【手続補正書】
【提出日】平成28年10月21日(2016.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCas9タンパク質コード核酸もしくはCas9タンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための組成物であって、ガイドRNAが標的DNAとハイブリダイズするcrRNA（CRISPR RNA）およびtracrRNA（トランス活性化crRNA）を含むデュアルRNA、またはcrRNAの一部およびtracrRNAの一部を含み、かつ標的DNAとハイブリダイズする一本鎖RNA（sgRNA）であり、標的DNAが真核細胞のDNAである、上記組成物。
【請求項２】
標的DNAがcrRNAまたはsgRNAに相補的な配列を有するヌクレオチドを含む鎖、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を含む鎖を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
crRNAまたはsgRNAが標的DNAに相補的な配列を有する20ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Cas9タンパク質がそのC-またはN-末端に核局在化シグナル（NLS）を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
真核細胞が哺乳類細胞である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
標的DNAが真核細胞の内在性DNAである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
Cas9タンパク質コード核酸またはCas9タンパク質がストレプトコッカス属菌（genus Streptococcus）に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ストレプトコッカス属菌（genus Streptococcus）が化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
PAMが5'-NGG-3'のトリヌクレオチドである、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
標的DNAの切断が部位特異的DNA二本鎖切断である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を含む、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するためのキット。
【請求項１２】
単離された真核細胞または非ヒト真核生物にCas9タンパク質コード核酸もしくはCas9タンパク質、およびガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNAを同時トランスフェクトまたは連続トランスフェクトするステップを含む、Cas9タンパク質およびガイドRNAを有する単離された真核細胞あるいは非ヒト真核生物を作製する方法であって、ガイドRNAが標的DNAとハイブリダイズするcrRNA（CRISPR RNA）およびtracrRNA（トランス活性化crRNA）を含むデュアルRNA、またはcrRNAの一部およびtracrRNAの一部を含み、かつ標的DNAとハイブリダイズする一本鎖RNA（sgRNA）であり、標的DNAが真核細胞のDNAである、上記方法。
【請求項１３】
標的DNAがcrRNAまたはsgRNAに相補的な配列を有するヌクレオチドを含む鎖、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を含む鎖を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
crRNAまたはsgRNAが標的DNAに相補的な配列を有する20ヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
真核細胞が哺乳類細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
標的DNAが真核細胞の内在性DNAである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
Cas9タンパク質コード核酸またはCas9タンパク質がストレプトコッカス属菌（genus Streptococcus）に由来する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ストレプトコッカス属菌（genus Streptococcus）が化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
PAMが5'-NGG-3'のトリヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
トランスフェクトするステップが、最初にCas9タンパク質コード核酸によるトランスフェクション、続いてガイドRNAによるトランスフェクションを含む連続トランスフェクションによって行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
Cas9タンパク質がそのC-またはN-末端に核局在化シグナル（NLS）を更に含む、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
標的DNAを有する単離された真核細胞または非ヒト真核生物に請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物をトランスフェクトするステップを含む、単離された真核細胞または非ヒト真核生物中の標的DNAを切断する方法。
【請求項２３】
真核生物が非ヒト哺乳類または植物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
トランスフェクトするステップが同時トランスフェクションまたは連続トランスフェクションによって行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
トランスフェクトするステップが、最初にCas9タンパク質コード核酸によるトランスフェクション、続いてガイドRNAによるトランスフェクションを含む連続トランスフェクションによって行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
標的DNAの切断が部位特異的DNA二本鎖切断である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物によって編集されたゲノムを有する非ヒト動物の胚。
【請求項２８】
請求項２７に記載の胚を非ヒト動物の卵管に移入することによって得られるゲノム改変非ヒト動物。
【請求項２９】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を非ヒト動物の胚に導入するステップ；およびその胚を偽妊娠した代理母の卵管に移入して、ゲノム改変非ヒト動物を生じさせるステップ、を含む、ゲノム改変非ヒト動物を作製する方法であって、偽妊娠した代理母が非ヒト動物である、上記方法。
【請求項３０】
以下：
Cas9タンパク質コード核酸もしくはCas9タンパク質；および
標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA
を有し、ガイドRNAが標的DNAとハイブリダイズするcrRNA（CRISPR RNA）およびtracrRNA（トランス活性化crRNA）を含むデュアルRNA、またはcrRNAの一部およびtracrRNAの一部を含み、かつ標的DNAとハイブリダイズする一本鎖RNA（sgRNA）である、単離された真核細胞または非ヒト真核生物。
【請求項３１】
標的DNAがcrRNAまたはsgRNAに相補的な配列を有するヌクレオチドを含む鎖、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を含む鎖を含む、請求項３０に記載の単離された真核細胞または非ヒト真核生物。
【請求項３２】
crRNAまたはsgRNAが標的DNAに相補的な配列を有する20ヌクレオチドを含む、請求項３０に記載の単離された真核細胞または非ヒト真核生物。
【請求項３３】
真核細胞が哺乳類細胞である、請求項３０に記載の単離された真核細胞または非ヒト真核生物。
【請求項３４】
標的DNAが真核細胞の内在性DNAである、請求項３０に記載の単離された真核細胞または非ヒト真核生物。
【請求項３５】
Cas9タンパク質コード核酸またはCas9タンパク質がストレプトコッカス属菌（genus Streptococcus）に由来する、請求項３０に記載の単離された真核細胞または非ヒト真核生物。
【請求項３６】
前記ストレプトコッカス属菌（genus Streptococcus）が化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）である、請求項３５に記載の単離された真核細胞または非ヒト真核生物。
【請求項３７】
PAMが5'-NGG-3'のトリヌクレオチドである、請求項３０に記載の単離された真核細胞または非ヒト真核生物。
【請求項３８】
Cas9タンパク質がそのC-またはN-末端に核局在化シグナル（NLS）を更に含む、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載の単離された真核細胞または非ヒト真核生物。