(57)【要約】  本発明は、カルボニル還元酵素および補酵素を用いて２−ブタノンの還元を酵素学的に触媒することにより２−ブタノールを調製するためのプロセスに関する。本発明は、カルボニル還元酵素および補酵素を含む水相がアルコール相と接触され、その結果、本発明では、形成された２−ブタノールが分離されることを特徴としている。本発明において、アルコール相は、水相と混和し得ず、かつ還元するための２−ブタノンを含んでいる。ただし、アルコール相に存在するアルコールは、補酵素を再生成し得かつ水の沸点より高い沸点を示し得る第２級アルコールである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボニル還元酵素および補酵素を用いて２−ブタノンの還元を酵素学的に触媒することにより２−ブタノールを調製するためのプロセスであって、
（ａ）カルボニル還元酵素および補酵素を含む水相がアルコール相と接触され、
該アルコール相は、該水相と混和し得ず、かつ還元するための２−ブタノンを含んでおり（ただし、該アルコール相に存在するアルコールは、該補酵素を再生成し得かつ水の沸点より高い沸点を示し得る第２級アルコールである。）、その結果、
（ｂ）形成された２−ブタノールが分離される
プロセス。
【請求項２】
前記アルコール相のアルコールが、２−ペンタノール、２−ヘキサノール、２−ヘプタノール、２−オクタノールまたは４−メチル−２−ペンタノールである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記アルコール相のアルコールが、２−ヘプタノールまたは２−オクタノールである、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記アルコール相のアルコールおよび前記２−ブタノンが、１：２〜１：１０の範囲のモル比（２−ブタノン：第２級アルコール）で使用される、請求項１〜３の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記モル比が１：２．５〜１：５の範囲である、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記２−ブタノンが、反応混合物の総量に基づいて、少なくとも５重量％、好ましくは１０〜２５重量％の量で使用される、請求項１〜５の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
１ｋｇの２−ブタノン当たり少なくとも２０００単位、好ましくは、少なくとも１００００単位のカルボニル還元酵素が使用される、請求項１〜６の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓより得られるカルボニル還元酵素が使用される、請求項１〜７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記２−ブタノールが蒸留により分離される、請求項１〜８の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
鏡像異性的には実質的に単一のＳ−２−ブタノールまたはＲ−２−ブタノールの調製を可能にするカルボニル還元酵素が使用される、請求項１〜９の何れか１項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、２−ブタノールを調製するためのプロセスに関し、より詳細には、カルボニル還元酵素および補酵素を用いて２−ブタノンの還元を酵素学的に触媒することにより、Ｒ−２−ブタノールまたはＳ−２−ブタノールを調製するためのプロセスに関する。
【０００２】
２−ブタノール、特に、キラル化合物であるＲ−２−ブタノールおよびＳ−２−ブタノールは、薬学的に活性な物質の生成において求められる中間体である。
【０００３】
鏡像異性的に単一の２−ブタノール（すなわち、Ｒ−２−ブタノールおよびＳ−２−ブタノール）の調製は複雑である。なぜなら、現在まで、Ｒ−２−ブタノールまたはＳ−２−ブタノールのそれぞれへの２−ブタノンの直接的な化学的触媒不斉還元は可能ではなかったからである。直接酵素的な還元のためのプロセスもそう多くは記載されていない。鏡像異性的に単一のＲ−２−ブタノールおよびＳ−２−ブタノールは、ラセミ化合物の分割を介する間接的な手段によってのみ商業スケールで生成され得る。
【０００４】
カルボニル還元酵素（別名：アルコールデヒドロゲナーゼ、オキシドレダクターゼ）は、それぞれ、カルボニル化合物の還元および第２級アルコールの酸化のための触媒として知られている。これらの酵素は、補酵素（例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）を必要とする。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒより得られるカルボニル還元酵素および補酵素ＮＡＤＰＨを用いる、ケトンの還元が知られている（例えば、米国特許第５，３４２，７６７号）。
【０００５】
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｓｐ．より得られるアルコールデヒドロゲナーゼの精製および特徴付けは、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４，３５６−３６２（１９９８）により知られている。
【０００６】
水相の媒体でのカルボニル還元酵素による２−ブタノンから２−ブタノールへの還元は困難である。なぜなら、反応混合物の再処理が容易ではなく、２−ブタノールが容易に水に溶けてしまう。さらに、２−ブタノールと水との分離のための抽出プロセスおよび蒸留プロセスは、技術的に複雑であることが示されている。
【０００７】
カルボニル還元酵素による２−ブタノンから２−ブタノールへの酵素学的な還元に関連するさらなる問題は、それぞれ補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの再生成にある。現在しばしば用いられている、２−プロパノールの用いるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生成法は、同様に問題を有している。なぜなら、後者は、生成物であるＲ−２−ブタノールまたはＳ−２−ブタノール各々の単離をより困難にし、そして過度の労力なしにはＲ−２−ブタノールまたはＳ−２−ブタノール各々を完全に分離し得ないからである。
【０００８】
水相の媒体での２−ブタノンの酵素学的な還元に関連するさらなる問題は、２−プロパノールを用いるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの補酵素再生成とともに、ほとんどの酵素が、２０％を超える量での２−プロパノールおよび２−ブタノールによって不活性化することにある。このことは、使用されるべき、過剰量の２−プロパノールから開始される場合、使用されるべき２−ブタノンの最終濃度が１０％（ｗ／ｖ）よりかなり低いことが必要であることを意味する。これらの低濃度の基質または生成物は順々に生じ得、反応混合物からのＲ−２−ブタノールまたはＳ−２−ブタノール各々の単離を阻害する。
【０００９】
本発明に係るプロセスは、カルボニル還元酵素および補酵素を用いる、２−ブタノンの還元を酵素学的に触媒することにより２−ブタノールを調製するためのものであり、上述した問題を解決することを目的としている。本発明に係るプロセスは、
（ａ）カルボニル還元酵素および補酵素を含む水相がアルコール相と接触され、ここで、アルコール相は、水相と混和し得ず、かつ還元するための２−ブタノンを含んでおり（ただし、該アルコール相に存在するアルコールは、該補酵素を再生成し得かつ水の沸点より高い沸点を示し得る第２級アルコールである。）、その結果、
（ｂ）形成された２−ブタノールが分離される。
【００１０】
従って、本発明に係るプロセスにおいて、カルボニル還元酵素による２−ブタノンから２−ブタノールへの還元は、酵素および補酵素が溶解されている水相、ならびに第２級アルコールおよび２−ブタノンから形成される有機相からなる二相系にて行われる。
【００１１】
補酵素再生成は、第２級アルコールを用いて行われる。この第２級アルコールは、水と混和し得ず、同時に、可能な限り水の沸点より明らかに高い沸点を示す。そのために、２−ペンタノール、２−ヘキサノール、２−ヘプタノール、２−オクタノールおよび４−メチル−２−ペンタノールが都合よく用いられ、特に、２−ヘプタノールおよび２−オクタノールが好ましい。
【００１２】
ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、補酵素として特に好ましい。さらに、水と混和し得ない第２級アルコールは、本発明に係るプロセスにおいてカルボニル還元酵素の安定化を導く。
【００１３】
補酵素の再生成のために第２級アルコールを使用することの利点はまた、還元されるべき基質２−ブタノンに対してより過剰量でこのアルコールが使用され得ることにある。従って、このことは、供給原料でのより高濃度の２−ブタノンと一緒により速いターンオーバーを達成することを可能にする。従って、アルコール相の第２級アルコールと２−ブタノンは、好ましくは１：２〜１：１０、特に好ましくは、１：２．５〜１：５の範囲のモル比（２−ブタノン：第２級アルコール）で使用される。
【００１４】
本発明に係るプロセスのさらなる実施形態において、２−ブタノンは、反応混合物の総量に基づいて、少なくとも５重量％、好ましくは、１０〜２５重量％の範囲で使用される。
【００１５】
好ましくは、カルボニル還元酵素は、１ｋｇの２−ブタノン当たり少なくとも２０００単位、好ましくは、少なくとも１００００単位が使用され、上限は、適切には、１ｋｇの２−ブタノン当たり２５０，０００単位である。これにより、酵素単位１Ｕは、１分間（ｍｉｎ）当たり１μｍｏｌの２−ブタノンを変換するために必要とされる酵素量に対応する。
【００１６】
特に、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓより得られるカルボニル還元酵素が、それぞれ、価値のあるカルボニル還元酵素またはアルコールデヒドロゲナーゼであることが示された。好ましくは、鏡像異性的には実質的に単一のＳ−２−ブタノールまたはＲ−２−ブタノールの調製を可能にするカルボニル還元酵素が使用される。このように行う際に、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓより得られるカルボニル還元酵素は、２−ブタノンをＳ−２−ブタノールに、鏡像異性的に還元し得ることが見出された。これにより、選択されるプロセスの条件に依存して、所望のエナンチオマーについて鏡像異性的に９８％を超える純度が達成され得る。
【００１７】
本発明に係るプロセスにおいて形成される２−ブタノールは、第２級アルコールの相にあり、そして第２級アルコールと一緒に水相から移動され得る。続いて、２−ブタノールは蒸留を介して単純な様式で取得され得る。
【００１８】
本発明に係るプロセスにおいて、対応する、鏡像異性的に単一なＳ−アルコールはまた、補酵素再生成に使用され得る。
【００１９】
反応混合物の総量に対する水相および有機相の量は変動し得る。ここで、水相の量は３重量％まで減少し得、その結果、使用した、９０％を超える２−ブタノンまたはＲ−２−ブタノールもしくはＳ−２−ブタノールの各々が、水に混和し得ないアルコールによって形成された相に配置される。
【００２０】
本発明に係るプロセスのさらなる利点は、高度に精製された形態でのＲ−２−ブタノールまたはＳ−２−ブタノールの各々の、比較的単純な再処理および単離にある。生成物Ｒ−２−ブタノールまたはＳ−２−ブタノールの各々の単離は、有機相を分離して、高沸点の、水に混和し得ない第２級アルコールから２−ブタノン／２−ブタノールを蒸留することにより行われる。
【００２１】
続いて、キラル生成物であるＲ−２−ブタノールまたはＳ−２−ブタノールの各々が、蒸留を介して、２−ブタノール／２−ブタノン混合物から９９％を超える化学的な純度および９８％を超える鏡像異性的な純度にて回収され得る。
【００２２】
本発明に係るプロセスにおいて、基質２−ブタノンについての使用されるべき濃度は、好ましくは５重量％を超え、より好ましくは１０〜２５重量％の範囲である。
【００２３】
補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの濃度は、水相に基づいて、０．０１〜１０ｍＭであり、０．１〜１ｍＭであることが好ましい。
【００２４】
好ましくは、緩衝液は、例えば、リン酸カリウム、ｔｒｉｓ／ＨＣｌまたはトリエタノールアミン緩衝液（５〜１０のｐＨ値、好ましくは６〜９のｐＨ値を有している。）が、本発明に係るプロセスにおいて使用される水相に添加される。
【００２５】
温度は、例えば、約１０〜６０℃であり、好ましくは２５〜３５℃である。
【００２６】
本発明に係るプロセスは、例えば、ガラスまたは金属により形成された、閉鎖された反応容器内で行われ得る。この目的のために、各成分が、個別に反応容器内に移され、例えば、窒素または空気の雰囲気下で攪拌される。反応時間は、１〜４８時間、特には２〜２４時間である。
【００２７】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓより得られるカルボニル還元酵素の代わりに、２−ブタノンをＳ−２−ブタノールまたはＲ−２−ブタノールに鏡像異性的に還元し得る他のカルボニル還元酵素が使用され得る。
【００２８】
以下の実施例により、本発明がより詳細に記載される。
【００２９】
〔実施例１〕
本実施例において、２−ブタノンからのＳ−２−ブタノールの生成、および使用した２−ブタノン／第２級アルコール（２−ヘプタノール）の比に依存する２−ブタノールの収率依存性を示す。カルボニル還元酵素として、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ由来の酵素を使用した。補酵素再生成を２−ヘプタノールを用いて行った。以下の表１において、異なる２−ブタノン／２−ヘプタノール比を示す３つの供給原料についての変換データを示す。
【００３０】
【表１】
2007535964.tif 000002
【００３１】
まず、反応容器内に緩衝液を配置することにより変換を行った。次いで、ＮＡＤおよび酵素を溶解した。続いて、２−ヘプタノールおよび２−ブタノンを、反応容器内に配置した。
【００３２】
次いで、反応混合物を入念に混合しながら３０℃でインキュベートした。２−ブタノンのさらなる変換が観察されない段階で反応を終了させた。これにより、反応が平衡に達した。
【００３３】
表１において、２−ヘプタノールの濃度増加とともにＳ−２−ブタノールの収率が実質的に増加することが見られる。
【００３４】
〔実施例２〕
本実施例において、収率が実質的に変化することなく水相が減少され得ることが３つの供給原料によって示される。
【００３５】
【表２】
2007535964.tif 000003
【００３６】
〔実施例３〕
本実施例において、種々の第２級アルコールを用いて補酵素の再生成を行うことができることを示す。３つの供給原料の結果を、以下の表３に示す。
【００３７】
【表３】
2007535964.tif 000004
【００３８】
〔実施例４〕
本実施例において、技術スケールでのＳ−２−ブタノールの予備的な（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）生成を示す。
【００３９】
Ｓ−２−ブタノールの予備的な生成のために、４．９６ｌの緩衝液（ＴＥＡ１００ｍＭ（ｐＨ＝７．０））を、攪拌した反応器の中に配置して温度を３０℃に調整した。続いて、４．９６ｇのＮＡＤをこの緩衝液に溶解し、３００，０００単位のＣａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ由来カルボニル還元酵素をこの緩衝液に添加した。反応混合物を、７６．１１ｌ（６０．９ｋｇ）の２−ヘプタノールの層で覆い、その上に基質２−ブタノン１２．５ｌ（１０ｋｇ）を加えた。
【００４０】
続いて、攪拌を開始し、反応混合物を入念に混合しながら１２時間インキュベートした。１２時間後、２−ブンタンをＳ−２−ブタノールに変換した（６８％）。これは、９８．４％の鏡学異性的な純度を含んだ。
【００４１】
反応の完了の際に、２−ブンタン／Ｓ−２−ブタノールを含むヘプタノール相を分離し、そして乾燥した。２−ブンタン／Ｓ−２−ブタノール混合物を、蒸留により、先ずヘプタノール相より得た（沸点約１５８〜１６１℃）。続いて、第２の蒸留において、２−ブンタン（沸点８０℃）とＳ−２−ブタノール（沸点９７〜１００℃）とを分離した。
【００４２】
この様式で、Ｓ−２−ブタノールを、９９％を超える化学的な純度で得ることができる。
【国際調査報告】
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