(57)【要約】【課題】本発明は、ヒアルロン酸の製造方法であって、(a) ヒアルロン酸の生産を促進する培地中でバシラス(Bacillus)細胞を培養し、ここで前記バシラス細胞は、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAをそして「-10」領域に配列TATARTを有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、を含んでなる三重プロモーターを有する核酸構成物を含んでなり、ここで前記三重プロモーターの各プロモーター配列はヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されており;そして(b) 前記培地からヒアルロン酸を単離することを含んでなる方法に関する。本発明はまた、(i)配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAをそして「-10」領域に配列TATARTを有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーターを含んでなる三重プロモーターを含んでなり、前記三重プロモーターの各プロモーター配列がヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されていることを特徴とする核酸構成物を含有するバシラス細胞にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
(a) ヒアルロン酸の生産を促進する培地中でバシラス(Bacillus;桿菌)細胞を培養し、ここで前記バシラス細胞は、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAをそして「-10」領域に配列TATAATを有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、を含んでなる三重プロモーターを有する核酸構成物を含んでなり、ここで前記三重プロモーターの各プロモーター配列はヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されており;そして
(b) 前記培地からヒアルロン酸を単離する;
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
前記変形amyLプロモーターが配列番号1の配列である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記共通プロモーターが、任意の細菌性プロモーターより得られる、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記共通プロモーターが、バシラスプロモーターより得られる、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記共通プロモーターが、E.コリlacオペロン、ストレプトマイセス・セリコロール(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子(dagA)、バシラス・レンタス(Bacillus lentus)アルカリ性プロテアーゼ遺伝子(aprH)、バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)アルカリ性プロテアーゼ遺伝子(サブチリシンCarlsberg遺伝子)、バシラス・サチリス(枯草菌、Bacillus subtilis)レバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バシラス・サチリスα-アミラーゼ遺伝子(amyE)、バシラス・リケニフォルミスα-アミラーゼ遺伝子(amyL)、バシラス・ステアロサーモフィルス麦芽アミラーゼ遺伝子(amyM)、バシラス・アミロリケファシエンスα-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バシラス・リケニフォルミスペニシリナーゼ遺伝子(penP)、バシラス・サチリス(Bacillus subtilis)xylAおよびxylB遺伝子、バシラス・スリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)亜種テネブリオニスcryIIIA遺伝子もしくはその部分、または原核生物のβ-ラクタマーゼ遺伝子に由来するプロモーターより得られる、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記共通プロモーターが、バシラス・アミロリクファシエンスα-アミラーゼ遺伝子(amyQ)である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記共通amyQ プロモーターが、配列番号42または配列番号43のヌクレオチド配列を有する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記共通amyQプロモーターが、配列番号42または配列番号43のヌクレオチド86〜185のヌクレオチド配列を有する、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記cryIIIAプロモーターが、バシラス・スリンジェンシスsubsp.テネブリオニス(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis)から得られる、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸構成物が、三重プロモーターの下流で且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記mRNAプロセシング/安定化配列が、cryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記mRNAプロセシング/安定化配列が、SP82 mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記バシラス細胞が前記核酸構成物の1または複数コピーを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記バシラス細胞が前記核酸構成物の1コピーを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸構成物が選択マーカー遺伝子を更に含んでなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記バシラス細胞が外来の選択マーカー遺伝子を全く含まない、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列が、ヒアルロナンシンターゼ、UDP-グルコース-6-デヒドロゲナーゼ、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、アミドトランスフェラーゼ、ムターゼおよびアセチルトランスフェラーゼ遺伝子から成る群より選ばれる、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸構成物がバシラス細胞の染色体中に含まれる、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸構成物が染色体外要素として含まれる、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
前記バシラス宿主細胞が、バシラス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)、バシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・ブレビス(Bacillus brevis)、バシラス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バシラス・クラウシィ(Bacillus clausii)、バシラス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、バシラス・ファーマス(Bacillus firmus)、バシラス・ロウタス(Bacillus lautus)、バシラス・レンタス(Bacillus lentus)、バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・プミリス(Bacillus pumilus)、バシラス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バシラス・サチリス(Bacillus subtilis)もしくはバシラス・スリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
前記バシラス細胞がバシラス・サチリス細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
前記バシラス細胞がバシラス・リケニフォルミス細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
(a) 配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域にTTGACA配列と「-10」領域にTATAAT配列を有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、からなる三重プロモーターであって、前記三重プロモーターの各プロモーター配列は、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されている、三重プロモーター;並びに所望により(b)前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列、を含んでなる核酸構成物を含有するバシラス細胞。
【請求項２４】
前記変形amyLプロモーターが配列番号1である、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項２５】
前記共通プロモーターが任意の細菌性プロモーターより得られる、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項２６】
前記共通プロモーターがバシラスプロモーターより得られる、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項２７】
前記共通プロモーターが、E.コリ lacオペロン、ストレプトマイセス・セリコロール(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子(dagA)、バシラス・レンタス(Bacillus lentus)アルカリ性プロテアーゼ遺伝子(aprH)、バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)アルカリ性プロテアーゼ遺伝子(サブチリシンCarlsberg遺伝子)、バシラス・サチリス(枯草菌、Bacillus subtilis)レバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バシラス・サチリスα-アミラーゼ遺伝子(amyE)、バシラス・リケニフォルミスα-アミラーゼ遺伝子(amyL)、バシラス・ステアロサーモフィルス麦芽アミラーゼ遺伝子(amyM)、バシラス・アミロリケファシエンスα-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バシラス・リケニフォルミスペニシリナーゼ遺伝子(penP)、バシラス・サチリスxylAおよびxylB遺伝子、バシラス・スリンジェンシス亜種テネブリオニス(Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis)cryIIIA遺伝子もしくはそれの部分;または原核生物β-ラクタマーゼ遺伝子に由来するプロモーターより得られる、請求項23のバシラス細胞。
【請求項２８】
前記共通プロモーターが、バシラス・アミロリクファシエンスα-アミラーゼ遺伝子(amyQ)より得られる、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項２９】
前記共通amyQプロモーターが、配列番号42または配列番号43のヌクレオチド配列を有する、請求項28に記載のバシラス細胞。
【請求項３０】
前記共通amyQプロモーターが、配列番号42または配列番号43のヌクレオチド86〜185のヌクレオチド配列を有する、請求項29に記載のバシラス細胞。
【請求項３１】
前記cryIIIAプロモーターがバシラス・スリンジェンシス亜種テネブリオニスより得られる、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項３２】
前記核酸構成物が、前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなる、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項３３】
前記mRNAプロセシング/安定化配列がcryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項32に記載のバシラス細胞。
【請求項３４】
前記mRNAプロセシング/安定化配列がSP82 mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項32に記載のバシラス細胞。
【請求項３５】
前記バシラス細胞が前記核酸構成物の1または複数コピーを含む、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項３６】
前記バシラス細胞が前記核酸構成物の1コピーを含む、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項３７】
前記核酸構成物が選択マーカー遺伝子を更に含んでなる、請求項23のバシラス細胞。
【請求項３８】
前記バシラス細胞が外来の選択マーカー遺伝子を全く含まない、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項３９】
前記ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列が、ヒアルロナンシンターゼ、UDP-グルコース-6-デヒドロゲナーゼ、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、アミドトランスフェラーゼ、ムターゼおよびアセチルトランスフェラーゼ遺伝子から成る群より選ばれる、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項４０】
前記核酸構成物がバシラス細胞の染色体中に含まれる、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項４１】
前記核酸構成物が染色体外要素として含まれる、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項４２】
前記バシラス宿主細胞が、バシラス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)、バシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・ブレビス(Bacillus brevis)、バシラス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バシラス・クラウシィ(Bacillus clausii)、バシラス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、バシラス・ファーマス(Bacillus firmus)、バシラス・ロウタス(Bacillus lautus)、バシラス・レンタス(Bacillus lentus)、バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・プミリス(Bacillus pumilus)、バシラス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バシラス・サチリス(Bacillus subtilis)もしくはバシラス・スリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)細胞である、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項４３】
前記バシラス細胞がバシラス・サチリス細胞である、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項４４】
前記バシラス細胞がバシラス・リケニフォルミス細胞である、請求項23に記載のバシラス細胞。
【請求項４５】
バシラス細胞の選択マーカー欠失変異体の製造方法であって、バシラス細胞の選択マーカー遺伝子を削除することを含んでなり、ここで前記バシラス細胞が、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域にTATAAT配列を有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーターを含んで成る三重プロモーターを含有する核酸構成物を含んでなり、ここで前記三重プロモーターの各プロモーターが、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されていることを特徴とする方法。
【請求項４６】
前記変形amyLプロモーターが、配列番号1のヌクレオチド配列である、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記共通プロモーターが任意の細菌プロモーターより得られる、請求項45に記載の方法。
【請求項４８】
前記共通プロモーターがバシラスプロモーターより得られる、請求項45に記載の方法。
【請求項４９】
前記共通プロモーターが、E.コリ lacオペロン、ストレプトマイセス・セリコロール(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子(dagA)、バシラス・レンタス(Bacillus lentus)アルカリ性プロテアーゼ遺伝子(aprH)、バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)アルカリ性プロテアーゼ遺伝子(サブチリシンCarlsberg遺伝子)、バシラス・サチリス(枯草菌、Bacillus subtilis)レバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バシラス・サチリスα-アミラーゼ遺伝子(amyE)、バシラス・リケニフォルミスα-アミラーゼ遺伝子(amyL)、バシラス・ステアロサーモフィルス麦芽アミラーゼ遺伝子(amyM)、バシラス・アミロリケファシエンスα-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バシラス・リケニフォルミスペニシリナーゼ遺伝子(penP)、バシラス・サチリスxylAおよびxylB遺伝子、バシラス・スリンジェンシス亜種テネブリオニス(Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis)cryIIIA遺伝子もしくはそれの部分;または原核生物β-ラクタマーゼ遺伝子に由来するプロモーターより得られる、請求項45に記載の方法。
【請求項５０】
前記共通プロモーターが、バシラス・アミロリクファシエンスα-アミラーゼ遺伝子(amyQ)より得られる、請求項45に記載の方法。
【請求項５１】
前記共通amyQプロモーターが、配列番号42または配列番号43のヌクレオチド配列を有する、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
前記共通amyQプロモーターが、配列番号42または配列番号43のヌクレオチド86〜185のヌクレオチド配列を有する、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
前記cryIIIAプロモーターがバシラス・スリンジェンシス亜種テネブリオニスより得られる、請求項45に記載の方法。
【請求項５４】
前記核酸構成物が、前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなる、請求項45に記載の方法。
【請求項５５】
前記mRNAプロセシング/安定化配列がcryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記mRNAプロセシング/安定化配列がSP82 mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項54に記載の方法。
【請求項５７】
前記バシラス細胞が前記核酸構成物の1または複数コピーを含む、請求項45に記載の方法。
【請求項５８】
前記バシラス細胞が前記核酸構成物の1コピーを含む、請求項45に記載の方法。
【請求項５９】
前記核酸構成物が選択マーカー遺伝子を更に含んでなる、請求項45に記載の方法。
【請求項６０】
前記バシラス細胞が外来の選択マーカー遺伝子を全く含まない、請求項45に記載の方法。
【請求項６１】
前記ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列が、ヒアルロナンシンターゼ、UDP-グルコース-6-デヒドロゲナーゼ、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、アミドトランスフェラーゼ、ムターゼおよびアセチルトランスフェラーゼ遺伝子から成る群より選ばれる、請求項45に方法。
【請求項６２】
前記核酸構成物がバシラス細胞の染色体中に含まれる、請求項45に記載の方法。
【請求項６３】
前記核酸構成物が染色体外要素上に含まれる、請求項45に記載の方法。
【請求項６４】
前記バシラス宿主細胞が、バシラス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)、バシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・ブレビス(Bacillus brevis)、バシラス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バシラス・クラウシィ(Bacillus clausii)、バシラス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、バシラス・ファーマス(Bacillus firmus)、バシラス・ロウタス(Bacillus lautus)、バシラス・レンタス(Bacillus lentus)、バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・プミリス(Bacillus pumilus)、バシラス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バシラス・サチリス(Bacillus subtilis)もしくはバシラス・スリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)細胞である、請求項45に記載の方法。
【請求項６５】
前記バシラス細胞がバシラス・サチリス細胞である、請求項45に記載の方法。
【請求項６６】
前記バシラス細胞がバシラス・リケニフォルミス細胞である、請求項45に記載の方法。
【請求項６７】
請求項45の方法により得られる、バシラス細胞の選択マーカー欠失変異体。
【請求項６８】
バシラス宿主細胞を獲得する方法であって、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域にTATAAT配列を有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーターを含んで成る三重プロモーターを含有する核酸構成物を、バシラス細胞中に導入し、ここで前記三重プロモーターの各プロモーターが、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されていることを特徴とする方法。
【請求項６９】
前記核酸構成物が、前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなる、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
前記mRNAプロセシング/安定化配列がcryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
前記mRNAプロセシング/安定化配列がSP82 mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項69に記載の方法。
【請求項７２】
配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域にTATAAT配列を有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、を含んで成る三重プロモーターを含有する核酸構成物。
【請求項７３】
前記核酸構成物が、前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなる、請求項72に記載の核酸構成物。
【請求項７４】
前記mRNAプロセシング/安定化配列がcryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項73に記載の核酸構成物。
【請求項７５】
前記mRNAプロセシング/安定化配列がSP82 mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項73に記載の核酸構成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌細胞中でのヒアルロン酸の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、β-1,4-グリコシド結合とβ-1,3-グリコシド結合により交互に連結したN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)とグルクロン酸(GlcUA)の二糖の繰り返し単位から構成される非硫酸化グリコサミノグリカンである。体内におけるヒアルロン酸の役割は数多く同定されている(Laurent T.C. & Fraser J.R.E., 1992, FASEB J. 6: 2397-2404;Toole B.P., 1991,"Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis and differentiation." In: Cell Biology of the Extracellular Matrix, pp. 305-341, Hay E.D.編、Plenum, New York参照)。ヒアルロン酸は硝子軟骨、滑液、並びに上皮と表皮の両方の皮膚組織に存在する。ヒアルロン酸は多数の生理学的役割、例えば接着、発達、細胞運動性、癌、血管形成および創傷治癒において役割を果たしていると思われる。ヒアルロン酸は独特な物理的および生物学的性質を有するため、眼や関節の手術に使用される。整形外科学、リウマチ学および皮膚学用のヒアルロン酸製品も開発されている。
【０００３】
従来、ニワトリのトサカ(鶏冠)がヒアルロン酸の一般的な入手源である。しかしながら、ヒアルロン酸の生合成のための遺伝子を含む組換え微生物の使用が代替法として浮上してきている。
【０００４】
バシラス菌類は、生来のおよび組換えタンパク質の生産のための宿主細胞系として十分に確立されている。米国特許出願第2002/0160489号は、ストレプトコッカス・ピオジェネス(Streptococcus pyogenes)のヒアルロナンシンターゼ遺伝子とUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の一方または両方を含む3種のバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)株の作製を開示している。
【０００５】
米国特許出願第2003/0092118号は、プロモーターの調節下にストレプトコッカス・エキシミリス(Streptococcus equisimilis)、ストレプトコッカス・ピオジェネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ユベリス(Streptococcus uberis)、パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)、スルホロバス・ソルファクタリカス(Sulfolobus solfactaricus)、バシラス・アンスラシス(Bacillus anthracis)pXO1、パラメシウム・ブルサリア・クロレラウイルス(Paramecium bursaria Chlorella)またはエクトカルパス・シリクロサス(Ectocarpus siliculosus)ウイルス由来のヒアルロナンシンターゼ遺伝子を含んでなる組換えバシラス宿主細胞を、ヒアルロン酸の生産に使用することを記載している。WO 03/054163公報は、ヒアルロナンシンターゼコード配列に対して異種のプロモーター配列に作用可能に連結されたヒアルロナンシンターゼコード配列を含んでなる核酸構成物を含有するバシラス宿主細胞を培養することにより、ヒアルロン酸を生産する方法を記載している。
【０００６】
米国特許第6,255,076号および同第5,955,310号明細書は、バシラス細胞中での酵素の発現のための縦列プロモーターおよび構成物並びにその使用方法を記載している。バシラス中での改良生産のためのcryIIIA安定化配列の使用もその中に記載されている。WO 03/095658公報は、amyL4199、単鎖共通amyQおよびcryIIIAプロモーター配列から構成された三重プロモーターを開示している。
本発明の目的は、バシラス株において、ヒアルロン酸を生産する改良方法を提供することにある。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、ヒアルロン酸の生産方法であって、(a)ヒアルロン酸の生産を促す培地中でバシラス宿主細胞を培養し、ここで前記バシラス細胞は、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域にTTGACA配列と「-10」領域にTATAAT配列を有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、からなる三重プロモーターを含んでなる核酸構成物を含み、ここで前記三重プロモーターの各プロモーター配列は、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されており;そして(b)培地からヒアルロン酸を単離することを含んで成るヒアルロン酸の生産方法に関する。好ましい観点によれば、前記核酸構成物は、前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなる。
【０００８】
本発明は、また、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域にTTGACA配列と「-10」領域にTATAAT配列を有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、からなる三重プロモーターを含んでなる核酸構成物を含有するバシラス細胞にも関し、ここで前記三重プロモーターの各プロモーター配列は、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されている。好ましい面によれば、前記核酸構成物は、前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなる。
【０００９】
本発明は、バシラス細胞の選択マーカー欠失変異体の作製方法であって、バシラス細胞の選択マーカー遺伝子を削除することを含んでなり、ここで前記バシラス細胞は、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域にTTGACA配列と「-10」領域にTATAAT配列を有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、からなる三重プロモーターを含んでなる核酸構成物を含有し、ここで前記三重プロモーターの各プロモーター配列はヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されている。
【００１０】
本発明はまた、バシラス宿主細胞の生産方法であって、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域にTTGACA配列と「-10」領域にTATAAT配列を有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、からなる三重プロモーターを含んでなる核酸構成物をバシラス細胞に導入することを含んでなり、ここで前記三重プロモーターの各プロモーター配列はヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されていることを特徴とする方法にも関する。
【００１１】
本発明は更に、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域にTTGACA配列と「-10」領域にTATAAT配列を有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、からなる三重プロモーターを含んでなる核酸構成物であって、ここで前記三重プロモーターの各プロモーター配列がヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されている、核酸構成物にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、ヒアルロン酸の生産方法であって、(a)ヒアルロン酸の生産を促す培地中でバシラス宿主細胞を培養し、ここで前記バシラス細胞は、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域にTTGACA配列と「-10」領域にTATAAT配列を有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、からなる三重プロモーターを含んでなる核酸構成物を含み、ここで前記三重プロモーターの各プロモーター配列は、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されており;そして(b)培地からヒアルロン酸を単離することを含んで成るヒアルロン酸の生産方法に関する。本発明の方法では、前記核酸構成物が前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなるのがより好ましい。
【００１３】
ヒアルロン酸
「ヒアルロン酸」とは、本明細書中では、β-1,4-グリコシド結合とβ-1,3-グリコシド結合により交互に一緒に連結されたN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)とグルクロン酸(GlcUA)の二糖繰り返し単位から構成された非硫酸化グリコサミノグリカンとして定義される。ヒアルロン酸はヒアルロナン、ヒアルロネートまたはHAとしても知られ、本明細書中でそれらは相互に交換可能に使われる。
【００１４】
好ましい面によれば、本発明の方法により得られるヒアルロン酸は約10,000〜約10,000,000ダルトン(Da)の分子量を有する。より好ましい面によれば、本発明の方法により得られるヒアルロン酸は約25,000〜約5,000,000Daの分子量を有する。最も好ましい面では、本発明の方法により得られるヒアルロン酸は約50,000〜約3,000,000Daの分子量を有する。
【００１５】
本発明のバシラス宿主細胞により生産されるヒアルロン酸のレベルは、改良カルバゾール法(Bitter & Muir, 1962, Anal Biochem. 4: 330-334)に従って決定することができる。更に、ヒアルロン酸の平均分子量は、当該技術の標準法、例えばUeno他、1988, Chem. Pharm. Bull. 36: 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta. 272: 1-40;およびWyatt Technologies, 1999, “Light Scattering University DAWN Couse Manual" and “DAWN EOS Manual", Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, Calforniaを使って決定することができる。
【００１６】
本発明の方法により得られるヒアルロン酸は、ヒアルロン酸を改変するための当該技術において知られるさまざまな方法に付することができ、例えば、米国特許第5,616,568号、同第5,652,347号および同第5,874,417号明細書中に記載されたようにして架橋せしめることができる。更に、ヒアルロン酸の分子量を周知技術を使って変更することができる。
【００１７】
宿主細胞
本発明は、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAと「-10」領域に配列TATAATを有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、からなる三重プロモーターを含んでなるバシラス細胞であって、ここで前記三重プロモーターの各プロモーター配列はヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されている、バシラス細胞にも関する。好ましい面によれば、核酸構成物は、前記三重プロモーターの下流で且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流の位置に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなる。別の好ましい面においてば、前記バシラス細胞は外来のまたは異種の選択マーカー遺伝子を欠いている。
【００１８】
本発明は、バシラス宿主細胞を獲得する方法であって、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAと「-10」領域に配列TATAATを有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、からなる三重プロモーターを含んでなる核酸構成物をバシラス細胞中に導入することを含んでなり、ここで前記三重プロモーターの各プロモーター配列がヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されている、バシラス宿主細胞を獲得する方法にも関する。好ましい面では、前記核酸構成物が、前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなる。
【００１９】
本発明の方法では、バシラス宿主細胞は、ヒアルロン酸の組換え生産に適した任意のバシラス細胞であることができる。バシラス宿主細胞は野生型バシラス細胞またはその変異体のいずれでもよい。本発明の実施において有用なバシラス細胞としては、非限定的に、バシラス・アガラデレンス(Bacillus agaraderhens)、バシラス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)、バシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・ブレビス(Bacillus brevis)、バシラス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バシラス・クラウシィ(Bacillus clausii)、バシラス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、バシラス・ファームス(Bacillus firmus)、バシラス・ロータス(Bacillus lautus)、バシラス・レンタス(Bacillus lentus)、バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・ピュミラス(Bacillus pumilus)、バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、バシラス・サチリス(Bacillus subtilis)およびバシラス・スリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)細胞を挙げることができる。組換え発現に特に適する変異体バシラス・サチリス細胞はWO 98/22598中に記載されている。本発明では、非莢膜バシラス細胞が特に有用である。
【００２０】
好ましい面によれば、バシラス宿主細胞は、バシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・クラウシィ(Bacillus clausii)、バシラス・レンタス(Bacillus lentus)、バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)またはバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)細胞である。より好ましい面では、バシラス細胞はバシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)細胞である。別のより好ましい面では、バシラス細胞はバシラス・クラウシィ(Bacillus clausii)細胞である。
【００２１】
別のより好ましい面では、バシラス細胞はバシラス・レンタス(Bacillus lentus)細胞である。別のより好ましい面では、バシラス細胞はバシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)細胞である。別のより好ましい面では、バシラス宿主細胞はバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)細胞である。最も好ましい面では、バシラス宿主細胞はバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)A164Δ5またはバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)168Δ4(米国特許第5,891,701号明細書を参照のこと)である。別の最も好ましい面では、バシラス宿主細胞はバシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)SJ1904である(米国特許第5,733,753号明細書を参照のこと)。
【００２２】
本発明の核酸構成物を用いたバシラス宿主細胞の形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換により(例えばChang & Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115参照)、コンピテント細胞を使うことにより(例えばYoung & Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829またはDubnau & Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221参照)、エレクトロポレーションにより(例えばShigekawa & Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751参照)、または接合により(例えばKoehler & Thorne, 1987, Journal of Biotechnology 169: 5271-5278参照)、実施することができる。
【００２３】
核酸構成物
ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数の遺伝子に作用可能に連結された三重プロモーター、または三重プロモーターとmRNAプロセシング/安定化配列を含んでなるバシラス細胞の作製は、当該技術分野で周知の方法を使って、前記三重プロモーターを、あるいはその上更にmRNAプロセシング/安定化配列を、前記1または複数の遺伝子に作用可能に連結せしめることによって前記1または複数の遺伝子を変更し、前記構成物をベクター中に挿入し、そして前記ベクターを相同組換えによりバシラス細胞の染色体中に導入するかまたは染色体外自己複製要素として(例えばプラスミドとして)バシラス細胞中に導入することにより達成することができる。しかしながら、当該技術分野で周知の方法を使って、バシラス細胞の生体内で前記1または複数の遺伝子を操作できることは、理解され得るところだろう。
【００２４】
「核酸構成物」とは、本明細書中では、天然に存在する遺伝子から単離されたものかまたは天然に存在しないような形で組み合わされそして連結された核酸のセグメントを含むように変更されている、一本鎖もしくは二本鎖のいずれかの核酸分子として定義される。核酸構成物という用語は、その核酸構成物がコード配列の発現に必要な調節配列を全て含む時には、発現カセットという用語と同意義である。
【００２５】
「プロモーター」とは、本明細書中では、遺伝子の転写を開始させるRNAポリメラーゼの結合に関与する核酸配列として定義される。
【００２６】
「三重プロモーター」とは、各々が1または複数のコード配列に作用可能に連結されており且つその1または複数のコード配列のmRNAへの転写を媒介する、縦列の3つのプロモーター配列として定義される。
【００２７】
「作用可能に連結された」とは、調節配列例えば三重プロモーターが、コード配列によりコードされるヒアルロン酸の生産を指令するように該コード配列に対する位置のところに適切に置かれている配置として定義される。
【００２８】
「コード配列」とは、適当な調節配列の調節下に置かれたときにmRNAに転写されそしてヒアルロン酸の生合成に関与する酵素(または別のタンパク質)に翻訳されるヌクレオチド配列として定義される。コード配列の境界は一般に、mRNAの5'末端のところの転写解読枠のすぐ上流に置かれたリボソーム結合部位と、該mRNAの3'末端のところの転写解読枠のすぐ下流に置かれた転写ターミネーター配列とにより決定される。コード配列としてはゲノムDNA、cDNA、半合成、合成および組換え核酸を挙げることができるが、それらに限定されない。
【００２９】
ポリペプチド(例えば酵素)をコードする遺伝子を単離またはクローニングするために用いる技術は当該技術分野で周知であり、例えば、ゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。そのようなゲノムDNAからの遺伝子のクローニングは、例えば、発現ライブラリーの抗体スクリーニング法を使って共通の構造的特徴を有するクローン化DNA断片を検出することにより、または周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法により、達成することができる。
【００３０】
例えば、Innis他、1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New Yorkを参照のこと。別の核酸増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応法、連結活性化転写法、および核酸配列に基づく増幅法を使うことができる。クローニング手順は、ポリペプチドをコードする遺伝子を含んでなる所望の核酸断片の切除と単離、該遺伝子のベクター分子中への挿入、および該ヌクレオチド配列のクローンが複製されるようなバシラス細胞中への組換えベクターの取り込みを包含する。遺伝子はゲノムDNA、cDNA、RNA、半合成、合成起源またはそれらの任意の組み合わせであることができる。
【００３１】
ヒアルロン酸の生合成に関与する酵素(または別のタンパク質)をコードする単離された遺伝子は、該酵素(または別のタンパク質)の発現に備えて様々なやり方で操作することができる。発現ベクターまたはバシラス宿主細胞に依存して、構成物またはベクター中への挿入前に遺伝子配列の操作が望ましいかまたは必要となることがある。クローニング法を使ってヌクレオチド配列を修飾する技術は当該技術分野で周知である。遺伝子の配列は、当該技術分野で周知の方法を用いて宿主細胞中において生体内で操作することもできる。
【００３２】
多数の酵素がヒアルロン酸の生合成に関与している。本発明の方法では、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数の遺伝子として、ヒアルロナンシンターゼ、UDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼ、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスフォリラーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、アミドトランスフェラーゼ、ムターゼおよびアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されない。ヒアルロナンシンターゼはヒアルロン酸の生産における鍵酵素である。
【００３３】
「ヒアルロナンシンターゼ」は、GlcUAおよびGlcNAc糖前駆体の付加によってヒアルロナン鎖の伸長を触媒する酵素として定義される。緑膿菌ヒアルロナンシンターゼ、脊椎動物ヒアルロナンシンターゼ、およびウイルスヒアルロナンシンターゼは、パスツレラ(Pasteurella)ヒアルロナンシンターゼとは異なり、第I群およびII群ヒアルロナンシンターゼとして分類されると提唱されている。第I群ヒアルロナンシンターゼとしては、緑膿菌ヒアルロナンシンターゼが挙げられる(DeAngelis, 1999, Cell. Mol. Life Sci. 56:670-682)。バシラス宿主細胞中でのヒアルロナンの生産のために、真核細胞起源のヒアルロナンシンターゼ、例えば哺乳類ヒアルロナンシンターゼを使うこともできるが、あまり好ましくない。
【００３４】
ヒアルロナンシンターゼ遺伝子は、バシラス宿主細胞中で発現可能である任意のヒアルロナンシンターゼ遺伝子であることができる。該遺伝子は任意の起源のものであることができる。好ましいヒアルロナンシンターゼ遺伝子としては、第I群またはII群のいずれかのもの、例えばストレプトコッカス・エキシミリス(Streptococcus equisimilis)、ストレプトコッカス・ピロゲネス(Streptococcus pyrogenes)、ストレプトコッカス・ユベリス(Streptococcus ubelis)およびストレプトコッカス・エキ(Streptococcus equi)subsp. ズーエピデミクス(Zooepidemicus)由来の第I群ヒアルロナンシンターゼ遺伝子、またはパスツレラ・マルトシダ(Pasturella multocida)の第II群ヒアルロナンシンターゼ遺伝子が挙げられる。
【００３５】
本明細書中に開示するヌクレオチド配列またはその部分配列、並びにそのアミノ酸配列またはその断片は、当該業界で周知の方法に従って、別の属または種の菌株からヒアルロン酸の生合成に関与する酵素をコードするDNAを同定・クローニングするための核酸プローブをデザインする目的に利用することができる。特に、そのようなプローブは、標準的サザンブロット法に従って、対応する遺伝子を同定し単離する目的で、着目の属または種のゲノムDNAまたはcDNAとのハイブリダイゼーションに用いることができる。そういったプローブは完全な配列よりもかなり短いが、少なくとも14、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、最も好ましくは少なくとも70ヌクレオチドの長さであるべきである。もっと長いプローブを使うこともできる。DNAプローブとRNAプローブの両方とも使用できる。プローブは典型的には対応する遺伝子を検出するために標識される(例えば32P,3H,35S,ビオチンまたはアビジンにより)。
【００３６】
かくして、そのような別の生物から調製したゲノムDNAまたはcDNAライブラリーを、上述のプローブとハイブリダイズし且つヒアルロン酸の生合成経路の中の酵素をコードするDNAについてスクリーニングすることができる。そのような別の生物由来のゲノムDNAまたは他のDNAは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動または他の分離技術により分離される。ライブラリーからのDNAまたは分離したDNAをニトロセルロースまたは別の適当な担体材料上に移行・固定化することができる。本明細書中に開示するヌクレオチド配列またはその部分配列と相同であるクローンまたはDNAを同定するために、その担体材料をサザンブロット法に用いることができる。本発明の目的上、ハイブリダイゼーションとは、核酸配列が、超低緊縮性から超高緊縮性条件下で、本明細書中に開示するヌクレオチド配列、その相補鎖または部分配列に相当する標識された核酸プローブにハイブリダイズすることを意味する。上記条件下で核酸プローブとハイブリダイズした分子は、X線フィルムを使って検出することができる。
【００３７】
少なくとも長さが100ヌクレオチドの長鎖プローブの場合、超低〜超高緊縮性条件とは、最適には標準サザンブロット法に従って、5×SSPE,0.3%SDS,200μg/mlせん断変性サケ精子DNA、25%ホルムアミド(超低〜低緊縮性条件の場合)、35%ホルムアミド(中〜中高緊縮性条件の場合)または50%ホルムアミド(高〜超高緊縮性条件の場合)のいずれかの中での42℃での12〜24時間の予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。
【００３８】
長さが少なくとも100ヌクレオチドの長鎖プローブの場合、担体材料は最後に2×SSC、0.2%SDSを使って、好ましくは少なくとも45℃(超低緊縮性)、より好ましくは少なくとも50℃(低緊縮性)、より好ましくは少なくとも55℃(中緊縮性)、より好ましくは少なくとも60℃(中〜高緊縮性)、更により好ましくは少なくとも65℃(高緊縮性)、および最も好ましくは少なくとも70℃(非常に高い緊縮性)で、各々15分間ずつ3回洗浄する。
【００３９】
長さが約15ヌクレオチドから約70ヌクレオチドである短鎖プローブの場合、緊縮性条件は、標準サザンブロット法に従って、0.9M NaCl,0.09M Tris-HCl pH 7.6、6 mM EDTA、0.5%NP-40、1×デンハーツ溶液、1mMピロリン酸ナトリウム、1mM一塩基性リン酸ナトリウム、0.1mM ATPおよび1mlあたり0.2mgの酵母RNA中で、Bolton & McCarthyに従った計算法を使って算出されたTmより約5℃から約10℃低い温度において、最適には12時間から24時間の間の予備ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄後ハイブリダイゼーションとして定義される。
【００４０】
長さ約15ヌクレオチドから約70ヌクレオチドである短鎖プローブの場合、担体材料は、算出されたTmより5℃から10℃低い温度において、6×SSC+0.1%SDS中で15分間1回、次いで6×SSCを使って15分間ずつ2回洗浄される。
好ましい観点では、ヒアルロナンシンターゼ遺伝子は第I群ヒアルロナンシンターゼ遺伝子である。
【００４１】
より好ましい面では、第I群ヒアルロナンシンターゼ遺伝子は、(a)  配列番号3、配列番号5または配列番号7に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更に最も好ましくは少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を持つヒアルロナンシンターゼをコードする遺伝子;(b)  配列番号2、配列番号4または配列番号6のものと低、中、中高または高緊縮性条件下でハイブリダイズする遺伝子;および(c)上記(a)または(b)の相補鎖から成る群より選ばれる。
【００４２】
本発明の目的上、2つのアミノ酸配列間の同一性(相同性)の程度は、LASERGENETM MEGALIGNTMソフトウエア(DNASTAR, Inc., Madiosn, WI)を使って、同一性表と次の多重アラインメント(整列)パラメーター:ギャップペナルティ=10、ギャップ長さペナルティ=10を使って、Clustal法(Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153)により決定される。整列パラメーターはKtuple=1、ギャップペナルティ=3、ウインドウ=5および対角線=5であった。
【００４３】
最も好ましい面では、第I群ヒアルロナンシンターゼ遺伝子は、配列番号3、配列番号5または配列番号7のアミノ酸配列を有するヒアルロナンシンターゼ;またはヒアルロナンシンターゼ活性を有するそれの断片をコードする。
別の好ましい面では、ヒアルロナンシンターゼ遺伝子は第II群ヒアルロナンシンターゼ遺伝子である。
【００４４】
より好ましい面では、第II群ヒアルロナンシンターゼ遺伝子は(a)  配列番号9に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更に最も好ましくは少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を持つヒアルロナンシンターゼをコードする遺伝子;(b)  配列番号8のものと低、中、中高または高緊縮性条件下でハイブリダイズする遺伝子;および(c)上記(a)または(b)の相補鎖から成る群より選ばれる。
【００４５】
最も好ましい面では、第II群ヒアルロナンシンターゼ遺伝子は、配列番号9のアミノ酸配列を有するヒアルロナンシンターゼ、またはヒアルロナンシンターゼ活性を有するその断片をコードする。
【００４６】
本発明において使用することができる別のヒアルロナンシンターゼは、バシラス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、スルフォロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)、エクトカルパス・シリクロサス(Ectocarpus siliculosus)ウイルス、およびパラメシウム・ブルサリア・クロレラ(Paramecium bursaria Chlorella)ウイルス(PBCV-1)由来のヒアルロナンシンターゼ遺伝子である。
【００４７】
別の好ましい面では、ヒアルロナンシンターゼ遺伝子は、(a)  配列番号11、配列番号13、配列番号15または配列番号17に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更に最も好ましくは少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を持つヒアルロナンシンターゼをコードする遺伝子;(b)  配列番号10、配列番号12、配列番号14または配列番号16のものと低、中、中高または高緊縮性条件下でハイブリダイズする遺伝子;および(c)前記(a)または(b)の相補鎖から成る群より選ばれる。
【００４８】
より好ましい面では、ヒアルロナンシンターゼ遺伝子は、配列番号11、配列番号13、配列番号15もしくは配列番号17のアミノ酸配列を有するヒアルロナンシンターゼ;またはヒアルロナンシンターゼ活性を有するその断片をコードする。
【００４９】
本発明の方法は、ヒアルロナンの前駆体の糖が、核酸構成物中に存在する内在性遺伝子により、非内在性遺伝子により、または内在性と非内在性遺伝子の組み合わせによりコードされることによって、宿主細胞に供給される核酸構成物も包含する、前駆体糖はD-グルクロン酸またはN-アセチルグルコサミンであることができる。
【００５０】
本発明の方法では、前記核酸構成物が、ヒアルロナンの前駆体糖の生合成に関与する酵素をコードする1または複数の遺伝子を更に含んでもよい。あるいは、バシラス宿主細胞が、前駆体糖の生合成に関与する酵素をコードする1または複数の遺伝子を含んでなる1または複数の第二の核酸構成物を更に含んでもよい。ヒアルロナン生産は、ヒアルロナンの前駆体糖の生合成経路の中の一段階を指令する1または複数の遺伝子を含む構成物を用いることにより改善される。「ヒアルロナンの前駆体糖の生合成経路の中の一段階を指令する」という文章は、該遺伝子から発現される酵素が、N-アセチルグルコサミンもしくはD-グルクロン酸、またはN-アセチルグルコサミンとD-グルクロン酸のいずれかの前駆体である糖の形成に作用することを意味する。
【００５１】
前駆体糖を供給するための好ましい方法では、ヒアルロナンの前駆体糖の生合成経路の酵素をコードする1または複数の遺伝子に作用可能に連結された三重プロモーターを含む組換え構成物を有する宿主細胞を培養することによって、ヒアルロナンシンターゼ遺伝子を生来に含有する宿主細胞中でのヒアルロナン生産を改善するように、構成物が提供される。好ましい方法では、宿主細胞は、ヒアルロナンシンターゼに作用可能に連結された三重プロモーターを有する組換え構成物も更に含んでなる。従って、本発明は、ヒアルロナンの前駆体糖の生合成経路の中の一段階を指令する1または複数の遺伝子を含む構成物を使用することによりヒアルロナン生産を改善するための構成物にも関する。核酸構成物中のそのような遺伝子は、本明細書中に記載される三重プロモーターに作用可能に連結される。
【００５２】
ヒアルロン酸の生産のための前駆体糖の生合成に関与する遺伝子としては、UDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼ遺伝子、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ遺伝子、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ遺伝子、ヘキソキナーゼ遺伝子、ホスホグルコムターゼ遺伝子、アミドトランスフェラーゼ遺伝子、ムターゼ遺伝子およびアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【００５３】
ヒアルロナンシンターゼ遺伝子を含む細胞中では、hasB,hasCおよびhasDのいずれか1つもしくは2つ以上の組み合わせ、またはそれの相同体、例えばバシラス・サチリスtuaD,gtaBおよびgcaD、並びにhasEが、ヒアルロナンシンターゼに利用可能な前駆体糖のプールを増加させるために発現可能である。バシラス・サチリスゲノムは、"Kunst他、Nature 390, 249-256, "The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis" (1997年11月20日)中に記載されている。場合によっては、宿主細胞が例えば生来のヒアルロナンシンターゼ活性を有さないような場合には、構成物はhasA遺伝子を更に含んでなる。
【００５４】
生合成酵素をコードする遺伝子は、宿主細胞に対して生来であってもよいが、別の場合には、生来の遺伝子と異種の遺伝子の組み合わせを使用することができる。1または複数の遺伝子が1つの構成物の中に含まれる場合、それらは生来のオペロンの中で互いに連結している遺伝子、例えばhasA,hasB,hasDおよびhasCを含んでなるストレプトコッカス・エキシミリス(Streptococcus equisimilis)のHASオペロンの遺伝子である。別の場合、オペロンの全ての成分が含まれているわけではない前駆体遺伝子のある種の組み合わせの使用が望ましいこともある。宿主細胞にとって生来である遺伝子と、外来である他の遺伝子の使用も好ましい場合がある。その選択は、特定の宿主細胞における利用可能な糖のプール、宿主細胞の別の機能に妨害されることなく過剰生産を調節することができる細胞の能力、および細胞が外来遺伝子よりも生来の遺伝子からの発現を区別して制御するかどうか、に依存するだろう。
【００５５】
一例として、代謝要件および細胞の増殖状態並びに利用可能な前駆体糖プールに依存して、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、例えばhasD遺伝子、バシラスgcaD遺伝子またはその相同体の発現により、N-アセチルグルコサミンの生産を増加させることが望ましい場合がある。あるいは、前駆体糖がD-グルクロン酸であることができる。そのような場合には、該遺伝子はUDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼをコードする。そのような遺伝子としては、バシラスtuaD遺伝子、ストレプトコッカスのhasB遺伝子またはその相同体が挙げられる。別の遺伝子は、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、例えばバシラスgtaB遺伝子、ストレプトコッカスのhasC遺伝子またはその相同体をコードすることができる。
【００５６】
本発明の方法では、UDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼ遺伝子はhasB遺伝子もしくはtuaD遺伝子またはその相同体であることができる。
【００５７】
好ましい面では、hasB遺伝子は、次の群:(a)配列番号19、配列番号21または配列番号23に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、または更に最も好ましくは少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を持つUDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子;(b)低、中、中高または高緊縮性条件下で配列番号18、配列番号20または配列番号22とハイブリダイズする遺伝子;および(c)上記(a)または(b)の相補鎖から成る群より選択される。
より好ましい面では、hasB遺伝子は、配列番号19、配列番号21または配列番号23のアミノ酸配列を有するUDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼ;またはUDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼ活性を有するその断片をコードする。
【００５８】
別の好ましい面では、tuaD遺伝子は、(a)配列番号25に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、または更に最も好ましくは少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;(b)低、中、中高または高緊縮性条件下で配列番号24とハイブリダイズするヌクレオチド配列;および(c)上記(a)または(b)の相補鎖、から成る群より選択される。
【００５９】
別のより好ましい面では、tuaD遺伝子は、配列番号25のアミノ酸配列を有するUDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼ;またはUDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼ活性を有するその断片をコードする。
本発明の方法では、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子はhasC遺伝子もしくはgtaB遺伝子;またはそれの相補体であることができる。
【００６０】
好ましい面では、hasC遺伝子は、(a)配列番号27、配列番号29または配列番号31に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、または更に最も好ましくは少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を持つUDP-グルコースピロホスホリラーゼをコードする遺伝子;(b)低、中、中高または高緊縮性条件下で配列番号26、配列番号28または配列番号30とハイブリダイズする遺伝子;および(c)上記(a)または(b)の相補鎖、からなる群より選択される。
【００６１】
別のより好ましい面では、hasC遺伝子は、配列番号27、配列番号29または配列番号31のアミノ酸配列を有するUDP-グルコースピロホスホリラーゼ;またはUDP-グルコースピロホスホリラーゼ活性を有するその断片をコードする。
【００６２】
別の好ましい面では、gtaB遺伝子は、次の群:(a)配列番号33に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、または更に最も好ましくは少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を持つUDP-グルコースピロホスホリラーゼをコードする遺伝子;(b)低、中、中高または高緊縮性条件下で配列番号32とハイブリダイズする遺伝子;および(c)上記(a)または(b)の相補鎖、からなる群より選択される。
【００６３】
別のより好ましい面では、gtaB遺伝子は、配列番号33のアミノ酸配列を有するUDP-グルコースピロホスホリラーゼ;またはUDP-グルコースピロホスホリラーゼ活性を有するその断片をコードする。
本発明の方法では、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ遺伝子はhasDもしくはgcaD遺伝子;またはそれの相補体であることができる。
【００６４】
好ましい面では、hasD遺伝子は、次の群:(a)配列番号35に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、または更に最も好ましくは少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を持つUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼをコードする遺伝子;(b)低、中、中高または高緊縮性条件下で配列番号34とハイブリダイズする遺伝子;および(c)上記(a)または(b)の相補鎖、からなる群より選択される。
【００６５】
別のより好ましい面では、hasD遺伝子は、配列番号35のアミノ酸配列を有するUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ;またはUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するその断片をコードする。
【００６６】
別の好ましい面では、gcaD遺伝子は、次の群:(a)配列番号37に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、または更に最も好ましくは少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を持つUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼをコードする遺伝子;(b)低、中、中高または高緊縮性条件下で配列番号36とハイブリダイズする遺伝子;および(c)上記(a)または(b)の相補鎖、からなる群より選択される。
【００６７】
別のより好ましい面では、gcaD遺伝子は、配列番号37のアミノ酸配列を有するUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ;またはUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するその断片をコードする。
本発明の方法では、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ遺伝子はhasEまたはそれの相同体であることができる。
【００６８】
好ましい面では、hasE遺伝子は、次の群:(a)配列番号39に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、または更に最も好ましくは少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を持つグルコース-6-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子;(b)低、中、中高または高緊縮性条件下で配列番号38とハイブリダイズする遺伝子;および(c)上記(a)または(b)の相補鎖、からなる群より選択される。
【００６９】
別のより好ましい面では、hasE遺伝子は、配列番号39のアミノ酸配列を有するグルコース-6-リン酸イソメラーゼ;またはグルコース-6-リン酸イソメラーゼ活性を有するその断片をコードする。
【００７０】
本発明は、ヒアルロナンシンターゼ遺伝子とUDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼ遺伝子、並びに所望によりUDP-グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ遺伝子およびグルコース-6-リン酸イソメラーゼ遺伝子を含んでなる、ヒアルロナンシンターゼオペロンをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる核酸構成物にも関する。
【００７１】
「人工オペロン」は、ストレプトコッカス・エキシミリス(Streptococcus equisimilis)(WO 03/054163)またはストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus equisimilis)(Crater & van de Rijn, 1995, J. Biol. Chem. 270: 18452-18458)のオペロンを模倣するように作製することができる。そのような人工オペロンはhasA,hasB,hasCおよびhasDまたはそれの相同体を含んでなるか、あるいはまた、ストレプトコッカス・エキシミリスのオペロン中に存在する全長でない相補体を含んでなってもよい。
【００７２】
人工オペロンはグルコース-6-リン酸イソメラーゼ遺伝子(hasE)並びにヘキソキナーゼ遺伝子、ホスホグルコムターゼ遺伝子、アミドトランスフェラーゼ遺伝子、ムターゼ遺伝子およびアセチルトランスフェラーゼ遺伝子から成る群より選ばれた1または複数の遺伝子を含んでなってもよい。ストレプトコッカス・エキシミリスのヒアルロナンシンターゼオペロンの大部分をコードするポリヌクレオチドは、配列番号40中に見つかる。この配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネスの場合と同様に、バシラス・サチリスのtuaD遺伝子(配列番号24)およびgtaB遺伝子(配列番号32)のそれぞれのhasB(配列番号18)およびhasC(配列番号26)相同体、並びにgcaD遺伝子(配列番号36)の相同体〔これはhasD(配列番号34)と名づけられている〕を含有する。
【００７３】
バシラス・サチリスgcaD遺伝子は、ヒアルロナンの2成分のうちの1つであるN-アセチルグルコサミンの合成に関与するUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼをコードする。gcaDのストレプトコッカス・エキシミリス相同体であるhasDは、ストレプトコッカス・エキシミリスによりヒアルロナンシンターゼオペロン上に配置される。該ポリヌクレオチドはhasA遺伝子の一部も含有する(配列番号2の最後の1156 bp)。
【００７４】
好ましい面では、核酸構成物は、hasA,hasB,tuaD,hasC,gtaB,hasD,gcaDおよびhasEから成る群より選ばれた1または複数の遺伝子を含んで成る。
別の好ましい面では、核酸構成物はhasAを含んでなる。
【００７５】
別の好ましい面では、核酸構成物はhasAとhasBまたはtuaDを含んでなる。別の好ましい面では、核酸構成物はhasAとhasCまたはgtaBを含んでなる。別の好ましい面では、核酸構成物はhasAとhasDまたはgcaDを含んでなる。別の好ましい面では、核酸構成物はhasAとhasEを含んでなる。別の好ましい面では、上述の各核酸構成物はhasAを含まない。
【００７６】
別の好ましい面では、hasAとhasBまたはtuaD、およびhasCまたはgtaBを含んでなる。別の好ましい面では、核酸構成物はhasA、hasBまたはtuaD、およびhasDまたはgcaDを含んでなる。別の好ましい面では、核酸構成物はhasA、hasBまたはtuaD、およびhasEを含んでなる。別の好ましい面では、核酸構成物はhasA、hasCまたはgtaB、およびhasDまたはgcaDを含んでなる。別の好ましい面では、核酸構成物はhasA、hasCまたはgtaBおよびhasEを含んでなる。別の好ましい面では、上述の各核酸構成物はhasAを含まない。
【００７７】
別の好ましい面では、核酸構成物はhasA,hasBまたはtuaD、hasCまたはgtaD、およびhasDを含んでなる。別の好ましい面では、核酸構成物はhasA、hasB、hasDまたはgcaD、およびhasEを含んでなる。別の好ましい面では、核酸構成物はhasA、hasCまたはgtaD、hasDまたはgcaD、およびhasEを含んでなる。別の好ましい面では、核酸構成物はhasA、hasBまたはtuaD、hasCまたはgtaD、およびhasEを含んでなる。別の好ましい面では、上述の各核酸構成物はhasAを含まない。
上記好ましい面に基づいて、指摘の遺伝子はそれの相同体と置き換えることができる。
【００７８】
本発明の方法では、核酸構成物は、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有し且つ「-10」領域に配列TATAATを有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、を含んでなる三重プロモーターに作用可能に連結されたヒアルロナンの生合成に関与する1または複数の遺伝子を含んでなり、ここで、前記三重プロモーターの各プロモーター配列が、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されていることを特徴とする。前記三重プロモーターのプロモーター配列は、任意の順序であることができる。
【００７９】
本発明の方法では、三重プロモーターの成分は任意の細菌源から得ることができる。好ましい面では、プロモーター配列は、グラム陽性菌、例えばバシラス株、例えばバシラス・アルカロフィラス、バシラス・アミロリケファシエンス、バシラス・ブレビス、バシラス・サーキュランス、バシラス・クラウシィ、バシラス・コアギュランス、バシラス・ファーマス、バシラス・ロウタス、バシラス・レンタス、バシラス・リケニフォルミス、バシラス・メガテリウム、バシラス・プミリス、バシラス・ステアロサーモフィルス、バシラス・サチリス、もしくはバシラス・スリンジェンシス;またはストレプトマイセス株、例えばストレプトマイセス・リビダンスもしくはストレプトマイセス・ムリヌス;あるいはグラム陰性菌、例えばE.コリまたはシュードモナス種から得られる。
【００８０】
本発明の方法に用いられる適当なamyLプロモーターの例は、バシラス・リケニフォルミスα-アミラーゼ遺伝子(amyL)のプロモーターである。本発明の方法に用いられる適当なcryIIIAプロモーターの例は、バシラス・スリンジェンシス亜種テネブリオニスcryIIIA遺伝子のプロモーターである。
【００８１】
本発明の方法では、配列番号1の第590位に相当する位置に突然変異を有する変形amyLプロモーター(配列番号1の第590位のTをAに変えると配列番号1になる)は、米国特許第5,698,415号および同第6,100,063号に従って得ることができる。米国特許第5,698,415号明細書は、バシラス・リケニフォルミスamyLプロモーターから誘導された変形プロモーターを開示している。上記特許の請求項1によると、そのような変形プロモーターは、N2〜N9が配列ATGTATCAを有するこの請求項に与えられた配列の断片である。
【００８２】
そのような変形プロモーターは、amyLプロモーター領域を包含する長鎖PCRプライマー28902(米国特許第6,100,063号明細書)中に所望の突然変異を組み込むことにより作製される。別のPCRプライマーLWN3216(米国特許第6,100,063号明細書)は前記amyLシグナルペプチドコード領域中のPstI部位にかかっている位置から上流を解読する。それらのプライマーは、一緒になって、親のamyLプロモーターから誘導された変形amyLプロモーター断片のPCR増幅を可能にする。
【００８３】
本発明では、親のamyLプロモーターは、(a)配列番号1と少なくとも70%同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド;または(b)少なくとも低緊縮性条件下で配列番号1またはその相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。
【００８４】
第一の面では、親のamyLプロモーターは、配列番号1に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更に最も好ましくは少なくとも97%の同一性の程度を有するヌクレオチド配列(以後、「相同amyLプロモーター」と称する)を含んでなる。
【００８５】
好ましくは、親のamyLプロモーターは、配列番号1のヌクレオチド配列またはプロモーター活性を有するその断片を含んでなる。好ましい態様では、親のamyLプロモーターは配列番号1のヌクレオチド配列を含んで成る。別の好ましい態様では、親のamyLプロモーターは配列番号1のヌクレオチド配列からなる。
【００８６】
第二の面では、親のamyLプロモーターは低緊縮性条件下で、好ましくは中緊縮性条件下で、より好ましくは中〜高緊縮性条件下で、更により好ましくは高緊縮性条件下で、最も好ましくは超高緊縮性条件下で、配列番号1またはその相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチドである(J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版,Cold Spring Harbor, New York)。そのような緊縮性条件は本明細書中に定義される。
【００８７】
配列番号1のヌクレオチド配列またはその断片は、当該技術分野で周知の方法に従って、異なる属または種の株から相同amyLプロモーターを同定しそしてクローニングするために利用することができる。
【００８８】
本発明では、単離されたamyLプロモーター変異体は、配列番号1に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更に最も好ましくは少なくとも97%の同一性の程度を有するヌクレオチド配列を含んでなる。
【００８９】
本発明の目的上、2つのヌクレオチド配列間の同一性(相同性)の程度は、LASERGENETM MEGALIGNTMソフトウエア(DNASTAR, Inc., Madison, WI)を使ったWibur-Lipman法(Wilbur & Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730)により、同一性表と次の多重整列パラメータ:GAPペナルティー=10およびGAP延長ペナルティー=10を使って決定される。対合パラメータは、Ktuple=3、GAPペナルティー=3、およびウインドウ=20である。
【００９０】
「共通」プロモーターの作製は、バシラス・サチリスの休止期「シグマA型」プロモーターの「-10」領域と「-35」領域について確立された共通配列に対して一層完全に一致するプロモーターを作製するような部位特異的突然変異誘発法(Voskuil他、1995, Molecular Microbiology 17: 271-279)によって達成することができる。「-35」領域の共通配列はTTGACAであり、そして「-10」領域の共通配列はTATAATである。共通プロモーターは、バシラス宿主細胞中で機能することができる任意のプロモーターから獲得することができる。
【００９１】
好ましい面では、「共通」プロモーターは、E.コリlacオペロン、ストレプトマイセス・セリコロール(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子(dagA)、バシラス・レンタス(Bacillus lentus)アルカリ性プロテアーゼ遺伝子(aprH)、バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)アルカリ性プロテアーゼ遺伝子(サブチリシンCarlsberg遺伝子)、バシラス・サチリス(枯草菌、Bacillus subtilis)レバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バシラス・サチリスα-アミラーゼ遺伝子(amyE)、バシラス・リケニフォルミスα-アミラーゼ遺伝子(amyL)、バシラス・ステアロサーモフィルス麦芽アミラーゼ遺伝子(amyM)、バシラス・アミロリケファシエンスα-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バシラス・リケニフォルミスのペニシリナーゼ遺伝子(penP)、バシラス・サチリスxylAおよびxylB遺伝子、バシラス・スリンジェンシス亜種テネブリオニス(Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis)cryIIIA遺伝子(配列番号41)またはそれの部分;または原核生物β-ラクタマーゼ遺伝子に由来するプロモーターより得られる。「共通」プロモーターは、spo1細菌ファージプロモーターより得ることもできる。
【００９２】
より好ましい面では、「共通」プロモーターは、バシラス・アミロリケファシエンスのα-アミラーゼ遺伝子(amyQ)より得られる。最も好ましい面では、共通プロモーターは配列番号42または配列番号43のヌクレオチド1から185に含まれる「共通」amyQプロモーターである。別の最も好ましい面では、共通プロモーターは配列番号42または配列番号43のヌクレオチド86から185に含まれる短鎖「共通」amyQプロモーターである。
【００９３】
配列番号42の「共通」amyQプロモーターは、野生型amyQプロモーター(配列番号44)を含むヌクレオチド配列の中に次の突然変異を含有する:(転写開始部位に関して)第135位と第136位の「-35」領域の中にそれぞれT→AとT→Cへの突然変異、および配列番号44の第156位の「-10」領域の中にA→Tへの突然変異。配列番号43の「共通」amyQプロモーターは更に、-35領域(配列番号43)の約20塩基対だけ上流のところの第116位にT→Aへの変異を含むが、この変異は重要な-10領域と-35領域から十分に離れているために、プロモーター機能に対して何ら有害な影響を与えない。
【００９４】
好ましい面では、三重プロモーターは、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーターを含んでなる。別の好ましい面では、三重プロモーターが配列番号1の変形amyLプロモーターを含んでなる。別の好ましい面では、三重プロモーターは「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域にTATAAT配列を有する共通amyQプロモーターを含んで成る。別の好ましい面では、三重プロモーターは「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域にTATAAT配列を有する短鎖の共通amyQプロモーターを含んで成る。別の好ましい面では、前記三重プロモーターはcryIIIAプロモーターまたはそれの部分を含んでなる(Agaisse & Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107)。
【００９５】
より好ましい面では、三重プロモーターは、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域に配列TATAAT配列を有する短鎖共通amyQプロモーター、およびcryIIIAプロモーターを含んで成る。
【００９６】
別の好ましい面では、三重プロモーターが、5′から3′の順序において、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域に配列TATAATを有する短鎖の共通amyQプロモーター、およびcryIIIAプロモーターを含んで成る。
【００９７】
最も好ましい面では、三重プロモーターが、配列番号1の変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域に配列TATAATを有する短鎖共通amyQプロモーター、および配列番号41のcryIIIAプロモーターを含んで成る。
【００９８】
別の最も好ましい面では、三重プロモーターが、5′から3′の順序において、配列番号1の変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域にTATAAT配列を有する短鎖の共通amyQプロモーター、および配列番号41のcryIIIAプロモーターを含んで成る。
【００９９】
「mRNAプロセシング/安定化配列」とは、前記三重プロモーターのうちの1または複数のプロモーター配列の下流であって且つ1または複数のコード配列の上流に配置されており、前記1または複数のプロモーター配列から合成されたmRNAの全部がプロセシングされて転写物の5′末端に安定化配列を有するmRNA転写物を生じるように、前記三重プロモーターの各々が前記1または複数のコード配列に作用可能に連結されている配列として定義される。mRNA転写物の5′末端にそのような安定化配列が存在するとそれらの半減期を増加させる(Agaisse & Lereclus, 1994,  前掲、Hue他、1995,Journal of Bacteriology 177: 3465-3471)。
【０１００】
mRNAプロセシング/安定化配列は、細菌の16SリボソームRNAの3′末端部に相補的である。好ましい面では、mRNAプロセシング/安定化配列は、転写物の5′末端のところに安定化配列を有する本質的に一本鎖の転写物を生成する。別の好ましい面では、mRNAプロセシング/安定化配列は、全長三重プロモーターの下流で且つ前記1または複数のコード配列の上流に配置される。別の好ましい面では、mRNAプロセシング/安定化配列は、前記三重プロモーターのcryIIIAプロモーターの下流で且つ前記1または複数のコード配列の上流のところに配置される。
【０１０１】
mRNAプロセシング/安定化配列は、好ましくは前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流のところに配置される。しかしながら、mRNAプロセシング/安定化配列は、前記三重プロモーターのプロモーター配列のうちのいずれかの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流のところに配置することもできる。更に、mRNAプロセシング/安定化配列は、前記三重プロモーターのプロモーター配列の各々の下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流のところに配置することもできる。そのような1または複数のmRNAプロセシング/安定化配列は、三重プロモーターの1または複数のプロモーター配列に対して異種であってもよく、そして/または互いに対して異種であってもよい。
【０１０２】
好ましい面では、mRNAプロセシング/安定化配列は、WO 94/25612中およびAgaisse & Lereclus, 1994(前掲)中に開示されたバシラス・スリンジェンシスcryIIIAのmRNAプロセシング/安定化配列、またはmRNAプロセシング/安定化機能を保持しているそれの部分である。別の好ましい面では、mRNAプロセシング/安定化配列は、Hue他、1995(前掲)中に開示されたバシラス・サチリスSP82 mRNAプロセシング/安定化配列、またはmRNAプロセシング/安定化機能を保持しているそれの部分である。
【０１０３】
cryIIIAプロモーターおよびそれのmRNAプロセシング/安定化配列を本発明の方法に使用する場合、配列番号41のヌクレオチド-635〜-22により限定されるWO 94/25612中およびAgaisse & Lereclus, 1994(前掲)中に開示された配列を含むDNA断片、またはプロモーター機能とmRNAプロセシング/安定化機能を保持しているそれの部分を使用してもよい。cryIIIAプロモーターはヌクレオチド-635〜-552により限定され、一方でcryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列はヌクレオチド-551〜-22の中に含まれる。
【０１０４】
好ましい面では、cryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列はヌクレオチド-568〜-22を含んでなる断片の中に含まれる。別の好ましい面では、cryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列はヌクレオチド-367〜-21を含む断片の中に含まれる。更に、当該技術分野で周知の方法を使ってcryIIIAプロモーターのみを含むDNA断片および/またはcryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列のみを含むDNA断片を調製し、様々な三重プロモーターとmRNAプロセシング/安定化配列の組み合わせを作製することができる。
【０１０５】
好ましい面では、cryIIIAプロモーターおよびそれのmRNAプロセシング/安定化配列は、好ましくは三重プロモーターを構成する別のプロモーター配列の下流であって且つ1または複数のコード配列の上流のところに配置される。
【０１０６】
より好ましい面では、三重プロモーターは、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域に配列TATAATを有する短鎖の共通amyQプロモーター(ここで前記2つのプロモーター配列は任意の順序であることができる)、およびcryIIIAプロモーター、並びにcryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列を含んでなる。
【０１０７】
別のより好ましい面では、三重プロモーターは、配列番号1の変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域に配列TATAATを有する短鎖の共通amyQプロモーター(ここで前記2つのプロモーター配列は任意の順序であることができる)、および配列番号41のcryIIIAプロモーター、並びにcryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列を含んでなる。
【０１０８】
最も好ましい面では、三重プロモーターは、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域にTATAAT配列を有する短鎖共通amyQプロモーター、およびcryIIIAプロモーター、並びにcryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列を、5′→3′の順序において含んでなる。
【０１０９】
別の最も好ましい面では、三重プロモーターは、配列番号1の変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域に配列TATAATを有する短鎖共通amyQプロモーター、および配列番号41のcryIIIAプロモーター、並びにcryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列を、5′→3′の順序で含んでなる。
【０１１０】
ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列は、その1または複数のコード配列のバシラス細胞中での発現を指令する1または複数の追加の調節配列に前記1または複数のコード配列を作用可能に連結せしめることにより、当該調節配列に適した条件下で更に操作することが可能である。発現とは、ポリペプチドの生産に関与する任意の段階、例えば非限定的に、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾およびトランスロケーションを包含すると解釈される。クローニング法を使ってヌクレオチド配列を変更する技術は当該技術分野で周知である。
【０１１１】
「調節配列」なる用語は、本明細書中では、コード配列の発現に必要または有利である全ての成分を包含するものとして定義される。各調節配列は1または複数のコード配列に対して生来であっても異種であってもよい。上述したような三重プロモーターに加えて、そのようなコード配列は、非限定的に、リーダー、シグナル配列および転写ターミネーターを包含する。調節配列とコード領域との連結を促進する特異的制限部位を導入する目的で、前記調節配列にリンカーを提供してもよい。
【０１１２】
調節配列は、適当な転写ターミネーター配列、すなわちバシラス細胞によって転写を終結させると認識される配列であることもできる。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの3′末端に作用可能に連結される。選択したバシラス細胞において機能的であるいずれのターミネーターでも、本発明の方法に使用可能である。
【０１１３】
調節配列は、適当なリーダー配列、すなわちバシラス細胞による翻訳にとって重要なmRNAの非翻訳領域であることもできる。そのようなリーダー配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5′末端に作用可能に連結される。選択したバシラス細胞において機能的であるいずれのターミネーターでも、本発明の方法に使用可能である。
【０１１４】
調節配列は、発現されたポリペプチドを例えば細胞膜中にトランスロケートする、該ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸をコードするシグナルペプチドコード領域であることもできる。そのようなシグナルペプチドコード領域は、該ポリペプチドに対して生来であってもよく、または外来起源より入手してもよい。コード配列の5′末端は、本質的に、トランスロケートされたポリペプチドをコードするコード領域の断片と翻訳解読枠の中で本来連結されている、シグナルペプチドコード領域を含んでもよい。あるいは、コード配列の5′末端が、トランスロケートされたポリペプチドをコードするコード配列の部分に対して外来である、シグナルペプチドコード領域を含んでもよい。
【０１１５】
外来のシグナルペプチドコード領域は、コード配列が通常はシグナルペプチドコード領域を含まないような場合に必要となる。あるいは、外来シグナルペプチドコード領域は、コード配列と通常連結している天然シグナルペプチドコード配列に比較して該ポリペプチドのトランスロケーションを増強する目的で、天然のシグナルペプチドコード領域の代わりに使用することもできる。発現されたポリペプチドのトランスロケーションを指令することができる任意のシグナルペプチドコード領域を本発明の方法に使用することが可能である。
【０１１６】
バシラス細胞は、少なくとも2つの異なる核酸構成物の1または複数のコピーを含んでもよく、ここで各構成物は上述したように作製される。
【０１１７】
核酸構成物は形質転換細胞の選択を容易にする1または複数の選択マーカーを更に含んでもよい。選択マーカーは、その生成物が殺生物剤耐性、重金属耐性、栄養素要求株に対する原栄養性などに備える遺伝子である。細菌性選択マーカーの例は、バシラス・サチリスもしくはバシラス・リケニフォルミス由来のdal遺伝子、または抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。更に、選択は同時形質転換、例えばWO 91/09129中に記載されたものにより達成することができ、この場合、選択マーカーは別個のベクター上に存在する。
【０１１８】
本発明の特別な利点は、外来選択マーカー遺伝子を含まないようなバシラス細胞を生産できること、即ち、核酸構成物をバシラス細胞中に導入後、バシラス細胞から外来選択マーカーを削除して細胞マーカー不含有にすることができることである。選択マーカー遺伝子を除去してそのようなマーカーを含まないバシラス細胞を生産することは、調節および環境的理由により好ましいだろう。
【０１１９】
選択マーカー遺伝子の完全な削除のために、遺伝子欠失または置換技術を使用できる。例えば、選択マーカー遺伝子の削除は、該選択マーカー遺伝子の両端に配置する5′および3′領域を隣接して含むように構成されているプラスミドを使った相同組換えにより、達成することができる。そのような隣接5′および3′領域は、プラスミドを細胞中に確立できるようにする許容温度で、第二の選択マーカーと組み合わせて、温度感受性プラスミド、例えばpE194上においてバシラス細胞に導入することができる。次いで、細胞を非許容温度に移行させ、相同隣接領域のうちの一方のところで染色体中にプラスミドが組み込まれている細胞について選択を行う。
【０１２０】
プラスミドの組み込みについての選択は、第二の選択マーカーについての選択により達成される。組み込み後、選択を行わずに複数世代にわたり細胞を許容温度に移行せしめることによって、もう一方の相同隣接領域のところの組換え現象を刺激する。次いで細胞を平板培養して単一コロニーを得、そのコロニーを両方の選択マーカーの欠失について検査する(例えばPerego, 1993, A.L. Sonneshein, J.A. Hoch & R. Losick編、Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, 第42章、American Society of Microbiology, Washington, D.C., 1993参照)。当該技術分野で周知の別の方法を使用してもよい。
【０１２１】
発現ベクター
本発明の方法では、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数の遺伝子、三重プロモーター、およびその上更に、mRNAプロセシング/安定化配列、並びに転写および翻訳終結シグナルを含んでなる組換え発現ベクターを、組換え生産に使用することができる。上述した様々な核酸および調節配列を一緒に連結して組換え発現ベクターを作製することができ、組換え発現ベクターはポリヌクレオチドの挿入または置換に備えるために1または複数の便利な制限部位を含んでもよい。
【０１２２】
あるいは、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数の遺伝子は、その1または複数の遺伝子をあるいは1または複数の遺伝子を含んでなる核酸構成物を適当な発現ベクター中に挿入することにより、発現させることができる。発現ベクターを作製する際には、コード配列が三重プロモーターに、別の場合にはその上更にmRNAプロセシング/安定化配列、および別の発現のための(おそらくトランスロケーションのための)適当な調節配列に作用可能に連結された状態になるように、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数の遺伝子がベクター中に配置される。
【０１２３】
組換え発現ベクターは、組換えDNA操作に好都合にかけることができ、且つバシラス細胞中に導入するとヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数の遺伝子の発現を行うことができるいずれのベクターであってもよい。ベクターの選択は、典型的には該ベクターを導入しようとするバシラス細胞と該ベクターとの適合性によるだろう。ベクターは直鎖状プラスミドまたは閉環状プラスミドであることができる。ベクターは自己複製性ベクター、即ちその複製が染色体の複製から独立している染色体外存在物として存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体または人工染色体であることができる。該ベクターは自己複製を確保するための何らかの手段を含んでもよい。あるいは、ベクターは、バシラス細胞に導入されるとその染色体に組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。ベクター系は単一のベクターまたはプラスミドであってもよく、2以上のベクターまたはプラスミド、あるいはトランスポゾンであってもよい。
【０１２４】
「導入」とは、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数の遺伝子を含んでなるベクターを、該ベクターが染色体組み込み物としてまたは自己複製性染色体外ベクターとして維持されるようにバシラス細胞中に導入することを意味する。1または複数のコード配列もしくは遺伝子が細胞において安定に維持されると思われるので、組み込みの方が一般に有利であると考えられる。染色体中へのベクターの組み込みは、相同組換え、非相同組換え、または転移により起こる。
【０１２５】
バシラス細胞中への発現ベクターの導入は、例えば、本明細書に記載のように、プロトプラスト形質転換により、コンピテント細胞を用いて、エレクトロポレーションにより、または接合により、行うことができる。
【０１２６】
ベクターの組み込みは、相同組換えによるゲノム中への該ベクターの安定な組み込みのためのベクターの任意成分によることができる。ベクターは、バシラス細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを指令するような追加のポリヌクレオチド配列を含んでもよい。その追加のポリヌクレオチド配列は、ベクターをバシラス細胞ゲノム染色体中の正確な位置に組み込ませることができる。正確な位置への組み込みの確率を高めるために、組み込み成分は、好ましくは十分な核酸の個数、例えば100から10,000塩基対、好ましくは400から10,000塩基対、最も好ましくは800〜10,000塩基対を含むべきであり、それは相同組換えの確率を増加させるために対応する標的配列と十分に相同であるべきである。組み込み成分は、バシラス細胞のゲノム中の標的細胞と相同であるいずれのポリヌクレオチド配列であってもよい。更に、組み込み成分は非コード配列またはコード配列であってもよい。
【０１２７】
自己複製のためには、ベクターは、該ベクターを問題のバシラス細胞中で自立的に複製できるようにする複製開始点を更に含んでなるだろう。細菌性複製開始点の例は、E.コリ中での複製を可能にするプラスミドpBR322, pUC19, pACYC177およびpACYC184の複製開始点、およびバシラス中での複製を可能にするpUB110, pE194, pTA1060およびpAMβ1である。複製開始点は、バシラス細胞中でその機能を温度感受性にするような突然変異を有するものであってもよい(例えば、Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433を参照のこと)。
【０１２８】
上記成分を連結せしめて組換え発現ベクターを作製するために用いる手法は当業者に周知である(例えばSambrook他,前掲を参照のこと)。
【０１２９】
生産
本発明の方法においては、ヒアルロン酸の生産に適した栄養培地中で、当該技術分野で周知の方法を使ってバシラス宿主細胞を培養する。例えば、細胞は、研究室もしくは工業的発酵層の中で、例えば振盪フラスコ培養、または小規模もしくは大規模発酵(連続式、バッチ式、流加、固相培養を含む)により、ヒアルロン酸合成に関与する酵素を発現させヒアルロン酸を単離できるようにする条件の下で適当な培地中で実施される。培養は、当業者に既知の手法を使って、炭素源、窒素源および無機塩類を含んでなる適当な栄養培地で行われる。適当な培地は、販売業者から入手可能であるかまたは発表された組成に従って(例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されるように)調製することができる。
【０１３０】
得られたヒアルロン酸は、当該技術分野で周知の方法を使って単離することができる。例えば、ヒアルロン酸は、例えば非限定的に遠心、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿といった常用の手法により栄養培地から単離することができる。単離されたヒアルロン酸は、次いで周知の様々な方法により、例えば非限定的にクロマトグラフィー(例えばイオン交換、アフィニティー、疎水的、クロマト分画、およびサイズ排除)、電気泳動法(例えば調製用等電点電気泳動法)、溶解度分別法(例えば硫酸アンモニウム沈澱)または抽出(例えばProtein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden編、VCH Publishers, New York, 1989)により更に精製することができる。
【０１３１】
組み換えバシラス細胞のヒアルロナンは培地中に直接発現されるので、培地からヒアルロナンを単離するために単純な方法を用いることができる。まず第一に、バシラス細胞と細胞残屑を培地から物理的に分離する。所望であれば、培地の粘度を低くするために最初に培地を希釈してもよい。培地から細胞を分離除去するためには、多数の方法、例えば遠心分離や精密濾過法などが当業者に知られている。次いで、所望であれば、残った上澄液を例えば限外濾過により濃縮してヒアルロナンから小さな分子混入物を除去することができる。
【０１３２】
細胞残屑の除去後、既知の方法により、培地からのヒアルロナンの単純沈澱が行われる。例えば、濾液からヒアルロナンを沈澱させるには、塩、アルコールまたは塩とアルコールの組み合わせを使うことができる。一度沈澱物に濃縮されれば、ヒアルロナンは物理的手段により溶液から容易に単離することができる。あるいは、噴霧乾燥のような既知の蒸発技術を使うことによって、ヒアルロナンを濾液から乾燥または濃縮してもよい。本発明のバシラス宿主細胞により生産されたヒアルロナンのレベルは、本明細書中に記載されるような改良カルバゾール法に従って決定することができる。
【０１３３】
本発明の方法では、バシラス細胞は、同じ生産条件下で培養した時、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結された三重プロモーターの中の唯一つのプロモーター配列のみを含有するバシラス細胞に比較して、好ましくは少なくとも25%多い、好ましくは少なくとも50%多い、より好ましくは少なくとも75%多い、より好ましくは少なくとも100%多い、更により好ましくは少なくとも200%多い、最も好ましくは少なくとも300%多い、更に最も好ましくは少なくとも400%多いヒアルロン酸を生産する。
【０１３４】
欠失/破壊
遺伝子欠失または置換技術は、外来または異種選択マーカー遺伝子または他の望ましくない遺伝子の完全除去のために用いられる。そのような方法では、選択マーカー遺伝子の両側に隣接する5′および3′領域を連続的に含むように作製されたプラスミドを使って、選択マーカー遺伝子の削除を行うことができる。例えば、プラスミドを細胞中に確立できるようにする許容温度において第二の選択マーカー遺伝子と組み合わせて、温度感受性プラスミド(例えばpE194)上において、隣接5′および3′領域をバシラス細胞中に導入することができる。次いで、相同隣接領域のうちの一方のところで染色体中にプラスミドが組み込まれている細胞について選択するために、非許容温度に細胞を付する。
【０１３５】
そのようなプラスミドの組み込みについての選択は、第二の選択マーカー遺伝子についての選択により行われる。組み込み後、細胞を非選択下で数世代にわたり許容温度に移行させることにより、第二の相同隣接領域における組み換え現象が感作される。次いで細胞を平板培養して単一コロニーを得、そのコロニーを両方の選択マーカー遺伝子の欠失について検査する(例えばPerego, 1993, A.L. Sonneshein, J.A. Hoch & R. Losick編、Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria,第42章、American Society of Microbiology, Washington, D.C., 1993参照)。
【０１３６】
選択マーカー遺伝子は、欠損遺伝子の5′領域と3′領域を含むが選択マーカー遺伝子を欠いている核酸断片を変異細胞中に導入することによる相同組み換えに続き、カウンター選別培地上で選択を行うことにより、除去することもできる。相同組み換えにより、選択マーカー遺伝子を含む欠損遺伝子は、選択マーカー遺伝子を欠いている核酸断片に置き換えられる。当業界で周知の別の方法を使用してもよい。
【０１３７】
上記手法は不要な遺伝子の削除または破壊にも使用できる。米国特許第5,891,701号は、spoIIAC、aprE、nprEおよびamyEといった複数遺伝子を削除するための技術を開示している。
別の望ましくない生物学的化合物、例えばcypX(受入番号BG12580)および/またはyvmC(受入番号BG14121)により合成される赤色色素も、上記方法により除去することができる。
【０１３８】
好ましい面では、バシラス宿主細胞はいずれの外来または異種選択マーカーによっても標識されない。別の好ましい面では、バシラス宿主細胞はcypXとyvmCにより合成される赤色色素をいずれも生産しない。
本発明を次の実施例により更に説明するが、この実施例が本発明の範囲を限定するものであると解釈してはならない。
【実施例】
【０１３９】
プライマーとオリゴ
全てのプライマーおよびオリゴは、製造業者の教示に従って、Applied Biosystems Model 394 Synthesizer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)上で合成した。
【０１４０】
実施例1:amyL遺伝子座にP11プロモーター/amyL発現カセットを含有するバシラス・リケニフォルミスMaTa2の作製
P11プロモーター(Prshort"consensus"amyQ/PrcryIIIA stab,米国特許第6,255,076号明細書)を、標準的遺伝子置換法により、バシラス・リケニフォルミスSJ1904(米国特許第5,733,753号明細書)中のamyL遺伝子〔第474位にTの代わりにCがあり、第523位にCの代わりにGがあり、第524位にGの代わりにCがあり、そして第768〜770位にTTTの代わりにAAAがあることを除き、本質的に受入れ番号M13256のものと同一である、Gray他、1986, J. Bacteriol. 166: 635参照〕の上流に導入した。
【０１４１】
機能的プロモーターの下流に置かれたamyLコード領域のプラスミド由来断片を使って実験することは難しいため、作製は下記のような2段階において実施した。第一に、amyLプロモーターとamyLリボソーム結合部位(RBS)を、RBSを欠く合成プロモーターにより置き換えた(amyLの発現を防止するため)。次いで、第二の遺伝子置換を行ってRBSを再導入し、それにより機能的発現カセットを作製した。
【０１４２】
pE194由来の温度感受性プラスミドpMRT064.1(WO 03/054163)を、エレクトロポレーション(Xue他、1999, Journal of Microbiological Methods 34: 183-191)によってバシラス・リケニフォルミス株SJ1904中に導入した。次いで、1mlあたり1μgのエリスロマイシンと25μgのリンコマイシンが補足されているトリプトース血液寒天ベース(TBAB)-寒天プレート上にて、28℃で24〜48時間インキュベーションした後、細胞を平板培養した。TBAB寒天プレートは、1リットルあたり33gのトリプトース血液寒天ベースから構成された。エリスロマイシン耐性形質転換体を単離し、エリスロマイシン(5μg/ml)の存在下で50℃の非許容温度にて増殖させた。この温度では、pE194複製開始点は不活性である。
【０１４３】
細菌染色体のamyL遺伝子座へのプラスミドの組み込みにより、細胞はエリスロマイシンの存在下でのみ増殖することができた。P11プロモーターによる内在性amyLプロモーターの置換とその後のRBS欠失を引き起こすであろうプラスミドの欠失または「ループアウト」を促進するために、30℃の許容温度において、非選択下で数世代にわたり組み込み体をLB(Luria-Bertani)培地中で増殖させた。LB培地は、1リットルあたり10gのトリプトン、5gの酵母エキスおよび5gのNaClから構成された。この温度では、pE194複製開始点が活性であり、ゲノムからのプラスミドの切除を促進した(Molecular Biological Methods for Bacillus, C.R. Harwood & S.M. Cutting, 1990, John Wiley and Sons Ltd.)。
【０１４４】
次いで細胞を非選択的LB寒天プレート(LB培地+LB培地1リットルあたり15gのバクト寒天)上で平板培養し、所望のプロモーター置換とpE194由来レプリコンの欠失を含むコロニーを、次の基準により同定した:(1)0.5%デンプン-アズール色素(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)+TBAB積層を含むTBABプレート上にハロ(光輪)を形成できないことが、P11プロモーターの存在とamyL RBSの欠失を示す;および(2)エリスロマイシン感受性がpE194由来レプリコンの欠失を示す。上記3つの条件を満たす1つの形質転換体が選択され、それをバシラス・リケニフォルミスSJ1904::pMRT064.1と命名した。
【０１４５】
上記株において、次のようにしてamyL RBSを復帰させた。プラスミドpNBT23(pDG268MCSΔneo-Pr short"consensus" amyQ/Pr cryIIIA/cryIIIAstab/SAV、米国特許第6,255,076号明細書)をPacIで消化し、T4 DNAポリメラーゼI(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)で末端を平滑化し、次いでSalIで消化した。プラスミドpUC19(Yanisch-Perron他, 1985, Gene 33: 103-119)をEcl136IIとSalIを消化した。消化物を44 mM Tris塩基、44 mMボロン酸、0.5 mM EDTA(0.5×TBE)緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で分解し、pUC19からの長いベクター断片(約2661 bp)とpNBT23からの短いcryIIIAstab/aprH 5′断片(約1069 bp)を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キット(QIAGEN Inc., Valencia, CA)を使ってゲル精製した。
【０１４６】
製造業者の教示に従ってT4 DNAリガーゼ(Roche Applied Science; Indianapolis, IN)を使って前記2つの精製された断片を一緒に連結せしめ、次いで連結混合物を用いてE.コリSURE（登録商標）コンピテント細胞(Stratagene, Inc., La Jolla, CA)を形質転換した。1mlあたり100μgのアンピシリンが補足された2×酵母-トリプトン(2×YT)寒天平板上で形質転換体を選択した。2×YT平板は、1リットルあたり16gのトリプトン、10gの酵母エキス、5gのNaClおよび15gのバクト寒天から構成された。製造業者の教示に従って、Bio Robot 9600(QIAGENE Inc., Valencia, CA)を使って数個の形質転換体よりプラスミドDNAを精製し、次いで0.5×TBE緩衝液を用いて0.8%アガロースゲル上でEcoRI+SalI消化によりプラスミドDNAを分析した。約1071 bp EcoRI/SalI cryIIIAstab/aprH 5′断片の存在により、正しいプラスミドを同定し、それをpNBT28(図1)と命名した。
【０１４７】
プラスミドpMRT038は、Horton他、1989, Gene 77: 61-8の手順に従って、重複伸長によるスプライシング(SOE)により作製した。プラスミドpDN1981(米国特許第5,698,415号明細書)からamyLプロモーター領域と5′コード配列を、それぞれプライマー対733-45-1と733-45-2、および733-68-1と733-70-1(後述)を使って、PCR増幅せしめた。PCR増幅は、1ngのpDN1981 DNA、0.4μMの各プライマー、各々200μMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP、1×PCR緩衝液II(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)から成る反応液50μL中で、2.5mM MgCl2と2.5単位のAmpliTaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)を使って行った。
【０１４８】
PCR反応は、95℃で10分を1サイクル;95℃で1分、50℃で1分および72℃で1分を各々25サイクル;そして72℃で7分を1サイクルとプログラミングされたRoboCycler 40熱循環装置(Stratagene, Inc., La Jolla, CA)中で実施した。PCR生成物を0.5×TBE緩衝液中で0.8%アガロースゲルを使って視覚化した。amyLプロモーター領域と5′コード配列についての予想される断片はそれぞれ約600 bpと500 bpであった。最終SOE断片は、プライマー733-45-1と733-70-1を使って増幅せしめた。その最終SOE断片をTA-TOPOクローニングキット(Stratagene, Inc., La Jolla, CA)を使ってpCR2.1中にクローニングした。1mlあたり100μgのアンピシリンが補足された2×YT寒天プレート上で形質転換体を選択し、37℃で16時間インキュベートした。正しいプラスミドを担持している形質転換体を、M13正および逆プライマー(Invitorogen, Inc., Carlsbad, CA)を使ったDNA配列決定により確認した。このプラスミドをpMRT038(図2)と命名した。
【０１４９】
プライマー  733-45-1:
5'-GTCCTTCTTGGTACCTGGAAGCAGAGC-3'(配列番号45)
プライマー  733-45-2:
5'-GTATAAATATTCGGCCCTTAAGGCCAGTACCATTTTCCC-3'(配列番号46)
【０１５０】
プライマー  733-68-1:
5'-TGGTACTGGCCTTAAGGGCCGAATATTTATACAATATCATGAGCTCCACATTGAAAGGG-3'(配列番号47)
プライマー  733-70-1:
5'-GGTGTTCTCTAGAGCGGCCGCGGTTGCGGTCAGC-3'(配列番号48)
【０１５１】
プラスミド pNBT28をBglIIで消化し、Klenow断片を使って末端を平滑化し、次いでSacIで消化した。プラスミド  pMRT038をEcoRIで消化し、Klenow断片を使って末端を平滑化し、次いでSacIで消化した。それらの消化物を0.5×TBE緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で分画し、pNBT28からの大きいベクター断片(約3253bp)とpMRT038からの小さい断片(約593bp)を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キットを使ってゲル精製した。2つの精製断片を一緒に連結し、その連結混合物をE.コリSURE（登録商標）コンピテント細胞中に形質転換せしめた。1mlあたり100μgのアンピシリンが補足された2×YT寒天平板上で形質転換体を選択した。製造業者の教示に従ってQUIAGEN Bio Robot 9600を使って数種類の形質転換体からプラスミドDNAを精製し、0.5×TBE緩衝液を用いて0.8%アガロースゲル上でEcoRIとHindIII消化により分析した。約1168 bpのEcoRI/HindIII断片の存在により正しいプラスミドを同定し、それをpNBT29(図3)と命名した。
【０１５２】
プラスミド pNBT29とpCJ791(WO 03/054163)をEcoRIとHindIIIで消化した。それらの消化物を0.5×TBE緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で分画し、pCJ791からの大きいベクター断片(約4340bp)とpNBT29からの小さい断片(約1168bp)を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キットを使ってゲル精製した。2つの精製断片をT4 DNAリガーゼを使って連結せしめ、その連結混合物をバシラス・サチリス168Δ4(WO 03/054163)中に形質転換せしめた。製造業者の教示に従ってtip-20カラム(QUIAGEN Inc., Valencia, CA)を使って数種類の形質転換体からプラスミドDNAを精製し、そして0.5×TBE緩衝液を用いて0.8%アガロースゲル上でEcoRIとHindIII消化により分析した。約1168 bpのEcoRI/HindIII断片の存在により正しいプラスミドを同定し、それをpWWWi001.1(図4)と命名した。
【０１５３】
バシラス・リケニフォルミス株 SJ1904::pMRT064.1中のamyL RBSを復帰させるために、エレクトロポレーションによりプラスミド pWWi001.1をこの株に導入し、次いで実施例1に記載の通りに染色体中に組み込み、切除して、バシラス・リケニフォルミス MaTa2を作製した。0.5%デンプン+TBAB積層を含むTBAB平板上で菌株を増殖させることによってamyL発現の復帰についてアッセイすることにより、所望のクローンを同定した。アミラーゼを生産する株はコロニーまたはパッチの周囲に透明な輪(ハロ)を形成した。
【０１５４】
実施例2:生来のamyL遺伝子座中にP12プロモーター/amyL発現カセットを含有するバシラス・リケニフォルミス MaTa3の作製
プラスミド pMRT064.1をHindIIIで消化し、Klenow断片を使ってフィルインし、次いでSfiIで消化した。プラスミドpNBT23(米国特許第6,255,076号明細書)をSfiIとEcl136IIで消化した。それらの消化物を0.5×TBE緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で分画し、pMRT064.1からの大きいベクター断片(約4892bp)とpNBT23からの小さい断片(約728 bp)を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キットを使ってゲル精製した。
【０１５５】
2つの精製断片をT4 DNAリガーゼを使って一緒に連結せしめ、その連結混合物をバシラス・サチリス168Δ4中に形質転換せしめた。製造業者の教示に従ってQIAGEN tip-20カラムを使って数種類の形質転換体からプラスミドDNAを精製し、そして0.5×TBE緩衝液を用いて0.8%アガロースゲル上でEcoRIとHindIII消化により分析した。制限酵素および/またはPCR分析により正しいプラスミドを同定し、それをpWWWi005(図5)と命名した。
【０１５６】
エレクトロポレーションによりバシラス・リケニフォルミス MaTa2中にプラスミド pWWi005を導入し、次いで染色体中に組み込ませ、実施例1に記載の通りに切除して、P11プロモーターをP12プロモーター(Prshort"consensus"amyQ/PrcryIIIA/cryIIIAstab、b米国特許第6,255,076号明細書)と置換し、バシラス・リケニフォルミス MaTa3株を作製した。下記に示すプライマー961197と94-935を使ってPCR分析により所望のクローンを同定した。
【０１５７】
PCR増幅は、200 ngのバシラス・リケニフォルミスMaTa3染色体DNA(Pitcher他、1989, Letters in Applied Microbiology 8: 151-156)、0.4μMの各プライマー、200μMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP、2.5 mM MgCl2を含む1×PCR緩衝液II、および2.5単位のAmpliTaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼから構成される反応液50μl中で実施した。PCR反応は、95℃で10分を1サイクル;95℃で1分、50℃で1分および72℃で1分を各々25サイクル;そして72℃で7分を1サイクルとプログラミングされたRoboCycler 40熱循環装置中で実施した。PCR生成物を0.5×TBE緩衝液中で2%アガロースゲルを使って視覚化した。期待されるPCR生成物は約230 bpであった。
【０１５８】
プライマー  961197:
5'-GGCCTTAAGGGCCTGCTGTCCAGACTGTCCGCT-3'(配列番号49)
プライマー  94-935:
5'-GGCGTTACAATTCAAAGA-3'(配列番号50)
【０１５９】
実施例3:生来のamyL遺伝子座中にP17プロモーター/amyL発現カセットを有するバシラス・リケニフォルミス株MDT217の作製
バシラス・リケニフォルミス SJ1904(米国特許第5,733,753号明細書)染色体DNAから、SfiI部位とSacI部位をそれぞれ組み込む後述の2つのプライマーを使って、amyL4199プロモーター(PramyL4199、米国特許第6,100,063号明細書、以後はP6プロモーターと称する)をPCR増幅せしめた。
【０１６０】
プライマー950872:
5'-CCAGGCCTTAAGGGCCGCATGCGTCCTTCTTTGTGCT-3'(配列番号51)
プライマー991151:
5'-GAGCTCCTTTCAATGTGATACATATGA-3'(配列番号52)
【０１６１】
PCR増幅は、50 ngのバシラス・リケニフォルミス SJ1904の染色体DNA、各々0.4μMのプライマー950872および991151、各々200μMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP、2.5mM MgCl2を含む1×PCR緩衝液II、および2.5単位のAmpliTaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼから成る反応液50μl中で三重反復において実施した。PCR反応は、95℃で9分を1サイクル;95℃で1分、55℃で1分および72℃で1分を各々30サイクル;そして72℃で5分を1サイクルとプログラミングされたRoboCycler 40熱循環装置中で実施した。PCR生成物を0.5×TBE緩衝液中で0.8%アガロースゲルを使って視覚化した。予想される断片は約600 bpであった。
【０１６２】
その600bp PCR断片をTA-TOPOクローニングキット(Stratagene, Inc., La Jolla, CA)を使ってpCR2.1中にクローニングし、次いでE.コリ OneShot（登録商標）コンピテント細胞を形質転換せしめた。1mlあたり100μgのアンピシリンが補足された2×YT寒天プレート上での37℃16時間の増殖後に形質転換体を選択した。それらの形質転換体からのプラスミドDNAを、製造業者の教示に従ってQIAGEN Bio Robot 9600を使うことにより精製し、そしてEcoRIによる消化と0.5×TBE緩衝液を用いた0.8%アガロースゲル上での電気泳動により分析した。該プラスミドは正しい断片(約3913 bpと640 bp)を有することがわかった。挿入されたDNAのDNA配列は、M13(-20)正プライマーとM13逆プライマー(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)を使ったDNA配列決定により確認した。正しいクローン化配列を有するプラスミドをpNBT30(図6)と命名した。
【０１６３】
プラスミドpNBT11(pDG268MCSΔneo-PrcryIIIA/SAV、米国特許第6,255,076号)とpNBT30をSfiIとSacIで消化した。消化物を0.5×TBE緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で分画し、pNBT11からの大きいベクター断片(約7931bp)とpNBT30からの小さい断片(約611bp)を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キットを使ってゲル精製した。2つの精製断片をT4 DNAリガーゼを使って連結せしめ、その連結混合物をE.コリ  SURE（登録商標）コンピテント細胞中に形質転換せしめた。1mlあたり100μgのアンピシリンが補足された2×YT寒天プレート上で形質転換体を選択した。それらの形質転換体からのプラスミドDNAを、製造業者の教示に従ってQUIAGEN Bio Robot 9600を使うことにより精製し、次いでNcoIによる消化と0.5×TBE緩衝液を用いた0.8%アガロースゲル上での電気泳動により分析した。該プラスミドは正しい断片(約6802 bpと1741 bp)を有することがわかった。そのプラスミドをpNBT31(図7)と命名した。
【０１６４】
PramyL4199/Prshort"consensus"amyQ/cryIIIAstab複合プロモーター(P16)は次のようにして作製した。まずプラスミドpNBT31をDraIIIとEcl136IIで消化した。プラスミドpNBT24(pDG268MCSΔneo-Prshort"consensus"amyQ/長鎖cryIIIAstab/SAV、米国特許第6,255,076号明細書)をSfiIで消化し、T4 DNAポリメラーゼIを用いて末端を平滑化し、次いでDraIIIで消化した。0.5×TBE緩衝液を用いて0.8%アガロースゲル上で消化物を分画し、pNBT31からの大きいベクター断片とpNBT24からの小さいプロモーター断片(約1100bp)を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キットを使ってゲル精製した。
【０１６５】
2つの精製断片をT4 DNAリガーゼを使って一緒に連結せしめ、その連結混合物をE.コリ  SURE（登録商標）コンピテント細胞中に形質転換せしめた。1mlあたり100μgのアンピシリンが補足された2×YT寒天プレート上で形質転換体を選択した。数個の形質転換体から、製造業者の教示に従ってQIAGEN Bio Robot 9600を使うことによりプラスミドDNAを精製し、次いでSfiI+SacI消化と0.5×TBE緩衝液を用いた0.8%アガロースゲル上での電気泳動により分析した。約1400 bpのSfiI/SacI断片の存在により正しいプラスミドを同定し、そのプラスミドをpNBT33(図8)と命名した。
【０１６６】
プラスミドpNBT33をAvalIとEcl136IIで消化した。プラスミドpMRT074(WO 03/054163)をNotIで消化し、T4 DNAポリメラーゼIを使って末端を平滑化し、次いでAvalIで消化した。消化物を0.5×TBE緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で分画し、pMRT074からの大きいベクター断片(約4433bp)とpNBT33からの小さい断片(約1157bp)を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キットを使ってゲル精製した。2つの精製断片をT4 DNAリガーゼを使って一緒に連結せしめ、その連結混合物をバシラス・サチリス168Δ4細胞中に形質転換せしめた。1mlあたり1μgのエリスロマイシンと25μgのリンコマイシンが補足されたTBAB-寒天プレート上で、28℃にて24〜48時間のインキュベーション後に形質転換体を選択した。数種の形質転換体からのプラスミドDNAを、製造業者の教示に従ってQIAGEN tip-20カラムを使って単離し、BamHIとHindIIIでの消化により確認した。生じたプラスミドをpMDT006(図9)と命名した。
【０１６７】
エレクトロポレーションによりプラスミドpMDT006をバシラス・リケニフォルミス MaTa3中に導入した。エリスロマイシン耐性形質転換体を単離し、実施例1に記載のものと同様にして染色体から切除し、P12縦裂プロモーターをP16プロモーターにより置換してバシラス・リケニフォルミスMDT216株を作製した。バシラス・リケニフォルミスMDT216は、本質的にバシラス・リケニフォルミスMDT216(実施例6参照)のリファムピシン感受性変異体である。プライマー94-935と94-919(上記)を使ったPCR分析により所望のクローンを同定した。
【０１６８】
プラスミドpWWi005(実施例2)をSfiIとEcoRIで消化し、amyL遺伝子の上流に置かれたDNA配列を除去した。T4 DNAポリメラーゼを使って末端を平滑化し、生じた断片を0.5×TBE緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で分画した。大きいベクター断片(約5069bp)を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キットを使ってゲル精製した。2つの精製断片をT4 DNAリガーゼを使って一緒に連結せしめ、その連結混合物をバシラス・サチリス168Δ4細胞中に形質転換せしめた。1mlあたり1μgのエリスロマイシンと25μgのリンコマイシンが補足されたTBAB-寒天プレート上で、28℃にて24〜48時間のインキュベーション後に、形質転換体を選択した。数種の形質転換体からのプラスミドDNAを、製造業者の教示に従ってQUIAGEN tip-20カラムを使って単離し、BamHIとHindIIIでの消化により確認した。生じたプラスミドをpMDT007(図10)と命名した。
【０１６９】
プラスミドpMDT007をエレクトロポレーションによりバシラス・リケニフォルミスMDT216 中に導入した。エリスロマイシン耐性形質転換体を単離し、実施例1に記載のものと同様にしてプラスミドを組み込み次いで染色体から切除し、P16プロモーターをPramyL4199/Prshort"consensus"amyQ/PrcryIIIA/cryIIIAstab三重縦裂プロモーター(P17)に変換して、バシラス・リケニフォルミスMDT217株を作製した。プライマー94-935と94-919(上記)を使ったPCR分析により、所望のクローンを同定した。
【０１７０】
実施例4:バシラス・リケニフォルミスMDT217のC成分プロテアーゼ欠失誘導体、バシラス・リケニフォルミスMDT220の作製
P17三重縦裂プロモーターの調節下にamyL遺伝子(受け入れ番号M13256)を含有するC成分欠失株であるバシラス・リケニフォルミスMDT220は、後述のようにしてバシラス・リケニフォルミスMDT217(実施例3)のC成分プロテアーゼ遺伝子の削除により作製した。
【０１７１】
バシラス・リケニフォルミスC成分プロテアーゼをコードする遺伝子の欠失変異体(米国特許第5,459,064号、受け入れ番号D10060、Kakudo他、1992、J. Biol. Chem. 267:23782)は、SOE(Horton他、1989、前掲)を使ったPCR法により作製した。5′C成分断片にはプライマー991173(これは5′EcoRI制限部位を導入する)とプライマー991174を、そして3′C成分断片にはプライマー991175と991176(これは3′HindIII制限部位を導入する)を使って、C成分遺伝子の5′領域と3′領域をバシラス・リケニフォルミスSJ1904 DNA(実施例3)からPCR増幅せしめた。
【０１７２】
プライマー991173:
5'-GAATTCGACGGCTTCCCGTGCGCC-3'(配列番号53)
プライマー991174:
5'-GCAAGCGAGCACGGATTGTAAGTACAAGTTAGATA-3'(配列番号54)
【０１７３】
プライマー991175:
5'-AACTTGTACTTACAATCCGTGCTCGCTTGCCGTAC-3′(配列番号55)
プライマー991176:
5'-AAGCTTCCATTCAAACCTGGTGAGGAAG-3′(配列番号56)
【０１７４】
PCR増幅は、50 ngのバシラス・リケニフォルミスSJ1904染色体DNA(Pitcher他,1989,前掲に従って得られる)、5′C成分断片については各0.4μMのプライマー対991173と991174、または3′C成分断片についてはプライマー対991175と991176、各々200μMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP、2.5mM MgCl2を含む1×PCR緩衝液II(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)、および2.5単位のAmpliTaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼから構成される30μlの反応液中で三通りにおいて行った。PCR反応は、95℃で9分を1サイクル;95℃で1分、52℃で1分および72℃で1分を各々3サイクル;95℃で1分、55℃で1分および72℃で1分を各々27サイクル;そして72℃で5分を1サイクルとプログラミングされたRoboCycler 40熱循環装置中で実施した。
【０１７５】
PCR生成物を0.5×TBE緩衝液中で0.8%アガロースゲルを使って視覚化した。予想される断片はサイズが約290 bpであった。最終SOE断片は、Horton, 1989,前掲に従って、プライマー991173と991176を使って作製し、その最終SOE断片をTA-TOPOクローニングキットを使ってpCR2.1中にクローニングした。1mlあたり100μgのアンピシリンが補足された2×YT寒天プレート上で37℃で16時間インキュベートした後に、形質転換体を選択した。数種の形質転換体からのプラスミドDNAを、製造業者の教示に従ってQIAGEN tip-20カラムを使って単離し、M13(-20)正プライマーとM13逆プライマーを使ったDNA配列決定により確認した。SOE断片を有するプラスミドをpNBT37(図11)と命名した。
【０１７６】
プラスミドpCJ791(WO 03/054163)とpNBT37をEcoRIとHindIIIで消化した。それらの消化物を0.5×TBE緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で分画し、pCJ791からの大きいベクター断片(約4340bp)とpNBT37からの小さいC成分欠損断片(約580bp)を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キットを使ってゲル精製した。2つの精製断片をT4 DNAリガーゼを使って一緒に連結せしめ、その連結混合物をバシラス・サチリス168Δ4細胞中に形質転換せしめた。1mlあたり1μgのエリスロマイシンと25μgのリンコマイシンが補足されたTBAB-寒天プレート上で、28℃にて24〜48時間のインキュベーション後に、形質転換体を選択した。数種の形質転換体からのプラスミドDNAを、製造業者の教示に従ってQIAGEN tip-20カラムを使って単離し、EcoRI+HindIIIでの消化とアガロースゲル電気泳動により確認した。約4340 bpおよび約580 bpの予想される断片サイズを含有するプラスミドをpNBT38(図12)と命名した。
【０１７７】
エレクトロポレーションによりプラスミドpNBT38をバシラス・リケニフォルミス MDT217中に導入した。エリスロマイシン耐性形質転換体を単離し、実施例1に記載のものと同様にして染色体から切除した。Pitcher他, 1989, 前掲に従って数種類の形質転換体から染色体DNAを単離し、上記と同様にしてプライマー991173と991176を使ったPCRにより分析してC成分欠損株を同定した。約580 bpの予想サイズのPCR断片を有する数種類の形質転換体を同定し、C成分遺伝子の部分欠失を確認した。それらの形質転換体のうちの1つを選択し、バシラス・リケニフォルミスMDT220と命名した。
【０１７８】
実施例5:プラスミドpTH012の作製
バシラス種JP170アルカリ性プロテアーゼをコードする遺伝子(WO 98/56927および米国特許第5891701号、受け入れ番号AR069954)を、下記プロモーターを使って、バシラス種JP170染色体DNAからPCR増幅せしめた。
【０１７９】
プライマー992843:
5'-CGAGCTCGATGTGTTATAAATTGAGAGGAG-3'(配列番号57)
プライマー961252:
5'-GCGGCCGCGTCATAAACGTTGCAATCGTGCTC-3'(配列番号58)
【０１８０】
PCR増幅は、50 ngのバシラス種JP170染色体DNA(Pitcher他、1989、前掲に従って得られる)、各0.4μMのプライマー対992843と961252、各々200μMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP、2.5mM MgCl2を含む1×PCR緩衝液II、および2.5単位のAmpliTaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼから構成される50μlの反応液中で三通りにおいて行った。PCR反応は、95℃で9分を1サイクル;95℃で1分、55℃で1分および72℃で1分を30サイクル;そして72℃で5分を1サイクルとプログラミングされたRoboCycler 40熱循環装置中で実施した。PCR生成物を0.5×TBE緩衝液中で0.8%アガロースゲルを使って視覚化した。予想される断片はサイズが約2163 bpであった。
【０１８１】
2163 bpのPCR断片をTA-TOPOクローニングキットを使ってpCR2.1中にクローニングし、そして1mlあたり100μgのアンピシリンが補足された2×YT寒天プレート上で37℃で16時間増殖させることにより選択した。数種の形質転換体からのプラスミドDNAを、QIAGEN Bio Robot 9600を使って精製し、0.5×TBE緩衝液を使った0.8%アガロースゲル上でのSacI+NotI消化により分析した。正しいサイズの挿入断片を有するプラスミドを同定し、その挿入断片のDNA配列を、M13(-20)正プライマーとM13逆プライマーを使ったDNA配列決定により確認した。正しい配列を有するプラスミドを同定し、それをpNBT39(図13)と命名した。
【０１８２】
プライマー992843:
5'-CGAGCTCGATGTGTTATAAATTGAGAGGAG-3′(配列番号59)
プライマー961021:
5'-GTCGAATATGATGGGGATG-3′(配列番号60)
プライマー960898:
5'-GGACAAGGACAGATTGTAGCAGTTGCTGATACTGG-3′(配列番号61)
【０１８３】
プライマー961048:
5'-GCGATTACAGTTGGGGCAACC-3′(配列番号62)
プライマー961222:
5'-GGTAGCACGACGGCATCACTAAC-3′(配列番号63)。
【０１８４】
プラスミドpMRT077(図19)は次のようにして作製した。amyL遺伝子の上流領域と3′領域を、下記に示すプライマー対733-45-1と733-45-7、およびプライマー対757-19-1と733-45-6をそれぞれ使ってSOEを介して融合した。
【０１８５】
プライマー733-45-1:
5'-GTCCTTCTTGGTACCTGGAAGCAGAGC-3′(配列番号64)
プライマー733-45-7:
5'-CATGCTGGGCCCTTAAGGCCAGTACCATTTTCCC-3′(配列番号65)
プライマー757-19-1:
5'-CAGTAGGCCTTAAGGGCCCAGCATGATTGAGCTCACCACCATGGGATCCGCGGCCGCACAAGGGAAGGC-3′(配列番号66)
プライマー733-45-6:
5′-CAATTCATCCTCTAGAGTCTCAGG-3′(配列番号67)
【０１８６】
PCR増幅は、1ngのpDN1981 DNA(米国特許第5,698,415号)、各0.4μMのプライマー対992843と961252、各々200μMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP、2.5mM MgCl2を含む1×PCR緩衝液II、および2.5単位のAmpliTaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼから構成される50μlの反応液中で行った。PCR反応は、95℃で10分を1サイクル;95℃で1分、50℃で1分および72℃で1分を25サイクル;そして72℃で7分を1サイクルとプログラミングされたRoboCycler 40熱循環装置中で実施した。PCR生成物を0.5×TBE緩衝液中で0.8%アガロースゲル電気泳動を使って視覚化した。予想される断片はそれぞれ約600 bpと500 bpであった。最終断片をプライマー733-45-1および733-45-6を用いて増幅せしめた。最終断片をTA-TOPOクローニングキットを使ってpCR2.1ベクター中にクローニングした。1mlあたり100μgのアンピシリンが補足された2×YT寒天プレート上で37℃で16時間増殖させることにより形質転換体を選択した。正しいプラスミドを担持している形質転換体を、M13正および逆プライマーを使ったDNA配列決定により確認した。そのプラスミドをpMRT040(図14)と命名した。
【０１８７】
プラスミド pMRT040をKpnI/XbaIで消化し、Klenow断片を使ってフィルインし、次いで製造業者の教示に従ってQIAquick DNA精製キットを使って0.8%アガロース-0.5×TBEゲルから約1000 bpの断片を単離した。この断片を、EcoRVで消化したプラスミドpShV3(WO 03/054163)中にクローニングし、製造業者の指示に従って(Stratagene, inc., La Jolla, CA)E.コリXL1 Blue細胞中に形質転換せしめた。形質転換体を1mlあたり100μgのアンピシリンが補足された2×YT寒天プレート上で選択し、37℃で16時間インキュベートした。数種の形質転換体からのプラスミドDNAを、製造業者の教示に従ってQIAGEN tip-20カラムを使って単離し、SacI/SphIでの制限分析により0.5×TBE緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で確認した。生じたプラスミドをpMRT044(図15)と命名した。
【０１８８】
プラスミドpMRT044とpNBT3(pDG268MCSΔneo-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV、米国特許第6,255,076号)をSacI+HindIIIで消化した。消化物をTBE緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で分画し、pMRT044からの大きいベクター断片(約7500bp)とpNBT3からの小さいcryIIIA安定化剤断片(約540 bp)を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キットを使ってゲル精製した。2つの精製断片をT4 DNAリガーゼを使って一緒に連結せしめ、その連結混合物をE.コリ XL1 Blue細胞中に形質転換せしめた。形質転換体を1mlあたり100μgのアンピシリンが補足された2×YT寒天プレート上で選択し、37℃で16時間インキュベートした。数種の形質転換体からのプラスミドDNAを、製造業者の教示に従ってQUIAGEN tip-20カラムを使って単離し、SacI/HindIIIでの制限分析により、0.5×TBE緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で確認した。生じたプラスミドをpMRT070(図16)と命名した。
【０１８９】
プラスミドpMRT074(WO 03/054163)とpMRT070を制限酵素EcoRI/HindIIIで消化した。pMRT074からの約3500 bp断片とpMRT070からの約1100 bp断片を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA精製キットを使って0.8%アガロース-0.5×TBE緩衝液から単離し、連結し、次いでバシラス・サチリス168Δ4コンピテント細胞中に形質転換せしめた。形質転換体を1mlあたり1μgのエリスロマイシンと25μgのリンコマイシンが補足されたTBAB-寒天プレート上で選択し、30℃で24〜48時間インキュベートした。数種の形質転換体からのプラスミドDNAを、製造業者の教示に従ってQIAGEN tip-20カラムを使って単離し、EcoRI/HindIIIでの制限分析により0.5×TBE緩衝液を用いて0.8%アガロースゲル上で確認した。生じたプラスミドをpMRT075(図17)と命名した。
【０１９０】
プラスミドpMRT075とpNBT40(図18)をSacI+NotIで消化した。プラスミドpNBT40は、バシラス・アミロリクファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)からの中性プロテアーゼをコードする遺伝子(npr[BamP])(Vasantha他, 1984, J. Bacteriol. 159:811, 受け入れ番号K02497)を含むpCR2.1-TOPOベクターである。pMRT075からの約5500 bpのDNA断片とpNBT40からの約1600 bpの断片を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA精製キットと0.5×TBE緩衝液を使って0.8%アガロースから単離し、連結し、次いでバシラス・サチリス168Δ4コンピテント細胞中に形質転換せしめた。形質転換体を1mlあたり1%の脱脂粉乳、1μgのエリスロマイシンおよび25μgのリンコマイシンが補足されたTBAB-寒天プレート上で選択し、30℃で24〜48時間インキュベートした。TBAB-寒天脱脂粉乳プレート上に透明ゾーンを生じる形質転換体を入手し、得られたプラスミドをpMRT077(図19)と命名した。
【０１９１】
プラスミドpNBT39とpMRT077をSacI+NotIで消化した。消化物を、0.5×TBE緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で分画し、プラスミドpMRT077からの大きいベクター断片(約5400 bp)とpNBT39からの小さいJP170プロテアーゼ断片(約2163bp)を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キットを使ってゲル精製した。2つの精製断片をT4 DNAリガーゼを使って一緒に連結せしめ、その連結混合物をバシラス・サチリス168Δ4コンピテント細胞中に形質転換せしめた。数種の形質転換体からのプラスミドDNAを、製造業者の教示に従ってQIAGEN tip-20カラムを使って精製し、SacI+NotIでの制限消化により、0.5×TBE緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で分析した。約2163 bp SacI/NotI JP170断片の存在により正しいプラスミドを同定し、そのプラスミドをpTH012(図20)と命名した。
【０１９２】
実施例6:amyL遺伝子座中にP17プロモーター/se hasA/tuaD/gtaB発現カセットの1コピーを含有するバシラス・リケニフォルミス株TH15の作製
プラスミド pMB748は、バシラス・リケニフォルミスamyL遺伝子由来のamyLシグナル配列に融合したバシラス種l633(WO 99/64619)由来のマンナナーゼ遺伝子の成熟部分を含有する。この遺伝子の先端が切除された変異体を、下記に示すようなプライマー対80501D1B11と172965、および鋳型としてのプラスミドpMB748を使って、マンナナーゼ遺伝子の3′部分を削除することにより作製した。
【０１９３】
PCR増幅は、50 ngのpMB748 DNA、各0.4μMのプライマー対80501D1B11と172965、各々200μMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP、2.5mM MgCl2を含む1×PCR緩衝液II、および2.5単位のAmpliTaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼから構成される50μlの反応液中で行った。PCR反応は、95℃で9分を1サイクル;95℃で1分、55℃で1分および72℃で1分を各30サイクル;そして72℃で5分を1サイクルとプログラミングされたRoboCycler 40熱循環装置中で実施した。約900 bpのPCR生成物を0.5×TBE緩衝液中で0.8%アガロースゲルを使って視覚化した。
【０１９４】
プライマー80501D1B11:
5'-CATTCTGCAGCCGCGGCAAATTCCGGATTTTATGTAAGCGG-3′(配列番号68)
プライマー172965:
5'-CATCATATGCGGCCGCTTATCATTGAAAAACGGTGCTTAATCTCGAAG-3′(配列番号69)
【０１９５】
PCR断片を、SacIとNotIで消化したプラスミドpMOL944(WO 99/64619)中にクローニングした。プラスミドベクター断片とamyL/マンナナーゼPCR断片を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA精製キットを使って0.8%アガロース-0.5×TBEゲルから単離し、連結し、次いでバシラス・サチリスPL2306(米国特許第6,677,147号)中に形質転換せしめ、1mlあたり10μgのカナマイシンが補足されたTBAB-寒天プレート上でカナマイシン耐性について選択した。数種の形質転換体からのプラスミドDNAを、製造業者の教示に従ってQIAprep Spin Miniprep Kit(QUIAGEN Inc., Valencia, CA)を使って精製した。プラスミドを制限酵素消化により分析した。正しい挿入断片を含むプラスミドを同定し、それをpMB1024(図21)と命名した。
【０１９６】
バシラス・サチリスMDT206を次のようにして作製した。プラスミドpMDT006(実施例3)をバシラス・リケニフォルミスMaTa4中に導入した。エリスロマイシン耐性形質転換体を単離し、実施例1に記載のものと同様にしてプラスミドを組み込みそして染色体から切除することにより、P11プロモーターをP16プロモーターへと置換し、バシラス・リケニフォルミス株MDT206を得た。所望のクローンをプライマー94-935(前記)と下記プロモーターを使ったPCR分析により同定した:
【０１９７】
プロモーター94-919:
5'-GGAAGTACAAAAATAAGC-3'(配列番号70)。
【０１９８】
cryIIIA mRNAプロセシング安定化配列とamyLシグナル配列を、次のようにしてバシラス・リケニフォルミス株MDT206からPCR増幅し、クローニングした。PCR増幅は、50 ngのバシラス・リケニフォルミスMDT206染色体DNA(Pitcher他、1989,前掲に従って得られる)、各々0.4μMのプライマー226370と219916、各々200μMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP、2.5mM MgCl2を含む1×PCR緩衝液II、および2.5単位のAmpliTaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼから構成される50μlの反応液中で行った。PCR反応は、95℃で9分を1サイクル;95℃で1分、55℃で1分および72℃で1分を各25サイクル;そして72℃で5分を1サイクルとプログラミングされたRoboCycler 40熱循環装置中で実施した。約650 bpのPCR生成物を0.5×TBE緩衝液中で0.8%アガロースゲルを使って視覚化した。
【０１９９】
プライマー226370:
5'-CATCCCCCCGGGAGCTTAATTAAAGATAATATCTTTGAATTG-3'(配列番号71)
プライマー219916:
5'-TGCCGCGGCTGCAGAATGAGGCAG-3'(配列番号72)
【０２００】
プラスミドpMB1024-1とcryIIIA/amyLシグナル配列PCR断片をXmaIとPstIで消化した。プラスミドpMB1024-1からの大きいベクター断片(約5500 bp)とcryIIIA/amyLシグナル配列PCR断片(約650 bp)を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA精製キットを使って0.8%アガロース-0.5×TBEゲルから単離し、連結し、次いでバシラス・サチリス株MOL2023中に形質転換せしめ、1mlあたり10μgのカナマイシンが補足されたTBABプレート上でカナマイシン耐性について選択した。この株は、本質的にydhT遺伝子(マンナンエンド-1,4-β-マンノシダーゼをコードする)中に挿入されたプラスミドpE194(Horinouch & Weisblum, 1982, J. Bacteriol. 150: 804-814)からのエリスロマイシン耐性遺伝子を有するバシラス・サチリスA164Δ10である。
【０２０１】
バシラス・サチリスA164Δ10は、バシラス・サチリスA164Δ5(米国特許第5,891,701号)から誘導され、そして次の遺伝子中に欠失を有する:spoIIAC,aprE,nprE,amyE,srfAC,wprA,bpr,vpr,mprおよびepr。数種の形質転換体からのプラスミドDNAを、製造業者の教示に従ってQIAprep Spin Miniprep Kitを使って精製し、制限酵素消化により分析した。正しい挿入断片を含むプラスミドを同定し、それをpMB1242(図22)と命名した。
【０２０２】
RBSとマンナナーゼ遺伝子を、下記に示すプライマー993634とプライマー733-68-1(実施例1)を使ってpMB1242からPCR増幅せしめた。
プライマー993634:
5'-GTTAACTTGAAAAACGGTGCTTAATC-3'(配列番号73)
【０２０３】
PCR増幅は、50 ngのpMB1242、各0.4μMのプライマー993634と733-68-1、各々200μMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP、2.5mM MgCl2を含む1×PCR緩衝液II、および2.5単位のAmpliTaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼから構成される50μlの反応液中で三通りに行った。PCR反応は、95℃で9分を1サイクル;95℃で1分、55℃で1分および72℃で1分を30サイクル;そして72℃で5分を1サイクルとプログラミングされたRoboCycler 40熱循環装置中で実施した。PCR生成物を0.5×TBE緩衝液中で0.8%アガロースゲルを使って視覚化した。予想される断片は約1052 bpであった。
【０２０４】
1052 bp断片を製造業者の教示に従ってTA-TOPOクローニングキットを使ってE.コリOne Shot（登録商標）コンピテント細胞中に形質転換せしめた。形質転換体は、1mlあたり100μgのアンピシリンが補足された2×YT寒天プレート上で、37℃で16時間増殖させることにより選択した。数種の形質転換体からのプラスミドDNAを、製造業者の教示に従ってQIAGEN BioRobot 9600を使って精製し、SacI+NotIで消化した。プラスミドを同定し、次いで挿入断片のDNA配列をM13(-20)正プライマーとM13逆プライマーを使ったDNA配列決定により確認した。正しい配列を有するプラスミドをpTH029(図23)と命名した。
【０２０５】
次に、以下のようにしてマンナナーゼ遺伝子をSacI/HpaI断片としてpNBT18(pDG268MCSΔneo-long cryIIIAstab/SAV、米国特許第6,255,076号)中にクローニングして、aprHコード領域と置き換えた。プラスミドpTH029をSacI+HpaIで消化した。プラスミドpNBT18をSacI+HpaIで消化した。消化物を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA精製キットを使って0.8%アガロースゲル-0.5×TBE緩衝液上で分画し、プラスミドpNBT18からの大きいベクター断片(約7330 bp)とpTH029からの小さいマンナナーゼ遺伝子断片(約1010 bp)を、製造業者の教示に従ってゲル精製した。2つの精製断片をT4 DNAリガーゼを用いて一緒に連結し、連結混合物をE.コリOneShot（登録商標）コンピテント細胞中に形質転換せしめた。形質転換体を1mlあたり100μgのアンピシリンが補足された2×YT寒天培地上で16時間増殖後に37℃で選択した。
【０２０６】
それらの形質転換体から、製造業者の教示に従ってQIAGEN robotを使ってプラスミドDNAを精製した。約1095 bp SacI/NotIマンナナーゼ遺伝子断片の存在により正しいプラスミドを同定し、そのプラスミドをpTH026(図24)と命名した。
【０２０７】
次いで、以下のようにして、pTH026からのマンナナーゼ遺伝子とaprH遺伝子ターミネーターをSacI/NotI断片としてpTH012中に挿入して、JP170プロテアーゼ遺伝子と置き換えた。プラスミドpTH012とpTH026をSacI+NotIで消化した。消化物を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キットを使って0.8%アガロースゲル-0.5×TBE緩衝液上で分画し、そしてプラスミドpTH012由来の大きいベクター断片(約5359 bp)とpTH026由来の小さいマンナナーゼ遺伝子断片(約1095 bp)を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キットを使ってゲル精製した。2つの精製断片をT4 DNAリガーゼを用いて一緒に連結し、連結混合物をバシラス・サチリス168Δ4中に形質転換した。
【０２０８】
数種の形質転換体から、製造業者の教示に従ってQIAGEN tip-20カラムを使ってプラスミドDNAを精製し、SacI+NotI消化により0.5×TBE緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で分析した。約1095 bp SacI/NotIマンナナーゼ遺伝子断片(この断片はamyL RBS、amyLシグナル-マンナナーゼコード配列融合体、およびaprHターミネーターを有するこの断片は、以後、「マンナナーゼ遺伝子」と証する)の存在により正しいプラスミドを同定した。そのプラスミドをpTH013(図25)と命名した。
【０２０９】
プラスミドpTH020は、ストレプトコッカス・エキシミリス(Streptococcus equisimillis)ヒアルロナンシンターゼ遺伝子(hasA)を含む人工ヒアルロン酸(HA)オペロンを、P17三重プロモーターの調節下にバシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)MDT220の染色体中に導入するために作製した。pHA3(WO 03/054163)からのcryIIIAstab/hasA/tuaD/gtaB人工オペロンをSacI/NotI断片としてプラスミドpTH013中に挿入することにより、下記のようにしてマンナナーゼ遺伝子を置き換えた。プラスミドpTH013とpHA3をSacI+NotIで消化した。
【０２１０】
消化物を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キットを使って0.8%アガロース-0.5×TBE緩衝液上で分画し、そしてプラスミドpTH013からの大きいベクター断片(約5400 bp)とpHA3からの小さいcryIIIAstab/hasA/tuaD/gtaB人工オペロン断片(約3800 bp)を、製造業者の教示に従ってQIAquick DNA抽出キットを使ってゲル精製した。2つの精製断片をT4 DNAリガーゼを用いて一緒に連結し、連結混合物をバシラス・サチリス168Δ4中に形質転換した。数種の形質転換体から、製造業者の教示に従ってQIAGEN tip-20カラムを使ってプラスミドDNAを精製し、SacI+NotI消化により0.5×TBE緩衝液を使って0.8%アガロースゲル上で分析した。制限酵素消化および/またはPCR分析により正しいプラスミドを同定した。その得られたプラスミドをpTH020(図26)と命名した。
【０２１１】
エレクトロポレーションによりプラスミドpTH020をバシラス・リケニフォルミス MDT220中に導入した。エリスロマイシン耐性形質転換体を単離し、実施例1に記載のものと同様にして染色体から切除した。数種類の形質転換体から染色体DNAを単離し(Pitcher他, 1989, 前掲)、PCRにより分析した。PCR分析は、プライマー992463と992468(hasA遺伝子)、992464と992472(tuaD遺伝子)、および992471と992477(gtaB遺伝子)を使って行った。HAオペロンを染色体中に組み込んだ後、最終菌株はプロテアーゼ陰性で且つエリスロマイシン感受性であるものとして同定し、再び同じプライマーを使ってオペロンが存在することを確かめた。それらの菌株のうちの1つを選択し、バシラス・リケニフォルミス  TH15と命名した。
【０２１２】
実施例7:バシラス・リケニフォルミス TH15の発酵
バシラス・リケニフォルミス  TH15によるヒアルロン酸(HA)の生産は、2リットルの発酵槽(Applikon, Inc., Holland)中、1リットルあたり6.5gのKH2PO4、4.5gのNa2HPO4、3.0gの(NH4)2SO4、2.0gのクエン酸ナトリウム、3.0gのMgSO4・7H20、15gのショ糖、0.5gのCaCl2・2H2O、6.0mlの微量金属溶液(組成は下記のとおり)および3.0mlの消泡剤から成る培地中で、7.0±0.2に調節されたpHで評価した。流加液は20%(w/w)ショ糖から成った。微量金属溶液は1リットルあたり100gのクエン酸、20gのFeSO4・7H20、5gのMnSO4・H20、2gのCuSO4・5H2Oおよび2.0gのZnCl2から構成された。48時間の発酵時間の間、温度を37℃に調節した。最大空気流および攪拌速度はそれぞれ1.5vvmおよび1300rpmであった。
【０２１３】
図27に示す結果は、hasA/tuaD/gtaBオペロンの発現を指令するP17三重プロモーターがバシラス・リケニフォルミス TH15中でHAを生産する能力を有することを証明する。
【０２１４】
本明細書中に記載され特許請求される発明は、明細書中に開示される特定の面により範囲を限定されるものではない。何故なら、それらの幾つかの局面は発明の例示として意図されるからである。幾つかの同等の局面は本発明の範囲内に入る。実際、本明細書中に例示および記載されるものに加えて、上記記載より本発明の様々な変更が当業者に明らかになるであろう。そのような変更は添付の特許請求の範囲の中にも入る。コンフリクトする場合、定義を含む発明の開示がコントロールするであろう。
様々な参考文献が明細書中に列挙されるが、その開示は参考としてその全内容が明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１】図1はpNBT28の制限地図を示す。
【図２】図2はpMRT038の制限地図を示す。
【図３】図3はpNBT29の制限地図を示す。
【図４】図4はpWWi001.1の制限地図を示す。
【図５】図5はpWWi005の制限地図を示す。
【図６】図6はpNBT30の制限地図を示す。
【図７】図7はpNBT31の制限地図を示す。
【図８】図8はpNBT33の制限地図を示す。
【図９】図9はpMDT006の制限地図を示す。
【図１０】図10はpMDT007の制限地図を示す。
【図１１】図11はpNBT37の制限地図を示す。
【図１２】図12はpNBT38の制限地図を示す。
【図１３】図13はpNBT39の制限地図を示す。
【図１４】図14はpMRT040の制限地図を示す。
【図１５】図15はpMRT044の制限地図を示す。
【図１６】図16はpMRT070の制限地図を示す。
【図１７】図17はpMRT075の制限地図を示す。
【図１８】図18はpNBT40の制限地図を示す。
【図１９】図19はpMRT077の制限地図を示す。
【図２０】図20はpTH012の制限地図を示す。
【図２１】図21はpMB1024-1の制限地図を示す。
【図２２】図22はpMB1242の制限地図を示す。
【図２３】図23はpTH029の制限地図を示す。
【図２４】図24はpTH026の制限地図を示す。
【図２５】図25はpTH013の制限地図を示す。
【図２６】図26はpTH020の制限地図を示す。
【図２７】図27はバシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)TH15によるヒアルロン酸の生産を示す。
【図１】
2007535917.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
2007535917000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月7日(2006.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
(a) ヒアルロン酸の生産を促進する培地中でバシラス(Bacillus;桿菌)細胞を培養し、ここで前記バシラス細胞は、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAをそして「-10」領域に配列TATAATを有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、を含んでなる三重プロモーターを有する核酸構成物を含んでなり、ここで前記三重プロモーターの各プロモーター配列はヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されており;そして
(b) 前記培地からヒアルロン酸を単離する;
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
前記変形amyLプロモーターが配列番号1の配列である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記共通プリモーターが、配列番号42または配列番号43のヌクレオチド配列を有する共通amyQ プロモーターである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸構成物が、三重プロモーターの下流で且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなる、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記mRNAプロセシング/安定化配列が、cryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列またはSP82 mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記バシラス細胞が外来の選択マーカー遺伝子を全く含まない、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列が、ヒアルロナンシンターゼ、UDP-グルコース-6-デヒドロゲナーゼ、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、アミドトランスフェラーゼ、ムターゼおよびアセチルトランスフェラーゼ遺伝子から成る群より選ばれる、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
(a) 配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域にTTGACA配列と「-10」領域にTATAAT配列を有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、からなる三重プロモーターであって、前記三重プロモーターの各プロモーター配列は、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されている、三重プロモーター;並びに所望により(b)前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列、を含んでなる核酸構成物を含有するバシラス細胞。
【請求項９】
前記変形amyLプロモーターが配列番号1である、請求項8に記載のバシラス細胞。
【請求項１０】
前記共通プロモーターが、配列番号42もしくは配列番号43のヌクレオチド配列またはすの部分を有する共通amyQプロモーターである、請求項8に記載のバシラス細胞。
【請求項１１】
前記核酸構成物が、前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなる、請求項8に記載のバシラス細胞。
【請求項１２】
前記mRNAプロセシング/安定化配列が、cryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列またはSP82mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項11に記載のバシラス細胞。
【請求項１３】
前記バシラス細胞が外来の選択マーカー遺伝子を全く含まない、請求項8に記載のバシラス細胞。
【請求項１４】
前記ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列が、ヒアルロナンシンターゼ、UDP-グルコース-6-デヒドロゲナーゼ、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、アミドトランスフェラーゼ、ムターゼおよびアセチルトランスフェラーゼ遺伝子から成る群より選ばれる、請求項8に記載のバシラス細胞。
【請求項１５】
バシラス細胞の選択マーカー欠失変異体の製造方法であって、バシラス細胞の選択マーカー遺伝子を削除することを含んでなり、ここで前記バシラス細胞が、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域にTATAAT配列を有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーターを含んで成る三重プロモーターを含有する核酸構成物を含んでなり、ここで前記三重プロモーターの各プロモーターが、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されていることを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記変形amyLプロモーターが、配列番号1のヌクレオチド配列である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記共通プロモーターが、配列番号42または配列番号43のヌクレオチド配列を有する共通amyQプロモーターである請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸構成物が、前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなる、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
前記mRNAプロセシング/安定化配列が、cryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列またはSP82 mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記バシラス細胞が外来の選択マーカー遺伝子を全く含まない、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列が、ヒアルロナンシンターゼ、UDP-グルコース-6-デヒドロゲナーゼ、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、アミドトランスフェラーゼ、ムターゼおよびアセチルトランスフェラーゼ遺伝子から成る群より選ばれる、請求項18に方法。
【請求項２２】
請求項15の方法により得られる、バシラス細胞の選択マーカー欠失変異体。
【請求項２３】
バシラス宿主細胞を獲得する方法であって、配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域にTATAAT配列を有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーターを含んで成る三重プロモーターを含有する核酸構成物を、バシラス細胞中に導入し、ここで前記三重プロモーターの各プロモーターが、ヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列に作用可能に連結されていることを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記核酸構成物が、前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなる、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記mRNAプロセシング/安定化配列が、cryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列またはSP82 mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号1の第590位に相当する位置に変異を有する変形amyLプロモーター、「-35」領域に配列TTGACAを有しそして「-10」領域にTATAAT配列を有する共通プロモーター、およびcryIIIAプロモーター、を含んで成る三重プロモーターを含有する核酸構成物。
【請求項２７】
前記核酸構成物が、前記三重プロモーターの下流であって且つヒアルロン酸の生合成に関与する1または複数のコード配列の上流に置かれたmRNAプロセシング/安定化配列を更に含んでなる、請求項26に記載の核酸構成物。
【請求項２８】
前記mRNAプロセシング/安定化配列が、cryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列またはSP82 mRNAプロセシング/安定化配列である、請求項27に記載の核酸構成物。