(57)【要約】本発明は、蛋白質チップを用いてインテグリンの拮抗物質を探索する方法及びそれにより探索された有用なペプチドに関する発明である。用いられた蛋白質チップは特定の基質(ｓｕｂｓｔｒａｔｅ)に新物質であるカリックスアーレン(ｃａｌｉｘａｒｅｎｅ)誘導体をコーティング(ｃｏａｔｉｎｇ)したものであって、蛋白質が均一で高い活性度(ａｃｔｉｖｉｔｙ)を維持することができ、この上にインテグリン受容体蛋白質を高密度で配列して、リガンドの結合を特異的に抑制できる物質(蛋白質、ペプチド、低分子化合物等)を探索することができる。用いられたインテグリンはインテグリンαVβ3とインテグリンαIIbβ3であり、ペプチドライブラリーを用いて探索された新しい拮抗ペプチドは結合力が卓越である。2007510139.tif 000005
2007510139.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）蛋白質チップ上にインテグリンαIIbβ3及び／またはαVβ3を付着する段階；ｂ）上記インテグリンが付着された蛋白質チップに蛍光物質が付いたリガンド蛋白質及びペプチドライブラリーのペプチドプールを反応させる段階；ｃ）上記反応が終った後、緩衝溶液で洗浄する段階；及びｄ）上記洗浄後、リガンド結合程度を測定する段階を含むインテグリン拮抗物質の超高速探索方法。
【請求項２】
上記リガンドはビトロネックチン、ファイブロネックチン、コラーゲン、ラミニン、ボンウィルレブランド因子(Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ; ｖＷＦ)、及びフィブリノゲンから構成された群より選択された何れか一つのリガンドであることを特徴とする請求項１に記載のインテグリン拮抗物質の超高速探索方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の探索方法により得られたインテグリンαVβ3拮抗作用を有する配列番号１のＨＳＤＶＨＫ、配列番号２のＨＧＤＶＨＫ、配列番号３のＨＨＬＬＨＫ、配列番号４のＨＧＬＶＨＫ、または配列番号５のＨＧＤＬＨＫペプチド。
【請求項４】
請求項３に記載のペプチドを含むことを特徴とする抗癌治療用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高感度蛋白質チップに少量の蛋白質のみを結合させた後、発生する蛋白質相互作用を用いた新薬候補物質のスクリーニング方法及びその方法により探索された有用なペプチドに関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム(Ｐｏｓｔ-ｇｅｎｏｍｅ)研究の重要な分野の一つは蛋白質体機能(ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ)研究分野であり、このような蛋白質体機能研究
は今後蛋白質発現パターンの分析、疾病診断のためのバイオマーカーの分析、新しいバイオマーカー及び新薬ターゲットの発掘、そして新薬候補物質の探索など、新薬開発の核心的な技術として広く応用される展望である。しかし、蛋白質機能研究の促進のためには新しい技術的な突破口に備え得る技術革新が行われるべきであり、このような分野が高感度・高密度蛋白質チップ(ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｃｈｉｐ)技術であると言える。蛋白質チップ技術は蛋白質、抗体、ペプチド、リガンドなどの生体分子を用いて小型化及び集積化されたチップ表面での反応から大量及び同時分析をするための技術であって、最近、ヒトゲノムマップの発表で蛋白質の相互作用及び機能分析の重要性が台頭されながら、ＤＮＡチップと共に活発に開発されつつある。
【０００３】
インテグリン受容体は、細胞付着及び移動、分化、増殖などのような細胞の重要な生理作用を調節する細胞表面受容体である。インテグリンはαとβ単位体(ｓｕｂｕｎｉｔ)が非共有結合からなるヘテロダイマ(ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ)として作用し、αとβ単位体が対を成して２２種のインテグリン系(ｆａｍｉｌｙ)を構成している。これらのリガンド特異性が各インテグリン種類によって異なり、一種類のインテグリンが複数のリガンドを同時に結合することができる。リガンドの種類としては、主に細胞外基質蛋白質(ｅｘｔ
ｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ)(ビトロネックチン(ｖｉｔｒｏ
ｎｅｃｔｉｎ)、フィブロネックチン(ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ)、コラーゲン(ｃｏｌｌａｇｅｎ)、ラミニン(ｌａｍｉｎｉｎ)、ボンウィルレブランド因子(Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂ
ｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ; ｖＷＦ)、フィブリノゲン(ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ)等)があって
、非常に多様である。インテグリンの構造を見ると、長い細胞外ドメイン(ｅｘｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ)と短い原形質ドメイン(ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ)とから成っているが、細胞外ドメインはリガンドが結合する部位を有し、原形質ド
メインは細胞質内のサイトスケレトン(ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ)と繋がっていて、インテグリンが活性化するとサイトスケレトン再配列(ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ)が行われてフォカルアドへジョンコンプレックス(ｆｏｃａｌ ａｄｈ
ｅｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ)を形成しながら細胞付着及び移動過程を遂行する。インテグリンαVβ3に対する拮抗物質は、例えば、蛇の毒から由来したディスインテグリン系(ｄ
ｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ｆａｍｉｌｙ)がある。ディスインテグリンは約３０余種類が知られており、共通したインテグリン結合部位であるＡｒｇ-Ｇｌｙ-Ａｓｐ(ＲＧＤ)配列を有するのでインテグリンとリガンドとの結合を抑える機能を有する。これらは血小板表面に存在するインテグリンの一種であるαIIbβ3インテグリンを遮ってリガンドであるフィブリノゲン(ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ)の結合を抑制し、血小板の凝集を阻害する作用をする。このようなディスインテグリンの特性のため、インテグリンαVβ3に対する拮抗物質として作用し、血管新生(ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ)を抑制する。
【０００４】
インテグリンαVβ3に対する人間化した(ｈｕｍａｎｉｚｅｄ)ｍＡｂであるビタックシン(Ｖｉｔａｘｉｎ)は、現在、固形癌治療目的で臨床試験１相で殆ど毒性がなく成功的に
完了され、現在、臨床試験２相が進行中である。特異なのは臨床試験を施した１２人の癌患者のうち、一人は癌組織が５０％以上減ったということである。ＥＭＤ１２１９７４はＭｅｒｃｋ社で開発した内皮細胞のインテグリンαVβ3を遮る低分子物質(ｃｙｃｌｉｃ
ＲＧＤペプチド)として臨床実験１相が進行中である。この物質はＲＧＤ配列を有するサ
イクリック(ｃｙｃｌｉｃ)ペンタペプチドであって，動物実験を通じてヒトの悪性黒色腫等において血管新生を抑え、癌成長を阻害する活性を有している。エンドスタチン(Ｅｎ
ｄｏｓｔａｔｉｎ)の場合、今までその作用メカニズムが明かになっていないが、最近組
み換えヒトエンドスタチン(ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ)が血管内皮細胞のα(５)-とα(ｖ)-インテグリンと作用して内皮細胞の移動のようなインテグリン−依存的な内皮細胞機能を抑制すると判明された。従って、このような結果は、インテグリンをターゲットにした拮抗物質は抗癌治療を目的とする血管新生抑制剤として開発を可能にするということを示唆するのである。
【０００５】
既存のインテグリンの拮抗物質探索技術は研究所又は病院などから診断を目的として常用化されて、広く用いられる技術の一つである酵素免疫抗体法(Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ)である。しかし、この方法は蛋白質量が多く要されるだけでなく、非特異的反応であり、大量探索に不適切である。
【０００６】
［発明の詳細な説明］
本発明は、蛋白質チップを用いてインテグリンに反応する拮抗物質を迅速かつ大量探索する方法を提供する。本発明は、また、前述したインテグリン拮抗物質探索方法を用いて探索された有用な新規ペプチドを提供する。
【０００７】
より具体的に、本発明は、前述した技術的課題を達成するために、蛋白質チップ上にインテグリンαIIbβ3及び／またはαVβ3を付着する段階、上記インテグリンが付着された蛋白質チップに、蛍光物質が付けられたリガンド蛋白質及びペプチドライブラリーのペプチドプールを反応させる段階、上記の反応が終った後、緩衝溶液で洗浄する段階、及び上記洗浄の後、リガンド結合程度を測定する段階を含むインテグリン拮抗物質の超高速探索方法を提供する。
【０００８】
本発明において、前述したリガンドは、ビトロネックチン(ＥＭＢＯ Ｊ．１９８５ Ｏ
ｃｔ； ４(１０):２５１９-２４)、ファイブロネクチン(Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１９８４ Ｊｕｌ ２５; １２(１４):５８５３-６８)、コラーゲン(ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｔｔ．１９８７  Ｄｅｃ １０; ２２５(１-２): １８８-９４)、ラミニン(Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．１９８９ Ｊｕｎ; ６０(６):７７２-８２)、ボンウィルレブランド因子(Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ; ｖＷＦ; Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８６ Ｊｕｎ ３;２５(１１): ３１７１-８４)及びフィブリノゲン(Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．１９７９ Ｊｕｎ ３０;４１(４):６６２-７０)からなる群より選択された何れか一つのリガンドであるのが望ましい。
【０００９】
本発明は、また、前述した探索方法によって探索されたインテグリン拮抗作用を有する有用な新規ペプチドである、配列番号１のＨＳＤＶＨＫ、配列番号２のＨＧＤＶＨＫ、配列番号３のＨＨＬＬＨＫ、配列番号４のＨＧＬＶＨＫ、及び配列番号５のＨＧＤＬＨＫペプチドを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において、蛋白質チップとして、ＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐTM (Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ソウル、韓国)が用いられる。ＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐTMは、アミン化した(ａｍｉｎａｔｅｄ)ガラススライドにカリックスアーレン(ｃａｌｉｘａｒｅｎｅ)誘導体を
コーティング(ｃｏａｔｉｎｇ)したものであって、カリックスアーレン誘導体は２つの作
用基を持つ分子リンカー(ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｎｋｅｒ)として作用する。（Ｈａｎ Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．：ＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐ，ｉｔｓ ｆａ
ｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ ＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐ，Ｋｏｒｅａ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００２-４１７７０，２００２及びＬｅｅ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．：ＰｒｏｔｅＣｈｉｐ:ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌ
ｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００３；３：２２
８９−２３０４参照）。ＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐTM(Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ Ｉｎｃ．から購入)にインテグリン受容体を付着させ、インテグリン単一層を構成した後、蛍光物質で標識
されたリガンド蛋白質と無作為配列を有するペプチドを混合してリガンド結合を妨げる最適なペプチドを超高速大量探索することができるか否かを実験した。
【００１１】
まず、チップ上に結合されたインテグリン受容体の安定性を調べるためにインテグリン-リガンド間の親和力を確認した結果、濃度依存的にリガンドがチップに固定されたイン
テグリンに結合することから見て、固定化されたインテグリン受容体の安定性には全く問題が無いということを確証したのである。今まで、インテグリン拮抗物質として知られているディスインテグリン(ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ)及びインテグリンに対する単一抗体等を利用してインテグリン-リガンド結合を抑えることができるのかを調べた結果、これら
の蛋白質が全てＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐTM上で効果的にインテグリン-リガンド結合を競争
的に抑制することを確認したのである。実際に、約２００万種類の無作為配列を有するペプチドを有するペプチドライブラリーを対象としてインテグリン−リガンド結合抑制実験をＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐTMで大量探索を試みたが、その結果、最適なアミノ酸配列を有するペプチドを探索することができたのである。このような結果は、ＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐTMがインテグリン−リガンド結合を妨げる新しい先導物質の探索を可能にして新薬開発の新しい探索技術として用いられることを証明するのである。
【００１２】
本発明の工程と望ましい非限定的な実施例に対して図面を参照しながら詳しく説明すると次のようである。
実施例１:蛋白質チップ上にインテグリン受容体の固定化
蛋白質チップとしてＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐTM(Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ソウル
、韓国)を用いて、ＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐTM(Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ソウル、韓国)上にマイクロアレイ(ＣＭ-１０００;Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ソウル、韓国)
でインテグリンをスポッティングし、インテグリン受容体マイクロアレイ(ｍｉｃｒｏａ
ｒｒａｙ)を構成した(Ｌｅｅ，Ｙ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．:ＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐ:ａ ｈｉｇ
ｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｐｒｏｐｏｓｅｄ 
ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｆｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ-ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００３；３：２２８９−２３０４参照)。αIIbβ3インテグリンはＧＲＧＤＳＰＫ−セファロス(Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ)コラム
クロマトグラフィーを用いて血小板から分離精製し(Ｋａｎｇ Ｉ．Ｃ．ａｎｄ ＫＩＭ Ｄ．Ｓ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  IIｂ−IIIａ
ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｆｒｏｍ
ｎａｔｕｒａｌ ｓｏｕｒｃｅｓ． Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９８；３
１：５１５−５１８参照)、αVβ3インテグリンはＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．(ＣＡ，ＵＳＡ)で購入して用いた。
【００１３】
１０ｍＭ β-オクチルチオグルコピラノサイド(ｏｃｔｙｌｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒ
ａｎｏｓｉｄｅ)、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ2、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、及び３０％グリセ
ロールを含有する燐酸-緩衝生理食塩水(ｐｈｏｓｐｈａｔｅ-ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌ
ｉｎｅ，ＰＢＳ)で希釈されたインテグリン(４０μg／ｍｌ)をスポッティングした後、３７℃で３時間保管し、その後、結合して残ったインテグリンを０．５％ツイン２０を含有した燐酸-緩衝生理食塩水(０．５％ＰＢＳＴ)で洗浄した。製造されたインテグリンマイ
クロアレイを使用時まで４℃で保管した。このように製造されたインテグリンマイクロアレイ(インテグリン付着蛋白質チップ)をインテグリン受容体の拮抗物質超高速大量探索に用いたのである(図１参照)。
【００１４】
実施例２:インテグリンマイクロアレイを用いたインテグリン-リガンド結合反応実験
実施例１で製造したインテグリン付着蛋白質チップに蛍光物質(Ｃｙ-５またはＣｙ-３;Ａｍｅｒｓｈａｍ-Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，米国)が付いているリガンド蛋
白質(ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎまたはｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ;Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．，米国)を１μg／ｍｌ〜１ｆｇ／ｍｌまでマイクロアレ
イにスポッティングした後、温度が３７℃湿度が７５％以上のオーブンで１時間反応させた。０．５％ＰＢＳＴに１０分程度浸して洗浄した後、蛍光スキャナーでインテグリン-
リガンド反応結果を観察した。
【００１５】
濃度に応じた蛍光の相対的強さをグラフに描くと、線形で示されることが分かる。これで、限界測定濃度が１ｆｇ／ｍｌまでであることが分かる。(図２)。
実施例３:インテグリン拮抗物質によるインテグリンαIIbβ3-フィブリノゲン結合抑制実験
実施例１で製造したインテグリンαIIbβ3-付着蛋白質チップに、蛍光物質(Ｃｙ-５)が付いているリガンド蛋白質(ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ １００ｎｇ／ｍｌ)と知られているイ
ンテグリン拮抗物質としてディスインテグリンの種類であるエッチスタチン(ｅｃｈｉｓ
ｔａｔｉｎ)２５０μg／ｍｌ、フラボリジン(ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎ)２５０μg／ｍｌ、
キストリン(ｋｉｓｔｒｉｎ)２５０μg／ｍｌ、サルモシン(ｓａｌｍｏｓｉｎ)２．６ｎ
ｇ／ｍｌとインテグリンに対する単一クローン抗体(ｍＡｂ)１．０ｍｇ／ｍｌ、及び多様な濃度の合成ＲＧＤペプチド(エッチスタチン、フラボリジン、キストリン：Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ，米国；サルモシン：遺伝子組換え大腸菌から分離精製；インテグリンに対する単一クローン抗体：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．米
国；合成ＲＧＤペプチド：韓国生命工学研究院で合成)を混合して、マイクロピペット又
はマイクロアレイ(ＣＭ-１０００；Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ソウル、韓国)を用
いてチップ表面に固定されたインテグリン受容体の上に落とした後、温度が３７度湿度が７５％以上のオーブンで４〜１２時間反応させた。反応後、３％ＢＳＡが含まれた０．５％ＰＢＳＴで１０分程度洗浄した。蛍光スキャナーを用いてリガンド結合程度を相対的蛍光の強さに分析することにより、拮抗物質の競争的拮抗能力を測定した。その結果、知られているインテグリン拮抗物質処理群から相対的に顕著に低い蛍光強さを示すことから見て、これらの物質がインテグリンαIIbβ3-フィブリノゲン結合反応を効果的に抑制する
のであることを証明する(図３)。
【００１６】
図３で実験に用いたＲＧＥとＲＧＤとは自動化ペプチド合成装置を用いて合成したものであって、このようなペプチドを注文者の要求に応じて合成してくれる業者から購入し実験した。実験に用いたものは塩基が６個であるものであって、中間に塩基配列であるＲＧＥまたはＲＧＤを有する。一般に、インテグリンαIIbβ3は塩基配列であるＲＧＤとは結合しフィブリノゲンがインテグリンαIIbβ3と結合することを抑制する。しかし、ＲＧＥはインテグリンαIIbβ3と結合しないのでこのような役割を果たせない。図３はこのような内容を実験した結果である。つまり、まず、インテグリンαIIbβ3がスポッティングされているチップに、ＲＧＤまたはＲＧＥを濃度別に一定濃度の蛍光が付いているフィブリノゲンと混合して抑制役割をするか否かを実験した結果である。結果は蛍光スキャナーで測定し蛍光強度を測定することになる。本来は赤色または青色のような一つの色で結果が
出るが、この場合、蛍光強度を見分け難く機器のソフトウェアがこれを蛍光強度に応じて色の変化を与えるようになっている。通常、最も蛍光強度が高い場合、白色、そして赤、橙色、黄色、緑、青の順に蛍光強度を表現するようになる。即ち、結果を見ると、ＲＧＥ(濃度別)とフィブリノゲンとが混合された場合、色が白色または赤色であってＲＧＥがインテグリンαIIbβ3とフィブリノゲン間の相互作用を抑えることができないということが分かる。しかし、ＲＧＤ(濃度別)と一定濃度のフィブリノゲンが混合された場合，ＲＧＤの濃度が増えることに従い、白色から黄色に変化する。つまり、ＲＧＤがフィブリノゲンのインテグリンに結合することを阻害し、蛍光強度が減って来ることが分かる。
【００１７】
実施例４:インテグリン拮抗物質によるインテグリンαVβ3- ビトロネックチン結合抑
制実験
実施例１で製造したインテグリンαVβ3-付着蛋白質チップに、蛍光物質(Ｃｙ-３)が付いているリガンド蛋白質(ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ １００ｎｇ／ｍｌ)と知られているイ
ンテグリン拮抗物質でディスインテグリンの種類であるエッチスタチン(ｅｃｈｉｓｔａ
ｔｉｎ)２５０μg／ｍｌ、フラボリジン(ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎ)２５０μg／ｍｌ、キス
トリン(ｋｉｓｔｒｉｎ)２５０μg／ｍｌ、サルモシン(ｓａｌｍｏｓｉｎ)２．６ｎｇ／
ｍｌとインテグリンに対する単一クローン抗体(ｍＡｂ)１．０ｍｇ／ｍｌ、及び多様な濃度の合成ＲＧＤペプチド(エッチスタチン、フラボリジン、キストリン：Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ，米国；サルモシン：遺伝子組換え大腸菌から分離精製；インテグリンに対する単一クローン抗体：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．米国；
合成ＲＧＤペプチド：韓国生命工学研究院で合成)を混合して、マイクロピペット又はマ
イクロアレイ(ＣＭ-１０００；Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ソウル、韓国)を用いて
チップ表面に固定されたインテグリン受容体の上に落とした後、温度が３７度湿度が７５％以上のオーブンで４〜１２時間反応させた。反応後、３％ＢＳＡが含まれた０．５％ＰＢＳＴ溶液で１０分程度洗浄した。蛍光スキャナーを用いてリガンド結合程度を相対的蛍光の強さに分析することで、拮抗物質の競争的拮抗能力を測定した。その結果、知られているインテグリン拮抗物質処理群から相対的に顕著に低い蛍光強さを示すことから見て、この物質がαVβ3-ビトロネックチン結合反応を効果的に抑制することを証明する(図４)
。
【００１８】
図４に用いた拮抗物質は既にインテグリンαVβ3-ビトロネックチンの拮抗物質で広く
知られている物質である。やはり、これも拮抗物質と蛍光を付けたビトロネックチンを混合してインテグリンαVβ3とビトロネックチン相互作用を抑制するか否かを実験した結果である。対照群(ｃｏｎｔｒｏｌ)は拮抗物質がなく蛍光が付いたビトロネックチンがある場合であり、その他は、拮抗物質とＲＧＥ塩基配列を含むペプチドをもって実験した結果である。これも、図３の説明のように、蛍光強度はにじ色で表現される。つまり、結果を見ると、対照群(ｃｏｎｔｒｏｌ)、つまり、蛍光の付いたビトロネックチンのみある場合、そしてＲＧＥが含まれたペプチドの場合、蛍光の色が白色と赤色で現れている。つまり、インテグリンαVβ3とビトロネックチンが相互作用をするということが分かる。しかし、拮抗物質が含まれた場合、拮抗物質がインテグリンαVβ3とビトロネックチンの相互作用を抑えてインテグリンαVβ3にビトロネックチンが結合しないので蛍光が最も低い青色で現れている。
【００１９】
実施例５:インテグリンマイクロアレイを用いてペプチドライブラリーからインテグリ
ン拮抗ペプチドの超高速大量探索
実施例１で製造したインテグリンαVβ3-付着蛋白質チップに、蛍光物質(Ｃｙ-３)が付いているリガンド蛋白質(フィブリノゲン１００ｎｇ／ｍｌ及びビトロネックチン１００
ｎｇ／ｍｌ)とペプチドライブラリーの１１４種類のペプチドプール(ｐｏｏｌ)を混合し
て、マイクロピペットまたはマイクロアレイ(ＣＭ-１０００；Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ウル、韓国)を用いてチップ表面に固定されたインテグリン受容体の上に落とした
後、温度が３７℃湿度が７５％以上のオーブンで４〜１２時間反応させた。反応後、３％ＢＳＡが含まれた０．５％ＰＢＳＴ溶液で１０分程度洗浄した。蛍光スキャナーを用いてリガンド結合程度を相対的蛍光の強さに分析することにより、拮抗物質の競争的拮抗能力を測定した。その結果、知られているインテグリン拮抗物質であるＲＧＤペプチドより相対的に顕著に低い蛍光強さを示すペプチドを観察することができ、よって、このペプチドが、インテグリンαVβ3に対する結合力が合成ＲＧＤペプチドより遥かに強いペプチドであることを証明するのである。四角で示されたペプチド配列は拮抗能力を有するペプチドを意味する(図５及び図７)。これを根拠として、αVβ3に特異的に結合し、拮抗作用をするペプチド配列を決めることができ、これらに対する生物学的活性分析結果は後述する図９、図１０、図１１、図１２及び１３に示した。各ペプチド配列はインテグリン結合部位として知られているアミノ酸配列(例；ＲＧＤ、ＬＤＶ等)とは全く異なり、かつ、今まで報告されなかった新しいアミノ酸配列を有している。この結果から見ると、本発明のインテグリンマイクロアレイは、拮抗ペプチドを探索する道具として非常に有用であることを証明するのであり、さらに、新薬候補物質の探索技術としてＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐTMを用いたインテグリンマイクロアレイが用いられるということを意味するのである。
【００２０】
実施例６:探索発掘されたインテグリン拮抗ペプチドのアミノ酸配列によるインテグリ
ン拮抗作用分析
実施例３〜５の競争的阻害分析(ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓ
ｓａｙ)を通じてインテグリンαVβ3-特異抑制活性を示す新しいペプチドを掘り出した(
表１及び表２参照)。表１は、インテグリンマイクロアレイを用いて発掘された拮抗ペプ
チド配列を示す表である。表１の結果に基づいて見ると、ヘキサペプチドの１番位置にヒスチジンまたはロイシン等を含むと、相対的に他のものより阻害程度が最も良いことを意味し、ヘキサペプチドの１番位置にグルタメート又はグルタミンがある場合、ある程度阻害するが、その程度がヒスチジン、ロイシン、又はチロシンよりは相対的に弱いということを意味する。以下の表１にインテグリンαVβ3-ビトロネックチン相互作用を阻害する
ヘキサペプチド群内の指定位置アミノ酸を示した。以下の表１において主な阻害は８０％以上の阻害である場合、付随的な阻害は５０％以下の阻害である場合を示し、この結果は三回の独立した実験を通じて得られたものである。
【００２１】
【表１】
2007510139.tif 000003
【００２２】
このような結果を基にインテグリンαVβ3-特異抑制活性を示すと予想される１２個の
ペプチドを製造し、これを用いて濃度別にインテグリンαVβ3-ビトロネックチン相互作
用の抑制程度を評価した。言い換えれば、アミノ酸配列の差による拮抗作用の強度を調べた。以下の表２にインテグリンαVβ3-ビトロネックチン相互作用を阻害する合成ペプチ
ド及びこれらの阻害濃度を示した。以下の表２において阻害はペプチドの無い対照群に対して拮抗活性を有する最大阻害濃度の１／２に定量化し、ＮＤは活性が検出されなかったということを意味する。
【００２３】
【表２】
2007510139.tif 000004
【００２４】
インテグリンαVβ3-特異抑制活性実験でＨＳＤＶＨＫとＨＧＤＶＨＫは既存に拮抗物
質として知られいるＧＲＧＤＳＰと比較優位の拮抗能力を示したが、ＨＨＤＶＨＫは拮抗能力が殆どないことと観察された。これは２、３、４番目のアミノ酸(ヘキサペプチドの
二番目のアミノ酸はＧｌｙ、Ｓｅｒ、及びＨｉｓであり；三番目のアミノ酸はＬｅｕ及びＡｓｐであり；四番目のアミノ酸がＬｅｕ及びＶａｌである)が拮抗作用に重要な役割を
果たすと予想される。拮抗作用を有するペプチドの中でもＨＳＤＶＨＫが最も効果的である。また、この結果はアミノ酸配列特異的拮抗作用をＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐTMを用いたインテグリンマイクロアレイで正確に測定できるということを明かす証拠である。ゆえに、本発明のインテグリンマイクロアレイは蛋白質-蛋白質相互作用を正確で、敏感に分析す
ることのできる道具になるだろうと解釈される。
【００２５】
実施例７:インテグリンマイクロアレイを用いて探索した拮抗ペプチドの生物学的活性
分析
７−１)ヒト子宮血管内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)移動実験
ＨＵＶＥ細胞を１０％牛胎児血清(ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ)と３ｎｇ／ｍｌ 
ｂＦＧＦが含有されたＭ１９９培地で培養した。この細胞を移動実験(ｍｉｇｒａｔｉｏ
ｎ ａｓｓａｙ)に用いるために１６時間コントロール培地(０．１％ＢＳＡが含まれたＭ
１９９)で培養した後、ボイデンチャンバー(Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ)内に挿入されているゼラチン(ｇｅｌａｔｉｎ)(４０μＭ)で塗布された多孔性膜の上側間に３Ｘ１０4
個で加えた。同時に、試料も濃度別に一緒に処理した。チャンバーの下側間にはケモアトラクタント(ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ)であるｂＦＧＦを入れてＨＵＶＥ細胞が下側間に移動できるように導いた。４時間３７℃で培養した後、膜を除去し固定した後、クリスタルバイオレット(ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ)で染め、膜を通って移動した細胞
数を顕微鏡で測定した。その結果を図９に示した。図９に示したように、ＨＳＤＶＨＫとＨＧＤＶＨＫとは効果的にヒト子宮血管内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)の移動を抑えたが、ＨＨＤＶＨＫは影響が殆ど無かった。このような結果から、インテグリンαVβ3-特異抑制ペプ
チドの生物学的活性を確認できるのである。
【００２６】
７−２)鶏絨毛膜血管新生抑制実験
(１)  実験材料及び試薬調剤
受精卵はプルムウォン(株)(韓国)から購入し、サンプルローディング(Ｓａｍｐｌｅ ｌｏａｄｉｎｇ)のためのサーマノックスカバースリップ(Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ ｃｏｖｅｒ-ｓｌｉｐｓ)はＮｕｎｃ社(米国)から、観察時必要な１０％イントラリポス(Ｉｎｔｒａｌｉｐｏｓｅ)(脂肪懸濁液)と注射器は緑十字社(韓国)から各々購入した。
【００２７】
(２)  実験段階(過程)
１日目(０日胚)：受精卵をインキュベータで孵す。この時、インキュベータの温度は３７〜３８℃で、湿度は９０％以上維持されるように随時確認した。
【００２８】
３日目(２日胚)：受精卵の尖った終部にカッターで疵を出した。以後、水平に横たえて５ｍｌ シリンジ(ｓｙｒｉｎｇｅ)で穴をつけた後、アルブミン(ａｌｂｕｍｉｎ)を２ｍ
ｌくらい抜き出した。受精卵が乾燥せず、また感染されないよう穴を透明なテープで封じた後、穴が下に向かうように置いてまたインキュベータに保管した。
【００２９】
４日目(３日胚)：受精卵のエアサック(ａｉｒ ｓａｃ)がある方(注射器穴の反対側)に
直径２〜３ｃｍの丸型窓(ｗｉｎｄｏｗ)をつけ、受精卵に確認されたものだけ広い透明テープで封じ、さらにインキュベートさせた。参考に、丸型窓をつける方法は鋭いカッターで受精卵の殻の上に丸型に疵を出した後ピンセットで殻を取り出した。
【００３０】
５日目(４．５日胚)：この時期になると、ＣＡＭが生成され、その直径が２〜５ｍｍ程度になる。サンプルを適当な溶媒(ｄｄＨ２Ｏ、エタノールなど)に溶かしてから４等分されたサーマノックスカバースリップの上に１０μｌずつ落とし、クリーンベンチ(ｃｌｅ
ａｎ ｂｅｎｃｈ)内で乾かした。ここで、サーマノックスカバースリップ(Ｔｈｅｒｍａ
ｎｏｘ ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ)は、はさみで切って４等分しクリーンベンチのＵＶ下でオーバーナイト(ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ)させたのである。受精卵の透明テープをカッターで取り出し、ＣＡＭを探して確かめた後、ピンセットでサンプルが処理されたサーマノックスを覆し置いて、さらに透明テープで防いだ。この際、使うはさみ、カッター、ピンセットなどは７０％エタノールで消毒して使用し、ピンセットはサンプルを一つ一つロードする度に消毒して用いた。
【００３１】
７日目(６．５日胚)：透明テープをカッターで取り出した。シリンジでイントラリポス(脂肪懸濁液)を１ｍｌ取って、気泡を除去した後、ＣＡＭのすぐ下に注入した。この際、白色基に明らかな血管を観察できた。シリンジでイントラリポスを注入する際には血管が傷つかないように注意する。観察が終った受精卵はカメラで近接撮影した。
【００３２】
実験結果、図９の結果と一致するように、ＨＳＤＶＨＫとＨＧＤＶＨＫは効果的に鶏絨毛膜血管新生(ＣＡＭ ａｎｇｉｏｈｅｎｅｓｉｓ)を抑える効果が強弱の差を表しながら
観察されたが、ＨＨＤＶＨＫは影響が殆ど無かった。結果をまとめて図１０に示した。
【００３３】
７−３)皮下固形癌の成長抑制実験
ルイス肺癌細胞(Ｌｅｗｉｓ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｃｅｌｌ、１Ｘ１０6個)をＣ５７ＢＬ／６マウスの背(ｄｏｒｓａｌ)中間部位に皮下注射し、腫瘍の嵩が１００〜２００ｍｍ3になった時、無作為に三つの群に分けた。二つの群には一日に一回、腫瘍か
ら離れた部位にＨＧＤＶＨＫ又はＨＳＤＶＨＫ(１００ｍｇ／マウスｋｇ)ＰＢＳ溶液を各々皮下注射し、他の一つの群には対照群としてＰＢＳ溶液を注射した。全てのグループにおいて、腫瘍の大きさを毎日同一時間に測定し、実験は対照群のマウスが死んだ時に中断した。
【００３４】
実験結果、ルイス肺癌細胞を実験マウスに注射して作った固形癌の成長は、１００ｍｇ／マウスｋｇの ＨＳＤＶＨＫを投与すると、顕著に抑制されることを観察した。このよ
うな結果は、ＨＳＤＶＨＫの抗新生血管形成活性により固形癌の成長を抑えた結果であると解釈される。その結果をまとめて図１１、図１２及び図１３に示した。
【００３５】
以上の結果から見ると、本発明により製造されたインテグリンマイクロアレイはペプチドライブラリーを通じてインテグリンと特異的に結合する拮抗ペプチドを効果的に探索す
ることができ、その結果、今まで知られていなかった独特なアミノ酸配列を有するペプチドを掘り出すことができたのである。同時に、このような拮抗ペプチドの生物学的活性をインビトロ(ｉｎ ｖｉｔｒｏ)ヒト子宮血管内皮細胞移動実験、インビボ(ｉｎ ｖｉｖｏ)鶏絨毛膜血管新生抑制実験及び皮下固形癌成長抑制実験を通じて証明したのである。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
以上のような本発明は次のような効果を奏する。
第一、新薬候補物質スクリーニングに応用することができる。インテグリン拮抗物質の超高速大量探索(Ｈｉｇｈ-Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ)が可能であるため、疾患と係わった他の種類の標識蛋白質に対する拮抗蛋白質の超高速大量探索が可能になるので短い時間内に多くの新薬候補物質を探索することができる。
【００３７】
第二、ＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐTMを用いて製造したインテグリン蛋白質チップのインテグリン-リガンド反応は、測定の限界が非常に低いので高感度測定が可能である。既存のイ
ンテグリン-リガンド相互作用研究方式はＥＬＩＳＡ方法であったが、これは蛋白質の量
が多く所要され、非特異的反応を現す短所があったのである。しかし、ＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐTMを用いて、使用される蛋白質の量がＥＬＩＳＡより１，０００倍以上少ない量を用いるため、既存に用いたものより費用の面で遥かに節減効果があり、さらに、その結果も既存のものより高感度測定が可能であるため、より良質の結果を得ることができる。
【００３８】
第三、蛋白質-蛋白質相互作用研究に用いられる。インテグリン受容体を一つの例とし
てインテグリン-リガンド相互作用を調べたが、他の多くの種類の蛋白質に対して反応す
る蛋白質-蛋白質相互作用研究も可能である。
【００３９】
第四、応用性が多様である。つまり、蛋白質-ＤＮＡ、蛋白質-小分子(Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ)(化学的化合物)、蛋白質-特定細胞との相互作用などの研究が可能になるのである。
【００４０】
第五、本発明は、優れたインテグリンαIIbβ3及びインテグリン αVβ3阻害活性を有
する新規ペプチドを提供し、このような本発明のペプチドは抗癌剤として用いられるのである。
【００４１】
本明細書に記載された実施例と図面に示された構成は本発明の最も望ましい一実施例に過ぎず、本発明の技術的思想のすべてを代弁するものではないため、本出願時点においてこれらに代替できる多様な均等物と変更例が有り得ることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は蛋白質チップであるＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐTM上にインテグリン受容体の固定化方法を模式的に示した図である。
【図２】図２は蛋白質チップであるＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐTMを用いたインテグリン-リガンド結合反応の実験結果を示した図である。
【図３】図３は上のようなインテグリン-リガンド結合反応の一つの実施例であって、インテグリン拮抗物質によるインテグリンαIIbβ3-フィブリノゲン結合抑制実験を遂行した結果である。実験に用いたＲＧＥとＲＧＤは自動化ペプチド合成装置を用いて合成したものであって、このようなペプチドを注文者の要求に応じて合成してくれる業者から購入した。実験に用いたものは塩基が６個であるもので中間に塩基配列であるＲＧＥまたはＲＧＤを有する。一般にインテグリンαIIbβ3は塩基配列であるＲＧＤとは結合してフィブリノゲンがインテグリンαIIbβ3と結合することを抑制する。しかし、ＲＧＥはインテグリンαIIbβ3とは結合しないのでこのような抑制役割を果たすことができない。図３はこのような内容を実験した結果である。
【図４】図４はインテグリン拮抗物質によるインテグリンαVβ3-ビトロネックチン結合抑制実験の結果である。
【図５】図５はインテグリンαIIbβ3に拮抗作用を有するペプチドを掘り出すための実験である。蛍光強度はにじ色で表現される。ここで用いられた１Ａ６のような記号において、一番目の数字は特定アミノ酸が調整された位置を、二番目の英文字はアミノ酸を、そして最後の数字はペプチドの長さを示すのである。例えば、２Ｈ６はヘキサペプチドであって、２番目の位置にヒスチジンがあるということを意味する。
【図６】図６は図５で実験した結果、つまり、蛍光強度を数字で計算してグラフとして描いた結果である。グラフにおいて黄色棒はフィブリノゲンのみある場合の蛍光強度と比べて蛍光強度が約３０％ないし約５０％の間である場合、そして、赤色棒は約２０％未満である場合を示す。グラフの下の１ない１９という数字は左側ボックスの内にある塩基を言い、「ｐｏｓｉｔｉｏｎ数字」は塩基が固定された位置である。例えば、ｐｏｓｉｔｉｏｎ１でＸ軸が１であるものはヘキサペプチドの１番位置にアラニンがあるということを意味する。また、Ｙ軸は蛍光強度であって色を数字で示したもので最大蛍光強度は６５５３５である。グラフが短いほど阻害する役割が大きいと言える。
【図７】図７は図５と同様の方法を用いてインテグリンαVβ3をもって実験した結果である。
【図８】図８は図６と同様の方法を用いてインテグリンαVβ3をもって実験した結果である。
【図９】図９はヒト子宮血管内皮細胞(ＨＵＶＥ ｃｅｌｌ)の移動に及ぶインテグリンαVβ3拮抗ペプチドの影響を分析した結果である。各拮抗ペプチドの生物学的特性研究の一環としてインビトロ(ｉｎ ｖｉｔｒｏ)血管内皮細胞移動実験を遂行した結果である。
【図１０】図１０は卵絨毛膜血管新生に及ぶインテグリンαVβ3拮抗ペプチドの影響を分析した結果である。各拮抗ペプチドの生物学的特性研究の一環としてインビボ(ｉｎ ｖｉｖｏ)で血管新生抑制実験を遂行した。図１０において、ＡはペプチドなしにｂＦＧＦのみを処理した陽性対照群(ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ群)の結果であり；ＢはｂＦＧＦなしに細胞のみある陰性対照群(ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ群)の結果であり；ＣはｂＦＧＦの存在下でＧＲＧＤＳＰペプチドで処理した群の結果であり；ＤはｂＦＧＦの存在下でＨＧＤＶＨＫペプチドで処理した群の結果であり；ＥはｂＦＧＦの存在下でＨＳＤＶＨＫペプチドで処理した群の結果であり；ＦはｂＦＧＦの存在下でＨＨＤＶＨＫペプチドで処理した群の結果である。
【図１１】図１１はルイス肺癌細胞を投与したＣ５７ＢＬ／６マウスを用いた皮下固形癌成長抑制実験においてインテグリンαVβ3拮抗ペプチドが及ぶ影響を評価した実験結果写真である。
【図１２】図１２はルイス肺癌細胞を投与したＣ５７ＢＬ／６マウスを用いた皮下固形癌成長抑制実験においてインテグリンαVβ3拮抗ペプチドを投与することによって変化する腫瘍の大きさを示した結果である。
【図１３】図１３はルイス肺癌細胞を投与したＣ５７ＢＬ／６マウスを用いた皮下固形癌成長抑制実験においてインテグリンαVβ3拮抗ペプチドを投与したことによって変化する腫瘍の重さを示した結果である。
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
インテグリン拮抗物質ペプチド
【図１】
2007510139.tif 000006
【図２】
2007510139.tif 000007
【図３】
2007510139.tif 000008
【図４】
2007510139.tif 000009
【図５】
2007510139.tif 000010
【図６】
2007510139.tif 000011
【図７】
2007510139.tif 000012
【図８】
2007510139.tif 000013
【図９】
2007510139.tif 000014
【図１０】
2007510139.tif 000015
【図１１】
2007510139.tif 000016
【図１２】
2007510139.tif 000017
【図１３】
2007510139.tif 000018
【配列表】
2007510139000001.app
【国際調査報告】
2007510139.tif 000019
2007510139.tif 000020
2007510139.tif 000021