(57)【要約】  本発明は、Bacillus licheniformis DSM 13 由来のＲecＡ因子(配列番号：２)、と共にその関連遺伝子recＡ(配列番号：１)にも関し、関連タンパク質およびそれらの遺伝子、例えばそれらの中で、特に配列番号３１および３２として示した変異体を包含する。本発明に従って、遺伝子recＡは、生物学的産生のために、それらの中でグラム陽性細菌の安全な系統を構築するために、その機能を不活性化することによって使用される。特定の実施態様において、該系統は、ＩＶ期の胞子形成遺伝子、好ましくは遺伝子spoＩＶ（Bacillus licheniformis）、遺伝子yqfＤ（Bacillus subtilis）、または該系統が天然に胞子を形成できる場合はそれらに対して相同である各遺伝子のさらなる機能削除により提供される。さらに、新規ＲecＡは、分子生物学的アッセイまたは細胞の分子生物学的活性について、特にＤＮＡ重合化または組み換え過程との関連において使用され得るタンパク質を示す。
2007533306.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載したアミノ酸配列と少なくとも９６％同一である、アミノ酸配列を有するＲecＡ因子。
【請求項２】
配列番号：２に記載したアミノ酸配列と、少なくとも９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％同一の順で好ましく、特に好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１記載の因子。
【請求項３】
核酸のヌクレオチド配列が、配列番号：１に記載したヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一である、核酸からコードされたＲecＡ因子。
【請求項４】
核酸のヌクレオチド配列が、配列番号：１に記載したヌクレオチド配列と、少なくとも８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の順で好ましく、特に好ましくは１００％同一である、核酸からコードされた請求項３記載の因子。
【請求項５】
ヌクレオチド配列が、配列番号：１に記載したヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一である、ＲecＡ因子をコードしている核酸。
【請求項６】
ヌクレオチド配列が、配列番号：１に記載したヌクレオチド配列の、少なくとも８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の順で好ましく、特に好ましくは１００％同一である、請求項５記載の核酸。
【請求項７】
請求項１〜４いずれかに記載のＲecＡ因子をコードしている、請求項５または６記載の核酸。
【請求項８】
バシラス・メガテリウムではないグラム陽性細菌における遺伝子recＡの機能不活性化のためのＲecＡ因子をコードしている、核酸の使用。
【請求項９】
非活性タンパク質をコードする核酸が、点突然変異により導入される、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
欠失突然変異または挿入突然変異を有する核酸を用い、好ましくはタンパク質をコードしている領域の少なくとも７０から１５０核酸位置を含む各々の境界配列を含む、請求項８記載の使用。
【請求項１１】
各々が少なくとも７０から１５０の核酸位置を含み、これにより少なくとも部分的に、好ましくは完全にタンパク質をコードしている領域に隣接する、２つの核酸セグメントの全てを有する核酸が用いられる、請求項８記載の使用。
【請求項１２】
請求項５〜７のいずれか１つの核酸、および／またはヌクレオチド配列が、位置３６９から１４１５における配列番号：３１に記載のヌクレオチド配列と、これらの１０４７位置の少なくとも１０４５、好ましくは少なくとも１０４６、特に好ましくは１０４７と一致する核酸に関するか、またはこれらの核酸と少なくとも部分的にコードしていないフランキング領域に関する、請求項８〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
グラム陽性細菌、好ましくはクロストリジウム属またはバシラス属の一つが天然に胞子形成でき、胞子形成のＩＶ期由来の遺伝子がrecＡと同時に機能不活性化される、請求項８〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
学名 バシラス・サブチリスのＩＶ期の胞子形成からの不活性化遺伝子は、遺伝子spoＩＶＡ、spoＩＶＢ、spoＩＶＣＡ、spoＩＶＣＢ、spoＩＶＦＡ、spoＩＶＦＢまたはyqfＤの一つに関するか、またはこれと相同な遺伝子に関し、好ましくはバシラス・サブチリスの場合には遺伝子はyqfＤであり、バシラス・リケニホルミスの場合には遺伝子はspoＩＶであり、そしてその他全ての場合にはこれと相同な遺伝子である、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
胞子形成のＩＶ期から厳密に１つの遺伝子が機能的に不活性化される、請求項１３または１４記載の使用。
【請求項１６】
遺伝子spoＩＶＡ、spoＩＶＢ、spoＩＶＣＡ、spoＩＶＣＢ、spoＩＶＦＡ、spoＩＶＦＢ、yqfＤまたはspoＩＶの、またはそれらの相同な各遺伝子の機能不活性化が、配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５または１７、またはその部分の助けによっておこる、好ましくは少なくとも７０から１５０の連続する核酸位置を含む部分の助けによっておこる、特に好ましくはそれらの間に位置する遺伝子の一部を取り巻く２つのそのような部分の助けによっておこる、請求項１４または１５記載の使用。
【請求項１７】
遺伝子recＡが機能不活性化される、バシラス・メガテリウムではないグラム陽性細菌。
【請求項１８】
機能不活性化が、完全タンパク質をコードしている領域の、点突然変異生成、部分的欠失または挿入、または全体的欠失によって行われる、請求項１７記載のグラム陽性細菌。
【請求項１９】
機能不活性化が、請求項５〜７のいずれかに記載の一つの核酸によって、および／または、ヌクレオチド配列が、位置３６９から１４１５における配列番号：３１に記載されたヌクレオチド配列と、これらの１０４７位置の少なくとも１０４５、好ましくは少なくとも１０４６、特に好ましくは１０４７と一致する核酸によって行われるか、あるいはこれらの核酸に対して少なくとも部分的にコードしていないフランキング領域によって行われる、請求項１７または１８記載のグラム陽性細菌。
【請求項２０】
天然に胞子形成でき、これによって胞子形成のＩＶ期由来の遺伝子がrecＡと同時に機能不活性化される、請求項１７〜１９記載のいずれか一つのグラム陽性細菌、好ましくはクロステリジウム属またはバシラス属のうちの一つのグラム陽性細菌。
【請求項２１】
学名バシラス・サブチリスにおいて胞子形成のＩＶ期由来の不活性化された遺伝子が、遺伝子spoＩＶＡ、spoＩＶＢ、spoＩＶＣＡ、spoＩＶＣＢ、spoＩＶＦＡ、spoＩＶＦＢまたはyqfＤの一つに関するか、またはこれに対する相同遺伝子に関し、好ましくはバシラス・サブチリスの場合には遺伝子がyqfＤであり、バシラス・リケニホルミスの場合には遺伝子がspoＩＶであり、他の全ての場合にはこれに対する相同遺伝子である、請求項２０に記載のグラム陽性細菌。
【請求項２２】
胞子形成のＩＶ期から厳密に１つの遺伝子が、機能的に不活性化される、請求項２０または２１に記載のグラム陽性細菌。
【請求項２３】
遺伝子spoＩＶＡ、spoＩＶＢ、spoＩＶＣＡ、spoＩＶＣＢ、spoＩＶＦＡ、spoＩＶＦＢ、yqfＤまたはspoＩＶの機能不活性化、またはそれらの各相同遺伝子の機能不活性化が、配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５または１７の配列またはその部分配列の助けによって、好ましくは少なくとも７０から１５０の連続した核酸位置を含む一部分の助けによって、特に好ましくはそれらの間に位置する遺伝子の一部を取り巻く２つのそのような部分の助けによって影響される、請求項２１または２２記載のグラム陽性細菌。
【請求項２４】
クロストリジウム属またはバシラス属の一つ、特にバシラス・サブチリス種、バシラス・リケニホルミス種、バシラス・アミロリクェファシエンス種、バシラス・ステアロサーモフィラス種、バシラス・グロビジー種、バシラス・クラウジー種またはバシラス・レンタス種の一つ、特にバシラス・リケニホルミスの株に関する、請求項１７〜２３のいずれかに記載のグラム陽性細菌。
【請求項２５】
請求項１７〜２４のいずれかに記載のグラム陽性細菌の発酵方法。
【請求項２６】
有用な産物、特に低分子量化合物またはタンパク質の製造のための、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
低分子量化合物が天然の産物、栄養サプリメントまたは医薬関連化合物に関する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
タンパク質が、酵素、特にα-アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼおよびヘミセルラーゼの群からの酵素に関する、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
分子生物学的反応方法における、請求項１〜４のいずれかに記載のＲecＡ因子、および／または配列番号：３２に記載のアミノ酸配列と、そこに示される３４８個のアミノ酸位置における少なくとも３４７、好ましくは３４８において一致するＲecＡ、の使用。
【請求項３０】
イン・ビトロでの組換え方法において、一本鎖ＤＮＡ、特にＤＮＡ重合化を安定化するための、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに、または逆も同様に変換するための、請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
請求項５〜７のいずれかに記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項３２】
発現ベクターに関する、請求項３１記載のベクター。
【請求項３３】
請求項１〜４のいずれかに記載のＲecＡ因子の製造方法。
【請求項３４】
請求項５〜７のいずれかに記載の核酸の添加のもとで、好ましくは請求項３２記載の発現ベクター、さらに好ましくはこの核酸またはこれらの発現ベクターを含む宿主の発酵による、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ＲecＡ因子を発現するために、請求項１〜４のいずれかに記載のＲecＡ因子をコードしている核酸の使用。
【請求項３６】
ＲecＡ因子それ自身を製造するための、特に請求項３４に記載の方法における、または目的の細胞の分子生物学的活性を調節するための、特にイン・ビボの組換え方法における、請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
イン・ビトロ方法において、特に関連核酸との相互作用によって遺伝子recＡのこの因子の不活性化のための、請求項５〜７のいずれかに記載のＲecＡ因子をコードしている核酸、および／またはヌクレオチド配列が、位置３６９から１４１５における配列番号：３１に記載のヌクレオチド配列と、これらの１０４７位置の少なくとも１０４５、好ましくは少なくとも１０４６、特に好ましくは１０４７と一致するＲecＡ因子をコードしている核酸、の使用。
【請求項３８】
recＡの部分配列をコードしているか、またはイン・ビボでrecＡと近位の、好ましくは１０００bp未満、特に好ましくは５００bp未満で離れて位置する部分配列をコードしている配列番号：２５から３０いずれかに記載の核酸。
【請求項３９】
配列番号：２５〜３０記載の少なくとも一つの、好ましくは少なくとも２つの互いに反対に向いている核酸の、それに含まれるイン・ビボでＤＮＡ領域の増幅のための使用。
【請求項４０】
recＡ遺伝子の増幅のための、請求項３９記載の使用。
【請求項４１】
請求項８〜１６のいずれかに記載の方法における、請求項３９または４０いずれかの使用。
【請求項４２】
請求項１７〜２４のいずれかに記載のグラム陽性細菌の産生のための、請求項３９〜４１のいずれかに記載の使用。
【請求項４３】
spoＩＶの部分配列、またはイン・ビボでspoＩＶと近位の、好ましくは１０００bp未満、特に好ましくは５００bp未満で離れて位置する部分配列をコードしている、配列番号：１９〜２４いずれかに記載の核酸。
【請求項４４】
配列番号：２５〜３０に記載の少なくとも一つの、好ましくは互いに反対に向いている少なくとも２つの核酸の、それに含まれるイン・ビボのＤＮＡ領域の増幅のための使用。
【請求項４５】
spoＩＶ遺伝子の増幅のための、請求項４４記載の使用。
【請求項４６】
請求項１３〜１６のいずれか一つに記載の方法における、請求項４４または４５記載の使用。
【請求項４７】
請求項２０〜２４いずれか一つに記載のグラム陽性細菌の産生のための、請求項４４〜４６いずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）DSM 13由来、ならびに生物工学的産生のための安全な株としての微生物由来のＲecＡ因子に関し、これらは関連遺伝子recＡの機能的欠失を示すことを特徴とする。さらに、ＲecＡは、それによりさらなる分子生物学的調製に利用可能である。
【０００２】
本発明は、生物工学の分野に、特に目的とする価値のある物質を形成し得る微生物の発酵によって価値のある物質の製造の分野にある。それらは、例えば低分子量化合物、例えば食品用サプリメントまたは医薬関連化合物、またはタンパク質の産生を包含し、それらの多様性の結果として、それらには広範囲の工業的用途がある。まず、目的とする微生物の代謝特性が有効利用および／または改変される；次に目的タンパク質の遺伝子を発現する細胞が導入される。それ故に、両方の場合、主に遺伝修飾された生物(ＧＭＯ)に関する。
【背景技術】
【０００３】
特に工業的規模における微生物の発酵を網羅する包括的な先行技術が存在する；それは、発酵層の技術設計を通じて形成速度および栄養利用に関して目的とする株の至適化から、目的とする細胞および／または発酵培地からの価値のある材料の回収にわたる。遺伝子的および微生物学的の両方ならびに加工技術的および生化学的手法が包含される。本発明の目的は、添加される微生物の関連する安全面に関して、即ち検討中の株の遺伝子特性のレベルに対して、この方法を改良することである。
【０００４】
バックグラウンドは、遺伝子修飾生物の使用が、一般的に生物学的安全性に関する厳しい法的規制に従うことである。ほとんどの国では、ＧＭＯを用いる設備オペレーターは、ＧＭＯが環境に至る可能性の回避を確実にする責任がある。加えて、生産に使用されるＧＭＯは、-それらが環境に達する場合-それらの繁殖を困難とする特性または危険なレベルによっては繁殖を不可能とする特性("抑制の概念")を所有すべきである。
【０００５】
S.Molinらによる総説記事"自殺遺伝子エレメントおよび細菌の生物学的抑制におけるその使用"(Annu. Rev. Microbiol., 1993, volume 47, pages 139 to 166)から、両方の基本的なストラテジーは、制御された自殺系が細胞に導入されている"活性な"成分に、または該細胞特性がストレス条件下で生き抜く機会を減少させるような方法で修飾された"受動"系とに区別される。本発明の第二の適当なストラテジーは、そこで"障害的アプローチ"として記載される。
【０００６】
偶然の流出の場合において、ヒトおよび環境に対して低いリスクを有するＧＭＯ株は、安全株として呼ばれる。微生物の基本特性によって、全て安全な態様を示す次第により多くの特性が必要とされる。結果として、安全株の調製のために利用できる様々な道具を持つことが有利である。これらの中で、いくつかの"受動"系は、先行技術で既に説明されている。
【０００７】
即ち、出願ＥＰ ３６９８１７ Ａ１は、タンパク質の製造および分泌のためのバシラス株、特にバシラス・サブチリスに関し、ここで細胞外および細胞内プロテアーゼに対する遺伝子、すなわちrp-Ｉ、rp-ＩＩ、isp-１、aprおよび／またはnprは、点突然変異または不活性遺伝子複製物の挿入によって機能的に不活性化される。これら遺伝子工学的修飾の意味は、これらの株を用いて生産される目的のタンパク質にとって有害であるプロテアーゼ活性を最小にすることである。目的の株は、胞子形成および結果として同様の有害な胞子形成プロテアーゼを阻害する突然変異を付加的に処理できる。次に、バシラス・サブチリスの胞子形成(下記を参照されたい)の０期における活性な遺伝子はspoＯＡと呼ばれ、細胞内プロテアーゼの形成を阻害するこの不活性化は、胞子形成と関連がある。
【０００８】
出願ＷＯ ９２/１６６４２ Ａ１は同じ解決方法を追求する：それは、バシラス由来のプロテアーゼ遺伝子apr、npr、isp-１、epr、bpr、rspおよびmprを不活性化することによって、細胞外プロテアーゼ活性の主要部分がスイッチ・オフとなることを開示しており、これは、残存プロテアーゼＩＩＩについて新規に記載された遺伝子ｖｐｒを不活性化することによってさらに改善され得ることを教示する。細胞内プロテアーゼの形成を阻害するために、spoＯＡの不活性化についての可能性もまたここでは注目される。
【０００９】
グラム陽性細菌の胞子形成は、不都合な環境的影響が続くことによる、休止形態、いわゆる胞子形成のための発育過程に関する。それは、おそらく１００以上の遺伝子および特異的なシグマ因子の感応による複雑な調節カスケードによって制御される。バシラス・サブチリスの細胞サイクルを伴ったこの過程の相互作用が、例えば"バシラス・サブチリスにおける細胞サイクルおよび胞子形成" [P.A. Levin and A. D. Grossmannら(1998), Curr. Opin. Microbiol., volume 1, pages 630-635]の刊行物において記載されている。ここで、主に転写因子ＳｐｏＯＡは、胞子形成のトリガーのための制御因子として示される。総説記事 "Bacillus subtilisの胞子形成中のシグマ因子活性の制御"［L. Kroos (1999)ら, Mol. Microbiol., volume 31, 第1285〜1294頁］は、様々なシグマ因子による期特異的遺伝子の順次的な活性化を要約している。この過程において、それらの配列は、連続的な段階０に続くＩ〜ＶＩＩの後に観察される。このヌメローテーション（numerotation）は、関連する遺伝子および因子の同定においても見出される。
【００１０】
出願ＥＰ ４９２２７４ Ａ２には、従来技術において胞子形成遺伝子の不活性化が、非特異的突然変異生成についてすでに達成されており、これによって胞子非形成変異体(ｓｐｏ−マイナス表現型)を得られることが開示されている。ＥＰ ４９２２７４ Ａ２自身は、初期胞子形成遺伝子における標的化した突然変異の誘発からspoＩＩＤ処理済みバシラス・サブチリス株を説明しており、これらは１０−８以下の復帰頻度を有し、実際にはもはや胞子形成できない。この出願は、製造ならびに安全面における利点がその点と関連するために、まず、生物工学的産生について価値ある産物の製造のために、さらなる遺伝子leu（ロイシン合成のための)、pyrＤ１(ウラシル合成のための)、aprおよびnprの不活性化後に該株を使用することを教示している。
【００１１】
出願ＷＯ ９７/０３１８５ Ａ１は、バシラス・サブチリスを除くバシラス種の胞子形成能力の不活性化、および価値のある産物の生物工学的製造のためのこれらの株の使用にも関する。この出願によれば、シグマ因子Ｆを早期にコードしている遺伝子spoＩＩＡＣは、機能的に不活性化されるはずであり、有利には、同様の活性化胞子形成遺伝子群spo２、spo３の遺伝子における欠失と組合せて不活性化されるはずである。このために、spoＩＩＡＣに関連のある染色体セグメントの不可逆的な不活性化が記載される。
【００１２】
出願 ＷＯ ０２/０９７０６４ Ａ１(ＥＰ １３９１５０２ Ａ１)は、胞子形成の段階ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶからの遺伝子は、削除されるか不活性化される微生物に関する。それらは、バシラス・サブチリスの遺伝子sigＥ、sigＦ、spoＩＩＥ、spoＩＩＳＢおよびsigＧに関し、これらは、バシラス・サブチリスのspoＩＶＣＢからspoＩＩＩＣの遺伝子座内に存在する。データバンクSubtiList(http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgiで利用できる)を用いると、これは、バシラス・サブチリスの全ゲノムの約２６４２０００kbから約２７０００００kb位置の領域の範囲に限定することができ、これはそれ以来よく知られるようになった。この出願の目的は、生物工学的生産を改良するために Bucillus 株の余分なまたは有害な活性の排除を基にしている。この方法を用いて胞子形成遺伝子を中間から後期に修飾することにより、目的とする株の使用によって、生物工学的生産のために胞子形成が抑制される；これは、栄養素の利用およびエネルギー利用に対する有利な効果を持っているであろう；発酵時間は同時に増加し、それによって目的とする価値のある産物の全収量が増加する。
【００１３】
胞子の休止形態へのグラム陽性細菌の移行は、望ましくない環境条件によっても引き起こされ得る。そのため、正確には、細菌が誤って設備内で発酵の至適生育条件から漏れ出し、その周辺環境に達した場合に、休止形態がおこるべきである。これに対して、すでに説明されてきたように、安全なＧＭＯの生産のための胞子形成能力の阻害は、現在までほとんど考慮されてこなかった。関連のある従来技術は、ａ）関連のあるプロテアーゼ活性のためおよび／またはｂ)発酵期間の延長のため、最終的にこのように得られた胞子非形成株の発酵収量を増やすために、グラム陽性細菌の胞子形成が、初期段階で完全に阻害されるべきであることを示唆しているだけのように思われる。これに対して、いくつかのさらに導入された突然変異が、安全面を追求するために開示されるのみである。
【００１４】
原核生物界において発現されるrecＡ因子をコードしている遺伝子recＡは、分子生物学ではよく知られているが、現在まで、安全株の製造においてと言うよりも別の意味で分子生物学ではよく知られている。この因子は、一本鎖ＤＮＡに特異的および協調的に結合することができ、ＡＴＰ加水分解によって二本鎖ＤＮＡの部分的巻き戻しを提供する。この方法は、遺伝子組換え方法、すなわち類似のＤＮＡ分子間の鎖交換を可能にする。すなわち、分子生物学において、欠失recＡのコピーを用いる適当な遺伝子構築によって不活性化し、それによってもはや組み換えできないrecＡ−マイナス表現型が作成されるような方法において、recＡ遺伝子を使用することは、標準的な方法である。ＵＳ特許 ４７１３３３７によれば、例えば交差反応によって産生された欠失変異体は、recＡのその後の不活性化によって遺伝学的に安定化される。
【００１５】
このように、recＡに対する引例は、最も多様な分子生物学的内容において現れる。例えば、ＤＥ １００１ １３５８ Ａ１では、Ｌ-型細菌株を扱っており、その他多数の起こりうる修飾の他に、特に改善された形質転換およびプラスミド安定性を達成するために、recＡを変異させる可能性についてさらに言及している。
【００１６】
エシュリキア・コリ由来のＲecＡの生物学的説明は、例えば、S. L. Lusetti ら (2003; J. Biol. Chem., Volume 278, Book 18, pages 16372-16380)による 文献 "エシュリキア・コリ（Escherichia coli）RecAのＣ末端欠失"に記載されている。文献により、この分子のＣ末端は特に一本鎖結合と相互作用し、および対応する欠失変異体は他の生物学的特性に加えて、この領域において高いマイトマイシン感受性を示すことが明らかとなる。マイトマイシンがＤＮＡ合成と干渉し、そのため殺菌薬として作用することはよく知られている。これに対して、Ｎ末端はＤＮＡ二本鎖の結合とより強い関連性を持つ。
【００１７】
上記で引用した、S.Molin らによる総説記事は、recＡ−マイナス突然変異がグラム陰性エシュリキア・コリのマーカー遺伝子として使用される研究についてもまた言及している。この１つの突然変異誘発だけで、この株による全ての環境的リスクを排除することが十分可能であると推測された。一方で、この方法に関する２つの欠点が議論されている、即ちこれらの突然変異体を作成することは技術的に困難であるということ、次に、関連論文において述べられた他の制限された生存性変異体を好むような方法では、目的の株がその短期間の競合特性において妨害されることである。また、安全な株を産生するための基本的に異なる方法、即ち自殺系の導入と組合せると、ＲecＡの不活性化は不都合となることが判った。
【００１８】
Selbitschkaら(2003; Biologie in unserer Zeit, volume 33, book 3, pages 162-175)による出版物"Freisetzung gentechnisch veraenderter Bakterien" "遺伝修飾細菌の放出"では、多年の野外試験において、ルシフェラーゼ遺伝子で修飾された種 シノリゾビウム・メリロッティ（Sinorhizobium meliloti)のグラム陰性細菌の放出を説明している。さらに、彼らは、recＡ遺伝子の不活性化を行い、これらのクローンの細胞は、天然条件下では最後まで生存できないという事実を導いた。
【００１９】
K.-D. Wittchenが、1995年にWestfalian Wilhelms University Muensterへ提出した"Entwicklung eines Sicherheitsstammes von Bacillus megaterium DSM 319 und molekular genetische Charakterisierung des Gens fuer die extrazellulaere neutrale Metallo Prrotease(nprM)" (Bacillus megaterium DSM 319の安全な株の開発および細胞外中性メタロプロテアーゼ nprM についての遺伝子の分子遺伝的特徴)という標題の彼の学位論文において、標的遺伝子の破壊後に中性メタロプロテアーゼ（標題に記載された)、そのイソプロピルマレート-デヒドロゲナーゼにおける欠失を含むグラム陽性のバシラス・メガテリウムの１つの株が提供されたが、より詳細に記載したＳｐｏＩＶ−タンパク質ではなかった。この株で導かれたrecＡ突然変異は、最終的にはそれが野生型と比較してこの株のＵＶ感受性に関しては有意な差はなかったが、マイトマイシンＣ含有寒天プレート上で増殖中に差異を示した。この４倍体の突然変異体は安全な株として提案されたが、その生存性の調査または適切に修飾された細菌株を用いる産生過程に対するこの修飾の実地結果もない。
【００２０】
同じ研究グループからの、H.Nahrstedt (2000)氏の修士論文、"Molekulargenetische Charakterisierung des recＡ-genes von Bacillus megaterium DSM 319 und Konstruktion einer Deletionsmutante", "Bacillus megaterium DSM 319 のrecＡ 遺伝子の分子発生学的特徴および欠失変異体の構築"は、遺伝子群に部分的に存在する並列化する４つの変異:recＡマイナス、プロテアーゼマイナス、ロイシン-栄養要求性および胞子形成欠損性を提案した。産生株中に、他のものに加えて、安全なマーカーとしてrecＡ欠損を導入することが議論された。これにより、最初に望ましくない組換え過程の阻害が導かれ、また目的とする変異体がＤＮＡ損傷剤に対する感受性の増加を示すことが理由である。即ち、それらは、環境において生存性の低い可能性を示すはずである。この提案はさらに追求されなかった。
【００２１】
現在までにこのタンパク質が遺伝学的事情から優先的に知られている効果に対するＲecＡについての従来技術を要約することができる。現在まで、この因子の使用および／またはＧＭＯの安全株の生産のための目的とする遺伝子の不活性化は、どちらかといえば、その生理学的重要性を理由に拒絶されてきた。成功として記載されたこの例示は、グラム陰性種シノリゾビウム・メリロッティおよびグラム陽性種バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）の単にrecＡ−マイナス変異体にすぎず、後者は３つのさらなる安全性に関連のある突然変異との単なる組合せにすぎない。
【００２２】
全体として、作用の"受動"モードを基にした様々な別の遺伝子系は、生物工学的生産（例えば、プロテアーゼ遺伝子の不活性化、アミノ酸要求株または核酸塩基要求株（auxotropes）を生産するための様々な代謝遺伝子の排除）のために安全な株の製造が確立されてきたことが考えられ得る。しかし、胞子形成グラム陽性細菌について、胞子形成の阻害は、発酵の際にさらなる利点を獲得するために、基本的には、特に初期の段階で述べられてきた。このために、特定株に対して複数の異なる作用系を互いに並べて配置するようにそれらを処理することは有利であると考えられ、そうすることで該株が特に正確に分類され得ることを確実にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
従って、本発明の目的は、遺伝子的に修飾されたグラム陽性細菌のためにさらに適当な安全な系を開発することであり、このための基本は、まず適当な因子および／または適当な遺伝子の同定である。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
かかる系の基本的な適合性を決定した後に、この目的の一態様は、そのために利用し得る遺伝子的エレメントの単離、場合により遺伝子および所望によりそれらのコードされた因子のアミノ酸配列によって示され、それらは、生産株において、特に安全性に寄与する１または複数のさらなる調節メカニズムを組合せて使用するための適当な分子生物学的構築をこの系に提供することである。
【００２５】
この目的のさらなる態様は、この系が他の安全な系と組合せる得るべきであることである。
【００２６】
それ故に、このタイプのさらに組み合わせ得る安全な系、好ましくは、さらにこれらの両方の系の他に別の変異を要求しないものである。いいかえると：これらの変異の最大の２つが、グラム陽性安全株を作成し、環境における生存性の低下について広範な要求を満たすために十分であるべき、即ち最小の復帰変異率を導くべきである。４つ以下の並列に並べた活性な系は、これらの株の製造のための仕事量を一層低下させることを意味する。
【００２７】
この目的の第二態様は、他の分子生物学的アプローチにおいて使用されることを阻害するために、それほど特異的でないこのタイプの安全な系を見出すことである。
【００２８】
この目的は、配列番号：２におけるアミノ酸配列と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を有するＲecＡ因子またはＲecＡ因子をコードした核酸によって達成され、このヌクレオチド配列は、配列番号：１に示されるヌクレオチド配列のものと少なくとも８５％同一である。
【００２９】
配列番号：２および１に示されたアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＲecＡについての配列である。１から１０４７の全ての位置はタンパク質をコードしている：最後の３つはストップコドンを示す。遺伝子およびタンパク質を各々recＡ、ＲecＡとして示す。それらは、the Deutschen Sammlung von Mikroorganisms und Zellkulturen GmbH, (German Collection of organismens and Cell Cultures) Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de)で、番号DSM 13として寄託された株 Bacillus licheniformisから得る。この問題に対する新規の解決法は、規定された％に対して十分なホモロジーを示す全ての因子または核酸によって示される。
【００３０】
バシラス・アミロリクェファシエンス由来の対応する因子は、最新の先行技術と見なすことができる。関連のあるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、the National Institute of Health, USA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)のNCBIデータバンクからエントリー番号AJ515542として公開されている。B. licheniform DSM 13 由来のＲecＡは、アミノ酸レベルで９４％同一性のホモロジー、そして核酸レベルで８１.２％の同一性一致を示す。両方の比較は、図１および２のアラインメントから明らかとなり、バシラス・アミロリクェファシエンスの配列は、２列目に各々示される。
【００３１】
バシラス・サブチリス由来のＲecＡ およびバシラス・サブチリス由来のＲecＥは、各々９３.４％の同一性を示す最も密接に類似した酵素として決定された。ＤＮＡレベルに対して、それらは各々８１．０％および８１．２％の同一性のホモロジー値を示す。それらは、the NCBI databankにおいて各々エントリー番号Z99112 (領域 161035〜162078)およびX52132として公開されている。これらの因子を有するアミノ酸およびＤＮＡの比較は、図１および２(各々３および４行)に示される。
【００３２】
本出願の実施例１は、同定されたホモロジー領域に適合するさらなるＲecＡ因子が、どのようにして、好適に得ることができるかを説明する。分子生物学的方法は、関連のある遺伝子または遺伝子セグメントが、特異的ＰＣＲプライマー、特にそこに開示されたオリゴヌクレオチド(配列番号：２５〜３０)によって、関連のある種の染色体ＤＮＡ調製物から獲得できることによって示される。もしこれらのプライマーが、上手く用いることができなければ、所望により類似のプライマーが用いられ、その中で個々の位置がプライマー合成において反応条件の関数として変化され得る。適当なプライマーの使用によって部分配列だけが得られる場合(図３Ｂを参照されたい）には、次いでこれらのＰＣＲ産物が、標準的方法(オーバーラッピングを利用)を用いて、隣接するＤＮＡ配列とアセンブルされ得る。アミノ酸配列は、遺伝子recＡから得られたコードされたＲecＡ因子から直接得る。あるいは、配列番号：１または配列番号：３１で開示した配列は、既知の方法を用いて、遺伝子バンクからの関連遺伝子を単離するためにプローブとしても使用され得る。
【００３３】
ここに記載された因子について、これらの高い得られたホモロジー値から、同一のＲecＡ因子は、特に関連株または種において、おそらく関係の少ない種においても、おそらくグラム陰性生物においてさえ、適切な機能を想定することが期待できる。本発明によれば、これは、上記で議論されたＤＮＡ一本鎖の結合、および核酸の組換え過程について関連のある役割におけるものである。比較し得る効果は、recＡ遺伝子の欠失、即ちＤＮＡ組換えの阻害、それによる生存性の低下と関連づけられるべきである。同時に、一つの株由来のrecＡ遺伝子は、この機能を別のものに引き継ぐために適当であるべきである；これは、類似性が増加するに従ってより良好に成功している。この方法において、目的とする遺伝子の使用は、最も変化したグラム陽性微生物の欠失変異体の生産に可能となる。
【００３４】
即ち、広義の技術的および商業的に関連のある分野は、ＲecＡに対しておよび基本的には関連のある遺伝子recＡに対して、即ち遺伝子的に修飾されたグラム陽性細菌の発酵による価値ある産物の製造に対して開放される。それらの遺伝子安定性およびそれらの安全性は、recＡにおける変異によって改善され得る。さらに下記に示すように、これは、生物工学的産生において、例えばバシラス・リケニホルミスなどにおいて実際に用いられる株について特にあてはまる。
【００３５】
より詳細に下記に述べるように、これは、好ましくは欠失に関連して生じ、特に好ましくは安全性に関連のない欠失に関して生じる。同様に、これは、好ましくは最も近縁関連株において生じる。しかし、これは、以前に述べられたように、第一には、この種自身のrecＡ遺伝子または存在する欠失変異体が利用可能であり、第二には、その大きな細胞によって特徴づけられるこの種および得られる関連のある微生物特性が、通常は産業規模では発酵に利用されないために、バシラス・メガテリウムに適用されない。
【００３６】
従って、本発明の目的は、バシラス・リケニホルミス DSM 13 由来のまたはその近縁株由来のＲecＡ因子(配列番号：２)および関連遺伝子recＡ(配列番号：１)に関する。グラム陽性細菌におけるその機能不活性化のためのrecＡ遺伝子の使用は、同様に、好ましくはグラム陽性微生物、好ましくはspoＩＶ、yqfＤまたはその同族体の胞子形成のＩＶ期における活性な遺伝子の機能不活性化と組合せて、一つの発明の課題を示す。有利なことには、これは、本出願においてさらに述べられる遺伝子spoＩＶおよびyqfＤの助けによって起こる。このようにして得られたグラム陽性微生物は、本発明の対応する対象を示す；同様に、発酵は、これらの生物、特に価値のある産物を製造するために実施され得る。さらに、ＲecＡタンパク質は、本出願によって利用出来るようになり、分子生物学的方法において、または細胞の分子生物学的活性を調節するために、特にＤＮＡ重合化方法または組換え方法と関連して、使用され得る。
【００３７】
第一の発明対象は、配列番号：２に記載したアミノ酸配列の、好ましくは少なくとも９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％と同一の順であり、また特に好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を含有する上記に定義した各ＲecＡ因子を包含する。
【００３８】
記載したように、類似性の増加は、機能一致の増加を提供し、それによって因子の互換性を提供すると考えられる。
【００３９】
これは、ヌクレオチド配列が配列番号：１に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一である核酸によってコードされるＲecＡ因子に関連するのが好ましい。
【００４０】
好ましい実施態様において、因子は、ヌクレオチド配列が、より好ましくは、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％と同一であり、また特に好ましくは１００％同一である核酸にコードされている。
【００４１】
目的とする因子、または別の種、好ましくは関連のある種への形質転換または修飾のための遺伝子は、核酸によって利用できるようになる。特に、それらは、下記により詳細に説明したように、目的の遺伝子の変異を包含する。列挙した配列との同一性の程度が増加するにつれて、このような種に対する成功が、バシラス・リケニホルミス種、特にバシラス・リケニホルミスそれ自身に対する関連性の増大とともに、より一層大きくなるべきであり、これは生物工学的産生に特に重要である。このような核酸は、上記議論したように、実施例１において得られる；また、遺伝子バンクからの単離に対する参照は既に為されている。
【００４２】
記載したように、主にＲecＡ因子をコードする核酸およびそのヌクレオチド配列は、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であり、本発明を実施するために役立つ。
【００４３】
そのヌクレオチド配列が、より好ましくは配列番号：１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であり、また特に好ましくは１００％同一である核酸の種類についてさらにあてはまる。それらは、形質転換および／または突然変異生成のための適当な構築体に使用でき、類似性の増加に従い所望の成功率も高くなりうる。
【００４４】
これは、以前に記載されたＲecＡ因子をコードするこのタイプの核酸が特別非常に好ましい。これは、機能的ＲecＡ因子が製造されるべきストラテジーに、例えば下記に示したような分子生物学的アプローチに、または修飾および／またはスイッチ・オフされるべきであるＲecＡを実際にコードしている内在遺伝子との最も高い一致を達成するのにあてはまる。多くの場合において、その天然の機能遺伝子または因子をスイッチ・オフするため、例えばナンセンス突然変異によっては、突然変異は一つの位置で十分である。
【００４５】
バシラス・メガテリウムではないグラム陽性細菌における遺伝子recＡの機能不活性化のためのＲecＡ因子をコードする核酸の使用は、本発明の本題を示す。
【００４６】
最初に、バシラス・メガテリウムについては、導入部で既に記載された研究が存在しており、その中で安全な株を提供するためにいくつかの他の変異と同時にrecＡを削除することが提案された。第二に、他のグラム陽性細菌、例えば バシラス（Bacillus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属およびクロステリジウム（Clostridium）属のものは、価値のある産物の生物工学的産生のために、先行技術においてより重要な宿主生物を示す(下記を参照されたい)。
【００４７】
本出願の意味において、機能不活性化は、修飾または突然変異の全てのタイプを意味すると解される。これによって、ＲecＡの一本鎖結合因子としての機能は阻害される。これは、事実上完全であるが不活性なタンパク質が形成される実施態様を包含する、そこで遺伝子recＡがもはや翻訳されないか、完全に欠失されるという可能性まで、ＲecＡの不活性部分が細胞中に存在する。即ち、はじめに説明されたこの実施態様のこの因子またはこの遺伝子の"使用"は、関連のある細胞からの因子または遺伝子が、もはや天然に機能しないという事実を含む。この発明の目的に従って、これは遺伝子的に達成される、即ち目的とする遺伝子がスイッチ・オフされる。
【００４８】
この使用の実施態様によれば、非活性タンパク質をコードする核酸は、点突然変異によって導入される。
【００４９】
このタイプの核酸は、既知の点突然変異生成方法の使用によって作成され得る。いくつかの方法が、例えば適切な手引き書、例えばFritsch, Sambrook und Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989.で説明される。さらに、現在これに利用できる市販のキット、例えばQuickChangeR kit（Stratagene社, La Jolla, USA）がある。一置換(ミスマッチ-プライマー)を有するオリゴヌクレオチドが合成され、提供される一本鎖遺伝子とハイブダイズされる；次いで、ＤＮＡ重合化は、対応する点突然変異を可能にするという代表的なことがそのなかにある。各種自身のrecＡ配列はこれに使用され得る。ホモロジーが高いため、配列番号：１に記載した配列を用いて、または関連のある種からの図２の他の配列を用いて、この反応を行うことが可能であり、この発明に従えば特に有利である。これらの配列は、関係種に対して、特に図２のアラインメントにおいて識別し得る保存された範囲のものを用いて、対応するミスマッチ-プライマーを作成するために役立ち得る。
【００５０】
この使用の実施態様によれば、欠失突然変異または挿入突然変異をもった核酸が導入され、好ましくは各境界配列を含み、それはタンパク質をコードする領域の少なくとも７０から１５０の核酸位置を含む。
【００５１】
これらの方法、それ自体は当業者にはよく知られている。この方法において、宿主細胞によって、ＲecＡ因子の形成を阻害することが可能であり、すなわち対応する形質転換ベクター由来の遺伝子の一部が、制限エンドヌクレアーゼを介して切除され、次いで該ベクターは目的の宿主に形質転換され、そこで-その時までなお可能である−相同組換えを経て、活性遺伝子が不活性コピーに交換される。挿入突然変異の実施態様において、インタクトな遺伝子は、簡単に、別の遺伝子、例えば選択マーカーのrecＡ遺伝子部分を遮断するために導入されるか、または代わりに導入され得る。突然変異の出現は、既知の方法によって表現型的観点から試験され得る。
【００５２】
かかる方法は、実施例２で選択された：そこで言及されたように、配列番号：３１由来の各々約３４０bpの２つのフランキング領域は、バシラス・リケニホルミス株(図３Ｂを参照されたい)の遺伝子recＡの中間部分を削除するために利用された。続く実施例３においては、この欠失の成功は、遺伝子レベルで検証される。図４（ＡおよびＢ)は、検討中のＤＮＡフラグメントがこの欠失によって適切に短くなることを証明する。この方法において得られた変異体の表現型の説明は次の実施例で示される。このことから、recＡ-不活性化株は、インタクトなrecＡ遺伝子(実施例６）を有するものよりもＵＶ感受性が有意に高い。
【００５３】
例えば染色体上で、知識の実際の状況に従って、細胞に導入された欠失遺伝子および内生的に存在するインタクトな遺伝子コピー間で、各々必要とされる組換の発生を可能にするために、非一致部分に対して両方の境界配列中の各々に、一致は各々少なくとも７０〜１５０位置の関連のある核酸位置に必要とされる、このため間にある部分にそれは依存しない。従って、これらの実施態様は、少なくともこれらのサイズの２つのフランキング領域を単に含むのが好ましい。
【００５４】
この使用の別の実施態様に従って、２つの核酸セグメント全体を有する核酸が導入され、これらには、各々好ましくは少なくとも７０〜１５０核酸位置が含まれ、それにより少なくとも部分的に、好ましくは完全にタンパク質をコードしている領域に隣接する。
【００５５】
タンパク質コード化セグメントは、相同組換えによる両遺伝子コピーの交換を可能にするためだけに必ずしも必要ではない。実際には、別の機能(プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等)を自然に発揮するか、または単に非機能的遺伝子間セグメントを示す目的とする遺伝子の境界領域は、このためにもまた適当である。従って、機能不活性化は、例えばプロモーターの欠失を含むことができ、そのためこの実施態様の欠失突然変異について、一つは隣接する非コード化セグメントを用いるべきである。ある場合において、タンパク質コード化領域へと部分的に伸張し、部分的に外側に位置づけられるフランキング領域について、これらのセグメントを選択することが賢明であり得る。
【００５６】
少なくとも部分的に非コード領域であるこれらの領域は、バシラス・リケニホルミスについて、例えば配列番号：３１から得られる。バシラス・アミロリクェファシエンス由来の遺伝子recＡおよび バシラス・サブチリス 由来のrecＡおよびrecＥについての配列は、例えば上記のデータバンクエントリーから得られる。他の株について、例えばバシラス・リケニホルミス由来のrecＡについて、ＰＣＲを基にした方法を用いてゲノムＤＮＡの調製物から関連のある非コード領域を入手し得る；実施例１に例示されているようなもの。これらの方法（例えば、未知領域の外側に向かうプライマーを用いるアンカーＰＣＲ)は、従来技術で確立されている。既知遺伝子セグメントは、開始点として機能し、いまだ未知の領域を利用できるように機能する。それらが増幅後に配列決定されるとすぐに、それらは、自身を別のプライマーを合成するために役立たせる。本発明に従って、配列番号：１および３１を基にした必要なプライマーは、グラム陽性細菌の他の種（特に、バシラス属の種を包含する）のために、所望によりすでに記載されているような可変位置の導入によって、構築され得る。
【００５７】
結果として、適当な使用は、前記した本発明の核酸および／または、ヌクレオチド配列が、配列番号：３１に挙げたヌクレオチド配列、これらの１０４７位置の３６９から、１４１５位置、少なくとも１０４５位置、好ましくは少なくとも１０４６位置、特に好ましくは１０４７位置において一致する核酸に関するか、またはこれらの核酸に対して少なくとも部分的にコードしていないフランキング領域に関する。
【００５８】
このように、例えば配列番号：１および３１の両方の核酸配列の比較から、それらが、３つの位置(配列番号：３１の位置３６９〜１４１５)でタンパク質をコードしている領域において異なることを示す。それらは、配列番号：１(ＣＡＣ)について位置２８２、２８３および２８４および配列番号：３１(ＡＣＡ)について６５０、６５１および６５２である。両方の配列は、上記に定義した本発明のホモロジー領域にあり、ここに示した本発明の態様の好ましい実施態様を特徴づける：配列番号：１は、市販購入し得る株 DSM 13を基準にされる；配列番号：３１は、基本的にはあらゆるバシラス・リケニホルミス株 (実施例１)を用いて本発明を改良することによって得られた。それらは配列番号：３１に対して１０４４位置で一致するので、実施例において成功したと説明された実施態様は、１０４５、１０４６および特に１０４７の一致する位置での増加する選択性にあるとされる。
【００５９】
このタイプの多様な実施態様は、相応じて好ましい。
【００６０】
グラム陽性細菌について、この使用の好ましい実施態様は、好ましくはクロストリジウム属またはバシラス属および天然に胞子形成し得るものに関し、胞子形成と同時に胞子形成のＩＶ期からの遺伝子がrecＡによって機能的に不活性化される。
【００６１】
導入部で述べたように、多くのグラム陽性細菌は、好ましくない環境条件下で胞子形成過程を誘導し得る。本発明に従って、これは胞子形成の比較的後期のＩＶからの胞子形成遺伝子が、recＡの上記不活性化を組合せて機能的に不活性化されるので、安全面に関する限り利用できる。この方法において、２つの組合せ得る系は、明確に表した目的に対応する安全なＧＭＯを製造するために、同時にかつ新規に利用し得る。現在までに、両方の系の組合せは、特にこの目的のためには知られていなかった。
【００６２】
クロストリジウム属およびバシラス属の種において胞子形成遺伝子の不活性化は、特に成功したものであって、それ故にこの特徴的な実施態様は相応じて好ましい。バシラス・リケニホルミス由来のspoＩＶについての実験は、本発明の実施例において説明され、概念的にはrecＡについて上記されているような同じ分子生物学的方法に従う。このように、実施例１に従って、配列番号：１９〜２４に示したプライマーを上手に用いて、バシラス・リケニホルミス株 (図３Ａを参照されたい)由来のspoＩＶ遺伝子を得た。実施例２は、機能不活性化のための方法および実施例３のその成功(図４)を示す。実施例４および図５から、予測された表現型の胞子形成欠損が証明される。
【００６３】
このような後期における胞子形成の阻害が、この目的のためにそれほど成功するとは、特に驚くべきことである。実際には、胞子(いわゆる「中間期（gray phase）の胞子」）は、バシラス・リケニホルミスのspoＩＶ突然変異体において適当な条件下で形成されるが、しかし、それらは不稔性であり、もはや発芽できない。この点で、この突然変異体は安全面に適応する。現在までは、胞子形成の妨害は、むしろより早期で有利に働いた。ＩＶ期での不活性化は、さらにより早い時点での胞子形成期における活性因子が、突然変異体中で形成され続けることを確実にする。この理論に縛られることは望まないが、少なくとも幾つかのこれらの細胞因子は、発酵中に起こる通常の代謝過程を獲得することが想定されるであろう。より早い時点でのそれらの排除によって、それらはもはや使用できない。逆に、ＩＶ期における胞子形成の不活性化による有利な効果は、細胞生理学において得られる干渉がそれほど重要ではないこと、そしてこの発酵それ自身がこれら遺伝子の早期排除に対するよりも影響が低いことにある。実施例５で決定され、そして図６に示された増殖曲線は、この概念に関する成功を示す。
【００６４】
使用する型は、学名バシラス・サブチリスの胞子形成ＩＶ期からの不活性化遺伝子が、遺伝子spoＩＶＡ、spoＩＶＢ、spoＩＶＣＡ、spoＩＶＣＢ、spoＩＶＦＡ、spoＩＶＦＢまたはyqfＤの内の一つであるか、またはこれに対して相同な遺伝子であるのが好ましく、バシラス・サブチリスの場合に好ましいのは遺伝子yqfＤであり、バシラス・リケニホルミスの場合には遺伝子spoＩＶであり、全ての他の場合は、これに対して相同な遺伝子である。
【００６５】
これら遺伝子の全ては自体既知であり、この胞子形成期について説明されてきた。バシラス・サブチリスの遺伝子spoＩＶＡは、Swiss-Prot(Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Geneva, Switzerland; http://www.Genebio.com/sprot.html)のデータバンクおよびNCBI(上記を参照されたい)のデータバンクにおいて番号P35149として受託されているＩＶ期の胞子形成タンパク質Ａをコードする。それは、インタクトな胞子外殻形成およびその会合に関与する。関連のあるＳｐｏＩＶＡ因子のアミノ酸配列は本発明の配列番号：８に記載され、実際には、パテントインのプログラムによって作成された前記ＤＮＡ配列の翻訳として記載される。関連のあるヌクレオチド配列は、番号BG10275としてthe Institute Pasteur, Paris, France (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi)のデータバンクSubtilistにおいて見出すことができ、配列番号：７において配列プロトコルに記載され、実際には５'末端の前に位置づけられる２００個のヌクレオチドおよび３'末端の後方に位置づけられる１９７個のヌクレオチドを有する。ここで、これらの境界配列は、完全に意味のある遺伝子情報、特に調節エレメントまたは他の遺伝子のセグメントも含む傾向があるという事実に関係なく、配列番号：７に記載された１から１８７６個までの完全なヌクレオチド配列が、遺伝子spoＩＶＡとして本発明に従って記載される。コード領域は、位置２０１から１６７９まで伸びる；第一コドン、即ち位置２０１〜２０３は、イン・ビボではロイシンとして翻訳されず、むしろメチオニンとして翻訳される。
【００６６】
バシラス・サブチリスの遺伝子spoＩＶＢは、Swiss-Prot および NCBI のデータバンクにおいて番号P17896として受託されるＩＶ期の胞子形成タンパク質Ｂをコードする。それは、母細胞における胞子形成またはその活性化中のシグマ因子Ｋ-依存性の伝達時点と関連がある。それは区画内のシグナル伝達に、おそらく疎水性Ｎ末端にわたって関与する。SpoＩＶＢ因子のアミノ酸配列は本発明の配列番号：１０に記載され、実際には、パテント・インプログラムによって作成された前記ＤＮＡ配列の翻訳として記載される。関連のあるヌクレオチド配列は、番号BG10311としてSubtilistのデータバンクにおいて見出すことができ、配列番号：９において配列プロトコルに記載され、実際には、５’末端の前に位置づけられる２００個のヌクレオチドおよび３’末端の後に位置づけられる１９７個のヌクレオチドを有する。ここで、これらの境界配列は、完全に重要な遺伝子情報、特に調節エレメントまたは他の遺伝子のセグメントを含む傾向があるという事実に関係なく、配列番号：９に記載された１から１６７５からの完全なヌクレオチド配列が、遺伝子spoＩＶＢとして本発明に従って記載される。コード領域は、位置２０１から１４７８まで伸びる。
【００６７】
バシラス・サブチリス遺伝子spoＩＶＣＡは、Swiss-Prot および NCBI の データバンクにおいて番号P17867として受託されている推定部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼをコードする。おそらく、遺伝子spoＩＩＩＣおよびspoＩＶＣＢを組み換えて、シグマ因子Ｋを出現させる役割に関与する。このリコンビナーゼのアミノ酸配列は本出願の配列番号：１２に記載され、実際には、パテントイン・プログラムによって作成された前記ＤＮＡ配列の翻訳として記載される。関連のあるヌクレオチド配列は、Subtilistデータバンクにおいて番号BG10458として見出すことができ、配列番号：１１における配列プロトコルに記載され、実際には、５’末端の前に位置づけられた２００個のヌクレオチドおよび３’末端の後に位置づけられた１９７個のヌクレオチドを有する。ここでは、これらの境界配列が、完全に重要な遺伝子情報、特に調節エレメントまたは他の遺伝子のセグメントを含む傾向にあるという事実に関係なく、配列番号：１１に記載された１から１９００までの完全なヌクレオチド配列が、遺伝子spoＩＶＣＡとして本発明に従って記載される。コード領域は、位置２０１から１７０３までにわたる；第一コドン、即ち位置２０１〜２０３は、イン・ビボでバリンとしてではなく、むしろメチオニンとして翻訳される。
【００６８】
バシラス・サブチリスの遺伝子spoＩＶＣＢは、Swiss-Prot および NCBI データバンクにおいて番号P12254として受託されているＲＮＡポリメラーゼシグマ因子Ｋ前駆体をコードする。この因子の残余部分は、クロモソーム上で約１０kb離れている遺伝子spoＩＩＩＣからコードされており、この間にある領域はＳＫＩＮと表示される。胞子形成期の直前でのこのフラグメントの切除により、転写因子として作用する活性なシグマ因子Ｋが得られる。部分的なＳpoＩＶＣＢ因子のアミノ酸配列は本発明の配列番号：１４に記載され、実際には、パテントイン・プログラムによって作成された前記ＤＮＡ配列の翻訳として記載される。関連のあるヌクレオチド配列は、Subtilistデータバンクにおいて番号BG10459として見出すことができ、実際には、５’末端の前に位置付けられた２００個のヌクレオチドおよび３’末端の後に位置づけられた１９７個のヌクレオチドと共に、配列番号：１３において配列プロトコルに記載される。ここでは、これらの境界配列が、完全に重要な遺伝子情報、特に調節エレメントまたは他の遺伝子のセグメントを含む傾向があるという事実に関係なく、配列番号：１３に記載の１から８６８までの完全なヌクレオチド配列は、遺伝子spoＩＶＣＢとして本発明に従って記載される。コード領域は、位置２０１から６７１までにわたる。
【００６９】
バシラス・サブチリス遺伝子spoＩＶＦＡは、ＩＶ期の胞子形成タンパク質ＦＡをコードする。おそらくＳpoＩＶＦＢ(下記を参照されたい)と共にヘテロダイマーを形成できるこの因子は、これらの因子を安定化するが、それによって同時にそれらを阻害する役割も満たす傾向がある。それ故に、ＳpoＩＶＦＡは、初期、おそらくフェーズＩＩにおいて既に形成されている。ＳpoＩＶＦＡのアミノ酸配列は、Swiss-Prot および NCBI データバンクにおいて番号P26936として受託される。それは本発明の配列番号：１６に記載され、実際には、パテントイン・プログラムによって作成された前記ＤＮＡ配列の翻訳として記載される。関連のあるヌクレオチド配列は、番号BG10331としてデータバンクSubtilistにおいて見出すことができ、実際には、５’末端の前に位置付けられた２００個のヌクレオチドおよび３’末端の後方に位置づけられた１９７個のヌクレオチドと共に、配列番号：１５における配列プロトコルに記載されている。ここでは、これらの境界配列が、完全に重要な遺伝子情報、特に調節エレメントまたは他の遺伝子セグメントも含む傾向にあるという事実に関係なく、配列番号：１５として記載された１から１１９２までの完全なヌクレオチド配列は、遺伝子spoＩＶＦＡとして本発明に従って記載される。このコード領域は、位置２０１から９９５までにわたる。
【００７０】
バシラス・サブチリスの遺伝子spoＩＶＦＢは、ＩＶ期の胞子形成タンパク質ＦＢをコードする。これは、おそらくプロシグマＫからシグマＫへのプロセシングに関与する膜関連メタロプロテイナーゼである；それは、既に胞子形成のフェーズＩＩで形成されている。ＳpoＩＶＦＢのアミノ酸配列は、Swiss-Prot および NCBI のデータバンクにおいて番号P26937として受託される。それは本発明の配列番号：１８に記載され、実際にはパテントイン・プログラムによって作成された前記ＤＮＡ配列の翻訳として記載される。関連のあるヌクレオチド配列は、データバンクSubtilistにおいて番号BG10332として見出すことができ、実際には、５’末端の前方に位置づけられた２００個のヌクレオチドおよび３’末端の後方に位置づけられた１９７個のヌクレオチドと共に、配列番号：１７における配列プロトコルに記載される。ここでは、これらの境界配列が完全に意味のある遺伝子情報、特に調節エレメントまたは他の遺伝子のセグメントを含む傾向があるという事実に関係なく、配列番号：１７として挙げられた１から１２６４までの完全なヌクレオチド配列は、遺伝子spoＩＶＦＢとして本発明に従って記載される。このコード領域は、位置２０１から１０６７までにわたる；第一コドン、即ち位置２０１〜２０３は、イン・ビボではロイシンとして翻訳されずに、むしろメチオニンとして翻訳される。
【００７１】
好ましい遺伝子の両方は、従来技術から明らかになる。バシラス・リケニホルミス由来のspoＩＶのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、Swiss-Prot および NCBIのデータバンクにおいて番号 AJ616332として受託される。この因子は、バシラス・リケニホルミスの胞子形成のための必須の因子としてM. Groneの修士論文(2002) entitled "Arbeiten zur Herstellung einer sporulations negative Mutante von Bacillus licheniformis" (Contributions to the manufacture of a sporulation negative mutant from Bacillus licheniformis), Department of Biology of the Westfalian Wilhelms-University Muenster, Germany.において説明された。調節領域の一部を含む関連のある配列は、配列番号３および４として本願に記載される。これらの配列について、本発明に従って、ヌクレオチド１から１７９２の領域は、遺伝子spoＩＶとして表記され、それによって実際のＳpoＩＶをコードするセグメントが位置１４０から１３３６までを含むことに注意すべきである；境界配列は、また他の遺伝子エレメント様の調節エレメントまたは他の遺伝子の一部を含み得る。ここで、第一コドンである位置１４０から１４２のＧＴＧは、イン・ビボではバリンとして翻訳されず、むしろメチオニンとして翻訳される。
【００７２】
この研究において、バシラス・サブチリス由来の因子または遺伝子yqfＤについて照合が為され、アミノ酸レベルに対して６８％同一性のホモロジーを有することで、今日までに知られている最も近縁の類似タンパク質であると見なされる。この因子は、番号P54469としてSwiss-Protのデータバンクに挙げられる；約２００bp フランキング領域を各々有するアミノ酸配列ならびにＤＮＡ配列の両方は、番号BG11654としてデータバンクSubtilistに存在する。このエントリーは、実際には未知タンパク質であるが、実在する配列ホモロジーを基にするＩＶ期の胞子形成タンパク質と類似すると考え得ることを述べている。関連のある配列は、本出願の配列番号：５および６で見出すことができる。これらの配列に関して、境界配列中に含まれる記載された類似物各々およびおそらく他の遺伝子エレメントに関わりなく、本発明に従って、ヌクレオチド１から１５９４の領域は遺伝子yqfＤとして表示され、実際のタンパク質をコードしているセグメントは位置２０１から１３９７を含むことも注目すべきである。ここで、バシラス・リケニホルミス由来のspoＩＶとして位置２０１から２０３の第一コドンＧＴＧは、イン・ビボではバリンとして翻訳されるのではなく、むしろメチオニンとして翻訳される。
【００７３】
天然に胞子形成し得る全ての他のグラム陽性微生物が、７つの前掲の遺伝子およびそこから得られる因子と同様の機能を有するホモログを持つことが考えられ得る。それらは、配列プロトコルに記載した核酸とのハイブリダイゼーションを介するか、またはすでに上記に議論されたようにこれらの微生物の関連のある染色体セグメントの配列決定のための、特に両方の相同配列の配列番号：３または５により、ＰＣＲを基にしたアプローチを介する既知の技術を用いて、直ちに同定され、それによって種の境界を含めた特定の変化を可能にする。
【００７４】
これらの遺伝子の一つ、好ましくはyqfＤ／spoＩＶまたはそのホモログは、対応する安全な株から獲得するために、本発明に従って、同時に産生株におけるrecＡによって不活性化される。有利なことには、欠失突然変異生成のための上記実施態様に対応して、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５または１７に記載した核酸が、不活性化のために各々使用される。この方法では、産生に使用した各種から目的とする相同な遺伝子を同定することは必要ではない。本明細書では、目的とする種がバシラス・サブチリスまたは バシラス・リケニホルミスに関係が近い程、これらの欠失はより成功しやすいと考えられる。これは、目的の遺伝子の高いホモロジーと関連づけられるべきである。この理由のために、約２００bpを含む境界配列も配列プロトコルに記載されており、このように、recＡのための実施態様に対応して、構築体が形成され、これは完全にフランキング領域において交差するために必要とされる少なくとも７０から１５０位置を含む領域を含有し、これに関して完全に特徴分析されていない微生物において検討中のセグメントの欠失に対するある成功確率をもって用いられ得る。
【００７５】
本発明に従って、recＡと一緒に、上記のＩＶ期の遺伝子のいくつかの遺伝子を不活性化することが可能であり、こうして得られるＲecＡに影響を与えるＤＮＡ組換えが不可能とされる安全な株は成熟胞子を形成できない。本発明によれば、recＡの他にこれらの遺伝子の一つのみを不活性化することは、このために十分であるので、このタイプの好ましい使用において、胞子形成のＩＶ期から厳密に１つの遺伝子が機能的に不活性化される。
【００７６】
このようにして、生物工学的生産のための安全な株が得られる。それらは、外部の至適発酵条件下、特に貧栄養供給物およびＤＮＡ有害因子、例えばＵＶ照射または反応性の高い化学物質を包含する環境的条件下では生存しにくい。環境因子の第一群は、天然に胞子形成でき、胞子の永久的形成へと変換するグラム陽性細菌を誘導する；第二の因子群は、ＲecＡに影響されるＤＮＡ修復過程および組換え過程にわたって天然の微生物により牽制され得る。細胞が両方で不可能であるか、または両方によってただ重度に制限されているだけの場合に、本発明に従ってそれらは安全な株として適当である。
【００７７】
recＡと共に、従来技術から既知の１以上の遺伝子をさらに不活性化することができ、それによって、さらにＲecＡ-に影響を与えるＤＮＡ組換えおよび成熟胞子を形成することができない得られる安全な株が、これらのさらなる特性によって特徴付けられる。ＧＭＯの産生のために、生存性および適切なストリンジェントな調節系を阻害するさらなる「活性な」系は、導入部で示した従来技術において「受動」系として表されてきた全てのものを包含する。それらは、特に、１以上の下記遺伝子における不活性化変異を包含する：epr、rp-I、rp-II、isp-１、apr、npr、spoOA、bpr、rsp、mpr、vpr、spOA、spoII:D、spoIIAC、spo２、spo３、sigE、sigF、spoIIE、spoIISB、sigG、spoIVCB、spoIIIC、nprMおよびイソプロピル・マレート・デヒドロゲナーゼ（leuB)に対する遺伝子。これらの遺伝子同定物は、本発明の導入部に示された従来技術から選択し得る。このように、ここで使用されたこれらの略称は、導入部で引用された出願および公開公報に記載されたそれぞれの意味を指すことを意味する。別の名称が、同一遺伝子または同一タンパク質をコードする遺伝子群について、先行技術において確立されている場合、特に細菌の別の種のホモログについて、引用文献を基にしたものとして同じものを等価に用いる。
【００７８】
しかし、本発明によれば、recＡに加えてさらなる遺伝子、好ましくはさらなる突然変異が基本的に分配され得るように、所望によりさらなる胞子形成ＩＶ期の遺伝子を不活性化することは、必ず必要というわけではない。本発明の目的において請求する利点は、同じ細胞において最も起こりうる並行な安全な系の確立と関連している。これは、バシラス・メガテリウムに対する引用研究において提案された４つの異なる欠失に対して実施されたものよりも、必要とする研究努力は少ない。これは、目的とする細胞が、まず−それらがまだ組換え得る限り−産生に関連のあるトランスジーンによって提供され、次いで安全な株、特にrecＡ-マイナス-表現型へ変換される場合に適切である。これらのタイプのさらなる突然変異は、非常に重大なケース、例えば高い病原性株について示されるだけである。
【００７９】
本発明により利用できるようになったこの配列により、胞子形成の欠陥は、学名バシラス・サブチリスにおいては、遺伝子spoＩＶＡ、spoＩＶＢ、spoＩＶＣＡ、spoＩＶＣＢ、spoＩＶＦＡ、spoＩＶＦＢまたはyqfＤにおいて、また学名バシラス・リケニホルミスの場合には遺伝子spoＩＶまたは特定の宿主細胞に存在するこれらに対するホモログである遺伝子において作られる。
【００８０】
このホモロジーは、配列比較を介した最初の概算として明らかにされ得る。これを確認するために、目的の遺伝子は、生物工学的産生について提供された微生物株において不活性化され、目的の遺伝子の機能的一致は、表現型の再現性(レスキュー)によって試験され得る。新規に関連のあるspoＩＶＡ、spoＩＶＢ、spoＩＶＣＡ、spoＩＶＣＢ、spoＩＶＦＡ、spoＩＶＦＢ、yqfＤ−またはspoＩＶ−複製物を並行に調製する場合、検討中のノック・アウト突然変異体を胞子形成の陽性表現型へと変換するなら、これは検討中の遺伝子の機能的な交換能が存在することを証明するものである。それ故に、本発明に従って、前述のＩＶ期の胞子形成遺伝子と相同性がある遺伝子は、特にこのタイプの「レスキュー」によって接近し易いものを包含する。可能である場合、好んで使用された胞子形成遺伝子に関する。それ故に、このコントロールは、特に合理的努力によって可能である。これは、最初に本発明に従って、１個のかかる機能的不活性突然変異体が作成されるべきであり、第二に本発明に対する配列プロトコルによって、バシラス・サブチリス 由来の関連のある配列およびバシラス・リケニホルミス由来の特に好ましい別のそれらの配列が利用できるようになり、このタイプのレスキューがその上に作成され得るためである。
【００８１】
好ましい実施態様において、遺伝子spoＩＶＡ、spoＩＶＢ、spoＩＶＣＡ、spoＩＶＣＢ、spoＩＶＦＡ、spoＩＶＦＢ、yqfＤまたはspoＩＶの機能不活性化またはそれらの相同な遺伝子の各々の機能不活性化について、新しく前記した使用は、配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５または１７、またはそれらの一部を有する配列の助けによって、好ましくは少なくとも７０〜１５０の立体配座的核酸位置を含む一部の助けによって、特に好ましくはそれらの間に位置する遺伝子の一部を囲む２つのかかる部分の助けによって生じる。
【００８２】
上記したように、特にバシラス・リケニホルミスおよび バシラス・サブチリス および密接に関連のある種に対するこれらの正確な配列を用いて、適当な分子生物学的構築体を調製することができる。このために、上記したrecＡの可能性の全てが利用でき、相応じて好ましい。
【００８３】
記載した方法によって得られた微生物は、本発明の別の実施態様を示す。従って、その最も広い意味では、それは遺伝子recＡが機能的に不活性化されているバシラス・メガテリウムでないグラム陽性細菌に関する。
【００８４】
これは、主に、遺伝子recＡが、遺伝子工学的、即ち合成方法によって機能的に不活性化されているグラム陽性細菌に関する。
【００８５】
既に記載したように、グラム陽性細菌は、例えば価値のある産物を分泌するその能力および／または発酵が比較的簡易性であるために、分子生物学的には最も重要な微生物である。これらの中のもので、様々な種は、多様な適用分野にとって好ましい；低分子量化合物、例えばアミノ酸などは、コリネバクテリアを用いて広範に産生される；バシラスおよびこれらの中のもので、特にバシラス・リケニホルミスは、特に細胞外タンパク質の産生のために特に価値がある。本発明に従って、それらは、ＲecＡの機能不活性化によって、少なくとも基本的に全て使用できる。
【００８６】
これらの新規細菌は、説明した組換えの欠点を特徴とし、それ故に天然条件下で、特に他の微生物との競争においてそれらの生存性に関して不利な点を有する、このために生物工学的産生のための安全株として適当である。これは、上記理由のためにバシラス・メガテリウムに関係しない。
【００８７】
前記した実施態様に従って、完全なタンパク質に対するコード領域の点突然変異生成、部分的欠失または挿入、または全ての欠失によって機能不活性化に影響されるそれらのグラム陽性細菌がさらに好ましい。
【００８８】
前記した実施態様に関して、機能不活性化が、ＲecＡをコードする新しい核酸によって、および／またはヌクレオチド配列が、配列番号：３１に記載したヌクレオチド配列とこれらの１０４７位置の位置３６９から１４１５まで、少なくとも１０４５まで、好ましくは少なくとも１０４６まで、特により好ましくは１０４７まで、一致する核酸によって、またはこれらの核酸の少なくとも部分的にコードしていないフランキング領域によって、影響されるグラム陰性細菌が、さらに好ましい。
【００８９】
この内容から、配列番号：１または、すでに記載した配列番号：３１の上記ホモロジー値の核酸は、相応して好ましい。これに関して、機能不活性化が、配列番号：１または３１に記載した核酸またはセグメントに起因する微生物が、最も好ましい微生物である。
【００９０】
上記説明に従って、交差反応を介する突然変異生成の場合には、好ましくは少なくとも７０から１５０bpの各々の境界配列が使用され、検討中の染色体のセグメントの配列決定によって確認され得る。
【００９１】
前記実施態様に従って、それらのグラム陽性細菌およびそのクロステリジウム属またはバシラス属がさらに好ましく、これらは天然に胞子形成でき、そして同時に胞子形成のＩＶ期からの遺伝子がrecＡによって機能的に不活性化される。
【００９２】
上記説明に従って、これ以降、このような遺伝子の欠損は、生物工学的介入によって実施されてきたものを意味すると特に理解される。
【００９３】
前記実施態様に従って、それらのグラム陽性細菌はさらに好ましく、これは学名バシラス・サブチリスには、胞子形成ＩＶ期からの不活性化遺伝子は、遺伝子spoＩＶＡ、spoＩＶＢ、spoＩＶＣＡ、spoＩＶＣＢ、spoＩＶＦＡ、spoＩＶＦＢまたはyqfＤの一つに関するか、またはこれに対する相同遺伝子であって、好ましくはバシラス・サブチリスの場合には遺伝子yqfＤであり、バシラス・リケニホルミスの場合には遺伝子spoＩＶであり、そして全て他の場合はこれに対して相同な遺伝子である。
【００９４】
特別な場合、例えば高い病原性株を用いる場合、複数の前述の胞子形成遺伝子または１以上の遺伝子または先行技術において記載された遺伝子群spoＩＶ／yqfＤ／ホモログ、epr、rp-Ｉ、rp−ＩＩ、isp−１、apr、npr、spoＯＡ、bpr、rsp、mpr、vpr、spo０Ａ、spoＩＩ：Ｄ、spoＩＩＡＣ、spo２、spo３、sigＥ、sigＦ、spoＩＩＥ、spoＩＩＳＢ、sigＧ、spoＩＶＣＢ、spoＩＩＩＣ、nprＭおよび／またはイソプロピル・マレート・デヒドロゲナーゼ(leuＢ)に対する遺伝子が、機能的に不活性化され得る。これらの略称は、導入部において引用した出願および文献に記載されたものの意味を持つと解され、考え得る同義語も包含される。
【００９５】
しかし、前記実施態様に従って、−recＡの不活性化に加えて−胞子形成ＩＶ期からの正確な一つの遺伝子が機能的に不活性化されているようなグラム陽性細菌が好ましい。
【００９６】
上記説明に従って、このようなグラム陽性細菌はさらに好ましく、その細菌では、遺伝子spoＩＶＢ、spoＩＶＣＡ、spoＩＶＣＢ、spoＩＶＦＡ、spoＩＶＦＢ、yqfＤまたはspoＩＶの、またはそれらの各々相同な遺伝子の機能不活性化が、配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５または１７またはそれらの部分の助けによって、好ましくは少なくとも７０から１５０の立体配座の核酸位置を含む一部の助けによって、特に好ましくはそれらの間に位置する遺伝子の一部をかこむ２つのかかる部分の助けによっておこる。
【００９７】
これは、目的のＤＮＡ、例えば新規株の染色体ＤＮＡ、および制限分析またはＰＣＲの調製物によって評価され得る。フランキング配列の各々は、このためのプライマーとして使用でき、ここでＰＣＲ産物のサイズは、挿入物の存在および場合により挿入物のサイズに対する情報を提供する。この方法は、本発明の実施例におけるspoＩＶについて説明される。
【００９８】
前記実施態様に従って、特に好ましい新規グラム陽性細菌は、代表的なクロストリジウム（Clostridium）属 または バシラス（Bacillus）属に関し、特にバシラス・スブチリス（Bacillus subtilis）種、バシラス・リケニホルミス（B. licheniformis）種、バシラス・アミロリクェファシエンス（B. amyloliquefaciens）種、バシラス・ステアロサーモフィラス（B. stearothermophilus）種、バシラス・グロビジー（B. globigii）種、バシラス・クラウジー（B. clausii）種またはバシラス・レンタス（B. lentus）種、より具体的にはバシラス・リケニホルミス株に関するものを包含する。
【００９９】
新規グラム陽性細菌を発酵させる方法は、本発明の別の目的を示す。
【０１００】
これらの方法は、好ましくは説明した好ましい実施態様と組合せて、ＲecＡは活性ではなく、目的の株は設備単位から環境への突発的放出の場合における顕著に最小化された安全性リスクを示すことを特徴とする。発酵方法は、それらがこれらの要件が一致する場合にのみ操作され得るように適切な安全性要件に従う。
【０１０１】
発酵中の至適条件下で基本的には不利でない株は、本発明の実施例５(図６)により証明される；これは、そこに記載された二重突然変異体についてもまたあてはまる。しかし、recＡの不活性化は、ＵＶの効果下では顕著に低下された生存性へと導く。これは、生産設備単位から環境へ出る可能性がある細菌に対峙する通常の環境因子である。さらに、ＵＶ照射は、研究室および生物工学的生産工業において滅菌に関する常法である。実施例によってさらに証明されるように、spoＩＶの不活性化は、胞子形成速度を劇的に低下させる。これらの実施例の結果として、両因子は、同じ細菌株では、互いに組合せることができる。さらに、作用の異なる基本的な方法によって、両方の「受動」系は、産業的に有用で安全な株の生産のためにお互いを補う。
【０１０２】
好ましくは、これらの方法は、価値のある産物製造、特に低分子量化合物またはタンパク質に関する。
【０１０３】
実際に、研究室スケールで適当な株が用いられる場合に有利であろう。しかし、ここで、典型的な一般条件を満たすことは一般的にはより容易であろう。さらに、微生物の発酵の主な適用は、価値のある産物の生物工学的製造を含む。
【０１０４】
これらの材料の重要性に従って、その低分子量化合物が、天然産物、栄養サプリメントまたは医薬関連化合物に関するような方法であるのが好ましい。
【０１０５】
これらは、例えばアミノ酸またはビタミンを包含し、これは、特に栄養サプリメントとして使用される。医薬関連化合物は、医薬物のための前駆体または中間体または医薬物それ自身に関する。これらの全ての場合は生物変換に関し、この微生物の代謝特性は、全体的に置き換えるか、または少なくとも幾つかの困難な化学合成ステップを置き換えるために活用される。
【０１０６】
同様に好ましい方法において、タンパク質は、酵素、特にα-アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼおよびヘミセルラーゼの群からの酵素に関する。
【０１０７】
このタイプの方法において製造される工業用酵素は、例えば食品産業で使用される。このように、α-アミラーゼは、例えば、パンの硬化を防止し、また果汁を清澄化するように機能する。プロテアーゼは、タンパク質を分解するために使用される。全てのこれらの酵素は、洗剤および清浄剤における使用のために記述されており、ここでは、特に、既にグラム陰性細菌から天然に産生されたサブチリシンプロテアーゼが重要な位置を占める。それらは、特に、織物および皮革産業において天然産物を手入れするために使用される。さらに、全てのこれらの酵素は、化学反応のための触媒として、生物変換という意味においても用いられ得る。
【０１０８】
本発明の目的において最初に述べたように、それを阻害するためには特異的すぎないが他の分子生物学的方法でも使用されているこのようなタイプの安全な系を見出すことが望まれた。これらの方法のタイプは、本発明のさらに独立した主題に要約され得る。
【０１０９】
一般的にいえば、分子生物学的反応方法において、上記ＲecＡ因子および／または、配列番号：３２に挙げたアミノ酸配列と、そこに示した３４８アミノ酸位置の少なくとも３４７、好ましくは３４８において一致するＲecＡの使用を意味する。
【０１１０】
この目的を達成するために、その天然に利用し得る活性は十分に活用される。
【０１１１】
結果として、その使用は、一本鎖ＤＮＡを、特にＤＮＡ重合化において、イン・ビトロでの組換え過程を安定化するために、または二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに、また逆も同様に変換するために好ましい。
【０１１２】
ＲecＡは、ＤＮＡ一本鎖結合タンパク質であり、上記したように、二本鎖ＤＮＡに対して特定の親和性も示す。この機能は、相同組換えの最中に交差する自然過程中に一つの効果を示す。このように、ＲecＡを、一本鎖を安定化するために、例えばＰＣＲまたはＤＮＡファージの調製に添加できる。イン・ビトロで組換え過程を再現する場合、例えば突然変異を導入することによって(即ち、上記した新規の突然変異に対して)、次いでそれらはＲecＡによって促進されうる。最終的に、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに（または逆も同様に）変換することは、ジャイレースまたはジャイレースのサポート機能を意味すると解される。これは、ＤＮＡトポロジー、例えばプラスミドＤＮＡと共に働いて、作用するように活用され得る。
【０１１３】
前記核酸を含むベクターは、本発明の別の主題を示す。本発明は、この形態においても実現される。即ち、このＤＮＡを、分子生物学的に処理するか、またはクローニングベクターの形態で保存することもできる。
【０１１４】
好ましくは、かかるベクターは発現ベクターである。それは、新規ＲecＡを作成するため、そしてこの因子の前記適用を伝達するために活用できる。
【０１１５】
従って、前記ＲecＡ因子の製造方法は、本発明のさらなる主題を示す。
【０１１６】
これは、上記核酸の一つ、特に配列番号：１に高いホモロジー値を有する核酸、好ましくは対応する発現ベクターを用いて、およびさらに好ましくはこの核酸またはこれらの発現ベクターを含む宿主の発酵によっておこる方法に関するもの好ましい。
【０１１７】
このように、本発明は、細胞が染色体コピーの形態でかかる遺伝子を獲得し、翻訳することで実施される。一方、この遺伝子の供給は、プラスミドの形態で容易に管理できると考えられ、所望により該因子の形成のために複数のコピーを提供する。
【０１１８】
この因子を発現するためのＲecＡ因子をコードする新規核酸の使用は、本発明の別の主題を示す。上記説明に従って、本発明は、少なくとも１つの態様において実現される。
【０１１９】
好ましくは、これは、この因子それ自身を産生するために機能し、特に上記した過程の一つにおいて機能する。一方、細胞内発現は、目的の細胞の分子生物学的活性を調節するように機能し、特にイン・ビボでの組換え過程において機能できる。
【０１２０】
不活性化、例えばアンチセンス法またはＲＮＡ干渉法による不活性化は、ここではＲecＡをコードするｍＲＮＡが選択的にスイッチ・オフされるか、または部分的にしか翻訳できないようにすることを意味する。この方法で、この因子の発現は、非常に上手く選択的に調節され得る。これは、生物工学的産生株および分子生物学的態様を研究するための実験方法の両方に対して有効である。
【０１２１】
さらに、本発明は、ＲecＡ因子をコードする上記新規核酸および／またはＲecＡ因子をコードする核酸の使用によって実現され、このヌクレオチド配列は、イン・ビトロ法において、特に関連のある核酸との相互作用により、この因子または遺伝子ＲecＡの不活性化に対して、配列番号：３１に記載したヌクレオチド配列と、これらの位置の１０４７において、位置３６９から１４１５まで、少なくとも１０４５まで、好ましくは少なくとも１０４６までに、一致する。
【０１２２】
これは、組換え過程、特にイン・ビトロ転写または翻訳アプローチを阻害するために有利であり得る。
【０１２３】
本発明のさらなる実施態様は、recＡおよびspoＩＶ遺伝子が利用できることによる分子生物学的観点に由来する。実施例１において説明したように、関連のあるＤＮＡセグメントは、基本的にはあらゆるバシラス・リケニホルミス株由来の配列番号：１９から３０に記載のオリゴヌクレオチドのおかげでＰＣＲから得られ、こうして本発明は特に簡単に再現できる。
【０１２４】
結果として、本発明の実施態様は、recＡの部分配列またはイン・ビボでrecＡと近位の、好ましくは１０００bp未満、特に好ましくは５００bp未満に位置する部分配列をコードしている、配列番号：２５から３０の一つに記載の核酸である。
【０１２５】
それらは、recＡの部分配列またはrecＡからわずか数百の介在する塩基対まで離れているものである。より好ましくは、最近傍まで１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００bpであり、即ちrecＡの開始点または終点での位置、好ましくはタンパク質をコードしていない領域である。recＡの抽出のために実施例１に従って、それらは、さらに特徴付けられていない株から得られ、この成功の可能性は、バシラス・リケニホルミスとの類似性が高くなればなる程増加する。
【０１２６】
前記実施態様に従って、実施例１に記述されたように、配列番号：２５〜３０記載の少なくとも一つの、少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つの互いに逆に配向する核酸の使用は、それによって含まれるイン・ビボでのＤＮＡ領域の増幅のために、本発明にも対応する。
【０１２７】
対合頻度（paired usage）は、各々と反対のプライマーを基本的に必要とするＰＣＲ法から生じる。目的のプライマーの配向は、図３Ｂに示される。比較的高いホモロジー値のために、基本的には、これらのプライマーが、まだ特徴付けられていないrecＡ遺伝子において類似の配向を呈することも想定し得る。
【０１２８】
好ましい使用の可能性は、最初に、中間に位置する領域を得るために、最も外側に結合するプライマーを産生する(例えば、図３ＢのrecＡ５と組合せたrecＡ６、またはこれが機能しないなら、recＡ１および／またはrecＡ４)ことを含む。次いで、具体的な欠失構築体を作成するために、さらなる内部結合のオリゴヌクレオチドが、プライマーとして、例えばrecＡ２(例えば、recＡ２と組み合わせて)およびrecＡ３(例えば、recＡ４と組合せて）用いることができ、ここで、内部プライマーのヌクレオチド配列は、必要であれば、先のＰＣＲから生じる配列を用いて訂正され得る。この方法が失敗した場合には、配列のバリエーションを有するＰＣＲプライマーを使用するべきであり、それ自体既知であり、またすでに前述されてきた。この方法の成功により、それらが所望によりrecＡ遺伝子である場合、配列番号：１および／または３１または図２に記載されたようなそれらの配列と有意なホモロジー値を示すはずである得られたフラグメントの配列決定が確認される。
【０１２９】
これは、recＡ遺伝子の増幅のための使用に関するのが好ましい。この方法において、この遺伝子不活性化に関する態様は、本発明に従って実現され得る。
【０１３０】
従って、好ましくは、これは、バシラス・メガテリウムではないグラム陽性細菌における遺伝子recＡの機能不活性化について上記詳細に説明した方法の範疇において、かかる使用に関し、本発明のこの態様に属する上記実施態様を包含する。
【０１３１】
同じように、好ましくは、これは、遺伝子recＡが機能的に不活性化されたバシラス・メガテリウムではないグラム陽性細菌の生産のためのかかる使用に関し、本発明のこの態様に属する上記実施態様を包含する。
【０１３２】
本発明のさらなる態様は、遺伝子spoＩＶの不活性化によって特徴付けられる。最近のrecＡについての説明によれば、下記態様は本発明の実現に関わる:
−配列番号：１９〜２４の一つのspoｌＶの部分配列またはイン・ビボでのspoｌＶと、好ましくは１０００bp未満、特に好ましくは５００bp未満近隣の部分配列をコードする離れた核酸、；
−配列番号：２５から３０の少なくとも一つの、好ましくは各々に対して逆に配向した少なくとも２つの核酸の、それによって含まれたイン・ビボでのＤＮＡ領域の増幅のための、使用；
−spoＩＶ遺伝子の増幅のためのかかる使用；
−バシラス・メガテリウムではないグラム陽性細菌における遺伝子recＡの機能不活性化のための方法の範疇にあるかかる使用、ここで胞子形成のＩＶ期からの遺伝子がrecＡと同時に機能的に不活性化され、本発明のこの態様に属する上記実施態様を含む;
−バシラス・メガテリウムではないグラム陽性細菌、好ましくは天然に胞子形成し得るクロステリジウム属またはバシラス属の一つの細菌の生産のためのかかる使用、ここで胞子形成ＩＶ期からの遺伝子がrecＡと同時に機能的に不活性化され、本発明の態様に属する上記実施態様に包含される。
【０１３３】
（実施例）
全ての分子生物学的ステップは、例えばFritsch, Sambrook und Maniatis "Molecuror cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour laboratory Press, New York, 1989 または "Mikrobiologische methoden: Eine Einfuehrung in grundlegende Arbeitstechniken" ("Miclobiological Methods: An introduction into fundamental techniques"), E.Bast (1999) Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin の出版物に記載されるような標準的方法に従うかまたは同等の関連著作物 Enzyme and Kit は、適切な製造業者の指示書に従って使用された。
【実施例１】
【０１３４】
実施例１
バシラス・リケニホルミス研究室株由来のspoｌＶ−およびrecＡ-領域の単離
基本的には、本発明は、配列の印刷物に記載されているバシラス・リケニホルミス DSM １３(配列番号：１または３) 由来のrecＡおよびspoｌＶに対する配列を用いる開始によって実行し得る。ここでは、出版物"A general method for cloning recＡ genes of Gram-positive bacteria by polymerase chain reaction" (1992) by Duwat et al. in J. Bacteriol., vol 174 (Nr. 15), pp. 5171 - 5175に記載されている通りに、バシラス株からこの遺伝子を単離するために、ＰＣＲを基にした方法を最初に用いることによって、より迅速に開始された。
【０１３５】
このために、ＰＣＲプライマーを、様々なグラム陽性細菌、特にバシラス・リケニホルミス DSM 13 由来の遺伝子spoｌＶおよびrecＡの既知のＤＮＡ配列から合成した。この中で最終的に成功したものはを表１および本願の配列複写物に記載した。各遺伝子座上のそれらの結合遺伝子座を、図３に示す。
表１：spoｌＶおよびrecＡ遺伝子座の増幅に使用したオリゴヌクレオチド
【表１】
2007533306.tif 000003
【０１３６】
この方法で、spoｌＶ−およびrecＡ-遺伝子座の両方の重複部分を、バシラス・リケニホルミス研究室株の染色体ＤＮＡの調製物からＰＣＲ技術によって単離した。バシラス・リケニホルミスとして表したこの株は、グラム陽性細菌のための例証として役立つ。この方法は、基本的に、特にこれらのプライマーが知られているので、全てのグラム陽性細菌を使用することができる。
【０１３７】
標準的ＰＣＲから得たＰＣＲフラグメントを配列決定した後、それらは全配列に各々あつめられる。spoＩＶ領域の場合には、これは、配列番号：３に挙げたバシラス・リケニホルミス DSM 13 由来の配列と、１７９２bpの全長にわたり１００％一致した。それ故に、フィールド<213>に見られる種の表示は、特定の株 DSM 13 または A を表すものではなく、むしろ一般的な種を表す。
【０１３８】
さらに、コード領域が１４０から１３３６(ストップコドンを包含する)に示した位置を包含するようにこの配列に加えるなら、開始コドンＧＴＧをコードする最初の３つはイン・ビボではメチオニンとして翻訳される。１７９２bpから示される全セグメントはここでは遺伝子spoＩＶとして示す、これはタンパク質コード部分のみだけではなくこの遺伝子に関係する調節エレメントも含むためである。この遺伝子設計は、他の遺伝子に最初に指定されたセグメントが内側に伸張し得るという事実に関わりなく従う。これは、遺伝子領域が時々重複していることが判明したため、妥当であるように思われる。
【０１３９】
recＡ-領域の場合には、ＤＮＡを１５５７bpの長さで得た。これは、３つの位置以外の全てにおいて、本発明の配列番号：１において、対応させ得る直接的なタンパク質コード領域と一致する。それを配列番号：３１に示す。得られたアミノ酸配列は、配列番号：３２に見出され得る。ＤＮＡレベルに対する配列番号：１の相違は、位置２８２-２８４に存在し、関連のあるコドンは、アミノ酸配列ＤＴの代わりにＥＨをコードする。この相違のために、配列番号：１および３１に対する種の表示を、株表示 DSM 13 および Aとともにフィールド<213>に追加した。加えるべきことは、該コード領域が配列番号：３１に示した位置３６９から１４１５(ストップコドンを包含する)を包含することである。spoＩＶに対する議論にしたがって、１５５７bpの表示された全セグメントは、遺伝子recＡとして示される。
【０１４０】
このようにして得られた遺伝子座spoｌＶおよびrecＡの両方は、データバンク GenBank (National Center for Biotechnology Inforamation NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)に、受託番号AJ616332として(spoｌＶについて)およびAJ511368 (recＡについて)として受託された。
【実施例２】
【０１４１】
実施例２
選択的遺伝子破壊によるspoｌＶ-およびrecＡ-遺伝子の欠失
選択的遺伝子破壊技術の使用によって、より広範な可能な領域が、spoＩＶ−またはrecＡ遺伝子から欠失され得る。この実験的設計を図３に概略した。パートＡは、spoｌＶにおける欠失の導入、即ち バシラス・リケニホルミスＡ由来の株 バシラス・リケニホルミスＡ.１(ΔspoｌＶ)の誘導体を示す。パートＢは、バシラス・リケニホルミスＡ.１(ΔspoｌＶ)からバシラス・リケニホルミスＡ.２(ΔspoｌＶ、ΔrecＡ)へのさらなる展開を示す。直接隣接する各遺伝子を包含する検討中の遺伝子座を、重要な制限切断部位として、および実施例１に記載した挙げたプライマーに対する結合領域として表示した。
【０１４２】
欠失について、染色体ＤＮＡからのフランキング領域を、図３に示したオリゴヌクレオチドを用いて増幅させ、次に詳細に述べるように、適当な欠失カートリッジの構築体を使用した。まず、それらをE. coli ベクター pUCBM21において作成した。これは、http://seq.yeastgenome.org/vectordb/vector_descrip/PUCBM21.html (2005年1月14日に受託）に記載され、Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim (formally Boehringer)から入手し得る。それらを、後にthe Bacillus vector pE194 へクローニングした。これは、http://seq. yeastgenome.org/vectordb/vector_descrip/PE194.html (14.1.2005 に受託)に記載され、the American type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (http://www.atcc.org)から入手し得る。
【０１４３】
かかるベクターによる遺伝子破壊の作成は、対応する相同なフランキング領域を介して組換え事象中におこる。ここで、元来のプラスミドに局在化した、破壊下の遺伝子のイン・ビトロで変異した複製物は、２つの連続的な１つの交差事象により細菌染色体において本来のインタクトな複製物と交換される。バシラスのベクターが温度感受性の複製起源を担持しているので、次いで許容できない条件(４２℃)下で成功した破壊の後、プラスミド分画を細胞から後にもう一度除去し、こうして安定な変異系を確立できる。
【０１４４】
spo７およびspo６と共にオリゴヌクレオチドspo３およびspo４を使用して、spoＩＶ欠失カートリッジを構築した；両方の隣接物は、各々約４５０bpの大きさであり、７４０bpの領域を構成する(後の削除サイズ)。recＡ３およびrecＡ４と共にオリゴヌクレオチドrecＡ１およびrecＡ２を使用して、recＡ欠失カートリッジを構築した；両方の隣接物は、各々約３４０bpの大きさであり、８５２bpの領域を構成する（後の削除のサイズ)。pE194 (B. subtilis DB104 で行った; Kawamura, F. and Doi, R. H. (1984), J. Bacteriol., vol. 160, pages 442-44 に記載された株）の一つのＰｓｔＩ切断部位への欠失カートリッジのクローニングの後、破壊ベクター pESpo2 および pErecＡ2の両方を得た。次いで、spoＩＶ遺伝子の選択的欠失について、ベクター pESpo2 を、プロトプラスト技術によって、バシラス・リケニホルミスＡで形質転換した(S. Chang und S.N. Cohen, (1979) Molec. Gen. Genef., vol. 168, pages 111-115に記載)。許容できない条件下で、ベクターを適当な形質転換体系から再び該細胞を間引いた。同時に、変異体の増幅の存在は、オリゴヌクレオチドspo１およびspo２を用いてＰＣＲによって調べ、安定なΔspoｌＶ変異体系（バシラス・リケニホルミスＡ.１と表示）を、数回の継代培養後に成功裏に単離した。
【０１４５】
この変異体系Ａ.１を、recＡ破壊因子 pErecＡ2 を用いるさらなる形質転換に使用した。同様な形質転換体を、４２℃で数回の継代培養において植え次ぎ、対応するΔrecＡ変異体（ΔspolV/ΔrecＡ二重変異体、バシラス・リケニホルミスＡ.２として表示）を、マイトマイシンＣ−感受性(0.03 μg/μl)に対するスクリーニングによって同定した。さらに、これらの表現型の結果を、オリゴヌクレオチドrecＡ６およびrecＡ５を用いてＰＣＲによって評価した。
【実施例３】
【０１４６】
実施例３
ΔspoｌＶの単独変異体の遺伝子特性およびΔspolV/ΔrecＡ二重変異体
対応する遺伝子領域における欠失(切断)を確認するために、両方の変異体株(バシラス・リケニホルミス A.1 および A.2)を開始株 バシラス・リケニホルミスＡとＤＮＡレベルで比較して試験した。即ち、プライマーspo１およびspo２を用いるＰＣＲ技術によって、７４０bp の欠失を、株Ａ.１およびＡ.２(図４Ａ左側の部分)のspoＩＶ遺伝子座において明確に検出できた。プライマー対recＡ６およびrecＡ５(図４Ａ１の右側)を用いると、変異体Ａ.２のrecＡ遺伝子における８５２bp 欠失についても同じことがあてはまる。
【０１４７】
さらに、３つの株をサザン分析に供した。spoＩＶ欠失は、各染色体ＤＮＡ（２μｇ）を制限エンドヌクレアーゼＣＩａｌにより切断することによって検出され、ゲル電気泳動による分離後、それらをＤＩＧマークしたＰＣＲ産物(開始ＤＮＡを用いてプライマーspo３およびspo４を用いて生成した)と標準的方法を用いてハイブリダイズした。株Ａ.１およびＡ.２の両方について検出された２つのＣＩaｌフラグメントのうち大きい方が、欠失のサイズに対応する開始株Ａよりも低いレベルに存在することがわかった(図４Ｂの左側)。
【０１４８】
recＡ欠失を、制限エンドヌクレアーゼＳspｌを用いてＤＮＡを消化することによって検出し、ＤＩＧマークしたＰＣＲ産物(プライマーrecＡ１およびrecＡ２を用いて同様の方法で生じる)を用いて同様の方法でハイブリダイズした。この場合では、削除の結果、株 Ａ.２に対応するＳspｌフラグメントは、親株Ａ.１または野生株Ａ(図４Ｂ右側)よりも相応により低いレベルであった。
【実施例４】
【０１４９】
実施例４
ΔspoｌＶ単独変異体Ａ.１およびΔspoｌＶＩΔrecＡ二重変異体Ａ.２の表現型特性付け：生存比率および胞子形成
胞子形成試験のための培養を、２つのバッフル付フラスコ（５００ml）中で、シャッファー胞子形成培地［ＬＢ−培地（１６．０ｇ）、ＫＣl（２．０g）、ＭgＳＯ4（０．５g）、ｘ７Ｈ２Ｏ、滅菌水添加（９９３,０ ml）；pＨ７．０；溶液をオートクレーブし、その後次の成分を補充した：Ｃa(ＮＯ３)２(０.１Ｍ)（１ml）、ＭnＣｌ２(０.１Ｍ)（１ml）、ＦeＳＯ４(１mＭ)（１ml）、グルコース（２０％(ｗ／ｖ))（４ml）］（２００ml）において行った。試験中の３つの株各々の３つのフラスコを、０.２５％のＬＢ前培養物にて植菌し、３０℃で約１２０rpm(lnnova 4230, New Brunswick Scientific, Edison, NY, USA)でインキュベートした。培養物（１１００μl）のサンプルを、滅菌エッペンドルフ管内に移した。このアリコート（１００μl）を用いて、１５mＭ ＮaＣｌに希釈して生存細胞数を決定した。各々の希釈工程の物を、４枚のＬＢ寒天プレート上に播種し、終夜３０℃でインキュベートした。生存細胞数を、４枚の各寒天プレート上のコロニーを計測することによって決定した。生存細胞数［コロニー形成単位(cfu)]を、プレートの容量および希釈工程を考慮して、一連のプレートの値を平均して決定した。残っているサンプル（１０００μl）を８０℃３０分間水浴中でインキュベートした。処理済懸濁液（２５０μl）を４枚のＬＢ寒天プレートに播種し、３０℃でインキュベートした。胞子力価値を、単一コロニーを形成する発芽胞子を計測することによって決定した。プレートの胞子数を平均し、次いでml培養液あたりで計算した。この結果を表２および図５に示した。
【０１５０】
表２：生存細胞数の平均値およびml培養物あたりの生存胞子数
各株を３つの並行実験(＝培養物)において試験した。各実験を、４回の測定値によって統計的に評価した。
Ａ＝開始株 バシラス・リケニホルミスＡ；Ａ.１＝ バシラス・リケニホルミスＡ.１(ΔspoｌＶ)；Ａ.２＝ バシラス・リケニホルミス MD1.2 (ΔspoｌＶ、ΔrecＡ)。
【表２】
2007533306.tif 000004
【０１５１】
これらの結果から、開始株の細胞のみが胞子形成できることがわかった。spoＩＶの欠失のために、両方の突然変異体は胞子形成できなかった。recＡ遺伝子のさらなる欠失を特徴とする突然変異体は、生存細胞数における急激な低下をある程度軽減することを示す。
【実施例５】
【０１５２】
実施例５
ΔspoｌＶ単独突然変異体Ａ.１およびΔspoｌＶＩΔrecＡ二重突然変異体Ａ.２の増殖曲線
この試験について、３つの前記した株の培養液（１０ml）を、単一コロニー(ＬＢプレートから）にて各々播種し、３７℃で１５０rpm、終夜インキュベートした。Sambrook（1989）ら［(１％(ｗ／ｖ)グルコース、０.１mＭ ＣaＣＩ2、０.０１％(ｗ／ｖ)酵母抽出物、０.０２％(ｗ／ｖ)カザミノ酸；ｐＨ７.０)］の最小培地（５０ ml）に、２つのバッフル付きエーレンマイヤーフラスコ(２５０ ml）を、これらの前培養物（２％）にて植菌した。これらの培養物を、３７℃１８０rpm(shaker lnnova 4230, New Brunswick Scientific, Edison, NY, USA)で培養し、ＯＤ５４６が約１.０(後期対数増殖期)に達するまで培養した。
【０１５３】
対数増殖期までに得られる増殖曲線を、図６に示した。注目すべきことは、全ての３つの株が、事実上、それらの二倍の速度に関しても同じ結果を示す。それ故に、ある株から別の株への変更は、いかなる検出し得る増殖阻害とも関連しない。
【実施例６】
【０１５４】
実施例６
ΔspoｌＶ単独突然変異体Ａ.１およびΔspoｌＶＩΔrecＡ二重突然変異体Ａ.２の表現型特性：ＵＶ感受性
前記実施例に関連して、図６での対数増殖期の時点での細胞を、１０−４のレベルまで１５mＭ ＮａＣｌ溶液で希釈し、ＬＢプレート上に希釈物の各アリコート（１００μl）を播種することによって、それらのＵＶ感受性について定量的に試験した。コントロールプレートとして後に供する２つのＬＢプレートを除いて、残っているＬＢプレートを、２５４nmの波長のＵＶ光を用いて異なる時間照射した:プレートを、出力１００μＷ／ｃｍ２のＵＶランプのもとに置いて種々の照射時間の後に隠して、さらなる光に対して保護するためにアルミニウムホイルで覆った。２〜６０秒の種々の照射時間は、上記ランプ出力で２〜６０ J/mのＵＶ照射強度に対応する。次いで、コントロールプレートおよびＵＶプレートを、１６時間３７℃暗所でインキュベートした。コントロールプレートのコロニー数に基づいて、その値は、ＵＶプレート上で１００％の生存速度に対応し、生存率（％）をＵＶ照射強度の関数として計算した。全３回の試験(＝培養物)からの二回の測定値を平均し(参照表３)、グラフ形式で示した(図７Ａ)。
【０１５５】
表３：ＵＶ照射強度の関数としての株Ａ、Ａ.１およびＡ.２の平均％生存率
各株を３回の実験で試験した(＝培養物)。各実験を、二回の測定値により統計的に評価した。Ａ＝ バシラス・リケニホルミスＡ；Ａ.１＝ バシラス・リケニホルミスＡ.１(ΔspoｌＶ)；Ａ.２＝ バシラス・リケニホルミスＡ.２(ΔspoｌＶ、ΔＲecＡ)。
【表３】
2007533306.tif 000005
【０１５６】
それらのＵＶ感受性に関する株Ａ.１およびＡ.２の両方の質的比較について、並行培養物からのアリコート（１５μl）を、４枚のＬＢプレートに各々暴露した。該プレートを、次いでPlexiglasスライドの右側を被覆し、もう半分をＵＶ光にて照射した（左側)。次いで、それらを上記のように１６時間３７℃の暗所でインキュベートした。
【０１５７】
この実験の結果を、図７Ｂに示す。注目すべきことは、調査した二重突然変異体は、単独突然変異体よりもＵＶ感受性が十分高かった。従って、両方の実験部から、recＡの欠失は、特にspoＩＶとの組合せにおいて、天然環境条件の効果下では生存できない突然変異体をもたらすことを証明した。この効果は、明細書に示したように、安全な株としてこれら変異体の使用に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、最も近縁の先行技術のＲec因子と配列番号：２のアミノ酸配列のアラインメントである。    次の意味を適用する：  １：バシラス・リケニホルミスDSM 13 (配列番号：２)由来のＲecＡ因子  ２：バシラス・アミロリクェファシエンス (NCBIにてAJ515542)由来のＲecＡ因子  ３：バシラス・サブチリス(NCBIにてZ99112; 領域 161035〜162078)由来のＲecＡ因子  ４：バシラス・サブチリス(NCBIにてX521 32) 由来の因子ＲecＥ
【図２】図２は、最も近い先行技術のrec 遺伝子の配列番号：１の核酸配列。    次の意味を適用する：  １：バシラス・リケニホルミス DSM 13 (配列番号：１)由来の遺伝子recＡ  ２：バシラス・ アミロリクェファシエンス (NCBIにてAJ515542)由来の遺伝子recＡ  ３：バシラス・サブチリス(NCBIにてZ99112; 領域 161035〜162078)由来の遺伝子recＡ  ４：バシラス・サブチリス(NCBIにてX521 32)由来の遺伝子ｒｅｃＥ
【０１５９】
【図３】図３は、野生型、ならびにspoｌＶ(Ａ)およびrecＡ(Ｂ)の突然変異体遺伝子座の遺伝子構成の概略図の説明であり、配列番号：１９から３０として記載したプライマーのための結合位置を包含する。  Ａ．  spoｌＶの機能不活性化（欠失）、即ち株 バシラス・リケニホルミスＡからのバシラス・リケニホルミス Ａ.１の誘導（実施例２を参照されたい)。  Ｂ．  recＡの機能不活性化(欠失)、即ち株 バシラス・リケニホルミス Ａ.１からのバシラス・リケニホルミス Ａ.２の誘導（実施例２を参照されたい)。
【０１６０】
【図４】図４は、ＰＣＲ(Ａ)およびサザン分析(Ｂ）により、開始株 バシラス・リケニホルミス Ａ と比較した突然変異体株Ａ.１およびＡ.２の遺伝子型の研究である。(実施例３を参照されたい)
【０１６１】
【図５】図５は、バシラス・リケニホルミス培養物の生存細胞数および胞子力価ののグラフである。各培養物を３つの並行実験において試験した。各実験を、４回の測定によって統計的に評価した(実施例４を参照されたい)。    次の意味を適用する：  黒色で中塗りした四角：バシラス・リケニホルミスＡ；  中抜きの丸：バシラス・リケニホルミスＡ.１(ΔspoｌＶ);   中抜きの三角：バシラス・リケニホルミスＡ.２(ΔspoｌＶ、ΔrecＡ);   点線：          生存細胞数  実線：胞子力価
【０１６２】
【図６】図６は、最小培地中の３つのバシラス・リケニホルミス株の培養物の増殖曲線(実施例５を参照されたい)である。
【図７】図７は、ＵＶ試験の結果である。  Ａ.  ＵＶ照射後の生存率のグラフ。各培養物を３つの並行実験において試験した。各実験を、二回の測定によって統計的に評価した(実施例６)。    次の意味を適用する：  黒色で中塗りした四角：バシラス・リケニホルミスA;   中抜きの丸：バシラス・リケニホルミスA.1 (ΔspoｌＶ)  中抜きの三角：バシラス・リケニホルミスA.2 (ΔspoｌＶ、ΔＲecＡ)  Ｂ．  半分が照射中被覆されたプレート上での株Ａ.１およびＡ.２の暴露によるＵＶ定量試験。
【図１】
2007533306.tif 000006
【図２−１】
2007533306.tif 000007
【図２−２】
2007533306.tif 000008
【図２−３】
2007533306.tif 000009
【図３】
2007533306.tif 000010
【図３】
2007533306.tif 000011
【図４】
2007533306.tif 000012
【図５】
2007533306.tif 000013
【図６】
2007533306.tif 000014
【図７】
2007533306.tif 000015
【配列表】
2007533306000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月25日(2006.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007533306000001.app
【国際調査報告】
2007533306.tif 000058
2007533306.tif 000059
2007533306.tif 000060
2007533306.tif 000061
2007533306.tif 000062
2007533306.tif 000063
2007533306.tif 000064
2007533306.tif 000065
2007533306.tif 000066
2007533306.tif 000067