(57)【要約】  サンプル、例えば、更なる分析に供されるべき体液サンプル、の中に存在する細胞から流体サンプル媒体を分離するためのマイクロ流体分離システム。このシステムは、マイクロ流体構造体と細胞凝集剤とを含んでもよい。マイクロ流体構造体は、サイズ排除により、凝集した細胞を流体サンプル媒体から分離することのできる１つ以上のマイクロ流体流路を含んでもよい。
2007519896.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に存在する細胞から流体サンプル媒体を分離するためのマイクロ流体分離システムであって、マイクロ流体構造体と細胞凝集剤とを含んでなり、前記マイクロ流体構造体が、凝集した細胞を流体サンプル媒体からサイズ排除により分離する１つ以上のマイクロ流体流路を含むものである、システム。
【請求項２】
前記凝集剤が、前記マイクロ流体構造体に隣接して、またはそこから離れて備えられてなる、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記マイクロ流体構造体が毛管路であることを特徴とする、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
前記マイクロ流体構造体が、１つ以上のサイズ排除空間を有するサイズ排除要素を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５】
前記毛管路が、凝集した細胞を流体サンプル媒体から分離するための１つ以上のサイズ排除空間であることを特徴とする、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記１つ以上のマイクロ流体流路の寸法が、前記サイズ排除空間を規定するために変化する、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記マイクロ流体流路が、寸法の異なるまたは変化する他のマイクロ流体流路と流体連通していてもよい、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記マイクロ流体構造体の前記毛管路が少なくとも一つの第一のマイクロ流体流路を含み、前記少なくとも一つの第一の流路が延長された側壁を有する基部を有し、前記流路が前記流路の深さ未満の深さを有する１つ以上の通路と、その長手方向側部に沿って流体連通しており、前記通路の深さがサイズ排除空間を規定する、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記または各通路が、更なるマイクロ流体流路と更なる流体連通をなしている、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記通路が、前記サイズ排除空間を変化させるための１つ以上の段形成部を備える、請求項８または９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記通路および／または更なる流路がサンプル媒体回収領域と流体連通しており、凝集した細胞から分離された前記サンプル媒体が前記回収領域へと流動する、請求項９または１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記毛管路が１つ以上のマイクロ流体流路を含み、前記１つ以上のマイクロ流体流路には、所望のサイズ排除空間に相当する空隙を規定する１つ以上のマイクロ構造体が設けられる、請求項７に記載のシステム。
【請求項１３】
複数のマイクロ構造体群が、同一サイズまたは異なるサイズで設けられており、互いに対していかなる特定の構成で配置されていてもよい、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
各群が、他の群と異なるサイズ排除空間を規定する、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記マイクロ構造体群が、前記サンプルがより大きなサイズ排除空間を規定する群を通って流動し、その後、より小さなサイズ排除空間を有する１つ以上の群を通って流動するように順序付けられた構成であり、ここで前記サンプル媒体が凝集した細胞から分離される、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
回収領域が前記マイクロ構造体の下流に設けられており、前記サンプル媒体が前記サイズ排除空間を通って流動し、分離された後に前記回収領域へと流動する、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記毛管路内の前記サイズ排除空間の寸法が、約５０μｍ以下、約４０μｍ以下、約３０μｍ以下、約２０μｍ以下、約１５μｍ以下、約１０μｍ以下、約５μｍ以下、または約２μｍ以下である、請求項４〜１６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１８】
前記マイクロ流体構造体と流体連通して該マイクロ流体構造体に前記サンプルを供給する導管を更に含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１９】
前記供給導管が、前記凝集剤をも前記マイクロ流体構造体に供給するものである、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記凝集剤が、前記導管の１つ以上の表面上、および／または前記サイズ排除空間の上流にある前記マイクロ流体構造体の前記毛管路の１つ以上の表面に備えられている、請求項１８または１９に記載のシステム。
【請求項２１】
分離されるべき前記流体サンプル媒体が全血である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２２】
前記凝集剤がデキストランまたはレクチンである、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
流体サンプルに対してアッセイを行うためのアッセイシステムであって、被験物検出区域と流体連通している請求項１〜２２のいずれか一項に記載のマイクロ流体分離システムを含んでなる、アッセイシステム。
【請求項２４】
前記分離システムの前記マイクロ流体構造体と流体接続している、流体サンプルを適用するためのサンプル入口を含んでなる、請求項２３に記載のアッセイシステム。
【請求項２５】
前記検出区域が前記マイクロ流体構造体の下流に設けられており、流体サンプルが、分離後に前記マイクロ流体構造体から前記検出区域内に流動する、請求項２３または２４に記載のアッセイシステム。
【請求項２６】
目的の被験物に対して特異的または非特異的な試薬が、前記アッセイシステム内に設けられており、前記検出区域の内側表面上に設けられている、請求項２５に記載のアッセイシステム。
【請求項２７】
前記アッセイシステム内での結合相互作用、またはシグナル生成および検出に干渉し得る前記サンプル由来の分子を中和または除去する役割を果たす干渉区域を更に含んでなる、請求項２６に記載のアッセイシステム。
【請求項２８】
前記アッセイが結合アッセイである、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載のアッセイシステム。
【請求項２９】
前記結合アッセイが均質または不均質である、請求項２８に記載のアッセイシステム。
【請求項３０】
伝達システムを更に含んでなる、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載のアッセイシステム。
【請求項３１】
流体サンプル中に存在する細胞から流体サンプル媒体を分離する方法であって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のマイクロ流体分離システムに流体サンプルを適用することを含んでなる、方法。
【請求項３２】
前記サンプルが、前記マイクロ流体分離システムの前記マイクロ流体構造体に添加される前に、細胞凝集剤と混合される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
流体サンプル中の被験物を検出する方法であって、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載のアッセイシステムに流体サンプルを適用することを含んでなる、方法。
【請求項３４】
前記サンプルが、前記マイクロ流体分離システムの前記マイクロ流体構造体に添加される前に、細胞凝集剤と混合される、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、流体サンプルから粒子を分離するためのマイクロ流体分離システム、ならびに流体サンプル中の被験物の量および／または存在を検出するための、若しくは流体サンプルの特性を決定するためのアッセイシステムに関する。特に、本発明は、サンプルからの細胞の分離、例えば、全血サンプルからの赤血球の分離に関する。
【０００２】
流体サンプル中に存在する被験物の存在および／または量を測定するための診断アッセイ装置は、治療時に、または家庭環境で使用するために開発されてきた。このような装置は、医療の専門職によって使用され、あるいは、自己管理のために患者が使用するなど、専門家ではない個人によっても同様に使用され得る。従って、このような装置は、使い易く、必要となる流体サンプルが少量であり、迅速に測定を行うように設計される。少量のサンプルが望ましいのは、例えば、ランセットまたはフィンガースティックを皮膚に適用することによって毛細血管の血液サンプルを得る時、患者から採取するのにあまり痛みを伴わないからである。典型的には、この装置は１ステップ装置であるので、使用者は更なるサンプル操作工程を行う必要なく、単に流体サンプルを装置に適用するだけで結果が得られる。このようなシステムは、典型的には持ち運び可能であり、最小限の移動部を有するか、または全く有さない。典型的には、流体サンプルを装置内で積極的に移動させる必要なく、毛管作用により装置内におよび／または装置を通ってサンプルを移動させるために、マイクロ流体流路または多孔性担体が使用される。
【０００３】
流体サンプルに対して診断アッセイ測定を行う場合、アッセイに干渉するかもしれない構成成分をサンプルから除去することが望ましいか、または必要な場合がある。例えば、試験計画が血漿サンプルを必要とする場合、全血から赤血球を除去することが必要な場合がある。赤血球はまた、例えば特定波長の光を吸収することにより、アッセイ測定に干渉することもある。従来より、赤血球は、遠心分離によって、または赤血球を沈殿させることによって全血から除去される。しかしながら、このような方法は、典型的には１００μｌから１μｌ未満までの容量の流体サンプルに対する診断アッセイを迅速に行うという目的には不適切である。
【０００４】
流体媒体からの粒子の分離は、適切な孔径を有する不織布などのフィルタを使用することによって行うことができる。しかしながら、このような装置の使用は、フィルタが閉塞し、結果として血漿ろ液の収量が低くなるという傾向があるため、全血から赤血球を分離する目的には不適切である。また、血漿回収のための時間が増大する。これは、毛管力のみに依存して流体サンプルの移送を行うマイクロ流体装置などの流動システムにおいては明らかに不利である。
【０００５】
従って、少量のサンプルを高い収量レベルで迅速に分離する分離システムへの希求が存在する。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の第一の態様によれば、サンプル中に存在する細胞から流体サンプル媒体を分離するためのマイクロ流体分離システムが提供され、このシステムはマイクロ流体構造体と細胞凝集剤とを含んでなり、このマイクロ流体構造体は、凝集した細胞を流体サンプル媒体からサイズ排除（篩い分け）により分離する１つ以上のマイクロ流体流路を含むものである。
【０００７】
凝集剤という用語は、細胞の凝集および／または凝集反応（agglutination）を引き起こし得るあらゆる薬剤、並びに赤血球などの細胞のロゼット形成を引き起こし得る薬剤および／または赤血球などの細胞における連銭形成を促進し得る薬剤を包含するものとする。
【０００８】
凝集剤を備えることにより、サンプル中の細胞が凝集し、故に細胞からのサンプル媒体の分離を助ける。凝集剤は、マイクロ流体構造体に隣接して、またはそれから離れて備えられてもよい。凝集剤は、マイクロ流体システムの内側表面から流体サンプルへの凝集剤の放出を助ける試薬と混合されてもよい。複数の凝集剤が備えられてもよい。
【０００９】
マイクロ流体構造体は、凝集した細胞がサンプル媒体から濾別されることを可能にする１つ以上のサイズ排除空間を有するサイズ排除要素とされてよい。サイズ排除空間により、マイクロ流体流路は流体サンプル媒体から凝集した細胞を分離することができる。排除用空間のサイズは、凝集した細胞をサンプル媒体から分離するか、または実質的に分離することができるあらゆる好適なサイズから選択してもよく、システムの寸法、凝集剤が流体サンプルと相互作用する時間、およびサンプル自身の性質に応じて決定される。排除用空間の好適なサイズは常套の実験により決定することができる。排除用空間の最適なサイズは、凝集体の分離効率に基づいて決定することができ、また、最も簡単には常套の実験により決定される。複数のサイズ排除空間を使用する場合、それらのサイズは同一であっても、異なっていてもよい。排除用空間の上限は、凝集体のサイズに応じて決定され、下限は分離の速度および効率によって決定される。
【００１０】
マイクロ流体構造体は毛管路であることを特徴とされてよい。毛管路は、流体サンプル媒体から凝集した細胞を分離するための１つ以上のサイズ排除空間として特徴付けられる。
【００１１】
マイクロ流体構造体の１つ以上のマイクロ流体流路の寸法は、サイズ排除空間に相当し得る。１つ以上のマイクロ流体流路の寸法は、サイズ排除空間を規定するために変化してもよい。１つ以上のマイクロ流体流路は、寸法の異なるまたは変化する他のマイクロ流体流路と流体連通していてもよい。
【００１２】
マイクロ流体構造体は、少なくとも一つの第一のマイクロ流体流路を含んでもよく、この少なくとも一つの第一の流路は延長された側壁を有する基部を有し、この流路の深さ未満の深さを有する１つ以上の通路とその長手方向側部に沿って流体連通しており、この通路の深さはサイズ排除空間を規定する。
【００１３】
サイズ排除空間を規定する通路の深さは、サンプル媒体が第一の流路から通路内へと通過することを可能とするものである。従って、サイズ排除により、凝集した細胞をサンプル媒体から分離することができる。
【００１４】
前記または各通路は、更なるマイクロ流体流路と更なる流体連通をなしていてもよい。従って、そのまたは各通路は、第一の流路と更なる流路との間の接続領域として機能してもよく、この通路がサイズ排除空間を規定する。この通路は、サイズ排除空間を変化させるための１つ以上の段形成部を備えてもよい。そのまたは各段形成部は、サイズ排除空間を通路に付与してもよい。
【００１５】
前記通路および／または更なる流路は、サンプル媒体回収領域と流体連通していてもよく、凝集した細胞から分離されたサンプル媒体は前記回収領域へと流動する。回収領域は、更なる導管であってもよいし、マイクロ流体構造体内のチャンバを構成してもよい。
【００１６】
あるいは、毛管路は１つ以上のマイクロ流体流路を含んでもよく、このマイクロ流体流路には、所望のサイズ排除空間に相当する空隙を規定する１つ以上のマイクロ構造体が設けられる。マイクロ構造体は、凝集した細胞をサンプルから分離するように構成することができる。マイクロ構造体は、約１μｍ〜約５０μｍの範囲のサイズ排除空間を規定し得る。複数のマイクロ構造体群は、同一サイズまたは異なるサイズで設けられてもよく、互いに対していかなる特定の構成で配置されていてもよい。各群は、他の群と異なるサイズ排除空間を規定してもよい。マイクロ構造体の群は、サンプルがより大きいサイズ排除空間を規定する群を通って流動した後に、より小さいサイズ排除空間を有する１つ以上の群を通って流動するように順序付けされた構成であってもよく、ここでサンプル媒体は凝集した細胞から分離される。回収領域は、マイクロ構造体の下流に設けられてもよく、サンプル媒体はサイズ排除空間を通って流動して分離された後に回収領域へと流動する。
【００１７】
マイクロ構造体は、溝付き表面の形状、ピラー形状、またはサイズ排除空間を規定するいかなる形状であってもよい。
【００１８】
毛管路内のサイズ排除空間の寸法は、約５０μｍ以下、約４０μｍ以下、約３０μｍ以下、約２０μｍ以下、約１５μｍ以下、約１０μｍ以下、約５μｍ以下であってもよく、または約２μｍ以下であってもよい。
【００１９】
毛管路は、蛇行路を規定してもよい。
【００２０】
システムは、更に、マイクロ流体構造体と流体連通して該マイクロ流体構造体にサンプルを供給する導管を含んでもよい。供給導管はまた、凝集剤をマイクロ流体構造に供給してもよい。凝集剤は、導管の１つ以上の表面上、および／またはサイズ排除空間の上流にあるマイクロ流体構造体の毛管路の１つ以上の表面に備えられてもよい。
【００２１】
導管のレイノルズ数は３０００未満とすることができる。あるいは、導管のレイノルズ数は１００未満であってもよい。導管は、好ましくは毛管である。レイノルズ数は、以下の式を用いて計算することができる。
【００２２】
【数１】
2007519896.tif 000003
【００２３】
式中、Ｒｅはレイノルズ数であり、ρは流体密度であり、Ｖは流速であり、ｄは長さスケールであり、ηは動態密度である。レイノルズ数が２０００以下であると、導管（マイクロ構造体またはマイクロ流路であると考えてもよい）は表面張力（毛管現象）のみによって消極的に充填される。
【００２４】
サンプルは導管に適用されてもよい。サンプルは、導管と流体接続しているサンプル入口を介して適用されてもよい。
【００２５】
好適な凝集剤の非限定的な例は、赤血球の凝集を引き起こすものであり、例えばデキストランなどである。あるいは、レクチンなどの凝集剤は、赤血球の凝集反応を引き起こす場合もある。更なる代替として、凝集剤は、赤血球に対する１つ以上の抗体を含んでもよい。あるいは、凝集剤は、赤血球のロゼット形成を促進してもよく、または赤血球における連銭形成を促進してもよい。
【００２６】
マイクロ流体システムは、内部マイクロ構造体、タイムゲート、流体混合チャンバ、サンプル収集チャンバ、ウェル、流路、バッフル、狭窄部、サンプル適用口などの更なるマイクロ流体要素を含んでもよい。マイクロ流体要素は、規則的な、または不規則な形状のものであってもよく、同一平面内または異なる平面内にあってもよい。マイクロ流体流路は、その長さに沿って変化する毛管寸法を有するものであってもよく、異なるまたは変化する毛管寸法を有する他のマイクロ流体要素と流体連通していてもよい。
【００２７】
サンプルがサイズ排除空間に到達する前に凝集剤と相互作用させられる時間は、例えば、システム内の何処に凝集剤が位置しているか、上流の流体導管の寸法、およびサンプルが流体導管に沿って移動する速度に影響される場合もある。必要である場合、凝集剤が十分に長い時間流体サンプルと相互作用することを保証する手段を設けてもよく、これは例えば、供給導管とサイズ排除空間との間を流体サンプルが通過する速度を低下させる役割を果たすチャンバまたはタイムゲートである。
【００２８】
マイクロ流体構造体要素の典型的な寸法は、０．１μｍ〜５００μｍの断面寸法（例えば、断面直径）を有するものであり、より典型的には１μｍ〜１００μｍの断面寸法を有するものである。好ましくは、断面寸法は、流体が毛管作用によりシステムの様々な要素に沿って、それらを通ってまたはそれらの中に移送されることが可能となるサイズであるように選択される。代替として、または更に、流体は動電ポンプ作用によるなど、外力によってシステムの１つ以上の要素を通って移送されてもよい。このような場合、断面寸法は毛管寸法を超えてもよい。
【００２９】
システムを作製するための基材は、ポリカーボネートなどのいかなる好適な材料であってもよい。基材が疎水性である場合、当技術分野において既知の方法、例えば酸素プラズマ処理などにより、その表面を処理して親水性にしてもよい。親水性表面を付与することに加え、他の種類の試薬は、内側表面上に固定されるか、またはそれ以外の方法で備えられてもよい。
【００３０】
システムは、例えば、構造体内のマイクロ流体流路の深さを規定する役割を果たす壁がその上に設けられる第一の平面基材層を提供し、次いでその壁の上側表面上に配置される第二の平面基材層を提供することによって作製することができる。接着剤などの好適な接着手段を使用して、様々な構造体を適宜接合することができる。構造体を作製する他の手段は、例えばスクリーン印刷、またはシステムの上側表面および下側表面としての役割を果たす上側積層表面および下側積層表面を有する多積層システム、並びにマイクロ流体構造体の要素を規定する役割を果たす構造を有する中間積層体の提供などである。
【００３１】
分離されるべき流体サンプル媒体は、好ましくは全血である。従って、システムは、凝集した赤血球のサンプル媒体からの分離を可能にするものとすることができる。
【００３２】
マイクロ流体分離システムは使い捨てであってもよい。
【００３３】
本発明の第二の態様によれば、流体サンプルに対してアッセイを行うためのアッセイシステムであって、被験物検出区域と流体連通している第一の態様によるマイクロ流体分離システムを含んでなるアッセイシステムが提供される。
【００３４】
このアッセイシステムは、分離システムのマイクロ流体構造体と流体接続している、流体サンプルを適用するためのサンプル入口を含んでもよい。検出区域は、マイクロ流体構造体の下流に設けられてもよく、流体サンプルは、分離後に、マイクロ流体構造体からこの検出区域内に流動し得る。目的の被験物に対して特異的または非特異的な試薬がアッセイシステム内に備えられてもよく、検出区域の内側表面上に備えられてもよい。アッセイシステムは、更に、アッセイシステム内での結合相互作用、またはシグナル生成および検出に干渉し得るサンプル由来の分子を中和または除去する役割を果たす干渉区域を含んでもよい。アッセイシステム内には、他の区域の１つ以上と流体連通する更に別の区域が設けられてもよく、これには洗浄区域、タイムゲート、事前混合区域、反応区域などが含まれる。
【００３５】
アッセイは、目的の被験物の存在および／または量を判別することができるあらゆるものから選択され得る。アッセイは、特異的結合事象が特異的な結合対の間で起こる特異的結合アッセイなどの結合アッセイであってもよく、この結合対の一方は目的の被験物であり、他方は分子の特定の空間的配向または極性配向、例えば、エピトープ性部位または決定基部位を認識することができるあらゆる化合物または組成物から選択される。好適な結合対の例は、抗体と抗原、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的なヌクレオチド配列、相補的なペプチド配列、エフェクタとレセプタ分子、酵素補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素、ペプチド配列とこの配列またはタンパク質全体に特異的な抗体、ポリマー性の酸と塩基、染料とタンパク質結合剤、ペプチドと特異的タンパク質結合剤などである。結合パートナーが抗体である場合、この抗体はモノクローン性またはポリクローン性であってよく、またはその断片であってもよい。その断片としては、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられる。アッセイは、被験物と酵素との間で起こる特異的反応を伴うものとしてもよく、好適な酵素は、ＦＡＤ／ＦＡＤＨ２、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ２またはＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ２系を用いるものである。
【００３６】
特異的結合対の一方は、検出可能な標識を備えてもよい。「標識」とは、視覚的手段または器具を用いた手段によって検出可能なシグナルを生成することができるあらゆる物質を指す。好適な標識の例としては、酵素および基質、色原体、触媒、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性標識、ならびに、金などの粒状コロイド金属粒子、またはポリウレタンなどの粒状の染色された有機物質が挙げられる。
【００３７】
結合アッセイは、不均質であるか、または均質であるかのいずれであってもよい。
【００３８】
アッセイが均質である場合、特異的結合パートナーに付される標識は、結合して特異的結合対が形成されると、ある検出可能な物理的変化または化学的変化を受け、結果として結合種を未結合種から区別可能とするものであることが望ましい。エネルギー移動を伴うか、または波長の変化を生じるこのような結合アッセイの例は、米国特許第５，７０５，６２２号および米国特許第６，２１５，５６０号に記載されている。
【００３９】
目的のサンプル媒体は全血であってもよいが、白血球など、凝集剤によって凝集され得る粒状物質の分離が必要とされる場合、いかなるサンプル媒体から選択されてもよい。
【００４０】
目的の被験物としては、これらに制限されるものではないが、トキシン、有機化合物、タンパク質、ペプチド、微生物、細菌、ウィルス、アミノ酸、核酸、炭水化物、ホルモン、ステロイド、ビタミン、乱用薬物、汚染物質、殺虫剤、および上述の物質のいずれかの代謝産物またはそれに対する抗体が挙げられる。その具体例は、トロポニンＴおよびトロポニンＩ、ＣＫＭＢ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＡＮＰおよびＢＮＰなどのナトリウム排出ペプチドならびにそれらのＮ末端断片を含む特異的心臓マーカーである。他の目的の被験物としては、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、黄体ホルモン（ＬＨ）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、並びに骨吸収のマーカーが挙げられる。
【００４１】
アッセイは結合アッセイであってもよく、このアッセイは発光を有し、発光酸素チャネリング免疫アッセイであってもよい。このような免疫アッセイは以下のものを含み得る：
ａ．光で照射されると一重項酸素を生成することができるドナー粒子；
ｂ．一重項酸素により活性化され、検出可能な光を放出する放出手段を含有するアクセプタ粒子；
ｃ．前記ドナーおよびアクセプタ粒子が、被験物を認識し、それに結合するように適合されており、ドナー粒子およびアクセプタ粒子の両方が被験物に結合すると、生成された一重項酸素がアクセプタ粒子上の放出手段を活性化し、検出可能な光を放出し；および
ｄ．アクセプタ粒子によって放出された光を検出する検出器。
【００４２】
ドナー粒子およびアクセプタ粒子は、粒子表面上に存在する抗体を通して被験物を認識する。放出手段は、一重項酸素により活性化されて化学発光を生成することができる溶解染料を含む。化学発光は、アクセプタ粒子内の蛍光体を活性化し、発光を引き起こす。光は５２０ｎｍ〜６２０ｎｍで放出され得る。一重項酸素は、波長６８０ｎｍの光で照射されると放出され得る。ドナー粒子は溶解フタロシアニンを含んでもよく、このフタロシアニンは照射されると一重項酸素を生成する。
【００４３】
アッセイシステムは、更に伝達システムを含んでもよい。伝達システムは、光学的、磁気的、電気化学的、放射線学的であってもよく、または検出すべき目的のシグナルに応じて、質量、周波数若しくはエネルギー状態の変化の測定を伴ってもよい。シグナルが光学的なものである場合、このシグナルはいかなる特定の検出可能な波長または波長域のものであってもよく、蛍光および化学発光シグナルが含まれる。
【００４４】
あるいは、または更に、アッセイシステムは、凝固時間またはプロトロンビン時間などの流体サンプルの特定的な特性を測定するために使用され得る。
【００４５】
検出区域は、マイクロ流体流路を含んでもよく、またはウェルを含んでもよい。検出手段は、検出区域の一体部分として設けられてもよい。また、励起手段もこの区域の一部として一体的に設けられてもよい。励起手段および検出手段の例は、それぞれ発光ダイオードおよび光検出器である。１つ以上の検出区域並びに１つ以上の励起および検出器手段がある場合もある。検出器手段および励起手段は、便利なサイズおよび形状となるように選択されてもよく、好ましくは、測定すべきシグナルの捕捉効率が最大となるように選択される。励起手段および検出器手段は、典型的には、検出区域付近の流体サンプルに対して外側の表面上に配置される。
【００４６】
検出区域の基材は、目的に応じてあらゆる好適な材料または材料群から選択されてもよい。好適な基材の例は、ポリカーボネートなどのプラスチック類である。検出すべきシグナルが光学シグナルである場合の検出区域の領域では、基材は、光学シグナルを送出することができるもの、例えば光学的に透明である好適なプラスチック材料などから選択されてもよい。
【００４７】
更に、またはあるいは、望ましくない波長の光を除去するために、プラスチック材料にフィルタを組み込んでもよい。更なる代替として、フィルタはアッセイ基材の表面上に存在してもよい。また、光学的に透明な基材は、その上に励起源または検出器が位置し得る収束レンズまたは発散レンズのいずれかであってもよい。こうして、光は所望されるように集束または発散され得る。また、基材は部分的に透明であるか、または表面の粗さを有していてもよく、従って、光の拡散源として機能し得る。
【００４８】
アッセイシステムは、サンプルが干渉区域内に流動した後、アッセイ検出区域に流動するように構成されてもよい。干渉区域は、流体サンプルのｐＨに影響を与えるための、または例えば界面活性剤で可溶化することによって、若しくは脂質結合剤と選択的に結合させることによって脂質などの特定種を除去若しくは可溶化するための１つ以上の薬剤を含んでもよい。
【００４９】
アッセイシステムは、全血であり得る体液中の被験物濃度を測定する場合もある。血漿は、アッセイシステムのマイクロ流体分離システムによって凝集した赤血球から分離されたものであってもよい。
【００５０】
アッセイシステムは使い捨てであってもよく、アッセイ結果を表示することができるメーターと組み合わせて使用するように設計されてもよい。メーターは、ディスプレイと、電源と、適切な回路とを含み得る。また、メーターは、光源と、検出器とを含み得る。あるいは、アッセイシステムおよびメーターは、使い捨てシステムと完全に一体化されていてもよい。アッセイシステムは、ランセットなどの流体採取および収集システムと一体化されてもよく、これにより、収集場所からアッセイシステムへサンプルを移動させることを避けることができる。
【００５１】
本発明の更なる態様によれば、流体サンプル中に存在する細胞から流体サンプル媒体を分離する方法であって、本発明の第一の態様によるマイクロ流体分離システムに流体サンプルを適用することを含んでなる方法が提供される。
【００５２】
１００μｌ以下のサンプルが適用されてもよい。
【００５３】
この方法は、全血中の赤血球から血漿を分離するためのものであってもよい。
【００５４】
サンプルは、細胞凝集剤と混合された後に、マイクロ流体分離システムのマイクロ流体構造体に添加されてもよい。
【００５５】
本発明の更なる態様によれば、流体サンプル中の被験物を検出する方法であって、本発明の第二の態様によるアッセイシステムに流体サンプルを適用することを含んでなる方法が提供される。
【００５６】
サンプルは、細胞凝集剤と混合された後に、マイクロ流体分離システムのマイクロ流体構造体に添加されてもよい。
【００５７】
本発明の各態様の好ましい特徴は、互いの態様に関して必要な変更を加えたものである。
【００５８】
以下、添付の図面を参照し、本発明を例示目的でのみ説明する。
【００５９】
本発明は、細胞からサンプル媒体を分離するためのマイクロ流体分離システム、サンプル中の被験物を検出および測定するための、および／またはサンプル中の被験物を測定するためのアッセイシステムに関する。
【００６０】
マイクロ流体分離システム１が、図１に図示されている。システム１は、マイクロ流体構造体２と、細胞凝集剤（図示せず）とを含む。マイクロ流体構造体２は毛管路であることを特徴とする。毛管路は流路３を含む。流路３の寸法はその長さに沿って変化する。特に領域４では、流路は細くなり、１０μｍ未満の寸法を有するサイズ排除空間を提供する。このサイズ排除空間は、凝集剤によって凝集された細胞が、この領域４の更に下流へと流動するのを防ぐように設計されている。凝集剤は、流路３内のサイズ排除空間の上流に備えることができ、またはサンプルがマイクロ流体構造体２に適用される前に、サンプルに適用してもよい。あるいは、サイズ排除空間の上流にある流路の１つ以上の表面上に凝集剤を固定化することもできる。流路は領域５で広くなり、細胞を含まないサンプル媒体が流入できるサンプル回収領域を提供する。このシステムはまた、流路３の上側表面を規定する蓋（図示せず）を備える。サンプルは、毛管力により毛管路を通って流動する。この流動を助けるために、毛管路の表面は親水性コーティングで被覆されている。
【００６１】
添付図面の図２はアッセイシステム１０を示す。システム１０は、マイクロ流体分離システム１２と、アッセイ検出区域１８とを含む。システム１０はまた、干渉区域１４と、前処理区域１６と、サンプル適用領域２０とを含む。アッセイシステム１０は、このシステムに適用されるサンプル中の被験物を検出するのに使用される。１００μｌ未満のサンプルを領域２０に適用することができ、その後、このサンプルは導管２４を下ってマイクロ流体分離システム１２に向かって流動する。導管２４はマイクロ流路であることができ、そのレイノルズ数は３０００未満、または１００未満（毛管の場合）であり得る。サンプルは毛管作用によって消極的に流動するか、または差圧の印加によってシステム１０まで積極的に流動する。アッセイシステム１０は、サンプルが一方向に移動するように構成される。
【００６２】
マイクロ流体分離システム１２は、毛管路をであることを特徴とするマイクロ流体構造体１３を含む。この構造体は、サイズ排除により、サンプル中に存在する細胞からサンプル媒体を分離するように構成される。サンプルが構造体１３を通過する前に、サンプルはシステムの細胞凝集剤と混合されて細胞凝集が生じる。細胞凝集剤は、サンプルを領域２０に適用する前にサンプルに添加することができる。あるいは、細胞凝集剤は、領域２０内、または導管２４内に備えることができる。細胞凝集剤は、領域２０または導管２４の少なくとも１つの表面上に備えることができる。
【００６３】
マイクロ流体構造体１３は、図３ｃおよび図４ｂにおいて最も良く図示される。図から明らかなように、導管２４は、多数の流路２６を有する毛管路に分かれる。流路２６のそれぞれは、その長手方向側部に沿って、通路２８の形状をなす更なる流路のそれぞれと流体連通しており、この通路２８の深さは、各流路２６のそれよりも浅い。通路２８の深さは、サイズ排除により、細胞の凝集体はそこを通り抜けられないが、サンプル媒体は通り抜けられるように構成される。従って、通路の深さが、サイズ排除空間を提供する。流路２６および通路２８は、蓋２２（図３ｃを参照）によって規定される上側表面を有する。
【００６４】
通路２８は、浅瀬部分を規定する段形成部３０を備えることができる。これは図３ｄに図示される。段形成部３０を設けることにより、プレフィルタとして作用する最初の通路の深さが提供され、サイズ排除空間を規定する段形成部３０は、凝集した細胞からサンプル媒体を分離する主要なフィルタとして機能する。段形成部３０はピラー形状または隆起した表面の形状をなし得る。
【００６５】
流路２６の深さはほぼ１００μｍである。通路２８の深さはほぼ２０μｍであり、段形成部３０によって付与される深さはほぼ１０μｍである。
【００６６】
通路２８内に流動した細胞媒体は、マイクロ流体構造体１３内にある毛管路の回収領域２９に向かって運ばれる。
【００６７】
別のマイクロ流体分離システム３４が、図５および図６に図示されるアッセイシステム３２内に設けられている。図５ａはシステム３２の斜視図である。システム３２は、干渉区域３６と、前処理区域３８と、アッセイシステム４０と、サンプル適用領域４２とを含む。
【００６８】
マイクロ流体分離システム３４は、凝集剤と、毛管路であることを特徴とするマイクロ流体構造体とを有する。毛管路は、第二の流路５０と流体連通している第一の流路４８を含む。ピラー４６の形状をなす多数のマイクロ構造体は、流路４８および５０の間に設けられる。ピラー４６は多数の空隙４４を規定する。空隙４４は、サンプル媒体はそこを通って流動し得るが、凝集した細胞は通ることができないようにされた大きさとされたものである。この空隙がサイズ排除空間である。第二の流路５０は、前処理区域３８への出口５４を備える。システム１０の場合と同じく、蓋５２が設けられる。
【００６９】
凝集剤は第一の流路４８内に備えられ、流路の１つ以上の表面上に固定化されてもよい。あるいは、凝集剤は、サンプルが分離システム３４のマイクロ流体構造体の毛管路内に流動する前にサンプルと接触する。
【００７０】
流路４８は流路５０よりも深い。実際、流路４８は１００μｍの深さを有し、流路５０は１０μｍ〜２０μｍの深さを有する。ピラー４６によって規定された空隙は、ほぼ１０μｍである。
【００７１】
マイクロ流体システム１０の場合と同じく、このシステムは、積極的に（例えば、差圧または動電ポンプ作用を用いて）、または消極的に（毛管作用および表面張力により）動作することができる。
【００７２】
上述のマイクロ流体分離システム１、１２、３４は、全血中の赤血球から血漿を分離するのに使用することができる。この例において、適用後の全血サンプルは、分離システム１、１２、３４の各マイクロ流体構造体に向かって流動する。赤血球凝集剤は、システム１、１２、３４のマイクロ流体構造体の上流に備えられる。あるいは、凝集剤は、システム１、１２、３４のマイクロ流体構造体内に備えられ、１つ以上のサイズ排除空間の上流の１つ以上の表面上に固定化されてもよい。システム１、１２、３４のマイクロ流体構造体は、サイズ排除により、凝集した赤血球から血漿を分離するように構成される。これら構造体内に規定されたサイズ排除空間は、血漿がそこを通って流動することを可能とする。
【００７３】
アッセイシステム１０、３２はまた、５０μｌ以下のサンプル中の被験物を検出および測定するための均質なアッセイ／検出システム２４、４０を含む。アッセイシステムの例が図７ａおよび図７ｂに図示される。このシステムは、ラテックス凝集反応および化学発光シグナルの組み合わせに基づく。この点において、被験物分子は２つのビーズを引き寄せ、化学反応のカスケードを生成して大幅にシグナルを増幅し、結果として、原理的には被験物のアトモル（attomolar）濃度が検出され得る。このシステムは、高効率な光捕捉検出チャンバ内で行われる高感度の均質な免疫アッセイを提供する。アッセイ構成要素によるサンプルのインキュベーションは、タイムゲート構造を通して達成される。
【００７４】
図７ａおよび図７ｂに図示されるアッセイは、発光酸素チャネリング免疫アッセイである。より詳細には、溶解したフタロシアニンを含有する光増感剤粒子（ドナー粒子）は、図７ａに示されるように、波長６８０ｎｍの光で照射されると一重項酸素を生成させる。生成した一重項酸素は、約４マイクロ秒という非常に短い半減期を有し、故に、急激に崩壊して粉砕状態になる。従って、一重項酸素は、崩壊して粉砕状態になる前に、粒子表面から数百ミクロンの距離までしか拡散することができない。しかしながら、一重項酸素は、図７ｂに示されるように、隣接する粒子対に入り込むのに十分なほど長く生存し得る。隣接する粒子対（アクセプタ粒子）は、溶解した染料を含有し、この溶解染料が受容された一重項酸素によって活性化され、化学発光を生じる。この化学発光は同一ビーズ内に含有された更なる蛍光体を活性化し、次いで５２０μｍ〜６２０μｍの発光を引き起こす。試薬は、最適化された幾何学形状および低光吸収度を有するウェル内で凍結乾燥され、これにより最大励起および光捕捉効率が確保される。ドナーおよびアクセプタ粒子は、粒子表面上に存在する抗体を通して被験物を認識することができ、それにより、粒子は被験物によって引き寄せられる。
【００７５】
アッセイの検出感度は、図８および図９に示す２つの方法で測定された。図８に示す３８４ウェルマイクロタイタープレートにおける第一の実験により、ユニビーズの総数とアッセイ出力シグナルとの間には線形挙動があることが証明された。ユニビーズは、アクセプタ粒子およびドナー粒子の両方を包含する予め結合された単一ビーズである。従って、一重項酸素の移動の量子効率は、粒子が近接しているので無視できる。この実験において、ビーズの総数は、１００〜１０００００の間で変更した。
【００７６】
図９において、最終的なチップ構成で使用されると思われる２μｌまで容量を減らすと、濃度が低下するにつれ、シグナルは横這いになることが分かる。これは、ユニビーズの自動蛍光発光に起因する。確実に検出できる最小粒子数は、２μｌのサンプルではおよそ４００である。図１０に示すアッセイを展開すると、２５μｌのアッセイ容量で３８４マイクロタイタープレートを使用するビオチン化−ＤＩＧアッセイから得られた標準曲線が得られた。
【００７７】
高感度で均質なアッセイが、マイクロ流体システムを基にして首尾よく設計および製造された。このアッセイは、マイクロタイタープレートからチップフォーマットまで首尾よく移送されて、用量反応曲線を生成し、それにより２μｌの血漿中に１．６ｘ１０−１０モルの被験物が検出できた。
【００７８】
アッセイシステムは、必ずしも発光酸素チャネリング免疫アッセイの形をとる必要はない。
【００７９】
上述のように、アッセイシステム１０、３２はまた、検出区域１８、４０での結合相互作用、またはシグナル生成および検出に干渉し得る分子の固相抽出のための干渉区域１４、３６を含む。干渉区域１４、３６は、サンプルが細胞分離システム１２、３４に直面する前、またはサンプルがアッセイ検出区域２５、４１内に流動する前に設けられてもよい。区域１４、３６は、サンプル由来の分子を中和または除去するための多数の薬剤を含む。干渉区域１４、３６はタイムゲート化され、完全に処理されたサンプルだけがアッセイシステム１８、４０内に流動することを保証する。
【実施例】
【００８０】
人間の患者から採取した全血サンプル（４５％ヘマトクリット）をＥＤＴＡチューブに流し込み、４μｌの血液サンプルを、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に５ｍｇｓ／ｍｌの濃度で溶解したレクチンＰＨＡ−Ｅ（Ｓｉｇｍａ）２μｌと１：１の割合で混合した。次いで、このサンプルを室温で１分間インキュベートし、図２、図３および図４に関して先に述べたマイクロ流体分離システムへ適用する前に、赤血球を凝集させた。
【００８１】
導管２４は、２００μｍ（幅）×１００μｍ（高さ）の寸法を有する。システムは、ベース基材を射出成形して、装置並びにマイクロ流体要素の基部または下部を形成し、次いで一体形の射出成形基材をベース基材に超音波溶接してシステムの蓋または上側表面を形成することによって、ポリカーボネート基材から作製された。組み立てる前に、基材を酸素プラズマで処理して、表面を親水性にした。表面の親水性度を測定し、表面接触角度は２０度であることが見出された。
【００８２】
流体サンプル（４μｌ）をサンプル適用領域２０に適用し、次いでマイクロ流体構造体１３に向かって移動させた。凝集した細胞はマイクロ流体構造体を実質的に通過することができず、結果として、凝集した赤血球から血漿／バッファろ液が分離された。
【００８３】
抽出された血漿／バッファの総量は、１０分未満の時間では２００ｎｌであった。血漿分離効率は、利用可能な血漿の総量の１１％として計算された。
【００８４】
本発明の各態様の好ましい特徴は、互いの態様に関して必要な変更を加えたものである。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、本発明によるマイクロ流体分離システムを示す。
【図２】図２は、本発明によるマイクロ流体分離システムを組み込んだ本発明によるアッセイを示す。
【図３】図３は、図２のアッセイシステムを更に図示している。図３ａはこのシステムの平面図である。図３ｂは図３ａの線Ｘ−Ｘに沿って切り取った断面図である。図３ｃは図３ｂの領域Ａの拡大図である。図３ｄは図３ｃの領域Ｂの拡大図である。
【図４】図４は、図２および図３のアッセイシステムにおけるマイクロ流体分離システムを更に図示している。図４ａはこのシステムの斜視図である。図４ｂは領域Ａの拡大図であり、このマイクロ構造を示している。
【図５】図５は、別のマイクロ流体分離システムが設けられた更なるアッセイシステムを図示している。図５ａはこのアッセイシステムの斜視図である。図５ｂは領域Ａの拡大図であり、この分離システムを示している。
【図６】図６は、図５の代替分離システムを更に図示するものである。図６ａは図５のアッセイシステムの平面図である。図６ｂは図６ａの線Ｘ−Ｘに沿って切り取った断面図である。図６ｃは図６ｂの領域Ａの拡大図である。図６ｄは図６ａの領域Ｂの拡大図であり、この分離システムを示している。
【図７】図７ａおよび図７ｂは、アッセイシステムを示す。
【図８】図８は、アッセイシステムの感度を示す。
【図９】図９もまた、アッセイシステムの感度を示す。
【図１０】図１０は、アッセイシステムに関する標準曲線を示す。
【図１】
2007519896.tif 000004
【図２】
2007519896.tif 000005
【図３Ａ】
2007519896.tif 000006
【図３Ｂ】
2007519896.tif 000007
【図３Ｃ】
2007519896.tif 000008
【図３Ｄ】
2007519896.tif 000009
【図４Ａ】
2007519896.tif 000010
【図４Ｂ】
2007519896.tif 000011
【図５Ａ】
2007519896.tif 000012
【図５Ｂ】
2007519896.tif 000013
【図６Ａ】
2007519896.tif 000014
【図６Ｂ】
2007519896.tif 000015
【図６Ｃ】
2007519896.tif 000016
【図６Ｄ】
2007519896.tif 000017
【図７】
2007519896.tif 000018
【図８】
2007519896.tif 000019
【図９】
2007519896.tif 000020
【図１０】
2007519896.tif 000021
【国際調査報告】
2007519896.tif 000022
2007519896.tif 000023
2007519896.tif 000024