(57)【要約】  抗腫瘍剤に耐性を有して発達した腫瘍を処置するための、式（Ｉ）のインドール化合物の一群の使用について、開示する。式（Ｉ）の化合物は、薬物耐性に影響を受けた腫瘍を処置するため、単剤療法で使用されてもよく、また、上述の抗腫瘍剤の作用の相乗効果的な促進剤として共治療（ｃｏ−ｔｈｅｒａｐｙ）で使用されてもよい。加えて、促進されるべき活性の抗腫瘍剤と関連付けられた式（Ｉ）に示すインドール誘導体を有する製剤組成物についても、述べる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）の化合物
【化１】
2007535521.tif 000011
の、抗腫瘍剤に対する耐性を処理するのに有用な薬剤の調製における使用であって、
Ｘは、−ＣＨ−、又は−Ｎ−から選択され；
Ａは、以下の基
【化２】
2007535521.tif 000012
又は
【化３】
2007535521.tif 000013
から選択され、Ｒは、アルコキシ基又はヒドロキシアルコキシ基であり、
Ｒ’は、水酸基、アルコキシ基、ヒドロキシアルコキシ基又はハロゲンであり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン及びアルコキシ基から選択され；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素若しくはアルキル基、又はＲ３とＲ４とが互いに結合して窒素原子を有する複素６乃至８員環を形成したものから選択されるものであって、該環は、１つ以上のアルキル基で任意に置換され；
Ｒ５は、水素、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基、アミノアルキル基、任意で置換されたアリル基若しくはアリルアルキル基、任意で置換された複素環基若しくは複素環アルキル基、又はＲ５とＲ４とが窒素原子とともに結合して、Ｎ、Ｏ及びＳから選択された２以上のヘテロ原子を有する任意で置換された複素５乃至８員環を形成した基から選択され；
Ｒ６及びＲ７は、独立に、水素及びアルキル基から選択される；
ことを特徴とする化合物の使用。
【請求項２】
Ｒは、ＯＭｅ及びＯＥｔから選択されることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｒ’は、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＯｉＰｒ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、Ｃｌ及びＢｒから選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ１及びＲ２は、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＭｅ及びＨから選択されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ３及びＲ４は、メチル基、ゲム−ジメチル基、カルボキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ベンジル基及びオキサジアゾリルアルキル基から選択された１つ以上の置換基で任意に置換されたピペリジン環を共に形成することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
Ｒ４及びＲ５は、任意でＣｌ、ＯＨ又はＯＭｅで置換されたＭｅ又はフェニル基から選択された置換基で任意に置換されたピペリジン環を共に形成することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記式（Ｉ）の化合物は、（２Ｚ，４Ｅ）  Ｎ−（１，２，２，６，６−ペンタメチル−ピペリジン−４−イル）５−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−２−メトキシ−ペンタ−２，４−ジエナミド、４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−３−エトキシ−Ｎ−（２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−４−イル）−ベンザミド、４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−ベンジミダゾール−２イル）−３−エトキシ−Ｎ−（２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−４−イル）−ベンザミド、４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−３−エトキシ−Ｎ−ピペリジン−４−イル−ベンザミド、４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−３−エトキシ−Ｎ−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−ベンザミド、４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−３−メトキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−（２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−４−イル）−ベンザミドから選択されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
既に耐性を獲得した前記腫瘍は、消化器系、泌尿器系、中枢神経系、胸若しくは骨の腫瘍又はメラノーマであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
１つ以上の抗腫瘍剤で既に処理され、又は処理中の腫瘍の処置におけることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗腫瘍剤の活性を促進することを特徴とする請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
抗転移剤として、及び放射線療法における放射線感受剤としての、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記抗腫瘍剤は、アントラサイクリン類、カンプトテシン類、白金化合物及びタキサン類から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
抗腫瘍剤とともに請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物を有することを特徴とする製剤組成物。
【請求項１４】
前記抗腫瘍剤は、アントラサイクリン類、カンプトテシン類、白金化合物及びタキサン類から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の製剤組成物。
【請求項１５】
注射可能溶液、注入用溶液、吸入用溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシール、点滴、座剤、可能なコーティングを施した錠剤、硬若しくは軟カプセル、マイクロカプセル、顆粒又は分散可能粉末の形態であることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の製剤組成物。
【請求項１６】
１ｍｇ以上１０００ｍｇ以下の前記式（Ｉ）の化合物を有する投与単位の形態であることを特徴とする請求項１３乃至１５のいずれか一項に記載の製剤組成物。
【請求項１７】
０．１ｍｇ以上１０００ｍｇ以下の前記抗腫瘍剤を有する投与単位の形態であることを特徴とする請求項１３乃至１６のいずれか一項に記載の製剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍薬理学の分野に関する。抗腫瘍薬で前に処理されこの抗腫瘍薬に対して耐性を生じた腫瘍を処置するためのインドール誘導体の使用について、述べる。
【背景技術】
【０００２】
全身的な腫瘍治療には、異なるクラスに属する数多くの薬物の使用が含まれる。腫瘍細胞学の知見における実質的な進歩と特定の治療的診断に有用な可能性のある細胞標的の同定にも関わらず、現代の医療において最も効果的な薬物としては、細胞毒性を有する薬物を使用し続けている。これらの薬物は、ＤＮＡ機能や細胞の複製などの重要な細胞プロセスに影響を与えることにより、作用するものであって、高い細胞毒性又は抗増殖活性を有する。この理由から、これらの薬物の重要な欠点は、その毒性と、低い治療指数とである。しかしながら、従来の抗腫瘍剤の最も重要な制約は、固形の腫瘍の大部分自体に生じる細胞薬物耐性の現象である。事実、従来からの治療が有意な数の生存率をもたらすいくつかの例外（リンパ腫、白血病、精巣腫瘍）を除いて、進行段階にあるヒトの腫瘍は、治療的な障害に関与する耐性状態へと発達する。これらの場合、高用量の意図的な処置や毒性を軽減する補助的な治療であっても、有利な治療結果をもたらさなかった。従って、初期的に治療効果をもたらす先天的な耐性及び後天的な耐性は、抗腫瘍化学療法の本質的な問題である。細胞毒性機構又は特定の様式を用いて腫瘍の発達を制御し得る新規の分子の探索に加えて、薬理治療の効果を向上させる有望な戦略は、細胞毒性治療処置の間における腫瘍の防御及び生存能を遮断し得る分子の同定にあるようである。腫瘍細胞の薬物耐性は、複雑且つ多因子性の現象である。腫瘍細胞における特定の変化は、薬物の標的（例えば、ＤＮＡトポイソメラーゼ）の発現を改変し得るし、或いは細胞毒性の障害を修復する能力を増加し得るし、（例えば、抗アポトーシス因子の過剰発現を介して）アポトーシスの可能性を減弱し得る。これらの変化のすべては、腫瘍細胞の生存能力を増加させることに関連する。また、腫瘍細胞では、その発達工程の間、固形の腫瘍のかさばった質量の典型例である無酸素／酸性環境など、好ましくないストレスの多い条件において生存及び増殖を可能とし、且つ遺伝毒性的な障害など可能性のある致死的な障害に耐え得る防御能が増加される。薬物の細胞間濃度を減少させる役割を演じ、或いは薬物と細胞間標的との相互作用を妨害する細胞内局在化の役割を演じる種々の防御因子（輸送系、液胞性ＡＴＰアーゼ）の発現は、先天的な耐性の典型例である多因子性耐性を伴った現象を特徴とする。従って、良好に許容された薬剤（ｗｅｌｌ−ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ａｇｅｎｔ）を用いた上述の防御機構を目的とした薬理的診断では、毒性を実質的に増加させることなく細胞毒性を有する薬物の効果を向上させる有意な治療的利点を発生させる必要がある（非特許文献１）。
【０００３】
腫瘍細胞における薬物耐性（多剤耐性；ＭＤＲ）の現象は、従って、薬物処置に対する耐性の発達を特徴とし、化学療法の主要な障害である。
【０００４】
多くの治療上の事例（非特許文献２及び３）が示すように、腫瘍におけるＭＤＲ現象は、細胞毒性を有する種々の薬剤の蓄積を減少させるＡＢＣトランスポーターファミリーに属するタンパク質（Ｐ−グリコプロテイン又はＰｇＰ、ＭＤＲ、ＭＲＰ、ＢＣＲＰ等）の過剰発現に関連する。このＭＤＲ現象は、細胞膜上又は腫瘍細胞内に見出されるその他のタンパク質の発現変化に関連する場合もあり、この蛋白としては、ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ（非特許文献４）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（非特許文献５）、カタラーゼ（非特許文献６）、液胞性ＡＴＰアーゼ（Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）（非特許文献７）がある。
【０００５】
高度に効果的な抗腫瘍化合物は、いわゆる「非マクロライド（ｕｎｕｓｕａｌ  ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ）」クラス（バフィロマイシンＡ１、コンカナマイシン）に見出されており、このマクロライドは、サリチル酸（サリチルハラミド、ロバタマイド（ｌｏｂａｔａｍｉｄｅ）、オキシミジン（ｏｘｉｍｉｄｉｎｅ）及びアピクラレン（ａｐｉｃｕｌａｒｅｎ））に由来する。最近の文献で示されるように、これらの製品は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて腫瘍細胞の成長を阻害し得る（非特許文献８及び９）。しかしながら、これらの製品に関する研究は、未だ進行中であって、この天然製品の利用し得ない十分量と、これらを得る合成方法が、利用可能であったとしても、非常に長く、非常に複雑で、非常に高価であるという事実とに起因して、困難である。これらの困難は、上述のマクロライドのいくつかにおける公知の先天的な毒性と共に、治療においてこれらの可能性のある使用を制限するものである。
【０００６】
特許文献１乃至４は、骨粗鬆症、ウィルス疾患、潰瘍、自己免疫疾患、高コレステロール症、動脈硬化、アルツハイマー病、血管新生関連疾患、関節リューマチ、糖尿病性網膜症、乾癬及び腫瘍などの種々の疾患を処置するのに有用な新規のインドール誘導体について、述べる；抗腫瘍剤への耐性を処置するため、これらの製品の使用については、述べておらず、抗腫瘍剤の活性を協調的に促進するため、公知の抗腫瘍剤と組み合わせて治療することについても、述べていない。
【特許文献１】国際公開第９８／０１４４３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／３３８２２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／０２３８８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／００５８７号パンフレット
【非特許文献１】Ｒ．Ｌ．Ｓｏｕｈａｍｉ、Ｉ．Ｔａｎｎｏｃｋ、Ｐ．Ｈｏｈｅｎｂｅｒｇｅｒ、及びＪ．Ｃ．Ｈｏｒｉｏｔ編、「Ｏｘｆｏｒｄ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（第２版）」、２００２年、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献２】Ｈｉｒｏｓｅ  Ｍ．著、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００３年、５０巻、ｐ．１２６〜１３５
【非特許文献３】Ｌｉｎ  Ｊ．Ｈ．著、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．、２００３年、３５巻、ｐ．４１７〜４５４
【非特許文献４】Ｊａｒｖｉｎｅｎ  Ｔ．Ａ．著、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．、２００３年、７８巻、ｐ．２９９〜３１１
【非特許文献５】Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  Ｄ．Ｍ．著、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００３年、２２巻、ｐ．７３６９〜７３７５
【非特許文献６】Ｔｏｍｅ  Ｍ．Ｅ．著、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００１年、６１巻、ｐ．２７６６〜２７７３
【非特許文献７】Ｔｏｒｉｇｏｅ  Ｔ．著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００２年、２７７巻、ｐ．３６５３４〜３６５４３
【非特許文献８】Ｂｏｙｄ  Ｍ．Ｒ．著、Ｊ．Ｐ．Ｅ．Ｔ．、２００１年、２９７巻、ｐ．１１４〜１２０
【非特許文献９】Ｂｏｗｍａｎ  Ｅ．Ｊ．著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、２７８巻、ｐ．４４１４７〜４４１５２
【非特許文献１０】Ｏｕａｒ  Ｚ．著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２００３年、３７０巻、ｐ．１８５〜１９３
【非特許文献１１】Ｏｈｔａ  Ｔ．著、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９９８年、１８５巻、ｐ．３２４〜３３０
【非特許文献１２】Ｎａｋａｓｈｉｍａ  Ｓ．著、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）、２００３年、１３４巻、ｐ．３５９〜３６４
【非特許文献１３】Ａｌｔａｎ  Ｎ．著、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９８年、１８７巻、ｐ．１５８３〜１５９８
【非特許文献１４】Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｚａｇｕｉｌａｎ  Ｒ．著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９９年、５７巻、ｐ．１０３７〜１０４６
【非特許文献１５】Ｃｈａｎ  Ｋ．著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８６年、１５７巻、ｐ．３７５〜３８０
【非特許文献１６】Ｃｉｄｏｎ  Ｓ．著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８３年、２５８巻、ｐ．２８９２〜２８９８
【非特許文献１７】Ｋｅｒｎ  Ｄ．Ｈ．著、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９８８年、４８巻、ｐ．１１７〜１２１
【非特許文献１８】Ｄｒｅｗｉｎｋｏ  Ｂ．著、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９７６年、１巻、ｐ．１８７〜１９５
【非特許文献１９】Ｐｒａｔｅｓｉ  Ｇ．著、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９１年、６３巻、ｐ．７１〜７４
【非特許文献２０】Ｃｏｒｔｉ  Ｃ．著、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９９６年、１２２巻、ｐ．１５４〜１６０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
先行技術を考慮すると、抗腫瘍剤耐性に対抗する新規の処置が強く望まれている。特に、古典的な抗腫瘍剤に耐性となった腫瘍細胞を感受性とし得る処置法が望まれており、これにより、抗腫瘍処置がより効果的となる。加えて、公知の抗腫瘍剤の活性を増加し得る製剤組成物も、望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
薬剤耐性及びこれに関連した腫瘍の処置に有用な一群の化合物について、特定した。これらの化合物は、下記の式（Ｉ）で定義される。
【０００９】
【化４】
2007535521.tif 000002
【００１０】
Ｘは、−ＣＨ−、又は−Ｎ−から選択され、Ａは、以下の基から選択される。
【００１１】
【化５】
2007535521.tif 000003
【００１２】
【化６】
2007535521.tif 000004
【００１３】
Ｒは、アルコキシ基又はヒドロキシアルコキシ基であり、Ｒ’は、水酸基、アルコキシ基、ヒドロキシアルコキシ基又はハロゲンであり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン及びアルコキシ基から選択され、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素若しくはアルキル基、又はＲ３とＲ４とが互いに結合して窒素原子を有する複素６乃至８員環を形成したものから選択され、この環は、任意で、１つ以上のアルキル基の置換体であってもよく、Ｒ５は、水素、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基、アミノアルキル基、任意で置換されたアリル基若しくはアリルアルキル基、任意で置換された複素環基若しくは複素環アルキル基、又はＲ５とＲ４とが窒素原子とともに結合して、Ｎ、Ｏ及びＳから選択された２以上のヘテロ原子を有する任意で置換された複素５乃至８員環を形成した基から選択され、Ｒ６及びＲ７は、独立に、水素及びアルキル基から選択される。
【００１４】
上述の式（Ｉ）に示す化合物及びその製造方法については、上述の特許文献１乃至４に記載されている。
【００１５】
式（Ｉ）に示す化合物は、公知の抗腫瘍剤耐性に発達した腫瘍の成長を阻害するのに特に効果的である；また、この化合物は、薬剤活性用量よりも低い用量において、トポテカン、タキソール、ＳＮ３８、ドキソルビシン及びシスプラチンなどの公知の抗腫瘍剤の活性を協調的に促進し得る：この促進に関する最も顕著な知見は、薬剤耐性腫瘍の場合に見出され、従って、抗腫瘍効果を促進する最も必要な条件下において、特に顕著なものである。
【００１６】
これらの偶然の活性を考慮すると、上述の化合物は、従って、薬剤耐性で影響を受けた腫瘍を処置するのに、単一治療と、公知の抗腫瘍剤の作用の協調的促進剤としての共治療との療法において、有用である；後者の処置は、既に処置されると共に従来の抗腫瘍剤の処置を行っている、上述の従来の抗腫瘍剤に耐性を形成した患者の場合に効果的である。
【００１７】
本発明の化合物は、多くの腫瘍で見出されている公知の現象である放射線療法に対する耐性を低減する放射線増感剤としても、有用である。
【００１８】
さらに、単独又は公知の抗腫瘍剤と組み合わせてｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける化学侵入（ｃｈｅｍｏｉｎｖａｓｉｏｎ）及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける転移を軽減する本発明の化合物の能力は、転移が癌に由来する死亡の主因の一つで有ることを考慮すると、新規の抗腫瘍剤として有用な特性を示すものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
上述の式（Ｉ）において、フリー、又はアルコキシ、ヒドロキシアルコキシ、ヒドロキシアルキルなどの他の置換基を有する全てのアルキル基は、炭素数１〜６の直鎖又は分岐のアルキル基であり、好ましくは炭素数１〜４であり、さらに好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基及びｉ−プロピル基である。
【００２０】
上述のハロゲン基において、意図されているハロゲン基としては、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素から選択されるものであり、好ましくは、塩素又は臭素である。
【００２１】
上述の任意の置換基において、他に示されていない場合には、この任意の置換基は、上述のアルキル基、ケト基、アリル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアリル基から好ましく選択される。
【００２２】
単一の置換基に有用なものとしては、以下の通りである：
Ｒは、ＯＭｅ、ＯＥｔから好ましく選択され、
Ｒ’は、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｉＰｒ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、Ｃｌ及びＢｒから好ましく選択され、
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、ＯＭｅ、Ｃｌ、Ｂｒから好ましく選択され、
Ｒ４は、上述したように、Ｒ３又はＲ５と複素環を形成してもよい（上述の式（Ｉ）において、Ｒ４は、Ｒ３又はＲ５のいずれかと複素環を形成してもよいが、同時に両方の置換基と形成するものことを意図するものではない）。
【００２３】
Ｒ４がＲ３と複素環を形成する場合、最も好適な複素環は、１つ以上の置換基で置換された、又は無置換のピペリジン環であることが好ましく、この置換基としては、メチル基、カルボキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ベンジル基、オキサジアゾリルアルキル基から選択されたものであり、特に好ましくは、ピペリジン環の窒素原子に隣り合った位置において２つのゲム−ジメチル基（ｇｅｍ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｇｒｏｕｐ）で置換されたピペリジン環である。
【００２４】
Ｒ４がＲ５と複素環を形成する場合、最も好適な複素環は、無置換、又は４位で、メチル基、フェニル基、クロロフェニル基、ヒドロキシフェニル基、メトキシフェニル基から選択された置換基で置換されたピペリジン環である。
【００２５】
Ｒ６及びＲ７は、Ｈ又はメチル基から好ましく選択される。
【００２６】
本発明に好適な具体的な化合物としては、以下に示すものである。
【００２７】
【化７】
2007535521.tif 000005
【００２８】
【化８】
2007535521.tif 000006
【００２９】
式（Ｉ）の化合物の調製方法は、特許文献１乃至４に十分に述べられており、これらの文献を参照して取り込む。
【００３０】
式（Ｉ）の化合物は、抗腫瘍剤に耐性を有する場合の処置に有利に使用され得る。これにより、上述の抗腫瘍剤に部分的又は全体的に感受性を喪失する腫瘍の処置に良好且つより有用となる。
【００３１】
従って、本発明の態様は、抗腫瘍剤に耐性を有する場合の処置に有用な薬剤の調製において１種類以上の式（Ｉ）の化合物を使用することである。本発明の別の態様は、抗腫瘍剤に耐性を有する場合の処置方法であって、これを必要とする患者に１種類以上の式（Ｉ）の化合物を投与することを特徴とする。
【００３２】
上述の処置は、これらの腫瘍及び抗腫瘍剤の処置後に耐性を獲得した患者の腫瘍の集団を治癒することであって、後者の処置は、式（Ｉ）の化合物の投与が完了されている、或いは既に進行されているものである。
【００３３】
式（Ｉ）の化合物の投与は、耐性が発生している場合に対して、抗腫瘍剤の投与と組み合わせて、又は抗腫瘍剤の投与の後に、行われてもよく、組み合わせて投与する場合、式（Ｉ）の化合物及び抗腫瘍剤は、同様の製剤組成物中に含まれることが好ましい。
【００３４】
種々の薬物耐性を惹起可能で、式（Ｉ）の化合物と組み合わせて処理するのに有用な従来の抗腫瘍剤の例としては、アントラサイクリン類（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ミトキサトロン）、カンプトテシン類（例えば、トポテカン、イリノテカン）、白金化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）及びタキサン類（例えば、タキソール及びタキソテール）が挙げられる。
【００３５】
耐性現象と関連した腫瘍は、ＭＤＲ現象を担う輸送系に高発現するものであって、ＢＣＲＰ及びＰｇＰなどが挙げられ：腫瘍の例としては、胃、結腸、肝臓及び膵臓の癌腫、泌尿器系の腫瘍、ニューロブラストーマやグリオーマなどの中枢神経系の腫瘍、乳癌、骨癌及びメラノーマなどが挙げられる（非特許文献１０乃至１４）。
【００３６】
式（Ｉ）の化合物は、所望の効果、患者の全身状態、問題となる腫瘍の寸法の程度に応じた用量限度の範囲内で投与されればよい。有用で、非限定的用量限度としては、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇである。
【００３７】
投与経路は、上述と同様の考慮に従い、且つ活性本体の吸収性及びキャリアとしての能力に依存して、選択され、静脈、筋肉内、皮下、経皮、経口、局所、吸入などの経路から無関係に選択され得る。
【００３８】
本発明の更なる態様は、可能であれば、適当な製薬的賦形剤の存在下で、上述の１種類以上の式（Ｉ）の化合物が１種類以上の抗腫瘍剤と組み合われた製剤組成物からなる。これらの組成物は、式（Ｉ）の化合物の効力により、促進された抗腫瘍効果を呈する。
【００３９】
これらの製剤組成物の投与単位は、１〜１０００ｍｇの式（Ｉ）の化合物を含有し、この投与単位は、患者において、単位キロ当たり好ましくは上述の限度の範囲内で達成されるように、投与される。
【００４０】
式（Ｉ）の化合物と共にこの組成物に存在する従来の抗腫瘍剤は、活性であると既に知られている通常の量、又は本発明で得られる協調的な促進効果の考慮により可能なより少ない量で、使用される。上述の投与単位の式（Ｉ）の化合物と組み合わせた抗腫瘍剤に関する非限定的な参照限度として、０．１〜１０００ｍｇの範囲が挙げられる。
【００４１】
本発明の製剤組成物は、上述の種々の投与経路に適合され得るものであって、注射可能溶液、注入用溶液、吸入用溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシール、点滴、座剤、可能なコーティングを施した錠剤、硬若しくは軟カプセル、マイクロカプセル、顆粒、分散可能粉末などの形態であってもよい。
【００４２】
本発明の組成物に含有される賦形剤は、製薬技術に通常使用されるものであって、当業者公知の様式（ｍｏｄｅ）及び用量で使用され得る。
【００４３】
経口投与用の錠剤及びカプセルなどの固形投与形態は、投与単位ごとに通常供給される。これらには、結合剤、フィラー、希釈剤、錠剤化剤、潤滑剤、界面活性剤、崩壊剤、色素及び湿潤剤などの従来の賦形剤が含まれ、当業者公知の方法に従って、コーティングされてもよい。
【００４４】
フィラーとしては、例えば、セルロース、マンニトール、ラクトース及び同様の化合物が挙げられる。崩壊剤としては、スターチ、ポリビニルピロリドン、グリコール酸スターチナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔａｒｃｈ  ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）などのスターチ誘導体が挙げられる；潤滑剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウムが挙げられる；湿潤剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００４５】
これらの固形の経口用の組成物は、従来の混合、充填又は錠剤化方法で調製され得る。混合方法は、大量のフィラーを含有する組成物中で活性本体を分散するように、繰り返されてもよい。これらは、通常の作業である。
【００４６】
水又適当なキャリアで再構築されるべき乾燥製品の形態などの場合、使用時に液体の調製物としてもよい。これらの液体の調製物は、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル又は水素化食用油脂などの懸濁剤、レシチン、ソルビタンモノラウリル酸又はアカシアなどのエマルジョン化剤、アーモンド油、分画されたココナッツ油、グリセリンエステル、プロピレングリコール若しくはエチルアルコールなどの油状エステルなどの非水キャリア（食用油を含んでもよい）、メチル若しくはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート若しくはソルビン酸などの保存料、及び所望であれば従来の香料や色素を、含有してもよい。
【００４７】
経口用の処方は、腸溶コーティング錠剤又は顆粒などの長期にわたって放出する従来の処方を有してもよい。
【００４８】
非経口投与用に、上述の化合物及び滅菌キャリアを有する流動性の投与単位を調製してもよい。キャリア及び濃度に依存して、この化合物は、懸濁されてもよく、溶解されてもよい。非経口用溶液は、適当なバイアル又はアンプルに充填される前、及びシーリングを施す前に、キャリアに上述の化合物を溶解し、濾過滅菌されて、通常調製される。局所麻酔剤、防腐剤及び緩衝剤などのアジュバントは、このキャリアに有利に溶解される。安定性を向上させるため、本発明の組成物は、バイアルに充填され吸引下で水分が除去された後で、凍結されてもよい。非経口用の懸濁剤は、化合物がキャリアに溶解されるよりも懸濁され得ること、及び滅菌キャリアに懸濁される前にエチレンオキサイドに曝露されて滅菌され得る以外は、上述の同様の方法で本質的に調製される。界面活性剤又は保湿剤は、本発明の化合物の均一な分布を促進するため、組成物に有利に含有されてもよい。
【００４９】
一般的な慣習であるように、本発明の組成物は、関連する処置における使用に関して、取扱説明書を通常添付される。
【実施例】
【００５０】
以下の実験方法は、本発明を限定する目的ではなく、本発明の化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性を示すものである。
【００５１】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける検討）
１．生化学
１．１  ヒト骨巨細胞腫（ｈＯｃ）における液胞性ＡＴＰａｓｅの阻害の同定
ヒト骨巨細胞腫より単離した破骨細胞様の巨細胞を、ガラス−テフロン（登録商標）製のホモジナイザーでホモジナイズし（１０００ｒｐｍ）、この材料を、６０００ｇで２０分間遠心分離する。得たペレットを再懸濁し、ミクロソーム画分を沈殿させるように、１０００００ｇで６０分間遠心分離する。得たペレットを、ｐＨ７．４の培地中で再懸濁し、液体窒素下で保存する。
【００５２】
９６穴のプレート中で、ヒト骨巨細胞腫のミクロソーム画分を、３７℃で３０分間インキュベートして、無機リン酸の放出を測定することで、バフィロマイシン感受性のＡＴＰａｓｅ活性の阻害を測定する。この反応媒体は、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）、５０ｍＭのＫＣｌ、５μＭのバリノマイシン、５μＭのニゲリシン（ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ）、１ｍＭのＣＤＴＡ−Ｔｒｉｓ、１００μＭのモリブデン酸アンモニウム、０．２Ｍのスクロース及び上述のミクロソーム画分（２０μｇタンパク／ｍＬ）を含有する。この反応は、ＭｇＳＯ４を添加して開始し、３０分後、非特許文献１５に従って調製した４倍量のマラカイトグリーン（ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ）試薬を添加して停止される。
【００５３】
１．２  ウシクロム親和性細胞膜（ＢＣＧ）における液胞性ＡＴＰａｓｅの阻害の同定
約２０の副腎を健常なウシより採取し（非特許文献１６）、その髄質を皮質からすばやく分離し、皮質を捨てる。この髄質を、ｐＨ７．５の適当な媒体を用いて、４℃でホモジナイズし、その後濾過する。得た固形の材料を、さらにホモジナイズし、濾過し、先の濾液と混和し、再懸濁し、１０００ｇで５分間遠心分離する；得た上清を、１００００ｇで２０分間遠心分離する。得たペレットを再懸濁し、下層を１５ｍＬの１．５Ｍスクロースとし上層を１０ｍＬの１．２Ｍスクロースとしたスクロースグラジエントを形成して層化する。ＳＷ２８ローターを用いて２００００ｒｐｍ、４℃で一昼夜遠心分離した後、クロム親和性細胞がペレットに堆積する。後者を再懸濁し、３０００ｇで１０分間遠心分離し、得た上清を、２０００００ｇで６０分間遠心分離する。そのペレットを、０．２μｇ／ｍＬのペプスタチンＡ及び０．４μｇ／ｍＬのロイペプチンを含有する適当な媒体４ｍＬに再懸濁し、液体窒素下で保存する。
【００５４】
ＡＴＰａｓｅ阻害の測定方法は、骨巨細胞腫用のものと同様である。
【００５５】
２．細胞薬理学
２．１  細胞株及び培養条件
ヒト結腸癌
ＨＴ２９及びＨＴ２９／Ｍｉｔ（ミトキサントロンに長時間曝露して得た細胞株であって、ＢＣＲＰを過剰発現することを特徴とし、トポテカン、イリノテカン及びその代謝産物であるＳＮ３８に交差耐性を有するもの）を、１０％ＦＣＳを含有するＭｃＣｏｙ５Ａ培地で保持する。
【００５６】
Ｌｏｖｏ及びＬｏｖｏ／Ｄｘ（ドキソルビシンに長時間曝露して得た細胞株であって、Ｐグリコプロテインを過剰発現することを特徴とし、ドキソルビシンに耐性を有するもの）を、１０％ＦＣＳを含有するＨＡＭ−Ｆ１２培地に保持する。
【００５７】
ＨＣＴ１１６を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に保持する。
【００５８】
ヒト神経芽細胞腫
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）を、１０％ＦＣＳを含有するＨＡＭ−Ｆ１２培地に保持する。
【００５９】
ヒト肝癌細胞
ＨｅｐＧ２を、１０％ＦＣＳ含有ＥＭＥＭ培地に保持する。
【００６０】
ヒト卵巣癌細胞
Ａ２７８０細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に保持する。
【００６１】
ヒト肺癌細胞
Ｈ４６０細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に保持する。
【００６２】
２．２  抗増殖活性実験のスキーム（処理時間７２時間）
各細胞（ＨＴ２９、ＨＴ２９／Ｍｉｔ（４０，０００細胞／ｍＬ）、Ｌｏｖｏ、Ｌｏｖｏ／Ｄｘ及びＨＣＴ１１６（５０，０００細胞／ｍＬ））を、９６穴プレート中に１００μＬの培地で播種する。播種後２４時間後、種々の濃度の薬剤の一部（１０μＬ）を添加する。２つの化合物の組み合わせの効果を試験するサンプルにおいて、細胞毒性を発現する前に阻害剤を添加する。用量／薬剤の各用量又は組み合わせに関し、処置の効果を４〜８個で同定する。
【００６３】
処置後７２時間において、スルフォルホダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを用いて抗増殖効果を検討する：各ウェルに２５μＬの５０％ＴＣＡを添加し、４℃で１時間保持して、細胞を固定する。水で洗浄し、乾燥させた後、１％酢酸中に０．４％のＳＲＢを含有する溶液の１００μＬを添加し、室温で３０分間保持する。１％酢酸で４回洗浄後、乾燥させ、タンパクで固定された色素を、１０ｍＭの冷Ｔｒｉｓの１００μＬ溶液の基本的な条件で溶解し、この溶液について、分光光度計を用いて、５５０ｎｍの吸光度を測定する。
【００６４】
データ解析
コントロール（未処理細胞）の光学密度に比較して、処理したサンプルの光学密度として、細胞成長の百分率を計算する。
【００６５】
１９８８年Ｋｅｒｎの方法（１９７６年のＤｒｅｗｉｎｋｏ  Ｂ．から続く者）に従って、以下の式により、組み合わせ指標（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ；Ｃ．Ｉ．）を同定した（非特許文献１７及び１８）：ＳＦａ及びＳＦｂを、それぞれ化合物ａ及びｂを用いた処理に生存する細胞画分とし、ＳＦａｂを、化合物ａと化合物ｂとの組み合わせに生存した細胞画分とした場合、（ＳＦａ＋ＳＦｂ）／ＳＦａｂで算出されるもの。この結果が１である場合、２つの化合物間の相互作用は、追加的なものであり、この値が１よりも大きい場合、２つの化合物間の相互作用は、協調的であり、この値が１未満の場合、２つの化合物間の相互作用は、阻害的である。
【００６６】
２．３  抗増殖活性実験のスキーム（処理時間４８時間）
各細胞（細胞濃度３０，０００細胞／ｍＬ）を、９６穴プレート中に９０μＬの培地で播種する。播種後２４時間後、種々の濃度の薬剤の一部（１０μＬ）を添加する（各濃度毎に３個ずつ）。処理４８時間後、抗増殖効果を、発光分析で評価する（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のＡＴＰｌｉｔｅを用いる）：
５０μＬの溶解溶液を、各ウェルに添加し、その後、ルシフェラーゼ及びＤ−ルシフェリンを含有する溶液を等量加える。代謝的に活性な細胞の全てに存在するＡＴＰは、ルシフェラーゼで触媒されるＤ−ルシフェリンの変換反応に供され、以下の式の発光信号を発生する：
ＡＴＰ＋Ｄ−ルシフェリン＋Ｏ２→オキシルシフェリン＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ＋ＣＯ２＋光
【００６７】
発生した発光（一秒当たりのカウントとして表示；ＣＰＳ）を、マイクロプレートシンチレーションアナライザー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ）により、測定する。
【００６８】
データ解析
コントロールに対する処置細胞における発光の阻害の百分率を算出する；Ｇｒａｆｉｔ  ｖ．５．０を用いて、濃度−反応曲線を解析する。
【００６９】
２．４  アポトーシス実験のスキーム
１．５×１０６細胞／サンプルを播種する。２４時間後、細胞を、上述の化合物で４８又は７２時間処理する。処置の終期において、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで剥がし、ＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）で洗浄し、１ｍＬの４％パラホルムアルデヒドを用い、室温で４５分間インキュベートする。
【００７０】
その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、透過化溶液（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（０．１％Ｔｒｉｔｏｎを含有する０．１％のクエン酸ナトリウム）で、氷中２分間再懸濁する。さらに洗浄した後、細胞を５０μＬのＴｕｎｅｌ反応混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）で再懸濁し、暗所、３７℃で１時間載置する。ＰＢＳで洗浄後、細胞を、ＰＢＳで再懸濁し、サイトフルオリメーター（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）で解析し、或いは蛍光顕微鏡で検討する。
【００７１】
２．５  放射実験のスキーム
ＨＴ２９細胞（５０，０００細胞／ｍＬ）を播種し、２４時間後、試験化合物の存在下及び不存在下で、１３７Ｃｓを線源として０．１３Ｇｙ／秒で照射した。処理７２時間後、接着細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、処置に係る細胞毒性効果を評価するように、カウントした。
【００７２】
２．６  転移及び浸潤のスキーム
Ｈ４６０細胞を、完全培地で播種し、異なる濃度の化合物で２４時間処理した。その後、細胞を回収し、以下の方法で、血清不含の培地中で、２４ウェルのトランスウェルチャンバー（コースター社製）に移動した。
【００７３】
転移アッセイ
上部チャンバーに１．２×１０５細胞／ｍＬで播種し、上述と同様の濃度の薬物を上部チャンバー及び下部チャンバーの両方に添加した。３７℃で４時間インキュベートした後、転移した細胞を、９５％エタノールで固定し、２％クリスタルバイオレット含有７０％エタノール溶液で染色し、倒立顕微鏡で、カウントした。
【００７４】
浸潤アッセイ
トランスウェルメンブレンを、１２．５μｇ／ウェルのマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ社製）でコートし、２４時間乾燥させた。その後、細胞を、２．４×１０５細胞／ウェルで、上部チャンバーの人工ベースメント膜（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）上に播種し、薬物を、上述の転移アッセイと同様に添加した。３７℃で２４時間インキュベートした後、マトリゲルに浸潤し、下部チャンバーに転移／移動（ｍｉｇｒａｔｅｄ）した細胞を染色し、上述の転移アッセイと同様に、カウントした。
【００７５】
２．７  結果
腫瘍細胞における抗増殖効果（単一処理）
表１乃至３（訳者註：原文では、「Ｔａｂｌｅ１」とあり、且つページをまたいで「Ｔａｂｌｅ１」が続いているが、表の作成の関係上、原文でいう「Ｔａｂｌｅ１」を以下の表１乃至３に分割した。したがって、以下、原文でいう「Ｔａｂｌｅ１」を表１と訳出するが、訳出された「表１」は、本明細書中では、表１乃至３を示すものである。）に結果を示す。
【００７６】
【表１】
2007535521.tif 000007
【００７７】
【表２】
2007535521.tif 000008
【００７８】
【表３】
2007535521.tif 000009
【００７９】
表１が示すように、本発明による例１乃至６の化合物は、使用したヒト腫瘍細胞株において、処理７２時間後（ＨＴ２９、ＨＴ２９／Ｍｉｔ、Ｌｏｖｏ、Ｌｏｖｏ／Ｄｘ及びＨＣＴ１１６）、並びに処理４８時間後（ＨｅｐＧ２、ＳＨＳＹ−５Ｙ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）及びＡ２７８０）、抗増殖活性を示す。特に、例２の化合物は、全ての腫瘍細胞株において、（公知の抗腫瘍剤に比較して非常に高い程度で）高い抗増殖能を示す。この抗増殖活性は、ＭＴ２９／Ｍｉｔ（ミトキサトロンに長時間曝露して得たものであって、ＢＣＲＰを過剰発現していることを特徴とし、トポテカン、イリノテカン及びその代謝産物であるＳＮ３８に交差耐性を示すもの）、及びＬｏＶｏ／Ｄｘ細胞株（ドキソルビシンに長時間曝露して得たものであって、Ｐグライコプロテインを過剰発現することを特徴とするもの）のうち、ＭＤＲ現象に関連した臨床的に興味のある細胞毒性を有する薬剤に耐性を有するヒト結腸癌細胞株で保持されている。
【００８０】
腫瘍細胞に対する抗増殖効果（公知の抗腫瘍剤と組み合わせて処理）
ＨＴ２９及びＨＴ２９／Ｍｉｔモデルにおいて、本発明による例２の化合物は、準毒性領域で準活性濃度（１μＭ未満）において、トポテカンの抗増殖活性を促進した。本発明による例２の化合物とトポテカンとの協調効果を、図１及び図２に示す。この実験は、ＨＴ２９／Ｍｉｔ細胞株（ミトキサントロン及びトポテカンに耐性を有するもの）を、トポテカンと、０．５μＭの例２の化合物（この濃度では、これ自体では細胞成長を阻害しない）とで７２時間共処理して行い、トポテカンの活性をかなり促進することが見出された（トポテカンのＩＣ５０が２０μＭよりも大きい値から４μＭとなった）。
【００８１】
Ｋｅｒｎによる組み合わせ指標（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）を算出した（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の２．２項参照）図２に示すように、トポテカンと、０．５μＭの例２の化合物とを組み合わせた場合、明確な協調効果が見られる。このグラフにおいて、トポテカンと、０．５μＭの例２の化合物とを組み合わせたさらなる実験を追加した。他の腫瘍細胞株であるＨＣＴ１１６細胞株において、例２の化合物は、準毒性領域で準活性濃度のシスプラチンとで、有意な協調効果を示した。また、ＬｏＶｏ細胞株において、例２の化合物と、タキソール、及びイリノテカンの活性代謝物であるＳＮ３８との間で、協調効果が観察された。ＳＮ３８との協調的相互作用は、ＭＤＲ表現型を示すＬｏＶｏ／Ｄｘにおいて、より顕著である。例２の化合物と、ドキソルビシン又はタキソールとの間においても、協調的相互作用が観察された。
【００８２】
例２の化合物は、ＨＴ２９細胞株において、高いレベルのアポトーシスを誘導する。
【００８３】
腫瘍細胞の転移及び浸潤に対する阻害効果
２４時間インキュベーション後の例２の化合物は、濃度依存的にＨ４６０の走化性を大幅に阻害した：阻害効果は、２．２μＭにおいて５１％であり、５．７μＭにおいて、９２％であった。さらに、例２の化合物は、マトリゲルアッセイにより評価したＨ４６０の化学浸潤（ｃｈｅｍｏｉｎｖａｓｉｏｎ）を非常に強力に阻害し、２．２μＭ及び５．７μＭにおいて、それぞれ９２％及び１００％であった。
【００８４】
（Ｉｎ  Ｖｉｖｏにおける検討）
１．１  ＨＴ２９／Ｍｉｔヒト結腸癌細胞異種移植片の抗腫瘍活性モデル
メスの無胸腺スイスヌードマウス（８〜１０週齢）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｃａｌｃｏ、イタリア）社製）を実験に使用した。この動物を、一定の温度と湿度に保持し、自由に飲食し得るようにした。この実験プロトコールは、ミラノのＩｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｚｉｏｎａｌｅ  Ｔｕｍｏｒｉの動物実験に関する倫理委員会に承認されたものである。
【００８５】
ＨＴ２９細胞及び／又はＨＴ２９／Ｍｉｔ細胞を移植した上述の無胸腺マウスモデルを用いて、本発明における化合物の抗腫瘍の有効性を検討した。この後者の種類は、トポテカン処理に強度に耐性を有するものである。この腫瘍細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した１０７個の細胞を皮下注により、ｉｎ  ｖｉｖｏに移植した。両側の皮下の腫瘍を有する５匹のマウスをランダム化したグループを、この実験に使用した。
【００８６】
トポテカン及びその他の公知の抗腫瘍剤（蒸留水又は適当な溶媒に溶解したもの）、及び本発明の化合物（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬと、エタノールと、生理食塩水とを５：５：９０で混合したもの、又は適当な溶媒に溶解した）を、検討すべき化合物の種類に応じた適当な様式で選択した処理スキームに従って、単独又は組み合わせて、３日目から経口的に投与した。
【００８７】
コントロールに対して比較した処置マウスにおける腫瘍の重量（又は容量）は、時間（Ｘ軸）に対してＹ軸に表記する。
【００８８】
１．２  Ｈ４６０ヒト非小型肺ガン細胞異種移植片の抗腫瘍活性及び抗転移活性モデル
上述のように、メスの無胸腺スイスヌードマウス（８〜１０週齢）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｃａｌｃｏ、イタリア）社製）を実験に使用した。
【００８９】
ａｓｃｉｔｉｓとして成長に適合させ、ｉ．ｐ．パッセージ（５×１０６細胞／マウスの０．５ｍＬＰＢＳ液）によりｉｎ  ｖｉｖｏで保持したヌードマウスに、Ｈ４６０細胞を、腹腔内で注射した（非特許文献１９）。詳しくは、ドナーであるマウスから接種後約７日目において、細胞を回収した。洗浄後、トリパンブルー排除能により、細胞数及び細胞のバイアビリティーを同定した。斯かる手法により、皮下注射又は静脈内注射に容易に適した単一の細胞懸濁液が得られる。
【００９０】
本発明の化合物及び／又はトポテカンの初代の腫瘍の成長及び自然発生的な肺転移に対する影響を、右の横腹に筋肉内注射でＨ４６０の腹水における腫瘍細胞（２×１０６／マウス）を接種したマウスにおいて検討した。各コントロール及び薬剤処置した群には、９〜１１匹のマウスが含まれる。筋肉内注射した腫瘍の成長を、腫瘍の寸法として、ノギスで２週間置きに測定した。１日目から８週間の間、経口的に薬剤処理を行った。トポテカンを１ｍｇ／ｋｇで投与し、本発明の化合物を３０ｍｇ／ｋｇで投与した；組み合わせ群において、本発明の化合物を、トポテカン処置のおよそ１時間後に投与した。コントロールのマウスは、薬物処置とともに、溶媒で経口的に処理した。
【００９１】
コントロールのマウスに対する薬物処理したマウスにおける薬物処理中及び薬物処理後の腫瘍の重量の阻害効果を、腫瘍の重量の阻害率（％）（ＴＷＩ％）＝１００−（処理群の腫瘍の重量の平均値／コントロール群の腫瘍の重量の平均値×１００）として薬物の有効性を算定した。コントロールのマウスが死亡に至る前に発生する処理マウスにおける種々の死亡で示される致死毒性か、Ｘを処理期間後の日数を示すものとして１００−（Ｘ日における体重／１日目における体重×１００）で示される体重の損失率のいずれかとして、腫瘍を有するマウスにおいて薬物耐性を算定した。
【００９２】
６３日目において、腫瘍を有するマウスを頸椎脱臼により屠殺し、その肺を取り出し、重さを計測した。肺胞を２つのガラススライドとの間に載置し、転移性結節（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｎｏｄｕｌｅ）を光学顕微鏡下でカウントした（非特許文献２０）。自然発生的な肺転移がコントロール群のマウスの１００％で生じた。２つの独立した観察者、つまり実験群を気づかない群と、観測者との間の再現性が９５％以上とすることにより、転移の解釈を行った。Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（Ｄｅｌｔａ  Ｓｙｓｔｅｍ社製（ローマ、イタリア））で得たデジタル画像の組織学的解析により、これらの領域の転移特性を確認した。
【００９３】
１．３  結果
抗腫瘍活性（ＨＴ２９／Ｍｉｔ異種移植片モデル）
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験における結果を図３に示す。
【００９４】
図３のデータによると、トポテカンで経口投与で毎日３回投与で４日にわたって処理したＨＴ２９／Ｍｉｔ異種移植片モデルでは、腫瘍の成長の阻害が低いことが分かる（約３０〜４０％）。例２の化合物もまた、腫瘍の成長を制御する点で、それ自体それほど効果的ではない（３０ｍｇ／ｋｇの経口投与）。しかしながら、例２の化合物及びトポテカンの投与を組み合わせると、統計学的に実質的に有意な腫瘍の成長阻害が起こり（約７５％）、これは、薬物処理を停止した後においても継続していた。
【００９５】
抗腫瘍活性及び抗転移活性（Ｈ４６０異種移植片モデル）
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果を表２（訳者註：この「表２」は、原文に記載の「Ｔａｂｌｅ２」に即して訳出したものであるが、これは、下記の表４に対応する記載であって、上記Ｔａｂｌｅ１についての言及と同趣旨である。）に示す。
【００９６】
トポテカン（１ｍｇ／ｋｇ経口投与）及び例２の化合物（３０ｍｇ／ｋｇ経口投与）の両者は、Ｈ４６０初代腫瘍に対して、明確で統計学的に有意な抗腫瘍活性を示し得る（腫瘍の成長阻害は、それぞれ５７％及び５８％）。これら両者の薬物を組み合わせると、処理５６日目において、腫瘍の成長阻害が７４％に達し、これは、統計学的に有意なものである。非常に興味深いことに、観察された肺の転移数は、トポテカン及び例２の化合物を組み合わせて処理した群において、減少した。これらの薬物を組み合わせると、転移の数に関してより高い有意的な阻害（８１％）が生じた。処理群の動物において毒性は観察されなかった。
【００９７】
【表４】
2007535521.tif 000010
＊印及び＊＊印は、それぞれ、コントロールに対するスチューデントＴテストによる危険率Ｐが、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１であることを示す。
‡印、†印、。印は、それぞれ、コントロール、トポテカン処理マウス、及び例２の化合物で処理したマウスに対するマン−ホイットニーＵテストによる危険率Ｐが、Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．００５であることを示す。
ａ印は、得られたＴＷＩ（腫瘍重量阻害）の最大値を示す。
ｂ印は、死滅した細胞の１０を底とするログ値（Ｌｏｇ１０細胞死滅数；ＬＣＫ）を示す。
ｃ印は、種々のコントロールマウスが死亡する前に起こった処理群のマウスにおける種々の死亡数を示す。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ＨＴ２９／Ｍｉｔ耐性細胞をトポテカンと例２の化合物とで共処理（７２時間）した結果であって、■は、トポテカン（ＩＣ５０＞２０μＭ）を示し、●は、トポテカン＋０．５μＭの例２の化合物（ＩＣ５０が４μｍ）を示す。
【図２】ＨＴ２９／Ｍｉｔ耐性細胞をトポテカンと例２の化合物とで共処理（７２時間）した結果（相乗作用をＫｅｒｎの方法に従って示した）であって、■は、トポテカン＋０．５μＭの例２の化合物（８８％）を示し、●は、トポテカン＋０．５μＭの例２の化合物（１０４％）を示す。
【図３】異種移植片のマウスモデルであるＨＴ２９／Ｍｉｔにおけるトポテカンと例２の化合物とを組み合わせた活性であって、×は、コントロールを示し、●は、トポテカン（１５ｍｇ／Ｋｇ）の経口投与群を示し、▲は、例２の化合物（３０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与群を示し、■は、トポテカン＋例２の化合物の投与群を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2007535521.tif 000019
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