(57)【要約】本発明は、色素、バイオセンサー、ならびに、選択したターゲット分子を検出するために色素およびバイオセンサーを使用する方法、を提供する。バイオセンサーは、結合ドメイン、ならびに、色素もしくは所望のターゲットに直接結合した色素、を有する。本発明で考慮される結合ドメインは、所望のターゲット分子と相互作用し、且つ分子の所定の構造状態もしくは共有結合修飾（例えば、リン酸化）に対して特異的でありえるような、生分子もしくは生分子のフラグメントを含む。或る実施形態においては、バイオセンサーの結合ドメインは、一本鎖可変領域フラグメント（scFv）と、CDR3領域に結合した本発明に係る色素との組み合わせである。また、本発明は、選択したターゲットの結合の変化、構造的変化、もしくは翻訳後修飾を検出するために有用な、環境感受性色素も提供する。【選択図】図１１Ａ
2007529718.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) ターゲット分子への特異的な親和性を有する結合ドメインと、
(b) 前記結合ドメインが前記ターゲット分子に結合したときに、特に、疎水性、水素結合、極性、極性化、活性化、もしくは構造的な環境に曝される位置において、前記結合ドメインに結合した環境感受性色素と
を含み、
前記結合ドメインが前記ターゲット分子と結合している間もしくは結合した後の、前記疎水性、水素結合、極性、極性化、活性化、もしくは構造的な環境が変化した際に、前記色素からの蛍光シグナルが変化する
ことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項２】
前記ターゲット分子が、特定の構造をとるか、もしくは特定のリガンドに結合しているか、もしくは翻訳後修飾をされているときに、前記結合ドメインが前記ターゲット分子と結合することを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項３】
前記ターゲット分子が、リン酸化によって翻訳後修飾されていることを特徴とする、請求項２記載のバイオセンサー。
【請求項４】
前記結合ドメインが、前記ターゲット分子上のリン酸化部位の近傍に結合することを特徴とする、請求項３記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記ターゲット分子が、核酸もしくは蛋白質を含むことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記結合ドメインが、核酸もしくはポリペプチドであることを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項７】
前記結合ドメインが、アプタマー、相補性決定領域（CDR）、 VH 領域、 VL 領域、Fvフラグメント、 F(ab) フラグメント、F(ab')2 フラグメント、抗体、抗体フラグメント、ロイシンジッパー、ヒストン、エンハンサー、一本鎖可変領域フラグメント（scFv）、リガンド、受容体、蛋白質複合体中のうちのひとつの蛋白質、アプタマー、もしくはレクチン、を含むことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項８】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、4、5、9、10、11、12、16、17、18、19、20、21、22、27に記載のうちのいずれかひとつの配列を含むことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項９】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号23もしくは24に記載の核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号5もしくは12に記載の配列を含み、ここで下記に示す配列表の配列番号5もしくは12の中の下線を引いたアミノ酸のうちの少なくともひとつが、システイン（cystene）であることを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【化１】
2007529718.tif 000077
【請求項１１】
前記色素が芳香環を含み、ここで、前記芳香環は、前記芳香環の成す平面から突出しているようなひとつもしくは複数の非平面状アルキル基もしくはヘテロ原子置換基を有していることを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
前記環境感受性色素が、下記の構造式の化合物のうちのひとつであって、
【化２】
2007529718.tif 000078
ここで、
R1 は、低級アルキル基、 -(CH2)3-SO3-、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I 、もしくは -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCSであり、
R2 は、 H 、 -NH2
、 -SO3- 、 CH3CONH-、ICH2CONH- 、 HO(CH2)2-S-CH2CONH- 、SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-、もしくは保護基であり、
R3 は、低級アルキル基、もしくはトリル-アセトニトリル（ tolyl-acetonitrile ）
であることを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
前記蛍光シグナルが、約 400nm 以上の波長の光を含むことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
前記蛍光シグナルが、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）に依存したものでは無いことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
前記結合ドメインが、リンカーによってターゲット分子と結合することを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
前記リンカーが、ヒドロキシスクシンイミド基類、マレイミド基類、ハロアセチル基類、ピリジルジスルフィド基類、ヒドラジン類、エチルジエチルアミノ-プロピルカルボジイミド基、およびヨードアセトアミド基、から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１５記載のバイオセンサー。
【請求項１７】
二つ以上の色素分子が、前記結合ドメインに結合することを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項１８】
前記色素分子のうちのひとつから発せられるシグナルが、前記結合ドメインのターゲット分子との結合に依って変化し、また、前記シグナルが、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）によって生成されたものでは無いことを特徴とする、請求項１７記載のバイオセンサー。
【請求項１９】
前記色素分子が、前記結合ドメインと、システイン、リシン、アルギニン、天然アミノ酸側鎖、誘導体化アミノ酸側鎖、非天然アミノ酸の箇所で結合することを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項２０】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、もしくは4に記載の配列を含んだ一本鎖可変領域フラグメントを含み、ここで、
配列表の配列番号1は、
LTQSPGTLSLSAGERATLSC(X)nWYQQ
KPGQAPRLLIY(X)nGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDLAVYYC(X)n
であり、
配列表の配列番号2は、
QVQLVQSGAEVKKPGSSVQVSCKASGGTF(X)n
WVRQAPGHGLEWMG(X)nRVTFTADQATSTAYMELTNLRSDDT
AVYYCAR(X)nWGQGTLVTVSSPRGPAGQ 
であり、
配列表の配列番号4は、
TQSPGTLSLSAGERATLSC(X)nWYQQKPGQA
PRLLIY(X)nGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDLAVYYC(X)nG
GGGSGGGGSGGGGSRSSQVQLVQSGAEVKKPGSSVQVSC
KASGGTF(X)nWVRQAPGHGLEWMG(X)nRVTFTADQATSTAY
MELTNLRSDDTAVYYCAR(X)nWGQGTLVTVSSPRGPAGQ 
であって、
それぞれの X は、独立に、可変であるアミノ酸であり、 n は、約3〜約25の整数であって、また、ひとつもしくは複数のアミノ酸 X を、前記色素が結合する部位となるシステインとすることができる
ことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項２１】
HIV を検出するためのバイオセンサーにおいて、 HIV と結合することが可能である結合ドメインと、色素とを含み、前記結合ドメインが、配列RASQSVSSGCLA（配列表の配列番号9）、GASCRAT （配列表の配列番号10）、 QQYGTSPCTFGQGTKVDIKR （配列表の配列番号11）、SMYGCN （配列表の配列番号16）、GIIPCFGTSNYAQKFRG（配列表の配列番号17）、 GIIPIFGTSNYAQKFCG （配列表の配列番号18）、DCGPDWEDGDSYDGSGRGFFDF（配列表の配列番号19）、DFGPDWEDCDSYDGSGRGFFDF （配列表の配列番号20）、DFGPDWEDGDCYDGSGRGFFDF （配列表の配列番号21）、もしくはDFGPDWEDGDSYDCSGRGFFDF （配列表の配列番号22）を有するペプチドから本質的に成るCDRフラグメントを含むことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項２２】
前記色素が、下記の構造式の化合物のうちのひとつであって、
【化３】
2007529718.tif 000079
ここで、
R1 は、低級アルキル基、 -(CH2)3-SO3-、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I 、もしくは -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCSであり、
R2 は、 H 、 -NH2 、 -SO3- 、 CH3CONH-、ICH2CONH- 、 HO(CH2)2-S-CH2CONH- 、SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-、もしくは保護基であり、
R3 は、低級アルキル基、もしくはトリル-アセトニトリルである
ことを特徴とする、請求項２１記載のバイオセンサー。
【請求項２３】
環境感受性蛍光色素において、
ひとつもしくは複数のインドール芳香環もしくはベンゾチオフェン芳香環と、
前記芳香環の成す平面から突出した、ひとつもしくは複数の非平面的脂肪族置換基またはヘテロ原子置換基と
を含み、前記色素が、疎水性、水素結合、極性、もしくは構造変化を含む環境の変化に曝されたときに、前記色素から発せられる蛍光シグナルが変化することを特徴とする、色素。
【請求項２４】
前記色素が、約400nm以上の波長の励起もしくは光の放射を含むことを特徴とする、請求項２３記載の色素。
【請求項２５】
前記色素が、下記の構造式の化合物のうちのひとつであって、
【化４】
2007529718.tif 000080
ここで、
R1 は、低級アルキル基、 -(CH2)3-SO3-、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I 、もしくは -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCSであり、
R2 は、 H 、 -NH2 、 -SO3- 、 CH3CONH-、ICH2CONH- 、 HO(CH2)2-S-CH2CONH- 、SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-、もしくは保護基であり、
R3 は、低級アルキル基、もしくはトリル-アセトニトリルである
ことを特徴とする、請求項２３記載のバイオセンサー。
【請求項２６】
前記色素が、ひとつもしくは複数のリンカーをさらに含むことを特徴とする、請求項２３記載のバイオセンサー。
【請求項２７】
前記色素が、バイオセンサー、結合ドメイン、生分子の結合部位、もしくはターゲット分子に結合することを特徴とする、請求項２３記載のバイオセンサー。
【請求項２８】
バイオセンサーと、
選択したターゲット分子を検出、監視、もしくは観察するために、前記バイオセンサーを使用する手引きと
を含み、また、
前記バイオセンサーが、結合ドメインおよび色素を含み、
前記結合ドメインが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント（scFv）であって、前記抗体は、前記 scFv 内部に、色素が結合する部位を有している
ことを特徴とする、キット。
【請求項２９】
色素と、
前記色素を使用する手引きと
を含み、前記色素が請求項２５記載の色素であることを特徴とする、キット。
【請求項３０】
前記キットの手引きが、前記色素を、選択した結合ドメインに結合させるための手引きを含むことを特徴とする、請求項２９記載のキット。
【請求項３１】
選択したターゲット分子を検出するための方法において、
前記選択したターゲットを含む可能性がある供試体を、バイオセンサーと接触させるステップと、
シグナルが、前記バイオセンサーから発せられたものであるかどうかを観察するステップと
を含み、前記バイオセンサーが、結合ドメインおよび環境感受性色素を含み、また、前記結合ドメインが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント（scFv）であって、前記抗体が、前記scFvのCDR3領域の内部に、色素が結合する部位を有している
ことを特徴とする、方法。
【請求項３２】
前記色素が結合する前記部位が、システインであることを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記バイオセンサー結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、もしくは4に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記色素が、請求項２５記載の色素であることを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
前記選択したターゲット分子が、蛋白質、受容体、リガンド、もしくは酵素、であることを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
前記供試体が、生細胞、細胞リシス生成物、細胞ライブラリ、もしくは細胞培地、を含むことを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
選択したターゲット分子の、細胞内部での活性もしくは位置を検出するための方法において、
前記細胞を、バイオセンサーと接触させるステップと、
前記バイオセンサーによって発せられたシグナルの変化、もしくは、前記シグナルの位置の変化、を観察するステップと
を含み、前記バイオセンサーが、結合ドメインおよび色素を含み、また、前記結合ドメインが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント（scFv）であって、前記抗体が、前記scFvのCDR3領域の内部に、色素が結合する部位を有している
ことを特徴とする、方法。
【請求項３８】
前記バイオセンサー結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、もしくは4に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記色素が、請求項２５記載の色素であることを特徴とする、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記選択されたターゲット分子が、蛋白質、受容体、リガンド、もしくは酵素、であることを特徴とする、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
前記選択されたターゲット分子の活性が、前記選択されたターゲット分子のリン酸化状態、細胞レベル以下の位置、細胞レベル以下の構造との相互作用、もしくは、細胞の蛋白質との相互作用、を含むことを特徴とする、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
選択した内因性ターゲット生分子と、細胞因子との相互作用を検出するための方法において、
a. 選択した内因性ターゲット生分子を含む細胞を同定するステップと、
b. 前記ターゲット生分子上の結合部位への特異的結合親和性を有する結合ドメインと、環境感受性色素とを含んだプローブ生分子を投与するステップと、
c. 前記プローブ生分子を、前記細胞と共にインキュベートするステップと、
d. 前記環境感受性色素から発せられるバックグラウンドシグナルを観察するステップと、
e. 前記環境感受性色素から発せられるシグナルの変化を検出することによって、前記ターゲット生分子と細胞因子との間の相互作用を検出するステップと
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項４３】
前記細胞因子が、細胞の核酸、蛋白質、ペプチド、酵素、受容体、サイトカイン、細胞骨格、およびシグナル伝達蛋白質、から成る群から選択されることを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
プローブ生分子の前記結合ドメインが、前記ターゲット生分子と、リン酸化部位において結合することができるものであることを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
前記結合ドメインが、前記ターゲット生分子の、特定の構造、リガンド相互作用、もしくは翻訳後修飾に対する、特異的親和性を有することを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、4、5、9、10、11、16、17、18、19、20、21、22、もしくは27に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項４７】
前記色素が、約600nm以上の波長の励起もしくは光の放射を含むことを特徴とする、
請求項４２記載の方法。
【請求項４８】
前記環境感受性色素が、請求項２５記載の色素であることを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項４９】
前記環境感受性色素が、前記結合ドメインと、前記プローブ生分子と前記ターゲット生分子との間の結合に対して影響を実質的に及ぼさない部位で結合することを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項５０】
前記部位が、前記結合部位もしくは前記ターゲット生分子の結晶構造の検査によって選択されるものであることを特徴とする、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記プローブ生分子が、TATペプチドと縮合していることを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項５２】
前記プローブ生分子を、電気穿孔法、形質導入、微量穿孔法、微量注入、界面活性剤、もしくは噴出物を使用することによって、前記細胞内へと導入するステップ、をさらに含むことを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項５３】
前記シグナルの変化が、蛍光が少なくとも50%増加するものであることを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項５４】
シグナルの変化を検出する前記ステップが、蛍光定量法、分光法、基質の酵素の変化、検鏡法、もしくは質量分光法、を含むことを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項５５】
シグナルの変化を検出する前記ステップが、
蛋白質の量を定量するステップ、蛋白質の位置決定をするステップ、前記ターゲットの構造変化を検出するステップ、前記ターゲットの活性化を検出するステップ、もしくは、前記ターゲットのリン酸化を検出するステップ、を含むことを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項５６】
対象とするターゲット分子の変化を検出するための方法において、
(a) ターゲット分子に、前記ターゲット分子上の部位に結合した環境感受性色素を加えるステップと、
(b) 前記色素から発せられるシグナルの、前記ターゲット分子を新たな環境に曝したことに因る変化を検出するステップと
を含み、
前記ターゲット分子上の前記部位の、疎水性、水素結合、極性、極性化、リン酸化、ポリペプチドの折り返し、水和、リガンド結合、もしくは、サブユニット相互作用が、前記ターゲット分子を前記新たな環境に曝すことによって変化するものである
ことを特徴とする、方法。
【請求項５７】
前記色素が、請求項２５記載の色素であることを特徴とする、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
GTP加水分解酵素（GTPアーゼ）の活性化を検出するためのバイオセンサーにおいて、
GTP加水分解酵素配列、第一蛍光蛋白質、第二蛍光蛋白質、および、前記GTP加水分解酵素の活性化形態と結合するドメイン、の順番で含んでいるポリペプチド鎖を含む
ことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項５９】
前記GTP加水分解酵素が、Rho であることを特徴とする、請求項５８記載のバイオセンサー。
【請求項６０】
前記第一蛍光蛋白質および前記第二蛍光蛋白質が、シアン蛍光蛋白質（CFP）、もしくは黄色蛍光蛋白質（YFP）を含むことを特徴とする、請求項５８記載のバイオセンサー。
【請求項６１】
前記ドメインが、活性化されていない前記GPT加水分解酵素の配列に対するものよりも大きい親和性を以って、活性化されたGTP加水分解酵素配列と結合することを特徴とする、請求項５８記載のバイオセンサー。
【請求項６２】
前記ドメインが、前記GTP加水分解酵素配列に結合することによって、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）が発生することを特徴とする、請求項５８記載のバイオセンサー。
【請求項６３】
前記ペプチド鎖をコードしている核酸配列を含んだ発現ベクターをさらに含むことを特徴とする、請求項５８記載のバイオセンサー。
【請求項６４】
Cdc42 の活性化を検出するためのバイオセンサーにおいて、
WASP ポリペプチド鎖と、
請求項２５記載の色素と
を含むことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項６５】
前記WASPポリペプチド鎖が、配列表の配列番号27に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項６４記載のバイオセンサー。
【請求項６６】
前記色素が、前記WASPポリペプチド鎖と、配列表の配列番号28に記載の配列の位置271に対応した位置において結合することを特徴とする、請求項６４記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、 United States Provisional Application Serial No. 60/552,663 （2004年03月12日出願、内容を本開示に完全に含める）の出願日の権利を享受するものである。
［政府補助金］
本発明は、 the National Institutes of Health の審査を受けた認定番号R01-AG-15430およびR01-GM-57464の米国政府支援を得ているものである。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
［技術分野］
本発明は、環境感受性色素（ environmentally-sensitive dyes ）、蛋白質活性を検出するためのこの色素の使用方法、選択したターゲットに結合可能なバイオセンサー分子、ならびに、例えば生細胞内部でターゲット生分子および蛋白質の活性を検出するための方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の挙動は、細胞レベル以下の特定の位置における蛋白質活性の一過性活性化（ transient activation ）を介して調節されている。生細胞内部の蛍光蛋白質アナログ（類縁体）の検鏡法の進歩により、蛋白質の転位（トランスロケーション）についてのわれわれの研究は著しく発展してきた。しかしながら、多くの場合、局在化された蛋白質活性は、蛋白質を活性部位へと転位することによって制御されるものでは無く、蛋白質給源（protein pool ）のうちのごく一部の局在活性化によって制御されている。 Hahn, K.; Toutchkine, A. Curr. Opin.Cell Biol., 2002, 14, 167-172 、 Wouters, F. S.; Verveer, P. J.; Bastiaens, P. I., Trends Cell Biol., 2001, 11, 203-211 を参照のこと。蛋白質の転位を研究する際、もしくは生体外での生化学的手法を使用する際には、こうした挙動は明瞭では無い。さらに言えば、シグナル蛋白質の活性化により生じる結果は、生化学的技法により算出される母集団平均において有意では無いような、活性化動態における微妙な変数に依存している。高速な活性化動態の正確な定量、および蛋白質活性化のレベルの正確な定量のためには、生細胞内の蛋白質活性を測定する必要もある。Wouters,F. S.; Verveer, P. J.; Bastiaens, P. I., Trends Cell Biol., 2001, 11, 203-211 、Williams, D. A.; Fogarty, K. E.; Tsien, R. Y.; Fay, F. S., Nature, 1985, 318,558-561、Berridge, M. J., J Biol. Chem., 1990, 265, 9583-9586 を参照のこと。
【０００３】
生細胞内の蛋白質活性を、 FRET（ fluorescence resonance energy transfer; 蛍光共鳴エネルギー転移）を用いて観察することがある。同様に、二つの蛋白質に対して異なるフルオロフォアを用いてそれぞれに標識（タグ）を付け、この二つの蛋白質を会合させてFRETにかけることによって、この二つの蛋白質の間の相互作用を観察することも行われてきた。また、特定の構造をとったときにのみ、蛋白質に結合するようなFRETバイオセンサーも製造されている。これらの手法は有用であると考えられるが、その一方で、FRETに基づいた技法は、多くの重要なターゲットの研究を妨げる制限を抱えてもいる。構造変化をしている蛋白質は、バイオセンサーで「試験」できないことがあり、これは、蛋白質が競合する配位子（リガンド）に結合されたり、もしくは、蛋白質が複数の蛋白質から成る複合体に取り込まれたりすることで、バイオセンサーの到達性が阻害されてしまうためである。しかしながら、このように大きく不安定な複合体を生体外で再生産することは明らかに困難であり、また、特定の位置におけるこうした複合体の一過性の構造については、損われていない細胞の中で研究しなくてはならないというのもまた確実なことである。たとえ蛋白質が立体的に阻害されていなかったとしても、FRET のために構造変化させる領域の近傍でのフルオロフォアを伴った誘導体化が、生物学的活性に影響を及ぼすことが考えられる。最後に、FRETは間接的な励起から発生させるものなので、比較的弱い蛍光シグナルが出力されるということがある。このような小さいシグナルでは感度が低くなり、また、真のシグナルを、自家蛍光もしくはFRETドナーの蛍光と辨別するための複雑な方法が必要になる。
【０００４】
したがって、蛋白質の運動を監視するよりも多くのことが可能であって、且つ上述したFRET の欠点を持たないような道具が求められている。多様な蛋白質活性（細胞レベル以下の位置の変化、構造変化、活性化状態、翻訳後修飾、および／もしくは、生体内の蛋白質への小さいリガンドの結合、を含む）を検出および定量するために使用することができるバイオセンサーもまた求められている。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、細胞レベル以下の位置の変化、構造変化、活性化状態、翻訳後修飾、および／もしくは、生体内の蛋白質へのリガンドの結合、を検出および定量するために使用することができる、色素ならびにバイオセンサーを提供する。
【０００６】
例えば、本発明に係る色素は、下記の構造式の化合物 1〜5 のうちのいずれかとすることができるものであって、
【０００７】
【化５】
2007529718.tif 000003
【０００８】
ここで、
R1 は、低級アルキル基、 -(CH2)3-SO3-、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I 、もしくは -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCSであり、
R2 は、 H 、 -NH2 、 -SO3- 、 CH3CONH-、ICH2CONH- 、 HO(CH2)2-S-CH2CONH- 、SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-、もしくは保護基であり、
R3 は、低級アルキル基、もしくはトリル-アセトニトリル （ tolyl-acetonitrile ）である。
【０００９】
本明細書中では、 Su とは、スクシンイミジルエステル （ succinimidyl ester ） のことを意味する。
【００１０】
これらの色素は、その置かれた環境の作用により、蛍光特性を変化させられることになり、それを利用して蛋白質の活性を検出するために用いることが可能である。こうした変化には、変化した蛍光強度、寿命、励起もしくは発光（放射）極大、励起もしくは発光極大の変化した状態、または、蛍光寿命、が含まれる。
【００１１】
また、本発明は、抗体の一本鎖可変領域フラグメント（ single chain variable fragment; scFv ）を含んだバイオセンサー結合ドメインも提供し、ここで、抗体はscFv上に色素が結合する部位を有するものである。いくつかの実施形態においては、バイオセンサー結合ドメイン内部の、色素が結合するための部位が、システインとなる。
【００１２】
例えば、本発明に係るバイオセンサーは、配列表の配列番号1、2、もしくは4に記載の配列を有する一本鎖可変領域フラグメントと、標識（ラベル）もしくは色素とを含むものであって、ここで、
配列表の配列番号1に記載の配列は、
LTQSPGTLSLSAGERATLSC(X)nWYQQKPGQAP
RLLIY(X)nGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDLAVYYC(X)n
であり、
配列表の配列番号2に記載の配列は、
QVQLVQSGAEVKKPGSSVQVSCKASGGTF(X)nWVRQAPG
HGLEWMG(X)nRVTFTADQATSTAYMELTNLRSDDTAVYY
CAR(X)nWGQGTLVTVSSPRGPAGQ
であり、
配列表の配列番号4に記載の配列は、
LTQSPGTLSLSAGERATLSC(X)nWYQQKPGQA
PRLLIY(X)nGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDLAVYYC(X)nG
GGGSGGGGSGGGGSRSSQVQLVQSGAEVKKPGSSVQVSCKASG
GTF(X)nWVRQAPGHGLEWMG(X)nRVTFTADQATSTAYMELT
NLRSDDTAVYYCAR(X)nWGQGTLVTVSSPRGPAGQ
であって、また、
それぞれの X は、独立に、可変であるアミノ酸のことを表し、nは、約3〜約25の整数であって、また、ひとつもしくは複数のアミノ酸X を、前記色素が結合する部位となるシステインとすることができる。
【００１３】
本発明の或る特徴は、結合ドメインおよび色素を含んだバイオセンサーであり、ここで結合ドメインは抗体の一本鎖可変領域フラグメント（scFv）であって、また、抗体はscFvのCDR3領域内部に、色素と結合するための部位を有する。
【００１４】
本発明の別の特徴は、HIVと結合することができる結合ドメインと、結合した色素とを含んだHIVを検出するためのバイオセンサーであって、ここで、結合ドメインは、下記の配列
【００１５】
【化６】
2007529718.tif 000004
【００１６】
を有するペプチドから本質的に成っているCDRフラグメント（断片）を含む。
【００１７】
本発明の別の特徴は、選択したターゲット分子を検出するための方法であって、選択したターゲット分子をバイオセンサーと接触させるステップと、この相互作用によって生成されるシグナルを観察するステップとを含むような方法である。このバイオセンサーは、結合ドメインと色素とを含み、ここでこの色素の蛍光は、結合に因る影響を受ける。結合ドメインは、抗体の一本鎖可変領域フラグメント（scFv）とすることができ、ここで、抗体は、scFvのCDR3領域内部に、色素が結合する部位、天然産生蛋白質の修飾フラグメント、または、特定の状態のターゲット蛋白質もしくはポリペプチドに結合する他の因子、を有する。
【００１８】
本発明の別の特徴は、細胞内部の選択したターゲット分子を検出するための方法であって、細胞をバイオセンサーと接触させるステップと、バイオセンサーから発せられたシグナルが変化したかどうかを観察するステップとを含み、また、バイオセンサーが結合ドメインと色素とを含み、また、結合ドメインが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント（scFv）であって、抗体が、色素が結合するための部位をscFv上に有している、ことを特徴とする。
【００１９】
本発明の別の特徴は、選択したターゲット分子を検出するための方法であって、選択したターゲット分子を含む可能性がある供試体をバイオセンサーと接触させるステップと、バイオセンサーが生成したシグナルが、供試体内部に局在化されるようになったかどうかを観察するステップとを含み、また、バイオセンサーが、結合ドメインと色素とを含み、また、結合ドメインが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント（scFv）であって、抗体が、scFvのCDR3領域の内部に、色素が結合するための部位を有している、ことを特徴とする。
【００２０】
本発明の別の特徴は、バイオセンサーと、バイオセンサーを選択したターゲット分子を検出、監視、もしくは観察するために用いる手引きとを含むキットであり、ここで、バイオセンサーは結合ドメインと色素とを含み、また、結合ドメインが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント（scFv）であって、抗体が、scFvのCDR3領域の内部に、色素が結合するための部位を有している、ことを特徴とする。
【００２１】
本発明の別の特徴は、色素と、色素を使用するための手引きとを含むキットであって、この色素は、上述した構造式 1, 2, 3, 4, 5 のいずれかの化合物である。このキットは、選択した蛋白質、ポリペプチド、もしくは核酸に対して色素を結合させるための手引きをさらに含むこともできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、ターゲット分子に結合して検出することができるバイオセンサー分子を指向するものである。また、本発明は、ホモジニアスアッセイ（ homogeneous assay ）および生細胞イメージングに関する種々の特性を有するような環境感受性色素を使用して、このような結合が起こったことを検出することも指向する。さらに本発明は、蛋白質の活性の変化および／もしくは構造の変化が、色素の蛍光の変化となって顕れるような、色素の所望の蛋白質への直接結合も指向する。本発明に係るバイオセンサー分子は、結合ドメインおよび環境感受性色素、所望の蛋白質および環境感受性色素、あるいは、結合したモジュール結合ドメイン／ターゲット蛋白質または結合していないモジュール結合ドメイン／ターゲット蛋白質であってFRETのための色素またはひとつもしくは複数の環境感受性色素を含むもの、を含むことができる。環境感受性色素は、ひとつもしくは複数の位置で、結合ドメインまたはターゲットに結合することができる。色素が一本鎖可変領域フラグメント（scFv）の結合ドメインに結合するための最適な位置、ならびに、色素が特定の修飾を施された天然蛋白質ドメインに結合するための最適な位置、が提供される。本発明に係るバイオセンサーは、特に、生細胞内部のターゲット分子の機能を観察する目的に適合する。
【００２３】
本発明は、蛋白質の活性、構造、もしくは蛋白質-蛋白質相互作用、を検査するための種々の方法を提供する。本発明に係る方法およびバイオセンサーは、蛋白質の局在化もしくは蛋白質の活性化を検知することができ、ならびに／あるいは、蛋白質の構造もしくは相互作用の変化の特定の様相を検知することもできる。バイオセンサーは、生細胞内での使用を可能にするための特徴を有する。多くの場合、バイオセンサーはホモジニアスアッセイに使用することができる。例えば、細胞リシス生成物（ライサート）のような複雑な混合物中の或る蛋白質の活性を、バイオセンサーを単に加えるだけで、洗浄ステップなどのような追加のステップを要すること無く、測定することが可能である。バイオセンサーは、FRETのフォーマットでシグナルを発することができ、もしくは、好ましくは単独の環境感受性色素の応答としてシグナルを発することもできる。環境感受性色素、ならびに従来のバイオセンサー手法もしくは新たなバイオセンサー手法におけるその環境感受性色素の使用方法は、本発明の重要な態様である。
【００２４】
本発明は、特定のリン酸化状態にあるターゲット分子への特異的な親和性を有するバイオセンサー結合ドメインを提供する。例えば、バイオセンサーの結合ドメインは、蛋白質が、シグナル伝達蛋白質を活性化するグアノシン三リン酸に結合した際に、この蛋白質上に形成される結合部位に対しての特異的親和性を有することができる。任意に、不活性形態にある蛋白質（例えば、グアノシン三リン酸の代わりにグアノシン二リン酸に結合した蛋白質）に対して、バイオセンサーが充分に低い親和性を有するようにすることができる。したがって、例えば、バイオセンサーの環境感受性色素が、結合部位近傍の結合ドメイン上の位置を占めて、そのターゲットに結合することで、結合環境が、色素から発せられる蛍光シグナルを変化させるようにすることができる。この位置は、ターゲットの蛋白質の生物学的活性を重大に阻害すること無く、色素のシグナルを充分に変化させることが可能なものである。この実施形態における活性化されたターゲットの検出では、ターゲットの構造変化、もしくは、ターゲットと相互作用している第三の分子の存在、を必ずしも要しない。
【００２５】
また、本発明に係るバイオセンサーは、蛋白質-蛋白質相互作用を検出することもできる。このような相互作用は、高い親和性を有する相互作用（例えば、抗原と抗体との間の相互作用）であってもよく、また、低い親和性を有する相互作用（例えば、酵素と、基質、シグナルカスケード構成員、もしくは蛋白質複合体の構成員との相互作用）であってもよい。二員間の蛋白質-蛋白質相互作用においては、一方の構成員を「ターゲット」と見做して、他方をバイオセンサーの「プローブ」と見做すことができる。ターゲットとプローブとの差異は、何かしらの任意なものではあるが、その一方で、この二分子は互いに相互作用をするため、蛋白質の相互作用について論じやすくするためにこれらの語を用いている。全般的に、本明細書中で用いているように、ターゲットとは、検出対象である分子のこととすることができ、また、プローブとは、所望の状態もしくは形態のターゲットの存在についての情報を得るためにサンプルに導入する構成員のこととすることができる。本発明に係る典型的な蛋白質-蛋白質バイオセンサーにおいては、この対のうちのひとつの構成員が、対の第二構成員の結合部位を敬する（complimentary）結合ドメインを有する。蛋白質-蛋白質相互作用対のうちの一方もしくは双方は、結合した環境感受性色素を含むことができる。蛋白質-蛋白質相互作用対の構成員は、完全な長さの天然蛋白質、天然蛋白質の合成アナログ（類縁体）、天然蛋白質の組換え体アナログ、またはそれらのフラグメント、とすることができる。蛋白質-蛋白質相互作用を含んだバイオセンサーは、環境感受性色素を、一方または双方の構成員上のひとつもしくは複数の位置において有して、構成員が結合している間、色素が構成員の間に在るようにすることができる。このような状態では、結合によって、構成員間の結合相互作用を重大に阻害すること無く、色素からのシグナルを充分に変化させることが可能となる。さらに望ましいもしくは最適な色素の位置は、本発明に係るバイオセンサー系における改善されたシグナルおよび／もしくは結合機能のための別の位置をスクリーニングすることによって確認することができる。
【００２６】
他の実施形態においては、バイオセンサーは、特定の構造をとったターゲット分子、特定のリカンドに結合したターゲット分子、もしくはリン酸化以外の特定の翻訳後修飾を施されたターゲット分子、に対する特異的親和性を有することができる。
【００２７】
或る実施形態においては、宿主細胞の受容体 CD4 を持つ複合体が形成された後に、HIV外被蛋白質gp120に結合するHIV-1中和抗体Fabフラグメント（X5）を含んだバイオセンサー分子が生成された。Moulard,M. et al., Broadly Cross-reactive HIV-1-neutralizing Human Monoclonal Fab Selected for Binding to gp120-CD4-CCR5 Complexes., Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 6913-6918 (2002) を参照のこと。 X5 抗体フラグメントのH鎖（VH）およびL鎖（VL）から得られる可変ドメインは、共に繋留されて、一本鎖可変領域フラグメント（scFv）として発現した。遊離Fabフラグメントの配列データおよび結晶構造に基づいて、いくつかのメロシアニン色素が、このscFv X5結合ドメインの十一箇所の異なる位置に結合された。生体外のgp120の結合の六倍にも達する蛍光強度を以って応答するような、バイオセンサーが得られた。gp120の発現は、生細胞上で可視化された。この作業によって、生細胞色素中の細胞レベル以下のターゲットの量および／もしくは位置を、鑑別ならびに定量するために、こうした結合ドメインとこうした環境感受性色素との組み合わせを有効に使用できるということが明らかとなった。このような経時特性を監視する機能によって、蛋白質の活性の動態にプローブを追随させることが可能となる。さらに、本発明によれば、scFv結合ドメインは、色素が広汎な部位に組み込まれることに対して顕著な耐性を持つので、当業者によって選択された適切な部位に環境感受性色素を組み込んだ結合ドメインとして、すべてでは無いにしろ多くのscFv分子を容易に使用することができる。第二の実施形態では、活性化状態のCdc42に対してのみ結合するような WASP フラグメントを、Cdc42の活性化を検出するために使用した。このフラグメントは、I-SO色素もしくはS-SO色素を以って、共有結合的に誘導体化した。Cdc42への結合に基づき、これによって蛍光強度が大幅に増大した。本発明に係るバイオセンサーによって、生体外、細胞リシス生成物中、および生細胞内における、Cdc42の活性のレベルが明らかとなった。
【００２８】
［環境感受性色素］
本発明は、ひとつもしくは複数の芳香環と、芳香環の成す平面から突出するひとつもしくは複数の非平面状置換基とを有する、環境感受性色素を提供する。この色素は、環境の変化（例えば、疎水性、水素結合、極性、もしくは構造変化）に曝された際に、色素から出るシグナルが変化するので、「環境感受性」（"environmentally sensitive" ）である。したがって、溶媒の変化、水素結合の変化、環境の疎水性の変化、変化した極性もしくは極性化、または、色素の構造に影響する変化、に曝された際に、本発明に係る環境感受性色素からのシグナルは、検出可能な変化を生じる。或る実施形態においては、環境感受性色素から出るシグナルが、色素がより疎水性の強い環境に曝されたときに増大する。別の実施形態においては、色素と環境中の成分との間の水素結合が強い環境に曝されたときに、環境感受性色素から出るシグナルが増大する。こうした疎水性の増大、もしくは水素結合の増大は、本発明に係るバイオセンサーが、ターゲットである蛋白質もしくは細胞レベル以下の成分と結合したときに発生しうる。他の実施形態においては、環境感受性色素から出るシグナルが、色素がより親水性の強い環境に曝されたときに減少する。さらなる実施形態においては、色素と環境中の成分との間の水素結合が弱い環境に曝されたときに、環境感受性色素から出るシグナルが減少する。こうした親水性の増大、もしくは水素結合の減衰は、本発明に係るバイオセンサーが水性環境に曝されたとき、または、このようなバイオセンサーが、ターゲットである蛋白質もしくは細胞レベル以下の成分から解離したときに発生しうる。
【００２９】
本発明に係る色素に用いることができる芳香環は、親となる芳香環系のうちのひとつの炭素原子からひとつの水素原子を除くことによって誘導されるような、六個〜二十個の炭素原子から成る芳香族炭化水素ラジカルを含む。典型的な芳香環は、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、およびビフェニルなど、から誘導されたラジカルを含むが、これらに限定はされない。また、縮合環系も考慮の裡に入れることができ、例えば、窒素、硫黄、もしくは酸素のようなヘテロ原子を含む縮合環が含まれる。使用できる芳香環の例としては、インドール、インドリン、ベンゾチオフェン、ジヒドロベンゾチオフェンなど、が含まれる。
【００３０】
本発明に係る色素には、生細胞内のターゲットおよび相互作用の検出にあたって特に適切となるような多くの特性を持たせることができる。例えば、色素は、細胞の自家蛍光のバックグラウンド周波数外の長波長を有するような輝度の高いものであって、細胞へのダメージを抑えることができる。芳香環系の一部を追加もしくは削除することによって、色素の励起波長および／もしくは放出波長をシフトさせ、細胞内の複数の現象を同時に監視することが可能になる。本発明に係る色素は、強い水溶性を持つように設計することも可能であり、例えば、疎水性を強めてしまうこと無く、凝集を立体的に阻害するような基を付加することによって行うことができる。これは、蛋白質の相互作用に影響する可能性のある高荷電基を使用するという、水溶性を高めるための旧来の望ましからざる手法とは対照的な手法である。本発明に係る色素は、強度変化、励起ピークまたは発光ピークの形状もしくは極大値の変化、ならびに／あるいは、色素の寿命、を観察することによって、細胞内でも検出することができるので、不均一な照射、細胞の厚みなどからの影響を排除することができるような、レシオイメージング法（ratio imaging）ならびに他の手法を使用することが可能となる。
【００３１】
優れたスペクトル特性を有するいくつかの色素が本発明者によって以前に開発されているが、これらの色素と蛋白質との間の反応によって、標識付けを低濃度の色素で行ったとしても、複数の色素の結合が起こってしまう。さらに言えば、「過剰に標識した」（"over-labeled"）複合体の蛍光は微弱である。このことからは、他のメロシアニン類について以前報告されていたことと同様に、水中でこれらの色素が、蛍光を発しないH凝集（H-aggregates）を形成していたことが示唆される。Wurthner et al., Angewandte Chemie, International Edition in English, 39, 1978-1981 (2000) 、 Lu et al., L., J. Am. Chem. Soc., 121, 8146-8156 (1999) 、 Valdes-Aguilera et al., Acc. Chem. Res., 22, 171-177 (1989) を参照のこと。従来に開発された本質的に平面状である色素は、その疎水性面の水への露出を減らすように凝集すると考えられている。
【００３２】
本発明では、四面体状の構造を有する嵩高い非平面状置換基を、芳香環に組み込み、スタッキングが不利となるようにすることによって、このような凝集を激減させた。この新機軸により、色素が、実質的に疎水性を保ちながら、良好な水溶性を有するようにすることができた。これらの色素は、センサーそれ自身に起因する蛋白質の構造変化、ターゲット分子の構造変化、および、センサーのターゲットへの結合による蛋白質-蛋白質相互作用など、に対して反応することができる。このような或る色素の構造およびスペクトルについて以下に示す。ここで、平面から逸れている（out-of-plane）置換基は、炭素に結合した二つのメチル基、および、硫黄原子に結合した二つの酸素原子である。
【００３３】
【化７】
2007529718.tif 000005
【００３４】
R1 基は、例えば、芳香環のスタッキングを阻害するおよび／もしくは水溶性を増大させるような任意の官能基とすることができる。例えば、適切なR1基は、色素分子の水溶性を減少させること無く、環のスタッキングを立体的に充分に阻害することがある。 R1 基は、例えば、炭素数一個〜約六個の脂肪族の性質を有することができる。好ましい実施形態においては、R1基は、極性を有するか、もしくは弱い荷電性とすることができる。特に好ましい R1 基は、例えば、アルキル基、アルキレンアミノアルキル基、硫酸アルキレン基（alkylenesulfate）、 -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCS、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I、 -(CH2)3-SO3、および／もしくはこれらの類似物、を含む。この化合物は、後述する構造式4 を有する化合物である。
【００３５】
溶媒の極性に応じて、溶媒環境に影響を受ける強い双極子を、本発明に係る色素に持たせることができる。本発明に係るメロシアニン色素は、極性化された基底状態を有するような、拡張された双性イオン構造を持つことができる（下記）。
【００３６】
【化８】
2007529718.tif 000006
【００３７】
この例の色素は、輝度の高い蛍光を維持しつつ、溶媒に強く依存した励起波長のシフトを呈することができる。青方シフトの形状では、ブロードなスペクトルを持つが、効率的な励起のためにブロードバンドフィルターを顕微鏡に用いることができる。上述したフルオロフォアは、本出願中のその他の色素について述べたことと同様に、凝集の抑止、溶解性の向上、蛋白質との相互作用への影響、および蛋白質への共有結合を可能にすることのために、側鎖を付けて誘導体化することができた。
【００３８】
例えば構造式 1〜5 を有する色素が、本発明の特徴である。本発明は、これらの独特なメロシアニン色素を、一般的な構造、記載された一般的な R 基を伴った構造、および、特に好ましいR基を伴った特定の構造、として提供する。本発明に係る好ましいメロシアニン色素は、色素の環に、四面体構造として配置されるひとつもしくは複数の基を有する。多くの場合、R基は、環のスタッキングを立体的に充分に阻害しうるようなひとつもしくは複数の炭素原子、および／もしくは、水溶性を高めるための弱イオン性を与える極性、を持つ基を含む。本発明に係る色素は、バイオセンサーを調製するための、水性化学物質、もしくは、水／有機溶媒の複合液と共存させることができる。色素は、色素を結合ドメインへと結合させるプロセスを促進するための、反応性基および／もしくは保護基を有することができる。本発明に係るバイオセンサーは、例えば、生細胞の細胞内環境および／もしくは細胞外環境内で、共存可能であり自由に移動できるような、結合ドメインに結合した色素を含む。バイオセンサー上の色素は、例えば、センサーとターゲットとの間の結合領域の中もしくは近傍に存在することができ、結合に重大の影響を及ぼすこと無く、検出可能なシグナルを出すことができる。
【００３９】
【化９】
2007529718.tif 000007
【００４０】
上記の構造式 1 は、本明細書中にて S-TBA とも称する。多数の特定の色素化合物を、構造式 1 に従って作成することが可能である。基 R1、R2、および／もしくは R3 は、一個〜六個の炭素原子を有することができ、上述したように、立体阻害性および／もしくは水溶性の増大を齎すことができる。構造式1 の好ましい実施形態は、例えば、化合物 1a〜1hを含む。色素化合物 1a〜1h のそれぞれについて存在する置換基は以下である。
1a: R1 = -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCS;R2= H; R3 = ブチル基
1b: R1 = エチル基; R2 = H; R3 = メチル基
1c: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = H; R3= メチル基
1d: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = FmocNH-; R3 = メチル基
1e: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = NH2; R3 = メチル基
1f: (S-TBA-IAA): R1= -(CH2)3-SO3-;R2 = ICH2CONH2; R3 = メチル基
1g: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = CH3CONH-; R3 = メチル基
1h: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = HO(CH2)2-S-CH2CONH-; R3= メチル基
構造式 2 は下記である。
【００４１】
【化１０】
2007529718.tif 000008
【００４２】
また、構造式 2 は、本明細書中では S-SO とも称する。基 R1 および／もしくは R2 は、上述したように、立体的な阻害および／もしくは水溶性の増大を齎す炭素数が一個〜六個の基を具えることができる。多数の特定の色素化合物を、構造式 2 に基づいて作成することができ、例えば、構造式2a〜2g を有する化合物が含まれる。色素化合物 2a〜2g のそれぞれについて存在する置換基は以下である。
2a: R1 = エチル基; R2 = H
2b: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = H
2c: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = FmocNH-
2d: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = NH2
2e: (S-SO-IAA): R1= -(CH2)3-SO3-;R2 = ICH2CONH-
2f: (S-SO-OSu): R1= -(CH2)3-SO3-;R2 = SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-
2g: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = HO(CH2)2S-CH2CONH-
構造式 3 は下記であって、
【００４３】
【化１１】
2007529718.tif 000009
ここで、
R1 は、低級アルキル基、 -(CH2)3-SO3-、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I 、もしくは -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCSであり、また、
R2 は、 H 、 -NH2 、 -SO3- 、 CH3CONH-、ICH2CONH- 、 HO(CH2)2-S-CH2CONH- 、SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-、もしくは保護基であり、また、
R3 は、低級アルキル基、もしくはトリル-アセトニトリル（ tolyl-acetonitrile ） である。
いくつかの実施形態においては、構造式 3 の化合物は下記の構造を有する。
【００４４】
【化１２】
2007529718.tif 000010
【００４５】
また、構造式 3 は、本明細書中では I-TBA とも称する。基 R1 および／もしくは R2 は、上述したように、立体的な阻害および／もしくは水溶性の増大を齎す炭素数が一個〜六個の基を具えることができる。多数の特定の色素化合物を、構造式3に基づいて作成することができ、例えば、構造式 3a〜3b を有する化合物が含まれる。色素化合物 3a〜3b のそれぞれについて存在する置換基は以下である。
3a: R1 = エチル基; R2 = H
3b: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = H
構造式 4 は下記である。
【００４６】
【化１３】
2007529718.tif 000011
【００４７】
また、構造式 4 は、本明細書中では I-SO とも称する。基 R1 および／もしくは R2 は、上述したように、立体的な阻害および／もしくは水溶性の増大を齎す炭素数が一個〜六個の基を具えることができる。多数の特定の色素化合物を、構造式4に基づいて作成することができ、例えば、構造式 4a〜4g を有する化合物が含まれる。色素化合物 4a〜4g のそれぞれについて存在する置換基は以下である。
4a: R1 = メチル基; R2 = H
4b: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = H
4c: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = FmocNH-
4d: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = NH2
4e: (I-SO-IAA): R1= -(CH2)3-SO3-;R2 = ICH2CONH-
4f: (I-SO-OSu): R1= -(CH2)3-SO3-;R2 = SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-
4g: R1 = -(CH2)3-SO3-；R2= HO(CH2)2S-CH2CONH-
構造式 5 は下記である。
【００４８】
【化１４】
2007529718.tif 000012
【００４９】
これらの化合物は、例えば、図８に示したように合成することができる。合成に用いる物質および方法については、実施例に記載する。
【００５０】
本発明に係る環境感受性色素は、生体外の抗体-抗原相互作用、および他の蛋白質-蛋白質相互作用を研究するにあたって、従来に用いられていた他の色素よりも、何倍もの輝度を得ることが可能である。Renard, M., Belkadi, L. & Bedouelle, H., Deriving Topological Constraints from Functional Data for the Design of Reagentless Fluorescent Immunosensors, J MolBiol, 326, 167-175 (2003) 、 Sloan, D. J. & Hellinga, H. W., Structure-based Engineering of Environmentally Sensitive Fluorophores for Monitoring Protein-protein Interactions., Protein Eng, 11, 819-823 (1998) 、Iwatani, S., Iwane, A. H., Higuchi, H., Ishii, Y. & Yanagida, T., Mechanical and Chemical Properties of Cysteine-modified Kinesin Molecules., Biochemistry, 38, 10318-10323 (1999) を参照のこと。
【００５１】
本発明に係る環境感受性色素の多くの量子収量は、例えば疎水性環境中では非常に高い。例えば、本発明に係る色素の多くが、疎水性の環境中もしくは溶媒中に在る場合に、量子収量は、約0.4、もしくは約 0.5 、もしくは約 0.6 、もしくは約 0.7 、もしくは約0.80 を上回る。いくつかの実施形態においては、本発明に係る色素は、約0.90 を上回る量子収量を有する。構造式 4 を持つ I-SO 色素は、約0.97 の量子収量を有し、ジメチルホルムアミド中での消光係数は約 143,000になりうる。このような大きな消光係数および量子収量によって、例えば、本発明に係るバイオセンサーから、強力なシグナルを直接得ることができる。これらの高い量子収量および消光係数により、内因性蛋白質の生物学的活性に対して最小限の影響しか及ぼさず、且つ、光褪色（フォトブリーチング）に先立って多数の画像を得ることによって高解像度の動態研究が可能となるような、非常に少量のバイオセンサーからの検出ができる。
【００５２】
バイオセンサーと環境感受性色素とを組み合わせて使用することによって、非環境感受性色素で抗体を標識してイメージングを行っている現行の親和性プローブ（アフィニティプローブ）を用いたスキームを、大幅に超える利点を得ることができる。Nizak,C. et al., Science, 300, 984-987 (2003) を参照のこと。例えば、蛍光強度もしくは発光波長の変化を、放射性物質法もしくはELISA法を用いて可視化したターゲットと遡及的に比較することで、ほぼリアルタイムで定量することができる。多くの場合、ターゲットの瞬間的な存在（fleeting presence）は、遅延した検出による方法では観測することができない。
【００５３】
別の態様においては、異なる発光波長を持つ二種以上の色素を用いて、同一細胞中の複数の蛋白質の活性のイメージングを（例えば同時に）行うことが可能である。本発明に係るバイオセンサーは、典型的には、結合が起かったことを（例えばレシオメトリック測定法を用いて）検出しやすくするために、ひとつもしくは複数のフルオロフォアを含む。単独の色素が好ましいとは言え、いくつかの場合には、バイオセンサーの結合ドメイン上に複数の色素分子を与え、結合が起こったことが監視しやすくなるようにすることが望ましい。
【００５４】
本発明に係るバイオセンサー中の独特な色素は、結合ドメインおよび／もしくはターゲットに結合することができる。バイオセンサーが、所望のターゲット分子から成っている場合には、例えば、ターゲットの構造の変化、リガンドのターゲットへの結合、ターゲットとの蛋白質-蛋白質相互作用、ターゲットのリン酸化、もしくは、ターゲットの翻訳後修飾、に基づいて、色素からのシグナルが変化するような位置で、本発明に係る環境感受性色素は、ターゲットと結合することができる。本発明に係る環境感受性色素は、バイオセンサー中の所望のターゲットと、後述する「色素と結合ドメインとの複合化」の節で述べる色素結合法を用いて、結合することができる。例えばシグナル強度の改善もしくは正常な生物学的活性への最小限の影響を得るために好ましいような、結合に際しての位置については、本明細書中（後述する「色素と結合ドメインとの複合化」の節など）で述べるスクリーニング法を用いて確認することが可能である。
【００５５】
［結合ドメイン］
本発明は、結合ドメインと環境感受性色素とを含むバイオセンサーを提供する。本発明に係る結合ドメインは、ターゲット分子に、適切な特異性を以って結合するような任意の分子を含むことができる。本発明に係る結合ドメインは、典型的には、生命科学分野で公知である親和性分子（アフィニティ分子）の結合領域であって、抗体、抗原フラグメント、ロイシンジッパー、ヒストン、エンハンサー、相補性決定領域（CDR）、一本鎖可変領域フラグメント（scFv）、受容体、リガンド、アプタマー、レクチン、および蛋白質複合体もしくは蛋白質対中の蛋白質のうちのひとつの蛋白質、を含むが、これらに限定はされない。結合ドメインは、例えば、蛋白質-蛋白質相互作用内の蛋白質対のうちのいずれかの構成員を単に含むものであって、ここで、「結合ドメイン」の構成員とは、例えば、所望のターゲットを検査するために、アッセイ系内に導入されるもののことであると見做せる。本発明に係る結合ドメインは、例えば、完全なサイズである親和性分子の結合領域、親和性分子のフラグメントの結合領域、もしくは、所望のターゲットの検出に際して有用な結合をするような親和性分子の最小の部分の結合領域、とすることができる。多くの実施形態では、結合ドメインは、細胞の内因性ペプチド（例えば、構成要素であるペプチドもしくは誘導可能なペプチドであるが、組換え体では無いペプチド）への特異的な親和性を有することができる。これは重要な利点である。
【００５６】
本発明に係るバイオセンサーの、対象とするターゲットおよび検出スキームは多種多様である。本発明に係るバイオセンサーは、ターゲット蛋白質の特定の状態にのみ結合するような結合ドメインを具えるように設計することが可能である。バイオセンサーがターゲットに結合すると、例えば、ターゲットとした状態にある蛋白質の量および／もしくは位置を示すように、蛍光が変化してシグナルを発することができる。経時変化を監視することができる。バイオセンサーには、特異的結合活性を具えた天然蛋白質の結合ドメインを組み込むことができる。結合ドメインは、任意に、例えば、完全な長さの親和性蛋白質、蛋白質-蛋白質相互作用対の構成員（もしくはその一部）、Fv抗体フラグメント、アプタマー、Vh抗体フラグメントなどとすることができる。バイオセンサーが発するシグナルは、FRET系に依ることもでき、あるいは、好ましくは単独の環境感受性色素を用いることもできる。一本鎖可変領域フラグメント（scFv）結合ドメインは、結合ドメインおよび／もしくはターゲットモジュールにリンカー（結合基）を伴って結合するような、本発明に係るモジュールバイオセンサー内に使用するのが特に有用であって、新たな所望の特異性をセンサーに与えるために、別のバージョンに置き換えることも可能である。別の好ましい態様においては、生細胞を検査する新規な方法のために、scFvを、本発明に係る環境感受性色素と組み合わせることができる。
【００５７】
本発明は、色素の、所望の蛋白質のすべてもしくは一部への結合を含むことができ、例えば、この蛋白質は、リン酸化状態および／もしくは蛋白質-リガンド相互作用（ここで、リガンドは小さい分子もしくは第二の蛋白質とすることができる）の変化に曝される。これによって、本発明に係る色素を用いた比較的単純なタイプのバイオセンサーを得ることができる。本発明に係る色素は、所望の蛋白質に共有結合して、リン酸化状態および／もしくは蛋白質-蛋白質相互作用に関連したシグナルを発することができる。このタイプの検出法は、第三の要素の活動に起因したターゲット蛋白質の構造変化をバイオセンサーが検出するような、従来に記載されていた検出法（Hahn et al., Solvent-sensitive Dyes to Report Protein Conformational Changes in Living Cells, J Am Chem Soc, 125, 4132-4145 (2003)）とは対照的なものである。例えば、 Hahn, K. M. et al., J. Biol. Chem., 265, pp 20335-20345, (1990) では、カルシウムを用いて、ターゲットであるカルモジュリンに構造変化を起こして、結合させた色素からのシグナルを検出できるようにしている。本発明においては、リン酸化に因って起きた構造変化にまで検出が拡張されているが、所望の蛋白質の構造変化を誘導する必要は無い。或る実施形態においては、色素をMAPキナーゼERK2に結合させた。ERK2のリン酸化に起因する構造変化に基づいて、共有結合した色素が構造変化させられた。この手法の重要な利点は、他のタイプのバイオセンサー（例えばターゲット蛋白質を見つけるためのドメインを必要とするもの）では阻害されてしまうであろう、複数の蛋白質の複合体の内部の蛋白質を監視できることである。本発明に係る環境感受性色素は、このようなバイオセンサー用途に対して特に適切である。従来の色素は、高分率の水性有機溶媒を除き、不溶性であるため、多数の蛋白質群には不適であった。さらに、本発明に係る色素では、単一の色素で検出をすることができ、例えば、FRETのように二種のフルオロフォアを使用すること無く、直接励起よりも輝度の高いシグナルを得ることができる。
【００５８】
結合ドメインは、ポリペプチド配列、もしくは核酸配列を含むことができる。例えば、結合ドメインは、一本鎖 DNA （sDNA）、二本鎖 DNA （dsDNA）、RNA、修飾塩基を持つ核酸、およびそれらの類似物、とすることができる。或る実施形態においては、結合ドメインがオリゴヌクレオチドのプローブであって、また、ターゲットが、敬するターゲット核酸（complimentary target nucleic acid ）である。別の実施形態においては、結合ドメインは、ターゲットであるエンハンサー蛋白質ターゲットに対して特異的な、dsDNAの鎖（ストランド）である。本発明に係る環境感受性色素は、当該技術分野において公知である任意の手法（例えば、色素上のリンカーと、核酸上の修飾塩基上の利用可能な反応性基との反応）によって、核酸に結合させることができる。
【００５９】
いくつかの好ましい実施形態においては、結合ドメインは、ポリペプチド、もしくはペプチド配列を含む。ペプチド結合ドメインの親和性の特異性は、アミノ酸の短い配列（例えば、3〜20個の残基）によって付与することができ、あるいは、ひとつもしくは複数の親和性蛋白質の一次構造、二次構造、三次構造、ならびに／または四次構造の近傍に配されたアミノ酸側鎖の構成要素に依存した特異性であってもよい。ペプチドから生成された結合ドメインは、本発明に係る色素上のリンカーと特異的に反応する反応性基を与えるような、天然アミノ酸側鎖、修飾された側鎖、もしくは、それらの類似物、を有することができる。別の手法として、本発明に係る色素は、結合ドメイン上のリンカーに対して特異的に反応するような、色素をドメインに結合させるための反応性基を有することもできる。ドメイン上の色素の位置は、さらに後述するように、ドメイン上の反応性基もしくはリンカー部分の位置によって測定することができる。いくつかの実施形態においては、結合ドメインは、色素上の基（例えば、色素上のヨードアセトアミド基）と反応するような、ひとつもしくは複数のシステイン残基を有する。本発明の一般的な実施形態においては、バイオセンサーは、蛋白質の免疫グロブリンの群の構成員もしくはその誘導体、であるような結合ドメインを含む。例えば、結合ドメインは、完全な免疫グロブリン、フラグメント、一本鎖可変領域フラグメント（scFv）、H鎖可変領域、L鎖可変領域、CDRペプチド配列、および／もしくはそれらの類似物、とすることができる。
【００６０】
血漿のファミリー （family of plasma） であって細胞表面蛋白質であり、且つ折り返し（フォールディング）もしくはドメインであるブロックを構築するような基礎構造を持つような免疫グロブリンに属する抗体分子は、免疫系および他の生物学的記憶系内の多くの分子中にさまざまな形態で用いられている。標準的な抗体は、二つの同一の免疫グロブリンのH鎖と、二つの同一のL鎖とから成る四量体構造であって、その分子量は約150,000 Daltons である。
【００６１】
抗体のH鎖とL鎖は、異なるドメインから構成される。L鎖のそれぞれは、ひとつの可変ドメイン（VL）と、ひとつの定常ドメイン（CL）とを有し、また、H鎖のそれぞれは、ひとつの可変ドメイン（VH）と、三個もしくは四個の定常ドメイン（CH）を有する。例えば、Alzari, P. N., Lascombe, M.-B. & Poljak, R. J. (1988) Three-dimensional structure of antibodies., Annu. Rev. Immunol., 6, 555-580 を参照のこと。ドメインのそれぞれは、約110個のアミノ酸残基から成っており、折り返され、互いに対して充填された二つのβ-シートから形成された特徴的なβ-サンドウィッチ構造となっている。VHドメインおよび VL ドメインのそれぞれは、ドメインの一方の端においてβ-ストランドと結合する、ループもしくは屈曲した三つの相補性決定領域（CDR1〜3）を有する。個々の鎖の特異性への寄与は均等では無いとは言え、全般的には、L鎖とH鎖の双方の可変領域が、抗原特異性に寄与していると言える。抗体分子は、これらの六個の無作為なループ（CDR）に亘って多数の分子と結合するように進化してきた。
【００６２】
免疫グロブリンは、そのH鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依って、さまざまなクラスに分類することができる。少なくとも五種のクラスの免疫グロブリンが存在する（IgA、IgD 、 IgE 、 IgG 、および IgM ）。これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）に分けることができ、例えば、 IgG-I 、IgG-2、 IgG-3 、およびIgG-4、ならびに、 IgA-1 および IgA-2 に分けることができる。クラス IgA 、 IgD 、IgE 、 IgG 、およびIgM の免疫グロブリンに対応するH鎖定常ドメインのことを、それぞれ、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、およびミュー（μ）と呼ぶ。抗体のL鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて明確に識別できる二種の型のうちのひとつに分類することができ、それぞれカッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ぶ。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および三次元構造については公知である。
【００６３】
抗体の可変ドメインについての説明における「可変」（"variable"）という語は、抗体ごとに、配列内の大部分で可変ドメインのうちの或る部分が変化しているという事実を指している。可変ドメインは、結合をするためのものであって、また、その特定の抗原に対する特定の抗体のそれぞれの特異性を決定する。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインを介して均一に与えられるものでは無い。実のところ、可変性は、L鎖とH鎖の双方の可変ドメイン内の、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる三個のセグメント（超可変領域としても知られる）に集中している。
【００６４】
可変ドメインのうち、変化の少ない部分のことを、フレーム構造（FR）領域と呼ぶ。天然のH鎖およびL鎖の可変ドメインは、それぞれが、大部分が三つの CDR によって繋がれたβ-シート構造をとっている四つのFR領域を含み、ここで、CDRはループを形成して、β-シート構造を繋いでおり、いくつかの場合にはβ-シート構造の一部を形成してもいる。それぞれの鎖の中のCDRは、FR領域の近傍に纏まって保持され、また、別の鎖のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の構造に寄与している。
【００６５】
本発明において使用が考えられる抗体は、さまざまな形態のうちの任意のものとすることができ、ここで、前述のさまざまな形態とは、免疫グロブリンの全長、ならびにFv、Fab、および類似のフラグメントといった抗体フラグメント、ならびに、可変ドメイン相補性決定領域（CDR）を含んだ一本鎖抗体、ならびに類似の形態、を含むものであって、本明細書中ではこれらのすべてを広義の「抗体」という語で括る。本発明は、抗体（多クローン抗体（ポリクロナール抗体）もしくは単クローン抗体（モノクロナール抗体））の任意の特異性を使用することを想定している。多くの実施形態において、本明細書中において記載する方法の説明中では、使用した抗体、もしくはそのフラグメントは、選択したターゲットに対して免疫特異性を持つ。
【００６６】
「抗体フラグメント」（"antibody fragment" ） という語は、完全な長さの抗体のうちの一部のことを指し、一般的には抗原結合領域もしくは可変領域を指す。抗体フラグメントの例としては、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、およびFvフラグメントが含まれる。抗体をパパインで消化すると、それぞれが単独の抗原結合部位を有する二つの同一の抗原結合フラグメント（Fabフラグメント）と、その残りとしてFc フラグメントが生成する。したがって、 Fabフラグメントは、損われていないL鎖と、ひとつのH鎖の一部とを有する。ペプシン処理によって、F(ab')2フラグメントが得られ、これは抗原を架橋結合できる二つの抗原結合フラグメントを有している。また、その残りのフラグメントはpFc'フラグメントと呼ばれる。 Fab'フラグメントは、ペプシンで消化した抗体を還元した後に得られるものであって、損われていないL鎖、およびH鎖の一部から構成されている。抗体分子ひとつあたりに、二つのFab'フラグメントが得られる。Fab'フラグメントは、H鎖 CH1 ドメインのカルボキシル末端に若干の残基（抗体のヒンジ領域のひとつもしくは複数のシステインを含む）を追加されていることがFabフラグメントとは異なっている。
【００６７】
Fv は、小型の抗体フラグメントであって、完全な抗原の識別と、結合部位とを含んでいる。この領域は、近接した、非共有結合の、ひとつのH鎖可変ドメインとひとつのL鎖可変ドメインとのダイマー（VH-VLダイマー）から構成されている。これは、それぞれの可変ドメインの三つのCDRが相互作用して、VH-VLダイマー表面上の抗原結合部位を定める、という構造である。正確には、六つのCDRが、抗体への抗原の特異的な結合を齎している。しかしながら、単独の可変ドメイン（もしくは、抗原に対する特異性を有するCDRを三つだけ含んだ、Fvの半分）は、たとえ完全な結合部位よりも低い親和性であったとしても、抗原に対する識別と結合とを行う能力を有する。本発明に係るバイオセンサー内に組み込まれる有用な抗体フラグメントとしては、例えば、単独のCDR、VH領域、VL領域、Fv フラグメント、 F(ab) フラグメント、および F(ab')2フラグメント、を含めることができる。
【００６８】
付加的なフラグメントとしては、二量体抗体（diabodies）、直鎖抗体 （linear antibodies） 、一本鎖抗体分子、および、抗体フラグメントから形成された多選択性抗体、を含めることができる。本発明に係る結合ドメインで使用される抗体フラグメントは、例えば、天然型、合成型、もしくは組換え型を含む。一本鎖抗体は、適切なポリペプチドのリンカーによって結合されたL鎖の可変領域およびH鎖の可変領域から構成され、遺伝子的に縮合した一本鎖分子となっているような、遺伝子的に改変された分子である。また、このような一本鎖抗体は、「一本鎖Fv」抗体フラグメントもしくは「scFv」抗体フラグメントとも呼ばれる。一般的に、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドのリンカーをさらに含み、抗原と結合するためにscFv が所望の構造をとれるようにしている。scFvのレビューについては、 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, N. Y., pp. 269-315 (1994) を参照のこと。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態においては、色素を結合させてバイオセンサーを形成することができるような結合ドメインの中に、任意の抗体もしくは抗体フラグメントを使用することが可能である。或る実施形態においては、一本鎖可変領域フラグメントを、結合ドメインとして使用する。任意の利用可能なscFvは、選択されたターゲットに充分な親和性を以って結合して、scFvと選択されたターゲットとの間で形成される複合体を検出できる限り、使用することができる。選択されたscFvの任意の適切な箇所に、蛍光色素を結合させることができる。しかしながら、本明細書中で記載しているように、結合した色素の蛍光は、その結合位置に影響を受ける可能性がある。例えば、S-SO蛍光色素（構造式2 ）もしくは I-SO 蛍光色素（構造式 4 ）の最高の蛍光応答は、H鎖の CDR3 ループ内の三箇所（H96, H100H, H100E）から得られ、位置H96 での複合化では、蛍光がおよそ六倍にも増大した（図１１Ｃ）。環境感受性色素が、シグナルに検出可能な変化（例えば、50%、100% 、200% 、500%、1000% 、もしくはそれ以上）を起こさせることができるということは、本発明の特徴のひとつである。
【００７０】
したがって、本発明は、色素が適切に結合できる部位を有するような scFv 分子を提供する。本発明に係る方法で使用することができるひとつの scFv X5 L鎖は、下記の配列（配列表の配列番号1）、もしくは、従来技術に係るそれらの置換体、を有し、ここで、それぞれのX は、それぞれ別々に不定であるかもしくは CDR アミノ酸であり、また、nは約3〜約25の整数であって、ひとつもしくは複数のアミノ酸 X は、任意のリンカーに対して反応性である基（linker reactive groups）（例えば、システインもしくは誘導アミノ酸）とすることができ、蛍光色素が結合する部位を与えるものである。いくつかの実施形態においては、付加的な結合部位を、トレオニン-システイン-トレオニン（TCT）配列をN末端に含めることによって具えることができる。配列表の配列番号1は以下である。
LTQSPGTLSLSAGERATLSC(X)nWYQQKPGQAP
RLLIY(X)nGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPED
LAVYYC(X)n
本発明に係る方法に用いることができるひとつの scFv X5 H鎖は、下記の配列（配列表の配列番号2）、もしくは、従来技術に係るそれらの置換体、を有し、ここで、それぞれのX は、それぞれ別々に不定であるかもしくは CDR アミノ酸であり、また、nは約3〜約25の整数であって、ひとつもしくは複数のアミノ酸 X は、任意のリンカーに対して反応性である基（例えば、システインもしくは誘導アミノ酸）とすることができ、蛍光色素が結合する部位を与えるものである。
QVQ LVQSGAEVKK PGSSVQVSCK ASGGTF(X)nWVR 
QAPGHGLEWM G(X)nRVTFTADQ ATSTAYMELT
NLRSDDTAVY YCAR(X)nWGQGT LVTVSSPRGPAGQ
或る実施形態においては、ひとつもしくは二つの色素分子を、 scFv H鎖の CDR3 領域の内部の、リンカーに対して反応性であるひとつもしくは二つの残基に結合させる。例えば、色素を、おおよそ位置95〜おおよそ位置105に結合させることができる。多くの実施形態においては、色素分子をただひとつだけ、scFvH鎖と、scFvのCDR3領域の内部にあたる残基で結合させ、例えば、おおよそ位置95〜おおよそ位置105 に結合させることができる。
【００７１】
色素が結合する好ましい残基は、システインである。本発明に係る結合ドメイン中の親和性配列と会合させるために、リンカーを使用することができる。このようなリンカーは、好ましくは、可撓性の鎖状構造（例えば、脂肪族鎖もしくはポリマー）をとる。より好ましい実施形態においては、リンカーは、充分に疎水性であるようなペプチドもしくは核酸である。L鎖とH鎖とを結合するための例示的なペプチド配列は、（配列表の配列番号3）GGGGSGGGGSGGGGSRSSである。
【００７２】
したがって、本発明は、下記の配列（配列表の配列番号4）、もしくはその従来技術に係る置換体を有するscFv結合ドメインを提供する。
LTQSPGTLSL SAGERATLSC (X)nWYQQKPGQA
PRLLIY(X)nGIPD RFSGSGSGTD FTLTIGRLEP
EDLAVYYC(X)nG GGGSGGGGSG GGGSRSS
QVQLVQSGAE VKKPGSSVQV SCKASGGTF(X)n
WVRQAPGHGL EWMG(X)nRVTFT ADQATSTAYM
ELTNLRSDDT AVYYCAR(X)nWG QGTLVTVSSP
RGPAGQ
ここで、それぞれの X は、それぞれ別々に不定であるかもしくは CDR アミノ酸であり、また、nは約3〜約25の整数であって、ひとつもしくは複数のアミノ酸 Xは、任意のリンカーに対して反応性である基（例えば、システインもしくは誘導アミノ酸）とすることができ、蛍光色素が結合する部位を与えるものである。
【００７３】
本明細書中に記載しているように、 HIV の宿主細胞との相互作用をイメージングするために使用した scFv X5 L鎖は、下記の配列（配列表の配列番号5）を有していて、ここでは、色素結合部位を得るために変異させた残基を太字・下線で示している。
【００７４】
【化１５】
2007529718.tif 000013
【００７５】
配列表の配列番号5の配列を具えたペプチドと、従来技術に係るその置換体とを含み、且つ、本発明に係る環境感受性色素が結合した後に、適切な結合およびシグナルを得るための位置に、反応性結合残基を持たせるように修飾された配列を含むような結合ドメインを、本発明は含む。N末端にTCT 配列を加えているが、これは X5 抗体の天然部分では無い。このX5 L鎖の CDR 領域は、下記のペプチジル配列を含むことができる。即ち、RASQSVSSGSLA（配列表の配列番号6）、 GASTRAT （配列表の配列番号7）、および QQYGTSPYTFGQGTKVDIKR （配列表の配列番号8）。上述した配列表の配列番号5の配列に示した残基をシステインへと変異させて、ひとつもしくは複数のCDR領域が、下記に示す配列を有するようにすることもできる。
【００７６】
【化１６】
2007529718.tif 000014
【００７７】
他の実施形態においては、ひとつもしくは複数のこのような残基が、システイン以外の、リンカーに対して反応性である基を含むことができる。
【００７８】
scFv X5 H鎖結合ドメインは、下記の配列（配列表の配列番号12）、もしくは従来技術に係るその置換体とを含み、ここで、変異させた残基を太字・下線で示している。
【００７９】
【化１７】
2007529718.tif 000015
【００８０】
この X5 L鎖の CDR 領域は、以下のペプチジル配列 SMYGFN （配列表の配列番号13）、GIIPIFGTSNYAQKFRG （配列表の配列番号14）、およびDFGPDWEDGDSYDGSGRGFFDF （配列表の配列番号15）、ならびに従来技術に係るこれらの変異体、を含むことができる。示した残基をシステインへと変異させることで、これらのCDR領域のひとつもしくは複数を、下記の配列とした。
【００８１】
【化１８】
2007529718.tif 000016
本発明は、これらのペプチド配列、従来技術に係るこれらの置換体、および／もしくは、ひとつもしくは複数のシステインを他のリンカーに対して反応性である基で置換したもの、を含む。
【００８２】
リンカーの鎖は、上述したように、L鎖とH鎖とを共に結合するために用いることができる。例えば、リンカーは、配列表の配列番号3の配列を有するペプチドとすることができる。
【００８３】
ペプチド中の、「従来技術に係るアミノ酸置換体」（"Conservative amino acid substitutions"）は、単独もしくは少数のアミノ酸を、実質的に類似した特性を有した異なるアミノ酸と置き換えて、機能性ペプチドとなるようにした置換体を含むことができる。同様に、遺伝子コードの縮重に因る「サイレント置換」（"silent substitutions" ）（即ち、コードされたポリペプチドには変化を及ぼさないような、核酸配列中の置換）は、アミノ酸をコードするすべての核酸配列にとっての当然の特徴である。開示された配列のそれぞれのこのような従来技術に係る変異体は、本発明の特徴である。
【００８４】
特定の核酸配列の「従来技術に係る変異体」 （"Conservative variations"） とは、同一のもしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸のことを指す（下記の表１を参照のこと）。当業者は、コードされた配列中の、単独のアミノ酸もしくは少ない割合のアミノ酸（典型的には5%未満、より典型的には 4% 、2% 、もしくは 1% 未満）を、変更、追加、または削除するような、個々の置換、欠損、または付加を、「従来技術に係る修飾をされた変異」、則ちアミノ酸の削除、アミノ酸の付加、またはアミノ酸の化学的に類似したアミノ酸による置換の結果として起こる変化のこととして、捉えることができる。したがって、列挙した本発明に係るポリペプチド配列の「従来技術に係る修飾をされた変異体」は、ポリペプチド配列中のアミノ酸のうちの少ない割合（典型的には、5%未満、より典型的には2%もしくは1%未満）を、従来技術に係る置換基から同じ従来技術によって選択したアミノ酸で、置換したものを含む。最後に、核酸分子のコードされた活性を変化させないような、配列への付加（例えば、非機能性配列、もしくは重要では無い機能を有する配列の付加）は、基本的な核酸の従来技術に係る変異である。
【００８５】
【表１】
2007529718.tif 000017
表１では、アミノ酸を、同じグループ（即ち、同じ行）の別のアミノ酸で置換することを、従来技術に係る置換であると見做すことができる。
【００８６】
X5 L鎖 は、下記の核酸（配列表の配列番号23）、もしくは従来技術に係るその変異体、またはそのユニーク下位配列によって、コードされた。本発明の好ましい実施形態においては、太字・下線で示したヌクレオチドを変異させて、別のアミノ酸残基をコードして、例えば本発明に係る色素と結合反応を起こせるようにすることができる。任意に、太字・下線で示したコドンにコードされたアミノ酸を、リンカーに対して反応性である基で置換することができる。
【００８７】
【化１９】
2007529718.tif 000018
【００８８】
X5 H鎖は、下記の核酸配列（配列表の配列番号24）によってコードされ、ここで、変異させる残基を太字・下線で示した。本発明は、配列表の配列番号24の配列、従来技術に係るその変異体、もしくはそのユニーク下位配列、を含む。本発明の好ましい実施形態においては、太字・下線で示したヌクレオチドを変異させて、別のアミノ酸残基をコードして、例えば本発明に係る色素と結合反応を起こせるようにすることができる。任意に、太字・下線で示したコドンにコードされたアミノ酸を、リンカーに対して反応性である基で置換することができる。
【００８９】
【化２０】
2007529718.tif 000019
【００９０】
リンカーは、上述したH鎖とL鎖とを結合させるために使用することができる。リンカーは、例えば、脂肪族鎖もしくはポリマー、好ましくは実質的に親水性であるペプチド、とすることができる。本発明に係るリンカーの配列の例としては、下記の配列表の配列番号25、および従来技術に係るその変異体、にコードされる。
1 GGTGGCGGTG GCTCGGGCGGTGGCGGTTCA GGTGGCGGTG
41 GCTCTAGATC T
結合ドメインの配列データおよび結晶構造に基づいて、本発明に係るひとつもしくは複数の色素を結合させて、本発明に係る好ましいバイオセンサーを得ることができる。例えば、遊離Fabフラグメントの配列データおよび結晶構造に基づいて、いくつかのメロシアニン色素を、一連のひとつもしくは複数の異なる残基の位置に結合させて、小型ではあるが高度に設計された、バイオセンサー候補のライブラリを作成することができる。得られたライブラリを、当業者が理解できるようなスクリーニングにかけて、所望の特性（例えば、シグナル強度および結合親和性）を有する候補を確認することができた。
【００９１】
典型的な実施形態においては、下記の scFv ヌクレオチド配列中の変更もしくは変異を用いて、選択された残基をシステイン残基に変えることができる。
Cys 変異： TCC -> TGC, ACC -> TGC, TAC -> TGC,
TTC -> TGC, ATC -> TGC, CGG -> TGT, TTT -> TGT,
TCC -> TGC, GGT -> TGT
上述したように、選択された残基を、結合化学にとって有用な他のアミノ酸へと任意に変異させることができる。さらに、選択された残基を、リンカーに対して反応性である他の部分（例えば、合成アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体）で任意に置換することもできる。
【００９２】
本発明で考慮される抗体フラグメントは、完全な長さの抗体である必要は無い。しかしながら、このような抗体フラグメントは、完全な長さの抗体と比較して、同様もしくは改善された免疫学的特性または他の特性を有するようにすることができる。例えば、このような抗体フラグメントは、完全な長さの抗体よりも短く、且つより安定なものとすることができる。このような抗体フラグメントは、約4個のアミノ酸、5個のアミノ酸、6個のアミノ酸、7個のアミノ酸、9個のアミノ酸、約12個のアミノ酸、約15個のアミノ酸、約17個のアミノ酸、約18個のアミノ酸、約20個のアミノ酸、約25個のアミノ酸、約30個のアミノ酸、もしくはそれ以上、を含むことができる。
【００９３】
全般的に、本発明に係る抗体フラグメントは、所望のターゲット分子に対する特異性を以って結合する抗体と比較して、同様もしくは改善された特性を持てる限りの、任意の上限サイズを有することができる。例えば、小型の抗体フラグメントは、抗体フラグメントが、L鎖抗体サブユニットに関するものである場合には、約200個未満のアミノ酸、約175個未満のアミノ酸、約150個未満のアミノ酸、約120個未満のアミノ酸、を有することができる。さらに、大型の抗体フラグメントは、抗体フラグメントが、H鎖抗体サブユニットに関するものである場合には、約425個未満のアミノ酸、約400個未満のアミノ酸、約375個未満のアミノ酸、約350個未満のアミノ酸、約325個未満のアミノ酸、約300個未満のアミノ酸、を有することができる。
【００９４】
選択されたターゲットに対して作られる抗体および抗体フラグメントは、当該技術分野で公知である手法によって調製することができる。いくつかの実施形態においては、抗体フラグメントを、完全な長さの抗体から調製することができる。多クローン抗体の調製方法を、当業者は利用することができる。例えば、Green, et al., Production of Polyclonal Antisera, in: Immunochemical Protocols (Manson,ed.), pages 1-5 (Humana Press)、 Coligan, et al., Production of PolyclonalAntisera in Rabbits, Rats Mice and Hamsters, in: Current Protocols in Immunology, section 2.4.1 (1992) （この参照によって本開示に含まれる）、を参照のこと。このような多クローン抗体は、例えば化学的処理もしくは酵素による処理によって開裂させて、本発明において有用であるような抗体フラグメントを調製することができる。
【００９５】
また、単クローン抗体およびそのフラグメントも、本発明で使用することができる。本明細書中の「単クローン抗体」（"monoclonal antibody"）という語は、実質的にホモジニアス（均一）な抗体群から得られた抗体のことを指す。換言すれば、群を含む個々の抗体が、いくつかの（少量存在する）抗体中でときどき自然発生する変異を除いて、同一であるということである。単クローン抗体は、高い特異性を持ち、また、単独の抗原部位に対して作成されるものである。さらに、通常は種々の決定基（エピトープ）に対して作成される種々の抗体を含む多クローン抗体とは対照的に、それぞれの単クローン抗体は、抗原上の単独の決定基に対して作成される。単クローン抗体には、その特異性に加えて、他の免疫グロブリンで汚染されていないハイブリドーマの培養によって合成することができるという利点がある。「単クローンの」（"monoclonal"）という修飾語は、実質的にホモジニアスな抗体群から得られ、且つ任意の特定の方法による抗体の製造を必要としないと見做せるような、抗体の性質を指す抗体の性質を指す。
【００９６】
特に本明細書中では、H鎖の一部および／もしくはL鎖の一部が、特定の種から誘導された抗体中、または、特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と、一致あるいは相似し、またその一方で、これらの鎖の残りの部分が、別の種から誘導された抗体中、または、別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と、一致あるいは相似するような「キメラ」抗体を、単クローン抗体が含む。また、このような抗体のフラグメントは、所望の生物学的活性を呈する限り使いつづけることができる。U.S. Patent No. 4,816,567 、および Morrison et al., Proc. Natl. Acad Sci., 81, 6851-55 (1984) を参照のこと。
【００９７】
単クローン抗体の調製も、同様に従来技術に関する。例えば、この参照により本開示に含まれる Kohler & Milstein, Nature,256:495 (1975) 、Coligan, et al., sections 2.5.1-2.6.7; and Harlow, et al., in: Antibodies: A Laboratory Manual, page 726 (Cold Spring Harbor Pub. (1988)) を参照のこと。単クローン抗体は、種々の公知の手法を用いて、ハイブリドーマ培養物から単離および精製することができる。このような単離手法は、Protein-A Sepharoseを用いたアフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、および、イオン交換クロマトグラフィ、を含む。例えば、Coligan,et al., sections 2.7.1-2.7.12 and sections 2.9.1-2.9.3; Barnes, et al.,Purification of Immunoglobulin G (IgG), in: Methods in Molecular Biology, Vol.10, pages 79-104 (Humana Press (1992)) を参照のこと。
【００９８】
生体外および生体内での抗体の操作方法は、当業者が利用可能である。例えば、本発明に従って使用される単クローン抗体は、上述したハイブリドーマ法で作成することも、または組換え体法（例えば、U.S. Pat. No. 4,816,567 に記載）で作成することも可能である。また、本発明で使用するための単クローン抗体は、ファージ抗体ライブラリ（phageantibody libraries） から、 Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) 、および、Markset al., J. Mol Biol., 222: 581-597 (1991) に記載の手法を用いて、単離することもできる。
【００９９】
また、抗体フラグメントの生成方法（例えば、この参照により本開示に含まれる、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1988) を参照のこと）も、当該技術分野において公知である。本発明に係る抗体フラグメントは、抗体の蛋白質加水分解によって調製することが可能であり、または、抗体フラグメントを適切な宿主にコードした核酸の発現によっても調製することができる。抗体フラグメントは、従来技術に係る、完全な抗体のペプシン消化もしくはパパイン消化による方法によって得ることができる。例えば、ペプシンで抗体を酵素的に開裂して、F(ab')2として記載された 5S フラグメントを得るようにすることで、抗体フラグメントを生成することが可能である。このフラグメントを、チオール還元剤と、さらに任意にジスルフィド結合の開裂によって生じるスルフヒドリル基を阻害する基とを用いて、さらに開裂して3.5SFab'一価フラグメントを作成することもできる。別の手法として、ペプシンを用いて酵素的に開裂を行うと、二つの一価 Fab' フラグメントと、ひとつのFcフラグメントとが直接に得られる。これらの方法は、例えば、US Patent No. 4,036,945および US Patent No. 4,331,647 ならびにそれらに含まれる参照文献に記載されている。これらの特許は、この参照により完全に本開示に含まれる。
【０１００】
また、抗体を開裂する他の方法（例えば、H鎖を分離して一価のL-H鎖フラグメントを形成する方法、フラグメントをさらに開裂する方法、または、他の酵素的、化学的、もしくは遺伝子学的手法）も、フラグメントが、損われていない抗体によって識別された抗原に結合できる限りは、使用することができる。例えば、Fvフラグメントは、VH鎖とVL鎖が会合したものを含む。この会合は非共有結合とすることができ、また、複数の可変鎖を、分子内のジスルフィド結合もしくは化学物質（例えばグルタルアルデヒド）による架橋によって結合することもできる。好ましくは、Fvフラグメントは、ペプチドリンカーによって繋がれたVH鎖およびVL鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合蛋白質（sFv）は、オリゴヌクレオチドで繋がれたVHドメインおよびVLドメインをコードするDNA配列を含んだ構造遺伝子を構築することによって調製することができる。この構造遺伝子は、発現ベクター内に挿入され、続いてE.coliなどの宿主細胞内に導入される。この組換え宿主細胞は、二つの V ドメインを架橋するリンカーペプチドを具えたポリペプチドの一本鎖を合成する。sFvsの生成方法については、例えば、Whitlow, et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol.2, page 97(1991) 、 Bird, et al., Science, 242:423-426 (1988) 、 Ladner, et al, US PatentNo. 4,946,778 、および、 Pack, et al., Bio/Technology, 11: 1271-77 (1993) に記載されている。
【０１０１】
抗体フラグメントの別の形態としては、一本鎖相補性決定領域（CDR）をコードするペプチドがある。CDRペプチド（「最小識別単位」）は、抗原の識別と結合に使われることがある。CDRペプチドは、所望の抗体の CDR をコードする遺伝子のクローニングもしくは構築によって得ることができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、抗体産生細胞のRNAの可変領域を合成することによって、このような遺伝子を調製することができる。例えば、Larrick, et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, page106 (1991) を参照のこと。
【０１０２】
単クローン抗体、多クローン抗体、それらのフラグメント、および類似物、のアミノ酸配列は、本発明に係るアミノ酸配列方法によって定めることができる。所望の抗体およびフラグメントのアミノ酸配列からは、本発明に係るバイオセンサーにおいて有用である結合配列（例えば、CDR配列）を評価することができる。所望の配列は、直接合成することもでき、または、当該技術分野で公知である遺伝子工学的手法を用いた操作のために、核酸配列内に翻訳することもできる。こうして得られたアミノ酸配列および核酸配列は、本発明に係るバイオセンサーにおいて望ましい結合特性を求めてスクリーニングすることができる。また、こうして得られた配列を、論理的に修飾するか、および／もしくは、無作為に変異させて、スクリーニングされて所望の特定のバイオセンサー系においてもっとも有用な配列であると確認される可能性のある付加的な結合ドメイン候補を任意に生成することができる。
【０１０３】
本発明は、ヒトの抗体、および、非ヒトの（例えば、マウスの）ヒト化抗体を考慮するものである。このようなヒト化抗体は、非ヒトから誘導された最小配列を含んだ、キメラ化免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（例えば、Fv、 scFv 、Fab 、 Fab' 、 F(ab')2 、もしくは抗体の他の抗原結合配列）である。大抵の場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（受容者抗体（recipient antibody ））であって、このヒト化抗体では、受容者の相補性決定領域（CDR）からの残基が、所望の特性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギといった非ヒト種のCDR（供与者抗体）からの残基で置換されている。
【０１０４】
或る例として、ヒト免疫グロブリンの Fv フレーム構造残基は、対応する非ヒトの残基で置換することができる。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体中にも、移入されたCDR もしくはフレーム構造配列中にも存在しないような残基を含むことも可能である。このような修飾を、抗体の性能をさらに改善および最適化するために行うことができる。全般的に、ヒト化抗体は、少なくともひとつ、典型的には二つの可変ドメインの実質的な全体を含むことになり、ここで、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域と、FR領域の全体もしくは実質的な全体とに対応する、この可変ドメイン中のCDR領域の全体もしくは実質的な全体は、ヒト免疫グロブリンの共通配列である。ヒト化抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンである免疫グロブリンの定常領域（Fc）の少なくとも一部を任意に含むことができる。さらなる詳細については、Joneset al., Nature, 321, 522-525 (1986) 、Reichmann et al., Nature, 332, 323-329(1988) 、 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, 593-596 (1992) 、 Holmes, et al., J. Immunol., 158:2192-2201 (1997) 、および Vaswani, et al., Annals Allergy, Asthma & Immunol., 81:105-115 (1998) を参照のこと。
【０１０５】
免疫系では、特異的抗体が、厖大なライブラリから選択および増幅される（親和性成熟（affinity maturation））。免疫細胞で使われる組み合わせ法（combinatorial techniques）を、結合因子の組み合わせライブラリーの変異原性および世代で模倣することができる。したがって、変異結合因子、抗体フラグメント、および抗体は、展示法（display-type technologies） を介して生成することもできる。こうした展示法には、例えば、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、および他の手法が含まれる。結合因子のライブラリを生成し、これらのライブラリをスクリーニングするために、当該技術分野で利用可能な手法を使用することができ、また、選択された結合因子を、追加で変異体化（例えば、親和性成熟）させることもできる。Wright and Harris（上記）、 Hanes and Plucthau, PNAS USA, 94:4937-4942 (1997) （リボソームディスプレイ）、Parmley and Smith, Gene, 73:305-318 (1988)（ファージディスプレイ）、 Scott, TIBS, 17:241-245 (1992)、 Cwirla et al., PNAS USA, 87:6378-6382 (1990) 、 Russel et al., Nucl. AcidsResearch, 21:1081-1085 (1993) 、 Hoganboom et al., Immunol. Reviews 130:43-68(1992) 、 Chiswell and McCafferty, TIBTECH, 10:80-84 (1992) 、およびU.S. Pat. No.5,733,743 。
【０１０６】
したがって、本発明は、抗体、 CDR 、または結合ドメインの、親和性、選択性、結合強度、および／もしくは他の所望の特性、を最適化するための、抗体、 CDR 、または結合ドメインの変異方法も提供する。変異結合ドメインとは、選択された結合ドメイン（例えば、CDR）のアミノ酸配列変異体のことを指す。一般に、変異結合ドメイン中のひとつもしくは複数のアミノ酸残基は、基準結合ドメイン（reference binding domain ）中に存在するものとは異なっている。このような変異抗体は、基準アミノ酸配列と較べたときに、 100% 未満の配列の同一性もしくは類似性を必然的に有する。一般的に、変異結合ドメインは、基準結合ドメインのアミノ酸配列と較べたとき、少なくとも75%のアミノ酸配列の同一性もしくは類似性を有する。変異結合ドメインは、基準結合ドメインのアミノ酸配列と較べたとき、好ましくは少なくとも 80% 、より好ましくは少なくとも85%、なおもさらに好ましくは少なくとも90%、もっとも好ましくは少なくとも95%の、アミノ酸配列の同一性もしくは類似性を有する。
【０１０７】
例えば、ファージディスプレイを用いた親和性成熟を、変異結合ドメインの生成方法のひとつとして利用することができる。ファージディスプレイを用いた親和性成熟については、Lowmanet al., Biochemistry, 30(45): 10832-10838 (1991) に記載のプロセスを参照されたく、さらに、Hawkins etal., J. Mol Biol., 254: 889-896 (1992) も参照されたい。このプロセスは、以下の記載に厳密に限定するわけでは無いが、各部位において可能なアミノ酸置換基のすべてを生成するという目的を以って、複数の異なる部位においていくつかの結合ドメインもしくは抗体超可変領域を変異することを含む、と要約できる。したがって、生成された結合ドメイン変異体は、融合蛋白質として、糸状ファージ粒子上に一価で展示される。一般的には、融合は、M13由来の gene III に施される。種々の変異体を発現しているファージは、所望の特性（例えば、結合親和性もしくは選択性）の選択を数度に亘って繰り返す間、運転させることができる。所望の変異体が、単離されて配列を測定される。このような方法のさらなる詳細については、U.S. Patent 5,750,373 、U.S. Patent 6,290,957 、および Cunningham, B. C. et al., EMBO J., 13(11), 2508-2515 (1994) に記載されている。
【０１０８】
したがって、或る実施形態においては、本発明は、選択されたターゲットを識別するような、結合因子もしくは抗体ポリペプチド、または、それらをコードして、改善された結合特性を有する結合因子、抗体、および抗体フラグメントを生成する核酸、を操作する方法を提供する。
【０１０９】
存在する結合因子もしくは抗体の一部を変異させるこうした方法は、結合ドメインをコードするポリペプチドをコードする核酸を、ファージ外被蛋白質をコードする核酸と融合させて、融合蛋白質をコードする組換え体核酸を生成するステップと、融合蛋白質をコードする組換え体核酸を変異させて、変異融合蛋白質をコードする変異核酸を生成するステップと、ファージの表面上に変異融合蛋白質を発現させるステップと、ターゲットに結合するファージを選択するステップとを、含む。
【０１１０】
したがって、本発明は、選択されたターゲット分子を認識して結合することが可能であるような抗体、抗体フラグメント、および結合因子ポリペプチドを提供する。さらに本発明は、このような抗体、抗体フラグメント、および結合因子ポリペプチドを操作して、その結合特性もしくは他の所望の特性（例えば、安定性、サイズ、使用のしやすさ）を最適化する方法も提供する。
【０１１１】
モジュールバイオセンサーは、本発明の特徴のひとつである。モジュールバイオセンサーとは、或る部品が変化して、例えばターゲット特異性および／もしくはシグナル特性を変化させることができるような、一体型のセンサーである。典型的には、モジュールバイオセンサーは、結合ドメインの特異性を好ましく変化させることができる。例えば、親和性分子は、組換え体発現構造体（例えば、発現ベクター）から発現させることができる。図１４に示したように、結合ドメイン140 を含んだ親和性分子は、リンカー鎖 142 を具えた一本鎖ペプチド、およびターゲット分子 141 （典型的にはペプチド）中に任意に発現させることができる。遺伝子構造体は、結合ドメインをコードする領域をブラケッティング（bracketing）するユニークなエンドヌクレアーゼ部位を含み、別の結合ドメインが、バイオセンサーの一部として発現する構造体内へと容易に挿入できるようになっている。モジュール結合ドメインは、例えば、結合ドメインのライブラリーから選択することができる。任意に、モジュールは、コードされたscFvドメインとすることができる。モジュール系は、別の結合ドメイン部位、別の色素結合部位、別の結合されたターゲット、別のリンカー、および／もしくはそれらの類似物、を具える親和性分子を含むことができる。別の手法として、結合ドメインを、広汎な特異性を持つものとし、且つ、ターゲットドメイン（即ち、種々のキナーゼ共通配列ペプチド）を、モジュールデザインに切り換えることができる。
【０１１２】
［色素と結合ドメインとの複合化］
本発明に係る色素は、結合ドメインもしくは蛋白質に結合させることで、本発明に係るバイオセンサーを調製することができる。典型的な実施形態においては、結合ドメインは、ひとつもしくは複数のリンカーに対して反応性である基を含み、且つ、色素は、結合ドメインと色素とを溶液中で単に接触させることによって結合できるようなリンカー基を含む。別の実施形態では、色素が、リンカーに対して反応性である基を含み、且つ、結合ドメインが、リンカー基を含む。なおも別の実施形態では、ドメインと色素の双方が、リンカーに対して反応性である基を含み、且つ、結合は二価のリンカー基を介して行う。
【０１１３】
リンカーに対して反応性である基は、選択されたリンカーと反応してひとつもしくは複数の化学結合を形成するような任意の化学基を含むことができる。例えば、結合ドメイン中の、天然アミノ酸、修飾アミノ酸、誘導アミノ酸、および／もしくは他の残基が、例えばアミン、スルフヒドリル、カルボン酸、アルコール、アルデヒド、およびチオールといった、市販されている二価リンカー分子に共有結合することができるような、リンカーに対して反応性である基を有することができる。上述したように、リンカーに対して反応性である基を、本発明に係る色素分子上に任意に配することもできる。
【０１１４】
リンカーは、本発明に係る結合ドメインを本発明に係る色素に結合させるにあたって、リンカーに対して反応性である利用可能な基と反応させる上で適切な任意のタイプのものとすることができる。市販のリンカー基は、例えば、ヒドロキシスクシンイミド類リンカー（一級アミンに対して反応性）、マレイミド類、ハロアセチル類（例えばヨードアセトアミド基）、ピリジルジスルフィド類（スルフヒドリル基に対して反応性）、ヒドラジン類（アルデヒドに対して反応性）、エチルジエチルアミノ-プロピルカルボジイミド基（EDC;カルボキシル基に対して反応性）、を含む。リンカーは、典型的には、適切な長さ且つ親水性であって且つ結合した分子間に架橋する可撓性の脂肪族鎖もしくはポリマー鎖、を含む。二価リンカー基は、その両端に、同一もしくは異なるリンカー化学作用を有することができる。リンカーは、保管、操作、もしくは他の化学的プロセスの間にリンカー基を保護するための、ひとつもしくは複数の保護基を含むことができる。この保護基は、所定の状態下で除去して、リンカー反応が完結できるようにすることができる。
【０１１５】
本発明に係る色素は、本明細書中に記載されたもしくは当業者に知られたリンカー化学物質を用いて、選択された結合ドメインと容易に複合化（結合）することができる。結合反応の高度なデザインは、典型的には、結合ドメイン内における、ターゲットに対して反応性である基の選択、もしくは、所望の反応性基を結合ドメイン中へと入れる操作から始まる。例えば、結合ドメインは、システイン残基（例えば、ハロアセチル類のリンカーに対して反応性）を適切な位置に天然に具えるものであってもよく、あるいは、このようなシステイン残基を含むように変異させることもできる。別の手法として、結合ドメインは、少数のシステイン残基を有することもできる。結合ドメインは、当該技術分野において利用可能な技法を用いて、単独もしくは少数のシステイン残基を含むように修飾することも変異させることもできる。
【０１１６】
充分な量（例えば、10〜20mM）の色素を DMSO に溶かしたものを、充分な量の結合ドメイン（例えば、結合ドメインの 200μM 溶液 200μL ）に加えることによって、選択された結合ドメインが、本発明に係る色素と複合化される。色素結合ドメイン混合物を、だいたい中性のpHのバッファー中でインキュベートして（例えば、リン酸ナトリウムバッファー（pH7.5）中で）、最終的な色素濃度を約1〜2mM にすることができる。反応混合物を、約4時間に亘って室温でインキュベートした後、1μL のメルカプトエタノールを加えてクエンチする。反応混合物は、短時間（例えば、2分間）の遠心分離（例えば、12,000rpm）にかけて、反応中に形成されたと覚しき沈澱物を除去することができる。遠心分離から得られた上清を、ゲル濾過（例えば、G25 Sepharose ゲル濾過）を用いて、さらに濾過することができる。色素と蛋白質との比率は、Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals; Molecular Probes Inc.: Eugene, OR, 1996 に記載されているように、蛋白質と色素の濃度を吸収スペクトル法を用いて測定することによって算出できる。こうして作成されたバイオセンサーのアリコート（切片）は、-80℃で保管することができる。六箇月の保管を経た後でも、結合能力の重大な損耗は一般に観察されない。反応時間、温度、および溶媒組成の変化を用いて、標識の程度および位置に影響を与えることもできる。
【０１１７】
［バイオセンサーの投与］
本発明に係るバイオセンサーは、生体外および／もしくは生体内で、所望のターゲット分子を検出するために使用できる。多くの場合、バイオセンサーは、ホモジニアスアッセイ中の供試体へと単に加えるだけでよく、ターゲットの検出前に複数の試薬を加えるステップ、および／もしくは洗浄するステップは要しない。
【０１１８】
本発明に係るバイオセンサーは、典型的には、ターゲット分子を含む供試体へと単に加えるだけで、生体外のターゲット分子と接触することができる。生体外アッセイのための供試体の例としては、分子ライブラリ、細胞リシス生成物、クロマトグラフィーのカラムからの分析溶出液、およびそれらの類似物がある。生体外アッセイでは、容器の代わりとして、例えば、マルチウェルプレートのウェル、試験管、Eppendorf tube、分光器セル、分析システムの導管、微小流体システムの流路、およびそれらの類似物、を用いることがある。本発明に係る例示的な生体外アッセイにおいては、所望の酵素蛋白質を、ありうる酵素基質のライブラリを呈する溶液も含んだ九十六ウェルディッシュの底に塗布する。酵素基質複合体への特異的親和性を有する本発明に係るバイオセンサーを、それぞれのウェルに加える。マルチウェルスキャニング蛍光光度計（multiwell scanning fluorometer） を使用して、各ウェルの蛍光を観測する。酵素基質を含んだウェルを、バイオセンサーの色素の波長の蛍光発光であるかを確認することができる。この例では、これはバイオセンサーの結合ドメインが、基質上ではたらく酵素だけに結合しているということであって、結合が、色素の発光強度を充分に変化させる結合ポケット環境（binding pocket environment）中に色素を収めているということである。
【０１１９】
本発明に係るバイオセンサーが生細胞に投与される場合、細胞表面上のターゲットが結合することも、あるいは、バイオセンサーが細胞内に移送されて、細胞内のターゲット分子と接触することも可能である。いくつかの場合には、単に細胞をバイオセンサーを含んだ媒体に曝すだけで、選択されたターゲットを含んでいる疑いのある細胞へとバイオセンサーを受動的に貫入させることができる。他の実施形態においては、当該技術分野で公知である機構（例えば、穿孔法（ポレーション）、注入法、転写ペプチドを以って行う形質導入、など）を用いて、バイオセンサーを細胞内へと能動的に移送する。
【０１２０】
いくつかの実施形態においては、当業者は、バイオセンサー上に転位機能性を組み込むことを選択して、このバイオセンサーを細胞の外側から内側へと転位もしくはインターナリゼーション（内部移行）させやすくすることができる。本明細書中では、「転位機能性」（"translocation functionality" ） という語は、他の化合物もしくは物質（例えば、バイオセンサー）を、細胞がインターナリゼーションさせる能力を増進させるような、化合物、基、または部分のことを指す。このような転位機能性の例としては、ペプチドの認識／移送配列、リポソーム組成物、もしくはその類似物、が含まれる。また、本発明では、別の転位方法および組成物も、第二の成分（例えば、PEG、ポーリン類、サポニン類、ストレプトリシン、もしくは類似物）の取り込みを誘起するために、利用することができる。
【０１２１】
バイオセンサーの取り込みを促進する上で有用な技法は、光穿孔法（optoporation） を含み、これは例えば、 Schneckenburger, H.,Hendinger, A., Sailer, R., Strauss, W. S. & Schmitt, M. Laser-assistedoptoporation of single cells., J Biomed Opt, 7, 410-6 (2002) 、もしくは、 Soughayer,J. S. et al., Characterization of Cellular Optoporation with Distance., AnalChem, 72, 1342-7 (2000) に記載されている。また、種々の形質導入ペプチドも、バイオセンサーの取り込みを促進する上で有用であって、Zelphati, O. et al., Intracellular Delivery of Proteins with a New Lipid-mediated delivery System., J Biol Chem, 276, 35103-10 (2001) 、 Yang, Y., Ma, J., Song, Z. & Wu, M., HIV-1 TAT-Mediated Protein Transduction and Subcellular Localization Using Novel Expression Vectors., FEBS Lett, 532, 36-44 (2002) 、および、Torchilin, V. P. et al., Cell Transfection in Vitro and In Vivo with Nontoxic TATPeptide-liposome-DNA Complexes., Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 1972-7 (2003) に記載のものを含む。
【０１２２】
また、電気穿孔法（エレクトロポレーション）などの付加的な技法も使用することができる。電気穿孔法の例は、 Glogauer, M. & McCulloch, C. A., Introduction of Large Molecules into Viable Fibroblasts by Electroporation: Optimization of Loading and Identification of Labeled Cellular Compartments., Exp Cell Res, 200, 227-34 (1992) 、 Teruel, M. N.& Meyer, T.,Parallel Single-cell Monitoring of Receptor-triggered Membrane Translocation of a Calcium-sensing Protein Module., Science, 295, 1910-2 (2002) 、および Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J. & Meyer, T., A Versatile Microporation Technique for the Transfection of Cultured  CNS Neurons., J Neurosci Methods, 93, 37-48 (1999) に記載されている。
【０１２３】
バイオセンサーなどの分子を細胞内に導入するための別の手法としては、滲透圧衝撃法（osmotic shock procedure）がある。滲透圧衝撃法の例としては、Okada, C. Y. & Rechsteiner, M., Introduction of Macromolecules into Cultured Mammalian Cells by Osmotic Lysis of Pinocytic Vesicles., Cell, 29,33-41 (1982) 、および Park, R. D., Sullivan, P. C. & Storrie, B., Hypertonic Sucrose Inhibition of Endocytic Transport Suggests Multiple Early Endocytic Compartments., J Cell Physiol, 135, 443-50 (1988) に記載のものが含まれる。
【０１２４】
また、当業者は、ビーズ／シリンジ担持法 （ bead/syringe loading ） を用いて、本発明に係るバイオセンサーを細胞内に導入することができる。ビーズ／シリンジ担持法は、McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F. & Taylor, D. L., A Method for Incorporating Macromolecules into Adherent Cells, J Cell Biol., 98, 1556-1564
(1984) 、および McNeil, P. L. & Warder, E., Glass Beads Load Macromolecules into Living Cells., Journal of Cell Science, 88, 669-678 (1987) に記載されている。
【０１２５】
本発明に係る結合ドメインをコードする核酸は、例えば形質導入もしくは他の形態変化を用いて、プラスミドを発現した細胞内に任意に導入することができる。生細胞の内側に入ると、結合ドメインが核酸から機能性ペプチドへと翻訳されうる。例えば、発現した結合ドメインに結合するように拡散注入法を用いることによって、本発明に係る色素を細胞内に入れ込み、in situでバイオセンサーを生成することができる。
【０１２６】
任意に、バイオセンサー系全体を、検知部分を含んだプラスミド上にコードすることもできる。例えば、 GTP加水分解酵素（GTPアーゼ）の活性についてのセンサーは、
GTP加水分解酵素の一本鎖ペプチド、ひとつもしくは複数の検知部分、および活性化した GTP加水分解酵素に結合するドメイン、をこの順にコードする拡散を含むことができる。本発明では、検知部分は、シグナリング因子として機能するポリペプチドである。検知部分は、外部からの光に曝露して、公知の波長で発光するような任意のポリペプチドとすることができる。検知部分の例としては、緑色蛍光蛋白質（green fluorescent protein; GFP）の変異体であるシアン蛍光蛋白質（cyan fluorescent protein; CFP）および黄色蛍光蛋白質（yellow fluorescent protein; YFP ）が含まれる。例示的な GTP加水分解酵素としては、例えば、Rho、 Rac 、 Arf 、CDC42 、などを含むことができる。発現時には、例えば、 GTP加水分解酵素を活性化する細胞内の条件によって、ドメインとGTP加水分解酵素との結合を起こすことができ、このとき、CFP と YFP との間の距離、向き、会合が、 FRET シグナルの変化を伴いつつ変化する。この按排は、重要な調節相互作用と、バイオセンサーの鎖の端にGTP加水分解酵素が在ることから無疵で残る膜局在化配列（membrane localization sequences） とについて利点を持つことができ、さらには強いFRET シグナルをも得ることができる。このタイプのバイオセンサーはこれまで進展してきたものであって、生細胞中でのGTP加水分解酵素の活性化を監視するために用いられている。バイオセンサーのすべての成分を、遺伝子的にコードされた一本鎖として発現することにより、例えば、トランスフェクションによるバイオセンサーの投与ができるようになり、また、安定したバイオセンサー細胞株を産生できるようになる、という利点を得ることができる。
【０１２７】
［ターゲット-バイオセンサー結合反応の検出］
広汎な結合反応を、本発明に係るバイオセンサーを用いて検出および監視することができ、例えば、蛋白質-蛋白質相互作用、受容体-リガンド相互作用、核酸相互作用、蛋白質-核酸相互作用、および類似物といったものが対象となる。ターゲット分子の検出によって、特定の状態におけるターゲットの同定、ターゲットの定量、および／もしくはターゲットの局在化、を行うことが可能となる。複数の測定によって、動態の測定が可能になる。複数のターゲットを監視することができれば、異なるシグナリング活性間のバランスを監視することができる。細胞内環境においては、これらのタイプの反応の多くが、細胞内のシグナル伝達の複雑なステップに関与している。例えば、細胞の特定の現象の活性化が、細胞表面の受容体と、そのリガンドとの相互作用によって誘発されることがある。受容体からのシグナルは、酵素と、他の蛋白質（例えば、キナーゼ）との結合を介して伝達させることがあり、その後、この他の蛋白質は、最終的な細胞系応答が行われるまでの間、シグナルを細胞へと走らせる。多くの場合、シグナルもしくは最終的な応答は、本発明に係るバイオセンサーを用いて検出することができる。例えば、シグナル伝達は、系の分子のリン酸化を含むことがあり、これは、結合部位に含まれるリン酸から直接検出することもでき、あるいは、リン酸化に起因する構造変化を通して間接的に検出することもできる。
【０１２８】
或る実施形態においては、本発明は、生細胞中の内因性蛋白質の活性化状態を確認するための方法を提供する。さまざまなプロセス（例えば、エンドサイトーシス）の間における受容体のリン酸化および活性化の、空間的調節、時間的調節、ならびに分劃的調節の、同定、定量、ならびに分析を、本発明に係るバイオセンサーによって行うことができる。別の実施形態においては、乳癌の増大および進行への、細胞上皮増殖因子受容体（EGFR）の影響を、本発明に係るバイオセンサーおよび方法によって観察することができる。さらなる実施形態においては、HIV gp120 と CD4 細胞受容体との複合体の形成を監視することもできる。
【０１２９】
本発明では、結合相互作用は、バイオセンサーと、ひとつもしくは複数のターゲット分子または細胞の成分との間で発生しうる。「所望のターゲット分子」とは、当業者にとって公知であり、本発明に係るバイオセンサーとの相互作用に応じて選択された分子のことである。ターゲット分子は、供試溶液または細胞の、標識されていないおよび／もしくはタグ付けされていない内因性成分を含むことがある。内因性成分は、例えば、天然に細胞に発現するものであってもよく、あるいは、細胞内に適切な遺伝子的構造体を導入した結果として存在するものであってもよい。例えば、核酸もしくは蛋白質であるターゲット分子は、細胞内で、天然に発現する（例えば、本来的に）か、あるいは、細胞株に導入された適切な遺伝子的構造体の誘導によって発現するかのいずれかとすることができる。
【０１３０】
［バイオセンサー検出にかける細胞］
本発明に係る方法およびバイオセンサーは、実質的に任意のタイプの生物細胞（例えば、哺乳類、真菌、細菌、酵母、昆虫、および植物の細胞）の表面の内外のターゲット分子の検出にあたって有用である。いくつかの実施形態においては、哺乳類（例えば、ヒト）、昆虫、細菌細胞、もしくは真菌細胞から新鮮に単離した細胞中から、ターゲット分子を検出することができる。例えば、B細胞、T細胞、単球、および好中球、ならびに類似物といった血液細胞を、本発明に係るバイオセンサーで検知することができる。他の実施形態においては、CHO、HEK-293、L細胞株、3T3細胞株、COS、もしくはTHP-1細胞株といった、安定維持された細胞株を、本発明に係る方法で調査することができる。
【０１３１】
任意のタイプの細胞から、本発明に係るバイオセンサーおよび方法を用いて有用な情報を得ることができる。例えば、ヒト蛋白質を、天然にもしくは組換え体的に発現するような、ヒト細胞もしくは動物細胞といった哺乳類細胞に対して、ヒトの治療法としてのポテンシャルを認定するために評価することも、生分子間の相互作用を観察することも、ならびに／あるいは、哺乳類の系とヒトの系の、リガンド、薬剤、および他の分子の影響を研究することもできる。別の実施例では、真菌細胞もしくは細菌細胞を用いて、抗生物質もしくは抗菌剤としてのポテンシャルを求めてスクリーニングすることもできる。
【０１３２】
いくつかの実施形態においては、ヒト細胞の機能の予測モデルとして公知であるような能く特徴づけられた細胞株を、薬学的もしくは医学的研究に用いて、ヒトの系と相関する結果を得ることができる。このような研究で有用である細胞株の例としては、COS細胞株、 CHO 細胞株、HEK-293細胞株、RBL-1、Jurkat、U937、および YB-1 細胞株が含まれる。
【０１３３】
監視する細胞は、固定化形態にすることもでき、あるいは、懸濁培養液として使うこともできる。固定化した細胞（例えば、細胞叢（cell lawns）、組織切片、もしくはライブラリ）を、例えば顕微鏡分光、スキャナー、またはイメージングシステムを用いて、監視することができる。固定化された細胞は、生かしたまま監視することもでき、あるいは、殺した細胞中のターゲット分子を検出するために固着してもよい。
【０１３４】
多くの実施形態においては、本発明に係るバイオセンサーでのターゲット分子の検出にかける細胞を、懸濁液中に入れる。懸濁させる細胞は、懸濁細胞培養液から得た細胞、または、組織もしくは叢から遊離した細胞、とすることができる。懸濁させる細胞は、流体系（例えば、セルソーター（細胞分取器）、セルカウンター（細胞計数器）、および微小流体システムなど）中での操作と監視にあたって特に適切である。細胞懸濁液には、使用する操作系および検出方法に対して適切な細胞密度を持たせることができる。最適な細胞密度の決定は、当業者にとってはありふれた作業である。本発明に係るフロースルー方式（flow-through） の実施形態においては、監視する懸濁液中の細胞密度は、例えば反応容器中もしくは検出流路中で、概して約 1cell/nl 〜約30cells/nlの範囲とする。試験管もしくはマルチウェルプレートでの反応の場合には、細胞密度は、典型的には約 1,000cells/mm2〜約100,000cells/mm2 の範囲とする。当然ながら、例えば、使用する細胞のタイプ、使用するバイオセンサーのタイプ、研究対象のタイプ、細胞の容器表面への相対的な接着力、または他の要素に基づいて、これらの範囲を変えることもできる。
【０１３５】
［バイオセンサーキット］
本発明は、ターゲット分子を、検出、監視、またはその他を観察するための、キットもしくは他の容器といった包装済組成物もさらに提供する。このキットもしくは容器には、本発明に係るバイオセンサーと、このバイオセンサーを用いてターゲット分子を検出、監視、もしくはその他を観察するための手引きとを収めることができる。このバイオセンサーは、少なくともひとつの結合ドメインと、色素とを含む。或る実施形態においては、キットは、scFv結合ドメインおよび色素を含んだバイオセンサーを収めた容器を含む。別の実施形態として、キットもしくは容器には、本発明に係る色素と、この色素を使用するための手引きとを収める。いくつかの実施形態においては、色素を含んだキットには、当業者が選択する結合ドメインに色素を結合させるための手引きを収めることができる。
【０１３６】
また、本発明に係るキットは、本発明に係る色素もしくはバイオセンサーを操作または使用する上で有用であるような、溶液あるいは道具を具えた容器、を含むことができる。こうした道具には、本発明に係る色素を選択した結合ドメインに結合させるための、バッファー（緩衝液）、反応管、試薬、および類似物、が含まれる。或る実施形態においては、キットが、本発明に係る色素を、選択した結合ドメインに結合させやすくするための溶媒および／もしくはバッファーの溶液、ならびに／あるいは、色素-結合ドメインの複合化反応をクエンチするためのメルカプトエタノール溶液、を含むことができる。また、キットには、だいたい中性のpHであるバッファー（例えば、リン酸ナトリウムバッファー、pH7.5）の容器を含めることができる。
【０１３７】
下記の実施例は、本発明を示すものであるが、限定をするものでは無い。厖大な種類の変形および加工を、本発明の範囲から逸脱すること無く、記載した本発明に対して施すことが可能である。
【０１３８】
［実施例1： 色素の合成］
この実施例では、色素 1a の有用且つ水溶性の誘導体の合成について記載する。例えば、色素 1a 中の四級アミノ基を、さらに強い親水性を持つスルホナト基（-SO3Na）で置換することによって、新規なアナログを作成した。いくつかのアナログには、結合ドメインと共有結合をするための、システイン選択性ヨードアセトアミド基を（例えば、R2に）加えた。
【０１３９】
構造式 1〜4 を有する色素を合成した。構造式 1 は下記である。
【０１４０】
【化２１】
2007529718.tif 000020
【０１４１】
構造式 1 のことを、本明細書中では S-TBA とも称する。構造式 1a〜1h の化合物を含む多数の特定の色素化合物が、構造式 1 に従って作成された。色素化合物1a〜1hのそれぞれについて存在した置換基は以下であった。
1a: R1 = -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCS;R2 = H; R3= ブチル基
1b: R1 = エチル基; R2 = H; R3 = メチル基
1c: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = H; R3= メチル基
1d: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = FmocNH-; R3 = メチル基
1e: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = NH2; R3 = メチル基
1f: (S-TBA-IAA): R1= -(CH2)3-SO3-;R2 = ICH2CONH2; R3 = メチル基
1g: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = CH3CONH-; R3 = メチル基
1h: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = HO(CH2)2-S-CH2CONH-; R3= メチル基
構造式 2 は下記である。
【０１４２】
【化２２】
2007529718.tif 000021
【０１４３】
また、構造式 2 は、本明細書中では S-SO とも称する。構造式 2a〜2g の化合物を含む多数の特定の色素化合物が、構造式 2 に従って作成された。色素化合物
2a〜2g のそれぞれについて存在した置換基は以下であった。
2a: R1 = エチル基; R2 = H
2b: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = H
2c: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = FmocNH-
2d: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = NH2
2e: (S-SO-IAA): R1= -(CH2)3-SO3-;R2 = ICH2CONH-
2f: (S-SO-OSu): R1= -(CH2)3-SO3-;R2 = SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-
2g: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = HO(CH2)2S-CH2CONH-
構造式 3 は下記であって、
【０１４４】
【化２３】
2007529718.tif 000022
【０１４５】
また、構造式 3 は、本明細書中では I-TBA とも称する。構造式 3a〜3b の化合物を含む多数の特定の色素化合物が、構造式 3 に従って作成された。色素化合物
3a〜3b のそれぞれについて存在した置換基は以下であった。
3a: R1 = エチル基; R2 = H
3b: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = H
構造式 4 は下記である。
【０１４６】
【化２４】
2007529718.tif 000023
また、構造式 4 は、本明細書中では I-SO とも称する。構造式 4a〜4g の化合物を含む多数の特定の色素化合物が、構造式 4 に従って作成された。色素化合物
4a〜4g のそれぞれについて存在した置換基は以下であった。
4a: R1 = メチル基; R2 = H
4b: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = H
4c: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = FmocNH-
4d: R1 = -(CH2)3-SO3-;R2 = NH2
4e: (I-SO-IAA): R1= -(CH2)3-SO3-;R2 = ICH2CONH-
4f: (I-SO-OSu): R1= -(CH2)3-SO3-;R2 = SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-
4g: R1 = -(CH2)3-SO3-；R2 = HO(CH2)2S-CH2CONH-
これらの化合物は、図８に示したように合成された。使用した物質および方法についての説明は後述する。
【０１４７】
［物質］
分析用試薬を、大手仕入先から購入した。 UV〜可視光スペクトルを、 Hewlett-Packard 8453 ダイオードアレイ分光計を用いて測定した。発光スペクトルおよび励起スペクトルを、SpexFluorolog 2 蛍光分光計を 23℃で用いて測定した。量子収量を、メロシアニン540（Onganer et al., J. Phys. Chem., 1993, 97, 2344-54）を内部標準として用いて測定した。 Demas et al., J. Phys. Chem., 1971, 75,991-1024 。対照実験では、これらの色素の蛍光が酸素でクエンチされず、これはおそらく色素の寿命が短いためであろうと考えられたため、溶液は脱気しなかった。IonSpec FT MS 分光計（MALDI-FT MS）、Hewlett-Packard 5890 ガスクロマトグラフと 5971 A 質量選択検出計（MS-EI）、ならびに、1100 質量選択検出計（MS-ESI）を具えたHewlett-Packard 1100 高速液体クロマトグラフから、質量スペクトルを得た。 CDCl3もしくはCD3SOCD3中の 0.5% 溶液の 1H スペクトルを、 Bruker DRX-400 分光計もしくはDRX-500 分光計で記録した。 CDCl3の残留プロトン（7.27ppm）、もしくは CD3-SOCD3の残留プロトン（2.49ppm）に対応するピークを、内部標準として用いた。色素に関するすべての操作は、低照度下で行った。色素を収めたフラスコは、アルミニウムホイルで包んだ。
【０１４８】
3-(2,3,3-トリメチル-3H-インドリウム-1-イル)プロパン-1-スルホナート （５） を、Flannagan et al., Bio conj. Chem.,1997, 8, 751-756 に従前に述べられた方法によって調製した。
【０１４９】
3-(2-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-3-イウム-3-イル)プロパン-1-スルホナート （６） を、 Lednev et al., Spectrochim. Acta, Part A, 1993, 49A, 1055-1056 に従前に述べられた方法によって調製した。
【０１５０】
沃化=3-エチル-2-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-3-イウム （７） 、 66 1-ベンゾチオフェン-3(2H)-オン=1,1-ジオキシドを、Regitz, M., Chem. Ber., 1965, 98, 36-45 に従前に述べられた方法によって調製した。
【０１５１】
2,3,3-トリメチル-3H-インドール-5-アミンを、 Mujumdar et al., Cytometry, 1989, 10, 11-19 に従前に述べられた方法によって調製した。
【０１５２】
2-methyl-1,3-ベンゾチアゾール-6-アミンを、 Manning, W. B.; Horak, V., Synthesis, 1978, 5,363 に従前に述べられた方法によって調製した。
【０１５３】
化合物の化学名は、 Advanced Chemistry Development Inc.: Toronto, Canada から購入したACD/Chem-Sketchソフトウェアを使用して得た。
【０１５４】
［ 5-[(2E)-3-メトキシプロパ-2-エニリデン]-1,3-ジメチル-2-チオオキソジヒドロピリミジン-4,6(1H,5H)-ジオン 5-[(2E)-3-Methoxyprop-2-enylidene]-1,3-dimethyl-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione（８） ］
1,3,3-トリメトキシプロペン（1.32g, 10mmol）を、 1,3-ジメチル-2-チオバルビツール酸（1.29g, 7.5mmol）の 10mL CHCl3-MeOH（1:1）煮沸混合液中に素早く加えた。還流を5分間続けた後、溶液を室温まで冷却した。得られた固体を濾過して、少量のMeOHで洗い、乾燥させた。収量は 1.20g（75%）であった。 1H NMR (400MHz, CDCl3):δ3.71(s, 6H, 2 x CH3) 、 3.96 (s, 3H, OCH3) 、 7.48 (t, 3JH-H=12.5Hz, 1H) 、 7.56 (d, 3JH-H =12.5Hz, 1H) 、 8.11 (d, 3JH-H=12.5Hz, 1H) 。 GC-MS (70eV) m/e（相対強度）: 240 (100, M+) 、 209 (25, (M - OCH3)+) 。
【０１５５】
［ (2E)-2-[(2E)-3-メトキシプロパ-2-エニリデン]-1-ベンゾチオフェン-3(2H)-オン=1,1-ジオキシド (2E)-2-[(2E)-3-Methoxyprop-2-enylidene]-1-benzothiophen-3(2H)-one 1,1-Dioxide （９）］
1,3,3-トリメトキシプロペン（2.64g, 20mmol）と、 1-ベンゾチオフェン-3(2H)-オン=1,1-ジオキシド（1.82g, 10mmol）との混合物を、90℃で12時間加熱した。得られた固体を、MeOHから再結晶して、 1.88g（収率 75% ）の最終生成物を得た。 1H NMR (400MHz, CDCl3):δ4.02(s, 3H, OCH3) 、 6.51 (t, 3JH-H= 12.3Hz, 1H) 、7.51〜8.11 (m, 6H)。 GC-MS (70eV) m/e（相対強度）: 250 (65, M+) 、 219 (100, (M -OCH3)+) 。
【０１５６】
［全般的な方法 A （色素 3a, 4a ）］
2-メチレン-1,3,3-トリメチルインドレニン（300mg, 1.9mmol）を、 500mg（2.00mmol）のエノールエーテル 8 もしくは 9 の5.0mLメタノールクロロホルムの煮沸混合液（1:1）へと一度に加えた。反応混合液を、還流させながら30分間に亘って攪拌した。冷却した後に、色素を結晶状固体として分離した。色素を、メタノールから再結晶してさらに精製した。
【０１５７】
［ 1,3-ジメチル-2-チオオキソ-5-[(2E,4Z)-4-(1,3,3-トリメチル-1,3-ジヒドロ-2H-インドール-2-イリデン)ブタ-2-エニリデン]ジヒドロピリミジン-4,6(1H,5H)-ジオン 1,3-Dimethyl-2-thioxo-5-[(2E,4Z)-4-(1,3,3-trimethyl-1,3-dihydro-2H-indol-2-ylidene)but-2-enylidene]dihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione（３ａ）］
収率は 75% であった。 1H NMR (500MHz, CDCl3): δ1.74 (s, 6H, C(CH3)2)、3.56 (s, 3H, NCH3) 、 3.88 (s, 6H, 2 x CH3) 、 6.09 (d, 3JH-H= 12.5Hz, 1H) 、 7.06〜8.22 (m, 6H) 。 MALDI-FTMS: MH+ の実測値 382.1584 、予測値382.1584 。
【０１５８】
［ (2Z)-2-[(2E,4Z)-4-(1,3,3-トリメチル-1,3-ジヒドロ-2H-インドール-2-イリデン)-ブタ-2-エニリデン]-1-ベンゾチオフェン-3(2H)-オン=1,1-ジオキシド (2Z)-2-[(2E,4Z)-4-(1,3,3-Trimethyl-1,3-dihydro-2H-indol-2-ylidene)-but-2-enylidene]-1-benzothiophen-3(2H)-one 1,1-Dioxide （４ａ） ］
収率は 68% であった。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ1.70 (s, 6H, C(CH3)2)、 3.60 (s, 3H, NCH3) 、 6.33 (d, 3JH-H=13.6Hz, 1H) 、 6.71 (t, 3JH-H = 13.2Hz, 1H) 、 7.2〜8.0(m,8H), 8.28 (t, 3JH-H = 13.6Hz, 1H) 。 MALDI-FTMS: MH+の実測値392.1313、予測値 392.1315 。
【０１５９】
［全般的な方法 B （色素 1b, 1c, 2a, 2b, 3b, 4b ）］
インドリウム塩もしくはベンゾチアゾリウム塩 5, 6, もしくは 7 （1.00mmol）を、エノールエーテル 8 もしくは 9 （500mg,2.00mmol）の5.0mL メタノール-クロロホルムの煮沸混合液（1:1）へと一度に加えた。反応混合液を、還流させながら30分間に亘って攪拌した。冷却した後に、色素を結晶状固体として分離した。色素を、メタノールから再結晶してさらに精製した。
【０１６０】
［ 1,3-ジメチル-5-[(2E,4E)-4-(3-エチル-1,3-ベンゾチアゾール-2(3H)-イリデン)-ブタ-2-エニリデン]-2-チオオキソジヒドロピリミジン-4,6(1H,5H)-ジオン 1,3-Dimethyl-5-[(2E,4E)-4-(3-ethyl-1,3-benzothiazol-2(3H)-ylidene)-but-2-enylidene]-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione（１ｂ）］
収率は 85% であった。 1H NMR (500MHz, CDCl3): δ1.55 (t, 3JH-H=6.6Hz,3H, CH3)、 3.86 (s, 6H, 2 x CH3) 、 4.26 (q, 3JH-H=6.6Hz, 2H, CH2N) 、 6.27 (d, 3JH-H= 12.8Hz, 1H) 、 7.40〜8.06 (m, 7H) 。 MALDIFTMS: MH+ の実測値 386.0989 、予測値386.0991。
【０１６１】
［ 3-[(2E)-2-[(2E)-4-(1,3-ジメチル-4,6-ジオキソ-2-チオオキソテトラヒドロ-ピリミジン-5(2H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル]プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-[(2E)-2-[(2E)-4-(1,3-Dimethyl-4,6-dioxo-2-thioxotetrahydro-pyrimidin-5(2H)-ylidene)but-2-enylidene]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl]propane-1-sulfonate（１ｃ）］
収率は 82% であった。 1H NMR (500MHz, CDCl3): δ2.03 (p, 3JH-H=7.0Hz, 2H, 
【化２５】
2007529718.tif 000024
) 、 2.60 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2SO3)、3.58 (s, 6H, 2 x CH3) 、 4.61 (t, 3JH-H = 7.0Hz,2H, CH2N) 、 6.91 (d, 3JH-H = 13.6Hz, 1H) 、7.40〜8.06 (m, 7H) 。 MALDI-FTMS MH+ の実測値 502.0545 、予測値 502.0536。
【０１６２】
［ (2Z)-2-[(2E,4E)-4-(3-エチル-1,3-ベンゾチアゾール-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-1-ベンゾチオフェン-3(2H)-オン=1,1-ジオキシド (2Z)-2-[(2E,4E)-4-(3-Ethyl-1,3-benzothiazol-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-1-benzothiophen-3(2H)-one 1,1-Dioxide （２ａ） ］
収率は 70% であった。 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ1.29 (t, 3JH-H= 6.6Hz, 3H, CH3) 、 4.40 (q, 3JH-H= 6.6Hz, 2H,CH2N) 、 6.57 (t, 3JH-H = 13.6Hz, 1H) 、 6.71(d,3JH-H
= 13.6Hz, 1H), 7.3〜7.8 (m, 10H) 。 MALDI-FTMS: MH+の実測値 396.0728、予測値 396.0723 。
【０１６３】
［ 3-[(2E)-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル]プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-[(2E)-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-Dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl]propane-1-sulfonate（２ｂ） ］
収率は 67% であった。 1H NMR (500MHz, DMSOd6): δ1.85 (p, 3JH-H=7.0Hz, 2H,
【０１６４】
【化２６】
2007529718.tif 000025
) 、 2.60 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2SO3)、4.44 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2N) 、6.67 (t, 3JH-H= 12.8Hz, 1H) 、 6.87 (d, 3JH-H= 13.2Hz, 1H) 、 7.40〜8.10(m, 10H) 。 ESI-MS: 490 (M - Na + 2H)+ 。
【０１６５】
［ 3-{(2Z)-2-[(2E)-4-(1,3-ジメチル-4,6-ジオキソ-2-チオオキソテトラヒドロ-ピリミジン-5(2H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-3,3-ジメチル-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-1-イル}プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-{(2Z)-2-[(2E)-4-(1,3-Dimethyl-4,6-dioxo-2-thioxotetrahydro-pyrimidin-5(2H)-ylidene)but-2-enylidene]-3,3-dimethyl-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl}propane-1-sulfonate（３ｂ）］
収率は 70% であった。 1H NMR (500MHz, CDCl3): δ1.74 (s, 6H, C(CH3)2)、2.05 (p, 3JH-H = 7.0Hz, 2H,
【０１６６】
【化２７】
2007529718.tif 000026
) 、 2.63 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2SO3)、3.67 (s, 6H, 2 x CH3) 、 4.34 (t, 3JH-H =7.0Hz, 2H, CH2N) 、 6.58 (d, 3JH-H = 12.6Hz,1H), 7.2〜8.4 (m, 7H) 。 ESI-MS: 490 (M - Na + 2H)+。
【０１６７】
［ 3-{(2Z)-5-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-3,3-ジメチル-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-1-イル}プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-{(2Z)-5-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-Dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-3,3-dimethyl-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl}propane-1-sulfonate （４ｂ） ］
収率は 65% であった。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ1.74 (s, 6H,C(CH3)2) 、 2.05(p, 3JH-H = 7.0Hz,2H,
【０１６８】
【化２８】
2007529718.tif 000027
) 、 2.63 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2SO3)、4.25 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2N) 、6.47 (d, 3JH-H= 13.6Hz, 1H) 、 6.72 (t, 3JH-H= 13.2Hz, 1H) 、 7.2〜8.4 (m,10H)。 ESI-MS: 500 (M - Na + 2H)+ 。
【０１６９】
［チオール反応性 S-TBA-IAA （１ｆ） 、 S-SO-IAA （２ｅ） 、および I-SO-IAA （４ｅ） 色素の調製］
［ 2-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-6-イルカルバミン酸=9H-フルオレン-9-イルメチル 9H-Fluoren-9-ylmethyl 2-Methyl-1,3-benzothiazol-6-ylcarbamate （１０） ］
1.64g（0.01mol）の 2-メチル-6-アミノベンゾチアゾール試料を、室温で、FMOC-Clのクロロホルム溶液 （2.59 g, 0.01mol）と炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との1:1 混合液
40mL に、少量ずつ加えた。添加が完了した後、攪拌を1時間続けた。有機層を分取して、水（2 x 20mL）で洗い、MgSO4で脱水した。溶媒を真空で除去し、固体残留物をメタノールから再結晶して、 3.0g（80%）の保護済アミンを得た。 1H NMR(400MHz, CDCl3): δ2.79 (s, 3H, CH3) 、4.27 (t, 3JH-H= 6.2Hz, 2H, OCH2) 、 4.58 (d, 3JH-H= 6.2Hz,1H, CH) 、 6.8〜7.8 (m, 11H, 芳香環) 、 8.3 (bs, 1H, NH) 。 ESI-MS: 387 (MH+)。
【０１７０】
［ 2,3,3-トリメチル-3H-インドール-5-イルカルバミン酸=9H-フルオレン-9-イルメチル 9H-Fluoren-9-ylmethyl 2,3,3-trimethyl-3H-indol-5-ylcarbamate（１１） ］
表記の化合物を、 （１０） と同様の方法で調製した。保護済アミンを、ジクロロメタンを溶離液として用いたシリカのクロマトグラフィーによって精製した。収量は
2.85g（72%）であった。 1H NMR (400MHz, CDCl3): δ2.79 (s, 3H, CH3)、4.27 (t, 3JH-H = 6.2Hz, 2H, OCH2) 、 4.58 (d, 3JH-H= 6.2Hz, 1H, CH) 、 6.8〜7.8 (m, 11H, 芳香環)、 8.3 (bs, 1H, NH) 。 ESI-MS: 397 (MH+)。
【０１７１】
［ 2-メチル-3-(3-スルホナトプロピル)-1,3-ベンゾチアゾール-6-イルカルバミン酸=9H-フルオレン-9-イルメチル 9H-Fluoren-9-ylmethyl 2-Methyl-3-(3-sulfonatopropyl)-1,3-benzothiazol-6-ylcarbamate（１２） ］
保護済アミン（8mmol）と、 1,3-プロパンスルホン（1.83g, 15mmol）を 10mL の 1,2-ジクロロベンゼンに溶かしたものとの混合液を、120℃で十二時間に亘って加熱した。固体を濾別して、熱ベンゼンと熱メタノールで洗って、白色固体を得た。収量は3.45g（87%）であった。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ2.18 (p, 3JH-H= 6.2Hz, 2H, 
【０１７２】
【化２９】
2007529718.tif 000028
) 、 2.68 (t, 3JH-H = 6.2Hz, 2H,
【０１７３】
【化３０】
2007529718.tif 000029
) 、 3.20 (s, 3H, CH3) 、 4.42 (t, 3JH-H=6.6Hz,1H, 
【０１７４】
【化３１】
2007529718.tif 000030
) 、 4.66 (d, 3JH-H = 6.6Hz, 2H,
【０１７５】
【化３２】
2007529718.tif 000031
) 、 4.91 (t, t, 3JH-H = 6.2Hz, 2H, CH2-N) 、7.3〜8.5(m, 10H) 、 10.34 (bs, 1H)。 ESI-MS: 509 (MH+) 。
【０１７６】
［ 3-(5-{[(9H-フルオレン-9-イルオキシ)カルボニル]アミノ}-2,3,3-トリメチル-3H-インドリウム-1-イル)プロパン-1-スルホナート 3-(5-{[(9H-Fluoren-9-yloxy)carbonyl]amino}-2,3,3-trimethyl-3H-indolium-1-yl)propane-1-sulfonate（１３）］
表記の化合物を、 （１２） と同様の方法で調製した。収率は 80% であった。 1H NMR(500MHz, DMSO-d6):δ1.55 (s, 6H, 2 x CH3) 、 2.21 (p, 3JH-H=6.2Hz, 2H, 
【０１７７】
【化３３】
2007529718.tif 000032
) 、 2.70 (t, 3JH-H = 6.2Hz, 2H,
【０１７８】
【化３４】
2007529718.tif 000033
) 、 2.84 (s, 3H, CH3) 、 4.40 (t, 3JH-H= 6.6Hz,1H,
【０１７９】
【化３５】
2007529718.tif 000034
) 、 4.56 (d, 3JH-H = 6.6Hz, 2H,
【０１８０】
【化３６】
2007529718.tif 000035
) 、 4.67 (t, 3JH-H = 6.2Hz, 2H,
【０１８１】
【化３７】
2007529718.tif 000036
) 、 7.3〜8.1 (m, 10H) 、 10.34 (bs, 1H) 。 ESI-MS: 519 (MH+) 。
【０１８２】
［保護済色素 1d, 2c, 4c の調製］
これらの色素を、全般的な方法 B を用いて、四級塩 12 もしくは 13 と、エノールエーテル 8 もしくは 9 とから調製した。
【０１８３】
［ 3-[(2Z)-{[(9H-フルオレン-9-イルオキシ)カルボニル]アミノ}-2-[(2E)-4-(1,3-ジメチル-4,6-ジオキソ-2-チオオキソテトラヒドロピリミジン-5(2H)-イリデン)-ブタ-2-エニリデン]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル]プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-[(2Z)-{[(9H-Fluoren-9-yloxy)carbonyl]amino}-2-[(2E)-4-(1,3-dimethyl-4,6-dioxo-2-thioxotetrahydropyrimidin-5(2H)-ylidene)-but-2-enylidene]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl]propane-1-sulfonate（１ｄ）］
収率は 90% であった。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ2.09 (p, 3JH-H= 7.0Hz, 2H, 
【０１８４】
【化３８】
2007529718.tif 000037
) 、 2.49 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-SO3)、 3.66 (s, 6H, 2 x CH3) 、 4.40 (t, 3JH-H =6.2Hz, 1H, 
【０１８５】
【化３９】
2007529718.tif 000038
) 、 4.60〜4.70 (m, 4H, 
【０１８６】
【化４０】
2007529718.tif 000039
, N-CH2) 、 6.8〜8.5 (m, 15H) 、 10.15 (bs, 1H) 。 MALDI-FTMS: MH+の実測値739.1343 、予測値 739.1325 。
【０１８７】
［ 3-[(2E)-6-{[(9H-フルオレン-9-イルオキシ)カルボニル]アミノ}-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル]プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-[(2E)-6-{[(9H-Fluoren-9-yloxy)carbonyl]amino}-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl]propane-1-sulfonate （２ｃ）］
収率は 85% であった。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ2.03 (p, 3JH-H= 7.0Hz, 2H, 
【０１８８】
【化４１】
2007529718.tif 000040
) 、 2.61 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-SO3)、4.39 (t, 3JH-H = 6.2Hz, 1H,
【０１８９】
【化４２】
2007529718.tif 000041
) 、 4.50〜4.70 (m, 4H, CH2-N,
【０１９０】
【化４３】
2007529718.tif 000042
) 、 6.5〜8.0 (m, 19H) 、 10.2 (bs, 1H) 。 MALDI-FTMS: MH+ の実測値 749.1033、予測値 749.1056 。
【０１９１】
［ 3-{(2Z)-5-{[(9H-フルオレン-9-イルオキシ)カルボニル]アミノ}-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-3,3-ジメチル-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-1-イル}プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-{(2Z)-5-{[(9H-Fluoren-9-yloxy)carbonyl]amino}-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-3,3-dimethyl-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl}propane-1-sulfonate（４ｃ）］
収率は 90% であった。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ1.67 (s, 6H, 2x CH3) 、 2.05(p, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, 
【０１９２】
【化４４】
2007529718.tif 000043
) 、 2.65 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-SO3)、 4.24 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-N) 、 4.38(t, 3JH-H= 6.6Hz, 1H,
【０１９３】
【化４５】
2007529718.tif 000044
) 、 4.54 (d, 3JH-H = 6.6Hz, 2H,
【０１９４】
【化４６】
2007529718.tif 000045
) 、 6.4〜8.5 (m, 19H) 、 9.95 (bs, 1H) 。 ESI-MS: 737.2 (M - Na + 2H)+。
【０１９５】
［Fmoc基の脱保護のための全般的な方法］
［色素 1e, 2d, 4d の調製］
Fmoc-保護をした色素（1.00mmol）と、酢酸ナトリウム（10mg, 0.12mmol）を、15mL のジメチルスルホキシドに溶かした混合液を、100℃で10分間攪拌した。混合液を20℃まで冷却して、 50mL のジエチルエーテルを加え、色素を沈澱させた。この色素を、さらなる精製はせずに次のステップに用いた。
【０１９６】
［ 3-[(2Z)-6-アミノ-2-[(2E)-4-(1,3-ジメチル-4,6-ジオキソ-2-チオオキソテトラヒドロピリミジン-5(2H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル]プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-[(2Z)-6-Amino-2-[(2E)-4-(1,3-dimethyl-4,6-dioxo-2-thioxotetrahydropyrimidin-5(2H)-ylidene)but-2-enylidene]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl]propane-1-sulfonate（１ｅ）］
収率は 93% であった。 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ2.00 (p, 3JH-H= 7.0Hz, 2H,
【０１９７】
【化４７】
2007529718.tif 000046
) 、 2.55 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-SO3)、3.61(s, 6H, 2 x CH3)、4.56 (t, 3JH-H=7.0Hz, 2H, CH2-N)、 5.83 (s, 2H, NH2) 、 6.8〜7.8 (m, 7H)。 ESI-MS: 495 (M &#8211; Na + 2H)+。
【０１９８】
［ 3-[(2E)-6-アミノ-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル]-プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-[(2E)-6-Amino-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl]-propane-1-sulfonate（２ｄ）］
収率は 95% であった。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ2.08 (p, 3JH-H= 7.0Hz, 2H,
【０１９９】
【化４８】
2007529718.tif 000047
) 、 2.64 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-SO3)、4.57 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-N) 、5.78 (s,2H, NH2) 、 6.4〜7.8 (m, 11H) 。 ESI-MS: 505 (M - Na + 2H)+。
【０２００】
［ 3-{(2Z)-5-アミノ-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-3,3-ジメチル-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-1-イル}プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-{(2Z)-5-Amino-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-3,3-dimethyl-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl}propane-1-sulfonate（４ｄ）］
収率は 80% であった。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ1.58 (s, 6H, 2x CH3)、 2.03 (p, 3JH-H = 6.2Hz, 2H, 
【０２０１】
【化４９】
2007529718.tif 000048
) 、 2.63 (t, 3JH-H = 6.2Hz, 2H, CH2-SO3)、4.24 (t, 3JH-H = 6.2Hz, 2H, CH2-N) 、5.42 (s,2H, NH2) 、 6.4〜8.5 (m, 11H) 。 ESI-MS: 515 (M - Na + 2H)+。
【０２０２】
［ 3-{(2Z)-5-[(ヨードアセチル)アミノ]-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-3,3-ジメチル-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-1-イル}プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-{(2Z)-5-[(Iodoacetyl)amino]-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-3,3-dimethyl-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl}propane-1-sulfonate（I-SO-IAA）（４ｅ） ］
塩化クロロアセチル（200mg, 1.78mmol）を 2mL の DMF に溶かした溶液を、 250mg（0.47mmol）の色素 21 と 100mg のトリエチルアミンとを10mLの DMF に溶かして冷却（-40℃）した溶液へと、滴下して加えた。添加が完了した後、反応混合液を、-40℃でさらに1時間ほど攪拌した。メタノール（10mL）を反応混合液に加え、温度を室温までゆっくりと上昇させた。ジエチルエーテルを混合液に加え、色素を沈澱させた。粗生成色素を、アセトン-メタノール3:1溶液を溶離液として用いたシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、201mg（70%）の精製クロロアセトアミド色素を得た。この色素を、600mgの沃化ナトリウムを含んだ10mLのメタノール中で、3時間に亘って還流した。この溶液を冷却し、濾過し、さらに真空で 5mL まで濃縮した。色素を 50mL のアセトンで沈澱させた後、濾過して乾燥させた。色素をメタノールから再結晶して精製した。収量は209mg（出発物質である色素21 を基準として 63% ）であった。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6):δ1.69 (s,6H, C(CH3)2) 、 2.03 (p, 3JH-H=7.0Hz, 2H,
【０２０３】
【化５０】
2007529718.tif 000049
) 、 2.63 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-SO3)、3.91 (s, 2H, CH2I) 、 4.24 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H,CH2-N) 、 6.4〜8.3 (m, 11H) 、 10.53 (s, 1H, NH) 。 MALDI-FTMS: MH+の実測値705.0219、計算値 705.0197 。
【０２０４】
［ 3-[(2Z)-2-[(2E)-4-(1,3-ジメチル-4,6-ジオキソ-2-チオオキソテトラヒドロ-ピリミジン-5(2H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-6-[(ヨードアセチル)-アミノ]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル]プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-[(2Z)-2-[(2E)-4-(1,3-Dimethyl-4,6-dioxo-2-thioxotetrahydro-pyrimidin-5(2H)-ylidene)but-2-enylidene]-6-[(iodoacetyl)-amino]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl]propane-1-sulfonate（S-TBA-IAA） （１ｆ） ］
この色素を、色素 4e と同一の方法で、色素 1e から出発して調製した。この色素をメタノールから再結晶して精製した。収率は 65% であった。 1HNMR (400MHz, DMSO-d6): δ2.07 (p, 3JH-H =7.0Hz,2H,
【０２０５】
【化５１】
2007529718.tif 000050
) 、 2.61 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H,
【０２０６】
【化５２】
2007529718.tif 000051
) 、 3.57 (s, 6H, 2 x CH3) 、 3.93 (s, 2H, CH2I) 、 4.59 (t,3JH-H
= 7.0Hz, 2H, CH2-N) 、 6.8〜8.5 (m, 7H) 、10.5 (s, 1H, NHCO) 。 ESI-MS: 663 (M - Na + 2H)+ 。
【０２０７】
［ 3-[(2E)-6-[(ヨードアセチル)アミノ]-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル]プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-[(2E)-6-[(Iodoacetyl)amino]-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl]propane-1-sulfonate（S-SO-IAA） （２ｅ） ］
この色素を、色素 4e と同一の方法で、色素 2d から出発して調製した。この色素をメタノールから再結晶して精製した。収率は 60% であった。 1HNMR (500MHz, DMSO-d6): δ2.08 (p, 3JH-H =7.0Hz, 2H,
【０２０８】
【化５３】
2007529718.tif 000052
) 、 2.67 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-SO3)、3.93 (s, 2H, CH2I) 、 4.57 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H,CH2-N) 、 6.6〜8.5 (m, 11H)、10.74 (s, 1H, NHCO) 。 MALDI-FTMS: MH+の実測値694.9431、予測値 694.9448 。
【０２０９】
［アミノ反応性の I-SO-OSu 色素 4f および S-SO-OSu 色素 2f の調製］
［ N-(2,3,3-トリメチル-3H-インドール-5-イル)アセトアミド N-(2,3,3-Trimethyl-3H-indol-5-yl)acetamide（１４） および N-(2-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-6-イル)アセトアミド N-(2-Methyl-1,3-benzothiazol-6-yl)acetamide（１５） ］
3mmol のアミン（ 2,3,3-トリメチル-3H-インドール-5-アミン、もしくは、 2-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-6-アミン）を、無水酢酸（10mL）と混合して、混合液を60℃で20分間に亘り加熱した。溶媒を真空で蒸発させて、アルコールから再結晶をするか（ベンゾチアゾール誘導体の場合）、もしくは、酢酸エチルを溶離液として用いたシリカカラムクロマトグラフィーにかけるか（インドレニン誘導体の場合）のいずれかによって、残留物を精製した。
【０２１０】
［ N-(2,3,3-トリメチル-3H-インドール-5-イル)アセトアミド N-(2,3,3-Trimethyl-3H-indol-5-yl)acetamide］
収率は 60% で、黄色粉末として得られた。 1H NMR (400MHz, CDCl3): δ1.26 (s,6H, 2 x CH3)、2.15 (s, 3H, COCH3) 、 2.24 (s, 3H, CH3)、6.8〜7.8(m, 3H, 芳香環) 、8.0 (bs, 1H, NH) 。 ESI-MS: 217 (MH+) 。
【０２１１】
［ N-(2-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-6-イル)アセトアミド N-(2-Methyl-1,3-benzothiazol-6-yl)acetamide］
収率は 80% で、白色粉末として得られた。 1H NMR (500MHz, CDC13): δ2.27 (s,3H, COCH3) 、 2.86 (s, 3H, CH3) 、 7.3〜8.5 (m, 4H, 芳香環, NH)。ESI-MS: 207 (MH+) 。
【０２１２】
［ N-メチル-N-(2,3,3-トリメチル-3H-インドール-5-イル)アセトアミド N-Methyl-N-(2,3,3-trimethyl-3H-indol-5-yl)acetamide（１６） および N-メチル-N-(2-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-6-イル)アセトアミド N-Methyl-N-(2-methyl-1,3-benzothiazol-6-yl)acetamide （１７） ］
以前の合成から得られたアセトアミド 14 もしくは 15 （2.00 mmol）を、 30mL のメチルスルホキシドに溶かした。水素化ナトリウム（鉱油中の60%懸濁液、 2.20mmol）をこの溶液に少量ずつ攪拌しながら加えた。水素を発生させて、混合液を室温で30分間置いた。その後、ジメチルスルホキシド中の沃化メチル（2.2mmol）を、10分間以上かけて滴下して加えた。添加が完了してから、混合液を室温で1時間に亘って攪拌した後、水（100mL）で希釈した。有機物を塩化メチレン（3x 50mL）で抽出した。有機層を併せて、水（2 x 50 mL）で洗った後、脱水した。溶媒を蒸発させて、 N-メチルアセトアミドを得、これをシリカクロマトグラフィーで溶離液として酢酸エチルを用いて精製した。
【０２１３】
［ N-メチル-N-(2-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-6-イル)アセトアミド N-Methyl-N-(2-methyl-1,3-benzothiazol-6-yl)acetamide（１６） ］
収率は 87% で、白色固体として得られた。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ1.87(s, 3H, COCH3) 、 2.84 (s, 3H, CH3) 、 3.29 (s, 3H, NCH3)、7.3〜8.5 (m, 3H, 芳香環)。 ESI-MS: 221 (MH+) 。
【０２１４】
［ N-メチル-N-(2,3,3-トリメチル-3H-インドール-5-イル)アセトアミド N-Methyl-N-(2,3,3-trimethyl-3H-indol-5-yl)acetamide（１７） ］
収率は 72% で、白色固体として得られた。 1H NMR (500MHz, CDCl3): δ1.31 (s,6H, 2 x CH3) 、 1.85 (s, 3H, COCH3) 、 2.29 (s, 3H, CH3)、3.26 (s, 3H, NCH3) 、 7.1〜7.6 (m, 3H, 芳香環) 。 ESI-MS: 231 (MH+)。
【０２１５】
［ N,2-ジメチル-1,3-ベンゾチアゾール-6-アミン N,2-Dimethyl-1,3-benzothiazol-6-amine （１８） およびN,2,3,3-テトラメチル-3H-インドール-5-アミン N,2,3,3-Tetramethyl-3H-indol-5-amine（１９） ］
以前の合成で得られたメチルアセトアミド 18 もしくは 19 （1.5mmol）を、濃塩酸（10mL）と混合し、混合液を還流しながら4時間攪拌した。冷却した後に、6gの水酸化ナトリウムを 50mL の水に溶かした溶液を、混合液に加えた。分取した有機物を、塩化メチレン（3 x 50mL）で抽出した。有機抽出物を併せて水（2 x50mL）で洗った後、脱水した。溶媒を蒸発させて、粗生成メチルアミンを得、これを、シリカカラムクロマトグラフィーで溶離液として酢酸エチルを用いて精製した。
【０２１６】
［ N,2-ジメチル-1,3-ベンゾチアゾール-6-アミン N,2-Dimethyl-1,3-benzothiazol-6-amine （１８） ］
収率は 90% で、白色固体として得られた。 1H NMR (500MHz, CDCl3): δ2.82 (s,3H, CH3) 、 2.94 (s, 3H, NCH3) 、 3.7 (bs, 1H, NH) 、 6.8〜7.3(m,3H, 芳香環) 。 ESIMS: 179 (MH+) 。
【０２１７】
［ N,2,3,3-テトラメチル-3H-インドール-5-アミン N,2,3,3-Tetramethyl-3H-indol-5-amine （１９） ］
収率は 86% で、黄色固体として得られた。 1H NMR (500MHz, CDCl3): δ1.34 (s,6H, 2 x CH3) 、 2.29 (s, 3H, CH3) 、 2.94 (s, 3H, NCH3)、3.52(s, 1H, NH) 、 6.5〜7.5(m, 3H, 芳香環) 。 ESI-MS: 189 (MH+) 。
【０２１８】
［ {2-[メチル(2,3,3-トリメチル-3H-インドール-5-イル)アミノ]-2-オキソエトキシ}-酢酸 {2-[Methyl(2,3,3-trimethyl-3H-indol-5-yl)amino]-2-oxoethoxy}-acetic Acid （２０） および {2-[メチル(2-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-6-イル)-アミノ]-2-オキソエトキシ}酢酸 {2-[Methyl(2-methyl-1,3-benzothiazol-6-yl)-amino]-2-oxoethoxy}acetic Acid （２１） ］
以前の合成から得られた N-メチルアミン（1.0mmol）を、 20mL のクロロホルムに溶かした。ジグリコール酸無水物の1.1mmolの試料を加え、混合液を還流しながら2時間攪拌した。冷却した後に、溶媒を蒸発させた。固体をアセトンから再結晶して、純粋な酸を得た。
【０２１９】
［ {2-[メチル(2,3,3-トリメチル-3H-インドール-5-イル)アミノ]-2-オキソエトキシ}-酢酸 {2-[Methyl(2,3,3-trimethyl-3H-indol-5-yl)amino]-2-oxoethoxy}-acetic Acid （２０） ］
収率は 75% で、白色粉末として得られた。 1H NMR (500MHz, CDCl3): δ1.33 (s,6H, 2 x CH3) 、 2.32 (s, 3H, CH3) 、 3.33 (s, 3H, NCH3)、4.05 (s, 2H, CH2CON) 、 4.15 (s, 2H, CH2COOH) 、 3.52 (s, 1H,NH) 、 7.1〜7.7 (m, 3H, 芳香環) 。 ESI- MS: 305 (MH+) 。
【０２２０】
［ {2-[メチル(2-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-6-イル)アミノ]-2-オキソエトキシ}-酢酸 {2-[Methyl(2-methyl-1,3-benzothiazol-6-yl)amino]-2-oxoethoxy}-acetic Acid （２１） ］
収率は 82% で、白色固体として得られた。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ2.80(s, 3H, CH3) 、 3.21 (s, 3H, NCH3) 、 3.94 (s, 2H, CH2CON)、4.03 (s, 2H, CH2COOH) 、 7.4〜8.2 (m, 3H, 芳香環) 。 ESI-MS: 295 (MH+)。
【０２２１】
［ 3-{5-[[(カルボキシメトキシ)アセチル](メチル)アミノ]-2,3,3-トリメチル-3H-インドリウム-1-イル}プロパン-1-スルホナート 3-{5-[[(Carboxymethoxy)acetyl](methyl)amino]-2,3,3-trimethyl-3H-indolium-1-yl}propane-1-sulfonate（２２）および 3-{6-[[(カルボキシメトキシ)アセチル](メチル)アミノ]-2-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-3-イウム-3-イル}プロパン-1-スルホナート 3-{6-[[(Carboxymethoxy)acetyl](methyl)amino]-2-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium-3-yl}propane-1-sulfonate （２３）］
酸 21 もしくは 22 （1.00mmol）を 25mL の無水アセトニトリルに溶かした溶液に、プロパンスルホン（ propane sulfone ）（10mmol）を加えた。この混合液を、還流しながら48時間攪拌した。冷却した後、この吸湿性の塩を濾別し、アセトンで洗って、そのまま直ぐに次のステップで使用した。
【０２２２】
［ 3-{5-[[(カルボキシメトキシ)アセチル](メチル)アミノ]-2,3,3-トリメチル-3H-インドリウム-1-イル}プロパン-1-スルホナート 3-{5-[[(Carboxymethoxy)acetyl](methyl)amino]-2,3,3-trimethyl-3H-indolium-1-yl}propane-1-sulfonate（２２）］
収率は 72% で、白色固体として得られた。 ESI-MS: 427 (MH+) 。
【０２２３】
［ 3-{6-[[(カルボキシメトキシ)アセチル](メチル)アミノ]-2-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-3-イウム-3-イル}プロパン-1-スルホナート 3-{6-[[(Carboxymethoxy)acetyl](methyl)amino]-2-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium-3-yl}propane-1-sulfonate（２３）］
収率は 64% で、白色固体として得られた。 ESI-MS: 417 (MH+) 。
【０２２４】
［ 3-{(2Z)-5-{[(カルボキシメトキシ)アセチル]メチルアミノ}-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-3,3-ジメチル-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-1-イル}プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-{(2Z)-5-{[(Carboxymethoxy)acetyl]methylamino}-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-3,3-dimethyl-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl}propane-1-sulfonate（２４）および 3-{(2Z)-6-{[(カルボキシメトキシ)アセチル]-メチルアミノ}-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル}プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-{(2Z)-6-{[(Carboxymethoxy)acetyl]-methylamino}-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl}propane-1-sulfonate（２５）］
四級塩 22もしくは 23 （0.5mmol）と、エノールエーテル 9 （0.625g, 2.50mmol）とを、 20mL のクロロホルム-酢酸 1:1 混合液に溶かした混合液を、窒素雰囲気下で60℃で磁石を使って攪拌した。 0.200g の酢酸ナトリウムを、 5mL の酢酸に溶かした溶液を、反応混合液へと滴下して加えた。攪拌をさらに2時間に亘って続けた。冷却した後に、色素25を反応混合液から晶出させて、濾別し、酢酸から再結晶した。色素 24 を含んだ反応混合液を真空濃縮した後、シリカゲルクロマトグラフィーでアセトン-酢酸（5:1）で溶離させ、精製した色素を、さらに酢酸から再結晶した。
【０２２５】
［ 3-{(2Z)-5-{[(カルボキシメトキシ)アセチル]メチルアミノ}-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-3,3-ジメチル-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-1-イル}プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-{(2Z)-5-{[(Carboxymethoxy)acetyl]methylamino}-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-3,3-dimethyl-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl}propane-1-sulfonate（２４）］
収率は 60% であった。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ1.69 (s, 6H, 2 x CH3)、2.04 (p, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, 
【０２２６】
【化５４】
2007529718.tif 000053
) 、 2.65 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-SO3)、3.25 (s, 3H, CH3N) 、 4.05 (bs, 2H, CH2COOH) 、 4.19 (bs,2H, CH2CON) 、 4.24 (t, 3JH-H= 7.0Hz, 2H, 
【０２２７】
【化５５】
2007529718.tif 000054
) 、 6.4〜8.5 (m, 11H) 。 MALDI-FTMS: MNa+ の実測値 689.1203 、予測値 689.1210 。
【０２２８】
［ 3-{(2Z)-6-{[(カルボキシメトキシ)アセチル]メチルアミノ}-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル}プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-{(2Z)-6-{[(Carboxymethoxy)acetyl]methylamino}-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl}propane-1-sulfonate（２５）］
収率は 54% であった。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ2.09 (p, 3JH-H=7.0Hz, 2H,
【０２２９】
【化５６】
2007529718.tif 000055
) 、 2.67 (t, 3JH-H= 7.0Hz, 2H, CH2-SO3)、3.27 (s, 3H, CH3) 、 4.09 (bs, 2H,
【０２３０】
【化５７】
2007529718.tif 000056
) 、 4.17 (bs, 2H, CH2-CON) 、 4.57 (t, 3JH-H=7.0Hz,2H, CH2-N) 、 6.8〜8.0 (m, 11H) 。 ESIMS: 635 (M - Na + 2H)+。
【０２３１】
［ 3-{(2Z)-5-[({2-[(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ]-2-オキソエトキシ}アセチル)メチルアミノ]-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-3,3-ジメチル-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-1-イル}プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-{(2Z)-5-[({2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-2-oxoethoxy}acetyl)methylamino]-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-3,3-dimethyl-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl}propane-1-sulfonate（I-SO-OSu）（４ｆ） および 3-[(2E)-6-[({2-[(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ]-2-オキソエトキシ}アセチル)-メチルアミノ]-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル]プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-[(2E)-6-[({2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-2-oxoethoxy}acetyl)-methylamino]-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl]propane-1-sulfonate（S-SO-OSu）（２ｆ） ］
以前の合成から得られた 0.50mmol の遊離酸色素の 10mL のジメチルホルムアミド溶液に、テトラフルオロ硼酸=テトラメチル(スクシンイミド)ウロニウム（301mg, 1.00mmol）およびジイソプロピルエチルアミン（200mg）を加えた。溶液を、窒素雰囲気下で、室温で1時間攪拌した。溶媒を高真空下で除去した。残渣をアセトン（5mL）で処理してから、エーテル（25mL）を沈澱物に加えて、反応性色素を沈澱させた。
【０２３２】
［ 3-{(2Z)-5-[({2-[(2,5-ジオキソプロリジン-1-イル)オキシ]-2-オキソエトキシ}アセチル)メチルアミノ]-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-3,3-ジメチル-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-1-イル}プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-{(2Z)-5-[({2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-2-oxoethoxy}acetyl)methylamino]-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-3,3-dimethyl-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl}propane-1-sulfonate（I-SO-OSu）（４ｆ） ］
収率は 90% であった。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ1.69 (s, 6H, 2 xCH3) 、 2.04(p, 3JH-H = 7.0Hz, 2H,
【０２３３】
【化５８】
2007529718.tif 000057
) 、 2.65 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-SO3)、2.92 (s, 4H, CH2CH2) 、 3.25 (s, 3H, CH3N) 、4.12〜4.17(m, 4H,
【０２３４】
【化５９】
2007529718.tif 000058
) 、 4.24 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-N) 、 6.4〜8.5(m,11H) 。 ESI-MS: 742 (M - Na + 2H)+ 。
【０２３５】
［ 3-[(2E)-6-[({2-[(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ]-2-オキソエトキシ}-アセチル)メチルアミノ]-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル]プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-[(2E)-6-[({2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-2-oxoethoxy}-acetyl)methylamino]-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl]propane-1-sulfonate （S-SO-OSu） （２ｆ） ］
収率は 87% であった。 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ2.09 (p, 3JH-H=7.0Hz, 2H,
【０２３６】
【化６０】
2007529718.tif 000059
) 、 2.67 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-SO3)、 2.80 (s, 4H, CH2CH2) 、 3.26 (s, 3H, CH3) 、4.13〜4.19 (m, 4H, CH2CON,
【０２３７】
【化６１】
2007529718.tif 000060
) 、 4.57 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-N) 、 6.4〜8.4(m,11H) 。 ESI-MS: 732 (M - Na + 2H)+ 。
【０２３８】
［ 3-[(2Z)-6-(アセチルアミノ)-2-[(2E)-4-(1,3-ジメチル-4,6-ジオキソ-2-チオオキソテトラヒドロピリミジン-5(2H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル]プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-[(2Z)-6-(Acetylamino)-2-[(2E)-4-(1,3-dimethyl-4,6-dioxo-2-thioxotetrahydropyrimidin-5(2H)-ylidene)but-2-enylidene]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl]propane-1-sulfonate（１ｇ）の調製］
色素 1e （200mg）を 10mL の無水酢酸に加えた懸濁液を、 80℃で12時間、窒素雰囲気下で攪拌した。冷却した後、粗生成色素を濾別して、メタノールから再結晶して精製した。収量は120mg（55%）であった。1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ1.90 (s, 3H, CH3CO)、2.00(p, 3JH-H
= 7.0Hz, 2H, 
【０２３９】
【化６２】
2007529718.tif 000061
) 、 2.55 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H,
【０２４０】
【化６３】
2007529718.tif 000062
) 、 3.61 (s, 6H, 2 x CH3) 、 4.56 (t, 3JH-H=7.0Hz, 2H,
【０２４１】
【化６４】
2007529718.tif 000063
) 、 6.8〜7.8 (m, 7H) 、 10.56 (1H, NH) 。 MALDI-FTMS: MH+ の実測値 559.0762、予測値559.075 。
【０２４２】
［色素 1h, 2g, 4g の調製］
［ヨードアセトアミド 1f, 2e, 4e と 2-メルカプトエタノールの反応］
ヨードアセトアミド色素（ 1f, 2e, 4e ）の試料 30mg を、 2-メルカプトエタノール（30mg）を 2.0mL の NaHCO3-Na2CO3バッファー（pH=8.0）に溶かした溶液に加えて、混合液を室温で2時間攪拌した。シリカゲルTLC（MeOH-H2O,90:10）によって、出発色素の消費が完了したことを確かめた。 C18カラムのクロマトグラフィーで、水-アセトニトリルで傾斜溶離して、複合体を単離した。
【０２４３】
［ 3-[(2Z)-6-({[(2-ヒドロキシエチル)チオ]アセチル}アミノ)-2-[(2E)-4-(1,3-ジメチル-4,6-ジオキソ-2-チオオキソテトラヒドロピリミジン-5(2H)-イリデン)-ブタ-2-エニリデン]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル]プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-[(2Z)-6-({[(2-Hydroxyethyl)thio]acetyl}amino)-2-[(2E)-4-(1,3-dimethyl-4,6-dioxo-2-thioxotetrahydropyrimidin-5(2H)-ylidene)-but-2-enylidene]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl]propane-1-sulfonate（１ｈ）］
1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ2.03 (p, 3JH-H=7.0Hz, 2H,
【０２４４】
【化６５】
2007529718.tif 000064
) 、 2.65 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-SO3)、2.80 (t, 3JH-H = 6.6Hz, 2H, CH2S) 、 3.40 (s, 2H,COCH2S) 、 3.60 (s, 6H, 2 x CH3) 、 3.64 (q, 3JH-H=6.6Hz,2H,
【０２４５】
【化６６】
2007529718.tif 000065
) 、 4.57 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-N) 、 4.94(bs,1H, OH) 、 6.8〜8.0 (m, 11H) 、 10.47 (s, 1H, NHCO) 。 ESIMS: 613 (M - Na +2H)+。
【０２４６】
［ 3-[(2Z)-6-({[(2-ヒドロキシエチル)チオ]アセチル}アミノ)-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-1,3-ベンゾチアゾール-3(2H)-イル]プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-[(2Z)-6-({[(2-Hydroxyethyl)thio]acetyl}amino)-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-1,3-benzothiazol-3(2H)-yl]propane-1-sulfonate（２ｇ）］
1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ2.08 (p, 3JH-H=7.0Hz, 2H,
【０２４７】
【化６７】
2007529718.tif 000066
) 、 2.66 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-SO3) 、2.79(t, 3JH-H = 6.6Hz, 2H,
【０２４８】
【化６８】
2007529718.tif 000067
) 、 3.47 (s, 2H, COCH2S) 、 3.64 (q, 3JH-H=6.6Hz,2H,
【０２４９】
【化６９】
2007529718.tif 000068
) 、 4.57 (t, 3JH-H = 7.0Hz, 2H, CH2-N) 、 4.95(t,3JH-H = 6.6Hz, 1H, OH) 、 6.6〜8.5 (m, 11H) 、 10.50 (s, 1H,NHCO) 。 MALDIFTMS: MH+ の実測値 645.0464 、計算値645.0458 。
【０２５０】
［ 3-{(2E)-5-({[(2-ヒドロキシエチル)チオ]アセチル}アミノ)-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-ジオキシド-3-オキソ-1-ベンゾチエン-2(3H)-イリデン)ブタ-2-エニリデン]-3,3-ジメチル-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-1-イル}プロパン-1-スルホン酸ナトリウム Sodium 3-{(2E)-5-({[(2-Hydroxyethyl)thio]acetyl}amino)-2-[(2E,4Z)-4-(1,1-dioxido-3-oxo-1-benzothien-2(3H)-ylidene)but-2-enylidene]-3,3-dimethyl-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl}propane-1-sulfonate（４ｇ）］
1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ1.70 (s, 6H, 2 x CH3)、2.08 (p, 3JH-H = 6.9Hz, 2H,
【０２５１】
【化７０】
2007529718.tif 000069
) 、 2.67 (t, 3JH-H = 6.9Hz, 2H, CH2-SO3)、2.81 (t, 3JH-H = 6.6Hz, 2H,
【０２５２】
【化７１】
2007529718.tif 000070
) 、 3.43 (s, 2H, COCH2S) 、 4.26 (t, 3JH-H=6.9Hz,2H, CH2-N) 、 6.4〜8.3 (m, 11H) 、 10.31 (s, 1H, NHCO) 。MALDI-FTMS: MNa+の実測値 677.1032 、計算値 677.1028 。
【０２５３】
［蛋白質の標識付け］
Wiskott Aldrich 症候群蛋白質（WASP、残基 201〜320）を、単独のシステイン（F271C）を含むように変異させたものを、S-SO-IAA色素、 Cy3,71 色素、もしくは Cy571 色素を用いて標識した。色素の DMSO 保存溶液（10〜20mM）を、 200μL の蛋白質溶液（リン酸ナトリウムバッファー中で200μM 、 pH = 7.5）に加えて、色素の最終的な濃度を 1〜2mM とした。反応混合液を室温で4時間に亘ってインキュベートした後、1μL のメルカプトエタノールを加えてクエンチした。反応混合液を、12,000rpm で2分間遠心分離して反応中に生じたと考えられるすべての沈澱を除去して、上清をG25 Sepharose ゲル濾過を用いて精製した。ゲル濾過によって、色素-蛋白質付加体が、遊離色素から明確に分離された。複合体の純度を、 SDS-PAGE電気泳動法によって確認した。精製した蛋白質複合体中には、遊離色素は観察されなかった。遊離色素の対照サンプルは、蛋白質よりも軽い分子量としてゲル上で明瞭に可視化された。複合体は、単独の高発色蛍光蛋白質バンドを形成し、その分子量はWASPフラグメントに依る。既知の吸光分光法を用いて、蛋白質と色素の濃度を測定し、色素と蛋白質との比率を算出した。 Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals; Molecular Probes Inc.: Eugene,OR, 1996 を参照のこと。各実験において、この比率は 0.9〜1.0 の範囲となった。 CBD の濃度は、ウシ血清アルブミンを基準として校正したCoomassie Plus assay （Pierce）を使って、独立に確認した。標識した CBD のアリコートを、-80℃で保存した。六ヶ月間の保存の後、結合能力の重大な損耗は観察されなかった。
【０２５４】
［ Cdc42 の活性化の分析］
WASP 複合体をアッセイバッファー（50mM Tris-HCl, pH7.6 、 50mM NaCl 、 5mM MgCl2 、1mM DTT）に溶かした溶液（300nM）を、 10mM の GDP もしくは GTPγS と後述するように平衡させた Cdc42 の溶液と、 1:1（v/v）で混合した。励起スペクトルおよび発光スペクトルを得るために、630nmでの発光と 600nm での励起をそれぞれ必要とした。ヌクレオチドの依存性のため、 Cdc42（500nM）に、種々の濃度のGTPγS（1〜500nM）を加えてプレインキュベートした。
【０２５５】
［光褪色］
すべての試料には、 1mM の色素を含ませて、最終的な体積を 10mL とした。窒素と酸素で飽和させるために、試料に溶媒飽和気体を30分間に亘って通した。90Wハロゲンタングステンランプを照射に用い、冷却のためのファンを併用した。反応中の試料の温度は、25±1℃であった。各試料の吸光スペクトルを、照射の前と、照射後10時間おきとに測定した。トラッピング実験（trapping experiment）のために、チオアニソール（1.0M）を、色素 1b の酸素飽和ブタノール溶液に加えた。60時間の照射の後、反応混合液をGC-MSを用いて、生じた物質を分析した。生成物であるメチルフェニルスルホキシドとメチルフェニルスルホンを、基準試料と比較することによって同定した。
【０２５６】
［結果］
［水溶性が改良され水中での凝集が抑えられたメロシアニン色素］
目標は、色素 1a の有用且つ水溶性である誘導体の作成であった。新規なアナログを、例えば、色素 1a の四級アミノ基を、より親水性の強いスルホナト基（-SO3Na）で置換することによって作成した。いくつかのアナログでは、蛋白質と共有結合するための、システイン選択性ヨードアセトアミド基をさらに加えた。スルホナトアナログ1cおよび 1d の溶解性は、元の構造 1a を充分に凌ぎ、また、色素 1d がシステインと共有結合する能力は、これをβ-メルカプトエタノールと反応させることによって確認した。しかしながら、これらの新規な色素は、蛋白質の標識に適するような濃度では、水溶性バッファーに溶解させることはできなかった。標識付けは、助溶媒として5%よりも多い DMSO を含んでいるときにのみ実行できた。単独のシステインを含んだ Wiskott Aldrich 症候群蛋白質（WASP）のフラグメントを標識付けする試みからは、標識した蛋白質から、非共有結合した色素を取り除くことは依然として非常に難しい（透析法（ダイアリシス）、サイズ排除、およびイオン交換クロマトグラフィーは、いずれも功を奏さなかった）、ということがわかった。
【０２５７】
低濃度の色素で標識して、複合体の蛍光が非常に弱かったにもかかわらず、蛋白質複合体は一当量よりも多い色素を含んだ。従前に他のメロシアニンについてWurthner et al., Angew. Chem., Int. Ed., 2000, 39, 1978-1981 、 Lu et al., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 8146-8156 、および Valdes-Aguilera et al., Ace. Chem. Res., 1989,22, 171-177 で報告されていたのと同様に、われわれはこれらのデータから色素が水中で非蛍光性H凝集を形成していたという仮説を立てた。これらは、水溶液中で実際に反応性化学種であったと思われる。色素1cの吸光スペクトルの分析によって、H凝集の形成が裏づけられた。水中でのスペクトルは、疎水性の強い溶媒（メタノールもしくはブタノールなど）中のスペクトルとは形状が異なっており、また、水溶液のスペクトルでは、515nmの短波長側ピークが濃度依存でシフトすることが示され、このことは非蛍光性H凝集の形成と矛盾しない。 Mandal et al., J. Phys. Chem. A, 1999, 103, 8156-8159 を参照のこと。さらに、励起スペクトルと吸光スペクトルとが異なっており、このことは、水中に複数の化学種が存在していたことを示唆している（図１）。これらのデータを考え合わせると、他のメロシアニン色素についてNakahara et al., J. Phys. Chem., 1986, 90, 6144-6148 に従前に記載されていたのと同様に、本質的に平面上である色素が、その疎水性表面の水への露出を減らすために凝集していた、ということが示唆される。
【０２５８】
このような凝集は、平面状色素分子が、水分子の大きさよりも小さい距離で互いに近接することができるような場合にのみ、エネルギー的に有利になる。凝集を抑えるために、われわれは、四面体構造を有する嵩高い非平面状置換基を芳香環に組み入れて、スタッキングが不利となるようにした（構造式1〜4を参照）。この方策により、ジェミナルジメチル基および／もしくはスルホナト基を用いて、色素を比較的疎水性に保つことが可能となった。これらの基を、一連の色素（1c, 2b, 3b, 4b; 図２参照）に独立に組み込むか、もしくは組み合せて組み込むことで、凝集への影響を解析した。色素2b および 3b のそれぞれは、このうちの一方の四面体状置換基を有し、さらにまた、色素4b では、単一構造内に双方の基を組み込んでいた。図２に示したように、比率AH/AM（ AHは、H凝集の吸光度であり、また、AM
は、単量体の色素から得られた、より長い波長における吸光度である）からは、四面体の基によって凝集が大幅に抑えられたことがわかった。両方のout-of-plane置換基を含んだ色素 4b の水中での吸光度スペクトルは、蛋白質の標識付けに典型的に用いられる範囲内において濃度には依存せず、これは250μM よりも高い濃度であっても凝集が起こらなかった、ということを示唆している（図３）。非平面状置換基の導入によって、凝集が抑えられただけでは無く、色素の水溶性もまた大幅に向上した。色素4bは優れた水溶性を呈し、これは、おそらく、置換基によって色素の対称性が減少したため、および／もしくは、H凝集が水への難溶性を齎していたため、と考えられる。
【０２５９】
まとめると、新規なフルオロフォアは、優れた水溶性と、凝集の起こしにくさとを示し、且つ、蛋白質と相互作用するための実質的な疎水性を保っていた。これらに対して、その末端の複素環に基づき、Hahn, K. M.; Waggoner, A. S.; Taylor, D. L., J. Biol. Chem., 1990, 265, 20335-20345 に記載の従来の命名体系を用いて、命名を行った。
【０２６０】
［生体内の蛋白質活性の検知のための特質：スペクトル特性ならびに化学的および光化学的安定性］
S-TBA 色素、 S-SO 色素、 I-TBA 色素、および I-SO 色素のすべてのフルオロフォアは、生細胞イメージングにおいて有用な長波長を吸光する（表２）。
【０２６１】
【表２】
2007529718.tif 000071
2007529718.tif 000072
a： 溶媒剪断粘度（Onganer, Y.; Yin, M.; Bessire, D.; Quitevis, E. J., Phys. Chem.,1993, 97, 2344-2354 から引用）
b： モル吸光係数（誤差： ±5%）
c： 蛍光の量子収量（誤差： ±10%）
これらの吸光係数および量子収量は、種々の溶媒で確認され（表２、図４、図５）、蛍光強度の変化が溶媒に依存して劇的に変化しており、これは主に量子収量の変化に因るものである。I-SOでは、 DMF 中の 0.97 からメタノール中の 0.08 まで、量子収量が12倍以上も変化した。同じ溶媒で、 S-SO は量子収量が4.4倍変化した。変化は水中ではさらに大きくなっているが、おそらくS-SO色素のうちのいくらかが凝集構造をとったままになっていると考えられるため、定量が困難であった。色素は、無極性環境内では、非常に輝度が高く、生細胞内で使用されている現行のもっとも輝度の高い色素と比較して、とても好ましいものであると言える。これらの色素の量子収量は溶媒感受性ではあるが、色素が溶媒の極性の変化を受けても、吸光度と発光極大がそこそこ変化するのみである。
【０２６２】
生細胞内で用いられる色素は、連続的にイメージを多数得るため、および、外因的に標識した物質の最小限の量から充分な光を得るために、光に対して安定でなくてはならない。新規な色素の光安定性は、ガラスフィルターを通したタングステンランプ（色素が生体内で照射されうるスペクトル範囲の全体を通じて、本質的に等しい強度が得られるような広汎なスペクトル光源）からの定常照射に、色素を曝して確認した。ファンを使って熱を抑え、また、色素溶液を等しい極大吸光になるように調節し、内部フィルター効果を最小化するために1μM 未満に保った。色素 1b, 2a, 3a, 4a の光褪色を、色素の凝集を齎さないような二種の溶媒（メタノールとブタノール）中で比較し、すべての反応が、均一な単量体色素で起こるようにした。すべての場合で、光褪色は一次速度式（first-order kinetics）に従った。
【０２６３】
生細胞イメージング色素としてよく使われ、光褪色速度が公知である Cy5 と、褪色速度を比較した。 Toomre, D.; Manstein, D. J., Trends Cell Biol., 2001, 11, 298-303を参照のこと。この比較結果を、表３および図６に示した。
【０２６４】
【表３】
2007529718.tif 000073
a： kph の誤差は±10%
b： エタノール中のトリプレット（三重項）状態構造の量子収量（ Benniston, A.; Gulliya, K.; Harriman, A., J. Chem. Soc, Faraday Trans, 1997, 93, 2491-2501 の記載から決定したもの）
表３に示したように、 I-SO は優れた光安定性を呈し、メタノール中では Cy5 のわずか 28% の速度で褪色した。
【０２６５】
フルオロフォアを壊す反応性酸素化学種を生成するような、三種の起こりうる機構のうちのひとつを通して、褪色が起こっている可能性が高いと考えられる。トリプレット励起状態の色素は、酸素と反応してシングレット（一重項）の酸素を生成することがありえ、あるいは、シングレット励起状態の色素からの電子移動によって、反応性酸素ラジカルアニオンが生成することもありえる。Kanony, C; Akerman, B.; Tuite, E., J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 7985-7995 を参照のこと。第三のありえる機構は、光合成された過酸化物から開始される、基底状態の色素と酸素との間の遊離ラジカル連鎖反応である。このような自動酸化は、オレフィン類で知られている。Collman,J. P.; Kubota, M.; Hosking, J. W., J. Am. Chem. Soc., 1967, 89, 4809-4811 、Zombeck, A.; Hamilton, D. E.; Drago, R. S., J. Am. Chem. Soc., 1982, 104,6782-6784 を参照のこと。しかしながら、長い誘導期間も、酸素濃度への強い依存性も観察されていないため、これらの系が在ったとは考えにくい。
【０２６６】
その他の二種の可能性を辨別するために、シングレット酸素もしくは超酸化物（スペルオキシド）と反応してスルホキシドもしくはスルホンを生成するトラッピング剤であるチオアニソールの存在下で、この反応を繰り返した。Foote,C. S.; Peters, J. W., J. Am. Chem. Soc., 1971, 93, 3795-3796 、 Correa, P. E.; Hardy, G.; Riley, D. P., J. Org. Chem., 1988, 53, 1695-1702 を参照のこと。色素 1b のブタノール溶液からは、90% のフェニルメチルスルホキシドと、10% のフェニルメチルスルホンが得られ、このことは、シングレット酸素が仲介する機構と矛盾しない。 Watanabe,Y.; Kuriki, N.; Ishiguro, K.; Sawaki, Y., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113,2677-2682 を参照のこと。また、メタノールから重メタノール-d4 40 へと交換したときに褪色速度が7.5 倍増大したこと、および、最も多く硫黄原子を含んでいる色素が最高の速度を示したという事実によって、シングレット酸素の形成が裏付けられている。硫黄原子は、内部重原子効果（inner heavy atom effect ） を介して、トリプレットの形成を促しうる。 Benniston, A.; Gulliya, K.; Harriman, A., J. Chem. Soc., Faraday Trans., 1997, 93, 2491-2501、 Turro, N. J., Tetrahedron, 1985, 41, 2089-2098 を参照のこと。溶液に窒素を通しても、速度には影響しなかった。これは、ほんの少しの濃度の溶解酸素であっても、反応を飽和させるには充分なためである。
【０２６７】
pH を 6〜9 の範囲で変化させても、色素の吸光度、蛍光強度、または励起極大および発光極大には影響は顕われなかった。 pH 6 もしくは 9 の水性バッファー中で、3時間に亘って室温でインキュベーションしても、影響は無かった。
【０２６８】
［部位特異的な蛋白質の標識付けのための誘導体］
生バイオセンサーにとって最も好ましい性質を示したフルオロフォア S-SO および I-SO を誘導して、蛋白質に部位特異的に結合できる反応性形態を生成した。スクシンイミジルエステルを使ってリシンに結合するようにしたアナログ、もしくは、ヨードアセトアミドを使ってシステインと選択的に反応するようにしたアナログ、を作成した。部位特異的な蛋白質の標識付けのためのこれらの基の使用方法は充分に確立されている。Dent, A.; Aslam, M., Bioconjugation, 1998, 364-482 を参照のこと。反応性色素の合成（図８）の間、出発物質にはアミノ基が存在しており、合成の終了時に側鎖の結合のために用いた。合成の初期ステップにおける四級化反応（quaternization reaction ） を越えて残り、その上、完成したフルオロフォアを壊すこと無く除去することができるようなアミン保護基を発見することは、やりがいのある課題と言える。Fmoc基に対して、（通常用いられるピペリジンのような強い塩基では無く）ジメチルスルホキシド中の酢酸ナトリウムを用いることで、きれいに除去することができる新規な脱保護条件を用いて、このハードルを克服した。また、これらの合成の間、3-スルホナトプロピル置換基を各色素に組み込んで、さらに水溶性を高めた。
【０２６９】
反応性側鎖の結合は、 S- SO 色素および I-SO 色素の双方の量子収量に影響した（表４）。
【０２７０】
【表４】
2007529718.tif 000074
a： モル吸光係数、誤差±5% 。
b： 蛍光の量子収量、誤差±10% 。
c： 水中での凝集により、定量不可。
すべての側鎖を、アミド結合を介してフルオロフォアに結合させているが、それぞれの側鎖とフルオロフォアの影響は非常に異なっていた。例えば、スクシンイミジルエステルをフルオロフォアに付加したとき、メタノール中での量子収量は、S-SOでは変化せず、一方、 I-SO では 38% 減少した。ヨードアセトアミド基は、両方のフルオロフォアの量子収量を減少させた（メタノール中の、S-SO で32% 減、 I-SO で 87% 減）。このようなI-SOヨードアセトアミドの輝度の大幅な減少によって、その利用が著しく制限されてしまう。この減少は、沃素の存在によって引き起こされた、蛍光クエンチ（quench fluorescence） として知られるものと考えられる。 McGlynn, S. P.; Azumi, T.; Kinoshita, M., Molecular Spectroscopy of the Triplet State; Prentice Hall: Englewood Cliffs, NJ, 1969 を参照のこと。これが正しいと仮定して、沃素を蛋白質との反応過程で消尽させれば、このような量子収量の減少の原因は問題では無くなるはずである。沃素の蛍光への影響を確かめるために、I-SO色素および S-SO 色素を、β-メルカプトエタノールと反応させた（表４の色素 2g, 4g ）ところ、 S-SO の量子収量は誘導されていないフルオロフォアのそれにまで回復し、また、I-SOの量子収量は、改変していないフルオロフォアのそれの半分になった。
【０２７１】
アミン置換基が量子収量に影響を及ぼす機構について、さらに調査するために、種々の置換基を付けた S-TBA 色素で確認した（表５）。誘導されていないアミノ基を、フルオロフォアに直接結合することによって、色素の吸光係数が63%減少し、且つ量子収量が13倍よりも大きく減少した。しかしながら、この影響は、最終的な反応性色素誘導体としてアミンをアセチル化することによって、ほぼ消失した。
【０２７２】
［Cdc42 の活性化についてのバイオセンサー中の S-SO および I-SO ］
S-SO 色素および I-SO 色素が蛋白質環境の変化に応答する能力を、これらの色素を用いて Cdc42 の活性化についての新規なバイオセンサーを作成することによって示した。WiskottAldrich 症候群蛋白質（WASP）は、活性化されて GTP に結合した形態の Cdc42 にのみ結合し、 GDP に結合した形態のCdc42 には結合しない。Machesky, L.; Insall, R., J. Cell. Biol., 1999, 146, 267-272 を参照のこと。この選択的結合能力を保持しているWASP のフラグメント（元の蛋白質の残基201〜320 ）を、 S-SO 色素 2e を使って誘導した。 WASP-Cdc42 複合体の結晶構造（Abdul-Mananet al., Nature, 1999, 399, 379-383）に従って、色素がいくつかの疎水性アミノ酸（ WASP フラグメントの F271C 変異体）と相互作用できるように、システインをフラグメント内に導入して、色素と結合するようにした。標識したWASPフラグメントは、活性化されたCdc42と共にインキュベートした場合には蛍光強度が 300% 増大したが、一方、 GDP に結合した未活性のCdc42 と共にインキュベートした場合には増大は見られなかった（図７）。さらに、Cdc42（150±50nM）の見かけの平衡結合定数を、一定の濃度の標識したWASP フラグメントを種々の量の cdc42-GTPγS で滴定することによって、生体外で測定した。この値は、WASP-Cdc42 相互作用についてのKim et al. （Nature, 2000, 404, 151-158）の結果（133±9mM）と良く一致しており、溶媒感受性フルオロフォアのWASPフラグメント内への組み込みが、 WASPドメインの結合特性に大きな影響を与えないということが示唆された。
【０２７３】
さらなる研究を、 WASP フラグメントの位置 F271C 上に結合させた I-SO 色素 4b を使って行った。このバイオセンサーは、上述した S-SO バイオセンサーと類似した特性を有した。S-SOバイオセンサーと同様に、 I-SO 色素は、位置 271 上で最大の蛍光応答を示した。特に、 I-SO-WASP バイオセンサーは、Cdc42-GTPγS に結合すると、単独のバイオセンサーもしくはGDP 担持 Cdc42 のいずれかに較べて蛍光強度が2.8倍増大した。Cdc42-WASP 複合体の NMR 構成からは、位置 271 上の色素が、Cdc42 と WASP の双方のアミノ酸から形成された疎水性ポケット内に挿入されていた、ということが示唆された。バイオセンサーの特異性を測定するために、活性化された種々のGTP加水分解酵素との相互作用を調査した。バイオセンサーは、Cdc42と密接に関連する蛋白質を、 Rho 族の他の構成員と区別した。このバイオセンサーは、生理学的な量よりも充分に高い濃度の RhoA もしくは Racとは相互作用をしなかったが、Cdc42 と、密接に関連する蛋白質 TC10 （同様の親和性を以って WASP と結合する）との双方に応答した。
【０２７４】
I-SO で標識した WASP フラグメントは、細胞リシス生成物中の Cdc42 の活性化のアッセイのためのわかりやすい手段となった。単にバイオセンサーをリシス生成物に加えるだけで、蛍光からCdc42の活性化を読み取れた。この方法を、化学誘引物質である fMetLeuPhe（fMLP）ペプチドで刺激した後の好中球中の Cdc42 の活性化動態を測定するために用いた。得られた結果は、充分に確立された方法を用いて従前に報告されたもの（Benard et al., J. Biol. Chem., 275: 36457 (2000)）と同様となった。また、バイオセンサーの蛍光を、生体外の Cdc42 GDP/GTP交換のリアルタイム動態の監視にも使った。標識した WASP フラグメントは活性化された Cdc42 に対して蛍光強度の変化を以って応答するため、レシオイメージング法を用いて、変化する細胞の厚み、不均一な照射、および、色素強度のイメージングに影響しうる他の要因の効果を補正した（Brightet al., Methods Cell Biol., 14: 157 (1989)）。バイオセンサーを、強化緑色蛍光蛋白質 （ enhanced greenfluorescent protein;EGFP ） と縮合させて、 Cdc42 の結合に対して蛍光シグナル非感受性としながら、感受性色素と同じような細胞レベル以下の分布を持つようにした。色素のイメージを、EGFPイメージで分離し、 Cdc42 の結合由来では無い色素強度の変化を規格化した。また、 WASP のプロリンに富む領域（アミノ酸 315〜321 ）を削除して、SH3ドメインを含んだ蛋白質に結合することを不可能にした。バイオセンサーの蛍光応答および Cdc42結合は、これらの修飾の後にもそのまま保たれていた。これを、Mero-CBD、則ち Cdc42 結合ドメインとメロシアニン色素の組み合わせ、と命名した。
【０２７５】
生きている線維芽細胞内にバイオセンサーを注入したところ、刺激していない細胞においても Cdc42 の局在化された活性を示し、細胞伸長（cell extensions） において最高値を示した。本質的に活性な Cdc42-Q61L を発現している細胞（Miller et al., Mol. Cell. Biol., 14:1075 (1994)）においては、 MeroCBD で示された全般的な活性のレベルがさらに高くなっており、且つ活性が細胞全体に分布した。
【０２７６】
偽の蛍光強度増大を生じる可能性のある、細胞膜もしくは他の疎水性細胞成分への色素の非選択的な結合が起こっていないことを示すために、 MeroCBD を、Cdc42の結合を充分に抑制する対照バイオセンサーと比較した。この変異バイオセンサーでは、内因性もしくはドミナントポジティブな Cdc42 のいずれについても局在的な活性化を示さず、Cdc42-Q61Lを発現している細胞内の全体の活性がわずかに増大しただけに留まった。本発明に係る MeroCBD バイオセンサーとは異なり、CBD-EGFP の単純な局在化からは、Cdc42 の活性化に関するデータは得られなかった。
【０２７７】
色素によって齎される内因性蛋白質を高感度で検出する能力は、 Cdc42 の研究を行う上で重要であった。 Cdc42 の過剰発現を必要とする従来の蛍光共鳴エネルギー転位（FRET）バイオセンサー（Sethet al., Biochemistry, 42: 3997 (2003)）とは異なり、高い感度によって天然の濃度での蛋白質の活性化を検出でき、且つ、より均一な活性化を示した。MeroCBDは、 FRET では必要である Cdc42 の末端の GFP 変異体による修飾（Itoh et al., Mol. Cell. Biol., 22: 6582(2002)）を必要とはしなかった。それゆえに、 MeroCBD
では、グアノシン解離阻害剤（guanosine dissociation inhibitors; GDIs ） による通常の調節が保たれていた。 Hoffman et al., Cell, 100: 345 (2000) を参照のこと。
【０２７８】
Cdc42 が、細胞の運動性（motility）における極性を維持する上で重要なものであることは公知ではあるが（S. Etienne-Manneville, J. Cell. Sci., 117: 1291 (2004)）、局在化された Cdc42 の活性化の役割については、あまり理解されているとは言えない。Cdc42は、 Rac の活性化および WASP の活性化を通じ、リーディングエッジ突起（ leading-edge extension ）を促成して、Arp2/3にアクチンフィラメントを形成させる。 Bishop et al., Biochem J., 348: 241 (2000) 、 Higgs et al.,J. Cell. Biol., 150: 1311(2000) を参照のこと。また、 Cdc42 は、糸状仮足（フィロポディア; filopodia）として知られる良好な細胞伸長も誘導する。Nobes et al., Biochem. Soc. Trans., 23: 456 (1995) 、 Kozma et al., Mol. Cell. Biol., 15:1942 (1995) を参照のこと。
【０２７９】
Cdc42 の活性化の空間時間的な相対的動態、突出部、およびフィロポディア構造を、フィブロネクチン上に結合させ播種した線維芽細胞中で検査した。播種後三十分〜四十五分経った時点で、フィオポディアが突出している細胞端部の細い帯部分においてCdc42が活性化した。フィロポディア自身の内部では、活性化は観察されなかった。活性化が低い領域は、フィロポディアの基部の細胞体の内部に伸展していた場合があり、これは、フィロポディア中のアクチン束が細胞体内に伸展することを示した研究結果と調和する。結合から90分〜120分後の時点で、より大型の活動的な突起の内部に活性が局在化されはじめ、全体的な活性が増大した。また、突起は、他のすべての領域の平均活性の二倍よりも高い活性を有していた（n= 22 cells）。画像およびさらなる詳細について、 Nalbant et al., Science, 305: 1615 (2004) （この参照により全体が本開示に含まれる）を参照のこと。対照群では、バイオセンサーの量は、播種もしくは自動能に影響を与えなかった。
【０２８０】
微小管もしくはアクチンが、 Cdc42 の活性化を、特異的に末梢の位置で起こるようにしている可能性がある。微小管脱重合剤（microtubule-depolymerizingagents）であるノコダゾール（nocodazole）およびコルヒチン、またはアクチン重合阻害剤であるサイトカラシンBで、細胞を処理することによって、この可能性を調査した。ノコダゾールとコルヒチンだけが、末梢のCdc42活性化に著しい影響を及ぼした。したがって、微小管は、小胞輸送への影響、もしくは接着複合体の調節現象によって、 Cdc42 とグアニン-ヌクレオチド交換因子との間の相互作用を局在化している可能性がある。
【０２８１】
Cdc42 は細胞内輸送に関わっている。 MeroCBD バイオセンサーは、一貫して内皮細胞のトランスゴルジ器官中での活性化を示し、また、線維芽細胞中でも活性化を示すことがあった。この主分泌室（major secretory compartment） 内での活性化からは、 Cdc42 が極性刺激（polarity cues） の方向性選別（directional sorting）もしくは輸送を調節しているということ、あるいは、活性化された Cdc42 の末梢の特定の部位への輸送を、微小管が媒介しているということが示唆される。
【０２８２】
色素の能力を用いて、低濃度のバイオセンサーの連続的なイメージを百回よりも多く得たことで、個々の突起の伸長および収縮中の Cdc42 の活性化の動態を、高解像度で研究することができた。アルゴリズムを用いて突起の境界を客観的に測定したことにより、個々の突起の変化する面積を、単位面積あたりの突起の活性化の合計値と対比した。Cdc42の活性の上昇および下降は、伸長と収縮の双方との著しい相関を見せた。この密接な相関からは、Cdc42 の活性化および失活が、伸長および収縮の律速段階になっていた可能性が示唆された。または、アップストリームシグナルが、誘導反応中のCdc42 の活性を協調的に阻害していた可能性もある。これらの可能性を、Rho キナーゼ（Y27632）の阻害剤を用いた阻害反応によって辨別した。これによって、Cdc42 の活性が減少した後にも突起が伸長し続けるようになり、このことは、（微小管細胞骨格によって能動的に調節されると思われる）アップストリームシグナルが、Cdc42活性と反応とを並行して調節するということを示唆している。 Cdc42 の活性は突出中には上昇し続けず、このことは、 Cdc42 が伸長を維持するものでは無く、伸長を開始するものであるということを示唆している。
【０２８３】
したがって、 MeroCBD は、蛍光色素の直接励起によって得られる感度を以って、内因性分子を検出する能力を組み込んだバイオセンサー手法を例証すると言える。蛋白質を検査するわれわれの能力をこのように拡張したことによって、生細胞研究のために誘導もしくは過剰発現をすること無く、高速の細胞内プロセスの詳細な動態分析が可能となった。本発明に係るバイオセンサーによって、トランスゴルジ器官中のCdc42の活性化、細胞末梢における（フィロポディア中では無い）微小管依存の活性化、ならびに、細胞の伸長、反応、および Cdc42 活性化の緊密に整合を持つ動態、が明らかとなった。
【０２８４】
［生細胞バイオセンサーのために有効なスペクトル特性］
生体外で現在使用されている溶媒感受性色素は、生細胞内で用いるには不適である。このような色素は、少量の標識した蛋白質からのスペクトル変化を測定するために充分な輝度を有しておらず、また、短い励起波長および発光波長によって、細胞に損傷を与えてしまい、且つ、細胞の自家蛍光の波長と重なってしまう。輝度を高くし且つより長い波長での蛍光を得るためには、色素が拡張共役を持つ必要があるが、こうした共役は水溶性を減らしてしまい、且つ自己凝集の原因にもなる。生細胞中での使用を目的として設計された色素としてよく使われていたものは、その環境に対して非感受性であることを元にして特に選択されていたが、これは蛋白質の分布を測定するために使用されてきたためである（即ち、フルオレセイン、ローダミン、Alexa、Cy3/5）。このような色素では、溶解性についての問題を、荷電基を色素の端部に組み込むことによって解決することができた。蛋白質の検出に用いることを想定した色素では、蛋白質の構造変化を検知する上で有用となるように、疎水性蛋白質領域と相互作用をしなくてはならないため、このような手法は望ましいものとは言えない。色素は、蛋白質表面と必然的に相互作用をするため、蛋白質の構造変化が、水との相互作用、水素結合、もしくは疎水性相互作用に影響を及ぼす。ドメインに基づくセンサー、もしくは抗体に基づくセンサーは、蛋白質の結合現象中に、水から疎水性ポケットへと移動することが可能であるようなものでなくてはならない。本発明に係る色素の開発に先行する、生体内の蛋白質活性の監視のための溶媒和発色色素（solvatochromic dyes ）の使用については、有機助溶媒中の疎水性色素によって標識付けすることができる蛋白質に対象が限定されてしまっていた。Hahn,K. M.; Waggoner, A. S.; Taylor, D. L., J. Biol. Chem., 1990, 265, 20335-20345 を参照のこと。
【０２８５】
本明細書中に記載した新規な色素では、溶解性の問題については、蛋白質と相互作用するための疎水性部分を保っている限りは解決ができた。脂肪族置換基、もしくは弱荷電性置換基を、芳香環の面から突き出すようにして組み込むことによって、水溶性であって、且つ、蛋白質の標識付けに用いられる濃度において凝集が最小限であるかもしくは無いような、メロシアニンを作成することができた。こうしたout-of-plane基を含んだ構造をスクリーニングして、生体内での蛋白質の構造変化を検知するために望ましい溶解性と、優れた溶媒感受性スペクトル特性とを有している二種のフルオロフォア（S-SOと I-SO）の同定を行った。
【０２８６】
I-SO は、 DMF 対メタノールで蛍光強度（ε*Φ 、表２）が 12 倍よりも大きく変化し、また、 S-SO では、同じ溶媒中で 5.4 倍の変化が見られた。このような変化の大きさは、従来のいずれの生細胞バイオセンサーで観察されたものよりも大きい。異なる溶媒中で生じる変化の大きさは、異なる構造を比較し、且つ、変化量の潜在的最大値とバイオセンサー中の色素の輝度とを示す上で有用である。したがって、実際のバイオセンサー（本明細書中で記載した、Cdc42活性化の指標）中で S-SO 色素の蛍光強度が 3 倍の変化をしたことを示すことが重要であると言える。この変化は、従来に生細胞中で成功裡に使われていた主流のバイオセンサーでの変化よりも、実質的に良好である。
【０２８７】
［ S-SO 色素のバイオセンサーへの適用］
内因性の標識されていない Cdc42 の活性化を検出する新規なバイオセンサーの構築において本発明に係る色素を使うことによって、本発明に係る色素の有用性を示した。
WASP-Cdc42 複合体の結晶構造を検査することによって、二種の蛋白質が結合した際に形成される疎水性ポケットが確認された。 S-SO がアミノ酸に結合し、WASPフラグメントが
Cdc42 に結合したときに、そのアミノ酸が S-SO をこのポケットの中へと収めることになったと考えられる。このフラグメントが、活性化された、GTPに結合した Cdc42 にのみ結合して、蛍光強度を3倍に変化させた。このような変化は、生体内で容易に検出することができる。
【０２８８】
WASP フラグメントを Cy3 フルオロフォアおよび Cy5 フルオロフォアで標識した対照実験においては、蛍光強度の変化は観察されなかった。これらの色素は、より強い疎水性環境、もしくはより粘性の高い環境へと移動すると、蛍光強度が大幅に増大するということが知られているが、溶媒との水素結合については感受性では無い。Soper, S. A.; Mattingly, Q. L., J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3744-3752 、Ischenko, A., Russ. Chem. ReV., 1991, 60, 865-884 を参照のこと。したがって、シアニンで標識した WASP フラグメントに応答しないことから、本発明に係る色素が、疎水性ポケット内に移動して、水への露出を減らしているために、本発明に係る色素が水素結合の変化に対して応答する、ということが示唆される。
【０２８９】
このバイオセンサーの構造と使用方法を示す実験によって、その生物学的な活性に重大な影響を与えること無く修飾することが不可能であるような多くの蛋白質を研究する上での、これらのタイプのバイオセンサーの有用性が示される。ゆえに、この手法によって、生細胞内での有用な新たな選択肢が得られる。また、本発明に係る色素は、蛋白質に直接結合させたときに、大型の分子機械内に組み込まれた蛋白質の構造変化を生体内で追跡することが可能となるということにおいても、有用であると言える。生体外での用途としては、本発明に係る色素から、現行の溶媒感受性フルオロフォアよりも実質的に輝度が高いシグナルを得ることができる。ゆえに色素は、高い親和性を有する結合相互作用、高処理量アッセイにおける少量の蛋白質、もしくは、他の色素にわずかの影響しか及ぼさないような蛋白質の変化、を研究する上での感受性を増大させることができる。
【０２９０】
［実施例2： バイオセンサーの作成方法および使用方法］
この実施例では、本発明に係るバイオセンサーの作成方法と使用方法についての説明を行う。本明細書中で記載される特定のバイオセンサーは、宿主細胞の受容体 CD4 と複合体を形成した後に、HIV外被蛋白 gp120 に結合するような、 HIV-1 中和抗体 Fab フラグメント X5 に基づいたものとした。 Moulard, M. et al, Broadly Cross-reactive HIV-1-Neutralizing Human Monoclonal Fab Selected for Bindingto gp120-CD4-CCR5 Complexes., Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 6913-6918 (2002) を参照のこと。
【０２９１】
［物質］
使用した SB 媒体およびファージミド pComb3X は、 Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor; 2001) の記載と同様にして得た。可溶性CD4および IgG 2G12 は、 the National Institute of Health AIDS Research and ReferenceProgram（ARRRP）から得た。また、可溶性CD4 は Progenics Pharmaceuticals, Inc. からも得た。 Gp120BaLは、 Quality Biological Inc. から得た（ HIV BaL rgp120 ）。
【０２９２】
［組換え体 DNA 法］
wild type scFv X5 をコードする pComb3X ベクター DNA をテンプレートとした QuikChange Kit（Stratagene）を使用したオリゴヌクレオチド部位直接突然変異誘発（ oligonucleotide site-directed mutagenesis ） によって、 ScFv X5 変異体を操作した。変異体クローンの配列を、DNA塩基配列決定法を使って検証した。
【０２９３】
scFv X5 フラグメントは、 VL-VH の向きの 18 残基のリンカー（ GGGGS GGGGS GGGGSRSS 、配列表の配列番号26）およびC末端 His6-タグおよび HA-タグであった。
【０２９４】
［ ScFv X5 の産生および精製］
野生型 scFv X5 フラグメントおよび変異体 scFv X5 フラグメントを、 E. coli の TOP1OF'株（Invitrogen）のペリプラズム（周縁質）に発現させた。細菌培地（4L）を、37℃で A600nm = 0.8 になるまで生長させてから、 1mM IPTG で誘導し、 30℃で一晩発現させた。細胞を遠心分離して沈降させ（pelleted） 、リシスバッファー（50mM リン酸ナトリウム, pH8 、 0.3M NaCl）中で再懸濁した。超音波振動にかけて細胞を破壊した。13,000rpmでの30分間の遠心分離の後、上清に予め平衡させた Ni-NTA ビーズ （Qiagen, 培地1リットルにつき 0.75ml の樹脂）を加え、4℃で2時間インキュベートした。結合したscFv X5 分子を、 10mM イミダゾールで洗ってから、リシスバッファー中の 100mM イミダゾールを使って溶離した。 scFv X5 を含んだ分劃をプールし、4℃で一晩かけてPBS 内へと透析した。精製 scFv X5 の収量は、各変異体ごとに異なり、培地あたり 0.2〜1.2mg/L の範囲となった。
【０２９５】
［ Fc-gp120 の発現および精製］
組換え体 Fc-gp120 を、グルタミン合成酵素遺伝子（glutamine synthetase gene）を選択マーカーとして使用して発現させた。 Bebbington, C. R. et al., High-level Expression of a Recombinant Antibody from MyelomaCells Using a Glutamine Synthetase Gene as an Amplifiable Selectable Marker.,Biotechnology (N Y), 10, 169-175 (1992) を参照のこと。使用した宿主細胞は、CHO-K1 細胞（Aymeric deParseval and John Elder, TSRI から提供）であった。グルタミンを含まない Glasgow minimum essential medium（GMEM, Sigma, St. Louis, MO）に、 5% Ultra Low IgG Fetal Bovine Serum（GIBCO Invitrogen Corp., Grand Island, NY）、 MEM 非必須アミノ酸（Gibco Invitrogen, Grand Island, NY）、 1mM MEM ピルビン酸ナトリウム（Gibco-BRL）、 500μM 1-グルタミン酸、500μM 1-アスパラギン、30μM アデノシン、 30μM アデノシン、 30μMグアノシン、 30μM シチジン、 30μM ウリジン、 10μM チミジン（Sigma）、 mL あたり100U のペニシリン、 mL あたり 100μgのストレプトマイシン、および 50 L-メチオニンスルホキシイミン（Sigma）を、3リットルのスピナーフラスコ内で加えたものの中で選択を行った。
【０２９６】
上清を滅菌濾過し、 protein A-Sepharose Fast Flow（Pharmacia, Arlington Heights, IL）を通して精製した。Fc-gp120を、 0.1M 枸櫞酸（pH 3.0）中で溶離した。蛋白質溶液の pH を、 2M Tris（pH9.0）を加えて即座に中性にしてから、蛋白質をPBS に対して透析した。蛋白質の濃度を、280nm の吸光によって測定し、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）によって確認した。この方法による蛋白質の収量は、0.5〜1.5 mg/Liter の範囲となった。
【０２９７】
［フルオロフォアカップリング］
上述の記載、および Toutchkine et al., Solvent-sensitive Dyes to Report Protein Conformational Changes in Living Cells., J Am Chem Soc, 125, 4132-4145 (2003) に記載の方法に従って、scFv X5 変異体を、 Cys 反応性の S-SO-IAA 色素および I-SO-IAA 色素のそれぞれで標識した。色素のDMSO 保存溶液 (10〜20mM)を、 500μl の蛋白質溶液(15〜100μM in PBS, pH 7) に加えて、過剰の色素のモル濃度を2.5〜5倍にした。反応混合液を2.5時間に亘って室温でインキュベートした。反応混合液を12,000rpm で2分間遠心分離し、反応中に生成したと考えられるすべての沈澱を除去した。さらに、上清を Sephadex G25（Amersham Biosciences）もしくはBio-Gel P2（Biorad） のゲル濾過を使って精製した。ゲル濾過の間に、色素-蛋白質付加体は遊離色素から明瞭に分離された。この複合体の純度を、SDS-PAGEを使って確認した。精製した蛋白質複合体中には、遊離色素は観察されなかった。複合体は、単独の色つき蛍光蛋白質バンドを形成し、その分子量はscFv X5 に応じた。吸光スペクトル法（S-SO についてε610nm =140,000M-1 、 I-SOについてε599nm=143,000M-1
； Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Edn. Ninth Edition. (Molecular Probes, Inc., Eugene; 2002) に記載されたもの）を使って測定した蛋白質と色素の濃度から、色素と蛋白質との比率を算出した。標識したscFvX5 のアリコートを、 -80℃で保存した。
【０２９８】
［Cdc42バイオセンサーの発現および精製］
CRIB モチーフを含み、アミノ酸（ WASP アミノ酸 201〜321 ）を包んだヒト WASP フラグメントが Cdc42 に結合したものをコードするDNAを、 PCR 法を用いて、 ATCC clone #99534 から増幅した。このペプチドフラグメントは、下記のアミノ酸配列（配列表の配列番号27）を有する。
DIQNPDITSSRYRGLPAPGPSPADKKRSGKKKISKADIGAPSGFKHVSHV
GWDPQNGFDVNNLDPDLRSLFSRAGISEAQLTDAETSKLIYDFIEDQGGL
EAVRQEMRRQEPLPPPPPPS
WASP 蛋白質の完全な配列（配列表の配列番号28）を下記に示す。
MSGGPMGGRP GGRGAPAVQQ NIPSTLLQDH ENQRLFEMLG RKCLTLATAV
VQLYLALPPG AEHWTKEHCG AVCFVKDNPQ KSYFIRLYGL QAGRLLWEQE
LYSQLVYSTP TPFFHTFAGD DCQAGLNFAD EDEAQAFRAL VQEKIQKRNQ
RQSGDRRQLP PPPTPANEER RGGLPPLPLH PGGDQGGPPV GPLSLGLATV
DIQNPDITSS RYRGLPAPGP SPADKKRSGK KKISKADIGA PSGFKHVSHV
GWDPQNGFDV NNLDPDLRSL FSRAGISEAQ LTDAETSKLI YDFIEDQGGL
EAVRQEMRRQ EPLPPPPPPS RGGNQLPRPP IVGGNKGRSG PLPPVPLGIA
PPPPTPRGPP PPGRGGPPPP PPPATGRSGP LPPPPPGAGG PPMPPPPPPP
PPPPSSGNGP APPPLPPALV PAGGLAPGGG RGALLDQIRQ GIQLNKTPGA
PESSALQPPP QSSEGLVGAL MHVMQKRSRA IHSSDEGEDQ AGDEDEDDEW
DD
配列表の配列番号27の配列をコードする DNA フラグメントを、 pET23a（Novagen）内へと、 C末端 6His 融合として、さらにクローン化した。部位特異性システイン変異体を、合成オリゴ（synthetic oligos）を用いた QuikChange（Stratagene）突然変異誘発で構築し、また、変異の存在を、 DNA 塩基配列決定法で確認した。得られた構造体を、E.coli の BL21DE3 株（Novagen）内に形質転換させてから、 1L Leuria-Bertani media（Sigma）中で、100μg/mlのカルベニシリンを加えて、 300℃で5時間に亘って発現させて、蛋白質を生成した。発現は 0.5mM IPTG で誘導し、OD600=0.8〜1とした。細胞を遠心分離して回収し、使用するまで-20℃で保管した。
【０２９９】
細胞沈渣（cell pellet）を、冷リシスバッファー（25mM Tris-HCl（pH7.9）、 150mM NaCl 、 5mM MgCl2、5% グリセロール、 1mM PMSF 、 2mM β-メルカプトエタノール）中で再懸濁して、すぐに氷浴しながら超音波処理にかけた。リゾチームおよびDNアーゼを懸濁液に加えて、最終濃度をそれぞれ0.1mg/mlと 100U/ml としてから、溶液をときどき攪拌しながら4℃で30分間インキュベートした。細胞リシス生成物を遠心分離（12,000g、30分間）にかけて、澄ませた上清を1mlの Talon 樹脂（Clontech）と共に 25℃で30分間インキュベートした。結合した Cd42 結合ドメイン（CBD）を含んだ樹脂を、低速遠心分離に少しかけてリシス生成物から分離し、15ml のリシスバッファーで二回洗った。最後に、樹脂をリシスバッファーで洗い、10mM イミダゾールを加えて、カラムに注ぎ入れた。溶離を 60mM イミダゾールを含んだ5ml のリシスバッファーで行った。大量の CBD を含んだ（SDSゲルで実証）分劃を併せて、 1L の透析バッファー（25mM Na2HPO4（pH7.5）、10mM NaCl）に対して4℃で5時間に亘って透析にかけた。その後、溶液を Aquacide パウダーを使って濃縮し、最終的な蛋白質濃度を 2〜10mg/mlとしてから、再度透析バッファーに対して透析にかけた。最終的な調製を、100μL アリコートを瞬間冷凍（flash-frozen） して行い、-80℃で保存した。全般的に言って、1L の細胞培地から 1〜3mg のCBD が得られた。組換え体 6His でタグ付けした cdc42 、 RhoA 、 Racl 、 ERK2 、およびMEK を、類似の手法で生成した。これらの酵素は、GTP 結合アッセイにおいて >90% の活性であると定量されている（Knaus, U. G.,Heyworth, P. G., Kinsella, B. T., Curnutte, J. T., and Bokoch, G. M. (1992) J.Biol. Chem.、 267, 23575-23582）。
【０３００】
［CBDと蛍光色素の複合化］
透析した CBD 試料（100〜150μM）を、モル濃度にして6〜7倍の過剰量の反応性色素を用いて、 25℃で3〜4時間かけてゆっくりと転化させた。10mMジチオスレイトール（DTT）を加えて反応を停止し、混合液を15分間に亘ってインキュベートした。 G25-Sepharose（Pharmacia）ゲル濾過カラム（25mMNa2HPO4（pH7.5）で平衡させて展開したもの）を用いて、未反応の色素を標識した蛋白質から分離した。溶離した分劃の純度を、アリコートをSDSゲル上で泳動させて蛍光を可視化することによって測定した。遊離色素を最小限しか含んでいない分劃だけを、この後の実験で使用した。色素と蛋白質との比率を、CBD濃度（ε280 = 8,250M-1 ）、ならびに、 617nm での A4C 濃度（ε = 70,000M-1）もしくは554nmでの Alexa546 濃度（ 50mM リン酸カリウム（pH7.0）中で ε = 104,000M-1 ）の測定によって定量した。ウシ血清アルブミンを基準として校正したCoomassie Plus assay（Pierce）を用いて、 CBD の濃度を独立に確認した。こうして得られた色素と蛋白質との比は、単独の色素について0.8〜1.2 の範囲、二つの色素の複合体については1.7〜2.1の範囲となった。標識した CBD のアリコート（ 15〜50μM ）を、 -80℃で保存した。六ヶ月の保管の後に、結合能力の重大な損耗は見られなかった。この実施例では、本発明に係る色素から作成したCBD-複合体のことを、mero-CBD （CBDと複合したメロシアニン色素）と呼ぶ。
【０３０１】
［生体外蛍光アッセイ］
Rhodamine B を内部標準として用いた Fluorolog 2 Spex 1681 Spectrometer（Jobin Yvon, Horiba）を使い、蛍光を25℃で測定した。励起および発光スリット幅は2mm とした。 600nm での励起と、 625nm（S-SO）もしくは 630nm（I-SO）での発光とを用いて、それぞれ励起スペクトルと発光スペクトルとを得た。scFvX5 複合体の蛍光を、
Fc-gp120/sCD4 （ 30℃の PBS 中で5分間に亘ってインキュベートしたもの）の濃度を高めながら滴定した。
【０３０２】
［ELISA 結合アッセイ］
九十六ウェルプレートを、 50ng の蛋白質を含んだ 0.05ml gp120BaL 溶液を用いて 4℃で一晩インキュベートすることによって、gp120BaLで直接被覆した。プレートを 3% BSA で処理して非特異的結合を抑止した後、 0.05% Tween-20 を含んだPBS で洗った。 100ng のsCD4（0.02% Tween-20 を含んだ 1% BSA 中のもの）と共に ScFv X5 を加えて、37℃で1.5時間に亘ってインキュベートした。結合したscFvX5 を、 INDIA HisProbe-HRP（Pierce）を用いて検出し、さらに比色アッセイ（ Immunopure TMB Substrate（Pierce）を硫酸で停止したもの）を光学濃度 450nm で測定することによって定量した。
【０３０３】
scFv X5 の野生型、変異体、および色素との複合体について、5倍の希釈をした系列を使って滴定を行った。 Sigma Plot 8.0 （ B = (Bmax*X5)/(KD
+ X5) 、ここで B は結合した X5 の量であり、 Bmaxは結合した X5 の最大量であり、X5は scFv X5 のバルク濃度であり、 KD は平衡解離定数である）を用いて、データを Langmuir 型吸着等温線にフィットさせた。
【０３０４】
［scFv X5 のモデル］
図１２に示した scFv X5 の均一モデルを、 Fab X5 の結晶構造から直接生成した。 graphics program O（Jones, T. A.,Kjeldgaard, M., Electron-density map interpretation., Methods in Enzymology, 277, 173-208 (1997)）を使用した後に配列最適化を行って、点突然変異を scFv の配列に応じて作成した。リンカーは複数の構造を取りうる可撓性が高いものであり、且つ結合には関与しないため、18個のアミノ酸を持つリンカーをこのモデルに含めなかった。
【０３０５】
［細胞培地およびトランスフェクション］
HEK293T 細胞を、 10% (v/v) ウシ胎児血清（Gibco）を含む DMEM 中で生長させた。細胞（1 x 105cells）を、ポリ-L-リシン（10μg/ml）上に播種して一晩置き、FuGENE6（Roche）を製造者のガイドラインに従って使用して一過性トランスフェクション（形質転換）を行った。
【０３０６】
［生体内細胞蛍光アッセイ］
HEK293T 細胞を、 pCAGGS-JRFLgp160wt（Binley, J. M. et al., Redox-triggered Infectionby Disulfide- shackled Human Immunodeficiency Virus Type 1 Pseudovirions., J. Virol, 77, 5678-5684 (2003)）および pCDNA3-EGFP を用いるか、あるいはpCDNA3-EGFP を単独で用いるかののいずれかによって、一過性同時トランスフェクションにかけた。トランスフェクション後36時間経った細胞を、EDTA（PBS中で 5mM）を用いて移動し、洗ってから PBS 中で再懸濁した。細胞懸濁液を、 H96-scFv X5-S-SO（65nM および100nM）と sCD4（50nM）を用いて、室温で30分間インキュベートした。S-SO と EGFP の蛍光を、 Fluorolog 2 Spex 1681Spectrometer を使って測定した。試料を、 600nm（S-S）もしくは488nm（EGFP）でそれぞれ励起させた。発光スペクトルを 612〜730nm（S-SO）および503〜700nm（EGFP）で得た。
【０３０７】
［蛍光抗体法］
カバーガラス上で gp120 を過剰発現させた HEK293T 細胞を、トランスフェクションから36時間後に、 3.7% ホルムアルデヒド-PBS で10分間かけて固定し、さらに2%BSA-PBS 中で45分間室温で置いてブロックした。細胞を、まず一次抗体 IgG1 2G12 （50ug/ml）を使って1.5時間インキュベートした後、二次抗体（20μg/mlのR-フィコエリトリンと複合化したヤギ抗ヒトIgG、 F(ab')2 フラグメント特異性、 Jackson Immuno Research）を使って1時間に亘り37℃でインキュベートした。カバーガラスはVectashield（Vector Laboratories）と共に載せた。Zeiss Axiovert 100TV microscope 、Quantix-cooled CCD camera（Roper Scientific）、および4Ox 1.3NA 油浸対物（露光時間： 100ms 、ビニング1x1）を使って画像を撮った。 R-フィコエリトリンの蛍光のための蛍光フィルター（Chroma）は、HQ470/40（励起）および HQ630/40（発光）であった。
【０３０８】
［結果］
［scFv ライブラリの設計］
一本鎖 X5 フラグメント内の、溶媒感受性フルオロフォアのカップリングのための最適な部位を確認した。ターゲットが蛍光色素の結合部位に結合したときに高い蛍光応答を実現するためには、結合への影響を最小限にしつつ結合部位が可能な限り近づくことが理想的であると考えられる。抗体の抗原結合部位は、scFvフラグメント内で組み立てられた、種々のH鎖およびL鎖から成る六個の相補性決定領域（CDR）から形成されている。遊離Fab X5フラグメントについての結晶学的データを本発明者は利用することができたが、gp120もしくは gp120/CD4 と複合化した X5 の構造は決定されていなかった。そのため、結合に関与した残基は未知であった。そこで、同一のファージライブラリとしてX5から誘導したいくつかのscFv および Fab の CDR 配列を比較した。比較的保存されていなかった （relatively non-conserved） 十個の残基を、システインで置換して、システインに対して反応性である色素誘導体を用いる部位選択性色素結合のために選択した（保存されていなかった残基は、抗体結合における重要性が薄かったと考えられる）。ひとつの色素カップリング部位をVL鎖のそれぞれの CDR 内に、ひとつをH鎖のCDR1 （CDR H1）内に、ふたつをCDR H2内に導入した（図９Ｂ）。
【０３０９】
X5 は拡張された CDR H3 ループ（22残基）を有する。また、他の HIV-1 中和抗体（例えば IgG1 b12 および IgG 17b）も、拡張されたH3ループを含む。 Saphire, E. O. et al., Crystal Structure of a Neutralizing Human IGG against HIV-1: a Template for Vaccine Design., Science, 293, 1155-1159 (2001) 、Kwong, P. D. et al., Structure of an HIV gp120 Envelope Glycoprotein in Complexwith the CD4 Receptor and a Neutralizing Human Antibody., Nature, 393, 648-659(1998) を参照のこと。これらのHIV-1中和抗体（IgG1 b12 および IgG 17b）においては、 CDR H3 が抗原結合に際して主要な役割を担っていることが知られている。したがって、四個の色素カップリング部位が、このループ中に組み込まれた。また、システインをH鎖のN末端に導入して、色素が、より一般的に適用可能なこの位置に配置されることが可能であるかどうかを検査した。
【０３１０】
十一種の変異体のそれぞれを、 E. coli のペリプラズム内に発現させて、適切な折り返し構造およびジスルフィド結合構造を可能とし、さらにヘキサヒスチジン親和性タグを使って精製した。野生型およびH鎖変異体を、良好な収量で生成できた（培地あたり0.7〜1.2mg/L）。L鎖にシステインを組み込んで付加した変異体は、際立って低い発現量を示した（培地あたり 0.2〜0.4mg/L）。
【０３１１】
また、十一種の変異体のそれぞれを、溶媒和発色色素 S-SO の、システイン特異的なヨードアセトアミド誘導体と反応させた。二種の CDR H3 変異体は、別の色素（I-SO）から上記と同様にして誘導した。これらのフルオロフォアは、非反応性を示したひとつのscFv X5変異体（L-S33C）を除いたすべてに対して共有結合することができた。標識した変異体の吸光スペクトルは、620nmでピークを示し、これは水性バッファー中での色素の吸収極大に対応するものである。
【０３１２】
scFv X5 の分子量に対応する有色の蛍光バンドが、 SDS-PAGE ゲル上で観察された。色素の対照試料を、同一のゲル上で泳動させたところ、遊離色素化学種は存在していなかった。われわれは、スペクトルから色素カップリングの収量（scFv分子のモル数あたりの色素のモル数）を算出することができた。標識したscFv の有する、色素／蛋白質の値が1未満となるように反応条件を調節した。このようにして、scFv X5あたりにひとつよりも多い色素分子を含まず、且つ（重要なことに）非共有結合した色素を含まないような分子化学種上で、scFv-色素複合体の特性評価を行った。
【０３１３】
［システイン変異体および標識した scFv の結合親和性］
scFv X5 と gp120/CD4 との間の相互作用のパラメータに対する、システイン変異の影響と、色素とのカップリングの影響とを測定した。平衡解離定数（KD）を、gp120と溶解性 CD4 （sCD4）とを使った ELISA アッセイを行って得た（図１０）。
【０３１４】
表５に示したように、野生型 scFv X5 は、 gp120/sCD4 と高い親和性を以って結合する（KD = 1.05nM）。
【０３１５】
【表５】
2007529718.tif 000075
結合親和性への Cys 変異の影響は、ひとつの CDR H3 変異体の場合を除き、最小限であった（表５）。 H-F96C は、 gp120/sCD4 といくらか低い親和性を以って結合していたが、このいくらか低い親和性はそれでもかなり高いものであった（KD=7.22nM）。H-G1OOcS および H-F34C は、若干低い親和性を示した（それぞれ、 KD = 3.4nM 、 2.78nM）。変異体scFvX5 フラグメントとその蛍光誘導体との KD を比較したところ（表５）、フルオロフォアの存在は、 gp120/sCD4 との相互作用に対して非常に小さい影響しか与えないということがわかった。対照実験では、変異体と同様の方法で野生型scFvX5 をフルオロフォアで処理したところ、共有結合の標識付けは起こらず、また、結果として結合活性が減少することも無かった。 I-SO 色素に対してS-SO 色素を使用したところ、結合親和性への重大な影響は見られなかった。このことは、これらの色素の構造の差異が小さいことと調和する。Toutchkine et al., Solvent-sensitive Dyes to Report Protein Conformational Changes in Living Cells., J Am Chem Soc, 125, 4132-4145 (2003) を参照のこと。これらの結果からは、バイオセンサー用途に対して影響を及ぼしうるレベルで親和性に作用してしまうこと無く、システインをscFv フラグメント上の或る範囲の位置に挿入することができた、ということがわかった。また、色素が良好な蛍光応答を示す位置に在ったという事実（後述）にもかかわらず、色素カップリングは結合親和性に大きな影響を与えなかった。
【０３１６】
［標識した scFv X5 フラグメントの生体外蛍光応答］
scFv S-SO 複合体の蛍光特性を、図１１に示したように評価した。図１１に示したように、色素の蛍光応答は、scFv結合ドメイン上の色素の位置に因る影響を受ける。
【０３１７】
色素複合体の蛍光強度を、等モル比の gp120 と sCD4 の濃度を高めながら測定した。蛍光強度の極大値は、発光波長 625nm において得られた。蛍光応答を滴定して極大応答を定量し、また、蛍光応答はgp120/sCD4との相互作用に対して特異的であった（図１１Ｂ）。gp120/sCD4 の濃度が、scFv X5 複合体の濃度である 130nM の五倍よりも高くなったところで飽和に達し、測定を行った。極大蛍光応答は、20%の増大から、ほぼ6倍の増大に至るまでに変化した（図１１Ａ）。蛍光応答の最高値は、H鎖の CDR3 ループの三箇所の位置（H96, H1OOH, H1OOE）から得られ、位置H96 での複合化からは、ほぼ6倍の増大が得られた（図１１Ｃ）。
【０３１８】
興味深いことに、最高の蛍光応答を有した変異体では、その結合親和性がシステイン変異と色素結合から最大の影響を受けた。異なるループ中の S-SO で標識した位置のいくつかでは、蛍光強度が2〜3倍増大した。S-SO をN末端近傍に導入したところ、応答は 2.1倍となった。四箇所の位置で、弱い応答（1.2〜1.8倍）が見られた。位置 CDR L1 は、 S-SO がこの部位に共有結合できなかったために検査不能であった。対照実験では、標識したscFv をオボアルブミンを加えてインキュベートした場合と、sCD4 単独でインキュベートした場合とのいずれにおいても、応答は見られなかった（図１１Ｂ）。
【０３１９】
二種の異なる色素（S-SO および I-SO）の蛍光応答を、位置 H96 および H100E で比較した（図１１Ｄ）。二種の色素は、類似した蛍光変化を見せた。標識した十一箇所の位置のうち、六箇所では優れた応答（2倍よりも多い）を有するscFv-色素複合体が得られ、四箇所では応答が20〜80% の強度増大をしたバイオセンサーが得られた。
【０３２０】
［scFv X5 構造と色素結合位置のモデル］
S-SO-複合体で観察された蛍光応答が、その結合表面上の位置によっていかにして左右されるのかを理解するために、Fv フラグメントのモデルを Fab X5 結晶構造（非公開データ）から誘導した。L鎖N末端ドメインとH鎖N末端ドメインから成るFab X5のN末端領域を、scFvモデルを生成するために用いた。 Fab のN末端領域の構造的特徴は、 scFv にも同様に保たれていると仮定した。Cys 点突然変異のために選択した十一個の残基の周囲の疎水性環境および溶媒到達性を検査した。
【０３２１】
図１２Ａは、 scFv フラグメントの中枢をリボン図として描いたものであって、溶媒感受性色素のための結合部位をカラーコードでマッピングして、各位置での蛍光応答を示したものである。十一個の残基のうち、H96は、充分な溶媒到達性を持つ表面を有しつつ、高い疎水性環境を有しており（図１２Ｂ）、ここからは最高の蛍光応答がほぼ6倍の増大として得られた。
【０３２２】
［生細胞上の gp120 発現の検出］
生細胞の表面上の gp120 の発現を、迅速且つ容易に定量するために、バイオセンサーを使用した。 EGFP と表面 gp120 の双方を一過性発現しているヒト胎児腎臓293T（HEK 293T）細胞を、過剰 sCD4（5OnM）と、二種の異なる濃度の H96-scFv X5-S-SO（65nM および 100nM）とを加えてインキュベートした。EGFP のみを発現している対照細胞も、同様に処理した。細胞懸濁液の SSO および EGFP 蛍光を、結合していないバイオセンサーを洗い流さずに、蛍光光度計中で測定した。S-SO と EGFP 蛍光との比率を、 gp120 発現細胞対対照細胞で比較した（図１３Ａ）。 scFv X5 S-SO-複合体の濃度に依存して、 S-SO/EGFP 比が対照細胞のそれの 200% となり、このことは、 gp120 に応答するバイオセンサーとして矛盾しない。 gp120 の表面発現を、蛍光抗体法で検証した（図１３Ｂ）。
【０３２３】
［実施例3： Erkの変化に起因したリン酸化の検出］
この実施例では、本発明に係る色素が、所望の蛋白質（例えば、 Erk）に直接結合でき、色素が構造変化およびリン酸化に応答できる、ということを示す。特に、I-TBA-3CNPh色素は、MAPキナーゼ Erk2 のシステイン 214 に結合して、 Erk のリン酸化に応答した。 I-TBA-3CNPh 色素の構造を下記に示す。
【０３２４】
【化７２】
2007529718.tif 000076
【０３２５】
図１５Ａは、 I-TBA-3CNPh 色素を、 Erk2 の構造内にフィットしていると考えたときの、空間充填モデルを示す。このモデルは、標識した蛋白質の質量分光配列法と組み合わせたトリプシン消化と、ドッキング（docking）の研究とに基づいたものであった。軽い方（黄色）の残基は、色素と水素結合する二つのリシンと、π-πスタッキングを介して相互作用するトリプトファンを示している。紫色の残基のリン酸化は、蛋白質の構造に依って変化し、トリプトファンの相互作用に影響し且つ水素結合のうちのいくつかに作用する。こうしたリン酸化および構造変化は、MEKキナーゼ（Erk2 をリン酸化する）および ATP と共にインキュベートした野生型 Erk2 蛋白質中で、 I-TBA-3CNPh 色素の蛍光のリン酸化に起因する増大（図１５Ｂ）を起こす上で充分なものであった。
【０３２６】
リン酸化不能である Erk2 変異体を使用したところ、過剰 MEK で飽和させても、蛍光変化は見られなかった。これらの結果からは、蛍光変化はリン酸化に因るものであって、MEKとの結合に因るものでは無い、ということが示唆された。ウェスタンブロット（Western blots）では、標識した Erk2 蛋白質の通常のリン酸化と、Erk2の基質であるElkの通常のリン酸化が示された。よって、標識した Erk2 蛋白質は、リン酸化活性を保っている。
【０３２７】
図１５Ｃは、生細胞中で、標識した Erk2 をインキュベートした結果を示す。血清飢餓状態の線維芽細胞における Erk2 蛍光（左図）を、 LPA で刺激した線維芽細胞（右図）と比較した。予測された核の活性化が、付着複合体のように見えるものの近傍に局在化した活性化と共に、観察された。
【０３２８】
これらの結果からは、蛋白質の通常の機能に不都合な影響を及ぼしてしまうこと無く、本発明に係る色素を蛋白質に成功裡に結合させることができ、また、これらの色素で標識した蛋白質の構造変化および機能変化を、生体外だけでは無く生体内でも観察することが可能となる、ということが示唆される。
【０３２９】
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【０３３０】
本明細書中で参照もしくは言及したすべての特許ならびに公報は、本発明が関係する技術分野における当業者の技術水準を示し、また、参照により個々がそれぞれ全体として含まれた場合か、もしくは全体として本明細書中に発表された場合と同一の範囲で、このような特許もしくは公報のそれぞれは、この参照により本開示に含まれる。出願人は、これらの参照した特許もしくは公報のいずれかからの、任意のもしくはすべての物質ならびに情報を、この明細書内に物質的に組み込む権利を保有する。
【０３３１】
本明細書中に記載された特定の方法および組成物は、好ましい実施形態を代表するものであって、本発明の範囲を限定しようとするものでは無い。他の物、特徴、および実施形態は、当業者が本明細書中の考察に基づいて実施することができるものであって、また、請求項の範囲によって定められる本発明の本質内に含まれる。当業者は、本発明の範囲および本質を逸脱すること無く、本明細書中で開示した発明に対して、置換基および修飾を変化させることができるということは明らかである。本明細書中で例示的に適切に記載された本発明は、本明細書中において本質的なものとして特に記載されたものでは無いいずれかのひとつもしくは複数の要素またはひとつもしくは複数の限定が存在しなくとも、実施をすることができる。本明細書中に例示的に適切に記載された方法およびプロセスは、ステップの順番を変えても実施することができ、また、本明細書中もしくは請求項中で示したステップの順番に限定する必要も無い。本明細書中および付加した請求項中で用いられている、単数形"a"、 "an" 、 および "the" は、複数参照を、文脈上明らかに異なる場合を除いて含む。ゆえに、例えば、「ひとつの宿主細胞」（"a host cell"） が参照するものは、複数の（例えば培地もしくは集団としての）このような宿主細胞、などを含む。本特許は、決して、本明細書中に記載した特定の実施例もしくは実施形態もしくは方法に限定されるように解釈されるものでは無い。特許庁のあらゆる審査官またはその他の職員もしくは従業員による声明が、出願人による応答書面中にて明瞭に採られた制限もしくは条件を変えていない場合では無いときには、本特許は決してこうした声明に限定されるように解釈されるものでは無い。
【０３３２】
用いてきた語および表現は、記載のための用語として使われたものであって、限定のためには使われてはおらず、また、こうした語および表現の使用にあたっては、示され記載された特徴およびその一部のいかなる等価物も除くことを意図してはいないが、請求された本発明の範囲内において種々の変形を施すことが可能であるということが認められる。したがって、本発明が、好ましい実施形態と付加的な特徴とを以って特に開示されていることにはかかわらず、本明細書中で開示した概念の変更および変形を、当業者に頼って行うことができ、また、このような変更および変形は、付随する請求項に定められる本発明の範囲の裡に在ると考えられる、と理解されたい。
【０３３３】
本発明は、本明細書中で広く全般的に記載されている。狭いスピーシーズと下位のグルーピングのそれぞれは、本発明の一部を成す包括的な開示の内部に包含される。これは、削除された物が本明細書中で特に説明されているかいないかにかかわらず、ジーナスから任意の構成要件を除くような条件もしくは除く限定（negative limitation）を伴う本発明の包括的な記載を含む。
【０３３４】
他の実施形態は、下記の請求項の内部に含まれる。加えて、本発明の特徴もしくは態様がマーカッシュ群の語で記載されている場合には、当業者は、本発明を、マーカッシュ群の構成員群のうちのいずれかの独立構成員もしくは下位グループの語でも記載できるということを認識することになる。
【図面の簡単な説明】
【０３３５】
【図１】図１は、 S-TBA 色素 1c の種々の濃度の水溶液の、吸光スペクトルおよび蛍光（励起）スペクトルを示す。濃度： 1.25μM （─）、2.5μM（─ ─）、 12.5μM （− − −）、 25μM （- - -）。内挿図：色素 1c の励起スペクトルで、水溶液濃度は1.25μM （─）、および2.5μM （─ ─）。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄは、色素 1c （図２Ａ）、色素 2b （図２Ｂ）、色素 3b （図２Ｃ）、および色素 4b （図２Ｄ）、の水溶液中の吸光スペクトルを示す。すべての濃度は1.0μMとした。 AH は凝集に因る光吸収であり、 AM はモノマーの光吸収である。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｄは、色素 1c （図２Ａ）、色素 2b （図２Ｂ）、色素 3b （図２Ｃ）、および色素 4b （図２Ｄ）、の水溶液中の吸光スペクトルを示す。すべての濃度は1.0μMとした。 AH は凝集に因る光吸収であり、 AM はモノマーの光吸収である。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｄは、色素 1c （図２Ａ）、色素 2b （図２Ｂ）、色素 3b （図２Ｃ）、および色素 4b （図２Ｄ）、の水溶液中の吸光スペクトルを示す。すべての濃度は1.0μMとした。 AH は凝集に因る光吸収であり、 AM はモノマーの光吸収である。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｄは、色素 1c （図２Ａ）、色素 2b （図２Ｂ）、色素 3b （図２Ｃ）、および色素 4b （図２Ｄ）、の水溶液中の吸光スペクトルを示す。すべての濃度は1.0μMとした。 AH は凝集に因る光吸収であり、 AM はモノマーの光吸収である。
【図３】図３は、 I-SO 色素 4b の水溶液中の吸光スペクトルであり、濃度は 1.25μM（─）、および 250μM （− − −）である。
【図４】図４は、 S-SO 色素 2b の、種々の溶媒（ブタノール（─）、メタノール（・・・）、水（- - -））中での、規格化した励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す。励起スペクトルには、640nmの照射を必要とした。発光スペクトルには、 530nm での励起を必要とした。 C(2b) = 0.01μM 。
【図５】図５は、 I-SO 色素 4b の、種々の溶媒（ブタノール（─）、メタノール（・・・）、水（- - -））中での、規格化した励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す。励起スペクトルには、640nmの照射を必要とした。発光スペクトルには、 530nm での励起を必要とした。 C(4b) = 0.01μM 。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｂは、 S-TBA 色素 1b の吸光特性を示す。図６Ａは、 S-TBA 色素 1b （C0 = 1μM）の、種々の照射時間（0、3 、 23 、 47 、 74 、 120時間）の後の、ブタノール中での吸光スペクトルである。図６Ｂは、 S-TBA 色素 1b の、ブタノール中での濃度壊変を図示したものである。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｂは、 S-TBA 色素 1b の吸光特性を示す。図６Ａは、 S-TBA 色素 1b （C0 = 1μM）の、種々の照射時間（0、3 、 23 、 47 、 74 、 120時間）の後の、ブタノール中での吸光スペクトルである。図６Ｂは、 S-TBA 色素 1b の、ブタノール中での濃度壊変を図示したものである。
【図７】図７には、 GDP-Cdc42 （・・・）の存在下、および GTPγS-Cdc42 （─）の存在下における、 Wiskott Aldrich 症候群蛋白質（WASP）のフラグメントに結合したS-SO色素の励起スペクトルならびに発光スペクトルを示す。図からは、バイオセンサーのCdc42 への結合によって、蛍光スペクトルが変化していることが分かる。励起スペクトルは630nmの照射を必要とし、また、発光スペクトルは 600nm での励起を必要とした。 [CBD] = 150nM 、 [Cdc42] = 300nM 、[GNP] =10μM 。
【図８】図８は、本発明に係る色素の合成経路を示す。以下のステップの条件を下記に示す。 (a) 1,3,3-トリメトキシプロペン、 MeOH 、還流。 (b)1,3,3-トリメトキシプロペン、90℃。 (c) AcONa 、 MeOH-CHCl3 、還流。 (d) AcONa 、 DMSO 、100℃。(e) ClCH2COCl/Et3N、 DMF 、 -40℃。 (f) NaJ 、 MeOH 、還流。 (g) ジグリコール酸無水物、CHCl3 、還流。 (h) プロパン=スルホン、C6H6 、 75℃。 (i)AcONa 、 AcOH 、 80℃。 (k) TSTU/(i-Pf)2EtN、 DMF 、室温。これらの化合物の合成については、実施例1でさらに記述する。
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、抗体に基づいたバイオセンサーのデザインの模式図である。図９Ａは、バイオセンサーのモデルを示す。環境感受性色素（丸印）は、抗体フラグメント（scFV）の結合部位に共有結合される。scFVがそのターゲットとする抗原に結合すると、色素（星印）の蛍光強度が大幅に増大する。図９Ｂは、一本鎖 Fv フラグメントの分子表面を図示しており、多様なH鎖（重鎖）およびL鎖（軽鎖）（H1〜3、 L1〜3）の六つの相補性決定領域（complementary determining regions; CDR ） を示している。環境感受性メロシアニン色素が結合する、十一箇所の位置が示されている。アミノ酸残基には、Kabatの分類法に従って番号を付した。 Johnson, G. & Wu, T. T., Kabat database and its applications:30 years after the first variability plot, NucleicAcids Res, 28, 214- 218(2000)
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、抗体に基づいたバイオセンサーのデザインの模式図である。図９Ａは、バイオセンサーのモデルを示す。環境感受性色素（丸印）は、抗体フラグメント（scFV）の結合部位に共有結合される。scFVがそのターゲットとする抗原に結合すると、色素（星印）の蛍光強度が大幅に増大する。図９Ｂは、一本鎖 Fv フラグメントの分子表面を図示しており、多様なH鎖（重鎖）およびL鎖（軽鎖）（H1〜3、L1〜3）の六つの相補性決定領域（complementary determining regions; CDR ） を示している。環境感受性メロシアニン色素が結合する、十一箇所の位置が示されている。アミノ酸残基には、Kabatの分類法に従って番号を付した。 Johnson, G. & Wu, T. T., Kabat database andits applications: 30 years after the first variability plot, NucleicAcids Res,28, 214- 218 (2000)
【図１０】図１０は、 gp120 と sCD4 との結合を図示したものであって、こうした結合の KD をここから導き出すことができる。Gp120は、九十六ウェルプレート上で直接コートし、さらに洗浄した。 sCD4 を添加した後、 6xHis-scFv X5 を指定の濃度で加えた。結合したscFv X5を、 anti-6xHis-HRP を用いて検出し、また、 450nm での光学濃度を監視した。この図では、 450nm での平均吸光を、scFv X5 の種々の濃度に対してプロットしており、また、一価の結合の等温線にフィットさせている。このグラフは、scFv X5 wild type （野生型）、システイン変異体（H65 および H96 ）、ならびに色素複合体 （dye-conjugate） （H96-S-SO ）、の結合を示している。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｄは、 scFv ポリペプチドと、種々のアミノ酸残基の位置に結合した色素とを供給する、標識した scFv X5 ライブラリから得られた、scFv変異体の生体外での特性を示す。図１１Ａは、種々の S-SO 複合 scFv X5 ポリペプチド類の、極大蛍光応答を示す。 scFv X5-S-SO 複合体のそれぞれは、gp120/sCD4の濃度を高めながら滴定を行い、また、発光強度は 625nm で測定した。飽和時の蛍光強度は、遊離 scFv複合体の強度を基に規格化した。図１１Ｂは、種々の濃度のgp120/sCD4の蛍光強度を、 S-SO 色素と複合した H96C scFv X5 変異体を用いて検出したものを示した。蛍光強度は 625nm で測定した。オボアルブミン（オバルブミン）もしくは単独のsCD4では、応答は得られなかった。図１１Ｃは、 H96-scFv X5-S-SO の、 gp120/sCD4 と結合する前後における、励起スペクトルおよび発光スペクトルを示すものである。図１１Ｄは、S-SOか I-SO のいずれかと複合し gp120/sCD4 で飽和した、 scFv X5 の蛍光発光の増大を示す。蛍光強度は、 625nm （S-SO）もしくは630nm（I-SO）で測定した後、遊離 scFv 複合体の強度を基にして規格化した。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｄは、 scFv ポリペプチドと、種々のアミノ酸残基の位置に結合した色素とを供給する、標識した scFv X5 ライブラリから得られた、scFv変異体の生体外での特性を示す。図１１Ａは、種々の S-SO 複合 scFv X5 ポリペプチド類の、極大蛍光応答を示す。 scFv X5-S-SO 複合体のそれぞれは、gp120/sCD4の濃度を高めながら滴定を行い、また、発光強度は 625nm で測定した。飽和時の蛍光強度は、遊離 scFv複合体の強度を基に規格化した。図１１Ｂは、種々の濃度のgp120/sCD4の蛍光強度を、 S-SO 色素と複合した H96C scFv X5 変異体を用いて検出したものを示した。蛍光強度は 625nm で測定した。オボアルブミン（オバルブミン）もしくは単独のsCD4では、応答は得られなかった。図１１Ｃは、 H96-scFv X5-S-SO の、 gp120/sCD4 と結合する前後における、励起スペクトルおよび発光スペクトルを示すものである。図１１Ｄは、S-SOか I-SO のいずれかと複合し gp120/sCD4 で飽和した、 scFv X5 の蛍光発光の増大を示す。蛍光強度は、 625nm （S-SO）もしくは630nm（I-SO）で測定した後、遊離 scFv 複合体の強度を基にして規格化した。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｄは、 scFv ポリペプチドと、種々のアミノ酸残基の位置に結合した色素とを供給する、標識した scFv X5 ライブラリから得られた、scFv変異体の生体外での特性を示す。図１１Ａは、種々の S-SO 複合 scFv X5 ポリペプチド類の、極大蛍光応答を示す。 scFv X5-S-SO 複合体のそれぞれは、gp120/sCD4の濃度を高めながら滴定を行い、また、発光強度は 625nm で測定した。飽和時の蛍光強度は、遊離 scFv複合体の強度を基に規格化した。図１１Ｂは、種々の濃度のgp120/sCD4の蛍光強度を、 S-SO 色素と複合した H96C scFv X5 変異体を用いて検出したものを示した。蛍光強度は 625nm で測定した。オボアルブミン（オバルブミン）もしくは単独のsCD4では、応答は得られなかった。図１１Ｃは、 H96-scFv X5-S-SO の、 gp120/sCD4 と結合する前後における、励起スペクトルおよび発光スペクトルを示すものである。図１１Ｄは、S-SOか I-SO のいずれかと複合し gp120/sCD4 で飽和した、 scFv X5 の蛍光発光の増大を示す。蛍光強度は、 625nm （S-SO）もしくは630nm（I-SO）で測定した後、遊離 scFv 複合体の強度を基にして規格化した。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｄは、 scFv ポリペプチドと、種々のアミノ酸残基の位置に結合した色素とを供給する、標識した scFv X5 ライブラリから得られた、scFv変異体の生体外での特性を示す。図１１Ａは、種々の S-SO 複合 scFv X5 ポリペプチド類の、極大蛍光応答を示す。 scFv X5-S-SO 複合体のそれぞれは、gp120/sCD4の濃度を高めながら滴定を行い、また、発光強度は 625nm で測定した。飽和時の蛍光強度は、遊離 scFv複合体の強度を基に規格化した。図１１Ｂは、種々の濃度のgp120/sCD4の蛍光強度を、 S-SO 色素と複合した H96C scFv X5 変異体を用いて検出したものを示した。蛍光強度は 625nm で測定した。オボアルブミン（オバルブミン）もしくは単独のsCD4では、応答は得られなかった。図１１Ｃは、 H96-scFv X5-S-SO の、 gp120/sCD4 と結合する前後における、励起スペクトルおよび発光スペクトルを示すものである。図１１Ｄは、S-SOか I-SO のいずれかと複合し gp120/sCD4 で飽和した、 scFv X5 の蛍光発光の増大を示す。蛍光強度は、 625nm （S-SO）もしくは630nm（I-SO）で測定した後、遊離 scFv 複合体の強度を基にして規格化した。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、標識した scFv X5 のモデルを示す。図１２Ａは、 Fv X5 のリボンモデルを示しており、色素結合部位を強調している。システインで置換されて色素と結合した側鎖を、ball-and-stickform で示した。色づけは、ターゲットが結合した位置における S-SO 蛍光応答に対応させている（赤色 = 5.9倍の変化、橙色= 2〜3倍の変化、黄色 =0.2〜1.0倍の変化、灰色 = 色素の結合無し）。β-ストランドは矢印として示し、また、ループ構造はチューブとして示している。図１２Ｂは、残基Phe-H96の疎水性環境を示す、 scFv モデルの構造を表している。β-ストランドは金色の矢印として示し、また、ループ構造は元の灰色のチューブとして示している。H鎖残基は、青色でラベルしており、また、L鎖残基は元の青緑色でラベルしてある。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂは、標識した scFv X5 のモデルを示す。図１２Ａは、 Fv X5 のリボンモデルを示しており、色素結合部位を強調している。システインで置換されて色素と結合した側鎖を、ball-and-stickform で示した。色づけは、ターゲットが結合した位置における S-SO 蛍光応答に対応させている（赤色 = 5.9倍の変化、橙色= 2〜3倍の変化、黄色 =0.2〜1.0倍の変化、灰色 = 色素の結合無し）。β-ストランドは矢印として示し、また、ループ構造はチューブとして示している。図１２Ｂは、残基Phe-H96の疎水性環境を示す、 scFv モデルの構造を表している。β-ストランドは金色の矢印として示し、また、ループ構造は元の灰色のチューブとして示している。H鎖残基は、青色でラベルしており、また、L鎖残基は元の青緑色でラベルしてある。
【図１３Ａ】図１３は、生細胞表面上の gp120 の検出を示したものである。図１３Ａは、色素と位置 H96 で複合した X5 が、 HEK 293T 細胞の表面上に発現したgp120を検出することを示している。細胞は、 gp120 および EGFP 、あるいは EGFP 単独を以ってトランスフェクションした。細胞はトランスフェクション後に36時間に亘って再懸濁した後、sCD4と、二種の異なる濃度の scFv 複合体とを加えて、インキュベート（温置）した。蛍光強度は、測定前に細胞を洗浄せずに、 625nm （S-SO）および510nm（EGFP）で測定した。 S-SO/EGFP 蛍光の平均比率を、 gp120 を発現している細胞について、 EGFP のみを発現している細胞に比して増大しているパーセンテージとして示した。gp120を発現している細胞では、蛍光は二倍以上に増大した。結果は、二つの別の実験のものを表している。図１３Ｂは、 293T 細胞上の gp120 の表面発現を検証する、顕微鏡写真である。固定した細胞を、gp120に対する抗体と共に温置した後、フィコエリスリンと複合した anti-F(ab')2 二次抗体を加えて温置した。図１３Ｃは、mock（モック）でトランスフェクションし、sCD4 に曝露した対照細胞群の顕微鏡写真である。
【図１３Ｂ】図１３は、生細胞表面上の gp120 の検出を示したものである。図１３Ａは、色素と位置 H96 で複合した X5 が、 HEK 293T 細胞の表面上に発現したgp120を検出することを示している。細胞は、 gp120 および EGFP 、あるいは EGFP 単独を以ってトランスフェクションした。細胞はトランスフェクション後に36時間に亘って再懸濁した後、sCD4と、二種の異なる濃度の scFv 複合体とを加えて、インキュベート（温置）した。蛍光強度は、測定前に細胞を洗浄せずに、 625nm （S-SO）および510nm（EGFP）で測定した。 S-SO/EGFP 蛍光の平均比率を、 gp120 を発現している細胞について、 EGFP のみを発現している細胞に比して増大しているパーセンテージとして示した。gp120を発現している細胞では、蛍光は二倍以上に増大した。結果は、二つの別の実験のものを表している。図１３Ｂは、 293T 細胞上の gp120 の表面発現を検証する、顕微鏡写真である。固定した細胞を、gp120に対する抗体と共に温置した後、フィコエリスリンと複合した anti-F(ab')2 二次抗体を加えて温置した。図１３Ｃは、mock（モック）でトランスフェクションし、sCD4 に曝露した対照細胞群の顕微鏡写真である。
【図１３Ｃ】図１３は、生細胞表面上の gp120 の検出を示したものである。図１３Ａは、色素と位置 H96 で複合した X5 が、 HEK 293T 細胞の表面上に発現したgp120を検出することを示している。細胞は、 gp120 および EGFP 、あるいは EGFP 単独を以ってトランスフェクションした。細胞はトランスフェクション後に36時間に亘って再懸濁した後、sCD4と、二種の異なる濃度の scFv 複合体とを加えて、インキュベート（温置）した。蛍光強度は、測定前に細胞を洗浄せずに、 625nm （S-SO）および510nm（EGFP）で測定した。 S-SO/EGFP 蛍光の平均比率を、 gp120 を発現している細胞について、 EGFP のみを発現している細胞に比して増大しているパーセンテージとして示した。gp120を発現している細胞では、蛍光は二倍以上に増大した。結果は、二つの別の実験のものを表している。図１３Ｂは、 293T 細胞上の gp120 の表面発現を検証する、顕微鏡写真である。固定した細胞を、gp120に対する抗体と共に温置した後、フィコエリスリンと複合した anti-F(ab')2 二次抗体を加えて温置した。図１３Ｃは、mock（モック）でトランスフェクションし、sCD4 に曝露した対照細胞群の顕微鏡写真である。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｄは、例示的なモジュールバイオセンサーの構成の模式図である。図１４Ａは、結合ドメイン 140 を有する親和性分子が、リンカー142を介して、ターゲット分子 141 と結合している構造を示している。色素 143 はターゲットに結合しており、結合ドメインがターゲットに結合した際に、変化したシグナル144を発する。変化したシグナルは、典型的には、色素 143 によって「検知」される、構造、リン酸化、リガンド結合などの変化から発せられるものである。図１４Ｂは、色素が結合ドメインに結合していることが特徴であるモジュールバイオセンサーの構造を示している。図１４Ｃは、センサーの結合ドメインとターゲット分子セグメントとの双方に、FRETを検知する色素が結合して含まれるような、モジュールバイオセンサーの構造を示している。いくつかの実施形態においては、結合ドメインと検知色素とが、互いに結合しないように、リンカー142を省くことが利点となる。図１４Ｄ１および１４Ｄ２は、 scFv に基づくバイオセンサーの、正のシグナル変化もしくは負のシグナル変化を得るための、ターゲット分子との二通りの相互作用を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｄは、例示的なモジュールバイオセンサーの構成の模式図である。図１４Ａは、結合ドメイン 140 を有する親和性分子が、リンカー142を介して、ターゲット分子 141 と結合している構造を示している。色素 143 はターゲットに結合しており、結合ドメインがターゲットに結合した際に、変化したシグナル144を発する。変化したシグナルは、典型的には、色素 143 によって「検知」される、構造、リン酸化、リガンド結合などの変化から発せられるものである。図１４Ｂは、色素が結合ドメインに結合していることが特徴であるモジュールバイオセンサーの構造を示している。図１４Ｃは、センサーの結合ドメインとターゲット分子セグメントとの双方に、FRETを検知する色素が結合して含まれるような、モジュールバイオセンサーの構造を示している。いくつかの実施形態においては、結合ドメインと検知色素とが、互いに結合しないように、リンカー142を省くことが利点となる。図１４Ｄ１および１４Ｄ２は、 scFv に基づくバイオセンサーの、正のシグナル変化もしくは負のシグナル変化を得るための、ターゲット分子との二通りの相互作用を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｄは、例示的なモジュールバイオセンサーの構成の模式図である。図１４Ａは、結合ドメイン 140 を有する親和性分子が、リンカー142を介して、ターゲット分子 141 と結合している構造を示している。色素 143 はターゲットに結合しており、結合ドメインがターゲットに結合した際に、変化したシグナル144を発する。変化したシグナルは、典型的には、色素 143 によって「検知」される、構造、リン酸化、リガンド結合などの変化から発せられるものである。図１４Ｂは、色素が結合ドメインに結合していることが特徴であるモジュールバイオセンサーの構造を示している。図１４Ｃは、センサーの結合ドメインとターゲット分子セグメントとの双方に、FRETを検知する色素が結合して含まれるような、モジュールバイオセンサーの構造を示している。いくつかの実施形態においては、結合ドメインと検知色素とが、互いに結合しないように、リンカー142を省くことが利点となる。図１４Ｄ１および１４Ｄ２は、 scFv に基づくバイオセンサーの、正のシグナル変化もしくは負のシグナル変化を得るための、ターゲット分子との二通りの相互作用を示す。
【図１４Ｄ１】図１４Ａ〜１４Ｄは、例示的なモジュールバイオセンサーの構成の模式図である。図１４Ａは、結合ドメイン 140 を有する親和性分子が、リンカー142を介して、ターゲット分子 141 と結合している構造を示している。色素 143 はターゲットに結合しており、結合ドメインがターゲットに結合した際に、変化したシグナル144を発する。変化したシグナルは、典型的には、色素 143 によって「検知」される、構造、リン酸化、リガンド結合などの変化から発せられるものである。図１４Ｂは、色素が結合ドメインに結合していることが特徴であるモジュールバイオセンサーの構造を示している。図１４Ｃは、センサーの結合ドメインとターゲット分子セグメントとの双方に、FRETを検知する色素が結合して含まれるような、モジュールバイオセンサーの構造を示している。いくつかの実施形態においては、結合ドメインと検知色素とが、互いに結合しないように、リンカー142を省くことが利点となる。図１４Ｄ１および１４Ｄ２は、 scFv に基づくバイオセンサーの、正のシグナル変化もしくは負のシグナル変化を得るための、ターゲット分子との二通りの相互作用を示す。
【図１４Ｄ２】図１４Ａ〜１４Ｄは、例示的なモジュールバイオセンサーの構成の模式図である。図１４Ａは、結合ドメイン 140 を有する親和性分子が、リンカー142を介して、ターゲット分子 141 と結合している構造を示している。色素 143 はターゲットに結合しており、結合ドメインがターゲットに結合した際に、変化したシグナル144を発する。変化したシグナルは、典型的には、色素 143 によって「検知」される、構造、リン酸化、リガンド結合などの変化から発せられるものである。図１４Ｂは、色素が結合ドメインに結合していることが特徴であるモジュールバイオセンサーの構造を示している。図１４Ｃは、センサーの結合ドメインとターゲット分子セグメントとの双方に、FRETを検知する色素が結合して含まれるような、モジュールバイオセンサーの構造を示している。いくつかの実施形態においては、結合ドメインと検知色素とが、互いに結合しないように、リンカー142を省くことが利点となる。図１４Ｄ１および１４Ｄ２は、 scFv に基づくバイオセンサーの、正のシグナル変化もしくは負のシグナル変化を得るための、ターゲット分子との二通りの相互作用を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、メロシアニン色素の蛍光が、 MAP キナーゼ Erk2 およびMAPキナーゼ E1k1 の特定の残基との、水素結合およびπ-πスタッキングに因る相互作用から影響を受けることを図示している。図１５Ｂ１〜１５Ｂ２は、Erk2のリン酸化を擾乱させない色素の結合（図１５Ｂ１）、もしくは、標識した Erk2 が、その基質であるElk1 をリン酸化する能力（図１５Ｂ２）、を示す。図１５Ｃは、Erk2のリン酸化に応答し、且つ MEK の結合には応答しないような色素を示している。飽和 MEK を、リン酸化不能な Erk2 変異体に加えたところ、蛍光の変化は見られなかった。
【図１５Ｂ１】図１５Ａは、メロシアニン色素の蛍光が、 MAP キナーゼErk2 およびMAPキナーゼ E1k1 の特定の残基との、水素結合およびπ-πスタッキングに因る相互作用から影響を受けることを図示している。図１５Ｂ１〜１５Ｂ２は、Erk2のリン酸化を擾乱させない色素の結合（図１５Ｂ１）、もしくは、標識した Erk2 が、その基質であるElk1 をリン酸化する能力（図１５Ｂ２）、を示す。図１５Ｃは、Erk2 のリン酸化に応答し、且つ MEK の結合には応答しないような色素を示している。飽和MEK を、リン酸化不能な Erk2 変異体に加えたところ、蛍光の変化は見られなかった。
【図１５Ｂ２】図１５Ａは、メロシアニン色素の蛍光が、 MAP キナーゼ Erk2 およびMAPキナーゼ E1k1 の特定の残基との、水素結合およびπ-πスタッキングに因る相互作用から影響を受けることを図示している。図１５Ｂ１〜１５Ｂ２は、Erk2のリン酸化を擾乱させない色素の結合（図１５Ｂ１）、もしくは、標識した Erk2 が、その基質であるElk1 をリン酸化する能力（図１５Ｂ２）、を示す。図１５Ｃは、Erk2 のリン酸化に応答し、且つ MEK の結合には応答しないような色素を示している。飽和MEK を、リン酸化不能な Erk2 変異体に加えたところ、蛍光の変化は見られなかった。
【図１５Ｃ】図１５Ａは、メロシアニン色素の蛍光が、 MAP キナーゼ Erk2 およびMAPキナーゼ E1k1 の特定の残基との、水素結合およびπ-πスタッキングに因る相互作用から影響を受けることを図示している。図１５Ｂ１〜１５Ｂ２は、Erk2のリン酸化を擾乱させない色素の結合（図１５Ｂ１）、もしくは、標識した Erk2 が、その基質であるElk1 をリン酸化する能力（図１５Ｂ２）、を示す。図１５Ｃは、Erk2のリン酸化に応答し、且つ MEK の結合には応答しないような色素を示している。飽和 MEK を、リン酸化不能な Erk2 変異体に加えたところ、蛍光の変化は見られなかった。
【図１】
2007529718.tif 000081
【図２Ａ】
2007529718.tif 000082
【図２Ｂ】
2007529718.tif 000083
【図２Ｃ】
2007529718.tif 000084
【図２Ｄ】
2007529718.tif 000085
【図３】
2007529718.tif 000086
【図４】
2007529718.tif 000087
【図５】
2007529718.tif 000088
【図６Ａ】
2007529718.tif 000089
【図６Ｂ】
2007529718.tif 000090
【図７】
2007529718.tif 000091
【図８】
2007529718.tif 000092
【図９Ａ】
2007529718.tif 000093
【図９Ｂ】
2007529718.tif 000094
【図１０】
2007529718.tif 000095
【図１１Ａ】
2007529718.tif 000096
【図１１Ｂ】
2007529718.tif 000097
【図１１Ｃ】
2007529718.tif 000098
【図１１Ｄ】
2007529718.tif 000099
【図１２Ａ】
2007529718.tif 000100
【図１２Ｂ】
2007529718.tif 000101
【図１３Ａ】
2007529718.tif 000102
【図１３Ｂ】
2007529718.tif 000103
【図１３Ｃ】
2007529718.tif 000104
【図１４Ａ】
2007529718.tif 000105
【図１４Ｂ】
2007529718.tif 000106
【図１４Ｃ】
2007529718.tif 000107
【図１４Ｄ１】
2007529718.tif 000108
【図１４Ｄ２】
2007529718.tif 000109
【図１５Ａ】
2007529718.tif 000110
【図１５Ｂ１】
2007529718.tif 000111
【図１５Ｂ２】
2007529718.tif 000112
【図１５Ｃ】
2007529718.tif 000113
【配列表】
2007529718000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月4日(2007.1.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) ターゲット分子への特異的な親和性を有する結合ドメインと、
(b) 前記結合ドメインが前記ターゲット分子に結合したときに、特に、疎水性、水素結合、極性、極性化、活性化、もしくは構造的な環境に曝される位置において、前記結合ドメインに結合した環境感受性色素と
を含み、
前記結合ドメインが前記ターゲット分子と結合している間もしくは結合した後の、前記疎水性、水素結合、極性、極性化、活性化、もしくは構造的な環境が変化した際に、前記色素からの蛍光シグナルが変化する
ことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項２】
前記ターゲット分子が、特定の構造をとるか、もしくは特定のリガンドに結合しているか、もしくは翻訳後修飾をされているときに、前記結合ドメインが前記ターゲット分子と結合することを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項３】
前記ターゲット分子が、リン酸化によって翻訳後修飾されていることを特徴とする、請求項２記載のバイオセンサー。
【請求項４】
前記結合ドメインが、前記ターゲット分子上のリン酸化部位の近傍に結合することを特徴とする、請求項３記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記ターゲット分子が、核酸もしくは蛋白質を含むことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記結合ドメインが、核酸もしくはポリペプチドであることを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項７】
前記結合ドメインが、アプタマー、相補性決定領域（CDR）、 VH 領域、 VL 領域、Fvフラグメント、 F(ab) フラグメント、F(ab')2 フラグメント、抗体、抗体フラグメント、ロイシンジッパー、ヒストン、エンハンサー、一本鎖可変領域フラグメント（scFv）、リガンド、受容体、蛋白質複合体中のうちのひとつの蛋白質、アプタマー、もしくはレクチン、を含むことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項８】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、4、5、9、10、11、12、16、17、18、19、20、21、22、27に記載のうちのいずれかひとつの配列を含むことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項９】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号23もしくは24に記載の核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号5もしくは12に記載の配列を含み、ここで下記に示す配列表の配列番号5もしくは12の中の下線を引いたアミノ酸のうちの少なくともひとつが、システインであることを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【化１】
2007529718.tif 000114
【請求項１１】
前記色素が芳香環を含み、ここで、前記芳香環は、前記芳香環の成す平面から突出しているようなひとつもしくは複数の非平面状アルキル基もしくはヘテロ原子置換基を有していることを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
前記環境感受性色素が、下記の構造式の化合物のうちのひとつであって、
【化２】
2007529718.tif 000115
ここで、
R1 は、低級アルキル基、 -(CH2)3-SO3-、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I、もしくは -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCSであり、
R2 は、 H 、 -NH2、 -SO3- 、 CH3CONH-、ICH2CONH- 、HO(CH2)2-S-CH2CONH- 、SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-、もしくは保護基であり、
R3 は、低級アルキル基、もしくはトリル-アセトニトリル（tolyl-acetonitrile ）
であることを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
前記蛍光シグナルが、約400nm以上の波長の光を含むことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
前記蛍光シグナルが、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）に依存したものでは無いことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
前記結合ドメインが、リンカーによってターゲット分子と結合することを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
前記リンカーが、ヒドロキシスクシンイミド基類、マレイミド基類、ハロアセチル基類、ピリジルジスルフィド基類、ヒドラジン類、エチルジエチルアミノ-プロピルカルボジイミド基、およびヨードアセトアミド基、から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１５記載のバイオセンサー。
【請求項１７】
二つ以上の色素分子が、前記結合ドメインに結合することを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項１８】
前記色素分子のうちのひとつから発せられるシグナルが、前記結合ドメインのターゲット分子との結合に依って変化し、また、前記シグナルが、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）によって生成されたものでは無いことを特徴とする、請求項１７記載のバイオセンサー。
【請求項１９】
前記色素分子が、前記結合ドメインと、システイン、リシン、アルギニン、天然アミノ酸側鎖、誘導体化アミノ酸側鎖、非天然アミノ酸の箇所で結合することを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項２０】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、もしくは4に記載の配列を含んだ一本鎖可変領域フラグメントを含み、ここで、
配列表の配列番号1は、
LTQSPGTLSLSAGERATLSC(X)nWYQQ
KPGQAPRLLIY(X)nGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDLAVYYC(X)n
であり、
配列表の配列番号2は、
QVQLVQSGAEVKKPGSSVQVSCKASGGTF(X)n
WVRQAPGHGLEWMG(X)nRVTFTADQATSTAYMELTNLRSDDT
AVYYCAR(X)nWGQGTLVTVSSPRGPAGQ 
であり、
配列表の配列番号4は、
LTQSPGTLSLSAGERATLSC(X)nWYQQKPGQA
PRLLIY(X)nGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDLAVYYC(X)nG
GGGSGGGGSGGGGSRSSQVQLVQSGAEVKKPGSSVQVSC
KASGGTF(X)nWVRQAPGHGLEWMG(X)nRVTFTADQATSTAY
MELTNLRSDDTAVYYCAR(X)nWGQGTLVTVSSPRGPAGQ 
であって、
それぞれの X は、独立に、可変であるアミノ酸であり、 n は、約3〜約25の整数であって、また、ひとつもしくは複数のアミノ酸Xを、前記色素が結合する部位となるシステインとすることができる
ことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項２１】
HIV を検出するためのバイオセンサーにおいて、 HIV と結合することが可能である結合ドメインと、色素とを含み、前記結合ドメインが、配列RASQSVSSGCLA（配列表の配列番号9）、GASCRAT（配列表の配列番号10）、 QQYGTSPCTFGQGTKVDIKR （配列表の配列番号11）、SMYGCN （配列表の配列番号16）、GIIPCFGTSNYAQKFRG（配列表の配列番号17）、GIIPIFGTSNYAQKFCG （配列表の配列番号18）、DCGPDWEDGDSYDGSGRGFFDF（配列表の配列番号19）、DFGPDWEDCDSYDGSGRGFFDF（配列表の配列番号20）、DFGPDWEDGDCYDGSGRGFFDF （配列表の配列番号21）、もしくはDFGPDWEDGDSYDCSGRGFFDF （配列表の配列番号22）を有するペプチドから本質的に成るCDRフラグメントを含むことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項２２】
前記色素が、下記の構造式の化合物のうちのひとつであって、
【化３】
2007529718.tif 000116
ここで、
R1 は、低級アルキル基、 -(CH2)3-SO3-、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I、もしくは -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCSであり、
R2 は、 H 、 -NH2 、 -SO3- 、 CH3CONH-、ICH2CONH-、HO(CH2)2-S-CH2CONH- 、SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-、もしくは保護基であり、
R3 は、低級アルキル基、もしくはトリル-アセトニトリルである
ことを特徴とする、請求項２１記載のバイオセンサー。
【請求項２３】
環境感受性蛍光色素において、
ひとつもしくは複数のインドール芳香環もしくはベンゾチオフェン芳香環と、
前記芳香環の成す平面から突出した、ひとつもしくは複数の非平面的脂肪族置換基ま
たはヘテロ原子置換基と
を含み、前記色素が、疎水性、水素結合、極性、もしくは構造変化を含む環境の変化に曝されたときに、前記色素から発せられる蛍光シグナルが変化することを特徴とする、色素。
【請求項２４】
前記色素が、約400nm以上の波長の励起もしくは光の放射を含むことを特徴とする、請求項２３記載の色素。
【請求項２５】
前記色素が、下記の構造式の化合物のうちのひとつであって、
【化４】
2007529718.tif 000117
ここで、
R1 は、低級アルキル基、 -(CH2)3-SO3-、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I、もしくは -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCSであり、
R2 は、 H 、 -NH2 、 -SO3- 、 CH3CONH-、ICH2CONH-、HO(CH2)2-S-CH2CONH- 、SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-、もしくは保護基であり、
R3 は、低級アルキル基、もしくはトリル-アセトニトリルである
ことを特徴とする、請求項２３記載のバイオセンサー。
【請求項２６】
前記色素が、ひとつもしくは複数のリンカーをさらに含むことを特徴とする、請求項２３記載のバイオセンサー。
【請求項２７】
前記色素が、バイオセンサー、結合ドメイン、生分子の結合部位、もしくはターゲット分子に結合することを特徴とする、請求項２３記載のバイオセンサー。
【請求項２８】
バイオセンサーと、
選択したターゲット分子を検出、監視、もしくは観察するために、前記バイオセンサーを使用する手引きと
を含み、また、
前記バイオセンサーが、結合ドメインおよび色素を含み、
前記結合ドメインが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント（scFv）であって、前記抗体は、前記 scFv 内部に、色素が結合する部位を有している
ことを特徴とする、キット。
【請求項２９】
色素と、
前記色素を使用する手引きと
を含み、前記色素が請求項２５記載の色素であることを特徴とする、キット。
【請求項３０】
前記キットの手引きが、前記色素を、選択した結合ドメインに結合させるための手引きを含むことを特徴とする、請求項２９記載のキット。
【請求項３１】
選択したターゲット分子を検出するための方法において、
前記選択したターゲットを含む可能性がある供試体を、バイオセンサーと接触させるステップと、
シグナルが、前記バイオセンサーから発せられたものであるかどうかを観察するステップと
を含み、前記バイオセンサーが、結合ドメインおよび環境感受性色素を含み、また、前記結合ドメインが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント（scFv）であって、前記抗体が、前記scFvのCDR3領域の内部に、色素が結合する部位を有している
ことを特徴とする、方法。
【請求項３２】
前記色素が結合する前記部位が、システインであることを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記バイオセンサー結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、もしくは4に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記色素が、請求項２５記載の色素であることを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
前記選択したターゲット分子が、蛋白質、受容体、リガンド、もしくは酵素、であることを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
前記供試体が、生細胞、細胞リシス生成物、細胞ライブラリ、もしくは細胞培地、を含むことを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
選択したターゲット分子の、細胞内部での活性もしくは位置を検出するための方法において、
前記細胞を、バイオセンサーと接触させるステップと、
前記バイオセンサーによって発せられたシグナルの変化、もしくは、前記シグナルの位置の変化、を観察するステップと
を含み、前記バイオセンサーが、結合ドメインおよび色素を含み、また、前記結合ドメイ
ンが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント（scFv）であって、前記抗体が、前記scFvのCDR3領域の内部に、色素が結合する部位を有している
ことを特徴とする、方法。
【請求項３８】
前記バイオセンサー結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、もしくは4に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記色素が、請求項２５記載の色素であることを特徴とする、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記選択されたターゲット分子が、蛋白質、受容体、リガンド、もしくは酵素、であることを特徴とする、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
前記選択されたターゲット分子の活性が、前記選択されたターゲット分子のリン酸化状態、細胞レベル以下の位置、細胞レベル以下の構造との相互作用、もしくは、細胞の蛋白質との相互作用、を含むことを特徴とする、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
選択した内因性ターゲット生分子と、細胞因子との相互作用を検出するための方法において、
a. 選択した内因性ターゲット生分子を含む細胞を同定するステップと、
b. 前記ターゲット生分子上の結合部位への特異的結合親和性を有する結合ドメインと
、環境感受性色素とを含んだプローブ生分子を投与するステップと、
c. 前記プローブ生分子を、前記細胞と共にインキュベートするステップと、
d. 前記環境感受性色素から発せられるバックグラウンドシグナルを観察するステップと、
e. 前記環境感受性色素から発せられるシグナルの変化を検出することによって、前記ターゲット生分子と細胞因子との間の相互作用を検出するステップと
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項４３】
前記細胞因子が、細胞の核酸、蛋白質、ペプチド、酵素、受容体、サイトカイン、細胞骨格、およびシグナル伝達蛋白質、から成る群から選択されることを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
プローブ生分子の前記結合ドメインが、前記ターゲット生分子と、リン酸化部位において結合することができるものであることを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
前記結合ドメインが、前記ターゲット生分子の、特定の構造、リガンド相互作用、もしくは翻訳後修飾に対する、特異的親和性を有することを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、4、5、9、10、11、16、17、18、19、20、21、22、もしくは27に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項４７】
前記色素が、約600nm以上の波長の励起もしくは光の放射を含むことを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項４８】
前記環境感受性色素が、請求項２５記載の色素であることを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項４９】
前記環境感受性色素が、前記結合ドメインと、前記プローブ生分子と前記ターゲット生分子との間の結合に対して影響を実質的に及ぼさない部位で結合することを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項５０】
前記部位が、前記結合部位もしくは前記ターゲット生分子の結晶構造の検査によって選択されるものであることを特徴とする、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記プローブ生分子が、TATペプチドと縮合していることを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項５２】
前記プローブ生分子を、電気穿孔法、形質導入、微量穿孔法、微量注入、界面活性剤、もしくは噴出物を使用することによって、前記細胞内へと導入するステップ、をさらに含むことを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項５３】
前記シグナルの変化が、蛍光が少なくとも50%増加するものであることを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項５４】
シグナルの変化を検出する前記ステップが、蛍光定量法、分光法、基質の酵素の変化、検鏡法、もしくは質量分光法、を含むことを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項５５】
シグナルの変化を検出する前記ステップが、
蛋白質の量を定量するステップ、蛋白質の位置決定をするステップ、前記ターゲットの構造変化を検出するステップ、前記ターゲットの活性化を検出するステップ、もしくは、前記ターゲットのリン酸化を検出するステップ、を含むことを特徴とする、請求項４２記載の方法。
【請求項５６】
対象とするターゲット分子の変化を検出するための方法において、
(a) ターゲット分子に、前記ターゲット分子上の部位に結合した環境感受性色素を加えるステップと、
(b) 前記色素から発せられるシグナルの、前記ターゲット分子を新たな環境に曝したことに因る変化を検出するステップと
を含み、
前記ターゲット分子上の前記部位の、疎水性、水素結合、極性、極性化、リン酸化、ポリペプチドの折り返し、水和、リガンド結合、もしくは、サブユニット相互作用が、前記ターゲット分子を前記新たな環境に曝すことによって変化するものである
ことを特徴とする、方法。
【請求項５７】
前記色素が、請求項２５記載の色素であることを特徴とする、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
GTP加水分解酵素（GTPアーゼ）の活性化を検出するためのバイオセンサーにおいて、
GTP加水分解酵素配列、第一蛍光蛋白質、第二蛍光蛋白質、および、前記GTP加水分解酵素の活性化形態と結合するドメイン、の順番で含んでいるポリペプチド鎖を含むことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項５９】
前記GTP加水分解酵素が、Rhoであることを特徴とする、請求項５８記載のバイオセンサー。
【請求項６０】
前記第一蛍光蛋白質および前記第二蛍光蛋白質が、シアン蛍光蛋白質（CFP）、もしくは黄色蛍光蛋白質（YFP）を含むことを特徴とする、請求項５８記載のバイオセンサー。
【請求項６１】
前記ドメインが、活性化されていない前記GTP加水分解酵素の配列に対するものよりも大きい親和性を以って、活性化されたGTP加水分解酵素配列と結合することを特徴とする、請求項５８記載のバイオセンサー。
【請求項６２】
前記ドメインが、前記GTP加水分解酵素配列に結合することによって、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）が発生することを特徴とする、請求項５８記載のバイオセンサー。
【請求項６３】
前記ペプチド鎖をコードしている核酸配列を含んだ発現ベクターをさらに含むことを特徴とする、請求項５８記載のバイオセンサー。
【請求項６４】
Cdc42 の活性化を検出するためのバイオセンサーにおいて、
WASP ポリペプチド鎖と、
請求項２５記載の色素と
を含むことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項６５】
前記WASPポリペプチド鎖が、配列表の配列番号27に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項６４記載のバイオセンサー。
【請求項６６】
前記色素が、前記WASPポリペプチド鎖と、配列表の配列番号28に記載の配列の位置271に対応した位置において結合することを特徴とする、請求項６４記載のバイオセンサー。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
また、本発明に係るバイオセンサーは、蛋白質-蛋白質相互作用を検出することもできる。このような相互作用は、高い親和性を有する相互作用（例えば、抗原と抗体との間の相互作用）であってもよく、また、低い親和性を有する相互作用（例えば、酵素と、基質、シグナルカスケード構成員、もしくは蛋白質複合体の構成員との相互作用）であってもよい。二員間の蛋白質-蛋白質相互作用においては、一方の構成員を「ターゲット」と見做して、他方をバイオセンサーの「プローブ」と見做すことができる。ターゲットとプローブとの差異は、何かしらの任意なものではあるが、その一方で、この二分子は互いに相互作用をするため、蛋白質の相互作用について論じやすくするためにこれらの語を用いている。全般的に、本明細書中で用いているように、ターゲットとは、検出対象である分子のこととすることができ、また、プローブとは、所望の状態もしくは形態のターゲットの存在についての情報を得るためにサンプルに導入する構成員のこととすることができる。本発明に係る典型的な蛋白質-蛋白質バイオセンサーにおいては、この対のうちのひとつの構成員が、対の第二構成員の結合部位と相補的であるような結合ドメインを有する。蛋白質-蛋白質相互作用対のうちの一方もしくは双方は、結合した環境感受性色素を含むことができる。蛋白質-蛋白質相互作用対の構成員は、完全な長さの天然蛋白質、天然蛋白質の合成アナログ（類縁体）、天然蛋白質の組換え体アナログ、またはそれらのフラグメント、とすることができる。蛋白質-蛋白質相互作用を含んだバイオセンサーは、環境感受性色素を、一方または双方の構成員上のひとつもしくは複数の位置において有して、構成員が結合している間、色素が構成員の間に在るようにすることができる。このような状態では、結合によって、構成員間の結合相互作用を重大に阻害すること無く、色素からのシグナルを充分に変化させることが可能となる。さらに望ましいもしくは最適な色素の位置は、本発明に係るバイオセンサー系における改善されたシグナルおよび／もしくは結合機能のための別の位置をスクリーニングすることによって確認することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
R1 基は、例えば、芳香環のスタッキングを阻害するおよび／もしくは水溶性を増大させるような任意の官能基とすることができる。例えば、適切なR1基は、色素分子の水溶性を減少させること無く、環のスタッキングを立体的に充分に阻害することがある。R1 基は、例えば、炭素数一個〜約六個の脂肪族の性質を有することができる。好ましい実施形態においては、R1基は、極性を有するか、もしくは弱い荷電性とすることができる。特に好ましいR1 基は、例えば、アルキル基、アルキレンアミノアルキル基、硫酸アルキレン基（alkylenesulfate）、-(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCS、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I、-(CH2)3-SO3-、および／もしくはこれらの類似物、を含む。この化合物は、後述する構造式4を有する化合物である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
結合ドメインは、ポリペプチド配列、もしくは核酸配列を含むことができる。例えば、結合ドメインは、一本鎖 DNA （sDNA）、二本鎖 DNA （dsDNA）、RNA、修飾塩基を持つ核酸、およびそれらの類似物、とすることができる。或る実施形態においては、結合ドメインがオリゴヌクレオチドのプローブであって、また、ターゲットが、相補性ターゲット核酸（complementary target nucleic acid）である。別の実施形態においては、結合ドメインは、ターゲットであるエンハンサー蛋白質ターゲットに対して特異的な、dsDNAの鎖（ストランド）である。本発明に係る環境感受性色素は、当該技術分野において公知である任意の手法（例えば、色素上のリンカーと、核酸上の修飾塩基上の利用可能な反応性基との反応）によって、核酸に結合させることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
また、単クローン抗体およびそのフラグメントも、本発明で使用することができる。本明細書中の「単クローン抗体」（"monoclonal antibody"）という語は、実質的にホモジニアス（均一）な抗体群から得られた抗体のことを指す。換言すれば、群を含む個々の抗体が、いくつかの（少量存在する）抗体中でときどき自然発生する変異を除いて、同一であるということである。単クローン抗体は、高い特異性を持ち、また、単独の抗原部位に対して作成されるものである。さらに、通常は種々の決定基（エピトープ）に対して作成される種々の抗体を含む多クローン抗体とは対照的に、それぞれの単クローン抗体は、抗原上の単独の決定基に対して作成される。単クローン抗体には、その特異性に加えて、他の免疫グロブリンで汚染されていないハイブリドーマの培養によって合成することができるという利点がある。「単クローンの」（"monoclonal"）という修飾語は、実質的にホモジニアスな抗体群から得られ、且つ任意の特定の方法による抗体の製造を必要としないと見做せるような、抗体の性質を指す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
沃化=3-エチル-2-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-3-イウム （７） を、Narayanan, N.; Patonay, G., J. Org. Chem., 1995, 60, 2391-2395 に記載の方法によって調製し、また、 1-ベンゾチオフェン-3(2H)-オン=1,1-ジオキシドを、Regitz, M., Chem. Ber., 1965, 98, 36-45 に従前に述べられた方法によって調製した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５３】
［蛋白質の標識付け］
Wiskott Aldrich 症候群蛋白質（WASP、残基 201〜320）を、単独のシステイン（F271C）を含むように変異させたものを、S-SO-IAA色素、Cy3,71 色素、もしくは Cy571 色素を用いて標識した。色素の DMSO 保存溶液（10〜20mM）を、 200μL の蛋白質溶液（リン酸ナトリウムバッファー中で200μM、 pH = 7.5）に加えて、色素の最終的な濃度を 1〜2mM とした。反応混合液を室温で4時間に亘ってインキュベートした後、1μL のメルカプトエタノールを加えてクエンチした。反応混合液を、12,000rpmで2分間遠心分離して反応中に生じたと考えられるすべての沈澱を除去して、上清をG25 Sepharose ゲル濾過を用いて精製した。ゲル濾過によって、色素-蛋白質付加体が、遊離色素から明確に分離された。複合体の純度を、SDS-PAGE電気泳動法によって確認した。精製した蛋白質複合体中には、遊離色素は観察されなかった。遊離色素の対照サンプルは、蛋白質よりも軽い分子量としてゲル上で明瞭に可視化された。複合体は、単独の高発色蛍光蛋白質バンドを形成し、その分子量はWASPフラグメントに依る。既知の吸光分光法を用いて、蛋白質と色素の濃度を測定し、色素と蛋白質との比率を算出した。Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals; Molecular Probes Inc.: Eugene,OR, 1996 を参照のこと。各実験において、この比率は 0.9〜1.0 の範囲となった。 CBD の濃度は、ウシ血清アルブミンを基準として校正したCoomassie Plus assay （Pierce）を使って、独立に確認した。標識した CBD のアリコート（15〜50μM）を、-80℃で保存した。六ヶ月間の保存の後、結合能力の重大な損耗は観察されなかった。
【国際調査報告】
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