【手続補正書】
【提出日】平成28年7月28日(2016.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）細胞の核酸の標的遺伝子に対して核酸構築物を誘導するための標的化アーム；
（ｂ）前記標的遺伝子の転写に関してセンス方向の、３’スプライシングアクセプターおよびそれに続くレポーターを含む、動作配列；
（ｃ）センス方向またはアンチセンス方向の薬剤選択カセット；
（ｄ）アンチセンス方向の目的のヌクレオチド配列；
（ｅ）アンチセンス方向のＣＯＩＮ（反転による条件的エレメント）；ならびに、
（ｆ）（ｉ）第１のリコンビナーゼによって認識される、類似するリコンビナーゼ認識部位の第１の対Ｒ１／Ｒ１’と、類似するリコンビナーゼ認識部位の第２の対Ｒ３／Ｒ３’；
（ｉｉ）第２のリコンビナーゼによって認識される、類似するリコンビナーゼ認識部位の第３の対Ｒ４／Ｒ４’と、類似するリコンビナーゼ認識部位の第４の対Ｒ５／Ｒ５’；および
（ｉｉｉ）第３のリコンビナーゼによって認識される、類似するリコンビナーゼ認識部位の第５の対Ｒ２／Ｒ２’
を含む、組み換え可能なユニット；
を含む核酸構築物であって、
前記第１、第２および第３のリコンビナーゼが同じものではなく；
前記動作配列は、上流にＲ１が隣接し、前記動作配列と前記薬剤選択カセットの間にＲ２が配置され、前記薬剤選択カセットと前記目的のヌクレオチド配列の間にＲ３が配置され、Ｒ３と前記目的のヌクレオチド配列の間にＲ４が配置され、前記目的のヌクレオチド配列と前記ＣＯＩＮの間にＲ５が配置され、Ｒ５と前記ＣＯＩＮの間にＲ１’が配置され、Ｒ１’と前記ＣＯＩＮの間にＲ３’が配置され、前記ＣＯＩＮの下流にＲ５’が配置され、Ｒ５’の下流にＲ４’が配置され、かつ、Ｒ４’の下流にＲ２’が配置され；
Ｒ１とＲ１’は反対方向で存在し、Ｒ２とＲ２’は同じ方向で存在し、Ｒ３とＲ３’は反対方向で存在し、Ｒ４とＲ４’は同じ方向で存在し、かつ、Ｒ５とＲ５’は同じ方向で存在する、
核酸構築物。
【請求項２】
（ａ）細胞の核酸の標的遺伝子に対して核酸構築物を誘導するための標的化アーム；
（ｂ）前記標的遺伝子の転写に関してセンス方向の、３’スプライシングアクセプターおよびそれに続くレポーターを含む、動作配列；
（ｃ）センス方向またはアンチセンス方向の薬剤選択カセット；
（ｄ）アンチセンス方向の目的のヌクレオチド配列；
（ｅ）アンチセンス方向のＣＯＩＮ（反転による条件的エレメント）；ならびに、
（ｆ）（ｉ）第１のリコンビナーゼによって認識される、類似するリコンビナーゼ認識部位の第１の対Ｒ１／Ｒ１’と、類似するリコンビナーゼ認識部位の第２の対Ｒ３／Ｒ３’；
（ｉｉ）第２のリコンビナーゼによって認識される、類似するリコンビナーゼ認識部位の第３の対Ｒ４／Ｒ４’と、類似するリコンビナーゼ認識部位の第４の対Ｒ５／Ｒ５’；および
（ｉｉｉ）第３のリコンビナーゼによって認識される、類似するリコンビナーゼ認識部位の第５の対Ｒ２／Ｒ２’
を含む、組み換え可能なユニット；
を含む核酸構築物であって、
前記第１、第２および第３のリコンビナーゼが同じものではなく；
第１の組み換え可能なユニットは、反対方向で存在するＲ１とＲ１’により枠で囲まれており、Ｒ１とＲ１’の間には、前記動作配列；Ｒ２；前記薬剤選択カセット；Ｒ３；Ｒ４；前記目的のヌクレオチド配列；およびＲ５が配置され；
第２の組み換え可能なユニットは、同じ方向で存在するリコンビナーゼ部位Ｒ２とＲ２’により枠で囲まれており、Ｒ２とＲ２’の間には、前記薬剤選択カセット；Ｒ３；Ｒ４；前記目的のヌクレオチド配列；Ｒ５；Ｒ１’；Ｒ３’；前記ＣＯＩＮ；Ｒ５’；およびＲ４’が配置され；
第３の組み換え可能なユニットは、反対方向で存在するリコンビナーゼ部位Ｒ３とＲ３’により枠で囲まれており、Ｒ３とＲ３’の間には、Ｒ４；前記目的のヌクレオチド配列；Ｒ５；およびＲ１’が配置され；
第４の組み換え可能なユニットは、同じ方向で存在するリコンビナーゼ部位Ｒ４とＲ４’により枠で囲まれており、Ｒ４とＲ４’の間には、前記目的のヌクレオチド配列；Ｒ５；Ｒ１’；Ｒ３’；前記ＣＯＩＮ；およびＲ５’が配置され；かつ
第５の組み換え可能なユニットは、同じ方向で存在するリコンビナーゼ部位Ｒ５とＲ５’により枠で囲まれており、Ｒ５とＲ５’の間には、Ｒ１’；Ｒ３’；および前記ＣＯＩＮが配置される、
核酸構築物。
【請求項３】
５対のリコンビナーゼ認識部位を含む核酸構築物であって、
リコンビナーゼ認識部位の第１の対Ｒ４／Ｒ４’と、リコンビナーゼ認識部位の第２の対Ｒ５／Ｒ５’が第１のリコンビナーゼによって認識され、
リコンビナーゼ認識部位の第３の対Ｒ２／Ｒ２’と、リコンビナーゼ認識部位の第４の対Ｒ３／Ｒ３’が第２のリコンビナーゼによって認識され、
リコンビナーゼ認識部位の第５の対Ｒ１／Ｒ１’が第３のリコンビナーゼによって認識され、そして
リコンビナーゼ認識部位のどの対も任意の他の対と同一ではなく、かつ、前記第１、第２および第３のリコンビナーゼが同じものではなく、
前記構築物は、センス鎖上の方向に関して５’から３’方向に、Ｒ１；Ｒ２；Ｒ３；アンチセンス方向のＣＯＩＮ（反転による条件的エレメント）；Ｒ４；Ｒ５；Ｒ３’；アンチセンス方向の目的のヌクレオチド配列；Ｒ２’；Ｒ４’；センス方向またはアンチセンス方向の薬剤選択カセット；Ｒ１’；センス方向のレポーター遺伝子；およびＲ５’を含み、
Ｒ３’は、Ｒ３に関して、Ｒ３とＲ３’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられており；Ｒ２’は、Ｒ２に関して、Ｒ２とＲ２’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられており；Ｒ４’は、Ｒ４に関して、Ｒ４とＲ４’の間の配列の反転を指示するように方向付けられており；Ｒ１’は、Ｒ１に関して、Ｒ１とＲ１’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられており；かつ、Ｒ５’は、Ｒ５に関して、Ｒ５とＲ５’の間の配列の反転を指示するように方向付けられている、
核酸構築物。
【請求項４】
５対のリコンビナーゼ認識部位を含む核酸構築物であって、
リコンビナーゼ認識部位の第１の対Ｒ２／Ｒ２’と、リコンビナーゼ認識部位の第２の対Ｒ３／Ｒ３’が第１のリコンビナーゼによって認識され、
リコンビナーゼ認識部位の第３の対Ｒ４／Ｒ４’と、リコンビナーゼ認識部位の第４の対Ｒ５／Ｒ５’が第２のリコンビナーゼによって認識され、
リコンビナーゼ認識部位の第５の対Ｒ１／Ｒ１’が第３のリコンビナーゼによって認識され、そして
リコンビナーゼ認識部位のどの対も任意の他の対と同一ではなく、かつ、前記第１、第２および第３のリコンビナーゼが同じものではなく、
前記構築物は、転写の方向に関して５’から３’方向に、Ｒ１；Ｒ２；Ｒ３；Ｒ４；アンチセンス方向の目的のヌクレオチド配列；Ｒ５；Ｒ２’；薬剤選択カセット；Ｒ１’；レポーター遺伝子；Ｒ３’；アンチセンス方向のＣＯＩＮ（反転による条件的エレメント）；Ｒ５’；およびＲ４’を含み、
Ｒ２’は、Ｒ２に関して、Ｒ２とＲ２’の間の配列の反転を指示するように方向付けられており；Ｒ１’は、Ｒ１に関して、Ｒ１とＲ１’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられており；Ｒ３’は、Ｒ３に関して、Ｒ３とＲ３’の間の配列の反転を指示するように方向付けられており；Ｒ５’は、Ｒ５に関して、Ｒ５とＲ５’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられており；かつ、Ｒ４’は、Ｒ４に関して、Ｒ４とＲ４’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられている、
核酸構築物。
【請求項５】
５対のリコンビナーゼ認識部位を含む核酸構築物であって、
リコンビナーゼ認識部位の第１の対Ｒ１／Ｒ１’と、リコンビナーゼ認識部位の第２の対Ｒ３／Ｒ３’が第１のリコンビナーゼによって認識され、
リコンビナーゼ認識部位の第３の対Ｒ４／Ｒ４’と、リコンビナーゼ認識部位の第４の対Ｒ５／Ｒ５’が第２のリコンビナーゼによって認識され、
リコンビナーゼ認識部位の第５の対Ｒ２／Ｒ２’が第３のリコンビナーゼによって認識され、そして
リコンビナーゼ認識部位のどの対も任意の他の対と同一ではなく、かつ、前記第１、第２および第３のリコンビナーゼが同じものではなく、
前記構築物は、転写の方向に関して５’から３’に方向に、Ｒ１；レポーター；Ｒ２；薬剤選択カセット；Ｒ３；アンチセンス方向の目的のヌクレオチド配列；Ｒ４；Ｒ５；Ｒ１’；Ｒ３’；アンチセンス方向のＣＯＩＮ（反転による条件的エレメント）；Ｒ５’；Ｒ４’；およびＲ２’を含み、
Ｒ１’は、Ｒ１に関して、Ｒ１とＲ１’の間の配列の反転を指示するように方向付けられており；Ｒ３’は、Ｒ３に関して、Ｒ３とＲ３’の間の配列の反転を指示するように方向付けられており；Ｒ５’は、Ｒ５に関して、Ｒ５とＲ５’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられており；Ｒ４’は、Ｒ４に関して、Ｒ４とＲ４’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられており；かつ、Ｒ２’は、Ｒ２に関して、Ｒ２とＲ２’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられている、
核酸構築物。
【請求項６】
５対のリコンビナーゼ認識部位を含む核酸構築物であって、
リコンビナーゼ認識部位の第１の対Ｒ４／Ｒ４’と、リコンビナーゼ認識部位の第２の対Ｒ５／Ｒ５’が第１のリコンビナーゼによって認識され、
リコンビナーゼ認識部位の第３の対Ｒ２／Ｒ２’と、リコンビナーゼ認識部位の第４の対Ｒ３／Ｒ３’が第２のリコンビナーゼによって認識され、
リコンビナーゼ認識部位の第５の対Ｒ１／Ｒ１’が第３のリコンビナーゼによって認識され、そして
リコンビナーゼ認識部位のどの対も任意の他の対と同一ではなく、かつ、前記第１、第２および第３のリコンビナーゼが同じものではなく、
前記構築物は、転写の方向に関して５’から３’方向に、Ｒ１；Ｒ２；Ｒ３；アンチセンス方向のＣＯＩＮ（反転による条件的エレメント）；Ｒ４；Ｒ５；Ｒ３’；Ｒ２’；アンチセンス方向の目的のヌクレオチド配列；Ｒ４’；薬剤選択カセット；Ｒ１’；センス方向のレポーター；およびＲ５’を含み、
Ｒ３’は、Ｒ３に関して、Ｒ３とＲ３’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられており；Ｒ２’は、Ｒ２に関して、Ｒ２とＲ２’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられており；Ｒ４’は、Ｒ４に関して、Ｒ４とＲ４’の間の配列の反転を指示するように方向付けられており；Ｒ１’は、Ｒ１に関して、Ｒ１とＲ１’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられており；かつ、Ｒ５’は、Ｒ５に関して、Ｒ５とＲ５’の間の配列の反転を指示するように方向付けられている、
核酸構築物。
【請求項７】
５対のリコンビナーゼ認識部位を含む核酸構築物であって、
リコンビナーゼ認識部位の第１の対Ｒ２／Ｒ２’と、リコンビナーゼ認識部位の第２の対Ｒ３／Ｒ３’が第１のリコンビナーゼによって認識され、
リコンビナーゼ認識部位の第３の対Ｒ４／Ｒ４’と、リコンビナーゼ認識部位の第４の対Ｒ５／Ｒ５’が第２のリコンビナーゼによって認識され、
リコンビナーゼ認識部位の第５の対Ｒ１／Ｒ１’が第３のリコンビナーゼによって認識され、そして
リコンビナーゼ認識部位のどの対も任意の他の対と同一ではなく、かつ、前記第１、第２および第３のリコンビナーゼが同じものではなく、
前記構築物は、転写の方向に関して５’から３’方向に、Ｒ１；Ｒ２；Ｒ３；アンチセンス方向の目的のヌクレオチド配列；Ｒ４；Ｒ５；Ｒ２’；薬剤選択カセット；Ｒ１’；センス方向のレポーター；Ｒ３’；アンチセンス方向のＣＯＩＮ（反転による条件的エレメント）；Ｒ５’；およびＲ４’を含み、
Ｒ２’は、Ｒ２に関して、Ｒ２とＲ２’の間の配列の反転を指示するように方向付けられており；Ｒ１’は、Ｒ１に関して、Ｒ１とＲ１’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられており；Ｒ３’は、Ｒ３に関して、Ｒ３とＲ３’の間の配列の反転を指示するように方向付けられており；Ｒ５’は、Ｒ５に関して、Ｒ５とＲ５’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられており；かつ、Ｒ４’は、Ｒ４に関して、Ｒ４とＲ４’の間の配列の切り出しを指示するように方向付けられている、
核酸構築物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の構築物を含有している、哺乳動物細胞。
【請求項９】
マウス細胞またはラット細胞である、請求項８に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１０】
前記細胞が幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ）、人工多能性細胞、多能性細胞、または全能細胞である、請求項８に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の構築物を含有している、非ヒト胚または非ヒト動物。
【請求項１２】
前記非ヒト動物がマウスまたはラットである、請求項１１に記載の非ヒト動物。
【請求項１３】
非ヒト細胞を修飾するための方法であって、前記方法は：
請求項１〜２のいずれか一項に記載の核酸構築物で細胞中の目的のヌクレオチド配列を標的化して、標的化された細胞を形成させる工程、
前記標的化された細胞を前記第１のリコンビナーゼに対して暴露して、前記動作配列と前記薬剤選択カセットを欠失し、かつ、センス方向の前記目的のヌクレオチド配列とアンチセンス方向の前記ＣＯＩＮを含有する条件的対立遺伝子を形成させる工程、および
前記条件的対立遺伝子を、前記目的のヌクレオチド配列を切り出し、前記ＣＯＩＮをセンス方向で配置する第２のリコンビナーゼに対して暴露する工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記細胞内の前記目的のヌクレオチド配列が、表現型と関係があるエキソンまたはヌクレオチド配列である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞内の前記目的のヌクレオチド配列が、請求項１〜２のいずれか一項に記載の核酸構築物により置き換えられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的化された細胞を形成させた後であるが、前記第１のリコンビナーゼに対して暴露する前に、前記表現型が最初に決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のリコンビナーゼに対して暴露した後に、前記表現型が２回目に決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
非ヒト細胞を修飾するための方法であって、前記方法は：
請求項３〜４のいずれか一項に記載の核酸構築物で細胞中の目的のヌクレオチド配列を標的化して、標的化された細胞を形成させる工程、
前記標的化された細胞を前記第１のリコンビナーゼに対して暴露して、前記レポーター遺伝子と前記薬剤選択カセットを欠失し、かつ、センス方向の前記目的のヌクレオチド配列とアンチセンス方向の前記ＣＯＩＮを含有する条件的対立遺伝子を形成させる工程、および
前記条件的対立遺伝子を、前記目的のヌクレオチド配列を切り出し、前記ＣＯＩＮをセンス方向で配置する第２のリコンビナーゼに対して暴露する工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記細胞内の前記目的のヌクレオチド配列が、表現型と関係があるエキソンまたはヌクレオチド配列である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞内の前記目的のヌクレオチド配列が、請求項３〜４のいずれか一項に記載の核酸構築物により置き換えられる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的化された細胞を形成させた後であるが、前記第１のリコンビナーゼに対して暴露する前に、前記表現型が最初に決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のリコンビナーゼに対して暴露した後に、前記表現型が２回目に決定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
非ヒト細胞を修飾するための方法であって、前記方法は：
請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸構築物で細胞中の目的のヌクレオチド配列を標的化して、標的化された細胞を形成させる工程、
前記標的化された細胞を前記第１のリコンビナーゼに対して暴露して、前記レポーターと前記薬剤選択カセットを欠失し、かつ、センス方向の前記目的のヌクレオチド配列とアンチセンス方向の前記ＣＯＩＮを含有する条件的対立遺伝子を形成させる工程、および
前記条件的対立遺伝子を、前記目的のヌクレオチド配列をアンチセンス方向で配置し、前記ＣＯＩＮをセンス方向で配置する第２のリコンビナーゼに対して暴露する工程
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記細胞内の前記目的のヌクレオチド配列が、表現型と関係があるエキソンまたはヌクレオチド配列である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞内の前記目的のヌクレオチド配列が、請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸構築物により置き換えられる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的化された細胞を形成させた後であるが、前記第１のリコンビナーゼに対して暴露する前に、前記表現型が最初に決定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のリコンビナーゼに対して暴露した後に、前記表現型が２回目に決定される、請求項２６に記載の方法。