(57)【要約】  本発明は、（ａ）輸送タンパク質トランスコバラミンＩＩ（ＴＣＩＩ）への結合親和性が無いかまたは低く、かつ（ｂ）ビタミンＢ１２代用品として活性を保持し、場合により治療薬および／または診断薬、たとえば放射性金属を担持するコバラミン誘導体に関するものである。これらの化合物は、血液および良性の器官、たとえば腎臓および肝臓中の蓄積率は、新生物組織中の蓄積率に比べてはるかに低く、そして血液からより急速に排除される。本発明はさらに、（ａ）哺乳類を一定期間ビタミンＢ１２欠乏食にさらし、（ｂ）続いて、診断薬および／または治療剤を担持する本発明のコバラミン誘導体を適用することを含む、哺乳類における新生物疾患または微生物による感染の診断方法および治療方法に関するものである。ビタミンＢ１２代用品として働くコバラミン誘導体を選択することにより、新生物組織における耐性子孫の形成の危険性が大きく低減される。
2007515457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）トランスコバラミンＩＩへの結合親和性が無いかまたは低く、かつ
（ｂ）ビタミンＢ１２代用品としての活性を保持する、コバラミン誘導体。
【請求項２】
（ａ）結合テストにおいて、非変性コバラミンの結合親和性に比べた場合、トランスコバラミンＩＩへの結合親和性が２０％未満であり、かつ
（ｂ）増殖試験において、ビタミンＢ１２代用品として、２％より高い活性を保持する、請求項１記載のコバラミン誘導体。
【請求項３】
（ａ）結合テストにおいて、非変性コバラミンの結合親和性に比べた場合、トランスコバラミンＩＩへの結合親和性が１０％未満であり、かつ
（ｂ）増殖試験において、ビタミンＢ１２代用品として、１０％より高い活性を保持する、請求項１記載のコバラミン誘導体。
【請求項４】
（ａ）結合テストにおいて、非変性コバラミンの結合親和性に比べた場合、トランスコバラミンＩＩへの結合親和性が５％未満であり、かつ
（ｂ）増殖試験において、ビタミンＢ１２代用品として、１０％より高い活性を保持する、請求項１記載のコバラミン誘導体。
【請求項５】
治療剤および／または診断剤を担持する、請求項１〜４のいずれか１項記載のコバラミン誘導体。
【請求項６】
放射性金属を担持する、請求項１〜５のいずれか１項記載のコバラミン誘導体。
【請求項７】
式（Ｉ）：
【化１】
2007515457.tif 000029
（式中、Ｒb、Ｒc、Ｒd、およびＲeは、互いに独立に、スペーサー−キレーター基、抗生物質もしくは抗増殖性の治療剤、炭素原子数４〜２０の立体的に必要な有機基、または水素であり；
ＲRは、それぞれリンカーＺを介して結合する、スペーサー−キレーター基または抗生物質もしくは抗増殖性の治療剤、あるいは水素であり；
ただし、Ｒb、Ｒc、Ｒd、Ｒe、およびＲRの少なくとも３個の残基は水素であり、そしてＲb、Ｒc、Ｒd、およびＲeの少なくとも１個の残基は、水素とは異なり；
Ｘは、単座配位子であり；そして
中心コバルト（Ｃｏ）原子は、場合により放射性同位体の形態である）の請求項１〜６のいずれか１項記載のコバラミン誘導体。
【請求項８】
Ｒeが水素である、請求項７記載のコバラミン誘導体。
【請求項９】
スペーサー−キレーター基が、
１個または２個の炭素原子が窒素および／または酸素原子に置換されていてもよく、そして脂肪族鎖がヒドロキシ、オキソまたはアミノで置換されていてもよい炭素原子数２〜１０の脂肪族鎖であるスペーサー、
金属原子と結合するような距離で、窒素、酸素、および硫黄から選択されるドナー原子２個、３個又はそれ以上を有する化合物であるキレーター、および
場合により金属原子
を含む、請求項７または８記載のコバラミン誘導体。
【請求項１０】
キレーターが、式（ＩＩ）〜（ＩＸ）：
【化２】
2007515457.tif 000030
（式中、カルボキシル基はエステルとして含有してもよい）のキレーターから選択される、請求項９記載のコバラミン誘導体。
【請求項１１】
放射性金属が、94mＴｃ、99mＴｃ、188Ｒｅ、186Ｒｅ、111Ｉｎ、90Ｙ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、または177Ｌｕである、請求項６〜１０のいずれか１項記載のコバラミン誘導体。
【請求項１２】
Ｘがシアノ、メチル、ヒドロキシ、アコ、または５’−デオキシアデノシル基である、請求項７〜１１のいずれか１項記載のコバラミン誘導体。
【請求項１３】
Ｘがシアノである、請求項１２記載のコバラミン誘導体。
【請求項１４】
中心コバルト原子が放射性同位体57Ｃｏまたは60Ｃｏである、請求項７〜１２のいずれか１項記載のコバラミン誘導体。
【請求項１５】
Ｒbが、場合により金属原子を担持し、スペーサーが炭素原子数２〜４の脂肪族鎖であり、そしてキレーターが式（ＩＩ）（式中、基ＣＯＯＨが場合によりエステルの形態である）であるスペーサー−キレーター基であり；
Ｒc、Ｒd、Ｒe、およびＲRが水素であり；そして
Ｘがシアノである、請求項１０記載のコバラミン誘導体。
【請求項１６】
Ｒbが、場合により金属原子を担持し、スペーサーが炭素原子数４の脂肪族鎖であり、そしてキレーターが式（ＩＩ）（式中、基ＣＯＯＨはエチルエステルの形態である）であるスペーサー−キレーター基であり；
Ｒc、Ｒd、Ｒe、およびＲRが水素であり；そして
Ｘがシアノである、請求項１５記載のコバラミン誘導体。
【請求項１７】
Ｒdが、場合により金属原子を担持し、スペーサーが炭素原子数３の脂肪族鎖であり、そしてキレーターが式（ＩＩ）（式中、基ＣＯＯＨは、場合によりエステルの形態である）であるスペーサー−キレーター基であり；
Ｒb、Ｒc、Ｒe、およびＲRが水素であり；そして
Ｘがシアノである、請求項１０記載のコバラミン誘導体。
【請求項１８】
Ｒbが、場合により金属原子を担持し、スペーサーが炭素原子数２の脂肪族鎖であり、そしてキレーターが式（ＩＩＩ）であるスペーサー−キレーター基であり；
Ｒc、Ｒd、Ｒe、およびＲRが水素であり；そして
Ｘがシアノである、請求項１０記載のコバラミン誘導体。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項記載のコバラミン誘導体を含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
（ａ）腫瘍性疾患または感染の疑いのある哺乳類を、一定期間ビタミンＢ１２欠乏食にさらし、
（ｂ）続いて、診断剤を担持する請求項１〜１８のいずれか１項記載のコバラミン誘導体を適用すること
を含む、哺乳類における腫瘍性疾患または微生物による感染の診断方法。
【請求項２１】
（ａ）治療が必要な哺乳類を一定期間ビタミンＢ１２欠乏食にさらし、
（ｂ）続いて、治療剤を担持する請求項１〜１８のいずれか１項記載のコバラミン誘導体を適用すること
を含む、腫瘍性疾患または微生物による感染を患う哺乳類の治療方法。
【請求項２２】
腫瘍性疾患もしくは微生物による感染の診断方法における、または腫瘍性疾患もしくは微生物による感染を患う哺乳類の治療方法における、請求項１〜１８のいずれか１項記載のコバラミン誘導体の使用。
【請求項２３】
癌の画像化における請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
腫瘍性疾患もしくは微生物による感染の診断方法において、または腫瘍性疾患もしくは微生物による感染を患う哺乳類の治療方法において使用するための薬学的組成物の製造のための、請求項１〜１８のいずれか１項記載のコバラミン誘導体の使用。
【請求項２５】
癌画像化用薬学的組成物の製造のための、請求項２４記載のコバラミン誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多細胞生物において急速に増殖する望ましくない細胞をイメージングおよび破壊する方法に関するものである。
【０００２】
背景技術
異常な細胞の増殖、特に過増殖は、多数の疾患（もっとも重い疾患は癌である）の源である。アメリカ合衆国単独で、毎年、約１５０万人の人々が癌と診断され、そして５０万人がそれがもとで死亡する。癌との戦いは、いくつかは成功したが多数の後退も見られている。腫瘍および転移の早期および正確な定位と同様に、抗癌剤の激しい副作用および癌細胞の耐性子孫の発生が主要な問題である。
【０００３】
過増殖する細胞、たとえば多くの癌細胞は、栄養の補給、成長因子、エネルギー、およびビタミンの増加に依存している。細胞の成長に不可欠であり、補給不足であることが多いビタミンの補給ルートを用いて、おそらくは薬物をこれらの不要な細胞に輸送することができるであろう。
【０００４】
ビタミンＢ１２としても公知であり、シアノ−コバラミン（ＣＮ−ＣｂＩ）、ヒドロキシル−コバラミン（ＨＯ−ＣｂＩ）、またはアコ−コバラミン（Ｈ2Ｏ−ＣｂＩ）として存在するコバラミン（ＣｂＩ）は、生物に不可欠であり、その体内濃度は極めて低い。ヒトを含む高等生物は、その食物から該ビタミンを得なければならない。コバラミンの生合成は、いくつかの原核生物、たとえば嫌気性バクテリアに限られている。コバラミンは、神経系の適切な機能にとって重要であり、炭水化物、タンパク質、および脂肪の適切な代謝に必要である。コバラミンは、不可欠な細胞内の代謝経路において用いられる。メチル−コバラミン（Ｍｅ−ＣｂＩ）として、それはメチオニンシンターゼ用補因子として機能する。５’−デオキシアデノシル−コバラミン（Ａｄｏ−ＣｂＩ）として、それはメチルマロニル−ＣｏＡをスクシニル−ＣｏＡへの転位において、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと一緒に機能する。コバラミン欠乏は悪性貧血を招くおそれがある。コバラミンは、ＤＮＡを生成するための、リボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドへの還元的転化にも関与する。
【０００５】
哺乳類において、ほとんどの細胞のコバラミンの取り込みは、血清輸送タンパク質および細胞膜受容体により調節されている。血漿中には２つのタイプのコバラミン結合タンパク質：非グリコシル化タンパク質トランスコバラミンＩＩ（ＴＣＩＩ）ならびにグリコシル化タンパク質トランスコバラミンＩおよびＩＩＩ（ＴＣＩおよびＴＣＩＩＩ）があり、Ｒ−バインダータンパク質またはハプトコリンとも言う。ＴＣＩおよびＴＣＩＩＩは免疫学的に交差反応性であり、おそらくその炭水化物組成物だけが異なる。ＴＣＩは循環中に見出された最初のＲ−バインダーである。簡単にするために、Ｒ−バインダータンパク質ＴＣＩとＴＣＩＩＩの両方を意味する場合、用語ＴＣＩを使用する。輸送タンパク質（ベクター）ＴＣＩおよびＴＣＩＩの両方のタイプは、部分的に飽和の（ホロ）である場合も、または部分的に不飽和の（アポ）場合もコバラミンと共に哺乳類の血液中を循環する。通常の細胞中に、幾分低い効率でコバラミンに対するベクターレス取り込みシステムも哺乳類の細胞中に存在する（Sennet, C. and Rosenberg, L. E., Ann. Rev. Biochem., 50, 1053-86 (1981)を参照）。
【０００６】
ＴＣＩＩは、受容体を介したエンドサイトーシスによって、血漿コバラミンを、全ての代謝的に活性な細胞へ送達するのに機能する。腫瘍の新生における加速された細胞の増殖は、循環から受容体を介したエンドサイトーシス取り込みによりＴＣＩＩに負荷されたコバラミンの消費の増加を主として伴うことが周知である。チミジンおよびメチオニン製造、ＤＮＡ合成のメチル化反応、ならびにミトコンドリア代謝を介する細胞のエネルギー使用の増加した代謝の需要を満たすための、ＴＣＩＩ受容体の数における上向き調節は、悪性の細胞系において広く実証されている。
【０００７】
一般的なＴＣＩＩ受容体は全ての組織中に存在するが、２番目以降の器官特異性の特定のＴＣＩＩ受容体（メガリン（megalin）と呼ばれる）は、腎臓近位尿細管および他のいくかの吸収性上皮中で激しく発現している。エンドサイトーシス内在化の後で、ＴＣＩＩはリソソーム中で分解され、遊離コバラミンは細胞質および核膜の内側に運ばれ、そこでそれはＭｅ−ＣｂＩおよびＡｄｏ−ＣｂＩに転化される。これらの２つの形態はビタミンＢ１２の活性の補酵素として働く。ＴＣＩＩの欠くことのできない役割は、遺伝性の先天的なＴＣＩＩの欠如は、巨大赤血球性貧血、好ましくない神経障害、さらに過剰なコバラミンで治療しない場合は死亡を導くという観察により、はっきりと立証されている。
【０００８】
ほとんど全ての細胞がＴＣＩＩを産出することができる。多くの細胞、たとえば肝細胞、線維芽細胞、神経細胞、腸細胞、およびマクロファージは、多量のＴＣＩＩを合成する。血管内皮がＴＣＩＩの第一の源であると考えられる。循環するコバラミンの約２０〜３０％は、ホロ−ＴＣＩＩとしてＴＣＩＩに結合されている。これは、全ての組織においてコバラミンの内在化を確かにする代謝的に有効な形態である（Rothenberg, E.et al., in: Chemistry and Biochemistry of B12, ed. R. Banerjee, New York, NY, 1999, pp. 441-473を参照）。
【０００９】
ＴＣＩは、血液および血漿中、ならびにほとんどの外分泌および他の液体中に存在する。それは主に、前腸組織、胃粘膜、唾液腺、涙腺、および内耳の腺上皮において生成する。ＴＣＩは、ＴＣＩＩとは違って、そのコバラミンを細胞の取り込みのために主として送達するとは思われず、血液中での半減期が長く、したがって任意の特定の瞬間に７５％より多い循環するコバラミン（およびコリン(corrin））を保持する。ほとんど全てのＴＣＩはホロ−ＴＣＩとして循環する。その役割は完全には理解されていない。全種類のコバラミンおよびコリンの微生物への補給を妨げることにより、静菌剤として機能することが提案されている。それは、アデノシル−コバラミンを安定させることもでき、それを光分解から保護する。循環中でＴＣＩＩよりも高い濃度を有するＴＣＩとは異なり、ＴＣＩＩのレベルは、入ってくるコバラミンに応答してアポＴＣＩＩを新規合成することにより極めて速く高めることができる。ＴＣＩはややゆっくり生成され、どんな誘引刺激にも、応答して実質的に促される可能性はない（Alpers, D. and Russell, G., in: Chemistry and Biochemistry of B12, supra pp. 411-441を参照）。
【００１０】
これまで、哺乳類の細胞におけるコバラミンのベクターレス（vector-less）取り込みは、コバラミン誘導体を過増殖する細胞へ補給する代わりのルートとしては考えられていなかった。哺乳類の良性の細胞によるコバラミンの取り込みの生理的に重要な機構は、ベクターＴＣＩＩおよびＴＣＩ（および消化管における固有の要因）を必要とすることは明白である。しかし、インビボおよびインビトロデータから、遊離コバラミンはベクタータンパク質の関与なしに形質膜を超えることもできることが分かる。遊離コバラミンを捕捉するさらなる能力の直接の証拠が、ＴＣＩＩが先天的に全く欠乏している子供の研究によってもたらされ、その子供たちに遊離コバラミンを非経口的投与すると、細胞内のコバラミン欠乏の臨床的および化学的兆候の著しい回復をまねく（Hall, C.E.  et. al.  Blood, 53, 251-263 (1979)を参照）。インビトロ研究は、HeLa細胞および線維芽細胞における遊離コバラミンの取り込みを示した。HeLa細胞での、遊離コバラミンの取り込みは、ＴＣＩＩ−結合されたコバラミンに対する値の１〜２％である。ヒト線維芽細胞を用いた、２時間間隔での遊離コバラミン蓄積は、ＴＣＩＩ−結合されたビタミンについて示されたものの約２０％に達する。ヒト線維芽細胞中の遊離ビタミン取り込みシステムは、BerlinerおよびRosenbergによりいくらか詳細に研究されている（Berliner, N. and Rosenberg,L.E., Metabolism, 30, 230-236 (1981））。遊離ＣＮ−［57Ｃｏ］−ＣｂＩの取り込みは２相システムとして確立されている：最初の取り込み部分は、迅速で、飽和でき、過剰な非標識化したＣＮ−ＣｂＩおよびＯＨ−ＣｂＩにより特異的に阻害され、３０分内で完結する。２番目の取り込み部分は遅く、時間に対して直線性で、過剰な非標識化したコバラミンにより阻害されず、８時間後でも頭打ちにならず、非特異的過程の特有の特質を示唆する。取り込みの最初のモードは、タンパク質を介する高い特異性の膜横断の特性を有し；それはスルフヒドリル試薬に敏感であり、シクロヘキシミドにより著しく阻害される（Sennet, C. and Rosenberg, L.E., Ann. Rev. Biochem. 50, 1053-86 (1981)）。これらの特性は、哺乳類における、タンパク質を介し、促進された遊離コバラミンの取り込みシステムの存在と合致している。
【００１１】
多くのバクテリアおよび全ての真核原生生物は、ビタミンＢ１２に対して栄養素要求株であり、哺乳類の固有の要因、ＴＣＩおよびＴＣＩＩよりも高い親和性でそれに結合することができることが明らかに確立されている。バクテリアおよび原生生物のＢ１２−結合タンパクはベクターレス作動細胞表面タンパク質であり種々のコリン（真のコバラミンを含む）と高い結合活性で結合することができる。したがって、放射性標識化したコバラミン誘導体の適用後の、全身像における細菌性感染の検出は、驚くべきことではなかった（Collins, D.A. et al., Mayo Clin. Proc. 75, 568-580(2000)）。哺乳類の細胞の過増殖する形態の発生は、すでに存在するベクターレスコバラミン取り込みシステムのより有効な形態の多段階発癌による発生を明らかに伴う。
【００１２】
放射性金属同位体を含む種々の生物活性剤に対してコバラミンをキャリヤとして用いる、研究方法が発表され特許化されている（Collins, D.A., US Pat. Appl. No., 2003/0144198を参照）。動物およびヒトにおいて得られた結果は、放射性標識化したコバラミン誘導体を使用する場合、腫瘍組織の標識化を示したが、健康な組織、たとえば腎臓および肝臓中でも、放射能の強い蓄積を示した。したがって、イメージングおよび放射線治療は最適には遠い。体の健康な器官の一部に重大な損傷をまねく可能性が今まで述べた適用を制限する。
【００１３】
診断用および治療用のコバラミン誘導体を、急速増殖する細胞に、通常の細胞に比べてより高い濃度で投与するための、化合物、組成物、および方法が明らかに必要とされている。本発明の目的は、異常に高増殖する細胞に対してより高い特異性を有するが、耐性細胞の子孫の発生を回避するコバラミン誘導体を同定し、合成し、特徴づけし、そして適用する新規な方法を提供することである。
【００１４】
発明の開示
本発明は、輸送タンパク質トランスコバラミンＩＩ（ＴＣＩＩ）への結合が無いかまたははるかに低いコバラミン誘導体を、適切に適用した場合、コバラミンそれ自体とは異なり、血液ならびに良性の器官、たとえば腎臓および肝臓中の蓄積率は、腫瘍性組織（新生物組織ともいう）中の蓄積率に比べてはるかに低く、そして血液からより急速に排除されるという観察に基づいている。ビタミンＢ１２代用品として働くコバラミン誘導体を選択することにより、新生物組織における耐性子孫の形成の危険性が大きく低減される。
【００１５】
本発明は、
（ａ）トランスコバラミンＩＩへの結合親和性が無いかまたは低く、かつ
（ｂ）ビタミンＢ１２代用品として活性を保持する、コバラミン誘導体に関するものである。
【００１６】
特に本発明は、
（ａ）結合テストにおいて、非変性コバラミンの結合親和性に比べた場合、トランスコバラミンＩＩへの結合親和性が２０％未満、好ましくは５％未満であり、かつ
（ｂ）増殖試験において、ビタミンＢ１２代用品として、２％より高い活性を保持する、コバラミン誘導体に関するものである。
【００１７】
ＴＣＩＩに対する結合親和性が低いか無い本発明の化合物の例は、治療剤および／または診断剤、たとえば放射性金属を担持する特定のコバラミン誘導体である。本発明の化合物は、精製したＴＣＩＩを用いる結合テストと、テスト生物としてLactobacillus delbrueckiiを用いる増殖試験の双方の結果に基づいて選択される。
【００１８】
本発明は、さらに、
（ａ）腫瘍性疾患（新生物疾患ともいう）または感染を負う疑いのある哺乳類を、一定期間ビタミンＢ１２欠乏食にさらし、
（ｂ）続いて、診断薬を担持する本発明のコバラミン誘導体を適用すること
を含む、哺乳類における新生物疾患または微生物による感染の診断方法に関するものである。
【００１９】
本発明は同様に、
（ａ）治療が必要な哺乳類を一定期間ビタミンＢ１２欠乏食にさらし、
（ｂ）続いて、治療剤を担持する本発明のコバラミン誘導体を適用すること
を含む、新生物疾患または微生物による感染を患う哺乳類の治療方法に関するものである。
【００２０】
本発明は、新生物疾患もしくは微生物による感染の診断方法における、または新生物疾患もしくは微生物による感染を患う哺乳類の治療方法における、本発明によるコバラミン誘導体の使用にも関するものである。
【００２１】
本発明は、さらに、本発明のコバラミン誘導体を含む薬学的組成物、特に診断用途に適切な薬学的組成物および治療用途に適切な薬学的組成物、ならびに診断方法および治療上の処置方法におけるこのような薬学的組成物の使用に関するものである。
【００２２】
本発明は、本発明による診断または治療上の処置において有用な化合物の製造用中間体、特に、結合放射性金属用キレーターで置換されているがキレーターに結合された金属または非放射性金属を有しない化合物にも関するものである。
【００２３】
本発明によるコバラミン誘導体は、攻撃的な、急速に進行する新生物疾患、たとえば癌の診断および／または治療ならびに／あるいは病原性微生物による局部感染の診断および／または治療にとって、特に高い価値がある。
【００２４】
発明の詳細な説明
コバラミンベクタータンパク質（または輸送タンパク質）ＴＣＩＩへの結合親和性が無いかまたは極めて低いコバラミン誘導体は、ビタミンＢ１２欠乏食にさらした哺乳類に適用した場合、過増殖する細胞中では高い取り込み率を維持しながら、血液中ならびに重大な器官、たとえば腎臓および肝臓中で大きく低減した蓄積を示し、したがって、新生物疾患および微生物による局部感染のより明確な診断および治療を可能にする。
【００２５】
ＴＣＩＩへの結合親和性が低く、かつビタミンＢ１２活性を維持する本発明の化合物は、たとえば式（Ｉ）：
【００２６】
【化３】
2007515457.tif 000003
【００２７】
（式中、Ｒb、Ｒc、Ｒd、およびＲeは、互いに独立に、スペーサー−キレーター基、抗生物質もしくは抗増殖性の治療剤、炭素原子数４〜２０の立体的に必要な有機基（sterically demanding organic group）、または水素であり；
ＲRは、それぞれリンカーＺを介して結合する、スペーサー−キレーター基または抗生物質もしくは抗増殖性の治療剤、あるいは水素であり；
ただし、Ｒb、Ｒc、Ｒd、Ｒe、およびＲRの少なくとも３個の残基は水素であり、そしてＲb、Ｒc、Ｒd、およびＲeの少なくとも１個の残基は、水素とは異なり；
Ｘは、単座配位子であり；そして
中心コバルト（Ｃｏ）原子は、場合により放射性同位体の形態である）の化合物である。
【００２８】
特定の態様では、Ｒeは水素である。
【００２９】
単座配位子Ｘは、たとえばシアノ；
ハロゲン、たとえばフルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨード、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、またはイソチオシアナト；
直鎖状または分岐状の、１〜２５個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子を含むアルキル、たとえばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、またはイソブチル、あるいはｎ−ヘキシル、またはｎ−デシル、そして場合によりヒドロキシ、メトキシ、またはアミノで置換された、たとえばヒドロキシメチル、メトキシメチル、アミノメチル、ヒドロキシエチル、またはメトキシエチル；
ニトリルＲ−ＣＮ、イソニトリルＲ−ＮＣ、カルボキシレートＲ−ＣＯＯ-、またはチオレートＲ−Ｓ-（式中、Ｒは、直鎖状または分岐状の、１〜１５個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を含むアルキル、またはアリール、たとえばフェニルまたはナフチルである）、たとえばアセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル、メチルイソシアニド、フェニルイソシアニド、アセテート、プロピオネート、ベンゾエート、メチルチオレート、エチルチオレート、ｎ−ヘキシルチオレート、またはチオフェノレート；
ホスファイト（ＲＯ）3Ｐ（式中、置換基Ｒは同じか異なり、１〜６個の炭素原子を含むアルキルまたはアリール、たとえば場合により置換フェニルまたはナフチルを表す）、たとえばトリメチルホスファイト、メチルジフェニルホスファイト、トリフェニルホスファイト、またはトリ−ｏ−トリルホスファイト；
ヒドロキシまたはアコ（aquo）；あるいは
５’−デオキシアデノシル基または関連するヌクレオシドである。
【００３０】
好ましくは、Ｘは、シアノ、メチル、ヒドロキシ、アコ、または５’−デオキシアデノシル基である。シアノがもっとも好ましい。
【００３１】
置換基Ｒb、Ｒc、Ｒd、Ｒe、またはＲRとしてのスペーサー−キレーター基は、コバラミンのＮＨまたはＯ官能基にスペーサーを介して結合された金属原子に対するキレーターであり、場合により金属原子、特に放射性金属原子を担持する。
【００３２】
スペーサー−キレーター基が金属原子を担持しない式（Ｉ）の化合物は、本発明による診断方法および／または治療上の処置において有用な化合物の製造で使用する中間体である。
【００３３】
置換基Ｒb、Ｒc、Ｒd、Ｒe、またはＲRとしての抗生物質または抗増殖性の治療剤は、アミノグリコシド系抗生物質、たとえばゲンタマイシン、テトラサイクリン系抗生物質、代謝拮抗物質、たとえばセレノメチオニン、マクロライド系抗生物質、たとえばエリスロマイシンおよびトリメトプリムから選択される抗生剤、あるいは、代謝拮抗物質、たとえば５−フルオロウラシル、アルキル化剤、たとえばオキサリプラチン、dacarbazin、シクロホスファミド、もしくはカルボプラチン、細胞周期阻害剤、たとえばビンブラスチンまたはドセタキセル、ＤＮＡブレーカー(breaker)（トポイソメラーゼ阻害剤、インターカレーター(intercalator)、ストランドブレーカー(strand breaker)）、たとえばドキソルビシン、ブレオマイシン、またはトポテカン、情報伝達経路を干渉する化合物、たとえばカスパーゼ活性調節剤、細胞死受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト、ならびにヌクレアーゼ、ホスファターゼ、およびキナーゼの調節剤、たとえばイマチニブメシラート、デキサメタゾン、ホルボールミリステートアセテート、サイクロスポリンＡ、クエルセチン、またはタモキシフェンから選択される抗増殖剤であり、いずれもコバラミンのＮＨまたはＯ官能基に直接に結合されるか、またはスペーサーを介して共有結合される。
【００３４】
スペーサーは、１個または２個の炭素原子を窒素および／または酸素原子に代えられていてもよく、そして脂肪族鎖がヒドロキシ、オキソ、またはアミノで置換されていてもよい炭素原子数２〜１０、好ましくは炭素原子数２〜６、たとえば炭素原子数２〜５の脂肪鎖である。特に２個の隣接する炭素原子がアミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−またはエステル官能基−Ｏ−ＣＯ−で置換されていてもよい。
【００３５】
コバラミンのＮＨまたはＯ官能基をキレーターと結合する顕著なスペーサーは、エチレン、プロピレン、ブチレン、またはペンチレン基、あるいは１個の炭素を酸素もしくは窒素に代えるか、または１個の炭素原子を酸素もしくは窒素に代え、隣接する炭素原子がオキソで置換されたような基である。
【００３６】
キレーターは、金属原子と結合するような距離で、窒素、酸素、および硫黄から選択されるドナー原子を２個、３個以上有する化合物である。顕著なキレーターは、互いに金属原子の結合が可能な距離にＮ、Ｏおよび／またはＳドナー原子を含む３箇所の金属結合部位を有する三座キレーターである。ドナー原子としての窒素原子は、たとえば脂肪族アミン、芳香族アミン、または窒素含有芳香族複素環の一部である。ドナー原子としての酸素原子は、たとえばアルコール、エーテル、エステル、またはカルボキシ官能基である。ドナー原子としての硫黄原子は、たとえばチオエーテルまたはチオールである。ドナーは、たとえば脂肪族の炭素鎖あるいはアミド結合および／またはエーテル官能基を含む鎖により結合することができ、アミノ酸誘導体、ポリエーテルなどとすることができる。
【００３７】
好ましいキレーターは、式（ＩＩ）〜（ＩＸ）のキレーターである。カルボキシル基は、金属原子との錯体形成に付随して開裂して配位カルボキシレート基を得るエステルとして含有できる。このようなエステル化されたキレーターにおいて、エステルは、アルキルが直鎖状または分岐状であり、そして１〜２５個の炭素原子を含み、場合により１〜５個の炭素原子が窒素または酸素に代えられるか、または１個もしくは２個の炭素原子が硫黄またはリンに代えられ、場合によりフェニル、ピリジル、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、オキソ、またはアミノで置換されたアルキルエステルとすることができる。エステルは、アリールまたはヘテロアリールが、３〜１０個の炭素原子と、０、１、もしくは２個の酸素、０、１、２、もしくは３個の窒素、または０もしくは１個の硫黄原子とを有するアリールまたはヘテロアリールエステルとすることもできる。このようなエステル残基は、特定の反応条件下でそれらを開裂可能にするために、たとえばカルボン酸に対する保護基として通常用いるエステルについて記載されているように（Green, T. W., and Wuts, P. G. M., Protective groups in organic synthesis, Wiley 1999を参照）適切に置換されていてもよい。
【００３８】
エステル化された、たとえばメチル、エチル、またはシアノエチルでエステル化されたキレーターも、好ましいキレーターの定義に含まれる。
【００３９】
【化４】
2007515457.tif 000004
【００４０】
考慮に入れる放射性金属は、放射性同位体、たとえば94mＴｃ、99mＴｃ、188Ｒｅ、186Ｒｅ、111Ｉｎ、90Ｙ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、および177Ｌｕ、特に99mＴｃ、188Ｒｅ、186Ｒｅ、および111Ｉｎである。
【００４１】
考慮に入れるＣｏの放射性同位体は、たとえば57Ｃｏおよび60Ｃｏである。
【００４２】
炭素原子数４〜２０の立体的に必要な有機基は、たとえば、場合によりヒドロキシ、アルコキシ、オキソ、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、またはアルコキシカルボニルで置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、またはヘテロアリールアルキル基である。アリール基の例は、フェニル、メチルフェニル、ジメチルフェニル、ヒドロキシフェニル、またはナフチルである。ヘテロアリール基の例は、ピリジル、ピロリル、イミダゾリル、またはベンズイミダゾリルである。アルキル鎖において、炭素原子は、窒素または酸素原子に代えられていてもよい。たとえば、アルキル鎖において、１個の炭素原子が窒素（または酸素）原子に代えられていてもよく、隣接する炭素原子がオキソで置換されていてもよく、これによりカルボキサミド（またはエステル官能基、それぞれ）に相当する。立体的に必要な有機基の顕著な例は、イソブチル、ｔ−ブチル、ｔ−ペンチル、ｏ−トリル、ｏ−メチルベンジル、または２，６−ジメチルベンジルである。
【００４３】
ＲRをスペーサー−キレーター基または抗生物質もしくは抗増殖性の治療剤に結合するリンカーＺは、ホスフェート、ホスフォネート、カルボン酸エステル、または炭素原子数１〜１０のアルキレンおよびこれらの組合せの群から選択される結合またはリンカーである。このようなリンカーは、スペーサー−キレーター基または治療剤（場合により前記定義のスペーサーを含む）を、コバラミンの酸素原子に結合する。
【００４４】
ＲRで誘導体化されているが、Ｒb、Ｒc、Ｒd、およびＲeが全て水素である化合物は、ＴＣにより認識され、そしてまだ酵素活性であり、したがって本発明の範囲から除外する。
【００４５】
本発明の化合物の選択は次の基準に基づいている：
（ａ）ＴＣＩＩへの結合親和性が、無いかまたは（非変性の）コバラミンの結合と比べた場合はるかに低く、たとえば２０％未満、特に１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満の結合親和性であり；かつ
（ｂ）ビタミンＢ１２依存バクテリアまたは哺乳類の細胞系を用いる増殖テストにおける、ビタミンＢ１２代用品としての活性が、（非変性の）コバラミンのビタミンＢ１２活性に比べた場合、たとえば２％より高い活性、特に１０％より高い活性、好ましくは２０％より高い活性である。
【００４６】
コバラミン（ＣｂＩ）誘導体のＴＣＩＩへの結合親和性をテストするために、ウサギの血液から得た部分的に精製したＴＣＩＩを用いてインビトロテストを行う。基質としてE. coli発現システムで調製した組み換えＴＣＩＩも使用することができる。
【００４７】
本発明のコバラミン誘導体は、そのビタミンＢ１２代用品としての機能を維持しなければならない。このため、細胞増殖速度をより高めることにつながる耐性の発生の危険性は、極めて低くなるであろう。多分、ＴＣＩＩへの結合活性が低いかまたは無いコバラミン誘導体をもはや捕捉することができない変異細胞は、極めて有効なＴＣＩＩ非依存ビタミンＢ１２取り込み機構のおかげで、高い増殖速度を達成するそれらの先祖細胞の利点を失ってしまうであろう。
【００４８】
コバラミン誘導体のビタミンＢ１２活性をテストするために、Lactobacillus delbrueckiiを用いて、シアノコバラミン（ＣＮ−ＣｂＩ）用国際勧告テスト株により試験を行う。シアノコバラミンを含まない試験培地へのシアノコバラミンの追加は、定量固体拡散プレート試験（quantitative solid diffusion plate assay）により測定することができる、シアノコバラミン栄養素要求株の菌株の増殖応答をまねく。該テストは、コバラミン誘導体が生命維持触媒としてシアノコバラミンにどの程度（％）置き換わることができるかを特定するために用いた。
【００４９】
本発明は、
（ａ）哺乳類を一定期間ビタミンＢ１２欠乏食にさらし、
（ｂ）続いて、診断薬または治療剤を担持する本発明のコバラミン誘導体を適用すること
を含む、哺乳類における新生物疾患および微生物による局部感染の診断方法および治療方法、ならびにこのような方法における本発明のコバラミン誘導体の使用に関するものである。
【００５０】
ビタミン欠乏食にさらした哺乳類において、ＴＣＩＩ非結合シアノコバラミン誘導体適用の、その体内分布へのポジティブな効果を表１に示す。
【００５１】
【表１】
2007515457.tif 000005
実施例５：シアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＰＡｃｅｔ
実施例６：シアノコバラミン−ｂ−ブチル−アミノカルボキシメチル−Ｈｉｓ−ＯＭｅ
実施例８：シアノコバラミン−ｃ−ブチル−ＰＡＰＡｃｅｔ
実施例１０：シアノコバラミン−ｂ−エチル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ
実施例１１：シアノコバラミン−ｂ−プロピル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ
実施例１２：シアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ
実施例１４：シアノコバラミン−ｂ−ヘキシル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ
実施例１８：シアノコバラミン−ｄ−プロピル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ
実施例２０：シアノコバラミン−ｂ−プロピル−Ｈｉｓ−ＯＭｅ
実施例２２：シアノコバラミン−ｂ−エチル−トリアミン
実施例２５：シアノコバラミン−５’−ホスホコラミン−Ｈｉｓ−ＯＭｅ
【００５２】
表１に集めた体内分布分析の結果から、ＴＣＩＩ非バインダー、たとえば実施例１０、１１、１２、１８、および２２に記載の本発明の化合物は、腫瘍において比較的高い蓄積、血液中の５倍以上、ならびに問題とすべき器官、腎臓および肝臓中で見られる量の少なくとも半分を有することが分かる。実施例５、６、８、１４、２０、および２５の化合物は、ＴＣＩＩに結合するので本発明の化合物の定義に該当せず、これらは参照化合物としてのみここで述べる。
【００５３】
本発明によるコバラミン誘導体は、攻撃的な、急速に進行する新生物疾患、たとえば癌の診断および／または治療にとって特に高い価値がある。本発明の化合物は、悪性腫瘍、たとえばメラノーマ、線維肉腫、卵巣嚢腫、膵臓腫瘍、骨肉腫、および急性白血病（ごくわずかの例を挙げると）に関与する、高増殖するヒト由来の細胞の治療に用いることができ、ＴＣＩＩを介したエンドサイトーシスを迂回することができる。本発明の方法は、放射性同位体を担持するまたは／および細胞を破壊する非放射性薬剤を担持するコバラミン誘導体のＴＣＩＩを介した好ましくない取り込みからの、良性器官の特定の保護を可能にする。
【００５４】
本発明の化合物は、癌画像化（イメージング）および癌治療においてばかりでなく、コバラミンの高い直接の取り込みに依存する微生物による局部感染の視覚化および可能性のある治療にも有用である。
【００５５】
抗増殖剤を担持する本発明の化合物は、該薬剤を活性な形態で過増殖する細胞（ここで、細胞内のアミド分解後にその作用を発揮することができる）に輸送するのに有効である。
【００５６】
新生物および／または感染性疾患の治療方法において、適切な治療剤を担持する本発明の化合物は、単独でまたは１種以上の他の治療剤と組み合わせて投与することができ、可能な組み合わせ治療は、固定された組合せの形態、あるいは本発明の化合物および１種以上の他の治療剤をずらしてまたは互いに独立に与える投与、あるいは固定された組合せおよび１種以上の他の治療剤を組み合わせた投与を用いる。本発明の化合物は、そのほかにまたはさらに、特に腫瘍治療については、化学療法、免疫療法、外科手術の介入、またはこれらの組み合わせと一緒に投与することができる。長期間の治療は、他の治療計画の状況において補助治療として同様に可能である。
【００５７】
本発明は、さらに、本発明のコバラミン誘導体を含む薬学的組成物、特に診断用途に適切な薬学的組成物および治療用途に適切な薬学的組成物に関するものである。
【００５８】
非経口的投与用薬学的組成物、たとえば静脈内、筋肉内、または皮下の投与が好ましい。組成物は、活性成分を単独でまたは薬学的に許容される担体とともに含む。活性成分の投与量は、治療する疾患、ならびに種類、その年齢、体重、および個々の病状、個々の薬物動態学のデータ、および投与形態に依存する。
【００５９】
製造方法
本発明の化合物は、当技術分野において公知の標準的な方法により製造する。
【００６０】
好ましくは、シアノコバラミン、すなわち式（Ｉ）（式中、Ｒb、Ｒc、Ｒd、Ｒe、およびＲRは、水素であり、そしてＸはシアノである）の化合物を、制御された条件下、たとえば希鉱酸を用いて加水分解し、得られたモノ酸の混合物（カルバモイル基ＣＯＮＨ2の一つがＣＯＯＨに転化した）を分離する。ビス酸も同様に得ることができる。
【００６１】
次に、シアノコバラミン−ｂ、ｃ、ｄ、またはｅ−酸、すなわちＣＯＮＨＲb、ＣＯＮＨＲc、ＣＯＮＨＲd、またはＣＯＮＨＲeをそれぞれＣＯＯＨに代え、そしてＸがシアノである式（Ｉ）の化合物を、アミド形成の標準条件、たとえばペプチドの化学において公知の条件下、対応するアミンＲb−ＮＨ2、Ｒc−ＮＨ2、Ｒd−ＮＨ2、およびＲe−ＮＨ2それぞれと反応させる。アミド形成を妨げる残基Ｒb、Ｒc、Ｒd、およびＲe中の官能基は、保護された形態であるのが好ましく、そしてアミド形成後に標準的な方法により脱保護する。スペーサーがアミド官能基を含む化合物の製造のために、アミド形成の標準条件下、シアノコバラミン−ｂ、ｃ、ｄ、またはｅ−酸とジアミンＨ2Ｎ（ＣＨ2）nＮＨ2とを反応させ、得られたＨ2Ｎ（ＣＨ2）n−官能化されたシアノコバラミンと対応するカルボン酸とを再びアミド形成の標準条件下でさらに縮合して、置換基Ｒb、Ｒc、Ｒd、およびＲeそれぞれを生成することも可能である。
【００６２】
Ｒcが水素とは異なる化合物製造のための、好ましい方法は、Brown et al., Inorg. Chem. 1995, 3038に記載のｏ−ラクトンの形成、次に還元的ラクトン開環反応である。
【００６３】
ＲRが水素とは異なる化合物の製造のために、シアノコバラミン（またはＲb、Ｒc、Ｒd、またはＲeが水素とは異なるシアノコバラミン誘導体）と、ＲR−Ｌ（式中、Ｌはエステル結合を形成するための適切な活性化脱離基で、たとえばハロゲン、混合無水物の残基、または通例のペプチドおよび核酸合成でのカルボン酸、ホスフェート、もしくはホスフォネートエステル形成のための別の通常の活性化残基である）とを反応させる。
【００６４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００６５】
実施例
Merck、Dietikon（CH）、AldrichまたはFluka、Buchs（CH）からの試薬グレードの化学物質を、それ以上精製せずに使用した。
【００６６】
ＢＯＰ＝１−ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＤＣＣ＝ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン
ＥＤＣ＝１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
Ｆｍｏｃ＝（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル
ＨＯＳｕ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＭＥＳ＝２−（４−モルホリニル）エタンスルホン酸
ＲＴ＝室温
ＴＢＴＵ＝ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＥＡＰ＝トリエチルアンモニウムホスフェート
Ｔｅｏｃ＝２−トリメチルシリル−エトキシカルボニル
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
【００６７】
ＨＰＬＣ分析を、EG & G Berthold LB 508 radiometric検出器を備えたMerck-Hitachi L-7000 systemで、Waters XTerra RP８カラム（粒子寸法５μm、１×１００mm）を用いて、流量１ml/minで行った。クロマトグラムは２５０および３６０nmで記録した。溶媒ａは主に緩衝剤水溶液とした。酢酸ナトリウム緩衝液ａは、酢酸２．９mlと、水９００mlおよびメタノール１００ml中の水酸化ナトリウム（２M）４．５５mlとを混合することにより調製した。トリス緩衝液ａは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（６０５mg）を水に溶解し、ｐＨ８．２に達するまで２MのＨＣｌを加え、容量を１０００mlに調整し、アセトニトリル（１０ml）を加えることにより調製した。溶媒ｂは常にメタノールとした。
【００６８】
分取ＨＰＬＣ分離を、Prostar ２１５ポンプ２個およびProstar ３２０ＵＶ／Ｖｉｓ検出器を備えたVarian Prostar systemで、Waters XTerra Prep RP８カラム（粒子寸法５μm、３×１００mmおよび３０×１００mm）を用いて行った。流量は、３×１００mmのカラムに対して４ml/minおよび３０×１００mmのカラムに対して３０ml/minとした。
【００６９】
ＵＶ／ＶｉｓスペクトルはVarian Cary 50 spectrometerで記録し、ＩＲスペクトルはBio-Rad FTS-45 spectrometerでＫＢｒ錠剤に押し固めたサンプルを用いて記録した。Electrospray ionisation massスペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）は、Merck Hitachi M-8000 spectrometerで記録した。レニウム化合物においては、187Ｒｅ同位体の値を示した。ＮＭＲスペクトルはBruker DRX 500 MHz spectrometerで記録した。化学シフトは、参照として残留の溶媒プロトンに対して示した。
【００７０】
コバラミン誘導体（mgの量）は、化合物の水溶液をChromafix RP18ce カートリッジに適用し、次に水で十分にすすぐことにより脱塩した。脱塩した生成物を次にメタノールで溶出し、溶媒を真空中で除去し、生成物を高真空で乾燥した。多量（５０mgより多）の場合は、Meth. Enzymol. 1971, 18(3), p. 43に記載のフェノール抽出により脱塩した。
【００７１】
（Ｎ−３−アミノプロピル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ）酢酸エチルエステル（プロピル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ）を、ペンチル類似化合物についてSchibli et al. (Nucl. Med.  Biol. 2003, 30, 465)に記載されているように製造した。この化合物は塩基性条件下で環化する傾向がある。したがって、Ｂｏｃ保護された中間体を保管し、さらなる官能化の直前に、希釈ＨＣｌ水溶液中で攪拌することによりＢｏｃを除去した。エチルおよびヘキシル誘導体は類似方法で製造した。
【００７２】
Ｒｅ（［Ｎ−３−アミノプロピル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ］酢酸）（ＣＯ）3を、完全に脱保護された（Ｎ−３−アミノプロピル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ）酢酸と、（ＮＥｔ４）２［Ｒｅ（ＯＨ２）３（ＣＯ）3］とを反応させることにより製造した。
【００７３】
メチル１−カルボキシメチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−ヒスチジナートトリフルオロアセテートを、Pak et al. (Chem. Eur. J. 2003, 9, 2053-2061)に記載されているように製造した。化合物をＨＣｌ（０．０５M）中で攪拌し、次に真空中、室温で蒸発させることにより、対イオンを塩素に交換した。
【００７４】
メチル３−アミノプロピル−Ｎ−Ｔｅｏｃ−ヒスチジナートを、van Staveren et al.(Organic & Molecular Chemistry 2004, 2, 2593)に記載されているように製造した。
【００７５】
３−（Ｎ−２−シアノエトキシカルボニルメチル）−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ）プロピオン酸４−ニトロ−フェニルエステルを、Kunze(Dissertation, University of Zurich, 2004)に記載されているように製造した。
【００７６】
実施例１：シアノコバラミンモノカルボン酸（ｂ、ｄおよびｅ）
Pathare et al. (Bioconjugate Chem. 1996, 217) に記載されているように、ビタミンＢ１２（１．８８g、１．３９mmol）を、ＨＣｌ０．１M（１９０ml）中で加水分解した。精製は次のように変更した。フェノール抽出による脱塩後、Dowexカラムで、３つの画分、ｄ−酸だけを含有する画分、ｂ−酸およびｄ−酸だけを含有する第２の画分、ｂ−酸およびｅ−酸だけを含有する第３の画分に単離させた。ｂ−酸およびｄ−酸の混合物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Waters XTerra Prep RP8、５μm、３０×１００mm；勾配ａ／ｂ０．５％min-1、１００％酢酸緩衝液ａから出発）により分離した。溶媒ａとしてトリス緩衝液を用いたほかは、同じシステムでｂ−酸およびｅ−酸の混合物を分離した。シアノコバラミン−ｂ−酸を収量２８０．６mg（１４．９％）で、シアノコバラミン−ｄ−酸を収量１３１．５mg（７．０％）で、およびシアノコバラミン−ｅ−酸を収量９４．２６mg（５．０％）で単離した。
【００７７】
実施例２：シアノコバラミン−ｂ−（２−アミノエチル）アミド［シアノコバラミン−ｂ−エチルアミン］
シアノコバラミン−ｂ−（２−アミノエチル）アミドを、ドデカン類似化合物の合成に対してPathare et al. (Bioconjugate Chem. 1996, 217)に記載されているように製造した。エチレンジアミン（１３２mg；０．１４７ml；２．２mmol）をＤＭＦ／Ｈ2Ｏ混合物（１０ml；１／１v/v）に溶解した。１MのＨＣｌの添加によりｐＨを５に調整した。この溶液にシアノコバラミン−ｂ−酸（６０．０mg、４４．４μmol）およびＫＣＮ（５７mg；０．８７mmol）を加え、次にｐＨを５．５に調整した。次に、ＥＤＣ（８４．２mg；０．４３mmol）およびＨＯＳｕ（５０．６mg；０．４４mmol）を加えた。この混合物をＲＴで３日間攪拌し、追加分のＥＤＣおよびＨＯＳｕを２４時間間隔で加えた。最後に、混合物を乾燥するまで真空中で蒸発させ、次に分取ＨＰＬＣ精製（アセテートシステム、勾配：０．５％min-1、１００％緩衝液ａから出発）して、シアノコバラミン−ｂ−（２−アミノエチル）アミド３４mg（５５％）を得た。
【００７８】
【表２】
2007515457.tif 000006
【００７９】
実施例３：シアノコバラミン−ｂ−（４−アミノブチル）アミド［シアノコバラミン−ｂ−ブチルアミン］を、エチル類似化合物の合成について上述したように製造した。
【００８０】
【表３】
2007515457.tif 000007
【００８１】
実施例４：シアノコバラミン−ｂ−エチル−ＰＡＰＡｃｅｔ
シアノコバラミン−ｂ−エチルアミン（実施例２；２４mg；１７．２μmol）をＤＭＦ／ＤＭＳＯ混合物（５ml；４／１v/v）に溶解した。この混合物に３−［Ｎ−２−シアノエトキシ−カルボニルメチル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ］−プロピオン酸４−ニトロフェニルエステル（１４mg、３４．１μmol）およびＤＩＰＥＡ（５μl、２９μmol）を加えた。ＲＴで２４時間攪拌後、混合物を乾燥するまで真空中で蒸発させた。分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム、勾配：０．５％min-1、１００％緩衝液ａから出発）により精製して、シアノコバラミン−ｂ−エチル−ＰＡＰＡｃｅｔ２０mg（７０％）を赤色固体として得た。
【００８２】
【表４】
2007515457.tif 000008
【００８３】
実施例５：シアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＰＡｃｅｔ
シアノコバラミン−ｂ−ブチルアミン（実施例３、５．５mg、３．９μmol）および３−［Ｎ−２−シアノエトキシ−カルボニルメチル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ］プロピオン酸４−ニトロフェニルエステル（２．５mg、６．１μmol）を、乾燥ＤＭＳＯ（０．５ml）およびＤＭＦ（０．５ml）の混合物に溶解した。ｐＨ８〜９に達するまでＤＩＰＥＡ（５μl、２９μmol）を加え、混合物を室温で攪拌した。５時間後、ＨＰＬＣ分析により生成物形成が完結したことを確認した。溶媒を真空中で部分的に蒸発させて、エチルエーテルを添加して生成物を沈殿させた。懸濁液を遠心分離にかけ、３回デカンテーションして、微粉末を得た。分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム、勾配：０．５％min-1、１００％緩衝液ａから出発）により精製して、純粋な生成物を収量２．７mg（４１％）で得た。
【００８４】
【表５】
2007515457.tif 000009
【００８５】
実施例６：シアノコバラミン−ｂ−ブチル−アミノカルボキシメチル−Ｈｉｓ−ＯＭｅ
乾燥ＤＭＳＯ（２ml）中シアノコバラミン−ｂ−ブチルアミン（４９．６mg、３４．８μmol）の溶液を、メチル１−カルボキシメチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−ヒスチネート塩酸塩（３５．５μmol）およびＢＯＰ（４６．２mg、１０４．４μmol）に加えた。ＤＩＰＥＡ（１２μl、７０．０μmol）を加え、この溶液をＲＴで１６時間攪拌した。ＨＰＬＣ分析によりコバラミン出発材料がＦｍｏｃ保護された中間体へ完全に転化したことを確認した。ジエチルエーテルを加えることにより中間体を沈殿させ、懸濁液を遠心分離にかけ、２回デカンテーションして微粉末を得た。中間体をＤＭＦ（５ml）に溶解し、ピペリジン（２２５μl）を加えた。ＲＴで１．５時間攪拌後、ジエチルエーテルを加えることにより生成物を沈殿させ、懸濁液を遠心分離にかけ、３回デカンテーションして微粉末を得た。分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム、勾配：１％min-1、１００％緩衝液ａから出発）により精製して、純粋な生成物を収量１７．１mg（３２．１％）で得た。
【００８６】
【表６】
2007515457.tif 000010
【００８７】
実施例７：シアノコバラミン−ｃ−（４−アミノブチル）−アミド［シアノコバラミン−ｃ−ブチルアミン］
シアノコバラミン−ｃ−酸をBrown et al. (Inorg. Chem. 1995, 3038)に記載されているように製造した。１,４−ジアミノブタン（０．０５９ml；０．５９mmol）をＤＭＦ／Ｈ2Ｏ混合物（１０ml；１／１v/v）に溶解した。１MのＨＣｌの添加によりｐＨを５．２に調整した。この溶液にシアノコバラミン−ｃ−酸（１６．０mg、１１．８μmol）、ＫＣＮ（１５．３mg；０．２３６mmol）、ＥＤＣ（９．０mg；４７．４μmol）、およびＨＯＳｕ（５．４mg；４７．２μmol）を加えた。混合物をＲＴで４日攪拌し、追加分のＥＤＣおよびＨＯＳｕを加えた。１日おいた後、追加分のＥＤＣおよびＨＯＳｕを再び加えた。合計６日後、ＨＰＬＣ分析によりコバラミン誘導体が完全に転化したことを確認した。最後に、混合物を乾燥するまで真空中で蒸発させ、次に分取ＨＰＬＣ精製（RP C18カラム、緩衝液ａとしてＨＣｌ１mM、勾配：３０分で２０％メタノールから５０％メタノールまで）して、シアノコバラミン−ｃ−ブチルアミン９．８mg（５８％）を得た。
【００８８】
【表７】
2007515457.tif 000011
【００８９】
実施例８：シアノコバラミン−ｃ−ブチル−ＰＡＰＡｃｅｔ
シアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＰＡｃｅｔの合成（実施例５）で述べたように、シアノコバラミン−ｃ−ブチルアミン（７．０mg、４．９μmol）と３−［Ｎ−２−シアノエトキシカルボニルメチル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ］プロピオン酸４−ニトロフェニルエステル（３．８mg、９．２μmol）とを反応させ、精製して、純粋な生成物を収量３．８mg（７８％）で得た。
【００９０】
【表８】
2007515457.tif 000012
【００９１】
実施例９：シアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＰＡ−Ｒｅ（ＣＯ）3
シアノコバラミン−ｂ−ブチルアミン（実施例３、２４．６mg、１７．２μmol）およびＲｅ（ＣＯ）3（３−［Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ］プロピオン酸）（９．１mg、１７．２μmol）をＤＭＳＯに溶解した。ＢＯＰ（２２．９mg、５１．７μmol）およびＤＩＰＥＡ（２．９４μl、１７．２μmol）を加え、混合物を室温で攪拌した。ＤＩＰＥＡおよびＢＯＰを４日間毎日加えた。ＨＰＬＣ分析により２種の生成物の形成を確認した。エチルエーテルを添加してこれらを沈殿させた。懸濁液を遠心分離にかけ、３回デカンテーションして微粉末を得た。分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム、勾配：０．５％min-1、１００％緩衝液ａから出発）により精製して、主生成物ピークを収量２．３mg（７．０％）で単離させた。
【００９２】
【表９】
2007515457.tif 000013
【００９３】
実施例１０：シアノコバラミン−ｂ−エチル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ
シアノコバラミン−ｂ−酸（２０．０mg、１４．８μmol）をＤＭＳＯ（０．８ml）に溶解した。続いてＤＭＦ（２ml）およびＮＥｔ3（０．１ml）を加えた。異なるフラスコ中、（Ｎ−２−アミノエチル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ）酢酸エチルエステル（エチル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ）塩酸塩（無水ＥｔＯＨ／２MのＨＣｌ混合物（７．５ml；４／１v/v）中で一晩攪拌し、続いて真空中で揮発分を除去することによる、Ｂｏｃ保護された誘導体の開裂を介して製造した）約５当量を、ＤＭＦ／ＮＥｔ3混合物（４．５ml；８／１v/v）に溶解した。２つの溶液を混合し、次にＴＢＴＵ（３２．１mg、０．１mmol）を添加した。ＲＴで４５分攪拌した後、真空中で溶媒を除去した。残留物を分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム、勾配：１．０％min-1、１００％緩衝液ａから出発）により精製して、シアノコバラミン−ｂ−エチル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ１２mg（５１％）を赤色固体として得た。
【００９４】
【表１０】
2007515457.tif 000014
【００９５】
実施例１１：シアノコバラミン−ｂ−プロピル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ
水（１ml）中の製造したての（Ｎ−３−アミノプロピル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ）酢酸エチルエステル（３６１μmol）溶液を、シアノコバラミン−ｂ−酸（６５．０mg、４８．１μmol）に加えた。ＥＤＣ（４６．１mg、２４０μmol）を加え、ＮａＯＨ（０．１M）でｐＨを５．５に調整した。ＲＴで１５時間攪拌した後、ＨＰＬＣ分析（酢酸ナトリウム緩衝液）から、生成物形成が約５０％であることが分かった。ＥＤＣ（４６．１mg、２４０μmol）を再び加えたが、室温での攪拌の延長はさらなる生成物形成を導かなかった。真空中で溶媒を除去し、分取ＨＰＬＣ（勾配ａ／ｂ０．５％min-1、１００％酢酸緩衝液ａから出発）により残留物を精製した。主画分を集め、真空中で溶媒を除去し、生成物を脱塩して、シアノコバラミン−ｂ−プロピル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔを収量２５．８mg（１６．２μmol、３３．３％）で得た。
【００９６】
【表１１】
2007515457.tif 000015
【００９７】
実施例１２：シアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ
シアノコバラミン−ｂ−酸（２０．０mg、１４．８μmol）をＤＭＳＯ（０．８ml）に溶解した。続いてＤＭＦ（２ml）およびＮＥｔ3（０．１ml）を加えた。異なるフラスコ中、（Ｎ−４−アミノブチル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ）酢酸エチルエステル（ブチル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ）塩酸塩（無水ＥｔＯＨ／２MのＨＣｌ混合物（７．５ml；４／１v/v）中で一晩攪拌し、続いて真空中で揮発分を除去することによる、Ｂｏｃ保護された誘導体の開裂を介して製造した）約５当量を、ＤＭＦ／ＮＥｔ3混合物（４．５ml；８／１v/v）に溶解した。２つの溶液を混合し、次にＴＢＴＵ（３２．１mg、０．１mmol）を添加した。ＲＴで４５分攪拌した後、真空中で溶媒を除去した。残留物を、分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム、勾配：１．０％min-1、１００％緩衝液ａから出発）により精製して、シアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ１５mg（６３％）を赤色固体としてを得た。
【００９８】
実施例１３：シアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＭＡ−ＯＨ
ブロモ酢酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルを、乾燥ＴＨＦ中、０℃で、ブロモアセチル臭化物および９Ｈ−フルオレンイルメタノールから製造した。Ｂｏｃ−ブチル−ＰＡＭＡ−ＯＦｍ（［（４−ｔ−ブトキシ−カルボニルアミノ−ブチル）−ピリジン−２−イルメチル−アミノ］−酢酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル）は、Schibli et al.がＢｏｃ−ペンチル−ＰＡＭＡ−ＯＭｅの合成について用いた手順(Nucl. Med. Biol. 2003, 30, 465)にしたがって、Ｂｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ2）4ＮＨ2、ピリジン−２−アルデヒド、およびブロモ酢酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルから製造した。
【００９９】
シアノコバラミン−ｂ−酸（２０．０mg、１４．８μmol）をＤＭＳＯ（０．８ml）に溶解し、続いてＤＭＦ（２ml）およびＮＥｔ3（０．１ml）を加えた。異なるフラスコ中、［（４−アミノ−ブチル）−ピリジン−２−イルメチル−アミノ］−酢酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（ブチル−ＰＡＭＡ−ＯＦｍ）（トリフルオロ酢酸／ＣＨ2Ｃｌ2混合物（４ml；１／２v/v）中で１時間攪拌し、続いて真空中で揮発分を除去することによる、Ｂｏｃ保護された誘導体の開裂を介して製造した）約５当量をＤＭＦ／ＮＥｔ3混合物（４．５ml；８／１v/v）に溶解した。２つの溶液を混合し、次にＴＢＴＵ（３２．１mg、０．１mmol）を加えた。ＲＴで４５分攪拌した後、真空中で溶媒を除去した。残留物を、分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム、勾配：１．５％min-1、１００％緩衝液ａから出発）により精製して、シアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＭＡ−ＯＦｍ１５mgを赤色固体として得た。
【０１００】
シアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＭＡ−ＯＦｍ（１５mg）をＨＮＥｔ2／ＤＭＦ混合物（２／１v/v）３mlに溶解し、ＲＴで２時間攪拌した。真空中で溶媒を除去し、残留物を、分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム、勾配：１．０％min-1、１００％緩衝液ａから出発）により精製してシアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＭＡ−ＯＨ９mgを赤色固体として得た。
【０１０１】
実施例１４：シアノコバラミン−ｂ−ヘキシル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ
シアノコバラミン−ｂ−酸（２０．０mg、１４．８μmol）をＤＭＳＯ（０．８ml）に溶解した。続いてＤＭＦ（２ml）およびＮＥｔ3（０．１ml）を加えた。異なるフラスコ中、Ｎ−６−アミノヘキシル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ）酢酸エチルエステル（ヘキシル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ）塩酸塩（無水ＥｔＯＨ／２MのＨＣｌ混合物（７．５ml；４／１v/v）中で一晩攪拌し、続いて真空中で揮発分を除去することによる、Ｂｏｃ保護された誘導体の開裂を介して製造した）約５当量を、ＤＭＦ／ＮＥｔ3混合物（４．５ml；８／１v/v）に溶解した。２つの溶液を混合し、次にＴＢＴＵ（３２．１mg、０．１mmol）を加えた。ＲＴで４５分攪拌した後、真空中で溶媒を除去した。残留物を、分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム、勾配：１．０％min-1、１００％緩衝液ａから出発）により精製して、シアノコバラミン−ｂ−ヘキシル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ１０mg（４１％）を赤色固体として得た。
【０１０２】
【表１２】
2007515457.tif 000016
【０１０３】
実施例１５：シアノコバラミン−ｂ−エチル−ＰＡＭＡ−Ｒｅ（ＣＯ）3
シアノコバラミン−ｂ−エチル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ（実施例１０、１１mg；７．０μmol）をＮａＨＣＯ3溶液（２M）４mlに溶解した。ＭｅＯＨ１．５ml中の（ＮＥｔ４）２［ＲｅＢｒ3（ＣＯ）3］１１mg（１４．２μmol）の溶液を加えた。この混合物を８５℃で１時間加熱した。混合物をＲＴに至らせた後、それを分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム、勾配：分当り２．０％、緩衝液ａから出発）により精製した。収量：１１mg（８６％）。
【０１０４】
実施例１６：シアノコバラミン−ｂ−プロピル−ＰＡＭＡ−Ｒｅ（ＣＯ）3
シアノコバラミン−ｂ−酸（２６．７mg、１９．８μmol）、Ｒｅ（［Ｎ−３−アミノプロピル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ］酢酸）（ＣＯ）3（２９．２mg、６０μmol）、ＥＤＣ（１１．５mg、６０μmol）、およびＨＯＳｕ（６．９mg、６０μmol）を、水（５ml）およびＤＭＳＯ（０．５ml）の混合物に溶解し、希ＨＣｌおよびＮａＯＨでｐＨを５．５に調整した。ＲＴで５時間攪拌した後、ＨＰＬＣ分析（酢酸緩衝液）から、生成物形成が約３３％であることが分かった。ＥＤＣおよびＨＯＳｕを再び加えた。ＥＤＣおよびＨＯＳｕを２４時間間隔で添加しながら、混合物を室温で３日間攪拌した。真空中で水を除去し、ジエチルエーテルの添加により生成物を沈殿させた。油状懸濁液を遠心分離にかけ、デカンテーションした。ジエチルエーテルでの洗浄を、微細な沈殿が形成するまで、２回繰り返した。粗生成物を高真空で乾燥し、分取ＨＰＬＣ（勾配ａ／ｂ１％min-1、１００％酢酸緩衝液ａから出発）により精製し、脱塩して、シアノコバラミン−ｂ−プロピル−ＰＡＭＡ−Ｒｅ（ＣＯ）3を収量９．１mg（２３％）で得た。
【０１０５】
【表１３】
2007515457.tif 000017
【０１０６】
実施例１７：シアノコバラミン−ｂ−ヘキシル−ＰＡＭＡ−Ｒｅ（ＣＯ）3
シアノコバラミン−ｂ−酸（２０．０mg、１４．８μmol）をＤＭＳＯ（０．８ml）に溶解し、続いてＤＭＦ（２ml）およびＮＥｔ3（０．１ml）を加えた。異なるフラスコ中、［Ｒｅ（［Ｎ−３−アミノプロピル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ］酢酸）（ＣＯ）3］・ＣＦ3ＣＯＯＨ（ＣＨ2Ｃｌ2およびＴＦＡ（２／１v/v）中で、０℃で１時間、保護された錯体をＢｏｃ開裂し、次に真空中、ＲＴで揮発分を除去することを介して製造した）約５当量を、ＤＭＦ／ＮＥｔ3混合物（４．５ml；８／１v/v）に溶解した。２つの溶液を混合し、次にＴＢＴＵ（３２．１mg、０．１mmol）を添加した。ＲＴで４５分攪拌した後、真空中で溶媒を除去した。残留物を分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム、勾配：２．０％min-1、１００％緩衝液ａから出発）により精製して、シアノコバラミン−ｂ−ヘキシル−ＰＡＭＡ−Ｒｅ（ＣＯ）3１１mg（４０％）を得た。
【０１０７】
【表１４】
2007515457.tif 000018
【０１０８】
実施例１８：シアノコバラミン−ｄ−プロピル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ
シアノコバラミン−ｂ−プロピル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔの合成（実施例１１）について述べたように、シアノコバラミン−ｄ−酸（９．３mg、６．９μmol）と、（Ｎ−３-アミノプロピル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ）酢酸エチルエステル（７μmol）およびＥＤＣ（６．６mg、３４μmol）とを反応させた。生成物を収量３．６mg（３３％）で単離した。
【０１０９】
【表１５】
2007515457.tif 000019
【０１１０】
実施例１９：シアノコバラミン−ｄ−プロピル−ＰＡＭＡ−Ｒｅ（ＣＯ）3
シアノコバラミン−ｄ−酸（２０．０mg、１４．８μmol）をＤＭＳＯ（１．５ml）に溶解した。続いてＤＭＦ（２ml）およびＮＥｔ3（０．１ml）を加えた。異なるフラスコ中、Ｒｅ（［Ｎ−３−アミノプロピル−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−アミノ］酢酸）（ＣＯ）3約５当量をＤＭＦ／ＮＥｔ3混合物（４．５ml；８／１v/v）に溶解した。２つの溶液を混合し、次にＴＢＴＵ（３２．１mg、０．１mmol）を加えた。ＲＴで４５分攪拌した後、真空中で溶媒を除去した。残留物を、分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム、勾配：２．０％min-1、１００％緩衝液ａから出発）により精製して、シアノコバラミン−ｄ−プロピル−ＰＡＭＡ−Ｒｅ（ＣＯ）3２０mg（７３％）を得た。
【０１１１】
実施例２０：シアノコバラミン−ｂ−プロピル−Ｈｉｓ−ＯＭｅ
シアノコバラミン−ｂ−酸（２０．０mg、１４．８μmol）をＤＭＳＯ（０．８ml）に溶解した。続いてＤＭＦ（２ml）およびＮＥｔ3（１ml）を加えた。異なるフラスコ中、メチル３−アミノプロピル−Ｎ−Ｔｅｏｃ−ヒスチジナート約４当量をＤＭＦに溶解した。これらの混合物を一緒にし、ＴＢＴＵ（３２．１mg；０．１mmol）を加えた。混合物を４５分攪拌した、続いて乾燥するまで真空中で蒸発させた。分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム；勾配：１分当り２．０％、緩衝液ａから出発）により精製して、赤色固体１６mg（６７％）を得た。
【０１１２】
【表１６】
2007515457.tif 000020
【０１１３】
このＴｅｏｃ保護された化合物のサンプル１９mgを、ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2混合物（４／１v/v）に０℃で溶解した。この温度で４時間攪拌した後、分析ＨＰＬＣから、出発材料の転化が完全であることが分かった。真空中、ＲＴで溶媒を除去した。残留物に乾燥Ｅｔ2Ｏを加え、次に真空中で溶媒を除去した。ＴＦＡを微量も残さず完全に除去するために、この工程を合計で３回行った。分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム；勾配：１分当り０．５％、１００％緩衝液ａから出発）により精製して、タイトルの化合物１１mgを得た。
【０１１４】
【表１７】
2007515457.tif 000021
【０１１５】
実施例２１：シアノコバラミン−ｂ−プロピル−Ｈｉｓ−Ｒｅ（ＣＯ）3
シアノコバラミン−ｂ−酸（２０．０mg、１４．８μmol）をＤＭＳＯ（０．８ml）に溶解した。続いてＤＭＦ（２ml）およびＮＥｔ3（０．１ml）を加えた。異なるフラスコ中、［Ｒｅ（メチル３−アミノプロピル−Ｎ−Ｔｅｏｃ−ヒスチジナート）（ＣＯ）3］・ＣＦ3ＣＯＯＨ（ＣＨ2Ｃｌ2およびＴＦＡ（２／１v/v）中で、０℃で１時間、保護された錯体をＢｏｃ開裂し、次に真空中、ＲＴで揮発分を除去することを介して製造した）約５当量を、ＤＭＦ／ＮＥｔ3混合物（４．５ml；８／１v/v）に溶解した。２つの溶液を混合し、次にＴＢＴＵ（３２．１mg、０．１mmol）を加えた。ＲＴで４５分攪拌した後、真空中で溶媒を除去した。残留物を、分取ＨＰＬＣ（アセテートシステム、勾配：２．０％min-1、１００％緩衝液ａから出発）により精製して、シアノコバラミン−ｂ−プロピル−Ｈｉｓ−Ｒｅ（ＣＯ）3７mg（７３％）を得た。
【０１１６】
【表１８】
2007515457.tif 000022
【０１１７】
実施例２２：シアノコバラミン−ｂ−エチル−トリアミン
トリエチレンテトラミン（５５．４μl、３６９μmol）を、ＤＭＦ（２．５ml）および水（２．５ml）の混合物に溶解した。ＫＣＮ（９．６mg、１４７μmol）を加え、ＨＣｌ水溶液の添加によりｐＨを６に調整した。シアノコバラミン−ｂ−酸（１０．０mg、７．４μmol）、ＥＤＣ（５．７mg、２９μmol）、およびＨＯＳｕ（３．４mg、２９μmol）を加えた。６時間、２４時間、４８時間、および１２０時間後、同じ量のＥＤＣおよびＨＯＳｕを加えた。ＨＰＬＣ分析（酢酸緩衝液）から、４８時間後７５％の転化率に達する遅い生成物形成であることが分かり、これは攪拌を延長しても超えなかった。１４４時間攪拌した後、真空中で溶媒を除去し、生成物を分取ＨＰＬＣ（緩衝液ａとしてＴＦＡ０．１％水溶液を、溶媒ｂとしてメタノールを用い、勾配１％min-1で、８０％緩衝液ａから出発）により精製した。生成物をシアノコバラミン−ｂ−エチル−トリアミン×３ＴＦＡとして収量７．５mg（５５％）で単離した。
【０１１８】
【表１９】
2007515457.tif 000023
【０１１９】
実施例２３：シアノコバラミン−ｂ−エチル−トリアミン−Ｒｅ（ＣＯ）3
シアノコバラミン−ｂ−エチル−トリアミン（５mg、２．７μmol）および（Ｅｔ4Ｎ）2［ＲｅＢｒ3（ＣＯ）3］（２．２mg、２．９μmol）を、リン酸緩衝液、ｐＨ７．４（０．１M、０．３３ml）中、５０℃で攪拌した。１時間後、ＨＰＬＣ分析から、出発材料が１つの生成物へ完全に転化したことが分かった。４時間後、反応混合物を脱塩して、ＨＰＬＣ分析によれば、２種の立体異性体の混合物（おおよその比２／１）である生成物を得た。シアノコバラミン−ｂ−エチル−トリアミンの99mＴｃでの標識化において、２種の立体異性体の同じパターンが見られた。
【０１２０】
【表２０】
2007515457.tif 000024
【０１２１】
実施例２４：シアノコバラミン−５’−ホスホコラミン
乾燥ＤＭＦ（２ml）および乾燥ピリジン（１ml）中の、シアノコバラミン（３０mg、２２．１４μmol）、ＤＣＣ（４５７mg、２．２１４mmol）、およびＮ−Ｆｍｏｃ−ホスホコラミン（７８．９mg、２１７．２μmol）の溶液を、Ｎ2雰囲気下、室温で２４時間攪拌した。水２mlを加えた後、沈殿したジシクロヘキシル尿素をろ別し、減圧下、６０℃で水およびピリジンを蒸発させた。残留の溶液をＤＭＦ中の５％ピペリジン溶液で容量８mlに希釈し、室温で２．５時間攪拌した。生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、遠心分離にかけ、そして数回洗浄した。分取ＨＰＬＣ（勾配：３０分で１００％→２０％ａ、０％→８０％ＭｅＯＨ；ａ＝０．１％ＡｃＯＨ、水中１０％アセトニトリル；流量１０ml/min；カラム：M＆N VP 250/21 Nucleosil 100-7 C18）により粗生成物を精製した。収率：８２％（赤色固体）。
【０１２２】
【表２１】
2007515457.tif 000025
【０１２３】
実施例２５：シアノコバラミン−５’−ホスホコラミン−Ｈｉｓ−ＯＭｅ
シアノコバラミン−５’−ホスホコラミン（５０mg、３３．８μmol）およびメチル１−（カルボキシメチル）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−ヒスチジナート塩酸塩（２５mg、５０．７μmol）を、乾燥ＤＭＳＯ（４ml）に溶解し、ｐＨをＤＩＰＥＡ２４μlで６〜７に調整した。この溶液に、ＢＯＰ（４５mg、１０１．５μmol）を固体として加え、ＲＴで攪拌した。１時間後、反応混合物のｐＨは酸性になり、再び中性に調整した。５時間後、分析ＨＰＬＣにより検出できる出発材料はなかった。ジエチルエーテルを用いて沈殿させた後、粗生成物を、ＤＭＦおよびピペリジンの１：１混合物（１０ml）中で、１．５時間、脱保護に供した。再沈殿後、シアノコバラミン−５’−ホスホコラミン（実施例２４）について述べたように、分取ＨＰＬＣを用いて精製して、生成物を４６％の収率で得た。
【０１２４】
【表２２】
2007515457.tif 000026
【０１２５】
実施例２６：シアノコバラミン−５’−ホスホコラミン−Ｈｉｓ−Ｒｅ（ＣＯ）3
メチル１−（カルボキシメチル）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−ヒスチジナート塩酸塩の代わりに１−（カルボキシメチル）ヒスチジナートのＲｅ（ＣＯ）3錯体を用いて、シアノコバラミン−５’−ホスホコラミン−Ｈｉｓ−ＯＭｅ（実施例２５）について述べたのと同じ手順を用いた。純粋な生成物の収率は３７％であった。
【０１２６】
【表２３】
2007515457.tif 000027
【０１２７】
【表２４】
2007515457.tif 000028
【０１２８】
実施例２７：一般的な標識化手順
前駆物質［99mＴｃ（ＯＨ２）３（ＣＯ）3］+の溶液を、［99mＴｃＯ4］-からボラノカルボナートキット（boranocarbonate kit）を用いてAlberto et al.(J. Am. Chem. Soc. 123, 3135-3136)に記載されているように製造した。ゴム栓付き１０mlのガラスバイアルをＮ2でフラッシングした。シアノコバラミン誘導体の溶液（水中０．０１M）２０μl、ＭＥＳ緩衝液（１．０M）２０μl、および［99mＴｃ（ＯＨ２）３（ＣＯ）3］+溶液２００μlを加え、反応混合物を７５℃で１〜２時間保持した。γ−検出を用いるＨＰＬＣ分析を、99mＴｃ種の完全な転化を確かめるために行った。このような条件下、キレーター中のエステル保護基は開裂してカルボキシラト錯体を得た。
【０１２９】
輸送ベクターに対するインビボ研究および結合研究のために、極めて高い特異性の活性が求められている。したがって、標識化した溶液１００μlを分析ＨＰＬＣシステムに注入して、非標識（cold）ビタミン誘導体から標識（hot）ビタミン誘導体を分離した。もっとも高いγ活性を有する溶出液画分（約３００μl）を、静脈内注射前に、通常の生理食塩水で、動物当りの濃度１０μCiに希釈した。分離条件は：酢酸緩衝液、XTerra RP8カラム、勾配：ｂ−およびｄ−誘導体の場合は０％メタノール（０分）、３０％メタノール（１５分）、１００％メタノール（２５分）、他の化合物の場合はSchibli et al. (Bioconjugate Chem. 2000, 343-351)に記載されているＴＥＡＰシステムである。
【０１３０】
実施例２８：ウサギ全血からのトランスコバラミンＩＩ（ＴＣＩＩ）の調製
ＴＣＩＩをシアノコバラミン−アガロースマトリックス（Sigma）でアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。ゲル（５ml）を、まず２００mlの５０mMトリス／１MＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で、その後２００mlの０．１Mグリシン／０．１Mグルコース／１MＮａＣｌ（ｐＨ１０）で、そして再び２００mlの５０mMトリス／１MＮａＣｌで洗浄した。２回遠心分離（４℃で、１回目５０００rpmで１５分、２回目２０，０００rpmで２０分）にかけた全血２００mlを、アフィニティカラムにかけ、カラムを前述のように連続して洗浄した。結合されたＴＣＩＩを、２０mlの４．０MグアニジンＨＣｌ／５０mMトリス（ｐＨ８．０）を用いて、第２工程で７．５MグアニジンＨＣｌ／５０mMトリス（ｐＨ８．０）を用いて溶離した。結合されたＴＣＩＩのほとんどは、すでに４MグアニジンＨＣｌで溶離した。プローブは、頻繁に４℃で２日間、Ｈ2Ｏで透析した。代表的な収量は５〜３０nmol/lであり、これをウサギ当りＴＣＩＩ７．５〜１０μg（MW：５０kDa）に変換した。
【０１３１】
実施例２９：バクテリアからのトランスコバラミンＩＩ（組み換えＴＣＩＩ）の調製
トランスコバラミンＩＩｃＤＮＡを、E. coli株FA113、trxBおよびgor遺伝子における２重欠損を有し、細胞質が酸化環境を形成し、ジスルフィド形成を可能にするK12誘導体中で発現させた。トランスコバラミンＩＩタンパク質は、PreScissionプロテアーゼ部位、次にＮ末端ヒスチジンタグを含有する。ニッケルキレートセファロースを用いて、E. coli抽出物の可溶性の画分からタンパク質を単離した。キレートカラムに結合されたトランスコバラミンＩＩから８M尿素を用いてシアノコバラミンを除去し、その後トランスコバラミンＩＩをイミダゾールにより放出した。いくつかの調製では、特定のプロテアーゼによりHis−タグを除去した。
【０１３２】
実施例３０：トランスコバラミンＩ（ＴＣＩ；ハプトコリン）の調製
トランスコバラミンＩの源として、菜食のヒト被験者の唾液を用いた。唾液を４℃、２０，０００rpmで２０分遠心分離にかけ、ＰＢＳと１：１混合し、無菌ろ過した。トランスコバラミンＩの結合容量は、通常１０ng/mlである。
【０１３３】
実施例３１：シアノコバラミン誘導体と輸送タンパク質ＴＣＩおよびＴＣＩＩとの相互作用（図１および図２）
放射性標識化した（57Ｃｏ、99mＴｃ、188Ｒｅ、111Ｉｎ）シアノコバラミン誘導体の相互作用を、ゲルシフト法により測定した。放射性標識化したシアノコバラミン（０．０５〜１ng）と、過剰な輸送タンパク質とを、室温で１５分反応させた。この混合物を、緩衝液ＰＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０が流れるゲルろ過カラム（Superdex 75, Amersham Biosciencies）にかけた。輸送タンパク質に結合する生物活性シアノコバラミンは、約１．４kDaの分子量から輸送タンパク質に依存して４０〜７０kDaへシフトした。輸送タンパク質の結合容量の滴定を、57Ｃｏ−シアノコバラミン（ICN Biomedicals GmbH, Germany；１０μCi／５０ng）で行った。
【０１３４】
実施例３２：188Ｒｅ−トリカルボニルを用いるシアノコバラミン誘導体の標識化
188Ｒｅ−トリカルボニルの調製およびシアノコバラミン誘導体の標識化は、１ポット反応で行った。ＢＨ3ＮＨ3７．５mgを、アスコルビン酸ナトリウム２０mg、シアノコバラミン誘導体（１０-3M）１００μl、［188ＲｅＯ4］-発生溶出液（０．９％生理食塩水；４０〜２７０mCi）９００μl、Ｈ3ＰＯ4（８５％）２０mgと混合し、一酸化炭素（ＣＯ）を２０分供給した。混合物を、６０℃で１／２〜２時間および９０℃で１／２〜２時間加熱した。非標識化合物から標識化されたシアノコバラミンを、逆相ＨＰＬＣカラム（Waters Xterra RP8）でリン酸緩衝液中、直鎖状メタノール勾配で分離した。静脈内注射前に、活性の画分を通常の生理食塩水で、イメージング目的に対して動物当り１０μCiに、治療上の処置に対して２mCiまでの濃度に希釈した。
【０１３５】
実施例３３：電離放射線に対する腫瘍細胞スフェロイドの感受性
放射線生物学において、スフェロイドと腫瘍異種移植担腫瘍マウスの間の放射線応答の類似性は、スフェロイドをインビボ照射研究のための良好な代わりのモデルとする。多細胞の腫瘍スフェロイドは、スピナーフラスコ中、３７℃で連続的に攪拌されて平均直径４００μmに成長した。スフェロイドを回収し、新しい培地中で洗浄し、次に２４穴平底組織培養プレート中で非標識誘導体または188Ｒｅ−標識化したシアノコバラミン誘導体と一緒に１時間インキュベートした。線量範囲は穴当り１〜２０μCiである。細胞毒性は、蛍光生存度マーカーにより、スフェロイド全体の直径の測定により、および半固体寒天中に分散したスフェロイドのクローン的分析により、評価した。
【０１３６】
実施例３４：マウス中の放射性標識化したシアノコバラミン誘導体の体内分布（図３、４、５、６）
57Ｃｏ−シアノコバラミンを用いる体内分布を検討するために、担腫瘍balb/cマウス（同系のマウスメラノーマB16-F10）において、放射性標識化したシアノコバラミン０．２μCi／１ngを通常の生理食塩水１８０μlと混合し、および静脈内注射した。特定の時間（５分〜２４時間）の後、動物をと殺し、器官を秤量し、γカウンターでカウントした。99mＴｃ−標識化したシアノコバラミンを用いる体内分布を検討するために、放射性標識化したシアノコバラミン１０μCi／０．５ngを通常の生理食塩水と混合し、前述のように使用した。111Ｉｎ−標識化したシアノコバラミンを用いる体内分布のために、放射性標識化したシアノコバラミン２μCi／５ngを通常の生理食塩水と混合し、前述のように使用した。ビタミンＢ１２の欠けた餌の効果を検討するために、２週間の期間、通常の餌を与えたマウスにおける標識化したシアノコバラミンの体内分布と、ビタミンＢ１２の欠けた餌を与えたマウスにおける体内分布とを比較した。
【０１３７】
実施例３５：担腫瘍マウスにおける188Ｒｅ−標識化したシアノコバラミン誘導体を用いる治療研究
治療研究のために、同系のメラノーマ腫瘍は、balb／cマウスにおいて、約２００mgの寸法（直径により測定）に成長した。線量を増加して（０．１〜２mCi）放射性標識化したシアノコバラミン構成物および非標識体構成物を静脈内注射した。腫瘍体積を直径について測定することにより評価した。腫瘍が寸法８００mgに達した時、動物をと殺した。実験のシリーズでは、動物を分割投薬で治療した：放射性標識化したシアノコバラミンを、１週間に３回間隔を開けて与えた。動物を腫瘍の再生について６０日観察した。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１Ａ】ゲルシフト法での、実施例１１の放射性標識化したシアノコバラミン−ｂ−プロピル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ（ＴＣＩＩ−非バインダー）と、輸送タンパク質との相互作用を示すグラフ（t＝時間、cpm＝１分当りのカウント）である。  Ａ）放射性標識化した誘導体のSuperdexTM 75カラムでのゲルろ過分析（ピークは１．５kDaで溶離）
【図１Ｂ】ゲルシフト法での、実施例１１の放射性標識化したシアノコバラミン−ｂ−プロピル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ（ＴＣＩＩ−非バインダー）と、輸送タンパク質との相互作用を示すグラフ（t＝時間、cpm＝１分当りのカウント）である。  Ｂ）ＴＣＩと混合した誘導体のゲルろ過分析（１．５kDaから４４kDaにピークのシフト）
【図１Ｃ】ゲルシフト法での、実施例１１の放射性標識化したシアノコバラミン−ｂ−プロピル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ（ＴＣＩＩ−非バインダー）と、輸送タンパク質との相互作用を示すグラフ（t＝時間、cpm＝１分当りのカウント）である。  Ｃ）ＴＣＩＩと混合した誘導体のゲルろ過分析（ピークは、１．５kDaで溶離し、シアノコバラミン−ｂ−プロピル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔが本質的にＴＣＩＩ−非バインダーであることが分かる）
【図２Ａ】ゲルシフト法での、実施例５の放射性標識化したシアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＰＡｃｅｔ（ＴＣＩＩ−バインダー）と、輸送タンパク質との相互作用を示すグラフ（t＝時間、cpm＝１分当りのカウント）である。  Ａ）放射性標識化した誘導体のSuperdexTM 75カラムでのゲルろ過分析（ピークは、１．５kDaで溶離）
【図２Ｂ】ゲルシフト法での、実施例５の放射性標識化したシアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＰＡｃｅｔ（ＴＣＩＩ−バインダー）と、輸送タンパク質との相互作用を示すグラフ（t＝時間、cpm＝１分当りのカウント）である。  Ｂ）ＴＣＩと混合した誘導体のゲルろ過分析（１．５kDaから４４kDaにピークのシフト）
【図２Ｃ】ゲルシフト法での、実施例５の放射性標識化したシアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＰＡｃｅｔ（ＴＣＩＩ−バインダー）と、輸送タンパク質との相互作用を示すグラフ（t＝時間、cpm＝１分当りのカウント）である。  Ｃ）ＴＣＩＩと混合した誘導体のゲルろ過分析（１．５kDaから６０kDaへのピークのシフトからシアノコバラミン−ｂ−ブチル−ＰＡＰＡｃｅｔは、ＴＣＩＩに結合しないことが分かる）
【図３】組織分布を示す棒グラフである。  ｙ−軸：組織１g当りの注射した放射能の百分率  ｘ−軸：器官１）血液、２）心臓、３）脾臓、４）腎臓、５）胃、６）腸、７）肝臓、８）筋肉、９）骨、１０）腫瘍  通常の餌を与えたマウスにおける、放射性シアノコバラミン（57Ｃｏ−ＣＮ−ＣｂＩ）の静脈内注射後の組織分布である。
【図４】組織分布を示す棒グラフである。  ｙ−軸：組織１g当りの注射した放射能の百分率  ｘ−軸：器官１）血液、２）心臓、３）脾臓、４）腎臓、５）胃、６）腸、７）肝臓、８）筋肉、９）骨、１０）腫瘍  ビタミンＢ１２の欠けた餌を与えたマウスにおける、放射性シアノコバラミン（57Ｃｏ−ＣＮ−ＣｂＩ）の静脈内注射後の組織分布である。
【図５】組織分布を示す棒グラフである。  ｙ−軸：組織１g当りの注射した放射能の百分率  ｘ−軸：器官１）血液、２）心臓、３）脾臓、４）腎臓、５）胃、６）腸、７）肝臓、８）筋肉、９）骨、１０）腫瘍  通常の餌を与えたマウスにおける、放射性シアノコバラミン−ｂ−プロピル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ（実施例１１）の静脈内注射後の組織分布である。
【図６】組織分布を示す棒グラフである。  ｙ−軸：組織１g当りの注射した放射能の百分率  ｘ−軸：器官１）血液、２）心臓、３）脾臓、４）腎臓、５）胃、６）腸、７）肝臓、８）筋肉、９）骨、１０）腫瘍  ビタミンＢ１２の欠けた餌を与えたマウスにおける、放射性シアノコバラミン−ｂ−プロピル−ＰＡＭＡ−ＯＥｔ（実施例１１）の静脈内注射後の組織分布である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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