(57)【要約】  本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）に感染した個体において治療用免疫応答を惹起するための改良された方法を提供する。該方法は、抑制されたウイルス血症を有する個体に、ＨＩＶ抗原を発現するアデノウイルスワクチン組成物を投与することを含む。このような感染個体の免疫化は、応答のレベルおよび応答の幅広さの両方において顕著である、該ウイルスに対する細胞性免疫応答を惹起する。結果的に生じる治療用免疫応答は、ウイルスの低力価を有効に維持する能力を有し、したがって、抗ウイルス療法に対する個体の依存性を軽減すると予想される。
2007515386.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）−１抗原をコードする核酸を含む組換え複製欠損型アデノウイルスをＨＩＶ感染個体に投与することを含んでなり、該個体が該投与の前にＨＩＶウイルスコピー数の減少を示している、ＨＩＶ感染個体においてＨＩＶに対する細胞性免疫応答を惹起するための方法。
【請求項２】
ＨＩＶウイルスコピー数の減少が、少なくとも部分的には、抗ウイルス剤での治療によるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗ウイルス剤がプロテアーゼインヒビター、逆転写酵素インヒビターおよびインテグラーゼインヒビターのうちの１以上を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
抗ウイルス剤がプロテアーゼインヒビターと逆転写酵素インヒビターとの組合せを含む、請求項２記載の方法。
【請求項５】
該個体に該アデノウイルスを投与および再投与することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＨＩＶ抗原をコードする核酸を含む別の血清型のアデノウイルスを投与することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＨＩＶ抗原をコードする核酸を含む異なるウイルス起源のウイルスを投与することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
該抗原がＨＩＶ  ｇａｇに由来する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該抗原がＨＩＶ  ｎｅｆに由来する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該抗原がＨＩＶ  ｐｏｌに由来する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該抗原がＨＩＶ  ｅｎｖに由来する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ＨＩＶ抗原をコードする核酸を含むポリヌクレオチド組成物を投与することを更に含む、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抑制されたウイルス血症を有するＨＩＶ感染個体においてウイルス複製を阻止するための有効な手段を開示する。該方法は、ＨＩＶ抗原をコードする外因性核酸を含む組換え複製欠損型アデノウイルスでの該個体の免疫化を含む。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は後天性ヒト免疫不全症候群（エイズ）および関連障害の病原体である。ＨＩＶはレトロウイルス科のＲＮＡウイルスであり、全てのレトロウイルスの５’−ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ＬＴＲ３’体制を示す。プロウイルスとして公知の組込み形態のＨＩＶは約９．８Ｋｂ長である。該ウイルスゲノムの各末端は、長末端反復配列（ＬＴＲ）として公知のフランキング配列を含有する。
【０００３】
ＨＩＶ遺伝子は少なくとも９個のタンパク質をコードしており、それらは主要構造タンパク質（Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ）、調節タンパク質（ＴａｔおよびＲｅｖ）および補助タンパク質（Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、ＶｉｆおよびＮｅｆ）の３つのクラスに分けられる。ｇａｇ遺伝子は５５キロダルトン（ｋＤａ）の前駆体タンパク質（ｐ５５）をコードしており、これは未スプライスウイルスｍＲＮＡから発現され、ＨＩＶプロテアーゼ（ｐｏｌ遺伝子の産物）によるタンパク質分解によりプロセシングされる。成熟ｐ５５タンパク質産物はｐ１７（マトリックス）、ｐ２４（カプシド）、ｐ９（ヌクレオカプシド）およびｐ６である。ｐｏｌ遺伝子は、ウイルスの複製に必要なタンパク質、すなわち、逆転写酵素、プロテアーゼ、インテグラーゼおよびＲＮアーゼＨをコードしている。これらのウイルスタンパク質は、リボソームフレームシフトにより産生される１６０ｋＤａの前駆体タンパク質であるＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質として発現される。該ウイルスコード化プロテアーゼはタンパク質分解により該Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合体からＰｏｌポリペプチドを切り離し、さらに該Ｐｏｌポリペプチドを成熟タンパク質にまで切断し、該成熟タンパク質はプロテアーゼ（Ｐｒｏ、Ｐ１０）、逆転写酵素（ＲＴ、Ｐ５０）、インテグラーゼ（ＩＮ、ｐ３１）およびＲＮアーゼＨ（ＲＮアーゼ、ｐ１５）活性をもたらす。ｎｅｆ遺伝子は、ＣＤ４発現のダウンレギュレーション、Ｔ細胞活性化の阻害およびＨＩＶ感染性の促進のような幾つかの活性を有することが示されている初期補助（アクセサリー）ＨＩＶタンパク質（Ｎｅｆ）をコードしている。ｅｎｖ遺伝子はウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードしており、該糖タンパク質は１６０キロダルトン（ｋＤａ）の前駆体（ｇｐ１６０）として翻訳され、ついで細胞プロテアーゼにより切断されて外部１２０ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）および膜貫通４１ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ４１）を与える。Ｇｐ１２０およびｇｐ４１は会合したままであり、ウイルス粒子上およびＨＩＶ感染細胞表面上に提示される。ｔａｔ遺伝子は、ＨＩＶの複製に必須の転写トランスアクチベーターであるＲＮＡ結合タンパク質であるＴａｔタンパク質の長い形態および短い形態をコードしている。ｒｅｖ遺伝子は、ＲＮＡ結合タンパク質である１３ｋＤａのＲｅｖタンパク質をコードしている。Ｒｅｖタンパク質は、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）と称されるウイルスＲＮＡの領域に結合する。Ｒｅｖタンパク質は核から細胞質への未スプライスウイルスＲＮＡの輸送を促進する。Ｒｅｖタンパク質はＨＩＶ後期遺伝子発現に要求され、そしてＨＩＶの複製に要求される。
【０００４】
該ウイルス発現タンパク質は、該ウイルスが標的細胞内に侵入し更なる感染性ウイルスの最終的産生のためのウイルスＲＮＡの複製を指令することを可能にする。Ｇｐ１２０は、他の補助受容体（コレセプター）分子に加えて、ヘルパーＴリンパ球、マクロファージおよび他の標的細胞の表面上に存在するＣＤ４／ケモカイン受容体に結合する。Ｘ４（マクロファージ指向性）ウイルスはＣＤ４／ＣＸＣＲ４複合体に対する指向性を示し、Ｒ５（Ｔ細胞系指向性）ウイルスはＣＤ４／ＣＣＲ５受容体複合体と相互作用する。ｇｐ１２０がＣＤ４に結合した後、ｇｐ４１が、ウイルスの侵入をもたらす融合事象を媒介する。ついで該ウイルスは標的細胞と融合しそれに侵入し、ついでＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、その一本鎖ＲＮＡゲノムから二本鎖ＤＮＡへの逆転写が生じる。ついで、プロウイルスとして公知の該ウイルスＤＮＡは細胞核に侵入し、該細胞核内で、該ウイルスＤＮＡは、該核内での新たなウイルスＲＮＡの産生、初期および後期ＨＩＶウイルスタンパク質の発現、ならびにそれに続く新たなウイルス粒子の産生および細胞放出を指令する。該一次感染は、該ウイルスの非常に高い産生および組織分布ならびにそれに続くウイルスの定常状態レベル（ただし、これはこの相における連続的なウイルス産生およびターンオーバーによるものである）を与え、最終的には、臨床的エイズ発症を招く更なるウイルス負荷の放出をもたらすことが、宿主内のウイルス負荷の検出能における最近の進歩から示されている。生産的感染細胞は数日間の半減期を有し、一方、慢性または潜伏感染細胞は３週間の半減期を有し、それに続く非生産的感染細胞は、長い半減期（１００日以上）を有するが、疾患経過の全体にわたり認められる日々のウイルス負荷に有意には寄与しない。
【０００５】
免疫防御に決定的に重要なＣＤ４ヘルパーＴリンパ球の破壊が、ＨＩＶ感染の特徴である進行性免疫機能不全の主要原因である。ＣＤ４  Ｔ細胞の喪失は、ほとんどの侵入体と戦う身体能力を著しく損なうが、それはウイルス、真菌、寄生生物および或る細菌（マイコバクテリアを含む）に対する防御に対して特に深刻な影響を及ぼす。
【０００６】
ＨＩＶ感染個体に対する有効な治療法が利用可能となっており、ＨＩＶ感染個体の治療に役立っている。ＨＩＶ複製のインヒビターとして作用する抗ウイルス剤（抗レトロウイルス療法（「ＡＲＴ」）を含むがこれに限定されるものではない）はエイズおよび類似疾患の治療において大きな成功を収めていることが示されており、抗ウイルス薬での有効な治療は、ウイルス負荷レベルを８週間以内に９０％以上減少させ、６ヶ月以内に最終的に検出不可能なレベルにまでウイルス負荷を連続的に減少させると報告されている。現在のところ、逆転写酵素インヒビター（例えば、アジドチミジン（ＡＺＴ）およびエファビレンツ）、プロテアーゼインヒビター（例えば、インジナビルおよびネルフィナビル）およびインテグラーゼインヒビターを含む（これらに限定されるものではない）幾つかのクラスの抗ウイルス化合物が存在する。
【０００７】
残念ながら、これらの薬物は世界の多くの地域における該疾患に対して有意な効果をもたらさないであろう。さらに、これらの治療選択が可能な個体においては、低レベルのウイルスを維持し最終的にはウイルスのリバウンドを防ぐためには、治療は長期間の抗レトロウイルス療法を要するであろう。この理由により、最近では、感染個体に免疫原を投与することにより、抗レトロウイルス療法を受けたＨＩＶ感染者の免疫応答を促進することに精力が注がれている。示されている刊行物においては、免疫原としてＨＩＶ抗原が使用され、ＤＮＡの投与、全不活化（ｇｐ１２０欠失）ＨＩＶ−１ワクチンの投与またはポックスウイルスベクター（例えば、ＡＬＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ）による投与によりそれが運搬されている。例えば、ＨｏｆｆおよびＭｃＮａｍａｒａ，１９９９  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３５３：１７２３−１７２４、ならびに以下の特許公開：ＷＯ  ９８／０８５３９、ＷＯ  ０１／０８７０２、ＷＯ  ０１／５４７０１およびＷＯ  ０２／０９５００５を参照されたい。
【０００８】
出願人が知る限りにおいては、抑制されたウイルス血症を示すＨＩＶ既感染者が、ＨＩＶ抗原をコードする外因性核酸を含む組換え複製欠損型アデノウイルスで免疫化されたということはない。本明細書に開示するとおり、この方法は、非常に幅広い性質のウイルス特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞応答の両方を非常に高レベルで誘導しうる。結果的に生じる治療用免疫応答は、低力価のウイルスを有効に維持する能力を有し、したがって、抗ウイルス療法に対する個体の依存性を軽減すると予想される。強力なＨＩＶ特異的細胞性免疫応答を感染個体において回復させるのを補助しうる、ＨＩＶ感染個体において有用なワクチン法を見出すことが、エイズとの闘いにおいて非常に重要であろう。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）に感染した個体において治療用免疫応答を惹起するための改良された方法を提供する。該方法は、少なくとも１つのＨＩＶ抗原をコードする外因性核酸を含む組換え複製欠損型アデノウイルスを投与することにより、ウイルス血症の能動的（ａｃｔｉｖｅ）抑制（能動免疫応答または抗ウイルス剤での治療によるもの）を示す感染個体を免疫化することを含む。このような免疫化は、非常に幅広い性質のウイルス特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞応答における顕著な増強を誘導する。結果的に生じる治療用免疫応答は、ウイルスの低力価を有効に維持する能力を有し、したがって、抗ウイルス療法に対する個体の依存性を軽減すると予想される。
【００１０】
細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）は免疫系の細胞性応答の必須部分を構成する。ＣＴＬ免疫応答を惹起するためには、抗原が細胞内で合成されるか細胞内に導入され、ついでプロテアソーム複合体により小さなペプチドにプロセシングされ、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質との最終的な会合のために小胞体／ゴルジ複合体分泌経路内に輸送されなければならない。ＣＤ８＋  Ｔリンパ球は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＣＤ８細胞表面タンパク質を介して、クラスＩ  ＭＨＣと会合した抗原を認識する。活性化エフェクターまたは記憶細胞へのナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化は、一般には、前記のとおりの抗原のＴＣＲ関与および共刺激タンパク質の関与の両方を要する。ＣＴＬ応答の最適な誘導は、通常、ＴＣＲおよびＣＤ４の関与を介してＭＨＣクラスＩＩ分子と会合した抗原を認識するＣＤ４＋  Ｔリンパ球からのサイトカインの形態での「援助」を要する。ＨＩＶに感染した個体が、ワクチン投与の前またはそれと同時に、該治療個体自身の能動免疫応答または抗ウイルス療法に対する好ましい応答により有効に阻止されたウイルス複製を示している場合、本発明は、該個体においてＣＤ８＋およびＣＤ４＋応答の両方を誘導する能力を有する。
【００１１】
したがって、本発明は、ＨＩＶウイルスコピー数の減少を示している個体に、ＨＩＶ抗原をコードする外因性核酸を含む組換え複製欠損型アデノウイルスを投与することを含んでなる、ＨＩＶに感染した個体においてＨＩＶに対する細胞性免疫応答を惹起するための方法に関する。過去の或る時点と比較してウイルス負荷（ｖｉｒａｌ  ｌｏａｄ）が減少している状態（促進されてそうなったのかどうかには無関係である）は、一般に、本明細書中では「抑制（されている）」または「阻止（されている）」と称される。好ましい実施形態においては、ウイルス負荷は減少しており、１０，０００ウイルスコピーまたはそれ未満、より好ましくは約５，０００コピーまたはそれ未満の規模である。好ましくは、該個体は血漿１ｍｌ当たり少なくとも３００細胞のＣＤ４＋数、より好ましくは、血漿１ｍｌ当たり４００細胞を超えるＣＤ４＋数、最も好ましくは、血漿１ｍｌ当たり５００細胞を超えるＣＤ４＋数を有する。また、該個体は未だエイズに進行していないことが好ましい。免疫化の時点でのウイルス数の減少の原因は重要ではない。該減少は、例えば、該ウイルスの存在に対して免疫系が応答する先天的能力、ウイルス負荷を抑制状態に維持するよう個体を補助する前もって行う免疫化、または抗ウイルス剤での治療によりもたらされうる。抗ウイルス剤は、ウイルス負荷の減少をもたらしうる任意の化合物または療法から選ばれうる。抗ウイルス剤は、好ましくは、プロテアーゼインヒビター、逆転写酵素インヒビターおよびインテグラーゼインヒビターよりなる化合物のクラスから選ばれる。好ましくは、個体に投与する抗ウイルス剤は、高活性抗レトロウイルス療法（「ＨＡＡＲＴ」）（この用語は、一般には、３種以上の抗ウイルス薬のカクテルを意味するものとして当技術分野で用いられ、ウイルスプロテアーゼインヒビターと逆転写酵素インヒビターとの組合せを包含する）において使用するもののような有効な抗ウイルス療法剤の何らかの組合せである。
【００１２】
本発明の方法において有用な組換え複製欠損型アデノウイルスは、少なくとも１つのＨＩＶ抗原をコードする外因性核酸を含む。該ＨＩＶ抗原は、個体において免疫応答を惹起しうる任意の抗原であることが可能であり、最も好ましくは、ＨＩＶ  ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ｒｅｖ、ｔａｔ、ｖｐｕ、ｖｐｒおよびｖｉｆよりなる群から選ばれるＨＩＶ抗原またはそれらの任意の抗原性／免疫原性部分に由来する。本発明は更に、ＨＩＶ抗原を発現する組換えアデノウイルスの単一および複数の投与を含み、したがって、それと共に、本発明の方法において使用する種々の初回−追加抗原刺激法を含む。そのような場合においては、個体に、まず、ＨＩＶ抗原をコードする核酸を含むウイルス（またはポリヌクレオチド）ビヒクルの初回量を投与し、ある期間の後、ＨＩＶ抗原をコードする核酸を含むウイルス（またはポリヌクレオチド）ビヒクルの追加量を投与し、ここで、初回投与または追加投与のいずれかはアデノウイルスビヒクルを使用する。好ましくは、最初に投与したビヒクルに対する宿主免疫を回避するために、初回投与のウイルスビヒクルおよび追加投与のウイルスビヒクルは互いに異なる。互いのウイルスビヒクルの選択は、本明細書に開示する方法の成功のために重要ではない。該抗原を運搬し該抗原の十分な発現を達成して細胞性免疫応答を惹起しうる任意のウイルスビヒクルが、アデノウイルスによる初回または追加投与に十分なはずである。互いに異なるビヒクルは、異なるアデノウイルス血清型から選ばれうる。あるいは、アデノウイルス投与の後または前に、異なる起源のウイルスビヒクル、例えばポックスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを投与することが可能である。本発明のもう１つの実施形態は、アデノウイルス投与の前または後に、ＨＩＶ抗原をコードする核酸のポリヌクレオチド投与を行う初回−追加法を用いる。本発明の更にもう１つの実施形態は、アデノウイルス投与の前または後に、タンパク質／組換えタンパク質投与の形態のＨＩＶ抗原の運搬を行う初回−追加法を用いる。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
抑制されたウイルス血症を有することにより特徴づけられるＨＩＶ感染個体において治療用免疫応答を惹起するための新規方法を記載する。該方法は、少なくとも１つのＨＩＶ抗原をコードする外因性核酸を含む組換え複製欠損型アデノウイルスを感染個体に投与することを含み、該個体は、該投与の前またはそれと同時に、ＨＩＶウイルスコピー数の減少を示している。免疫化の時点でのウイルスコピー数（すなわち、ウイルス負荷）の減少の具体的な原因は重要ではない。該減少は、例えば、該ウイルスの存在に対して免疫系が応答する先天的能力、ウイルス負荷を抑制状態に維持するよう個体を補助する前もって行う免疫化、抗ウイルス剤での治療、または恐らくは不明なままでさえありうる任意の他の原因によりもたらされうる。重要なのは、治療されたＳＩＶ感染マカクにおけるウイルス特異的細胞傷害性ＣＤ８＋およびヘルパーＣＤ４＋  Ｔ細胞応答の顕著な増強により示されるとおり、このような（すなわち、この感染段階におけるアデノウイルスビヒクルでの）治療個体の免疫化が該個体においてウイルス特異的細胞性免疫応答を有効に惹起することが判明したという知見である。結果的に生じる治療用免疫応答は、ウイルスの低力価を有効に維持する能力を有し、したがって、抗ウイルス療法に対する個体の依存性を軽減すると予想される。
【００１４】
感染個体の治療において使用する具体的な抗ウイルス剤は本方法の有用性とは無関係である。抗ウイルス剤は、例えば、抗体、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチドまたは小さな分子に基づく／由来するものでありうる。個体内のウイルス複製／ウイルス負荷を有効に軽減する任意の抗ウイルス剤が、本明細書に開示する方法による免疫化のための十分な準備を個体にもたらすはずである。抗ウイルス剤はウイルスの機能／生活環を妨げ、該ウイルスの適切な生活環に必須のタンパク質／機能を標的化し、その作用はインビボまたはインビトロアッセイにより容易に測定されうる。特定のウイルスタンパク質を標的化する幾つかの代表的な抗ウイルス剤としては、プロテアーゼインヒビター、逆転写酵素インヒビター（ヌクレオシド類似体、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターおよびヌクレオチド類似体）およびインテグラーゼインヒビターが挙げられる。プロテアーゼインヒビターには、例えばインジナビル／ＣＲＩＸＩＶＡＮ（登録商標）、リトナビル／ＮＯＲＶＩＲ（登録商標）、サキナビル／ＦＯＲＴＯＶＡＳＥ（登録商標）、ネルフィナビル／ＶＩＲＡＣＥＰＴ（登録商標）、アンプレナビル／ＡＧＥＮＥＲＡＳＥ（登録商標）、ロピナビルおよびリトナビル／ＫＡＬＥＴＲＡ（登録商標）が含まれる。逆転写酵素インヒビターには、例えば、（１）ヌクレオシド類似体、例えばジドブジン／ＲＥＴＲＯＶＩＲ（登録商標）（ＡＺＴ）、ジダノシン／ＶＩＤＥＸ（登録商標）（ｄｄＩ）、ザルシタビン／ＨＩＶＩＤ（登録商標）（ｄｄＣ）、スタブジン／ＺＥＲＩＴ（登録商標）（ｄ４Ｔ）、ラミブジン／ＥＰＩＶＩＲ（登録商標）（３ＴＣ）、アバカビル／ＺＩＡＧＥＮ（登録商標）（ＡＢＣ）、（２）非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、例えばネビラピン／ＶＩＲＡＭＵＮＥ（登録商標）（ＮＶＰ）、デラビルジン／ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ（登録商標）（ＤＬＶ）、エファビレンツ／ＳＵＳＴＩＶＡ（登録商標）（ＥＦＶ）、および（３）ヌクレオチド類似体、例えばテノフォビルＤＦ／ＶＩＲＥＡＤ（登録商標）（ＴＤＦ）が含まれる。インテグラーゼインヒビターには、例えば、２００３年３月２０日付け公開の米国特許出願公開番号ＵＳ２００３／００５５０７１および国際出願ＷＯ  ０３／０３５０７７に開示されている分子が含まれる。示されているとおり、該抗ウイルス剤は該ウイルス／ウイルスタンパク質の機能、例えば、それぞれトランス活性化応答領域（「ＴＡＲ」）またはｒｅｖ応答要素（「ＲＲＥ」）との調節タンパク質ｔａｔまたはｒｅｖの相互作用をも標的化しうる。
【００１５】
本発明は、抗ウイルス剤の組合せで治療された個体の免疫化をも含む。例えば、抗ウイルス剤は、以下の表に示すものを含む（それらに限定されるものではない）、ＨＩＶ感染またはエイズの治療に有用なＨＩＶ／エイズ抗ウイルス剤、免疫調節剤、抗感染剤またはワクチンの有効量と組合せて投与することが可能である。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
本明細書に開示する方法において免疫化の前にウイルス負荷を減少させるために使用しうる抗ウイルス剤の組合せの範囲は前記表に限定されるものではなく、原理上は、ＨＩＶ感染またはエイズの治療に有用な任意の医薬組成物との任意の組合せを含むと理解されるであろう。抗ウイルス剤および他の物質は、ＨＩＶ／エイズの治療のための治療剤として使用される場合には、典型的には、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２０００に記載されている投与量を含む、当技術分野において報告されているそれらの通常の投与量範囲および投与計画で使用される。
【００１８】
ウイルスの生活環の抗ウイルス的阻害およびそれに伴うウイルス負荷に対する影響は、とりわけ、治療の前、途中および／または後に個体内に存在するウイルスコピーの数を分析することにより測定することが可能である。この測定結果は、任意の特定の抗ウイルス治療計画の成功／失敗に関する指標として使用することが可能であり、個体の臨床的進行の診断またはリスクを予想するための基礎となる。特定の個体は或る抗ウイルス剤に対する耐性を示すことがあり、したがって、任意の特定の抗ウイルス治療計画の成功の度合を監視することが重要である。ウイルス負荷は患者の細胞、血漿または組織内のウイルス／ウイルス感染細胞の量の尺度である。疾患の進行に関連した絶対的な数は存在しないが、血漿内のウイルスの或るレベルは個体の感染状態を示すものとして分類されている。血漿ＨＩＶ  ＲＮＡレベルの減少は生存の延長および疾患への進行の可能性の減少に関連づけられている。したがって、ウイルスのレベルが高くなればなるほど、発症が速くなるようである。血漿１ｍｌ当たりに約１００，０００コピー以上のＨＩＶ  ＲＮＡが存在する場合には非常に高レベルのウイルスが存在すると言われており、血漿１ｍｌ当たりに約３０，０００〜５０，０００コピーのＨＩＶ  ＲＮＡが存在する場合には高レベルのウイルスが存在すると言われており、血漿１ｍｌ当たりに約５，０００〜１０，０００コピーのＨＩＶ  ＲＮＡが存在する場合には低レベルのウイルスが存在すると言われている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら，１９９６  ＪＡＭＡ  ２７６：１４７−１５４）。患者の血液細胞、組織、血清または血漿に対して行うアッセイにより直接的または間接的にウイルス負荷を測定するためには幾つかの手段が利用可能である。例えば、“Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＩＨ  ｔｏ  Ｄｅｆｉｎｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＨＩＶ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”，Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ  ＆  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  Ｗｅｅｋｌｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，４７（Ｎｏ．ＲＲ−５）の１９９８年４月２４日号（１９９８年６月１７日改訂）；Ｖｏｌｄｂｅｒｄｉｎｇ  ＆  Ｊａｃｏｂｓｏｎ，１９９２  ＡＩＤＳ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡを測定するために利用可能な技術には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）増幅技術（例えば、ＷＯ  ９４／２０６４０；ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９４  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９１（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．））；分岐ＤＮＡ（「ｂＤＮＡ」）試験（例えば、ＷＯ  ���２／０２５２６；米国特許第５，４５１，５０３号；米国特許第４，７７５，６１９号；ＱＵＡＮＴＩＰＬＥＸ（登録商標）；ＶＥＲＳＡＮＴ（登録商標））；標準的なハイブリダイゼーション（ハイブリダイゼーションにおけるプローブの使用を含む；例えば、ＥＰ  ６１７，１３２を参照されたい）；および抗体検出方法。ウイルス負荷は、抗ウイルス剤での治療の前に測定すべきである。抗ウイルス薬での有効な治療は、ウイルス負荷を８週間以内に９０％以上減少させ、その後、６ヶ月以内に検出不可能なレベルにまでウイルス負荷を減少させ続けると報告されている。好ましくは、本発明の方法におけるワクチン接種の前に投与する抗ウイルス剤はウイルス負荷の減少をもたらし、ウイルス負荷をウイルスの定常状態レベルの１／３以下に、より好ましくは、「検出不可能」なレベル（これは、その時点で利用可能な技術および用いる具体的な技術により定義される用語である）にまで減少させる。
【００１９】
出願人は、抑制されたウイルス血症の存在／非存在と、ＨＩＶ抗原をコードする核酸の運搬において組換え複製欠損型アデノウイルスを使用する免疫化プロトコールの利益との間の相関性を同定した。したがって、本発明は、ウイルス負荷が抑制されている（すなわち、ウイルス負荷レベルが、過去の或る時点において存在したものから減少している）ＨＩＶ感染個体の免疫化に基づくものである。したがって、本発明の１つの実施形態は、ウイルス血症の抑制の後またはそれと同時に行うＨＩＶ感染個体の治療用免疫化を含む。ウイルス血症の抑制は、素質的（免疫化）／先天的免疫応答、抗ウイルス剤での治療などから生じる、ウイルス負荷の減少と定義される。アデノウイルスは、感染した免疫化対象においてウイルス特異的細胞性免疫応答を引き起こしうることが確認されている。
【００２０】
アデノウイルスは、いくつかの鳥類および哺乳類宿主において同定されている非外包性正二十面体ウイルスである（Ｈｏｒｎｅら，１９５９  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：８４−８６；Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９０  Ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編，ｐｐｓ．１６７９−１７２１）。最初のヒトアデノウイルス（Ａｄ）は４０年以上前に分離された。それ以来、種々の哺乳類種に感染する１００を超える異なるアデノウイルス血清型が分離されており、それらのうちの５１個はヒト由来である（Ｓｔｒａｕｓ，１９８４，Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｈ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ編，ｐｐｓ．４５１−４９８，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｓ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら，１９８８  Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５８：８０４−８１３；ＳｃｈｎｕｒおよびＤｏｎｄｅｒｏ，１９９３，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ；３６：７９−８３；Ｊｏｎｇら，ｌ９９９  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７：３９４０−５）。ラットおよびアカゲザル赤血球の赤血球凝集特性、ＤＮＡ相同性、制限酵素切断パターン、Ｇ＋Ｃ含量比および腫瘍原性を含む多数の生化学的、化学的、免疫学的および構造的基準に基づき、ヒト血清型は６つの亜属（Ａ〜Ｆ）に分類されている（Ｓｔｒａｕｓ，前掲；Ｈｏｒｗｉｔｚ，前掲）。
【００２１】
アデノウイルスゲノムは非常に詳細に特徴づけられている。それは約３６，０００塩基対の直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子よりなり、いくつかの異なる血清型が存在するにもかかわらず、同様に位置した特異的機能を有するアデノウイルスゲノムの全体的な体制においては或る程度の全般的保存性が認められる。
【００２２】
アデノウイルスは外因性遺伝子の運搬のための非常に魅力的な標的である。アデノウイルスの生物学は非常に詳細に理解されている。アデノウイルスが免疫適格性個体における重篤なヒト病理に関連していることは見出されていない。該ウイルスはそのＤＮＡを宿主細胞内に非常に効率的に導入し、多種多様な細胞に感染しうる。さらに、該ウイルスは、高いウイルス力価で大量に生産されうる。また、該ウイルスはウイルスゲノムの必須初期領域１（Ｅ１）の欠失／修飾により複製欠損型にされることが可能であり、該ウイルスは、Ｅ１活性を欠いた（または実質的に欠いた）もの、したがって、意図される宿主／ワクチン被接種体における複製能を喪失したものとなりうる。例えば、Ｂｒｏｄｙら，１９９４  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，７１６：９０−１０１を参照されたい。Ｅ１以外のアデノウイルス遺伝子（例えば、Ｅ３、Ｅ２および／またはＥ４）の欠失により、より大きな外因性遺伝子収容能を有するアデノウイルスベクターが得られており、該アデノウイルスベクターは有効な遺伝子運搬ビヒクルでもあることが判明した。したがって、そのようなベクターは、本発明の方法における使用に適している。前記理由の多くにより、アデノウイルスベクターはワクチン用および遺伝子治療用の遺伝子導入ベクターとして広範に使用されている。
【００２３】
現在のところ、Ｃ亜群からの２つの良く特徴づけられたアデノウイルス血清型であるＡｄ５およびＡｄ２が、最も広く使用されている遺伝子運搬用ベクターである。アデノウイルス血清型５は、外因性遺伝物質の発現を達成するための非常に有効なアデノウイルスビヒクルであることが判明している。野生型アデノウイルス血清型５配列は公知であり、当技術分野において記載されている。参照により本明細書に組み入れるＣｈｒｏｂｏｃｚｅｋら，１９９２  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８６：２８０を参照されたい。したがって、本発明の特定の実施形態は、初回投与または追加投与において野生型アデノウイルス血清型５配列に基づくアデノウイルスビヒクルを使用する免疫化方法であり、そのウイルスはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）にＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ−５として寄託されている。もう１つの実施形態は、使用するアデノウイルスベクター（Ａｄ５、Ａｄ６またはその他）がＷＯ  ０２／２２０８０（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている、本発明の免疫化方法である。該ベクターは、Ｅ１において少なくとも部分的に欠失しており、いくつかのアデノウイルスパッケージング反復を含む（すなわち、Ｅ１欠失は、野生型Ａｄ５配列に対応する塩基対約４５０−４５８までには開始しない）。これらの特性はウイルスの増殖特徴／特性を著しく促進することが判明している。
【００２４】
本発明は、アデノウイルス血清型２、５または６（ＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ−６；例えば、２００３年４月１７日付け公開のＷＯ  ０３／３１５８８を参照されたい）を使用して有効に行うことが可能であるが、本発明においては、単一投与法または別のウイルスビヒクルまたはポリヌクレオチド／タンパク質投与との組合せ投与における本明細書に開示されている方法において、別の異なるヒトおよび非ヒトアデノウイルスを使用することが可能であると予想される。当業者は、別の異なるアデノウイルス血清型（例えば、前記の亜属Ａ〜Ｆにおいて見出される種々の血清型；例えば、Ａｄ７、Ａｄ３５（例えば、ＥＰ１０５４０６４を参照されたい）、Ａｄ２４、Ａｄ３４などを包含するがこれらに限定されるものではない）および非ヒト血清型（霊長類アデノウイルス（例えば、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら，２００３  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（３）：１４１６−１４２２；Ｘｉａｎｇら，２００２  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（６）：２６６７−２６７５を参照されたい）を包含するがこれらに限定されるものではない）を容易に同定し、本明細書に開示されている方法にそれを組み入れることが可能である。代替的Ａｄ血清型は、一般集団においてそれよりも優勢なアデノウイルス血清型に対する中和抗体から逃れる能力を有するため、そのような代替的Ａｄ血清型が望ましい。また、血清型が異なれば、それが有する指向性も異なり、したがって、代替的血清型がワクチンまたは遺伝子治療に用いられた場合には、より優れた免疫応答が惹起されうる。
【００２５】
本発明の方法における使用に適したアデノウイルスベクターは、Ｈｉｔｔら，１９９７“Ｈｕｍａｎ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０：１３７−２０６（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に概説されているような公知技術を用いて構築することが可能である。関心のある特定のアデノウイルスに相同な配列を含む、関心のある異種核酸を含有するプラスミドまたはシャトルベクターを作製することが多い。ついで、相同組換えが生じて該ウイルス核酸内への該異種核酸の取り込みが生じる宿主細胞内に、シャトルベクターおよびウイルスＤＮＡまたは第２プラスミド（クローン化ウイルスＤＮＡを含有するもの）をコトランスフェクトする。好ましいシャトルベクターおよびクローン化ウイルスゲノムはアデノウイルス部分およびプラスミド部分を含有する。複製欠損型ベクターの構築において使用するシャトルベクターでは、アデノウイルス部分は、典型的には、非機能的な又は欠失したＥ１およびＥ３領域、ならびに簡便な制限部位に隣接した遺伝子発現カセットを含有する。シャトルベクターのプラスミド部分は、典型的には、原核生物プロモーターの転写制御下で抗生物質耐性マーカーを含有する。アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子および他の薬学的に許容される耐性マーカーを使用することが可能である。原核生物における発酵による該核酸の高レベルの産生を補助するためには、シャトルベクターが原核生物複製起点を含有し高コピー数であるのが好都合である。多数の商業的に入手可能な原核生物クローニングベクターがこれらの利点をもたらす。非必須ＤＮＡ配列は、好ましくは除去される。また、該ベクターは真核細胞内で複製不能であることが好ましい。これは、核酸ワクチン配列が被投与者のゲノム内に組込まれるリスクを最小にする。該核酸の発現を特定の組織型に限定するのが望ましい場合には、組織特異的プロモーターまたはエンハンサーを使用することが可能である。シャトルベクターおよび野生型アデノウイルスウイルスＤＮＡ（Ａｄバックボーンベクター）の相同組換えはアデノウイルスプレプラスミドの生成を引き起こす。線状化後、該プレプラスミドはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞または代替的Ｅ１相補性細胞系において複製されうる。ついで、ウイルスの複製が完了したら、感染細胞および培地を回収することが可能である。ついで、回収した物質を精製し、製剤化し、宿主への投与まで保存することが可能である。
【００２６】
組換えアデノウイルスの増殖およびレスキューのために使用するＥ１相補性細胞系は、ウイルスが複製するのに必須の要素（該要素が該細胞の遺伝物質内にコードされているかトランスで提供されるかには無関係である）を提供すべきである。さらに、Ｅ１相補性細胞系およびベクターは、複製可能ウイルス（または複製可能アデノウイルス（「ＲＣＡ」））を潜在的に与えうる、該ベクターのＤＮＡと該細胞系のＤＮＡとの間の相同組換えを可能にしうる重複要素を含有しないことが好ましい。典型的には、Ｅ１相補性細胞は、網膜または腎臓に由来するヒト細胞であるが、適当なＥ１または任意の他の重要な欠失領域を発現しうる任意の細胞系を使用して、本発明の方法での使用に適したアデノウイルスを作製することが可能である。羊膜細胞のような胚性細胞はＥ１相補性細胞系の作製に特に適していることが示されている。いくつかの細胞系が利用可能であり、それらには、公知細胞系ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）、９１１、２９３およびＥ１  Ａ５４９が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系はＷＯ  ９７／００３２６（１９９７年１月３日付け公開）および発行された米国特許第６，０３３，９０８号（それらを共に参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）は、相同組換えによる複製可能アデノウイルスの生成を妨げるように設計された、複製欠損型（ＦＧ）アデノウイルスの産生を相補するＥ１遺伝子セグメントが導入された初代ヒト網膜芽細胞系である。２９３細胞は、参照により本明細書に組み入れるＧｒａｈａｍら，１９７７  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ  ３６：５９−７２に記載されている。非Ｃ群アデノウイルスベクターの増殖およびレスキューのためには、増殖させるウイルスにおいて欠失しているＥ１領域に相補的なＥ１領域を発現する細胞系を使用することが可能である。あるいは、同じ血清型に由来するＥ１およびＥ４の領域を発現する細胞系を使用することが可能である。例えば、米国特許第６，２７０，９９６号を参照されたい。もう１つの別法は、利用可能なＥ１発現細胞系（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、Ａ５４９または２９３）内で非Ｃ群アデノウイルスを増殖させることであろう。この後者の方法は、決定的に重要なＥ４領域を、増殖させるアデノウイルス内に導入することを含む。決定的に重要なＥ４領域は、相補性細胞系のＥ１遺伝子産物（特にＥ１Ｂ  ５５Ｋ領域）のものと同じ又は非常に類似した血清型のウイルスに固有のものであり、少なくとも、Ｅ４  Ｏｒｆ６をコードする核酸を含む。当業者は、本発明の方法での使用に適した組換え複製欠損型アデノウイルスの製造に適した多数の他の方法を容易に理解し実施することが可能である。
【００２７】
本発明での使用に適した組換えアデノウイルスは、ＨＩＶ抗原またはその免疫学的に関連した修飾体をコードする外因性核酸を含む。関心のあるＨＩＶ抗原には、ＨＩＶの主要構造タンパク質、例えばＧａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ（ｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１を包含する）、調節タンパク質（例えば、ＴａｔおよびＲｅｖ）および補助タンパク質（例えば、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、ＶｉｆおよびＮｅｆ）、それらの免疫学的に関連した修飾体／誘導体およびそれらの免疫原性部分が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明は、ＨＩＶ抗原をコードする核酸の種々のコドン最適化形態、例えば、コドン最適化ＨＩＶ  ｇａｇ（コドン最適化完全長（「ＦＬ」）ＧａｇおよびｔＰＡ−Ｇａｇ融合タンパク質のｐ５５形態を包含するがこれらに限定されるものではない）、ＨＩＶ  ｐｏｌ、ＨＩＶ  ｎｅｆ、ＨＩＶ  ｅｎｖ、ＨＩＶ  ｔａｔ、ＨＩＶ  ｒｅｖおよび免疫学的に関連のある選択された修飾体をも含む。特定の実施形態において、参照により本明細書に組み入れるＷＯ  ０２／２２０８０に開示されているｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ抗原を含む組換え複製欠損型アデノウイルスを使用する。コドン最適化ＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子はＷＯ  ０２／２２０８０に開示されている。コドン最適化ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子はＰＣＴ国際出願ＷＯ  ９７／３１１１５およびＷＯ  ９７／４８３７０に開示されている。コドン最適化ＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子は、２０００年１２月２１日付け出願の米国特許出願第０９／７４５，２２１号およびＷＯ  ０１／４５７４８に開示されている。コドン最適化ＨＩＶ−１  ｎｅｆ遺伝子は、２０００年１２月１５日付け出願の米国特許出願第０９／７３８，７８２号およびＷＯ  ０１／４３６９３に開示されている。特定のＨＩＶ抗原またはその免疫学的に関連した部分もしくは修飾体／誘導体をコードする前記のものを含む（それらに限定されるものではない）適当なヌクレオチド配列を選択することは当業者の認識範囲内に十分に含まれる。本明細書においては、「免疫学的に関連」または「抗原性」は、（１）ウイルス抗原に関しては、該タンパク質が、投与されると、該ウイルスの増殖および／または広がりを遅延させるのに及び／又は個体内に存在するウイルス負荷を減少させるのに十分な個体内における測定可能な免疫応答を惹起しうること、または（２）ヌクレオチド配列に関しては、該配列が、前記の能力を有するタンパク質をコードしうることを意味する。
【００２８】
該組換え複製欠損型アデノウイルスにより運搬される関心のある単一のタンパク質または抗原に加えて、２以上のタンパク質または抗原を別々のビヒクルまたは同一のビヒクルにより運搬することが可能である。複数の遺伝子／機能的等価体を適当なシャトルプラスミド内に連結して、複数のオープンリーディングフレームを含む前アデノウイルスプラスミドを作製することが可能である。複数の遺伝子／機能的等価体に関するオープンリーディングフレームは、異なるプロモーターおよび転写終結配列に、機能しうる形で連結されうる。他の実施形態においては、該オープンリーディングフレームは、単一プロモーターに、機能しうる形で連結されることが可能であり、該オープンリーーディングフレームは、内部リボソーム進入シグナル（ＩＲＥＳ；ＷＯ  ９５／２４４８５に開示されている）、または複数のオープンリーディングフレームの転写を単一プロモーターから外す（ｒｕｎ  ｏｆｆ）ことを可能にする適当な代替物に、機能しうる形で連結されうる。ある実施形態においては、該オープンリーディングフレームは、段階的（ｓｔｅｐｗｉｓｅ）ＰＣＲ、または２つのオープンリーディングフレームを互いに融合させるための適当な代替法により、互いに融合されうる。本発明での使用に適したｇａｇ−ｐｏｌ融合構築物の一例および種々の他の組合せ形式投与計画が、参照により本明細書に組み入れるＷＯ  ０２／２２０８０に開示されている。当技術分野で認識されている幾つかのＨＩＶ抗原の多様な組合せから構築された融合構築物（ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ融合体を包含するがこれに限定されるものではない）に到達しそれを有効に使用することは当業者の認識範囲内に十分に含まれる。本発明において有用なすべての構築物においては、ウイルスビヒクルの有効なパッケージング限界に、適切な配慮をしなければならない。例えば、アデノウイルス５型は野生型Ａｄ５配列の約１０５％のクローニング容量上限を示すことが判明している。
【００２９】
外因性核酸は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、株Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｏ、ＩＩＩＢ、ＬＡＶ、ＳＦ２、ＣＭ２３５およびＵＳ４を含む（これらに限定されるものではない）いずれかのＨＩＶ株に由来しうる。例えば、参照により本明細書に組み入れるＭｙｅｒｓら編，“Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ：１９９５（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＮＭ  ８７５４５）を参照されたい。本明細書に開示する方法での使用に適したもう１つのＨＩＶ株はＨＩＶ−１株ＣＡＭ−１である（参照により本明細書に組み入れるＭｙｅｒｓら編，“Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ：１９９５，ＩＩＡ３−ＩＩＡ１９）。この遺伝子はクレードＢ（北米／欧州）配列のコンセンサスアミノ酸配列に酷似している。ＨＩＶ遺伝子配列は種々のクレードのＨＩＶ−１に基づくことが可能であり、その具体例としては、クレードＢおよびＣが挙げられる。多数のＨＩＶ株の遺伝子の配列がＧｅｎＢａｎｋから公に入手可能であり、ＨＩＶの初代野外分離体は、これらの株を入手可能にするようＱｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と契約しているＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＮＩＡＩＤ）から入手可能である。また、株は、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ），Ｇｅｎｅｖａ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからも入手可能である。
【００３０】
外因性核酸はＤＮＡおよび／またはＲＮＡであることが可能であり、二本鎖または一本鎖でありうる。該核酸は、Ｅ１平行（５’から３’へ転写される）または逆平行（ベクターバックボーンに対して３’から５’方向へ転写される）配向で挿入されうる。該核酸は、所望の宿主（例えば、哺乳類宿主）内での発現のためにコドンが最適化されうる。該異種核酸は発現カセットの形態でありうる。遺伝子発現カセットは、典型的には、（ａ）関心のあるタンパク質または抗原をコードする核酸、（ｂ）該タンパク質をコードする核酸に機能しうる形で連結された異種プロモーター、および（ｃ）転写終結シグナルを含有する。特定の実施形態においては、該異種プロモーターは真核生物ＲＮＡポリメラーゼにより認識される。本発明での使用に適したプロモーターの一例は、最初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーターである（Ｃｈａｐｍａｎら，１９９１  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３９７９−３９８６）。本発明で使用されうるプロモーターの更なる例としては、強力免疫グロブリンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーターおよびβアクチンプロモーターが挙げられるが、意図される宿主内で発現を引き起こしうる任意のプロモーターが本発明の方法において使用されうると当業者に認識されうる。該プロモーターは、Ｔｅｔオペレーター配列のような調節可能配列を含みうる。転写および発現の調節の可能性をもたらすこれらのような配列は、遺伝子転写の抑制が望まれる場合に有用である。アデノウイルス遺伝子発現カセットは転写終結配列を含むことが可能であり、その具体例としては、ウシ成長ホルモン終結／ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）または以下のとおりに定められる５０ヌクレオチド長の短い合成ポリＡシグナル（ＳＰＡ）が挙げられる。
【００３１】
【化１】
2007515386.tif 000013
【００３２】
リーダーまたはシグナルペプチドをトランスジーン内に組込むことも可能である。特定の実施形態においては、リーダーは組織特異的プラスミノーゲンアクチベータータンパク質ｔＰＡに由来する。
【００３３】
該組換えアデノウイルスは、単独で又は初回／追加抗原刺激投与法の一部として投与することが可能である。この場合、個体に、まず、ＨＩＶ抗原をコードする核酸を含むウイルス（またはポリヌクレオチド）ビヒクルの初回量を投与し、ある期間の後、ＨＩＶ抗原をコードする核酸を含むウイルス（またはポリヌクレオチド）ビヒクルの追加量を投与し、ここで、初回投与または追加投与のいずれかはアデノウイルスビヒクルを使用する。初回量は免疫応答を有効に初回刺激して、後で循環免疫系において抗原が同一のものと確認されると該免疫応答は宿主内の該抗原を即座に認識しそれに応答しうる。好ましくは、最初に投与したビヒクルに対する宿主免疫を回避するために、初回投与のウイルスビヒクルおよび追加投与のウイルスビヒクルは互いに異なる。互いのウイルスビヒクルの選択は、本明細書に開示する方法の成功のために重要ではない。該抗原を運搬し該抗原の十分な発現を達成して細胞性免疫応答を惹起しうる任意のビヒクルが、アデノウイルスによる初回または追加投与に十分なはずである。混合様式の初回および追加接種法は、既存の抗ベクター免疫が存在する場合には特に、増強された免疫応答をもたらすであろう。初回−追加投与は、典型的には、（ウイルスベクター、プラスミド、タンパク質などにより）少なくとも１回、対象を初回抗原刺激し、所定の長さの時間を経過させ、ついで（ウイルスベクター、プラスミド、タンパク質などにより）追加抗原刺激することを含む。通常、複数の初回抗原刺激、典型的には１〜４回の初回抗原刺激を行うが、より多数の初回抗原刺激を行うことが可能である。初回抗原刺激と追加抗原刺激との間の時間の長さは、典型的には約４ヶ月〜１年と様々となりうるが、当業者に認識されるとおり他の時間枠を用いることも可能である。また、追従（ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ）または追加投与を、選択された時間間隔で反復することも可能である。
【００３４】
初回−追加法は、異なるアデノウイルス血清型、異なる起源のウイルス、ウイルスベクター／タンパク質の組合せ、ならびにウイルスおよびポリヌクレオチド投与の組合せを用いることが可能である。そのようなプロトコールの一例として、第１血清型の組換えアデノウイルスベクターを含む初回量を投与し、ついで、第２の異なる血清型の組換えアデノウイルスベクターを含む追加量を投与することが挙げられるであろう。そのような実施形態の一例は、血清型５の組換えアデノウイルスベクターを含む初回量を投与し、ついで、血清型６の組換えアデノウイルスベクターを含む追加量を投与することを含むであろう（参照により本明細書に組み入れる２００３年３月１２日付け出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０７７２７）。もう１つの実施形態は、初回投与および追加投与において、多様な起源の、異なるウイルスビヒクルの使用を含むであろう。ただし、初回投与および／または追加投与の少なくともいずれかはアデノウイルスビヒクルを使用する。異なるウイルスビヒクルの具体例には、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」；例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら，１９８７  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｓａｍｕｌｓｋｉら，１９８９  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８を参照されたい）、レトロウイルス（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，１９９０  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：５−１４；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）、ポックスウイルス（限定的なものではないが複製欠損型ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣおよびＭＶＡベクターを含む；例えば、Ｐａｎｉｃａｌｉ  ＆  Ｐａｏｌｅｔｔｉ，１９８２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：４９２７−３１；Ｎａｋａｎｏら  １９８２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：１５９３−１５９６；Ｐｉｃｃｉｎｉら，Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５４５−６３（Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）；Ｓｕｔｔｅｒら，１９９４  Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０３２−４０；Ｗｙａｔｔら，１９９６  Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：１４５１−８；ならびに米国特許第４，６０３，１１２号、第４，７６９，３３０号、第４，７２２，８４８号、第４，６０３，１１２号、第５，１１０，５８７号、第５，１７４，９９３号および第５，１８５，１４６号を参照されたい）およびアルファウイルス（例えば、ＷＯ  ９２／１０５７８；ＷＯ  ９４／２１７９２；ＷＯ  ９５／０７９９４；ならびに米国特許第５，０９１，３０９号および第５，２１７，８７９号を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＨＩＶ抗原の運搬のためにアデノウイルスおよびポックスウイルスベクターを使用する初回−追加法は、参照により本明細書に組み入れる２００３年３月１２日付け出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０７５１１に記載されている。前記免疫化法に代わる方法としては、アデノウイルスによる初回および／追加投与と共にポリヌクレオチド投与（限定的なものではないが「裸ＤＮＡ」または促進されたポリヌク���オチド運搬を含む）を用いるものが挙げられるであろう。例えば、Ｗｏｌｆｆら，１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５および以下の特許公開を参照されたい米国特許第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号、第５，７３９，１１８号、第５，７３６，５２４号、第５，６７９，６４７号、ＷＯ  ９０／１１０９２およびＷＯ  ９８／０４７２０。もう１つの代替手段としては、アデノウイルスと共に初回−追加法において組換えタンパク質の投与を用いるものが挙げられるであろう。
【００３５】
可能な宿主／ワクチン被接種体／個体には、霊長類、特にヒトおよび非ヒト霊長類が含まれ、商業的または家畜獣医学的に重要な任意の非ヒト哺乳類が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
該組換えウイルスベクターを含む組成物は、バッファー、正常食塩水またはリン酸緩衝食塩水、スクロース、他の塩およびポリソルベートのような生理的に許容される成分を含有しうる。ある実施形態においては、該製剤は、２．５〜１０ｍＭ  ＴＲＩＳバッファー、好ましくは約５ｍＭ  ＴＲＩＳバッファー；２５〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、好ましくは約７５ｍＭ  ＮａＣｌ；２．５〜１０％  スクロース、好ましくは約５％  スクロース；０．０１〜２ｍＭ  ＭｇＣｌ２；および０．００１％〜０．０１％  ポリソルベート８０（植物由来）を含有する。ｐＨは、約７．０〜９．０、好ましくは約８．０であるべきである。当業者は、他の通常のワクチン賦形剤も該製剤中で使用しうると理解するであろう。特定の実施形態においては、該製剤は、５ｍＭ  ＴＲＩＳ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート８０をｐＨ８．０で含有する。これは、ガラス表面へのウイルスの吸着の可能性を最小にしウイルス安定性のために最適に近いｐＨおよび二価陽イオン組成を有する。それは、筋肉注射の際に組織刺激を引き起こさない。それは、好ましくは、使用まで凍結される。
【００３７】
ワクチン被接種体内に導入されるワクチン組成物中のウイルス粒子の量は、使用する転写および翻訳プロモーターの強度ならびに発現遺伝子産物の免疫原性に左右されるであろう。一般には、１×１０７〜１×１０１２粒子、好ましくは約１×１０１０〜１×１０１１粒子の免疫学的または予防的に有効な用量を筋肉組織内に直接投与する。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した圧入（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）および他の投与様式、例えば腹腔内、静脈内または吸入運搬も意図される。本発明のワクチン組成物の非経口的導入と同時またはその後の、免疫応答を増強または拡張する他の物質（インターロイキン１２）の非経口投与、例えば静脈内、筋肉内、皮下または他の手段の投与も有利である。
【００３８】
以下の非限定的な実施例は本発明を例示するために記載されている。
【実施例１】
【００３９】
ＳＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含有するＡｄ５前（プレ）アデノウイルスプラスミドの構築
Ａ．アデノウイルスシャトルベクターの構築
ＳＩＶ  ｇａｇはｍａｃ２３９株から最初に分離された（Ｋｅｓｔｌｅｒら，１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１１０９−１１１２）。コドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号１）を化学合成し、ｐＶｌＲ−ＣＭＶＩ−ＳＩＶｇａｇ（Ｅｇａｎら，２０００  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７４８５−７４９５）内にクローニングした。制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩを使用する消化により、プラスミドｐＶｌＲ−ＣＭＶＩ−ＳＩＶｇａｇからＳＩＶ  ｇａｇ  ＤＮＡを単離した。ついで該ＢｇｌＩＩ断片をゲル精製し、プラスミドｐＭＡ１（ＭＲＫｐｄｅｌＥｌ＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）とも称される）（塩基対（「ｂｐ」）１−５７９２のＡｄ５配列を含有しｂｐ４５１−３５１０のＥ１配列の欠失を伴うプラスミドであり、該Ｅ１欠失内にＨＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨｐＡがＥ１平行配向で挿入されており、それらを唯一のＢｇｌＩＩ部位が隔てている）内のＢｇｌＩＩ部位内に連結した。この方法によりＡｄ５前プラスミドｐＭＡｌ−ｈＣＭＶ８−ＳＩＶｇａｇを得た。これは後にＭＲＫｐＡｌ−  ｈＣＭＶ８−ＳＩＶｇａｇと改名された。ＭＲＫｐＡｌ−ｈＣＭＶ８−ＳＩＶｇａｇ（ｐＭＡｌ−ｈＣＭＶ８−ＳＩＶｇａｇ）の遺伝的構造を制限酵素およびＤＮＡ配列決定により確認した。
【００４０】
Ｂ．前アデノウイルスプラスミドの構築
シャトルプラスミドＭＲＫｐＡｌ−ｈＣＭＶ８−ＳＩＶｇａｇ（ｐＭＡｌ−ｈＣＭＶ８−ＳＩＶｇａｇ）を制限酵素ＳｇｒＡＩおよびＢｓｔＺＩ１７Ｉで消化し、ついで線状化（ＣｌａＩ消化）Ａｄ５バックボーンプラスミドＭＲＫｐＡｄ（Ｅｌ−／Ｅ３−）ＣｌａＩと共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＪ５１８３内に同時形質転換した。生じたＭＲＫｐＡｄ−ｈＣＭＶ８−ＳＩＶｇａｇをＢＪ１５８３から回収し、大量生産のためにコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ２内に再形質転換した。ＭＲＫｐＡｄ−ｈＣＭＶ８−ＳＩＶｇａｇの遺伝的構造を制限酵素消化により確認した。ＥＬＩＳＡおよびウエスタン分析の結果はＳＩＶ  ｇａｇ遺伝子の発現を証明した。
【実施例２】
【００４１】
ＳＩＶ  ｎｅｆ遺伝子を含有するＡｄ５前アデノウイルスプラスミドの構築
Ａ．ＳＩＶ  ｎｅｆＧ２Ａ突然変異の作製およびアデノウイルスシャトルベクターの構築
ＳＩＶ  ｎｅｆ配列はｍａｃ２５１株から最初に分離された（Ｋｅｓｔｌｅｒら，１９８８  Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：６１９−６２２）。コドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号２）を化学合成し、ｐＡ１−Ｔｏ−ＳＩＶｎｅｆ内にクローニングした。プラスミドｐＡ１−Ｔｏ−ＳＩＶｎｅｆは、テトラサイクリンオペレーター（Ｔｏ）により調節されるヒトＣＭＶプロモーター、およびＳＩＶ  ｎｅｆ遺伝子の発現調節要素としてのウシ成長ホルモン転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルを利用するものである。ＧＣＣと各末端のＢｃｌＩ部位とを含有するプライマーを使用するＰＣＲ増幅により、ＳＩＶ  ｎｅｆのグリシン（Ｇ）の第２コドンＧＧＴをアラニン（Ａ）のＧＣＣに変換した。新たな遺伝子はｎｅｆＧＣＣ（新コドン）またはｎｅｆＧ２Ａ（アミノ酸変化）は称される。第２コドンの位置にＧＣＣを含有するプライマーを使用して、該ｎｅｆ遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＢｃｌＩで消化し、ゲル精製し、ＭＲＫＡｄ５シャトルプラスミドＭＲＫ２内のＢｇｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＢｃｌＩおよびＢｇｌＩＩの付着末端は適合性である）内に連結して、プラスミドＭＲＫ２−ｈＣＭＶ−ＳＩＶｎｅｆＧＣＣを得た。該プラスミドの遺伝的構造をＤＮＡ配列決定および制限酵素消化により確認した。
【００４２】
Ｂ．前アデノウイルスプラスミドの構築
シャトルプラスミドＭＲＫ２−ｈＣＭＶ−ＳＩＶｎｅｆＧＣＣを制限酵素ＢｓｔＺｌ７ＩおよびＳｇｒＡＩで消化し、ついで線状化（ＣｌａＩ消化）Ａｄ５バックボーンプラスミドｐＨＶＥ３と共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＪ５１８３内に同時形質転換した。生じたＭＲＫｐＡｄ−Ｅ３−ｈＣＭＶ−ＳＩＶｎｅｆ（ＧＣＣ）をＢＪ１５８３から回収し、大量生産のためにコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ２内に再形質転換した。前プラスミドＭＲＫｐＡｄ−Ｅ３−ｈＣＭＶ−ＳＩＶｎｅｆ（ＧＣＣ）の遺伝的構造を制限酵素消化により確認した。ウエスタン分析の結果はＳＩＶ  ｎｅｆＧＣＣ遺伝子の発現を証明した。
【実施例３】
【００４３】
研究用組換えアデノウイルスの作製
前臨床動物研究のためのウイルスを製造するために、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）付着単層細胞培養内で前アデノウイルスプラスミドを感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスＭＲＫＡｄ５ＳＩＶｇａｇをレスキューするためには、３０μｇのＭＲＫｐＡｄ−ｈＣＭＶ８−ＳＩＶｇａｇを制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ２キット（ＧＴＳ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用してＴ７５フラスコ内のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内にトランスフェクトした。感染性ウイルスＭＲＫＡｄ５ＳＩＶｎｅｆＧＣＣをレスキューするためには、３０μｇの前アデノウイルスプラスミドＭＲＫｐＡｄ−Ｅ３−ｈＣＭＶ−ＳＩＶｎｅｆ（ＧＣＣ）を制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、リン酸カルシウム共沈技術（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を用いてＴ７５フラスコ内のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）内にトランスフェクトした。ＰａｃＩ消化はプラスミド配列からウイルスゲノムを遊離させて、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）内への侵入後にウイルス複製を引き起こした。完全なウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察された後、感染細胞および培地を回収した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）付着単層細胞培養内での複数回の継代により、該ウイルスストックを増幅した。最終継代時に、ウイルスをＣｓＣｌ超遠心により細胞ペレットから精製し、特徴づけした。ウイルス粒子に関してウイルスゲノムを定量する分析用アッセイにより、ウイルスの量を測定した。組織培養感染量５０％（ＴＣＩＤ５０）アッセイにより、ウイルス感染力を測定した。精製されたウイルスの同一性および純度を、精製されたウイルスＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ（ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＰａｃＩ）分析により確認した。制限分析のためには、消化されたウイルスＤＮＡをＰ３３−ｄＡＴＰで末端標識し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、オートラジオグラフィーにより可視化した。ＳＩＶ  ｇａｇおよびｎｅｆＧＣＣ（Ｇ２Ａ）の遺伝子発現を、インビトロで増殖させたウイルス感染哺乳類細胞から集めた材料で、ＥＬＩＳＡまたはウエスタン分析によりモニターした。ＭＲＫＡｄ５ＳＩＶｇａｇおよびＭＲＫＡｄ５ＳＩＶｎｅｆＧＣＣ（ＭＲＫＡｄ−Ｅ３−ｈＣＭＶ−ＳＩＶｎｅｆ（ＧＣＣ））をマウスおよびアカゲザルにおける免疫学的評価において使用した。
【実施例４】
【００４４】
ＳＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含有するＡｄ６前アデノウイルスプラスミドの構築
ＳＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含有するＭＲＫＡｄ５前プラスミドの作製に使用したＭＲＫＡｄ５シャトルプラスミドｐＭＲＫｈＣＭＶＳＩＶｇａｇｂＧＨ（ＭＲＫｐＡｌ−ｈＣＭＶ８−ＳＩＶｇａｇまたはｐＭＡｌ−ｈＣＭＶ８−ＳＩＶｇａｇとも称される）を、対応するＭＲＫＡｄ６前プラスミドの作製に使用した。シャトルプラスミドｐＭＲＫｈＣＭＶＳＩＶｇａｇｂＧＨをＥｃｏＲＩおよびＳｔｕＩで消化し、ついで線状化（ＣｌａＩ消化）Ａｄ６バックボーンプラスミドｐＭＲＫＡｄ６Ｅｌ−と共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＪ５１８３内に同時形質転換した。回収したプラスミドを、大量生産のためにコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ２内に再形質転換した。前プラスミドｐＭＲＫＡｄ６Ｅｌ−ｈＣＭＶＳＩＶｇａｇｂＧＨの遺伝的構造を制限酵素消化により確認した。
【実施例５】
【００４５】
ＳＩＶ  ｎｅｆＧＣＣ遺伝子を含有するＡｄ６前アデノウイルスプラスミドの構築
ＳＩＶ  ｎｅｆ（ＧＣＣ）を含有するＭＲＫＡｄ５前プラスミドの作製に使用したＭＲＫＡｄ５シャトルプラスミドｐＭＲＫｈＣＭＶＳＩＶｎｅｆ（Ｇ２Ａ）（ＭＲＫ２−ｈＣＭＶ−ＳＩＶｎｅｆ（ＧＣＣ）とも称される）を、対応するＭＲＫＡｄ６前プラスミドの作製に使用した。シャトルプラスミドｐＭＲＫｈＣＭＶＳＩＶｎｅｆ（Ｇ２Ａ）をＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＸＩで消化し、ついで線状化（ＣｌａＩ消化）Ａｄ６バックボーンプラスミドｐＭＲＫＡｄ６Ｅｌ−と共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＪ５１８３内に同時形質転換した。ついで、回収したプラスミドを、大量生産のためにコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ２内に再形質転換した。前プラスミドｐＭＲＫＡｄ６Ｅｌ−ｈＣＭＶＳＩＶｎｅｆｂＧＨ（ＧＣＣまたはＧ２Ａ）の遺伝的構造を制限酵素消化により確認した。
【実施例６】
【００４６】
研究用組換えＭＲＫＡｄ６  ｇａｇおよびｎｅｆの作製
前臨床免疫原性研究のためのウイルスを製造するために、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）付着単層細胞培養内で前アデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ６Ｅｌ−ｈＣＭＶＳＩＶｇａｇｂＧＨおよびｐＭＲＫＡｄ６Ｅｌ−ｈＣＭＶＳＩＶｎｅｆｂＧＨを感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするためには、３０μｇのｐＭＲＫＡｄ６Ｅｌ−ｈＣＭＶＳＩＶｇａｇｂＧＨまたはｐＭＲＫＡｄ６Ｅｌ−ｈＣＭＶＳＩＶｎｅｆｂＧＨを制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で部分消化し、リン酸カルシウム共沈技術（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を用いてＴ７５フラスコ内のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内にトランスフェクトした。ｐＭＲＫＡｄ６Ｅｌ−ｈＣＭＶＳＩＶｇａｇｂＧＨおよびｐＭＲＫＡｄ６Ｅｌ−ｈＣＭＶＳＩＶｎｅｆｂＧＨはそれぞれ、３個のＰａｃＩ制限部位（各ＩＴＲに１個ずつ及び初期領域３内に位置する１個）を含有する。前Ａｄプラスミドの線状化（それらの３個のＰａｃＩ部位のうちの１個のみにおける消化）に好ましい消化条件を用いた。なぜなら、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内への侵入後のウイルスＤＮＡの複製の開始を可能にするためには、１個のみのＩＴＲの遊離が要求されるからである。完全なウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察された後、感染細胞および培地を回収した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内での複数回の継代により、該ウイルスストックを増幅した。最終継代時に、ウイルスをＣｓＣｌ超遠心により細胞ペレットから精製し、特徴づけした。ウイルス粒子に関してウイルスゲノムを定量する分析用アッセイにより、ウイルス量を測定した。組織培養感染量５０％（ＴＣＩＤ５０）アッセイにより、ウイルス感染力を測定した。精製されたウイルスの同一性および純度を、精製されたウイルスＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ（ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＰａｃＩ）分析により確認した。制限分析のためには、消化されたウイルスＤＮＡをＰ３３−ｄＡＴＰで末端標識し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、オートラジオグラフィーにより可視化した。ＳＩＶ  ｇａｇおよびｎｅｆ（ＧＣＣまたはＧ２Ａ）の遺伝子発現を、インビトロで増殖させたウイルス感染哺乳類細胞から集めた材料で、ＥＬＩＳＡまたはウエスタン分析によりモニターした。ＭＲＫＡｄ６ｈＣＭＶＳＩＶｇａｇｂＧＨおよびＭＲＫＡｄ６ｈＣＭＶＳＩＶｎｅｆｂＧＨ（ＧＣＣまたはＧ２Ａ）をマウスおよびアカゲザルにおける免疫学的評価において使用した。
【実施例７】
【００４７】
薬物の製剤化
化合物（２００３年３月２０日付け公開の米国特許出願第ＵＳ２００３／００５５０７１号に開示されているＮ−１−（７−｛［（４−フルオロベンジル）アミノ］カルボニル｝−８−ヒドロキシ−１，６−ナフチリジン−５−イル）−Ｎ−ｌ−，Ｎ−２−，Ｎ−２−トリメチルエタンジアミド）の新鮮な溶液を以下のとおりに毎週製剤化した。化合物を正確に秤量し、５．２４ｍｇ／ｍＬの濃度で蒸留脱イオン水に溶解した。液体が透明になり可視性化合物粒子を含有しなくなった際に溶解は完了する。
【実施例８】
【００４８】
ウイルス、試験薬物およびワクチンの投与
該研究は、ｍａｍｕＡ０１（＋）アカゲザルの４つのコホートよりなるものであった。第０日に、全コホートにＳＩＶｍａｃ２３９を直腸内感染させた。該ウイルスは以下のとおりに製造した。該ウイルスを１０％ウシ胎児血清／ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地に３．２×１０−５  ＴＣＩＤ５０／ｍＬの最終濃度まで希釈した。直腸内投与のために、１ｍＬ容量を別々のシリンジに充填した。第３０日に、コホート１および３の動物にＢＩＤ用量のＮ−１−（７−｛［（４−フルオロベンジル）アミノ］カルボニル｝−８−ヒドロキシル−１，６−ナフチリジン−５−イル）−Ｎ−ｌ−，Ｎ−２−，Ｎ−２−トリメチルエタンジアミドの投与を開始した。鼻−胃チューブを介して運搬される該化合物を２０．９８ｍｇ／ｋｇ／日で各サルに投与した。第１２２日および第１５０日にコホート１および２に５×１０１０  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５−ＳＩＶｇａｇ＋５×１０１０  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５−ＳＩＶｎｅｆのカクテルを筋肉内投与し、ついで第２３４日に５×１０１０  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ６−ＳＩＶｇａｇ＋５×１０１０  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ６−ＳＩＶｎｅｆのカクテルを追加投与した。すべての場合において、各ワクチンの全量を１ｍＬのバッファーに懸濁させた。該マカクを麻酔（ケタミン／キシレン）し、ツベルクリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して該ワクチンを０．５ｍＬのアリコートで両方の三角筋に筋肉内投与した。コホート４には該薬物投与も免疫化も行わなかった。該免疫化計画中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから、血漿、血清および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。すべての動物の世話および扱いは、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌに記載されている原則に従いＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されている基準に従い行った。
【実施例９】
【００４９】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
アカゲザルに対するＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、いくつかの修飾を伴う既に記載されているプロトコール（Ａｌｌｅｎら，２００１  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２）：７３８−７４９）に従い行った。抗原特異的刺激のために、１０−ａａの重複を伴う全ＨＩＶ−１  ｇａｇ配列を含む２０−ａａペプチド（Ｓｙｎｐｅｐ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）からペプチドプールを調製した。各ウェルに、５０μＬの２〜４×１０５個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を加え、８０フェムトリットル（「ｆＬ」）に設定された下方（ｌｏｗｅｒ）サイズカットオフを有するＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ２粒子分析装置を使用して、該細胞を計数した。５０μＬの培地または該ｇａｇペプチドプール（８μｇ／ｍＬ濃度／ペプチド）を該ＰＢＭＣに加えた。該サンプルを３７℃、５％  ＣＯ２で２０〜２４時間インキュベートした。相応してスポットを展開し、特製イメージャー、およびＩｍａｇｅＰｒｏプラットフォーム（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）に基づく自動計数サブルーチーンを使用して、該プレートを処理した。該計数を１０６細胞投入に対して正規化した。
【実施例１０】
【００５０】
細胞内サイトカイン染色
完全ＲＰＭＩ培地（１７×１００ｍｍ丸底ポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＣ）中）内の１ｍｌの２×１０６  ＰＢＭＣ／ｍｌに、抗ｈＣＤ２８（クローンＬ２９３、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）および抗ｈＣＤ４９ｄ（クローンＬ２５、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）モノクローナル抗体を１μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えた。ｇａｇ特異的刺激のために、１０μＬの該ペプチドプール（０．４ｍｇ／ｍＬ／ペプチド）を加えた。該チューブを３７℃で１時間インキュベートし、ついで２０μＬの５ｍｇ／ｍｌ  ブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ）を加えた。該細胞を３７℃、５％  ＣＯ２、湿度９０％で１６時間インキュベートした。４ｍＬの冷ＰＢＳ／２％  ＦＢＳを各チューブに加え、該細胞を１２００ｒｐｍで１０分間ペレット化した。該細胞をＰＢＳ／２％  ＦＢＳに再懸濁させ、いくつかの蛍光タグ付きｍＡｂ：２０μＬ／チューブ  抗ｈＣＤ３−ＡＰＣ、クローンＦＮ−１８（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）；２０μＬ  抗ｈＣＤ８−ＰｅｒＣＰ、クローンＳＫ１（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）；および２０μＬ  抗ｈＣＤ４−ＰＥ、クローンＳＫ３（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、表面マーカーに関して染色した（３０分間、４℃）。この段階からのサンプルの取扱いは暗所で行った。該細胞を洗浄し、７５０μＬの１×ＦＡＣＳ  Ｐｅｒｍバッファー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中、室温で１０分間インキュベートした。該細胞をペレット化し、ＰＢＳ／２％  ＦＢＳに再懸濁させ、０．１μｇのＦＩＴＣ抗ｈＩＦＮγ、クローンＭＤ−１（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を加えた。３０分間のインキュベーションの後、該細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させた。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置の全４色チャンネルを使用して、サンプルを分析した。該データを分析するために、低い側方および前方散乱リンパ球集団をまずゲーティング（ｇａｔｅ）した。サイトカイン陽性事象に関する一般的な蛍光カットオフを、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方の集団に対して並びにサンプルの模擬およびｇａｇペプチド反応チューブに対して用いた。
【実施例１１】
【００５１】
ウイルス負荷の測定
ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出系を使用するＳＩＶリアルタイムＲＮＡレベルと称されるアッセイ（Ｌｅｕｔｅｎｅｇｇｅｒら，２００１  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏ．１７（３）：２４３−５１；Ｈｏｆｍａｎｎ−Ｌｅｈｍａｎｎ）をＣｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｖａｎ  Ｎｕｙｓ，ＣＡにおいて行うことにより、ＥＤＴＡ処理血漿からウイルス負荷を測定した。このリアルタイムアッセイは８桁にわたって正確であり高感度であり再現性を有し、該研究の経過中のウイルス負荷の有効な特徴づけを可能にすることが示された。この試験は、ＨＩＶではなくＳＩＶのウイルス負荷を特異的に検出する。直線性は１０１〜１０９コピー／ｍＬの範囲であった。
【実施例１２】
【００５２】
結果
該研究におけるすべての動物はＳＩＶｍａｃ２３９による感染の最初の１７日以内にピークレベルのウイルス複製（３×１０６〜９×１０８ウイルスコピー／ｍＬ）を示した（図１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａ）。コホート１（図１Ａ）においては、６匹中３匹の動物が、第３０日に開始した薬物治療に応答し、ウイルス負荷はベースラインレベルまで３桁以上低下した。コホート３（図３Ａ）においては、６匹中２匹の動物が薬物治療に強力に応答し、ウイルス負荷はベースラインレベルまで低下している。
【００５３】
第１２２日および第１５０日に、コホート１および２にＭＲＫＡｄ５−ＳＩＶｇａｇ  ＋  ＭＲＫＡｄ５−ＳＩＶｎｅｆで免疫化を行い、ついで第２３４日に、ＭＲＫＡｄ６−ＳＩＶｇａｇ  ＋  ＭＲＫＡｄ６−ＳＩＶｎｅｆの混合物を投与した。第１１１、１３７、１５８および２５５日に、細胞内サイトカイン染色を用いて、抗ｇａｇ  Ｔ細胞応答を評価した。結果を図１Ｂ、１Ｃ、２Ｂ、２Ｃ、３Ｂ、３Ｃ、４Ｂおよび４Ｃに要約する。コホート１（図１Ｂ、１Ｃ）においては、ＭＲＫＡｄ５に基づくワクチンでの免疫化は、動物０２−Ｒ０５２、０２−Ｒ０５０および０２−Ｒ０５６において、ｇａｇ特異的細胞傷害性ＣＤ８＋およびヘルパーＣＤ４＋応答の両方の劇的な増強（＞１０倍）を誘導した。全３匹の動物はそれらのウイルス負荷レベルの薬物誘導性抑制を示した。ｇａｇ特異的Ｔ細胞応答の増強は、ＭＲＫＡｄ６に基づくワクチンでの免疫化の際にも、これらの動物において明らかであった。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋応答の増強を示した唯一の他の動物は０２−Ｒ０５３であった。この動物は、継続的薬物療法に応答したウイルス負荷の抑制を示さなかった。しかし、Ｔ細胞応答の増強は、ＭＲＫＡｄ６追加ワクチンの投与後には維持されなかった。薬物治療を行わなかったコホート２（図２Ｂ、２Ｃ）においては、２匹の動物（０２−Ｒ０５８、０２−Ｒ０４７）は、該コホート内のその他の動物より良好に、ウイルス抑制を自然に示したらしく、これらの２匹の動物は、ＭＲＫＡｄ５およびＭＲＫＡｄ６免疫化後に、ｇａｇに対するＣＤ８＋およびＣＤ４＋応答の両方における顕著な増強を示した。予想どおり、コホート３および４においてはＴ細胞応答における有意な変動は認められなかった。一般に、Ｔ細胞応答のレベルはコホート１において最高であり、コホート２、コホート３、そして最後にコホート４が続いた。抗ｎｅｆＴ細胞応答においても、全４個のコホートにおいて同様の傾向が観察された（データ非表示）。
【００５４】
また、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、ｇａｇペプチドプールをより小さな１０個のサブプールに分けることにより、Ｔ細胞応答の幅を測定した。それぞれはＮ末端からＣ末端までのタンパク質の約５０−ａａのセグメントを代表する。第７４日、第１５８日および第２６９日に、動物からのＰＢＭＣを該サブプールに対して試験した。図５は、与えられた時点で各動物に関して陽性抗原特異的応答が検出されたサブプールの数を示す。最も幅広いＴ細胞応答はコホート１、特に、薬物誘導性ウイルス抑制および該ワクチンに対する最強の免疫応答を示した動物（０２−Ｒ０５２、０２−Ｒ０５０、０２−Ｒ０５６）において観察された。
【００５５】
これらの知見は、抑制されたウイルス血症を示す感染個体のアデノウイルス媒介性免疫化が、非常に幅広い性質の非常の高レベルのウイルス特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞応答の両方をもたらしうるという見解を裏付けるものである。増強された免疫応答を惹起するこの方法は、感染個体が低ウイルス負荷を維持するよう補助し、したがって、抗ウイルス療法に対する個体の依存性を軽減すると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは抗レトロウイルス療法（「ＡＲＴ」）＋ワクチンコホートにおける結果を示す。（ａ）ウイルス負荷（ＲＮＡコピー／ｍＬ）が各動物について示されている。矢印は薬物療法の開始時（Ａ）および免疫化の時点（Ｖ）を示す。（ｂ）第１１１日（第１免疫化の前）、第１３７日（第１免疫化の後）、第１５８日（第２免疫化の後）、第２２７日（ＭＲＫＡｄ６免疫化の前）および第２５５日（ＭＲＫＡｄ６免疫化の後）におけるｇａｇ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレベル（リンパ球１０６個当たりのｇａｇ特異的ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の数）。これらは、全ＳＩＶｍａｃ２３９タンパク質を含む１０アミノ酸の重複を伴う２０アミノ酸のペプチドよりなるペプチドプールを使用して測定した。ここに示されている値は、模擬反応チューブにおけるレベルを得るために差し引かれた。（ｃ）（ｂ）と同じアッセイ日におけるｇａｇ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞のレベル（リンパ球１０６個当たりのｇａｇ特異的ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の数）。ここに示されている値も、模擬反応チューブにおけるレベルを得るために差し引かれた。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは「ワクチンのみ」コホートにおける結果を示す。（ａ）ウイルス負荷（ＲＮＡコピー／ｍＬ）が各動物について示されている。矢印は免疫化の時点（Ｖ）を示す。（ｂ）第１１１日（第１免疫化の前）、第１３７日（第１免疫化の後）、第１５８日（第２免疫化の後）、第２２７日（ＭＲＫＡｄ６免疫化の前）および第２５５日（ＭＲＫＡｄ６免疫化の後）におけるｇａｇ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレベル（リンパ球１０６個当たりのｇａｇ特異的ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の数）。これらは、全ＳＩＶｍａｃ２３９タンパク質を含む１０アミノ酸の重複を伴う２０アミノ酸のペプチドよりなるペプチドプールを使用して測定した。ここに示されている値は、模擬反応チューブにおけるレベルを得るために差し引かれた。（ｃ）（ｂ）と同じアッセイ日におけるｇａｇ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞のレベル（リンパ球１０６個当たりのｇａｇ特異的ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の数）。ここに示されている値も、模擬反応チューブにおけるレベルを得るために差し引かれた。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは「ＡＲＴのみ」コホートにおける結果を示す。（ａ）ウイルス負荷（ＲＮＡコピー／ｍＬ）が各動物について示されている。矢印は薬物療法の開始時（Ａ）を示す。（ｂ）第１１１日、第１３７日、第１５８日、第２２７日および第２５５日におけるｇａｇ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレベル（リンパ球１０６個当たりのｇａｇ特異的ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の数）。これらは、全ＳＩＶｍａｃ２３９タンパク質を含む１０アミノ酸の重複を伴う２０アミノ酸のペプチドよりなるペプチドプールを使用して測定した。ここに示されている値は、模擬反応チューブにおけるレベルを得るために差し引かれた。（ｃ）（ｂ）と同じアッセイ日におけるｇａｇ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞のレベル（リンパ球１０６個当たりのｇａｇ特異的ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の数）。ここに示されている値も、模擬反応チューブにおけるレベルを得るために差し引かれた。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは「無処理」対照コホートにおける結果を示す。（ａ）ウイルス負荷（ＲＮＡコピー／ｍＬ）が各動物について示されている。（ｂ）第１１１日、第１３７日、第１５８日、第２２７日および第２５５日におけるｇａｇ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレベル（リンパ球１０６個当たりのｇａｇ特異的ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の数）。これらは、全ＳＩＶｍａｃ２３９タンパク質を含む１０アミノ酸の重複を伴う２０アミノ酸のペプチドよりなるペプチドプールを使用して測定した。ここに示されている値は、模擬反応チューブにおけるレベルを得るために差し引かれた。（ｃ）（ｂ）と同じアッセイ日におけるｇａｇ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞のレベル（リンパ球１０６個当たりのｇａｇ特異的ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の数）。ここに示されている値も、模擬反応チューブにおけるレベルを得るために差し引かれた。
【図５】図５Ａ〜５Ｄはｇａｇ特異的Ｔ細胞応答の広さを示す。ｇａｇサブプールに対する陽性は、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける５０  ＳＦＣ／１０６  ＰＢＭＣ以上の応答により判定される。最大スコアは１０である。第７４日（ｄａｙ７４）（第１免疫化の前）、第１５８日（ｄａｙ１５８）（第２免疫化の後）および第２６９日（ｄａｙ２６９）（第３免疫化の後）に各動物についてＰＢＭＣをアッセイした。（ａ）ＡＲＴ＋ワクチンコホート。（ｂ）「ワクチンのみ」コホート。（ｃ）「ＡＲＴのみ」コホート。（ｄ）「無処理」対照コホート。
【図６】図６は、ＳＩＶｍａｃ２３９  ｇａｇをコードするコドン最適化核酸配列（配列番号１）を示す。
【図７】図７は、Ｇ２Ａ突然変異を有するＳＩＶｍａｃ２５１  ｎｅｆをコードするコドン最適化核酸配列（配列番号２）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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