(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つのＧＡＢＡＢＲ１ａサブユニットおよび少なくとも１つのＧＡＢＡＢＲ２サブユニットを含んでなり、該ＧＡＢＡＢ受容体が１つの高親和性アゴニスト結合部位および１つの低親和性アゴニスト結合部位を有することを特徴とする単離されたＧＡＢＡＢ受容体タンパク質を提供する。特に、受託番号ＬＭＢＰ  ６０４６ＣＢで２００３年８月２２日にＣＨＯ−Ｋ１  ｈ−ＧＡＢＡ−ｂ  Ｒ１ａ／Ｒ２クローンとしてＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託されたｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系により発現される単離された組み換えＧＡＢＡＢ受容体タンパク質。従って、受託番号ＬＭＢＰ  ６０４６ＣＢで２００３年８月２２日にＣＨＯ−Ｋ１  ｈ−ＧＡＢＡ−ｂ  Ｒ１ａ／Ｒ２クローンとしてＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託されたｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系を提供することが本発明の目的である。本発明はまた、機能もしくは結合アッセイを用いてＧＡＢＡＢ受容体アゴニストを同定する方法における上記の細胞系の使用も提供する。特に、例えば３Ｈ−ＧＡＢＡもしくは３Ｈ−バクロフェンのような放射性標識アゴニストの使用を含んでなる放射性リガンド結合アッセイにおける。特定の態様として、本発明は機能もしくは結合アッセイを用いて高親和性ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストを同定する方法における上記のＧＡＢＡＢ受容体の使用を提供する。特に、例えば３Ｈ−ＧＡＢＡもしくは３Ｈ−バクロフェンのような放射性標識アゴニストの使用を含んでなる放射性リガンド結合アッセイにおける。あるいはまた、上記の結合アッセイは、細胞抽出物、特に上記の細胞の細胞膜調製物上で行われる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＧＡＢＡＢＲ１ａサブユニットおよび少なくとも１つのＧＡＢＡＢＲ２サブユニットを含んでなり、該ＧＡＢＡＢ受容体が１つの高親和性アゴニスト結合部位および１つの低親和性アゴニスト結合部位を有することを特徴とする単離されたＧＡＢＡＢ受容体タンパク質。
【請求項２】
ＧＡＢＡＢＲ１ａサブユニットが配列番号１からなるオリゴヌクレオチド配列によりコードされ、そしてＧＡＢＡＢＲ２サブユニットが配列番号３からなるオリゴヌクレオチド配列によりコードされる請求項１に記載のＧＡＢＡＢ受容体タンパク質。
【請求項３】
該受容体タンパク質が、受託番号ＬＭＢＰ  ６０４６ＣＢで２００３年８月２２日にＣＨＯ−Ｋ１  ｈ−ＧＡＢＡ−ｂ  Ｒ１ａ／Ｒ２クローン２０としてＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託されたｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系により発現される請求項１もしくは２に記載のＧＡＢＡＢ受容体タンパク質。
【請求項４】
ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストもしくはアンタゴニストを同定する方法における請求項１〜３のいずれか１つに記載のＧＡＢＡＢ受容体タンパク質の使用。
【請求項５】
受託番号ＬＭＢＰ  ６０４６ＣＢで２００３年８月２２日にＣＨＯ−Ｋ１  ｈ−ＧＡＢＡ−ｂ  Ｒ１ａ／Ｒ２クローンとしてＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託されたｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系。
【請求項６】
ａ）機能性ＧＡＢＡＢ受容体を発現する細胞（ここで、そのような細胞は通常はＧＡＢＡＢ受容体を発現しない）をＧＡＢＡＢ受容体に結合することが知られている化合物の存在もしくは不在下に試験化合物と接触させること、および
ｂ）対照としてＧＡＢＡＢ受容体に結合することが知られている化合物を用いてＧＡＢＡＢ受容体への試験化合物の結合を決定すること
を含んでなる、試験化合物が請求項１〜３のいずれか１つに記載のＧＡＢＡＢ受容体タンパク質に結合し、従って、ＧＡＢＡＢ受容体の潜在的（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）アゴニストもしくはアンタゴニストであるかどうかを同定する方法。
【請求項７】
ＧＡＢＡＢ受容体に結合することが知られている化合物が検出可能に標識され、そして該標識がＧＡＢＡＢ受容体への試験化合物の結合を決定するために用いられる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＧＡＢＡＢ受容体に結合することが知られている化合物が、３Ｈ−ＧＡＢＡ、３Ｈ−バクロフェン、３Ｈ−３−ＡＰＰＡ、３Ｈ−ＣＧＰ５４２６２６および３Ｈ−ＳＣＨ５０９１１よりなる群から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ａ）機能性ＧＡＢＡＢ受容体を発現する細胞（ここで、そのような細胞は通常はＧＡＢＡＢ受容体を発現しない）を試験化合物の存在もしくは不在下にＧＡＢＡＢの標識アゴニストにさらすこと、および
ｂ）該細胞への標識アゴニストの結合を決定すること
ここで、標識アゴニストの結合の量が試験化合物の存在下で少ない場合には、該化合物はＧＡＢＡＢ受容体の潜在的アゴニストである、
を含んでなるＧＡＢＡＢ受容体アゴニストの同定方法。
【請求項１０】
標識アゴニストが３Ｈ−ＧＡＢＡ、３Ｈ−バクロフェンおよび３Ｈ−３−ＡＰＰＡよりなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ａ）機能性ＧＡＢＡＢ受容体を発現する細胞（ここで、そのような細胞は通常はＧＡＢＡＢ受容体を発現しない）を試験化合物の存在もしくは不在下にＧＡＢＡＢの標識アンタゴニストにさらすこと、および
ｂ）該細胞への標識アンタゴニストの結合を決定すること
ここで、標識アンタゴニストの結合の量が試験化合物の存在下で少ない場合には、該化合物はＧＡＢＡＢ受容体の潜在的アンタゴニストである、
を含んでなるＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストの同定方法。
【請求項１２】
標識アンタゴニストが３Ｈ−ＣＧＰ５４２６２６および３Ｈ−ＳＣＨ５０９１１よりなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）検出可能に標識されたＧＡＢＡＢ受容体アゴニストの存在下に請求項５に記載の細胞の細胞組成物に化合物を投与すること；および
ｂ）該細胞組成物への標識アゴニストの結合を決定すること
ここで、標識アゴニストの結合の量が試験化合物の存在下で少ない場合には、該化合物はＧＡＢＡＢ受容体の潜在的アゴニストである、
を含んでなるＧＡＢＡＢ受容体アゴニストとして化合物を同定する方法。
【請求項１４】
細胞組成物が請求項５に記載の細胞の膜画分からなる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標識アゴニストが３Ｈ−ＧＡＢＡ、３Ｈ−バクロフェンおよび３Ｈ−３−ＡＰＰＡよりなる群から選択される請求項１３もしくは１４に記載の方法。
【請求項１６】
ａ）検出可能に標識されたＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストの存在下に請求項５に記載の細胞の細胞組成物に化合物を投与すること；および
ｂ）該細胞組成物への標識アンタゴニストの結合を決定すること
ここで、標識アンタゴニストの結合の量が試験化合物の存在下で少ない場合には、該化合物はＧＡＢＡＢ受容体の潜在的アンタゴニストである、
を含んでなるＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストとして化合物を同定する方法。
【請求項１７】
細胞組成物が請求項５に記載の細胞の膜画分からなる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標識アンタゴニストが３Ｈ−ＣＧＰ５４２６２６および３Ｈ−ＳＣＨ５０９１１よりなる群から選択される請求項１６もしくは１７に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）ＧＡＢＡＢ受容体の活性化を可能にする条件下に、機能性ＧＡＢＡＢ受容体を発現する細胞（ここで、該細胞は通常は機能性ＧＡＢＡＢ受容体を発現しない）を少なくとも１つの対照化合物と接触させること；
ｂ）ＧＡＢＡＢ受容体の活性化を可能にする条件下に、段階ａ）の細胞を試験化合物と接触させること、および
ｃ）該試験化合物が対照化合物と比較してＧＡＢＡＢ受容体活性を調節するかどうかを決定すること
を含んでなるＧＡＢＡＢ受容体活性を調節する能力を有する化合物の同定方法。
【請求項２０】
ＧＡＢＡＢ受容体活性を調節する試験化合物の能力が、カリウム電流の変化、カルシウム濃度の変化、ｃＡＭＰの変化およびＧＴＰγＳ結合の変化よりなる群から選択される機能的応答の１つもしくはそれ以上を用いて決定される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ａ）ＧＡＢＡＢ受容体の活性化を可能にする条件下に、請求項５に記載の細胞の膜画分を放射性標識ＧＴＰγＳの存在下に試験すべき化合物と接触させること；および
ｂ）膜画分へのＧＴＰγＳ結合を決定すること
ここで、化合物の存在下でのＧＴＰγＳ結合の増加は、該化合物がＧＡＢＡＢ受容体活性を活性化することの指標となる、
を含んでなるＧＡＢＡＢ受容体活性を調節する能力を有する化合物の同定方法。
【請求項２２】
ａ）ＧＡＢＡＢ受容体の活性化を可能にする条件下に、請求項５に記載の細胞の膜画分を放射性標識ＧＴＰγＳの存在下に試験すべき化合物と接触させること；および
ｂ）膜画分へのＧＴＰγＳ結合を決定すること
ここで、化合物の存在下でのＧＴＰγＳ結合の減少は、該化合物がＧＡＢＡＢ受容体活性を不活性化することの指標となる、
を含んでなるＧＡＢＡＢ受容体活性を調節する能力を有する化合物の同定方法。
【請求項２３】
ＧＡＢＡＢ受容体の活性化を可能にする条件がＧＡＢＡＢ受容体アゴニストの存在を含んでなる請求項２１もしくは２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストがＧＡＢＡ、バクロフェンおよび３−ＡＰＰＡよりなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
スティッフマン症候群、胃食道逆流、神経障害性疼痛、失禁ならびに咳およびコカイン嗜癖の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｕｇｈ  ａｎｄ  ｃｏｃａｉｎｅ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）のような適応症の処置のための薬剤の製造における式（Ｉ）
【化１】
2007535480.tif 000018
［式中；
＝Ｚ１−Ｚ２＝Ｚ３−Ｚ４＝は、＝Ｎ−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ＝（ａ）、＝Ｎ−ＣＨ＝Ｎ−ＣＨ＝（ｂ）、＝ＣＨ−Ｎ＝ＣＨ−Ｎ＝（ｃ）、＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝（ｄ）、＝Ｎ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝（ｅ）、＝ＣＨ−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ＝（ｆ）、＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｎ−ＣＨ＝（ｇ）および＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ＝（ｈ）よりなる群から選択される２価の基を表し；
Ｒ１は水素、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１〜６アルキル、ＣＦ３、アミノまたはモノ−もしくはジ（Ｃ１〜４アルキル）アミノを表し；
Ｒ２は水素、Ｃ１〜６アルキルもしくはヒドロキシカルボニル−Ｃ１〜６アルキル−を表す］
の化合物、そのＮ−オキシド形態、製薬学的に許容しうる付加塩および立体化学的異性体の使用。
【請求項２６】
一過性下部食道括約筋弛緩（ＴＬＥＳＲ）を減少させるための薬剤の製造における式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項２７】
＝Ｚ１−Ｚ２＝Ｚ３−Ｚ４＝が（ａ）、（ｂ）もしくは（ｄ）を表す式（Ｉ）の化合物、より好ましくは、＝Ｚ１−Ｚ２＝Ｚ３−Ｚ４＝が（ｄ）を表す式（Ｉ）の化合物。
【請求項２８】
薬剤としての使用のための請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
一過性下部食道括約筋弛緩（ＴＬＥＳＲ）を減少させるための薬剤の製造における請求項２７に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換えＧＡＢＡＢＲ１ａ／Ｒ２受容体発現細胞における３Ｈ−ＧＡＢＡ結合アッセイを用いて、ＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストである物質を同定する新規な方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＡＢＡ（γ−アミノ−酪酸）は、２つの異なった受容体ファミリー：急速なシナプス伝達のためのイオンチャンネル型ＧＡＢＡＡおよびＧＡＢＡＣ受容体、ならびにより緩やかなシナプス伝達を支配する代謝調節型ＧＡＢＡＢ受容体を活性化する中枢神経系（ＣＮＳ）における最も広く分布しているアミノ酸抑制性神経伝達物質である。
【０００３】
ＧＡＢＡＢ受容体は、ニューロンのＫ＋もしくはＣａ２＋チャンネルと共役している７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体のスーパーファミリーのメンバーである。シナプス前ＧＡＢＡＢ受容体活性化は、一般に、Ｃａ２＋コンダクタンスの抑制をもたらし、神経伝達物質の誘発放出の減少につながることが報告されている。シナプス後でＧＡＢＡＢ受容体活性化の主要な影響は、カリウムチャンネルを開いて、シナプス後抑制電位を生成することである。
【０００４】
ＧＡＢＡＢ受容体の発現は、小脳分子層、脚間核、前頭皮質、嗅核、視床核、側頭皮質、大縫線および脊髄において特に高レベルで、哺乳類の神経軸（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｘｉｓ）に広く分布している。ＧＡＢＡＢ受容体はまた、感覚神経上および副交感神経上の両方で、末梢神経系にも存在する。これらの神経を調節するそれらの能力は、肺、胃腸管および膀胱の疾患における標的としての可能性をそれらに与える（非特許文献１）。
【０００５】
例えば、無痛覚、低体温、緊張病、低血圧、記憶の固定および保持の減少、ならびにインシュリン、成長ホルモンおよびグルカゴン放出の刺激のような、多数の薬理活性がＧＡＢＡＢ受容体活性化に起因している（総説には非特許文献２を参照）。ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストおよびアンタゴニストは、スティッフマン症候群、胃食道逆流、神経障害性疼痛、失禁ならびに咳およびコカイン嗜癖の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｕｇｈ
ａｎｄ  ｃｏｃａｉｎｅ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）のような適応症において薬理学的に有用であることは十分に認められている。例えば、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストのバクロフェンは、一過性下部食道括約筋弛緩（ＴＬＥＳＲ）を減少することが示されており、そして逆流の大部分のエピソードはＴＬＥＳＲ中に起こるので、従って、逆流の処置において有用である。しかしながら、バクロフェンのような現在のＧＡＢＡＢ受容体アゴニストは比較的非選択的であり、そして鎮静および呼吸抑制のような様々な望ましくない行動作用を示す。改善された選択性を有しそして上記の望ましくない作用の少ない追加のＧＡＢＡＢ受容体アゴニストを開発することが望ましい。
【０００６】
薬剤開発の現在の方法は、一般に、特定の標的に対する所望の活性を有する少数の化合物を同定するために何万もしくは何十万の化合物の生物学的活性を評価すること、すなわち、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を含む。典型的なＨＴＳ関連スクリーニング形式において、アッセイは９６、３８４もしくは１５３６ウェルプレートのようなマルチウェルマイクロプレートにおいて行われ、原料物質（すなわち、組み換えＧＡＢＡＢ受容体を発現する細胞の膜調製物）の入手可能性を包含する実施するアッセイの設定にある種の制約を加える。ＨＴＳ関連スクリーニングは、好ましくは、再現可能なそして信頼性のあるアウトプットで、短いサイクル時間を必要とする、アッセイにおける試験する化合物の各々の単一の測定で室温で行われる。
【０００７】
ＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストとして化合物を同定するための現在のインビトロスクリーニングは、ラット脳膜における結合アッセイのような天然のあまり豊富でない資源に依存するかもしくは例えば組み換えＧＡＢＡＢ受容体を発現する細胞において行われるＣａ２＋応答、ｃ−ＡＭＰ応答ならびにＣａ２＋およびＫ＋チャンネルへの影響のような機能スクリーニングアッセイからなるいずれかである。これらの機能アッセイのあるものにおいて、ＧＡＢＡＢ受容体はＧタンパク質、例えばＧα１６もしくはＧｑｉ５またはキメラＧタンパク質Ｇαｑ−ｚ５と共発現され、Ｇタンパク質共役を増加することができる（非特許文献３）。しかしながら、ＨＴＳサイクル時間および組み換えタンパク質のような生物化学物質の資源をさらに減少するＧＡＢＡＢアゴニスト結合アッセイは、現在利用できない。
【０００８】
本発明は、放射性リガンド結合実験においてアゴニスト結合を示すことが意外にも見出された、ヒトＧＡＢＡＢ受容体サブユニットＧＡＢＡＢＲ１ａおよびＧＡＢＡＢＲ２を共発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系の開発を記述する。さらに、本発明は、ｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系が、組み換え発現されたＧＡＢＡＢ受容体において１つの高親和性および１つの低親和性アゴニスト結合部位を有することを示した。従って、本発明により提供されるｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系は、化合物スクリーニングを可能にするだけではなく、化合物−受容体相互作用の性質を特性化するための有用な手段も提供する。
【非特許文献１】Ｂｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７：２６９７−２７０４
【非特許文献２】Ｂｏｗｅｒｙ，１９８９，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１０：４０１−４０７
【非特許文献３】Ｂｒａｅｕｎｅｒ−Ｏｓｂｏｒｎｅ  ＆  Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２８：１３７０−１３７４
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
本発明は、少なくとも１つのＧＡＢＡＢＲ１ａサブユニットおよび少なくとも１つのＧＡＢＡＢＲ２サブユニットを含んでなり、該ＧＡＢＡＢ受容体が１つの高親和性アゴニスト結合部位および１つの低親和性アゴニスト結合部位を有することを特徴とする単離されたＧＡＢＡＢ受容体タンパク質を提供する。特に、受託番号ＬＭＢＰ  ６０４６ＣＢで２００３年８月２２日にＣＨＯ−Ｋ１  ｈ−ＧＡＢＡ−ｂ  Ｒ１ａ／Ｒ２クローンとしてＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託されたｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系により発現される単離された組み換えＧＡＢＡＢ受容体タンパク質。従って、受託番号ＬＭＢＰ  ６０４６ＣＢで２００３年８月２２日にＣＨＯ−Ｋ１  ｈ−ＧＡＢＡ−ｂ  Ｒ１ａ／Ｒ２クローンとしてＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託されたｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系を提供することが本発明の目的である。
【００１０】
本発明はまた、機能もしくは結合アッセイを用いてＧＡＢＡＢ受容体アゴニストを同定する方法における上記の細胞系の使用も提供する。特に、例えば３Ｈ−ＧＡＢＡもしくは３Ｈ−バクロフェンのような放射性標識アゴニストの使用を含んでなる放射性リガンド結合アッセイにおける。
【００１１】
本発明はさらに、上記の細胞系を試験化合物と接触させることおよびＧＡＢＡＢ受容体への該試験化合物の結合を測定することを含んでなる、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストの同定方法を提供する。特に、該方法は、上記の細胞を試験化合物の存在もしくは不在下にＧ
ＡＢＡＢの標識アゴニストにさらすことおよび本発明の細胞への標識リガンドの結合を測定すること、ここで、標識リガンドの結合の量が試験化合物の存在下で少ない場合には、該化合物はＧＡＢＡＢ受容体の潜在的（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）アゴニストである、を含んでなる、放射性リガンド結合アッセイからなる。
【００１２】
高親和性ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストの同定方法を提供することもまた本発明の目的であり、該方法は、上記の細胞を試験化合物の存在もしくは不在下にＧＡＢＡ、バクロフェンおよび３−アミノプロピルホスフィン酸（３−ＡＰＰＡ  別名ＡＰＭＰＡ）よりなる群から選択される放射性標識アゴニストと接触させることおよび本発明の細胞への標識リガンドの結合を測定すること、ここで、高親和性結合部位への標識リガンドの結合の量が試験化合物の存在下で少ない場合には、該化合物はＧＡＢＡＢ受容体の潜在的高親和性アゴニストである、を含んでなる。
【００１３】
あるいはまた、上記の結合アッセイは細胞抽出物、特に受託番号ＬＭＢＰ  ６０４６ＣＢで２００３年８月２２日にＣＨＯ−Ｋ１  ｈ−ＧＡＢＡ−ｂ  Ｒ１ａ／Ｒ２クローンとしてＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託されたｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２
ＣＨＯ細胞系の細胞膜調製物上で行われる。
【００１４】
別の態様として、本発明は、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストの同定方法を提供し、該方法は、試験する化合物と上記の細胞系を接触させることおよび該化合物が該細胞におけるＧＡＢＡＢ受容体の機能的応答を活性化するかどうかを決定することを含んでなる。特に、機能的応答は、以下に説明するようなイオンチャンネルのもしくは細胞内メッセンジャーの活性の調節からなる。
【００１５】
本発明のこのおよびさらなる態様を以下にさらに詳細に説明する。
［発明の詳細な記述］
本発明を記述する目的のために：ＧＡＢＡＢＲ１ａもしくはｈＧＡＢＡＢＲ１ａは、本明細書において用いる場合、Ｋａｕｐｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４９９１−１４９９６においてＧＡＢＡＢＲ１ａとして知られているヒトＧＡＢＡＢ受容体サブユニット（そのアミノ酸配列（配列番号：２）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２８で見出されることができる）ならびにその哺乳類相同分子種をさす。ＧＡＢＡＢＲ１ａはまた、上記のものからのアミノ酸配列のわずかな変化を有する他のＧＡＢＡＢ受容体サブユニットもさし、ただし、これらの他のＧＡＢＡＢ受容体サブユニットは、上記のサブユニットと実質的に同じ生物学的活性を有する。ＧＡＢＡＢＲ１ａサブユニットは、それが配列番号：２に少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも９５％同一である、より好ましくは少なくとも９７％同一である、そして最も好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有しそしてＧＡＢＡ、例えばバクロフェンおよびガバペンチンのようなＧＡＢＡＢ受容体アゴニストもしくは例えばＣＧＰ５４６２６Ａ、ＳＣＨ５０９１１、サクロフェンおよびファクロフェンのようなＧＡＢＡＢ受容体アンタゴストについての天然のＧＡＢＡＢ受容体のＫｄもしくはＥＣ５０より５倍以下大きい、ＧＡＢＡまたは同じＧＡＢＡＢ受容体アゴニストもしくはＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストについてのＫｄもしくはＥＣ５０を有する場合に実質的に同じ生物学的活性を有する。
【００１６】
ＧＡＢＡＢＲ２は、本明細書において用いる場合、Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３９６：６７９−６８２においてＧＡＢＡＢＲ２として知られているヒトＧＡＢＡＢ受容体サブユニット（そのアミノ酸配列（配列番号：４）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５８７９５で見出されることができる）ならびにその哺乳類相同分子種をさす。ＧＡＢＡＢＲ２はまた、上記のものからのアミノ酸配列のわずかな変化を有する他のＧＡＢＡＢ受容体サブユニットもさし、ただし、これらの他のＧＡＢＡＢ受容体サブユニットは、上記のサブユニットと実質的に同じ生物学的活性を有する。ＧＡＢＡＢＲ２サブユニットは、それが配列番号：４に少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも９５％同一である、より好ましくは少なくとも９７％同一である、そして最も好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有しそしてＧＡＢＡ、例えばバクロフェンおよびガバペンチンのようなＧＡＢＡＢ受容体アゴニストもしくは例えばＣＧＰ５４６２６Ａ、ＳＣＨ５０９１１、サクロフェンおよびファクロフェンのようなＧＡＢＡＢ受容体アンタゴストについての天然のＧＡＢＡＢ受容体のＫｄもしくはＥＣ５０より５倍以下大きい、ＧＡＢＡまたは同じＧＡＢＡＢ受容体アゴニストもしくはＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストについてのＫｄもしくはＥＣ５０をＧＡＢＡＢＲ１サブユニットと組み合わせて有する場合に実質的に同じ生物学的活性を有する。
【００１７】
天然のＧＡＢＡＢ受容体のＫｄおよびＥＣ５０値は、当業者に知られている方法を用いて、特に例えばＣｒｏｓｓ  ＆  Ｈｏｒｔｏｎ，１９８７  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４１（１）：１５９−１６２に記述されているような組織調製物上での競合結合研究を用いて決定される。簡潔に言えば、粗シナプス膜を全脳の均質化、遠心分離（３００００ｘｇ、２０分）および徹底的な洗浄により調製する。全結合は３Ｈ−ＧＡＢＡもしくは３Ｈ−バクロフェンと膜とのインキュベーションにより測定され、一方、非特異的結合は１００μＭのバクロフェンの存在下で測定される。濾過により結合していないリガンドを除去して、フィルターをβ−カウンターもしくはＴｏｐｃｏｕｎｔ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐａｃｋｈａｒｄ）において計数する。競合実験では、結合は増加する濃度の非標識化合物の存在下で行われる。
【００１８】
従って、該単離されたＧＡＢＡＢ受容体が高親和性および低親和性アゴニスト結合部位の両方を有することをさらに特徴とする、少なくとも１つのＧＡＢＡＢＲ１ａおよび少なくとも１つのＧＡＢＡＢＲ２サブユニットにより形成される単離されたＧＡＢＡＢ受容体タンパク質を提供することは本発明の目的である。さらなる態様として、この単離されたＧＡＢＡＢ受容体は、細胞により発現される機能性ＧＡＢＡＢ受容体であり、ここで、該細胞は通常はＧＡＢＡＢ受容体を発現しない。市販されている適当な細胞には、Ｌ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＭＲＣ細胞、特にＣＨＯ細胞が包含されるがこれらに限定されるものではなく、ここで、ＧＡＢＡＢ受容体タンパク質は配列番号１からなるオリゴヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１つのＧＡＢＡＢＲ１ａサブユニットおよび配列番号３からなるオリゴヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１つのＧＡＢＡＢＲ２サブユニットを含んでなる。さらに特定の態様として、本発明の単離されたＧＡＢＡＢ受容体は、受託番号ＬＭＢＰ  ６０４６ＣＢで２００３年８月２２日にＣＨＯ−Ｋ１  ｈ−ＧＡＢＡ−ｂ  Ｒ１ａ／Ｒ２クローン２０としてＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託されたｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系により発現される受容体タンパク質からなる。
【００１９】
「機能性ＧＡＢＡＢ受容体」は、最も好ましくはＧＡＢＡＢＲ２およびＧＡＢＡＢＲ１ａのヘテロダイマーをもたらす、細胞におけるＧＡＢＡＢＲ２およびＧＡＢＡＢＲ１ａの共発現により形成されるＧＡＢＡＢ受容体をさし（ここで、該細胞は通常はＧＡＢＡＢ受容体を発現しない）、ここで、機能性ＧＡＢＡＢ受容体は、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストＧＡＢＡにさらした場合に少なくとも１つの機能的応答を媒介する。機能的応答の例は：ゼノパスメラニン保有細胞における色素凝集、ｃＡＭＰレベルの負の調節、内向き整流性カリウムチャンネルとの共役、ニューロンにおける後期抑制性シナプス後電位の媒介、カリウムコンダクタンスの増加、カルシウムコンダクタンスの減少、ＭＡＰキナーゼ活性化、細胞外ｐＨ酸性化およびＧタンパク質共役受容体に特有である他の機能的応答である。当業者は、ＧＡＢＡＢ受容体のようなＧタンパク質共役受容体の機能的応答を測定する様々な方法に精通している（例えば、Ｌｅｒｎｅｒ，１９９４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：１４２−１４６［メラニン保有細胞における色素分布の変化］；Ｙｏｋｏｍｉｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：６２０−６２４［ｃＡＭＰもしくはカルシウム濃度の変化；走化性］；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：９７４−９７７［ゼノパス卵母細胞における膜電流の変化］；ＭｃＫｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１：４１５−４２３［エクオリンアッセイを用いて測定されるカルシウム濃度の変化］；Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ  ＆  Ｓｉｍｏｎ，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５１７５−１５１８０［イノシトールリン酸レベルの変化］を参照）。ＧＡＢＡＢＲ１ａおよびＧＡＢＡＢＲ２のヘテロマーが発現される細胞、およびそれ故にそのようにして形成される機能性ＧＡＢＡＢ受容体が共役しているＧタンパク質により、そのような方法のあるものがそのような機能性ＧＡＢＡＢ受容体の機能的応答を測定するために適切であり得る。既定の実験系について機能的応答を測定する適切な方法を選択することは、当業者の能力の十分に範囲内である。
【００２０】
「化合物」、「試験化合物」、「因子」もしくは「候補因子」という用語は、本明細書において用いる場合、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストとしてのそれらの活性について調べることを望む例えばペプチド、ポリヌクレオチドもしくは小分子を包含する任意のタイプの分子であることができ、そしてここで、該因子はそれを受ける被験体に治療利益を与えることができる。候補因子は、例えば経口的または静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、嚢内、腹腔内、直腸内、槽内のような非経口的を包含する様々な経路によりまたはそれぞれ例えば皮膚パッチもしくは経皮イオン導入を用いる皮膚を通した受動的もしくは促進的吸収により個体に投与することができる。さらに、化合物は、注射、挿管もしくは局所的により投与することができ、このうち後者は、例えば軟膏の直接使用により受動的であるか、または例えば鼻スプレーもしくは吸入剤を用いて能動的であることができ、この場合、組成物の１つの成分は適切な推進剤である。化合物の投与の経路は、一つには、化合物の化学構造により決まる。例えば、ペプチドおよびポリヌクレオチドは、消化管において分解されることができるので経口で投与する場合に特に有用ではない。しかしながら、ペプチドを化学的に改変する、例えばそれらを分解を受けにくくする方法は周知であり、そして例えばＤ−アミノ酸の使用、ペプチド模倣物に基づくドメインの使用もしくはビニル性ペプトイドのようなペプトイドの使用が包含される。
【００２１】
スクリーニング方法に使用する因子は、製薬学的に許容しうる担体において用いることができる。例えば、因子の製剤の製造とともに用いることができる典型的な担体および製薬学的組成物を製造する常法を開示しそして本明細書に引用することにより組み込まれる、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐ．Ａ．による、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，最新版を参照。
細胞
上記にすでに概説したように、本発明は、上記に定義するようなＧＡＢＡＢ受容体サブユニットＧＡＢＡＢＲ１ａおよびＧＡＢＡＢＲ２の発現を導く発現ベクターで安定にトランスフェクションされた細胞系を提供する。特に、該発現ベクターでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞。そのような発現ベクターは分子生物学の分野において日常的に構築され、そしてタンパク質発現を可能にするために、必要である可能性がありそして正しい向きに配置される、プラスミドＤＮＡならびに適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他の要素の使用を含むことができる。一般に、ポリヌクレオチドを維持し、増やし、もしくは発現させて宿主においてポリペプチドを生産するために適当な任意の系もしくはベクターを用いることができる。適切なヌクレオチド配列、すなわち、上記に定義するようなヒトＧＡＢＡＢＲ１ａもしくはＧＡＢＡＢＲ２サブユニットのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉ
ｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９７に記載されるもののような様々な周知のそして日常的な技術のいずれかにより発現系に挿入することができる。
【００２２】
特定の態様として、本発明のＣＨＯ細胞は、それぞれヒトＧＡＢＡＢＲ１ａ（配列番号：１）およびヒトＧＡＢＡＢＲ２（配列番号：３）をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる市販されている発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１で共トランスフェクションされる。より好ましくは、本発明は、受託番号ＬＭＢＰ  ６０４６ＣＢで２００３年８月２２日にＣＨＯ−Ｋ１  ｈ−ＧＡＢＡ−ｂ  Ｒ１ａ／Ｒ２クローン２０としてＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託されたｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系を提供する。この細胞系は、このＣＨＯ細胞系における機能性ＧＡＢＡＢ受容体がＧＡＢＡＢ受容体アゴニストの低親和性および高親和性結合部位の両方を有することを特徴とする。本発明の細胞系を用いることは、化合物スクリーニングを可能にするだけではなく、化合物−受容体相互作用、すなわち、それがＧＡＢＡＢ受容体の低親和性もしくは高親和性アゴニスト結合部位と相互作用するという性質の特性化のための有用な手段も提供する。
【００２３】
核酸構築物の製造、突然変異誘発、シークエンシング、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析に関するさらなる詳細は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。
アッセイ
本発明はまた、本発明の機能性ＧＡＢＡＢ受容体と相互作用することができる化合物のアッセイも提供し、このアッセイは：本発明のｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系により発現されるＧＡＢＡＢ受容体を準備すること、該受容体を推定の結合化合物と接触させること；および該化合物が該受容体と相互作用することができるかどうかを決定することを含んでなる。
【００２４】
アッセイの１つの態様として、受容体もしくは受容体のサブユニットを結合アッセイに用いることができる。結合アッセイは、競合的もしくは非競合的であることができる。そのようなアッセイは、もしあれば、どの化合物がポリペプチドに結合することができるかを決定するための多数の化合物の迅速なスクリーニングに利用することができる（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｅ）。
【００２５】
この関連内で、本発明は、試験化合物が本発明の単離されたＧＡＢＡＢ受容体タンパク質に結合し、従って、ＧＡＢＡＢ受容体の潜在的アゴニストもしくはアンタゴニストであるかどうかを同定する方法を提供し、該方法は；
ａ）機能性ＧＡＢＡＢ受容体を発現する細胞（ここで、そのような細胞は通常はＧＡＢＡＢ受容体を発現しない）をＧＡＢＡＢ受容体に結合することが知られている化合物の存在もしくは不在下に試験化合物と接触させること、および
ｂ）対照としてＧＡＢＡＢ受容体に結合することが知られている化合物を用いてＧＡＢＡＢ受容体への試験化合物の結合を決定すること
を含んでなる。試験化合物のもしくは以下で対照化合物とも呼ばれるＧＡＢＡＢ受容体に結合することが知られている化合物の結合は、タンパク質−リガンド相互作用の研究のための当該技術分野で既知の方法を用いて評価される。例えば、そのような結合は、標識された物質もしくは対照化合物を用いることにより測定することができる。試験化合物もしくは対照化合物は、当該技術分野において知られている任意の通常の方法で、例えば放射活性的に、蛍光的にもしくは酵素的に標識することができる。上記の方法の特定の態様として、対照化合物とも呼ばれるＧＡＢＡＢ受容体に結合することが知られている化合物は
検出可能に標識され、そして該標識は、ＧＡＢＡＢ受容体への試験化合物の結合を決定するために用いられる。該対照化合物は放射性標識、蛍光標識もしくは酵素標識、より好ましくは放射性標識を用いて標識される。さらに特定の態様として、本発明は試験化合物が単離されたＧＡＢＡＢ受容体タンパク質に結合するかどうかを同定する方法を提供し、該方法は、ＧＡＢＡＢ受容体に結合することが知られている化合物の使用を含んでなり、ここで、該対照化合物は、３Ｈ−ＧＡＢＡ、３Ｈ−バクロフェン、３Ｈ−３−ＡＰＰＡ、３Ｈ−ＣＧＰ５４２６２６および３Ｈ−ＳＣＨ５０９１１よりなる群から選択される。
【００２６】
続いて、そのような化合物が本発明のポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用するかどうかをさらに決定するために、結合することが見出された化合物でさらに詳細なアッセイを実施することができる。
【００２７】
従って、さらなる態様として、本発明は、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストを同定する方法を提供し、該方法は、
ａ）機能性ＧＡＢＡＢ受容体を発現する細胞（ここで、そのような細胞は通常はＧＡＢＡＢ受容体を発現しない）を試験化合物の存在もしくは不在下にＧＡＢＡＢの標識アゴニストにさらすこと、および
ｂ）該細胞への標識アゴニストの結合を決定すること
ここで、標識アゴニストの結合の量が試験化合物の存在下で少ない場合には、該化合物はＧＡＢＡＢ受容体の潜在的アゴニストである、
を含んでなる。上記の一般的な結合アッセイにすでに特定したように、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストの結合は、タンパク質−リガンド相互作用の研究のための当該技術分野で既知の方法を用いて評価される。標識は、一般に、放射性標識、蛍光標識もしくは酵素標識、特に放射性標識から選択され、ここで、該アゴニストは、３Ｈ−ＧＡＢＡ、３Ｈ−バクロフェンおよび３Ｈ−３−ＡＰＰＡよりなる群から選択される。
【００２８】
同様に、本発明はＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストを同定する方法を提供し、該方法は、
ａ）機能性ＧＡＢＡＢ受容体を発現する細胞（ここで、該細胞は通常はＧＡＢＡＢ受容体を発現しない）を試験化合物の存在もしくは不在下にＧＡＢＡＢの標識アンタゴニストにさらすこと、および
ｂ）該細胞への標識アンタゴニストの結合を決定すること
ここで、標識アンタゴニストの結合の量が試験化合物の存在下で少ない場合には、該化合物はＧＡＢＡＢ受容体の潜在的アンタゴニストである、
を含んでなる。上記の一般的な結合アッセイにすでに特定したように、ＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストの結合は、タンパク質−リガンド相互作用の研究のための当該技術分野で既知の方法を用いて評価される。標識は、一般に、放射性標識、蛍光標識もしくは酵素標識、特に放射性標識から選択され、ここで、該アンタゴニストは、３Ｈ−ＣＧＰ５４２６２６および３Ｈ−ＳＣＨ５０９１１よりなる群から選択される。
【００２９】
本発明の代わりの態様として、上記の結合アッセイは、上記に定義するようなＧＡＢＡＢ受容体を含んでなる細胞組成物、すなわち、細胞抽出物、細胞画分もしくは細胞小器官上で行われる。さらに特に、上記の結合アッセイは、上記に定義するようなＧＡＢＡＢ受容体を含んでなる細胞組成物、すなわち、細胞抽出物、細胞画分もしくは細胞小器官上で行われ、ここで、該細胞組成物、すなわち、細胞抽出物、細胞画分もしくは細胞小器官は、機能性ＧＡＢＡＢ受容体を発現する細胞から得られ、ここで、該細胞は通常はＧＡＢＡＢ受容体を発現しない。より好ましくは、細胞組成物、すなわち、細胞抽出物、細胞画分もしくは細胞小器官は、受託番号ＬＭＢＰ  ６０４６ＣＢで２００３年８月２２日にＣＨＯ−Ｋ１  ｈ−ＧＡＢＡ−ｂ  Ｒ１ａ／Ｒ２クローン２０としてＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託されたｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系から得られる。
【００３０】
従って、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストもしくはアンタゴニストとして化合物を同定する方法を提供することが本発明の目的であり、該方法は；
ａ）ＧＡＢＡＢ受容体の検出可能に標識されたアゴニストもしくはアンタゴニストの存在下に、機能性ＧＡＢＡＢ受容体を発現する細胞（ここで、該細胞は通常はＧＡＢＡＢ受容体を発現しない）の細胞組成物に化合物を投与すること；および
ｂ）該細胞組成物への標識アゴニストもしくはアンタゴニストの結合を決定すること
ここで、標識アゴニストもしくはアンタゴニストの結合の量が試験化合物の存在下で少ない場合には、該化合物はＧＡＢＡＢ受容体のそれぞれ潜在的アゴニスト、アンタゴニストである、
を含んでなる。
【００３１】
上記の一般的な結合アッセイにすでに特定したように、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストもしくはアンタゴニストの結合は、タンパク質−リガンド相互作用の研究のための当該技術分野で既知の方法を用いて評価される。標識は、一般に、放射性標識、蛍光標識もしくは酵素標識、特に放射性標識から選択され、ここで、該アゴニストは３Ｈ−ＧＡＢＡ、３Ｈ−バクロフェンおよび３Ｈ−３−ＡＰＰＡよりなる群から選択され、そして該アンタゴニストは３Ｈ−ＣＧＰ５４２６２６および３Ｈ−ＳＣＨ５０９１１よりなる群から選択される。さらに特定の態様として、上記の結合アッセイは、上記の放射性標識アゴニストおよび／もしくはアンタゴニストの１つもしくはそれ以上を用いて、本発明の細胞の膜画分からなる細胞組成物上で、特に、受託番号ＬＭＢＰ  ６０４６ＣＢで２００３年８月２２日にＣＨＯ−Ｋ１  ｈ−ＧＡＢＡ−ｂ  Ｒ１ａ／Ｒ２クローン２０としてＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託されたｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系の膜画分上で行われる。
【００３２】
さらなる態様として、本発明は、本発明の細胞におけるＧＡＢＡＢ受容体活性を調節する化合物を同定する機能アッセイを提供する。そのようなアッセイは、本発明の、すなわち、ヒトＧＡＢＡＢＲ１ａおよびヒトＧＡＢＡＢＲ２サブユニットで共トランスフェクションされた細胞を用いて行われる。細胞を少なくとも１つの対照化合物と接触させ、ここで、ＧＡＢＡＢ受容体活性を調節する該化合物の能力は知られている。その後で、細胞を試験化合物と接触させ、そして該試験化合物が対照化合物と比較してＧＡＢＡＢ受容体の活性を調節するかどうかを決定する。「対照化合物」は、本明細書において用いる場合、ＧＡＢＡＢ受容体に結合することおよび／もしくはその活性を調節することが知られている化合物をさす。
【００３３】
本発明のポリペプチドの「活性を調節する」化合物もしくはシグナルは、ポリペプチドが該化合物もしくはシグナルの存在下では該化合物もしくはシグナルのない場合と異なって機能するようにその活性を改変する化合物もしくはシグナルをさす。調節に影響を及ぼす化合物には、アゴニストおよびアンタゴニストが包含される。ＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストには、ＧＡＢＡＢ受容体機能を活性化するＧＡＢＡ、バクロフェンおよび３−ＡＰＰＡのような化合物が包含される。あるいはまた、アンタゴニストには、ＧＡＢＡＢ受容体機能を妨げる化合物が包含される。典型的に、アンタゴニストの効果は、アゴニストにより誘導される受容体活性化の阻止として認められる。アンタゴストには、競合的ならびに非競合的アンタゴニストが包含される。競合的アンタゴニスト（もしくは競合的遮断薬）は、アゴニスト結合に特異的な部位ともしくはその近くで相互作用する。非競合的アンタゴニストもしくは遮断薬は、アゴニスト相互作用部位以外の部位と相互作用することにより受容体の機能を不活性化する。
【００３４】
一つの態様として、本発明はＧＡＢＡＢ受容体活性を調節する能力を有する化合物の同定方法を提供し、該方法は；
ａ）ＧＡＢＡＢ受容体の活性化を可能にする条件下に、機能性ＧＡＢＡＢ受容体を発現する細胞（ここで、該細胞は通常は機能性ＧＡＢＡＢ受容体を発現しない）を少なくとも１つの対照化合物と接触させること；
ｂ）ＧＡＢＡＢ受容体の活性化を可能にする条件下に、段階ａ）の細胞を試験化合物と接触させること、および
ｂ）該試験化合物が対照化合物と比較してＧＡＢＡＢ受容体活性を調節するかどうかを決定すること
を含んでなる。
【００３５】
ＧＡＢＡＢ受容体活性を調節する試験化合物の能力を決定する方法は、Ｇタンパク質共役受容体の機能的応答を決定するために利用可能な様々なアッセイ（上記参照）に、そして特にカリウム電流の変化、カルシウム濃度の変化、ｃＡＭＰの変化およびＧＴＰγＳ結合の変化を決定するアッセイに基づく。当該技術分野において一般に知られているＧＡＢＡＢ受容体の活性化を可能にする条件、例えばアンタゴニストスクリーニングの場合に、これらの条件はアッセイ系におけるＧＡＢＡＢ受容体アゴニストの存在を含んでなる。これらの活性アッセイに使用する典型的なＧＡＢＡＢ受容体アゴニストは、ＧＡＢＡ、バクロフェンもしくは３−ＡＰＰＡである。さらに特に、以下に概説するようなＧＴＰγＳアッセイでは、ＧＡＢＡＢ受容体タンパク質を不活性化する試験化合物の能力を評価するためにＧＡＢＡを用いてＧＡＢＡＢ受容体を活性化する。
【００３６】
上記のアッセイにおいて、試験化合物の存在下でのＧＴＰγＳ結合の増加は、該化合物がＧＡＢＡＢ受容体活性を活性化すること、従って、該試験化合物がＧＡＢＡＢ受容体タンパク質の潜在的アゴニストであることの指標となる。試験化合物の存在下でのＧＴＰγＳ結合の減少は、該化合物がＧＡＢＡＢ受容体タンパク質を不活性化すること、従って、該試験化合物がＧＡＢＡＢ受容体タンパク質の潜在的アンタゴニストであることの指標となる。
【００３７】
アッセイの特に好ましいタイプには、下記のように行うことができる結合アッセイおよび機能アッセイが包含される：
結合アッセイ
本発明のｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系により発現されるＧＡＢＡＢ受容体の過剰発現は、リガンド結合研究用に該受容体（便宜上、ＧＡＢＡＢ結合受容体と本節では呼ばれる）を保有する膜調製物を製造するために用いることができる。これらの膜調製物は、放射性標識ＧＡＢＡＢリガンド（３Ｈ−ＧＡＢＡ、３Ｈ−バクロフェン、３Ｈ−３−ＡＰＰＡ、３Ｈ−ＣＧＰ５４２６２６、３Ｈ−ＳＣＨ５０９１１を包含する）の結合および結合部位の競合相手によるそのような放射性リガンドの置換を検出するために通常のフィルター結合アッセイ（例えばＢｒａｎｄｅｌフィルターアッセイ装置を用いる）においてもしくはハイスループットシンチレーション近接タイプ結合アッセイ（ＳＰＡおよびＣｙｔｏｓｔａｒ−Ｔフラッシュプレート技術；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）において使用することができる。放射能は、９６、３８４，１５３６マイクロタイターウェル形式からの迅速な測定を行うことができる、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔもしくは同様の装置で測定することができる。ＳＰＡ／Ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ技術はハイスループットスクリーニングに特に適しており、従って、この技術は基準リガンドを置換することができる化合物のスクリーニングとして使用するのに適している。
【００３８】
天然の状態に近い環境におけるＧＡＢＡＢ結合受容体タンパク質へのリガンドの結合を
研究する別の方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ）により使用される表面プラズモン共鳴効果を利用する。膜調製物もしくは全細胞におけるＧＡＢＡＢ結合受容体をＢｉａｃｏｒｅのバイオセンサーチップに取り付け、そして結合部位の競合相手を同定するために化合物の存在もしくは不在下にリガンドの結合を調べることができる。
機能アッセイ
ＧＡＢＡＢ受容体は、ＧＩＲＫ（内向き整流性カリウムチャンネル）に共役しているＧタンパク質共役受容体ファミリーに属するので、これらの受容体の活性化でカリウムイオンの流れが生じるはずである。このイオンの流れは、特定の化合物のアゴニストもしくはアンタゴニスト作用を決定するために様々な技術を用いてリアルタイムで測定することができる。従って、本発明の細胞系において発現される組み換えＧＡＢＡＢ結合受容体タンパク質は、興味のある化合物の作用機序を決定するために全細胞および単一チャンネル電気生理学を用いて特性化することができる。ＧＡＢＡＢ結合受容体タンパク質で活性の化合物の電気生理学的スクリーニングは、通常の電気生理学技術およびそれらが利用可能になる場合には現在開発中の新規のハイスループット方法を用いて行うことができる。
【００３９】
Ｃａ２＋チャンネルへのＧＡＢＡＢ受容体活性化のシナプス前作用を考慮して、代わりの機能スクリーニングでは化合物の調節作用を細胞内カルシウムの変化によって評価する。カルシウムの流れは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓを包含する供給業者からのｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４、ｆｌｕｏ−５Ｎ、ｆｕｒａ  ｒｅｄおよび他の同様のプローブを包含するいくつかのイオン感受性蛍光色素を用いて測定できる。従って、ＧＡＢＡＢ受容体活性化の結果としてのカルシウム流入の阻害は、画像解析アルゴリズムと組み合わせたレーザー共焦点方法の存在もしくは不在下にの蛍光顕微鏡検査を包含する、蛍光分析および蛍光イメージング技術を用いてリアルタイムで特性化することができる。
【００４０】
別の方法は、カルシウム過渡電流に影響を与えるアゴニストもしくはモジュレーターのいずれかとして活性の化合物のハイスループットスクリーニングアッセイである。このアッセイは、蛍光イメージングプレートリーダー（（ＦＬＩＰＲＲ）、Ｍｏｌｅｃｕａｒ
Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれる装置に基づく。その最も一般的な形態において、それはフルオレセインに基づく色素により放出される蛍光を励起しそして測定する。それはフルオロフォアの４８８ｎｍでの高出力励起をもたらすためのアルゴンイオンレーザー、９６／３８４ウェルプレートの底にわたって迅速にスキャンするための光学系および放出された蛍光を捕獲するための高感度の冷却ＣＣＤカメラを使用する。それはまた、装置が９６／３８４ウェルプレートのウェルに試験因子の溶液を送達することを可能にする９６／３８４ウェルピペッティングヘッドも含有する。ＦＬＩＰＲアッセイは、同時に全ての９６／３８４ウェルから、リアルタイムで、化合物の添加の前、間および後に細胞の集団から蛍光シグナルを測定するように設計される。ＦＬＩＰＲアッセイは、ｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系で機能的に活性の化合物をスクリーニングしそして特性化するために用いることができる。
【００４１】
ＧＡＢＡＢアゴニストを同定するために特に有用なハイスループットスクリーニングアッセイは、ｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞に適切な蛍光色素を負荷し、試験化合物とインキュベーションし、そして相互作用を与えるために十分な時間（８〜２４時間、典型的には１２〜２４時間、特に２４時間）の後にＦＬＩＰＲもしくはＡｓｃｅｎｔ  Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒｕｓｓｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている）のような自動蛍光プレートリーダーを用いて相対蛍光単位の変化を測定する手順（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）からなることができる。
【００４２】
さらなる態様として、機能アッセイは、ＧＡＢＡＢ結合受容体へのＧＴＰγＳ結合の変化に基づく。特に、放射性標識したＧＴＰγＳの置換を決定するための競合結合アッセイを用いること。一般に、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストを同定するこの方法は、本発明のｈ
ＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２ヘテロダイマーを発現する細胞から膜画分を調製すること、ＧＡＢＡＢ受容体の活性化を可能にする条件下で、該膜調製物を放射性標識したＧＴＰγＳの存在下で試験する化合物と接触させること、および膜画分へのＧＰＴγＳ結合を検出することを含んでなる。化合物の存在下でのＧＴＰγＳ結合の増加は、該化合物がｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２受容体を活性化することの指標となる。化合物の存在下でのＧＴＰγＳ結合の減少は、該化合物がｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２受容体を不活性化することの指標となる。好ましくは、このＧＴＰγＳ結合アッセイは、受託番号ＬＭＢＰ  ６０４６ＣＢで２００３年８月２２日にＣＨＯ−Ｋ１  ｈ−ＧＡＢＡ−ｂ
Ｒ１ａ／Ｒ２クローン２０としてＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託されたｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系から得られる膜画分上で行われる。さらに、ＧＡＢＡＢ受容体の活性化を可能にする条件は、アッセイ系における例えばＧＡＢＡ、バクロフェンおよび３−ＡＰＰＡのようなＧＡＢＡＢ受容体アゴニストの存在を含んでなる。特にＧＡＢＡ。
【００４３】
このおよび他の機能スクリーニングアッセイは、以下の実施例に提供される。
ＧＡＢＡＢ受容体アゴニスト
さらなる態様として、本発明は上記のスクリーニングアッセイの１つを用いて同定されるＧＡＢＡＢ受容体アゴニストを提供し、ここが、該ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストは、式（Ｉ）
【００４４】
【化１】
2007535480.tif 000003
【００４５】
［式中；
＝Ｚ１−Ｚ２＝Ｚ３−Ｚ４＝は、＝Ｎ−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ＝（ａ）、＝Ｎ−ＣＨ＝Ｎ−ＣＨ＝（ｂ）、＝ＣＨ−Ｎ＝ＣＨ−Ｎ＝（ｃ）、＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝（ｄ）、＝Ｎ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝（ｅ）、＝ＣＨ−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ＝（ｆ）、＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｎ−ＣＨ＝（ｇ）および＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ＝（ｈ）よりなる群から選択される２価の基を表し；
Ｒ１は水素、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１〜６アルキル、ＣＦ３、アミノまたはモノ−もしくはジ（Ｃ１〜４アルキル）アミノを表し；
Ｒ２は水素、Ｃ１〜６アルキルもしくはヒドロキシカルボニル−Ｃ１〜６アルキル−を表す］
の化合物、そのＮ−オキシド形態、製薬学的に許容しうる付加塩および立体化学的異性体により表される。
【００４６】
特に以下の制限；
（ｉ）＝Ｚ１−Ｚ２＝Ｚ３−Ｚ４＝は、＝Ｎ−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ＝（ａ）、＝Ｎ−ＣＨ＝Ｎ−ＣＨ＝（ｂ）、＝ＣＨ−Ｎ＝ＣＨ−Ｎ＝（ｃ）および＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝（ｄ）よりなる群から選択される２価の基を表す；
（ｉｉ）Ｒ１はハロ、アミノまたはモノ−もしくはジ（Ｃ１〜４アルキル）アミノを表す；
（ｉｉｉ）Ｒ２は酪酸を表す
の１つもしくはそれ以上が適用される式（Ｉ）の化合物。
【００４７】
また興味深いのは：
（ｉ）Ｒ１が位置Ｚ１で結合しており；そして／または
（ｉｉ）＝Ｚ１−Ｚ２＝Ｚ３−Ｚ４＝が（ａ）、（ｂ）もしくは（ｄ）を表し、より好ましくは＝Ｚ１−Ｚ２＝Ｚ３−Ｚ４＝が（ｄ）を表す
式（Ｉ）の化合物である。
【００４８】
上記の定義および以下において用いる場合、ハロはフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードの総称であり；Ｃ１〜４アルキルは、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、１−メチルエチル、２−メチルプロピル、２，２−ジメチルエチルなどのような１〜４個の炭素原子を有する直鎖状および分枝鎖状の飽和炭化水素基を定義し；Ｃ１〜６アルキルは、例えばペンチル、ヘキシル、３−メチルブチル、２−メチルペンチルなどのような１〜６個の炭素原子を有する直鎖状および分枝鎖状の飽和炭化水素基を定義する。
【００４９】
上記のような製薬学的に許容しうる付加塩は、式（Ｉ）の化合物が形成することのできる、治療的に有効な無毒の酸付加塩形態を含んでなるものとする。後者は、そのような適切な酸で塩基形態を処理することにより都合よく得ることができる。適切な酸は、例えば、ハロゲン化水素酸、例えば塩酸もしくは臭化水素酸；硫酸；硝酸；リン酸などのような無機酸；または例えば酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸（すなわち、ブタン二酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、パモン酸などのような有機酸を含んでなる。
【００５０】
上記のような製薬学的に許容しうる付加塩は、式（Ｉ）の化合物が形成することのできる治療的に有効な無毒の塩基付加塩形態を含んでなるものとする。そのような塩基付加塩形態の例は、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム塩、そしてまた例えばアンモニア、アルキルアミン、ベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ヒドラバミン、アミノ酸、例えばアルギニン、リシンのような製薬学的に許容しうるアミンとの塩である。
【００５１】
逆に、該塩形態を適切な塩基もしくは酸での処理により遊離酸もしくは塩基形態に転化することができる。
【００５２】
上記に使用するような付加塩という用語はまた、式（Ｉ）の化合物ならびにその塩が形成することのできる溶媒和物も含んでなる。そのような溶媒和物は、例えば水和物、アルコラートなどである。
【００５３】
上記に使用するような立体化学的異性体という用語は、式（Ｉ）の化合物が有することのできる可能な異なる異性体ならびに立体配座形態を定義する。他に記載されるかもしくは示されない限り、化合物の化学表示は全ての可能な立体化学的および立体配座的異性体の混合物を意味し、該混合物は基本分子構造の全てのジアステレオマー、鏡像異性体および／もしくは配座異性体を含有する。純粋形態のもしくは相互との混合物の両方の、式（Ｉ）の化合物の全ての立体化学的異性体は、本発明の範囲内に包含されるものとする。
【００５４】
式（Ｉ）の化合物のＮ−オキシド形態は、１個もしくは数個の窒素原子がいわゆるＮ−オキシドに酸化される式（Ｉ）の化合物を含んでなるものとする。
【００５５】
本発明の７，８−ジヒドロ−フェノチアジン誘導体は、一般に、Ｎｅｍｅｒｙｕｋ  Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｋｈｉｍｉｋｏ−Ｆａｒｍａｔｓｅｖｔｉｃｈｅｓｋｉｉ  Ｚｈｕｒｎａｌ（１９８５），１９（８），９６４−９６８により記述されるように製造される。簡潔に言えば、既知のオルト−アミノ置換された（ヘテロ）アレーン−チオール（ＩＩ）を適切な２−ブロモ−５，５，−ジメチル−３−オキソ−シクロヘキシ−１−エニルアミノ誘導体（ＩＩＩ）と、これら２つの反応物質をエタノールもしくはＮ−メチルピロリドンのような適当な溶媒中で加熱することにより縮合させる。標準的なワークアップおよび精製により式（Ｉ）の所望の生成物を生成せしめる（スキーム１）。
【００５６】
【化２】
2007535480.tif 000004
【００５７】
ここで、＝Ｚ１−Ｚ２＝Ｚ３−Ｚ４＝、Ｒ１およびＲ２は、上記の式（Ｉ）の化合物についてのように定義される。
【００５８】
適切な２−ブロモ−５，５，−ジメチル−３−オキソ−シクロヘキシ−１−エニルアミノ誘導体（ＩＩＩ）は、一般に、当該技術分野で既知のアミノ化条件下で一般式（ＩＶ）の適切なアミンでの５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオンのアミノ化、続いてＮ−ブロモスクシンイミドでの臭素化により得ることができる（スキーム２）。
【００５９】
【化３】
2007535480.tif 000005
【００６０】
ここで、Ｒ２は上記の式（Ｉ）の化合物についてのように定義される。
【００６１】
式（Ｉ’）の化合物と以下で呼ばれる、Ｒ２が酪酸を表す式（Ｉ）の化合物では、該化合物は、オルト−アミノ置換された（ヘテロ）アレーン−チオール（ＩＩ）を４−（２−ブロモ−５，５−ジメチル−３−オキソ−シクロヘキシ−１−エニルアミノ）−酪酸もしくはｔ−ブチルエステル（Ｖ）のようなエステル誘導体と、例えばこれら２つの反応物質をエタノールもしくはＮ−メチルピロリドンのような適当な溶媒において加熱することによるような当該技術分野で既知の条件を用いて縮合させることにより得られる。標準的なワークアップおよび精製により所望の生成物、もしくはエステル誘導体を生成せしめ、それを酸性もしくは塩基性条件下で加水分解して必要な酪酸（Ｉ’）を生成せしめることができる（スキーム３）。
【００６２】
【化４】
2007535480.tif 000006
【００６３】
上記の合成方法を用いる式（Ｉ）の化合物の合成のさらなる例は、以下の実験部分に提供される。
【００６４】
必要もしくは所望に応じて、任意の順序の以下のさらなる段階の任意の１つもしくはそれ以上を行うことができる：
（ｉ）任意の残留保護基（１つもしくはそれ以上）を除くこと；
（ｉｉ）式（Ｉ）の化合物もしくはその保護された形態を式（Ｉ）のさらなる化合物もしくはその保護された形態に転化すること；
（ｉｉｉ）式（Ｉ）の化合物もしくはその保護された形態を式（Ｉ）の化合物もしくはその保護された形態のＮ−オキシド、塩、第四級アミンもしくは溶媒和物に転化すること；（ｉｖ）式（Ｉ）の化合物もしくはその保護された形態のＮ−オキシド、塩、第四級アミンもしくは溶媒和物を式（Ｉ）の化合物もしくはその保護された形態に転化すること；
（ｖ）式（Ｉ）の化合物もしくはその保護された形態のＮ−オキシド、塩、第四級アミンもしくは溶媒和物を式（Ｉ）の化合物もしくはその保護された形態の別のＮ−オキシド、製薬学的に許容しうる付加塩、第四級アミンもしくは溶媒和物に転化すること。
【００６５】
上記の方法において、中間化合物の官能基は保護基によりブロックされる必要があり得ることは当業者により理解される。
【００６６】
保護することが望ましい官能基には、ヒドロキシ、アミノおよびカルボン酸が包含される。ヒドロキシの適当な保護基には、トリアルキルシリル基（例えばｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルもしくはトリメチルシリル）、ベンジルおよびテトラヒドロピラニルが包含される。アミノの適当な保護基には、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルもしくはベンジルオキシカルボニルが包含される。カルボン酸の適当な保護基には、Ｃ（１〜６）アルキルもしくはベンジルエステルが包含される。
【００６７】
官能基の保護および脱保護は、反応段階の前もしくは後に行われることができる。
【００６８】
保護基の使用は、‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’第３版，Ｔ  Ｗ  Ｇｒｅｅｎｅ  ＆  Ｐ  Ｇ  Ｍ  Ｗｕｔｚ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（Ｊｕｎｅ  １９９９）に完全に記述されている。
【００６９】
さらに、式（Ｉ）の化合物におけるＮ原子は、例えば２−プロパノン、テトラヒドロフランもしくはジメチルホルムアミドのような適当な溶媒中でＣＨ３−Ｉを用いて当該技術分野で既知の方法によりメチル化することができる。
【００７０】
上記の反応方法に使用するような中間体および出発物質のいくつかは既知の化合物であり、そして市販されている可能性があるかもしくは当該技術分野で既知の方法に従って製造することができる。
処置の方法
本発明はまた、スティッフマン症候群、胃食道逆流、神経障害性疼痛、失禁ならびに咳
およびコカイン嗜癖の治療のような適応症の処置のための薬剤の製造における、上記のアッセイの１つを用いてＧＡＢＡＢ受容体活性モジュレーターとして同定される化合物、特に上記のような式（Ｉ）の化合物の使用も提供する。特に、一過性下部食道括約筋弛緩（ＴＬＥＳＲ）を減少するための薬剤の製造における使用。従って、スティッフマン症候群、胃食道逆流、神経障害性疼痛、失禁ならびに咳およびコカイン嗜癖の治療、特にＴＬＥＳＲのような適応症に苦しむ温血動物、例えばヒトを包含する哺乳類の処置の方法を提供することは本発明の目的である。
【００７１】
該方法は、本発明の方法を用いてＧＡＢＡＢ受容体モジュレーターとして同定される化合物の有効量を処置を必要とする温血動物に投与することを含んでなる。特に、ヒトを包含する温血動物への本発明の化合物の有効量の全身もしくは局所投与。
【００７２】
そのような因子は、製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤と一緒に因子を含んでなる組成物に調合することができる。因子はエステル、または酸付加塩もしくは塩基性金属塩のような塩、またはＮもしくはＳオキシドのような生理学的に機能性の誘導体の形態であることができる。組成物は、任意の適当な経路および投与の手段用に調合することができる。製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤には、経口、直腸、経鼻、吸入可能、局所（口腔および舌下を包含する）、膣内もしくは非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外を包含する）投与に適当な製剤に使用されるものが包含される。担体もしくは希釈剤の選択は、もちろん、提案される投与経路に依存し、それは因子およびその治療目的により決まり得る。製剤は単位投与形態物において都合よく与えることができ、そして薬学の当該技術分野において周知である方法のいずれかにより製造することができる。そのような方法には、有効成分を１つもしくはそれ以上の副成分を構成する担体と会合させる段階が包含される。一般に、製剤は、有効成分を液状担体もしくは細かく分割した固形担体または両方と均一にそして密接に会合させ、そして次に必要に応じて生成物を成形することにより製造される。
【００７３】
固形組成物では、通常の無毒の固形担体が包含され、例えば、製薬学的等級のマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが用いることができる。上記に定義するような活性化合物は、担体として例えばポリアルキレングリコール、アセチル化トリグリセリドなどを用いて座薬として調合することができる。液状の製薬学的に投与可能な組成物は、例えば、上記に定義するような活性化合物および任意の製薬学的添加剤を例えば水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどのような担体に溶解すること、分散させることなどによって溶液もしくは懸濁液を生成せしめることにより製造することができる。所望に応じて、投与する製薬学的組成物はまた、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンなどのような微量の無毒の補助剤を含有することもできる。そのような投与形態物を製造する実際の方法は知られているか、もしくは当業者に明らかである；例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，第１８版，１９９０を参照。
【００７４】
投与する組成物もしくは製剤は、いずれにしても、処置する被験体の症状を軽減するために有効な量の活性化合物（１つもしくは複数）の量を含有する。
【００７５】
０．２５〜９５％の範囲の有効成分を含有し、残りは無毒の担体から構成される投与形態物もしくは組成物を製造することができる。
【００７６】
経口投与用には、製薬学的に許容しうる無毒の組成物は、例えば製薬学的等級のマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、ナトリウムクロスカルメロース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤のいずれかの導入により形成される。そのような組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとる。そのような組成物は、１％〜９５％の有効成分、より好ましくは２〜５０％、最も好ましくは５〜８％を含有することができる。
【００７７】
非経口投与は、一般に、皮下、筋肉内もしくは静脈内のいずれかの注射を特徴とする。注射剤は、液状の溶液もしくは懸濁液、注射の前の液体における溶解もしくは懸濁に適当な固形形態として、またはエマルジョンとして、通常の形態で製造することができる。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。さらに、所望に応じて、投与する製薬学的組成物はまた、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウムなどのような、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤などのような微量の無毒の補助剤を含有することもできる。
【００７８】
そのような非経口用組成物に含有される活性化合物のパーセンテージは、その特定の性質、ならびに化合物の活性および被験体の必要性に非常に依存する。しかしながら、溶液中０．１％〜１０％の有効成分のパーセンテージが使用でき、そして組成物が上記のパーセンテージに後で希釈される固体である場合にはさらに高い。好ましくは、組成物は溶液中に０．２〜２％の有効成分を含んでなる。
【００７９】
本記述の全体にわたって、「標準方法」、「標準プロトコル」および「標準手順」という用語は、分子生物学技術との関連で用いられる場合、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，編集者Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９４もしくはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８９のような通常の実験室マニュアルに見出されるプロトコルおよび手順と理解されるべきである。
【００８０】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することによりさらによく理解されるが、これらはその後に続く請求項にさらに十分に記述されるような本発明を例証するにすぎないことを当業者は容易に理解する。さらに、本願の全体にわたって、様々な公開が引用される。これらの公開の開示は、本発明が関係する最新技術をさらに十分に記述するために本願に引用することにより本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００８１】
実験部分
Ｉ．ＧＡＢＡＢアゴニストの合成
以下に記述する方法において、以下の略語を使用した：「ＤＩＰＥ」はジイソプロピルエーテルを表し；「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを表す。
【００８２】
ある化学物質には化学式、例えばアセトニトリルにはＣＨ３ＣＮ、アンモニアにはＮＨ３、ジクロロメタンにはＣＨ２Ｃｌ２、硫酸マグネシウムにはＭｇＳＯ４、そして塩酸にはＨＣｌを使用した。
Ａ．中間体の製造
［実施例Ａ．１］
【００８３】
【化５】
2007535480.tif 000007
【００８４】
４−アミノブタン酸１，１−ジメチルエチルエステル［５０４７９−２２−６］（１４ｇ、０．０８７ｍｏｌ）および５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン［１２６−８１−８］（１２．２６ｇ、０．０８７ｍｏｌ）をトリクロロメタン（２５０ｍｌ）に溶解し、そしてＮ，Ｎ−ジエチルエタナミン（０．５ｍｌ）を加えた。反応混合物を３日間攪拌し、そして次に２５０ｍｌの水の３回分（ｔｈｒｅｅ  ｐｏｒｔｉｏｎｓ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、そして減圧下で濃縮した。残留物をＤＩＰＥ／ＣＨ３ＣＮにおいて再結晶化させて１８．６ｇ（７６％）の中間体１を生成せしめた。
【００８５】
この生成物をメタノール（２５０ｍｌ）および水（１００ｍｌ）に溶解した。１−ブロモ−２，５−ピロリジンジオン（１１．８ｇ、０．０６６ｍｏｌ）を３０分の期間にわたって少しずつ加えた。さらに１時間攪拌した後に、５００ｍｌの水を加えた。混合物を３回分のジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、そして減圧下で濃縮して２２ｇ（９２％）の中間体２を生成せしめた。
【００８６】
同様にして、
【００８７】
【化６】
2007535480.tif 000008
【００８８】
中間体３もまた製造した。
［実施例Ａ．２］
【００８９】
【化７】
2007535480.tif 000009
【００９０】
エタノール（ｑ．ｓ．）中の５，６−ジアミノ−４（１Ｈ）−ピリミジンチオン［２８４６−８９−１］（０．００２７ｍｏｌ）および中間体２（０．００２７ｍｏｌ）の混合物を８５℃で２時間攪拌した。反応混合物を濾過し、そして溶媒を蒸発させた。残留物を高速液体クロマトグラフィーにより精製した。生成物画分を集め、そして溶媒（ＣＨ３ＣＮ）を蒸発させた。水層をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして溶媒を蒸発させ、０．４００ｇ（３０％）の中間体４を生成せしめた。
［実施例Ａ．３］
【００９１】
【化８】
2007535480.tif 000010
【００９２】
１−メチル−２−ピロリジノン［８７２−５０−４］（１５ｍｌ）中の２−アミノベンゼンチオール［１３７−０７−５］（０．００４ｍｏｌ）および中間体２（０．００４ｍｏｌ）の混合物を１４０℃で１時間攪拌した。反応混合物を冷却し、そして層をＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ（ＮＨ３）で分離した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして溶媒を蒸発させた。残留物を高速液体クロマトグラフィーにより精製した。生成物画分を集め、そして溶媒（ＣＨ３ＣＮ）を蒸発させた。水層をＥｔＯＡｃで抽出し、そして次に有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過して分離し、そして溶媒を蒸発させ、０．６ｇ（４０％）の中間体５を生成せしめた。
Ｂ．化合物の製造
［実施例Ｂ．１］
【００９３】
【化９】
2007535480.tif 000011
【００９４】
トリフルオロ酢酸（５ｍｌ）およびジクロロメタン（５ｍｌ）中の中間体４（０．００１ｍｏｌ）の混合物を室温で１時間攪拌した。反応混合物を窒素の流れの下で乾燥させた。得られる残留物をジエチルエーテルに懸濁した。所望の生成物を濾過して分離し、そして３０℃で乾燥させ（真空）、化合物２のトリフルオロ酢酸塩０．１２０ｇ（２３％）を生成せしめた。
【００９５】
同様にして：
【００９６】
【化１０】
2007535480.tif 000012
【００９７】
化合物１の臭化水素酸塩および
【００９８】
【化１１】
2007535480.tif 000013
【００９９】
化合物４のトリフルオロ酢酸塩もまた製造した。
［実施例Ｂ．２］
［実施例Ｂ．２］
【０１００】
【化１２】
2007535480.tif 000014
【０１０１】
トリフルオロ酢酸（５ｍｌ）およびジクロロメタン（５ｍｌ）中の中間体５（０．００１５５ｍｏｌ）の混合物を室温で２０時間攪拌した。反応混合物を窒素の流れの下で乾燥させた。得られる残留物をジエチルエーテルにおいて凝固させた。所望の生成物を濾過して分離し、そして３０℃で乾燥させ（真空）、化合物３のトリフルオロ酢酸塩０．３２０ｇ（６７％）を生成せしめた
ＩＩ．ＧＡＢＡＢ−ＣＨＯ−Ｋ１細胞の開発
材料および方法
リポフェクトアミンＰＬＵＳを用いるＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＧＡＢＡＢＲ１ａおよびＧＡＢＡＢＲ２の永続的トランスフェクション：
ＣＨＯ細胞をｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ｐｃＤＮＡ３．１でトランフェクションした。モノクローナルの安定なＲ１ａ発現細胞をｈＧＡＢＡＢＲ２／ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ＋でトランスフェクションした。クローンの選択は、８００μｇのゲネチシン＋８００μｇのハイグロマイシン／ｍｌで行われた。
膜調製：
ＰＢＳでの短時間のすすぎの後に、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４において、ブチレートで刺激した（最終５ｍＭ）細胞をはがし、そして４℃で２３５００ｇで１０分間遠心分離した。ペレットをＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ（２４０００ｒｐｍ）により５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４において均質化し、続いて４℃で３００００ｇで２０分間遠心分離した。得られるペレットを５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４に再懸濁し、そして再均質化した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード法を用いて決定した。
ＧＴＰγ３５Ｓ活性化アッセイ：
１０μｇの膜調製物を２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｎＭ  ＧＴＰγ３５Ｓ、３μＭ  ＧＤＰ、１０μｇのサポニン／ｍｌにおいて２５０μｌで、１ｍＭのＧＡＢＡの存在もしくは不在下に（バクロフェンのない場合の基本活性）、３７℃で２０分間インキュベーションした。濾過をＨａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）において９６ウェルＧＦ／Ｂフィルタープレート上に実施した。フィルターを冷えた１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４で６回すすぎ、そして一晩乾燥させ、その後で３０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  Ｏを加え、そしてＴｏｐｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ、１分／ウェル）において測定した。
３Ｈ−アゴニスト結合：
３０〜６０μｇの膜調製物を５００μｌで５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｎＭ  ３Ｈ−ＧＡＢＡもしくは２０ｎＭ  ３Ｈ−バクロフェンにおいて２０℃でインキュベーションした。非特異的結合は、１００μＭのバクロフェンの存在下で決定した。９０分後に、混合物をＨａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）により９６ウェルＧＦ／Ｂフィルタープレート上に移した。フィルターを冷えた５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２で６回すすぎ、そして一晩乾燥させ、その後で３０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  Ｏを加え、そしてＴｏｐｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ、１分／ウェル）において測定した。
結果
ＧＴＰγ３５Ｓ活性化アッセイ
安定にｈＧＡＢＡＢＲ１ａでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の膜において、アンタゴニスト３Ｈ−ＣＧＰ５４６２６の結合を測定した。最も高いアンタゴニスト結合を有するＲ１ａクローンにおいてｈＧＡＢＡＢＲ２を共トランスフェクションした。サブクローニング後に、ＧＡＢＡによる膜の刺激の際にＧＴＰγ３５Ｓ結合アッセイにおいて機能活性を示す安定なクローンが得られ、ここで、該活性は正のモジュレーターＣＧＰ７９３０（Ｕｒｗｙｌｅｒ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６０：９６３−９７１）の存在下で増強された（図１）。
アゴニストフィルター結合アッセイ
アゴニストフィルター結合アッセイは、９６ウェルＧＦ／Ｂフィルタープレートにおいて開発されている。既知のアゴニストおよびアンタゴニストのＩＣ５０を決定した（図２）。安定なｈＧＡＢＡＢＲ１ａもしくは一過性のｈＧＡＢＡＢＲ２モノマーＧＡＢＡＢ受容体を発現する細胞は、アゴニスト３Ｈ−ＧＡＢＡもしくは３Ｈ−バクロフェンへのいかなる結合も示さなかったが（データは示されない）、意外にも、我々のｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／Ｒ２ヘテロダイマークローンにおいてアゴニスト結合が両方のリガンドで検出された。３Ｈ−バクロフェン、３Ｈ−ＧＡＢＡおよび３Ｈ−ＣＧＰ５４６２６のＫｄを飽和実験において決定し、そして組織調製物で得られた公開結果とよく比較した（表１）。
【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
アゴニストの効能の順序は、ＡＭＰＡ＞ＧＡＢＡ＞バクロフェンであり、そしてアンタ
ゴニストのはＣＧＰ５４６２６＞ＳＣＨ５０９１１であった（図２）。得られるＩＣ５０は、異なる膜調製物間で再現可能であった（図３）。
【０１０４】
完全なライブラリースクリーニングの際に対照化合物ＧＡＢＡおよびバクロフェンと匹敵する効能で結合およびシグナル伝達特性を有するいくつかの化合物を同定した（表２）。
【０１０５】
【表２】
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【０１０６】
アゴニスト遠心分離結合アッセイ
代わりの結合アッセイにおいて、結合していないリガンドを濾過の代わりに遠心分離により膜から分離した。アッセイは、結合していないリガンドを微量遠心分離機において１２５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により膜から分離したという違いを有して、前記のフィルター結合アッセイに従って行った。上清を捨て、ペレットを洗浄バッファーですすぎ、そして２００μｌの水に溶解した。シンチレーション液を加え、そして結合した３Ｈ−ＧＡＢＡをＴｏｐｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ、１分／ウェル）において測定した。
【０１０７】
増加する濃度の３Ｈ−ＧＡＢＡ（最終１〜４００ｎＭ）を用いる飽和アッセイにおいて、ｈＧＡＢＡＢＲ１ａ／ＧＡＢＡＢＲ２  ＣＨＯ細胞系により発現されるＧＡＢＡＢ受容体は低親和性および高親和性アゴニスト結合部位を有することが見出された。飽和およびスキャッチャード解析の結果を表３に要約する。飽和アッセイを１０μＭのＧＡＢＡＢアンタゴニストＣＧＰ５４６２６もしくは本発明のＧＡＢＡＢアゴニストの１つ（化合物１）の存在下で行った場合、高親和性および低親和性部位の両方への３Ｈ−ＧＡＢＡ結合が阻止された（図４ａ、ｂ）。
【０１０８】
【表３】
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【０１０９】
説明
我々の知る限り、フィルター結合アッセイにおける高親和性および低親和性結合部位とのアゴニスト結合を示す、先行報告は組み換えｈＧＡＢＡ受容体の文献においてなされなかった。ＨＴＳアゴニストフィルター結合スクリーニングは、３Ｈ−ＧＡＢＡを用いて開発されている。膜調製物から独立して、既知のアゴニストおよびアンタゴニストの再現可能なＫｉ値が見出された。
【０１１０】
さらに、組み換えＧＡＢＡＢ受容体は２つのアゴニスト結合部位を有することが示されている。１つの高親和性および１つの低親和性結合部位。ＧＡＢＡＢ受容体の高親和性アゴニストは、低親和性アゴニストと比較して異なる応答を引き出すと予想される。従って、本発明の細胞系は、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストを同定することを可能にするだけではなく、化合物受容体相互作用の性質を特性化するための有用な手段も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】正のアロステリックモジュレーターＣＧＰ７９３０の存在もしくは不在下に、最大ＧＡＢＡ刺激のパーセンテージとして表されるＧＡＢＡによる膜の刺激の際のＧＴＰγ３５Ｓ−結合を示すグラフである。
【図２】アゴニスト（バクロフェン、ＧＡＢＡおよびＡＰＭＰＡ）およびアンタゴニスト（ＳＣＨ５０９１１およびＣＧＰ５４６２６）による３Ｈ−ＧＡＢＡの置換を示すグラフである。
【図３】膜調製物から独立して再現可能なアゴニストＩＣ５０値（ｎ＝５）のグラフである。
【図４】１０μＭのＣＧＰ５４６２６（ａ）もしくはＪＮＪ４３０９７４７−ＡＡＤ（ｂ）の存在もしくは不在下での両側（ｔｗｏ  ｓｉｄｅｄ）３Ｈ−ＧＡＢＡアゴニスト結合曲線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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