(57)【要約】  本発明は、ヤブレツボカビ目の微生物をナトリウム塩及び塩化物を添加せずに、総塩含量が３．５ｇ／Ｌ未満（海水塩含量の１０％未満に相当）である低塩培地において培養し、ＰＵＦＡを微生物及び／または培地から単離する前記微生物を培養するための最適化方法に関する。本発明は特に、総塩含量を実質的に低減させた、特にＮａＣｌ含量を著しく低減させた新規な最適化培地に関する。ＰＵＦＡの産生は、Ｎａ＋イオンとＣｌ−イオンの全重量比が１．７５ｇ／Ｌを越えない培地組成として各種塩の新規組合せを用いることにより実質的に改善され、十分に簡素化され得る。更に、培地は好ましくは添加したナトリウム塩及び塩化物を全く含まず、塩を含有する廃水により生ずる環境ダメージを防止するのを助ける。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）属の微生物を、ナトリウム塩及び塩化物を添加することなく、総塩含量が総塩の３．５ｇ／Ｌ未満である発酵培地において培養する前記微生物の培養方法。
【請求項２】
微生物が乾燥バイオマスの重量単位あたり３０重量％以上、好ましくは３５重量％以上の油を産生する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
最高３ｇ／Ｌ、好ましくは１ｇ／ＬのＣａＣＯ３を培地に添加する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
微生物が乾燥バイオマスあたり１０％以上、好ましくは１４％以上、非常に特に好ましくは１８％以上のＤＨＡを産生する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
微生物が乾燥バイオマスあたり５％以上、好ましくは７％以上、非常に特に好ましくは１０％以上のＤＰＡを産生する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
総塩含量が海水の塩含量の＜１５％、好ましくは＜１２％、特に好ましくは＜１０％、非常に特に好ましくは＜８％である低塩培地を用いる請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
低塩培地中のＮａ＋イオン及びＣｌ−イオンの重量分率の合計が１．７５ｇ／Ｌ未満である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
低塩培地の総ナトリウム含量が１５０ｍｇ／Ｌ未満である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
低塩培地の総塩化物含量が２５０ｍｇ／Ｌ未満である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
低塩培地がグルコース、酵母抽出、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム及びリン酸カリウムを含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
低塩培地がグルコース、コーンスティープリカー、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム及びリン酸カリウムを含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
低塩培地が硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム及びリン酸カリウムをそれぞれ３ｇ／Ｌ未満、特に好ましくは１ｇ／Ｌ未満含む請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
培地が３〜１０、好ましくは５〜７のｐＨを有する請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
培養を１０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で実施する請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
培養を１〜１０日間、好ましくは３〜９日間実施する請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
微生物がシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属に属する請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
微生物がウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９である請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
微生物がシゾキトリウム種ＳＲ  ２１である請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて産生し、その後培養ブロス及び／または本発明において利用可能なバイオマスから単離した少なくとも１０％のＤＨＡ含量を有する油。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて産生し、その後培養ブロス及び／または本発明において利用可能なバイオマスから単離した少なくとも５％のＤＨＡ含量を有する油。
【請求項２１】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて産生し、その後培養ブロス及び／または本発明において利用可能なバイオマスから単離した少なくとも９０％の純度を有するＤＨＡ。
【請求項２２】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて産生し、その後培養ブロス及び／または本発明において利用可能なバイオマスから単離した少なくとも９０％の純度を有するＤＰＡ。
【請求項２３】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて産生し、その後培養ブロスから分離して得ることができるバイオマス。
【請求項２４】
請求項２３に記載のバイオマスを含む動物飼料。
【請求項２５】
請求項２３に記載のバイオマスを含むヒト栄養のための食料。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
各種ＰＵＦＡ（ポリ不飽和脂肪酸）、特にω−３脂肪酸（ｎ−３脂肪酸）はヒト栄養の必須成分である。
【０００２】
しかしながら、大部分の工業国ではｎ−３脂肪酸の供給は不十分である。対照的に、食事中の脂肪の全量及び飽和脂肪酸やｎ−６脂肪酸の摂取はかなり多い。これは、食事の組成が変化したためであり、この変化は特に最近約１５０年間に生じており、工業国での主な死亡原因である心血管疾患のような各種の慢性文明病の出現とリンクしている（A.P.Simopoulos, Am.J.Clin.Nutr., 70:560-569(1999)）。一方で、多数の研究から、ｎ−３脂肪酸、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を多く摂取すると心血管リスクをかなり低下できることが判明している（GISSI-Prevenzione Investigators (Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'Infarto miocardico), Dietary supplementation with n-3 polysaturated fatty acids and vitamin E after myocardial infarction: results of the GISSI-pevenzione trial., Lancet, 354:447-455(1999)；Burrら, Effects of changes in fat, fish, and fiber intake on death and myocardial reinfarction: diet and reinfarction trial (DART), Lancet, 2:757-761(1989)）。従って、多くの各種機構(ＷＨＯ、ＦＡＯ、ＡＨＡ、ＩＳＳＦＡＬ、英国栄養財団等)はｎ−３脂肪酸の摂取をかなり多くすることを推奨している（Kris-Ehertonら, Fish Consumption, Fish Oil, Omega-3 Fatty Acids, and Cardiovascular Disease,Circulation, 2747-2757(2002)）。
【０００３】
ＰＵＦＡ、特にｎ−３脂肪酸を産生するためのソースは特に、海洋冷水魚及びそこから抽出される油だけでなく、海洋微生物もある。海洋微生物は、魚と比較して費用効果が適切でコントロールされる条件下でＰＵＦＡを産生するための発酵において使用され得るという利点を有している。発酵産生は、魚またはそこから抽出される魚油に関してしばしば記載されている汚染リスクを生じない（S.F.Olsen, Int.J.Epidemiol., 1279-80(2001)）。加えて、抽出した油の組成は、生物及び培養条件を選択することにより明確に影響され得、魚及び魚産物に関して記載されているような（Gamez-Mezaら, Lipids, 639-42(1999)）季節変動を受けない。
【０００４】
ｎ−３  ＰＵＦＡを産生させるのに適した微生物は、例えばビブリオ属の細菌（例えば、ビブリオ・マリヌス（Ｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ））；渦鞭毛虫類（渦鞭毛植物）、特にクリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属（例えばＣ・コーニイ（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ））；またはストラメノパイルス（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）（例えば、グロッソマスティクス（Ｇｌｏｓｓｏｍａｓｔｉｘ）、黄色藻類（Ｐｈａｅｏｍｏｎａｓ）、ピオグイオクリシス（Ｐｉｎｇｕｉｏｃｈｒｙｓｉｓ）、ピングイオコッカス（Ｐｉｎｇｕｉｏｃｏｃｃｕｓ）やポリドクリシス（Ｐｏｌｙｄｏｃｈｒｙｓｉｓ）のようなピンギオ藻網）の中にある。ＰＵＦＡの発酵産生のための好ましい微生物は、ストラメノパイルス（すなわち、ラビリンツラ類)、特にヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｃｈｙｔｒｉｉｄｅａ）、並びにジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム属、ヤブレツボカビ属、アルトルニア（Ａｌｔｈｏｒｎｉａ）属、ラビリンツロイデス（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属及びウルケニア属に属する。
【０００５】
上記した微生物の幾つかが脂肪酸を工業的に産生するために使用され得ることは公知であり、対応する方法も記載されている。従って、国際特許出願公開第91/07498号パンフレットはヤブレツボカビ属及びシゾキトリウム属の生物を用いるＰＵＦＡの産生を開示している。国際特許出願公開第91/11918号パンフレットはクリプテコジニウム・コーニイを用いるＰＵＦＡの産生を開示している。国際特許出願公開第96/33263号パンフレット及び対応の欧州特許出願公開第0 823 475号明細書はシゾキトリウム属の微生物を用いるＰＵＦＡの産生を開示しており、国際特許出願公開第98/03671号パンフレットはウルケニア属の微生物を用いるＰＵＦＡの産生を開示している。
【０００６】
上記した微生物、特にラビリンツア藻網の天然生息地は海洋である。従って、これらの微生物は通常塩含有培地において培養されている。なお、本発明の目的で海水の塩含量は３２〜３５ｇ／Ｌ及び９０〜９５％のナトリウム及び塩化物含量として定義される。ヤブレツボカビまたはシゾキトリウムのような海洋微生物を培養するための典型的な培地は海水を主成分としている（例えば、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）７９０  Ｂｙ＋培地［酵母抽出物１．０ｇ、ペプトン１．０ｇ、Ｄ＋グルコース５．０ｇ、海水１Ｌ］）。しかしながら、ヤブレツボカビ目の微生物が非常に低い塩分濃度の培地において生き延びることができることも公知である。しかしながら、７．５〜１５‰の塩分濃度に相当する７．５〜１５ｇ／Ｌの塩の限界以下では、その成長は非常に遅く、低塩分濃度範囲で中間最大レベルなしであると記載されている。最適成長率は上記した塩分濃度限界を超えたときのみ達成される（Fanら, Botanica Marina, 45:50-57(2002)）。
【０００７】
広塩性微生物の商業的発酵のための海水の約５０〜６０％の低塩含量が記載されている。Hendersonの“Dictionary of biological terms”によれば、広塩性海洋生物は広い塩含量に適応できるものである（W.D.Henderson, E.Lawrence, Henderson’s dictionary of biological terms, 第10版, p.173(1992年)発行）。
【０００８】
ストラメノパイルス（または、ラビリンツラ門）に属する広塩性微生物がナトリウムイオン含量の低い(海水の６０％)発酵培地において大量のＰＵＦＡを産生できることは記載されている（米国特許第6,451,567号明細書）。発酵装置に対する塩化物の腐食作用を低下させる目的で塩化物含量の低い培地を用いることも記載されている（米国特許第6,410,281号明細書）。このことは、例えば塩化物濃度が３ｇ／Ｌ未満の発酵培地を用いてヤブレツボカビ属及びシゾキトリウム属の微生物について示されている（米国特許第5,340,742号明細書、同第6,451,567号明細書及び同第6,410,281号明細書）。海水と比較して低塩含量の条件下で培養することが可能であることも公知である。特に、国際特許出願公開第98/03671号パンフレット、欧州特許出願公開第0 823 475号明細書、米国特許第6,451,567号明細書及び米国特許第6,410,281号明細書を参照されたい。
【０００９】
更に、シゾキトリウム属の微生物（シゾキトリウム種S31；ＡＴＣＣ  ２０８８８）の発酵の場合、脂肪酸の相対収率の最大が１．７５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム濃度で達成されることが公知である。そのために使用される塩の総量は海水塩含量の１０％未満であるが、主としてナトリウムイオン及び塩化物イオンからなる(欧州特許出願公開第0 512 997号明細書及び米国特許第5,518,918号明細書)。
【００１０】
しかしながら、今までに公表された方法はすべて欠点を有している。発酵方法の有効性は特に得られ得るバイオマス及びバイオマスあたりの産物含量により限定される。更に、産生される油は、必ずしも所望産物に対応しない脂肪酸スペクトルを部分的にしか与えることができず、まず手続き上修飾されなければならない。比較的少量の産物を得るのに比較的大量のバイオマスを処理しなければならないので、バイオマスあたりの産物含量がある程度低いことにより処理はしばしば複雑となる。更に、今までに公表された方法はすべて培地中の総塩含量が比較的高い。これにより、産物の処理中に大きな問題が生じ、バイオマスが大量なだけでなく、廃棄しなければならない塩含有廃水が大量に生ずるので環境上非常に不利である。
【００１１】
従って、上記技術水準に照らして、本発明の目的は塩含量が低い培地を用いてヤブレツボカビ目を培養するための新規で簡単且つ経済的な培養方法を提供することである。費用効果とは別に、この方法は簡単に実施され、高純度のＰＵＦＡまたはＰＵＦＡ含有産物を高収率で産生できなければならない。
【００１２】
上記目的及び明瞭に記載されていないが序の欄に記載されている関係から容易に推論または推察され得る更なる目的は本発明の請求の範囲に規定する主題により達成される。
【００１３】
ヤブレツボカビ目を培養するための有利な方法は請求項１に記載されている方法により提供される。この方法は、ヤブレツボカビ目の微生物を固体または溶解形態のナトリウムイオンまたは塩化物イオンを添加することなく総塩含量が海水に対して１０％未満、すなわち総塩含量が約３．５ｇ／Ｌ未満である低塩培地において前記微生物を培養することを含む。
【００１４】
本発明は更に、高純度ＰＵＦＡを産生する方法を含む。
【００１５】
本発明によれば、好ましいＰＵＦＡはＤＨＡ、ＤＰＡ及びＥＰＡである。
【００１６】
特に、上記した方法により培養した微生物は、乾燥バイオマスあたり１０％以上、好ましくは１４％以上、特に好ましくは１８％以上のＤＨＡを産生する。
【００１７】
特に、上記した方法により培養した微生物は、乾燥バイオマスあたり５％以上、好ましくは７％以上、非常に特に好ましくは１０％以上のＤＰＡを産生する。
【００１８】
ＰＵＦＡは、培養後微生物(バイオマス)及び／または培地からＰＵＦＡを単離することにより高い純度及び収率で得ることができる。
【００１９】
更に、本発明は、本発明の培養方法により得られるバイマスの産生方法を含む。
【００２０】
このバイオマスは、全ての考えられる限りの方法で使用され得る。特に、このバイオマスは、例えば乾燥形態（乾燥バイオマス）で直接食料または動物飼料として使用され得る。
【００２１】
加えて、本発明はまた、本発明の培養方法を実施し、微生物（バイオマス）及び／または培地から油を単離することにより得られる油タイプを含む。
【００２２】
特に、これは多くの他の好ましい用途とは別にヒト栄養のために有利に使用され得る油タイプである。
【００２３】
本発明の条件下で、微生物は、乾燥バイオマスの重量単位あたり３０重量％以上、好ましくは３５重量％以上の油を産生する。
【００２４】
本発明によれば、油は、当業者に公知のヤブレツボカビ目の通常の脂肪酸スペクトルに相当する少なくとも７０％の中性脂質及び少なくとも２％のリン脂質の割合であると理解される。中性脂質は少なくとも８０％のトリグリセリド及び他の成分（例えば、ジアシルグリセリド、ステロール等）を含む。更に、トリグリセリドの重量分率は約９５％の脂肪酸及び５％のグリセリンからなる。典型的な海水塩含量の１０％未満に相当する低塩濃度で海洋微生物が発酵できること、特に海水中で優勢であり、通常海水中で利用可能なイオンの約９０％を占めているＮａ＋イオン及びＣｌ−イオンの添加を完全に省くことができることはかなり驚くべきことであった。
【００２５】
驚くことに、本発明の低塩培地を使用するとき、発酵が可能であるだけでなく、更にはバイオマス中のＰＵＦＡの割合が有意に増加する。更に驚くことは、この効果は産生されるバイオマスの僅かな減量を補償するだけでなく、それを越えることさえある（実施例２）。これにより、乾燥バイオマスあたりの主なＰＵＦＡ  ＤＨＡの量は培地１（海水塩含量の５０％）における比較発酵に比べて１０％以上増加する。産物の処理は、産物濃度がより高く、塩汚染がより低く、全体的に高い空時収率により簡素化される。
【００２６】
本発明まで、ナトリウムも塩化物も添加することなく塩濃度が低い培地を用いてヤブレツボカビ目の微生物においてｎ−３脂肪酸を産生するために公知の発酵方法は利用されていなかった。
【００２７】
ＰＵＦＡは、少なくとも２個の二重結合を含む＞Ｃ１２の鎖長を有するポリ不飽和長鎖脂肪酸である。本発明の方法に従って産生され得るＰＵＦＡは特にｎ−３脂肪酸及びｎ−６脂肪酸である。
【００２８】
本発明において、ｎ−３脂肪酸（オメガ−３脂肪酸、ω−３脂肪酸）は少なくとも２個以上の二重結合を含み、第１二重結合がアルキル末端から数えてＣ３とＣ４炭素間にある＞Ｃ１２の鎖長を有するポリ不飽和長鎖脂肪酸であると理解される。従って、ｎ−６脂肪酸の場合第１二重結合はアルキル末端から数えてＣ６とＣ７炭素間にある。
【００２９】
ラビリンツア門に属する微生物は本発明の方法に従うＰＵＦＡの産生のために考えられる。ヤブレツボカビ目（ヤブレツボカビ科）の微生物が好ましい（T.E.Lewis, P.D.Nichols, T.A.McMeekin, The Biotechnological Potential of Thraustochytrids, Marine Biotechnology,S.580-587(1999)及びD.Porter, Phylum Labryinthulomycota in Handbook of protoctista: the structure, cultivation, habitats, and life histories of the eukaryotic microorganisms and their descendants exclusive of animals, plants, and fungi: a guide to the algae, ciliates, foraminifera, sprorozoa, water molds, and other protoctists,編集者:L.Margulis,J.O.Corliss,M Melkonian及びD.J.Chapman,編集コーディネーター:H.I.McKhann,Jones and Bartlett Publishers, ISBN 0-86720-052-9,S.388-398(1990)）。ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム属、ヤブレツボカビ属、アルトルニア（Ａｌｔｈｏｒｎｉａ）属、ラビリンツロイデス（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属及びウルケニア属の微生物が特に好ましい。これらの中で、シゾキトリウム、ヤブレツボカビ及びウルケニアが非常に特に好ましい。特に好ましいのは、ジャポノキトリウム種（ＡＴＣＣ  ２８２０７）、ヤブレツボカビ・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）（特に、ＡＴＣＣ  ２８２１１及びＡＴＣＣ  ３４３０４）、ヤブレツボカビ・ロセウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）（ＡＴＣＣ  ２８２１０）、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（ＡＴＣＣ  ２０８９０、ＡＴＣＣ  ２０８９１、ＡＴＣＣ  ２０８９２及びＡＴＣＣ  ２６１８５）、シゾキトリウム・アグレガツム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）（ＡＴＣＣ  ２８２０９）、シゾキトリウム種（ＡＴＣＣ  ２０８８８及びＡＴＣＣ  ２０８８９）、シゾキトリウムＳＲ２１及びウルケニア種（ＳＡＭ  ２１７９及びＳＡＭ  ２１８０）である。
【００３０】
本発明の方法に適した微生物は野生型形態、そこから誘導される変異体及び株、並びに対応生物の組換え株である。本発明は特にＰＵＦＡの産生を増加させるために変異体または組換え株を含む。
【００３１】
本発明の微生物は、液体または固体培地に上記生物の前培養物を接種することにより培養される。
【００３２】
ヤブレツボカビ目の微生物に適した培養技術は当業者に公知である。通常、排他的ではないが、培養は対応容器において水性発酵により実施される。この種の発酵のための典型的な容器の例には、振とうフラスコまたはバイオリアクター（例えばＳＴＲ（撹拌式タンク反応器））またはバブルカラムが含まれる。培養は、通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃、特に好ましくは２５〜３０℃、更に特に好ましくは２７〜２９℃、特に２８℃の温度で実施される。
【００３３】
本発明の更なる実施態様では、低塩培地の総塩含量は１．５ｇ／Ｌ未満である。
【００３４】
本発明の更に好ましい実施態様では、低塩培地の総塩含量は海水の塩含量の＜１５％、好ましくは＜１２％、特に好ましくは＜１０％の値に相当する。海水の塩含量の＜８％が非常に特に好ましい。
【００３５】
低塩培地にナトリウム塩を添加しない。更に、本発明の低塩培地には塩化物も添加しない。
【００３６】
本発明によれば、添加は溶解形態及び固体形態での添加を意味すると解される。例えば、たとえ最少量であっても海水の添加は本発明によればナトリウム塩及び塩化物の添加であろう。本発明の培地への一般的でない培地成分の添加は、その一般的でない培地成分が対応するナトリウムイオンまたは塩化物イオンを含んでいるならばこれらの塩の添加と解される。しかしながら、通常の（多くの場合必要な、すなわち必須の）培地成分である水（水道水）、酵母抽出物、コーンスティープリカーまたは同等物は非常に少量の避けがたい量のナトリウム及び塩化物を含むことは当業者には自明である。従って、通常の培地成分の添加は本発明のナトリウム塩及び塩化物の添加と解されない。
【００３７】
酵母抽出物は、例えば２重量％未満のＮａＣｌを含む。このため酵母抽出物を通常量（すなわち、１０〜２０ｇ／Ｌ）培地に添加しても、ＮａＣｌ含量は０．２ｇ／Ｌ未満しか上昇しない。これは、本発明のＮａＣｌ添加と見なされない。
【００３８】
従って、特に好ましい実施態様では、前記培地にはナトリウム塩及び／または塩化物が添加されていない。
【００３９】
低塩培地の総ナトリウム含量は、好ましくは２ｇ／Ｌ未満、好ましくは５００ｍｇ／Ｌ未満、非常に特に好ましくは１５０ｍｇ／Ｌ未満である。低塩培地の総塩化物含量は、好ましくは２ｇ／Ｌ未満、好ましくは５００ｍｇ／Ｌ未満、非常に特に好ましくは２５０ｍｇ／Ｌ未満である。
【００４０】
Ｎａイオン及びＣｌイオンの重量分率の合計は、特に好ましくは１．７５ｇ／Ｌ未満である。
【００４１】
更に好ましくは、低塩培地は１つ以上の炭素源及び１つ以上の窒素源を含む。ヤブレツボカビ目の微生物を培養するための炭素源及び窒素源として使用可能な物質は当業者に公知である。
【００４２】
使用可能な炭素源の例は、炭水化物（例えば、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、可溶性デンプン、フコース、グルコサミン、デキストラン、グルタミン酸、糖蜜、グリセリンまたはマンニトール）、油脂または植物加水分解物である。
【００４３】
使用可能な天然窒素源の例は、ペプトン、酵母抽出物、麦芽抽出物、肉抽出物、カザミノ酸、コーンスティープリカーまたは大豆であり、使用可能な有機窒素源の例はグルタメート及び尿素であり、無機窒素源（例えば、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、硫酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウム）も窒素源として使用され得る。
【００４４】
低塩培地は、ヤブレツボカビ目の微生物の培養を助けるために当業者に公知のすべての他の成分、特に無機塩（例えば、Ｃａ、Ｍｇ、Ｋ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＭｏまたはＺｎ）を含み得る。リン酸塩（例えば、リン酸水素カリウム）、炭酸塩（例えば、炭酸カルシウム）、硫酸塩（例えば、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄または硫酸ナトリウム）を例示することができる。更に使用可能な無機塩は、例えばハロゲン化物（例えば、臭化カリウムまたはヨウ化カリウム）である。
【００４５】
可能ならば、培地は追加の多量栄養素及び微量栄養素、例えばアミノ酸、プリン、ピリミジン、コーンスティープリカー、タンパク質加水分解物、ビタミン（水溶性及び／または水不溶性）及び当業者に公知の他の培地成分を含み得る。所要により、消泡剤を添加してもよい。培地は複合成分を含んでいても、または化学的に規定されていてもよい。
【００４６】
微生物の成長または生産性に対して悪影響がない限り、各成分の量は変更可能である。当業者は、微生物の要件に応じて個々の事例で組成を容易に決定することができる。通常、炭素源は５０〜３００ｇ／Ｌの濃度で添加され、窒素源は１〜３０ｇ／Ｌの濃度である。好ましくは、窒素源は培地の炭素含量に応じて調節される。
【００４７】
特に好ましい低塩培地は、場合に応じて栄養成分のような他の成分は別として、本発明の総塩含量を超えない限り硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム及びリン酸カリウムからなる群から選択される少なくとも１つの塩を含み、前記した塩は好ましくはそれぞれ３ｇ／Ｌ以下、特に好ましくはそれぞれ１ｇ／Ｌ以下添加される。硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム及びリン酸カリウムを培地に添加することが特に好ましい。
【００４８】
好ましい栄養成分は、通常量のグルコース、酵母抽出物及び／またはコーンスティープリカー（ＣＳＬ）及び当業者に公知の更なる一般的な栄養成分である。
【００４９】
培地のｐＨ値は、対応する酸または塩基を添加することにより３〜１０、好ましくは４〜８、特に好ましくは５〜７、非常に特に好ましくは約６に設定する。
【００５０】
培地はその後滅菌される。培地の滅菌方法は当業者に公知であり、高圧蒸気滅菌及び滅菌濾過が例示され得る。
【００５１】
培養は、通常当業者には公知のように回分、流加モードまたは連続的に実施され得る。
【００５２】
回分または流加培養は通常１〜１２日間、好ましくは２〜１０日間、特に好ましくは３〜９日間実施する。
【００５３】
培地成分は低塩培地に個々に、または混合物として添加され得る。混合物を予め調製することも可能である。前記成分（特に、炭素源及び窒素源）または特定の培地添加物は培養前または培養中に添加され得る。添加は２回または複数回繰り返され得、或いは連続的にも実施され得る。
【００５４】
産生したＰＵＦＡは通常中性脂肪（例えば、トリアシルグリセリド）または極性脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルイノシトール）の形態で利用可能である。
【００５５】
本発明の目的で、用語「ＰＵＦＡ」、「ｎ−３脂肪酸」または「ｎ−３活性物質」は、対応脂肪酸が存在し得る全ての考えられ得る形態、すなわち遊離脂肪酸、エステル、トリグリセリド、リン脂質または他の誘導体の形態を有すると理解される。これらの物質は全て以下の説明においてまとめられ、これらの用語は同義的に使用される。更に、ＰＵＦＡは、培養から単離する前またはその後に例えば適当な酵素（リパーゼ）を用いて化学的または生体触媒エステル交換により変換され、濃縮され得る。
【００５６】
発酵微生物または培地からのＰＵＦＡの単離及び脂肪酸スペクトルの分析は当業者に公知の一般的な手順（U.N.Wanasundara, J.Wanasundara, F.Shahidi, Omega-3 fatty acid concentrates: a review of production technologies, Seafoods - Quality, Technology and Nutraceutical Applications, S.157-174(2002)）を用いて実施される。
【００５７】
本発明の方法の基礎をなす発酵培地を以下幾つかの実施例により説明する。しかしながら、発酵培地及び本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例１】
【００５８】
ウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９によるＰＵＦＡの産生に対する培地中の異なる塩量の影響
ＳＡＭ  ２１７９株（ウルケニア種ＢＰ−５６０１；国際特許出願公開第９８／０３６７１号パンフレット）をじゃま板を有する３００ｍｌ容量の三角フラスコ中の培地（５０ｍｌ）において培養した（温度：２８℃、振とう速度：１５０ｒｐｍ）。
【００５９】
培地１：ＤＨ１培地
グルコース１水和物（ｇ／Ｌ）：５６．２５
酵母抽出物（ｇ／Ｌ）        ：１２．５［Ｄｉｆｃｏ］
トロピックマリン（ｇ／Ｌ）  ：１６．６５［ドイツ国ワールテンベルクに所在のＤｒ．Ｂｉｅｎｅｒ  ＧｍｂＨ］
ｐＨ値をＨＣｌで６．０に設定。
【００６０】
培地２：ＤＨ２培地（塩なし）
グルコース１水和物（ｇ／Ｌ）：５６，２５
酵母抽出物（ｇ／Ｌ）        ：１２．５［Ｄｉｆｃｏ］
ｐＨ値をＨＣｌで６．０に設定。
【００６１】
培地１の塩（トロピックマリン）は以下の濃度で使用した：１×（培地１）、０．７５×（培地１．１）、０．５×（培地１．２）、０．２５×（培地１．３）及び０．１×（培地１．４）。
【００６２】
４８時間培養後遠心して細胞を収集した。その後、これらの細胞を凍結乾燥し、乾燥バイオマスを調べた。細胞消化及び脂肪酸測定を、１０％メタノール性塩酸中６０℃で（撹拌しながら）２時間加熱することにより実施した。エステルをガスクロマトグラフィーにより分析して、脂肪酸組成を調べた(U.N.Wanasundara, J.Wanasundara, F.Shahidi, Omega-3 fatty acid concentrates: a review of production technologies, Seafoods − Quality, Technology and Nutraceutical Applications, p.157-174(2002))。
【表１】
2007510422.tif 000002
【表２】
2007510422.tif 000003
【００６３】
トロピックマリンの濃度を海水塩含量の約５０％から０％に変化させてウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９株を発酵させると、バイオマスは培地中の塩含量が低下するにつれて減量する傾向を有していることが分かる。しかしながら、海水の約５％という低塩含量で発酵させると、驚くことに明らかな例外が見られる。バイオマス産生傾向は、高値が再び得られる中間最大値を示す。加えて、乾燥バイオマス中の主な脂肪酸ＤＨＡの割合は塩酸濃度が低下するにつれて増加し、海水塩含量の５％でまた最高値を有し、塩含量が更に低下すると再び低下する。必須ＰＵＦＡ  ＤＨＡの空時収率に関して、約５％の海水塩含量で最大値になる（表１参照）。この最大値で、ＤＨＡ空時収率が１５％以上増加する。全脂肪酸スペクトルに関して、約５％の海水塩含量でのＤＨＡの割合は塩含量がより高いまたはより低い場合よりもわずかに低いが（表２参照）、ＤＨＡ及び脂肪酸または油の全生産性は通常正確にこの％で最高レベルにある（表１参照）。本発明の主題である低塩培地は上記した驚くべき結果に基づいて開発された。
【実施例２】
【００６４】
各種発酵培地においてウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９を用いるＰＵＦＡの産生
ＳＡＭ  ２１７９株をじゃま板を有する３００ｍｌ容量の三角フラスコ中の培地（５０ｍｌ）において培養した（温度：２８℃、振とう速度：１５０ｒｐｍ）。
【００６５】
培地１：ＤＨ１培地
グルコース１水和物（ｇ／Ｌ）：５６．２５
酵母抽出物（ｇ／Ｌ）        ：１２．５［Ｄｉｆｃｏ］
トロピックマリン（ｇ／Ｌ）  ：１６．６５［ドイツ国ワールテンベルクに所在のＤｒ．Ｂｉｅｎｅｒ  ＧｍｂＨ］
ｐＨ値をＨＣｌで６．０に設定。
【００６６】
培地２：ＤＨ２培地（塩なし）
グルコース１水和物（ｇ／Ｌ）：５６．２５
酵母抽出物（ｇ／Ｌ）        ：１２．５［Ｄｉｆｃｏ］
ｐＨ値をＨＣｌで６．０に設定。
【００６７】
培地３：ＤＨ３培地（ナトリウム及び塩化物を添加することなく塩を補充）
グルコース１水和物（ｇ／Ｌ）：５６．２５
酵母抽出物（ｇ／Ｌ）        ：１２．５［Ｄｉｆｃｏ］
硫酸マグネシウム（ｇ／Ｌ）  ：１
炭酸カルシウム（ｇ／Ｌ）    ：１
リン酸カリウム（ｇ／Ｌ）    ：１
ｐＨ値をＨ２ＳＯ４で６．０に設定。
【００６８】
４８時間培養後遠心して細胞を収集した。その後、これらの細胞を凍結乾燥し、乾燥バイオマスを調べた。細胞消化及び脂肪酸測定を、１０％メタノール性塩酸中６０℃で（撹拌しながら）２時間加熱することにより実施した。エステルをガスクロマトグラフィーにより分析して、脂肪酸組成を調べた。
【表３】
2007510422.tif 000004
【００６９】
本発明のナトリウムも塩化物も添加されていない低塩培地をまず海水塩含量の約１０％の濃度（培地３）での発酵において使用した。こうして得られたバイオマスは、約５０％の海水塩含量を用いる発酵と比較してわずかに少ないが、乾燥バイオマスあたりのＤＨＡ含量は高く、よって空時収率は総合的に等しいかまたは場合により高くなることさえある（表３参照）。これは、ＤＨＡを得るためにバイオマスを後に処理するためにはかなり有利である。驚くことに、有利には発酵のためにナトリウム及び／または塩化物(海水中の主な塩)の添加を完全に省くことができることが判明した。
【実施例３】
【００７０】
ウルケニア種ＳＡＭ  ２１７９によるＰＵＦＡの産生に対するナトリウム及び塩化物が添加されていない培地中の異なる塩量の影響
ＳＡＭ  ２１７９株をじゃま板を有する３００ｍｌ容量の三角フラスコ中の培地（５０ｍｌ）において培養した（温度：２８℃、振とう速度：１５０ｒｐｍ）。
【００７１】
培地３：ＤＨ３培地（ナトリウム及び塩化物を添加することなく塩を補充）
グルコース１水和物（ｇ／Ｌ）：５６．２５
酵母抽出物（ｇ／Ｌ）        ：１２．５［Ｄｉｆｃｏ］
硫酸マグネシウム（ｇ／Ｌ）  ：１（１×塩）
炭酸カルシウム（ｇ／Ｌ）    ：１（１×塩）
リン酸カリウム（ｇ／Ｌ）    ：１（１×塩）
ｐＨ値をＨ２ＳＯ４で６．０に設定。
【００７２】
培地３の塩は以下の濃度で使用した：１０×はそれぞれ１０ｇ／Ｌを含む；２×はそれぞれ２ｇ／Ｌを含む；１×はそれぞれ１ｇ／Ｌを含む；０．５×はそれぞれ０．５ｇ／Ｌを含む；または０．２５×はそれぞれ０．２５ｇ／Ｌを含む。
【００７３】
４８時間培養後遠心して細胞を収集した。その後、これらの細胞を凍結乾燥し、乾燥バイオマスを調べた。細胞消化及び脂肪酸測定を、１０％メタノール性塩酸中６０℃で（撹拌しながら）２時間加熱することにより実施した。エステルをガスクロマトグラフィーにより分析して、脂肪酸組成を調べた。
【表４】
2007510422.tif 000005
【００７４】
ナトリウムも塩化物も添加されていない発酵培地の最適塩濃度は、異なる塩濃度を有する上記培地においてウルケニア種２１７９株の微生物を発酵させることにより決定した。この場合、乾燥バイオマスあたりのＤＨＡ含量は海水の５％の塩濃度の場合再び最高であった（実施例１参照）。空時収率で表される生産性もこの塩含量で最適値を有している（表４参照）。
【実施例４】
【００７５】
各種発酵培地におけるシゾキトリウム  ＳＲ２１株（シゾキトリウム種；ＭＹＡ−１３８１；欧州特許出願公開第０８２３４７５号明細書）を用いるＰＵＦＡの産生
シゾキトリウム  ＳＲ２１株をじゃま板を有する３００ｍｌ容量の三角フラスコ中の培地（５０ｍｌ）において培養した（温度：２８℃、振とう速度：１５０ｒｐｍ）。
【００７６】
培地１：ＤＨ１培地
グルコース１水和物（ｇ／Ｌ）：５６．２５
酵母抽出物（ｇ／Ｌ）        ：１２．５［Ｄｉｆｃｏ］
トロピックマリン（ｇ／Ｌ）  ：１６．６５［ドイツ国ワールテンベルクに所在のＤｒ．Ｂｉｅｎｅｒ  ＧｍｂＨ］
ｐＨ値をＨＣｌで６．０に設定。
【００７７】
培地２：ＤＨ２培地（塩なし）
グルコース１水和物（ｇ／Ｌ）：５６．２５
酵母抽出物（ｇ／Ｌ）        ：１２．５［Ｄｉｆｃｏ］
ｐＨ値をＨＣｌで６．０に設定。
【００７８】
培地３：ＤＨ３培地（ナトリウム及び塩化物を添加することなく塩を補充）
グルコース１水和物（ｇ／Ｌ）：５６．２５
酵母抽出物（ｇ／Ｌ）        ：１２．５［Ｄｉｆｃｏ］
硫酸マグネシウム（ｇ／Ｌ）  ：１
炭酸カルシウム（ｇ／Ｌ）    ：１
リン酸カリウム（ｇ／Ｌ）    ：１
ｐＨ値をＨ２ＳＯ４で６．０に設定。
【００７９】
４８時間培養後遠心して細胞を収集した。その後、これらの細胞を凍結乾燥し、乾燥バイオマスを調べた。細胞消化及び脂肪酸測定を、１０％メタノール性塩酸中６０℃で（撹拌しながら）２時間加熱することにより実施した。エステルをガスクロマトグラフィーにより分析して、脂肪酸組成を調べた。
【表５】
2007510422.tif 000006
【表６】
2007510422.tif 000007
【００８０】
ラビリンツラ門（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ）に属する他の生物の場合も本明細書に記載されている低塩培地によりＰＵＦＡの産生が最適化される。よって、シゾキトリウム種ＳＲ２１株の微生物を塩も塩化物も添加されていない低塩培地において発酵させることが可能である。この場合、乾燥バイオマスに対するＤＨＡ含量も塩含量が海水の１０％のとき最適値を有する。更に、ＤＨＡの空時収率及び発酵生産性に対する強い効果も本明細書中に示されている。驚くほど高い空時ＤＨＡ収率に悪影響を与えることなく（表５参照）、全脂肪酸スペクトルに対するＤＨＡ含量もこの場合わずかに低下している（表６参照）。本発明の基礎をなす低塩培地により、ラビリンツラ門のいろいろなメンバーでＰＵＦＡの産生が増加する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】塩濃度に依存したＤＨＡの産生を示す。本発明の範囲内の最大値が明白である(実施例１からのデータ)。
【図２】塩濃度に依存したバイオマス及びＤＨＡ含量を示す。本発明の範囲内の最大値がこの場合にも明白である(実施例１からのデータ)。
【図１】
2007510422.tif 000008
【図２】
2007510422.tif 000009
【国際調査報告】
2007510422.tif 000010
2007510422.tif 000011
2007510422.tif 000012
2007510422.tif 000013
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2007510422.tif 000015
2007510422.tif 000016
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2007510422.tif 000018
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2007510422.tif 000021
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