(57)【要約】  本発明は、生物学、遺伝学、および医学の分野に関する。本発明は、（１）診断および治療目的のための、ゲノムおよびプロテオミクス研究を行なうための、すなわち、下記細胞のための新規マーカーおよび／または治療標的の同定のための、サプレッサーＴ細胞またはリンパ球（Ｔｓ）またはその前駆体（ｐＴｓ）の同定；（２）サプレッサーＴ細胞またはリンパ球（Ｔｓ）またはその前駆体（ｐＴｓ）の産生、および／または、エフェクターおよび／またはレギュレーターリンパ球の活性異常を伴う疾患を含む、様々な病的症状の制御のためのインビボまたは生体外でのその操作、を可能とする方法および組成物を記載する。本発明は、Ｔｓリンパ球およびｐＴｓに基づく前記組成物の調製、および、細胞療法におけるその使用に関する。本発明により得られるＴｓリンパ球およびｐＴｓに基づく組成物または細胞個体群は、腫瘍、自己免疫疾患、アレルギー、移植片対宿主疾患、移植片対感染効果（ＧＶＩ）または移植片対白血病効果（ＧＶＬ）、炎症疾患、１型糖尿病、ウイルス性、細菌性、もしくは寄生虫性感染の処置に、免疫再構成に、あるいは、哺乳動物における幹細胞、組織もしくは臓器の移植の場合の耐容性の誘導に特に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＨＹ−１分子を発現しているヒトＴリンパ球のインビトロまたは生体外での選択、分離、または単離のステップを含む、ヒトサプレッサーＴリンパ球（および／またはその前駆体）を得る、調製する、または産生する方法。
【請求項２】
（ａ）Ｔリンパ球を含むヒト起源の細胞個体群を得ること、および
（ｂ）ＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球を回収すること：
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）の前または後にＴリンパ球の増幅ステップを行なうことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球を、ＴＨＹ−１に特異的なリガンドにより選択、分離、単離、または回収することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記特異的リガンドが、ＴＨＹ−１に特異的な抗体、または、実質的に同じ抗原特異性を有する前記抗体の断片もしくは誘導体であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記特異的リガンドが、ＴＨＹ−１に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記特異的リガンドが、ＴＨＹ−１に特異的な多機能、単量体または多量体の抗体であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記特異的リガンドが、アプタマーであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドが、支持体上に固定されているか、または溶液中に置かれていることを特徴とする、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記支持体が、カラムまたはビーズ、好ましくは磁気ビーズであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記リガンドが標識されていることを特徴とする、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識を、蛍光、放射能、発光、リン光、化学的または酵素的検出標識により行なうことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
回収、選択、または単離のステップを、フローサイトメトリー、アフィニティクロマトグラフィー、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ、またはＤ／ＭＡＣＳにより行なうことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞個体群が、骨髄、脾臓、肝臓、胸腺、前以てＴリンパ球を強化したまたは強化していない血液、臍帯血、胎児もしくは成人の末梢血、腫瘍、炎症部位、移植臓器、または前記組織の１つもしくはその他で確立された細胞培養物からなる群より選択される組織に由来することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞個体群をＴＨＹ−１に特異的なリガンドに晒し、前記リガンドと前記細胞の間の複合体の形成を判断および／または定量することを含む、前記細胞個体群におけるヒトサプレッサーＴリンパ球を同定および／または定量する方法であって、前記複合体の形成が、前記細胞個体群におけるサプレッサーＴリンパ球の存在および／または量を示す、前記方法。
【請求項１６】
（ａ）ヒトＴリンパ球を含む生物学的試料を得ること、
（ｂ）前記生物学的試料中でＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球を選択すること、
（ｃ）医薬的に許容されるアジュバントまたは培地中でＴＨＹ−１抗原を発現している前記Ｔリンパ球をコンディショニングすること：
を含む、医薬組成物の製造法。
【請求項１７】
（ａ）ヒトＴリンパ球を含む生物学的試料を得ること、
（ｂ）前記生物学的試料からＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球を枯渇させること、
（ｃ）医薬的に許容されるアジュバントまたは培地中でＴＨＹ−１抗原を発現していない前記Ｔリンパ球をコンディショニングすること：
を含む、医薬組成物の製造法。
【請求項１８】
ヒトサプレッサーＴリンパ球を、インビトロまたは生体外で、選択、同定、選別、または調製するための、ＴＨＹ−１抗原に特異的なリガンドの使用。
【請求項１９】
ヒトサプレッサーＴリンパ球のインビボでの選択、同定、または定量を目的とした診断組成物を調製するための、ＴＨＹ−１抗原に特異的なリガンドの使用。
【請求項２０】
ヒトサプレッサーＴリンパ球のインビボでの改変、刺激、または排除を目的とした治療組成物を調製するための、ＴＨＹ−１抗原に特異的なリガンドの使用。
【請求項２１】
抑制活性を示し、ＣＤ８またはＣＤ４マーカーおよびＴＨＹ−１を発現することを特徴とする、単離されたヒトＴリンパ球。
【請求項２２】
少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％のヒトＣＤ８＋ＴＨＹ−１＋またはＣＤ４＋／ＴＨＹ−１＋Ｔ細胞を含む、細胞組成物。
【請求項２３】
ウイルスベクターにより遺伝子的に改変されていることを特徴とする、請求項２１に記載のＴリンパ球。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の少なくとも１種類のサプレッサーＴリンパ球および医薬的に許容されるアジュバントもしくは培地を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２５】
治療法の遂行を目的とした組成物を調製するための請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のＴリンパ球またはＴリンパ球個体群の使用。
【請求項２６】
前記組成物が、ワクチンとしての使用を目的としていることを特徴とする、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
腫瘍、自己免疫疾患、アレルギー、移植片対宿主疾患、炎症疾患、１型糖尿病、ウイルス性もしくは細菌性感染の処置、免疫再構成、または哺乳動物における幹細胞、組織もしくは臓器の移植の場合の耐容性の誘導を目的とした、組成物の調製のための、請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
溶液中に置かれたまたは支持体上のＴＨＹ−１に特異的なリガンド、および、場合により前記リガンドの検出のための試薬を含む、ヒトサプレッサーＴリンパ球の単離または特徴付けのためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、遺伝学、および医学の分野に関する。本発明は、レギュレーターＴ細胞（すなわちＴｒｅｇ）とも呼ばれる、サプレッサーＴ細胞またはリンパ球（Ｔｓ）（その前駆体（ｐＴｓ）も含む）の生体外またはインビボでの同定、産生、および操作を可能とする方法および組成物、エフェクターおよび／またはレギュレーター／サプレッサーＴリンパ球の活性異常を伴う疾患を含む、様々な病的症状の制御のための上記サプレッサーリンパ球の使用を記載する。本発明は、Ｔｓリンパ球およびｐＴｓに基づく上記組成物の調製、並びに、細胞および／または遺伝子治療におけるその使用に関する。本発明により得られたＴｓリンパ球およびｐＴｓに基づく組成物もしくは細胞個体群は、遺伝子疾患もしくは後天性疾患、特に腫瘍、自己免疫疾患、アレルギー、移植片対宿主疾患、移植片対感染効果（ＧＶＩ）または移植片対白血病効果（ＧＶＬ）、例えばアテローム性動脈硬化症、糖尿病、ウイルス性、細菌性、もしくは寄生虫性感染を含む炎症疾患の処置に、免疫再構成に、あるいは、哺乳動物における幹細胞、組織もしくは臓器の移植の場合の耐容性の誘導に特に適している。
【０００２】
免疫系においてレギュレーター／サプレッサー機能を遂行できる細胞の存在が昔から疑われていた。１９８０年代、多くの科学的刊行物により、Ｔリンパ球個体群内のサプレッサー活性の存在が明らかとなった。しかし、特にエフェクター機能を含む多くのその他の機能も有している、全リンパ球個体群から上記機能を有する細胞を特徴付け単離することが不可能であったことから、この現象をより良く理解することができなかった。１９９５年、ＣＤ２５マーカーを構成的に発現しているＣＤ４＋Ｔリンパ球の亜個体群が、げっ歯類において、免疫応答および自己免疫疾患を制御する上で主要な役割を果たしているとして同定された。上記ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、レギュレーターまたはサプレッサーＴ細胞（Ｔｓ）とも呼ばれているが、これはマウスにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞の約５〜１０％を占める。Ｔｓ細胞は、他のＴリンパ球と同様に、抗原特異的Ｔ細胞受容体を発現しているが、その総合的作用は、部分的に非特異的であり、「感染抑制」と呼ばれる現象を通じて、他のそれ以外のサプレッサーＴリンパ球も採用している可能性がある。ヒトにおいては、ＣＤ４＋Ｔ細胞の５％未満を占めているＣＤ４＋／ＣＤ２５＋調節細胞個体群も記載されている。現在、いくつかの実験により、数多くの疾患におけるＣＤ４＋／ＣＤ２５＋サプレッサーＴリンパ球による治療の可能性が確立されている。
【０００３】
例えば、Ｔｓ細胞は、１型糖尿病のような自己免疫疾患または同種Ｔリンパ球により誘発される移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の制御において、主要な役割を果たす。Ｔｓ細胞を、同種造血幹細胞およびエフェクターＴリンパ球を含む移植片に添加することで、ＧＶＨＤの開始または発生を制御することができる。Ｔｓ細胞を注射することで、自己免疫性多発性筋炎における自己免疫応答を減弱することができる（未公表）。Ｔｓ細胞はまた、組織または臓器の移植中および／または導入遺伝子などの免疫原性分子の存在下での、耐容性の確立または誘導において主要な役割を果たす。Ｔｓ細胞はさらに、感染性物質に対する、特に細胞内細菌およびウイルスに対する応答の変調において重要な役割を果たす。
【０００４】
Ｔｓ細胞は、アテローム性動脈硬化症などのいくつかの炎症疾患において役割を果たす。この場合、Ｔｓ細胞の不在またはその数の減少により、疾患発達の加速および疾患重症度の増大が起こる（未公表の結果）。
【０００５】
現在では、Ｔｓ細胞は、エフェクターの抗腫瘍応答の発生を妨害し、該Ｔｓ細胞がなければ、腫瘍が根絶される可能性があることが十分に確立されている。マウスにおいては、Ｔｓ細胞の枯渇により、多くの癌モデルにおいて、エフェクターの免疫応答を通じて腫瘍が根絶される。ヒトにおいては、好ましくない疾患経過とＴｓ細胞の間の相関が、いくつかの悪性病態において記載されている。腫瘍Ｔｓ細胞は、生存率低下と関連している。さらに、Ｔｓ細胞を薬理学的に変調（modulation）することにより、腫瘍浸潤リンパ球に基づく処置が改善される。
【０００６】
Ｔｓ細胞はまた、特異的免疫応答の発生を抑制することができるので、ワクチン接種においても重要である。同様に、Ｔｓを枯渇または減少させることにより、抗癌ワクチンの効果は非常に顕著に改善される。
【０００７】
最後に、多くの刊行物が、現在、様々な疾患および所与の疾患の進行中における異常な数または比率のＴｓ細胞の存在を報告している。
【０００８】
これらの全ての議論により、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋レギュレーターＴ細胞のインビトロまたはインビボでの同定、選択、増殖、または枯渇は、多くの疾患、特に自己免疫疾患、炎症疾患、感染症、癌、および移植片拒絶における診断および治療の多大なる可能性を示すことが示される。
【０００９】
Ｔｓ細胞の特徴付けも、大きな重要性がある。このＴｓリンパ球個体群の恒常性および調節に関するデータは僅かであるが、Ｆｏｘｐ３転写因子は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋サプレッサーＴリンパ球の発達および機能に重要な役割を果たしている物質のようである。Ｆｏｘｐ３が、全てのＴｓ細胞上に発現されていることは確立されていないが、マウスにおけるＦｏｘｐ３発現の不在は、Ｔｓ細胞機能の劇的な低下に相関しており、エフェクターＴリンパ球においてＦｏｘｐ３を強制発現させることにより、上記エフェクターＴリンパ球はＴｓ細胞に変換される。
【００１０】
ＣＤ４およびＣＤ２５マーカーは、サプレッサーＴリンパ球を含む細胞個体群を特徴付けているが、事実、上記抑制機能は、全てがＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞に起因するものではなく、とりわけ、全てのＣＤ４＋／ＣＤ２５＋が抑制細胞であるというわけではないようである。事実、ＣＤ２５マーカーは、活性化エフェクターＴ細胞にも発現されている。上記マーカーに基づくＴｓ細胞の同定および精製は、実際に同定され精製されたものが、活性化エフェクターＴ細胞であろうというリスクから大きな問題となっている。所与の免疫疾患の場合では、ＣＤ４およびＣＤ２５を発現している活性化Ｔリンパ球は、正にこのようなエフェクターＴ細胞を含む可能性が高く、このエフェクターＴ細胞に対する治療的介入が望まれる。したがって、診断の場合（同定）におけるＣＤ４およびＣＤ２５の使用は、信頼性のおけるものではなく、治療の場合（精製、注射）におけるその使用は、無効であるかまたはさらには疾患を増悪させるリスクがあるだろう。
【００１１】
活性化エフェクターＴリンパ球とＴｓ細胞を区別できることが現在知られている最善のマーカーは、Ｆｏｘｐ３転写因子の発現である。しかし、この細胞内転写因子は、簡単な免疫表現型的同定法および精製法には使用できない。ＣＤ６２Ｌのような他のマーカーも、Ｔｓ細胞のより良好な特徴付けを可能とするが、完璧な同定の実現には程遠い。さらに、いくつかの刊行物により、ＣＤ４＋／ＣＤ２５−個体群および特定のＣＤ８＋細胞における抑制活性の存在が実証されている。それ故、Ｔｓ細胞の診断的および治療的使用は、明らかに、その特異的な同定に依存し、現在の知識では、これまで、サプレッサーＴリンパ球に特異的なマーカーは全く判明しなかったようである。
【００１２】
さらに、胸線において分化するＴｓリンパ球もあるようであるが（それらは、「天然」Ｔｓ細胞とも呼ばれることが多い）、末梢で産生されるＴｓリンパ球もあり、Ｔ細胞前駆体からのＴｓ細胞の個体発生については何も知られていない。
【００１３】
本発明は、初めて、サプレッサーＴ細胞個体群、特にヒト、特に（ｉ）Ｔｓ前駆体個体群、および（ｉｉ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の中の純粋なＴｓ細胞個体群を、同定、単離、解析（トランスクリプトーム、プロテオームなど）および操作（培養、活性化、枯渇、遺伝子改変など）する機会を提供する。本発明は、ＣＤ９０分子（ＴＨＹ−１とも呼ばれる）が、ヒトＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔｓ細胞並びにその前駆体に特徴的であり、上記細胞個体群の同定に効率的に使用できるマーカーを提示するという発見に由来する。
【００１４】
ＴＨＹ−１抗原（Sekiら、1985；Planellesら、1995）は、ホスファチジルイノシトール橋により膜にアンカーされている十分に特徴付けられている表面糖タンパク質に相当する。上記タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、約１４０アミノ酸（２５〜３０ｋＤａ）を含む。この抗原は、当初、マウス胸腺および脳に発現されている分化マーカーとして同定された。ヒトにおいては、ＴＨＹ−１は、低い比率で胎児胸腺細胞に、未熟ＣＤ３４＋造血前駆体に、および末梢循環中に存在するＣＤ３＋リンパ球の１％未満に発現されている。ＴＨＹ−１はまた、間葉細胞、内皮細胞、およびいくつかの確立されている細胞系にも発現されている。ＴＨＹ−１の機能は不明である。
【００１５】
マウスにおいては、ＴＨＹ−１は、胸腺中のＴ細胞前駆体および前駆物質上に発現されている。また、調節細胞上（Mukasaら、Clin.Exp.Immunol.96(1994)138；Torre-Amioneら、Cell.Immunol.124(1989)50；Sakatsumeら、Int.Immunol.3(1991)377）並びに全ての循環中のＴリンパ球にも発現されている。この理由から、特定の細胞型の識別マーカーにはなりえない。さらに、マウスにおいて２つのアイソフォーム、すなわちＴｈｙ−1．１およびＴｈｙ−１．２が記載されている。
【００１６】
本発明らは、今回、驚くべき様式で、ＴＨＹ−１分子の発現は、Ｔｓ活性に密接に関連しており、ＴＨＹ−１分子は、サプレッサーＴリンパ球に特異的なマーカーであり、特に、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋リンパ球中のＴｓ前駆体および／または純粋なＴｓ個体群のインビトロまたはインビボでの同定、選択、増殖、または枯渇を可能とすることを発見した。
【００１７】
それ故、本発明の第一の態様は、ＴＨＹ−１分子を発現しているＴリンパ球の選択、分離、および／または単離のステップを含む、サプレッサーＴリンパ球（および／またはその前駆体）を得る、調製する、または産生する方法に関する。上記ステップは、リンパ球を含む任意の生物学的試料で行なうことができる。
【００１８】
本発明のより特定の目的は、
（ａ）Ｔリンパ球を含む哺乳動物細胞の個体群を得ること、
（ｂ）ＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球を回収すること：
を含む、サプレッサーＴリンパ球（および／またはその前駆体）を得る、調製する、または産生する方法に関する。
【００１９】
ＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球は、好ましくは、ＴＨＹ−１に特異的なリガンドにより、選択、分離、単離、回収、または排除される。有利には、上記リガンドは、抗体または抗体断片からなる群より選択する。例えば、上記リガンドは、支持体上に固定されていても、溶液中に置かれていてもよい。このようなリガンドは、以下の本発明の記述においてより完全に定義されている。さらに、ステップ（ｂ）の前および／または後に、Ｔリンパ球の増幅ステップおよび／またはリンパ球亜個体群（例えばＣＤ４＋またはＣＤ８＋リンパ球）または所与の抗原に特異的なリンパ球の精製ステップを行なうことができる。
【００２０】
本発明の別の目的は、細胞個体群を、ＴＨＹ−１に特異的なリガンドに晒し、上記リガンドと上記細胞の間の複合体の形成を判断および／または定量することを含む、上記細胞個体群におけるサプレッサーＴリンパ球（および／またはその前駆体）の同定および／または定量の方法に関するものであって、上記複合体の形成は、上記細胞個体群におけるサプレッサーＴリンパ球（および／またはその前駆体）の存在および／または量を示す。上記リガンドに結合している細胞を、上記リガンドに結合していない細胞から分離することができる。
【００２１】
本発明の別の目的は、細胞個体群における生体外（ex vivo）でのサプレッサーＴリンパ球（および／またはその前駆体）の強化または枯渇のための、ＴＨＹ−１抗原に特異的なリガンドの使用に関する。ＴＨＹ−１抗原それ自体を、細胞個体群内のＴｓリンパ球またはｐＴｓの選択のためのマーカーとして使用できる。本発明の別の目的は、ＴＨＹ−１に特異的なリガンドを使用することにより患者におけるＴｓ細胞の活性の存在、数、または状態を判断することを含む、上記患者における診断法に基づいている。上記診断は、インビトロ、生体外、またはインビボで行なうことができ、免疫系の活性に関連する病理症状の検出、または処置効力のモニタリング、または特定の治療プロトコルに含めるか否かの観点から考える患者の選択を可能とする。
【００２２】
本発明の別の目的は、Ｔｓリンパ球またはｐＴｓの選択、同定、選別、または調製（インビトロまたは生体外）のための、ＴＨＹ−１抗原に特異的なリガンドの使用に基づいている。本発明はさらに、本発明の方法により得ることができるＴＨＹ−１抗原を発現しているサプレッサーＴリンパ球（および／またはその前駆体）に関する。
【００２３】
本発明の別の目的は、サプレッサーＴリンパ球（その前駆体を含む）のインビボでの選択、同定、または定量を目的とした診断組成物の調製のための、ＴＨＹ−１抗原に特異的なリガンドの使用に基づいている。
【００２４】
本発明の別の目的は、サプレッサーＴリンパ球のインビボでの改変、刺激、または排除を目的とした治療組成物の調製のための、ＴＨＹ−１抗原に特異的なリガンドの使用に基づいている。これに関して、本発明の特定の目的は、生体外またはインビボでの細胞個体群におけるサプレッサーＴリンパ球（その前駆体を含む）の強化または枯渇のための、ＴＨＹ−１に特異的なリガンドの使用に関する。
【００２５】
本発明の別の目的は、細胞個体群におけるＴｓリンパ球またはｐＴｓのインビボ、インビトロ、または生体外での強化または枯渇のための選択マーカーとしてのＴＨＹ−１抗原の使用に基づいている。
【００２６】
本発明はまた、上記に定義したような方法により得ることができるＴＨＹ−１抗原を発現しているサプレッサーＴリンパ球（その前駆体を含む）、並びに、Ｔ細胞の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６５％がＴＨＹ−１抗原を発現している、Ｔｓ細胞またはｐＴｓの強化された細胞個体群に関する。本発明によれば特に好ましい細胞個体群または組成物は、ＴＨＹ−１を発現しているＴｓ細胞またはｐＴｓを、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５、９０、または９５％含む。
【００２７】
本発明はさらに、抑制活性を示し、マーカーＣＤ８またはＣＤ４およびＴＨＹ−１を発現することを特徴とする単離ヒトＴリンパ球、並びに、ＣＤ８＋／ＴＨＹ−１＋またはＣＤ４＋／ＴＨＹ−１＋サプレッサーＴ細胞を含む細胞個体群、好ましくは、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％のＣＤ８＋／ＴＨＹ−１＋Ｔ細胞を含む個体群に関する。上記細胞はまた、部分的にＣＤ２５抗原を発現していてもよい。
【００２８】
本発明の特定の実施形態において、哺乳動物細胞個体群に存在するＴリンパ球またはＴｓリンパ球またはｐＴｓ（ＴＨＹ−１マーカーを有する）は、対象の生物学的産物を発現するように遺伝子的に改変されていてもよく、これにより特に、上記産物の効力および／または安全性を向上することが可能となる。
【００２９】
本発明はまた、典型的には医薬的に許容されうるビヒクルまたは賦形剤を伴っている、上記に定義した細胞または細胞個体群を含む医薬組成物に関する。
【００３０】
本発明の別の特定の目的は、生体外で増幅されたヒトサプレッサーＴ細胞（および／またはその前駆体）および医薬的に許容されうるアジュバントもしくは培地を含む医薬組成物に関し、上記増幅細胞は、ＴＨＹ−１抗原を発現している細胞、場合により、特定の抗原、例えばアレルゲン、自己抗原、同種抗原、または感染性物質の抗原に特異的な細胞が強化されている。好ましい様式において、上記抗原は、免疫疾患、特に自己免疫疾患、炎症疾患、移植片対宿主疾患、アレルギー、または移植片拒絶からなる群より選択される病理症状に関与またはそれに特異的である。
【００３１】
本発明はさらに、少なくとも１種類のこのようなサプレッサーＴリンパ球、上記に定義したＴｓ細胞および／またはｐＴｓの強化された個体群、あるいは逆にＴｓ細胞および／またはｐＴｓを枯渇させた個体群、並びに医薬的に許容されうるアジュバントもしくは培地からなる組成物の調製、並びに、治療法の遂行を目的とした組成物それ自体に関する。
【００３２】
したがって、本発明の特定の目的は、
（ａ）Ｔリンパ球を含む生物学的試料を得ること、
（ｂ）上記生物学的試料中のＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球を選択すること、そして
（ｃ）医薬的に許容されうるアジュバントまたは培地中でＴＨＹ−１抗原を発現している上記Ｔリンパ球をコンディショニング（conditioning）すること：
を含む、医薬組成物の製造法に関する。
【００３３】
本発明の別の特定の目的はまた、
（ａ）Ｔリンパ球を含む生物学的試料を得ること、
（ｂ）上記生物学的試料からＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球を枯渇させること、そして
（ｃ）医薬的に許容されうるアジュバントまたは培地中でＴＨＹ−１抗原を発現していない上記Ｔリンパ球をコンディショニングすること：
を含む、医薬組成物の製造法にも関する。
【００３４】
本発明はまた、場合により支持体上に堆積または溶液中に置かれたＴＨＹ−１に特異的なリガンド、および、場合により上記リガンドの検出のための試薬を含む、Ｔｓ細胞の単離または特徴付けのためのキットにも関する。上記リガンドは、典型的には、容器に、例えばプレート、シリンジ、チューブ、ピペット、バイアルなどに入っている。上記キットはまた、試験する個体から採取した生物学的試料中でまたは直接的にインビボで、上記Ｔｓ細胞およびｐＴｓの存在を診断するのに使用できる。
【００３５】
本発明はさらに、場合により溶液中に置かれているかまたは支持体上にあり、毒性産物（放射能、毒素など）と結合させた、ＴＨＹ−１に特異的なリガンドを含む、インビボ、インビトロ、または生体外でのＴｓ細胞およびｐＴｓの排除を目的としたキットまたは組成物に関する。本発明はまた、遺伝子を発現させるために、ウイルスまたは非ウイルスベクターをＴｓおよびｐＴｓに特異的に標的化させるためのＴｈｙ−１リガンドの使用にも関する。
【００３６】
本発明はさらに、場合により溶液中に置かれているかまたは支持体上にあり、Ｔリンパ球を活性化できる産物（例えばサイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５）と結合させた、ＴＨＹ−１に特異的なリガンドを含む、インビボ、生体外、またはインビトロでＴｓ細胞およびｐＴｓを活性化させるためのキットまたは組成物に関する。本発明はまた、活性化遺伝子または任意の治療遺伝子を発現させるために、ウイルスまたは非ウイルスベクターをＴｓに特異的に標的化させるためのＴＨＹ−１のリガンドの使用に関する。
【００３７】
Ｔｓ細胞、単離もしくは増幅Ｔｓ細胞およびｐＴｓを含む組成物、並びに本発明の脈絡で得られたＴｓ細胞およびｐＴｓの強化された組成物は、有利には、実験または治療目的に使用することができる。本発明の脈絡で使用される細胞は、哺乳動物細胞、典型的にはヒトである。本発明はまた、特に霊長類に使用でき、それ故、霊長類、特にサルのサプレッサーＴ細胞にも関する。
【００３８】
したがって、本発明の特定の目的は、サプレッサーＴリンパ球（またはその前駆体）において特異的に発現される遺伝子配列を解析し得るための方法に関し、１つの方法は、ＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球個体群からＲＮＡを単離し、上記ＲＮＡを、非サプレッサーＴリンパ球個体群から抽出したＲＮＡと比較し、サプレッサーＴリンパ球に特異的なＲＮＡを回収することを含む。本発明はまた、サプレッサーＴリンパ球（またはその前駆体）に特異的なＲＮＡからプローブを作製し、上記プローブとハイブリダイズさせることを目的とした核酸個体群をスクリーニングすることを含む、上記したような方法に関する。１つの方法はまた、発現プロファイルを確立するための、バイオチップでのＲＮＡハイブリダイゼーションによるトランスクリプトーム解析に相当する。これらの様々な方法により、ＴｓおよびｐＴｓの分化、成熟、調節、および機能に対して重要な遺伝子発現の特徴付けがなされ、これにより、可能性ある新規なマーカーおよび／または治療標的を定義することが可能となる。
【００３９】
それ故、本発明の特定の目的は、サプレッサーＴリンパ球（またはその前駆体）に特異的に発現されているタンパク質を得る方法に関する。１つの方法は、ＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球個体群からタンパク質を単離し、上記タンパク質を、非サプレッサーＴリンパ球個体群から抽出したものと比較することを含む。これらの様々な方法により、ＴｓおよびｐＴｓの分化、成熟、調節、および機能に対して重要なタンパク質発現の特徴付けがなされ、これにより、可能性ある新規なマーカーおよび／または治療標的を定義することが可能となる。
【００４０】
それ故、本発明の特定の目的は、ＴＨＹ−１抗原を発現しているＴｓリンパ球（またはｐＴｓ）または上記の同細胞からの細胞もしくはタンパク質画分での免疫化により、サプレッサーＴリンパ球（またはその前駆体）において特異的に発現されている新規分子を同定する方法に関する。
【００４１】
本発明の別の特定の目的はまた、例えば多くの被験者の処置、例えば免疫疾患、特に異常なＴ細胞応答により誘発される疾患に罹患しているかまたは発症するリスクを呈するヒト患者の処置のための、治療的状況における、Ｔｓ細胞（またはｐＴｓ）の、単離もしくは増幅Ｔｓ細胞（またはｐＴｓ）からなる組成物の、および、本発明の脈絡で得られたＴｓ細胞（またはｐＴｓ）の強化された組成物の、使用に関する。したがって、Ｔｓ細胞（またはｐＴｓ）は、Ｔリンパ球に影響を及ぼす疾患、特に腫瘍、自己免疫疾患、アレルギー、移植片対宿主疾患、炎症疾患、１型糖尿病、ウイルス性もしくは細菌性感染などにより誘発される様々な病態または疾患を処置するのに適している。それらはまた、哺乳動物における幹細胞、組織または臓器の生着または移植の場合における免疫再構成および耐容性の誘導を促進する。これは、例えば、骨髄または造血幹細胞移植の後に該当する。処置は、予防でも治癒でもよい。他の処置と組み合わせてもよい。
【００４２】
ヒトサプレッサーＴ細胞（またはその前駆体）
本発明の脈絡において、サプレッサーＴリンパ球（または細胞）なる語句は、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される免疫反応を抑制または消失させる能力により特徴付けられる、Ｔ細胞個体群を示す。上記語句は、ＣＤ２５マーカーを強力に発現している従来のＴｓ細胞、および、抑制活性を示し、培養液中で、従来のＴｓ細胞を生じることのできるその前駆体（ｐＴｓと呼ばれる）を含む。事実、本発明は、ＴＨＹ−１およびＣＤ２５マーカーを発現し、抑制特性を示し、培養液中で従来のＴｓ細胞を生じることのできる、ｐＴｓと称される、サプレッサーＴ細胞個体群の存在を実証する。サプレッサーＴリンパ球なる語句はまた、ＴＨＹ−１を発現している、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋型の全ての（またはＣＤ２５−）リンパ球個体群から生じるＴｓリンパ球を含む。
【００４３】
序論で述べたように、ＣＤ４およびＣＤ２５マーカーは、免疫表現型見地からサプレッサーＴリンパ球（またはその前駆体）を特徴付けるが、事実、抑制機能の全てがＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞によりもたらされるわけではなく、全てのＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞が抑制細胞ではないようである。事実、ＣＤ２５は、活性化エフェクターＴ細胞によっても発現されるマーカーである。本発明は、抗原性分子ＴＨＹ−１が、ヒトＴｓ細胞およびｐＴｓに特徴的なマーカーを表し、上記細胞個体群の同定に効率的に使用できるという実証から導かれる。
【００４４】
上記に示したように、したがって、本発明は、
（ａ）Ｔリンパ球を含むヒト細胞個体群を得ること、そして
（ｂ）ＴＨＹ−１を発現しているＴリンパ球を回収すること：
を含む、ヒトサプレッサーＴリンパ球（その前駆体を含む）を得る、調製する、選択する、または産生する方法に関する。
【００４５】
ステップ（ａ）において、細胞個体群は、リンパ球を含む生物学的試料から、特に、骨髄、脾臓、肝臓、胸腺、前もってＴリンパ球の強化されたまたは強化されていない血液、臍帯血、胎児、新生児、もしくは成人の末梢血、血漿、リンパ節、腫瘍、炎症部位、移植臓器、または上記組織の１つもしくはその他で確立された細胞培養液からなる群より選択された組織の試料から得ることができる。リンパ球は、典型的には、末梢血から単離または収集される。
【００４６】
ＴＨＹ−１を発現しているＴリンパ球は、ＴＨＹ−１に特異的な任意のリガンド、すなわち、典型的には細胞表面上でＴｈｙ−１に選択的に結合できる任意の分子の助けにより、特にステップ（ｂ）の間に、回収、選択、単離、枯渇、または選別できる。上記リガンドは、好ましくは、抗体、好ましくは抗ＴＨＹ−１抗体、その類似体または断片からなる群より選択される。
【００４７】
ＴＨＹ−１は、そのＣ末端を通して膜に付着しているグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）により細胞膜と相互作用している細胞質内ドメインの欠失している分子である。Ｔｈｙ−１の配列、例えば、ヒトタンパク質のヌクレオチド配列（Ｎｏ．ＮＭ００６２８８（ｇｉ：１９９  ２３３  ６１）およびアミノ酸配列（Ｎｏ．ＮＰ００６２７９（gi：１９９  ２３３  ６２））が決定されており、文献において見出すことができる。本発明に記載の特異的リガンドは、好ましくは、ヒトＴｈｙ−１タンパク質の全てまたは一部の配列を含むポリペプチドに選択的に結合する能力を有する分子、好ましくは、ヒトＴｈｙ−１タンパク質のエピトープを含む分子である。上記リガンドは、自然には、既知および／またはＴＨＹ−１の細胞外部分と相互作用できる分子からなる群より選択される。
【００４８】
本発明で使用できるＴＨＹ−１の好ましいリガンドは、抗ＴＨＹ−１抗体（すなわち、ＴＨＹ−１に特異的な抗体）である。上記抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。上記抗体はまた、実質的に同じ抗原特異性を示す抗体断片もしくは誘導体の断片群もしくは誘導体群、特に抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲｓ）、ヒト化抗体、ヒト抗体、多機能、単量体抗体（ＳｃＦｖ）、または多量体抗体（例えばＣ４ｂｐカップリング）などであってもよい。上記抗体、およびそれ故、特異的リガンドの作製に使用できるＴＨＹ−１分子の認識部位は、非ヒト動物を、ＴＨＹ−１ポリペプチドまたはエピトープを含む上記ポリペプチドの断片で免疫化し、血清（ポリクローナル）または脾臓細胞を回収（適切な細胞系との融合によりハイブリドーマを作製するために）することを含む、従来の方法により製造できる。異なる種からポリクローナル抗体を作製する様々な方法が、従来技術に記載されている。典型的には、上記抗原は、アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と組み合わせ、動物に、例えば皮下注射により投与する。反復注射してもよい。血液試料を収集し、免疫グロブリンおよび血清を分離する。
【００４９】
古典的なモノクローナル抗体作製法は、非ヒト動物を抗原で免疫化し、その後に不死化細胞、例えばミエローマ細胞と融合させる脾臓細胞を回収することを含む。得られたハイブリドーマはモノクローナル抗体を産生し、限界希釈により選択し、個々のクローンを単離できる。ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片は、従来の技術にしたがって、プロテアーゼでの消化により作製できる。
【００５０】
好ましい抗体は、ＴＨＹ−１タンパク質に特異的な、すなわち、他の抗原よりも上記タンパク質に対してより高い親和性を有する抗体であるが、非特異的およびより低い親和性結合も排除できない。特に、「特異的」または「選択的」なる語句は、上記リガンドのＴＨＹ−１タンパク質への結合を、上記リガンドの他の分子への偶発的な結合と区別できることを示す。
【００５１】
したがって、Ｔｓ細胞およびｐＴｓは、ステップ（ｂ）の状況において、細胞個体群を、上記に定義した特異的リガンドと接触させることにより単離することができる。本発明に記載の特異的リガンドの具体例は、特に、ハイブリドーマＫ１７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ−８５５３）、クローン５Ｅ１０、Ｆ１５−４２−１、Ｔｈｙ−１／３１０、ＦＩＢＩ（クローンＡＳ０２）により産生されるモノクローナル抗体、並びに、上記抗体の任意の断片または誘導体である。
【００５２】
本発明に記載の他の特異的リガンドは、例えば、ＴＨＹ−１に特定の親和性を示す、人工的リガンドである。上記リガンドは、核酸（例えばアプタマー）または合成化学的分子などの異なる性質であってもよい。このような分子は、例えば、上記に定義した特異的抗体によるＴＨＹ−１分子の認識部位の配列に基づいて作製できる。
【００５３】
したがって、Ｔｓ細胞およびｐＴｓは、ステップ（ｂ）の状況において、細胞個体群を、上記に定義したリガンドなどの１種類以上の特異的リガンドと接触させることにより単離することができる。
【００５４】
本発明の範囲において、ＴＨＹ−１に特異的な１種類以上のリガンドを、おそらく、特にＣＤ２５などの他のＴ細胞マーカーに特異的な他のリガンドと組み合わせて使用することが可能である。したがって、特定の実施形態において、本発明は、ＴＨＹ−１特異的リガンドとＣＤ２５特異的リガンドの組合せを使用する。第二のリガンドは、任意の他のＴ細胞マーカー、特にサプレッサーＴ細胞、例えば本明細書で記載したゲノムおよびプロテオミクス方法により同定されるマーカーであってもよい。
【００５５】
上記リガンドは、支持体上に、例えばカラムまたはビーズ（特に磁気ビーズ）に固定されていても、または溶液中に入っていてもよい。さらに、または変法として、上記リガンドは、場合により標識されていてもよい。標識は、蛍光、放射能、発光、リン光、化学的もしくは酵素的標識により行なうことができる。検出標識は、好ましくは、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ビオチン、およびストレプトアビジン、シアニンからなる群より選択される。
【００５６】
その後、上記リガンドと標識細胞により形成される複合体を使用して、当業者に既知の様々な方法にしたがって、細胞を、視覚化、検出、定量、選別、単離、および／または枯渇できる。したがって、細胞を、例えば、フローサイトメトリー、アフィニティクロマトグラフィー、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）、ＭＡＣＳ（磁気ビーズ細胞選別）、Ｄ／ＭＡＣＳ（二重磁気ビーズ細胞選別）、アフィニティクロマトグラフィー（二重磁気ビーズ細胞選別）、固相表面上での選択法（パンニング）、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験などから選択される方法により回収、選択、選別、分離、単離、枯渇させることができる。
【００５７】
ＭＡＣＳ手法は、Miltenyiら、「ＭＡＣＳによる高勾配磁気細胞分離」、Cytometry 11:231-238(1990)に詳述されている。細胞を回収するために、磁気ビーズで標識された細胞を、常磁性分離カラムに通す。分離カラムを磁石の隣に置き、これによりカラム内に磁場を作る。磁気標識細胞をカラムに補足し、他の細胞をそれに通す。その後、カラムに補足された細胞を溶出する。
【００５８】
Ｄ／ＭＡＣＳ手法において、細胞試料を、抗体を含む磁気ビーズで標識し、細胞を磁場をかけることにより収集または選別する。
【００５９】
好ましい実施形態によれば、細胞（例えば末梢血に由来する）を、連続的に、飽和量の機能的抗ＴＨＹ−１抗体（例えばビオチン標識）および官能基化されている（例えばストレプトアビジンでコーティングされている）固相支持体（例えばマイクロビーズ）と共にインキュベートする。その後、細胞を、支持体を回収することにより、例えば細胞の磁気による分離により精製する。細胞の精製を増強するために、続いて、陽性画分からの細胞を、別のカラムで分離することができる。精製は、一般に、リン酸緩衝液中で行なうが、他の適切な媒体も使用してよい。
【００６０】
細胞を、食塩水溶液、緩衝液、培養培地、特にＤＭＥＭ、ＲＰＭＩなどの任意の適切な緩衝液または培地中で培養または維持できる。細胞は、凍結しても、冷やして保持してもよい。それらは、任意の適切な装置または器具、例えばチューブ、フラスコ、アンプル、プレート、シリンジ、バッグなど、好ましくは医薬使用に適した無菌条件で製剤化できる。
【００６１】
前に記述したように、本明細書で上記した方法のステップ（ｂ）は、有利には、その前および／またはその後に、Ｔリンパ球亜個体群（例えばＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋）の精製ステップおよび／またはリンパ球増幅ステップ（生体外またはインビトロで行なうことができる）を行なってもよい。
【００６２】
増幅は、リンパ球の活性化により行なうことができる。上記活性化は、非特異的（例えば、インターロイキン、例えばＩＬ−２を用いてまたはその存在下で、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体により得られる）であっても、または特異的（例えば抗原提示細胞（樹状細胞、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、抗原を提示できリンパ球を活性化できる遺伝子的に改変された細胞）、エキソソーム、デキソソーム、人工構造などにより、Ｔｓリンパ球またはｐＴｓに適切に提示される抗原または同種抗原により得られる）であってもよい。増幅ステップは、Ｔｓリンパ球およびｐＴｓを選択する前に、最初のＴリンパ球個体群（エフェクターＴリンパ球およびサプレッサーＴリンパ球を含む）に存在するＴリンパ球の数を増加させ、および／または、ＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球を選択した後でＴｓリンパ球およびｐＴｓの数を増加させることを可能とする。また、２つの増幅ステップを行なうことが可能であり、１つは、哺乳動物細胞個体群に存在する一般的なＴリンパ球個体群に関し、他方は、Ｔｓリンパ球およびｐＴｓの個体群に関する。
【００６３】
好ましい実施形態において、精製ステップは、Ｔｓ（またはｐＴｓ）に好ましい条件で行ない、これによりその強化が可能となる。例えば、本発明は、Ｎ−アセチルシステインの非存在下での培養は、Ｔｓの増殖を促進することを示す（図１）。本発明の特定の実施形態において、細胞を、Ｎ−アセチルシステインを含まない培地中で培養することにより増幅する。さらに、天然または改変（特に遺伝子的に）抗原提示細胞の特定の個体群の使用は、Ｔｓ（またはｐＴｓ）の増殖を促進することができる。例えば、例は、ＣＤ３４＋造血前駆体から誘導され間質ＤＣ型の表現型を有する樹状細胞は、Ｔｓ（またはｐＴｓ）の増殖を促進することを示す（図２）。特定の実施形態において、細胞は、樹状細胞、特に間質樹状細胞の存在下で培養することにより増幅される。
【００６４】
ステップ（ａ）の終わりに得られた個体群はまた、一般的なＴ細胞個体群（すなわち、エフェクターＴリンパ球およびサプレッサーＴリンパ球またはそれらの前駆体を含む）に属するＴ細胞を強化することができる。
【００６５】
したがって、ステップ（ａ）の個体群は、Ｔ細胞、おそらく１つ以上のリンパ球特異的亜個体群（例えばＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋）を強化することができる。また、場合によっては、特定のリンパ球亜個体群も枯渇させることができる。したがって、ステップ（ａ）の終わりに得られた個体群は、場合により増幅および／または選別されているが、これは、好ましくは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６５％のＴ細胞を含む。ステップ（ｂ）に使用できるＴ細胞の強化されている特に好ましい組成物は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％のＴ細胞を含む。
【００６６】
ＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球個体群もまた増幅することができる。さらに、先に示したように、２つの増幅ステップを行なうことが可能であり、１つは、一般的なＴリンパ球個体群に関し、他方は、Ｔｓリンパ球またはｐＴｓの個体群に関する。
【００６７】
したがって、本発明の特定の目的は、
（ａ）Ｔリンパ球を含む哺乳動物細胞個体群を得ること、
（ａ’）上記細胞個体群内のＴリンパ球を増幅すること、そして
（ｂ）ＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球を回収すること：
を含む、サプレッサーＴリンパ球（および／またはその前駆体）を得る方法に関する。
【００６８】
本発明の別の特定の目的は、
（ａ）Ｔリンパ球を含む哺乳動物細胞個体群を得ること、
（ｂ）ＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球を回収すること、そして
（ｂ’）ＴＨＹ−１抗原を発現している上記Ｔリンパ球を増幅すること：
を含む、サプレッサーＴリンパ球（および／またはその前駆体）を得る方法に関する。
【００６９】
一般的なＴリンパ球個体群（エフェクターＴ細胞、Ｔｓ細胞、およびｐＴｓ）に属するリンパ球の増幅は、好ましくは、細胞を、サイトカインおよびおそらく刺激剤の存在下で培養することにより行なう。ＴＨＹ−１抗原を発現しているリンパ球（Ｔｓリンパ球およびｐＴｓ）の場合、培養は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔリンパ球の個体群内の上記細胞個体群の増幅を達成するに十分な時間続ける。活性化は、一般に、細胞を、サイトカイン、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、またはインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）（好ましくはヒト起源）の存在下で培養することを必要とする。刺激剤は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、すなわち、Ｔ細胞、特にＴｓ細胞の活性化を促進する任意の抗原提示細胞または任意の細胞であってもよい。ＡＰＣは、好ましくは、その増幅を回避するために、使用前に照射する。ＡＰＣは、ドナーから単離された細胞であっても、または患者自身から単離された細胞であってもよい。所望の活性プロファイルを示すＴｓ細胞およびｐＴｓを産生するように選択できる。このようなＡＰＣの典型例は、末梢血単核細胞、樹状細胞、脾臓細胞、臍帯血細胞、組織もしくは臓器の試料などを含む。他の適切なＴｓまたはｐＴｓ刺激剤は、ＭＨＣポリマー、レクチン（例えばＰＨＡ）、抗体（例えば抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体）またはその断片、自己抗原（好ましくはＡＰＣと組み合わせた、組織、細胞、細胞断片もしくは破片、精製ペプチドもしくはポリペプチドなどを含む）などを含む。
【００７０】
想定される使用に応じて、Ｔｓ細胞およびｐＴｓは、抗原特異的であるか否かで、異なる方法で増幅できる。特に、いくつかの使用では、大量の完全なＴ細胞レパートリーを好ましくは使用（例えば注射）する。特に、この方法は、Ｔｓ細胞およびｐＴｓが全体的に欠陥している（量的にまたは機能的に）患者に適合している。このような適応においては、Ｔｓ細胞およびｐＴｓは、好ましくは、例えば、自己ＡＰＣ細胞およびＰＨＡまたは抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２５抗体（または任意の他のＴまたはＴｓ細胞活性化剤）の助けにより、同じまたは異なる性質のサイトカインの存在下で増幅する。
【００７１】
一般には、Ｔｓ細胞およびｐＴｓの特異性を考慮することが重要である。事実、特異的免疫応答を制御するために非特異的Ｔｓ細胞を使用することは可能であるが、特異的Ｔｓ細胞の使用がより効率的であるようである。したがって、ヒトおよびマウスにおいて、Ｔｓリンパ球およびｐＴｓは、インビトロで、インターロイキン−２、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を含む培養培地の存在下で、成長および増殖させることができる。特異的Ｔｓリンパ球およびＴｓはまた、例えば、同種抗原提示細胞の存在下で刺激し、その後、インターロイキン−２と共に培養することにより単離、生成できる。別の実施形態によれば、特に自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、ＧＶＨＤなどの状況において、特異的エフェクターＴ細胞の排除が望まれる場合に、より特異的な増幅を想定できる。このような適応において、上記細胞は、好ましくは、特定の抗原（例えば同種または感染物質を起源）を提示するＡＰＣの存在下で増幅させ、病原性エフェクターＴ細胞に対して好ましくは活性化されるＴｓ細胞の増幅を促進する。上記抗原は、ペプチドの形で、またはＲＮＡもしくはＤＮＡの転移後に提示される。
【００７２】
自己免疫疾患の処置のために、Ｔｓ細胞およびｐＴｓは好ましくは患者から得、標的組織の自己ＡＰＣおよび自己抗原により、サイトカインの存在下で刺激する。自己抗原は、組織、細胞、細胞断片、精製タンパク質、ペプチド、核酸などであってもよい。
【００７３】
同種移植片または異種移植片の処置のために、Ｔｓ細胞は好ましくは患者から得、ドナーのＡＰＣまたは組織により、サイトカインの存在下で刺激する。患者由来のＴｓ細胞はまた、自己ＡＰＣにより、ドナー由来の組織、細胞、細胞断片、精製タンパク質、またはペプチド、およびサイトカインの存在下で刺激する。
【００７４】
アレルギーの処置のために、Ｔｓ細胞は、典型的には患者から得、ＡＰＣおよびアレルゲンにより、サイトカインの存在下で活性化する。
【００７５】
先に示したように、好ましくは使用されるサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、および／またはＩＬ−１５である。
【００７６】
先に示したように、様々な病態、例えば移植臓器の拒絶、自己免疫疾患、アレルギー、ウイルス疾患の処置に使用されるＴｓ細胞およびｐＴｓは、好ましくは、自己であり、すなわち、処置する被験者に由来している。同系細胞も使用してよい。他の状況において、例えばＧＶＨＤまたは他の病態の処置の脈絡において、Ｔｓ細胞およびｐＴｓは、典型的には、同種であり、すなわち、それらは異なるヒトに由来する。これらの場合、ドナー被験者（例えばエフェクター細胞を供与した被験者）に由来するＴｓ細胞およびｐＴｓを使用することが好ましい。
【００７７】
Ｔ細胞並びに特にＴｓ細胞およびｐＴｓの遺伝子改変
本発明の特定の実施形態において、哺乳動物細胞個体群に存在するＴリンパ球（一般にはＴリンパ球個体群）またはサプレッサーＴリンパ球（ＴＨＹ−１マーカーを有する）を遺伝子的に改変して、対象の生物学的産物を発現させることができる。
【００７８】
「遺伝子的に改変」なる語句は、細胞が、改変していないＴ細胞には天然には存在しないか、または、その天然の状態ではない場合には（例えば増幅されている場合）上記細胞に存在している、核酸分子を含むことを示す。核酸分子は、上記細胞または親細胞もしくは前駆細胞に導入することができる。
【００７９】
したがって、本発明の特定の目的は、
（ａ）Ｔリンパ球を含む哺乳動物細胞個体群を得ること、
（ｂ）ＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球を回収すること、そして
（ｃ）上記リンパ球を組換え核酸分子と接触させることにより、ＴＨＹ−１抗原を発現している上記Ｔリンパ球を遺伝子的に改変すること：
を含む、サプレッサーＴリンパ球（および／またはその前駆体）を得るまたは製造する方法に関する。
【００８０】
本発明の特定の目的は、
（ａ）Ｔリンパ球を含む哺乳動物細胞個体群を得ること、
（ｂ）上記細胞個体群を組換え核酸分子と接触させることにより、上記Ｔリンパ球を遺伝子的に改変すること、そして
（ｃ）ＴＨＹ−１抗原を発現しているＴリンパ球を回収すること：
を含む、サプレッサーＴリンパ球（またはその前駆体）を得るまたは製造する方法に関する。
【００８１】
いくつかのアプローチを使用して、例えば、ウイルス、裸ＤＮＡ、物理的処理などにより遺伝子を送達することにより、哺乳動物細胞個体群［一般的なＴリンパ球個体群（エフェクターＴ細胞およびＴｓ細胞）に等価］に属するＴ細胞またはＴｓリンパ球およびｐＴｓを遺伝子的に改変することができる。
【００８２】
このために、核酸を、一般に、組換えウイルス、プラスミド、ファージ、エピソーム、人工染色体などのベクターに取り込む。
【００８３】
本発明の特定の実施形態によれば、前の段落で定義したＴ細胞を、ウイルスベクター（または組換えウイルス）により遺伝子的に改変する。異種核酸を、例えば、組換えウイルスに導入し、これをその後にＴリンパ球の感染に使用する。様々な種類の組換えウイルス、特に組換えレトロウイルスまたはＡＡＶを使用することができる。好ましくは、Ｔリンパ球は、組換えレトロウイルスにより改変する。レトロウイルスの使用は、レトロウイルス感染により細胞ゲノムへの核酸の安定な組込みが可能である限り、特に評価される。この特性は、インビトロであろうとインビボであろうと被験者における注射後のリンパ球の増幅に、導入遺伝子が細胞分裂中に安定に維持されることが必要とされる限り、特に重要である。使用できるレトロウイルスの例は、オンコウイルス、レンチウイルス、およびスプマウイルスファミリーのものである。オンコウイルスファミリーの具体例は、ＭｏＭＬＶ、ＡＬＶ、ＢＬＶ、またはＭＭＴＶであるが、ＲＳＶなどもある。レンチウイルスファミリーの例は、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ、またはＣＡＥＶなどを含む。
【００８４】
組換えレトロウイルスを作製する方法は、文献に十分に記載されている（第ＷＯ８９／０７１５０号、第ＷＯ９０／０２８０６号、および第ＷＯ９４／１９４７８号、これらの教義の全体を本出願に取り込む）。上記方法は、一般に、導入遺伝子を含むレトロウイルスベクターを適切なパッケージング細胞系に導入し、その後、産生されるウイルスを回収することを含み、上記ウイルスは、そのゲノムに導入遺伝子を含む。
【００８５】
本発明の特定の実施形態において、組換えレトロウイルスは、ＧＡＬＶウイルスエンベロープ（ＧＡＬＶ−偽型レトロウイルス）を含む。造血細胞を組換えレトロウイルスで感染させることは、レトロウイルスエンベロープがＧＡＬＶレトロウイルス（テナガザル白血病ウイルス）に由来する場合にはより効率的である。上記レトロウイルスエンベロープを使用することにより、９５％を超えるリンパ球形質導入効率を、形質導入細胞の選択前に達成することができる。
【００８６】
Ｔリンパ球は、組換えレトロウイルスの助けにより、様々なプロトコルを用いて、例えばウイルス上清と共にインキュベート、精製ウイルスと共にインキュベート、Ｔリンパ球をウイルスパッケージング細胞と共に培養、トランスウェル技術などにより感染させることができる。遠心分離ステップを含む特に効率的な方法は、Movassaghら（Movassagh M、Desmyter C、Baillou C、Chapel-Fernandes S、Guigon M、Klatzmann D、Lemoine FM、Hum Gene Ther.1998:9:225-234）により記載されている。
【００８７】
非ウイルス的な方法は、カチオン性脂質、ポリマー、ペプチド、合成物質などの使用を含む。代替的な方法は、「遺伝子銃」技術、電場、衝撃、沈降などを利用する。本発明を実施する場合、全てのＴｓ細胞およびｐＴｓが遺伝子的に改変されている必要はない。したがって、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％の遺伝子的に改変されたリンパ球を含む、Ｔリンパ球個体群を使用することが可能である。インビトロまたは生体外で、例えば、ＧＡＬＶエンベロープおよび／または特定の感染条件（Movassaghら）を使用することにより、および／または効率的に遺伝子的に改変されている細胞を選択することにより、より高いレベル（例えば１００％まで）を得ることができる。改変細胞表面上に存在する特異的マーカーを認識する抗体の使用、耐性遺伝子（例えばネオマイシン耐性遺伝子およびＧ４１８分子）の使用、または導入遺伝子（例えばチミジンキナーゼ）を発現していない細胞に対して毒性のある化合物の使用を含む、様々な選択法を使用することができる。選択は、好ましくは、膜タンパク質を発現しているマーカー遺伝子の助けにより行なう。上記タンパク質の存在により、磁気ビーズを用いた分離、カラムまたはフローサイトメトリーの使用などの従来の分離法による選択が可能となる。
【００８８】
Ｔ細胞を遺伝子的に改変するために使用される核酸は、治療導入遺伝子であってもよく、ポリペプチド（例えばタンパク質、ペプチドなど）、ＲＮＡなどを含む様々な活性生物学的産物をコードしていてもよい。好ましい実施形態において、上記核酸は、免疫抑制活性を示すポリペプチドをコードしている。別の実施形態において、上記核酸は、毒性であるか、または、細胞に対して条件的な毒性を有するポリペプチドをコードしている。好ましい例は、チミジンキナーゼ（ヌクレオシド類似体の存在下で毒性を付与する）、例えばＨＳＶ−１  ＴＫ、シトシンデアミナーゼ、ｇｐｒｔなどを含む。それは無毒性のポリペプチドであってもよいが、必要であれば注射された細胞の排除を可能とするものである（例えば、細胞膜に発現される分子および補体に固定されたモノクローナル抗体）。
【００８９】
核酸の別の好ましい範疇は、標的化を可能とするものを含む。それらは、ＴもしくはＢ細胞受容体またはそのサブユニットもしくは機能的等価体をコードする核酸であってもよい。例えば、Ｔｓ細胞における自己抗原に特異的な組換えＴＣＲの発現は、被験者における組織を破壊するエフェクターＴ細胞に対してより特異的に作用できるＴｓ細胞およびｐＴｓを産生する。他の種類の生物学的に活性な分子は、成長因子、リンホカイン（Ｔｓ細胞を活性化する様々なサイトカインを含む）、免疫抑制サイトカイン（ＩＬ−１０またはＴＧＦ−βのように）、補助分子、抗原提示分子、抗原受容体などを含む。核酸は、「Ｔ体」、すなわちＴ細胞受容体と免疫グロブリンの間のハイブリッド受容体をコードしていてもよい。このような「Ｔ体」は、例えば抗原複合体の標的化を可能とする。
【００９０】
好ましい様式において、サプレッサーＴリンパ球（またはその前駆体）は遺伝子的に改変され、チミジンキナーゼなどの上記細胞に対して条件的な毒性を示す産物をコードしている組換え核酸を含む。本発明の別の好ましい実施形態によれば、遺伝子的に改変されたＴｓ細胞およびｐＴｓは、Ｔ細胞受容体またはそのサブユニットまたはその機能的等価体をコードしている組換え核酸分子を含む。
【００９１】
特に同種骨髄移植などのいくつかの適応において、Ｔｓ（およびｐＴｓ）およびエフェクターＴリンパ球の別々の調製を行なうことができ、各々は、条件的毒性を示す産物をコードする異なる遺伝子を発現しており、これにより、細胞個体群の一方または他方を排除できる。
【００９２】
本発明によりＴ細胞に導入される核酸は、典型的には、コード領域の他に、調節配列、例えばプロモーターおよびポリアデニル化配列を含む。
【００９３】
組成物
本発明の特定の目的は、例えば生体外で単離、遺伝子的に改変および／または増幅される本発明に記載の少なくとも１種類のサプレッサーＴリンパ球、または先に定義したサプレッサーＴ細胞の強化された個体群、または逆にサプレッサーＴ細胞の枯渇した個体群、並びに医薬的に許容されうるアジュバントもしくは培地を含む組成物である。
【００９４】
本発明の別の特定の目的は、第一の自殺遺伝子を形質導入したサプレッサーＴリンパ球（その前駆体を含む）および第一のものとは異なる第二の自殺遺伝子を形質導入したエフェクターＴ細胞を含む組成物である。
【００９５】
上記組成物は、上記組成物の治療利点に有意に影響を及ぼすことなく、他の細胞型も含むことができる。
【００９６】
好ましい実施形態によれば、上記細胞は、処置する病態により約１０５〜１０１０個のサプレッサーＴ細胞、より一般的には１０５〜約１０９個のサプレッサーＴ細胞を含む組成物中で整える（パッケージング）。
【００９７】
特定の本発明の組成物は、エフェクターＴ細胞に関して抑制特性を示す、ＴＨＹ−１陽性ヒトリンパ球個体群を含む。
【００９８】
培地またはアジュバントは、場合により保存剤を補充した、任意の培養培地、規定培地、水性、緩衝化懸濁液または溶液であってもよい。本発明の組成物は、任意の適切な経路、例えば静脈内、動脈内、皮下、経皮などにより投与できる。上記組成物の反復投与をしてもよい。
【００９９】
本発明に記載の他の特定の組成物は、毒性（条件的またはそうではない、例えばＴＫ、リシン毒素など）またはＴリンパ球（例えばサイトカイン、特にＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５など）に対する刺激活性を示す分子などの、エフェクター分子と結合またはコンジュゲートさせたＴｈｙ−１特異的リガンドを含む。上記組成物は、インビボ（または生体外）において使用でき、被験者におけるサプレッサーＴ細胞のレパートリーまたは活性を変調できる。例えば、毒性分子を含むコンジュゲートの投与により、被験者におけるサプレッサーＴ細胞活性の失活または低下が可能となり、それ故、エフェクター細胞の活性の上昇が可能となる。逆に、活性化分子を含むコンジュゲートの投与により、被験者におけるサプレッサーＴ細胞の活性を刺激することができ、したがって、エフェクター細胞の活性を低下させることができる。結合は共有結合であってもなくてもよい。
【０１００】
他の特定の本発明の組成物は、Ｔｈｙ−１特異的リガンドと結合させたトランスフェクション物質を含む。上記結合により、トランスフェクション物質とＴｓ細胞の間の相互作用を標的化または促進させることが可能となる。トランスフェクション物質は、ウイルス性粒子（例えば組換え、欠損、減弱化、合成など）または非ウイルス性トランスフェクション物質、例えばリポソーム、カチオン性脂質、ポリマーなどであってもよい。結合は共有結合であってもなくてもよい。上記組成物は、被験者におけるサプレッサーＴ細胞の標的化改変を可能とし、これにより例えば新規な特性を付与することができる。
【０１０１】
使用
本発明は、先に示したＴ細胞活性に関連した様々な病態の処置に使用できる細胞個体群を提供する。処置は、予防であっても治癒であってもよい。さらに、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）の強化された細胞個体群、および本発明の組成物は、他の活性化合物または物質、例えば他の細胞個体群、免疫抑制条件または免疫抑制分子、照射、遺伝子療法産物などと組み合わせて使用できる。
【０１０２】
処置なる語句は、疾患の症候または原因の低減、疾患の減退、疾患の遅延、患者の状態の向上、患者の苦しみの寛解、患者の生存期間の延長などを意味する。
【０１０３】
サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）の強化された細胞個体群、および本発明に記載の組成物は、同種臓器移植、特に骨髄（または造血幹細胞または非造血幹細胞）移植を受けた被験者における移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の遅延または予防に特に適している。造血幹細胞移植に関連したＧＶＨＤおよび頻繁な合併症は、移植片における成熟ドナーＴ細胞の存在に起因する。しかし、移植前に上記細胞を除去すれば、移植の失敗、免疫抑制の長期化、および白血病の再発が起こる。移植時における本発明に記載のＴｓ細胞の投与により、ＧＶＨＤは遅延またはさらには予防される。逆に、残留白血病細胞に対する注射された細胞の反応性を高めるために、移植片からサプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）を枯渇させることが有利である場合がある。ＴＨＹ−１細胞の上記枯渇は、例えばＣＤ２５に特異的な抗体などの他の抗体を用いた枯渇を伴っていても伴っていなくてもよい。
【０１０４】
サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）の強化された細胞個体群、および本発明に記載の組成物はまた、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性筋炎、多発性硬化症、糖尿病、アテローム動脈硬化症などの自己免疫疾患（慢性炎症疾患を含む）の処置に適している。自己免疫疾患は、多くの生物学的および組織学的研究により示されているように免疫学的成分を有する。このような疾患の中心因子は、不適切な免疫応答である。さらに、このような疾患における自己抗原を同定し、有害なＴ細胞が活性化される期間を定義することが可能であることが多い。本発明を使用して、被験者に十分量のサプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）を投与することにより、このような病態を予防、処置、低減、または減弱することができ、これにより、上記の有害なＴ細胞の活性を抑制または低減することができる。必要であれば反復投与してもよい。
【０１０５】
サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）の強化された細胞個体群、および本発明に記載の組成物はまた、感染症の処置、特にウイルスにより誘発される免疫疾患の処置に使用することができる。感染性物質に対して指向された免疫応答は、致死的な免疫病原性結果を有する可能性がある。例は、肝炎を引き起こす特定のウイルスに対する応答である。上記ウイルスは肝細胞中で複製し、免疫系による感染肝細胞の破壊は、肝炎を誘発し、これは時に致死的な結果をもたらすことがある。この慢性肝炎の経過は、生物学的徴候および免疫応答異常（例えば抗ＤＮＡ抗体またはクリオグロブリン血症の存在）により特徴づけられる。サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）の強化された細胞個体群、および本発明に記載の組成物は、病態に関与する活性Ｔリンパ球の排除、抑制、または低減を可能とし、これにより、ウイルスにより誘発される免疫病態の結果を低減することができる。
【０１０６】
サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）の強化された細胞個体群、および本発明に記載の組成物はまた、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓などの移植臓器の拒絶の処置または予防に使用できる。特定の臓器疾患の通常の処置は、これが必要になる場合、臓器を、死亡したドナー（または場合によっては生存しているドナー、またはさらには別の種からのドナー）の健康臓器と置き換えることからなる。これはまた、膵臓または膵臓島細胞などのインスリン産生臓器または細胞を移植することによる、インスリン依存性糖尿病の処置についても当てはまる。組織適合性抗原に関して最大の適合性を有する臓器ドナーを選択するために極度の注意を払うが、移植臓器は常に、ホモ接合性双生児間の移植を除き、上記臓器により特異的に発現される抗原に対して指向される免疫応答の発生を誘発する。免疫抑制処置にも関わらず、この反応は、臓器移植拒絶をもたらすことが多い（これは、同種移植の失敗の最大の原因である）。体液性応答が主に関与する特定の超急性または急性拒絶を除いて、臓器移植拒絶は、大半の場合において、主にエフェクターＴリンパ球により媒介される。
【０１０７】
本発明は今回、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）の助けにより、臓器拒絶の処置（例えば低減または延期）を想定することが可能である。上記細胞は、患者の細胞から調製でき、ドナー抗原で刺激でき、臓器移植前または最中に患者に再投与できる。必要であれば反復投与してもよい。このアプローチは、特に糖尿病の処置に、すなわち、移植したインスリン産生細胞、組織、または臓器（特に膵臓島細胞）の拒絶を低減、遅延、または予防するのに適合している。典型的には、Ｔｓ細胞は、ドナー組織に由来する自己抗原の存在下で培養することにより増幅および活性化される。上記細胞は、例えば、移植片に対して自己である樹状細胞の存在下での培養により産生できる。上記の増幅され活性化されたサプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）は、臓器移植の前、最中および／またはその後に患者に注射でき、これにより、エフェクターＴ細胞の破壊活性を低減させることができる。
【０１０８】
サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）の強化された細胞個体群、および本発明に記載の組成物はまた、アレルゲンと呼ばれる特定の抗原に対して指向された免疫応答により媒介されるアレルギーの処置に適している。場合により上記アレルゲンにより生体外で活性化されている、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）を患者に投与することにより、これらの有害な免疫応答を低減させることが可能である。
【０１０９】
本発明の別の目的は、哺乳動物宿主におけるエフェクターＴリンパ球の活性（および／または量）を低減させる方法に関し、上記方法は、哺乳動物に、上記哺乳動物宿主と適合性の、好ましくは自己の、本発明に記載のサプレッサーＴリンパ球（またはその前駆体）を投与することを含む。
【０１１０】
サプレッサーＴリンパ球（またはその前駆体）の低減が、（例えば癌処置の状況において）望ましい場合がある。いくつかの処置様態を使用できる。
【０１１１】
第一のアプローチは、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）の枯渇した、活性（例えば抗癌活性）を有する細胞の生体外での調製からなる。上記枯渇は、本明細書で上記した本発明の方法にしたがって生体外で行なうことができる。枯渇は、前段階の培養期を行なわずに、および／またはＴｓリンパ球（ｐＴｓ細胞を含む）の増殖を減少させるＮ−アセチルシステインを含む培地中での培養期後に生体外で行なうことができる（図１参照）。その後、処置は、患者に、Ｔリンパ球個体群、または、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）の枯渇したこのような個体群を含み生体外で活性化されているまたは活性化されていない組成物を再投与することからなる。上記処置は、場合によりコンディショニングを受けている患者において、化学療法および／または放射線療法を併用または併用していない１回以上のワクチン接種（例えば抗腫瘍）により行なうことができる。特に、前記コンディショニングは、Ｔリンパ球、特に分裂中のＴリンパ球（効果的な免疫応答が行なわれない原因であるサプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）を含む）（例えば、効果的な抗腫瘍応答の発達を妨げるＴｓ）を排除することを目的とした、リンパ節切除、骨髄切除処置を含んでいても含んでいなくてもよい。
【０１１２】
別の様態は、サプレッサーＴ細胞を、インビボで、リガンドおよび任意の適切な毒性分子または活性（例えば放射能または毒素）を使用することにより枯渇させることからなる。
【０１１３】
全てのこれらの病態の処置はまた、上記活性を有する任意の分子、特に抗ＴＨＹ−１抗体、またはサプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）の活性を変調する任意の分子（その発見は、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）のトランスクリプトームおよびプロテオームの知識から得られた）の助けにより、インビボでのサプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）の変調（抑制または活性化）により行なうことができる。
【０１１４】
サプレッサーＴリンパ球（ｐＴｓ細胞を含む）はまた、例えば、リンパ球活性化分子（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１０）に結合させたＴｈｙ−１リガンドにより活性化させることができる。その後、処置は、全身投与（例えば静脈内投与）または作用が望まれる部位（例えば関節リウマチの場合には滑液）に投与することができる。
【０１１５】
本発明の特定の目的は、ワクチン接種の脈絡において、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）、サプレッサーＴ細胞（ｐＴｓ細胞を含む）の強化された細胞個体群、または本発明に記載の組成物の使用に対応する。
【０１１６】
様々な投与経路およびプロトコルを、本発明の範囲内で行なうことができる。処置する疾患に応じて当業者はそれらを適合させることができる。一般に、全身または局所投与を想定でき、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、または皮下経路などを使用する。細胞を、外科手術中にまたは任意の適切な手段により、例えばシリンジの助けにより注射できる。ＧＶＨＤ、移植片対感染効果（ＧＶＩ）、または移植片対白血病効果（ＧＶＬ）または移植臓器拒絶のような疾患を制御するために、細胞組成物は、骨髄（または臓器）移植前、最中またはその後に投与できる。さらに、病態を予防または延長するために、移植後に追加の投与を行なってもよい。
【０１１７】
本発明は、本明細書で記載した特定の実施形態には限定されないが、当業者の通常の知識の一部である変法も包含する。
【０１１８】
実施例
１．ＣＤ９０マーカーは、ヒトＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋／ＣＤ２５＋Ｔリンパ球により発現された。
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球個体群における、ＣＤ２５と比較した、ＣＤ９０マーカーの発現を研究するために、成人末梢血単核細胞を、フィコール勾配により得、その後、蛍光色素に直接結合させた以下の抗体で標識した：抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２５、および抗ＣＤ９０。免疫表現型解析のために、上記細胞を、フローサイトメトリー（FACscalibur）により解析し、事象を、セルクエスト（Cellquest）およびフロウジョ（FlowJo）ソフトウェアにより再解析した。
【０１１９】
図３Ａは、ＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるＣＤ２５およびＣＤ９０マーカーの発現、並びに、ＣＤ４＋細胞におけるＣＤ２５およびＣＤ９０の共発現を示した。ＣＤ４＋リンパ球の６％および１．２％がそれぞれＣＤ２５およびＣＤ９０マーカーを発現していたことが分かった。ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋細胞の大半（＞８０％）が、ＣＤ２５＋の中程度の発現を示したのに対し、ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋細胞の約５％および１５％がそれぞれＣＤ２５＋＋およびＣＤ２５−であった。
【０１２０】
図３Ｂは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球におけるＣＤ２５およびＣＤ９０マーカーの発現、並びに、ＣＤ８＋細胞におけるＣＤ２５およびＣＤ９０の共発現を示した。ＣＤ８＋リンパ球の７％および０．２％が、それぞれＣＤ２５およびＣＤ９０マーカーを発現していたことが分かった。ＣＤ４＋細胞とは対照的に、どのＣＤ８＋細胞もＣＤ２５を強力に発現しなかったことが特筆される。ＣＤ８＋／ＣＤ９０＋細胞の大半（７５％）がＣＤ２５−であったのに対し、ＣＤ８＋／ＣＤ９０−の約２５％がＣＤ２５＋であった。
【０１２１】
２．ＣＤ９０マーカーは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋個体群におけるヒトサプレッサーＴリンパ球を同定した。
ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋細胞が抑制機能を有することを実証するために、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞の枯渇した自己ＣＤ４＋Ｔリンパ球（ＣＤ２５−）を、ウェルの底に前以て固定させたＯＫＴ３／ＣＤ２８抗体の混合物で刺激した。ＣＤ２５−細胞を、単独で、または、等数のＣＤ４＋／ＣＤ９０＋またはＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞（陽性対照）の存在下で４日間培養し、その後、増殖を、βカウンターで測定するためにトリチウム標識したチミジン取り込みにより評価した。これらの実験において、ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋またはＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞を、１５グレイで前以て照射した。結果をｃｐｍで表した。阻害率を、式にしたがって計算した：阻害％＝ｃｐｍ数（１−ｃｐｍの数（ＣＤ２５−＋Ｔｓ）／ｃｐｍの数（ＣＤ２５−）×１００。
【０１２２】
図４Ａは、ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋およびＣＤ４＋／ＣＤ２５＋個体群が、自己ＣＤ２５−Ｔリンパ球の増殖を阻害したことを示す。結果は、ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋細胞が、７５％を超える比率でＣＤ２５−の細胞増殖を阻害したことを示し、これにより、その抑制機能が明示された。
【０１２３】
実験はまた、ＥＢＶ細胞または同種樹状細胞（ＤＣ）を使用して行ない、ＣＤ２５−細胞の増殖を刺激した。ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋またはＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞を加えることにより、上記細胞が、図４Ｂおよび４Ｃで明示されているように、ＣＤ２５−細胞増殖に対して抑制作用を奏功したことを示した。
【０１２４】
ＣＤ８＋／ＣＤ９０＋細胞が抑制機能を有することを実証するために、上記細胞を、ＯＫＴ３／ＣＤ２８抗体の混合物で刺激した等数のＣＤ２５−細胞の存在下に置き、細胞増殖を、トリチウム標識したチミジン取り込みにより４日後に評価した。図４Ａの結果は、ＣＤ８＋／ＣＤ９０＋個体群が、ＣＤ２５−細胞の増殖に対して抑制機能を奏功したことを示した。
【０１２５】
３．ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋およびＣＤ８＋／ＣＤ９０＋リンパ球は、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ４およびＴＧＦβを発現した。
Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＴＧＦβ遺伝子の発現を、試験中の種々のリンパ球個体群に由来する１０００または５０００個の細胞から抽出したＲＮＡの逆転写後、入れ子ＰＣＲにより解析した。図５の結果は、ＣＤ４＋／９０＋およびＣＤ８＋／ＣＤ９０＋リンパ球が、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋＋細胞のように、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ４およびＴＧＦβを発現したことを示した。
【０１２６】
４．ＣＤ９０は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球前駆細胞の個体群の同定を可能とした。
ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋個体群がＣＤ４＋／ＣＤ２５＋＋細胞と関連しているかどうかを判断するために、ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋細胞を、フローサイトメトリーにより高度に精製し（純度＞９８％）、液体培地中で、ＯＫＴ３／ＣＤ２８抗体とインターロイキン２の混合物の存在下で培養した。細胞を、マーカーＣＤ４／ＣＤ９０およびＣＤ４／ＣＤ２５について、培養の１日目から７日目までフローサイトメトリーにより連続的に解析した。それぞれ従来のサプレッサーＴリンパ球および活性化Ｔリンパ球を表す選別されたＣＤ４＋／ＣＤ２５＋＋およびＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ９０−個体群を、平行して同じ条件で培養した。図６の結果は、ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋細胞が次第にＣＤ９０マーカーを失い、ＣＤ２５マーカーに対して高度に陽性になったことを示した。最初はＣＤ９０−であった、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋＋細胞の免疫表現型進化は、この個体群が、ＣＤ９０マーカーを獲得することなく、数日間の培養後にＣＤ２５マーカーをさらにより強力に過剰発現したことを示した。ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ９０−個体群は、ＣＤ２５マーカーを強力に獲得したが、ＣＤ９０マーカーは獲得しなかった。培養後のこれらの種々の個体群の抑制機能を研究するために、細胞を選別し、１５グレイで照射し、同種ＣＤ２５−細胞の存在下に配置した。
【０１２７】
結果は、１）ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋細胞が、抑制活性を有するＣＤ４＋／ＣＤ２５＋＋細胞を生じることができ；２）ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋＋細胞が、その抑制活性を保存し；３）ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ９０−細胞が、抑制活性を含まないＣＤ２５＋＋細胞を生じることを示した。これらの結果は、ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋細胞が、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋＋抑制細胞を生じることができ、サプレッサーリンパ球（Ｔｓ）の前駆細胞（Ｔｓ）であるとみなすことができる。
【０１２８】
５．ＣＤ９０は、培養後のＣＤ４＋／ＣＤ９０＋およびＣＤ８＋／ＣＤ９０＋サプレッサーリンパ球の同定を可能とした。
ＣＤ９０マーカーが、活性化Ｔリンパ球においても発現されているＣＤ２５マーカーとは対照的に、Ｔリンパ球の活性化および培養後にサプレッサーＴリンパ球の同定を可能とするかどうかを判断するために、１０％ヒト血清ＡＢおよび５ｍｃｇのＯＫＴ３抗体を含むＲＰＭＩ１６４０液体培地を使用して、全Ｔリンパ球を培養し、その中のＣＤ４＋／ＣＤ９０＋、ＣＤ８＋／ＣＤ９０＋、およびＣＤ４＋／ＣＤ２５＋個体群を、６日間の培養後にフローサイトメトリーにより精製した。培養後、種々の細胞型をサイトメトリーにより解析し、抑制活性について試験した。
【０１２９】
図７Ａは、６日間の培養後の、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球におけるＣＤ２５およびＣＤ９０マーカーの発現を示した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球のそれぞれ６．９％および１０％がＣＤ９０マーカーを発現し、一方、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の８４％および９４．３％がＣＤ２５マーカーを発現した。
【０１３０】
図７Ｂは、ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋およびＣＤ８＋／ＣＤ９０＋個体群が、自己ＣＤ２５−Ｔリンパ球の増殖を阻害し、一方、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球がもはや、培養後にＣＤ２５−細胞に対する抑制効果を有していないことを示した。これらの知見は、ＣＤ９０マーカーが、ＣＤ２５とは対照的に、培養されているＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球内のサプレッサー個体群に特異的であることを示した。
【０１３１】
６．ＣＤ９０は、培養されているＣＤ２５−／ＣＤ９０−リンパ球に由来するサプレッサーリンパ球および前駆細胞の出現を同定した。
ＣＤ２５およびＣＤ９０細胞が両方共に枯渇しているＴリンパ球（ＣＤ２５−／ＣＤ９０−細胞）の活性化および培養後に、ＣＤ９０マーカーが依然として、サプレッサーＴリンパ球の同定を可能とするかを決定するために、ＣＤ２５−／ＣＤ９０−Ｔリンパ球を、１０％ヒト血清ＡＢおよび５ｍｃｇのＯＫＴ３抗体を含むＲＰＭＩ１６４０液体培地中で培養した。ＣＤ２５およびＣＤ９０マーカーを、フローサイトメトリーにより培養中の種々の時点で解析した。図８の結果により、培養の２４時間後から開始して２つの分化経路の出現が明らかになった。したがって、ＣＤ２５＋／ＣＤ９０−細胞の出現と同時に起こるＣＤ９０＋／ＣＤ２５−細胞を検出することが可能であった。２〜３日後、ＣＤ９０＋細胞はＣＤ９０＋／ＣＤ２５＋＋となり、一方、ＣＤ２５＋／ＣＤ９０−細胞はＣＤ２５＋＋／ＣＤ９０−となった。ＣＤ９０＋／ＣＤ２５＋＋細胞の選別および機能的研究により、これらの細胞が、ＯＫＴ３／ＣＤ２８抗体により刺激される自己ＣＤ２５−／ＣＤ９０−Ｔリンパ球の増殖を阻害したことが示された。これらの知見により、ＣＤ２５−／ＣＤ９０−Ｔリンパ球から出発して、ＣＤ９０マーカーにより同定できるサプレッサーＴリンパ球の産生が可能であることが示された。
【０１３２】
７．同定および診断モニタリング
本発明者らは、Ｃ型肝炎の自己免疫合併症を呈する患者は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球が欠損していることを示した（Boyerら、Blood、準備中）。他の著者は、１型糖尿病における類似した欠損を報告していた。これらの病態の診断並びに生物学的および臨床的モニタリングは、特にＴｓ前駆体個体群を同定するＣＤ９０標識によりＴｓ細胞をモニタリングすることにより、より特定された。上記モニタリングは、例えば関節リウマチまたは多発性硬化症などの発赤により進行する疾患に対してはるかにより重要であった。治療介入（特にＴｓ細胞の注射の可能性がある）の選択および時期は、Ｔｓ細胞をＣＤ９０マーカーを通してモニタリングすることにより規定した。Ｔｓ細胞の同定は、対象の任意の生物学的液体（例えば、血液、ＣＳＦ、滑液）または対象の任意の組織もしくは臓器（腫瘍、移植臓器など）中で行なった。
【０１３３】
例えば、慢性期（ＭＳ）および急性期（急性ＭＳ）の多発性硬化症患者を研究した。図９により、慢性期または対照群と比べた、急性ＭＳ中のＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔリンパ球（活性化Ｔリンパ球）の増加、および、対照的なＣＤ４＋／ＣＤ９０＋細胞の減少が明らかとなった。これらの知見は、サプレッサーＴリンパ球を特に活性化Ｔリンパ球とは区別することにより、自己免疫疾患の急性エピソード中のサプレッサーＴリンパ球の減少を評価するための、ＣＤ９０マーカーの価値を示した。
【０１３４】
例えば、ＩＰＥＸ症候群の患者を研究した。図１０は、ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋細胞は、健康ドナーと比較したところ、ＩＰＥＸ患者の血液には実質的に存在せず、一方、活性化Ｔリンパ球も認識するＣＤ２５マーカーの使用によってもこの差異を明示できないことを示した。
【０１３５】
８．ＧＶＨＤ制御のためのＴｓ細胞の治療的注射
本発明者らは、Ｔｓ細胞が、ＧＶＨＤの制御に重要な役割を果たし、同種活性化により特異的Ｔｓを調製することが可能であることを示した（Cohenら、JEM 2003、Trenadoら、JCI 2003）。これらの用途のために、Ｔｓは、血液、臍帯血、骨髄、Ｔリンパ球を含む任意の組織から得ることができる。これらの用途において、Ｔｓは、遺伝子的に改変されていてもされていなくてもよい。
【０１３６】
９．ＭＳ制御のためのＴｓ細胞の治療的注射
Ｔｓ細胞を、患者または適合性ドナーから、好ましくは遺伝子同一体から得た。免疫磁気ビーズ、フローサイトメトリー、特異的抗体（パニング）でコーティングし場合により凍結させた固相支持体への接着により精製した。患者のＴｓ細胞計数をモニタリングした。発赤の開始を示す臨床徴候が出現した場合、または、Ｔｓ計数が減少した場合、患者は、そのために調製されたまたは前以て調製されたＴｓ細胞の注射を受けた。
【０１３７】
１０．腫瘍処置のためのＴｓ細胞の消滅
本発明者らは、Ｔｓ細胞が、効率的な抗腫瘍免疫応答の向上を妨害することを示した。上記細胞の枯渇により、これらの応答を発生させることができる。さらに、生体外での抗腫瘍Ｔリンパ球の調製は、Ｔｓ細胞の混入のリスクがあった。
【０１３８】
それ故、処置の原則は、インビボにおいてＴｓを排除、特に毒素と結合させたＣＤ９０リガンドの助けにより排除することであった。古典的処置（例えば、抗リンパ球血清、抗ＣＤ３、Campath抗体、照射など）によりＴリンパ球の全セットを枯渇させてもよい。上記処置は、Ｔｓ細胞を枯渇させた後に、腫瘍抗原に対して生体外で活性化されたリンパ球を投与することにより完了できた。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】ヒトＣＤ９０＋Ｔリンパ球の好ましい増殖または非増殖に対するＮ−アセチルシステインの効果。  精製ＣＤ３＋Ｔリンパ球を、１０％ヒト血清、インターロイキン−２、抗ＣＤ３抗体を補充したＲＰＭＩ培地中で、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の存在下または非存在下で培養した。時間の経過におけるＣＤ９０マーカーを発現しているＣＤ３＋Ｔ細胞の比率を、フローサイトメトリーにより測定した。
【図２】ヒトＣＤ４＋／ＣＤ９０＋Ｔリンパ球の好ましい増殖または非増殖に対する樹状細胞の効果。  ＣＤ３４＋細胞に由来しＣＤ１ａマーカー（ランゲルハンスＤＣ）またはＣＤ１４マーカー（間質ＤＣ）の強化された樹状細胞（ＤＣ）を、同種Ｔリンパ球と共に１：５の比で５２日間培養した。時間の経過におけるＣＤ９０マーカーを発現しているＣＤ３＋Ｔ細胞の比率を、フローサイトメトリーにより測定した。
【図３】ヒトＣＤ４＋（Ａ）およびＣＤ８＋（Ｂ）Ｔリンパ球によるＣＤ２５およびＣＤ９０抗原の発現。  Ｔ細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＣＤ９０抗原を認識する抗体で標識した。これらの異なるマーカーの発現を、フローサイトメトリーにより研究した。
【図４】ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋およびＣＤ８＋／ＣＤ９０＋Ｔリンパ球は、抑制機能を有する。精製ＣＤ４／ＣＤ９０＋、ＣＤ４／ＣＤ２５＋＋およびＣＤ８／ＣＤ９０＋個体群を、１５グレイで照射し、（Ａ）ＯＫＴ３／ＣＤ２８抗体、（Ｂ）ＥＢＶで形質転換した同種Ｂリンパ球、（Ｃ）同種樹状細胞（ＤＣ）で刺激し、ＣＤ２５細胞を枯渇させた同種Ｔリンパ球（ＣＤ２５−）と共に等しい比で４日間培養した。同じ条件下で単独で刺激したＣＤ２５−細胞を、陽性対照として使用した。増殖は、トリチウム標識したチミジン取り込みにより４日後に評価した。
【図５】ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋およびＣＤ８＋／ＣＤ９０＋Ｔリンパ球によるＦｏｘＰ３遺伝子の発現。  ＣＤ４、ＩＬ−１０、ＣＴＬＡ−４、およびＦｏｘＰ３遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより、異なる精製細胞個体群ＣＤ４＋／ＣＤ２５−、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋＋、ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋、ＣＤ８＋／ＣＤ９０＋で研究した。
【図６】ＣＤ９０は、ＣＤ４／ＣＤ２５＋＋サプレッサーリンパ球の前駆体を同定する。  ＣＤ４／ＣＤ９０＋、ＣＤ４／ＣＤ２５＋、ＣＤ４／ＣＤ２５＋＋細胞個体群を、細胞選別により高度に精製し、ヒト血清ＡＢ、ＩＬ−２、およびＯＫＴ／ＣＤ２８抗体の混合物を含むＲＰＭＩ培地中で７日間培養した。ＣＤ９０およびＣＤ２５マーカーを、培養中の種々の時点で解析した。７日目に、個体群を、細胞選別により強化し、１５グレイで照射し、それらを、ＯＫＴ３／ＣＤ２８抗体の混合物で刺激しＣＤ２５およびＣＤ９０細胞が両方共に枯渇した同種Ｔリンパ球（ＣＤ２５−／ＣＤ９０−）と共に等しい比で共培養することにより抑制活性について試験した。数は、対照（単独で培養し刺激したＣＤ２５−／ＣＤ９０−細胞）と比較した、増殖阻害率を示す。
【図７】ＣＤ９０は、６日間の培養後に、ＣＤ４＋／ＣＤ９０＋およびＣＤ８＋／ＣＤ９０＋サプレッサーリンパ球を同定する。  ＣＤ３Ｔリンパ球を、ＩＬ−２およびＯＫＴ／ＣＤ２８抗体の混合物の存在下で６日間培養した。ＣＤ４およびＣＤ８個体群上のＣＤ２５およびＣＤ９０マーカーの解析により、ＣＤ２５＋およびＣＤ９０＋細胞の比率の測定が可能となった（Ａ）。その後、ＣＤ４／ＣＤ２５＋＋、ＣＤ４／ＣＤ９０＋およびＣＤ８／ＣＤ９０＋細胞を選別し、照射し、それらを、ＯＫＴ３／ＣＤ２８抗体混合物で刺激しＣＤ２５細胞（ＣＤ２５−）の枯渇した同種Ｔリンパ球と共に等しい比で共培養することにより抑制活性について試験した（Ｂ）。増殖は、トリチウム標識したチミジン取り込みにより４日後に評価した。
【図８】ＣＤ９０は、ＣＤ２５−／ＣＤ９０−Ｔリンパ球培養液中におけるサプレッサーリンパ球および前駆細胞の出現の同定を可能とする。  ＣＤ２５およびＣＤ９０細胞が両方共に枯渇したＴリンパ球（ＣＤ２５−／ＣＤ９０−）を、ＩＬ−２およびＯＫＴ／ＣＤ２８抗体の混合物の存在下で７日間培養した。ＣＤ９０およびＣＤ２５マーカーを、培養中の種々の時点で解析した。７日目に、ＣＤ２５＋／ＣＤ９０＋個体群を、細胞選別により強化し、１５グレイで照射し、ＯＫＴ３／ＣＤ２８抗体の混合物で刺激しＣＤ２５およびＣＤ９０細胞の両方共が枯渇した同種Ｔリンパ球（ＣＤ２５−／ＣＤ９０−）と共に等しい比で共培養することにより抑制活性について試験した。数は、対照（単独で培養し刺激したＣＤ２５−／ＣＤ９０−細胞）と比較した、増殖阻害率を示す。
【図９】ヒト病態におけるＣＤ９０マーカーの使用：多発性硬化症の例。  健康ドナー（ｎ＝６）、慢性期の多発性硬化症の患者（多発性硬化症ＭＳ、ｎ＝５）、急性期の多発性硬化症の患者（急性ＭＳ、ｎ＝３）からフィコール勾配で得られた単核細胞を、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ９０モノクローナル抗体で標識した。ＣＤ２５およびＣＤ９０マーカーを発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を、フローサイトメトリーにより研究した。
【図１０】ヒト病態におけるＣＤ９０マーカーの使用：ＩＰＥＸ症候群の患者の例。  ＦｏＸＰ３遺伝子をシークエンスすることにより確認された、健康ドナーおよびＩＰＥＸ症候群の患者からのフィコール勾配で得られた単核細胞を、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ９０モノクローナル抗体で標識した。ＣＤ２５およびＣＤ９０マーカーを発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を、フローサイトメトリーにより研究した。ＩＰＥＸ患者の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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