(57)【要約】  1または2以上の細胞を障壁によって拘束することにより、細胞培養することができる。障壁間の距離は、被培養細胞の寸法とほぼ同等である。障壁の間の空間は、十分に狭く、そこに培養された細胞特性を制御し、あるいはモニターすることが可能である。細胞は、完全に拘束され、あるいは2つの対向する障壁表面の間で移動することができる。2つの対向する障壁の間の間隙は、十分に狭く、細胞の単分子層のみが培養される。障壁は透明であっても良い。障壁の表面は、細胞の生物学的ニッチの特性を模擬した、1または2以上の予め選択された特性を有しても良い。細胞培養時の細胞数は、制限され、個々の細胞の特性の制御が可能となる。培養細胞は、標準的な明視野または蛍光画像化技術を用いた画像化等により、長期にわたってモニターされても良い。
2007515958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1および第2の障壁の間に細胞を拘束するステップであって、前記障壁は、前記細胞と接触するように、前記細胞の寸法と同等の距離で離間され、前記細胞が、前記第1および第2の障壁のそれぞれの方にあるいはそれぞれから離れるように移動することが防止されるステップと、
前記第1および第2の障壁が、前記細胞を過剰に圧縮することを防止するため、前記第1および第2の障壁の間に、1または2以上のスペーサを設置するステップと、
前記細胞に培養物質を提供するステップと、
を有する、細胞培養の方法。
【請求項２】
前記第1の障壁は、前記第2の障壁と隣接するように動かされ、
前記拘束するステップおよび前記設置するステップは、少なくとも部分的に前記第1および第2の障壁を分離するステップと、前記第1および第2の障壁の間に、前記細胞と、前記1または2以上のスペーサとを導入するステップと、を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記1または2以上のスペーサは、硬質球であり、各々は、前記細胞の寸法と同等の径を有することを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記障壁の各々は、前記細胞の生物学的ニッチの特徴を模擬するように選択された、1または2以上の特徴を有することを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
前記提供するステップは、前記空間内に、前記培養物質の予め選択された濃度勾配を構成するステップを有することを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
さらに、前記細胞に隣接して、特定の細胞種を手動で設置するステップを有することを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
前記第1および第2の障壁は、第1および第2の板を有することを特徴とする請求項1乃至6のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
前記障壁の間で、細胞の単分子層が培養されることを特徴とする請求項1乃至7のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
さらに、細胞が、1または2以上の予め定められた基準に合致することが観察された際に、前記細胞の単分子層から前記細胞を除去するステップを有することを特徴とする請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記1または2以上の基準は、核型、形態および寸法のうちの1または2以上に関するものであることを特徴とする請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、
前記細胞の特性制御を可能にするため、前記細胞を取り囲む細胞数を制限するステップを有することを特徴とする請求項1乃至10のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞を取り囲む細胞は、前記細胞に隣接して、選択された表面を提供するように選定されることを特徴とする請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記導入するステップは、前記第1および第2の障壁の間に、前記細胞のサスペンションと、前記1または2以上のスペーサとを導入するステップを有することを特徴とする請求項2に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、弾性定着剤で、前記第2の障壁の端部を前記第1の障壁に固定するステップを有し、
前記弾性定着剤によって、前記第1の障壁は、前記第2の障壁と隣接するように動かされることを特徴とする請求項2乃至13のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞は、前記第1の障壁の表面と前記第2の障壁の表面の間に拘束され、各表面は、前記各表面に、前記細胞が吸着することを抑制するように選択されることを特徴とする請求項1乃至14のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
前記1または2以上のスペーサは、前記第1および第2の障壁とともに、前記細胞の生物学的ニッチの形状を模擬した形状を有する空間を定形するように配置されることを特徴とする請求項1乃至15のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１７】
前記提供するステップは、所定の速度で、前記細胞に前記培養物質を供給するステップを有することを特徴とする請求項1乃至16のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】
前記板は、光学的に透明であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
【請求項１９】
前記提供するステップは、前記第1および第2の障壁の一つまたは両方を介して、前記培養物質を、前記第1および第2の障壁の間にまで透過させるステップを有することを特徴とする請求項1乃至18のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２０】
さらに、前記第1および第2の障壁の間の空間に隣接して設置されたセンサを用いて、分子濃度、温度、浸透圧、pHおよび剪断力のうちの1または2以上を検知するステップを有することを特徴とする請求項1乃至19のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２１】
前記第1の障壁の前記表面は、第1の種類の分子を有し、前記第2の障壁の前記表面は、第2の種類の分子を有することを特徴とする請求項15に記載の方法。
【請求項２２】
人工組織を製作する方法であって、
第1の細胞の単分子層を、第2の細胞の単分子層上に設置するステップと、
前記第1の単分子層の細胞を、前記第2の単分子層の細胞と相互作用させるステップと、
を有し、
前記第1および第2の単分子層の各々は、請求項1乃至21のいずれか一つに記載の方法に従って培養されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
細胞培養装置と細胞培養の組み合わせであって、
第1および第2の障壁ならびに1または2以上のスペーサであって、
両者の間に、所望の細胞培養空間を定形し、
前記障壁は、前記培養空間に拘束された細胞または細胞体と接触し、
スペーサは、十分に剛性があり、前記第1および第2の障壁の動きを抑制し、前記細胞または細胞体の寸法に近く、
前記第1および第2の障壁の間の距離は、被培養細胞または細胞体の寸法と同等であり、
スペーサは、前記第1および第2の障壁が前記細胞または細胞体を過度に圧縮することを防止する、第1および第2の障壁ならびに1または2以上のスペーサと、
所定の速度で、前記培養空間に培養物質を提供する手段と、
を有する、細胞培養装置と細胞培養の組み合わせ。
【請求項２４】
前記空間に前記培養物質を提供する前記手段は、前記空間におよび前記空間から、流体が流れることが可能な、1または2以上の流体経路を有することを特徴とする請求項23に記載の組み合わせ。
【請求項２５】
前記1または2以上の流体経路は、1または2以上の微小流体溝を有し、各々の溝は、前記空間に隣接して終端することを特徴とする請求項24に記載の組み合わせ。
【請求項２６】
さらに、前記空間へのまたは前記空間からの、流体の流れを調整する手段を有することを特徴とする請求項23乃至25のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項２７】
前記少なくとも2つの障壁のうちの少なくとも一つは、栄養物およびガスに対して透過性があることを特徴とする請求項23乃至26のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項２８】
さらに、前記空間に拘束された前記細胞をモニターする手段を有することを特徴とする請求項23乃至27のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項２９】
前記モニターする手段は、前記チャンバ室に設置されたセンサを有することを特徴とする請求項28に記載の組み合わせ。
【請求項３０】
前記センサは、分子濃度、温度、浸透圧、pH、および剪断力のうちの1または2以上を検知するセンサであることを特徴とする請求項29に記載の組み合わせ。
【請求項３１】
さらに、前記センサを制御システムに接続する、1または2以上の透明電極を有することを特徴とする請求項29または30に記載の組み合わせ。
【請求項３２】
前記障壁の一つの少なくとも一部は、透明であることを特徴とする請求項23乃至31のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項３３】
前記障壁は、顕微鏡カバースリップを有することを特徴とする請求項32に記載の組み合わせ。
【請求項３４】
前記障壁の前記一部は、ポリスチレン、多孔質ガラスまたは他のコンタクトレンズ材料の一つで構成されることを特徴とする請求項32に記載の組み合わせ。
【請求項３５】
前記障壁の少なくとも一つは、前記空間の寸法を調整するように移動することが可能であることを特徴とする請求項23乃至34のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項３６】
さらに、前記障壁の前記少なくとも一つを動かす作動装置を有することを特徴とする請求項35に記載の組み合わせ。
【請求項３７】
前記作動装置は、膨張性浮き袋、スクリュー、レバー、クランプ、マイクロメータおよび圧電性結晶のうちの1または2以上を有することを特徴とする請求項36に記載の組み合わせ。
【請求項３８】
前記1または2以上のスペーサは、前記第1もしくは第2の障壁から取り外すことが可能であることを特徴とする請求項23乃至37のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項３９】
前記1または2以上のスペーサは、前記第1もしくは第2の障壁に取り付けられていることを特徴とする請求項23乃至37のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項４０】
さらに、前記チャンバ室を複数の領域に区画する仕切り板を有し、前記細胞が前記領域間を移動することが防止されることを特徴とする請求項23乃至37のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項４１】
前記仕切り板は、前記容器から取り外すことが可能であることを特徴とする請求項40に記載の組み合わせ。
【請求項４２】
前記障壁の表面は、異なる分子種を有することを特徴とする請求項23乃至41のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項４３】
前記空間に隣接する開口を被覆するように設置された透過性膜を有し、前記細胞が、前記開口を介して前記空間から放出されることが防止されることを特徴とする請求項23乃至42のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項４４】
前記障壁は、複数の細胞を拘束する複数の空間を定形することを特徴とする請求項23乃至43のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項４５】
カートリッジ内に収容されることを特徴とする請求項23乃至44のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項４６】
さらに、前記チャンバ室に収容され、前記細胞が浸漬される流体培養媒体を有することを特徴とする請求項23乃至45のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項４７】
前記容器の少なくとも一つの壁は、注射器またはピペットで前記空間にアクセスすることが可能となる隔膜を有することを特徴とする請求項46に記載の組み合わせ。
【請求項４８】
さらに、前記空間にまたは前記空間から、細胞収容流体を輸送するためのキャピラリ溝を有することを特徴とする請求項23乃至47のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項４９】
細胞培養装置と細胞培養の組み合わせであって、
流体培養媒体を収容するチャンバ室を定形する容器と、
前記チャンバ室に空間を定形する、少なくとも2つの障壁であって、該障壁の各々は、1または2以上の予め選定された特性を有する、少なくとも2つの隔壁と、
前記空間に拘束された2以上の細胞の集合体であって、培養の間、前記障壁の各々と継続的に接触した状態で前記空間に保持される、2以上の細胞の集合体と、
所定の速度で、前記空間に培養物質を提供する手段と、
を有する、細胞培養装置と細胞培養の組み合わせ。
【請求項５０】
前記空間は、十分に小さく、培養中の個々の細胞の特性を制御することが可能であることを特徴とする請求項49に記載の組み合わせ。
【請求項５１】
前記集合体は、細胞の単分子層を有することを特徴とする請求項49または50に記載の組み合わせ。
【請求項５２】
前記空間に培養物質を提供する前記手段は、前記空間におよび前記空間から、流体が流れることが可能な、1または2以上の流体経路を有することを特徴とする請求項49乃至51のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項５３】
前記1または2以上の流体経路は、前記空間に隣接して終端する、1または2以上の微小流体溝を有することを特徴とする請求項52に記載の組み合わせ。
【請求項５４】
さらに、前記空間へのまたは前記空間からの、流体の流れを調整する手段を有することを特徴とする請求項49乃至53のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項５５】
前記少なくとも2つの障壁のうち少なくとも一つは、栄養物およびガスに対して透過性があることを特徴とする請求項49乃至54のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項５６】
さらに、前記空間に拘束された前記細胞をモニターする手段を有することを特徴とする請求項49乃至55のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項５７】
前記モニターする手段は、前記チャンバ室に設置されたセンサを有することを特徴とする請求項56に記載の組み合わせ。
【請求項５８】
前記センサは、分子濃度、温度、浸透圧、pHおよび剪断力のうちの1または2以上を検知するセンサであることを特徴とする請求項57に記載の組み合わせ。
【請求項５９】
さらに、前記センサを制御システムに接続する、1または2以上の透明電極を有することを特徴とする請求項57または58に記載の組み合わせ。
【請求項６０】
前記障壁の一つの少なくとも一部は、透明であることを特徴とする請求項49乃至59のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項６１】
前記障壁の一つは、顕微鏡カバースリップであることを特徴とする請求項60に記載の組み合わせ。
【請求項６２】
前記障壁の前記一部は、ポリスチレン、多孔質ガラス、または他のコンタクトレンズ材料の一つで構成されることを特徴とする請求項61に記載の組み合わせ。
【請求項６３】
前記障壁の少なくとも一つは、前記空間の寸法を調整するように移動することが可能であることを特徴とする請求項49乃至62のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項６４】
さらに、前記障壁の前記少なくとも一つを動かす作動装置を有することを特徴とする請求項63に記載の組み合わせ。
【請求項６５】
前記作動装置は、膨張性浮き袋、スクリュー、レバー、クランプ、マイクロメータおよび圧電性結晶のうちの1または2以上を有することを特徴とする請求項64に記載の組み合わせ。
【請求項６６】
さらに、前記障壁の間に設置された、1または2以上のスペーサを有し、前記障壁が前記細胞を過剰に圧縮することが防止されることを特徴とする請求項49乃至65のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項６７】
前記1または2以上のスペーサは、前記障壁の1もしくは2以上に取り付けられていることを特徴とする請求項66に記載の組み合わせ。
【請求項６８】
さらに、前記チャンバ室を複数の領域に区画する仕切り板を有し、前記細胞が前記領域間を移動することが防止されることを特徴とする請求項49乃至67のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項６９】
前記仕切り板は、前記容器から取り外すことが可能であることを特徴とする請求項68に記載の組み合わせ。
【請求項７０】
前記障壁の表面は、異なる分子種を有することを特徴とする請求項49乃至69のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項７１】
前記空間に隣接する開口を被覆するように設置された透過性膜を有し、細胞が、前記開口を介して、前記空間から放出されることが防止されることを特徴とする請求項49乃至70のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項７２】
前記障壁は、複数の細胞の集合体を拘束する複数の空間を定形することを特徴とする請求項49乃至71のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項７３】
カートリッジ内に収容されることを特徴とする請求項49乃至72のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項７４】
さらに、前記チャンバ室に収容され、前記細胞の集合体が浸漬される、流体培養媒体を有することを特徴とする請求項49乃至73のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項７５】
前記容器の少なくとも一つの壁は、注射器またはピペットで前記空間にアクセスすることが可能となる隔膜を有することを特徴とする請求項74に記載の組み合わせ。
【請求項７６】
さらに、前記空間にまたは前記空間から、流体を輸送するためのキャピラリ溝を有することを特徴とする請求項49乃至75のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項７７】
請求項1乃至21のいずれか一つに記載の方法に従って培養された細胞を有する、細胞の集合体。
【請求項７８】
請求項1乃至21のいずれか一つに記載の方法に従って培養された細胞。
【請求項７９】
人工組織、臓器、細胞移植もしくは体外受精に使用される、請求項77に記載の細胞集合体または請求項78に記載の細胞。
【請求項８０】
制御環境内で細胞を培養する機器であって、
i）第1および第2の障壁ならびに1または2以上のスペーサであって、両者の間に所望の拘束空間が定形され、障壁間の距離は、被培養細胞もしくは細胞体の寸法と同等であり、障壁は、前記細胞もしくは細胞体と接してそれらの動きを妨げ、前記スペーサは、十分な剛性があり、前記第1および第2の障壁の動きを抑制し、該第1および第2の障壁が前記細胞もしくは細胞体を過剰に圧縮することが防止される、第1および第2の障壁ならびに1または2以上のスペーサと、
ii）前記細胞の生物学的環境の特性を模擬するように選択された、1または2以上の特性を有する、前記第1および第2の障壁の一方もしくは両方の内表面と、
iii）前記空間に培養物質を提供する手段と、
を有する機器。
【請求項８１】
前記障壁は、2つの対向するガラス板を有することを特徴とする請求項80に記載の機器。
【請求項８２】
前記空間は、単一の細胞の寸法と同等の寸法を有することを特徴とする請求項80または81に記載の機器。
【請求項８３】
前記空間は、培養される細胞を単分子層に制限することを特徴とする請求項80乃至82のいずれか一つに記載の機器。
【請求項８４】
前記提供する手段は、前記空間におよび前記空間から、流体が流れることが可能な、1または2以上の流体経路を有することを特徴とする請求項80乃至83のいずれか一つに記載の機器。
【請求項８５】
前記1または2以上の流体経路は、前記空間に隣接して終端する、1または2以上の微小流体溝を有することを特徴とする請求項84に記載の機器。
【請求項８６】
さらに、前記空間へのまたは前記空間からの流れを調整する手段を有することを特徴とする請求項80乃至85のいずれか一つに記載の機器。
【請求項８７】
前記障壁の少なくとも一つは、栄養物およびガスに対して透過性があることを特徴とする請求項80乃至86のいずれか一つに記載の機器。
【請求項８８】
さらに、前記空間に拘束された細胞をモニターする手段を有することを特徴とする請求項80乃至87のいずれか一つに記載の機器。
【請求項８９】
前記モニターする手段は、前記チャンバ室に設置されたセンサを有することを特徴とする請求項88に記載の機器。
【請求項９０】
前記センサは、分子濃度、温度、浸透圧、pHおよび剪断力のうちの1または2以上を検知するセンサであることを特徴とする請求項89に記載の機器。
【請求項９１】
さらに、前記センサを制御システムに接続する、1または2以上の透明電極を有することを特徴とする請求項89または90に記載の機器。
【請求項９２】
前記障壁の一つの少なくとも一部は、透明であることを特徴とする請求項89乃至91のいずれか一つに記載の機器。
【請求項９３】
前記障壁の一つは、顕微鏡カバースリップであることを特徴とする請求項92に記載の機器。
【請求項９４】
前記障壁の前記一部は、ポリスチレン、多孔質ガラスまたは他のコンタクトレンズ材料の一つで構成されることを特徴とする請求項93に記載の機器。
【請求項９５】
前記障壁の少なくとも一つは、前記空間の寸法を調整するように移動することが可能であることを特徴とする請求項80乃至94のいずれか一つに記載の機器。
【請求項９６】
さらに、前記障壁の前記少なくとも一つを動かす作動装置を有することを特徴とする請求項95に記載の機器。
【請求項９７】
前記作動装置は、膨張性浮き袋、スクリュー、レバー、クランプ、マイクロメータ、および圧電性結晶のうちの1または2以上を有することを特徴とする請求項96に記載の機器。
【請求項９８】
前記1または2以上のスペーサは、前記第1もしくは第2の障壁から取り外すことが可能であることを特徴とする請求項80乃至97のいずれか一つに記載の機器。
【請求項９９】
前記1または2以上のスペーサは、前記第1もしくは第2の障壁に取り付けられることを特徴とする請求項80乃至97のいずれか一つに記載の機器。
【請求項１００】
さらに、前記チャンバ室を複数の領域に区画する仕切り板を有し、前記細胞が前記領域間を移動することが防止されることを特徴とする請求項80乃至98のいずれか一つに記載の機器。
【請求項１０１】
前記仕切り板は、前記容器から取り外すことが可能であることを特徴とする請求項99に記載の機器。
【請求項１０２】
前記障壁の表面は、異なる分子種を有することを特徴とする請求項80乃至101のいずれか一つに記載の機器。
【請求項１０３】
前記空間に隣接する開口を被覆するように設置された透過性膜を有し、細胞が前記開口を介して、前記空間から放出されることが防止されることを特徴とする請求項80乃至102のいずれか一つに記載の機器。
【請求項１０４】
前記障壁は、複数の細胞を拘束する複数の空間を定形することを特徴とする請求項80乃至103のいずれか一つに記載の機器。
【請求項１０５】
カートリッジ内に収容されることを特徴とする請求項80乃至104のいずれか一つに記載の機器。
【請求項１０６】
さらに、前記チャンバ室に収容された流体培養媒体を有することを特徴とする請求項80乃至105のいずれか一つに記載の機器。
【請求項１０７】
前記容器の少なくとも一つの壁は、注射器またはピペットで前記空間にアクセスすることが可能となる隔壁を有することを特徴とする請求項106に記載の機器。
【請求項１０８】
さらに、前記空間にまたは前記空間から、流体を輸送するためのキャピラリ溝を有することを特徴とする請求項80乃至107のいずれか一つに記載の機器。
【請求項１０９】
複数の装置を有する細胞培養の組立体であって、
前記装置の各々は、請求項23乃至79のいずれかに記載の組み合わせおよび請求項80乃至108のいずれかに記載の機器のうちの一つであることを特徴とする組立体。
【請求項１１０】
前記複数の装置の各々は、略板状であり、前記複数の装置は、平行に積層されることを特徴とする請求項109に記載の組立体。
【請求項１１１】
1または2以上の細胞を、該1または2以上の細胞の動きを抑制して、培養するステップであって、前記1または2以上の細胞の各々は、2つの対向する障壁表面と継続的に接触し、前記障壁表面の間を移動することができるステップを有する、細胞培養の方法。
【請求項１１２】
前記障壁表面は、相互に略平行であることを特徴とする請求項111に記載の方法。
【請求項１１３】
前記障壁表面は、略平坦であることを特徴とする請求項111または112に記載の方法。
【請求項１１４】
さらに、前記培養の間、前記1または2以上の細胞の、1または2以上の画像を取得するステップを有することを特徴とする請求項111乃至113のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１５】
前記1または2以上の画像は、非共焦点画像化装置を用いて取得されることを特徴とする請求項114に記載の方法。
【請求項１１６】
前記1または2以上の画像は、明視野画像化装置あるいは蛍光画像化装置を用いて取得されることを特徴とする請求項114に記載の方法。
【請求項１１７】
前記1または2以上の画像は、微分干渉コントラスト（DIC）画像化装置を用いて取得されることを特徴とする請求項116に記載の方法。
【請求項１１８】
前記1または2以上の画像は、約1日よりも長い期間にわたって取得された複数の画像を有することを特徴とする請求項114乃至117のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１９】
前記1または2以上の画像は、一つのもしくは複数の細胞の挙動の履歴に関する情報を収集することを妨害する、光毒性効果による顕著なあるいは実質的な制限を受けずに、長い期間にわたって取得された複数の画像を有することを特徴とする請求項114乃至117のいずれか一つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般に細胞培養に関し、特に培養細胞、細胞培養の方法および機器に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、細胞は、温度およびpHを含むある条件制御下の滅菌容器内の流体またはゲル状成長媒体中で成長させることによって、生体外培養される。多くの幹細胞培養では、例えば細胞は、媒体のサスペンション内で自由浮遊集合体として成長する。しかしながら、そのような培養では、細胞の極近傍の微環境が絶えず変化し、細胞は、様々な未制御環境にさらされ、細胞生体内環境があまり模擬されないことになる。この結果、単一の細胞で培養を開始した場合でも、細胞種の異種混合が生じる。
【０００３】
生体内で細胞によって分泌された分子は、それら細胞の機能および隣接細胞の機能に重要である。しかしながら、従来の培養システムでは、これらの分子は、速やかに拡散し、希釈されるため、生体内で生じる細胞と局部的に分泌された分子との相互作用は、失われ、または有効ではなくなり、1または2以上の細胞の通常の機能が影響を受ける。さらに、ある通常の細胞培養では、細胞は、細胞培養容器の表面に付着または吸着する傾向にあり、これは、ある細胞種には好ましくない。例えば、多くの幹または前駆細胞の付着は、これにより分化が促進されるため、あるいは細胞表現型が変化するため、好ましくない。
【０００４】
従来の生体外細胞培養の方法および機器では、個々の細胞の特性および表現型を制御したり、細胞分裂および細胞系譜を追跡したり、培養液中の各細胞の活動（挙動）履歴をモニターし記録したりすることは、難しく、あるいは不可能である。培養細胞の高解像度の像を得る、レーザー走査共焦点顕微鏡のような従来の技術は、長期間にわたる培養細胞の画像化には適さない。例えば、レーザー走査共焦点顕微鏡のような従来の高解像度画像化技術では、通常、培養細胞は、高強度光にさらされる。その結果、光またはレーザー誘起光毒症のため、生きた細胞を画像化する時間が制限される。また通常、従来の技術を用いて培養セルの高解像度の像を得るには、コストがかかる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、細胞培養の制御を改善することに対する要望がある。本発明は、特に細胞培養の方法および培養細胞、細胞培養機器を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
1または2以上の細胞は、障壁によって空間に拘束されて培養される。細胞は、完全に拘束され、あるいは2つの対向する障壁表面の間を水平に移動する。2つの対向する障壁の間の間隙は、十分に狭く、細胞の単分子層のみが培養される。
【０００７】
拘束された空間内で、細胞を培養することが有意であることは明らかである。例えば、各細胞の環境を正確に制御することが可能となり、生物学的ニッチを反映した培養環境を提供することができる。また、培養細胞の集合体から特殊な細胞を除去したり、培養細胞の集合体に細胞を付加することも可能である。さらに、障壁間に細胞を拘束しているため、共焦点顕微鏡またはレーザー画像化装置を用いず、標準的な明視野画像化法または蛍光画像化法のような画像化技術を用いて、生きた細胞の成長を、細胞以下の寸法で細部にわたって直接観察することが容易となる。細胞が対物レンズの焦点化面内の近傍に拘束されている場合、焦点化面から離れた細胞の像に比べて、画質は有意に向上する。
【０００８】
従って、本発明の態様では、細胞培養の方法が提供される。この方法では、細胞は、第1および第2の障壁の間に拘束される。障壁は、細胞が接触するように、細胞の寸法程度の距離で離間されており、細胞が、第1および第2の障壁のそれぞれの方に移動したり、これらから離れたりすることが抑制される。
【０００９】
本発明の別の態様では、細胞培養液中の個々の細胞の特性を制御する方法が提供される。この方法では、細胞は、細胞と接する、少なくとも2つの表面によって定形された空間に拘束される。この空間は、細胞と同程度の寸法を有する。細胞が接する各表面は、1または2以上の予め選択された特性を有する。細胞を取り囲む細胞数は、細胞の特性が制御できる程度に限定される。空間には、培養物質が設置される。前記予め選択された特性は、細胞の生物学的ニッチの特性を模擬するように選定されても良い。
【００１０】
前述のいずれかの方法において、障壁または表面の間に、複数の細胞が培養されても良い。複数の細胞は、単分子層を形成しても良い。培養細胞は、例えば、光学装置またはセンサを用いてモニターしても良い。モニターの結果は、記録されても良い。また、2つの細胞が相互に相互作用するように、手動で、培養細胞に隣接する追加の細胞を設置しても良い。
【００１１】
本発明の別の態様では、人工組織を形成する方法が提供される。この方法は、細胞の単分子層を、別の細胞の単分子層上に設置するステップと、一つの単分子層内の細胞を、他の単分子層の細胞と相互作用させるステップとを有する。各細胞の単分子層は、本発明の方法により培養される。
【００１２】
本発明の別の態様では、本発明の方法によって培養された細胞またはそのような細胞を有する細胞集合体が提供される。細胞または細胞集合体は、人工組織、臓器、細胞移植または体外受精用として使用されても良い。
【００１３】
本発明の別の態様では、細胞培養装置と細胞培養の組み合わせが提供される。この組み合わせは、流体培養媒体を収容するチャンバ室を定形する容器と、チャンバ室内の空間を定形する少なくとも2つの隔壁とを有する。細胞は、培養中、障壁のそれぞれと継続的に接するようにして、空間内に収容される。各障壁は、1または2以上の予め選択された特性を有する。この組み合わせは、空間に、所定の速度で培養物質を提供する手段を有し、この手段は、チャンバ室におよびチャンバ室から流体が流れることが可能となる、1または2以上の流体通路を有する。チャンバ室にまたはチャンバ室から流れる流体の、流速を調整する手段が設けられても良い。また、空間内に収容された細胞をモニターする手段が設けられても良い。
【００１４】
本発明の別の態様では、細胞培養装置と細胞培養の組み合わせが提供される。この組み合わせは、流体培養物質を収容するチャンバ室を定形する容器と、チャンバ室内の空間を定形する少なくとも2つの障壁と、を有する。各障壁は、1または2以上の予め選択された特性を有する。2またはそれ以上の細胞集合体は、培養中、集合体が障壁のそれぞれと継続的に接した状態で保持されるように、空間内に収容される。また、この組み合わせは、空間に、所定の速度で培養物質を提供する手段を有する。集合体は、1または2以上の細胞層を有しても良い。例えば、集合体は、細胞の単分子層を有しても良い。
【００１５】
本発明の別の態様では、制御された人工空間で、細胞を培養する機器が提供される。この機器は、流体培養媒体を収容するチャンバ室を定形する容器と、細胞培養用のチャンバ室内の空間を定形する少なくとも2つの障壁と、を有する。各障壁の内表面は、1または2以上の予め選択された特性を有する。空間は、十分に小さく、空間内に培養された、1または2以上の個々の細胞の特性を制御することが可能である。またこの装置は、空間に培養物質を提供する手段を有する。
【００１６】
本発明の別の態様では、複数の装置が提供される。各々の装置は、前述の機器および組み合わせのうちの一つであり、相互に組み合わされて、細胞培養用組立体を構成する。複数の装置の各々は、略板状であり、当該装置は、平行に積層される。
【００１７】
本発明の別の態様では、細胞を培養する方法が提供され、この方法は、細胞の移動を制限したまま、1または2以上の細胞を培養するステップを有し、各細胞は、2つの対向する障壁表面と継続的に接する。ただし、細胞は、障壁表面の間を移動することができる。培養中、細胞は、微分干渉コントラスト（DIC）式画像化装置を含む、明視野画像化装置または蛍光画像化装置のような非共焦点画像化装置を用いて画像化される。
【００１８】
本発明の他の態様、特徴および利点は、添付図面を参照した、以下の本発明の特定の実施例に関する記載を参照することにより、当業者には明らかとなろう。
【００１９】
図は、本発明の一実施例を示すために示されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本願発明者らは、培養チャンバ室内の個々の細胞の微環境を制御することにより、体外細胞培養が有意に制御されることを見出した。細胞の微環境とは、細胞または細胞の極近傍を取り囲む局部的な環境であり、ニッチとしても知られている。本発明では、生体内の生物学的環境を「天然ニッチ」、あるいは同義的に「生物学的ニッチ」と呼び、細胞培養における生体外微環境を「人工ニッチ」と呼ぶ。
【００２１】
発明者らは、細胞の人工ニッチのある態様を同定した。この態様は、人工ニッチによって、生物学的ニッチを模擬するため、制御される必要がある。一つのそのような態様は、細胞と接する隣接物によって少なくとも部分的に定形される、人工ニッチの寸法および形状である；別の態様は、細胞を取り囲む、人工ニッチを形成する表面の物理的および／または化学的特性、あるいは表面特性である；別の態様は、人工ニッチへの栄養物の供給と、人工ニッチからの代謝体の除去である。また、各個々の細胞およびその微環境の特性のモニターならびに記録によって、所望の表現型等の、所望の特性を有する個々のセルの培養が容易となる。
【００２２】
有機体においては、細胞の微環境は、各細胞種に固有のものであり、ほぼ各細胞に固有のものである；従って、例えば人体のような複雑なパターンを得ることが可能となる。発明者らは、表現型、細胞分化等の細胞の特性を制御するために、細胞の微環境が満たすべき要件を同定した。細胞培養において、これらの要件が満たされたとき、従来のシステムよりも精度の高い制御が可能となる。場合によっては、培養細胞は、人工ニッチにおいて、生物学的ニッチよりも正確に制御することが可能となる。細胞培養の精密な制御のためには、その微環境は、特定の細胞種に適した方法で、以下の要件を満足する必要がある：1）ニッチは、適当な寸法および形状を有する；2）ニッチの境界および内部を形成する固体、液体、気体または他の相は、適当な化学的および物理的特性を有する；3）ニッチは、適当な溶液源（ソース）と溶液だめ（槽）を有する。人工ニッチおよび個々の細胞特性は、モニターされることが好ましい。発明者らは、これらの要件を満たす人工ニッチを製作した。
【００２３】
培養液中に、人工ニッチは、単独でまたは隣接群として存在する。換言すれば、培養装置は、2以上の人口ニッチを有しても良い。バルク培養時の、各細胞の周囲の微環境が、無秩序で制御されていない細胞集合とは異なり、本発明の実施例において形成される人工ニッチは、定形され、制御されている。各細胞を取り囲む境界を定形し、制御することにより、大きな細胞群が得られるとともに、群への溶液の拡散が可能となり、群内の各細胞を取り囲むニッチが、有効に定形され制御されるようになる。モニタリングによって、好ましくない細胞が（例えば光切除によって）除去され、有機体の免疫システムの機能が再生される。
【００２４】
また、別個のニッチまたはニッチの隣接群は、溝によって相互に接続されても良く、これにより、培養装置内のいくつかの細胞が、他の細胞と物理的に接触されない状態で、化学的な連結が可能となる。培養装置は、別個のニッチ、ニッチ組立体、および物理的に非接触で、化学的にあるいは他の方法で連結されたニッチの、いかなる組み合わせを有しても良い。
【００２５】
特に、発明者らは、例えば2つ以上の細胞外障壁の間もしくは隣接する細胞の間のような、所定の空間内に、細胞を収容または拘束し、その空間が細胞もしくはその生物学的ニッチの寸法と同等の寸法を有するようにすることにより、その人工ニッチの特性が、有効に制御されおよび／またはモニターされることを可能にした。所定の空間に、培養細胞が収容されている場合、その人工ニッチを、その生物学的ニッチのモデルに近づけるように制御することが可能となる。例えば、拘束障壁は、空間の所望の寸法および形状を定形しても良く、所望の表面特性を有しても良く、適当な供給源および供給槽に接続されても良い。また、細胞が拘束されている場合、細胞の動きが制限されるため、個々の細胞の成長および分裂がモニターできる。多くの実施例では、対象細胞が、全ての側を拘束されまたは限定されることが好ましいが、ある実施例では、上記の利点を得るため、予め定形された空間には、細胞またはその生物学的ニッチの寸法と同等の寸法を有することのみが要求されることは明らかである。
【００２６】
細胞は、細胞の寸法と同等の距離だけ離間された2つの障壁の間に拘束され、障壁は、細胞と接し、細胞が各障壁の方に移動したり、各障壁から離れたりすることが抑制される。
【００２７】
従って障壁は、細胞と接する少なくとも2つの別個の表面によって形成され、これは、例えば細胞を連続ゲル中に植え付けることにより、細胞の外周を形成する、単一の連続障壁とは区別される。
【００２８】
障壁は、障壁に対する細胞の動きを抑制する。障壁は、いかなる硬質な非細胞材料で構成されても良く、各種形状にすることができる。障壁は、浸透性、選択浸透性、または不透性である。例えば、障壁は、ガラス板、多孔質膜、またはゲルであっても良い。障壁は、細胞の所望の規則、表現型、挙動、機能または増殖が容易に得られるような微環境を形成するように機能し、適当な障壁の選定は、細胞培養の特定の目的に依存することは、以下の記載から当業者には明らかである。
【００２９】
障壁間の最小距離は、拘束される細胞の寸法と同等であり、これにより、細胞の動きが抑制される一方、細胞は、過度に圧縮されず、細胞が悪影響を受けたり、偶発的に影響を受け、例えば損傷したり、死滅したり、異常な機能を呈したりすることのない範囲で圧縮される。
【００３０】
以下に示すように、本発明のある実施例では、細胞の微環境は、細胞と接触する表面の物理的、化学的および生物学的特性を制御することにより、少なくとも部分的に制御される。また、細胞の微環境は、細胞ニッチに培養物質を提供し、分散させる方法を制御することにより、少なくとも部分的に制御することも可能である。例えば流体培養媒体の場合、流体の流れの方向および流速、媒体中のある成分の濃度、ならびに濃度勾配が、制御され調整される。培養物質は、成長因子、栄養物および（溶解）酸素等を有する培養流体を含む。流体の流れが調整され、例えば濃度勾配が生成する。流体の流れは、拡散フラックスまたは対流速度または両方を調整することにより制御することができることは明らかである。培養物質が、各種方法および各種構造で、細胞ニッチに提供され得ることは明らかである。例えば、流体は、流体溝、透過性板または培養チャンバ室の開口を介して供給される。また培養物質は、他の細胞によって細胞に提供されても良い。
【００３１】
前述の方法で人工ニッチを制御し、生物学的ニッチを十分に模擬することによっても、所望の特性の培養細胞を得ることができることは明らかである。
【００３２】
さらに以下に示すように、本発明のある実施例では、個々の基本細胞に基づいて、細胞成長および分裂を（例えば光学的に）モニターし、記録することができる。各培養細胞の系譜履歴は、モニターし、記録することができる。従って、各個々の細胞の特性に関する特定の情報を得ることができる。細胞特性および履歴の正確な情報は、細胞の培養物を制御する際、および将来の培養細胞の適用の際に有益となる。
【００３３】
方法および機器を含む本発明の特定の実施例を、添付図面を参照して以下に示す。
【００３４】
図1を参照すると、本発明の一例としての実施例は、細胞培養機器20を有する。機器20は、ベース板22と、ベース板22に取り付けられたチューブ24とを有し、これにより、液体培養媒体を受け入れ、収容するチャンバ室26を定形する容器25が形成される。さらに機器20は、チューブ24のヒンジに着脱可能に取り付けられたカバー（図示されていない）を有しても良く、これにより、容器によって形成されるチャンバ室に、不純物が侵入することが回避される。別の実施例では、カバーは、ガス交換が可能となるように、透明ガラスまたは透明膜に緩く取り付けられる。
【００３５】
ベース板22の上部のチャンバ室26の内部には、カバー板28がベース板22と対向するように設置される。ベース板22とカバー板28は、以下に示すように、所望の距離だけ離間するように設置され、これらの間には、内部に細胞が収容され、拘束されるニッチチャンバ室30が定形される。以下に示すように、ベース板22とカバー板28は、その間に1または2以上の細胞を収容する障壁を構成し、これにより、細胞は、板の方に移動したり、板から離れたりすることはできず、常に板と接した状態に維持される。障壁表面は、略平坦でありまたは湾曲していても良い。
【００３６】
図2および3を参照すると、ベース板22とカバー板28は、板28の2つの対向する端部位置のシリコーン接着ガセット32の組のような接着剤によって、位置が保持される。あるいは、両板は、他の化学的または機械的保持機構によって、相互に保持されても良い。カバー板28は、ベース板22のヒンジによって、着脱可能に取り付けられる。例えば、カバー板28の一端は、ベース板22にヒンジ取り付けされ、反対の端部は、ベース板22にクリップ止めされる。さらにニッチチャンバ室30は、ベース板22およびカバー板28に組み合わされたサイド板（図示されていない）によって定形され、密閉チャンバ室が形成されても良く、この実施例では、密閉チャンバ室は、1または2以上の開口を有し、開口を介して、ニッチチャンバ室30とチャンバ室26の間の連通が可能となる（サイド板が存在しない場合、ベース板22とカバー板28が、チャンバ室26と連通する開口ニッチチャンバ室30を定形することは、明らかである）。
【００３７】
板22および板28は、十分に接近させ、さらに、好ましくない結果が得られないよう、または元に戻せない細胞の損傷、不慮の細胞分化、細胞反応もしくは細胞機能の変化等の不測の影響が生じないよう、僅かに細胞を圧縮することにより、両者の間の細胞を拘束する必要があることは明らかである。
【００３８】
培養チャンバ室を定形する容器の構成に適した材料は、当業者には明らかである。例えば、チューブ24は、ガラスまたはポリスチレンのようなプラスチックで構成されても良い。透明材料は、細胞を光学的にモニタリングすることが可能となるため、有意である。チューブ24は、いかなる所望の寸法または形状であっても良く、複数のニッチチャンバ室が収容できる程の大きさであっても良い。
【００３９】
板22および板28は、各種寸法、形状および厚さであっても良い。ベース板22の厚さは、細胞モニタリングの要件を満たすように選定され、例えば、画像化装置の最大ワーク距離よりも薄くなるように選定される。板22の厚さは、通常の顕微鏡カバースリップの厚さであっても良い。板22および板28は、十分な剛性が得られるよう、十分に厚くしても良い。ただし別の実施例では、板22および28の一方または両方は、可撓性であっても良く、これについては以降に詳細を示す。
【００４０】
板22および板28は、同じ材料で構成されても、異なる材料で構成されても良い。好適な材料は、（多孔質）ガラス、コンタクトレンズ材料、ガラスポリスチレン混合物、ポリエチレン、天然もしくは合成生体適合性高分子、または被培養細胞に基づいて選定された他の生体適合性材料であり、これらについては、以下に示す。例えば、板22および板28は、未処理生体不活性ガラスまたは未処理ポリスチレンで構成されても良い。
【００４１】
培養前または培養中に、1または2以上の板22および28を、細胞外マトリクス分子、接着配位子、成長因子、レセプタ等で被覆もしくはコーティングしても良い。培養チャンバ室の内表面へのコーティングの使用が、有意であることは当業者には明らかである。
【００４２】
細胞は、好ましいか否かに関わらず、細胞が接触する表面に接着し得ることは明らかである。細胞の接着を抑制するには、板の内表面を、吸着抑制物質で構成したり、吸着抑制物質で被覆する。吸着抑制物質の一例には、未処理ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ゲル、または多糖類、プロテオグリカン、プロテイン、もしくはポリエチレン酸化物を含む抗吸着生体分子がある。従って細胞は、必ずしも板22および28に接着または吸着させなくても、拘束することができる。例えば、板22および28の一方または両方は、例えばポリ（ジメチルアクリルアミド）もしくはジメチルジクロロシラン等の、細胞の吸着および挙動に影響を及ぼす材料でコーティングされても良い。
【００４３】
ある種類の細胞との間で親和性を有する内表面を使用して、細胞の成長を制御することも可能である。培養細胞に対して、表面が、親和性を全くあるいはほとんど有さない場合、培養細胞は、拘束されても、カバー板の表面には吸着しない。このため、細胞は可動性となり、板の内表面に沿って水平に動くことができる。例えば、細胞は、培養媒体内の濃度勾配によって移動しても良く、あるいは細胞は、磁場等の外力によって動かされても良い。細胞は、表面特性に応じて、ある方向に配向しても良い。また表面材料は、ある細胞を引き寄せまたは排斥する化合物を評価するため選択されても良い。
【００４４】
板22および28の内表面（細胞と接する内表面を意味する）は、特に、ある細胞の成長を促進させまたは抑制するように選択された材料で構成されても良い。
【００４５】
各板22および28（および存在する場合、サイド板）は、気体透過性（または不透過性）であっても良い。気体透過性板は、気体をニッチチャンバ室30に浸透させることが好ましい場合に必要となる。またカバー板28は、液体培養媒体の所与の成分に対して透過性にし、成分が板28を介してニッチチャンバ室30に輸送されるようにしても良く、あるいは、この代わりにまたはこれに加えて、ニッチチャンバ室30に開口を設けても良い。板22および28は、透明または不透明であっても良い。透明板は、培養物中の細胞の光学的なモニタリングを容易にし、培養チャンバ室または細胞内での、光を用いたある化学的もしくは生物学的変化の促進を可能にする。
【００４６】
板22および28は、被培養細胞および目的とする用途に応じて、極めて硬質であっても、柔らかく可撓性があっても良い。硬質の障壁は、正確に細胞を拘束する場合に使用することができる。柔らかい障壁は、限られた範囲の寸法内で、細胞を伸張したり成長させたりすることが好ましい用途に、例えば培養骨細胞、レンズ細胞および他の硬質組織等に使用することができる。またカバー板は、形状記憶材料、または光電形状感応高分子で構成されても良い。そのようなカバー板は、細胞培養時に、障壁間の間隔を変化させることが好ましい場合に使用され、例えば細胞が受ける圧縮力または引張力が周期的に変化するような場合に使用される。
【００４７】
板22および28は、前述のように、所与の用途において各種特性を有しても良いが、両板は、所与の用途において、ニッチチャンバ室30内に拘束された細胞の微環境全体の制御を向上させるため、ある特定の特徴を有するように選択することもできる。
【００４８】
両板間の距離は、ニッチチャンバ室30内に拘束された単一の細胞の寸法と同等であり、細胞は、ニッチチャンバ室内で単分子層として成長する。その場合、距離は、被培養細胞の寸法に依存して変化する。別の実施例では、板22および28の間の距離は、約0.05から250ミクロンであり、バクテリアの培養の場合は、このうち低い範囲の方が適している。例えば、幹細胞を培養する場合、この距離は、約2から40ミクロンの範囲である。
【００４９】
当業者には明らかなように、単分子層内で細胞を成長させることは、有意である。例えば、以下の理由により、培養物中の細胞のモニタリングが容易となる；単分子層を横断する光路が短くなる；対象細胞のニッチを制御する（例えば、隣接する間質細胞を設置または除去する）ための、隣接する細胞の直接操作が可能；対象細胞に対する源および槽の正確な位置決めが可能。
【００５０】
板22および28の間の隙間が、単分子層の細胞成長に限定するように寸法化されている場合、培養チャンバ室26に導入される、成長因子またはサイトカン等の大きな単分子層は、酸素およびグルコース等の小さな分子に比べて抑制された速度で、ニッチチャンバ室30にのみ都合良く拡散し、バルク媒体と、両板間の開口から離れて設置された細胞との間に、濃度勾配が生じる。生体内では、濃度勾配が生じるため、ある用途において生物学的な微環境を模擬する場合、そのような勾配を形成することが好ましい。板22および28が単一の細胞の寸法と同等の距離だけ離間されている場合、いくつかの大きな分子に生じる勾配は、好適なことに、生物学的ニッチでのこれらの分子の勾配にほぼ対応する。
【００５１】
ニッチチャンバ室30の開口の数および寸法は、必要であれば、特定の用途の特定の要件に合致するように、動的に調整することができる。例えば、ニッチチャンバ室30は、例えば1または2以上のサイド板（図示されていない）を設けることにより、密閉して、あるいは部分的に密閉しても良い。サイド板は、1または2以上の開口を有する。サイド板は、透過性、不透過性または選択透過性であっても良い。サイド板の開口は、ナノメートルスケールのポアから、ニッチチャンバ室30からの細胞の移動または伸張が可能となるような細胞スケールの溝までの様々な寸法であっても良い。
【００５２】
サイド板が存在しない場合、またはサイド板が同一の開口を有する場合、ニッチチャンバ室30内に、対称な濃度勾配が形成される。一つのサイド板のみが含まれる場合、または非対称な開口がサイド板に設けられている場合、ニッチチャンバ室30内には、マクロ分子の比較的長く続く方向の濃度勾配が形成され、生体内で特定の細胞種が受ける濃度勾配が再形成される。さらに容器25は、ニッチチャンバ室30の開口に隣接する堰を有し、バルク媒体が仕切られ、ニッチチャンバ室30には、大きな単一方向の濃度勾配が生じる。勾配の強度および時間は、いずれも固有の細胞消費速度、拡散分子寸法、チャンバ室26での分子濃度、および障壁間の距離に依存する。
【００５３】
板22および28は、略平行にまたは僅かに傾斜した状態となっている。傾斜ニッチチャンバ室は、パイ状のニッチを形成する場合、および狭い軸に沿った細胞移動を促進する場合には、好ましい。顕微鏡の単一の視野内に、連続勾配の広い範囲の寸法を有することは、細胞の間隙寸法の範囲の効果を評価する場合に有益である。例えば、0から45度の範囲の角度が使用される。
【００５４】
機器20は、容易に入手できる材料で構成されても良い。ベース板22として、標準的な顕微鏡カバースリップが使用され、カバー板28として、小片状の顕微鏡スライドが使用されても良い。これらは、カバー板28の少なくとも2つの端部に沿って、あるいは板28の外周に沿った位置のいくつかの組み合わせによって、シリコン接着剤または歯科用接着剤等の生体適合性弾性接着剤を用いて、相互に接着される。所望の寸法または容積のニッチチャンバ室30を形成するため、カバー板28は、接着剤を設置する間、スペーサによってベース板22から離され、または弾性膠着が使用される場合、カバー板28は、接着剤の設置後にベース板22から離される。プラスチック、ガラスまたはシリコーン等の組織培養用の標準的な材料を用いて、いかなる寸法または形状のチューブが構成されても良く、このチューブをベース板22の上部に接着して、容器25が形成される。
【００５５】
必要であれば、1または2以上の流体導通チューブ（図示されていない）をチャンバ室26の各位置に接続して、チャンバ室26におよびチャンバ室26から流体を流通させても良い。チューブは、ニッチチャンバ室30の開口に向かって延伸し、またはこの開口にまで延伸する。各チューブは、異なる寸法を有しても良く、別個に制御されても良い。従って、特定の流体成分が、特定の所望の速度で、チャンバ室26またはニッチチャンバ室30の特定の位置に輸送される。
【００５６】
また必要に応じて、チャンバ室26は、板28の上部にわたる堰を有する2つの部分に区画されても良い。チャンバ室26の2つの区画に収容された媒体は、異なる圧力にされ、あるいは異なる成分濃度となり、ニッチチャンバ室30を通る流れが形成される。この流れは、圧力差もしくは濃度を制御することにより制御され、または調整される。
【００５７】
図1、4および5を参照すると、作動時に、1または2以上の細胞36が植え付けられ、ニッチチャンバ室30内で培養される。
【００５８】
細胞36を設置する前に、例えばオートクレーブを用いてまたはUV線露光により、チャンバ室26およびニッチチャンバ室30が殺菌される。
【００５９】
必要であれば、細胞36を設置する前、設置しているとき、または設置した後に、板22および28の間のニッチチャンバ室30に、1または2以上の同等の寸法の硬質スペーサ34が設置される。好適なスペーサ34は、ポリスチレン等の高分子またはガラスミクロスフィアを含む。スペーサは、蛍光体であっても良い。これらは、生体分子または反応性化学官能基でコーティングすることもできる。これらは、磁性体であっても良い。スペーサ34は、十分な剛性があり、圧縮に対して抵抗力がある。スペーサ34は、板22および28の位置合わせを容易にし、ニッチチャンバ室30の細胞が、損傷するほど過度に圧縮されることを防止する。
【００６０】
先に示したように、板22および28は、細胞36を過度に圧縮しないにすることが好ましい。発明者らは、両板が最初に正確に整列されていても、予防手段を講じなければ、細胞培養中の外乱によって、板が僅かに変形し、これにより板22および28間の細胞36が損傷を受けることを見出した。この点から、両板の間に硬質スペーサ34を設置することは、特に好ましい。スペーサ34としてミクロスフィアを使用することにより、好適におよび正確に、両板が設置され、細胞が過度に圧縮されることが防止できる。ミクロスフィアの寸法は、正確に制御することができる。ミクロスフィアは、所望の通り、分散させ、再設置させ、または置換することが容易に行える。ミクロスフィアは、十分な剛性があり、板28の移動を防止することが可能な、いかなる生体適合性材料で構成されても良い。前述のように、ある実施例では、ミクロスフィアは、高分子で構成される。別の実施例では、スペーサ32は、板22もしくは28の内表面、または両板の表面での型押し等によって、1または2以上の板を一体化して構成される。
【００６１】
スペーサ34および／または細胞36は、各種好適な方法で設置される。例えば、スペーサ34および細胞36は、
ニッチチャンバ室30の1もしくは2以上の開口を介しての注入または毛細管現象を利用して、あるいはニッチチャンバ室30に挿入されたチューブを利用して、チャンバ室30に流入される流体によって、一緒にあるいは別個に運搬される。これらは、カバー板28を除去または開いた後に、直接ベース板22上に成膜することも可能である。カバー板28は、ピンセットおよび／または仮スペーサを用いて板22および28を離間することによって、僅かに開けることができる。細胞36は、注射器またはピペットを用いて設置することもできる。使用するピペットは、先端が狭くなっており、例えば数ミクロンの断面積を有し、個々の細胞は、高精度で設置することができる。このため、容器25の壁は、注射器またはピペットをニッチチャンバ室30に通すことができる隔膜を有する。
【００６２】
細胞の設置の際に、カバー板28が除去または開かれた場合、カバー板28は、設置後に細胞が損傷しないように、注意深く再設置され、あるいは閉じられる。
【００６３】
媒体チャンバ室26には、適当な培養媒体が満たされる。チャンバ室26は、細胞36を設置する前または後に充填される。
【００６４】
細胞36は、本願に示されたあるいは当業者には公知な適当な条件下のニッチチャンバ室30内で成長し、分裂する。
【００６５】
板22および28は、細胞36を僅かに圧縮することは明らかである。従って、細胞36は、両者の間で物理的に拘束され、ニッチチャンバ室30内に保持され、各板22および28と絶えず接触した状態が維持される。細胞36は、両板に向かってまたは両板から離れるように移動することはできない。
【００６６】
このように、ニッチチャンバ室30内で成長する細胞は、ベース板22およびカバー板28によって、所定の空間に物理的に拘束される。両板の間の間隙は、単一の細胞の寸法とほぼ等しくなっており、図4および5に示すように、細胞の単分子層のみがニッチチャンバ室30内で成長することができる。
【００６７】
細胞36が拘束されているため、細胞のニッチの特性を制御が容易となることは明らかである。例えば、対象細胞に隣接する細胞を、選択的に設置することができる。隣接する細胞は、対象細胞の細胞種とは異なる1または2以上の特定の細胞種であっても良い。対象細胞を取り囲む培養媒体の、ある成分の濃度勾配を、正確に制御することができる。対象細胞を、連続的にモニタリングすることができ、その成長または分裂履歴を追跡して、記録することが可能である。また、板22および28は、細胞36をバルク環境から保護し、細胞36が、上部または底部で、別の物体もしくは別の表面と接触することを防止する。板22および28の表面の特性は、予め選択することができるため、細胞36が、制御されていないあるいは好ましくない特性を有する表面に暴露されることを防止することができる。例えば、板の表面が、細胞が生物学的ニッチにおいて暴露される環境を模擬した特性を有するように選択された場合、細胞36は、絶えずそのような特性を有する表面にさらされる。従って、各細胞36の微環境の制御性が改善される。障壁の予め選択された特性は、障壁に元来備わっている特性であっても、障壁の特定の処理の結果として生じるものであっても良いことは明らかである。
【００６８】
前述のように細胞の単分子層が培養された場合、隣接細胞にあまり外乱を与えずに、細胞の単分子層から特定の細胞を除去することが可能となる。特定の細胞の除去は、例えば核型、形態および細胞サイズに関する1または2以上の基準に合致する、特定の細胞が観察された際に、実施されることが好ましいことは、当業者には明らかである。
【００６９】
1または2以上の細胞36は、各細胞36が2つの対向する障壁表面と絶えず接触した状態で、細胞の動きが限定されたまま、培養されることは明らかである。ただし、各細胞または細胞全体は、障壁表面の間を移動することができる。すなわち、細胞は、障壁表面と略平行な方向に移動することができる。好適なことに、細胞は、明視野画像化装置もしくは蛍光画像化装置等の、微分干渉コントラスト（DIC）画像化装置を含む非共焦点画像化装置を用いて、培養中に画像化することができる。細胞は、非共焦点画像化装置の焦点面近傍に拘束されているため、共焦点顕微鏡を用いなくても、高解像度の画像を得ることができる。従って、細胞にあまり悪影響を与えずに、長期にわたって（多くの日数で）、細胞36を画像化したり、モニターすることができる。
【００７０】
板22および28の間の間隙は、個々のニッチ全体の制御、さらには個々の細胞の特性制御が十分に可能な範囲で、両板の間で複数の細胞層が成長できるように、拡張しても良い。大部分の実施例では、細胞層の数は、通常4または5を超えない。例えば、間隙は、2つの細胞の全長にほぼ等しい。また前述のように、板22および28の内表面は、異なる細胞種に対して異なる親和性を有しても良い。そのような場合、第1の層が第1の細胞種を有し、第2の層が第2の細胞層を有するというように、板22および28の間で、2つの細胞層を培養することが可能となることは明らかである。2つの層の細胞は、通常、天然の環境の場合と同様の相互作用を示す。
【００７１】
培養チャンバ室30内の細胞36の数、あるいは特定の細胞36を取り囲む細胞の数は、板22および28の使用と設置により、制限される。細胞数を制限することは、各種目的に役立ち、例えば個々の細胞の特性を制御することが可能となり、または培養細胞の改良されたモニタリング法が得られる。
【００７２】
図6および7には、別の実施例を概略的に示す。細胞培養機器40は、ベース板42と、カバー板44と、相互にニッチチャンバ室48を定形する多数の側壁46と、を有する。
【００７３】
ベースおよびカバー板42、44は、適当な距離の位置に相互に対向して設置される。この距離は、被培養細胞の寸法と同等である。板42および44の内表面は、略平坦あるいは湾曲している。多くの被培養細胞の寸法が異なる場合、板42および44の距離は、最大の細胞寸法とほぼ等しくされるか、異なる位置に異なる寸法の細胞を収容するように寸法が変化する。例えば精子細胞を培養する場合、最小の距離としては、8ミクロンが適している。
【００７４】
側壁46は、ベースおよびカバー板42、44の間に介在され、所望の生体内細胞境界を模擬するように設置される。各対向する側壁46組の間の距離は、用途に応じて変化することは当業者には明らかである。例えば、精子細胞を培養する場合、側壁間の距離は、30から80ミクロンまで変化する。
【００７５】
チャンバ室48の1または2以上の内表面は、生物学的ニッチの界面の形状を模擬するように定形される。1または2以上の内表面は、被培養細胞に対して非吸着性であっても良い。細胞吸着を促進させたり他の細胞との反応性を高めるため、1または2以上の内表面は、細胞外液マトリクスプロテイン、ゲル、プロテオグリカンおよび成長因子等の材料でコーティングされても良い。
【００７６】
また機器40は、チャンバ室48への、およびチャンバ室48からの流体移動用の複数の流体溝を有し、これは、供給溝50、ソース溝52、54，56および58、ならびにシンク溝60および62を有する。細胞は、キャリア流体を用いて、供給溝50を介してチャンバ室48に供給される。成長媒体を含む培養流体は、ソース溝52、54、56および58を介してチャンバ室48に供給されても良い。流体は、栄養物、溶解ガス、調合化合物、追跡色素、免疫体等の各種分子でコーティングされた磁性粒子、被培養細胞によって通常分泌される分子を含む溶解分子、または特定のエフェクター分子がコーティングされた固体もしくは相識別マトリクス、等を含んでも良い。キャリア液、未消費成長媒体、廃棄物、死細胞の堆積物等の物質を含むチャンバ室48内の流体は、シンク溝60および62を通ってチャンバ室48から抽出される。溝の数は、用途および製造条件によって変化することは明らかである。例えば、単一の溝が、ソース溝およびシンク溝の両方に交互に使用されても良い。
【００７７】
溝の構成の細部は、特定の用途での実施機能に応じて変化する。一例として、想定し得る溝構造の簡単な記載を以下に示す。
【００７８】
溝の断面寸法は、キャリア流体の必要な流速に応じて変化する。従ってこれらは、チャンバ室48内の細胞に供給される栄養物または他の媒体量、またはチャンバ室48内で生成され、排出することが必要な廃棄物および堆積物のような、所望の液体成分量から計算される。例えば、精子細胞の培養の場合、ソース溝は、キャピラリによる血液供給を模擬するように構造化される。ソース溝が10ミクロンの断面径を有する場合、流速は、1から100ミクロン／秒となり、これは、例えば10細胞に、酸素を供給するには十分である。別の例では、精子細胞の培養のため、ソース溝およびシンク溝を用いて、細精管流体が供給および排出され、この流体が未成熟精子の鞭毛を流れて、栄養が提供され、それらを精密に成長させることが可能となる。一つの構成例では、1pL／秒の流速が必要であり、この流速は、生体内変化を模擬するため、培養時に変化する。従って、シンク溝およびソース溝は、10ミクロンの径であることが好ましい。別の例では、ニッチチャンバ室48には存在しないが生体内に存在する細胞の存在を模擬するため、シンク溝およびソース溝を用いて、例えばサイトカンのような流体含有細胞が提供および排出される。この場合、流れは、断続的で低速であることが必要であり、例えばfL（フェムトリットル）／秒程度の速度である。従って、溝は、2ミクロン径の円形である。
【００７９】
フィルタまたは透過性膜63を、溝（例えば、図6の溝62）とチャンバ室48の間の界面に設置しても良く、これにより、流速が正確に制御または調整され、あるいは流体中の選択物質のみを通過させることが可能となる。
【００８０】
溝内の流速を調整または制御するため、溝にはバルブ64を設置しても良い。各溝は、制御バルブ64を有しても良い。バルブ64は、特定の用途に応じて異なる種類のものであっても良い。バルブは、付帯溝が圧縮されて膜が変形し溝が遮断されるような、単純な油圧式のもの、ガスが加熱されて同様の膜が膨張する加熱式のもの、pHによって体積が大きく変化するヒドロゲルで溝を遮蔽するヒドロゲルpH制御式のもの（付帯溝を介してpHが設定される）、または他の適当な方式のものであっても良い。例えばバルブの設計は、本願の参照文献として取り入れられている、アンガー（M. A. Unger）らの「多層化ソフト写真転写によるモノリシック小型加工バルブおよびポンプ」、サイエンス、288巻、p113-116、2000年；ユ（C. Yu）らの「熱反応性モノリシック高分子をベースとした、機械的部分のない解析微小流体チップの流束制御」、アナリティカルケミストリー、75巻、p1958-1961、2003年；およびユ（Q. Yu）らの、「微流体用の反応性生体模倣ヒドロゲルバルブ」、アプライドフィジックスレターズ、78巻、p2589、2001年；に示されている。
【００８１】
前述のようにモニタリングのため、1または2以上のセンサ66をベース板42（またはカバー板44）に設置しても良い。各種センサが使用できる。例えば、生体適合性のあるイオン反応性電界効果トランジスタ（ISFET）系のセンサを用いて、酸素濃度およびpHを測定しても良い；クラーク式電流バイオセンサを用いてグルコース濃度および勾配を検出しても良い。チップ型のバイオセンサのレビューは、本願の参照文献として取り入れられている、エジンズ（Brian R. Eggins）の化学センサおよびバイオセンサ、John Wiley & Sons、2002年に示されている。センサ66は、各種寸法および形状である。3ミクロン未満の寸法を有するセンサは、ある用途に適している。センサ66には、分子濃度、温度、浸透圧、pH、剪断力等を検知するセンサが含まれることは、当業者には明らかである。そのようなセンサは、従来技術であり、容易に入手または製造することができる。
【００８２】
機器40は、ベース板42とカバー板44の間に、基板プレートを介在させることによって製作されても良い。基板には、流体溝およびバルブを有するミクロ流体ネットワークが埋設される。また機器40は、垂直接続配線に接続された、透明インジウムスズ酸化物導体を有し、この垂直接続配線は、基板上のミクロ流体ネットワークを横断する。ネットワークは、当業者には公知の各種方法で製作され、例えば、本願の参照文献として取り入れられている、ジョー（B.-H. Jo）らの、「ポリジメチル-シロキサン（PDMS）エラストマー内の三次元微細溝加工」、ジャーナルオブマイクロエレクトロメカニカルシステムズ、9巻、p76-81、2000年；ナラシムハン（J. Narasimhan）、パパウツスキー（I. Papautsky）、「PDMSを用いた高温エンボスツールの高速加工」、Micorfludics、BioMEMSおよびMedical Microsystems、インターナショナルソサイエティフォアオプチカルエンジニアリング（International Society for Optical Engineering） 4982プロシーディングス、ｐ110-119、2003年；ルッドマン（M. Rudman）ら、「近接場サブ波長微細パターンの形成、ピペット誘導フッ化アルゴンエキシマレーザー微細加工」、ジャーナルオブアプライドフィジックス、72巻、p4379-4383、1992年；ナベツ（B. Nabeth）ら、「各種反応性賦形剤を有するUV硬化ポリウレタンアクリレートの動機械的特性」、ジャーナルオブアプライドポリマーサイエンス、60巻、p2113-2123、1996年；に示されている。
【００８３】
ネットワークは、PDMSのマイクロスタンプ法、ホットエンボス法、シリコン微細機械加工法、レーザーアブレーション法、またはイソボルニルアクリレート（IBA）等の材料のUV硬化法によって構成されても良い。PDMSは、好適な材料であり、標準的な微細加工技術を用いて、PDMS層の成形に使用される型を形成することができ、PDMS層の表面には、チャンバ室48を取り囲む各種溝が押印されている。PDMS層は、当業者には公知の方法で、相互に上下に積層され、側壁45が構成される。PDMSの別の層は、PDMSを形成するために混合された2つの成分のうちの一方が過剰となるように構成される。硬化後に、隣接する層同士が熱によって溶融され、一つの層内の過剰な成分が、この層を挟む層内の過剰な成分と反応する。
【００８４】
各側壁46の材料（すなわちその特性）は、個々に選定され、所望の特定の効果が生じ、または好ましくない特定の効果が回避される。例えば、幹細胞の生体内ニッチを模擬するため、精原細胞およびそれらを支持するセルトリ細胞は、コラーゲン−IVおよび／またはラミニン−1で被覆される。ラミニンは、生物学的ニッチ内の精原細胞を区画する基底膜の支配的な成分であるため、ラミニン−1は好適である。男性生殖幹細胞は、コラーゲン−IVとは強固に結合されず、コラーゲン−IVゲルからなる壁は、チャンバ室48内で成長する細胞の配向を制御することが容易となるため、コラーゲン−IVゲルは、好適である。コラーゲン−IVゲルは、通常、細胞膜に見られる結合プロテインで被覆され、セルトリ細胞は、クラウディン、オクルーディン、カドヘリン、コネクシンおよびセレクティン等の生物学的ニッチにさらされる。チャンバ室48の残りの内表面は、ガラスまたはポリジメチルシロキサン（PDMS）等の生物学的ニッチで構成される。
【００８５】
側壁46、特にその輪郭を示す内表面は、当業者には公知の標準的な微細機械加工法を用いて定形され、例えば、本願の参照文献として取り入れられている、「微細写真転写、微細機械加工、および微細加工のハンドブック」、1、2巻、インターナショナルソサイエティフォアオプチカルエンジニアリング（International Society for optical Engineering）、ライコウドハリー（P. Rai-Choudhury）（編集者）、1997年に示されている。
【００８６】
機器40は、チャンバ室48への光の透過を可能にする透明材料で構成されても良く、これにより、細胞が光学的にモニターされ、あるいは光を用いて、チャンバ室48内で特定の光化学反応が開始される。
【００８７】
機器40は、細胞培養の所与の目的に必要なあるいは好ましい他の物理的、化学的または電気的部品を有しても良い。バイオプロセスの技術者には明らかなように、例えば装置は、培養工程の適切な作動のため、他の装置および機器に接続され、これは、「生物化学的エンジニアリング」、Marcel Dekker Press社、ブランシェ（H. Blanche）、クラーケ（D. Clarke）、1997年に示されている。
【００８８】
コンピュータまたは他の自動装置等の制御システム（図示されていない）を用いて、機器40の動作がモニターおよび制御され、得られたデータが解析される。チャンバ室48内の培養環境は、リアルタイムでの収集情報に基づいて動的に調整される。媒体の流れおよび代謝体の濃度は、モニターされ制御される。例えば、センサ66は、透明電極を用いて制御システムに接続され、チャンバ室48内の酸素濃度およびpHの同時測定に使用される。また、複数のセンサ66を用いて、チャンバ室内での所与の物質の勾配が測定されても良い。フィードバック情報には、チャンバ室48内のpH、グルコースと酸素の濃度、温度、浸透圧、剪断力が含まれる。
【００８９】
微小流体ポンプ（図示されていない）を溝に接続し、流体をチャンバ室48に供給し、チャンバ室48から排出させても良い。いかなる好適なポンプを使用しても良い。例えばポンプは、本願の参照文献として取り入れられている、ハッチ（A. Hatch）ら、「フェロ流体磁気小型ポンプ」、ジャーナルオブマイクロエレクトロメカニカルシステムズ、10巻、p215-221、2001年；ソエレンセン（O. Soerensen）ら、「微細機械加工流束ハンドリング部品−小型ポンプ」、プロシーディングス、SPIE−インターナショナルソサイエティフォアオプチカルエンジニアリング（International Society for Optical Engineering） 3857、p52-60、1999年；ヲイアス（P. Woias）、「小型ポンプ−初期の20年間のまとめ」、プロシーディングス、SPIE−インターナショナルソサイエティフォアオプチカルエンジニアリング（International Society for Optical Engineering ）4560、p39-52、2001年；に示されている。好適なポンプの例には、リングチャンバの周囲の回転磁石によって推進されるフェロ流体スラグ、わき柱を密閉する圧電性結晶ドア、圧電性結晶ポンプ等が含まれる。断面積寸法が0から100ミクロンの溝内の動電的ポンプの流速は、10または100ミクロン／秒に達する。ポンプは、チャンバ室48に接続された溝のネットワークの各位置に設置され、特に長い溝における流れの抵抗が抑制される。
【００９０】
細胞を設置する前に、チャンバ室48の表面には、細胞の吸着または挙動を制御するため、正または負の電荷が与えられても良い。電荷は、当業者には公知の各種手段によって付与され、例えば400℃の酸素ガスにさらすこと、酸または塩基にさらすこと、あるいは異なる電子親和性の材料で擦ることによって付与される。
【００９１】
チャンバ室40の内表面は、他の分子がそれに共有結合されるような反応性を有しても良い。表面には、当業者には公知の各種方法で、反応性が付与され、例えばアミノプロピルトリメトキシシラン（APTS）のような、表面にアミン基を有する分子で処理することにより、反応性が付与される。薄い層またはバルク材料が、表面に連結されても良い。バルク材料には、プロテイン、ポリアクリルアミド、または他の物質からなるゲルが含まれる。そのようなゲルは、標準的な微細加工技術を用いた型内で形成されても良い。ゲルは、側壁に設置され、活性表面との反応により共有結合する。例えば、コラーゲン−IVゲルまたはフィブロネクチンが使用される。男性生殖幹細胞は、コラーゲン−IVまたはラミニン−1のようなフィブロネクチンには強固に結合しないため、チャンバ室48のいくつかの表面が、コラーゲン−IVゲルまたはフィブロネクチンによってコーティングされており、他の表面がラミニン−1でコーティングされている場合、チャンバ室の細胞は、所望の通り配向させることができる。
【００９２】
表面は、結合プロテインで被覆しても良く、この場合、対象細胞型は、通常、クラウディンおよびオクルーディン（密着結合の場合）、カドヘリン（アクチン−結合、吸着結合の場合）、コネクシン（ギャップ結合の場合）、およびセレクチン（セレクチン−レクチン相互作用の場合）のような天然環境にさらされる。プロテインの薄い層は、チャンバ室40の内表面にパターン化されても良く、例えば、グルタルアルデヒドもしくは光活性化架橋4−ベンゾイルベンゾイック酸スクシニミドイルエステルを有する、APTS処理表面の処理によって、または当業者には公知の、本願の参照文献として取り入れられている、イトウおよびヨシヒロ、「細胞機能調整のための表面微細パターン化」、バイオマテリアルズ、20巻、p2333-2342、1999年に示されている他の技術を用いて、パターン化される。プロテインは、いずれの種類のものであっても良い。例えば、精子細胞を培養する場合、ラミニン−1は、精子細胞の生体内ニッチにおける基底膜の支配的な成分であるため、このラミニン−1が使用される。プロテインは、当業者には公知の方法で、ニッチ区画表面での濃度勾配内でパターン化されても良い。
【００９３】
機器40には、センサとポンプの電極を、外部電子機器および電源に接続するため、導体（図示されていない）が埋設されても良い。導体は、標準的な微細電子加工技術を用いて設置される。例えば、導体は、厚さがナノメートルのオーダーである。導体は、基板の表面に沿って、または基板を貫通するように設置される。また導体は、酸化アルミニウムのような非導電性材料の不活性コーティングで被覆されても良い。
【００９４】
ニッチチャンバ室48は、例えば哺乳類の精巣に見られる細胞など、特定の細胞種を培養する場合に有益である。前述のように、チャンバ室48は、細胞集合体の培養に使用され、各細胞は、それぞれ個々に制御されるニッチを有し、全体の集合体によって、所望の生物学的効果が生まれ、精子等が生成される。
【００９５】
機器40を構成する方法の一例は、以下の通りである：
シリコンまたは二酸化珪素からなり、ベース板42を形成する略平坦な基板を準備する工程；
センサ66をベース板42に組み込む工程；
インジウムスズ酸化物または窒化チタンの透明導体（図示されていない）を設置して、センサ66をベース板42の外表面上の電極に接続する工程；
導体の上部に絶縁層（図示されていない）を成膜する工程であって、絶縁層は、例えば窒化珪素、ポリイミドまたはポリシロキサンで構成される工程；
いくつかの基板層の形成および積層により、微小流体ネットワークを有する側壁46を構成し、前述のように、各々の層の表面に溝が組み込まれる工程；
カバー板44を形成する略平坦な基板で、側壁46を被覆し、これによりチャンバ室40が形成される工程； 
チャンバ室40を被覆する前または後に、必要に応じて実施される、チャンバ室40のいくつかの内表面を反応性にして、ある分子がここに共有結合される工程；
チャンバ室40を被覆する前または後に、必要に応じて実施される、チャンバ室40のいくつかの内表面にプロテインの薄い層をパターン化する工程。
【００９６】
作動時にチャンバ室48には、多くの所望の種細胞が設置される。ベースおよびカバー板42、44は、両者の間に細胞を拘束し、細胞のベースおよびカバー板に向かう動きまたは両者から遠ざかる動きを制限する。
【００９７】
図8に示すように、対象細胞68をさらに拘束するため、または対象細胞68に所望の微環境を提供するため、1または2以上の他の細胞（例えば細胞70、72および74）が、チャンバ室48内の対象細胞68の周囲に設置される。そのような場合、他の細胞は、対象細胞の拘束を助長する。対象細胞および隣接細胞は、手動で、チャンバ室48の特定の位置に設置されても良い。またはこれらは、自己組織化によって設置されても良い。2つの隣接する細胞は、これらが相互に圧縮される場合、互いに拘束されることは明らかである。従って対象細胞も、隣接細胞の拘束を助長する。
【００９８】
細胞は、上部からカバー板44を除去し、マイクロピペットを用いて設置することにより、チャンバ室48内に植え付けられる。カバー板44は、細胞を妨害しないように、ゆっくりと降ろして設置される。カバー板44は、標準的な位置合わせ手段を用いて設置される。また細胞は、1または2以上の流体溝50乃至62を介して植え付けられても良い。例えば、細胞は、一つの溝50によってチャンバ室48に供給される。キャリア流体は、溝50と62のバルブ64を開けることにより、溝62を通って除去される。一旦供給されると、細胞は、チャンバ室48で自己組織化し、または自己集合化するため、特定の細胞に対する適当な親和性など、予め選択された好適な特徴を有する、チャンバ室48にある障壁表面によって、これらの操作が容易に行える。
【００９９】
種細胞が設置された後、溝50のバルブ64が閉じられる。
【０１００】
チャンバ室48は、溝52を通る流体培養媒体を収容する。例えば精原細胞を培養する場合、好適な媒体は、細精管液代替物を含む。媒体は、高濃度のアミノ酸、カリウム、アンドロゲンおよびエストロゲンを含んでも良い。これらの媒体は、精子鞭毛の適切な発達に必要な細精管を模擬していることは明らかである。
【０１０１】
キャリア流体は、溝62から排出されても良い。
【０１０２】
補給培養媒体は、それぞれ、ソース溝およびシンク溝として機能する溝58および60を通ってチャンバ室48に供給される。例えば補給媒体は、テストステロンを含み、これは、通常、細精管内腔に対向する基底膜の側面の有機体に含まれている。
【０１０３】
媒体の流束および濃度は、モニターされ、制御される。例えばセンサ66を用いて、チャンバ室48内の酸素濃度とpHが同時に測定される。また、複数のセンサ66を用いて、チャンバ室48内の所与の物質の勾配を測定することも可能である。
【０１０４】
機器40が透明な場合、例えば顕微鏡画像化装置を用いて、チャンバ室48内の細胞成長をモニターすることが可能となる。例えば、そのような装置を使用して、成熟精子、すなわち除去される精子と目的用途に使用される精子の存在を検出しても良い。
【０１０５】
コンピュータまたは他の自動化装置を用いて、機器40の動作をモニターし、制御して、得られたデータを解析しても良い。チャンバ室48の培養環境は、リアルタイムで収集された情報に基づいて動的に調整されても良い。フィードバック情報には、チャンバ室48内のpH、グルコースおよび酸素濃度が含まれる。
【０１０６】
図8には、機器40において培養される細胞の特定の例を示す。図のように、チャンバ室48は、A型の薄い精原細胞68、B型の薄い精原細胞70、および2つのセルトリ細胞72を有する。図には示されていないが、各細胞は、ベースおよびカバー板42、44によって、両者の間に拘束されていることは明らかである。当業者には明らかなように、チャンバ室48において成長する各細胞のニッチは、そのような細胞の生物学的ニッチに近い。各細胞は、1または2以上の他の細胞によって拘束され、ある場合には、1または2以上の側壁46によって拘束される。例えば、細胞68は、水平方向では細胞70および72によって拘束され、垂直方向では壁46および細胞74によって拘束される。換言すれば、細胞70および72は、両者の間で細胞68を拘束し、これらは、対向する側で細胞68と接し、細胞68がこれらの細胞から遠ざかることが防止される；同様に、細胞74および底部側壁46は、細胞68を両者の間に拘束し、対向する側で細胞68と接触し、細胞68が両者から遠ざかることが防止される。
【０１０７】
チャンバ室48内の細胞は、細胞同士の間の空間を介しての拡散によって、およびそれほどではないが、細胞を介して栄養物を受け取る。また栄養物は、細胞の上部または底部に設置された溝を通って供給される。
【０１０８】
必要であれば、細胞は、培養チャンバ室から除去しても良い。チャンバ室48から、精子のような細胞を除去するため、溝50が一時的に開き、細胞が流体キャリアによってチャンバ室48から搬出される。
【０１０９】
機器40の一つの壁は、隔膜を有しても良く、これによりピンセットまたはマイクロピペットを用いて、チャンバ室48に近づくことが可能となる。
【０１１０】
機器40は、各種用途に使用することができる。
【０１１１】
例えば、機器40を用いて、万一の場合、例えば、睾丸癌または不妊症の場合、男性の関心遺伝子プロファイルを有する健康な精子を生成することができる。精原細胞は、健康な対象から取得され、その後、本願に示すように成長を制御した状態で保管される。
【０１１２】
有機体では、しばしばマルチ細胞ユニットに、特定の機能を示す複数の細胞種がともに存在することがあり、これらのユニットは、しばしば物理的に明確なニッチ組立体を形成する。機器40を用いて、人工ニッチ組立体を提供し、制御することができることは明らかである。
【０１１３】
また機器40を用いて、単一の細胞用の単一のニッチ、あるいはマルチ細胞ユニットの一部のニッチを提供しても良い。例えば、前述の精子細胞を培養する場合、セルトリ細胞を植え付ける代わりに、Sry、インヒビンおよびアンドロゲン結合プロテイン等の、セルトリ細胞によって生成される重要なプロテイン、ならびに、血液精巣隔膜を構成するため、セルトリ細胞によって形成されるものと同様の境界壁を提供するように、機器40を構成し、制御しても良い。
【０１１４】
機器40の配列は、単一の装置上に加工しても良いことは明らかである。図に示すように、チャンバ室48は、複数の細胞を収容しても、単一の対象細胞を培養するように設計されても良い。
【０１１５】
別の特定の実施例を以下に示す。
（i）自動モニタリングおよび制御
前述のように、コンピュータおよびコンピュータプログラムを用いて、細胞培養とモニタリングを制御し、得られたデータを解析しても良い。培養装置または別の中央ユニットに、マイクロプロセッサを取り付けても良い。コンピュータシステムは、センサからの測定結果を記録し、データを解析し、これに従ってニッチを制御することができる。ニッチおよび付帯装置は、1または2以上のプロセッサ、およびソフトウェアプログラムによってモニターされ、制御されても良い。
【０１１６】
図9には、一例として、培養工程を制御するコンピュータシステム90と、培養制御解析システム92の間のデータ経路の配置を示す。
【０１１７】
ニッチ環境は、携帯式カートリッジに収容され、このカートリッジは、他の装置と結合される外表面に、開口、電気接続部、機械的コネクタ、および他の特徴物を有する。例えば、カートリッジは、定常の培養機能を実施する装置にプラグ接続され、この培養機能を、各ニッチ組立体の極近傍から一定の距離の位置に集中させることができる。そのような機能は、栄養物およびガスの保管、液体、固体もしくは気体を移動させるための正または負の圧力の供給、ニッチ内のセンサからの信号の受信と解析を含む。装置は、マルチウェル板を有し、カートリッジは、各ウェルに設置される。あるいは、カートリッジは、生物センサ装置内に設置され、この装置は、例えば、ニッチを通る光を放ち、細胞が特定のレポーター遺伝子を表すかどうかを定める。さらに別の方法では、カートリッジは、顕微鏡ステージ上に設置され、またはマルチウェル板に設置される。
（ii）単一の制御ニッチ内の細胞スケールの分子生物学的な処理
人工ニッチ内の細胞に、分子生物学的手段を適用しても良い。これは、複数の利点を有する。細胞は、既知の状態であり、定められた環境にある。細胞培養装置は、細胞に生命維持を提供することにより、細胞用の「手術室」を提供し、これにより細胞が外傷性処理に耐え、細胞が所定の位置に保持され、微量注入または電気せん孔法等の処理の緻密な制御が可能となる。培養装置は、単一のニッチまたは複数のニッチを有しても良い。
【０１１８】
本発明の一例としての細胞培養機器または装置を用いて、明確化された適切な微環境の個々の細胞について、単一細胞分子の生物学的、化学的解析または他の操作が行われる。
【０１１９】
図10および11には、ニッチチャンバ室を定形する培養装置100を示す。ニッチチャンバ室は、予め定形された形状および寸法を有し、少なくとも一次元において、1乃至3つのニッチのみが収容される。
【０１２０】
ニッチチャンバ室は、内表面101を有し、ニッチチャンバ室には、バルブ102によって調整される複数の微小流体溝103が接続される。別の溝103を用いて、異なる溶液もしくは物質をチャンバ室に供給またはチャンバ室から排出させても良く、別の溝103は、異なる寸法および形状を有しても良い。溝103は、溝104を介して隣接する細胞培養ユニットに相互接続されても良い。溝103および104によって、ベクター、免疫体、塩化カルシウム、リポフェクチンまたは他の何らかの配位子が導入され、細胞を洗浄するために媒体が流通される。補助ニッチ環境は、ハンドリング時に、細胞と接触した状態を維持する表面への異方性、生体模倣外部細胞マトリクスコーティング、好適なソースおよびシンク溶液、ならびにニッチチャンバ室の寸法および形状、によって構成される。
【０１２１】
細胞は、溶液を溝114および104に流通させたまま、バルブ112、124を有する微小流体溝113を介して設置または除去される。バルブ124は、スライダ122を有し、これは、板105と109の間に、スライド自在に取り付けられている。板105および109は、それぞれ、貫通孔（図示されていない）を有し、ニッチチャンバ室へのアクセス、および／またはニッチチャンバ室との流体の連通が可能となる。スライダ122は、板105と109の間を出入りするようにスライドすることができ、貫通孔を開閉する。スライダ122は、浮き袋110によって操作され、この浮き袋は、バルブ111によって制御される。ゲルまたはフィルタ107によって、細胞の自然な浸漬を模擬した溶液の拡散が可能となる。細胞は、ニッチチャンバ室の上部もしくは底部から、マイクロピペットで設置することにより、あるいは例えば板105および109を通過する溝を介して、導入することもできる。
【０１２２】
電気せん孔法では、電極108によって、細胞を横断する電場が構成される。電極108は、細胞の反対側に設置され、ニッチ内の細胞が電気せん孔される。通常の電気せん孔法では、細胞膜に障害が生じるため、高レベルで細胞が死滅する。前述の方法で制御された人工ニッチでは、細胞は、全てその側に支持することができる。この方法を使用することにより、制御されたコピー数で細胞の増殖を行うことができる。単一のベクターは、単一細胞の極近傍に設置され、これは、バルク溶液中で、これらの2つが相互に結びつく機会に頼る方法とは異なるからである。
【０１２３】
ピストン120が提供され、設置され、これがチャンバ室内でスライドすることにより、例えば浮き袋117の圧力下において、チャンバ室の容積が変化する。浮き袋117の膨張収縮は、溝115とバルブ106によって制御される。
【０１２４】
装置100のニッチチャンバ室の容積は、膨張式浮き袋以外の他の作動装置によって変化させても良いことは明らかである。例えば、ピストン120は、他の既知の作動機構によって作動される。例えばピストンは、スクリュー、レバー、クランプ、マイクロメータ、圧電性結晶等の巨視的な手段によって、上下に移動可能な板に設置されても良い。
【０１２５】
例えば、膨張式浮き袋117によって、ピストン120でチャンバ室内の細胞を圧縮して破裂させ、ある場合には、同じモノリシック装置100の他の位置で、例えば細胞の内容物を溝114を用いてサンプリングして、これをマイクロキャピラリ電気泳動法、RT−PCR、または他の方法によって解析する。培養細胞は、圧縮され、または細胞を破裂させる他の処理にさらされ、細胞の内容物が、微小流体溝を介して、マイクロキャピラリ電気泳動装置、単一細胞mRNA抽出装置、HPLC−質量分析装置、および他の解析手段等の解析装置に輸送される。
【０１２６】
また培養細胞を相互に圧縮して、細胞融合させても良い。細胞融合は、例えば、ハイブリドーマを生成する場合に好ましい。膨張式浮き袋117により、2つの細胞を相互に圧縮させるとともに、ピストン120で可動式ニッチ隔壁を圧縮して、許容容積を減少させる。ポリエチレングリコール等の融合用化学物質、または高塩濃度溶液等の細胞破裂用の化学物質を、溝を介して添加しても良い。
【０１２７】
培養装置100は、本発明の他の実施例のような単一の機器内の他の装置と一体化形成されても良い。例えば、図12Aおよび12Bに示すように、装置100の組立体126が提供される。別の実施例では、組立体は、1または2以上の本願の他の実施例を含む。装置100のようなユニット装置が、両者の間に、スペーサを用いてあるいは用いずに、ガスおよび／または媒体の層を用いてあるいは用いずに、相互に積層される。図のように、各ユニット装置は、略板状であり、ユニットは、平行に積層されても良い。個々の培養ユニットは、2Ｄおよび3Ｄ配列で配置されても良い。隣接する装置のスロットおよびグルーブまたは他の交差形状を用いて、装置が整列されても良い。溝104および電気接続部119は、隣接する装置の対応物と接続される。
【０１２８】
微小流体溝の開口は、培養細胞と接触し、細胞のパッチクランプ法によってイオンチャンネル機能を検出することが可能となる。
【０１２９】
微小流体溝によって、ニッチ成分がサンプリングされ、マイクロキャピラリ電気泳動装置、ガスクロマト装置、高圧流体クロマト装置、質量分析装置、または他の測定装置等の、そのような解析を実行する装置に供給される。
【０１３０】
2以上のニッチチャンバ室と接続された流体溝104内の流体は、サンプリングされ、高特性液体クロマトグラフィー（HPLC）質量分析装置、マイクロキャピラリ電気泳動装置、または他の解析手段によって解析される。
（iii）3Ｄ組織
既存の人工臓器の問題は、これらの微細構造が不十分なことである。例えば、既存の人工臓器には、毛包および汗腺がなく、従って快適性がなく、不自然である。
【０１３１】
図13には、本発明の一実施例として、細胞を三次元（3Ｄ）のパターンに集合化させる手順を示す。複数の人工ニッチ131が、二次元（2Ｄ）層132に形成される。そのような層132のいくつかは、形成され、培養されても良い。各層132は、異なる細胞種を培養する異なるニッチ131を有し、非培養細胞の自然な2Ｄパターンで配置される。異なる層132において培養される細胞は、異なる細胞種またはパターンを有しても良く、個別に成長する。層132は、相互に積層され、人工皮膚137が形成され、この人工皮膚は、自然の皮膚においてみられるものと同じ3Ｄパターンを有する。
【０１３２】
一実施例では、いくつかのパターン層132内の細胞は、独立して成長し、各層132は、対象組織種の細胞の層に対応する。細胞用のニッチのパターンは、皮膚の単一細胞厚さまたは数細胞厚さにおいて見られる細胞種のパターンに対応するように構成される。細胞の各層は、上部障壁133と底部障壁134の間に拘束された状態で培養される。上部および底部障壁133および134は、天然の組織内の障壁の上部および底部の細胞の層によって、自然の細胞が通常さらされるものと同様のニッチ成分を、細胞に提供する。上部および底部障壁133および134は、ニッチ境界を形成するように、層内で水平に相互接続されても良い。
【０１３３】
人工皮膚組織137を形成するため、皮下組織層に対応する基底層132Aが、最初に選定される。障壁133Aを除去して、細胞をニッチ131に暴露することも可能である。上部障壁133Aが除去された場合、ニッチ131が露出されるが、依然として、底部からニッチが供給されることは明らかである。次に、例えば真皮層に対応する層132Bが、層132Aの上部に設置される。層132B用の底部障壁134Bは、設置される細胞が最小となるように、例えば、細胞の一方の側への簡単な外部細胞マトリクス（ECM）プロテアーゼの導入によって処理される。層132Bを覆う上部障壁（図示されていない）の除去後に、層132Bは、微小流体溝（図示されていない）を介して、各細胞の下側を圧縮することにより、底部障壁134Bから放出される。別の層132を加えるため、底部障壁134Bが除去される。この工程が繰り返され、追加の層が設置される。積層された層132は、外科手術おいて通常使用されるような生物学的接着剤によって、相互に接着される。この一連の層の設置および接着工程は、積層層によって、自然の皮膚組織の3Ｄ組織体に似た人工皮膚組織137が形成されるまで繰り返される。血管および毛包等の自然の組織が垂直に通る構造は、層が整列され積層され、組織137内の細胞が相互に密着し、構造を形成するまで、別の層132内に徐々に成長する。
【０１３４】
血管上皮細胞の島が培養され、血管形成および主要血管システムとの一体化が容易となる。従って血管は、速やかに形成され、集合組織137への供給が始まる。隣接する層を横断する血管は、一連の層に整列して内皮組織のリングが成長することによって形成される。また神経が、パターン化される。本体部が層内に延伸する軸索を有する層の端部の周囲に設置されたニューロンによって、臓器合成後の神経分布の必要性がなくなる。現在の組織エンジニアリング技術では再生できない毛包のような微細構造物は、この方法で再生しても良い。
【０１３５】
ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸のような生体分解性高分子の層、または適当な孔を有するコラーゲンシーツのような細胞外マトリクス材料の層は、層を結束して積層する前に、外科手術用の接着剤で層132の上部に設置され、接着される。
【０１３６】
いくつかのニッチは、上部障壁133が除去された際に上部が開いた溝を介して、細胞外マトリクス材料によって、これらの細胞が隣接するニッチに接続されるように設計される。
（iv）体外受精
体外受精に最適化された状態の人工ニッチ内で、卵子を成長させることができる。マイクロピペットの先端をニッチに挿入して、卵子を微量注入する。ニッチは、卵子の分裂に適応するため膨張しても良い。
（v）細胞の長期間保管（セルバンク）
現在、後の使用のため細胞を保管する最も一般的な方法は、細胞を冷凍させることである。冷凍法の問題は、細胞が自然に反する環境にさらされることであり、これは、死亡率の増大等の好ましくない影響を引き起こし得る。
【０１３７】
個々に制御された人工ニッチ内で培養された細胞は、長期間特定の状態に維持することができる。細胞の代謝作用は、例えば、これらを凍結点以上の低温に保持することにより、遅くすることができる。細胞は、遮蔽によって宇宙線から保護しても良い。人工ニッチを区画する表面は、（幹細胞または前駆細胞等の）細胞を非差別化状態に保持するように選定される。例えば、差別化は、障壁に細胞が吸着することを防止することによって、抑制されまたは制御される。
（vi）細胞−派生生成物の製作
組み換えタンパクまたは他の生物分子の製作に使用される従来の生物反応器では、細胞にとって有害で、製品収率が低下するような悪条件が存在することは当業者には明らかである。通常の有害条件には、アンモニア、乳酸塩またはエタノールの蓄積；酸素不足または過剰；グルタミン、グルコースもしくは成長因子の欠如；低もしくは高pHまたは温度；他の因子；が含まれる。
【０１３８】
有害条件が検出されると、個々に制御される人工ニッチは、即座に改善される。従って、本発明の実施例の適用は、健康な細胞を製作することを容易にし、生産収率および／または品質が向上する。
【０１３９】
また従来の細胞培養では、媒体および細胞は、しばしば培養チャンバ室内の局部的な濃度を低下させるため撹拌される。撹拌は、細胞に有害なレベルの剪断力を生じさせる。制御された人工ニッチでは、培養媒体が細胞に栄養を与えるため、媒体または細胞の撹拌を行わないでも濃度勾配が制御され、撹拌によって生じる有害な剪断力が回避される。
【０１４０】
また、ニッチの基本条件（すなわち有害条件が存在しないときの細胞の条件）を制御して、従来のバルク培養よりもさらに高い生産収率を得ることができる。
【０１４１】
バルク培養装置の1または2以上のニッチは、個々に制御されモニターされる。制御されたニッチで培養された細胞は、常時高倍率でおよび／またはバイオセンサで観察することができる。そのような場合、これらの細胞を用いて、全体としてのバルク培養条件がモニターされる。
【０１４２】
さらに、標準的な撹拌容器生物反応器内に、ニッチ依存型細胞の培養のための小さな粒子に、最適化された細胞スケールのニッチを配列することができる。
（vii）「チップ上の有機体」
本発明の実施例を使用して、相互支持細胞型のシステムを製作することができる。個々に制御された異なる細胞種の人工ニッチの組立体は、臓器機能を果たすサブネットワークに接続され、これらのサブネットワークは、有機体の臓器システムとしての機能を果たす大きなネットワークに接続される。例えば、単一の装置が、腎臓に見られる異なる細胞種のニッチと、肝臓に見られる異なる細胞種のニッチと、体の臓器の全てを制御しても良い。
【０１４３】
異なる有機体の組織からの細胞のニッチは、有機体を模擬した循環系ネットワークを介して、相互に化学的に接続される。ニッチのシステムは、有機体の機能および生理機能を再生する。
【０１４４】
一例として、装置140を図14Aおよび14Bに示す。この装置は、単一のネットワークを有する。ネットワークは、図14Aおよび14Bに示すものとは異なる接続形態を有しても良いことは明らかである。装置140は、ポンプ142、バルブ144および流体連通溝146を有し、この溝は、ニッチチャンバ室14内の化学的な連通を可能にする。自然の有機体の消化器系および循環系は、装置140内で再生され、装置140内で培養される細胞には、食物等のより複雑な培養物質を供給することができる。
（viii）ニッチ最適化巻き付け装着
1または2以上の人口ニッチは、細胞の天然の層または天然の組織の層に直接接続されても良い。例えば、ニッチの層が患者の治療部分に隣接して、これに接するように設置され、患者の天然の組織が、層内のニッチの上部境界を形成するときまで、ニッチの層は、各ニッチの上部が開いた状態で、細胞培養装置内に形成される。
【０１４５】
歯に歯肉を再成長させるような特定の例では、裸の歯質またはエナメルは、ニッチ内の細胞が歯質に向かって露出したニッチ巻き付け装着部によって被覆されて両者が付着するとともに、既存の歯肉と面する巻き付け装着部の端部で、細胞が、表面層を除去することによって露出した歯肉中の細胞に露出される。ニッチ内の細胞は、歯質および他の細胞に吸着し、これらは、ニッチチャンバ室によって区画された全ての側面に、栄養物、機械的支持、成長因子の勾配、および他のニッチ成分を供給する。ニッチチャンバ室には、管およびバルブが接続され、細胞は、既存の組織からニッチの方に移動することができる。この特定の例は、図15に示されており、この図には、組織の再生成を支持するように設計された、巻き付け装着部150が示されている。歯151は、その歯肉153に根付く。歯肉153は、歯質152の露出を抑制する。装着部150は、一方の側が開放された多くのニッチチャンバ室154を定形する。開放された側は、歯質152に貼り合わされ、ニッチチャンバ室154内の細胞（図示されていない）は、長期にわたって歯質152に吸着する。細胞には、電源157からのエネルギーを用いて、微小流体ポンプ156によって加圧される媒体リザーバ155から、溝159を介して栄養物が供給される。装着部は、PDMSのような可撓性材料で構成されても良く、これにより、歯質152の表面、歯肉153およびエナメル158に適合される。
（ix）可変形状
ニッチチャンバ室の形状、さらには人工ニッチの形状は、例えば分化の成長段階のような、培養中の細胞の形状変化に適応するため、制御されても良い。
【０１４６】
図16Aおよび16Bには、ニッチチャンバ室161の一例を示す。このニッチチャンバ室は、分化のような神経前駆細胞の成長軸索に適応するように、形状が変化する。ニッチチャンバ室161は、管腔164を有するプランジャー163を収容するチューブ162に接続される。
【０１４７】
作動時には、ニッチチャンバ室161は、円形ニューロン前駆体でシールされる。軸索の成長円錐を引き寄せる分子は、プランジャー163の管腔164を介して、チャンバ室161に供給される。ニューロンの軸索は、プランジャー先端の方に向かって移動するため、この先端は、チューブ162に引き入れられる。チューブ162は、必要であればメートル単位の長さであっても良い。シュワン細胞のような細胞のニッチは、軸索を有髄化するため、チューブ162に並列させることができる。軸索が成長すると、ニッチチャンバ室161の上部が除去され、軸索が捕獲される。ニッチチャンバ室のコーナー部のパッチクランプから解放された分子は、ニューロンを刺激するシナプスの存在を模擬する。
【０１４８】
また人工ニッチは、半径方向の膨張を制御しても良い。これは、例えば、ゲルまたは固体でニッチを取り囲むことにより可能となり、このゲルまたは固体は、細胞を成長させ分裂させるため、圧縮され、破裂する。
【０１４９】
例えば、将来卵子となる成長卵胞に適応するように製作された培養装置において、ニッチチャンバ室の寸法は、成長卵胞のみに適応するため、約10ミクロン径から、100ミクロンを超える径に増大させる必要があり、卵胞を取り囲む粒状細胞、さらには排卵前の卵子に隣接する液体充填洞を含む場合には、より大きくする必要がある。
【０１５０】
一例として、膨張可能なニッチチャンバ室を有する細胞培養装置は、図17A、17Bおよび18に示されている。細胞培養装置170は、ゲル172を受ける囲いを有し、この囲いは、ニッチチャンバ室172を定形する。ゲル171は、境界線177に沿って相互に圧縮された2つの半球171Aおよび171Bを有する。ゲル171は、溝178を介して、プランジャー（図示されていない）によって装置170に設置される。装置170の溝175と176に接続され、ゲル171が通る溝173、174は、ニッチチャンバ室172への、およびニッチチャンバ室172からの液体供給および排出用の経路を供給する。タブ179は、ゲル171と接するように提供され、溝173乃至176を適当な配列に維持する。
【０１５１】
作動時には、マイクロピペットおよび装置170外部のマイクロ設置器によって、一次卵胞が、粒状細胞の単一の層とともにニッチチャンバ室172に設置される。ゲル171は、自然の粒状細胞が、卵巣内で露出される間質細胞を模擬したパターンの生物分子で構成される。ゲルの外側が開放された追加の溝（図示されていない）が、ゲル全体に溶液を拡散させることにより、この機能を補完することもできる。2つの1／2ゲル171Aおよび171Bは、設置された卵胞を取り囲むゲル171を形成するため相互に合わされ、ゲル171は、プランジャーを用いて、溝178を介して装置170に導入される。培養流体は、それが骨髄内の血液供給に対応する位置にあるため、卵巣内で露出された自然の成長卵胞に供給される栄養物および成長因子の分極勾配を模擬した方法で、ニッチに供給される。卵胞および粒状細胞が成長すると、これらは、ゲル171を押し出し、図18に示すように、ニッチチャンバ室180が拡張される。これは、卵巣内の間質細胞を押し出す細胞のため、自然の卵巣において生じる膨張を模擬している。膨張細胞の空間を作るため、ゲル171は、圧縮性材料で構成されても良く、これは、細胞からの圧力によって圧縮される。あるいは、ゲル171は、可消化または可消費材料で構成されても良く、これは、部分的に消化され、または消費される。例えば、アルギン酸塩またはコラーゲンのゲルは、それぞれ、アルギナーゼまたはコラギナーゼによって消化される。破損生成物を潅流によって流出させても良い。
（x）系統情報科学の研究
系統情報科学の研究は、図19Aおよび19Bに示す拘束細胞培養装置を用いて、実施した。
【０１５２】
この装置の培養チャンバ室は、22×50mmのカバースリップ（底部板として）と、1.3×8×1mmの顕微鏡スライド（上部板として）を使用して構成した。顕微鏡スライドの端部をカバースリップと接着させ、これらを小さなクランプを用いて相互に固定した。使用接着剤は、医療用のタイプAシリコーン接着剤（ダウコーニング（登録商標））である。接着剤は、細胞にさらす前に、72時間かけて硬化させた。接着剤を乾燥させた後、クランプを取り除き、図19Aに示すように、チャンバ室の周囲にガラス管を接着し、媒体リザーバとしてのウェルを形成した。汚染を防ぎ、結像中の光散乱を最小限に抑えるため、カバースリップの上部と丁度寸法が合う蓋を用いることが有益である。
【０１５３】
細胞は以下のように調整され培養される。
【０１５４】
大人の雄のCD1マウス（25-30g、チャールズリバー、カナダ、ケベック）を頚部脱臼により殺傷し、トロペッペ（V. Tropepe）らの、「前脳副上衣内のニューラル前駆細胞増殖の抑制を示す、成長因子−αゼロおよび老年マウスの変換」、ジャーナルオブニューロサイエンス、17巻、p7850-7859（Tropepe 97）、1997年に示されている方法で、ニューラル幹細胞を隔離した。本文献は、本願の参照文献として取り入れられている。簡単に言えば、脳を切除し、これを1.3MgCl2、26NaHCO3、10D-グルコース、124NaCl、5KCl、および2CaCl2（全てmM単位）を含む、酸素処理人工中枢神経系流体容器内に設置した。側脳室上衣を解剖して、37℃の酵素溶液（1.33mg／mlのトリプシン（シグマ）、0.67mg／mlのヒアルロニダーゼ（シグマ）、および0.2mg／mlのキヌレン酸（シグマ））中に30分間、設置した。組織は、0.7mg／mlのトリプシンインヒビター（Roche（登録商標））を含み血清を含まない媒体中に輸送し、これを1500rpmで5分間、遠心分離した。浮遊物を除去し、20ng／mlの表皮成長因子（EGF、マウス下顎、シグマ（登録商標））と、10ng／mlの線繊芽細胞成長因子（FGF2、ヒューマンリコンビナント、シグマ）と、2μg／mlのヘパリン（シグマ）とを含み、血清を含まない媒体からなる完全媒体（CM）で置換した。ペレットは、無菌火気研磨パスツレラピペットを用いて粉末にし、再度1500rpmで5分間、遠心分離した。次にペレットを、CM中に再度懸濁させ、20セル／μl未満のクローン密度で細胞を培養した。
【０１５５】
一次ニューロスフィアの生成後、培養物は、V. Tropepeら、「EGFおよびFGFに対する、成長マウス端脳におけるニューラル幹細胞増殖」、Developmental Biology、208巻、p168-88（Tropepe 99）、1999年に示されている方法で、5乃至7日毎にバルク通過させた。本文献は、本願の参照文献として取り入れられている。簡単に言えば、ニューロスフィアは、収集され、1500rpｍで5分間遠心分離され、CMに再懸濁され、火気研磨ピペットを用いて単一細胞のサスペンションに倍散され、CM内に設置される。細胞は、組織培養フラスコ（Nunc（登録商標）、イリノイ州、ネーパービル）内に、一定のクローン密度で設置される。
【０１５６】
平均径が5.8μmのポリスチレンミクロスフィア（ポリサイエンス（登録商標））は、ナノピュア水（登録商標）で3回洗浄され、空気乾燥される。ミクロスフィアは、UVランプの下で殺菌され、CMに再懸濁される。ニューロスフィアは、シリコン製ピペット先端に10μL採取され、殺菌カバースリップガラスに混濁されるまで、5乃至15倍に倍散される。次に細胞サスペンションは、40μmの殺菌ナイロン篩（ベクトンジキンソン（登録商標））を用いてフィルタ処理される。濾過液の細胞密度は、106セル／mLに調整される。ミクロスフィアは、3×106ミクロスフィア／mLの密度で添加される。上部板は、ゴム引きのピンセットで持ち上げられ、2μLの細胞／マイクロスフィアサスペンションが、チャンバ室端部に設置され、サスペンションが毛細管力で間隙に流入することが可能となる。次に上部板が、数秒以上の時間をかけてゆっくりと降ろされる。上部板が降ろされた際に放出される余分な細胞サスペンションは、上部および底部板の間の間隙の開口からピペットで吸い取られる。その後、ウェルに1mLの新鮮なCMが充填され、細胞が成長する。
【０１５７】
固定後に、培養チャンバ室内の拘束された培養空間への試薬の輸送が促進されるように、120rpmで攪拌器が撹拌し、洗浄と培養が実施される。細胞は、洗浄され、4％のパラホルムアルデヒドで15分間固定され、0.3％のトリトンX-100で5分間、透過処理され、10％ヤギ血清中で、1時間固定される。細胞は、ウサギ抗−GFAP（ケミコン（登録商標））、マウス抗−β−チュブリンIII  IgG（シグマ）、マウス抗−O4 IgM（ケミコン（登録商標））、マウス抗−ネスチン IgG、またはマウス抗−S100  IgGで、1時間培養される。一次免疫体を染みこませた後、細胞を2時間洗浄し、その後、適切な二次免疫体：AMCA−結合ヤギ抗−ウサギIgG、フルオロセイン結合のヤギ抗−マウスIgM、およびロンダミン−結合ヤギ抗−マウスIgG（Jackson Immunoresearch（登録商標））、で30分間培養した。細胞は、室温のローダミン−結合ファロイジン（Molecular Probes（登録商標））で、30分間培養した。
【０１５８】
培養細胞は、DIC光学装置を用いて、反転顕微鏡（Zeiss、Axiovert200（登録商標））で画像化した。細胞培養チャンバ室は、37℃で5％CO2湿潤空気環境に維持された。サンプルは、画像取得の間、3分毎に照射し、それ以外のときは暗い状態に保持した。画像は、デジタルカメラ（ソニー（登録商標））でキャプチャーした。まず細胞は、単一の細胞が分裂することが確認されるまで、低倍率（5×）で画像化され、その後のコロニーの発達は、40倍の倍率で画像化した。
【０１５９】
系統情報科学情報は、以下のように取得した。一定周期において、例えば109時間で、多数の画像フレームを取得した。画像シーケンスの各フレーム内の各細胞の位置を記憶し、実験対象の微環境、挙動、および形態の変化を記録した。速度および他の細胞またはコロニーとの近接度のような得られた値を、コンピュータおよび特殊開発ソフトウェアを用いて計算した。合体したデータセットを、多くの2Dおよび3D視野、パターン検索、クラスター解析を用いて、系統ツリーの中でクエリーし、解析した。
【０１６０】
DICまたは共焦点画像化法では、表面深さが約15μmを超えると、ニューロスフィア内での個々の細胞を確実に識別することは難しかった。この限界を克服するため、5.8μmのポリスチレンミクロスフィアによって離間された平行ガラス板の間に、解離UNCを拘束した。細胞は、チャンバ室内の単一層に幾何学的に拘束され、大まかに環状のコロニーを形成するため、成長コロニーを「ニューロディスク」と呼ぶ。この拘束された幾何学形状の培養システムは、成長コロニー内の全ての細胞の長期にわたる高解像視察を可能にする。クローン派生コロニーの完全な発達は、3分毎に撮像される画像でモニターされる。図20には、26細胞のコロニーの像を示す。これは、単一の細胞から、5日後の成長状況である。培養中に、3つの細胞が死滅し、一つの細胞が視野から移動したことが観察される。個々の細胞は、別の細胞に接していない場合、あまり移動、回転または分散していない。一方、他の細胞と接している細胞は、絶えず移動し、相互に膨張している。これは、拘束表面は、移動または分散のための十分な細胞の吸着を支援しないことを意味している。従って、この培養システムでは、有効な非密着性を提供する。ニューロスフィアの表面の細胞の移動は、低速度画像化技術を用いても観察される。
【０１６１】
細胞は、5.8μmの厚さの空間で成長が拘束されているため、細胞界面の細部が観測できる。また小胞および小胞輸送が観測され、細胞追跡が極めて容易に行える。いくつかのディスクの周囲では、時々、細胞泡（すなわち、細胞の境界に沿った小さな膜泡の形成）が観察される。
【０１６２】
単一の細胞派生ディスクの発達を追跡するため、109時間にわたってDIC像が収集される。画像は、培養細胞の系統関係を得るため解析される。例えば各一連の画像内での、細胞位置、形態、および挙動が追跡される。完全な一連の画像記録は、コロニーの系統履歴の再構築を可能にする。手動侵入位置および表現型のデータから、細胞群内の位置、最近接履歴、速度、細胞面積を含む派生特性が計算される。
【０１６３】
拘束された培養幾何形状において、紡錘体軸は、常に観察軸と垂直であり、分裂対称性の研究が容易となる。この培養装置を用いて測定することができるパラメータには、娘の相対寸法および形状、細胞の集団に対する細胞分裂の位置、紡錘軸の配向、染色体配向、ならびに細胞質およびシスター間の成分の配分が含まれる。これらの変数の各々は、シスター細胞の運命比較の系統解析の際に用いられる。
【０１６４】
本発明の実施例は、従来の培養装置および方法を超える、いくつかの利点を有することは明らかである。
【０１６５】
例えば、特定の所望の分子または細胞を、対象細胞に隣接して設置することにより、および／または特定の隣接細胞を人工ニッチから除去することにより、例えば、本発明の実施例によって提供される人工ニッチ内で、精密に制御された特性を有する単一の細胞を培養することができる。また、培養媒体中の、栄養物および酸素ガス等の濃度勾配を制御することもできる。これらは、ある細胞の配向および設置を促進するために使用される（例えば、ソース物質を植え付けるため、細胞を所望の方向に移動させても良い）。従って、装置によって提供されるニッチは、生物学的ニッチを反映する。
【０１６６】
また各種実施例において、長期間ニッチおよび単一細胞レベルの細胞成長をモニターすること、例えば、単一のセルに対して完全な成長履歴を取得しこれを記録することが可能である。従って、正確な表現型を含む成長細胞の生物学的特性について、正確な知識を得ることができる。さらに、障壁間に細胞を拘束することにより、生きた細胞の細胞成長および小細胞の細部を直接観察することができ、これには、標準的な明視野画像化装置または蛍光画像化装置等の画像化技術が用いられ、共焦点顕微鏡もしくはレーザー画像化装置は、使用されない。細胞が対物レンズの焦点面の近傍に拘束されている場合、焦点面から離れた位置に移動した細胞の像に比べて、画質が有意に向上することは明らかである。実験結果は、5μmオーダーの一次元境界内で培養された細胞の像は、細胞レベル以下の高解像度を有することを示している。また、高解像度の像は、共焦点画像化技術等の従来の高解像度画像化技術を用いる場合に必要となる高強度光に、培養細胞を露出させずに得ることができる。その結果、これらの細胞は、（1日から数週間のような）何日のもの間、細胞に明らかな悪影響（発芽性の低下または物資増殖速度の変化）を及ぼさずに、拘束され、画像化される。従って長期間、微分干渉コントラスト（DIC）法のような高解像度技術で、拘束細胞を画像化することができる。レーザー操作共焦点顕微鏡は、蛍光標識細胞と同等の解像度を提供するが、前述のように、レーザー誘起光毒症は、この技術を用いて画像化される生きた細胞の画像化期間を著しく短くする。従って、前述の実施例を用いて、培養細胞のサンプルを画像化することにより、共焦点顕微鏡を使用して同じサンプルを画像化した場合に比べて、期間を長期化することができる。また、前述の非共焦点画像化法は、共焦点画像化法またはマルチ光子画像化法およびニプコーディスク画像化法等の他の従来の高解像度法において、通常使用されるものより安価な設備を用いて実施することができる。
【０１６７】
細胞の集合体が単一の層に拘束されている場合、集合体から、特定の細胞または細胞群を除去することが容易となる。従って、得られる培養細胞数を制御することが可能となり、例えば、得られる集合体中に、ある好ましくない表現型を有する細胞が存在しないようにすることができる。
【０１６８】
これまでに示されていない本発明の他の特徴、利点および有意点は、明細書の記載および添付図面から、当業者には明らかであろう。
【０１６９】
本願に示した本発明の実施例について、多くの修正が可能であることは、当業者には明らかである。
【０１７０】
例えば、スペーサ34は、他の間隔保持部材に変更しても良い。非球状のスペーサを使用しても良い。障壁板は、これらに挟まれた格子状平坦スペーサによって分離されても良く、この場合、複数のニッチチャンバ室が定形される。
【０１７１】
また、チャンバ室26の内部に、ニッチチャンバ室30の配列を設置することも可能である。
【０１７２】
底部障壁板は、容器25を構成するベース板22と必ずしも同じである必要はない。代わりに、底部障壁板およびベース板を2つの別個の板にして、底部障壁板が、容器25に着脱可能式に設置され、両方の板がチャンバ室26から取り外し可能であっても良い。
【０１７３】
前述のように、堰のような追加の障壁部材が、カバー板と隣接して、容器に、着脱可能にまたは固定して設置され、媒体液の流束が、部分的にまたは完全に遮蔽され、培養チャンバ室内の媒体の勾配が制御され、あるいはチャンバ室に一方向の勾配が形成されても良い。
【０１７４】
また一つの媒体容器25に、培養ニッチチャンバ室30の配列を設置することも可能である。
【０１７５】
機器40の構成および作動を、培養精原細胞を例にして示したが、必要であれば、機器40を修正して、異なる細胞種に対して適当なまたは好ましい微環境を形成させても良いことは、当業者には明らかである。
【０１７６】
ニッチチャンバ室30または48の可能な寸法は、100nmから10cmの範囲である。
【０１７７】
培養チャンバ室またはニッチチャンバ室は、ある用途では圧縮しても良い。
【０１７８】
細胞培養の間、ニッチチャンバ室30または48の内表面は、動的に制御しても良く、例えば、電圧電位の印加によって撥水性もしくは親水性になる表面コーティングを用いて制御される。細胞成長または分裂の間、表面形状は、例えば、膨張性浮き袋を用いて、あるいは圧電性結晶等の作動装置を用いて壁を移動させて、変化させても良い。
【０１７９】
培養前もしくは培養時に、ニッチを制御しまたはモニターする他の特徴には、これに限定されないが、分子を細胞側にまたは細胞から拡散させる自由度；液体が流れる自由度；気体、液体分子、生物学的もしくは他の高分子、信号発生分子および他の分子の濃度；これらの分子の強度および濃度勾配；表面、他の分子および他の細胞に吸着する、そのような分子の提供；pH；形状；硬度、選択透過性、および細胞の近傍または細胞と接触する表面の化学的改質；細胞近傍物の動的動きの量；ニッチを取り囲む細胞密度；所与の細胞の近傍の細胞種；が含まれる。
【０１８０】
細胞は、遠心分離、磁性粒子の移動、または化学誘因物質による引き寄せによって、培養チャンバ室またはニッチチャンバ室に設置され、あるいはここから除去される。
【０１８１】
一時的な仕切り板を設置して、仕切り板が動かされ、あるいは壊されるまで、細胞が培養空間のある領域に移動することを防止しても良い。例えば、仕切り板が除去されるまで、細胞種が成長もしくは膨張することが可能となり、あるいは2つの細胞が接触することが回避される。仕切り板は、水圧的、機械的、電気的、化学的または他の手段で除去または壊される。
【０１８２】
固体材料、例えば特殊なコーティングがされた、スペーサに使用されるマイクロスフィアを、あるいは他の目的に用いられるマイクロスフィアを、微小流体溝、マイクロピペット、成膜、光学ピンセットまたは他の手段により、培養時に、培養空間に導入しても良い。
【０１８３】
培養チャンバ室もしくはニッチチャンバ室は、例えば放射線源を有することにより、あるいは、それらを短波長光に露光することにより、変異誘発させても良い。これは、強制評価実験を行う場合に有意である。
【０１８４】
本発明の実施例は、原核細胞および真核細胞、幹細胞、前駆細胞、末期細胞、最終分化細胞、形質転換細胞または胚細胞等の哺乳類細胞を含む、いかなる種類の細胞を培養するために利用しても良い。
【０１８５】
本発明の実施例は、培養細胞の履歴をロギングすることにより、培養細胞が（挙動、形態および環境的に）医学的使用に適しているかどうか検証するために使用しても良い。
【０１８６】
機器10および40に電極を提供して、分子または他の関心刺激の存在に応答する、ニューロンのような細胞の電気応答性を検出することも可能である。例えば、ニッチ内の細胞によって生じる電気的または蛍光応答を用いて、神経毒または他の生体活性剤を検出しても良い。
【０１８７】
本発明の実施例は、有機体に移植しても良い。そのような移植装置の使用には、主要臓器環境に応答する有益な生体分子の分泌、または血液、リンパ液もしくは他の流体のろ過が含まれる。
【０１８８】
細胞は、本発明の実施例に従って、または本発明の実施例を用いて、培養され、人工組織、臓器、細胞移植もしくは体外受精に使用されても良い。
【０１８９】
前述の記載は、本発明の実施例の可能な用途および変形例を示すための単なる一例であることは明らかである。従って、本発明は、特許請求の範囲の記載によって定められ、発明の範囲内にあるそのような変形の全てを包含することを意図するものである。
【０１９０】
本願は、「細胞培養の装置および方法」という題目の2003年12月19日に出願された米国仮出願第60／530,614号の優先権を主張するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】本発明の実施例による細胞培養機器の斜視図である。
【図２】図1の機器の部分上面図である。
【図３】図2に示す部分の正面図である。
【図４】作動時の図1の機器の部分正面図である。
【図５】図1の機器内で培養される細胞の微分干渉コントラスト（DIC）像である。
【図６】本発明の別の実施例による細胞培養機器の上部断面図である。
【図７】図6の機器の概略正面断面図である。
【図８】作動時の図6に示す機器の概略上面図である。
【図９】本発明の一実施例としての、制御システムと細胞培養解析システムの間のデータの経路を示す概略ブロック図である。
【図１０】本発明の別の実施例による、セル培養機器の概略上面図である。
【図１１】図10の機器の概略正面図である。
【図１２Ａ】複数の細胞培養機器の組立体の概略斜視図である。
【図１２Ｂ】図12Aの組立体の概略上面図である。
【図１３】本発明の一実施例による、細胞集合体の構成を示す概略図である。
【図１４Ａ】本発明の一実施例による、細胞培養機器の概略上面図である。
【図１４Ｂ】図14Aの細胞培養機器の概略正面図である。
【図１５】本発明の一実施例による、巻き付け装着部の適用を示す概略図である。
【図１６Ａ】本発明の一実施例による、細胞培養機器の概略上面図である。
【図１６Ｂ】図16Aの機器の概略正面図である。
【図１７Ａ】本発明の一実施例による、セル培養機器の概略上面図である。
【図１７Ｂ】図17Aの機器の概略正面図である。
【図１８】作動時の図17Aの機器の概略上面図である。
【図１９Ａ】実際の細胞培養装置の写真である。
【図１９Ｂ】実際の細胞培養装置の写真である。
【図２０】図19の装置内で培養された細胞のDIC像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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