(57)【要約】  本発明は、癌の処置用の医薬の製造のための、少なくとも１種の一般式（１）の化合物の使用に関する。
2007535525.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2007535525.tif 000024
（式中、
−Ｒ1は、Ｈ、ＯＨ、または炭素数１〜１２のアルコキシ基を表し、
−Ｒ2は、Ｈ、炭素数１〜１２のアルコキシカルボニル基、特にtert−ブトキシカルボニル基、または炭素数１〜１２のアルキル基を表し、
−Ｒ3は、ＯまたはＣＨ3を表すが、ただし、Ｒ3がＯを表すとき、ａは二重結合を表し、ｂおよびｃは単結合を表し、Ｒ4は、Ｈを表し、また、Ｒ3がＣＨ3を表すとき、ａは単結合を表し、ｂおよびｃは二重結合を表し、Ｒ4は、いかなる基をも表さない）
の少なくとも１種の化合物またはその薬学的に許容できる塩の、結腸癌、白血病、骨髄腫、乳癌、神経芽細胞腫、肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、精巣癌、胃癌、膵臓癌、または網膜芽細胞腫等の癌の処置用の医薬の製造のための使用。
【請求項２】
少なくとも１種のＤＮＡ複製を阻害する化合物と組み合わせての、少なくとも１種の一般式（１）の化合物の、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
一般式（１）の化合物が、
−下記の式（２）：
【化２】
2007535525.tif 000025
の化合物に、または
−下記の式（３）：
【化３】
2007535525.tif 000026
（式中、Ｒ1およびＲ2は、請求項１で定義されたとおりである）の化合物に、
対応する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
一般式（１）の化合物が、
−ハルミン（４）：
【化４】
2007535525.tif 000027
−ハルマン（５）：
【化５】
2007535525.tif 000028
または、
−ハルマラシジン（６）：
【化６】
2007535525.tif 000029
に対応する、請求項１〜３の一項に記載の使用。
【請求項５】
ＤＮＡ複製を阻害する化合物が、
−アルキル化剤、例えばシクロホスファミド、マイトマイシンＣまたはチオテパ；
−代謝拮抗剤、例えば５−フルオロウラシル、アラＣまたはメトトレキサート；
−白金の配位錯体、例えばカルボプラチンまたはシスプラチン；あるいは
−トポイソメラーゼＩＩを阻害する薬剤、例えばドキソルビシン、ミトキサントロンまたはアムサクリン、
からなる群から選択される、請求項２〜４の一項に記載の使用。
【請求項６】
ハルミンまたはハルマラシジンおよびシクロホスファミドの、請求項２〜５の一項に記載の使用。
【請求項７】
ハルミンまたはハルマラシジンおよび５−フルオロウラシルの、請求項２〜５の一項に記載の使用。
【請求項８】
少なくとも１種のＤＮＡ複製を阻害する化合物と、薬学的に許容できる賦形剤とを組み合わせての、有効成分として少なくとも１種の一般式（１）の化合物またはその薬学的に許容できる塩を含む、医薬組成物。
【請求項９】
一般式（１）の化合物が、
−ハルミン（４）：
【化７】
2007535525.tif 000030
−ハルマン（５）：
【化８】
2007535525.tif 000031
または、
−ハルマラシジン（６）：
【化９】
2007535525.tif 000032
に対応する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＤＮＡ複製を阻害する化合物が、
−アルキル化剤、例えばシクロホスファミド、マイトマイシンＣまたはチオテパ；
−代謝拮抗剤、例えば５−フルオロウラシル、アラＣまたはメトトレキサート；
−白金の配位錯体、例えばカルボプラチンまたはシスプラチン；あるいは
−トポイソメラーゼＩＩを阻害する薬剤、例えばドキソルビシン、ミトキサントロンまたはアムサクリン、
からなる群から選択される、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
経口または静脈内経路による投与に適した、請求項８〜１０の一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
シクロホスファミドと、薬学的に許容できる賦形剤とを組み合わせて、ハルミンまたはハルマラシジンを有効成分として含む、請求項８〜１１の一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日のハルミンまたは約１〜約５ｍｇ／ｋｇ／日のハルマラシジン、および約１〜約５ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミドの、
経口経路による投与に適した、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
約１〜約３ｍｇ／ｋｇ／日のハルミンまたは約１〜約３ｍｇ／ｋｇ／日のハルマラシジン、および約１〜約５ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミドの、
静脈内経路による投与に適した、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
５−フルオロウラシルと、薬学的に許容できる賦形剤とを組み合わせて、ハルミンまたはハルマラシジンを有効成分として含む、請求項８〜１１の一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日のハルミンまたは約１〜約５ｍｇ／ｋｇ／日のハルマラシジン、および約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の５−フルオロウラシルの、
経口経路による投与に適した、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
約１〜約３ｍｇ／ｋｇ／日のハルミンまたは約１〜約３ｍｇ／ｋｇ／日のハルマラシジン、および約１〜約５ｍｇ／ｋｇ／日の５−フルオロウラシルの、
静脈内経路による投与に適した、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
結腸癌、白血病、骨髄腫、乳癌、神経芽細胞腫、肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、精巣癌、胃癌、膵臓癌、または網膜芽細胞腫等の癌の処置のフレームワーク内での、同時もしくは別々の使用用のまたは長期間にわたる組合せ製品としての、
−少なくとも１種の一般式（１）の化合物またはその薬学的に許容できる塩、および
−少なくとも１種のＤＮＡ複製を阻害する化合物、
を含む製品。
【請求項１９】
一般式（１）の化合物が、
−ハルミン（４）：
【化１０】
2007535525.tif 000033
−ハルマン（５）：
【化１１】
2007535525.tif 000034
または、
−ハルマラシジン（６）：
【化１２】
2007535525.tif 000035
に対応する、請求項１８に記載の製品。
【請求項２０】
ＤＮＡ複製を阻害する化合物が、
−アルキル化剤、例えばシクロホスファミド、マイトマイシンＣまたはチオテパ；
−代謝拮抗剤、例えば５−フルオロウラシル、アラＣまたはメトトレキサート；
−白金の配位錯体、例えばカルボプラチンまたはシスプラチン；あるいは
−トポイソメラーゼＩＩを阻害する薬剤、例えばドキソルビシン、ミトキサントロンまたはアムサクリン、
からなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の製品。
【請求項２１】
結腸癌、乳癌、肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、または膵臓癌等の癌の処置のフレームワーク内での、同時もしくは別々の使用用のまたは長期間にわたる組合せ製品としての、
−ハルミンまたはハルマラシジン、および
−５−フルオロウラシル、
を含む、請求項１８〜２０の一項に記載の製品。
【請求項２２】
結腸癌、白血病、骨髄腫、乳癌、神経芽細胞腫、肝細胞癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、または網膜芽細胞腫等の癌の処置のフレームワーク内での同時もしくは別々の使用用のまたは長期間にわたる組合せ製品としての、
−ハルミンまたはハルマラシジン、および
−シクロホスファミド、
を含む、請求項１８〜２０の一項に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、ハルミン（harmine）、ハルマン（harman）およびハルマラシジン（harmalacidine）等のペガナム・ハルマラ（Peganum Harmala）から抽出されたものに対応する、アルカロイドであるβ−カルボリン誘導体を含有する医薬組成物ならびに癌の処置のフレームワーク内でのそれらの使用に関する。
【０００２】
【化１３】
2007535525.tif 000003
【０００３】
北アフリカまたはアジアのハーブである、ペガナム・ハルマラは、多くの疾患に対する伝統医薬中で使用される。ペガナムアルカロイドは、それらの抗菌性、抗真菌性、抗ウイルス性、体温降下特性、およびとりわけその幻覚効果が知られている（Boukef, "Les plants dans la medecine traditionnelle tunisienne", Agence de Cooperation Culturellle at Technique, Paris 1986）。
【０００４】
初期の研究は、Ｐ・ハルマラの種の抽出物のラットおよびマウスの腫瘍に対する抗新生物活性を立証している。そこで、Ｐ・ハルマラの種のアルカロイド粗抽出物を、経口経路で、５０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与すると、処置したマウスの８０％において、マウスの（皮下に）移植された腫瘍が消失した（Lamchouri et al. (1999) Therapie 54: 753-758）。
【０００５】
また、ある種の単離精製されたＰ・ハルマラアルカロイドは、マウス腫瘍細胞に対する中程度の細胞毒性を、５０％細胞増殖阻害濃度（ＩＣ50）がバシシノンについて１９．２〜６０μｇ／ｍｌ、ハルミンについて２．４〜１８．４μｇ／ｍｌ、ペガニンについて不活性、およびハルマラシジンについて８．０〜２８．９μｇ／ｍｌで示している（Lamchouri, thesis "Proprietes cytotoxiques et antitumorales de Peganum harmala sur des modeles experimentaux de cancer in vitro e in vivo" (2000) Faculte des Sciences Dhar Mahraz, Fes, Maroc）。
【０００６】
最後に、他の研究は、また、ある種のヒト腫瘍細胞系に対する、ある種のβ−カルボリン誘導体、例えば、ハルミン（１．６〜１８．５μｇ／ｍｌのＩＣ50）およびハルマン（８〜２０μｇ／ｍｌのＩＣ50）の中程度の細胞毒性作用を立証している（Ishida et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 3319-3324）。
【０００７】
一般に、マウスでの生体内試験への移行を企図することができるためには、所与の化合物について、ヒトの細胞に対して、０．０１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ50が必要であると考えられる。
【０００８】
また、特に、Ｐ・ハルマラから抽出されるものに対応する、β−カルボリン誘導体の生体内での抗新生物効果は、従来技術において、全く記述されていない。
【０００９】
さらに、腫瘍細胞系、たとえヒト細胞系であっても、これに対する所与の化合物の細胞毒性活性の実証は、生体内での抗腫瘍効果を少しも意味するものではない。事実、この化合物は、例えば、生体内で不活性であることが証明され、あるいは、さらに、生体へのその投与が相容れないような細胞毒性をも有する。
同様に、マウスの腫瘍に活性な化合物は、必ずしも、ヒトの癌に活性ではない。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、癌の処置用の医薬の製造のための、β−カルボリン由来の化合物を含む医薬組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の目的は、また、癌の処置用の医薬の製造のための、β−カルボリン由来の化合物との相乗作用に加わることができる他の化合物を提供することである。
【００１２】
そこで、本発明は、一般式（１）：
【００１３】
【化１４】
2007535525.tif 000004
【００１４】
（式中、
−Ｒ1は、Ｈ、ＯＨ、または炭素数１〜１２のアルコキシ基を表し、
−Ｒ2は、Ｈ、炭素数１〜１２のアルコキシカルボニル基、特にtert−ブトキシカルボニル基、または炭素数１〜１２のアルキル基を表し、
−Ｒ3は、ＯまたはＣＨ3を表すが、ただし、Ｒ3がＯを表すとき、ａは二重結合を表し、ｂおよびｃは単結合を表し、Ｒ4は、Ｈを表し、また、Ｒ3がＣＨ3を表すとき、ａは単結合を表し、ｂおよびｃは二重結合を表し、Ｒ4は、いかなる基をも表さない）
の少なくとも１種の化合物またはその薬学的に許容できる塩の、結腸癌、白血病、骨髄腫、乳癌、神経芽細胞腫、肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、精巣癌、胃癌、膵臓癌、または網膜芽細胞腫等の癌の処置用の医薬の製造のための使用に関する。
【００１５】
本発明の特定の実施態様によれば、少なくとも１種の一般式（１）の化合物が、少なくとも１種のＤＮＡ複製を阻害する化合物と組み合わされる。
【００１６】
「ＤＮＡ複製を阻害する化合物」は、複製に関与する酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、プリマーゼ、リガーゼの活性を阻害することによるか、または例えばＤＮＡの２本の鎖に結合することにより（例えば、アルキル化剤）もしくはチミジンの合成を防止することによりＤＮＡを結合もしくは修飾することにより、ＤＮＡ複製の段階を阻害することができる任意の化合物を意味する。
【００１７】
有利には、一般式（１）の化合物とＤＮＡ複製を阻害する化合物との組合せは、腫瘍の処置における相乗効果を有する。また、一般式（１）の化合物は、有利には、抗腫瘍医薬の製造のフレームワーク内で、ＤＮＡ複製を阻害する化合物の効果を増大させることを意図するアジュバントとして使用される。
【００１８】
本明細書中で意味するように、用語「組合せ」は、一般式（１）の化合物およびＤＮＡの複製を阻害する化合物が、双方とも、本発明に係る医薬または医薬組成物中に、構造的に独立な形で存在すること、およびそれらは、共有型または配位型の強い化学結合により互いに結合されていないことを表す。
【００１９】
一般式（１）の化合物の薬学的に許容できる塩のうち、塩酸塩が特に好ましい。
【００２０】
本発明のより特定の実施態様によれば、一般式（１）の化合物は、
−下記の式（２）：
【００２１】
【化１５】
2007535525.tif 000005
【００２２】
の化合物に、または
−下記の式（３）：
【００２３】
【化１６】
2007535525.tif 000006
【００２４】
（式中、Ｒ1およびＲ2は上で定義されたとおりである）の化合物に対応する。
【００２５】
本発明のさらにより特定の実施態様によれば、一般式（１）の化合物は、
−ハルミン（４）：
【００２６】
【化１７】
2007535525.tif 000007
【００２７】
−ハルマン（５）：
【化１８】
2007535525.tif 000008
【００２８】
または、
−ハルマラシジン（６）：
【００２９】
【化１９】
2007535525.tif 000009
【００３０】
に対応する。
【００３１】
有利には、本発明者等は、ハルミンおよびハルマラシジンが、特にヒトにおける腫瘍において、生体内での抗腫瘍作用を有することを実証した。ハルミンおよびハルマラシジンを、ＤＮＡ複製を阻害する化合物と組み合わせて投与したときに、この作用は強化される。
【００３２】
有利には、上記の式（４）、（５）および（６）の化合物の薬学的に許容できる塩は、また、本発明に従って使用することができ、特には、ハルミン塩酸塩、ハルマン塩酸塩およびハルマラシジン塩酸塩である。
【００３３】
また、その化学構造がハルミンのそれに近いハルマンは、ハルミンと共通の対象細胞を有することが示されている（Sobhani et al. (2002) J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 5: 19-23）。したがって、本発明のフレームワーク内で、それは、ハルミンと同じ目的で使用することができる。
【００３４】
本発明の他の特定の実施態様によれば、ＤＮＡ複製を阻害する化合物は、
−アルキル化剤、例えばシクロホスファミド、マイトマイシンＣまたはチオテパ；
−代謝拮抗剤、例えば５−フルオロウラシル、アラＣ（ara-C）またはメトトレキサート；
−白金の配位錯体、例えばカルボプラチンまたはシスプラチン；あるいは
−トポイソメラーゼＩＩを阻害する薬剤、例えばドキソルビシン（doxorubicin）、ミトキサントロン（mitoxantrone）またはアムサクリン（amsacrine）、
からなる群から選択される。
【００３５】
これらの化合物は、当業者に周知である。
特に、アルキル化剤は、強固な共有架橋を形成することにより単一フラグメントのＤＮＡの２つの鎖の分離を防止することにより作用する。
【００３６】
代謝拮抗剤は、塩基の代わりをすること（５−フルオロウラシルまたはアラ−Ｃ）、またはチミジンの酵素的合成を阻害すること（５−フルオロウラシル、メトトレキサート）のいずれかにより、これを防止する。
【００３７】
白金の配位錯体は、特に、単一フラグメントにおけるＤＮＡの２つの鎖の間で強固な橋架けを形成する。
【００３８】
トポイソメラーゼＩＩは、超らせんＤＮＡの緩和のフレームワーク内で、単一フラグメントのＤＮＡの２つの鎖を開裂し、再結合する活性を有する。
【００３９】
本発明の好ましい実施態様によれば、後者は、一般式（１）の化合物のモル量が、それが組み合わされるＤＮＡ複製を阻害する化合物のモル量よりも多い、上で定義された使用に関する。特に、一般式（１）の化合物のモル量は、それが組み合わされるＤＮＡ複製を阻害する化合物のモル量よりも、少なくとも２０％多い。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様によれば、後者は、ハルミンまたはハルマラシジンおよびシクロホスファミドの、上で定義された使用に関する。
【００４１】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、後者は、ハルミンまたはハルマラシジンおよび５−フルオロウラシルの、上で定義された使用に関する。
【００４２】
本発明は、また、少なくとも１種のＤＮＡ複製を阻害する化合物と組み合わせての、有効成分としての、少なくとも１種の一般式（１）の化合物またはその薬学的に許容できる塩と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む、医薬組成物に関する。
【００４３】
本発明の好ましい実施態様によれば、医薬組成物は、一般式（１）の化合物が、
−ハルミン（４）：
【００４４】
【化２０】
2007535525.tif 000010
【００４５】
−ハルマン（５）：
【００４６】
【化２１】
2007535525.tif 000011
【００４７】
または、
−ハルマラシジン（６）：
【００４８】
【化２２】
2007535525.tif 000012
【００４９】
に対応するようなものである。
【００５０】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、医薬組成物は、ＤＮＡ複製を阻害する化合物が、
−アルキル化剤、例えばシクロホスファミド、マイトマイシンＣまたはチオテパ；
−代謝拮抗剤、例えば５−フルオロウラシル、アラＣまたはメトトレキサート；
−白金の配位錯体、例えばカルボプラチンまたはシスプラチン；あるいは
−トポイソメラーゼＩＩを阻害する薬剤、例えばドキソルビシン、ミトキサントロンまたはアムサクリン、
からなる群から選択されるようなものである。
【００５１】
他の好ましい実施態様によれば、本発明に係る医薬組成物は、経口または静脈内経路による投与に好適である。
【００５２】
特定の好ましい実施態様によれば、本発明に係る医薬組成物は、シクロホスファミドおよび薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせて、ハルミンまたはハルマラシジンを有効成分として含む。
【００５３】
より特定の好ましい実施態様によれば、上記の医薬組成物は、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日のハルミンまたは約１〜約５ｍｇ／ｋｇ／日のハルマラシジン、および約１〜約５ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミドの、経口経路による投与に好適である。
【００５４】
他のより特定の好ましい実施態様によれば、上記の医薬組成物は、約１〜約３ｍｇ／ｋｇ／日のハルミンまたは約１〜約３ｍｇ／ｋｇ／日のハルマラシジン、および約１〜約５ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミドの、静脈内経路による投与に好適である。
【００５５】
他の特定の好ましい実施態様によれば、本発明に係る医薬組成物は、５−フルオロウラシルおよび薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせて、ハルミンまたはハルマラシジンを有効成分として含む。
【００５６】
より特定の好ましい実施態様によれば、上記の医薬組成物は、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日のハルミンまたは約１〜約５ｍｇ／ｋｇ／日のハルマラシジン、および約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の５−フルオロウラシルの、経口経路による投与に好適である。
【００５７】
他のより特定の好ましい実施態様によれば、上記の医薬組成物は、約１〜約３ｍｇ／ｋｇ／日のハルミンまたは約１〜約３ｍｇ／ｋｇ／日のハルマラシジン、および約１〜約５ｍｇ／ｋｇ／日の５−フルオロウラシルの、静脈内経路による投与に好適である。
【００５８】
好ましい実施態様によれば、上で定義された医薬組成物は、それが組み合わされるＤＮＡ複製を阻害する化合物のモル量よりも多い、一般式（１）の化合物のモル量を投与するのに好適である。特に、その医薬組成物は、それが組み合わされるＤＮＡ複製を阻害する化合物のモル量よりも少なくとも２０％多い、一般式（１）の化合物のモル量を投与するのに好適である。
【００５９】
本発明は、また、結腸癌、白血病、骨髄腫、乳癌、神経芽細胞腫、肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、精巣癌、胃癌、膵臓癌、または網膜芽細胞腫等の癌の処置のフレームワーク内での同時もしくは別々の使用用のまたは長期間にわたる組合せ製品としての、
−少なくとも１種の一般式（１）の化合物またはその薬学的に許容できる塩、および
−少なくとも１種のＤＮＡ複製を阻害する化合物、
を含む製品に関する。
【００６０】
本明細書中で意味するように、用語「組合せ」は、一般式（１）の化合物およびＤＮＡ複製を阻害する化合物が、双方とも、本発明に係る製品中に、構造的に独立な形で存在すること、およびそれらが、共有型または配位型の強い化学結合により互いに結合されていないことを表す。
【００６１】
本発明の特定の実施態様によれば、組合せ製品は、一般式（１）の化合物が、
−ハルミン（４）：
【００６２】
【化２３】
2007535525.tif 000013
【００６３】
−ハルマン（５）：
【００６４】
【化２４】
2007535525.tif 000014
【００６５】
または、
−ハルマラシジン（６）：
【００６６】
【化２５】
2007535525.tif 000015
【００６７】
に対応するようなものである。
【００６８】
本発明の他の特定の実施態様によれば、組合せ製品は、ＤＮＡ複製を阻害する化合物が、
−アルキル化剤、例えばシクロホスファミド、マイトマイシンＣまたはチオテパ；
−代謝拮抗剤、例えば５−フルオロウラシル、アラＣまたはメトトレキサート；
−白金の配位錯体、例えばカルボプラチンまたはシスプラチン；あるいは
−トポイソメラーゼＩＩを阻害する薬剤、例えばドキソルビシン、ミトキサントロンまたはアムサクリン、
からなる群から選択されるようなものである。
【００６９】
好ましい実施態様によれば、本発明は、結腸癌、乳癌、肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、または膵臓癌等の癌の処置のフレームワーク内での同時もしくは別々の使用用のまたは長期間にわたる組合せ製品としての、
−ハルミンまたはハルマラシジン、および
−５−フルオロウラシル、
を含む、上で定義された製品に関する。
【００７０】
他の好ましい実施態様によれば、本発明は、結腸癌、白血病、骨髄腫、乳癌、神経芽細胞腫、肝細胞癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、または網膜芽細胞腫等の癌の処置のフレームワーク内での同時もしくは別々の使用または用の組合せ製品としての、
−ハルミンまたはハルマラシジン、および
−シクロホスファミド、
を含む、上で定義された製品に関する。
【００７１】
好ましい実施態様によれば、上で定義された製品は、それが組み合わされるＤＮＡ複製を阻害する化合物のモル量よりも多い、一般式（１）の化合物のモル量を含む。特に、その製品は、それが組み合わされるＤＮＡ複製を阻害する化合物のモル量よりも少なくとも２０％多い、一般式（１）の化合物のモル量を含む。
【００７２】
実施例
実施例１
ペガナム・ハルマラのアルカロイドの抽出
粉砕したＰ・ハルマラの種（Zygophyllaceae）（１ｋｇ）からの粉末を、メタノールで抽出した。溶媒をエバポレートした後、残渣を２％塩酸中に溶解した。次いで、酸性水溶液をジクロロメタンで洗浄し、その後、重炭酸ナトリウムでアルカリ性とし、ジクロロメタンで抽出した。次いで、有機相は、溶媒をエバポレートすることにより、アルカロイドの混合物の粗抽出物（２４ｇ）を残した。抽出物を、ジクロロメタン／メタノール（９／１）混合物で溶離する、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付して、２３画分に分離した。
【００７３】
ジクロロメタン／メタノール混合物中での画分３〜５の結晶化により、純粋なハルミン（Ａ）（３ｇ）が得られた（Ｍ： ２１２．３；ＭＰ．２６１℃（２６１℃； Goebel, F. Justus Liebigs Ann. Chem. 1841, 38, 363およびHochstein, A. J. Amer. Chem. Soc., 1957, 49, 5735)）。バシシン（Ｂ）は、画分１０〜１２から、ハルマラシジン（Ｃ）（１２．６ｇ、Ｍ：２１６，ＭＰ．１９７℃（１９７〜１９８℃； Hashimoto, Y., Kawanishi, K. Phytochemistry 1976, 15, 1559-1560; Siddiqui, S. Heterocycles 1988, 27, 1401)）は画分１７〜２１、および脱メチルハルマラシジン（Ｄ）は画分２２〜２３から取り出された。
【００７４】
【化２６】
2007535525.tif 000016
【００７５】
ハルミンは、詳細に特徴付けられた：
−ハルミンの質量スペクトルは、分子式Ｃ13Ｈ12Ｎ2Ｏ（Ｍ：２１２．３）に対応する、ｍ／ｚ２１２ダルトンの分子イオン［Ｍ］・＋を示す。
−1Ｈおよび13ＣＮＭＲスペクトルならびに二次元ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣスペクトルの分析は、以下に示すハルミンの構造を支持する。
【００７６】
【化２７】
2007535525.tif 000017
【００７７】
−ハルミン塩酸塩二水和物も分析された：ＭＰ．２６２℃（２６８〜２７０℃；The Merck Index, Xth, M. Windholz, ed., Merck 1 co., Inc., Rahway, N.J. USA, 1983, p.666）、Ｍ．２８４．８；
−毒性はＢＡＬＢ／ｃマウスで決定した；致死量５０（ＬＤ50）経口で３００ｍｇ／ｋｇ（２４３ｍｇ／ｋｇ、ｓｃ、マウス、３８ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ，The Merck Index, Xth, M. Windholz, ed., Merck 1 co., Inc., Rahway, N.J. USA, 1983, p.666）。
【００７８】
ハルマラシジンも、特徴付けられた：
−ハルマラシジンの質量スペクトルは、分子式Ｃ12Ｈ12Ｎ2Ｏ2（Ｍ：２１６．２）に対応する、ｍ／ｚ２１６ダルトンの分子イオン［Ｍ］・＋を示す。
−1Ｈおよび13ＣＮＭＲスペクトルならびに二次元ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣスペクトルの分析は、以下に示すハルマラシジンの構造を支持する（Hashimoto, Y., Kawanishi, K. Phytochemistry 1976, 15, 1559-1560; Siddiqui, S. Heterocycles 1988, 27, 1401）。
【００７９】
【化２８】
2007535525.tif 000018
【００８０】
−ハルマラシジン塩酸塩二水和物の分子量：Ｍ２８８。
【００８１】
実施例２
Ｐ・ハルマラのアルカロイドの生体内細胞毒性効果
Ｐ・ハルマラの様々なアルカロイド抽出物の細胞毒性効果を、いくつかの細胞系について検討した：
−ヒト白血病細胞系：Ｋ５６２およびジャーカット（Jurkat）（白血病）、Ｕ９３７（骨髄腫）、
−ヒト固形腫瘍細胞系：ＫＢ（鼻咽頭のエピテリオーマ）およびＨＴ２９（結腸）、
−不死化ヒト骨髄内皮細胞系：ＨＢＭＥＣ。
【００８２】
細胞を、１０％ウシ胎仔血清、０．０１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミン２ｍＭを追加した、Ｋ５６２、ジャーカット、Ｕ９３７およびＨＴ２９についてはＲＰＭＩ１６４０培地ならびにＫＢについてはＤＭＥＭ中で、またＨＢＭＥＣ細胞についてはＥＧＭ２培地中で、５％ＣＯ2雰囲気下に３７℃のオーブン中で培養した。
【００８３】
細胞毒性試験は、９６穴マイクロプレート中で、試験すべき抽出物を４０、２０、１０、５、１、０．５μｇ／ｍｌと濃度を変えて存在させまたは製品を存在させずに、３７℃で４日間インキュベートした後に行った。３日目に、生存細胞により吸収されるニュートラルレッドの溶液を加えた。溶解細胞が放出した染料の光学濃度（ＯＤ）を、イライザプレートリーダーにより５４０ｎｍで測定した。毒性（増殖阻害％）は、光学濃度に反比例する。
【００８４】
阻害パーセントは、製品無しのＯＤと製品存在下のＯＤとの差を製品無しのＯＤと比較したものとして定義される。
細胞増殖を５０％阻害する濃度は、濃度の対数の関数として、阻害パーセントを表す曲線から得られる。
得られた全ての結果を、下記の表１に示す。
【００８５】
【表１】
2007535525.tif 000019
【００８６】
まとめると、悪性腫瘍および内皮細胞に対するＩＣ50は、以下のとおりである：
アルカロイドの粗抽出物について、５〜１２μｇ／ｍｌ、
ハルミンについて、２．９〜４．６μｇ／ｍｌ（１４〜２２μＭ）、
ハルミン塩酸塩について、３〜１０μｇ／ｍｌ（１０．５〜３５μＭ）、
ハルマラシジン塩酸塩について、１０．５〜２９μｇ／ｍｌ（３４．４〜１３４μＭ）。
【００８７】
実施例３
ハルミンの生体内抗新生物活性
【００８８】
材料および方法
選択された動物モデルは、ヒト腫瘍細胞の異種移植片を受け入れた重症複合免疫不全マウス（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）である。
３月齢以上の雄性および雌性ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、厳密な滅菌環境で、ろ過滅菌空気を通気した隔離装置内で、２２℃、湿度４０％で、昼１２時間−夜１２時間のサイクルで生育した。ケージ、給餌瓶および水は、１２０℃のオートクレーブ中で３０分間滅菌し、餌および床敷きは、γ線照射で処理した。全ての取扱いは、層流フード下で、無菌状態で行った。
マウスは、２ｍｇ／ｍｌのハイプノミデート（hypnomidate）０．３〜０．４ｍｌを腹腔内注射することにより、全身麻酔に処した。次いで、ＰＢＳ２００μｌ中の懸濁液中のＨＴ２９ヒト結腸腫瘍細胞１ｘ１０7を、マウスの背中に皮下注射した。移植１０日後、腫瘍の長さは、約１ｃｍに達した。
ハルミン塩酸塩２０１ｍｇを、水８ｍｌに溶解し、得られた溶液を、孔隙率０．２２μｍの膜で濾過して、滅菌した。
移植後１０日目に、５匹のマウスの６群に、それぞれ、０（対照）、１００、１２５、１５０、１７５および２００ｍｇ／ｋｇ／日の割合で６０日間、胃チューブを用いて、ハルミンを経口経路で投与した。
腫瘍のおよその容積は、定期的にキャリブレーションし、式：
容積（ｃｍ3）＝長さ（ｃｍ）ｘ幅（ｃｍ）ｘ高さ（ｃｍ）ｘ０．５
に従って算出した。
【００８９】
結果
得られた結果を、表２および図１に示す。
【００９０】
【表２】
2007535525.tif 000020
【００９１】
腫瘍増殖に対するハルミンの阻害作用は、１２５〜１７５ｍｇの間で、投与量依存的であることを示している。１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量では、非常に弱い効果である。１２５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で、有意な効果を示し始め、腫瘍の容積は、非処置群の腫瘍の５５〜６７％に達する。１５０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量では、腫瘍の容積は、５０日までは、対照群のそれの４２％のみを示したが、６０日目には５１％に達している。１７５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量では、処置の全期間について、Ｔ／Ｃ＝４０％で、有効であることが証明されている。２００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量では、耐えることができず、マウスは処置の２、３日後に死亡した。
【００９２】
実施例４
シクロホスファミドのみ、またはハルミンとの組合せにおける、生体内抗新生物活性
シクロホスファミド（M＝２６１）のみ、またはハルミンとの組合せにおける、生体内抗新生物活性を実施例３の方法に従って測定した。
シクロホスファミド（Sigma）１５０ｍｇを、水８ｍｌに溶解し、得られた溶液を孔隙率０．２２μｍの膜で濾過して、滅菌した。マウスには、５０、１００もしくは１５０ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミドのみ、または１５０ｍｇ／ｋｇ／日のハルミン＋５０ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミドもしくは１００ｍｇ／ｋｇ／日のハルミン＋１００ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミドの混合物のいずれかが与えられた。
得られた結果を、表３ならびに図２Ａおよび２Ｂに示す。
【００９３】
【表３】
2007535525.tif 000021
【００９４】
シクロホスファミドを単独で投与すると（表３、図２Ａ、２Ｂ）、５０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で、４０〜３０％のＴ／Ｃ比となった。１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量では、腫瘍の増殖が非常に強く阻害された：２５〜１５％のＴ／Ｃ。１５０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量では、腫瘍容積は、ほとんど増加しなかったが、マウスはこの投与量に耐えることができず、処置の約１５日目で、全てが死亡した。
【００９５】
ハルミン１５０ｍｇとシクロホスファミド５０ｍｇ／ｋｇ／日の同時投与の間（表３、図２Ｂ）（ハルミン／シクロホスファミドのモル比  ３．７／１）、腫瘍容積は、６０日目の処置まで、Ｔ／Ｃ比１０％未満で、静止状態が保たれていた。したがって、ハルミン−シクロホスファミドの組合せは、混合物中で使用された濃度でのハルミン単独の使用およびシクロホスファミド単独の使用に比べて、腫瘍増殖の阻害についての相乗効果を有している。このことは、この組合せを癌の処置に使用することを企図することを可能にする。
【００９６】
しかしながら、注目すべきは、１５０ｍｇ／ｋｇ／日のハルミンと５０ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミドとの組合せは、３０日目からは十分には許容されるものではないということである。累積中毒の症状は、肝腎障害の結果としての毛の黄ばみまたは浮腫の発生で示されるが、シクロホスファミドを止めることで、これは消失する。したがって、シクロホスファミドの毎日の投与を停止し、７日間の休止と３日間の処置というサイクルに切り替える必要があった。それに対して、ハルミンは、中断することなく投与された。この組み合わせられ、制御された処置に付されたマウスは、中毒の兆候を全く示さず、このように処置されたマウスの７５％が、１ｃｍ3未満の腫瘍容積で１００日を超えて生存した。
【００９７】
１００ｍｇ／ｋｇ／日のハルミン＋１００ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミドの組合せは、Ｔ／Ｃ比が１０％近くで、腫瘍増殖の同様の阻害をもたらした（表３、図２Ａ）。
【００９８】
実施例５
５−フルオロウラシルのみ、またはハルミンとの組合せにおける、生体内抗新生物活性
５−フルオロウラシル（Ｍ＝１３０）のみ、またはハルミンとの組合せにおける、生体内抗新生物活性を実施例３の方法に従って測定した。
５−フルオロウラシル（Sigma）５０ｍｇを、水８ｍｌに溶解し、得られた溶液を孔隙率０．２２μｍの膜で濾過して、滅菌した。マウスには、３、６、９、１２もしくは２４ｍｇ／ｋｇ／日の５−フルオロウラシルのみ、または１５０ｍｇ／ｋｇ／日のハルミン＋１２ｍｇ／ｋｇ／日の５−フルオロウラシルの混合物のいずれかが与えられた。
得られた結果を、表４ならびに図３Ａおよび３Ｂに示す。
【００９９】
【表４】
2007535525.tif 000022
【０１００】
５−フルオロウラシルを単独で、３〜１２ｍｇ／ｋｇ／日の間からなる投与量で６０日間、経口で投与したとき（表４、図３Ａ）、腫瘍（ＨＴ２９）は増殖し続けている。１２ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で、腫瘍の大きさは、５０日までゆっくり増大し（Ｔ／Ｃ＝５２％）、その後、腫瘍はより急速に増殖し始めて、６０日に、９ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で観察されたものと同様の大きさに達する。６日の処置と６日の休止とを交互にして投与された、２４ｍｇ／ｋｇ／日の投与量は、２０日の処置まで有効であった（Ｔ／Ｃ＝１７％）が、その後、有効性は減少する：３０日目（Ｔ／Ｃ＝５４％）。この投与量は、３５〜４５日の投与の間で致命的となる。
【０１０１】
ハルミン１５０ｍｇ／ｋｇ／日を、増大する投与量の５−フルオロウラシル：３，６，９および１２ｍｇ／ｋｇ／日と組み合わせて同時に投与した。
１５０ｍｇ／ｋｇ／日のハルミン＋１２ｍｇ／ｋｇ／日の５−フルオロウラシルの組合せのみを、表４に示す（７．７／１のハルミン／５−フルオロウラシルのモル比）。６日の処置と６日の休止のサイクルで投与したこの組合せは、腫瘍増殖の阻害についての相乗効果を有しており（表４、図３Ｂ）、６０日目の処置においてさえも、２３％のＴ／Ｃで、１．３ｃｍ3より低い腫瘍容積を維持することができた。
【０１０２】
実施例６
ビンブラスチンのみ、またはハルミンとの組合せにおける、生体内抗新生物活性
ビンブラスチンの抗新生物活性は、皮下投与により、４０日目まで、０．１２５〜０．５ｍｇ／ｋｇ／日の間で投与量依存的である。１ｍｇ／ｋｇ／日より多い投与量は、６日目を超えては、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにより許容されなかった。
１５０ｍｇ／ｋｇ／日のハルミンとそれぞれ０，１２５、０．２５および０．５ｍｇ／ｋｇ／日のビンブラスチンとの組合せについて、相乗効果は認められなかった。
【０１０３】
実施例７
ハルマラシジンのみ、またはシクロホスファミドとの組合せにおける、生体内抗新生物活性
ハルマラシジンのみ、またはシクロホスファミドとの組合せにおける、生体内抗新生物活性を実施例３の方法に従って測定した。
ハルマラシジン塩酸塩二水和物１００ｍｇを、水８ｍｌに溶解し、得られた溶液を孔隙率０．２２μｍの膜で濾過して、滅菌した。マウスには、２５、５０もしくは１００ｍｇ／ｋｇ／日のハルマラシジンのみ、または２５もしくは５０ｍｇ／ｋｇ／日のハルマラシジン＋５０ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミドの混合物のいずれかが与えられた。
得られた結果を、表５ならびに図４に示す。
【０１０４】
【表５】
2007535525.tif 000023
【０１０５】
ハルマラシジンを単独で、２５および５０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で６０日間、経口で投与したとき（表５および図４）、腫瘍（ＨＴ２９）は５０日までゆっくり増大し（Ｔ／Ｃ＝６５および４５％）、その後、腫瘍はより急速に増殖し始めて、６０日に、Ｔ／Ｃ＝７７および５７％に達する。１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量は、１０日を超えては、許容されなかった。
ハルマラシジン２５または５０ｍｇ／ｋｇ／日を、５０ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミドと組み合わせて同時に投与した。
５日の処置と２日の休止のサイクルで投与したこの組合せは、腫瘍増殖の阻害についての相乗効果を有しており（表５、図４）、６０日目の処置においてさえも、それぞれ２５および２０％のＴ／Ｃで、１．５および１．２ｃｍ3より低い腫瘍容積を維持することができた。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、非処理（菱形）の、または１００ｍｇ／ｋｇ／日（十字）、１２５ｍｇ／ｋｇ／日（四角）、１５０ｍｇ／ｋｇ／日（三角）もしくは１７５ｍｇ／ｋｇ／日（丸）のハルミンで処理した、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植されたＨＴ２９腫瘍のサイズの増大（ｃｍ3で、ｙ軸）を、時間の関数（日数で、ｘ軸）として表す。
【図２Ａ】図２Ａは、非処理（十字）の、あるいは５０ｍｇ／ｋｇ／日（三角）、１００ｍｇ／ｋｇ／日（四角）のシクロホスファミドで、または１００ｍｇ／ｋｇ／日のハルミン＋１００ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミド（丸）もしくは１５０ｍｇ／ｋｇ／日のハルミン＋５０ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミド（菱形）の混合物で処理した、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植されたＨＴ２９腫瘍のサイズの増大（ｃｍ3で、ｙ軸）を、時間の関数（日数で、ｘ軸）として表す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、非処理（菱形）の、あるいは１５０ｍｇ／ｋｇ／日（三角）のハルミン、５０ｍｇ／ｋｇ／日（十字）のシクロホスファミドで、または１５０ｍｇ／ｋｇ／日のハルミン＋５０ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミド（丸）の混合物で処理した、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植されたＨＴ２９腫瘍のサイズの増大（ｃｍ3で、ｙ軸）を、時間の関数（日数で、ｘ軸）として表す。
【図３Ａ】図３Ａは、非処理（丸）の、あるいは３ｍｇ／ｋｇ／日（三角）、６ｍｇ／ｋｇ／日（四角）、９ｍｇ／ｋｇ／日（十字）、１２ｍｇ／ｋｇ／日（菱形）または２４ｍｇ／ｋｇ／日（ダッシュ）の５−フルオロウラシルで処理した、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植されたＨＴ２９腫瘍のサイズの増大（ｃｍ3で、ｙ軸）を、時間の関数（日数で、ｘ軸）として表す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、非処理（三角）の、あるいは１５０ｍｇ／ｋｇ／日のハルミン（十字）、１２ｍｇ／ｋｇ／日の５−フルオロウラシル（四角）で、または１５０ｍｇ／ｋｇ／日のハルミン＋１２ｍｇ／ｋｇ／日の５−フルオロウラシル（丸）の混合物で処理した、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植されたＨＴ２９腫瘍のサイズの増大（ｃｍ3で、ｙ軸）を、時間の関数（日数で、ｘ軸）として表す。
【図４】図４は、非処理（四角）の、あるいは２５ｍｇ／ｋｇ／日（三角）もしくは５０ｍｇ／ｋｇ／日（十字）のハルマラシジン、５０ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミド（菱形）または２５ｍｇ／ｋｇ／日のハルマラシジン＋５０ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミド（ダッシュ）もしくは５０ｍｇ／ｋｇ／日のハルマラシジン＋５０ｍｇ／ｋｇ／日のシクロホスファミド（丸）の混合物で処理した、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植されたＨＴ２９腫瘍のサイズの増大（ｃｍ3で、ｙ軸）を、時間の関数（日数で、ｘ軸）として表す。
【図１】
2007535525.tif 000036
【図２Ａ】
2007535525.tif 000037
【図２Ｂ】
2007535525.tif 000038
【図３Ａ】
2007535525.tif 000039
【図３Ｂ】
2007535525.tif 000040
【図４】
2007535525.tif 000041
【国際調査報告】
2007535525.tif 000042
2007535525.tif 000043
2007535525.tif 000044
2007535525.tif 000045
2007535525.tif 000046
2007535525.tif 000047