(57)【要約】  癌，特に乳癌のリスクを予測するために用いることができる診断方法が開示される。この方法は，（ｉ）患者のゲノムのサンプルを単離し；そして（ｉｉ）本明細書において配列番号１として識別される配列中に含まれる遺伝子の存在または発現を検出することを含み，ここで，遺伝子の存在または発現は，癌の存在またはリスクを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において癌の存在またはリスクを検出する方法であって，
（ｉ）患者のゲノムのサンプルを単離し；そして
（ｉｉ）本明細書において配列番号１として識別される配列中に含まれる遺伝子の存在または発現を検出する
の各工程を含み，ここで，遺伝子の存在または発現は癌の存在またはリスクを示す，
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
遺伝子が配列番号２として識別されるものである，請求項１記載の方法。
【請求項３】
ゲノムサンプルが乳組織，子宮または精巣から得られたものである，請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
癌が乳癌である，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
検出がポリメラーゼ酵素を用いて遺伝子を増幅することにより行われる，請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
本明細書において配列番号１として識別されるヌクレオチド配列，またはその相補体，またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該配列（またはその相補体）にハイブリダイズする少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのポリヌクレオチドを含む，単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列が本明細書において配列番号２として識別される配列である，請求項６記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
患者において癌のリスクを試験するためのインビトロ診断アッセイにおける，請求項６または７記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項９】
癌が乳癌である，請求項８記載の使用。
【請求項１０】
本明細書において配列番号３として識別される配列，またはその少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基のフラグメントを含むペプチド。
【請求項１１】
請求項１０記載のペプチドに対して少なくとも１０-6Ｍの親和性を有する抗体。
【請求項１２】
請求項６または７に記載のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子にハイブリダイズするかまたはその発現を阻害する第２のポリヌクレオチドの，癌，特に乳癌の治療用の医薬品の製造における使用。
【請求項１３】
遺伝子が請求項７記載のポリヌクレオチドを含む，請求項１２記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，癌，特に乳癌のリスクの存在の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界で１年に１００万件以上の乳癌の症例があり，そのうち米国はおよそ５０万人，英国は４万人，およびアイルランドはほぼ２，０００人である。女性ではこれは癌による死亡の第１位である。西洋では，疾病の全体的な発症率は増加しているが，より広いスクリーニングおよび改良された治療により，致死率は１９９１年から１年に約１％で徐々に低下している。初期の乳癌と診断された患者は，９０％を越える５年生存率を有するが，これに対し遠位転移乳癌と診断された患者の場合は２０％である。いずれにしても，乳癌に対する確実な初期スクリーニング試験は存在せず，現在，診断はマンモグラフィーおよび細針生検の結果により行われている。マンモグラフィーには限界があり，疑わしい結果の８０％以上は擬陽性であることが後にわかり，乳癌を有する女性の１０−１５％は擬陰性の結果を与える。しばしば，腫瘍は検出の前に後期の発達段階に達しており，患者の生存の確率は低下し，治療およびヘルスケアシステムの管理のコストが増加する。患者の死亡率を低下させるために，乳の小さい（直径２ｃｍ未満）の初期のインシトゥー癌腫を検出するより感度の高い方法が求められている。初期の検出に加え，既知の癌の分類および腫瘍タイプの区別において，疾病を良性であるか悪性であるかに分類する上で深刻な問題が存在する。さらに，現在進行中の治療の効果をモニターし，特定の治療法に耐性となりつつある患者を識別することが求められている。乳腺は成人期の間，特に妊娠，授乳および退縮の間に形態学的および機能的に著しく変化するいくつかの臓器の１つであり，この変化は同じ乳腺の分子シグニチャーが経時的に変化することにつながる可能性があるため，そのような検出プロセスはさらに複雑である。
【０００３】
疾病の診断は，しばしば，小数の生物学的マーカーの相対的レベルの注意深い検査により行われる。最近の進歩にもかかわらず，患者のケアおよび臨床的帰結に対する現在のバイオマーカーの貢献は限られている。これは，現存するマーカーは診断の感度および疾病特異性が低いためである。しかし，分子バイオマーカーのいくつかは，疾病診断において日常的に用いられており，例えば，前立腺癌スクリーニングには前立腺特異的抗原が用いられており，新たな候補マーカーが発見される速度は増加している（Ｐｒｉｔｚｋｅｒ，２００２）。よく検証されたバイオマーカーのパネルの使用が，試験の陽性予測価値を高め，擬陽性または擬陰性を最小にするであろうことが認められつつある（Ｓｒｉｎｉｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。さらに，現在ニューラルネットワークに対する興味が増加しており，これは，種々のバイオマーカーからの弱いが独立した情報を組み合わせて，各バイオマーカー単独より有益な予後／予測指標を与えることの有望性を示す（Ｙｏｕｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０００４】
より多くの分子情報を照合すると，患者の帰結につながる遺伝的シグニチャーにしたがって乳癌等の疾病をさらに分類することができ，医師にとって価値のある情報を与えることができる。分子医薬において新たに生じた技術は，伝統的な病理学的基準では認識できない疾病のサブタイプ間を区別するのに（Ｓｏｒｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１），および癌の進行に関与する特異的な遺伝的事象を同定するのに（Ｓｒｉｎｉｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２），有力であることが示されている。平行して考慮する必要がある別の問題は，性別および人種の間のバイオマーカーの有効性に関するものであり，したがって，異なる集団の大規模なスクリーニングが必要である。
【０００５】
通常は乳においてのみ発現しているが，疾病の結果身体のあらゆる場所で見いだされる新規マーカーを用いることにより，乳癌の管理を改良することができる。疾病の活性を予測しうる物，特に本来の位置の腺管癌が発達して侵襲性の腺管癌となるか否かを予測しうる物は，疾病の管理においても利用価値がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明の第１の観点にしたがえば，以下の各工程を含む，患者における癌の存在またはリスクを検出する方法が提供される：
（ｉ）患者のゲノムのサンプルを単離し；そして
（ｉｉ）本明細書において配列番号１として識別される配列中に含まれる遺伝子またはその相補体の存在または発現を検出し，
ここで，該遺伝子の存在または発現は，癌の存在またはリスクを示す。
【０００７】
本発明の第２の観点にしたがえば，単離されたポリヌクレオチドは，本明細書において配列番号１または配列番号２として識別されるヌクレオチド配列，またはその相補体，またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該配列（またはその相補体）にハイブリダイズする少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのポリヌクレオチドを含む。
【０００８】
本発明の第３の観点においては，単離されたペプチドは，本明細書において配列番号３として識別される配列または少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基のそのフラグメントを含む。
【０００９】
本発明の第４の観点においては，抗体は，上で定義したペプチドに対して少なくとも１０-6Ｍの親和性を有する。
【００１０】
本発明の第５の観点においては，配列番号１として識別される配列中に含まれる内因性遺伝子にハイブリダイズするか，またはさもなくばその発現を阻害するポリヌクレオチドを，癌，特に乳癌の治療用の医薬品の製造において使用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の説明
本発明は，癌，特に乳，子宮または精巣癌に罹患している患者において発現されている遺伝子の同定に基づく。患者から取得したサンプルにおける遺伝子（またはその発現産物）の同定は，患者における癌の存在またはリスクを示す。
【００１２】
本発明はさらに，癌の素因を検出，診断，モニタリング，予後予測，予防，イメージング，治療または判定するのに有用な試薬，例えばポリペプチド配列に関する。
【００１３】
本発明は，子宮，精巣または乳の癌，特にＥＲα陽性腫瘍の検出に特に適している。
【００１４】
診断を実施する方法は，試験サンプル中のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し，遺伝子またはそのフラグメントに対応するｃＤＮＡの適当な部分を増幅し，産物をその組織における疾病の存在の指標として検出する，または遺伝子配列を含むｍＲＮＡの翻訳産物を疾病の存在の指標として検出することを含むことができる。
【００１５】
有用な試薬には，診断方法，例えば，生検組織，血液または他の試験サンプルから抽出されたｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ，ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用なポリペプチドまたはそのフラグメント，またはそのようなｍＲＮＡの翻訳産物である蛋白質，またはこれらの蛋白質に対する抗体が含まれる。これらのアッセイはまた，体内で生じうる可能な翻訳後修飾，例えば，サブユニット複合体の形成における，補因子，阻害剤，アクチベータおよび他の蛋白質等の分子との相互作用を考慮して，遺伝子産物（蛋白質）を検出する方法を含む。
【００１６】
癌に関連する遺伝子は，配列番号１で示されるポリヌクレオチド配列中に含まれる。推定コーディング領域は配列番号２に示される。遺伝子の発現産物は，本明細書において配列番号３で示される。遺伝子またはその発現産物の同定は，ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの検出または特性決定について知られる手法を用いて行うことができる。例えば，患者から単離された遺伝子材料を，標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする短いオリゴヌクレオチドを用いて探索することができる。オリゴヌクレオチドプローブは，標的遺伝子とハイブリダイゼーションしたときにプローブを検出しうるように，例えば蛍光団等で検出可能なように標識してもよい。あるいは，ポリメラーゼ連鎖反応を用いて遺伝子またはその一部を増幅し，この産物を標識オリゴヌクレオチドを用いて同定してもよい。
【００１７】
この遺伝子，または関連する蛋白質または抗体を利用した診断アッセイとしては，限定されないが，
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
リアルタイムＰＣＲ
インシトゥーハイブリダイゼーション
サザンドットブロット
免疫組織化学
リボヌクレアーゼ保護アッセイ
ｃＤＮＡアレイ手法
ＥＬＩＳＡ
結合実験において有用な，ガラスまたはセラミクス等の固体支持体上の蛋白質，抗原または抗体アレイ
小干渉ＲＮＡ機能アッセイ
が挙げられる。上述の手法はすべて当業者にはよく知られている。
【００１８】
別の検出方法は，当該技術分野において"分子ビーコン"と称されるものを使用する。分子ビーコンは，標的核酸の検出および定量のために設計されたオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは，通常は，標的核酸がない場合にステム−ループ構造を形成する自己ハイブリダイズ部分を含む。蛍光成分およびクエンチャー成分が，オリゴヌクレオチドの各末端に結合しており，これらは，オリゴヌクレオチドがステム−ループの幾何学的配置をとる場合には隣接して位置する。この幾何学的配置では，蛍光はクエンチャー成分により有効に妨害される。オリゴヌクレオチドのループ部分は特定の標的核酸に相補的であり，標的の存在下では，標的へのハイブリダイゼーションが生じてステムループの幾何学的配置が乱れ，蛍光団とクエンチャーとが離れて，検出可能な蛍光が増加する。分子ビーコン法を遺伝子配列の検出に使用することは米国特許６５４８２５４に開示されている。
【００１９】
本発明はまた，配列番号１または配列番号２として識別される配列，またはその相補体を含む単離されたポリヌクレオチド，または少なくとも１５個の連続するヌクレオチド，好ましくは３０個のヌクレオチド，より好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチドを含むそのフラグメントに関する。上述のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲内である。ハイブリダイゼーションは，通常，ストリンジェントな条件下で行う。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者に知られており，非相補的ハイブリダイゼーションの可能性を低下させるように選択される。適当な条件の例は，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ  ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９８５）に開示されている。より詳細には，ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は，５０％ホルムアミド，５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣＬ，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム），５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐｈ７．６），５ｘデンハルト溶液，１０％硫酸デキストランおよび２０ｐｇ／ｍｌの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベーションし，次に０．１ｘＳＳＣ中で約６５℃で洗浄することを含む。
【００２０】
また，遺伝子の同定により，その遺伝子が治療用分子の標的である治療法を開発することが可能となる。例えば，遺伝子治療用に開発された，特定の遺伝子を標的としその発現を防止する多くの既知の分子が存在する。１つの特定の分子は，小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり，これは，標的ｍＲＮＡの分解を促進することにより，特定の標的蛋白質の発現を抑制する。目的とする遺伝子に結合して発現を改変することができる他の合成オリゴヌクレオチド（またはその制御要素）も知られている。ＤＮＡと結合させたペプチド核酸（ＰＮＡｓ）（ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ）もまた，強いデコイ活性を有しており，目的とする遺伝子の発現を変更することが示されている。これらの分子を用いて，遺伝子またはその制御上流要素に結合させて，発現を防止する。
【００２１】
本発明はまた，目的とする遺伝子の単離されたポリペプチド産物に関する。本発明の単離されたポリペプチドは，本明細書において配列番号３として識別される配列，または少なくとも１０個の連続するアミノ酸，好ましくは少なくとも１５個の連続するアミノ酸，より好ましくは少なくとも２０アミノ酸を有するそのフラグメントを含む。ポリペプチドは，抗体の作成，またはインビボで蛋白質に結合してその活性を阻害しうる蛋白質結合分子の開発に有用であろう。
【００２２】
本発明はまた，本発明のポリペプチドに対して生成された抗体を含む。抗体は，通常，ポリペプチドに対して少なくとも１０-6Ｍ，より好ましくは，１０-9Ｍ，最も好ましくは少なくとも１０-11Ｍの親和性を有する。抗体は適当ないずれのタイプのものであってもよく，例えば，モノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。試験サンプルにおけるポリペプチド抗原の存在を判定するためのアッセイキットもまた含まれる。１つの態様においては，アッセイキットは，抗原に特異的に結合する抗体の入った容器を含み，ここで，抗原は，本発明の遺伝子によりコードされる少なくとも１つのエピトープを含む。これらのキットはさらに，試験サンプル，例えば，血液，唾液，尿または糞を回収するのに有用な道具の入った容器を含むことができる。そのような道具としては，血液を採取し安定化させるためのランセットおよび吸収紙または布，唾液を採取し安定化させるための綿棒，尿および糞サンプルを採取し安定化させるためのカップが挙げられる。抗体は，固相，例えば，ガラスまたはセラミック表面に結合させることができる。
【００２３】
これらの抗体を含むと疑われる試験サンプル中で，抗原と特異的に結合する抗体の検出を行うこともできる。この検出方法は，試験サンプルを遺伝子の少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドと接触させることを含む。接触は，抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件で行う。この方法はさらにポリペプチドを含む複合体を検出することも意味する。ポリペプチド複合体は，組換え的にまたは合成により製造することができ，あるいは天然起源から精製してもよい。
【００２４】
本発明の別の態様においては，その抗原に対する抗体またはそのフラグメントを用いて，疾病または状態を検出または診断する目的で，患者における抗原の局在の画像を検出することができる。そのような抗体は，モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく，または分子生物学手法で作成してもよく，種々の検出可能な試薬，例えば，限定されないが，放射性同位体で標識することができる。
【００２５】
さらに別の態様においては，抗体またはそのフラグメント（モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく，分子生物学手法により作成してもよい）は，本発明の遺伝子の発現により特徴づけられる疾病の治療のための治療薬として用いることができる。抗体は誘導化せずに使用してもよく，細胞傷害剤，例えば，放射性同位体，酵素，トキシン，薬剤，プロドラッグ等で誘導化してもよい。
【００２６】
"抗体"との用語は，広くすべての免疫学的結合剤，例えばＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤおよびＩｇＥを表す。抗体はまた，抗原結合領域を有するすべての抗体様分子を表し，例えば，限定されないが，シングルドメイン抗体（ＤＡＢＳ），Ｆｖ，ｓｃＦｖ等の抗体フラグメントが含まれる。抗体に基づく種々のコンストラクトおよびフラグメントを製造し使用する手法は，当該技術分野においてよく知られている。
【００２７】
所望の場合には，診断または予後のさらに信頼性の高い指標を与えるために，本発明の癌スクリーニング方法を他の方法と容易に組み合わせて，マルチマーカー試験とすることができる。
【００２８】
以下の実施例では，添付の図面を参照して本発明を説明する。
【実施例】
【００２９】
乳癌患者のマッチした臨床サンプルに由来するｃＤＮＡ集団から，非同位体ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）を用いて，多数の異なるように発現されている遺伝子フラグメントを単離した。これらのフラグメントの１つ（本明細書においてＤＤ１１と称する）は，多数のドナーからの乳腫瘍組織サンプルにおいて，有意にアップレギュレートされていることが明らかとなった。この新規の分子マーカーの発現プロファイル，その全長および対応する推定蛋白質配列を以下に詳細に説明する。
【００３０】
材料および方法
同じドナーからの正常な乳組織と腫瘍組織とのマッチした対の間のディファレンシャル遺伝子発現を実施した。組織サンプルは，Ｐａｔｈｌｏｒｅ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）から，完全な倫理学的認可および患者のインフォームドコンセントをもって入手した。腫瘍を外科的に除去した後，腫瘍組織の１つのサンプルを採取し，共に切り出された隣接する正常な組織からのサンプルも採取した。それぞれ，Ｄｙｎａｌｄ  Ｔ１ｓ−タグ付きダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写プロトコルを用いて，メッセンジャーＲＮＡを抽出し，次にｃＤＮＡを合成した。ディファレンシャルディスプレイ逆転写ＰＣＲ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）を用いて，これらのマッチしたサンプルの遺伝子発現プロファイルの間の相違を観察し，アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを示す個々の遺伝子転写産物を単離し，さらに調べた。
【００３１】
Ｌｉａｎｇ＆Ｐａｒｄｅｅ（１９９２）により最初に記載されているように，ディファレンシャルディスプレイ逆転写ＰＣＲ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）は，２またはそれ以上の生物学的サンプルからのｍＲＮＡを，３つの可能なアンカープライマーの１つを用いて，逆転写による代表的ｃＤＮＡ合成のテンプレートとして用いる。そのそれぞれのアンカープライマーを８０個の任意配列１３−ｍｅｒプライマーの１つと組み合わせて，３つの亜集団のそれぞれをＰＣＲ増幅した。このプライマーの組み合わせの数は，ｍＲＮＡ集団中で発現された遺伝子の９６％を表すことを容易にすると見積もられている（Ｓｔｕｒｔｅｖａｎｔ，２０００）。この集団をさらに分割して，各プライマーセットについて，第２鎖ｃＤＮＡ合成の終了後には，真核生物細胞で発現していると見積もられる１２，０００−１５，０００個のｍＲＮＡを１００−１５０の転写産物に減少させた。これは，マッチしたプライマーセットをポリアクリルアミドゲル上で平行に電気泳動分離し，正確に可視化することを容易にし，一方の組織サンプルで発現しているが他方では発現していない遺伝子フラグメントの同定につながる。
【００３２】
目的とするフラグメントを切り出して再増幅した後，逆サザンドットブロットにより擬陽性を除いた。これを用いて各再増幅フラグメントを２枚のナイロン膜（ＨｙｂｏｎｄＮ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にスポットし，フラグメントが由来するドナーの腫瘍または正常な組織ｃＤＮＡ集団のいずれかを用いてハイブリダイズさせた。次に，異なるように発現されていることが確認されたフラグメントを，クローニングせずに直接配列決定し，ウエブに基づくデータベース検索を行って，各遺伝子が新規であるかどうかを判定した。既知の遺伝子とマッチしなかったフラグメントは，それが由来する乳癌の新規マーカーを表す可能性があると考えた。多数の乳腫瘍ドナーからの一連のマッチしたｃＤＮＡ集団を用いて，半定量的ＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲのいずれかにより，各転写産物のさらなるスクリーニングを行った。すべての場合において，ｃＤＮＡテンプレートを検定するために，およびＰＣＲの間の内部陽性対照として，β−アクチンを構成的参照遺伝子として用いた。各推定新規マーカー遺伝子の発現は，検定したテンプレートについて，遺伝子特異的プライマーセットを用いて行った。次に，オープンリーディングフレーム（遺伝子の蛋白質をコードする部分）を含む新規遺伝子フラグメントの全長転写産物を，５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）として知られる複雑なプロセスを用いて合成した。これは，遺伝子特異的伸長および増幅を組み込んでおり，配列決定により確認可能である。
【００３３】
組織特異性の決定は，非乳組織，例えば，脳，心臓，リンパ球，脾臓，腎臓，精巣および筋肉からのｃＤＮＡ集団（Ｏｒｉｇｅｎｅから入手）に対して，各新規マーカーからの遺伝子特異的プライマーを用いてアッセイした。ＤＤ１１分子マーカーは，２２のヒト組織タイプのより包括的なパネルに由来するｃＤＮＡ集団を用いてさらに試験した。これらは以下のとおりである。
【００３４】
【表１】
2007503826.tif 000002
【００３５】
なお，これらのサンプルの大部分は，Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｐａｎｅｌ  ＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の一部であるが，アスタリスクで印を付けた２つのサンプルはＰａｔｈｌｏｒｅ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ）から組織塊として入手し，Ｒａｎｄｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．で加工したものである。
【００３６】
さらに，Ｐａｔｈｌｏｒｅを通して入手したある範囲の倫理学的に認定されたヒト腫瘍サンプルについてアッセイを行った。卵巣，精巣，胃，肝臓，肺，膀胱，結腸および膵臓からの腫瘍を代表するｃＤＮＡを，β−アクチンおよびＤＤ１１の両方に対してリアルタイムＰＣＲにより調べた。
【００３７】
新規のマーカーの発現分析と組み合わせて，乳組織のそれぞれのマッチした対について分子シグニチャー分析を行った。これは各組織ｃＤＮＡに対する半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて，先に公表されている多数の乳癌分子マーカーに特異的な１組のプライマーを用いて行う。各分子マーカー間の関係を判定し，各サンプルについて一覧表にして，参照として用いる。これに対して新たなマーカーを比較することができる。これは，腫瘍タイプを副分類し，新規マーカーをそのようなサブタイプと関連づけることができるようにして，診断マーカーの力を著しく増加させることを目的として行った。
【００３８】
結果および考察
ディファレンシャルディスプレイを用いると，乳癌ドナーからのマッチした組織のｃＤＮＡ集団に由来する，ＤＤ１１と名付けられた遺伝子フラグメントは，対応する正常な組織ｃＤＮＡと比較して，腫瘍ｃＤＮＡ集団中で有意にアップレギュレートされていることが認められた。この産物は，リバースサザンドットブロットにより，異なるように発現されていることが確認された。配列分析および続くデータベース検索により，ＤＤ１１はそれぞれＥＭＢＬおよびＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースにおいて既知の遺伝子または蛋白質と相同ではないことが決定され，したがって，新規である可能性が高いと考えられた。しかし，これは，ポリＡテールを除去した後に，ヒトゲノムの染色体８からのクローン（ＲＰ１１−８７５０１１）（受託番号ＡＣ１０７９５９）と１００％相同であった。
【００３９】
このフラグメントを，他の患者から供与された多数のマッチした乳腫瘍組織に由来するｃＤＮＡ集団を用いてさらにスクリーニングした。スクリーニングしたドナーサンプルのうち，９サンプル中６サンプルが顕著な発現の増加を示し，ＤＤ１１が乳腫瘍の存在の推定分子マーカーであることが確認された（図１）。この分析は，現在利用可能なマッチした乳組織サンプルのすべての分子シグニチャー分析により実証された。結果は以下のとおりである。
【００４０】
【表２】
2007503826.tif 000003
【００４１】
さらなる分析を容易にするために，５’−ＲＡＣＥを用いて，遺伝子の全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および５’非コーディング配列を含むよう，フラグメントを伸長した。この手法を用いて，５１３ヌクレオチドの推定全長産物が導かれた（配列番号１）。これは，続くデータベース調査により，先のヒト染色体８に対するホモロジーが確認され，配列の全長にわたり１００％相同である（５１３／５１３）ことが確認された。この配列から，６つすべてのアミノ酸リーディングフレームを生成して，＋２フレームで，４７アミノ酸を含み停止コドンを含む（配列番号３）小さい推定ＯＲＦ（配列番号２）が見いだされた。この小さい蛋白質は，ＳＷＡＬＬデータベースにおいていずれの既知の蛋白質とも高いホモロジーを示さず，したがって新規であると考えられる。
【００４２】
臓器特異性を判定するために，乳癌ドナーからのマッチした対のｃＤＮＡに加えて，８個のヒト非乳組織からのｃＤＮＡ集団をＤＤ１１プライマーに対して試験した。また，同じサンプルを構成的なハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンからのプライマーを陽性対照として用いて試験して，半定量的ＰＣＲ分析用のテンプレートを検定した。β−アクチン産物は，試験したすべてのｃＤＮＡ集団において強く増幅されたが，ＤＤ１１産物は乳腫瘍サンプルにおいてのみ検出された（図２）。このことは，この新規遺伝子が乳腫瘍の存在の非常に強力な分子マーカーでありうることのさらなる証拠を与える。
【００４３】
この分子マーカーを，２２種のヒト組織タイプのパネルに由来するｃＤＮＡ集団を用いて，慣用のおよびリアルタイムＰＣＲ分析の両方により，さらに試験した。Ｏｐｔｉｃｏｎ  ＩＩリアルタイムサーマルサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて試験した組織のうち，ＤＤ１１は胎盤および精巣からのサンプルにおいてのみ検出された。さらに，マーカーが乳腫瘍特異的であるか，またはより特異性の低い腫瘍マーカーであるかを確認するために，Ｐａｔｈｌｏｒｅを通して入手した倫理的に認定されたある範囲のヒト腫瘍サンプルをアッセイした。卵巣，精巣，結腸，胃，肝臓，肺，膀胱および膵臓からの腫瘍のｃＤＮＡ代表物を，β−アクチンおよびＤＤ１１の両方について試験した。これらのうち，ＤＤ１１は，精巣腫瘍に由来するｃＤＮＡにおいてのみ有意なレベルで検出された。直接配列決定により，これらのＰＣＲ増幅からの産物がＤＤ１１であることを確認した。
【００４４】
２２種の正常なヒト組織ｃＤＮＡおよび８種の腫瘍ｃＤＮＡ集団を組み合わせたパネルを用いて，標準的なサーマルサイクラーでの慣用のＰＣＲ増幅を行って，ＤＤ１１が非常に限定された数の組織タイプに特異的であることを確認した。リアルタイムＰＣＲ分析におけるように，精巣ｃＤＮＡ集団はＤＤ１１を発現し，精巣腫瘍も発現した。このマーカーの有意な発現を示した唯一の他の集団は子宮サンプルからのものであった。胎盤サンプルは低いレベルの発現を示したが，これは精巣および子宮サンプルと同程度まではなかった。低いレベルの産物は幾つかの他の組織サンプルにおいても見いだされたが，これらは無視しうると考えられた。このことは，ＤＤ１１は試験したサンプルの全てのうち，生殖ホルモンの影響下にある組織，詳細には，乳および関連する腫瘍，精巣および関連する腫瘍，および子宮に由来する組織においてのみ強く発現されていることを示す。胎盤組織もまた，より低い程度でこのマーカーを発現する。
【００４５】
ＤＤ１１はまた，"標準的な"乳癌マーカーであると最も広く考えられているマーカー，例えば，エストロゲンレセプター（ＥＲα）およびヒト表皮成長因子レセプター（ｃ−ＥｒｂＢ−２）のいくつかと比較して好ましいものであった。これは，すべてのマッチした乳癌組織サンプルの分子シグネチャー分析においても，明らかである。すなわち，ヒト正常組織および腫瘍組織からの３０のｃＤＮＡ集団の社内パネルに対する標的特異的プライマーを用いて，多くの場合に同じ患者からの両方のサンプルにおいて発現が類似している。
【００４６】
参考文献
DeRisi, J. L., lyer, V. R. and Brown, P. O. 1997. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science. 278: 680- 686.
Liang, P. and Pardee, A. B. 1992. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase reaction. Science. 257: 967-971.
Pritzker, K. P. 2002 Cancer biomarkers: easier said than done. Clin. Chem. 2002 Aug; 48 (8): 1147-50. 
Salodof MacNeil. 2001. From genes to proteins: The FLEXgene consortium. HMS Beagle. 112: on-line journal. 
Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R, Aas T, Geisler S, Johnsen H, Hastie T, Eisen MB, van de Rijn M, Jeffrey SS, Thorsen T, Quist H, Matese JC, Brown PO, Botstein D, Eystein Lonning P, Borresen-Dale AL. 2001. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci U S A. Sep 11 ; 98 (19): 10869-74.
Srinivas PR, Verma M, Zhao Y, Srivastava S. 2002. Proteomics for cancer biomarker discovery. Clin Chem. Aug; 48 (8): 1160-9.
Sturtevant, J. Applications of differential-display reverse transcription- PCR to molecular pathogenesis and medical mycology. Clin Microbiol Rev. 2000 Jul ; 13 (3): 408-27. 
Yousef et al., 2002 Yousef GM, Scorilas A, Kyriakopoulou LG, Rendl L, Diamandis M, Ponzone R, Biglia N, Giai M, Roagna R, Sismondi P, Diamandis EP. Human kallikrein gene 5 (KLK5) expression by quantitative PCR : an independent indicator of poor prognosis in breast cancer. Clin Chem. 2002 Aug; 48 (8): 1241-50.
Zong, Q. , Schummer, M. , Hood, L. and Morris, D. R. 1999. Messenger RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 10632-10636. 
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は，種々の組織における，目的とする遺伝子の存在を判定するためのスクリーニングアッセイの結果を示す。Ｔは腫瘍組織のｃＤＮＡを表し，Ｍは同じドナーから共に切除した乳組織のｃＤＮＡを表す。
【図２】図２は，種々の組織サンプルにおける，目的とする遺伝子の発現を判定するために行った発現分析の結果を示す。
【図１】
2007503826.tif 000004
【図２】
2007503826.tif 000005
【配列表】
2007503826000001.xml
【国際調査報告】
2007503826.tif 000008
2007503826.tif 000009