明は、合理的な薬剤設計を行うことによりＰＫＣθを含む結晶の三次元構造を有する物質を選択することを含む方法に関する。該方法は、該物質をＰＫＣθと接触させ、次いで、該物質がＰＫＣθに結合する能力を検出することを含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は、ＰＫＣθをリガンドと接触させて組成物を形成し、次いで、その組成物を結晶化して、リガンドがＰＫＣθに結合している結晶複合体を形成することを含む方法に関する。該結晶複合体は、少なくとも約３．５Åの分解能でＸ線を回折する。
【００１３】
さらなる別の態様において、本発明は、コンピュータシステムが、リガンドに結合しているＰＫＣθの構造に関する情報を受容し、候補物質に関する情報を受容し、次いで、ＰＫＣθに対する候補物質の結合特性を決定するための命令を含むソフトウェアシステムに関する。この決定は、リガンドに結合しているＰＫＣθの構造に関する情報および候補物質に関する情報に基づく。
【００１４】
別の態様において、本発明は、複数の命令が格納されているコンピュータ可読媒体上のコンピュータプログラムに関する。命令が１またはそれ以上のプロセッサにより実行される場合、１または複数のプロセッサは、リガンドに結合しているＰＫＣθの構造および候補物質に関する情報を受容し、次いで、ＰＫＣθポリペプチドに対する該物質の結合特性を決定する。結合特性は、ＰＫＣθの構造に関する情報および候補物質に関する情報に基づく。
【００１５】
別の態様において、本発明は、リガンドに結合しているＰＫＣθを含む複合体の構造に関する情報を受容し、次いで、候補物質に対するＰＫＣθの結合特性をモデリングすることを含む方法に関する。該方法は、例えば、ソフトウェアシステムにより実行される。
【００１６】
別の態様において、本発明は、複数の命令が格納されているコンピュータ可読媒体上のコンピュータプログラムに関する。命令が１またはそれ以上のプロセッサにより実行される場合、１または複数のプロセッサは、リガンドに結合しているＰＫＣθを含む複合体の構造に関する情報を受容し、次いで、候補物質に対するＰＫＣθの結合特性をモデリングする。
【００１７】
別の態様において、本発明は、コンピュータシステムが、リガンドに結合しているＰＫＣθを含む複合体の構造に関する情報を受容し、次いで、候補物質に対するＰＫＣθの結合特性をモデリングするための命令を含むソフトウェアシステムに関する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、対象においてＰＫＣθ活性を調節する方法であって、合理的な薬剤設計を用いて、ＰＫＣθ活性の調節能を有する物質を選択し、次いで、治療上有効量の該物質を対象へ投与することを含む方法に関する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、ＰＫＣθ活性に付随する症状を有する対象を処置する方法であって、合理的な薬剤設計を用いて、ＰＫＣθ活性の作用能を有する物質を選択し、次いで、治療上有効量の該物質をその必要のある対象へ投与することを含む方法に関する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、ＰＫＣθ活性に付随する症状に罹り易い対象を予防的に処置する方法であって、対象が該症状に罹り易いかを決定し、合理的な薬剤設計を用いて、ＰＫＣθ活性の作用能を有する物質を選択し、次いで、治療上有効量の該物質を対象へ投与することを含む方法に関する。
【００２１】
構造に基づくモデリングは、ＰＫＣθと相互作用し得る化学構造を同定するために、インビボまたはインビトロで多種多様な化合物を実験的に試験する必要なく、ＰＫＣθと相互作用し得る物質の同定を可能とする。かかるスクリーニングは、多大な費用および時間がかかり得る。構造に基づく設計を用いて、ＰＫＣθと相互作用する既知の物質の修飾を調べ、修飾剤それぞれを調製および試験する必要なく、より望ましい特性、例えば、他のプロテインキナーゼよりもＰＫＣθについてより密接な結合またはより大きな選択性を有する物質を同定できる。
【００２２】
１またはそれ以上の実施態様の詳細は、添付の図および以下の記載において示される。他の特徴、目的および利点は、明細書および図および特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
プロテインキナーゼＣシータ（ＰＫＣθ）およびプロテインキナーゼＢ／ＡＫＴは、Ｔ細胞の活性化および生存に至るＴ細胞シグナル伝達に関与している。ＰＫＣθの発現および役割は相対的に、Ｔ細胞活性化およびサイトカイン産生に寄与するＴ細胞受容体刺激に応答するシグナル伝達を伴う、Ｔ細胞に限られている。故に、ＰＫＣθ阻害は、Ｔ細胞白血病およびＴ細胞介在自己免疫疾患において望ましい。例えば、Ｆａｂｂｒｏら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ９３：７９−９８，２００２；およびＡｌｔｍａｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：５６７−５７３，２０００を参照のこと。該文献の各々は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
【００２４】
ＰＫＣサブファミリーのメンバーは、カルシウム、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびホルボールエステルにより調節されており、およびそれらの補因子の必要条件に基づいて、３群：慣用的（ＰＫＣα、βＩ、βＩＩ、γ）、新規（ＰＫＣδ、ε、θ、η）および非定型（ＰＫＣζ、ι、λ、μ）アイソフォームに分けられ得る（Ａｒｅｎｄｔら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３２３−３３０，２００２を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。これらの密接に関連したＰＫＣアイソザイムは、順応性および先天性免疫に寄与するＴ細胞、Ｂ細胞およびマスト細胞において重要な役割を有することが示されている。それらは、アポトーシス、分化、運動性、インスリン耐性および炎症のごとき細胞機能において多様な役割も有する。ＰＫＣの阻害剤は現在、様々な型の癌について臨床試験中である。
【００２５】
三次元構造は、ＡＫＴ（ＰＫＢ）およびｃＡＭＰ依存性ＰＫＡのキナーゼドメインについて決定されており、その両方はＡＧＣキナーゼファミリーに属する（ＨｕｓｅおよびＫｕｒｉｙａｎ，Ｃｅｌｌ  １０９：２５７−２８２，２００２を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。ただ１つのキナーゼを特異的に阻害するキナーゼ阻害剤を得ることが所望され得る。しかし、キナーゼドメインＡＴＰ結合部位間の構造類似性により、疾患療法として用いるための非常に特異的な阻害剤の開発において困難がもたらされる（Ｄａｖｉｅｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５１：９５−１０５，２０００を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。キナーゼ活性部位および密接に関連したファミリーメンバーの構造解明は、阻害剤の選択性および酵素作用の機序への理解を増大し得る。加えて、構造情報は、Ｔ細胞介在アレルギーおよび自己免疫疾患のための療法としての小分子阻害剤の合理的設計および最適化に役立ち得る。
【００２６】
構造座標は、分子または分子複合体中の他の原子に関連する三次元空間における原子の位置を示すデカルト座標である。構造座標は、例えば、Ｘ線結晶学的技法またはＮＭＲ技法を用いて得られてもよい。さらなる構造情報は、スペクトル技法（例えば、旋光分散（ＯＲＤ）、円偏光二色性（ＣＤ））、ホモロジーモデリングおよび計算法から得ることができ、例えば、分子力学または動態分析からのデータを含むものである。
【００２７】
様々なソフトウェアプログラムにより、一連の構造座標のグラフィック表示が可能となり、分子またはスタウロスポリンに結合したＰＫＣθのごとき分子複合体の表示を得ることができる。一般的に、かかる表示は、構造座標または構造座標に由来する情報、例えば、特徴間の距離もしくは角度を（相対的および／または絶対的に）正確に反映する必要がある。表示は、立体的二次元図のごとき二次元図、または対話型二次元ディスプレイ（例えば、分子もしくは分子複合体の異なる面を表示し得るコンピュータディスプレイ）または対話型立体的二次元ディスプレイであり得る。座標を用いて、ｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｔｉｃｋモデルまたは迅速なプロトタイピングにより作成されるモデルのごとき、分子もしくは分子複合体の物理的な三次元表示の作成を導くことができる。構造座標は、数学的操作、例えば、反転または整数付加または減法により修飾されてもよい。そのようなものとして、構造座標は相対的な座標であり、および表２の実際のｘ、ｙ、ｚ座標に厳密に限定されることはない。
【００２８】
三次元分子モデルは、分子または分子複合体の表示である。三次元モデルは、分子構造の物理的なモデル（例えば、ｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｔｉｃｋモデル）または分子構造のグラフィック表示であり得る。グラフィック表示は、例えば、コンピュータディスプレイ上で提示される描画または図であり得る。例えば、遠近法、陰影付けを用いて、または観察者から遠くにある特徴を観察者に近い特徴で遮ることを介して、二次元表示が三次元情報を反映する場合、二次元グラフィック表示（例えば、描画）は、三次元モデルであり得る。好ましくは、グラフィック表示は、構造座標または構造座標に由来する情報、例えば、モデルの特徴間の距離もしくは角度を正確に反映する。三次元モデルがＰＫＣθポリペプチドのごときポリペプチドを含む場合、モデルは１またはそれ以上の異なるレベルの構造、例えば、一次構造（アミノ酸配列）、二次構造（例えば、α−へリックスおよびβ−シート）、三次構造（全体的に折り畳まれた）および四次構造（オリゴマー化状態）を含み得る。モデルは細部において異なるレベルを含み得る。例えば、モデルは、原子の位置を特定することなく蛋白質の二次構造特徴の相対的位置を含み得る。より詳細なモデルは原子の位置を含み得る。
【００２９】
モデルは、構造座標および他の化学的情報に由来する特徴を含み得る。例えば、溶媒接触可能表面の形状は、構造座標、モデルの原子のファン・デル・ワールス半径および溶媒（例えば、水）のファン・デル・ワールス半径に由来し得る。構造座標に由来し得る他の特徴は、静電気ポテンシャル、巨大分子構造内の空隙またはポケットの位置、および水素結合および塩架橋の位置を含むが、これらに限定されない。
【００３０】
モデルは、分子構造中の原子の構造座標を含み得る。構造座標は、実験により、例えば、Ｘ線結晶学もしくはＮＭＲ分光法により測定され得るか、または例えば、ホモロジーモデリングによりもたらされ得る。分子構造は、単一の分子、分子の一部、２もしくはそれ以上の分子の複合体、分子の群またはそれらの組み合わせを含み得る。分子複合体のモデルにおいて、分子は、例えば、水素結合、疎水性相互作用または静電気的引力を含む共有または非共有結合により結合され得る。分子複合体は、密接に結合した分子、例えば、酵素／阻害剤複合体、および緩く結合した分子、例えば、結晶中に秩序立った溶媒分子もしくはイオンを有する結晶性化合物を含み得る。モデルは、例えば、阻害剤に結合した酵素の複合体のごとき、物質に結合した蛋白質の複合体を含み得る。モデルが構造座標を含む場合、分子中の幾つかの原子の座標が省かれ得る。
【００３１】
保存的置換は、置換したアミノ酸残基と機能的または構造的に等価なアミノ酸置換である。保存的置換は、１つの残基を、置換される残基と同様の極性、立体配置を有するか、または同じクラス（例えば、疎水性、酸性もしくは塩基性）に属する別のものに変換することを含み得る。保存的置換は、ＰＫＣθと相互作用する物質の特定および設計について、ならびに分子置換分析またはホモロジーモデリングのために、ＰＫＣθの三次元構造に対して重要ではない効果を有する置換を含む。
【００３２】
物質は、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡを含む）、分子、化合物または薬剤を含む。物質は、基質、阻害剤、活性化因子、アロステリックエフェクターまたは結合パートナーとして酵素に作用し得る。
【００３３】
活性部位は、物質（蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含む核酸、分子、化合物または薬剤を包含するが、これらに限定されない）と相互作用もしくは連結し得る分子または分子複合体の領域である。活性部位は、例えば、物質の結合部位、ならびに特定の物質と相互作用もしくは結合する際に活性に作用し得る実際の結合部位に隣接もしくは近位の補助的な（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）結合部位を含んでもよい。活性部位は、阻害剤結合部位を含み得る。阻害剤は、実際の基質結合部位に直接干渉することにより（すなわち、基質結合に競合することにより）、または立体コンフォメーションもしくは電荷ポテンシャルに間接的に作用することにより阻害し得、それにより、実際の基質結合部位において基質の結合を阻害または軽減する。例えば、活性部位は、補因子結合、基質結合（例えば、リン酸化すべき基質）または阻害剤結合の部位であり得る。活性部位は、アロステリックエフェクター結合の部位、またはリン酸化、グリコシル化、アルキル化、アシル化もしくは他の共有結合修飾の部位を含み得る。
【００３４】
標準偏差（ｒｍｓ偏差またはｒｍｓｄ）は、平均からの偏差の二乗の算術平均の平方根であり、および構造座標からの偏差もしくは差異を表す一の方法である。アミノ酸残基の保存的置換は、規定の標準偏差内の構造座標を有する分子モデルをもたらし得る。特に、保存的置換により互いに異なるポリペプチドの２つの分子モデルは、１．５Å未満、１．０Å未満もしくは０．５Å未満のごとき規定のｒｍｓ偏差内のバックボーン原子の座標を有し得る。ポリペプチドのバックボーン原子は、アルファ炭素（ＣαもしくはＣＡ）原子、カルボニル炭素（Ｃ）原子、カルボニル酸素（Ｏ）原子およびアミド窒素（Ｎ）原子を含む。
【００３５】
ＰＫＣθのアミノ酸残基のナンバリングは、本明細書中に示すものと異なってもよく、およびバックボーン原子についての±ｒｍｓｄが１．５Å未満の、表２により定義されるものと同じ三次元構造を生じる特定の保存的アミノ酸置換、付加もしくは欠失であってもよい。他のアイソフォームまたはアナログにおける対応するアミノ酸および保存的置換は、関連するアミノ酸配列を目視検査することにより、または市販のホモロジーソフトウェアプログラム（例えば、ＭＯＤＥＬＬＡＲ，ＭＳＩ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いることにより容易に同定される。アイソフォームは、その一次構造が異なる蛋白質の任意の幾つかの複合的な形態である。アナログは、保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドである。
【００３６】
「ＰＫＣθ」は、ＰＫＣθ蛋白質もしくは核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはそのフラグメントを言う。幾つかの実施態様において、ＰＫＣθのフラグメントは、例えば、蛋白質のＮ−末端ドメインのみ、蛋白質のＣ−末端ドメインのみ、または蛋白質のいずれかのドメインのフラグメントを含み得る。別の実施態様において、ＰＫＣθのフラグメントは、Ｎ−末端ドメインおよびＣ−末端ドメインの両方を含み得る。ＰＫＣθ蛋白質または核酸は、非哺乳類または哺乳類種に由来し得る。哺乳類のＰＫＣθは、例えば、ヒトに由来し得る。ヒトでない哺乳類の例は、ヒトでない霊長類（例えば、サルもしくは類人猿）、マウス、ラット、ヤギ、ウシ、雄ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イノシシ、ラッコ、ネコまたはイヌを含む。哺乳類でない種の例は、ニワトリ、シチメンチョウ、エビ、アリゲーターまたは魚類を含む。
【００３７】
ＰＫＣθは、Ｎ−末端ドメインおよびＣ−末端触媒ドメインを含む。Ｎ−末端ドメインは、複数のモジュールからなり、および調節ドメインとして機能する（例えば、Ｎｅｗｔｏｎ，Ａ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７０，３６１−３７１，２００３を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。Ｃ−末端触媒ドメインは、例えば、ヒトＰＫＣθの全長配列の残基３６２〜７０６を含む可溶性、活性蛋白質としてＤＮＡプラスミドから発現され得る。発現は、誘導プロモーターのごときプロモーターにより駆動され得る。図３Ａは、ＰＫＣθの全長配列を示し、および図３Ｂは、Ｃ−末端ヘキサヒスチジンタグが付加した触媒ドメインの残基３６２〜７０６の配列である。図３Ｂに示すものよりもむしろ他のポリペプチド配列、例えば、全長ＰＫＣθ配列のＮ−末端に付加的な残基もしくはより少ない残基を有する配列、またはＣ−末端により少ない残基を有する配列が用いられ得る。幾つかの実施態様において、ＰＫＣθは、ヘキサヒスタジン以外のタグ、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｍｙｃ、ＨＡ、ＳｔｒｅｐまたはＦＬＡＧタグとの融合蛋白質として発現され得る。タグは、細菌細胞もしくは哺乳類細胞株のごとき細胞からのＰＫＣθの単離を容易にし得る。例えば、ＰＫＣθは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において発現され、かつ単離され得る。融合蛋白質は、融合蛋白質中に設計されたプロテアーゼ部位で、例えば、ポリペプチドおよびタグ間の融合部位またはその近くで切断され得る。ＰＫＣθおよびリガンド、例えば、スタウロスポリン（天然生成物のキナーゼ阻害剤）間で複合体を形成することが所望される場合、ＰＫＣθは、切断および精製の後に、リガンドに接触され得る。例えば、ＰＫＣθは、精製の前に（例えば、ポリペプチドタグの分解の前に）、スタウロスポリンと混合され得るか、またはＰＫＣθは、精製の後に、スタウロスポリンと混合され得る。幾つかの実施態様において、スタウロスポリンは、精製の前およびまた精製の後に、ＰＫＣθと混合され得る。
【００３８】
ＰＫＣθは、スペクトルデータもしくはＮＭＲデータを収集するための、または結晶を成長させるための溶液中に配置され得る。例えば、ＰＫＣθは、塩（例えば、ナトリウム塩）、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））および／または有機溶媒の存在下で結晶化され得る。結晶は、様々な方法、例えば、ｓｉｔｔｉｎｇまたはｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ蒸気拡散法により成長され得る。一般的に、結晶化は、約４℃〜約６０℃（例えば、約４℃〜約４５℃、例えば、約４℃、約１５℃、約１８℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３２℃、約３５℃、約３７℃）の温度で実施され得る。
【００３９】
ＰＫＣθのＣ−末端触媒ドメインは、物質との複合体として結晶化され得る。特に、それは、スタウロスポリン（天然生成物のキナーゼ阻害剤）との１：１の複合体として、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびトリスバッファーを含む溶液から結晶化され得る。溶液は、硫酸アンモニウムのごとき沈殿剤を含み得る。ＰＫＣθの結晶は、空間群Ｃ２に属し得、ａ＝１３９．６Å、ｂ＝４２．４Å、ｃ＝６７．７Åおよびβ＝１１６．２°の寸法を有する。空間群は、結晶の全体的な対称性を言い、および点対称性および空間対称性を含む。特定の実施態様において、スタウロスポリンに結合したＰＫＣθの結晶は、非対称ユニット中にＰＫＣθの１分子を含み得る。非対称ユニットは、最小の単位であり、そこから、空間群の対称操作を利用することにより、結晶構造が生じ得る。結晶は、一般的に、空間群の対称操作により定められる非対称ユニット上のモチーフ、および結晶格子によるそのモチーフの並進で構成される。
【００４０】
一般的に、スタウロスポリンに結合したＰＫＣθの結晶は、約３．５Åまたはそれ未満（例えば、約３．２Åまたはそれ未満、約３．０Åまたはそれ未満、約２．５Åまたはそれ未満、約２．４Åまたはそれ未満、約２．３Åまたはそれ未満、約２．２Åまたはそれ未満、約２．１Åまたはそれ未満、約２．０Åまたはそれ未満、約１．９Åまたはそれ未満、約１．８Åまたはそれ未満、約１．７Åまたはそれ未満、約１．６Åまたはそれ未満、約１．５Åまたはそれ未満、約１．４Åまたはそれ未満）の分解能でＸ線を回折し得る。幾つかの実施態様において、結晶は、約１．６〜約２．５Å（例えば、約１．８〜約２．２Å）の分解能でＸ線を回折し得る。
【００４１】
結晶を表す構造データは、例えば、Ｘ線回折により得ることができる。結晶についてのＸ線回折データは、構造座標を得るために、様々な手段により収集され得る。適当なＸ線源は、回転陽極およびシンクロトロンソース（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ），Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；またはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ），Ａｒｇｏｎｎｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を含む。特定の実施態様において、回折データを生み出すためのＸ線は、約０．５Å〜約１．６Å（例えば、約０．７Å、約０．９Å、約１．０Å、約１．１Å、約１．３Å、約１．４Å、約１．５Å、約１．６Å）の波長を有し得る。適当なＸ線検出器は、面積検出器および電荷結合素子（ＣＣＤ）を含む。スタウロスポリンに結合したＰＫＣθの複合体の結晶のＸ線回折データを用いて、複合体中の原子の構造座標を得ることができる。
【００４２】
幾つかの実施態様において、Ｘ線回折データを用いて、スタウロスポリンに結合したＰＫＣθの電子密度マップを構築でき、およびその電子密度マップを用いて、スタウロスポリンに結合したＰＫＣθを含む複合体または複合体のフラグメントの表示（例えば、二次元表示、三次元表示）を導くことができる。電子密度マップの作成は、典型的に、Ｘ線散乱の位相に関する情報の使用を含む。位相情報は、例えば、回折データ、または電子密度マップの構築を完成するための補足的な回折実験のいずれかから引き出され得る。Ｘ線回折データから位相を算出するための方法は、多波長異常分散（ＭＡＤ）、多重同形置換（ＭＩＲ）、異常分散を用いる多重同形置換（ＭＩＲＡＳ）、逆格子空間溶媒平滑化（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）、分子置換、および異常分散を用いる単一同形置換（ＳＩＲＡＳ）、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。これらの方法は、天然蛋白質に同形の構造的修飾を行うことにより、例えば、重原子を含ませるか、または既存の重原子の散乱強度を変化させ、次いで、天然蛋白質および修飾した場合それぞれについて回折振幅を測定することにより、位相情報を生じる。さらなる重原子の位置またはその散乱強度における変化が知られているならば、一連の位相についての連立方程式（ｓｔｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）を解くことにより、回折された各Ｘ線の位相が決定され得る。重原子部位の位置は、コンピュータプログラム、例えば、ＳＨＥＬＸＳ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ａｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍｉｅ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて同定され得、および回折データは、コンピュータプログラム、例えば、ＭＯＳＦＬＭ、ＳＣＡＬＡ、ＳＯＬＯＭＯＮおよびＳＨＡＲＰを用いて処理され得る（“Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，”Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ，５４：９０５−９２１，１９９７；ｄｅＬａ  Ｆｏｒｔｅｌｌｅ  ａｎｄ  Ｂｒｉｇｏｇｎｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２７６：４７２−４９４，１９９７）。位相が決定されると、複合体の電子密度マップが構築され得る。
【００４３】
電子密度マップを用いて、ポリペプチドもしくは複合体（例えば、リガンドに結合したポリペプチドを含む複合体）の三次元モデルを電子密度マップとアラインすることにより、ポリペプチド、複合体、またはポリペプチドもしくは複合体のフラグメントの表示を導くことができる。例えば、スタウロスポリンに結合したＰＫＣθに対応する電子密度マップは、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する非結合ＴＰＫ１δポリペプチドに対応する、予め決定された電子密度マップとアラインされ得る。電子密度マップは、「平均」電子密度マップを作成するために重ね合わされた（ｏｖｅｒｌａｙｅｄ）同様の構造の一群（例えば、５、６もしくは７プロテインキナーゼ構造の一群）から作成された電子密度マップとさらにアラインされ得る。
【００４４】
アラインメント過程により、計算された電子密度マップが既知のポリペプチドもしくは既知の複合体のモデルと異なる程度を示す比較モデルがもたらされる。次いで、比較モデルを、１またはそれ以上のサイクル（例えば、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル）にわたって精密化し、電子密度マップとのより良好な適合を生み出す。ＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４：９０５−９２１，１９９８）のごときソフトウェアプログラムを用いて、モデルを精密化できる。比較モデルにおける適合の質は、例えば、ＲｗｏｒｋまたはＲｆｒｅｅの値により決定され得る。一般的に、より小さなＲｗｏｒｋもしくはＲｆｒｅｅの値は、より良好な適合を示す。比較モデルにおけるミスアラインメントは、修飾比較モデルおよびより低いＲｗｏｒｋもしくはＲｆｒｅｅの値を与えるように調整され得る。該調整は、他の知られているプロテインキナーゼポリペプチド（例えば、ＴＫＰ１δポリペプチド）、ヒトＰＫＣθポリペプチド、スタウロスポリンまたはヒトＰＫＣθポリペプチド／スタウロスポリン複合体に関する情報（例えば、配列情報）に基づき得る。一例として、ＴＫＰ１δポリペプチドの構造モデルのごとき既知のプロテインキナーゼの１またはそれ以上のモデルが用いられる実施態様において、一の調整は、異なるプロテインキナーゼ（例えば、ヒトＰＫＣθポリペプチド）の対応する部位にあるアミノ酸で既知のプロテインキナーゼポリペプチド中のアミノ酸を置換することを含み得る。修飾比較モデルへの調整が電子密度マップへの最良の適合を満たす場合、得られたモデルは、Ｘ線データが由来するポリペプチドもしくは複合体を描写するために決定されるものである。かかる過程の方法は、例えば、ＣａｒｔｅｒおよびＳｗｅｅｔ，ｅｄｓ．，“Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７７，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７およびその引用文献、例えば、ＪｏｎｅｓおよびＫｊｅｌｄｇａａｒｄ，“Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｍａｐ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ，”ｐ．１７３ならびにＫｌｅｙｗｅｇｔおよびＪｏｎｅｓ，“Ｍｏｄｅｌ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，”ｐ．２０８において開示されている。
【００４５】
ポリペプチドもしくは複合体の結晶に対応する新たに計算された電子密度マップを用いて既知のポリペプチドもしくは既知の複合体の三次元モデルをアラインすることにより複合体の表示を導く方法が上記されている。このモデリング過程において用いられ得る一の調整は、既知の複合体の表示中の化合物をスタウロスポリンで置換することを含み得る。
【００４６】
上記したように、構造座標を含むＰＫＣθの三次元モデルは、ＰＫＣθ／スタウロスポリン結晶のＸ線回折データから誘導され得る。かかる一のモデルの構造座標を以下の表２に示す。三次元モデルは、アミノ酸のアルファ炭素原子からの±標準偏差が１．５Å以下、好ましくは１．０Å以下、および最も好ましくは０．５Å以下である、表２に記載の、ＰＫＣθの一部（例えば、ＰＫＣθの構造コアまたはＰＫＣθの活性部位）の構造座標を含み得る。ＰＫＣθの三次元モデルは、ＰＫＣθの様々な活性部位の可視化、同定および特徴付けを含むがこれらに限定されない多数の適用のために有用である。活性部位構造は、次いで、ＰＫＣθと相互作用する物質を設計するために用いられてもよい。
【００４７】
コンピュータのごとき機械は、機械に連結されたディスプレイ上に構造座標の三次元グラフィック表示を作成し得るプログラムと共に、ＰＫＣθモデルの構造座標を有するメモリ中にプログラミングされ得る。別法または追加的に、構造座標を受容し、かつ格納させるために、ソフトウェアシステムが設計および／または利用され得る。ソフトウェアシステムは、構造座標のグラフィック表示を作成可能である。ソフトウェアシステムは、スタウロスポリンと同様の構造特徴を有する化合物を同定するため、および／またはＰＫＣθと相互作用する可能性のある１もしくは複数の候補剤を提供し得る特徴を有する１またはそれ以上の候補剤を同定するために、外部データベースにアクセス可能でもある。
【００４８】
かかるデータを含むメモリを有する機械またはかかるデータを含むソフトウェアシステムは、ＰＫＣθもしくはＰＫＣθ複合体に関連する物質の能力を評価することを含む、ＰＫＣθ活性の阻害剤もしくは活性化因子の合理的設計または選択において、ならびに構造的もしくは配列ホモロジーによりＰＫＣθに関連付けられる化合物もしくは蛋白質のモデリングにおいて役立ち得る。例えば、かかる機械もしくはソフトウェアシステムは、ＰＫＣθに関連する物質の能力を評価する際に役立ち得るか、または、構造的もしくは配列ホモロジーによりＰＫＣθに関連付けられる化合物もしくは蛋白質のモデリングにおいて役立ち得る。本明細書中用いるような活性化因子またはアゴニストは、ＰＫＣθの少なくとも１つの活性を高める化合物を言い、および阻害剤またはアンタゴニストは、ヒトＰＫＣθポリペプチドの少なくとも１つの活性を阻害するか、もしくはその逆の活性を有する化合物を言う。例えば、スタウロスポリンのごとき化合物は、Ｔ細胞におけるＰＫＣθキナーゼ活性の比率を減少させることにより、ヒトＰＫＣθポリペプチドのアンタゴニストとして機能し得る。
【００４９】
機械は、ＰＫＣθ、その一部分（例えば、活性部位もしくは結合部位を含む一部分）、ＰＫＣθ／スタウロスポリン複合体またはＰＫＣθアナログの表示（例えば、二次元表示もしくは三次元表示）をもたらし得る。ソフトウェアシステムは、例えば、かかる情報を機械に生じさせ得る。機械は、機械可読データによりコードされたデータ格納用材料を含む機械可読データ格納媒体を含み得る。機械可読データは、ＰＫＣθまたはスタウロスポリンに結合したＰＫＣθの原子の構造座標を含み得る。データ格納用材料を含む機械可読格納媒体は、慣用的なコンピュータハードデバイス、フロッピー（登録商標）ディスク、ＤＡＴテープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、および他の磁気、光磁気、光媒体、およびコンピュータと併用するのに適合し得る他の媒体を含み得る。機械は、機械可読データを所望の三次元表示に処理するために、機械可読データを処理するための命令を格納するためのワーキングメモリ、ならびにワーキングメモリおよび機械可読データ格納媒体に連結した中央演算処理装置（ＣＰＵ）も有し得る。最終的に、ディスプレイがＣＰＵに連結され得、その結果、使用者は三次元表示を見ることができる。従って、該データを用いるための命令がプログラミングされた機械（例えば、本明細書中に記載した種類の１またはそれ以上のプログラムを搭載したコンピュータ）を用いる場合、機械は、本明細書中に記載の任意の分子もしくは分子複合体または分子複合体の分子部分のグラフィック表示（例えば、二次元グラフィック表示、三次元グラフィック表示）をディスプレイし得る。
【００５０】
ＰＫＣθの活性部位は、スタウロスポリン結合部位のごとき阻害剤結合部位を含み得る。ＰＫＣθの活性部位は、アミノ酸残基Ｌｅｕ３８６、Ｇｌｙ３８７、Ｇｌｙ３８９、Ｖａｌ３９４、Ａｌａ４０７、Ｌｙｓ４０９、Ｖａｌ４２２、Ｍｅｔ４５８、Ｇｌｕ４５９、Ｔｙｒ４６０、Ｌｅｕ４６１、Ｇｌｙ４６４、Ｌｅｕ４６６、Ａｓｐ５０８、Ａｓｎ５０９、Ｌｅｕ５１１、Ａｌａ５２１およびＡｓｐ５２２の１またはそれ以上を含み得る（図３Ａおよび３Ｂを参照のこと）。活性部位は、活性化セグメントに属するアミノ酸残基、残基５２２〜５４３、または活性化セグメントと相互作用する残基、例えば、Ｇｌｕ４２８、Ａｒｇ５０３、Ａｓｐ５０４、Ｌｙｓ５２７、Ｔｈｒ５３６およびＴｈｒ５３８を含み得る。ＰＫＣθの活性部位は、疎水性モチーフのアミノ酸残基、または疎水性モチーフと相互作用するアミノ酸残基、例えば、Ｌｙｓ４１３、Ｖａｌ４１６、Ｌｅｕ４１７、Ｖａｌ４２２、Ｍｅｔ４２６、Ｌｙｓ４２９、Ｔｈｒ４４７、Ｇｌｎ４４９、Ｌｅｕ４５４、Ｐｈｅ４５６、Ｐｈｅ６９１、Ａｒｇ６９２、Ａｓｎ６９３、Ｐｈｅ６９４およびＳｅｒ６９５を含み得る。ＰＫＣθの活性部位は、構造座標により示され得る。構造座標は、アミノ酸のアルファ炭素原子について、１．５Å以下、好ましくは１．０Å以下、および最も好ましくは０．５Å以下の±標準偏差に調整され得る。活性部位は、表２の構造座標により示され得る（以下を参照のこと）。
【００５１】
ＰＫＣθと相互作用（例えば、結合）する物質は、ＰＫＣθの表示、例えば、スタウロスポリンに結合したＰＫＣθの三次元モデルの使用を含む方法により同定または設計され得る。モデルは、ＰＫＣθアミノ酸配列からの保存的置換を有するＰＫＣθアナログのモデルであり得る。好ましくは、モデルは、ＰＫＣθの原子の構造座標を含む。構造座標は、例えば、表２の座標であり得、所望により、ＰＫＣθのアルファ炭素原子について１．５Å以下、１．０Å以下または０．５Å以下の±標準偏差に調節される。該方法において、三次元モデルは、スタウロスポリンに結合したＰＫＣθの構造座標を用いて作成される。モデルは、ＰＫＣθの一部分、例えば、活性部位を含み得る。モデルと相互作用する候補剤は、次いで、三次元モデルを用いて候補剤のコンピュータフィッティング分析を行うことにより設計または同定され得る。
【００５２】
ディスプレイ（例えば、コンピュータディスプレイ）は、ＰＫＣθの三次元モデルの表示、例えば、ＰＫＣθの活性部位のダイアグラムを使用者に示し得る。該モデルは、ＰＫＣθに結合した物質を含み得るか、または使用者は、ＰＫＣθモデル上に物質の三次元モデルを重ね合わせることができる。該物質は、例えば、ＰＫＣθの基質もしくは阻害剤、候補基質または候補阻害剤であり得る。モデル中の物質は、知られている化合物、新規化学構造または一の化学構造の一フラグメントであり得る。使用者は、ＰＫＣθ／物質複合体の得られた三次元モデルを調べることができる。ＰＫＣθ／物質複合体の三次元モデルは、例えば、既に存在しているＰＫＣθ／物質複合体モデル、例えば、ＰＫＣθ／スタウロスポリン複合体のモデルを改変することによっても作成され得る。該物質をより密接に活性部位へ適合させることが所望され得る。すなわち、該物質は、活性部位の形状を補完する形状を有し得る。物質の原子およびＰＫＣθの原子の間には、好ましい一の距離または距離範囲があり得る。好ましい距離よりも長い距離は、該物質とＰＫＣθ（例えば、ＰＫＣθの活性部位）の間の弱い相互作用に関連していてもよい。好ましい距離よりも短い距離は、該物質とＰＫＣθの間の相互作用を弱め得る斥力に関連していてもよい。原子間の距離が短すぎる場合、立体的衝突（ｓｔｅｒｉｃ  ｃｌａｓｈ）が生じ得る。２つの原子の位置が不当に互いに接近する場合、例えば、２つの原子がそれらのファン・デル・ワールス半径の合計未満の距離で離れている場合、立体的衝突が生じる。立体的衝突が存在するならば、使用者は、立体的衝突が取り除かれるまで、ＰＫＣθに対して該物質の位置を調節（例えば、該物質の剛体の並進または回転）することができる。使用者は、立体的衝突を取り除くために、該物質または該物質に近接するＰＫＣθのコンフォメーションを調節することができる。該物質の構造を改変することにより、例えば、芳香環のごとき大きな基をメチルもしくはヒドロキシ基のごときより小さな基へ変換することによってか、または柔軟性のない基（ｒｉｇｉｄ  ｇｒｏｕｐ）を、立体的衝突を生じないコンフォメーションに適応し得る柔軟性のある基に変換することにより、立体的衝突を取り除くこともできる。静電気力は、物質と活性部位の間の相互作用にも影響し得る。例えば、静電気特性は、該物質とＰＫＣθの間の相互作用を弱め得る斥力に関連し得る。静電気的反発力は、該物質の電荷を改変することにより、例えば、正に荷電した基を中性の基に置換することにより緩和され得る。
【００５３】
該物質とＰＫＣθの間の結合力に影響する力も、ＰＫＣθ／物質モデルにおいて評価され得る。これらは、水素結合、静電気力、疎水性相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用、双極子−双極子相互作用、π−スタッキング力およびカチオン−π相互作用を含み得るが、これらに限定されない。使用者はこれらの力を視覚的に、例えば、水素結合に適切な距離および角度で配列した水素結合供与体／受容体対に注目することにより評価できる。該評価に基づいて、使用者は、ＰＫＣθと該物質の間のより有利な相互作用を見出すためにモデルを改変できる。モデルの改変は、その化学構造を改変することなく、例えば、アミノ酸側鎖のコンフォメーションまたはバックボーン二面角を改変することにより、ＰＫＣθの三次元構造を変更することを含み得る。モデルの改変は、上記のように、該物質の位置またはコンフォメーションを改変することを含み得る。モデルの改変は、例えば、基を置換、付加または除去することにより該物質の化学構造を改変することも含み得る。例えば、ＰＫＣθ上の水素結合供与体が該物質上の水素結合供与体の近くに位置するならば、使用者はは、該物質上の水素結合供与体を水素結合受容体で置換することができる。
【００５４】
該物質およびＰＫＣθの相対的位置またはそれらのコンフォメーションは、ＰＫＣθに対する特定の物質の最適化された結合のジオメトリー（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）を見出すために調節され得る。最適化された結合のジオメトリーは、例えば、有利な水素結合の距離および角度、最大静電気的引力、最小静電気的反発力、水性環境からの疎水性部分の隔離、および立体的衝突の不在により特徴付けられる。最適化されたジオメトリーは、ＰＫＣθ／物質複合体についての可能なジオメトリーの一ファミリーの算出された最低エネルギーを有し得る。最適化されたジオメトリーは、例えば、分子力学または分子動態計算により決定され得る。
【００５５】
異なって結合された物質を有するＰＫＣθ／物質複合体の一連のモデル（例えば、二次元モデル、三次元モデル）が作成され得る。ＰＫＣθ／物質複合体の各モデルについて、順次、スコアが計算され得る。スコアは、例えば、ＰＫＣθと該物質の間の相互作用の予想される力を示し得る。スコアは、上記した結合力に影響する上記因子の１つを反映し得る。スコアは、一つ以上の因子を反映する総合的なスコアであり得る。異なる物質は、それらのスコアに従ってランク付けされ得る。
【００５６】
該物質の設計における工程は、機械（例えば、コンピュータ）による自動化様式にて実行され得る。例えば、ＰＫＣθ活性部位のモデルは、一連の候補物質のモデルを用いて、機械にプログラミングされ得る。機械は、ＰＫＣθ活性部位に対する各候補物質の最適化された結合のジオメトリーを見出し、次いで、スコアを計算し、一連の物質のうち、どの物質が最も強くＰＫＣθと相互作用する可能性があるかを決定できる。
【００５７】
ソフトウェアシステムは、これらの工程を促進するために設計および／または実行され得る。かかる三次元モデルを作成するか、または必要なフィッティング分析を実行するために用いられるソフトウェアシステム（例えば、コンピュータプログラム）は：Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのＭＣＳＳ、Ｌｕｄｉ、ＱＵＡＮＴＡ、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ、Ｃｅｒｉｕｓ２、ＣＨＡＲＭｍおよびＭｏｄｅｌｅｒ；ＴＲＩＰＯＳ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＳＹＢＹＬ、Ｕｎｉｔｙ、ＦｌｅＸＸおよびＬＥＡＰＦＲＯＧ；ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；ＧＲＩＤ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）；ＤＯＣＫ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）；ならびにＦｌｏ＋およびＦｌｏ９９（Ｔｈｉｓｔｌｅｓｏｆｔ，Ｍｏｒｒｉｓ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，ＮＪ）を含むが、これらに限定されない。他の有用なプログラムは、Ｏｐｅｎｅｙｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎｔａ  Ｆｅ，ＮＭ）からのＲＯＣＳ、ＺＡＰ、ＦＲＥＤ、ＶｉｄａおよびＳｚｙｂｋｉ；Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）からのＭａｅｓｔｒｏ、ＭａｃｒｏｍｏｄｅｌおよびＧｌｉｄｅ；ＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ）、Ａｌｌｅｇｒｏｗ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、ＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ，ら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌ．Ｓｅｃｔ．Ｄ  ５４：９０５−９２１，１９９７）ならびにＧＯＬＤ（Ｊｏｎｅｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４５：４３−５３，１９９５）を含む。構造座標は、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ、ＲＡＳＴＥＲ３ＤまたはＰＹＭＯＬ（Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４：９４６−９５０，１９９１；ＢａｃｏｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．６：２１９−２２０，１９９８；ＤｅＬａｎｏ，Ｔｈｅ  ＰＹＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（２００２）ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）を用いてＰＫＣθの三次元構造を可視化するためにも用いられ得る。
【００５８】
阻害剤または活性化因子に関わらず、物質は、適切なデータベースをスクリーニングすることにより選択されてもよく、適切なソフトウェアプログラムと併せて、空の（ｅｍｐｔｙ）ＰＫＣθ活性部位の立体コンフィギュレーションおよび電荷ポテンシャルを分析することにより新たに設計されてもよく、またはＰＫＣθもしくは他のプロテインキナーゼに対する既知の阻害剤もしくは活性化因子の特徴を用いて設計されてもよい。該方法を用いて、ＰＫＣθ阻害剤もしくは活性化因子を設計または選択できる。ソフトウェアシステムは、データベースサーチおよび／または物質の選択および設計を容易にするために、設計および／または実行され得る。
【００５９】
物質が設計または同定されたならば、それを入手または合成してもよく、およびさらにＰＫＣθ活性に対するその効果を評価してもよい。例えば、該物質は、同定された物質をＰＫＣθと接触させ、次いで、ＰＫＣθ活性に対する該物質の効果を測定することにより評価されてもよい。該物質を評価するための方法は、インビトロまたはインビボで行われる活性アッセイを含み得る。例えば、該物質は、それをＰＫＣθと接触させ、次いで、ポリペプチドによるキナーゼ活性に対する該物質の効果を測定することにより評価され得る。物質は、ペプチド基質、例えば、ビオチン化ペプチド基質ＦＲＡＫＧＳＬＦＱをリン酸化するＰＫＣθの能力を増大または軽減するそれらの能力により評価され得る。反応は、標識されたＡＴＰ（例えば、３３Ｐ−ＡＴＰ）を含み得、およびキナーゼ活性は、標識されたペプチド基質の結果として生じるレベルを測定することによりモニタリングされ得る。
【００６０】
キナーゼ活性アッセイのごとき活性アッセイは、インビボで行われ得る。例えば、該アッセイは細胞に基づくアッセイであり得る。
【００６１】
ＰＫＣθにおける物質の作用に応じて、該物質は、ＰＫＣθ活性の阻害剤または活性化因子のいずれかとして作用してもよい。ＰＫＣθとスタウロスポリン間の結合を該物質が阻害するか否かを決定するために、該物質は、スタウロスポリンの存在下にてＰＫＣθと接触されてもよい。同定された物質に結合したＰＫＣθを含む結晶は成長され得、およびＸ線結晶学により構造が決定され得る。ＰＫＣθと第１の物質の相互作用に基づいて、第２の物質が設計または同定され得る。
【００６２】
様々な分子分析および合理的な薬剤設計技法は、例えば、米国特許第５，８３４，２２８号、第５，９３９，５２８号および第５，８５６，１１６号ならびにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６８７９、公報ＷＯ  ９９／０９１４８においてさらに開示されており、その内容は出典明示により本明細書の一部となる。
【００６３】
特定の実施態様が記載されているが、他の実施態様も熟慮される。一例として、スタウロスポリンに結合したＰＫＣθを含む実施態様が記載されているが、本明細書の記載は、より一般的に、任意のＰＫＣθポリペプチドおよび任意のリガンドに関する。
【００６４】
実施例
残基３６２から残基７０６までのヒトＰＫＣθのＣ−末端触媒ドメインをｐＥＴ−１６ｂ発現ベクターにクローニングした。このベクターの発現蛋白質のＣ−末端にヘキサヒスチジンタグを導入した（図３Ｂを参照のこと）。プラスミドを用いて、過剰発現用の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１−ＤＥ３を形質転換した。１０リットルの細胞培養液を３７℃で約０．４のＯＤ６００まで増殖させた。次いで、温度を２５℃に下げ、その後、ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭで加え、発現を誘導した。その細胞をさらに４時間成長させ、その後、回収した。
【００６５】
回収した細胞を、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５ｍＭのイミダゾール、５０μＭのＡＴＰおよびプロテアーゼ阻害剤中に再懸濁し、次いで、マイクロフルイダイザーを用いて溶解した。その溶解物を２０ｍＬのニッケル−ＮＴＡ樹脂に４℃で１時間アプライした。その後、その樹脂をクロマトグラフィーカラムとして注ぎ、次いで、２５ｍＭのイミダゾール含有の同じバッファーで十分に洗浄した。樹脂に結合した蛋白質を２００ｍＭのイミダゾールバッファーで溶離した。次いで、その蛋白質を直ちにアニオン交換体ＨＱ（大容量４級化ポリエチレンイミン）にロードし、次いで、そのカラムを、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、５０μＭのＡＴＰで洗浄し、次いで、２５ｍＭないし５００ｍＭの直線勾配のＮａＣｌを加えることにより、分離した。ＰＫＣθを含むフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより選択し、プールし、次いで、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、５ｍＭのＤＴＴで２倍希釈し、次いで、ヘパリンクロマトグラフィーカラムにロードした。流出画分（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を直ちにヒドロキシアパタイトカラムにアプライし、次いで、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴで十分に洗浄した。０ないし１００ｍＭの直線勾配の硫酸ナトリウムにより、標的蛋白質を溶離した。次いで、その蛋白質をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィーカラムにてモノマーとして大きさにより分類し、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴに対して一晩透析し、次いで、７ｍｇ／ｍＬに濃縮し（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより測定）、その後、結晶化実験のために用いた。最後の濃縮工程の前に、スタウロスポリンをＰＫＣθへ、過剰な１：１．２のモル比にて加えた。
【００６６】
キナーゼドメインを発現する細菌抽出物を調製し、次いで、各５μｇの蛋白質、および２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．２中の、最終濃度８３μＭのビオチン化ペプチド基質（ＦＲＡＫＧＳＬＦＱ）（配列番号３）、１６６μＭのＡＴＰ、０．５μＬの３３Ｐ  ＡＴＰ（特異的活性  ３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍＬ）、８４ｎｇ／μＬのホスファチジルセリン、８．４ｎｇ／μＬのジアシルグリセロール、２５ｍＭのβ−グリセルアルデヒド、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＣａＣｌ２を最終容量３０μＬで用いて、３０分間、室温で、インビトロでのキナーゼ活性を分析した。精製したキナーゼの活性を、同様の放射性キナーゼアッセイにおいて４〜１０ｎＭのキナーゼドメインを用いてアッセイした。ＥＤＴＡ含有バッファーを加えることにより、キナーゼ反応を停止させ、次いで、洗浄およびプレートリーダーでの放射活性検出のために、ストレプトアビジンでコーティングしたシンチプレート（ｓｃｉｎｔｉｐｌａｔｅ）へ移した。別法では、５〜１０μＬの反応混合物をホスホセルロースペーパー上にスポットし、次いで、０．７５％のリン酸で３回、次いで、アセトンで１回洗浄した。シンチレーションカクテルをホスホセルロースペーパーに添加し、次いで、シンチレーションカウンターを用いて、結合した放射活性を検出した。ペプチドのみ、およびキナーゼのみの対照の反応に関連する放射活性を、バックグラウンドとして、最終カウントから差し引いた。
【００６７】
スタウロスポリンを添加した、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．０中のＰＫＣθ溶液を７ｍｇ／ｍＬに濃縮した。１８℃での懸滴から結晶を得た。該滴は、１μＬの蛋白質溶液および１μＬの沈殿溶液を含んだ。該沈殿溶液は、２Ｍの硫酸アンモニウム、４０ｍＭのＤＴＴおよび０．１Ｍのビス−トリス、ｐＨ５．０であった。結晶を、結晶化試薬および２５％のグリセロール含有の低温溶液（ｃｒｙｏ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で安定化させ、ナイロンループに取り付け、次いで、１００Ｋの窒素気流下で急速冷凍した。Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）にて、Ｑｕａｎｔｕｍ−４  ＣＣＤ検出器（Ａｒｅａ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、２Åの分解能までのＸ線回折データを集め、次いで、ＨＫＬ２０００ソフトウェア（ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉおよびＭｉｎｏｒ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２７６：３０７−３２６，１９９７を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）を用いて、そのデータを縮小した。収集データの統計値を表１に示す。
【００６８】
配列アライメントは、ヒトＰＫＣθおよびＴＰＫ１δ、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するｃＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットが、４２％の配列同一性および６３％の二次構造類似性を有することを示した。ＡＭＯＲＥを用いて、ＴＰＫ１δの構造（蛋白質データバンクコード  １ＦＯＴ）をサーチモデルとした分子置換により、位相を計算した（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０，１９９４；およびＭａｓｈｈｏｏｎら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８７：１１−１９，２００１を参照のこと。該文献の各々は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。８から３．５Åまでのデータを用いて、回転（ｒｏｔａｔｉｏｎ）および並進（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）関数の解を見出した。ＢＵＳＴＥＲプログラムおよびＴＮＴを用いて、最大エントロピーオミットマップを作成し、モデルバイアスを減じ、次いで、結合阻害剤についてのより詳細なマップを作成した（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ４９：３７−６０，１９９３；およびＴｒｏｎｒｕｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２７７Ｂ，１９９７を参照のこと。該文献の各々は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。Ｎ−ローブ中の幾つかの残基および全ての屈曲性ループは、該マップにあまり適合しない。モデルバイアスを改善し、およびＰＫＣθモデルについてのよりよいマップを作成するために、１ＦＯＴ．ｐｄｂデータファイルからのものを含む７つのプロテインキナーゼ座標を重ね合わせることにより、「平均マップ（ａｖｅｒａｇｅ  ｍａｐ）」を予測した。ＣＮＳプログラムを用いて、平均マップを作成した（Ｂｒｕｎｇｅｒら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５４：９０５−９２１，１９９８を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。得られた電子密度マップは、特にＮ−ローブ中のループ領域について、解釈がより容易だった。そのモデルをさらに再構築および精密化し、次いで、そのモデルの質をＲ−因子、Ｒｆｒｅｅにおける減少により評価し、および残基がどのようにマップに適合しているかも評価した。多数の再構築サイクルに付した後、精密化は、０．２０１のＲ−因子および０．２１６のＲｆｒｅｅに収束した。精密化統計値を表１の上に示す。最終的なモデルは、残基Ｉｌｅ３７７〜Ｐｒｏ６４９およびＧｌｎ６８８〜Ｐｈｅ６９６、２つのリン酸基（ホスホセリンおよびホスホトレオニンとして。下記を参照のこと）、１１５個の規則的な水分子および１個のスタウロスポリン分子の座標を含んだ。Ｎ−末端にある初めの１２残基、Ｃ−末端領域のＰｒｏ６５０〜Ａｓｐ６８７、およびＣ−末端にある最後の１０残基は、その電子密度の無秩序性に起因して、モデルに含まれなかった。
【００６９】
表１．Ｘ線回折収集データの統計値
【表１】
2007533309.tif 000003
【００７０】
精密化モデルの構造座標を以下の表２に提供する。表２において、「＃」の欄は、座標が提供される各原子についての番号を与える。「ｎａｍｅ」の欄は、原子の型を示し、および「ｒｅｓ」の欄は、原子が属する残基の型を示す。「ｃｈａｉｎ」は、原子が属するポリペプチドを示す。「ｒｅｓ  ＃」の欄は、原子の残基番号を与える。例えば、番号１の原子（表２の第１列目）は、Ｉｌｅ３７７のβ炭素（ＣＢ）である。そのｘ、ｙおよびｚの構造座標をそれぞれＸ、ＹおよびＺの欄に与える。「ｏｃｃ」の見出しのついた欄は、原子に割り当てられた占有率（１．００＝完全な占有率）を記載しており、および「Ｂ」の欄は、Å２の単位のＢ因子（または温度因子）を与える。結合したスタウロスポリンの座標は、「ｒｅｓ」の欄にある「ＳＴＵ」にて示されており、ならびにホスホトレオニンおよびホスホセリンはそれぞれ「ＴＰＢ」および「ＳＰＢ」により示されている。
【００７１】
ＰＫＣθの触媒ドメインの全体的な折り畳みは、ＡＧＣファミリー、ＰＫＡおよびＰＫＢ／ＡＫＴのものを含む、他のプロテインキナーゼと同様であった（Ｙａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：９４０−９４４，２００２を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。図１に示したリボンダイアグラムは、保存された構造コア、ヒンジとして機能する柔軟なポリペプチドリンカー（残基４６２〜４６５、ＮＧＧＤ）により連結されている小さなＮ−末端ローブ（残基３７７〜４６１）および大きなＣ−末端ローブ（残基４６６〜６９６）を示す。Ｎ−末端ローブは、５本のストランドのβ−シート（β１〜β５）および２本のアルファへリックス（αＢおよびαＣ）を含み、ならびにＣ−末端ローブは、大部分がらせん状であり、８本のα−へリックス（αＤ〜αＫ）および４本のβ−ストランド（β６〜β９）を有した。
【００７２】
ＡＴＰ−結合ポケットはスタウロスポリンにより占有されており、および２つのローブの接合部分にあるヒンジセグメント付近に位置した。グリシンに富むループ（ｇｌｙｃｉｎ−ｒｉｃｈ  ｌｏｏｐ）（ＬＧｘＧｘｘＧｘＶ）とも呼ばれている、βストランド１と２の間のヌクレオチド−結合ループ（残基３８６〜３９４）は、多数のプロテインキナーゼにおいてかなりの構造的多様性を示す（Ｂｏｓｓｅｍｅｙｅｒら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：２０１−２０５，１９９４を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。ＰＫＣθ構造において、グリシンに富むループは、スタウロスポリンが結合する結果として、閉鎖した、固定されたコンフォメーションをとる。全てのキナーゼにおいて不変である主な触媒残基が、ＰＫＣθ構造に存在した。これらの残基は、触媒活性のあるキナーゼコンフォメーションを定めるために用いられる構造基準に従って、他の活性キナーゼ構造において観察される分子内相互作用を保存していた（ＨｕｓｅおよびＫｕｒｉｙａｎ，Ｃｅｌｌ  １０９：２５７−２８２，２００２を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。
【００７３】
活性酵素を反映するほとんどのＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ構造においてのように（Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｃｅｌｌ８５：１４９−１５８，１９９６。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）、Ｃ−ローブの活性化セグメント（残基５２６〜５４０）は十分に秩序立っており、広がったコンフォメーションをとり、および５３８位にリン酸化されたＴｈｒを有した。キナーゼドメインが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にて発現されるように、Ｔｈｒ５３８のリン酸化は、活性化セグメントの自己リン酸化（別の酵素に触媒されるリン酸化と対照的に）を表した。特に、ホスホトレオニン５３８と正に荷電したＡｒｇ５０３およびＬｙｓ５２７との間の、幾つかのイオン性相互作用は、ＰＫＡおよびＰＫＢにおける等価な相互作用と同様であり、一方で、へリックスαＣを含むものの間には明かな違いがあった（下記を参照のこと）。
【００７４】
Ｃ−末端疎水性モチーフ（ＨＭ，配列：ＦｘｘＦＳ＊，ここで、＊は、セリン側鎖のリン酸化を示す）は、ＡＧＣファミリーにわたって保存されている特徴である。ＰＫＣθ構造において、Ｓｅｒ６９５はリン酸化されており、およびＰＫＡおよびＰＫＢのＦＸＸＦ−結合ポケットと同様の位置で、Ｎ−ローブの疎水性の溝に隣接していた。ＨＭモチーフもＰＫＣθキナーゼドメインにより自己リン酸化される。ＨＭセリンのリン酸化は、ＨＭとＮ−ローブの間の密接な分子内結合を促進することにより、ＡＧＣキナーゼの活性コンフォメーションを安定化することが示唆されている（Ｙａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：９４０−９４４，２００２を参照のこと）。特徴的な芳香族残基、ホスホセリン６９５およびＮ−ローブの疎水性の溝の間の相互作用が保存されており、このことは、ホスホセリン６９５がＰＫＡおよびＰＫＢにおいてと同様の役割をＰＫＣθにおいて果たすことを示す。
【００７５】
スタウロスポリンは、天然生成物のプロテインキナーゼ阻害剤であり、ＰＫＣアイソフォームに対しては低いナノモルの抗力を有するが、カゼインキナーゼ１（ＣＫ１）、カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）およびＣＳＫのごとき他のプロテインキナーゼに対してはわずかなマイクロモルの効力を有する（Ｍｅｇｇｉｏら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３４：３１７−２２，１９９５を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。この選択性のために、スタウロスポリンは、合理的な薬剤設計のためにキナーゼの触媒部位をターゲッティングするためのファーマコフォアモデルとして用いられてきた。
【００７６】
スタウロスポリンは、ＰＫＣθのアデノシン−結合ポケットを占有していた。該阻害剤は、酵素のバックボーンと３つの水素結合を形成し、そして、Ｎ−およびＣ−ローブの間の深い疎水性の亀裂内に広大なファン・デル・ワールス結合を生じた。図２を参照のこと。該図は、ＡＴＰ−結合部位におけるスタウロスポリンとＰＫＣθの間のファン・デル・ワールス結合を示す。水素結合モチーフは、スタウロスポリンのラクタム環とＧｌｕ４５９およびＬｅｕ４６１のバックボーン原子の間、およびグリコシド環とＡｓｐ５０８のカルボニル酸素の間の相互作用に関与していた。大部分の非極性相互作用は、グリシンに富むループの残基（Ｌｅｕ３８６、Ｇｌｙ３８７、Ｇｌｙ３８９、Ｖａｌ３９４）に由来しており、ならびに残りの相互作用は、Ｎ−末端ローブに由来する４残基（Ａｌａ４０７、Ｌｙｓ４０９、Ｍｅｔ４５８およびＴｙｒ４６０）およびＣ−末端ローブに由来する９残基（Ｌｅｕ４６１、Ｇｌｙ４６４、Ｌｅｕ４６６、Ｌｅｕ５１１、Ａｌａ５２１、Ｖａｌ４２２、Ａｓｎ５０９、Ａｌａ５２１およびＡｓｐ５２２）に関与していた。
【００７７】
スタウロスポリンに結合したＰＫＡおよびＣＤＫ２キナーゼの構造と比較すると、スタウロスポリン−ＰＫＣθ結合には有意な違いがあった。初めに、スタウロスポリンはＰＫＣθと水素結合を３つだけ形成し、これは、ＰＫＡおよびＣＤＫ２の両方における４つの潜在的な水素結合接触と対照的だった。有意な違いがグリシンに富むループにある。特に、ＰＫＡおよびＣＤＫ２と対照的に、ＰＫＣθ中にスタウロスポリンを順応させることにより、グリシンに富むループが十分に閉鎖される。結果として、この領域（残基３８８〜３９２）にあるバックボーンおよび側鎖の残基は、ＡＴＰ−結合ポケットのより深くに移動し、ＡＴＰと衝突し得る位置をとり、それにより、スタウロスポリンとより非極性の結合を形成する。相当する残基の同様の移動も、ＭＫ２に対するスタウロスポリンの結合において観察された（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １１：６２７−６３６，２００３。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。
【００７８】
活性化セグメントは、プロテインキナーゼの調節および触媒活性のために重要である非常に変わりやすい構造エレメントである。この領域は、補因子を活性化または不活性化するためのドッキング部位として作用し（ＥｎｇｈおよびＢｏｓｓｅｍｅｙｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ９３：９９−１１１，２００２を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）、およびペプチド基質が順応するためのＰ＋１ポケットを提供する。他のＳｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼにおいてと同様に、ＰＫＣθの活性化セグメント（残基５２２〜５４３）は、不変なＤＦＧとＴＰＤモチーフの間に位置し、およびＴｈｒ５３８に高度に保存されたリン酸化部位を含む。実際、この残基に結合したリン酸基について明瞭な電子密度が観察され、このことは、Ｔｈｒ５３８が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現の間、自己触媒的にリン酸化されていることを示す。興味深いことに、リン酸化Ｔｈｒ５３８に隣接する配列（ＫＴＮＴ＊Ｆ、ここで、＊はリン酸化を示す）は、−３位に正に荷電した残基を含み、これは、ＰＫＣサブファミリーにより認識される好ましい基質の配列（ＲＸＸＴ＊／Ｓ＊Ｆ）に矛盾しない（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９５２−６０，１９９７を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。この基本的な残基を欠失している大部分のＰＫＣアイソフォームとは違って、Ｌｙｓ５３５の存在は、Ｔｈｒ５３８においてＰＫＣθがそれ自身でリン酸化するための可能性を示唆しており、および全長ＰＫＣθのＫ４０９Ｗ突然変異体は活性化ループにてリン酸化されておらず、かつ不活性であるという決定と一致する（Ｌｉｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１：２５５−２６５，２００２を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。同様に、ＰＫＣθの触媒ドメインのＫ４０９Ｗ突然変異体は活性化ループにてリン酸化されておらず、かつ不活性であった。
【００７９】
構造的結果は、活性化セグメントにおけるリン酸基についての主要な役割が、活性化セグメントの方向を示す正に荷電した残基のクラスターを補填することであることを示唆している。ＰＫＣθにおいて、リン酸化Ｔｈｒ５３８は、Ａｒｇ５０３と２つの水素結合およびＬｙｓ５２７と１つの水素結合を形成した。この相互作用ネットワークは、多数のプロテインキナーゼにおいて高度に保存されており、および活性化において重要な役割を果たす。特に、保存されたＡｒｇ５０３とリン酸化Ｔｈｒ５３８のイオン性相互作用は、触媒塩基Ａｓｐ５０４の正確な配向性を安定化させるのに役立つ、触媒ループへの直接結合をもたらし得る。塩基性残基との静電気的相互作用に加えて、リン酸化Ｔｈｒ５３８は、Ｔｈｒ５３６の側鎖の酸素と水素結合もされていた。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から免疫沈降した全長ＰＫＣθのインビトロ活性研究は、Ｔｈｒ５３８Ｇｌｕ突然変異体が野生型酵素よりも３倍低い活性であることを示した（Ｌｉｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１：２５５−２６５，２００２を参照のこと）。これは、リン酸基の全ての３つの酸素原子が蛋白質とのイオン性相互作用に直接関与しているという知見と一致し、この位置にあるグルタミン酸はホスホアミノ酸の部分的模倣体のみをもたらし得ることを示す。概して、これらのイオン結合は、ＰＫＡおよびＰＫＢの活性化状態において観察されるものと同様の、リン酸化活性化ループのコンフォメーションを安定化し得る。
【００８０】
ＰＫＣサブファミリーにおいて、活性化セグメントＴｈｒでのリン酸化は、ＰＫＣθ、ＰＫＣεおよびＰＫＣδの間で異なる。ＰＫＣθおよびＰＫＣεのいずれとも対照的に、ＰＫＣδは、活性のために活性化セグメントＴｈｒを必要としない。ＰＫＣδは恐らく近くの残基Ｇｌｕ５００を利用して、リン酸化ＰＫＣθキナーゼドメインについて上記したイオン性相互作用の幾つかを維持する。興味深いことに、Ｇｌｕ５００はＰＫＣδに特有であり、および他のＰＫＣアイソフォームでは見られない。これと一致し、かつさらにＰＫＣθと対照的に、ＰＫＣδにおけるＴｈｒからＧｌｕへの酸置換は、恐らく蛋白質とのさらなるイオン性相互作用を促進することにより、野生型と比較してキナーゼ活性を高めることのみに役立つ（Ｌｉｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１：２５５−２６５，２００２を参照のこと）。ＰＫＣθと違って、ＰＫＣε活性化セグメントＴｈｒは自己リン酸化できず、およびＰＤＫ−１によりリン酸化されることが報告されている（Ｃｅｎｎｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６３：５３７−５４５，２００２を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。ＰＫＣθとＰＤＫ−１の関連性も報告されている（Ｌｉｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１：２５５−２６５，２００２を参照のこと）。しかし、ＰＫＣθキナーゼドメインは、活性化セグメントＴｈｒを自己リン酸化し得る。
【００８１】
ＰＫＣ新規サブファミリー内での特質に加えて、活性化ループとへリックスαＣとの間の構造カップリングに関与する相互作用の詳細は、ＰＫＡおよびＰＫＢを含む他のＡＧＣキナーゼと比べて、ＰＫＣθにおいてかなり異なる。他のキナーゼにおいてのように、αＣへリックスは、Ｎ−ローブ、Ｃ−ローブおよび活性部位をまとめて結合する。図１を参照のこと。へリックスのＮ−末端にある不変なグルタミン酸残基であるＧｌｕ４２８は、触媒中心にある不変なリジン残基であるＬｙｓ４０９とイオン対を形成し、そして活性化セグメントの保存されたＤＦＧモチーフと直接的接触を形成した。Ｋ４０９Ｒ突然変異は、ＰＫＣθの触媒活性を排除した（ＶｉｌｌａｌｂａおよびＡｌｔｍａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２：１２５−１３７，２００２を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。
【００８２】
ＰＫＡおよびＰＫＢの両方において、へリックスαＣは、塩基性残基（ＰＫＡにおいてＨｉｓ８７、およびＰＫＢにおいてＨｉｓ１９６）をもたらし、ホスホアミノ酸と接触した。ＰＫＣθにおいて、構造的に等価な残基はＣｙｓ４２４である。この配列の差異に起因して、等価なイオン対はＰＫＣθに不在であった。その代わりに、αＣへリックスを直接活性化セグメントに連結するという新しい水素結合パターンが観察されたが、リン酸基に結合しなかった。このペアリングスキームは、活性化セグメントのＮ−末端部分に由来するＧｌｕ５２８とαＣへリックスに由来するＡｒｇ４３０の間の静電気的相互作用を含んだ。故に、ＰＫＡおよびＰＫＢにおいて正確なローブ配向性を促進する、不変なヒスチジン−ホスホトレオニン結合の構造的役割は、Ｇｌｕ５２８およびＡｒｇ４３０を含む代替イオン対により、ＰＫＣθにおいて成し遂げられ得る。
【００８３】
他のプロテインキナーゼと同様に、ＰＫＣθは、ターンモチーフ（残基６５７〜６８５）および疎水性モチーフ（ＨＭ）ＦｘｘＦＳ＊（残基６９１〜６９５）と称されるさらなる２つの保存されたリン酸化部位を有する。ＰＫＣθ構造において、ターンモチーフに相当する領域は完全に無秩序であった。残基６５０〜６８７について明瞭に定められた電子密度はなかった。残基６９７〜７０６も無秩序であった。一続きの秩序立った１７個のアミノ酸残基を有するＰＫＢの疎水性モチーフ（ＨＭ）と違って、ＰＫＣθのＨＭは非常に短く（残基６８８〜６９６）、かつこのセグメントにおける無秩序性を示す、高いＢ−因子の値を示した。また、これらの観察結果は、この特有の結晶形態において、またはキナーゼ基質の不在に起因して、ＰＫＣθのターンモチーフおよびＨＭが本質的にフレキシブルであることを示唆した。
【００８４】
ＰＫＣθのＳｅｒ６９５に結合したリン酸基は、明瞭な電子密度を有し、ならびにＧｌｎ４４９と２つの水素結合−１つは側鎖原子との結合およびもう１つはその主鎖アミド窒素との結合−を形成した。観察された水素結合パターンは、インビトロでのＰＫＣθ活性の分析結果と一致した。全長ＰＫＣθのこの位置にあるセリンのグルタミン酸での置換（すなわち、Ｓｅｒ６９５Ｇｌｕ突然変異体）は、十分なＰＫＣθＨＭリン酸化模倣体であった。全長ＰＫＣθのＳｅｒ６９５Ｇｌｕは野生型全長ＰＫＣθの触媒活性の６０％を有した（Ｌｉｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３６１：２５５−２６５，２００２を参照のこと）。
【００８５】
Ｎ−ローブのＨＭモチーフと疎水性の溝の間には広範な疎水結合もあった。これらは、不変なフェニルアラニン残基（Ｐｈｅ６９１およびＰｈｅ６９４）、ならびにαＢおよびαＣへリックスならびにβ５ストランドに由来する残基（Ｌｙｓ４１３、Ｖａｌ４１６、Ｌｅｕ４１７、Ｖａｌ４２２、Ｍｅｔ４２６、Ｌｙｓ４２９、Ｔｈｒ４４７、Ｌｅｕ４５４およびＰｈｅ４５６）を含んだ。また、これらの相互作用は、αＢおよびαＣへリックスの秩序あるコンフォメーションを安定化するのに重要な構造的役割を担うことができる。ＰＫＡおよびＰＫＢにおいて等価なフェニルアラニン残基は、これらの酵素の安定性および触媒活性に必須であることが示された（Ｂａｌｅｎｄｒａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９：３９３−４０４，１９９９；およびＡｌｅｓｓｉら，ＥＭＢＯＪ．１５：６５４１−６５５１，１９９６を参照のこと。該文献の各々は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。
【００８６】
ＰＫＣθのＨＭリン酸化は、最適な酵素活性のために必要とされており、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から免疫沈降した全長ＰＫＣθのＳｅｒ６９５Ａｌａ突然変異体において、キナーゼ活性を５倍低下した（Ｌｉｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１：２５５−２６５，２００２を参照のこと）。ＰＫＣθ突然変異体Ｔ５３８Ａはその疎水性モチーフのリン酸化を完全に欠失し、このことは、ＨＭ領域が自己リン酸化部位であることを示す。ＬａｎｇおよびＣｏｈｅｎ，Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ  １０８：ＲＥ１７，２００１；およびＹａｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ９：１２２７−１２４０，２００２を参照のこと。該文献の各々は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されるキナーゼドメインの突然変異分析により、本発明者らは、Ｓｅｒ６９５Ａｌａ触媒ドメイン突然変異体がＴｈｒ５３８にある活性化セグメントのリン酸化を完全に欠失していたことを示し、このことは、ＰＫＣθ自己リン酸化が最初の活性化機序としてＨＭおよび活性化セグメントリン酸化の両方を含むことを示唆する。
【００８７】
それらのリン酸化および非−または部分的−リン酸化対応物を含む、他の公開されたＡＧＣキナーゼの不活性および活性コンフォメーションは、異なる構造特徴を示した。活性化セグメントおよびＣ−末端疎水性モチーフにおいて見られたコンフォメーション変化に加えて、これらの違いは、Ｎ−ローブにおけるαＢおよびαＣへリックスの構造無秩序性またはミスアラインメントに関連するＮ−およびＣ−ローブの相対的配置を含んだ。ＰＫＢおよびＰＫＡ（その活性化状態において結晶化されていた）と同様に、ＰＫＣθのαＢおよびαＣへリックス、活性化セグメントならびにＨＭは、十分に秩序立っており、および触媒部位の残基に対して整列していた。これは、コンフォメーションの無秩序性または構造的ミスアラインメントにより特徴付けられる、不活性ＰＫＡおよびＰＫＢの対応する領域に対照的であった。
【００８８】
さらに、「開放した」および「閉鎖した」として言及されたプロテインキナーゼの今までに報告された２つの主要なコンフォメーション状態とＰＫＣθとの詳細な比較により、スタウロスポリンとの複合体におけるＰＫＣθのキナーゼドメインは、部分的に閉鎖した特有のコンフォメーションをとることが示された（Ｂｉｏｎｄｉら，ＥＭＢＯＪ．２１：４２１９−４２２８，２００２を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる）。２つの分類基準：グリシンに富むループの開き（ＰＫＡ構造におけるＳｅｒ５３−Ｇｌｙ１８６の距離に基づいて）およびαＣ−へリックスのポジショニング（Ｈｉｓ８７とリン酸化Ｔｈｒ１９７の間の距離に基づいて）を適用して、開放および閉鎖したコンフォメーションを区別した。Ｔａｙｌｏｒら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４２９−６２，１９９２を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。構造的に等価な位置での配列差異に関連した起こりうる問題を回避し、それにより、これらの基準をＰＫＣθに適用するために、対応する残基のＣα−原子間の距離を代わりに測定した。この比較の結果は、グリシンに富むループを除き（ｅｘｐｅｃｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｌｏｏｐ）、ＰＫＣθにおけるローブの相対的位置は、「中間体」キナーゼ構造：阻害剤スタウロスポリンとの複合体中のＰＫＡまたはＡＴＰとの複合体中のバラノール（ｂａｌａｎｏｌ）およびＰＤＫ１に最も類似性を見せることが示された。故に、ＰＣＫθの触媒ドメインは、スタウロスポリンが結合する際の、グリシンに富むループの完全な閉鎖に伴う、「中間体」コンフォメーション、すなわち、部分的に閉鎖したコンフォメーションを示した。
【００８９】
表２．ＰＫＣθ／スタウロスポリン複合体に関する構造座標
【表２】
2007533309.tif 000004
【表３】
2007533309.tif 000005
【表４】
2007533309.tif 000006
【表５】
2007533309.tif 000007
【表６】
2007533309.tif 000008
【表７】
2007533309.tif 000009
【表８】
2007533309.tif 000010
【表９】
2007533309.tif 000011
【表１０】
2007533309.tif 000012
【表１１】
2007533309.tif 000013
【表１２】
2007533309.tif 000014
【表１３】
2007533309.tif 000015
【表１４】
2007533309.tif 000016
【表１５】
2007533309.tif 000017
【表１６】
2007533309.tif 000018
【表１７】
2007533309.tif 000019
【表１８】
2007533309.tif 000020
【表１９】
2007533309.tif 000021
【表２０】
2007533309.tif 000022
【表２１】
2007533309.tif 000023
【表２２】
2007533309.tif 000024
【表２３】
2007533309.tif 000025
【表２４】
2007533309.tif 000026
【表２５】
2007533309.tif 000027
【表２６】
2007533309.tif 000028
【表２７】
2007533309.tif 000029
【表２８】
2007533309.tif 000030
【表２９】
2007533309.tif 000031
【表３０】
2007533309.tif 000032
【表３１】
2007533309.tif 000033
【表３２】
2007533309.tif 000034
【表３３】
2007533309.tif 000035
【表３４】
2007533309.tif 000036
【表３５】
2007533309.tif 000037
【表３６】
2007533309.tif 000038
【表３７】
2007533309.tif 000039
【表３８】
2007533309.tif 000040
【表３９】
2007533309.tif 000041
【表４０】
2007533309.tif 000042
【表４１】
2007533309.tif 000043
【表４２】
2007533309.tif 000044
【表４３】
2007533309.tif 000045
【表４４】
2007533309.tif 000046
【表４５】
2007533309.tif 000047
【表４６】
2007533309.tif 000048
【表４７】
2007533309.tif 000049
【表４８】
2007533309.tif 000050
【表４９】
2007533309.tif 000051
【表５０】
2007533309.tif 000052
【表５１】
2007533309.tif 000053
【００９０】
他の実施態様も特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、スタウロスポリンと複合体化したヒトＰＫＣθのリボンダイアグラムである。
【図２】図２は、実験から得た構造座標に基づいた、ヒトＰＫＣθに結合したスタウロスポリンのダイアグラムである。
【図３Ａ】図３Ａは、全長ヒトＰＫＣθのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｃ−末端にヘキサヒスチジンタグを有するヒトＰＫＣθの触媒ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１】
2007533309.tif 000054
【図２】
2007533309.tif 000055
【図２】
2007533309.tif 000056
【図３】
2007533309.tif 000057
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月12日(2006.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007533309000001.app
【国際調査報告】
2007533309.tif 000058
2007533309.tif 000059
2007533309.tif 000060
2007533309.tif 000061
2007533309.tif 000062
2007533309.tif 000063