(57)【要約】  ムチンに対する免疫応答を生じさせるための発現ベクターを提供する。ベクターは分泌可能なポリペプチドをコードする転写ユニットを含み、ポリペプチドは分泌性シグナル、ムチン抗原、およびCD40リガンドを含む。また、有効量のベクターを投与することによってムチンを発現する細胞に対する免疫応答を生じさせる方法を提供する。更に、有効量のベクターを投与することによって個体においてムチンを発現する癌細胞に対する免疫応答を生じさせる方法を提供する。また、有効量のベクターを投与することによってムチン自己抗原に対する不顕性を克服する方法を提供する。
2007535304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムチン抗原に対する免疫を生じさせるための発現ベクターであって、該ベクターが分泌可能なポリペプチドをコードする転写ユニットを含み、該ポリペプチドが分泌シグナル配列、ムチン抗原、およびCD40リガンドを含む上記ベクター。
【請求項２】
該CD40リガンドが膜貫通ドメインの全部または実質的に全部を欠失している、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
該ムチン抗原をコードする配列が該CD40リガンドをコードする配列の5'側にある、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項４】
該ムチン抗原がMUC1、MUC2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC9、MUC12、MUC13、MUC15、およびMUC16からなる群から選択されるムチンに由来するものである、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項５】
該ムチン抗原がMUC1由来である、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項６】
該ムチン抗原がムチンの細胞外ドメインを含む、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項７】
該ムチン抗原がムチンのタンデムリピートの少なくとも１つを含む、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項８】
該ムチン抗原がムチンのSEAドメインの全部または一部を含む、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項９】
該ムチン抗原がMUC1の細胞外ドメインである、請求項６記載の発現ベクター。
【請求項１０】
該転写ユニットが該ムチン抗原と該CD40リガンドとの間のリンカーをコードする、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１１】
該ベクターが転写ユニットの転写を制御するためのヒトサイトメガロウイルスプロモーター/エンハンサーを含む、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１２】
該発現ベクターがウイルスベクターである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
該CD40リガンドがヒトCD40リガンドである、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１５】
該CD40リガンドが細胞質ドメインを欠失している、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１６】
ベクターが膜貫通ドメインのいずれかの末端からの6以下の残基を含むCD40リガンドをコードする、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項１７】
該ベクターがCD40リガンドの膜貫通ドメインをコードしない、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項１８】
該CD40リガンドが残基47-261を含む、請求項17記載の発現ベクター。
【請求項１９】
該CD40リガンドが残基1-23および47-261を含む、請求項17記載の発現ベクター。
【請求項２０】
該ベクターが正常なヒト細胞において非複製性とされている、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項２２】
個体においてムチン抗原を発現する細胞に対する免疫応答を生じさせる方法であって、分泌可能なポリペプチドをコードする転写ユニットを含む有効量の発現ベクターを個体に投与することを含み、該ポリペプチドが分泌シグナル配列、ムチン抗原、およびCD40リガンドを含む上記方法。
【請求項２３】
該CD40リガンドがヒトCD40リガンドである、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
該癌細胞が癌腫細胞である、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
該投与が繰り返し行われる、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
該免疫応答が該ムチン抗原に対する細胞傷害性CD8+ T細胞の生成を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
投与後、該ベクターが細胞に取り込まれ、その後細胞は転写ユニットによりコードされる融合タンパク質を分泌する、請求項22記載の方法。
【請求項２８】
該融合タンパク質がCD40リガンド細胞外ドメインの相互作用によってホモ３量体を形成する、請求項22記載の方法。
【請求項２９】
該ムチンがMUC1である、請求項22記載の方法。
【請求項３０】
該ムチンが個体中の自己抗原である、請求項22記載の方法。
【請求項３１】
ムチン抗原を発現する癌に罹患した個体の治療法であって、分泌可能なポリペプチドをコードする転写ユニットを含む有効量の発現ベクターを個体に投与することを含み、該ポリペプチドが分泌シグナル配列，ムチン抗原、およびCD40リガンドを含む上記方法。
【請求項３２】
該CD40リガンドがヒトCD40リガンドである、請求項28記載の方法。
【請求項３３】
該癌が癌腫である、請求項28記載の方法。
【請求項３４】
該投与が繰り返し行われる、請求項28記載の方法。
【請求項３５】
該免疫応答が該腫瘍関連抗原に対する細胞傷害性CD8+ T細胞の生成を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３６】
投与後、該ベクターが細胞に取り込まれ、その後細胞は転写ユニットによりコードされる融合タンパク質を分泌する、請求項28記載の方法。
【請求項３７】
該融合タンパク質がCD40リガンド細胞外ドメインの相互作用によってホモ３量体を形成する、請求項28記載の方法。
【請求項３８】
ヒトにおいてムチンに対する免疫応答を生じさせる方法であって、ここでムチンはヒト自己抗原であり、個体の免疫細胞はムチンに対して不顕性であり、分泌可能なポリペプチドをコードする転写ユニットを含む有効量の発現ベクターを個体に投与することを含み、該ポリペプチドが分泌シグナル配列、ムチン抗原、およびCD40リガンドを含む上記方法。
【請求項３９】
該CD40リガンドがヒトCD40リガンドである、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
該投与が繰り返し行われる、請求項38記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明はCD40リガンドに融合したムチン抗原を含む分泌可能なポリペプチドを発現するベクターを使用してムチンに対する免疫を生じさせることに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
以下の本発明の背景に関する記載は読者の本発明の理解を容易にするために提供するものであり、本発明に対する従来技術を記述または構成すると認めるものではない。本出願は米国特許出願第60/524,925号（2003年11月24日出願）、 60/525,552号（2003年11月25日出願）、60/529,015号（2003年12月11日出願）（これらは全て、図面も含めてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張するものである。本出願に関連する出願はPCT/US03/36237（2003年11月12日出願；標題“アデノウイルスベクターワクチン”）（図面も含めてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）である。
【０００３】
樹状細胞（DC）を含む抗原提示細胞（APC）の活性化、およびそれに続く抗原提示細胞による当該抗原の担持は、癌細胞に対するT細胞依存型免疫応答の生成に必須の段階である。腫瘍抗原での活性化および担持が起こると、DCは所属リンパ節（LN）に移動し、T細胞に対して抗原を提示する。非常に多くの場合、これらのAPCは、腫瘍抗原を認識する能力のあるT細胞クローンが最適に活性化および増殖するのに必要な表面活性化分子を不十分な量しか発現しない。Shortman, ら, Stem Cells 15:409-419, 1997参照。
【０００４】
APCの表面上で共刺激分子が発現していない状態でナイーブT細胞へ抗原が提示されると、T細胞は不顕性（anergy）となる。Steinbrinkら, Blood 99: 2468-2476, 2002参照。更に、CD4+T細胞の助力なしでのDCによるクロスプレゼンテーションでは、末梢での所属LNにおけるAg特異的T細胞の欠失が起こる。Kusuharaら, Eur J Immunol 32:1035-1043, 2002参照。これに対して、CD4+T細胞の助力があれば、DCはT細胞をクロスプライム（Cross-prime）する機能的能力を習得し、それによってエフェクターT細胞のクローン増殖が起こる。Gunzerら, Semin Immunol 13:291-302, 2001参照。このCD4+T細胞の助力はCD40-CD40リガンド（CD40L）相互作用で置き換えることができる。Luftら, Int Immunol 14:367-380, 2002参照。CD40Lは33kDaのII型膜タンパク質で、TNF遺伝子ファミリーのメンバーであり、TCRの活性化（engagement）後にCD4+T細胞上で一時的に発現される。Skovら, J Immunol. 164: 3500-3505, 2000参照。
【０００５】
インビボにおいてDCが抗腫瘍免疫応答を生じさせる能力は多くの動物腫瘍モデルで報告されている。Pagliaら, J Exp Med 183: 317-322, 1996；Zitvogelら, J Exp Med. 183: 87-97, 1996参照。しかしながら、DCが介在する免疫誘導には多くの治療上の困難がある。抗原提示細胞が好適な接着分子およびケモカイン受容体を発現して第2のリンパ器官にDCを誘引し、T細胞をプライミングするようにさせることを確実にすることは困難であると考えられている。Fongら, J Immunol. 166: 4254-4259, 2001；Markowiczら, J Clin Invest. 85: 955-961, 1990；Hsuら, Nat Med. 2: 52-58, 1996；Nestleら, Nat Med. 4: 328-332, 1998； Murphyら, Prostate 38: 73-78, 1999；Dhodapkarら, J Clin Invest. 104: 173-180, 1999参照。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
第1の観点では、本発明はムチンに対する免疫を生じさせるための発現ベクターを提供する。ベクターは分泌シグナル配列、ムチン抗原、およびCD40リガンドを含む分泌可能なポリペプチドをコードする転写ユニットを含む。好ましい態様では、CD40リガンドはヒトCD40リガンドである。
【０００７】
あるアプローチでは、転写ユニット中のムチン抗原をコードする配列はCD40リガンドをコードする配列の5'側にある。別のアプローチでは、転写ユニット中のCD40リガンドをコードする配列はムチン抗原をコードする配列の5'側にある。好ましい態様では、CD40リガンドはその膜貫通ドメインの全部または一部を欠失している。
【０００８】
好ましい態様では、発現ベクターはウイルス発現ベクターであってもよく、非ウイルス発現ベクターであってもよい；例えばアデノウイルスベクター；ムチン抗原がMUC1、MUC2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC9、MUC12、MUC13、MUC15、およびMUC16からなる群から選択されるムチン由来である；ムチン抗原がMUC1由来である；ムチン抗原がムチンの細胞外ドメインを含む；またはムチンのタンデムリピートの少なくとも1つ；そして転写ユニットが腫瘍抗原とCD40リガンドとの間のリンカーをコードする配列を含む。好適なリンカーの長さおよび組成は種々である。
【０００９】
他の態様では、発現ベクターは、転写ユニットの転写を制御するためのヒト・サイトメガロウイルス・プロモーター/エンハンサーを含む。
【００１０】
別の観点では、本発明は、アミノ末端側から出発して、分泌シグナル配列、ムチン抗原、および分泌型CD40リガンドを含むポリペプチドをコードする転写ユニットを含む有効量のベクターを投与することにより、個体においてムチン抗原を発現する細胞に対する免疫応答を生じさせる方法を提供する。
【００１１】
好ましい態様では、細胞は癌細胞である；そしてこの方法によりムチンに対する細胞傷害性CD8+T細胞が生成される。
【００１２】
更に別の観点では、本発明はムチン抗原を発現する癌に罹患した個体を治療する方法を提供する。この方法は上記のムチン抗原およびCD40リガンドを含むポリペプチドをコードする転写ユニットを含有する有効量のベクターを個体に投与することを含む。
【００１３】
好ましい態様では、癌細胞は癌腫細胞である。
【００１４】
更なる観点では、本発明はヒトにおいてムチンに対する免疫応答を生じさせる方法を提供し、ここでムチンはヒト自己抗原であり、個体の免疫細胞はムチンに対して不顕性である。方法は上記のムチン抗原およびCD40リガンドを含むポリペプチドをコードする転写ユニットを含有する有効量のベクターを個体に投与することを含む。
【００１５】
上記の方法において、有利には、ベクターを皮下投与し、続けて1回以上投与して免疫応答を増加させてもよい。抗原に対する免疫は長期にわたって持続し、細胞傷害性CD8+T細胞の生成を伴う。
【００１６】
本明細書で使用する略号には以下がある：“Ad”（アデノウイルス）；“sig”（シグナル配列）；および“ecd”（細胞外ドメイン）。
【００１７】
これらおよび他の態様を以下に詳細に記述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明のある観点によれば、ムチン抗原に対する免疫を生じさせるためのベクターを提供する。ベクターは分泌シグナル配列、ムチン抗原、およびCD40リガンドを含む分泌可能なポリヌクレオチドをコードする転写ユニットを含む。好ましい態様では、転写ユニットはアミノ末端側から、分泌シグナル配列、ムチン抗原、および分泌型CD40リガンドを含む。好ましい態様では、分泌型CD40リガンドはその膜貫通ドメインの全部または実質的に全部を欠失している。
【００１９】
本明細書で使用する転写ユニットを含む“ベクター”（“発現ベクター”としても知られる）という用語は、インビボで投与された時に標的細胞に侵入してコードされたタンパク質を発現できるウイルス性および非ウイルス性の発現ベクターをいう。インビボでの運搬および外因性タンパク質の発現に好適なウイルスベクターは周知であり、それらにはアデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純疱疹ウイルスベクターなどがある。ウイルスベクターは好ましくは正常細胞内で複製欠陥を起こす（are preferably made replication defective in normal cells）。米国特許第6,669,942号；6,566,128号；6,794,188号；6,110,744号；6,133,029号参照。
【００２０】
本明細書で使用する“アデノウイルス発現ベクター”という用語は、ポリペプチドをコードする、そのゲノムに挿入された外因性DNAを含むアデノウイルス由来の任意のベクターをいう。ベクターは、任意の欠損した必須遺伝子がトランスで提供された際に、複製および封入される能力を有さなければならない。好ましくは、アデノウイルスベクターはウイルスDNAの複製を支持するのに必要な各末端反復の少なくとも一部、好ましくは完全長ITR配列の少なくとも約90％、およびウイルスキャップシドにゲノムを封入するのに必要なDNAを含む。多くの好適なアデノウイルスベクターが当該分野で報告されてきた。米国特許第6,440,944号および6,040,174号参照（複製欠陥E1欠損ベクターおよび特殊化パッケージング細胞系）。好ましいアデノウイルス発現ベクターは、正常細胞において複製欠陥のあるものである。
【００２１】
アデノ関連ウイルスとは、その遺伝物質を19番染色体上の特定の部位に挿入できる小型1本鎖DNAウイルスのクラスを表す。遺伝子運搬のためのアデノ関連ウイルスベクターの調製および使用は米国特許第5,658,785号に記載されている。
【００２２】
遺伝子運搬のための非ウイルス性ベクターには、運搬の際にベクターのDNAを保護するために脂質、タンパク質、および他の分子（またはそれらを組み合わせたもの）と合わせた種々の型の発現ベクター（例えばプラスミド）が含まれる。融合性（Fusigenic）非ウイルス性ベクター粒子は、ウイルス性融合タンパク質を記載の発現ベクターと組み合わせることによって構築できる。Kaneda, Curr Drug Targets (2003) 4(8):599-602。再構築したHVJ（hemagglutinating virus of Japan；センダイウイルス）-リポソームを使用して発現ベクターを運搬するか、またはリポソームを使用せずに不活性化HVJ粒子にベクターを直接導入することもできる。Kaneda, Curr Drug Targets (2003) 4(8):599-602参照。DMRIE/DOPE脂質混合物は非ウイルス性発現ベクターの媒体として有用である。米国特許第6,147,055号参照。ポリカチオン-DNA複合体を非ウイルス性遺伝子運搬媒体として使用してもよい。Thomasら, Appl Microbiol Biotechnol (2003) 62(1):27-34参照。
【００２３】
本明細書において発現ベクターに関連して使用する“転写ユニット”という用語は、RNAポリメラーゼによって1本の連続するmRNA鎖として転写される一続きのDNAであって、転写の開始および停止のためのシグナルを含むものをいう。例えばある態様では、本発明の転写ユニットは5’側から3’側に、分泌シグナル配列、ムチン抗原、およびCD40リガンドをコードする核酸を含む。転写ユニットは転写および/または翻訳発現調節要素、例えばプロモーター、そして必要により任意の上流または下流エンハンサー要素と、機能的に結合している。有用なプロモーター/エンハンサーはサイトメガロウイルス（CMV）IE（immediate-early）プロモーター/エンハンサーである。米国特許第5,849,522号および 6,218,140号参照。
【００２４】
本明細書で使用する“分泌シグナル配列”（“シグナル配列”、“シグナルペプチド”、“リーダー配列”、または“リーダーペプチド”としても知られる）という用語は（in charter）一般に疎水性である約20から30アミノ酸を含む短鎖ペプチド配列をいい、これはポリペプチドのN末端で合成され、ポリペプチドを小胞体に誘導する。分泌シグナル配列は一般に、ポリペプチドの小胞体へのトランスロケーションの際に切断される。真核生物の分泌シグナル配列は、発現ベクターの外因性遺伝子産物の分泌を誘導するのに好ましい。種々のそのような好適な配列が当該分野で知られており、それらにはヒト成長ホルモン、免疫グロブリンのκ鎖の分泌シグナル配列などがある。ある態様では、外来性ムチンシグナル配列を用いて分泌を起こさせてもよい。
【００２５】
本明細書で使用する“腫瘍関連抗原”（TAA）という用語は、腫瘍細胞上、および胎児期の正常細胞上（癌胎児性抗原）に存在するタンパク質をいい、これは出産後は選択された臓器中、または多くの正常細胞上に存在するがその濃度は腫瘍細胞上よりかなり低い濃度である。種々のTAAが報告されている。代表的なTAAはムチン（例えばMUC1）であり、以下に更に詳細に記載する。これに対して腫瘍特異抗原（TSA）（腫瘍特異移植抗原またはTSTAともいう）は正常細胞には存在しないタンパク質をいう。TSAは通常、感染するウイルスによって細胞が不死化し、ウイルス抗原が発現される際に出現する。代表的なウイルスTSAはHPV16型のＥ6またはＥ7タンパク質である。ウイルスによって誘導されないTSAにはイディオタイプ、B細胞リンパ腫に関係する免疫グロブリンイディオタイプ、またはT細胞リンパ腫上のT細胞受容体（TCR）がある。
【００２６】
TAAおよびTSAは共に、発現ベクターワクチンの免疫学的標的となりうる。特に記載しない限り、本明細書において“腫瘍抗原”という用語は集合的にTAAおよびTSAを示す。
【００２７】
本明細書で使用する“ムチン”という用語は、スレオニン、セリン、およびプロリン含量の高いタンデムリピート構造を持つペプチド配列にＯ−グリコシド結合した高含量のクラスター化したオリゴ糖を有する、任意のクラスの高分子量糖タンパク質をいう。ムチンは細胞防御において役割を果たし、伸張構造上に露出された多くの糖で、種々の型の細胞（白血球および感染性物質を含む）との複数の相互作用に影響を与える。ムチン抗原には以下と同定されているものもある：CD227、腫瘍関連上皮膜抗原（EMA）、多型上皮性ムチン（PEM）、ピーナツ反応性尿ムチン（Peanut-reactive Urinary Mucin；PUM）、エピシアリン（episialin）、乳癌関連抗原DF3、H23抗原、ムチン1、エピシアリン（Episialin）、腫瘍関連ムチン、癌関連ムチン。また、CA15-3抗原、M344抗原、Sialosyl Lewis抗原（SLA）、CA19-9、CA195、およびこれまでにモノクローナル抗体によって同定された他のムチン抗原（例えば米国特許第5,849,876号参照）もある。ムチンという用語はプロテオグリカン（タンパク質バックボーンに共有結合したグリコサミノグリカン鎖を特徴とする糖タンパク質である）を含まない。
【００２８】
少なくとも15の異なるムチンが報告されており、それらにはMUC1、MUC2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC9、MUC12、MUC13、MUC15、およびMUC16が含まれる（これらは“MUC”と数字の間にハイフンを入れて示してもよい）。これらのムチンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は周知である。これらムチンのNCBIおよびSwiss Protアクセッション番号は以下の通りである：MUC1（NCBI NM002456, Swiss Prot P15941）、MUC2（NCBI NM002457, Swiss Prot Q02817） 、MUC3A（NCBI AF113616, Swiss Prot Q02505）、MUC3B（NCBI AJ291390, Swiss Prot Q9H195）、MUC4（NCBI NM138299, Swiss Prot Q99102）、MUC5AC（NCBI AF043909, Swiss Prot Q8WWQ5）、MUC5B（Swiss Prot Q9HC84）、MUC6（NCBI U97698, Swiss Prot Q8N8I1）、MUC7（NCBI L42983, Swiss Prot Q8TAX7）、MUC8（NCBI U14383, Swiss Prot Q12964）、MUC9（NCBI U09550, Swiss Prot Q12889）、 MUC12（Swiss Prot Q9UKN1）、MUC13（NCBI NM017648, Swiss Prot Q9H3R2）、MUC15（NCBI NM145650, Swiss Prot Q8WW41）、およびMUC16（NCBI AF361486, Swiss Prot Q8WXI7; CA125ともいう）。
【００２９】
ムチンには構造的および機能的に異なる2つのクラス：分泌型ゲル形成ムチン（MUC2、MUC5AC、MUC5B、およびMUC6）および膜貫通ムチン（MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC12、MUC17）がある。いくつかのMUC遺伝子の産物はいずれのクラスにも該当しない（MUC7、MUC8、MUC9、MUC13、MUC15、MUC16）。
【００３０】
特定の癌におけるTAAとしての特定のムチンの特徴は、前腫瘍性病変および腫瘍性病変に伴う発現および構造の変化によって確認される（Filipe MI: Invest Cell Pathol 1979, 2:195-216；Filipe MI, Acta Med Port 1979, 1:351-365）。例えば、正常な胃粘膜はMUC1、MUC5A/C、MUC6 mRNA、およびコードされる免疫反応性タンパク質の発現を特徴とする。また、高レベルのMUC2、MUC3ムチンmRNA、およびコードされる免疫反応性タンパク質は腸上皮化生に関係する。胃癌は隣接する正常な粘膜と比較して顕著に変化した分泌型ムチンmRNAレベルを示し、MUC5およびMUC6 mRNAレベルは低下し、MUC3およびMUC4  mRNAレベルは上昇する。高レベルのMUC2およびMUC3  mRNAおよびタンパク質は小腸で検出可能であり、MUC2は最も存在量の多い結腸ムチンである。
【００３１】
ムチンは膵臓癌および他の細胞型の早期検出のための診断マーカーである。研究で明らかになったところによれば、腺癌（ductal adenocarcinomas；ＤＡＣ）および腫瘍細胞系は通常、MUC1ムチンを過剰発現する。Andrianifahananaら, Clin Cancer Res 2001, 7:4033-4040参照。このムチンは、ほとんどの慢性膵炎および正常な膵臓組織では低レベルでしか検出されないが、膵臓癌の全段階で過剰発現される。膵臓癌および細胞系におけるMUC4のデノボ発現が報告されている（Hollingsworthら, Int J Cancer 1994, 57:198-203）。MUC4  mRNA発現は大多数の膵臓癌および確立された膵臓癌細胞系で観察されているが、正常な膵臓または慢性膵炎組織では観察されていない。MUC4発現は肺癌との関係も見いだされている（Nguyenら, 1996 Tumor Biol. 17:176-192参照）。MUC5は非小細胞肺癌において転移と関係する（Yuら, 1996 Int. J. Cancer 69:457-465参照）。胃型および浸潤性DACではMUC6が過剰発現され、MUC5ACがデノボ発現される（Kimら, Gastroenterology 2002, 123:1052-1060）。MUC7は浸潤性膀胱癌のマーカーとして報告されている（Retzら, 1998 Cancer Res. 58:5662-5666）。
【００３２】
MUC2分泌型ゲル形成ムチンの発現は一般に大腸腺癌で減少し、粘液癌（マイクロサテライト不安定性を伴う異なるサブタイプの大腸癌）では保存されている。MUC2は咽頭癌で上昇する（Jeannonら, 2001 Otolaryngol Head Neck Surg. 124:199-202）。別の分泌型ゲル形成ムチン、MUC5AC（正常な胃粘膜の産物）は正常な結腸には存在しないが、大腸腺癌および大腸癌では高頻度で存在する。
【００３３】
MUC1（エピシアリンとしても知られる）、多型上皮性ムチン（PEM）、ムチン様癌関連抗原（MCA）、CA27.29、ピーナツ反応性尿ムチン（PUM）、腫瘍関連上皮ムチン、上皮膜抗原（EMA）、ヒト乳脂肪球（HMFG）抗原、MUC1/REP、MUC1/SEC、MUC1/Y、CD227は最もよく知られたムチンである。MUC1をコードする遺伝子はｌq21-q24にマッピングされる。MUC1遺伝子は7つのエクソンを含み、7つの異なるスプライス変異体を生成する。タンデムリピートドメインは高度にＯ−グリコシル化されており、グリコシル化の変化が上皮癌細胞において明らかになっている。
【００３４】
MUC1  mRNAはサイズ多型である。現在のところ、スプライシングの変化に基づいて9つのMUC1のアイソフォームがある（アイソフォーム番号：NCBIアクセッション番号；1：ID P15941-1、2：ID P15941-2、3：ID P15941-3、4：ID P15941-4、5：P15941-5、6：ID P15941-6、7：ID P15941-7、8：ID P15941-8、9：ID P15941-9）。
【００３５】
MUC1アイソフォーム1（MUC1/REPともいう）は多型のＩ型膜貫通タンパク質であり、以下を含む：1）主に20-アミノ酸（aa）反復モチーフ（可変数（30-100）タンデムリピート（Variable Number of tandem repeats-VNTR）として知られる領域）から成る大型の細胞外ドメイン；2）膜貫通ドメイン；および3）72-aa細胞質尾部。生合成の際、MUC1/REPタンパク質は大幅に修飾され、相当な数のＯ−結合糖部分は成熟タンパク質上にムチン様の特徴を与える。翻訳後まもなくMUC1/REPは切断されて2つの産物となり、これらは強く結合したヘテロダイマー複合体を形成するが、これは大型の細胞外ドメインが細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含むそれよりかなり小型のタンパク質に非共有結合したものから構成される。細胞外ドメインは細胞から離脱できる。参照としてSwiss Prot P15941を用い（図1参照）、MUC1アイソフォーム1の細胞外ドメイン（ecm）はアミノ酸24から1158であり、膜貫通ドメインは1159-1181であり、そして細胞質ドメインは1182-1255である。SEAドメインは1034-1151であり、細胞外ドメインと呼ばれるC末端部分である。ムチンのSEAドメインは一般にタンパク分解による切断の標的であり、2つのサブユニットを生成し、小さい方は細胞膜と結合する。
【００３６】
MUC1アイソフォーム5（MUC1/SECともいう）は細胞によって分泌されるMUC1の型である。アイソフォーム1（MUC1/REP）と同じ細胞外ドメインを有するが、細胞膜にタンパク質を係留するための膜貫通ドメインを有さない。MUC1アイソフォーム7（MUC1/Yともいう）はアイソフォーム1（MUC1/REP）および5（MUC1/SEC）で観察される細胞質および膜貫通ドメインを含むが、MUC1より小さい細胞外ドメインを有し、反復モチーフおよびその隣接領域を有さない（Baruch A.ら, 1999 Cancer Res. 59, 1552-1561参照）。アイソフォーム7は受容体として作用し、分泌型アイソフォーム5に結合する。結合によりアイソフォーム7のリン酸エステル化が誘導され、細胞の形態学に変化が起き、GRB2のような第2のメッセンジャータンパク質を通して細胞シグナリングが開始される（Zrihan-Licht S.ら, 1995 FEBS Lett. 356, 130-136参照）。β-カテニンはMUC1の細胞質ドメインと反応することが明らかになっている（Yamamoto M.ら, 1997 J. Biol. Chem. 272, 12492-12494）。
【００３７】
MUC1は正常な上皮細胞表面上で局所的に低レベルで発現される。15参照。Greenleeら, Cancer Statistics CA Cancer J. 50, 7-33 (2000)；Renら, J. Biol. Chem. 277, 17616-17622 (2002)；Kontaniら, Br. J. Cancer 84, 1258-1264 (2001)；Rowseら, Cancer Res. 58, 315 (1998)。MUC1は乳癌、卵巣癌、膵臓癌、並びに他の癌で過剰発現される（Gendler S.J.ら, 1990 J. Biol. Chem. 265, 15286-15293も参照されたい）。MUC1遺伝子の更なるコピーの獲得と高mRNAレベルの間には相関関係が見られ（p<0.0001）、これはMUC1遺伝子の過剰発現の原因である遺伝子機構を明らかにしており、乳癌の病因におけるMUC1遺伝子投与（dosage）の役割を支持している（(Bieche I.ら, 1997 Cancer Genet. Cytogenet. 98, 75-80参照）。MUC1ムチンは免疫学的検出によれば、結腸癌（これは予後の悪さと関係する）および卵巣癌で発現が上昇する。
【００３８】
MUC1抗原の高レベル発現は、足場依存性増殖の調節を混乱させる（E-カドヘリン機能を混乱させる）ことによって腫瘍性上皮粘膜細胞の増殖において役割を果たし、これによって転移が起こる。Greenleeら, Cancer Statistics CA Cancer J. 50, 7-33 (2000)；Renら, J. Biol. Chem. 277, 17616-17622 (2002)参照。MUC1に対する非MHC制限細胞傷害性T細胞の反応が乳癌患者において報告されている。Kontaniら, Br. J. Cancer 84, 1258-1264 (2001)参照。ヒトMUC1トランスジェニックマウス（“MUC1.Tg”）はヒトMUC1抗原での刺激に反応しないことが報告されている。Rowseら, Cancer Res. 58, 315 (1998)参照。ヒトMUC1トランスジェニックマウスは自己抗原としてのMUC1に対する免疫の確立を評価するのに有用である。
【００３９】
MUC1タンパク質およびmRNAはER陽性MCF-7およびBT-474細胞、並びにER陰性MDA-MB-231およびSK-BR-3 BCC細胞において観察されている。mRNA転写レベルはER-よりER+細胞系の方が高い。MUC1は細胞内接着分子-1（ICAM-1）と反応する。MUC1の少なくとも6つのタンデムリピートが必要である（Regimbaldら, 1996 Cancer Res. 56,4244-4249）。T-47D BCC由来のMUC1のタンデムリピートペプチドは高度にＯ−グリコシル化されており、ミルク由来のムチンのリピート当たり2.6グリコシル化部位に比較してリピート当たり4.8部位である。
【００４０】
本明細書で使用する“ムチン抗原”は完全長のムチンの全部、または本明細書に記載するようにインビボで投与されたMUC-CD40L発現ベクターを用いて細胞免疫を誘導できることを特徴とするエピトープを含むムチンの一部をいう。“ムチン抗原”はムチンの細胞外ドメインからの1つ以上のエピトープ、例えばVNTRに関連する1つ以上のタンデムリピートモチーフまたはSEA領域を含む。ムチン抗原は細胞外ドメイン全体を含んでもよい。また、“ムチン抗原”の意味には、保存的アミノ酸変化など、天然のムチン配列と交差反応する免疫応答を誘導する抗原の能力を変更しない、配列の変種も含まれる。
【００４１】
VNTRは遺伝子多型およびムチンの性質に従って長さ（および組成）の異なる可変数のタンデムリピートペプチド配列から成る。VNTRは変性タンデムリピートを含有する5’および3’領域も含んでもよい。例えばMUC1では、北欧人集団においてリピートの数は21から125まで種々である。米国では、最も頻度の低い対立遺伝子は41および85リピートを含み、より一般的な対立遺伝子は60-84リピートを有する。MUC1リピートは一般的なリピートペプチド配列PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA（SEQ ID NO : 3）を有する。基礎となるMUC1タンデムリピートは太字およ下線で示す3つの位置（位置2、3、および13）における遺伝子配列多型である。協奏的置換（concerted replacement）DT→ES（配列変種1）および単一置換P→Q（配列変種2）、P→A（配列変種3）、およびP→T（配列変種4）が同定されており、ドメイン中の位置は種々である（Engelmannら, 2001 J. Biol. Chem. 276:27764-27769参照）。最も頻度の高い置換DT→ESは50％までのリピートで起こる。表1に代表的なタンデムリピート配列を示す。
【００４２】
【表１】
2007535304.tif 000003
【００４３】
本明細書で使用するムチン抗原は1つのタンデムリピート配列モチーフだけを含んでもよいが、ベクターが複数のそのようなリピートを含めば一般に生成される免疫応答はより強く、より有効であることは理解されるべきである。本発明のベクターは好ましくは2-4、より好ましくは5-9、より好ましくは10-19、より好ましくは20-29、更に好ましくは30-39、そして更により好ましくは40-50のムチンタンデムリピートをコードする。50より大きいタンデムリピートが可能であり、天然ムチンで見られるリピート数を含んでもよい。
【００４４】
本明細書で使用するムチン抗原という用語は種々のタイプのムチン由来のタンデムリピートを含んでもよい。例えば発現ベクターは2つの異なるムチン（例えばMUC1およびMUC2）由来のタンデムリピートをコードしてもよい。それらのベクターは複数の型のSEAドメインを同様にコードしてもよく、またはタンデムリピートと1つ以上のSEAドメインを組み合わせて含んでもよい。
【００４５】
分泌型ムチンはその膜貫通ドメインの全部または実質的に全部が欠失したものである。ムチンの膜貫通ドメインは、もし存在するなら、一般に約24アミノ酸長で、ムチンまたはムチンのフラグメントを細胞膜に係留する機能を果たす。全部の膜貫通ドメインが欠失した分泌型のMUC1は残基1159-1181が欠失したMUC1である。実質的に全部の膜貫通ドメインが欠失したムチンは、ドメインが膜貫通ドメインの一端の配列の6残基以下、より好ましくは膜貫通ドメインの一端の配列の約4残基未満、更に好ましくは膜貫通ドメインの一端の配列の約2残基未満、そして最も好ましくは膜貫通ドメインの一端の1残基以下を含むものである。従って、膜貫通ドメインの実質的に全部が欠失して分泌可能となったムチンは、膜貫通ドメインの一端における配列の6を超えない残基を含むものである。好ましい態様では、ワクチンベクター転写ユニットは膜貫通ドメインの全部を欠失した分泌型のムチンをコードする。
【００４６】
機能性膜貫通ドメインが欠失したムチンは、（もし存在する場合は）細胞質ドメインの全部または一部およびSEAの全部または一部をなおも含みうることは理解されるべきである。
【００４７】
種々のムチンおよびムチン抗原をコードするDNA源は、市販のcDNA合成キットおよび増幅（確立されたムチンDNA配列から設計できる好適なPCRプライマー対を使用）を用いてムチン発現細胞系から得てもよい。例えばMUC1またはMUC2をコードする核酸はAmerican Type Culture Collectionから入手できるCRL-1500細胞から得てもよい。ムチンをコードするDNAは、ヒトまたは他の動物組織から採取または調製したRNAまたはcDNAから増幅して得てもよい。さほど大きくないDNAセグメントでは、DNAは自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成してもよい。
【００４８】
本明細書で発現ベクターの転写ユニットに関して使用する“リンカー”という用語は、ムチン抗原およびCD40リガンド間にある1つ以上のアミノ酸残基をいう。リンカーの組成および長さは当該分野で周知の方法に従って決定してもよく、有効性に関して試験してもよい。例えばAraiら, "Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein" Protein Engineering, Vol. 14, No. 8, 529-532, August 2001参照。リンカーは一般に約3から約15アミノ酸長、より好ましくは約5から約10アミノ酸長であるが、より長い、もしくはより短いリンカーを使用してもよく、またはリンカーが全く無くてもよい。より長いリンカーは約50アミノ酸まで、または約100アミノ酸まで及んでもよい。ムチン抗原がCD40リガンドのN-末端側にある場合は、10残基未満の短いリンカーが好ましい。
【００４９】
本明細書で使用する“CD40リガンド”（CD40L）という用語はCD154またはTNF5としても知られる分子の全長または一部をいう。CD40LはN-末端に細胞質ドメイン、膜貫通領域、そして細胞外ドメインをC-末端に有するII型膜ポリペプチドである。特に記載しない限り、本明細書では完全長のCD40Lを“CD40L”、“wtCD40L”、または“wtTmCD40L”と記載する。細胞質ドメインが欠失した型のCD40Lを、本明細書では“ΔCtCD40L”と記載する。膜貫通ドメインが欠失した型のCD40Lを、本明細書では“ΔTmCD40L”と記載する。細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの両方が欠失した型のCD40Lを、本明細書では“ΔCtΔTmCD40L”と記載する。マウスおよびヒト由来のCD40Lのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は当該分野で周知であり、例えば米国特許第5,962,406号（Armitageら）に報告されている。本発明の融合タンパク質に関連して、ムチンに対する免疫応答を誘導するリガンドの能力に変化を与えないような、保存的アミノ酸変化などを含む配列変異体も“CD40リガンド”の意味に含まれる。
【００５０】
マウスCD40L（mCD40L）は260アミノ酸長である。mCD40Lの細胞質（Ct）ドメインはおおよそ1-22位、膜貫通ドメインはおおよそ23-46位、細胞外ドメインはおおよそ47-260位にわたる。
【００５１】
ヒトCD40L（hCD40L）は261アミノ酸長である。hCD40Lの細胞質ドメインはおおよそ1-22位、膜貫通ドメインはおおよそ23-46位、細胞外ドメインはおおよそ47-261位にわたる。
【００５２】
分泌型のCD40リガンドは膜貫通ドメインの全部または実質的に全部が欠失したものである。約24アミノ酸長を含むCD40Lの膜貫通ドメインは細胞膜においてCD40リガンドを係留する機能を果たす。膜貫通ドメインの全部が欠失したCD40Lは、残基23-46が欠失したCD40リガンドである。実質的に全部の膜貫通ドメインが欠失したCD40リガンドは、膜貫通ドメインの一端の配列の6残基以下、より好ましくは膜貫通ドメインの一端の配列の約4残基未満、更に好ましくは膜貫通ドメインの一端の配列の約2残基未満、そして最も好ましくは膜貫通ドメインの一端の1残基以下を保有するものである。従って、膜貫通ドメインの実質的に全部が欠失して分泌可能となっているCD40Lは、ドメインの一端の配列の6を超えない残基を保有するものである。そのように、CD40Lは、細胞外ドメインおよび必要により細胞質ドメインに加え、CD40Lの膜貫通ドメインに位置するアミノ酸41-46または23-28を超えないアミノ酸を含む（Such as CD40L would contain, in addition to the extracellular domain and optionally the cytoplasmic domain, and no more than amino acids 41-46 or 23-28 located in the transmembrane domain of CD40L.）。 好ましい態様では、ワクチンベクター転写ユニットは、膜貫通ドメインの10％未満を含む分泌型CD40をコードする。更に好ましくは、CD40Lは膜貫通ドメインを含まない。
【００５３】
機能性膜貫通ドメインが欠失したCD40Lは細胞質ドメインの全部または一部をなおも含みうることは理解すべきである。同様に、機能性膜貫通ドメインが欠失したCD40Lは細胞外ドメインの全部または実質的に一部を含みうる。
【００５４】
本明細書で使用するように、本発明の発現ベクターをワクチンとして投与し、ムチンに対する免疫を誘導することができる。ベクターは必要により、好適な医薬的に許容しうるキャリアーと共に調製してもよい。従って、ベクターを薬剤または医薬組成物の製造に使用してもよい。発現ベクターを非経口投与のための溶液または凍結乾燥粉末として調製してもよい。使用の前に好適な希釈剤または他の医薬的に許容されるキャリアーを添加して粉末を再調製してもよい。液体製剤は緩衝された等張の水溶液であってもよい。粉末を乾燥状態でスプレーしてもよい。好適な希釈剤の例は通常の等張食塩水、標準的な5％デキストロース水溶液、または酢酸ナトリウムもしくはアンモニウム緩衝液である。それらの製剤は非経口投与に特に好適であるが、経口投与に使用するか、または吸入のための定量噴霧式吸入器もしくはネブライザーに含有させてもよい。ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシアゴム、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどのような賦形剤の添加が所望されうる。
【００５５】
あるいはまた、ベクターを経口投与用に調製してもよい。医薬的に許容される固体または液体キャリアーを添加して組成物を向上もしくは安定化させるか、またはベクターの調製を容易にしてもよい。固体キャリアーにはデンプン、ラクトース、硫酸カルシウム2水和物、白土（terra alba）、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシアガム、寒天、またはゼラチンがある。液体キャリアーにはシロップ、落花生油、オリーブ油、食塩水、および水がある。キャリアーはモノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンのような持続放出物質を単独で、またはワックスと共に含有してもよい。固体キャリアーの量は種々であるが、好ましくは投与ユニット当たり約20mgから約1gの間である。液体キャリアーを使用する場合、製剤はシロップ、エリキシル、エマルジョン、または水性もしくは非水性懸濁液の形態であってもよい。
【００５６】
本発明のベクターは、他の医薬的に有用な薬剤または生物学的物質を含有させて調製してもよい。ベクターを、本発明の化合物が目的とする疾病または症状に有用な他の薬剤または生物学的物質の投与と併せて投与してもよい。
【００５７】
本明細書で使用する“有効量”という語句は、そのレシピエントにおいて免疫応答を生じさせる（または生成に関与する）のに十分高い濃度となるような投与量をいう。特定の被験体についての固有の有効量は種々の因子に依存し、それらには治療すべき障害、障害の重篤度、特定の化合物の活性、投与経路、ウイルスベクターのクリアランス速度、治療期間、ウイルスベクターと併用する、または同時に使用する薬剤、年齢、体重、性別、食事、および被験体の全身の健康状態、そして医学および科学の分野で周知の因子がある。“治療的有効量”を決定するための種々の一般的に考慮される点は当該分野で周知であり、例えば以下に記載されている：Gilmanら編, Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 第8版, Pergamon Press, 1990；およびRemington's Pharmaceutical Sciences,第17版, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990。ベクターの投与では、投与当たりの粒子の範囲は一般に約1x107から1x1011、より好ましくは1x108から5x1010、そして更に好ましくは5ｘ108から2x1010である。ベクターは非経口で、例えば血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下などで投与してもよい。投与は経口、経鼻、直腸内、経皮、またはエアロゾルを介した吸入であってもよい。ベクターはボーラスまたは点滴（slowly infused）で投与してもよい。ベクターは、好ましくは皮下投与する。
【００５８】
本発明の組換え発現ベクターはDNAワクチンより効率の高い遺伝子移入を可能とする、潜在的に優れた方法を提供する。本明細書に示すように、腫瘍関連抗原をコードするアデノウイルスベクターは、それらの抗原（すでに寛容が確立されたものを含む）に対する防御細胞および体液免疫を誘導する。いずれの理論に拘束されることも望まないが、本発明のワクチンはDCの成熟を促進し、有効な抗原特異的免疫の生成を促進したと考えられる。また、本明細書に示すように、アデノウイルスベクターから生成された膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが欠失したヒトMUC1およびマウスCD40Lの細胞外ドメイン（すなわちsighMUC1-ΔCtΔTmCD40L）をコードする分泌可能な融合タンパク質は、MUC1発現腫瘍細胞に対する細胞免疫応答の有効性を劇的に向上した。いずれの理論に拘束されることも望まないが、Ad-K-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40Lベクターの皮下注射によって強いMUC1特異的CD8+ T細胞介在型免疫が誘導され、これによってMUC1腫瘍関連抗原を発現する癌細胞の生着が予防されると考えられる。
【００５９】
本発明のベクターワクチンを使用してムチン抗原に対して生じさせた免疫は長期にわたって持続される。本明細書で使用する“長期持続”という用語は、ベクターにコードされるムチン抗原に対して誘導された免疫が最終投与から6ヶ月まで、好ましくは8ヶ月まで、より好ましくは1年まで、より好ましくは1.5年まで、そして更に好ましくは少なくとも2年間示されることを意味する。
【００６０】
ある態様では、ムチンTAAに対する免疫を生じさせるために、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠失させたCD40リガンドのアミノ末端に融合させたMUC1の細胞外ドメインを含む融合タンパク質を生成してもよい。それらのベクターの構築を実施例に開示する。本明細書で観察されたように、このアデノウイルスベクタームチンワクチンの皮下投与によって、MUC1抗原を保持する癌細胞に対する非常に強力な長期持続性のCD8+ 細胞傷害性T細胞依存型全身免疫が誘導された。ムチンワクチンは長期持続性免疫の基礎となる記憶細胞の生成を誘導した。
【００６１】
マウスにアデノウイルスベクター  Ad-sig-ecdhMUC1/ecdmCD40Lをワクチン接種すると、100％のhMUC1トランスジェニックマウス（すなわちこれらのマウスはベクター注射以前はhMUC1抗原に対して不顕性である）でヒトMUC1（hMUC1）抗原陽性腫瘍細胞の増殖を抑制する免疫応答が誘導された。Rowseら, Cancer Res. 58, 315 (1998)参照。Ad-sig-ecdhMUC1/ecdmCD40Lベクターに対する免疫応答は1年まで持続し、抗原特異性を示した。これらの結果は、MUC1を発現する上皮性悪性病変の治療にAd-sig-ecdhMUC1-ecd/ecdCD40Lベクターを使用できることを示している。
【００６２】
アデノウイルスMUC1発現ベクターの皮下注射によって、注射したhMUC1トランスジェニックマウスの脾臓におけるhMUC1特異的T細胞のレベルが250倍上昇した。トランスジェニックマウスはベクター注射以前はhMUC1抗原に対して不顕性であった。従って、ベクター注入によって不顕性が克服され、抗原特異的かつHLA拘束性であるCD8+ T細胞依存的全身Th1免疫応答が誘導される。アデノウイルスMUC1発現ベクターの接種で観察されたような不顕性を克服する能力は、トランスジェニックマウスに精製したecdhMUC1/ecdCD40L-HISタンパク質を接種した場合には観察されなかった。
【００６３】
いずれの理論にも拘束されることを望まないが、ベクターの皮下注射部位の近傍の感染した細胞がムチン抗原/CD40リガンド分泌物を放出し、これが感染細胞の近傍の抗原表示細胞（例えばDC）に取り込まれると考えられる。内在化されたムチン抗原はプロテオソームで消化され、生じるムチン抗原ペプチドは小胞体に移動し、そこでMHCクラスＩ分子と結合する。最終的にDCはMHCクラスＩ分子において表面上にムチン抗原を提示する。活性化された腫瘍抗原を担持する抗原提示細胞はリンパ球を保有する第2の器官、例えば所属リンパ節または脾臓に移動する。2週間にわたるムチン抗原/CD40リガンドタンパク質の連続放出の間、腫瘍関連抗原を運搬する細胞を認識および死滅させる能力のあるCD8細胞傷害性T細胞は、活性化された、抗原を担持する樹状細胞の存在によってリンパ節および脾臓で増殖する。ベクターに感染させた細胞からの連続的放出によるムチン抗原特異的細胞傷害性T細胞の刺激および増殖の連続性により、非分泌性であるムチン抗原/CD40リガンドを運搬するベクターを用いて得られるより強い免疫反応が生ずると考えられる。
【００６４】
従って本発明の方法を使用して個体において自己抗原であるムチンに対する免疫を生じさせることができる。例えば、MUC1由来のムチン抗原をコードする本発明のベクターを使用して、MUC1ムチン抗原が自己抗原であるヒトにおいてCD8+ 免疫を生じさせることができる。本発明の方法を使用して、自己抗原であるムチンに対する免疫学的不顕性状態を克服することもできる。
【実施例】
【００６５】
以下の実施例は本発明を例証するためのものである。これらの実施例は本発明の範囲を制限することを意図しない。
【００６６】
1．アデノウイルス発現ベクターの構築
アデノウイルスベクターの転写ユニットsig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40Lはシグナル配列（Igカッパ鎖由来）、次いでヒトMUC1の細胞外ドメインをコードし、これは膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを有さず細胞外ドメインを含有するCD40リガンド（ヒトまたはマウス）のフラグメントにリンカーを介して結合している。カッパ鎖シグナル配列を融合タンパク質のアミノ末端に添加することにより、ベクター感染細胞から融合タンパク質が分泌されるように遺伝子操作した。
【００６７】
ヒトMUC1のアミノ酸配列およびコードするヌクレオチド配列を、それぞれ図2および1に示す。コードされたMUC1タンパク質はSEQ ID NO : 1のヌクレオチド74から3,841にコードされる1255アミノ酸に相当する。最初の23アミノ酸（SEQ ID NO : 1の74から142にコードされる）はMUC1シグナル配列であり、成熟ムチンからは除去される。細胞外ドメインは24位から1158位の約1135アミノ酸（ヌクレオチド143から3547にコードされる）である。タンデムリピート領域は約900アミノ酸に相当する。アミノ酸74から126（SEQ ID NO : 1の229から451にコードされる）は5’変性タンデムリピート領域、アミノ酸127から945はタンデムリピート領域（SEQ ID NO : 1の452から2,908にコードされる）であり、アミノ酸946から962は3’変性タンデムリピート領域（SEQ ID NO : 1の2809から2959にコードされる）に相当する。SEAドメインはアミノ酸1034から1151、膜貫通ドメインは1159から1181、そして細胞質ドメインは1181から1255である（SEQ ID NO : 2参照）。
【００６８】
転写ユニットをアデノウイルスベクターのバックボーンのE1遺伝子領域に導入した。アデノウイルスベクター粒子をHEK293細胞で生成させた後、塩化セシウム密度勾配遠心分離法によってベクターDNAを精製した。アデノウイルスベクター中のシグナルペプチドの存在を、制限酵素分析およびDNAシーケンシングによって確認した。
【００６９】
ヒトMUC-1をコードするDNAの上流にマウスIgGカッパ鎖遺伝子のシグナル配列をコードするDNAを含む転写ユニット（“sig-ecdhMUC-1”）をPCRで生成したが、これにはプラスミドpcDNA3-hMUC-1（Finn O.J., University of Pittsburgh School of Medicineより供与）および以下のプライマーを用いた：マウスIgGカッパ鎖METDTLLLWVLLLWVPGSTGD（1文字アミノ酸コード）（SEQ ID NO : 11）をコードするDNAをPCR増幅で調製し（SEQ ID NO : 12、13、および14）、完全長の21アミノ酸マウスIgGカッパ鎖シグナル配列を生成した（SEQ ID NO : 12において、開始コドン“ＡTＧ”を下線で示す）。
【００７０】
5'-CCACC ATG GAG ACAGAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG-3'
（SEQ ID NO : 12）
5'- TC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTC TGG GTT CCAGGT TC-3'
（SEQ ID NO : 13）
5'- TG CTC TGG GTT CCAGGT TCC ACT GGT GAC GAT G -3'
（SEQ ID NO : 14）
5'- GGT TCC ACT GGT GAC GAT GTC ACC TCG GTC CCAGTC-3'
（SEQ ID NO : 15）（MUC-1リピート領域の順向きプライマー）
5'- GAGCTCGAG ATT GTG GAC TGG AGG GGC GGT G-3'
（SEQ ID NO : 16）（MUC-1リピート領域の逆向きプライマー）
【００７１】
上流にカッパシグナル配列を有するsig-ecdhMUC-1を4ラウンドのPCR増幅で生成した（第1ラウンド：プライマーSEQ ID NO : 15および16；第2ラウンド：プライマーSEQ ID NO : 14および16；第3ラウンド：プライマーSEQ ID NO : 13および16；第4ラウンド：プライマーSEQ ID NO : 12および16）。sig-ecdhMUC-1をコードするDNAをpcDNATM 3.1 TOPOベクター（Invitrogen, San Diego, CA）にクローニングしてpcDNA-sig-ecdhMUC-1を構築した。
【００７２】
pShuttle -ΔCtΔTmCD40L（シグナル配列が無く、マウスCD40Lを含む）を以下のように調製した：プラスミドpDC406-mCD40LはAmerican Type Culture Collectionから購入した。1組のPCRプライマー（SEQ ID NO : 17および18）を、マウスCD40リガンドの52位から260位（すなわち細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含まない）を増幅し、増幅子の5’末端にリンカーをコードする配列（“＋スペーサー”と表示）が含まれるように設計した。
【００７３】
マウスΔCtΔTmCD40L＋スペーサー順向きプライマー（MCD40LSPF）（CD40L配列はイタリック体（小文字）；クローニング部位は下線および太字）：
5'- CCGCTCGAGAACGACGCACAAGCACCAAAATCAAAGGTCGAAGAGGAAGTA -3'
（SEQ ID NO : 17）
マウスCD40L逆向きプライマー（MCD40LR；クローニング部位は下線）：
5'-GCGGGCC CGCGGCCGCCGCTAG TCTAGAGAG TTT GAG TAAGCC AAAAGA TGAG-3'
（SEQ ID NO : 18）
【００７４】
順向きプライマーMCD40LSPFは転写ユニットのムチンおよびCD40Lリガンド（mCD40L）間に位置する10残基のスペーサー（LENDAQAPKS；1文字コード；SEQ ID NO : 19）をコードする。順向きおよび逆向きプライマー（SEQ ID NO : 17および18）およびテンプレートとしてプラスミドpDC406-mCD40Lを使用してPCRを行い、PCRフラグメント“スペース＋ΔCtΔTMCD40L”を得、これをXbaI（TCTAGA）およびXho I（CTCGAG）で制限エンドヌクレアーゼ消化した後、プラスミドpcDNA-sig-ecdhMUC1に挿入した。このベクターをpcDNA-sig- ecdhMUC1/ΔCtΔTmCD40Lで消化する。切り詰め型（truncated form）ではなく完全長のCD40Lをコードすること以外は同じであるベクターを構築した。このベクターの生成は、CD40順向きプライマーを用い、マウスCD40Lの開始コドンにアニールさせて行った。このベクターをpShuttlsig40Lと記載する（シグナル配列なし）。
【００７５】
HindIII-XbaI 制限を用いてpCDNA3TOPO ベクターからsig-ecdhMUC1/ΔCtΔTmCD40LをコードするDNAを切り出し、pShuttle-CMV（Murphyら, Prostate 38: 73-78, 1999参照）のCMVプロモーターの下流に挿入した。このプラスミドをpShuttle-sig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40Lと記載する。従って転写ユニットsig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40LはマウスIgGカッパ鎖分泌シグナル、次いでヒトMUC1の細胞外ドメイン、次いで10アミノ酸リンカー（NDAQAPK；SEQ ID NO : 19）、次いでマウスCD40リガンド残基52-260をコードする。
【００７６】
あるベクターでは、マウスHSF1 3量体ドメインをecdhMUC1をコードするDNAおよびΔCtΔTm CD40L間に添加したが、これはプラスミドpcDNA-sig-ecdhMUC1/ΔCtΔTmCD40Lおよび以下のプライマーを用いたPCRで行った：
5'-AAC AAG CTC ATT CAG TTC CTG ATC TCA CTG GTG GGATCC AAC GAC GCA CAAGCA CCAAAA TC-3'
（SEQ ID NO : 20）
5'- AGC CTT CGG CAG AAG CAT GCC CAG CAA CAG AAAGTC GTC AAC AAG CTC ATT CAG TTC CTG-3'
（SEQ ID NO : 22）
5'GAT ATC CTC AGG CTC GAG aac gac gca caagca ccaaaagAG AAT GAG GCT CTG TGG CGG G-3'
（SEQ ID NO : 23）
5'-GCGGGCC CGCGGCCGCCGCTAG TCTAGA GAG TTT GAG TAAGCC AAAAGA TGAG-3'
（SEQ ID NO : 18）。
【００７７】
3量体ドメイン配列を持つHSF1/ΔCtΔTm CD40Lを4ラウンドのPCR増幅によって生成した（第1ラウンド：プライマーSEQ ID NO : 23および18；第2ラウンド：プライマーSEQ ID NO : 22および18；第3ラウンド：プライマー21および18；第4ラウンド：プライマーSEQ ID NO : 20および18）。HSF1/ΔCtΔTm CD40LをコードするDNAをpcDNA-sig- hMUC-1制限部位XbaI（TCTAGA）およびXho I（CTCGAG）にクローニングした。MUC1とmCD40Lとの間の配列は以下である：
L E N D A Q A P K E N E A L W R E V A S F R Q K H A Q Q Q K V V N K L I Q F L I S L V G S N D A Q A P K S（SEQ ID NO : 24）
ここで、下線のセグメントは3量体配列であり、これがリンカーLENDAQAPK （SEQ ID NO : 25）およびNDAQAPKS（SEQ ID NO : 26）に結合する。
【００７８】
あるベクターでは、Hisタグをコードする配列をΔCtΔTm CD40Lの末端に添加し、プラスミドpDC406-mCD40L（American Type Culture Collectionより購入）および以下のプライマーを用いたPCRで生成した：
5'-CCG CTCGAG AACGACGCACAAGCACCAAAATCAAaggtcgaagaggaagta -3'（SEQ ID NO : 27）（順向きプライマー）
5'-ATG GTG ATG ATG ACC GGT ACG GAG TTT GAG TAA GCC AAA AGA TGA GAA GCC-3' (SEQ ID NO: 28)（逆向きプライマー）
5'-GTGC tctaga TCAgaattc <ATG GTG ATG GTG ATG ATG> ACC GGT ACG GAG -3'（SEQ ID NO : 29）（ポリHis領域は囲み線内（＜＞内）のヌクレオチドにコードされる）。
【００７９】
Hisタグ配列を持つベクター/ΔCtΔTm CD40L/Hisを2ラウンドのPCR増幅で生成した（第1ラウンド：プライマー1＋2；第2ラウンド：プライマー1＋3）。/ΔCtΔTmCD40L/HisをコードするDNAをpcDNA-sig-ecdhMUC-1 制限部位XbaI（TCTAGA）およびXho I（CTCGAG）にクローニングした。
【００８０】
組み換えアデノウイルスベクターをAdEasyベクター系（Stratagene, San Diego, CA）を用いて生成した。簡潔に記載すると、得られたプラスミドpShuttle-sig- ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40Lおよび他のコントロールアデノウイルスベクターをPme Iで直線化し、ウイルスDNAプラスミドpadEasy-1と共にE. coli株BJ5183に共トランスフォームした。組換え体をカナマイシンで選択し、制限酵素分析によってスクリーニングした。その後、組換えアデノウイルスコンストラクトをPac Iで切断してその逆向き末端反復配列（ITR）を暴露し、293A細胞にトランスフェクトしてウイルス粒子を生成した。組換えアデノウイルスの力価を組織培養感染価（TCID50）法で測定した。
【００８１】
ヒトCD40リガンドcDNAテンプレートを用いるヒトΔCtΔTmCD40L+スペーサーの増幅のためのプライマーを以下に記載する。
ヒトΔCtΔTmCD40L+スペーサー順向きプライマー（HCD40LSPF）（イタリック体（小文字）はCD40L配列）：
5'- CCG CTCGAGAACGACGCACAAGCACCAAAATCAGTGTATCTTcatagaaggttggacaag-3'
（SEQ ID NO : 30）
ヒトCD40L逆向きプライマー（HCD40LR）
5'-CCCTCTAGA TCAGAGTTTGAGTAAGCCAAAGGAC-3'(SEQ ID NO : 31）
【００８２】
これらのプライマーはヒトCD40Lの47-261をコードするΔCtΔTmCD40L+スペーサーを増幅する。順向きプライマーHCD40LSPFは転写ユニットの腫瘍抗原およびCD40リガンド（hCD40L）間に位置する10残基スペーサー（LENDAQAPKS；1文字コード；SEQ ID NO : 19）をコードする。順向きおよび逆向きプライマー（SEQ ID NO : 30および31）、およびテンプレートとしてプラスミドpDC406-hCD40Lを使用してPCRを実施してPCRフラグメント“space+ΔCtΔTmCD40L（ヒト）”を得、これをXbaI（TCTAGA）およびXho I（CTCGAG）での制限エンドヌクレアーゼ消化後、プラスミドpcDNA-sig-ecdhMUC1に挿入した。HindIII-XbaI 制限を用いてpCDNA3TOPO からsig-ecdhMUC1 /ΔCtΔTmCD40L（ヒト）をコードするDNAを切り出し、これをpShuttle-CMV（Murphyら, Prostate 38: 73-78, 1999）のCMVプロモーターの下流に挿入した。このベクターをpShuttle sig-ecdhMUC1/ΔCtΔTmCD40L（ヒト）と記載する。ヒトCD40リガンド配列の上流にecdhMUC1を含有させるためのpShuttle sig-ecdhMUC1/ΔCtΔTmCD40L（ヒト）の修飾を、本質的にマウスCD40リガンドをコードするベクターに関して前記したようにして行った。従って転写ユニットsig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40L（ヒト）はカッパ分泌性シグナル、次いでヒトMUC1の細胞外ドメイン、次いで10アミノ酸リンカー（NDAQAPK；SEQ ID NO : 19）、次いでヒトCD40リガンド残基47-261をコードする。
【００８３】
別の方法では、ヒト成長ホルモンシグナル配列MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA（1文字アミノ酸コード）（SEQ ID NO : 32）をコードするDNAをカッパ鎖シグナル配列の代わりに使用してもよい。
【００８４】
２．MUC1トランスジェニックマウスにおけるMUC1に対する不顕性の克服
ａ）アデノウイルス感染DCのサイトカイン生成
骨髄由来DCをhMUC-.Tgトランスジェニックマウスから、アデノウイルスベクターへの暴露の48時間後に回収した。MOI 100で細胞をベクターに暴露し、24ウェルプレートに2×105細胞/mlで播種した。37℃で24時間インキュベートした後、上清（1ml）を回収し、遠心分離してデブリを除去した。培養液に放出されたマウスIL-12またはIFN-ガンマのレベルの評価を、マウスIL-12 p70またはIFN-ガンマR & Dシステムキットを用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって行った。
【００８５】
Ad-sig-ecdmMUC1-ΔCtΔTCD40L（マウス）ベクターと接触させた骨髄由来DCにより、ベクターへの暴露の48時間後にhMUC-.Tgトランスジェニックマウスから回収したDCからのインターフェロン・ガンマおよびIL-12サイトカインのレベルが有意に上昇した。これと対照的に、cMUC1の細胞外ドメインをコードするが分泌型のCD40Lに融合させていないアデノウイルスベクターで免疫化した動物由来の再刺激DCからは実質的にサイトカインは検出されなかった。これらの結果はecdhMUC1/ecdmCD40L（マウス）融合タンパク質が機能性3量体を形成し、DC上のCD40受容体に結合することを示している。
【００８６】
ｂ）Ad-sig-ecdhMUC1-HSF1-ΔCtΔTmCD40L-HISから発現されるecdhMUC1-HSF1-ΔCtΔTmCD40L融合タンパク質による3量体形成の評価
ecdhMUC1-HSF1-ΔCtΔTmCD40L-HIS融合タンパク質の3量体化を、Ad-sig-ecdhMUC1-HSF1-ΔCtΔTmCD40L-HISベクターで形質転換した細胞からの放出に従って評価した。発現された融合タンパク質を、Hisタグ精製キットを用いてベクターに暴露した293細胞の上清から精製した。非変性ゲル電気泳動は、分子量が3量体の形成と矛盾しないことを示した。
【００８７】
ｃ）MUC1発現癌細胞の確立に対するAd-sig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40Lベクター注射の影響
Ad-sig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40L （マウス）ベクターを皮下注射したhMUC1.TgマウスはhMUC1ポジティブLL2/LL1hMUC1マウス癌細胞による移植に対して耐性を示した。ベクターを注射しないコントロール動物は同じ細胞の増殖に対して耐性を示さなかった。また、Ad-sig-ecdhMUC1/ecdCD40L （マウス）ベクターを注射したhMUC1.Tgマウスは、MUC1を発現しない親細胞系（LL2/LL1）による移植に対して耐性を示さなかった。
【００８８】
ecdhMUC1- ΔCtΔTmCD40L（マウス）タンパク質を静脈内注射したhMUC1.TgマウスはhMUC1ポジティブLL2/LL1hMUC1マウス癌細胞による移植に対して耐性を示さなかった。更に、Ad-sig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40L（マウス）ベクターを注射したhMUC1.Tgマウスはコントロールベクター注射し、その後LL2/LL1hMUC1細胞系を投与したマウスより長く生存した。
【００８９】
3．不顕性の崩壊の根底にある細胞機構
ａ）ワクチン接種マウスvs非ワクチン接種マウスからのサイトカイン放出
脾臓CD8+ Tリンパ球の集団を、Ad-sig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40L（マウス）ベクター投与の7日後、CD4+抗体をコーティングしたビーズを用いてCD4+ Tリンパ球を涸渇させることによって得た。単離したCD8+ Tリンパ球は、コントロールベクター（MUC1未含有）を投与したMUC1.Tgマウス由来のCD8+ T細胞の2,000倍高いレベルのインターフェロンガンマを放出した。
【００９０】
ｂ）細胞傷害性アッセイ
Ad-sig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40L（マウス）ベクターの投与７日後のhMUC1.Tgマウスから回収した脾臓Ｔ細胞をhMUC1抗原ポジティブLL2/LL1hMUC1癌細胞と共にインビトロで7日間培養した。刺激した膵臓Ｔ細胞を種々の比率のhMUC1ポジティブLL2/LL1hMUC1癌細胞またはhMUC1ネガティブLL2/LL1癌細胞と混合した。結果は、Ad-sig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40L（マウス）ベクター接種マウス由来のＴ細胞がhMUC1を発現する癌細胞にだけ細胞傷害性を有することを示した。
【００９１】
ｃ）Ad-sig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40Lベクター注射によってhMUC1特異的Ｔ細胞の増殖に対する耐性が克服される
インビトロで骨髄細胞から得たDCをAd-sig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40L（マウス）ベクターに48時間暴露した。脾臓CD8+ T細胞（ベクターを注射しない、またはAd- sig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40L（マウス）ベクターを皮下注射した7日後のhMUC1.Tgトランスジェニックマウスから採取）を1/1の割合でAd- sig-ecdhMUC1/ecdCD40L（マウス）ベクター感染DCと混合した。ERK1/EK2タンパク質（Ras/MAPKシグナリング経路の終点）は、Ad-sig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40L（マウス）ベクター感染DCへのインビトロでの45分間の暴露後にAd-sig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40Lベクター注射hMUC1.Tgトランスジェニックマウスから単離したCD8+ T細胞においてリン酸化された。これに対して未接種hMUC1.Tgマウス由来のCD8ポジティブT細胞ではERK1およびERK2タンパク質のリン酸化の上昇は観察されなかった。これらの結果は、Ad-sig-ecdhMUC1-ΔCtΔTmCD40L（マウス）ベクターを接種したMUC1.Tgトランスジェニックマウス由来のCD8ポジティブT細胞がもはやMUC1に対して不顕性ではなくなったことを示している。
【００９２】
４．MUC1-CD40L融合タンパク質をコードするベクターの接種による腫瘍免疫療法
腫瘍予防のプロトコールのために、動物に1、7、および21日目に動物にAd-sig-ecdhMUC-1/ecdCD40Lベクターを投与した。3週間後、動物にLL2/LL1hMUC-1腫瘍細胞を皮下注射した。2週間後、マウスに500,000のLL2/LL1hMUC-1腫瘍細胞を尾静脈投与した。発生した皮下腫瘍結節のサイズをカリパーで複数の時点で測定し、LL2/LL1hMUC-1細胞の増殖に対する種々のワクチンスケジュールの効果を皮下結節として測定した。殺傷後、肺の総重量で肺転移を測定した。
【００９３】
種々の時点で皮下腫瘍を測定した。ベクター接種したマウスは皮下LL2/LL1hMUC-1腫瘍の発生が完全に抑制された。ベクター接種した動物では、肺に発生する転移癌結節の増殖も有効に抑制された。
【００９４】
（定着後の）腫瘍治療のプロトコールを評価した。このスケジュールでは、皮下腫瘍（500,000のLL2/LL1hMUC-1）を1日目に投与し、5日目にワクチン接種を行った。5、12、および26日目にベクターを投与した。35日目に腫瘍を静脈内注射し、49日目に腫瘍の発生（皮下および肺）を評価した。ベクター接種した動物において皮下腫瘍のサイズおよび肺転移結節の程度が低下した。
【００９５】
本明細書に記載する全ての特許および文献は本発明が属する分野の技術者のレベルを示すものである。全ての特許および文献は、個々の文献が特定かつ個別に参照によって組み込まれることが示されるのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９６】
本明細書に例証的に記載する本発明は、任意の要素（単数または複数）、制限（単数または複数）無しで好適に実施してもよいが、それらについては本明細書で特に開示しない。従って、例えば本明細書においてそれぞれの場合で、“〜を含む”、“本質的に〜からなる”、および“〜からなる”という用語の任意のものを他の2つのいずれかで置き換えてもよい。使用した用語および表現は制限ではなく説明のための用語として使用されるものであり、それらの用語および表現の使用に際して明示および記載する特徴と同等のものまたはそれらの一部のいずれを排除することも意図しないが、認識されるように、種々の修飾が請求する本発明の範囲内で可能である。従って、好ましい態様および必要に応じた（optional）特徴によって本発明についての特定の開示を行ったが、当業者は本明細書に開示するコンセプトの修飾および変更を行ってもよく、それらの修飾および変更は添付する請求の範囲に定義する本発明の範囲内にあると見なされることは理解すべきである。
【００９７】
他の態様を添付の請求の範囲内に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１−１】ヒトMUC1をコードするヌクレオチド配列である（SEQ ID NO : 1）。
【図１−２】ヒトMUC1をコードするヌクレオチド配列である（SEQ ID NO : 1）。
【図２】ヒトMUC1のアミノ酸配列である（SEQ ID NO : 2）。
【図１−１】
2007535304.tif 000004
【図１−２】
2007535304.tif 000005
【図２】
2007535304.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月12日(2007.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムチン抗原に対する免疫を生じさせるための発現ベクターであって、該ベクターが分泌可能なポリペプチドをコードする転写ユニットを含み、該ポリペプチドが分泌シグナル配列、ムチン抗原、およびCD40リガンドを含む上記ベクター。
【請求項２】
該CD40リガンドが膜貫通ドメインの全部または実質的に全部を欠失している、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
該ムチン抗原をコードする配列が該CD40リガンドをコードする配列の5’側にある、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項４】
該ムチン抗原がMUC1、MUC2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC9、MUC12、MUC13、MUC15、およびMUC16からなる群から選択されるムチンに由来するものである、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項５】
該ムチン抗原がMUC1由来である、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項６】
該ムチン抗原がムチンの細胞外ドメインを含む、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項７】
該ムチン抗原がムチンのタンデムリピートの少なくとも１つを含む、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項８】
該ムチン抗原がムチンのSEAドメインの全部または一部を含む、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項９】
該ムチン抗原がMUC1の細胞外ドメインである、請求項６記載の発現ベクター。
【請求項１０】
該転写ユニットが該ムチン抗原と該CD40リガンドとの間のリンカーをコードする、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１１】
該ベクターが転写ユニットの転写を制御するためのヒトサイトメガロウイルスプロモーター/エンハンサーを含む、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１２】
該発現ベクターがウイルスベクターである、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１３】
該ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１４】
該CD40リガンドがヒトCD40リガンドである、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１５】
該CD40リガンドが細胞質ドメインを欠失している、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１６】
ベクターが膜貫通ドメインのいずれかの末端からの6以下の残基を含むCD40リガンドをコードする、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項１７】
該ベクターがCD40リガンドの膜貫通ドメインをコードしない、請求項２記載発現ベクター。
【請求項１８】
該CD40リガンドが残基47-261を含む、請求項17記載の発現ベクター。
【請求項１９】
該CD40リガンドが残基1-23および47-261を含む、請求項17記載の発現ベクター。
【請求項２０】
該ベクターが正常なヒト細胞において非複製性とされている、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項２１】
個体においてムチン抗原を発現する細胞に対する免疫応答を生じさせるための医薬組成物であって、分泌可能なポリペプチドをコードする転写ユニットを含む有効量の発現ベクターを含み、該ポリペプチドが分泌シグナル配列、ムチン抗原、およびCD40リガンドを含む上記医薬組成物。
【請求項２２】
該CD40リガンドがヒトCD40リガンドである、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２３】
該癌細胞が癌腫細胞である、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２４】
該免疫応答が該ムチン抗原に対する細胞傷害性CD8+ T細胞の生成を含む、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２５】
投与後、該ベクターが細胞に取り込まれ、その後細胞は転写ユニットによりコードされる融合タンパク質を分泌する、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２６】
該融合タンパク質がCD40リガンド細胞外ドメインの相互作用によってホモ３量体を形成する、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２７】
該ムチンがMUC1である、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２８】
該ムチンが個体中の自己抗原である、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ムチン抗原を発現する癌に罹患した個体を治療するための医薬組成物であって、分泌可能なポリペプチドをコードする転写ユニットを含む有効量の発現ベクターを含み、該ポリペプチドが分泌シグナル配列，ムチン抗原、およびCD40リガンドを含む上記医薬組成物。
【請求項３０】
該CD40リガンドがヒトCD40リガンドである、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３１】
該癌が癌腫である、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３２】
該免疫応答が該腫瘍関連抗原に対する細胞傷害性CD8+ T細胞の生成を含む、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３３】
投与後、該ベクターが細胞に取り込まれ、その後細胞は転写ユニットによりコードされる融合タンパク質を分泌する、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３４】
該融合タンパク質がCD40リガンド細胞外ドメインの相互作用によってホモ３量体を形成する、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３５】
ヒトにおいてムチンに対する免疫応答を生じさせるための医薬組成物であって、ここでムチンはヒト自己抗原であり、個体の免疫細胞はムチンに対して不顕性であり、分泌可能なポリペプチドをコードする転写ユニットを含む有効量の発現ベクターを含み、該ポリペプチドが分泌シグナル配列、ムチン抗原、およびCD40リガンドを含む上記医薬組成物。
【請求項３６】
該CD40リガンドがヒトCD40リガンドである、請求項３５記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2007535304.tif 000007
2007535304.tif 000008
2007535304.tif 000009
2007535304.tif 000010
2007535304.tif 000011