(57)【要約】  本発明は、内部対照としてミトコンドリアＤＮＡプローブを用いて、組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の質を観測する方法を提供する。本発明はまた、組織サンプルまたは細胞サンプル中の、標的核ＤＮＡおよび標的ミトコンドリアＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出のための試薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の質を観測する方法であって、
（ａ）前記組織サンプルまたは細胞サンプルに存在する染色体ＤＮＡおよび染色体外ＤＮＡを、相補的配列へのハイブリダイゼーションに利用できるようにするために組織サンプルまたは細胞サンプルを処理する工程と、
（ｂ）ハイブリダイズする条件下で前記組織サンプルまたは細胞サンプルを、
（ｉ）第１の検出可能な標識に結合した標的核ＤＮＡに実質的に相補的である核ＤＮＡプローブと、
（ｉｉ）第２の検出可能な標識に結合した標的ミトコンドリアＤＮＡに実質的に相補的であるミトコンドリアＤＮＡプローブ
を含むプローブ組成物に接触させる工程と、
（ｃ）その標的に特異的にハイブリダイズするプローブを、前記組織サンプルまたは細胞サンプルから洗浄する工程と、
（ｄ）以下のＤＮＡ間のハイブリダイゼーション：
（ｉ）前記核ＤＮＡプローブと前記標的核ＤＮＡとの間、および
（ｉｉ）前記ミトコンドリアＤＮＡプローブと前記標的ミトコンドリアＤＮＡとの間
の程度を評価する工程であって、前記プローブとそれらの対応する標的との間
のハイブリダイゼーションの程度を、同時にまたは連続的に評価する工程と、
（ｅ）前記標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の性質を判定するために、前記ミトコンドリアＤＮＡプローブと前記標的ミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度を、前記ミトコンドリアＤＮＡプローブと前記標的ミトコンドリアＤＮＡとの間の予想されたハイブリダイゼーションの程度と比較する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記核ＤＮＡプローブが、ヒト乳頭腫ウィルスＤＮＡに実質的に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ミトコンドリアＤＮＡプローブが、以下のアンプライマー（amplimer）：
（ａ）５’−ＣＴＣ−ＴＡＧ−ＡＧＣ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＴＡＡ−ＡＧ−３’（配列番号３）および５’−ＴＧＡ−ＣＣＧ−ＴＡＧ−ＴＡＴ−ＡＣＣ−ＣＣＣ−ＧＧ−３’（配列番号８）；
（ｂ）５’−ＣＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＴ−ＣＧＧ−ＡＴＴ−ＣＴＡ−ＣＣＣ−ＴＡＧ−３’（配列番号４）および５’−ＧＧＧ−ＧＡＡ−ＧＣＧ−ＡＧＧ−ＴＴＧ−ＡＣＣ−ＴＧ−３’（配列番号６）；
（ｃ）５’−ＣＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＴ−ＣＧＧ−ＡＴＴ−ＣＴＡ−ＣＣＣ−ＴＡＧ−３’（配列番号４）および５’−ＴＧＡ−ＣＣＧ−ＴＡＧ−ＴＡＴ−ＡＣＣ−ＣＣＣ−ＧＧ−３’（配列番号８）；
（ｄ）５’−ＣＴＣ−ＴＡＧ−ＡＧＣ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＴＡＡ−ＡＧ−３’（配列番号３）および５’−ＧＧＣ−ＡＧＧ−ＡＧＴ−ＡＡＴ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＴＧ−３’（配列番号５）；または
（ｅ）５’−ＡＡＣ−ＡＴＡ−ＣＣＣ−ＡＴＧ−ＧＣＣ−ＡＡＣ−ＣＴ−３’（配列番号１）および５’−ＣＴＡ−ＧＧＧ−ＴＡＧ−ＡＡＴ−ＣＣＧ−ＡＧＴ−ＡＴＧ−ＴＴＧ−３’（配列番号７）
を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の検出可能な標識および／または前記第２の検出可能な標識が、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、発光剤、放射標識、色素、酵素、またはハプテンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の検出可能な標識および／または前記第２の検出可能な標識が、フルオロセイン（fluoroscein）、ジニトロフェニル、ビオチン、またはジゴキシゲニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の検出可能な標識と、前記第２の検出可能な標識が同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の検出可能な標識と、前記第２の検出可能な標識が異なっている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の質を観測する方法であって、
（ａ）前記組織サンプルまたは細胞サンプルに存在する染色体ＤＮＡおよび染色体外ＤＮＡを、相補的配列へのハイブリダイゼーションに利用できるようにするために、組織サンプルまたは細胞サンプルを処理する工程と、
（ｂ）前記組織サンプルまたは細胞サンプルを、
（ｉ）第１の検出可能な標識に結合した標的核ＤＮＡに、実質的に相補的である核ＤＮＡプローブと、
（ｉｉ）第１の検出可能な標識に結合した標的ミトコンドリアＤＮＡに、実質的に相補的であるミトコンドリアＤＮＡプローブ
のいずれかと接触させる工程と、
（ｃ）工程（ｂ）においてその標的に特異的にハイブリダイズするプローブを、前記組織サンプルまたは細胞サンプルから洗浄する工程と、
（ｄ）工程（ｂ）において用いられたプローブとその標的との間のハイブリダイゼーションの程度を評価する工程と、
（ｅ）前記組織サンプルまたは細胞サンプルを、下記のいずれかに接触させる工程：
（ｉ）第２の検出可能な標識に結合した前記標的核ＤＮＡに、実質的に相補的な核ＤＮＡプローブと。ただしこの時、組織サンプルまたは細胞サンプルは、工程（ｂ）のミトコンドリアＤＮＡプローブに接触している、
（ｉｉ）第２の検出可能な標識に結合した標的ミトコンドリアＤＮＡに実質的に相補的なミトコンドリアＤＮＡプローブと。ただしこの時、組織サンプルまたは細胞サンプルは、工程（ｂ）の核ＤＮＡプローブに接触している、
（ｆ）工程（ｅ）においてその標的に特異的にハイブリダイズするプローブを、組織サンプルまたは細胞サンプルから洗浄する工程と、および
（ｇ）工程（ｅ）において用いられたプローブとその標的との間のハイブリダイゼーションの程度を評価する工程と、
（ｈ）前記標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の質を判定するために、前記ミトコンドリアＤＮＡプローブと前記標的ミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度を、予想された前記ミトコンドリアＤＮＡプローブと前記標的ミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度と比較する工程と
を含む方法。
【請求項９】
前記核ＤＮＡプローブが、ヒト乳頭腫ウィルスＤＮＡに実質的に相補的である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ミトコンドリアＤＮＡプローブが、以下のアンプライマー：
（ａ）５’−ＣＴＣ−ＴＡＧ−ＡＧＣ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＴＡＡ−ＡＧ−３’（配列番号３）および５’−ＴＧＡ−ＣＣＧ−ＴＡＧ−ＴＡＴ−ＡＣＣ−ＣＣＣ−ＧＧ−３’（配列番号８）；
（ｂ）５’−ＣＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＴ−ＣＧＧ−ＡＴＴ−ＣＴＡ−ＣＣＣ−ＴＡＧ−３’（配列番号４）および５’−ＧＧＧ−ＧＡＡ−ＧＣＧ−ＡＧＧ−ＴＴＧ−ＡＣＣ−ＴＧ−３’（配列番号６）；
（ｃ）５’−ＣＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＴ−ＣＧＧ−ＡＴＴ−ＣＴＡ−ＣＣＣ−ＴＡＧ−３’（配列番号４）および５’−ＴＧＡ−ＣＣＧ−ＴＡＧ−ＴＡＴ−ＡＣＣ−ＣＣＣ−ＧＧ−３’（配列番号８）；
（ｄ）５’−ＣＴＣ−ＴＡＧ−ＡＧＣ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＴＡＡ−ＡＧ−３’（配列番号３）および５’−ＧＧＣ−ＡＧＧ−ＡＧＴ−ＡＡＴ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＴＧ−３’（配列番号５）；または
（ｅ）５’−ＡＡＣ−ＡＴＡ−ＣＣＣ−ＡＴＧ−ＧＣＣ−ＡＡＣ−ＣＴ−３’（配列番号１）および５’−ＣＴＡ−ＧＧＧ−ＴＡＧ−ＡＡＴ−ＣＣＧ−ＡＧＴ−ＡＴＧ−ＴＴＧ−３’（配列番号７）
を用いてポリメラーゼ連鎖反応により調製される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の検出可能な標識および／または前記第２の検出可能な標識が、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、発光剤、放射標識、色素、酵素、またはハプテンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の検出可能な標識および／または前記第２の検出可能な標識が、フルオレセイン、ジニトロフェニル、ビオチン、またはジゴキシゲニンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の検出可能な標識と、前記第２の検出可能な標識が同一である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の検出可能な標識と、前記第２の検出可能な標識が異なっている、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡおよび標的ミトコンドリアＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出用試薬であって、
（ａ）第１の検出可能な標識に結合した前記標的核ＤＮＡに実質的に相補的である核ＤＮＡプローブ；および
（ｂ）第２の検出可能な標識に結合した前記標的ミトコンドリアＤＮＡに実質的に相補的であるミトコンドリアＤＮＡプローブ
を含む試薬。
【請求項１６】
前記核ＤＮＡプローブが、ヒト乳頭腫ウィルスＤＮＡに実質的に相補的である、請求項１５に記載の試薬。
【請求項１７】
前記ミトコンドリアＤＮＡプローブが、以下のアンプライマー：
（ａ）５’−ＣＴＣ−ＴＡＧ−ＡＧＣ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＴＡＡ−ＡＧ−３’（配列番号３）および５’−ＴＧＡ−ＣＣＧ−ＴＡＧ−ＴＡＴ−ＡＣＣ−ＣＣＣ−ＧＧ−３’（配列番号８）；
（ｂ）５’−ＣＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＴ−ＣＧＧ−ＡＴＴ−ＣＴＡ−ＣＣＣ−ＴＡＧ−３’（配列番号４）および５’−ＧＧＧ−ＧＡＡ−ＧＣＧ−ＡＧＧ−ＴＴＧ−ＡＣＣ−ＴＧ−３’（配列番号６）；
（ｃ）５’−ＣＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＴ−ＣＧＧ−ＡＴＴ−ＣＴＡ−ＣＣＣ−ＴＡＧ−３’（配列番号４）および５’−ＴＧＡ−ＣＣＧ−ＴＡＧ−ＴＡＴ−ＡＣＣ−ＣＣＣ−ＧＧ−３’（配列番号８）；
（ｄ）５’−ＣＴＣ−ＴＡＧ−ＡＧＣ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＴＡＡ−ＡＧ−３’（配列番号３）および５’−ＧＧＣ−ＡＧＧ−ＡＧＴ−ＡＡＴ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＴＧ−３’（配列番号５）；または
（ｅ）５’−ＡＡＣ−ＡＴＡ−ＣＣＣ−ＡＴＧ−ＧＣＣ−ＡＡＣ−ＣＴ−３’（配列番号１）および５’−ＣＴＡ−ＧＧＧ−ＴＡＧ−ＡＡＴ−ＣＣＧ−ＡＧＴ−ＡＴＧ−ＴＴＧ−３’（配列番号７）
を用いてポリメラーゼ連鎖反応により調製される、請求項１５に記載の試薬。
【請求項１８】
前記第１の検出可能な標識および／または前記第２の検出可能な標識が、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、発光剤、放射標識、色素、酵素、またはハプテンである、請求項１５に記載の試薬。
【請求項１９】
前記第１の検出可能な標識および／または前記第２の検出可能な標識が、フルオレセイン、ジニトロフェニル、ビオチン、またはジゴキシゲニンである、請求項１５に記載の試薬。
【請求項２０】
前記第１の検出可能な標識と、前記第２の検出可能な標識が同一である、請求項１５に記載の試薬。
【請求項２１】
前記第１の検出可能な標識と、前記第２の検出可能な標識が異なっている、請求項１５に記載の試薬。
【請求項２２】
前記核ＤＮＡプローブが第１の容器で提供され、前記ミトコンドリアＤＮＡプローブが第２の容器で提供されるキットを含む、請求項１５に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、内部対照としてミトコンドリアＤＮＡプローブを用いて、組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の質を観測するための方法に関する。また、本発明は、組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡおよび標的ミトコンドリアＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを検出するための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
核酸ハイブリダイゼーションは、二本鎖核酸ハイブリッドを形成するために、十分に相補的な配列を有する２つの一本鎖核酸分子を好適な反応条件下で相互作用させる方法である。ハイブリダイゼーション技術は、以下の３つの群のうちの１つに分類できる：（１）相補的な一本鎖核酸分子間のハイブリダイゼーション反応が溶液中で実施される、溶液ハイブリダイゼーション法；（２）一本鎖核酸分子の一本を、相補的一本鎖核酸分子とのハイブリダイゼーションの前に固体マトリックスに結合させる、フィルターまたはブロットハイブリダイゼーション法；（３）一本鎖核酸分子の一本を、好適に調製された細胞または組織切片から単離し、それによって、組織または細胞の構造体の内（例えば、細胞の核内）の特定の核酸配列の検出または位置確認を可能にするｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）。したがって、ＩＳＨは、調べている細胞サンプルまたは組織サンプルにおける生化学的および形態学的特徴の同時判定を可能にするという追加の利益を有する。
【０００３】
ＩＳＨアッセイの１つのタイプは、クロモゲンを用いて相補的な一本鎖核酸分子間のハイブリダイゼーション反応が検出される、クロモゲンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）である。例えば、細胞の標的核酸に対する標識核酸プローブのハイブリダイゼーションは、標識プローブに特異的な一次抗体、該一次抗体に特異的な二次抗体−酵素結合体、および該二次抗体−酵素結合体との反応の際に不溶性の着色沈殿へと変換されるクロモゲン基質を用いて検出することができる。ＣＩＳＨは他のＩＳＨアッセイとは対照的に、従来の光学顕微鏡下での分子マーカーの直接的な視覚化を可能にする。
【０００４】
ＩＳＨアッセイは、子宮頚部癌の診断に使用するために開発された。このようなアッセイの１つにおいて、子宮頚部癌に関連したヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）遺伝型が、ニックトランスレーション法によって作製され、およそ２００〜６００長の塩基対プローブからなるウィルスプローブカクテルを用いて検出される。
【０００５】
ＩＳＨは、細胞サンプルまたは組織サンプルの破壊を必要とするサザンブロットハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの分子診断法より多くの利点を提供する。他のタイプの核酸ハイブリダイゼーションとは対照的に、ＩＳＨは、細胞溶解およびそれに引き続いて、試験前に、細胞サンプルまたは臨床サンプルから核酸分子を単離することを必要としない。替わりに、細胞サンプルまたは臨床サンプルを直接スライドに置いてから、標識プローブによってハイブリダイズすることができる。
【０００６】
しかし、いずれの分子診断法でもそうであるように、ＩＳＨの結果の確認および解釈は、好適な対照の使用に依存する。例えば、標的および陽性対照プローブは、同様な方法によって調製する必要があり、標的および陽性対照プローブは、アンマスキング標的に対するプロテイナーゼ消化、核酸ハイブリダイゼーション、免疫学的検出、およびクロモゲン視覚化などの全体的なアッセイ性能の観測を可能にするために、同様な条件、好ましくは同じスライド上で、細胞サンプルまたは組織サンプルにハイブリダイズし、検出する必要がある。検体採集および固定などのスライド調製、ならびに年齢およびサンプルの貯蔵法もまた、ＩＳＨアッセイの信頼性に影響を及ぼし得る。
【０００７】
好適なＩＳＨ対照の１つは、ヒトＡｌｕエレメントに特異的に結合することのできるプローブである。Ａｌｕ配列は、典型的には、３００ヌクレオチド長の短い散在エレメントである。ヒトゲノムは、１４０万以上のＡｌｕエレメントを含有し、それは、該ゲノムのおよそ１０％を占めている（International Human Genome Sequencing Consortium、2001年）。Ａｌｕプローブは、検体採集、サンプルの処理および送付、ならびにＩＳＨアッセイ時の標的ＤＮＡの完全性評価のために使用できる。例えば、細胞サンプルまたは組織サンプルの不適切な保存により、標的ＤＮＡの分解がもたらされて、偽陰性の診断結果に至り得る。また、欠陥のあるＩＳＨ検出試薬を使用することによっても信頼できない結果を得る可能性がある。一般に、Ａｌｕ対照プローブによって不適切な染色結果が得られる場合は、ある特定の標的プローブに関して得られた陰性ＩＳＨ結果はいずれも信頼できないと考えるべきである。
【０００８】
しかし、ＩＳＨ対照としてＡｌｕプローブを使用することにはいくつかの不利な点もある。第１に、ヒト細胞におけるＡｌｕエレメントのコピー数はいずれも約１４０万であるが、ＩＳＨアッセイにおける大抵の診断標的のコピー数は、数千倍から１００万倍少ない。したがって、Ａｌｕエレメントは、ＩＳＨアッセイに関しては低感度の対照配列として考えることができる。第２に、ＡｌｕエレメントはＧＣの多い反復領域を含む短い散在配列であるため、Ａｌｕプローブは、異なったプローブ調製法および異なったハイブリダイゼーション条件を必要とする。例えば、Ａｌｕプローブは、オリゴヌクレオチド合成機上で化学的合成によって容易に調製できるが、ＨＰＶゲノムプローブは、酵素的方法（例えば、ニックトランスレーション）または直接的修飾を用いて調製しなければならない。さらに、それらの異なるプローブ長および組成のため、ＡｌｕおよびＨＰＶゲノムプローブは、特定のプローブハイブリダイゼーション条件および洗浄ストリンジェンシーを必要とする。最後に、ＡｌｕおよびＨＰＶゲノムプローブは、核に対する制御シグナルと標的シグナル双方の共局在化により、ＩＳＨアッセイにおいて、さらに検出上の困難を示す。したがって、実際、Ａｌｕ制御プローブを用いたＩＳＨアッセイは、別個のスライド上で実施しなければならないため、２つのスライド間の検体の調製、取り扱い、またはハイブリダイゼーション操作上の偏差を十分に制御することができない。
【０００９】
ミトコンドリアは、エネルギー産生および細胞呼吸を担っている小型の細胞内細胞小器官である。もっぱら細胞質内に位置しているこれらの細胞小器官は、およそ１６．５ｋｂ長の二本鎖環状ゲノムを有する（Andersonら、1981年、Nature 290: 457〜465頁）。個々の細胞は、ミトコンドリアゲノムの複数コピーを有し、例えば、１個のヒト筋肉細胞は、１．６×１０４から８．５×１０４の間のコピーを有する（Heら、2002年、Nucleic Acids Res. 30: e68）。組織サンプルおよび細胞サンプル間でのミトコンドリアのＤＮＡコピー数は変動するが、同一の組織サンプルまたは細胞サンプルの個々の細胞におけるコピー数は比較的安定しており、変動は２倍以下である（Veltriら、1990年、J.CELL.PHYSIOL. 143: 160〜164頁およびSmithら、2002年、Reprod.Biomed.Online 4: 248〜255頁）。
【００１０】
最初に記載されて以来、ＩＳＨは方法論および適用において、連続的な発展を経てきた。現在、ＩＳＨは細胞生物学、臨床診断、発生生物学、遺伝学、およびウィルス学などの生物医療および臨床研究の多くの分野で直接適用されている。しかし、ＩＳＨ技術には、代替のＩＳＨ対照を開発する必要性が存在している。ミトコンドリアの生物学的性質により、ミトコンドリアＤＮＡは、ＩＳＨアッセイにおける、より具体的には、子宮頚部異常のＨＰＶ標的検出における使用に好適な内部対照となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、内部対照としてミトコンドリアＤＮＡプローブを用いて、組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の質を観測するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一方法において、組織サンプルまたは細胞サンプル中に存在する染色体ＤＮＡおよび染色体外ＤＮＡを相補的配列に対するハイブリダイゼーションに利用できるようにするために、組織サンプルまたは細胞サンプルを処理すること；該組織サンプルまたは細胞サンプルを、第１の検出可能な標識に結合した標的核ＤＮＡに実質的に相補的な核ＤＮＡプローブと、第２の検出可能な標識に結合した標的ミトコンドリアＤＮＡに実質的に相補的なミトコンドリアＤＮＡプローブとを含むプローブ組成物と、ハイブリダイズする条件下で接触させること；標的に特異的にハイブリダイズするプローブを、該組織サンプルまたは細胞サンプルから洗浄すること；核ＤＮＡプローブと標的核ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度およびミトコンドリアＤＮＡプローブとミトコンドリアＤＮＡ標的との間のハイブリダイゼーションの程度を同時に評価すること；ミトコンドリアＤＮＡプローブとミトコンドリアＤＮＡ標的との間に見られるハイブリダイゼーションの程度を、ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間の予想されたハイブリダイゼーションの程度と比較し、核ＤＮＡ標的のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の質を判定することによって、組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの質を観測する。
【００１３】
本発明の他の方法において、組織サンプルまたは細胞サンプル中に存在する染色体ＤＮＡおよび染色体外ＤＮＡを相補的配列に対するハイブリダイゼーションに利用できるようにするために、組織サンプルまたは細胞サンプルを処理すること；該組織サンプルまたは細胞サンプルを、第１の検出可能な標識に結合した標的核ＤＮＡに実質的に相補的な核ＤＮＡプローブと、第２の検出可能な標識に結合した標的ミトコンドリアＤＮＡに実質的に相補的なミトコンドリアＤＮＡプローブとを含むプローブ組成物と、ハイブリダイズする条件下で接触させること；標的に特異的にハイブリダイズするプローブを、該組織サンプルまたは細胞サンプルから洗浄すること；核ＤＮＡプローブと標的核ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度を評価すること；ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度を評価すること；ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間に見られるハイブリダイゼーションの程度を、ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの予想される程度と比較して、標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の質を判定することによって、組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの質を観測する。
【００１４】
本発明の他の方法において、組織サンプルまたは細胞サンプル中に存在する染色体ＤＮＡおよび染色体外ＤＮＡを相補的配列に対するハイブリダイゼーションに利用できるようにするために、組織サンプルまたは細胞サンプルを処理すること；該組織サンプルまたは細胞サンプルを、第１の検出可能な標識に結合した標的核ＤＮＡに実質的に相補的な核ＤＮＡプローブと、第２の検出可能な標識に結合した標的ミトコンドリアＤＮＡに実質的に相補的なミトコンドリアＤＮＡプローブとを含むプローブ組成物と、ハイブリダイズする条件下で接触させること；標的に特異的にハイブリダイズするプローブを、該組織サンプルまたは細胞サンプルから洗浄すること；ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度を評価すること；核ＤＮＡプローブと標的核ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度を評価すること；ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間に見られるハイブリダイゼーションの程度を、ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間の予想されたハイブリダイゼーションの程度と比較し、標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の質を判定することによって、組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの質を観測する。
【００１５】
本発明の他の方法において、組織サンプルまたは細胞サンプル中に存在する染色体ＤＮＡおよび染色体外ＤＮＡを相補的配列に対するハイブリダイゼーションに利用できるようにするために、組織サンプルまたは細胞サンプルを処理すること；該組織サンプルまたは細胞サンプルを、第１の検出可能な標識に結合した標的核ＤＮＡに実質的に相補的な核ＤＮＡプローブに接触させること；標的核ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする核ＤＮＡプローブを、該組織サンプルまたは細胞サンプルから洗浄すること；核ＤＮＡプローブと標的核ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度を評価すること；該組織サンプルまたは細胞サンプルを、第２の検出可能な標識に結合した標的ミトコンドリアＤＮＡに実質的に相補的なミトコンドリアＤＮＡプローブに接触させること；標的ミトコンドリアＤＮＡに特異的にハイブリダイズするミトコンドリアＤＮＡプローブを、該組織サンプルまたは細胞サンプルから洗浄すること；ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度を評価すること；ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度を、ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの予想される程度と比較して、標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の質を判定することによって、組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの質を観測する。
【００１６】
本発明の他の方法において、組織サンプルまたは細胞サンプル中に存在する染色体ＤＮＡおよび染色体外ＤＮＡを相補的配列に対するハイブリダイゼーションに利用できるようにするために、組織サンプルまたは細胞サンプルを処理すること；該組織サンプルまたは細胞サンプルを、第１の検出可能な標識に結合した標的ミトコンドリアＤＮＡに実質的に相補的なミトコンドリアＤＮＡプローブに接触させること；標的ミトコンドリアＤＮＡに特異的にハイブリダイズするミトコンドリアＤＮＡプローブを、該組織サンプルまたは細胞サンプルから洗浄すること；ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度を評価すること；該組織サンプルまたは細胞サンプルを、第２の検出可能な標識に結合した標的核ＤＮＡに実質的に相補的な核ＤＮＡプローブに接触させること；標的核ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする核ＤＮＡプローブを、該組織サンプルまたは細胞サンプルから洗浄すること；核ＤＮＡプローブと標的核ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度を評価すること；ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間に見られるハイブリダイゼーションの程度を、ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間の予想されたハイブリダイゼーションの程度と比較して、標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の質を判定することによって、組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの質を観測する。
【００１７】
本発明はまた、組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出のための試薬を提供する。
【００１８】
本発明の試薬の１つは、第１の検出可能な標識に結合した標的核ＤＮＡに実質的に相補的な核ＤＮＡプローブと、第２の検出可能な標識に結合した標的ミトコンドリアＤＮＡに実質的に相補的なミトコンドリアＤＮＡプローブとを組み合わせることによって調製される。
【００１９】
本発明の特定の好ましい実施形態は、以下の一定の好ましい実施形態のより詳細な説明および請求項から明らかになるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、内部対照としてミトコンドリアＤＮＡプローブを用いて、組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の質を観測するための方法を提供する。また、本発明は、組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡおよび標的ミトコンドリアＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを検出するための試薬を提供する。
【００２１】
細胞の核およびミトコンドリアは細胞質の別々の領域を占める異なる細胞小器官を構成しているという事実を利用して、内部対照としてミトコンドリアＤＮＡプローブを用いることにより、標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の質を観測することができる。ＩＳＨアッセイの質を観測するために、組織サンプルまたは細胞サンプルの染色体外ＤＮＡと、好適なミトコンドリアＤＮＡプローブ（実施例２に記載されたミトコンドリアＤＮＡプローブなど）との間のハイブリダイゼーションの程度を評価し（例えば、目視検査により）、ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間に見られたハイブリダイゼーションの程度を、その組織サンプルまたは細胞サンプルに関するミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの予想される程度と比較する。ハイブリダイゼーションの見られた程度と、ハイブリダイゼーションの予想された程度とが有意に異なっていない場合、該標的核ＤＮＡに関するＩＳＨアッセイの結果は信頼できると考えることができる。
【００２２】
同じ組織サンプルまたは細胞サンプルの個々の細胞内のミトコンドリアＤＮＡコピーは比較的一定であるため、組織サンプルまたは細胞サンプル中の標的核ＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の質を観測するために、ミトコンドリアＤＮＡプローブを内部対照として用いることができる。例えば、Veltriら、1990年、J.CELL.PHYSIOL. 143: 160〜164頁は、マウスの肝臓、腎臓、心臓および脳におけるミトコンドリアＤＮＡのコピー数は臓器特異的であることを教示している。他の多数の組織タイプおよび細胞タイプに関する、および種々の発生段階における組織タイプまたは細胞タイプのミトコンドリアＤＮＡのコピー数が文献に公表されている。例えば、Steuerwaldら、2000年、Zygote 8: 209〜215頁は、マウスおよびヒトの卵母細胞は、それぞれ、平均、１．５９×１０５と３．１４×１０５のミトコンドリアゲノムを含有していることを教示している。
【００２３】
本明細書に用いられる用語の「ハイブリダイゼーションの程度」とは、好適なハイブリダイゼーション条件下で、特定の標的に特異的な標識プローブと、該標的との間に生じるハイブリダイゼーションの程度を言う。標識プローブ（例えば、ミトコンドリアＤＮＡプローブ）と標的（例えば、ミトコンドリアＤＮＡ）との間のハイブリダイゼーションの程度は、組織サンプルまたは細胞サンプルをすすいで、ハイブリダイズしなかったプローブを除去した後に、組織サンプルまたは細胞サンプル上に残留している標識プローブの相対的な強度または量を測定することによって評価できることを、当業者は理解されるであろう。また、本発明の方法の実践において、ハイブリダイゼーションの程度は、定性的にも定量的にも評価できることを、当業者は理解されるであろう。例えば、ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度は、ハイブリダイゼーション後に、組織サンプルまたは細胞サンプルの簡単な目視検査によって定性的に評価できる。ハイブリダイゼーションの程度の定性的評価において、当業者は、ハイブリダイゼーションの程度を、例えば、強（＋＋＋）、中（＋＋）、弱（＋）、または無検出（−）として等級付けできる。
【００２４】
あるいは、ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度を、標的ミトコンドリアＤＮＡにハイブリダイズする標識ミトコンドリアＤＮＡプローブの量を測定することによって、定量的に評価することができる。自動組織染色法によりタンパク質を定量するための代表的な方法および装置は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている、2001年１２月６日に公表され、標題が「画像解析によるタンパク質の定量法」である米国特許出願公開第２００１／００４９１１４号に教示されている。他の市販のスライド画像化システムは、ＡＲＩＯＬ  ＳＬ−５０として、Applied Imaging Corporation（カリフォルニア州、Santa Clara）により販売されている。また、ミトコンドリアＤＮＡを定量するための多くの方法が開発されているため、ミトコンドリアＤＮＡプローブと標的ミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの予想される程度を判定するために、任意の組織サンプルまたは細胞サンプルに関するミトコンドリアＤＮＡのコピー数を容易に算出することができる。例えば、Veltriら、1990年、J.CELL.PHYSIOL. 143: 160〜164頁は、放射標識ミトコンドリアＤＮＡプローブを用いて、細胞中のミトコンドリアＤＮＡのコピー数を求める方法を教示している。また、Steuerwaldら、2000年、Zygote 8: 209〜215頁は、個々の細胞中に存在するミトコンドリアゲノムの数を求めるための蛍光高速サイクルＤＮＡ増幅法を教示している。さらに、Chabiら、2003年、Clin.Chem. 49: 1309〜1317頁は、個々の細胞中のミトコンドリアＤＮＡのコピー数を求めるための定量的ＰＣＲアッセイを教示している。Chabiらの方法において、各々がミトコンドリアゲノムの異なる領域に位置する４つの異なるミトコンドリア遺伝子に特異的なクローン化ミトコンドリアＤＮＡプローブの連続希釈液から、検量線が作成される。種々の細胞型のミトコンドリアＤＮＡ含量は、これらの、および他の好適な方法を、２８の異なるヒト組織を含有するHuman Body Tour Tissue Array（City of Hope；カリフォルニア州、Duarte；米国特許第５，００２，３７７号）などの組織アレイと一緒に用いて判定できると考えられる。
【００２５】
該方法に使用するためのミトコンドリアＤＮＡプローブおよび本発明の試薬は、当業者に知られた多数の方法によって調製できる。好適なミトコンドリアＤＮＡプローブは、選択されたプローブがミトコンドリアＤＮＡに特異的にハイブリダイズするという条件で、試験される組織または細胞のミトコンドリアゲノムの任意の部分を認識できる。本発明の方法および試薬の好ましい実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡプローブは、アンプライマー（amplimer）、５’−ＣＴＣ−ＴＡＧ−ＡＧＣ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＴＡＡ−ＡＧ−３’（配列番号３）および５’−ＴＧＡ−ＣＣＧ−ＴＡＧ−ＴＡＴ−ＡＣＣ−ＣＣＣ−ＧＧ−３’（配列番号８）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって調製される。他の好ましい実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡプローブは、アンプライマー、５’−ＣＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＴ−ＣＧＧ−ＡＴＴ−ＣＴＡ−ＣＣＣ−ＴＡＧ−３’（配列番号４）および５’−ＧＧＧ−ＧＡＡ−ＧＣＧ−ＡＧＧ−ＴＴＧ−ＡＣＣ−ＴＧ−３’（配列番号６）；アンプライマー、５’−ＣＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＴ−ＣＧＧ−ＡＴＴ−ＣＴＡ−ＣＣＣ−ＴＡＧ−３’（配列番号４）および５’−ＴＧＡ−ＣＣＧ−ＴＡＧ−ＴＡＴ−ＡＣＣ−ＣＣＣ−ＧＧ−３’（配列番号８）；またはアンプライマー、５’−ＣＴＣ−ＴＡＧ−ＡＧＣ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＴＡＡ−ＡＧ−３’（配列番号３）および５’−ＧＧＣ−ＡＧＧ−ＡＧＴ−ＡＡＴ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＴＧ−３’（配列番号５）を用いて調製される。さらに他の好ましい実施形態において、アンプライマーは、５’−ＡＡＣ−ＡＴＡ−ＣＣＣ−ＡＴＧ−ＧＣＣ−ＡＡＣ−ＣＴ−３’（配列番号１）および５’−ＣＴＡ−ＧＧＧ−ＴＡＧ−ＡＡＴ−ＣＣＧ−ＡＧＴ−ＡＴＧ−ＴＴＧ−３’（配列番号７）である。
【００２６】
本発明の方法および試薬に使用するための核ＤＮＡプローブは、当業者に知られた多数の方法によって調製できる。好適な核ＤＮＡプローブは任意の標的核ＤＮＡを認識できる。本発明の方法および試薬の好ましい実施形態において、標的核ＤＮＡは、ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）ＤＮＡである。
【００２７】
本発明の方法および試薬に使用するための、ミトコンドリアおよび核のＤＮＡプローブは、当業者に知られた多数の方法および標識を用いて標識化できる。好適な標識としては、例えば、酵素、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、発光剤、放射標識、色素、およびハプテンが挙げられる。励起エネルギー源に依存する発光剤は、放射線発光、化学発光、生物発光、および光発光（蛍光およびリン光など）に分類できる。
【００２８】
本発明の一方法において、該標識は、適当な反応物と組み合わせた場合に認識できる変化を生じさせる化学的試剤である。好適な化学的試剤の一例は、適切な酵素基質および補因子と混合した場合に、検出可能な有色の沈殿物を生じる酵素である。種々の酵素基質を用い、種々多様な有色反応産物が一般に利用できる。アルカリホスファターゼは、組織の標識化に従来用いられてきた酵素の一例である。本発明の方法の実践に使用できる他の酵素としては、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびガラクトシダーゼが挙げられる。本発明の方法の実践に使用できる酵素の各々は、特定の基質、補因子、および結果として生じる色素発生反応産物の、それ自体の独特な色素産生系を有している。
【００２９】
本発明の他の方法において、ミトコンドリアおよび核のＤＮＡプローブは、適切な波長の光に曝露されると高エネルギー状態へと励起して蛍光を発する蛍光色素によって標識される。有意な量の蛍光を放出する物質である蛍光色素は、一般に、大きく２つのクラス、内因性蛍光物質および外因性蛍光物質に分けることができる。内因性蛍光物質は、励起光を吸収し、より長い波長の光を放出する示された能力が、それらの内部構造および化学的形成に直接基づいている天然の生物学的分子からなる。典型的な内因性蛍光体としては、例えば、トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニンを含有するタンパク質およびポリペプチドが挙げられる。さらに、ＮＡＤＨ、ＦＭＮ、ＦＡＤ、およびリボフラビンなどの酵素補因子は、高蛍光性である。外因性蛍光体は大部分、天然には生じず、タンパク質、免疫グロブリン、脂質、および核酸を標識するために、色素としての使用を目的に開発された。この広範な群には、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ならびにそれらのイソシアネートおよびイソチオシアネート誘導体；塩化ダンシル；ナフタルアミンスルホン酸およびそれらの誘導体；アクリジンオレンジ；プロフラビン；臭化エチジウム；および塩化キナクリンが含まれる。これらすべてが本発明の範囲内の使用に好適であると考えられる。
【００３０】
本発明の方法および試薬の好ましい実施形態において、ミトコンドリアおよび核のＤＮＡプローブは、フルオレセイン、ジニトロフェニル、ビオチン、またはジゴキシゲニンによって標識される。これらの標識は、例えば、フルオレセイン標識ヌクレオチド類似体（フルオレセイン−ｄＣＴＰ）（図３）、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）−標識ヌクレオチド類似体（ＤＮＰ−ｄＣＴＰ）（図１）、またはビオチン化ヌクレオチド類似体（ビオチン−ｄＣＴＰ）（図２）のいずれかを用いて、ミトコンドリアおよび核のＤＮＡプローブ内に、該プローブの調製時に組み込まれる。
【００３１】
内部対照としてミトコンドリアＤＮＡプローブを用いて、標的核ＤＮＡの色素産生ＩＳＨ分析を観測する場合、標的の核およびミトコンドリアＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションの程度は、同一のハプテンと検出系、異なるハプテンと同一の検出系、または異なるハプテンと検出系を用いて判定できる。
【００３２】
細胞の核およびミトコンドリアは、細胞質の別個の領域を占める異なる細胞小器官を構成しているため、本発明の方法および試薬に用いられるミトコンドリアおよび核ＤＮＡのプローブは、検出可能な同じ標識を用いて標識化できる。あるいは、ミトコンドリアおよび核ＤＮＡのプローブは、検出可能な異なる標識を用いて標識化できる。
【実施例】
【００３３】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態、およびそれらの種々の使用法を例示するものである。それらは、単に、例示を目的として記載されており、本発明を限定するものとして考えるべきではない。
【００３４】
（実施例１）
クロモゲンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析用組織サンプルおよび細胞サンプルの調製
２つのヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）陽性細胞系のＣａＳｋｉ（ＨＰＶ１６の２００〜６００コピーを含有）およびＨｅＬａ（ＨＰＶ１８の１０〜５０コピーを含有）、ならびに１つのＨＰＶ陰性細胞系（Ｔ２４）を用いて、クロモゲンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）分析を実施した。細胞サンプルは、１０％の中性緩衝化ホルマリン中に固定し、パラフィンに埋め込み、４〜８ミクロンに切片化した。固定した細胞サンプルを、ＣＩＳＨ分析の前に、Superfrost（登録商標）Plusガラススライド（VWR Scientific；ペンシルベニア州、West Chester）上に置いた。
【００３５】
また、組織生検の子宮頚部病巣細胞およびCytyc Corp.（マサチューセッツ州、Boxborough）およびTriPath Imaging Inc.（ノースカロライナ州、Burlington）の市販の液体ベースプレップ（ＬＢＰ）システムを用いて調製した子宮頚部スメアサンプルについて、ＣＩＳＨ分析を実施した。
【００３６】
（実施例２）
クロモゲンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析用プローブの調製
クロモゲンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）分析用ＨＰＶ  ＤＮＡプローブは、遺伝子型の１６、１８、３１、３３、３５、および５１のＨＰＶ  ＤＮＡを、国際出願ＰＣＴ００／２４７６０号に記載されているとおり、プラスミドベクター内にクローニングすることによって調製した。
【００３７】
ＣＩＳＨ分析用のミトコンドリアＤＮＡプローブは、Expand Long Template PCR System（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州、Indianapolis）および表１に示されたプライマーを用いてＰＣＲ増幅によって調製した。５００μＭのｄＮＴＰ、５単位のＴａｑポリメラーゼ、０．３μＭの各プライマー、５０ｍＭのＫＣｌ、２．７５ｍＭのＭｇ２Ｃｌ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、およびヒト細胞系のＤＮＡテンプレート、Ｃ３３Ａを含有する増幅反応を、９４℃で２分間を１サイクル、９４℃で１０分間、５５℃で３０分間、および６８℃で１５分間を３５サイクル実施した。増幅産物は、０．６％寒天ゲル上で分離し、α−イメージャーを用いて分析した。５種のプライマー対（表ＩＩ）の各々を用いて予想したサイズを有する産物を得た。各産物を配列決定し、該配列がヒトミトコンドリアＤＮＡ由来であることを確認した。
【表１】
2007535944.tif 000002
【表２】
2007535944.tif 000003
【００３８】
ＨＰＶおよびミトコンドリアのＤＮＡプローブは、QIAGENカラム（Qiagen Inc.；カリフォルニア州、Valencia）上でカラム精製してから、デオキシシトシン三リン酸類似体（図１〜３；TriLink BioTechnologies, Inc.；カリフォルニア州、San Diego）を用いたニックトランスレーションによって標識化した。ＤＮアーゼＩを用いてプローブをニックし、１００〜６００ｂｐの平均サイズを有するニック断片を生成させた。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて、ハプテン標識ｄＣＴＰをニック断片に組み込んだ。次いで、非組み込み遊離ヌクレオチドを、エタノール沈殿またはQIAGENカラム上でのカラム精製によって、反応混合物から除去した。ＣＩＳＨ分析の前に、精製、標識化したプローブを、ホルムアミドベースのハイブリダイゼーション溶液に溶解させた。
【００３９】
（実施例３）
同一のハプテンと検出系を用いたクロモゲンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる核およびミトコンドリアの標的ＤＮＡの分析
同一のハプテンと検出系を用いた核およびミトコンドリアの標的ＤＮＡのＣＩＳＨ分析を、以下のとおり実施した。実施例１に記載されたとおり、ＣａＳｋｉおよび組織生検の子宮頚部病巣細胞を調製した。サンプルは、ホルマリン固定／パラフィン埋め込み組織、ホルマリン固定／パラフィン埋め込み組織培養細胞ペレット、Cytospin調製スライド、およびThinPrep Pap Test検体採集システム（Cytyc Corp.）を用いて調製した固定子宮頚部細胞を含んだ。ＨＰＶおよびミトコンドリアのＤＮＡプローブを調製し、実施例２に記載されているとおり、ニックトランスレーションにより、ビオチン−ｄＣＴＰを用いて標識化した。
【００４０】
ＣＩＳＨは、BenchMark（登録商標）自動スライド染色機（Ventana Medical Systems Inc.）上で実施した。ＨＰＶおよびミトコンドリアのＤＮＡプローブとそれらそれぞれの標的との間のハイブリダイゼーションの程度は、２つの検出方式の１つを用いて判定した。第１の検出方式において、ＨＰＶおよびミトコンドリアのＤＮＡプローブとそれらそれぞれの標的との間のハイブリダイゼーションの程度は、ＨＲＰ／ＤＡＢ検出キットを用いて判定した。このキットは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジンを含むが、これは、ビオチン標識プローブと複合体化し、クロモゲン、３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ）と反応して、褐色の沈殿を形成する。第２の検出方式において、ＨＰＶおよびミトコンドリアのＤＮＡプローブとそれらそれぞれの標的との間のハイブリダイゼーションの程度は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）−ストレプトアビジンを用いて判定したが、これは、ビオチン標識プローブと複合体化し、基質、ブロモクロロインドリル（ＢＣＩＰ）を脱リン酸化し、これが次に、クロモゲン、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と反応して、青色沈殿を形成するか、またはクロモゲン、アゾイックジアゾ成分（Azoic Diazo Component）と反応して、赤色沈殿を形成する。核およびミトコンドリアの標的ＤＮＡのＣＩＳＨ分析は、同じサンプルから調製された別個のスライド上で、または単一のスライド上で実施し、ＨＰＶおよびミトコンドリアのＤＮＡプローブとそれらそれぞれの標的との間のハイブリダイゼーションを、同時に、または連続的に検出した。
【００４１】
（実施例４）
異なるハプテンおよび同一の検出系を用いたクロモゲンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる核およびミトコンドリアの標的の分析
異なるハプテンおよび同一の検出系を用いた核およびミトコンドリアの標的ＤＮＡのＣＩＳＨ分析を、以下のとおり実施した。実施例１に記載されたとおり、ＣａＳｋｉおよび組織生検の子宮頚部病巣細胞を調製した。サンプルは、ホルマリン固定／パラフィン埋め込み組織、ホルマリン固定／パラフィン埋め込み組織培養細胞ペレット、Cytospin調製スライド上の固定組織培養細胞、およびThinPrep Pap Test検体採集システム（Cytyc Corp.）を用いて調製した固定子宮頚部細胞を含んだ。ＨＰＶプローブを調製し、フルオレセイン−ｄＣＴＰまたはＤＮＰ−ｄＣＴＰを用いて標識化し、また、ミトコンドリアＤＮＡプローブを調製し、実施例２に記載されているとおり、ニックトランスレーションにより、ビオチン−ｄＣＴＰを用いて標識化した。
【００４２】
ＣＩＳＨは、BenchMark（登録商標）自動スライド染色機上で実施した。ＨＰＶおよびミトコンドリアのＤＮＡプローブとそれらそれぞれの標的との間のハイブリダイゼーションの程度は、２つの検出方式の１つを用いて判定した。第１の検出方式において、ＨＰＶおよびミトコンドリアのＤＮＡプローブとそれらそれぞれの標的との間のハイブリダイゼーションの程度は、Ventana Medical Systems, Inc.のiVIEW（商標）BlueまたはＶ−Ｒｅｄ検出キットを用いて判定した。ＨＰＶおよびミトコンドリアのＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションは、まず、ハイブリダイゼーション複合体を、ハプテン標識プローブに特異的に結合できる一次抗体に曝露し、次いで、該複合体を、一次抗体に特異的に結合できるビオチン化抗体に曝露することによって検出した。次いで、ビオチン化２次抗体と複合体化するＡＰ−ストレプトアビジンを該反応混合物に加えた。ＡＰ−ストレプトアビジンは、基質、ＢＣＩＰを脱リン酸化し、次にこれが、クロモゲン、ＮＴＰと反応して、青色沈殿を形成するか、またはクロモゲン、アゾイックジアゾ成分と反応して、赤色沈殿を形成する。第２の検出方式において、ＨＰＶおよびミトコンドリアのＤＮＡプローブとそれらそれぞれの標的との間のハイブリダイゼーションの程度は、上記のとおり、ＨＲＰ／ＤＡＢ検出キットを用いて判定した。区別できるクロモゲン検出系によって、核およびミトコンドリアの標的ＤＮＡのＣＩＳＨ分析を、単一のスライド上で実施することができ、ＨＰＶおよびミトコンドリアのＤＮＡプローブとそれらそれぞれの標的との間のハイブリダイゼーションは、同時にまたは連続的に検出される。
【００４３】
（実施例５）
異なるハプテンおよび検出系を用いたクロモゲンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる核およびミトコンドリアの標的ＤＮＡの分析
異なるハプテンおよび検出系を用いた核およびミトコンドリアの標的ＤＮＡのＣＩＳＨ分析を、以下のとおり実施した。実施例１に記載されたとおり、ＣａＳｋｉおよび組織生検の子宮頚部病巣細胞を調製した。サンプルは、ホルマリン固定／パラフィン埋め込み組織、ホルマリン固定／パラフィン埋め込み組織培養細胞ペレット、およびCytospin調製スライド上の固定組織培養細胞を含んだ。ＨＰＶプローブを調製し、フルオレセイン−ｄＣＴＰまたはＤＮＰ−ｄＣＴＰを用いて標識化し、また、ミトコンドリアＤＮＡプローブを調製し、実施例２に記載されているとおり、ニックトランスレーションにより、ビオチン−ｄＣＴＰを用いて標識化した。
【００４４】
ＣＩＳＨは、BenchMark（登録商標）自動スライド染色機上で実施した。ＨＰＶプローブと核ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度は、実施例４に記載されたＡＰ／ＮＢＴ／ＢＣＩＰ検出キットを用いて判定した。ミトコンドリアＤＮＡプローブとミトコンドリアＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの程度は、実施例３に記載されたＨＲＰ／ＤＡＢ検出キットを用いて判定した。核およびミトコンドリアの標的ＤＮＡのＣＩＳＨ分析を、単一のスライド上で実施し、ミトコンドリアＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションの検出に続いて、ＨＰＶプローブのハイブリダイゼーションの検出をおこなった。
【００４５】
（実施例６）
内部対照としてミトコンドリアＤＮＡを用いたクロモゲンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる標的核ＤＮＡの分析
ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ、およびＴ２４細胞系を含有するHPV High Risk Tissue System Control Slides（Ventana Medical Systems, Inc.）、または臨床サンプルのいずれかを用いてＣＩＳＨ分析を実施した。細胞サンプルおよび組織サンプルに対するＨＰＶおよびミトコンドリアのＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを検出するために、３つの異なる色素産生検出系を用いた。ＡＰ／アゾイックジアゾ成分検出系を用いたＣＩＳＨ分析の結果は、図４Ａ〜４Ｂ、４Ｅ〜４Ｆ、および５Ｄに；ＨＲＰ／ＤＡＢ検出系を用いたＣＩＳＨ分析の結果は、図４Ｃ〜４Ｄおよび５Ａ〜５Ｂに；ＡＰ／ＢＣＩＰ／ＮＢＴ検出系を用いたＣＩＳＨ分析の結果は、図５Ｃおよび５Ｅに示されている。
【００４６】
細胞サンプルにおいて、ＨＰＶ染色は、ＣａＳｋｉ細胞（図４Ｈ）とＨｅＬａ細胞（図４Ｉ）の双方に検出されたが、Ｔ２４細胞（図４Ｊ）においては検出されなかった。ミトコンドリアＤＮＡとＨＰＶ双方の染色に関して分析された細胞系において、ＣａＳｋｉ細胞（図４Ａ、４Ｃ、および４Ｅ）とＴ２４細胞（図４Ｂおよび４Ｄ）の双方に、同等のミトコンドリアＤＮＡ染色が見られ、ＨＰＶ染色は、ＣａＳｋｉ細胞（図４Ｆ）のみに見られた。
【００４７】
試験されたすべての臨床サンプル（図５Ａ、５Ｂ、および５Ｄ）に、同等のミトコンドリアＤＮＡ染色が見られたが、ＨＰＶ染色は、子宮頚部病巣サンプル（図５Ｅ）のみに見られた。子宮頚部病巣サンプル（図５Ｂ）と子宮頚部スメアサンプル（図５Ｄ）の双方に、同等のミトコンドリアＤＮＡ染色が見られたため、これらのサンプル（図５Ｃおよび５Ｅ）において見られたＨＰＶ染色の結果は信頼できる。したがって、ＣＩＳＨ分析後に、ミトコンドリアＤＮＡ染色を生じるが、ＨＰＶ染色を生じない組織サンプルまたは細胞サンプルは真のＨＰＶ陰性であると考えることができ、ミトコンドリアＤＮＡ染色を生じない組織サンプルまたは細胞サンプルは、ＨＰＶ染色が陽性、陰性に関わりなく、信頼できないものとして廃棄することができる。
【００４８】
先の開示は、本発明の特定の実施形態を強調するものであり、それと等価なすべての変更または代替は、添付の請求項に記載された本発明の精神および範囲内にあることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】クロモゲンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用するプローブ標識化に好適なジニトロフェニル（ＤＮＰ）標識化ヌクレオチド類似体（ＤＮＰ−ｄＣＴＰ）を示す図である。
【図２】クロモゲンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用するプローブ標識化に好適なビオチン化ヌクレオチド類似体（ビオチン−ｄＣＴＰ）を示す図である。
【図３】クロモゲンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用するプローブ標識化に好適なフルオレセイン標識化ヌクレオチド類似体（フルオレセイン−ｄＣＴＰ）を示す図である。
【図４】内部対照として、ミトコンドリアＤＮＡを用いた、細胞系におけるヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）に関するクロモゲンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す図であり；Ａ枠およびＢ枠では、ＣａＳｋｉ細胞（Ａ枠）またはＴ２４細胞（Ｂ枠）をCytoSpinによって調製し、ＨＰＶおよびミトコンドリアのＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）およびアゾイックジアゾ成分を用いて検出し；Ｃ枠およびＤ枠では、ＣａＳｋｉ細胞（Ｃ枠）およびＴ２４細胞（Ｄ枠）を寒天に埋め込み、４μｍの厚さに切断し、ＨＰＶおよびミトコンドリアのＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）および３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ）を用いて検出し；Ｅ枠およびＦ枠では、ミトコンドリアＤＮＡプローブ（Ｅ枠）およびＨＰＶプローブ（Ｆ枠）の寒天中のＣａＳｋｉ細胞におけるハイブリダイゼーションを、ＡＰおよびアゾイックジアゾ成分を用いて検出し；Ｈ枠〜Ｊ枠では、ＣａＳｋｉ細胞（Ｈ枠）、ＨｅＬａ細胞（Ｉ枠）、またはＴ２４細胞（Ｊ枠）におけるＨＰＶプローブのハイブリダイゼーションを、HPV High Risk Tissue System Control Slide（Ventana Medical Systems, Inc.）を用いて検出した図である。
【図５】内部対照として、ミトコンドリアＤＮＡを用いた、臨床サンプルにおけるヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）に関するクロモゲンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す図であり；Ａ枠では、腎臓組織におけるミトコンドリアＤＮＡのハイブリダイゼーションを、ＨＲＰおよびＤＡＢを用いて検出し；Ｂ枠では、子宮頚部組織におけるミトコンドリアＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを、ＨＲＰおよびＤＡＢを用いて検出し；Ｃ枠では、子宮頚部病巣におけるＨＰＶプローブのハイブリダイゼーションを、ＡＰ、ブロモクロロインドリル（ＢＣＩＰ）、およびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を用いて検出し；Ｄ枠では、子宮頚部スメア液ベース調製物におけるミトコンドリアＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを、ＡＰおよびアゾイックジアゾ成分を用いて検出し；Ｅ枠では、子宮頚部スメア液ベース調製物におけるＨＰＶプローブのハイブリダイゼーションを、ＡＰ、ＢＣＩＰ、およびＮＢＴを用いて検出した図である。
【図１】
2007535944.tif 000004
【図２】
2007535944.tif 000005
【図３】
2007535944.tif 000006
【図４】
2007535944.tif 000007
【図５】
2007535944.tif 000008
【配列表】
2007535944000001.app
【国際調査報告】
2007535944.tif 000009
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