(57)【要約】  本発明は、哺乳類の対象における免疫介在性もしくは免疫関連性の疾患または障害、感染症、代謝障害および癌の治療方法を提供する。本方法は、自然発生的な哺乳類の中間代謝物またはＴ細胞受容体リガンド、好ましくはグルコシルセラミドの哺乳類の対象に対する投与を含む。好ましい実施形態では、かかる哺乳類の対象はヒトである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の対象に有効量の中間代謝物を投与する工程を含む、前記対象における疾患の治療方法。
【請求項２】
哺乳類の対象に有効量のＴ細胞リガンドを投与する工程を含む、前記対象における疾患の治療方法。
【請求項３】
その結果が、前記対象の代謝特性の変化を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
その結果が、耐糖能の増大を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
その結果が、肝脂肪含量の低下を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
その結果が、サイトカイン応答の変化を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
疾患を治療するために哺乳類の対象に投与される中間代謝物の類似体または誘導体のｉｎ  ｖｉｔｒｏのスクリーニングアッセイであって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、
（ｉ）前記対象または別の対象由来の調節性、免疫調節性またはＮＫＴ細胞と；
（ｉｉ）抗原提示細胞と；
（ｉｉｉ）前記中間代謝物の類似体または誘導体と、を供給する工程と、
ｂ）前記調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞の増殖の低下を同定する工程と、を含むスクリーニングアッセイ。
【請求項８】
疾患を治療するために哺乳類の対象に投与される中間代謝物の類似体または誘導体のｉｎ  ｖｉｔｒｏのスクリーニングアッセイであって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、
ｉ）第１試験管内の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞と、ＢＳＡと；
ｉｉ）第２試験管内の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞と、前記中間代謝物の類似体もしくは誘導体と；
ｉｉｉ）第３試験管内の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞と、抗原提示細胞と、ＢＳＡと；
ｉｖ）調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞と、抗原提示細胞と、前記中間代謝物の類似体もしくは誘導体と、を供給する工程と；
ｂ）前記試験管のそれぞれにおいて調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞増殖量を判定する工程と；
ｃ）前記第４試験管において、調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞増殖の最小量を同定する工程と、を含むスクリーニングアッセイ。
【請求項９】
哺乳類の対象における疾患を治療するための方法であって、
ａ）調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞を含む細胞を前記対象または別の対象から得る工程と；
ｂ）ｉ）中間代謝物；
ｉｉ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；および
ｉｉｉ）抗原提示細胞；または
ｉｖ）上記の任意の組み合わせ、の存在下でｅｘ  ｖｉｖｏで前記細胞を処理または教育する工程と；
ｃ）前記対象に前記処理または教育を受けた細胞を再投与する工程と、を含む方法。
【請求項１０】
哺乳類の対象における疾患を治療するための方法であって、
ａ）調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞を含む細胞を前記対象または別の対象から得る工程と；
ｂ）ｉ）中間代謝物；
ｉｉ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；および
ｉｉｉ）抗原提示細胞；または
ｉｖ）上記の任意の組み合わせ、の存在下でｅｘ  ｖｉｖｏで前記細胞を処理または教育する工程と；
ｃ）前記対象に前記処理または教育を受けた細胞を再投与する工程と；
ｄ）ｉ）有効量の中間代謝物；
ｉｉ）抗原提示細胞；
ｉｉｉ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；または
ｉｖ）上記の任意の組み合わせ
を前記対象に投与する工程と、を含む方法。
【請求項１１】
哺乳類の対象における疾患の治療方法であって、
ａ）有効量の中間代謝物；
ｂ）抗原提示細胞；
ｃ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；または
ｄ）上記の任意の組み合わせ
を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項１２】
哺乳類の対象における疾患の治療のための治療用組成物であって、
ａ）中間代謝物；
ｂ）抗原提示細胞；
ｃ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；または
ｄ）上記の任意の組み合わせ、を含む治療用組成物。
【請求項１３】
前記中間代謝物が脂質または複合生体分子を含む、請求項１または３〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記中間代謝物が任意の極性脂質を含む、請求項１または３〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記複合生体分子が抗体、サイトカイン、またはホルモン以外の糖脂質、リポタンパク質、アポリポタンパク質、または糖タンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記糖脂質が単糖類セラミドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記単糖類セラミドがグルコシルセラミドまたはガラクトシルセラミドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記グルコシルセラミドがグルコセレブロシドを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記グルコシルセラミドがグルコセレブロシド類似体または誘導体を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗原が前記免疫関連性もしくは免疫介在性の障害または疾患を患うドナーから得られる同種抗原、異種抗原、同系抗原、自家抗原、非自家抗原、組換えによって調製された抗原、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項９〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗原提示細胞が樹状細胞またはＣＤ１ｄ受容体提示樹状細胞を含む、請求項７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｔ細胞受容体リガンドの類似体または誘導体のｉｎ  ｖｉｔｒｏのスクリーニングアッセイであって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、
（ｉ）前記対象もしくは別の対象由来の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞と；
（ｉｉ）抗原提示細胞と；
（ｉｖ）前記Ｔ細胞受容体リガンドの類似体または誘導体と、を供給し；
ｂ）前記調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞増殖の低下を同定することを含む、スクリーニングアッセイ。
【請求項２３】
疾患を治療するために哺乳類の対象に投与されるＴ細胞受容体リガンドの類似体もしくは誘導体のｉｎ  ｖｉｔｒｏのスクリーニングアッセイであって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、
ｉ）第１試験管内の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞およびＢＳＡと；
ｉｉ）第２試験管内の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞およびＴ細胞受容体リガンドの前記類似体もしくは誘導体と；
ｉｉｉ）第３試験管内の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞、抗原提示細胞およびＢＳＡと；
ｉｖ）調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞、抗原提示細胞および前記Ｔ細胞受容体リガンドの類似体もしくは誘導体と、を供給し；
ｂ）前記試験管のそれぞれにおいて調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞増殖量を判定し；
ｃ）前記第４試験管において調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞増殖の最小量を同定することを含む、スクリーニングアッセイ。
【請求項２４】
哺乳類の対象における疾患を治療するための方法であって、
ａ）調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞を含む細胞を前記対象もしくは別の対象から得る工程と；
ｂ）ｉ）Ｔ細胞受容体リガンド；
ｉｉ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；および
ｉｉｉ）抗原提示細胞；または
ｉｖ）上記の任意の組み合わせ、の存在下でｅｘ  ｖｉｖｏで前記細胞を処理または教育する工程と；
ｃ）前記対象に前記処理または教育を受けた細胞を再投与する工程と、を含む方法。
【請求項２５】
哺乳類の対象における疾患を治療するための方法であって、
ａ）調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞を含む細胞を前記対象または別の対象から得る工程と；
ｂ）ｉ）Ｔ細胞受容体リガンド；
ｉｉ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；および
ｉｉｉ）抗原提示細胞；または
ｉｖ）上記の任意の組み合わせ、の存在下でｅｘ  ｖｉｖｏで前記細胞を処理または教育する工程と；
ｃ）前記対象に前記処理または教育された細胞を再投与する工程と；
ｄ）ｉ）有効量のＴ細胞受容体リガンド；
ｉｉ）抗原提示細胞；
ｉｉｉ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；または
ｉｖ）上記の任意の組み合わせ、を前記対象に投与する工程と、を含む方法。
【請求項２６】
哺乳類の対象における疾患を治療するための方法であって、
ａ）有効量のＴ細胞受容体リガンド；
ｂ）抗原提示細胞；
ｃ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；または
ｄ）上記の任意の組み合わせ、を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２７】
哺乳類の対象における疾患の治療のための治療用組成物であって、
ａ）Ｔ細胞受容体リガンド；
ｂ）抗原提示細胞；
ｃ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；あるいは
ｄ）上記の任意の組み合わせ
を含む、治療用組成物。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞受容体リガンドが脂質または複合生体分子を含む、請求項２〜６または２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔ細胞受容体リガンドが任意の極性脂質を含む、請求項２〜６または２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記複合生体分子が抗体、サイトカイン、またはホルモン以外の糖脂質、リポタンパク質、アポリポタンパク質、または糖タンパク質を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記糖脂質が単糖類セラミドを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記単糖類セラミドがグルコシルセラミドまたはガラクトシルセラミドを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記グルコシルセラミドがグルコセレブロシドを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記グルコシルセラミドがグルコセレブロシド類似体または誘導体を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗原が前記免疫関連性もしくは免疫介在性の障害または疾患を患うドナーから得られる同種抗原、異種抗原、同系抗原、自家抗原、非自家抗原、組換えによって調製された抗原、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗原提示細胞が樹状細胞、またはＣＤ１ｄ受容体を提示する樹状細胞を含む、請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記投与工程が経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸もしくは皮下投与、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患がＣｏｎ−Ａ肝炎、任意のタイプのウイルス介在性もしくは免疫薬介在性の肝炎、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、または寄生虫感染症を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ウイルス感染症がＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患が大腸炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性ループス、骨粗鬆症、非アルコール性脂肪肝炎、糖尿病、耐糖能異常、肥満、代謝症候群、移植片対宿主疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、ブドウ膜炎、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、他のリウマチ性疾患、内分泌疾患、脈管炎、強皮症、クレスト、神経疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、重症筋無力症、非ＨＩＶ  ＡＩＤＳ、（全身性）ループスエリテマトーデス、若年性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、レイノー現象、混合性結合組織病、セリアック病、クレスト症候群（皮膚石灰沈着症、レイノー現象、食道機能障害、手指硬化症および毛細血管拡張）あるいは任意の他の免疫関連性もしくは免疫介在性の障害または疾患を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患が高脂血症、アテローム性動脈硬化症、原発性肺高血圧症およびすべての他のタイプの高血圧、任意のタイプの虚血性心疾患、喘息、サルコイドーシス、慢性肺疾患、アルツハイマー病、任意のタイプの神経変性疾患、脳血管疾患、または任意の他の代謝障害を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記疾患がメラノーマ、任意のタイプの腫瘍性障害、任意の腫瘍成長、悪性もしくは非悪性の、固形腫瘍、非固形腫瘍、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、または任意の他のタイプの癌を含む請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
哺乳類の対象における疾患の治療方法であって、前記対象に有効量の中間代謝物を投与する工程を含み、前記投与の結果が調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞の数または機能の変化を含む、方法。
【請求項４４】
哺乳類の対象における疾患の治療方法であって、前記対象に有効量の中間代謝物を投与する工程を含み、前記投与の結果が調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞の数または機能の減少、阻害、あるいは低下を含む、方法。
【請求項４５】
哺乳類の対象に有効量の中間代謝物を投与する工程を含む前記対象における疾患の治療方法であって、前記投与の結果が調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞の数または機能の刺激あるいは増大を含む、方法。
【請求項４６】
前記調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞が肝内ＮＫＴ細胞である請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記阻害が、前記ＣＤ１ｄ分子からの活性化因子の競合置換を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記刺激が、前記ＣＤ１ｄ分子からの活性化因子の増強された結合を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記結果が、サイトカイン応答における変化をさらに含む、請求項４３、４４または４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ１０、またはＩＬ１２を含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記サイトカイン応答が、前炎症性、抗炎症性または前炎症性および抗炎症性応答の両方を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記結果が、前記対象の免疫系におけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスの変化をさらに含む、請求項４３、４４または４５に記載の方法。
【請求項５３】
哺乳類の対象に有効量の中間代謝物および抗原提示細胞を投与する工程を含む前記対象における疾患の治療方法であって、前記投与の結果が調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞増殖における低下を含む、方法。
【請求項５４】
哺乳類の対象に有効量の中間代謝物および抗原提示細胞を投与する工程を含む前記対象における疾患の治療方法であって、前記投与の結果が調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞増殖の増大を含む、方法。
【請求項５５】
調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞における変化をもたらす疾患を治療するために哺乳類の対象に投与される中間代謝物の類似体もしくは誘導体に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるスクリーニングアッセイであって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、
（ｉ）前記対象または別の対象由来の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞と；
（ｉｉ）抗原提示細胞と；
（ｉｉｉ）前記中間代謝物の類似体もしくは誘導体と、を提供し；
ｂ）前記調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞増殖における低下を同定することを含む、スクリーニングアッセイ。
【請求項５６】
調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞における変化をもたらす疾患を治療するために哺乳類の対象に投与される中間代謝物の類似体もしくは誘導体に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるスクリーニングアッセイであって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、
ｉ）第１試験管内の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞およびＢＳＡと；
ｉｉ）第２試験管内の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞および中間代謝物の前記類似体もしくは誘導体と；
ｉｉｉ）第３試験管内の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞、抗原提示細胞およびＢＳＡと；
ｉｖ）調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞、抗原提示細胞および前記中間代謝物の類似体もしくは誘導体と、を提供し；
ｂ）前記試験管のそれぞれにおいて調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞の増殖量を判定し；
ｃ）前記第４試験管において調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞増殖の最小量を同定することを含む、スクリーニングアッセイ。
【請求項５７】
哺乳類の対象における疾患を治療するための方法であって、
ａ）調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞を含む細胞を前記対象もしくは別の対象から得る工程と；
ｂ）ｉ）中間代謝物；
ｉｉ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；および
ｉｉｉ）抗原提示細胞；または
ｉｖ）上記の任意の組み合わせ
の存在下でｅｘ  ｖｉｖｏにおいて前記細胞を処理または教育する工程と；
ｃ）前記対象に前記処理または教育された細胞を再投与する工程と、を含み、前記投与の結果が前記細胞の数における変化を含む、方法。
【請求項５８】
哺乳類の対象における疾患を治療するための方法であって、
ａ）調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞を含む細胞を前記対象もしくは別の対象から得る工程と；
ｂ）ｉ）中間代謝物；
ｉｉ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；および
ｉｉｉ）抗原提示細胞；または
ｉｖ）上記の任意の組み合わせ
の存在下でｅｘ  ｖｉｖｏにおいて前記細胞を処理または教育する工程と；
ｃ）前記対象に前記処理または教育された細胞を再投与する工程と；
ｄ）ｉ）有効量のＴ細胞受容体リガンド；
ｉｉ）抗原提示細胞；
ｉｉｉ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；あるいは
ｉｖ）上記の任意の組み合わせ
を前記対象に投与する工程と、を含み、
ｅ）前記投与の結果が調節性細胞、免疫調節性細胞もしくはＮＫＴ細胞の数における変化を含む、方法。
【請求項５９】
哺乳類の対象における疾患の治療方法であって、
ａ）有効量の中間代謝物；
ｂ）抗原提示細胞；
ｃ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；あるいは
ｄ）上記の任意の組み合わせ
を前記対象に投与する工程を含み、
ｅ）前記投与の結果が調節性細胞、免疫調節性細胞もしくはＮＫＴ細胞の数における変化を含む、方法。
【請求項６０】
哺乳類の対象の免疫系において少なくとも１つの成分を調節するかまたは変化させるように前記対象に有効量の中間代謝物を投与する工程を含む、前記対象における疾患を治療するための方法。
【請求項６１】
哺乳類の対象における疾患の治療のための治療用組成物であって、
ａ）中間代謝物と；
ｂ）抗原提示細胞と；
ｃ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ；または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープと；
ｄ）上記の任意の組み合わせと、を含む前記組成物の投与が調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞の数における変化をもたらす、治療用組成物。
【請求項６２】
前記結果が前記細胞の数もしくは機能における減少、阻害、または低下を含む請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記結果が前記細胞の数もしくは機能における刺激または増大を含む請求項６１に記載の組成物。
【請求項６４】
疾患を患う哺乳類の対象において調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞を操作するための組成物の製造における中間代謝物の利用。
【請求項６５】
前記操作が、前記細胞の数もしくは機能における変化を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記変化が、前記細胞の数もしくは機能における減少、阻害、または低下を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記変化が、前記細胞の数もしくは機能における刺激または増大を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記中間代謝物が、脂質または複合生体分子を含む、請求項４３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記中間代謝物が任意の極性脂質を含む、請求項４３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記複合生体分子が、抗体、サイトカイン、またはホルモン以外の糖脂質、リポタンパク質、アポリポタンパク質、または糖タンパク質を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記糖脂質が単糖類セラミドを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記単糖類セラミドがグルコシルセラミドまたはガラクトシルセラミドを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記グルコシルセラミドがグルコセレブロシドを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記グルコシルセラミドがグルコセレブロシド類似体もしくは誘導体を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗原が前記免疫関連性もしくは免疫介在性の障害または疾患を患うドナーから得られる同種抗原、異種抗原、同系抗原、自家抗原、非自家抗原、組換えによって調製された抗原、あるいはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項５７、５８、５９、６１あるいは６２に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗原提示細胞が樹状細胞またはＣＤ１受容体を提示する樹状細胞を含む、請求項５５〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記疾患がＣｏｎ−Ａ肝炎である、請求項４３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記疾患がウイルス介在性もしくは免疫薬介在性の肝炎、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、または寄生虫感染症の任意のタイプを含む請求項４３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ウイルス感染症がＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記投与工程が経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸もしくは皮下投与、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項４３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
哺乳類の対象に有効量の中間代謝物を投与する工程を含む、前記対象における免疫介在性もしくは免疫関連性の障害または疾患の治療方法であって、前記投与の結果が前記対象における調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞分布の変化を含む、方法。
【請求項８２】
哺乳類の対象に有効量の中間代謝物を投与する工程を含む、前記対象における免疫介在性もしくは免疫関連性の障害または疾患の治療方法であって、前記投与の結果が前記対象における調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞分布の変化および／または末梢／肝内のＴ細胞比における変化を含む、方法。
【請求項８３】
前記末梢／肝内のＴ細胞比における前記変化が前記比における上昇を含む請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
哺乳類の対象に有効量の中間代謝物を投与する工程を含む、前記対象における免疫介在性もしくは免疫関連性の障害または疾患の治療方法であって、前記投与の結果が前記対象における調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞分布の変化および／または肝内ＣＤ８＋Ｔ細胞捕捉における変化を含む、方法。
【請求項８５】
肝内ＣＤ８＋Ｔ細胞捕捉における前記変化が前記捕捉の増大を含む請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞が肝内または脾臓内ＮＫＴ細胞を含む請求項８１〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記結果がサイトカイン応答における変化をさらに含む請求項８１〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記サイトカインがＩＦＮγ、ＴＮＦａ、ＩＬ４、またはＩＬ１０を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記サイトカイン応答が前炎症性、抗炎症性または前炎症性および抗炎症応答の両方を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記結果が前記対象の免疫系におけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスの変化をさらに含む、請求項８１〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
哺乳類の対象に有効量の中間代謝物および／または抗原提示細胞を投与する工程を含む、前記対象における免疫介在性もしくは免疫調節性の障害または疾患の治療方法であって、前記投与の結果が調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞分布の変化を含む、方法。
【請求項９２】
哺乳類の対象に有効量の中間代謝物および／または抗原提示細胞を投与する工程を含む、前記対象における免疫介在性もしくは免疫調節性の障害または疾患の治療方法であって、前記投与の結果が調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞分布の機能の変化を含む、方法。
【請求項９３】
調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞分布の変化をもたらす疾患を治療するために哺乳類の対象に投与される中間代謝物の類似体もしくは誘導体に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるスクリーニングアッセイであって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、
（ｉ）前記対象または別の対象由来の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞と；
（ｉｉ）抗原提示細胞と；
（ｉｉｉ）前記中間代謝物の類似体もしくは誘導体と、を提供し；
ｂ）前記調節性、免疫調節性およびＮＫＴ細胞増殖における低下を同定することを含む、スクリーニングアッセイ。
【請求項９４】
調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞分布の変化をもたらす疾患を治療するために哺乳類の対象に投与される中間代謝物の類似体もしくは誘導体に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるスクリーニングアッセイであって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、
ｉ）第１試験管内の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞およびＢＳＡと；
ｉｉ）第２試験管内の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞および中間代謝物の前記類似体もしくは誘導体と；
ｉｉｉ）第３試験管内の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞、抗原提示細胞およびＢＳＡと；
ｉｖ）調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞、抗原提示細胞および前記中間代謝物の類似体もしくは誘導体と、を提供し；
ｂ）前記試験管のそれぞれにおいて調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞の増殖量を判定し；
ｃ）前記第４試験管において調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞増殖の最小量を同定することを含む、スクリーニングアッセイ。
【請求項９５】
哺乳類の対象における疾患を治療するための方法であって、
ａ）調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞を含む細胞を前記対象もしくは別の対象から得る工程と；
ｂ）ｉ）中間代謝物；
ｉｉ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；および
ｉｉｉ）抗原提示細胞；または
ｉｖ）上記の任意の組み合わせ
の存在下でｅｘ  ｖｉｖｏにおいて前記細胞を処理または教育する工程と；
ｃ）前記対象に前記処理または教育された細胞を再投与する工程と、を含み、前記投与の結果が前記細胞分布における変化を含む、方法。
【請求項９６】
哺乳類の対象における疾患を治療するための方法であって、
ａ）調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞を含む細胞を前記対象もしくは別の対象から得る工程と；
ｂ）ｉ）中間代謝物；
ｉｉ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；および
ｉｉｉ）抗原提示細胞；または
ｉｖ）上記の任意の組み合わせ
の存在下でｅｘ  ｖｉｖｏにおいて前記細胞を処理または教育する工程と；
ｃ）前記対象に前記処理または教育された細胞を再投与する工程と；
ｄ）ｉ）有効量の中間代謝物；
ｉｉ）抗原提示細胞；
ｉｉｉ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；あるいは
ｉｖ）上記の任意の組み合わせ
を前記対象に投与する工程と、を含み、
ｅ）前記投与の結果が調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞分布の変化を含む、方法。
【請求項９７】
哺乳類の対象における疾患の治療方法であって、前記対象に
ａ）有効量の中間代謝物；
ｂ）抗原提示細胞；
ｃ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ、または免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；あるいは
ｄ）上記の任意の組み合わせ
を投与する工程を含み、
ｅ）前記投与の結果が調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞分布の変化を含む、方法。
【請求項９８】
哺乳類の対象の免疫系における少なくとも１つの成分を調節するかまたは変化させるように前記対象に有効量の中間代謝物を投与する工程を含む、前記対象における疾患を治療するための方法。
【請求項９９】
哺乳類の対象における疾患の治療のための治療用組成物であって、前記組成物の投与が調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞分布の変化をもたらし、前記組成物が
ａ）中間代謝物；
ｂ）抗原提示細胞；
ｃ）前記疾患に関連する抗原もしくはエピトープ；または前記免疫介在性の炎症応答に関連する抗原もしくはエピトープ；あるいは
ｄ）上記の任意の組み合わせ
を含む、組成物。
【請求項１００】
免疫関連性もしくは免疫介在性の障害または疾患を患う哺乳類の対象における調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞の操作のための組成物の製造における中間代謝物の利用。
【請求項１０１】
前記操作が前記対象における前記細胞の分布の変化を含む請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記中間代謝物が脂質または複合生体分子を含む請求項８１〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記中間代謝物が極性脂質を含む請求項８１〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記複合生体分子が抗体、サイトカイン、またはホルモン以外の糖脂質、リポタンパク質、アポリポタンパク質、または糖タンパク質を含む請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記糖脂質が単糖類セラミドを含む請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記単糖類セラミドがグルコシルセラミドまたはガラクトシルセラミドを含む請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記グルコシルセラミドがグルコセレブロシドを含む請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記グルコシルセラミドがグルコセレブロシド類似体もしくは誘導体を含む請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記抗原が前記免疫関連性もしくは免疫介在性の障害または疾患を患うドナーから得られる同種抗原、異種抗原、同系抗原、自家抗原、非自家抗原、組換えによって調製された抗原、あるいはこれらの任意の組み合わせを含む請求項９５、９６、９７または９９に記載の方法。
【請求項１１０】
前記抗原提示細胞が樹状細胞またはＣＤ１ｄ受容体を提示する樹状細胞を含む請求項９３、９４、９５、９６、９７または９９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記免疫介在性または免疫関連性の疾患または障害が大腸炎を含む請求項８１〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記疾患が炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性ループス、骨粗鬆症、非アルコール性脂肪肝炎、糖尿病、耐糖能異常、肥満、代謝症候群、移植片対宿主疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、ブドウ膜炎、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、他のリウマチ性疾患、内分泌疾患、脈管炎、強皮症、クレスト、神経疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、重症筋無力症、非ＨＩＶ  ＡＩＤＳ、（全身性）ループスエリテマトーデス、若年性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、レイノー現象、混合性結合組織病、セリアック病、クレスト症候群（皮膚石灰沈着症、レイノー現象、食道機能障害、手指硬化症および毛細血管拡張）あるいは任意の他の免疫関連性もしくは免疫介在性の障害または疾患を含む請求項８１〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記投与工程が経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸もしくは皮下投与、またはこれらの任意の組み合わせを含む請求項８１〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願に対する参照
本願明細書は「中間代謝物レベルの操作による免疫応答の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  Ｌｅｖｅｌｓ）」という名称のもとで、２００３年２月２７日付けで出願された米国特許出願第１０／３７５９０６号明細書の一部継続出願である。当該特許出願の内容は、参照により本明細書に全体にわたって援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、哺乳類の対象における免疫介在性もしくは免疫関連性の疾患または障害、感染症、代謝障害および癌の処理における自然発生的な哺乳類の中間代謝物またはＴ細胞受容体リガンド、好ましくはグルコセレブロシドの利用に関する。
【０００３】
本発明に関連する最先端技術をより十分に記載するため、すべての特許、特許出願、特許公報、科学論文などが参照により本明細書に全体にわたって援用される。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
哺乳類の対象における免疫関連性もしくは免疫介在性の障害または疾患、感染症、代謝障害および種々のタイプの癌の処理において様々な方法が説明されている。これらの方法の１つは、対象における免疫応答の調節に関与する。これは選択的免疫ダウンレギュレーション（ＳＩＤＲ）と称される、新しく想定外の免疫調節をもたらしかつ適用するための手順または手順の組み合わせを用いた免疫応答系のダウンレギュレーションを含む。免疫学的な調節とは、試薬、手順および方法の導入に応答する対象の免疫系において人為的に誘発された変異である。これらの手順は、１９９７年２月２８日付けで出願された米国特許出願第０８／８０８６２９号明細書、２００３年３月４日付けで出願された米国特許出願第１０／３７７６２８号明細書、２００３年３月４日付けで出願された米国特許出願第１０／３７７６０３号明細書、１９９７年２月２８日付けで出願された米国特許出願第０９／４４７７０４号明細書、２００１年５月９日付けで出願された米国特許出願第１０／３８５４４０号明細書、ならびに１９９９年７月１６日付けで出願された米国特許出願第０９／３５６２９４号明細書において詳細に説明されている。上記特許のそれぞれは、本特許出願において参照により全体にわたって援用され、さらに本発明と関連して利用されうる。
【０００５】
他の方法は、種々の疾患の治療において教育または処理された細胞の利用法を説明する。具体的には、同方法は抗炎症性もしくは前炎症性サイトカイン産生細胞に対してＴｈ１／Ｔｈ２バランスの調節をもたらす、対象におけるＮＫＴ細胞集団の操作を意図している。これらの発明の詳細な記載は、２００３年６月２５日付けで出願されたヤロン  イアン（Ｙａｒｏｎ  ｌｌａｎ）らによる「教育されたＮＫＴ細胞および免疫関連性障害の処理におけるそれらの利用（Ｅｄｕｃａｔｅｄ  ＮＫＴ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」という名称の米国特許出願（出願番号はまだ割り当てられていない）、２００１年１２月２４日付けで出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＬ０１／０１１９７号明細書、および２００３年２月２７日付けで出願された米国特許出願第１０／３７５９０６号明細書において開示されている。上記特許のそれぞれは、本特許出願において参照により全体にわたって援用され、さらに本発明と関連して利用されうる。
【０００６】
本発明は、哺乳類の対象、および好ましくはヒト対象における免疫関連性もしくは免疫介在性の障害または疾患、感染症、代謝障害および種々のタイプの癌の処理のための新たな方法を提供する。この方法は、中間代謝物またはＴ細胞受容体リガンドの対象に対する投与に関与する。本明細書において開示される他の方法は、本明細書において参照によって援用される先行する特許出願において記載される他の手順とともにこの投与工程を利用する。これらの方法は、さらに下記に詳細に説明される。
【０００７】
中間代謝物またはＴ細胞受容体リガンドは、疾患の治療のために本発明において用いられる。中間代謝物またはＴ細胞受容体リガンドは、脂質または複合生体分子（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む場合がある。ここで複合生体分子は、抗体、サイトカイン、またはホルモン以外の糖脂質、リポタンパク質、アポリポタンパク質、または糖タンパク質を順に含む場合がある。糖脂質は単糖類セラミドを含む場合がある。単糖類セラミドは、グルコシルセラミドまたはガラクトシルセラミドを含む場合がある。
【０００８】
グルコシルセラミドは、グルコースが付着するセラミドからなる自然発生的な糖脂質である。スフィンゴシンおよび脂肪酸であるセラミドは、すべてのスフィンゴ脂質に共通の構造単位である。スフィンゴ脂質は種々の細胞機能を有する。これらは膜構造的役割および細胞シグナル伝達への関与を含む（スラード（Ｓｕｌｌａｒｄ）ら、２０００  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ３５：３４７−３５３頁）。グルコシルセラミドは、２つの分子に共に付着する酵素グルコシルセラミドシンターゼによって生成される（図１および図２参照）。グルコシルセラミドの例として、グルコセレブロシド、またはグルコセレブロシド類似体もしくは誘導体が挙げられる。
【０００９】
遺伝的疾患であるゴーシェ病は、グルコシルセラミドの蓄積によって特徴づけられる。適切な酵素療法によるこの障害の処理において、余分のグルコシルセラミドが分解される。この処理では２つの副作用が注目されている。この処理の過程において、Ｃ型肝炎ウイルス感染症に付随する慢性活動性肝炎が悪化した。さらに、特定の患者（前糖尿病状態を有する）がＩＩ型糖尿病の発症を示唆する糖尿病状態の発生を経験した。これらの観察により、ヒト対象においてグルコシルセラミドの濃度が免疫介在性もしくは免疫調節性の障害または疾患の発症を調節することがさらに直接に確認される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明は、哺乳類の対象における免疫介在性もしくは免疫関連性の疾患または障害、感染症、代謝障害および癌の処理における自然発生的な哺乳類の中間代謝物またはＴ細胞受容体リガンドの利用に関する。好ましい実施形態では、かかる哺乳類の対象はヒトである。
【００１１】
本発明は、哺乳類の対象に有効量の哺乳類の中間代謝物を投与する工程を含む、該対象における疾患を治療するための方法を提供する。
【００１２】
本発明は、哺乳類の対象に有効量のＴ細胞受容体リガンドを投与する工程を含む、該対象における疾患を治療するための方法をさらに提供する。
【００１３】
本発明は、哺乳類の対象に有効量のグルコセレブロシドを投与する工程を含む、該対象における疾患を治療するための方法をさらに提供する。
【００１４】
本発明の別の態様は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける哺乳類の対象から得られる細胞の処理または教育を含む、哺乳類の対象における疾患の治療を提供する。該細胞は、有効量の中間代謝物によって処理または教育される。次いで処理または教育された細胞は、該対象に再投与される。
【００１５】
本発明の別の態様は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける哺乳類の対象から得られる細胞の処理または教育を含む、哺乳類の対象における疾患の治療を提供する。該細胞は、有効量のＴ細胞受容体リガンドで処理または教育される。次いで処理または教育された細胞は、該対象に再投与される。
【００１６】
さらに本発明の別の態様は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける哺乳類の対象から得られる細胞の処理または教育を含む、哺乳類の対象における疾患の治療を提供する。該細胞は、有効量のグルコセレブロシドで処理または教育される。次いで処理または教育された細胞は、該対象に再投与される。
【００１７】
本発明は、処理または教育された細胞の哺乳類の対象への再投与および有効量の中間代謝物の該対象への直接投与を含む、該対象における疾患の治療にも関する。
【００１８】
本発明は、処理または教育された細胞の哺乳類の対象への再投与および有効量のＴ細胞受容体リガンドの該対象への直接投与を含む、該対象における疾患の治療を提供する。
【００１９】
本発明は、処理または教育された細胞の哺乳類の対象への再投与および有効量のグルコセレブロシドの該対象への直接投与を含む、該対象における疾患の治療にも関する。
【００２０】
本発明の極めて多数の他の態様および実施態様が下記にさらに詳細に説明される。
【００２１】
本発明は、有効量の中間代謝物の哺乳類の対象への投与によって該対象における疾患を治療するための方法を提供する。中間代謝物として、Ｔ細胞受容体リガンド、脂質、極性脂質、複合生体分子、糖脂質、リポタンパク質、アポリポタンパク質、糖タンパク質、単糖類もしくは多糖セラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミド、グルコセレブロシド、グルコセレブロシド類似体もしくは誘導体、スフィンゴシン、スフィンゴ脂質またはセラミドが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の好ましい実施形態では、哺乳類の対象はヒトである。
【００２２】
本発明は、調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞が処理される対象または別の対象から得られ、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて教育または処理されるといった疾患を治療するための方法を記載する。該細胞は、中間代謝物、抗原もしくはエピトープ、および抗原提示細胞、またはこれらの任意の組み合わせの存在によって処理または教育される。次いで処理または教育された細胞は、該対象に再投与される。該細胞は養子免疫伝達によって該対象に投与される場合がある。
【００２３】
上で説明したｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞の処理または教育に関与する方法に加えて、本発明は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける処理または教育に種々の方法、有効量の中間代謝物、抗原提示細胞、および抗原もしくはエピトープ、または上記の任意の組み合わせによって処理対象の該対象に直接投与する方法を伴う場合の方法も提供する。有効量の中間代謝物、抗原提示細胞、および抗原もしくはエピトープ、または上記の任意の組み合わせの直接投与のみによって疾患が処理される場合もある。
【００２４】
疾患の治療において使用するための治療用組成物は、有効量の中間代謝物、抗原提示細胞、および抗原もしくはエピトープ、または上記の任意の組み合わせを含む場合がある。
【００２５】
記載される方法のいずれかにおける疾患の治療により、調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞の数もしくは機能において変化がもたらされる。この変化は、細胞の数もしくは機能における減少、阻害、または低下を包含する。この阻害は、ＣＤ１ｄ分子由来の活性化因子の競合置換によって引き起こされうる。変化は細胞の数もしくは機能における刺激または増大も含む場合がある。この刺激は、ＣＤ１ｄ分子由来の活性化因子の結合の増強によって引き起こされうる。
【００２６】
疾患の治療は、サイトカイン応答の変化をもたらす場合もある。免疫系における任意のサイトカインはこれらの応答に関与しうる。同変化は、前炎症性または抗炎症性応答をもたらすことが可能である。特定のサイトカインが上昇すると同時に他のサイトカインが低下することから前炎症性および抗炎症性応答もありうる。
【００２７】
疾患の治療における別の結果は、対象における調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞分布の変化である。この変化には末梢／肝内のＴ細胞比における変化を伴う場合もある。更なる結果が肝内ＣＤ８＋Ｔ細胞捕捉における変化も含む場合がある。肝内捕捉においては増大または低下がありうる。同結果は脾臓内Ｔ細胞捕捉における変化も含む場合があり、該変化は増大または低下であることが可能である。
【００２８】
本発明では、疾患を治療するために対象に投与される中間代謝物の類似体もしくは誘導体に対する２つのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるスクリーニングアッセイも提供される。第１のアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて処理される対象または別の対象由来の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞、抗原提示細胞、および中間代謝物の類似体もしくは誘導体を提供することに関与する。調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞増殖における低下が同定される場合の特異的な類似体もしくは誘導体は、疾患に対する処理である。
【００２９】
第２のアッセイは、第１の試験管では調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞およびＢＳＡ；第２の試験管では調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞および中間代謝物の類似体もしくは誘導体；第３試験管では調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞、抗原提示細胞およびＢＳＡ；ならびに第４の試験管では調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞、抗原提示細胞および中間代謝物の類似体もしくは誘導体を提供することに関与する。最小量の調節性細胞、免疫調節性細胞またはＮＫＴ細胞増殖が第４の試験管内に認められる場合の特異的な類似体もしくは誘導体は、疾患に対する処理である。
【００３０】
本発明を実施するための方法、および得られる結果を支持しさらに説明する実験結果は以下のとおりである。
【実施例】
【００３１】
実施例
Ｉ．コンカナバリン−Ａ肝炎のグルコセレブロシド処理
材料および方法
試薬
コンカナバリンＡをウォーシングトン・バイオケミカル・コーポレーション（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国から購入した。
【００３２】
動物
５群の雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝６匹／群）を試験した。
【００３３】
血清トランスアミナーゼ測定
自動の市販キット（コダック  ＳＭＡ（Ｋｏｄａｋ  ＳＭＡ））によって血清ＡＬＴおよびＡＳＴ血漿活性を測定した。
【００３４】
肝組織学的検査
肝臓障害の程度を判定するためにすべてのマウス由来の肝臓の組織学的切片を検査した。各マウスにおいて単一の肝区域を１０％緩衝化ホルムアルデヒドで固定し、組織学的分析のためにパラフィン包埋した。切片をヘマトキシリン／エオシンで染色し、組織学的評価を行った。
【００３５】
サイトカインレベルの測定
すべての群におけるマウスから採血し、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓキット（ジェンザイム・ダイアグノスティックス（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、マサチューセッツ州）を用いて「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡによって血清ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ１０およびＩＬ−１２レベルを測定した。
【００３６】
脾臓および肝臓リンパ球の単離
上記のように脾細胞を単離し、赤血球を採取した［ビカリ、Ａ．Ｐ．（Ｖｉｃａｒｉ、Ａ．Ｐ．）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １７（２）：７１頁（１９９６年）］。上記のように試験の最終時点ですべてのマウス群から肝内リンパ球を単離し、一部修飾を加えた［ビカリ（Ｖｉｃａｒｉ）ら、（１９９６年）同上；Ｂｌｅｉｃｈｅｒ、Ｐ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：６７９−６８２頁（１９９０年）］。下大静脈を横隔膜の上方で切断し、肝臓を蒼白色になるまで冷却ＰＢＳ５ｍｌで洗浄した。結合組織および胆嚢を摘出し、肝臓を冷却した滅菌ＰＢＳ中の１０ｍｌのディッシュ内に置いた。肝臓および脾臓をステンレスメッシュ（サイズ６０、シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、セントルイス、ミズーリ州）を介して粉砕した。細胞懸濁液を５０ｍｌの試験管内に３分間置いて、冷却ＰＢＳで２回洗浄し（１０分間、１，２５０ｒｐｍ）、そして残渣を除去した。細胞をＰＢＳに再懸濁し、ＰＢＳに予浸したナイロンメッシュを介して細胞懸濁液を置き、結合していない細胞を収集した。ＰＢＳ４５ｍｌで細胞を２回洗浄した（室温で１，２５０ｒｐｍ）。肝臓および脾臓のリンパ球単離において、ｈｉｓｔｏｐａｇｕｅ  １０７７（シグマ・ダイアグノスティクス（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、セントルイス、ミズーリ州）２０ｍｌを５０ｍｌの試験管内のＰＢＳ７ｍｌに懸濁した細胞に下からゆっくりと加えた。試験管を室温で１５分間１，６４０ｒｐｍで遠心分離した。界面にある細胞を収集し、５０ｍｌの試験管で希釈し、そして氷冷ＰＢＳで２回洗浄した（１０分間、１，２５０ｒｐｍ）。約１×１０６細胞／マウスの肝臓を回収した。トリパンブルー染色によると、生存率は９５％を超えた。すべての実験群におけるすべての動物から脾細胞および肝臓に関連するリンパ球の両方を単離した。
【００３７】
末梢血中のＮＫＴリンパ球に対するフローサイトメトリー解析
肝内および脾臓内リンパ球の単離の直後、３通りの２〜５×１０４細胞／ＰＢＳ５００μｌをＦａｌｃｏｎ２０５２試験管内に入れて１％ＢＳＡ４ｍｌとともに１０分間インキュベートし、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞を抗−ＮＫ１．１および抗−ＣＤ３抗体（ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、米国）とともにＦＣＳ１０μｌに再懸濁し、３０分間１０分ごとに混合した。細胞を１％ＢＳＡで２回洗浄し、読み取るまで４℃で保存した。対照群においては１％ＢＳＡを５μｌだけ添加した。蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳＴＡＲ  ｐｌｕｓ、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて各群由来の１×１０４細胞に対して分析的細胞選別（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を行った。生細胞数のみを測定し、非抗体で処理したリンパ球からのバックグラウンド蛍光を得られたレベルから差し引いた。前方および側方散乱に対してゲートを設定することで死細胞および赤血球を除去した。データをＣｏｎｓｏｒｔ３０の二色コンタープロットプログラム（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、オックスナード、カリフォルニア州）、またはＣＥＬＬＱｕｅｓｔプログラムで分析した。
【００３８】
実施例１
ＮＫＴ調節リンパ球の阻害によるコンカナバリン−Ａ肝炎のグルコセレブロシドでの改善
コンカナバリン−Ａ（Ｃｏｎ−Ａ）に誘発される肝炎に対するグルコセレブロシドの免疫調節効果を評価するため、１群あたりマウス６匹からなる５群のＢａｌｂ／Ｃマウスを試験した。Ａ群およびＢ群を、それぞれＣｏｎ−Ａ５００μｇの静脈内投与の２時間前および２時間後に腹腔内においてグルコセレブロシド１μｇによって処理した。Ｃ群マウスは、Ｃｏｎ−Ａを５００μｇだけ受け、グルコセレブロシドを全く受けなかった。Ｄ群マウスをグルコセレブロシド１μｇを用い、かつＣｏｎ−Ａを全く用いないで処理した。群Ｅマウスはｎａｉｖｅ対照であった。これを表１に要約する。
【００３９】
【表１】
2007533632.tif 000002
【００４０】
顕著に低下した血清ＡＳＴおよびＡＬＴレベルによって図３に示されるように、グルコセレブロシドによる処理はＣｏｎ−Ａに誘発される肝炎を大幅に改善した。Ａ群のＡＬＴレベルは５７ＩＵであった。Ｂ群およびＣ群のＡＬＴレベルは、それぞれ４２０ＩＵおよび８０１ＩＵであった。Ａ群のＡＳＴレベルは１４３ＩＵであった。Ｂ群およびＣ群のＡＳＴレベルは、それぞれ５５９ＩＵおよび６００ＩＵであった。Ｄ群へのグルコセレブロシドの単独投与は、群Ｅすなわちｎａｉｖｅ対照と比べてＡＳＴまたはＡＬＴレベルにおける大幅な変化を示さなかった。
【００４１】
表２に示すように、Ａ群におけるＣｏｎ−Ａ投与２時間前のグルコセレブロシドによる処理は、ほぼすべての生検において正常な結果をもたらした。Ｂ群およびＣ群マウスは、虚血、壊死およびアポトーシスを呈した。図４に示すように、Ａ群およびＢ群マウスから調製した肝臓の組織学的切片は、大規模な肝細胞障害および固有のアポトーシスに関連する変化を内在するＣ群の肝臓から調製した切片と比較すると、障害が顕著に減弱したことを示した。
【００４２】
【表２】
2007533632.tif 000003
【００４３】
図５は、グルコセレブロシド処理によって血清ＩＦＮγレベルが顕著に低下したことを示す。Ａ群では約３，７２５ｐｇ／ｍｌであり、Ｃ群では５，６２０ｐｇ／ｍｌであった。図６は、グルコセレブロシド処理によって血清ＩＬ２レベルが上昇したことを示す。ここでＡ群では約６０２ｐｇ／ｍｌであり、Ｃ群では２０６ｐｇ／ｍｌであった。図７に示すように、グルコセレブロシドによって血清ＩＬ１２レベルも上昇した。ここでＡ群では約２２，２５０ｐｇ／ｍｌであり、Ｃ群では１０，１００ｐｇ／ｍｌであった。図８および図９にそれぞれ示すように、グルコセレブロシド処理によって血清ＩＬ４およびＩＬ１０レベルは低下した。図８によると、Ａ群の血清ＩＬ４レベルは約３１ｐｇ／ｍｌであり、Ｃ群では３７ｐｇ／ｍｌであった。図９によると、Ａ群の血清ＩＬ１０レベルは約８ｐｇ／ｍｌであり、Ｃ群では２６ｐｇ／ｍｌであった。
【００４４】
図１０に示すように、グルコセレブロシドの免疫介在性肝炎に対する効果は、肝内ＮＫＴリンパ球における顕著な低下に関連した。かかる低下は脾臓内ＮＫＴリンパ球では生じなかった（図１１参照）。
【００４５】
図１２では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて様々な成分を含むＮＫＴ細胞の増殖を試験した。Ａ群はＮＫＴ細胞およびＢＳＡを含んだ；Ｂ群はＮＫＴ細胞およびグルコセレブロシドを含んだ；Ｃ群はＮＫＴ細胞、樹状細胞およびＢＳＡを含んだ；ならびにＤ群はＮＫＴ細胞、樹状細胞およびグルコセレブロシドを含んだ。Ａ群からＤ群にかけて刺激指数は低下した。これはＮＫＴ細胞の増殖が全体的に低下したことを示す。グルコセレブロシドおよび樹状細胞の存在は、このＮＫＴ細胞における低下にとって必要である。
【００４６】
グルコセレブロシドの投与は、Ｃｏｎ−Ａ肝炎の大幅な改善をもたらした。この効果はＩＦＮγ応答における顕著な低下を伴った。これらの結果は、グルコセレブロシド効果がＣＤ１ｄ分子由来の活性化因子の競合置換による肝内ＮＫＴ細胞の阻害に関連する場合があることを示唆している。
【００４７】
ＩＩ．大腸炎のグルコセレブロシド処理
材料および方法
動物
正常な近交系２〜４週齢Ｂａｌｂ／ｃ雄マウスをジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国から入手し、Ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌにおいて維持した。マウスを標準飼料によって維持し、１２時間の明／暗サイクルで保存した。
【００４８】
大腸炎の誘発
２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）−ＴＮＢＳ１ｍｇ／マウスの直腸点滴注入によって大腸炎を誘発し、［コリンズ、Ｃ（Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｃ．）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：３１１４−３１１８頁（１９９６年）］に記載のように５０％エタノール１００ｍｌ中に溶解した。
【００４９】
グルコセレブロシドの実験的大腸炎に対する効果の評価
大腸炎に対する以下のパラメータの監視によってグルコセレブロシドの効果を評価した。
【００５０】
大腸炎の臨床評価
試験を通じて毎日下痢を伴った。
【００５１】
大腸炎の肉眼的スコア
標準パラメータを用いて大腸炎の誘発後１４日目に大腸炎の評価を行った［マセン、Ｋ．Ｌ．（Ｍａｄｓｅｎ、Ｋ．Ｌ．）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１３：１５１−１５９頁（１９９７年）；トロップ、Ｓ．（Ｔｒｏｐ、Ｓ．）ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：７４６−７５５頁（１９９９年）］。
【００５２】
４つの巨視的パラメータを決定した。すなわち、下痢、結腸潰瘍形成；腸および腹膜への接着；および壁肥厚の程度である。
【００５３】
２名の熟練した盲検化した試験者によって各パラメータが０（完全に正常）から３（最も重症）までのスケールに基づいて類別された。
【００５４】
組織学的病変の類別
炎症の組織学的評価用に、遠位結腸組織（最後の１０ｃｍ）を摘出し、１０％ホルムアルデヒドで固定した。次いで、標準技術を用いることによって各マウス由来の５つのパラフィン切片をヘマトキシリン−エオシンで染色した。腸の顕微鏡的断面上の炎症の程度について半定量的に０から４まで類別した［マセン（Ｍａｄｓｅｎ）ら、（１９９７年）同上；トロップ（Ｔｒｏｐ）ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：７４６−７５５頁（１９９９年）］。グレード０：正常で炎症の兆候を全く伴わない；グレード１：極めて低レベルの白血球浸潤；グレード２：低レベルの白血球浸潤；およびグレード３：高い血管密度を伴う高レベルの浸潤、および腸管壁肥厚；グレード４：杯細胞の欠損、高い血管密度、壁肥厚、および正常な腸管構造の破裂を伴う貫壁性浸潤。２名の熟練した盲検化した試験者によって類別が行われた。
【００５５】
脾臓および肝臓リンパ球の単離
上記のように脾細胞を単離し、赤血球を採取した［ビカリ、Ａ．Ｐ．（Ｖｉｃａｒｉ、Ａ．Ｐ．）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １７（２）：７１頁（１９９６年）］。上記のように試験の最終時点ですべてのマウス群から肝内リンパ球を単離し、一部修飾を加えた［ビカリ（Ｖｉｃａｒｉ）ら、（１９９６年）同上；Ｂｌｅｉｃｈｅｒ、Ｐ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：６７９−６８２頁（１９９０年）］。下大静脈を横隔膜の上方で切断し、肝臓を蒼白色になるまで冷却ＰＢＳ５ｍｌで洗浄した。結合組織および胆嚢を摘出し、肝臓を冷却した滅菌ＰＢＳ中の１０ｍｌのディッシュ内に置いた。肝臓および脾臓をステンレスメッシュ（サイズ６０、シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、セントルイス、ミズーリ州）を介して粉砕した。細胞懸濁液を５０ｍｌの試験管内に３分間置いて、冷却ＰＢＳで２回洗浄し（１０分間、１，２５０ｒｐｍ）、そして残渣を除去した。細胞をＰＢＳに再懸濁し、ＰＢＳに予浸したナイロンメッシュを介して細胞懸濁液を置き、結合していない細胞を収集した。ＰＢＳ４５ｍｌで細胞を２回洗浄した（室温で１，２５０ｒｐｍ）。肝臓および脾臓のリンパ球単離において、ｈｉｓｔｏｐａｇｕｅ  １０７７（シグマ・ダイアグノスティクス（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、セントルイス、ミズーリ州）２０ｍｌを５０ｍｌの試験管内のＰＢＳ７ｍｌに懸濁した細胞に下からゆっくりと加えた。試験管を室温で１５分間１，６４０ｒｐｍで遠心分離した。界面にある細胞を収集し、５０ｍｌの試験管で希釈し、そして氷冷ＰＢＳで２回洗浄した（１０分間、１，２５０ｒｐｍ）。約１×１０６細胞／マウスの肝臓を回収した。トリパンブルー染色によると、生存率は９５％を超えた。すべての実験群におけるすべての動物から脾細胞および肝臓に関連するリンパ球の両方を単離した。
【００５６】
ＮＫＴ、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに対する肝内および脾臓内リンパ球のＦＡＣＳ
リンパ球の単離の直後、３通りの２〜５×１０４細胞／ＰＢＳ５００μｌをＦａｌｃｏｎ２０５２試験管内に入れて１％ＢＳＡ４ｍｌとともに１０分間インキュベートし、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離した。抗−ＮＫ１．１、抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ４および抗−ＣＤ−８抗体を用いてリンパ球亜群の分析を行った。細胞を１％ＢＳＡで２回洗浄し、読み取るまで４℃で保存した。対照群においては１％ＢＳＡを５μｌだけ添加した。蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳＴＡＲ  ｐｌｕｓ、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて各群由来の１×１０４細胞に対して分析的細胞選別を行った。生細胞数のみを測定し、非抗体で処理したリンパ球からのバックグラウンド蛍光を得られたレベルから差し引いた。前方および側方散乱に対してゲートを設定することで死細胞および赤血球を除去した。データをＣｏｎｓｏｒｔ３０の二色コンタープロットプログラム（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、オックスナード、カリフォルニア州）、またはＣＥＬＬＱｕｅｓｔプログラムで分析した。
【００５７】
サイトカインレベルの測定
すべての群におけるマウスから採血し、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓキット（ジェンザイム・ダイアグノスティックス（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、マサチューセッツ州）を用いて「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡによって血清ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ１０およびＩＬ−１２レベルを測定した。
【００５８】
実施例１
グルコセレブロシドによる実験的大腸炎の改善
実験的大腸炎のマウスモデルにおけるグルコセレブロシドの免疫調節効果を評価するため、１群あたりマウス１０匹からなる４群のＢａｌｂ／ｃマウスを試験した。Ａ群およびＢ群マウスに直腸ＴＮＢＳを負荷し、Ｃ群およびＤ群に正常生理食塩水を与えた。Ｂ群およびＤ群マウスに１日にグルコセレブロシド１．５μｇを９日間にわたって腹腔内に投与した。これを表３にまとめる。
【００５９】
【表３】
2007533632.tif 000004
【００６０】
図１４に示すように、グルコセレブロシドによる処理は、下痢に対する肉眼的大腸炎スコアにおいて改善を示した。Ａ群のスコアは約０．２２であり、Ｂ群のスコアは約０．５であった。結腸潰瘍の程度に対するスコアもまた、Ａ群のスコアが約０．１１であり、Ｂ群のスコアが約０．２であったことから改善した。壁肥厚に対する肉眼的スコアにおいても、Ａ群とＢ群の両方のスコアがそれぞれ約２．４４と約２．５６であったことからわずかな改善があった。しかしながら、Ｂ群に対し、Ａ群において腸および腹膜への接着が増大し、近似スコアがそれぞれ２．５６および１．４であった。
【００６１】
図１３および図１５に示すように、グルコセレブロシドを受けなかったＡ群は約３．６の最高の顕微鏡的大腸炎スコアを有し、高度の炎症があることを証明した。Ｂ、ＣおよびＤ群は、事実上生検は正常であった（顕微鏡的スコアの低下）。
【００６２】
グルコセレブロシドの投与は、大腸炎の顕著な緩和をもたらした。これはＢ群マウスと比べてＡ群マウスでは肉眼的および顕微鏡的大腸炎スコアが大幅に改善したことによって明らかとなった。
【００６３】
グルコセレブロシドのＣ群およびＤ群マウスに対する効果は、脾臓のＣＤ４／ＣＤ８比がそれぞれ３．０および１．８９であることを示した。グルコセレブロシドのＣ群およびＤ群マウスに対する効果は、肝臓のＣＤ４／ＣＤ８比がそれぞれ８．８および３．４であることを示した。Ｃ群マウス（ｎａｉｖｅ動物）とＤ群マウス（グルコセレブロシドで処理した動物）との比率は、それぞれ０．３４および０．６５であった。これらの結果は、末梢および肝臓におけるＮＫＴ細胞の低下および末梢および肝臓におけるＣＤ４／ＣＤ８比の低下を示す。したがって、グルコセレブロシドの効果は、肝内ＣＤ８の一層の捕捉であった。これらの結果を図１６および図１７に示す。
【００６４】
グルコセレブロシドのＡ群およびＢ群マウスに対する効果は、脾臓のＣＤ４／ＣＤ８比がそれぞれ１．８９および３．３３であることを示した。グルコセレブロシドのＡ群およびＢ群マウスに対する効果は、肝臓のＣＤ４／ＣＤ８比がそれぞれ５．０および５．２４であることを示した。Ａ群マウス（グルコセレブロシドで処理していない大腸炎を有する動物）とＢ群マウス（グルコセレブロシドで処理した大腸炎を有する動物）との比率は、それぞれ０．３４および０．６５であった。これらの結果は、末梢においてＮＫＴ細胞が増加し、かつ肝臓においてＮＫＴ細胞が全く変化しなかったことを示す。末梢においてＣＤ４／ＣＤ８比の上昇、肝臓においてＣＤ４／ＣＤ８比の軽度の上昇があった。これらの結果を図１６および図１７にも示す。グルコセレブロシド処理は、肝内ＣＤ８の一層の捕捉をもたらした。
【００６５】
図１８は、グルコセレブロシドの血清サイトカインレベルに対する効果を示す。血清ＩＦＮγレベルがグルコセレブロシド処理によって上昇した。Ａ群では約８．３ｐｇ／ｍｌであり、Ｂ群では約２７．１ｐｇ／ｍｌであった。血清ＴＮＦａレベルもグルコセレブロシド処理によって上昇し、Ａ群では約７５ｐｇ／ｍｌであり、Ｂ群では約１０３．６ｐｇ／ｍｌであった。血清ＩＬ４レベルもグルコセレブロシドによって上昇し、Ａ群では約５．７ｐｇ／ｍｌであり、Ｂ群では約９．１ｐｇ／ｍｌであった。しかしながら、血清ＩＬ１０レベルはグルコセレブロシド処理によって低下した。Ａ群の血清ＩＬ１０レベルは約４２．１ｐｇ／ｍｌであり、Ｂ群では約２１．４ｐｇ／ｍｌであった。
【００６６】
グルコセレブロシド処理による大腸炎の緩和は、肝内ＣＤ８＋Ｔ細胞捕捉における顕著な増大に関連した。末梢／肝内のＣＤ４＋／ＣＤ８＋は、無処理のＢ群マウスに対するグルコセレブロシドで処理したＡ群マウスでは８５％上昇した。グルコセレブロシドをｎａｉｖｅ動物に投与した際に同様の効果を観察した。すなわち、末梢／肝内のＣＤ４＋／ＣＤ８＋比は、無処理の動物に対するＣ群のグルコセレブロシドで処理したマウスでは６１％上昇した。グルコセレブロシド処理によってｎａｉｖｅマウスにおける末梢／肝内のＮＫＴ細胞比が１０８％上昇するに至ったのに対し、グルコセレブロシドのＴＮＢＳ大腸炎に対する有益な効果は同比の相対的低下と関連した。
【００６７】
グルコセレブロシド１５μｇの経口投与によって同一の実験を行った際、同様な結果を得た。表４に示すように、無処理のＢ群マウスと比べ、Ａ群のグルコセレブロシドで処理したマウスでは、肉眼的および顕微鏡的大腸炎スコアの大幅な改善によって大腸炎の顕著な緩和を呈した。
【００６８】
【表４】
2007533632.tif 000005
【００６９】
ＩＩＩ．非アルコール性脂肪肝炎のグルコセレブロシド処理
材料および方法
動物
１０週齢の雄でレプチンが不足したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび脂肪のないＣ５７ＢＬ／６マウスをハーラン・ラボラトリーズ（Ｈａｒｌａｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入し、Ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌにおいて維持した。マウスに標準飼料を給餌し、１２時間明／暗サイクルで保存した。
【００７０】
ブドウ糖負荷試験
グルコースの経口投与によって耐糖能を評価した（１ｇ／ｋｇ体重）。尾部から採血した血液に対して０'、１５'、３０'、６０'、９０'、１２０'および１８０'でのグルコースを測定した。Ｅｌｉｔｅグルコース・テストストリップ（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｅｓｔ  ｓｔｒｉｐ）および血糖計を用いて血糖値を測定した。
【００７１】
肝臓における脂肪含量のＭＲＩ測定
マウス肝臓内の脂肪の評価／定量において一回の処理で同相および逆相の画像を提供する二重エコー化学シフト傾斜−エコー磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）シーケンスを用いて肝脂肪含量を測定した。Ｔ１で重み付けした逆相ＭＲイメージング技術は、比較的少量の組織脂肪の検出において感度が良い。１．５−Ｔシステム（シグナ  ＬＸ；ＧＥ（Ｓｉｇｎａ  ＬＸ；ＧＥ）、ミルウォーキー州、米国）を用いてＭＲＩイメージングを実施した。１２５ｍｓｅｃの繰返し時間（ＴＲ）、４と６．５ｍｓｅｃの二重エコー時間（ＴＥ）、および８０°のフリップ角で二重エコーＭＲイメージングを実施した。イメージングパラメータは、３ｍｍの切片厚、１３ｃｍの視野、２５６＊１６０マトリックス、およびニーコイル（ｋｎｅｅ  ｃｏｉｌ）の使用によって得られる１つのシグナルを含んだ。３ｍｍの切片厚があり交差ギャップを全く含まない肝臓レベルで横断像（軸方向）および冠状断像（ｃｏｒｏｎａｌ  ｉｍａｇｅ）を取得した。前報に記載のように同相および逆相画像の間のＳＩ変化のシグナル強度（ＳＩ）測定値の定量評価をコンピュータで算出した（ミッチェル  ＤＧ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＤＧ）ら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ  ２６：１０４１−１０５２頁（１９９１年）；トモヒロ  Ｎ（Ｔｏｍｏｈｉｒｏ  Ｎ）ら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２１８：６４２−６４６頁（２００１年））。ＳＩ指数を以下のように算出した。すなわち、ＳＩ指数＝（ＳＩｉｐ−ＳＩｏｐ）／ＳＩｉｐで、式中Ｓｌｉｐは同相画像上のＳＩであり、かつＳＩｏｐは逆相画像上のＳＩである。ＳＩ指数は、同相画像上のＳＩと比較した場合の逆相画像上のＳＩ欠損部を示す。
【００７２】
実施例１
グルコセレブロシドの糖尿病に対する効果
ＮＡＳＨモデルの様々な代謝および免疫成分に対するグルコセレブロシドの効果を評価するために、１群あたりマウス１２匹からなる４群のＣ５７ｂｌマウスを試験した。表５に示すように、Ａ群およびＢ群マウスがｏｂ／ｏｂマウスである一方、Ｃ群およびＤ群マウスは同マウスではなかった。１４日間１日おきにＡ群およびＣ群マウスの腹腔内にＰＢＳ１００μｌ中の１．５μｇを注射した。Ｂ群およびＤ群におけるｎａｉｖｅ  ｏｂ／ｏｂマウスおよびｎａｉｖｅ  Ｃ５７ｂｌマウスをそれぞれ無処理のまま放置した。
【００７３】
【表５】
2007533632.tif 000006
【００７４】
１４日目に、各群からのマウス６匹ずつについてブドウ糖負荷試験を実施した。図１９に示すように、グルコセレブロシドで処理したＡ群マウスは、処理していないｎａｉｅｖｅ  ｏｂ／ｏｂマウスよりも高い耐糖能を有した。これはグルコセレブロシドの注射がｏｂ／ｏｂマウスの代謝特性を変化させ、それらの耐糖能結果を改善し、同マウスが糖尿病に罹りにくくなることを示唆する。
【００７５】
実施例２
経口投与したグルコセレブロシドのＮＡＳＨに対する効果
ＮＡＳＨモデルの様々な代謝および免疫成分に対するグルコセレブロシドの効果を評価するため、１群あたりマウス１２匹からなる４群のＣ５７ｂｌマウスを試験した。表６に示すように、Ａ群およびＢ群マウスがｏｂ／ｏｂマウスである一方、Ｃ群およびＤ群マウスは同マウスではなかった。１４日間１日おきにＡ群およびＣ群マウスの腹腔内にＰＢＳ１００μｌ中の１．５μｇを注射した。Ｂ群およびＤ群におけるｎａｉｅｖｅ  ｏｂ／ｏｂマウスおよびｎａｉｅｖｅ  Ｃ５７ｂｌマウスをそれぞれ無処理のまま放置した。
【００７６】
【表６】
2007533632.tif 000007
【００７７】
１４日目に、各群からのマウス６匹ずつについてブドウ糖負荷試験を実施した。図２０に示すように、グルコセレブロシドによって処理したＡ群マウスは、処理していないｎａｉｅｖｅ  ｏｂ／ｏｂマウスよりも高い耐糖能を有した。これは経口での免疫調節の誘発を介する免疫調節がｏｂ／ｏｂマウスの代謝特性を変化させ、それらの耐糖能結果を改善し、同マウスが糖尿病に罹りにくくなることを示唆する。
【００７８】
実施例３
グルコセレブロシドの肝脂肪含量に対する効果
ＮＡＳＨモデルの様々な代謝および免疫成分に対するグルコセレブロシドの効果を評価するため、１群あたりマウス１２匹からなる４群のＣ５７ｂｌマウスを試験した。表７に示すように、Ａ群およびＢ群マウスがｏｂ／ｏｂマウスである一方、Ｃ群およびＤ群マウスは同マウスではなかった。１４日間１日おきにＡ群およびＣ群マウスの腹腔内にＰＢＳ１００μｌ中の１．５μｇを注射した。Ｂ群およびＤ群におけるｎａｉｅｖｅ  ｏｂ／ｏｂマウスおよびｎａｉｅｖｅ  Ｃ５７ｂｌマウスをそれぞれ無処理のまま放置した。
【００７９】
【表７】
2007533632.tif 000008
【００８０】
肝脂肪含量を測定するため、実験の１４日目に４群すべてのマウスに腹部ＭＲＩを施した（表８）。肝脂肪含量を測定し、ＳＩ指数（ＩＰ−ＯＰ／ＩＰ）として記載した。肝臓の面積によるサイズも測定した。同結果は、グルコセレブロシド処理による肝脂肪含量の減少を示した。グルコセレブロシドで処理したＡ群マウスのＳＩ指数は、Ｂ群のＳＩ指数が０．５４であったのに対して０．４６であった。グルコセレブロシド処理から肝臓サイズの減少も生じた。グルコセレブロシドで処理したＡ群マウスの肝臓面積は、Ｂ群の肝臓面積が２４．２であったのに対して２０．１４であった。
【００８１】
【表８】
2007533632.tif 000009
【００８２】
【表９】
2007533632.tif 000010
【００８３】
これはグルコセレブロシドが感受性哺乳類の肝臓における脂肪蓄積およびＮＡＳＨの程度において減少をもたらす方法において代謝特性を変化させることを示唆する。
【００８４】
ＩＶ．メラノーマのグルコセレブロシド処理
材料および方法
動物
４群のＣ５７ｂｌマウスを試験した。
【００８５】
組織学的検査
肺障害の程度を判定するために、マウス由来の肺の組織学的切片を検査した。組織学的分析のために各マウスにおける単一の肺区域を１０％緩衝化ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。切片をヘマトキシリン／エオシンで染色し組織学的評価を行った。
【００８６】
実施例１
グルコセレブロシド処理のメラノーマに対する効果
グルコセレブロシドのメラノーマに対する効果を評価するため、１群あたりマウス８匹からなる４群のＣ５７ｂｌマウスを試験した。Ａ群およびＢ群に１×１０６細胞のＢ１６メラノーマ細胞系統を皮下投与し、Ｃ群およびＤ群を１×１０５細胞のＢ１６メラノーマ細胞系統で静脈内に処理することで、メラノーマを誘発した。Ａ群およびＣ群を毎日グルコセレブロシド１μｇで腹腔内に処理し、毎週の最後の２日を省略し、第１週の２日目に開始した。Ｂ群およびＤ群マウスに生理食塩水のみを与えた。これを表９に要約する。
【００８７】
【表１０】
2007533632.tif 000011
【００８８】
グルコセレブロシドによる処理は、腫瘍サイズを大幅に改善した。腫瘍を除去に引き続き測定した。Ａ群における平均腫瘍重量は１．６３＋／−０．８２ｇであり、Ｂ群における平均腫瘍重量は２．８９＋／−０．０１ｇであった。図２１に腫瘍サイズにおける差異を認めることができる。
【００８９】
グルコセレブロシドによる処理は、肺転移における低下も示した。Ｃ群およびＤ群の肺細胞を組織学的分析のために固定した。Ｃ群における肺転移の平均数は肺あたり３＋／−１で、Ｄ群における肺転移の平均数は肺あたり８＋／−３であった。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】グルコセレブロシドの化学物質構造を示す。
【図２】グルコシルセラミド合成に対する経路を示す。
【図３】グルコセレブロシドの肝酵素に対する効果を示す。
【図４】マウスから調製された肝臓の組織学的切片を示す。
【図５】グルコセレブロシドの血清ＩＦＮγに対する効果を示す。
【図６】グルコセレブロシドの血清ＩＬ２に対する効果を示す。
【図７】グルコセレブロシドの血清ＩＬ１２に対する効果を示す。
【図８】グルコセレブロシドの血清ＩＬ−４に対する効果を示す。
【図９】グルコセレブロシドの血清ＩＬ１０に対する効果を示す。
【図１０】肝臓のＮＫＴ細胞に対するグルコセレブロシドの効果を示す。
【図１１】脾臓のＮＫＴ細胞に対するグルコセレブロシドの効果を示す。
【図１２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＮＫＴ細胞増殖に対するグルコセレブロシドの効果を示す。
【図１３】マウスから調製された結腸の組織学的切片を示す。
【図１４】グルコセレブロシドの肉眼的大腸炎スコアに対する効果を示す。
【図１５】グルコセレブロシドの顕微鏡的大腸炎スコアに対する効果を示す。
【図１６】グルコセレブロシドの脾臓ＣＤ４／ＣＤ８比に対する効果を示す。
【図１７】グルコセレブロシドの肝臓ＣＤ４／ＣＤ８比に対する効果を示す。
【図１８】グルコセレブロシドの血清サイトカインレベルに対する効果を示す。
【図１９】グルコセレブロシド処理におけるブドウ糖負荷試験を示す。
【図２０】グルコセレブロシド処理におけるブドウ糖負荷試験を示す。
【図２１】グルコセレブロシドの腫瘍サイズに対する効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2007533632.tif 000020
【図１０】
2007533632.tif 000021
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2007533632.tif 000024
【図１４】
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【図１５】
2007533632.tif 000026
【図１６】
2007533632.tif 000027
【図１７】
2007533632.tif 000028
【図１８】
2007533632.tif 000029
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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