(57)【要約】本発明は、親和性定数および速度定数を測定する工程を包含する、タンパク質およびタンパク質の他の分子との相互作用を検出するための組成物および方法に関する。本方法は、例えば、互いに識別可能であるフルオロフォアのような検出可能な標識で標識した二つ以上のタンパク質特異的プローブを使用する。そのプローブの標識タンパク質への結合は、同時シグナルとして検出され、従って複数のプローブの単一の標的タンパク質への結合は、サンプル中にそのタンパク質が存在することを示唆する。
2007529758.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を検出するための方法であって、該方法は、以下：
試料と、第１のタンパク質特異的プローブおよび第２のタンパク質特異的プローブとを接触させる工程；ならびに
単一のタンパク質に対する該第１のタンパク質特異的プローブおよび該第２のタンパク質特異的プローブの両方の結合を、同時シグナルとして検出する工程；
を包含し、
該第１のタンパク質特異的プローブおよび該第２のタンパク質特異的プローブは、互いに区別可能な第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識によってそれぞれ標識され、そして単一のタンパク質に対する該第１のタンパク質特異的プローブおよび該第２のタンパク質特異的プローブの両方の結合は、該タンパク質が、該試料中に存在することを示す、方法。
【請求項２】
前記第１のタンパク質特異的プローブおよび前記第２のタンパク質特異的プローブは、抗体または抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のタンパク質特異的プローブおよび前記第２のタンパク質特異的プローブは、前記タンパク質の異なる領域に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の検出可能な標識および前記第２の検出可能な標識は、フルオロフォアである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の検出可能な標識および前記第２の検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ４８８およびＣｙ５である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２のタンパク質特異的プローブは、タンパク質の改変に対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
種々の時点において、前記第１のタンパク質特異的プローブおよび前記第２のタンパク質特異的プローブの結合を検出する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
別の分子の存在下で前記第１のタンパク質特異的プローブおよび前記第２のタンパク質特異的プローブの結合を検出する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記試料と、第３の検出可能な標識によって標識される第３のタンパク質特異的プローブとを接触させる工程、および前記タンパク質に対して、前記第１のタンパク質特異的プローブ、前記第２のタンパク質特異的プローブおよび該第３のタンパク質特異的プローブの結合を同時シグナルとして検出する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第３の検出可能な標識は、フルオロフォアである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第３の検出可能な標識は、Ｃｙ３である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記第３のタンパク質特異的プローブは、タンパク質の改変に対して特異的である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質の改変は、リン酸化アミノ酸である、請求項６または１２に記載の方法。
【請求項１４】
種々の時点において、前記第１のタンパク質特異的プローブ、前記第２のタンパク質特異的プローブおよび前記第３のタンパク質特異的プローブの結合を検出する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
別の分子の存在下で前記第１のタンパク質特異的プローブ、前記第２のタンパク質特異的プローブおよび前記第３のタンパク質特異的プローブの結合を検出する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のタンパク質特異的プローブおよび前記第２のタンパク質特異的プローブの結合のレベルを、前記第１のタンパク質特異的プローブ、前記第２のタンパク質特異的プローブおよび前記第３のタンパク質特異的プローブの結合のレベルと比較する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料と、第２のタンパク質に対して特異的なプローブの第２の対とを接触させることによって第２のタンパク質を検出する工程をさらに包含し、該第２の対の各メンバーは、区別可能であって検出可能な標識によって標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料と、複数のタンパク質の各メンバーに対する特異的プローブの対とを接触させることによって該複数のタンパク質を検出する工程をさらに包含し、対の各メンバーは、区別可能であって検出可能な標識によって標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質は、１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質は、３０ｆＭ以下の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質は、前記試料中で２×１０６個の分子中に１個の頻度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、または尿試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料は、ナノリットルの容量である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質の４次構造において、前記第１のタンパク質特異的プローブは、１つの鎖に対して特異的であり、そして前記第２のタンパク質特異的プローブは、別の鎖に対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を検出するための方法であって、該方法は、以下：
試料と、第１のｍｉＲＮＡ特異的プローブおよび第２のｍｉＲＮＡ特異的プローブとを接触させる工程；ならびに
単一のｍｉＲＮＡに対する該第１のｍｉＲＮＡ特異的プローブおよび該第２のｍｉＲＮＡ特異的プローブの両方の結合を、同時シグナルとして検出する工程；
を包含し、
該第１のｍｉＲＮＡ特異的プローブおよび該第２のｍｉＲＮＡ特異的プローブは、互いに区別可能な第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識によってそれぞれ標識され、そして単一のｍｉＲＮＡに対する該第１のｍｉＲＮＡ特異的プローブおよび該第２のｍｉＲＮＡ特異的プローブの両方の結合は、該ｍｉＲＮＡが、該試料中に存在することを示す、方法。
【請求項２６】
前記第１のｍｉＲＮＡ特異的プローブおよび前記第２のｍｉＲＮＡ特異的プローブは、核酸である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｍｉＲＮＡ特異的プローブは、配列特異的プローブである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の検出可能な標識および前記第２の検出可能な標識は、フルオロフォアである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の検出可能な標識および前記第２の検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ４８８およびＣｙ５である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料と、第２のｍｉＲＮＡに対して特異的であるプローブの第２の対とを接触させることによって該第２のｍｉＲＮＡを検出する工程をさらに包含し、該プローブの第２の対は、区別可能であって検出可能な標識によってそれぞれ標識される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料と複数のプローブ対とを接触させることによって複数のｍｉＲＮＡを検出する工程をさらに包含し、該複数のプローブ対は、該複数のｍｉＲＮＡのメンバーに対してそれぞれ特異的であり、そして各対の各メンバーは、区別可能であって検出可能な標識によって標識される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｍｉＲＮＡは、１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｍｉＲＮＡは、３０ｆＭ以下の濃度で存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｍｉＲＮＡは、前記試料中で２×１０６個の分子中に１個の頻度で存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料は、ナノリットルの容量である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
１種より多くの構成要素を含む複合体を検出するための方法であって、該方法は、以下：
試料と、第１の構成要素特異的プローブおよび第２の構成要素特異的プローブとを接触させる工程；ならびに
単一の複合体に対する該第１の構成要素特異的プローブおよび該第２の構成要素特異的プローブの両方の結合を、同時シグナルとして検出する工程；
を包含し、
該第１の構成要素特異的プローブおよび該第２の構成要素特異的プローブは、互いに区別可能な第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識によってそれぞれ標識され、そして単一の複合体に対する該第１の構成要素特異的プローブおよび該第２の構成要素特異的プローブの両方の結合は、該複合体が、該試料中に存在することを示す、方法。
【請求項３７】
前記第１の構成要素は、タンパク質であり、そして前記第２の構成要素は、核酸である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の構成要素特異的プローブは、抗体または抗体フラグメントであり、そして前記第２の構成要素特異的プローブは、核酸である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の構成要素および前記第２の構成要素は、両方ともタンパク質である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の構成要素特異的プローブおよび前記第２の構成要素特異的プローブは、両方とも抗体または抗体フラグメントである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１の構成要素および前記第２の構成要素は、両方とも核酸である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１の構成要素特異的プローブおよび前記第２の構成要素特異的プローブは、両方とも核酸である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１の構成要素は、酵素であり、そして前記第２の構成要素は、基質である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１の構成要素は、公知の分子であり、そして前記第２の構成要素は、該第１の構成要素の推定上の結合パートナーである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１の検出可能な標識および前記第２の検出可能な標識は、フルオロフォアである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１の検出可能な標識および前記第２の検出可能な標識は、それぞれ、Ａｌｅｘａ４８８およびＣｙ５である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料と、第３の検出可能な標識によって標識される第３の構成要素特異的プローブとを接触させる工程、ならびに前記第１の構成要素特異的プローブ、前記第２の構成要素特異的プローブ、および該第３の構成要素特異的プローブの結合を同時シグナルとして検出する工程をさらに包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第３の検出可能な標識は、フルオロフォアである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記試料と、複数の構成要素特異的プローブとを接触させる工程であって、該複数の構成要素特異的プローブの各々は、前記複合体中の別個の構成要素に対して特異的であり、かつ区別可能であって検出可能な標識によってそれぞれ標識される、工程、および該複数の構成要素特異的プローブの結合を同時シグナルとして検出する工程をさらに包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
前記複合体は、１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５１】
前記複合体は、３０ｆＭ以下の濃度で存在する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５２】
前記複合体は、前記試料中で２×１０６個の分子中に１個の頻度で存在する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５３】
前記試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、または尿試料である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５４】
前記試料は、ナノリットルの容量である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５５】
１種より多くの構成要素を含む複合体を検出するための方法であって、該方法は、以下：
第１の検出可能な標識によって標識された第１の構成要素特異的プローブを、該第１の検出可能な標識と区別可能である第２の検出可能な標識によって標識された第２の構成要素を含有する試料に接触させる工程；および
該第２の構成要素を含有する複合体に対する該第１の構成要素特異的プローブの結合を同時シグナルとして検出する工程；
を包含し、
同時シグナルは、該複合体が、該試料中に存在することを示す、方法。
【請求項５６】
前記第２の構成要素は、内因的に標識される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記第２の構成要素は、前記第２の検出可能な標識で標識される第２の構成要素特異的プローブによって標識される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記第１の構成要素は、タンパク質であり、そして前記第２の構成要素は、核酸である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１の構成要素および前記第２の構成要素は、両方ともタンパク質である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１の構成要素および前記第２の構成要素は、両方とも核酸である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１の構成要素特異的プローブは、抗体または抗体フラグメントである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１の構成要素特異的プローブは、核酸である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
前記第１の構成要素特異的プローブは、抗体または抗体フラグメントである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
前記第２の構成要素特異的プローブは、核酸である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
前記第２の構成要素特異的プローブは、抗体または抗体フラグメントである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
前記第１の構成要素は、酵素であり、そして前記第２の構成要素は、基質である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１の構成要素は、公知の分子であり、そして前記第２の構成要素は、該第１の構成要素の推定上の結合パートナーである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６８】
前記第２の構成要素は、公知の分子であり、そして前記第１の構成要素は、該第２の構成要素の推定上の結合パートナーである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１の構成要素および前記第２の構成要素は、区別可能なフルオロフォアによって標識される、請求項５５に記載の方法。
【請求項７０】
前記区別可能な標識は、Ａｌｅｘａ４８８およびＣｙ５である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記試料と、第３の検出可能な標識によって標識される第３の構成要素特異的プローブとを接触させる工程、ならびに前記複合体に対する前記第１の構成要素特異的プローブおよび該第３の構成要素特異的プローブの結合を同時シグナルとして検出する工程をさらに包含する、請求項５５に記載の方法。
【請求項７２】
前記第３の検出可能な標識は、フルオロフォアである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記試料と、複数の構成要素特異的プローブとを接触させる工程であって、該複数の構成要素特異的プローブの各々は、前記複合体中の別個の構成要素に対して特異的であり、かつ区別可能であって検出可能な標識によってそれぞれ標識される、工程、および該複数の構成要素特異的プローブの結合を同時シグナルとして検出する工程をさらに包含する、請求項５５に記載の方法。
【請求項７４】
前記複合体は、１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する、請求項５５に記載の方法。
【請求項７５】
前記複合体は、３０ｆＭ以下の濃度で存在する、請求項５５に記載の方法。
【請求項７６】
前記複合体は、前記試料中で２×１０６個の分子中に１個の頻度で存在する、請求項５５に記載の方法。
【請求項７７】
前記試料は、ナノリットルの容量である、請求項５５に記載の方法。
【請求項７８】
１種より多くの構成要素を含む複合体を検出するための方法であって、該方法は、以下：
第１の検出可能な標識によって標識された第１の構成要素と、該第１の検出可能な標識と区別可能である第２の検出可能な標識によって標識された第２の構成要素とを接触させる工程；および
該第２の構成要素に対する該第１の構成要素の結合を同時シグナルとして検出する工程；
を包含し、
同時シグナルは、該複合体が、存在することを示す、方法。
【請求項７９】
前記第１の構成要素は、第１の検出可能な標識によって内因的に標識される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記第２の構成要素は、第２の検出可能な標識によって内因的に標識される、請求項７８または７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記第１の構成要素は、前記第１の検出可能な標識で標識される第１の構成要素特異的プローブによって標識される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記第２の構成要素は、前記第２の検出可能な標識で標識される第２の構成要素特異的プローブによって標識される、請求項７８または８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記第１の構成要素および前記第２の構成要素は、両方とも核酸である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８４】
前記第１の構成要素および前記第２の構成要素は、両方ともタンパク質である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８５】
前記第１の構成要素は、タンパク質であり、そして前記第２の構成要素は、核酸である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８６】
前記第１の構成要素特異的プローブは、抗体または抗体フラグメントである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８７】
前記第２の構成要素特異的プローブは、抗体または抗体フラグメントである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８８】
前記第１の構成要素特異的プローブは、核酸である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８９】
前記第２の構成要素特異的プローブは、核酸である、請求項８２に記載の方法。
【請求項９０】
前記第１の構成要素は、酵素であり、そして前記第２の構成要素は、基質である、請求項７８に記載の方法。
【請求項９１】
前記第１の構成要素は、公知の分子であり、そして前記第２の構成要素は、該第１の構成要素の推定上の結合パートナーである、請求項７８に記載の方法。
【請求項９２】
前記第１の検出可能な標識および前記第２の検出可能な標識は、フルオロフォアである、請求項７８に記載の方法。
【請求項９３】
前記区別可能な標識は、Ａｌｅｘａ４８８およびＣｙ５である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記第２の構成要素に対する前記第１の構成要素の結合は、別の分子の存在下で測定される、請求項７８に記載の方法。
【請求項９５】
前記第２の構成要素に対する前記第１の構成要素の結合は、種々の時点において測定される、請求項７８に記載の方法。
【請求項９６】
第３の検出可能な標識によって標識された第３の構成要素を、前記第１の構成要素および前記第２の構成要素に接触させる工程、ならびに該第１の構成要素、該第２の構成要素、および該第３の構成要素の結合を、同時シグナルとして検出する工程をさらに包含し、同時シグナルは、３つの構成要素の複合体が存在することを示す、請求項７８に記載の方法。
【請求項９７】
前記第３の検出可能な標識は、フルオロフォアである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
区別可能であって検出可能な標識によってそれぞれ標識された複数の構成要素を接触させる工程、および該複数の構成要素の１つ以上の結合を同時シグナルとして検出する工程をさらに包含する、請求項７８に記載の方法。
【請求項９９】
前記複合体は、１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する、請求項７８に記載の方法。
【請求項１００】
前記複合体は、３０ｆＭ以下の濃度で存在する、請求項７８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記複合体は、前記試料中で２×１０６個の分子中に１個の頻度で存在する、請求項７８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記試料は、ナノリットルの容量である、請求項７８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、発明の名称「ＳＩＮＧＬＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ」であって、２００４年３月１９日に出願された米国仮特許出願番号第６０／５５４，７９２号、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ  ＡＮＤ  ＱＵＡＮＴＩＦＹＩＮＧ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ  ＩＮ  Ａ  ＳＡＭＰＬＥ」であって、２００４年３月２２日に出願された米国仮特許出願番号第６０／５５５，４８４号、および発明の名称「ＳＩＮＧＬＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ  ＡＮＤ  ＰＨＯＳＰＨＯＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ」であって、２００４年４月３０日に出願された米国仮特許出願番号第６０／５６６，６４６号に基づく優先権を主張し、これらの出願の全ての全内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、タンパク質（特に、その希少な種）のような単一分子の検出、およびこのような分子に関連する相互作用の測定に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
分子生物学および細胞生物学の研究は、細胞の微視的構造に集中している。細胞がその細胞の機能性を制御する複雑な微細構造を有することは、公知である。細胞の構造および機能に関連する多くの多様性は、種々の構成要素を、異なる細胞機構へと組み立てる細胞の能力に起因する。次に、細胞の細胞内容物は、細胞の転写制御および翻訳制御、ならびに細胞内容物の間の他の相互作用によって一部支配される。
【０００４】
細胞内容物およびその相互作用をそれぞれ同定する能力は、細胞の機能（例えば、増殖および分化）の理解に不可欠であり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
より迅速であり、そして困難でない、タンパク質のような分子およびそれらの相互作用の検出、測定ならびに分析に対する必要性は、特にこのような分子が非常に低濃度である場合に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、タンパク質のような単一分子の分析（検出および測定が挙げられる）に、部分的に関連する。このような分子の改変はまた、本発明に従って分析され得る。これらの改変としては、タンパク質の翻訳後修飾（例えば、リン酸化およびグリコシル化）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの改変は、不活性なタンパク質を活性なタンパク質に変換し得（逆もまた同じ）、したがって本方法はまた、タンパク質の活性状態を評価するのに使用され得る。本発明はまた、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のような単一の核酸分子の分析（検出および測定が挙げられる）に、部分的に関連する。
本発明はさらに、タンパク質を含有する複合体または核酸を含有する複合体のような複合体の分析（検出および測定が挙げられる）に部分的に関連する。例えば、本発明の方法は、タンパク質間の相互作用、核酸間の相互作用、タンパク質と核酸との間の相互作用、他の構成要素を有するタンパク質間の相互作用、および他の構成要素を有する核酸間の相互作用を検出し得る。これらの分析は、１つの時点または種々の時点において行われ得、それによって時間経過を生じ得る。これらの分析はまた、他の構成要素の存在下または非存在下で行われ得、これらの構成要素としては、例えば、このような相互作用の候補アゴニストまたは候補アンタゴニストが挙げられる。本発明は、結合速度および結合親和性を決定するための方法を提供する。
【０００７】
したがって、１つの局面において、本発明は、タンパク質を検出するための方法を提供し、この方法は、試料と、第１のタンパク質特異的プローブおよび第２のタンパク質特異的プローブとを接触させる工程、ならびに単一のタンパク質に対する第１のタンパク質特異的プローブおよび第２のタンパク質特異的プローブの両方の結合を同時シグナルとして検出する工程を包含する。第１のタンパク質特異的プローブおよび第２のタンパク質特異的プローブは、互いに区別可能な第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識によってそれぞれ標識され、そして単一のタンパク質に対するこの第１のタンパク質特異的プローブおよびこの第２のタンパク質特異的プローブの両方の結合は、このタンパク質が、この試料中に存在することを示す。この第１のタンパク質特異的プローブおよび第２のタンパク質特異的プローブは、好ましくは互いに異なり、したがって他方と異なる様式で、それぞれ、標的タンパク質を認識しかつ標的タンパク質に結合する。例えば、この第１のタンパク質特異的プローブおよび第２のタンパク質特異的プローブは、タンパク質の異なる領域（例えば、異なるドメイン、異なる２次構造など）に結合し得る。
１つの実施形態において、上記第１のタンパク質特異的プローブおよび第２のタンパク質特異的プローブは、抗体または抗体フラグメントであるが、それらはこれに限定されない。
なお別の実施形態において、本方法は、試料と第３の検出可能な標識によって標識された第３のタンパク質特異的プローブとを接触させる工程、ならびに第１のタンパク質特異的プローブ、第２のタンパク質特異的プローブおよび第３のタンパク質特異的プローブのタンパク質に対する結合を、同時シグナルとして検出する工程を包含する。
別の実施形態において、上記第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識は、フルオロフォアである。例として、この第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識は、それぞれ、Ａｌｅｘａ４８８およびＣｙ５である。この第３の検出可能な標識は、フルオロフォアであり得るが、これに限定されない。例として、この第３の検出可能な標識は、Ｃｙ３であり得る
１つの実施形態において、上記第２のタンパク質特異的プローブおよび／または上記第３のタンパク質特異的プローブは、タンパク質の改変（例えば、リン酸化されたアミノ酸残基が挙げられるが、これらに限定されない）に対して特異的であり得る。
本方法は、１つの時点または種々の時点において、上記第１のタンパク質特異的プローブおよび上記第２のタンパク質特異的プローブの結合（またはこの第１のタンパク質特異的プローブ、この第２のタンパク質特異的プローブおよび上記第３のタンパク質特異的プローブ）の結合を検出する工程を包含し得る。この種々の時点は、等間隔または無作為の間隔であり得る。
本方法は、別の分子の存在下で、第１のタンパク質特異的プローブおよび第２のタンパク質特異的プローブの結合（または第１のタンパク質特異的プローブ、第２のタンパク質特異的プローブおよび第３のタンパク質特異的プローブ）を検出する工程を、さらに包含し得る。この他の分子は、公知の分子であり得るが、これに限定されない。例えば、この他の分子は、標的タンパク質を改変するその能力、または、さらに他の分子によるタンパク質の改変を調節するその能力についてスクリーニングされる候補分子であり得る。これらの後者の実施形態において、本方法は、特定の活性を有する分子を同定するためのスクリーニング方法を包含し得る。
【０００８】
本方法は、第１のタンパク質特異的プローブ、および第２のタンパク質特異的プローブの結合のレベルを、第１のタンパク質特異的プローブ、第２のタンパク質特異的プローブ、および第３のタンパク質特異的プローブの結合のレベルに対して比較する工程をさらに包含し得る。
【０００９】
本方法は、１種より多いタンパク質を同時に検出するのに使用され得る。したがって、本方法は、試料と、第２のタンパク質に対して特異的なプローブの第２の対とを接触させることによって第２のタンパク質を検出する工程をさらに包含し得、この第２の対の各メンバーは、区別可能であって検出可能な標識によって標識される。同様に、本方法は、複数のタンパク質を検出するのに使用され得、したがって、試料と、複数のタンパク質の各メンバーに対する特異的プローブの対とを接触させることによってこの複数のタンパク質を検出する工程を包含し、対の各メンバーは、区別可能であって検出可能な標識によって標識される。
【００１０】
１つの実施形態において、そのタンパク質は、１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。別の実施形態において、そのタンパク質は、３０ｆＭ以下の濃度で存在する。なお別の実施形態において、そのタンパク質は、その試料中で２×１０６個の分子中に１個の頻度で存在する。
【００１１】
１つの実施形態において、上記試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、または尿試料である。別の実施形態において、その試料は、ナノリットルの容量である。
【００１２】
別の実施形態において、上記タンパク質を含む４次構造において、上記第１のタンパク質特異的プローブは、第１の鎖に対して特異的であり、そして上記第２のタンパク質特異的プローブは、第２の鎖に対して特異的である。なお別の実施形態において、この第１のタンパク質特異的プローブおよび第２のタンパク質特異的プローブは、このタンパク質上の、同一であるが繰り返されるエピトープに対して結合する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を検出するための方法を提供し、この方法は、試料と、第１のｍｉＲＮＡ特異的プローブおよび第２のｍｉＲＮＡ特異的プローブとを接触させる工程、ならびに単一のｍｉＲＮＡに対するこの第１のｍｉＲＮＡ特異的プローブおよび第２のｍｉＲＮＡ特異的プローブの両方の結合を同時シグナルとして検出する工程を包含する。この第１のｍｉＲＮＡ特異的プローブおよび第２のｍｉＲＮＡ特異的プローブは、互いに区別可能な第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識によってそれぞれ標識され、そして単一のｍｉＲＮＡに対するこの第１のｍｉＲＮＡ特異的プローブおよびこの第２のｍｉＲＮＡ特異的プローブの両方の結合は、ｍｉＲＮＡが、その試料中に存在することを示す。
【００１４】
１つの実施形態において、第１のｍｉＲＮＡ特異的プローブおよび第２のｍｉＲＮＡ特異的プローブは、核酸である。別の実施形態において、このｍｉＲＮＡ特異的プローブは、配列特異的プローブである。
【００１５】
１つの実施形態において、第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識は、フルオロフォアである。この第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識は、それぞれ、Ａｌｅｘａ４８８およびＣｙ５であり得るが、検出可能な標識が互いに区別可能である限り、それらに限定されない。
【００１６】
１つの実施形態において、本方法は、試料と、第２のｍｉＲＮＡに対して特異的であるプローブの第２の対とを接触させることによってこの第２のｍｉＲＮＡを検出する工程をさらに包含し、このプローブの第２の対は、区別可能であって検出可能な標識によってそれぞれ標識される。複数のｍｉＲＮＡもまた、試料と複数のプローブ対とを接触させることによって複数のｍｉＲＮＡを検出する工程で検出され得、この複数のプローブ対は、この複数のｍｉＲＮＡのメンバーに対して特異的であり、そして各対の各メンバーは、区別可能であって検出可能な標識によって標識される。
【００１７】
１つの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。別の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、３０ｆＭ以下の濃度で存在する。なお別の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、その試料中で２×１０６個の分子中に１個の頻度で存在する。その試料は、ナノリットルの容量であり得る。
【００１８】
なお別の局面において、本発明は、１種より多くの構成要素を含む複合体を検出するための方法を提供し、この方法は、試料と、第１の構成要素特異的プローブおよび第２の構成要素特異的プローブとを接触させる工程、ならびに単一の複合体に対するこの第１の構成要素特異的プローブおよびこの第２の構成要素特異的プローブの両方の結合を、同時シグナルとして検出する工程を包含する。この第１の構成要素特異的プローブおよびこの第２の構成要素特異的プローブは、互いに区別可能な第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識によってそれぞれ標識され、そして単一の複合体に対するこの第１の構成要素特異的プローブおよびこの第２の構成要素特異的プローブの両方の結合は、この複合体が、この試料中に存在することを示す。
【００１９】
１つの実施形態において、この第１の構成要素は、タンパク質であり、そしてこの第２の構成要素は、核酸である。関連する実施形態において、この第１の構成要素特異的プローブは、抗体または抗体フラグメントであり、そしてこの第２の構成要素特異的プローブは、核酸である。
【００２０】
別の実施形態において、この第１の構成要素およびこの第２の構成要素は、両方ともタンパク質である。関連する実施形態において、この第１の構成要素特異的プローブおよびこの第２の構成要素特異的プローブは、両方とも抗体または抗体フラグメントである。
【００２１】
なお別の実施形態において、その第１の構成要素およびその第２の構成要素は、両方とも核酸であり、そして関連する実施形態において、この第１の構成要素特異的プローブおよびこの第２の構成要素特異的プローブは、両方とも核酸である。
【００２２】
さらに別の実施形態において、この第１の構成要素は、酵素であり、そしてこの第２の構成要素は、基質である。なお別の実施形態において、この第１の構成要素は、公知の分子であり、そしてこの第２の構成要素は、この第１の構成要素の推定上の結合パートナーである。
【００２３】
種々の実施形態において、この第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識は、フルオロフォアである。例えば、この第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識は、それぞれＡｌｅｘａ４８８およびＣｙ５である。
【００２４】
１つの実施形態において、本方法は、試料と、第３の検出可能な標識によって標識される第３の構成要素特異的プローブとを接触させる工程、およびこの第１の構成要素特異的プローブ、この第２の構成要素特異的プローブおよびこの第３の構成要素特異的プローブの結合を、同時シグナルとして検出する工程をさらに包含する。この第３の検出可能な標識は、フルオロフォアであり得るが、これに限定されない。
【００２５】
別の実施形態において、本方法は、試料と、複数の構成要素特異的プローブとを接触させる工程であって、この複数の構成要素特異的プローブの各々は、この複合体中の別個の構成要素に対して特異的であり、かつ区別可能であって検出可能な標識によってそれぞれ標識される、工程、およびこの複数の構成要素特異的プローブの結合を同時シグナルとして検出する工程をさらに包含し得る。
【００２６】
別の局面において、本発明は、１種より多くの構成要素を含む複合体を検出するための方法であって、この方法は、第１の検出可能な標識によって標識された第１の構成要素特異的プローブを、この第１の検出可能な標識と区別可能である第２の検出可能な標識によって標識された第２の構成要素を含有する試料に接触させる工程、およびこの第２の構成要素を含有する複合体に対するこの第１の構成要素特異的プローブの結合を同時シグナルとして検出する工程を包含し、同時シグナルは、この複合体が、この試料中に存在することを示す方法を提供する。
【００２７】
１つの実施形態において、この第２の構成要素は、内因的に標識される。別の実施形態において、この第２の構成要素は、この第２の検出可能な標識で標識される第２の構成要素特異的プローブによって標識される。
【００２８】
上記実施形態に依存して、この第１の構成要素は、タンパク質であり得、そしてこの第２の構成要素は、核酸あり得るか、またはこの第１の構成要素およびこの第２の構成要素は、両方ともタンパク質であってもよく、またはこの第１の構成要素およびこの第２の構成要素は、両方とも核酸であってもよい
上記実施形態に依存して、この第１の構成要素特異的プローブは、抗体もしくは抗体フラグメントまたは核酸であり得、そしてこの第２の構成要素特異的プローブは、抗体もしくは抗体フラグメントまたは核酸であり得る。他の実施形態において、この第１の構成要素は、酵素であり、そしてこの第２の構成要素は、基質である。さらに別の実施形態において、この第１の構成要素は、公知の分子であり、そしてこの第２の構成要素は、この第１の構成要素の推定上の結合パートナー（または、逆もまた同じ）である。
【００２９】
１つの実施形態において、この第１の構成要素および第２の構成要素は、区別可能なフルオロフォア（例えば、Ａｌｅｘａ４８８およびＣｙ５であるが、これらに限定されない）によって標識される。
【００３０】
なお別の実施形態において、本方法は、試料と、第３の検出可能な標識によって標識される第３の構成要素特異的プローブとを接触させる工程、およびその複合体に対するこの第１の構成要素特異的プローブおよび第３の構成要素特異的プローブの結合を同時シグナルとして検出する工程をさらに包含する。この第３の検出可能な標識は、フルオロフォアであり得るが、これに限定されない。
【００３１】
別の実施形態において、本方法は、試料と、複数の構成要素特異的プローブとを接触させる工程であって、この複数の構成要素特異的プローブの各々は、その複合体中の別個の構成要素に対して特異的であり、かつ区別可能であって検出可能な標識によってそれぞれ標識される、工程、およびこの複数の構成要素特異的プローブの結合を同時シグナルとして検出する工程をさらに包含する。
【００３２】
なお別の局面において、本発明は、１種より多くの構成要素を含む複合体を検出するための方法であって、この方法は、第１の検出可能な標識によって標識された第１の構成要素と、この第１の検出可能な標識と区別可能である第２の検出可能な標識によって標識された第２の構成要素とを接触させる工程、およびこの第２の構成要素に対するこの第１の構成要素の結合を同時シグナルとして検出する工程を包含し、同時シグナルは、この複合体が、存在することを示す方法を提供する。
【００３３】
１つの実施形態において、その第１の構成要素は、第１の検出可能な標識によって内因的に標識される。別の実施形態において、その第２の構成要素は、第２の検出可能な標識によって内因的に標識される。なお別の実施形態において、その第１の構成要素は、その第１の検出可能な標識で標識される第１の構成要素特異的プローブによって標識される。いくつかの実施形態において、この第２の構成要素は、この第２の検出可能な標識で標識される第２の構成要素特異的プローブによって標識される。
【００３４】
上記実施形態に依存して、この第１の構成要素および第２の構成要素は、両方とも核酸であるか、またはそれらは、両方ともタンパク質であるか、この第１の構成要素は、タンパク質であり、そしてその第２の構成要素は、核酸である。
【００３５】
１つの実施形態において、この第１の構成要素特異的プローブは、抗体または抗体フラグメントである。別の実施形態において、この第２の構成要素特異的プローブは、抗体または抗体フラグメントである。
【００３６】
別の実施形態において、この第１の構成要素特異的プローブは、核酸である。さらに別の実施形態において、この第２の構成要素特異的プローブは、核酸である。
【００３７】
さらに別の実施形態において、この第１の構成要素は、酵素であり、そしてこの第２の構成要素は、基質である。別の実施形態において、この第１の構成要素は、公知の分子であり、そしてこの第２の構成要素は、この第１の構成要素の推定上の結合パートナーである。
【００３８】
この第１の検出可能な標識およびこの第２の検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ４８８およびＣｙ５のようなフルオロフォアであり得るが、これらに限定されない。
【００３９】
１つの実施形態において、この第２の構成要素に対するこの第１の構成要素の結合は、別の分子の存在下で測定される。この第２の構成要素に対するこの第１の構成要素の結合は、１つの時点または種々の時点において測定され得る。
【００４０】
１つの実施形態において、本方法は、第３の検出可能な標識によって標識された第３の構成要素をこの第１の構成要素およびこの第２の構成要素に接触させる工程、ならびにこの第１の構成要素、この第２の構成要素およびこの第３の構成要素の結合を、同時シグナルとして検出する工程をさらに包含し、同時シグナルは３つの構成要素の複合体が存在することを示す。この第３の検出可能な標識は、フルオロフォアであり得るが、これに限定されない。
【００４１】
本方法は、それぞれ標識された複数の構成要素を区別可能であって検出可能な標識に接触させる工程、およびこの複数の構成要素の１つ以上の結合を同時シグナルとして検出する工程をさらに包含し得る。
【００４２】
本発明のこの局面および他の局面において、この複合体は、１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で存在するか、または３０ｆＭ以下の濃度で存在する。同様に、その複合体はまた、その試料中で２×１０６個の分子中に１個の頻度で存在し得る。この試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、または尿試料であり得るが、これらに限定されない。この試料は、ナノリットルの容量であり得る。これらの方法は、単一分子検出システムまたは単一分子分析システムを使用して行われ得る。
【００４３】
本発明の限定の各々は、本発明の種々の実施形態を包含し得る。したがって、要素のいずれか１つまたは要素の組み合わせに関連する本発明の限定の各々が、本発明の各局面に包含され得ることが、予想される。本発明は、以下の記載に示されるか、もしくは図面において例示される構成要素の構造および／または配置の詳細に対するその適用に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり得、そして種々の手段で実施され得るかまたは実行され得る。
【００４４】
図は、単なる例示であり、そして本発明が実施可能であるために必要とされない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、単一分子の検出のための方法を提供する。本発明は、単一分子を検出し得、この単一分子としては、単一のタンパク質、単一の核酸（例えば、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）、ならびにタンパク質および核酸のいずれかまたは両方を潜在的に含む単一の複合体が挙げられる。本発明は、このような単一の分子における変化をさらに分析し得、この変化としては、リン酸化事象および脱リン酸化事象、ならびに会合事象または解離事象が挙げられる。この際に、本発明は、単一分子の状態（例えば、タンパク質の活性状態または不活性状態）を決定するための方法を提供し、別の分子に対する分子の親和性定数および結合定数（例えば、別のタンパク質または別の核酸に対するタンパク質の結合親和性）、その反応速度などを決定するための方法を提供する。本発明はまた、上記の現象のいずれかを妨害するかまたは促進する因子を同定し、そして単離するためのスクリーニング方法に使用され得る。
【００４６】
本明細書中で提供される方法は、分析されるタンパク質または分析される複合体の個々の構成要素に対して特異的な検出可能な標識の、時間的な同時検出に基づいて、単一分子または単一の複合体を検出する能力を包含する。本明細書中で使用される場合、同時検出とは、所定の時間において１種より多い検出可能な標識からの放出シグナルの検出をいう。一般的に、この時間は短く、単一分子を分析するのに必要な時間に近似する。図面および実施例に示されるように、この時間は、ミリ秒の桁であり得る。また図面に示されるように、同時検出は、放出シグナルとして明らかとなり、この放出シグナルは、時間の関数として重複する。所定の時間枠中の放出シグナルの共存は、それぞれ独立かつ区別可能に標識された２つの相互作用しない分子が、同時に呼掛け（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）スポットに存在することを示し得る。例としては、呼掛けスポットにおいて、非結合性であるが、検出可能かつ区別可能に標識された２つのプローブが同時に存在することが挙げられる。しかし、このスポットの量は、非常に小さい（そして対応する分析時間が非常に短い）ので、この事象の確からしさは小さい。むしろ、２つのプローブが同時に呼掛けスポットに存在する場合、このことは、そのスポットを通過する単一分子に対する両方のプローブの結合に起因するようである。
【００４７】
本発明の同時検出方法は、１つより多い放出シグナルを同時に検出することに関する。同時的な多くの放出シグナルは、多くの区別可能であって検出可能である利用可能な標識、多くの利用可能なプローブ、多くの検出される構成要素、使用される検出システムの性質などに依存する。一般的に、少なくとも２の放出シグナルが、検出される。いくつかの実施形態において、３つの放出シグナルが、検出される。しかし、本発明は、それらに限定されない。したがって、複数の構成要素は、単一の分析において検出され、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、１００、５００、１０００またはそれ以上の放出シグナルが、同時に検出され得る。
【００４８】
同時結合とは、単一分子または単一の複合体に対する２つ以上のプローブの結合をいう。２つ以上のプローブの同時結合は、目的の分子または複合体の指標として使用される。同時結合は、多くの形態を採り得、この形態としては、同時発色事象が挙げられるが、これに限定されず、それによって第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識に対応する２つの色が検出される。同時結合はまた、ＦＲＥＴドナーフルオロフォアである第１の検出可能な標識およびＦＲＥＴアクセプターフルオロフォアである第２の検出可能な標識の近接した結合として明らかとなり得る。この後者の実施形態において、正のシグナルは、ＦＲＥＴドナーフルオロフォアのレーザーによる励起に対する、ＦＲＥＴアクセプターフルオロフォアからのシグナルである。
【００４９】
同時検出分析は、非常に低い濃度で単一分子を検出し得る。例えば、本明細書中で議論されるように、低いフェムトモル濃度のタンパク質および他の単一分子は、２つまたは３つの放出シグナルのアプローチを使用して検出され得る。さらに、この分析は、４桁の規模より大きいダイナミックレンジを実証する。２放出シグナルのアプローチはまた、１ｎｇ／ｍｌ以下のレベルで単一分子（例えば、単一のタンパク質）を検出し得る。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、タンパク質は、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸モノマー（または残基）からなるポリマーである。したがって、タンパク質は、ペプチドを包含する。タンパク質はまた、天然に存在するタンパク質もしくは天然に存在しないタンパク質の、フラグメントまたは領域（例えば、ドメイン）を包含する。アミノ酸モノマーは、天然に存在するアミノ酸もしくは天然に存在しないアミノ酸であり得る。検出されるべきタンパク質は、本明細書中で「標的」タンパク質と称される。
【００５１】
本適用に依存して、このタンパク質は、検出可能な標識によって内因的に（例えば、合成の間に直接標識したアミノ酸を使用して）標識され得る。内因的に標識された分子は、検出されるために別個のプローブを必要としない。むしろ、内因的な標識は、この分子を検出可能にするのに十分である。代替的に、そしてより一般的に、このタンパク質は、このタンパク質に対する特異的プローブの結合によって標識される（すなわち、タンパク質は、外因的に標識される）。このプローブは、配列特異的プローブまたは構造特異的プローブであり得、この配列または構造は、そのタンパク質に対して十分に固有のプローブによって認識されそして結合される。
【００５２】
したがって、上記プローブは、標的タンパク質の１次構造、２次構造、または３次構造を認識し得る。タンパク質の１次構造は、アミノ酸の直線的な配列である。タンパク質の２次構造は、互いに近付けられる離れたアミノ酸を生じる種々のコンフォメーションへの、ペプチド「骨格」鎖の折り畳みをいう。２次構造の例としては、αへリックス、βプリーツシート、ランダムコイルが挙げられる。タンパク質の３次構造は、その全体的な３次元の構造である。タンパク質の４次構造は、１つ以上の他の高分子（例えば、他のタンパク質）との非共有結合性の相互作用によって形成される構造である。４次構造の例は、ヘモグロビンをなす４つのグロビンタンパク質サブユニットによって形成される構造である。本発明のプローブは、上述の構造のいずれかに対して特異的であり得る。４次構造はまた、本明細書中に記載されるように、複合体として認識され得る。
【００５３】
上記プローブは、それ自体がタンパク質であり得るが、これに限定されない。適切なタンパク質特異的プローブの例としては、抗体および抗体フラグメント、核酸（例えば、タンパク質標的を認識するアプタマー）、タンパク質の基質（好ましくは触媒不可能である）などが挙げられる。抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が挙げられ、そしてさらに、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤならびに抗体改変体（例えば、単鎖抗体）が挙げられる。抗体フラグメントは、少なくとも抗原結合部位を含み、したがって、これとしては、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書中で提供される方法は、特定の様式で標的分子に結合するプローブの使用を包含する。本明細書中で使用される場合、特異的結合は、このプローブが、他の分子に結合する場合よりも大きい親和性でこの標的に結合することを意味する。このプローブは、他の分子に結合し得るが、好ましくはこのような結合は、背景強度においてか、または背景強度付近で結合し得る。目的のタンパク質に対するプローブの親和性は、他の分子に対する親和性の、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、またはそれ以上であり得る。最も大きい差次的な親和性を有するプローブは、ほとんどの実施形態において好ましいが、それらは、標的に対する最も大きい親和性を有するプローブではあり得ない。
【００５５】
したがって、単一のタンパク質は、一般的には、そのタンパク質に特異的な少なくとも２つのプローブ（すなわち、本明細書中で議論されるようなタンパク質特異的プローブ）を使用して検出される。２つのプローブは、一般的に、十分な数であるが、より多い数が本適用に応じて使用され得る。試料は、そのタンパク質が存在する場合に、このタンパク質に対するこのプローブの結合を可能にする時間および条件下で、２つ以上のタンパク質特異的プローブとそのタンパク質を接触させることによってタンパク質の存在について試験され得る。両方のプローブの過剰な量は、全ての結合部位が占められることを確実にするために使用され得る。好ましくはこのプローブは、それらがこのタンパク質の異なる領域に結合し、したがってこのタンパク質に対する結合に関して互いに競合し得ないように選択される。このプローブはまた区別可能であって検出可能な標識（すなわち、その第１のプローブ上の検出可能な標識は、その第２のプローブ上の検出可能な標識とは異なる）によって標識される。一旦、このプローブが、（タンパク質が試料中に存在する場合）このタンパク質に結合可能にされると、この試料は、同時放出シグナルについて分析される。例えば、両方のプローブによって結合されたタンパク質は、この結合したプローブからの重複する放出シグナルとして明らかとなる。これは、単一分子検出システムまたは単一分子分析システムを使用して達成され得る。単一分子検出システムまたは単一分子分析システムは、個々の分子を検出および分析し得るシステムである
本方法は、希少または少ないサンプル（例えば、ナノリットルの容量の試料）またはタンパク質濃度が低い試料中のタンパク質を検出するのに特に適している。本発明は、１種より多い異なるタンパク質、および好ましくは数種の異なるタンパク質が同時に検出されることを可能にし、それによって試料を温存する。言い換えると、本方法は、高度な多重化が可能である。例えば、多重化の程度は、２（すなわち、１回の分析で２種類のタンパク質が検出され得る）、３、４、５、６、７、８、９、１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、またはそれ以上であり得る。各タンパク質は、そのプローブ対の各メンバーがこのタンパク質に対して特異的である特定のプローブ対を使用して検出され、そして分析に使用される各プローブは、区別可能な標識によって標識される。したがって、複数のタンパク質は、検出され、そして分析され得る。本明細書中で使用される場合、複数は、２つより大きいが、無限より小さい量である。複数は、ときとして、１００万より小さいか、１０００より小さいか、または１００より小さい。
【００５６】
実施例は、タンパク質特異的プローブとして抗体を使用するサンドイッチイムノアッセイを使用してそのタンパク質レベルを検出する能力を実証する。２つの抗体が使用され、これらの抗体の各々は、フルオロフォアによって標識される。このアッセイは、例えば、血漿試料中の希少な存在量のタンパク質マーカーを検出するのに十分なレベルである、１ｎｇ／ｍＬより少ない抗原に対して感受性である。実施例は、ポリクローナル抗体を使用するインターロイキン６（ＩＬ−６）の検出を実証する。ポリクローナル抗体は、本発明のこの局面および他の局面に使用され得る。なぜなら、本発明は、実質的に任意の分子に対するポリクローナル抗体を産生可能である必要があるからである。ポリクローナル抗体は、特定の分子に対して指向される抗体の不均質な混合物である。この混合物中の各抗体は、その標的分子上の異なるエピトープを認識し得る。
【００５７】
実施例はまた、Ａｋｔ１の検出を実証する。Ａｋｔ１は、３つのドメインを有し、これらのドメインは、プレクストリン（ｐｌｅｋｓｔｒｉｎ）相同性（ＰＨ）ドメイン、触媒（Ｃａｔ）ドメインおよび調節（Ｒｅｇ）ドメインである。ＰＨドメインおよびＲｅｇドメインに対する抗体は、Ａｋｔ１を検出するのに使用された。
【００５８】
本発明の別の局面において、上記標的は、複数の位置にてその標的分子に結合し得るプローブを使用して検出され、それによってこのシステムにおけるシグナル増幅、およびランダムノイズからの区別を可能にする。図８〜図１１に示される通り、複数のプローブ（例えば、抗体（またはそのフラグメント））の凝集を介して標的タンパク質または標的核酸の存在を検出することが可能である。プローブに対する標的の比が１である場合、抗原が検出される可能性はより少なくなる。しかし、所定の標的分子に結合されるプローブの数を増加させることによって、その複合体によって放出される全ての増加したシグナルに起因して、この標的を検出する可能性は、より大きくなる。
【００５９】
特異的プローブが目的のタンパク質に利用可能である限り、本発明は、検出され得るタンパク質に限定されない。検出され得るタンパク質としては、臨床的に重要なタンパク質（例えば、尿または血液（血漿および血清を含む）のような臨床的試料中に通常検出されるタンパク質）が挙げられる。これらとしては、標準的な診断プロトコル（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１３版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．に列挙されるプロトコル）に使用される成長因子およびサイトカイン、ホルモン、組織から漏出するタンパク質、ならびに古典的な血漿タンパク質が挙げられる。検出されるべきタンパク質としてはまた、法医学的な有用性を有するタンパク質（例えば、ＨＬＡマーカーおよびそれらに対して指向される抗体、ＡＢＯ式血液型およびそれらに対して指向される抗体、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ  ２−１）、赤血球酸性ホスファターゼ（ＥＡＰ）、エステラーゼＤ（ＥｓＤ）、アデニルキナーゼ（ＡＫ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６−ＰＧＤ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤ）ならびにトランスフェリン（Ｔｆ））が挙げられる。実質的に、特異的プローブによって検出され得る多型性を有する任意のタンパク質は、本発明の法医学的方法における標的であり得る。検出されるべき他のタンパク質としては、シグナル伝達タンパク質（例えば、レセプターキナーゼ、アダプター分子など）、転写因子、発育メディエーター（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ）、ヒストンおよびヒストン修飾酵素（例えば、デアセチラーゼ）、ホスファターゼ、脂質修飾酵素などが挙げられる。
【００６０】
本明細書中に記載されるように時間または条件の関数として、タンパク質の存在、非存在、およびレベルを測定することもまた可能である。
【００６１】
本発明は、試料中のタンパク質の相対濃度または絶対量を決定するのに使用され得る。この相対濃度または相対量は、タンパク質に対して同時に結合されるプローブからの同時シグナルの量を測定することによって決定される。この同時シグナルのレベルは、その試験溶液が絶対的な定量化のために分析される前か、またはそれと同時に、作成される標準検量線と比較され得る。この標準検量線は、既知のタンパク質濃度（ｘ軸）に対する関数としてのシグナル強度（ｙ軸）のプロットである。当業者は、このような曲線の作成に精通している。同様のアプローチは、他の分子（例えば、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない）の濃度を決定するのに使用され得る。
【００６２】
上記プローブは、目的のタンパク質の任意の領域に対して特異的であり得る。いくつかの実施形態において、このプローブは、タンパク質の改変に対して特異的である。タンパク質の改変としては、翻訳後修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、アセチル化など）が挙げられる。検出され得る改変の型に対する唯一の制限は、それぞれに対する特異的プローブの利用能である。
【００６３】
リン酸化の場合において、プローブは、特定のタンパク質上のリン酸化残基を認識し得る。このタンパク質が、リン酸化形態および脱リン酸化形態で存在する場合、このプローブ（単独で使用される場合）は、タンパク質のサブセットのみを認識する。しかし、そのリン酸化に特異的なプローブと、そのタンパク質の他の領域を認識する他のプローブとを組み合わせることによって、リン酸化されるタンパク質の割合を決定することが可能である。時間経過としてこの分析を行うことによって、リン酸化形態または脱リン酸化形態への変換速度を研究することが、さらに可能である。
【００６４】
実施例は、例として、Ａｋｔ１を使用して、タンパク質のリン酸化を検出する能力を例示する。Ｓｅｒ／ＴｈｒキナーゼＡｋｔ１は、残基Ｓｅｒ４７３にてリン酸化される。抗体は、Ｓｅｒ４７３がリン酸化される場合（すなわち、ｐＳｅｒ４７３）、Ｓｅｒ４７３を特異的に認識し、そしてこれに特異的に結合し得る。このＡｋｔ１のリン酸化形態が、活性であるのに対して、その脱リン酸化形態は、不活性である。これらの実施例において、このリン酸化形態は、上記ＰＨドメインに対する１つの抗体プローブ、上記Ｃ末端（またはＲｅｇ）ドメインに対する１つの抗体プローブ、およびｐＳｅｒ４７３に対する１つの抗体を使用して検出される。赤色シグナル、緑色シグナルおよび青色シグナルの同時検出は、Ａｋｔ１のリン酸化形態、したがってＡｋｔ１の活性形態を示す。ｐＳｅｒ４７３特異的抗体の結合は、そのＣ末端抗体の結合を干渉しない。したがって、全てのＡｋｔ１は、Ａｋｔ１の活性種および不活性種の両方が、そのタンパク質がリン酸化されるか否かにかかわらずそのＰＨ抗体およびＣ末端抗体に結合することに起因して、赤色−緑色の同時発生の総数によって示される。
【００６５】
単一分子検出は、生物学的修飾因子（例えば、キナーゼおよびホスファターゼのインヒビターならびに標的）の発見および特徴付けに対して、迅速かつ定量的な方法を提供する。Ａｋｔ１の実施例において、リン酸化Ａｋｔ１の存在は、１種以上の他の分子の存在下、非存在下または濃度変化の下で決定され得る。これらのスクリーニングアッセイは専らＡｋｔ１に対する効果に限定されないことが、理解されるべきである。むしろ、それらは、適切な特異的プローブが利用可能である限り、リン酸化され得る任意のタンパク質に適合され得る。
【００６６】
種々の改変に対して特異的な抗体は、商業的な供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎなど）から入手でき、またはこれらの抗体は、当該分野において公知である技術によって合成され得る。
【００６７】
本発明の方法はまた、複合体の存在、複合体の形成、複合体の解離、および複合体の含量を分析するために使用され得る。本明細書中で使用される場合、複合体は、互いに対してイオン的または非イオン的に結合された２種以上の構成要素である。本明細書中で使用される場合、複合体中の各メンバーは、構成要素と称される。この構成要素は、互いに同一であっても異なっていてもよい。この構成要素は、タンパク質、核酸、化合物などであり得る。複合体の例としては、タンパク質−タンパク質複合体、タンパク質−核酸複合体、核酸−核酸複合体、酵素−基質複合体などが挙げられる。複合体は、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、またはそれ以上の構成要素を有し得る。
【００６８】
複合体は、その複合体の各構成要素に対して特異的なプローブを使用し、そしてこのようなプローブからの同時シグナルを検出することで検出される。したがって、２つの構成要素の複合体は、各構成要素に対して１つである２つのプローブからの同時シグナルによって検出される。同様に、３つの構成要素の複合体は、各構成要素に対して１つである３つのプローブからの同時シグナルによって検出される。この目的のために使用されるプローブは、構成要素特異的プローブといわれる。したがって、複合体の第１の構成要素を認識するプローブは、第１の構成要素特異的プローブといわれる。同様に、複合体の第２の構成要素を認識するプローブは、第２の構成要素特異的プローブといわれる。
【００６９】
その実施形態に依存して、この構成要素は、検出可能な標識によって内因的に標識され得、それによって特定の構成要素を検出するためのさらなるプローブに対する必要性を回避する。例えば、分析される複合体がタンパク質−核酸複合体である場合、核酸合成の間にその構造中に組み込まれた検出可能な標識を有する核酸を使用することが、可能である。同様に、タンパク質は、その合成中に検出可能に標識されたアミノ酸残基を使用する検出可能な標識を内因的に含み得る。これらの構成要素は、複合体の形成に対する他の分子の影響を分析する場合（例えば、複合体に対するインヒビターのスクリーニング）に、より適切であり得る。
【００７０】
実施例は、転写因子およびそれらの核酸標的の複合体の検出を実証する。これらの実施例において、この核酸は、２本鎖であり、そしてＣｙ５フルオロフォアによって標識されている。このタンパク質は、初期増殖応答因子（Ｅａｒｌｙ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅｇｒ−１の、ジンクフィンガー核酸が結合するドメインであり、そしてこのタンパク質は、ＢＯＤＩＰＹ−Ｆ１によって標識されている。時間的に同時のＣｙ５シグナルおよびＢＯＤＩＰＹシグナルの出現および消失を介する、形成および解離の時間の関数としての分析は、会合速度、解離速度、したがってその構成要素の互いに対する親和性に関する情報を与え、そして最終的にその複合体の安定性に関する情報を与える。このような方法に使用されるデータ分析は、当該分野において標準的である。
【００７１】
本明細書中で言及されるように、複合体の形成および安定性に対する他の分子の効果を研究することが、可能である。これらの他の化合物としては、複合体の形成に関する、推定上のアゴニストまたはアンタゴニストが挙げられる。このような化合物は、天然に存在する化合物および／または天然に存在しない化合物を含むライブラリーに由来し得る。本発明は、目的の複合体に対するこれらのライブラリーメンバーのそれぞれの効果を検出する高感度な方法を提供する。
【００７２】
本発明はまた、既知の構成要素に対して特定の親和性を有する化合物を同定するために使用され得る。これらの実施形態において、複合体の１つの構成要素は、既知であり、そしてその目的は、その構成要素に結合する化合物を同定し、かつ単離することである。後者の化合物は、本明細書中で、その既知の構成要素の「結合パートナー」といわれる。その推定上の結合パートナーは、上記されるようなライブラリー中にあり得る。しかし、この実施形態において、そのライブラリーメンバーは、その既知の構成要素との接触前に、（同一の標識によって）検出可能に標識され得る。その既知の化合物は、同じアッセイに使用される他の標識とは異なる検出可能な標識によって標識される。検出可能に標識された既知の構成要素およびライブラリーメンバーからの同時シグナルは、そのライブラリーメンバーがその既知の構成要素に対して特定の結合親和性を有することを示す。例えば、親和性の程度は、環境の調節（例えば、塩濃度、ｐＨ、および温度の増加または減少）によって、さらに分析され得る。
【００７３】
用語「核酸」は、本明細書中で、複数のヌクレオチド（すなわち、置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである、交換可能な有機塩基に連結された糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含有する分子）を意味するために使用される。本明細書中で使用される場合、この用語は、オリゴリボヌクレオチドならびにオリゴデオキシリボヌクレチドをいう。この用語はまた、ポリヌクレオシド（すなわち、リン酸を除いたポリヌクレオチド）、およびポリマーを含む任意の他の有機塩基を包含する。核酸は、既存の核酸の供給源（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）から得られても、合成的手段（例えば、核酸合成によって生成される）によって得られてもよい。
【００７４】
核酸に関する文脈において使用される場合、「配列特異的」プローブは、ヌクレオチドまたはその誘導体の、特定の直線的な（または準直線的な）配列を認識するプローブを意味する。好ましい実施形態において、このプローブは、それ自体が核酸要素（例えば、ＤＮＡ要素、ＲＮＡ要素、ＰＮＡ要素およびＬＮＡ要素ならびにそれらの組み合わせ）（以下で議論されるような）からなる。好ましい実施形態において、この直線的な配列は、そのプローブ中の対応する相補的ヌクレオチドにそれぞれ結合する、連続したヌクレオチドまたはその誘導体を含む。しかし、いくつかの実施形態において、この配列は、そのプローブ上の対応する相補的残基を有さない１つ、２つ、またはそれ以上のヌクレオチドが存在し得るように、連続的ではあり得ない。
【００７５】
構造的特異性または配列特異性によって核酸を認識し得る任意の分子が、使用され得る。ほとんどの場合において、このようなプローブは、少なくともその核酸標的とワトソン−クリック結合を形成する。他の場合において、その核酸プローブは、核酸標的とフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）結合を形成し、それによって３重鎖を形成し得る。フーグスティーン結合によって結合する核酸プローブは、核酸標的の主溝に進入し、そしてそこに位置する塩基とハイブリダイズする。これらの後者のプローブの例としては、核酸の副溝および主溝を認識し、そしてそこに結合する分子（例えば、抗生物質のいくつかの形態）が挙げられる。いくつかの実施形態において、この核酸プローブは、その核酸標的と、ワトソン−クリック結合およびフーグスティーン結合の両方を形成し得る。例えば、ビスＰＮＡプローブは、核酸に対するワトソン−クリック結合およびフーグスティーン結合の両方が可能である。
【００７６】
核酸プローブの長さはまた、結合の特異性を決定し得る。そのプローブとその核酸標的との間の単一ミスマッチのエネルギーコストは、より長い配列に対してより、より短い配列に対してのほうが、相対的に高い。したがって、より小さい核酸プローブのハイブリダイゼーションは、より長い核酸プローブのハイブリダイゼーションより特異的である。なぜなら、そのより長いプローブは、ミスマッチを含み、そしてその条件に依存して、さらにその核酸に結合し続け得るからである。しかし、より短いプローブの使用に対する１つの潜在的な制限は、所定の温度および塩濃度におけるそれらの本質的な、より低い安定性である。この後者の制限を回避するために、ビスＰＮＡプローブは、十分なハイブリッド安定性を伴って、より短い配列を結合するために使用され得る。
【００７７】
これらの但し書きにもかかわらず、核酸プローブは、少なくとも４ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチドを超える範囲の任意の長さであり得る。好ましい実施形態において、このプローブは、５〜１００ヌクレオチド長であり、より好ましくは５〜２５ヌクレオチド長の間であり、そしてさらにより好ましくは５〜１２ヌクレオチド長である。あらゆる長さが本明細書中に明確に列挙されたものとして、このプローブの長さは、ヌクレオチド間の任意の長さであり得、本明細書中に列挙される範囲が挙げられる。したがって、この長さは、少なくとも５ヌクレオチド長，少なくとも１０ヌクレオチド長，少なくとも１５ヌクレオチド長，少なくとも２０ヌクレオチド長、もしくは少なくとも２５ヌクレオチド長であっても、それ以上の長さであってもよい。このプローブの全てとは限らない残基がその核酸標的中の相補的残基に対してハイブリダイズする必要があることが、理解されるべきである。例えば、このプローブは、その核酸標的にハイブリダイズする残基の、５０残基長であり得、さらに２５残基長のみの長さであり得る。好ましくは、ハイブリダイズする残基は、互いに連続的である。
【００７８】
この核酸プローブは、好ましくは１本鎖であるが、そのプローブはこれに限定されない。例えば、このプローブがビスＰＮＡである場合、そのプローブは、その核酸標的を伴う２次構造を採り得、３重へリックスのコンフォメーションを生じ、このコンフォメーションは、そのポリマーの骨格とフーグスティーン結合を形成するビスＰＮＡクランプの１つの領域およびその標的のヌクレオチド塩基とワトソン−クリック結合を形成するビスＰＮＡクランプの別の領域を有する。
【００７９】
上記核酸プローブは、その核酸標的内の相補的配列に対してハイブリダイズする。その結合の特異性は、ハイブリダイズ条件に基づいて操作され得る。例えば、塩濃度および温度は、その核酸プローブによって認識される配列の範囲を変化させるために調節され得る。当業者は、所望の特異性のための至適条件を決定し得る。
【００８０】
上記核酸標的は、本明細書中で議論される配列特異的な標識化に加えて、配列非特異的な様式で標識され得る。例えば、ＤＮＡ骨格は、骨格標識によって染色され得る。配列非特異的な様式で核酸を標識する骨格染色因子の例としては、インターカレートする色素（例えば、フェナントリジン、およびアクリジン（例えば、エチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、エチジウムホモダイマー−１およびエチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジドおよびＡＣＭＡ））；副溝結合因子（例えば、インドールおよびイミダゾール（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３４５８０およびＤＡＰＩ））；および種々の核酸染色因子（例えば、アクリジンオレンジ（またインターカレートし得る）、７−ＡＡＤ、アクチノマイシンＤ、ＬＤＳ７５１、およびヒドロキシスチルバミジン）が挙げられる。上述の核酸染色因子の全ては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．のような供給業者から市販されている。
【００８１】
核酸染色因子のさらに他の例としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから得られる以下の色素が挙げられる：シアニン色素（例えば、ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＪＯＪＯ−１、ＬＯＬＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩＩ、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＳＹＴＯ−４０、ＳＹＴＯ−４１、ＳＹＴＯ−４２、ＳＹＴＯ−４３、ＳＹＴＯ−４４、ＳＹＴＯ−４５（青色）、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＴＯ−１６、ＳＹＴＯ−２４、ＳＹＴＯ−２１、ＳＹＴＯ−２３、ＳＹＴＯ−１２、ＳＹＴＯ−１１、ＳＹＴＯ−２０、ＳＹＴＯ−２２、ＳＹＴＯ−１５、ＳＹＴＯ−１４、ＳＹＴＯ−２５（緑色）、ＳＹＴＯ−８１、ＳＹＴＯ−８０、ＳＹＴＯ−８２、ＳＹＴＯ−８３、ＳＹＴＯ−８４、ＳＹＴＯ−８５（橙色）、ＳＹＴＯ−６４、ＳＹＴＯ−１７、ＳＹＴＯ−５９、ＳＹＴＯ−６１、ＳＹＴＯ−６２、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６３（赤色））。
【００８２】
さらに、上記核酸標的は、伸長する核酸中にフルオロフォアを直接組み込む様式で合成され得る。例えば、この後者の標識化は、化学的手段または核酸中への活性アミノ基または活性チオール基の導入によって達成され得る。（ＰｒｏｕｄｎｉｋｏｖおよびＭｉｒａｂｅｋｏｖ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４：４５３５−４５３２，１９９６）。核酸ポリマーに対して行われ得る改変手順に関する広範な記述は、本明細書中に参考として援用されるＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６に見出され得る。
【００８３】
ＤＮＡを、化学的に直接標識する数種の公知である方法が存在する（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６；Ｒｏｇｅｔら、１９８９；ＰｒｏｕｄｎｉｋｏｖおよびＭｉｒａｂｅｋｏｖ，１９９６）。この方法の１つは、ＤＮＡの部分的な脱プリン化によるアルデヒド基の導入に基づく。結合したヒドラジン基を有する蛍光標識は、アルデヒド基と効率的に結合され、そしてこのヒドラジン結合は、約６０％のナトリウム標識効率を有する還元によって安定化される。過剰なアミンフルオロフォアの存在下での、シトシンと亜硝酸水素塩との反応は、そのＮ４位におけるアミノ基転移を生じる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６）。反応条件（例えば、ｐＨ、アミンフルオロフォアの濃度、およびインキュベーション時間）および温度は、形成される生成物の収率に影響する。高濃度（３Ｍ）のアミンフルオロフォアにおいて、アミノ基転移は、１００％に近づき得る（ＤｒａｐｅｒおよびＧｏｌｄ，１９８０）。
【００８４】
上記の方法に加えて、蛍光的に標識されたヌクレオチドを使用して、デノボ（例えば、自動核酸合成機を使用する）で核酸を合成することもまた、可能である。このようなヌクレオチドは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓおよびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ／Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒのような供給業者から市販されている。
【００８５】
本発明はまた、核酸分子（例えば、マイクロＲＮＡおよびｓｉＲＮＡであり、これらの両方は、一般的に低いレベルで存在する）の検出に適している。ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、それぞれ、約７〜３５ヌクレオチド長の範囲である、比較的短いＲＮＡ分子である。それらのＲＮＡは、ｍＲＮＡ種からの翻訳を干渉し得、したがって、細胞中のタンパク質発現を制御し得る。
【００８６】
本発明は、２つ以上のプローブを使用するこれらのＲＮＡ種の測定を企図する。このプローブは、そのＲＮＡに対するそれぞれ他の結合を干渉するべきではなく、そして非常に好ましくは、このプローブは、その標的ＲＮＡの異なる領域を認識し、そしてそれに結合する。適切なプローブは、通常、相補的な様式でそれらの標的中のヌクレオチドの直線的な配列を認識し、そしてそれに結合する配列特異的プローブであり得る。
【００８７】
いくつかの実施形態において、上記プローブは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ビスＰＮＡクランプ、ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）、ｓｓＰＮＡ、偽相補的（ｐｓｅｕｄｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）ＰＮＡ（ｐｃＰＮＡ）、２つの腕を持った（ｔｗｏ−ａｒｍｅｄ）ＰＮＡ、２つの腕を持ったＤＮＡ、２つの腕を持ったＲＮＡ、もしくは上記の共核酸（ｃｏ−ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（例えば、ＤＮＡ−ＬＮＡ共核酸）（出願番号第１０／４２１，６４４号および公開番号ＵＳ  ２００３−０２１５８６４  Ａ１号を有し、そして２００３年１１月２０日に公開された同時係属中の米国特許出願、ならびに出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１２４８０号および公開番号ＷＯ０３／０９１４５５  Ａ１を有し、そして２００３年４月２３日に出願され、２００３年１１月６日に公開されたＰＣＴ出願に記載されるような）、またはそれらのコポリマー（例えば、ＤＮＡ−ＬＮＡコポリマー）である。
【００８８】
図１２Ａは、核酸（例えば、ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ（例えば、２１マーの合成２本鎖）に対する例示的なアッセイの模式図である。差次的に標識されたプローブが使用され、これらの各々は、その標的ｍｉＲＮＡの異なる領域に結合する（例えば、このプローブが核酸である場合にはまた、ハイブリダイズする）。１つの分子上の検出可能な標識の両方の検出は、特定の標的の存在を示す。ハイブリダイズ条件は、そのアッセイにおいて必要とされるストリンジェンシーおよび特異性のレベルによって変化し得る。図１２Ｂは、全てのＲＮＡバックグラウンド中に急上昇した（ｓｐｉｋｅｄ）ｌｉｎ−４  ｍｉＲＮＡに対する分析結果を示す。このアッセイは、ピコモル以下の感度、高い特異性、および幅広いダイナミックレンジを示す。時間依存性の様式（例えば、アッセイ進行の間）でｍｉＲＮＡレベルの変化を測定することもまた、可能である。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのモデルシステムにおいて、Ｌ１段階、Ｌ２段階、Ｌ３段階および成熟段階の間およびこれらの段階を通してｌｉｎ−４レベルを測定することが可能であり、この測定は、これまでに報告された結果と相関する結果を伴った（データは示さず）。
【００８９】
本明細書中に記載される方法を使用して、ｓｉＲＮＡ曝露後のｍＲＮＡレベルの変化を検出することもまた可能であった。本発明の方法は、ＲＴ−ＰＣＲの結果と相関する結果を与えた（データは示さず）。
【００９０】
本明細書中で提供される方法およびシステムは、３ｆＭの桁における感度（１億個の全バックグラウンド分子あたり約１コピー）および４＋  ｌｏｇのダイナミックレンジおよび１０％未満のＣＶを実証する。
【００９１】
試験されるべき試料は、生物学的試料または身体上の試料（例えば、組織生検、尿、痰、精液、糞、唾液など）であり得る。いくつかの場合において、この試料は、目的の分子の収集および／または単離無しで分析され得る。あるいは、タンパク質、核酸または複合体の収集および単離が行われ得、そしてそれを実行するための方法は、当該分野において慣習的に実施され、そしてその方法は、標準的な分子生物学の教科書（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ’Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙのような）中に見出され得る。
【００９２】
重要な実施形態において、上記試料は、ナノリットルの容量を有する。すなわち、本明細書中で記載される方法を行うために、この検出システム中にナノリットルの容量をロードすることのみが必要とされる。さらに他の重要な実施形態において、このタンパク質は、その試料中で１，０００，０００個の分子中に１個の頻度、または２，０００，０００個の分子中に１個の頻度で存在する。したがって、本方法は、非常に希少であるタンパク質を検出し、そして分析するために使用され得る。
【００９３】
上記タンパク質および核酸は、分析前に直線状にされても伸展されてもよいが、このことは、この検出システムが伸展された変化形および凝縮された変化形の両方を分析し得る場合、必要ではない。これは特に、同時発生の事象が検出される場合であり、この同時発生の事象は、これらの事象が、少なくとも２つの標識の存在または非存在を単に必要とするが、その標的の相対位置決め方式に必ずしも依存しないことに起因して検出される（しかし、これらの事象がＦＲＥＴを使用して検出されるとき、それらが互いの間のエネルギー輸送を可能にするために、互いに対して十分に近い場合に限る）。いくつかの場合において、特に、そのプローブが２次構造、３次構造または４次構造を認識するプローブである場合、このタンパク質または複合体のコンフォメーションを改変することさえも望まれ得ない。
【００９４】
本明細書中で使用される場合、上記標的タンパク質または標的核酸を伸展することは、それらが、コンパクトな形態、コイルした形態および／または折り畳まれた（例えば、２次）形態よりもむしろ、実質的に直線状に伸ばされた（例えば、変性された）形態で提供されることを意味する。分析前にこのタンパク質を伸展することは、この直線状の形態を維持するために、例えば、単一分子検出システムの特定の構成を使用して達成され得る。これらの構成は、その標的がコンパクトな形態で分析され得る場合、必要とされない。
【００９５】
この試料または反応混合物は、分析前に洗浄され得る。本明細書中で使用される場合、「洗浄すること」とは、結合していないプローブを除去するプロセスをいう。この洗浄する工程は、多くの手段で達成され得、この手段としては、カラム精製が挙げられるが、これに限定されない。一般的に、カラム精製は、より大きい分子（例えば、この標的タンパク質）の貫流による、カラム内における小さい分子の捕捉を包含する。しかし、特に同時検出は、所望の結合事象と人為的事象との間を区別し得るので、本方法が分析前にこれらの試薬を除去せずに行われ得ることが、理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態において、その結合していない検出可能なプローブは、分析前に除去されない。
【００９６】
本発明の標的およびプローブは、内因的かまたは外因的に、検出可能に標識される。検出可能な標識は、その存在が直接的または間接的に確認され得る部分である。一般的に、この標識の検出は、（例えば、エネルギーの放出のような）検出可能なシグナルの生成に関する。この標識は、化学物質性の標識、ペプチド性の標識または核酸性の標識であり得るが、これらに限定されない。使用される標識の性質は、因子の変化形に依存し、その因子としては、実行される分析の性質、使用されるエネルギー源および検出器の型、および標的の型が挙げられる。この標識は、それが結合される成分に、立体的および化学的に適合可能であるべきである。検出可能な標識は、例えば、光を放出する標識、エネルギーを受容する標識、蛍光を発する標識、放射活性標識、消光する標識などであり得るが、本発明はこの点に限定されない。適切な標識を選択するための指針およびポリマーに外因的な標識を添加するための方法は、米国特許第６，３５５，４２０  Ｂ１号中でより詳細に提供される。
【００９７】
上記検出可能な標識は、直接的かまたは間接的に検出され得る。直接的に検出可能な部分は、特定の波長の光を放出および／または吸収するその能力によって直接検出され得る部分である。間接的に検出可能な部分は、特定の波長の光を次々に放出または吸収し得る別の部分を結合し、補充し、そしていくつかの場合において切断するその能力によって、間接的に検出され得る部分である。間接的な検出の例は、基質を直接的に検出可能な産物へと切断する第１の酵素標識の使用である。この標識は、有機的性質であっても無機的性質であってもよい。例えば、それは、本質的に化学物質、ペプチド物質または核酸物質であり得るが、これらに限定されない。標識は、チオール基、アミノ基またはカルボキシル基を使用して、ポリマーまたはプローブと結合体化され得る。
【００９８】
より具体的には、上記検出可能な標識は、例えば、蛍光分子のような直接的に検出可能な標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、Ｃｙ−７、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｐｈａｒ−Ｒｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フルオレセインアミン、エオシン、ダンシル、ウンベリフェロン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナートスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン、アクリジンイソチオシアナート、ｒ−アミノ−Ｎ−（３−ビニルスルホニル）フェニルナフタルイミド−３，５，ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノ−４−トリフルオロメチルコウルアリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ  １５１）、シアノシン、４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５’’−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ）、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナートフェニル）−４−メチルクマリンジエチレントリアミンペンタアセテート、４，４’−ジイソチオシアナートジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアナート（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシンイソチオシアナート、エリスロシンＢ、エリスロシンイソチオシアナート、エチジウム、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、フルオレスカミン、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎイソチオシアナート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザニリン、Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ、Ｂ−フィコエリトリン、ｏ−フタルジアルデヒド、ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル  １−ピレンブチレート、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ．ＲＴＭ．Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ３Ｂ−Ａ）、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）ローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸ、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体、テトラメチルローダミン、リボフラビン、ロゾール酸、およびテルビウムキレート誘導体）、化学発光分子、生物発光分子、色素生産性分子、放射性同位体（例えば、Ｐ３���またはＨ３、１４Ｃ、１２５Ｉおよび１３１Ｉ）、電子スピン共鳴分子（例えば、ニトロキシルラジカルのような）、光学濃度分子または電子密度分子、電荷を変換する分子または電荷を移動する分子、電磁気的分子（例えば、磁性もしくは常磁性のビーズまたは粒子）、半導体ナノ結晶または半導体ナノ粒子（例えば、米国特許第６，２０７，３９２号に記載され、そしてＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＥｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販される量子ドット）、コロイド金属、コロイド金のナノ結晶、核磁気共鳴分子などからなる群より選択され得る。
【００９９】
上記検出可能な標識はまた、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビピルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼのようなルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）；グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのようなサッカライドオキシダーゼ；複素環オキシダーゼ（例えば、過酸化水素を用いてＨＲＰのような色素前駆体を酸化する酵素、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼにカップリングされるウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ））、酵素基質、アフィニティー分子、リガンド、レセプター、ビオチン分子、アビジン分子、ストレプトアビジン分子、抗原（例えば、ＦＬＡＧエピトープまたはＨＡエピトープのようなエピトープタグ）、ハプテン（例えば、ビオチン、ピリドキサール、ギゴキシゲニンフルオレセインおよびジニトロフェノール）、抗体、抗体フラグメント、マイクロビーズなどのような間接的に検出可能な標識からなる群より選択され得る。
【０１００】
さらに、上記標識は、電子スピン共鳴分子（例えば、ニトロキシルラジカルのような）、蛍光分子（すなわち、フルオロフォア）、化学発光分子（例えば、化学発光基質）、放射性同位体、光学濃度マーカーまたは電子密度マーカー、酵素、酵素基質、ビオチン分子、ストレプトアビジン分子、電荷を移動する分子（すなわち、電荷を変換する分子）、色素生産性基質、半導体ナノ結晶、半導体ナノ粒子、コロイド金のナノ結晶、リガンド、マイクロビーズ、磁性ビーズ、常磁性粒子、量子ドット、アフィニティー分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗原、ハプテン、抗体、抗体フラグメント、および脂質からなる群より選択され得る。
【０１０１】
使用される検出システムの性質は、使用される検出可能な標識の性質に依存する。その検出システムは、当該分野において公知である多くの検出システムから選択され得る。これらとしては、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）検出システム、電荷結合素子（ＣＣＤ）検出システム、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）検出システム、光電子増倍（ＰＭＴ）検出システム、蛍光検出システム、電気的検出システム、写真用フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）検出システム、走査トンネル顕微鏡法（ＳＴＭ）検出システム、光学的検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近視野検出システム、および全反射（ＴＩＲ）検出システムが挙げられ、これらの多くは、電磁気的検出システムである。
【０１０２】
結合された抗体の検出は、当業者に公知である技術によって達成される。抗体は、検出可能な標識によってその抗体を直接標識するか、またはそれ自体が検出可能に標識され、かつその標的に結合される１次抗体に対して特異的である２次抗体をその抗体に結合することのいずれかによって検出され得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、上記検出可能な標識は、１つの型の検出システムを使用して検出可能である区別可能なシグナルを、全て放出する。例えば、この検出可能な部分は、全て蛍光標識であり得る。他の実施形態において、この検出可能な標識は、異なる検出システムを使用して検出され得る。例えば、一方のプローブは、フルオロフォアによって標識され得るが、他方のプローブは、放射性同位体によって標識され得る。
【０１０４】
いくつかの場合において、上記検出可能な標識は、蛍光シグナルを用いるＦＲＥＴシステムの一部であり、この蛍光シグナルは、ドナー分子およびアクセプター分子の近い配置に依存する。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、「結合体化される」は、任意の物理化学的手段によって、互いに安定して結合された２つの実体を意味する。この結合の性質がいずれの実体の有効性を実質的に損なわないようなものであることが、重要である。これらのパラメーターを注意して維持すること、当業者に公知である任意の共有結合的な連結または非共有結合的な連結は、本明細書中の他所で明確に記載されない限り企図される。非共有結合的な結合体化としては、疎水的相互作用、イオン的相互作用、高親和性相互作用（例えば、ビオチン−アビジンの複合体化およびビオチン−ストレプトアビジンの複合体化）および他の親和性相互作用が挙げられる。結合のこのような手段および方法は、当業者に公知である。結合体化は、当業者に共通する標準的な技術を使用して行われ得る。例えば、米国特許第３，９４０，４７５号および同第３，６４５，０９０号は、抗体に対する、フルオロフォアおよび酵素の結合体化を実証する。
【０１０６】
例えば、種々の標識と反応性である官能基としては、（官能基：光放射性化合物の反応性基）活性化エステル：アミンまたはアニリン；アシルアジド：アミンまたはアニリン；アシルハライド：アミン、アニリン、アルコールまたはフェノール；アシルニトリル：アルコールまたはフェノール；アルデヒド：アミンまたはアニリン；アルキルハライド：アミン、アニリン、アルコール、フェノールまたはチオール；アルキルスルホネート：チオール、アルコールまたはフェノール；無水物：アルコール、フェノール、アミンまたはアニリン；アリールハライド：チオール；アジリジン：チオールまたはチオエーテル；カルボン酸：アミン、アニリン、アルコールまたはアルキルハライド；ジアゾアルカン：カルボン酸；エポキシド：チオール；ハロアセトアミド：チオール；ハロトリアジン：アミン、アニリンまたはフェノール；ヒドラジン：アルデヒドまたはケトン；ヒドロキシアミン：アルデヒドまたはケトン；イミドエステル：アミンまたはアニリン；イソシアネ−ト：アミンまたはアニリン；およびイソチオシアネート：アミンまたはアニリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
ポリマーは、単一分子分析システムを使用して分析され得る。単一分子分析システムは、他の分子と別々に単一の分子を検出し得る。このようなシステムは、十分に感受性であり、単一分子およびその結合したプローブから放出されるシグナルを検出する。このシステムは、単一の分子が線形様式（すなわち、そのポリマーの長さに従う点において始まり、その後１つの方向または別の方向に進行性に移動する）で分析される、線形分子検出システムであり得る。検出が主にシグナル（例えば、同時シグナル）の存在または非存在に基づく特定の実施形態において、線形分析は、必要とされ得ない。このシステムは、単一のポリマーが同時に検出される、複数のプローブおよび標識を伴う全体性において分析される直接的な分子分析システムであり得る。
【０１０８】
このシステムは、好ましくは電気泳動法ではなく、したがってこのシステムは、ときとして非電気泳動式の単一分子検出（または分析）システムといわれる。このようなシステムは、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動に依存しないで、互いから分子を分離する。
【０１０９】
単一分子検出／分析システムの例は、Ｇｅｎｅ  ＥｎｇｉｎｅＴＭ技術に基づくＴｒｉｌｏｇｙＴＭ機器であり、Ｇｅｎｅ  ＥｎｇｉｎｅＴＭ技術は、それぞれ１９９８年８月１３日および２０００年２月２４日に公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／３５０１２および同ＷＯ００／０９７５７、および公報が発行された米国特許第６，３５５，４２０  Ｂ１号（２００２年３月１２日に公報が発行された）に記載される。この後者のシステムは、単一のポリマーが相互作用ステーションを通過することを可能にし、それによってそのポリマーの単位または化合物の標識は、そのポリマー／化合物／複合体に結合体化された検出可能な標識が存在するか否かを決定するために、個別に検索される。解析は、エネルギー源（例えば、設定波長の光学的照射）に対してこの標識を曝す工程を包含する。エネルギー源への曝露に対する応答において、この検出可能な標識は、検出可能なシグナルを放出する。シグナル放出および検出についての機構は、検出が求められる標識の型に依存する。
【０１１０】
ＴｒｉｌｏｇｙＴＭ技術は、分子の線形分析を必要とせず、そしてむしろその全体性において分子を分析する。ＴｒｉｌｏｇｙＴＭは、ナノリットルの解析区画中で個々に標識された分子のリアルタイムの集計を提供する。このシステムは、低いフェムトモル濃度において、標識された分子を検出し、そして４＋  ｌｏｇを超えるダイナミックレンジを提示する。このシステムは、標準的な試料キャリア（例えば、９６ウェルプレートまたは微量遠心（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブであるがこれらに限定されない）に適応し得る。この試料の容量はマイクロリットルの桁（例えば、１μｌ容量）であり得る。
【０１１１】
本発明は、以下の実施例によって、さらに例示され、これらの実施例は、決してさらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用される全ての参考文献（参考文献、公報が発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）の内容全体は、本明細書によって参考として明確に援用される。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１．単一分子検出の実験的プラットフォーム）
単一分子検出は、Ｕ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＴｒｉｌｏｇｙＴＭ機器を使用して達成され得る。Ｕ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＴｒｉｌｏｇｙＴＭ機器は、共焦点のインテグレイテッドオプティクス、多色レーザー解析および多色レーザー検出、ミクロフルイディクス（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）および機器を制御するため、データを取り込むため、および分析するための搭載型ソフトウェアを備える。蛍光標識された分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）を含む試料がこの機器を貫流する場合の模式図は、図１Ａに示される。この試料は、フルオロフォアがレーザー励起を受け、そして生じた発光が測定されるミクロフルイディクスチャンバーを通して移動する。２重に標識された分子は、２色の同時発光を生成するが、遊離のフルオロフォアまたは結合されなかったプローブは、単一色を放出する。図１Ｂにおいて、検出されるような多数の赤色−緑色の同時ピークを同定する５０ｍｓの画面写真が、示される。いくつかの次数の大きさにわたって直線的な反応（より低いフェムトモル範囲（挿入図）および各試行間の低い変動の感受性）を示す２重に標識されたオリゴＤＮＡの滴定は、図１Ｃに示される
（実施例２．単一分子のイムノアッセイ）
複数の抗体（Ａｂ）の間に挟まれた抗原（Ａｇ）から構成される免疫複合体の形成は、図２Ａに示される模式図に図示される。図２Ｂおよび図２Ｃは、単一分子のイムノアッセイからのデータを、蛍光強度  対  時間として示すグラフを含む。抗原の非存在下（図２Ｂ）において、個々の色素標識された抗体分子は、単独で検出区画を通過し、そして設定された閾値を上回る分離した蛍光ピークを、それぞれ示す。抗原の存在下（図２Ｃ）において、抗原に対して結合される異なる色で色素標識された抗体の対は、上記検出区画を同時に通過し、そしてこの免疫複合体は、一対の同時ピークを示す。
【０１１３】
（実施例３．単一分子のイムノアッセイを使用するタンパク質レベルの定量化）
タンパク質レベルを、単一分子のイムノアッセイおよびＵ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＴｒｉｌｏｇｙＴＭ機器を使用して定量化した。ＩＬ−６の個々の分子を、ＩＬ−６ならびにＡｌｅｘａ４８８およびＣｙ５によって別個に標識したポリクローナル抗体の混合物を含む溶液における、青色−赤色（Ａｌｅｘａ４８８−Ｃｙ５）の同時ピークとして検出した。図３に示した結果は、３つの測定値の平均＋標準偏差（棒）を示す。検出した分子の数は、ＩＬ−６濃度に、直線的に依存する。この特定のアッセイの感度は、＜１ｎｇ／ｍＬである。
【０１１４】
（実施例４．単一分子のイムノアッセイを使用するＡｋｔ１の特異的リン酸化状態の定量化）
Ｓｅｒ−／Ｔｈｒ−キナーゼＡｋｔ１およびそのリン酸化による活性化の模式図は、図４Ａに示される。Ａｋｔ１（すなわち、ＰＫＢ）は、細胞の応答（例えば、転写、タンパク質合成、グリコーゲン合成、細胞増殖および細胞の生存、ならびに新脈管新生）において中心的な役割を果たす。ＢｒａｚｉｌおよびＨｅｍｍｉｎｇｓ  ２００１，ＴＩＢＳ，２６：６５７。Ａｋｔ１は、図４Ａに示されるように、上記調節ドメインの残基Ｓｅｒ４７３のリン酸化によって、不活性酵素から活性酵素に変換される。
【０１１５】
Ａｋｔ１の活性化状態に対して特異的なフルオロフォア標識された抗体は、図４Ｂに図示される。図４Ｃは、Ａｋｔ１に対する、ＰＨドメイン特異的モノクローナル抗体（Ｃｙ５（赤色）によって標識された）およびＣ末端特異的ポリクローナル抗体（Ｃｙ３（緑色）によって標識された）の結合を示す。図４Ｄは、Ｃｙ５（赤色）によって標識されたＰＨドメイン特異的モノクローナル抗体、Ｃｙ３（緑色）によって標識されたＣ末端特異的ポリクローナル抗体、およびＡｌｅｘａ４８８（青色）によって標識されたＡｋｔ１ホスホ−Ｓｅｒ４７３特異的モノクローナル抗体の結合を示す。全３種の抗体を含む混合物とＡｋｔ１との反応後、不活性Ａｋｔ１分子および活性Ａｋｔ１分子は両方とも、緑色−赤色（Ｃｙ３−Ｃｙ５）の同時ピークとして検出されるのに対して、活性Ａｋｔ１分子だけは、青色−緑色−赤色（Ａｌｅｘａ４８８−Ｃｙ３−Ｃｙ５）の同時ピークとして検出される。
【０１１６】
図６は、単一分子のイムノアッセイを使用して、Ａｋｔ１の特異的リン酸化状態を定量化するために得られたデータを示す。Ａｋｔ１を、３つの異なる色の抗体の混合物と反応させ、そして各試料を、複数のレーザーによって同時に分析した。図５ＡはＡｋｔ１のＣ末端（Ｃｙ３、緑色）およびＰＨドメイン（Ｃｙ５、赤色）を認識する色素標識された抗体の、２色（緑色−赤色）の同時発生を示し、このことは、Ａｋｔ１の特異的検出を示す。活性Ａｋｔ１および不活性Ａｋｔ１の両方は、緑色−赤色の同時ピークを生じ；このようなピークは、Ａｋｔ１の非存在下またはＧＳＴコントロールの存在下で検出されなかった。図５Ｂにおいて、Ｓｅｒ４７３におけるＡｋｔ１リン酸化（Ａｌｅｘａ４８８、青色）およびＡｋｔ１のＰＨドメイン（Ｃｙ５、赤色）（パネルＡにおいてそれと同時に行った）を認識する色素標識された抗体の青色−赤色の同時発生は、活性Ａｋｔ１分子の特異的検出を示す。活性Ａｋｔ１だけが、青色−赤色の同時ピークを生じるのに対して、このようなピークは、Ｓｅｒ４７３がリン酸化されていない不活性Ａｋｔ１の存在下で検出されなかった。図５Ｃは、分子の数  対  活性Ａｋｔ１の％を示すグラフである。Ａｋｔ１のＰＨドメイン（Ｃｙ５、赤色）、Ｃ末端（Ｃｙ３、緑色）、およびリン酸化されたＳｅｒ４７３（Ａｌｅｘａ４８８、青色）を認識する、フルオロフォア標識された抗体の３色の同時発生（活性Ａｋｔ１の相対的レベルの定量化を示す）が示される。各試料は、示された画分から構成される合計１００ｎＭの不活性Ａｋｔ１である残余を伴う活性Ａｋｔ１の望ましい分数からなるＡｋｔ１を含んだ。検出された分子の数は、Ｓｅｒ４７３においてリン酸化された酵素分子の数に関する画分の増加に起因して、活性Ａｋｔ１分子の比率と共に直線的に増加した。
【０１１７】
（実施例５．複合体の分析）
図６Ａ〜図６Ｃは、核酸とジンクフィンガードメイン（ＺＦＤ）との間に形成されるべき複合体を模式的に示す。図７Ａは、一度、平衡状態に到達する結合反応の結果を示す。図７Ｂは、このシステムの動態解析を示す。２本鎖ＤＮＡ標的に対して結合する初期増殖応答タンパク質Ｅｇｒ−１のＺＦＤを、Ｂｏｄｉｐｙ−Ｆｌ標識したＺＦＤとＣｙ５標識した２本鎖ＤＮＡ標的とを混合することによって研究した。単一分子分析を使用して測定したＺＦＤ−ＤＮＡの解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、公開データと一致した。同様に、測定したＫｄ（解離定数は、１／Ｋａと等しく、Ｋａは、平衡定数である）は、公開データと一致した。
【０１１８】
（等価物）
前述された明細書は、当業者に本発明の実施を可能とするのに十分であると考えられる。本発明は、実施例が本発明の１つの局面の単なる例示として意図され、そして他の機能的に等価な実施形態が本発明の範囲内であることに起因して、提供された実施例によって範囲が限定されるべきではない。本明細書中に示されかつ記載される改変に加えて、本発明の種々の改変は、前述の記載から当業者に明らかとなる。本発明のそれぞれの限定は、本発明の種々の実施形態を包含し得る。したがって、要素のいずれか１つまたは要素の組み合わせを包含する本発明のそれぞれの制限が、本発明の各局面に含まれ得ることが予期される。本発明は、添付の記載に示されるかまたは図面に示される構成要素の構造および配置の細部への適用に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、そして種々の手段によって実施され得るかまたは実行され得る。
【０１１９】
本明細書中で使用される語法および専門用語は、説明の目的のためであり、限定と見なされるべきではない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、および本明細書におけるそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目およびその等価物ならびにさらなる項目を含むことを意味する。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１−１】図１Ａは、検出スポットを通過する試料の流れ中の、分子（例えば、タンパク質または複合体）の移動を示す模式図である。このタンパク質または複合体は、結合された検出可能な標識の存在によって示されるような、１つ以上のプローブによって標識され得る。結合されていない、検出可能に標識されたプローブはまた、呼掛けスポット（または区画）を通過する。一旦、この呼掛けスポットに入ると、検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）は、レーザー励起を受け、そしてその結果として起こる発光は、収集され、そして測定される。２重に標識された分子は、同時に発光を生じるのに対して、遊離の（すなわち、結合されていない）プローブは、単一色を放出する。
【図１−２】図１Ｂは、図１Ａに従って分析された試料の発光プロフィールを示す、代表的な画面取り込みである。この画面取り込みは、５０ミリ秒のデータを含む。それは、多くの２色の同時ピーク（矢印によって示される）を含む。図１Ｃは、このアッセイの感度の範囲を決定するプローブ滴定実験の結果を示すグラフである。２重に標識されたオリゴヌクレオチドの濃度と検出される同時ピークの数との間の直線的な関係は、数桁の大きさにわたって観察され、この関係は、低いフェムトモル範囲〜中程度のフェムトモル範囲（挿入図）および各試行間の低い変動性である感度を伴う。
【図２−１】図２Ａは、抗原（Ａｇ）（例えば、タンパク質）に対する、検出可能かつ区別可能に標識された抗体プローブ（Ａｂ）の結合を示す模式図である。抗体プローブ対は、その対の各メンバーがその抗原の別々の領域を認識し、そしてそれに結合し、それによってこの抗原に対するこの対の、最大限の同時（例えば、同時の（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）または同時の（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ））結合を確保するように、設計される。
【図２−２】図２Ｂは、結合されなかった、検出可能かつ区別可能に標識された抗体プローブの試料の発光プロフィールを示す模式図である。各プローブは、２つのプローブがその解析スポットに共存する可能性が小さいことに起因して、個々に検出される。点線は、設定された閾値を示す。図２Ｃは、結合されていない、検出可能かつ区別可能に標識された抗体プローブおよび２重に標識された抗原（例えば、タンパク質）を含む試料の発光プロフィールを示す模式図である。この結合されていないプローブは、個別の、時間的に離れたピークとして検出されるが、その抗原は、区別可能であって検出可能な標識の２つの重複するピークによって検出される。点線は、設定された閾値を示す。
【図３】図３は、２色の同時検出アプローチを使用する、ＩＬ−６に対するアッセイの結果を示すグラフである。ＩＬ−６の個々の分子を、Ａｌｅｘａ４８８およびＣｙ５によって個々に標識されたポリクローナル抗体を使用して、同時発生的な青色−赤色（例えば、Ａｌｅｘａ４８８−Ｃｙ５）として検出した。結果は、３つの測定値の平均＋標準偏差（棒）として示される。分子の数は、ＩＬ−６濃度に直線的に依存する。このアッセイの感度は、１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【図４−１】図４Ａは、Ａｋｔ１のドメイン構造およびその活性化に対するリン酸化の役割を示す模式図である。ＰＨは、プレクストリン相同性ドメインを示す。Ｃａｔは、触媒ドメインを示す。Ｒｅｇは、調節ドメインを示す。
【図４−２】図４Ｂは、リン酸化（すなわち、活性）Ａｋｔ１と非リン酸化（すなわち、不活性）Ａｋｔ１との間を区別するための３つの抗体プローブの使用を示す模式図である。２つの抗体プローブ（例えば、ＰＨ特異的抗体およびＣ末端ドメイン特異的抗体）は、活性Ａｋｔ１および不活性Ａｋｔ１を検出するために使用され、そして別の抗体は、リン酸化アミノ酸残基（すなわち、ｐＳｅｒ４７３）を検出するために使用される。活性Ａｋｔ１は、１つのＡｋｔ１抗体プローブおよび１つのｐＳｅｒ４７３抗体プローブによって達成され得るか、または２つのＡｋｔ２抗体プローブおよび１つのｐＳｅｒ４７３抗体プローブによって達成され得る。使用される抗体プローブの各々は、区別可能に標識される。図４Ｃは、リン酸化されていない（すなわち、不活性）Ａｋｔ１に結合する抗体プローブを示す模式図である。このアプローチは、Ａｋｔ１の活性状態または不活性状態にかかわらず、Ａｋｔ１を検出するために使用され得る。図４Ｄは、リン酸化（すなわち、活性）Ａｋｔ１に対して結合する抗体プローブを示す模式図である。活性Ａｋｔ１は、青色−緑色−赤色の同時ピークとして検出されるのに対して、全Ａｋｔ１は、緑色−赤色の同時ピークとして検出される。３色のシステムの使用は、活性Ａｋｔ１と不活性Ａｋｔ１との間を区別する。全Ａｋｔ１の知見または不活性Ａｋｔ１への変換なしで、活性Ａｋｔ１だけを検出することが目的とされる場合、このアプローチは、Ａｋｔ１（例えば、ＰＨ−ドメインまたはＲｅｇドメインのいずれか）に対する１つの抗体プローブ、およびｐＳｅｒ４７３に対する１つの抗体に単純化され得る。
【図５−１】図５Ａは、ＰＨドメインに対する抗体およびＡｋｔ１のＣ末端に対する抗体を使用する場合に、活性Ａｋｔ１の存在下、不活性Ａｋｔ１の存在下、および非Ａｋｔ１コントロール（すなわち、ＧＳＴ）の存在下で検出される２色の同時ピークの数を示す棒グラフである。図５Ｂは、ＰＨドメインに対する抗体およびｐＳｅｒ４７３に対する抗体を使用する場合に、活性Ａｋｔ１の存在下、不活性Ａｋｔ１の存在下、および非Ａｋｔ１コントロール（すなわち、ＧＳＴ）の存在下で検出される２色の同時ピークの数を示す棒グラフである。
【図５−２】図５Ｃは、ＰＨドメインに対する抗体、およびＣ末端に対する抗体、およびＡｋｔ１のｐＳｅｒ４７３に対する１つの抗体を使用する場合に、試料中の活性Ａｋｔ１の存在と３色の同時ピークの数との間の直線的な関係を示すグラフである。各試料は、合計１００ｎＭの、不活性Ａｋｔ１である残余を伴う活性Ａｋｔ１の種々の画分を構成するＡｋｔ１を含んだ。検出された分子の数は、Ｓｅｒ４７３においてリン酸化された酵素分子の数における画分の増加に起因して、活性Ａｋｔ１分子の比率と共に直線的に増加する。
【図６−１】図６Ａは、タンパク質分子と核酸分子との間の相互作用を示す模式図である。このタンパク質は、核酸に結合する転写因子であり得る。この図において、ジンクフィンガードメイン（ＺＦＤ）である核酸結合ドメインが、示される。
【図６−２】図６Ｂは、相互作用しないが区別可能に標識されたタンパク質（例えば、ＺＦＤ）およびこのタンパク質が結合し得る核酸を含む試料の発光プロフィールを示す模式図である。このタンパク質とこの核酸との間の相互作用のない間、各々は、個別のピークとして検出される。図６Ｃは、各々が個別のピークとして検出される相互作用しない核酸およびタンパク質ならびに重複するピークの対として検出される核酸−タンパク質複合体を含む試料の発光プロフィールを示す模式図である。この核酸とこのタンパク質との間の相互作用が可逆的である場合、時間経過分析は、結合する速度および結合が切れる速度を決定するために行われ得る。別のアプローチにおいて、構成要素の結合親和性は、平衡状態において結合された構成要素および結合されていない構成要素の量を測定することによって決定され得る。なお別のアプローチにおいて、特定の核酸（またはヌクレオチド配列）に対して結合するタンパク質が、検出され得、そして必要に応じて単離され得る。この分析が、各構成要素に対して特異的なプローブが利用可能であるか、または例えば、合成の間に本質的に標識される構成要素を生成することが可能である任意の複数構成要素のシステムに対して行われ得ることが、理解されるべきである。
【図７】図７Ａは、平衡状態において遊離の標的ＤＮＡの濃度の関数として観察される同時ピークの数を示すグラフである。この同時ピークは、この標的ＤＮＡに対するＺＦＤの結合を示す。遊離の標的ＤＮＡ濃度は、単一のＣｙ５ピークを使用して決定される。Ｋｄは、遊離のＤＮＡに対するタンパク質−ＤＮＡ複合体の関数である。同時ピークの数を、検出スポットにおける分子の無作為な同時発生について補正した。結果は、３つの測定値の平均＋標準偏差（棒）として示される。実線は、単一部位の結合に対して最も適合する方程式を示す。挿入図は、半対数プロットで示された同じデータを示す。図７Ｂは、標的ＤＮＡに対して結合するＺＦＤの動態を示すグラフである。タンパク質−ＤＮＡ複合体の解離動態を、そのＣｙ５標識した標的ＤＮＡに対してＺＦＤを前結合（ｐｒｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ）し、その後の１００倍のモル濃度過剰の標識されていない標的ＤＮＡの添加による解離の開始後に測定した。挿入図は、遊離のＺＦＤとＣｙ５標識した標的ＤＮＡとの混合後に測定した、ＺＦＤ−ＤＮＡ複合体の会合動態を示す。実線は、最も適した１次指数方程式を示す。
【図８】図８Ａは、標的抗原を欠く試料に関する、強度  対  時間プロフィールを示す模式図である。この標的抗原は、その抗原上で反復するエピトープを認識する抗体を使用して検出される。各強度ピークは、結合されていない抗体に対応する。図８Ｂは、抗原が、その抗原上で反復するエピトープを認識する抗体を使用して検出される場合に、抗原（Ａｇ）を含む試料に関する強度  対  時間プロフィールを示す模式図である。抗原に対する、少なくとも２つ、そして好ましくはより多くの抗体の結合は、単一の結合された抗体のシグナルより大きい強度のシグナルを生じる。したがって、単一の抗原上への抗体の凝集は、より大きいシグナルを生じ、そしてこのシステム中のランダムノイズよりもむしろ、抗原に対応するピークを同定するために使用され得る。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、抗原の非存在下（９Ａ）および抗原の存在下（９Ｂ）での生データを示す、代表的な２００ミリ秒の画面写真である。この例において、抗体および抗原の最終濃度は、それぞれ、７０ｐＭおよび１０ｐＭであった。
【図１０】図１０は、タンパク質の凝集が、ランダムノイズから抗原のシグナルを区別するために使用される場合に起こり得る強度ピークの高さにおけるシフトを示すグラフである。
【図１１】図１１は、抗原の存在下または非存在下での免疫複合体の定量化を示す棒グラフである。
【図１２】記載なし。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６Ａ】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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