(57)【要約】  試料中の分析物６０の存在を検出するためのセンサ構造物１０は、分子骨格２０、フェルスター共鳴エネルギ移動を介して相互作用する一対の標識４０、５０、及び少なくとも１つの分子認識ドメイン３０を含む。分析物６０に分子認識ドメイン３０が結合した場合、一対の標識４０、５０間のフェルスター共鳴エネルギ相互作用が妨害され、その結果光学信号が変化する。
2007529747.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析物の検出方法であって、
（ａ）（ｉ）分析物に特異的に結合する分子認識ドメイン、
（ｉｉ）ＲＥＴ供与体を含む第１標識、及び
（ｉｉｉ）第１標識のＲＥＴ供与体に対するＲＥＴ受容体であって、フェルスター共鳴エネルギ移動の発生を可能にする距離だけＲＥＴ供与体から離間しているＲＥＴ受容体を含む第２標識
を含むセンサ構造物であって、分子認識ドメインが分析物と結合するとき、分析物がＲＥＴ供与体及び／又はＲＥＴ受容体に接近することによって、ＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間のＦＲＥＴ相互作用が妨害されるセンサ構造物を調製するステップ、
（ｂ）試料をセンサ構造物に接触させるステップ、及びその後
（ｃ）センサ構造物からの光学信号を測定するステップ
を含み、ＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間のフェルスター共鳴エネルギ移動相互作用の妨害が検出されるとき、試料中に分析物が存在すると決定する方法。
【請求項２】
ＲＥＴ受容体をＲＥＴ供与体から約２５ナノメータ未満の距離だけ離間させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に複数のＲＥＴ供与体及びＲＥＴ受容体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＲＥＴ供与体を、蛍光タンパク質、発光タンパク質、非タンパクフルオロフォア、非タンパク化学発光化合物、及び蛍光ナノ結晶からなる群より選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
供与体を、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、及びそれらの内の１つの誘導体からなる群より選択された蛍光タンパク質とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＲＥＴ受容体を、蛍光タンパク質、非タンパクフルオロフォア、蛍光ナノ結晶、及び消光剤からなる群より選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
センサ構造物を試料に接触させる前にセンサ構造物のＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間のフェルスター共鳴エネルギ移動相互作用により発生するコントロール光学信号を測定するステップ、及び
コントロール光学信号と、ステップ（ｃ）の光学信号との差異を測定するステップ
を更に含み、コントロール光学信号とステップ（ｃ）の光学信号との差異によって試料中の分析物の量が示される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
コントロール光学信号とステップ（ｃ）の光学信号との差異を測定するステップが、センサ構造物の蛍光又は発光の強度又は減衰キネティクスの変化を測定することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
センサ構造物がポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが抗体のＦｖ部分を含み、分子認識ドメインがＦｖ部分のＣＤＲ領域を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
センサ構造物を調製するステップが、分子認識ドメインを含むポリペプチド、第１標識、及び第２標識を別々に調製することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第１標識がタンパク質ＡのＥドメインを含むリンカーを含み、第２標識がタンパク質Ｌの結合ドメインを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
分子認識ドメインがキレート化金属を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
分子認識ドメインがオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）分析物のエピトープに特異的に結合する分子認識ドメイン、
（ｂ）ＲＥＴ供与体を含む第１標識、及び
（ｃ）第１標識のＲＥＴ供与体に対するＲＥＴ受容体であって、フェルスター共鳴エネルギ移動の発生を可能にする距離だけＲＥＴ供与体から離間しているＲＥＴ受容体を含む第２標識
を含む分析物検出用のセンサ構造物であって、分子認識ドメインが分析物に結合すると、分析物の一部分がＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間に挿入される、センサ構造物。
【請求項１６】
ポリペプチドを含む、請求項１５に記載のセンサ構造物。
【請求項１７】
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含み、分子認識ドメイン中にｓｃＦｖのＣＤＲ領域を含む、請求項１６に記載のセンサ構造物。
【請求項１８】
第１標識がｓｃＦｖに結合している、請求項１７に記載のセンサ構造物。
【請求項１９】
第２標識がｓｃＦｖに結合している、請求項１７に記載のセンサ構造物。
【請求項２０】
抗体のＦｖ部分を含み、分子認識ドメイン中にＦｖ部分のＣＤＲ領域を含む、請求項１６に記載のセンサ構造物。
【請求項２１】
第１標識がＦｖのＶＨ部分に結合しており、第２標識がＦｖのＶＬ部分に付着している、請求項２０に記載のセンサ構造物。
【請求項２２】
第１標識がタンパク質ＡのＥドメインを含み、第２標識がタンパク質Ｌの結合ドメインを含む、請求項２１に記載のセンサ構造物。
【請求項２３】
第１標識がＦｖのＶＬ部分に付着しており、第２標識がＦｖのＶＨ部分に結合している、請求項２０に記載のセンサ構造物。
【請求項２４】
第１標識がタンパク質Ｌの結合ドメインを含み、第２標識がタンパク質ＡのＥドメインを含む、請求項２３に記載のセンサ構造物。
【請求項２５】
抗体を含む、請求項１６に記載のセンサ構造物。
【請求項２６】
第１標識が、タンパク質Ｌの結合ドメイン及びタンパク質ＡのＥドメインからなる群より選択されるリンカーを含む、請求項２５に記載のセンサ構造物。
【請求項２７】
第２標識が、タンパク質Ｌの結合ドメイン及びタンパク質ＡのＥドメインからなる群より選択されるリンカーを含む、請求項２５に記載のセンサ構造物。
【請求項２８】
分子認識ドメインがペプチドエピトープを含む、請求項１６に記載のセンサ構造物。
【請求項２９】
分子認識ドメインがオリゴヌクレオチドを含む、請求項１５に記載のセンサ構造物。
【請求項３０】
第１標識が分子認識ドメインを含む、請求項１５に記載のセンサ構造物。
【請求項３１】
第２標識が分子認識ドメインを含む、請求項１５に記載のセンサ構造物。
【請求項３２】
一対のヘテロ二量体コイルドコイルポリペプチドを含む、請求項１６に記載のセンサ構造物。
【請求項３３】
一対のヘテロ二量体コイルドコイルポリペプチドが、ＷｉｎＺｉｐ−Ａ２／ＷｉｎＺｉｐ−Ｂ１及びＥ／Ｋコイルからなる群より選択される、請求項３２に記載のセンサ構造物。
【請求項３４】
周辺質結合タンパク質を含む、請求項１６に記載のセンサ構造物。
【請求項３５】
周辺質結合タンパク質がマルトース結合タンパク質である、請求項２８に記載のセンサ構造物。
【請求項３６】
分子認識ドメインがセンサ構造物に特異的に結合する、請求項１６に記載のセンサ構造物。
【請求項３７】
（ａ）分析物に特異的に結合する分子認識ドメインを含む分子骨格、
（ｂ）ＲＥＴ供与体を含む第１標識、及び
（ｃ）第１標識のＲＥＴ供与体に対するＲＥＴ受容体であって、フェルスター共鳴エネルギ移動の発生を可能にする距離だけＲＥＴ供与体から離間しているＲＥＴ受容体を含む第２標識
を含む分析物検出用のセンサ構造物であって、分子認識ドメインが分析物に結合すると、分析物の一部分がＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間に挿入されるセンサ構造物。
【請求項３８】
ポリペプチドを含む、請求項３７に記載のセンサ構造物。
【請求項３９】
分子認識ドメインがキレート化金属を含む、請求項３７に記載のセンサ構造物。
【請求項４０】
（ａ）抗体のＦｖ部分を含むポリペプチド、
（ｂ）ＲＥＴ供与体を含む第１標識、及び
（ｃ）第１標識のＲＥＴ供与体に対するＲＥＴ受容体を含む第２標識、
を別々の成分として含むキットであって、第１標識及び第２標識のいずれか一方がタンパク質ＡのＥドメインを含み、他方の標識がタンパク質Ｌの結合ドメインを含む、請求項２０に記載のセンサ構造物を作製するためのキット。
【請求項４１】
（ａ）ＲＥＴ供与体及び第１ヘテロ二量体コイルドコイルポリペプチドを含む第１標識、
（ｂ）第１標識のＲＥＴ供与体に対するＲＥＴ受容体及び第２ヘテロ二量体コイルドコイルポリペプチドを含む第２標識であって、第１ヘテロ二量体コイルドコイルポリペプチドが第２ヘテロ二量体コイルドコイルポリペプチドに特異的に結合する第２標識、及び、
（ｃ）分子認識ドメインを含み、第１標識又は第２標識に特異的に結合するリンカーに付着される分子骨格
を含む、センサ構造物作製キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本出願明細書は、２００４年３月１７日出願の、米国仮特許出願第６０／５５４３１３号（表題「新規な蛍光ナノセンサタンパク質」）の優先権を主張するものであり、この出願の開示内容全体を本明細書中に参照文献として包含する。
【０００２】
背景
イムノアッセイ及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイは、分析物検出に最も広範に用いられる技術の一部である。ＰＣＲに基づく技術の感度は一般に良好であるが、多くの研究室における日常検査に広くは採用されていない。一つの理由は、ＰＣＲを生物学的材料中の分析物の検出に用いる場合、その精度が、ＰＣＲアッセイ自体の性能、並びに試験される生物学的材料から抽出される核酸の品質に強く影響されるためである。加えて、ＰＣＲに基づく方法の検出感度は、増幅過程を妨害する可能性のある抽出物中のインヒビタによって低減される場合がある。熟練研究者が、確実に精度の高いＰＣＲ測定を実行する必要がある。
イムノアッセイは一般により廉価であり、実行するのにそれ程訓練を必要としない。イムノアッセイは様々な形式で採用されており、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、側方流イムノアッセイ、及びウェスタンブロットアッセイが最も一般的である。しかしながら、現在のＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法は多数のインキュベーションステップを必要とし、オペレータエラーが発生しやすい。側方流イムノアッセイは一般に比較的迅速であるが、従来のＥＬＩＳＡと比べて正確でない。
【０００３】
Tsien等によって、分析物検出のための別の測定フォーマットが提案された。米国特許第５９９８２０４号に記述されたこの技術は、分析物結合領域及び２つの蛍光標識を有するタンパク質を利用する。分析物結合領域が分析物と結合すると高次構造の変換が起こり、それにより２つの蛍光標識が互いに位置を換える。これにより、２つの標識間の蛍光共鳴エネルギ相互作用が変化し、この変化を検出することにより分析物結合を測定する。
Frommer等は、ＰＣＴ国際出願第０３／０２５２２０号の中で、同様のアッセイフォーマットを提案した。このアッセイは、周辺質結合タンパク質部分及び２つの蛍光タンパク質部分を含む融合タンパク質を利用する。融合タンパク質は、分析物と結合すると高次構造を変化させ、２つの蛍光タンパク質部分の相対的位置が変化する。その際、変化した蛍光共鳴エネルギ相互作用が蛍光タンパク質部分間に誘発される。
Tsien及びFrommerにより開示されたアッセイ系は、いずれも、対象の分析物と結合すると高次構造を変化させるセンサ構造物の使用を必要とする。更に両者とも、例えば単糖類やアミノ酸類などの小さい分析物だけを検出する。従って、共鳴エネルギ移動相互作用を利用するが、分析物を検出するために高次構造を変化させなければならない構造物又は小さい分析物だけを検出する構造物に限定されない、分析物検出に更に広く使用できるアプローチが依然として必要とされている。
【０００４】
概要
試料中の分析物を検出する本発明の方法は、（ｉ）分析物と特異的に結合する分子認識ドメイン、（ｉｉ）ＲＥＴ供与体を含む第１標識、及び（ｉｉｉ）ＲＥＴ供与体に対するＲＥＴ受容体を含む第２標識を含むセンサ構造物を使用する。ＲＥＴ受容体はＲＥＴ供与体から、供与体から受容体へのフェルスター共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）の発生を可能にする距離だけ離され、その距離は好ましくは約１〜２５ナノメータである。センサ構造物の分子認識ドメインが分析物と結合すると、分析物がＲＥＴ供与体及び／又はＲＥＴ受容体に接近することによって、ＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間のＦＲＥＴ相互作用が妨害され、その結果検出可能な光学信号が発生する。試料中の分析物の存在はこの光学信号の検出によって示される。
更に具体的には、本発明の方法は、センサ構造物が試料と接触する前に、センサ構造物のＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間のフェルスター共鳴エネルギ移動相互作用により発生するコントロール光学信号を測定し、その後コントロール光学信号と、センサ構造物が試料と接触した後に検出される光学信号との差異を測定する特定のステップを含むことができる。この信号とコントロール光学信号との間の差異は、試料中の分析物の量を示し、よって分析物の定量的検出を可能にする。好ましくは、センサ構造物の蛍光又は発光の強度又は減衰キネティクスの変化を光学信号として測定する。
【０００５】
本方法において、ＲＥＴ供与体は、蛍光タンパク質、発光タンパク質、非タンパク質フルオロフォア、非タンパク質化学発光化合物、又は蛍光ナノ結晶などの、多数の蛍光又は発光部分のいずれかとすることができる。ＲＥＴ受容体は、ＲＥＴ供与体からの信号を消去する分子とすることができ、一部の実施形態においては、受容体信号の増大及び感度の増強を示す。光学信号の強度を増大するために、多数のＲＥＴ供与体及びＲＥＴ受容体を各センサ構造物上に含めることができる。センサ構造物自体はポリペプチドとすることができ、抗体、又は抗体のＦｖ部分などの抗体断片を含むことができる。そのような実施形態において、分子認識ドメインはセンサ構造物のＦｖ部分のＣＤＲ領域である。分子認識ドメインは代わりに、キレート化金属などの金属、又はオリゴヌクレオチドを含むこともできる。
センサ構造物の一部の実施形態において、分子骨格、分子認識ドメイン、及び／又は標識を別々の分子として調製し、結合させてセンサ構造物を形成することができる。例えば、分子骨格はヘテロ二量体コイルドコイルポリペプチドペアを含むことができ、分子認識ドメインは抗体のＦｖ断片（ＶＨ断片及びＶＬ断片を含む）の結合領域を含むことができる。この実施形態における分子認識ドメインは、キレート化金属、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ビオチン分子、又は非ペプチド酵素基質／インヒビタ分子とすることもできる。そのような実施形態におけるセンサ構造物の種々の成分は、互いに接触させると自己組織化し、ＲＥＴ供与体からＲＥＴ受容体へのフェルスター共鳴エネルギ移動の発生を可能にする。
【０００６】
本発明の上記及びその他の特徴、態様及び利点は、以下の説明、特許請求の範囲及び添付図面によって更に深く理解される。
本明細書中で特定される全ての寸法は例示のみを目的としており、限定的なものではない。更に図面中に示される比率は必ずしも正確でない。本技術分野の当業者であれば理解するように、本明細書中に開示されるあらゆる装置及び装置の部分の実際の寸法は、その使用目的によって決定される。
【０００７】
詳細な説明
本発明のセンサ構造物は、２つの標識間のフェルスター共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）相互作用を妨害することにより分析物の検出を可能にする。センサ構造物が分析物と結合すると、そのような妨害の結果異なる強度の光学信号が発生し、その信号を高感度のレシオメトリック測定又は蛍光寿命測定により検出することができる。本センサ構造物は分析物に結合すると検出可能な信号を発生するので自己信号性であり、分析物を検出するために追加の信号発生要素を含まなければならない多くの現行の検出アッセイより有利である。加えて、本発明のセンサ構造物は固体支持体に取り付ける必要がないので、本発明の方法は非競合アッセイとして溶液中で実行することができ、アッセイの処理量を増大させることができる。
【０００８】
定義
本明細書中で用いる以下の用語は、使用される文脈において明らかに異なる意味が意図されていない限り、以下に規定する意味を有する。
「分析物」は、試料中の分子、化合物又はその他の成分を指す。分析物は、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、有機分子、糖又はその他炭水化物又は炭水化物ポリマー、脂質、又はビタミン、ホルモン及び疾病マーカーを含むその他の種類の分子とすることができる。分析物は、その他の分子との組み合わせで及び／又はその他の分子の一部として発生し得る。好適には、分析物はＲＥＴ供与体及びＲＥＴ受容体を含まない。
【０００９】
「抗体」は、分析物に特異的に結合する免疫グロブリンタンパク質を指す。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＭなどの免疫グロブリンの種々のクラス及びアイソタイプを含む。「抗体断片」は、インタクトな抗体の部分を含むＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ(ａｂ’)２及びＦａｂ’分子などの分子を指す。「抗体誘導体」は、キメラ抗体などの、付加又は置換を有する抗体又はそれらの断片を指す。抗体、抗体断片及び抗体誘導体は、人間又は動物源の雑種細胞腫から、組み換え法又は従来技術に公知の他のいずれかの方法によって誘導することができる。
「エピトープ」は、分子認識ドメインが特異的に結合する分析物の表面上の１又は複数の局在的な領域を指す。
【００１０】
「蛍光」は、レーザーなどの外部光源からの電磁放射（一般的には可視光の範囲内）に曝露されることにより発生する物質からの発光を指す。定義上、蛍光には、励起放射が中止された後の物質による連続的な発光として定義されるリン光が含まれる。
「フェルスター半径」は、ＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間の共鳴エネルギ移動の効率が５０％である距離を指す（即ち、励起された供与体のスペクトル発光の５０％がＦＲＥＴ相互作用により減光される）。
【００１１】
「ＦＲＥＴ」、「ＦＲＥＴ相互作用」及び類似語は、ＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間のフェルスター共鳴エネルギ移動、並びに厳密にはフェルスターの理論に従わない類似型のエネルギ移動、例えば非オーバラップ受容体を用いる際の非オーバラップエネルギ移動を指す（例えば、Anal. Chem 2005, 77:1483-1487参照）。
「ＦＲＥＴ比」（図７Ａ〜７Ｉ中において記号「Ｒ」で示される）は、センサ構造物が最適なＲＥＴ供与体励起波長（λｍａｘ）で励起される場合の、蛍光ＲＥＴ供与体及び蛍光ＲＥＴ受容体の各発光ピークにおける定常状態の蛍光強度の比率を指す。「標識」は検出可能な信号を提供できる分子又は部分を指す。本発明のセンサ構造物及び方法において、標識はＲＥＴ供与体又はＲＥＴ受容体であり、信号は電磁信号（例えば光学信号）である。
【００１２】
「発光」は、非熱源からの、即ち熱い白熱体以外のものからの、光の生成及び放出を指す。発光の種類は複数あり、例えばそれぞれ化学反応及び生化学反応によって生成される化学発光及び生物発光がある。発光に蛍光は含まれない。
「部分」は対象の特性を有する分子の部分を指す。
【００１３】
「分子認識ドメイン」又は「ＭＲＤ」は、分析物と特異的に結合することができる分子又は部分を指す。ＭＲＤの例としては、抗体結合ドメイン（即ちＣＤＲ領域）、抗原エピトープ（例えば抗体を検出する場合の）、キレート化金属、オリゴヌクレオチド、ペプチド及びホルモンレセプターが挙げられる。
球状タンパク質又はペプチドに関する「分子サイズ」は分子の水力学的半径を指す。
【００１４】
「オリゴヌクレオチド」は、５〜２００個、通常約２０〜１００個、好ましくは約３０個のヌクレオチドの鎖を指す。
「ペプチド」は、５０個以下の結合アミノ酸を含む分子を指す。
「ポリヌクレオチド」は、２個以上の結合核酸を含む分子を指す。ポリヌクレオチドには、核酸と共に、置換及び付加を有する核酸分子が含まれる。
【００１５】
「ポリペプチド」は、２個以上の結合アミノ酸を含む分子を指す。
「タンパク質」は、５０個を超える結合アミノ酸を含む分子を指す。
「レシオメトリック法」は、ＲＥＴ供与体からの蛍光とＲＥＴ受容体からの蛍光との比率を測定することによって試料中の分析物の量を決定する方法を指す。レシオメトリック測定は蛍光測定器を用いて行うことができる。
【００１６】
「ＲＥＴ供与体」は、フェルスター共鳴エネルギ移動を介してＲＥＴ受容体と相互作用できる蛍光又は発光性の部分又は分子を指す。
「ＲＥＴ受容体」は、ＲＥＴ受容体の蛍光を増大させること及び／又はＲＥＴ供与体からの信号を消去することにより、フェルスター共鳴エネルギ移動を介してＲＥＴ供与体と相互作用することができる部分又は分子を指す。
【００１７】
「センサ構造物」は、分析物がセンサ構造物に結合する結果として試料中の分析物の存在を示す検出可能な信号を提供できる分子、又はまとまって機能するサブユニットを含む分子の集合を指す。
分析物と分子認識ドメインとの間の相互作用に関する「特異的結合」又は「特異的に結合する」という表現は、分子認識ドメインが、特定のアッセイの条件下で、分析物に付着し、試料中の他の成分には付着しないことを意味する。ＭＲＤによる比較的少量の非特異的結合は一部のアッセイでは許容されるが、アッセイの結果を解釈する際には考慮して、間違った陽性の結果又は不正確な定量データに繋がらないようにする。分子認識ドメインは、場合によっては分子の特定の群又はクラスと結合することができ、その場合も、例えばＭＲＤが分子の群に共通のエピトープと結合する場合、上記の分子と特異的に結合するとみなされる。分子認識ドメインによる分析物の結合は可逆的であってよく、即ち分析物は、分析物又は特異的結合のパートナーを構造的に変化させることなく特異的結合のパートナーから分離することができるか、又は、例えばビオチンとアビジンとの間の結合のように不可逆的であってもよい。
【００１８】
「特異的エピトープ結合」「エピトープと特異的に結合する」、及び同様の表現は、分子認識ドメインが、分析物の特定のエピトープに付着することを指す。そのような結合は、分子認識ドメインと特定のエピトープとの間だけで起こるが、一部のアッセイでは少量の非特異的結合が許容され、例えばオリゴヌクレオチドが、複数の不適正塩基対を有する別のオリゴヌクレオチドに結合し得るか、又は抗体結合ドメインが分析物のアイソフォームに結合し得る。特異的なエピトープ結合には、分析物と多数の異なる分子との間で起こり得る結合相互作用、例えばキレート化剤と多数の異なる金属のいずれかとの間のイオン結合は含まれない。しかしながら、分子認識ドメインは、分子の特定の群又はクラス上の同じエピトープと結合する場合、特異的エピトープ結合を示すと言える。例えば、抗体の１つのクラスのＦｃ領域にＭＲＤを方向付けることができ、それによりＭＲＤはその特定のクラスの多数の異なる抗体と特異的に結合する。
本明細書中で用いる「含む」及び同義の表現は、他の添加剤、成分、整数又はステップの排除を意図しない。本明細書中で数を明記せずに用いられる名詞は、文脈において特に別の意味を示していない限り、単数と複数の両方を包含する。
【００１９】
ＦＲＥＴ
フェルスター共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）は、分析物を検出する本発明の方法に利用される物理的原理である。ＦＲＥＴは、通常は励起状態の蛍光又は発光部分であるＲＥＴ供与体から、別の励起可能な部分であるＲＥＴ受容体への、非放射性双極子−双極子相互作用によるエネルギ移動である。ＲＥＴ供与体−受容体ペアは、本センサ構造物が、供与体と受容体との間でのＦＲＥＴ相互作用を確実に可能とするように選択される。供与体の発光スペクトルは、一般に受容体の発光スペクトルより短い波長を有する（即ち、供与体の最適発光波長の最大値（λmax）は、受容体の同値より短い）。伝統的なＦＲＥＴにおいては、供与体の発光スペクトルと受容体の吸収スペクトルとはある程度重ならねばならない。しかしながら、ランタニドキレート供与体及び非オーバラップ受容体に基づく反ストークシフトＦＲＥＴの場合のように、この法則には例外がある（例えば、Anal. Chem. 2005 Mar 1;77(5):1483-7参照）。
加えて、ＦＲＥＴ相互作用が起こるためには、センサ構造物上でＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体が非常に接近して位置しなければならない。一般に、ＦＲＥＴは供与体と受容体との隔たりが１０ナノメータ未満の場合に発生するものと見られるが、ＦＲＥＴは供与体と受容体との間の分子間距離が２５ナノメータでも検出されている（例えば、J. Am. Chem,. Soc. 2005 Mar 9; 127(9):3115-3119参照）。フェルスターの理論によれば、エネルギ移動効率は供与体と受容体との間の媒体の屈折率、エネルギ供与体による蛍光／発光放出に対する速度定数、及び受容体不存在下における供与体の量子収率にも依存する。異なる供与体と受容体のペアは異なるフェルスター半径を有するので、本発明のセンサ構造物のＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間のＦＲＥＴ相互作用により発生する光学信号の強度は、供与体及び受容体の同一性に依存する。
【００２０】
ＲＥＴ供与体が励起状態にあり、供与体と受容体との間でＦＲＥＴ相互作用が起こるとき、供与体の蛍光又は発光は消光される（即ち、総発光量が低減される）。一部のＲＥＴ受容体では、発光はＲＥＴ供与体からのエネルギ吸収又はエネルギ移動により引き起こされ、その結果受容体が発光する。消光剤として公知の他の受容体は、ＲＥＴ供与体から吸収したエネルギを散逸し、発光しない（又は非常に弱く発光する）。
本方法におけるＦＲＥＴ相互作用は、従来技術に公知の標準法を用いて、センサ構造物の定常状態の又は時間分解の蛍光又は発光を測定することにより検出することができる（例えば、Curr. Opin. Chem. Biol. 2003 Oct;7(5):635-40参照）。例えば、ＲＥＴ受容体の蛍光、ＲＥＴ供与体の蛍光又は発光の消光、又はそれらの両方を測定することができる。ＲＥＴ受容体として消光剤が用いられる場合、通常供与体の発光の消光が測定される。本方法では、ＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間に期待されるＦＲＥＴ相互作用が妨害されることにより、試料中の分析物の存在が示される。
【００２１】
センサ構造物の構成要素
図１に示すように、本発明のセンサ構造物１０は、３つの主要な要素、即ち分子骨格２０、分子認識ドメイン３０、及びフェルスター共鳴エネルギ移動を介して相互作用可能な一対の標識４０、５０を含む。標識４０、５０は分子骨格２０に十分接近して固定されているので、センサ構造物１０のＭＲＤ３０に結合する分析物６０が存在しない場合、フェルスター共鳴エネルギ移動を介して相互作用可能である。分子認識ドメイン３０は、分子骨格２０又は標識の一方（４０又は５０）に組み込まれるか又は固定されており、よって分析物６０の分子認識ドメイン３０への結合により標識４０、５０のペアの間のフェルスター共鳴エネルギ移動が妨害される。図１に示すように、一実施形態では、ＭＲＤ３０が分析物６０に結合すると分析物が２つの標識４０、５０の間に挿入される。
【００２２】
分子認識ドメイン
検出する分析物に応じて多数の異なる種類のＭＲＤを本センサ構造物に用いることができる。一実施形態において、ＭＲＤは抗体の結合ドメイン、即ちＣＤＲ領域である。場合によっては、抗体のＣＤＲ３部分などのＣＤＲ領域の一部分がＭＲＤとして機能することができる。抗体結合ドメインがＭＲＤである場合、それは完全な抗体の一部分であってよく、その場合、分析物の単一エピトープに対する抗体を用いることが好ましい。従来技術に公知であるように、そのような抗体は雑種細胞腫法を用いて作製されるモノクローナル抗体とすることができるか、又は組み換え法で作製することができる。或いは、ポリクローナル抗体をＭＲＤとして用いて分析物を検出することができる。
ＭＲＤはまた、特異的な結合特性を保持する抗体断片に含めることもできる。そのような断片は、例えば、抗体のＦｃ部分を欠く抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ(ａｂ’)２断片とすることができる。Ｆａｂ及びＦ(ａｂ’)２断片は、従来技術に公知の方法、例えばパパイン、トリプシン、フィシン及び／又はペプシンなどのタンパク質分解酵素を用いてモノクローナル抗体を切断することにより作製することができる。Ｆａｂ’断片は、ジチオスレイトール又はメルカプトエタノールなどの薬剤を用いるＦ(ａｂ’)２断片の還元性切断により作製することができる。同様に、抗体結合領域全体を単一ポリペプチド鎖中に組み込む一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)抗体は、インタクトな抗体の重鎖成分を結合するジスルフィド結合の還元性切断により得ることができる。好適な一実施形態では、抗体断片は別法として組み換え法を用いて作製することができる。
【００２３】
抗体の結合部分を含むＭＲＤは、多数の方法で分子骨格中に組み込むことができる。一実施形態では、抗体結合領域を含む抗体又はその部分は、分子骨格から独立して作製し、その後骨格に付着させる。例えば、ビオチン部分を有する抗体は、適切な位置に付加したアビジン部分を有する分子骨格に付着させることができる。好適な一実施形態では、分子骨格は組み換え法で作製されるタンパク質を含んで成り、ＭＲＤは分子骨格中に組み込まれる抗体の結合部分である。このようにして、分子骨格及びＭＲＤは一緒に作製することができ、ＭＲＤを分子骨格に付着させるための追加のステップは必要ない。
代替的な一実施形態において、ＭＲＤは、金属結合剤を捕捉するためのキレート化金属、例えばニッケルとすることができる。この実施形態において、好適には、金属は、分子骨格又は標識に化学的に結合する金属キレート化基（例えばニトリロ三酢酸基など）を介してセンサ構造物にキレート結合されることにより分子骨格に結合する。好適には、検出対象の分析物は、Ｈｉｓタグ、つまりペプチド又はタンパク質のＮ又はＣ末端近傍に複数（通常５又は６）のヒスチジン残基を付けたペプチド又はタンパク質である。
【００２４】
或いは、ＭＲＤは、他のポリペプチド又は場合によっては非ペプチドに結合するペプチドでもよい。現行の組み合わせペプチドライブラリスクリーニング技術により、様々な分子と結合する独特のペプチドを選択することが可能である（例えば、Science. 1990 Jul 27;249(4967):404-6参照）。ペプチドＭＲＤはセンサ構造物の分子骨格又は標識に組み込むことができる。
ＭＲＤが、他の種類の特異的結合分子を含むことも可能である。例えば、ＭＲＤは、相補的な配列を有するポリヌクレオチドを検出するためのオリゴヌクレオチドとすることができる。アプタマーと称される特定のＤＮＡ／ＲＮＡ  ＭＲＤがタンパク質と結合することができ、従ってタンパク質分析物の検出に有用である。ＭＲＤはまた、例えば試料中の抗体の存在を検出するために、一般にイムノアッセイ用の抗原とみなされる部分を含むこともできる。一実施形態において、試料は血漿又は血液を含むことができ、ＭＲＤを抗ＨＩＶ抗体に対するペプチドエピトープとすることにより、抗ＨＩＶ抗体の存在を検出することができる。
本技術分野の当業者であれば理解するように、特異的結合ペア（例えば、抗体と抗原）のいずれのメンバーも、分子認識ドメインを含むことができる。特異的結合ペアには、炭水化物とレクチン、ビオチンとアビジン、葉酸と葉酸塩結合タンパク質、ビタミンＢ１２と内因子、及びタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇと免疫グロブリン、が含まれる。
【００２５】
標識
本発明のセンサ構造物に、様々な標識をＲＥＴ供与体及び／又はＲＥＴ受容体として用いることができる。ＲＥＴ供与体及びＲＥＴ受容体の両方を蛍光標識とし、それらにフルオレッセイン、ローダミン、クマリン、及びそれらの誘導体などの色素を含めることができる。ＦＲＥＴ中の供与体としてランタニド（希土類元素）原子を、受容体として従来の有機色素を用いることも可能である（例えば、Nat. Struct. Biol. 2000 Sep;7(9):730-4参照）。更に蛍光色素を下記表１にまとめる。これらはみな市販のものである（例えば、Sigma Chemical（ミズーリ州セントルイス）製）。
表１．蛍光標識
2007529747.tif 000003
【００２６】
蛍光標識には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質も含まれる。ＧＦＰは、オワンクラゲから単離された自発性蛍光タンパク質であり、多数のＧＦＰ変異体（青色シフトしたもの及び赤色シフトしたものの両方）が開発された。そのような変異体又は誘導体は、天然ＧＦＰ配列に置換、付加及び／又は削除を加えた分子を含む。ＧＦＰ変異体にはＢＦＰ（青色）、ＣＦＰ（シアン）及びＹＦＰ（黄色）に加え、ＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ及びＥＹＦＰなどの、前記の分子の更に変異度の高い変異体が含まれる。ＧＦＰがフルオロフォアの１つである場合、ローダミン又はマリナブルー（Molecular Probes（オレゴン州ユージーン）製）がＦＲＥＴペアの他方のパートナーとして有利に使用される。加えて、礁珊瑚の種属から得られる多数の赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）及びそれらをエンジニアリングした変異体も使用できる。
蛍光タンパク質は、ＭＲＤ及び／又は分子骨格を組み換え法で作製する場合、本センサ構造物中のＲＥＴ供与体及びＲＥＴ受容体として有利に使用される。この場合、ＲＥＴ供与体及びＲＥＴ受容体は、分子骨格及び／又はＭＲＤと一緒に単一ポリペプチド分子として作製することができ、分子上へのＲＥＴ供与体及びＲＥＴ受容体の配置を精密に制御することができる。
【００２７】
本センサ構造物の標識として用いることが可能なその他の蛍光化合物には、量子ドットとも称されるナノ結晶が含まれる。量子ドット（ＱＤ）は、その蛍光発光波長が結晶のサイズに比例する半導体ナノ結晶である。量子ドットは化合物の励起子ボーア半径のオーダーの直径を有し、通常２〜１０ナノメータの幅を有する。それらは一般に２つの元素、即ち周期律表の２つの属、第２属と第６属、第３属と第５属又は第４属と第６属の各々から１つずつ選ばれる２つの元素から形成される化合物を含む。材料の例としてはＣｄＳｅ、ＺｎＳ及びＰｂＳｅが挙げられる。量子ドットの外表面は有機分子に容易に接合させることができるので、本センサ構造物の分子骨格などの他の部分への付着が促進される。
一部の実施形態において、センサ構造物のＲＥＴ供与体は、蛍光部分の代わりに発光部分を含むことができる。例えば、ＲＥＴ供与体は、基質であるセレンテラジンに作用すると光を発生させるルシフェラーゼを含むことができる。ＹＦＰ及びＧＦＰなどの蛍光分子はルシフェラーゼと共にＲＥＴ受容体として作用することができる。ルシフェラーゼ又はエクオリンなどの生物学的に誘導された化合物をＲＥＴ供与体として用いることをしばしばＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギ移動）と称する。
【００２８】
化学発光部分などの他の発光部分もまた、ＲＥＴ供与体として用いることができる。例えば、ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジン−ジオン）は、ルミノールを酸化する過ホウ酸塩、過マンガン酸塩、次亜塩素酸塩、ヨウ素又は過酸化水素などの塩基性溶液に曝されると緑青光を発する化学発光化合物である。他の発光部分には、ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）シュウ酸（ＴＣＰＯ）及びビス（２−(３，６，９−トリオアデカニルオキシカルボニル)−４−ニトロフェニル）シュウ酸（ＴＤＰＯ）などの過オキシシュウ酸塩化学発光団が含まれる。
加えて、本発明の方法の一部の実施形態では、消光剤をＲＥＴ受容体として用いることができる。ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ又はＱＳＹ色素（例えば、Molecular Probes（オレゴン州ユージーン）が販売するＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１、ＱＳＹ３５）などの消光剤を用いることにより、直接的（即ち非ＦＲＥＴ）受容体励起の結果として生じるバックグラウンド蛍光という潜在的な問題を有利に排除できる。
【００２９】
分子骨格
本発明の分子骨格は、ＲＥＴ供与体、ＲＥＴ受容体及びＭＲＤに結合し、これらの部分を互いに特定の空間的相関関係に維持する。ＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体とは、ＭＲＤに結合する分析物の不存在下で、供与体と受容体との間のフェルスター共鳴エネルギ相互作用を可能にする距離内になければならない。ＲＥＴ供与体、ＲＥＴ受容体及びＭＲＤはまた、ＦＲＥＴ相互作用を促進するために正しい双極子配向に保持しなければならない（例えば、Stryer L., Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler, Annu. Rev. Biochem., 47:819-46 (1978)参照）。ＭＲＤは更に、好ましくは分子骨格により保持され、それによって分析物と結合するときＭＲＤにより結合した分析物又は少なくともその一部がＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間に挿入され、その際供与体と受容体との間のフェルスター共鳴エネルギ相互作用を妨害する。分析物の検出を可能にするために、本センサ構造物中の分子骨格の高次構造を変化させる必要はない。
標識及びＭＲＤと結合可能な様々に異なる分子を、本センサ構造物の分子骨格として用いることができる。例えば、ペプチド、タンパク質、炭水化物及び有機分子、並びに、核酸など上記分子の組み合わせを含む分子は、本センサ構造物の分子骨格部分として用いることができる。一実施形態において、分子骨格は、Ｆｖ部分などの、抗体、抗体断片又は抗体誘導体を含むタンパク質である。Ｆｖ部分は、好ましくは柔軟性のリンカーにより安定化されて一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成するか、又はヘテロ二量体コイルドコイルにより安定化され、らせん体安定化Ｆｖ（ｈｓＦｖ）を形成するＶＨ断片及びＶＬ断片を含む。
【００３０】
別の実施形態において、分子骨格は、周辺質結合タンパク質などのタンパク質を含む。そのようなタンパク質の１つがマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）である。ＧＦＰ及びＹＦＰなどの標識は、それぞれＭＢＰのＮ末端及びＣ末端に付着すると、フェルスター共鳴エネルギ相互作用を介して相互作用することができる。
分子骨格として小分子に結合すると高次構造を変化させる、ＭＢＰ又はその他同様のタンパク質などの周辺質結合タンパク質を用いる場合、そのような高次構造の変化を利用して本アッセイの感度を高めることができるが、そのような高次構造の変化は本センサ構造物を用いた分析物の検出に必須ではない。マルトースの存在下で、ＭＢＰは蝶つがい屈曲様の高次構造の変化を受け、それによりＲＥＴ供与体及びＲＥＴ受容体を接近させることができ、結果として検出可能なＦＲＥＴ相互作用が起こる。しかしながら、ＭＲＤに結合する標的分析物の存在下ではこのＦＲＥＴ効果は低減する。
その他の種類の分子骨格も、本センサ構造物の形成に用いることができる。例えば、ヘテロ二量体コイルドコイルを使用して、ＭＲＤ及び標識を提供することができる。或いは、米国特許第５９４５５２６号に記載されているような有機化合物を含む剛性リンカーを使用してＲＥＴ供与体、ＲＥＴ受容体及びＭＲＤを保持することができる。ポリヌクレオチド分子もまた、分子骨格として用いることができる。
【００３１】
標識の結合
ＲＥＴ供与体、ＲＥＴ受容体及びＭＲＤは、分子骨格の種類に応じて様々な方法で分子骨格に付着させることができる。分子骨格及び／又はＭＲＤが組み換え法を用いて作製したタンパク質である場合、蛍光又は発光タンパク質（ＧＦＰ及びルシフェラーゼなどの）を有利に組み換えタンパク質に組み込み、分子骨格又はＭＲＤと一緒に単一分子として作製することができる。例えば、ヘキサヒスチジンタグは、分子骨格又はＭＲＤを含むタンパク質中に含めることができる。このことにより、センサ構造物の簡便な金属親和性精製が可能となるばかりでなく、Ｎｉ-ＮＴＡ接合フルオロフォアを用いたヒスチジンタグの標識が可能となる（例えば、Kapanidis AN, Ebright YW, Ebright RH, Site-specific incorporation of fluorescent probes into protein: hexahistidine-tag-mediated fluorescent labeling with (Ni(2+):nitrilotriacetic Acid (n)-fluorochrome conjugates, J. Am. Chem. Soc. 2001 Dec 5;123(48):12123-5参照）。
タンパク質の部位特異的標識の別の方法では、チオール反応性試薬を用いたシステイン特異的標識を使用する。部位特異的突然変異誘発は、ｓｃＦｖ部分などのタンパク質中にＮ末端システインを導入するために用いることが可能である（例えば、Gentle等、Direct production of proteins with N-terminal cysteine for site-specific conjugation, Bioconjug. Chem., 15:658-663(2004)参照）。この時、ｓｃＦｖ部分のアミノ末端の部位特異的標識は、チオール反応性蛍光プローブ又は消光剤プローブを組み込むための化学的結合法を用いて達成することが可能である（例えば、Dawson等、Synthesis of proteins by native chemical ligation, Science, 266:776-779(1994)参照）。幅広いチオール反応性フルオロフォアが市販されている。或いは、チオール反応性蛍光オリゴヌクレオチドプローブを、チオール反応性オリゴヌクレオチド中にフルオロフォアの多数のコピーを導入するための市販のキットを用いて作製することができ、そのようなチオール反応性蛍光オリゴヌクレオチドプローブを使用して、Ｎ末端システインなどのシステイン部分を標識することができる（例えば、Tung, CH 及び Stein, S, Preparation and applications of peptide oligonucleotide conjugates, Bioconjug. Chem., 11:605-618 (2000)参照）。
【００３２】
分子骨格が抗体、抗体断片又は抗体誘導体を含む場合、標識は、タンパク質Ｌ、タンパク質Ａ及び／又はタンパク質Ｇなどの特異的結合部分を用いることにより特異的に付着させることができる。タンパク質Ｌ（ペプトストレプトコッカスマグヌスから元々単離されている）は、免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）のフレームワーク領域に結合する。タンパク質Ｌの単一領域（ＰｐＬ）はまた、ＶＬのフレームワーク領域への強い結合を示し、抗原結合に影響を及ぼすことなくＶＬに結合できる。ブドウ球菌タンパク質ＡのＥドメイン（ＳＰＡ−Ｅ）は、やはり分析物結合に影響を及ぼすことなくＶＨのフレームワーク領域に強く結合する。ＶＬ領域のアミノ末端とＶＨ領域のアミノ末端は、ＦＲＥＴの発生を可能にする距離内にあり（約３ｎｍ〜４ｎｍ）、従ってセンサ構造物を構成する標識に結合する適切な位置にある。
この実施形態において、ＰｐＬ及びＳＰＡ−Ｅを大腸菌中に発現させて精製し、各々ＲＥＴ供与体及び受容体を用いて標識することができる。抗体、抗体断片又は抗体誘導体と接触すると、標識されたＰｐＬ分子及びＳＰＡ−Ｅ分子はそれらに結合し、その際これらの分子を標識する。分子骨格に標識を付着させるその他の方法も可能である。例えば、標識は従来の化学的結合反応を用いて分子骨格に付着させることができ、よって標識が分子骨格に共有結合性に付着する。
分子骨格がポリヌクレオチドである場合、色素−ホスホラミダイトを用いる合成の間、標識をポリヌクレオチドの配列中に直接組み込むことができ、ポリヌクレオチドは合成の間にヌクレオチドホスホラミダイトに置換される。ポリヌクレオチド中に蛍光色素を組み込むその他の方法も従来技術に公知である。
【００３３】
図３に示すように、接着によってＭＲＤと分析物との結合が妨害されない限り、標識（即ち図３の標識４０）は、分子骨格に直接付着させずにＭＲＤ３０に直接付着させることができる。そのような接着はまた、分析物とＭＲＤ３０との結合の前にＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間のＦＲＥＴ相互作用を妨害するものであってはならない。
一部の実施形態において、センサ構造物中に複数のＲＥＴ供与体部分及び／又は複数のＲＥＴ受容体部分を含めることが有利である。図４Ａに示すように、複数のＲＥＴ供与体４２、４４及び４６を標識４０上に設け、複数のＲＥＴ受容体５２、５４及び５６をＲＥＴ受容体５０上に設ける。センサ構造物１０中に複数のＲＥＴ供与体及びＲＥＴ受容体を用いることにより、本センサ構造物により発生する光学信号の強度を増大することができる。
【００３４】
センサ構造物
多種多様な分子認識ドメイン、標識及び分子骨格を組み合わせて本センサ構造物を形成することができる。本明細書に記載のポリペプチドセンサ構造物を設計する場合、ディープビュー／スイスＰＤＢビューア（http://www.expasy.org/spdbv/から入手可能）などの分子モデリングツールをタンパク質構造の観察及び操作に用いることができる。ドック５.０などのプログラム（Molecular Design Institute, University of California（サンフランシスコ）から入手可能）は分子ドッキングに用いることができ、インタプレＴＳ（http://www.russell.embl.de/interprets/から入手可能）はタンパク質相互作用の分析に用いることができる。そのようなツールを用いるためのタンパク質の構造は、例えばＲＣＳＢタンパク質データバンク（http://pdbbeta.rcsb.org/pdb/から入手可能）から得ることができる。
一実施形態において、ＭＲＤをセンサ構造物の標識の１つに付着させることができる。図２に示すように、ＭＲＤ３０を標識４０に付着させる。有利には、標識とＭＲＤとはポリペプチドであり、単一分子として一緒に作製される。図２に示す実施形態において、ＭＲＤ３０は標識４０のＮ末端に付着させる。例示された実施形態では、標識４０は、ポリペプチド分子骨格２０のＮ末端に付着している。この場合、分子骨格２０はＭＢＰとすることができる。更なるタンパク質標識５０を分子骨格２０のＣ末端に付着させる。同様の実施形態を図２Ａに示す。この場合、ＭＲＤ３０は、ポリペプチド標識４０の配列中に挿入されたペプチドループである。
【００３５】
図３に示す別のアプローチにおいて、ポリペプチド分子骨格２０（例えばマルトース結合タンパク質）の両末端は各々、ＧＦＰなどの標識５０及びｓｃＦｖ又はその他の抗体断片などのポリペプチド分子認識ドメイン３０を含む分子に、組み換えＤＮＡ法を用いて融着されている。この場合、ＭＲＤ３０を含む分子は標識４０を用いて標識されている。標識はローダミンなどのフルオロフォアとすることができる。ペプチド及び場合によってはタンパク質領域も含むＭＲＤは、ＭＢＰのヌクレオチド配列の一定の部位に挿入することもでき、そのような融合タンパク質は、ＭＢＰのマルトース結合能に影響を及ぼすことなく、組み換え法により発現させることが可能である（例えば、Betton等、Location of tolerated insertions/deletions in the structure of the maltose binding protein, FEBS Lett. 325(1-2):34-8(1993)及びGuntas Ostermeier, Creation of an allosteric enzyme by domain insertion, J Mol Biol. 336(1):263-73(2004)参照）。或いは、ＭＲＤ３０は、ＭＢＰの特定の位置に化学的に結合することができる。
図３Ａに更なるアプローチを例示する。この実施形態においては、ＭＲＤ３０を分子骨格２０に直接付着させる。ＭＲＤは上述のように分子骨格に付着させることができる。図３Ａは更に分析物６０のＭＲＤ３０への結合を示す。
【００３６】
本発明のセンサ構造物１０の一部の実施形態において、構造物は別々の分子から形成し、それらを互いに付着させるか又は結合してセンサ構造物１０を形成することができる。例えば、図に示すように、本センサ構造物１０の分子骨格２０及び／又はＭＲＤ３０は、一実施形態において、別々に作製された後で組み合わされる２つの分子を含むことができる。このことは、２つの分子の一方にＲＥＴ供与体を、他方にＲＥＴ受容体を付着させることができるという利点を有し、これにより、標識の、分子骨格及び／又はＭＲＤの部分への結合をよりよく制御できる。２つの別々の分子から自己組織化センサ構造物を作製する１つの方法は、ＷｉｎＺｉｐ−Ａ２Ｂ１などのヘテロ二量体コイルドコイルポリペプチド部分を利用することである（例えば、J Mol Biol. 2000 Jan 21:295(3):627-39参照）。図４に示すように、ＷｉｎＺｉｐ−Ａ２などのヘテロ二量体コイルドコイル部分７０が分子骨格２０の一部分２２に付着し、第１のコイルドコイル部分７０に特異的に結合する別のコイルドコイル部分８０（例えばＷｉｎＺｉｐ−Ｂ１）が分子骨格２０の他の部分２４に付着すると、コイル７０及びコイル８０は結合して分子骨格２０の別々の部分２２及び２４を連結し、ＭＲＤ３０を形成する。そのようなコイルは、図４及び４Ａに例示される短鎖ペプチドリンカー２６及び２８などのリンカーを介して分子骨格部分に連結することができる。
この実施形態を含む１つの特定の分子は、そのＦａｂ断片のＣＨ１及びＣＬドメインがヘテロ二量体コイルドコイル（ＷｉｎＺｉｐ−Ａ２Ｂ１又はＥ／Ｋコイルドコイルポリペプチドなど）で置換された、らせん体安定化組み換えＦｖである。分子骨格の１つの部分がＷｉｎＺｉｐＡ２に付着したＦｖ断片のＶＨ領域を含み、他の部分はＷｉｎＺｉｐＢ１に付着したＶＬ領域を含む。これら両方の部分は、遺伝的融合及び従来技術に公知の標準組み換え法により作製することができる。ＶＨ及びＶＬ部分が互いに接触して配置されると、それらは自己組織化してセンサ構造物を形成する。
【００３７】
図５Ａ、５Ｂ及び６に示す関連実施形態において、分子骨格２０は、コイルドコイルポリペプチドペアなどの、互いに特異的に結合する２つの部分を含むことができる。図５Ａ及び５Ｂに示す実施形態では、第１コイルドコイルポリペプチドパートナー７０を、リンカー２６により標識４０に付着させる。この分子には特異的結合領域２７も含まれる。リンカー２８を介して第２コイルドコイルポリペプチドパートナー８０を標識５０に付着させ、これら２つのコイルドコイルパートナーを互いに接触させるとそれらは互いに特異的に結合する。ＭＲＤ３０は特異的結合領域２７のパートナー２５に付着し、特異的結合領域２７と接触すると同様にそれと結合する。図５Ｂに示すように、ＭＲＤ３０が特異的に結合するエピトープ６２を含む分析物６０が、センサ構造物１０のこの実施形態を含む別の分子と接触すると、ＭＲＤ３０に結合した分析物６０は結合パートナー２５及び２７を介して構造物に付着し、標識４０と標識５０との間のＦＲＥＴ相互作用を妨害するか又は変化させる。
本センサ構造物１０の更に別の実施形態では、図６に示すように、ＭＲＤは標識４０も付着する第１特異的結合分子２５に付着させることができる。第２標識５０（図６では量子ドットとして示す）は、特異的結合分子２５の結合パートナー２７に付着させる。特異的結合パートナー２５及び２７は互いに接触すると結合して分子骨格２０を形成する。
【００３８】
測定方法
本センサ構造物は、細胞、ウイルス、抗体及びタンパク質など、特に約１ｎｍ〜約２５ｎｍ、より好ましくは約３ｎｍ〜約６ｎｍの分子サイズを有する分析物などの、大きな標的分析物を検出するのに適している。従って、本センサ構造物は診断的アッセイに有利に用いられる。例えば、ある病状を有する可能性がある人の試験を、本センサ構造物を用いて行うことができ、これは当該患者から採取された試料（例えば唾液、尿、細胞質、血清、血液又はその他組織）を、本センサ構造物を含む溶液と接触させることにより行う。センサ構造物は試料中に存在すると思われる状態を示す指標と結合する。試料中の指標のセンサ構造物への結合が適切なレベルの信号強度で検出される場合、その患者はその状態を有していると診断することができる。精製されるか、或いはアリコート又はバッチに分注された実験材料又は製造材料の試料を試験して、特定のアリコート又はバッチ中の所望の材料の存在を決定することもできる。例えば、クロマトグラフィー分離からの溶出物の画分を試験して、いずれの画分が溶液中に対象の分析物を含むかを決定することができる。環境試料などのその他の試料も本方法に従って試験することができ、それにより例えばそのような試料中の望ましくない混入物を検出することができる。
好ましくは、本方法に従って行われるアッセイは非競合アッセイであり、センサ構造物が分析物との結合に直接応答して信号を発生させる。試料をセンサ構造物に接触させた後、センサ構造物からの光学信号を測定する。センサ構造物のＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間のフェルスター共鳴エネルギ移動相互作用の妨害が検出される場合、対象の分析物が試料中に存在することが示される。好ましくは、センサ構造物のＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間のフェルスター共鳴エネルギ移動相互作用により発生するコントロール光学信号を測定するために、センサ構造物に試料を接触させる前にセンサ構造物を含む溶液からの光学信号を取得する。コントロール光学信号と試料溶液中で測定される光学信号との差異を使用して、試料中に存在する分析物の量を定量することができる。レシオメトリック法は、従来技術に公知であるように、この定量を行うために用いることができる。この目的のために、センサ構造物からの発光の強度変化及び／又はセンサ構造物から発せられる光学信号の減衰キネティックスの変化を測定することができる。また、従来技術に公知であるように、ランタニドなどの長寿命のＲＥＴ供与体を用いる場合、時間分解法を利用することができる。
【００３９】
本方法の１つの利点は、センサ構造物を固体支持体に付着させることなく、溶液中で実施できることである。これにより、従来のＥＬＩＳＡなどの固体相アッセイに必要な多数の結合ステップ及び洗浄ステップを避けることができ、従ってオペレータエラーの可能性を低減すると同時にアッセイの処理量を大幅に増大させることができる。本構造物は、必要に応じて、マイクロタイターウェル又はマイクロアレイなどの固体支持体に取り付けることもできる。本センサ構造物を固体支持体に取り付ける場合、種々の分析物に特異的な複数のセンサ構造物を、固体支持体上の個別の位置、例えばマイクロアレイに配置することができる。試料に含まれる特定の分析物の存在は、特定の分析物と結合するセンサ構造物が結合する支持体上の個別の位置からの適切な光学信号により示される。このようにして、単一試料により複数の分析物の存在を試験することができる。
本方法のこの実施形態に多種多様な固体支持体を用いることができる。適切な固体支持体には、プレート、ウェル、膜及び繊維が含まれる。例えば、固体支持体は、粒子、マイクロアレイ、マイクロタイターウェル、導波管又は毛細管とすることができる。固体支持体は、本センサ構造物が結合でき、且つＭＲＤの分析物への結合又はＲＥＴ供与体とＲＥＴ受容体との間のＦＲＥＴ相互作用を妨害しない、あらゆる材料から製造することができる。適切な材料には、ニトロセルロース、ガラス、並びに、ナイロン、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリグリシジルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアミド及びポリビニルクロライドを含む多数の合成ポリマーが含まれる。
【００４０】
本センサ構造物は、従来技術に公知の方法で固体支持体に結合することができる。例えば、固体支持体がシリカ表面を有する粒子である場合、シアノシラン結合剤を用いることができる（例えば、Falipou等、New use of cyanosilane coupling agent for direct binding of antibodies to silica supports, Bioconjug. Chem., 10:346-353 (1999)参照）。マイクロアレイフォーマットについては、市販のマルチウェルガラスマイクロアレイスライド上にセンサ構造物を点状に配列することができる。ウェルは、マイクロアレイを作製するためにピンツール型マイクロアレイ作製器を用いる疎水性コーティング（Erie Scientific（ニューハンプシャー州ポーツマス）から入手可能）を使用して作製できる。
フルオロフォアを励起し、本センサ構造物により発生する光学信号を検知及び測定するための種々のシステムが従来技術に公知である。例えば、広視野蛍光顕微鏡法及びレーザー走査共焦点顕微鏡法（ＬＳＣＭ）を用いることができる。
【００４１】
キット
一実施形態では、本センサ構造物は、分析物検出用キットに含めて提供することができる。例えば、そのようなキットは、抗体のＦｖ部分を含むポリペプチド、タンパク質ＡのＥドメインを含むポリペプチドに結合したＲＥＴ供与体を含む第１標識、及びタンパク質Ｌの結合ドメインを含むポリペプチドに結合したＲＥＴ受容体を含む第２標識を含むことができる。これら別々の成分を溶液中で組み合わせると、第１標識はタンパク質Ａドメインを介してＦｖ部分のＶＨ部分に結合し、第２標識はタンパク質Ｌドメインを介してＦｖ部分のＶＬ部分に結合する。或いは、第１標識がＲＥＴ受容体を含み、第２標識がＲＥＴ供与体を含むことができる。
更なる実施形態において、そのようなキットは、ヘテロ二量体コイルドコイルポリペプチドにリンクするＲＥＴ供与体を含む第１標識、及び第１標識のコイルドコイルポリペプチドに特異的に結合するヘテロ二量体コイルドコイルポリペプチド及びＲＥＴ受容体を含む第２標識を含むことができる。この実施形態のキットは、第１標識、第２標識、又はその両方に、好ましくはリンカーを介して特異的に結合する分子骨格上に担持された分子認識ドメインも含むことができる。
【実施例】
【００４２】
実施例１．抗ＧＦＰ抗体の検出
本方法の有用性を検証するために、マルトース結合タンパク質構造物を試験した。構造物（蛍光指標タンパク質又はＦＬＩＰとして公知）は、マルトース結合タンパク質を主成分とするものであった。ＭＢＰ部分のＮ末端にＥＣＦＰ（高感度シアン蛍光タンパク質）を付着させ、ＭＢＰのＣ末端にＥＹＦＰ（高感度黄色蛍光タンパク質）を付着させた。更に、ヘキサヒスチジンタグを構造物のＮ末端に付着させた。ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ０３／０２５２２０号に記載されたこの構造物は、Carnegie Institution of WashingtonのWolf Frommer教授により提供された。
この構造物を用いて複数の異なる実験を行った。その結果を図７Ａ〜７Ｉに示し、図に用いた記号を下記の表２に説明する。
表２．図７中の記号
2007529747.tif 000004
【００４３】
この構造物は、マルトースの存在下で、分子のＭＢＰ部分の高次構造の変化によりＦＲＥＴ比（Ｒ）の増大を示し、その結果フルオロフォアが互いに接近した。濃度を複数の異なる段階に変化させた構造物を、マルトースの存在下及び不在下の両方で、抗ＧＦＰポリクローナル抗体（ＥＣＦＰ及びＥＹＦＰに結合する）を用いてインキュベートした。図７Ａ及び７Ｂに示すように、センサ構造物のＦＲＥＴ比は、抗ＧＦＰ抗体の存在下で低下した。これは、抗体がＧＦＰと結合したことにより、構造物のＲＥＴ受容体とＲＥＴ供与体の間のＦＲＥＴ効果が妨害されたためである。この構造物からのＦＲＥＴ発光を、ＧＦＰに特異的でない抗体の存在下で更に測定したところ、ＦＲＥＴ発光強度に殆ど変化はなかった。これらの結果を図７Ｃに示す。比較のため、図７Ｃには図７Ｂに示す結果も含めている。
それぞれ図７Ｅ及び７Ｆに示すように、センサのＦＲＥＴ比減少と同様の傾向がモノクローナル抗ＧＦＰ抗体及びモノクローナル抗Ｈｉｓタグ抗体について観測された。センサタンパク質が標的（この場合抗ＧＦＰポリクローナル抗体）に結合した時のＦＲＥＴ比を、時間の関数として更に測定した。図７Ｄに示すように、ＦＲＥＴ比の変化は試験開始後すぐに起こり、この系で最大の低下が約３０分後に測定された。センサ濃度の変化に伴うＦＲＥＴ比の変化を試験することにより、本方法の定量的特性を示した。この実験のために、固定濃度のポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（３０ｎＭ）を標的分析物として用い、センサ濃度を変化させながらセンサのＦＲＥＴ比の変化を測定した。図７Ｇに示すように、センサ信号（ＦＲＥＴ比）は約３０ｎＭで飽和し始めた。これは、標的分析物（即ちポリクローナル抗ＧＦＰ抗体）の濃度を正確に示している。
【００４４】
実施例２．溶液中のＨｉｓタグ付きタンパク質を検出するための、分子骨格としてＭＢＰを含むセンサ構造物
Ｎ末端にＥＣＦＰ部分を付着させ、Ｃ末端にＥＹＦＰ部分を付着させた組み換えマルトース結合タンパク質を含む、実施例１に記載したものと同様のセンサ構造物を作製した。しかしながら、実施例１とは異なり、この融合タンパク質にはヘキサヒスチジンタグは含めなかった。ＥＣＦＰのＮ末端又はＥＹＦＰのＣ末端は変異し、チオール反応性ニトリロ三酢酸（マレイミド−Ｃ３−ＮＴＡ；DoJindo、メリーランド州ゲイサーズバーグ）との化学的接合を可能にするシステイン残基を取り込んだ。接合されたニトリロ三酢酸を用いてニッケルなどの金属イオンをキレート化し、次いでヒスチジンタグを付けたタンパク質と結合させた。別法では、ニトリロ三酢酸基は、特定部位の突然変異誘発及び従来技術に公知の化学的接合法を用いて、そのＮ末端とＣ末端との間の位置でマルトース結合タンパク質に結合することができる。このセンサは、Ｈｉｓタグを含むタンパク質を検出するために用いることができる。
【００４５】
実施例３．溶液中のＨｉｓタグ付きタンパク質を検出するための、分子骨格としてコイルドコイルを含む自己組織化センサ構造物
分子骨格としてヘテロ二量体コイルドコイルを含むセンサ構造物を次のようにして作製した。Ｅコイル（ＥＶＳＡＬＥＫ７配列）を、従来技術に公知の組み換え法を使用し、ペプチドリンカーを介してＷｉｎＺｉｐ−Ａ２コイル（例えば、J. Mol. Biol. 2000 Jan 21;295(3):627-39参照）に結合させた。ＥコイルのＮ末端は変異し、ＲＥＴ標識へのチオール結合のためのシステイン残基を取り込んだ。Ｎ末端システインで修飾されたＫコイル（ＫＶＳＡＬＫＥ７配列）を化学的ペプチド合成又は組み換え手段により作製し、チオール反応性ニトリロ三酢酸で標識した。加えて、遺伝的融合及び従来技術に公知の組み換え方法を使用し、ペプチドリンカーを介してＥコイル（変異してＲＥＴ標識へのチオール結合のためのシステイン残基を取り込んだＮ末端を有する）をＷｉｎＺｉｐ−Ｂ１コイル（例えば、J. Mol. Biol. 2000 Jan 21;295(3):627-39参照）に結合した。これら３つのペプチドコイルを一緒にインキュベートし、図５Ａに示される自己組織化コイルドコイルセンサ構造物の形成を可能にした。Ｈｉｓタグ付きタンパク質に結合すると、センサ構造物のＦＲＥＴ特性が図５Ｂに示すように変化した。
【００４６】
実施例４．組み換えＦｖ抗体を含む自己組織化センサ構造物
組み換えＦｖ抗体断片を含むセンサ構造物を、２つの融合タンパク質を別々に作製することにより作製した（例えば、J Mol Biol. 2001 Sep 7;312(1):221-8参照）。第１融合タンパク質は、Ｃ末端がリンカーに結合するＦｖ分子のＶＨ部分を含み、このリンカーがＶＨ部分をペプチドコイルＷｉｎＺｉｐ−Ａ２のＮ末端に接続することによりＶＨ：リンカー：ＷｉｎＺｉｐ−Ａ２が形成される。リンカーは、アミノ酸Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから成る、長さ約２.４〜２.６ｎｍの柔軟な１４アミノ酸ペプチドを含む。第２融合タンパク質は、Ｃ末端がリンカーに結合するＦｖ分子のＶＬ部分を含み、このリンカーがＶＬ部分を別のペプチドコイルＷｉｎＺｉｐ−Ｂ１のＮ末端に接続することによりＶＬ：リンカー：ＷｉｎＺｉｐ−Ｂ１が形成される。第２融合タンパク質に対するリンカーは、同様に、アミノ酸Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから成る、長さ約２.４〜２.６ｎｍの柔軟な１４アミノ酸ペプチドを含む。
次に、ＰｐＬ及びＳＰＡ−Ｅを使用して２つの融合タンパク質を標識した。ヘキサヒスチジンタグ付きＰｐＬ及びＳＰＡ−Ｅを大腸菌中で発現させ、固定金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、各々ＲＥＴ供与体及びＲＥＴ受容体フルオロフォアで標識した。次に、フルオロフォアで標識したＰｐＬ及びＳＰＡ−Ｅを適切な融合タンパク質を用いてインキュベートし、各々ＶＬ及びＶＨドメインに特異的に結合させた。
【００４７】
実施例５．モノクローナル抗体を含む自己組織化センサ構造物
実施例４に記載したように、フルオロフォア接合したＰｐＬ及びＳＰＡ−Ｅを作製し、モノクローナル抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域の標識に用いた。ＰｐＬがＶＬのフレームワーク領域だけに結合したのに対し、ＳＰＡ−ＥはＶＨと、程度はそれよりも小さいがＦｃの両方に結合した。Ｆｃに対するＳＰＡ−Ｅの結合親和性は、Ｆｃ結合性レンサ球菌タンパク質Ｇ−Ｂ１（ＳＰＧ−Ｂ１）ドメインの同親和性より小さいので、ＳＰＧ−Ｂ１を用いてまずモノクローナル抗体をインキュベートしてＳＰＡ−ＥのＦｃへの結合を遮断した。次に、抗体を用いて、フルオロフォアで標識したＰｐＬ及びＳＰＡ−Ｅをインキュベートした。
【００４８】
特定の好適な実施形態を参照して本発明を詳細に説明したが、他の実施形態も可能である。本方法に開示されたステップは限定的なものでなく、各ステップは本方法に必須ではなくて単に例示的なものである。従って、特許請求の範囲は本明細書に記載の好適な実施形態に限定されるものではない。本明細書中に引用した全ての参考文献の内容全体を参照により本明細書に包含する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本方法によるセンサ構造物に対する分析物の結合を示す。
【図２】ＭＲＤを標識に付着させた本センサ構造物の別の実施形態を示す。
【図２Ａ】ＭＲＤを標識に付着させた本センサ構造物のまた別の実施形態を示す。
【図３】本センサ構造物の更に別の実施形態に対する分析物の結合を示す。
【図３Ａ】本センサ構造物のまた別の実施形態に対する分析物の結合を示す。
【図４】ＭＲＤが自己組織化する本センサ構造物の更に別の実施形態を示す。
【図４Ａ】標識も自己組織化する図４に示すセンサ構造物の一実施形態を示す。
【図５Ａ】本センサ構造物の別の自己組織化の実施形態による組織化を示す。
【図５Ｂ】図５Ａのセンサ構造物に対する分析物の結合を示す。
【図６】分子骨格が自己組織化する本センサ構造物の一実施形態を示す。
【図７Ａ】本方法に従って行った実験の結果を示すグラフである。
【図７Ｂ】本方法に従って行った実験の結果を示すグラフである。
【図７Ｃ】本方法に従って行った実験の結果を示すグラフである。
【図７Ｄ】本方法に従って行った実験の結果を示すグラフである。
【図７Ｅ】本方法に従って行った実験の結果を示すグラフである。
【図７Ｆ】本方法に従って行った実験の結果を示すグラフである。
【図７Ｇ】本方法に従って行った実験の結果を示すグラフである。
【図７Ｈ】本方法に従って行った実験の結果を示すグラフである。
【図７Ｉ】本方法に従って行った実験の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図４】
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【図４Ａ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【国際調査報告】
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