(57)【要約】本発明は、所定の種類の細胞に損傷もしくは障害のあるまたは所定の種類の細胞が欠損している哺乳動物(例えば、ヒト患者)において所定の種類の機能細胞、例えば、膵臓のインスリン産生細胞、肝細胞、脾臓細胞、または骨細胞の数を増加または維持する方法を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の臓器または組織において所定の種類の機能細胞の数を増加または維持する医薬剤を調製する際の、Hox11遺伝子を発現する多能性細胞の使用であって、該臓器または組織には該機能細胞の損傷、障害、または欠損がある、使用。
【請求項２】
多能性細胞が、Hox11遺伝子を形質移入した多能性細胞または全能性細胞に由来する、請求項1記載の使用。
【請求項３】
多能性細胞が、CD45を発現しない細胞において濃縮される、請求項1記載の使用。
【請求項４】
a)多能性細胞を含有する哺乳動物抹消血または組織を提供する段階；
b)該抹消血または組織から多能性細胞を分離する段階；
c)該多能性細胞を、該細胞の表面にCD45抗原を主に発現する第1の細胞集団と、該細胞の表面にCD45抗原を主に発現しない第2の細胞集団とに分離する段階；および
d)該第2の細胞集団を選択する段階
を含む方法によって、多能性細胞が哺乳動物の抹消血または組織から得られる、請求項3記載の使用。
【請求項５】
多能性細胞が脾臓に由来する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
哺乳動物の臓器または組織において所定の種類の機能細胞の数を増加または維持する医薬剤を調製する際の、CD45(-)多能性細胞の使用であって、該臓器または組織には該機能細胞の損傷、障害、または欠損があるが、ただし該多能性細胞は骨髄細胞または筋肉細胞ではない、使用。
【請求項７】
多能性細胞が、抹消リンパ球、臍帯血細胞、および脾細胞からなる群より選択される、請求項6記載の使用。
【請求項８】
多能性細胞が脾細胞である、請求項7記載の使用。
【請求項９】
a)多能性細胞を含有する哺乳動物脾臓組織を提供する段階；
b)該脾臓組織から多能性細胞を分離する段階；
c)該多能性細胞を、該細胞の表面にCD45抗原を主に発現する第1の細胞集団と、該細胞の表面にCD45抗原を主に発現しない第2の細胞集団とに分離する段階；および
d)該第2の細胞集団を選択する段階
を含む方法によって、多能性細胞が得られる、請求項6〜8記載の使用。
【請求項１０】
多能性細胞が半同種(semi-allogeneic)である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
多能性細胞が同質(isogeneic)である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
臓器または組織が刺激されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
多能性細胞がMHCクラスIとペプチドを提示し、該MHCクラスIが、哺乳動物によって発現されるMHCクラスI対立遺伝子に一致する少なくとも1つの対立遺伝子を有する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
多能性細胞が、レチノイン酸受容体、エストロゲン受容体、EGF受容体、CD49b、VLA2、CD41、LFA-1、ITB2、CD29、NTC3受容体、プラスミノーゲン受容体、トランスフェリン受容体、TGF受容体、PDGF受容体、甲状腺成長ホルモン受容体、およびインテグリンβ5からなる群より選択される1つまたは複数の細胞表面マーカーを含有する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
多能性細胞の輸送、分化、または増殖を妨害または防止する細胞集団を選択的に阻害する、除去する、または死滅させる第2の薬剤を医薬剤がさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
多能性細胞の輸送、分化、または増殖を妨害または防止する細胞集団がTリンパ球を含む、請求項15記載の使用。
【請求項１７】
第2の薬剤がTNF-αである、請求項15記載の使用。
【請求項１８】
第2の薬剤がTNF-αアゴニストまたはTNF-α誘導物質である、請求項15記載の使用。
【請求項１９】
TNF-αアゴニストまたはTNF-α誘導物質が、完全フロインドアジュバント(CFA)、ISS-ODN、LPS様活性を有する微生物細胞壁成分、コレラ粒子、大腸菌易熱性エンテロトキシン、レシチンベシクルと複合体形成した大腸菌易熱性エンテロトキシン、ISCOMS免疫刺激複合体、ポリエチレングリコール、ポリ(N-2-(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)、CpGまたはCpAモチーフを含有する合成オリゴヌクレオチド、モノホスホリル脂質A、カルメット-ゲラン桿菌、γインターフェロン、組織プラスミノーゲン活性化因子、LPS、インターロイキン1、インターロイキン2、UV光線、リンフォトキシン、カケクチン、TNFR-1アゴニスト、TNFR-2アゴニスト、TNF-αシグナル伝達経路の細胞内メディエーター、NFκB誘導物質、IRF-1、STAT1、リンフォカイン、またはTNF-αと抗TNFR-1抗体の組み合わせである、請求項18記載の使用。
【請求項２０】
TNF-αアゴニストまたはTNF-α誘導物質が、完全フロインドアジュバント、カルメット-ゲラン桿菌、またはγインターフェロンである、請求項19記載の使用。
【請求項２１】
哺乳動物の臓器または組織において所定の種類の機能細胞の数を増加または維持する医薬剤を調製する際の薬剤の使用であって、該臓器または組織には該機能細胞の損傷、障害、または欠損があり、該薬剤は、Hox11発現多能性細胞を誘導する、使用。
【請求項２２】
Hox11発現多能性細胞がCD45を発現しない、請求項17記載の使用。
【請求項２３】
薬剤が、プロモーターに機能的に結合しているHox11遺伝子を含む遺伝子治療ベクターであり、該ベクターが多能性細胞においてHox11を発現する、請求項21または22記載の使用。
【請求項２４】
Hox11発現多能性細胞が骨髄細胞ではない、請求項21または22記載の使用。
【請求項２５】
哺乳動物の臓器または組織において所定の種類の機能細胞の数を増加または維持する医薬剤を調製する際の薬剤の使用であって、該臓器または組織には該機能細胞の損傷、障害、または欠損があり、該薬剤は、CD45を発現しない多能性細胞を誘導する、使用。
【請求項２６】
薬剤が、サイトカイン、ケモカイン、または増殖因子であるか、または哺乳動物においてサイトカイン、ケモカイン、または増殖因子を誘導する、請求項21、22、24、および25のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
サイトカイン、ケモカイン、または増殖因子が、上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、形質転換増殖因子β(TGF-β)、形質転換増殖因子α(TGF-α)、血管内皮増殖因子(VEGF)、エリスロポイエチン(Epo)、インスリン様増殖因子I(IGF-I)、インスリン様増殖因子II(IGF-II)、インターロイキン、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、腫瘍壊死因子β(TNF-β)、インターフェロンγ(INF-γ)、ストロマ細胞由来因子1(SDF-1)、およびコロニー刺激因子(CSF)からなる群より選択される、請求項26記載の使用。
【請求項２８】
臓器または組織が、膵臓、脾臓、肝臓、腎臓、神経組織、または骨であるか、またはその一部である、請求項1〜27のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
臓器または組織が膵臓であるか、またはその一部である、請求項28記載の使用。
【請求項３０】
哺乳動物の臓器または組織において所定の種類の機能細胞の数を増加または維持する医薬剤を調製する際の薬剤の使用であって、該臓器または組織には該機能細胞の損傷、障害、または欠損があり、該薬剤は、多能性細胞の輸送、分化、または増殖を妨害する細胞集団を選択的に阻害する、除去する、または死滅させる、使用。
【請求項３１】
薬剤が、CD180の発現が欠損している細胞集団を標的とする、請求項30記載の使用。
【請求項３２】
薬剤が、BCG、LPS、トリアセチル化リポペプチド、フェノール可溶性モジュリン、またはB. ブルグドルフェリ(B. burgdorferi)のOspA LP、TLR1もしくはTLR6を有するトリアセチル化リポペプチド、TL4を有するHSP60、HSP60、マンヌロン酸ポリマー、フラボリピン、テシフロン酸(tecihuronic acid)、ニューモリシン、線毛(fimbriae)、サーファクタントタンパク質A、ヒアルロナン、硫酸ヘパリンまたは硫酸ヘパリン断片、フィブリノーゲンペプチド、βデフェンシン2、フラゲリン、またはイミダゾールキノリンである、請求項31記載の使用。
【請求項３３】
多能性細胞がHox11を発現する、請求項30記載の使用。
【請求項３４】
多能性細胞がCD45を発現しない、請求項30記載の使用。
【請求項３５】
多能性細胞が同質である、請求項30記載の使用。
【請求項３６】
多能性細胞が半同種である、請求項30記載の使用。
【請求項３７】
哺乳動物が自己免疫疾患を有する、請求項1〜36のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３８】
疾患が糖尿病である、請求項37記載の使用。
【請求項３９】
疾患が免疫学的に媒介される糸球体腎炎である、請求項37記載の使用。
【請求項４０】
疾患が慢性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、または原発性硬化性胆管炎である、請求項37記載の使用。
【請求項４１】
組織または臓器が膵臓、唾液腺、下垂体、腎臓、心臓、嗅腺、耳、骨、肝臓、脳、抹消神経系、中枢神経系、脊髄、乳腺、または精巣である、請求項1〜36記載のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４２】
少なくとも75%の細胞がHox11を発現する、単離されたCD45(-)多能性細胞集団。
【請求項４３】
少なくとも90%の細胞がHox11を発現する、請求項42記載の多能性細胞集団。
【請求項４４】
少なくとも75%の細胞がCD45を発現しない、単離されたHox11発現多能性細胞集団。
【請求項４５】
少なくとも90%の細胞がCD45を発現しない、請求項44記載の多能性細胞集団。
【請求項４６】
細胞が、レチノイン酸受容体、エストロゲン受容体、EGF受容体、CD49b、VLA2、CD41、LFA-1、ITB2、CD29、NTC3受容体、プラスミノーゲン受容体、トランスフェリン受容体、TGF受容体、PDGF受容体、甲状腺成長ホルモン受容体、およびインテグリンβ5からなる群より選択される1つまたは複数の細胞表面マーカーを含有する、請求項42〜45のいずれか一項に記載の多能性細胞集団。
【請求項４７】
a)多能性細胞を含有する哺乳動物抹消血または組織を提供する段階；
b)該抹消血または組織から多能性細胞を分離する段階；
c)該多能性細胞を、該細胞の表面にCD45抗原を主に発現する第1の細胞集団と、該細胞の表面にCD45抗原を主に発現しない第2の細胞集団とに分離する段階；および
d)該第2の細胞集団を選択する段階
を含む方法によって哺乳動物の抹消血または組織から得られる、請求項42〜45のいずれか一項に記載の多能性細胞集団。
【請求項４８】
レチノイン酸受容体、エストロゲン受容体、EGF受容体、CD49b、VLA2、CD41、LFA-1、ITB2、CD29、NTC3受容体、プラスミノーゲン受容体、トランスフェリン受容体、TGF受容体、PDGF受容体、甲状腺成長ホルモン受容体、およびインテグリンβ5からなる群より選択される細胞表面マーカーを主に発現する第3の細胞集団と、該細胞表面マーカーを主に発現しない第4の細胞集団とにCD45(-)多能性細胞を分離することによってさらに精製される、請求項47記載の多能性細胞集団。
【請求項４９】
脾臓に由来する、請求項42〜48のいずれか一項に記載の多能性細胞集団。
【請求項５０】
膵臓細胞、脾臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、神経細胞、および骨細胞からなる群より選択される細胞に分化することができる、Hox11遺伝子を形質移入した多能性細胞。
【請求項５１】
膵臓細胞に分化することができる、請求項50記載の細胞。
【請求項５２】
ヒトHox11遺伝子が形質移入されている、請求項50記載の細胞。
【請求項５３】
脾臓に由来する多能性細胞である、請求項50記載の細胞。
【請求項５４】
臍帯血に由来する多能性細胞である、請求項50記載の細胞。
【請求項５５】
CD45を発現しない多能性細胞である、請求項50〜54のいずれか一項に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明は、哺乳動物(例えば、ヒト患者)において損傷した組織を修復し、再生することに関する。このような損傷は既存の自己免疫によって生じても、または非自己免疫発作の結果であってもよい。自己免疫細胞を除去し、免疫系を再教育することは、自己免疫疾患の効果的な治療の重要な要素であることを本発明者は以前に示した(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第10/358,664号、同第09/521,064号、同第09/768,769号およびRyu et al., Journal of Clinical Investigations, 108: 31-33, 2001に記載されている)。自己免疫疾患は治療が成功する可能性があるが、患者は、以前の自己免疫発作の結果として重大な組織損傷を被ることがある。
【０００２】
多数の組織は、障害を生じる発作が排除されると、自身を修復する生来の能力を有するが、障害を修復するこの能力は発作の期間に関連して低下する。例えば、内因性膵島の再生能力は長期のI型糖尿病、すなわち15年より長くこの疾患に罹患している患者では実質的になくなっている。内因性組織が再生能力を失っている場合には、障害は、例えば、移植によって患者に外因性組織を提供することによって修復することができる。糖尿病の有望な治療法である島移植は、10年来のヒトを対象とした臨床試験の主題となっている。動物では島移植の成功が多数報告されているが、これらは、動物が自然発症の疾患ではなく化学的処理により糖尿病になった場合において見られたものであった。バリアがなく、毒性のない方法を使用し、自然発症した糖尿病マウスにおいて島移植の成功を示している立証可能で論文審査された唯一の検討は同質(自己)島を使用している。TNF-α(腫瘍壊死因子α)；BCG(カルメット-ゲラン桿菌、マイコバクテリウム  ボビス(Mycobacterium bovis)の弱毒化株)；またはTNF-αのインデューサーであるCFA(完全フロインドアジュバント)で事前-処理した活動性の(acitve)糖尿病が認められる非肥満型糖尿病(NOD)マウスに同質島が移植された(Rabinovitch et al., J. Immunol. 159: 6298-6303, 1997)。この方法は、主に同系島が入手可能でないので、臨床的に適用可能ではない。さらに、既存の細胞置換方法は末期疾患を予防することもまたは膵島炎を永久的に回復させることもなかった。島移植の同種移植状況では、免疫抑制を用いても移植片は結局拒絶される。さらに、全身照射および骨髄移植などの糖尿病宿主治療は許容されないほど毒性であり、インスリン短期代替療法に興味が集まっている。
【０００３】
最近、島移植が臨床試験においてわずかではあるが成功を収めており、1型糖尿病患者が6ヶ月を超える期間にわたって正常血糖に持続的に回復している。これらの結果は、しばしば同時に実施される救命的な腎移植の状況において、持続的で、毒性を生じる場合もある薬物療法を用いて得られている。しかし、成功率が中程度のこれらの島移植は、一部には薬物治療自体がインスリン耐性を誘導することによると推測される失敗がほぼ1年で表れる。(膵臓が切除されている癌患者におけるなどの)島移植を受けた非糖尿病患者と比較して、1型糖尿病における島移植の失敗が早期に現れるのは、移植片拒絶に対して免疫抑制療法が自己免疫の防止を上回る効果を示すという懸念を生ずる。これらの懸念が信じられるのは、非糖尿病型(NOD)マウスを使用する動物検討において同種または異種島移植の移植片拒絶を防止するための免疫抑制療法の無効性が観察されることである。
【０００４】
ドナー抗原が宿主の免疫系から隠蔽されるように細胞が改変されている非免疫抑制宿主に同種および異種組織を導入する移植方法を本発明者は以前に記載している(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,283,058号)。一般に、遮蔽された島またはMHCクラスI分子が切断されている遺伝子導入島はNODマウスにおいて自己免疫疾患再発から一部にすぎないが保護される(Markmann et al., Transplantation 54: 1085-89, 1992)。短期間の2成分療法は、自己寛容を回復し、アポトーシスを誘導することによってNODマウスの病的なメモリーT細胞を選択的に排除することができることも示されている(Ryu et al., Journal of Clinical Investigations, 108: 31-33, 2001)。従って、重症の糖尿病動物をTNF-α(または内因性TNF-α産生のインデューサー)および(病原性の未処理のT細胞を再選択するための)MHCクラスI抗原に関して部分的または完全に一致している脾細胞で同時治療することにより、確立されている糖尿病の永久的な回復を生ずる。この「治癒」は、正常マウスにおいて見られるものと識別不可能なように血中グルコース濃度を制御することができるインスリン分泌島が治療後の動物の膵臓に再出現することを伴う。
【０００５】
哺乳動物成体の骨髄に多能性幹細胞が存在することは十分に実証されている。骨髄外の多能性細胞の存在も証明されている(Kuehnle and Goodell, Br. Med. J. 325: 372-6; 2002; Rosenthal, New Eng. J. Med. 349: 267-74; 2003)。MHCが一致する骨髄細胞を全身照射宿主に導入すると、宿主骨髄を再増殖させ、稀な例では、組織特異的細胞が散逸している肝臓、脳、筋肉および心臓を含む宿主実質臓器のドナー生着が生じることをマウスおよびヒトにおける検討は示している。しかし、このような生着は頑強でもなければ、耐久性もない。培養下では、多能性細胞は中胚葉、神経外胚葉および内胚葉に分化することもできる(Jiang et al., Nature 418: 41, 2002)。おそらく、移植検討におけるドナー起源の非リンパ系細胞は、ある種の成体細胞種類の別の種類への転換である分化転換産物である。さらに、培養中の成体骨髄幹細胞は、低頻度であるが、同時培養中の胚細胞と融合することがある。宿主全身照射し、骨髄細胞を移植した後に肝障害のマウスモデルの残りの肝組織においてさらに頑強な融合事象が生じる。しかし、このような融合は染色体異常が顕著な細胞を生じ、分化転換または発生上の可塑性を示さない。幹細胞がヒトにおいて治療目的のために使用される予定の場合には、培養中の多能性細胞またはインビボにおけるそれらの融合派生物の一部の機能または悪性化の可能性についての懸念も生じている。
【０００６】
成体の多能性細胞を使用して損傷組織を再生する方法の必要性が存在する。望ましくは、多能性細胞は障害を生じる前処理(例えば、照射または化学的処理)をほとんどもしくは全く必要としないか、または内因性起源由来で、誘導もしくは刺激される。理想的には、再生方法は、自己免疫発作によって生じる組織損傷に適用可能であるだけでなく、非自己免疫性損傷にも適用可能であると思われる。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、哺乳動物(例えば、ヒト被験者)において臓器または組織を再生する方法を提供する。従って、第一の局面において、本発明は、所定の種類の細胞が損傷または障害されている哺乳動物の臓器または組織において所定の種類の機能細胞の数を増加または維持する方法であって、Hox11遺伝子を発現する多能性細胞が濃縮されている組成物を哺乳動物に投与する段階を含む方法を特徴とする。一態様において、Hox11遺伝子発現多能性細胞は、Hox11遺伝子を形質移入した多能性または全能性細胞に由来する。
【０００８】
別の局面において、本発明は、所定の種類の細胞が損傷もしくは障害されている、または所定の種類の細胞が欠損している哺乳動物の臓器または組織において所定の種類の機能的細胞の数を増加または維持する方法であって、CD45(-)であるが、ただし骨髄細胞または筋細胞ではない多能性細胞が濃縮されている組成物を哺乳動物に投与する段階を含む方法を特徴とする。本発明に有用なCD45(-)多能性細胞の例には、抹消血リンパ球、臍帯血細胞、および脾細胞が挙げられる。好ましくは、多能性細胞は脾細胞である。
【０００９】
本発明の方法に使用される多能性細胞は半同種(semi-allogeneic)または同質(isogeneic)であってもよい。本発明の組成物のいずれかは、組成物が投与される哺乳動物によって発現されるMHCクラスI対立遺伝子に一致する少なくとも1つの対立遺伝子を有するMHCクラスIおよび哺乳動物の内因性の細胞に由来するペプチドを提示する部分(例えば、細胞)をさらに含んでもよい。
【００１０】
CD45タンパク質を発現しない細胞において濃縮されている組成物または細胞集団は、例えば、多能性細胞を含有する脾臓などの哺乳動物抹消血または組織を提供し；細胞表面においてCD45タンパク質を主に発現する第1の細胞集団(すなわち、主にCD45(+)である細胞集団)および細胞表面においてCD45タンパク質を主に発現しない第2の細胞集団(すなわち、主にCD45(-)である細胞集団)に多能性細胞をさらに分離し；および第2の細胞集団を選択することによって得ることができる。主にCD45(-)である細胞集団は、細胞表面においてこのタンパク質を発現しない細胞を、このタンパク質を発現する細胞より多く含有するものである。望ましくは、第2の細胞集団の少なくとも75%、さらに望ましくは少なくとも90%、最も望ましくは少なくとも95%が、CD45を発現しない細胞で占められている。CD45(-)細胞集団は、アフィニティークロマトグラフィーを使用することによってまたは細胞選別技法によってCD45発現細胞を除去することによって得られる。
【００１１】
本発明の方法のいずれかにおいて、臓器または組織は多能性細胞組成物を投与する前に刺激される。刺激は、新たな細胞増殖のために臓器または組織を損傷するまたは作製する薬剤の使用を含んでもよい。刺激剤には、TNF-α、TNF-αアゴニストまたは例えば、完全フロインドアジュバント(CFA)、ISS-ODN、LPS様活性を有する微生物細胞壁成分、コレラ粒子、大腸菌易熱性エンテロトキシン、レシチンベシクルと複合体形成した大腸菌易熱性エンテロトキシン、ISCOMS免疫刺激複合体、ポリエチレングリコール、ポリ(N-2-(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)、CpGまたはCpAモチーフを含有する合成オリゴヌクレオチド、モノホスホリル脂質A、MPL、カルメット-ゲラン桿菌、γインターフェロン、組織プラスミノーゲン活性化因子、LPS、インターロイキン1、インターロイキン2、UV光線、リンフォトキシン、カケクチン、TNFR-1アゴニスト、TNFR-2アゴニスト、TNF-αシグナル伝達経路の細胞内メディエーター、NFκB誘導物質、IRF-1、STAT1、リンフォカインまたはTNF-αと抗TNFR-1抗体の組み合わせが挙げられる。好ましくは、刺激剤はTNF-α、BCG、γインターフェロンまたはCFAである。刺激剤は、多能性細胞組成物投与前の任意の時間、好ましくは、6〜12時間前に投与してもよい。
【００１２】
別の実施態様において、CD45(-)および／またはHox11発現多能性細胞は、レチノイン酸受容体、エストロゲン受容体、EGF受容体、CD49b、VLA2、CD41、LFA-1、ITB2、CD29、NTC3受容体、プラスミノーゲン受容体、トランスフェリン受容体、TGF受容体、PDGF受容体、甲状腺成長ホルモン受容体およびインテグリンβ5からなる群より選択される1つまたは複数の細胞表面マーカーを含有する。
【００１３】
さらに別の態様において、多能性細胞集団におけるHox11発現はエクスビボにおいて誘導され、次にHox11-多能性細胞組成物を哺乳動物に投与することができる。本発明の方法において、多能性細胞組成物は1回以上投与することができる。典型的には、組成物は毎日、週2回または毎週追加され、投与頻度は療法に対する治療中の被験者の応答(すなわち、所定の種類の臓器または組織の再生の成功)に依存する。
【００１４】
本発明の方法のいずれかにおいて、組織/臓器再生の対象である所定の種類の障害細胞は、膵臓(内分泌または外分泌)、唾液腺、下垂体、腎臓、心臓、嗅腺、耳、骨、肝臓、脳(小脳、後脳-中脳、脳神経、パリオ-サブパリアル境界(pallio-subpallial boundary)、大脳、前脳および上腕弓(brachial arch)を含む)、抹消神経系、中枢神経系、脊髄、乳腺または精巣の細胞であってもよい。
【００１５】
別の局面において、本発明は、所定の種類の細胞が損傷もしくは障害されている、または所定の種類の細胞が欠損している哺乳動物の臓器または組織において所定の種類の機能的細胞の数を増加または維持する方法であって、多能性または全能性細胞、好ましくは、半同種または同質多能性細胞およびHox11遺伝子、好ましくは、ヒトHox11遺伝子の形質移入によって生じる多能性細胞を含有する組成物を哺乳動物に投与する段階を含む方法を特徴とする。好ましくは、多能性細胞の形質移入によってHox11遺伝子が発現される。最も好ましくは、形質移入される細胞はCD45(-)である。一態様において、多能性細胞は脾細胞であるかまたは臍帯血から得られる。別の態様において、形質移入される細胞は、膵臓細胞、脾臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞または骨細胞に分化することができ、最も好ましくは、膵臓細胞に分化することができる。
【００１６】
別の局面において、本発明は、所定の種類の細胞が損傷もしくは障害されている、または所定の種類の細胞が欠損している哺乳動物の臓器または組織において所定の種類の機能的細胞の数を増加または維持する方法であって、CD45(-)および／またはHox11発現多能性細胞を誘導および／または刺激する薬剤を哺乳動物に投与する段階を含む方法を特徴とする。一態様において、多能性細胞は骨髄細胞ではない。
【００１７】
Hox11発現多能性細胞の一態様において、薬剤はプロモーターに機能的に結合しているHox11遺伝子を含む遺伝子治療ベクターであり、ベクターは多能性細胞においてHox11を誘導する。別の態様において、好適な薬剤は、CD45(-)および／またはHox11発現多能性細胞を誘導もしくは刺激するサイトカイン、ケモカインもしくは増殖因子である、またはそれを誘導もしくは刺激するものである。これらの薬剤の例は、上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、形質転換増殖因子β(TGF-β)、形質転換増殖因子α(TGF-α)、血管内皮増殖因子(VEGF)、エリスロポイエチン(Epo)、インスリン様増殖因子I(IGF-I)、インスリン様増殖因子II(IGF-II)、インターロイキン、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、腫瘍壊死因子β(TNF-β)、γインターフェロン (INF-γ)、ストロマ細胞由来因子1(SDF-1)およびコロニー刺激因子(CSF)からなる群より選択されうる。
【００１８】
別の態様において、CD45(-)および／またはHox11発現多能性細胞は、哺乳動物に刺激/誘導剤を投与する前後に定量される。定量は、第1のマーカー、好ましくは、Hox11発現細胞におけるHox11遺伝子発現の結果であるマーカー、またはレチノイン酸受容体、エストロゲン受容体、EGF受容体、CD49b、VLA2、CD41、LFA-1、ITB2、CD29、NTC3受容体、プラスミノーゲン受容体、トランスフェリン受容体、TGF受容体、PDGF受容体、甲状腺成長ホルモン受容体およびインテグリンβ5からなる群より選択されるものを検出することによって支援されうる。定量は、対照細胞集団または第2の多能性細胞集団によって発現され、CD45(-)および／またはHox11発現多能性細胞上に存在しない第2のマーカーを検出することによってさらに支援されうる。第1のマーカーを検出するために使用される方法は、好ましくは、マーカーの結合定数が1.0 μＭ以下のマーカーに特異的な抗体の使用を含んでもよい。CD45(-)および／またはHox11発現細胞の相対的な増加または減少は、組成物投与前後において第2のマーカーに対する第1のマーカーの比を比較することによって評価することができる。CD45(-)および／またはHox11発現細胞刺激/誘導剤を投与することによりCD45(-)および／またはHox11発現多能性細胞が増加しないと判定された場合には、同じ刺激/誘導剤の追加の量または異なる刺激/誘導剤を哺乳動物に投与してもよい。
【００１９】
別の局面において、本発明は、所定の種類の細胞が損傷もしくは障害されている、または所定の種類の細胞が欠損している哺乳動物の臓器または組織において所定の種類の機能的細胞の数を増加または維持する方法であって、多能性細胞の輸送、分化、または増殖を妨害または防止する細胞集団(例えば、Tリンパ球など)を選択的に阻害(例えば、老化の誘導によって)、除去するまたは死滅させる薬剤を哺乳動物に投与する段階を含む方法を特徴とする。多能性細胞は同質または半同種であってもよい。好ましくは、これらの細胞はHox11を発現するおよび／またはCD45(-)である。次いで、薬剤の反復投与または異なる薬剤の投与を治療中適宜実施してもよい。一例において、患者の血液試料を入手し、例えば、FACS分析などの当業者に公知の技法によって感受性細胞を定量することによって、アポトーシスに対する感受性が上昇しているTリンパ球(例えば、CD180の発現が欠損している)のレベルを評価することができる。アポトーシスに感受性のTリンパ球を減少または排除するために適宜薬剤を追加してもよい。
【００２０】
本発明の方法のいずれかは、多能性細胞組成物を投与する前に所定の種類の臓器または組織細胞の障害または刺激を誘導することをさらに含んでもよい。本発明の方法はまた、CD45(-)および／またはHox11発現多能性細胞組成物またはCD45(-)および／またはHox11発現多能性細胞を刺激もしくは誘導する薬剤の投与前、投与中または投与後に、多能性細胞の輸送、分化、または増殖を妨害または防止する細胞集団を選択的に阻害、除去または死滅させる薬剤の投与を含んでもよい。先に記載するように、薬剤の反復投与または異なる薬剤の投与を治療中に適宜実施してもよい。
【００２１】
多能性細胞の輸送、分化、または増殖を妨害または防止する細胞集団(例えば、Tリンパ球など)を選択的に阻害、除去するまたは死滅させる薬剤には、例えば、完全フロインドアジュバント(CFA)、ISS-ODN、LPS様活性を有する微生物細胞壁成分、コレラ粒子、大腸菌易熱性エンテロトキシン、レシチンベシクルと複合体形成した大腸菌易熱性エンテロトキシン、ISCOMS免疫刺激複合体、ポリエチレングリコール、ポリ(N-2-(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)、CpGまたはCpAモチーフを含有する合成オリゴヌクレオチド、モノホスホリル脂質A、カルメット-ゲラン桿菌、γインターフェロン、組織プラスミノーゲン活性化因子、LPS、インターロイキン1、インターロイキン2、UV光線、リンフォトキシン、カケクチン、TNFR-1アゴニスト、TNFR-2アゴニスト、TNF-αシグナル伝達経路の細胞内メディエーター、NFκB誘導物質、IRF-1、STAT1、リンフォカインまたはTNF-αと抗TNFR-1抗体の組み合わせなどの物質を含むTNF-α、TNF-αアゴニストまたはTNF-α誘導物質が挙げられる。好ましくは、薬剤はTNF-α、CFA、γインターフェロンまたはBCGである。
【００２２】
Tリンパ球減少症を誘発する化合物の他の例には、TNF受容体スーパーファミリー(例えば、TNF受容体1または2、Trail-R1、Trail-R2、Trail-R3、Trail-R4、OPG、Rank、Fn14、DR6、Hvem、LtbetaR、DcR3、Tramp、Fas、CD40、CD30、CD27、4-1BB、OX40、Gitr、Ngfr、BCMA、Taxi、Baff-r、EDAR、Xedar、Troy、ReltまたはCD95L)の1つ以上のメンバーに結合またはそれを活性化する化合物が挙げられる。治療剤にはTNF受容体スーパーファミリーサイトカインアゴニストまたはサイトカインアゴニスト抗体を挙げることができる。TNF-αを直接または間接的に増加する追加の化合物は、TNF-α発現レベルまたは活性の通常のスクリーニングアッセイを使用して容易に同定することができる。望ましくは、Tリンパ球減少症の誘発剤はまた、臓器形成を促進する、ドナー細胞(例えば、血液細胞)の望ましい細胞種への分化を促進する、および／または所定の細胞種の宿主細胞への障害を誘導してドナー細胞の望ましい臓器への組み込みを促進する。いくつかの態様において、一過的なTリンパ球減少症は、患者の自己免疫細胞(例えば、自己反応抗体を産生するB細胞、提示された自己エピトープによって活性化されるT細胞、または抗原提示が欠損している抗原提示細胞のサブセット)の少なくとも10、20、30、40、50、60、80、90、95または100%を破壊するのに十分な期間にわたって誘発される。いくつかの態様において、未処理のT細胞を死滅させる薬剤はBCGまたはFASではない。
【００２３】
Tリンパ球減少症を誘発するために哺乳動物に投与することができる他の薬剤には、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-18、INF-α、IFN-β、IFN-γ、TFG-β、PDGFおよび／またはVEGF、ならびにTLR1、TLR2、TLR6、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7および／またはTLR9の小分子または抗体アゴニストが挙げられる。BCG以外に、BCG、BLP、フィブロネクチンドメインA、リポアラビノマンナン、LPS結合タンパク質、LPS、リポテイコ酸、マクロファージ刺激リポペプチド2、マンノシル化ホスファチジルイノシトールペプチドグリカン、呼吸器合胞体ウイルスタンパク質Fおよび可溶性結核因子などの種々の組成物の生物製剤も適宜Tリンパ球減少症を誘発するために投与することができる。
【００２４】
本発明の方法のいずれかは、自己免疫、例えば、糖尿病、免疫学的に媒介される糸球体腎炎、慢性肝炎、原発性胆汁性肝硬変または原発性硬化性胆管炎を有する哺乳動物(例えば、ヒト患者)を治療するために使用することができる。
【００２５】
別の局面において、本発明は、集団の少なくとも75%がCD45(-)である単離されたHox11発現多能性細胞集団を特徴とする。一態様において、細胞集団の少なくとも90%はCD45(-)である。別の態様において、細胞集団は、レチノイン酸受容体、エストロゲン受容体、EGF受容体、CD49b、VLA2、CD41、LFA-1、ITB2、CD29、NTC3受容体、プラスミノーゲン受容体、トランスフェリン受容体、TGF受容体、PDGF受容体、甲状腺成長ホルモン受容体およびインテグリンβ5からなる群より選択される1つ以上の細胞表面マーカーを含有する。CD45を発現しない細胞が濃縮されている細胞集団の単離は本明細書に先に記載されているように実施する。好ましくは、多能性細胞集団は精製された脾臓細胞集団である。細胞集団は、上記の細胞表面マーカーの1つ以上を使用する当技術分野において公知の標準的なアフィニティー技法によりさらに精製することができる。
【００２６】
別の局面において、本発明は、集団の少なくとも75%がHox11を発現する単離されたCD45(-)多能性細胞集団を特徴とする。一態様において、細胞集団の少なくとも90%がHox11を発現する。別の態様において、細胞集団は、レチノイン酸受容体、エストロゲン受容体、EGF受容体、CD49b、VLA2、CD41、LFA-1、ITB2、CD29、NTC3受容体、プラスミノーゲン受容体、トランスフェリン受容体、TGF受容体、PDGF受容体、甲状腺成長ホルモン受容体およびインテグリンβ5からなる群より選択される1つ以上の細胞表面マーカーを含有する。CD45を発現しない細胞が濃縮されている細胞集団の単離は本明細書に先に記載されているように実施する。好ましくは、多能性細胞集団は精製された脾臓細胞集団である。細胞集団は、上記の細胞表面マーカーの1つ以上を使用する当技術分野において公知の標準的なアフィニティー技法によりさらに精製することができる。
【００２７】
さらに別の局面において、本発明は、膵臓細胞、脾臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、神経細胞および骨細胞からなる群より選択される細胞に分化することができる、Hox11遺伝子、好ましくは、ヒトHox11遺伝子を形質移入し、多能性細胞を特徴とする。好ましい態様において、細胞は臍帯血または脾臓に由来する。最も好ましい態様において、細胞はCD45を発現しない。
【００２８】
定義
「自己免疫疾患」とは、免疫系の応答が自己エピトープに対して形成される疾患を意味する。自己免疫疾患の一部の例には、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、セリアック-スプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、チャーグ-ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円盤状狼瘡、本態性混合型(mixed)クリオグロブリン血症、線維筋痛-繊維筋炎、グレーブス病、ギラン-バレー、橋本甲状腺炎、甲状腺機能低下症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎障害、インスリン依存性糖尿病、若年性関節炎、扁平苔癬、狼瘡、メニエール病、混合型結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多発性分泌腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびに重症筋無力症が挙げられる。
【００２９】
本発明において、MHCクラスIとペプチドの複合体(MHC class I and peputide complex)は、病的な(例えば、自己免疫性)T細胞を排除することによってT細胞選択を修復するために使用することができる。本明細書において使用する「MHCクラスIとペプチド(MHC class I and peputide)」という用語は、天然型複合体(すなわち、未変性の抗原由来ペプチドとのMHC複合体)および未変性の抗原由来ペプチドと異なるが、本発明による機能的細胞を維持するのに効果的であるクラスIと複合体を形成することができるペプチドとの複合体を含む。未変性の抗原由来ペプチドと異なる例示的なペプチドは、非天然型アミノ酸、例えば、D-アミノ酸および天然型アミノ酸を含んでもよい。有用なMHCペプチド複合体には、2つ以上の宿主T細胞受容体に架橋するための結合型複合体であるものが挙げられる。結合型複合体は高い親和性を有するので、自己反応性T細胞の除去に効果的となりうる。MHCクラスIとペプチドの複合体はまた、外部結合溝を含むが、保存領域が除去または改変されているMHC断片を含んでもよい。MHCクラスIと自己ペプチドの複合体は結晶化されており、得られた結晶構造は、未変性の複合体と同一または類似するT細胞受容体に結合している可溶性化合物を形成するために使用されている。これらの可溶性化合物も本発明の方法に使用することができる。
【００３０】
MHCクラスIとペプチドの好ましい複合体は、長さ8〜10残基のアミノ酸鎖がMHCクラスI分子と適切に複合体形成したものであり、MHCクラスI分子は半同種である、すなわち、ドナーとレシピエント間において少なくとも一方のMHCクラスI対立遺伝子がミスマッチで、少なくとも一方のMHCクラスI対立遺伝子がマッチしているか、または同系(syngeneic)である、すなわち、全てのMHCクラスI対立遺伝子がドナーとレシピエント間でマッチしている。MHCクラスIとペプチドの複合体は免疫系の再教育または再選択に寄与する。
【００３１】
MHCクラスIと自己ペプチドの複合体は正常なリンパ球から収集することができる。または、MHCクラスIと自己ペプチドの複合体は大腸菌または真核細胞において発現され、次いで投与前にインビトロにおいて抗原性ペプチドと共にリフォールディングされてもよい。いくつかの態様において、MHCクラスIとペプチドは、患者に投与される細胞の表面に存在する。MHCクラスIとペプチドの他の複合体は、細胞の表面において発現されない可溶性複合体である。特定の態様において、ペプチドをMHCクラスI断片に結合させる条件下において公知の方法によりMHCクラスIの細胞外領域(例えば、MHCクラスIのFab断片)または可溶性完全長のMHCクラスIを、1つ以上のペプチドと共にインキュベーションし、得られたMHCクラスIとペプチドの複合体を患者に投与する。他の態様においては、MHCクラスIとペプチドの混合物を患者に投与してMHCクラスIおよびペプチドが患者への投与後にインビボにおいて結合させる、またはMHCクラスIとペプチドの多数の複合体を投与する。いくつかの態様において、投与されたMHCクラスIは、患者によって発現されるMHCクラスIと少なくとも60、70、80、90、95または100%の配列の同一性をもつ1、2、3、または4つの対立遺伝子を有する。配列の同一性は、典型的には、明記されているデフォルトパラメーターを用いる配列分析ソフトウェアを使用して測定される(例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)。このソフトウェアプログラムは、種々の置換、欠損および他の改変に対する相同性の程度を割り当てることによって同様の配列を一致させる。
【００３２】
「CD45(-)」または「CD45を発現しない細胞」とは、免疫蛍光分析によってCD45受容体を発現しない細胞、または細胞の少なくとも75%(例えば、80%、90%または95%など)が免疫蛍光分析によってCD45受容体を発現しない細胞集団を意味する。
【００３３】
「機能的細胞」とは、インビボにおける正常な活性を実行する細胞を意味する。本発明のある望ましい態様において、細胞は、MHCクラスIに関連して内因性自己ペプチドを発現することができる。
【００３４】
「Hox11発現細胞」とは、RNA分析によってHox11を発現する細胞、または細胞の少なくとも75%(例えば、80%、90%または95%など)がRNA分析によってHox11を発現する細胞集団を意味する。
【００３５】
機能的細胞に言及して使用される場合の「所定の種類」とは、規定された細胞種を意味する。例えば、膵臓において機能的な島細胞の数を増加または維持するために、本発明の方法を実施することを当業者は決定することができる。この例では、所定の種類の細胞は島細胞または島前駆体細胞である。
【００３６】
「主に発現する」とは、細胞の少なくとも75%(例えば、80%、90%または95%など)が、そのフレーズが言及する特徴(例えば、細胞表面マーカー)を発現する細胞集団を意味する。
【００３７】
標準的なアッセイを使用して、投与された細胞がインビボにおいて所定細胞種の細胞を形成するかどうか判定することができる。例えば、細胞は、標準的なウェスタンもしくは免疫蛍光分析を使用して特定のタンパク質(例えば、所定の細胞種に特異的なタンパク質)の発現について分析することができ、またはcDNAアレイを使用して特定のmRNA分子(例えば、所定の細胞種に特異的なmRNA分子)の発現について分析することができる(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 2000)。投与された細胞が望ましい細胞種に変換されたかどうかを判定するために分析することができる投与された細胞の他の特徴の例には、細胞サイズ、細胞形態、細胞質の容量および細胞の機能(例えば、インスリンまたは他のホルモンの産生)が挙げられる。
【００３８】
「半同種」とは、種が同一で異なる個体の同じ種類の細胞間における少なくとも1つのマーカー、例えば、MHCクラス対立遺伝子のマッチを意味する。望ましくは、少なくとも2つまたは3つのMHCクラスI対立遺伝子がドナーと宿主間で一致する。ドナー細胞によって発現されるMHCクラスI対立遺伝子がレシピエントによって発現されるMHCクラスI対立遺伝子に一致するかどうかを判定するために標準的な方法を使用することができる。例えば、特定のMHCクラスI対立遺伝子に特異的な抗体は、どの対立遺伝子が発現されるかを判定するために使用することができる。または、MHCクラスI対立遺伝子をコードする核酸のPCR増幅を使用することができる。
【００３９】
「同系ドナー細胞」または「同質ドナー細胞」とは、(i)レシピエントの細胞に対してHLA領域が遺伝子的に同一であるもしくはマッチしている(すなわち、レシピエントの細胞に共通する少なくとも4つ、好ましくは、6つ全ての標準的なマーカーを有する)ドナー細胞または(ii)入手元の患者と同じ患者に再投与されるドナー細胞を意味する。
【００４０】
「TNF-α誘導剤」とは、望ましくは、内因性TNF-αを発現させる、TNF-αの分泌を増強する、またはTNF-αのバイオアベイラビリティーもしくは安定性を増強する化合物である。しかし、TNF-αアゴニスト、TNF-αシグナル伝達を刺激するもしくは受容体後のTNF-α作用を増強する薬剤、または自己免疫細胞の細胞死を促進させる経路に作用する薬剤もこの定義に含まれる。TNF-α誘導の刺激(例えば、CFAの投与による)は、望ましくは、インビボにおける細胞の(植え込みまたは注射による)投与前、投与後または投与中に実施される。
【００４１】
同様に、他の「誘導剤」は、サイレント遺伝子の内因性細胞への活性化によってまたは外因性遺伝子の内因性細胞への挿入(例えば、遺伝子治療アプローチによる)によって遺伝子産物の発現を生ずることができる。遺伝子治療アプローチは当業者に公知である(例えば、米国特許第6,384,202号参照)。
【００４２】
「血液細胞を選択的に死滅させる」とは、未刺激細胞または刺激された細胞の亜集団などの血液細胞の亜集団(例えば、T細胞もしくはB細胞などの自己反応性リンパ球または欠損抗原提示細胞)の数または相対的な割合を直接または間接的に低下させることを意味する。望ましい態様において、亜集団はT細胞、B細胞またはマクロファージである。望ましくは、死滅させられるメモリーT細胞は自己免疫T細胞、すなわち、提示された自己エピトープによって活性化されるT細胞である。望ましい態様において、死滅させられる未変性のT細胞は、自己免疫T細胞になると思われる細胞である。望ましくは、自己免疫T細胞または自己免疫T細胞になると思われる細胞の数は、健康な非自己免疫T細胞の数が減少する少なくとも25、50、100、200または500%以上減少する。いくつかの態様において、自己免疫T細胞または自己免疫T細胞になると思われる細胞の数は、標準的な方法を使用して測定するとき、少なくとも25、50、75、80、90、95または100%減少する。T細胞は、アポトーシス、壊死および／または活性化後細胞死などの任意の経路により死滅させることができる。アポトーシスは、カスパーゼ依存的細胞収縮、核の凝結またはDNAの核内分解を検出することによってアッセイすることができる。壊死は、カスパーゼ-非依存的細胞膨潤、細胞の分解または細胞質物質の放出によって認識することができる。壊死により後期ミトコンドリア損傷を生じるが、チトクロームCは放出されない。いくつかの態様において、メモリーT細胞はアポトーシスによって死滅され、未変性のT細胞は壊死によって死滅される。狼瘡の治療には、望ましくはB細胞が死滅されるか、または別の方法として、それらは発生学上成熟される。
【００４３】
「刺激された細胞」、「刺激された臓器」または「刺激された組織」とは、抗原または細胞-表面受容体のリガンド(例えば、アポトーシスを誘導する受容体のリガンドなど)に暴露された、それぞれ、細胞(例えば、メモリーT細胞、B細胞またはマクロファージ)、臓器または組織を意味する。
【００４４】
「未刺激の細胞」、「未刺激の臓器」または「未刺激の組織」とは、抗原または細胞-表面受容体のリガンドに暴露されていない、それぞれ、細胞(例えば、未処理のT細胞、B細胞またはマクロファージ)、臓器または組織を意味する。
【００４５】
本明細書において使用する「全能性細胞」という用語は、全ての系統の細胞に発生することができる細胞をいう。同様に「全能性細胞集団」という用語は、全ての細胞系統に発生することができる細胞の組成物をいう。また本明細書において使用する「多能性細胞」という用語は種々の系統(全ての系統ではないが)に発生することができる細胞をいう。「多能性細胞集団」は、全てではない細胞系統に発生することができる細胞の組成物をいう。定義により、全能性細胞または細胞組成物は多能性細胞または細胞組成物より発生の程度が低い。
【００４６】
詳細な説明
糖尿病NOD成獣マウス(H-2KdDb)におけるほぼ正常な膵島組織構造(histology)の回復および高血糖の長期回復のための治療プロトコールは、最初の記載(Ryu et al., Journal of Clinical Investigations, 108: 31-33, 2001)以来、MHCクラスI抗原が部分的一致している(C57BL/6；H-2KbDb)または完全に一致している(CByF1B6F1/J(CByB6F1)；H-2KbKdDbDd)脾細胞の週2回注射による40日の治療ならびにTNF-αの反復投与または完全フロインドアジュバント(CFA)の単回注射を含むように最適化されており、後者は内因性TNF-αおよび他のサイトカインの産生を誘導する。好ましくは、ドナー脾細胞は少なくとも1つのMHCクラスI分子が一致し、さらに好ましくは、2つのMHCクラスI対立遺伝子が一致している。この治療の効率は、同系島の移植、アルギネート-カプセル化した島の腹腔内移植またはインスリンの適当な投与によって正常血糖を同時に生ずることによっても増加させることができる。
【００４７】
末期糖尿病NODマウスにおける自己免疫の回復は膵臓における機能的島の再出現を伴った。半同種生脾細胞で治療した雌NODマウスは、雄脾臓由来細胞の成熟した島実質細胞への安定な分化転換を呈した。脳、肝臓および腎臓を含む臓器への雄脾細胞の生着、分化転換または融合の徴候は観察されず、観察される低レベルの造血系へのキメラ化以外には、ドナー細胞の顕著な取り込みは患部膵臓に選択的であることを示唆している。
【００４８】
従って、自己免疫の回復への寄与以外に、ドナー脾細胞は、成獣の脾臓由来細胞の成熟した島実質細胞への安定な分化転換を発現することによって、NODマウス宿主における膵島の再生にも直接寄与することができ、治療成果の成功が宿主膵臓からのインスリン分泌のみによる哺乳動物の糖尿病の治療プロトコールを生ずることを本発明者は見出した。
【００４９】
Hox11遺伝子が発現されるが、CD45タンパク質を発現しない多能性細胞の投与は、自己抗原を提示することによって未処理のT細胞の教育を媒介し、島細胞への分化を受けることも本発明者は見出した。
【００５０】
胚性肝細胞は、内皮および内胚葉細胞に分化することができるという点において多能性であり、それらはCD45の表面発現を欠損している。膵臓は、内胚葉上皮細胞の増殖およびこれらの細胞による周囲間充組織の侵襲の結果としてマウスにおいて胎日数(E) 9.5日後に形成される。隣接する脾臓は臓側中胚葉から誘導され、Hox11ホメオボックス遺伝子の発現は脾臓多能性細胞の分化に必須である(Roberts et al., Nature 368: 747-9, 1994)。Hox11が欠損するマウスは脾臓を欠損している；対応する幹細胞は分化経路を変更し、膵臓の発生に寄与する(Kanzler et al., Dev. Biol. 234: 231-43, 2001)。
【００５１】
照射脾細胞で治療した糖尿病NODマウスは正常血糖の長期回復を示すが、生脾細胞で治療したNOD動物において明らかなものより動態が顕著に低く、糖尿病NOD成獣マウスは、根本的な自己免疫疾患が排除されると、新たな同系島組織を生じることができる内因性前駆細胞を含有することを示唆していることを本明細書に示すデータは示している。
【００５２】
ドナーCD45(+)脾細胞は、MHCクラスIと自己ペプチドの複合体の寄与の結果としての疾患の回復に必須であるが、島発生に直接関与することができる細胞を含有しないことも本明細書に示すデータは示している。
【００５３】
従って、(照射細胞が投与されるNOD宿主において明らかである)内因性細胞に依存する遅い島再生と比較して、生脾細胞で治療した糖尿病NODマウスにおける島細胞の迅速な再生は、ドナー脾臓細胞に存在する多能性細胞の動員によること、およびドナー生脾細胞は、おそらく自己抗原の提示によって未処理のT細胞の教育を媒介することによって自己免疫の回復に寄与しただけでなく、島細胞への分化を受ける細胞(Hox11+CD45(-)前駆細胞)を提供したことが提案されている。
【００５４】
本発明の実施例に記載するNODマウスを用いる検討は、ヒトにおける糖尿病または他の自己免疫疾患の治療の適応を有しうる。成体の脾臓細胞集団が確立されている糖尿病を永久的に回復させる能力および新たな島を生ずることができるNODマウスの内因性幹細胞集団の存在は、自己免疫性糖尿病を回復させる治療は外因性成体島の移植を組み入れる必要がないことを示している。
【００５５】
材料と方法
動物、細胞および疾患の治療
NOD雌マウス(Taconic Farms, Germantown, NY)および雄CByF1B6F1/J(CByB6F1)マウス(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)は無菌条件下で維持した。NOD雌は、体重および血糖をモニタリングすることによって糖尿病の発症についてスクリーニングし、体重低下後の糖尿病の診断は2回連続する>400 mg/dLの血糖濃度を伴った。糖尿病は、本発明の検討中NODコロニーにおいて40週齢までに雌の〜80%において発症した。糖尿病末期には、膵臓組織構造は、識別可能な島組織のほぼ完全な消失および根底の島の障害を不明瞭にする可能性のある膵島炎団の消失を明らかにした(表1、図5D)。
【００５６】
NOD雌を治療するための脾細胞はCByB6F1(H-2KbKdDbDd)雄マウスから誘導した。照射は、脾細胞を137Cs線源の30 Gyのイオン化照射に暴露した。脾細胞(9×106)は、尾静脈を介して週2回40日間NODレシピエント(H-2KdDb)に注射した。完全フロインドアジュバント(CFA, Difco, Detroit, MI)は使用直前に等容量の生理食塩液と混合し、次いで島移植時または初回の脾細胞注射と同時に各後足のパッドに注射した(50μL)。このモデルでは、CFAによる内因性TNF-αの誘導は、TNF-αの直接投与と同様に効果的である。
【００５７】
CD45(+)脾細胞およびCD45(-)脾細胞をCByB6F1ドナーマウスから分離するのは、ピンセットで機械的に裂いた全脾臓組織からマウス特異的CD45 MicroBeads(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)を使用することによって前者の細胞を単離することにより実施した。CD45(+)脾細胞またはCD45(-)脾細胞(4×105〜5×105)を前糖尿病NOD雌に週2回2週間注射した。レシピエントにはCFAの単回注射も実施し、血糖濃度を120日または17週間モニターした。
【００５８】
高感度緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子導入雄(+/-)マウス(C57BL/6-TgH(ACTbEGFP)10sb)を購入し(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)、BALB/c雌マウスと交配させて、CByB6F1-GFP遺伝子型の雄F1子孫を作製した。ニワトリβアクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルスエンハンサーの制御下の「高感度」GFP cDNAを有するGFP遺伝子導入マウスは、励起光によってのみ緑色を呈する全てではないがほとんどの組織を作製する。(JaxMice Data Sheet, Bar Harbor, ME)。GFP発光のためのランゲルハンス島は免疫組織化学のための抗GFP抗体を必要とし、励起により最小自己蛍光を有した。
【００５９】
島移植
一時的な正常血糖の維持のための島移植は、左腎被膜の下側に若い(5〜7週齢)の前糖尿病NOD雌から単離直後の650の同系島を外科的に植え込むことによって実施した。外因性の島は片側の腎摘出によって切除した。
【００６０】
Glucometer Elite装置(Bayer, Mishawaka, IN)を用いて非絶食動物の眼窩血の糖濃度を移植後週2〜3回モニターし、糖濃度が手術後24時間以内に<150 mg/dLに低下した場合には移植は成功であると考えた。体重も週2〜3回モニターした。血糖濃度が2回連続して>250 mg/dLに増加した場合には、島移植片は拒絶されたと考えられた。
【００６１】
フローサイトメトリー
脾臓はステンレス鋼製ふるいで穏やかに分割し、得られた脾臓細胞懸濁液および眼窩静脈から採取したヘパリン処理済み血液は、0.83% NH4Clを含有する溶液に5分接触させることによって赤血球細胞を除去した。次いで、H-2Kbに対するフィコエリスリン結合マウスモノクローナル抗体およびH-2Kdに対するFITC結合マウスモノクローナル抗体抗体(Becton-Dickinson, San Diego, CA)でリンパ球を染色し、その後それら(試料あたり>10,000細胞)にFACScan装置(Becton-Dickinson)を用いてフローサイトメトリーを実施した。
【００６２】
組織構造および免疫蛍光染色
NODマウスは頚椎脱臼によって屠殺し、膵臓を速やかに切除し、パラフィン-包埋または凍結保存切片の調製のために固定した。5μm〜15μmの連続切片は、ヘマトキシリン-エオシン染色のためにホルマリン(10%)で1時間固定し、免疫蛍光分析のためにアセトン(100%)で4℃において10分固定し、次いでリン酸緩衝生理食塩液(PBS)で3回洗浄した。抗体の非特異的結合を防止するためにPBS中で5%マウス血清と共に30分間インキュベーション後、切片をマウスCD45に対するラットモノクローナル抗体(1:25希釈)(NeoMarkers, Fremont, CA)またはインスリンに対するモルモット抗体(1:100)(Linco, St. Charles, MD)または抗GFPに対するウサグ抗体(1:50)(Abcan Limited, Cambrige, UK)で2時間染色した；CD45に対する抗体はCD45の全てのマウスアイソフォームおよび対立遺伝子変種と反応する。次いで、スライドをPBSで5分間3回洗浄し、FITC結合またはテキサスレッド結合ヤギ二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)と共に1時間インキュベーションし、次いでPBSで5分間3回洗浄した。カバースリップにVectashield封入剤(Vector, Burlingame, CA)を適用し、スライドを蛍光顕微鏡で調査した。シグナルの特異性を証明するために、標識に対する対応および無関係のフィルターを用いて全ての蛍光を評価した。
【００６３】
FISHおよび共焦点顕微鏡分析
単一標識および二重標識蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)分析は記載されているように実施した(Schwartz et al., J. Clin. Invest. 109: 1291-302; 2002)。膵臓、脳、肝臓および腎臓を含む全臓器をOCT化合物に浸漬し、次いで-80℃に凍結した。連続凍結切片(厚さ、5μm)を切断し、メタノールと酢酸(3:1、vol/vol)の混合物で90分固定し、空気乾燥し、段階的なシリーズのエタノール溶液に接触させることによって脱水した。それらを再度空気乾燥し、70%ホルムアミド中で65℃において90秒〜120秒インキュベーションし、氷冷した70%エタノールに接触させ、段階的なシリーズのエタノール溶液で脱水した。
【００６４】
65℃において10分、次いで37℃において60分〜90分インキュベーションすることによってヌクレオチドプローブを個別に脱水した。1つ(15μL)または2つ(30μL)のプローブを各スライドに添加し、次いで22×32 mmのカバースリップで覆い、フレーム固定剤(Eppendorf, Wesbury, NY)で密封した。42℃において終夜ハイブリダイゼーション後、カバースリップを除去し、Y染色体単独を検出するために、ビオチン結合プローブ(Cambio, Cambridge, UK)をテキサスレッド結合ストレプトアビジンで可視化した。同じ核内のYおよびX染色体を検出するために、対応するプローブをそれぞれFITCおよびCy3に結合した。核はまたDAPIで染色した。
【００６５】
FISH分析は、組織切片における部分的な核サンプリングの結果としてY染色体陽性核の数え落としを生じる。この分析に使用する組織切片を薄くすることにより、核シグナルの重なりによる偽陽性を防ぐが、それらにより対照雄組織切片の一部の核(20%)は検出可能なY染色体を欠損する。Y染色体陽性細胞の割合について表2に示すデータは補正係数0.8で正規化されている。
【００６６】
共焦点顕微鏡は、Multi-Photonシステム(Bio-Rad, Hercules, CA)を装備したRadiance 2100装置を用いて実施した。蛍光は488 nmで励起し、発光は>515 nmでモニターした。核サイズはNIH画像ソフトウェア(バージョン1.62)で評価した。
【００６７】
RT-PCRおよびウェスタン分析
ポリアデニル化RNAは、C57BL/6、CByB6F1、NODまたはNOD/LtSz-Prkdcscid(NOD SCID)マウスの膵臓または脾臓(被膜および脾柱を含む)から単離した。後者の動物はB細胞およびT細胞を欠損しており、重症複合型免疫不全を示し、従ってそれらの膵臓は膵島炎がなく、脾臓はほとんどのリンパ球集団を欠損している。単離されたRNAからRTによって合成される相補的なDNAに、Pdx1に特異的なプライマー
2007521019.tif 000002
を用いるPCRを実施した。総RNA抽出前にRNA単離カラム(Qiagen Inc., Valencia, CA)を使用して終夜RNA安定化試薬(Qiagen Inc., Valencia, CA)に浸漬した、切除後の脾臓および膵臓にワンステップRT-PCRを実施した。RNAの鋳型は各試料に対して2μgに固定し、反応混合物は、12.5 mM MgCl2、10 mMの各デオキシヌクレオシド三リン酸、20 mM Tris-Cl(pH 8.7)、7.5 mM(NH4)2SO4、0.6μgの各プライマー、0.4μLのRNase阻害剤(Invitrogen, Carlsbad, CA)ならびに逆転写酵素およびDNAポリメラーゼを含む2μLの酵素ミックスであった。増幅プロトコールは50℃、30分、次いで95℃、15分の初期インキュベーション；94℃、1分、60℃、1分(Pdx-1)または63.9℃、1分(Hox11)または66.5℃、1分(βアクチン)、および72℃、10分のサイクルを3サイクル含んだ。PCR産物は1%トリ/ホウ酸/EDTA(TBE)アガロースゲルで電気泳動によって分離し、臭化エチジウムで染色した。
【００６８】
膵臓の細胞質抽出物中のGFPタンパク質の検出のためには、膵臓全体を液体窒素に入れ、次いで100μLのプロテアーゼ阻害剤カクテル(プロテアーゼ阻害剤カクテルIII；Calbiochem, San Diego, CA)、100μLのホスファターゼ阻害剤カクテル1および100μLのホスファターゼ阻害剤カクテル2(Sigma, St. Louis, MO)を含有する700μLのリン酸緩衝生理食塩液(pH 7.4)に溶解した。溶解液は500xgで3分間遠心分離し、得られた上清を使用した。レーンあたり合計2μgまたは5μgのタンパク質をSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に移した。抗GFP抗体を用いて検出される陽性のGFPバンドはECL試薬(Amersham Bioscience, Piscataway, N. J.)を使用して同定した。
【００６９】
実施例1.  ドナー生脾細胞対ドナー照射脾細胞の、自己免疫を調節する能力
ドナー生脾細胞対ドナー照射脾細胞の、未変性T細胞の選択により自己免疫を調節する能力を以下のように調査した。17匹の重症糖尿病NOD雌を、CFAと雄CByB6F1マウス生脾細胞または照射脾細胞のいずれかを投与する2つの治療群に無作為に割り付けた。最近発症した糖尿病が認められるNODマウスの膵臓は散在性の島および膵島炎の残存領域を含有している可能性があるので、顆粒状または脱顆粒状の眼で識別できる島が存在しないことおよび死滅した島または死滅しそうな島を不明瞭にする可能性のある残存膵島炎全てのほぼ完全な排除を確実にするためにこの末期糖尿病状態を選択した(表1)。血糖濃度の調節は、一方の腎臓の被膜下に同系島を一時的に植え込むことによって実施した。40日の治療後、島移植を片側の腎摘出によって除去し、内因性膵島の回復を評価するために血糖濃度をモニターした。生脾細胞を投与した9匹のNODマウスのうち6匹は正常血糖を維持した(図1A)。一方、照射脾細胞を投与した8匹のNODマウスのうち正常血糖を維持したマウスはなく、島植え込み物の除去後急速に重症の高血糖を発症した。
【００７０】
生脾細胞または照射脾細胞が、活発な自己免疫の徴候である侵襲性膵島炎を排除する能力は、治療後の動物の膵臓組織構造を調査することによって評価した。生脾細胞の注射により正常血糖が回復したNODマウスの膵臓を治療開始から〜80日後(島移植片の除去から〜40日後)に切除した；照射脾細胞で治療したNODマウスの膵臓を高血糖への逆戻り後(治療開始から〜40から45日後)に切除した。以前の観察(Ryu, et al., J. Clin. Invest. 108: 63; 2001)と矛盾することなく、生脾細胞で治療した正常血糖動物の膵臓は侵襲性の膵島炎がほぼ一様に認められない大量の島を含有し(図1B)、非進行性疾患に関連するパターンである、周囲に分布する小さい膵島炎領域(膵島周囲炎)を伴った。照射脾細胞を投与したNODマウスの膵臓も侵襲性膵島炎をあまり認めない島を含有したが、島の数は生脾細胞で治療した動物において見られるものより少なかった(図1B)；全てのリンパ球を選択的に認識する(実質細胞を認識しない)CD45に対する抗体による免疫蛍光染色によって確認するとき(図1B)、これらの島は、典型的には、顕著な膵島周囲炎を示した。これらの組織学的所見は、血糖レベルの250 mg/dLまでの増加を示し(2日以内)、その膵臓が島の量の全体的な減少ならびに既存の島組織を消失した侵襲性膵島炎および膵島周囲炎を示した25週齢の前糖尿病NODマウスにおいて観察されるものと対照的である(図1B)。従って、治療開始から40〜45日後に調査したとき、生脾細胞および照射脾細胞は侵襲性膵島炎を回復させることができると思われ、生細胞は正常血糖の回復および豊富な膵島の再出現の誘導により効果的である。
【００７１】
（表１）未治療のNOD雌マウスの膵島組織構造
2007521019.tif 000003
* 区分近くにまたがる大きい島は1回より多く計測されるので、計測される島の数は実際の値の過大評価である。膵島炎クラスターは、侵襲性膵島炎を有する島、または眼で確認することができる島組織のない膵島炎クラスターと規定した。
** (1X)は、このNODマウスが屠殺時に255の血糖を1回示したことを意味する：
(>2X)は、このNODマウスが400 mg/dLを上回る血糖を2回示したことを意味する。
【００７２】
実施例2.  膵島回復の動態
糖尿病NODマウスの追加のグループにおいて膵島回復の動態を以下のように調査した。25匹の新たな重症糖尿病NOD雌を、CFAと雄生脾細胞または雄照射脾細胞のいずれかを投与する治療グループに無作為割り付けし、一時的な同系島移植物を腎摘出の前の120日間維持して、インサイチューにおける島再生を長期間可能にした。生脾細胞を投与した12匹のNODマウスのうちの11匹(92%)は、疾患発症後26週より長くまたは52週齢を超えて正常血糖を維持した。さらに、照射脾細胞を投与した13匹のNODマウスのうちの11匹(85%)も、疾患発症後27週より長くまたは48週齢を超えて正常血糖を維持した(図1A)。治療中異所的に課せられた長期間の正常血糖は、両実験グループにおける機能的な島の回復頻度を大幅に増加し、生脾細胞および照射脾細胞は長期疾患排除に貢献することができた。正常血糖を維持したマウスの実験目標(landmark)経過時の平均週齢を表2に提供する。
【００７３】
（表２）正常血糖を回復したNOD雌の種々の実験目標経過時の週齢*
2007521019.tif 000004
* データは平均±標準誤差である。
【００７４】
生脾細胞または照射脾細胞による治療が成功し、腎摘出後〜9週間持続的な正常血糖を経験したマウスの膵臓組織構造も調査した(表3)。照射脾細胞を投与したNODマウスの膵臓は、ヘマトキシリン-エオシン染色で明らかにされるように、浸潤性膵島炎は認められないが、顕著な膵島周囲炎が認められる膵島の再出現を呈した。一方、生脾細胞を投与したNODマウスの膵臓は、浸潤性膵島炎は認められないが、膵島周囲炎をわずかに認めるまたは全く認めない膵島の再出現を示した。(図1C、表3)。
【００７５】
（表３）治療が成功したNODマウスの膵島組織構造
2007521019.tif 000005
* 各NODレシピエントについて約10個の島を調査し、膵島炎の主なパターンを各島について判定した；各膵臓の島における膵島炎の主な程度(+、++、または+++)も示す。
【００７６】
実施例3.  造血系のキメラ化
宿主の致死的なプレコンディショニング(全身照射など)およびMHCが一致する骨髄細胞の導入により、長期造血系キメラ化が生じる(Weissman, Science 287: 1442, 2000)。造血系キメラ化が、実施例4の治療プロトコールにより生脾細胞または照射脾細胞を投与したプレコンディショニングなしのNODマウス宿主においても生じるかどうかを判定するために、糖尿病発症の〜17週後およびドナー脾細胞の最後の注射の>11週後に、それぞれ、平均週齢43週および39週においてこれらの動物の抹消血リンパ球(PBL)をフローサイトメトリーによって調査した(表2)。眼窩静脈から血液を採取し、採取後もマウスを生存させた。
【００７７】
H-2KbまたはH-2Kd MHCクラスIタンパク質に対する対立遺伝子特異的抗体を用いて残存するCByB6F1生ドナー細胞(H-2KbKd)について、疾患が回復したNODマウス(H-2Kd)のPBLを調査した。生脾細胞を投与した5匹の動物の結果を表4に示し、生脾細胞または照射脾細胞を投与したマウスの代表的なヒストグラムを図2に示す。CByB6F1照射脾細胞で治療したNODマウスのPBLはH-2Kbについてはバックグラウンドの染色のみを示し、ドナー造血細胞が残存しないことを示している。一方、CByB6F1生脾細胞で治療したNODマウスのPBLの4.4%〜12.6%はドナー起源であった。未治療NODマウスのPBLはH-2Kdを発現する細胞だけを含有し、CByB6F1マウスのPBLは、H-2KbおよびH-2Kdを同時発現する細胞を主に含有した。生脾細胞で治療したNODマウスは、継続的な免疫抑制または致死的なプレコンディショニングを用いないで生じる半同種細胞を伴う低レベルの持続的な血液キメラ化を示した。
【００７８】
（表４）疾患が回復した5匹のNOD雌マウスにおけるドナー生着の頻度および程度
2007521019.tif 000006
【００７９】
実施例4.  島再生に対する外因性脾細胞の寄与
注射した雄CByB6F1生脾細胞が、種々のリンパ球および治療が成功したNOD雌の膵臓において新たに出現した島などの非造血組織に寄与する可能性を検討した。39〜57週齢において、造血系および実質細胞キメラ化をさらに分析するためにCFAおよびCByB6F1生脾細胞によって誘導される安定な疾患回復を示したNODマウスを屠殺した。
【００８０】
調査した5匹の治療が成功したNODマウスの脾細胞において、フローサイトメトリー分析は、未治療の対照NODマウスの脾細胞の0.3%のバックグラウンドレベルの二重陽性染色と比較して、H-2KdおよびH-2Kbが陽性の細胞の3.5%〜4.7%の存在を明らかにし、全てのレシピエントにおけるドナーCByB6F1細胞の存続を確認した。種々の造血系統のマーカーのゲーティング差(differential gating)は、CByB6F1ドナー脾細胞はT細胞(CD3+)、単球(Mac1+)およびB細胞(CD45R+)に寄与することを明らかにした。
【００８１】
次いで、雄ドナー細胞のY染色体を検出するために、実質組織をFISH分析によってキメラ化について調査した。先ず、ヘマトキシリン-エオシン染色およびインスリンに対する抗体を用いる免疫蛍光分析によって膵臓の一連の切片を島の存在について評価し、調査した治療が成功した5匹のNODマウスにおいて十分に形成されている大きい島が両方法によって同定された。2匹の動物のデータを図3Aおよび3Bに示す。血糖測定は、治療は、47週齢にマウスを屠殺するまで長期正常血糖を回復したことを証明した 図3A。インスリンに対する抗体による一連の膵臓切片の染色は、正常血糖の回復と一致して、大きい島における均一なインスリン含量を明らかにした 図3B。単色FISH分析は、形態およびインスリン免疫反応性によって規定するとき、島内のY染色体が陽性の多量の核の存在を明らかにした 図3B。一方、膵臓の外分泌部分は主に雄細胞を欠損していた。同様の結果は、調査した治療後の5匹全てのNOD雌マウスで得られた。定量分析は、これらの5匹の動物の島細胞の29%〜79%はドナー起源であることを明らかにした。治療前のNOD雌の膵臓は検出可能な島および残存する膵島炎クラスターを欠損しているという事実に一致して、宿主起源だけの島は検出されなかった。
【００８２】
NOD雌膵管上皮における雄細胞の寄与は島に見られるものより異種性が強いが、雄ドナー細胞はNOD雌膵管上皮にも寄与した 図3B。詳細に検討した5匹の治療後のNOD雌において、33%〜75%の管は雄起源の遺伝物質を含有した。宿主起源のみの管は、雄細胞を含有する隣接島に関連していなかった。5匹のNODマウスの膵管における雄細胞の割合は9%〜41%の範囲であった。単色FISH分析は、対照C57BL/6雄マウスの膵臓の外分泌および内分泌部分のY染色体が陽性の多量の核の存在を明らかにしたが、対照C57BL/6雌の膵臓はY染色体を欠損していた 図3C。
【００８３】
膵内リンパ球が、治療後のNOD雌の島または膵管において検出されるY染色体シグナルを生ずる可能性は排除された。すでに示したように、ドナー生脾細胞の導入は、連続膵臓切片の完全なセットのヘマトキシリン-エオシン染色によって明らかにされるように、NODマウスの膵臓全体の侵襲性膵島炎を均一に排除した；リンパ球が島内でごくまれに観察された(図1C、表3)。さらに、治療が成功したNODマウスの肝臓、脳、皮膚または腎臓に由来する組織切片のFISH分析は、Y染色体の実質細胞のシグナルは実質的に存在しないことを証明しており、正常な実質内リンパ球または移入(passenger)リンパ球が島および膵管のY染色体シグナルの原因であることを不可能にしている。
【００８４】
最近の研究には、インビボにおける成体幹細胞の観察される柔軟性を前培養中の胚性幹細胞との融合に起因するとしているものもある(Terada et al., Nature 416: 542, 2002；Ying et al., Nature 416: 545, 2002)。ハイブリッド細胞は顕著に肥大した核および多数の核小体を含有し、四倍体である。一連の切片および共焦点顕微鏡を使用して、5匹の治療後のNOD雌のβ細胞の>800の核および隣接する外分泌組織の>800の核を詳細に検討した。これらの動物の1つのデータを図3Dおよび表5に示す。走査した3つの焦点距離では、島内で再生された細胞で、隣接する未変性の外分泌細胞と比較して肥大しているものはなかった。β細胞核は正常サイズであり、多数の核小体を含有しなかった。再生された島細胞は、ドナー脾細胞と死滅したまたは損傷されている内因性のβ細胞との融合産物でなかったことをこれらの観察は示唆している。
【００８５】
（表５）治療が成功したNODマウス(表2の#789)におけるβ細胞と外分泌細胞の核の径の比較*
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* インスリンに対する抗体およびヨウ化プロピジウムで染色した膵臓切片を、3つの異なる焦点面において共焦点顕微鏡で調査した。インスリン陽性細胞の核をβ細胞核として計数し、膵臓の外分泌部分のインスリン陰性細胞の核を外分泌細胞核として計数した。核の径はNIH画像ソフトウェアによって求めた。データは、調査した示した数の核の平均±標準偏差である。島と外分泌細胞を比較するためのP値はスチューデントのt検定によって得られた。
【００８６】
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)(緑)に結合したY染色体特異的プローブおよびシアニン3(Cy3)(赤)が結合したX染色体特異的プローブを用いる2色FITC分析による治療が成功したNODマウスの再生された島における細胞の性染色体の倍数性をさらに調査した。島細胞核は4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で青にも染色した。図4Aは、CByB6F1雄の生脾細胞による治療が成功したNOD雌における主に雄起源の島を示す。個々の核の検査は、明らかなXXYまたはXXXY遺伝子型を有する島細胞をあったとしてもごくまれに明らかにした。性染色体の正常な相補性も膵管上皮に観察された。再生された島細胞は、ドナー雄細胞と宿主雌細胞の頻繁な融合の結果である可能性が低かったことをこれらの結果も示している。
【００８７】
同様に、CFAおよびCByB6F1雄の照射脾細胞を用いた治療により疾患が長期回復したNOD雌の再生された島も調査した。検出可能なY染色体を含有する島細胞核はなく、各核は、XXの遺伝子型に対応する2つの赤色シグナルを生じた(図4A)。未治療の雌および雄NODマウスの膵臓の2色FISH分析は、この方法は偽陰性データ(赤色シグナルのないまたは1つだけの赤色シグナルの雌核)を生ずることがあるが、偽陽性データ(雌細胞の核の緑色シグナルまたは個々の雄核内の2つの緑色シグナル)を生じることはほとんどないことを明らかにした(図4B)。
【００８８】
実施例5.  Hox11発現の分析
成獣C57BL/6、CByB6F1、NOD SCIDおよびNODの脾臓を、Hox11発現について逆転写(RT)およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって調査した。分析は、調査したマウス株の各々において12週齢の動物の脾臓における多量のHox11転写物の存在を明らかにした(図5A)。ほとんどのリンパ球集団を欠損するNOD SCIDマウスの脾臓におけるHox11 mRNAの存在は、Hox11が成獣脾臓の非リンパ部分において発現されることを確認している。胚日齢15(E15)のC57BL/6胚の膵臓組織はHox11 mRNAを含有しなかった(図5A)。
【００８９】
また、成獣マウスの脾臓および膵臓を、E8.5〜E16.5の背側および腹側膵臓芽状突起を示すPdx1遺伝子の発現について調査した(Offield et al., Development 122:983-95, 1996)。成獣マウスの脾臓はPdx1 mRNAを含有しないが、E15のC57BL/6胚の膵臓は含有することが見出された(図5A)。これらのデータはまた、Hox11を発現する多能性細胞は早期膵臓系統マーカーPdx1を発現せず、成獣マウスの脾臓に存在するリンパ(CD45(+))起源ではないことも示す。
【００９０】
実施例6.  CD45(+)脾細胞対CD45(-)脾細胞の使用
ドナー生脾細胞で治療したNODマウスの膵島の再生におけるこの非リンパ幹細胞集団の考えられる役割を調査するために、12週齢のNOD雌(n=20)に、CD45(+)CByB6F1-GFP+脾細胞またはCD45(-)CByB6F1-GFP+脾細胞および未分離脾細胞を注射した。全てのグループのNODマウスにCFAも投与し、血糖を>120日間モニターした。使用したNODメスは前糖尿病であり(すなわち、治療開始時に島機能が残存しているが、活発な自己免疫が認められる)、島移植を受けていないおよび注射によって投与される脾細胞の数は4×105から5×105に低下され、2週間にわたって4回投与されたという点においてこれらの実験は以前の実験と異なる。注射したドナー脾細胞からの島細胞の再増殖を証明するためのモニタリング方法としてGFP蛍光を使用した。CD45(+)CByB6F1-GFP+(n=5)またはCD45(-)(n=5)CByB6F1-GFP+を投与したNODマウスの全ておよび未分離脾細胞(n=10)を投与したものはモニタリング期間中正常血糖を維持したが、全ての未治療NOD同腹子(n=10)は、同様の飼育および観察条件下で糖尿病になった。治療動物はその後120日の正常血糖後屠殺し、全GFP+発現について膵臓にウェスタン分析を実施し(図5B)、膵島のCByB6F1-GFP+細胞の個々の蛍光の検出のために膵臓連続切片に免疫組織化学分析を実施した(図5C)。切片はまたCD45およびインスリンに対する抗体でも染色した(図5D)。
【００９１】
CByB6F1-GFPマウスのCD45(+)またはCD45(-)のいずれかの脾細胞による短期間の低用量治療によって生じる疾患回復が成功した長期正常血糖NODマウスは膵臓において対比するGFPタンパク質発現を示した。CD45(-)脾細胞の濃縮集団で早期に120日間治療したNODマウスの膵臓抽出物は強力なGFPタンパク質発現を示したが、CD45(+)脾細胞で治療したNODマウスはほとんど検出不可能なGFPシグナルを示した(図5B)。CByB6F1-GFPマウスの膵臓細胞質抽出物は、抗GFP抗体と反応性の強力なバンドを示し、対照C57BL/6マウスはGFP反応性バンドを示さなかった(図5B)。CByB6F1 CD45(-)脾細胞およびCFAによる前糖尿病マウスの同時治療により、導入した脾細胞集団のGFP+誘導体を安定して長期発現する膵臓局在化細胞集団が存続した。
【００９２】
生脾細胞で治療した重症糖尿病NODマウスを用いて実施例5において得られた結果と同様に、CD45(-) CByB6F1-GFP脾細胞または未分離CByB6F1-GFP脾細胞のどちらかで治療した前糖尿病NOD雌の膵臓はGFPマーカーが陽性の島を含有した(図5C)。さらに、新たに作製された島はリンパ球浸潤が見られず、インスリンおよびCD45同時染色で観察されるように、膵島周囲炎にはわずかしか関連していないかまたは全く関連していなかった(図5D)。GFP起源の島の数は、CD45(-)脾細胞または全脾細胞で治療した前糖尿病NOD雌では、重症糖尿病NOD雌より少なく、前糖尿病マウスの膵臓は膵島周囲炎に罹患している内因性島を含有したことおよび動員された前駆細胞による前糖尿病動物の治療は障害のある島を救済し、デノボ島再生も促進したという事実に一致している。
【００９３】
CD45(+)脾細胞で治療した前糖尿病NOD雌の膵臓も侵襲性膵島炎のない島を含有した。しかし、免疫組織化学的分析は、これらの雌宿主においてGFPマーカーが陽性の島が存在しないことを明らかにした(図5C)。さらに、実施例5において照射脾細胞で治療した重症糖尿病NODマウスにおいて観察される島再生と同様に、CD45(+)脾細胞を用いて治療した前糖尿病NOD雌に新たに出現する島は顕著な膵島周囲炎を示した(図5Cおよび図5D)。
【００９４】
実施例7.  始原脾細胞の特徴づけ
細胞の単離
正常B6ドナーマウスのCD45(+)脾細胞およびCD45(-)脾細胞の分離は、CByB6F1ドナーマウスについて上記するように、マウス特異的CD45 MicroBeads(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)を使用して実施した。CD45(+)脾細胞およびCD45(-)脾細胞集団の各々を核、細胞質および膜分画に分画化し、さらにSDS PAGEによって分画化した。ゲルレーンを水平に10スライスに分割し、各水平分割部分の含有物にゲル内トリプシン消化を実施した。得られたペプチド混合物は各々、以下に記載するようにナノスケールLC-MS/MSによる自動システムにおいて24時間分析した。
【００９５】
質量分析法による細胞の特徴づけ
ペプチド混合物の同定および配列分析は、オートサンプラー、オートサンプラーに接続しているキャピラーリーHPLCシステム、イオントラップMSおよびデータシステムからなるFinnigan(商標)LCQ(商標)Deca XP(thermo electron)イオントラップ質量分析計によるナノスケールマイクロキャピラリーLC-MS/MSによる自動化システムにおいて実施した。ゲル内消化では、試料をオートサンプラーバイアルに個々に入れた。その後、試料は内径75μmのカラムに自動的に添加され、最初に0.4%酢酸/0.005%ヘプタフルオロ酪酸/5%アセトニトリル/95%水で5μl/minで洗浄し、次いで、アセトニトリル濃度を漸増する濃度勾配システムを用いて〜150 nl/minで溶出した。質量分析計は、ペプチドを溶出するためにm/z比を測定し(MSモード)、強度がある閾値(MS/MS)モードに達するペプチドイオンを溶出するために配列決定情報を収集するデュアルモードで作動した。各試料について典型的な2時間の濃度勾配中に約3000〜4000のMS/MSスペクトルが獲得され、各MS/MSスペクトルは1つのペプチドだけの配列情報を含有した。
【００９６】
上記のMSを使用すると、正常マウスから採取したCD45(-)脾臓細胞対CD45(+)脾臓細胞についてのタンパク質の差が同定された。本発明のCD45(-)/Hox11を発現する成獣脾細胞を特徴づけるタンパク質のリストの一部を表6に示す。
【００９７】
（表６）CD45(-)/Hox11を発現する成獣脾細胞を特徴づけるタンパク質
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【００９８】
実施例8.  糖尿病を治療するための標的としてのCD180欠損細胞
CD180(RP150)は、細菌リポポリサッカライド(LPS)に対するB細胞の応答に重要なトール様受容体(TLR)である。12週齢を超えるNODマウスの全NOD脾細胞を、このタンパク質の存在について質量分析法で分析した。次いで、B6マウス(正常な対照)のリンパ球を非T細胞およびT細胞集団に分離し、共に質量分析法で同様に分析した。CD180タンパク質は対照マウスの非T細胞分画において検出されるが、NODマウスには検出されないことが見出された。CD180はB細胞に限定されると考えられるので、予想されるように、NODマウスおよびB6マウスのT細胞はCD180を発現しなかった。
【００９９】
次いで、糖尿病マウスにおいて、BCG投与は、CD180を欠損しているB細胞亜集団を死滅させることが見出された。一態様において、NODおよびB6マウスに、脚パッドに1回皮下注射することによってBCG処理を実施した。BCG処理の2日後に、脾細胞を取り出し、CD180抗原について調査し、この時点においてB6およびNODマウスは、非T細胞集団において等しいの量のCD180抗原を示した。これらの結果はウェスタンゲルによる分析によって確認した。
【０１００】
成熟B細胞(TLR4およびCD180)上で発現される少なくとも2つのTLRはLPSシグナル伝達を媒介することが知られている。自己免疫に関与するB細胞の亜集団はCD180発現の欠損に関連している可能性があることおよび自己反応性B細胞のこの亜集団はLPSまたは他の受容体アゴニスト(例えば、Toll、TLR、MD-1またはLy78に結合するものなど)によって排除されるという所見は、B細胞コンパートメントにおける自己反応性を妨害する新規経路を規定し、従って疾患の原因となる細胞の選択的な死滅に基づく自己免疫疾患(例えば1型糖尿病または狼瘡)の新規治療を同定する。
【０１０１】
CD180発現が欠損している自己反応性B細胞の排除に影響を与えることができる薬剤には、TLR1の低分子もしくは抗体アゴニスト(例えばトリアセチル化リポペプチド(LP)、フェノール可溶性モジュリン、またはB.ブルグドルフェリ(B. burgdorferi)のOspA LPなど)、TLR2の低分子もしくは抗体アゴニスト(例えばTLR1もしくはTLR6を有するLP、またはTL4を有するHSP60)、TLR3の低分子もしくは高分子アゴニスト(例えば、2本鎖RNAなど)、TLR4の低分子もしくは抗体アゴニスト(例えば、グラム陰性細菌のLPS、HSP60、マンヌロン酸ポリマー、フラボリピン、テシフロン酸(tecihuronic acid)、ニューモリシン、線毛(fimbriae)、サーファクタントタンパク質A、ヒアルロナン、オリゴサッカライド、硫酸ヘパリンフラグメント、フィブリノーゲンペプチドまたはβデフェンシン2)、TLR5の低分子もしくは抗体アゴニスト(例えば、フラジェリンなど)、TLR6の低分子もしくは抗体アゴニスト(例えば、脱アセチル化LPまたはフェノール可溶性モジュリンなど)、TLR7の低分子もしくは抗体アゴニスト(例えば、イミダゾールキノリン抗ウイルスなど)、TL8の低分子もしくは抗体アゴニスト(例えば、イミダゾールキノリンなど)またはTLR9の低分子もしくは抗体アゴニスト(例えば、CpGモチーフとしての細菌DNA)が挙げられる。
【０１０２】
実施例9.  NODマウスにおける膵臓、唾液腺、および神経組織再生
NOD雌マウス(Taconic Farms, Germantown, NY)および雄CByF1B6F1/J(CByB6F1)マウス(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)を無菌条件下で維持した。治療前に、NOD雌は少なくとも20週齢および／または血糖が250 mg/dlのレベルまで上昇するまで飼育した。糖尿病は40週齢までに〜80%の雌に発症し、自己免疫は主に雌マウスに発症した。
【０１０３】
NOD雌を治療するための脾細胞はCByB6F1(H-2KbKdDbDd)雄またはB6雄マウスから入手し、生きた状態でこれらの動物に注射した。脾細胞(約9×106)は、尾静脈から週2回40日間NODレシピエント(H-2KdDb)に注射した。等容量の生理食塩液(50 mL)と混合直後のCFA(Difco, Detroit, MI)も、島移植時または最初の脾細胞注射と同時に各後脚パッドに注射した。
【０１０４】
従って、7匹のNOD治療マウスおよび5匹のNOD対照マウスは、CFAプラス正常マウスのCD45(-)脾細胞の週2回注射のプロトコールで治療した。治療開始前に、全てのマウスは正常血糖であった(治療および未治療グループ)；全てのNODマウスは、C57BL/6対照動物と比較したとき、唾液機能の40〜50%低下を示した(無作為割り付けした2つのNODグループ(治療および未治療)は唾液流量が識別不可能で、低下していた)；および全てのNODマウスはほぼ100%聴力損失を生じていた。
【０１０５】
40日間のCFAおよび脾細胞注射による治療後、治療NODマウスの7匹全ては生存しており、未治療のNODグループの5匹のうち1匹は高血糖で死亡した。治療NODグループを未治療NODグループと比較すると、治療グループの唾液流速(唾液腺機能の試験)は、唾液流量の統計学的に有意な(p=0.009)回復/安定化を示し、治療は唾液腺の自己免疫を低減することを示唆している。治療グループについては、NODマウスの1匹が聴力の30〜40%回復を証明した。未治療グループでは、全てのNODマウスは聴力損失のままであった。NODマウスの試験は、それらが5週齢までにほぼ100%聴力を損失したことを迅速に確認した。
【０１０６】
CFAおよび脾細胞注射による120日の治療後、治療グループの1匹のマウスが脾細胞注射中に死亡した。残りの6匹は正常血糖であった(死亡した治療動物は、脂肪時まで正常血糖であった)。一方、未治療NODマウスは高血糖で死亡した。治療NODグループでは、唾液流速は、未治療NOD動物と比較してさらに改善したが、正常なC57BL/6対照マウスにおいて見られるレベルまで十分に回復していなかった。治療群では、40日目に聴力の30〜40%回復を証明したNODマウスはこのレベルの聴力を継続した。未治療群では、全てのNODマウスが聴力を損失したままであった。
【０１０７】
以前に、本発明者らは、糖尿病はNODマウスにおいて回復することができること(Ryu et al., Journal of Clinical Investigations, 108: 31-33, 2001)および膵島は、外因性の細胞を導入しないで再生することができることを証明した。しかし、再生した島は周囲の膵島炎の影響を受けやすく、島自体が本質的な発生上の欠陥を有することを示唆している。本発明において、本発明者らは、Hox11が発現されるCD45(-)多能性島前駆細胞の脾臓からの単離を記載している。Hox11は島発生、唾液腺発生および聴覚の脳神経の発生を含む多数の形態の神経発生を制御するので、上記の実験は、正常マウスのCD45(-)/Hox11発現脾細胞がNODマウスにおいて神経組織および唾液組織を再生することができるかどうかを判定するために実施した。結果は、本発明のCD45(-)/Hox11発現多能性細胞の多系統の可能性を証明している。6匹の治療NODマウスのうちの1匹だけが聴力機能が部分的に回復したが、聴力損失の回復の割合が低いのはNODマウスにおいて聴力損失の発症時期が早期であることに原因がある可能性がある。従って、中年期における再生は効率が悪い可能性がある。
【０１０８】
実施例10.  Hox11を発現するCD45(-)多能性細胞が濃縮されている組成物による患者の治療
本明細書に記載する治療は前糖尿病、すなわち、I型糖尿病に進行すると診断されているが、まだ高血糖ではない患者を治療する際に有効である可能性があるが、本発明者らは、本発明の方法は、I型糖尿病または任意の他の自己免疫疾患の哺乳動物、例えば、ヒトを治療するためにも使用することができることに注目している。すでに高血糖であり、従って大部分または全ての島が破壊されている患者を治療する能力は、本発明の治療の大きな利点である。
【０１０９】
一般に、本発明の多能性細胞を含む組成物で患者を治療する前に、患者が2つの疾患の表現型を有することを判定するために患者から血液を任意に入手してもよい。第1の疾患表現型は、血中の循環CD45RA陽性細胞の数の増加である(CD95、CD62Lまたは未処理もしくは未刺激細胞の他のマーカーが陽性の細胞の数の変化としても規定される)。CD45、CD95およびCD62Lは、フローサイトメトリーによってモニターし、年齢が一致する対照と比較することができる全ての細胞表面抗原である。本発明者らは、糖尿病または任意の他の自己免疫疾患が認められる被験者の抹消血におけるこれらの未処理または未刺激の細胞の量がわかることを期待している。第2の表現型は、アポトーシスまたは壊死による細胞死に対する感受性が増加しているリンパ球の亜集団の存在である。例えば、細胞の亜集団は、TNF-α、TCR受容体架橋剤、T細胞特異的抗体(例えば、αTCRまたはαCD3)、またはBCGによる非特異的刺激によって生じる細胞死に対する感受性が増加していることがある。本発明者らは、これらの患者からリンパ球を単離し、TNF-αでインビトロにおいてそれらを処理し、TNF-α、他のサイトカイン、化学的試薬または表面タンパク質を選択する抗体に接触させたときアポトーシスまたは壊死を受ける亜集団をリンパ球が含有することを示すことによってこのような細胞の存在をアッセイすることができる。望ましくは、対照ドナーリンパ球はこれらの薬剤に対する感受性を示さない。この表現型は、細胞死の感受性が増加している変化である、細胞内シグナル伝達経路が変更されている主に病原性起源からなるリンパ球の結果である。この表現型を有する全ての細胞の排除または変換は自己免疫の永久的な回復に望ましい。これらの欠損の割合は糖尿病または他の自己免疫患者において比較的高いと思われ、第1の表現型は、I型糖尿病の95%を超える浸透度を有すると思われ、第2の表現型は50%を超える浸透度を有すると思われる。
【０１１０】
従って、I型糖尿病または任意の他の自己免疫状態を有する被験者の治療を開始する前に、本発明者らは、被験者がこれら2つの遺伝子型のどちらかまたは両方を有し、従って治療に応じやすいかどうかを血液分析だけから判定することができる。第1の表現型(すなわち、循環CD45RA陽性細胞の数の増加)を治療するためには、MHCクラスIと自己ペプチドに対する耐性を再確立しなければいけない可能性がある。本発明者らは、本発明者らの結果から、MHCクラスIと自己ペプチドの機能的複合体の欠損が抹消における未処理のT細胞過多または少なくともこれを生じる表現型の1つにおける結果を生じると結論づけている。従って、この表現型を治療するために、本発明者らは、MHCクラスIと自己ペプチドの複合体に半同種または完全に同種の一致した血液または骨髄を投与することができる。さらに、血液または骨髄由来細胞、または場合によっては不死化されている線維芽細胞は、望ましくは、MHCクラスIと自己ペプチドの正常な複合体提示を有する；言い換えると、それらは罹患患者由来であるべきではない。そのような表現型は、この治療におけるドナー細胞の好適性を判定するために治療前に容易にモニターされる。例えば、MHCクラスIと自己ペプチドの立体配座的に特異的な抗体は、複合体が適切に充填されているかを示すために使用することができる。また、この治療局面において、宿主のHLAクラスI対立遺伝子に対する一致数の増加は疾患の回復期間の延長を生ずることを本発明者らは知っている。望ましくは、ドナー細胞の少なくとも2つ、望ましくは4つ全てのHLAクラスI対立遺伝子(例えば、HLA AおよびHLA B対立遺伝子)が一致する。従って、これらのドナー細胞は完璧に一致してもまたは半同種であってもよい(すなわち、個々の細胞において部分的にのみ一致している)。
【０１１１】
治療は、任意の所定のクラスIハプロタイプの任意の所定のドナーの1×107細胞の週2回の静脈内注入を含んでもよい。投与される細胞は単離直後であり、保存剤で処理されたりまたは凍結されないことが望ましい。本発明の方法に使用することができる細胞は、例えば、血液バンクから入手してもよい。また、半同種細胞は、両親または兄弟姉妹などの患者の近親者から入手してもよい。さらに、血液容量を低下するために製剤から赤血球細胞を排除し、リンパ球を投与することが有利であると思われる。または、CD45(-)多能性細胞(例えば、脾細胞または臍帯血由来の細胞、または胚性幹細胞)にHox11の遺伝子、好ましくは、ヒト遺伝子を形質移入しても、またはHox11を発現するように誘導してもよく、得られた細胞を治療に使用することができる。
【０１１２】
MHCクラスIとペプチドを投与する別法として、未処理のT細胞を不活性化または死滅させる別の薬剤を投与してもよい。例示的な薬剤には、未処理のT細胞上のT細胞受容体に結合して不活性化する抗体または結合して、病的な細胞だけの選択的な細胞死を誘発する抗体が挙げられる。いくつかの態様において、抗体は、メモリーT細胞の活性を阻害するより少なくとも2、5、10または15倍、未処理のT細胞の活性を阻害する。
【０１１３】
ドナー細胞の投与と同時に、カルメット-ゲラン桿菌(BCG)もしくはCFAなどの他の免疫アジュバントによる刺激、またはTNF-αの直接投与によって内因性TNF-α産生を誘導することも望ましい。例えば、少なくとも週2回または望ましくは週3回BCGを投与することができる。また、その表現型の病的な細胞が排除されたかどうかを調べるために、週2回血液試料を分析することによって、当業者は細胞およびTNF-αまたはBCGの用量を個別に設定することができる。例えば、MHCクラスIを発現するドナー細胞の適切な用量を設定するために、本発明者らは抹消血における多量の未処理の細胞を排除しようとしても、TNF-αまたはBCGの適切な用量を設定するために、本発明者らは、インビトロにおいてTNF-αの感受性をなくすようにしてもよい。
【０１１４】
治療の第2の局面に関しては、TNF-α、BCGまたは別の非特異的形態の免疫刺激が内因性TNF-αの誘導を促進することがある。例えば、TNF-αは筋肉内、小胞内(intravesicularly)または静脈内に投与することができる。さらに、組換えヒトTNF-αまたはTNF受容体2アゴニストなどの新規薬剤を使用することができる。このような化合物は2つの作用を有し、一方は、モニターすることができる抹消のアポトーシスまたは細胞死感受性細胞の排除であり、他方は内因性β細胞の再生およびおそらく新規ドナー血液の分化である。患者に投与することができるTNF-αの例示的な用量は約40 μg/m2または200μg/m2である。他の例示的な用量には、1週間に2回投与するための1日2×106〜5×106 mgの用量が挙げられる。自己免疫疾患患者は高用量のTNF-αに耐用性を生じることがあり、かつ／または治療のために低用量を必要とすることがある。TNF-αの代用物として、TCRを架橋することによってまたは同一経路による非特異的ワクチン投与によって耐用性を獲得してもよい(例えば、BCGワクチン投与)。Tリンパ球減少症インデューサー(例えば、TNF-α)を患者に直接投与する別法として、Tリンパ球減少症のインデューサーを患者から得られた血液に投与し、処理した血液を患者に再度投与してもよい。半減期が短いTリンパ球減少症のインデューサー(例えば、TNF-α)については、あったとしても少量の化合物が、患者に再導入される血中に残存する。従って、本発明の方法は、化合物の考えられる任意の有害な副作用の発現頻度または重症度を低下するはずである。
【０１１５】
本明細書に記載する任意の併用治療、例えば、MHCクラスIを発現する細胞とTNF-α誘導を使用する治療を、疾患の治療が成功するまで投与してもよい。例えば、この治療は約40日継続してもよい；しかし、この期間は、観察される表現型に基づいて容易に調節することができる。さらに、TNF-αの用量は、残存じている自己免疫細胞の量を示す、TNF-αに対する感受性が増加している患者の血液試料における細胞の割合に基づいて容易に調節することができる。また、I型糖尿病を治療する際には、患者ができるだけ正常血糖近くに維持することが望ましい。血糖の顕著な変動は膵臓の正常な再生の可能性を妨害することをマウスのデータは証明した。従って、これらの患者は、例示的な40日の疾患回復治療だけでなく、再生過程を最適化するための120日の期間のためにインスリンポンプによる治療を行ってもよい。長期糖尿病の膵臓(すなわち、15年を超えて糖尿病が認められるもの)は、前駆細胞がもはや存在しない程度まで減少した膵臓の再生の可能性を有しうる。これらの患者では、治療は、治療の長さを除いて同じであってもよい。例えば、ドナー血液または骨髄細胞は、これらの細胞が膵臓のβ細胞などの適切な組織種に変換するように生存していなければならない。
【０１１６】
上記に記載するように、本発明のいくつかの態様は、自己または正常ドナーから単離した、Hox11を発現するCD45(-)多能性細胞(例えば、骨髄、脾臓または抹消血由来であるが、好ましくは脾臓由来)を使用する。典型的には、この細胞は検出可能な程度で、CD90+、CD44+またはCD29+を発現するが、評価できる量のCD34を発現しない。この正常なドナー細胞は、好ましくは、静脈内または腹腔内経由で人に投与されて、炎症、損傷または疾患部位への迅速な輸送を可能にする。望ましくは、この細胞は、活発な自己免疫が認められる人に投与される。または、細胞は、自己免疫が認められない人または静止した自己免疫が認められる人に投与されてもよい。人(宿主)において活発な自己免疫が存在しないことは、再生部位における炎症応答または損傷を開始するための宿主の事前処理を必要とすることがある。また、ドナー細胞の事前処理も必要とされることがある。宿主は、動員されたHox11発現細胞との最適な相互作用のために血管内皮細胞を調製するために、TNF-α、IFN-γ、IL-2、VEGF、FGFまたはIGF-1で処理してもよい。さらに、内皮細胞におけるVEGFで刺激された発現経路はPI-3'-キナーゼの選択的阻害剤で増強することができる。または、動員された中胚葉細胞との最適な相互作用のために、宿主を壁細胞(例えば、神経堤または心外膜由来)に由来する血小板由来増殖因子で前処理してもよい。さらに、内皮細胞との接着を最適化するために中胚葉細胞を前処理してもよい。この種類の治療は、ランゲルハンス島、肝臓、膵臓、脾臓および骨を含む種々の臓器または細胞小器官の再生に有用であると思われる。
【０１１７】
他の態様
上記説明から、変更および改良を本明細書に記載する本発明に行って、種々の使用および条件に適合させることができることが明らかである。このような態様も以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０１１８】
本明細書に記載する全ての刊行物は、個々の刊行物、特許または特許出願各々が、参照により組み入れられることが具体的且つ個別に示されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】糖尿病NODマウスにおける正常血糖および膵臓組織構造の回復に対する、生脾細胞または照射脾細胞を用いた治療の影響を示す。(A)正常血糖のカプラン-マイヤー曲線である。糖尿病NOD雌を、CFAの単回注射およびCByB6F1雄由来の生脾細胞(丸)または照射脾細胞(四角)の週2回40日間の注射で治療した。治療開始時に腎臓下に(subrenally)移植した同系雌の島を40日後(左のパネル)または120日後(右のパネル)切除した。島移植片の切除後示した時間に血糖濃度をモニターし、正常血糖を維持している動物の割合をプロットした。データは、2つの治療群を比較するための、それぞれ、生脾細胞または照射脾細胞を投与された9もしくは8匹(左のパネル)または12もしくは13匹(右のパネル)の動物のもである；P=0.0002(左のパネル)、P=0.68(右のパネル)。(B)膵臓組織構造。生脾細胞(右のパネル)または照射脾細胞(中央のパネル)で治療し、(A)に記載するように40日後に島移植片を切除したNODマウスを、治療開始から80日後または高血糖に戻ったとき屠殺した。膵臓切片をヘマトキシリン-エオシン(上のパネル)染色するかまたはCD45に対する抗体を用いる免疫蛍光分析を実施した(下のパネル)。軽度の高血糖発症後の未治療のNOD雌(25週齢)の膵臓も示す(右のパネル)。侵襲性膵島炎(左のパネル)、膵島周囲炎(peri-insulitis)(中央のパネル)および最小膵島周囲炎(右のパネル)の特徴のある組織学的パターンが明白である。矢印は島の輪郭を示す。最初の倍率、×200。(C)膵臓組織構造。照射脾細胞(上のパネル)または生脾細胞(下のパネル)で治療が成功した3匹のNODマウスを、120日の島移植片の切除から〜9週後に屠殺した。各膵臓切片をヘマトキシリン-エオシンで染色した。照射細胞で治療したNODマウスにおいてのみ顕著な膵島周囲炎が明白であった。最初の倍率、×200。
【図２】CFAおよびCByB6F1雄の生脾細胞(右上のパネル)または照射脾細胞(左上のパネル)で治療が成功した雌NODマウスから得られるPBLのH-2KdまたはH-2Kbに特異的な抗体を用いる2色フローサイトメトリー分析を示す。腎臓下島移植片を120日後に切除し、治療停止からそれぞれ12週および11週後に血液を採取した。12週齢の未治療のNODマウス(左下のパネル)および12週齢の正常なCByB6F1マウスのPBLを比較のために同様に分析した。H-2KdおよびH-2Kbを発現する細胞の割合を示す。
【図３】治療が成功したNOD雌マウスにおける正常血糖の長期回復およびドナー脾細胞の島再生への直接的な寄与を示す。(A)CFAおよびCByB6F1雄脾細胞ならびに同系島の一過的な腎臓下移植で治療が成功した2匹のNOD雌(表2の#789および#790)の生涯にわたる血糖濃度である。(B)治療が成功したNOD雌#789(左のパネル)および#790(右のパネル)の膵臓の連続切片の免疫蛍光および蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)である。上の2枚のパネルはインスリンに対する抗体による島の免疫蛍光染色を示す；続く3組の画像は、それぞれ、島(矢印)、膵管(アローヘッド)および膵臓外分泌腺を含有する切片においてY染色体特異的プローブで得られるFISHシグナルおよびDAPIによる核染色を示す。(C)C57BL/6雄(左のパネル)およびC57BL/6雌(右のパネル)の膵臓の連続切片の免疫蛍光およびFISH分析である。上の2枚のパネルはインスリンに対する抗体による島の免疫蛍光染色を示す；続く3組の画像は、(B)と同様に、膵臓の内分泌および外分泌部分の切片におけるY染色体特異的プローブで得られるFISHシグナルおよびDAPIによる核染色(青)を示す。(D)治療が成功したNODマウス#789由来の膵臓切片の3つの焦点面(-3、0および+3μm)から得られる代表的な共焦点顕微鏡写真である。画像は、インスリンに対する抗体による染色および外分泌腺組織が取り囲んでいる大きい島の核染色を示す。下のパネルは、上のパネルに示す視野の高倍率画像である。
【図４】雄の生脾細胞または照射脾細胞による治療が成功したNOD雌マウスの6つの染色体の2色FISH分析を示す。(A)CByB6F1雄の生脾細胞(上のパネル)または照射脾細胞(下のパネル)による治療が成功したNOD雌における島および膵管キメラ化の分析である。膵臓の切片に、DAPIによる染色(青)ならびにCy3結合X染色体特異的プローブ(赤いドット)およびFITC結合Y染色体特異的プローブによるFISH分析を実施した。紫はCy3およびDAPIシグナルの重なりを示す。矢印は島の輪郭を示す。(B)(A)と同様に染色した未治療のNOD雌(左のパネル)および未治療のNOD雄(右のパネル)の対照膵臓切片である。(C)CFAおよび雄CByB6F1生脾細胞による治療によって誘発される長期疾患回復後のNOD雌マウスの脳、肝臓および腎臓から調製した切片を(A)と同様に染色した。
【図５】成獣マウスの脾臓におけるHox11発現多能性細胞の同定および前糖尿病NODマウスにおける膵臓組織構造に対する分離型CD45-またはCD45(+)を用いる治療の影響を全CByB6F1-GFP脾細胞と比較したものを示す。(A)E15のC57BL/6マウス胚の膵臓またはC57BL/6、CByB6F1、NOD SCIDもしくはNOD成獣マウスの脾臓から単離したポリアデニル化RNAに、Hox11、Pdx1またはβアクチン遺伝子に特異的なプライマーを用いるRT-PCR分析を実施した。Hox11およびPdx1 mRNAに由来するPCR産物の量をデンシトメトリーによって測定し、βアクチンmRNAに由来する産物の対応する量によって正規化した；正規化後の値を示す。(B)ウェスタンブロット。対照および治療NODマウスの膵臓抽出物(2μgまたは5μg) を抗GFP抗体でプロービングした。(C)前糖尿病NOD雌(12週齢)をCFAおよびCD45-(左上のパネル)、CD45(+)(右上のパネル)または全(左下のパネル)CByB6F1-GFP脾細胞で治療し、>120日モニターした。次いで、インスリンおよびCD45同時染色で同定された島を含有する膵臓の連続切片に、抗GFP抗体を用いる免疫組織化学的分析を実施した。右のパネル：ローダミンフィルター。(D)糖尿病NOD、前糖尿病NOD(12週齢)、C57BL/6対照、CFAおよび全CByB6F1脾細胞で治療した前糖尿病NOD雌、CFAおよびCD45(+)CByB6F1脾細胞で治療した前糖尿病NOD雌、ならびにCFAおよびCD45(-)CByB6F1脾細胞で治療した前糖尿病NOD雌の膵臓の連続切片に、示すようにインスリンまたはCD45に対する抗体を用いる免疫蛍光分析を実施した；合わせた画像を下の列に示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2007521019.tif 000025
【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2007521019.tif 000031
【図５Ｃ】
2007521019.tif 000032
【図５Ｄ】
2007521019.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月31日(2006.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007521019000001.app