(57)【要約】  修飾されたヒトインターフェロンポリペプチドおよびこれらの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド。
【請求項２】
ｈＧＨポリペプチドが１つ以上の翻訳後修飾を含む、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが、リンカー、ポリマーまたは生物活性分子に連結されている、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドが、水溶性ポリマーに連結されている、請求項３に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが、二官能性ポリマー、二官能性リンカー、また少なくとも１つの追加のｈＧＨポリペプチドに連結されている、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項６】
二官能性リンカーまたはポリマーが、第二のポリペプチドに連結されている、請求項５に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項７】
第二ポリペプチドが、ｈＧＨポリペプチドである、請求項６に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項８】
水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）部分を含む、請求項４に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項９】
前記水溶性ポリマーが、ｈＧＨポリペプチド中に存在する天然にはコードされないアミノ酸に連結されている、請求項４に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項１０】
天然にはコードされないアミノ酸が、配列番号２からの１−５、６−３３、３４−７４、７５−９６、９７−１０５、１０６−１２９、１３０−１５３、１５４−１８３および１８４−１９１から成る群より選択される位置で置換されている、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項１１】
天然にはコードされないアミノ酸が、配列番号２からの位置１より前（すなわち、Ｎ末端位置）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、該タンパク質のカルボキシ末端位置）およびこれらのあらゆる組合せから成る群より選択される残基の位置で置換されている、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項１２】
天然にはコードされないアミノ酸が、配列番号２からの残基２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６、１８７およびこれらのあらゆる組合せから成る群より選択される位置で置換されている、請求項１１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項１３】
天然にはコードされないアミノ酸が、配列番号２からの残基２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６、１８７およびこれらのあらゆる組合せから成る群より選択される位置で置換されている、請求項１１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項１４】
天然にはコードされないアミノ酸が、配列番号２からの残基３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５および１５５およびこれらのあらゆる組合せから成る群より選択される位置で置換されている、請求項１１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項１５】
天然にはコードされないアミノ酸が、配列番号２からの残基３０、７４、１０３およびこれらのあらゆる組合せから成る群より選択される位置で置換されている、請求項１１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項１６】
天然にはコードされないアミノ酸が、配列番号２からの残基３５、９２、１４３、１４５およびこれらのあらゆる組合せから成る群より選択される位置で置換されている、請求項１１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項１７】
天然にはコードされないアミノ酸が、配列番号２からの位置１より前（すなわち、Ｎ末端位置）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、該タンパク質のカルボキシ末端位置）およびこれらのあらゆる組合せから成る群より選択される残基の位置で置換されている、請求項４に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項１８】
天然にはコードされないアミノ酸が、配列番号２からの残基３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５およびこれらのあらゆる組合せから成る群より選択される位置で置換されている、請求項１７に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項１９】
天然にはコードされないアミノ酸が、配列番号２からの残基３５、９２、１４３、１４５およびこれらのあらゆる組合せから成る群より選択される位置で置換されている、請求項１８に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項２０】
ｈＧＨポリペプチドが、ｈＧＨ受容体に対する該ｈＧＨポリペプチドの親和性を調節する１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含む、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号２からのＦ１０Ａ、Ｆ１０Ｈ、Ｆ１０Ｉ；Ｍ１４Ｗ、Ｍ１４Ｑ、Ｍ１４Ｇ；Ｈ１８Ｄ；Ｈ２１Ｎ；Ｒ１６７Ｎ；Ｄ１７１Ｓ；Ｅ１７４Ｓ；Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔおよびこれらのあらゆる組合せから成る群より選択されるアミノ酸置換を含む、請求項２０に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項２２】
ｈＧＨポリペプチドが、該ｈＧＨポリペプチドの安定性または溶解性を増大させる１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含む、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号２におけるアミノ酸置換Ｇ１２０Ａを含む、請求項２２に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項２４】
ｈＧＨポリペプチドが、組換え宿主細胞またはインビトロでの合成における該ｈＧＨポリペプチドの発現を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含む、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号２におけるアミノ酸置換Ｇ１２０Ａを含む、請求項２４に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項２６】
ｈＧＨポリペプチドが、該ｈＧＨポリペプチドのプロテアーゼ耐性を増大させる１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含む、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項２７】
Ｃ−Ｄループ、Ｒ１３４Ｄ、Ｔ１３５Ｐ、Ｋ１４０Ａおよびこれらのあらゆる組合せの内の置換から成る群より選択されるアミノ酸置換を含む、請求項２６に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項２８】
天然にはコードされないアミノ酸が、ポリペプチド中の２０の共通アミノ酸のいずれに対しても非反応性であるリンカー、ポリマーまたは生物活性分子に対して反応性である、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項２９】
天然にはコードされないアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を含む、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項３０】
天然にはコードされないアミノ酸が、カルボニル基を含む、請求項２９に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項３１】
天然にはコードされないアミノ酸が、構造：
【化１】
2007519420.tif 000040
（ここでｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキルおよび置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはアミノ末端修飾基であり；ならびにＲ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である）
を有する、請求項３０に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項３２】
天然にはコードされないアミノ酸が、アミノオキシ基を含む、請求項２９に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項３３】
天然にはコードされないアミノ酸が、ヒドラジド基を含む、請求項２９に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項３４】
天然にはコードされないアミノ酸が、ヒドラジン基を含む、請求項２９に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項３５】
天然にはコードされないアミノ酸残基が、セミカルバジド基を含む、請求項２９に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項３６】
天然にはコードされないアミノ酸残基が、アジド基を含む、請求項２９に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項３７】
天然にはコードされないアミノ酸が、構造：
【化２】
2007519420.tif 000041
（ここでｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールであるか、存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、存在せず；ｍは、０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはアミノ末端修飾基であり；ならびにＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である）
を有する、請求項３６に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項３８】
天然にはコードされないアミノ酸が、アルキン基を含む、請求項２９に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項３９】
天然にはコードされないアミノ酸が、構造：
【化３】
2007519420.tif 000042
（ここでｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、存在せず；ｍは、０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはアミノ末端修飾基であり；ならびにＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である）
を有する、請求項３８に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項４０】
水溶性ポリマーが、約０．１ｋＤａと約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項４に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項４１】
水溶性ポリマーが、約０．１ｋＤａと約５０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項４０に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項４２】
カルボニル含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドとアミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド基を含む水溶性ポリマーとを反応させることにより作製される、請求項４に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項４３】
アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド基が、アミドリンケージにより水溶性ポリマーに連結されている、請求項４２に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項４４】
カルボニル基を含む水溶性ポリマーとアミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド基を含む天然にはコードされないアミノ酸を含むポリペプチドとを反応させることにより作製される、請求項４に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項４５】
アルキン含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドとアジド部分を含む水溶性ポリマーとを反応させることによって作製される、請求項４に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項４６】
アジド含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドとアルキン部分を含む水溶性ポリマーとを反応させることによって作製される、請求項４に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項４７】
アジドまたはアルキン基が、アミドリンケージにより水溶性ポリマーに連結されている、請求項２９に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項４８】
水溶性ポリマーが、分枝ポリマーまたはマルチアームポリマーである、請求項４にｈＧＨポリペプチド。
【請求項４９】
分枝ポリマーの各枝が、約１ｋＤａと約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項４８に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項５０】
ポリペプチドがｈＧＨ拮抗薬である、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項５１】
天然にはコードされないアミノ酸が、配列番号２からの残基１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１８、１９、２２、２５、２６、２９、６５、１０３、１０６、１０７、１０８、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、１２７、１２８、１２９、１６８、１７４、位置１の前（すなわち、Ｎ末端位置）、およびこれらのあらゆる組合せから成る群より選択される位置で置換されている、請求項５０に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項５２】
ポリペプチドが１つ以上の後翻訳修飾、リンカー、ポリマーまたは生物活性分子を含む、請求項５０に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項５３】
ポリマーが、水溶性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール）から成る群より選択される部分を含む、請求項５２に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項５４】
天然にはコードされないアミノ酸が、ｈＧＨポリペプチドのＳｉｔｅ  ＩＩ領域内に存在する、請求項５０に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項５５】
ポリペプチドがｈＧＨ受容体の二量体化を防止する、請求項５０に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項５６】
天然にはコードされないアミノ酸が、糖部分を含む、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項５７】
リンカー、ポリマーまたは生物活性分子が、糖部分によりポリペプチドに連結されている、請求項３に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項５８】
少なくとも１つのセレクターコドンを含むポリヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件下で配列番号２１または配列番号２２にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項５９】
セレクターコドンが、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、および四塩基コドンから成る群より選択される、請求項５８に記載の単離された核酸。
【請求項６０】
天然にはコードされないアミノ酸を含む単離されたｈＧＨポリペプチドを、該天然にはコードされないアミノ酸と反応する部分を含むリンカー、ポリマーまたは生物活性分子と接触させることを含む、請求項３に記載のｈＧＨポリペプチドを製造する方法。
【請求項６１】
ポリマーが、水溶性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール）から成る群より選択される部分を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
天然にはコードされないアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
天然にはコードされないアミノ酸が、カルボニル部分を含み、リンカー、ポリマーまたは生物活性分子が、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド部分を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド部分が、アミドリンケージによりリンカー、ポリマーまたは生物活性分子に連結される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
天然にはコードされないアミノ酸が、アルキン部分を含み、リンカー、ポリマーまたは生物活性分子が、アジド部分を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
天然にはコードされないアミノ酸が、アジド部分を含み、リンカー、ポリマーまたは生物活性分子が、アルキン部分を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
アジドまたはアルキン部分が、アミドリンケージによりリンカー、ポリマーまたは生物活性分子に連結される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
ポリ（エチレングリコール）部分が、約０．１ｋＤａと約１００ｋＤａの間の平均分子量を有する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６９】
ポリ（エチレングリコール）部分が、分枝またはマルチアームポリマーである、請求項６１に記載の方法。
【請求項７０】
請求項１に記載のｈＧＨポリペプチドおよび医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項７１】
天然にはコードされないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結されている、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
請求項７０に記載の組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、ｈＧＨによって調節される疾患に罹患している患者を治療する方法。
【請求項７３】
請求項５８に記載の核酸を含む細胞。
【請求項７４】
細胞が直交性ｔＲＮＡシンセターゼまたは直交性ｔＲＮＡを含む、請求項７３に記載の細胞。
【請求項７５】
ｈＧＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（単数または複数）を含み、セレクターコドン、直交性ＲＮＡシンセターゼおよび直交性ｔＲＮＡを含む細胞を、天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの発現を可能ならしめる条件下で培養すること、および該ｈＧＨポリペプチドを精製することを含む、天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドを作製する方法。
【請求項７６】
ｈＧＨポリペプチド中のいずれか１つ以上の自然発生アミノ酸を１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸で置換することを含む、ｈＧＨポリペプチドの血清半減期または循環時間を増加させる方法。
【請求項７７】
配列番号２１または配列番号２２に示す配列を有し、セレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされ、少なくとも１つの天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド。
【請求項７８】
天然にはコードされないアミノ酸が、リンカー、ポリマー、水溶性ポリマーまたは生物活性分子に連結されている、請求項７７に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項７９】
水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）部分を含む、請求項７８に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項８０】
天然にはコードされないアミノ酸が、配列番号２からの位置１より前（すなわち、Ｎ末端位置）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端位置）およびこれらのあらゆる組合せから成る群より選択される残基の位置で置換されている、請求項７７に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項８１】
天然にはコードされないアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を含む、請求項７７に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項８２】
ポリ（エチレングリコール）部分が、約０．１ｋＤａと約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項７９に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項８３】
ポリ（エチレングリコール）部分が、分枝またはマルチアームポリマーである、請求項７９に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項８４】
ポリ（エチレングリコール）部分が、約１ｋＤａと約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項８３に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項８５】
請求項７７に記載のｈＧＨポリペプチドおよび医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項８６】
組換え宿主細胞おけるｈＧＨポリペプチドの発現を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含むｈＧＨポリペプチド。
【請求項８７】
アミノ酸置換Ｇ１２０Ａを含む、請求項８６に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項８８】
共有結合によってｈＧＨポリペプチドの単一のアミノ酸に連結されている水溶性ポリマーを含むｈＧＨポリペプチド。
【請求項８９】
水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）部分を含む、請求項８８に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項９０】
水溶性ポリマーに共有結合で連結されているアミノ酸が、天然にはコードされないアミノ酸である、請求項８８に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項９１】
天然にはコードされないアミノ酸が、配列番号２に対応する基３５、９２、１４３および１４５から成る群より選択される位置で置換されている、請求項９０に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項９２】
前記天然にはコードされないアミノ酸が、ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている、請求項１１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項９３】
アミノ酸置換Ｇ１２０Ａをさらに含む、請求項９１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項９４】
少なくとも１つのリンカー、ポリマーまたは生物活性分子を含むｈＧＨポリペプチドであって、前記リンカー、ポリマーまたは生物活性分子が、該ポリペプチドにリボソームにより組み込まれている天然にはコードされないアミノ酸の官能基により該ポリペプチドに取り付けられているｈＧＨポリペプチド。
【請求項９５】
モノＰＥＧ化されている、請求項９４に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項９６】
１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸に取り付けられているリンカー、ポリマーまたは生物活性分子を含み、前記天然にはコードされないアミノ酸が、予め選択された部位でこのポリペプチドにリボソームにより組み込まれているｈＧＨポリペプチド。
【請求項９７】
ｈＧＨポリペプチドが１つの前記リンカー、ポリマーまたは生物活性分子を含む、請求項９６に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項９８】
ｈＧＨポリペプチドが、該ｈＧＨポリペプチドの免疫原性を調節する１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含む、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項９９】
ｈＧＨポリペプチドが、該ｈＧＨポリペプチドの血清半減期または循環時間を調節する１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含む、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項１００】
ｈＧＨポリペプチド中のいずれか１つ以上の自然発生アミノ酸を１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸で置換することを含む、ｈＧＨポリペプチドの免疫原性を調節する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の記載）
本出願は、２００４年２月２日出願の米国特許仮出願番号６０／５４１，５２８、２００４年６月１８日出願の米国特許仮出願番号６０／５８１，３１４、２００４年６月１８日出願の米国特許仮出願番号６０／５８１，１７５、２００４年６月１８日出願の米国特許仮出願番号６０／５８０，８８５、および２００４年１２月２２日出願の６０／６３８，６１６と題する米国特許開出願への優先権を主張するものである。これらの明細書は、これら全文、本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、少なくとも１つの天然にはコードされないアミノ酸で修飾された成長ホルモンポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
成長ホルモン（ＧＨ）超遺伝子ファミリー（Ｂａｚａｎ，Ｆ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １１：３５０−３５４（１９９１）；Ｍｏｔｔ，Ｈ．Ｒ．およびＣａｍｐｂｅｌｌ，ｌ．Ｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：１１４−  １２１（１９９５）；Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ，Ｏ．およびＩｈｌｅ，Ｊ．Ｎ．（１９９６）ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ  ＢＹ  ＴＨＥ  ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ  ＣＹＴＯＫＩＮＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ）は、類似した構造特性を有する一組のタンパク質を表す。タンパク質のこのファミリーの各メンバーは、４つのへリックスバンドルを含む。この一般構造を図１に示す。まだ同定されていないこのファミリーのさらに多くのメンバーが存在するが、このファミリーの一部のメンバーとしては、次のものが挙げられる：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、白血病抑制因子、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、オメガインターフェロン、タウインターフェロン、イプシロンインターフェロン、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）およびカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）（「ＧＨ超遺伝子ファミリー」）。ＧＨ超遺伝子ファミリーのメンバーは、限られたアミノ酸またはＤＮＡ配列同一性を一般に有するという事実にもかかわらず、類似した二次および三次構造を有する。これらの共有される構造的特徴により、この遺伝子ファミリーの新たなメンバーを容易に同定することができる。ファミリーメンバーｈＧＨ、ＥＰＯ、ＩＦＮα−２、およびＧ−ＣＳＦの一般構造を図２、３、４および５にそれぞれ示す。
【０００４】
ＧＨ超遺伝子ファミリーの１つのメンバーは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である。ヒト成長ホルモンは、正常なヒトの成長および発育の調節の多くに関与している。この自然発生１本鎖下垂体ホルモンは、１９１のアミノ酸残基から成り、約２２ｋＤａの分子量を有する。ｈＧＨは、数ある中でも線形成長（体形成）、乳汁分泌、マクロファージの活性化、インスリン様作用および糖尿病誘発作用をはじめとする、多数の生物学的作用を示す（Ｃｈａｗｌａ，Ｒ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．３４：５１９−５４７（１９８３）；Ｉｓａｋｓｓｏｎ，Ｏ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４７：４８３−４９９（１９８５）；Ｈｕｇｈｅｓ，Ｊ．およびＦｒｉｅｓｅｎ、Ｈ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４７：４６９−４８２（１９８５））。
【０００５】
ｈＧＨの構造は、周知であり（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４−５４８（１９７９））、ｈＧＨの三次元構造は、Ｘ線結晶学により解明されている（ｄｅ  Ｖｏｓ，Ａら、Ｓｃｉｅｃｅ  ２５５：３０６−３１２（１９９２））。このタンパク質は、Ｎ末端から始まってＡからＤと名づけられた４つの両親媒性アルファへリックスバンドルを含み、これらのバンドルが、ループにより継ぎ合わされている緻密球形構造を有する。ｈＧＨは、４つのシステイン残基も含有し、これらは、２つの分子間ジスルフィド結合に関与する：Ｃ５３は、Ｃ１６５と対になり、Ｃ１８２が、Ｃ１８９と対になる。このホルモンは、グリコシル化されず、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における分泌形で発現された（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．ら、Ｇｅｎｅ  ５５：１８９−１９６（１９８７））。
【０００６】
ｈＧＨの多数の自然発生突然変異体が、同定されている。これらには、ｈＧＨ−Ｖ（Ｓｅｅｂｅｒｇ，ＤＮＡ  １：２３９（１９８２）；米国特許第４，４４６，２３５号、同４，６７０，３９３号および第４，６６５，１８０号；これらは、本明細書に参照により組み込まれている）およびｈＧＨの残基３２から４６の欠失を有する２０−ｋＤａ  ｈＧＨ（Ｋｏｓｔｙｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９２５：３１４（１９８７）；Ｌｅｗｉｓ，Ｕ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５３：２６７９−２６８７（１９７８））が挙げられる。加えて、後転写、後翻訳、分泌、代謝プロセッシングおよび他の生理プロセスから生じる非常に多数のｈＧＨ変異体が、報告されている（Ｂａｕｍａｎｎ，Ｇ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １２：４２４（１９９１））。
【０００７】
ｈＧＨの生物学的作用は、特異的細胞受容体とのこの相互作用に由来する。ホルモンは、胎盤性ラクトゲンおよびプロラクチンを含む相同タンパク質のファミリーのメンバーである。しかし、ｈＧＨは、このファミリーメンバーの間では、広範な種特異性を示す点、およびクローニングされた体細胞原性受容体（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：５３７−５４３（１９８７））またはプロラクチン受容体（Ｂｏｕｔｉｎ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ  ５３：６９−７７（１９８８））のいずれかに結合する点で珍しい。構造および生化学の研究を基に、乳腺刺激性および体細胞原性結合ドメインについての官能性マップが報告されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．およびＷｅｌｌｓ，Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：３４０７（１９９１））。ｈＧＨ受容体は、造血性／サイトカイン／成長因子受容体ファミリーの１メンバーであり、このファミリーは、幾つかの他の成長因子受容体、例えばインターロイキン（ＩＬ）−３、−４および−６受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体、ならびにＧ−ＣＳＦ受容体を含む。Ｂａｚａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：６９３４−６９３８（１９９０）参照。前記サイトカイン受容体ファミリーのメンバーは、４つの保存システイン残基と、膜貫通領域のすぐ外側に位置するトリプトファン−セリン−Ｘ−トリプトファン−セリンモチーフを含有する。保存配列は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与すると考えられる。例えば、Ｃｈｉｂａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８４：４８５−４９０（１９９２）参照。ｈＧＨとこの受容体の細胞外ドメイン（ｈＧＨｂｐ）の間の相互作用は、中でも、最もよく理解されているホルモン−受容体相互作用である。高分解能Ｘ線結晶学データ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：８２１−８２５（１９９１））により、ｈＧＨは、２つの受容体結合部位を有し、２つの受容体分子にこれらの分子上の別個の部位を利用して逐次的に結合することが証明された。これらの２つの受容体結合部位は、Ｓｉｔｅ  ＩおよびＳｉｔｅ  ＩＩと呼ばれる。Ｓｉｔｅ  Ｉは、へリックスＤのカルボキシ末端、へリックスＡの一部およびこのＡ−Ｂループの一部を含み、これに対してＳｉｔｅ  ＩＩは、へリックスＡのアミノ末端領域およびへリックスＣの一部を包含する。ＧＨのこの受容体への結合は、最初にＳｉｔｅ  Ｉから始まって逐次的に発生する。この後、Ｓｉｔｅ  ＩＩが、第二のＧＨ受容体に係合し、この結果、受容体の二量体化と、ホルモンに対する細胞応答を導く細胞内シグナル伝達経路の活性化とが生じる。Ｇ１２０Ｒ置換がＳｉｔｅ  ＩＩに導入されたｈＧＨ突然変異タンパク質は、単一のｈＧＨ受容体に結合することができるが、２つの受容体を二量体化することはできない。この突然変異タンパク質は、おそらく、細胞内シグナル伝達経路を活性化することなく受容体部位を占有することにより、インビトロでｈＧＨ拮抗薬として作用する（Ｆｕｈ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１６７７−１６８０（１９９２））。
【０００８】
組換えｈＧＨは、治療薬として用いられており、多数の適応症の治療用に承認されている。ｈＧＨ欠損は、例えば小人症を導き、これは、このホルモンの外因性投与により、１０年より長きにわたりうまく治療されている。ｈＧＨ欠損に加えて、ｈＧＨは、腎不全（子供におけるもの）、ターナー症候群、およびＡＩＤＳ患者の悪液質の治療用にも承認されている。最近、米国食品医薬局（ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ））は、非ＧＨ依存性低身長の治療用にｈＧＨを承認した。現在、ｈＧＨは、老化、老人の虚弱、短小腸症候群、およびうっ血性心不全の治療用にも調査されている。
【０００９】
組換えｈＧＨは、１日１回の注射用製品として現在販売されており、５つの主要製品が、現在市販されている：Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）およびＳａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ）。しかし、治療薬としての成長ホルモンの使用の有意な問題は、このタンパク質のインビボ半減期が短く、このため、有効性を最大にするには毎日、皮下注射により投与しなければならないということである（ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８１：１８０６−１８０９（１９９６））。相当な努力が、生産コストを下げること、患者にとって投与がより容易になること、効力および安全性プロフィールを改善すること、ならびに競争できる利点をもたらす他の特性を生じさせることによる、ｈＧＨ作動薬および拮抗薬の投与改善手段に向けられている。例えば、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＡｌｋｅｒｍｅｓは、以前、小児の成長ホルモン欠損症用のＮｕｔｒｏｐｉｎ  Ｄｅｐｏｔ（商標）、ｈＧＨのデポー製剤を販売していた。このデポーは、より少ない投薬頻度（１日１回ではなく、２から３週間に１回）を可能にするが、望ましくない副作用、例えば、バイオアベイラビリティの低下および注射部位の痛みも随伴し、２００４年に販売が中止された。もう一つの製品、Ｐｅｇｖｉｓｏｍａｎｔ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）も、最近、ＦＤＡにより承認された。Ｐｅｇｖｉｓｏｍａｎｔ（商標）は、先端巨大症の治療に指示される高選択的成長ホルモン受容体拮抗薬として機能する、ｈＧＨの遺伝子操作類似体である（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｌｙら、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３５８：１７５４−１７５９（２００１））。Ｐｅｇｖｉｓｏｍａｎｔ（商標）の幾つかのアミノ酸残基は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーで誘導体化されているが、この製品は、やはり１日１回投与される。これは、この薬学的特性が最適でないことを示唆している。ＰＥＧ化およびデポー製剤に加えて、ｈＧＨの吸入および経口剤形をはじめとする他の投与経路が、初期前臨床および臨床開発中であり、ＦＤＡからの承認を受けたものは未だない。従って、成長ホルモン活性を示すが、より長い血清半減期および従ってより最適な治療レベルのｈＧＨおよび治療的半減期の増加ももたらすポリペプチドが、必要とされている。
【００１０】
親水性ポリマーポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧと略記する）の共有結合による取り付けは、水溶性、バイオアベイラビリティを増大させる、血清半減期を増加させる、治療的半減期を増加させる、免疫原性を調節する、生物活性を調節する、またはタンパク質、ペプチドおよび特に疎水性分子をはじめとする多数の生物活性分子の循環時間を延長する１つの方法である。ＰＥＧは、医薬において、人工インプラントに対して、おならびに生体適合性、毒性欠如および免疫原性欠如が重要となる他の用途において、広範に使用されている。所望のＰＥＧ特性を最大にするために、生物活性分子に取り付けられるＰＥＧポリマー（１つまたは複数）の全分子量および水和状態は、ＰＥＧポリマー取り付けに一般に付随する有利な特徴、例えば水溶性および循環半減期の増加をもたらすために十分な高さでなければならないが、この親分子の生物活性に悪影響を及ぼすほどの高さであってはらない。
【００１１】
ＰＥＧ誘導体は、反応性化学官能基、例えば、リシン、システインおよびヒスチジン残基、このＮ末端および炭水化物部分により生物活性分子に連結されることが多い。タンパク質および他の分子が有するポリマーの取り付けに利用できる反応性部位の数は限られている。多くの場合、ポリマー取り付けによる修飾に最も適する部位は、受容体結合に有意な役割を果たし、この分子の生物活性の維持に必要である。結果として、生物活性分子上のこうした反応性部位へのポリマー鎖の無差別な取り付けは、多くの場合、このポリマー変性分子の生物活性の有意な減少または全損失さえも導く。Ｒ．Ｃｌａｒｋら、（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２１９６９−２１９７７。ターゲット分子に所望の利点を付与するために十分なポリマー分子量を有するコンジュゲートを形成するための先行アプローチは、この分子への多数のポリマーアームの無作為な取り付けを一般に含んでおり、この結果、親分子の生物活性が減少するまたは全て損われる危険性さえ増加させるものであった。
【００１２】
タンパク質にＰＥＧ誘導体を取り付けるための座を形成する反応性部位は、このタンパク質の構造に左右される。タンパク質（酵素を含む）は、一般構造Ｈ２Ｎ−−ＣＨＲ−−ＣＯＯＨを有するアルファ−アミノ酸の様々な配列から成る。１つのアミノ酸のアルファアミノ部分（Ｈ２Ｎ−−）が、隣接するアミノ酸のカルボキシル部分（−−ＣＯＯＨ）につながってアミドリンケージを形成し、これは、−−（ＮＨ−−ＣＨＲ−−ＣＯ）ｎ−−（この式中、下付き文字「ｎ」は、数百または数千に相当し得る）と表すことができる。Ｒによって表されるフラグメントは、タンパク質の生物活性のための、およびＰＥＧ誘導体の取り付けのための反応性部位を含有しうる。
【００１３】
例えば、アミノ酸リシンの場合、イプシロン位ならびにアルファ位に−−ＮＨ２部分が存在する。このイプシロン−−ＮＨ２は、塩基性ｐＨの条件下では自由に反応できる。ＰＥＧでのタンパク質誘導体化の分野における技術の多くが、タンパク質中に存在するリシン残基のイプシロン−−ＮＨ２部分に取り付けるためのＰＥＧ誘導体の開発に向けられてきた。「高度なＰＥＧ化のためのポリエチレングリコールおよび誘導体（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）」，Ｎｅｋｔａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃａｔａｌｏｇ，２００３，ｐｐ．１−１７。しかし、これらのＰＥＧ誘導体のすべてが、タンパク質の表面に、多くの場合、非常に多数のリシン残基が存在する中、選択的に取り付けることができないという共通の制限を有する。これは、リシン残基が、例えば、酵素活性部位に存在するタンパク質活性に重要である事例、またはリシン残基がこのタンパク質と他の生体分子の相互作用の媒介に一定の役割を果たす場合、例えば受容体結合部位の場合、有意な制限となり得る。
【００１４】
既存のタンパク質ＰＥＧ化方法の第二の、同様に重要な複雑化要因は、ＰＥＧ誘導体が、所望のもの以外の残基との望ましくない副反応を受け得ることである。ヒスチジンは、構造的には−−Ｎ（Ｈ）−−と表される反応性イミノ部分を含有するが、イプシロン−−ＮＨ２と反応する多くの化学反応性種も、−−Ｎ（Ｈ）−−と反応し得る。同様に、アミノ酸システインの側鎖は、構造的には−ＳＨと表される遊離スルフヒドリル基を有する。一部の事例では、リシンのイプシロン−−ＮＨ２基に向けられたＰＥＧ誘導体が、システイン、ヒスチジンまたは他の残基とも反応する。これは、ＰＥＧ誘導体化生物活性分子の複合、異種混合物、およびターゲットとなる生物活性分子の活性を壊す危険性を生じさせることがある。十分に定義されてもおり予測可能でもあるタンパク質表面上の特異的部位における生物活性分子への１つ以上のＰＥＧポリマーの選択的カップリングを可能にする、このタンパク質の中の単一の部位に化学官能基を導入することができる、ＰＥＧ誘導体の開発が望まれるであろう。
【００１５】
リシン残基に加えて、当該技術分野では、システイン、ヒスチジンおよびこのＮ末端を含む他のアミノ酸側鎖をターゲットにする活性化ＰＥＧ試薬の開発に、相当な努力が向けられてきた。例えば、米国特許第６，６１０，２８１号（これは、本明細書に参照により組み込まれている）、および「高度なＰＥＧ化のためのポリエチレングリコールおよび誘導体（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）」，Ｎｅｋｔａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃａｔａｌｏｇ，２００３，ｐｐ．１−１７参照。部位特異的突然変異誘発および当該技術分野において公知である他の技法を使用して、システイン残基をタンパク質の構造に部位選択的に導入することができ、結果として生じた遊離スルフヒドリル部分を、チオール反応性官能基を有するＰＥＧ誘導体と反応させることができる。しかし、このアプローチは、遊離スルフヒドリル基の導入により、結果として生じるタンパク質の発現、フォールディングおよび安定性が複雑化し得る点で、複雑である。従って、タンパク質への１つ以上ＰＥＧポリマーの選択的カップリングを可能にする一方で、それと同時に、スルフヒドリルおよびタンパク質において一般に見出せる他の化学官能基と相溶性である（すなわち、これらとの望ましくない副反応に関与しない）生物活性分子に、化学官能基を導入する手段を有することが望まれるであろう。
【００１６】
当該技術分野のサンプリングからわかるように、タンパク質の側鎖、特に、リシンアミノ酸側鎖上の−−ＮＨ２部分およびシステイン側鎖上の−ＳＨ部分に取り付けるために開発されたこれらの誘導体の多くは、これらの合成および使用に問題があることが立証されている。加水分解され、この結果、分解、減成されるか、水性環境の中、例えば血流中で別様に不安定である、タンパク質との不安定なリンケージを形成するものもある。より安定なリンケージを形成するが、このリンケージ形成前に加水分解を受けるものもある。これは、ＰＥＧ誘導体上の反応性基を不活性化させた後、このタンパク質を取り付けることができることを意味する。多少毒性であり、このためインビボでの使用にあまり適さないものもある。反応が遅すぎて、事実上、有用でないものもある。タンパク質の活性に責任を負う部位に取り付けることが、このタンパク質活性を失わせることもある。これらが付く部位が特異的でないものもあり、これらも望ましい活性を失い、結果の再現性をなくすことになり得る。ポリ（エチレングリコール）部分でのタンパク質の修飾に付随する問題を克服するために、より安定なＰＥＧ誘導体（例えば米国特許第６，６０２，４９８号、これは本明細書に参照により組み込まれている）または分子および表面上のチオール部分と選択的に反応するＰＥＧ誘導体（例えば米国特許第６，６１０，２８１号、これは本明細書に参照により組み込まれている）が、開発された。選択的に反応して安定な化学結合を形成するように求められるまでは生理環境で化学的に不活性であるＰＥＧ誘導体が、当該技術分野において明確に必要とされている。
【００１７】
最近、タンパク質の部位特異的修飾に付随する制限の多くを克服する見込みがある、タンパク質科学に関する全く新しい技術が報告された。具体的には、新たな成分が、原核生物大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、Ｗａｎｇら、（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００）および真核生物サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））（例えば、Ｃｈｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−７（２００３））のタンパク質生合成機構に追加され、それにより、遺伝的にコードされないアミノ酸をインビボでタンパク質に組み込むことが可能になった。この方法論を用いて、光親和性ラベルおよび光異性化性アミノ酸、ケトアミノ酸およびグリコシル化アミノ酸をはじめとする、新規化学的、物理的および生物学的特性を有する多数の新たなアミノ酸が、アンバーコドン、ＴＡＧに応答して、大腸菌および酵母菌中のタンパク質に、効率的に、および高忠実度で組み込まれた。例えば、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら、（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら、（２００２），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４；およびＬ．Ｗａｎｇ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０参照。タンパク質中では見出せない、２０の共通の、遺伝的にコードされたアミノ酸において見出される官能基のすべてに対して化学的に不活性である；および効率的および選択的に反応させて安定な二重結合を形成するために使用することができる化学官能基、例えばケトン基、アルキン基およびアジド部分を、選択的および日常的に導入することが可能であることが、これらの研究により実証された。
【００１８】
遺伝的にはコードされないアミノ酸をタンパク質に組み込むことができることにより、自然発生官能基、例えば、リシンのイプシロン−ＮＨ２、システインのスルフヒドリル−ＳＨ、ヒスチジンのイミノ基などに対する価値のある代替を提供することができる化学官能基の導入が可能となる。一定の化学官能基は、２０の共通の、遺伝的にコードされるアミノ酸において見出される官能基に対して不活性であるが、明らかにおよび効率的に反応して、安定な結合を形成することがわかっている。例えば、アジドおよびアセチレン基は、触媒量の銅の存在下、水性条件で、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化を受けることが、当該技術分野において公知である。例えば、Ｔｏｒｎｏｅら、（２００２）Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４；およびＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９参照。例えば、タンパク質構造へのアジド部分の導入により、タンパク質において見出されるアミン、スルフヒドリル、カルボン酸、ヒドロキシル基に対して化学的に不活性であるが、アセチレン部分と円滑におよび効率的に反応して付加環化生成物を形成することもできる官能基を組み込むことができる。重要なこととして、アセチレン部分の不在下、アジドは、他のタンパク質側鎖の存在下および生理条件下で、化学的に不活性および非反応性のままである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、数あるなかでも、ＧＨポリペプチドの活性および生産に関連した問題に対処し、ならびに改善された治療的半減期などの改善された生物学的または薬理学的特性を有するｈＧＨポリペプチドの生産にも対処する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の簡単な要約）
本発明は、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸を含む、ｈＧＨポリペプチドをはじめとするＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーを提供する。
【００２１】
一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチドは、１つ以上の後翻訳修飾を含む。一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチドは、リンカー、ポリマーまたは生物活性分子に連結されている。一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチドは、二官能性ポリマー、二官能性リンカー、または少なくとも１つの追加のｈＧＨポリペプチドに連結されている。
【００２２】
一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。一部の実施態様において、前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。一部の実施態様において、前記ポリ（エチレングリコール）分子は、二官能性ポリマーである。一部の実施態様において、前記二官能性ポリマーは、第二のポリペプチドに連結されている。一部の実施態様において、前記第二ポリペプチドは、ｈＧＨポリペプチドである。
【００２３】
一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチドは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む水溶性ポリマーに連結されている少なくとも２つのアミノ酸を含む。一部の実施態様において、少なくとも１つのアミノ酸は、天然にはコードされないアミノ酸である。
【００２４】
ｈＧＨの領域は、次のように説明することができる（この場合、ｈＧＨのアミノ酸位置は、真ん中の列に示す）：
【００２５】
【表１】
2007519420.tif 000002
【００２６】
一部の実施態様では、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸が、ｈＧＨの二次構造に対応する次の領域（下記のとおり）のうちの１つ以上の領域内のいずれかの位置で組み込まれる：配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸からの、１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａヘリックス）、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）。他の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸からの残基：１−５、３２−４６、９７−１０５、１３２−１４９および１８４−１９１から成る群より選択される位置で置換される。一部の実施態様において、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸は、ｈＧＨにおける次の位置の１つ以上において組み込まれる：位置１の前（すなわち、Ｎ末端位置）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、カルボキシル末端位置）（配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。
【００２７】
一部の実施態様において、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸は、次の位置：２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６、および１８７（配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）の１つ以上で置換される。
【００２８】
一部の実施態様において、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸は、次の位置：２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６、および１８７（配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）の１つ以上で置換される。
【００２９】
一部の実施態様において、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸は、次の位置：３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５、および１５５（配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）の１つ以上で置換される。
【００３０】
一部の実施態様において、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸は、次の位置：３０、７４、１０３（配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）の１つ以上で置換される。一部の実施態様において、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸は、次の位置：３５、９２、１４３、１４５（配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）の１つ以上で置換される。
【００３１】
一部の実施態様において、これらの位置（下記の位置を含むが、これらに限定されない）の１つ以上における自然には発生しないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結される：位置１の前（すなわち、Ｎ末端位置）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、カルボキシ末端位置）（配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。一部の実施態様において、これらの位置：３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）の１つ以上における自然には発生しないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結される。一部の実施態様において、これらの位置：３５、９２、１４３、１４５（配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）の１つ以上における自然には発生しないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結される。
【００３２】
ヒトＧＨ拮抗薬としては、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、および１２７における置換もしくは位置１（すなわちＮ末端）における付加またはこれらのあらゆる組合せ（配列番号２、または配列番号１、３もしくは他のいずれかのＧＨ配列の対応するアミノ酸）を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
一部の実施態様において、本ｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨポリペプチド受容体に対するこのｈＧＨポリペプチドの親和性を調節する置換、付加または欠失を含む。一部の実施態様において、本ｈＧＨポリペプチドは、このｈＧＨポリペプチドの安定性を増大させる置換、付加または欠失を含む。一部の実施態様において、本ｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨ配列番号２におけるＦ１０Ａ、Ｆ１０Ｈ、Ｆ１０Ｉ；Ｍ１４Ｗ、Ｍ１４Ｑ、Ｍ１４Ｇ；Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ；Ｇ１２０Ａ；Ｒ１６７Ｎ；Ｄ１７１Ｓ；Ｅ１７４Ｓ；Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔまたはこれらのあらゆる組合せから成る群より選択されるアミノ酸置換を含む。一部の実施態様において、本ｈＧＨポリペプチドは、このｈＧＨポリペプチドの免疫原性を調節する置換、付加または欠失を含む。一部の実施態様において、本ｈＧＨポリペプチドは、このｈＧＨポリペプチドの血清半減期または循環時間を調節する置換、付加または欠失を含む。
【００３４】
一部の実施態様において、本ｈＧＨポリペプチドは、このｈＧＨポリペプチドの水溶性を増大させる置換、付加または欠失を含む。一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチドは、宿主細胞において生産されたこのｈＧＨポリペプチドの溶解性を増大させる置換、付加または欠失を含む。一部の実施態様において、本ｈＧＨポリペプチドは、宿主細胞におけるこのｈＧＨポリペプチドの発現またはインビトロで合成されるこのｈＧＨポリペプチドの発現を増加させる置換、付加または欠失を含む。一部の実施態様において、本ｈＧＨポリペプチドは、アミノ酸置換Ｇ１２０Ａを含む。この置換を含むｈＧＨポリペプチドは、作動薬活性を保持し、宿主細胞における発現レベルを維持または改善する。一部の実施態様において、本ｈＧＨポリペプチドは、このｈＧＨポリペプチドのプロテアーゼ耐性を増大させる置換、付加または欠失を含む。
【００３５】
一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、自然発生アミノ酸での置換であってもよいし、自然には発生しないアミノ酸での置換であってもよいが、但し、少なくとも１つの置換は、天然にはコードされないアミノ酸での置換であることを条件とする。
【００３６】
一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を含む。
【００３７】
一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、カルボニル基を含む。一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、構造：
【００３８】
【化４】
2007519420.tif 000003
（この場合、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキルおよび置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはアミノ末端修飾基であり；ならびにＲ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である）
を有する。
【００３９】
一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、アミノオキシ基を含む。一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、ヒドラジド基を含む。一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、ヒドラジン基を含む。一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸残基は、セミカルバジド基を含む。
【００４０】
一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸残基は、アジド基を含む。一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、構造：
【００４１】
【化５】
2007519420.tif 000004
（この場合、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールであるか、存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、存在せず；ｍは、０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはアミノ末端修飾基であり；ならびにＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である）
を有する。
【００４２】
一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、アルキン基を含む。一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、構造：
【００４３】
【化６】
2007519420.tif 000005
（この場合、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、存在せず；ｍは、０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはアミノ末端修飾基であり；ならびにＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である）
を有する。
【００４４】
一部の実施態様において、前記ポリペプチドは、ｈＧＨポリペプチド作動薬、部分作動薬、拮抗薬、部分拮抗薬、または逆作動薬である。一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチド作動薬、部分作動薬、拮抗薬、部分拮抗薬、または逆作動薬は、水溶性ポリマーに連結された天然にはコードされないアミノ酸を含む。一部の実施態様において、前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチド作動薬、部分作動薬、拮抗薬、部分拮抗薬、または逆作動薬は、天然にはコードされないアミノ酸、および１つ以上の後翻訳修飾、リンカー、ポリマーまたは生物活性分子を含む。一部の実施態様において、前記水溶性ポリマーに連結された天然にはコードされないアミノ酸は、ｈＧＨポリペプチドのＳｉｔｅ  ＩＩ領域（ＡＣへリックスバンドル面、へリックスＡのアミノ末端領域、およびヘリックスＣの一部を包含する、タンパク質の領域）内に存在する。一部の実施態様において、前記水溶性ポリマーに連結された天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、このｈＧＨポリペプチド拮抗薬が第二のｈＧＨポリペプチド受容体分子に結合することを防止することにより、このｈＧＨポリペプチド受容体の二量体化を防止する。一部の実施態様では、グリシン以外のアミノ酸により、配列番号２（ｈＧＨ）におけるＧ１２０が置換される。一部の実施態様では、アルギンにより、配列番号２におけるＧ１２０が置換される。一部の実施態様では、天然にはコードされないアミノ酸により、配列番号２におけるＧ１２０が置換される。
【００４５】
本発明は、少なくとも１つのセレクターコドンを含むポリヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件下で配列番号２１または２２にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸も提供する。一部の実施態様において、前記セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、および四塩基コドンから成る群より選択される。
【００４６】
本発明は、水溶性ポリマーに連結されているｈＧＨポリペプチドを作製する方法も提供する。一部の実施態様において、この方法は、天然にはコードされないアミノ酸を含む単離されたｈＧＨポリペプチドを、この天然にはコードされないアミノ酸と反応する部分を含む水溶性ポリマーと接触させることを含む。一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチドに組み込まれている前記天然にはコードされないアミノ酸は、２０の共通アミノ酸のいずれに対しても別様に非反応性である水溶性ポリマーに対して反応性である。一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチドに組み込まれている天然にはコードされないアミノ酸は、２０の共通アミノ酸のいずれに対しても別様に非反応性であるリンカー、ポリマーまたは生物活性分子に対して反応性である。
【００４７】
一部の実施態様において、前記水溶性ポリマーに連結されているｈＧＨポリペプチドは、カルボニル含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドと、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド基を含むポリ（エチレングリコール）分子とを反応させることにより作製される。一部の実施態様において、前記アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド基は、アミドリンケージにより前記ポリ（エチレングリコール）分子に連結される。
【００４８】
一部の実施態様において、前記水溶性ポリマーに連結されているｈＧＨポリペプチドは、カルボニル基を含むポリ（エチレングリコール）分子と、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド基を含む天然にはコードされないアミノ酸を含むポリペプチドとを反応させることにより作製される。
【００４９】
一部の実施態様において、前記水溶性ポリマーに連結されているｈＧＨポリペプチドは、アルキン含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドとアジド部分を含むポリ（エチレングリコール）分子とを反応させることにより作製される。一部の実施態様において、前記アジドまたはアルキン基は、アミドリンケージにより前記ポリ（エチレングリコール）分子に連結される。
【００５０】
一部の実施態様において、前記水溶性ポリマーに連結されているｈＧＨポリペプチドは、アジド含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドとアルキン部分を含むポリ（エチレングリコール）分子とを反応させることにより作製される。一部の実施態様において、前記アジドまたはアルキン基は、アミドリンケージにより前記ポリ（エチレングリコール）分子に連結される。
【００５１】
一部の実施態様において、前記ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１ｋＤａと約１００ｋＤａの間の分子量を有する。一部の実施態様において、前記ポリ（エチレングリコール）分子は、０．１ｋＤａと５０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００５２】
一部の実施態様において、前記ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝ポリマーである。一部の実施態様において、前記ポリ（エチレングリコール）分枝ポリマーの各枝は、１ｋＤａと１００ｋＤａの間、または１ｋＤａと５０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００５３】
一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチドに連結されている水溶性ポリマーは、ポリアルキレングリコール部分を含む。一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチドに組み込まれている天然にはコードされないアミノ酸残基は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を含む。一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチドに組み込まれている天然にはコードされないアミノ酸残基は、カルボニル部分を含み、前記水溶性ポリマーは、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基またはセミカルバジド基を含む。一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチドに組み込まれている天然にはコードされないアミノ酸残基は、アルキン部分を含み、前記水溶性ポリマーは、アジド部分を含む。一部の実施態様において、前記ｈＧＨポリペプチドに組み込まれている天然にはコードされないアミノ酸残基は、アジド部分を含み、前記水溶性ポリマーは、アルキン部分を含む。
【００５４】
本発明は、天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドおよび医薬的に許容される担体を含む組成物も提供する。一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。
【００５５】
本発明は、セレクターコドンを含むｈＧＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞も提供する。一部の実施態様において、前記細胞は、天然にはコードされないアミノ酸をｈＧＨポリペプチドに置換するために、直交性ＲＮＡシンセターゼおよび／または直交性ｔＲＮＡを含む。
【００５６】
本発明は、天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドを作製する方法も提供する。一部の実施態様において、この方法は、ｈＧＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（単数または複数）、直交性ＲＮＡシンセターゼおよび／または直交性ｔＲＮＡを含む細胞を、このｈＧＨポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養すること；ならびにこの細胞および／または培地からこのｈＧＨポリペプチドを精製することを含む。
【００５７】
本発明は、ｈＧＨポリペプチドの治療的半減期、血清半減期または循環時間を増加させる方法も提供する。本発明は、ｈＧＨポリペプチドの免疫原性を調節する方法も提供する。一部の実施態様において、この方法は、自然発生ｈＧＨポリペプチドにおけるいずれか１つもしくはそれ以上のアミノ酸を天然にはコードされないアミノ酸で置換すること、および／またはこのｈＧＨポリペプチドをリンカー、ポリマー、水溶性ポリマーもしくは生物活性分子に連結させることを含む。
【００５８】
本発明は、本発明のｈＧＨ分子の有効量でこうした治療が必要な患者を治療する方法も提供する。一部の実施態様において、この方法は、天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドおよび医薬的に許容される担体を含む医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む。一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。
【００５９】
本発明は、少なくとも１つのアミノ酸が、天然にはコードされないアミノ酸により置換されていることを除き、配列番号１、２、３に示す配列または他のあらゆるＧＨポリペプチド配列を含むｈＧＨポリペプチドも提供する。一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。一部の実施態様において、前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む。一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、配列番号３（ｈＧＨ）からの残基１−５、８２−９０、１１７−１３４および１６９−１７６から成る群より選択される位置で置換される。
【００６０】
本発明は、医薬的に許容される担体、および少なくとも１つのアミノ酸が、天然にはコードされないアミノ酸により置換されている、配列番号１、２、３または他のあらゆるＧＨポリペプチド配列を含む、ｈＧＨポリペプチドを含む、医薬組成物も提供する。一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、糖部分を含む。一部の実施態様において、前記水溶性ポリマーは、糖部分により前記ポリペプチドに連結されている。一部の実施態様において、リンカー、ポリマーまたは生物活性分子が、糖部分により前記ｈＧＨポリペプチドに連結されている。
【００６１】
本発明は、共有結合によってこのｈＧＨポリペプチドの単一のアミノ酸に連結されている水溶性ポリマーを含む、ｈＧＨポリペプチドも提供する。一部の実施態様において、前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。一部の実施態様において、前記水溶性ポリマーに共有結合により連結されているアミノ酸は、前記ポリペプチド中に存在する、天然にはコードされないアミノ酸である。一部の実施態様において、天然にはコードされていないアミノ酸は位置３５から１４５で置換される。
【００６２】
本発明は、少なくとも１つのリンカー、ポリマーまたは生物活性分子を含むｈＧＨポリペプチドを提供し、前記リンカー、ポリマーまたは生物活性分子は、前記ポリペプチドにリボソームにより組み込まれた天然にはコードされないアミノ酸の官能基によって、前記ポリペプチドに取り付けられている。一部の実施態様において、前記ポリペプチドは、モノＰＥＧ化されている。本発明は、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸に取り付けられているリンカー、ポリマーまたは生物活性分子を含むｈＧＨポリペプチドも提供し、この場合、前記天然にはコードされないアミノ酸は、予め選択された部位でこのポリペプチドにリボソームにより組み込まれている。
【００６３】
定義
本発明は、本明細書に記載する特定の方法論、プロトコル、細胞系、構築物および試薬に限定されず、それなりに変化し得ることは、理解されるはずである。本明細書において用いる専門用語は、単に特定の実施態様を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するとは解釈されず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることも、理解されるはずである。
【００６４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、この文脈が明確に別様に指示していない限り、言及しているものの複数形を包含する。従って、例えば、「ｈＧＨ」への言及は、１つ以上のこうしたタンパク質への言及であり、当業者に公知であるこの等価物などを包含する。
【００６５】
別様に定義しない限り、本明細書において用いるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書において説明するものと同様または等価のあらゆる方法、装置および材料を、本発明の実施および検査において使用することができるが、好ましい方法、装置および材料をこれから説明する。
【００６６】
本明細書において言及するすべての出版物および特許は、今説明している発明と共に使用されることがある、例えばこれらの出版物に記載されている構築物および方法論を説明および開示するために、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書において論じる出版物は、本出願の出願日より前のこれらの開示についてのみ提供する。本発明者らが、先行発明により、またはあらゆる他の理由のために、こうした開示より前の日付を付ける権利がないものと承認されるものは、本明細書にはない。
【００６７】
用語「実質的に精製された」は、この自然発生環境（すなわち、天然細胞、または組換え生産ｈＧＨポリペプチドの場合には宿主細胞）において見出されるようなタンパク質に、通常、随伴する、またはこれらと相互作用する成分が、実質的にまたは本質的にないであろう、ｈＧＨポリペプチドを指す。細胞材料が実質的にないであろうｈＧＨポリペプチドとしては、（乾燥重量で）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の汚染タンパク質を有する、タンパク質の調製物が挙げられる。ｈＧＨポリペプチドまたはこの変異体が、宿主細胞により組換え生産される場合、このタンパク質は、これらの細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％もしくは約１％またはそれ未満で存在し得る。ｈＧＨポリペプチドまたはこの変異体が、宿主細胞により組換え生産される場合、このタンパク質は、この細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、もしくは約１ｍｇ／Ｌ、またはそれ未満で、培地中に存在し得る。従って、本発明の方法により生産される場合の「実質的に精製された」ｈＧＨポリペプチドは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣおよびキャピラリー電気泳動などの適切な方法により判定して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、とりわけ、少なくとも約７５％、８０％、８５％の純度レベル、さらにとりわけ、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％またはそれ以上の純度レベルを有する。
【００６８】
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入のために使用される方法（例えば、直接取り込み、導入、ｆ−マッチング、または組換え宿主細胞を生じさせることが当該技術分野において公知である他の方法）にかかわらず、外在性ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外在性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えばプラスミドとして維持されることもあり、または宿主ゲノムに組み込まれることもある。
【００６９】
ここで用いる用語「培地（単数または複数）」は、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核生物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、ＣＨＯ細胞または大腸菌はじめとするいずれかの宿主細胞および細胞内容物を支持または含有することができる、あらゆる培養基、溶液、固体、半固体、または剛性支持体を包含する。従って、この用語は、宿主細胞を成長させた培地、例えば、増殖段階前または後、いずれかの培地を含む、ｈＧＨポリペプチドが分泌された培地を包含する。この用語は、ｈＧＨポリペプチドが細胞内で生産される場合、および宿主細胞が溶解または破壊されて、ｈＧＨポリペプチドを放出する場合のような、宿主細胞溶解産物を含有する緩衝液または試薬も包含する。
【００７０】
タンパク質リフォールディングに関してここで用いる「還元剤」は、スルフヒドリル基を還元状態で維持し、分子内または分子間ジスルフィド結合を減少させる、あらゆる化合物または材料と定義する。適する還元剤としては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリトリトール、システイン、システアミン（２−アミノエタンチオール）、および還元グルタチオンが挙げられるが、これらに限定されない。多種多様な還元剤が、本発明の方法および組成物での使用に適することは、通常の当業者には容易にわかる。
【００７１】
タンパク質リフォールディングに関してここで用いる「酸化剤」は、酸化される化合物から電子を除去することができるあらゆる化合物または材料と定義する。適する酸化剤としては、酸化グルタチオン、シスチン、シスタミン、酸化ジチオトレイトール、酸化エリトレイトール、および酸素が挙げられるが、これらに限定されない。多種多様な酸化剤が、本発明の方法および組成物での使用に適することは、通常の当業者には容易にわかる。
【００７２】
ここで用いる「変性作用因子（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」または「変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）」は、タンパク質の可逆的アンフォールディングを生じさせるであろう化合物または材料と定義する。変性作用因子または変性剤の強さは、この特定の変性作用因子または変性剤の特性と濃度の両方により決まるだろう。適する変性作用因子または変性剤は、カオトロープ、界面活性剤、有機溶媒、水混和性溶媒、リン脂質、またはこうした作用因子２つまたはそれ以上の組合せであり得る。適するカオトロープとしては、尿素、グアニジン、およびチオシアン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。有用な界面活性剤としては、強界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムまたはポリオキシエチレンエーテル（例えば、ＴｗｅｅｎもしくはＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、Ｓａｒｋｏｓｙｌ、弱非イオン性界面活性剤（例えば、ジギトニン）、弱カチオン性界面活性剤［例えば、Ｎ−＞２，３−（ジオレイオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム］、弱イオン性界面活性剤（例えば、コール酸ナトリウムもしくはデオキシコール酸ナトリウム）または両性イオン性界面活性剤［スルホベタイン（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）、硫酸３−（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパン（ＣＨＡＰＳ）、およびスルホン酸３−（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパン（ＣＨＡＰＳＯ）を含むが、これらに限定されない］が挙げられるが、これらに限定されない。有機、水混和性溶媒、例えばアセトニトリル、低級アルカノール（とりわけ、Ｃ２−Ｃ４アルカノール、例えば、エタノールもしくはイソプロパノール）または低級アルカンジオール（とりわけ、Ｃ２−Ｃ４アルカンジオール、例えば、エチレン−グリコール）は、変性剤として使用することができる。本発明において有用なリン脂質は、天然リン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルイノシトール、または合成リン脂質誘導体もしくは変異体、例えば、ジヘキサノイルホスファチジルコリンもしくはジヘプタノイルホスファチジルコリンであり得る。
【００７３】
ここで用いる「リフォールディング」は、ジスルフィド結合含有ポリペプチドを、不適切にフォールドされた、またはアンフォールドされた状態から、本来の配座またはジスルフィド結合を基準にして適切にフォールドされた配座に変換する、あらゆるプロセス、反応または方法を記述するものである。
【００７４】
ここで用いる「コフォールディング」は、互いに相互作用する少なくとも２つのポリペプチドを利用し、アンフォールドされたまたは不適切にフォールドされたポリペプチドを本来の適切にフォールドされたポリペプチドに変換させる、リフォールディングプロセス、反応または方法を特に指す。
【００７５】
ここで用いる「成長ホルモン」または「ＧＨ」は、これらの生物活性にかかわらず、およびさらにこれらの合成または製造方法［組換え法（ｃＤＮＡから生産されるものであろうと、ゲノムＤＮＡから生産されるものであろうと、合成ＤＮＡからの生産されるものであろうと、または他の形態の核酸から生産されるものであろうと）、合成法、トランスジェニック法、および遺伝子活性化法を含むが、これらに限定されない］にかかわらず、ヒト成長ホルモンの少なくとも１つの生物活性を有するポリペプチドおよびタンパク質、ならびにＧＨ類似体、ＧＨアイソフォーム、ＧＨ模擬体、ＧＨフラグメント、ハイブリッドＧＨタンパク質、融合タンパク質オリゴマーおよび多量体、相同体、グリコシル化パターン変異体、およびこれらの突然変異タンパク質を包含するものとする。
【００７６】
用語「ｈＧＨポリペプチド」は、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含むｈＧＨポリペプチドを包含する。置換の具体例としては、例えば、天然ｈＧＨの位置４１におけるリシンの置換または位置１７６におけるフェニルアラニンの置換が挙げられる。場合により、この置換は、位置４１での置換であるならば、イソロイシンもしくはアルギニン残基であり得、または位置が１７６であるならば、チロシン残基である。位置Ｆ１０は、例えばＡ、ＨまたはＩで置換することができる。位置Ｍ１４は、例えばＷ、ＱまたはＧで置換することができる。置換の他の具体例としては、
Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ；
Ｒ１６７Ｅ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ；
Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ；
Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ；
Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ａ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ；
Ｆ１０Ｈ、Ｍ１４Ｇ、Ｈ１８Ｎ、Ｈ２１Ｎ；
Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ａ、Ｔ１７５Ｔ、Ｉ１７９Ｔ；または
Ｆ１０Ｉ、Ｍ１４Ｑ、Ｈ１８Ｅ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ｓ、Ｉ１７９Ｔ
を含む（しかし、これらに限定されない）、いずれかの置換またはこれらの組合せが挙げられる。例えば、米国特許第６，１４３，５２３号参照（これは、本明細書に参照により組み込まれている）。
【００７７】
作動薬活性を増大させる置換、プロテアーゼ耐性を増大させる置換、ポリペプチドを拮抗薬に変換する置換などを含む、自然発生ｈＧＨの多種多様なアミノ酸位置における置換の具体例が、記載されており、これらは、用語「ｈＧＨポリペプチド」に包含される。
【００７８】
作動薬ｈＧＨ配列としは、例えば、次の修飾を含む自然発生ｈＧＨ配列が挙げられる：Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔ。例えば、米国特許第５，８４９，５３５号参照（これは、本明細書に参照により組み込まれている）。さらなる作動薬ｈＧＨ配列としては、
Ｈ１８Ｄ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ｓ；
Ｈ１８Ａ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ｓ；または
Ｈ１８Ｄ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ａ
が挙げられる。例えば、米国特許第６，０２２，７１１号参照（これは、本明細書に参照により組み込まれている）。Ｈ１８Ａ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ａにおける置換を含むｈＧＨポリペプチドは、Ｓｉｔｅ  ＩにおけるｈＧＨ受容体に対する親和性を強化する。例えば、米国特許第５，８５４，０２６号参照（これは、本明細書に参照により組み込まれている）。プロテアーゼに対する耐性を増大させたｈＧＨ配列としては、このＣ−Ｄループ内における１つ以上のアミノ酸置換を含むｈＧＨポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。一部の実施態様において、置換としては、Ｒ１３４Ｄ、Ｔ１３５Ｐ、Ｋ１４０Ａおよびこれらのあらゆる組合せが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ａｌａｍら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：１８３−１９０参照。
【００７９】
ヒト成長ホルモン拮抗薬としては、例えば、Ｇ１２０（例えば、Ｇ１２０Ｒ、Ｇ１２０Ｋ、Ｇ１２０Ｗ、Ｇ１２０Ｙ、Ｇ１２０Ｆ、またはＧ１２０Ｅ）における置換を有するもの、および時として次の置換：Ｈ１８Ａ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ａをさらに含むものが挙げられる。例えば、米国特許第６，００４，９３１号参照（これは、本明細書に参照により組み込まれている）。一部の実施態様において、ｈＧＨ拮抗薬は、ＧＨを拮抗薬として作用させる領域１０６から１０８または１２７から１２９における置換を少なくとも１つ含む。例えば、米国特許第６，６０８，１８３号参照（これは、本明細書に参照により組み込まれている）。一部の実施態様において、ｈＧＨ拮抗薬は、ｈＧＨ分子のＳｉｔｅ  ＩＩ結合領域内に存在する水溶性ポリマーに連結されている天然にはコードされないアミノ酸を含む。一部の実施態様において、ｈＧＨポリペプチドは、Ｇ１２０における置換と共に次の置換：Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔ、をさらに含む（例えば、米国特許第５，８４９，５３５号参照）。
【００８０】
完全長自然発生ＧＨアミノ酸配列ならびに成熟自然発生ＧＨアミノ酸配列および自然発生突然変異体については、本明細書における配列番号１、配列番号２および配列番号３をそれぞれ参照のこと。一部の実施態様において、ｈＧＨポリペプチドは、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３、または成長ホルモンポリペプチドの他のいずれかの配列と実質的に同一である。ｈＧＨの多数の自然発生突然変異体が、同定されている。これらとしては、ｈＧＨ−Ｖ（Ｓｅｅｂｅｒｇ，ＤＮＡ  １：２３９（１９８２）；米国特許第４，４４６，２３５号、同第４，６７０，３９３号および同第４，６６５，１８０号（これらは、本明細書に参照により組み込まれている））およびｈＧＨの残基３２から４６の欠失を有する２０−ｋＤａ  ｈＧＨ（配列番号３）（Ｋｏｓｔｙｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９２５：３１４（１９８７）；Ｌｅｗｉｓ，Ｕ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５３：２６７９−２６８７（１９７８））が挙げられる。胎盤成長ホルモンは、Ｉｇｏｕｔ，Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７（１０）：３９９８（１９８９）に記載されている。加えて、タンパク質溶解性切断変異体または２本鎖変異体をはじめとする、後転写プロセス、後翻訳プロセス、分泌プロセス、代謝プロセッシングプロセス、および他の生理プロセスから生じた多数のｈＧＨ変異体が、報告されている（Ｂａｕｍａｎｎ，Ｇ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １２：４２４（１９９１））。Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィドリンケージにより直接連結しているｈＧＨ二量体は、Ｌｅｗｉｓ，Ｕ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３６９７−３７０２（１９７７）；Ｂｒｏｓｔｅｄｔ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｏｏｓ，Ｐ．，Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９：２１７−２２９（１９８９）に記載されている。ｈＧＨ突然変異体および突然変異ｈＧＨポリペプチドをコードする核酸分子は周知であり、こうした核酸分子としては、米国特許第５，５３４，６１７号；同第５，５８０，７２３号；同第５，６８８，６６６号；同第５，７５０，３７３号；同第５，８３４，２５０号；同第５，８３４，５９８号；同第５，８４９，５３５号；同第５，８５４，０２６号；同第５，９６２，４１１号；同第５，９５５，３４６号；同第６，０１３，４７８号；同第６，０２２，７１１号；同第６，１３６，５６３号；同第６，１４３，５２３号；同第６，４２８，９５４号；同第６，４５１，５６１号；同第６，７８０，６１３号および米国特許出願公開第２００３／０１５３００３号（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
ｈＧＨの市販製剤は、次の名前で販売されている：Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）およびＳａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉ（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ）。
【００８２】
用語「ｈＧＨポリペプチド」は、自然発生ｈＧＨの医薬的に許容される塩およびプロドラッグ、これらの塩のプロドラッグ、多形、水和物、溶媒和物、生物活性フラグメント、生物活性変異体および立体異性体、ならびに自然発生ｈＧＨおよびこのポリペプチド融合体の作動薬変異体、模倣変異体および拮抗薬変異体も包含する。追加のアミノ酸をこのアミノ末端、カルボキシ末端または両方に含む融合体は、用語「ｈＧＨポリペプチド」に包含される。融合体の具体例としては、例えば、組換え発現の結果としてメチオニンがｈＧＨのＮ末端に連結されているメチオニル成長ホルモン；精製のための融合体（ポリ−ヒスチジンもしくは親和性エピトープを含むが、これらに限定されない）；血清アルブミン結合ペプチドとの融合体；および血清アルブミンなどの血清タンパクとの融合体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
様々な参考文献により、ポリマーのコンジュゲーションまたはグリコシル化によるポリペプチドの修飾が開示されている。用語「ｈＧＨポリペプチド」は、ＰＥＧなどのポリマーにコンジュゲートしたポリペプチド、およびシステイン、リシンまたは他の残基の１つ以上の追加の誘導体化から成り得るポリペプチドを包含する。加えて、ｈＧＨポリペプチドは、リンカーまたはポリマーを含むことができ、この場合、このリンカーまたはポリマーがコンジュゲートしているアミノ酸は、本発明の天然でないアミノ酸であってもよく、または当該技術分野において公知である技法、例えば、リシンもしくはシステインへのカップリングを利用して天然にコードされたアミノ酸にコンジュゲートさせることができる。
【００８４】
ｈＧＨポリペプチドのポリマーコンジュゲーションが報告されている。例えば、５，８４９，５３５号、同第６，１３６，５６３号および同第６，６０８，１８３号参照（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）。米国特許第４，９０４，５８４号には、少なくとも１つのリシン残基が欠失しているか、他のいずれかのアミノ酸残基で置換されている、ＰＥＧ化リシン枯渇ポリペプチドが開示されている。国際公開第９９／６７２９１号には、タンパク質をＰＥＧとコンジュゲートさせるプロセスが開示されており、この場合、このタンパク質上の少なくとも１つのアミノ酸残基は、欠失しており、このタンパク質をＰＥＧと、このタンパク質へのコンジュゲーションを達成するために十分な条件下で接触させる。国際公開第９９／０３８８７号には、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドのＰＥＧ化変異体が開示されており、この場合、システイン残基が、このポリペプチドの指定領域内に位置する非必須アミノ酸で置換されている。国際公開第００／２６３５４号は、対応する親ポリペプチドと比較して、少なくとも１つの追加グリコシル化部位を含む、アレルゲン性が低減されたグリコシル化ポリペプチドの生産方法が開示されている。
【００８５】
用語「ｈＧＨポリペプチド」は、Ｎ連結またはＯ連結型グリコシル化形態のポリペプチドも包含する。単一のヌクレオチド変更を有する変異体もｈＧＨポリペプチドの生物活性変異体と見なされる。加えて、スプライス変異体も包含される。用語「ｈＧＨポリペプチド」は、化学的手段により連結された、もしくは融合タンパク質として発現された、いずれか１つ以上のｈＧＨポリペプチドまたは他のあらゆるポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、小分子、リガンドもしくはあらゆるタイプの他の活性分子のｈＧＨポリペプチドへテロ二量体、ホモ二量体、ヘテロ多量体またはホモ多量体も包含し、ならびに例えば特異的欠失または他の修飾を有するポリペプチド類似体は、生物活性をなお維持する。
【００８６】
本明細書に記載するｈＧＨに関するアミノ酸および位置へのすべての言及は、特に別の指定が（すなわち、この比較が、配列番号１、３または他のｈＧＨ配列に基づくと述べられている場合で）ない限り、配列番号２における位置に基づく。配列番号１、２、３または他のあらゆるＧＨ配列における位置に対応するアミノ酸位置をｈＧＨ融合体、変異体、フラグメントなどの他のあらゆるｈＧＨ分子において容易に同定できることは、当業者には理解されるだろう。例えば、ＢＬＡＳＴなどの配列アラインメントプログラムは、配列番号１、２、３または他のいずれかのＧＨ配列における位置と一致するタンパク質内の特定の位置をアラインおよび同定するために使用することができる。配列番号１、２、３または他のいずれかのＧＨ配列を参照して本明細書に記載されているアミノ酸の置換、欠失または付加は、本明細書に記載されている、または当該技術分野において知られている、および本発明に明白に包含される、ｈＧＨ融合体、変異体、フラグメントなどの対応する位置における置換、欠失または付加も指すと解釈する。
【００８７】
用語「ｈＧＨポリペプチド」は、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含むｈＧＨポリペプチドを包含する。本発明のｈＧＨポリペプチドは、１つ以上の天然でないアミノ酸修飾と共に、１つ以上の天然アミノ酸での修飾から成り得る。作動薬活性を増大させる、このポリペプチドの溶解性を増大させる、このポリペプチドを拮抗薬に変換するなど（しかし、これらに限定されない）ｈＧＨポリペプチドの１つ以上の生物活性を調節する置換をはじめとする（しかし、これらに限定されない）自然発生ｈＧＨポリペプチドにおける多種多様なアミノ酸位置での典型的な置換は記載されており、これらはこの用語「ｈＧＨポリペプチド」に包含される。
【００８８】
ヒトＧＨ拮抗薬としては、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、および１２７における置換もしくは位置１での（すなわち、Ｎ末端での）付加、またはこれらのあらゆる組合せを有するもの（配列番号２、または配列番号１、３もしくは他のいずれかのＧＨ配列における対応するアミノ酸）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施態様において、ｈＧＨ拮抗薬は、ＧＨを拮抗薬として作用させる、領域１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａへリックス）、３４−７４（ＡへリックスとＢへリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂへリックス）、９７−１０５（ＢへリックスとＣへリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃへリックス）、１３０−１５３（ＣへリックスとＤへリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄへリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）における少なくとも１つの置換を含む。他の実施態様において、天然にはコードされないアミノ酸が組み込まれる部位の具体例としては、へリックスＡのアミノ末端領域およびヘリックスＣの一部の中の残基が挙げられる。もう一つの実施態様では、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンまたはＯ−プロパルギル−Ｌ−チロシンなどの天然にはコードされないアミノ酸でのＧ１２０置換。他の実施態様では、上に挙げた置換を、ｈＧＨポリペプチドをｈＧＨ拮抗薬にさせる追加の置換と組み合わせる。例えば、天然にはコードされないアミノ酸を本明細書において特定する位置の１つで置換し、Ｇ１２０（例えば、Ｇ１２０Ｒ、Ｇ１２０Ｋ、Ｇ１２０Ｗ、Ｇ１２０Ｙ、Ｇ１２０Ｆ、またはＧ１２０Ｅ）における同時置換を導入する。一部の実施態様において、ｈＧＨ拮抗薬は、ｈＧＨ分子の受容体結合領域内に存在する水溶性ポリマーに連結された天然にはコードされないアミノ酸を含む。
【００８９】
一部の実施態様において、ｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨポリペプチドの生物活性を調節する付加、置換または欠失をさらに含む。例えば、前記付加、置換または欠失は、ｈＧＨポリペプチド受容体に対する親和性を調節することができ、受容体の二量体化を調節する（「増加させる」または「減少させる」を含むが、これらに限定されない）ことができ、受容体二量体を安定させることができ、循環半減期を調節することができ、治療的半減期を調節することができ、ポリペプチドの安定性を調節することができ、用量を調節することができ、放出もしくはバイオアベイラビリティを調節することができ、精製を助長することができ、または特定の投与経路を改善もしくは変更することができる。同様に、ｈＧＨポリペプチドは、このポリペプチドの検出（ＧＦＰを含むが、これに限定されない）、精製または他の特性を改善する、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧもしくはポリＨｉｓを含むが、これらに限定されない）もしくは他の親和性に基づく配列（ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴなどを含むが、これらに限定されない）または連結された分子（ビオチンを含むが、これに限定されない）を含むことができる。
【００９０】
用語「ｈＧＨポリペプチド」は、同じまたは異なる天然にはコードされないアミノ酸側鎖に連結されているか、天然にコードされるアミノ酸側鎖に連結されている（天然にはコードされないアミノ酸側鎖により直接連結されているものを含むが、これに限定されない）、またはリンカーにより間接的に連結されている、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体およびヘテロ多量体も包含する。リンカーの具体例としては、水溶性ポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）もしくはポリデキストラン、またはポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
「天然にはコードされないアミノ酸」は、２０の共通アミノ酸またはピロリシンもしくはセレノシステインのうちの１つではないアミノ酸を指す。用語「天然にはコードされないアミノ酸」と同義に用いることができる他の用語は、「天然でないアミノ酸」、「非天然アミノ酸」、「自然には発生しないアミノ酸」ならびにこれらの様々にハイフンでつながれた、およびハイフンでつながれていないバージョンである。用語「天然にはコードされないアミノ酸」は、天然にコードされるアミノ酸（２０の共通アミノ酸またはピロリシンおよびセレノシステインを含むが、これらに限定されない）の修飾（例えば、後翻訳修飾）により発生するが、これら自体がこの翻訳複合体により成長ポリペプチド鎖に自然に組み込まれないアミノ酸を含むが、これらに限定されない。こうした自然には発生しないアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニンおよびＯ−ホスホチロシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
「アミノ末端修飾基」は、ポリペプチドのアミノ末端に取り付けることができるあらゆる分子を指す。同様に、「カルボキシ末端修飾基」は、ポリペプチドのカルボキシ末端に取り付けることができるあらゆる分子を指す。末端修飾基には、様々な水溶性ポリマー、ペプチドもしくはタンパク質、例えば血清アルブミン、またはペプチドの血清半減期を増加させる他の部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
用語「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応性部位」、「化学反応性基」および「化学反応性部分」は、当該技術分野において用いられており、ここでは、分子の個別の定義できる部分または単位を指すために用いる。これらの用語は、化学技術分野ではやや同義であり、ここでは、何らかの機能または活性を果たし、他の分子と反応性である分子の部分を指すために使用する。
【００９４】
用語「リンケージ」または「リンカー」は、化学反応の結果として正常に形成され、一般には共有結合性リンケージである基または結合を指すためにここでは用いる。加水分解安定性リンケージは、このリンケージが水中で実質的に安定であり、有用なｐＨ値で水と反応しないことを意味し、前記「有用なｐＨ値で」は、「長期間にわたって生理条件下で」を含み、おそらく「無期限に生理条件下で」さえも含むが、これらに限定されない。加水分解不安定性または分解性リンケージは、これらのリンケージが、水または水溶液（例えば血液を含む）中で分解し得ることを意味する。酵素安定性または分解性リンケージは、このリンケージが、１つ以上の酵素により分解され得ることを意味する。当該技術分野において理解されているように、ＰＥＧおよび関連ポリマーは、ポリマー主鎖に、またはポリマー主鎖とこのポリマー分子の１つもしくはそれ以上の末端官能基の間のリンカー基に、分解性リンケージを含むことができる。例えば、ＰＥＧカルボン酸または活性ＰＥＧカルボン酸が生物活性因子上のアルコール基と反応することにより形成されるエステルリンケージは、一般に、生理条件下で加水分解して、この因子を放出する。他の加水分解分解性リンケージとしては、カルボネートリンケージ；アミンとアルデヒドの反応から生じるイミンリンケージ；アルコールをリン酸基と反応させることにより形成されるリン酸エステルリンケージ；ヒドラジンとアルデヒドの反応生成物であるヒドラゾンリンケージ；アルデヒドとアルコールの反応生成物であるアセタールリンケージ；ギ酸塩とアルコールの反応生成物であるオルトエステルリンケージ；ＰＥＧなどのポリマーの末端を含むがこれに限定されない位置のアミン基とペプチドのカルボキシル基により形成されるペプチドリンケージ；およびポリマーの末端を含むがこれに限定されない位置のホスホルアミダイト基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基により形成されるオリゴヌクレオチドリンケージが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
ここで用いる場合の用語「生物活性分子」、「生物活性部分」または「生物活性因子」は、ウイルス、細菌、真菌、植物、動物およびヒトを含むがこれらに限定されない生物体のいずれかの物理的または生化学的特性に作用することができるあらゆる物質を意味する。特に、ここで用いる生物活性分子としては、ヒトもしくは他の動物における疾病の診断、治癒、緩和、治療もしくは予防、またはヒトもしくは動物の肉体的もしくは精神的に良好な状態を別様に強化することを目的とするあらゆる物質が挙げられるが、これらに限定されない。生物活性分子の例としては、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リボソーム、微粒子およびミセルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明とともに使用するために適する生物活性因子のクラスとしては、抗生物質、殺真菌薬、抗ウイルス薬、抗炎症薬、抗腫瘍薬、心血管薬、抗不安薬、ホルモン、成長因子、ステロイド剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
「二官能性ポリマー」は、他の部分（アミノ酸側鎖を含むが、これに限定されない）と特異的に反応して共有結合性または非二重結合性リンケージを形成することができる２つの別個の官能基を含むポリマーを指す。特定の生物活性成分上の基と反応する１つの官能基および第二の生体成分上の基と反応するもう１つの基を有する二官能性リンカーを使用して、第一の生物活性成分、二官能性リンカーおよび第二の生物活性成分を含むコンジュゲートを形成することができる。ペプチドに様々な化合物を取り付けるための多数の手順およびリンカー分子が公知である。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号；米国特許第４，６７１，９５８号、同第４，６５９，８３９号、同第４，４１４，１４８号、同第４，６９９，７８４号、同第４，６８０，３３８号、同第４，５６９，７８９号、および同第４，５８９，０７１号参照（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）。「多官能性ポリマー」は、他の部分（アミノ酸測基を含むが、これらに限定されない）と特異的に反応して共有結合性または非共有結合性リンケージを形成することができる２つまたはそれ以上の別個の官能基を含むポリマーを指す。
【００９７】
置換基が、左から右に記載されたこれらの従来どおりの化学式により指定されているとき、これらは、右から左に構造を記載することにより得られる化学的に同一な置換基を同様に包含し、例えば、構造−ＣＨ２Ｏ−は、構造−ＯＣＨ２−と等価である。
【００９８】
用語「置換基」は、「非干渉置換基」を含むが、これに限定されない。「非干渉置換基」は、安定な化合物を生じさせる基である。適する非干渉置換基またはラジカルとしては、ハロ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２アラルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルカリール、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ７−Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２オキシアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホニル、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（この場合のｍは、１から８である）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、複素環式ラジカル、置換複素環式ラジカル、ニトロアルキル、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−ＮＲＣ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、Ｃ２−Ｃ１０アルキルチオアルキル、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−ＯＨ、−−ＳＯ２、＝Ｓ、−−ＣＯＯＨ、−−ＮＲ２、カルボニル、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）――ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）−Ｓ−−（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（この場合のｍは、１から８である）、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−−ＳＯ２ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、およびこれらの塩などが挙げられるが、これらに限定されない。ここで用いる各Ｒは、Ｈ、アルキルもしくは置換アルキル、アリールもしくは置換アリール、アラルキルまたはアルカリールである。
【００９９】
用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、ヨウ素、および臭素を包含する。
【０１００】
それ自体、または別の置換基の一部としての用語「アルキル」は、別様に明記していない限り、直鎖もしくは分枝鎖または環状炭化水素ラジカル、またはこれらの組合せを意味し、これらは、完全に飽和されていてもよいし、一置換されていてもよいし、または多置換されていてもよく、ならびに指定の炭素原子数を有する（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０は、１から１０個の炭素原子を意味する）二価および多価ラジカルを包含し得る。飽和炭化水素ラジカルの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、ならびに例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルの相同体および異性体などが挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高次の相同体および異性体が挙げられるが、これらに限定されない。用語「アルキル」は、別様に述べていない限り、より詳細に下で定義するアルキルの誘導体、例えば「ヘテロアルキル」も包含するものと考える。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と呼ぶ。
【０１０１】
それ自体、または別の置換基の一部としての用語「アルキレン」は、構造−ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（しかし、これらに限定されない）により例示されるようなアルカンから誘導される二価ラジカルを意味し、「ヘテロアルキレン」として下で説明する基をさらに包含する。典型的に、アルキル（またはアルキレン）基は、１から２４個の炭素原子を有するであろうが、１０個またはそれ以下の炭素原子を有する基が、本発明では好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、より短い鎖のアルキルまたはアルキレン基、一般には８個またはそれ以下の炭素原子を有するアルキルまたはアルキレン基である。
【０１０２】
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）は、これらの従来どおりの意味で用いており、それぞれ酸素原子、アミノ基または硫黄原子によりこの分子の残りの部分に取り付けられているアルキル基を指す。
【０１０３】
それ自体、または別の用語との組合せでの用語「ヘテロアルキル」は、別様に明記していない限り、明記されている数の炭素原子と、Ｏ、Ｎ、ＳｉおよびＳから成る群より選択される少なくとも１つのヘテロ原子（この場合、前記窒素および硫黄原子は、場合により酸化されていてもよく、前記窒素原子は、場合により四級化されていてもよい）とから成る、安定な直鎖もしくは分枝鎖または環状炭化水素ラジカル、またはこれらの組合せ意味する。ヘテロ原子（複数を含む）Ｏ、ＮおよびＳならびにＳｉは、このヘテロアルキル基のいずれかの内部位置で置換されていてもよいし、またはアルキル基がこの分子の残りの部分に取り付けられている位置で置換されていてもよい。例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３のように、２個以下のヘテロ原子が連続していてもよい。同様に、それ自体、または別の置換基の一部としての用語「ヘテロアルキレン」は、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−により例示される（しかし、これらに限定されない）ようなヘテロアルキルから誘導される二価ラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基については、同じまたは異なるヘテロ原子が、この鎖の末端のいずれかまたは両方を占有していることがある（アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、アミノオキシアルキレンなどが挙げられるが、これらに限定されない）。なお、さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基については、この連結基の式に記載されている方向は、この連結基の配向を意味するものではない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−と−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
【０１０４】
これら自体、または他の用語との組合せでの用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、別様に明記していない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状バージョンを表す。従って、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルは、飽和および不飽和環リンケージを含む。加えて、ヘテロシクロアルキルについてのヘテロ原子は、この複素環がこの分子の残りの部分に取り付けられる位置を占有することがある。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキシル、３−シクロヘキシル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、この用語は、二環式および三環式環構造を包含する。同様に、それ自体、または別の置換基の一部としての用語「ヘテロシクロアルキレン」は、ヘテロシクロアルキルから誘導される二価ラジカルを意味し、それ自体、または別の置換基の一部としての用語「シクロアルキレン」は、シクロアルキルから誘導される二価ラジカルを意味する。
【０１０５】
ここで用いる用語「水溶性ポリマー」は、水性溶媒に可溶性であるあらゆるポリマーを指す。水性ポリマーのｈＧＨポリペプチドへのリンケージは、未修飾形態を基準にして血清半減期の増加もしくは調節または治療的半減期の増加もしくは調節、免疫原性の調節、物理的会合特性、例えば凝集および多量体形成の調節、受容体結合の変更および受容体二量体化または多量体化の変更をはじめとする（しかし、これらに限定されない）変化を生じさせることができる。水溶性ポリマーは、それ独自の生物活性を有していてもよいし、または有していなくてもよい。適するポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、モノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはこのアリールオキシ誘導体（本明細書に参照により組み込まれている米国特許第５，２５２，７１４号に記載されているもの）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、無水マレイン酸ジビニルエーテル、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体（硫酸デキストランを含む）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリンフラグメント、多糖類、オリゴ糖類、グリカン、セルロースおよびセルロース誘導体（メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含むが、これらに限定されない）、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびこの誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびこれらの誘導体、ポリビニルエチルエーテルならびにアルファ−ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミドなど、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。こうした水溶性ポリマーの例としては、ポリエチレングリコールおよび血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
ここで用いる用語「ポリアルキレングリコール」または「ポリ（アルケングリコール）」は、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびこれらの誘導体を指す。用語「ポリアルキレングリコール」は、線状ポリマーと分枝ポリマーの両方を包含し、０．１ｋＤａと１００ｋＤａの間の分子量を有する。他の具体例としての実施態様は、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログ「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（２００１）などの市場の供給業者のカタログに載っている。
【０１０７】
別様に明記していない限り、用語「アリール」は、単一の環であってもよいし、または共に融合しているか共有結合により連結している多数の環（好ましくは１から３個の環）であってもよい、多不飽和芳香族炭化水素置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１から４個のヘテロ原子（この場合、前記窒素および硫黄原子は場合により酸化されており、前記窒素原子は場合により四級化されている）を含有するアリール基（または環）を指す。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子によりこの分子の残りの部分に取り付けられていてもよい。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリニル、５−イソキノリニル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上述のアリールおよびヘテロアリール環の各々についての置換基は、下で説明する許容可能な置換基の群より選択される。
【０１０８】
簡略のため、他の用語との組合せで用いるときの用語「アリール」（アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキルを含むが、これらに限定されない）は、上で定義したようなアリール環とヘテロアリール環の両方を包含する。従って、用語「アリールアルキル」は、炭素原子（メチレン基を含むが、これに限定されない）が例えば酸素原子により置換されているもの（フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシプロピルなどを含むが、これらに限定されない）をはじめとする、アリール基がアルキル基（ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなどを含むが、これらに限定されない）に取り付けられているラジカルを包含するものと考える。
【０１０９】
上の用語（「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」を含むが、これらに限定されない）の各々は、指示されているラジカルの置換形と非置換形の両方を包含するものと考える。各タイプのラジカルにつての置換の具体例は、下で提供する。
【０１１０】
アルキルおよびヘテロアルキルラジカル（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクロアルケニルと、多くの場合、呼ばれる基を含む）についての置換基は、ゼロから（２ｍ’＋１）（この式中、ｍ’は、こうしたラジカル中の炭素原子の総数である）の範囲の数での、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ”’）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から選択される種々の基（しかし、これらに限定されない）の１つ以上であり得る。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ”’は、各々独立して、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール（１から３個のハロゲンで置換されているアリールを含むが、これに限定されない）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が、例えば１つより多くのＲ基を含む場合、これらのＲ基の各々は、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””基の１つより多くが存在するときの各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””基であるように、独立して選択される。Ｒ’およびＲ”が、同じ窒素原子に取り付けられている場合、これらは、この窒素原子と組み合わさって、５、６または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含む（しかし、これらに限定されない）ものと考える。置換基に関する上の論議から、用語「アルキル」を、水素原子以外の基に結合している基（炭素原子を含む）、例えば、ハロアルキル（−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３を含むがこれらに限定されない）およびアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含むがこれらに限定されない）を包含するものと考えることは、当業者には理解されるであろう。
【０１１１】
アルキルラジカルについて説明した置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基についての置換基は様々であり、ゼロからこの芳香族環構造の開原子価の総数の範囲の数で、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ”’）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（この場合、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””は、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択される）から選択されるが、これらに限定されない。本発明の化合物が、例えば１つより多くのＲ基を含む場合、これらのＲ基の各々は、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””基の１つより多くが存在するときの各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””基であるように、独立して選択される。
【０１１２】
ここで用いる用語「調節された血清半減期」は、この未修飾形態を基準にした修飾された生物活性分子の循環半減期における正または負の変更を意味する。血清半減期は、生物活性分子の投与後、様々な時点で血液サンプルを採取し、各サンプル中のこの分子の濃度を判定することによって測定される。血清濃度と時間の相関関係により、この血清半減期を計算することができる。血清半減期増加は、望ましくは少なくとも約二倍の血清半減期増加を有するが、例えば、それによって満足な薬剤投与計画が可能となり、毒性効果が回避される場合には、それより少ない増加が有用であることもある。一部の実施態様において、この増加は、少なくとも約三倍、少なくとも約五倍、または少なくとも約十倍である。
【０１１３】
ここで用いる用語「調節された治療的半減期」は、この未修飾形態を基準にした修飾された活性分子の治療有効量の半減期における正または負の変更を意味する。治療的半減期は、投与後、様々な時点でこの分子の薬物動態特性および／または薬力学的特性を測定することによって測定される。治療的半減期増加により、特定の有益な薬剤投与計画、特定の有用な総用量が可能となり、または望ましくない作用が回避される。一部の実施態様において、治療的半減期増加は、効力増加、修飾された分子のこのターゲットに対する結合の増加もしくは減少、または未修飾分子の別のパラメータもしくは作用メカニズムの増加または減少から生じる。
【０１１４】
核酸またはタンパク質に適用される場合の用語「単離された」は、この核酸またはタンパク質に、この天然の状態でそれに随伴する他の細胞成分が実質的にないことを示す。これは、均質状態であり得る。単離された物質は、乾燥もしくは半乾燥状態であり得るか、溶液（水溶液を含むが、これに限定されない）状態であり得る。純度および均質性は、一般に、分析化学技法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して判定される。調製物中に存在する最も優勢な化学種であるタンパク質が、実質的に精製される。特に、単離された遺伝子は、遺伝子に隣接し、対象となる遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて実質的に１つのバンドを生じさせることを示す。特に、この核酸またはタンパク質が、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９９％またはそれ以上純粋であることを意味する。
【０１１５】
用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチド、および１本鎖形態もしくは２本鎖形態いずれかでのこれらのポリマーを指す。特に制限がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、自然発生ヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの既知類似体を含有する核酸を包含する。特に他の制限がない限りこの用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス法に使用されるＤＮＡの類似体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、など）を含むオリゴヌクレオチド類似体も指す。他の指示がない限り、特定の核酸配列は、これらの保存的修飾変異体（縮重コドン置換を含むが、これらに限定されない）および相補配列ならびに明示される配列も暗黙に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第三位が、混合塩基および／またはでオキシイノシン残基で置換されている配列を生じさせることにより達成することができる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；およびＣａｓｓｏｌら（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０１１６】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すためにここでは交換可能に用いられている。すなわち、ポリペプチドに関する記載は、ペプチドの記載およびタンパク質の記載と同様にあてはまり、逆もまた同じである。これらの用語は、自然発生アミノ酸ポリマー、ならびに１つ以上のアミノ酸残基が天然にはコードされないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーにあてはまる。ここで用いるこれらの用語は、アミノ酸残基がペプチド共有結合により連結されている完全長タンパク質（すなわち抗原）を含むあらゆる長さのアミノ酸鎖を包含する。
【０１１７】
用語「アミノ酸」は、自然発生および自然には発生しないアミノ酸、ならびに自然発生アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然にコードされるアミノ酸は、２０の共通アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン）ならびにピロリシンおよびセレノシステインである。アミノ酸類似体は、自然発生アミノ酸と同じ塩基化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）に結合しているα炭素、を有する化合物を指す。こうした類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、自然発生アミノ酸と同じ塩基化学構造を保持する。
【０１１８】
本明細書では、一般に公知である三文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨されている一文字記号、いずれかによりアミノ酸に言及することがある。同様に、一般に認められている一文字コードによりヌクレオチドに言及することがある。
【０１１９】
「保存的修飾変異体」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方にあてはまる。特定の核酸配列に関しての「保存的修飾変異体」は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸または本質的に同一の配列にアミノ酸配列をコードしない核酸を指す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が、いずれかの所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは、すべて、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンにより指定されるすべての位置において、このコドンを、コードされたポリペプチドを変えることなく、記載の対応するコドンのいずれかに変えることができる。こうした核酸の変異形は、「沈黙変異形」であり、これは保存的修飾を受けた変異形の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書における核酸配列のすべてが、この核酸のすべての可能な沈黙変異形も示す。核酸中の各コドン（通常はメチオニンについての唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンについての唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一の分子を生じさせるように修飾できることは、当業者には理解されるであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各沈黙変異形は、記載する各配列に必然的に含まれる。
【０１２０】
アミノ酸配列に関するかぎり、このコード配列内の単一のアミノ酸または低率のアミノ酸を変更、付加または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、この変更が化学的に類似したアミノ酸でのアミノ酸の置換を結果的に生じさせる場合、「保存的修飾変異体」であることは、当業者には理解されるであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において周知である。こうした保存的修飾変異体は、本発明の多形変異体、種間相同体および対立遺伝子に加えてのものであり、これらを除外しない。
【０１２１】
次の８つのグループは、互いに保存的置換であるアミノ酸を各々含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．；２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９３、１２月）参照）。
【０１２２】
２つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して、用語「同一」または「同一性」度は、同じである２つまたはそれ以上の配列または部分配列を指す。比較ウインドウを用いて、または以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用してもしくは手作業でのアラインメントおよび目視検査により測定されるような指定領域を用いて、最大応答について比較し、アラインしたとき、一定の百分率の同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチド（すなわち、特定領域に対する約６０％同一性、場合により約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％同一性）を有する場合、配列は、「実質的に同一」である。この定義は、被検配列の成分も指す。同一性は、少なくとも５０のアミノ酸もしくはヌクレオチドの長さの領域にわたって、または７５から１００のアミノ酸もしくはヌクレオチドの長さの領域にわたって、または指定がない場合は全配列またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの全域に存在し得る。
【０１２３】
配列比較については、一般に、１つの配列が参照配列としての役割を果たし、それを被検配列と比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被検配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、または代替パラメータを指定することができる。次に、この配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータを基に、参照配列を基準にして被検配列についての配列同一性度を計算する。
【０１２４】
ここで用いる「比較ウインドウ」は、ある配列と連続位置数が同じである参照配列とを、これら２つの配列を最低にアラインした後、比較することができる、２０から６００、普通は約５０から２００、より普通には約１００から１５０から成る群より選択される連続位置数のうちのいずれか１つの位置数のセグメントについての参照を含む。比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性探索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実現（ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、または手作業でのアラインメントおよび目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）により、行うことができる。
【０１２５】
配列同一性度および配列類似性度の判定に適するアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公的に入手することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＩＮプログラム（核酸配列用）は、デフォルトとして１１の語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３の語長、１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を用いる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、一般に、「低複雑性」フィルタを切って行われる。
【０１２６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、二配列間の類似性の統計学的分析も行う（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供されるもう一つの類似性測定は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する最少合計確立（Ｐ（Ｎ））である。例えば、核酸は、被検核酸と参照核酸の比較における最少合計確立が約０．２より小さい、さらに好ましくは約０．０１より小さい、最も好ましくは約０．００１より小さい場合、参照配列に類似していると見なされる。
【０１２７】
フレーズ「〜に選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」は、この配列が複合混合物（全細胞またはライブラリＤＮＡまたはＲＮＡを含むがこれらに限定されない）中に存在するときのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチド配列のみへの分子の結合、二重化またはハイブリダイゼーションを指す。
【０１２８】
フレーズ「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、当該技術分野において公知であるような低イオン強度および高温の条件を指す。一般に、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸の複合混合物（全細胞またはライブラリＤＮＡまたはＲＮＡを含むがこれらに限定されない）中のこのターゲット部分配列にハイブリダイズするであろうが、この複合混合物中の他の配列にはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、様々な環境で、異なるであろう。長い配列ほど、高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションへの広範な指針が、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，「ハイブリダイゼーションの原理の総説および核酸アッセイの戦略（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ）」（１９９３）において見出せる。一般に、ストリンジェントな条件は、被定義イオン強度ｐＨでの指定配列についての熱融解点（Ｔｍ）より約５から１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、ターゲットに対して相補的なプローブの５０％が平衡時にこのターゲット配列にハイブリダイズする（被定義イオン強度、ｐＨおよび核酸濃度のもとでの）温度である（ターゲット配列が過剰に存在する場合、Ｔｍでは平衡時にプローブの５０％が占有される）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０から８．３で、ならびに短いプローブ（１０から５０のヌクレオチドを含むが、これに限定されない）については少なくとも約３０℃の温度および長いプローブ（５０より多いヌクレオチドを含むが、これに限定されない）については少なくとも約６０℃で、塩濃度が、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１から１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）である条件であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションのために、正のシグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、場合によってはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍であり得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の具体例は、次のとおりであり得る：５０％ホルムアミド、５Ｘ  ＳＣＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５Ｘ  ＳＣＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーション、と０．２Ｘ  ＳＣＣおよび０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄。こうした洗浄は、５、１５、３０、６０、１２０またはそれ以上の分数にわたって行うことができる。
【０１２９】
本明細書で用いる用語「真核生物」は、系統発生的ドメイン真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物、例えば、動物（哺乳類、昆虫、爬虫類、鳥類を含むが、これらに限定されない）、繊毛虫、植物（単子葉植物、双子葉植物、藻類などを含むが、これらに限定されない）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫類、原生生物を指す。
【０１３０】
ここで用いる用語「非真核生物」は、真核生物でない生物を指す。例えば、真核生物でない生物は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ（大腸菌、サームス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｒｅｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）などを含むが、これらに限定されない）系統発生的ドメイン、またはＡｒｃｈａｅａ（メタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタロバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロバクテリウム属（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、例えばハロフェラックス・ボラカニイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）およびハロバクテリウム属種ＮＲＣ−Ｉ、好熱性硫黄細菌（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、エアロパイラム・ペルニクス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍｐｅｒｎｉｘ）などを含むが、これらに限定されない）系統発生的ドメインに属すことができる。
【０１３１】
ここで用いる用語「被験者」は、治療、観察、実験の対象である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
【０１３２】
ここで用いる用語「有効量」は、治療する疾病、状態または疾患の症状の１つ以上をある程度緩和するであろう、投与する（修飾された）天然でないアミノ酸ポリペプチドの量を指す。ここで説明する（修飾された）天然でないアミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、予防的処置、治療強化、および／または治療的処置のために投与することができる。
【０１３３】
用語「強化する」または「強化」は、効能または持続時間、いずれかの点で所望の効果を増加または延長することを意味する。従って、治療薬の効果の強化に関して、この用語「強化」は、系に対する他の治療薬の効果を、効能または持続時間、いずれかの点で増加または延長することができることを指す。ここで用いる「強化有効量」は、所望の系における別の治療薬の効果を強化するために妥当な量を指す。患者において使用する場合、この使用についての有効量は、この疾病、疾患または状態の重症度および経過、以前の治療法、この患者の健康状態および薬物への応答、ならびに治療する医師の判断に依存するであろう。
【０１３４】
ここで用いる用語「修飾された」は、ポリペプチドに対する後翻訳修飾が存在することを指す。「（修飾された）」形の用語は、論じているポリペプチドが、場合によっては修飾されている、すなわち、論じているポリペプチドが、修飾されていてもよいし、未修飾であってもよいことを意味する。
【０１３５】
用語「後翻訳修飾された」および「修飾された」は、アミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれた後、こうしたアミノ酸に対して行われる天然または天然でないアミノ酸のあらゆる修飾を指す。この用語は、単なる例として、ただ共翻訳インビボ修飾、後翻訳インビボ修飾および後翻訳インビトロ修飾を包含する。
【０１３６】
予防的用途において、前記（修飾された）天然でないアミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、特定の疾病、疾患または状態に罹患しやすいか、特定の疾病、疾患または状態のリスクを別様に有する患者に投与される。こうした量は、「予防有効量」と定義する。この使用における正確な量も、患者の健康状態、体重などに依存する。常用の実験（例えば、用量漸増臨床試験）によりこうした予防有効量を決定することは、十分に当業者の範囲内であると考えられる。
【０１３７】
用語「保護された」は、「保護基」、または一定の反応条件下で化学反応性官能基の反応を防止する部分の存在を指す。保護基は、保護される化学反応基のタイプに依存して変わるであろう。例えば、この化学反応基が、アミンまたはヒドラジンである場合、反応基は、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）から成る群より選択することができる。この化学反応基が、チオールである場合、保護基は、オルトピリジルジスルフィドである。この化学反応性基が、ブタン酸またはプロピオン酸などのカルボン酸、またはヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジルまたはアルキル基、例えばメチル、エチルもしくはｔ−ブチルであり得る。当該技術分野において公知である他の保護基も、ここに記載する方法および組成物において、またはここに記載する方法および組成物とともに使用することができる。
【０１３８】
単なる例として、ブロッキング／保護基は、
【０１３９】
【化７】
2007519420.tif 000006
から選択することができる。
【０１４０】
他の保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９９（これは、この全文、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている。
【０１４１】
治療用途において、前記（修飾された）天然でないアミノ酸ポリペプチドは、疾病、状態または疾患に既に罹患している患者に、この疾病、疾患または状態の症状を治癒するか、少なくとも一部は阻止するために十分な量で投与される。こうした量を「治療有効量」と定義し、これは、この疾病、疾患または状態の重症度および経過、以前の治療法、この患者の健康状態および薬物への応答、ならびに治療する医師の判断に依存するであろう。常用の実験（例えば、用量漸増臨床試験）によりこうした治療有効量を決定することは、十分に当業者の範囲内であると考えられる。
【０１４２】
用語「治療」は、予防的および／または治療的処置のいずれかを指すために使用する。
【０１４３】
他に指示がない限り、当該技術分野の技術の範囲内の、質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ法および薬理学の通常の方法を利用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１４４】
（詳細な説明）
Ｉ．序論
少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むｈＧＨ分子を本発明において提供する。本発明の一定の実施態様において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するｈＧＨポリペプチドは、少なくとも１つの後翻訳修飾を含む。一つの実施態様において、前記少なくとも１つの後翻訳修飾は、特定の反応性基に適することが通常の当業者に公知である化学方法論を利用して、第一の反応性基を含む少なくとも１つの非天然アミノ酸に、第二の反応性基を含む分子を取り付けることを含み、前記分子には、ラベル、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬物、親和性ラベル、光親和性ラベル、反応性化合物、樹脂、第二タンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗原フラグメント、金属キレート化剤、補助因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、抑制リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光体、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合性もしくは非共有結合性相互作用をする基、光ケージド部分、光異性体化性部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学分解性の基、光分解性の基、延長された側鎖、炭素に連結した糖、レドックス活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位元素で標識された部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度の基、磁性を有する基、介在基、発色団、エネルギー変換因子、生物活性因子、検出可能ラベル、小分子、または上記のあらゆる組合せ、または他のいずれかの望ましい化合物もしくは物質が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、前記第一反応性基は、アルキニル部分（非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシアラニン（この場合のプロパルギル基は、時としてアセチレン部分とも呼ばれる）を含むが、これに限定されない）であり、前記第二反応性基は、アジド部分であり、および［３＋２］付加環化化学方法論を利用する。もう一つの例において、前記第一反応性基は、アジド部分（非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを含むが、これに限定されない）であり、第二反応性基は、アルキニル部分である。本発明の修飾されたｈＧＨポリペプチドの一定の実施態様では、少なくとも１つの後翻訳修飾を含む少なくとも１つの非天然アミノ酸（ケト官能基を含有する非天然アミノ酸を含むが、これに限定されない）を使用し、この場合の少なくとも１つの後翻訳修飾は、糖部分を含む。一定の実施態様において、前記後翻訳修飾は、真核細胞または非真核細胞においてインビボで行う。
【０１４５】
一定の実施態様において、前記タンパク質は、１つの宿主細胞によりインビボで行われる少なくとも１つの後翻訳修飾を含み、この場合の後翻訳修飾は、別の宿主細胞タイプによっては正常に行われない。一定の実施態様において、前記タンパク質は、真核細胞によってインビボで行われる少なくとも１つの後翻訳修飾を含み、この場合の後翻訳修飾は、非真核細胞によっては正常に行われない。後翻訳修飾の例には、アセチル化、アクリル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、糖脂質リンケージ修飾などが挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施態様において、前記後翻訳修飾は、ＧｌｕＮＡｃ−アスパラギンリンケージのよるアスパラギンへのオリゴ糖の取り付けを含む（前記オリゴ糖が、（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃを含む場合などを含むが、これらに限定されない）。もう一つの実施態様において、前記後翻訳修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−トレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン、またはＧｌｃＮＡｃ−トレオニンリンケージによるセリンまたはトレオニンへのオリゴ糖（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなど）を含むが、これらに限定されない）の取り付けを含む。一定の実施態様において、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、分泌もしくは局在配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグおよび／またはＧＳＴ融合などを含むことができる。
【０１４６】
対象となるタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、もしくは少なくとも１０またはそれ以上の非天然アミノ酸を含有することができる。前記非天然アミノ酸は、同じであってもよいし、異なっていてもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる部位が存在し得る。一定の実施態様では、タンパク質の自然発生バージョンの中に存在する特定のアミノ酸の少なくとも１つ（しかし、すべてよりは少数）を非天然アミノ酸で置換する。
【０１４７】
本発明は、少なくとも１つの天然にはコードされないアミノ酸を含むＧＨ超遺伝子ファミリー、特にｈＧＨのメンバーに基づく方法および組成物を提供する。ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーへの少なくとも１つの天然にはコードされないアミノ酸の導入により、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸とは反応するが、共通して発生する２０のアミノ酸とは反応しない（これを含むが、これらに限定されない）特異的化学反応を含むコンジュゲーション化学の適用を可能ならしめることができる。一部の実施態様において、天然にはコードされないアミノ酸を含むＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーを、この天然にはコードされないアミノ酸の側鎖により水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結させる。本発明は、ＰＥＧ誘導体でタンパク質を選択的に修飾するための非常に効率的な方法を提供し、この方法は、２０の自然に組み込まれるアミノ酸においては見出せない官能基または置換基（ケトン、アジドまたはアセチレン部分を含むが、これらに限定されない）を含有するものをはじめとする（しかし、これらに限定されない）遺伝的にはコードされないアミノ酸の、セレクターコドンに応答するタンパク質への選択的組み込み、および続く安定した反応性のＰＥＧ誘導体での修飾を含む。組み込んだら、これらのアミノ酸側鎖は、この天然にコードされるアミノ酸中に存在する特定の官能基または置換基に適することが通常の当業者に公知である化学方法論を利用することにより、修飾することができる。多種多様な公知化学方法論が、タンパク質に水溶性ポリマーを組み込むための本発明での使用に適する。こうした方法論としては、アセチレンまたはアジド誘導体（を含むが、これらに限定されない）それぞれでのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．  ｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．４，（１９９１）Ｅｄ．Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．、Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．１０６９−１１０９；およびＨｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．  ｉｎ  １，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９８４）Ｅｄ．Ｐａｄｗａ，Ａ．，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．１−１７６参照）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１４８】
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化法は、求核置換反応ではなく付加環化を伴うため、タンパク質を極めて高い選択性で修飾することができる。この反応は、反応混合物への触媒量のＣｕ（Ｉ）の添加により、室温で、水性条件で、卓越した位置選択性（１，４＞１，５）で行うことができる。例えば、Ｔｏｒｎｏｅら、（２００２）Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４；およびＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９；および国際公開第０３／１０１９７２号参照。［３＋２］付加環化により本発明のタンパク質に付加することができる分子としては、アジドまたはアセチレン誘導体をはじめとする（しかし、これらに限定されない）適する官能基または置換基を有する実質的にあらゆる分子が挙げられる。これらの分子を、アセチレン基（ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを含むが、これに限定されない）またはアジド基（ｐ−アジド−フェニルアラニンを含むが、これに限定されない）をそれぞれ有する非天然アミノ酸に、付加することができる。
【０１４９】
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化により生じる５員環は、一般に、還元環境下で可逆的ではなく、水性環境下では長期間にわたって加水分解に対して安定である。従って、多種多様な物質の物理的および化学的特性を、要求水準が高い水性条件下で、本発明の反応性ＰＥＧ誘導体で修飾することができる。さらにもっと重要なこととして、アジドおよびアセチレン部分が互いに特異的である（および例えば、２０の共通の遺伝的にコードされたアミノ酸とは反応しない）ため、タンパク質を極めて高い選択性で１つ以上の特定部位において修飾することができる。
【０１５０】
本発明は、１つ以上のアセチレンまたはアジド部分を有するＰＥＧ誘導体および関連親水性ポリマーの水溶性および加水分解安定性誘導体も提供する。アセチレン部分を含有するＰＥＧポリマーは、セレクターコドンに応答してタンパク質に選択的に導入されたアジド部分とのカップリングに非常に選択的である。同様に、アジド部分を含有するＰＥＧ誘導体は、セレクターコドンに応答してタンパク質に選択的に導入されたアセチレン部分とのカップリングに非常に選択的である。
【０１５１】
さらに具体的には、前記アジド部分は、アルキルアジド、アリールアジドおよびこれらのアジドの誘導体を含むが、これらに限定されない。前記アルキルおよびアリールアジドの誘導体は、このアセチレン特異的反応性が維持されるならば、他の置換基を含むことができる。前記アセチレン部分は、アルキルおよびアリールアセチレンならびに各々の誘導体を含む。前記アルキルおよびアリールアセチレンの誘導体は、このアジド特異的反応性が維持されるならば、他の置換基を含むことができる。
【０１５２】
本発明は、様々な官能基、置換基または部分を有する物質と他の物質とのコンジュゲートを提供し、前記他の物質としては、ラベル；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性ラベル；光親和性ラベル；反応性化合物；樹脂；第二のタンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗原フラグメント；金属キレート化剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；抑制リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピンラベル；蛍光体；金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合性もしくは非共有結合性相互作用をする基；光ケージド部分；光異性体化性部分；ビオチン；ビオチンの誘導体；ビオチン類似体；重原子を組み込む部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；延長された側鎖；炭素に連結した糖；レドックス活性剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位元素で標識された部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度の基；磁性を有する基；介在基；発色団；エネルギー変換因子；生物活性因子；検出可能ラベル；小分子；または上記のあらゆる組合せ、または他のいずれかの望ましい化合物もしくは物質が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、アジドまたはアセチレン部分を有する物質と対応するアセチレンまたはアジド部分を有するＰＥＧポリマー誘導体とのコンジュゲートも含む。例えば、アジド部分を含有するＰＥＧポリマーは、アセチレン官能基を有する遺伝的にコードされないアミノ酸を含有するタンパク質中の一定の位置の生物活性分子にカップリングさせることができる。前記ＰＥＧ分子と前記生物活性分子をカップリングするリンケージとしては、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化生成物が挙げられるが、これに限定されない。
【０１５３】
ＰＥＧを使用して生体材料の表面を修飾することができることは、当該技術分野において十分に確立されている（例えば、米国特許第６，６１０，２８１号；Ｍｅｈｖａｒ，Ｒ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．，３（１）：１２５−１３６（２０００）参照（これは、本明細書に参照により組み込まれている））。本発明は、１つ以上の反応性アジドまたはアセチレン部位を有する表面およびＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化リンケージによりこの表面にカップリングされた本発明の１つ以上のアジドまたはアセチレン含有ポリマーを含む生体材料も含む。生体材料および他の物質を、アジドまたはアセチレンリンケージ以外のリンケージにより、例えば、カルボン酸、アミン、アルコールまたはチオール部分を含むリンケージにより、アジドまたはアセチレン活性化ポリマー誘導体にカップリングさせて、後続の反応に利用できるアジドまたはアセチレン部分を残すこともできる。
【０１５４】
本発明は、本発明のアジドおよびアセチレン含有ポリマーを合成する方法も含む。アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合、アジドは、前記ポリマーの炭素原子に直接結合させることができる。また、アジド含有ＰＥＧ誘導体は、結果として生じるポリマーがこの末端にアジド部分を有するように、一方の末端にアジド部分を有する結合因子を従来の活性化ポリマーに取り付けることによって調製することができる。アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合、アセチレンを前記ポリマーの炭素原子に直接結合させることができる。また、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、結果として生じるポリマーがこの末端にアセチレン部分を有するように、一方の末端にアセチレン部分を有する結合因子を従来の活性化ポリマーに取り付けることによって調製することができる。
【０１５５】
さらに具体的には、アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合、少なくとも１つの活性ヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーを、より反応性が高い部分（例えば、メシレート、トレシレート、トシレートまたはハロゲン脱離基）を有する置換ポリマーを生成させる反応に付す。スルホニル酸ハロゲン化物、ハロゲン原子および他の脱離基を含有するＰＥＧ誘導体の調製および使用は、当業者に周知である。結果として生じたポリマーは、次いで、このポリマーの末端のより反応性が高い部分をアジド部分で置換する反応に付す。また、少なくとも１つの活性求核または求電子部分を有する水溶性ポリマーを、一方の末端にアジドを有するカップリング剤との反応に付して、ＰＥＧポリマーとカップリング剤の間に共有結合を形成し、アジド部分をこのポリマーの末端に配置する。アミン、チオール、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコール、カルボキシレート、アルデヒド、ケトンおよびチオエステルなどをはじめとする求核および求電子部分は、当業者に周知である。
【０１５６】
さらに具体的には、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合、少なくとも１つのヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーを、アセチレン部分を含有する前駆体から水素または他の活性化脱離基を外す反応に付す。また、少なくとも１つの求核または求電子部分を有する水溶性ポリマーを、一方の末端にアセチレンを有するカップリング剤との反応に付して、ＰＥＧポリマーとカップリング剤の間に共有結合を形成し、アセチレン部分をこのポリマーの末端に配置する。有機合成に関連したハロゲン部分、活性化脱離基、求核および求電子部分の使用、ならびにＰＥＧ誘導体の調製および使用は、当業者には十分に定着している。
【０１５７】
本発明は、水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧおよびアジドまたはアセチル部分を含有するＰＥＧ誘導体をはじめとする（しかし、これらに限定されない）、修飾するタンパク質に他の物質を付加させるタンパク質の選択的修飾方法も提供する。前記アジドおよびアセチレン含有ＰＥＧ誘導体を使用して、表面および分子の特性を修飾することができる（この場合、生体適合性、安定性、溶解度、および免疫原性の欠如が重要である）一方で、同時に、当該技術分野において以前から公知であるものより選択的な、ＰＥＧ誘導体のタンパク質への取り付け手段を提供することができる。
【０１５８】
ＩＩ．成長ホルモン超遺伝子ファミリー
成長ホルモン（ＧＨ）超遺伝子ファミリーの遺伝子によりコードされるタンパク質（Ｂａｚａｎ，Ｆ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １１：３５０−３５４（１９９１）；Ｂａｚａｎ，Ｊ．Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：４１０−４１１（１９９２）；Ｍｏｔｔ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：１１４−１２１（１９９５）；Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ，Ｏ．ａｎｄ  Ｉｈｌｅ，Ｊ．Ｎ．，ＳＩＧＮＡＬＬＩＮＧ  ＢＹ  ＴＨＥ  ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ  ＣＹＴＯＫＩＮＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ（１９９６））としては、次のタンパク質が挙げられる：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、イプシロンインターフェロン、ガンマインターフェロン、オメガインターフェロン、タウインターフェロン、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）およびカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）（「ＧＨ超遺伝子ファミリー」）。この遺伝子ファミリーの追加のメンバーが、将来、遺伝子クローニングおよび塩基配列決定により同定されることが予想される。ＧＨ超遺伝子ファミリーのメンバーは、限られたアミノ酸またはＤＮＡ配列同一性を一般に有するという事実にもかかわらず、類似した二次および三次構造を有する。これらの共有される構造的特徴により、この遺伝子ファミリーの新たなメンバーを容易に同定することができ、本明細書に記載する天然でないアミノ酸の方法および組成物に同様に適用することができる。ＧＨ超遺伝子ファミリーのメンバー間の構造的相同性の程度を想定して、天然にはコードされないアミノ酸を、本発明を使用してＧＨ超遺伝子ファミリーのいずれかのメンバーに組み込むことができる。タンパク質のこのファミリーの各メンバーは、４へリックスバンドルを含み、この一般構造は、図１に示す。ファミリーメンバーｈＧＨ、ＥＰＯ、ＩＦＮα−２、およびＧ−ＣＳＦの一般構造は、図２、３、４および５にそれぞれ示す。
【０１５９】
Ｇ−ＣＳＦ（Ｚｉｎｋら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１４：４３５（１９９２）；Ｚｉｎｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：８４５３（１９９４）；Ｈｉｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５１６７（１９９３））、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ，Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５４：１７７９−１７８２（１９９１）；Ｗａｌｔｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：１０７５−１０８５（１９９２））、ＩＬ−２（Ｂａｚａｎ，Ｊ．Ｆ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：４１０−４１１（１９９２）；ＭｃＫａｙ，Ｄ．Ｂ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：４１２（１９９２））、ＩＬ−４（Ｒｅｄｆｉｅｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１１０２９−１１０３５（１９９１）；Ｐｏｗｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１６７３−１６７７（１９９２））、およびＩＬ−５（Ｍｉｌｂｕｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：１７２−１７６（１９９３））をはじめとするサイトカインのメンバーの構造は、Ｘ線回折およびＮＭＲ検査により決定されており、有意な一次配列相同性を欠くにもかかわらず、ＧＨ構造での顕著な保存を示す。ＩＦＮは、モデリングおよび他の研究（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１５：３４１（１９９５）；Ｍｕｒｇｏｌｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：６２（１９９３）；Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１４５３（１９９６）；Ｋｌａｕｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７４：６６１（１９９７））を基に、このファミリーのメンバーであると考えられている。ＥＰＯは、モデリングおよび突然変異誘発研究（Ｂｏｉｓｓｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５９８３−１５９９３（１９９３）；Ｗｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２８３９−２２８４６（１９９４））を基に、このファミリーのメンバーであると考えられている。上記サイトカインおよび成長因子のすべてが、１つの大きな遺伝子ファミリーを構成すると、現在、考えられている。
【０１６０】
類似した二次および三次構造を共有することに加えて、このファミリーのメンバーは、細胞内シグナル伝達経路を活性化するために細胞表面受容体をオリゴマー化しなければならないという特性を共有する。ＧＨおよびＥＰＯをはじめとする（しかし、これらに限定されない）一部のＧＨファミリーメンバーは、１つのタイプの受容体にしか結合せず、この受容体にホモ二量体を形成させる。ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−６をはじめとする（しかし、これらに限定されない）他のファミリーメンバーは、１つより多くのタイプの受容体に結合し、これらの受容体にヘテロ二量体またはより高次の凝集体を形成させる（Ｄａｖｉｓら、（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１８０５−１８０８；Ｐａｏｎｅｓｓａら、（１９９５），ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１９４２−１９５１；Ｍｏｔｔ  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：１１４−１２１（１９９５））。突然変異誘発の研究により、ＧＨと同様、これらの他のサイトカインおよび成長因子は、複数の、典型的には２つの受容体結合部位を有し、これらの同源受容体に逐次的に結合することが証明された（Ｍｏｔｔ  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：１１４−１２１（１９９５）；Ｍａｔｔｈｅｗｓら、（１９９６）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：９４７１−９４７６）。ＧＨと同様、これらの他のファミリーメンバーについての一次受容体結合部位は、４つのアルファへリックスおよびＡ−Ｂループ内に主として発生する。受容体結合に参加するこれらのへリックスバンドル内の特異的アミノ酸は、ファミリーメンバー間で異なる。ＧＨ超遺伝子ファミリーのメンバーと相互作用する大部分の細胞表面受容体が、構造的に関連しており、第二の大きな多遺伝子ファミリーを構成する。例えば、米国特許第６，６０８，１８３号参照（これは、本明細書に参照により組み込まれている）。
【０１６１】
ＧＨ超遺伝子ファミリーの様々なメンバーの突然変異の研究から、アルファへリックスを接続するループは一般には受容体結合に関与しない傾向があるという一般的な結論に達した。特に、短いＢ−Ｃループは、すべてでないにせよ大部分のファミリーメンバーにおいて、受容体結合に必須ではないようである。このため、Ｂ−Ｃループは、ＧＨ超遺伝子ファミリーのメンバーの中の本明細書に記載するような天然にはコードされないアミノ酸で、置換することができる。Ａ−Ｂループ、Ｃ−Ｄループ（およびインターフェロンのＤ−Ｅループ／ＧＨ超遺伝子ファミリーのＩＬ−１０様メンバー）も、自然には発生しないアミノ酸で置換することができる。へリックスＡに隣接し、最終へリックスに対して遠位のアミノ酸も、受容体結合に関与しない傾向があり、自然には発生しないアミノ酸を導入するための部位であり得る。一部の実施態様において、天然にはコードされないアミノ酸は、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−ＤまたはＤ−Ｅループの最初の１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上のアミノ酸をはじめとする（しかし、これらに限定されない）ループ内のいずれかの位置で、置換されている。一部の実施態様において、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸が、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−ＤまたはＤ−Ｅループの最後の１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上のアミノ酸の中で置換される。
【０１６２】
ＥＰＯ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２  ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５およびベータインターフェロンをはじめとする（しかし、これらに限定されない）ＧＨファミリーの一定のメンバーは、Ｎ連結および／またはＯ連結型の糖を含有する。これらのタンパク質中のグリコシル化部位は、ほぼ排他的にループ領域で発生し、アルファへリックスバンドルでは発生しない。これらのループ領域は、一般には受容体結合に関与しないため、および糖基を共有結合で取り付けるための部位であるため、自然には発生しないアミノ酸を前記タンパク質に導入するための有用な部位であり得る。前記タンパク質におけるＮおよびＯ連結型グリコシル化部位を含むアミノ酸は、表面が露出されるため、自然には発生しないアミノ酸の置換のための部位であり得る。従って、天然タンパク質は、これらの部位でこれらのタンパク質に取り付けられる嵩高い糖基を許容することができ、またグリコシル化部位は、受容体結合部位から離れて位置する傾向がある。
【０１６３】
ＧＨ超遺伝子ファミリーの追加メンバーが将来発見される可能性は高い。ＧＨ超遺伝子ファミリーの新メンバーは、予測されるタンパク質配列のコンピュータ支援二次および三次構造解析により同定することができる。ＧＨ超遺伝子ファミリーのメンバーは、非へリックスアミノ酸（ループ領域）によりつなぎ合わされた４つまたは５つの両親媒性へリックスを一般に有する。これらのタンパク質は、細胞からの分泌を促進するために、Ｎ末端に疎水性シグナル配列を含有し得る。ＧＨ超遺伝子ファミリーのこうした後日発見されたメンバーも、本発明に包含される。
【０１６４】
従って、この成長ホルモン超遺伝子ファミリーの説明は、例証を目的として、および単なる例として提供するものであり、本明細書に記載の方法、組成物、戦略および技法の範囲に対する限定として提供するものではない。さらに、本出願におけるＧＨポリペプチドへの言及は、ＧＨ超遺伝子ファミリーのいずれかのメンバーの一例としてこの総称を使用していると解釈する。従って、ｈＧＨポリペプチドまたはタンパク質に関して本明細書で説明する修飾および化学作用は、本明細書に特に記載するものを含むＧＨ超遺伝子ファミリーのいずれのメンバーにも等しく適用することができる。
【０１６５】
ＩＩＩ．本発明と共に使用するための一般的な組換え核酸法
本発明の多数の実施態様において、対象となるｈＧＨポリペプチドをコードする核酸は、単離され、クローニングされ、および多くの場合、組換え法を使用して変更されることとなる。こうした実施態様は、タンパク質発現のために使用され、またはｈＧＨポリペプチドに由来する変異体、誘導体、発現カセットもしくは他の配列の生成中に使用される（これらの使用を含むが、これらに限定されない）。一部の実施態様において、本発明のポリペプチドをコードする配列は、非相同プロモータに作動可能に連結される。ｈＧＨの単離および宿主細胞におけるＧＨの生産は、例えば、米国特許第４，６０１，９８０号、同第４，６０４，３５９号，同第４，６３４，６７７号，同第４，６５８，０２１号，同第４，８９８，８３０号，同第５，４２４，１９９号，同第５，７９５，７４５号，同第５，８５４，０２６号，同第５，８４９，５３５号；同第６，００４，９３１号；同第６，０２２，７１１号；同第６，１４３，５２３および同第６，６０８，１８３号（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている。
【０１６６】
天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２で示すアミノ酸配列を有するもの（ｈＧＨ）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）親ポリペプチドのアミノ酸配列を基にして合成し、次いで、このヌクレオチド配列を、関連アミノ酸残基（複数を含む）の導入（すなわち、組み込みもしくは置換）または除去（すなわち、欠失もしくは置換）を達成するように変化させることができる。前記ヌクレオチド配列は、従来の方法に従って、部位特異的突然変異誘発により、適便に修飾することができる。また、前記ヌクレオチド配列は、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づきオリゴヌクレオチドを設計するオリゴヌクレオチド合成装置の使用、および好ましくは、組換えポリペプチドが生産されることとなる宿主細胞において好適であるコドンの選択を含む（しかし、これらに限定されない）化学合成によって調製することができる。例えば、ＰＣＲ、ライゲーションまたはライゲーション連鎖反応により、所望のポリペプチドの部分についての幾つかのオリゴヌクレオチドコーディングを合成し、組立てることができる。例えば、Ｂａｒａｎｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１８９−１９３（１９９１）；米国特許第６，５２１，４２７号参照（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）。
【０１６７】
本発明は、組換え遺伝学の分野における常用の技法を利用する。本発明において使用する一般的な方法を開示している基本テキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，１９９４））が挙げられる。
【０１６８】
分子生物学的技法を記載している一般テキストとしては、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９９まで増刊）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））が挙げられる。これらのテキストには、突然変異誘発；ベクターの使用；プロモータ；および非天然アミノ酸、直交性ｔＲＮＡ、直交性シンセターゼおよびこれらのペアをはじめとするタンパク質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の生成（これらを含むが、これに限定されない）に関する多くの他の関連トピックスが、記載されている。
【０１６９】
ｔＲＮＡのライブラリの作製、シンセターゼのライブラリの作製、セレクターコドンの作製、対象となるタンパク質またはポリペプチドへの非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンの挿入をはじめとする（しかし、これらに限定されない）様々な目的のために、様々なタイプの突然変異誘発を本発明では使用する。これらには、部位特異的突然変異誘発、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャッフリングまたは他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有テンプレートを使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップを有する二重鎖ＤＮＡなどを使用する突然変異誘発、またはこれらのあらゆる組合せが挙げられるが、これらに限定されない。追加の適切な方法としては、点ミスマッチ修復、修復不全宿主株を使用する突然変異誘発、制限選択および制限精製、欠失突然変異体誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復などが挙げられる。キメラ構築を伴う（これを含むが、これに限定されない）突然変異体誘発も本発明に包含される。１つの実施態様において、突然変異体誘発は、自然発生分子または変更されたもしくは突然変異させた自然発生分子についての公知情報（配列、配列比較、物理的特性または結晶構造などを含むが、これらに限定されない）により導くことができる。
【０１７０】
本明細書において見出されるテキストおよび実施例には、これらの手順が記載されている。追加情報は、以下の出版物およびこれらに引用されている参考文献において見つけられる：Ｌｉｎｇら、Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８（１９９７）；Ｄａｌｅら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ＆  Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．およびＬｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２（１９８７）；Ｂａｓｓら、Ｍｕｔａｎｔ  Ｔｒｐ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０−２４５（１９８８）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｙ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００（１９８２）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８���）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ｎｉｃｋｅｄ  ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｎａｋａｍａｙｅ  ＆  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｎｃｉ  Ｉ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｙ−Ｔ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ，（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４；Ｋｒａｍｅｒら、Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒ  ＆  Ｆｒｉｔｚ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７２０７（１９８８）；Ｆｒｉｔｚら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９（１９８８）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ，Ｃｅｌｌ  ３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３（１９８７）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６）；Ｗｅｌｌｓら、Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ  ３１７：４１５−４２３（１９８６）；Ｎａｍｂｉａｒら、Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１（１９８４）；ＳａｋａｍａｒおよびＫｈｏｒａｎａ、Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｏｄ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２（１９８８）；Ｗｅｌｌｓら、Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ‘ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６（１９８５）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７１７７−７１８１（１９８６）；Ａｒｎｏｌｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４５０−４５５（１９９３）；Ｓｉｅｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：４５６−４６０（２００１）；Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，３８９−９１（１９９４）；およびＩ．Ａ．Ｌｏｒｉｍｅｒ，Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，３０６７−８（１９９５）。上記方法の多くに関する追加情報は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １５４において見つけることができ、これには、様々な突然変異誘発法に伴うトラブルシューティング問題に対する有用な制御も記載されている。
【０１７１】
本発明は、真核動物宿主細胞、非真核動物宿主細胞、および直交性ｔＲＮＡ／ＲＳペアによる天然でないアミノ酸のインビボ組み込み用の生物にも関する。宿主細胞を本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含む構築物（例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであり得る、本発明のベクターを含むが、これに限定されない）で遺伝子操作（形質転換、形質導入またはトランスフェクトを含むが、これらに限定されない）する。このベクターは、例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、裸ポリヌクレオチド、またはコンジュゲートしているポリヌクレオチドの形態であり得る。ベクターは、エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５））；ウイルスベクターによる感染；小さなビーズもしくは粒子のマトリック内またはこの表面上、いずれかに核酸を有する小さな粒子による高速衝撃貫入（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）（Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，７０−７３（１９８７））をはじめとする標準的な方法により細胞および／または微生物に導入する。
【０１７２】
遺伝子操作する宿主細胞は、例えばスクリーニング段階、プロモータの活性化または形質転換体の選択などの活動に適するように変性された従来の栄養培地で培養することができる。これらの細胞は、場合によってはトランスジェニック生物へと培養することができる。単離および培養についての（例えば、後続の核酸単離についての）ものを含む（しかし、これらに限定されない）他の有用な参考文献として、次のものが挙げられる：Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびこの中に引用されている参考文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ．）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ．）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ。
【０１７３】
細胞にターゲット核酸を導入する幾つかの周知である方法を利用することができ、これらはいすれも本発明において使用することができる。これらには、ＤＮＡを含有する細菌プロトプラストとの受容細胞の融合、エレクトロポレーション、発射衝撃（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｍｅｎｔ）、およびウイルスベクターでの感染（下でさらに論じる）などが挙げられる。細菌細胞は、本発明のプラスミド含有ＤＮＡ構築物の数を増幅させるために使用することができる。細菌を対数期に成長させ、この細菌内のプラスミドを、当該技術分野において公知である様々な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ参照）によって単離することができる。加えて、過剰なキットが、細菌からのプラスミドの精製用に市販されている（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐ（商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（商標）、両方ともＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈからのもの；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（商標）；およびＱｉａｇｅｎからのＱＩＡｐｒｅｐ（商標）参照）。単離および精製したプラスミドは、次いで、他のプラスミドを生産するようにさらに処理し、これらを使用して細胞をトランスフェクトするか、関連ベクターに組み込んで、生物を感染させる。代表的なベクターは、転写および翻訳ターミネータ、転写および翻訳開始配列、および特定のターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモータを含有する。これらのベクターは、少なくとも１つの独立ターミネータ配列を含有する遺伝子発現カセット、真核生物もしくは原核生物または両方においてこのカセットを複製することができる配列（シャトルベクターを含むが、これに限定されない）、および原核系と真核系の両方のための選択マーカーを場合により含む。ベクターは、原核生物、真核生物または好ましくは両方における複製および組み込みに適する。Ｇｉｌｉｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒ（すべて上記）参照。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージのカタログは、例えば、ｔｈｅ  ＡＴＣＣにより提供されている（例えば、ｔｈｅ  ＡＴＣＣ発行のＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら（ｅｄｓ））。塩基配列決定およびクローニングのための追加の基本手順ならびに分子生物学の他の側面および基礎理論の考察は、Ｗａｔｓｏｎら（１９９２）  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹにおいても見つけられる。加えて、本質的にあらゆる核酸（および標準的であろうと、標準的でなかろうと、事実上、あらゆる標識核酸）を、様々な市場の供給業者、例えば、ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（テキサス州、ミッドランド；ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｍｃｒｃ．ｃｏｍで入手可能）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍ��ａｎｙ（カリフォルニア州、ラモーナ；ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｇｅｎｃｏ．ｃｏｍで入手可能）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（イリノイ州、シカゴ；ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍで入手可能）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、アラミダ）およびこの他多数の供給業者のいずれかからカスタムオーダーまたは標準オーダーすることができる。
【０１７４】
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝子コドンの枠組みを発展させた。例えば、セレクターコドンとしては、非反復三塩基コドン；ナンセンスコドン、例えば、アンバーコドン（ＵＡＧ）もしくはオパールコドン（ＵＧＡ）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）停止コドン、非天然コドン、四塩基またはそれ以上の塩基数のコドン、またはレアコドンが挙げられるが、これらに限定されない。ｈＧＨポリペプチドの少なくとも一部をコードする単一のポリヌクレオチドにおいて所望の遺伝子に導入することができるセレクターコドンの数が、広範である（１またはそれ以上、２またはそれ以上、３より多数、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上を含むが、これらに限定されない）ことは、通常の当業者には容易にわかる。
【０１７５】
一つの実施態様において、本方法は、真核細胞においてインビボで非天然アミノ酸を組み込むための停止コドンであるセレクターコドンの使用を含む。例えば、ＵＡＧをはじめとする（しかし、これに限定されない）停止コドンを認識するＯ−ｔＲＮＡを生産し、所望の非天然アミノ酸でＯ−ＲＳによりアミノアシル化する。このＯ−ｒＲＮＡは、自然発生宿主のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによっては認識されない。従来の部位特異的突然変異誘発を使用して、ＴＡＧをはじめとする（しかし、これに限定されない）停止コドンを、対象となるポリペプチドの対象となる部位に導入することができる。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ら、（１９８８），５，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，７９１−８０２参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、および対象となるポリペプチドをコードする核酸をインビボで併せると、非天然アミノ酸が、ＵＡＧコドンに応答して組み込まれて、特定の部位に非天然アミノ酸を含有するポリペプチドを生じさせる。
【０１７６】
インビボでの非天然アミノ酸の組み込みは、真核動物宿主細胞の有意な摂動を伴わずに行うことができる。例えば、ＵＡＧコドンの抑制効率は、Ｏ−ｔＲＮＡ（アンバーサプレッサｔＲＮＡを含むが、これに限定されない）と真核細胞放出因子（ｅＲＦを含むが、これに限定されない）（これは、停止コドンも結合し、リボソームからの成長ペプチドの放出を開始させる）の間の競合に依存するため、この抑制効率は、Ｏ−ｔＲＮＡおよび／またはサプレッサｔＲＮＡの発現レベルを増加させること（これを含むが、これに限定されない）によって調節することができる。
【０１７７】
セレクターコドンは、四塩基またはそれ以上の塩基数のコドン、例えば、四塩基、五塩基、六塩基またはそれ以上の塩基数のコドンをはじめとする拡張コドンも含む。四塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵなどが挙げられるが、これらに限定されない。五塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一つ特徴としては、フレームシフト抑制に基づく拡張コドンの使用が挙げられる。四塩基またはそれ以上の塩基数のコドンにより、１つまたは複数の非天然アミノ酸（これらを含むが、これに限定されない）を同じタンパク質に挿入することができる。例えば、突然変異Ｏ−ｔＲＮＡ、アンチコドンループ（例えば、少なくとも８から１０ｎｔのアンチコドンループ）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）特別なフレームシフトサプレッサｔＲＮＡ、の存在下では、四塩基またはそれ以上の塩基数のコドンが、単一のアミノ酸として読み取られる。他の実施態様においては、アンチコドンループは、少なくとも四塩基コドン、少なくとも五塩基コドンもしくは少なくとも六塩基コドンまたはそれ以上の塩基数のコドン（しかし、これらに限定されない）を解読することができる。２５６の可能な四塩基配列が存在するので、四塩基またはそれ以上の塩基数のコドンを使用して、多数の非天然アミノ酸を同じ細胞内でコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；Ｍａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  「Ｓｈｉｆｔｙ」  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９参照。
【０１７８】
例えば、四塩基コドンは、インビトロ生合成法を使用してタンパク質に非天然アミノ酸を組み込むために使用されている。例えば、Ｍａら、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：７９３９；およびＨｏｈｓａｋａら、（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４参照。ＣＧＧＧおよびＡＧＧＵは、２つの化学的アシル化フレームシフトサプレッサｔＲＮＡで、２−ナフチルアラニンとリシンのＮＢＤ誘導体とをインビトロでストレプタビジンに同時に組み込むために使用された。例えば、Ｈｏｈｓａｋａら、（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４参照。インビボ試験において、Ｍｏｏｒｅらは、ＮＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕ誘導体が、ＵＡＧＮコドン（Ｎは、Ｕ、Ａ、ＧまたはＣであり得る）を抑制する能力を検査し、クァドループレットＵＡＧＡは、ＵＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕにより１３から２６％の効率で解読され得るが、０または−１フレーム内ではほとんど解読されないことを発見した。Ｍｏｏｒｅら、（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５参照。１つの実施態様において、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づく拡張コドンを本発明において使用することができ、それにより、ミスセンス読み過ごしおよび他の望ましくない部位でのフレームシフト抑制を低減することができる。
【０１７９】
この内在性の系が天然塩基コドンを使用しない（またはめったに使用しない）所定の系については、セレクターコドンが、天然三塩基コドンの１つを含むこともある。例えば、これには、天然三塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠く系、および／またはこの三塩基コドンがレアコドンである系が挙げられる。
【０１８０】
セレクターコドンは、場合によっては非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は、既存の遺伝子アルファベットをさらに拡張する。１つ余分な塩基対により、トリプレットコドンの数が６４から１２５に増加する。第三の塩基対の特性としては、安定で選択的な塩基対合、ポリメラーゼによる高い忠実性でのＤＮＡへの効率的酵素的組み込み、および発生期非天然塩基対の合成後の効率的連続プライマー伸張が挙げられる。方法および組成物に適合させることができる非天然塩基対の記載としては、例えば、Ｈｉｒａｏら、（２００２）Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２が挙げられる。他の関連出版物は、下に列挙する。
【０１８１】
インビボでの使用のために、非天然ヌクレオシドは、膜透過性であり、リン酸化されて対応する三リン酸塩を形成する。加えて、増加される遺伝子情報は、安定であり、細胞性酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒ他による以前の努力は、標準Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対（この最も注目すべき例は、イソ−Ｃ：イソ−Ｇ塩基対である）におけるもとのとは異なる水素結合パターンを利用するものであった。例えば、Ｓｗｉｔｚｅｒら、（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２；およびＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２参照。一般に、これらの塩基は、ある程度、天然塩基とミス対合し、酵素的に複製され得ない。Ｋｏｏｌおよび共同研究者は、塩基間の疎水性充填相互作用が、水素結合に取って代わって塩基対を形成させることを実証した。Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；およびＧｕｃｋｉａｎ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ，（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５参照。上記要求すべてを満たす非天然塩基対を開発する努力では、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇおよび共同研究者が、一連の非天然疎水性塩基を系統的に合成し、研究した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳセルフペアは、天然塩基対より安定であることが判明し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組み込むことができる。例えば、ＭｃＭｉｎｎら、（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６；およびＯｇａｗａら、（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４参照。３ＭＮ：３ＭＮセルフペアは、生体機能に十分な効率および選択性でＫＦにより合成することができる。例えば、Ｏｇａｗａら、（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３参照。しかし、両方の塩基は、さらなる複製のための鎖末端としての機能を果たす。最近、突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＩＣＳセルフペアを複製するために使用できることが考案された。加えて、７ＡＩセルフペアを複製することができる。例えば、Ｔａｅら、（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規金属塩基対、Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙが開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら、（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．．１２２：１０７１４参照。拡張コドンおよび非天然コドンは、天然コドンに本質的に直交するため、本発明の方法では、この特性を利用して、これらについての直交性ｔＲＮＡを作製することができる。
【０１８２】
翻訳バイパス系を使用して、所望のポリペプチドにおける非天然アミノ酸を組み込むこともできる。翻訳バイパス系では、大きな配列が遺伝子に組み込まれるが、タンパク質へは翻訳されない。この配列は、リボソームにこの配列を飛び越させ、この挿入の下流の翻訳を再開させる合図としての役割を果たす構造を含有する。
【０１８３】
一定の実施態様において、本発明の方法および／または組成物における対象となるタンパク質またはポリペプチド（またはこれらの一部）は、核酸によってコードされる。典型的に、この核酸は、少なくとも１つのセレクターコドン、少なくとも２つのセレクターコドン、少なくとも３つのセレクターコドン、少なくとも４つのセレクターコドン、少なくとも５つのセレクターコドン、少なくとも６つのセレクターコドン、少なくとも７つのセレクターコドン、少なくとも８つのセレクターコドン、少なくとも９つのセレクターコドン、１０またはそれ以上のセレクターコドンを含む。
【０１８４】
対象となるタンパク質またはポリペプチドについての遺伝子コーディングは、当業者に周知である方法および本明細書に記載の方法を使用して、例えば、非天然アミノ酸の組み込みのための１つ以上のセレクターコドンを含むように突然変異誘発することができる。例えば、対象となるタンパク質についての核酸を、１つ以上のセレクターコドンを含むように突然変異誘発することにより、１つ以上の非天然アミノ酸の組み込みを生じさせる。本発明は、突然変異体、あらゆるタンパク質の変異形（例えば、少なくとも１つの非天然アミノ酸でのものを含む）を含む、こうしたあらゆる変異体を包含する。同様に、本発明は、対応する核酸、すなわち１つ以上のアミノ酸をコードする１つ以上のセレクターコドンを有するあらゆる核酸、も包含する。
【０１８５】
ｈＧＨポリペプチドなどの対象となるタンパク質をコードする核酸分子は、ポリペプチドのいずれかの所望位置においてシステインを導入するように容易に突然変異させることができる。システインは、反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質または多種多様な他の分子を対象となるタンパク質に導入するために幅広く使用されている。ｈＧＨポリペプチドの所望位置へのシステインの組み込みに適する方法は、米国特許第６，６０８，１８３号（これは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されているものおよび標準的突然変異誘発法など、当該技術分野において周知である。
【０１８６】
ＩＶ．天然にはコードされないアミノ酸
多種多様な天然にはコードされないアミノ酸が、本発明での使用に適する。あらゆる数の天然にはコードされないアミノ酸をｈＧＨポリペプチドに導入することができる。一般に、導入される天然にはコードされないアミノ酸は、実質的には２０の共通の遺伝的コードされるアミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン）に化学的に挿入される。一部の実施態様において、前記天然にはコードされないアミノ酸は、２０の共通アミノ酸では見出せない官能基と効率的および選択的に反応して安定なコンジュゲートを形成する側鎖官能基（アジド、ケトン、アルデヒドおよびアミノオキシ基を含むが、これらに限定されない）を含む。例えば、アジド官能基を含有する天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドを、ポリ（エチレングリコール）をはじめとする（しかし、これに限定されない）ポリマー、または代替として、アルキン部分を含有する第二のポリペプチドと反応させて、安定なコンジュゲートを形成することができ、これにより、結果として、このアジド官能基およびアルキン官能基の選択的反応のため、Ｈｕｓｇｅｎ［３＋２］付加環化生成物が形成される。
【０１８７】
アルファ−アミノ酸の一般構造は、次のように示される（式Ｉ）：
【０１８８】
【化８】
2007519420.tif 000007
【０１８９】
天然にはコードされないアミノ酸は、典型的に、上に記載した式（式中、Ｒ基は、２０の天然アミノ酸において用いられているもの以外のいずれかの置換基である）を有するあらゆる構造であり、ならびに本発明での使用に適切であり得る。本発明の天然にはコードされないアミノ酸は、側鎖の構造だけが天然アミノ酸と異なるため、これらの天然にはコードされないアミノ酸は、自然発生ポリペプチドにおいて形成されるのと同じように、他のアミノ酸（天然アミノ酸または天然にはコードされないアミノ酸を含むが、これらに限定されない）とアミド結合を形成する。しかし、これらの天然にはコードされないアミノ酸は、これらを天然アミノ酸と区別する側鎖基を有する。例えば、Ｒは、アルキル−、アリール−、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ−、スルホニル−、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミンもしくはアミノ基、またはこれらのあらゆる組合せを含む。本発明での使用に適する、対象となる天然にはコードされないアミノ酸としては、光活性化性架橋剤を含むアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光性アミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；新規官能基を有するアミノ酸；他の分子と共有結合性または非共有結合性相互作用をするアミノ酸；光ケージドおよび／または光異性体化性アミノ酸；ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸；グリコシル化アミノ酸、例えば糖置換セリン；他の炭水化物変性アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性なおよび／または光分解性アミノ酸；天然アミノ酸と比較して延長された側鎖（約５より多いまたは約１０より多い炭素数のものを含むが、これらに限定されないポリエーテルまたは長鎖炭化水素を含むが、これらに限定されない）を有するアミノ酸；炭素架橋型糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；ならびに１つ以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
本発明での使用に適切であり得る、および水溶性ポリマーとの反応に有用である、天然にはコードされないアミノ酸の具体例としては、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジドおよびアルキン反応性基を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施態様において、天然にはコードされないアミノ酸は、糖部分を含む。こうしたアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトースアミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコースアミニル−Ｌ−アスパラギン、およびＯ−マンノースアミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。こうしたアミノ酸の例には、アミノ酸と糖の間の自然発生Ｎ−またはＯ−リンケージが、天然では一般に見いだせない共有結合リンケージ  −  アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどが挙げられるが、これらに限定されない  −  によって置換されている例も含まれる。こうしたアミノ酸の例には、自然発生タンパク質では一般に見出せない糖類、例えば、２−デオキシ−グルコースおよび２−デオキシガラクトースなども含まれる。
【０１９１】
本明細書において提供する天然にはコードされないアミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国、ミズーリ州、セントルイス）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ドイツ、ダルムシュタットのＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの一部門）またはＰｅｐｔｅｃｈ（米国、マサチューセッツ州のバーリントン）から市販されている。市販されていないものは、本明細書において提供するように、または当業者に公知である標準的な方法を使用して、場合により合成される。有機合成法については、例えば、ＦｅｓｓｅｎｄｏｎおよびＦｅｓｓｅｎｄｏｎによるＯｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＣａｒｅｙ  ａｎｄ  ＳｕｎｄｂｅｒｇによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照。米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号および同第２００３／０１０８８８５号も参照（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）。新規側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、本発明での使用に適する非天然アミノ酸には、式ＩＩおよびＩＩＩ：
【０１９２】
【化９】
2007519420.tif 000008
（式中、Ｚは、典型的にはＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’またはＳ−Ｒ’を含み；ＸおよびＹは、同じであってもよいし、異なっていてもよく、典型的にはＳまたはＯを含み；ならびにＲおよびＲ’は、同じであってもよいし、異なっていてもよく、典型的には、式Ｉを有する非天然アミノ酸について上に記載したＲ基についての構成成分と同じリストならびに水素から選択される）の構造により示されるような、変性された骨格構造も場合により含まれる。例えば、本発明の非天然アミノ酸は、式ＩＩおよびＩＩＩにより図示されるようなアミノまたはカルボキシル基における置換を含む。このタイプの非天然アミノ酸としては、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレート（共通の２０の天然アミノ酸または非天然側鎖に対応する側鎖を有するものを含むが、これらに限定されない）が挙げられるが、これに限定されない。加えて、α炭素での置換としては、Ｌ、Ｄまたはα−α−二置換アミノ酸、例えば、Ｄ−グルタメート、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシンおよびアミノ酪酸などが場合により挙げられるが、これらに限定されない。他の構造的代替としては、環状アミノ酸、例えばプロリン類似体および３、４、６、７、８および９員環プロリン類似体、βおよびγアミノ酸、例えばβアラニンおよびγ−アミノ酪酸が挙げられる。
【０１９３】
多数の非天然アミノ酸が、天然アミノ酸、例えばチロシン、グルタミンおよびフェニルアラニンなど、に基づくものであり、本発明での使用に適する。チロシン類似体としては、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、およびメタ置換チロシンが挙げられるが、これらに限定されず、この場合、前記置換チロシンは、ケト基（アセチル基を含むが、これに限定されない）、ベンジル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖もしくは分枝炭化水素、飽和もしくは不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基またはアルキニル基など（これらを含むが、これらに限定されない）を含む。加えて、多置換アリール基も考えられる。本発明での使用に適するグルタミン類似体としては、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換誘導体、環状誘導体、および置換グルタミン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明での使用に適切であり得るフェニルアラニン類似体の例としては、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニンおよびメタ置換フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されず、この場合、前記置換基は、ヒドロキシル基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（アセチル基を含むが、これに限定されない）、ベンゾイルまたはアルキニル基など（を含むが、これらに限定されない）を含む。本発明での使用に適切であり得る非天然アミノ酸の具体的な例としては、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソポリペプチド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンおよびｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明での使用に適切であり得る様々な非天然アミノ酸の構造の例は、例えば、「非天然アミノ酸のインビボ組み込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）」と題する国際公開第２００２／０８５９２３号に提供されている。追加のメチオニン類似体については、Ｋｉｉｃｋら、（２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｚｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ，ＰＮＡＳ  ９９：１９−２４も参照のこと。
【０１９４】
１つの実施態様では、非天然アミノ酸（例えば、ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン）を含むｈＧＨポリペプチドの組成物を提供する。ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニンを含み、ならびにタンパク質および／または細胞を含む（しかし、これらに限定されない）様々な組成物も提供する。一つの側面において、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン非天然アミノ酸を含む組成物は、直交性ｔＲＮＡをさらに含む。前記非天然アミノ酸は、前記直交性ｔＲＮＡに結合（共有結合を含むが、これに限定されない）していてもよく、これは、アミノアシル結合により直交性ｔＲＮＡに共有結合していてもよい、直交性ｔＲＮＡの末端リボース糖の３’ＯＨまたは２’ＯＨに共有結合していてもよい、などを含むが、これらに限定されない。
【０１９５】
タンパク質に組み込むことができる非天然アミノ酸による化学部分により、このタンパク質の様々な利点および操作が提供される。例えば、ケト官能基のユニークな反応性により、多数のヒドラジン含有またはヒドロキシルアミン含有試薬のいずれかでのタンパク質をインビトロおよびインビボで選択的に変性することができる。例えば、重原子非天然アミノ酸は、Ｘ線構造データの同期に有用であり得る。非天然アミノ酸を使用する重電子の部位特異的導入は、重電子の位置の選択に関する選択性および自由度ももたらす。光反応性非天然アミノ酸（ベンゾフェノンおよびアリールアジド（フェニルアジドを含むが、これに限定されない）を有するアミノ酸を含むが、これらに限定されない）は、タンパク質の効率的なインビボおよびインビトロ光架橋を可能にする。光反応性非天然アミノ酸の例としては、ｐ−アジド−フェニルアラニンおよびｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。そういうわけで、光反応性非天然アミノ酸を有するタンパク質は、光反応性基の励起をもたらす一時的制御により随意に架橋させることができる。一例では、核磁気共鳴および振動分光学を使用して（これを含むが、これに限定されない）、非天然アミノのメチル基を、局所的構造および動態のプローブとして同位体標識されたメチル基（これを含むが、これに限定されない）で置換することができる。例えば、アルキニルまたはアジド官能基により、［３＋２］付加環化反応による分子でのタンパク質の選択的修飾が可能となる。
【０１９６】
ポリペプチドのアミノ末端に組み込まれる天然でないアミノ酸は、２０の天然アミノ酸に用いられているもの以外のいずれかの置換基であるＲ基、およびα−アミノ酸中に通常存在するＮＨ２基とは異なる第二の反応性基（式Ｉ参照）から成り得る。類似の天然でないアミノ酸を、α−アミノ酸中に通常存在するＣＯＯＨ基とは異なる第二の反応性基（式Ｉ参照）を有するカルボキシル末端に、組み込むことができる。
【０１９７】
非天然アミノ酸の化学合成
本発明での使用に適する非天然アミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ（米国）またはＡｌｄｒｉｃｈ（米国、ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から市販されている。市販されていないものは、本明細書において提供するように、または様々な出版物に提供されているように、または当業者に公知である標準的な方法を使用して、場合によっては合成される。有機合成法については、例えば、ＦｅｓｓｅｎｄｏｎおよびＦｅｓｓｅｎｄｏｎによるＯｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＣａｒｅｙ  ａｎｄ  ＳｕｎｄｂｅｒｇによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照。非天然アミノ酸の合成を記載している追加の出版物としては、例えば、「非天然アミノ酸のインビボ組み込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）」と題する国際公開第２００２／０８５９２３号；Ｍａｔｓｏｕｋａｓら、（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．＆  Ｋｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）  Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  ｙ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．＆  Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．（１９５９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．ら（１９８８）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）．  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ，Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ．＆  Ｆｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．（１９９１）Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ．＆  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．＆  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐ���ｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  （＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎら、（１９８７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−  ａｎｄ  Ｄ−ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｌ−ａ−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；およびＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら、（１９９２）Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａｎｏｖｅｌ  ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ．  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７参照。２００３年１２月２２日出願、出願番号１０／７４４，８９９の「プロテインアレイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ）」と題する特許出願および２００２年１２月２２日出願、出願番号６０／４３５，８２１の特許出願も参照。
【０１９８】
Ａ．カルボニル反応性基
カルボニル反応性基を有するアミノ酸は、数ある中でも求核付加またはアルドール縮合反応により分子（ＰＥＧまたは他の水溶性分子が挙げられるが、これらに限定されない）に連結する様々な反応を可能にする。
【０１９９】
カルボニル含有アミノ酸の具体例は、次のように表すことができる：
【０２００】
【化１０】
2007519420.tif 000009
（式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキルおよび置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはアミノ末端修飾基であり；ならびにＲ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である）。一部の実施態様において、ｎは、１であり、Ｒ１は、フェニルであり、Ｒ２は、単純アルキル（すなわち、メチル、エチルまたはプロピル）であり、ならびにケトン部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。一部の実施態様において、ｎは、１であり、Ｒ１は、フェニルであり、Ｒ２は、単純アルキル（すなわち、メチル、エチルまたはプロピル）であり、ならびにケトン部分は、アルキル側鎖に対してメタ位に位置する。
【０２０１】
ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンおよびｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンは、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている（これは、本明細書に参照により組み込まれている）。当業者は、他のカルボニル含有アミノ酸を同様に調製することができる。
【０２０２】
一部の実施態様では、天然にはコードされないアミノ酸を含むポリペプチドを化学修飾して、反応性カルボニル官能基を生じさせる。例えば、コンジュゲーション反応に有用なアルデヒド官能基は、隣接したアミノ基とヒドロキシル基を有する官能基から生じさせることができる。この生物活性分子がポリペプチドである場合、例えば、Ｎ末端セリンまたはトレオニン（これは、正常に存在するものであってもよいし、または化学的または酵素的消化により露出されていてもよい）を使用して、穏やかな酸化分解条件下、過ヨウ素酸塩の使用により、アルデヒド官能基を生じさせることができる。例えば、Ｇａｅｒｔｎｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：２６２−２６８（１９９２）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．＆  Ｓｔｒｏｈ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｇａｅｒｔｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７２２４−７２３０（１９９４）参照。しかし、当該技術分野において公知である方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端のアミノ酸に限定されない。
【０２０３】
本発明では、隣接したヒドロキシル基およびアミノ基を有する天然にはコードされないアミノ酸を、「マスクされた」アルデヒド官能基としてポリペプチドに組み込むことができる。例えば、５−ヒドロキシリシンは、イプシロンアミンに隣接したヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生じさせるための反応条件は、このポリペプチド内の他の部位での酸化を回避するために、穏やかな条件下でモル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加することを一般に含む。酸化反応のｐＨは、典型的には約７．０である。典型的な反応は、約１．５モル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを緩衝ポリペプチド溶液に添加し、次いで、暗所で約１０分間、インキュベートすることを含む。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号参照（これは、本明細書に参照により組み込まれている）。
【０２０４】
カルボニル官能基は、水溶液中、穏やかな条件下で、ヒドラジン含有、ヒドラジド含有、ヒドロキシルアミン含有、またはセミカルバジド含有試薬と選択的に反応させて、生理条件下で安定な、対応するヒドラゾン、オキシムまたはセミカルバゾンリンケージをそれぞれ形成することができる。例えば、Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，４７５−４８１（１９５９）；Ｓｈａｏ，Ｊ．およびＴａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）参照。さらに、このカルボニル基のユニークな反応性により、他のアミノ酸側鎖の存在下での選択的修飾が可能となる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１（１９９６）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．＆  Ｓｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｍａｈａｌ，Ｌ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１１２５−１１２８（１９９７）参照。
【０２０５】
Ｂ．ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド反応性基
ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジドなどの求核性の基を含有する天然にはコードされないアミノ酸により、様々な求電子性の基（ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーを含むが、これらに限定されない）と反応してコンジュゲートを形成することが可能となる。
【０２０６】
ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド含有アミノ酸の具体例は、次のように表すことができる：
【０２０７】
【化１１】
2007519420.tif 000010
（式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルもしくは置換アリールであるか、存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮもしくはＳであるか、存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはアミノ末端修飾基であり；ならびにＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である）。
【０２０８】
一部の実施態様において、ｎは、４であり、Ｒ１は、存在せず、Ｘは、Ｎである。一部の実施態様において、ｎは、２であり、Ｒ１は、存在せず、Ｘは、存在しない。一部の実施態様において、ｎは、１であり、Ｒ１は、フェニルであり、Ｘは、Ｏであり、酸素原子は、アリール環上の脂肪族基に対してパラに位置する。
【０２０９】
ヒドラジド含有、ヒドラジン含有、およびセミカルバジド含有アミノ酸は、市場の供給業者から入手することができる。例えば、Ｌ−グルタメート−γ−ヒドラジンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ミズーリ州、セントルイス）から入手できる。市販されていない他のアミノ酸は、当業者により調製され得る。例えば、米国特許第６，２８１，２１１号参照（これは、本明細書に参照により組み込まれている）。
【０２１０】
ヒドラジド、ヒドラジンまたはセミカルバジド基を有する、天然にはコードされないアミノ酸を含有するポリペプチドを、アルデヒドまたは類似の化学反応性を有する他の官能基を含有する様々な分子と効率的および選択的に反応させることができる。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．およびＴａｍ，Ｊ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）参照。ヒドラジド、ヒドラジンおよびセミカルバジド官能基のユニークな反応性は、２０の共通アミノ酸上に存在する求電子性の基（セリンもしくはトレオニンのヒドロキシル基、またはリシンおよびこのＮ末端のアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない）と比較して、アルデヒド、ケトンおよび他の求電子性の基に対するこれらの反応性を有意に高くする。
【０２１１】
Ｃ．アミノオキシ含有アミノ酸
アミノオキシ（ヒドロキシルアミンとも呼ばれる）を含有する天然にはコードされないアミノ酸により、様々な求電子性の基（ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーを含むが、これらに限定されない）と反応してコンジュゲートを形成することが可能となる。ヒドラジン、ヒドラジドおよびセミカルバジドと同様、アミノオキシ基の強化された求核性により、アルデヒドまたは同様の化学反応性を有する他の官能基を含有する様々な分子と効率的および選択的に反応することが可能となる。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．およびＴａｍ，Ｊ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）；Ｈ．ＨａｎｇおよびＣ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：７２７−７３６（２００１）参照。しかし、ヒドラジン基との反応の結果が対応するヒドラゾンであるのに対し、オキシムは、一般に、アミノオキシ基とカルボニル含有基、例えばケトンとの反応から生じる。
【０２１２】
アミノオキシ基含有アミノ酸の具体例は、次のように表すことができる：
【０２１３】
【化１２】
2007519420.tif 000011
（式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであるか、存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、存在せず；ｍは、０から１０であり；Ｙ＝Ｃ（Ｏ）または存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはアミノ末端修飾基であり；ならびにＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である）。一部の実施態様において、ｎは、１であり、Ｒ１は、フェニルであり、Ｘは、Ｏであり、ｍは、１であり、Ｙは、存在する。一部の実施態様において、ｎは、２であり、Ｒ１およびＸは、存在せず、ｍは、０であり、Ｙは、存在しない。
【０２１４】
アミノオキシ含有アミノ酸は、容易に入手できるアミノ酸前駆体（ホモセリン、セリンおよびトレオニン）から調製することができる。例えば、Ｃａｒｒａｓｃｏ  ａｎｄ  Ｒ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６８：８８５３−８８５８（２００３）参照。一定のアミノオキシ含有アミノ酸、例えば、Ｌ−２−アミノ−４−（アミノオキシ）酪酸）は、天然源から単離されている（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｇ．ら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６０：１６３５−１６４１（１９９７））。他のアミノオキシ含有アミノ酸は、当業者により調製され得る。
【０２１５】
Ｄ．アジドおよびアルキン反応性基
アジドおよびアルキン官能基のユニークな反応性が、これらをポリペプチドおよび他の生体分子の選択的修飾に極めて有用にしている。一般に、有機アジド、特に脂肪族アジド、およびケトンは、通常の反応性化学条件に対して安定である。特に、アジド官能基とアルキン官能基の両方が、自然発生ポリペプチドにおいて見出される２０の共通アミノ酸の側鎖（すなわち、Ｒ基）に対して不活性である。しかし、近接させると、アジド基およびアルキン基の「ｓｐｒｉｎｇ−ｌｏａｄｅｄ」特性が現れ、これらがＨｕｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応により選択的および効率的に反応して、対応するトリアゾールを生じさせる。例えば、Ｃｈｉｎ  Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１：９６４−７（２００３）；Ｗａｎｇ，Ｑ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，３１９２−３１９３（２００３）；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）参照。
【０２１６】
Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化は、求核置換ではなく選択的付加環化を伴う（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．，ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳにおいて，Ｖｏｌ．４，（ｅｄ．Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，１９９１），ｐ．１０６９−１１０９；Ｈｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．  １，３−ＤＩＰＯＬＡＲ  ＣＹＣＬＯＡＤＤＩＴＩＯＮ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹにおいて，（ｅｄ．Ｐａｄｗａ，Ａ．，１９８４），ｐ．１−１７６参照）ため、アジドおよびアルキン含有側鎖を有する天然にはコードされないアミノ酸の組み込みにより、結果として生じるポリペプチドをこの天然にはコードされないアミノ酸の位置で選択的に修飾することができる。アジドまたはアルキン含有ｈＧＨポリペプチドを伴う付加環化反応は、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）にインサイチューで還元するための還元剤が触媒量で存在する状態でのＣｕ（ＩＩ）の添加（触媒量のＣｕＳＯ４の形態での添加を含むが、これに限定されない）により、室温、水性条件下で行うことができる。例えば、Ｗａｎｇ，Ｑ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，３１９２−３１９３（２００３）；Ｔｏｒｎｏｅ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４（２００２）；Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９（２００２）参照。還元剤の具体例としては、アスコルベート、金属銅、キノリン、ヒドロキノン、ビタミンＫ、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、および負荷電位が挙げられる（挙げられるが、これらに限定されない）。
【０２１７】
アジドとアルキンの間のＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応が所望される一部のケースでは、ｈＧＨポリペプチドが、アルキン部分を含む天然にはコードされないアミノ酸を含み、このアミノ酸に取り付けられる水溶性ポリマーが、アジド部分を含む。また、逆の反応（すなわち、アミノ酸上のアジド部分と水溶性ポリマー上のアルキン部分との反応）も行うことができる。
【０２１８】
アリールエステルを含有し、アリールホスフィン部分で適切に官能化された水溶性ポリマーとアジド官能基を選択的に反応させて、アミドリンケージを生じさせることもできる。アリールホスフィン基が、アジドをインサイチューで還元し、次に結果として生じたアミンが、隣接するエステルリンケージと効率的に反応して、対応するアミドを生じさせる。例えば、Ｅ．ＳａｘｏｎおよびＣ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，２００７−２０１０（２０００）参照。このアジド含有アミノ酸は、アルキルアジド（２−アミノ−６−アジド−１−へキサン酸を含むが、これに限定されない）またはアリールアジド（ｐ−アジド−フェニルアラニン）のいずれかであり得る。
【０２１９】
アリールエステルおよびホスフィン部分を含有する水溶性ポリマーの具体例は、次のように表すことができる：
【０２２０】
【化１３】
2007519420.tif 000012
（式中、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり得るか、存在せず、Ｐｈは、フェニルであり、Ｗは、水溶性ポリマーであり、Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキルおよび置換アリール基であり得る）。Ｒ基の具体例としては、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＣＮおよび−ＮＯ２が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””は、各々、独立して、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール（１から３個のハロゲンで置換されているアリールを含むが、これに限定されない）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が、１つより多くＲ基を含む場合、各Ｒ基は、１つり多くのＲ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””基が存在するときの各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””基であるかのように、独立して選択される。Ｒ’およびＲ”が、同じ窒素原子に取り付けられている場合、これらは、この窒素原子と協力して、５、６または７員環を形成する。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含む（しかし、これらに限定されない）ものと考える。置換基の上での論議から、用語「アルキル」が、水素原子以外に結合した炭素原子を含む基、例えば、ハロアルキル（−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３を含むが、これらに限定されない）およびアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含むが、これらに限定されない）を包含するものと考えることは、当業者には理解されるであろう。
【０２２１】
チオエステルを含有し、アリールホスフィン部分で適切に官能化された水溶性ポリマーとアジド官能基を選択的に反応させて、アミドリンケージを生じさせることもできる。アリールホスフィン基が、アジドをインサイチューで還元し、結果として生じたアミンが、次いで、チオエステルリンケージと効率的に反応して、対応するアミドを生じさせる。チオエステルおよびホスフィン部分を含有する水溶性ポリマーの具体例は、次のように表すことができる：
【０２２２】
【化１４】
2007519420.tif 000013
（式中、ｎは、１から１０であり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり得るか、存在せず；Ｐｈは、フェニルであり；Ｗは、水溶性ポリマーである）。
【０２２３】
アルキン含有アミノ酸の具体例は、次のように表すことができる：
【０２２４】
【化１５】
2007519420.tif 000014
（式中、ｎは、１から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであるか、存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、存在せず；ｍは、０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；ならいびにＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。一部の実施態様において、ｎは、１であり、Ｒ１は、フェニルであり、Ｘは、存在せず、ｍは、０であり、アセチレン部分は、このアルキル側鎖のパラ位に位置する。一部の実施態様において、ｎは、１であり、Ｒ１は、フェニルであり、Ｘは、Ｏであり、ｍは、１であり、ならびにプロパルギルオキシ基は、このアルキル鎖に対してパラ位に位置する（すなわち、Ｏ−プロパルギル−チロシン）。一部の実施態様において、ｎは、１であり、Ｒ１およびＸは、存在せず、ｍは、０である（すなわち、プロパリールグリシン）。
【０２２５】
アルキル含有アミノ酸は、市販されている。例えば、プロパルギルグリシンは、Ｐｅｐｔｅｃｈ（マサチューセッツ州、バーリントン）から市販されている。また、アルキン含有アミノ酸は、標準的な方法に従って調製することができる。例えば、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンは、例えば、Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ａ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１１７８２−１１７８３（２００３）に記載されているように合成することができ、４−アルキン−Ｌ−フェニルアラニンは、Ｋａｙｓｅｒ，Ｂ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３（７）：２４７５−２４８４（１９９７）に記載されているように合成することができる。他のアルキン含有アミノ酸は、当業者により調製され得る。
【０２２６】
アジド含有アミノ酸の具体例は、次のように表すことができる：
【０２２７】
【化１６】
2007519420.tif 000015
（式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールであるか、存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、存在せず；ｍは、０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはアミノ末端修飾基であり；ならびにＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である）。一部の実施態様において、ｎは、１であり、Ｒ１は、フェニルであり、Ｘは、存在せず、ｍは、０であり、ならびにアジド部分は、このアルキル側鎖に対してパラに位置する。一部の実施態様において、ｎは、０から４であり、Ｒ１およびＸは、存在せず、ならびにｍ＝０である。一部の実施態様において、ｎは、１であり、Ｒ１は、フェニルであり、Ｘは、Ｏであり、ｍは、２であり、ならびにβ−アジドエトキシ部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。
【０２２８】
アジド含有アミノ酸は、市場の供給業者から入手することができる。例えば、４−アジドフェニルアラニンは、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（イリノイ州、ウッド・デール）から入手することができる。市販されていないアジド含有アミノ酸については、適する脱離基（ハロゲン化物、メシレート、トシレートを含むが、これらに限定されない）による方法または適切に保護されたラクトンの開環による方法をはじめとする（しかし、これらに限定されない）当業者に公知である標準的な方法を使用して、比較的容易に調製することができる。例えば、ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照。
【０２２９】
Ｅ．アミノチオール反応性基
ベータ置換アミノチオール官能基のユニークな反応性が、これらを、チアゾリジンの形成によるアルデヒド基を含有するポリペプチドおよび他の生物活性分子の選択的置換に、極めて有用にしている。例えば、Ｊ．ＳｈａｏおよびＪ．Ｔａｍ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７（１４）３８９３−３８９９参照。一部の実施態様では、ベータ置換アミノチオールアミノ酸をｈＧＨポリペプチドに組み込み、次いで、アルデヒド官能基を含む水溶性ポリマーと反応させることができる。一部の実施態様において、水溶性ポリマー、薬物コンジュゲートまたは他のペイロードを、ベータ置換アミノチオールを含むｈＧＨポリペプチドに、チアゾリジンの形成経由でカップリングさせることができる。
【０２３０】
非天然アミノ酸の細胞取り込み
真核細胞による非天然アミノ酸取り込みは、タンパク質への組み込み（これを含むが、これに限定されない）のために非天然アミノ酸を設計および選択する際に典型的に考えられる一つの論点である。例えば、高電荷密度のα−アミノ酸は、これらの化合物が細胞透過性である可能性が高いことを暗示している。天然アミノ酸は、タンパク質に基づく輸送系の収集により、真核細胞に取り込まれる。もし必要であれば、どの非天然アミノ酸が細胞によって取り込まれるかを評価する迅速スクリーニングを行うことができる。例えば、毒性アッセイ、例えば、出願番号１０／７４４，８９９の「プロテインアレイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ）」と題する特許出願および２００２年１２月２２日出願、出願番号６０／４３５，８２１の特許出願、ならびにＬｉｕ，Ｄ．Ｒ．＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．  ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ９６：４７８０−４７８５におけるものを参照のこと。取り込みは、様々なアッセイで容易に分析されるが、細胞取り込み経路に適する非天然アミノ酸の設計に代わるものは、インビボでアミノ酸を作るための生合成経路の提供である。
【０２３１】
非天然アミノ酸の生合成
アミノ酸および他の化合物を生産するための多数の生合成経路が、既に細胞内に存在する。真核細胞（これを含むが、これに限定されない）における特定の非天然アミノ酸の生合成方法は、天然には存在し得ないが、本発明は、こうした方法を提供する。例えば、新たな酵素の追加または既存の宿主細胞経路の修飾により、宿主細胞において非天然アミノ酸の生合成経路を場合により発生させる。追加の新たな酵素は、場合により、自然発生酵素または人工的に発生させた酵素である。例えば、ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成（例えば、「非天然アミノ酸のインビボ組み込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｅｓ）」と題する国際公開第２００２／０８５９２３号の一実施例に提示されているようなもの）は、他の生物からの公知酵素の組合せの追加に依存する。これらの酵素の遺伝子は、これらの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換させることにより、真核細胞に組み込むことができる。遺伝子は、細胞において発現されると、所望の化合物を合成するための酵素的経路を生じさせる。場合により追加される酵素のタイプの例は、下の実施例において提供する。追加の酵素の配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて見つけられる。人工的に発生させた酵素も同じ要領で細胞に場合によっては追加される。この要領で、細胞機構および細胞資源を操作して、非天然アミノ酸を生産する。
【０２３２】
様々な方法が、生合成経路で使用するための新規酵素を生産するために、または既存経路の発生ために利用することができる。例えば、Ｍａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．により開発されたもの（これを含むが、これに限定されない）（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍで利用可能）のような再帰的組換えを場合によっては使用して、新規酵素および経路を開発する。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４），Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０（４）：３８９−３９１；およびＳｔｅｍｍｅｒ，（１９９４），ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１：１０７４７−１０７５１参照。同様に、Ｇｅｍｅｃｏｒにより開発されたＤｅｓｉｇｎＰａｔｈ（商標）（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｇｅｎｅｃｏｒ．ｃｏｍで利用可能）が、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンを細胞で作る経路を操作する（これを含むが、これに限定されない）代謝経路操作に場合により使用される。この技術は、機能的ゲノムにより同定される（これを含むが、これに限定されない）新たな遺伝子の組に合わせならびに分子の発生および設計を用いて宿主生物における既存の経路を再構築する。Ｄｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍで利用可能）も、新規経路をつくるため（これを含むが、これに限定されない）の遺伝子ライブラリおよび遺伝子経路を迅速にスクリーニングする技法を提供している。
【０２３３】
典型的に、本発明の被操作生合成経路で生産される非天然アミノ酸は、天然の細胞量を含む（しかし、これに限定されない）効率的なタンパク質生合成に十分であるが、他のアミノ酸の濃度に影響を及ぼしたり、細胞資源を枯渇させたりしない程度の濃度で生産される。この要領でインビボで生産される典型的な濃度は、約１０ｍＭから約０．０５ｍＭである。特定の経路および非天然アミノ酸に望ましい酵素を生産するために使用される遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換したら、場合によりインビボ選択を利用して、リボソームタンパク質生合成と細胞成長の両方のためにこの非天然アミノ酸の生産をさらに最適化する。
【０２３４】
非天然アミノ酸を有するポリペプチド
非天然アミノ酸の組み込みは、目的に合わせたタンパク質構造および／または機能変更、サイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼターゲット部位の接近容易性の変更、ある部分に対するターゲット設定（タンパク質アレイのためのものを含むが、これに限定されない）などを含む（しかし、これらに限定されない）様々な目的のために行うことができる。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、強化された、またはそれどころか全く新しい触媒または生合成経路を有することができる。例えば、タンパク質に非天然アミノ酸を含めることにより、次の特性が場合によっては修飾される：毒性、生体内分布、構造特性、分光特性、化学および／または光化学特性、触媒能、半減期（血清半減期を含むが、これに限定されない）ならびに他の分子と反応する（「共有結合的に」または「非共有結合的に」を含むが、これらに限定されない）能力。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物は、例えば、新規療法、診断、触媒性酵素、工業用酵素、タンパク質（酵素を含むが、これに限定されない）結合、ならびにタンパク質構造および機能の研究（を含むが、これらに限定されない）に有用である。例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ（２０００）Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２参照。
【０２３５】
本発明の一つの側面において、組成物は、少なくとも１つ（少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、もしくは少なくとも１０またはそれ以上を含むが、これらに限定されない）の非天然アミノ酸を有する少なくとも１つのタンパク質を含む。これらの非天然アミノ酸は、同じであることもあり、または異なることもある（１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質に、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上の異なる部位が存在し得ることを含むが、これらに限定されない）。もう一つの側面において、組成物は、このタンパク質中に存在する少なくとも１つ、しかしすべてよりは少ない特定のアミノ酸が、非天然アミノ酸で置換されているタンパク質を含む。１つより多くの非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質については、これらの非天然アミノ酸が、同じであることもあり、または異なることもある（タンパク質が、２つまたはそれ以上の異なるタイプの非天然アミノ酸を含むこともあり、または２つの同じ非天然アミノ酸を含むこともあるということを含む、これらに限定されない）。２つまたはそれ以上の非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質については、これらの非天然アミノ酸は、同じであることもあり、異なることもあり、または同じ種類の多数の非天然アミノ酸と少なくとも１つの異なる非天然アミノ酸の組合せであることもある。
【０２３６】
少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する、対象となるタンパク質またはポリペプチドが、本発明の一つの特徴である。本発明は、本発明の組成物および方法を使用して生産される、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するポリペプチドまたはタンパク質も包含する。賦形剤（医薬的に許容される賦形剤を含むが、これに限定されない）も本タンパク質とともに存在し得る。
【０２３７】
真核細胞において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する、対象となるタンパク質またはポリペプチドを生産することにより、タンパク質またはポリペプチドは、真核性後処理修飾を一般に含むこととなる。一定の実施態様において、タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸と、真核細胞によってインビボで行われる少なくとも１つの後翻訳修飾とを含み、この後翻訳修飾は、原核細胞によって行われない。例えば、この後翻訳修飾には、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、糖脂質リンケージ修飾およびグリコシル化などが挙げられるが、これらに限定されない。一つの側面における後翻訳修飾としては、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギンリンケージへのオリゴ糖の取り付け（（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）を含むが、これに限定されない）が挙げられる。真核性タンパク質のＮ結合型オリゴ糖の一部の例を記載している（示されていない追加の残基も存在する）表１を参照のこと。もう一つの側面における後翻訳修飾としては、ＧａｌＮＡｃ−セリンもしくはＧａｌＮＡｃ−トレオニンリンゲージまたはＧｌｃＮＡｃ−セリンもしくはＧｌｃＮＡｃ−トレオニンリンケージによるセリンまたはトレオニンへのオリゴ糖の取り付け（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどを含むが、これらに限定されない）が挙げられる。
【０２３８】
【表２】
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2007519420.tif 000017
【０２３９】
さらにもう一つの側面における後翻訳修飾としては、前駆体（カルシトニン前駆体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体、プレプロ副甲状腺ホルモン、プレプロインスリン、プロインスリン、プレプロオピオメラノコルチンおよびプロオピオメラノコルチンなどを含むが、これらに限定されない）の真核性プロセッシング、多サブユニットタンパク質への組立てもしくは高分子組立て、細胞内の別の部位への翻訳（細胞器官、例えば、小胞体、ゴルジ体、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、小胞などへのもの、または分泌経路によるものを含むが、これらに限定されない）が挙げられる。一定の実施態様において、タンパク質は、分泌もしくは局在化配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグまたはＧＳＴ融合などを含む。米国特許第４，９６３，４９５号および同第６，４３６，６７４号（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）には、ｈＧＨポリペプチドの分泌を改善するように設計された構築物が詳述されている。
【０２４０】
非天然アミノ酸の一つの利点は、それが、追加分子を付加させるために使用することができる追加の化学部分を提供することである。これらの修飾は、真核細胞もしくは非真核細胞においてインビボで、またはインビトロで行うことができる。従って、一定の実施態様において、後翻訳修飾は、非天然アミノ酸によるものである。例えば、後翻訳修飾は、求核−求電子反応によるものであり得る。タンパク質の選択的修飾に現在使用されている殆どの反応が、α−ハロケトンとヒスチジンまたはシステイン側鎖との反応を含む（しかし、これらに限定されない）、求核性反応パートナーと求電子性反応パートナーの間の共有結合形成を含む。これらの場合の選択性は、このタンパク質中の求核性残基の数および接近容易性によって決まる。本発明のタンパク質では、他のより選択的な反応、例えば、非天然ケトアミノ酸とヒドラジンまたはアミノオキシ化合物とのインビトロおよびインビボでの反応、を用いることができる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈら、（１９９６）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１５０−８１５１；Ｍａｈａｌら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１２５−１１２８；Ｗａｎｇら、（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎら、（２００２）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇら、（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００：５６−６１；Ｚｈａｎｇら、（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４２：６７３５−６７４６；およびＣｈｉｎら、（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ参照。これは、蛍光体、架橋剤、糖誘導体および細胞毒性分子をはじめとする試薬の宿主での実質的にあらゆるタンパク質の選択的標識を可能にする。２００３年１月１６日出願の「糖タンパク質合成（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」と題する米国特許出願番号１０／６８６，９４４参照（これは、本明細書に参照により組み込まれている）。アジドアミノ酸によるものをはじめとする（しかし、これに限定されない）後翻訳修飾は、シュタウディンガーライゲーション（トリアリールホスフィン試薬でのものを含むが、これに限定されない）によって行うこともできる。例えば、Ｋｉｉｃｋら、（２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｚｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ，ＰＮＡＳ  ９９：１９−２４参照。
【０２４１】
本発明は、タンパク質を選択的に修飾するためのもう一つの非常に効率的な方法を提供し、この方法は、セレクターコドンに応答してのタンパク質への非天然アミノ酸（アジドまたはアルキニル部分を含有するものを含むが、これらに限定されない）の遺伝子組み込みを含む。次に、これらのアミノ酸側鎖は、それぞれアルキニルまたはアジド誘導体（これらを含むが、これらに限定されない）とのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応（これを含むが、これに限定されない）により、修飾することができる（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．  ｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｖｏｌ．４，（１９９１）  Ｅｄ．Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．１０６９−１１０９；およびＨｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．、１，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおいて，（１９８４）  Ｅｄ．Ｐａｄｗａ，Ａ．，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．１−１７６参照）。この方法は、求核置換ではなく付加環化を要するため、極めて高い選択性でタンパク質を修飾することができる。この反応は、反応混合物への触媒量のＣｕ（Ｉ）塩の添加により、室温、水性条件下、卓越した位置選択性（１，４＞１，５）で行うことができる。例えば、Ｔｏｒｎｏｅら、（２００２）Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４；およびＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９参照。使用することができるもう一つの方法は、テトラシステインモチーフを有する二砒酸化合物を用いるリガンド交換である。例えば、Ｇｒｉｆｆｉｎら、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２６９−２７２参照。
【０２４２】
［３＋２］付加環化により本発明のタンパク質に付加させることができる分子としては、アジドまたはアルキニル誘導体を有する実施的にあらゆる分子が挙げられる。分子としては、色素、蛍光体、架橋剤、糖誘導体、ポリマー（ポリエチレングリコールの誘導体を含むが、これに限定されない）、光架橋剤、細胞毒性化合物、親和性ラベル、ビオチンの誘導体、樹脂、ビーズ、第二のタンパク質またはポリペプチド（またはそれ以上）、ポリヌクレオチド（複数を含む）（ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含むが、これらに限定されない）、金属キレート化剤、補助因子、脂肪酸および炭水化物などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの分子は、アルキニル基を有する非天然アミノ酸（ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを含むが、これに限定されない）またはアジド基を有する非天然アミノ酸（ｐ−アジド−フェニルアラニンを含むが、これに限定されない）に付加させることができる。
【０２４３】
Ｖ．遺伝的にコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのインビボ生成
本発明のｈＧＨポリペプチドは、修飾されたｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンセターゼを使用して、自然発生系ではコードされないアミノ酸に付加させる、またはこれらを置換することにより、インビボで生じさせることができる。
【０２４４】
自然発生系ではコードされないアミノ酸を使用するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンセターゼの生成方法は、例えば、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）および同第２００３／０１０８８８５号（出願番号１０／１２６，９３１）（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている。これらの方法は、この翻訳系に対して内在性の（従って、時として「直交性」と呼ばれる）シンセターゼおよびｔＲＮＡの、独立して機能する翻訳機構の生成を含む。典型的に、この翻訳系は、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。典型的に、Ｏ−ＲＳは、この翻訳系に少なくとも１つの非天然発生アミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、このＯ−ｔＲＮＡが、この系内の他のｔＲＮＡによって認識されない少なくとも１つのセレクターコドンを認識する。従って、この翻訳系は、コードされたセレクターコドンに応答して、この系内で生産されたタンパク質に天然にはコードされないアミノ酸を挿入し、この結果、このコードされたポリペプチド内の一定の位置にアミノ酸を置換する。
【０２４５】
ポリペプチドへの特定の合成アミノ酸の挿入のための多種多様な直交性ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼが、当該技術分野において説明されており、一般に、本発明での使用に適する。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼは、Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５６−６１（２００３）およびＺｈａｎｇ，Ｚ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２（２２）：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている。典型的なＯ−ＲＳまたはこの部分は、ポリヌクレオチド配列によりコードされ、ならびに米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号および同第２００３／０１０８８８５号（これらは、各々、本明細書に参照により組み込まれている）に開示されているアミノ酸配列を含む。Ｏ−ＲＳと共に使用するための対応するＯ−ｔＲＮＡも、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）および同第２００３／０１０８８８５号（出願番号１０／１２６，９３１）（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）に開示されている。
【０２４６】
アジド特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ系の一例は、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）に記載されている。ｐ−アジド−Ｌ−ＰｈｅのＯ−ＲＳ配列の具体例としては、米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号（出願番号１０／１２６，９３１）（これは、本明細書に参照により組み込まれている）に開示されているようなヌクレオチド配列  配列番号１４−１６および２９−３２ならびにアミノ酸配列  配列番号４６−４８および６１−６４が挙げられるが、これらに限定されない。本発明での使用に適するＯ−ｔＲＮＡの具体例としては、米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号（出願番号１０／１２６，９３１）（これは、本明細書に参照により組み込まれている）に開示されているようなヌクレオチド配列、配列番号１−３が挙げられるが、これらに限定されない。特定の天然にはコードされないアミノ酸に対して特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの他の例は、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）（これは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている。Ｓ．セレビジエにおいてケト含有アミノ酸とアジド含有アミノ酸の両方を組み込むＯ−ＲＳおよび−ｔＲＮＡが、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−９６７（２００３）に記載されている。
【０２４７】
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの使用は、天然にはコードされないアミノ酸をコードする特定のコドンの分泌を伴う。いずれのコドンを使用してもよいが、Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼが発現される細胞ではめったにまたは絶対に使用されないコドンを選択するのが、一般に望ましい。例えば、コドンの具体例としては、ナンセンスコドン、例えば停止コドン（アンバー、オーカーおよびオパール）、四塩基またはそれ以上の塩基数のコドン、およびめったにまたは全く使用されない他の天然三塩基コドンが挙げられる。
【０２４８】
当該技術分野において公知である突然変異誘発法（部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、制限選択突然変異誘発などが挙げられるが、これらに限定されない）を使用して、特定のセレクターコドン（複数を含む）をｈＧＨポリヌクレオチドコード配列内の適切な部位に導入することができる。
【０２４９】
天然にはコードされないアミノ酸を組み込むために使用することができるＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡおよび直交性Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアなどのタンパク質生合成機構の成分の生成方法は、Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００（２００１）；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）；Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている。天然にはコードされないアミノ酸のインビボ組み込みのための方法および組成物は、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）（これは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている。生物のインビボ翻訳系において使用するための直交性ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼの選択方法も、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）および同第２００３／０１０８８８５号（出願番号１０／１２６，９３１）（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている。
【０２５０】
少なくとも１つの組換え直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を生産する方法は、（ａ）原核生物、例えばメタノコッカス・ヤナシイ、メタロバクテリウム・サーモオートトロフィカム、ハロバクテリウム属、大腸菌、好熱性硫黄細菌、Ｐ．フリオサス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクスもしくはＴ．サーモフィラスなど、または真核生物をはじめとする（しかし、これらに限定されない）第一生物からの少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）から誘導される（場合によっては突然変異）ＲＳのライブラリの生成；（ｂ）天然にはコードされないアミノ酸および天然アミノ酸の存在下で直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する膜についてのＲＳ（場合によっては突然変異ＲＳ）のライブラリの選択（および／またはスクリーニング）、それによる活性（場合によっては突然変異）ＲＳのプールの提供；および／または（ｃ）天然にはコードされないアミノ酸の存在下でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳ（突然変異を含むが、これに限定されない）についての前記プールの選択（場合によってはネガティブ選択によるもの）、それによる少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳの提供を含み、この場合、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳが、Ｏ−ｔＲＮＡを天然にはコードされないアミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
【０２５１】
一つの実施態様において、前記ＲＳは、不活性ＲＳである。この不活性ＲＳは、活性ＲＳを突然変異により生じさせることができる。例えば、この不活性ＲＳは、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、もしくは少なくとも約１０またはそれ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸（アラニンを含むが、これに限定されない）に突然変異させることによって生じさせることができる。
【０２５２】
突然変異ＲＳのライブラリは、タンパク質三次元ＲＳ構造に基づく合理的設計、または無作為もしくは合理的設計法でのＲＳヌクレオチドの突然変異誘発をはじめとする（しかし、これらに限定されない）当該技術分野において公知である様々な技法を使用して生じさせることができる。例えば、突然変異ＲＳは、部位特異的突然変異、ランダム突然変異、多様性発生性組換え突然変異、キメラ構築、合理的設計により、または本明細書に記載のもしくは当該技術分野において公知である他の方法により生じさせることができる。
【０２５３】
一つの実施態様において、天然にはコードされないアミノ酸および天然アミノ酸の存在下で直交性ｒＲＮＢ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアシル化する（これを含むが、これに限定されない）、活性である膜についてのＲＳ（場合によっては突然変異ＲＳ）のライブラリの選択（および／またはスクリーニング）は、ポジティブ選択またはスクリーニングマーカー（抗生物質耐性遺伝子を含むが、これに限定されない）および（場合によっては突然変異）ＲＳのライブラリの多数の細胞への導入［この場合、前記ポジティブ選択および／またはスクリーニングマーカーは、アンバー、オーカーまたはオパールコドンをはじめとする（しかし、これらに限定されない）少なくとも１つのセレクターコドンを含む］；選択剤の存在下での前記多数の細胞の成長；ポジティブ選択またはスクリーニングマーカー内の少なくとも１つのセレクターコドンの抑制よる前記選択および／またはスクリーニング剤の存在下で生存する（または特異的応答を示す）細胞の同定、それによる活性（場合によっては突然変異）ＲＳのプールを含有するポジティブ選択された細胞のサブセットの提供を含む。場合により、前記選択および／またはスクリーニング剤濃度を変化させることができる。
【０２５４】
一つの側面において、前記ポジティブ選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、前記セレクターコドンは、このＣＡＴ遺伝子内のランバー停止コドンである。場合により、前記ポジティブ選択マーカーは、β−ラクタマーゼ遺伝子であり、前記セレクターコドンは、このβ−ラクタマーゼ遺伝子内のアンバー停止コドンである。もう一つの側面において、前記ポジティブスクリーニングマーカーは、蛍光もしくは発光スクリーニングマーカーまたは親和性に基づくスクリーニングマーカー（細胞表面マーカーを含むが、これに限定されない）を含む。
【０２５５】
一つの実施態様において、天然にはコードされないアミノ酸の存在下でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳ（場合によっては突然変異体）についてのネガティブ選択またはスクリーニングは、ポジティブ選択もしくはスクリーニングまたはこのポジティブ選択もしくはスクリーニングからの活性（場合によっては突然変異）ＲＳのプールの、第二の生物の多数の細胞への導入［この場合、前記ネガティブ選択またはスクリーニングマーカーは、少なくとも１つのセレクターコドン（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含むが、これに限定されない）抗生物質耐性遺伝子を含むが、これに限定されない］；ならびに天然にはコードされないアミノ酸およびスクリーニングまたは選択剤を補足した第一の培地内で生存するか、特異的スクリーニング応答を示すが、この天然にはコードされないアミノ酸および選択またはスクリーニング剤を補足していない第二の培地内では生存することまたは特異的応答を示すことができない細胞の同定、それによる、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを有する生存細胞または被スクリーニング細胞の提供を含む。例えば、ＣＡＴ同定プロトコルは、適切なＯ−ＲＳの組換え体を決定する際、ポジティブ選択および／またはネガティブスクリーニングとしての機能を場合によっては果たす。例えば、クローンのプールは、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸を有するまたは有さないＣＡＴ（少なくとも１つのセレクターコドンを含むもの）を収容している増殖プレートを用いて場合により複製される。従って、天然にはコードされないアミノ酸を収容している前記プレートでの排他的に成長するコロニーは、組換えＯ−ＲＳを含有すると見なされる。一つの側面では、前記選択（および／またはスクリーニング）剤の濃度を変化させる。一部の側面では、前記第一生物と第二生物は異なる。例えば、前記第一および／または第二生物は、原核生物、真核生物、哺乳動物、大腸菌、真菌、酵母、古細菌、ユーバクテリウム、植物、昆虫、原生生物などを場合により含む。他の実施態様において、前記スクリーニングマーカーは、蛍光もしくは発光スクリーニングマーカーまたは親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。
【０２５６】
もう一つの実施態様において、活性（場合によっては突然変異）ＲＳのプールについてのスクリーニングまたは選択（ネガティブ選択を含むが、これに限定されない）は、ポジティブ選択段階（ｂ）からの活性突然変異ＲＳのプールの単離；ネガティブ選択またはスクリーニングマーカー（この場合のネガティブまたはスクリーニングマーカーは、少なくとも１つのセレクターコドンを含み、このセレクターコドンとしては、少なくとも１つのセレクターコドンを含む毒性マーカー遺伝子が挙げられるが、これに限定されず、この毒性マーカー遺伝子としては、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子が挙げられるが、これに限定されない）および活性（場合によっては突然変異）ＲＳのプールの、第二の生物の多数の細胞への導入；ならびに天然にはコードされないアミノ酸を補足していない第一倍地内で生存するか、特異的スクリーニング応答を示すが、天然にはコードされないアミノ酸を補足した第二倍地内では生存することおよび特異的スクリーニング応答を示すことができない細胞の同定、それによる、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを有する生存または被スクリーニング細胞の提供を含み、この場合の少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳは、前記天然にはコードされないアミノ酸に対して特異的である。一つの側面において、前記少なくとも１つのセレクターコドンは、約２またはそれ以上のセレクターコドンを含む。こうした実施態様としては、少なくとも１つのセレクターコドンが、２つまたはそれ以上のセレクターコドンを含む実施態様、および第一生物と第二生物が異なる（各生物としては、原核生物、真核生物、哺乳動物、大腸菌、真菌、酵母、古細菌、ユーバクテリウム、植物、昆虫、原生生物などが場合によっては挙げられるが、これらに限定されない）実施態様を、場合により挙げることができる。また、一部の側面としては、ネガティブ選択マーカーが、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子（少なくとも１つのセレクターコドンを有するもの）を含むものが挙げられる。他の側面としては、前記スクリーニングマーカーが、蛍光もしくは発光スクリーニングマーカーまたは親和性に基づくスクリーニングマーカーを場合により含むものを挙げることができる。ここでの実施態様における前記スクリーニングおよび／または選択は、スクリーニングおよび／または選択ストリンジェンシーの変動を場合によっては含む。
【０２５７】
一つの実施態様において、少なくとも１つの組換え直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を生産するための方法は、（ｄ）少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳの単離；（ｅ）この少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳから誘導されるＯ−ＲＳ（場合によっては突然変異したもの）の第二のセットの生成；および（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する能力を含む突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまで、段階（ｂ）および（ｃ）の反復をさらに含む。場合により、少なくとも約２回（これを含むが、これに限定されない）、段階（ｄ）から（ｆ）を反復する。一つの側面において、前記少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳから誘導され突然変異Ｏ−ＲＳの第二セットは、ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換えまたはこれらの組合せをはじめとする（しかし、これらに限定されない）突然変異誘発により生じさせることができる。
【０２５８】
上記方法における、ポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）またはポジティブおよびネガティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）および（ｃ）の両方をはじめとする（しかし、これらに限定されない）選択／スクリーニング段階のストリンジェンシーは、この選択／スクリーニングストリンジェンシーの変更を場合によっては含む。もう一つの実施態様において、ポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）またはポジティブおよびネガティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）および（ｃ）の両方が、レポータの使用を含み、この場合、レポータは、蛍光活性化細胞解析分離（ＦＡＣＳ）により検出され、または発光により検出される。場合により、このレポータは、ファージディスプレイなどを用いて細胞表面上に提示され、天然にはコードされないアミノ酸または類似体に関わる親和性または触媒活性を基に選択される。一つの実施態様において、前記突然変異シンセターゼは、ファージディスプレイなどを用いて細胞表面上に提示される。
【０２５９】
組換え直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の生産方法は、（ａ）第一生物からの、サプレッサｔＲＮＡをはじめとする（しかし、これに限定されない）少なくとも１つのｔＲＮＡから誘導される突然変異ｔＲＮＡのライブラリの生成；（ｂ）第一生物からのＲＳの不在下、第二生物からのアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される（場合によっては突然変異）ｔＲＮＡについての前記ライブラリの選択（ネガティブ選択を含むが、これに限定されない）またはスクリーニング、それによるｔＲＮＡ（場合によっては突然変異体）のプールの提供；および（ｃ）導入された直交性ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーについてのこのｔＲＮＡ（場合によっては突然変異体）のプールの選択またはスクリーニング、それによる少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡの提供を含み、この場合、前記少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識するが、第二生物からのＲＳによって効率的に認識されず、ならびにＯ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。一部の実施態様において、前記少なくとも１つのｔＲＮＡは、サプレッサｔＲＮＡであり、ならびに／または天然および／もしくは非天然塩基のユニークな三塩基コドンを含むか、ナンセンスコドン、レアコドン、非天然コドン、少なくとも４つの塩基を含むコドン、アンバーコドン、オーカーコドンまたはオパール停止コドンである。一つの実施態様において、前記組換えＯ−ｔＲＮＡは、直交性の改善を有する。一部の実施態様において、Ｏ−ｔＲＮＡが、修飾を必要とせずに第二生物から第一生物に場合により移入されることは、理解されるであろう。様々な実施態様において、前記第一および第二生物は、同じであるか、異なり、ならびに原核生物（メタノコッカス・ヤナシイ、メタロバクテリウム・サーモオートトロフィカム、大腸菌、ハロバクテリウム属などを含むが、これらに限定されない）、真核生物、哺乳動物、真菌、酵母、古細菌、真性細菌、植物、昆虫、原生生物など（これらを含むが、これらに限定されない）から場合により選択される。加えて、前記組換えｔＲＮＡは、天然にはコードされないアミノ酸によって場合によりアミノアシル化され、この場合の天然にはコードされないアミノ酸は、天然に、または遺伝子操作により、インビボで生合成される。この天然にはコードされないアミノ酸は、少なくとも第一または第二生物のための成長培地に場合により添加される。
【０２６０】
一つの側面において、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによりアミノアシル化される（場合によっては突然変異）ｔＲＮＡについての前記ライブラリの選択（ネガティブ選択を含むが、これに限定されない）またはスクリーニング（段階（ｂ））は、第二生物からの多数の細胞への毒性マーカー遺伝子および（場合によっては突然変異）ｔＲＮＡのライブラリの導入［この場合、前記毒性マーカー遺伝子は、セレクターコドン（または毒性剤もしくは抑制剤の生産を導く細胞、もしくはこうしたマーカー遺伝子が少なくとも１つのセレクターコドンを含む生物に不可欠な遺伝子）の少なくとも１つを含む］；および生存細胞の選択［この場合、前記生存細胞は、少なくとも１つの直交性ｔＲＮＡまたは非機能性ｔＲＮＡを含む（場合によっては突然変異）ｔＲＮＡのプールを含有する］を含む。例えば、生存細胞は、細胞密度比率比較アッセイ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｒａｔｉｏ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｓｓａｙ）を使用することにより選択することができる。
【０２６１】
もう一つの側面において、前記毒性マーカー遺伝子は、２つまたはそれ以上のセレクターコドンを含むことができる。これらの方法のもう一つの実施態様において、前記毒性マーカー遺伝子は、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子であり、このリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、少なくとも１つのアンバーコドンを含む。場合により、前記リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、２つまたはそれ以上のアンバーコドンを含むことができる。
【０２６２】
一つの実施態様において、導入された直交性ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーについての前記（場合によっては突然変異）ｔＲＮＡのプールの選択またはスクリーニングは、第二生物からの多数の細胞への、Ｏ−ＲＳおよび（場合によっては突然変異）ｔＲＮＡのプールと、ポジティブ選択もしくはスクリーニングマーカー遺伝子または毒性剤の解毒を導く遺伝子の導入［この場合、前記ポジティブマーカー遺伝子は、薬物耐性遺伝子（セレクターコドンのうちの少なくとも１つ、例えば少なくとも１つのアンバー停止コドンを含むβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むが、これに限定されない）またはこの生物に不可欠な遺伝子を含む］；ならびに抗生物質をはじめとする（しかし、これに限定されない）選択またはスクリーニング剤の存在下で成長した生存細胞または被スクリーニング細胞の同定、それによる少なくとも１つの組換えｔＲＮＡを処理する細胞のプールの提供を含み、この場合の少なくとも１つの組換えｔＲＮＡは、Ｏ−ＲＳによりアミノアシル化され、ならびに少なくとも１つのセレクターコドンに応答してアミノ酸をポジティブマーカー遺伝子によりコードされる翻訳産物に挿入する。もう一つの実施態様では、前記選択および／またはスクリーニング剤の濃度を変化させる。
【０２６３】
特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアの生成方法を提供する。これらの方法は、（ａ）第一生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡから誘導される突然変異ｔＲＮＡのライブラリの生成；（ｂ）第二生物からのアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）により、第一生物からのＲＳ不在下でアミノアシル化される（場合によっては突然変異）ｔＲＮＡについて前記のライブラリのネガティブ選択またはスクリーニング、それによる（場合によっては突然変異）ｔＲＮＡのプールの提供；（ｃ）導入された直交性ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーについての前記（場合によっては突然変異）ｔＲＮＡのプールの選択またはスクリーニング、それによる少なくとも１つのＯ−ｔＲＮＡの提供を含む。前記少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第二生物からのＲＳにより効率的に認識されず、およびＯ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。前記方法は、（ｄ）第三生物からの少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）から誘導される（場合によっては突然変異）ＲＳのライブラリの生成；（ｅ）天然にはコードされないアミノ酸および天然アミノ酸の存在下で少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーについての前記突然変異ＲＳのライブ来の選択またはスクリーニング、それによる活性（場合によっては突然変異）ＲＳのプールの提供；ならびに（ｆ）天然にはコードされないアミノ酸不在下で少なくとも１つの組換えＯ−ｒＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性（場合によっては突然変異）ＲＳについての前記プールのネガティブ選択またはスクリーニング、それによる少なくとも１つの特異的Ｏ−ｒＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアの提供も含み、この場合、前記少なくとも１つの特異的Ｏ−ｒＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアは、天然にはコードされないアミノ酸に対して特異的である少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳおよび少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを含む。これらの方法により生産される特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳを包含する。例えば、前記特異的Ｏ−ｒＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアとしては、ｍｕｔＲＮＡ  Ｔｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳペア、例えば、ａｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳペアなど（これらを含むが、これらに限定されない）を挙げることができる。さらに、こうした方法は、第一生物と第三生物が同じである（メタノコッカス・ヤナシイを含むが、これに限定されない）場合を含む。
【０２６４】
第二生物のインビボ翻訳系で使用するための直交性ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼの選択方法も、本発明に包含される。これらの方法は、第二生物からの細胞の第一セットへの、第一生物から単離または誘導されたマーカー遺伝子、ｔＲＮＡおよびアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）の導入；第二生物からの二重重複細胞セットへの前記マーカー遺伝子およびｔＲＮＡの導入；ならびに前記二重重複細胞セットにおいて生存することができない第一セット内の生存細胞についての選択、または前記二重重複細胞セットでは与えることができない特異的スクリーニング応答を示す細胞についてのスクリーニングを含み、この場合、前記第一セットおよびこの二重重複細胞セットは、選択またはスクリーニング剤の存在下で成長させ、前記生存または被スクリーニング細胞は、第二生物のインビボ翻訳系において使用するための直交性ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼペアを含む。一つの実施態様において、比較および選択またはスクリーニングは、インビボ相補性アッセイを含む。前記選択またはスクリーニング剤の濃度は、変化させることができる。
【０２６５】
本発明の生物は、様々な生物および様々な組合せを含む。例えば、本発明の方法の第一および第二生物は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。一つの実施態様において、前記生物は、場合により、メタノコッカス・ヤナシイ、メタロバクテリウム・サーモオートトロフィカム、ハロバクテリウム属、大腸菌、好熱性硫黄細菌、Ｐ．フリオサス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクスもしくはＴ．サーモフィラスなどをはじめとする（しかし、これらに限定されない）真核生物である。また、前記生物は、植物（単子葉植物または双子葉植物などの複雑型植物を含むが、これらに限定されない）、藻類、原生生物、真菌（酵母などを含むが、これらに限定されない）または動物（哺乳動物、昆虫、節足動物などを含むが、これらに限定されない）などをはじめとする（しかし、これらに限定されない）真核生物を場合により含む。もう一つの実施態様において、前記第二生物は、メタノコッカス・ヤナシイ、メタロバクテリウム・サーモオートトロフィカム、ハロバクテリウム属、大腸菌、好熱性硫黄細菌、ハロバクテリウム属、Ｐ．フリオサス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクスまたはＴ．サーモフィラスなどをはじめとする（しかし、これらに限定されない）原核生物である。また、第二生物は、酵母、動物細胞、植物細胞、真菌または哺乳動物細胞などをはじめとする（しかし、これらに限定されない）真核生物であり得る。様々な実施態様において、前記第一生物と第二生物は異なる。
【０２６６】
ＶＩ．ｈＧＨポリペプチドにおける自然には発生しないアミノ酸の位置
本発明は、ｈＧＨポリペプチドへの１つ以上の自然には発生しないアミノ酸の組み込みを考えている。１つ以上の自然には発生しないアミノ酸は、前記ポリペプチドの活性を破壊しない特定の位置に組み込むことができる。これは、疎水性アミノ酸での疎水性アミノ酸の置換、バルキーなアミノ酸でのバルキーなアミノ酸の置換、親水性アミノ酸での親水性アミノ酸の置換をはじめとする（しかし、これらに限定されない）「保存的」置換および／または活性に必要とされない位置での自然には発生しないアミノ酸の挿入を行うことによって達成することができる。
【０２６７】
ｈＧＨの領域は、次のように説明することができる（この場合、ｈＧＨにおけるアミノ酸位置を真ん中の列に示す（配列番号２））：
【０２６８】
【表３】
2007519420.tif 000018
【０２６９】
様々な生物学的および構造的アプローチを利用して、ｈＧＨポリペプチド内の天然にはコードされないアミノ酸での置換に望ましい部位を選択することができる。ポリペプチド鎖のいずれの位置も、天然にはコードされないアミノ酸を組み込むための選択に適すること、および選択が、合理的設計に基づくものであってもよいし、いずれかの所望される目的のためのまたは特にこれといって所望される目的がないランダム選択によるものであってもよいことは、通常の当業者には容易にわかる。所望の部位の選択は、作動薬、超作動薬、逆作動薬、拮抗薬、受容体結合調節因子、二量体もしくは多量体形成、天然分子と比較して変わらない活性もしくは特性をはじめとする（しかし、これらに限定されない）いずれいかの所望の特性または活性を有するｈＧＨポリペプチド分子を生産するため、または溶解度凝集もしくは安定性などのこのポリペプチドのいずれかの物理的もしくは化学的特性を操作するためのものであり得る。例えば、ｈＧＨポリペプチドの生物活性に必要とされるこのポリペプチド内の位置は、当該技術分野において公知であるアラニンスキャニング法または相同スキャニング法を使用して特定することができる。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．およびＷｅｌｌｓ，Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）（ｈＧＨ生体活性にとって重要である１４残基の特定）およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１３３０−１３３６（１９８９）（相同スキャニング突然変異誘発を使用する抗体および受容体エピトープの特定）参照。アラニンまたは相同スキャニング突然変異誘発により生物活性に重要なものとして特定されたもの以外の残基は、このポリペプチドに要求される所望の活性に依存して、天然にはコードされないアミノ酸での置換の良好な候補となり得る。また、生物活性に重要であると特定された部位も、またこのポリペプチドに要求される所望の活性に依存して、天然にはコードされないアミノ酸での置換の良好な候補となり得る。もう一つの代替は、このポリペプチド鎖上の各位置において天然にはコードされないアミノ酸での系列置換を単純に行い、このポリペプチドの活性に対する効果を観察することであろう。天然でないアミノ酸でのいずれかのポリペプチドを置換する位置を選択するためのあらゆる手段、技法または方法が、本発明での使用に適することは、通常の当業者には容易にわかる。
【０２７０】
欠失を有するｈＧＨポリペプチドの自然発生突然変異体の構造および活性を検査して、天然にはコードされないアミノ酸での置換に対して寛容である可能性が高いタンパク質の領域を決定することもできる。例えば、ｈＧＨについては、Ｋｏｓｔｙｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９２５：３１４（１９８７）；Ｌｅｗｉｓ，Ｕ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５３：２６７９−２６８７（１９７８）参照。同様の手法で、プロテアーゼ消化およびモノクローナル抗体を使用して、ｈＧＨ受容体への結合の責任を負うｈＧＨの領域を特定することができる。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１３３０−１３３６（１９８９）；Ｍｉｌｌｓ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１０７：３９１−３９９（１９８０）；Ｌｉ，Ｃ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４６：３１−４１（１９８２）（残基１３４から１４９の間のアミノ酸は、活性を喪失することなく欠失させることができるこを指摘）参照。天然にはコードされないアミノ酸での置換に寛容である可能性が高い残基を削除したら、残りの位置の各々での提案された置換の影響をｈＧＨおよびこの結合タンパク質の三次元結晶構造から調査することができる。例えば、ｈＧＨについては、ｄｅ  Ｖｏｓ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：３０６−３１２（１９９２）参照；ｈＧＨのすべての結晶構造は、ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（３ＨＨＲ、１ＡＸＩ、および１ＨＷＧを含む）（ＰＤＢ；ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｒｃｓｂ．ｏｒｇで利用可能）、タンパク質および核酸の巨大分子の三次元構造データを含む集中データベース、において入手できる。従って、当業者は、天然にはコードされないアミノ酸で置換することができるアミノ酸位置を容易に特定することができる。
【０２７１】
一部の実施態様において、本発明のｈＧＨポリペプチドは、このポリペプチドのヘリックスまたはベータシート二次構造を破壊しないタンパク質の領域内に位置する１つ以上の自然には発生しないアミノ酸を含む。
【０２７２】
天然にはコードされないアミノ酸の組み込みの典型的な残基は、潜在的受容体結合部位（Ｓｉｔｅ  ＩおよびＳｉｔｅ  ＩＩを含むが、これらに限定されない）から除外されるもの、溶媒に完全に露出されていることがあり、もしくは部分的に溶媒に露出されていることがあるもの、近接残基と最少の水素結合相互作用を有するか、近接残基との水素結合相互作用を有さないもの、近接反応性残基に最小限、露出されていることがあるもの、ならびにｈＧＨポリペプチドとこの受容体の三次元結晶構造により予測して非常に可撓性である領域（Ｃ−Ｄループを含むが、これに限定されない）内または構造的に硬い領域（Ｂヘリックスを含むが、これに限定されない）内にあり得るものであり得る。
【０２７３】
一部の実施態様において、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸は、ｈＧＨにおける二次構造に対応する次の領域の１つ以上におけるいずれかの位置に組み込まれる：配列番号２からの、１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａヘリックス）、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ−末端）。他の実施態様において、ｈＧＨポリペプチドは、Ｎ末端（１−５）、Ａ−ＢループのＮ末端（３２−４６）、Ｂ−Ｃループ（９７−１０５）、Ｃ−Ｄループ（１３２−１４９）、およびＣ末端（１８４−１９１）から成る群より選択されるｈＧＨの少なくとも１つの領域内に位置する少なくとも１つのアミノ酸を置換する少なくとも１つの自然には発生しないアミノ酸を含む。一部の実施態様において、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸は、次のｈＧＨ位置の１つ以上の位置に組み込まれる：位置１の前（すなわち、Ｎ末端位置）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、このタンパク質のカルボキシ末端位置）（配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。
【０２７４】
１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸の組み込みの典型的な部位としては、配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸からの２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６、および１８７またはこれらのあらゆる組合せが挙げられる。
【０２７５】
１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸の組み込みのための典型的な部位のサブセットとしては、配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸からの、２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６、および１８７、またはこれらのあらゆる組合せが挙げられる。ｈＧＨおよびｈＧＨのｈＧＨ受容体との相互作用の結晶構造の調査は、これらのアミノ酸残基の側鎖が、溶媒に完全にまたは部分的に近接でき、天然にはコードされないアミノ酸の側鎖が、このタンパク質表面から離れる方向に向き、溶媒の中を指し得ることを示している。
【０２７６】
１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸の組み込みのための典型的な位置としては、配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸からの３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５、および１５５またはこれらのあらゆる組合せが挙げられる。ｈＧＨおよびｈＧＨのｈＧＨ受容体との相互作用の結晶構造の調査は、これらのアミノ酸残基の側鎖が、溶媒に完全に露出されており、この天然残基の側鎖が、溶媒の中を指していることを示している。
【０２７７】
１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸の組み込みのための典型的な部位のサブセットとしては、配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸からの、３０、７４、１０３、またはこれらのあらゆる組合せが挙げられる。１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸の組み込みのための典型的な部位のもう１つのサブセットとしては、配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸からの、３５、９２、１４３、１４５、またはこれらのあらゆる組合せが挙げられる。
【０２７８】
一部の実施態様において、これらの位置：位置１の前（すなわち、Ｎ末端位置）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、このタンパク質のカルボキシル末端）（配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）（これらを含むが、これらに限定されない）の１つ以上における自然には発生しないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結される。一部の実施態様において、これらの位置：３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）の１つ以上における自然には発生しないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結される。一部の実施態様において、これらの位置：３５、９２、１４３、１４５（配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）の１つ以上における自然には発生しないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結される。
【０２７９】
ヒトＧＨ拮抗薬としては、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、および１２７での置換もしくは位置１（すなわち、Ｎ末端）での付加、またはこれらのあらゆる組合せ（配列番号２、または配列番号１、３もしくは他のいずれかのＧＨ配列の対応するアミノ酸）を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８０】
多種多様な天然にはコードされないアミノ酸でｈＧＨポリペプチドにおける所定の位置を置換することができ、またはこれらのアミノ酸をｈＧＨポリペプチドにおける所定の位置に組み込むことができる。一般に、ｈＧＨポリペプチドとこの受容体の三次元結晶構造、保存的置換（すなわち、Ｐｈｅ、ＴｒｙまたはＴｒｐについてのｐ−アセチルフェニルアラニンまたはＯ−プロパルギルチロシンなどのアリール系の天然にはコードされないアミノ酸の置換）の嗜好性、およびｈＧＨポリペプチドへの導入（例えば、アルキン部分有する水溶性ポリマーとのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化、またはアリールエステルを有し、このエステルがまたホスフィン部分を組み込む水溶性ポリマーとのアミド結合形成を行うことが望まれる場合の、４−アジドフェニルアラニンの導入）が望まれる特異的コンジュゲーション化学の調査を基に、特定の天然にはコードされないアミノ酸を組み込みのために選択する。
【０２８１】
一つ実施態様において、この方法は、タンパク質への非天然アミノ酸の導入（この場合、前記非天然アミノ酸は、第一反応性基を含む）；および前記タンパク質と第二の反応性基を含む分子（ラベル、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬物、親和性ラベル、光親和性ラベル、反応性化合物、樹脂、第二のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体フラグメント、金属キレート化剤、補助因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、抑制リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光体、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合性もしくは非共有結合性相互作用する基、光ケージド部分、光異性化性部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチンの誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学分解性の基、光分解性の基、延長側鎖、炭素結合型糖、レドックス活性因子、アミノチオ酸、毒性部分、アイソトープ標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光性の基、高電子密度の基、磁性を有する基、介在基、発色団、エネルギー変換因子、生物活性因子、検出可能ラベル、小分子、または上記のあらゆる組合せ、または他のいずれかの望ましい化合物もしくは物質を含むが、これらに限定されない）との接触をさらに含む。前記第一反応性基は、第二反応性基と反応して、この分子を［３＋２］付加環化により非天然アミノ酸に取り付ける。１つの実施態様において、前記第一反応性基は、アルキニルまたはアジド部分であり、前記第二反応性基は、アジドまたはアルキニル部分である。例えば、前記第一反応性基は、アルキニル部分（非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを含むが、これに限定されない）であり、前記第二反応性基は、アジド部分である。もう１つの例では、前記第一反応性基が、アジド部分（非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを含むが、これに限定されない）であり、前記第二反応性基が、アルキニル部分である。
【０２８２】
場合によっては、天然にはコードされないアミノ酸置換基（複数を含む）は、ｈＧＨポリペプチドにおける他の付加、置換または欠失と組み合わさって、このｈＧＨポリペプチドの他の生物学的特性に影響を及ぼすこととなる。場合によっては、前記他の付加、置換または欠失が、ｈＧＨポリペプチドの安定性（タンパク質溶解性分解に対する耐性を含むが、これに限定されない）を増大させる、またはｈＧＨポリペプチドのこの受容体に対する親和性を増大させることがある。一部の実施態様において、ｈＧＨポリペプチドは、配列番号２におけるＦ１０Ａ、Ｆ１０Ｈ、Ｆ１０Ｉ；Ｍ１４Ｗ、Ｍ１４Ｑ、Ｍ１４Ｇ；Ｈ１８Ｄ；Ｈ２１Ｎ；Ｇ１２０Ａ；Ｒ１６７Ｎ；Ｄ１７１Ｓ；Ｅ１７４Ｓ；Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔまたはこれらのあらゆる組合せから成る群より選択されるアミノ酸置換を含む。場合によっては、前記他の付加、置換または欠失が、ｈＧＨポリペプチドの溶解性（大腸菌または他の宿主細胞において発現されたときのものを含むが、これらに限定されない）を増大させることがある。一部の実施態様において、付加、置換または欠失が、大腸菌組換え宿主細胞での発現後にこのポリペプチドの溶解性を増大させることがある。一部の実施態様において、ｈＧＨポリペプチドは、アミノ酸置換Ｇ１２０Ａを含む。この置換を含むｈＧＨポリペプチドは、作動薬活性を保持し、ならびに宿主細胞における発現レベルを保持または改善する。一部の実施態様において、大腸菌組換え宿主細胞での発現後にこのポリペプチドの溶解性を増大させることとなる天然でないアミノ酸の組み込みのためのもう１つの部位に加えて、天然にコードされるアミノ酸または天然でないアミノ酸での置換のための部位が選択される。一部の実施態様において、ｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨポリペプチド受容体に対する親和性を調節する、受容体二量体化を調節（増加または減少を含むが、これらに限定されない）する、受容体二量体化を安定させる、循環半減期を調節する、放出もしくはバイオアベイラビリティを調節する、精製を助長する、または特定の投与経路を改善または変更する、別の付加、置換または欠失を含む。例えば、本明細書に記載の１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸の導入に加えて、ｈＧＨ変異体のこの受容体に対する親和性を増大させるために、以下の置換のうちの１つ以上が導入される：Ｆ１０Ａ、Ｆ１０ＨまたはＦ１０Ｉ；Ｍ１４Ｗ、Ｍ１４Ｑ、またはＭ１４Ｇ；Ｈ１８Ｄ；Ｈ２１Ｎ；Ｒ１６７Ｎ；Ｄ１７１Ｓ；Ｅ１７４Ｓ；Ｆ１７６ＹおよびＩ１７９Ｔ。同様に、ｈＧＨポリペプチドは、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧまたはポリＨｉｓを含むが、これらに限定されない）もしくは他の親和性に基づく配列（ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴなどを含むが、これらに限定されない）、またはこのポリペプチドの欠失（ＧＦＰを含むが、これに限定されない）、精製もしくは他の特性を改善する連結分子（ビオチンを含むが、これに限定されない）を含むことができる。
【０２８３】
一部の実施態様において、天然にはコードされないアミノ酸の置換は、ｈＧＨ拮抗薬を生じさせる。１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸の組み込みのための典型的な部位のサブセットとしては、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、１２７、または位置１の前での付加（配列番号２、または配列番号１、３もしくは他のいずれかのＧＨ配列の対応するアミノ酸）が挙げられる。一部の実施態様において、ｈＧＨ拮抗薬は、ＧＨを拮抗薬として作用させる領域１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａへリックス）、３４−７４（ＡへリックスとＢへリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂへリックス）、９７−１０５（ＢへリックスとＣへリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃへリックス）、１３０−１５３（ＣへリックスとＤへリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄへリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）における少なくとも１つの置換を含む。他の実施態様において、天然にはコードされないアミノ酸の組み込み部位の具体例としては、ヘリックスＡのアミノ末端領域およびヘリックスＣの一部の中の残基が挙げられる。もう１つの実施態様では、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンまたはＯ−プロパルギル−Ｌ−チロシンなどの天然にはコードされないアミノ酸でのＧ１２０の置換。他の実施態様では、上に挙げた置換基を、ｈＧＨポリペプチドがｈＧＨ拮抗薬になるようにする追加の置換と組み合わせる。例えば、天然にはコードされないアミノ酸が、本明細書において特定されている位置のうちの１つで置換され、同時的置換が、Ｇ１２０（例えば、Ｇ１２０Ｒ、Ｇ１２０Ｋ、Ｇ１２０Ｗ、Ｇ１２０Ｙ、Ｇ１２０Ｆ、またはＧ１２０Ｅ）に導入される。一部の実施態様において、アルギニンが、配列番号２におけるＧ１２０を置換する。一部の実施態様において、ｈＧＨ拮抗薬は、このｈＧＨ分子の受容体結合領域内に存在する水溶性ポリマーに連結された天然にはコードされないアミノ酸を含む。
【０２８４】
場合によっては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸が、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸で置換される。場合によっては、ｈＧＨポリペプチドは、自然発生アミノ酸に対する１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の置換をさらに含む。例えば、一部の実施態様において、ｈＧＨの以下の領域内の少なくとも２つの残基が、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸で置換される：１−５（Ｎ末端）、３２−４６（Ｎ末端  Ａ−Ｂループの末端）、９７−１０５（Ｂ−Ｃループ）、および１３２−１４９（Ｃ−Ｄループ）、および１８４−１９１（Ｃ末端）。一部の実施態様において、ｈＧＨの以下の領域内の少なくとも２つの残基が、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸で置換される：１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａへリックス）、３４−７４（ＡへリックスとＢへリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂへリックス）、９７−１０５（ＢへリックスとＣへリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃへリックス）、１３０−１５３（ＣへリックスとＤへリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄへリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）。一部の実施態様において、ｈＧＨの以下の領域内の少なくとも２つの残基が、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸で置換される：１−９（Ｎ末端）、１０−２１（Ａへリックス）、２２−３９（ＡへリックスとＢへリックスの間の領域）、４０−７５（Ｂへリックス）、７６−７７（ＢへリックスとＣへリックスの間の領域）、７８−１００（Ｃへリックス）、１０１−１１０（ＣへリックスとＤへリックスの間の領域）、１１１−１３２（Ｄへリックス）、１３３−１３６（ＤヘリックスとＥヘリックスの間の領域）、１３７−１５５（Ｅヘリックス）、１５６−１６５（Ｃ末端）場合によっては、前記２つまたはそれ以上の天然にはコードされないアミノ酸を、１つ以上の低分子量線状または分枝ＰＥＧ（質量で約〜５から２０ｋＤａまたはそれ以下）に連結させ、これにより、単一のより高分子量のＰＥＧに取り付けられた化学種を基準にして結合親和性および匹敵する血清半減期が強化される。
【０２８５】
一部の実施態様において、ｈＧＨの以下の位置の残基のうちの２つ以下が、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸で置換される：２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６、および１８７。場合によっては、以下の置換ペアのいずれかがなされる：Ｋ３８Ｘ＊およびＫ１４０Ｘ＊；Ｋ４１Ｘ＊およびＫ１４５Ｘ＊；Ｙ３５Ｘ＊およびＥ８８Ｘ＊；Ｙ３５Ｘ＊およびＦ９２Ｘ＊；Ｙ３５Ｘ＊およびＹ１４３Ｘ＊；Ｆ９２Ｘ＊およびＹ１４３Ｘ＊（この場合、Ｘ＊は、天然にはコードされないアミノ酸を表す）。２つまたはそれ以上の天然にはコードされないアミノ酸の組み込みに好ましい位置としては、以下の残基の組合せが挙げられる：２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６、および１８７。２つまたはそれ以上の天然にはコードされないアミノ酸の組み込みに特に好ましい部位としては、以下の残基の組合せが挙げられる：３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５、および１５５。
【０２８６】
２つまたはそれ以上の天然にはコードされないアミノ酸のｈＧＨにおける組み込みに好ましい部位としては、以下の残基の組合せが挙げられる：配列番号２からの、位置１の前（すなわち、Ｎ末端位置）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、このタンパク質のカルボキシル末端位置）またはこれらのあらゆる組合せ。
【０２８７】
ＶＩＩ．非真核生物および真核生物における発現
クローニングされたｈＧＨポリヌクレオチドの高レベルの発現を達成するために、一般には、転写を指示する強いプロモータ、転写／翻訳ターミネータ、および核酸がタンパク質をコードしている場合には翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクターに、本発明のｈＧＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをサブクローニングする。適する細菌性プロモータは、当該技術分野において周知であり、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらに記載されている。
【０２８８】
本発明のｈＧＨポリペプチドを発現させるために、大腸菌、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）細菌発現系を利用することができる（Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：５４３−５４５（１９８３））。こうした発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞についての真核性発現系は、当該技術分野において周知であり、市販もされている。直交性ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（上で説明したもの）を使用して、本発明のｈＧＨポリペプチドを発現させる場合、発現のための宿主細胞は、この直交性成分を使用するこれらの能力に基づき選択される。宿主細胞の具体例としては、グラム陽性菌（Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含むが、これらに限定されない）およびグラム陰性菌（大腸菌、シュードモナス・フルオレッセンス、緑膿菌、シュードモナス・プチダを含むが、これらに限定されない）、ならびに酵母および他の真核細胞が挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを含む細胞は、本明細書に記載するとおり使用することができる。
【０２８９】
本発明の真核生物宿主細胞または非真核生物宿主細胞は、多く有用な量の非天然アミノ酸を含むタンパク質を合成する能力をもたらす。一つの側面において、本組成物は、非天然アミノ酸を含むタンパク質の少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラムまたはそれ以上、またはインビボタンパク質生産法（組換えタンパク質生産および精製に関する詳細は、本明細書に提供する）で達成され得る量（これらを含むが、これらに限定されない）を場合により含む。もう一つの側面において、前記タンパク質は、細胞溶解産物、緩衝液、医薬用緩衝液または他の懸濁液［概して約１ｎＬから約１００Ｌ（を含むが、これらに限定されない）の体積（を含むが、これに限定されない）の］中、１リットルあたり少なくとも１０マイクログラムのタンパク質、１リットルあたり少なくとも５０マイクログラムのタンパク質、１リットルあたり少なくとも７５マイクログラムのタンパク質、１リットルあたり１００マイクログラムのタンパク質、１リットルあたり少なくとも２００マイクログラムのタンパク質、１リットルあたり少なくとも２５０マイクログラムのタンパク質、１リットルあたり少なくとも５００マイクログラムのタンパク質、１リットルあたり少なくとも１ミリグラムのタンパク質、もしくは１リットルあたり少なくとも１０ミリグラムのタンパク質またそれ以上（を含むが、これらに限定されない）の濃度で組成物中に場合により存在する。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む真核細胞における大量の他の方法で一般に可能な量より多い量を含むが、これに限定されない）タンパク質の生産（インビボ翻訳をはじめとする（しかし、これに限定されない）は、本発明の一つの特徴である。
【０２９０】
本発明の真核宿主細胞または非真核宿主細胞は、多く有用な量の非天然アミノ酸を含むタンパク質を生合成する能力をもたらす。例えば、非天然アミノ酸を含むタンパク質は、細胞抽出物、細胞溶解産物、培地および／または緩衝液などにおいて、少なくとも１０μｇ／リットル、少なくとも５０μｇ／リットル、少なくとも７５μｇ／リットル、少なくとも１００μｇ／リットル、少なくとも２００μｇ／リットル、少なくとも２５０μｇ／リットル、または少なくとも５００μｇ／リットル、少なくとも１ｍｇ／リットル、少なくとも２ｍｇ／リットル、少なくとも３ｍｇ／リットル、少なくとも４ｍｇ／リットル、少なくとも５ｍｇ／リットル、少なくとも６ｍｇ／リットル、少なくとも７ｍｇ／リットル、少なくとも８ｍｇ／リットル、少なくとも９ｍｇ／リットル、少なくとも１０ｍｇ／リットル、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／リットル、１ｇ／リットル、５ｇ／リットル、１０ｇ／リットルまたはそれ以上のタンパク質（を含むが、これらに限定されない）の濃度で生産することができる。
【０２９１】
Ｉ．発現系、培養および単離
ｈＧＨポリペプチドは、例えば酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞および細菌をはじめとするあらゆる数の適する発現系において発現させることができる。発現系の具体例の説明を下に提供する。
【０２９２】
酵母  ここで用いる用語「酵母」は、ｈＧＨポリペプチドをコードする遺伝子を発現することができる様々な酵母のいずれをも包含する。こうした酵母としては、有子嚢胞子酵母［エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）］、担子胞子酵母（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ  ｙｅａｓｔ）、および不完全菌類に属する酵母［不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）］が挙げられるが、これらに限定されない。有子嚢胞子酵母は、２つの科、Ｓｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ科およびサッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）に分けられる。後者は、４つの亜科、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ亜科［例えば、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）］、Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ亜科、ＬｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ亜科［例えば、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クライベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）］ら成る。担子胞子酵母としては、ロイコスポリジウム属（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、スポリジオボラス属（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、フィロバシジウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、およびフィロバシジエラ属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ）が挙げられる。不完全菌類に属する酵母（不完全酵母菌類）は、２つの科、スポロボロミケス科（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）［例えば、スポロボロミセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）およびブレラ属（Ｂｕｌｌｅｒａ）］ならびにクリプトコックス科（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）［例えば、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）］に分けられる。
【０２９３】
本発明での使用に特に興味深いのは、ピチア属、クライベロミセス属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、およびカンジダ属であり、これらには、Ｐ．パストリス、Ｐ．ギリエリモンジィ（Ｐ．ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ）、Ｓ．セレビジエ、Ｓ．カールスベルゲンシス（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ジサスタティカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ダグラシィ（Ｓ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｓ．ノルベンシス（Ｓ．ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、シェリー酵母（Ｓ．ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．マルトーサ（Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ）およびＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が含まれる。
【０２９４】
ｈＧＨポリペプチドの発現に適する酵母の選択は、当業者の技術の範囲内である。発現のための酵母宿主を選択する際、適する宿主としては、例えば、良好な分泌能力、低いタンパク質溶解活性、良好な分泌能力、良好な可溶性タンパク質生産、および総合的な頑強性を有することが明らかにされているものを挙げることができる。一般に、酵母は、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（カリフォルニア州、バークレー）、および米国微生物系統保存機関［ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）］（バージニア州、マナッサス）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）様々な供給源から入手することができる。
【０２９５】
用語「酵母宿主」または「酵母宿主細胞」は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡのための受容個体として使用することができる、または使用されている酵母を包含する。この用語は、組換えベクターまたは他の輸送ＤＮＡを受け取った原酵母宿主細胞の後代を包含する。単一親細胞の後代が、偶発的または計画的突然変異のため、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体に関して原親と必ずしも完全に同じであるとは限らないことは、理解される。ｈＧＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在などの関連特性を特徴として有するほど十分に親に類似している親細胞の後代は、この定義により指定される後代に包含される。
【０２９６】
染色体外レプリコンおよび組み込みベクターをはじめとする発現および形質転換ベクターが、多数の酵母宿主への形質転換のために開発された。例えば、発現ベクターは、Ｓ．セレビジエ（Ｓｉｋｏｒｓｋｉら、ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９８）１１２：１９；Ｉｔｏら、Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８３）１５３：１６３；Ｈｉｎｎｅｎら、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９）；Ｃ．アルビカンス（Ｋｕｒｔｚら、ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８６）６：１４２）；Ｃ．マルトーサ（Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．ＢＡＳＩＣＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８５）２５：１４１）；Ｈ．ポリモルファ（Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ．ＧＥＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８６）１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、ＭｏＬ．ＧＥＮ．ＧＥＮＥＴ．（１９８６）２０２：３０２）；Ｋ．フラギリス（Ｄａｓら、Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８４）１５８：１１６５）；Ｋ．ラクティス（Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８３）１５４：７３７；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（１９９０）８：１３５）；Ｐ．ギリエリモンジィ（Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．ＢＡＳＩＣＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８５）２５：１４１）；Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）（米国特許第５，３２４，６３９号、同第４，９２９，５５５号、および同第４，８３７，１４８号；Ｃｒｅｇｇら、ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８５）５：３３７６）；シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，ＮＡＴＵＲＥ（１９８１）３００：７０６）；およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（Ｄａｖｉｄｏｗら、ＣＵＲＲ．ＧＥＮＥＴ．（１９８５）１０：３８０（１９８５）；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら、ＣＵＲＲ．ＧＥＮＥＴ．（１９８５）１０：４９）；Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｂａｌｌａｎｃｅら、ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．（１９８３）１１２：２８４−８９；Ｔｉｌｂｕｒｎら、ＧＥＮＥ（１９８３）２６：２０５−２２１；およびＹｅｌｔｏｎら、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：１４７０−７４）；黒色アスペルギルス（Ａ．ｎｉｇｅｒ）（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：４７５４７９）；Ｔ．リージア（Ｔ．ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第０  ２４４  ２３４号）；および例えばアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラシウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）などの糸状菌（国際公開第９１／００３５７号）のために開発されている（前記参考文献は、各々、本明細書に参照により組み込まれている）。
【０２９７】
酵母ベクター用の制御配列は当業者に周知であり、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）（欧州特許第０  ２８４  ０４４号）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許第０  ３２９  ２０３号）などの遺伝子からのプロモータ領域を含むが、これらに限定されない。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子も、有用なプロモータ配列を提供しうる（Ｍｙａｎｏｈａｒａら、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：１）。酵母宿主と共に使用するための他の適するプロモータ配列としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９８０）２５５：２０７３）；ならびに他の糖分解酵素、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼおよびグルコースリン酸イソメラーゼ（Ｈｏｌｌａｎｄら、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９７８）１７：４９００；Ｈｅｓｓら、Ｊ．ＡＤＶ．ＥＮＺＹＭＥ  ＲＥＧ．（１９６８）７：１４９）のためのプロモータを挙げることができる。成長条件により制御される転写の追加利点を有する誘導性酵母プロモータとしては、アルコール脱水素酵素２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、窒素代謝に随伴する崩壊酵素、ならびにマルトースおよびガラクトース消費に責任を負う酵素についてのプロモータ領域を挙げることができる。酵母発現における使用に適するベクターおよびプロモータは、欧州特許第０  ０７３  ６５７号にさらに記載されている。
【０２９８】
酵母エンハンサを酵母プロモータとともに使用することもできる。加えて、合成プロモータも酵母プロモータとして機能することができる。例えば、酵母プロモータの上流活性化配列（ＵＡＳ）を別の酵母プロモータの転写活性化領域とつなぎ合させて、合成ハイブリッドプロモータを作ることができる。こうしたハイブリッドプロモータの例としては、ＧＡＰ転写活性化領域に連結されたＡＤＨ調節配列が挙げられる。例えば、米国特許第４，８８０，７３４号および同第４，８７６，１９７号参照（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）。ハイブリッドプロモータの他の例としては、ＧＡＰまたはＰｙＫなどの糖分解酵素遺伝子の転写活性領域と組み合わせた、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０またはＰＨ０５遺伝子の調節配列から成るプロモータである。欧州特許第０  １６４  ５５６号参照。さらに、酵母プロモータとしては、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始させる能力を有する、酵母起源ではない自然発生プロモータを挙げることができる。
【０２９９】
酵母発現ベクターの部分を含むことができる他の制御要素としては、ターミネータ、例えば、ＧＡＰＤＨまたはエノラーゼ遺伝子からのもの（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９８１）２５６：１３８５）が挙げられる。加えて、２μプラスミド起点からの複製起点が、酵母に適する。酵母での使用に適する選択遺伝子は、酵母プラスミド中に存在するｔｒｐｌ遺伝子である。Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、ＧＥＮＥ（１９８０）１０：１５７；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、ＧＥＮＥ（１９７９）７：１４１参照。ｔｒｐｌ遺伝子は、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の突然変異株のための選択マーカーをもたらす。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母菌株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知プラスミドにより相補される。
【０３００】
酵母宿主への外在性ＤＮＡの導入方法は、当業者に周知であり、スフェロプラストの形質転換またはアルカリカチオンで処理したインタクトな酵母宿主細胞の形質転換のいずれかを一般に含むが、これらに限定されない。例えば、酵母の形質転換は、Ｈｓｉａｏら、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３８２９およびＶａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．ＢＡＣＴ．（１９７７）１３０：９４６に記載されている方法に従って行うことができる。しかし、ＳＡＭＢＲＯＯＫら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢ．ＭＡＮＵＡＬ（２００１）に一般に記載されているような、核注入、エレクトロポレーションまたはプロトプラスト融合などによる細胞にＤＮＡを導入するための他の方法も使用することができる。次に、通常の当業者に公知である標準的な技法を使用して、酵母宿主細胞を培養することができる。
【０３０１】
酵母宿主細胞において異種タンパク質を発現させるための他の方法は、通常の当業者に周知である。一般に、米国特許出願公開第２００２００５５１６９号、米国特許第６，３６１，９６９号、同第６，３１２，９２３号、同第６，１８３，９８５号、同第６，０８３，７２３号、同第６，０１７，７３１号、同第５，６７４，７０６号、同第５，６２９，２０３号、同第５，６０２，０３４号および同第５，０８９，３９８号、；米国特許再審査番号ＲＥ３７，３４３およびＲＥ３５，７４９；ＰＣＴ公開特記出願国際公開第９９／０７８６２１号、同第９８／３７２０８号および同第９８／２６０８０号；欧州特許出願第０  ９４６  ７３６号、同第０  ７３２  ４０３号、同第０  ４８０  ４８０号、同第０  ４６０  ０７１号、同第０  ３４０  ９８６号、同第０  ３２９  ２０３号、同第０  ３２４  ２７４号および同第０  １６４  ５５６号参照。Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎら、ＡＮＴＯＮＩＥ  ＶＡＮ  ＬＥＥＵＷＥＮＨＯＥＫ（１９９２）６２（１−２）：７９−９３；Ｒｏｍａｎｏｓら、ＹＥＡＳＴ（１９９２）８（６）：４２３−４８８；Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（１９９０）１８５：３−７も参照（これらの各々が、本明細書に参照により組み込まれている）。
【０３０２】
酵母宿主株は、通常の当業者に周知である標準的なフィードバッチ発酵方法を使用して増幅段階の間に発酵装置内で成長させることができる。発酵方法は、個々の酵母宿主の炭素消費経路または発現制御モードの違いの理由に合わせることができる。例えば、サッカロミセス属酵母宿主の発酵は、単一グルコースの供給、複雑な窒素源（例えば、カゼイン加水分解物）および多数のビタミン補足を必要とし得る。対照的に、メチロトローフ酵母Ｐ．パストリスは、グリセロール、メタノールおよび微量金属の供給を必要とし得るが、最適な成長および発現のために単純なアンモニウム（窒素）塩しか必要としない。例えば、米国特許第５，３２４，６３９号；Ｅｌｌｉｏｔｔら、Ｊ．ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＨＥＭ．（１９９０）９：９５；およびＦｉｅｓｃｈｋｏら、ＢＩＯＴＥＣＨ．ＢＩＯＥＮＧ．（１９８７）２９：１１１３参照（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）。
【０３０３】
しかし、こうした発酵方法は、利用される酵母宿主株に依存しない一定の共通した特徴を有し得る。例えば、成長制限栄養、典型的には炭素を増幅期の間に発酵装置に添加して、最大成長を可能ならしめることができる。加えて、発酵方法は、適量の炭素、窒素、基礎塩（ｂａｓａｌ  ｓａｌｔ）、リンおよび他の微量栄養素（ビタミン、微量金属および塩など）を含有するように設計された発酵培地を一般に利用する。ピチア属での使用に適する発酵培地の例は、米国特許第５，３２４，６３９号および同第５，２３１，１７８号に記載されている（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）。
【０３０４】
バキュロウイルス感染昆虫細胞  用語「昆虫宿主」または「昆虫宿主細胞」は、組換えベクターまたは他の輸送ＤＮＡのための受容個体として使用することができる、または使用されている昆虫を指す。この用語は、トランスフェクトされた原昆虫宿主細胞の後代を包含する。単一親細胞の後代が、偶発的または計画的突然変異のため、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体に関して原親と必ずしも完全に同じであるとは限らないことは、理解される。ｈＧＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在などの関連特性を特徴として有するほど十分に親に類似している親細胞の後代は、この定義により指定される後代に包含される。
【０３０５】
ｈＧＨポリペプチドの発現に適する昆虫細胞の選択は、通常の当業者に周知である。幾つかの昆虫種は、当該技術分野において十分説明されており、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、スポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）およびイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）をはじめとする昆虫種は、市販されている。発現のための昆虫宿主を選択する際に適する宿主としては、中でも、良好な分泌能力、低いタンパク質溶解活性および総合的な頑強性を有することが明らかにされているものを挙げることができる。一般に、昆虫は、ｔｈｅ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  （カリフォルニア州、バークレー）；および米国微生物系統保存機関［ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）］（バージニア州、マナッサス）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）様々な供給源から入手することができる。
【０３０６】
一般に、バキュロウイルス感染昆虫発現系の成分としては、バキュロウイルスゲノムのフラグメントおよび発現させる異種遺伝子の挿入に適便な制限部位、両方を含有するトランスファーベクター、通常は細菌プラスミド；このトランスファーベクター内のバキュロウイルス特異的フラグメントに相同な配列（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および成長培地が挙げられる。ベクターの構築、細胞のトランスフェクション、プラークのピッキングおよび培養での細胞の成長において使用される材料、方法および技術は、当該技術分野において公知であり、これらの技術が記載されているマニュアルを利用することができる。
【０３０７】
トランスファーベクターに異種遺伝子を挿入した後、ベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、このベクターおよびウイルスゲノムを組み換える昆虫宿主細胞にトランスフェクトする。パッケージされた組換えウイルスを発現させ、組換えプラークを同定し、精製する。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（カリフォルニア州、カールズバッド）からキット形で市販されている。これらの技術は、当業者に一般に公知であり、ＳＵＭＭＥＲＳ  ＡＮＤ  ＳＭＩＴＨ，ＴＥＸＡＳ  ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＯＮ  ＢＵＬＬＥＴＩＮ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）（これは、本明細書に参照により組み込まれている）に十分に記載されている。ＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮ，３９  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ：ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ（１９９５）；ＡＵＳＵＢＥＬら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  １６．９−１６．１１（１９９４）；ＫＩＮＧ  ＡＮＤ  ＰＯＳＳＥＥ，ＴＨＥＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＳＹＳＴＥＭ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＧＵＩＤＥ（１９９２）；およびＯ’ＲＥＩＬＬＹら、ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）も参照。
【０３０８】
実際、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を使用する様々な異種タンパク質の生産が、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第６，３６８，８２５号；同第６，３４２，２１６号；同第６，３３８，８４６号；同第６，２６１，８０５号；同第６，２４５，５２８号；同第６，２２５，０６０号；同第６，１８３，９８７号；同第６，１６８，９３２号；同第６，１２６，９４４号；同第６，０９６，３０４号；同第６，０１３，４３３号；同第５，９６５，３９３号；同第５，９３９，２８５号；同第５，８９１，６７６号；同第５，８７１，９８６号；同第５，８６１，２７９号；同第５，８５８，３６８号；同第５，８４３，７３３号；同第５，７６２，９３９号；同第５，７５３，２２０号；同第５，６０５，８２７号；同第５，５８３，０２３号；同第５，５７１，７０９号；同第５，５１６，６５７号；同第５，２９０，６８６号；国際公開第０２／０６３０５号；同第０１／９０３９０号；同第０１／２７３０１号；同第０１／０５９５６号；同第００／５５３４５号；同第００／２００３２号；同第ＷＯ９９／５１７２１号；同第９９／４５１３０号；同第９９／３１２５７号；同第９９／１０５１５号；同第９９／０９１９３号；同第９７／２６３３２号；同第９６／２９４００号；同第９６／２５４９６号；同第９６／０６１６１号；同第９５／２０６７２号；同第９３／０３１７３号；同第９２／１６６１９号；同第９２／０３６２８号；同第９２／０１８０１号；同第９０／１４４２８号；同第９０／１００７８号；同第９０／０２５６６号；同第９０／０２１８６号；同第９０／０１５５６号；同第８９／０１０３８号；同第８９／０１０３７号；同第８８／０７０８２号参照（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）。
【０３０９】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系において有用であるベクターは、当該技術分野において公知であり、こうしたベクターとしては、例えば、ヘルパー非依存性ウイルス発現ベクターである、バキュロウイルス  オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する昆虫発現およびトランスファーベクターが挙げられる。これらの系から誘導されたウイルスベクターは、強いウイルスポリヘドリン遺伝子プロモータを利用して、異種遺伝子の発現を誘導する。一般には、Ｒｅｉｌｌｙら、ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）参照。
【０３１０】
バキュロウイルスゲノムに外来遺伝子を挿入する前に、プロモータ、リーダー（所望に応じて）、対象となるコード配列、および転写終了配列を含む上記成分を、一般に、中間置換構築物（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）（トランスファーベクター）に組立てる。中間置換構築物は、細菌などの宿主において安定して維持することができる染色体外成分（例えば、プラスミド）のようなレプリコン内に維持されることが多い。このレプリコンは、複製系を有するであろう。従って、クローニングおよび増幅に適する宿主内にそれを維持することができる。より具体的には、このプラスミドは、ポリヘドリン多アデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら、ＡＮＮ．ＲＥＶ．ＭＩＢＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８８）４２：１７７）、および原核性アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子、および大腸菌における選択および増殖の複製起点を含有し得る。
【０３１１】
外来遺伝子をＡｃＮＰＶに導入するための１つの一般に使用されるトランスファーベクターは、ｐＡｃ３７３である。例えばｐＶＬ９８５をはじめとする、ポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変更し、このＡＴＴから３２塩基対下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する、当業者に公知である他の多くのベクターも設計された。Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，１７  ＶＩＲＯＬＯＧＹ  ３１（１９８９）参照。他の市販ベクターとしては、例えば、ＰＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−Ｈｉｓ；ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２；ｐＭｅｌＢａｃ；ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）が挙げられる。
【０３１２】
異種遺伝子の挿入後、トランスファーベクターおよび野生型バキュロウイルスゲノムを昆虫細胞宿主にコ・トランスフェクトする。バキュロウイルスの所望の部位に異種ＤＮＡを導入するための方法は、当該技術分野において公知である。ＳＵＭＭＥＲＳ  ＡＮＤ  ＳＭＩＴＨ，ＴＥＸＡＳ  ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＯＮ  ＢＵＬＬＥＴＩＮ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８３）３：２１５６；Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，ＶＩＲＯＬＯＧＹ（１９８９）１７：３１参照。例えば、この挿入は、相同二重交叉組換えによるポリヘドリン遺伝子などの遺伝子へのものであってもよく、所望のバキュロウイルス遺伝子へと操作される制限酵素部位へのものであってもよい。Ｍｉｌｌｅｒら、ＢＩＯＥＳＳＡＹＳ（１９８９）４：９１参照。
【０３１３】
トランスフェクションは、エレクトロポレーションにより達成することができる。ＴＲＯＴＴＥＲ  ＡＮＤ  ＷＯＯＤ，３９  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９５）；Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇ，Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８９）７０：３５０１参照。また、リボソームを使用して、組換え発現ベクターおよびバキュロウイルスで昆虫細胞をトランスフェクトすることができる。例えば、Ｌｉｅｂｍａｎら、ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（１９９９）２６（１）：３６；Ｇｒａｖｅｓら、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９９８）３７：６０５０；Ｎｏｍｕｒａら、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９８）２７３（２２）：１３５７０；Ｓｃｈｍｉｄｔら、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（１９９８）１２：３２３；Ｓｉｆｆｅｒｔら、ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９８）１８：４５；ＴＩＬＫＩＮＳら、ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  １４５−１５４（１９９８）；Ｃａｉら、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（１９９７）１０：２６３；Ｄｏｌｐｈｉｎら、ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９７）１７：４９１；Ｋｏｓｔら、ＧＥＮＥ（１９９７）１９０：１３９；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１：２２２０３；Ｒｏｗｌｅｓ，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１（３７）：２２３７６；Ｒｅｖｅｒｓｅｙら、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１（３９）：２３６０７−１０；Ｓｔａｎｌｅｙら、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９５）２７０：４１２１；Ｓｉｓｋら、Ｊ．ＶＩＲＯＬ．（１９９４）６８（２）：７６６；およびＰｅｎｇら、ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（１９９３）１４．２：２７４参照。市販のリボソームとしては、例えば、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）が挙げられる。加えて、リン酸カルシウムトランスフェクションを用いることができる。ＴＲＯＴＴＥＲ  ＡＮＤ  ＷＯＯＤ，３９  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９５）；Ｋｉｔｔｓ，ＮＡＲ（１９９０）１８  （１９）：５６６７；およびＭａｎｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇ，Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８９）７０：３５０１参照。
【０３１４】
バキュロウイルス発現ベクターは、通常、バキュロウイルスプロモータを含有する。バキュロウイルスプロモータは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合し、ｍＲＮＡへのコドン配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３’）転写を開始させることができるあらゆるＤＮＡ配列である。プロモータは、このコドン配列の５’末端に隣接する位置に通常はある転写開始領域を有するであろう。この転写開始領域は、一般にはＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルスプロモータは、エンハンサと呼ばれる第二のドメインを有することもあり、それは、存在するならば、構造遺伝子に対して遠位にある。さらに、発現は、調節型発現であってもよいし、構成性発現であってもよい。
【０３１５】
感染サイクルにおける後期に異常転写される構造遺伝子によって、特に有用なプロモータ配列が生じる。例としては、ウイルス多面体タンパク質をコードする遺伝子（ＦＲＩＥＳＥＮら、Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＴＨＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＯＦＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＳ（１９８６）；欧州特許第０  １２７  ８３９号および同第０  １５５  ４７６号）およびｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら、Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８８）６９：７６５）から誘導された配列が挙げられる。
【０３１６】
当業者に公知である技法により、新たに形成されたバキュロウイルス発現ベクターを感染組換えバキュロウイルスにパッケージし、この後、成長したプラークを精製することができる。Ｍｉｌｌｅｒら、ＢＩＯＥＳＳＡＹＳ（１９８９）４：９１；ＳＵＭＭＥＲＳ  ＡＮＤ  ＳＭＩＴＨ，ＴＥＸＡＳ  ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＯＮ  ＢＵＬＬＥＴＩＮ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）参照。
【０３１７】
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、幾つかの昆虫細胞への感染のために開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、とりわけ、ネッタイシマカ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１２５）、カイコガ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８９１０）、キイロショウジョウバエ（ＡＴＣＣ番号１９６３）、スポドプテラ・フルジペルダおよびイラクサギンウワバのために開発された。国際公開第８９／０４６，６９９号；Ｗｒｉｇｈｔ，ＮＡＴＵＲＥ（１９８６）３２１：７１８；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｊ．ＶＩＲＯＬ．（１９８５）５６：１５３；Ｓｍｉｔｈら、ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８３）３：２１５６参照。一般には、Ｆｒａｓｅｒら、ＩＮ  ＶＩＴＲＯ  ＣＥＬＬ．ＤＥＶ．ＢＩＯＬ．（１９８９）２５：２２５参照。より具体的には、バキュロウイルス発現ベクター系に使用される細胞系としては、一般に、Ｓｆ９（スポドプテラ・フルジペルダ）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７１１）、Ｓｆ２１（スポドプテラ・フルジペルダ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１４９７−０１３（カリフォルニア州、カールズバッド））、Ｔｒｉ−３６８（イラクサギンウワバ）、およびＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ（商標）ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（イラクサギンウワバ）が挙げられる。
【０３１８】
バキュロウイルス／発現における異種ポリペプチドの直接発現と融合発現、両方のための細胞および培養基が、市販されており、細胞培養技術は、当業者に一般に公知である。
【０３１９】
大腸菌および他の原核細胞  細菌発現技術は、当該技術分野において周知である。多種多様なベクターが、細菌宿主での使用に利用できる。これらのベクターは、単一コピー型ベクターであってもよいし、高多コピー型ベクターであってもよい。ベクターは、クローニングおよび／または発現のために役立ち得る。ベクターに関する豊富な文献、多数のベクターの市販、ならびにベクターを説明するマニュアルおよびこれらの制限マップまでもを考慮して、ここで詳細にわたり論じる必要はない。周知であるように、これらのベクターは、選択を可能にするマーカーを通常は含み、これらのマーカーが、細胞毒製剤耐性、原栄養性または免疫性を規定する。多くの場合、異なる特性を規定する多数のマーカーが存在する。
【０３２０】
細菌性プロモータは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し、ｍＲＮＡへのコドン配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３’）転写を開始させることができるあらゆるＤＮＡ配列である。プロモータは、このコドン配列の５’末端に隣接する位置に通常はある転写開始領域を有するであろう。この転写開始領域は、一般にはＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌性プロモータは、ＲＮＡ合成が開始する隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位に重なることがある、オペレータ呼ばれる第二のドメインを有することもある。このオペレータは、遺伝子レプレッサタンパク質がこのオペレータに結合し、これにより特定の遺伝子の転写を阻害し得るので、負調節型（誘導性）転写を可能にならしめる。構成性発現は、オペレータなどの負調節要素の不在下で発生し得る。加えて、正の調節は、遺伝子活性化タンパク質結合配列により達成され得、この配列が存在する場合、それは、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に隣接（５’）する。遺伝子活性化タンパク質の一例は、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）であり、これは、大腸菌のラクトースオペロンの転写開始を助長する［Ｒａｉｂａｕｄら、ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＧＥＮＥＴ．（１９８４）１８：１７３］。従って、調節型発現は、正のものであってもよいし負のものであってもよく、これにより転写が強化されるか、低減される。
【０３２１】
代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモータ配列を提供する。例としては、糖代謝酵素、例えばガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇら、ＮＡＴＵＲＥ（１９７７）１９８：１０５６］およびマルトースから誘導されるプロモータ配列が挙げられる。追加の例としては、生合成酵素、例えばトリプトファン（ｔｒｐ）から誘導されるプロモータ配列［Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃ．ＡＣＩＤＳＲＥＳ．（１９８０）８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら、ＮＵＣＬ．ＡＣＩＤＳＲＥＳ．（１９８１）９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＧＨＰｕｂ．番号第０３６  ７７６号および同第１２１  ７７５号］が挙げられる。β−ガラクトシダーゼ（ｂｌａ）プロモータ系［Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「インターフェロンのクローニングおよび他の間違い（Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ）」．Ｉｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ３（Ｅｄ．Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ）］、バクテリオファージラムダＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、ＮＡＴＵＲＥ（１９８１）２９２：１２８］およびＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号（これは、本明細書に参照により組み込まれている）］プロモータ系も、有用なプロモータ配列を生じさせる。本発明の好ましい方法は、Ｔ７プロモータなどの強力なプロモータを利用して、高レベルでｈＧＨポリペプチドを生産する。こうしたベクターの例は、当該技術分野において周知であり、こうしたものとしては、ＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ２９シリーズ、および国際公開第９９／０５２９７号（これは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載のｐＰＯＰベクターが挙げられる。こうした発現系は、宿主の生存率または成長パラメータを損なわせることなく宿主において高レベルのｈＧＨポリペプチドを生産する。
【０３２２】
加えて、天然では発生しない合成プロモータも、細菌性プロモータとして機能する。例えば、ある細菌性またはバクテリオファージプロモータの転写活性化配列を別の細菌性またはバクテリオファージプロモータのオペロン配列とつなぎ合わせて、合成ハイブリッドプロモータを作ることができる［米国特許第４，５５１，４３３号（これは、本明細書に参照により組み込まれている）］。例えば、ｔａｃプロモータは、ｔｒｐプロモータとｌａｃオペロンの両方から成るハイブリッドｒｉｐ−ｌａｃプロモータであり、前記ｌａｃオペロンは、ｌａｃレプレッサにより規定される［Ａｍａｎｎら、ＧＥＮＥ（１９８３）２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｃｌ．（１９８３）８０：２１］。さらに、細菌性プロモータは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始させる能力を有する、細菌起源でない自然発生プロモータを含むことができる。細菌起源でない自然発生プロモータを適合性ＲＮＡポリメラーゼとカップリングさせて、原核生物における一部の遺伝子の高レベルの発現を生じさせることができる。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ／プロモータ系は、カップリングされるプロモータ系の一例である［Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｊ．ＭＯＬ．ＢｌＯＬ．（１９８６）１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８５）８２：１０７４］。加えて、ハイブリッドプロモータが、バクテリオファージプロモータおよび大腸菌オペレータ領域から成ることもある（欧州特許第２６７  ８５１号）。
【０３２３】
機能性プロモータ配列に加えて、効率的リボソーム結合部位も原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。大腸菌におけるこのリボソーム結合部位は、シャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）およびこの開始コドンの３から１１ヌクレオチド上流に位置する長さ３から９ヌクレオチドの配列を含む［Ｓｈｉｎｅら、ＮＡＴＵＲＥ（１９７５）２５４：３４］。このＳＤ配列は、ＳＤ配列およびこの３’と大腸菌１６Ｓ  ｒＲＮＡのものとの間の塩基の対合により、リボソームへのｍＲＮＡの結合を促進すると考えられる［Ｓｔｅｉｔｚら「メッセンジャーＲＮＡにおける遺伝子シグナルおよびヌクレオチド配列（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）」，Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｅｄ．Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ，１９７９）］。真核性遺伝子および弱いリボソーム結合部位を有する原核性遺伝子を発現させること［Ｓａｍｂｒｏｏｋら「大腸菌におけるクローン化遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８９］。
【０３２４】
用語「細菌宿主」または「細菌宿主細胞」は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡのための受容個体として使用することができる、または使用されている細菌を指す。この用語は、トランスフェクトされた原細菌宿主細胞の後代を包含する。単一親細胞の後代が、偶発的または計画的突然変異のため、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体に関して原親と必ずしも完全に同じであるとは限らないことは、理解される。ｈＧＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在などの関連特性を特徴として有するほど十分に親に類似している親細胞の後代は、この定義により指定される後代に包含される。
【０３２５】
ｈＧＨポリペプチドの発現に適する宿主細菌の選択は、当業者に周知である。発現のために細菌を選択する際に適する宿主としては、とりわけ、良好な封入体形成能力、低いタンパク質溶解活性および総合的な頑強性を有することが明らかにされているものを挙げることができる。一般に、細菌宿主は、ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  （カリフォルニア州、バークレー）；および米国微生物系統保存機関［ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）］（バージニア州、マナッサス）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）様々な供給源から入手することができる。工業的／製薬的発酵には、Ｋ株（例えば、Ｗ３１１０）から誘導された細菌またはＢ株（例えば、ＢＬ２１）から誘導された細菌が使用される。これらの株は、これらの成長パラメータが極めて周知であり、頑強であるため、特に有用である。加えて、これらの株は、病原性ではなく、このことは、製品化という視点から安全性および環境上の理由のため重要である。本発明の方法の１つの実施態様において、大腸菌宿主は、ＢＬ２１の株である。本発明の方法のもう１つの実施態様において、大腸菌宿主は、ＯＭＰ−およびＬＯＮ−をはじめとする（しかし、これらに限定されない）プロテアーゼマイナス株である。本発明の方法のもう１つの実施態様において、宿主細胞株は、シュードモナス・フルオレッセンス、緑膿菌およびュードモナス・プチダをはじめとする（しかし、これらに限定されない）シュードモナス属種である。ＭＢ１０１株と呼ばれるシュードモナス・フルオレッセンス次亜種１は、Ｔｈｅ  Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙによる治療用タンパク質生産プロセスに宿主株として利用できる（ミシガン州、ミッドランド  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｄｏｗ．ｃｏｍで利用できる）。米国特許第４，７５５，４６５号および同第４，８５９，６００（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）には、ｈＧＨ生産のための宿主細胞としてのシュードモナス株の使用が記載されている。
【０３２６】
組換え宿主細胞株を樹立したら（すなわち、発現構築物を宿主細胞に導入し、適正な発現構築物を有する宿主細胞を単離したら）、この組換え宿主細胞を、ｈＧＨポリペプチドの生産に適する条件下で培養する。当業者には明らかであろうように、組換え宿主細胞を培養する方法は、利用される発現構築物の性質および宿主細胞の素性に依存するであろう。一般に、組換え宿主株は、当該技術分野において周知である方法を使用して培養される。組換え宿主細胞は、炭素、窒素および無機塩の同化性供給源を含有し、場合により、ビタミン、アミノ酸、成長因子および当該技術分野において周知である他のタンパク質性培養補足物を含有する液体培地中で一般には培養する。宿主細胞を培養するための液体培地は、望ましくない微生物の成長を予防するために抗生物質または抗真菌薬を、および／または発現ベクターを含有する宿主細胞を選択するために抗生物質をはじめとする（しかし、これに限定されない）化合物を、場合により含有する。
【０３２７】
組換え宿主細胞は、バッチ形式または連続形式で培養することができ、バッチ形式または連続形式のいずれかでの細胞を回収する（ｈＧＨポリペプチドが細胞内に蓄積する場合）か、培養上清を回収する。原核性宿主細胞での生産については、バッチ式培養および細胞回収が好ましい。
【０３２８】
本発明のｈＧＨポリペプチドは、組換え系での発現後、一般には精製される。本ｈＧＨポリペプチドは、当該技術分野において公知である様々な方法により宿主細胞から精製することができる。一般に、細菌宿主細胞において生産されたｈＧＨポリペプチドは、可溶性不良であるか、不溶性である（封入体の形態）。本発明の１つの実施態様において、ｈＧＨポリペプチドのアミノ酸置換は、容易に行うことができ、これらは、本明細書に開示する方法ならびに当業者に公知である方法を利用して組換え生産タンパク質の溶解性を増大させる目的で選択される。可溶性タンパク質の場合、このタンパク質を遠心分離により宿主細胞溶解産物から回収し、次いで、さらに、これらの細胞の均質化することができる。溶解性不良タンパク質の場合、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をはじめとする（しかし、これに限定されない）化合物を添加して、一部可溶性のタンパク質の沈殿を誘導することができる。次に、沈殿したタンパク質は、遠心分離により回収することができる。通常の当業者に周知である様々な方法を使用することにより、組換え細胞を破壊または均質化して、これらの細胞内から封入体を放出させることができる。宿主細胞の破壊または均質化は、酵素的細胞破壊、超音波処理、ダンス型均質化または高圧放出破壊をはじめとする（しかし、これらに限定されない）周知である技法を使用して行うことができる。本発明の方法の１つの実施態様では、高圧放出技法を使用して大腸菌宿主細胞を破壊して、ｈＧＨポリペプチドの封入体を放出させる。ホモジナイザーにより大腸菌宿主細胞の１つの継代のみを利用することにより、封入体の形態での可溶性ｈＧＨポリペプチドの収率を増加させることができることが判明した。ｈＧＨポリペプチドの封入体を取り扱う際、反復により均質化時間を最少にして、可溶化、機械的剪断またはタンパク質溶解などの因子に起因する損失を伴わずに封入体の収量を最大にすると有利である。
【０３２９】
次に、当該技術分野において公知である多数の適する可溶化剤を使用して、不溶性または沈殿したｈＧＨポリペプチドを可溶化することができる。好ましくは、尿素または塩酸グアニジンでｈＧＨポリペプチドを可溶化する。従来どおり処理できるバッチサイズを用いて大きなバッチを生産できるように、可溶化されるｈＧＨポリペプチド−ＢＰの体積を最少にすべきである。この因子は、何千リットルもの体積であるバッチで組換え宿主を成長させることができる大規模工業用設定では有意であり得る。加えて、大規模工業用設定で、特にヒトの医薬用途の、ｈＧＨポリペプチドを製造する場合、機械および容器またはタンパク質製品そのものを損傷させ得る刺激の強い化学薬品の回避は、可能であれば、回避すべきである。本発明の方法では、より刺激の強い変性剤変性グアニジンの代わりに、より弱い変性剤尿素を使用してｈＧＨポリペプチド封入体を可溶化することができることが判明した。この尿素の使用は、ｈＧＨポリペプチド封入体を有意に可溶化する一方で、ｈＧＨポリペプチドの製造および精製プロセスに利用されるステンレス鋼装置を損傷する危険性を有意に低減する。
【０３３０】
ｈＧＨポリペプチドが、融合タンパク質として生産される場合、この融合配列は、好ましくは除去する。融合配列の除去は、酵素的または化学的切断により、好ましくは酵素的分解により達成することができる。融合配列の酵素的除去は、当業者に周知である方法を使用して達成することができる。融合配列を除去するための酵素の選択は、この融合体の素性により決まるであろうし、また反応条件は、当業者には明らかであるような酵素の選択により指定されるであろう。分解ｈＧＨポリペプチドは、好ましくは、周知である方法によるこの分解融合配列から精製する。こうした方法は、当業者には明らかであるように、この融合配列およびｈＧＨポリペプチドの素性および特性により決まるであろう。精製のための方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーもしくは透析またはこれらのあらゆる組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３１】
好ましくは、ｈＧＨポリペプチドは、このタンパク質溶液からＤＮＡを除去するためにも精製される。ＤＮＡは、当該技術分野において公知であるいずれかの適する方法、例えば、沈殿またはイオン交換クロマトグラフィーにより除去することができるが、好ましくは、硫酸プロタミンなど（しかし、これに限定されない）の核酸沈殿剤での沈殿により除去される。ｈＧＨポリペプチドは、沈殿したＤＮＡから、遠心分離または濾過をはじめとする（しかし、これらに限定されない）周知である標準的な方法を使用して分離することができる。宿主核酸分子の除去は、ｈＧＨポリペプチドをヒトの治療に使用することとなる設定、および本発明の方法により宿主細胞ＤＮＡを医薬適合性レベルに減少させる設定において重要な因子である。
【０３３２】
発酵装置、振盪フラスコ、流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル培養システムおよび攪拌タンクバイオリアクターシステムをはじめとする（しかし、これらに限定されない）小規模または大規模な発酵方法もタンパク質発現に使用することができる。これらの各方法は、バッチ、フェッド−バッチ、または連続モードプロセスで行うことができる。
【０３３３】
本発明のヒトｈＧＨポリペプチドは、当該技術分野において標準的な方法を使用して、一般に回収することができる。例えば、培地または細胞溶解産物を遠心分離または濾過して、細胞破壊片を除去することができる。この上清を濃縮もしくは蒸留して所望の体積にしてもよいし、ダイアフィルタを通して、さらなる精製のためのこの調製物のコンディショニングに適する緩衝液へと濾過してもよい。本発明のｈＧＨポリペプチドのさらなる精製は、アミド分解された形態および剪断された形態のｈＧＨポリペプチド変異体とインタクトな形のものとの分離を含む。
【０３３４】
以下の具体例としての手順のいずれを本発明のｈＧＨポリペプチドの精製に利用してもよい：親和性クロマトグラフィー；アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（これを含むが、これに限定されない）を使用）；シリカでのクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲル濾過（ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−７５（これを含むが、これに限定されない）を使用）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外濾過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈降法；硫酸アンモニウム沈降法；クロマトフォーカッシング；置換クロマトグラフィー；電気泳動手順（分取等電点分画電気泳動法を含むが、これに限定されない）、示差溶解度（流砂アンモニウム沈降法を含むが、これに限定されない）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出。
【０３３５】
非天然アミノ酸、非天然アミノ酸を含むタンパク質に対する抗体、非天然アミノ酸を含むタンパク質の結合パートナーなどを含むタンパク質をはじめとする（しかし、これらに限定されない）本発明のタンパク質は、当業者に公知であり、当業者に使用されている標準的な手順に従って、部分的にまたは実質的に均質に精製することができる。従って、本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降法、酸または塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、親和性カラムクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーおよびゲル電気泳動法などをはじめとする（しかし、これらに限定されない）当該技術分野において周知である多数の方法のいずれによっても回収および精製することができる。所望される場合には、適性にフォールディングされた成熟タンパク質を作るタンパク質リフォールディング段階を用いることができる。高純度が望まれる最終精製段階では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、親和性クロマトグラフィーまたは他の適する方法を利用することができる。１つの実施態様において、非天然アミノ酸（または非天然アミノ酸を含むタンパク質）に対して作られた抗体を、１つ以上の非天然アミノ酸を含むタンパク質を親和性に基づき精製するため（これを含むが、これに限定されない）に、精製試薬として使用する。所望どおり部分的にまたは均質になるまで精製したら、これらのポリペプチドは、アッセイ成分、治療用、予防用、診断用、研究用試薬として、および／または抗体生産のための免疫原として（これらを含むが、これらに限定されない）、多種多様な用役のために場合により使用される。
【０３３６】
本明細書において述べる他の参照に加えて、様々な精製／タンパク質フォールディング法が当該技術分野において周知であり、こうしたものとしては、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ，（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，第二版  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ，（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ，（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  第三版  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ，（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．第二版  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；およびＷａｌｋｅｒ（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；ならびにこれらの中に引用されている参考文献に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３７】
真核性宿主細胞または非真核性宿主細胞において非天然アミノ酸を有する対象となるタンパク質またはポリペプチドを生産することの一つの利点は、一般に、これらのタンパク質またはポリペプチドが、これらの本来の配座でフォーディングされるであろうことである。しかし、本発明の一定の実施態様において、合成、発現および／または精製後、タンパク質は、この関連ポリペプチドの望ましい配座とは異なる配座を有することがあることは、当業者には理解されるであろう。本発明の一つの側面では、発現されたタンパク質を場合により変性させ、次いで、復元させる。これは、対象となるタンパク質またはポリペプチドにシャペロニンを付加させることによる；グアニジンＨＣｌなどのカオトロピック剤にタンパク質を可溶化することによる；タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを利用することによる、など（これらを含むが、これらに限定されない）、当該技術分野において公知である方法を利用して達成することができる。
【０３３８】
一般に、発現されるポリペプチドを変性および還元させ、この後、これらのポリペプチドを好ましい配座にリフォールドさせることが時として望ましい。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥおよび／またはシャペロニンを対象となる翻訳産物に添加することができる。タンパク質を還元、変性および復元させる方法は、当業者に周知である（上記参考文献、ならびにＤｅｂｉｎｓｋｉら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１４０６５−１４０７０；Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，４：５８１−５８５；およびＢｕｃｈｎｅｒら、（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０５：２６３−２７０参照）。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉらは、グアニジン−ＤＴＥにおける封入タンパク質の変性および還元を記載している。これらのタンパク質は、酸化されたグルタチオンおよびＬ−アルギニン（これらを含むが、これらに限定されない）を含有する酸化還元緩衝液中でリフォールドされ得る。リフォールディング試薬を流して、または別様に移動させて、１つ以上のポリペプチドまたは他の発現産物と接触させることができ、またはこの逆もできる。
【０３３９】
ｈＧＨポリペプチドの原核細胞生産の場合、このように生産されたｈＧＨポリペプチドは、ミスフォールドされていることがあり、したがって、生物活性を欠くか、低減された生物活性を有する。タンパク質の生体活性は、「リフォールディング」により回復させることができる。一般に、ミスフォールドされたｈＧＨポリペプチドは、例えば、１つ以上のカオトロピック剤（例えば、尿素および／またはグアニジン）ならびにジスルフィド結合を還元することができる還元剤（例えば、ジチオトレイトール、ＤＴＴまたは２−メルカプトエタノール、２ＭＥ）を使用して、このポリペプチド鎖を可溶化（このｈＧＨポリペプチドも不溶性である場合）、アンフォールドおよび還元することにより、リフォールドさせる。この後、中等度のカオトロープ濃度で、酸化剤（例えば、酸素、システインまたはシスタミン）を添加し、それによってジスルフィド結合を再構成することができる。ｈＧＨポリペプチドは、米国特許第４，５１１，５０２号、同第４，５１１，５０３号および同第４，５１２，９２２号（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されているものなどの当該技術分野において公知である標準的な方法を使用してリフォールドさせることができる。ｈＧＨポリペプチドを他のタンパク質とコフォールドさせて、ヘテロ二量体またはヘテロ多量体を形成することもできる。リフォールディングまたはコフォールディング後、このｈＧＨポリペプチドを好ましくはさらに精製する。
【０３４０】
一般精製法  ｈＧＨポリペプチドを含む細胞溶解産物を用いて、または親和性クロマトグラフィー、オン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）膨張床吸着、またはこれらの、あらゆる適切な順序でのあらゆる組合せおよび／もしくは繰り返しをはじめとする（しかし、これらに限定されない）あらゆる単離段階から得られるあらゆるｈＧＨポリペプチド混合物を用いて、様々な単離段階のいずれを行ってもよい。
【０３４１】
本明細書に記載する技法を行う際に使用される装置および他の必要材料は、市販されている。ポンプ、分別回収装置、モニター、レコーダーおよび完全システムは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州、フォスター・シティー）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、ハーキュリーズ）、およびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）から入手することができる。交換マトリックス材料、培地および緩衝液をはじめとする（しかし、これらに限定されない）クロマトグラフ材料も、こうした会社から入手することができる。
【０３４２】
平衡、ならびに本明細書に記載のカラムクロマトグラフィープロセスにおける他の段階、例えば洗浄および溶離は、ポンプなどの専用装置を使用して、より容易に遂行することができる。市販のポンプとしては、ＨＩＬＯＡＤ  Ｐｕｍｐ  Ｐ−５０、Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  Ｐｕｍｐ  Ｐ−１、Ｐｕｍｐ  Ｐ−９０１、およびＰｕｍｐ  Ｐ−９０３（ニュージャージー州、ピスカタウェイのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４３】
分別回収装置の例としては、ＲｅｄｉＦｒａｃ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ、ＦＲＡＣ−１００およびＦＲＡＣ−２００  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒｓ、ならびにＳＵＰＥＲＦＲＡＣＯ（登録商標）  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（ニュージャージー州、ピスカタウェイのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。ｐＨおよび線形濃度勾配を形成するために、ミキサーを利用することもできる。市販のミキサーとしては、Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｉｘｅｒ  ＧＭ−１およびＩｎ−Ｌｉｎｅ  Ｍｉｘｅｒｓ（ニュージャージー州、ピスカタウェイのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。
【０３４４】
クロマトグラフプロセスは、市販のモニターを使用してモニターすることができる。こうしたモニターを使用して、ＵＶ、ｐＨおよび電導性のような情報を集めることができる。検出器の例としては、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−１、ＵＶＩＣＯＲＤ（登録商標）Ｓ  ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−Ｍ  ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＰＣ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ｐＨ／Ｃ−９００、およびＣｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ（ニュージャージー州、ピスカタウェイのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。実際、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）からの様々なＡＫＴＡ（登録商標）をはじめとする完全システムが、市販されている。
【０３４５】
本発明の一つの実施態様において、例えば、結果として生じたｈＧＨポリペプチドを尿素中で先ず変性させ、続いて、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有する、適するｐＨのＴＲＩＳ緩衝液で希釈することにより、ｈＧＨポリペプチドを還元および変性させることができる。もう一つの実施態様では、ｈＧＨポリペプチドを約２Ｍから約９Ｍの間の濃度範囲で尿素中で変性させ、この後、約５．０から約８．０の範囲のｐＨでＴＲＩＳ緩衝液中で希釈する。続いて、この実施態様のリフォールディング混合物をインキュベートしてもよい。一つの実施態様において、前記リフォールディング混合物は、室温で４から２４時間インキュベートする。還元および変性されたｈＧＨポリペプチド混合物を、この後、さらに単離または精製してもよい。
【０３４６】
ここで述べる第一ｈＧＨポリペプチド混合物のｐＨは、いずれの後続単離段階を行う前にも調整することができる。加えて、当該技術分野において公知である技法を使用して、この第一ｈＧＨポリペプチド混合物またはこれらのあらゆる後成混合物を濃縮することができる。さらに、この第一ｈＧＨポリペプチド混合物またはこれらのあらゆる後成混合物を含有する溶離緩衝液を、通常の当業者に周知である技法を使用して次の単離段階に適する緩衝液と交換することができる。
【０３４７】
イオン交換クロマトグラフィー  一つの実施態様において、および任意の追加段階として、前記第一ｈＧＨポリペプチド混合物を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行うことができる。一般には、ＩＯＮ  ＥＸＣＨＡＮＧＥ  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１１１４−２１，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニュージャージー州、ピスカタウェイ））参照。市販のイオン交換カラムとしては、ＨＩＴＲＡＰ（登録商標）、ＨＩＰＲＥＰ（登録商標）およびＨＩＬＯＡＤ（登録商標）Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ニュージャージー州、ピスカタウェイ）が挙げられる。こうしたカラムでは、強アニオン交換体、例えば、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、およびＱ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＸＬ；強カチオン交換体、例えば、ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、およびＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＸＬ；弱アニオン交換体、例えば、ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ；ならびに弱カチオン交換体、例えば、ＣＭ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ニュージャージー州、ピスカタウェイ）が利用される。精製プロセスのあらゆる段階でｈＧＨポリペプチドでのカチオン交換カラムクロマトグラフィーを行って、実質的に精製されたｈＧＨポリペプチドを単離することができる。このカチオン交換クロマトグラフィー段階は、いずれかの適するカチオン交換マトリックスを使用して行うことができる。有用なカチオン交換マトリックスとしては、繊維状、多孔性、非多孔性、微粒子状、ビーズ状または架橋型カチオン交換マトリックス材料が挙げられるが、これらに限定されない。こうしたカチオン交換マトリックス材料としては、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル、または上記のいずれかの複合材料が挙げられるが、これらに限定されない。カチオン交換マトリックスへのｈＧＨポリペプチドの吸着後、実質的に精製されたｈＧＨポリペプチドを、このマトリックスからｈＧＨポリペプチドを排除するために十分な高さのｐＨまたはイオン強度を有するバッファとこのマトリックスを接触させることにより、溶離することができる。実質的に精製されたｈＧＨポリペプチドの高ｐＨ溶離における使用に適する緩衝液としては、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約１００ｍＭの濃度にわたるクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ギ酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＨＰＥＳ緩衝液およびＭＥＳ緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４８】
逆相クロマトグラフィー  当業者に公知である適するプロトコルに従って、ＲＰ−ＨＰＬＣを行って、タンパク質を精製することができる。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎら、ＡＮＡＬ  ＢＩＯＣＨＥＭ．（１９８２）１２４：２１７−２３０（１９８２）；Ｒｉｖｉｅｒら、Ｊ．ＣＨＲＯＭ．（１９８３）２６８：１１２−１１９；Ｋｕｎｉｔａｎｉら、Ｊ．ＣＨＲＯＭ．（１９８６）３５９：３９１−４０２参照。ＲＰ−ＨＰＬＣをｈＧＨポリペプチドで行って、実質的に精製されたｈＧＨポリペプチドを単離することができる。これに関しては、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ３０、少なくともＣ３から少なくともＣ２０、または少なくともＣ３から少なくともＣ１８樹脂をはじめとする（しかし、これらに限定されない）多種多様な長さのアルキル官能基を有するシリカ誘導体化樹脂を使用することができる。また、高分子樹脂を使用することができる。例えば、スチレンポリマー樹脂であるＴｏｓｏＨａｓｓ  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ１０００ｓｄ樹脂を使用することができる。多種多様なアルキル鎖長を有するシアノまたは高分子樹脂も使用することができる。さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムは、エタノールなどの溶媒で洗浄することができる。イオン対形成剤および有機改質剤、例えばメタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリルまたはエタノールを含有する、適する溶離緩衝液を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムからｈＧＨポリペプチドを溶離することができる。最も一般的に使用されているイオン対形成剤としては、酢酸、ギ酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。溶離は、１つ以上の勾配またはイソクラティック条件を使用して行うことができ、分離時間を縮小し、ピーク幅を減少させる勾配条件のほうが好ましい。もう一つの方法は、異なる溶媒濃度範囲での２つの勾配の使用を伴う。ここでの使用に適する溶離緩衝液の例としては、酢酸アンモニウムおよびアセトニトリル溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４９】
疎水性相互作用クロマトグラフィー精製法  疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）をｈＧＨポリペプチドに対して行うことができる。一般には、ＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＣ  ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮ  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２０−９０，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）（これは、本明細書に参照により組み込まれている）参照。適するＨＩＣマトリックスとしては、アルキル置換もしくはアリール置換マトリックス、例えばブチル置換、ヘキシル置換、オクチル置換もしくはフェニル置換マトリックス［アガロース、架橋アガロース、セファロース、セルロース、シリカ、デキストラン、ポリスチレン、ポリ（メタクリレート）マトリックスを含むが、これらに限定されない］および混合型樹脂［ポリエチレンアミン樹脂またはブチル置換もしくはフェニル置換ポリ（メタクリレート）マトリックスを含むが、これらに限定されない］が挙げられるが、これらに限定されない。疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーのための市販の供給源としては、ＨＩＴＲＡＰ（登録商標）、ＨＩＰＲＥＰ（登録商標）、およびＨＩＬＯＡＤ（登録商標）カラム（ニュージャージー州、ピスカタウェイのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。簡単に言うと、負荷する前に、当業者に公知である標準的な緩衝液、例えば酢酸／塩化ナトリウム溶液または硫酸アンモニウム含有ＨＥＰＥＳを使用して、ＨＩＣカラムを平衡させることができる。ｈＧＨポリペプチドを負荷した後、標準的な緩衝液および条件を使用してこのカラムを洗浄して、望ましくない材料を除去するが、ＨＩＣカラムにｈＧＨポリペプチドは保持することができる。ｈＧＨポリペプチドは、約３から約１０カラム量の標準的な緩衝液、例えば、数ある中でも、ＥＤＴＡと平衡緩衝液より低い硫酸アンモニウム濃度とを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液、または酢酸／塩化ナトリウム緩衝液で溶離することができる。例えばリン酸カリウムの勾配を使用する漸減線形塩勾配を使用してｈＧＨ分子を溶離することもできる。この後、この溶離液は、例えばダイアフィルトレーションまたは限外濾過などの濾過によって、濃縮することができる。ダイアフィルトレーションを利用して、使用される塩を除去して、ｈＧＨポリペプチドを溶離することができる。
【０３５０】
他の精製法  例えばゲル濾過（本明細書に参照により組み込まれている、ＧＥＬ  ＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２２−１８，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ニュージャージー州、ピスカタウェイ））、ＨＰＬＣ、膨張床吸着、限外濾過、ダイアフィルトレーションおよび凍結乾燥などを使用するさらにもう一つの単離段階を最初のｈＧＨポリペプチド混合物またはこのあらゆる後成混合物に対して行って、あらゆる過剰な塩を除去し、この緩衝液を次の単離段階にまたは最終薬物生成の調合にさえ適する緩衝液で置換する。実質的に精製されたｈＧＨポリペプチドを含むｈＧＨポリペプチドの収量は、当業者に公知である技法を使用して、ここに記載の各段階でモニターすることができる。こうした技法を使用して、最終単離段階後に実質的に精製されたｈＧＨポリペプチドの収量を評価することもできる。例えば、ｈＧＨポリペプチドの収量は、様々なアルキル鎖長を有する幾つかの逆相高圧液体クロマトグラフィーのいずれか、例えば、シアノＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ、ならびにカチオン交換ＨＰＬＣおよびゲル濾過ＨＰＬＣを使用してモニターすることができる。
【０３５１】
純度は、標準的な技法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、またはウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイを使用するｈＧＨポリペプチドの測定により、判定することができる。例えば、ポリクローナル抗体を、負調整型酵母発酵およびカチオン交換回収から単離したタンパク質に対して産生させることができる。これらの抗体は、宿主細胞への汚染の存在についてのプローブとして使用することもできる。
【０３５２】
ＲＰ−ＨＰＬＣ材料Ｖｙｄａｃ  Ｃ４（Ｖｙｄａｃ）は、表面にＣ４−アルキル鎖を有するシリカゲル粒子から成る。タンパク質性不純物とｈＧＨポリペプチドの分離は、これらの疎水性相互作用の強度の差に基づく。溶離は、希トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配で行う。分取ＨＰＬＣは、ステンレス鋼カラム（２．８から３．２リットルのＶｙｄａｃ  Ｃ４シリカゲルを充填したもの）を使用して行う。ヒドロキシアパタイト・ウルトロゲル（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）溶離液をトリフルオロ酢酸の添加により酸性化し、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４カラムに負荷する。洗浄および溶離には、希トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を使用する。画分を回収し、リン酸緩衝液で直ちに中和する。ＩＰＣの範囲内にあるｈＧＨポリペプチド画分をプールする。
【０３５３】
ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）材料は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズの表面に共有結合しているジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基から成る。このＤＥＡＥ基へのｈＧＨポリペプチドの結合は、イオン相互作用により媒介される。アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸はこのカラムを通過し、カラムに保持されない。これらの物質を洗い出した後、微量不純物を中性リン酸緩衝液で洗浄し、ｈＧＨポリペプチドを漸増イオン強度の緩衝液で溶離する。このカラムにＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗを充填する。ゲル  １ｍＬあたりｈＧＨポリペプチド  ３から１０ｍｇの範囲内でのｈＧＨポリペプチドの負荷を確保するようにカラム量を調整する。このカラムを水および平衡緩衝液（リン酸ナトリウム／カリウム）で洗浄する。ＨＰＬＣ溶離液のプール画分を負荷し、このカラムを平衡緩衝液で洗浄する。次に、カラムを洗浄緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）で洗浄し、続いて平衡緩衝液で洗浄する。続いて、ｈＧＨポリペプチドを溶離緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）でカラムから溶離し、マスター溶離プロフィールに従って単一画分で回収する。ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの溶離液をこの比導電率に調整する。得られた薬物は、滅菌濾過してＴｅｆｌｏｎ瓶に入れ、−７０℃で保管する。
【０３５４】
Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含むが、これに限定されない）および当業者に公知であるタンパク質を特性付けするための他の方法をはじめとする（しかし、これらに限定されない）多種多様な方法および手順を利用して、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸を有するｈＧＨポリペプチドの収量および純度を評価することができる。
【０３５５】
ＶＩＩＩ．代替系での発現
非組換え宿主細胞、突然変異誘発宿主細胞または無細胞系においてタンパク質に非天然アミノ酸を導入するために、幾つの戦略が利用されている。これらの系は、本発明のｈＧＨポリペプチドを作製する際の使用にも適する。反応性側鎖、例えばＬｙｓ、ＣｙｓおよびＴｙｒを有するアミノ酸の誘導体化により、リシンをＮ２−アセチル−リシンに転化させた。化学合成により、非天然アミノ酸を組み込むための直接的な方法も提供する。ペプチドフラグメントの酵素的ライゲーションおよび天然の化学的ライゲーションに対する最近の開発により、より大きなタンパク質の作製が可能である。例えば、Ｐ．Ｅ．ＤａｗｓｏｎおよびＳ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ、  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９：９２３（２０００）参照。所望の非天然アミノ酸で化学的にアシル化されたサプレッサｔＲＮＡを、タンパク質生合成を支援することができるインビトロ抽出物に添加する一般的なインビボ生合成法を使用して、１００を超える非天然アミノ酸が、実質的にあらゆるサイズの様々なタンパク質に部位特異的に組み込まれた。例えば、Ｖ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｄ．Ｍｅｎｄｅｌ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９５，３４：６２１（１９９５）；Ｃ．Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，Ｓ．Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２−１８８（１９８９）；およびＪ．Ｄ．Ｂａｉｎ，Ｃ．Ｇ．Ｇｌａｂｅ，Ｔ．Ａ．Ｄｉｘ，Ａ．Ｒ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｅ．Ｓ．Ｄｉａｌａ，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８０１３−８０１４（１９８９）参照。タンパク質の安定性、タンパク質フォールディング、酵素メカニズムおよいシグナル伝達の研究のために、広範な官能基がタンパク質に導入されている。
【０３５６】
野生型シンセターゼの乱交性を利用するために、選択圧型組み込み（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれるインビボ法が開発された。例えば、Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ，Ｃ．Ｍｉｎｋｓ，Ｓ．Ａｌｅｆｅｌｄｅｒ，Ｗ．Ｗｅｎｇｅｒ，Ｆ．Ｍ．Ｄｏｎｇ，Ｌ．ＭｏｒｏｄｅｒおよびＲ．Ｈｕｂｅｒ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１３：４１（１９９９）参照。特定の天然アミノ酸を細胞に供給する関連代謝経路が切断されている栄養要求性菌株を、限定濃度の非天然アミノ酸を含有する最少培地で成長させるが、ターゲット遺伝子の転写は抑制する。生育定常期の開始時、天然アミノ酸を枯渇させ、非天然アミノ酸類似体で置換する。組換えタンパク質の発現の誘導により、この非天然アミノ酸を含有するタンパク質を蓄積させる。例えば、この戦略を用いて、ｏ−、ｍ−およびｐ−フルオロフェニルアラニンがタンパク質に組み込まれており、これは、容易に特定することができるＵＶスペクトルの２つの特徴的な肩を示し［例えば、Ｃ．Ｍｉｎｋｓ，Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｌ．ＭｏｒｏｄｅｒおよびＮ．Ｂｕｄｉｓａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８４：２９（２０００）参照］；バクテリオファージＴ４リゾチームにおいてトリフルオロメチオニンがメチオニンの代わりに用いられ、キトオリゴ糖リガンドとのこの相互作用が１９Ｆ  ＮＭＲにより研究されており［例えば、Ｈ．Ｄｕｅｗｅｌ，Ｅ．Ｄａｕｂ，Ｖ．ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＪ．Ｆ．Ｈｏｎｅｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：３４０４（１９９７）参照］；ならびにトリフルオロロイシンをロイシンの代わりに組み込まれ、この結果、ロイシン−ジッパータンパク質の熱および化学安定性が増加した［例えば、Ｙ．Ｔａｎｇ，Ｇ．Ｇｈｉｒｌａｎｄａ，Ｗ．Ａ．Ｐｅｔｋａ，Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｗ．Ｆ．ＤｅＧｒａｄｏおよびＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，４０：１４９４（２００１）参照］。さらに、Ｘ線結晶学における相の溶解を助長するために、セレノメチオニンおよびテルロメチオニンが様々な組換えタンパク質に組み込まれている。例えば、Ｗ．Ａ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．ＨｏｒｔｏｎおよびＤ．Ｍ．Ｌｅｍａｓｔｅｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９：１６６５（１９９０）；Ｊ．Ｏ．Ｂｏｌｅｓ，Ｋ．Ｌｅｗｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｋｕｎｋｌｅ，Ｊ．Ｄ．Ｏｄｏｍ，Ｂ．Ｄｕｎｌａｐ，Ｌ．Ｌｅｂｉｏｄａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈａｔａｄａ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１：２８３（１９９４）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ，Ｂ．Ｓｔｅｉｐｅ，Ｐ．Ｄｅｍａｎｇｅ，Ｃ．Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎ，Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３０：７８８（１９９５）；およびＮ．Ｂｕｄｉｓａ，Ｗ．Ｋａｒｎｂｒｏｃｋ，Ｓ．Ｓｔｅｉｎｂａｃｈｅｒ，Ａ．Ｈｕｍｍ，Ｌ．Ｐｒａｄｅ，Ｔ．Ｎｅｕｅｆｅｉｎｄ，Ｌ．ＭｏｒｏｄｅｒおよびＲ．Ｈｕｂｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０：６１６（１９９７）参照。アルケンまたはアルキン官能基を有するメチオニン類似体も効率的に組み込まれており、これにより、化学的手段によるタンパク質のさらなる変性が可能となった。例えば、Ｊ．Ｃ．Ｍ．ｖａｎＨｅｓｔおよびＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２８：６８（１９９８）；Ｊ．Ｃ．Ｍ．ｖａｎ  Ｈｅｓｔ，Ｋ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１２８２（２０００）；およびＫ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５６：９４８７（２０００）；米国特許第６，５８６，２０７号；米国特許公開第２００２／００４２０９７号参照（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）。
【０３５７】
この方法の成功は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによる非天然アミノ酸類似体の認識に依存し、これには、タンパク質翻訳の忠実度を保障する高度な選択性が、一般に必要とされる。この方法の範囲を拡大する一つの手段は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの基質特異性を減少させることであり、これは、限られた事例で達成されている。例えば、大腸菌フェニルアラニン−ｒＲＮＡシンセターゼ（ＰｈｅＲＳ）におけるＧｌｙによるＡｌａ２９４の置換は、基質結合ポケットのサイズを増大させ、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によるｔＲＮＡ  Ｐｈｅのアシル化を生じさせる。Ｍ．Ｉｂｂａ，Ｐ．ＫａｓｔおよびＨ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：７１０７（１９９４）参照。この突然変異体ＰｈｅＲＳを有する大腸菌株により、フェニルアラニンの代わりにｐ−Ｃｌ−フェニルアラニンまたはｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンを組み込むことができる。例えば、Ｍ．ＩｂｂａおよびＨ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３６４：２７２（１９９５）；およびＮ．Ｓｈａｒｍａ，Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐ．ＫａｓｔおよびＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４６７：３７（２０００）参照。同様に、大腸菌チロシル−ｔＲＮＡシンセターゼのアミノ酸結合部位近くでの点突然変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒにより、チロシンより効率的にアザチロシンを組み込むことができることが、証明された。例えば、Ｆ．Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕ，Ｔ．Ｉｗａｍａ，Ｓ．Ｓａｉｔｏ−Ｙａｎｏ，Ｋ．Ｔａｋａｋｕ，Ｙ．Ｍｏｎｄｅｎ，Ｍ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ，Ｄ．ＳｏｌｌおよびＳ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：４０３２４（２０００）参照。
【０３５８】
非天然アミノ酸をインビボで組み込むためのもう一つの戦略は、校正メカニズムを有するシンセターゼの修飾である。これらのシンセターゼは、同源天然アミノ酸に構造的に類似しているアミノ酸を識別することができず、したがって、活性化することができない。このエラーは、別の部位で校正され、これにより、ｔＲＮＡから間違えて負荷されたアミノ酸が脱アシル化されて、タンパク質翻訳の適合性が維持される。このシンセターゼの校正活性が使用不能であると、間違えて活性化される構造類似体が、編集機能を免れて組み込まれることがある。このアプローチは、バリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＶａｌＲＳ）で、最近、実証された。Ｖ．Ｄｏｒｉｎｇ，Ｈ．Ｄ．Ｍｏｏｔｚ，Ｌ．Ａ．Ｎａｎｇｌｅ，Ｔ．Ｌ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｖ．ｄｅ  Ｃｒｅｃｙ−Ｌａｇａｒｄ，Ｐ．ＳｃｈｉｍｍｅｌおよびＰ．Ｍａｒｌｉｅｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：５０１（２００１）参照。ＶａｌＲＳは、Ｃｙｓ，Ｔｈｒまたはアミノブチレート（Ａｂｕ）を有するｔＲＮＡ  Ｖａｌを間違えてアミノアシル化することがあり、これらの非同源アミノ酸は、後に編集ドメインにより加水分解される。大腸菌染色体のランダム突然変異誘発後、ＶａｌＲＳの編集部位での突然変異を有する突然変異体大腸菌株が選択された。この修正欠陥ＶａｌＲＳは、Ｃｙｓを有するｔＲＮＡ  Ｖａｌに間違って負荷する。Ａｂｕは、Ｃｙｓと立体配置が似ている（Ｃｙｓの−ＳＨ基が、Ａｂｕでは−ＣＨ３で置換されている）ため、突然変異体ＶａｌＲＳは、この突然変異体大腸菌株をＡｂｕの存在下で成長させると、タンパク質にＡｂｕも組み込む。質量スペクトル分析は、天然タンパク質においてバリンの約２４％が各バリン位置でＡｂｕにより置換されることを示す。
【０３５９】
固相合成および半合成法よっても、新規アミノ酸を含有する多数のタンパク質を合成することができる。例えば、次の出版物およびこれらの中に引用されている参考文献（以下のとおり）を参照：Ｃｒｉｃｋ，Ｆ．Ｊ．Ｃ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｌ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ｗａｔｔｓ−Ｔｏｂｉｎ，Ｒ．Ｇｅｎｅｒａｌ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，１９２：１２２７−１２３２（１９６１）；Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．，Ｂｏｈｎ，Ｈ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＸＸＸＶＩ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｙｒａｚｏｌｅ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｎ  Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ，８８（２４）：５９１４−５９１９（１９６６）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｅｎｙｚｍｅｓ，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ，４７−５４（１９８９）；Ｎａｋａｔｓｕｋａ，Ｔ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｈｉｏｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，３８０８−３８１０（１９８７）；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ．，Ｋｅｎｔ，Ｓ  Ｂ  Ｈ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｄｏｖｅｔａｉｌｉｎｇ  ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６（５０５４）：２２１−２２５（１９９２）；Ｃｈａｉｋｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１１（３）：２５５−３０１（１９８１）；Ｏｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅａｎｓ？  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１（３）：１５１−１５７（１９８７）；およびＪａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｙ．，Ｂｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．，Ｑｕａｎ，Ｃ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．，Ｔｏｍ，Ｊ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．Ａ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｓｅ  ｆｏｒ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ  ｗｉｔｈ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６（５１８３）：２４３  （１９９４）。
【０３６０】
化学修飾を用いて、補助因子、スピンラベルおよびオリゴヌクレオチドをはじめとする様々な非天然側鎖がインビトロでタンパク質に導入された。例えば、Ｃｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８（４８３２）：１４０１−１４０３（１９８７）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｄ．Ｓ．，Ｒｏｋｉｔａ，Ｓ．Ｅ．Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，５４：５６５−５９５（１９８５）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｄ．Ｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｙｚｍｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６（４６７４）：５０５−５１１（１９８４）；Ｎｅｅｔ，Ｋ．Ｅ．，Ｎａｎｃｉ  Ａ，Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２４３（２４）：６３９２−６４０１（１９６８）；Ｐｏｌｇａｒ，Ｌ．Ｂ．，Ｍ．Ｌ．Ａ  ｎｅｗ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ  ｆｏｒｍｅｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ．Ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ．Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，３１５３−３１５４（１９６６）；およびＰｏｌｌａｃｋ，Ｓ．Ｊ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２（４８８１）：１０３８−１０４０（１９８８）参照。
【０３６１】
また、化学変性されたアミノアシル−ｔＲＮＡを利用する生合成法を用いて、幾つかの生物物理学的プローブが、インビトロで合成されたタンパク質に組み込まれた。以下の出版物およびこれらの中に引用されている参考文献を参照のこと：Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．Ｎｅｗ  Ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，６２：４８３−５１４（１９９３）；およびＫｒｉｅｇ，Ｕ．Ｃ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．，Ｈｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｅ．Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｐｒｅｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５４−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８３（２２）：８６０４−  ８６０８（１９８６）。
【０３６２】
以前、所望のアンバーナンセンス突然変異を有する遺伝子とのプログラムされたタンパク質合成反応に、化学的にアミノアシル化したサプレッサｔＲＮＡを付加させることにより、非天然アミノ酸をインビトロでタンパク質に部位特異的に組み込むことができることが証明された。これらのアプローチを利用することにより、特定のアミノ酸に対して栄養要求性の株を用いて、２０の共通アミノ酸の多数を構造的に近い相同体で、例えばフェニルアラニンをフルオロフェニルアラニンで、置換することができる。例えば、Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（１９８９）；Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：４３９−４２（１９９５）；Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｄｉｘ，Ｔ．Ａ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ａ．Ｒ．，Ｄｉａｌａ，Ｅ．Ｓ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１１１：８０１３−８０１４（１９８９）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１３：４１−５１（１９９９）；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｓ．，Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．，３０１−３３６（１９９２）；およびＭｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．２４，４３５−６２（１９９５）参照。
【０３６３】
例えば、停止コドンＵＡＧを認識し、非天然アミノ酸で化学的にアミノアシル化されたサプレッサｔＲＮＡが、調製された。従来の部位特異的突然変異誘発を用いて、停止コドンＴＡＧが、タンパク質遺伝子の対照と成る部位に導入された。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｎｏｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１６（３）：７９１−８０２（１９８８）参照。アシル化されたサプレッサｔＲＮＡと突然変異遺伝子をインビトロ転写／翻訳系において併せると、非天然アミノ酸がＵＡＧコドンに応答して組み込まれ、これにより、特定位置にこのアミノ酸を有するタンパク質が得られた。［３Ｈ］−Ｐｈｅを使用する実験およびα−ヒドロキシ酸での実験により、所望のアミノ酸だけが、ＵＡＧコドンにより指定された位置に組み込まれること、およびこのアミノ酸は、このタンパク質の他のいずれの部位にも組み込まれないことが実証された。例えば、Ｎｏｒｅｎら、上記；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、（２００３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０（６）：４２５−４３２；およびＥｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５（５０４１）：１９７−２００（１９９２）参照。
【０３６４】
マイクロインジェクション技法も、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むために使用されている。例えば、Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ，Ｐ．Ｃ．Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｒ．Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｓａｋｓ，Ｃ．Ｇ．Ｌａｂａｒｃａ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｗ．Ｇ．Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｔｈｏｒｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｎ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｄ．Ａ．ＤｏｕｇｈｅｒｔｙおよびＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：４３９（１９９５）；およびＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６４５（２０００）参照。アフリカツメガエル卵母細胞を、インビトロで作製された２つのＲＮＡ種（対象となるアミノ酸位置にＵＡＧ停止コドンを有するターゲットタンパク質をコードするｍＲＮＡ、および所望の非天然アミノ酸でアミノアシル化されたアンバーサプレッサｔＲＮＡ）とともに共注入した。次に、この卵母細胞の翻訳機構により、この非天然アミノ酸がＵＡＧにより指定された位置に挿入される。この方法は、インビトロ発現系には一般に従わない、膜内在性タンパク質のインビボ構造−機能研究を可能にした。例としては、蛍光共鳴エネルギー移動により距離を測定するためのタキキニンニューロキニン−２受容体への蛍光アミノ酸の組み込み［例えば、Ｇ．Ｔｕｒｃａｔｔｉ，Ｋ．Ｎｅｍｅｔｈ，Ｍ．Ｄ．Ｅｄｇｅｒｔｏｎ，Ｕ．Ｍｅｓｅｔｈ，Ｆ．Ｔａｌａｂｏｔ，Ｍ．Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｈ．Ｖｏｇｅｌ  ａｎｄ  Ａ．Ｃｈｏｌｌｅｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１９９９１（１９９６）参照］；イオンチャネル内の表面露出残基を特定するためのビオチニル化アミノ酸の組み込み［例えば、Ｊ．Ｐ．Ｇａｌｌｉｖａｎ，Ｈ．Ａ．ＬｅｓｔｅｒおよびＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：７３９（１９９７）参照］；現時間でイオンチャネルにおける配座変化をモニターするためのケージドチロシン類似体の使用［例えば、Ｊ．Ｃ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｄ．Ａ．ＤｏｕｇｈｅｒｔｙおよびＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｎｅｕｒｏｎ，２０：６１９（１９９８）参照］；およびイオンチャネル骨格を変化させてこれらのゲーティングメカニズムを探査するためのアルファヒドロキシアミノ酸の使用［例えば、Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ，９６：８９（１９９９）；およびＴ．Ｌｕ，Ａ．Ｙ．Ｔｉｎｇ，Ｊ．Ｍａｉｎｌａｎｄ，Ｌ．Ｙ．Ｊａｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ  ａｎｄ  Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，４：２３９（２００１）参照］が挙げられる。
【０３６５】
非天然アミノ酸をタンパク質にインビボで直接組み込むことができることにより、高い突然変異タンパク質収率、技術的な容易さ、細胞でまたはことによると生体で突然変異タンパク質を研究する可能性、および治療的処置におけるこれらの突然変異タンパク質の使用という利点が得られる。様々なサイズ、酸性度、求核性度、疎水性度および他の特性を有する非天然アミノ酸をタンパク質に含めることができることにより、タンパク質の機能の探査、新規特性を有する新たなタンパク質または生物の創作、両方のために、タンパク質の構造を合理的で、系統的に操作する能力を大いに拡大することができる。しかし、このプロセスは、タンパク質翻訳の高い忠実度の達成を必要とするｔＲＮＡ−シンセターゼ相互作用の複雑な性質のため、困難である。
【０３６６】
パラ−Ｆ−Ｐｈｅを部位特異的に組み込む一つの試みでは、酵母アンバーサプレッサｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンセターゼペアが、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ耐性、Ｐｈｅ栄養要求性大腸菌株において使用された。例えば、Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，７：４１９（１９９８）参照。
【０３６７】
無細胞（インビトロ）翻訳系を使用して、本発明のｈＧＨポリペプチドの発現を達成することもできる。テンプレートとしてｍＲＮＡ（インビトロ翻訳）またはテンプレートとしてＤＮＡ（インビトロ転写および翻訳の併用）、いずれかを含むこれらの系において、リボソームによりインビトロ合成を直接行う。無細胞タンパク質発現系の開発には相当な努力が注がれている。例えば、Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７４：３０９−３１６（２００１）；Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２，１５３７−１５４２，（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，１６，３８５−３９０，（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６６，１８０−１８８，（１９９９）；およびＰａｔｎａｉｋ，Ｒ．ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４，８６２−８６８，（１９９８）；米国特許第６，３３７，１９１号；米国特許公開第２００２／００８１６６０号；国際公開第００／５５３５３号、同第ＷＯ  ９０／０５７８５参照（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）。天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの発現に適用することができるもう一つのアプローチとしては、ｍＲＮＡ−ペプチド融合法が挙げられる。例えば、Ｒ．Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９４：１２２９７−１２３０２（１９９７）；Ａ．Ｆｒａｎｋｅｌら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１０４３−１０５０（２００３）参照。このアプローチでは、ピューロマイシンに連結させたｍＲＮＡテンプレートをリボソームでペプチドに翻訳する。１つ以上のｔＲＮＡ分子を修飾すると、非天然アミノ酸もこのペプチドに組み込むことができる。最終ｍＲＮＡコドンが読み取られた後、ピューロマイシンは、このペプチドのＣ末端を捕捉する。結果として生じたｍＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートが、インビトロアッセイで関心のある特性を有すると判明した場合、この素性は、このｍＲＮＡ配列から容易に明らかにすることができる。このようにして、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのライブラリをスクリーニングして、所望の特性を有するポリペプチドを特定することができる。より最近、天然にはコードされないアミノ酸で置換されたペプチドを合成することができる精製成分でのインビトロリボソーム翻訳が、報告された。例えば、Ａ．Ｆｏｒｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：６３５３（２００３）参照。
【０３６８】
ＩＸ．ｈＧＨポリペプチドにカップリングさせた高分子ポリマー
本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドへの様々な修飾は、本明細書に記載の組成物、方法、技法および戦略を使用して行うことができる。これらの修飾としては、このポリペプチドの非天然アミノ酸成分へのさらなる官能基の組み込みが挙げられ、こうした官能基としては、ラベル；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性ラベル；光親和性ラベル；反応性化合物；樹脂；第二タンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗原フラグメント；金属キレート化剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；抑制リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピンラベル；蛍光体；金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合性もしくは非共有結合性相互作用をする基；光ケージド部分；光異性体化性部分；ビオチン；ビオチンの誘導体；ビオチン類似体；重原子を組み込む部分；化学分解性の基；光分解性の基；延長された側鎖；炭素に連結した糖；レドックス活性剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位元素で標識された部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度の基；磁性を有する基；介在基；発色団；エネルギー変換因子；生物活性因子；検出可能ラベル；小分子；または上記のあらゆる組合せ、または他のいずれかの望ましい化合物もしくは物質が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の組成物、方法、技法および戦略の実例となる非限定的な例として、以下の説明は、そこに記載されている組成物、方法、技法および戦略が、上に挙げたものをはじめとする（しかし、これらに限定されない）他の官能基の付加にも適用することができる（必要に応じて適切な修飾を伴い、また、当業者が本明細書における開示を用いて行うことができる）という理解で、非天然アミノ酸への高分子ポリマーの付加に焦点を合わせた。
【０３６９】
多種多様な高分子ポリマーおよび他の分子を本発明のｈＧＨポリペプチドに連結させて、このｈＧＨポリペプチドの生物学的特性を調節し、および／またはこのｈＧＨ分子に新たな生物学的特性をもたらすことができる。これらの高分子ポリマーは、天然にコードされるアミノ酸により、天然にはコードされないアミノ酸により、または天然もしくは非天然アミノ酸のいずれかの官能性置換基、または天然もしくは非天然アミノ酸に付加させたいずれかの置換基もしくは官能基により、ｈＧＨポリペプチドに連結させることができる。
【０３７０】
本発明は、ポリマー：タンパク質コンジュゲートの実質的に均質な製剤を提供する。ここで用いる「実質的に均質な」とは、ポリマー：タンパク質コンジュゲート分子が、全タンパク質の半分より多く観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質コンジュゲートは、生物活性を有し、本明細書において提供する本「実質的に均質な」ＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチド製剤は、均質製剤の利点、例えばロットごとの薬物動態を予測できることでの臨床適用の容易さ、を示すほど均質であるものである。
【０３７１】
ポリマー：タンパク質コンジュゲート分子の混合物の調製も選択することができ、本明細書において提供する利点は、この混合物に含めるモノ−ポリマー：タンパク質コンジュゲートの比率を選択できるということである。従って、所望される場合には、取り付けられているポリマー部分の数が様々である（すなわち、ジ−、トリ−、テトラ−、など）様々なタンパク質の混合物を調製することができ、前記コンジュゲートと本発明の方法を使用して調製されたモノ−ポリマー：タンパク質コンジュゲートとを併せることができ、および混合物を所定のモノ−ポリマー：タンパク質コンジュゲート比にすることができる。
【０３７２】
選択されるポリマーは、それを取り付けるタンパク質が水性環境、例えば生理環境で沈殿しないように、水溶性であり得る。ポリマーは、分枝状であってもよいし、非分枝状であってもよい。好ましくは、最終製品製剤の治療使用のために、ポリマーは、医薬的に許容されるであろう。
【０３７３】
ポリエチレングリコール分子のタンパク質分子に対する比率により、反応混合物中のこれらの濃度を意のままに変えられるであろう。一般に、（過剰な未反応タンパク質またはポリマーが最少である反応効率という点で）最適な比率は、選択されるポリエチレングリコールの分子量により、および利用可能な有効反応性基の数を基に、決定することができる。分子量に関連して、典型的に、ポリマーの分子量が高いほど、このタンパク質に取り付けることができるポリマー分子の数は少ない。同様に、これらのパラメータを最適化する際、ポリマーの分枝を考慮しなければならない。一般に、分子量が高いほど（分枝が多いほど）、ポリマー：タンパク質比は高い。
【０３７４】
ここで用いる場合、およびＰＥＧ：ｈＧＨポリペプチドコンジュゲートを考えるとき、用語「治療有効量」は、患者に恩恵をもたらす、ヘマトクリットで増加を生じさせる量を指す。この量は、個体ごとに異なり、患者の健康状態および貧血の基礎原因をはじめとする多数の因子に依存するであろう。例えば、慢性腎不全に罹患している患者についてのｈＧＨポリペプチドの治療有効量は、週３回の５０から１５０単位／ｋｇである。治療に使用されるｈＧＨポリペプチドの量により、許容可能なヘマトクリット増加率が得られ、このヘマトクリットが有益なレベル（通常は少なくとも約３０％、典型的には３０％から３６％の範囲）で維持される。当業者は、公的に利用できる材料および手順を用いて、本組成物の治療有効量を容易に突きとめることができる。
【０３７５】
水溶性ポリマーは、線状、分岐状または分枝状をはじめとする（しかし、これらに限定されない）あらゆる構造であり得る。典型的に、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）であるが、他の水溶性ポリマーも利用することができる。例として、ＰＥＧを使用して、本発明の一定の実施態様を説明する。
【０３７６】
ＰＥＧは、周知である水溶性ポリマーであり、これは、市販されており、または当該技術分野において周知である方法に従ってエチレングリコールの開環重合により調製することができる（Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ  １３８−１６１）。用語「ＰＥＧ」は、サイズまたはこのＰＥＧ末端における修飾にかかわらず、あらゆるポリエチレングリコール分子を包含するために幅広く使用し、ならびにｈＧＨポリペプチドに連結されている場合、式：
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
（式中、ｎは、２から１０，０００であり、Ｘは、Ｈであるか、Ｃ１−４アルキルをはじめとする（しかし、これに限定されない）末端修飾である）
により表すことができる。
【０３７７】
場合によっては、本発明で使用するＰＥＧは、一方の末端がヒドロキシまたはメトキシで終わっている。すなわち、Ｘは、ＨまたはＣＨ３である（「メトキシＰＥＧ」）。また、ＰＥＧは、反応性基で終わっており、この結果、二官能性ポリマーを形成することがある。典型的な反応性基としては、２０の共通アミノ酸において見出される官能基と反応させるために一般に使用される反応性基（マレイミド基、活性化カーボネート（ｐ−ニトロフェニルエステルを含むが、これに限定されない）、活性化エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステルを含むが、これらに限定されない）およびアルデヒドを含むが、これらに限定されない）ならびに２０の共通アミノ酸への挿入物であるが、天然にはコードされないアミノ酸中に存在する相補性官能基（アジド基、アルキレン基を含むが、これらに限定されない）と特異的に反応する官能基を挙げることができる。上の式中、Ｙで示されているＰＥＧの他の末端が、ｈＧＨポリペプチドに直接、または天然にはコードされないアミノ酸により間接的に取り付けられるであろうことに注目される。例えば、Ｙは、ポリペプチドのアミン基（リシンのイプシロンアミンまたはＮ末端を含むが、これらに限定されない）へのアミド、カルバメートまたは尿素リンケージであり得る。また、Ｙは、チオール基（システインのチオール基を含むが、これに限定されない）へのマレイミドリンケージであり得る。また、Ｙは、２０の共通アミノ酸により一般に接近できない残基へのリンケージであり得る。例えば、ＰＥＧ上のアジド基をｈＧＨポリペプチド上のアルキン基と反応させて、Ｈｕｉｇｅｎ［３＋２］付加環化生成物を形成することができる。また、ＰＥＧ上のアルキン基を天然にはコードされないアミノ酸中に存在するアジド基と反応させて、同様の基を形成することができる。一部の実施態様において、強い求核分子（ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドを含むが、これらに限定されない）を天然にはコードされないアミノ酸中のアルデヒドまたはケトン基と反応させて、ヒドラゾン、オキシムまたはセミカルバゾンを形成することができ、適用可能な場合には、場合によっては適切な還元剤での処理によりそれをさらに還元することができる。また、強い求核分子を天然にはコードされないアミノ酸によりｈＧＨポリペプチドに組み込み、この水溶性ポリマー中に存在するケトンまたはアルデヒド基と優先的に反応させるために使用することができる。
【０３７８】
ＰＥＧについての分子量は、実際の望みどおりに使用することができ、これは、望みどおりに約１００ダルトン（Ｄａ）から１００，０００Ｄａまたはそれ以上（時として、０．１から５０ｋＤａまたは１０から４０−ｋＤａを含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない。各鎖が１から１００ｋＤａ（１から５０ｋＤａまたは５から２０ｋＤａを含むが、これらに限定されない）の範囲のＭＷを有するＰＥＧ分子をはじめとする（しかし、これらに限定されない）分枝鎖ＰＥＧも使用することができる。多種多様なＰＥＧ分子が、ｔｈｅ  Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．ｃａｔａｌｏｇ、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｃａｔａｌｏｇ（これらは、本明細書に参照により組み込まれており、これらを含むが、これらに限定されない）に記載されている。
【０３７９】
一般に、ＰＥＧ分子の少なくとも１つの末端は、天然にはコードされないアミノ酸との反応に利用することができる。例えば、アミノ酸側鎖との反応のためのアルキンおよびアジド部分を有するＰＥＧ誘導体を使用して、本明細書に記載するように、天然にはコードされないアミノ酸にＰＥＧを取り付けることができる。この天然にはコードされないアミノ酸が、アジドを含む場合には、ＰＥＧは、［３＋２］付加環化生成物を形成させるアルキン部分、またはアミドリンケージを形成させるホスフィン基を含有する活性化ＰＥＧ種（すなわち、エステル、カーボネート）、いずれかを典型的に含有するであろう。また、この天然にはコードされないアミノ酸が、アルキンを含む場合には、ＰＥＧは、［３＋２］Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化生成物を形成させるアジド部分を典型的に含有するであろう。この天然にはコードされないアミノ酸が、カルボニル基を含む場合、典型的にはＰＥＧが、強力な求核分子（ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンまたはセミカルバジド官能基を含むが、これらに限定されない）を典型的には含んで、ヒドラゾン、オキシムおよびセミカルバゾンリンケージをそれぞれ形成させるであろう。他の代替では、上に記載した反応性基の配向の逆を用いることができる。すなわち、天然にはコードされないアミノ酸中のアジド部分をアルキン含有ＰＥＧ誘導体と反応させることができる。
【０３８０】
一部の実施態様において、ＰＥＧ誘導体を有するｈＧＨポリペプチド変異体は、この天然にはコードされないアミノ酸の側鎖上に存在する化学官能基と反応性である化学官能基を含有する。
【０３８１】
本発明は、一部の実施態様において、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格を含むアジド含有およびアセチル含有ポリマー誘導体を提供する。この水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）であり得る。しかし、ポリ（エチレン）グリコールおよび他の関連ポリマー［ポリ（デキストラン）およびポリ（プロピレングリコール）を含むが、これらに限定されない］をはじめとする（しかし、これらに限定されない）多種多様な水溶性ポリマーも、本発明を実施する際に使用に適すること、ならびにＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の使用が、すべてのこうした分子を包含するおよび含むと解釈することは、理解されるはずである。用語ＰＥＧは、二官能性ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ（すなわち、このポリマー骨格に１つ以上の案の浮きペンダントを有するＰＥＧまたは関連ポリマー）またはこの中に分解性リンケージを有するＰＥＧをはじめとする、このあらゆる形態でのポリ（エチレングリコール）を含むが、これらに限定されない。
【０３８２】
ＰＥＧは、典型的には、透明で、無色で、無臭で、水溶性で、熱安定性で、多数の化学薬剤に対して不活性であり、加水分解および劣化せず、ならびに一般に非毒性である。ポリ（エチレングリコール）は、生体適合性である、すなわち、ＰＥＧは、傷害をもたらすことなく生体組織または生体と共存できると考えられている。より具体的には、ＰＥＧは、実質的に非免疫原性であり、すなわち、ＰＥＧは、抗体において免疫応答を生じさせる傾向がない。体内で何らかの望ましい機能を有する分子、例えば生物活性因子、に取り付けられると、ＰＥＧは、この因子をマスクする傾向があり、ならびに生物がこの因子の存在に耐えることができるようにあらゆる免疫応答を低減または排除することができる。ＰＥＧコンジュゲートは、実質的な免疫応答を生じさせない、または凝固もしくは他の望ましくない作用を生じさせない傾向がある。式−−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−（式中、ｎは、約３から約４０００、典型的には約２０から約２０００である）を有するＰＥＧは、本発明での使用に適する。約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧは、本発明の一部の実施態様において、ポリマー骨格として特に有用である。
【０３８３】
このポリマー骨格は、線状であってもよいし、分枝状であってもよい。分枝ポリマー骨格は、当該技術分野において一般に公知である。典型的に、分枝ポリマーは、中心枝コア部分およびこの中心枝コアに連結された多数の線状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、分枝形態で一般に使用され、これは、エチレンオキシドを、様々なポリオール、例えばグリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリトリトールおよびソルビトールに付加させることにより調製することができる。中心枝コア部分は、幾つかのアミノ酸、例えばリシン、から誘導することもできる。分枝ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（式中、Ｒは、コア部分、例えばグリセロール、グリセロールオリゴマーまたはペンタエリトリトールから誘導され、ならびにｍは、アームの数を表す）のような一般式で表すことができる。マルチアームＰＥＧ分枝、例えば、米国特許第５，９３２，４６２号、同第５，６４３，５７５号、同第５，２２９，４９０号、同第４，２８９，８７２号；米国特許出願第２００３／０１４３５９６号；国際公開第９６／２１４６９号および同第９３／２１２５９号（これらの各々が、本明細書に参照により組み込まれている）も、ポリマー骨格として使用することができる。
【０３８４】
分枝ＰＥＧは、ＰＥＧ（−−ＹＣＨＺ２）ｎ（式中、Ｙは、連結基であり、ならびにＺは、被定義長の原子鎖によりＣＨに連結された活性化末端基である）により表される分岐ＰＥＧの形態であってもよい。
【０３８５】
さらにもう一つの分枝形態、ペンダントＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端ではなくＰＥＧ骨格に沿ってカルボキシルなどの反応性基を有する。
【０３８６】
ＰＥＧのこれらの形態に加えて、骨格内に弱いまたは分解性のリンケージを有するポリマーも調製することができる。例えば、加水分解を受けるポリマー骨格内のエステルリンケージを有するＰＥＧを調製することができる。下に示すように、この加水分解により、このポリマーは低分子量のフラグメントに分解する：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ→ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−。
用語ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧが、本明細書に開示するものを含む（しかし、これらに限定されない）当該技術分野において公知であるすべての形態を表す、または包含することは、当業者には理解される。
【０３８７】
多数の他のポリマーも、本発明での使用に適する。一部の実施態様において、２から約３００の末端を有する水溶性のポリマー骨格が、本発明において特に有用である。適するポリマーの例としては、他のポリ（アルキレングリコール）、例えばポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、これらのコポリマー（エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーを含むが、これらに限定されない）、これらのターポリマー、およびこれらの混合物などが挙げられる。ポリマー骨格の各鎖の分子量は、様々であり得るが、典型的には約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａ、多くの場合、約６，０００Ｄａから約８０，０００Ｄａの範囲内である。
【０３８８】
実質的に水溶性の骨格についの上記リストが、決して排他的ではなく、単なる実例であること、ならびに上に記載した特質を有するすべての高分子材料が、本発明での使用に適すると考えられることは、通常の当業者には理解されるであろう。
【０３８９】
本発明の一部の実施態様において、ポリマー誘導体は、「多官能性」であり、これは、このポリマー骨格が、官能基で官能化または活性化された少なくとも２つの末端およびことによると３００もの多さの末端を有すること意味する。多官能性ポリマー誘導体としては、２つの末端を有し、各末端が官能基に結合しており、この官能基が、同じであってもよいし、異なっていてもよい線状ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９０】
一つの実施態様において、ポリマー誘導体は、構造：
【０３９１】
【化１７】
2007519420.tif 000019
（式中、
Ｎ＝Ｎ＝Ｎは、アジド部分であり；
Ｂは、連結基であり、これは、存在してもよいし、不在であってもよく；
ＰＯＬＹは、水溶性非抗原性ポリマーであり；
Ａは、連結部分であり、これは、存在してもよいし、不在であってもよく、Ｂと同じであってもよいし、異なっていてもよく；ならびに
Ｘは、第二の官能基である）
を有する。ＡおよびＢについての連結部分の例としては、１８個以下、さらに好ましくは１個から１０個の間の炭素原子を含有する多重官能化アルキル基が挙げられるが、これらに限定されない。窒素、酸素または硫黄などのヘテロ原子をアルキル鎖とともに含めることができる。このアルキル鎖は、ヘテロ原子で枝分れしていてもよい。ＡおよびＢについての連結部分の他の例としては、１０個以下、さらに好ましくは５個から６個の炭素原子を含有する多重官能化アリール基が挙げられるが、これに限定されない。このアリール基は、１つ以上の炭素原子、窒素、酸素または硫黄原子で置換されていてもよい。適する連結基の他の例としては、米国特許第５，９３２，４６２号、同第５，６４３，５７５号；および米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号（これの各々が、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている連結基が挙げられるが、これらに限定されない。連結部分についての上記リストが、決して排他的ではなく、単なる実例であること、ならびに上に記載した特質を有するすべての連結部分が、本発明での使用に適すると考えられることは、通常の当業者には理解されるであろう。
【０３９２】
Ｘとしての使用に適する官能基の例としては、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アルコキシ、活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾールエステル、活性カーボネート、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護アミン、ヒドラジン、保護ヒドラジン、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、アルケン、ケトンおよびアジドが挙げられるが、これらに限定されない。当業者には理解されるように、選択されるＸ部分は、アジド基との反応が発生しないように、アジド基と相溶性でなければならない。アジド含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であり得、これは、第二の官能基（すなわち、Ｘ）もアジド部分であることを意味し、またはヘテロ二官能性であり得、これは、第二の官能基が、異なる官能基であることを意味する。
【０３９３】
用語「保護されている」は、一定の条件下での化学反応性官能基の反応を防止する保護基または保護部分の存在を指す。保護基は、保護される化学反応基のタイプに依存して変わるであろう。例えば、この化学反応性基が、アミンまたはヒドラジンである場合、保護基は、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）から成る群より選択することができる。この化学反応性基が、チオールである場合、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る。この化学反応性基が、カルボン酸、例えば酪酸またはプロピオン酸、であるか、ヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジルまたはアルキル基、例えばメチル、エチルもしくはｔ−ブチルであり得る。当該技術分野において公知である他の保護基も、本発明で使用することができる。
【０３９４】
文献中の末端官能基の具体的な例としては、Ｎ−スクシンイミジルカーボネート（例えば、米国特許第５，２８１，６９８号、同第５，４６８，４７８号参照）、アミン（例えば、Ｂｕｃｋｍａｎｎら．Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９（１９８１）、Ｚａｐｌｉｐｓｋｙら．Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９：１１７７（１９８３）参照）、ヒドラジド（例えば、Ａｎｄｒｅｓｚら．Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：３０１  （１９７８）参照）、スクシンイミジルプロピオネートおよびスクシンイミジルブタノエート（例えば、Ｏｌｓｏｎら．ｉｎ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ１７０−１８１，Ｈａｒｒｉｓ  ＆  Ｚａｐｌｉｐｓｋｙ  Ｅｄｓ．，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９７参照；米国特許第５，６７２，６６２号も参照）、スクシンイミジルスクシネート（例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７：１７５（１９８４）およびＪｏｐｐｉｃｈら．Ｍａｃｒｏｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０：１３８１（１９７９）参照）、スクシンイミジルエステル（例えば、米国特許第４，６７０，４１７号参照）、ベンゾトリアゾールカーボネート（例えば、米国特許第５，６５０，２３４号参照）、グリシジルエーテル（例えば、Ｐｉｔｈａら．Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：１１（１９７９）、Ｅｌｌｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：３５４（１９９１）参照）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５（１９８３）、Ｔｏｎｄｅｌｌｉら．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １：２５１（１９８５）参照）、ｐ−ニトロフェニルカーボネート（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１１：１４１（１９８５）；およびＳａｒｔｏｒｅら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５（１９９１）参照）、アルデヒド（例えば、Ｈａｒｒｉｓら．Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．２２：３４１（１９８４）、米国特許第５，８２４，７８４号、同第５，２５２，７１４号参照）、マレイミド（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎら．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３４３（１９９０）、Ｒｏｍａｎｉら．ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２：２９（１９８４）参照）、およびＫｏｇａｎ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍ．２２：２４１７（１９９２）参照）、オルトピリジル−ジスルフィド（例えば，Ｗｏｇｈｉｒｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：３１４（１９９３）参照）、アクリロール（例えば、Ｓａｗｈｎｅｙら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：５８１（１９９３）参照）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５，９００，４６１号参照）が挙げられるが、これらに限定されない。上記参考文献および特許のすべてが、本明細書に参照により組み込まれている。
【０３９５】
本発明の一定の実施態様において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
【０３９６】
【化１８】
2007519420.tif 000020
（式中、
Ｘは、上に記載したような官能基であり；および
ｎは、約２０から約４０００である）
を有するポリマー骨格を含む。もう一つの実施態様において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
【０３９７】
【化１９】
2007519420.tif 000021
（式中、
Ｗは、１から１０個の間の炭素原子を含む脂肪族または芳香族リンカー部分であり；
ｎは、約２０から約４０００であり；
Ｘは、上に記載したような官能基であり；
ｍは、１と１０の間である）
を有するポリマー骨格を含む。
【０３９８】
本発明のアジド含有ＰＥＧ誘導体は、当該技術分野において公知である、および／または本明細書に開示する様々な方法により調製することができる。下に示す一つの方法では、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格であって、第一官能基に結合した第一末端および適する脱離基に結合した第二末端を有するポリマー骨格を、アジドアニオン（これは、ナトリウム、カリウムおよびｔ−ブチルアンモニウムなどをはじめとする多数の適する対イオンのいずれかと対を形成することができる）と反応させる。この脱離基が、求核置換を受け、アジド部分により置換されることにより、所望のアジド含有ＰＥＧポリマーが生じる。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ  ＋  Ｎ３−  →  Ｘ−ＰＥＧ−Ｎ３
【０３９９】
示したように、本発明での使用に適するポリマー骨格は、式Ｘ−ＰＥＧ−Ｌを有し、この式中のＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アジド基と反応しない官能基であり、Ｌは、適する脱離基である。適する官能基の例としては、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護アミン、保護ヒドラジン、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、マレイミド、ジチオピリジンおよびビニルピリジン、ならびにケトンが挙げられるが、これらに限定されない。適する脱離基の例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレートおよびトシレートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４００】
本発明のアジド含有ポリマーのもう一つの調製方法では、アジド官能基を有するカップリング剤を、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格と接触させて（ここで、前記カップリング剤は、ＰＥＧポリマー上の化学官能基と選択的に反応するであろう）、アジド含有ポリマー誘導体生成物を形成する（この場合、前記アジドは、連結基による前記ポリマー骨格と分けられている）。
【０４０１】
反応図式の一具体例を下に示す：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｍ＋Ｎ−ｌｉｎｋｅｒ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ→ＰＧ−Ｘ−ＰＥＧ−ｌｉｎｋｅｒ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ。
（図式中、
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アルコキシなどのキャッピング基または上に記載したような官能基であり；ならびに
Ｍは、アジド官能基と反応性ではないが、Ｎ官能基とは効率的および選択的に反応するであろう官能基である）。
【０４０２】
適する官能基の具体例としては、Ｎが、アミンである場合、カルボン酸、カーボネートまたは活性エステルであるＭ；Ｎが、ヒドラジンまたはアミノオキシ部分である場合、ケトンであるＭ；Ｎが、求核分子である場合、脱離基であるＭが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０３】
粗生成物の精製は、生成物の沈殿、必要に応じてこの後のクロマトグラフィー、をはじめとする（しかし、これに限定されない）周知の方法により達成することができる。
【０４０４】
アミンのうちの１つが、ｔ−ブチル−Ｂｏｃなどの保護基部分により保護され、結果として生じる一保護ＰＥＧジアミンが、アジド官能基を有する連結部分と反応する、ＰＥＧジアミンの場合のより具体的な例を下に示す：
ＢｏｃＨＮ−ＰＥＧ−ＮＨ２＋ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）３−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ。
【０４０５】
この例では、様々な活性化剤、例えば塩化チオニルまたはカルボジイミド試薬、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを使用することによりアミン基をカルボン酸とカップリングさせて、モノアミンＰＥＧ誘導体とアジドをゆするリンカー部分との間にアミド結合を生じさせることができる。アミド結合の形成成功後、結果として生じたＮ−ｔ−ブチルＢｏｃ保護アジド含有誘導体を直接使用して、生体活性分子を修飾するか、さらに手を加えて他の有用な官能基を導入することができる。例えば、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ基を強酸の処理により加水分解して、オメガ−アミノ−ＰＥＧ−アジドを生じさせることができる。結果として生じたアミンを合成ハンドルとして使用して、価値のあるヘテロ二官能性試薬を生じさせるための他の有用な官能基、例えばマレイミド基、活性化ジスルフィドおよび活性化エステルなどを導入することができる。
【０４０６】
ヘテロ二官能性誘導体は、ポリマーの各末端に異なる分子を取り付けることが望まれる場合、特に有用である。例えば、オメガ−Ｎ−アミノ−Ｎ−アジドＰＥＧは、活性求電子基、例えばアルデヒド、ケトン、活性エステルおよび活性カーボネートなど、を有する分子をＰＥＧの１つの末端に取り付け、アセチレン基を有する分子をＰＥＧの他の末端に取り付けることができる。
【０４０７】
本発明のもう一つの実施態様において、ポリマー誘導体は、構造：
【０４０８】
【化２０】
2007519420.tif 000022
（この構造中、
Ｒは、Ｈであるか、アルキル、アルケン、アルコキシまたはアリールもしくは置換アリール基であり；
Ｂは、連結部分であり、これは、存在してもよいし、不在であってもよく；
ＰＯＬＹは、水溶性非抗原性ポリマーであり；
Ａは、連結部分であり、これは、存在してもよいし、不在であってもよく、およびＢと同じであってもよいし、異なっていてもよく；
Ｘは、第二の官能基である）
を有する。
【０４０９】
ＡおよびＢの連結部分の例としては、１８個以下、さらに好ましくは１個から１０個の間の炭素原子を含有する多重官能化アルキル基が挙げられるが、これらに限定されない。窒素、酸素または硫黄などのヘテロ原子をアルキル鎖とともに含めることができる。このアルキル鎖は、ヘテロ原子で枝分れしていてもよい。ＡおよびＢについての連結部分の他の例としては、１０個以下、さらに好ましくは５個から６個の炭素原子を含有する多重官能化アリール基が挙げられるが、これに限定されない。このアリール基は、１つ以上の炭素原子、窒素、酸素または硫黄原子で置換されていてもよい。適する連結基の他の例としては、米国特許第５，９３２，４６２号、同第５，６４３，５７５号；および米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号（これの各々が、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている連結基が挙げられるが、これらに限定されない。連結部分についての上記リストが、決して排他的ではなく、単なる実例であること、ならびに上に記載した特質を有する多種多様なの連結部分が、本発明での使用に適すると考えられることは、通常の当業者には理解されるであろう。
【０４１０】
Ｘとしての使用に適する官能基の例としては、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アルコキシ、活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾールエステル、活性カーボネート、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護アミン、ヒドラジン、保護ヒドラジン、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、アルケン、ケトンおよびアセチレンが挙げられる。理解されるであろうこととして、選択されるＸ部分は、アセチレン基との反応が発生しないように、アセチレン基と相溶性でなければならない。アセチレン含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であり得、これは、第二の官能基（すなわち、Ｘ）もアセチル部分であることを意味し、またはヘテロ二官能性であり得、これは、第二の官能基が、異なる官能基であることを意味する。
【０４１１】
本発明のもう一つの実施態様において、ポリマー誘導体は、構造：
【０４１２】
【化２１】
2007519420.tif 000023
（この構造中、
Ｘは、上に記載したような官能基であり；
ｎは、約２０から約４０００であり；
ｍは、１と１０の間である）
を有するポリマー骨格を含む。各二官能性ＰＥＧポリマーの具体的な例を下に示す。
【０４１３】
本発明のアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、当業者に公知である、および／または本明細書に開示する方法を使用して調製することができる。一つの方法において、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格であって、第一官能基に結合した第一末端および適する求核基に結合した第二末端を有するポリマー骨格を、アセチレン官能基とＰＥＧ上の求核基との反応に適する脱離基との両方を有する化合物と反応させる。求核部分を有するＰＥＧポリマーと脱離基を有する分子を併せると、脱離基が求核置換されて、求核部分により置換され、これにより、所望のアセチレン含有ポリマーが生じる。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ＋Ｌ−Ａ−Ｃ−Ｘ→ＰＥＧ−Ｎｕ−Ａ−Ｃ≡ＣＲ’
【０４１４】
示したように、本発明での使用に好ましいポリマーは、式Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕを有し、この式中のＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｎｕは、求核部分であり、およびＸは、Ｎｕ、Ｌまたはアセチレン官能基と反応しない官能基である。
【０４１５】
Ｎｕの例としては、ＳＮ２型メカニズムにより主として反応するであろう、アミン、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、イミノ、カルボキシレート、ヒドラジン、アミノオキシ基が挙げられるが、これらに限定されない。Ｎｕ基の追加例としては、主として求核付加反応により反応するであろう官能基が挙げられるが、これらに限定されない。Ｌ基の例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート、トシレート、および求核置換を受けると予想される他の基、ならびにケトン、アルデヒド、チオエステル、オレフィン、アルファ−ベータ不飽和カルボニル基、カーボネート、および求核試薬による付加を受けると予想される他の求電子基が挙げられる。
【０４１６】
本発明のもう一つの実施態様において、Ａは、炭素原子数が１から１０個の間の脂肪族リンカーまたは炭素原子数が６から１４の間の置換アリール環である。Ｘは、アジド基と反応しない官能基であり、Ｌは、適する脱離基である。
【０４１７】
本発明のアセチレン含有ポリマー誘導体のもう一つの調製方法では、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの平均分子量を有し、１つの末端に保護基またはキャッピング基を有し、他の末端に適する脱離基を有するＰＥＧポリマーを、アセチレンアニオンと接触させる。
【０４１８】
反応図式の具体例を下に示す：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋−Ｃ≡ＣＲ’→Ｘ−ＰＥＧ−Ｃ≡ＣＲ’。
（この図式中、
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、およびＸは、アルコキシなどのキャッピング基であるか、上に記載したような官能基であり；
Ｒ’は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アリールもしくはアリールオキシ基、または置換アルキル、アルコキシ、アリールもしくはアリールオキシ基である）。
【０４１９】
上の例において、脱離基Ｌは、十分な濃度のアセチレンアニオンと接触させたときに、ＳＮ２型置換を受けるために十分な活性を有さなければならない。アセチレンによる脱離基のＳＮ２置換を達成するために必要な反応条件は、当該技術分野において周知である。
【０４２０】
粗生成物の精製は、生成物の沈殿、必要に応じてこの後のクロマトグラフィー、をはじめとする（しかし、これに限定されない）当該技術分野において公知である方法によって、通常、達成することができる。
【０４２１】
水溶性ポリマーを本発明のｈＧＨポリペプチドに連結させることができる。この水溶性ポリマーは、本ｈＧＨポリペプチドに組み込まれた天然にはコードされないアミノ酸により連結されてもよいし、または天然にはコードされないもしくは天然にコードされるアミノ酸のいずれかの官能基もしくは置換基、または天然にはコードされないもしくは天然にコードされるアミノ酸に付加しているいれかの官能基もしくは置換基により連結されてもよい。また、水溶性ポリマーは、天然にはコードされないアミノ酸が組み込まれているｈＧＨポリペプチドに、自然発生アミノ酸（Ｎ末端残基のシステイン、リシンまたはアミン基を含むが、これらに限定されない）により連結させる。場合によっては、本発明のｈＧＨポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の非天然アミノ酸を含み、この場合、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸が、水溶性ポリマー（複数を含む）（ＰＥＧおよび／またはオリゴ糖を含むが、これらに限定されない）に連結されている。場合によっては、本発明のｈＧＨポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の天然にはコードされないアミノ酸をさらに含む。場合によっては、本発明のｈＧＨポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸、および水溶性ポリマーに連結された１つ以上の自然発生アミノ酸を含む。一部の実施態様において、本発明において用いる水溶性ポリマーは、このコンジュゲート形態を基準にしてｈＧＨポリペプチドの半減期を増加させる。
【０４２２】
本発明のｈＧＨポリペプチドに連結する水溶性ポリマーの数（すなわち、ＰＥＧ化またはグリコシル化の程度）は、薬理学的、薬物動態学的または薬力学的特性、例えばインビボ半減期、の変更（増加または減少を含むが、これらに限定されない）をもたらすように調整することができる。一部の実施態様において、ｈＧＨの半減期は、未修飾ポリペプチドより、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０−パーセント、２倍、５倍、１０倍、５０倍、または少なくとも約１００倍増加される。
【０４２３】
強求核基（すなわち、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンまたはセミカルバジド）を含有するＰＥＧ誘導体
本発明の一つの実施態様において、カルボキシを含有する天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、ＰＥＧ骨格に直接連結されている末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジドまたはセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体で修飾される。
【０４２４】
一部の実施態様において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（この構造中、
Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは、２から１０であり、およびｎは、１００から１，０００である（すなわち、平均分子量は、５から４０ｋＤａの間である））
を有するであろう。
【０４２５】
一部の実施態様において、ヒドラジン含有またはヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（この構造中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり；ｍは、２から１０であり；ｎは、１００から１，０００であり；およびＸは、場合によりカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であり、これは存在してもよいし、不在であってもよい）
を有するであろう。
【０４２６】
一部の実施態様において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（この構造中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは、２から１０であり、およびｎは、１００から１，０００である）
を有するであろう。
【０４２７】
本発明のもう一つの実施態様において、カルボニル含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、アミドリンケージによりＰＥＧ骨格に連結されている、末端ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、ヒドラジンまたはセミカルバジド部分を含有するＰＥＧで修飾される。
【０４２８】
一部の実施態様において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（この構造式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは、２から１０であり、およびｎは、１００から１，０００である（すなわち、平均分子量は、５から４０ｋＤａの間である））
を有する。
【０４２９】
一部の実施態様において、ヒドラジン含有またはヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（この構造中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり；ｍは、２から１０であり；ｎは、１００から１，０００であり；およびＸは、場合によりカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であり、これは存在してもよいし、不在であってもよい）
を有する。
【０４３０】
一部の実施態様において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（この構造中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは、２から１０であり、およびｎは、１００から１，０００である）
を有する。
【０４３１】
本発明のもう一つの実施態様において、カルボニル含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジドまたはセミカルバジド部分を含有する分枝ＰＥＧで修飾され、この分枝ＰＥＧの各鎖は、１０から４０ｋＤａ、さらに好ましくは５から２０ｋＤａの範囲のＭＷを有する。
【０４３２】
本発明のもう一つの実施態様において、天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、分枝構造を有するＰＥＧ誘導体で修飾される。例えば、一部の実施態様において、ヒドラジン末端またはヒドラジド末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（この構造中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり；ｍは、２から１０であり；ｎは、１００から１，０００であり；およびＸは、場合によりカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であり、これは存在してもよいし、不在であってもよい）
を有するであろう。
【０４３３】
一部の実施態様において、セミカルバジド基を含有するＰＥＧ誘導体は、構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（この構造中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは、場合により、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか、存在せず、ｍは、２から１０であり、およびｎは、１００から１，０００である）
を有するであろう。
【０４３４】
一部の実施態様において、ヒドロキシルアミン基を含有するＰＥＧ誘導体は、構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（この構造中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは、場合により、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか、存在せず、ｍは、２から１０であり、およびｎは、１００から１，０００である）
を有するであろう。
【０４３５】
水溶性ポリマーをｈＧＨポリペプチドに連結させる程度および部位により、Ｓｉｔｅ  ＩのｈＧＨポリペプチド受容体へＩｈＧＨポリペプチドの結合を調節することができる。一部の実施態様では、ｈＧＨについてのＳｐｅｎｃｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：７８６２−７８６７（１９８８）に記載されているような平衡結合アッセイにより測定して、約４００ｎＭまたはそれ以下のＫｄで、１５０ｎＭまたはそれ以下のＫｄで、および場合によっては１００ｎＭまたはそれ以下のＫｄで、ｈＧＨポリペプチドが、Ｓｉｔｅ  ＩのｈＧＨポリペプチド受容体に結合するように、リンケージをアレンジする。
【０４３６】
ポリマーの活性化ならびにペプチドのコンジュゲーションについての方法および化学は、文献に記載されており、当該技術分野において公知である。ポリマーの活性化に一般に使用される方法としては、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンなどでの官能基の活性化が挙げられるが、これらに限定されない（Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ，（１９９１），ＰＲＯＴＥＩＮ  ＩＭＭＯＢＩＬＩＳＡＴＩＯＮ．ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，（１９９２），ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩＮＧ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、（１９９３），ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ  ＡＦＦＩＮＩＴＹ  ＬＩＧＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｄｕｎｎ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｅｄｓ．ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｖｏｌ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１参照）。
【０４３７】
ＰＥＧの官能化およびコンジュゲーションに関する幾つかの総説およびモノグラフは、利用することができる。例えば、Ｈａｒｒｉｓ，Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５−３７３（１９８５）；Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：３０−６５（１９８７）；Ｗｏｎｇら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６−８７４（１９９２）；Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：２４９−３０４（１９９２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５（１９９５）参照。
【０４３８】
ポリマーの活性化方法は、国際公開第９４／１７０３９号、米国特許第５，３２４，８４４号、国際公開第９４／１８２４７号、同第９４／０４１９３号、米国特許第５，２１９，５６４号、同第５，１２２，６１４号、国際公開第９０／１３５４０号、米国特許第５，２８１，６９８号および国際公開第９３／１５１８９号においても見つけることができ、ならびにＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ（国際公開第９４／１５６２５）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７）、酸素担持分子（米国特許第４，４１２，９８９号）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１−４５（１９８５）をはじめとする酵素と活性ポリマーとの間のコンジュゲーション方法も見つけることができる。引用したすべての参考文献および特許は、本明細書に参照により組み込まれている。
【０４３９】
天然にはコードされないアミノ酸、例えばｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを含有するｈＧＨポリペプチドのＰＥＧ化（すなわち、いずれかの水溶性ポリマーの付加）は、従来のいずれかの方法により行う。例えば、ｈＧＨポリペプチドィは、アルキン基を末端に有するｍＰＥＧ誘導体でＰＥＧ化される。簡単に言うと、攪拌しながら、室温で、過剰な固体ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨを、ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ−含有ｈＧＨポリペプチドの水溶液に添加する。典型的に、この水溶液は、反応が行われることとなるｐＨ（一般には約４から１０）付近のｐＫａを有する緩衝液で、緩衝される。例えばＰＨ７．５でのＰＥＧ化に適する緩衝液の例としては、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＥＰＰＳおよびＴＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＨは、継続的にモニターし、必要に応じて調整する。この反応は、典型的に、約１から４８時間の間、継続することができる。
【０４４０】
この後、反応生成物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに付して、遊離ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ、および非ブロック化ＰＥＧがこの分子の両末端で活性化され、この結果、ｈＧＨポリペプチド変異体分子が架橋されたときに形成し得る高分子量のＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチド複合体から、ＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチド変異体を分離する。疎水性相互作用クロマトグラフィー中の条件は、遊離ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨが、カラムから流出する一方で、１つ以上のＰＥＧ基にコンジュゲートした１つのｈＧＨポリペプチド変異体分子を含有する所望の形態が溶離された後、架橋ＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチド変異体複合体が溶離されるような条件である。適する条件は、所望のコンジュゲートに対する架橋複合体の相対サイズに依存して変化し、また当業者により容易に決定される。所望のコンジュゲートを含有する溶離物を限外濾過によって濃縮し、ダイアフィルトレーションによって脱塩する。
【０４４１】
必要な場合には、疎水性クロマトグラフィーから得られたＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチドを、親和性クロマトグラフィー；アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥを使用するものを含むが、これに限定されない）；シリカでのクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲル濾過（ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−７５を使用するものを含むが、これに限定されない）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外濾過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈降法；硫酸アンモニウム沈降法；クロマトフォーカッシング；置換クロマトグラフィー；電気泳動手順（分取等電点分画電気泳動法を含むが、これに限定されない）または抽出をはじめとする（しかし、これらに限定されない）当業者に公知である１つ以上の手順により、さらに精製することができる。見掛けの分子量は、球状タンパク質標準物質との比較によりＧＰＣによって概算することができる（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＭＥＴＨＯＤＳ，Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｈａｒｒｉｓ  ＆  Ａｎｇａｌ，Ｅｄｓ．）  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，２９３−３０６）。ｈＧＨ−ＰＥＧコンジュゲートの純度は、タンパク溶解性分解（トリプシン分解を含むが、これに限定されない）、この後の質量スペクトル分析により評価することができる。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  Ｂ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９７（３）：１０５９−６６（２００１）。
【０４４２】
本発明のｈＧＨポリペプチドのアミノ酸に連結される水溶性ポリマーは、限定ではないが、さらに誘導体化または置換することができる。
【０４４３】
アジド含有ＰＥＧ誘導体
本発明のもう一つの実施態様において、ｈＧＨポリペプチドは、天然にはコードされないアミノ酸の側鎖上に存在するアルキン部分と反応するであろうアジド部分を含有するＰＥＧ誘導体で修飾される。一般に、このＰＥＧ誘導体は、１から１００ｋＤａｍ一部の実施態様では１０から４０ｋＤａの平均分子量を有するであろう。
【０４４４】
一部の実施態様において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３
（この構造式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは、２から１０であり、およびｎは、１００から１，０００である（すなわち、平均分子量は、５から４０ｋＤａの間である））
を有するであろう。
【０４４５】
もう一つの実施態様において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３
（この構造式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは、２から１０であり、ｐは、２から１０であり、およびｎは、１００から１，０００である（すなわち、平均分子量は、５から４０ｋＤａの間である））
を有するであろう。
【０４４６】
本発明のもう一つの実施態様において、アルキン含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、末端アジド部分を含有する分枝ＰＥＧ誘導体で修飾され、この分枝ＰＥＧの各鎖は、１０から４０ｋＤａ、カルボキサミド５から２０ｋＤａの範囲のＭＷを有する。例えば、一部の実施態様において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＮ３
（この構造中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり；ｍは、２から１０であり；Ｐは、２から１０であり；ｎは、１００から１，０００であり；およびＸは、場合により、Ｏ、Ｎ、Ｓまたはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であり、これは、各場合、存在してもよいし、不在であってもよい）
を有するであろう。
【０４４７】
アルキン含有ＰＥＧ誘導体
本発明のもう一つの実施態様において、ｈＧＨポリペプチドは、天然にはコードされないアミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分と反応するであろうアルキン部分を含有するＰＥＧ誘導体で修飾される。
【０４４８】
一部の実施態様において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
（この構造式中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは、２から１０であり、およびｎは、１００から１，０００である（すなわち、平均分子量は、５から４０ｋＤａの間である））
を有するであろう。
【０４４９】
本発明のもう一つの実施態様において、アルキンを含有する天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、アミドリンケージによりＰＥＧ骨格に連結されている末端アジドまたは末端アルキン部分を含有するＰＥＧ誘導体で修飾される。
【０４５０】
一部の実施態様において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ
（この構造中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり；ｍは、２から１０であり；Ｐは、２から１０であり；ｎは、１００から１，０００である）
を有するであろう。
【０４５１】
本発明のもう一つの実施態様において、アジド含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、末端アルキン部分を含有する分枝ＰＥＧ誘導体で修飾され、この分枝ＰＥＧの各鎖は、１０から４０ｋＤａ、さらに好ましくは５から２０ｋＤａの範囲のＭＷを有する。例えば、一部の実施態様において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＣ≡ＣＨ
（この構造中、Ｒは、単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり；ｍは、２から１０であり；Ｐは、２から１０であり；ｎは、１００から１，０００であり；およびＸは、場合により、Ｏ、Ｎ、Ｓまたはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であるか、存在しない）
を有するであろう。
【０４５２】
ホスフィン含有ＰＥＧ誘導体
本発明のもう一つの実施態様において、ｈＧＨポリペプチドは、活性官能基（エステル、カーボネートを含むが、これらに限定されない）を含有し、この天然にはコードされないアミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分と反応するであろうアリールホスフィン基をさらに含むＰＥＧ誘導体で修飾される。一般に、ＰＥＧ誘導体は、１から１００ｋＤａ、一部の実施態様では１０から４０ｋＤａの範囲の平均分子量を有するであろう。
【０４５３】
一部の実施態様において、このＰＥＧ誘導体は、構造：
【０４５４】
【化２２】
2007519420.tif 000024
（この構造中、ｎは、１から１０であり；Ｘは、Ｏ、ＮもしくはＳであり得、または存在しなくてもよく；Ｐｈは、フェニルであり；およびＷは、水溶性ポリマーである）
を有するであろう。
【０４５５】
一部の実施態様において、このＰＥＧ誘導体は、構造：
【０４５６】
【化２３】
2007519420.tif 000025
（式中、Ｘは、Ｏ、ＮもしくはＳであり得、または存在しなくてもよく；Ｐｈは、フェニルであり；Ｗは、水溶性ポリマーであり、ならびにＲは、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキルおよび置換アリール基であり得る）
を有するであろう。Ｒ基の具体例としては、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＣＮおよび−ＮＯ２が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””は、各々、独立して、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール（１から３個のハロゲンで置換されたアリールを含むが、これに限定されない）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が、例えば１つより多くのＲ基を含む場合、これらのＲ基の各々は、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””基の１つより多くが存在するときの各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””基であるように、独立して選択される。Ｒ’およびＲ”が、同じ窒素原子に取り付けられる場合、これらは、この窒素原子と組み合わさって、５、６または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含む（しかし、これらに限定されない）ものと考える。置換基に関する上の論議から、用語「アルキル」を、水素基以外の基に結合している基（炭素原子を含む）、例えば、ハロアルキル（−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３を含むがこれらに限定されない）およびアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含むがこれらに限定されない）を包含するものと考えることは、当業者には理解されるであろう。
【０４５７】
他のＰＥＧ誘導体および一般ＰＥＧ化技法
ｈＧＨポリペプチドに連結させることができるＰＥＧ分子ならびにＰＥＧ化方法の他の具体例としては、例えば、米国特許公開第２００４／０００１８３８号；同第２００２／００５２００９号；同第２００３／０１６２９４９号；同第２００４／００１３６３７号；同第２００３／０２２８２７４号；同第２００３／０２２０４４７号；同第２００３／０１５８３３３号；同第２００３／０１４３５９６号；同第２００３／０１１４６４７号；同第２００３／０１０５２７５号；同第２００３／０１０５２２４号；同第２００３／００２３０２３号；同第２００２／０１５６０４７号；同第２００２／００９９１３３号；同第２００２／００８６９３９号；同第２００２／００８２３４５号；同第２００２／００７２５７３号；同第２００２／００５２４３０号；同第２００２／００４００７６号；同第２００２／００３７９４９号；同第２００２／０００２２５０号；同第２００１／００５６１７１号；同第２００１／００４４５２６号；同第２００１／００２７２１７号；同第２００１／００２１７６３号；米国特許第６，６４６，１１０号；同第５，８２４，７７８号；同第５，４７６，６５３号；同第５，２１９，５６４号；同第５，６２９，３８４号；同第５，７３６，６２５号；同第４，９０２，５０２号；同第５，２８１，６９８号；同第５，１２２，６１４号；同第５，４７３，０３４号；同第５，５１６，６７３号；同第５，３８２，６５７号；同第６，５５２，１６７号；同第６，６１０，２８１号；同第６，５１５，１００号；同第６，４６１，６０３号；同第６，４３６，３８６号；同第６，２１４，９６６号；同第５，９９０，２３７号；同第５，９００，４６１号；同第５，７３９，２０８号；同第５，６７２，６６２号；同第５，４４６，０９０号；同第５，８０８，０９６号；同第５，６１２，４６０号；同第５，３２４，８４４号；同第５，２５２，７１４号；同第６，４２０，３３９号；同第６，２０１，０７２号；同第６，４５１，３４６号；同第６，３０６，８２１号；同第５，５５９，２１３号；同第５，６１２，４６０号；同第５，７４７，６４６号；同第５，８３４，５９４号；同第５，８４９，８６０号；同第５，９８０，９４８号；同第６，００４，５７３号；同第６，１２９，９１２号、国際公開第９７／３２６０７号、ＥＰ２２９，１０８、ＥＰ４０２，３７８、国際公開第９２／１６５５５号、同第９４／０４１９３号、同第９４／１４７５８号、同第９４／１７０３９号、同第９４／１８２４７号、同第９４／２８０２４号、同第９５／００１６２号、同第９５／１１９２４、同９５／１３０９０号、同第９５／３３４９０号、同第９６／０００８０号、同第９７／１８８３２号、同第９８／４１５６２号、同第９８／４８８３７号、同第９９／３２１３４号、同第９９／３２１３９号、同第９９／３２１４０号、同第９６／４０７９１号、同第９８／３２４６６号、同第９５／０６０５８、ＥＰ４３９５０８号、国際公開第９７／０３１０６号、同第９６／２１４６９号、同第９５／１３３１２、ＥＰ９２１１３１号、国際公開第９８／０５３６３号、ＥＰ８０９９９６号、国際公開第９６／４１８１３号、同第９６／０７６７０、ＥＰ６０５９６３、ＥＰ５１０３５６、ＥＰ４００４７２、ＥＰ１８３５０３およびＥＰ１５４３１６（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されているものが挙げられる。本明細書に記載するＰＥＧ分子はいずれも、１本鎖、分枝鎖、マルチアーム鎖、一官能性、二官能性、多官能性またはこれらのあらゆる組合せをはじめとする（しかし、これらに限定されない）あらゆる形態で使用することができる。
【０４５８】
血清アルブミンに対する親和性の強化
様々な分子を本発明のｈＧＨポリペプチドに融合させて、血清中のｈＧＨポリペプチドの半減期を調節することができる。一部の実施態様において、分子を本発明のｈＧＨポリペプチドに連結または融合させて、動物における内在性血清アルブミンに対する親和性を強化する。
【０４５９】
例えば、場合によっては、ｈＧＨポリペプチドとアルブミン結合配列の組換え融合体を作製する。アルブミン結合配列の具体例としては、連鎖球菌Ｇタンパクからのアルブミン結合ドメイン（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７７：５３４−５４２（１９９６）およびＳｊｏｌａｎｄｅｒら、Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１：１１５−１２３（１９９７）参照）または例えば、Ｄｅｎｎｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）に記載されているものなどのアルブミン結合ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６０】
他の実施態様において、本発明のｈＧＨポリペプチドは、脂肪酸でアシル化される。場合によっては、これらの脂肪酸が、血清アルブミンへの結合を促進する。例えば、Ｋｕｒｔｚｈａｌｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１２：７２５−７３１（１９９５）参照。
【０４６１】
他の実施態様において、本発明のｈＧＨポリペプチドは、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンを含むが、これに限定されない）と直接融合させる。多種多様な他の分子も本発明においてｈＧＨに連結させて、血清アルブミンまたは他の血清成分への結合を調節することができることは、当業者には理解されるであろう。
【０４６２】
Ｘ．ｈＧＨポリペプチドのグリコシル化
本発明は、糖残基を有する１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸が組み込まれているｈＧＨポリペプチドを包含する。これらの糖残基は、天然のもの（Ｎ−アセチルグルコサミンを含むが、これに限定されない）であってもよいし、非天然のもの（３−フルオロがラクトースを含むが、これに限定されない）であってもよい。糖は、ＮまたはＯ連結型グリコシドリンケージ（Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリンを含むが、これに限定されない）または天然でないリンケージ（オキシムまたは対応するＣもしくはＳ連結型グリコシド）のいずれかにより、天然にはコードされないアミノ酸に連結させることができる。
【０４６３】
糖（グリコシルを含むが、これに限定されない）部分は、インビボまたはインビトロでｈＧＨポリペプチドに付加させることができる。本発明の一部の実施態様では、カルボニルを含有する天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドを、アミノオキシ基で誘導体化した糖で修飾して、オキシムリンケージにより連結された対応するグリコシル化ポリペプチドを生じさせる。天然にはコードされないアミノ酸に取り付けたら、グリコシルトランスフェラーゼおよび他の酵素での処理により糖にさらに手を加えて、ｈＧＨポリペプチドに結合したオリゴ糖を生じさせることができる。例えば、Ｈ．Ｌｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１７０２−１７０３（２００３）参照。
【０４６４】
本発明の一部の実施態様において、カルボニルを含有する天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、アミノオキシ誘導体として調製された被定義構造を有するグリカンで直接修飾される。アジド、アルキン、ヒドラジド、ヒドラジンおよびセミカルバジドをはじめとする他の官能基を使用して、天然にはコードされないアミノ酸に糖を連結させることができることは、当業者には理解されるであろう。
【０４６５】
本発明の一部の実施態様において、アジドまたはアルキニルを含有する天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、この後、アルキニルまたはアジド誘導体（これらを含むが、これらに限定されない）それぞれとのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応（これを含むが、これに限定されない）により修飾することができる。この方法により、タンパク質を極めて高い選択性で修飾することができる。
【０４６６】
ＸＩ．ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバー二量体および多量体
本発明は、ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーの組合せ（ｈＧＨを含むが、これに限定されない）ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体またはヘテロ多量体（すなわち、三量体、四量体など）にも備えており、この場合、ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーポリペプチド、例えば、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸を含有するｈＧＨは、別のＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーもしくはこの変異体または（非ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーもしくはこの変異体である）他のいずれかのペプチドに、このペプチド骨格に直接、またはリンカーにより、結合されている。単量体と比較して増加される分子量のため、ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバー、例えばｈＧＨ、の二量体または多量体コンジュゲートは、単量体ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーを基準にして、異なる薬理学的特性、薬物動態学的特性、薬力学的特性、調節された治療的半減期または調節だれた血漿半減期をはじめとする新しいまたは望ましい特性を示すことができる。一部の実施態様において、本発明のＧＨ超遺伝子ファミリーメンバー、例えばｈＧＨ、の二量体は、ＧＨ超遺伝子ファイミリーメンバー受容体の二量体化を調節するであろう。他の実施態様において、本発明のＧＨ超遺伝子ファミリーメンバー二量体または多量体は、ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバー受容体拮抗薬、作動薬または調節因子として作用するであろう。
【０４６７】
一部の実施態様において、ｈＧＨ含有二量体または多量体中に存在する１つ以上のｈＧＨ分子は、Ｓｉｔｅ  ＩＩ結合領域内に存在する水溶性ポリマーに連結した天然にはコードされないアミノ酸を含む。従って、二量体または多量体のｈＧＨ分子の各々は、このＳｉｔｅ  Ｉ界面によるｈＧＨポリペプチド受容体への結合には利用しやすいが、Ｓｉｔｅ  ＩＩ界面による第二のｈＧＨポリペプチド受容体への結合には利用することができない。このように、ｈＧＨポリペプチド二量体または多量体は、２つの別個のｈＧＨポリペプチド受容体のＳｉｔｅ  Ｉ結合部位に係合するが、このｈＧＨ分子は、Ｓｉｔｅ  ＩＩ領域内に存在する遺伝的にコードされないアミノ酸に取り付けられた水溶性ポリマーを有するので、これらのｈＧＨポリペプチド受容体は、ｈＧＨポリペプチドリガンドのＳｉｔｅ  ＩＩ領域には係合できず、この二量体または多量体は、ｈＧＨポリペプチド拮抗薬として作用する。一部の実施態様では、ｈＧＨポリペプチド含有二量体または多量体中に存在する１つ以上のｈＧＨ分子は、Ｓｉｔｅ  Ｉ結合領域内に存在する水溶性ポリマーに連結された天然にはコードされないアミノ酸を含み、これにより、Ｓｉｔｅ  ＩＩ領域に結合することができる。また、一部の実施態様において、ｈＧＨポリペプチド含有二量体または多量体中に存在する１つ以上のｈＧＨ分子が、Ｓｉｔｅ  ＩおよびＳｉｔｅＩＩ結合領域の両方を結合に利用できるようにＳｉｔｅ  ＩまたはＳｉｔｅＩＩ結合領域内ではない部位に存在する水溶性ポリマーに連結された天然にはコードされないアミノ酸を含む。一部の実施態様では、結合に利用できるＳｉｔｅ  Ｉ、Ｓｉｔｅ  ＩＩまたは両方を有するｈＧＨ分子の組合せが用いられる。少なくとも１つの分子が、結合に利用できるＳｉｔｅ  Ｉを有し、および少なくとも１つの分子が、結合に利用できるＳｉｔｅ  ＩＩを有するｈＧＨ分子の組合せにより、所望の活性または特性を有する分子を生じさせることができる。加えて、結合に利用できるＳｉｔｅ  ＩおよびＳｉｔｅ  ＩＩの両方を有するｈＧＨ分子の組合せにより、超作動薬ｈＧＨ分子を生じさせることができる。
【０４６８】
一部の実施態様において、ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドは、Ａｓｎ−ＬｙｓアミドリンケージまたはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィドリンケージにより（これらを含むが、これらに限定されない）直接連結させる。一部の実施態様において、連結されたＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーポリペプチド、および／または連結された非ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーは、二量体化を助長するように異なる天然にはコードされないアミノ酸を含むであろう（これは、第一ｈＧＨポリペプチドの天然にはコードされない１つのアミノ酸中のアルキンと第二ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーの天然にはコードされない第二のアミノ酸中のアジドが、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化によりコンジュゲートするであろうということを含むが、これに限定されない）。また、第一ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバー、および／または連結された非ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバー、ケトンを含有する天然にはコードされないアミノ酸を含むポリペプチドは、ヒドロキシルアミンを含有する天然にはコードされないアミノ酸を含む第二のＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドにコンジュゲートすることができ、これらのポリペプチドは、対応するオキシムの形成を経て反応させる。
【０４６９】
また、２つのＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーポリペプチド、および／または連結された非ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバーをリンカーにより連結させる。いずれかのヘテロまたはホモ二官能性リンカーを使用して、２つのＧＨ超遺伝子ファミリーメンバー、および／または連結された非ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバー、同じ一次配列を有してもよいし、異なる一次配列を有してもよいポリペプチドを連結させることができる。場合によっては、ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバー、および／または連結された非ＧＨ超遺伝子ファミリーメンバー、ポリペプチドを共につなぐために使用されるリンカーは、二官能性ＰＥＧ試薬であり得る。
【０４７０】
一部の実施態様において、本発明は、ａ）ポリマー骨格の少なくとも第一末端上のアジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミンまたはカルボニル含有部分；およびｂ）このポリマー骨格の第二末端上の少なくとも第二官能基を含む、ダンベル構造を有する水溶性二官能性リンカーを提供する。この第二官能基は、第一官能基と同じであってもよいし、異なっていてもよい。この第二官能基は、一部の実施態様では、第一官能基と反応性ではない。一部の実施態様において、本発明は、分枝状分子構造の少なくとも１つのアームを含む水溶性化合物を提供する。例えば、この分枝状分子構造は、樹枝状であり得る。
【０４７１】
一部の実施態様において、本発明は、構造：
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ
（この構造中、ｎは、約５から３，０００であり、ｍは、２から１０であり、Ｘはｍアジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシルアミン、アセチルまたはカルボニル含有部分であり得、およびＲは、Ｘと同じであってもよいし異なっていてもよい、キャッピング基、官能基または脱離基である）
を有する水溶性活性ポリマーとの反応により形成される、１つ以上のＧＨ超遺伝子ファミリーメンバー、例えばｈＧＨ、を含む多量体を提供する。Ｒは、例えば、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アルコキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾールエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、１−ベンゾトリアゾリルカーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護アミン、ヒドラジン、保護ヒドラジン、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレート、アルケン、ならびにケトンから成る群より選択される官能基であり得る。
【０４７２】
ＸＩＩ．ｈＧＨポリペプチド活性およびｈＧＨポリペプチド受容体に対するｈＧＨポリペプチドの親和性の測定
ｈＧＨ受容体は、ＭｃＦａｒｌａｎｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：４９４−４９９（１９８９）およびＬｅｕｎｇ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５３７−５４３  （１９８７）に記載されているように調製することができる。ｈＧＨポリペプチド活性は、用準的なインビトロまたはインビボアッセイを使用して判定することができる。例えば、ｈＧＨの存在下で増殖する細胞系（例えば、ｈＦＨ受容体またはラクトゲン性受容体を発現する細胞系）を使用して、ｈＧＨ受容体結合をモニターすることができる。例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３６）：２１９６９（１９９６）；Ｗａｄａら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２：１４６−１５６（１９９８）；Ｇｏｕｔ，Ｐ．Ｗ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４０，２４３３−２４３６（１９８０）；国際公開第９９／０３８８７号参照。天然でないアミノ酸を含む非ＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチドについては、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）バイオセンサ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用することによりこのホルモンのこの受容体に対する親和性を測定することができる。例えば、米国特許第５，８４９，５３５号；Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：７８６２−７８６７（１９８８）参照。ｈＧＨ活性を検査するためにインビボ動物モデルとしては、例えば、Ｃｌａｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３６）：２１９６９−２１９７７（１９９６）に記載されているものが挙げられる。１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの二量体化能力についてのアッセイは、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：８２１−８２５（１９９１）およびＦｕｈ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１６７７−１６８０（１９９２）に記載されているように行うことができる。引用したすべての参考文献および特許は、本明細書に参照により組み込まれている。
【０４７３】
アッセイ方法論についての上記コンパイルおよび参考文献は、排他的ではなく、当業者は、所望の最終結果のための検査に有用な他のアッセイを認識するであろう。
【０４７４】
ＸＩＩＩ．効力、機能的インビボ半減期および薬物動態パラメータの測定
本発明の重要な態様は、水溶性ポリマー部分へのコンジュゲーションを伴うまたは伴わない、ｈＧＨポリペプチドの構築により得られる長期生体半減期である。ｈＧＨポリペプチド血清濃度の急速な低下が、ｈＧＨポリペプチドを、コンジュゲートしたおよびコンジュゲートしていないｈＧＨポリペプチドおよびこれらの変異体での治療への生体応答の評価に重要なものにした。好ましくは、本発明のコンジュゲートしたおよびコンジュゲートしていないｈＧＨポリペプチドおよびこれらの変異体は、静脈内投与後も長期血清半減期を有し、これにより、例えば、ＥＬＩＳＡ法または一次スクリーニングアッセイによる測定が可能となる。ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（カリフォルニア州、カマリロ）またはＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（テキサス州、ウエブスター）いずれかからのＥＬＩＳＡまたはＲＩＡキットを使用することができる。インビボ生体半減期の測定は、本明細書に記載するとおり行うことができる。
【０４７５】
天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの効能および機能的インビボ半減期は、Ｃｌａｒｋ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３６，２１９６９−２１９７７（１９９６）に記載されているプロトコルに従って判定することができる。
【０４７６】
天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドについての薬物動態パラメータは、正常な雄Ｓｐａｒｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（治療グループあたり動物数Ｎ＝５）において評価することができる。動物に２５ｕｇ／ラット（静脈内）または５０ｕｇ／ラット（皮下）の１回量を与え、一般に、水溶性ポリマーにコンジュゲートしていない天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドについては約４時間、および天然にはコードされないアミノ酸を含み、水溶性ポリマーにコンジュゲートしているｈＧＨポリペプチドについては約４日間にわたる、予め定義された時間経過に従って、約５から７個の血液サンプルを採取することとなる。ｈＧＨポリペプチドについての薬物動態データは、幾つかの種において十分研究されており、天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドについて得られたデータと直接比較することができる。ｈＧＨに関連した研究については、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ  Ｊ．ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８（１１）：１３５１−５９（１９９１）参照。
【０４７７】
本発明のｈＧＨポリペプチドの特異的活性は、当該技術分野において公知である様々なアッセイにより判定することができる。本発明に従って得られ、精製されるｈＧＨポリペプチド突然変異タンパク質またはこれらのフラグメントの生物活性は、本明細書において記載するもしくは言及する方法、または当業者に公知である方法により検査することができる。
【０４７８】
ＸＩＶ．投与および医薬組成物
本発明のポリペプチドまたはタンパク質（ｈＧＨシンセターゼ、１つ以上の非天然アミノ酸を含むタンパク質を含むが、これらに限定されない）は、場合により、適する医薬用担体との組合せで（これを含むが、これに限定されない）治療用途に利用される。こうした組成物は、例えば、治療有効量の化合物、および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む。こうした担体または賦形剤としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、および／またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。調合は、投与方式に適するように行う。一般に、タンパク質の投与方法は、当該技術分野において周知であり、本発明のポリペプチドの投与に適用することができる。
【０４７９】
場合により、本発明の１つ以上のポリペプチドを含む治療用組成物は、有効度、組織代謝を確認するために、および投薬量を概算するために、当該技術分野において周知である方法に従って、１つ以上の適するインビトロおよび／またはインビボ動物疾病モデルにおいて検査する。具体的には、投薬量は、天然アミノ酸相同体に対する本明細書における非天然アミノ酸相同体の活性、安定性または他の適する測定（天然アミノ酸ｈＧＨポリペプチドに対する１つ以上の非天然アミノ酸を含むように修飾されたｈＧＨポリペプチドの比較を含むが、これに限定されない）により、すなわち妥当なアッセイにおいて、最初に決定することができる。
【０４８０】
投与は、分子を最終的には血液または組織細胞と接触させるように導くために通常使用される経路のいずれかによる。本発明の非天然アミノ酸は、いずれかの適する手法で、場合により１つ以上の医薬的に許容される担体とともに、投与される。本発明に関連してこうしたポリペプチドを患者に投与する、適する方法を利用でき、また、１つより多くの経路を使用して、特定の組成物を投与することはできるが、多くの場合、特定の経路が、別の経路より即効的および効果的な作用または反応をもたらすことができる。
【０４８１】
医薬的に許容される担体は、投与される特定の組成物により、ならびにこの組成物を投与するために使用される特定の方法によって、一部、決まる。従って、本発明の医薬組成物の多種多様な適する調合物が存在する。
【０４８２】
ポリペプチド組成物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下または直腸内手段をはじめとする（しかし、これらに限定されない）多数の経路により投与することができる。修飾されたまたは未修飾の天然でないアミノ酸ポリペプチドを含む組成物は、リボソームによって投与することもできる。こうした投与経路および適切な調合物は、当業者に一般に公知である。
【０４８３】
単独で、または他の適する成分との組合せで天然でないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、エーロゾル調合物にして（すなわち、これらは、「霧状にする」ことができる）、吸入により投与することもできる。エーロゾル調合物は、許容可能な加圧噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパンおよび窒素などに入れることができる。
【０４８４】
例えば、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路などの非経口投与に適する調合物としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、およびこの調合物を所期の受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および保存薬を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。パッケージされた核酸の調合物は、１回量または複数回分の用量が封入された容器、例えばアンプルおよびバイアルに入った状態で提供することができる。
【０４８５】
非経口投与および静脈内投与が好ましい投与方法である。特に、現在使用されている調合と共に、非天然アミノ酸相同体療法薬（ＥＰＯ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮｓ、インターロイキン、抗体および／または他のあらゆる薬学的に産生されたタンパク質）のために既に使用されている投与経路は、本発明のポリペプチドに好ましい投与経路および調合となる。
【０４８６】
本発明に関連して、患者に投与される用量は、適用に依存して、ある期間にわたって患者の有益な治療応答を得るために、または病原体による感染もしくは適切な活性を抑制するために（これを含むが、これに限定されない）、十分なものである。この用量は、特定のベクターまたは調合物、利用される非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性または血清半減期、および患者の状態、ならびに治療する患者の体重または表面積によって決まる。用量のサイズは、特定の患者における特定のベクターまたは調合物などの投与に随伴するあらゆる有害副作用の存在、性質および程度によっても決まる。
【０４８７】
疾病（癌、遺伝性疾患、糖尿病またはＡＩＤＳなど）の治療または予防において投与することができるベクターまたは調合物の有効量を決定する際、医師は、循環血漿レベル、調合物の毒性、疾病の進行、および／または該当する場合には、抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の生産を評価する。
【０４８８】
例えば７０キログラムの患者に投与される用量は、一般に、現在使用されている治療用タンパク質の投薬量と同等の範囲内であり、それを該当組成物の変化した活性または血清半減期について調整する。本発明のベクターは、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性剤、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体および生体応答調節剤などの投与をはじめとするいずれかの公知従来的治療法による治療条件に追加することができる。
【０４８９】
投与については、本発明の調合物は、該当調合物のＬＤ−５０もしくはＥＤ−５０、および／または患者の体重および総合的な健康状態に適用されるような（これを含むが、これに限定されない）、様々な濃度での非天然アミノ酸のあらゆる副作用の観察により決定される速度で投与される。投与は、１回量または分割量により遂行することができる。
【０４９０】
調合物の吸入を受ける患者が、発熱、悪寒または筋肉痛を発現した場合、彼／彼女には、適切な用量のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェンまたは他の疼痛／発熱制御薬を与える。吸入に対する反応、例えば発熱、筋肉痛および悪寒を経験する患者は、さらなる吸入の３０分前に、アスピリン、アセトアミノフェン、またはジフェニルヒドラミン（これを含むが、これに限定されない）を前投与する。メペリジンは、解熱剤および抗ヒスタミン剤に迅速に応答しない、より重度の悪寒および筋肉痛に使用する。細胞吸入は、この反応の重症度に依存して遅速させるか、中止する。
【０４９１】
本発明のヒトｈＧＨポリペプチドは、哺乳動物被験者に直接投与することができる。投与は、被験者にｈＧＨポリペプチドを導入するために一般に使用されるいずれかの経路による。本発明の実施態様のｈＧＨポリペプチド組成物としては、経口投与、直腸内投与、局所投与、吸入適用（エーロゾルによるものを含むが、これに限定されない）、口腔内投与（舌下を含むが、これに限定されない）、膣投与、非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、関節内投与、胸膜内投与、腹腔内投与、脳内投与、動脈内投与または静脈内投与を含むが、これらに限定されない）、局所投与（すなわち、皮膚および粘膜表面（気道表面の両方の投与を含むが、これに限定されない）および経皮投与に適するものが挙げられるが、あらゆる所定の場合に最も適する経路は、治療する状態の性質および重症度に依存するであろう。投与は、局所的であってもよいし、全身的であってもよい。化合物の調合物は、単位用量または複数回分の用量が封入された容器、例えばアンプルおよびバイアルの中に入った状態で提供することができる。本発明のｈＧＨポリペプチドは、医薬的に許容される担体との単位用量注射用形態（溶液、懸濁液または乳剤を含むが、これらに限定されない）での混合物で調製することができる。本発明のｈＧＨポリペプチドは、持続注入（浸透圧ポンプなどのミニポンプ（これらを含むが、これらに限定されない）を使用）、単一のボーラスまたは遅速放出型デポー調合物により投与することもできる。
【０４９２】
投与に適する調合物としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、およびこの調合物を等張にする溶質を含有し得る水性および非水性溶液、等張滅菌溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および保存薬を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【０４９３】
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される担体を含むことができる。医薬的に許容される担体は、投与される特定の組成物、ならびにこの組成物を投与するために用いられる特定の方法により、一部、決まる。従って、本発明の医薬組成物（任意の医薬的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含む）の多種多様な適する調合物が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．１９８５参照）。
【０４９４】
適する担体としては、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩および他の有機酸を含有する緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む）；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；二価金属イオン、例えば、亜鉛、コバルトもしくは銅；糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）もしくはＰＥＧが挙げられる。
【０４９５】
ＰＥＧなどの水溶性ポリマーに連結したものを含む、本発明のｈＧＨポリペプチドは、持続放出性の系により、またはこれらの一部として投与することもできる。持続放出性組成物としては、フィルムまたはマイクロカプセルをはじめとする（しかし、これらに限定されない）成形品の形態での半透過性ポリマーマトリックス（これらを含むが、これらに限定されない）が挙げられる。持続放出性マトリックスとしては、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、上記）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）、ポリラクチド（ポリ乳酸）（米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許第５８，４８１号）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）ポリ無水物、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｕ．Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，５４７−５５６（１９８３））、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、硫酸コンドロイチン、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、マレイン酸、ポリアミノ酸、アミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコーンなどの生態適合性材料からのものが挙げられる。持続放出性組成物は、リボソームに閉じ込められた化合物も包含する。化合物を含有するリボソームは、本質的に公知である方法により調製される：ドイツ特許第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；欧州特許第５２，３２２号、同第３６，６７６号、同第８８，０４６号、同第１４３，９４９号および同第１４２，６４１号；日本特許出願８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびに欧州特許第１０２，３２４号。引用したすべての参考文型および特許出願は、本明細書に参照により組み込まれている。
【０４９６】
リボソームに閉じ込められたｈＧＨポリペプチドは、例えば、ドイツ特許第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；欧州特許第５２，３２２号、同第３６，６７６号、同第８８，０４６号、同第１４３，９４９号および同第１４２，６４１号；日本特許出願８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびに欧州特許第１０２，３２４号に記載されている方法によって調製することができる。リボソームの組成物およびサイズは、周知であり、または当業者により経験的に容易に決定され得る。リボソームの一部の例は、例えば、Ｐａｒｋ  ＪＷら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１３２７−１３３１（１９９５）；Ｌａｓｉｃ  ＤおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  Ｄ（ｅｄｓ）：ＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＬＩＰＯＳＯＭＳ（１９９８）；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ＤＣら、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，ｉｎ  Ｔｅｉｃｈｅｒ  Ｂ（ｅｄ）：ＣＡＮＣＥＲ  ＤＲＵＧ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＡＮＤ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ（２００２）；Ｐａｒｋ  ＪＷら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：１１７２−１１８１（２００２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＵＢら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５９１（１−３）：１０９−１１８（２００２）；Ｍａｍｏｔ  Ｃら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：３１５４−３１６１（２００３）に記載されている。引用したすべての参考文型および特許出願は、本明細書に参照により組み込まれている。
【０４９７】
本発明に関連して、患者に投与される用量は、一定の期間にわたって被験者において有益な応答を生じさせるために十分でなければならない。一般に、一用量あたりの非経口投与される本発明のｈＧＨポリペプチドの全薬学的有効量は、患者の体重の約０．０１μｇ／ｋｇ／日から約１００μｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの範囲内であるが、これは、治療上の判断によって決まる。投薬の頻度も治療上の判断によって決まり、ヒトでの使用の承認を受けている市販のｈＧＨポリペプチド製品より多い頻度であってもよいし、少ない頻度であってもよい。一般に、本発明のＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチドは、上に記載した投与経路のいずれかにより投与することができる。
【０４９８】
ＸＶ．本発明のｈＧＨポリペプチドの治療的使用
本発明のｈＧＨポリペプチドは、多種多様な疾患の治療に有用である。
【０４９９】
本発明のｈＧＨ作動薬ポリペプチドは、例えば、成長不全および免疫疾患の治療、ならびに心機能の刺激に有用であり得る。成長不全の個体としては、例えば、ターナー症候群の個体、ＧＨ欠損の個体（子供を含む）、骨端軟骨閉鎖前約２から３年の正常な成長曲線において遅延または遅滞の経験がある子供（時として、「ショート・ノーマル・チルドレン」として公知である）、およびＧＨに対するインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）応答が、化学的に（すなわち、糖質コルチコイド治療により）、または自然条件により（ＧＨに対するＩＧＦ−Ｉ応答が自然に減少する成体患者の場合など）遮断された個体が挙げられる。
【０５００】
作動薬ｈＧＨ変異体は、哺乳動物の免疫系をこの免疫機能の上昇により、この上昇が、抗体媒介によるものであろうと、または細胞媒介によるものであろうと、およびこの免疫系が、ｈＧＨポリペプチドでの治療を受けた宿主に内在するものであろうと、またはｈＧＨポリペプチドを与えた宿主受容者に供与者から（骨髄移植片として）移植されたものであろうと、刺激するように作用することができる。「免疫疾患」は、薬物（例えば、化学療法薬）治療のために免疫が低減された小さな脾臓を有する個体をはじめとする、個体の免疫系が、正常より低減された抗体または細胞応答を有するあらゆる状態を包含する。免疫疾患に罹患している個体の例としては、例えば、老人患者；化学療法または放射線療法を受けている個体；大病から回復するまたは手術を受けようとしている個体；ＡＩＤＳに罹患している個体；先天性および後天性Ｂ細胞不全、例えば低γグロブリン血症、通常の各種無γグロブリン血症（ｃｏｍｍｏｎ  ｖａｒｉｅｄ  ａｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）および選択性免疫グロブリン欠損症（例えば、ＩｇＡ欠損症）に罹患している患者；この患者の免疫応答より短い潜伏時間を有する狂犬病ウイルスなどのウイルスに感染している患者；ならびにディ・ジョージ症候群などの遺伝性疾患に罹患している個体が挙げられる。
【０５０１】
本発明のｈＧＨ拮抗薬ポリペプチドは、巨人症および先端巨大症、糖尿病および糖尿病から生じる合併症（糖尿病性網膜症、糖尿病性腎障害）、血管性眼疾患（例えば、増殖性血管新生）、腎症、およびＧＨ反応性悪性病変の治療に有用であり得る。
【０５０２】
欠陥性眼疾患としては、例えば、網膜症（例えば、早産または鎌状赤血球性貧血に起因するもの）および黄斑変性が挙げられる。
【０５０３】
ＧＨ反応性悪性病変としては、例えば、ウイルムス腫瘍、肉腫（例えば、骨原性肉腫）、乳癌、大腸癌、前立腺癌および甲状腺癌、ならびにＧＨ受容体ｍＲＮＡを発現する組織の癌（すなわち、胎盤、胸腺、脳、唾液腺、前立腺、骨髄、骨格筋、器官、脊髄、網膜およびリンパ節の癌、ならびにバーキットリンパ腫、結腸直腸癌、肺癌、リンパ芽球性白血病および黒色腫からの癌）が挙げられる。
【０５０４】
ｈＧＨの平均量は、様々であり得、特に、資格を有する医師の推奨および処方に基づくであろう。ｈＧＨの正確な量は、治療する状態の正確なタイプ、治療する患者の状態、ならびにこの組成物中の他の成分などの因子によって決まる選択事である。
【０５０５】
実施例
以下の実施例は、例証のために提供するものであり、特許請求の範囲に記載する本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【０５０６】
この実施例では、天然にはコードされないアミノ酸のｈＧＨへの組み込みの好ましい部位の選択に重要な可能性のある多数のセットのうちの一つを説明する。
【０５０７】
この実施例は、天然にはコードされないアミノ酸の組み込みに好ましいｈＧＨポリペプチド内の部位を選択する方法を示すものである。受容体の細胞外ドメインの２つの分子と複合体を形成したｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）から成る結晶構造３ＨＨＲを使用して、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸を導入することができる好ましい位置を決定した。他のｈＧＨ構造（例えば、１ＡＸＩ）を利用して、結晶構造データセット間の一次および二次構造要素の潜在的変化を検査した。これらの構造の座標は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）（Ｂｅｒｓｔｅｉｎら．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７，１１２，ｐｐ５３５）から、またはｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｒｃｓｂ．ｏｒｇ．で利用できるＴｈｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＰＤＢにより入手できる。構造モデル３ＨＨＲは、結晶の無秩序さのため割愛した残基１４８から１５３およびＣ末端Ｆ１９１残基を除き、ｈＧＨの全成熟２２ｋＤａ配列を含有する。Ｃ５３とＣ１６５およびＣ１８２とＣ１８５により形成された２つのジスルフィド架橋が存在する。この実施例で使用した配列番号付けは、配列番号２に示す成熟ｈＧＨのアミノ酸配列（２２ｋＤａ変異体）に従うものである。
【０５０８】
以下の基準を用いて、天然にはコードされないアミノ酸を導入するためのｈＧＨの各一を評価した：残基は、（ａ）３ＨＨＲ、１ＡＸＩおよび１ＨＷＧの構造解析（ｈＧＨｂｐ単量体または二量体とコンジュゲートしたｈＧＨの結晶構造）に基づき、いずれのｈＧＨｂｐの結合にも干渉してはならない、（ｂ）アラニンまたは同族体走査型突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１０８１−１０８５およびＣｕｍｍｉｎｇｈａｍら．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４３：１３３０−１３３６）による影響を受けてはならない、（ｃ）表面が露出されており、周囲の残基との最小限のファン・デル・ワールスまたは水素結合相互作用を示さなければならない、（ｄ）ｈＧＨ変異体（例えば、Ｔｙｒ３５、Ｌｙｓ３８、Ｐｈｅ９２、Ｌｙｓ１４０）が欠失しているか、可変的でなければならない、（ｅ）天然にはコードされないアミノ酸での置換により保存的変化が生じるであろう、ならびに（ｆ）高可撓性領域（ＣＤループを含むが、これに限定されない）または構造的に堅い領域（ヘリックスＢを含むが、これに限定されない）のいずれかにおいて見出すことができる。加えて、Ｃｘプログラム（Ｐｉｎｔａｒら．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１８，ｐｐ９８０）を利用してｈＧＨ分子に関するさらなる計算を行って、各タンパク質原子についての突出度を評価した。結果として、一部の実施態様では、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸が、以下のｈＧＨの位置の１つ以上（しかし、これらに限定されない）に導入される：位置１の前（すなわち、Ｎ末端位置）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、このタンパク質のカルボキシル末端位置）（配列番号２、または配列番号１もしくは３における対応するアミノ酸）。
【０５０９】
一部の実施態様において、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸は、以下の位置の１つ以上で置換される：２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６、および１８７（配列番号２、または配列番号１もしくは３における対応するアミノ酸）。
【０５１０】
一部の実施態様において、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸は、以下の位置の１つ以上で置換される：２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６、および１８７（配列番号２、または配列番号１もしくは３における対応するアミノ酸）。
【０５１１】
一部の実施態様において、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸は、以下の位置の１つ以上で置換される：３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５、および１５５（配列番号２、または配列番号１もしくは３における対応するアミノ酸）。
【０５１２】
一部の実施態様において、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸は、以下の位置の１つ以上で置換される：３０、７４、１０３（配列番号２、または配列番号１もしくは３における対応するアミノ酸）。一部の実施態様において、１つ以上の天然にはコードされないアミノ酸は、以下の位置の１つ以上で置換される：３５、９２、１４３、１４５（配列番号２、または配列番号１もしくは３における対応するアミノ酸）。
【０５１３】
一部の実施態様において、位置１の前（すなわち、Ｎ末端位置）、位置：１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、このタンパク質のカルボキシル末端位置）（配列番号２、または配列番号１もしくは３における対応するアミノ酸）を含む（しかし、これらに限定されない）これらの位置の１つ以上における自然には発生しないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結されている。一部の実施態様において、これらの位置：３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（配列番号２、または配列番号１もしくは３における対応するアミノ酸）の１つ以上における自然には発生しないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結されている。一部の実施態様において、３５、９２、１４３、１４５（配列番号２、または配列番号１もしくは３における対応するアミノ酸）の１つ以上における自然には発生しないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結されている。
【０５１４】
ｈＧＨ拮抗薬の生成のための一部の部位としては、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、１２７、もしくは位置１の前での付加、これらのあらゆる組合せ（配列番号２、または配列番号１、３もしくは他のいずれかのＧＨ配列における対応するアミノ酸）が挙げられる。これらの部位は、前記作動薬設計の基準（ｃ）から（ｅ）を利用して選択することができる。この拮抗薬設計は、ｈＧＨｂｐへの結合親和性を増大させるためにＳｉｔｅ  Ｉ残基の部位特異的修飾も包含し得る。
【実施例２】
【０５１５】
この実施例では、大腸菌における天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのクローニングおよび発現を詳述する。この実施例では、修飾されたｈＧＨポリペプチドの生物活性の一評価方法も説明する。
【０５１６】
ｈＧＨおよびこのフラグメントのクローニング方法は、米国特許第４，６０１，９８０号；同第４，６０４，３５９号；同第４，６３４，６７７号；同第４，６５８，０２１号；同第４，８９８，８３０号；同第５，４２４，１９９号；および同第５，７９５，７４５号（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）において詳述されている。完全長ｈＧＨまたはＮ末端シグナル配列を欠く熟成形態のｈＧＨをコードするｃＤＮＡを配列番号２１および配列番号２２にそれぞれ示す。
【０５１７】
直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む導入翻訳系を使用して、天然にはコードされないアミノ酸を含有するｈＧＨを発現させる。このＯ−ＲＳは、天然にはコードされないアミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。そしてまた、この翻訳系は、コードされたセレクターコドンに応答して、この天然にはコードされないアミノ酸をｈＧＨに挿入する。
【０５１８】
【表４】
2007519420.tif 000026
【０５１９】
修飾されたｈＧＨ遺伝子および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡ対（所望の天然にはコードされないアミノ酸に対して特異的なもの）を含有するプラスミドでの大腸菌の形質転換により、天然にはコードされないアミノ酸をｈＧＨポリペプチドに部位特異的に組み込むことができる。０．０１から１００ｍＭの間の特定の天然にはコードされないアミノ酸を含有する培地中、３７℃で成長させた形質転換大腸菌は、高い忠実度および効率で修飾されたｈＧＨを発現する。天然にはコードされないアミノ酸を含有するＨｉｓ標識ｈＧＨを大腸菌宿主により封入体または凝集体として生産させる。これらの凝集体を６Ｍ  グアニジンＨＣｌ中、変性条件下で可溶化し、親和精製する。５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０μＭ  ＣｕＳＯ４、および２％（ｗ／ｖ）Ｓａｒｋｏｓｙｌ中で一晩、４℃で透析することにより、リフォールディングを行う。この後、この材料を、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２に透析し、続いて、Ｈｉｓタグを除去する。Ｂｏｉｓｓｅｌら、（１９９３）２６８：１５９８３−９３参照。ｈＧＨの精製方法は、当該技術分野において周知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット分析またはエレクトロスプレー・イオン化トラップ質量分析などにより確認される。
【０５２０】
図６は、精製されたｈＧＨポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Ｈｉｓ標識突然変異ｈＧＨタンパク質は、このゲルを負荷する前に、ＰｒｏＢｏｎｄ  Ｎｉｃｋｅｌ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、この製造業者により提供された標準的なＨｉｓ標識タンパク質精製手順により精製し、続いて、アニオン交換カラムを使用して精製した。レーン１は、分子量マーカーを示し、レーン２は、天然でないアミノ酸が組み込まれていないＮ−Ｈｉｓ  ｈＧＨを表す。レーン３から１０は、位置：Ｙ３５、Ｆ９２、Ｙ１１１、Ｇ１３１、Ｒ１３４、Ｋ１４０、Ｙ１４３、およびＫ１４５の各々にそれぞれ天然でないアミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニンを含む、Ｎ−Ｈｉｓ  ｈＧＨを含む。
【０５２１】
修飾されたｈＧＨポリペプチドの生物活性をさらに評価するために、ｈＧＨのこの受容体との相互作用の下流マーカーを測定するアッセイを用いた。ｈＧＨのこの内在生産受容体との相互作用は、ヒトＩＭ−９リンパ球細胞系において、転写ファミリーメンバーのシグナルトランデューサおよびアクチベータのチロシンリン酸化を導く。ＳＴＡＴ５の２つの形態、ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂは、ＩＭ−９  ＤＮＡライブラリから同定された。例えば、Ｓｉｌｖａら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９９６）１０（５）：５０８−５１８参照。ＩＭ−９細胞上のヒト成長ホルモン受容体は、ラット成長ホルモンもヒトプロラクチンも、検出可能なＳＴＡＴ５リン酸化を生じさせなかったので、ヒト成長ホルモンに対して選択的である。重要なこととしては、ラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）細胞外ドメインおよびＧ１２０Ｒ含有ｈＧＨは、ｐＳＴＡＴ５リン酸化を刺激したｈＧＨに対して有効に競合する。
【０５２２】
ＩＭ−９細胞を本発明のｈＧＨポリペプチドで刺激した。ヒトＩＭ−９リンパ球は、ＡＴＣＣ（バージニア州、マナッサス）から購入し、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン（サンディエゴ、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ユタ州、ローガンのＨｙｃｌｏｎｅ）を補足したＲＰＭＩ  １６４０中で成長させた。このＩＭ−９細胞を一晩、アッセイ培地（フェノールレッド不含ＲＰＭＩ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１％熱不活性化チャコール／デキストラン処理ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリンおよびストレプトマイシン）中で飢餓させ、この後、１２点用量範囲のｈＧＨポリペプチドで、１０分間、３７℃で刺激した。刺激した細胞を１％ホルムアルデヒドで固定した後、氷上で１時間、９０％氷冷メタノールで透過性化した。ＳＴＡＴ５リン酸化レベルは、一次ホスホ−ＳＴＡＴ５抗体（マサチューセッツ州、ベヴァリーのＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で３０分間、室温で、この後、ＰＥにコンジュゲートした二次抗体で細胞内染色することにより検出した。ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙでサンプル収集を行い、得られたデータをＦｌｏｗｊｏソフトウェア（オレゴン州、アッシュランドのＴｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）で解析した。ＳｉｇｍａＰｌｏｔを利用してタンパク質濃度に対して平均蛍光強度（ＭＦＩ）をプロットした用量応答曲線からＥＣ５０値を導出した。
【０５２３】
下の表３は、突然変異ｈＧＨポリペプチドを用いて生成させたＩＭ−９データをまとめたものである。異なる位置で天然でないアミノ酸置換された様々なｈＧＨポリペプチドを説明したようにヒトＩＭ−９細胞で検査した。具体的には、図７、パネルＡは、Ｈｉｓ標識ｈＧＨポリペプチドについてのＩＭ−９データを示すものであり、図７、パネルＢは、Ｙ１４３に対する天然でないアミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニン置換を含むＨｉｓ標識ｈＧＨについてのＩＭ−９データを示すものである。同アッセイを用いて、ＰＥＧ化されている天然でないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの生物活性を評価した。
【０５２４】
【表５】
2007519420.tif 000027
【実施例３】
【０５２５】
この実施例では、カルボニル含有アミノ酸の導入およびこの後のアミノオキシ含有ＰＥＧとの反応を詳述する。
【０５２６】
この実施例では、ケトンを含有する天然にはコードされないアミノ酸を導入し、それを、この後、約５，０００のＭＷのアミノオキシ含有ＰＥＧと反応させる、ｈＧＨポリペプチドの生成方法を示す。実施例１の基準に従って同定した残基３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１２０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５、および１５５（ｈＧＨ）の各々を、以下の構造：
【０５２７】
【化２４】
2007519420.tif 000028
を有する天然にはコードされないアミノ酸で別々に置換する。
【０５２８】
ｐ−アセチル−フェニルアラニンのｈＧＨへの部位特異的組み込みに利用する配列は、配列番号２（ｈＧＨ）、ならびに上の実施例２に記載の配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ，Ｍ．ヤナシイ  ｍｔＲＮＡＴｙｒＣｕＡ）および１６、１７または１８（ＴｙｒＲＳ  ＬＷ１、５、６）である。
【０５２９】
修飾したら、このカルボニル含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド変異体を、次の形態：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２））ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒは、メチルであり、ｎは、３であり、Ｎは、約５，０００ＭＷである）
のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させる。２５ｍＭ  ＭＥＳ（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇａｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（ｐＨ６．０）、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇａｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（ｐＨ７．０）中、または１０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇａｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（ｐＨ４．５）中、１０ｍｇ／ｍＬで溶解したｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する精製ｈＧＨを、１０から１００倍過剰なアミノオキシ含有ＰＥＧと反応させ、この後、１０から１６時間、室温で攪拌する（Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５９，８１，ｐｐ  ４７５）。この後、このＰＥＧ−ｈＧＨを即時精製および分析のために適切な緩衝液で希釈する。
【実施例４】
【０５３０】
アミドリンケージによりＰＥＧに連結されたヒドロキシルアミンから成るＰＥＧとのコンジュゲーション。
【０５３１】
以下の構造を有するＰＥＧ試薬を、実施例３に記載の手順を用いて、ケトンを含有する天然にはコードされないアミノ酸にカップリングさせる：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝４、およびＮは、適切には２０，０００ＭＷである）。反応、精製および分析条件は、実施例３に記載したとおりである。
【実施例５】
【０５３２】
この実施例では、ｈＧＨポリペプチドへの２つの別個の天然にはコードされないアミノ酸の導入を詳述する。
【０５３３】
この実施例では、以下の残基：Ｅ３０、Ｅ７４、Ｙ１０３、Ｋ３８、Ｋ４１、Ｋ１４０、およびＫ１４５の中の２つの位置にケトン官能基を含む天然にはコードされないアミノ酸が組み込まれているｈＧＨポリペプチドの生成方法を示す。このｈＧＨポリペプチドは、サプレッサコドンをこの核酸内の２つの別個の部位に導入すること以外は、実施例１および２に記載したとおり調製する。
【実施例６】
【０５３４】
この実施例では、ヒドラジン含有ＰＥＧへのｈＧＨポリペプチドのコンジュゲーションおよびこの後のインサイチュー還元を詳述する。
【０５３５】
カルボニル含有アミノ酸が組み込まれているｈＧＨポリペプチドは、実施例３３および３に記載の手順に従って調製する。修飾したら、以下の構造を有するヒドラジン含有ＰＥＧをこのｈＧＨポリペプチドにコンジュゲートさせる：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝２、Ｎ＝１０，０００ＭＷ、およびＸは、カルボニル（Ｃ＝Ｏ）基である）。ｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する精製ｈＧＨを、２５ｍＭ  ＭＥＳ（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇａｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（ｐＨ６．０）、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇａｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（ｐＨ７．０）に、または１０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇａｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（ｐＨ４．５）に、０．１から１０ｍｇ／ｍＬの間で溶解し、１から１００倍過剰なヒドラジン含有ＰＥＧと反応させ、１０から５０ｍＭの最終濃度になるようにＨ２Ｏに溶解した原液１Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇａｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の添加により、対応するヒドラゾンをインサイチューで還元する。反応は、暗所、４℃から室温で、１８から２４時間行う。５０ｍＭの最終Ｔｒｉｓ濃度までのまたは即時精製のために適切な緩衝液で希釈した１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇａｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（約ｐＨ７．６）の添加により、反応を停止させる。
【実施例７】
【０５３６】
この実施例では、ｈＧＨポリペプチドへのアルキン含有アミノ酸の導入およびｍＰＥＧ−アジドでの誘導体化を詳述する。
【０５３７】
以下の残基、３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１４０、１４３、１４５、および１５５を、以下の天然にはコードされないアミノ酸（配列番号２）：
【０５３８】
【化２５】
2007519420.tif 000029
で各々置換する。
【０５３９】
ｈＧＨへのｐ−プロパルギル−チロシンの部位特異的組み込みに利用する配列は、配列番号２（ｈＧＨ）、ならびに上の実施例２に記載の配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ，Ｍ．ヤナシイ  ｍｔＲＮＡＴｙｒＣｕＡ）および９、１０または１１である。プロパルギルチロシンを含有するｈＧＨポリペプチドを大腸菌において発現させ、実施例３に記載した条件を用いて精製する。
【０５４０】
プロパルギル−チロシンを含有する精製ｈＧＨを、ＰＢ緩衝液（１００ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝８）中、０．１から１．０ｍｇ／ｍＬの間で溶解し、１０から１０００倍過剰のアジド含有ＰＥＧをこの反応混合物に添加する。次に、触媒量のＣｕＳＯ４およびＣｕ線をこの反応混合物に添加する。この混合物をインキュベート（約４時間、室温もしくは３７℃で、または一晩、４℃でのインキュベーションを含むが、これらに限定されない）した後、Ｈ２Ｏを添加し、この混合物を透析膜に通して濾過する。実施例３に記載した同様の手順（これを含むが、これに限定されない）により、サンプルを付加について分析することができる。
【０５４１】
この実施例では、ＰＥＧは、以下の構造：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２））ｎ−Ｎ３
（式中、Ｒは、メチルであり、ｎは、４であり、Ｎは、ｍ１０，０００ＭＷである）
を有するであろう。
【実施例８】
【０５４２】
この実施例では、ｈＧＨポリペプチド中の大きな疎水性アミノ酸のプロパルギルチロシンでの置換を詳述する。
【０５４３】
ｈＧＨの以下の領域：１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａへリックス）、３４−７４（ＡへリックスとＢへリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂへリックス）、９７−１０５（ＢへリックスとＣへリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃへリックス）、１３０−１５３（ＣへリックスとＤへリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄへリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）（配列番号２）の１つの中に存在するＰｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒを、実施例７に記載したような以下の天然にはコードされないアミノ酸で置換する：
【０５４４】
【化２６】
2007519420.tif 000030
【０５４５】
修飾したら、アルキン含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド変異体にＰＥＧを取り付ける。このＰＥＧは、以下の構造：
Ｍｅ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ３
を有し、カップリング手順は、実施例７におけるものに従うこととなる。これにより、大きな疎水性の自然発生アミノ酸の１つとほぼ等比体積である天然にはコードされないアミノ酸を含み、このポリペプチド内の別個の部位がＰＥＧ誘導体で修飾されている、ｈＧＨポリペプチド変異体が生じることとなる。
【実施例９】
【０５４６】
この実施例では、１つ以上のＰＥＧリンカーによって分けられているｈＧＨポリペプチドホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体またはヘテロ多量体の生成を詳述する。
【０５４７】
実施例７において生成させたアルキン含有ｈＧＨポリペプチド変異体を、次の形態：
Ｎ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
（式中、ｎは、４であり、ＰＥＧは、約５，０００の平均ＭＷを有する）
の二官能性ＰＥＧ誘導体と反応させて、２つのｈＧＨ分子がＰＥＧによって物理的に分けられている対応するｈＧＨポリペプチドホモ二量体を生じさせる。類似の手法で、ｈＧＨポリペプチドを１つ以上の他のポリペプチドとカップリングさせて、ヘテロ二量体、ホモ多量体またはヘテロ多量体を形成することができる。カップリング、精製および分析は、実施例７および３の場合のように行うこととなる。
【実施例１０】
【０５４８】
この実施例では、ｈＧＨポリペプチドへの糖部分のカップリングを詳述する。
【０５４９】
以下：２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６、および１８７のうちの１つの残基を、実施例３に記載したように、下記の天然にはコードされないアミノ酸で置換する。
【０５５０】
【化２７】
2007519420.tif 000031
【０５５１】
修飾したら、このカルボニル含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド変異体を、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ連結型アミノオキシ類似体と反応させる。このｈＧＨポリペプチド変異体（１０ｍｇ／ｍＬ）とアミノオキシ糖（２１ｍＭ）を１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝水溶液（ｐＨ５．５）中で混合し、３７℃で７から２６時間インキュベートする。１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中、周囲温度で４８時間、この糖にコンジュゲートしたｈＧＨポリペプチドをＵＤＰ−ガラクトース（１６ｍＭ）およびβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（０．４単位／ｍＬ）とともにインキュベートすることにより、第一の糖に第二の糖を酵素的にカップリングさせる（Ｓｃｈａｎｂａｃｈｅｒら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０，２４５，５０５７−５０６１）。
【実施例１１】
【０５５２】
この実施例では、ＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチド拮抗薬の生成を詳述する。
【０５５３】
以下の残基：１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、または１２７（ｈＧＨ、配列番号２、または配列番号１もしくは３における対応するアミノ酸）のうちの１つを、実施例３に記載したように、下記の天然にはコードされないアミノ酸で置換する。
【０５５４】
【化２８】
2007519420.tif 000032
【０５５５】
修飾したら、このカルボニル含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド変異体を、次の形態：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒは、メチルであり、ｎは、４であり、Ｎは、２０，０００ＭＷである）
のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させて、天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド拮抗薬（このポリペプチド内の単一の部位が、ＰＥＧ誘導体で修飾されている）を生じさせる。カップリング、精製および分析は、実施例３の場合のとおりである。
【実施例１２】
【０５５６】
ｈＧＨ分子が直接連結されているｈＧＨポリペプチドホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体またはヘテロ多量体の生成
アルキン含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド変異体を、アジド含有アミノ酸を含む別のｈＧＨポリペプチド変異体に直接カップリングさせることができ、これらの変異体の各々が、実施例１０（しかし、これに限定されない）に記載した部位での天然にはコードされないアミノ酸置換を含む。これにより、２つのｈＧＨポリペプチド変異体がＳｉｔｅ  ＩＩ結合界面で物理的につなぎ合わされている、対応するｈＧＨポリペプチドホモ二量体を生が生じることになる。類似の手法で、ｈＧＨポリペプチドを１つ以上のポリペプチドとカップリングさせて、ヘテロ二量体、ホモ多量体またはヘテロ多量体を形成することができる。カップリング、精製および分析は、実施例３、６および７の場合のとおり行う。
【実施例１３】
【０５５７】
ＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’→ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’
Ａ                            Ｂ
ポリアルキレングリコール（Ｐ−ＯＨ）をハロゲン化アルキル（Ａ）と反応させて、エーテル（Ｂ）を形成する。これらの化合物において、ｎは、１から９の整数であり、およびＲ’は、直鎖または分枝鎖飽和または不飽和Ｃ１からＣ２０アルキルまたはヘテロアルキル基である。Ｒ’は、Ｃ３からＣ７飽和もしくは不飽和環状アルキルもしくは環状へテロアルキル、置換もしくは非置換アリールもしくはヘテロアリール基、または置換もしくは非置換アルカリール（このアルキルは、Ｃ１からＣ２０飽和もしくは不飽和アルキルである）もしくはヘテロアルカリール基であってもよい。典型的に、ＰＥＧ−ＯＨは、８００から４０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
【実施例１４】
【０５５８】
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
２０，０００Ｄａの分子を有するｍＰＥＧ−ＯＨ（ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０ｋＤａ；２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）を、ＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理した。キシレン中の８０重量％溶液として溶解した臭化プロパルギルの溶液（０．５６ｍＬ、５ｍｍｏｌ、５０当量、Ａｌｄｒｉｃｈ）および触媒量のＫＩを、次いで、この溶液に添加し、得られた混合物を加熱して２時間還流させた。この後、水（１ｍＬ）を添加し、真空下で溶媒を除去した。残留物にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、約２ｍＬに体積を減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をエーテル（１５０ｍＬ）に一滴ずつ直接添加した。生じた沈殿を回収し、数回分の冷ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させて、プロパルギル−Ｏ−ＰＥＧを得た。
【実施例１５】
【０５５９】
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ
２０，０００Ｄａの分子を有するｍＰＥＧ−ＯＨ（ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０ｋＤａ；２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）を、ＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理した。５０当量の５−ブロモ−１−ペンチン（０．５３ｍＬ、５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）および触媒量のＫＩを、この後、この混合物に添加した。得られた混合物を加熱して１６時間還流させた。この後、水（１ｍＬ）を添加し、真空下で溶媒を除去した。残留物にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、約２ｍＬに体積を減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に一滴ずつ直接添加した。生じた沈殿を回収し、数回分の冷ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させて、対応するアルキンを得た。５−クロロ−１−ペンチンを同様の反応に用いることができる。
【実施例１６】
【０５６０】
（１）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ＋ＮａＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＭｓＣｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（３）ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＬｉＢｒ→ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（４）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
ＴＨＦ（５０ｍＬ）および水（２．５ｍＬ）中の３−ヒドロキシベンジルアルコール（２．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液に、先ず、粉末水酸化ナトリウム（１．５ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）、次に、キシレン中の８０重量％溶液として溶解した臭化プロパルギルの溶液（３．３６ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を６時間、還流させながら加熱した。この混合物に１０％クエン酸（２．５ｍＬ）を添加し、真空下で溶媒を除去した。残留物を酢酸エチル（３ｘ１５ｍＬ）で抽出し、併せた有機層をＮａＣｌ飽和溶液（１０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、３−プロパルギルオキシベンジルアルコールを得た。
【０５６１】
塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、０℃でＣＨ２Ｃｌ２中の化合物３（２．０ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、この反応物を冷蔵庫内に１６時間置いた。通常の処理によって、このメシレートを淡黄色の油として得た。この油（２．４ｇ、９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を加熱して１時間還流させ、次いで、室温に冷却した。この混合物に水（２．５ｍＬ）を添加し、真空下で溶媒を除去した。この残留物を酢酸エチル（３ｘ１５ｍＬ）で抽出し、併せた有機層をＮａＣｌ飽和溶液（１０ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、所望の臭化物を得た。
【０５６２】
ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０ｋＤａ（１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、この溶液を氷浴で冷却した。ＮａＨ（６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を激しく攪拌しながら数分間かけて添加し、この後、上で得られた臭化物（２．５５ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）および触媒量のＫＩを添加した。冷却浴を取り外し、得られた混合物を加熱して１２時間還流させた。水（１．０ｍＬ）をこの混合物に添加し、真空下で溶媒を除去した。残留物にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、約２ｍＬに体積を減少させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）に一滴ずつ添加することによって、白色の沈殿を生じさせ、それを回収して、このＰＥＧ誘導体を得た。
【実施例１７】
【０５６３】
ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’
上に示したように、末端官能基を含有するポリ（エチレングリコール）ポリマーとアルキン官能基を含有する反応性分子とをカップリングさせることにより、末端アルキン含有ポリ（エチレングリコール）ポリマーも得ることができる。ｎは、１と１０の間である。Ｒ’は、Ｈであってもよいし、Ｃ１からＣ４の小さなアルキル基であってもよい。
【実施例１８】
【０５６４】
（１）ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ＋ＮＨＳ＋ＤＣＣ→ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
４−ペンチン酸（２．９４３ｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．８０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（４．６６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を一晩、室温で攪拌した。得られた粗製ＮＨＳエステル７を、さらに精製せずに後続の反応で使用した。
【０５６５】
５，０００Ｄａの分子量を有するｍＰＥＧ−ＮＨ２（ｍＰＥＧ−ＮＨ２、１ｇ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解し、この混合物を４℃に冷却した。ＮＨＳエステル７（４００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を激しく攪拌しながら少しずつ添加した。この混合物を３時間攪拌させておき、この間に室温に温めた。次いで、水（２ｍＬ）を添加し、真空下で溶媒を除去した。残留物にＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、約２ｍＬに体積を減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をエーテル（１５０ｍＬ）に一滴ずつ添加した。生じた沈殿を回収し、真空下で乾燥させた。
【実施例１９】
【０５６６】
この実施例は、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホニルエステル（これは、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホネートまたはメシレートと呼ぶこともできる）の調製を表すものである。対応するトシレートおよびハロゲン化物を同様の手順で調製することができる。
【０５６７】
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ＣＨ３ＳＯ２Ｃｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＳＯ２ＣＨ３→ｍＰＥＧ−Ｎ３
１５０ｍＬのトルエン中のｍＰＥＧ−ＯＨ（ＭＷ＝３，４００、２５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を窒素下で２時間、共沸蒸留し、この溶液を室温に冷却した。４０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２および２．１ｍＬの乾燥トリエチルアミン（１５ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加した。この溶液を氷浴で冷却し、１．２ｍＬの蒸留塩化メタンスルホニル（１５ｍｍｏｌ）を一滴ずつ添加した。この溶液を室温、窒素下で一晩攪拌し、２ｍＬの無水エタノールの添加により反応を停止させた。この混合物を真空下で蒸発させて溶媒、主としてトルエン以外のもの、を除去し、濾過し、再び真空下で濃縮し、この後、１００ｍＬのジエチルエーテル中に沈殿させた。濾液を数回分の冷ジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥させて、このメシレートを得た。
【０５６８】
このメシレート（２０ｇ、８ｍｍｏｌ）を７５ｍＬのＴＨＦに溶解し、この溶液を４℃に冷却した。この冷却溶液にアジ化ナトリウム（１．５６ｇ、２４ｍｍｏｌ）を添加した。この反応物を加熱して窒素下で２時間還流させた。この後、溶媒を蒸発させ、残留物をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈した。有機画分をＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。２０ｍＬに体積を減少させ、この生成物を１５０ｍＬの冷乾燥エーテルへの添加により沈殿させた。
【実施例２０】
【０５６９】
（１）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ２Ｈ→Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ
（２）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ→Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
（３）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
４−アジドベンジルアルコールは、米国特許第５，９９８，９９５号（これは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている方法を使用して製造することができる。塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、０℃でＣＨ２Ｃｌ２中の４−アジドベンジルアルコール（１．７５ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、この反応物を冷蔵庫内に１６時間置いた。通常の処理によりこのメシレートを淡黄色の油として得た。この油（９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を加熱して１時間還流させ、この後、室温に冷却した。この混合物に水（２．５ｍＬ）を添加し、真空下で溶媒を除去した。残留物を酢酸エチル（３ｘ１５ｍＬ）で抽出し、併せた有機層をＮａＣｌ飽和溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、所望の臭化物を得た。
【０５７０】
ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０ｋＤａ（２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）で処理し、臭化物（３．３２ｇ、１５ｍｍｏｌ）を触媒量のＫＩと共にこの混合物に添加した。得られた混合物を加熱して１２時間還流させた。水（１．０ｍＬ）をこの混合物に添加し、真空下で溶媒を除去した。残留物にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、約２ｍＬに体積を減少させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）に一滴ずつ添加することによって、沈殿を生じさせ、これを回収して、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３を得た。
【実施例２１】
【０５７１】
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ  ＋  Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２−ＮＨＳ→Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ（ＭＷ３，４００Ｄａ、２．０ｇ）をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（１０ｍＬ）に溶解し、この溶液を０℃に冷却した。プロピオン酸３−アジド−１−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５当量）を激しく攪拌しながら添加した。３時間後、２０ｍＬのＨ２Ｏを添加し、この混合物をさらに４５分間、室温で攪拌した。０．５ＮのＮａ２ＳＯ４でこのｐＨを３に調整し、ＮａＣｌを約１５重量％の濃度になるまで添加した。この反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬｘ３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。冷ジエチルエーテルで沈殿させた後、生成物を濾過によって回収し、真空下で乾燥させて、オメガ−カルボキシ−アジドＰＥＧ誘導体を得た。
【実施例２２】
【０５７２】
ｍＰＥＧ−ＯＭｓ＋ＨＣ≡ＣＬｉ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−Ｈ
当該技術分野において公知であるように調製し、ＴＨＦ中で−７８℃に冷却したリチウムアセチリド（４当量）の溶液に、ＴＨＦに溶解したｍＰＥＧ−ＯＭｓの溶液を、激しく攪拌しながら一滴ずつ添加した。３時間後、この反応物を放置して室温に温め、１ｍＬのブタノールの添加により反応を停止させた。次いで、２０ｍＬのＨ２Ｏを添加し、この混合物をさらに４５分間、室温で攪拌した。０．５ＮのＨ２ＳＯ４でこのｐＨを３に調整し、約１５重量％の濃度になるまでＮａＣｌを添加した。この反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬｘ３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。冷ジエチルエーテルで沈殿させた後、生成物を濾過によって回収し、真空下で乾燥させて、１−（ブト−３−イニルオキシ）−メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を得た。
【実施例２３】
【０５７３】
Ｌ．Ｗａｎｇら、（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−７（２００３））；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら、（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら、（２００２），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４：およびＬ．Ｗａｎｇ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０を使用して、アジド含有およびアセチレン含有アミノ酸をタンパク質に部位特異的に組み込んだ。アミノ酸を組み込んだら、リン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ８）中、２ｍＭ  ＰＥＧ誘導体、１ｍＭ  ＣｕＳＯ４、および〜１ｍｇ  Ｃｕ線の存在下、３７℃で４時間、付加環化反応を行った。
【実施例２４】
【０５７４】
この実施例では、ｐ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＦ）およびｍ−ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン誘導体の合成を説明する。
【０５７５】
Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ａ．Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｃｈｏ，Ｃ．＆Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００３）４２，６７３５−６７４６に以前に記載された手順を用いて、ラセミｐＡＦを合成した。
【０５７６】
ｍ−ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン誘導体を合成するために、以下の手順を完了した。室温（ＲＴ）で１時間攪拌した、ジクロロメタン（ＤＣＭ、７０ｍＬ）中の（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノオキシ）酢酸（０．３８２ｇ、２．０ｍｍｏｌ）および１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（０．１６ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液に、メトキシ−ポリエチレングリコールアミン（ｍ−ＰＥＧ−ＮＨ２、７．５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、Ｂｉｏ  ＶｅｃｔｒａからのＭｔ．３０Ｋ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．１ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を添加した。この反応物を室温で４８時間攪拌し、この後、約１００ｍＬに濃縮した。この混合物を冷エーテル（８００ｍＬ）に一滴ずつ添加した。ｔ−Ｂｏｃ保護生成物が沈殿し、それを濾過により回収し、エーテル  ３ｘ１００ｍＬにより洗浄した。ＤＣＭ（１００ｍＬ）での再溶解およびエーテル（８００ｍＬ）中での沈殿、２回により、それをさらに精製した。この生成物を真空下で乾燥させることにより、７．２ｇ（９６％）を生じた（ＮＭＲおよびＮｉｈｄｒｉｎ試験により確認）。
【０５７７】
上で得られた保護生成物の（７．０ｇ）の脱Ｂｏｃを、５０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（４０ｍＬ）中、０℃で１時間、次いで、室温で１．５時間行った。真空下で大部分のＴＦＡを除去した後、残留物へのジオキサン中４ＮのＨＣｌ（１ｍＬ）の添加により、このヒドロキシルアミン誘導体のＴＦＡ塩をＨＣｌ塩の転化させた。沈殿をＤＭＳ（５０ｍＬ）に溶解し、エーテル（８００ｍＬ）に再び溶解した。最終生成物（６．８ｇ、９７％）を濾過によって回収し、エーテル  ３ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させ、窒素下で保管した。他のＰＥＧ（５Ｋ、２０Ｋ）ヒドロキシルアミン誘導体は、同じ手順を用いて合成した。
【実施例２５】
【０５７８】
この実施例では、天然でないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドに使用する発現および精製方法を説明する。宿主細胞を直交性ｔＲＮＡ、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、およびｈＧＨ構築物で形質転換されている。
【０５７９】
形質転換ＤＨ１０Ｂ（ｆｉｓ３）細胞の冷凍グリセロールストックの少量（ｓｍａｌｌ  ｓｔａｂ）を、先ず、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有する２ｍＬの合成培地（ロイシン、イソロイシン、微量金属およびビタミンを補足したグルコース最小培地）中、３７℃で増殖させた。ＯＤ６００が、２から５に達したら、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有する６０μＬを６０ｍＬの新たな合成培地に移し、２から５のＯＤ６００まで３７℃で再び増殖させた。この培養物の５０ｍＬを、５リットル発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＢＩ）内の１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有する２リットルの合成培地に移した。発酵槽のｐＨは、炭酸カリウムで６．９に制御し、温度は３７℃に制御し、空気流量は５Ｌｐｍに制御し、およびポリアルキレン脱泡剤ＫＦＯ  Ｆ１１９（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ）で泡を制御した。攪拌速度は、溶解酸素レベル≧３０％を維持するように自動調整し、攪拌速度が最大値に達したら、純粋な酸素を使用して、空気のスパージングを補足した。３７℃で８時間後、培養物に５０Ｘ濃度の合成培地を指数増加速度で供給して、０．１５時間−１の比増殖速度を維持した。ＯＤ６００が、１００に達したら、パラ−アセチル−フェニルアラニンのラセミ混合物を３．３ｍＭの最終濃度になるまで添加し、温度を２８℃に下げた。０．７５時間後、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを０．２５ｍＭの最終濃度になるまで添加した。細胞をさらに８時間、２８℃で増殖させ、ペレット化し、さらなる処理まで−８０℃で保管した。
【０５８０】
Ｈｉｓ標識突然へにｈＧＨタンパク質は、ＰｒｏＢｏｎｄ  Ｎｉｃｋｅｌ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇａｎのインストラクションマニュアルにより提供された標準的なＨｉｓ標識タンパク質精製手順により精製し、この後、アニオン交換カラムを使用して精製した。
【０５８１】
精製したｈＧＨを８ｍｇ／ｍＬに濃縮し、緩衝液を反応緩衝液（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ４．０）に交換した。ＭＰＥＧ−Ｏｘｙａｍｉｎｅ粉末を、このｈＧＨ溶液に、２０：１のＰＥＧ：ｈＧＨモル比で添加した。穏やかに攪拌しながら、２８℃で２日間、反応を行った。このＰＥＧ−ｈＧＨを、アニオン交換カラムにより、未反応ＰＥＧおよびｈＧＨから精製した。
【０５８２】
動物実験に入る前に、各ＰＥＧ化突然変異ｈＧＨの量を３回のアッセイにより評価した。ＰＥＧ−ｈＧＨの純度は、非還元条件下でＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファを用いて４から１２％アクリルアミドＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルをランすることにより検査した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。クマシーブルーでゲルを染色した。ＰＥＧ−ｈＧＨバンドは、比重走査を基に９５％より高い純度であった。各ＰＥＧ−ｈＧＨにおける内毒素レベルは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州、ウィルミントン）からのＫＴＡ２キットを使用する反応速度ＬＡＬアッセイにより検査し、１用量あたり５ＥＵ未満であった。ＰＥＧ−ｈＧＨの生物活性を（実施例２で述べた）ＩＭ−９  ｐＳＴＡＴ５バイオアッセイで評価し、ＥＣ５０値は、１５ｎＭ未満であった。
【実施例２６】
【０５８３】
この実施例では、天然でないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの精製および均質性を評価する方法を説明する。
【０５８４】
図８は、位置９２に天然でないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。このゲルのレーン３、４および５は、５ｋＤａ、２０ｋＤａまたは３０ｋＤａいずれかのＰＥＧ分子に共有結合により連結している位置９２のｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨを示すものである。ＰＥＧ化されている天然でないアミノ酸を含むさらなるｈＧＨポリペプチドを図１１に示す。核ＰＥＧ−ｈＧＨタンパク質の５μｇを各ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した。図１１、パネルＡ：レーン１、分子量マーカー；レーン２、ＷＨＯ  ｒｈＧＨ参照標準物質（２μｇ）；レーン３および７、３０ＫＰＥＧ−Ｆ９２ｐＡＦ；レーン４、３０ＫＰＥＧ−Ｙ３５ｐＡＦ；レーン５、３０ＫＰＥＧ−Ｒ１３４ｐＡＦ；レーン６、２０ＫＰＥＧ−Ｒ１３４ｐＡＦ；レーン８、ＷＨＯ  ｒｈＧＨ参照標準物質（２０μｇ）。図１１、パネルＢ：レーン９、分子量マーカー、レーン１０、ＷＨＯ  ｒｈＧＨ参照標準物質（２μｇ）；レーン１１、３０ＫＰＥＧ−Ｆ９２ｐＡＦ；レーン１２、３０ＫＰＥＧ−Ｋ１４５ｐＡＦ；レーン１３、３０ＫＰＥＧ−Ｙ１４３ｐＡＦ；レーン１４、３０ＫＰＥＧ−Ｇ１３１ｐＡＦ；レーン１５、３０ＫＰＥＧ−Ｆ９２ｐＡＦ／Ｇ１２０Ｒ、およびレーン１６  ＷＨＯ  ｒｈＧＨ参照標準物質（２０μｇ）。図９は、ＩＭ−９細胞におけるＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチド（５ｋＤａ、２０ｋＤａ、または３０ｋＤａ  ＰＥＧ）の生物活性を示すものであり、方法は、実施例２において説明したとおり行った。
【０５８５】
ｈＧＨ−ＰＥＧコンジュゲートの純度は、タンパク質溶解性分解（トリプシン分解を含むが、これに限定されない）、続く質量スペクトル分析により評価することができる。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  Ｂ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９７（３）：１０５９−６６（２００１）。トリプシン消化を行うための方法は、ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（２００２）第四版，ｐｐ．１９３８）にも記載されている。記載されているこれらの方法への修正を行った。サンプルを、一晩、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で透析した。ｒｈＧＨポリペプチドを、３７℃の水浴内で４時間、６６：１の質量比でトリプシン（ＴＰＣＫ処理トリプシン、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）と共にインキュベートした。これらのサンプルを数分間、氷上でインキュベートして、消化反応を停止させ、この後、ＨＰＬＣ分析の間は４℃に保った。０．１％トリフルオロ酢酸中、消化サンプル（〜２００μｇ）を、２５  ｘ  ０．４６ｃｍ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ−８カラム（５μＭ  ビーズサイズ、１００Å  細孔サイズ）に負荷し、３０℃、１ｍＬ／分の流量で、７０分にわたって０から８０％アセトニトリルの勾配で溶離した。トリプシンペプチドの溶離は、２１４ｎｍでの吸光度によりモニターした。
【０５８６】
図１０、パネルＡは、ｈＧＨの一次構造を描いたものであり、トリプシン分解部位を指摘し、ならびに天然でないアミノ酸置換、Ｆ９２ｐＡＦを矢印で指定している（  Ｂｅｃｋｅｒら  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１０（４）：３２６−３３７からのものを修正した図）。パネルＢは、ＰＥＧ化されている天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドから生じさせたペプチド（３０Ｋ  ＰＥＧ  Ｈｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ  ｒｈＧＨ、Ａと標識してあるもの）、天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドから生じさせたペプチド（Ｈｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ  ｒｈＧＨ、Ｂと標識してあるもの）、および野生型ｈＧＨから生じさせたペプチド（ＷＨＯ  ｒｈＧＨ、Ｃと標識してあるもの）の重ね合わせマップを示すものである。ＷＨＯ  ｒｈＧＨのトリプシンマップとＨｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ  ｒｈＧＨのトリプシンマップの比較は、２つのピーク（ペプチドピーク１およびペプチドピーク９）のみがシフトしており、残りのピークは同じであることを示す。これらの違いは、ピーク１のシフトを生じさせる、発現されたＨｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ  ｒｈＧＨのＮ末端上のＨｉｓ６の付加に起因しており、これに対して、ピーク９におけるシフトは、残基９２のフェニルアラニンのｐ−アセチル−フェニルアラニンでの置換により生じる。パネルＣ  −  パネルＢからのピーク９の拡大図を示す。Ｈｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ  ｒｈＧＨトリプシンマップと３０Ｋ  ＰＥＧＨｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ  ｒｈＧＨトリプシンマップの比較は、Ｈｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ  ｒｈＧＨがＰＥＧ化するとピーク９が消えることを示し、従って、修飾がペプチド９に特異的であることが確認される。
【実施例２７】
【０５８７】
この実施例では、各々が天然でないアミノ酸を含む２つのｈＧＨポリペプチドから成るホモ二量体を説明する。
【０５８８】
図１２は、位置９２でのｐ−アセチル−フェニルアラニン置換を含むＨｉｓ標識ｈＧＨポリペプチドからのＩＭ−９アッセイ結果と、ｈＧＨのＰＥＧ化について実施例２５で説明したような官能基および反応性を有する二官能性のリンカーをでつなぎ合わされたこの修飾されたポリペプチドからのＩＭ−９アッセイ結果とを比較するものである。
【実施例２８】
【０５８９】
この実施例では、ｈＧＨ拮抗薬として作用する単量体および二量体ｈＧＨポリペプチドを説明する。
【０５９０】
Ｇ１２０Ｒ置換がＳｉｔｅ  ＩＩに導入されたｈＧＨ突然変異タンパク質は、単一のｈＧＨ受容体に結合することができるが、２つの受容体を二量体化することはできない。この突然変異タンパク質は、おそらく細胞内シグナル伝達経路を活性化することなく受容体部位を占有することにより、インビトロでｈＧＨ拮抗薬として作用する（Ｆｕｈ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１６７７−１６８０（１９９２））。図１３、パネルＡは、Ｇ１２０Ｒ置換を有するｈＧＨによるｐＳＴＡＴ５のリン酸化を測るＩＭ−９アッセイデータを示すものである。同じ位置（Ｇ１２０）に天然でないアミノ酸が組み込まれたｈＧＨポリペプチドは、図１３、パネルＢに示すように、ｈＧＨ拮抗薬としても作用する分子を生じさせた。図１３、パネルＢに示すｈＧＨ拮抗薬の二量体は、ｈＧＨのＰＥＧ化について実施例２５で説明したような官能基および活性を有する二官能性のリンカーでつなぎ合わせることにより構築した。図１４は、このダイマーも、ＩＭ−９アッセイにおいて生物活性を欠くことを示すものである。
【０５９１】
Ｇ１２０ｐＡＦ置換を含むｈＧＨポリペプチドと、ＰＥＧリンカーによりつなぎ合わされたＧ１２０ｐＡＦ修飾ｈＧＨポリペプチドの二量体とを比較する追加アッセイを行った。ＳＴＡＴ５のリン酸化を導入したＷＨＯ  ｈＧＨを、この単量体およびＰＥＧリンカーによりつなぎ合わされた二量体の用量応答曲線と比較した。表面受容体競合試験も行い、これは、この単量体および二量体が、ＩＭ−９およびラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）／ＢＡＦ３細胞上の細胞表面受容体結合についてＧＨと競合することを示した。二量体は、単量体より強力な拮抗薬として作用した。表４は、これらの試験からのデータを示すものである。
【０５９２】
【表６】
2007519420.tif 000033
2007519420.tif 000034
【実施例２９】
【０５９３】
この実施例では、ｈＧＨ活性およびｈＧＨポリペプチドのｈＧＨ受容体に対する親和性の測定を詳述する。
【０５９４】
ラットＧＨ受容体のクローニングおよび精製  ラットＧＨ受容体の細胞外ドメイン（ＧＨＲ  ＥＣＤ、アミノ酸Ｓ２９−Ｔ２３８）を、Ｃ末端６Ｈｉｓタグを有するフレーム内のＮｄｅ  Ｉ部位とＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位の間のｐＥＴ２０ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。Ｌ４３からＲへの突然変異を導入して、ヒトＧＨ受容体結合部位にさらに近づけた（Ｓｏｕｚａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．（１９９５）９２（４）：９５９−６３）。３０℃で４から５時間、０．４ｍＭ  ＩＰＴＧと共にインキュベートすることにより、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）において組換えタンパク質を生産させた。これらの細胞を溶解した後、このペレットを、ダンスにおいて懸濁させることにより、３０ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で４回、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含まない同緩衝液で２回洗浄した。この時点で、封入体は、９５％より多くのＧＨＲ  ＥＣＤから成り、これらを０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ１１．５）、２Ｍ  尿素中で可溶化した。この封入体溶液のアリコートを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、１Ｍ  Ｌ−アルギニン、３．７ｍＭ  シスタミン、６．５ｍＭ  システアミンで平衡させたＳ１００（Ｓｉｇｍａ）ゲル濾過カラムに通すことにより、リフォールディングを遂行した。可溶性タンパク質を含有する画分を併せ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロールに対して透析した。このサンプルを短時間、遠心分離して、一切の沈殿を除去し、Ｔａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のアリコートと共に、製造業者のインストラクションに従ってインキュベートした。５ｍＭ  イミダゾールを補足した２０容量の透析緩衝液でこの樹脂を洗浄した後、透析緩衝液中の１２０ｍＭ  イミダゾールでタンパク質を溶離した。最後に、サンプルを、一晩、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロールに対して透析し、短時間、遠心分離して一切の沈殿を除去し、２０％グリセロール最終濃度に調整し、アリコートにして、−８０℃で保管した。ε＝６５，７００Ｍ−１＊ｃｍ−１の計算吸光係数を使用してＯＤ（２８０）によりこのタンパク質の濃度を測定した。
【０５９５】
ＧＨのＧＨＲに対する結合のＢｉｏｃｏｒｅ（商標）分析
製造業者により推奨されているような標準的なアミンカップリング手順を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）で、可溶性ＧＨＲ  ＥＣＤの約６００から８００ＲＵを固定化した。たとえ受容体の優位な部分が、この技法により不活性化されたとしても、このレベルの不動化は、結合反応速度を顕著に変化させることなく約１００から１５０ＲＵの最大特異的ＧＨ結合応答を生じさせるために十分であることが判明した。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９３）２３４（３）：５５４−６３およびＷｅｌｌｓ  ＪＡ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９６）９３（１）：１−６）参照。
【０５９６】
ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中の様々な濃度の野生型または突然変異ＧＨ（０．１から３００ｎＭ）を、４０μＬ／分の流量で４から５分間、ＧＨＲ表面に注入し、注入後１５分間、解離をモニターした。１５秒パルスの４．５Ｍ  ＭｇＣｌ２により、この表面を再生した。少なくとも１００の再生サイクル後、結合親和性の最小損失（１から５％）しか観察されなかった。固定化された受容体がない参照細胞を用いて、一切の緩衝液バルク効果および非特異的結合を減算した。
【０５９７】
ＧＨ滴定試験から得られた結合反応速度データをＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウェア（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））で処理した。「Ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎａｌｙｔｅ」会合モデルは、提案された経時的１：２（ＧＨ：ＧＨＲ）二量体化と一致する、申し分のないフィット（一般には３未満のカイ二乗値）を提示した（Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ（１９９６）９３（１）：１−６）。平衡解離定数（Ｋｄ）は、個々の速度定数の比（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）として計算した。
【０５９８】
表５は、ＣＭ５チップ上に固定化したラットＧＨＲ  ＥＣＤ（Ｌ４３Ｒ）を使用したときのＢｉａｃｏｒｅ（商標）からの結合パラメータを示すものである。
【０５９９】
【表７】
2007519420.tif 000035
2007519420.tif 000036
【０６００】
ＣＨＲ安定細胞系
ＲＰＭＩ  １６４０、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、５０ｕＭ  ２−メルカプトエタノール、およびＩＬ−３源として１０％ＷＥＨＩ−３細胞系調整培地中で、ＩＬ−３依存性マウス細胞系、ＢＡＦ３を型どおり継代させた。すべての細胞培養物は、５％  ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で維持した。
【０６０１】
ＢＡＦ３細胞系を使用して、ラットＧＨＲ（Ｌ４３）安定細胞クローン、２Ｅ２−２Ｂ１２−Ｆ４を樹立した。簡単に言うと、１Ｘ１０７中等度集密ＢＡＦ３細胞を、完全長ラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）ｃＤＮＡを含有する１５ｕｇの線状ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドとともにエレクトロポレーションに付した。トランスフェクトされた細胞を放置して、４８時間回復させた後、８００ｕｇ／ｍＬ  Ｇ４１８および５ｎＭ  ＷＨＯ  ｈＧＨを含有する培地中で限界希釈法によりクローニングした。ヒトＧＨＲ（ミネソタ州、ミネアポリスのＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する抗体での表面染色により、ＧＨ発現トランスフェクタントを特定し、ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ（カリフォルニア州、サンディエゴのＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。良好なレベルのＧＨＲを発現しているトランスフェクタントを、次いで、（下で説明するような）ＢｒｄＵ増殖アッセイで、ＷＨＯ  ｈＧＨに対する増殖活性についてスクリーニングした。表面受容体発現および増殖能力について常にプロフィールしながら、１．２ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８および５ｎＭ  ｈＧＨの存在下での所望のトランスフェクタントのサブクローニングをさらに２ラウンド繰り返すことにより、安定にトランスフェクトされたラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）細胞クローンを樹立した。このようにして樹立した細胞クローン、２Ｅ２−２Ｂ１２−Ｆ４を、ｈＧＨが不在の状態でＢＡＦ３培地＋１．２ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８中で型どおり維持した。
【０６０２】
ＢｒｄＵ標識による増殖
血清飢餓状態のラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）発現ＢＡＦ３細胞系、２Ｅ２−２Ｂ１２−Ｆ４を、９６ウエルプレート内、細胞数５Ｘ１０４／ウエルの密度でプレーティングした。１２点容量範囲のｈＧＨタンパク質で細胞を活性化すると同時に、５０ｕＭ  ＢｒｄＵ（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）で標識した。培養状態で４８時間後、細胞を、１００ｕＬのＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３０分間、室温で、固定／透過性化した。ＢｒｄＵエピトープを露出するために、固定／透過性化した細胞を、３０ｕｇ／ウエルのＤＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ）で１時間、３７℃で処理した。ＡＰＣコンジュゲート型抗ＢｒｄＵ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での免疫蛍光染色により、ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙでサンプルを分析できるようになった。
【０６０３】
表６は、ｐＳＴＡＴ５（ＩＭ−９）およびＢｒｄＵ増殖アッセイでプロフィールしたＰＥＧ  ｈＧＨ突然変異体の生体活性を示すものである。
【０６０４】
【表８】
2007519420.tif 000037
【実施例３０】
【０６０５】
この実施例では、ＰＥＧ化ｈＧＨのインビトロおよびインビボ活性を測定する方法を説明する。
【０６０６】
細胞結合アッセイ
細胞（３ｘ１０６）を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１００μＬ）中、様々な濃度（体積：１０μＬ）の非標識ＧＨ、ｈＧＨまたはＧＭ−ＣＳＦの不在または存在下、および１２５Ｉ−ＧＨの存在下、０℃で、９０分間、二重重複でインキュベートする。次に、３５０μＬ遠心分離管内で、２００μＬの氷冷ＦＣＳを用いて細胞を浮遊させ、層化し、遠心分離（１０００ｇ；１分）する。この管の端を切断することによりペレットを回収し、ガンマカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ）でペレットおよび上清を別々にカウントする。
【０６０７】
特異的結合（ｃｐｍ）は、競合物質（二重重複の平均）マイナス結合（ｃｐｍ）の不在下、１００倍過剰の非標識ＧＨ（非特異的結合）の存在下での全結合として決定する。非特異的結合を各細胞タイプについて測定する。実験は、１２５Ｉ−ＧＨの同じ調製物を使用して別の日に行う。１２５Ｉ−ＧＨは、ＧＨ受容体生産細胞への結合を示す。この結合は、非標識天然ＧＨまたはｈＧＨにより用量依存的に阻害されるが、ＧＭ−ＣＳＦおよび負の対照によっては阻害されない。天然ＧＨに類似した天然１２５Ｉ−ＧＨの結合について競合するｈＧＨのこの能力は、これらの受容体が、両方の形態を等しく十分に認識することを示唆している。
【０６０８】
ＰＥＧ化ｈＧＨのインビボ試験
ＰＥＧ−ｈＧＨ、未修飾ｈＧＨおよび緩衝溶液をマウスまたはラットに投与する。結果は、未修飾ｈＧＨと比較して本発明のＰＥＧ化ｈＧＨの勝った活性および延長された半減期を示すであろう（これは、有意な体重増加によって示される）。
【０６０９】
コンジュゲートしたおよびコンジュゲートしていないｈＧＨおよびこれらの変異体のインビボ半減期の測定
すべての動物実験は、セントルイス大学の施設内動物管理使用委員会（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により承認されたプロトコルのもと、ＡＡＡＬＡＣ認証施設内で行った。１２時間昼夜サイクルの室内のケージにラットを個別に収容した。動物は、認定Ｐｕｒｉｎａ  ｒｏｄｅｎｔ  ｃｈｏｗ  ５００１および水に任意に接近できるようにした。下垂体を切除したラット用の飲料水は、５％グルコースを追加で含むものであった。
【０６１０】
薬物動態試験
動物実験に入る前に、各ＰＥＧ化突然変異ｈＧＨの量を３つのアッセイにより評価した。ＰＥＧ−ｈＧＨの純度は、非還元条件下でＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファを用いて４から１２％アクリルアミドＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルをランすることにより検査した（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。クマシーブルーでゲルを染色した。ＰＥＧ−ｈＧＨバンドは、比重走査を基に９５％より高い純度であった。各ＰＥＧ−ｈＧＨにおける内毒素レベルは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州、ウィルミントン）からのＫＴＡ２キットを使用する反応速度ＬＡＬアッセイにより検査し、１用量あたり５ＥＵ未満であった。ＰＥＧ−ｈＧＨの生物活性を（実施例２で述べた）ＩＭ−９  ｐＳＴＡＴ５バイオアッセイで評価し、ＥＣ５０値は、１５ｎＭ未満であることが確認された。
【０６１１】
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２６１から４２５ｇ）において、ＰＥＧで修飾された成長ホルモン化合物の薬物動態特性を、互いに、および非ＥＰＧ化成長ホルモンと比較した。首尾よくカテーテルを取り付けた後、動物を投薬前に治療グループ（１グループにつき３から６匹）に割り付けた。１ｍｇ／ｋｇの化合物を０．４１から０．５５ｍＬ／ｋｇの投薬量で動物に皮下投与した。留置カテーテルにより様々な時点で血液サンプルを回収し、ＥＤＴＡ被覆遠心分離管に入れた。遠心分離後、血漿を回収し、分析するまで−８０℃で保管した。化合物濃度は、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（カリフォルニア州、カマリロ）またはＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（テキサス州、ウエブスター）いずれかからの抗体サンドイッチ型成長ホルモンＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。投薬した類似体に対応する標準物質を使用して濃度を計算した。薬物動態パラメータは、モデリングプログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、バージョン４．１）を使用して概算した。線形上昇／対数下降の台形関数での非区画分析を使用し、濃度データに均一に重み付けした。
【０６１２】
図１５は、ラットにおける１回の皮下投与後の平均（＋／−Ｓ．Ｄ．）血漿濃度を示すものである。ラット（グループあたり、ｎ＝３から４）に、１ｍｇ／ｋｇのｈＧＨ野生型タンパク質（ＷＨＯ  ｈＧＨ）、Ｈｉｓ標識ｈＧＨポリペプチド（ｈｉｓ−ｈＧＨ）、または３０ｋＤａ  ＰＥＧに共有結合により連結している位置９２の天然でないアミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むＨｉｓ標識ｈＧＨポリペプチド（３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９２（ｈｉｓ）ｈＧＨ）のボーラス１回量を与えた。血漿サンプルを示されている時間間隔で採取し、記載されている注入化合物についてアッセイした。３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９２（ｈｉｓ）ｈＧＨは、対照ｈＧＨと比較して劇的に延長された循環時間を有した。
【０６１３】
図１６は、ラットにおける１回の皮下投与後の平均（＋／−Ｓ．Ｄ．）血漿濃度を示すものである。ラット（グループあたり、ｎ＝３から６）に、１ｍｇ／ｋｇのタンパク質をボーラス１回量を与えた。６つの異なる位置各々で３０ｋＤａ  ＰＥＧに共有結合により連結している天然でないアミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨポリペプチドを、ＷＨＯ  ｈＧＨおよび（ｈｉｓ）−ｈＧＨと比較した。血漿サンプルを示されている時間間隔で採取し、記載されている注入化合物についてアッセイした。図７は、図１６に示したｈＧＨポリペプチドの１回量投与についての薬物動態パラメータを示すものである。濃度対時間曲線を非区画分析（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、バージョン４．１）により評価した。示されている値は、平均（＋／−標準偏差）である。Ｃｍａｘ：最大濃度；終末ｔ１／２：終末半減期；ＡＵＣ０→ｉｎｆ：無限大に外挿される濃度−時間曲線の曲線下面積；ＭＲＴ：平均滞留時間；Ｃ１／ｆ：見掛けの全血漿クリアランス；Ｖｚ／ｆ：終末基の間の見掛けの分布容積。
【０６１４】
【表９】
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【０６１５】
薬力学的試験
下垂体を切除した雄Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。下垂体は、週齢３から４週で手術により除去された。動物を３週の期間にわたって順化させ、この間の体重をモニターした。この試験の開始前の７日の期間に体重が０から８ｇ増えた動物は、組み入れ、治療グループにランダムに割り付けた。ラットにボーラス量または１日量を皮下投与した。この試験を通して、ラットを毎日、順次、計量し、麻酔、瀉血し、投薬した（適用可能な場合）。ヘパリンで処理した毛細管を使用して眼窩から血液を採取し、ＥＤＴＡ被覆遠心分離管に入れた。遠心分離により血漿を単離し、分析するまで−８０℃で保管した。
【０６１６】
図１７は、ラットにおける１回の皮下投与後の平均（＋／−Ｓ．Ｄ．）血漿濃度を示すものである。ラット（グループあたり、ｎ＝５から７）に、２．１ｍｇ／ｋｇのタンパク質をボーラス１回量を与えた。２つの異なる位置（位置３５、９２）で３０ｋＤａ  ＰＥＧに共有結合により連結している天然でないアミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨポリペプチドからの結果を示す。血漿サンプルを示されている時間間隔で採取し、記載されている注入化合物についてアッセイした。
【０６１７】
ペプチドＩＧＦ−１は、ソマトメジンまたはインスリン様成長因子のファミリーの１メンバーである。ＩＧＦ−１は、成長ホルモンの成長促進効果の多くを媒介する。規定ラット／マウスＩＧＦ−１標準物質（Ｄｉａｇｎｏｓｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対する競合結合酵素イムノアッセイキットを使用して、ＩＧＦ−１濃度を測定した。両側分布、対応なし、等分散を用いるｔ検定により有意差を決定した。図１８、パネルＡは、下垂体を切除したラットにおける化合物の評価を示すものである。ラット（１グループあたりｎ＝５から７）に１回量または１日量を皮下投与した。動物を、毎日、順次、計量し、麻酔し、瀉血し、投薬した（適用可能な場合）。プラシーボ治療、野生型ｈＧＨ（ｈＧＨ）、Ｈｉｓ標識ｈＧＨ（（ｈｉｓ）ｈＧＨ）、および位置３５および９２で３０ｋＤａ  ＰＥＧに共有結合により連結しているｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨポリペプチドについての体重の結果を示す。図１８、パネルＢ  −  ＰＥＧ化されている天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの１回量の投与後の循環血清ＩＧＦ−１レベルに対する効果を示す図である。図１８、パネルＡにおいて、３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ３５（ｈｉｓ）ｈＧＨ化合物についての９日目の体重増加が、３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９２（ｈｉｓ）ｈＧＨ化合物と統計学的に異なっており（ｐ＜０．０００５）、より大きな体重増加が観察された。
【０６１８】
図１８、パネルＣは、下垂体を切除した（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅｃｔｏｍｉｚｅｄ）ラットにおける化合物の評価を示すものである。ラット（１グループあたりｎ＝１１）に１回量または１日量を皮下投与した。動物を、毎日、順次、計量し、麻酔し、瀉血し、投薬した（適用可能な場合）。プラシーボ治療、野生型ｈＧＨ（ｈＧＨ）、および位置９２、１３４、１４５、１３１および１４３で３０ｋＤａ  ＰＥＧに共有結合により連結しているｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨポリペプチドについての体重の結果を示す。図１８、パネルＤ  −  プラシーボ治療および野生型ｈＧＨと比較して、ＰＥＧ化されている（位置９２、１３４、１４５、１３１、１４３）天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの１回量の投与後の循環血清ＩＧＦ−１レベルに対する効果を示す図である。図１８、パネルＥは、ＰＥＧ化されている（位置９２、１３４、１４５、１３１、１４３）天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドに対応する平均（＋／−Ｓ．Ｄ．）血漿濃度を示すものである。血漿サンプルを示されている時間間隔で採取し、記載されている注入化合物についてアッセイした。棒は、標準偏差を表す。
【実施例３１】
【０６１９】
天然にはコードされないアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨの安全性および／または有効度のヒト臨床試験
目的    皮下投与される、天然にはコードされないアミノ酸を含むＰＥＧ化組換えヒトｈＧＨの安全性および薬物動態を、市販のｈＧＨ製品（Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）およびＳａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ））の１つ以上と比較すること。
【０６２０】
患者    年齢範囲２０から４０の間、体重６０から９０ｋｇの間の健康な１８人のボランティアが、この試験に登録した。被験者は、血液学または血清化学に関する臨床的に有意な異常検査値、ならびに負の尿毒素スクリーニング、ＨＩＶスクリーニングおよびＢ型肝炎抗原を有さないであろう。彼らは、以下のいかなる証拠も有してはならない：高血圧；あらゆる原発性血液疾患の履歴；有意な肝臓病、腎臓病、心血管疾患、胃腸疾患、尿生殖器疾患、代謝性疾患、神経疾患の履歴；貧血または発作疾患の履歴；細菌もしくは哺乳動物由来の製品、ＰＥＧまたはヒト血清アルブミンに対する既知感受性；カフェイン含有飲料の常用者および大量消費者；いずれかの他の臨床試験への参加、または試験開始の３０日以内に輸血または血液供与を受けている；試験開始の３ヶ月以内にｈＧＨに暴露されている；試験開始の７日以内に病気にかかっている；ならびに試験開始の１４日以内に試験前身体検査または臨床試験評価で有意な異常を有する。すべての被検は、安全性について評価することができ、薬物動態分析のためのすべての血液採取は、計画されたとおり採取する。すべての試験は、施設内倫理委員会の承認および患者の同意をもって行う。
【０６２１】
試験計画    これは、健康な男性ボランティアにおけるＩ相、一施設、非盲検、無作為化、二点交叉試験となる。１８人の被験者を２つの治療シーケンスグループ（被験者９人／グループ）のうちの１つに無作為に割り付ける。天然にはコードされないアミノ酸を含む本ＰＥＧ化ｈＧＨおよび選択された市販の製品の等用量を使用して、上腿におけるボーラス皮下注射として、２つの別の投薬期間でＧＨを投与する。市販の製品の投与の用量および頻度は、このパッケージラベルに指示されているとおりである。追加の被験者グループを組み入れることにより、市販の製品を使用して、追加の投薬、投薬頻度、または望みどおりの他のパラメータを本試験に追加してもよい。各投薬期間は、１４日のウォッシュアウト期間により分けられている。投薬期間と投薬期間の間ではなく、２つの投薬期間各々の前少なくとも１２時間および後７２時間は、患者を試験施設内に拘束した。ＰＥＧ化ｈＧＨの追加の投薬頻度または他のパラメータに対して同様に検査しなければならない場合には、追加の被験者グループを追加することができる。ヒトでの使用の承認を受けている多数の調合物をこの試験おいて使用することができる。Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）およびＳａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ）は、ヒトでの使用の承認を受けている市販のＧＨ製品である。ｈＧＨの実験用調合物は、天然にはコードされないアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨである。
【０６２２】
採血    ｈＧＨの投与前および後に直接静脈穿刺により連続血液採取する。血清ＧＨ濃度を判定するための静脈血液サンプル（５ｍＬ）を、投薬前約３０、２０および１０分の時点（３つのベースラインサンプル）ならびに投薬後のほぼ次の時点で得る：３０分、ならびに１、２、５、８、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０および７２時間。各血清サンプルを２つのアリコートに分ける。すべての血清サンプルは、−２０℃で保管する。血清サンプルは、ドライアイスを用いて出荷される。１日目の最初の投薬直前、４日目の朝、１６位置目の投薬直前、および１９日目の朝に絶食時臨床検体検査（血液学、血清化学および尿検査）を行う。
【０６２３】
生体分析方法    ＥＬＩＳＡキット手順（テキサス州、ウエブスターのＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［ＤＳＬ］）を血清ＧＨ濃度の判定に使用する。
【０６２４】
安全性の判定    各投薬（１日目および１６日目）の直前ならびに各投薬の６、２４、４８および７２時間後に、生命徴候を記録する。安全性の判定は、悪性事象の発生数およびタイプならびにベースラインからの臨床検体検査の変化に基づく。加えて、血圧をはじめとする生命徴候測定に関する試験前からの変化および身体検査の結果を評価する。
【０６２５】
データ分析    投薬前３０、２０および１０分の時点で採取した３つのサンプルからのＧＨレベルの平均から決定される平均ベースラインＧＨ濃度を投薬後の各値から減算することにより、投薬後血清濃度値を投薬前ベースラインＧＨ濃度について補正する。投薬前ＧＨ濃度は、これらがこのアッセイの定量レベルより下である場合には、平均値の計算に含めない。ベースラインＧＨ濃度について補正した血清濃度データから、薬物動態パラメータを決定する。薬物動態パラメータは、最新版のＢＩＯＡＶＬソフトウェアを使用して、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＶＡＸ  ８６００コンピュータシステムで、機種非依存型の方法により計算する。以下の薬物動態パラメータを決定する：ピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）；ピーク血清濃度までの時間（ｔｍａｘ）；線形台形法則を使用して計算したゼロ時から最終血液採取時までの濃度−時間曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）（ＡＵＣ０−７２）；および排出速度定数からコンピュータ計算される、終末排出半減期（ｔ２／１）。排出速度定数は、対数−線形濃度−時間プロットの終末線形領域における連続データ点の線形解析により概算される。薬物動態パラメータの平均、標準偏差（ＳＤ）および変動係数（ＣＶ）を治療ごとに計算する。パラメータ平均の比（保存されるフォーミュレーション／保存されないフォーミュレーション）を計算する。
【０６２６】
安全性の結果    有害事象の発生は、治療グループ全体にわたって等しく分散されている。ベースラインならびに試験前臨床検体検査および血圧からの臨床的に有意な変化はなく、ならびに身体検査の結果および生命徴候測定に関する試験前から顕著な変化はない。２つの治療グループについての安全性プロフィールは、同様に見える。
【０６２７】
薬物動態の結果    １つ以上の市販のｈＧＨ製品（Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）およびＳａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ）を含むが、これらに限定されない）の１回量を受けた後の１８人すべての被験者における平均血清ＧＨ濃度−時間プロフィール（ベースラインＧＨレベルについて未補正）を、測定した各時点で、天然にはコードされないアミノ酸を含む本ＰＥＧ化ｈＧＨと比較する。すべての被験者は、正常な生理範囲内の投薬前ベースラインＧＨ濃度を有さねばならない。薬物動態パラメータは、投薬前平均ベースラインＧＨ濃度について補正した血清データから決定し、ならびにＣｍａｘおよびｔｍａｘを決定する。（Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）およびＳａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ））から選択される臨床コンパレータ（複数を含む）についての平均ｔｍａｘは、天然にはコードされないアミノ酸を含む本ＰＥＧ化ｈＧＨについてのｔｍａｘより有意に短い。検査した市販のｈＧＨ製品についての終末半減期値は、天然にはコードされないアミノ酸を含む本ＰＥＧ化ｈＧＨについての終末半減期と比較して、有意に短い。
【０６２８】
本試験は、健康な男性被験者において行うが、同様の吸収特性および安全性プロフィールが、他の患者集団、例えば、癌もしくは慢性腎疾患に罹患している男性もしくは女性患者、小児腎疾患患者、自己血貯血プログラムを受けている患者、または選択的な手術が予定されている患者にも期待されるであろう。
【０６２９】
結論として、天然にはコードされないアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨの皮下投与１回量は、安全であり、健康な男性患者に許容されるであろう。有害事象発生率、臨床検査値、生命徴候、および身体検査の結果の比較を基に、市販の形態のｈＧＨおよび天然にはコードされないアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨは、等価であろう。天然にはコードされないアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨは、患者およびヘルスケア提供者に大きな臨床的有用性をもたらす。
【０６３０】
本明細書に記載の実施例および実施態様が、例証をのみを目的とするものであること、本明細書に記載の実施例および実施態様にかんがみて様々な変形および変更が、当業者に示唆されるであろうということ、こうした変形および変更が、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に包含されることは、理解される。本明細書において引用したすべての出版物、特許および特許出願は、あらゆることを目的として、これら全文、本明細書に参照により組み込まれている。
【０６３１】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【０６３２】
【図１】４へリックスバンドル型タンパク質の一般構造を示す図である。
【図２】４へリックスバンドル型タンパク質成長ホルモン（ＧＨ）の一般構造を示す図である。
【図３】４へリックスバンドル型タンパク質エリスロポエチン（ＥＰＯ）の一般構造を示す図である。
【図４】４へリックスバンドル型タンパク質インターフェロンアルファ−２（ＩＦＮα−２）の一般構造を示す図である。
【図５】４へリックスバンドル型タンパク質顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の一般構造を示す図である。
【図６】天然にはコードされないアミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンを次の各位置：Ｙ３５、Ｆ９２、Ｙ１１１、Ｇ１３１、Ｒ１３４、Ｋ１４０、Ｙ１４３、またはＫ１４５に含むｈＧＨの発現を実証する、クマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図７−１】パネルＡおよびＢ：ＩＭ９細胞上の天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨ（パネルＢ）および野生型ｈＧＨ（パネルＡ）の生物活性を示す図である。
【図７−２】パネルＡおよびＢ：ＩＭ９細胞上の天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨ（パネルＢ）および野生型ｈＧＨ（パネルＡ）の生物活性を示す図である。
【図８】この天然にはコードされないアミノ酸へのＰＥＧの共有結合性リンケージ（５、２０および３０ｋＤａ）によりＰＥＧ化される天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨの生産を実証する、クマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図９】ＩＭＦ９細胞上の天然にはコードされないアミノ酸を含む、様々なＰＥＧ化形態のｈＧＨの生物活性の実証を示す図である。
【図１０−１】パネルＡ：ｈＧＨの一次構造を示し、トリプシン切断部位を指摘し、天然でないアミノ酸置換、Ｆ９２ｐＡＦを矢印で指定した図（Ｂｅｃｋｅｒら．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１０（４）：３２６−３３７から修正した図）である。
【図１０−２】パネルＢ：ＰＥＧ化されている天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドから生成させたペプチド（Ａと標識したもの）、天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドから生成させたペプチド（Ｂと標識したもの）、およびＷＨＯ  ｒｈＧＨから生成させたペプチド（Ｃと標識したもの）の、トリプシン重ね合わせマップを示す図である。パネルＣ：パネルＢからのピーク９の拡大図である。
【図１１】パネルＡおよびＢ：精製ＰＥＧ−ｈＧＨポリペプチドのクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図１２】ＩＭ９細胞上のｈＧＨ二量体分子の生物活性を示す図である。
【図１３】パネルＡ：Ｇ１２０Ｒ置換を有するｈＧＨ拮抗薬によるｐＳＴＡＴ５のリン酸化を測定するＩＭ−９アッセイのデータを示す図である。パネルＢ：同じ位置（Ｇ１２０）に天然でないアミノ酸が組み込まれているｈＧＨポリペプチドによるｐＳＴＡＴ５のリン酸化を測定するＩＭ−９アッセイのデータを示す図である。
【図１４】図１３、パネルＢに示すｈＧＨ拮抗薬の二量体も、ＩＭ−９アッセイにおいて生物活性を欠くことを示す図である。
【図１５】ラットにおけるＰＥＧ化されている天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの血清半減期と、ＰＥＧ化されていないｈＧＨポリペプチドの血清半減期との比較を示す図である。
【図１６】ＰＥＧ化されている天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのラットにおける血清半減期の比較を示す図である。
【図１７】ＰＥＧ化されている天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのラットにおける血清半減期の比較を示す図である。ラットに２．１ｍｇ／ｋｇを１回投薬した。
【図１８−１】パネルＡ：ＰＥＧ化されている（位置３５、９２）天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの１回量を投薬した後のラットの体重増加に対する影響を示す図である。パネルＢ：ＰＥＧ化されている（位置３５、９２）天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの１回量を投薬した後の循環血漿中ＩＧＦ−１レベルに対する影響を示す図である。
【図１８−２】パネルＣ：ＰＥＧ化されている（位置９２、１３４、１４５、１３１、１４３）天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの１回量を投薬した後のラットの体重増加に対する影響を示す図である。パネルＤ：ＰＥＧ化されている（位置９２、１３４、１４５、１３１、１４３）天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの１回量を投薬した後の循環血漿中ＩＧＦ−１レベルに対する影響を示す図である。
【図１８−３】パネルＥ：ＰＥＧ化されている（位置９２、１３４、１４５、１３１、１４３）天然にはコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのラットにおける血清半減期の比較を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2007519420.tif 000058
【図１５】
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【図１６】
2007519420.tif 000060
【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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