(57)【要約】  ２つの非同一ポリヌクレオチドからヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを調製し、一方の鎖の塩基対ミスマッチ部位またはその近傍にニックを導入し、ニックが生じたミスマッチ部位からミスマッチ塩基を除去し、除去した塩基を第１鎖中の塩基を補完する塩基で置き換えるために、反対鎖をテンプレートとして使用することによって、非同一ポリヌクレオチド配列間で配列変異を再分配するインビトロ法を記載する。この方法により、ミスマッチの部位で、一方の鎖から他方の鎖へと情報が伝達される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの親ポリヌクレオチドに由来する異なるヌクレオチド配列を有する改変体ポリヌクレチドを作製する方法であって、該方法は、以下：
少なくとも該２つの親ポリヌクレオチド間で少なくとも１つのヘテロ二重鎖を調製する工程、
該ヘテロ二重鎖中の少なくとも一方のポリヌクレオチド鎖をミスマッチ部位で切断して切断部位を形成させる工程、
該切断部位またはその近傍で少なくとも一方のポリヌクレオチド鎖上の少なくとも１つのヌクレオチドを置換する工程、
を包含し、該ポリヌクレオチド鎖の少なくとも一方が、該少なくとも２つの親ポリヌクレオチドのどちらとも異なるヌクレオチド配列を有する方法。
【請求項２】
ヘテロ二重鎖を形成する前記ポリヌクレオチドが環状である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調製工程がインビトロで行われ、かつ前記切断工程および前記置換工程がインビボで行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列が遺伝子を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列がゲノムである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列が、約１００ｂｐを超えるポリヌクレオチド分子内の一領域である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも３つの親ポリヌクレオチドを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
複数の改変体ポリヌクレオチドが形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
所望の機能的特性をコードするポリヌクレオチド配列を取得する方法であって、該方法は、以下：
少なくとも２つの親ポリヌクレオチドから少なくとも１つのヘテロ二重鎖を作製する工程、
該ヘテロ二重鎖中の少なくとも一方のポリヌクレオチド鎖をミスマッチ部位で切断して切断部位を形成させる工程、
該切断部位またはその近傍で少なくとも一方のポリヌクレオチド鎖上の少なくとも１つのヌクレオチドを置換して、該少なくとも２つの親ポリヌクレオチドのどちらとも異なるポリヌヌクレオチド配列を有する複数の改変体ポリヌクレオチド鎖を形成させる工程、
該所望の機能的特性に関して、改変体の集団を選別または選択する工程、
を包含する方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、該方法は、以下：
少なくとも一つの改変体ポリヌクレオチド鎖を含む第２ヘテロ二重鎖を形成させる工程、
該第２ヘテロ二重鎖中の少なくとも一方のポリヌクレオチド鎖をミスマッチ部位で切断して切断部位を形成させる工程、
該切断部位またはその近傍で少なくとも一方のポリヌクレオチド鎖上の少なくとも１つのヌクレオチドを置換して、該第２ヘテロ二重鎖中に存在するどちらの親ポリヌクレオチドとも異なるヌクレオチド配列を有する複数の改変体ポリヌクレオチド鎖を形成させる工程、および
該所望の機能的特性に関して、改変体の集団を選別または選択する工程、
を、さらに包含する方法。
【請求項１１】
前記選別または選択の工程に先立って前記改変体ポリヌクレオチドをＲＮＡに変換する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記改変体ポリヌクレオチドまたはそこから転写されたＲＮＡを翻訳してポリペプチドを産生させる工程をさらに包含し、前記選別または選択の工程が前記ポリペプチドに対して行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
所望の機能的特性を有する再集合ＤＮＡ分子を同定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）少なくとも１つの一本鎖修飾ポリヌクレオチドであって、該一本鎖修飾ポリヌクレオチドまたはその相補鎖が該所望の特性を有するかまたは該所望の特性をコードし、該修飾ポリヌクレオチドはハイブリダイゼーション可能であるが増幅不可能である、少なくとも１つの一本鎖修飾ポリヌクレオチドを提供する工程、ｂ）該一本鎖修飾ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な１つまたは複数の非同一一本鎖ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子が少なくとも１つのさらなる改変体を有するかまたはコードする、１つまたは複数の非同一一本鎖ＤＮＡ分子を用意する工程、
該一本鎖修飾ポリヌクレオチドを、工程（ｂ）の少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡ分子と接触させ、それにより、アニールしたＤＮＡ分子を生成させる工程、
該アニールしたＤＮＡ分子を、ミスマッチエンドヌクレアーゼ、校正酵素およびリガーゼと共にインキュベートし、それにより、該一本鎖修飾ポリヌクレオチドにアニールした組換えＤＮＡ鎖を生成させる工程、および
該所望の機能的特性をコードするＤＮＡ分子を同定するために、再集合ＤＮＡ分子の集団を選別または選択し、それにより、該所望の機能的特性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数のＤＮＡ分子を同定する工程、
を包含する方法。
【請求項１４】
前記修飾ポリヌクレオチドが増幅されない条件下で前記再集合ＤＮＡ鎖を増幅することにより、前記選別または選択の工程に先立って、再集合ＤＮＡ分子の集団を調製する工程をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記修飾ポリヌクレオチドがウラシルを含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
所望の機能的特性を有する組換えＤＮＡ分子を同定する方法であって、該方法は、以下：
少なくとも、
ａ．少なくとも１つの一本鎖修飾ポリヌクレオチドであって、該一本鎖修飾ポリヌクレオチドまたはその相補鎖が、該修飾ポリヌクレオチドはハイブリダイゼーション可能であるが増幅不可能である、少なくとも１つの一本鎖修飾ポリヌクレオチドと、
ｂ．該一本鎖修飾ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な少なくとも１つの非同一一本鎖ＤＮＡであって、該ＤＮＡ分子が少なくとも１つのさらなる改変体を有するかまたはコードしている、少なくとも１つの非同一一本鎖ＤＮＡと
の間に、アニールした二本鎖分子を形成させる工程、
該アニールした二本鎖分子の少なくともＤＮＡ鎖を切断して切断部位を形成させる工程、および
該切断部位またはその近傍でヌクレオチドを置換し、それにより、該修飾ポリヌクレオチドにアニールした組換えＤＮＡ鎖を生成させる工程であって、該組換えＤＮＡ鎖は、該アニールした二本鎖分子のどちらのポリヌクレオチドとも異なるヌクレオチド配列を有する工程、および
該所望の機能的特性を有するかまたはコードしている組換えＤＮＡ分子を同定するために、組換えＤＮＡ分子の集団を選別または選択し、それにより、該所望の機能的特性を有するかまたはコードしている１以上のＤＮＡ分子を同定する工程、
を包含する方法。
【請求項１７】
前記修飾ＤＮＡ分子が増幅されない条件下で組換えＤＮＡ鎖を増幅することにより、前記選別または選択の工程に先立って、組換えＤＮＡ分子の集団を生成する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記切断工程がミスマッチ部位で起こる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記修飾ポリヌクレオチドがウラシルを含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つのヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドからインビトロで配列改変体を作製する方法のための組成物であって、該ヘテロ二重鎖は少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対を有し、該組成物は、有効量の、エキソヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性およびミスマッチ鎖切断活性を有する１つまたは複数の作用因子を含む組成物。
【請求項２１】
リガーゼ活性をさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
少なくとも１つのヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドからインビトロで配列改変体を作製する方法のための組成物であって、該ヘテロ二重鎖は少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対を有し、該組成物は、有効量の、３’→５’校正エキソヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性および鎖切断活性を有する１つまたは複数の作用因子を含む組成物。
【請求項２３】
リガーゼ活性をさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
少なくとも１つのヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドからインビトロで配列改変体を作製するために使用されるキットであって、該ヘテロ二重鎖は少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対を有し、該キットは、有効量の、エキソヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性および鎖切断活性を有する１つまたは複数の作用因子を含有する複数の容器を含むキット。
【請求項２５】
リガーゼ活性を有する１つまたは複数の作用因子をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対と、該２つの非相補的ヌクレオチド塩基対の少なくとも１つに位置するニックとを有する、ニックが入った環状ヘテロ二重鎖。
【請求項２７】
ニックが、前記少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対の少なくとも２つに位置する、請求項２６に記載のニックが入った環状ヘテロ二重鎖。
【請求項２８】
ヘテロ二重鎖内で解消されるポリ核酸配列の長さを変化させる方法であって、該方法は、以下：
ａ．少なくとも１つのヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを調製する工程、
ｂ．該ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを、有効量の、少なくともエキソヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性および鎖切断活性を有する１つまたは複数の作用因子と混合する工程、および
ｃ．該ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドの鎖間の相補率が増加するのに十分な時間待つ工程、
を包含し、該ヘテロ二重鎖のポリヌクレオチド鎖間で所望の長さの解消が得られるように、リガーゼ活性に対するポリメラーゼ活性の比を変化させる方法。
【請求項２９】
前記鎖切断活性がミスマッチ鎖切断活性である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
所望のポリヌクレオチド内の特定ヌクレオチドを囲むゾーンで突然変異を生成させる方法であって、該方法は、以下：
ａ．該所望のポリヌクレオチドを囲む該ゾーン内に少なくとも１つの非相補的ヌクレオチドを有する少なくとも１つの部分相補ポリヌクレオチドを調製する工程、
ｂ．該所望のポリヌクレオチドと該部分相補ポリヌクレオチドとの間に少なくとも１つのヘテロ二重鎖を形成させる工程、
ｃ．該ヘテロ二重鎖を少なくとも１つのヌクレオチド類似体、有効量の、エキソヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性およびミスマッチ鎖切断活性を有する１つまたは複数の作用因子と混合する工程、および
ｄ．核酸類似体が該所望のポリヌクレオチドもしくは該部分相補ポリヌクレオチドまたはその両方に組み込まれるのに十分な時間待つ工程、
を包含する方法。
【請求項３１】
リガーゼ活性を有する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１、１３、１８、２０または２９に記載の方法によって製造される非天然改変体ポリヌクレオチド。
【請求項３３】
所望の機能的特性を有する、請求項３２に記載の非天然改変体ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項１３、１８または２０に記載の方法によって製造される、所望の機能的特性を有する非天然改変体ポリペプチド。
【請求項３５】
前記所望の機能的特性が、親ポリヌクレオチドがコードしているポリペプチドの対応する所望の機能的特性とは異なっている、請求項３４に記載の非天然ポリペプチド。
【請求項３６】
請求項３０の方法によって製造される非天然突然変異型ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記突然変異が前記ヘテロ二重鎖中のミスマッチに存在するか、またはその３０ヌクレオチド以内に存在する、請求項３６に記載の非天然突然変異型ポリヌクレオチド。
【請求項３８】
第１ヌクレオチド配列および第２ヌクレオチド配列である少なくとも２つの部分を含み、
該第１ヌクレオチド配列は、第１天然ポリヌクレオチドの一部に対して同一または相補的であり、かつ第２天然ポリヌクレオチドの対応する部分に対しては同一でも相補的でもなく、
該第２ヌクレオチド配列は、第２天然ポリヌクレオチドの一部に対して同一または相補的であり、かつ第１天然ポリヌクレオチドの対応する部分に対しては同一でも相補的でもない、
非天然改変体ポリヌクレオチド。
【請求項３９】
第３ヌクレオチド配列をさらに含み、該第３ヌクレオチド配列は、第３天然ポリヌクレオチドの一部に対して同一または相補的であり、かつ前記第１天然配列または前記第２天然配列の対応する部分に対しては同一でも相補的でもない、請求項３８に記載の非天然改変体ポリヌクレオチド。
【請求項４０】
第１ペプチド配列および第２ペプチド配列である少なくとも２つの部分を含み、
該第１ペプチド配列が、第１天然ポリペプチドの一部に対して同一または相補的であり、かつ第２天然ポリペプチドの対応する部分に対しては同一でも相補的でもなく、
該第２ペプチド配列は、第２天然ポリペプチドの一部に対して同一または相補的であり、かつ第１天然ポリペプチドの対応する部分に対しては同一でも相補的でもない、
非天然改変体ポリペプチド。
【請求項４１】
第３ペプチド配列をさらに含み、該第３ペプチド配列は、第３天然ポリペプチドの一部に対して同一または相補的であり、かつ前記第１天然配列または前記第２天然配列の対応する部分に対しては同一でも相補的でもない、請求項４０に記載の非天然改変体ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本願は、米国仮特許出願第６０／４０２，３４２号（２００２年８月８日出願）に基づく優先権を主張する米国特許出願第１０／６３７，７５８号（２００３年８月８日出願）、米国特許出願第１０／２２６，３７２号（２００２年８月２１日出願）、米国特許出願第１０／２８０，９１３号（２００２年１０月２５日出願）、ならびに米国仮特許出願第６０／２６８，７８５号（２００１年２月１４日出願）および米国仮特許出願第６０／２６６，３８６号（２００１年２月２日出願）に基づく優先権を主張する米国特許出願第１０／０６６，３９０号（２００２年２月１日）の一部継続出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は概して分子生物学に関し、より具体的には、関連する核酸分子の集団を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景情報）
ＤＮＡシャフリングは、２つ以上のＤＮＡ配列間で組換え体を取得してそれらを加速度的に進化させるための強力なツールである。ＤＮＡシャフリングのプロセスに用いられる親ＤＮＡまたはインプットＤＮＡは、典型的には、野生型に対して何らかの改善された特徴を持つ、与えられた遺伝子の突然変異体または改変体である。ＤＮＡシャフリングの産物は、親核酸に由来する遺伝子配列の基本的にランダムな再集合体のプールに相当し、新しい配列の組合せがもたらす相加的または相乗的効果について、これを解析することができる。
【０００４】
帰納的な配列再集合は、適切な特性を持つ改変体だけが次世代の生成にその遺伝物質を提供することが許される進化過程に似ている。ＤＮＡシャフリングによる配列再集合を行った後、性能の漸進的改善について試験することにより、最適化された改変体を作製する。さらなる再集合と試験のサイクルにより、そのプロセスの以前のサイクルで同定された遺伝的改善の新しい組合せを持つ遺伝子が生成する。有益な遺伝的変化を再集合させ、組み合わせることにより、考えうる配列の組合せの全てを個別に作製し、選別しなくても、最適化された配列を生じさせることができる。
【０００５】
これは、既に改善されている配列に対する後続の改善が、主として偶然の発見によってもたらされるランダム突然変異誘発法とは、はっきりと異なる。例えば、強化された特性の所望の組合せを持つタンパク質を取得するには、種々の有益な突然変異の組合せを持つ突然変異体を同定する必要があるだろう。これらの有益な遺伝的変化を組み合わせるために利用できる方法がない場合は、さらなるランダム突然変異誘発が必要になるだろう。しかし、ランダム突然変異誘発法では、多数の突然変異体を作製し、それらを選別するサイクルを繰り返す必要があり、それは退屈で高度に労働集約的な方法になる。その上、配列が望ましくない影響を持つ突然変異をこうむる率は、配列の情報量と共に増加する。したがって情報量、ライブラリーサイズおよび突然変異生成速度が増加するにつれて、有益な突然変異に対する有害な突然変異の割合も増加し、さらなる改善の選択がますます困難になるだろう。最後に、いくつかのコンピュータシミュレーションにより、点突然変異誘発法はそれだけでは、多くの場合、漸進的すぎて、継続的で劇的な配列進化に要求される大規模ブロック変化は、可能にならないらしいことが示唆されている。
【０００６】
ランダム突然変異誘発には多種多様な技術が使用されている。例えばある方法では、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して、突然変異体遺伝子をライブラリー形式で生成させる（ＣａｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ，１９９２；Ｇｒａｍら、１９９２）。もう一つの方法はカセット突然変異誘発法である（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ，１９９２；Ｄｅｌａｇｒａｖｅら、１９９３；ＤｅｌａｇｒａｖｅおよびＹｏｕｖａｎ，１９９３；ＧｏｌｄｍａｎおよびＹｏｕｖａｎ，１９９２；Ｈｅｒｍｅｓら、１９９０；Ｏｌｉｐｈａｎｔら、１９８６；Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９３）。この方法では、最適化すべき特定領域を、合成的に突然変異させたオリゴヌクレオチドで置き換える。
【０００７】
エラープローンＰＣＲでは、配列全体に低レベルの点突然変異を導入するために、忠実度の低い重合条件を使用する。しかしこの方法の限界は、公表されたエラープローンＰＣＲプロトコールではポリメラーゼの連続移動性が低くなるため、平均的サイズの遺伝子でランダム突然変異生成を行うには、この方法は非効率的だということである。
【０００８】
オリゴヌクレオチド指定ランダム突然変異誘発法では、合成的に突然変異させたオリゴヌクレオチドで、短い配列を置き換える。遠く離れた突然変異の組合せを作製するには、異なる部位を異なるオリゴヌクレオチドによって同時に処理しなければならない。全ての部位を満たすのに必要なライブラリーサイズと比較して、この方法で得られるライブラリーサイズは限られているので、最適化を行うには何ラウンドも数多くの選択を行う必要がある。合成オリゴヌクレオチドを使った突然変異誘発法では、各選択後に個々のクローンを配列決定し、次いでそれらを複数のファミリーにグループ分けし、一つのファミリーを恣意的に選択して、それをコンセンサスモチーフにまとめる必要がある。そのようなモチーフを再合成し、一つの遺伝子に再挿入した後、さらなる選択を行う。この工程は統計的ボトルネックを生じ、労働集約的であり、何ラウンドも数多くの突然変異誘発を行うには実用的でない。
【０００９】
これらの理由から、エラープローンＰＣＲおよびオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発法は、例えば配列の微調整など、必要な配列改変のサイクル数が比較的少ない突然変異誘発プロトコールには使用できるが、数多くの突然変異誘発および選択サイクルを必要とする方法では（大きい遺伝子配列に対するものでは特に）、その有効性に限界がある。
【００１０】
上述のように、ランダムに突然変異させた遺伝子から改善された遺伝子産物を作製する先行技術の方法は、その有用性が限られている。ランダムに再集合させた遺伝子配列を作製するための方法として認識されている一方法では、酵素を使用して、長いヌクレオチド鎖を短い断片に切断する。次に、切断剤を遺伝物質から分離し、その物質を、遺伝物質がポリヌクレオチド鎖として再構成することが可能であるような方法（この際、その再構成はランダムであるか、または特定の順序に従う）で増幅する。この方法では、ランダムな断片に分解された遺伝子の改変体を組み立てるために、数ラウンドの増幅を行う必要がある（（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４ａ；Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４ｂ）、米国特許第５，６０５，７９３号、米国特許第５，８１１，２３８号、米国特許第５，８３０，７２１号、米国特許第５，９２８，９０５号、米国特許第６，０９６，５４８号、米国特許第６，１１７，６７９号、米国特許第６，１６５，７９３号、米国特許第６，１５３，４１０号）。この方法の変法では、再構成に先立って、プライマーと限定的ポリメラーゼ伸長反応とを利用して断片を作製する（米国特許第５，９６５，４０８号、米国特許第６，１５９，６８７号）。
【００１１】
しかしどちらの方法にも制限がある。これらの方法には技術的に複雑だという難点がある。そのため、これらの方法を応用できるのは、十分な経験を積んだスタッフを持つ施設に限定される。また、断片から分子を再構成することに起因する複雑な問題、例えば意図しない突然変異が生成することや、サイズが増すにつれて大きい標的分子を再構成させる困難さが増すことなどがあり、それらの問題が、長いポリヌクレオチド鎖を再構成させることに関して、これらの方法の有用性を制限する。
【００１２】
これらの断片化と再構成に基づく遺伝子シャフリングの方法が持つもう一つの制限は、親テンプレートポリヌクレオチドが不均質性を増すにつれて発生する。これらの方法のアニーリング工程では、小さいポリヌクレオチド断片が、塩基対形成相互作用によって生じる安定化力に依存して、適正にアニールする。小さなアニーリング領域はその短さゆえに限られた安定化力しか持たないので、高度に相補的な配列のアニーリングは、相違の大きい配列よりも有利になる。そのような場合、これらの方法は、ある特定の親テンプレートに由来する相補的一本鎖のアニーリングによって親テンプレートポリヌクレオチドを再生する傾向を強く持っている。したがって親テンプレートは基本的に自分自身を再構成して、ライブラリー中に不変ポリヌクレオチドのバックグラウンドを生成し、それが組換え分子の検出をより困難にする。この問題は、親テンプレートが不均質になればなるほど、すなわち親テンプレート間の配列一致率が減少するにつれて、ますます重大になる。この結果はＫｉｋｕｃｈｉら（Ｇｅｎｅ  ２４３：１３３−１３７，２０００）によって実証された。Ｋｉｋｕｃｈｉらは、Ｐａｔｔｅｎら、１９９７；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９８；Ｈａｒａｙａｍａ，１９９８；Ｋｕｍａｍａｒｕら、１９９８；Ｃｈａｎｇら、１９９９；Ｈａｎｓｓｏｎら、１９９９によって報告されたファミリーシャフリングの方法を使って、ｘｙｌＥとｎａｈＨの間の組換え体を作製しようと試みた。Ｋｉｋｕｃｈｉらは、組換え体が実質上生成しないこと（＜１％）を見いだした。彼らは、一本鎖ＤＮＡの断片化および再構成によってキメラ遺伝子の形成を改善する方法も開示している。彼らはこの方法を使って１４パーセントの割合でキメラ遺伝子を取得したが、他の８６パーセントは親配列だった。
【００１３】
組換え体の回収効率が低いという特徴は、配列一致率が低い親テンプレート（すなわち多様性が高い親テンプレート）から新規ポリヌクレオチドを生成させることに関して、これらの方法の有用性を制限する。したがって、これらの要求に応える遺伝子配列作製方法が必要とされている。
【００１４】
本発明は、上述の必要を満たす方法を提供すると共に、それに関連する利点も提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の概要）
本発明は、ヘテロ二重鎖分子を形成させ、次に、ミスマッチ部位における配列情報が一方の鎖から他方の鎖に伝達されるようにミスマッチを取り扱うことにより、インビトロで突然変異を関連ポリヌクレオチド間で再集合させる方法を提供する。好ましい一態様では、ミスマッチニッキング酵素、ｄＮＴＰ類の存在下で３’→５’校正活性を持つポリメラーゼ、およびリガーゼを含有する反応液中でヘテロ二重鎖分子をインキュベートすることによって、ミスマッチを取り扱う。これらの各活性は、与えられたミスマッチ部位で、ヘテロ二重鎖にニックを入れ、不対塩基を一方の鎖から除去した後、テンプレートとして反対鎖を使用して置換し、そしてニックを閉じるように、協調して作用する。アウトプットポリヌクレオチドは、増幅してからクローニングするか、直接クローニングし、改善された特性について試験する。ミスマッチ解消再集合と試験のサイクルをさらに繰り返すことが、さらなる改善につながりうる。
【００１６】
一態様として、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列の２本の鎖間の均質性を増加させるインビトロ法は、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列を有効量のミスマッチ指向性鎖切断活性、校正活性およびリガーゼ活性と混合すること、ならびにヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列の２本の鎖間の均質性が生じるのに十分な時間待つことを含む。
【００１７】
もう一つの態様として、少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対を持つヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列中の相補的塩基対の数を増加させるインビトロ法は、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列のコピーを有効量のミスマッチ指向性鎖切断活性、校正活性およびリガーゼ活性と混合すること、ならびに多くの非相補的ヌクレオチド塩基対が相補的塩基対に変換されて、鎖間の均質性が少なくとも１つの相補的塩基対分は増加するのに十分な時間待つことを含む。
【００１８】
もう一つの態様として、少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対を持つヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列から配列改変体の集団を作製するインビトロ法は、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列を有効量のミスマッチ指向性鎖切断活性、校正活性およびリガーゼ活性と混合すること、ならびに多くの非相補的ヌクレオチド塩基対が相補的塩基対に変換されて、ポリペプチド配列の多様な集団が生じるのに十分な時間待つことを含む。
【００１９】
もう一つの態様として、所望の機能的特性をコードするポリヌクレオチド配列を取得するインビトロ法は、少なくとも１つのヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列を調製すること、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列のコピーを有効量のミスマッチ指向性鎖切断活性、校正活性およびリガーゼ活性と混合すること、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列の鎖間の相補率が増加して集団中の配列多様性が増すのに十分な時間待つこと、ならびに所望の機能的特性について改変体の集団を選別または選択することを含む。
【００２０】
もう一つの態様として、所望の機能的特性をコードするポリヌクレオチドを取得するインビトロ法は、少なくとも１つのヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを調製すること、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列のコピーを有効量のミスマッチ指向性鎖切断活性、校正活性およびリガーゼ活性と混合すること、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列中のミスマッチヌクレオチド塩基対の一部または全部が相補的塩基に変換されて、ポリヌクレオチド配列の多様な集団が生じるのに十分な時間待つこと、所望の機能的特性を持つ改変体の集団を選別または選択すること、前記改変体の集団を変性させて一本鎖ポリヌクレオチド配列の集団を取得すること、前記一本鎖ポリヌクレオチド配列の集団をアニールさせてヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列の多様な集団を形成させること、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列を有効量のミスマッチ指向性鎖切断活性、校正活性およびリガーゼ活性と混合すること、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列中のミスマッチヌクレオチド塩基対の一部または全部がマッチ塩基対に変換されて、ポリヌクレオチド配列の多様な集団が生じるのに十分な時間待つこと、そして所望の機能的特性を持つ改変体の集団を選別または選択することを含む。ＤＮＡは、選別に先立って、ＤＮＡの転写により、ＲＮＡに変換することができる。リガーゼ活性は校正後の鎖を閉じるために加えることができる。
【００２１】
この方法の利点の一つは、配列が環状または線状であるということである。これは、ほぼ無制限な配列長のシャフリングを可能にする。改変体ポリヌクレオチド配列はさまざまな量の相補性を持つ。下記の実施例では、配列相同性が４７％しかない２つのポリヌクレオチド間のポリヌクレオチドヘテロ二重鎖における相補性の増加を示すデータを記載する。
【００２２】
今までの遺伝子シャフリング法、例えばＳｔｅｍｍｅｒらの方法と比較した、本発明の利点の一つは、ミスマッチの発生率が高い区域内で配列を交換できることである。Ｓｔｅｍｍｅｒらの方法は断片の再アニーリングを必要とするので、かなりの量の一致度（一般的には少なくとも約７０％の一致度）が要求される。本発明は、はるかに低い一致度を持つ領域でも、切断し解消することができる。なぜなら、二本鎖が切断され、変性され、再アニールするのではなく、ポリヌクレオチド全体は概して単にニックが入るだけで、一つにまとまっているからである。
【００２３】
このプロセスは、与えられたヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子の多くの部位で、また両方の鎖で、同時に起こりうる。その結果、インプット鎖間の配列差のランダム化が起こり、出発配列の集団よりも多様な配列改変体の集団が得られる。
【００２４】
もう一つの態様として、所望の機能的特性を持つタンパク質をコードする再集合ＤＮＡ分子を同定する方法は、少なくとも１つの一本鎖ウラシル含有ＤＮＡ分子であって、その一本鎖ウラシル含有ＤＮＡ分子またはその相補鎖がタンパク質をコードしているものを用意すること、前記一本鎖ウラシル含有ＤＮＡ分子にハイブリダイズする能力を持つ１つまたは複数の非同一一本鎖ＤＮＡ分子であって、前記ＤＮＡ分子が前記タンパク質の少なくとも１つの追加改変体をコードしているものを用意すること、前記一本鎖ウラシル含有ＤＮＡ分子を工程（ｂ）の少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡ分子と接触させることにより、アニールしたＤＮＡ分子を生成させること、アニールしたＤＮＡ分子をミスマッチエンドヌクレアーゼ、校正ポリメラーゼおよびリガーゼと共にインキュベートすることにより、ウラシル含有ＤＮＡ分子にアニールした配列再集合ＤＮＡ鎖を生成させること、ウラシル含有ＤＮＡ分子が増幅されない条件下で再集合ＤＮＡ鎖を増幅することにより、再集合ＤＮＡ分子の集団を生成させること、そして所望の機能的特性を持つポリペプチドをコードするものを同定するために再集合ＤＮＡ分子の集団を選別または選択することにより、所望の機能的特性を持つポリペプチドをコードする１つ以上のＤＮＡ分子を同定することを含む。このプロセスはテンプレートとしてＲＮＡ分子を使用して行うこともできる。
【００２５】
（定義）
本明細書および特許請求の範囲が、ここで各用語に与えられている範囲を含めて、明確にかつ首尾一貫して理解されるように、以下の定義を記載する。
【００２６】
本明細書で使用する「増幅」という用語は、ポリヌクレオチドのコピー数が増加するプロセスを指す。これは、その分子に対して直接行うか、またはそれを（例えば形質転換、トランスインフェクション（ｔｒａｎｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）などによって）細胞内に入れて、その細胞にそのポリヌクレオチドを自然に複製させることなどによって、間接的に行うことができる。
【００２７】
本明細書で使用する「アニーリング」という用語は、少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションによる、少なくとも部分的に二本鎖である核酸の形成を指す。部分的に二本鎖である核酸は、短い方の核酸鎖が長い方の核酸の一部と１００％同一である場合に、短い方の核酸鎖が長い方の核酸鎖にハイブリダイズすることによって生じうる。また、１００％の一致度は持たないが、ある特定の一組のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするのに十分な相同性を持つ２つの核酸鎖がハイブリダイズすることによっても、部分的に二本鎖である核酸は生じうる。
【００２８】
本明細書で使用する「クランプ」という用語は、例えばＰＣＲプライマーへのクランプ配列の組込みなどの方法によって、ポリヌクレオチドの一端に付加されるユニークなヌクレオチド配列を指す。以前に記載されているように（Ｓｋａｒｆｓｔａｄ，Ｊ．Ｂａｃｔ，ｖｏｌ  １８２，Ｎｏ  １１，Ｐ．３００８−３０１６）、クランプ配列は、異なる親に由来する鎖同士のハイブリダイゼーションによって生じるポリヌクレオチド配列（すなわちヘテロ二重鎖分子）だけの増幅を可能にし、それによって完全長ハイブリッド産物の生成を確実にするためのものである。
【００２９】
本明細書で使用する「切断」という用語は、ポリヌクレオチドを酵素で消化すること、または他の方法でポリヌクレオチド内のリン酸ジエステル結合を破壊することを意味する。
【００３０】
本明細書で使用する「相補的塩基対」という用語は、一方の鎖中のアデニンが他方の鎖中のチミン（またはウラシル）と向かい合い、一方の鎖中のシトシンが他方の鎖中のグアニンと向かい合っているような、二重らせん中のＤＮＡ（またはＲＮＡ）塩基の対応を指す。
【００３１】
本明細書で使用する「〜に相補的」という用語は、ここでは、相補配列が基準ポリヌクレオチド配列の全部または一部の逆相補鎖と同一であること、または一方の鎖中の各ヌクレオチドが反対鎖中のヌクレオチドまたはその類似体と塩基対を形成できることを意味するために用いられる。例えば、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は基準配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００３２】
本明細書で使用する「変性（する／させる）」または「変性した」という用語は、これを核酸に関して使用する場合には、二本鎖核酸から一本鎖核酸への変換を指す。二本鎖核酸を変性させる方法は当業者にはよく知られており、例えば塩基対形成を不安定化する作用因子の添加、温度を上昇させること、塩濃度を低下させること、またはそれらの組合せが含まれる。これらの要因は、鎖の相補性に応じて、すなわち鎖が１００％相補的であるか、それとも１つ以上の非相補ヌクレオチドを持っているかに応じて適用される。
【００３３】
本明細書で使用する「所望の機能的特性」という用語は、選択または選別の目的となりうる表現型特性を意味し、例えばポリペプチドをコードすること、連結されたポリヌクレオチドの転写を促進すること、タンパク質を結合すること、あるポリペプチド、生物またはベクターの機能または生物学的特性を改善することなどが含まれるが、これらに限るわけではない。そのような所望の機能的特性を持つポリヌクレオチドは、例えば適切な植物、動物、真菌、酵母または細菌発現ベクターからの発現、組込みによるトランスジェニック植物、トランスジェニック動物またはトランスジェニック微生物の作出、リボザイムの発現などを含む（ただしこれらに限らない）数多くの方法で、使用することができる。
【００３４】
本明細書で使用する「ＤＮＡシャフリング」という用語は、ここでは、実質上相同であるが同一ではない配列間での配列情報の再集合を示すために用いられる。
【００３５】
本明細書で使用する「有効量」という用語は、ある作用因子がその所期の活性をもたらすのに必要なその作用因子の量を指す。本発明の場合、この決定は、当業者の知識で十分に可能である。
【００３６】
本明細書で使用する「エキソヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド鎖の末端から１回に１つのヌクレオチドを切断する酵素、すなわちポリヌクレオチド分子の３’端または５’端のどちらかからリン酸ジエステル結合を加水分解する酵素を指す。そのようなエキソヌクレアーゼには、例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌Ｐｏｌ  １およびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼなどがあるが、これらに限るわけではない。３’→５’方向に加水分解するエキソヌクレアーゼは「３’→５’エキソヌクレアーゼ活性」を持つと言われる。同様に、５’→３’活性を持つエキソヌクレアーゼは「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性」を持つと言われる。なお、例えば大腸菌Ｐｏｌ  Ｉなど、一部のエキソヌクレアーゼは３’→５’活性と５’→３’活性を両方とも持つことが知られている。
【００３７】
本明細書で使用する「ミスマッチ解消による遺伝子再集合（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＲＡＭＭＲ）」という用語は、２つの非同一ポリヌクレオチドからヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを作製し、一方の鎖の塩基対ミスマッチ部位またはその近傍にニックを導入し、ニックが生じたミスマッチ部位からミスマッチ塩基を除去し、除去した塩基を第１鎖中の塩基を補完する塩基で置き換えるために、反対鎖をテンプレートとして使用することによって、非同一ポリヌクレオチド配列間で配列変異を再分配するインビトロ法を使って、関連ポリヌクレオチド間で配列変異を再集合させる方法を指す。この方法により、ミスマッチの部位で一方の鎖から他方の鎖へと情報が伝達される。
【００３８】
この方法では、部分相補分子中の複数の部分を、独立して同時に取り扱うことができる。その結果として、ポリヌクレオチド配列中の相補塩基対の割合が上昇する。
【００３９】
ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列の２本の鎖間にある１つ以上の塩基対ミスマッチは、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列を有効量のミスマッチ指向性鎖切断活性、校正活性およびリガーゼ活性と混合することで１つ以上のミスマッチを解消するインビトロ法によって、解消される。この方法により、ミスマッチの部位で一方の鎖から他方の鎖に情報が伝達される。
【００４０】
ミスマッチは、２つの非相補塩基が互いに向かい合って存在する結果であることができる。ミスマッチ部位は、隣接ミスマッチによって不安定になるヌクレオチド塩基対を含む、いくつもの不対ヌクレオチドのクラスターからなることができる。ミスマッチは、一方の鎖に、反対鎖上に数量的対応のない１つ以上の塩基が存在する結果であることもできる。例えば、ミスマッチの部位では、一方の鎖には１つの不対塩基が存在し、他方の鎖には不対塩基が存在しないかもしれない。これは、一方の鎖の当該部位に単一の不対ヌクレオチドを含んでいる配列長不均質部位をもたらしうる。このミスマッチ部位で最初にニックが入る鎖がどちらであるかに依存して、本発明の方法では、短い方の鎖に対して一塩基の挿入が起こることになるか、または元々余分な不対ヌクレオチドを持っていた鎖に対して一塩基の欠失が起こることになるだろう。一方の鎖から他方の鎖に配列長情報が伝達されるこの原理は、２本の鎖上のミスマッチ塩基の数が互いに一致していない任意のミスマッチ部位に、当てはまりうる。
【００４１】
通常は、反応液中にヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドのコピーが数多く存在する。この状況では、ポリヌクレオチドの一コピー上のトップ鎖と、別の一コピー中のボトム鎖とをテンプレートとして、ミスマッチ部位の配列情報が伝達されうる。十分なコピー数を利用できると仮定した場合、単一のミスマッチが存在するなら、２つのアウトプット改変体が考えられる。２つのミスマッチ部位が存在するなら、２×２個の改変体が生じうる。ｎ個のミスマッチ部位が存在するなら、少なくとも２のｎ乗個、すなわち２ｎ個の遺伝子再集合体が、ミスマッチ解消によって可能になる。考えうる結果は少なくとも２ｎ個の改変体ポリヌクレオチドである。ここで少なくともと言うのは、正確な機構が完全にはわかっていないからである。２塩基以上の長さのミスマッチ部位の場合、個々の事象は、１個、２個またはそれ以上のミスマッチ塩基をテンプレートにするのだろうと、推測することができる。そうであるとすれば、生じうる改変体の数は増加することになるだろう。
【００４２】
本明細書で使用する「ＧＥＮＥＷＡＲＥ」または「ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）」という用語は、少なくとも一部がトバモウイルスに由来し、追加の（通常は異種の）サブゲノムプロモーターを持つように修飾されているウイルスベクターを指す。自然界に見いだされるトバモウイルスは、典型的には、移動タンパク質およびコートタンパク質のサブゲノムプロモーターを持っている。ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）はＬａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｃｏｒｐｏｔａｔｉｏｎの登録商標である。
【００４３】
本明細書で使用する「粒状性」という用語は、与えられた子孫ポリヌクレオチド中に隣接した配列として存在する、与えられた親ポリヌクレオチドに由来する核酸配列情報の量を指す。
【００４４】
本明細書で使用する「テンプレート配列」という用語は、第２ポリヌクレオチド配列に部分的に相補的な第１一本鎖ポリヌクレオチド配列であって、ＧＲＡＭＭＲで処理すると、そのテンプレート鎖から第２鎖への遺伝情報の伝達が起こるようになっているものを指す。
【００４５】
テンプレート鎖から伝達される配列情報の単位が大きいほど、粒状性は高い。テンプレート鎖から伝達される配列情報のブロックが小さいほど、粒状性は低いまたは細かい。低い粒状性は、ＤＮＡシャフリングまたは再集合法が、より小さい孤立した遺伝情報のブロックをテンプレート鎖から第２鎖に伝達できることを示す。低い粒状性を持つＤＮＡシャフリングまたは再集合法の利点は、小さい核酸配列を他から分割し、その配列情報を伝達することができるという点である。主として高い粒状性を与えるＤＮＡシャフリングまたは再集合法では、小さい核酸配列を他から分割することは容易でない。
【００４６】
本明細書で使用する「ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド」という用語は、同一でない一本鎖（典型的には別個の鎖）をアニールさせることによって形成される二本鎖ポリヌクレオチドを指す。ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドは、一本鎖ループまたは一本鎖バブルとして存在する不対領域を持っていてもよい。ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド領域は１本の一本鎖ポリヌクレオチドによって形成させることもでき、その場合は、部分的自己相補性がステム−ループ構造の形成を可能にし、その鎖のアニーリング部分が非同一である。
【００４７】
本明細書で使用する「ヘテロ二重鎖ＤＮＡ」という用語は、同一でない一本鎖（典型的には別個の鎖）をアニールさせることによって形成される二本鎖ＤＮＡを指す。ヘテロ二重鎖ＤＮＡは一本鎖ループまたは一本鎖バブルとして存在する不対領域を持っていてもよい。ヘテロ二重鎖ＤＮＡ領域は１本の一本鎖ポリヌクレオチドに形成させることもでき、その場合は、部分的自己相補性がステム−ループ構造の形成を可能にし、その鎖のアニーリング部分が非同一である。
【００４８】
本明細書で使用する「相同」という用語は、１つの一本鎖核酸配列が少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズしうることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、後述するように、配列間の一致量、温度および塩濃度などのハイブリダイゼーション条件を含む多くの要因に依存しうる。
【００４９】
核酸が共通する祖先配列から自然にまたは人工的に導かれる場合、それらは「相同」である。自然進化の過程では、長い間に２つ以上の子孫配列が親配列から分岐する場合に、すなわち突然変異と自然淘汰によって、これが起こる。人工的条件下では、例えば２つの基本的方法のうちの１つで、分岐が起こる。第１に、与えられた配列は、例えば典型的なクローニング中に起こるように、別の配列と人工的に組み換えて、子孫核酸を生成させるか、または与えられた配列を化学修飾するか、他の方法で操作して、結果として生じる分子を修飾することができる。もう一つの選択肢として、選択した親核酸配列とは配列が異なる核酸を合成することにより、核酸を新規合成することもできる。２つの核酸の祖先について明確な知識がない場合、相同性は、典型的には、２つの配列間の配列比較によって推断される。２つの核酸配列が各核酸のかなりの部分にわたって配列類似性を示す場合、それら２つの核酸は共通の祖先を持つと推断される。相同性を確定する配列類似性の厳密なレベルは、さまざまな要因に依存して、当技術分野内でもさまざまである。
【００５０】
本明細書においては、２つの核酸がそれら２つの核酸分子間でＧＲＡＭＭＲによる情報伝達を起こすのに十分な配列一致度を持つ場合に、それらは相同であると見なされる。
【００５１】
本明細書で使用される「同一」または「一致（度）」という用語は、２つの核酸配列が同じ配列または相補的な配列を持つことを意味する。したがって「一致区域」とは、ポリヌクレオチドの領域もしくは区域またはポリヌクレオチド全体が、もう一つのポリヌクレオチドの区域と同一または相補的であることを意味する。
【００５２】
本明細書で使用する「相補率の増加」という用語は、ヘテロ二重鎖分子中の相補塩基対率が大きくなることを意味する。
【００５３】
本明細書で使用する「リガーゼ」という用語は、核酸中の隣接ヌクレオチド間にリン酸ジエステル結合を樹立する酵素を指す。
【００５４】
本明細書で使用する「ミスマッチ」という用語は、正常な塩基対形成相互作用を形成することができない塩基対（すなわち「Ａ」と「Ｔ」（もしくは「Ｕ」）または「Ｇ」と「Ｃ」以外）を指す。
【００５５】
本明細書で使用する「ミスマッチ解消」という用語は、ミスマッチ塩基対の相補塩基対への変換を意味する。
【００５６】
本明細書で使用する「突然変異」という用語は、野生型核酸配列もしくは基準核酸配列の配列変化またはポリペプチドの配列変化を意味する。そのような突然変異は、トランジションまたはトランスバージョンなどの点突然変異であることができる。突然変異は欠失、挿入または重複であることができる。
【００５７】
本明細書で使用する「ニックトランスレーション」という用語は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性と５’→３’ポリメラーゼ活性との組合せにより、二本鎖ポリヌクレオチド中の一本鎖切断点（「ニック」）の位置を５’→３’方向に移動させることができるという、ポリメラーゼの特性を指す。
【００５８】
本明細書で使用する「核酸」または「核酸分子」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを意味し、一本鎖核酸および二本鎖核酸ならびにオリゴヌクレオチドを包含する。本発明で有用な核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミド、コスミド、ＰＣＲ産物および合成オリゴヌクレオチドが含まれ、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方を表すことができる。核酸には、一般に、自然界に存在する４つのヌクレオチド、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミジン／ウリジンが組み込まれる。本発明の核酸は、自然界に存在するまたは自然界に存在しない他のヌクレオチド（その誘導体を含む、ただし、そのヌクレオチド誘導体が、ポリメラーゼにより、所望のポリヌクレオチド産物を生成するのに十分な効率でポリヌクレオチド中に組み込まれうる場合に限る）も組み込むことができる。
【００５９】
本明細書で使用する「親核酸」という用語は、部分相補核酸の出発集団に含まれる元の一本鎖核酸に対して１００％同一な配列を持つ核酸を指す。例えば図２で説明すると、部分相補核酸の組合せ１＋／４−または２−／３＋を本発明の方法での出発集団として使用したとすると、親核酸には、核酸ＸおよびＹが含まれる。
【００６０】
本明細書で使用する「部分相補（部分的に相補）」という用語は、別の核酸に対して実質上相補的であるが、少なくとも２つ以上のヌクレオチドが当該別の核酸とは異なっている核酸を指す。
【００６１】
本明細書で使用する「部分相補核酸集団」という用語は、実質上相補的な配列を持つ個々の核酸群から構成される核酸集団であるが、ある特定の群に属する核酸はいずれも、当該集団中の他のどの配列群についても、厳密な相補配列を持っていないような、核酸集団を指す。
【００６２】
本明細書においては、部分相補核酸集団のメンバーはどれでも、その集団の別の核酸またはその相補鎖とは、２つ以上のヌクレオチドで異なっている。したがって、厳密に相補的な配列（すなわち１００％の相補性を持つ相補配列）を含む集団は、部分相補核酸からは明確に除外される。したがって、そのような部分相補核酸集団の各メンバーは、その集団の他のメンバーとは、両方の鎖を含めて２つ以上のヌクレチドで異なっている。一方の鎖をトップ鎖と呼び、その相補鎖をボトム鎖と呼ぶ。
【００６３】
本明細書で使用する「トップ」鎖という用語は、５’→３’の方向に読まれるポリペプチドを指し、「ボトム鎖」とはその相補鎖を指す。ある配列をボトム鎖またはトップ鎖と呼ぶが、そのような呼称は、相補鎖を識別することを意図するものであると理解される。というのも、溶液状態では、ある鎖をトップ鎖またはボトム鎖として固定する配向はないからである。
【００６４】
例えば、４本の鎖のいずれかを使って一本鎖部分相補核酸集団を生成させることができる２つの二本鎖核酸から、２つの核酸メンバーを含む集団を導くことができる。本発明の部分相補核酸集団を得るために使用することができる２つの核酸の鎖の潜在的組合せの一例を図２に示す。部分相補核酸集団の潜在的メンバーである２つの核酸配列を「Ｘ」（ＡＧＡＴＣＡＡＴＴＧ）および「Ｙ」（ＡＧＡＣＣＧＡＴＴＧ）と名付ける（図２Ａ）。これらの核酸配列は２つの位置（「＊」で示した４位および６位）で異なっている。核酸ＸおよびＹの「トップ」鎖をそれぞれ「１＋」および「３＋」と名付け、核酸ＸおよびＹの「ボトム鎖」をそれぞれ「２−」および「４−」と名付ける。
【００６５】
図２Ｂに４本の核酸鎖の考えうる組合せを示す。考えうる鎖の組合せが６つあるうち、１＋／２−、１＋／４−、２−／３＋、または３＋／４−という組合せだけが、要求される部分相補核酸集団のトップ鎖とボトム鎖を構成する。これらのトップ／ボトム配列の組合せのうち、１＋／４−または２−／３＋だけが、２つの異なる分子の部分相補核酸集団の一例を構成する。なぜなら、これらの組合せだけが、少なくとも１つのヌクレオチドが異なる相補配列を持つからである。残りの組合せ１＋／２−および２＋／４−は、厳密に相補的な配列を含むので、本発明の部分相補核酸集団を構成しない。
【００６６】
２つの異なる分子の集団に関する上述の例では、１つ以上のヌクレオチドが異なっているが同じセンスである鎖の組合せ、例えば１＋／３＋または２−／４−は、核酸分子の部分相補集団から除外された。しかし、より大きな集団には、その集団が少なくとも１本のボトム鎖と少なくとも１本のトップ鎖とを含む限り、このような同鎖核酸の組合せも含まれうる。例えば、鎖５＋および６−を持つ第３の核酸「Ｚ」を含めると、１＋／３＋／６−または２−／４−／５＋という組合せが部分相補核酸集団を構成するだろう。同様に、その集団が少なくとも１つのトップ鎖および少なくとも１つのボトム鎖を含み、かつその集団が厳密な相補鎖であるメンバーを含まない限り、本発明の部分相補核酸集団を生成させるために、いくつもの核酸ならびにそれらの対応するトップ鎖およびボトム鎖を組み合わせることができる。
【００６７】
本発明の核酸集団は約３個以上、約４個以上、約５個以上、約６個以上、約７個以上、約８個以上、約９個以上、約１０個以上、約１２個以上、約１５個以上、約２０個以上、約２５個以上、約３０個以上、約４０個以上、約５０個以上、約７５個以上、約１００個以上、約１５０個以上、約２００個以上、約２５０個以上、約３００個以上、約３５０個以上、約４００個以上、約４５０個以上、約５００個以上、さらには約１０００個以上の異なる核酸分子であることができる。１つの集団は、約２０００個以上、約５０００個以上、約１×１０４個以上、約１×１０５個以上、約１×１０６個以上、約１×１０７個以上、さらには約１×１０８個以上の異なる核酸を含むことができる。当業者は、本明細書に開示するように、所望する再集合実験成果の性質および利用できる選別方法に応じて、本発明に含めるべき望ましい集団を容易に決定することができる。
【００６８】
本明細書で使用する「ポリメラーゼ」という用語は、テンプレートによる指定を受けてヌクレオチドのポリマー（すなわちポリヌクレオチド）の形成を触媒する酵素を指す。本発明で役立つポリメラーゼは、例えば動物、植物、細菌およびウイルスポリメラーゼなど、任意の生物または供給源に由来することができる。ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡをＤＮＡに転写する能力を持つ逆転写酵素であることができる。
【００６９】
本明細書で使用する「校正」という用語は、ミスマッチヌクレオチドなどのヌクレオチドが３’→５’方向に除去されて、典型的には塩基対形成ヌクレオチドで置き換えられうるという酵素の特性を表す。挿入または欠失によって生じるループを取り扱う場合、校正は、ミスマッチヌクレオチドの除去のみ、または塩基対形成ヌクレオチドの付加のみを伴いうる。
【００７０】
本明細書で使用する「組換え」ポリヌクレオチドという用語は、少なくとも２つの異なるポリヌクレオチドに由来する配列情報を含むポリヌクレオチドを指す。
【００７１】
本明細書で使用する「関連ポリヌクレオチド」という用語は、それらポリヌクレオチドのある領域または区域が同一であり、それらポリヌクレオチドのある領域または区域が非同一であることを意味する。
【００７２】
本明細書で使用するＤＮＡ「再集合」という用語は、ここでは、非同一配列間での配列変異の再分配を示すために用いられる。
【００７３】
本明細書で使用する「レプリコン」という用語は、ある長さのポリヌクレオチドとその複製開始部位とを含む複製の遺伝単位を指す。
【００７４】
本明細書で使用する「配列多様性」という用語は、非同一ポリヌクレオチドの存在量を指す。「集団中の配列多様性を増加させる」という用語は、集団中の非同一ポリヌクレオチドの相対的存在量を増加させることを意味する。
【００７５】
本明細書で使用する「配列改変体」という用語は、基準分子と比較して１つ以上の配列差を持つ分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドなど）を指す。例えば、ＧＲＡＭＭＲ中にヘテロ二重鎖分子の全体にわたって起こる別個の独立したミスマッチ解消事象の総和は、その分子の全体にわたる配列情報の再集合をもたらす。配列情報が、さまざまな組合せで再集合することにより、「配列改変体」の複雑なライブラリーが生成する。
【００７６】
本明細書で使用する「鎖切断活性」または「切断」という用語は、ポリヌクレオチド鎖の主鎖に含まれるリン酸ジエステル結合の破壊、例えばニックの形成を指す。鎖切断活性は、酵素剤によって（そのような作用因子には、例えばＣＥＬ  Ｉ、ＲＥＳ  Ｉ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、またはＴ７エンドヌクレアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＢＡＬ−３１ヌクレアーゼ、ＦＥＮ１、クレベース、膵ＤＮアーゼＩ、ＳＰヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、およびヌクレアーゼＰ１などがあるが、これらに限るわけではない）、または化学的作用因子によって（そのような作用因子には、例えば過マンガン酸カリウム、酢酸テトラエチルアンモニウム、立体的に嵩高い光活性化可能なＤＮＡ挿入剤［Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）］３＋、四酸化オスミウムとピペリジン、およびヒドロキシルアミンとピペリジンなどがあるが、これらに限るわけではない）、または電離放射線もしくは動的放射線（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）の形態のエネルギーによって提供されうる。
【００７７】
本明細書で使用する「ミスマッチ指向性鎖切断」という用語は、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド配列上のミスマッチ塩基対、ミスマッチ塩基対群、またはらせん外塩基もしくはらせん外塩基群の部位を認識し、そのミスマッチ部位で一方の鎖を切断する鎖切断活性を意味する。二本鎖切断および／またはランダム一本鎖切断も少しは起こりうるが、この反応の一次的な焦点は、ミスマッチ塩基対の部位にニックを入れることである。
【００７８】
本明細書で使用する「十分な時間」という用語は、反応またはプロセスが所望の産物を与えるのに必要な期間を指す。本発明の場合、十分な時間の決定は、当業者の知識で十分に可能である。なお、「十分な時間」は、実施者の要望に依存して、反応の機能性または所望の産物の品質には影響を及ぼさずに、広く変化しうる。
【００７９】
本明細書で使用する「野生型」という用語は、ある核酸断片が突然変異を一切含まないことを意味する。「野生型」タンパク質とは、そのタンパク質が自然界に見いだされる活性レベルで活性であり、典型的には自然界に見いだされるアミノ酸配列であるだろうことを意味する。一側面として、「野生型」または「親配列」という用語は、本発明の操作前の出発配列または基準配列を示すことができる。
【００８０】
本明細書で使用するポリペプチド表記では、標準的な用法と慣習に従って、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシ末端方向である。同様に、別段の指定がない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向という。新生ＲＮＡ転写物の５’→３’付加方向を転写方向という。
【００８１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対を持つ少なくとも１つのヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドから配列改変体を作製するインビトロ法であって、少なくとも１つのヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを調製し、前記ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを、有効量の、鎖切断活性、校正活性およびリガーゼ活性を持つ１つまたは複数の作用因子と混合し、相補率が増加して、少なくとも１つ以上の改変体が作製されるのに十分な時間待つことを含む方法を提供する。
【００８２】
本発明のもう一つの側面は、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドが環状、線状またはレプリコンである点である。
【００８３】
本発明のもう一つの側面は、所望の改変体がさまざまな量の相補性を持つ点である。
【００８４】
本発明のもう一つの側面は、鎖切断活性、校正活性、およびリガーゼ活性が逐次的に、または同時に加えられる点である。
【００８５】
本発明のもう一つの側面は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、またはＴａｑ  ＤＮＡリガーゼなどの作用因子によって提供されるリガーゼ活性の添加を提供する。
【００８６】
本発明のもう一つの側面では、鎖切断活性が、ＣＥＬ  Ｉ、ＲＥＳ  Ｉ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、またはＴ７エンドヌクレアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＢＡＬ−３１ヌクレアーゼ、ＦＥＮ１、クリベース（ｃｌｅａｖａｓｅ）、膵ＤＮアーゼＩ、ＳＰヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、およびヌクレアーゼＰ１などの酵素、過マンガン酸カリウム、酢酸テトラエチルアンモニウム、立体的に嵩高い光活性化可能なＤＮＡ挿入剤［Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）］３＋、四酸化オスミウムとピペリジン、およびヒドロキシルアミンとピペリジンなどの化学的作用因子、または電離放射線もしくは動的放射線などのエネルギーの形態によって提供される。
【００８７】
本発明のもう一つの側面では、ポリメラーゼ活性がＰｏｌベータによって提供される。
【００８８】
本発明のもう一つの側面は、ポリメラーゼ活性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が両方ともＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌Ｐｏｌ  １またはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによって提供される点である。
【００８９】
本発明のもう一つの側面は、ポリメラーゼ活性と５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を両方とも持つ作用因子が大腸菌Ｐｏｌ  １である点である。
【００９０】
本発明のもう一つの側面は、ポリメラーゼ活性を持つ作用因子が３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠き（例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはクレノウフラグメント（３’→５’ｅｘｏ−）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから入手できる酵素）、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（３’→５’ｅｘｏ−）、またはＫｌｅｎｔａｑ（Ｂａｒｎｅｓ，Ｇｅｎｅ  １１２（９２）２９）など）、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ作用因子がポリメラーゼ活性を欠く（例えば大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｘｏ  ＩＩＩ）またはＡｐｅ１（Ｈａｄｉら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３１６（０２）８５３））点である。鎖置換活性を持つポリメラーゼの場合は、Ｔ４  ＲＮアーゼＨ（Ｂｈａｇｗａｔら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２（１９９７）２８５２３）などのフラップエンドヌクレアーゼ活性を持つ作用因子も加えることが好ましい。
【００９１】
本発明のもう一つの側面では、校正活性がＴ４  ＤＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼによって提供される。
【００９２】
本発明のもう一つの側面では、有効量の鎖切断活性、および校正活性およびリガーゼ活性が、ＲＥＳ  Ｉ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、および大腸菌ＤＮＡリガーゼによって提供される。
【００９３】
本発明のもう一つの側面では、有効量の鎖切断活性、および校正活性およびリガーゼ活性が、ＲＥＳ  Ｉ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４  ＤＮＡリガーゼによって提供される。
【００９４】
本発明のもう一つの態様は、配列集団内の多様性を増加させるインビトロ法であって、少なくとも１つのヘテロ二重鎖を調製し、そのヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを、有効量の、校正活性、リガーゼ活性および鎖切断活性を持つ１つまたは複数の作用因子と混合し、相補率が増加して、集団内の多様性が増加するのに十分な時間待つことを含む方法を提供する。
【００９５】
本発明のもう一つの態様は、所望の機能的特性をコードするポリヌクレオチドを取得する方法であって、少なくとも１つのヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを調製し、前記ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを、有効量の、校正活性、リガーゼ活性および鎖切断活性を持つ１つまたは複数の作用因子と混合し、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドの鎖間の相補率が増加して、集団内の多様性が増加するのに十分な時間待ち、そして所望の機能的特性に関して改変体の集団を選別または選択することを含む方法を提供する。
【００９６】
本発明のもう一つの態様は、所望の機能的特性をコードするポリヌクレオチドを取得する方法であって、少なくとも１つのヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを調製し、前記ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを、有効量の、校正活性、リガーゼ活性および鎖切断活性を持つ１つまたは複数の作用因子と混合し、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドの鎖間の相補率が増加して、集団内の多様性が増加するのに十分な時間待ち、ＤＮＡをＲＮＡに変換し、そして所望の機能的特性に関して、リボ核酸改変体の集団を選別または選択することを含む方法を提供する。
【００９７】
本発明のさらにもう一つの態様は、所望の機能的特性を持つポリペプチドを取得する方法であって、少なくとも１つのヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを調製し、前記ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを、有効量の、校正活性、リガーゼ活性および鎖切断活性を持つ１つまたは複数の作用因子と混合し、前記ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドの鎖間の相補率が増加するのに十分な時間待ち、前記ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドをＲＮＡに変換して、前記ＲＮＡをポリペプチドに変換し、そして前記所望の機能的特性に関して。ポリペプチド改変体の集団を選別または選択することを含む方法を提供する。
【００９８】
本発明のさらにもう一つの態様は、所望の機能的特性をコードするポリヌクレオチドを取得する方法であって、少なくとも１つのヘテロ二重鎖ポリヌクレオチド（このヘテロ二重鎖は、随意に、約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、６２％、５８％または４７％同一であり、約１００塩基対、１０００塩基対、１０，０００塩基対または１００，０００塩基対以上のサイズである）を調製し、前記ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを、有効量の、校正活性、リガーゼ活性および鎖切断活性を持つ１つまたは複数の作用因子と混合し、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドの鎖間の相補率が増加するのに十分な時間待ち、所望の機能的特性を持つ改変体の集団を選別または選択し、前記改変体の集団を変性させて一本鎖ポリヌクレオチドを取得し、前記一本鎖ポリヌクレオチドをアニールさせて少なくとも１つの第２ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを形成させ、前記第２ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを有効量の、校正活性、リガーゼ活性および鎖切断活性を持つ１つまたは複数の作用因子と混合し、ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドの鎖間の相補率が増加するのに十分な時間待ち、要すれば所望の機能的特性を持つ改変体の手段を選別または選択することを含む方法を提供する。第２ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドは、先に形成された改変体の集団だけから形成させるか、一本鎖親ポリヌクレオチドの一方または両方と共に形成させるか、または代替一本鎖ポリヌクレオチドと共に形成させることができる。
【００９９】
２つの鎖が多くのミスマッチを持っている場合、ヘテロ二重鎖は比較的小さい領域（１５〜２０塩基対程度、好ましくは少なくとも１００塩基対、そしてことによると、上記のようにそれよりはるかに大きな領域）に、ミスマッチを濃縮していてもよい。例えば、ＰＯＰ−ＧＲＡＭＭＲの場合のように、ヘテロ二重鎖がベクターに挿入される場合、プラスミドの大半は完全に相補的であり、この比較的小さい領域だけが主にミスマッチを含んでいる。上述の一致率は、そのような状況では、その比較的小さい領域だけに適用しうる。
【０１００】
本発明は、改善されたポリヌクレオチド配列または改善されたポリヌクレオチド配列の集団を、典型的には増幅および／またはクローニングされたポリヌクレオチドの形態で作製する方法に向けられ、ここにその改善されたポリヌクレオチド配列は、選択または選別の目的となりうる少なくとも１つの表現型特徴を持つ（例えばポリペプチドをコードする、連結されたポリヌクレオチドの転写を促進する、タンパク質を結合する、ウイルスベクターの機能を改善するなど）。そのような所望のポリヌクレオチドは、例えば適切な植物、動物、真菌、酵母または細菌発現ベクターからの発現、組込みによるトランスジェニック植物、トランスジェニック動物またはトランスジェニック微生物の作出、リボザイムの発現など、数多くの方法で使用することができる。
【０１０１】
ＧＲＡＭＭＲは、インビトロ反応におけるヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子上のミスマッチ塩基対の解消に対応している。この反応は、ミスマッチまたはその近傍で起こる一方の鎖または他方の鎖の切断によって開始された後、切断された鎖からのミスマッチ塩基の切り出しと、その結果生じたギャップを他方の鎖の配列をテンプレートするヌクレオチドで埋めるための重合とが起こる。生じたニックは、主鎖が再結合するようにライゲーションによって閉じることができる。ヘテロ二重鎖分子の全体にわたって起こる個別の独立したミスマッチ解消事象の総和が、その分子の全体にわたる配列情報の再集合をもたらすだろう。配列情報は、さまざまな組合せで再集合して、配列改変体の複雑なライブラリーを生成する。
【０１０２】
ＧＲＡＭＭＲの一態様では、当技術分野で知られている任意の方法、例えば突然変異導入ＰＣＲ、化学的突然変異誘発などによって、突然変異体のライブラリーを作製した後、所望の特性を持つ突然変異体の選別または選択を行う。突然変異体ＤＮＡを混合し、一本鎖に変性し、アニールさせる。ハイブリダイズする部分相補鎖は、ミスマッチ部位に非塩基対形成ヌクレオチドを持つことになる。ＣＥＬ  Ｉ（Ｏｌｅｙｋｏｗｓｋｉら、１９９８；Ｙａｎｇら、２０００）または同様のミスマッチ指向性活性、例えばＲＥＳ  Ｉで処理すると、一方のポリヌクレオチド鎖または他方のポリヌクレオチド鎖の各ミスマッチの３’側にニックが入ることになる（その他、ＣＥＬ  ＩまたはＲＥＳ  Ｉは、挿入／欠失の３’側にニックを入れて、挿入／欠失の再集合をもたらすこともできる）。校正活性を持つポリメラーゼ（例えば  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌ）が存在すると、ミスマッチの切り出しが可能になり、それに続いて５’→３’ポリメラーゼ活性が、他方の鎖のテンプレートとして使用することにより、ギャップを埋めるだろう。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および鎖置換活性を持たないポリメラーゼは、ギャップを埋めて、元のＣＥｌＩ切断部位が位置するＤＮＡの５’末端に到達すると重合を停止するので、短い配列のパッチを再合成するに過ぎない。次に、ＤＮＡリガーゼ（例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼまたは大腸菌ＤＮＡリガーゼ）が修復された鎖のリン酸エステル主鎖を復元することにより、ニックを閉じることができる。このプロセスは、与えられたヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子の多くの部位で、そしてどちらの鎖でも、同時に起こりうる。その結果、インプット鎖間の配列差のランダム化が起こって、出発配列の集団よりも多様な配列改変体の集団が得られる。これらのアウトプットポリヌクレオチドは、適切なベクターに直接クローニングするか、またはＰＣＲで増幅してからクローニングすることができる。もう一つの選択肢として、二重鎖環状プラスミド分子という背景、またはＧＲＡＭＭＲ反応後に適切な宿主に直接導入することができる他の適切なレプリコンという背景を持つヘテロ二重鎖領域で、反応を行うこともできる。さらにもう一つの選択肢として、ウイルスベクター転写プラスミドの場合などでは、アウトプットポリヌクレオチドをＲＮＡポリヌクレオチドに転写し、それを直接的に、例えば植物ウイルスベクターの植物への接種などによって、使用することもできる。その結果得られるクローンを、所望の特性の改善に関する選択または選別に付す。次に、さらなる改善を達成する試みとして、選択したクローンで、このプロセス全体を１回以上繰り返すことができる。
【０１０３】
アウトプットポリヌクレオチドを直接クローニングする場合は、解消が不完全な分子が残っていて、それがクローニング宿主での複製時に、同じ細胞中に２種類のプラスミドをもたらす可能性がある。これらのプラスミドは混合プラスミドコロニーを生じる可能性がある。そのような可能性を避けることを望む場合は、アウトプットポリヌクレオチド分子を宿主中で増殖させて複製／解消を許し、ポリヌクレオチドを単離し、それを使って新しい宿主細胞を再び形質転換する。
【０１０４】
もう一つの態様として、１分子につき３つ以上の親からの配列インプットが望まれる場合は、上記の手順を繰り返してから、アウトプットポリヌクレオチドのクローニングを行う。ＧＲＡＭＭＲ反応後に、二本鎖ポリヌクレオチドを変性し、アニールさせ、ミスマッチ解消プロセスを繰り返す。そのようなサイクルを所望の回数行った後は、アウトプットポリヌクレオチドを直接クローニングし、適切なベクター中に導入するか、ＰＣＲで増幅してからクローニングすることができる。得られたクローンを所望の特性の改善に関する選択または選別に付す。
【０１０５】
もう一つの態様では、所望の突然変異から有害な突然変異のバックグラウンドを排除するのを助けるために、「分子戻し交配」を行う。この方法を行うために、所望の突然変異体ＤＮＡのプールを野生型ＤＮＡにハイブリダイズさせることができる。クローンを改善について選択し、プールし、有意義な変化が起こらなくなるまで、野生型に再び戻し交配する。
【０１０６】
本プロセスの効率は、出発集団をヘテロ二重鎖分子について濃縮し、その結果として無改変の親型アウトプット分子の数を減らすことによって、改善される。ミスマッチハイブリッドは、アプタマー、色素またはミスマッチＤＮＡに結合する他の作用因子を使って、アフィニティー精製することができる。好ましい態様は、ＭｕｔＳタンパク質アフィニティーマトリックス（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３（１９）：３９４４−３９４８（１９９５）；Ｓｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８３：５０５７−５０６１（１９８６））またはミスマッチに結合するが切断はしないファージＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩの突然変異体（ＧｏｌｚおよびＫｅｍｐｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９  ；２７：ｅ７）の使用である。
【０１０７】
ある態様では、インプットポリヌクレオチドが、各配列改変体の一本鎖からなるように、手順が変更される。例えば、非対称ＰＣＲによって部分相補一本鎖分子を生成させることにより、反対鎖である一本鎖ＤＮＡを、異なる親配列から製造することができる。実施例１に記載するように、これらの鎖を互いにアニールさせてヘテロ二重鎖にする。もう一つの選択肢として、各親二本鎖ＤＮＡの一方の鎖をラムダエキソヌクレアーゼで優先的に消化することによって一本鎖ＤＮＡを生成させた後、残った鎖を互いにアニールさせることもできる。この態様の場合、アニールする鎖には、それと再アニールする１００％相補的な鎖が存在しない。したがって、アウトプットポリヌクレオチド間の無修飾ポリヌクレオチド（すなわち「親ポリヌクレオチド」）のバックグラウンドは低くなり、配列変異を再集合させる効率が高くなる。この効率の向上は、所望のポリヌクレオチドに関する試験に、選択ではなく選別を用いる場合には、とりわけ有益である。
【０１０８】
ヘテロ二重鎖形成のもう一つの方法は、二本鎖親ＤＮＡを混合し、鎖が解離するように変性させ、一本鎖ＤＮＡを互いにアニールさせて、ヘテロ二重鎖および親ホモ二重鎖の集団を作製することである。次に、ヘテロ二重鎖捕捉法（例えばＭｕｔＳまたは非切断性Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ突然変異体を使用する上述の方法）によって、ヘテロ二重鎖を選択的に濃縮することができる。もう一つの選択肢として、ヘテロ二重鎖では切断されないが親ホモ二重鎖分子では切断されるようにミスマッチ部位と重なっている制限酵素によって、集団中の親ホモ二重鎖分子を切断することもできる。次に、実施例５に記載する完全長プラスミド・オン・完全長プラスミドヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子を作製するために行ったように、アガロースゲルでのサイズ分画によって、切断されていないヘテロ二重鎖ＤＮＡを単離することができる。次に、ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートすることにより、完全長ヘテロ二重鎖プラスミド分子中のニックを閉じた。
【０１０９】
もう一つの態様では、「クランプ」配列の付加によって、親（またはインプット）二本鎖ポリヌクレオチドを修飾する。一方のインプットポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプールを、５’プライマー中にユニーク配列が付加されているＰＣＲによって増幅する。他方のインプットポリヌクレオチドまたはプールは、３’プライマー中にユニーク配列を付加して、ＰＣＲによって増幅する。クランプ配列は、ＧＲＡＭＭＲ反応の産物をクローニングするステップで、第１ポリヌクレチド（またはプール）に由来する５’クランプを持つ産物と、第２ポリヌクレオチド（またはプール）に由来する３’末端を持つ産物だけがクローニングに適した末端を持つことになるように、興味ある遺伝子の５’末端用および３’末端用として、それぞれユニークな制限酵素部位を含むように設計することができる。もう一つの選択肢として、５’クランプおよび３’クランプのユニーク配列を使って、ＧＲＡＭＭＲ反応の産物をＰＣＲ増幅することにより、同様の結果を得ることもできる。したがって、アウトプットポリヌクレオチドクローン間の無修飾ポリヌクレオチド（すなわち「親ポリヌクレオチド）のバックグラウンドは低くなり、配列変異を再集合させる効率が高くなる。この効率の向上は、所望のポリヌクレオチドに関する試験に、選択ではなく選別を用いる場合には、とりわけ有益である。所望により、どちらの親もトップ鎖として役だって両方の相互ヘテロ二重鎖がミスマッチ解消反応に参加できるように、クランププライマー配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーをＧＲＡＭＭＲ反応に加えることもできる。
【０１１０】
環状ヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを作製するもう一つの方法は、親二本鎖ＤＮＡが上述の末端クランプ配列を持ち、二重鎖の一端から伸びる一本鎖クランプ配列が、二重鎖の他端から伸びる一本鎖クランプ配列に相補的である場合に行われる。これらの相補一本鎖クランプをアニールさせることにより、ヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子を環化する。同一配列の再アニーリングによって生じる親ホモ二重鎖はクランプ配列を１つしか持たないので、環化に利用できる相補的な一本鎖配列を末端に持たない。また、環状分子中のあらゆるギャップを埋め、主鎖中のニックを閉じるために、それぞれＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼを使って、共有結合によって閉じた環状ヘテロ二重鎖分子の集団を形成させることができる。共有結合によって閉じた環状ヘテロ二重鎖分子は、さらなる変性条件に付されても、その成分鎖に解離しないので、変性、環化およびライゲーションのプロセスを繰り返すことにより、より多くの線状二本鎖親二重鎖を閉じた環状ヘテロ二重鎖に変化することができる。
【０１１１】
もう一つの態様では、ファージミドＤＮＡなどの一本鎖環状ベクターの一領域を、関連しているが同一ではない線状ＤＮＡにハイブリダイズさせた後、それをＴ７  ＤＮＡポリメラーゼまたはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼとＴ４遺伝子３２タンパク質とを使って伸長し、次に、結果として生じたニックをライゲートすることにより、ＤＮＡ間の相違部位にヘテロ二重鎖領域を持つ環状二本鎖分子を得ることができる。次に、この分子でＧＲＡＭＭＲを行うことにより、配列再集合分子のライブラリーを得ることができる。
【０１１２】
もう一つの選択肢として、プラスミド骨格および再集合の標的である親遺伝子配列に関して反対の鎖極性を持つ２つの一本鎖環状ベクター／ファージミドＤＮＡを、互いにアニールさせる。ファージｆ１起点配列が存在するところに、広範なミスマッチ領域が生じる。しかし、ＧＲＡＭＭＲ処理を行うと、この広範なミスマッチ領域は、どちらかの親タイプ配列に復帰して、機能的なｆ１起点が修復されうる。これらの二本鎖分子は、興味ある親遺伝子をコードする鎖間の相違部位にも、ミスマッチ領域を含む。次に、この分子でＧＲＡＭＭＲを行うことにより、配列再集合分子のライブラリーを得ることができる。
【０１１３】
先の段落で述べたように、出発ＤＮＡまたはインプットＤＮＡは、いくつもの形態をとることができる。例えば、実施例１で示すように、インプットＤＮＡは、完全長であり、一本鎖であり、かつ反対センスを持つものであることができる。もう一つの選択肢として、インプットＤＮＡは、完全長鎖の断片であることもできる。インプットＤＮＡは、一方または両方が、二本鎖であることができ、また、例えばメチル化、ホスホロチオラート結合、ペプチド−核酸、ＤＮＡへのウラシルの組込み、一方または両方の鎖におけるＲＮＡの置換などによって修飾されていてもよい。これらの修飾はハイブリダイゼーションを許すが、ＰＣＲなどのさまざまな技術による増幅は妨げるかもしれない。一方の鎖は改変体配列を含まないだろうという理由でその鎖が増幅可能であることを望まない場合は、ハイブリダイズは可能であるが増幅は不可能である上述のような修飾を、その一方の鎖に組み込むことができる。二重鎖のどちらも鎖も、両鎖に沿って連続的であるか、不連続ではあるが隣接しているか、不連続であってオーバーラップを持つか、不連続であってギャップを持つことができる。
【０１１４】
ＧＲＡＭＭＲは、ＤＮＡの断片化および再構成に基づくＤＮＡシャフリングスキームにも応用することができる。例えば、遺伝子再構成の過程で、遺伝子断片が変性、アニーリングおよび伸長のサイクルによって採取される方法では、ＧＲＡＭＭＲを中間ステップとして使用することができる。
【０１１５】
そのような態様の一つでは、遺伝子または突然変異体遺伝子のプールに由来するＤＮＡを、酵素的、機械的または化学的手段によって断片化し、要すれば、それらの断片のうち、一定のサイズ範囲にあるものを、アガロースゲルでの分離などの手段によって単離する。出発ポリヌクレオチド、例えば野生型もしくは所望の改変体またはそのプールを断片に加え、その混合物を変性させた後、アニールさせる。アニールしたポリヌクレオチドをポリメラーゼで処理することにより、無傷の鎖をテンプレートとして使用して、一本鎖ギャップを埋める。得られた部分相補二本鎖は、ミスマッチ部位に、非塩基対形成ヌクレオチドを持つだろう。ＣＥＬ  Ｉ（Ｏｌｅｙｋｏｗｓｋｉら、１９９８；Ｙａｎｇら、２０００）または同様の活性を持つ作用因子、例えばＲＥＳ  Ｉで処理することにより、各ミスマッチの３’側で一方または他方のポリヌクレオチド鎖にニックが入ることになる。校正活性を持つポリメラーゼ、例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼなどを添加すると、ミスマッチの切り出しが可能になり、それに続く５’→３’ポリメラーゼ活性が、他方の鎖をテンプレートとして使用して、ギャップを埋めることになる。次に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼにより、修復された鎖のリン酸エステル主鎖を復元することにより、ニックを閉じることができる。結果として、インプット鎖間での配列変異のランダム化が起こって、改善された特性を持つ可能性のあるアウトプット鎖が得られる。これらのアウトプットポリヌクレオチドは、適切なベクター中に直接クローニングするか、ＰＣＲで増幅してからクローニングすることができる。得られたクローンを、所望の特性の改善に関する選択または選別に付す。
【０１１６】
そのような態様の一つでは、突然変異体遺伝子のプールに由来するＤＮＡを酵素的、機械的または化学的手段で断片化するか、親テンプレートにアニールさせたランダムオリゴヌクレオチドの限定的伸長によって断片を生成させ（米国特許第５，９６５，４０８号）、要すれば、それらの断片のうち、一定のサイズ範囲にあるものを、アガロースゲルでの分離などの手段によって単離する。その混合物を変性した後、アニールさせる。アニールしたポリヌクレオチドを、要すれば、ポリメラーゼで処理することにより、一本鎖ギャップを埋める。その結果得られる部分相補二本鎖断片は、ミスマッチ部位に、非塩基対形成ヌクレオチドを持つだろう。ＣＥＬ  Ｉ（Ｏｌｅｙｋｏｗｓｋｉら、１９９８；Ｙａｎｇら、２０００）または同様の活性を持つ作用因子、例えばＲＥＳ  Ｉで処理することにより、各ミスマッチの３’側で一方または他方のポリヌクレオチド鎖にニックが入ることになる。校正活性を持つポリメラーゼ、例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼなどを添加すると、ミスマッチの切り出しが可能になり、それに続く５’→３’ポリメラーゼ活性が、他方の鎖をテンプレートとして使用して、ギャップを埋めることになる。次に、要すれば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼにより、修復された鎖のリン酸エステル主鎖を復元することにより、ニックを閉じることができる。結果として、インプット鎖間での配列変異のランダム化が起こって、改善された特性を持つ可能性のあるアウトプット鎖が得られる。次に変性、アニーリングおよびＧＲＡＭＭＲを行うことにより、遺伝子再構成が起こる。ＰＣＲを使って、再構成遺伝子の所望の部分を増幅することができる。これらのＰＣＲアウトプットポリヌクレオチドは適切なベクターにクローニングすることができる。得られたクローンを、所望の機能的特性に関する選択または選別に付す。
【０１１７】
本発明のもう一つの態様は、連続的な足場鎖から開始し、そこに別の遺伝子または遺伝子群の断片がアニールすることを提供する。Ｃｏｃｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １９（０１）３５４；米国特許第６，３１９，７１３号に記載されているようにフラップおよびギャップをトリミングし、ＧＲＡＭＭＲを行う。このプロセスでは、テンプレート鎖と、フラップおよびギャップのトリミングおよびライゲーションによって得られた鎖との間の配列情報の伝達を可能にすることによって、ＧＲＡＭＭＲがさらなる配列再集合を生じさせる。この方法により、１つの連続した鎖に特定の配列パッチを組み込むことの利益が得られる。同じ配列または遺伝子に多くの断片を同時にアニールさせることにより、多くの個別部位を同時に取り扱うことができ、それによって、複数の配列または遺伝子を一度に再集合させることが可能になる。この態様では、足場は必ずしも分解されず、むしろ二重鎖を直接クローニングするか、ＰＣＲで増幅してからクローニングすることができる。徹底的なミスマッチ解消により、完全に二重化したＤＮＡが得られるだろう。部分ミスマッチ解消は、１つの二重鎖につき基本的に２つの異なる再集合産物を与えるだろう。
【０１１８】
本明細書から理解できるように、ＧＲＡＭＭＲは、関連ＤＮＡのアニーリングをそのプロセス中の一ステップとして含むさまざまな方法に応用することもできる。例えば多くの部位指定突然変異誘発プロトコールは、一本鎖型環状ＤＮＡ（ファージミドまたは変性ファージミド）への突然変異体コードＤＮＡ分子のアニーリングを必要とする。次に、これらのＤＮＡはポリメラーゼを使って伸長された後、リガーゼによる処理でニックを閉じ、さらなる操作によって親配列が除去されて、親遺伝子バックグラウンド中に組み込まれた所望の突然変異または突然変異群が残される。これらのプロトコールは特定の突然変異を特定のＤＮＡ配列中に組み込むために広く使用されているが、そのようなプロセスで生成するヘテロ二重鎖分子にＧＲＡＭＭＲ反応を応用することによって、それらの２つの鎖間で配列変異を再集合させ、その結果として、再集合した遺伝子変異を持つ子孫の多様なセットを得ることが可能である。
【０１１９】
もう一つの態様は、興味あるＤＮＡの特定領域だけで行われる逐次的再集合の繰り返しに対応する。例えば、ＤＮＡ配列を環状一本鎖ファージミドＤＮＡにアニールさせ、ＧＲＡＭＭＲを行う。それらの断片は、それらが物理的にアウトプット物質に組み込まれることがないように、処理することができる。例えば、これらの断片はその３’末端をジデオキシ残基で終わらせることにより、伸長不可能にすることができる。再集合は複数回にわたって行うことができるが、元のインプット一本鎖ＤＮＡに由来する修飾分子だけが回収されるだろう。その結果、この再集合に使用したＤＮＡ断片は、最終産物に配列情報だけを与え、最終的な回収可能産物に物理的に組み込まれることはないだろう。
【０１２０】
重要なミスマッチ部位、すなわち約１〜３個のミスマッチを含むパッチだけを解消することを望む場合は、Ｓ１ヌクレアーゼを使用することができる。Ｓ１ヌクレアーゼは一本鎖核酸に特異的なエンドヌクレアーゼである。これはＤＮＡ：ＤＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中のミスマッチ塩基対の限定された領域を認識し切断することができる。Ｓ１ヌクレアーゼによる認識と切断には、一般に、少なくとも約４個の連続した塩基対のミスマッチが必要である。両鎖が切断されるとミスマッチ解消は起こらないだろうから、第１ニックが入った後、カウンターニックが入る前に、ＤＮＡは修復されなければならない。配列、配列コンテキストまたはミスマッチのサイズに応じて切断特異性を特異的に調整するには、他のヌクレアーゼが好ましいかもしれない。
【０１２１】
また、ミスマッチ残基を取り扱う他の手段、例えばミスマッチの化学的切断なども使用することができる。もう一つの選択肢として、ヘテロ二重鎖ＤＮＡの鎖を、例えばＤＮアーゼＩまたは二重鎖領域だけを切断する作用因子が示すような活性によるランダムニッキングにかけることを、選択することもできる。２つの遺伝子間の一致領域でニック形成が起こると、反応液中に存在するＤＮＡリガーゼがニックを閉じ、配列情報の正味の伝達は起こらないだろう。しかし、ニック形成がミスマッチ部位の近傍で起こると、３’−５’エキソヌクレアーゼによるミスマッチ塩基の除去、ポリメラーゼによるギャップの充填、続いてリガーゼによるニックの閉鎖が起こりうる。もう一つの選択肢として、不均質領域の全体にわたってニックトランスレーションを適用することにより、配列再集合を引き起こすこともできる。これらのプロセスは、もっぱらＤＮＡのミスマッチ状態によって指示されるわけではないが、修復された鎖に配列情報を伝達するのに役立ち、したがって再集合配列をもたらす。
【０１２２】
ＧＲＡＭＭＲは、予め選択されたライブラリーメンバー間の組換えを達成するために、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーディスプレイ法に使用することができる。ＧＲＡＭＭＲはインプットＤＮＡの断片化を必要としないので、極めて短いストレッチの配列間で配列情報を再集合させることが可能だろう。例えば小さいペプチドをコードするＤＮＡや、特定の特性、例えば標的結合などに関して選択されたＲＮＡアプタマーを、再集合させることができる。選択したＤＮＡ分子間でアニーリングが起こるように、分子間には、ある程度の配列相同性が（例えばコード配列の５’領域および３’領域に、または結合活性が類似しているので類似性を持つランダム化された配列セグメントの領域中に、または特定のデフォルトセットに対するコドンゆらぎ塩基のバイアシングによって）存在すべきである。ヘテロ二重鎖の形成を助けるには、相同性の低い鎖のアニーリング能力を増加させるために、５’および／または３’末端に相補領域を付加してもよい。
【０１２３】
ＧＲＡＭＭＲを実行する際の反応温度を操作することが有益な場合がある。例えば、温度を下げると、ヘテロ二重鎖の安定化が助長されるので、より高度にミスマッチした基質でＧＲＡＭＭＲを行うことが可能になる。また、鎖間の塩基対形成に影響を及ぼす添加物、例えば塩類、ＰＥＧ、ホルムアミドなどは、ＧＲＡＭＭＲ反応におけるヘテロ二重鎖の安定性を変化させることによって、反応の結果に影響を及ぼすために、使用することができる。
【０１２４】
もう一つの態様では、ミスマッチした二本鎖ポリヌクレオチドを生成させ、ＤＮＡグリコシラーゼによる処理でアプリン酸部位またはアピリミジン酸部位（すなわち「ＡＰ部位」）を形成させ、ＡＰエンドヌクレアーゼ活性による処理でリン酸ジエステル結合を切断し、デオキシリブロースホスホジエステラーゼによる処理で、そのデオキシリボース−リン酸分子を除去し、ＤＮＡポリメラーゼβまたは他のＤＮＡポリメラーゼによる処理でギャップ位置でＤＮＡ鎖の３’末端に１つのヌクレオチドを付加し、ＤＮＡリガーゼによる処理でそのギャップを閉じる。その結果、インプット鎖間の配列変異の再集合が起こって、改善された特性を持つ可能性のあるアウトプット鎖が得られる。これらのアウトプットポリヌクレオチドは、適切なベクターに直接クローニングするか、ＰＣＲで増幅してからクローニングすることができる。その結果得られるクローンを、所望の特性の改善に関する選択または選別に付す。
【０１２５】
もう一つの態様は、ＧＲＡＭＭＲによるゾーン突然変異誘発、すなわち、多重塩基対形成能を持つヌクレオチド類似体を使ったミスマッチ残基またはそのすぐ近傍におけるランダムまたはセミランダム突然変異に対応する。これは、基本的にランダムな突然変異誘発を興味ある特定の一点に集中させるものであり、本発明にもう一つの利益を付加する。互いに似ているがわずかに異なる機能を持っている遺伝子の群（例えば多くの酵素）は、各々の活性にとって重要な意味を持つであろう領域に、互いに中程度の配列差を示すだろう。そのような活性としては、例えば基質選択性、結合パートナー、調節部位などを挙げることができる。これらの機能を支配する遺伝子配列は、関連遺伝子の集団内で、不均質なはずである。そのような機能の特異性はこれらのアミノ酸およびその近隣残基に関係することが知られているので、遺伝子間での配列情報の再集合に加えて、ＧＲＡＭＭＲ突然変異誘発も、ランダム化に対する耐性が低い可能性がある他の配列、例えば構造フレームワーク、不変残基および他のそのような重要部位を乱さずに、ランダム突然変異誘発をこれらの領域に向かわせて、それらの機能を進化させるために使用することができる。
【０１２６】
別個の機能を持つ異なる酵素は、活性部位および調節部位などの作動領域だけが異なるわけではない。それらは、互いに、遺伝的浮動によって生じる他の相違も持っているだろう。したがって、そのような変化部分におけるさらなるランダム化は、突然変異誘発実験の結果に対して中立的であるか、ごくわずかな重要性しか持たないか、有害であると見なしてもよい。ランダム突然変異誘発をそのような重要でない部位から遠ざけると共に、より良いランダム突然変異誘発の結果が得られそうな部位、例えば酵素の活性部位などに向けるには、遺伝子のコドン使用頻度の偏りを操作して、それらの領域におけるヌクレオチド相補性の全体的レベルを増減することができるだろう。高い相補性を持つ領域が低い相補性を持つ領域よりもＧＲＡＭＭＲの影響を受けにくいなら、与えられた部位でのＧＲＡＭＭＥＲによるゾーンランダム突然変異誘発の度合いを、調整することができる。
【０１２７】
もう一つの態様では、ヘテロ二重鎖分子が形成させてから、ヘテロ二重鎖の各末端の一方の鎖が消化されて後退するように、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ酵素を加える。平均して望ましい量の３’→５’消化が起きた時点で、同じ酵素または追加酵素に由来する５’→３’ポリメラーゼ活性に反対鎖をテンプレートとして二重鎖を修復させるために、ｄＮＴＰ類を加える。このようにして、消化された領域中のミスマッチは解消されて、相補性を生じる。要すれば、結果として生じた二重鎖を精製し、変性させた後、アニールさせる。消化に次いで重合を行うプロセスを繰り返すことにより、新しいキメラ配列が得られる。このプロセスは、所望に応じて、さらに何巡か行うことができる。アウトプット二重鎖分子をクローニングし、所望の機能的特性について試験する。このプロセスは断片化および再構成を必要としない。さらにこのプロセスはエンドヌクレアーゼ的切断も必要としない。
【０１２８】
もう一つの態様では、ヘテロ二重鎖分子を形成させてから、ヘテロ二重鎖の各末端の一方の鎖が消化されるように、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つ酵素、例えばＥｎｇｅｒ，ＭＪおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ＣＣ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５８（８３）１１１９７に開示されているＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼなどを加える。平均して望ましい量の５’→３’消化が起きた時点で、反応を停止させ、エキソヌクレアーゼを失活させる。標的ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを加えて、アニールさせる。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼおよびｄＮＴＰ類を加えることにより、反対鎖をテンプレートとして、５’→３’ポリメラーゼ活性にプライマーを伸長させ、二重鎖を修復させると共に、リガーゼでニックを閉じる。このようにして、消化された領域中のミスマッチは解消されて、相補性を生じる。要すれば、結果として生じた二重鎖を精製し、変性させた後、アニールさせる。消化に次いで重合を行うプロセスを繰り返すことにより、新しいキメラ配列が得られる。このプロセスは、所望に応じて、さらに何巡か行うことができる。アウトプット二重鎖分子をクローニングし、所望の機能的特性について試験する。このプロセスは断片化および再構成を必要としない。さらにこのプロセスはエンドヌクレアーゼ的切断も必要としない。
【０１２９】
どのＤＮＡシャフリング実験でも、シャッフルされた子孫の集団内に得られるシャッフルされていないＤＮＡ、すなわち親ＤＮＡの比率を、最小限に抑えることが望ましい。これを達成するには数多くのアプローチを用いることができる。シャッフルすべき遺伝子が別個の、しかし他の点では同一の、プラスミド上に存在するプラスミド−オン−プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ−ｏｎ−ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡシャフリング形式では、存在する異なるユニーク制限部位のいずれかで、各プラスミドを線状化する。制限エンドヌクレアーゼを除去した後、線状化したＤＮＡを混合し、ばらばらに融解し、ニックの入った閉じた環状ヘテロ二重鎖分子であるか二本鎖の線状ホモ二重鎖であるヘテロ二重鎖ＤＮＡの集団が形成されるようにアニールさせる。ＧＲＡＭＭＲ反応の望ましい基質に相当するのは環状二本鎖ヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子の集団である。実験者は、この望ましい集団をゲル分画によって濃縮するか、またはこの集団の物理的分離を必要とせずに非シャッフル親分子の回収を妨害するような、１つまたは複数の方法を用いることができる。そのような方法を以下にいくつか挙げる。
【０１３０】
まず、線状親ホモ二重鎖および環状二本鎖ヘテロ二重鎖の混合集団のＧＲＡＭＭＲ反応後に、一般的には大腸菌の形質転換を行う。環状ＤＮＡは対応する線状型よりもはるかに高い効率で大腸菌を形質転換するので、親ホモ二重鎖は、それらが環化して形質転換コンピテント分子になるのを妨げることにより、このステップで、強く差別することができる。ＧＲＡＭＭＲ反応のリガーゼ成分として大腸菌ＤＮＡリガーゼを使用することは、親ホモ二重鎖の再環化を妨げるのに役立つだろう。というのも、このリガーゼは、制限エンドヌクレアーゼ切断によって生じる短い付着末端をつなぎ合わせるよりも効率よくニックを閉じるからである。また、この酵素は極めて非効率的にしか平滑末端をライゲートしない。この戦略を使用すると、結果として、ＧＲＡＭＭＲ反応液による大腸菌の形質転換によって得られる子孫からは、非シャッフル親遺伝子が枯渇し、ヘテロ二重鎖基質としてＧＲＡＭＭＲ反応に参加した分子が濃縮される。
【０１３１】
ＧＲＡＭＭＲアウトプット分子の集団から親遺伝子の混入を排除するもう一つの方法は、プラスミド線状化部位を選択可能マーカー内に置くことである。これらの部位は、ヘテロ二重鎖の付着末端間でアニーリングが起こりうるように、互いに十分な距離を持つべきであり、充填または切り揃えることのできる突出部分を持つか、または切断時に配列の欠失を引き起こすべきである。上述のように、シャッフルすべき遺伝子を含有するプラスミドを、それらの部位の一方または他方で、線状化する。制限エンドヌクレアーゼを除去した後、線状化したＤＮＡを混合し、融解し、アニールさせる。その結果得られる試料は、環状ヘテロ二重鎖と線状ホモ二重鎖の混合物から構成される。次に、この試料を、ｄＮＴＰ類の存在下に、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼなどの校正ポリメラーゼで処理することができる。環状ホモ二重鎖は影響を受けないはずだが、線状親ホモ二重鎖はその末端が平滑化されて、ＧＲＡＭＭＲ反応の任意の時点で、または大腸菌の形質転換後に、その分子が再び環状化されると、選択マーカー配列に効率よく塩基が付加されるか、または選択マーカー配列から効率よく塩基が除去されるだろう。これらの配列の付加または欠失によって選択可能マーカーの機能が破壊されるのであれば、結果として生じる分子は、適切な選択下では回収されないだろう。
【０１３２】
シャッフルライブラリーへの非シャッフル親遺伝子の混入を防ぐために用いることができるもう一つの方法は、線状化したＤＮＡを、融解およびアニーリングに先立って、脱リン酸化することである。線状ホモ二重鎖分子は環状分子にライゲートすることができなくなるだろうが、環状ヘテロ二重鎖は、各鎖に単一のニックを持っているだけで、環状のままであり、したがって、大腸菌を効率よく形質転換させることが可能だろう。
【０１３３】
シャッフルライブラリーへの非シャッフル親遺伝子の混入を防ぐために用いることができるもう一つの方法は、ヘテロ二重鎖分子中のミスマッチと重複する認識部位を持つ酵素で消化することである。それらの部位で親ホモ二重鎖を消化すると、その結果生じる分子は線状になるので、親遺伝子の混入を減少させるために、上述した処理のいずれかに付すことができる。その結果生じる分子は小さくもなり、無傷の環状ヘテロ二重鎖分子からの分離が容易になりうる。
【０１３４】
シャフリング実験から非シャッフル親分子を排除するだけでなく、２つ以上の親遺伝子の集団のうちの任意の２つ以上の遺伝子間でのシャフリングを防止したい場合にも、上記と同じ原理を応用することができる。
【０１３５】
本発明では、ランダムな再集合がインビトロＤＮＡミスマッチ解消反応で起こる。この方法では、今までの突然変異再集合（「シャフリング」）法の基礎として役立っている「遺伝子再構成」のステップが一切必要ない。その代わりに、インビトロでのハイブリダイゼーションとミスマッチ解消とによって１つ以上のＤＮＡ鎖から別のＤＮＡ鎖へと配列変異を伝えるという、再構築ＤＮＡまたは人工ＤＮＡミスマッチ解消系の能力に基づいている。
【０１３６】
組換えＤＮＡ技術の標準的技法は、一般に、さまざまな刊行物、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，１９８７、Ａｕｓｕｂｅｌ，１９９９、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９など（これらの文献はそれぞれ参照によりそのまま本明細書に組み込まれる）に記載されている。ポリヌクレオチド修飾酵素は製造者の推奨に従って使用した。所望により、所定のＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲアンプリマーを、実施者の裁量で選択してもよい。
【０１３７】
ＧＲＡＭＭＲ反応に関与する、本発明に教示する各活性は、類似の活性を持つ機能的に等価な作用因子と交換することができ、そのような変更も本発明の範囲に包含されることに、留意されたい。例えば、実施例２に示すように、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの代わりにＴａｑ  ＤＮＡリガーゼを使用することができた。大腸菌ＤＮＡリガーゼなどの他のリガーゼも、代用することができる。また、実施例８に示すように、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼの代わりにＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。適当な校正活性を持つ他の酵素は、これらの酵素のいずれかの代わりに、ＧＲＡＭＭＲ反応に必要な校正活性の機能を果たすことができる。同様にして、ＧＲＡＭＭＲに役立つことが実証されたものと機能的に等価な活性を持つ任意のポリメラーゼを、代用することができる。
【０１３８】
鎖切断は数多くの方法で引き起こすことができる。ＣＥＬ  Ｉの他にも、多くの機能的等価物、およびさまざまな植物種から得られる抽出物中に見いだされる潜在的に類似する活性（Ｏｌｅｙｋｏｗｓｋｉ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９８；２６：４５９７−６０２）を使用することができる。他のミスマッチ指向性エンドヌクレアーゼ、例えばＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、およびＳＰヌクレアーゼ（Ｏｌｅｙｋｏｗｓｋｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９９；３８：２２００−５）なども使用することができる。特に有用なもう一つのミスマッチ指向性エンドヌクレアーゼはＲＥＳ  Ｉである。一本鎖ＤＮＡを攻撃する他のヌクレアーゼ、例えばＳ１ヌクレアーゼ、ＦＥＮ１、クリベース、マングビーンヌクレアーゼ、およびヌクレアーゼＰ１なども使用することができる。ＤＮＡのランダムな切断を引き起こす酵素、例えばＤＮアーゼＩなども、ＧＲＡＭＭＲにおける鎖切断活性に代用することができる。他の手段による鎖切断を引き起こす方法も、数多く予想される。それらには、過マンガン酸カリウムと酢酸テトラエチルアンモニウムとの併用、立体的に嵩高い光活性化可能なＤＮＡ挿入剤、例えば［Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）］３＋、四酸化オスミウムとピペリジンアルカロイド、およびヒドロキシルアミンとピペリジンアルカロイドの使用、ならびに鎖破壊をもたらす放射エネルギーの使用などが含まれる。
【０１３９】
本発明のもう一つの態様は、非天然（外来）核酸配列の維持および転写または発現用として安定であり、そのような外来配列を宿主植物内で全体的に転写または発現させる能力を持つ、組換え植物ウイルス核酸および組換えウイルスに向けられる。より具体的に述べると、本発明の組換え植物ウイルス核酸は、天然植物ウイルスサブゲノムプロモーターと、少なくとも１つの非天然植物ウイルスサブゲノムプロモーターと、植物ウイルスコートタンパク質コード配列とを含み、要すれば、少なくとも１つの非天然核酸配列を含む。
【０１４０】
本発明は、ＣＥＬ  Ｉエンドヌクレアーゼを発現させるためのベクターまたはプラスミドとして有用な、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４などの核酸配列を含む核酸分子を提供する。配列番号３および配列番号４の核酸分子は、それぞれ配列番号１および配列番号２に含まれるＣＥＬ  Ｉオープンリーディングフレームである。配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４の核酸分子の作製および使用については、本明細書の実施例１２でさらに詳しく教示する。本発明は、ＲＥＳ  Ｉエンドヌクレアーゼを発現させるためのベクターまたはプラスミドとして有用な、図３の核酸配列（配列番号１６）を含む核酸分子も提供する。
【０１４１】
さらに本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または図３（配列番号１６）からなる群より選択される核酸配列を含んでなるベクターまたはプラスミドを含む、宿主細胞または産生細胞である植物細胞を提供する。
【０１４２】
本発明は、宿主細胞または産生細胞である植物細胞中でＣＥＬ  ＩまたはＲＥＳ  Ｉエンドヌクレアーゼを転写または発現させる能力を持つ少なくとも１つのサブゲノムプロモーターを含んでなる組換え植物ウイルス核酸も提供する。本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または図３（配列番号１６）からなる群より選択される核酸配列を含んでなる組換え植物ウイルス核酸を使ってＣＥＬ  ＩまたはＲＥＳ  Ｉエンドヌクレアーゼを発現させる方法も提供する。
【０１４３】
本明細書で使用する「宿主」という用語は、ベクターまたは植物ウイルス核酸を複製する能力を持ち、そのウイルスベクターまたは植物ウイルス核酸を含有するウイルスに感染しうる細胞、組織または生物を指す。この用語は、原核および真核細胞、器官、組織または生物を、適宜、包含するものとする。
【０１４４】
本明細書で使用する「表現型形質」という用語は、ある遺伝子の発現に起因する観察可能な特性を指す。
【０１４５】
本明細書で使用する「植物細胞」という用語は、プロトプラストと細胞壁とからなる植物の構造的および生理学的単位を指す。
【０１４６】
本明細書で使用する「植物器官」という用語は、植物の明確に異なる視覚的に識別できる部分、例えば根、茎、葉または胚などを指す。
【０１４７】
本明細書で使用する「植物組織」という用語は、植物体内の、または培養された、任意の植物組織を指す。この用語は、植物全体、植物細胞、植物器官、プロトプラスト、植物培養、または構造的および機能的な単位に組織された任意の植物細胞群を包含するものとする。
【０１４８】
本明細書で使用する「産生細胞」という用語は、ベクターまたはウイルスベクターを複製する能力を持つが、ウイルスにとって必ずしも宿主ではない細胞、組織または生物を指す。この用語は、原核および真核細胞、器官、組織または生物、例えば細菌、酵母、真菌類および植物組織などを包含するものとする。
【０１４９】
本明細書で使用する「プロモーター」という用語は、コード配列の転写の開始に関与する、コード配列に隣り合う５’隣接非コード配列を指す。
【０１５０】
本明細書で使用する「プロトプラスト」という用語は、細胞壁を持たず、植物培養または植物全体に再生する潜在力を持っている、単離された植物細胞を指す。
【０１５１】
本明細書で使用する「組換え植物ウイルス核酸」という用語は、非天然核酸配列を含むように改変されている植物ウイルス核酸を指す。
【０１５２】
本明細書で使用する「組換え植物ウイルス」という用語は、組換え植物ウイルス核酸を含有する植物ウイルスを指す。
【０１５３】
本明細書で使用する「実質的な配列相同性」という用語は、互いに実質上機能的に等価であるヌクレオチド配列を指す。実質的な配列相同性を持つそのような配列間のヌクレオチド差は、その配列がコードする遺伝子産物またはＲＮＡの機能には、ごくわずかな影響しか及ぼさないだろう。
【０１５４】
本明細書で使用する「転写」という用語は、ＤＮＡ配列の相補的コピーとしての、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の産生を指す。
【０１５５】
本明細書で使用する「ベクター」という用語は、細胞間でＤＮＡセグメントを輸送する自己複製ＤＮＡ分子を指す。
【０１５６】
植物細胞における有用な表現型形質には、例えば、除草剤耐性の改善、暑さまたは寒さの両極端、干ばつ、塩分または浸透圧ストレスに対する耐性の改善、病害虫（昆虫、線虫またはクモ類）または疾病（真菌、細菌またはウイルス）に対する耐性の改善、酵素または二次代謝産物の産生、雄性または雌性不稔、矮性、早熟性、収量、活力、雑種強勢、栄養的品質、香織または加工特性の改善などが含まれるが、これらに限るわけではない。他の例には、商業的用途を持つ重要なタンパク質または他の産物、例えばリパーゼ、メラニン、色素、抗体、ホルモン、医薬、抗生物質などの産生も含まれる。もう一つの有用な表現型形質は、例えば大麦の根発生を防止または阻害するのに利用されるような、消化酵素または阻害酵素の産生である。表現型形質は、バイオリアクターでの産生が望まれる二次代謝産物であってもよい。
【０１５７】
本発明のさらにもう一つの特徴は、指定したポリペプチドまたはタンパク質産物、例えば酵素、複雑な生体分子、リボザイム、またはアンチセンスＲＮＡから生じるポリペプチドもしくはタンパク質産物などの製造方法である。そのような産物には、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２など、ＥＰＯ、ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなどを含む）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ｔＰＡ、ｈＧＨ、受容体および受容体アンタゴニスト、抗体、神経ポリペプチド、メラニン、インスリン、ワクチンなどがあるが、これらの限るわけではない。ＲＰＶＮＡの非天然核酸は、所望の産物の産生をもたらす転写可能な配列を含む。この方法では、適当な植物宿主を、上述したような組換えウイルスまたは組換え植物ウイルス核酸に感染させ、感染した宿主を生育して所望の産物を産生させ、必要なら所望の産物を単離する。感染した宿主の生育と、その結果得られる産物の単離は、従来の技術に従って行われる。
【０１５８】
（ＣＥＬ  Ｉはミスマッチエンドヌクレアーゼである。）
ＣＥＬ  Ｉはセロリから単離されるミスマッチエンドヌクレアーゼである。標的ポリヌクレオチド配列（特にガンに関係するもの）中の突然変異を検出するための診断方法におけるＣＥｌ  Ｉの使用は、米国特許第５，８６９，２４５号に開示されている。ＣＥＬ  Ｉを単離し、調製する方法も、この特許に開示されている。しかし、ＤＮＡ配列再集合におけるＣＥＬ  Ｉの使用に関する開示は、この特許にはない。
【０１５９】
ＣＥＬ  Ｉをコードする核酸分子は、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ  ０１／６２９７４  Ａ１に開示されている。米国特許第５，８６９，２４５号と同様に、ガンに関係する標的ポリヌクレオチド配列中の突然変異を検出するための診断方法におけるＣＥＬ  Ｉの使用が開示されている。ここでもやはり、ＤＮＡ配列再集合におけるＣＥＬ  Ｉの使用に関する開示はない。
【０１６０】
（ＲＥＳ  Ｉはミスマッチエンドヌクレアーゼである。）
標的ポリヌクレオチド配列（特にガンに関係するもの）中の突然変異を検出するための診断方法にはＲＥＳ  Ｉミスマッチエンドヌクレアーゼを使用することが考えられる。これらのタイプの診断方法のいくつかの例は、米国特許第５，８６９，２４５号、Ｓｏｋｕｒｅｎｋｏら、およびＤｅｌ  Ｔｉｔｏらに開示されている。
【０１６１】
ファージＴ４のエンドヌクレアーゼＶＩＩと、８、４もしくは１ヌクレオチドのＤＮＡループ、または考えうる８つの塩基ミスマッチのいずれかとのインビトロでの反応性が、「Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ  Ｔ４  Ｔｒｉｇｇｅｒｓ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ」Ｓｏｌａｒｏら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３０（９３）８６８に開示されている。この刊行物には、エンドヌクレアーゼＶＩＩが誤対合の３’側、６ヌクレオチド以内に、ニックおよびカウンターニックを生じさせることによって、二本鎖切断点を導入する機構が報告されている。この刊行物は、第１ニックの発生とカウンターニックの発生との間の遅延は、カウンターニックが発生する前に、ｇｐ４３の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がその誤対合を除去し、そのポリメラーゼ活性がギャップを埋めるのに十分であったことを開示している。一方の鎖上のミスマッチの３’側に位置し、ミスマッチの５’側の最初の安定な塩基対で停止する第１ニックから、ヌクレオチドが削除される。ポリメラーゼ活性は最初のニックに向かって５’→３’方向に進行し、これはＤＮＡリガーゼによって閉じられる。結果として、３〜４ヌクレオチドの極めて短い修復トラックが、元のミスマッチ部位を横切って伸びることになる。この刊行物はエンドヌクレアーゼＶＩＩがファージＴ４内に持ちうるさまざまな活性に関する議論で終わっている。しかし、この刊行物は、ファージＴ４外にあるエンドヌクレアーゼＶＩＩの実用性は何ら開示しておらず、ＤＮＡ再集合におけるその利用可能性に関する開示もない。
【０１６２】
大腸菌中にインビボでキメラＤＮＡ配列のライブラリーを作製する方法は、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，Ｖｏｌ  ２７，Ｎｏ．１８，ｅ１８，Ｖｏｌｋｏｖ，Ａ．Ａ．，Ｓｈａｏ，Ｚ．およびＡｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．に開示されている。この方法では、インビトロで形成されたヘテロ二重鎖を使って大腸菌を形質転換し、そのなかで、ヘテロ二重鎖中の非同一領域の修復により、各親の要素から構成される新しい組換え配列のライブラリーが生成する。この刊行物には、既存のＤＮＡ組換え法、すなわちＤＮＡシャフリングへの便利な追加として、この方法を使用することが開示されているが、開示されている方法は、大腸菌のインビボ環境に限定される。大腸菌におけるミスマッチ修復に利用できる機構は複数存在することと、ＭｕｔＳ／Ｌ／Ｈ酵素系を利用する「ロングパッチ」修復機構が、おそらくはヘテロ二重鎖修復の原因だったのだろうということを、この刊行物は述べている。
【０１６３】
本発明を例示するために、以下の非限定的な例を記載する。
【０１６４】
【数１】
2007529991.tif 000002
【０１６５】
【数２】
2007529991.tif 000003
【０１６６】
【数３】
2007529991.tif 000004
【実施例】
【０１６７】
（実施例１）
（ＣＥＬ  ＩによるミスマッチＤＮＡ基質の切断）
この実施例では、ＣＥＬ  Ｉ酵素の調製およびミスマッチＤＮＡ基質の切断におけるその使用を教示する。
【０１６８】
ホモジナイゼーション、硫酸アンモニウム、およびＹａｎｇらが記載したコンカナバリンＡ−セファロースプロトコール（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９：３５３３−３５４１（２０００）、この文献は参照により本明細書に組み込まれる）を使って、セロリの茎からＣＥＬ  Ｉ酵素を調製した。冷凍セロリ茎部の試料１．５ｋｇをジューサーでホモジナイズした。１リットルの汁を集め、１００μＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）になるように調節し、２層のミラクロスを通して濾過した。氷上で撹拌しながら（ＮＨ４）２ＳＯ４固体を２５％飽和になるまでゆっくり加えた。３０分後に、その懸濁液を、４℃、２７，０００ｇで、１．５時間遠心分離した。上清を集め、氷上で撹拌しながら（ＮＨ４）２ＳＯ４固体で８０％飽和になるように調節し、次に、２７，０００ｇで２時間遠心分離した。ペレットを緩衝液Ｂ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｃ−ＨＣｌ、ｐＨ７．７、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１００μＭ  ＰＭＳＦ）に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。
【０１６９】
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）セファロースアフィニティークロマトグラフィーは、まず、透析した試料を２ｍｌのＣｏｎＡ樹脂と共に穏やかに撹拌しながら終夜インキュベートすることによって行った。次に、そのＣｏｎＡ樹脂を直径０．５ｃｍのカラムに充填し、数カラム体積の緩衝液Ｂで洗浄した。溶出は、緩衝液Ｂ中の０．３Ｍアルファ−メチル−マンノシドを使って行った。各１ｍｌの画分を収集した。参照により本明細書に組み込まれるＯｌｅｙｋｏｗｓｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６：４５９７−４６０２（１９９８）に記載されているように、０．１μｌの各画分をミスマッチプローブと共に緩衝液Ｄ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中、４５℃で、３０分間インキュベートすることにより、各画分を放射標識ミスマッチ基質に対するミスマッチ切断活性についてアッセイした。７％尿素を含む１０％ＴＢＥ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離した後、オートラジオグラフィーを行うことにより、反応産物を可視化した。ミスマッチ切断活性を持つＣＥＬ  Ｉ画分を小分けして−２０℃で凍結保存した。次に、第５  ＣＥＬ  Ｉ画分の５倍希釈系列を、放射標識ミスマッチ基質のミスマッチ切断について解析した。反応は、緩衝液Ｄ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｃ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ  ＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）、またはＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール−８０００）で行った。反応産物を上述のように可視化した。緩衝液Ｄでの切断活性とＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液での切断活性とはほぼ等しいことがわかったのに対して、ＰＥＧを含有するＧｉｂｃｏ／ＢＲＬリガーゼ緩衝液での切断は、他の緩衝液と比較して５〜１０倍、強化された。
【０１７０】
２種類の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子から得られる明確に定義されたヘテロ二重鎖ＤＮＡを基質として使用することにより、ＣＥＬ  Ｉ活性をさらに解析した。このＧＦＰヘテロ二重鎖基質は、センス鎖上のサイクル３  ＧＦＰ（配列番号３０）に相当する一本鎖ＤＮＡと、アンチセンス鎖上の野生型ＧＦＰ（配列番号２９）に相当する一本鎖ＤＮＡとをアニールさせることによって調製した。一本鎖ＤＮＡは、非対称ＰＣＲによって合成し、アガロースゲル電気泳動によって単離したものである。１×ＮＥＢ制限酵素緩衝液２（１０ｍＭ  Ｔｒｉｃ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイトール）の存在下で９０℃に加熱し、室温まで冷ますことによってアニールさせた後、アガロースゲル電気泳動を行い、続いてヘテロ二重鎖バンドを切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＤＮＡスピンカラムを使って抽出することにより、ヘテロ二重鎖ＤＮＡを単離した。ヘテロ二重鎖分子の全長にわたって、１または２ヌクレオチド長のミスマッチが、全部で２８個生じる。ミスマッチの分布は、１個または２個のヌクレオチドで隔てられた数個のミスマッチからなる小さいクラスターから、両側が３０個を超える塩基対で隔てられているミスマッチまで、さまざまである。
【０１７１】
１×ＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中にＣＥＬ  Ｉの３倍希釈系列を調製し、それぞれ０．５μｇのスーパーコイルプラスミド調製物または１００ｎｇのサイクル３／野生型ＧＦＰヘテロ二重鎖を基質として含有する２系列の１０μｌ反応液中で、各希釈液を１μｌずつインキュベートした。反応はすべて１×ＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中で行った。反応液を４５℃で３０分間インキュベートし、臭化エチジウムの存在下で１．５％ＴＢＥ−アガロースゲルに流した。
【０１７２】
スーパーコイルプラスミド調製物を、増加する一連のＣＥＬ  Ｉ量で処理すると、スーパーコイルＤＮＡは、まずニックの入った環状分子に変換され、次に線状分子に変換され、次にランダムなサイズを持つ小さいＤＮＡ断片に変換された。ミスマッチＧＦＰ基質をＣＥＬ  Ｉ調製物で処理すると、完全長ヘテロ二重鎖が消化されて、ミスマッチクラスターの近傍にある反対ＤＮＡ鎖での切断を表すと思われるラダー状ＤＮＡバンドが生じた。さらなる消化により、ミスマッチＧＦＰ基質は、ＣＥＬ  Ｉ調製物によるヘテロ二重鎖ＤＮＡの限界消化物に相当すると思われるさらに小さいＤＮＡに変換された。
【０１７３】
（実施例２）
（ミスマッチ解消カクテルによる完全長ＧＦＰ遺伝子の変換）
この実施例では、完全長ＧＦＰ遺伝子を保存する種々のミスマッチ解消カクテルを教示する。ミスマッチＧＦＰ基質を、全体として合成ミスマッチ解消系を構成する酵素カクテルの存在下で、さまざまな濃度のＣＥＬ  Ｉで処理した。使用した酵素はＣＥＬ  Ｉ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼである。ＣＥＬ  Ｉ活性は、ヘテロ二重鎖のミスマッチ塩基の３’側に、ニックを入れるはずである。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼはニックが入ったヘテロ二重鎖からミスマッチ塩基を切り出すための３’→５’校正活性を含んでいる。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼと、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、ギャップを埋める能力を持つＤＮＡポリメラーゼを含んでいる。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、修復された分子中のニックを閉じる。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは５’フラップアーゼ（ｆｌａｐ−ａｓｅ）活性も持っている。
【０１７４】
ＧＦＰヘテロ二重鎖基質中のミスマッチを解消するのに役立つであろう反応条件を同定するために、マトリックス実験を行った。ある実験では、サイクル３／野生型ＧＦＰヘテロ二重鎖を、マトリックス形式で、８種類の濃度の第５  ＣＥＬ  Ｉ画分（上述）の連続希釈液と共にインキュベートした。各反応液は、ヘテロ二重鎖基質１００ｎｇと、１×ＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）０．２μｌと、それぞれ２５０μＭのｄＮＴＰ類とを、１０μｌの反応体積中に含んだ。マトリックスは全部で９６個の反応液を含んだ。一組の反応液を室温で３０分間インキュベートし、もう一組の反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１７５】
インキュベーション後に、ＰＣＲを使って、各反応液からＧＦＰ遺伝子を増幅した。次に、各ＰＣＲ反応液の一部をＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｐａＩで消化し、臭化エチジウムを含む３％アガロースゲルで電気泳動した。サイクル３  ＧＦＰだけがＨｉｎｄＩＩＩ部位を持ち、野生型だけがＨｐａＩ部位をコードしている。
【０１７６】
ＤＮＡミスマッチ解消がＨｉｎｄＩＩＩミスマッチ部位かＨｐａＩミスマッチ部位で起こったとすると、ある割合のＰＣＲ産物は、両方の部位を含有し、新規なバンドを与えると予想される。そのバンドは、ＣＥＬ  ＩもＴ４  ＤＮＡポリメラーゼもＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼも含有しない陰性対照試料を含めて、全ての試料に観察された。これらの結果から、基礎レベルのバックグラウンド組換えが、ＧＲＡＭＭＲ反応以外の実験中のどこかの時点で（おそらくはＰＣＲステップ中に）起こっているらしいことが示唆された。ＰＣＲが媒介する組換えは、関連配列間では、増幅中に、ある頻度で起こることが知られている。Ｐａａｂｏら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５（９０）４７１８−４７２１。
【０１７７】
もう一つの実験では、２００ｎｇのサイクル３／野生型ＧＦＰヘテロ二重鎖を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（０．２単位；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）の存在下または不在下に、さまざまな濃度のＣＥＬ  ＩおよびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼならびに２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼで処理した。各反応液は、１×ＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液と、０．０５ｍＭの各ｄＮＴＰを、２０μｌの最終体積中に含んだ。反応液を３７℃で３０分間インキュベートし、１０μｌを、臭化エチジウムの存在下で２％ＴＢＥ−アガロースゲルに流した。その結果から、ＤＮＡリガーゼは存在するがＴ４  ＤＮＡポリメラーゼは存在しない状態では、ＣＥＬ  Ｉの量が増加するにつれてヘテロ二重鎖ＤＮＡの分解は多くなること、しかしこの効果は反応液中のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ量を増やすことによって相殺されうることがわかった。これらの結果から、完全な反応液のさまざまな成分が全体として、ＤＮＡミスマッチ解消の全体を通して、完全長遺伝子の完全性を保存するように働きうることが示された。
【０１７８】
これらの結果をさらに詳しく調べ、この合成系に関してＤＮＡミスマッチ解消のさらなる条件を同定するために、もう一つのマトリックス実験を行った。０．５ｍＭの各ｄＮＴＰを含有する１×ＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中、１０μｌの反応体積で、２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび０．２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼの存在下に、さまざまな濃度のＣＥＬ  ＩおよびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで、６０ｎｇのサイクル３／野生型ＧＦＰヘテロ二重鎖を処理した。各組の反応液を２０℃、３０℃、３７℃または４５℃で１時間インキュベートした。次に、全ての反応液を臭化エチジウムの存在下で１．５％ＴＢＥ−アガロースゲルに流した。その結果から、ＧＦＰヘテロ二重鎖は、ＣＥＬ  Ｉ調製物だけでは、ばらばらの断片に切断されることがわかった。まずは、ＧＦＰ配列の完全長が見かけ上、ＣＥＬ  Ｉの存在下で、ミスマッチ解消系の他の成分によって保全される度合いにより、ＤＮＡミスマッチ解消の成功を判断した。このアッセイで高い割合のＤＮＡを完全長分子として保存する酵素濃度および温度の条件を同定した。すなわち、実験中は一定に保たれた他の反応成分の存在下で、１μｌの第５  ＣＥＬ  Ｉ画分調製物（実施例１に記載）を、１μｌ（１単位）のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼと共に使用した。反応温度が上昇すると、それに応じてＣＥＬ  Ｉの分解活性も増加することがわかった。さらに、修復反応の他の成分は、２０℃、３０℃および３７℃では、完全長ＤＮＡの完全性を保存するように作用するが、４５℃では完全長ＤＮＡを保存する効率が著しく低下することもわかった。これらの結果から、我々は、これらの実験条件では、４５℃でのインキュベーションはＧＲＡＭＭＲのプロセスにとって最適でなく、２０℃、３０℃および３７℃でのインキュベーションは許容されると結論した。
【０１７９】
ＤＮＡミスマッチ解消反応に代替酵素を使用するもう一つの実験を行った。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの代わりにＴａｑ  ＤＮＡリガーゼを使用した。３’エキソヌクレアーゼ／ポリメラーゼとしてＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを含む一組の反応液との同時比較に、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。反応は、８単位のＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、さまざまなＣＥＬ  Ｉ希釈液、およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを含有するＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中で行った。反応液を、臭化エチジウムの存在下で、１．５％ＴＢＥ−アガロースゲルに流した。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼの存在下では、ＣＥＬ  Ｉ処理した基質ＤＮＡの完全長の保全が、ＣＥＬ  ＩのみとインキュベートしたＤＮＡと比較して強化されることがわかった。この結果は、機能的に等価な活性を持つ酵素をＧＲＡＭＭＲ反応に代用してもうまくいくことを示している。
【０１８０】
（実施例３）
（ＤＮＡミスマッチ解消（ＧＲＡＭＭＲ）後のＧＦＰヘテロ二重鎖ＤＮＡにおける制限部位の復元）
この実験では、制限部位の復元を実証することによって、ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝子再集合（ＧＲＡＭＭＲ）の実施可能性を教示する。
【０１８１】
上で見いだした至適条件（１×反応液は、１０μｌの反応体積で、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰを含有する１×ＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中、２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび０．２単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼの存在下に、６０μｇのヘテロ二重鎖ＤＮＡ、１μｌの第５  ＣＥＬ  Ｉ画分（実施例１に記載）、１単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを含有する）を使用して、２０倍にスケールアップしたＧＲＡＭＭＲ反応を、３７℃で１時間行うことによって得た完全長産物をゲルで単離し、エンドヌクレアーゼ（その認識部位が、ＧＦＰヘテロ二重鎖中のミスマッチとオーバーラップするため、ＤＮＡ中のそれらの部位が、制限酵素切断に対して耐性になっているもの）による制限酵素解析に付した。使用した酵素は、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、およびＸｈｏＩである。陰性対照は未処理のＧＦＰヘテロ二重鎖から構成された。陽性対照は、個別に、サイクル３  ＧＦＰ配列または野生型ＧＦＰ配列から構成された。対照は全て、ＤＮＡミスマッチ解消反応の産物と同じ酵素で消化した。全ての試料を、臭化エチジウムの存在下で、２％ＴＢＥ−アガロースゲルに流した。
【０１８２】
ミスマッチ解消カクテルによる処理後に、ＤＮＡの一部は、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼに対する感受性を獲得したことから、ＤＮＡミスマッチ解消が起こったことが示された。ＨｐａＩ切断試料は、陰性対照で低レベルの切断が起こったので、解釈することができなかった。ＧＲＡＭＭＲ処理試料では、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位が、異なる切断度を示した。ＸｈｏＩ部位の復元はＢａｍＨＩ部位の復元よりも多く、ＢａｍＨＩ部位の復元はＨｉｎｄＩＩＩ部位の復元よりも多かった。
【０１８３】
切断が起こる程度は、その部位においてＤＮＡ中のミスマッチが解消されている程度を示す。ミスマッチ解消効率の相違は、それらの部位に存在するミスマッチの性質または密度に関係するのかもしれない。例えば、ＸｈｏＩ部位は３つのミスマッチクラスターにまたがっているが、ＢａｍＨＩ部位は２つのミスマッチにまたがり、ＨｉｎｄＩＩＩ部位は単一のミスマッチにまたがっている。
【０１８４】
（実施例４）
（ＧＲＡＭＭＲ処理したＧＦＰ遺伝子）
この実施例では、ＧＲＡＭＭＲが、ヘテロ二重鎖中の２つの遺伝子配列間で、配列変異を再集合させうることと、直接クローニングしたＧＲＡＭＭＲ産物またはＰＣＲ増幅後にクローニングしたＧＲＡＭＭＲ産物に、有意な差はないことを実証する。
【０１８５】
実施例３のＧＲＡＭＭＲ処理ＤＮＡ分子を、続いて、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのライゲーションによって直接クローニングするか、ＰＣＲで増幅して、製造者の使用説明書に従ってｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯにライゲートしてから、大腸菌の形質転換に使用した。個々のコロニーを拾い上げ、液体培地で生育した後、ＤＮＡを調製し、ＧＦＰインサートの配列を決定した。陰性対照として、未処理のＧＦＰヘテロ二重鎖基質を直接クローニングするか、またはＰＣＲ増幅してからプラスミド中にクローニングした。
【０１８６】
ＧＲＡＭＭＲでは、一方の鎖から他方の鎖への情報伝達のプロセスによって、配列情報の再集合が起こる。これらの情報伝達部位は、組換えに基づくＤＮＡシャフリング法で起こる交叉事象と類似している。しかし、これらの再集合実験の結果を述べるために、ＧＲＡＭＭＲアウトプット配列を交叉の観点から記述する。ＧＲＡＭＭＲ処理ＧＦＰ遺伝子に由来する２０個の完全長ＧＦＰクローンの配列を解析した。これらのクローンのうち４つは、ＧＲＡＭＭＲ反応後にｐＺｅｒｏＢｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接クローニングしたＤＮＡから得た（ＰＣＲ増幅なし）。他の１６個の配列は、ＰＣＲ増幅後にクローニングした。これらの完全長ＧＦＰ配列の解析により、２０個の配列は全て配列再集合を起こしていて、１遺伝子につき１〜１０点の交叉を持っていることが明らかになった。この遺伝子の集合には全部で９９点の交叉が見つかったので、平均すると、交叉は１遺伝子につき約５点になる。最初のミスマッチと最後のミスマッチの間の距離は約５９０ヌクレオチドであることから、交叉の総合的頻度は１２０塩基対につきほぼ１点と計算された。この２０個のクローンからなる集合では、全部で７つの点突然変異がＰＣＲプライマー配列間に位置する配列内で起こっていて、突然変異頻度はほぼ０．０５％になった。
【０１８７】
ＧＲＡＭＭＲ反応を受けていない３５個のクローンを配列決定した。これらの対照のうち、１４個は直接的なクローニングによって得たものであり、２１個は、ＧＦＰヘテロ二重鎖をテンプレートとして使用するＰＣＲ増幅を経て得たものである。これら３５個の非ＧＲＡＭＭＲ処理対照クローンのうち、８個は組換え体であり、交叉は１〜３点だったが、大半は一点交叉事象だった。全部で２５個の点突然変異が、ＰＣＲプライマー間に位置する配列内で起こっていて、突然変異頻度はほぼ０．１％になった。
【０１８８】
直接クローニングしたＧＲＡＭＭＲ処理産物またはＰＣＲ増幅したＧＲＡＭＭＲ処理産物の間に、有意な差は観察されなかった。しかし、注目すべきことに、非ＧＲＡＭＭＲ処理対象の場合は、直接クローニングしたＤＮＡよりも、ＰＣＲ増幅したＤＮＡの方が、組換え頻度が高かった。この高い頻度は、「ジャンピングＰＣＲ（ｊｕｍｐｉｎｇ  ＰＣＲ）」が一定レベルの組換えを引き起こすことを見いだした他の研究（Ｐａａｂｏら「ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｊｕｍｐｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｅｍｐｌａｔｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５（９０）４７１８−４７２１）で得られた結果と合致している。
【０１８９】
（実施例５）
（ＧＦＰプラスミドのＤＮＡミスマッチ解消によるプラスミド−オン−プラスミド遺伝子再編成（ＰＯＰ  ＧＲＡＭＭＲ）用のヘテロ二重鎖基質の調製）
この実施例では、ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝子再集合用のヘテロ二重鎖基質が、無傷の環状プラスミドの形態をとりうることを教示する。サイクル３−ＧＦＰおよび野生型ＧＦＰヘテロ二重鎖分子をプラスミド−オン−プラスミド（ＰＯＰ）形式で調製した。この形式では、環状二本鎖プラスミドベクター骨格を背景として、ＧＦＰ配列を再集合させた。これにより、ＧＲＡＭＭＲ反応液の一部を使った大腸菌の直接形質転換による再集合産物の回収が可能になった。したがって、再集合クローンを得るために、ＧＲＡＭＭＲ処置ＤＮＡにＰＣＲ増幅を行う必要も、他の追加操作を行う必要もなかった。
【０１９０】
野生型ＧＦＰ（配列番号２９）およびサイクル３  ＧＦＰ（配列番号３０）を含有するＰＯＰ−ＧＲＡＭＭＲ反応用のミスマッチＤＮＡ基質を作製して、２つのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系プラスミド、それぞれｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列番号３１）およびｐＢＳＣ３ＧＦＰ（配列番号１７）を得た。ＧＦＰは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔポリリンカーのＫｐｎＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に、２つのプラスミド間で唯一の配列差が、野生型ＧＦＰとサイクル３  ＧＦＰとが互いに異なっている部位に生じるように、挿入した。ＳａｐＩでプラスミド骨格を消化することにより、両方のプラスミドを線状化し、ＤＮＡスピンカラムを使って精製し、混合し、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｂａｒｎｅｓ，１９９４；ＰＮＡＳ，９１，２２１６−２２２０）に変更し、沸騰水浴で３分間加熱し、室温まで徐冷することにより、変性したＤＮＡ鎖をアニールさせた。これらのＤＮＡを変性させアニールさせることにより、二重鎖の混合物が得られる。つまり、親二重鎖の再形成と、２つのインプットプラスミドのそれぞれに由来する鎖のアニーリングによるヘテロ二重鎖の形成が起こる。親二重鎖はＧＲＡＭＭＲにとって望ましくないとみなし、一方または他方の親二重鎖を切断するがヘテロ二重鎖分子を切断しない制限酵素を使った消化によって除去した。ＰｍｌＩは野生型ＧＦＰ配列だけを切断し、ＸｈｏＩはサイクル３  ＧＦＰだけを切断するので、この作業には、ＰｍｌＩとＸｈｏＩを選択した。これらの酵素で処理した後、産物をアガロースゲル上で分割した。バンドを切り出してＤＮＡスピンカラムで精製することにより、完全長未切断ヘテロ二重鎖分子を、アガロースゲル中のＰｍｌＩ切断親ホモ二重鎖およびＸｈｏＩ切断親ホモ二重鎖から分割し、精製した。
【０１９１】
その結果得られたヘテロ二重鎖分子の集団を、ＤＮＡリガーゼで処理することにより、線状ＤＮＡを環状二本鎖ＤＮＡヘテロ二重鎖に変換した。アガロースゲルシフト解析によって確認した後、環状二本鎖ＧＦＰヘテロ二重鎖プラスミドを、ＧＲＡＭＭＲ反応の基質として使用した。得られたクローンの例を、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８として記載する。
【０１９２】
（実施例６）
（ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝子再集合に関する典型的な反応パラメータ：ＣＥＬ  Ｉ濃度およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ濃度の比較）
ＧＲＡＭＭＲ反応には、数多くの酵素活性の相互作用が含まれる。例えばＣＥＬ  Ｉ濃度、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ濃度、反応温度、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼによるＴ４  ＤＮＡポリメラーゼの置換、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの存在、およびＣＥＬ  Ｉ酵素の起源など、ＧＲＡＭＭＲ反応に関係するパラメーターをいくつか検討した。３種類のＣＥＬ  Ｉ濃度と２つのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ濃度とからなるマトリックスを設定して、インビトロＤＮＡミスマッチ解消反応の限界を調べた。
【０１９３】
実施例５に記載したように調製した環状二本鎖ヘテロ二重鎖プラスミド２１ｎｇを、１×ＮＥＢリガーゼ緩衝液、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１．０単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、１．０単位または０．２単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、および０．３μｌ、０．１μｌまたは０．０３μｌのＣＥＬ  Ｉ調製物（実施例１に記載の第５画分）を含む一連の１０μｌ反応液で、基質として使用した。２つのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ濃度と３つのＣＥＬ  Ｉ濃度とからなる６つの組合せの全てを表す６つの反応液を調製し、５μｌずつの等価な二組に分割し、それらを２０℃または３７℃でインキュベートした。ＣＥＬ  Ｉを含有せず０．２単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを他の反応成分と共に含有している対照反応を調製し、３７℃でインキュベートした。３０分後に、各反応液を１μｌずつ使ってコンピテントＤＨ５−アルファ大腸菌を形質転換し、それをＬＢａｍｐ平板にプレーティングした。コロニーを拾って培養した。プラスミドＤＮＡを抽出し、制限断片長多型解析（ＲＦＬＰ）によって調べた後、ＧＦＰ遺伝子配列の配列解析を行った。ＲＦＬＰ解析は、野生型ＧＦＰ遺伝子とサイクル３  ＧＦＰ遺伝子との間にある数カ所の制限酵素認識部位の相違に基づいて行った。ＲＦＬＰの結果は、制限部位の再集合、すなわちＧＲＡＭＭＲが、ＣＥＬ  Ｉ／Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ／温度マトリックスの全体にわたって起こったことと、ＣＥＬ  Ｉ非含有対照クローンではそのような再集合が起こらなかったことを示した。ＤＮＡ配列解析により、再集合はＣＥＬ  Ｉ含有試料の全てで起こっていたことが確認された。また、１６個の対照クローンのうちただ１つのクローン（これは一方の遺伝子配列から他方の遺伝子配列への一塩基変化を持っていた。これはおそらく大腸菌における修復によるものか、またはランダム突然変異によるものだろう）を除いて、ＣＥＬ  Ｉ非含有対照では再集合が起こっていないことも、配列決定によって確認された。典型的なＧＲＡＭＭＲアウトプットＧＦＰクローンの配列をいくつか示すが、これらはいずれも、０．３μｌのＣＥＬ  Ｉ調製物と１．０単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼとを含む反応液を３７℃でインキュベートすることによって得たものである。参考のために、親野生型ＧＦＰ遺伝子とサイクル３  ＧＦＰ遺伝子を、最初に示す。
【０１９４】
（実施例７）
（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡミスマッチ解消による遺伝子再集合に必要ではない）
この実験では、仮にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼがＧＲＡＭＭＲの機能をもたらしたり、妨害したりすることがあったとしても、それは劇的なものではないということを教示する。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは５’フラップアーゼ活性を持つと報告されており、先の実施例では、ＧＲＡＭＭＲ反応を受けているヘテロ二重鎖ＤＮＡに望ましくない５’フラップが形成され存続する可能性に対する防護手段として含めていた。
【０１９５】
実施例６と同様に、１×ＮＥＢリガーゼ緩衝液、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ、１．０単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、１．０μｌのＣＥＬ  Ｉ調製物（実施例１に記載の第５画分）および２．５単位もしくは０．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含むか、またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含まない１０μｌ反応液中に、２１ｎｇの環状二本鎖二重鎖ＧＦＰプラスミド基質を使って、ＧＲＡＭＭＲ反応を設定した。３０分後に、各反応液を１μｌずつ使ってコンピテントＤＨ５−アルファ大腸菌を形質転換し、それをＬＢ  ａｍｐ平板にプレーティングした。コロニーを拾って培養した。プラスミドＤＮＡを抽出し、ＲＦＬＰ解析によって調べた後、ＧＦＰ遺伝子配列の配列解析を行った。ＲＦＬＰの結果は、ＧＲＡＭＭＲ反応中にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが存在しても存在しなくても、制限部位の再集合、すなわちＧＲＡＭＭＲが起こっていたことを示した。これらの結果はＤＮＡ配列解析によって確認された。したがってこのデータは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼがＧＲＡＭＭＲには不必要だったことを示している。
【０１９６】
（実施例８）
（ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝子再集合用の代替校正ＤＮＡポリメラーゼ）
この実験では、ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝子再集合がＴ４  ＤＮＡポリメラーゼの使用に限定されるわけではないことと、それに代えて代替ＤＮＡポリメラーゼを使用できることとを教示する。
【０１９７】
実施例６と同様に、１×ＮＥＢリガーゼ緩衝液、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、１０単位または２単位のＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、１．０μｌのＣＥＬ  Ｉ調製物（実施例１に記載の第５画分）および２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む１０μｌ反応液中に、２１ｎｇの環状二本鎖二重鎖ＧＦＰプラスミド基質を使って、ＧＲＡＭＭＲ反応を設定した。３０分後に、各反応液を１μｌずつ使ってコンピテントＤＨ５−アルファ大腸菌を形質転換し、それをＬＢ  ａｍｐ平板にプレーティングした。コロニーを拾って培養した。プラスミドＤＮＡを抽出し、ＲＦＬＰ解析によって調べた後、ＧＦＰ遺伝子配列の配列解析を行った。ＲＦＬＰの結果は、どちらのＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ含有反応でも、制限部位の再集合、すなわちＧＲＡＭＭＲが起こっていたことを示した。これらの結果はＤＮＡ配列解析によって確認された。したがってこのデータは、ＧＲＡＭＭＲには、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼの代わりにＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを使用できるということを示している。またこれは、ＧＲＡＭＭＲでは個々の成分および機能を広く代替物で置き換えることができ、それでもなお同様の結果が得られることを示している。
【０１９８】
（実施例９）
（ＧＲＡＭＭＲ反応におけるクローン化ＣＥＬ  Ｉの使用）
この実施例では、セロリから精製される天然ＣＥＬ  Ｉ酵素の代わりに、クローン化された供給源に由来するＣＥＬ  Ｉを、ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝子再集合に使っても、結果に顕著な変化は生じないことを教示する。
【０１９９】
ＣＥＬ  ＩのｃＤＮＡをセロリＲＮＡからクローニングした。その遺伝子をＴＭＶウイルスベクターに挿入し、発現させた。そのコンストラクトの転写物を使って、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を感染させた。感染組織を収集し、ＣＥｌ  Ｉ酵素を精製した。この精製酵素を使って得られるＧＲＡＭＭＲ反応の結果を、セロリから精製したＣＥＬ  Ｉを使って得られるものと比較したところ、よく似ていることがわかった。
【０２００】
１×ＮＥＢリガーゼ緩衝液、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、１単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、およびセロリから精製したＣＥＬ  Ｉ調製物（実施例１に記載の第５画分）１．０μｌまたはクローン化された供給源から精製したＣＥＬ  Ｉ  ０．３μｌを含む１０μｌ反応液中に、実施例５に記載の環状二本鎖二重鎖ＧＦＰプラスミド基質２１ｎｇを使って、ＧＲＡＭＭＲ反応を設定した。３０分後に、各反応液を１μｌずつ使ってコンピテントＤＨ５−アルファ大腸菌を形質転換し、それをＬＢ  ａｍｐ平板にプレーティングした。コロニーを拾って培養した。プラスミドＤＮＡを抽出し、ＲＦＬＰ解析によって調べた後、ＧＦＰ遺伝子配列の配列解析を行った。ＲＦＬＰの結果は、セロリ由来ＣＥＬ  Ｉ含有反応でも、クローン化ＣＥＬ  Ｉ含有反応でも、制限部位の再集合、すなわちＧＲＡＭＭＲが起こっていたことを示した。これらの結果はＤＮＡ配列解析によって確認された。したがってこのデータは、ＧＲＡＭＭＲでは、セロリ由来のＣＥＬ  Ｉの代わりに、クローン化された供給源に由来するＣＥＬ  Ｉを使用できることを示している。さらにこのデータは、ＧＲＡＭＭＲ反応の一部であるのはＣＥＬ  Ｉ活性であって、セロリからＣＥＬ  Ｉを抽出する際に用いる精製ステップがもたらす偶然の効果ではないことも証明している。
【０２０１】
（実施例１０）
（ウイルスベクターにおけるトバモウイルス３０Ｋ遺伝子の分子育種）
先の実施例では、ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝子再集合が、高度に相同な配列を再集合させるのに有用であることを教示した。例えばｗｔＧＦＰとサイクル３  ＧＦＰは９６％一致する。この実施例では、さらに分岐した核酸配列、例えばトバモウイルス移動タンパク質遺伝子をコードする遺伝子などを再集合させるために、ＧＲＡＭＭＲを使用することもできるということを教示する。
【０２０２】
約７５％一致している２つのトバモウイルス移動タンパク質（ＭＰ）遺伝子のヘテロ二重鎖を作製した。このヘテロ二重鎖基質は、非対称ＰＣＲで合成した反対鎖である部分相補一本鎖ＤＮＡ同士（一方の鎖はタバコモザイクウイルスＵ１型株（ＴＭＶ−Ｕ１）由来の移動タンパク質遺伝子（配列番号９）をコードし、他方の鎖はトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）由来の移動タンパク質遺伝子（配列番号１０）をコードする）をアニールさせることによって調製した。これら２つの部分相補移動タンパク質遺伝子の配列には、末端部でのそれらのＤＮＡのアニーリングを促進し、ＰＣＲによる増幅およびクローニングを容易にするために、絶対的な相補性を持つ３３ヌクレオチドを隣接させた。アニーリング反応は、２．５μｇの各一本鎖ＤＮＡを、３３３ｍＭ  ＮａＣｌ、３３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３．３ｍＭジチオトレイトール、１６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７を含む１５０μｌの反応液中で混合し、９５℃で１分間インキュベートした後、室温まで徐冷することによって行われた。ＧＲＡＭＭＲは、１×ＮＥＢリガーゼ緩衝液、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．４単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、２．０単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＣＥＬ  Ｉを含む２０μｌの反応液中で、５μｌのヘテロ二重鎖基質をインキュベートすることによって行った。このＣＥＬ  Ｉはクローン化調製物から得たものであり、使用した量はさまざまで、２μｌの当該調製物に始まって、５つの３倍連続希釈液に及んだ。ＣＥＬ  Ｉを含まない７番目の調製物も調製し、これを対照とした。
【０２０３】
室温で１時間後に、ＳｔｒａｔａｐｒｅｐスピンＤＮＡ精製カラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州ラホーヤ）を使ってＤＮＡを反応液から精製し、上記２つの配列の隣接プライマー結合部位にアニールするように設計されたプライマーを用いるＰＣＲ反応に、テンプレートとして使用した。各反応で得たＰＣＲ産物をＳｔｒａｔａｐｒｅｐカラムを使って精製し、ＡｖｒＩＩおよびＰａｃＩで消化し、同様に切断したｐＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）−ＭＰ−Ａｖｒ−Ｐａｃの移動タンパク質スロットにライゲートした。このプラスミドは、移動タンパク質遺伝子を他の移動タンパク質遺伝子で置き換えることができるように、移動タンパク質遺伝子に隣接するＡｖｒＩＩ部位とＰａｃＩ部位で修飾された完全長感染性トバモウイルス−ＧＦＰクローンを含んでいる。ＤＨ５−アルファ大腸菌を形質転換し、プレーティングした後、コロニーを拾い、培養物を生育させ、ＤＮＡを抽出した。移動タンパク質インサートを両方向からＤＮＡ配列解析にかけたところ、ＧＲＡＭＭＲ処理材料から得られるインサートの大半は、ＴＭＶ−Ｕ１移動タンパク質遺伝子配列とＴｏＭＶ移動タンパク質遺伝子配列の両方から構成される再集合配列であることが、配列データによって確認された。いくつかの典型的なＧＲＡＭＭＲアウトプットＭＰクローンのＤＮＡ配列を、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５として示す。
【０２０４】
（実施例１１）
（改良されたヒ酸塩解毒細菌を作出するためのＧＲＡＭＭＲ）
ヒ素解毒は、硫ヒ鉄鉱を含む金鉱の採掘および他の用途、例えば環境改善などにとって重要である。ヒ酸塩解毒オペロンを含有するプラスミドｐＧＪ１０３（ＪｉおよびＳｉｌｖｅｒ，１９９２）（Ｊｉ，Ｇ．およびＳｉｌｖｅｒ，Ｓ．「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｓｅｎｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｐｅｒｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＩ２５８」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４，３６８４−３６９４（１９９２）、この論文は参照により本明細書に組み込まれる）は、Ｓｉｍｏｎ  Ｓｉｌｖｅｒ博士（イリノイ大学、イリノイ州シカゴ）から入手することができる。ｐＧＪ１０３（ｐＵＣ１９にクローニングされたｐＩ２５８  ａｒｓオペロンを含有する）を保持する大腸菌ＴＧ１は、ＬＢアンピシリン寒天平板上で４μｇ／ｍｌのＭＩＣ（最小発育阻止濃度）を持つ。ａｒｓオペロンを突然変異誘発ＰＣＲ（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ＰＣＲ）によって増幅し、ｐＵＣ１９にクローニングし、大腸菌ＴＧ１の形質転換に使用する。形質転換した細胞を、ある範囲のヒ酸ナトリウム濃度（２、４、８、１６ｍＭ）で、プレーティングする。最も高いヒ酸塩レベルを持つ平板からコロニーを拾う。それらのコロニーを適当なヒ酸塩選択下に混合培養で生育させる。その培養物からプラスミドＤＮＡを単離する。そのプラスミドＤＮＡを、ｐＵＣ１９プラスミド骨格に一度だけ切り込みを入れる制限エンドヌクレアーゼで消化することにより、線状にする。その線状プラスミドを９４℃で１０分間加熱することによって変性させる。一本鎖のアニーリングが促進されるように反応液を冷ます。ハイブリダイズする部分相補鎖はミスマッチ部位に非塩基対形成ヌクレオチドを持つ。ＣＥＬ  Ｉ（実施例９の方法で精製したもの）で処理することにより、各ミスマッチの３’側で、どちらか一方のポリヌクレオチド鎖にニックが入る。校正活性を持つポリメラーゼ、例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼなどが存在すると、ミスマッチの切り出しが可能になり、それに続いて５’→３’ポリメラーゼ活性が、他方の鎖をテンプレートとして、ギャップを埋める。次に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼが、修復された鎖のリン酸主鎖を復元することによって、ニックを閉じる。その結果、インプット鎖間で突然変異のランダム化が起こって、改善された特性を持つ可能性のあるアウトプット鎖が得られる。これらのアウトプットポリヌクレオチドを直接使って大腸菌ＴＧ１を形質転換し、それらの細胞を、さらに高いヒ酸塩レベル（８、１６、３２、６４ｍＭ）で、プレーティングする。最も高いヒ酸塩レベルを持つプレートからコロニーを拾い、再集合を上述のようにもう１回行う。ただし、結果として生じる形質転換細胞は、３２、６４、１２８、２５６ｍＭのヒ酸塩濃度で、プレーティングする。次に、さらなる改善を達成するための試みとして、選択したクローンを使って、このプロセスを１回以上繰り返すことができる。
【０２０５】
（実施例１２）
（ＣＥＬ  Ｉエンドヌクレアーゼのクローニング、発現および精製）
この実施例では、植物からＣＥＬ  Ｉエンドヌクレアーゼを発現させるために使用した核酸分子（ここではｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬ  Ｉ  Ａｖｒ（配列番号１）およびｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬ  Ｉ  ６ＨＩＳ（配列番号２）と呼ぶ）の作製を教示する。特にこの実施例では、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３１６，９３１号、第５，５８９，３６７号、第５，８６６，７８５号および第５，８８９，１９０号に教示されている開示に言及する。
【０２０６】
（セロリＲＮＡ抽出：）
セロリは地元の市場で購入した。少量のセロリ組織（０．５〜０．７５ｇ）を切り刻み、液体窒素で凍結し、粉砕ガラスの存在下に乳鉢と乳棒で摩砕した。４００μｌのＴｒｉｚｏｌを加えてさらに摩砕し、７００μｌの抽出物を取り出して、氷上に５分間保った。次に２００μｌのクロロホルムを加え、試料を遠心分離し、室温に３分間放置し、再び１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。水層を新しいチューブに取り出し、等体積のイソプロパノールを加えた。チューブを上下逆さにして混合し、室温で１０分間放置した後、４℃、１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを、４００μｌの７０％エタノール中で２回、１００％エタノール中で１回洗浄し、風乾し、４０μｌの蒸留水に再懸濁した。１μｌのＲＮａｓｉｎを加え、３．５μｌを１％アガロースゲルに流して、ＲＮＡ調製物の品質をチェックした（ゲル像）。残りはさらに使用するまで−７０℃で保存した。
【０２０７】
（ウイルスベクターによるＣＥＬ  Ｉ遺伝子のクローニングおよび発現：）
セロリから得た全ＲＮＡを逆転写にかけた後、ＰＣＲを行うことにより、ＣＥＬ  Ｉ遺伝子配列をコードするｃＤＮＡを増幅した。別個の反応では、１１μｌの全セロリＲＮＡ調製物を、１μｌ（５０ｐｍｏｌ）のＣＥｌＩ−Ａｖｒ−Ｒ、ＣＥｌＩ−６Ｈ−Ｒと混合するか、または２μｌのオリゴｄＴプライマーと混合した。ＣｅｌＩ−Ａｖｒ−Ｒは、ｃＤＮＡをプライミングし、遺伝子の３’末端にある天然ＣＥＬ  Ｉ配列を増幅するために使用した。一方、ＣｅｌＩ−６Ｈ−Ｒは、ＣＥＬ  Ｉ遺伝子の３’末端にリンカーペプチドおよび６−Ｈｉｓタグをコードする配列を付加するために使用した。試料を７０℃に１分間加熱し、氷で急冷した後、４μｌの５×Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ緩衝液、２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭ各ｄＮＴＰ、および１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を各反応液に加えた。これらの反応液を４２℃で１時間インキュベートした。
【０２０８】
ＣＥＬ  Ｉ  ｃＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅は、Ｗ．Ｍ．Ｂａｒｎｅｓの方法（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４  Ｍａｒ  １５；９１（６）：２２１６−２０）により、Ｔａｑ−Ｐｆｕ混合物を使って、またはＰｆｕだけを使って行った。ＣｅｌＩ−Ａｖｒ−ＲでプライミングしたＲＴ反応液は、ＣｅｌＩ−Ａｖｒ−Ｒ（リバースプライマーとして）と対にしたＣｅｌＩ−Ｐａｃ−Ｆ（フォワードプライマーとして）をプライマーとするＰＣＲに、テンプレートとして使用した。他のＰＣＲでは、オリゴｄＴでプライミングしたＲＴ反応液を、上記プライマー対の両方に、テンプレートとして使用した。全てのＰＣＲ反応は、液量を１００μｌとし、５０℃でのアニーリングと７２℃で２分間の伸長とを３０サイクル行った。得られた反応液の一部をアガロースゲル電気泳動で解析した。Ｐｆｕを唯一のポリメラーゼとして使用した反応液には、生成物は認められなかった。Ｔａｑ／Ｐｆｕ混合物を使って行った反応は全て、予想されるサイズの産物を与えた。しかし、Ｃｅｌ  Ｉ特異的プライマー対でプライミングしたｃＤＮＡから増幅されたものは、オリゴｄＴでプライミングしたｃＤＮＡから増幅された反応よりも多くの産物を与えた。最も多くの産物が得られたＰＣＲ反応液から、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  ＤＮＡスピンカラムキットを使ってＤＮＡを精製し、ＰａｃＩおよびＡｖｒＩＩで消化し、ゲル単離し、ＰａｃＩおよびＡｖｒＩＩで消化したプラスミドｐＲＴ１３０（トバモウイルス系ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ベクター）にライゲートした。２μｌの各ライゲーション液を使ってＤＨ５αコンピテント大腸菌を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天平板で一晩培養した。コロニーを拾い、液体培養で一晩生育させ、Ｑｉａｇｅｎプラスミドプレップキットを使ってプラスミドＤＮＡを単離した。各コンストラクトから得た１２個のクローンを、ＰａｃＩおよびＡｖｒＩＩによる消化でスクリーニングしたところ、各組１２個のうち１１個が、正しいサイズを持つインサートに関して陽性だった。各コンストラクトにつき１０個のクローンをインビトロで転写し、ＲＮＡをＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物に接種した。また、１０個のクローンからなる各組のＣＥＬ  Ｉ遺伝子インサートを配列解析にかけた。天然型ＣＥＬ  Ｉをコードするインサートを含有する数個のクローンは、ＷＯ  ０１／６２９７４  Ａ１に公表されているＣＥＬ  Ｉ配列と同じ配列を持っていた。６−ヒスチジン配列に融合したＣＥＬ  Ｉをコードするインサートを含有する１個のクローンは、公表されたＣＥＬ  Ｉ配列と同一だった。それぞれ１個のクローン（それぞれｐＲＴ１３０−ＣＥＬ  Ｉ  Ａｖｒ−Ｂ３およびｐＲＴ１３０−ＣＥＬ  Ｉ  ６Ｈｉｓ−Ａ９）を選択して、それ以降の作業に使用した。次に、これらのクローン中のＣＥＬ  Ｉコード配列を、別のＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ベクターに移した。これらのクローン、すなわちｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬ  Ｉ  Ａｖｒ−Ｂ３およびｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬ  Ｉ  ６Ｈｉｓ−Ａ９の配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２として記載する。
【０２０９】
（クローン化ＣＥＬ  Ｉ活性のアッセイ：）
Ｃｅｌ  Ｉ配列を含有するＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）コンストラクトが活性なＣＥｌ  Ｉ酵素を産生できるかどうかを決定するために、ｐＲＴ１３０−ＣＥＬ  Ｉ  Ａｖｒ（配列番号１）およびｐＲＴ１３０−ＣＥＬ  Ｉ  ６Ｈｉｓ（配列番号２）ならびにＧＦＰ−ＧＥＮＥＷＡＲＥ対照感染植物の試料を収集し、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ中、小さい乳鉢と乳棒でホモジナイズした。抽出物を清澄化し、スーパーコイルＤＮＡニッキング活性についてアッセイした。各スーパーコイルＤＮＡニッキングアッセイは、１０μｌの総体積で、１×ＮＥＢリガーゼ緩衝液中にｐＵＣ１９誘導体のスーパーコイルプラスミド調製物０．５μｇを含有する反応液で行った。反応液に加えた植物抽出物の量は、０．１μｌ、０．０１μｌ、または０．００１μｌであり、４２℃で３０分間インキュベートした後、臭化エチジウムの存在下で１％ＴＢＥ−アガロースゲルに流した。ＧＦＰ−ＧＥＮＥＷＡＲＥ対照感染植物抽出物にはニッキング活性はほとんどまたは全く検出されなかったが、ＣＥＬ  Ｉ−ＧＥＮＥＷＡＲＥコンストラクトに感染した植物から得た抽出物は、プラスミドＤＮＡ基質に対してかなりの量の活性を示した。
【０２１０】
ｐＲＴ１３０−ＣＥＬ  Ｉ  Ａｖｒ−Ｂ３およびｐＲＴ１３０−ＣＥＬ  Ｉ  ６Ｈｉｓ−Ａ９を接種した植物の抽出物に対して、さらなる活性アッセイを行った。これらのアッセイでは、感染した葉から細胞内液を洗い出し、残った洗浄済みの葉組織から得られる物質とは別々にアッセイした。アッセイは、インキュベーションを３７℃で１時間行った点を除いて、上述の通りに行った。試料を、臭化エチジウムの存在下で１％ＴＢＥ−アガロースゲルに流し、写真撮影した。
【０２１１】
（感染Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物からの６Ｈｉｓ標識ＣＥＬ  Ｉの精製）
Ｎ．ｂｅｎｔｔｈａｍｉａｎａ植物に、播種後２０〜２１日の時点で、ｐＲＴ１３０−ＣＥＬ  Ｉ  ６Ｈｉｓ−Ａ９から得られるＲＮＡ転写物を接種した。接種の１０日後に、９６個の感染植物体から組織を収集し、細胞内液洗浄にかけた。簡単に述べると、感染した葉および茎材料に、冷たい浸潤緩衝液（７ｍＭβ−ＭＥの存在下、５０ｍＭリン酸塩、ｐＨ４）を使って３０秒間の減圧浸潤処理を２回行った。浸潤処理した組織を拭って過剰の緩衝液を吸着させ、バスケットローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使って２５００×ｇで２０分間の遠心分離を行うことにより、分泌タンパク質を回収した。組換えＣＥＬ＿Ｉを含有する抽出された細胞内液（ＩＦ）に最終濃度が１ｍＭになるようにＰＭＳＦを加え、撹拌しながら２５℃で１５分間撹拌した。抽出物にイミダゾール（ｐＨ６．０）とＮａＣｌを最終濃度がそれぞれ５ｍＭと０．５Ｍになるように加えた後、ＩＦをｐＨ５．２に調節し、１．２μＳａｒｔｏｒｉｕｓ  ＧＦメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ）を通して濾過することにより、ルビスコおよび緑色色素の大半を取り除いた。清澄化後直ちに、濃ＮａＯＨ溶液を使ってｐＨを７．０に調節し、氷上で２０分間インキュベートして、非タンパク質物質を沈殿させた。０．８μまたは０．６５／０．４５μＳａｒｔｏｒｉｕｓ  ＧＦ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使って、ＩＦをさらに清澄化した。清澄化したＩＦから、５ｍＭイミダゾールを含有する結合緩衝液（５０ｍＭリン酸、０．５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で平衡化したＮｉ２＋  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ニュージャージー州）を用いる金属キレートアフィニティクロマトグラフィーにより、３００ｃｍ／時の線速度で、組換えＣＥＬ  Ｉを精製した。結合していないタンパク質を２０ｍＭイミダゾール／結合緩衝液で洗浄し、結合緩衝液中、２０→４００Ｍイミダゾールの直線的勾配で、Ｎｉ２＋  ＳｅｐｈａｒｏｓｅからＣＥＬ  Ｉを溶出させた。まだイミダゾールを含有している画分を、スーパーコイルＤＮＡニッキング活性について上述のようにアッセイしたが、取るに足りない活性しか持っていないことがわかった。次に、１０ｋＤ  ＭＷＣＯＦ透析チューブ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ＺｎＣｌ２の存在下で、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８ｌ．０）に対して、同じ画分を透析し、再びアッセイした。スーパーコイルＤＮＡニッキング活性は、この透析によって回復した。
【０２１２】
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）プレキャストＴｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールズバッド）を使用し、Ｌａｅｍｍｌｉの緩衝液系で、Ｘｃｅｌｌ  ＩＩ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールズバッド）を使って、ＩＦおよび精製ＣＥＬ−Ｉタンパク質を分析した。クーマシーブリリアントブルーおよび銀染色によって、タンパク質バンドを可視化した。Ｂｉｏ−Ｒａｄゲルイメージャーを使ってＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査し、解析した。
【０２１３】
（精製ＣＥＬ  Ｉの質量分析：）
マトリックス支援レーザー／脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって、精製ＣＥＬ  Ｉの平均分子量を決定した。ＣＥＬ  Ｉの一部を５０％アセトニトリル／水で１：１０希釈し、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＤＥ−Ｐｒｏ質量分析計を使って、シナピン酸マトリックスと混合（１：１  ｖ／ｖ）した。質量分析は、２５ｋＶの加速電圧を使って、ポジティブ−リニアイオンモードで行った。
【０２１４】
（精製ＣＥＬ  Ｉから単離されたペプチドの質量分析：）
ＣＥＬ  Ｉを、１４％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。単一の均質なバンドが見えた。このバンドを切り出し、完全に脱染した。タンパク質を、５０％アセトニトリル中、１０ｍＭ  ＤＤＴの存在下に、３７℃で３０分間還元し、還元されたスルフヒドリル基を、５０％アセトニトリル中、２８ｍＭヨードアセトアミドの存在下で、遮光下に２４℃で３０分間ブロックした。ゲル片を５０％アセトニトリルで洗浄し、部分脱水後に、切り出したＣＥＬ  Ｉバンドを高純度トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）の溶液中で浸解した。このタンパク質分解消化を３７℃で１６時間進行させた。得られたペプチドを、５０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でゲル片から溶出させ、ＳｐｅｅｄＶａｃで濃縮した。それらのペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した。混合トリプシン消化物を、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸のマトリックス中で結晶化させ、遅延引き出し機構を実装したＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＤＥ−ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を使用し、リフレクター−ポジティブイオンモードおよび加速電圧２０ｋＶで稼働させて分析した。予想される理論質量は、ＭＳ−ｄｉｇｅｓｔ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ）またはＧＰＭＡＷプログラム（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ  Ｄａｔａ、デンマーク・オーゼンセ）によって計算した。タンデム質量分析（ナノエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法）用に、ペプチド試料を５％アセトニトリル／０．１％ギ酸で希釈し、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳにかけて、四重極直交型飛行時間質量分析装置（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｉｎｃ．，英国マンチェスター）で解析した。データをＭｓｌｙｎｘで処理し、Ｓｏｎａｒでデータベースを検索した。
【０２１５】
ウイルスが発現させる組換えＣＥＬ  Ｉは、ＩＦに分泌された。
【０２１６】
清澄化したＩＦ抽出材料を使って、Ｈｉｓ−タグＣＥＬ  Ｉ活性を精製した。ＣＥＬ  Ｉは、一段階Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィー分離によって精製された。クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析で確認したところ、高度に精製された均質な単一タンパク質バンドが精製された。成熟タンパク質のサイズおよび糖鎖付加率は、セロリから単離されたＣＥＬ  Ｉタンパク質（Ｙａｎｇら、２０００）について報告されているものと一致する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によると、精製ＣＥＬ  Ｉは４０ｋＤの平均分子量を持ち、質量ベースで２３．５％の糖鎖付加を示す。ＣＥＬ  Ｉは、アミノ酸位置５８、１１６、１３４および２０８に、４つの潜在的糖鎖付加部位を持っている。モノアイソトピック質量２１５２．６０８６（理論値２１５２．００６８）。
【０２１７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで回収されたペプチド１０７−１２５（Ｋ）ＤＭＣＶＡＧＡＩＱＮＦＴＳＱＬＧＨＦＲ（Ｈ）（配列番号３５）の質量に相当するＤａは、アスパラギン１１６は糖鎖付加されていないことを示す。これらのゲル分析と質量分析データは、全体として、ＣＥＬ  Ｉタンパク質のかなりの部分が回収可能だったことと、このタンパク質がＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物中で正しくプロセシングされたことを示している。以降の実験のために、ｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬ  Ｉ  ６Ｈｉｓ−Ａ９を使って、６−Ｈｉｓタグ付きＣＥＬ  Ｉ遺伝子を製造した。このクローンを転写し、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物に接種し、それを感染の８日後に収集した。この植物材料を２体積の抽出緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＰｉ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、７ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２ｍＭ  ＰＭＳＦ）と混合し、減圧浸潤処理した。緩衝液浸潤後に、組織をジューサーで浸解し、得られた緑色の液汁を４％ｗ／ｖポリエチレングリコールに調節して、４℃で１時間静置した。その緑色液汁を、２０分間の低速（３５００×ｇ）での遠心分離によって清澄化するか、パーライト（２％ｗ／ｖ）と混合し、１．２μｍフィルターを通して濾過した。清澄化した緑色液汁から、金属アフィニティークロマトグラフィーによって、タグ付きＣＥＬ  Ｉを精製した。緑色液汁をニッケル−ＮＴＡ樹脂と混合して、ＣＥＬ  Ｉのバッチ結合を行うか、緑色液汁をニッケル−ＮＴＡ樹脂床に流すカラム形式で精製を行った。結合のために、清澄化した緑色液汁を１０％ｗ／ｖグリセロールおよび１０ｍＭイミダゾールに調節した。結合後に、洗浄緩衝液（３３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ８．０、１０ｍＭイミダゾール）で樹脂を十分に洗浄し、結合しているＣＥＬ  Ｉ酵素をニッケル−ＮＴＡから２樹脂床体積の４００ｍＭイミダゾール含有１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶出させた。次に、そのＣＥＬ  Ｉ調製物を１×ＰＢＳに対して透析することでイミダゾールを除去し、活性をアッセイし、グリセロールを加えて、またはグリセロールを加えずに、使用時まで、４℃または−２０℃で保存した。
【０２１８】
（実施例１３）
（Ｒｅｓ  Ｉエンドヌクレアーゼのクローニング、発現および使用）
この実施例では、Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ  ｌｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌａからの、ｃＤＮＡライブラリーの構築、そのライブラリーからの、エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列の同定、およびここで「ＲＥＳ  Ｉ」と呼ぶその新しいエンドヌクレアーゼの発現を教示する。
【０２１９】
フッカツソウＳｅｌａｇｉｎｅｌｌａ  ｌｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌａの組織からＴｒｉｚｏｌ法を使ってＲＮＡを抽出し、標準的な方法でオリゴｄＴプライムドｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡをＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）系クローニングベクターにライゲートし、そのライゲーション産物を使ってコンピテント大腸菌細胞を形質転換した。ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ｃＤＮＡクローンを含有する細菌コロニーを無作為に拾い、液体培養物として生育させた後、ＤＮＡ調製およびクローン化したｃＤＮＡ配列の決定を行った。クローン化したＳｅｌａｇｉｎｅｌｌａ  ｃＤＮＡの配列ファイルをデータベースにロードし、そのデータベースを、ＣＥＬ  Ｉ遺伝子のＤＮＡ配列に対して類似性を持つ配列について、ＢＬＡＳＴ解析によって検索した。他の種から得られたｃＤＮＡの配列を含む他のＤＮＡ配列データベースでもＢＬＡＳＴ解析を行った。
【０２２０】
セロリＣＥＬ  Ｉ配列に対してあるレベルの相同性を示したＢＬＡＳＴヒットを、いくつかの種に由来するライブラリー中に同定し、対応するＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ｃＤＮＡクローンを、一セットのＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ｃＤＮＡクローンに再配置した。次に、このｃＤＮＡクローンのセットをインビトロで転写することによって感染性ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）転写物を作製し、次に、それをＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の葉に接種して、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ウイルスゲノム内にコードされているｃＤＮＡ配列の発現解析を行った。接種の７日後に、感染した植物から葉試料を採取し、２体積の水中でホモジナイズした。次に、抽出物をスーパーコイルＤＮＡニッキングおよび切断活性についてアッセイした。
【０２２１】
各スーパーコイルＤＮＡニッキングアッセイは、１×ＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中にｐＵＣ１９誘導体のスーパーコイルプラスミド調製物０．５μｇを含有する、総体積１０μｌの反応液で行った。反応液に加えた植物抽出物の量は１μｌ、０．３３μｌまたは０．０１１μｌであり、これを３７℃で３０分間インキュベートして、Ｇｅｌｓｔａｒ蛍光ＤＮＡ染色試薬の存在下で１％ＴＡＥ−アガロースゲルに流した。ニッキング活性は非感染植物抽出物にはほとんどまたは全く検出されなかったが、Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ  ｌｅｐｉｄｏｐｙｌｌａに由来する一遺伝子のｃＤＮＡを含有するＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）コンストラクトに感染させた植物から得た抽出物だけは、プラスミドＤＮＡ基質に対してかなりの量の活性を示した。
【０２２２】
これらのクローンの完全遺伝子配列を決定し、非コード５’および３’配列を持たないオープンリーディングフレームを増幅し、かつコードされているタンパク質のＣ末端に６ヒスチジンテールを付加するためのＰＣＲプライマーを、設計した。次に、それらのプライマーを使って、活性完全長Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａクローンの１つからＯＲＦを増幅した。次に、植物体内で発現させるために、得られたＰＣＲ産物をＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ベクターｐＤＮ４のＰａｃＩ部位とＡｖｒＩＩ部位の間にクローニグした。得られたクローンｐＬＳＢ２２２５（これはＲＥＳ  Ｉ  ＯＲＦ（配列番号１６）を含有し、ＲＥＳ  Ｉタンパク質（配列番号３４）をコードする）を配列決定することにより、この遺伝子が正しく挿入されていることを確認した後、それをインビトロで転写し、その感染性転写物をＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物に接種した。接種の７日後に、感染植物抽出物を上述のように調製し、スーパーコイルＤＮＡニッキングおよび消化活性についてアッセイすることにより、クローン化された酵素の活性を確認した。
【０２２３】
各スーパーコイルＤＮＡニッキングアッセイは、５０ｍＭ  ＫＣｌの存在下、１×ＮＥＢ大腸菌ＤＮＡリガーゼ緩衝液中にｐＵＣ１９誘導体のスーパーコイルプラスミド調製物０．５μｇを含有する総体積１０μｌの反応液で行った。反応液に加えた植物抽出物の量は０．２μｌ、０．０４μｌ、０．００８μｌまたは０．００１６μｌであり、これを３７℃で３０分間インキュベートして、Ｇｅｌｓｔａｒ蛍光ＤＮＡ染色試薬の存在下で０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルに流した。ニッキング活性は非感染植物抽出物にはほとんどまたは全く検出されなかったが、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）−ＳｅｌａｇｉｎｅｌｌａコンストラクトｐＬＳＢ２２２５に感染させた植物から得た抽出物は、プラスミドＤＮＡ基質に対してかなりの量の活性を示した。
【０２２４】
このアッセイで陽性結果を得た後、ｐＬＳＢ２２２５感染植物の抽出物をＧＲＡＭＭＲ反応に使用して、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）によって製造されたＣＥＬ  Ｉ酵素の代わりにミスマッチ解消反応の一成分として機能するこの酵素の能力を試験した。
【０２２５】
（実施例１４）
（ＧＲＡＭＭＲ反応におけるＲＥＳ  Ｉの使用）
この実施例では、セロリから精製された天然ＣＥＬ  Ｉ酵素の代わりにＲＥＳ  Ｉを、ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝子再集合に使用することができ、そのようにしても、結果には顕著な変化が何も生じないことを教示する。
【０２２６】
ｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列番号３１）によってコードされるｐＢＳ誘導体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州ラホーヤ）中の野生型Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＧＦＰ遺伝子（Ｐｒａｓｈｅｒら、Ｇｅｎｅ  １１１（９２）２２９）と、大腸菌における蛍光強度を増大させると共に放射波長を青色光放射に変化させる突然変異を持つ改変体（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４（９６）３１５；Ｈｅｉｍら、ＰＮＡＳ  ９１（９４）１２５０１；Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（９８）８２１２）との間で、ＧＲＡＭＭＲを行った。図５（配列番号３２）に示すプラスミドｐＢＳＣ３ＢＦＰによってコードされるこの改変体遺伝子は、長波長ＵＶ光によって励起されると明るい青色光を放射する蛍光タンパク質をコードしている。
【０２２７】
ＧＲＡＭＭＲ反応は、環状二本鎖プラスミドＤＮＡを背景とするＧＦＰ／ｃ３ＢＦＰヘテロ二重鎖で行った。この環状全プラスミドヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質は、まず、ｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列番号３１）およびｐＢＳＣ３ＢＦＰ（図５、配列番号３２）を、それぞれＫｐｎ  ＩおよびＮｇｏＭ  ＩＶによる消化で線状化し、次に、消化したＤＮＡをＤＮＡスピンカラムで精製することによって調製した。次に、それら２つの線状化プラスミドを２００ｎｇずつ混合し、体積２０μｌで１×ＳＳＰＥ（１８０ｎＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）にした。次に、その混合物を、９５℃で４分間インキュベートし、氷水に浸けてその状態を１０分間保ってから、３７℃でインキュベートした。３０分後に、アニールしたＤＮＡ試料を氷に戻し、ＧＲＡＭＭＲ反応で使用するまでそのままにしておいた。
【０２２８】
ＧＲＡＭＭＲによる配列シャフリングを促進する能力について、ＣＥＬ  ＩをＲＥＳＩと比較するために、独立した２系列のシャフリング反応を行った。各ＧＲＡＭＭＲ反応液は、ＫＣｌを５０ｍＭになるように補足した１×ＮＥＢ大腸菌リガーゼ緩衝液中に、１単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、２単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、および５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰを含んだ。次に、２つの酵素の連続希釈を個別に行った。上記のカクテルを分注した２系列のチューブのそれぞれに、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）によって発現させたＣＥＬ  ＩまたはＲＥＳ  Ｉ抽出物を１μｌずつ、１／３、１／９、１／２７、１／８１または１／２４３の希釈率で加えた。エンドヌクレアーゼを含まない対照反応液も調製した。各反応液に、アニールしたＤＮＡヘテロ二重鎖基質２０ｎｇを含有する１μｌの液を加え、その反応液を室温で１時間、氷上で３０分間インキュベートした後、コンピテント大腸菌の形質転換に使用した。
【０２２９】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）は、得られたコロニー中に、長波長ＵＶ照射によって可視化することができた。親野生型ＧＦＰは暗い緑色蛍光を持ち、親ｃ３ＢＦＰは明るい青色蛍光を放つ。これらの蛍光タンパク質をコードしている遺伝子では、放射色を決定する配列と、蛍光強度を支配する配列とが、互いに異なる位置にある。ＤＮＡシャフリングは放射色を決定する配列と蛍光強度を支配する配列との「切り離し」をもたらすだろうと予想される。結果として、得られる子孫は、放射色および強度という機能的特性の再集合を示すと予想されるだろう。したがって、対応する平板上の細菌コロニーから生じる蛍光の色および強度を調べることによって、各反応で起こったＤＮＡシャフリングの程度の尺度を採点することができた。ヌクレアーゼ非含有対照では、暗い緑色コロニーと明るい青色コロニーしか観察されなかった。しかし、ＣＥＬ  ＩかＲＥＳ  Ｉのどちらか一方を含有する反応液から得られるＤＮＡで形質転換した細胞を含む平板では、幾分明るい緑色コロニーと、幾分暗い青色コロニーが観察され、ＤＮＡ配列のシャフリングが起こったことを示した。ＤＮＡ配列解析により、これが実際にその通りであることと、シャッフルされたクローンの回収率はＣＥＬ  ＩでもＲＥＳ  Ｉでも平均で８５％を超えることと、情報伝達事象の数および分布はどちらの酵素でもよく似ていることが確認された。ただし、高濃度のＲＥＳ  Ｉ調製物で処理した反応液が低い形質転換効率を持つことからわかるように、この実験におけるＲＥＳ  Ｉの活性は、ＣＥＬ  Ｉの活性よりも数倍高いようだった。
【０２３０】
（実施例１５）
（ＤＮＡミスマッチ解消によるプラスミド−オン−プラスミド遺伝子再集合（ＰＯＰ  ＧＲＡＭＭＲ）を使ったウイルスベクター中の著しく分岐したトバモウイルス３０Ｋ遺伝子の分子育種）
実施例１０は、数種類の分岐したトバモウイルス株（約７５％同一；ｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＭＰ−Ａｖｒ−Ｐａｃベクターにクローニングされているもの）に由来する移動タンパク質（ＭＰ）の、ＧＲＡＭＭＲを使った再集合を教示している。この実施例では、さらに著しく分岐した種を再集合させるためのプラスミド−オン−プラスミドＧＲＡＭＭＲ（ＰＯＰ  ＧＲＡＭＭＲ）の使用を教示する。
【０２３１】
トバモウイルスＴＭＶ−Ｃｇ（図６、配列番号１８）、ＴＭＶ−Ｏｂ（図７、配列番号１９）、ＴＭＶ−Ｕ２（図８、配列番号２０）、ＴＭＶ−Ｕ１（配列番号９）、およびトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）（配列番号１０）に由来する出発親ＭＰ遺伝子を使用した。ｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴｏＭＶ  ＭＰのプラスミドはＳｍａ  Ｉによる消化で線状化した。ＴＭＶ−Ｃｇ、ＴＭＶ−Ｏｂ、ＴＭＶ−Ｕ２、またはＴＭＶ−Ｕ１に由来するＭＰ遺伝子を含有するｐＧＥＮＥＷＡＲＥのプラスミドはＳｔｕ  Ｉで消化した。消化されたｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＭＰコンストラクトはＤＮＡスピンカラムを使って精製した。以下のヘテロ二重鎖対を作製した：ｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−Ｃｇ  ＭＰとｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴｏＭＶ  ＭＰ、ｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴＭＶ−Ｏｂ  ＭＰとｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴｏＭＶ  ＭＰ、ｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴＭＶ−Ｕ２  ＭＰとｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴｏＭＶ  ＭＰ、ｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴＭＶ−Ｕ１  ＭＰとｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴｏＭＶ  ＭＰ。これらのＭＰ遺伝子配列のヘテロ二重鎖は、それぞれ約４７％、５８％、６２％および７５％同一である。ヘテロ二重鎖ＤＮＡは、１×ＳＳＰＥ（１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中、２０μｌの体積で、２つの線状化プラスミドをそれぞれ２００ｎｇずつ混合することによって作製した。その混合物を９５℃で４分間インキュベートし、氷水に浸けてその状態を１０分間保ってから、３７℃でインキュベートした。３０分後に、アニールしたＤＮＡ試料を氷に戻し、ＧＲＡＭＭＲ反応で使用するまでそのままにしておいた。
【０２３２】
各１０μｌのＧＲＡＭＭＲ反応液は、ＫＣｌを５０ｍＭになるように補足した１×ＮＥＢ大腸菌リガーゼ緩衝液中に、１単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、２単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、および０．５ｍＭの各ｄＮＴＰを含んだ。次に、ＣＥＬ  Ｉ（１／３、１／９、１／２７、１／８１、１／２４３、または１／７２９希釈したもの）を１μｌずつ加えた。エンドヌクレアーゼを含まない対照反応液も調製した。各反応液に、アニールしたＤＮＡヘテロ二重鎖基質２０ｎｇを含有する１μｌの液を加え、その反応液を室温で１時間、氷上で３０分間インキュベートした後、コンピテント大腸菌の形質転換に使用した。
【０２３３】
ＤＮＡ解析を両方向から行ったところ、その配列データは、ＧＲＡＭＭＲ処理材料に由来するかなりの数のクローンが、両方の親移動タンパク質遺伝子配列に由来する情報を含有する再集合配列であることを示した。ＧＲＡＭＭＲ反応によって得た典型的アウトプットｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＭＰクローンの配列を以下にいくつか示す：ＴＭＶ−Ｃｇ／ＴｏＭＶクローン、図９、配列番号２１、および図１０、配列番号２２；ＴＭＶ−Ｏｂ／ＴｏＭＶクローン、図１１、配列番号２２、および図１２、配列番号２４；ＴＭＶ−Ｕ２／ＴｏＭＶクローン、図１３、配列番号２５、および図１４、配列番号２６；ならびにＴＭＶ−Ｕ１／ＴｏＭＶクローン、図１５、配列番号２７、および図１６、配列番号２８。
【０２３４】
（実施例１６）
（選択可能マーカー内を切断するエンドヌクレアーゼを用いる線状化ＤＮＡ基質でのＧＲＡＭＭＲ）
この実施例では、選択可能マーカー遺伝子内を切断する制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡ基質分子を直線化するＧＲＡＭＭＲ反応を教示する。
【０２３５】
ｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列番号３１）によってコードされるｐＢＳ誘導体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州ラホーヤ）中の野生型Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＧＦＰ遺伝子（Ｐｒａｓｈｅｒら、Ｇｅｎｅ  １１１（９２）２２９）と、大腸菌における蛍光強度を増大させると共に放射波長を青色光放射に変化させる突然変異を持つ改変体（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４（９６）３１５；Ｈｅｉｍら、ＰＮＡＳ  ９１（９４）１２５０１；Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（９８）８２１２）との間で、ＧＲＡＭＭＲを行う。プラスミドｐＢＳＣ３ＢＦＰ（入れる番号３２）がコードするこの改変体遺伝子は、長波長ＵＶ光によって励起されると明るい青色光を放射する蛍光タンパク質をコードしている。
【０２３６】
ＧＲＡＭＭＲ反応は、環状二本鎖プラスミドＤＮＡを背景とするＧＦＰ／ｃ３ＢＦＰヘテロ二重鎖で行う。この環状全プラスミドヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質は、まず、ｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列番号３１）およびｐＢＳＣ３ＢＦＰ（配列番号３２）を、それぞれＡｈｄＩおよびＢｃｇＩによる消化で線状化し、次に、消化したＤＮＡをＤＮＡスピンカラムで精製することによって調製する。次に、それら２つの線状化プラスミドを２００ｎｇずつ混合し、体積２０μｌで１×ＳＳＰＥ（１８０ｎＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）にする。次に、その混合物を、９５℃で４分間インキュベートし、氷水に浸けてその状態を１０分間保ってから、３７℃でインキュベートする。３０分後に、アニールしたＤＮＡ試料を氷に戻し、ＧＲＡＭＭＲ反応で使用するまでそのままにしておく。
【０２３７】
ＧＲＡＭＭＲによる配列再集合を促進する能力について、ＣＥＬ  ＩをＲＥＳＩと比較するために、独立した２系列の再集合反応を行う。各反応を、まず、ＫＣｌを５０ｍＭになるように補足した１×ＮＥＢ大腸菌リガーゼ緩衝液中、５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰの存在下で、１単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼにより、室温で１０分間処理する。次に、２単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼを加える。次に、２つの酵素の連続希釈を個別に行う。上記のカクテルを分注した２系列のチューブのそれぞれに、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）によって発現させたＣＥＬ  ＩまたはＲＥＳ  Ｉ抽出物を１μｌずつ、１／３、１／９、１／２７、１／８１または１／２４３の希釈率で加える。エンドヌクレアーゼを含まない対照反応液も調製する。各反応液に、アニールしたＤＮＡヘテロ二重鎖基質２０ｎｇを含有する１μｌの液を加え、その反応液を室温で１時間、氷上で３０分間インキュベートしてから、コンピテント大腸菌の形質転換に使用する。
【０２３８】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）は、得られたコロニー中に、長波長ＵＶ照射によって可視化される。親野生型ＧＦＰは暗い緑色蛍光を放ち、親ｃ３ＢＦＰは明るい青色蛍光を放つ。これらの蛍光タンパク質をコードしている遺伝子では、放射色を決定する配列と、蛍光強度を支配する配列とが、互いに異なる位置にある。
【０２３９】
ＤＮＡ再集合は放射色を決定する配列と蛍光強度を支配する配列との「切り離し」をもたらすだろうと予想される。結果として、得られる子孫は、放射色および強度という機能的特性の再集合を示すと予想されるだろう。したがって、対応する平板上の細菌コロニーから生じる蛍光の色および強度を調べることによって、各反応で起こったＤＮＡシャフリングの程度の尺度を採点することができる。
【０２４０】
（実施例１７）
（選択可能マーカー内を切断するエンドヌクレアーゼを用いる線状化ＤＮＡ基質でのＧＲＡＭＭＲ）
この実施例では、選択可能マーカー遺伝子内で切断する制限エンドヌクレアーゼを使ってＤＮＡ基質を線状化するＧＡＲＡＭＭＲ法を教示する。
【０２４１】
ｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列番号３）によってコードされるｐＢＳ誘導体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州ラホーヤ）中の野生型Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＧＦＰ遺伝子（Ｐｒａｓｈｅｒら、Ｇｅｎｅ  １１１（９２）２２９）と、大腸菌における蛍光強度を増大させると共に放射波長を青色光放射に変化させる突然変異を持つ改変体（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４（９６）３１５；Ｈｅｉｍら、ＰＮＡＳ  ９１（９４）１２５０１；Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（９８）８２１２）との間で、ＧＲＡＭＭＲ再集合を行う。プラスミドｐＢＳＣ３ＢＦＰ（配列番号１７）がコードするこの改変体遺伝子は、長波長ＵＶ光によって励起されると明るい青色光を放射する蛍光タンパク質をコードしている。
【０２４２】
ＧＲＡＭＭＲ反応は、環状二本鎖プラスミドＤＮＡを背景とするＧＦＰ／ｃ３ＢＦＰヘテロ二重鎖で行う。この環状全プラスミドヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質は、まず、ｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列番号３）およびｐＢＳＣ３ＢＦＰ（配列番号１７）を、それぞれＡｈｄＩおよびＢｃｇＩによる消化で線状化し、次に、消化したＤＮＡをＤＮＡスピンカラムで精製することによって調製する。次に、それら２つの線状化プラスミドを２００ｎｇずつ混合し、体積２０μｌで１×ＳＳＰＥ（１８０ｎＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）にする。次に、その混合物を、９５℃で４分間インキュベートし、氷水に浸けてその状態を１０分間保ってから、３７℃でインキュベートする。３０分後に、アニールしたＤＮＡ試料を氷に戻し、ＧＲＡＭＭＲ反応で使用するまでそのままにしておく。
【０２４３】
ＧＲＡＭＭＲによる配列再集合を促進する能力について、ＣＥＬ  ＩをＲＥＳＩと比較するために、独立した２系列の再集合反応を行う。各反応液を、まず、ＫＣｌを５０ｍＭになるように補足した１×ＮＥＢ大腸菌リガーゼ緩衝液中、５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰの存在下で、１単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼにより、室温で１０分間処理する。次に、２単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼを加える。次に、２つの酵素の連続希釈を個別に行う。上記のカクテルを分注した２系列のチューブのそれぞれに、ＧＥＮＥＷＡＲＥによって発現させたＣＥＬ  ＩまたはＲＥＳ  Ｉ抽出物を１μｌずつ、１／３、１／９、１／２７、１／８１または１／２４３の希釈率で加える。エンドヌクレアーゼを含まない対照反応液も調製する。各反応液に、アニールしたＤＮＡヘテロ二重鎖基質２０ｎｇを含有する１μｌの液を加え、その反応液を室温で１時間、氷上で３０分間インキュベートしてから、コンピテント大腸菌の形質転換に使用する。
【０２４４】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）は、得られたコロニー中に、長波長ＵＶ照射によって可視化される。親野生型ＧＦＰは暗い緑色蛍光を放ち、親ｃ３ＢＦＰは明るい青色蛍光を放つ。これらの蛍光タンパク質をコードしている遺伝子では、放射色を決定する配列と、蛍光強度を支配する配列とが、互いに異なる位置にある。
【０２４５】
ＤＮＡ再集合は放射色を決定する配列と蛍光強度を支配する配列との「切り離し」をもたらすだろうと予想される。結果として、得られる子孫は、放射色および強度という機能的特性の再集合を示すと予想されるだろう。したがって、対応する平板上の細菌コロニーから生じる蛍光の色および強度を調べることによって、各反応で起こったＤＮＡシャフリングの程度の尺度を採点することができる。
【０２４６】
（実施例１８）
（ＧＲＡＭＭＲ反応における他のヌクレアーゼの使用）
この実施例では、ミスマッチエンドヌクレアーゼ以外のヌクレアーゼを、ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝子再集合に使用できることを教示する。
【０２４７】
ｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列番号３）によってコードされるｐＢＳ誘導体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州ラホーヤ）中の野生型Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＧＦＰ遺伝子（Ｐｒａｓｈｅｒら、Ｇｅｎｅ  １１１（９２）２２９）と、大腸菌における蛍光強度を増大させると共に放射波長を青色光放射に変化させる突然変異を持つ改変体（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４（９６）３１５；Ｈｅｉｍら、ＰＮＡＳ  ９１（９４）１２５０１；Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（９８）８２１２）との間で、ＧＲＡＭＭＲシャフリングを行った。図５（配列番号１７）に示すプラスミドｐＢＳＣ３ＢＦＰによってコードされるこの改変体遺伝子は、長波長ＵＶ光によって励起されると明るい青色光を放射する蛍光タンパク質をコードしている。
【０２４８】
ＧＲＡＭＭＲ反応は、環状二本鎖プラスミドＤＮＡを背景とするＧＦＰ／ｃ３ＢＦＰヘテロ二重鎖で行った。この環状全プラスミドヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質は、まず、ｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列番号３）およびｐＢＳＣ３ＢＦＰ（図５、配列番号１７）を、それぞれＫｐｎ  ＩおよびＮｇｏＭ  ＩＶによる消化で線状化し、次に、消化したＤＮＡをＤＮＡスピンカラムで精製することによって調製した。次に、それら２つの線状化プラスミドを２００ｎｇずつ混合し、体積２０μｌで１×ＳＳＰＥ（１８０ｎＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）にした。次に、その混合物を、９５℃で４分間インキュベートし、氷水に浸けてその状態を１０分間保ってから、３７℃でインキュベートした。３０分後に、アニールしたＤＮＡ試料を氷に戻し、ＧＲＡＭＭＲ反応で使用するまでそのままにしておいた。
【０２４９】
非ミスマッチ特異的ヌクレアーゼがＧＲＡＭＭＲによる配列シャフリングを促進できるかどうかを決定するために、独立した数系列のシャフリング反応を行った。各ＧＲＡＭＭＲ反応液は、ＫＣｌを５０ｍＭになるように補足した１×ＮＥＢ大腸菌リガーゼ緩衝液中に、１単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、２単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、および５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰを含んだ。次に、２つの酵素の連続希釈を個別に行った。上記のカクテルを分注した６系列のチューブのそれぞれに、Ｂａｌ３１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＤＮアーゼＩ（Ａｍｂｉｏｎ）、マングビーンヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＲＱ１  ＤＮアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｓ１ヌクレアーゼ（ＢＲＬ）、またはファージＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含むさまざまなヌクレアーゼ（いずれも、大腸菌ＤＮＡリガーゼ緩衝液で希釈することにより、１μｌあたり１単位になるように調節したもの）を１μｌずつ、１／３、１／９、１／２７、１／８１または１／２４３の希釈率で加えた。ＴＭＶウイルスベクターによって発現されたＣＥＬ  Ｉを使って、もう１系列の酵素希釈液も調製した。エンドヌクレアーゼを含まない対照反応液も調製した。各反応液に、アニールしたＤＮＡヘテロ二重鎖基質２０ｎｇを含有する１μｌの液を加え、その反応液を室温で１時間、氷上で３０分間インキュベートした後、コンピテント大腸菌の形質転換に使用した。
【０２５０】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）は、得られたコロニー中に、長波長ＵＶ照射によって可視化することができた。親野生型ＧＦＰは暗い緑色蛍光を持ち、親ｃ３ＢＦＰは明るい青色蛍光を放つ。これらの蛍光タンパク質をコードしている遺伝子では、放射色を決定する配列と、蛍光強度を支配する配列とが、互いに異なる位置にある。ＤＮＡシャフリングは放射色を決定する配列と蛍光強度を支配する配列との「切り離し」をもたらすだろうと予想される。結果として、得られる子孫は、放射色および強度という機能的特性の再集合を示すと予想されるだろう。したがって、対応する平板上の細菌コロニーから生じる蛍光の色および強度を調べることによって、各反応で起こったＤＮＡシャフリングの程度の尺度を採点することができた。
【０２５１】
ヌクレアーゼ非含有対照では、暗い緑色コロニーと明るい青色コロニーしか観察されなかった。ヌクレアーゼＢａｌ３１、マングビーンヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、およびＴ７エンドヌクレアーゼＩを含有する反応液でも、同じ観察結果だった。しかし、ＣＥＬ  Ｉ、ＤＮアーゼＩ、またはＲＱ１  ＤＮアーゼを含有する反応液から得られるＤＮＡで形質転換した細胞を含む平板では、幾分明るい緑色コロニーと、幾分暗い青色コロニーが観察され、ＤＮＡ配列のシャフリングが起こったことを示した。ＣＥＬ  Ｉ処理に対応する平板では、ＲＱ１  ＤＮアーゼ処理に相当する平板よりも明るい緑色コロニーが得られ、ＲＱ１  ＤＮアーゼ処理に相当する平板では、ＤＮアーゼＩ処理で観察されるものよりも、数が多かった。しかし、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩを使って得られた陰性の結果は、その後、無視することにした。なぜなら、使用した酵素調製物は、検出可能なヌクレアーゼ活性を持たないことが、他の実験でわかったからである。
【０２５２】
（実施例１９）
（ＲＱ１  ＤＮアーゼ、およびＤＮアーゼＩ活性の比較）
上記の結果の一部を再確認するために、もう一組の実験を行った。反応液は上述のように調製し、ＲＱ１  ＤＮアーゼ、ＤＮアーゼＩ（１μｌあたり１単位に希釈したもの）およびＣＥＬ  Ｉを１／３、１／９、１／２７、１／８１、１／２４３、１／７２９、または１／２１８７に希釈し、それぞれ１μｌを反応カクテルに加えてから、ヘテロ二重鎖ＤＮＡを加えた。エンドヌクレアーゼを含有しない対照反応液も調製した。
【０２５３】
結果は先の実施例で得たものと同様だった。各酵素系列について全部で約５００個のコロニーを得た。ＣＥＬ  Ｉ系列では合計２０個の明るい緑色コロニーが観察されたのに対して、ＲＱ１  ＤＮアーゼ処理に対応する平板には６個の明るい緑色コロニーが見つかった。ＤＮアーゼＩ平板またはヌクレアーゼ非含有対照平板には、明るい緑色コロニーは観察されなかった。
【０２５４】
（実施例２０）
（ＤＮアーゼＩおよびｐｏｌ  Ｉを用いる代替ＤＮＡシャフリング法）
この実験では、ヘテロ二重鎖ＤＮＡを非特異的エンドヌクレアーゼ（ＤＮアーゼＩ）で処理するという、ＭｏｏｒｅらのＷＯ０２／２４９５３に記載されている実験を再現する。次に、ヘテロ二重鎖ＤＮＡを、ヘテロ二重鎖ＤＮＡ上でニックトランスレーションを行うニックトランスレーティングＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ  Ｉ）と接触させることにより、ＤＮＡシャフリングの一形態を引き起こす。
【０２５５】
この実験ではＧＦＰ遺伝子とｃ３ＢＦＰ遺伝子を使用した。環状二本鎖プラスミドＤＮＡを背景とするＧＦＰ／ｃ３ＢＦＰ遺伝子間のヘテロ二重鎖を作製した。この環状全プラスミドヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質は、まず、ｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列番号３１）およびｐＢＳＣ３ＢＦＰ（図５、配列番号３２）を、それぞれＫｐｎ  ＩおよびＮｇｏＭ  ＩＶによる消化で線状化し、次に、消化したＤＮＡをＤＮＡスピンカラムで精製することによって調製した。次に、それら２つの線状化プラスミドを、液量１０μｌ中で、１２５ｎｇずつ混合し、９５℃で４分間インキュベートし、氷水に１０分間浸けた。次に、１．１μｌの１０×ＳＳＰＥ（１８００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を加えてから、３７℃でインキュベートした。３０分後に、アニールしたＤＮＡを氷に戻した。その試料を、２％低融点アガロースゲルに流し、ニックが入った環状ヘテロ二重鎖バンドをゲル単離し、ＤＮＡスピンカラムを使って精製した。
【０２５６】
以下の試薬を氷上で混合した：水５．４μｌ；１０×ＮＴ緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５；０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２；１０ｍＭジチオスレイトール［ＤＴＴ］；０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）１．０μｌ；Ｐｏｌ  Ｉ（４単位）０．４μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  １．８μｌ、ＤＮアーゼＩ（０．１８単位、５０％グリセロール、１×ＮＴ緩衝液中の１０単位／μｌ原液から希釈したもの）０．４μｌ、およびヘテロ二重鎖ＤＮＡ（２０ｎｇ）１μｌ。ＤＮアーゼＩとＰｏｌ  Ｉの一方または両方を欠く対照反応も設定した。反応は全て１４℃で１５分間行い、０．５μｌの５００ｍＭ  ＥＤＴＡで停止させた。１μｌの反応液を使ってコンピテント大腸菌を形質転換した。
【０２５７】
ＤＮＡ配列解析を両方向から行った。その結果、ＤＮアーゼＩとＰｏｌ  Ｉを両方とも含有する反応液では、解析したクローンの４４％が２つの親遺伝子のキメラであることがわかった。各クローンは交叉部位を１箇所だけ含んでいた。また、これらのキメラは全て、交叉部位の上流にあるｃ３ＢＦＰ配列と、交叉部位の下流にある野生型ＧＦＰ配列とから構成されていた。これらの著しい極性効果と、もっぱら一点交叉であるキメラとは、純粋にニックトランスレーションに基づくＤＮＡシャフリングの機構から予測されるものと合致している。ＤＮアーゼＩを欠く対照反応では、解析したクローンの３４％が２つの親遺伝子のキメラであり、ＤＮアーゼＩ＋Ｐｏｌ  Ｉ反応で観察されたものと同じ極性効果を示した。Ｐｏｌ  Ｉを欠く対照反応では、解析したクローンの１７％が２つの親遺伝子のキメラだった。ＤＮアーゼＩとＰｏｌ  Ｉを両方とも欠く対照反応では、解析したクローンの１０％が２つの親遺伝子のキメラだった。
【０２５８】
（実施例２１）
（ＤＮＡミスマッチ解消反応による遺伝子再集合の粒状性を調節するための、さまざまな比率のＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼの使用）
この実験では、ＧＲＡＭＭＲ反応の一定成分の濃度を操作することにより、情報伝達部位の長さ（粒状性）を調節できることを教示する。
【０２５９】
伝達される配列情報のブロックが長いほど、粒状性は粗くなる。伝達される配列情報がのブロックが短いほど、粒状性は細かくなる。
【０２６０】
この実験ではＧＦＰ遺伝子とｃ３ＢＦＰ遺伝子を使用した。実施例１４で説明したように環状二本鎖プラスミドＤＮＡを背景とするＧＦＰ／ｃ３ＢＦＰ遺伝子間のヘテロ二重鎖を作製した。ＧＲＡＭＭＲにおけるＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼの相対濃度を変化させるマトリックス実験を行った。ＮＥＢ大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｐｏｌ  Ｉ；ＣＥＬ  Ｉによるニックが入ると、校正後に、その部位からニックトランスレーションを行うことができる）およびＮＥＢ  大腸菌ＤＮＡリガーゼを使用した。これら２つの酵素を原液濃度から１×大腸菌リガーゼ緩衝液で希釈した。使用したＰｏｌ  Ｉの濃度は、０．０１、０．１、１．０および５．０単位／μＬである。使用した大腸菌ＤＮＡリガーゼの濃度は、０．０、０．０２、０．２および２．０単位／μＬである。マトリックスは全部で１６の個別反応を含んだ。各反応液は、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、ＫＣｌを５０ｍＭになるように補足した１×ＮＥＢ大腸菌リガーゼ緩衝液、１μｌの希釈大腸菌ＤＮＡリガーゼ、１μｌの希釈Ｐｏｌ  Ｉ、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）によって発現させたＣＥＬ  Ｉ調節物１μｌ（タンパク質含量２７ｎｇ）およびアニールしたＤＮＡヘテロ二重鎖２０ｎｇを含んだ。反応液を室温で１時間インキュベートしてから、コンピテント大腸菌の形質転換に直接使用した。
【０２６１】
無作為に選択したいくつものクローンに対してＤＮＡ配列解析を両方向から行ったところ、粒状性の度合いと交叉頻度は、使用したＰｏｌ  ＩとＤＮＡリガーゼの相対濃度に依存して、子孫クローン間でさまざまであることが、配列データからわかった。例えば、ＤＮＡリガーゼを使用せず、１．０単位のＰｏｌ  Ｉを使用した反応では、子孫クローンが大きい粒状性を示し、親クローン間の交叉は１点だけだった。０．２単位のＤＮＡリガーゼと０．１単位のＰｏｌ  Ｉとを使用した反応では、粒状性は細かく、親クローン間に平均で約３点の交叉があった。２．０単位のＤＮＡリガーゼと０．１単位のＰｏｌ  Ｉとを使用した反応では、粒状性は相対的にはるかに細かく、親クローン間に平均で約７点の交叉があった。
【０２６２】
この実験から、リガーゼ：Ｐｏｌ  Ｉ比が高いほど粒状性は細かくなるという傾向が明らかになった。リガーゼの濃度がＰｏｌ  Ｉに対して低いと、Ｐｏｌ  Ｉ酵素は、リガーゼによってニックが閉じられるまでの間に、より長い距離にわたってニックトランスレーションを行うことができるのだろう。しかし、リガーゼの濃度が増えるにつれて、ニック閉鎖の可能性が増大し、それがニックトランスレーション事象を早めに終了させ、したがって情報伝達部位の平均長を短くする傾向を持つことになる。
【０２６３】
（実施例２２）
（ＧＦＰの、ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝子再集合を使ったプラスミド−オン−プラスミドゾーン突然変異誘発（ＰＯＰ  ｚｍＧＲＡＭＭＲ））
この実施例では、多重塩基対形成能を持つヌクレオチド類似体の存在下でＧＲＡＭＭＲを行うことにより、ミスマッチ残基またはそのすぐ近傍に、ランダムまたはセミランダム突然変異を組み込むことができるということを教示する。最終結果は、出発遺伝子間の不均質領域に集中した突然変異を持つ、シャッフルされた遺伝子の集団である。
【０２６４】
通常のＧＲＡＭＭＲ法とは異なり、ゾーン突然変異誘発ＧＲＡＭＭＲは、ヘテロ二重鎖中にヌクレオチド対ミスマッチを１つしか必要としない。ヘテロ二重鎖中の２つのポリ核酸間の相違を解消する代わりに、多様性を増加させている。ポリヌクレオチドの一方は完全長である必要はなく、１つの塩基がミスマッチしながらもハイブリダイズするのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであることができる。これは所望のポリヌクレオチド鎖に対して部分的に相補的である。このようにして、特定のゾーンまたはその近傍にミスマッチを持つ完全長親鎖がなくても、合成オリゴまたはポリヌクレオチドを使って、その特定ゾーンに突然変異誘発を誘導することができる。
【０２６５】
ヘテロ二重鎖を形成する各鎖上の突然変異誘発ゾーンは、ミスマッチした塩基対と、両鎖上の上流および下流１〜約５０ヌクレオチド以内の領域を含む。より好ましくは、突然変異誘発ゾーンは、ミスマッチした塩基対と、ミスマッチの両側の１〜約１０ヌクレオチドを含む。
【０２６６】
ヌクレオチド類似体は、直ちに、またはそのヌクレオチド類似体を組み込んだポリヌクレオチド鎖または相補鎖の複製後に、同じ鎖または相補鎖に塩基変化を誘発する任意のヌクレオチド類似体または複数のヌクレオチド類似体の組合せであることができる。ヌクレオチド類似体は、どちらかの鎖に１ヌクレオチド以上の挿入または欠失を誘発してもよい。多数のヌクレオチド類似体が、それ自体は知られている。
【０２６７】
実施例１４で説明したように、環状二本鎖プラスミドＤＮＡを背景とするＧＦＰ／ｃ３ＢＦＰ遺伝子間のヘテロ二重鎖を作製した。リガーゼとポリメラーゼの比および類似体ヌクレオチドとｄＮＴＰの比がさまざまなであるようなｚｍＧＲＡＭＭＲ反応液をいくつか設定した。これらのｚｍＧＲＡＭＭＲ反応液は以下の成分を含有した：０．１単位のＰｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼ；２単位または１０単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ：０または０．５ｍＭの２’−デオキシ−Ｐ−ヌクレオシド−５’−三リン酸（ｄＰＴＰ）；０または０．５ｍＭの８−オキソ−２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸（８−オキソ−ｄＧＴＰ）；０，５、２５、５０または５００ｎＭの各ｄＮＴＰ；およびＫＣｌを５０ｍＭになるように補足した１×ＮＥＢ大腸菌リガーゼ緩衝液。Ｐｏｌ  Ｉの代わりに１単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼまたは５単位のクレノウポリメラーゼを使用する反応も設定した。次に、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）によって発現させたＲＥＳ  Ｉ調製物１μｌ（タンパク質量２ｎｇ）を加えた。エンドヌクレアーゼを含有しない対照反応も調製した。最後に、アニールしたＤＮＡヘテロ二重鎖基質２０ｎｇを加え、完全になった反応液を２５℃で１時間インキュベートした。ｚｍＧＲＡＭＭＲ処理したヘテロ二重鎖をカラム精製し、コンピテント大腸菌の形質転換に使用した。
【０２６８】
得られたコロニーをＵＶ照射下で調べた。ｄＮＴＰに対して高濃度のヌクレオチド類似体を使用したｚｍＧＲＡＭＭＲ反応では、非蛍光コロニーの割合が高かったが、類似体なしで行った対照反応から得られるコロニーでは、非蛍光コロニーは、たとえあったとしてもごくわずかだった。クレノウポリメラーゼを含有する反応液からはごくわずかなコロニーが生じ、それらはすべて非蛍光性だった。無作為に拾ったいくつものクローンで行ったＤＮＡ配列から、ヌクレオチド類似体含有ＧＲＡＭＭＲ反応から得られるかなりの数のクローンが、ＧＦＰ／ｃ３ＢＦＰ遺伝子間のミスマッチ部位またはそのごく近傍に集中している突然変異（すなわち両親とは無関係な反応）を含むことがわかった。ｄＮＴＰに対するヌクレオチド類似体の比が高い反応ほど、突然変異を含有するクローンのパーセンテージが高くなった。クレノウを使ったｚｍＧＲＡＭＭＲ反応はほとんどがうまくいかず、類似体を含まない対照反応でさえ、コロニーはほとんど回収されなかった。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使ったｚｍＧＲＡＭＭＲ反応によって得られるコロニーでは、Ｐｏｌ  Ｉ含有反応から得られるものよりも、突然変異がミスマッチ部位に集中していた。これは予想どおりの結果だった。なぜなら、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼはニックトランスレーションを行わないので、切り出されたミスマッチの部位か、そのごく近傍にしか類似体を組み込まないと予想されるからである。
【０２６９】
塩基類似体はＧＲＡＭＭＲ反応中に組み込まれるので、これらの突然変異は反応途中のポリメラーゼの道に印を付ける働きをする。実施例１８で教示したようにリガーゼとＰｏｌ  Ｉの比を変化させることにより、突然変異させる道の幅を操作することができる。
【０２７０】
（寄託情報）
バージニア州マナッサス、ユニバーシティ・ブルバード１０８０１のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に、３つの寄託がなされている。タバコモザイクウイルスの誘導体と、６ＨＩＳタグが付加されたセロリ由来のＣＥＬ  Ｉミスマッチエンドヌクレアーゼ遺伝子のｃＤＮＡとを含有するプラスミドＤＮＡコンストラクトが寄託されている。このコンストラクトは、内部ではＰ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬ  Ｉ  ６ＨＩＳと呼ばれ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３９２７（受託日２００１年１２月１３日）を割り当てられている。タバコモザイクウイルスの誘導体と、セロリ由来のＣＥＬ  ＩミスマッチエンドヌクレアーゼのｃＤＮＡとを含有するプラスミドＤＮＡコンストラクトが寄託されている。このコンストラクトは、内部ではＰ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬ  Ｉ  Ａｖｒと呼ばれ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３９２６（受託日２００１年１２月１３日）を割り当てられている。タバコモザイクウイルスの誘導体と、Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ  ｌｅｐｉｄｏｐｙｌｌａ由来の３４ｋＤａタンパク質をコードするｃＤＮＡインサートとを含有するプラスミドＤＮＡコンストラクトが寄託されている。このｃＤＮＡインサートをＲＥＳ  Ｉ−６ＨＩＳという。ＲＥＳ  Ｉはミスマッチエンドヌクレアーゼ遺伝子である。このコンストラクトは内部ではｐＬＳＢ−２２２５と呼ばれ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４５６２（受託日２００２年７月３０日）を割り当てられている。
【０２７１】
これらの寄託は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の取り決めに基づいてなされたものであり、少なくとも３０年間、および当該受託機関が当該寄託物の試料の分譲を求める最新の請求を受け取った後少なくとも５年間、または本願またはこれらの寄託物のいずれかに言及する以後の出願に対して発行された特許の有効期間のうち、最も長い期間にわたって維持される。各寄託物がこの期間中に生存不可能になった場合は補充されるだろう。
【０２７２】
上記各クローンについて出願人が使用する名称は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎになされた上記寄託のための寄託物では短縮されていることに注意すべきである。すなわち、ｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬ  Ｉ  Ａｖｒ−Ｂ３をｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬ  Ｉ  Ａｖｒといい、ｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬ  Ｉ  ６Ｈｉｓ−Ａ９をｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬ  Ｉ  ６Ｈｉｓという。クローンｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬ  Ｉ  Ａｖｒ（配列番号１）は、ヌクレオチド５７６５から６６５５までのＣＥＬ  Ｉオープンリーディングフレーム（配列番号３）を含有し、クローンｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬ  Ｉ  ６Ｈｉｓ−Ａ９（配列番号２）は、ヌクレオチド５７６５から６６７９までのＣＥＬ  Ｉオープンリーディングフレーム（配列番号４）を含んだ。
【０２７３】
【表１】
2007529991.tif 000005
【０２７４】
【表２】
2007529991.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０２７５】
【図１】図１は、ミスマッチ解消による遺伝子再集合（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＲＡＭＭＲ）のプロセスを表す。少なくとも２つのヌクレオチド位置で異なっている２つの仮想ポリヌクレオチド間で起こる再集合を考える。Ａのトップ鎖とＢのボトム鎖との間に起こるアニーリングを示す。これにより、２つの位置でミスマッチが生じる。再集合ミスマッチ解消プロセス後は、４つの異なる産物ポリヌクレオチド、すなわち親タイプＡおよびＢと、再集合産物ＸおよびＹが認められる。
【図２】図２は、２分子の典型的な部分相補核酸集団を表す。図２Ａは、完全に相補的なトップ／ボトム鎖（それぞれ１＋／２−および３＋／４−）を持つ２つの核酸分子「Ｘ」および「Ｙ」の配列を表す。核酸ＸおよびＹ間の相違ヌクレオチドの位置を表示する（＊）。図２Ｂは、変性およびアニーリング後の核酸ＸおよびＹに由来する一本鎖の考えうる組合せを表し、それらの組合せのどれが、２成分の部分相補核酸集団を構成するかを示している。
【図３】図３は、実施例１３に記載のＲＥＳ  Ｉエンドヌクレアーゼの核酸配列（配列番号１６）を表す。
【図４】図４は、対応するＲＥＳ  Ｉのアミノ酸配列（配列番号３４）を表す。
【図５】図５は、実施例１４に記載のプラスミドｐＢＳＣ３ＢＦＰの核酸配列（配列番号３２）を表す。
【図６】図６は、実施例１５に記載のＴＭＶ−Ｃｇのトバモウイルス移動タンパク質オープンリーディングフレームの核酸配列（配列番号１８）を表す。
【図７】図７は、実施例１５に記載のＴＭＶ−Ｏｂのトバモウイルス移動タンパク質オープンリーディングフレームの核酸配列（配列番号１９）を表す。
【図８】図８は、実施例１５に記載のＴＭＶ−Ｕ２のトバモウイルス移動タンパク質オープンリーディングフレームの核酸配列（配列番号２０）を表す。
【図９】図９は、実施例１５に記載のＴＭＶ−ＣｇおよびＴｏＭｖ  ＧＲＡＭＭＲ反応によって得られるクローン（配列番号２１）を表す。
【図１０】図１０は、実施例１５に記載のＴＭＶ−ＣｇおよびＴｏＭｖ  ＧＲＡＭＭＲ反応によって得られるもう一つのクローン（配列番号２２）を表す。
【図１１】図１１は、実施例１５に記載のＴＭＶ−ＯｂおよびＴｏＭｖ  ＧＲＡＭＭＲ反応によって得られるクローン（配列番号２３）を表す。
【図１２】図１２は、実施例１５に記載のＴＭＶ−ＯｂおよびＴｏＭｖ  ＧＲＡＭＭＲ反応によって得られるもう一つのクローン（配列番号２４）を表す。
【図１３】図１３は、実施例１５に記載のＴＭＶ−Ｕ２およびＴｏＭｖ  ＧＲＡＭＭＲ反応によって得られるクローン（配列番号２５）を表す。
【図１４】図１４は、実施例１５に記載のＴＭＶ−Ｕ２およびＴｏＭｖ  ＧＲＡＭＭＲ反応によって得られるもう一つのクローン（配列番号２６）を表す。
【図１５】図１５は、実施例１５に記載のＴＭＶ−Ｕ１およびＴｏＭｖ  ＧＲＡＭＭＲ反応によって得られるクローン（配列番号２７）を表す。
【図１６】図１６は、実施例１５に記載のＴＭＶ−Ｕ１およびＴｏＭｖ  ＧＲＡＭＭＲ反応によって得られるもう一つのクローン（配列番号２８）を表す。
【図１７】図１７は、実施例１５に記載のＴＭＶのトバモウイルス移動タンパク質オープンリーディングフレームの核酸配列（配列番号９）を表す。
【図１８】図１８は、実施例１５に記載のＴｏＭＶのトバモウイルス移動タンパク質オープンリーディングフレームの核酸配列（配列番号１０）を表す。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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