(57)【要約】  本発明は、西ナイルウイルスの検出法、および本発明の方法に有用な西ナイルウイルスのコンセンサス配列に由来するオリゴヌクレオチド試薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｒ１−Ｎ−Ｒ２、ここで
Ｎは
【表１】
2007521022.tif 000034
【表２】
2007521022.tif 000035
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドであり；
Ｒ１はＮの５’末端に共有結合した図１（配列番号１）に示す西ナイルウイルスコンセンサス配列中におけるＮの５’末端の直ぐ上流の該コンセンサス配列の０〜２０個の連続した塩基のオリゴヌクレオチド配列であるが、ただしＮが該コンセンサス配列に相補的である時、Ｒ１は該コンセンサス配列の相補鎖から選択され；そして
Ｒ２はＮの３’末端に共有結合した該コンセンサス中におけるＮの３’末端の直ぐ下流の該コンセンサス配列の０〜２０個の連続した塩基のオリゴヌクレオチド配列であるが、ただしＮが該コンセンサス配列に相補的である時、Ｒ２は該コンセンサス配列の相補鎖から選択され；
（ｂ）（ａ）で規定するＮの単離されたフラグメント、ここで該フラグメントは１０〜１９塩基長であり；
（ｃ）Ｒ１−Ｘ−Ｒ２、ここでＸは（ａ）で規定するＮの少なくとも１０個の連続した塩基であり、そしてＲ１およびＲ２は（ａ）で規定する通りであり、ここでＲ１が存在する時、Ｒ２は存在せず、そしてＸはＸの５’末端の塩基がＮの５’末端の塩基と同じとなるように選択され；そしてＲ２が存在する時、Ｒ１は存在せず、そしてＸはＸの３’末端の塩基がＮの３’末端の塩基と同じとなるように選択され；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のオリゴヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する単離されたオリゴヌクレオチド；または
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の完全長相補鎖である単離されたオリゴヌクレオチド、
を含んでなる単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
上記オリゴヌクレオチドが
【表３】
2007521022.tif 000036
【表４】
2007521022.tif 000037
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
上記オリゴヌクレオチドが
【表５】
2007521022.tif 000038
【表６】
2007521022.tif 000039
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドからなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
上記オリゴヌクレオチドが
【表７】
2007521022.tif 000040
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
上記オリゴヌクレオチドが
【表８】
2007521022.tif 000041
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
上記オリゴヌクレオチドが
【表９】
2007521022.tif 000042
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
上記オリゴヌクレオチドが
【表１０】
2007521022.tif 000043
を含んでなる請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
上記オリゴヌクレオチドが検出可能な標識をさらに含んでなる請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
上記検出可能な標識が５’末端に結合した蛍光分子である請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
３’末端に消去剤分子をさらに含んでなる請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
【表１１】
2007521022.tif 000044
【表１２】
2007521022.tif 000045
【表１３】
2007521022.tif 000046
からなる群から選択される一対の単離されたオリゴヌクレオチド配列。
【請求項１２】
上記対が
【表１４】
2007521022.tif 000047
からなる群から選択される、請求項１１に記載の一対の単離されたオリゴヌクレオチド配列。
【請求項１３】
上記対が
【表１５】
2007521022.tif 000048
である請求項１１に記載の一対の単離されたオリゴヌクレオチド配列。
【請求項１４】
上記対が
【表１６】
2007521022.tif 000049
である請求項１１に記載の一対の単離されたオリゴヌクレオチド配列。
【請求項１５】
【表１７】
2007521022.tif 000050
からなる群から選択される１組のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
上記組が
【表１８】
2007521022.tif 000051
【請求項１７】
上記組が
【表１９】
2007521022.tif 000052
である請求項１５に記載の組。
【請求項１８】
試験サンプル中の西ナイルウイルスの検出法であって：
該試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸を増幅させ；そして
増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出が該試験サンプル中の西ナイルウイルスの存在を示し、該方法が西ナイルウイルスの核酸を増幅または検出するために請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを使用する上記方法。
【請求項１９】
試験サンプル中の西ナイルウイルスの検出法であって：
試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸を、請求項２に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを使用して増幅させ；そして
増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出が該試験サンプル中の西ナイルウイルスの存在を示す上記方法。
【請求項２０】
試験サンプル中の西ナイルウイルスの検出法であって：
該試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸を増幅させ；そして
請求項６に記載したオリゴヌクレオチドを使用して増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出が該試験サンプル中の西ナイルウイルスの存在を示す上記方法。
【請求項２１】
試験サンプル中の西ナイルウイルスの検出法であって：
そのようなウイルスを含有する該試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸を、請求項１１に記載の一対のオリゴヌクレオチドを使用して増幅させ；そして
増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出が該試験サンプル中の西ナイルウイルスの存在を示す上記方法。
【請求項２２】
試験サンプル中の西ナイルウイルスの検出法であって：
該試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸を増幅させ；そして
増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出が該試験サンプル中の西ナイルウイルスの存在を示し、該増幅工程および該検出工程が請求項１５に記載の１組を用いて行われる上記方法。
【請求項２３】
上記増幅工程および上記検出工程が、
【表２０】
2007521022.tif 000053
のオリゴヌクレオチド組を用いて行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記増幅および上記検出工程が、
【表２１】
2007521022.tif 000054
のオリゴヌクレオチド組を用いて行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
試験サンプル中の西ナイルウイルスの検出法であって、
請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを、試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸とハイブリダイズさせ；そして
請求項１に記載の該少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと西ナイルウイルス核酸とのハイブリダイゼーションを検出する、
工程を含んでなる上記方法。
【請求項２６】
上記試験サンプルがヒト血漿を含んでなる、請求項１８ないし２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
核酸配列を検出するためのプライマーを同定する方法であって、
（ｄ）少なくとも１０００塩基長の核酸配列を準備し；
（ｅ）該核酸配列を、該配列の１つの末端から始まる約５００塩基長の非重複セグメントに分割し；そして
（ｆ）各セグメントおよび／またはその相補鎖の配列から、各々約１５〜２５塩基長のフォワードおよびリバースプライマーを選択し、ここでフォワードおよびリバースプライマーは重複配列を持たず、そして約５０〜２００塩基を有するアンプリコンを生成するように選択される、上記方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法を使用して同定したプライマー。
【請求項２９】
図１（配列番号１）に示す配列の約１５から約７５個の連続した塩基またはその相補鎖を含んでなる単離されたオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが北米またはイスラエル以外からの西ナイルウイルスの単離物よりも、北米またはイスラエルからの西ナイルウイルスの単離物に由来する核酸に大きな親和性で結合する、上記の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
上記オリゴヌクレオチドが、図１（配列番号１）に示す西ナイルウイルスのコンセンサス配列の約１５から約５０個の連続した塩基またはその相補鎖を含んでなる、請求項２９に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
上記オリゴヌクレオチドが、図１（配列番号１）に示す西ナイルウイルスのコンセンサス配列の約１５から約２５個の連続した塩基またはその相補鎖を含んでなる請求項２９に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
上記オリゴヌクレオチドが米国またはイスラエル以外からの西ナイルウイルス単離物よりも北米またはイスラエルの西ナイルウイルス単離物に由来する核酸に大きな親和性で結合する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、西ナイルウイルスの検出するための方法および試薬に関する。より詳細には本発明は、西ナイルウイルスを検出する核酸に基づく方法およびそのような方法に有用な核酸試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
西ナイルウイルスは、約１１キロベースの１本鎖の陽極性のＲＮＡゲノムを含有する球状の、エンベロープを持つウイルスである。西ナイルウイルスのサブタイプは、エンベロープ（ＥまたはＥＮＶ）タンパク質中の抗原性の変化により、およびアミノ酸１５４−１５６でのＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ）の存在により識別することができる（非特許文献１）。西ナイルウイルスは分類学的にフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｄａｅ）、フラビウイルス属（ｇｅｎｕｓ  Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）のファミリーに分類される。このウイルスは１９３７年にウガンダの西ナイル地方に住む熱のあるヒトから初めて単離された。
【０００３】
西ナイルウイルスは増幅する宿主として役立つカおよび渡り鳥を介してヒトおよび家畜に伝播することができる。西ナイルウイルスの感染は、ウイルスが地方病性である場合は一般に世界の各地で無症状性であるが、感染したヒトは微熱、発疹、悪心、頭痛、失見当および背中の疼痛を受け得る。西ナイルウイルスの感染に由来するさらに重篤な合併症には、肝炎、膵炎、脳炎、心筋炎、髄膜炎、神経感染および死を含む。
【０００４】
西ナイルウイルスは地理的にはアフリカ、中東、西および中央アジア、インド、オーストラリア（クンジン  ウイルス）およびヨーロッパに分布している。最初に記録された流行病は１９５０年代の始めにイスラエルで起こった。さらに最近では、西ナイルウイルスにより引き起こされたヒト脳炎の大発生がルーマニアおよびロシアで記録された。西ナイルウイルスは最近、米国北東部に伝わり、１９９９年にはニューヨーク市および周辺地域で７名のヒトの死亡を引き起こした。比較的大量の鳥、特にカラスおよびウマも死亡した。続いて２０００年にはカおよび鳥からの西ナイルウイルスの回収により、ウイルスが米国北東部で樹立されたことが確認された（非特許文献２）。
【０００５】
西ナイルウイルスが確認された州では、カの幼虫および成虫の防除、マッピング、噴霧および増殖場所の除去を介して西ナイルウイルスの伝播の防止が試みられた。これらの努力にもかかわらず、西ナイルウイルスはその伝播様式から脅威である。現在、西ナイルウイルスの感染に関するワクチンまたは他の既知の処置はない。したがって西ナイルウイルスの感染を診断するために、まだ対応されていない試薬および方法の必要性が存在する。
【０００６】
米国において、２００２年の西ナイルウイルスの流行中に、２３名の人がウイルスに感染したドナーから血液成分を受けた後に西ナイルウイルスに感染したことが報告された（非特許文献３）。その結果、感染した血液を確認するために血液または血漿のような血液成分を用いて使用することができる西ナイルウイルス感染を診断する試薬および試験の必要性も存在する。
【０００７】
ＰＣＲに基づくアッセイを使用した西ナイルウイルスの検出が報告された。２００３年２月２７日に公開された特許文献１は、アガロースゲルにより分析される４９５塩基対のＰＣＲ産物を生産する二重増幅アッセイで、ＰＣＲに基づき西ナイルウイルスを検出する方法を開示する（英語による要約から）。
【０００８】
パスツール  アンド  キムロン獣医学研究所（Ｐａｓｔｅｕｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｒｏｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に割り当てられた２００２年１０月１７日に公開された特許文献２は、ＩＳ−９８−ＳＴ１として知られている西ナイルウイルスの神経侵襲性および神経毒性株、そのゲノムに由来する核酸分子および西ナイルウイルスの検出法を開示する。
【０００９】
非特許文献４は、西ナイルウイルスのゲノムの９２１塩基部分を増幅するためのプライマーを開示する。非特許文献５は、西ナイルウイルスを検出するためのＰＣＲアッセイを開示し、ここでプライマーはエンベロープ（ＥＮＶ）および３’非コード領域から選択された。非特許文献６は西ナイルウイルスを検出するためのＰＣＲアッセイを開示し、ここでプライマーはＥ遺伝子から選択された。非特許文献７は、西ナイルウイルスを検出するためのＰＣＲアッセイを開示し、ここでプライマーはＮＳ５（非構造タンパク質５）およびＥＮＶ遺伝子から選択された。非特許文献７は、西ナイルウイルスの検出に関するＰＣＲアッセイを開示し、ここでプライマーがＮＳ５（非構造タンパク質５）およびＥＮＶ遺伝子から選択された。
【特許文献１】ロシア国特許出願第ＲＵ２１９９５８９号明細書
【特許文献２】国際公開第０２／０８１５１１号パンフレット
【非特許文献１】Ｊｉａ，Ｌａｎｃｅｔ．３５４：１９７１−２，１９９９
【非特許文献２】Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８（２３）：１２８８５−１２８８９，２００１
【非特許文献３】Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  Ｗｅｅｋｌｙ  Ｒｅｐｏｒｔ，５２（３２）；７６９−７７２，２００３
【非特許文献４】Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：２３３１−２３３３，１９９９
【非特許文献５】Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８（１１）：４０６６−４０７１
【非特許文献６】Ｂｒｉｅｓｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ８（５）２００２年５月
【非特許文献７】Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ８（１２）２００２年１２月
【発明の開示】
【００１０】
発明の要約
本発明は、西ナイルウイルスを検出するための方法およびオリゴヌクレオチド試薬を提供する。
【００１１】
本発明は
（ａ）Ｒ１−Ｎ−Ｒ２、ここで
Ｎは
【００１２】
【表１】
2007521022.tif 000002
【００１３】
【表２】
2007521022.tif 000003
【００１４】
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドであり；
Ｒ１はＮの５’末端に共有結合した図１（配列番号１）に示す西ナイルウイルスコンセンサス配列中におけるＮの５’末端の直ぐ上流の該コンセンサス配列の０〜２０個の連続した塩基のオリゴヌクレオチド配列であるが、ただしＮが該コンセンサス配列に相補的である時、Ｒ１は該コンセンサス配列の相補鎖から選択され；そして
Ｒ２はＮの３’末端に共有結合した該コンセンサス配列中におけるＮの３’末端の直ぐ下流の該コンセンサス配列の０〜２０個の連続した塩基のオリゴヌクレオチド配列であるが、ただしＮが該コンセンサス配列に相補的である時、Ｒ２は該コンセンサス配列の相補鎖から選択され；
（ｂ）（ａ）で規定するＮの単離されたフラグメント、ここで該フラグメントは１０〜１９塩基長であり；
（ｃ）Ｒ１−Ｘ−Ｒ２、ここでＸは（ａ）で規定するＮの少なくとも１０個の連続した塩基であり、そしてＲ１およびＲ２は（ａ）で規定する通りであり、ここでＲ１が存在する時、Ｒ２は存在せず、そしてＸはＸの５’末端の塩基がＮの５’末端の塩基と同じとなるように選択され；そしてＲ２が存在する時、Ｒ１は存在せず、そしてＸはＸの３’末端の塩基がＮの３’末端の塩基と同じとなるように選択され；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のオリゴヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する単離されたオリゴヌクレオチド；または
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の完全長相補鎖である単離されたオリゴヌクレオチド、
を含んでなる単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１５】
好ましくは本発明のオリゴヌクレオチドは
【００１６】
【表３】
2007521022.tif 000004
【００１７】
【表４】
2007521022.tif 000005
【００１８】
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるか、またはからなる。
【００１９】
より好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは
【００２０】
【表５】
2007521022.tif 000006
【００２１】
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【００２２】
最も好ましくは、本発明は
【００２３】
【表６】
2007521022.tif 000007
【００２４】
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２５】
別の好適な態様では、本発明は
【００２６】
【表７】
2007521022.tif 000008
【００２７】
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるか、またはからなるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２８】
より好ましくは、オリゴヌクレオチドは
【００２９】
【表８】
2007521022.tif 000009
【００３０】
を含んでなる。
【００３１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識をさらに含んでなることができる。
【００３２】
好ましくは、検出可能な標識は５’末端に結合した蛍光分子を含んでなる。さらに好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは３’末端に消去剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）分子をさらに含んでなる。
【００３３】
本発明の別の観点は、
【００３４】
【表９】
2007521022.tif 000010
【００３５】
【表１０】
2007521022.tif 000011
【００３６】
【表１１】
2007521022.tif 000012
【００３７】
からなる群から選択される単離されたオリゴヌクレオチド配列の対を提供する。
【００３８】
より好ましくは、単離されたオリゴヌクレオチド配列の対は
【００３９】
【表１２】
2007521022.tif 000013
【００４０】
からなる群から選択される。
【００４１】
最も好ましくは単離されたオリゴヌクレオチドの対は、
【００４２】
【表１３】
2007521022.tif 000014
【００４３】
である。
【００４４】
本発明のさらなる観点は、
【００４５】
【表１４】
2007521022.tif 000015
【００４６】
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの組を提供する。
【００４７】
さらに好ましくは、組は
【００４８】
【表１５】
2007521022.tif 000016
【００４９】
である。
【００５０】
本発明はさらに試験サンプル中の西ナイルウイルスの検出法を提供し、この方法は該試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸を増幅させ；そして増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出は該試験サンプル中の西ナイルウイルスの存在を示し、該増幅工程または該検出工程、または両工程は本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを用いて行われる。好ましくは、本発明の方法は上記１対のオリゴヌクレオチドを用いて行われる。より好ましくは本発明の方法は上記の組のオリゴヌクレオチドを用いて行われる。最も好ましくは本発明は
【００５１】
【表１６】
2007521022.tif 000017
【００５２】
のオリゴヌクレオチド組を用いて行われる。
【００５３】
本発明は試験サンプル中の西ナイルウイルスの他の検出法を提供し、この方法は本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを、試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸とハイブリダイズさせ；そして本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと西ナイルウイルスの核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含んでなる。
【００５４】
本発明の好適な態様では、試験サンプルがヒト血漿を含んでなる。
【００５５】
また本発明は、核酸配列を検出するためのプライマーを同定する方法を提供し、この方法は、
（ａ）少なくとも１０００塩基長の核酸配列を準備し；
（ｂ）該核酸配列を、該配列の１つの末端から始まる約５００塩基長の非重複セグメントに分割し；そして
（ｆ）少なくとも１つのセグメントおよび／またはその相補鎖の配列から、各々約１５〜２５塩基長のフォワードおよびリバースプライマーを選択し、ここでフォワードおよびリバースプライマーは重複配列を持たず、そして約５０〜２００塩基を有するアンプリコンを生成するように選択される。
【００５６】
また本発明は上記の方法により同定したプライマーにも拡大する。
【００５７】
本発明のさらに別の観点は、図１（配列番号１）に示す配列の約１５から約７５個の連続した塩基を含んでなる単離されたオリゴヌクレオチドまたはその相補鎖を提供し、ここでオリゴヌクレオチドは北米またはイスラエル以外からの西ナイルウイルスの単離物よりも、北米またはイスラエルの西ナイルウイルスの単離物に由来する核酸に大きな親和性で結合する。好ましくはオリゴヌクレオチドは図１（配列番号１）に示す西ナイルウイルスのコンセンサス配列の約１５から約５０個の連続した塩基またはその相補鎖を含んでなる。より好ましくはオリゴヌクレオチドは図１（配列番号１）に示す西ナイルウイルスのコンセンサス配列の約１５から約２５個の連続した塩基またはその相補鎖を含んでなる。本発明のさらに別の観点は、米国またはイスラエル以外の西ナイルウイルス単離物よりも北米またはイスラエルの西ナイルウイルス単離物に由来する核酸に大きな親和性で結合する上記のオリゴヌクレオチドを提供する。
【００５８】
本発明のさらに別の観点は、本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含んでなる試験キットを提供する。
【００５９】
本発明のこれらのおよび他の観点は、添付する特許請求の範囲および以下の詳細な説明でさらに完全に説明される。
発明の詳細な説明
米国では西ナイルウイルス感染の発生が増えている。西ナイルウイルスでは滅多に死なないが、ウイルスに感染した１５０人に約１人は脳炎または髄膜炎の死亡例を発症する可能性がある。現在、西ナイルウイルス感染を処置または防止する手立てはない。早期の検出が感染を診断し、そして症状を処置するために重要である。献血された血液中の西ナイルウイルスの検出は、汚染された血液および血液誘導体から生じる感染の防止に重要である。
【００６０】
本発明は西ナイルウイルスを検出するための方法およびオリゴヌクレオチド試薬を提供する。本発明の方法およびオリゴヌクレオチドは、血漿中の西ナイルウイルスの検出に特に有用である。
【００６１】
本発明はＲ１−Ｎ−Ｒ２を含んでなる単離されたオリゴヌクレオチドを提供し、ここでＮは
【００６２】
【表１７】
2007521022.tif 000018
【００６３】
【表１８】
2007521022.tif 000019
【００６４】
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドであり；
Ｒ１はＮの５’末端に図１（配列番号１）に示す西ナイルウイルスコンセンサス配列中で共有結合したＮの５’末端の直ぐ上流のコンセンサス配列の０〜２０個の連続した塩基のオリゴヌクレオチド配列であるが、ただしＮが該コンセンサス配列に相補的である時、Ｒ１は該コンセンサス配列の相補鎖から選択され；そしてＲ２はＮの３’末端に該コンセンサス配列中で共有結合したＮの３’末端の直ぐ下流のコンセンサス配列の０〜２０個の連続した塩基のオリゴヌクレオチド配列であるが、ただしＮが該コンセンサス配列に相補的である時、Ｒ２は該コンセンサス配列の相補鎖から選択される。
【００６５】
オリゴヌクレオチドは、図１のコンセンサス配列にＮを配置し、そしてＮの最初の塩基から５’方向の上流に連続させ、そしてＮの最初の塩基に隣接する０〜２０個の塩基を選択し、かつ／またはＮの最後の塩基から３’方向の下流に連続させ、そしてＮの最後の塩基に隣接する０〜２０個の連続する塩基を選択することにより選択される。Ｎがコンセンサス配列に相補的である場合、Ｒ１およびＲ２はコンセンサス配列の相補鎖から同じ様式で選択される。好ましくはＲ１およびＲ２は独立して０〜１５個の連続した塩基長であり、より好ましくは０〜１０個の連続した塩基長であり、最も好ましくは０〜５個の連続した塩基長である。
【００６６】
また本発明は本明細書に定義するＮの単離されたフラグメントを提供し、ここでフラグメントは１０〜１９塩基長、好ましくは１５〜１９塩基長である。
【００６７】
さらに本発明はＲ１−Ｘ−Ｒ２を含んでなる単離されたヌクレオチドを提供し、ここでＸは本明細書で定義するＮの少なくとも１０個の連続した塩基であり、そしてＲ１およびＲ２は本明細書に定義する意味を有し、ここでＲ１が存在する時、Ｒ２は存在せず、そしてＸはＸの５’末端の塩基がＮの５’末端の塩基と同じとなるように選択され；そしてＲ２が存在する時、Ｒ１は存在せず、そしてＸはＸの３’末端の塩基がＮの３’末端の塩基と同じとなるように選択される。オリゴヌクレオチドはＮを図１に示すコンセンサス配列中に配置し、そして５’末端から始まる少なくとも１０個の連続した塩基を選択し、そして３’末端に向けて下流に少なくとも１０個の連続した塩基を続けることにより選択され得る。あるいはオリゴヌクレオチドはＮを図１に示すコンセンサス配列中に配置し、そして３’末端から始まる少なくとも１０個の連続した塩基を選択し、そして５’末端に向けて上流に少なくとも１０個の連続した塩基を続けることにより選択され得る。ＸがＮの５’末端から選択される時、Ｒ２は存在せず、そしてＲ１はＮの最初の塩基から５’方向に上流に連続し、そしてＮの最初の塩基に隣接する０〜２０個の塩基を選択することにより選択される。ＸがＮの３’末端から選択される時、Ｒ１は存在せず、そしてＲ２はＮの最後の塩基から３’方向に下流に連続し、そしてＮの最後の塩基に隣接する０〜２０個の連続した塩基を選択することにより選択される。好ましくはＲ１およびＲ２は独立して０〜１５個の連続した塩基長であり、より好ましくは０〜１０個の連続した塩基長であり、最も好ましくは０〜５個の連続した塩基長である。Ｎがコンセンサス配列に相補的である場合、Ｒ１およびＲ２はコンセンサス配列の相補鎖から同じ様式で選択される。
【００６８】
また提供するのは、式Ｒ１−Ｎ−Ｒ２を有するオリゴヌクレオチド（ここでＲ１、ＮおよびＲ２は本明細書に規定する意味を有する）、本明細書に定義するＮのフラグメント、または式Ｒ１−Ｘ−Ｒ２を有するオリゴヌクレオチド（ここでＲ１、ＸおよびＲ２は本明細書に規定する意味を有する）と少なくとも８０％の配列同一性を有する単離されたオリゴヌクレオチドである。配列同一性の割合は配列をマニュアルで並べ、そして両配列中の同じ塩基の数を算出することにより、または数学的計算法を使用して決定することができる。そのような数学的計算法は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７の計算法；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的な相同性の計算法；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の相同性アライメント計算法；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：２４４４−２４４８の類似性調査法；Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７のように修飾されたＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４の計算法である。これらの数学的計算法のコンピューターによる実行は、配列を比較するために利用して配列の同一性を決定することができる。そのような実施には限定するわけではないが：ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（インテリジェネティックス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）から入手可能、マウンテンビュー、カリフォルニア州）；ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）およびウィスコンシン  ジェネティックス  ソフトウェア  パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン８のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（ジェネティックス  コンピューター  グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ：ＧＣＧ）、５７５サイエンス  ドライブ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ）から入手可能、マジソン、ウィスコンシン州、米国）がある。これらのプログラムを使用したアライメントは、デフォルトパラメーターを使用して行うことができる。好ましくはオリゴヌクレオチドは式Ｒ１−Ｎ−Ｒ２のオリゴヌクレオチド（ここでＲ１、ＮおよびＲ２は本明細書に定義する意味を有する）、本明細書で定義するＮのフラグメントまたは式Ｒ１−Ｘ−Ｒ２を有するオリゴヌクレオチド（ここでＲ１、ＸおよびＲ２は本明細書に定義する意味を有する）と８５、９０または９５％の配列同一性を有する。
【００６９】
本発明はさらにオリゴヌクレオチドの完全長相補鎖である単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。
【００７０】
用語「単離された」オリゴヌクレオチドは、その自然な環境以外の条件下で見いだされるオリゴヌクレオチドを指す。好適な状態ではオリゴヌクレオチドは、通常、その自然に存在する環境中で見られるようなオリゴヌクレオチドに付随するか、または相互反応する他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡのような他の核酸配列を実質的に含まない。また用語「単離された」オリゴヌクレオチドは、組換えオリゴヌクレオチドおよび化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを包含する。
【００７１】
本発明の別の観点は、ウイルスを含有すると思われるサンプル中の西ナイルウイルスの検出法を提供し、この方法はそのようなウイルスを含有すると思われるサンプル中の西ナイルウイルスの核酸を増幅させ；そして増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出がサンプル中の西ナイルウイルスの存在を示し、この方法は西ナイルウイルスの核酸を増幅または検出するために本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを使用する。
【００７２】
本発明のさらなる観点は、サンプル中の西ナイルウイルスの検出法を提供し、この方法は本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを、西ナイルウイルスの核酸とハイブリダイズさせ、そして少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと西ナイルウイルスの核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含んでなる。
【００７３】
西ナイルウイルスはＲＮＡゲノムウイルスであり、そしてアッセイ形式によっては増幅前にＲＮＡをＤＮＡに変換させる必要がある。ＲＮＡのＤＮＡへの変換は逆転写酵素を使用して行うことができる。
【００７４】
増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法のような任意の種類の核酸鋳型に基づく方法を使用して行うことができる。
【００７５】
ＰＣＲ技法は熱的な鎖の分離に続いて熱的な解離に依存する。この工程中、鎖あたり少なくとも１つのプライマー、循環装置、高い反応温度および特異的な熱安定性酵素が使用される（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，８８３，２０２明細書）。あるいはＤＮＡを一定温度で増幅することも可能である（増幅に基づく核酸配列（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＢＡ）Ｋｉｅｖｉｔｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９１；３５，２７３−３８６；およびＭａｌｅｋ，Ｌ．Ｔ．、米国特許第５，１３０，２３８号明細書；Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが媒介する増幅（Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＴＭＡ）（Ｇｉａｃｈｅｔｔｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００２  Ｊｕｌ；４０（７）；２４０８−１９；または鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＤＡ），Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．ａｎｄ  Ｓｃｈｒａｍ，Ｊ．Ｌ．、欧州特許出願公開第０  ５００  ２２４  Ａ２号明細書；Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２；２０，１６９１−１６９６）。
【００７６】
好ましくは増幅はＰＣＲおよびコンセンサス配列またはその相補鎖から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーまたはその相補鎖を使用して行う。プライマーは好ましくは１５〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは１５〜２５塩基長、最も好ましくは約２０ヌクレオチド長である。好ましくは少なくとも１つのプライマーは、
【００７７】
【表１９】
2007521022.tif 000020
【００７８】
【表２０】
2007521022.tif 000021
【００７９】
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドである。
【００８０】
より好ましくは増幅はプライマーとして本発明のオリゴヌクレオチドの対を用いて行われ、プライマーの対は
【００８１】
【表２１】
2007521022.tif 000022
【００８２】
【表２２】
2007521022.tif 000023
【００８３】
【表２３】
2007521022.tif 000024
【００８４】
からなる群から選択される。
【００８５】
最も好ましくは、増幅は
【００８６】
【表２４】
2007521022.tif 000025
【００８７】
からなる群から選択される単離されたオリゴヌクレオチドの対を使用して行われる。
【００８８】
西ナイルウイルスの核酸を増幅するために特に好適な単離されたオリゴヌクレオチドの対は
【００８９】
【表２５】
2007521022.tif 000026
【００９０】
である。
【００９１】
増幅した核酸は、当該技術分野で周知な種々の検出技法を使用して検出することができる。例えば増幅産物は、エチジウムブロミド染色および紫外線（ＵＶ）光への暴露による、または確認のための増幅産物の配列分析による、またオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによる視覚化を用いた電気泳動を行うことによりアガロースゲルを使用して検出することができる。
【００９２】
好ましくは増幅した核酸は、西ナイルウイルスのコンセンサス配列またはその相補鎖に由来するオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションにより検出される。プローブ配列は好ましくは１０〜５０ヌクレオチド長、より好ましくは１５〜４０ヌクレオチド長、最も好ましくは２５〜３５ヌクレオチド長であり、そして１対のプライマーにより増幅される配列から選択される。場合によりプローブは検出可能な標識で標識することができる。
【００９３】
好適なプローブは
【００９４】
【表２６】
2007521022.tif 000027
【００９５】
からなる群から選択される単離されたオリゴヌクレオチドを含む。
【００９６】
より好ましくはオリゴヌクレオチドプローブは
【００９７】
【表２７】
2007521022.tif 000028
【００９８】
である。
【００９９】
好ましくはオリゴヌクレオチドプローブは検出可能な標識で標識される。検出可能な標識は、例えば放射性同位体、フルオロフォア、化学発光団、酵素、コロイド粒子および蛍光微粒子のような検出することができる特性または特徴を有する任意の分子または部分であることができる。
【０１００】
プローブ配列は、増幅産物を検出するための種々の方法論を使用して採用することができる。一般にすべてのそのような方法は、プローブが増幅産物の鎖にハイブリダイズして増幅産物／プローブハイブリッドを形成する工程を採用する。次いでハイブリッドは、プライマー、プローブまたはプライマーおよびプローブの両方の標識を使用して検出することができる。増幅産物を検出するための均一な検出台の例には、標的配列の存在でシグナルを発するプローブに付けられたＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）標識の使用を含む。米国特許第５，２１０，０１５号；同第５，８０４，３７５号；同第５，４８７，７９２号；および同第６，２１４，９７９号明細書（各々、引用により本明細書に編入する）に記載されている“ＴａｑＭａｎ”アッセイ、および米国特許第５，９２５，５１７号明細書（引用により本明細書に編入する）に記載されているモレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ）アッセイは、核酸配列を検出するために使用することができる技術の例である。“ＴａｑＭａｎ”アッセイ形式を用いて、増幅反応産物はそれらが形成された時、または所謂「リアルタイム」様式で検出することができる。その結果、増幅産物／プローブハイブリッドは、反応混合物が増幅条件下にある間に形成され、そして検出される。
【０１０１】
好ましくはＰＣＲプローブは、５’末端がフルオロフォアで標識され、そして３’末端が消去剤分子で標識されているＴａｑＭａｎ（商標）プローブである。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブと使用するために適切なフルオロフォアおよび消去剤は、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，８０４，３７５号、同第５，４８７，７９２号および同第６，２１４，９７９号明細書および国際公開第０１／８６００１号パンフレット（バイオサーチ  テクロノジーズ：Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に開示されている。好適な消去剤は、国際公開第０１／８６００１号パンフレットに開示されているブラック  ホール  消去剤（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ）である。
【０１０２】
本発明の好適な態様では、オリゴヌクレオチドプライマーは西ナイルウイルスのＲＮＡをＤＮＡに逆転写した後にＰＣＲにより試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸を増幅するために使用する。増幅した核酸は、５’末端を５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で標識し、そして３’末端を国際公開第０１／８６００１号パンフレットに開示されているブラック  ホール  消去剤で標識した二重標識“ＴａｑＭａｎ”プローブを使用して検出される。蛍光は蛍光計を使用して検出される。
【０１０３】
本発明の方法は、好ましくは
【０１０４】
【表２８】
2007521022.tif 000029
【０１０５】
からなる群から選択される１組のオリゴヌクレオチドを使用して行われる。
【０１０６】
より好ましくは、本発明の方法は以下の
【０１０７】
【表２９】
2007521022.tif 000030
【０１０８】
オリゴヌクレオチドの組のいずれかを使用して行われる。
【０１０９】
前記の各オリゴヌクレオチド組において、第１および第３のオリゴヌクレオチドはプライマーとして使用され、そして中央のオリゴヌクレオチドは増幅した核酸を検出するためのプローブとして使用される。プローブは場合により検出可能な標識で標識される。
【０１１０】
また本発明のオリゴヌクレオチドは、核酸の増幅には基づかない当該技術分野で知られいる方法および技法を使用して、西ナイルウイルスを検出するためにも使用することができる。
【０１１１】
核酸のハイブリダイゼーションは、当該技術分野で知られている技法および条件を使用して行うことができる。特異的なハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションを使用するアッセイの種類に依存する。ハイブリダイゼーション技法および条件は、例えばＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）生化学および分子生物学における研究技法−−核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ）、第Ｉ部、第２章（エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）出版、ニューヨーク）；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編集（１９９５）  分子生物学における最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２章（グリーネ出版およびウィリーインターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、プレインビュー、ニューヨーク州）に見いだすことができる。
【０１１２】
核酸のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行うことができる。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブがその標的配列に他の配列よりも大きい検出可能度でハイブリダイズする条件を意図する（例えばバックグラウンドよりも少なくとも２倍より高い）。ストリンジェント条件は配列依存的であり、そして異なる状況では異なるだろう。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに１００％相補的な標的配列を同定することができる。あるいはストリンジェンシー条件は、より低い程度の類似性が検出されるように、配列中に幾つかの誤対合を可能とするように調整することができる。
【０１１３】
典型的には、ストリンジェント条件は塩濃度が約１．５ＭのＮａイオン未満、典型的にはｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度であり（または他の塩）、そして温度が短いプローブに関して（１０〜５０ヌクレオチド）少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブに関して（例えば５０ヌクレオチドより長い）少なくとも約６０℃の条件である。ストリンジェント条件はホルムアルデヒドのような不安定化剤を添加して達成することもできる。低ストリンジェンシー条件の例には、３７℃で３０〜３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）のバッファー溶液を用いたハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃で１ｘ〜２ｘＳＳＣ（２０ｘＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）中での洗浄を含む。中程度のストリンジェンシー条件の例には、３７℃で４０〜４５％のホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃で０．５ｘ〜１ｘＳＳＣ中での洗浄を含む。高ストリンジェンシー条件の例には、３７℃で５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃で０．１ｘＳＳＣ中での洗浄を含む。ハイブリダイゼーションの期間は一般に約２４時間未満であり、通常、アッセイ形式に依存して約４〜約１２時間未満である。
【０１１４】
本発明のオリゴヌクレオチドは意図する使用およびアッセイ形式に依存してプライマーまたはプローブとして使用することができることに注目すべきである。例えば１つのアッセイでプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、別のアッセイでプローブとして使用することができる。オリゴヌクレオチドのプライマー対およびプライマー／プローブ組へのグループ分けは、本発明の特定の好適な態様を反映する。しかし異なる好適なプライマー対から選択されたフォワードおよびリバースプライマーからなる他のプライマー対の使用が具体的に企図される。
【０１１５】
本明細書で使用する用語「試験サンプル」は、西ナイルウイルスおよび／または西ナイルウイルスの核酸の存在について試験するために設計された任意のものであることを意味する。試験サンプルは、例えば血液、血漿、細胞培養物、組織およびカのサンプルのような任意の生物起源であるか、またはそれらに由来することができる。試験サンプルは供給源から得られた時に直接使用することができ、または前処理してサンプルの特徴を修飾した後に使用することができる。このように試験サンプルは例えば血液から血漿を調製し、細胞またはウイルス粒子を破壊し、固体材料から液体を調製し、粘稠な流体を希釈し、液体を濾過し、液体を蒸発させ、液体を濃縮し、妨害成分を不活性化し、試薬を加え、そして核酸を精製することにより、使用前に前処理することができる。
【０１１６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で知られており、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、米国（１９８９）のようなマニュアルに開示されている標準的な分子生物学技術、または従来のヌクレオチドホスホラミダイト化学および市販されている合成装置を用いて作成することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。また本発明は本発明のオリゴヌクレオチドおよびそれらの相補鎖のＲＮＡ均等物も対象とする。
【０１１７】
本発明の別の観点は、核酸配列を検出するためのプライマーを同定する方法を提供し、この方法は（ａ）少なくとも１０００塩基長の核酸配列を準備し；（ｂ）該核酸配列を、配列の１つの末端から始まる約５００塩基長の非重複セグメントに分割し；そして（ｃ）少なくとも１つのセグメントおよび／またはその相補鎖の配列から、各々約１５〜２５塩基長のフォワードおよびリバースプライマーを選択し、ここでフォワードおよびリバースプライマーは重複配列を持たず、そして約５０〜２００塩基を有するアルプリコンを生成するように選択される。
【０１１８】
本発明の方法は、ウイルスのような生物の全ゲノムを含め、少なくとも約１，０００塩基長の核酸配列を検出するためのプライマーを同定するために使用することができる。既知の遺伝子の一部、または配列中の他の位置をプライマーを同定するために使用した従来の方法とは異なり、本発明の方法はオープンリーディングフレームまたは配列中の他の目印とは無関係に全配列を系統的に網羅する。この方法は天然またはコンセンサス配列を含む任意の種類の配列を用いて使用することができる。核酸配列を約５００塩基長の非重複セグメントに分割する。５００にならない配列に関しては、そのセグメントの長さは付加塩基を考慮して調整することができるか、または短いセグメントとして末端に付加的塩基を使用することができる。１もしくは複数のプライマーの組を少なくとも１つのセグメントおよび／またはその相補鎖から、好ましくは３Ｐｒｉｍｅｒ３ＰＣＲプライマーデザインソフトウェア（ホワイトヘッド  インスティチュート  フォ  バイオメディカルリサーチ（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）のようなプライマーデザインソフトウェアを使用して選択する。好ましくは１もしくは複数のプライマーの組が各セグメントについて選択される。プライマーの設計は一般に、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、特異性、相補的プライマー配列、Ｇ／Ｃ含量、ポリピリミジン（Ｔ、Ｃ）またはポリプリン（Ａ、Ｇ）ストレッチ、およびプライマーが使用されるアッセイ形式および条件のような因子を考慮する。プライマー組は、同じアッセイ形式および条件を使用して選択されたセグメントを増幅するそれらの能力について試験することができる。
【０１１９】
西ナイルウイルスに関して、８種の完全長のＵＳ  ＷＮＶ単離物から最高の配列転換を示す図１のコンセンサス配列の１０９４４ｂｐ領域を、ＰＣＲ増幅プライマー設計に選択した。この相同的領域は、系統的に約５００ｂｐの区分に破壊され、そして各区分中に１対の増幅プライマーが、Ｐｒｉｍｅｒ３ＰＣＲプライマーデザインソフトウェア（ホワイトヘッド  インスティチュート  フォ  バイオメディカルリサーチ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を使用して選択された。Ｐｒｉｍｅｒ３を使用したプライマー設計のためのデフォルト設定は、１００〜１５０ｂｐのアンプリコンについて至適化され、５５〜６０℃の範囲のプライマーＴｍ（融解温度）、およびＧ／Ｃ含量は、二重標識蛍光プローブに基づくアッセイ（“ＴａｑＭａｎ”アッセイ）について至適化された。
【０１２０】
本発明の別の観点は、試験サンプル中に西ナイルウイルスを検出する方法を提供し、この方法は、該試験サンプル中で西ナイルウイルスの核酸を増幅させ；そして増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出は該試験サンプル中の西ナイルウイルスの存在を示し、そしてこの方法は西ナイルウイルスの核酸を増幅または検出するために、上で検討した方法に従い同定される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを使用する。
【０１２１】
図１に示す西ナイルウイルスのコンセンサス配列をプライマーおよびプローブの選択に使用することは、北米またはイスラエル以外の西ナイルウイルス感染よりも、北米およびイスラエルの西ナイルウイルス単離物に高い配列相同性を有するオリゴヌクレオチドの同定をもたらした。
【０１２２】
このように本発明の別の観点は、コンセンサス配列の約１５から約７５個の連続した塩基またはその相補鎖、より好ましくは約１５から約６０個の連続した塩基、もっとも好ましくはコンセンサス配列の約１５から約３０個の連続した塩基またはその相補鎖を含んでなる単離されたオリゴヌクレオチドを提供し、ここでオリゴヌクレオチドは北米またはイスラエル以外からの西ナイルウイルス単離物よりも、北米またはイスラエルからの西ナイルウイルス単離物に由来する核酸に大きな親和性で結合する。
【０１２３】
Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２９８：９６−１０５，２００２は、米国、ヨーロッパおよび中東から単離された西ナイルウイルス株の系統発生的分析を開示する。Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．により構築された系統発生樹は、西ナイルウイルスの２つの遺伝的系統の存在を明らかにした。系統１の西ナイルウイルスは、米国北東部、ヨーロッパ、イスラエル、アフリカ、インド、ロシアおよびオーストラリアから単離された。系統２の西ナイルウイルスは、サハラ以南のアフリカおよびマダカスカルでのみ単離された。系統１のウイルスはさらに３種の単系クレード副分割された。米国およびイスラエルで生じたすべての単離物は互いに緊密に関連することが分かり、そしてＵＳ／イスラエルクレードと言う同じクレードに置かれた。Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．による系統発生分析に、および図１のコンセンサス配列の構築のために出願人に使用された米国の単離物に関する寄託番号は、実施例１にある。イスラエルのコウノトリ（ｓｔｏｒｋ）からの単離物の寄託番号は、ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号ＡＹ０３３３８９である。Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、米国およびイスラエルからの単離物が９９％より高いヌクレオチド配列の同一性およびアミノ酸の同一性を有することを見いだした。世界のこれ以外の地域から生じた単離物は、より低いヌクレオチド配列同一性を有する（米国およびイスラエルの単離物とは９６．５％未満、しかし多くの場合でアミノ酸配列の同一性は９９％より高かった）。
【０１２４】
さらに本発明は本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含んでなる試験キットを提供する。しばしば試験キットは、本明細書に開示するプライマー対のような１もしくは複数のオリゴヌクレオチド対、または本明細書に開示する１もしくは複数のオリゴヌクレオチド組を含む。アッセイキットは、さらに４種のデオキシヌクレオチドホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、および有効量の核酸重合酵素を含んでなることができる。重合剤として有用な多数の酵素が当該技術分野では知られている。これらには限定するわけではないが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノーフラグメント、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素およびサーマス  アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のような好熱性細菌に由来するポリメラーゼを含む。後者のポリメラーゼはそれらの高い温度安定性について知られており、そして例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＩを含む。リボヌクレアーゼＨのような他の酵素を、鋳型ＤＮＡを再生するためにキットに含むことができる。キットの他の任意選択のさらなる成分には、例えばプローブおよび／またはプライマーを標識するために使用する手段（フルオロホア、消去剤、色原体等のような）、および逆転写、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション反応用の適切なバッファーを含む。また通常、キットは方法を行うための使用説明書も含む。
【実施例】
【０１２５】
実施例１
西ナイルウイルス（ＷＮＶ）の配列分析：コンセンサス配列
ＷＮＶは、約１１ｋｂの１本鎖の陽極性ＲＮＡゲノムである。ＧｅｎＢａｎｋの調査は、米国で確認された単離物から８種のほぼ完全長のＷＮＶゲノム配列の同定をもたらした（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＦ１９６８３５、ＡＦ２６０９６７、ＡＦ２０２５４１、ＡＦ２０６５１８、ＡＦ４０４７５３、ＡＧ４０４７５４、ＡＦ４０４７５５およびＡＦ４０４７５６）。配列のアライメントおよび比較は、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｎｔｉ  Ｓｕｉｔｅ７．０（インフォマックス（ＩｎｆｏｒＭａｘ）、フレデリック、メリーランド州、米国）を使用して行い、そしてコンセンサス配列はこれら８種の配列の分析に由来した（全ＷＮＶコンセンサス配列は図１に列挙する）。現在知られているＷＮＶの米国の単離物は、ヌクレオチドレベルで高い相同性を有し、ほとんどが米国におけるウイルスの最近の「創始者効果」感染の結果らしい。米国の株に対してヨーロッパおよび他のさらに祖先の単離物に関するＷＮＶ配列比較は、ヌクレオチドレベルで一層高い多様性を明らかにする。
実施例２
２．１  ＰＣＲ増幅プライマーの設計：
ＷＮＶコンセンサス配列から、８種の完全長の米国ＷＮＶ単離物に由来する最高に配列が保存された１０９４４ｂｐ領域を、ＰＣＲ増幅プライマーの設計に選択した。この相同性領域を系統的に５００ｂｐ区画に破壊し、そして各区分中に１対の増幅プライマーがＰｒｉｍｅｒ３ＰＣＲプライマーデザインソフトウェア（ホワイトヘッド  インスティチュート  フォ  バイオメディカルリサーチ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を使用して選択された。Ｐｒｉｍｅｒ３を使用したプライマー設計のためのデフォルト設定は、１００〜１５０ｂｐのアンプリコンについて至適化され、５５〜６０℃の範囲のプライマーＴｍ（融解温度）、およびＧ／Ｃ含量は、二重標識蛍光プローブに基づくアッセイ（“ＴａｑＭａｎ”アッセイ）について至適化された（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）。
【０１２６】
ＷＮＶ増幅用に同定されたプライマー配列は、化学的に合成した。個別の増幅プライマー対の各々は、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ；Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｅｐ  ＱＲＴ−ＰＣＲシステム、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジョラ、カリフォルニア州、米国）を使用して、ＷＮＶ  ＲＮＡを増幅する能力についてアッセイした。反応は各３１個のＷＮＶ増幅プライマー対を、鋳型無しの負のＰＣＲ対照と一緒に使用して設定した。ＲＴ−ＰＣＲ反応を完了した後、全５０μｌの反応容量の５μｌを４−２０％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に使用して、ＲＴ−ＰＣＲが成功したかどうかを決定した。予想されるサイズのＰＣＲアンプリコンが、行った３１反応の２８で観察された。
【０１２７】
アンプリコンを生成しなかったプライマーを除いたプライマーを表１に示す。
【０１２８】
【表３０】
2007521022.tif 000031
【０１２９】
【表３１】
2007521022.tif 000032
【０１３０】
２．２  ＷＮＶの蛍光に基づくＰＣＲ検出のためのプローブ設計：
ＷＮＶゲノムのコンセンサス配列内で同定された２８個の陽性ＰＣＲ増幅プライマー対の中の６組を、溶液中で低濃度のＷＮＶ標的を増幅する能力に基づき、核酸の蛍光検出の開発で考慮するために選択した（表２）。このために、これら６個のＷＮＶアンプリコンの配列は、ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔｓｍソフトウェア（インテグレイティッドＤＮＡテクノロジーズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、コーラルヴィル、アイオワ州、米国）を使用して評価して、ＷＮＶアンプリコン内でハイブリダイズする最適な蛍光プローブを同定した。ソフトウェアを行うためのデフォルト設定は、最適なプローブサイズ＝３０ｎｔ；最適なプローブＴｍ＝７０℃；そして最適なプローブＧＣ％＝５０であった。プローブの配置は増幅プライマーの最大２０ヌクレオチドの３’内となるように優先順位をつけ、そして両鎖を分析して、６個の各ＷＮＶアンプリコン内で確認できる１つの最適プライマーを同定した。選択したプローブを表２に示す。
【０１３１】
５’末端に５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、そして３’末端にブラック  ホール  消去剤（Ｂｈｑｅｎｃｈｅｒ；バイオサーチテクノロジーズ（ＢｉｏＳｅｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ノバト、カリフォルニア州、米国）を含有する蛍光ＷＮＶプローブを合成した。６種の各増幅プライマー対／蛍光プローブの組み合わせは（これを表２に示す）、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｅｐ  ＱＲＴ−ＰＣＲシステム、ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州、米国）により、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）中で希釈した標的濃度のＷＮＶの検出について試験した。標的は１：２０、１：１００、１：２００、１：１，０００，１：２０００および１：１０，０００に希釈した。６種すべての増幅プライマー対／蛍光プローブの組み合わせは、ヒト血漿中のＷＮＶを検出することができた。
【０１３２】
【表３２】
2007521022.tif 000033
【０１３３】
実施例３
３．１  ヒト血漿からＷＮＶ核酸単離の至適化：    
核酸の単離は、イソチオシアン酸グアニジン溶解／アルコール沈殿法（ＡｍｐｌｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｒｅｐ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ、ロッシュ  ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、バーゼル、スイス）を使用して既知濃度のＷＮＶ  ＲＮＡでスパイクした正常ヒト血漿で行った。ポリアクリルアミド担体をＲＮＡのイソプロパノール沈殿前に加えた。単離毎に１ｍＬ容量の血漿を使用し、そして沈殿した核酸を全容量２００μＬの溶出バッファーに懸濁した。全単離容量の２５％（５０μＬ）を各ＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。
３．２  ヒト血漿からＷＮＶを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ条件の至適化：
販売元の推薦からわずかに修飾したＢｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｅｐ  ＱＲＴ−ＰＣＲシステム（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州、米国）を、核酸の増幅に使用した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＲＴ−ＰＣＲ反応に加えた。リアル−タイムＰＣＲをＡＢＩ７９００ＨＴ  ＤＮＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）で行った。使用したＲＴ−ＰＣＲ熱循環条件は、４５℃で３０分間；９５℃で８分間；次いで９５℃で１５秒間と５５℃で１分間との間を交互に６０サイクルであった。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】西ナイルウイルスのコンセンサス配列を示す（配列番号１）。コンセンサス配列は、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｎｔｉ  Ｓｕｉｔｅ７．０（インフォマックス、フレデリック、メリーランド州、米国）を使用して、米国で確認された単離物に由来する８種のほぼ完全長の西ナイルウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＦ１９６８３５、ＡＦ２６０９６７、ＡＦ２０２５４１、ＡＦ２０６５１８、ＡＦ４０４７５３、ＡＧ４０４７５４、ＡＦ４０４７５５およびＡＦ４０４７５６）の配列アライメントおよび比較に由来した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【配列表】
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