(57)【要約】本発明はウイルス学の分野に関する。本発明は、コロナウイルス群に入る新規な単離された本質的に哺乳動物プラス鎖一本鎖RNAウイルス（EMCR-CoV）およびその成分を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図1の配列またはその相同体を含む、単離された本質的に哺乳動物プラス鎖一本鎖RNAウイルス（EMCR-CoV）。
【請求項２】
コロナウイルスに属する、ならびにウイルスの核酸配列を決定し、ブートストラップ100個および無秩序なもの（jumble）3個を用いて最尤樹を作製する系統樹解析においてそれを試験し、それがPEDV（ブタ流行性下痢ウイルス）、HCoV-229E（ヒトコロナウイルス229E）、PRCoV（ブタ呼吸器コロナウイルス）、TGEV（伝染性胃腸炎ウイルス）、CaCoV(イヌコロナウイルス)、およびFeCoV（ネココロナウイルス）のウイルス分離株に相当するよりも、図1に示した配列を有するウイルス分離株に系統発生的により近接して相当することを見出すことにより、コロナウイルスに系統発生的に相当すると同定され得る、単離されたプラス鎖一本鎖RNAウイルス（EMCR-CoV）。
【請求項３】
核酸配列がウイルスのウイルスタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ORF）を含む、請求項1または2記載のウイルス。
【請求項４】
オープンリーディングフレームが、ウイルスレプリカーゼ、ヌクレオカプシドタンパク質、マトリックスタンパク質、およびスパイクタンパク質をコードするORFの群より選択される、請求項3記載のウイルス。
【請求項５】
異型肺炎を有するヒトから単離され得る、請求項1〜4のいずれか一項記載のウイルス。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか一項記載のウイルスから得られる、単離されたもしくは組換えの核酸またはそのEMCR-CoVウイルス特異的機能断片。
【請求項７】
請求項6記載の核酸を含むベクター。
【請求項８】
請求項6記載の核酸または請求項7記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項6記載の核酸によってコードされる、単離されたもしくは組換えのタンパク質性分子またはそのEMCR-CoVウイルス特異的機能断片。
【請求項１０】
請求項9記載のタンパク質性分子またはそのEMCR-CoVウイルス特異的機能断片を含む抗原。
【請求項１１】
請求項10記載の抗原に対して特異的に指し向けられた抗体。
【請求項１２】
ウイルス分離株またはその成分を請求項11記載の抗体と反応させる段階を含む、ウイルス分離株をEMCR-CoVウイルスであると同定する方法。
【請求項１３】
ウイルス分離株またはその成分を請求項6記載の核酸と反応させる段階を含む、ウイルス分離株をEMCR-CoVウイルスであると同定する方法。
【請求項１４】
試料を請求項6記載の核酸または請求項11記載の抗体と反応させることにより、哺乳動物の試料中のウイルス分離株またはその成分の存在を決定する段階を含む、哺乳動物のEMCR-CoV感染をウイルス学的に診断する方法。
【請求項１５】
試料を請求項9記載のタンパク質性分子もしくはその断片または請求項10記載の抗原と反応させることにより、哺乳動物の試料中のEMCR-CoVウイルスまたはその成分に対して特異的に指し向けられた抗体の存在を決定する段階を含む、哺乳動物のEMCR-CoV感染を血清学的に診断する方法。
【請求項１６】
請求項1〜5のいずれか一項記載のウイルス、請求項6記載の核酸、請求項9記載のタンパク質性分子もしくはその断片、請求項10記載の抗原、および/または請求項11記載の抗体を含む、EMCR-CoV感染を診断するための診断キット。
【請求項１７】
薬学的組成物を作製するための、請求項1〜5のいずれか一項記載のウイルス、請求項6記載の核酸、請求項7記載のベクター、請求項8記載の宿主細胞、請求項9記載のタンパク質性分子もしくはその断片、請求項10記載の抗原、または請求項11記載の抗体の使用。
【請求項１８】
EMCR-CoVウイルス感染を治療または予防する薬学的組成物を作製するための、請求項17記載の使用。
【請求項１９】
異型肺炎を治療または予防する薬学的組成物を作製するための、請求項17または18記載の使用。
【請求項２０】
請求項1〜5のいずれか一項記載のウイルス、請求項6記載の核酸、請求項7記載のベクター、請求項8記載の宿主細胞、請求項9記載のタンパク質性分子もしくはその断片、請求項10記載の抗原、または請求項11記載の抗体を含む薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項20記載の薬学的組成物を個体に提供する段階を含む、EMCR-CoVウイルス感染を治療または予防する方法。
【請求項２２】
請求項20記載の薬学的組成物を個体に提供する段階を含む、異型肺炎を治療または予防する方法。
【請求項２３】
図1に示す配列またはその相同体を含むRNA配列によってコードされるウイルスレプリカーゼ。
【請求項２４】
図1に示すアミノ酸配列またはその相同体を含むウイルススパイクタンパク質。
【請求項２５】
図1に示す配列またはその相同体を含むRNA配列によってコードされるウイルス核カプシドタンパク質。
【請求項２６】
図1に示す配列またはその相同体を含むRNA配列によってコードされるウイルスnsp 3またはエンベロープタンパク質。
【請求項２７】
図1に示す個々のウイルスタンパク質をコードする配列の1つもしくは複数を含む核酸配列、またはストリンジェントな条件下でこれらの配列のいずれかとハイブリダイズし得る核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルス学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、SARS（重症急性呼吸器症候群）ウイルスにも任意の他の既知であるウイルス感染にも起因し得ない呼吸器疾患（異型肺炎）が8ヶ月齢の患者で診断された。この患者はインフルエンザ、パラインフルエンザ、おたふく風邪、およびRSVの検査で陰性であり、さらにこの疾患はSARSに酷似しているウイルスに起因していると同定された。
【０００３】
その起源を追跡し、その疫学をモニターし、疾患の蔓延の可能性を妨げ得るためには、肺炎のウイルス原因を早期に認識し得ることが非常に重要である。特に、重篤な疾患がウイルスによって起こることが認められる場合、診断手段および可能な治療法を開発するためにできるだけ早くウイルスの同一性を検出することが必要である。SARSの流行から、疾患の蔓延を妨げるには、適時に有効な単離手段を講じて検疫予防を開始するために早期診断を受け得ることが最も重要であることが示された。そうして初めて、世界規模の汚染を妨ぐことができる。
【０００４】
さらに、疾患のウイルス原因を同定することで、感染している危険性のある人を保護するために予防的に使用し得るワクチンの開発が可能になる。最終的に、ウイルス原因の知識により、治療手段を開発することが可能になる。
【０００５】
したがって、ウイルス性肺炎全般、とりわけ特にウイルスであると考えられる場合の新規な病原感染体の診断ツールおよび治療法を開発する必要性が大いに存在する。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、新規疾患の病原体である、コロナウイルスに属する単離された本質的に哺乳動物プラス鎖一本鎖RNAウイルスのヌクレオチド配列を提供する（このウイルスは以下EMCR-CoVと称し、この疾患は以下EMCR-CoV性肺炎と称する）。このウイルスのマトリックスおよびヌクレオカプシド遺伝子配列の系統発生解析から（図2aおよび2b）、このウイルスは、PEDV（ブタ流行性下痢ウイルス）、HCoV-229E（ヒトコロナウイルス229E）、PRCoV（ブタ呼吸器コロナウイルス）、TGEV（伝染性胃腸炎ウイルス）、CaCoV(イヌコロナウイルス)、およびFeCoV（ネココロナウイルス）によって形成される群の異なるメンバーであると考えられる。アミノ酸同一性行列によれば、ヒトコロナウイルス229Eが最も近縁であるようである（PEDVとやや近縁度が高いと考えられるマトリックスを除くすべてのORFについて−図3を参照）。
【０００７】
系統発生解析はウイルスを同定する簡便な方法を提供するが、ウイルスまたはウイルスタンパク質またはウイルスに由来する核酸を同定するための、いくらかやや粗雑ではあるがより簡単な可能性のあるいくつかの他の方法もまた本明細書において提供する。EMCR-コロナウイルスは大ざっぱなやり方で、同定すべきウイルス、タンパク質、または核酸を本明細書において同定されたウイルスタンパク質または核酸と配列により比較した相同性の割合で同定することができる。ウイルス種、特にRNAウイルス種は、ウイルス群がそのメンバー間で異質性を示す疑似種を形成する場合が多いことが一般に知られている。したがって、各分離株は、本明細書において提供する分離株の配列といく分異なる割合の関連性を有することが予測される。
【０００８】
ウイルス分離株を図1に収載した配列と比較しようとする場合に、本発明は、コロナウイルスに属する、ならびにウイルスの核酸配列を決定し、そのような核酸配列が収載する配列に対して、本明細書において以下で同定される核酸をPEDV、229E、PRCoV、TGEV、CaCoV、およびFeCoVと比較して本明細書で同定される割合よりも高い割合の核酸同一性を有することを決定することにより、コロナウイルスに系統発生的に相当すると同定され得る、単離された本質的に哺乳動物プラス鎖一本鎖RNAウイルス（EMCR-CoV）を提供する。同様に、コロナウイルスに属する、ならびにウイルスのアミノ酸配列を決定し、そのようなアミノ酸配列が収載する配列に対して、PEDV、229E、PRCoV、TGEV、CaCoV、およびFeCoVと比較して本明細書において提供される割合よりも本質的に高い割合のアミノ酸相同性を有することを決定することにより、コロナウイルスに系統発生的に相当すると同定され得る、単離された本質的に哺乳動物プラス鎖一本鎖RNAウイルス（EMCR-CoV）を提供する。
【０００９】
このEMCR-コロナウイルス（EMCR-CoV）の配列情報を提供することで、本発明は、このウイルスによる感染と関連した特に哺乳動物の、より具体的にはヒトの疾患、特に呼吸器疾患（異型肺炎）の診断、予防、および/または治療に使用される診断手段および方法、予防手段および方法、ならびに治療手段および方法を提供する。ウイルス学的には、そのような感染を引き起こす特定のウイルスに最も特異的な試薬を用いて、特定のウイルス感染を診断、予防、および/または治療することが最も勧められる。この場合、このことは、EMCR-CoVウイルスのそのような診断、予防、および/または治療が、EMCR-CoVウイルスに最も特異的である試薬を用いて行われることが好ましいことを意味する。しかしこのことは、例えばより簡便に入手することができ、目先の課題に十分対処するという理由で、特異性は低いが十分に交差反応性のある試薬を代わりに使用する可能性を決して排除するものではない。
【００１０】
本発明は例えば、試料を本発明によるEMCR-CoV特異的核酸または抗体と試料を反応させることにより、動物の試料中のウイルス分離株またはその成分の存在を決定する段階を含む、動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトのEMCR-CoVをウイルス学的に診断する方法、および試料を本発明によるEMCR-CoV特異的タンパク質性分子もしくはその断片または抗原と反応させることにより、哺乳動物の試料中のEMCR-CoVウイルスまたはその成分に対して特異的に指し向けられた抗体の存在を決定する段階を含む、哺乳動物のEMCR-CoV感染を血清学的に診断する方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、本発明によるEMCR-CoVウイルス、EMCR-CoVウイルス特異的核酸、タンパク質性分子もしくはその断片、抗原、および/または抗体を含む、EMCR-CoV感染を診断する診断キット、および好ましくは、例えば当技術分野において使用されるフルオロフォアまたは酵素検出系のように励起可能な基を含む、EMCR-CoVウイルス、EMCR-CoVウイルス特異的核酸、タンパク質性分子もしくはその断片、抗原、および/または抗体を検出する手段を提供する（適切な診断キット形式の例には、IF、ELISA、中和アッセイ、RT-PCRアッセイが含まれる）。今のところ同定されていないウイルス成分、または核酸、タンパク質性分子もしくはその断片のようなその合成類似体がEMCR-CoVウイルス特異的であり得るかどうかを決定するには、例えば本明細書に提供するような系統発生解析を使用して、例えば好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも40のヌクレオチドまたはアミノ酸（それぞれ）のひと配列に関して、提供されるEMCR-CoVウイルス配列および既知の非EMCR-CoVウイルス配列（ヒトコロナウイルス299Eを使用することが好ましい）と比較した配列相同性により成分の核酸またはアミノ酸配列を解析することで十分である。EMCR-CoVまたは非EMCR-CoVウイルス配列との関連性の程度により、成分または合成類似体を同定することができる。
【００１２】
したがって本発明は、新規な病原体、コロナウイルス科に属する単離された本質的に哺乳動物プラス鎖一本鎖RNAウイルス（本明細書ではEMCR-CoVとも称する）の核酸配列、およびEMCR-CoVウイルス特異的成分またはその合成類似体を提供する。
【００１３】
コロナウイルスは1937年に初めてトリから単離され、最初のヒトコロナウイルスは1965年にTyrellおよびBonoeによってインビトロで拡大された。現在は、ウシ、ブタ、齧歯動物、ネコ、イヌ、鳥類、およびヒトに感染する約13種がこの科に存在する。コロナウイルス粒子は不規則な形をしており、直径は約60〜220 nmであり、外殻は特有の「こん棒状」ペプロマー（約20 nm長および遠位端で10 nm幅）を有する。この「王冠型」の外観から、この科にはこの名称が与えられている。エンベロープは2つの糖タンパク質を有する：S：細胞融合に関与し、主要な抗原であるスパイク糖タンパク質、およびM：出芽およびエンベロープ形成に関与する膜糖タンパク質。ゲノムは、Nと称する基本的リンタンパク質と会合している。一本鎖プラスRNA鎖であるコロナウイルスのゲノムは典型的に27〜31 Kb長であり、5'メチルキャップおよび3'ポリA尾部を含み、それによってこのゲノムは感染細胞内でmRNAとして直接機能し得る。最初に5' ORF 1（約20 Kb）が翻訳されてウイルスポリメラーゼが生成され、次いでこれが全長マイナス鎖を生成する。マイナス鎖は転写産物の「入れ子セット」としてのmRNAを生成する鋳型として用いられ、これらのmRNAはすべて72ヌクレオチドの同一の5'非翻訳リーダー配列を有し、それと同時に3'ポリアデニル化末端を有する。このようにして生成される各mRNAはモノシストロン性であり、5'末端にある遺伝子は最も長いmRNAから翻訳され、以下同様である。これらの珍しい細胞質構造は、スプライシングではなく、転写時のポリメラーゼによって形成される。各遺伝子間には反復遺伝子間配列−AACUAAAC−が存在し、これが転写酵素および細胞因子と相互作用して各ORFの開始点にリーダー配列をスプライシングする。いくつかのコロナウイルスでは、上記のタンパク質に加えて、さらにヘマグルチニンエステラーゼ（HE）およびいくつかの他の非構造タンパク質をコードする約8個のORFが存在する。
【００１４】
新たに単離されたウイルスは、本発明者らの原型EMCR-CoVウイルスに十分類似した遺伝子順序および/またはアミノ酸配列および/またはヌクレオチド配列を含む場合、系統発生的に、ひいては分類学的にEMCR-CoVウイルスに相当する。EMCR-CoVウイルスと今日までに知られている同じ科の他のウイルスのいずれかとのORFの間で最も高いアミノ酸配列同一性は、ヒトコロナウイルス299Eまたはブタ流行性下痢ウイルスとの間で見られる（図3および図4を参照のこと）。ヒトコロナウイルス229Eとのアミノ酸同一性は45%（核タンパク質）〜81%（レプリカーゼ1b）であり；興味深いことに、レプリカーゼ1aはレプリカーゼ1bの81%同一性とは対照的に56%の同一性しか有していない。EMCR CoVは、PEDVのマトリックスORFとやや近縁度が高いマトリックスを除くすべての推定ORFについて、今日までに知られている同じ科の他のウイルスのいずれかとよりもヒトコロナウイルス229Eとより近い同一性を有する。それぞれこれらの示した最大値よりも高い相同性を有する個々のタンパク質またはウイルス分離株全体は、系統発生的に、ひいては分類学的にEMCR-CoVウイルスに相当すると見なされ、一般に図1に示すような配列と構造的に相当する核酸配列によってコードされる。本明細書において本発明は、配列が図1に示される単離されたウイルスに系統発生的に相当するウイルスを提供する。
【００１５】
他のウイルスと同様に、異なる供給源から単離されたEMCR-CoVウイルスの間にはある程度の変動が予測され得ることに留意されたい。
【００１６】
また、本明細書において提供するEMCR-CoVウイルスのウイルス配列または単離されたEMCR-CoVウイルス遺伝子は、例えばGenbank（例えば、アクセッション番号af304460（HCoV-229E）またはaf353511（PEDV））において見出され得るように、ヒトコロナウイルス229Eまたはブタ流行性下痢ウイルスのそれぞれのヌクレオチドまたはアミノ酸配列と、例えば95%未満、好ましくは90%未満、より好ましくは80%未満、より好ましくは70%未満、最も好ましくは65%未満のヌクレオチド配列相同性、または95%未満、好ましくは90%未満、より好ましくは80%未満、より好ましくは70%未満、最も好ましくは65%未満のアミノ酸配列相同性を示す。
【００１７】
世界中のEMCR-CoV株の配列分散は、他のコロナウイルスと同様にいくらか高い可能性がある。
【００１８】
本明細書で使用する「ヌクレオチド配列相同性」という用語は、2つの（ポリ）ヌクレオチド間に相同性が存在することを示す。ポリヌクレオチドは、最大限の一致が得られるように整列させた際に2つの配列のヌクレオチド配列が同一である場合に、「相同な」配列を有する。2つまたはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列比較は一般的に、比較領域にわたって2つの配列の部分を比較して、配列類似性の局所領域を同定し比較することによって行われる。比較領域は一般に約20〜200個の連続したヌクレオチドである。50、60、70、80、90、95、98、99、または100パーセント配列相同性のようなポリヌクレオチドに関する「配列相同性の割合」は、比較領域にわたって2つの最適に整列された配列を比較することにより決定され得り、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の部分は、2つの配列の最適なアライメントを得るために（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでよい。この割合は、次のようにして算出される。(a) 両配列において同一の核酸塩基が存在する位置の数を決定し、一致する位置の数を得る；(b) 一致する位置の数を比較領域における全位置数で割る；(c) その結果に100を掛けて配列相同性の割合を得る。比較する配列の最適なアライメントは、既知のアルゴリズムのコンピュータによる実施によって、または目視によって行われ得る。容易に利用できる配列比較アルゴリズムおよび複数配列アライメントアルゴリズムはそれぞれ、どちらもインターネットで利用可能なBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）（Altschul, S.F. et al. 1990. J. Mol. Biol. 215:403；Altschul, S.F. et al. 1997. Nucleic Acid Res. 25:3389-3402）およびClustalWプログラムである。他の適切なプログラムには、Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group (GCG)、米国、ウィスコンシン州、マディソン）のGAP、BESTFIT、およびFASTAが含まれる。
【００１９】
本明細書で用いる「実質的に相補的」とは、2つの核酸配列が相互に少なくとも約65%、好ましくは約70%、より好ましくは約80%、さらにより好ましくは90%、最も好ましくは約98%の配列相補性を有することを意味する。このことは、プライマーおよびプローブがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするために、それらの鋳型および標的核酸それぞれと十分な相補性を示さなければならないことを意味する。したがって、本明細書において開示するプライマー配列は鋳型上の結合領域の正確な配列を反映する必要はなく、縮重プライマーを使用することが可能である。実質的に相補的なプライマー配列とは、プライマー結合および第2鎖合成をもたらすのに十分な、増幅鋳型に対する配列相補性を有する配列である。
【００２０】
「ハイブリッド」という用語は、相補的ヌクレオチド間の水素結合によって形成される二本鎖核酸分子または二本鎖を指す。「ハイブリダイズする」または「アニールする」という用語は、一本鎖の核酸配列が相補的ヌクレオチド間の水素結合により二重らせん部分を形成する過程を指す。
【００２１】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、リン結合（例えば、リン酸ジエステル、アルキルおよびアリル-リン酸、ホスホロチオエート）または非リン結合（例えば、ペプチド、スルファミン酸など）によって結合されたヌクレオチド単量体の短い配列（通常、6〜100ヌクレオチド）を指す。オリゴヌクレオチドは、修飾塩基（例えば、5-メチルシトシン）および修飾糖基（例えば、2'-O-メチルリボシル、2'-O-メトキシエチルリボシル、2'-フルオロリボシル、2'-アミノリボシルなど）を有する修飾ヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、環状、分岐状、または線状形態を有し、任意に安定な二次構造を形成し得るドメインを含む（例えば、ステムアンドループ構造およびループ-ステム-ループ構造）、二本鎖および一本鎖DNAならび二本鎖および一本鎖RNAの天然分子または合成分子であってよい。
【００２２】
本明細書で用いる「プライマー」という用語は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼなどの重合剤の存在下、ならびに適切な温度およびpHに置かれた場合に、増幅標的とアニーリングし得り、DNAポリメラーゼを結合させて、それによってDNA合成の開始点として機能し得るオリゴヌクレオチドを指す。（増幅）プライマーは、増幅効率を最大限にするために一本鎖であることが好ましい。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分長くなくてはならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源を含む多くの要因に依存する。本明細書で用いる「二方向性プライマー対」という用語は、PCR増幅などのDNA増幅の当技術分野において通常用いられる1つのフォワードプライマーおよび1つのリバースプライマーを指す。
【００２３】
「プローブ」という用語は、標的核酸配列分析物中の相補的配列またはそのcDNA派生物を認識し、それと水素結合二本鎖を形成する一本鎖オリゴヌクレオチド配列を指す。
【００２４】
「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、例えば温度、塩濃度、pH、ホルムアミド濃度など、ハイブリッドの安定性に影響するハイブリダイゼーション条件を指す。これらの条件は、プライマーまたはプローブの標的核酸配列への特異的結合を最大限にし、非特異的結合を最小限に抑えるように実験により最適化される。用いられるこれらの用語は、プローブまたはプライマーがその標的配列に対して、他の配列よりも検出可能に高い程度で（例えば、バックグラウンドの少なくとも2倍）ハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は配列に依存し、状況によって異なる。長い配列ほど高い温度で特異的にハイブリダイズする。ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおける特定の配列に対する融解温度（Tm）よりも約5℃低くなるように選択される。Tmとは、相補的標的配列の50%が、完全に一致するプローブまたはプライマーとハイブリダイズする（規定のイオン強度およびpHにおける）温度である。典型的に、ストリンジェントな条件は、pH 7.0〜8.3において塩濃度が約1.0 M Na+イオンよりも低く、典型的に約0.01〜1.0 M Na+イオン濃度（またはその他の塩）である条件であり、温度は短いプローブまたはプライマー（例えば、10〜50ヌクレオチド）については少なくとも30℃であり、長いプローブまたはプライマー（例えば、50ヌクレオチド超）については少なくとも約60℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。例示的な低ストリンジェント条件または「低ストリンジェンシーの条件」には、37℃における30%ホルムアミド、1 M NaCl、1% SDSの緩衝液でのハイブリダイゼーション、および40℃における2X SSC中での洗浄が含まれる。例示的な高ストリンジェント条件には、37℃における50%ホルムアミド、1 M NaCl、1% SDS中でのハイブリダイゼーション、および60℃における0.1X SSC中での洗浄が含まれる。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野において周知であり、例えばAusubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994に記載されている。
【００２５】
「抗体」という用語は、抗体の抗原結合形態（例えば、Fab、F(ab)2）への言及を含む。「抗体」という用語は、分析物（抗原）と特異的に結合し認識する、1つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチドまたはその断片を指す。しかし、無傷の抗体の消化の観点で様々な抗体断片が規定され得るが、当業者はそのような断片が化学的にまたは組換えDNA法を利用して新規に合成され得ることを理解すると考えられる。したがって、本明細書で使用する抗体という用語はまた、一本鎖Fv、キメラ抗体（すなわち、異なる種に由来する定常領域および可変領域を含む）、ヒト化抗体（すなわち、非ヒト供給源に由来する相補性決定領域（CDR）を含む）、および異種結合抗体（例えば、二重特異性抗体）などの抗体断片を含む。
【００２６】
要約すると、本発明は、コロナウイルスに属する、ならびにウイルスの適切なゲノム断片の核酸配列を決定し、ブートストラップ100個および無秩序なもの（jumble）3個を用いて最尤樹を作製する系統樹解析においてそれを試験し、それがPEDV（ブタ流行性下痢ウイルス）、HCoV-229E（ヒトコロナウイルス229E）、PRCoV（ブタ呼吸器コロナウイルス）、TGEV（伝染性胃腸炎ウイルス）、CaCoV(イヌコロナウイルス)、およびFeCoV（ネココロナウイルス）のウイルス分離株に相当するよりも、図1に示した配列を有するウイルス分離株に系統発生的により近接して相当することを見出すことにより、コロナウイルスに系統発生的に相当すると同定され得る、単離された本質的に哺乳動物プラス鎖一本鎖RNAウイルス（EMCR-CoV）を提供する。
【００２７】
それぞれそのような系統樹解析に有用である適切な核酸ゲノム断片は、例えば図1に開示するマトリックスタンパク質またはヌクレオカプシドタンパク質をコードする断片のいずれかであり、これによって図2aまたは2bにおいて本明細書で開示する系統樹解析がもたらされる。このような系統樹解析に有用である他の適切な核酸断片は、例えば、レプリカーゼ1aおよび1b、スパイク、orf 4aおよび4b、ならびにEをコードする断片のいずれかである。
【００２８】
系統発生解析において有用である適切なオープンリーディングフレーム（ORF）は、ウイルスレプリカーゼをコードするORF（ORF 1a）を含む。解析するレプリカーゼの、図1のアミノ酸を含む配列を有するレプリカーゼとの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の全体的アミノ酸同一性が認められる場合、解析したウイルス分離株は本発明によるEMCR-Covウイルス分離株を含む。
【００２９】
系統発生解析において有用である適切なオープンリーディングフレーム（ORF）は、ウイルスレプリカーゼをコードするORF（ORF 1b）を含む。解析するレプリカーゼの、図1のアミノ酸を含む配列を有するレプリカーゼとの少なくとも82%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の全体的アミノ酸同一性が認められる場合、解析したウイルス分離株は本発明によるEMCR-Covウイルス分離株を含む。
【００３０】
系統発生解析において有用である別の適切なオープンリーディングフレーム（ORF）は、ヌクレオカプシドタンパク質をコードするORFを含む。解析するヌクレオカプシドタンパク質の、図1の配列F（の一部）を含む配列によってコードされるヌクレオカプシドタンパク質との少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の全体的アミノ酸同一性が認められる場合、解析したウイルス分離株は本発明によるEMCR-Covウイルス分離株を含む。
【００３１】
系統発生解析において有用である別の適切なオープンリーディングフレーム（ORF）は、マトリックスタンパク質をコードするORFを含む。解析するマトリックスタンパク質の、図1の配列F（の一部）を含む配列によってコードされるマトリックスタンパク質との少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の全体的アミノ酸同一性が認められる場合、解析したウイルス分離株は本発明によるEMCR-Covウイルス分離株を含む。
【００３２】
系統発生解析において有用である別の適切なオープンリーディングフレーム（ORF）は、スパイクタンパク質SをコードするORFを含む。解析するSタンパク質の、図1に示すSタンパク質のEの翻訳物2およびF配列の翻訳物1の配列を含む配列によってコードされるSタンパク質との少なくとも55%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の全体的アミノ酸同一性が認められる場合、解析したウイルス分離株は本発明によるEMCR-Covウイルス分離株を含む。EMCR-CoVウイルスのS ORFは（ウイルスレプリカーゼをコードしている）ORF 1abの近傍に位置しているようであり、これによってEMCR-CoVウイルスは、Sタンパク質とウイルスポリメラーゼとの間にいわゆる2a遺伝子およびHE遺伝子を有するウシコロナウイルスおよびマウス肝炎ウイルスと識別される。
【００３３】
本発明は特に、本発明によるウイルスから得られる単離されたもしくは組換えの核酸またはそのウイルス特異的機能断片を提供する。単離されたまたは組換え核酸は、図1に提供される配列、またはストリンジェントな条件下でそれらとハイブリダイズし得る相同体の配列を含む。特に本発明は、EMCR-CoVウイルス核酸の同定に適したプライマーおよび/またはプローブを提供する。
【００３４】
さらに本発明は、本発明による核酸を含むベクターを提供する、まず第一に、EMCR-CoVウイルスのゲノム（の一部）を含むプラスミドベクター、EMCR-CoVのゲノム（の一部）を含むウイルスベクター（例えば、これらに限定されないが、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス）などのベクター、または他のウイルスもしくは他の病原体のゲノム（の一部）を含むEMCR-CoVウイルスを提供する。
【００３５】
また本発明は、本発明による核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。EMCR-CoVウイルスのレプリカーゼ成分を含むプラスミドベクターまたはウイルスベクターは、関連する細胞種（細菌、昆虫細胞、真核細胞）においてその成分を発現させるために原核細胞において作製される。EMCR-CoVウイルスゲノムの全長または部分的コピーを含むプラスミドベクターまたはウイルスベクターは、インビトロまたはインビボでウイルス核酸を発現させるために原核細胞において作製される。後者のベクターは、キメラウイルスまたはキメラウイルスタンパク質を作製するために他のウイルス配列を含み得り、複製欠損ウイルスを作製するためにウイルスゲノムの一部を欠いてよく、さらに弱毒ウイルスを作製するために変異、欠失、または付加を含み得る。
【００３６】
EMCR-CoVウイルス（野生型、弱毒、複製欠損、またはキメラ）の感染性コピーは、上記した最先端の技術に従ってポリメラーゼ成分を同時発現させて作製され得る。
【００３７】
さらに、1つまたは複数の全長または部分的EMCR-CoVウイルスタンパク質を一過性にまたは安定して発現する真核細胞を使用することができる。そのような細胞はトランスフェクション（タンパク質または核酸ベクター）、感染（ウイルスベクター）、または形質導入（ウイルスベクター）によって作製され得り、野生型、弱毒、複製欠損、またはキメラウイルスの補完に有用であり得る。
【００３８】
キメラウイルスは、2つまたはそれ以上のウイルスを防御する組換えワクチンを作製するのに特に有用であると考えられる。例えば、ヒトメタニューモウイルスの1つもしくは複数のタンパク質を発現するEMCR-CoVウイルスベクター、またはEMCR-CoVウイルスの1つもしくは複数のタンパク質を発現するヒトニューモウイルスベクターは、そのようなベクターをワクチン接種した個体を両ウイルス感染から防御することが想定され得る。例えば、ヒトメタニューモウイルスはコロナウイルス感染患者に存在する場合が多く、同時感染が疑われるため、そのような特定のキメラウイルスは本発明において特に有用である。弱毒ウイルスおよび複製欠損ウイルスは、他のウイルスについて示唆されているように、生ワクチンによるワクチン接種目的に有用であり得る。
【００３９】
好ましい態様において、本発明は、本発明による核酸によってコードされるタンパク質性分子、またはコロナウイルス特異的ウイルスタンパク質、またはその断片を提供する。有用なタンパク質性分子は、例えば本発明によるウイルスに由来し得る遺伝子またはゲノム断片のいずれかに由来する。本明細書において提供するそのような分子またはその抗原断片は、例えば診断方法または診断キット、ならびにサブユニットワクチンおよび阻害性ペプチドなどの薬学的組成物において有用である。特に有用であるのは、抗原もしくはサブユニット免疫原として含めるためのウイルスレプリカーゼタンパク質、スパイクタンパク質、マトリックスタンパク質、ヌクレオカプシド、またはそれらの抗原断片であるが、不活化したウイルス全体を用いることもできる。特に有用であるのはまた、インビボであろうと（例えば、防御目的または診断抗体を提供するため）インビトロであろうと（例えば、ファージディスプレイ技術または合成抗体の作製に有用な別の技法による）特にEMCR-CoVウイルス特異的抗体を誘発するための、系統発生解析に関して同定される、当然のことながら好ましくは系統発生解析において有用なORFの好ましい領域境界内にある組換え核酸断片によってコードされるタンパク質性物質である。
【００４０】
本明細書ではまた、天然ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、または合成抗体（例えば、（ファージ）ライブラリー由来結合分子）であるかどうかにかかわらず、本発明によるタンパク質性分子またはそのEMCR-CoVウイルス特異的機能断片を含む抗原と特異的に反応する抗体を提供する。そのような抗体は、ウイルス分離株またはその成分を本明細書において提供する抗体と反応させる段階を含む、ウイルス分離株をEMCR-CoVウイルスであると同定する方法において有用である。これは、例えば、ELISA、RIA、FACS、または抗原検出アッセイ法の類似の形式により（Current Protocols in Immunology）、精製もしくは非精製EMCR-CoVウイルスまたはその一部（タンパク質、ペプチド）を使用して達成され得る。または、感染細胞または細胞培養物を用いて、古典的な免疫蛍光法または免疫組織化学法によりウイルス抗原を同定することもできる。この点で特に有用であるのは、図1に開示する配列の1つまたは複数を含むヌクレオチド配列によってコードされるEMCR-CoVウイルスタンパク質に対して産生された抗体である。
【００４１】
ウイルス分離株をEMCR-CoVウイルスであると同定する他の方法は、ウイルス分離株またはその成分を本発明によるウイルス特異的核酸と反応させる段階を含む。
【００４２】
このような方法で本発明は、本発明による方法によって、コロナウイルス科のEMCR-CoVウイルス属に属すると同定され得る可能性の高いプラス鎖一本鎖RNAウイルスに分類学的に相当する哺乳動物ウイルスであると同定され得るウイルス分離株を提供する。
【００４３】
本方法は、哺乳動物のEMCR-CoVウイルス感染をウイルス学的に診断する方法において有用であり、この方法は例えば、試料を本発明による核酸または抗体と反応させることにより、哺乳動物試料中のウイルス分離株の存在を決定する段階を含む。
【００４４】
本発明の方法は原理上、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR法；Mullis 1987、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、および第4,800,159号）などの任意の核酸増幅法により、またはリガーゼ連鎖反応法（LCR法；Barany 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193；欧州特許出願第320,308号）、自律的配列複製法（3SR法；Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）、鎖置換増幅法（SDA法；米国特許第5,270,184号および第5,455,166号）、転写増幅系（TAS；Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）、Qβレプリカーゼ法（Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197）、ローリングサークル増幅法（RCA法；米国特許第5,871,921号）、核酸配列に基づく増幅法（NASBA法）、クリベース断片長多型法（米国特許第5,719,028号）、等温キメラプライマー核酸増幅法（ICAN法）、分枝-伸長増幅法（RAM法；米国特許第5,719,028号および第5,942,391号）、もしくは核酸の増幅に適した他の方法などの増幅反応により実施され得る。
【００４５】
1つまたは複数の増幅プライマーに対して少数のミスマッチを有する核酸を増幅するには、ストリンジェンシーを下げた条件下で増幅反応を行い得る（例えば、アニーリング温度38℃または3.5 mM MgCl2の存在を使用したPCR増幅）。当業者は、適切なストリンジェンシー条件を選択し得ると考えられる。
【００４６】
本明細書におけるプライマーは、増幅すべき各特定配列の異なる鎖上に存在する標的領域に対して「実質的に」相補的（すなわち、少なくとも65%、より好ましくは少なくとも80%が完全に相補的）であるように選択される。例えば、イノシトール残基もしくはあいまいな塩基を含むプライマー配列、またはさらには標的配列と比較して1つもしくは複数のミスマッチを含むプライマーを使用することも可能である。一般に、標的DNAまたはRNAオリゴヌクレオチド配列と少なくとも65%、より好ましくは少なくとも80%の相同性を示す配列は、本発明の方法で使用するのに適していると見なされる。配列ミスマッチはまた、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いる場合には重要でない。
【００４７】
増幅産物の検出は、原理上、当技術分野において周知である任意の適切な方法で達成され得る。検出断片は、放射性標識、抗体、発光色素、蛍光色素、または酵素試薬で直接染色または標識することができる。直接的なDNA染色には、例えば、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、モノアジドエチジウム、またはHoechst色素などのインターカレート色素が含まれる。または、DNAまたはRNA断片は、標識dNTP塩基の合成断片への取り込みによって検出され得る。ヌクレオチド塩基と結合させ得る検出標識には、例えば、フルオレセイン、シアニン色素、またはBrdUrdが含まれる。
【００４８】
プローブに基づく検出系を使用する場合、本発明における使用に適した検出手順は、例えば酵素免疫測定法（EIA）形式を含む（Jacob et al., 1997, J. Clin. Microbiol. 35, 791-795）。EIA手順の様式により検出を行うには、増幅反応で使用するフォワードプライマーまたはリバースプレイマーのいずれかが、その後標的DNA-単位複製配列をEIA検出するための例えばストレプトアビジンをコーティングしたマイクロタイタープレートウェル上に標的DNA PCR単位複製配列を固定化するためのビオチン基などの捕獲基を含み得る（以下を参照のこと）。当業者は、EIA形式で標的DNA PCR単位複製配列を固定化するための他の基を使用し得ることを理解すると考えられる。
【００４９】
本明細書に開示する標的DNAの検出に有用なプローブは、好ましくはDNA増幅手順によって増幅されるDNA配列領域の少なくとも一部にのみ結合する。当業者は、本明細書に示したように過度の実験を行うことなく、標的DNAのヌクレオチド配列に基づいて検出に適したプローブを調製することができる。また、標的DNAの相補的ヌクレオチド配列は、DNAであろうとRNAであろうと、または化学合成類似体であろうと、そのような相補鎖が用いられる増幅反応おいて増幅されるならば、本発明の方法において型特異的検出プローブとして適切に使用され得る。
【００５０】
本明細書で使用するのに適した検出手順は、例えば、単位複製配列の固定化、および例えばサザンブロッティングによるそのDNA配列のプロービングを含み得る。他の形式は上記のEIA形式を含み得る。結合の検出を容易にするため、特異的単位複製配列検出プローブは、増幅反応の反応産物に対するプローブ結合のモニタリングが容易になるように、フルオロフォア、発色団、酵素、または放射性標識などの標識部分を含み得る。そのような標識は当業者には周知であり、これには例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、35S、または125Iが含まれる。他の例は当業者には明らかであると考えられる。
【００５１】
検出はまた、例えばVan den Brule et al.（2002, J. Clin. Microbiol. 40, 779-787）によって記載されているいわゆるリバースラインブロット（RLB）アッセイによって行うことができる。このために、RLBプローブは好ましくは、その後例えばカルボキシコーティングナイロン膜上に固定化するための5'アミノ基を用いて合成される。RLB形式の利点は系の簡便さおよびその速さであり、それによってハイスループットの試料処理が可能になる。
【００５２】
RNAまたはDNA断片の検出のための核酸プローブの使用は、当技術分野において周知である。ほとんどの場合、これらの手順は標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーション、およびハイブリダイゼーション後の洗浄を含む。特異性は典型的にハイブリダイゼーション後の洗浄の作用であり、重要な要因は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。核酸ハイブリダイゼーションでは、以下のMeinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284 (1984)の式からTmを概算することができる；Tm = 81.5℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (% GC) - 0.61 (% form ) - 500/L；式中、Mは一価カチオンのモル濃度であり、% GCは核酸中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの割合であり、% formはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Lは塩基対で表したハイブリッドの長さである。Tmとは、相補的標的配列の50%が、完全に一致するプローブとハイブリダイズする（規定のイオン強度およびpHにおける）温度である。Tmはミスマッチ1%につき約1℃低下する；したがって、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように調節することができる。例えば、>90%同一性を有する配列を探す場合、Tmは10℃低下し得る。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおける特定の配列およびその相補体の融解温度（Tm）よりも約5℃低く選択される。しかし、厳しいストリンジェント条件では、融解温度（Tm）よりも1、2、3、または4℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用し得り；中程度のストリンジェント条件では、融解温度（Tm）よりも6、7、8、9、または10℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用し得り；低ストリンジェンシー条件では、融解温度（Tm）よりも11、12、13、14、15、または20℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用し得る。式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成、ならびに所望のTmを使用することにより、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄溶液のストリンジェンシーの変化が本質的に記載されることを理解すると考えられる。所望のミスマッチの程度が45℃（水溶液）または32℃（ホルムアミド溶液）未満のTmをもたらす場合には、より高い温度が使用できるようにSSC濃度を上げることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての詳細な手引きは、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistm and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」, Elsevier. New York (1993);およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley - Interscience, New York (1995)に見出される。
【００５３】
別の局面において、本発明は、標的RNAまたはDNAの一般的検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを提供する。本明細書における検出プローブは、本発明の増幅反応によって作製される二本鎖核酸の一方の鎖に「実質的に」相補的であるように選択される。好ましくはプローブは、標的RNAまたはDNAから作製された単位複製配列の、固定化可能な、例えばビオチン標識されたアンチセンス鎖と実質的に相補的である。
【００５４】
本発明の検出プローブが、それらの標的配列に対して1つまたは複数のミスマッチを含むことが許容される。一般に、標的オリゴヌクレオチド配列と少なくとも65%、より好ましくは少なくとも80%の相同性を示す配列は、本発明の方法で使用するのに適していると見なされる。
【００５５】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体もまた、例えば抗体を液相でまたは固相担体に結合させて利用し得る免疫測定法において、本発明の検出目的で使用することができる。さらに、これらの免疫測定法におけるモノクローナル抗体は、様々な方法で検出可能に標識され得る。種々の免疫測定形式を用いて、特定のタンパク質（またはたの分析物）と特異的に反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ELISA免疫測定法は、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために日常的に使用される。選択的結合を決定するために使用され得る免疫測定形式および条件の説明については、Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)を参照されたい。本発明の抗体を利用し得る免疫測定法の種類の例は、直接または間接的形式における競合および非競合免疫測定法である。そのような免疫測定法の例は、放射性免疫測定法（RIA法）およびサンドイッチ（免疫測定）アッセイ法である。本発明の抗体を用いた抗原の検出は、生理学的試料における免疫組織化学アッセイ法を含む、順方向、逆方向、または同時様式のいずかで行われる免疫測定法を利用して行うことができる。当業者は他の免疫測定形式に周知であると考えられ、または過度に実験を行うことなくそれを容易に識別し得る。
【００５６】
抗体を多くの様々な担体に結合させ、これを用いて標的分子の存在を検出することができる。周知である担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および加工セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱が含まれる。本発明の目的のために、担体の性質は可溶性であっても不溶性であってもよい。当業者は、モノクローナル抗体を結合させるための他の適切な担体に周知であると考えられ、または日常的な実験を用いてそれを確認し得ると考えられる。
【００５７】
本発明はまた、試料を本発明によるタンパク質性分子もしくはその断片または抗原と反応させることにより、哺乳動物の試料中のEMCR-CoVウイルスまたはその成分に対して特異的に指し向けられた抗体の存在を決定する段階を含む、哺乳動物のEMCR-CoV感染を血清学的に診断する方法を提供する。
【００５８】
本明細書において提供する方法および手段は、ウイルス学的診によろうと血清学的診断によろうと、EMCR-CoVウイルス感染を診断するための診断キットに特に有用である。そのようなキットまたはアッセイ法は、例えば本発明によるウイルス、核酸、タンパク質性分子もしくはその断片、抗原、および/または抗体を含み得る。
【００５９】
本発明によるウイルス、核酸、タンパク質性分子もしくはその断片、抗原、および/または抗体の使用はまた、例えば特にヒトのEMCR-CoVウイルス感染の治療もしくは予防、および/または異型肺炎の治療もしくは予防のための薬学的組成物の作製のために提供される。好ましくは、図1の関連する翻訳物に示されるスパイクタンパク質のアミノ酸配列の一部を含むペプチドが、治療または予防ペプチドの調製に用いられる。同様に好ましくは、図1の関連する翻訳物に示されるスパイクタンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質が、サブユニットワクチンの調製に用いられる。さらに、図1の翻訳物に示されるコロナウイルスのヌクレオカプシドは、コロナウイルスに対する細胞性免疫を誘発するのに特に有用であることが知られており、これをサブユニットワクチンの調製に使用することができる。
【００６０】
ウイルスの弱毒化は、この目的のために開発された確立した方法によって達成され得り、この方法はこれらに限定されるわけではないが、他の種の関連ウイルスの使用、実験動物または/および組織/細胞培養による連続継代、37℃未満の温度で細胞培養することによる連続継代（低温適応）、分子クローンの部位特異的突然変異誘発、ならびに関連ウイルス間での遺伝子または遺伝子断片の置換を含む。
【００６１】
本発明によるウイルス、核酸、タンパク質性分子もしくはその断片、抗原、および/または抗体を含む薬学的組成物は、例えば、本発明による薬学的組成物を個体に提供する段階を含む、EMCR-CoVウイルス感染および/または呼吸器疾患を治療または予防する方法において使用することができる。これは、個体がヒトを含む場合に最も有用である。EMCR-CoVウイルスタンパク質に対する、特にEMCR-CoVウイルスのスパイクタンパク質に対する、好ましくは、図1の翻訳物に示すアミノ酸配列に対する抗体もまた、受動ワクチンとして予防または治療目的に有用である。他のコロナウイルスから、スパイクタンパク質が非常に強力な抗原であること、およびスパイクタンパク質に対する抗体を予防的および治療的ワクチン接種に使用できることが周知である。
【００６２】
本発明はまた、本発明によるウイルスを含む細胞培養物または実験動物を確立する段階、そのような培養物または動物を候補抗ウイルス剤で処置する段階、およびその薬剤がウイルスまたは培養物もしくは動物の感染に及ぼす影響を決定する段階を含む、異型肺炎の治療に有用な抗ウイルス剤を取得する方法を提供する。そのような抗ウイルス剤の例には、本明細書において提供するEMCR-CoVウイルス中和抗体またはその機能的成分が含まれるが、他の性質の抗ウイルス剤も同様に取得することができる。
【００６３】
本発明はまた、特にEMCR-CoVウイルス感染によって起こる場合の異型肺炎を治療する薬学的組成物を調製するための、本発明による抗ウイルス剤の使用を提供し、また薬学的組成物を個体に提供する段階を含む、EMCR-CoVウイルス感染または異型肺炎を治療または予防する方法において有用である、本発明による抗ウイルス剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００６４】
本発明はまた、予防および/または治療の方法および/または調製物を試験するために使用し得る動物モデルを含む。類人猿はEMCR-CoVウイルスに感染し得り、それによって臨床症状、より重要なことには、EMCR-CoVウイルスによって起こる異型肺炎を罹患したヒトにおいて認められるのと類似した組織形態を示すと仮定される。類人猿をウイルスによる感染の前または感染過程で予防または治療処置に供することは、そのような予防または治療をヒト対象に適用するための優れたかつ有用な予測値を有すると考えられる。
【００６５】
本発明を実施例においてさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００６６】
実施例
試料の採取
鼻腔用綿棒を使用して、肺炎に罹患している8ヶ月齢の患者からウイルスを採取した。
【００６７】
ウイルスの単離および培養
咽頭スワブをtMK細胞の培養液に浸し、4回継代した。次いで、ウイルスをVero-118細胞に添加した。ウイルス含有細胞培養上清1リットルを回収し、超遠心によりウイルスをペレット化し、ウイルスペレットをPBS 1 mlに再懸濁した。
【００６８】
RNAの単離
製造業者（Roche Diagnostics、オランダ、アルメーレ）の取扱説明書に従ってHigh Pure RNA Isolationキットを使用し、感染細胞培養液の上清またはショ糖勾配画分からRNAを単離した。
【００６９】
配列決定
配列決定のため、精製したRNAをBaseClear holding BV（オランダ、ライデン）に送付した。
【００７０】
系統発生解析
ヌクレオチド配列を、BioEditバージョン5.0.9で実行するClustal Wを用いて整列させた。ブートストラップ100個および無秩序なもの3個を使用し、Phylip 5.6のSeqbootおよびDNA-MLパッケージを用いて最尤樹を作製した。Phylip 5.6のConsenseパッケージを用いて合意樹を算出した。DNA-MLにおいてこれらの合意樹をユーザー樹として使用し、元の配列からの枝の長さを算出し直した。
【００７１】
EMCR-CoVの配列は、コロナウイルスの4つの群内に存在する種それぞれを表す参照ウイルスの配列と比較した。これらは以下の通りであった：ヒトコロナウイルス229E（229E）、af304460；ブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）、af353511；伝染性胃腸炎ウイルス（TGEV）、aj271965；ウシコロナウイルス（BoCoV）、af220295；マウス肝炎ウイルス（MHV）、af201929；鳥類伝染性気管支炎ウイルス（AIBV）、m95169、、イヌコロナウイルス（CaCoV）、d13096、ネココロナウイルス（FeCoV）、ay204704；ブタ呼吸器コロナウイルス（PRCoV）、z24675、ヒトコロナウイルスOC43（OC43）、m76373、114643、m933990；ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（HEV）、ay078417；ラットコロナウイルス（RtCoV）、af207551。ウイルスの照会は、NCBIカタログ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/）の番号である）。
【００７２】
一般に、EMCR-CoVなどのコロナウイルスは、以下の手順に従って単離および同定され得る：
【００７３】
試料の採取
ウイルス分離株を見出すには、好ましくはヒト、肉食動物（イヌ、ネコ、イタチ(mustellits)、アザラシなど）、ウマ、反芻動物（ウシ、ヒツジ、ヤギなど）、ブタ、ウサギ、鳥類（家禽、ダチョウなど）などの哺乳動物に由来する鼻咽頭吸引物、咽頭および鼻腔スワブ、気管支肺胞洗浄物、血清および血漿試料、ならびに便を調べるべきである。鳥類の排泄スワブおよび糞も同様に試験することができる。ELISA法、RT-PCRなどの分子に基づくアッセイ法、およびウイルス中和アッセイ法などの免疫学的アッセイ法には、血清が採取されるべきである。
【００７４】
採取したウイルス試料は、ダルベッコMEM培地（BioWhittaker、メリーランド州、ウォーカーズビル）5 mlで希釈して、ボルテックスミキサーで1分間完全に混合し得る。次いで、懸濁液を840 x gで10分間遠心分離する。免疫蛍光法のため、沈降物をマルチスポットスライド（Nutacon、オランダ、レイモイデン）上に広げ、上清はウイルス単離に使用する。
【００７５】
ウイルスの単離
ウイルスを単離するため、10%ウシ胎児血清（BioWhittaker、ベルギー、ベルビエ）を添加した以下に記載の培地を用いて、Vero-118細胞またはtMK細胞（RIVM、オランダ、ビルトーベン）をスライドガラスを含む24ウェルプレート（Costar、英国、ケンブリッジ）で培養した。接種する前にプレートをPBSで洗浄し、0.52/リットルグラム NaHCO3、0.025 M Hepes（Biowhittaker）、2 mM L-グルタミン（Biowhittaker）、200単位/リットル ペニシリン、200μg/リットル ストレプトマイシン（Biowhittaker）、1グラム/リットル ラクトアルブミン（Sigma-Aldrich、オランダ、ズヴァインドレヒト）、2.0グラム/リットル D-グルコース（Merck、オランダ、アムステルダム）、10グラム/リットル ペプトン（Oxoid、オランダ、ハールレム）、および0.02%トリプシン（Life Technologies、メリーランド州、ベテスダ）を添加したハンクス塩含有イーグル培地（ICN、カリフォルニア州、コスタメサ）を添加した。プレートに患者試料の上清を三つ組でウェル当たり0.2 ml接種し、次いで840x gで1時間遠心した。接種後、プレートを37℃で1〜7日間インキュベートし、培養物をCPEに関して毎日調べた。一般的に大規模なCPEが5〜10の間で認められ、これは単層からの細胞の脱離を含んだ。
【００７６】
ウイルスの培養
上記の培地中のtMK細胞またはVeroクローン118細胞のサブコンフルエントな単層に、CPEを示した試料の上清または患者から採取した試料を接種した。
【００７７】
RNAの単離
製造業者（Roche Diagnostics、オランダ、アルメーレ）の取扱説明書に従ってHigh Pure RNA Isolationキットを使用し、感染細胞培養液の上清またはショ糖勾配画分からRNAを単離した。RNAは、当技術分野において周知である他の手順に従って単離することもできる（Current Protocols in Molecular Biology）。
【００７８】
配列解析
配列解析は、BaseClear holding BV（オランダ、ライデン）によって行われた。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】EMCR-CoVウイルスの一部のヌクレオチド配列。ポリペプチドの推定アミノ酸配列も含める。
【図２】分離株EMCR-CoVとその遺伝的に最も近縁な種のヌクレオチド配列の系統発生関係。ブートストラップ100個および無秩序なもの3個を用いて、最尤解析により系統樹を作製した。樹それぞれについて、ヌクレオチド変化の数を表す目盛りを示す。図1a。マトリックス遺伝子ヌクレオチド配列の最尤樹。樹内の数字はブートストラップ値を示す。目盛りバーは、関連する配列間の10%のヌクレオチドの相違を大まかに示す。図1b。ヌクレオカプシド遺伝子ヌクレオチド配列の最尤樹。樹内の数字はブートストラップ値を示す。目盛りバーは、関連する配列間の10%のヌクレオチドの相違を大まかに示す。
【図３】EMCR-CoVウイルスと近縁コロナウイルスとの間の、推定レプリカーゼ1a、レプリカーゼ1b、レプリカーゼ1ab、スパイク、Orf E、マトリックス、およびヌクレオカプシドタンパク質（それぞれ3a〜g）、ならびに推定マトリックスタンパク質および核タンパク質（それぞれ3hおよび3i）のアミノ酸同一性を示す類似度マトリックス。
【図４】様々なコロナウイルスとのアライメント：5'非翻訳領域ゲノム配列(a)；推定orf 1aアミノ酸配列(b)；推定orf 1bアミノ酸配列(c)；推定orf 1abアミノ酸配列(d)；推定スパイクアミノ酸配列(e)；推定orf 4aアミノ酸配列(f)；推定orf 4abアミノ酸配列(g)；推定orf Eアミノ酸配列(h)；推定マトリックスアミノ酸配列(i)；推定核タンパク質アミノ酸配列(j)；推定3'非翻訳ゲノム配列(k)；略語については本文を参照のこと。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
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【図１−２６】
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【図１−２７】
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【図１−２８】
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【図１−２９】
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【図１−３０】
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【図１−３１】
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【図１−３２】
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【図１−３３】
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【図１−３４】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図３ｈ】
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【図３ｉ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ−１】
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【図４ｂ−２】
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【図４ｂ−３】
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【図４ｂ−４】
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【図４ｂ−５】
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【図４ｂ−６】
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【図４ｂ−７】
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【図４ｂ−８】
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【図４ｂ−９】
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【図４ｂ−１０】
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【図４ｂ−１１】
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【図４ｂ−１２】
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【図４ｃ−１】
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【図４ｃ−２】
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【図４ｃ−３】
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【図４ｃ−４】
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【図４ｃ−５】
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【図４ｃ−６】
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【図４ｃ−７】
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【図４ｄ−１】
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【図４ｄ−２】
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【図４ｄ−３】
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【図４ｄ−４】
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【図４ｄ−５】
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【図４ｄ−６】
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【図４ｄ−７】
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【図４ｄ−８】
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【図４ｄ−９】
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【図４ｄ−１０】
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【図４ｄ−１１】
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【図４ｄ−１２】
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【図４ｄ−１３】
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【図４ｄ−１４】
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【図４ｄ−１５】
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【図４ｄ−１６】
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【図４ｄ−１７】
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【図４ｄ−１８】
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【図４ｅ−１】
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【図４ｅ−２】
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【図４ｅ−３】
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【図４ｅ−４】
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【図４ｅ−５】
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【図４ｅ−６】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図４ｈ】
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【図４ｉ−１】
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【図４ｉ−２】
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【図４ｊ−１】
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【図４ｊ−２】
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【図４ｊ−３】
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【図４ｋ】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月9日(2006.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007511237000001.app
【国際調査報告】
2007511237.tif 000099
2007511237.tif 000100
2007511237.tif 000101