(57)【要約】  本発明は、等電点(“pI”)に基づき混合物成分を、単離、特定するための材料、装置、方法、およびシステムに関する。ある態様において、該材料は、所定の等電点を有するよう適合された粒子である。該粒子は、内部に複数のキャビティが広がる多孔質体を含む。所定の等電点を有する物質は、キャビティ内に担持されて、粒子の等電値を与える。【選択図】図３
2007529309.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の等電点を有するように適合された粒子であって、その表面から内部に広がる複数のキャビティを有する実質的に多孔質の粒子体を含み、さらに、所定のpHで実質的に中性の静電荷を維持するように、所定の等電点を有する物質を含んでなる、該粒子。
【請求項２】
所定の等電点を有する物質が、粒子のキャビティ内に担持されている、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
物質がポリマーである、請求項２に記載の粒子。
【請求項４】
ポリマーがポリアクリルアミドである、請求項３に記載の粒子。
【請求項５】
ポリマーがブロックコポリマーである、請求項３に記載の粒子。
【請求項６】
キャビティが粒子の外面と内面を規定し、且つ、所定の等電点を有する物質が外面と内面上に担持されている、請求項１に記載の粒子。
【請求項７】
物質がアミノ酸を含む、請求項６に記載の粒子。
【請求項８】
物質が２以上のアミノ酸を含む、請求項７に記載の粒子。
【請求項９】
粒子が、実質的に零の電気浸透力を生ずる、請求項１に記載の粒子。
【請求項１０】
粒子が、電気浸透力を実質的に生ずることができない材料を含む、請求項９に記載の粒子。
【請求項１１】
材料がポリスチレンである、請求項１０に記載の粒子。
【請求項１２】
材料が複数の鉱物性酸化物を含み、粒子が電気浸透力を実質的に生ずることができないような効果的な割合で、鉱物性酸化物が提供される、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１３】
鉱物性酸化物が、ジルコニア、シリカ、チタニア、アルミナ、およびその混合物からなる群から選択される、請求項１２に記載の粒子。
【請求項１４】
粒子が、１次電気浸透力を生ずる基材を含み、粒子が実質的に零の電気浸透力を生ずるように、基材が、１次電気浸透力と実質的に大きさが等しく、反対の電気浸透力を生ずるような物質で実質的にコーティングされている、請求項９に記載の粒子。
【請求項１５】
基材がシリカであり、物質がポリカチオン性の親水性ポリマーである、請求項１４に記載の粒子。
【請求項１６】
基材がジルコニアであり、物質がポリアニオン性の親水性ポリマーである、請求項１４に記載の粒子。
【請求項１７】
規定の等電点を有する成分を、該成分を含む２以上の構成成分を有する混合物から、分離するための装置であって、装置は、請求項１に記載の所定の等電点を有する粒子を保持するように適合された容器を含み、所定の等電点は、規定の等電点と実質的に同等であり、容器は、さらに、第１のポートと第２のポートを含んでなり、第１のポートは、容器内に混合物を導入できるように適合されていて、混合物が規定および所定の等電点の少なくとも１つと実質的に同等なpH値を有する条件下で、成分と粒子を流体接触で相互作用させ、第２のポートは、混合物の相互作用しない構成成分を装置から取り出すことができるように適合されている、該装置。
【請求項１８】
粒子を、２以上の粒子の小集団に分けることができ、小集団は、それぞれ、その他の小集団とは異なる電気浸透力を有し、粒子の集団全体の平均電気浸透力が実質的に零となるように小集団が組み合わされている、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
下記の工程:
a. 所定の等電点を有する架橋ポリマーを重合で得るようにモノマーとその量を選択する工程;
b. モノマー溶液を調製する工程;
c. 粒子内にかかる溶液の流体流入を可能にするような大きさの多孔質の粒子体を有する粒子と、かかる溶液とを接触させる工程;および
d. 多孔質の粒子体内に所定の等電点を有するポリマーを形成するのに効果的な条件下で前記モノマーを反応させて、所定の等電点を有する複合粒子を形成する工程
を含んでなる、所定の等電点を有する複合粒子を製造する方法。
【請求項２０】
モノマーが、N-アクリロイルグリシン、４-アクリルアミド酪酸、２-モルホリノエチルアクリルアミド、３-モルホリノプロピルアクリルアミド、N，N-ジメチルアミノエチルアクリルアミド、N，N-ジメチルアミノプロピルアクリルアミドからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
粒子が、酸化ジルコニウムを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
粒子の直径が約１０μm〜約２００μmである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
粒子の細孔容積が、ビーズ全容積の約４０%を超える、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
モノマーが、両性イオンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
モノマーが、アミノ酸またはペプチドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
規定の等電点を有する成分を、かかる成分を含む混合物から分離する方法であって、下記工程：
a. 成分の等電点と実質的に同等である所定の等電点を有する請求項１に記載の粒子に混合物を導入して、粒子を成分と流体接触させる工程;および、
b. 粒子の等電点と実質的に等しい値に、混合物のpHを調整して、混合物のその他の成分から、かかる成分を実質的に単離する工程
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、分析化学の分野、より具体的には、複合混合物の成分の分離に関する。さらにより具体的には、本発明は、混合物からの、規定の等電点を有する物質の分離に関する。本発明は、生化学、プロテオミクス、および臨床化学の分野での用途を有する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、組織、または流体などの特定の生物学的環境内で発現した一連のタンパク質を分析するプロテオミクスは、生物医学研究の次なる至高の目標となっている。１５０種を超えるゲノムが分類されているが、生体系の病的な動作状態と正常な動作状態との違いを正確に機能的に理解するには、遺伝子活性の配列と発現したタンパク質の対応するプロフィールとの相関が必要とされる。遺伝子転写分析は、この相関を得るには十分ではない。なぜなら、多くの遺伝子は、例えば、所謂干渉RNA(“RNAi”)により調節された所謂スプライセオソームによるプロセッシングを介して間接的に発現するか、またはその発現したタンパク質が翻訳後の因子によって修飾されるからである。したがって、タンパク質の目録を、直接引き出さなければならない。
【０００３】
タンパク質の混合物から成分タンパク質を分離するための最も際立った２つの技術は、タンパク質の等電点と分子量である。というのは、２つの異なるタンパク質が全く同一の等電点と同一の分子量を有する可能性はきわめて低いからである。これらのパラメータは、二次元電気泳動(“２-DE”)にすでに用いられており、混合物中のタンパク質は、先ず等電点によって、その後、ドデシル硫酸ナトリウム(“SDS”)マトリックスを介した電気泳動により分離される。しかしながら、SDS電気泳動の使用は、プロテオームまたは臨床の用途に必要とされる幾分大規模な分析の場合に、非常に有効であるとは考えられていない。
【０００４】
質量分析法は、質量だけでなく、試料のフラグメンテーションパターンと、公知タンパク質のフラグメンテーションパターンを相関させることによりタンパク質の同一性を測定する技術として、より一層強力である。１のアプローチでは、ポリアクリルアミドゲルプレートを使用した２-DE分離が用いられ、単一の分離スポットをそれぞれゲルから取り除き、質量分析法により分析する。しかしながら、これは非実用的である。というのは、典型的なプロテオームにおいて発現した何千ものタンパク質を分類することはあまりに困難であるからである。より実用的なアプローチでは、ゲルマトリックスからタンパク質を分離することを避けるであろう。
【０００５】
Cretichらの“Separation of Proteins in a Multicompartment Electrolyzer with Chambers Defined by a Bed of Gel Beads”, Electrophoresis 24 (2002) 577-581には、商標名IMMOBILINETM(Amersham Biosciences、Uppsala、Swedenから入手可能)の下で当業者に公知の架橋されたアクリルアミドとアクリルアミドモノマーとのマトリックスを用いた等電点に基づくタンパク質の分離が記載されている。しかしながら、このマトリックスの機械的特性は、満足できるものではなく、そのため著者らは電気的に不活性な多孔質ビーズの使用を示唆している。しかしながら、かかるビーズについての説明はされていない。
【０００６】
変更可能な環境(例えば、野菜の成長)において、一定のレベルでpHを維持するためにモノマー混合物を用いた自己緩衝ビーズが記載されている。これらのビーズは、文献(例えば、Righetti, P.G., Chiari, M. and Crippa, L.: “Macroreticulate Buffers: a Novel Approach to pH Control in Living Systems”, J. Biotechnol. 17 (1991) 169-176; Chiari, M., Pagani, L. and Righetti, P.G.: "Physico-Chemical Properties of Amphoteric, Isoelectric, Macroreticulate Buffers", J. Biochem. Biophys. Methods 23 (1991) 115-130; Pompei, R., Lampis, G., Chiari, M. and Righetti, P.G.: "Culture of Eukaryotic Cells with Macroreticulate Buffers: Fermentation of Cellulolytic Fungi", BioTechniques 11 (1991) 701-706を参照のこと)に記載がある。同一の中性ポリマー骨格にグラフトされたこれらのビーズは、最大の緩衝能力を保証するように、緩衝イオンと、そのpK値付近で緩衝イオンを滴定するのに必要とされる対イオンの両方を含んでいる。しかしながら、かかるビーズは、緩衝細胞成長培地などでしか用いることができない。かかるビーズは、両方の種類の基、すなわち正と負に帯電した基を含有するビーズの性質上、タンパク質交換体として有用ではないので、イオン交換体として採用することができないであろう。
【非特許文献１】Cretichらの“Separation of Proteins in a Multicompartment Electrolyzer with Chambers Defined by a Bed of Gel Beads”, Electrophoresis 24 (2002) 577-581
【非特許文献２】Righetti, P.G., Chiari, M. and Crippa, L.: “Macroreticulate Buffers: a Novel Approach to pH Control in Living Systems”, J. Biotechnol. 17 (1991) 169-176
【非特許文献３】Chiari, M., Pagani, L. and Righetti, P.G.: “Physico-Chemical Properties of Amphoteric, Isoelectric, Macroreticulate Buffers”, J. Biochem. Biophys. Methods 23 (1991) 115-130
【非特許文献４】Pompei, R., Lampis, G., Chiari, M. and Righetti, P.G.: “Culture of Eukaryotic Cells with Macroreticulate Buffers: Fermentation of Cellulolytic Fungi”, BioTechniques 11 (1991) 701-706
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、強固な材料を用いたpIに基づく混合物成分を分離するための媒体に対する要求が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、規定の等電点(“pI”)を有する成分を、かかる成分を含む混合物から分離するための材料、方法、装置、およびシステムを提供する。
【０００９】
１の態様において、本発明は、所定の等電点を有するように適合された粒子を提供する。粒子は、その表面から内部に広がる複数のキャビティを有する実質的に多孔質の粒子体と、かかる粒子が所定のpHで実質的に中性の静電荷を維持するように所定の等電点を有する物質とを含む。いくつかの実施形態においては、この物質を粒子のキャビティ内に担持する。かかる物質の例としては、ポリアクリルアミドおよびブロックコポリマーなどのポリマーが含まれる。別の実施形態においては、粒子のキャビティが、外面と内面を規定し、所定の等電点を有する物質を、粒子のかかる外面と内面に担持する。このような実施形態に適切な物質の例には、１、２、またはそれ以上のアミノ酸が含まれ得る。
【００１０】
本発明の粒子はまた、電気浸透力を生ずることが実質的に不可能な材料、例えば、電気浸透力を生ずることが実質的に不可能な粒子とするのに効果的な割合で提供されたポリスチレンまたは鉱物性酸化物を含む粒子からなることもできる。適切な材料の例には、ジルコニア、シリカ、チタニア、アルミナ、およびその混合物が含まれる。かかる粒子の別の実施形態には、１次電気浸透力（first electroendoosmotic force）を生ずる基材を含み、かかる基材が、１次電気浸透力と実質的に大きさが等しく、反対の電気浸透力を生ずる物質で実質的にコーティングされている粒子が含まれる。かかる組み合わせの例には、シリカ基材と、ポリカチオン性の親水性ポリマーコーティングとを有する粒子、またはジルコニア基材と、ポリアニオン性の親水性ポリマーコーティングとを有する粒子が含まれる。
【００１１】
別の態様において、本発明は、規定の等電点を有する１または複数の成分を、かかる成分を含む混合物から分離するための装置を提供する。１の実施形態において、該装置は、本明細書に記載の本発明の所定の等電点を有する粒子を保持するように適合された容器を含む。容器には、混合物の導入と、容器内での粒子との流体相互作用の後に溶出液の取り出しが可能な第１および第２のポートが含まれる。いくつかのより特定的な実施形態では、混合物は、所定または規定の等電点の少なくとも１つと実質的に等しいpH値を有する。さらに他の実施形態では、実質的に中性の総平均電気浸透力を有する本明細書に記載の粒子からなる２以上の集団が、容器内に提供される。
【００１２】
さらに他の態様において、本発明は、規定の等電点を有する１または複数の成分を、かかる成分を含む混合物から分離するための方法を提供する。１の実施形態において、該混合物は、所定の等電点を有する本発明の粒子と成分が流体接触するようにその粒子と接触する。さらに特定的な実施形態において、粒子の所定の等電点は、少なくとも１種の成分の規定の等電点と実質的に等しく、例えば、pI値の差(絶対値で)が約０.５未満、より具体的には約０.１未満、さらにより具体的には、約０.０１未満、さらにより具体的には約０.００１未満である。混合物のpHは、粒子のpIと実質的に等しい値、すなわちpHとpIの絶対値の差が０.５未満、より具体的には約０.１未満、さらにより具体的には、約０.０１未満、さらにより具体的には約０.００１未満に調整されている。
【００１３】
さらに他の態様において、本発明の材料、装置、および方法は、追加の分析システム（例えば質量分光分析器）と組み合わせて、本明細書に記載のように分離した混合物成分の追加の分析を提供する。かかる組み合わせは、科学的用途および臨床用途のプロテオーム分析における使用に対して、複合混合物の成分、例えば、血液その他の体液成分のかなり詳細な性状を提供することができる。
【００１４】
本発明のこれらの、および、さらに他の性質および利点は、添付の図面と併せて下記説明を参照すると十分理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、異なる等電点を有する物質、特にタンパク質を、かかる物質の混合物から分離するのに用いられ得る新規な材料、方法、および装置を提供する。本明細書に記載のこの新規な材料、方法、および装置は、成分物質の等電点(“pI”)の差に基づく混合物のクロマトグラフィー分離により物質を精製するのに応用することができる。さらに、本明細書に記載のこの新規な材料、方法、および装置は、追加の材料および装置と組み合わせて用いて、精製した物質に関する追加の分析情報を提供することもできる。本明細書に記載のいくつかの実施形態において、本発明に従って精製された物質を、質量分析にかけ、さらにより具体的な実施形態においては、精製後に飛行時間(time-of-flight “ToF”)質量分析にかける。いくつかの実施形態において、こうして行われる後の分析は、その精製された物質を同定するのに有効である。したがって、本発明に係るこの新規な材料、方法、および装置は、複合混合物からタンパク質を精製するのに用いられ、重要な臨床および生化学的情報を、例えば、医学およびプロテオーム向けに提供することができる。規定の等電性および電気浸透性を有する粒子
【００１６】
ある態様において、本発明は、規定の等電点を有する混合物成分を分離するのに有用な規定の等電性および電気浸透性を有する粒子を提供する。粒子と混合物成分とが相互作用をする媒体のpHに依存して、幾つかの混合物成分は、該粒子と相補性の(すなわち反対の符号の)電荷を有し、その他の成分は粒子と同じ符号の電荷を有する状態か、或いは、全く電荷を有しない(すなわち、pH=pI成分である場合には中性である)状態が存在する。前者の成分は、ほとんど相互作用することなくカラムを移動する後者の成分よりも粒子表面により強く吸着される。その後、吸着されたタンパク質は、pH勾配または塩勾配により脱着することができる。その結果、成分は成分pIに基づいて分離できる。
【００１７】
１の実施形態において、本発明は、表面から内部に広がる複数のキャビティを有する実質的に多孔質の粒子体を提供する。粒子はさらに、かかる粒子が所定のpHで実質的に中性の静電荷を維持するように所定の等電点を有する物質を含む。１の実施形態において、粒子は、生物学的材料の分離に適合する大きさ、機械強度、および浮力を有する。より特定した実施形態において、粒子は、１または複数の鉱物性酸化物などの材料を用いるか、または、本明細書に記載のポリマーが、粒子内部に導入され得るように十分に多孔質のプラスチックビーズを用いて製造される。ポリスチレンは、クロマトグラフィー用の細孔を有するビーズに形成することができる周知のポリマーである。本発明に有用な他の合成ポリマーは、メタクリル酸メチル樹脂などのアクリル樹脂系のポリマー、多孔質のナイロン、多孔質のポリビニル樹脂、およびポリカーボネートである。さらにその他のものも、ポリマー分野における当業者によく知られている。さらにより特定された実施形態において、材料は、１または複数の鉱物性酸化物、例えば、制限されるわけではないが、三価の鉱物性酸化物、例えば、アルミニウム、ガリウム、インジウム、スカンジウム、イットリウム、ランタン、アクチニウム、その他の希土類の鉱物、または四価の鉱物性酸化物、例えば、チタニア、ジルコニア、またはハフニアからなる。本発明の実施に用いられ得る適切な多孔質の粒子体の例には、米国特許第６,６１３,２３４号;第５,４７０,４６３号;第５,３９３,４３０号;および第５,４４５,７３２号に記載の多孔質の粒子体がある［これらの特許はそれぞれ、全体としておよびあらゆる目的のために引用により本明細書中に組み込まれる］。好適な粒子は、商標名HYPERD（商標）およびHYPERZ（商標）の下で、Ciphergen Biosystems of Fremont、CAから販売されている。
【００１８】
ある態様において、本発明は、所定の等電点を有する複合粒子を製造する方法を提供する。１の実施形態において、該方法は、以下の工程:重合にて所定の等電点を有する架橋ポリマーを得るためのモノマーおよびモノマー量を選択する工程;モノマー溶液を調製する工程;多孔質の粒子体を有する粒子とモノマー溶液を接触させる工程（該粒子体は流体が粒子内に流入可能となるような大きさである）;および多孔質の粒子体内にかかる所定の等電点を有するポリマーを形成するのに効果的な条件でモノマーを反応させて、所定の等電点を有する複合粒子を形成する工程が含まれる。典型的な例示は、米国特許第６,６１３,２３４号;第５,４７０,４６３号;第５,３９３,４３０号;および第５,４４５,７３２号に見出され得る。いくつかの実施形態において、粒子の直径は、約１０μm〜約２００μmであり、より特定した実施形態において、粒子の細孔容積は、全粒子容積の約４０%超、さらにより具体的には、全粒子容積の約５０%超である。いくつかの実施形態において、モノマーは、N-アクリロイルグリシン、４-アクリルアミド酪酸、２-モルホリノエチルアクリルアミド、３-モルホリノプロピルアクリルアミド、N，N-ジメチルアミノエチルアクリルアミド、N，N-ジメチルアミノプロピルアクリルアミドからなる群から選択される。他の実施形態において、粒子は酸化ジルコニウムからなる。さらに、場合によりポレーション剤（poration agent）を用いてもよい。例えば、細孔誘導剤、例えばポリエチレングリコール６０００を約８%〜約２０%の濃度で加えることができる。粒子はまた、場合により、例えば米国特許出願公開２００２-０００５３８３ A１に記載のような公知の表面保護剤（passivating agent）で被覆してもよい。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態において、所定の等電点を有する物質は、粒子のキャビティ内に担持される。より具体的な実施形態には、該物質が所定の等電点を有するポリマーであるものが含まれる。さらにより特定された実施形態では、該ポリマーがポリアクリルアミドであるか、または該ポリマーがブロックコポリマーである。かかる実施形態は、高分子化学および生化学の当業者に周知の材料および方法を用いて調製することができる。例えば、好適な等電性物質は、規定の等電点を有するポリマーを生成するのに効果的な量および条件下でアクリルアミドモノマーとイモビラインを組み合わせることにより製造可能である。簡単に言うと、生物分析化学の当業者に公知であり、米国特許第４,９７１,６７０号（Faupelら）に記載のように、イモビラインは、一般式:
【化１】
2007529309.tif 000003
【００２０】
［式中、Rは、特有のpIを提供する基を含む］
を有するアクリルアミド誘導体である。この記載にて包含される分子は多数存在するが、等電性ゲルを作り出すための１のコレクションとしては、Amershamより、商標名IMMOBILINE（登録商標）の下で商品化されている。このコレクションには、表示されたpIを有する以下の分子(“イモビライン”)が含まれる:N-アクリロイルグリシン(pK３.６);４-アクリルアミド酪酸(pK４.６);２-モルホリノエチル-アクリルアミド(pK６.２);３-モルホリノプロピルアクリルアミド(pK７.０);N，N-ジメチルアミノエチルアクリルアミド(pK８.５);およびN，N-ジメチルアミノプロピルアクリルアミド(pK９.３)。これらのモノマーを組み合わせて、且つ、アクリルアミドおよびN，N'-メチレンビスアクリルアミド、その他の適切な架橋剤と共重合して、所望のpIを有する特定のポリマーを生成する。メチルアクリルアミドは、アクリルアミドに代替することができる。所望のpIの組成物は、以下のURL: http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/content/E466EDD469D4CF4BC1256A5E00538B4E?OpenDocument&Path=Catalog&Hometitle=Catalog&entry=2&newrel&LinkParent=C1256B810034E9C1-3F2278B4DDBFF6ED41256B8A003011A6_RelatedLinksNew-858FD25382BD896AC1256BC100402117&newrel&hidesearchbox=yes&moduleid=40401にて、表題“Isoelectric membrane formulas for isoprime purification of proteins”の下で提供されている情報に従って入手可能なソフトウェア、例えばDoctor pH(Amersham, Uppsala, Sweden at www. amersham. comから入手可能)を用いて、イモビラインおよび共重合用試薬を組み合わせることにより得ることができる。
【００２１】
種々の高分子のpI値を測定する方法は公知である。かかる方法には、例えば、以下のものが含まれる: Ribeiro JM. Sillero A. 1990 “An algorithm for the computer calculation of the coefficients of a polynomial that allows determination of isoelectric points of proteins and other macromolecules", Computers in Biology & Medicine 20(4):235-42; Ribeiro JM. Sillero A., 1991 "A program to calculate the isoelectric point of macromolecules" Computers in Biology & Medicine 21(3):131-41; and Sillero A. Ribeiro JM., 1989 "Isoelectric points of proteins: theoretical determination" Analytical Biochemistry 179(2):319-25。かかる方法は、本明細書に記載のポリマーのpI値を測定するために用いることができる。
【００２２】
例えば制限するわけではないが、本発明に係る規定の等電点を有する粒子は、下記に示した特定の実施例に従って調製することができる。要約すれば、実施例１に示すように、所望のpIを提供するのに効果的なアクリルアミドモノマー水溶液を、適切な架橋剤と組み合わせ、且つ、重合触媒を、スラリー中で、アクリルアミドの重合が粒子のキャビティ内で生ずるのに十分な割合で上記の粒子と組み合わせるが、より詳細には、組み込まれた特許’２３４および’７６３に記載の通りであり、これにより規定のpIを有する粒子を作成する。
【００２３】
他の実施形態において、所定の等電点を有する物質を、粒子の外面と内面(すなわち上記のキャビティの内部細孔容積により形成される内部および外部の粒子表面)に担持する。この担持は、化学結合その他の手段によってなされ得る。アミノ酸は、規定の等電点を有するのでかかる表層を提供するのに有用である。したがって、いくつかの実施形態において、該物質には、アミノ酸が含まれ、より特定した実施形態では、該物質には、２以上のアミノ酸が含まれる。アミノ酸は、いかなる２０種の天然アミノ酸であってもよく、またはアミノ酸は、人工アミノ酸であってもよい。より具体的には、有用なアミノ酸には、イオン性側鎖を有する２０種の天然アミノ酸、例えば、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、システイン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミンのいずれかが含まれる。さらに、上記の内部と外部の粒子表面に結合し得る規定のpI値を有するその他の化合物を、本発明で用いることができることは、生化学の分野における当業者に理解されるであろう。粒子表面上に結合部位を提供するのにリンカーを用いてもよい。好適なリンカー化学は、表面化学の当業者によく知られている。
【００２４】
粒子表面へのアミノ酸修飾の形成を記載した１例が、下記の実施例６にて示されている。アガロースヒドロゲルで充填した多孔質のジルコニアビーズを、先ず、水酸化ナトリウム(NaOH)および臭化アリル(CH２CH２CH２Br)と反応させて、アリルオキシ基が結合した粒子表面を生成させる。アリルオキシ基を、さらに臭素化して、３-ブロモプロピルオキシ表面リンカーを形成し、次いでリジンと反応させて、粒子のpI値が８.２のリジン結合表面を有する粒子を得る。
【００２５】
他の実施形態において、上記粒子は、さらに、実質的に零の電気浸透力を生み出す。これら実施形態のいくつかにおいては、粒子は、電気浸透力を生ずることが実質的に不可能な材料を含み、より具体的な実施形態においては、材料はポリスチレンである。他のかかる実施形態においては、粒子は、実質的に大きさが等しく、反対の電気浸透作用を有する２以上の材料から形成され、その結果、実質的に零の電気浸透力を有する粒子を形成する。これらの実施形態の例には、かかる粒子が実質的に電気浸透力を生ずることができない効果的な割合で提供される鉱物性酸化物を有する粒子が含まれる。適切な鉱物性酸化物の例は、ジルコニア、シリカ、チタニア、アルミナ、およびその混合物からなる群から選択される。
【００２６】
さらに他の実施形態において、粒子は、１次電気浸透力を引き起こす基材を含み、ここでかかる基材は、粒子が実質的に零の電気浸透力を生ずるように、１次電気浸透力と実質的に大きさが等しく、反対の電気浸透力を引き起こす物質で実質的にコーティングされている。したがって、本発明は、実質的に零の電気浸透力を有する粒子を提供するために本明細書に記載の粒子の電気浸透性を調整する方法および材料を提供する。好適な粒子とコーティングの組み合わせの例には、基材がシリカであり、かかる物質がポリカチオン性の親水性ポリマーである粒子と、基材がジルコニアであり、かかる物質がポリアニオン性の親水性ポリマーである粒子が含まれる。さらに、１または複数のアミノ酸の好適なポリマーを用いて、所望の補整的な表層を提供してもよい。鉱物性酸化物をコーティングし、ほぼ零に電気浸透性レベルを低減するのに用いるポリマーは、相補型電荷を伴うわずかにイオン溶解性のポリマーである。例えば、シリカ系ビーズの場合には、ポリマーは、DEAEデキストランなどのアミノ基含有ポリマーであり得る。実際には、ポリマーは、適切な時間、シリカビーズと接触させて、過剰のポリマーは、充分な水洗で除去する。シリカの酸性の特性を打ち消すことができるカチオン性デキストランの必要量だけが、ビーズに残る。材料の総電荷が正である酸化ジルコニウムの場合には、適切なポリマーは、カルボキシル基などの弱酸を有するポリマーである。コーティングポリマーの量は、得られる複合材料の正味の電荷がおよそ零となるように選択されるべきである。
【００２７】
別の態様において、本発明は、イオン交換クロマトグラフィーのための方法および材料を提供する。例えば制限するわけではないが、当業者は、本発明の粒子の電荷が緩衝剤のpHを調整することにより制御可能であることを理解するであろう。なぜなら、上記のように、いかなる所与のpHにおいても、本発明の粒子は、そのpIに基づく電荷を有するからである。粒子の電荷が一旦設定されると、タンパク質精製分野の当業者は、標準的な方法を用いて、例えば、粒子をサンプルに詰めて、粒子とタンパク質の電荷相互作用に基づいて本発明に係る粒子上にタンパク質を捕らえて、例えば、段階的または連続的な塩勾配で粒子からタンパク質を溶出することで、イオン交換クロマトグラフィーを行うことができる。
【００２８】
別の態様において、本発明は、成分の異なる等電点に基づいて混合物の成分を分離する装置を提供する。図１に関連して記載する１の実施形態において、本発明は、規定の等電点を有する上記粒子を保持し、且つ、粒子を介する混合物の通過により、成分の等電点に基づいて混合物成分の分離をもたらすことが可能となるような大きさの容器１０２を含む装置１００を提供する。容器１０２には、混合物の導入を可能とするような大きさの入口１０４と、混合物全体から分離した成分を含む混合物成分を排出できる出口１０６が含まれる。入口１０４と出口１０６の間には、本発明の粒子１１０を含む分離区域１０８がある。したがって、分離区域１０８は、装置１００を、分離前区域１１２と、分離後区域１１４にそれぞれ分割する。
【００２９】
混合物成分を少なくとも部分的に分けるための図１に示した装置の使用を説明する。分離前の混合物を、入口１０４から区域１１２に導入する。電位を、容器（ハウジング）１０２の両端に(すなわち入口１０４と出口１０６の間に)与えて、混合物のpHを、粒子１１０のpIに満たない、または、超えて、または等しい値に調整する。次いで、混合物を、分離区域１０８と粒子１１０に通過させ、混合物の成分を少なくとも部分的に分離させ、混合物は分離後区域１１４を通過して、その後の収集(例えば、分画による)またはさらなる処理(例えば、質量分析による)のために出口１０６を介して装置１００を出る。粒子は、上記原理に従って相互作用して、成分および粒子のpIに依存する成分分離度をもたらす。
【００３０】
図２は、本発明の別の実施形態（２００）を図示している。分析用混合物２０２は、個々の装置２０６、２０８、および２１０を含む２０４で全体を示す分離装置の連続構成に導入され、各装置は、異なるpI値で操作され、図１の装置１００に記載のように配置、操作される。装置２０６、２０８、および２１０は、図のように連結器２１２、２１４、および２１６にて流体連通している。さらに、単離したものは、収集のために、２２０、２２２、および２２４で示される個々の各装置の通過後に、受け器２３０、２３２、および２３４にそれぞれ集められる。
【００３１】
操作中、分画する混合物を、装置２０６に接触させる。混合物のpHを、所望の操作値に調整する。pHが粒子のpIよりも大きい場合には、粒子は、正味の負電荷を有するであろう。反対に、pHが、粒子のpIより小さい場合には、正味の電荷は正である。混合物を粒子に接触させる。装置２０６内の粒子と反対の電荷を持つような等電点を有するあらゆる混合物成分は、粒子と相互作用して、そのため、粒子と同一の電荷符号を有する成分、または操作pHにて中性である成分よりもゆっくりと溶出するであろう。強く相互作用する粒子は、受け器２３０内に集められ、残余の相互作用しない成分は、装置２０８に移送される。装置２０８のpHは調整され、混合物は、粒子と上記のように接触し、装置２０８内の粒子と強く相互作用するあらゆる混合物成分が、受け器２３２内に集められる。残余の成分は、その次の装置に移送され、かかる工程は、混合物を最後の装置２１０に接触させるまで繰り返され、該装置内で粒子と強く相互作用するあらゆる混合物成分が、受け器２３４に集められる。残余の画分は、異なる手法により分離するか(例えば、イオン交換またはアフィニティークロマトグラフィー)、または廃棄してもよい。
【００３２】
図３は、本発明の装置の別の実施形態を３００として図示している。装置３００には、入口３０４および出口３０６をそれぞれ含む実質的に中空のハウジング３０２が含まれる。ハウジング３０２の全長に渡って電圧を与える手段が、３０８にて一般的に示されている。ハウジング３０２の内部には、分離域３１０、３１２、および３１４が含まれ、各分離域は、本明細書に記載の粒子を含み、ここで各分離域の該粒子は、異なるpIを有している。分離域３１０、３１２、および３１４は、さらに、ハウジング３０２をチャンバ３１６、３１８、３２０、３２２、および３２４にそれぞれ分割している。操作中、異なる等電点を有する成分の同一の混合物を、チャンバ３１６-３２４に導入し、各混合物のpHを異なる所定の値に調整する。電圧をかけ、得られた画分をさらなる分析のために集める。
【００３３】
図４Ａ-４Ｄを参照して、本発明の作動をより詳細に説明する。特定の等電点(pI=８.５)を有する本発明の粒子を、実施例１に記載のように調製する。したがって、粒子は、pHが８.５にて中性である。オバルブミン(pI=４.５)、シトクロム c(pI=１０.５)、およびリソチーム(pI=１１.５)を含む試料を、幾つかのpH値の１にて粒子に導入し、混合物を１０.０、８.０、７.０、および５.０のpH値で溶出した結果を、それぞれ図４Ａ-４Ｄに示す。図４Ａに関して、pHが１０.０にて、粒子は、オバルブミン(“O”)と同様、正味の負電荷を有する。したがって、オバルブミンは最初に溶出する。シトクロム c(“C”)は、わずかな正電荷をこのpH(シトクロム cのpIに近い値)で有し、そのためシトクロム cは、幾分、粒子と相互作用するが、より強い正電荷(pI>pH)を保持するリソチーム(“L”)ほどは強くない。そのため、これらの種は、オバルブミンよりもゆっくりと溶出する。したがって、図４Ａは、予想された分離および溶出順序を示している。
【００３４】
図４Ｂは、粒子のpIに近いpH＝８.０での実施結果を示している。かかる条件の下、粒子は、実質的に中性であり、粒子との相互作用がないので、オバルブミン、シトクロム c、およびリソチームが一緒に溶出する。しかしながら、図４Ｃに示すように、pHが７.０である場合には、シトクロム cおよびリソチームと同様に粒子は、正に帯電しているが、オバルブミンは負電荷を保持している。そのため、これらの条件下で、シトクロム cおよびリソチームは、粒子との静電気相互作用を有するオバルブミンよりも先に一緒に溶出する。最後に、図４Ｄに示されるように、pHがオバルブミンのpIに近い場合には、成分の全てが、粒子と同一の電荷(シトクロム c、リソチーム)または実質的に中性(オバルブミン)であるため、再度一緒に溶出する。
【実施例】
【００３５】
実施例１:pI８.５の酸化ジルコニウム等電性ビーズの調製
アクリルアミドモノマー水溶液を以下のように調製した。第１の溶液は、２.００mlの水を、４-アクリルアミド酪酸を含有する１７１.００マイクロリットル(μL)の溶液(０.２モル(M)濃度)、６００μLの２-モルホリノエチルアクリルアミド(０.２M濃度)、４７５μLの３-モルホリノプロピルアクリルアミド(０.２M濃度)、１９０μLのN，N-ジメチルアミノエチルアクリルアミド(０.２M濃度)、および６４μLのN，N-ジメチルアミノプロピルアクリルアミド(０.２M濃度)と組み合わせることにより調製した。次いで、第１の溶液のモノマーを、３ミリリットル(３.００ml)の脱イオン水と、１１１.００μLの１Mの酢酸とを含有する第２の溶液に加えた。合わせた第１および第２の溶液に、１００mlの水に溶解した２８.８グラム(g)のアクリルアミドおよび１.２gのN，N'-メチレンビスアクリルアミドの第３の溶液の３.３３mlを加えた。
【００３６】
合わせた第１の、第２の、および第３の溶液に、４.００ミリグラム(mg)の過硫酸アンモニウムおよび５.００μLのN，N，N'，N'-テトラメチルエチレンジアミンを加え、得られた組み合わせを、４℃-６℃の温度で迅速に混合した。
【００３７】
モノマーと重合触媒との得られた溶液を、デキストラン皮膜したシリカの固体の多孔質ビーズと、ビーズの多孔質容積が実質的に溶液全てを吸収するのに十分な量で混合した。ビーズを、真空下で、酸素パージし、窒素雰囲気下に置いた。次いで、混合物を、窒素雰囲気下、５０℃で、２時間加熱した。次いでビーズを、充分に水洗して、非共重合材料および副生成物を取り除いた。次いで、洗浄したビーズを、滴定カーブで特徴付け、前端分析(frontal analysis)を用いて、帯電基の数を測定した。得られた複合ビーズは、pIが８.５であることを確認した。
【００３８】
実施例２:pIが５.０である酸化ジルコニウム等電性ビーズの調製
第１の溶液は、２mlの水を、３１０μLのN-アクリロイルグリシン含有溶液(０.２M濃度)、２２９μLの４-アクリルアミド酪酸(０.２M濃度)、２３５μLの２-モルホリノエチルアクリルアミド(０.２M濃度)、６５μLの３-モルホリノプロピルアクリルアミド(０.２M濃度)、および１９０μLのN，N-ジメチルアミノプロピルアクリルアミド(０.２M濃度)に加えることにより調製した。第１のモノマー溶液を、３.６mlの脱イオン水および４７μLの１Mトリス-ヒドロキシメチルアミノメタンを含有する第２の溶液に加えた。次いで、合わせた第１および第２の溶液を、１００mlの水に溶解した２８.８gのアクリルアミドおよび１.２gのN，N'-メチレンビスアクリルアミドを含有する第３の溶液の３.３３mlと合わせた。
【００３９】
３つの合わせた溶液を、４mgの過硫酸アンモニウムおよび５μLのN，N，N'，N'-テトラメチルエチレンジアミンと一緒に加えて、４℃〜８℃の温度で迅速に混合した。
【００４０】
モノマーと重合触媒との得られた溶液を、デキストラン皮膜した酸化ジルコニウムの固体の、多孔質ビーズ（商標名HYPERZ（商標）の下で、Ciphergen Biosystems、Inc.(Fremont、CA)から販売されている）と、ビーズの多孔質容積が実質的に溶液全てを吸収するのに十分な量で混合した。ビーズを、真空下、酸素パージし、窒素雰囲気下に置いた。次いで、混合物を、窒素雰囲気下、５０℃で、２時間加熱した。次いでビーズを、充分に水洗して、非共重合材料および副生成物を取り除いた。次いで、洗浄したビーズを、滴定カーブで特徴付け、前端分析を用いて、帯電基の数を測定した。得られた複合ビーズは、pIが５.０であることを確認した。
【００４１】
実施例３:pIが７.０の酸化ジルコニウム等電性ビーズの調製(低電荷)
アクリルアミドモノマーの第１の溶液を、２mlの水と、７５μLのN-アクリロイルグリシン溶液(０.２M濃度)、４７５μLの４-アクリルアミド酪酸(０.２M濃度)、２０８μLの２-モルホリノエチルアクリルアミド(０.２M濃度)と、１０６μLの３-モルホリノプロピルアクリルアミド(０.２M濃度)、２９４μLのN，N-ジメチルアミノエチルアクリルアミド(０.２M濃度)、および１７７μLのN，N-ジメチルアミノプロピルアクリルアミド(０.２M濃度)とを組み合わせることにより調製した。第１のモノマー溶液を、３.３０mlの脱イオン水および１３μLの１M酢酸の第２の溶液に加えた。次いで、合わせた溶液を、１００mlの水に溶解した２８.８gのアクリルアミドおよび１.２gのN，N'-メチレンビスアクリルアミドを含む第３の溶液の３.３３mlと混合した。次いで、得られた混合物を、４mgの過硫酸アンモニウムおよび５μLのN，N，N'，N'-テトラメチルエチレンジアミンを含む第４の溶液と組み合わせて、４℃〜６℃の温度で迅速に混合した。
【００４２】
モノマーと重合触媒との得られた溶液を、デキストラン皮膜した酸化ジルコニウムの固体の、多孔質ビーズ（商標名HYPERZ（商標）の下で、Ciphergen Biosystems、Inc.(Fremont、CA)から販売されている）と、ビーズの多孔質容積が実質的に溶液全てを吸収するのに十分な量で混合した。ビーズを、真空下、酸素パージし、窒素雰囲気下に置いた。次いで、混合物を、窒素雰囲気下、５０℃で、２時間加熱した。次いでビーズを、充分に水洗して、非共重合材料および副生成物を取り除いた。次いで、洗浄したビーズを、滴定カーブで特徴付け、前端分析を用いて、帯電基の数を測定した。得られた複合ビーズは、pIが７.０であることを確認した。
【００４３】
実施例４:pIが７.０の酸化ジルコニウム等電性ビーズの調製(高電荷)
アクリルアミドモノマーの第１の水溶液は、１０mlの水と、１７５mgのN-アクリロイルグリシン溶液、１.３４gの４-アクリルアミド酪酸、６９０mgの２-モルホリノエチルアクリルアミド、３８０mgの３-モルホリノプロピルアクリルアミド、７５０μLのN，N-ジメチルアミノエチルアクリルアミド、および５００mgのN，N-ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを組み合わせることにより調製した。溶液のpIを、１Mの酢酸を用いて７.０に調整し、その後、１５０mgのN，N'-メチレンビスアクリルアミドおよび１.５gのアクリルアミドを溶液に加えた。次いで、混合物の容積を、脱イオン水で３０mlに調整し、１２mgの過硫酸アンモニウム、および１５μLのN，N，N'，N'-テトラメチルエチレンジアミンを加え、この組み合わせを、４℃〜６℃で迅速に混合した。
【００４４】
モノマーと重合触媒との得られた溶液を、デキストラン皮膜した酸化ジルコニウムの固体の、多孔質ビーズ（商標名HYPERZ（商標）の下で、Ciphergen Biosystems、Inc.(Fremont、CA)から販売されている）と、ビーズの多孔質容積が実質的に溶液全てを吸収するのに十分な量で混合した。ビーズを、真空下、酸素パージし、窒素雰囲気下に置いた。次いで、混合物を、窒素雰囲気下、５０℃で、２時間加熱した。次いでビーズを、充分に水洗して、非共重合材料および副生成物を取り除いた。次いで、洗浄したビーズを、滴定カーブで特徴付け、前端分析を用いて、帯電基の数を測定した。得られた複合ビーズは、pIが７.０であることを確認した。
【００４５】
実施例５:pIが７.０の酸化ケイ素の等電性ビーズの調製
アクリルアミドモノマーの第１の水溶液は、２mlの水と、７５μLのN-アクリロイルグリシン溶液(０.２M濃度)、４７５μLの４-アクリルアミド酪酸(０.２M濃度)、２０８μLの２-モルホリノエチルアクリルアミド(０.２M濃度)、１０６μLの３-モルホリノプロピルアクリルアミド(０.２M濃度)、２９４μLのN，N-ジメチルアミノエチルアクリルアミド(０.２M濃度)、１７７μLのN，N-ジメチルアミノプロピルアクリルアミド(０.２M濃度)とを混合することにより調製した。得られたモノマー溶液を、３.３mlの脱イオン水、１３μLの１M酢酸から製造した第２の溶液と、１００mlの水に溶解した２８.８gのアクリルアミドおよび１.２gのN，N-メチレンビスアクリルアミドを含有した第３の溶液の３.３mlと組み合わせた。得られた溶液に、４mgの過硫酸アンモニウムおよび５μLのN，N，N'，N'-テトラメチルエチレンジアミンを加えて、４℃〜６℃で迅速に混合した。
【００４６】
モノマーと重合触媒との得られた溶液を、デキストラン皮膜したシリカの固体の、多孔質ビーズと、ビーズの多孔質容積が実質的に溶液全てを吸収するのに十分な量で混合した。ビーズを、真空下、酸素パージし、窒素雰囲気下に置いた。次いで、混合物を、窒素雰囲気下、５０℃で、２時間加熱した。次いでビーズを、充分に水洗して、非共重合材料および副生成物を取り除いた。次いで、洗浄したビーズを、滴定カーブで特徴付け、前端分析を用いて、帯電基の数を測定した。得られた複合ビーズは、pIが７.０であることを確認した。
【００４７】
実施例６:リジンからの等電性ビーズの調製
約１００gのアガロース-ジルコニア複合ビーズを、室温で、５０mlの０.５M水酸化ナトリウム水溶液と混合した。振とう下で、４mlの臭化アリル(Sigma-Aldrich Corp.、St.Louis、MOから入手可能)を加え、攪拌を、約１２時間(一晩)継続した。次いで、アリル化ビーズを濾別して、脱イオン水で充分に洗浄し、水抜きし、５０mlの脱イオン水と室温で、攪拌により混合した。５グラムのN-ブロモコハク酸イミド(Sigma-Aldrich Corp.、St.Louis、MOから入手可能)を、縣濁液に加え、約５分後、８.３gの臭化カリウム(Sigma-Aldrich)をさらに、攪拌した混合物に加えた。縣濁液のpIを、３.７〜３.９の値に低減し、６０分間、この範囲の値に維持した。次いで、得られた臭素化ジルコニアビーズを、ろ過により集めて、充分に水洗し、５０mlの脱イオン水中に再縣濁した。この縣濁液に、４グラムのL-リジンを加え、縣濁液のpIを、９〜１０の値に、速やかに調整し、約２時間、室温で維持した。共有結合したリジンを担持する所望のジルコニアビーズを、充分に水洗し、あらゆる未反応材料および副生成物を取り除いた。ビーズを、滴定カーブと帯電基の数により特徴付けて、等電点が８.２であると決定した。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、成分の等電点に基づいて混合物の成分を分離するための、本発明の粒子(非表示)を含んでなる本発明の装置の図である。
【図２】図２は、直列配列で結合した本発明に係る幾つかの装置を含む本発明の実施形態の図である。
【図３】図３は、本発明に係る複数のチャンバを有する等電点電気泳動装置の図である。
【図４Ａ】図４Ａは、pI値が８.５である本発明の粒子を用いた、pH＝１０.０でのオバルブミン(“O”)、シトクロム c(“C”)、およびリソチーム(“L”)の溶出順序を図示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、pI値が８.５の本発明の粒子を用いた、pH＝８.０でのオバルブミン(“O”)、シトクロム c(“C”)、およびリソチーム(“L”)の溶出順序を図示している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、pI値が８.５である本発明の粒子を用いた、pH＝７.０でのオバルブミン(“O”)、シトクロム c(“C”)、およびリソチーム(“L”)の溶出順序を図示している。
【図４Ｄ】図４Ｄは、pI値が８.５である本発明の粒子を用いた、pH＝５.０でのオバルブミン(“O”)、シトクロム c(“C”)、およびリソチーム(“L”)の溶出順序を図示している。
【符号の説明】
【００４９】
１００  装置
１０２  容器
１０４  入口
１０６  出口
１０８  分離区域
１１２  分離前区域
１１４  分離後区域
２０２  分析用混合物
２０６、２０８、２１０  装置
２１２、２１４、２１６  連結器
２３０、２３２、２３４  受け器
３００  装置
３０２  ハウジング
３０４  入口
３０６  出口
３１０、３１２、３１４  分離域
３１６、３１８、３２０、３２２、３２４  チャンバ
【図１】
2007529309.tif 000004
【図２】
2007529309.tif 000005
【図３】
2007529309.tif 000006
【図４Ａ】
2007529309.tif 000007
【図４Ｂ】
2007529309.tif 000008
【図４Ｃ】
2007529309.tif 000009
【図４Ｄ】
2007529309.tif 000010
【国際調査報告】
2007529309.tif 000011
2007529309.tif 000012
2007529309.tif 000013
2007529309.tif 000014