(57)【要約】  本発明は、遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクターに関し、該ベクターは、５’から３’に向けて配向している以下の構成要素：ｉ．第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、アデノウイルスをパッケージするためのシグナル配列とを含むアデノウイルス起源の第一鎖；ｉｉ．第一の非コーディングスタッファ配列；ｉｉｉ．組織特異的プロモーターに相当する配列；ｉｖ．アルファウイルス由来のｃＤＮＡ鎖であって、アルファウイルスＲＮＡ配列に対して部分的に相補的な配列を有し、少なくとも１種の目的の外来遺伝子をコードする少なくとも１種の配列を含む、アルファウイルス由来のｃＤＮＡ鎖；ｖ．ポリアデニル化配列；およびｖｉ．第二のアデノウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を少なくとも含む。本発明は、好ましくは、目的の外来遺伝子として哺乳類インターロイキンＩＬ−１２、より好ましくはヒトインターロイキンｈＩＬ−１２の治療遺伝子を含むアデノウイルスハイブリッドベクター、並びに、細胞、特に、好ましくはアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を発現する腫瘍細胞に遺伝子物質を導入するための方法における前記ハイブリッドベクターの使用、および異種抗原に対する免疫応答を誘発するための前記ハイブリッドベクターの使用に関する。
2007537742.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’から３’に向けて配向している以下の構成要素：
ｉ．第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、アデノウイルスをパッケージするためのシグナル配列とを含むアデノウイルス起源の第一鎖；
ｉｉ．第一の非コーディングスタッファ配列；
ｉｉｉ．組織特異的プロモーターに相当する配列；
ｉｖ．アルファウイルス由来のｃＤＮＡ鎖であって、アルファウイルスＲＮＡ配列に対して部分的に相補的な配列を有し、少なくとも１種の目的の外来遺伝子をコードする少なくとも１種の配列を含む、アルファウイルス由来のｃＤＮＡ鎖；
ｖ．ポリアデニル化配列；および
ｖｉ．第二のアデノウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列
を少なくとも含んでなる、遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項２】
構成要素ｖと構成要素ｖｉとの間に、第二の非コーディングスタッファ配列である構成要素ｖｉｉをさらに含んでなる、請求項１に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項３】
構成要素ｉｉがヒト非コーディングスタッファ配列である、請求項１に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項４】
構成要素ｉｉが、ヒトゲノムヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）のイントロン領域である、請求項１または３に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項５】
構成要素ｉが配列番号１の配列を有するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項６】
構成要素ｉｉｉが腫瘍特異的プロモーターである、請求項１に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項７】
構成要素ｉｉｉが、ＡＦＰ、テロメラーゼＴＥＲＴ、ＰＡＰ、Ｅ２ＦおよびＨＩＦから選択される腫瘍特異的プロモーターである、請求項６に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項８】
構成要素ｉｉｉが、ＡＦＰ  ｐ＋ｅに相当する配列番号７、およびテロメラーゼＴＥＲＴに相当する配列番号１５から選択される配列を有する腫瘍特異的プロモーターである、請求項１に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項９】
構成要素ｉｖが、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）由来の配列を含むものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項１０】
前記アルファウイルス由来のｃＤＮＡ鎖ｉｖが、アルファウイルスＲＮＡに対して部分的に相補的な配列を有し、少なくとも１種の目的の外来遺伝子をコードする少なくとも１種の配列を含むものであり、さらには、
ａ）前記アルファウイルスの複製に必要な５’配列と、
ｂ）前記アルファウイルスＲＮＡの複製に必要な非構造タンパク質をコードする配列と、
ｃ）前記アルファウイルスの少なくとも１種のサブゲノムプロモーターと、
ｄ）前記アルファウイルスの複製に必要な３’配列と
を含むものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項１１】
構成要素ｉｖの配列ａ）〜ｃ）が全体として配列番号３および配列番号４から選択される配列を有するものである、請求項１０に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項１２】
構成要素ｉｖのｄ）が配列番号５の配列を有するものである、請求項１０または１１に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項１３】
前記目的の外来遺伝子が、１種以上の治療遺伝子、１種以上のリポーター遺伝子およびこれらの組み合わせから選択されるものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項１４】
前記目的の外来遺伝子が、哺乳類インターロイキンＩＬ−１２治療遺伝子である、請求項１３に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項１５】
前記目的の外来遺伝子が、ヒトインターロイキンｈＩＬ−１２治療遺伝子である、請求項１３に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項１６】
前記目的の外来遺伝子が、コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、アルファ−インターフェロンおよび単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）から選択される治療遺伝子である、請求項１３に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項１７】
構成要素ｉｖが、（サブゲノムプロモーター＋目的の外来遺伝子）の１以上のサブセットを連続して含むものである、請求項１１に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項１８】
前記目的の外来遺伝子が、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼＨＳＶ−ＴＫおよびＧＦＰから選択されるレポーター遺伝子である、請求項１３に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項１９】
構成要素ｉｖが、前記プロモーターｉｉｉによって機能的に制御されるレプリコンを形成し、構成要素ｉｖのｃ）に含まれる前記アルファウイルスサブゲノムプロモーターが、前記目的の外来遺伝子の発現を機能的に制御する、請求項９〜１８のいずれか一項に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項２０】
構成要素ｖがＳＶ４０のポリアデニル化配列である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項２１】
構成要素ｖが配列番号６の配列を有するものである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項２２】
前記第二の非コーディングスタッファ配列がＣ３４６である、請求項２に記載の遺伝子発現アデノウイルスベクター。
【請求項２３】
構成要素ｖｉが配列番号２の配列を有するものである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の遺伝子発現アデノウイルスベクター。
【請求項２４】
ｉ．第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、アデノウイルスをパッケージするためのシグナル配列とを含むアデノウイルス起源の第一鎖；
ｉｉ．ヒトゲノムヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）のイントロン領域である、第一の非コーディングスタッファ配列；
ｉｉｉ．ＡＦＰプロモーターである組織特異的プロモーターに相当する配列；
ｉｖ．アルファウイルス由来のｃＤＮＡ鎖であって、ＳＦＶウイルス由来のアルファウイルスＲＮＡに対して部分的に相補的な配列を有し、ｈＩＬ−１２である目的の外来遺伝子をコードする配列を含む、アルファウイルス由来のｃＤＮＡ鎖；
ｖ．ＳＶ４０のポリアデニル化配列；
ｖｉ．第二のアデノウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列；および
ｖｉｉ．構成要素ｖと構成要素ｖｉとの間に位置する、ヒトゲノムＣ３４６である第二の非コーディングスタッファ配列
を含んでなる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項２５】
ｉ．第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、アデノウイルスをパッケージするためのシグナル配列とを含むアデノウイルス起源の第一鎖；
ｉｉ．ヒトゲノムヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）のイントロン領域である、第一の非コーディングスタッファ配列；
ｉｉｉ．ＡＦＰプロモーターである組織特異的プロモーターに相当する配列；
ｉｖ．アルファウイルス由来のｃＤＮＡ鎖であって、ＳＦＶウイルス由来のアルファウイルスＲＮＡに対して部分的に相補的な配列を有し、ｍＩＬ−１２およびＬａｃＺから選択される目的の外来遺伝子をコードする配列を含む、アルファウイルス由来のｃＤＮＡ鎖；
ｖ．ＳＶ４０のポリアデニル化配列；
ｖｉ．第二のアデノウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列；および
ｖｉｉ．構成要素ｖと構成要素ｖｉとの間に位置する、ヒトゲノムＣ３４６である第二の非コーディングスタッファ配列
を含んでなる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項２６】
長さが２７ｋｂ〜３８ｋｂである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項２７】
配列番号８の配列を有する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項２８】
配列番号９の配列を有する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項２９】
配列番号１０の配列を有する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクター。
【請求項３０】
遺伝子物質を細胞に導入するための方法における、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルスハイブリッドベクターの使用。
【請求項３１】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記細胞がＡＦＰを発現する腫瘍細胞である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
腫瘍の治療に有効な医薬を製造するための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルスハイブリッドベクターの使用。
【請求項３４】
異種抗原に対する免疫応答を誘発するための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルスハイブリッドベクターの使用。
【請求項３５】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアデノウイルスハイブリッドベクターを含んでなる、医薬組成物。
【請求項３６】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアデノウイルスハイブリッドベクターを含んでなる医薬組成物であって、前記目的の外来遺伝子がｈＩＬ−１２である、医薬組成物。
【請求項３７】
異種抗原に対する免疫応答を誘発するための方法における、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアデノウイルスハイブリッドベクターを含んでなる医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、治療産物を得るためのアデノウイルス由来の遺伝子発現ベクターに関する。
【０００２】
本発明以前の技術水準
従来の癌治療が直面する主要な問題の１つは、腫瘍特異性の欠如、即ち、しばしば重篤な副作用を引き起こし、適用可能な治療的投与量を制限する状況である。遺伝子治療は、依然として癌治療にとって非常に有望であるが、トランスジェニック発現の対象を腫瘍部位とするという具体的な課題にも直面している。多数の研究では、ウイルスベクターが病変部内に投与される際、トランスジェニック発現は、本質的には針の軌跡に近接する領域に限定されるが、かかる発現は他の組織内でも起こり得ることが示唆されている。従って、癌に適用される遺伝子治療における重要な目標は、健康な細胞に悪影響を及ぼすことなく、新生組織（「標的組織（tissue objective）」）に対する特異的投与および／または当該新生組織内での特異的活性化（「標的転写（transcriptional objective）」）を通じて治療遺伝子発現の対象を腫瘍とすることである。「標的組織」は、レセプター−リガンド相互作用の修正によって標的化されたベクターを作製し、それにより特定レセプターを発現する細胞の感染を可能とすることによって達成し得る。「標的転写」は、トランスジェニック発現の制御に腫瘍特異的プロモーターを用いることによって達成し得る。以前の研究では様々な腫瘍特異的プロモーターが使用されていた。しかしながら、これらは、高レベルの遺伝子発現を生じることはなく、その結果として抗腫瘍活性が制限されるという点で本質的な限界を有する。
【０００３】
遺伝子治療のためのウイルスベクターの開発における最新の進歩に関する総評は、Lundstrom K. “Latest development in viral vectors for gene therapy”; Trends in Biotechnology, 2003, 21:118-122に見ることができる。
【０００４】
現在使用されているウイルスベクターとしてはアルファウイルスが挙げられる。アルファウイルスは、単純な陽性ＲＮＡ鎖をゲノムとして含有するエンベロープウイルスである。アルファウイルスであるシンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）およびベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスに由来する発現ベクターが設計および開発されてきた。アルファウイルスベクターは、アルファウイルスゲノム由来の自己複製ＲＮＡ分子の使用に基づくものであり、複製に必要な５’および３’配列およびレプリカーゼ（Ｒｅｐ）遺伝子は維持されているが、ウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子は欠失し、導入遺伝子で置換されている。これらのベクターの細胞トランスフェクション後、Ｒｅｐが翻訳され、ＲＮＡベクターが陰性ＲＮＡ鎖にコピーされ、ＲＮＡベクター増幅のための鋳型として使用される。Ｒｅｐはまた、陰性ＲＮＡ鎖内のサブゲノムプロモーターを認識することができ、次いでそこからより小さなサブゲノムＲＮＡ断片が合成され、これが翻訳されて、重要なレベルの異種タンパク質を生成することができる。アルファウイルスベクターは、ＳＰ６またはＴ７のような原核生物プロモーターからｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写される際にはＲＮＡとして、またはレプリコン配列がＣＭＶのような真核生物プロモーター下に位置する際にはＤＮＡとして直接使用され得る。ＲＮＡベクターは、ウイルス構造タンパク質をコードする１種以上の「ヘルパー」ＲＮＡと共に、細胞内におけるその共トランスフェクションを通じてウイルス粒子内にパッケージされ得る。アルファウイルスベクターは、これらベクターを遺伝子治療にとって魅力のあるものとする一連の特性を有する：非常に大きな親和性、低い免疫性および高レベルの異種タンパク質発現。しかしながら、かかる発現は、複製が行われるときに細胞内でアポトーシスが誘発されるため、一過性である。文献Rayner J.O., Dryga S.A., Kamrud K.I. “Alphavirus vectors and vaccination”; Rev. Med. Virol. 2002;12 279-296には、ワクチン分野で使用するための、アルファウイルスをベースとする発現ベクターの開発について記載されている。
【０００５】
別のウイルスベクター系は、アデノウイルスをベースとするものである。アデノウイルスの使用に関しては多くの文献があり、これらは遺伝子治療の不都合の一部を克服するべく、そして発現ベクターを作製するための供給源として開発されてきた。アデノウイルスベクター分野における最新の進歩を報告する文献がVolpers C, Kochanek S.により提供されている：“Adenoviral vectors for gene transfer and therapy”; J Gene. Med. 2004; 6: S164-S171。アデノウイルスは、高い形質導入効率を付与するという利点と、エピゾーム形態を持続する能力とを有する。しかしながら、アデノウイルスタンパク質の発現は強い免疫応答を誘発し、この免疫応答がトランスジェニック発現の期間を制限し、ベクターに感染した細胞内で毒性を誘発する。これらの課題を解決するために、弱いアデノウイルスが開発された。これらの弱いアデノウイルスは、全ての対応するアデノウイルス遺伝子を奪われ（維持される配列は、２つの逆方向末端反復配列およびパッケージシグナルだけである）、結果として、形質導入細胞はアデノウイルス産物を発現せず、ベクターに対する免疫応答も誘発しない。簡単に言えば、全てのアデノウイルス遺伝子を取り除くと、大きな発現カセットを収容する十分な空間が残るので、弱いアデノウイルスは大容量アデノウイルスベクターとも呼ばれる。ウイルスタンパク質をコードする全ての配列の欠失に関連するアデノウイルスベクターの具体的な態様を記載している文献がMorsy MA et al.により提供されている：“An adenoviral vector deleted for all viral coding sequence results in enhanced safety and extended expression of a leptin transgene”; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95:7866-7871。Schiedner G et al.により提供された文献（“Variables affecting in vivo performance of high-capacity adnovirus vectors”; J. Virol. 2002, 76:1600-1609）には、弱いアデノウイルスをベースとする発現ベクターにおけるスタッファＤＮＡの使用について記載されており、かかるスタッファＤＮＡの存在が遺伝子発現の顕著な増加を達成するのに必須であること、および、一般的に大容量（弱い）アデノウイルスをベースとするベクターの設計は実質的に遺伝子発現の程度および期間を修正可能であることが示されている。
【０００６】
一方、米国特許第５，９８１，２２５号明細書には、アデノウイルスをベースとする遺伝子導入用ベクターが記載されており、このベクターは逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、少なくとも１種のパッケージシグナル配列と、ＶＡＩアデノウイルス遺伝子および／またはＶＡＩＩアデノウイルス遺伝子とを含み、且つ、アデノウイルスの標的細胞内で機能的なプロモーターに動作可能に結合した、アデノウイルスに対して外来の遺伝子を含む。
【０００７】
米国特許第５，９８５，８４６号明細書には、アデノウイルスの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、これらの配列を含むアデノウイルスの組み換え粒子とを含む遺伝子導入ベクターが記載されている。
【０００８】
米国特許第６，５６６，０９３号明細書には、アルファウイルスのＲＮＡの少なくとも一部に相補的なＤＮＡからなるアルファウイルス由来のｃＤＮＡ（アルファウイルス複製に必須）、および異種ｃＤＮＡ、例えば所望の物質をコードするｃＤＮＡのベクターが記載されている。後者は、生物学的に活性なタンパク質もしくはポリペプチド、並びに免疫原性もしくは抗原性のタンパク質もしくはポリペプチド、治療的に活性なタンパク質もしくはポリペプチド、または治療的に活性なＲＮＡであり得る。
【０００９】
本発明の目的は、ハイブリッドベクターによって媒介される、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞におけるトランスジェニック発現およびアポトーシスの誘発を改良することである。更なる目的は、ハイブリッドベクターによる動物モデルでの腫瘍治療効率を向上させることである。
【００１０】
また、更なる目的はハイブリッドベクターを使用することによる遺伝子治療方法、特に癌治療のための遺伝子治療方法を開発することである。
【００１１】
本発明の目的は、単一ベクター内で以下の事項を組み合わせることにより達成される：
−アデノウイルス放出系を使用することによる、高い感染能力、
−ＳＦＶのようなアルファウイルス由来のベクターを使用することによる、高いトランスジェニック発現およびアポトーシス誘発、および
−腫瘍特異的プロモーターを使用することによる、腫瘍特異性。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、第一に遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクターに関し、このベクターは、５’から３’に向けて配向している以下の構成要素を少なくとも含んでなる：
ｉ．第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、アデノウイルスをパッケージするためのシグナル配列とを含むアデノウイルス起源の第一鎖；
ｉｉ．第一の非コーディングスタッファ配列；
ｉｉｉ．組織特異的プロモーターに相当する配列；
ｉｖ．アルファウイルス由来のｃＤＮＡ鎖であって、アルファウイルスＲＮＡに対して部分的に相補的な配列を有し、少なくとも１種の目的の外来遺伝子をコードする少なくとも１種の配列を含む、ｃＤＮＡ鎖；
ｖ．ポリアデニル化配列；および
ｖｉ．第二のアデノウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列。
【００１３】
より特定的には、本発明は、腫瘍特異的プロモーター（構成要素ｉｉｉ）の転写制御下において、ＳＦＶ組み換えレプリコンの配列に相当するアルファウイルス由来のｃＤＮＡ鎖を構成要素ｉｖとして含むアデノウイルスハイブリッドベクターの構築に関し、この腫瘍特異的プロモーターは、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）のプロモーターとされる。この構築物において、ＳＦＶレプリコンに導入遺伝子を挿入し、ＳＦＶのサブゲノムプロモーターにより駆動することができる。このハイブリッドベクターによる腫瘍細胞の感染後、ＳＦＶレプリコンのｍＲＮＡが腫瘍特異的プロモーターにより転写され、ＳＦＶレプリカーゼ遺伝子を構成する非構造タンパク質−ｎｓＰｓ−が、ＳＦＶレプリコンの前記ｍＲＮＡから翻訳される。これらのｎｓＰｓタンパク質−ウイルスレプリカーゼ−は、ＳＦＶレプリコンのｍＲＮＡの複製を開始し、ＳＦＶのサブゲノムＲＮＡを生成する。結果的に、導入遺伝子はＳＦＶのサブゲノムＲＮＡから高レベルで発現し得る。この全体的なウイルス複製プロセスは、感染細胞におけるアポトーシスを生じさせる。非腫瘍細胞がこれらのハイブリッドに感染した場合、ＳＦＶレプリコンのｍＲＮＡは腫瘍特異的プロモーターによって転写されることはなく、これらの細胞内では活性でない。従って、導入遺伝子の発現はなく、ハイブリッドベクターに感染した正常な細胞内ではアポトーシスは起こらない。
【００１４】
更に、本発明は、前記アデノウイルスハイブリッドベクターを得るための方法に関し、この方法は、遺伝子工学技術を用いることにより、先に定義したアデノウイルスハイブリッドベクターの構成要素ｉ〜ｖｉを組み立てることを含んでなる。
【００１５】
また、本発明は、遺伝子物質を細胞に導入するための、更に詳細には、アデノウイルスの標的細胞であり得る真核細胞において外来遺伝子を導入および発現させるための、上述のハイブリッドベクターの使用に関する。
【００１６】
遺伝子物質の導入により、好ましくは前記細胞内で異種抗原に対する免疫応答が誘発される。
【００１７】
また、本発明は、前記アデノウイルス−アルファウイルスハイブリッドベクターを含んでなる医薬組成物、および、前記医薬組成物を被検体に投与することを含んでなる、癌の治療における前記医薬組成物の使用に関する。
【００１８】
また、本発明は、前記ハイブリッドベクターを被検体に投与することを含んでなる、先に定義したハイブリッドベクターの使用による癌治療方法に関する。
【００１９】
本発明は、５’から３’に向けて配向している以下の構成要素：
ｉ．第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、アデノウイルスをパッケージするためのシグナル配列とを含むアデノウイルス起源の第一鎖；
ｉｉ．第一の非コーディングスタッファ配列；
ｉｉｉ．組織特異的プロモーターに相当する配列；
ｉｖ．アルファウイルス由来のｃＤＮＡ鎖であって、アルファウイルスＲＮＡ配列に対して部分的に相補的な配列を有し、少なくとも１種の目的の外来遺伝子をコードする少なくとも１種の配列を含む、アルファウイルス由来のｃＤＮＡ鎖；
ｖ．ポリアデニル化配列；および
ｖｉ．第二のアデノウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列
を少なくとも含んでなる、遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクターに関する。
【００２０】
本発明によるアルファウイルス−アデノウイルスハイブリッドベクターにおける構成要素ｉの性質、即ち、第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、アデノウイルスをパッケージするためのシグナル配列（Ψ）とを含むアデノウイルス起源鎖の性質は、本発明では重要な特徴ではなく、あらゆるアデノウイルス血清型に由来し得る。前記血清型は当技術分野において周知であり、これには、例えば、Ａｄ１２（Ａ亜群）、Ａｄ３およびＡｄ７（Ｂ亜群）、Ａｄ２およびＡｄ５（Ｃ亜群）、Ａｄ８（Ｄ亜群）、Ａｄ４（Ｅ亜群）、Ａｄ４０（Ｆ亜群）、並びにブタ、ヒツジ、ウシおよび鳥類などの種に由来し得る他の既知の非ヒトアデノウイルスが含まれる。故に、長さでおよそ１００ｂｐ〜５００ｂｐを含有し得るこの第一の逆方向末端反復配列は、使用するアデノウイルス血清型に応じて変化し得る。同様に、アデノウイルスをパッケージするためのシグナル配列も、使用するアデノウイルス血清型に応じて変化し得る。
【００２１】
好ましい特定の実施態様によれば、前記遺伝子発現アデノウイルスベクターは、配列番号１の配列を有するか、または同じ機能を有するように配列番号１と十分な相同性を有するその他の配列を有する構成要素ｉを含む。
【００２２】
本発明によるアデノウイルスハイブリッドベクターにおける構成要素ｉｉの性質は、本発明の重要な特徴ではない。前記構成要素ｉｉの機能は構築物の全体の大きさを大きくすることであり、この構成要素ｉｉは、いかなる非コーディングスタッファ配列であってもよい。この配列は、好ましくはヒト非コーディング配列とされる。更により好ましくは、この非コーディングスタッファ配列は、ヒトゲノムヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）のイントロン領域とされる。
【００２３】
好ましくは、定義したアデノウイルスハイブリッドベクターはまた、構成要素ｖｉｉを含み、これは第二の非コーディングスタッファ配列であり、先に定義した構成要素ｖと構成要素ｖｉとの間に位置する。
【００２４】
本発明によるアデノウイルスハイブリッドベクターにおける構成要素ｉｉｉの性質は、本発明の重要な特徴ではない。組織特異的プロモーターｉｉｉは、好ましくは腫瘍特異的プロモーターとされる。腫瘍特異的プロモーターの例としては、ＡＦＰ、テロメラーゼＴＥＲＴ、ＰＡＰ（膵臓関連タンパク質）、Ｅ２ＦおよびＨＩＦのプロモーターが挙げられる。
【００２５】
本発明の好ましい特定の実施態様によれば、腫瘍特異的プロモーターは、ＡＦＰプロモーター／エンハンサー、（ＡＦＰ  ｐ＋ｅ）に相当する配列番号７の配列、またはテロメラーゼＴＥＲＴに相当する配列番号１５の配列、または同じ機能を有するように配列番号７の配列もしくは配列番号１５の配列と十分な相同性を有するその他の配列を有する。
【００２６】
本発明によるアデノウイルスハイブリッドベクターにおける構成要素ｉｖの性質は、本発明の重要な特徴ではない。構成要素ｉｖのアルファウイルス配列は、好ましくはセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）由来である。しかしながら、例えば、ＳＩＮ、ＲＲＶおよびＶＥＥなどのトガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）科に属する種のいずれかに由来する他のアルファウイルス配列を使用することもできる。
【００２７】
その配列がアルファウイルスＲＮＡに部分的に相補的である前記アルファウイルス由来ｃＤＮＡ鎖ｉｖは、好ましくは（少なくとも１種の目的の外来遺伝子をコードする配列に加え）以下のものを含む：
ａ）前記アルファウイルスの複製に必要な５’配列、
ｂ）前記アルファウイルスＲＮＡの複製に必要な非構造タンパク質をコードする配列、
ｃ）前記アルファウイルスの少なくとも１種のサブゲノムプロモーター、および
ｄ）前記アルファウイルスの複製に必要な３’配列。
【００２８】
構成要素ｉｖは、好ましくはプロモーターｉｉｉによって機能的に制御されるレプリコンを形成し、次いで、構成要素ｉｖのｃ）に含まれるアルファウイルスサブゲノムプロモーターは、目的の外来遺伝子の発現を機能的に制御する。
【００２９】
好ましい特定の実施態様によれば、構成要素ｉｖの配列ａ）〜ｃ）は全体として、配列番号３（ＳＦＶ  ５’−ｒｅｐ−Ｐｓｇ）または同じ機能を有するように配列番号３と十分な相同性を有するその他の配列、並びに配列番号４（ＳＦＶ  ５’−ｒｅｐ−Ｐｓｇ−ｅｎｈ）または同じ機能を有するように配列番号４と十分な相同性を有するその他の配列から選択される配列を有する。
【００３０】
特に好ましい特定の実施態様によれば、構成要素ｉｖのｄ）は、配列番号５の配列（ＳＦＶ３’）、または同じ機能を有するように配列番号５と十分な相同性を有するその他の配列を有する。
【００３１】
本発明によるアルファウイルス−アデノウイルスハイブリッドベクターの構成要素ｉｖでは、目的の外来遺伝子は、好ましくは治療遺伝子もしくはレポーター遺伝子、またはこれらの組み合わせとされる。制限されるものではないが、治療遺伝子は、哺乳類インターロイキンＩＬ−１２、コロニー刺激因子ＧＭＣＳＦ、アルファインターフェロンおよび単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）から選択されるのが好ましい。
【００３２】
構成要素ｉｖにおける目的の外来遺伝子は、更にレポーター遺伝子であってもよい。制限されるものではないが、レポーター遺伝子は、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼ、ｔｋおよびＧＦＰから選択できる。
【００３３】
治療遺伝子は、特に好ましくは哺乳類インターロイキンＩＬ−１２とされ、より好ましくは、治療遺伝子はヒトインターロイキンｈＩＬ−１２とされる。
【００３４】
遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクターは、構成要素ｉｖ内に（サブゲノムプロモーター＋目的の外来遺伝子）の１以上のサブセットを連続して包含し得る。
【００３５】
本発明によるアデノウイルスハイブリッドベクターにおける構成要素ｖの性質は、本発明の重要な特徴ではない。構成要素ｖは、好ましくはＳＶ４０のポリアデニル化配列とされる。前記ＳＶ４０のポリアデニル化配列は、配列番号６の配列、または同じ機能を有するように配列番号６の配列と十分な相同性を有するその他の配列とするのが特に好ましい。
【００３６】
本発明によるアデノウイルスハイブリッドベクターにおける構成要素ｖｉの性質は、本発明の重要な特徴ではない。好ましい実施態様によれば、前記遺伝子発現アデノウイルスベクターは、配列番号２の配列、または同じ機能を有するように配列番号２の配列と十分な相同性を有するその他の配列を有する逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を構成要素ｖｉとして含む。
【００３７】
本発明によるアデノウイルスハイブリッドベクターにおける構成要素ｖｉｉの性質は、本発明の重要な特徴ではない。第二の非コーディングスタッファ配列は、いかなる配列であってもよい。この配列は、好ましくはヒト非コーディング配列とされ、特に好ましくはヒトコスミドＣ３４６からの配列とされる。
【００３８】
本発明による遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクターの長さは可変であり得るが、好ましくは２７ｋｂ〜３８ｋｂの長さを有する。
【００３９】
好ましい特定の実施態様によれば、アデノウイルスハイブリッドベクターは、第一の逆方向末端反復配列としてのＩＴＲ５’と；第一のスタッファ配列としてのＨＰＲＴ、即ちヒトゲノムヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼのイントロン領域と；ＡＦＰ（ｐ＋ｅ）、即ち腫瘍特異的プロモーターと；マウス由来のインターロイキンー１２であるｍＩＬ−１２を含有するＳＦＶレプリコン配列と；ＳＶ４０  ＰｏｌｙＡ、即ちＳＶ４０のポリアデニル化配列と；第二のスタッファ配列としてのＣ３４６、即ちヒトゲノムコスミドＣ３４６と；第二の逆方向末端反復配列としてのＩＴＲ３’とを含む。
【００４０】
更なる好ましい特定の実施態様によれば、アデノウイルスハイブリッドベクターは、第一の逆方向末端反復配列としてのＩＴＲ５’と；第一のスタッファ配列としてのＨＰＲＴ、即ちヒトゲノムヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼのイントロン領域と；ＡＦＰ（ｐ＋ｅ）、即ち腫瘍特異的プロモーターと；ＬａｃＺを含有するＳＦＶレプリコン配列と；ＳＶ４０  ＰｏｌｙＡ、即ちＳＶ４０のポリアデニル化配列と；第二のスタッファ配列としてのＣ３４６、即ちヒトゲノムコスミドＣ３４６と；第二の逆方向末端反復配列としてのＩＴＲ３’とを含む。
【００４１】
特に好ましい更なる実施態様によれば、アデノウイルスハイブリッドベクターは、第一の逆方向末端反復配列としてのＩＴＲ５’と；第一のスタッファ配列としてのＨＰＲＴ、即ちヒトゲノムヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼのイントロン領域と；ＡＦＰ（ｐ＋ｅ）、即ち腫瘍特異的プロモーターと；ｈＩＬ−１２、即ちヒトインターロイキンー１２を含有するＳＦＶレプリコン配列と；ＳＶ４０  ＰｏｌｙＡ、即ちＳＶ４０のポリアデニル化配列と；第二のスタッファ配列としてのＣ３４６、即ちヒトゲノムコスミドＣ３４６と；第二の逆方向末端反復配列としてのＩＴＲ３’とを含む。
【００４２】
本発明の好ましい特定の実施態様によれば、遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクターは、配列番号８の配列、または同じ機能を有するように配列番号８と十分な相同性を有するその他の配列を有する。
【００４３】
本発明の更なる好ましい特定の実施態様によれば、遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクターは、配列番号９の配列、または同じ機能を有するように配列番号９と十分な相同性を有するその他の配列を有する。
【００４４】
本発明の更なる好ましい特定の実施態様によれば、遺伝子発現アデノウイルスハイブリッドベクターは、配列番号１０の配列、または同じ機能を有するように配列番号１０と十分な相同性を有するその他の配列を有する。
【００４５】
本発明は更に、前記アデノウイルスハイブリッドベクターを得るための方法に関し、この方法は、遺伝子工学技術を用いることにより、先に定義したアデノウイルスハイブリッドベクターの構成要素ｉ〜ｖｉ、またはｉ〜ｖｉｉを組み立てることを含んでなる。
【００４６】
本発明はまた、細胞に遺伝子物質を導入するための、より特定的には、アデノウイルスの標的細胞であり得る真核細胞において外来遺伝子を導入および発現させるための、前記ハイブリッドベクターの使用に関する。この使用は、前記ハイブリッドベクターを被検体に投与することを含んでなる。
【００４７】
本発明によるアデノウイルスハイブリッドベクターを腫瘍細胞に感染させることにより、腫瘍特異的プロモーターによってＳＦＶアルファウイルスレプリコンのｍＲＮＡの転写が行われ、故に、Ｒｅｐ遺伝子が翻訳され、ＳＦＶのＲＮＡが増幅される。Ｒｅｐはまた、ＳＦＶのサブゲノムＲＮＡを生成し、そこから治療遺伝子またはレポーター遺伝子が高レベルで発現される。感染細胞により分泌された治療遺伝子産物は、感染部位における免疫細胞を活性化させる。ＳＦＶの複製は更に感染細胞のアポトーシスを誘発し、アポトーシス細胞からの腫瘍抗原の放出を引き起こす。腫瘍抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により捕捉され、それにより腫瘍に対する免疫応答を活性化することができる。しかしながら、このハイブリッドベクターが非腫瘍細胞に感染しても、ＳＦＶレプリコンのｍＲＮＡは転写されず、故にトランスジェニック発現もアポトーシスも起こらない。
【００４８】
腫瘍細胞は、好ましくは、ＳＦＶレプリコンのｍＲＮＡが腫瘍特異的プロモーターＡＦＰから転写されるように、本発明によるアデノウイルスハイブリッドベクターに感染しているので、Ｒｅｐ遺伝子が翻訳され、ＳＦＶのＲＮＡが増幅される。Ｒｅｐはまた、ＳＦＶのサブゲノムＲＮＡを生成し、そこからｍＩＬ−１２またはｈＩＬ−１２が高レベルで発現される。感染細胞により分泌されたｍＩＬ−１２またはｈＩＬ−１２は感染部位において免疫細胞を活性化させる。ＳＦＶの複製は更に感染細胞のアポトーシスを誘発し、アポトーシス細胞による腫瘍抗原の放出を引き起こす。腫瘍抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により捕捉され、それにより腫瘍に対する免疫応答を活性化することができる。しかしながら、このハイブリッドベクターを非腫瘍細胞に感染させても、ＳＦＶレプリコンのｍＲＮＡは転写されず、故にトランスジェニック発現もアポトーシスも起こらない。
【００４９】
本発明の更なる目的は、細胞、好ましくは腫瘍細胞に遺伝子物質を導入するための方法における、先に定義したアデノウイルスハイブリッドベクターの使用であり、この使用は前記ハイブリッドベクターを被検体に投与することを含んでなる。更に好ましくは、前記細胞は、ＡＦＰを発現する腫瘍細胞である。
【００５０】
本発明の更なる目的は、腫瘍の治療に有効な医薬を製造するための、定義したアデノウイルスハイブリッドベクターの使用、および異種抗原に対する免疫応答を誘発するためのその使用である。この使用は、前記医薬を被検体に投与することを含んでなる。
【００５１】
本発明の更なる目的は、本発明により定義されたアデノウイルスハイブリッドベクターを少なくとも含んでなる医薬組成物、および腫瘍の治療のための、または異種抗原に対する免疫応答を誘発するための方法におけるその使用である。
【００５２】
前記医薬組成物は、好ましくは本発明によるアデノウイルスハイブリッドベクターを含み、目的の外来遺伝子は哺乳類インターロイキンＩＬ−１２、好ましくはヒトインターロイキンｈＩＬ−１２である。前記使用は、前記ハイブリッドベクターを含む医薬組成物を被検体に投与することを含んでなる。
【００５３】
本発明はまた、本発明によるハイブリッドベクターを使用することにより、癌を治療するための方法に関し、この方法は、前記ハイブリッドベクターを被検体に投与することを含んでなる。
【００５４】
従って、本発明の好ましい実施態様によれば、腫瘍特異的プロモーターとしてＡＦＰ（ｐ＋ｅ）が選択されており、２つのアデノウイルスハイブリッドベクターは、ＳＦＶレプリコンがＡＦＰプロモーターにより制御され、レポーター遺伝子ＬａｃＺおよび治療遺伝子ＩＬ−１２がＳＦＶサブゲノムプロモーターの制御下に挿入されるように構築され−それぞれ、Ａｄ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺおよびＡｄ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２−、ＡＦＰプロモーターによって直接制御されるマウス由来のＬａｃｚおよびＩＬ−１２を担持する２つの弱いアデノウイルスベクター−Ａｄ／ＡＦＰ−ＬａｃＺおよびＡｄ／ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２−が対照ベクターとして調製されている。本発明によるハイブリッドベクターは、現在までに使用されてきた対照ベクターよりも効率よく作用することが示されている。
【００５５】
本発明によれば、ベクターＡｄ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２が、ＡＦＰを発現するＨＣＣ（悪性肝癌）腫瘍の治療に有用なベクターであり得ることが示されている。
【００５６】
また、ＳＦＶを制御するために、最も悪性の腫瘍において広く活性化されるテロメラーゼプロモーター、ＴＥＲＴのような他の腫瘍プロモーターを使用することにより、本発明のもののようなハイブリッドベクターの使用は、全種類の癌を治療するための包括的な手段となり得ることが示されている。
【００５７】
更におよび有利には、本発明によるハイブリッドベクターは、腫瘍細胞と特異的に作用し、治療遺伝子を組み入れる必要なく、腫瘍細胞を破壊する。更に、本発明によるハイブリッドベクターは、有利なことに、ＩＬ−１２などの治療遺伝子を包含していると強い抗腫瘍活性を誘発することが示されている。
【発明の実施態様】
【００５８】
プラスミド
ｐＧＥＭ−Ｔ「ｅａｓｙ」およびｐＣＭＶｂをＰｒｏｍｅｇａ（米国）から、並びにｐＢＳ−ＳＫ＋をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国）から入手した。ｐＳＴＫ１２０はＫｏｃｈａｎｅｋ博士（ウルム大学（University of Ulm）、ドイツ）から寄贈された。ｐＢＫ−ＳＦＶ−１およびｐＢＫ−ＳＦＶ−３はBerglund P. et al.”Enhancing immune responses using suicidal DNA vaccines,” Nature Biotechnology 1998, 16: 562-565に記載されている。ｐＧＬ３／ＡＦＰおよびｐＢＳ／ｍＩＬ−１２（Yonglian Sun, Cheng Qian, Dacheng PengおよびJusus Prieto, 2000。ＩＬ−１２に加えて、Ｂ７−１の肝癌細胞への遺伝子導入により、免疫エフェクター機構が変化し、ＩＬ−１２のみにより誘発されたＴｈ１サイトカイン産生が抑制される。Human Gene Therapy 11:127-138)は研究室で作製した。
【００５９】
ｐＧＬ３／ＡＦＰの構築のために、ヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により、ＡＦＰプロモーター／エンハンサー（ｐ＋ｅ）の領域を得た。ＡＦＰプロモーター（ＡＦＰ  ｐｒｏ）の増幅に使用したプライマーは、ＣＴＣＴＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧＣＣＣＣＡＡＡＧＡＧＣＴＣおよびＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＡＴＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡであった。ＡＦＰエンハンサーの増幅に使用したプライマーは、ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＴＧＴＣＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＡＡおよびＣＴＣＴＡＧＡＣＴＧＴＣＡＡＡＴＡＡＧＴＧＧ  ＣＣＴＧＧであった。プロモーターの配列（２１７塩基対）およびエンハンサーの配列（７８５塩基対）をｐＧＥＭ−Ｔプラスミド中にクローニングした。その後、増幅した断片を配列決定により確認した。ＡＦＰプロモーターを、Ｘｂａ  Ｉ／ＢａｍＨＩによる制限処理によりｐＧＥＭ−Ｔ／ＡＦＰ−ｐプラスミドから取り出し、平滑末端連結により、Ｓｍａ  Ｉで消化したｐＧＬ３−基本プラスミドに挿入した。このようにして、ｐＧＬ３／ＡＦＰ−ｐプラスミドが得られた。ＡＦＰエンハンサーをＸｂａ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩによる制限処理によりｐＧＥＭ−Ｔ／ＡＦＰ−ｅプラスミドから取り出し、平滑末端連結を通じて、Ｎｈｅ  Ｉで消化したｐＧＬ３／ＡＦＰ−ｐプラスミドに挿入し、最終的にｐＧＬ３／ＡＦＰプラスミドを得た。
【００６０】
細胞系および組織培養物
ヒトＨＣＣ細胞系Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＨｅｐＧ２およびＳＫ−Ｈｅｐ−１、ヒト頚部上皮腺癌系ＨｅＬａ、ヒト肺腺癌系Ａ５４９、ヒト胚腎細胞系２９３、ラットＨＣＣ細胞ＭｃＡ−ＲＨ７７７７、ＭＨＣ１および正常なラットの肝細胞Ｃｌｏｎｅ９、並びにラットＨＣＣ細胞系Ｈｅｐａ１−６をＡＴＣＣから得た。Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する２９３細胞（２９３Ｃｒｅ４）をＭｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。加熱およびペニシリン／ストレプトマイシンにより不活性化させた１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ培地内で、Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＨｅＬａ、ＳＫ−Ｈｅｐ−１、Ｃｌｏｎｅ  ９、Ｈｕｈ−７およびＨｅｐａ１−６細胞を生育した。加熱およびペニシリン／ストレプトマイシンにより不活性化させた１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地内で、ＨｅｐＧ２およびＡ５４９細胞を生育した。２０％ウマ血清および５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地内で、ＭｃＨ−ＲＨ７７７７およびＭＨＣ１細胞を生育した。１０％ＦＢＳおよび０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したＤＭＥＭ培地内で、２９３Ｃｒｅ４細胞を生育した。
【００６１】
動物
７週齢の雌ヌード免疫不全ＢＡＬＢ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（スペイン、バルセロナ）から入手した。４〜６週齢の雄のバッファローラットをＣＩＦＡ（ナバラ大学動物研究所（Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｓｔａｌｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎａｖａｒｒａ））から入手した。ＣＩＦＡにおいて、マウスおよびラットを通常条件下で収容した。ヌードマウスには、オートクレーブ処理した飲料水と共に照射食物を与えた。ヌードマウスの取り扱いは常に層状フローチャンバ下で行った。動物に関する全ての処置は、実験動物の世話および使用に関する標準的な推奨規格およびプロトコールに従って行った。
【００６２】
ベクターの構築
発現カセットＡＦＰ−ＳＦＶの構築
ＳＦＶレプリコンの完全な配列を含有するｐＢＫ−ＳＦＶ−１プラスミドを鋳型として用い、ＳＦＶの５’末端配列（１−２９２ｎｔ）をＰＣＲにより増幅した。プライマー１は、５’末端（下線）にＳｐｅ  Ｉ制限部位、次いで５０ｎｔのＡＦＰプロモーター配列およびＳＦＶ配列の最初の２０ｎｔ（括弧内）を含有するものとした：５’−ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＡＡＧ  ＡＧＴ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＴＴＴＣＡＧ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＣＣ［Ａ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＡＴＡ  Ｃ］−３’。プライマー２は、Ｘｈｏ  Ｉ制限部位（下線）の後に１９ｎｔのＳＦＶ配列（括弧内）を含有するものとした：５’−ＣＴＣ  ［ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＡ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＴＧＴ  ＧＴ］−３’。３４２ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲにより生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙプラスミド内に直接クローニングし、ｐＧＥＭ−Ｔｅ−ＳＦＶ−１を生成した。配列決定により、このプラスミドにＰＣＲエラーがないことを確認した。３４２ｂｐの断片を、Ｓｐｅ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉでの消化によりｐＧＥＭ−Ｔｅ−ＳＦＶ−１から取り出し、同じ酵素を使って消化したｐＧＬ３／ＡＦＰ内にクローニングし、ｐＧＬ３／ＡＦＰ−ＳＦＶ−１を得た。これは完全なＡＦＰプロモーター（２１７ｂｐ）およびエンハンサー（７８５ｂｐ）、およびその後にＳＦＶの５’末端配列（２９２ｂｐを含むＳＦＶ−１）を有している。Ｍｌｕ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉ消化により、ｐＧＬ３／ＡＦＰ−ＳＦＶ−１からＡＦＰ−ＳＦＶ−１（１３４２ｂｐ）カセットを得て、これをクレノウで処理し、ＥｃｏＲ  Ｖで消化したｐＢＳ−ＳＫ＋内にクローニングし、ｐＢＳ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−１を生成した。ＳＶ４０  ｌａｔｅ  ｐｏｌｙＡ（２６２ｂｐ）をＸｂａ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉ消化によりｐＧＬ３／ＡＦＰから取り出し、クレノウで平滑化して、これもまたクレノウで平滑化したｐＢＳ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−１のＳａｌ  Ｉ部位に挿入し、それによりｐＢＳ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−１−ｐＡを得た。唯一となるＡｐａ  ＩおよびＮｒｕ  Ｉ部位の両方を含有するポリリンカーをｐＢＳ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−１−ｐＡ内のＢａｍ  ＨＩおよびＸｍａ  Ｉ部位間に挿入した。７９８５ｂｐを含むＳＦＶの３’末端配列をＳｐｅ  Ｉ／ＥｃｏＲ  Ｖでの消化によりｐＢＫ−ＳＦＶ−１から取り出し、クレノウで平滑化し、ｐＢＳ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−１−ｐＡのＥｃｏＲ  Ｖ位置に挿入することにより、ｐＢＳ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｐＡを得た。
【００６３】
ＬａｃＺレポーター遺伝子を、Ｎｏｔ  Ｉでの消化によりｐＣＭＶｂから得て、クレノウで処理し、クレノウで処理したｐＢＳ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｐＡのＢａｍＨ  Ｉ部位に挿入することにより、ｐＢＳ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺ−ｐＡを形成した。内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が連結したｐ３５およびｐ４０サブユニットをコードする遺伝子を含有するｍＩＬ−１２カセットを、Ｓｐｅ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉでの消化によりｐＢＳ／ｍＩＬ−１２から分離し、クレノウで処理し、これもまたクレノウで平滑化したｐＢＳ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２−ｐＡのＢａｍＨＩ位置に挿入し、プラスミドｐＢＳ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２−ｐＡを生成した。
【００６４】
弱いハイブリッドアデノウイルスベクターの構築
図２に示すように、４種の弱いアデノウイルスベクターを構築した。ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｌａｃＺおよびＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２は、ＡＦＰプロモーターおよびエンハンサーにより制御された組み換えＳＦＶレプリコン配列を含有する。これらのベクターにおいて、レポーター遺伝子ＬａｃＺまたは治療遺伝子ｍＩＬ−１２をそれぞれＳＦＶサブゲノムプロモーターの制御下にクローニングした。ＡＦＰ−ｌａｃＺおよびＡＦＰ−ｍＩＬ−１２も弱いアデノウイルスベクターであり、ＬａｃＺおよびｍＩＬ−１２遺伝子を含有し、ＡＦＰプロモーター／エンハンサーによりそれぞれ直接制御される。これらのベクター構築後の方法を以下に記載する。ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＩＬ−１２発現カセットを収容するのに十分なクローニング空間を備えたアデノウイルスベクターを生成するために、弱いアデノウイルスの配列を含有するｐＳＴＫ１２０プラスミドを改変した。そのために、Ａｐａ  Ｉでの消化により、ｐＳＴＫ１２０プラスミドから９ｋｂの断片を排除した。更に、Ａｓｃ  ＩおよびＳｂｆ  Ｉ部位を含有するポリリンカーをこの新たなプラスミドに挿入することにより、ｐＴＧＣ３００１を得た。このプラスミドは左側ＩＴＲ、パッケージシグナル、ＨＰＲＴおよびＣ３４６からのスタッファＤＮＡおよび右側ＩＴＲを含有する。ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺカセットを、Ａｐａ  Ｉでの消化によりｐＢＳ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｌａｃＺ−ｐＡから分離し、ｐＴＧＣ３００１のＡｐａ  Ｉ部位に挿入することにより、ｐＴＧＣ３０１１を得た。同様に、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２カセットを、ＢｓｓＨ  ＩＩでの消化によりｐＢＳ／ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２−ｐＡから取り出し、これをクレノウで処理し、同様にクレノウで処理したｐＴＧＣ３００１のＡｓｃ  Ｉ部位に挿入し、ｐＴＧＣ３０１２を得た。
【００６５】
対照ベクターの構築
弱いアデノウイルスベクターＡＦＰ−ＬａｃＺの構築
ＡＦＰエンハンサー／プロモーター（ＡＦＰ  ｐ＋ｅ）配列を、Ｍｌｕ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉでの消化によりｐＧＬ３／ＡＦＰから分離し、クレノウで処理し、予めＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏ  Ｉで消化し、クレノウで処理したｐＣＭＶｂに挿入した。このように、ＣＭＶ前初期プロモーターをｐＣＭＶｂから取り除き、ＡＦＰ（ｐ＋ｅ）で置換して、ｐＡＦＰｂを得た。その後、ＡＦＰ−ＬａｃＺカセット（５０７７ｂｐ）を、Ｘｂａ  Ｉ／Ｎａｒ  Ｉでの消化によりｐＡＦＰｂから取り出し、クレノウで処理し、これもまたクレノウで平滑化したｐＳＴＫ１２０のＳｗａ  Ｉ部位に挿入することにより、ｐＴＧＣ３０１３を得た。
【００６６】
弱いアデノウイルスベクターＡＦＰ−ｍＩＬ−１２の構築
ｍＩＬ−１２カセットを、Ｘｈｏ  Ｉ／Ｓｐｅ  Ｉでの消化によりｐＢＳ／ｍＩＬ−１２から取り出し、予めＸｈｏ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉで消化したｐＧＬ３／ＡＦＰに挿入し、この後者のプラスミドからルシフェラーゼ遺伝子を排除し、ｐＡＦＰ−ｍＩＬ−１２を得た。ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２カセット（３７６０ｂｐ）をＢａｍＨ  Ｉ／Ｓｃａ  Ｉでの消化によりｐＡＦＰ−ｍＩＬ−１２から取り出し、クレノウで処理し、Ｓｗａ  Ｉにより消化して同様にクレノウで処理したｐＳＴＫ１２０に挿入し、ｐＴＧＣ３０１４を得た。
【００６７】
弱いアデノウイルスベクターの救出
Ｐｍｅ  Ｉ消化、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿後、２μｇのｐＴＧＣ３０１１、ｐＴＧＣ３０１２、ｐＴＧＣ３０１３またはｐＴＧＣ３０１４のＤＮＡをそれぞれ２９３Ｃｒｅ４細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をヘルパーウイルスＡｄＬＣ８ｃｌｕｃに感染させた。次いで大規模な増幅および調製工程を、文献に記載のように行った（Philip Ng., Robin J. Parks, and Frank L. Graham. Preparation of helper-dependent adenoviral vectors. Methods in Molecular Medicine, Vol. 69, Gene Therapy Protocols, 2nd. Ed. 69, 371-88, 2002; H. Zhou, L. Pastore, A. L. Beaudet. Helper-dependent adenoviral vectors. Methods in Enzymology, vol, 346, 177-198, 2002; Hillgenberg M., et al. System for efficient helper-dependent minimal adenovirus constructions and rescue. Hum Gene Ther., 12; 643-657, 2001）。全てのベクター調製物をＣｓＣｌ勾配遠心分離により２回精製した。精製したＤＮＡベクターを制限酵素での消化により分析すると、配列の再配列は見られなかった。弱いアデノウイルスの滴定およびヘルパーウイルス汚染を定量的ＰＣＲにより評価した。全ウイルス粒子対感染ユニット（ｉｕ）の割合は２０：１であった。ヘルパーウイルス粒子による汚染はおよそ０．５％〜１％であった。
【００６８】
定量的ＰＣＲ
ヘルパーウイルス汚染の程度を測定するために、Ａｄ５  Ｅ４領域の定量的ＰＣＲ用プローブおよびプライマーをＴａｑＭａｎプログラム（ＴａｑＭａｎプローブ＃２）を用いて設計し、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｌｔｄ.（プライマー）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（プローブ）に依託して合成した。弱いアデノウイルスの力価を測定するために、マウス由来のＬａｃＺおよびｍＩＬ−１２配列の定量的ＰＣＲ用プローブおよびプライマーをＴａｑＭａｎプログラム（ＴａｑＭａｎプローブ＃２）を用いて設計し、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｌｔｄ（プライマー）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（プローブ）に依託して合成した。野生型Ａｄによる汚染を測定するために、Ａｄ５  Ｅ１領域の定量的ＰＣＲ用プローブおよびプライマーをＴａｑＭａｎプログラム（ＴａｑＭａｎプローブ＃２）を用いて設計し、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｌｔｄ．（プライマー）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（プローブ）に依託して合成した。
【００６９】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
弱いアデノウイルスベクターに感染させた細胞におけるトランスジェニック発現
ＨＣＣ由来細胞系（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２およびＰＬＣ／ＰＲＦ／５）および非ＨＣＣ由来細胞系（Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＭＨＣ１およびＣｌｏｎｅ  ９）またはＡＦＰを発現しないＨＣＣ由来細胞系（ＳＫ−Ｈｅｐ−１）を「ｍｏｉ」１０００、１００または１０（粒子／細胞）それぞれにて４種の弱いアデノウイルスベクター（ＡＦＰ−ＬａｃＺ、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺ、ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２またはＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２）の各々に感染させた。３つの第一世代アデノウイルス（Ａｄ／ＣＭＶ−ｍＩＬ−１２、Ａｄ／ＣＭＶ−ＬａｃＺおよびＡｄ／ＡＦＰ−ＬａｃＺ）を対照として使用した。ｍＩＬ−１２ベクターに感染させた細胞からの上澄みおよびＬａｃＺベクターに感染させた細胞からの溶解産物を、ｍＩＬ−１２およびβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）レベルをそれぞれ測定するために、ウェルから２回ずつ収集した。また、ＬａｃＺベクターに感染させた細胞をＸ−ｇａｌで染色した。ｍＩＬ−１２レベル（ｐ７０）をＥＬＩＳＡキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ））を用いて測定した。β−ｇａｌレベルをＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ（スイス））を用いて測定した。ｍＩＬ−１２発現の時間過程を、「ｍｏｉ」１０００にて、ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２に、または対照ベクターＡｄ／ＣＭＶ−ｍＩＬ−１２に感染させた後のＨＣＣ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７）において評価した。感染後５日まで毎日上澄みを収集した。
【００７０】
Ａｄ−ＳＦＶハイブリッドベクターを用いたトランスジェニック発現の特異性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
先に記載した組み換えベクターでのトランスジェニック発現の特異性を検討するために、４種のヒトＨＣＣ細胞系（Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ−７およびＰＬＣ／ＰＲＦ／５）およびＨＣＣ由来ではない２種のヒト細胞系（ＨｅＬａおよびＡ５４９）、またはＨＣＣ由来であるが、ＡＦＰを発現しないもの（ＳＫ−Ｈｅｐ−１）を、異なる「ｍｏｉ」（１０、１００または１０００）にて、陽性対照としてのＡＦＰ−ｍＩＬ−１２、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２またはＡｄ−ＣＭＶ−ｍＩＬ−１２に感染させた。感染から２日後、上澄みを収集し、そのｍＩＬ−１２含有量を測定した。結果を図３（Ａ）および（Ｂ）に示す。「ｍｏｉ」１０または１００にてＡＦＰ−ｍＩＬ−１２に感染させた場合、ヒトＨＣＣ細胞においてｍＩＬ−１２発現は観察されず、唯一「ｍｏｉ」１０００にて、幾つかの細胞系において非常に低レベルのｍＩＬ−１２が見られた（図３Ａ）。対照的に、これらの細胞を「ｍｏｉ」１０、１００または１０００にてＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２に感染させると、用量依存的にｍＩＬ−１２の発現が生じた（図３Ａ）。「ｍｏｉ」１０でＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２に感染させた細胞におけるｍＩＬ−１２の発現レベルは、「ｍｏｉ」１０００でＡＦＰ−ｍＩＬ−１２に感染させた細胞で得られるレベルに匹敵していた。更に、異なる「ｍｏｉ」にてＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２に感染させたＨＣＣ細胞におけるｍＩＬ−１２レベルは、対照ベクターＡｄ−ＣＭＶ−ｍＩＬ−１２で得られるレベルに匹敵していた。しかしながら、ＡＦＰを発現しない細胞をＡＦＰ−ｍＩＬ−１２またはＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２に感染させると、最も高い「ｍｏｉ」（１０００）を用いたとしても、ｍＩＬ−１２は検出可能なレベルでは生じなかった（図３Ｂ）。これらの細胞において、対照ベクターＡｄ−ＣＭＶ−ｍＩＩ−１２はｍＩＬ−１２の発現を高レベルで生じさせることができた。
【００７１】
一方、４種のＨＣＣ細胞系（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ−７、ＨｅｐＧ２およびＰＬＣ／ＰＲＦ／５）を、異なる「ｍｏｉ」（１０、１００または１０００）にて、ＬａｃＺ−ＡＦＰ−ｌａｃＺまたはＡＦＰ−ＳＦＶ−ｌａｃＺのハイブリッドベクターに感染させ、β−ｇａｌの特異的発現を測定した。同様のデータを本件において同様に得た。その結果を図４に示す。
【００７２】
図５は、弱いアデノウイルスベクターＡＦＰ−ｌａｃＺおよびＡＦＰ−ＳＦＶ−ｌａｃＺに感染させ、次いでＸ−ｇａｌで染色したＨＣＣ細胞の顕微鏡写真を示している。ＡＦＰ−ｌａｃＺをＨＣＣ細胞に感染させると、感染細胞において低レベルの発現が生じ、これはごく薄く染色された。対照的に、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｌａｃＺをＨＣＣ細胞に感染させると、β−ｇａｌが高レベルで発現し、これは、Ｘ−ｇａｌによる濃い染色によって反映されている。このデータによれば、ＡＦＰプロモーターの制御下にＳＦＶレプリコンを含むハイブリッドベクターＡｄ−ＳＦＶにより、ＡＦＰを発現する腫瘍細胞での強いトランスジェニック発現が高レベルで生じ得ることが示されている。
【００７３】
ＨＣＣ細胞におけるｍＩＬ−１２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現の時間過程
Ａｄ−ＳＦＶハイブリッドベクターの感染後、異なる時間でのｍＩＬ−１２産生を検討するにあたり、２種のＨＣＣ細胞系（Ｈｅｐ３ＢおよびＨｕｈ−７）をＡＦＰ−ｍＩＬ−１２またはＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２に感染させ、感染から５日間、毎日上澄みを収集した。図６は、上記細胞の感染後に得られたトランスジェニック発現の結果を示している。その結果は、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２に感染させた細胞において、感染後１日目から４日目まで、ｍＩＬ−１２の発現が一定に増加していることを反映している（図６）。しかしながら、感染後５日目に、ｍＩＬ−１２レベルは僅かに減少した。ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２に感染させた細胞において、発現レベルは非常に低く、経時的に見て、ｍＩＬ−１２の産生はごく僅かに増加するのみであった。
【００７４】
細胞毒性試験−ＭＴＴ組み込みによる細胞増殖の評価
ＨＣＣ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、ＭＣＨ−ＲＨ７７７７、Ｈｅｐ１−６）を、「ｍｏｉ」１０００にて、ＡＦＰ−ＬａｃＺ、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺ、ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２またはＡｄ／ＣＭＶ／ｍＩＬ−１２に感染させた。感染してから５日後、ＭＴＴアッセイ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル）２，５−臭化ジフェニルテトラゾリウム）により細胞生存率を測定した（Mosmann, T. (1983) J. Immunol. Meth. 65, 55-63; Tada, H. et al. (1986) J. Immunol. Meth. 93, 157-65）。簡単に言えば、ＰＢＳで細胞を一回洗浄し、２００μｌの新たに調製したＭＴＴ染料溶液をウェルごとに加えた（４８ウェルのプレート内）。細胞を更に３〜４時間培養し、次いで５００μｌの可溶化緩衝液を添加した。波長５７０ｎｍの分光測光器において、吸光度の測定用に１００μｌの各サンプルを採取した。
【００７５】
Ａｄ−ＳＦＶハイブリッドベクターによるＨＣＣ細胞の感染後のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞死の誘発
ＳＦＶベクターの複製は、脊椎動物由来の細胞の大半においてアポトーシス媒介型の細胞死を誘発することが報告されている。これがＡｄ−ＳＦＶハイブリッドベクターに感染させたＨＣＣ細胞にもあてはまるかどうかを評価するため、Ｈｅｐ３ＢおよびＨｕｈ−７細胞をこれらのベクターに感染させ、感染後５日目に細胞生存率を測定した。図７に見られるように、この感染後の時点での生存率は、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２またはＡＦＰ−ＳＦＶ−ｌａｃＺに感染させた細胞においては２０％未満であった。しかしながら、ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２またはＡＦＰ−ｌａｃＺ、または対照ベクターＡｄＣＭＶｍＩＬ−１２にこれらの細胞を感染させても細胞生存率に影響は及ばなかった。これらの結果は、ＡＦＰ−ＳＦＶベクターに感染させた細胞においてＳＦＶが複製することを示している。
【００７６】
免疫蛍光法によるＳＦＶ  Ｒｅｐの検出
ＨＣＣ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、ＭＣＨ−ＲＨ７７７７）を６ウェルのプレート内のカバーガラス上に接種し（１×１０５細胞／ウェル）、「ｍｏｉ」１０００にてＡＦＰ−ｍＩＬ−１２、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２またはＡｄ／ＣＭＶ−ｍＩＬ−１２に感染させた。感染から２日後、ＰＢＳでカバーガラスを２回洗浄し、細胞を−２０℃で６分間メタノールで固定した。プレートを再度ＰＢＳで３回洗浄し、０．５％のゼラチンと、０．２５％のＢＳＡとを含有するＰＢＳを用いて３０分間室温（ＲＴ）でインキュベートし、非特異的結合をブロックした。次いで、ブロッキング緩衝液を、ブロッキング緩衝液中１：１０に希釈した一次抗体（抗レプリカーゼＭＡｂ）と取替え、ＲＴで３０分間インキュベートした。細胞を再度ＰＢＳ−０．２５％ＢＳＡで３回洗浄し、ブロッキング緩衝液中１：２５０に希釈した二次抗体（ＦＩＴＣと結合した抗マウス・ラビット血清（Ｓｉｇｍａ））とともにＲＴで３０分間インキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳ−０．２５％ＢＳＡで３回洗浄し、水で１回洗浄し、Ｄａｐｉ付きＶｅｃｔａシールドを使用してガラススライド上に配置し、細胞核を染色した。
【００７７】
Ａｄ−ＳＦＶハイブリッドベクターに感染させたＨＣＣ細胞におけるＳＦＶ  Ｒｅｐのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現
ＳＦＶ  Ｒｅｐの発現を、このタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫蛍光法により、Ａｄ−ＳＦＶハイブリッドベクターに感染させたＨＣＣ細胞において検査した。図８は、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２またはＡＦＰ−ＳＦＶ−ｌａｃＺに感染させたＨＣＣ細胞がＲｅｐに対して強い細胞質陽性を示したことを表している。対照的に、ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２またはＡＦＰ−ｌａｃＺに感染させた細胞には染色は見られなかった。
【００７８】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
ＨＣＣ異種移植片の導入並びにｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入効率および特異性についての検討
Ｈｕｈ−７細胞を収集し、血清を含まない培地で２回洗浄した。２×１０６の細胞を１００μｌの生理食塩水血清に再懸濁し、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。細胞接種から４週間後、腫瘍塊の直径が６〜８ｍｍに達したら、８０μｌの生理食塩水で希釈したＡＦＰ−ＬａｃＺ（ｎ＝４）またはＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺ（ｎ＝４）の１×１０１０のウイルス粒子を腫瘍内に注射した。対照動物（ｎ＝３）の腫瘍内には８０μｌの生理食塩水を注射した。接種後３日目または６日目にマウスを殺した。この時に腫瘍および肝臓を各動物から摘出し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．（Ｓａｋｕｒａ（オランダ））に埋め込み、−８０℃で冷凍した。冷凍組織を切片化し、ガラススライド上に置いて、Ｘ−ｇａｌで染色するか、またはＴＵＮＥＬにより分析した。ハイブリッドベクターによる感染の特異性をｉｎ  ｖｉｖｏで検査するために、正常なＢａｌｂ／ｃマウスにＡＦＰ−ＬａｃＺ（ｎ＝４）、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺ（ｎ＝４）またはＡｄ／ＣＭＶ−ＬａｃＺを１０１０ウイルス粒子／マウスの用量にて静脈内注射した。接種後３日目に動物を殺し、主要な器官を収集し、Ｘ−ｇａｌでの染色により、ＬａｃＺの発現を分析した。
【００７９】
ヌード免疫不全マウスにおけるヒトＨＣＣ異種移植片でのＡｄ−ＳＦＶハイブリッドベクターの遺伝子導入効率
弱いハイブリッドベクターの形質導入効率をｉｎ  ｖｉｖｏで試験するために、ＡＦＰを発現できるＨｕｈ７細胞をベースとしたヒトＨＣＣモデルを使用した。Ｈｕｈ７細胞をヌード免疫不全Ｂａｌｂ／ｃマウスに皮下接種し、３０日後に腫瘍塊が生成した後、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺまたはＡＦＰ−ＬａｃＺの１×１０１０のウイルス粒子を対照として動物の腫瘍内に注射した。ウイルス注射から３日または６日後にマウスを殺し、腫瘍および肝臓の両方を摘出し、Ｘ−ｇａｌで染色することにより検査した。図９Ａに見られるように、ＡＦＰ−ｌａｃＺを注射した動物の腫瘍切片には弱いトランスジェニック発現がある。対照的に、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺを注射した動物の腫瘍切片には強いＬａｃＺ発現がある（図９Ｂ）。ＡＦＰ−ＬａｃＺまたはＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺのいずれかを注射した動物からの肝臓切片では、トランスジェニック発現は観察されなかった。これは、ベクターが接種部位内に限定されたであろうことを示している（データは示さず）。Ａｄ−ＳＦＶハイブリッドベクターが感染腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発するか否かを検査する目的で、ＴＵＮＥＬ技法により、処理済み腫瘍切片を分析した。ＡＦＰ−ＬａｃＺを接種したマウスからのサンプルにはアポトーシスは観察されなかった（図９Ｃ）。しかしながら、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺを注射した動物の腫瘍には十分な量のアポトーシス細胞が観察された（図９Ｄ）。このデータは、Ａｄ−ＳＦＶハイブリッドベクターが腫瘍内に特異的な遺伝子発現を誘発するだけでなく、これら同細胞内においてアポトーシスによる選択的な細胞死も誘発することを示している。
【００８０】
Ａｄ−ＳＦＶハイブリッドベクターのＩｎ  ｖｉｖｏ特異性
ハイブリッドベクターの特異性を示すために、ＡＦＰ−ＬａｃＺ、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺの、または対照ベクターＡｄ／ＣＭＶ−ＬａｃＺの１０１０のウイルス粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに静脈内投与した。ベクター投与から３日後、肝臓内でのβ−ガラクトシダーゼの発現を分析した。図９（Ｅ−Ｆ）に見られるように、ＡＦＰ−ＬａｃＺもＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺも肝臓における導入遺伝子の検出可能な発現を誘発することはできなかった。しかしながら、Ａｄ／ＣＭＶ−ＬａｃＺを投与したそれらの動物において、肝組織切片内に高い割合のβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞が観察された（図９Ｇ）。これらのデータは、ハイブリッドベクターが介在する発現が腫瘍細胞に特異的であることを確証している。
【００８１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの同所性ＨＣＣ誘発および遺伝子治療
バッファローラットの左肝葉に５×１０５のＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞を接種した。腫瘍細胞の接種から１０日後、各動物において、直径７〜１０ｍｍの単一細胞塊の出現が観察された。ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２の１０１１または２×１０１１ウイルス粒子で、または対照として生理食塩水で腫瘍を処理した。処理から２週間および４週間後、動物を麻痺させ、開腹手術に供して腫瘍の発生を観察した。動物生存率の分析も行った。各塊の長さおよび幅を測定し、式：腫瘍体積＝（長さ（単位：ｍｍ））×（幅（単位：ｍｍ））２×０．５２３６（Ｊａｎｉｋら、１９７５年）を適用することにより、腫瘍の大きさを評価した。
【００８２】
バッファローラットにおける同所性ＨＣＣ処理の効率
ＩＬ−１２を担持しているＡｄ−ＳＦＶハイブリッドベクターの抗腫瘍効率を検査するために、ラットＭｃＨ−ＲＨ７７７７細胞をラットの肝臓に移植することによって同所性ＨＣＣ腫瘍を確立した。このモデルが選択された理由は、ＭｃＨ−ＲＨ７７７７細胞はＡＦＰを発現することが証明されているからである。第一の実験では、ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２の１×１０１１ウイルス粒子の単回腫瘍内注射で、または対照として生理食塩水で動物を処理した（図１０Ａ−Ｃ）。ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２を注射した動物は、対照動物と比較して腫瘍の大きさが小さくなっており、対照動物は実験全体を通して腫瘍の大きさが一定に増大した（図１０Ａ−Ｂ）。しかしながら、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２による処理により、４匹の処理済みラットのうち１匹では腫瘍が完全に退縮し、２匹では疾患が安定化し、１匹では応答がなかった（図１０Ｃ）。ハイブリッドベクターの投与量が多いほど抗腫瘍効果が増大し得るか否かを実証する目的で、第二の実験を行った。この実験では、ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２の２×１０１１ウイルス粒子の用量で、または対照として生理食塩水で動物を腫瘍内処理した（図１０D−Ｇ）。前の実験と同様に、ＡＦＰ／ＩＬ−１２ベクターを注射した動物は、ごく僅かな抗腫瘍応答しか示さず、すなわち、全部で１２匹の処理済み動物のうち、完全な寛解を示したのは１匹だけであり、４匹の動物の腫瘍は対照動物のものよりも緩慢に成長し、７匹の動物は何の応答も示さなかった（図１０Ｅ）。しかしながら、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＩＬ−１２ベクターでの処理ははるかに強い効果を有しており、全部で１２匹の処理済み動物のうち、４匹の動物では完全な腫瘍退縮を誘発し（３３％）、６匹の動物では部分的な退縮を誘発し（５０％）、２匹の動物では腫瘍成長の進行を遅らせ（１６％）、他の２匹の動物では応答がなかった（１６％）（図１０Ｆ）。この第二試験では、ＡＦＰ／ＳＦＶ−ＩＬ−１２ベクターにより、処理済み動物の生存率が５０％となり、一方、ＡＦＰ−ＩＬ−１２または生理食塩水で処理した動物の生存率は０％であった（図１０Ｇ）。
【００８３】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性試験：血清中のトランスアミナーゼおよびＩｌ−１２レベルの測定、並びに肝臓の組織学的評価
接種から４日および８日後に、用量２×１０１１にてアデノウイルスベクターＡＦＰ−ＳＦＶ−ＩＬ−１２またはＡＦＰ−ＩＬ−１２で、または生理食塩水で腫瘍内処理したラットから血液サンプルを収集した。この試験でも、アルファウイルスＳＦＶ−ＩＬ−１２の１０８粒子を接種したラットを用いた。２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することにより血液から血清を分離した。Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１１自動分析器（Boehringer Mannheim、ドイツ）を用いてトランスアミナーゼレベルを測定した。ＩＬ−１２レベルはＥＬＩＳＡ法により測定した。処理から３日後に接種された動物の肝臓を摘出することにより、組織学的試験を行った。器官をホルマリン中に固定し、パラフィンに埋め込み、ミクロトームを用いて厚さ６ミクロンに切片化した。次いで、これらの切片をヘマトキシリン／エオシンで染色した。
【００８４】
ラットにおけるＡｄ−ＳＦＶハイブリッドベクターの毒性試験
ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＩＬ−１２ハイブリッドベクターの投与に関連する毒性を評価するために、異なるベクターの２×１０１１ウイルス粒子で腫瘍内処理したラットの血清において、トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、ＧＰＴおよびＧＧＴＬ）のレベルを測定した（前記参照のこと）。この試験でも、アルファウイルスベクターＳＦＶ−ＩＬ−１２の１０８ウイルス粒子を腫瘍内接種したラット群を用いた（図１１Ａ）。ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＩＬ−１２またはＡＦＰ−ＩＬ−１２アデノウイルスベクターを接種したラットは非常に低いトランスアミナーゼレベルを示し、これらのレベルは生理食塩水を接種した対照動物のレベルと酷似していた。しかしながら、ＳＦＶ−ＩＬ−１２粒子で処理した動物のトランスアミナーゼレベルは、他の群におけるレベルよりも著しく高かった（ｐ＜０．０５）。この試験では、同時点で動物の血清に見られるＩＬ−１２レベルの測定も行った。Ａｄ  ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＩＬ−１２もしくはＡＦＰ−ＩＬ−１２ベクター、または生理食塩水を接種した動物の血清中にＩＬ−１２は検出されなかった（図１１Ｂ）。これは、これらベクター内での導入遺伝子の発現が腫瘍に限定されることを示しており、Ａｄ−ＳＦＶハイブリッドベクターの毒性が非常に低いことを示唆している。しかしながら、ＳＦＶ−ＩＬ−１２ウイルス粒子での処理は、短時間の後にＩＬ−１２の高い血清レベル、即ち、肝臓毒性を生じ得る状況を誘発した。最後に、前述と同じベクターで、且つ同じ用量で腫瘍内処理したラットから得られた、ヘマトキシリン／エオシンで染色した肝臓切片の組織学的分析を行うことによって、毒性試験を完了させた（図１２）。この試験は、生理食塩水を注射したラットと、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＩＬ−１２またはＡＦＰ−ＩＬ−１２アデノウイルスベクターを注射したラットとの間には何ら組織学的差異が見られなかったことを示していた。しかしながら、ＳＦＶ−ＩＬ−１２ウイルス粒子で処理したラットの肝臓切片において、エオシン好性の肝細胞だけでなく、これら肝細胞の融合物を有する領域が観察された。これは、ある程度の毒性があることを示している（黒矢印、図１２Ｄ）。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１（Ａ）は、本発明の実施態様によるハイブリッドベクターＡｄ−ＳＦＶのダイアグラムであり、このハイブリッドベクターＡｄ−ＳＦＶは、ＡＦＰプロモーター／エンハンサー（ＡＦＰ（ｐ＋ｅ））の制御下においてＳＦＶレプリコンが挿入された弱いアデノウイルス配列を含有し、且つＳＦＶサブゲノムプロモーター（Ｐｒ  ｓｇ）の制御下に置かれる異種ｍＩＬ−１２遺伝子を含有している。図１（Ｂ）は、本発明によるハイブリッドベクターの抗腫瘍活性を示しており、このハイブリッドベクターによるＨＣＣ腫瘍細胞の感染（右）の後、ハイブリッドベクター内のｍＩＬ−１２を含むＳＦＶレプリコンの存在に起因してｍＩＬ−１２が高レベルに発現し、感染部位における免疫細胞が活性化される。ＳＦＶの複製は更に感染細胞のアポトーシスを誘発する。しかしながら、このハイブリッドベクターが非腫瘍細胞に感染した場合には、ＳＦＶレプリコンのｍＲＮＡは転写されず、結果としてトランスジェニック発現もアポトーシスもない。この図では、−ＩＴＲ、アデノウイルス逆方向末端反復配列；−Ψ、アデノウイルスパッケージシグナル；−ＨＰＲＴおよびＣ３４６、ヒトゲノムヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼのイントロン領域からの、またはヒトコスミドＣ３４６からのスタッファＤＮＡ配列；−ＰｏｌｙＡ、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０のもの）；−ＡＰＣ、抗原提示細胞。
【図２】図２は、弱いアデノウイルスハイブリッドベクターおよび弱いアデノウイルスベクターの構造を示している。ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺおよびＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２はハイブリッドアデノウイルスベクターであり、ＳＦＶレプリコン配列がＡＦＰプロモーター／エンハンサー（ＡＦＰ（ｐ＋ｅ））の制御下にあり、異種遺伝子ＬａｃＺまたはｍＩＬ−１２が、ＳＦＶサブゲノムプロモーター（Ｐｒ  ｓｇ）の制御下でそれぞれクローニングされている。ＡＦＰ−ｌａｃＺおよびＡＦＰ−ｍＩＬ−１２は、ＡＦＰ（ｐ＋ｅ）によって直接制御されるＬａｃＺまたはｍＩＬ−１２を含有するアデノウイルスベクターである。ＳＦＶ  ｎｓｐ１−４は、ＳＦＶの非構造タンパク質である。
【図３】図３は、Ａｄ−ＳＦＶのハイブリッドベクター：ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２（ＡＦＰ−１２）、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２（ＡＦＰ−ＳＦＶ−１２）による、または対照ベクターＡｄＣＭＶｍＩＬ−１２（ＣＭＶ−１２）による感染後、ＡＦＰを発現する悪性肝癌細胞ＨＣＣにおける（Ａ）、および非ＨＣＣ由来細胞における（Ｂ）、ｍＩＬ−１２のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特異的発現を示している。異なる複数の感染「ｍｏｉ」を試験した（１０、１００および１０００）。Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ−７、ＨｅｐＧ２およびＰＬＣ／ＰＲＦ／５：ＨＣＣ細胞系；Ｈｅｌａ、Ａ５４９、ＭＨＣ１、ＳＫ−Ｈｅｐ−１およびＣｌｏｎ９：非ＨＣＣ由来細胞系。図３Ｂのみがｍｏｉ１０００に相当する発現を示している。
【図４】図４は、異なる「ｍｏｉ」（１０、１００または１０００）でのハイブリッドベクターＡＦＰ−ＳＦＶ−ｌａｃＺによる、または対照ベクターＡＦＰ−ＬａｃＺによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染後、４種のＨＣＣ細胞系（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ−７、ＨｅｐＧ２およびＰＬＣ／ＰＲＦ／５）におけるβ−ｇａｌの特異的発現を示している。
【図５】図５は、ＡＦＰ−ＬａｃＺおよびＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺに感染させたＨＣＣ細胞系でのβ−ｇａｌの発現の分析を示している。ＡＦＰ−ＬａｃＺ（Ａ−Ｃ）またはＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺ（Ｄ−Ｆ）に感染させ、Ｘ−Ｇａｌで染色した細胞の顕微鏡写真。ＡおよびＤ、Ｈｅｐ３Ｂ；ＢおよびＥ、Ｈｕｈ７；ＣおよびＦ、ＨｅｐＧ２。
【図６】図６は、「ｍｏｉ」１０００にてアデノウイルスベクターＡＦＰ−ｍＩＬ−１２（ＡＦＰ−１２）またはＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２（ＡＦＰ−ＳＦＶ−１２）にｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染させたＨＣＣ細胞系Ｈｅｐ３Ｂ（Ａ）およびＨｕｈ−７（Ｂ）におけるＩＬ−１２の発現動態を示している。
【図７】図７は、ベクターＡＦＰ−ＩＬ−１２（ＡＦＰ−１２）、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＩＬ−１２（ＡＦＰ−ＳＦＶ−１２）、ＡＦＰ−ＬａｃＺ、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺ、または対照ベクターＡｄ／ＣＭＶｍＩＬ−１２（ＣＭＶ−１２）をＨＣＣ細胞系−Ｈｅｐ３Ｂ（Ａ）およびＭｃＡ−ＲＨ７７７７（Ｂ）−にｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染させた後の細胞死の誘発を示している。細胞の生存率は、感染していない対照ウェル内の生きた細胞に対する、感染ウェル内の生きた細胞の百分率として示されている。
【図８】図８は、ベクターＡＦＰ−ｍＩＬ−１２（ＡおよびＢ）またはＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２（Ｃ−Ｆ）を「ｍｏｉ」１０００で感染させた後の、ＨＣＣ細胞−Ｈｅｐ３B（Ａ−Ｄ）およびＨｕｈ−７（ＥおよびＦ）−におけるＳＦＶ  Ｒｅｐの発現を示している。感染から２日後、細胞を固定し、Ｒｅｐに対する特異的抗体を用いた免疫蛍光法により分析した。Ｒｅｐを発現する細胞を、ＦＩＴＣフィルタを備えた蛍光顕微鏡下で視覚化し（Ａ、ＣおよびＥ）、全細胞中のＤＡＰＩで染色した核をＵＶフィルタで視覚化した（Ｂ、ＤおよびＦ）。
【図９】図９は、弱いハイブリッドベクターによるｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子導入（Ａ−Ｄ）、遺伝子導入効率およびＨｕｈ−７腫瘍におけるアポトーシスの誘発を示している。ヌード免疫不全マウス内に確立されたヒトＨｕｈ−７腫瘍は、１×１０１０のウイルス粒子／動物にて、ベクターＡＦＰ−ＬａｃＺ（ｎ＝４）またはＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺ（ｎ＝４）の腫瘍内注射を通じて処理した。ウイルス投与から３日後、マウスを殺し、腫瘍切片を分析し、Ｘ−Ｇａｌを用いた染色により導入遺伝子発現を検査するか（Ａ−Ｂ）、またはＴＵＮＥＬによりアポトーシスの誘発を検査した（Ｃ−Ｄ）。Ａ、Ｃ；ＡＦＰ−ＬａｃＺを受容した腫瘍の顕微鏡写真。Ｂ、Ｄ；ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺを受容した腫瘍の顕微鏡写真。（Ｅ−Ｇ）、弱いハイブリッドベクターによる遺伝子発現の特異性。健康なＢａｌｂ／ｃマウスに、ベクターＡＦＰ−ＬａｃＺ（Ｅ）、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＬａｃＺ（Ｆ）またはＡｄ／ＣＭＶ−ＬａｃＺ（Ｇ）の１×１０１０ウイルス粒子を静脈内注射した。接種してから３日後に採取し、Ｘ−Ｇａｌで染色した肝組織切片の顕微鏡写真が示されている。
【図１０−１】図１０は、ハイブリッドベクターでのＨＣＣ腫瘍の処理を示している。ラット肝臓にＭｃＨ−ＲＨ７７７７細胞を移植することにより、同所性ＨＣＣ腫瘍を確立した。腫瘍が直径７ｍｍ〜１０ｍｍの大きさに達したら、ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２の１０１１（Ａ−Ｃ）もしくは２×１０１１（Ｄ−Ｇ）ウイルス粒子で、または対照として生理食塩水で動物を処理した。腫瘍の大きさは、生理食塩水（ＡおよびＥ）、ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２（ＢおよびＦ）またはＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２（ＣおよびＧ）の投与後１５日目および３０日目に測定した。Ｇ；動物生存率。
【図１０−２】図１０は、ハイブリッドベクターでのＨＣＣ腫瘍の処理を示している。ラット肝臓にＭｃＨ−ＲＨ７７７７細胞を移植することにより、同所性ＨＣＣ腫瘍を確立した。腫瘍が直径７ｍｍ〜１０ｍｍの大きさに達したら、ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２の１０１１（Ａ−Ｃ）もしくは２×１０１１（Ｄ−Ｇ）ウイルス粒子で、または対照として生理食塩水で動物を処理した。腫瘍の大きさは、生理食塩水（ＡおよびＥ）、ＡＦＰ−ｍＩＬ−１２（ＢおよびＦ）またはＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２（ＣおよびＧ）の投与後１５日目および３０日目に測定した。Ｇ；動物生存率。
【図１１Ａ】図１１は、ＩＬ−１２を発現するベクターを接種したラットにおける毒性試験を示している。トランスアミナーゼ（ＧＰＴ、ＧＯＬＴおよびＧＧＴＬ）（Ａ）またはＩＬ−１２（Ｂ）のレベルを、肝臓にＨＣＣ腫瘍を担持し、且つアデノウイルスベクターＡＦＰ−ＳＦＶ−ＩＬ−１２、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２、アルファウイルスベクターＳＦＶ−ＩＬ−１２、または生理食塩水を腫瘍内に接種されたラットの血清において測定した。測定は、処理から４日後および８日後に行った。
【図１１Ｂ】図１１は、ＩＬ−１２を発現するベクターを接種したラットにおける毒性試験を示している。トランスアミナーゼ（ＧＰＴ、ＧＯＬＴおよびＧＧＴＬ）（Ａ）またはＩＬ−１２（Ｂ）のレベルを、肝臓にＨＣＣ腫瘍を担持し、且つアデノウイルスベクターＡＦＰ−ＳＦＶ−ＩＬ−１２、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ｍＩＬ−１２、アルファウイルスベクターＳＦＶ−ＩＬ−１２、または生理食塩水を腫瘍内に接種されたラットの血清において測定した。測定は、処理から４日後および８日後に行った。
【図１２】図１２は、アデノウイルスハイブリッドベクターで処理したラットの肝臓切片の、ヘマトキシリン／エオシンでの染色を示している。ＨＣＣ腫瘍を担持するラットを、生理食塩水（Ａ）、アデノウイルスベクターＡＦＰ−ＩＬ−１２（Ｂ）、ＡＦＰ−ＳＦＶ−ＩＬ−１２（Ｃ）、またはＳＦＶ−ＩＬ−１２（Ｄ）のウイルス粒子の腫瘍内注射により処理した。処理から３日後、動物を殺し、その肝臓を取り出し、ホルマリンで固定し、切片を得て、ヘマトキシリン／エオシンで染色した。黒い矢印は、エオシン好性の肝細胞を有する領域を示している。
【図１３】図１３Ａおよび図１３Ｂは、プラスミドｐＧＬ３／ＡＦＰおよびｐＢＳ／ｍＩＬ−１２それぞれの制限マップを示している。
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、プラスミドｐＴＧＣ３００１およびｐＴＧＣ３０１１それぞれの制限マップを示している。
【図１５】図１５Ａおよび図１５Ｂは、プラスミドｐＴＧＣ３０１２およびｐＴＧＣ３０１３それぞれの制限マップを示している。
【図１６】図１６は、プラスミドｐＴＧＣ３０１４の制限マップを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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