(57)【要約】  本発明は、様々な適用における使用のためのプローブに関する。例えばかかるプローブは、プローブに結合する核酸分子または他の分子を検出、定量、同定、または分析するために使用し得る。本発明はまた、該プローブを含む組成物およびキット、ならびに該プローブを使用する方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34、配列番号:35、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:55、配列番号:56、配列番号:57、配列番号:58、配列番号:59、配列番号:60、配列番号:61、配列番号:62、配列番号:63、配列番号:64、配列番号:65、配列番号:66、配列番号:67、配列番号:68、配列番号:69、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72、配列番号:73、配列番号:74、配列番号:75、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78、配列番号:79、配列番号:80、配列番号:81、配列番号:82、配列番号:83、配列番号:84、配列番号:85、配列番号:86、配列番号:87、配列番号:88、配列番号:89、配列番号:90、配列番号:91、配列番号:92、配列番号:93、配列番号:94、配列番号:95、配列番号:96、配列番号:97、配列番号:98、配列番号:99、配列番号:100、配列番号:101、配列番号:102、配列番号:103、配列番号:104、配列番号:105、配列番号:106、または配列番号:107
に示すヌクレオチド配列を実質的に含む核酸、および
（b）低ストリンジェンシー条件下で（a）の核酸の相補体にハイブリダイズする、少なくとも一つの核酸または核酸類似体
から選択される核酸プローブ。
【請求項２】
（a）部分の核酸が、
配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34、配列番号:35、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:55、配列番号:56、配列番号:57、配列番号:58、配列番号:59、配列番号:60、配列番号:61、配列番号:62、配列番号:63、配列番号:64、配列番号:65、配列番号:66、配列番号:67、配列番号:68、配列番号:69、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72、配列番号:73、配列番号:74、配列番号:75、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78、配列番号:79、配列番号:80、配列番号:81、配列番号:82、配列番号:83、配列番号:84、配列番号:85、配列番号:86、配列番号:87、配列番号:88、配列番号:89、配列番号:90、配列番号:91、配列番号:92、配列番号:93、配列番号:94、配列番号:95、配列番号:96、配列番号:97、配列番号:98、配列番号:99、配列番号:100、配列番号:101、配列番号:102、配列番号:103、配列番号:104、配列番号:105、配列番号:106、または配列番号:107
に示す配列と70%同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸プローブ。
【請求項３】
（a）部分の核酸が、
配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34、配列番号:35、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:55、配列番号:56、配列番号:57、配列番号:58、配列番号:59、配列番号:60、配列番号:61、配列番号:62、配列番号:63、配列番号:64、配列番号:65、配列番号:66、配列番号:67、配列番号:68、配列番号:69、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72、配列番号:73、配列番号:74、配列番号:75、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78、配列番号:79、配列番号:80、配列番号:81、配列番号:82、配列番号:83、配列番号:84、配列番号:85、配列番号:86、配列番号:87、配列番号:88、配列番号:89、配列番号:90、配列番号:91、配列番号:92、配列番号:93、配列番号:94、配列番号:95、配列番号:96、配列番号:97、配列番号:98、配列番号:99、配列番号:100、配列番号:101、配列番号:102、配列番号:103、配列番号:104、配列番号:105、配列番号:106、または配列番号:107
に示す配列と80%同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸プローブ。
【請求項４】
（a）部分の核酸が、
配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34、配列番号:35、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:55、配列番号:56、配列番号:57、配列番号:58、配列番号:59、配列番号:60、配列番号:61、配列番号:62、配列番号:63、配列番号:64、配列番号:65、配列番号:66、配列番号:67、配列番号:68、配列番号:69、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72、配列番号:73、配列番号:74、配列番号:75、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78、配列番号:79、配列番号:80、配列番号:81、配列番号:82、配列番号:83、配列番号:84、配列番号:85、配列番号:86、配列番号:87、配列番号:88、配列番号:89、配列番号:90、配列番号:91、配列番号:92、配列番号:93、配列番号:94、配列番号:95、配列番号:96、配列番号:97、配列番号:98、配列番号:99、配列番号:100、配列番号:101、配列番号:102、配列番号:103、配列番号:104、配列番号:105、配列番号:106、または配列番号:107
に示す配列と90%同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸プローブ。
【請求項５】
（a）部分の核酸が、
配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34、配列番号:35、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:55、配列番号:56、配列番号:57、配列番号:58、配列番号:59、配列番号:60、配列番号:61、配列番号:62、配列番号:63、配列番号:64、配列番号:65、配列番号:66、配列番号:67、配列番号:68、配列番号:69、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72、配列番号:73、配列番号:74、配列番号:75、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78、配列番号:79、配列番号:80、配列番号:81、配列番号:82、配列番号:83、配列番号:84、配列番号:85、配列番号:86、配列番号:87、配列番号:88、配列番号:89、配列番号:90、配列番号:91、配列番号:92、配列番号:93、配列番号:94、配列番号:95、配列番号:96、配列番号:97、配列番号:98、配列番号:99、配列番号:100、配列番号:101、配列番号:102、配列番号:103、配列番号:104、配列番号:105、配列番号:106、または配列番号:107
に示す配列と95%同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸プローブ。
【請求項６】
（a）部分の核酸が、
配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34、配列番号:35、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:55、配列番号:56、配列番号:57、配列番号:58、配列番号:59、配列番号:60、配列番号:61、配列番号:62、配列番号:63、配列番号:64、配列番号:65、配列番号:66、配列番号:67、配列番号:68、配列番号:69、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72、配列番号:73、配列番号:74、配列番号:75、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78、配列番号:79、配列番号:80、配列番号:81、配列番号:82、配列番号:83、配列番号:84、配列番号:85、配列番号:86、配列番号:87、配列番号:88、配列番号:89、配列番号:90、配列番号:91、配列番号:92、配列番号:93、配列番号:94、配列番号:95、配列番号:96、配列番号:97、配列番号:98、配列番号:99、配列番号:100、配列番号:101、配列番号:102、配列番号:103、配列番号:104、配列番号:105、配列番号:106、または配列番号:107
に示す配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸プローブ。
【請求項７】
プローブが、少なくとも一つの検出可能な標識を含む、請求項１記載の核酸プローブ。
【請求項８】
少なくとも一つの検出可能な標識が、少なくとも一つの発色団、蛍光色素、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、量子ドット（Quantum Dot）、ビーズ（bead）、アミノヘキシル、ピレン、および化学発光化合物から選択される、請求項１記載の核酸プローブ。
【請求項９】
蛍光色素が、少なくとも一つの5（6）−カルボキシフルオレセイン、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、（ジエチル−アミノ）クマリン、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、リサミン、テキサスレッド（Texas Red）、AMCA、TRITC、IR色素、Dyomics色素、フィコエリトリン、カスケードブルー、オレゴングリーン（Oregon green）488、パシフィックブルー、ローダミングリーン、およびAlexa色素から選択される、請求項８記載の核酸プローブ。
【請求項１０】
ハプテンが少なくとも一つの5（6）−カルボキシフルオレセイン、2,4−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ローダミン、ブロモデオキシウリジン、スルホネート、アセチルアミノフルレン、トリニトロフェノール（trintrophonol）水銀、エストラジオール、およびビオチンから選択される、請求項８記載の核酸プローブ。
【請求項１１】
酵素が、少なくとも一つのダイズペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびホースラディッシュペルオキシダーゼから選択される、請求項８記載の核酸プローブ。
【請求項１２】
化学発光化合物がアクリジニオンである、請求項８記載の核酸プローブ。
【請求項１３】
（a）配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34、配列番号:35、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:55、配列番号:56、配列番号:57、配列番号:58、配列番号:59、配列番号:60、配列番号:61、配列番号:62、配列番号:63、配列番号:64、配列番号:65、配列番号:66、配列番号:67、配列番号:68、配列番号:69、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72、配列番号:73、配列番号:74、配列番号:75、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78、配列番号:79、配列番号:80、配列番号:81、配列番号:82、配列番号:83、配列番号:84、配列番号:85、配列番号:86、配列番号:87、配列番号:88、配列番号:89、配列番号:90、配列番号:91、配列番号:92、配列番号:93、配列番号:94、配列番号:95、配列番号:96、配列番号:97、配列番号:98、配列番号:99、配列番号:100、配列番号:101、配列番号:102、配列番号:103、配列番号:104、配列番号:105、配列番号:106、または配列番号:107
に示すヌクレオチド配列の相補体を実質的に含む核酸、および
（b）低ストリンジェンシー条件下で（a）の核酸にハイブリダイズする、少なくとも一つの核酸または核酸類似体
から選択される核酸プローブ。
【請求項１４】
（a）請求項１記載の少なくとも2つの核酸プローブ、ならびに
（b）染色体構造の変化を検出するためのアッセイを行うための試薬および組成物
を含むキット。
【請求項１５】
染色体の試料に対する核酸の非特異的結合を阻害する試薬をさらに含み、試薬がPNAおよび総ヒトDNAから選択される、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
a）染色体の標本を得ること
b）染色体の標本を請求項１記載の少なくとも2つの核酸プローブと接触させることであって、ここで請求項１記載の各プローブが異なる標識を含み、その結果請求項１記載の各核酸を請求項１記載の他の核酸と識別し得、標識された核酸プローブが正常染色体対照試料への結合時に特定可能な染色パターンを創造する該接触、および
c）正常染色体対照試料の染色パターンと比較したときの染色体標本における染色パターンの変化を検出することにより染色体構造の変化を検出すること
を含む、染色体構造の変化を検出する方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の少なくとも1つの核酸プローブおよび少なくとも1つのブロッキングプローブを含む、組成物。
【請求項１８】
ブロッキングプローブが核酸および核酸類似体の1つから選択される、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
ブロッキングプローブが標識されていない、請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】
ブロッキングプローブが検出可能な標識を含む、請求項１７記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、どちらも2004年5月4日に出願され、その全体が参考文献により本明細書に組み込まれる、米国特許仮出願第60／567,570号及び同第60／567,440号の優先権を主張する。
【０００２】
本出願は、印刷紙コピーではなくCD−Rによって提出され、その全体が参考文献により本明細書に組み込まれる、「非常に長い」配列表を包含する。2005年5月3日に記録された前記CD−Rは、それぞれラベル付きCRF、「コピー1」、「コピー2」及び「コピー3」であり、各々が唯一の同一21.4MBファイル（91386pct.APP）を含む。
【０００３】
本発明は、様々な適用における使用のためのプローブに関する。例えばこれらのプローブは、プローブに結合する核酸分子又は他の分子を検出する、定量する、特定する又は分析するために使用し得る。本発明はまた、前記プローブを含む組成物及びキット並びに前記プローブを使用する方法を包含する。
【背景技術】
【０００４】
プローブに基づくアッセイは、プローブを核酸試料にハイブリダイズさせることによる核酸の検出、定量及び分析において有用である。プローブは、細菌、真菌、ウイルス又は他の生物からの核酸の存在に関して試料を分析するために長年にわたって使用されてきた（例えば米国特許第4,851,330号、同第5,288,611号、同第5,567,587号、同第5,601,984号及び同第5,612,183号参照）。プローブに基づくアッセイはまた、以下で述べるように、対象とする遺伝学に基づく臨床状態を検査する上でも有用である。
【０００５】
核酸試料にハイブリダイズするために使用し得るいくつかのタイプのプローブが存在する（一般的にはSzeles, Acta Microbiol. Immmunol. Hungarica, 49:69-80 (2002)参照）。これらのプローブは、短い配列のゲノムDNA又はcDNA、全染色体ペイント、染色体反復配列及び全ゲノムを含む。ゲノムプローブの場合、哺乳動物ゲノムにおいてしばしば反復される配列は、相対的に進化的保存をほとんど有さない。それ故、全核又はゲノムDNAを種特異的プローブとして使用することができる。染色体ペイントは、単一染色体型に由来するDNA配列のコレクションであり、分裂中期及び間期の核における特定染色体型を特定することができる。種々の染色体型はまた、プローブハイブリダイゼーションのための標的となり得る特有の反復配列を持つ（Cremer et al., Hum. Genet., 74:346-52 (1986)参照）。これらの染色体反復配列プローブは、ヒト染色体型の3分の2以上についてクローン化されている（Szeles, Acta Microbiol. Immmunol. Hungarica, 49:69-80 (2002)参照）。特有の単一コピー配列を標的する大型挿入プローブは、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用し得るプローブ型のもう1つの例である。これらのプローブは、コスミド、細菌人工染色体（BAC）、P1由来(diverted)人工染色体（PAC）、又は酵母人工染色体（YAC）であり得る。これらの大型プローブに関しては、ハイブリダイゼーション効率はプローブの大きさに反比例する。それでもやはり、２ｋｂという小さなプローブが使用されてきた（同上参照）。
【０００６】
分子生物学における基本的工程を含む、インサイチュハイブリダイゼーションによる核酸配列の検出は数年間にわたって適用されてきた（Speel, Histochem. Cell Biol., 112:89-113 (1999)）。非常に短いオリゴマー（＜10塩基対「bp」）における一塩基という微妙な配列相違（点突然変異）が、非標的配列と比較したときに相補的核酸標的配列へのハイブリダイゼーションの識別を可能にするのに十分であり得る。それにもかかわらず、固有生物又は対象とする臨床状態を正しく特定するために必要な配列多様性を得るためには、一般に10bp以上の長さのプローブが必要とされる。野生型と突然変異複合体の間での熱安定性の差はプローブの長さが上昇するにつれて低下するので、密接に関連する配列を識別する能力はハイブリダイゼーションプローブの長さに反比例する。インサイチュハイブリダイゼーションは、放射能標識されたプローブを使用することによって始まった。現在は、しかしながら、以下に述べるように、いくつかの選択的検出可能標識が使用可能である。
【０００７】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「FISH」）は、本発明のプローブを使用し得るプローブベースのアッセイの一例である。FISHは1970年代後期に最初に開発された（Rudkin および Stollar, Nature, 265:472-73 (1977)）。この技術は一般に、細胞試料を調製すること、プローブを標識すること、標的染色体及びプローブを変性させること、プローブを標的配列にハイブリダイズさせること、及びシグナルを検出することを必要とする。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー又は他の適切な機器を用いて位置、大きさ又は数が測定できるように標的配列を蛍光的に染色する。哺乳動物細胞において、染色体は対合して配列される。対の各々の染色体は姉妹染色体である。市販の機器と組み合わせた現在のハイブリダイゼーション技術を用いて全ゲノムから数キロ塩基までの範囲にわたるDNA配列を検討することができる。
【０００８】
FISHに基づく染色は、ハイブリダイゼーションシグナルが分裂中期スプレッド（metaphase spreads）及び間期核の両方で認められるように十分に差異的である。プローブを使用した、単色又は多色FISHは、出生前診断、白血病診断、及び腫瘍細胞遺伝学を含む、一般に分子細胞遺伝学として知られる様々な臨床適用に利用されてきた。一般に、FISH技術は、使用の容易さ、迅速な結果、蛍光標識に先行する放射能標識と比較して低いバックグラウンド、及び高い感受性を含むいくつかの利点を有する。
【０００９】
FISH技術は臨床環境におけるいくつかの適用を有する。これらの適用としては、例えば、出生前診断における染色体異数性、血液癌及び固形腫瘍の検出；癌遺伝子増幅、遺伝子欠失又は遺伝子融合などの遺伝子異常の検出；転座、重複、挿入又は逆位などの染色体構造異常；微小欠失症候群などの隣接遺伝子症候群の検出；治療の遺伝的影響の観測；体細胞内のウイルス性核酸及び染色体内のウイルス組込み部位の検出；遺伝子マッピング；及び細胞周期分析が挙げられる（Luke および Shepelsky, Cell Vision 5:49-53 (1998)）。
【００１０】
癌研究における適用に関しては、FISH技術は、乳房、腎臓、肺、子宮、精巣及び卵巣を含む様々な組織における癌と関連付けられてきた、ヒト染色体内のいくつかの欠失を生じやすい領域の特定を導いた（Szeles, Acta Microbiol. Immmunol. Hungarica, 49:69-80 (2002)）。FISH分析はまた、腫瘍サプレッサー遺伝子及びDNA修復遺伝子を分析するためにも使用されてきた。
【００１１】
当該技術分野において染色体を分析するために使用されてきたFISH技術のいくつかの変法が存在する（Luke および Shepelsky, Cell Vision 5:49-53 (1998)）。例えば比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）では、全ゲノムを染色し、異常コピー数を有する領域の検出のために正常標準ゲノムと比較する。FISHは、スペクトルの異なる蛍光色素が使用可能であるので、多数のハイブリダイゼーションプローブの同時検出のために理想的に適する。加えて、FISHはハイブリダイゼーションシグナルの正確な定量を可能にする。これらの特徴が多色適用への道を開き、染色体のFISHに基づく核型決定のための24又はそれ以上のDNAプローブの同時ハイブリダイゼーションへと進化した。そのような適用のために、多重(mutiplex)FISH（m−FISH；Speicherら, Nat. Genet., 12:368-75 (1996)）、スペクトル核型決定（SKY;Schrockら, Science, 273:494-97 (1996)）、総合二値比標識（combined binary ration labeling）（COBRA; Tankeら, Eur. J. Hum. Genet., 7:2-11 (1999)）、又は色変化核型決定（color-changing karyotyping）（Henegariu ら, Nat. Genet., 23:263-64 (1999)）を含むいくつかの技術が開発された。さらに、異種間カラーバンディング法（Mullerら, Hum. Genet., 100:271-78 (1997)）又は高分解能多色バンディング法(high resolution multicolor banding)（Chudobaら, Cytogenet. Cell Genet., 84:156-60 (1999)）などのFISHに基づくバンディング技術が、核型決定のため及び染色体内再配列の特定を容易にするために開発された。それ故、種々様々な多色FISH技術が当業者に使用可能である。多色FISHの基本原理が最近になって再検討された（Lichter, Trends Genet., 13:475-79 (1997)）。異常物質に対して使用したとき、プローブは異常染色体を染色し、それによってそれらが由来する正常染色体を推論する（Macville Mら, Histochem Cell Biol., 108:299-305 (1997)）。ABL遺伝子のような特定DNA配列は、わずか15kbのプローブを用いて確実に染色することができる（Tkachukら, Science, 250:559-62 (1990)）。テロメア多重FISH（TM-FISH）は、1つの試料スライド上のいくつかのサブテロメアプローブの同時ハイブリダイゼーションを可能にする（Henegariuら, Lab. Invest., 81:483-91 (2001)）。これらのサブテロメアプローブは、染色体の末端から100kb−1Mbである。
【００１２】
SKYは、走査する各々のピクセルについての蛍光波長のスペクトルを評価するために電荷結合デバイス（CCD）画像化及びフーリエ分光法を使用し、特定されるスペクトルにより特定偽色を割り当てる（Schrockら, Science, 273:494-497 (1996)）。http://www.biologia.uniba.it/eca/NEWSLETTERS/NS-7/02-Multiplex-FISH.htmlで入手可能な、SKYの一般的な説明に関するE.C.A. Newsletterも参照されたい。小さなゲノムセグメントを含む染色体異常の場合は、SKY分析は、より小さなサブテロメアプローブ又は染色体彩色プローブを使用する補足的FISH分析を必要とし得る（Fanら, Genetic Testing, 4:9-14(2000); Hilgenfeldら, British J. Haematol., 113:305-17 (2001)）。
【００１３】
スプリットシグナルFISH（ssFISH）は、各々が異なる検出可能標識によって標識されている2個のプローブを使用することによって染色体構造の変化を検出する。検出可能標識は互いに識別可能であるべきである。各々のプローブは、染色体内の疑わしい切断点のいずれかの側で染色体に結合する。正常染色体では、2個のプローブは、それらの異なる標識の結合シグナルが各々の標識単独とは異なるシグナルを形成するように、互いに対して十分に近位である。それ故、正常染色体試料は、姉妹染色体上の2個のプローブの結合又は融合シグナルだけを含む。異常試料では、1個の姉妹染色体が疑わしい切断点で切断されている場合、正常な姉妹染色体上に融合シグナルが残るであろう。切断された染色体上では、1個のプローブが、完全に異なる位置に移動しており、そこではその転座したプローブの個々のシグナルが明らかになる。その他の個々のプローブは分裂した染色体上に残り、もはやその他のプローブに対して近位ではないので、やはり個々のシグナルを発する。つまり、染色体構造の切断のために、2個のプローブはもはや並列せず、それらが一緒になって生じる融合シグナルを各々のプローブについての個別シグナルに分割する。一般的にはWO第98/51817号を参照されたい。
【００１４】
融合シグナルFISHは、2個の異なる識別可能な標識を有する2個のプローブが、2個の標識の近位性が新しい融合シグナルを生じるように使用されるという点でss FISHに類似する。この2つの方法は、融合シグナルFISHについては、2個のプローブが、染色体転座の結果として互いに近位となることが疑われる2つの異なる位置に結合するという点で異なっている。それ故、正常試料では、個々のプローブからのシグナルだけが存在し、融合シグナルは現われない。1個の染色体の断片がもう1つ別の染色体に結合した異常試料では、2つの対の各々における正常染色体がまだ個々のプローブのシグナルの各々を発するであろう。プローブが、転座のために今や近位である異常染色体では、融合シグナルが現われる。融合シグナルFISHについての一般的考察については、Arnoldusら, Cytogenet. Cell Genet., 54:108-11 (1990)を参照されたい。蛍光顕微鏡を使用せずに同様の結果を得ることができる。そのような方法としては、インサイチュハイブリダイゼーション（ISH）及び放射性インサイチュハイブリダイゼーション又は発色インサイチュハイブリダイゼーション（CISH）が挙げられる。Tannerら, Am. J. Pathol., 157:1467-72 (2000)を参照されたい。
【００１５】
本発明は、上述したアッセイ又は他のプローブベースのアッセイにおいて使用し得る一連のプローブを提供する。例示的な代替のプローブベースのアッセイの一般的考察については、Veltmanら, Biotechniques, 35:1066-70 (2003)を参照されたい。
【００１６】
（発明の概要）
本発明は、様々なプローブベースのアッセイにおいて使用し得るプローブに関する。1つの態様では、プローブは、配列番号1〜107に示す核酸配列と同一である。もう1つの態様では、プローブは、配列番号1〜107に示す核酸配列と実質的に同一である。さらにもう1つの態様では、プローブは検出可能な標識で標識される。もう1つの態様では、プローブは標識されない。
【００１７】
もう１つの態様では、プローブは染色体の切断点領域に隣接する。もう１つの態様では、プローブは染色体の切断点領域と部分的に重複する。もう１つの態様では、プローブは染色体の切断点領域を越えて伸びる。
【００１８】
さらにもう1つの態様では、染色体切断点領域にある相補的標識プローブを除去し、それによって標識切断点プローブを生じさせるために、非標識プローブを使用する。例えば染色体切断点領域内に伸びる2個の区別をつけて標識されたプローブは、互いに重複し得る。図1に示すように、転座を検出するためのアッセイにおいてこれらの標識プローブを使用するとき、プローブ配列におけるこの重複のために転座の存在を隠してしまうことがある。そこで、区別をつけて標識されたプローブが転座に関して2つの識別可能なシグナルを与えるべきである場合に、重複プローブは、その代わりに、2個の標識を結合したシグナルを生じ得る。結合シグナルは、染色体内に存在する実際の転座ではなく、誤って染色体配列の重複を指示し得る。この問題は、切断点領域への標識プローブの結合と競合してそれをブロックする、過剰量の「ブロッキングプローブ」を添加し、それによって正しいシグナルを生成することによって解決できる。図1を参照されたい。ブロッキングプローブの例としては、限定されないが、標識プローブに相補的な配列を含む核酸配列、低ストリンジェンシー条件下で標識プローブに結合する核酸配列、又は低ストリンジェンシー条件下で標識プローブに結合する核酸類似体プローブが挙げられる。ブロッキングプローブは、限定されないが、プラスミド、コスミド、PAC、BAC又はYACが挙げられ、様々なベクターから作製し得る。ブロッキングプローブは非標識であり得、又は検出可能標識を含み得る。
【００１９】
さらなる態様では、核酸プローブは、(a)実質的に配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、又は配列番号107に示すヌクレオチド配列を含む核酸；及び（b）低ストリンジェンシー条件下で（a）の核酸の相補体にハイブリダイズする核酸、から選択される。別の態様において、ハイブリダイゼーションは、中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシー条件下で生じ得る。
【００２０】
1つの態様では、核酸プローブは、対象結合領域に相補的な、本明細書で開示する核酸プローブの断片である。
【００２１】
さらなる態様では、プローブは染色体構造の変化を検出するために使用し得る。染色体構造におけるこれらの変化は、様々な疾患に関連し得る。例えば、リンパ腫はしばしば転座に関連する。もう1つの例として、TELとしても知られる、ヒトETV6遺伝子（Golubら, Cell, 77:307-16 (1994)）は、12番染色体のバンドp13上の240kbの領域を占める8個のエクソンから成る（Baensら, Genome Res., 6:404-13 (1996)）。ETV6タンパク質は2つの重大なドメインを含み、エクソン3及び4によってコードされた5ヘリックス−ループ−ヘリックス（HLH）二量化ドメイン、一方エクソン6−8は3’E26形質転換特異的（ETS）DNA結合ドメインをコードする（同上）。ETV6遺伝子は、骨髄内の造血のために特に必要とされる配列特異的転写リプレッサーをコードする（Wangら, Genes Dev., 12:2392-402 (1998)）。この遺伝子は、多くの異なるパートナーと融合して、慢性骨髄単球性白血病（CMML）、急性骨髄性白血病（AML）及び急性リンパ芽球性白血病（ALL）などの広範なヒト白血病において特定されている（Mitelmanら, http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelmanにおいて入手可能）。
【００２２】
小児の癌における最も一般的な遺伝子再配列は、小児B細胞系ALLを有する症例の約22−25％でのETV6とAML1（RUNX1及びCBFA2としても知られる）の融合である（Shurtleffら, Leukemia, 9:1985-89 (1995); Romanaら, Blood, 86:4263-69 (1995)）。ETV6／AML1転座は、HLHモチーフとETS DNA結合ドメインの間の遺伝子を分断するETV6を含む。この融合は、再配列された断片が関与する染色体の形態にほとんど影響を及ぼさないので、従来の細胞遺伝学的分析では容易に見逃されてしまう隠れたｔ（12；21）転座を生じる（Ferrando および Look, Sem. Hematol., 37:381-95 (2000)）。転座していないETV6対立遺伝子の欠失は、しばしば小児ALLにおけるｔ（12；21）に関連する（Raynaudら, Blood, 87:2891-99 (1996); Caveら, Leukemia, 11:1459-64 (1997)）。この欠失の程度は、症例の大半における、ETV6の全体が欠失している場合から、少数の、欠失が遺伝子内である場合まで大きく異なり得る（Raynaudら, Blood, 87:2891-99 (1996)）。ｔ（12；21）の存在は、小児ALLにおいて91％のイベントフリー生存率を有する有意に良好な予後因子であることが示されている（Rubnitzら, J. Clin. Oncol., 15:1150-57 (1997)）。表1は、本発明のプローブによって検出される疾患のいくつかの非網羅的リストを示す。
【００２３】
【表１】
2007535968.tif 000002
2007535968.tif 000003
2007535968.tif 000004
【００２４】
他の態様は、本発明のプローブを含むキット又は組成物を包含し、前記キット又は組成物は、上記疾患又は、同様に、特許請求するプローブによって結合される標的配列と関連する他の任意の疾患を診断するために使用され得る。
【００２５】
本発明のさらなる目的及び利点は、一部には、以下の説明において示される。また、前記の一般的な説明及び以下の詳細な説明は、単なる例示及び説明であり、特許請求する本発明を限定するものではない。
【００２６】
（発明の説明）
本明細書中で使用される場合、「プローブ」という用語は、「核酸」プローブ又は「核酸類似体」プローブを指す。本明細書中で使用される場合、「核酸」という用語は、天然に生じるヌクレオチド又は非修飾ヌクレオチドだけから形成される主鎖を有する、核酸塩基配列を含むオリゴマー、ポリマー又はポリマーセグメントを指す。本明細書中で使用される場合、「核酸類似体」は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドから成るオリゴマー、ポリマー又はポリマーセグメント、又はヌクレオチドの修飾から直接誘導されるサブユニットを指す。天然に生じる核酸塩基の非限定的な例としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシルが挙げられる。修飾ヌクレオチドの非限定的な例としては、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン（pseudoisocytosine）、2−チオウラシル及び2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−（2−アミノ−6−クロロプリン）、N9−（2,6−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、N9−（7−デアザ−グアニン）、N9−（7−デアザ−8−アザ−グアニン）及びN8−（7−デアザ−8−アザ−アデニン）が挙げられる。適切な核酸塩基の他の非限定的な例としては、Buchardt ら（米国特許第6,357,163号）の図2（A）及び2（B）に例示されている核酸塩基が挙げられる。
【００２７】
「核酸類似体」という用語はまた、核酸に結合することができる合成分子を指す。例えば核酸類似体プローブは、ペプチド核酸（PNA）、ロックト核酸（LNA）又は核酸の何らかの誘導形態から構成され得る。本明細書中で使用される場合、「ペプチド核酸」又は「PNA」という用語は、その全てが参照によって本明細書中に援用される、米国特許第5,539,082号、同第5,527,675号、同第5,623,049号、同第5,714,331号、同第5,718,262号、同第5,736,336号、同第5,773,571号、同第5,766,855号、同第5,786,461号、同第5,837,459号、同第5,891,625号、同第5,972,610号、同第5,986,053号、同第6,107,470号、同第6,201,103号、同第6,228,982号及び同第6,357,163号の中でペプチド核酸として言及又は特許請求されている任意のオリゴマー又はポリマーセグメントを含むが、これらに限定されない、少なくとも1又はそれより多くのPNAサブユニット（残基）を含む任意のオリゴマー又はポリマーを意味する。PNAという用語はまた、以下の公表文献の中に記述されている核酸模倣体の2つ又はそれ以上のサブユニットを含む任意のオリゴマー又はポリマーセグメントに適用される：Lagriffoul ら, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 4: 1081-1082 (1994); Petersen ら, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 6: 793-796 (1996); Diderichsen ら, Tett. Lett. 37: 475-478 (1996); Fujii ら, Bioorg. Med. Chem. Lett. 7: 637-627 (1997); Jordan ら, Bioorg. Med. Chem. Lett. 7: 687-690 (1997); Krotz ら, Tett. Lett. 36: 6941-6944 (1995); Lagriffoul ら, Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 1081-1082 (1994); Diederichsen, U., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 7: 1743-1746 (1997); Lowe ら, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, (1997) 1: 539-546; Lowe ら, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 11: 547-554 (1997); Lowe ら, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1:5 55-560 (1997); Howarth ら, J. Org. Chem. 62: 5441-5450 (1997); Altmann, K-H ら, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 7: 1119-1122 (1997); Diederichsen, U., Bioorganic & Med. Chem. Lett., 8: 165-168 (1998); Diederichsen ら, Angew. Chem. Int. Ed., 37: 302-305 (1998); Cantin ら, Tett. Lett., 38: 4211-4214 (1997); Ciapetti ら, Tetrahedron, 53: 1167-1176 (1997); Lagriffoule ら, Chem. Eur. J., 3: 912-919 (1997); Kumar ら, Organic Letters 3(9): 1269-1272 (2001); 及び国際公開広報第WO96/04000号に開示されているShah らのPeptide-Based Nucleic Acid Mimics (PENAMs)。本明細書中で使用される場合、「ロックト核酸」又は「LNA」という用語は、少なくとも1又はそれ以上のLNAサブユニットを含むオリゴマー又はポリマーを意味する。本明細書中で使用される場合、「LNAサブユニット」という用語は、リボースの2’−酸素を4’−炭素と結合するメチレン架橋を含むリボヌクレオチドを意味する。一般に、Kurreck, Eur. J. Biochem., 270:1628-44 (2003)参照。
【００２８】
「同一」という用語は、当該配列が所与の配列の非反復領域と100％同一であることを意味する。「実質的に同一」又は「実質的に」という用語は、当該配列が所与の配列の非反復領域と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％又は99％同一であることを意味する。例として、そのような配列は、様々な種から誘導される配列である対立遺伝子変異体であり得るか、又は末端切断、欠失、アミノ酸置換又は付加によって所与の配列から誘導され得る。核酸に関しては、比較配列の長さは一般に、少なくとも50、100、150、300又はそれより多くのヌクレオチドである。2個の配列の間の同一性パーセントは、例えばAltschul ら, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)に述べられているBasic Local Alignment Tool（BLAST）、Needleman ら, J. Mol. Biol., 48:444-453 (1970)のアルゴリズム、又はMeyers ら, Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)のアルゴリズムなどの標準アラインメント（alignment）アルゴリズムによって決定される。
【００２９】
1つの態様では、核酸プローブは、（a）表2に示す少なくとも1つのヌクレオチド配列を実質的に含む核酸；及び（b）低ストリンジェンシー条件下で（a）の核酸の相補体にハイブリダイズする核酸、から選択される。
【００３０】
【表２】
2007535968.tif 000005
2007535968.tif 000006
2007535968.tif 000007
2007535968.tif 000008
【００３１】
別の態様では、本発明の核酸プローブは、表2において特定される配列の少なくとも1つと同一である。
【００３２】
プローブはある条件下で標的配列に結合する。「結合する」という用語は「ハイブリダイズする」と同義である。2個の分子がハイブリダイズするとき、それらは1つ以上の種類の化学結合を通して、相補的塩基対合を通して又は水素結合の形成を通して、2個の分子の組合せを形成する。加えて、プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを妨げない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって連結され得る。それ故、オリゴヌクレオチドプローブは、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって連結された成分塩基を有し得る。本明細書中で使用される場合、相補的という用語は、互いにハイブリダイズし得る核酸塩基を指す。例えばアデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。本明細書中で使用される場合、「ある条件下で結合する」という用語は、互いにかなり同一又は相同であるヌクレオチド配列が互いに結合したままである、ハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件を表わすことが意図されている。前記条件は、少なくとも約80％及び少なくとも約85〜90％同一であるような、少なくとも約70％同一である配列が互いに結合したままであるような条件であり得る。本明細書中で使用される場合、「標的配列」という用語は、測定しようとする核酸塩基配列を指す。前記核酸塩基配列は、対象とする核酸分子（例えば染色体）のサブ配列（subsequence）であり得る。他の態様では、標的配列は、ETV6遺伝子、MLL遺伝子、TCF3遺伝子（E2A遺伝子としても知られる）又はTLX3遺伝子（HOX11L2遺伝子としても知られる）内に位置する。
【００３３】
適切なハイブリダイゼーション条件は、Ausubel ら (1995), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 2, 4, および 6節に例示されるように最小限の実験で当業者によって選択され得る。加えて、ストリンジェンシー条件は、Sambrook ら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, 7, 9, および 11章に述べられている。本明細書中で使用される場合、「低ストリンジェンシー（low stringency）」の定義条件は以下の通りである。DNAを含むフィルターを、35％ホルムアミド、5×SSC、50mM Tris-HCl（pH7.5）、5ｍM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA及び500μg/ml変性サケ精子DNAを含む溶液中、40℃で6時間前処理する。ハイブリダイゼーションを、以下の修正を加えて同じ溶液中で実施する：0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/mlサケ精子DNA、10％（重量／容量）硫酸デキストラン及び5〜20×106cpmの32P標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中40℃で18〜20時間インキュベートし、その後2×SSC、25mM Tris-HCl（pH7.4）、5ｍM EDTA及び0.1％SDSを含む溶液中、55℃で1時間半洗浄する。洗浄液を新鮮溶液と交換し、60℃でさらに1時間半インキュベートする。フィルターをブロットして乾燥し、オートラジグラフィーのために感光させる。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「中ストリンジェンシー」の定義条件は以下の通りである。DNAを含むフィルターを、35％ホルムアミド、5×SSC、50mM Tris-HCl（pH7.5）、5ｍM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA及び500μg/ml変性サケ精子DNAを含む溶液中、50℃で7時間前処理する。ハイブリダイゼーションを、以下の修正を加えて同じ溶液中で実施する：0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/mlサケ精子DNA、10％（重量／容量）硫酸デキストラン及び5〜20×106cpmの32P標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中50℃で30時間インキュベートし、その後2×SSC、25mM Tris-HCl（pH7.4）、5ｍM EDTA及び0.1％SDSを含む溶液中、55℃で1時間半洗浄する。洗浄液を新鮮溶液と交換し、60℃でさらに1時間半インキュベートする。フィルターをブロットして乾燥し、オートラジグラフィーのために感光させる。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「高ストリンジェンシー」の定義条件は以下の通りである。DNAを含むフィルターのプレハイブリダイゼーション（Prehybridization）を、6×SSC、50mM Tris-HCl（pH7.5）、1ｍM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA及び500μg/ml変性サケ精子DNAから成る緩衝液中、65℃で8時間から一晩実施する。フィルターを、100μg/ml変性サケ精子DNA及び5〜20×106cpmの32P標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中65℃で48時間ハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄を、2×SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll及び0.01％BSAを含む溶液中37℃で1時間実施する。これに続いて0.1×SSC中50℃で45分間の洗浄を実施する。
【００３６】
上記条件が不適切である場合は（例えば異種間ハイブリダイゼーションのために使用されるように）、当技術分野で周知の低、中及び高ストリンジェンシーの他の条件（例えば異種間ハイブリダイゼーションのために使用されるような）を使用し得る。
【００３７】
1つの態様では、プローブは検出可能な標識を含む。本明細書中で使用される場合、検出可能標識は、それによってオリゴマー又はポリマーを機器又は方法で検出可能にするためにオリゴマー又はポリマーに直接又は間接的に結合することができる部分を指す。1つの態様では、検出可能標識はプローブに直接結合し得る。もう1つの態様では、検出可能標識はプローブに間接的に結合し得る。例えば検出可能標識は、リンカーを使用することによってプローブに結合し得る。検出可能標識は、例えば蛍光色素、発色団、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、量子ドット（Quantum Dot）、ビーズ（beads）、アミノヘキシル、ピレン、及びアクリジニオンなどの化学発光化合物であり得る。本発明の方法において使用し得る蛍光色素としては、IR色素、Dyomics色素、フィコエリトリン、カスケードブルー、オレゴングリーン488、パシフィックブルー、ローダミングリーン、5（6）−カルボキシフルオレセイン、シアニン色素（すなわちCy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7）、（ジエチル−アミノ）クマリン、フルオレセイン（すなわちFITC）、テトラメチルローダミン、リサミン、テキサスレッド（Texas Red）、AMCA、TRITC及びAlexa色素が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において使用し得るハプテンとしては、5（6）−カルボキシフルオレセイン、2,4−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ローダミン、ブロモデオキシウリジン、アセチルアミノフルレン、トリニトロフェノール水銀、エストラジオール及びビオチンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において使用し得る酵素としては、ダイズペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明のプローブはキットの一部を構成し得る。1つの態様では、キットは、（a）少なくとも2個の本発明のプローブ及び（b）染色体構造の変化を検出するアッセイを実施するための他の試薬及び組成物から成る。本発明はまた、本発明のプローブを使用するための方法を含む。例えば染色体構造の変化を検出するための方法において。もう1つの態様では、本発明の方法は、（a）染色体の標本を得ること；（b）染色体の標本を、各々のプローブが他の標識と識別可能な異なる標識を含み、標識プローブが正常対照染色体の試料における染色パターンを創造する、少なくとも2個の本発明のプローブと接触させること；及び（c）正常対照試料と比較して染色体標本における染色パターンの変化を検出することによって染色体構造の変化を検出すること、を含む。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「染色体構造の変化」という用語は、正常染色体対照と比較したときの被験試料中の染色体の変化を指す。本明細書中で使用される場合、正倍数性は、正常な数の構造的に正常な染色体を有する状態である。例えばヒト女性からの正倍数性体細胞は、合計46個の染色体又は23の染色体対について、44個の常染色体および2個のX染色体を含む。正倍数性雄ウシは、58個の常染色体、1個のX染色体及び1個のY染色体を有する。
【００４０】
染色体変化の非網羅的な例は、異数性、遺伝子増幅、遺伝子欠失を含む欠失、遺伝子融合、転座、重複、挿入又は逆位を含む。本明細書中で使用される場合、異数性は、任意の正常な正倍数性状態からの逸脱又は正常な二倍体数の染色体よりも少ない又は多い染色体を有する状態を指す。異数性は最も頻繁に認められる種類の細胞遺伝学的異常である。一般に、染色体数の重大な変化の致死的性質の故に、重大な逸脱はまれにしか検出されないので、異数性は正倍数性からの小さな逸脱として認識される。本明細書中で使用される場合、増幅は、特定DNAフラグメントのコピー数の増加を指す。そのようなDNAフラグメントは、例えば遺伝子又は全染色体を含む。本明細書中で使用される場合、欠失は、核酸配列が染色体から除去される遺伝学的事象を指す。本明細書中で使用される場合、遺伝子融合は、2個の遺伝子のDNAの偶発結合を指す。遺伝子融合は転座又は逆位によって起こり得る。遺伝子融合は、ハイブリッドタンパク質又は別の遺伝子のシス調節エレメント（例えばエンハンサー又はプロモーター）の並置による1個の遺伝子の転写の調節不全を生じさせ得る。本明細書中で使用される場合、転座は、1個の染色体の核酸配列の一部がその染色体から移動して異なる染色体に結合する遺伝学的事象を指す。本明細書中で使用される場合、重複は、染色体又は染色体セグメント内のヌクレオチド配列の反復を指す。例えば重複は、重複配列に線状に並置されたヌクレオチド配列の反復を生じさせ得る。本明細書中で使用される場合、挿入は、核酸配列が染色体内の2箇所の間に導入される遺伝学的事象を指す。本明細書中で使用される場合、逆位は、染色体内の核酸配列の方向が逆転する遺伝学的事象である。本明細書中で使用される場合、染色体切断点は、染色体が2つの断片に切断している染色体内の位置を指す。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、染色体の標本は、対象とする細胞型からの染色体から成る組成物を指す。対象細胞型は哺乳動物細胞であり得る。さらなる態様では、染色体標本は、有糸分裂の様々な段階の哺乳動物細胞から作製され得る。例えば染色体標本は、分裂中期の細胞から作製され得る。FISHも、間期の細胞からの染色体の標本に関して使用し得る。FISH分析における使用のための染色体標本及び核を作製するための方法は、当業者に周知である。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、A、B、及びCなどの項目のリストに続く「の1つ以上から選択される」、「の少なくとも1つから選択される」、「1つ以上から選択される」及び「少なくとも1つから選択される」という語句は、A、B、及びCの1つ以上を選択し得ること（例えばAだけ;Bだけ；Cだけ；AとBだけ；BとCだけ；AとCだけ；又はA、B、及びC）を指示し、及びまた、各々のA、B、又はCカテゴリーの中の1つ以上の種類を選択し得ること（例えばA1とA2だけ；A1とA2とB1だけ；B1とB2とC1だけ等）も指示する。
【００４３】
ここで以下の実施例を詳細に参照するが、これらは本発明をさらに説明するためにのみ提供するものである。これらの実施例は、いかなる意味においても特許請求の範囲の範囲又は意味を限定することを意図しない。
【実施例】
【００４４】
実施例１
ユニーク配列プローブを以下のように作製した。対象プローブを含むベクターを含む細胞を各々の細胞系について適切な条件で増殖させた。プローブ配列を含むDNAを細胞培養から単離した。一般に、Zhao および Stodolsky, Methods in Molecular Biology: Library Construction, Physical Mapping, and Sequencing, 1巻, 第1版, Humana Press (2004)参照。
【００４５】
プローブ前駆体DNAをニックトランスレーションによって蛍光色素で直接標識した。氷上で、DNA 10μgを反応緩衝液250μlに再懸濁した。反応緩衝液は、10Xニックトランスレーション緩衝液（500mmol/L Tris-HCl、100mmol/L MgCl2、1mmol/L DTT、100mg/L BSA、pH7.5）25μl；10X dNTP混合物（50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA、0.5mmol/L dATP、0.5mmol/L dGTP、0.5mmol/L dCTP、0.34mmol/L dTTP、pH7.6）25μl；dUTP蛍光色素（1mmol/L ）4μl；DNAポリメラーゼＩ（Invitrogen, 10U/μl）10μl；及びDNアーゼＩ（Sigma Aldrich）0.3μlを含んだ。標識反応物（reaction）を15℃で4時間インキュベートした。500mmol/L EDTA 25μlを添加し、65℃で10分間インキュベートして反応を停止させた。組み込まれなかったヌクレオチドを、Microcon YM-10遠心ろ過装置(Milipore)を用いた遠心分離によって除去した。精製標識プローブを氷冷（−20℃）TE緩衝液（10mmol/L Tris HCl、0.1mmol/L EDTA、pH8.0）25μlに再懸濁した。
【００４６】
実施例２
中期スプレッド（spreads）及び間期核を含むスライドガラスを、Human Cytogenetics, a Practical Approach, 1巻, 第2版, D.E. Rooney および B. H. Czepulkowski 編 (1992)に述べられているように、3.7％ホルムアルデヒドを含むTBS（50mmol/L Tris、150mmol/L NaCl、pH7.6）中、室温で2分間前処理した。次にスライドガラスをリン酸緩衝食塩水（PBS）中室温で、各々の洗浄につき5分間ずつ2回洗浄した。洗浄後、スライドガラスを一連の低温（4℃）エタノール中で、70％エタノール中4℃で2分間インキュベートし、85％エタノール中4℃で2分間インキュベートし、次に96％エタノール中4℃で2分間インキュベートして、その後空気乾燥することにより、脱水した。
【００４７】
各々の標的領域に、DNAハイブリダイゼーション緩衝液（フルオレセイン標識プローブ100ng、テキサスレッド（Texas Red）標識プローブ100ng、PNAオリゴ混合物（Oligo Mix）5μM、45％ホルムアミド、300mM NaCl、5mM NaPO4、10％硫酸デキストラン）10μLを添加し、ハイブリダイゼーション領域を覆うために18×18mmのカバーガラスを置いた。カバーガラスの縁をゴム接着剤で密封した後、82℃で5分間変性させた。スライドガラスを45℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを取り除き、スライドガラスをストリンジェント洗浄緩衝液（0.2×SSC、0.1％Triton X-100）中65℃で10分間洗浄した。
【００４８】
次にスライドガラスをTBS中で１分間洗浄し、その後上述したように70％、85％及び96％の一連の低温（4℃）エタノール中で脱水した。各々のスライドガラスを、0.1μg/mLの4,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール（DAPI, Sigma Chemicals）を添加した退色防止液（Vectashield H-1000, Vector Laboratories, Inc. Burlingame）10μLとともに固定し、カバーガラスで密封した。CCDデジタルカメラを備えた蛍光顕微鏡を用いてスライドガラスを分析した。
【００４９】
図2〜6は、それぞれBCR、ETV6、MLL、TCF3及びTLX3遺伝子に結合するプローブに関する結果を示す。
【００５０】
実施例３
BCL2プローブを、正常末梢血からの中期スプレッド（metaphase spreads）からの中期染色体にハイブリダイズさせた。18番染色体上の2つの正常BCL2遺伝子座が2個の黄色の点又は共局在（co-localized）緑色／赤色シグナルによって示された。
【００５１】
BCL3プローブを、正常末梢血からの中期スプレッドからの中期染色体にハイブリダイズさせた。19番染色体上の2つの正常BCL3遺伝子座が2個の黄色の点又は共局在緑色／赤色シグナルによって示された。
【００５２】
BCL6プローブを、正常末梢血からの中期スプレッドからの中期染色体にハイブリダイズさせた。3番染色体上の2つの正常BCL6遺伝子座が2個の黄色の点又は共局在緑色／赤色シグナルによって示された。
【００５３】
CCND1プローブを、正常末梢血からの中期スプレッドからの中期染色体にハイブリダイズさせた。11番染色体上の2つの正常CCND1遺伝子座が2個の黄色の点又は共局在緑色／赤色シグナルによって示された。
【００５４】
MYCプローブを、正常末梢血からの中期スプレッドからの中期染色体にハイブリダイズさせた。8番染色体上の2つの正常MYC遺伝子座が2個の黄色の点又は共局在緑色／赤色シグナルによって示された。
【００５５】
MALTプローブを、正常末梢血からの中期スプレッドからの中期染色体にハイブリダイズさせた。18番染色体上の2つの正常MALT遺伝子座が2個の黄色の点又は共局在緑色／赤色シグナルによって示された。
【００５６】
PAX5プローブを、正常末梢血からの中期スプレッドからの中期染色体にハイブリダイズさせた。9番染色体上の2つの正常PAX5遺伝子座が2個の黄色の点又は共局在緑色／赤色シグナルによって示された。
【００５７】
TLX1プローブを、正常末梢血からの中期スプレッドからの中期染色体にハイブリダイズさせた。10番染色体上の2つの正常TLX1遺伝子座が2個の黄色の点又は共局在緑色／赤色シグナルによって示された。
【００５８】
PDGFRAプローブを、ELO-1細胞系からの中期スプレッド及び核の中期染色体、及び正常組織からの核にハイブリダイズさせた。中期スプレッドに関しては、4番染色体上の1つの正常PDGFRA遺伝子座が黄色の点又は共局在緑色／赤色シグナルによって示された。1個の赤色シグナルの喪失は低欠失（sub-deletion）を指示した。4番誘導（derivative）染色体の増幅の結果としてさらなる4番染色体が検出できた。核に関しては、4番染色体上の1つの正常PDGFRA遺伝子座が黄色の点又は共局在緑色／赤色シグナルによって示された。1個の赤色シグナルの喪失は低欠失を指示した。4番誘導染色体の増幅の結果としてさらなる4番染色体が検出できた。
【００５９】
PDGFRBプローブをまた、NALM-6細胞系からの中期スプレッドからの中期染色体にハイブリダイズさせた。5番染色体上の1つの正常PDGFRA遺伝子座が黄色の点又は共局在緑色／赤色シグナルによって示された。1個の緑色シグナルの喪失は5番誘導染色体の欠失を指示し、1個の赤色シグナルは別の染色体への転座を指示した。
【００６０】
本発明の他の態様は、本明細書及び本明細書中で開示する本発明の実施を考慮して当業者には明白である。明細書及び実施例は例示としてのみ考慮されることが意図されている。本明細書中で論じたか又は言及したかのいずれかの全ての参考文献は参照によって援用される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図1は、標識プローブの染色体切断点への結合をブロックする非標識ブロッキングプローブの使用を示す。図の上部では、2個の「赤色プローブ」を、細い線を用いて左上に示し、4個の「緑色プローブ」を太い線で右上に示す。「ブロッキングプローブ」は中間の太さの線を用いて示す。示される3つのプレート上で、明るい影の部分は第一標識からのシグナル（例えば赤色）を表わし、濃い影の部分は第二標識からのシグナル（例えば緑色）を表わし、影のない部分は共局在（例えば緑色／赤色）シグナルを表わす。
【図２】図2は、中期染色体へのBCRプローブのハイブリダイゼーションを示す。（A）異なる色のプローブを短い点線と長い点線で表わした、プローブによってカバーされる領域の図；（B）正常末梢血からの中期スプレッドへのBCRプローブのハイブリダイゼーション。22番染色体上の2つの正常なBCR遺伝子座が、2つの明るい色の点（例えば緑色と赤色シグナルの重なりからの、黄色）又は共局在する異なる色のシグナル（例えば緑色および赤色）によって示される；（C）正常末梢血からの核へのBCRプローブのハイブリダイゼーション。2つの正常なBCR遺伝子座が、2つの明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナルによって示される；（D）BV173細胞系からの中期スプレッドへのBCRプローブのハイブリダイゼーション。22番染色体上の１つの正常なBCR遺伝子座が、明るい色の点又は2つの異なる色のプローブからの共局在シグナル（図の左上の明るい点を参照されたい）によって示される。9番と22番の染色体（BV173細胞系における）の間の転座から生じる2個の誘導染色体が検出できる。付加的な9番染色体が、9番誘導染色体の増幅の結果として検出できる；（E）BV173細胞系からの核へのBCRプローブのハイブリダイゼーション。１つの正常なBCR遺伝子座が、明るい色の点又は2つの異なる色のプローブからの共局在シグナルによって示される。（ここに示される核の右上の明るい点を参照されたい）。9番と22番の染色体（BV173細胞系における）の間の転座から生じる2個の誘導染色体が検出できる。付加的な9番染色体が、9番誘導染色体の増幅の結果として検出できる。
【図３】図3は、中期染色体へのETV6プローブのハイブリダイゼーションを示す。（A）異なる色のプローブを短い点線と長い点線で表わした、プローブによってカバーされる領域の図；（B）正常末梢血からの中期スプレッドへのETV6プローブのハイブリダイゼーション。12番染色体上の2つの正常なETV6遺伝子座が、2つの明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナルによって示される；（C）正常末梢血からの核へのETV6プローブのハイブリダイゼーション。2つの正常なETV6遺伝子座が、2つの明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナルによって示される；（D）REH細胞系からの中期スプレッドへのETV6プローブのハイブリダイゼーション。12番染色体上の正常なETV6遺伝子座が欠失しており、明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナルの欠如によって示される。その代わりに、このスプレッド上に示される各々のシグナルは1つの純色（緑色又は赤色）である。12番と21番の染色体（REH細胞系における）の間の転座から生じる2個の誘導染色体が検出できる。小さな緑色のシグナルが、欠失したETV6遺伝子座の残りの部分として検出できる；（E）REH細胞系からの核へのETV6プローブのハイブリダイゼーション。12番染色体上の正常なETV6遺伝子座が欠失しており、明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナルの欠如によって示される。12番と21番の染色体（REH細胞系における）の間の転座から生じる2個の誘導染色体が検出できる。小さな緑色のシグナルが、欠失したETV6遺伝子座の残りの部分として検出できる（このスプレッド上の右上及び左下の点）。
【図４】図4は、中期染色体へのMLLプローブのハイブリダイゼーションを示す。（A）異なる色のプローブを短い点線と長い点線で表わした、プローブによってカバーされる領域の図；（B）正常末梢血からの中期スプレッドへのMLLプローブのハイブリダイゼーション。11番染色体上の2つの正常なMLL遺伝子座が、2つの明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナル（示される4個の点全部）によって示される；（C）正常末梢血からの核へのMLLプローブのハイブリダイゼーション。2つの正常なMLL遺伝子座が、2つの明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナル（示される全部の点）によって示される；（D）RS-4;11細胞系からの中期スプレッドへのMLLプローブのハイブリダイゼーション。11番染色体上の１つの正常なMLL遺伝子座が、明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナル（右上）によって示される。4番と11番の染色体（RS-4;11細胞系における）の間の転座から生じる2個の誘導染色体が検出できる；（E）RS-4;11細胞系からの核へのMLLプローブのハイブリダイゼーション。11番染色体上の１つの正常なMLL遺伝子座が、明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナル（右上と下のスプレッド上の大きな点）によって示される。4番と11番の染色体（RS-4;11細胞系における）の間の転座から生じる2個の誘導染色体が検出できる。
【図５】図5は、中期染色体へのTCF3プローブのハイブリダイゼーションを示す。（A）異なる色のプローブを短い点線と長い点線で表わした、プローブによってカバーされる領域の図；（B）正常末梢血からの中期スプレッドへのTCF3プローブのハイブリダイゼーション。19番染色体上の2つの正常なTCF3遺伝子座が、2つの明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナルによって示される；（C）正常末梢血からの核へのTCF3プローブのハイブリダイゼーション。2つの正常なTCF3遺伝子座が、2つの明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナルによって示される；（D）697細胞系からの中期スプレッドへのTCF3プローブのハイブリダイゼーション。19番染色体上の1つの正常なTCF3遺伝子座が、明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナル（右の2個の明るい点）によって示される。1番と19番の染色体（697細胞系における）の間の転座から生じる2個の誘導染色体が検出できる；（E）697細胞系からの核へのTCF3プローブのハイブリダイゼーション。19番染色体上の１つの正常なTCF3遺伝子座が、明るい色の点又は共局在する異なる色のプローブからのシグナル（スプレッド上の中央の並置する点）によって示される。1番と19番の染色体（697細胞系における）の間の転座から生じる2個の誘導染色体が検出できる。
【図６】図6は、中期染色体へのTLX3プローブのハイブリダイゼーションを示す。（A）異なる色のプローブを短い点線と長い点線で表わした、プローブによってカバーされる領域の図；（B）正常末梢血からの中期スプレッドへのTLX3プローブのハイブリダイゼーション。5番染色体上の2つの正常なTLX3遺伝子座が、2つの明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナル（ここに示す全部の点）によって示される；（C）正常末梢血からの核へのTLX3プローブのハイブリダイゼーション。2つの正常なTLX3遺伝子座が、2つの明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナルによって示される；（D）HPB-ALL細胞系からの中期スプレッドへのTLX3プローブのハイブリダイゼーション。5番染色体上の1つの正常なTLX3遺伝子座が、明るい色の点又は共局在する異なる色のシグナル（右上）によって示される。5番と14番の染色体（HPB-ALL細胞系における）の間の転座から生じる2個の誘導染色体が検出できる；（E）HPB-ALL細胞系からの核へのTLX3プローブのハイブリダイゼーション。5番染色体上の１つの正常なTLX3遺伝子座が、明るい色の点又は共局在する異なる色のプローブからのシグナル（中央の点）によって示される。5番と14番の染色体（HPB-ALL細胞系における）の間の転座から生じる2個の誘導染色体が検出できる。
【００６２】
図1−6のカラー版は、参考文献により本明細書に組み込まれ、本出願が優先権を主張する、米国特許仮出願第60/567,570号と共に提出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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