(57)【要約】  糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ）に結合し、及び／又はその活性を調節する能力を有する化合物を同定するために蛍光偏光を使用する方法及びシステムが開示される。本発明の方法及びシステムを使用して同定される化合物は、小有機分子ＲＡＧＥアンタゴニストを含んでもよい。本発明の方法及びシステムを使用して同定される小有機分子ＲＡＧＥアンタゴニストは、糖尿病又はアルツハイマー病のなどの（しかし、これらに限定されない）ＲＡＧＥ媒介性疾患を治療するために使用され得る。
2007529752.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むＲＡＧＥポリペプチド、（ｉｉ）蛍光ＲＡＧＥリガンド、及び（ｉｉｉ）被検化合物を供給すること、
（ｂ）前記被検化合物及び前記蛍光ＲＡＧＥリガンドを、前記ＲＡＧＥポリペプチドへ添加すること、及び
（ｃ）前記蛍光ＲＡＧＥリガンドの偏光を測定すること
を含む、ＲＡＧＥモジュレーターの検出方法。
【請求項２】
（ｄ）偏光のレベルを、ＲＡＧＥポリペプチドへ結合した蛍光ＲＡＧＥリガンドの量と相関させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
様々な量の前記被検化合物の存在下で、前記ＲＡＧＥポリペプチドへ結合した蛍光ＲＡＧＥリガンドの量を測定することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＲＡＧＥポリペプチドへの蛍光ＲＡＧＥリガンドの結合を既定量低減させるのに要される被検化合物の量に基づいて、ＲＡＧＥリガンド結合領域に対する被検化合物の親和性を決定することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記被検化合物の、前記ＲＡＧＥポリペプチドへの蛍光ＲＡＧＥリガンドの結合を低減させる能力は、第２の化合物の、前記ＲＡＧＥポリペプチドへの蛍光ＲＡＧＥリガンドの結合を低減させる能力と比較される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の化合物は前記ＲＡＧＥリガンド結合領域へ実質的に結合せず、前記ＲＡＧＥリガンド結合領域への結合の測定用の陰性対照として機能する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の化合物が、前記ＲＡＧＥリガンド結合領域に対する実質的な結合親和性を有し、前記ＲＡＧＥリガンド結合領域への結合の測定用の陽性対照として機能する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の化合物が、前記被検化合物の構造改変体又は化学改変体の少なくとも１つを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光リガンドが、糖化最終産物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光リガンドが、アミロイドβポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アミロイドβペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を有するアミロイドβ（１−４０）を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アミロイドβペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を有するアミロイドβ（１−４２）を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
フルオレセインが前記アミロイドβポリペプチドのアミノ末端へ結合している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記蛍光リガンドが、ｓ１００ｂを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記蛍光リガンドが、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記蛍光リガンドが、アンフォテリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記蛍光リガンドが、カルグラヌリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光リガンドが、１，０００ダルトン未満の分子量の小有機分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドが、第２のポリペプチドへ共有結合で連結されるか、又は該第２のポリペプチドと複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドが、ＲＡＧＥ又はそのフラグメントを認識する抗体と複合体を形成する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記被検化合物が、小有機分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記小有機分子が、１，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）蛍光ＲＡＧＥリガンド、
（ｂ）ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むＲＡＧＥポリペプチド、及び
（ｃ）被検化合物の存在下での（ａ）及び（ｂ）の希釈用の少なくとも１つのアッセイ試薬、の個別にパッケージングされた容器を含み、前記ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドへの前記蛍光ＲＡＧＥリガンドの結合が定量化される、リガンドのＲＡＧＥへの結合を調節する化合物を検出するためのシステム。
【請求項２７】
前記蛍光リガンドの偏光を測定するためのデバイスをさらに含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記ＲＡＧＥリガンド結合領域に対する既定の結合親和性を有する化合物をさらに含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２９】
前記ＲＡＧＥリガンド結合領域に対する既定の結合親和性を有する化合物がＲＡＧＥ結合領域へ実質的に結合せず、ＲＡＧＥリガンド結合領域への結合の測定用の陰性対照として機能する、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記第２の化合物が、ＲＡＧＥ結合領域に対する実質的な結合親和性を有し、ＲＡＧＥリガンド結合領域への結合の測定用の陽性対照として機能する、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３１】
前記第２の化合物が、前記被検化合物の構造改変体又は化学改変体の少なくとも１つを含む、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３２】
前記蛍光リガンドが糖化最終産物を含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３３】
前記蛍光リガンドがアミロイドβポリペプチドを含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３４】
前記アミロイドβペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を有するアミロイドβ（１−４０）を含む、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記アミロイドβペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を有するアミロイドβ（１−４２）を含む、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３６】
フルオレセインが、前記アミロイドβポリペプチドのアミノ末端へ結合している、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３７】
前記蛍光リガンドが、ｓ１００ｂを含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３８】
前記蛍光リガンドが、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）を含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３９】
前記蛍光リガンドが、アンフォテリンを含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４０】
前記蛍光リガンドが、カルグラヌリンを含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４１】
前記蛍光リガンドが、１，０００ダルトン未満の分子量の小有機分子を含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４２】
前記ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４３】
前記ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４４】
前記ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４５】
ＲＡＧＥの結合領域を含むポリペプチドが、第２のポリペプチドへ共有結合で連結されているか、又は該第２のポリペプチドと複合体を形成する、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４６】
前記ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドが、ＲＡＧＥ又は該ＲＡＧＥのフラグメントを認識する抗体と複合体を形成する、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４７】
前記被検化合物が小有機分子を含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４８】
前記小有機分子が１，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項４７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ）を調節する能力を有する化合物を同定するための蛍光偏光を使用する方法及びシステムの使用に関する。
【０００２】
［関連出願］
本出願は、米国特許法第１１９条に基づいて、２００４年３月１８日に出願された「ＲＡＧＥを調節する化合物を同定するための蛍光偏光の使用」という表題の米国仮特許出願第６０／５５４，１８３号からの優先権を主張する。米国特許出願第６０／５５４，１８３号の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
［背景］
タンパク質又は脂質をアルドース糖類とインキュベートすると、タンパク質のアミノ基の非酵素的糖化及び酸化が起こり、アマドリ付加物が生成される。時間の経過とともに、その付加物ではさらに転位、脱水、及び他のタンパク質との架橋が起こり、糖化最終産物（ＡＧＥ）として知られる複合体が生成される。ＡＧＥの生成を促進する要因としては、タンパク質代謝回転の遅延（例えば、アミロイド症で見られる）、リジン含有量の高い巨大分子の蓄積、及び高血糖値（例えば、糖尿病で見られる）(Horiら、J． Biol． Chem．
270： 25752-761(1995))がある。ＡＧＥは、糖尿病や正常な老化に関連する合併症を含む多様な障害に関係してきた。
【０００４】
ＡＧＥは、微小血管系の内皮細胞、単球、及びマクロファージ、平滑筋細胞、メサンギウム細胞、並びにニューロンの細胞表面の受容体へ特異的かつ飽和性に結合する。糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ）は、細胞表面分子の免疫グロブリンスーパーファミリーの一構成要素である。ＲＡＧＥの細胞外（Ｎ−末端）領域には、１つのＶ（可変）タイプ領域に続き２つのＣ（定常）タイプ領域といった３タイプの免疫グロブリン領域がある(Neeperら、J. Biol. Chem. 267：14998-15004(1992); Schmidtら、Circ. (Suppl.) 96#194(1997))。細胞外領域の次に単一の膜貫通型スパニング領域及び高い帯電状態にある短いサイトゾル末端が続く。細胞外領域であるＮ−末端は、ＲＡＧＥのタンパク質分解又は分子生物学的手法により単離でき、Ｖ及びＣ領域から成る可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）が生成される。
【０００５】
ＲＡＧＥは、ほとんどの組織で発現し、特に、胚形成時に皮質性ニューロンで見られる(Horiら、J. Biol. Chem. 270:25752-761(1995))。高いレベルのＲＡＧＥが、老化した組織でも見られ(Schleicherら、J. Clin. Invest. 99 (3): 457-468(1997))、また糖尿病性の網膜、血管構造及び腎臓でも見られる(Schmidtら、Nature Med. 1:1002-1004(1995))。異なった組織及び器官でのＲＡＧＥの活性化により、多くの病態生理学的結果がもたらされる。ＲＡＧＥは、急性及び慢性の炎症(Hofmannら、Cell 97:889-901(1999))、血管浸透性の増大といった糖尿病性後期合併症の進行(Wautierら、J. Clin. Invest. 97:238-243(1995))、腎障害(Teilletら、J. Am. Soc. Nephrol. 11:1488-1497(2000))、アテローム性動脈硬化症(Vlassaraら、The Finnish Medical Society DUODECIM,Ann. Med. 28:419-426(1996))、及び網膜症(Hammesら、Diabetologia 42:603-607(1999))等の多様な状態に関係してきた。また、ＲＡＧＥは、アルツハイマー病(Yanら、Nature 382: 685-691(1996))、勃起障害、及び腫瘍の浸潤及び転移(Taguchiら、Nature 405: 354-357(2000))にも関係してきた。
【０００６】
ＡＧＥに加えて、他の化合物がＲＡＧＥに結合して、ＲＡＧＥを調節できる。正常な発達において、ＲＡＧＥは、培養した胚性ニューロンにおける神経突起の増殖の媒介をするポリペプチドの一つである、アンフォテリンと相互作用をする（Horiら、１９９５）。また、ＲＡＧＥは、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、カルグラヌリン様リガンド、及びβ−アミロイドと相互に作用することがこれまでに示されている(Yanら、Nature  389:589-595(1997);Yanら、Nature 382:685-691(1996);Yanら、Proc． Natl．Acad． Sci． 94:5296-5301(1997))。
【０００７】
ＡＧＥ、Ｓ１００／カルグラヌリン、β−アミロイド、ＣＭＬ（Ｎε−カルボキシメチルリジン）、及びアンフォテリン等のリガンドのＲＡＧＥへの結合によって、多様な遺伝子の発現が修飾されることがこれまでに示されている。例えば、数多くの細胞タイプで、ＲＡＧＥとそのリガンドとの相互作用により、酸化的ストレスが生じ、これによって、フリーラジカル感応性の転写因子ＮＦ−κＢが活性化され、サイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦ−α等のＮＦ−κＢ調節遺伝子が活性化される。さらに、ｐ２１ｒａｓ、ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１及びＥＲＫ２等その他のいくつかの制御経路が、ＡＧＥ及びその他のリガンドのＲＡＧＥへの結合により活性化されることがこれまでに示されている。事実、ＲＡＧＥ自体の転写は、少なくとも部分的にはＮＦ−κＢにより調節される。こうして、上向性の、そしてしばしば有害でありうるスパイラルは、リガンド結合により始まる正のフィードバックループにより活気づけられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＲＡＧＥに対する生理学的リガンドの結合を拮抗することは、過剰濃度のＡＧＥ及び他のＲＡＧＥリガンドにより引き起こされる生理学的変化のダウンレギュレーションに関する論理的な標的であり得る。ＲＡＧＥへの内因性リガンドの結合を低減させることにより、ＲＡＧＥ媒介性障害に関連した症状が低減され得る。したがって、ＲＡＧＥ受容体への生理学的リガンドの結合を調節する化合物を発見する方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
［概要］
本発明の実施の形態は、糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ）を調節する能力を有する化合物を同定するために蛍光偏光を使用する方法及びシステムを提供する。本発明は、ＲＡＧＥへの生理学的リガンドの結合を調節することができる化合物の発見のためのアッセイ方法及び／又はシステムを含む。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、ＲＡＧＥモジュレーターの検出方法であって、（ｉ）ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むＲＡＧＥポリペプチド、（ｉｉ）蛍光ＲＡＧＥリガンド、及び（ｉｉｉ）被検化合物を供給することを含むＲＡＧＥモジュレーターの検出方法を含む。本方法は、被検化合物及び蛍光ＲＡＧＥリガンドを、ＲＡＧＥポリペプチドへ添加すること、及び蛍光ＲＡＧＥリガンドの偏光を測定することをさらに含む。
【００１１】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＲＡＧＥモジュレーターの検出用のシステムを含む。上記システムは、（ａ）蛍光ＲＡＧＥリガンド、（ｂ）ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチド、及び（ｃ）被検化合物の存在下での（ａ）及び（ｂ）の希釈用の少なくとも１つのアッセイ試薬の、個別にパッケージングされた容器を含んでもよく、それにより、ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドへの蛍光ＲＡＧＥリガンドの結合が定量化される。一実施形態では、上記システムは、陽性対照としてＲＡＧＥリガンド結合領域に対する実質的な結合親和性を有する非標識ＲＡＧＥリガンドをさらに含んでもよい。
【００１２】
本発明の特定の実施形態に関連する様々な利点が存在する。例えば、本発明の方法及びシステムは、ＲＡＧＥへの生理学的リガンドの結合、及びかかる結合の変化を測定し得る。また、本発明の方法及びシステムは、被検化合物の、ＲＡＧＥへ結合する能力、又はＲＡＧＥへの生理学的リガンドの結合を調節する能力を定量化することが可能である。
【００１３】
従来の結合アッセイに関連した洗浄工程の多くを排除することにより、本発明の方法及びシステムは、多数の化合物のハイスループットな自動スクリーニングを提供し得る。したがって、本発明の方法及びシステムは、潜在的なＲＡＧＥモジュレーターの迅速解析を提供し得る。
【００１４】
また、上記方法及びシステムは、ＲＡＧＥへの高親和性の定量化可能な結合を示すアッセイ試薬を含み、上記アッセイは、ＲＡＧＥに結合する、および／又はＲＡＧＥを調節する潜在性を有する化合物を検出するための高感度且つ非常に特異的なアッセイ系を提供し得る。
【００１５】
また、本発明の方法及びシステムは、放射標識試薬を使用するシステムに特有の安全性及び廃棄問題の多くにより制限されない安全且つ信頼性高いアッセイ系を提供し得る。上記アッセイは、研究所員又は環境へ脅威を提示しない非放射標識試薬を使用する。
【００１６】
上記方法は、ＲＡＧＥにより媒介される生物活性を調節するようにｉｎ  ｖｉｖｏで機能し得る分子を同定するために、多数の潜在的なＲＡＧＥモジュレーターをスクリーニングするための高感度ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試薬として、全長ＲＡＧＥタンパク質、又はＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むＲＡＧＥポリペプチドを利用し得る。使用される蛍光リガンドの性質を変更することにより、構造及び生理学的影響が異なるモジュレーターを同定することが可能である。
【００１７】
当然のことながら、本発明のさらなる特徴はこれ以降に記載される。本発明は、その用途において、添付の特許請求の範囲、明細書及び図面において記述される詳細に限定されないことが理解されよう。本発明は、他の実施の形態が可能であり、様々な方法で実施又は実行され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
［詳細な説明］
本発明は、ＲＡＧＥ活性を調節することができる化合物の発見のためのハイスループットアッセイの使用に関する。上記方法の実施形態は、ＲＡＧＥリガンド結合領域の生理学的及び構造的完全性が実質的に維持される条件下で、被検化合物の、ＲＡＧＥタンパク質又はリガンド結合領域を含むＲＡＧＥのフラグメントへの蛍光ＲＡＧＥリガンドの結合を調節する能力を測定する。続いて、ＲＡＧＥへのリガンド結合を調節することが可能な化合物は、生理学的活性に関して評価され得る。
【００１９】
本発明の一実施形態は、ＲＡＧＥのリガンド結合領域へのＲＡＧＥリガンドの結合を調節することができる化合物を検出する方法を含む。上記方法は、（ａ）（ｉ）ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むＲＡＧＥポリペプチド、（ｉｉ）蛍光ＲＡＧＥリガンド、及び（ｉｉｉ）被検化合物を供給する工程、（ｂ）上記被検化合物及び上記蛍光ＲＡＧＥリガンドを、上記ＲＡＧＥポリペプチドへ添加する工程、及び（ｃ）上記蛍光ＲＡＧＥリガンドの偏光を測定する工程を含み得る。
【００２０】
上記方法は、蛍光ＲＡＧＥリガンドの偏光のレベルを、ＲＡＧＥポリペプチドへ結合した蛍光ＲＡＧＥリガンドの量と相関させる工程をさらに含んでもよい。一実施形態では、蛍光ＲＡＧＥリガンドの偏光は、蛍光ＲＡＧＥリガンドが、ＲＡＧＥリガンド結合領域を
含むＲＡＧＥポリペプチドへ結合する場合に増大し得る。したがって、溶液中で遊離する蛍光リガンドに関する蛍光偏光度(milli-polarization)の値は、第２の分子（例えば、ＲＡＧＥポリペプチド）へ結合した同じ蛍光リガンドに関する蛍光偏光度の値より低い。被検非標識化合物が、ＲＡＧＥポリペプチドへの結合に関して有効に競合することが可能である場合、蛍光ＲＡＧＥリガンドは、ＲＡＧＥポリペプチドから離れ、それにより偏光の測定レベルを低減させる。被検化合物が競合的に蛍光ＲＡＧＥリガンドを置き換える場合、偏光は、遊離の（すなわち、結合していない）蛍光ＲＡＧＥリガンドに関して観察されるレベルへ低減される。
【００２１】
上記アッセイは、結合親和性の定量的測定を提供し得る。例えば、上記アッセイは、様々な量の被検化合物の存在下で、ＲＡＧＥポリペプチドへ結合した蛍光ＲＡＧＥリガンドの量を測定することを含んでもよい。一実施形態では、ＲＡＧＥリガンド結合領域に対する被検化合物の親和性は、ＲＡＧＥポリペプチドへの蛍光ＲＡＧＥリガンドの結合を既定量低減させるのに要される被検化合物の量に基づいて定量化される。したがって、上記システムは、様々な量の被検化合物の存在下で、ＲＡＧＥポリペプチドへ結合した蛍光ＲＡＧＥリガンドの量を比較する工程を含んでもよい。被検化合物が競合的にＲＡＧＥリガンド結合領域から蛍光ＲＡＧＥリガンドを置き換える場合、偏光のレベルは、被検非標識化合物の量が増大するにつれ減少すると予測される。
【００２２】
被検化合物は、ＲＡＧＥ又はＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドに対して様々な親和性を有する他の化合物と比較され得る。したがって、一実施形態では、被検化合物の、ＲＡＧＥポリペプチドへの蛍光ＲＡＧＥリガンドの結合を低減させる能力は、第２の化合物の、ＲＡＧＥポリペプチドへの蛍光ＲＡＧＥリガンドの結合を低減させる能力と比較される。一実施形態では、第２の化合物は、ＲＡＧＥリガンド結合領域へ実質的に結合せず、ＲＡＧＥリガンド結合領域への結合の測定用の陰性対照として機能する。
【００２３】
例えば、本発明の方法は、被検化合物の、ＲＡＧＥリガンド結合領域への結合に関して蛍光ＲＡＧＥリガンドと競合する能力を、生理学的特異性をもってＲＡＧＥリガンド結合領域へ結合しない第２の化合物と比較することを含んでもよい。このようにして、被検化合物の影響は解釈される。したがって、被検化合物がＲＡＧＥポリペプチドから蛍光リガンドに取って代わり、且つ陰性対照化合物による置き換えに類似した濃度を要する場合、被検化合物は、高親和性でＲＡＧＥリガンド結合領域へ結合しない可能性がある。代替的実施形態では、陰性対照は、１ｍＭより大きい、又は１００μＭより大きい、又は５０μＭより大きい、又は２０μＭより大きい、又は１０μＭより大きい、又は５μＭより大きいＲＡＧＥへの結合に関する解離定数（Ｋｄ）を示す分子であり得る。
【００２４】
或いは、第２の化合物は、ＲＡＧＥリガンド結合領域に対する実質的な結合親和性を有し、ＲＡＧＥリガンド結合領域への結合の測定用の陽性対照として機能する。このようにして、ＲＡＧＥへの結合に関して陽性対照化合物と比較した場合の被検化合物の相対的親和性が評価され得る。したがって、被検化合物が、陽性対照化合物による置き換えに類似した濃度で、ＲＡＧＥポリペプチドから蛍光リガンドを置き換える場合、被検化合物は、高親和性でＲＡＧＥリガンド結合領域へ結合する可能性がある。一実施形態では、陽性対照は、実質的な結合親和性でＲＡＧＥへ結合する小分子ＲＡＧＥアンタゴニストを含み得る。代替的実施形態では、陽性対照は、１μＭ未満、又は２００ｎＭ未満、又は５０ｎＭ未満、又は１０ｎＭ未満のＲＡＧＥへの結合に関する解離定数（Ｋｄ）を示す分子であり得る。
【００２５】
一実施形態では、第２の化合物は、被検化合物の化学的及び／又は構造的改変体である実験的分子を含んでもよい。被検化合物の相対的親和性を、被検化合物の化学的及び／又は構造的改変体である第２の化合物と比較することにより、ＲＡＧＥポリペプチドに対す
る結合親和性に対する特定の化学的及び／又は構造的変動の影響が決定され得る。このようにして、上記アッセイは、ＲＡＧＥリガンドに関する構造活性相関（ＳＡＲ）を規定するのに使用され得る。
【００２６】
本発明はまた、ＲＡＧＥへのリガンド結合及び／又はＲＡＧＥ活性を調節する能力を有する化合物の検出用のシステムを含んでもよい。一実施形態では、本発明は、ＲＡＧＥへのリガンドの結合を調節する化合物の検出用のシステムであって、（ａ）蛍光ＲＡＧＥリガンド、（ｂ）ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むＲＡＧＥポリペプチド、及び（ｃ）被検化合物の存在下での（ａ）及び（ｂ）の希釈用の少なくとも１つのアッセイ試薬の、個別にパッケージングされた容器を含み、それにより、上記ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含む上記ポリペプチドへの上記蛍光ＲＡＧＥリガンドの結合が定量化される検出用のシステムを含む。
【００２７】
上記システムは、ＲＡＧＥへのリガンド結合の定量的分析を可能にする。したがって、一実施形態では、上記システムは、蛍光リガンドの偏光を測定するためのデバイスを含む。
【００２８】
本発明のシステムを使用して、被検化合物は、ＲＡＧＥ又はＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドに対して様々な親和性を有する他の化合物と比較され得る。したがって、一実施形態では、被検化合物の、ＲＡＧＥポリペプチドへの蛍光リガンドの結合を低減させる能力は、ＲＡＧＥリガンド結合領域に対する既定の結合親和性を含む化合物の、ＲＡＧＥポリペプチドへの蛍光リガンドの結合を低減させる能力と比較される。一実施形態では、ＲＡＧＥリガンド結合領域に対する既定の結合親和性を含む化合物は、ＲＡＧＥ結合領域へ実質的に結合せず、そのような第２の化合物がＲＡＧＥリガンド結合領域への結合の測定用の陰性対照として機能する。或いは、第２の化合物は、ＲＡＧＥ結合領域に対する既定の結合親和性を含み、ＲＡＧＥリガンド結合領域への結合の測定用の陽性対照として機能してもよい。一実施形態では、陽性対照は、実質的な結合親和性でＲＡＧＥへ結合する小分子ＲＡＧＥアンタゴニストを含んでもよい。
【００２９】
第２の化合物は、被検化合物の化学的及び／又は構造的改変体である実験的分子を含んでもよい。被検化合物の相対的親和性を、被検化合物の化学的及び／又は構造的改変体である第２の化合物と比較することにより、ＲＡＧＥポリペプチドに対する結合親和性に対する特定の化学的及び／又は構造的変動の影響が決定され得る。このようにして、上記アッセイは、ＲＡＧＥリガンドに関する構造活性相関（ＳＡＲ）を規定するために使用され得る。一実施形態では、上記システムは、様々な被検化合物に関するＳＡＲ結果を分析するためのコンピュータシステム及び／又はソフトウェアを含んでもよい。
【００３０】
一実施形態では、ＲＡＧＥリガンド結合領域を含むＲＡＧＥポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１に対して９０％同一の配列を有するポリペプチド、又は配列番号１のフラグメントを含む。一実施形態では、配列番号１に対して少なくとも９０％同一の配列は、第１のアミノ酸としてグリシン（Ｇ）ではなくメチオニン（Ｍ）を含み得る。
【００３１】
ＲＡＧＥのフラグメントは、高親和性でＲＡＧＥリガンドを結合することが既知であるポリペプチドを含んでもよい。配列番号１のフラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２に対して９０％同一の配列、又は配列番号２のフラグメントにより規定されるようなヒトｓＲＡＧＥを含んでもよい。一実施形態では、配列番号２に対して少なくとも９０％同一の配列は、第１のアミノ酸としてグリシン（Ｇ）ではなくメチオニン（Ｍ）を有する組換えｓＲＡＧＥを含み得る（例えば、配列番号７）。
【００３２】
或いは、配列番号１のフラグメントは、配列番号３のアミノ酸配列、又は配列番号３に対して少なくとも９０％同一の配列、又は配列番号３のフラグメントにより規定されるようなヒトＲＡＧＥのＶ領域を含んでもよい。Ｖ領域は、ｓＲＡＧＥ及びＲＡＧＥのリガンド結合領域として同定されている（例えば、ＷＯ９９／１８９８７号を参照）。
【００３３】
或いは、Ｖ領域のフラグメントを使用してもよい。一実施形態では、配列番号１のフラグメントは、配列番号４のアミノ酸配列、又は配列番号４に対して少なくとも９０％同一の配列により規定されるようなヒトＲＡＧＥのＶ領域を含んでもよい。或いは、配列番号４のフラグメントが、ＲＡＧＥリガンド結合領域として使用されてもよい。
【００３４】
本発明の方法及びシステムはともに、様々な蛍光リガンドを含んでもよい。一実施形態では、蛍光ＲＡＧＥリガンドは、アミロイドβポリペプチドを含む。例えば、代替的実施形態では、蛍光ＲＡＧＥリガンドは、配列番号５のアミノ酸配列を有するヒトアミロイドβ（１−４０）、又は配列番号６のアミノ酸配列を有するヒトアミロイドβ（１−４２）を含み得る。一実施形態では、フルオロフォアは、蛍光リガンドを生成するようにアミロイドβポリペプチドのアミノ末端に結合される。或いは、フルオロフォアは、蛍光リガンドを生成するようにアミロイドβポリペプチドのカルボキシル末端に結合される。代替的実施形態では、フルオロフォアは、ポリペプチド鎖の長さ方向に沿って他の残基に結合される。
【００３５】
別の実施形態では、蛍光ＲＡＧＥリガンドは、糖化最終産物を含んでもよい。例えば、蛍光ＲＡＧＥリガンドは、蛍光カルボキシメチルリジン又は蛍光カルボキシメチルリジン修飾ＡＧＥを含み得る。或いは、蛍光ＲＡＧＥリガンドは、蛍光基又は蛍光Ｓ−１００ｂで標識されるカルグラヌリンを含んでもよい。或いは、蛍光ＲＡＧＥリガンドは、アンフォテリン又は１，０００ダルトン未満の分子量を含む小有機分子を含んでもよい。
【００３６】
フルオロフォアがＲＡＧＥリガンド結合領域へのリガンドの結合を実質的に妨害しない限りは、様々なフルオロフォアを使用して、被検ＲＡＧＥリガンドを標識してもよい。或る実施形態では、フルオレセインを使用して、ＲＡＧＥリガンドを標識する。或いは、ルシファーイエロー、エオシン、ヨウ化プロピジウム、ローダミン（すなわち、テトラメチルローダミン又はリサミンローダミンＢ）、シアニン３（Ｃｙ３）、シアニン５（Ｃｙ５）、テキサスレッド又はアロフィコシアニンのような（しかし、これらに限定されない）他のフルオロフォアが使用されてもよい。フルオロフォアに関して好ましい励起／発光極大は、個々のフルオロフォア並びにＲＡＧＥリガンドへのフルオロフォアのカップリングの性質に依存し得る。
【００３７】
フルオロフォアは、当該技術分野で既知の方法を使用して、ＲＡＧＥリガンドを標識するために使用される。例えば、核酸及びペプチドを標識するためのキットが市販されている（例えば、Molecular Probes, Inc., Eugene, OR、emp Biotech, GmbH）。フルオロフォアは、フルオロフォアとＲＡＧＥリガンドとの化学的カップリングにより組み込まれ得る。例えば、一実施形態では、アミロイドβを作製するために、ポリペプチドは、そのＮ末端にて５−カルボキシフルオレセインで標識される。蛍光アミロイドβペプチドは市販されている（例えば、rPeptide, Athens, GA、Biosource, Camarillo, CA）。
【００３８】
本発明の方法又はシステムのいずれかの選択的実施形態では、ＲＡＧＥの結合領域を含むポリペプチドは、第２の非ＲＡＧＥポリペプチドへ連結されるか、又は第２の非ＲＡＧＥポリペプチドと複合体を形成する。第２のポリペプチドは、免疫グロブリン領域を含んでもよい。一実施形態では、ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドは、ＲＡＧＥリガンド結合領域を含むポリペプチドを認識し、且つＲＡＧＥリガンド結合領域を含むポリペプチドへ結合する抗体と複合体を形成する。抗体は、ポリクローナル抗体を含んで
もよい。或いは、抗体は、モノクローナル抗体を含んでもよい。ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドを、抗ＲＡＧＥ抗体と複合体形成させることにより、ＲＡＧＥ結合部位を含む構築物のサイズが増大されて、それにより、ＲＡＧＥポリペプチドへの結合時に、蛍光リガンドに関する偏光のより大きな増大をもたらす。
【００３９】
一実施形態では、ｓＲＡＧＥに対する抗体が使用される。例えば、ｓＲＡＧＥは、ＲＡＧＥリガンド結合領域を含むポリペプチドとして使用されてもよく、抗ｓＲＡＧＥ抗体は、ｓＲＡＧＥと複合体形成することが可能である。
【００４０】
ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドは、蛍光リガンド及び／又は被検化合物の結合に先立って、抗ＲＡＧＥ抗体と複合体を形成させてもよい。或いは、ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドは、蛍光ＲＡＧＥリガンド及び／又は被検化合物の結合と実質的に同時に、抗ＲＡＧＥ抗体と複合体を形成させてもよい。さらに別の実施形態では、ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドは、ＲＡＧＥペプチドが蛍光ＲＡＧＥリガンド及び／又は被検化合物を結合させた後に、抗ＲＡＧＥ抗体と複合体を形成させてもよい。
【００４１】
本発明は、ＲＡＧＥ活性を調節する能力を有する化合物を発見するための生理学的に適切な結合アッセイの使用に関する。したがって、別の実施形態では、本発明は、ＲＡＧＥへの蛍光リガンドの結合を調節する能力を有する、本発明の方法及び／又はシステムにより同定される化合物を含む。一実施形態では、ＲＡＧＥへの蛍光リガンドの結合を調節する能力を有する、本発明の方法及び／又はシステムにより同定される化合物は、ＲＡＧＥのリガンド結合領域へ結合し得る。或いは、ＲＡＧＥへの蛍光リガンドの結合を調節する能力を有する、本発明の方法及び／又はシステムにより同定される化合物は、リガンド結合領域への結合なしでＲＡＧＥと相互作用し得る。また、ＲＡＧＥへの蛍光リガンドの結合を調節する能力を有する、本発明の方法及び／又はシステムにより同定される化合物は、ＲＡＧＥアゴニストとして作用し得る。或いは、ＲＡＧＥへの蛍光リガンドの結合を調節する能力を有する、本発明の方法及び／又はシステムにより同定される化合物は、ＲＡＧＥアンタゴニストとして作用し得る。
【００４２】
或る実施形態では、被検化合物は、小有機分子を含む。例えば、化合物は、小有機分子ＲＡＧＥアンタゴニストを含む。一実施形態では、小有機分子は、１，０００ダルトン未満の分子量を含む。代替的実施形態では、小有機分子は、約４００〜９００ダルトン、又は約５００〜約８００ダルトンの範囲の分子量を含む。
【００４３】
他のタイプの潜在的ＲＡＧＥモジュレーターは、本発明の方法及び／又はシステムを使用して同定され得る。したがって、被検化合物及び潜在的ＲＡＧＥモジュレーターは、ペプチドを含んでもよい。或いは、被検化合物及び潜在的ＲＡＧＥモジュレーターは、ペプチド擬似体を含んでもよい。或いは、被検化合物及び潜在的ＲＡＧＥモジュレーターは、無機化合物を含んでもよい。また、被検化合物及び潜在的ＲＡＧＥモジュレーターは、脂質を含んでもよい。別の実施形態では、被検化合物及び潜在的ＲＡＧＥモジュレーターは、炭水化物を含んでもよい。また、被検化合物及び潜在的ＲＡＧＥモジュレーターは、核酸を含んでもよい。
【００４４】
本発明の方法及び／又はシステムを使用して同定される化合物は、ＲＡＧＥ媒介性疾患又は症候群の危険性があるか、或いはＲＡＧＥ媒介性疾患又は症候群を患う被験体へ投与されるべき組成物として配合され得る。本明細書中で記載されるように、ＲＡＧＥは、様々な疾患状態を媒介し得る多数の細胞プロセスに関与することが知られている。ＲＡＧＥ、及びＡＧＥのプロセシングを妨害することにより、本発明の方法及び／又はシステムを使用して同定される化合物は、治療薬として使用される。
【００４５】
例えば、本発明の方法及び／又はシステムを使用して同定される化合物は、アミロイドーシスを治療するために使用される。一実施形態では、本発明の方法及び／又はシステムを使用して同定される化合物は、アルツハイマー病を治療するために使用される。或いは、本発明の方法及び／又はシステムを使用して同定される化合物は、糖尿病及び／又は糖尿病後期合併症を治療するために使用される。別の実施形態では、本発明の方法及び／又はシステムを使用して同定される化合物は、癌を治療するために使用される。或いは、又はさらに、本発明の方法及び／又はシステムを使用して同定される化合物は、炎症を治療するために使用される。別の実施形態では、本発明の方法及び／又はシステムを使用して同定される化合物は、腎不全を治療するために使用され得る。或いは、本発明の方法及び／又はシステムを使用して同定される化合物は、全身性ループス腎炎又は炎症性ループス腎炎を治療するために使用される。また、本発明の方法及び／又はシステムを使用して同定される化合物は、勃起障害を治療するために使用される。さらに別の実施形態では、本発明の方法及び／又はシステムを使用して同定される化合物は、発作又は心臓麻痺を治療するために使用される。
【００４６】
幾つかの実施形態では、ＲＡＧＥ媒介性障害の治療に使用される組成物は、少なくとも１つのさらなる治療剤を含んでもよい。例えば、アルキル化剤、代謝拮抗物質、植物性アルカロイド、抗生物質、ホルモン、生物反応修飾物質、鎮痛薬、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、グルココルチコイド、スルホニル尿素、ビグアニド、インスリン、コリンエステラーゼ阻害剤、抗精神病薬、抗うつ薬又は鎮痙薬のうちの少なくとも１つを含むさらなる治療剤が使用される。
【００４７】
定義
以下の定義は、本明細書中の説明を理解するために使用される。別で定義しない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語はすべて、当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４８】
単数「ａまたはａｎ」で記載される用語は、本明細書中で使用される場合、文脈が明らかに他の状況を示さない限りは、２個以上の所定を指し得る。「又は」という用語は、文脈が明らかに他の状況を示さない限りは、「及び／又は」という用語と交換可能に使用される。
【００４９】
「リガンド」は、受容体へ結合して、複合体を形成する分子である。
【００５０】
「モジュレーター」は、第２の分子及び／又は分子の複合体と物理的に相互作用して、第２の分子及び／又は複合体の少なくとも１つの特徴の変化を引き起こすことができる分子である。変化は、第２の分子及び／又は複合体の化学的変化（例えば、化学結合の形成、正味の電荷の変更）、物理的変化（例えば、三次元構造の変化）、及び／又は生物学的活性の変化（例えば、触媒活性の変更）を含み得る。
【００５１】
「アゴニスト」は、受容体へ結合して、関与する受容体に特異的な薬理反応を誘発する複合体を形成する化合物を含む。
【００５２】
「アンタゴニスト」は、アゴニスト又は受容体へ結合して、実質的な薬理反応を生じず、且つアゴニストにより誘発される生物学的反応を阻害することができる複合体を形成する化合物を含む。
【００５３】
したがって、ＲＡＧＥアゴニストは、ＲＡＧＥへ結合して、ＲＡＧＥ媒介性細胞プロセスを刺激することができ、ＲＡＧＥアンタゴニストは、ＲＡＧＥ媒介性プロセスがＲＡＧ
Ｅアゴニストにより刺激されることを阻害し得る。例えば、ＲＡＧＥアゴニストにより刺激される細胞プロセスは、ＴＮＦ−α遺伝子転写、又はＮＦ−κＢ遺伝子転写の活性化、或いは別の細胞プロセスを含み得る。
【００５４】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、部分的又は全長タンパク質のいずれかを含みるタンパク質分子について記載するために本明細書中で交換可能に使用される。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「小有機分子」は、少なくとも１つの炭素原子を含有する２，０００ダルトン未満の分子量を有する分子である。
【００５６】
「ポリペプチド領域（ドメイン）」は、独立ユニットを含むポリペプチドに沿った領域を含む。領域は、構造、配列及び／又は生物学的活性に関して定義され得る。一実施形態では、ポリペプチド領域は、領域の残部から実質的に独立している様式で折り重なるタンパク質の領域を含んでもよい。領域は、ＰＦＡＭ、ＰＲＯＤＯＭ、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＳＢＡＳＥ、ＩＳＲＥＣ  ＰＲＯＦＩＬＥＳ、ＳＡＭＲＴ及びＰＲＯＣＬＡＳＳのような（しかし、これらに限定されない）領域データベースを使用して同定され得る。「リガンド結合領域」は、リガンドを結合するポリペプチドの領域である。
【００５７】
「免疫グロブリン領域」は、免疫グロブリンの領域に対して構造的に相同又は同一であるアミノ酸配列である。免疫グロブリン領域のアミノ酸の配列の長さは、いかなる長さであってもよい。一実施形態では、免疫グロブリン領域は、２５０個未満のアミノ酸であり得る。一例の実施形態では、免疫グロブリン領域は、約８０〜１５０個のアミノ酸長であり得る。
【００５８】
「ポリクローナル抗体」という用語は、所定の抗原で免疫化した動物の血清に由来する抗体分子の異種集団である抗体を指す。フロイント（完全及び不完全）、ペプチド、油乳剤、リゾレシチン、ポリオール、ポリアニオン等のようなアジュバントを使用して、免疫反応を増大させてもよい。例えば、ｓＲＡＧＥに対するポリクローナル抗体は、当該技術分野で既知の方法を使用して、アジュバントを補充したｓＲＡＧＥのウサギへの注射により調製され得る（例えば、Schmidtら、J. Biol. Chem., 267: 14987-14997 (1992)）。
【００５９】
「モノクローナル抗体」は、特定の抗原に対する抗体の同種集団であり、概して、細胞の連続培養により抗体の生産を提供する任意の技術により得られる（例えば、米国特許第４，８７３，３１３号を参照）。例えば、ｓＲＡＧＥタンパク質は、当該技術分野において既知の方法を使用したモノクローナル抗体の生産に使用され得る(Zymed Laboratories,
San Francisco, CA)。
【００６０】
「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドである。この用語は、一本鎖核酸、二本鎖核酸、並びにヌクレオチド又はヌクレオシド類縁体から作製されるＲＮＡ及びＤＮＡを包含するために使用される。
【００６１】
「ベクター」という用語は、第２の核酸分子を細胞へ輸送するために使用され得る核酸分子を指す。一実施形態では、ベクターは、ベクターへ挿入されたＤＮＡ配列の複製を可能にする。ベクターは、少なくとも幾つかの宿主細胞において核酸分子の発現を増強するためにプロモーターを含んでもよい。ベクターは、（染色体外で）自己複製してもよく、又は宿主細胞染色体へ組み込まれてもよい。一実施形態では、ベクターは、ベクターへ挿入された核酸配列の少なくとも一部に由来するタンパク質を生産することが可能な発現ベクターを含み得る。
【００６２】
「％同一」という用語は、２つのアミノ酸配列間又は２つの核酸配列間の配列同一性を指す。％同一性は、２つの配列を整列させることにより決定することができ、比較される配列により共有される位置で、同一の残基（すなわち、アミノ酸又はヌクレオチド）の数を指す。配列アラインメント及び比較は、当該技術分野で標準的なアルゴリズム（例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl, Math. 2:482 (1981)、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 85:2444 (1988))を使用して、又は、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡとして公的に入手可能なこれらのアルゴリズムのコンピュータ版(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI)により実施され得る。同様に、the National Institutes of Health, Bethesda MDを介して入手可能なＥＮＴＲＥＺは、配列比較に使用され得る。一実施形態では、２つの配列の％同一性は、各アミノ酸ギャップが、２つの配列間で単一のアミノ酸又はヌクレオチドのミスマッチであるかのように加重されるように、ギャップウェイト１でＧＣＧを使用して決定され得る。
【００６３】
当該技術分野で既知であるように、核酸配列を互いにハイブリダイズさせる条件は、低〜高の範囲のストリンジェンシーとして記載され得る。概して、高度にストリンジェントなハイブリッド形成条件は、高温で低塩緩衝液中でハイブリッドを洗浄することを指す。ハイブリッド形成は、６５℃での０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような当該技術分野で標準的なハイブリッド溶液、及びプローブの長さに応じて室温〜６８℃の範囲の温度での０．２５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、３．５％ＳＤＳ中での洗浄、続く０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄を使用して、結合ＤＮＡをフィルタリングすることであり得る（例えば、Ausubel, F.M.,ら、Short Protocols in Molecular
Biology, 4th Ed., Chapter 2, John Wiley & Sons, N.Y.を参照）。例えば、高ストリンジェント洗浄は、１４塩基オリゴヌクレオチドプローブに関して３７℃での、又は１７塩基オリゴヌクレオチドプローブに関して４８℃での、又は２０塩基オリゴヌクレオチドプローブに関して５５℃での、又は２５塩基オリゴヌクレオチドプローブに関して６０℃での、又は約２５０ヌクレオチド長のヌクレオチドプローブに関して６５℃での６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄を含む。核酸プローブは、例えば［γ−32Ｐ］ＡＴＰによる末端標識、又はランダムプライマー標識による［α−32Ｐ］ｄＣＴＰのような放射標識ヌクレオチドの組込みにより、放射性ヌクレオチドで標識され得る。或いは、プローブは、ビオチン化又はフルオレセイン標識ヌクレオチドの組込みにより標識されてもよく、プローブは、ストレプトアビジン又は抗フルオレセイン抗体を用いて検出されてもよい。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「ＥＣ５０」という用語は、所望の効果の５０％をもたらす作用物質の濃度として定義される。例えば、測定可能な生物学的効果を有する治療剤のＥＣ５０は、その作用物質が生物学的効果の５０％を示す値を含む。
【００６５】
本明細書中で使用する場合、「ＩＣ５０」という用語は、測定される効果の５０％阻害をもたらす作用物質の濃度として定義される。例えば、ＲＡＧＥ結合のアンタゴニストのＩＣ５０は、アンタゴニストが、ＲＡＧＥのリガンド結合領域へのリガンド結合を５０％低減させる値を含む。
【００６６】
本明細書中で使用する場合、被検化合物の「化学的改変体」は、被検化合物において原子団の少なくとも１つの置換を有する分子を含む。本明細書中で使用する場合、被検化合物の「構造改変体」は、被検化合物と同じ実験式を有するが、異なる三次元立体配置を有する分子を含む。
【００６７】
ＲＡＧＥリガンド相互作用を調節する化合物を同定するための蛍光偏光の使用
本発明は、ＲＡＧＥへの生理学的リガンドの結合を調節する能力を有する化合物の検出
のための、ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドを利用した方法及びシステムを含む。ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドは、ＲＡＧＥタンパク質、又はＲＡＧＥのフラグメントを含み得る。一実施形態では、上記方法は、被検化合物による、ＲＡＧＥのリガンド結合領域を含むポリペプチドからの蛍光ＲＡＧＥリガンドの置き換えを測定することを含んでもよい。被検化合物が、蛍光リガンドを置き換える能力を有する場合、被検化合物は、ＲＡＧＥ、及び／又はＲＡＧＥ媒介性生物学的活性の潜在的モジュレーターを含み得る。
【００６８】
本発明の方法及び／又はシステムの略図を図１に示す。蛍光偏光検出方法は、受容体／リガンド相互作用の程度の定量化を可能にする。結合の蛍光偏光検出を可能にする物理的プロセスは、より小さな分子が、溶液中でより大きな分子よりも迅速に回転するという原理に基づいている。より小さな分子に関するより大きな回転は、同じ溶液相中でのより大きな分子と比較した場合に、より小さな蛍光偏光シグナルへ変換する。したがって、図１において三角構造として概略的に表されるアミロイドβ１−４０の蛍光誘導体のような比較的小さなリガンドは、それが溶液中で遊離している場合、蛍光リガンドがその同族受容体（例えば、ｓＲＡＧＥ、図１Ａ）へ結合されている場合の蛍光偏光度値と比較して、より低い蛍光偏光度（ｍＰ）値を有する。一実施形態では、偏光の程度は、リガンドと受容体との間の結合の程度に応じて、実質的に線形様式で増大し得る(Allenら、J. Biomol Screen, 2:63-69(2000))。
【００６９】
図１Ｂに示すように、アッセイは、被検非標識化合物（例えば、四角構造）の、ＲＡＧＥリガンド結合部位から蛍光リガンド（三角構造）を置き換える能力の評価を可能にし得る。より小さな未結合蛍光リガンドは、ＲＡＧＥポリペプチド（例えば、ｓＲＡＧＥ）へ結合した蛍光リガンドよりも迅速に回転するため、蛍光リガンドが置き換えられると、蛍光標識を含有する構造の平均サイズが減少するにつれ、蛍光偏光度（ｍＰ）値は減少する。
【００７０】
一実施形態では、アッセイを実施するために要される最小限の濾過、洗浄又は移送工程が存在する。例えば、アッセイを実施するために、試薬（すなわち、蛍光ＲＡＧＥリガンド、ＲＡＧＥポリペプチド、被検化合物及びアッセイ緩衝液）は、マイクロプレートウェルへ添加され得る。インキュベーション工程後、蛍光は、蛍光偏光読取り機を使用して測定される。したがって、簡潔な方法論により、ハイスループット薬物スクリーニング用の有用な方式を提供することができる。
【００７１】
本明細書中で使用する場合、全長ＲＡＧＥタンパク質又はＲＡＧＥポリペプチドを含み得る全長ＲＡＧＥタンパク質のフラグメントが、アッセイで使用され得る。したがって、ＲＡＧＥリガンド結合領域を含むＲＡＧＥタンパク質又はポリペプチドは、配列番号１として示されるアミノ酸配列（図２Ａ）又は当該アミノ酸配列の一部であり得る(Neeperら、J. Biol. Chem. 267: 14998-15004, (1992))。ＲＡＧＥのリガンド結合領域は、生理学的特異性でリガンドを結合することが可能なタンパク質の当該領域を含む。本明細書中で使用する場合、全長ＲＡＧＥタンパク質のフラグメントは、少なくとも５アミノ酸長であり、３０アミノ酸長を上回ってもよいが、全アミノ酸配列未満である。一実施形態では、ＲＡＧＥポリペプチドは、ｓＲＡＧＥ（配列番号２、図２Ｂ）又はそのフラグメントを含み、ここでｓＲＡＧＥは、細胞膜から遊離したＲＡＧＥタンパク質である(Parkら、Nature Med., 4:1025-1031(1998))。一実施形態では、配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも９０％同一の配列が使用され得る。例えば、ＲＡＧＥポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２を含み得るが、第１のアミノ酸としてグリシン（Ｇ）ではなくメチオニン（Ｍ）を有する。例えば、第１の残基としてメチオニン（Ｍ）を含むｓＲＡＧＥの組換え形態（例えば、配列番号７、図２Ｅ）が使用され得る。別の実施形態では、ＲＡＧＥタンパク質は、Ｖ領域（配列番号３、図２Ｃ）(Neeperら、J. Biol. Chem. 267: 14998-15004
(1992))又はそのフラグメント（例えば、配列番号４、図２Ｄ）を含む。さらに別の実施形態では、ＲＡＧＥフラグメントは、合成ペプチドである。
【００７２】
上記アッセイは、蛍光リガンドへのＲＡＧＥの結合の線形領域を含むＲＡＧＥポリペプチドの量の選択を可能にするように設計され得る。例えば、非常に低濃度のＲＡＧＥポリペプチドが使用される場合、結合の検出は、低シグナルに起因して困難であり得る。しかしながら、過剰のＲＡＧＥポリペプチドが使用される場合、被検化合物の、蛍光リガンドと競合する能力は、リガンド及び被検化合物の両方への過剰ＲＡＧＥポリペプチドの結合に起因して減少され得る。代替的実施形態では、ＲＡＧＥリガンド結合部位を含むポリペプチドは、約０．００１ｎＭ〜約５０μＭ、又は約０．０１ｎＭ〜約５μＭの最終アッセイ濃度（ＦＡＣ）、又は約０．１ｎＭ〜約５００ｎＭ  ＦＡＣ、又は約１ｎＭ〜約１００ｎＭ  ＦＡＣの範囲であり得る。本明細書中に記載するあらゆる範囲に関して、範囲内の任意の範囲を使用してもよく、したがって、範囲内の任意の範囲が記載されていることが意図される。したがって、１ｎＭ〜約１００ｎＭを含む範囲は、２ｎＭ〜９９ｎＭ、又は３ｎＭ〜９８ｎＭ、及びその間にあるあらゆる範囲（しかし、これらに限定されない）を包含する。
【００７３】
また、或る実施形態では、アッセイは、蛍光リガンドの最適化を可能にするように設計される。したがって、或る実施形態では、使用される蛍光リガンドの量は、最大シグナルを可能にするように滴定することができるが、高レベルのバックグラウンド結合を含むほど高くない。より好ましくは、最大シグナルを可能にする蛍光シグナルの量は、競合する化合物の濃度に関係なく同様の範囲を含む。代替的実施形態では、蛍光リガンド（例えば、蛍光アミロイドβ）の最終アッセイ濃度は、約１ｐＭ〜約５０μＭ、又は約０．００５ｎＭ〜約５μＭ、又は約０．０５ｎＭ〜約５００ｎＭ、又は約０．５ｎＭ〜５０ｎＭの範囲であり得る。同様に、本明細書中に記載するあらゆる範囲に関して、範囲内の任意の範囲を使用してもよいことが意図される。
【００７４】
一実施形態では、蛍光リガンドは、アミロイドβポリペプチドを含んでもよい。例えば、代替的実施形態では、蛍光リガンドは、配列番号５のアミノ酸配列を有するアミロイドβ（１−４０）又は配列番号６のアミノ酸配列を有するアミロイドβ（１−４２）を含み得る（図３）。一実施形態では、フルオレセインは、アミロイドβポリペプチドのアミノ末端へ結合され得る。アミロイドβが標識リガンドとして使用される場合、アッセイにリガンドを添加する前に、蛍光アミロイドβをプレインキュベートする必要がある場合があり、それは、かかるプレインキュベーションによりアミロイドβがプリーツシート（pleated sheet）形態へ自己凝集することが可能であるためである。一実施形態は、アミロイドβは、プリーツシートの形態で、ＲＡＧＥへ優先的に結合し得る。
【００７５】
アッセイはまた、一連の濃度にわたって被検化合物を試験するように最適化され得る。代替的実施形態では、被検化合物は、約１ｐＭ〜５００μＭ、又は約０．０１０ｎＭ〜約２００μＭ、又は約０．１ｎＭ〜約５０μＭ、又は約１ｎＭ〜約４０μＭ、又は約１０ｎＭ〜約３０μＭの範囲の濃度で、アッセイ中に存在し得る。
【００７６】
本発明の方法及びシステムは、アッセイ感度を最大にするように設計され得る。例えば、ｓＲＡＧＥが、最終アッセイ濃度（ＦＡＣ）４０ｎＭで、ＲＡＧＥ結合部位を含むポリペプチドとして使用され、且つ蛍光リガンドがアミロイドβ（１−４０）である場合、ほぼ最大のシグナルが、５０ｎＭのアミロイドβ（１−４０）で観察され得る。競合アッセイの一実施形態では、結合反応ウェル（アッセイ容量４０μＬ）１つ当たり１０ｎＭ〜３０μＭの濃度の非標識リガンド（すなわち、被検化合物）は、ｓＲＡＧＥへの蛍光リガンド結合の線形減少を含む。
【００７７】
アッセイは、多種多様な潜在的ＲＡＧＥモジュレーターの、ＲＡＧＥの結合領域からフルオレセイン化リガンドを置き換える能力を検出及び定量化するために使用され得る。図４に示すように、非標識ＲＡＧＥリガンドは、非標識リガンドに関する生理学的範囲における有効濃度（ＥＣ５０）で、ｓＲＡＧＥへの結合に関して競合し得る。例えば、非標識アミロイドβ（１−４０）は、約６２ｎＭのＥＣ５０で、ｓＲＡＧＥへの結合に関してフルオレセイン化アミロイドβ（１−４０）と競合し得る。同様に、非標識ｓ１００ｂは、約４３ｎＭのＥＣ５０で、ｓＲＡＧＥへの結合に関してフルオレセイン化アミロイドβ（１−４０）と競合し得る。また、非標識ＣＭＬ（カルボキシメチルリジン）は、約７９ｎＭのＥＣ５０で、ｓＲＡＧＥへの結合に関してフルオレセイン化アミロイドβ（１−４０）と競合し得る。図４のデータに関して、ＥＣ５０値は、最大偏光が生じる濃度（「ＢＯＴＴＯＭ」）から最小偏光をもたらす濃度（「ＴＯＰ」）の中間の、蛍光リガンドの置き換えをもたらす非標識リガンドの濃度である。
【００７８】
アッセイは、試験される化合物を溶解するのに要される任意の溶媒と無関係であるように最適化され得る。例えば、場合によっては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような有機溶媒を使用して、ＲＡＧＥの潜在的モジュレーターとして試験されるべきである有機化合物を溶解してもよい。例えば、アッセイにおいて被検有機化合物の溶解に一般的に使用されるＤＭＳＯの濃度であるＤＭＳＯ１．５％の最終アッセイ濃度（ＦＡＣ）で、アッセイは概して、最大シグナルを提供し得る（図５）。ＤＭＳＯ１０％程度と高い濃度でさえ、アッセイは、ｓＲＡＧＥへのフルオレセイン化アミロイドβ（１−４０）結合、及び被検化合物によるかかる結合の置き換えの検出に関する適正なウィンドウを提供し得る。
【００７９】
したがって、アッセイは、任意の実験的変動に起因するアッセイ結果の変動が最小限となり得るように、各構成成分の最適化を可能にし得る。特異的な蛍光リガンド及びＲＡＧＥポリペプチドに関していったん最適化されると、アッセイは、試験されるべき所定の特異的な競合化合物（すなわち、推定上のモジュレーター）にかかわらず、サンプル結合親和性の信頼性の高い評価を提供することができる。また、或る実施形態では、アッセイは、再現性があり、且つ正確であるハイスループットアッセイを含む。一実施形態では、アッセイは、２０％未満の分散を含む。代替的実施形態では、アッセイは、１０％未満又は５％未満の分散を含み得る。
【００８０】
本発明の方法及びシステムは、蛍光リガンドへのＲＡＧＥポリペプチドの結合が、ｉｎ
ｖｉｖｏでのリガンドへのＲＡＧＥの結合の性質を反映するように設計され得る。例えば、蛍光リガンドは、特異的且つ可飽和性様式で、ＲＡＧＥポリペプチドへ結合し得る。一実施形態では、アッセイは、約０．１ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲の濃度でのｓＲＡＧＥポリペプチドが、可飽和性様式で蛍光アミロイドβ（１−４０）を結合するように設計され得る。本発明の方法及びシステムは、低及び高親和性結合部位の両方を拮抗する化合物を検出するように設計され得る。例えば、リガンド結合領域を含むＲＡＧＥポリペプチド（ＲＡＧＥポリペプチドは、約０．１ｎＭ〜約１０ｎＭの範囲の濃度である）を使用することにより、競合リガンドとして非標識アミロイドβ（１−４０）を使用して、１０ｎＭ未満のＫｄを含む高親和性結合部位の特性化が提供され得る。また、約２０ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲の濃度でリガンド結合領域を含むＲＡＧＥポリペプチドを使用することにより、より低い親和性結合部位の特性化が提供され得る。スキャッチャード変換を用いたデータの解析は、高及び低親和性部位の両方を示すために使用され得る(Hofmannら、Cell, 97:889-901 (1999); Horiら、J. Biol. Chem., 270: 25752-25761 (1995))。
【００８１】
小分子は、大分子よりも迅速に回転すること、及び分子のサイズは、蛍光偏光のレベル（すなわち、ｍＰ値）により反映されることがアッセイの前提である。ＲＡＧＥリガンド結合領域を含む複合体のサイズを増大させることにより、蛍光リガンドが、溶液中で自由
に回転している状態から、蛍光リガンドがＲＡＧＥリガンド結合領域へ結合される状態へと進むにつれ、偏光のより大きな変化が見られる。したがって、一実施形態では、ＲＡＧＥリガンド結合領域を含むポリペプチドは、受容体のサイズを増大させる方法として、第２のポリペプチド又はタンパク質と複合体形成される。例えば、ｓＲＡＧＥへの蛍光ＲＡＧＥリガンドの結合は、蛍光偏光度（ｍＰ）値を（例えば、３３０から４３０へ）増大し得るのに対して、第２のポリペプチドと複合体形成されるｓＲＡＧＥへの蛍光ＲＡＧＥリガンドの結合は、より一層大きな値へと偏光を増大し得る。
【００８２】
図６に示されるように、ＲＡＧＥリガンド結合部位を含むポリペプチドは、抗ＲＡＧＥ抗体と複合体形成させることが可能である。例えば、ｓＲＡＧＥは、ＲＡＧＥリガンド結合領域を含むポリペプチドとして使用されてもよく、抗ｓＲＡＧＥ抗体は、ｓＲＡＧＥと複合体形成させることが可能である。ｓＲＡＧＥの検出に使用され得る抗体としては、市販の抗ＲＡＧＥポリクローナル抗体（例えば、ヤギ抗ＲＡＧＥポリクローナル抗体、Cat.No.：ab7714、Novus Biologicals, Littleton, CO、ヤギ抗ヒトＲＡＧＥポリクローナル抗体、Cat.No.：ST1025、CalBiochem, San Diego, CA）及びモノクローナル抗体（抗ヒトＲＡＧＥモノクローナル抗体、Cat.No.：R1031、United States Biological, Swampscott, MA）が挙げられる。また、特注の抗ＲＡＧＥ抗体は、当該技術分野で既知であるように作製され得る。
【００８３】
ＲＡＧＥリガンド結合領域を含むポリペプチドと抗体との間で複合体を形成するために使用される方法は、使用される抗体に依存し得る。抗体が、ＲＡＧＥ結合領域への蛍光ＲＡＧＥリガンドの結合を妨害しないか、又はそれを変更しないことが好ましい場合がある。
【００８４】
アッセイ緩衝液は、ウェルへの第２のポリペプチド（例えば、ｓＲＡＧＥ抗体）のバックグラウンド結合を低減するための構成成分を含んでもよい。例えば、アッセイ構成成分は、ＢＳＡ（例えば、０．５％〜０．５％）及び／又はＴＷＥＥＮ２０（例えば、０．０１〜０．１％）を含む緩衝液を使用して調製される。或いは、アッセイウェルは、アッセイウェルへの抗体のバックグラウンド結合を低減するために、ブロッキング緩衝液（例えば、５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．２、１〜５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０１〜０．１％  ＴＷＥＥＮ２０）で処理してもよい。続いて、ブロッキング緩衝液は、ウェルから吸引されてもよく、アッセイウェルは洗浄される。例えば、ブロッキング緩衝液によるアッセイウェルの処理後に、アッセイウェルは、洗浄緩衝液（例えば、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて４００μｌ／ウェルで３回、各洗浄間に洗浄緩衝液中での任意の浸積を伴って洗浄される。
【００８５】
次に、アッセイを実施するために、個々の構成成分（例えば、ＤＭＳＯ中に溶解した被検化合物５〜１０μｌ）、ｓＲＡＧＥ（例えば、ｓＲＡＧＥ  １０μｌ、ＦＡＣ  ４０ｎＭ）、蛍光リガンド（例えば、蛍光アミロイドβ  ５〜１０μｌ、ＦＡＣ  ５０ｎＭ）及び抗体（例えば、ｓＲＡＧＥに対するモノクローナル抗体１０μｌ）を各ウェルに同時に添加してもよく、３７℃で１時間インキュベートしてもよい。或いは、抗体及びＲＡＧＥポリペプチドは、インキュベートして複合体を形成させた後に、それらをアッセイウェルへ添加してもよい。複合体は、約３０分〜２４時間、４℃〜３７℃で形成され得る。概して、より温かいインキュベーション温度は、より短いインキュベーション時間を可能にする。さらに別の実施形態では、ＲＡＧＥの結合領域を含むポリペプチドは、ＲＡＧＥポリペプチドと蛍光ＲＡＧＥリガンド及び／又は被検化合物とを結合させた後に、抗ＲＡＧＥ抗体と複合体形成させてもよい。このアプローチは、ＲＡＧＥポリペプチドへの蛍光リガンド及び被検化合物の結合の抗体による任意の潜在的な妨害を最小限に抑えることが望まれる場合に好ましい。
【００８６】
アッセイは、使用される抗ＲＡＧＥ抗体の量の最適化を可能にするように設計され得る。したがって、或る実施形態では、使用される抗体の量は、最大シグナルであるが、高レベルのバックグラウンド結合を生じるほど高くないシグナルを可能とするように滴定することができる。抗体の好ましい量は、アッセイで使用されるＲＡＧＥポリペプチドの量及びＲＡＧＥに対する抗体の親和性に基づく。一実施形態では、最大シグナルを可能にする抗体の量は、被検化合物又は蛍光ＲＡＧＥリガンドの濃度にかかわらず、類似の範囲を含み得る。
【００８７】
ＲＡＧＥリガンド結合領域を含むポリペプチドは、組換え技法を使用して調製され得る。当該技術分野で既知であるように、本発明の方法及びシステムで使用されるＲＡＧＥポリペプチドを発現するために使用される核酸構築物は、突然変異により、例えば目的の突然変異を含むプライマーを用いた核酸鋳型のＰＣＲ増幅により改変され得る。このようにして、ＲＡＧＥリガンドに関して様々な親和性を含むポリペプチドが設計され得る。一実施形態では、突然変異配列は、元のＤＮＡに対して９０％以上同一であり得る。或いは、突然変異配列は、元のＤＮＡに対して、８０％、又は７０％以上同一であり得る。したがって、変異体は、ストリンジェント条件下（例えば、１モル塩中、ＤＮＡ二重鎖の融点（ＴＭ）より約２０〜２７℃低い温度）でハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含し得る。
【００８８】
本発明の方法及びシステムで使用されるＲＡＧＥポリペプチド及びタンパク質は、有効性を増加させるためにさらに修飾されてもよい。したがって、本発明の方法及びシステムで使用されるＲＡＧＥポリペプチドは、翻訳後プロセシングにより、又は化学的修飾により修飾され得る。例えば、ＲＡＧＥポリペプチドは、Ｌ、Ｄ又は非天然アミノ酸、α−二置換アミノ酸、或いはＮ−アルキルアミノ酸を包含するように合成的に調製されてもよい。さらに、ＲＡＧＥポリペプチドは、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ホスファチジイノシトールのような脂質の結合、ジスルフィド結合の形成等により修飾され得る。
【００８９】
本発明の方法及びシステムは、生理学的結合条件下でＲＡＧＥと相互作用する化合物を同定するための結合アッセイを提供する。ここで、生理学的結合条件は、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察されるのと同様の結合親和性をもたらす条件を含む。
【００９０】
別の実施形態では、本発明は、ＲＡＧＥへのリガンド結合を調節する能力を有する、本発明の方法及び／又はシステムにより同定される化合物を含む。本発明の方法及び／又はシステムにより同定される化合物は、幾つかの異なる化学的タイプを含み得る。例えば、一実施形態では、ＲＡＧＥモジュレーター化合物は、ペプチドを含む。別の実施形態では、ＲＡＧＥモジュレーター化合物は、ペプチド擬似体を含む。別の実施形態では、ＲＡＧＥモジュレーター化合物は、有機分子を含む。さらに別の実施形態では、ＲＡＧＥモジュレーター化合物は、無機分子を含む。場合によっては、ＲＡＧＥモジュレーター化合物は、その半減期を増大するように誘導体化されてもよい。
【００９１】
上述のように、ＲＡＧＥを調節する能力を有する化合物として同定される化合物は、ペプチド擬似体を含む。或る実施形態では、ペプチド擬似体は、少なくとも部分的に非天然である。好ましくは、被検化合物は、安定性、有効性、効力及びバイオアベイラビリティを増大するように修飾され得る。例えば、或る実施形態では、化合物は、Ｌ、Ｄ又は非天然アミノ酸、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸又は乳酸を包含するように合成的に調製され得る。或る実施形態では、化合物は、適切な擬似体で置き換えられたペプチド骨格又はアミノ酸を有するペプチド擬似体を含む。
【００９２】
また、ＲＡＧＥを調節する能力を有する化合物として同定される化合物は、小有機分子
を含み得る。或る実施形態では、有機分子は、１，０００ダルトン未満の分子量を含む。例えば、図７に示されるように、ＴＴＰ−Ａ、ＴＴＰ−Ｂ、ＴＴＰ−Ｃ、ＴＴＰ−Ｄ及びＴＴＰ−Ｅは、それぞれ約２５９ｎＭ、３７６ｎＭ、３６７ｎＭ、７４９ｎＭ及び２．０４μＭのＩＣ５０値で、蛍光アミロイドβ（１−４０）のｓＲＡＧＥへの結合を阻害する。ＴＴＰ−Ａ、ＴＴＰ−Ｂ、ＴＴＰ−Ｃ、ＴＴＰ−Ｄ及びＴＴＰ−Ｅを包含する被検小有機化合物の構造は、公開番号第２００２／０００６９５７号、第２００３／００３２６６３号、第２００２／０１９３４３２号及び第２００４／００８２５４２号を含む同一人により所有される米国特許出願（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）により提供される。
【００９３】
或る実施形態では、結合アッセイにより同定される化合物は、ＲＡＧＥの生物学的活性を調節する能力を有することについてさらに試験される。例えば、化合物は、遺伝子発現又は他の細胞プロセスにおけるＲＡＧＥ誘導性増大を調節する能力に関して試験することができる。したがって、或る実施形態では、結合アッセイにより同定される化合物は、ＮＦ−κＢ媒介性転写のＲＡＧＥによる活性化を調節するために使用され得る。潜在的モジュレーター化合物の、ＮＦ−κＢ媒介性転写のＲＡＧＥによる活性化を調節する能力は、ＮＦ−κＢプロモーターの下流にあるレポーター遺伝子を使用して評価され得る。或いは、結合アッセイにより同定される化合物は、ＴＮＦ−α媒介性転写のＲＡＧＥによる活性化を調節するために使用されてもよく、ここで潜在的モジュレーター化合物の、ＴＮＦ−α媒介性転写のＲＡＧＥによる活性化を調節する能力は、ＴＮＦ−αプロモーターの下流にあるレポーター遺伝子を使用して評価され得る。一実施形態では、ＲＡＧＥへのリガンド結合を調節する化合物は、他の細胞プロセスに対するＲＡＧＥの影響を調節する化合物として同定される。
【００９４】
［実施例］
本発明により網羅される発明概念の特徴及び利点は、以下の実施例においてさらに説明される。
【実施例１】
【００９５】
実施例１：蛍光偏光アッセイプロトコル
簡潔に述べると、この方法は、組換えヒトｓＲＡＧＥ（最終アッセイ濃度４０ｎＭ、配列番号７のアミノ酸配列を有する）１０μｌを、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４(Sigma, St. Louis MO)１０μｌへ添加すること、続いてＲＡＧＥアンタゴニスト（最終アッセイ濃度１０ｎＭ〜３０μＭ）１０μｌの存在下で、蛍光アミロイドβ（１−４０）ペプチド(Biosource, Camarillo, CA)１０μＬ（最終アッセイ濃度５０ｎＭ）を添加することを包含する。プリーツシート構造でないアミロイドβは、高親和性でｓＲＡＧＥへ結合しない場合があるため、アミロイドβがプリーツシート構造を形成するように、蛍光アミロイドβリガンドをプレインキュベートする必要がある場合がある。プリーツシート構造を形成するために、アミロイドβは、アッセイで使用される前に少なくとも２４時間プレインキュベートされ得る。アミロイドβをプレインキュベートするために、凍結乾燥ペプチドは、６ｍｇ／ｍｌの濃度で高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）等級の水中に溶解される。いったん溶解されたら、ペプチドを、リン酸緩衝生理食塩水（カルシウムを含まない）で１ｍｇ／ｍｌの濃度へ希釈して、３７℃で２４〜４８時間インキュベートさせる。
【００９６】
複合体を３７℃で１時間インキュベートし、続いて蛍光偏光度（ｍＰ）値をＥｎｖｉｓｉｏｎプレート読取り機(Perkin Ekmer)を使用して読取った。場合によっては、ヒトｓＲＡＧＥの純度に応じて、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は０．０５％の洗浄剤ＴＷＥＥＮ２０をリン酸緩衝生理食塩水へ添加して、アッセイウェルへのｓＲＡＧＥのバックグラウンド結合を低減させてもよい。
【実施例２】
【００９７】
実施例２：アッセイ条件の最適化
アッセイ条件の最適化に関する実験を実施した。例えば、最終アッセイ濃度４０ｎＭで組換えｓＲＡＧＥを使用すると、反応容量４０μＬ当たり４〜４００ｎｇ／ｍｌの蛍光アミロイドβ濃度が、ｓＲＡＧＥ結合において線形増大をもたらすことがわかった。
【００９８】
次に、様々なｓＲＡＧＥ濃度でのアッセイの最適化を評価した。５０ｎＭの蛍光標識アミロイドβ（１−４０）を使用すると、ｓＲＡＧＥの結合が、アッセイ容量４０μＬ当たり０．６〜６００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で線形増大を示し、最大シグナルが、約４０ｎＭのｓＲＡＧＥで観察されることがわかった。
【００９９】
フルオレセイン化アミロイドβ１−４０リガンドと相互作用するｓＲＡＧＥに関する蛍光偏光度（ｍＰ）値に対する、増大する濃度のＤＭＳＯの影響を示す代表的な実験を図４に示す。最大２％最終容量のＤＭＳＯ濃度は、得られる蛍光偏光度値に対して有意な影響はなかった。２％ＦＡＣ（最終アッセイ濃度）を超えるＤＭＳＯ濃度では蛍光偏光度値に対して幾らか影響が見られたが、ベースライン（ｓＲＡＧＥが存在しない場合のフルオレセイン化アミロイドβ１−４０リガンド）のｍＰ値が約４７０±５ｍＰであったため、２％を超えるＤＭＳＯ濃度でウィンドウが達成され、検出の適正なウィンドウを付与した。誤差棒は、算出した標準偏差を伴う４回の測定の平均値を表す。
【０１００】
概して、アッセイは、０．５ｎＭ〜５０ｎＭの蛍光アミロイドβ及び１〜１００ｎＭのｓＲＡＧＥを使用した。被検化合物は、１ｎＭ〜３０μＭの範囲であった。
【０１０１】
アッセイ変動性を定量化するための実験を実施した。概して、アッセイ変動性は１０％未満であることがわかった。
【実施例３】
【０１０２】
実施例３：ｓＲＡＧＥへのリガンド結合の検出
図３は、ＲＡＧＥ特異的リガンドがｓＲＡＧＥへフルオレセイン化アミロイドβ１−４０と競合することを実証する代表的な実験を示す。競合は、用量依存的様式で行われ、増大する量の非標識リガンドが、蛍光アミロイドβ１−４０リガンドを置き換えて、より低い蛍光偏光度（ｍＰ）値をもたらした。
【０１０３】
非標識アミロイドβ１−４０（四角形）に関して６２ｎＭ、非標識Ｓ１００ｂ（三角形）に関して４３ｎＭ、及び非標識カルボキシメチルリジン（逆三角形）に関して７９ｎＭのＥＣ５０値は、ｓＲＡＧＥへの結合に関する文献値と一致する(Yanら、Nature, 382: 685-691 (1996), Kislingerら、J. Biol. Chem. 274:31740-31749 (1999))。各点は、算出した標準偏差を伴う４回の測定の平均値を表すことに留意されたい。
【実施例４】
【０１０４】
実施例４：小有機モジュレーターによるｓＲＡＧＥ結合の阻害
小有機分子が、ｓＲＡＧＥへの結合に関してフルオレセイン化アミロイドβ１−４０と競合することができることを実証する代表的な実験を図７に示す。例えば、ＴＴＰ−Ａ、ＴＴＰ−Ｂ、ＴＴＰ−Ｃ、ＴＴＰ−Ｄ及びＴＴＰ−Ｅは、それぞれ約２５９ｎＭ、３７６ｎＭ、３６７ｎＭ、７４９ｎＭ及び２．０４μＭのＩＣ５０値で、蛍光アミロイドβ（１−４０）へのｓＲＡＧＥ結合を阻害する。競合は、用量依存的様式で行われ、増大する量の非標識リガンドが、増大する量の蛍光アミロイドβ１−４０リガンドを置き換えて、より低い蛍光偏光度（ｍＰ）値をもたらす。蛍光アミロイドβの５０％置き換えをもたらす非標識リガンドの濃度が、ＩＣ50値である。このデータは、本発明のアッセイが、ＲＡＧＥアンタゴニスト活性に関する小有機分子用スクリーンとして利用することができること
が実証する。図７では、各点は、算出した標準偏差を伴う４回の測定の平均値を表す。
【０１０５】
上述の説明に関して、本発明の一部の（特異的構成成分及び使用の様式における変動を包含するための）最適範囲の関係は、当業者に容易に明確且つ明瞭であるとみなされ、図面で説明され、また明細書中に記載されるものと同等の関係はすべて、本発明に包含されることが意図される。上述事項は、本発明の原理を単に例示するものとみなされる。多数の変更及び変化が当業者に容易に思い浮かぶため、図示且つ記載した実際の実施形態に本発明を限定することは意図されず、添付の特許請求の範囲の範疇にある適切な変更及び均等物はすべて、本発明の概念内であるとみなされる。
【０１０６】
本明細書中で使用する表現及び専門用語は、説明の目的であり、限定するものとみなされるべきでないことがさらに理解されるべきである。この開示が基づく概念は、本発明の幾つかの目的を実施するための方法及びシステムを設計するための基盤として容易に使用され得ることが当業者に理解されよう。特許請求の範囲は、本発明の意図及び範囲を逸脱しない限り、かかる同等の構成を含むものとみなされる。
【０１０７】
本発明の様々な特徴、態様及び利点は、以下の図面を参照して、より明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１Ａ】ＲＡＧＥ−リガンド相互作用を測定するための蛍光偏光の使用の略図である。ここで、図（Ａ）は、蛍光リガンドに関してより高い蛍光偏光度（ｍＰ）値をもたらすｓＲＡＧＥへの蛍光リガンド（三角）の結合を示す。
【図１Ｂ】ＲＡＧＥ−リガンド相互作用を測定するための蛍光偏光の使用の略図である。ここで、本発明の代替的実施形態により、図（Ｂ）は、蛍光偏光度（ｍＰ）の低減を伴う、非標識ＲＡＧＥリガンド（長方形）によるｓＲＡＧＥへの蛍光リガンド（三角）の結合の低減を示す。
【図２Ａ】配列番号１、すなわちGenBank/EMBLデータベース（アクセッション番号ＸＭ００４２０５）で報告されるヒトＲＡＧＥに関するアミノ酸配列を示す図である。
【図２Ｂ】本発明の代替的実施形態により、配列番号２、すなわちヒトｓＲＡＧＥのアミノ酸配列を示す図である。
【図２Ｃ】本発明の代替的実施形態により、配列番号３、すなわちヒトＲＡＧＥのＶ−領域に関するアミノ酸配列を示す図である。
【図２Ｄ】本発明の代替的実施形態により、配列番号４、すなわちヒトＲＡＧＥのＶ−領域のＮ末端フラグメントを示す図である。
【図２Ｅ】本発明の代替的実施形態により、配列番号７、すなわちヒトｓＲＡＧＥの代替的アミノ酸配列を示す図である。
【図３】配列番号５、すなわちヒトアミロイドβ（１−４０）のアミノ酸配列及び配列番号６、すなわちヒトアミロイドβ（１−４２）のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】様々なＲＡＧＥリガンドが、本発明の代替的実施形態により、ｓＲＡＧＥへの結合に関して蛍光アミロイドβ（Ｆｌ−アミロイドβ）と競合し得ることを示す図である。
【図５】本発明の一実施形態によるｓＲＡＧＥへの蛍光アミロイドβの結合に対するＤＭＳＯの影響を示す図である。
【図６】遊離蛍光リガンド（三角）に対する蛍光偏光度の変化を受容体へ結合した蛍光リガンドと比較して増大させる手段として、ＲＡＧＥリガンド結合領域（例えば、ｓＲＡＧＥ）と抗ＲＡＧＥ抗体（例えば、Ａｂ）とを含むＲＡＧＥポリペプチド複合体形成の略図である。
【図７】本発明の代替的実施形態によるＲＡＧＥと蛍光アミロイドβ（１−４０）との間の相互作用を阻害する小有機分子アンタゴニストのプロットを示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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