(57)【要約】  プロテオミクス、ゲノミクス、医薬、薬の発見、及び診断などの研究の分野において興味深い、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、細胞、小分子、及び他の化学的又は生物学的分子の結合のための、表面上のアミン官能基を提供するための方法。
2007510928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高密度アミン機能化表面を調製するための方法であって、
（ａ）エポキシシランを用いて表面を処理してエポキシ機能性表面を形成し；そして
（ｂ）一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがエポキシ機能性表面と反応する条件下で、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含む溶液をエポキシ機能性表面に加えることにより、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーをエポキシ機能性表面に結合させ、このことにより高密度アミン機能化表面を形成する、
の各工程を含む方法。
【請求項２】
一つ又はそれ以上の化学的又は生物学的分子を、表面に結合した一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーに共有結合的に結合させる工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
高密度アミン機能化表面を含むバイオセンサー。
【請求項４】
バイオセンサーが光学センサーである、請求項３記載のバイオセンサー。
【請求項５】
バイオセンサーが比色共鳴バイオセンサーである、請求項４記載のバイオセンサー。
【請求項６】
バイオセンサーが音響バイオセンサーである、請求項３記載のバイオセンサー。
【請求項７】
バイオセンサーが電気バイオセンサーである、請求項３記載のバイオセンサー。
【請求項８】
一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーが同一又は異なっている、請求項１記載の方法。
【請求項９】
一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーが同一である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーが一級アミンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーが二級アミンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーが一級及び二級アミンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがポリエチレンイミンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがポリエチレンイミンからなる、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがポリビニルアミンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがポリビニルアミンからなる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
化学的又は生物学的分子が、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子、ビオチン、細胞、分画された細胞、細胞抽出物、細胞画分、及び細胞の部分からなる群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項１８】
化学的又は生物学的分子がタンパク質を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質が酵素である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質が抗体である、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質が、アビジン又はストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
化学的又は生物学的分子がペプチドを含む、請求項２記載の方法。
【請求項２３】
化学的又は生物学的分子がポリヌクレオチドを含む、請求項２記載の方法。
【請求項２４】
化学的又は生物学的分子が、細胞、分画された細胞、細胞抽出物、細胞画分、又は細胞の部分を含む、請求項２記載の方法。
【請求項２５】
化学的又は生物学的分子が小分子を含む、請求項２記載の方法。
【請求項２６】
化学的又は生物学的分子がビオチンを含む、請求項２記載の方法。
【請求項２７】
アミン含有ポリマーが同一又は異なっている、及びアミン含有ポリマーが２つ又はそれ以上のアミン基を含む、機能性エポキシを介して表面に共有結合的に結合した一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含む、高密度アミン機能化ポリマーマトリクス。
【請求項２８】
アミン含有ポリマーが３つ又はそれ以上のアミン基を含む、請求項２７記載の高密度アミン機能化ポリマーマトリクス。
【請求項２９】
アミン含有ポリマーがポリエチレンイミンを含む、請求項２７記載の高密度アミン機能化ポリマーマトリクス。
【請求項３０】
アミン含有ポリマーがポリビニルアミンを含む、請求項２７記載の高密度アミン機能化ポリマーマトリクス。
【請求項３１】
生体分子を表面に固定化する方法であって、生体分子を、請求項１記載の高密度アミン機能化表面と接触させ、このことにより生体分子が固定化される、ことを含む方法。
【請求項３２】
生体分子を表面に固定化する方法であって、生体分子を、請求項５記載の高密度アミン機能化表面と接触させ、このことにより生体分子が固定化される、ことを含む方法。
【請求項３３】
生体分子を表面に固定化する方法であって、生体分子を、請求項１３記載の高密度アミン機能化表面と接触させ、このことにより生体分子が固定化される、ことを含む方法。
【請求項３４】
生体分子を表面に固定化する方法であって、生体分子を、請求項１４記載の高密度アミン機能化表面と接触させ、このことにより生体分子が固定化される、ことを含む方法。
【請求項３５】
高密度アミン機能化表面を含むバイオセンサーであって、高密度アミン機能化表面が、
（ａ）エポキシシランを用いて表面を処理してエポキシ機能性表面を形成し、そして
（ｂ）一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがエポキシ機能性表面と反応する条件下で、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含む溶液をエポキシ機能性表面に加えることにより、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーをエポキシ機能性表面に結合させ、ここのことにより高密度アミン機能化表面を形成することを含む方法により調製される、ことを特徴とするバイオセンサー。
【請求項３６】
バイオセンサーが光学センサーである、請求項３５記載のバイオセンサー。
【請求項３７】
バイオセンサーが比色析共鳴バイオセンサーである、請求項３６記載のバイオセンサー。
【請求項３８】
バイオセンサーが音響バイオセンサーである、請求項３５記載のバイオセンサー。
【請求項３９】
バイオセンサーが電気バイオセンサーである、請求項３５記載のバイオセンサー。
【請求項４０】
表面がプラスチック表面である、請求項１記載の方法。
【請求項４１】
一つ又はそれ以上の化学的又は生物学的分子を、表面に結合した一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーに共有結合的に結合させる工程をさらに含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
表面がプラスチック表面である、請求項３記載のバイオセンサー。
【請求項４３】
表面がプラスチック表面である、請求項３５記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年１１月６日に出願されたアメリカ仮出願番号６０／５１７，８４７に基づく優先権を主張しており、この出願は、図も含めてその全体が参照により本出願に取り込まれる。
【０００２】
本発明は、化学的又は生物学的分子が付着するのに有用な、アミン官能基を持つ表面に関する。本発明はまた、例えば、付着した生体分子を、次の生体分子相互作用検出のために、共有結合的に固定化するような、機能的ポリマーの移植を用いた、高性能な表面化学を生み出す方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトゲノムのシークエンスの完了した状態で、分子生物学の次の大きな挑戦の一つは、ＤＮＡによってコードされている、多くのタンパク質標的がいかにして他のタンパク質、小分子薬剤候補、そして多数の酵素と阻害剤を相互作用しているかを理解することであろう。例えば、Ｐａｎｄｅｙ＆Ｍａｎｎ，“Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，４０５，ｐ．８３７−８４６，２０００；Ｌｅｉｇｈ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，ｐ．４０８−４１２，２０００；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，“Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｔｈｅ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，ｐ．４１３−４１８，２０００；ＭａｃＢｅａｔｈ  ＆  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，“Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９，ｐ．１７６０−１７６３，２０００；Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８，ｐ．９８９−９９４，２０００などを参照。この目的を達成するために、多くの異なる生体分子の相互作用を高感度で同時に同定及び／又は定量する能力を持つツールが、医薬の発見、プロテオミクス、そして診断法において応用されるであろう。さらに、広範に使用されるこれらのツールは、使うのに単純で、所有し操作するのに廉価で、そして例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、小さいタンパク質、抗体、そして細胞全体でさえも含む、広範囲な検体に応用可能でなければならない。
【０００４】
担体表面への標的分子の固定化は、生物学的な検定の開発において重要な観点である。一般的に、生物学的検定は、マイクロウェルプレート、顕微鏡のスライド、チューブ、シリコンの基板、または膜の表面で行われる。標的分子は、表面上の官能基と分子の官能基との間の結合反応を用いて、共有結合的に表面に固定化される。ガラス表面上への一般的な表面機能化技術の一つは、機能的シランを用いたシラン化である。Ｇｅｌｅｓｔ  Ｉｎｃ．、チュリータウン、ペンシルバニア州によって出版された、Ｓｉｌａｎｅ，Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ，ａｎｄ  Ｍｅｔａｌ−Ｏｒｇａｎｉｃｓ，ｐ．８８（２０００）を参照。Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（コーニング、ニューヨーク州）によって生産されるＧＡＰＳ  ＩＩでコートされたスライド、ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ（サニーヴェイル、カリフォルニア州）によって供給されるＡｒｒｙｉｔTM  ＳｕｐｅｒＡｍｉｎｅスライド、Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（セントルイス、ミズーリ州）によって供給されるＳＩＬＡＮＥ−ＰＲＥTMアミン機能化スライド、そしてその他のものが、顕微鏡スライド方式における生物学的検定表面として利用可能な例である。ＳｕｐｅｒＡｍｉｎｅスライドは、平方ミリメートルあたり５ｘ１０12のアミン官能基を供給すると主張している。もう一つの例では、ナイロン担体上でアミジンに誘導体化されたアミド基が、特異的なポリヌクレオチド配列を検出するためのハイブリダイゼーション検定のＤＮＡとＲＮＡプローブを固定化するために使われる。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ４，８０６，５４６を参照。Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ロチェスター、ニューヨーク州）によって供給されるＮｕｃｌｅｏＬｉｎｋTMとＣｏｖａＬｉｎｋTMを含む、マイクロウェルプレートやチューブの方式の生産品は、ポリマー様担体表面においてのみ利用可能である。ＣｏｖａＬｉｎｋTM生産品は、表面領域の平方ミリメートルあたり、およそ１０12で二級アミン官能基表面を与える。二級アミンは、多くの共役反応において、一級アミンより低い反応性を示す。Ｌｏｕｄｏｎ，Ｇ．Ｍａｒｃ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｄ  ｅｄ．，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，レッドウッドシティ、カリフォルニア州（１９９５）を参照。
【０００５】
例えば、シリコン、ガラス、又は金といった材料の表面を化学的に機能化するための、数多くの既知の方法が存在する。表面の機能化は、しばしば表面の拡張された応用をもたらすため、大いに興味深く、非化学的に機能化された表面を持つ表面と比べて、結合が向上し、表面に対する様々な分子の分析が可能になる。表面をコートする化学的機能化のタイプ、量、そして質は、共有結合の強さと、特異的な検体に結合する表面の能力を決定づける。コーティング自体が、容易に洗浄されないこと、又は複数回の使用後に分解しないことが、高く望まれる。表面にコートされたアミン官能基は、生体分子を検出するための多目的なプラットフォームを供給することが示される。これらの官能基は、例えば静電的相互作用又は化学的結合といった物理的誘引力を通して、生体分子を捕らえる。そのような化学的結合は、直接又は非直接的（すなわち化学的リンカーを通して）に達成できる。多くの同種二機能性又は異種二機能性リンカーが、この分野においては知られている。アミンで表面をコーティングするための単純な方法は、洗浄した表面をポリリジンに直接さらすことである。一つの例は、マイクロアレイプリントに使うガラススライド表面である。しかしながら、このタイプの表面は、複数回の使用の後には不安定になることが示されている。アミンで表面をコーティングする別の方法は、共によく知られる、ガラス上にシラン又は金上にチオールを結合させた、アミン−コーティング分子を表面に共有結合的に結合させることである。
【０００６】
様々なアミノアルキルシラン試薬が、アミノ基を持つシリコン又はガラスを基板にした表面をコートするのに使われる。そのような表面をコートするのに使われるプロセスは、様々なシラン試薬、溶媒、そして異なった物理的処理方法の使用を含む。さらに、表面上の化学官能基の存在をテストするために、放射線、比色分析、蛍光、ＸＰＳ、ＦＴＩＲ、ＡＦＭ、そしてその他のものを含む多くの方法が使われる。感度は、表面テストの適切な方法を選ぶ場合には、重要な問題である。一般的に言って、バイオセンサーの表面を化学的にコートするための標準的な工業的方法も、そのようなバイオセンサー上で特異的な化学部位の存在又は量を検出するための標準的なテスト方法も、存在しない。
【０００７】
過去において、化学的にコートされた不活性なプラスチックを基板にした表面を準備する際に、かなりの困難に突き当たった。あるプラスチック表面を化学的にコートする試みは、しばしば望まない分解をもたらす、すなわちプラスチックが溶解し、食刻され、又は構造的に崩壊される。さらに、多くの場合、不活性なプラスチックを基板とした表面のコーティングは実用的ではなく、化学的なコーティングの層は表面に正確に接着せず、特に親水性ポリマーのコーティングの場合には、複数回の使用の後簡単に洗い流されてしまう。アミン−機能化表面に関しては、表面を準備するプロセスが、試薬の不適合、望まない長い反応時間、又はプラスチックを基板とする表面を変化又は分解するような、必要な硬化温度の上昇などの、様々な望ましくない組成上の、及び／又はプロセス上の限界を有する。
【０００８】
さらに、定性的に及び／又は定量的に、表面上の官能基を特徴づけるのは難しい。アミン基の存在を確認するために、現行の比色分析そして蛍光による方法は、通常溶液中のサンプルを用いており、この方法では、検出は乾燥表面上のサンプルよりはるかに高感度である。乾燥した全体的に平らでない表面上で、１０オングストロームより薄い化学官能基の表面の特徴づけを行うことも、難しい作業であることが証明されている。
【０００９】
例えば、オリゴヌクレオチド、抗体−抗原相互作用、ホルモン−受容体相互作用、そして酵素−基板相互作用を含む、様々な生体分子の複合体を検出するためにバイオセンサーが、開発されている。一般的に、バイオセンサーは２つの構成要素から成る：高い特異性を持つ認識要素と、分子認識事象を定量可能なシグナルへと変換する変換器である。シグナル変換は、蛍光、干渉分光法（Ｊｅｎｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｎ  ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  ｃｏａｔｅｄ  ｓｉｌｉｃｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，ｐ．６２−６５；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｐｏｒｏｕｓ  ｓｉｌｉｃｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，ｐ．８４０−８４３，（１９９７））、そして重量測定（Ａ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９８））を含む、多くの方法によって達成されている。
【００１０】
光学活性に基づいた伝達方法の中で、蛍光化合物による検体のラベリングを必要としない直接的な方法は、相対的な検定の簡便さと、容易にラベル化できない小分子とタンパク質の相互作用を研究するための能力のために、興味深い。直接的な光学的方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｊｏｒｄａｎ＆Ｃｏｒｎ，“Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｎｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｏｌｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ，”Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９：１４４９−１４５６（１９９７））、グレーティングカプラ（Ｍｏｒｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ，”Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，７０，ｐ．２３２−２４２，（２０００））、偏光解析法（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３２，ｐ．６９−７２，（１９９５））、エバネッセント光装置（Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｉｎｇ（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ），”Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，６，ｐ．１２２−１２６，（１９９２））、そして反射計（Ｂｒｅｃｈｔ＆Ｇａｕｇｌｉｔｚ，“Ｏｐｔｉｃａｌ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ，”Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１０，ｐ．９２３−９３６，（１９９５））を含む。これらの検出方法の理論上予想される検出限界は、診断上関連性のある濃度範囲に至るまで実現可能であることが実験的に確認され、決定されている。しかしながら、これまでのところ、これらの方法はまだ、ハイスループットの生体分子相互作用解析に最も頻繁に使われる、マイクロタイタープレートに基づいた、又はマイクロアレイに基づいた基盤技術と容易に適合したフォーマットで、いずれのタイプのラベルも必要とせずに高感度検定を行うことが可能な、市販のハイスループット実験器具はない。
【００１１】
生物学的検定に関連するような、化学的及び生物学的分子は、検定培地中で立体構造を持つ。固体表面に固定化された場合には、分子の立体配座は妨げられるかもしれない。高密度の化学的又は生物学的分子が、二次元担体表面に固定化された場合、立体構造の密集が起こる。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐ．２１：５（１９９９）参照。立体構造の密集又はアクセシビリティの問題は、化学的又は生物学的分子の相互作用に大きく影響する。これは、多くの大きなサイズの分子にとっては特に真実である。例えば、Ｇｒａｙとその共同研究者は、オリゴヌクレオチド塩基が、アンモニアがオリゴヌクレオチドの脱保護に使われる場合、立体障害を解消するように支持表面から十分に溶け出すようであり、その結果、向上したハイブリダイゼーションシグナルが観測されることを報告している。Ｇｒａｙ，ＤＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１３：２８３３（１９９７）；Ｍａｔｓｏｎ，ＲＳ，Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３（１）：１１０（１９９５）参照。Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖらは、固定化したオリゴヌクレオチドと固体支持体表面の間にスペーサーを加えることが、ハイブリダイゼーションシグナルをかなり向上させたことを示した。Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５（６）：１１５５−６１（１９９７）参照。
【００１２】
支持体表面の官能基の密度を増加させるために、そして立体障害を減少させるために、化学的に機能性なポリマーが、支持体表面の先端に三次元マトリクスを与えるように使われた。例えば、パーキンエルマーライフサイエンス（ボストン、マサチューセッツ州）によって供給される、三次元タンパク質マイクロアレイ基板ＨｙｄｒｏＧｅｌTMでコートされたスライドは、タンパク質相互作用のための、高度に膨潤可能なポリマーマトリクスを提供する。このポリマーマトリクスは、乾燥させた時には２μｍの厚さを持ち、完全に水和させた時には最大９０μｍまでの厚さを持つ。Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（投稿準備中）参照。アマシャムバイオサイエンス（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）から供給される、３Ｄ−ＬｉｎｋTMもまた、３次元ポリマーマイクロアレイ基板を供給するための試みである。しかしながら、架橋されたポリマーマトリクスの網目状構造は、大きなサイズの生体分子のアクセシビリティを限定する。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ６，４１３，７２２（参照によって本願明細書に援用される）。逆相表面ポリマー化を用いて、水性溶液中で、最も不活性なポリマー表面上でさえも、フリーラジカル転移により非架橋“ブラシ”ポリマー構造を成長させることができる。Ｗａｎｇ，  Ｇ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，６ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｈａｗａｉｉ（２０００）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ６，３５８，５５７（参照によって本願明細書に援用される）。様々な機能性と化学的官能基密度が、機能的なフリーラジカルポリマー化可能なモノマー又は混合物の添加によって、容易に得られる。しかしながら、それは、有機物のポリマー表面又は無機物の表面上にポリマープライマーを必要とする。“ブラシ”ポリマー表面はまた、イニシエイターを含むシランでシラン処理されたガラス上の表面でのラジカル生成によって開始される、フリーラジカルポリマー化を用いて構築される。Ｅ．Ｐ．Ｏ．Ｐａｔｅｎｔ  １，１７６，４２３参照。シランの合成が、このプロセスにとって決定的である。アミンを含むポリマーは、多段階の反応を通して、塩化シアヌル試薬のカップリングを用いて、アミノ−シラン化ガラス表面上に共有結合的に結合される。しかしながら、塩化シアヌル活性化は、無水の溶液中で行われなければならず（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ６，４１３，７２２参照）、プロセス上限定される。それゆえ、この問題に対処するための技術が必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一つの態様においては、本発明は、高密度アミン機能化表面を調製するための方法を提供する。この方法は、
（ａ）エポキシシランで表面を処理してエポキシ機能性表面を形成し、そして
（ｂ）一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがエポキシ機能性表面と反応するような条件下で、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーの溶液をエポキシ機能性表面に加えることにより、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーをエポキシ機能性表面に結合させ、このことにより、高密度アミン機能化表面を形成することを含む。さらに表面はプラスチックでありうる。
【００１４】
本発明の別の態様において、この方法は、一つ又はそれ以上の化学的又は生物学的分子を、表面に結合した一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーに共有結合的に結合させる工程を含む。化学的又は生物的分子は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子、ビオチン、細胞、分画された細胞、細胞抽出物、細胞分画物、そして細胞の部分を含むことができる。さらに、タンパク質は、酵素、抗体、アビジン、ストレプトアビジン、又はペプチドでありうる。さらに、化学的又は生物学的分子は、小分子でありうる。小分子は、ビオチンでありうる。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、高密度アミン機能化表面を含むバイオセンサーを含む。バイオセンサーは、比色共鳴バイオセンサーのような、光学活性的センサーでありうる。あるいは、バイオセンサーは、音響バイオセンサー又は電気バイオセンサーでありうる。さらに表面はプラスチックでありうる。
【００１６】
高密度アミン機能化表面は、同じ又は異なっている一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含みうる。一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーは、一級アミン、二級アミン、又はその両方を含むことができる。アミン含有ポリマーは、ポリエチレンイミン又はポリビニルアミンであることができる。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、高密度のアミン機能化ポリマーマトリクスを含み、これは機能的なエポキシ基を介して表面に共有結合的に結合した一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含み、ここで、アミン含有ポリマーは同一又は異なっており、アミン含有ポリマーは二つ又はそれ以上のアミン基を含む。あるいは、アミン含有ポリマーは、三つ又はそれ以上のアミン基を含む。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、表面に生体分子を固定化する方法を含み、この方法は、生体分子を以下の工程により作成される高密度アミン機能化表面と接触させることを含む：（ａ）エポキシシランで表面を処理してエポキシ機能性表面を形成させ、そして、（ｂ）一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがエポキシ機能性表面と反応するような条件下で、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含む溶液をエポキシ機能性表面に加えることにより、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーをエポキシ機能性表面に結合させ、このことにより生体分子を固定化する。
【００１９】
本発明の別の態様は、高密度アミン機能化表面を含むバイオセンサーを含み、ここで、高密度アミン機能化表面は、以下の方法によって調製される：
（ａ）エポキシシランで表面を処理してエポキシ機能性表面を形成し、そして
（ｂ）一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがエポキシ機能性表面と反応するような条件下で、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含む溶液をエポキシ機能性表面に加えることにより、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーをエポキシ機能性表面に結合させ、このことにより高密度アミン機能化表面を形成する。さらに、バイオセンサーは光学センサー、比色共鳴バイオセンサー、音響バイオセンサー、電気バイオセンサーでありうる。さらに、表面はプラスチックでありうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
図面の簡単な説明
図１は、比色共鳴反射バイオセンサーに用いられる光学回折格子構造の様々な態様の模式図である。ｎsubstrateは、基板材料を表す。ｎ1はカバー層の屈折率を表す。ｎ2は一次元又は二次元回折格子の屈折率を表す。ｎbioは一つ又はそれ以上の特異的結合物質の屈折率を表す。ｔ1はカバー層の厚さを表す。ｔ2は回折格子の厚さを表す。ｔbioは一つ又はそれ以上の特異的結合物質の層の厚さを表す。
図２は、アミン含有ポリマーがエポキシ表面に結合するグラフト反応を表す。
図３は、異なる表面上における、ｐｍｏｌ／ｍｍ2で表されるアミン基のアミン密度を示す。
図４は、水性媒体中のエポキシ表面と５つの濃度のポリエチレンイミンのグラフト反応後、遠心分離乾燥又は凍結乾燥されたサンプルの、オングストロームで表された、ポリエチレンイミン（“ＰＥＩ”）の厚さを表す。
図５は、三つの定義されたグループについて、表面に結合した分子の量の検出応答、すなわち脈波伝播速度（ＰＷＶ）シフトを表す。
図６は、ストレプトアビジン結合の応答を表す。
図７は、処理した表面上のＳＡ（ストレプトアビジン）の動態曲線と固定化の終点を表す。
図８は、表面上に固定化されたＳＡに対するビオチンの応答を表す。
【００２１】
アミンでコートされた表面は、例えば、プロテオミクス、ゲノミクス、医薬、創薬、そして診断研究などの分野において興味ある、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子、ビオチン、細胞、分画された細胞、細胞抽出物、細胞分画物、細胞の一部、そして、他の化学的又は生物学的分子などの、化学的又は生物学的分子の結合に有用である。例えば、バイオセンサーは、興味深い化学的又は生物学的分子を結合するための、アミンでコートされたものでありうる。本発明は、高密度アミン機能化表面と、表面上に高密度のアミン官能基を提供するプロセスに関する。本発明は、可塑性なバイオセンサー構造に使われるような、プラスチック表面を変化させない又は分解させない化学的試薬を用いて、高密度の機能的なアミン結合部位を提供することができる。
【００２２】
本発明の方法は、特に、アミン基とエポキシ基との間のグラフト反応を用いて、エポキシ表面上にアミン含有ポリマーを共有結合的に結合させる方法を提供する。本発明のポリマーは、一つ以上のアミノ基を含む。ポリマーは、一級アミン、二級アミン、又は一級と二級アミンの両方を含みうる。
【００２３】
本願明細書で使われている、アミンとは、直接又は連結分子を通して表面に結合する、−ＮＨ2の化学式を有する一級アミンならびに二級アミンの両方を表す。アミンでコートされた表面又はアミン機能化表面とは、化学的又は生物学的分子の直接又は間接的な結合などの、化学修飾が可能なアミン基を与える表面を表す。間接的な結合とは、当該技術分野において知られている、化学的リンカーを通した化学的又は生物学的分子の結合を表す。
【００２４】
プラスチックを基礎とするバイオセンサー又はプラスチックバイオセンサーとは、プラスチックの格子又はセンサー表面、格子のためのプラスチック支持体（基板とも呼ばれる）、及び／又は他のプラスチック構成要素を含むバイオセンサーを表す。そのようなバイオセンサーは、バイオセンサーの表面の機能化に使われる反応条件の結果として分解を受けやすい。光学的特性を有するプラスチックが好ましい。プラスチックは、粒子状のものがなく、きれいで透き通っていて、なめらかで平らな仕上がりを与える能力がある。一つの例として、バイオセンサーは、アクリルポリマー格子層を支持するポリエステル基板を含みうる。他のプラスチックの非限定的な例は、ポリエステルとポリウレタンを含む。しかしながら、バイオセンサーに使われるための光学的特性を与える、いずれのプラスチックも使用することができる。別の例では、格子表面が、基板と格子の両方として機能するプラスチックである。
【００２５】
アミン機能化表面とは、化学的又は生物学的分子が結合されたコーティングを有する表面を表す。例えば、アミン機能化表面は、限定されないが、高屈折率材料のコーティングを有する、プラスチックを基礎とするバイオセンサーのセンサー表面を表すことができる。そのような高屈折率材料は、例えば、シリコン窒化物、硫化亜鉛、二酸化チタン、又は酸化タンタルを含む。任意に、酸化シリコン層が、表面機能化の前に、高屈折率材料上にコートされうる。高屈折率材料または酸化シリコンのいずれかが、化学的又は生物学的分子の結合のために、アミン官能基で機能化されうる。高屈折率材料でコートされた格子表面をアミン機能化するのに使われる試薬は、アクリルポリマーであろうと他のプラスチックであろうと、格子材料と基板材料に適合するものでなければならない。格子は、高屈折率材料でコートされ、これは表面をアミン機能化するのに使われる試薬から格子材料をある程度保護するが、格子の反対側は、機能化プロセスの間じゅうずっと露出されている。同じように、格子が基板に結合している時は、基板の反対側は活性化試薬にさらされている。また、格子表面の高屈折率材料のコーティングの不完全さは、格子表面の上側の領域の露出をもたらすかもしれない。従って、様々な層の材料および層間の接着は、機能化およびその後のいずれの検定手順の間じゅう、無傷のままであるべきである。
【００２６】
バイオセンサーのアミン機能化表面とは、プラスチックを基礎としたバイオセンサーならびにプラスチックに基づかないバイオセンサーを表す。例えば、バイオセンサーは、酸化チタンでコートされたセンサー、又は高い屈折率を有するさらなるセンサー、上層や基本材料構造のためのコート又は低い吸着率のカバーなどを含む。加えて、その様々な物理的形状の全てにおける二酸化シリコン、又は低い吸着率、低い屈折率を有する材料が、検討される。これらのバイオセンサーは、例示を意味し、アミン機能化表面を有するバイオセンサーに限られない。
【００２７】
サブ波長格子表面（ＳＷＳ）バイオセンサー
本発明の一つの態様では、サブ波長格子表面（ＳＷＳ）を用いて、特異的に結合する物質又は結合パートナー又はその両方といった、化学的又は生物学的材料の相互作用を高感度で探知するために使うことができる、特定の波長での鋭い光の共鳴反射を作り出す。比色共鳴回折格子表面は、特異的な結合物質のための表面結合プラットフォームとして働く。偏光解析法、表面プラズモン共鳴、そして反射率スペクトルのように、この方法は、化学的に結合する材料が特異的な場所内に存在する場合にこれを決定するために、表面上の屈折率の変化を用いる。
【００２８】
サブ波長格子表面は、薄膜コーティングの効果を模倣することができる、回折光学の従来にはないタイプである。（Ｐｅｎｇ＆Ｍｏｒｒｉｓ，“Ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｒａｔｉｎｇｓ，”Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ａ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．５，ｐ．９９３，Ｍａｙ；Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，＆Ｗａｎｇ，“Ｎｅｗ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｉｌｔｅｒｓ，”Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，６１，Ｎｏ．９，ｐ．１０２２，Ａｕｇｕｓｔ，１９９２；Ｐｅｎｇ＆Ｍｏｒｒｉｓ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｏｎａｎｔ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｒａｔｉｎｇｓ，”Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．８，ｐ．５４９，Ａｐｒｉｌ，１９９６）。ＳＷＳ構造は、表面レリーフの、一次元又は二次元の格子を含み、ここでは、格子周期が入射光の波長と比較して小さいので、反射し伝達したゼロ次以外のどの回折次数も伝搬ができない。アメリカ特許出願番号１０／０５９，０６０と１０／０５８，６２６を参照（その全体が本出願の参照として取り込まれる）。ＳＷＳ表面ナローバンドフィルターは、格子溝を満たす、基板層とカバー層との間に挟まれた、一次元または二次元の格子を含むことができる。任意に、カバー層は使われない。格子領域の有効屈折率が、基板又はカバー層より大きい時には、導波モード共鳴効果が起こる。フィルターが適切にデザインされている時には、一次元又は二次元格子構造が選択的に、波長の狭周波数帯で光を合わせる。光が散乱を受け、そして前方と後方に伝搬するゼロ次光を合わせる。導波モード共鳴効果は、いずれかのフォトンが構造内に入る点からおよそ３ミクロンの高度に局在化した領域に起こる。横方向の導波モードの伝搬は支持されていないので、導波路は作られない。
【００２９】
この構造の反射した又は伝達した色は、特異的結合物質又は結合パートナー又はその両方などの分子をカバー層の上方の表面又は一次元又は二次元格子表面に加えることにより変調されうる。添加した分子は、構造を通して入射放射の光路長を増加させ、そして従って、最大の反射率又は透過率が起こるであろう波長を加減する。
【００３０】
一つの態様では、バイオセンサーは、白色光を当てた場合、唯一の波長を反射するように設計される。化学的又は生物学的分子といった、特異的結合物質がバイオセンサーの表面に結合した時には、反射した波長（色）は、格子と連動した光の光路の変化のためにシフトする。特異的結合物質をバイオセンサー表面に結合させることによって、相補的な結合パートナー分子が、いずれの種類の蛍光プローブ又は微粒子ラベルの使用もなく、検出されうる。検出技術は、例えば、タンパク質結合の〜０．１ｎｍの厚さの分解の変化まで可能であり、そして、バイオセンサー表面が流体中に浸されていても乾燥していても実行しうる。
【００３１】
例えば、検出システムは、例えば繊維光プローブを通して垂直の入射でバイオセンサーの小さな点を照らす光源及び、例えば第二の繊維光プローブを通して垂直の入射で反射光を集める分光計から構成される。励起／検出システムとバイオセンサー表面との間には物理的接触は起こらないので、特別な結合プリズムは必要とされず、バイオセンサーは、例えばマイクロタイタープレート及びマイクロアレイスライドを含む、いずれの一般的に使われる検定プラットフォームにも容易に適用されうる。単一の分光計読み取りは、数ミリ秒で行われうる、従って、バイオセンサー表面上で並行して起こる多数の分子相互作用をすばやく測定でき、リアルタイムで反応の動態をモニターすることができる。
【００３２】
この技術は、特に分子ラベルが、研究下の分子の機能性を変化させる又は阻害する場合において、多数の生体分子相互作用を並行して測定する点で応用上有用である。タンパク質を標的とした医薬的化合物ライブラリーのハイスループットなスクリーニング、及びプロテオミクスのためのタンパク質−タンパク質相互作用のマイクロアレイスクリーニングは、本発明の組成及び方法によって与えられる、感度及びスループットを必要とする、応用の例である。
【００３３】
ＳＷＳ構造の例の概念図は図１に示される。図１において、ｎsubstrateは基板材料を表し、ｎ1は任意的なカバー層の屈折率を表す。ｎ2は二次元格子の屈折率を表す。Ｎbioは一つ又はそれ以上の特異的結合物質の屈折率を表す。ｔ1は二次元格子構造の上のカバー層の厚さを表す。ｔ2は格子の厚さを表す。ｔbioは一つ又はそれ以上の特異的結合物質の層の厚さを表す。一つの態様において、ｎ2＞ｎ1である（図１参照）。層の厚さ（すなわち、カバー層、一つ又はそれ以上の特異的結合物質、又は格子）は、上面の付加的分子に対する共鳴波長の感度を達成されるように選択される。格子周期は、望みの波長で共鳴が達成されるように選択される。その構造は、ガラス及びシリコン窒化物誘電性材料から組み立てられうる。あるいは、構造は、適切な誘電性カバー層とともに、エンボス加工したプラスチックから形成されることができる。
【００３４】
本発明の一つの態様は、ＳＷＳバイオセンサーを提供する。ＳＷＳバイオセンサーは、一次元又は二次元格子、格子を支持する基板層、及び基板層と反対の格子の表面に固定化された一つ又はそれ以上の特異的結合物質を含む。
【００３５】
一次元又は二次元格子は、例えば、硫酸亜鉛、二酸化チタン、酸化タンタル、及びシリコン窒化物を含む材料を含むことができる。格子の切断面のプロファイルは、期間的に繰り返している機能、例えば“正方形の波”を含むことができる。格子は、連続的は平行線、正方形、円形、楕円形、三角形、台形、正弦波、卵形、長方形、及び六角形からなる群から選択される、繰り返しのパターンの形から構成されうる。正弦波の切断面プロファイルは、格子の形をプラスチックのような柔らかい材料にエンボス加工すること、又は繰り返しの格子の表面をエポキシのような材料にレプリカすることを必要とする製造的な応用のためには好ましい。本発明の一つの態様では、格子の深さは約０．０１ミクロンから約１ミクロンであり、格子の周期は約０．０１ミクロンから約１ミクロンである。
【００３６】
ＳＷＳバイオセンサーはまた、一次元の線状の格子表面構造、すなわち一連の平行線又は溝を含むことができる。一次元の線状格子は、導波モード共鳴フィルター効果を産み出すために十分である。二次元格子が、両方のサブ波長であるセンサー表面の平面を横切る二つの横方向の特徴を持つのに対し、一次元格子の切断面は、長さが共鳴格子効果の波長より大きい時には、一つの横方向へのサブ波長のみである。一次元の格子バイオセンサーは、一次元格子の表面構造を、より低い屈折率の材料を覆った薄いフィルムとしてコートされた高い屈折率の材料を含むことができる。あるいは、一次元格子バイオセンサーは、低い屈折率の材料基板を含み、その上に高い屈折率の薄いフィルム材料が一次元格子の表面構造の模様でつけられている。低い屈折率の材料は、ガラス、プラスチック、ポリマー又は加硫したエポキシでありうる。高い屈折率の材料は、低い屈折率の材料より大きい屈折率を有さなければならない。高い屈折率の材料は、例えば、硫酸亜鉛、シリコン窒化物、酸化タンタル、二酸化チタン又は酸化インジウム錫などでありうる。
【００３７】
一つの態様において、ＳＷＳ構造は、例えば、標準的な顕微鏡スライドと同じサイズの格子表面を構築することによって、及び格子構造上の場所のｘ−ｙのマス目上に高い親和性の化学的受容体試薬の微小水滴を置くことによって、マイクロアレイプラットフォームとして使われる。あるいは、ＳＷＳ構造は、標準的なマイクロタイタープレートと同じサイズとして構築されて、プレート全体の底面へと組み込まれる。例えば、マイクロアレイ／マイクロタイタープレートの化学的に機能化された表面が、検体などの分子にさらされる場合、分子は高い親和性を持つ場所へと優先的に引き寄せられるだろう。結果として、ある表面の場所には付加材料が集まり、その他の表面の場所には集まらない。付加材料を引き寄せる表面の場所は、それぞれ個別のマイクロアレイ／マイクロタイター表面の場所といった個別の表面の場所内で、共鳴波長におけるシフトを測定することによって決定されうる。従って、例えば、サンプル中の結合した分子、検体などの量、及び受容体試薬と分子の間の化学的親和性は、共鳴波長のシフトの範囲を測定することによって決定されうる。
【００３８】
本発明の一つの態様において、第一の分子と第二のテスト分子との相互作用が検出されうる。上記のＳＷＳバイオセンサーが使われ；しかしながら、その表面に固定化された特異的結合物質は存在しない。それゆえ、バイオセンサーは、一次元又は二次元格子、一次元又は二次元格子を支持する基板層、及び任意にカバー層を含む。上記の通り、バイオセンサーが照射された時、反射した放射線スペクトル上で共鳴格子効果が産み出され、そして格子の深さと周期は、共鳴格子効果の波長より小さい。
【００３９】
第一の分子と第二のテスト分子の相互作用を検出するために、第一及び第二の分子の混合物がバイオセンサー上の別々の場所にアプライされる。別々の場所とは、バイオセンサー上のある点又はウェル、又はバイオセンサー上の大きな領域でありうる。第一の分子と第三のコントロール分子の混合物もまた、バイオセンサー上の別々の場所にアプライされる。そのバイオセンサーは、上記のバイオセンサーと同じ、又は第二のバイオセンサーでありうる。もしバイオセンサーが同じバイオセンサーであるならば、第二の別々の場所が、第一の分子と第三のコントロール分子の混合物のために使われうる。あるいは、別々のバイオセンサーの同じ場所が、第一及び第二の分子がバイオセンサーから洗浄された後で使われうる。第三のコントロール分子は、第一の分子と相互作用せず、そして第一の分子とおよそ同じサイズである。バイオセンサー又は複数のバイオセンサーの別々の場所からの光の反射波長におけるシフトが測定される。もし第一の分子と第二のテスト分子を有する別々の場所からの光の反射波長におけるシフトが、第一の分子と第三のコントロール分子を有する別々の場所からの反射波長におけるシフトより大きければ、その場合第一の分子と第二のテスト分子は相互作用している。相互作用は、例えば、核酸分子のハイブリダイゼーション、抗体又は抗体断片と抗原の特異的結合、及びポリペプチドの結合でありうる。第一の分子、第二のテスト分子、又は第三のコントロール分子は、例えば、核酸、ポリペプチド、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、小さな有機分子、細胞、ウィルス、及び細菌でありうる。
【００４０】
アミン機能化バイオセンサー
シリコン窒化物のような高い屈折率の材料の層が、プラスチック構造のような構造にコートされた後、デバイスは、高い屈折率の材料の表面上でアミン官能基の結合によって、センサーとしての使用のために準備される。プラスチックに基づいたバイオセンサーは、その表面にアミン官能基を与える化学修飾の間に、分解されうる（すなわち、センサー上の構造又は組成が変化する）。そのような分解を避けるため、本発明は、バイオセンサーのプラスチックにも対応できる試薬を用いて、バイオセンサーのアミン表面機能化のためのプロセスを提供する。高い屈折率の材料が、プラスチックバイオセンサーの格子表面上に溶着された後、そのセンサーは保管してもよく、又は機能化のために直接使用してもよい。センサーは、アミン機能化の手順の前に、ウェット（例えば溶媒などの液体を用いた洗浄）又はドライ（例えば、ＵＶ、オゾン、プラズマ）法を用いる洗浄工程に供される。一つの態様では、アミン機能化の手順は、（ａ）プラスチック比色共鳴バイオセンサーを、アルコール性シラン溶液にさらす、それから（ｂ）さらされたプラスチック比色共鳴バイオセンサーをアルコールで洗う、という工程を含む。バイオセンサーが乾燥したら、格子表面はアミン官能基、すなわち、−ＮＨ2基を含む。
【００４１】
本発明の一つの観点においては、シラン溶液は、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、及びエタノール又は他の適切な低分子量アルコールのようなアルコールを含む。同様に、適切な低分子量アルコールを用いて、バイオセンサーを洗浄してもよい。アミンでプラスチックのバイオセンサーをコートする一つの例は、まずセンサーを３−アミノプロピルトリエトキシシランとエタノールを含む溶液にさらし、それからエタノール中でセンサーを簡単に洗い、そして最後にセンサーを乾燥する。エタノール中の３−アミノプロピルトリエトキシシランの濃度は、３−アミノプロピルトリエトキシシランの濃度がエタノール中約１から約１５％であるように調節されることができる。さらに、エタノールは約９０％から１００％（体積／体積、水で調節された）であってもよい。乾燥工程は、オーブン中で、例えば約７０℃で１０分間行われることができる。乾燥は、バイオセンサーの分解が起こらないように選択された温度で、より高い温度で行われることができる。
【００４２】
本発明に基づいて、多数の適切な温度、濃度、反応時間、及び硬化／インキュベーション時間を用いることができる。本発明の検討されるバリエーションは、表面のタイプ、シラン試薬（３−アミノプロピルトリメトキシシランなどの他のシラン）、シランの濃度、コーティングの溶媒又は溶媒の組み合わせ（例えば、エタノールと水）、コーティングの反応時間、洗浄溶媒又は溶媒の組み合わせ（例えば、エタノールと水）、硬化時間、及び硬化温度などを含む。
【００４３】
表面の処理
本発明の一つの態様において、バイオセンサー表面は化学的な処理によって修飾されうる。例えば、表面は、溶液中に表面を浸すことによって、溶液で処理されうる。あるいは、化学的蒸気又は噴霧凝華を含む気相の処理が、表面のコーティングのために使われうる。気相処理は、幾何学的に平らでない表面の等角的なコーティングを確実にするために使われうる。そのようなコーティングは、表面をシラン化する工程において、又は表面に他の有機材料を添加するために、使われうる。表面を処理する他の方法は、当業者によって認識されているだろう。
【００４４】
プラズマによる処理は、気相のコーティングプロセスの前に、一般的に使われうる。プラズマ処理は、表面上のほとんどの汚染を除去し、次に続く気相のコーティングプロセスの吸着を改善するために表面を活性化しうる。
【００４５】
気相のコーティングプロセスは、化学的機能性を付加し、そして吸着する湿気、有機汚染物、及びポリマーフィルム表面上の低分子量材料などを最小化するために使われうる。気相のコーティングは、表面の均一的な処理、ポリマーフィルムが処理される場合の裏側の処理が不要、多穴性の材料を処理する場合に穴が不要であることを含む、ただしそれらに限定されない長所を有する。そのようなコーティングは、シグマ・テクノロジーズ（トゥーソン、アリゾナ州）、４ｔｈステート（ベルモント、カリフォルニア州）、イールド・エンジニアリング（サン・ホセ、カリフォルニア州）、エリー・サイエンティフィック（ポーツマス、ニューハンプシャー州）、及びＡＳＴプロダクツ（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ビルリカ、マサチューセッツ州）によって提供されているサービスを含む、ただしそれらに限定されない、本発明における有用性を与える。
【００４６】
音響バイオセンサー
本発明の別の態様において、音響バイオセンサーが使われる。音響バイオセンサーは、検体などの分子と、分子及び／又は検体の結合の結果としての溶着物の変化によってもたらされるバイオセンサー表面の共鳴振動周波数の変化を検出することによって、表面に共有結合的に結合した化学的又は生物学的分子との、結合を測定する。共鳴振動周波数は、例えば、ピエゾ抵抗的なデバイス、微小機械化肘木、膜、又は音叉といった機械的な振動器、又は表面音波発振器などを用いることによって測定されうる。
【００４７】
電気バイオセンサー
本発明の別の態様において、電気バイオセンサーが使われる。電気バイオセンサーは、検体などの分子と、分子及び／又は検体の結合の結果としての溶着物の変化によってもたらされるバイオセンサー表面の、抵抗的に、例えば、直流電流又は交流電流、低又は高周波数、電気容量、又はインダクタンスの変化を検出することによって、表面に共有結合的に結合した化学的又は生物学的分子との、結合を測定する。
【００４８】
特異的な結合物質と結合パートナー
一つ又はそれ以上の特異的結合物質が、もし存在するならば、例えば物理的吸着によって、又は化学的結合によって、一次元又は二次元格子、又はカバー層上に固定化される。特異的結合物質は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、小さな有機分子、ビオチン、細胞、ウィルス、細菌、ポリマー、ペプチド溶液、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ溶液、ＲＮＡ溶液、コンビナトリアルな化学ライブラリー由来の化合物を含む溶液、又は生物学的サンプル、でありうる。生物学的サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、胃腸分泌物、組織又は腫瘍のホモジネート、滑液、糞便、唾液、痰、嚢胞液、羊膜液、脳脊髄液、腹膜液、肺洗浄液、精液、リンパ液、涙、又は前立腺液、などでありうる。
【００４９】
好ましくは、一つ又はそれ以上の特異的結合物質は、バイオセンサー上の別々の場所のマイクロアレイ中に配置される。特異的結合物質のマイクロアレイは、表面が多くの別々の場所を含み、それぞれ異なった特異的結合物質を持つか又は異なった量の特異的結合物質を持つように、本発明のバイオセンサーの表面上の一つ又はそれ以上の特異的結合物質を含む。例えば、あるアレイは、１、１０、１００、１，０００、１０，０００、又は１００，０００の異なった場所を含む。そのようなバイオセンサー表面は、一つ又はそれ以上の特異的結合物質が典型的にｘ−ｙ座標の標準的なマス目パターン中にきれいに配置されているので、マイクロアレイと呼ばれる。しかしながら、本発明のマイクロアレイは、いずれかの標準的な、又は非標準的なパターンに配置された、一つ又はそれ以上の特異的結合物質を含みうる。例えば、別々の場所は、一つ又はそれ以上の特異的結合物質の点のマイクロアレイを定義できる。マイクロアレイの点は、直径およそ５０からおよそ５００ミクロンでありうる。マイクロアレイの点はまた、直径およそ１５０からおよそ２００ミクロンでありうる。一つ又はそれ以上の特異的結合物質は、その特異的結合パートナーと結合しうる。
【００５０】
本発明のバイオセンサー上のマイクロアレイは、例えば、一次元又は二次元格子、又はカバー層表面上の場所のｘ−ｙマス目上に、一つ又はそれ以上の特異的結合物質の微小滴下量を置くことによって作られうる。バイオセンサーが、一つ又はそれ以上の結合パートナーを含むテストサンプルにさらされる場合、結合パートナーは、結合パートナーに対して高い親和性を有する特異的結合物質を含むマイクロアレイ上の特殊な場所に優先的に結合されるだろう。特殊な場所において、その表面上に結合パートナーが集まる場所もあれば、集まらない場所もあるだろう。
【００５１】
特異的結合物質は、本発明のバイオセンサーの表面に加えられた結合パートナーに、特異的に結合する。特異的結合物質は、その結合パートナーに特異的に結合するが、バイオセンサーの表面に加えられた他の結合パートナーには十分に結合しない。例えば、特異的結合物質が抗体であり、そしてその結合パートナーが抗原である場合、抗体は特定の抗原に特異的に結合するが、他の抗原には十分に結合しない。結合パートナーは、例えば、核酸、ポリペプチド、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、小さな有機分子、細胞、ウィルス、細菌、ポリマー、ペプチド溶液、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ溶液、ＲＮＡ溶液、コンビナトリアルな化学ライブラリー由来の化合物を含む溶液、又は生物学的サンプル、でありうる。生物学的サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、胃腸分泌物、組織又は腫瘍のホモジネート、滑液、糞便、唾液、痰、嚢胞液、羊膜液、脳脊髄液、腹膜液、肺洗浄液、精液、リンパ液、涙、又は前立腺液、などでありうる。
【００５２】
本発明のマイクロアレイの一例は、アレイ内のそれぞれ別々の場所が、異なる核酸分子を含む、核酸のマイクロアレイである。この態様において、核酸マイクロアレイ内の点は、テストサンプル中の核酸の反対の鎖で、相補的な化学結合を検出する。
【００５３】
マイクロタイタープレートが、生化学的検定に使われる最も一般的なフォーマットであるのに対し、マイクロアレイは、貴重な試薬の量を最小化しながら一度で測定できる、生化学的な相互作用の数を最大化する方法として、徐々に見られるようになってきている。本発明のバイオセンサー上に、マイクロアレイスポッターを使って特異的結合物質のアプライを行うことによって、平方インチあたり１０，０００の特異的結合物質の密度が得られうる。一つのマイクロアレイの場所を調べるために照射ビームを集中させることによって、バイオセンサーは、ラベル不要なマイクロアレイ読み出しシステムとして使われうる。
【００５４】
一つ又はそれ以上の特異的結合物質の固定化
一つ又はそれ以上の結合物質のバイオセンサー上への固定化は、特異的結合物質が洗浄手順によって洗い落とされないように、及びテストサンプル中においてその結合パートナーへの結合がバイオセンサー表面によって妨げられないように、行われる。表面化学方法のいくつかの異なるタイプが、様々なタイプのマイクロアレイやバイオセンサーの使用のために、例えば、ガラスに対しての特異的結合物質の共有結合のために実行された。これらの同じ方法は、本発明のバイオセンサーに容易に適合させうる。一つ又はそれ以上の特異的結合物質の結合のための正確な官能基を含むようなバイオセンサーの表面の準備は、バイオセンサーの製造プロセスのなくてはならない部分である。
【００５５】
本願明細書で使われる、“化学的又は生物学的分子”という用語は、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーに結合しうる、いずれかの化学的又は生物学的分子を表す。化学的又は生物学的分子は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子、ビオチン、細胞、分画された細胞、細胞抽出物、細胞画分、及び細胞の部分からなる群から選択されうる。
【００５６】
本願明細書で使われる、タンパク質、ペプチド、及びポリペプチドという用語は、アミノ酸残基のポリマーを表す。その用語はまた、一つ又はそれ以上のアミノ酸が、翻訳後のプロセス（例えば、グリコシル化やリン酸化）によって修飾されたアミノ酸を含む、天然のアミノ酸に相当する化学的アナログである、アミノ酸ポリマーにも適用される。本願明細書で使われる“タンパク質”という用語は、ペプチド、酵素、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、成長因子、など、限定なく含まれ、またそれに限定されないものを意味する。
【００５７】
“ポリペプチド”という用語は、ポリマーの長さを問わないアミノ酸のポリマーを表す；従って、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質が、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語は、天然のポリペプチド及び合成のポリペプチドの両方を表す。この用語は、ポリペプチドの化学的又は翻訳後修飾を含みうる。それゆえ、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質の官能基、及びその他同類のものの共有結合を含むポリペプチドの修飾は、ポリペプチドという用語によって明白に含まれる。化学的に修飾されたポリペプチドは、同定又はキャプチャータグがポリペプチドに取り込まれたものを含む。天然又は上記の例にリストされているその他の化学修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、及びアミノ又はカルボキシ末端を含む、ポリペプチドのどこにでも起こりうる。同じタイプの修飾が、与えられたポリペプチドのいくつかの部位で同じ又は変化する度合いにおいて存在することは、評価されるだろう。また、与えられたポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含むことができる。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として枝分かれしていてもよく、そして枝分かれしている又はしておらず、環状であってもよい。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、フォスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、水素付加、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセス、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレニル化、硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡを介したタンパク質へのアミノ酸の付加、及びユビキチン化、を含む。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ-Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照）。また、一つ又はそれ以上のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然のアミノ酸、無関係な生物学的システムにおいて天然にのみ起こるアミノ酸、ほ乳類のシステム由来の修飾アミノ酸などを含む）、置換された結合、ならびに当該技術分野で知られた他の修飾を持つ、天然及び非天然の両方のポリペプチドを含むポリペプチドが定義内に含まれる。ポリペプチドは、天然物又は合成品であることができる。
【００５８】
一つ又はそれ以上の特異的結合物質は、物理的吸着（すなわち化学的リンカーの使用なしで）によって、又は化学的結合（すなわち化学的リンカーを使用して）によってバイオセンサーの表面に結合しうる。化学的結合は、バイオセンサーの表面上で特異的結合物質のより強い結合を産み出すことができ、そして表面に結合した分子の明確な配向及び配座を与えうる。
【００５９】
約０．１ｎｇ／ｍｌより低い濃度での結合パートナーの検出のために、バイオセンサーに結合した結合パートナーを、バイオセンサーの表面上のさらなる層へと増幅及び伝達することが望ましい。バイオセンサー上に溶着した質量の増加は、光路長の増加の結果として簡単に検出できる。バイオセンサーの表面上へのより大きい質量の組み入れによって、表面上の結合パートナーの光学密度もまた増加し、従って加わった質量がない場合に起こるだろうよりも大きな共鳴波長のシフトが与えられる。質量の付加は、例えば、酵素的に“サンドイッチ”検定を通して、又は、様々なサイズ及び組成の適切に結合させたビーズ又はポリマーの形でバイオセンサーの表面への質量の直接的な添加によって、達成されうる。この原理は、質量の増幅なしで達した感度限界を１５００倍以上も超える感度の増加を示す、他のタイプの光学バイオセンサーに利用された。例えば、Ｊｅｎｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｎ  ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  ｃｏａｔｅｄ  ｓｉｌｉｃｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：６２−６５，２００１を参照。
【００６０】
一つの例として、ＮＨ2機能化バイオセンサーは、表面上に固定化された一本鎖ＤＮＡキャプチャープローブを含む特異的結合物質を有することができる。キャプチャープローブは、その相補的な標的結合パートナーと選択的に相互作用する。結合パートナーは、順に、“検出器”分子と結合するだろう配列又はタグを含むようにデザインされうる。検出器分子は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とのリンカーを含むことができ、正確な酵素がさらされた場合、検出器分子が存在する場合のみ、バイオセンサー上に付加材料が選択的に溶着するだろう。そのような手順は、例えば、数分内にバイオセンサーに３００オングストロームの検出可能な生体材料を加えることができる。
【００６１】
“サンドイッチ”方法はまた、検出感度を向上させるために使われうる。この方法において、大きな分子量の分子が、低分子量の分子の存在を増幅するのに使われうる。例えば、約０．１ｋＤａから約２０ｋＤａの分子量を持つ結合パートナーは、例えば、スクシニミジル−６−［ａ−メチル−ａ−（２−ピリジル−ジチオ）トルアミド］ヘキサノエイト（ＳＭＰＴ）、又はジメチルピメリミデイト（ＤＭＰ）、ヒスチジン、又はビオチン分子でタグを付けることができる。タグがビオチンの場合、ビオチン分子は、６０ｋＤａの分子量を持つストレプトアビジンと強く結合するであろう。ビオチン／ストレプトアビジンの相互作用は高度に特異的であるから、ストレプトアビジンは、小さな結合パートナーによってのみ産み出されるだろうシグナルを６０倍にまで増幅する。
【００６２】
検出感度は、化学的に誘導化された小さな粒子の使用を通してさらに向上されうる。コロイド状の金、様々なプラスチック、又はガラスで作られた、約３から３００ｎｍの直径を持つ“ナノ粒子”が、結合パートナーに選択的に共有的にそれらに結合することができるであろう分子種によってコートされうる。例えば、ストレプトアビジンで共有結合的にコートされたナノ粒子は、バイオセンサー表面上でビオチンタグの付加された結合パートナーの視感度を向上させるのに使われうる。ストレプトアビジン分子自身は６０ｋＤａの分子量を持つのに対し、誘導化されたビーズは、例えば６０ｋＤａを含む、いずれのサイズの分子量を持ちうる。大きなビーズの結合は、バイオセンサー表面上で光学密度の大きな変化及び容易に測定できるシグナルを結果としてもたらすだろう。この方法は、感度分解において、およそ１０００倍の結果をもたらすことができる。
【００６３】
バイオセンサーを使用する方法
本発明のバイオセンサーは、一つ又は多数の特異的結合物質／結合パートナーの相互作用を並行して調べるために使われうる。一つ又はそれ以上の特異的結合物質とそのそれぞれの結合パートナーとの結合は、ラベルを使うことなく、その表面に一つ又はそれ以上の特異的結合物質が固定化されたバイオセンサーに対し、一つ又はそれ以上の結合パートナーをアプライすることによって、検出されうる。例えば、ＳＷＳバイオセンサーは、光で照らされ、反射波長の最大、又は光の伝達波長の最小が、バイオセンサーから検出される。もし一つ又はそれ以上の特異的結合物質が、そのそれぞれの結合パートナーに結合した場合、そのとき反射した光の波長が、一つ又はそれ以上の特異的結合物質がそのそれぞれの結合パートナーと結合していない場合を比べて、シフトする。ＳＷＳバイオセンサーが、一つ又はそれ以上の特異的結合物質を含むアレイの別々の場所にコートされている場合、そのとき反射した波長の最大又は光の伝達波長の最小は、バイオセンサーのそれぞれ別の場所から検出される。
【００６４】
本発明の一つの態様において、種々の特異的結合物質、例えば抗体は、本発明のバイオセンサー上にアレイフォーマットで固定化されうる。次に、バイオセンサーは、タンパク質のような結合パートナーを含む興味のあるテストサンプルと接触される。バイオセンサー上に固定化された抗体に特異的に結合するタンパク質のみが、バイオセンサーに結合したままになる。そのような方法は、根本的に酵素結合免疫検定法の大スケールの種類である；しかしながら、酵素又は蛍光ラベルの使用は必要ない。
【００６５】
酵素の活性は、一つ又はそれ以上の特異的結合物質が固定化されたバイオセンサーに対して、一つ又はそれ以上の酵素をアプライすることによって検出されうる。例えば、バイオセンサーは洗浄され、光で照らされる。光の反射した波長がバイオセンサーから検出される。一つ又はそれ以上の酵素が、酵素活性によって、バイオセンサーの一つ又はそれ以上の特異的結合物質を変化させた場合、光の反射した波長はシフトする。
【００６６】
加えて、テストサンプル、例えば、結合パートナーを含む細胞溶解物は、本発明のバイオセンサーにアプライされ、続いて結合しなかった材料を除去するために洗浄される。バイオセンサーに結合した結合パートナーは、バイオセンサーから溶出され、例えば、質量分析によって同定されうる。任意に、ファージＤＮＡディスプレイライブラリーは本発明のバイオセンサーにアプライされ、続いて結合しなかった材料を除去するために洗浄される。バイオセンサーに結合した個々のファージ粒子は単離されうる、そしてこれらのファージ粒子の挿入物はそれから結合パートナーの同定を決定するために配列決定されうる。
【００６７】
上記の応用のために、そして特にプロテオミクスへの応用において、本発明のバイオセンサー上に、テストサンプル由来の結合パートナーのような材料を選択的に結合させる能力、それに続いて、さらなる分析のために結合した材料をバイオセンサーの別々の場所から選択的に除去する能力は、有利である。本発明のバイオセンサーはまた、光の反射した波長のシフトを測定することによって、バイオセンサーアレイの別々の場所に結合したサンプル由来の結合パートナーを検出し、その量を定量する能力を持つ。例えば、一つの別個のバイオセンサーの場所での波長のシフトは、バイオセンサーアレイの別々の場所に結合した結合パートナーの量を決定するために、他の別個のバイオセンサーの場所でのポジティヴ及びネガティヴコントロールと比較することができる。
【実施例１】
【００６８】
ＳＷＳバイオセンサーの組み立て
ＳＷＳバイオセンサーの詳細な製造プロセスは以前に述べられている。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｂ．ｅｔａｌ．，Ｓｅｎｓｏｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  ６７７９，１−６（２００２）を参照、本願明細書に引用して援用する。具体的に、光学グレードのポリマーフィルムが、ＳＷＳセンサーの支持として使われた。ＵＶ硬化型のアクリルベースのポリマーコーティングが、円形がＳＷＳ構造を形成する９６ウェルマイクロタイタープレートの標準的フォーマットに相当する、９６個の円を有するシリコンの覆いを用いて、フィルム上をコートされ、複製された。ゼノン・コーポレーション（ウォバーン、マサチューセッツ州）により提供されたＵＶランプ  ＲＣ６００が、複製後のコーティングの硬化のために使われた。続いて、二酸化チタンの層及び二酸化シリコンの層が、表面の上面に溶着された。
【実施例２】
【００６９】
エポキシシランを用いたシラン化
組み立てられたＳＷＳバイオセンサーシートは、脱イオン水中５０ｐｐｍの水酸化ナトリウム溶液に２０分間浸され、それから大量の脱イオン水で洗われた。シラン溶液は、ダウ・コーニング（ミッドランド、ミシガン州）によって提供された、４ｍＬの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（Ｚ−６０４０）と、１９６ｍＬの９５％エタノール、５％の脱イオン水、及び０．１ｍＬの酢酸を含む溶媒混合物を用いて調製された。シラン溶液は、シラン化の前に１５分間寝かせた。洗浄したＳＷＳバイオセンサーシートが、シラン溶液中に１分間浸された。それらはその後、２００ｍＬのイソプロピルアルコールで３回洗浄された。ＳＷＳバイオセンサーは、遠心を用いて乾燥され、６５％の相対湿度の部屋で１８時間硬化された。
【実施例３】
【００７０】
ポリエチレンイミンを用いた表面移植
アルドリッチ・ケミカル（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）により５０％の水溶液として提供されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、２０％、１５％、１０％、５％、及び１．５％へと希釈され、そして濃塩酸を用いてｐＨ８．０に調節された。実施例２に記載されたシラン化されたＳＷＳバイオセンサーシートは、調製されたＰＥＩ溶液に１８時間浸され、そしてまず脱イオン水を用いて洗われ、その後３Ｘ  ＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて洗われ、そして最後に脱イオン水を用いて洗われた。
【実施例４】
【００７１】
表面上のアミン基の密度の測定
実施例３に記載されたＳＷＳバイオセンサーシートは、２５ｘ７５ｍｍのサイズへと切られた。様々な表面上のアミン基の密度を測定するために、切られたＳＷＳバイオセンサーシート、コーニング（コーニング、ニューヨーク州）製のコーニングＧＡＰＳ  ＩＩアミノ−シランコートスライド、テレケム・インターナショナル（サニーベール、カリフォルニア州）製のＡｒｒｙｉｔスーパーアミンスライド、シグマ（セントルイス、ミズーリ州）製のシグマＳｉｌａｎｅ−Ｐｒｅｐアミンスライド、及びコントロールとして洗浄したガラススライド、からなる５つのグループのスライドが、それぞれ５つの四角形の皿に置かれた。測定は三連で行われた。２０ｍＬの５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムバッファー、ｐＨ８．５中、０．１ｍＭスルフォスクシニジル−４−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−ブチレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＤＴＢ）が調製され、そしてすぐにそれぞれの皿へと注がれた。皿は３０分間振とうされ、サンプルは続いて乾燥された。ＭＪリサーチ（ウォータータウン、マサチューセッツ州）製の１９ｘ６０ｍｍ2の開口ガスケット試験槽が、それぞれのサンプルの上に置かれた。４００μＬの３０％過塩素酸が、それぞれの試験槽に加えられた。サンプルはその後１０分間振とう器で振とうされた。２００μＬの最終溶液が、モレキュラー・デバイス（サニーベール、カリフォルニア州）製のプレート読み取り器ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓを用いて、４９５ｎｍの吸光度で測定された。生産物の濃度は、７０，０００Ｍ-1ｃｍ-1の減衰係数を用いた測定吸光度に基づいて計算された。Ｇａｕｒ，Ｒ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｇｕｐｔ，Ｋ．Ｃ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０，２５３−２５８（１９８９）を参照。サンプル上のアミン基の密度は、図３に表される。この実験結果は、接近可能な、そして比較的大きなサイズのＳｕｌｆｏ−ＳＤＴＢ（分子量６０５．５９）と反応することができる、表面上のアミン基の密度を反映する。
【実施例５】
【００７２】
偏光解析器を用いたＰＥＩ層の厚さの測定
ＳＩ−ＴＥＣＨ（ジェニーバ、イリノイ州）より提供されたシリコンウェハースＧＨ５０３−３が２ｘ３ｃｍの小片に切られた。その２ｘ３ｃｍの小片は、脱イオン水中１０％の水酸化ナトリウムに２０分間浸し、その後大量の脱イオン水で洗うことによって洗浄された。乾燥の後、そのシリコン小片は、実施例２に記載された手順に従って、エポキシシランＺ−６０４０を用いてシラン化された。５つのグループのシラン化シリコン小片は、三連で、５０ｍＬの脱イオン水中２０％、１５％、１０％、５％、及び１．５％ＰＥＩ、ｐＨ８．０に１８時間浸され、その後大量の水で洗われた。それぞれのグループのサンプルの５つの小片は、遠心を用いて乾燥された。別のそれぞれのグループ由来のサンプルの５つの小片は、液体窒素で凍結され、それから凍結乾燥機中で乾燥された。２つのセットのサンプルのＰＥＩの厚さは、ガートナー・サイエンティフィック社（スコーキー、イリノイ州）によって製造されたＧａｅｒｔｎｅｒ  Ｌ１１６Ａ偏光解析器を用いて測定された。厚さは、より高い濃度のＰＥＩが使われた場合には、より厚いＰＥＩ層がエポキシ表面に移植されたことを示す（図４参照）。遠心で乾燥されたサンプルと比較して、同じグループの凍結乾燥されたサンプルは、より大きな厚さを示した。同じ量のＰＥＩが、凍結乾燥と遠心のサンプルの両方の表面上に移植されたが、凍結乾燥されたサンプルのより厚いＰＥＩ層が観測された。それは、凍結乾燥されたサンプル上のＰＥＩ層は多穴性であることを示し、凍結乾燥が水性媒体中で移植されたＰＥＩのあるポリマー構造を凍らせた。このことは、表面上のＰＥＩポリマー鎖が、乾燥型のＰＥＩ層と比べて、水性媒体中ではより伸ばされたということを示した。伸びたＰＥＩポリマー鎖は、少なくとも５０オングストロームの厚さを有する、表面上の接触可能な層を形成した。水性媒体中の表面のＰＥＩ層の厚さは、二次元表面と比較して立体障害が減少することが期待される、三次元ポリマー基板である構造を確立した。
【実施例６】
【００７３】
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）を用いた表面の特徴づけ
実施例３で調製されたサンプルの表面成分は、ＸＰＳを用いて分析された。５５°の発信角度が選択され、そしておよそ５ｎｍの最上表面層が分析された。窒素はＰＥＩによってのみ供給され、そして表面のＰＥＩ量を見積もるために用いられた。表１は、グラフト反応に使われたＰＥＩの濃度が高くなるにつれて増加した窒素の含量を示す。
【実施例７】
【００７４】
ＰＥＩセンサー表面へのビオチンの固定化
実施例２のシラン化されたセンサーシートは、底のない９６ウェルプレートの底に取り付けられた。２００μＬの脱イオン水中１５％ＰＥＩ、ｐＨ８．０が、３ｘ６のウェルに入れられ、そして１８時間後に除去された。そのウェルは、実施例３に記載された手順に従って洗われた。エポキシ表面ウェルの残りは、後の実験でコントロールとして使われた。
【００７５】
１ｍｇ／ｍＬのビオチン−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＮＨＳ（式量３４００）及び１ｍＬ／ｍＬのｍＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳ（式量３４００）が、１ｘＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）（“ＰＢＳ”）中に調製された。両方の試薬は、ネクター・セラピューティクス、サンカルロス、カリフォルニア州によって提供された。２００ｍＬの２つの調製された試薬溶液及びコントロールとしてのＰＢＳは、３つのグループのそれぞれについて６つのウェルに入れられ、そしてＰＢＳで３回洗われ、それから９６ウェルプレート読み取り器（ＳＲＵバイオシステムズ、ウォバーン、マサチューセッツ州）を用いて測定された。表面に結合した分子の量の検出応答、ＰＷＶシフトは、以前に述べた。Ｃｕｎｉｎｇｈａｍ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｎｓｏｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  ６７７９：１−６（２００２）を参照。３つのグループのＰＷＶは、図５に示される。Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＮＨＳ及びｍＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳの両方が、コントロールと比較して、２つの試薬から、ＰＥＩ上のアミンとＮＨＳエステルの反応を用いて、センサー表面に固定化された。
【実施例８】
【００７６】
ビオチン化されたＰＥＩ表面へのストレプトアビジンの結合
１００μｇ／ｍＬのストレプトアビジン（ＳＡ）が、プロザイム社（サンリアンドロ、カリフォルニア州）によって提供された、ＳＡ１０を用いてＰＢＳ中に調製された。２００ｍＬのＳＡ溶液及びＰＢＳコントロールが、実施例６のそれぞれのグループにおける３つのウェル及びエポキシ表面ウェルに、それぞれ加えられた。室温での６０分のインキュベーションの後、実験ウェルはＰＢＳを用いて３回洗われた。ＳＡ結合の応答は、９６ウェルプレート読み取り器を用いて測定され、そして図６に示される。ＳＡは、他の７つのコントロールグループと比較して、はっきりとＰＥＩを用いた表面に固定化されたビオチンと結合した。
【実施例９】
【００７７】
ポリビニルアミンを用いた表面移植
ＬＵＰＡＭＩＮR９０９５という商標の下、ＢＡＳＦ社（マウントオリーヴ、ニュージャージー州）によって水中２０％の溶液で供給された、ポリビニルアミン（ＰＶＡ）は、水を用いて１５％に希釈され、濃塩酸を用いてｐＨ７．４にまで調節された。１００μＬのＰＶＡ溶液が、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに加えられた。９６ウェルプレートは、底のない９６ウェルプレートに対して、実施例２に記載されたようなシラン化されたＳＷＳバイオセンサーシートを取り付けることによって、組み立てられた。ＰＶＡ溶液は、ウェルの中で室温にて一晩、エポキシシラン処理された表面と反応され、そして二日目に除去された。そのウェルは、水を用いて３回洗われ、そして空にされた。１００μＬの２５％グルタルアルデヒド水溶液が、それぞれのウェルに加えられ、そして２時間のインキュベーションの後除去された。ウェルは、水で３回、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファーで３回洗われ、そしてＰＢＳ中で保管された。
【実施例１０】
【００７８】
ポリビニルアミン機能化ＳＷＳバイオセンサー表面上のストレプトアビジンの固定化
プロザイム社（サンリアンドロ、カリフォルニア州）によって提供されたＳＡ１０を用いて、５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４中に調製された、５０μＬの０．５ｍｇ／ｍＬのＳＡ溶液が、実施例９に記載されたプレートのそれぞれの空のウェルに加えられた。そのプレートは、図７左側に見られるような、ストレプトアビジンの固定化の応答を観測するために、９６ウェルプレート読み取り器（ＳＲＵバイオシステムズ、ウォバーン、マサチューセッツ州）上に置かれた。２０時間の固定化の後、ＳＡ溶液は除去され、そしてそのウェルはＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）を用いて洗われた。ＰＶＡ及びコントロールを通した機能化ウェル上のＳＡ固定化の終点は、図７右側に示される。
【実施例１１】
【００７９】
処理された表面上に固定化されたＳＡに対するビオチンの応答
シグマ（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）によって提供されたビオチン（カタログ番号Ｂ０３０１）のＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中の０．０５ｍｇ／ｍＬの溶液が、実施例１０に記載されたように調製された、ＳＡ結合表面の４つのウェルへと加えられ、ビオチンとＳＡの相互作用を飽和させるように０．５時間インキュベートされた。そのウェルは、ＰＢＳバッファーで３回洗われ、その後空にされた。その４つのビオチン処理されたウェルは、コントロールとして使われた。９０μＬのＰＢＳバッファーが、４つの異なるＳＡが結合した空のウェル及び４つのコントロールウェルに入れられた。０．６分のベースラインの読み取りの後、１０μＬのＰＢＳバッファー中０．５μｇ／ｍＬのビオチンが、４つのビオチン処理されたウェル及び４つのコントロールウェルへと加えられた。図８に示したビオチンの応答は、固定化されたＳＡが活性を保持していたことを示す。
【００８０】
本発明、そしてそれを製造及び使用する方法とプロセスは、今、それに関連するいずれの当業者が同じものを作り、使うことができるように、十分な、明白な、簡潔な、及び正確な用語で記載されている。前述の発明の好ましい態様、及び特許請求の範囲に記載された発明の本質又は範囲から逸脱しない範囲で修正をなすことができることが、理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】比色共鳴反射バイオセンサーに用いられる光学回折格子構造の様々な態様の模式図である。ｎsubstrateは、基板材料を表す。ｎ1はカバー層の屈折率を表す。ｎ2は一次元又は二次元回折格子の屈折率を表す。ｎbioは一つ又はそれ以上の特異的結合物質の屈折率を表す。ｔ1はカバー層の厚さを表す。ｔ2は回折格子の厚さを表す。ｔbioは一つ又はそれ以上の特異的結合物質の層の厚さを表す。
【図２】アミン含有ポリマーがエポキシ表面に結合するグラフト反応を表す。
【図３】異なる表面上における、ｐｍｏｌ／ｍｍ2で表されるアミン基のアミン密度を示す。
【図４】水性媒体中のエポキシ表面と５つの濃度のポリエチレンイミンのグラフト反応後、遠心分離乾燥又は凍結乾燥されたサンプルの、オングストロームで表された、ポリエチレンイミン（“ＰＥＩ”）の厚さを表す。
【図５】三つの定義されたグループについて、表面に結合した分子の量の検出応答、すなわち脈波伝播速度（ＰＷＶ）シフトを表す。
【図６】ストレプトアビジン結合の応答を表す。
【図７】処理した表面上のＳＡ（ストレプトアビジン）の動態曲線と固定化の終点を表す。
【図８】表面上に固定化されたＳＡに対するビオチンの応答を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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