(57)【要約】  感染した生きている動物および人間の症状発現前の検出を含む、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥｓ）の指標としてのプリオン・タンパク質のコンフォメーションに関連するの疾患の検出方法、及び、屍体検出方法が、開示される。本発明の一態様において、試験被験者の組織または体液試料を、プリオン・タンパク質の疾患関連のコンフォメーションのみに結合する抗体と、非変性条件で接触させる。
2007537431.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液および体液画分、とりわけ血液または尿中のプリオン蛋白質のアイソフォーム（ＰｒＰD ）の検出方法であって、ここに、該アイソフォームＰｒＰD はＴＳＥに関連しており、プロテアーゼ感受性アイソフォームとしてまたはプロテアーゼ抵抗性アイソフォームとして存在しているものであり、該検出方法は、
ａ．ＴＳＥ関連アイソフォームＰｒＰD 上のコンフォメーション依存エピトープを認識できる捕捉抗体によって該体液またはその画分を処理することであって、該エピトープはＴＳＥ関連アイソフォームＰｒＰD に特異性をもつが、必ずしもプリオン蛋白質のプロテアーゼ抵抗性アイソフォームを示すものではないものであり、
ｂ．可能なＰｒＰD ・捕捉抗体複合体を検出すること、
を包含する検出方法。
【請求項２】
該体液がＰｒＰD をプロテアーゼ感受性アイソフォームとしてのみ含有している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該体液またはその画分を、プリオン蛋白質（ＰｒＰ）のＮ末端を認識できるさらなる検出抗体で処理する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＰｒＰD 検出のための方法を、血液試料から調製した血漿について実施する先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該血漿試料を、抗体／ＰｒＰD 複合体のための最適結合条件を可能にする化学薬品によって処理する該請求項に記載の方法。
【請求項６】
該捕捉抗体として抗体１５Ｂ３を用いる先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該抗体／ＰｒＰD 複合体を免疫検定法によって直接または間接的に検出する先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
血液または血液画分を、とりわけヒト血液の輸血に関連して、試験するための、先行請求項に記載のいずれかの方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物およびヒトにおけるプリオン病の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）またはプリオン病は、動物およびヒトにおける致命的な神経変性疾患である。臨床的疾患の発症に先立って、数か月ないし数十年間の長い潜伏期間が先行する。ＴＳＥの臨床症状には、痴呆および運動協調喪失を含む。１９８０年代に、ＴＳＥの共通した顕著な特徴が、罹患動物およびヒトにおける宿主によってコードされているプリオン蛋白質（ＰｒＰC ）の異常なプロテアーゼ抵抗性アイソフォーム（ＰｒＰres またはＰｒＰSc）の蓄積であることが見出された。ＰｒＰScの発見は、すべてのプリオン病に特異的であるとともに、プリオンと呼ばれる感染粒子の主要な、おそらくは唯一の構成成分であることが示された分子マーカーをもたらした。
【０００３】
ＰｒＰ２７−３０と呼ばれるＰｒＰScのプロテアーゼ抵抗性の核は、シリアンハムスターの脳からの見掛け分子量２７−３０ｋＤａのプロテイナーゼＫ処理画分のスクレーピー感染力を解析することによって発見された。ＰｒＰ−２７−３０のＮ末端配列決定は、宿主によってコードされているＰｒＰ遺伝子のクローニングおよび無感染動物におけるプリオン蛋白質（ＰｒＰC ）のプロテアーゼ感受性アイソフォームの同定へと導いた。ＴＳＥにおいて重要な病因となる事象は、宿主によりコードされているプリオン蛋白質（ＰｒＰC ）のコンフォメーション（立体配座）が（実験的にスクレーピーに感染させたげっ歯類において最初に同定された後で）ＰｒＰScと呼ばれる病原性アイソフォームへと変化することである。このコンフォメーションの変化は、ＰｒＰC のαヘリックスがＰｒＰScのβシートへとたたみ直されることを含む。このたたみ直された蛋白質ＰｒＰScは、その三次構造がＰｒＰC と異なるのみであり、従って、Ｎ結合型糖付加およびＧＰＩアンカーのような翻訳後修飾と同様に同じアミノ酸配列を有する。ＰｒＰScは凝集して、アミロイドフィブリルを形成し、神経組織中に、また相対的に軽度ではあるがリンパ細網組織中に、蓄積する。
【０００４】
感染宿主においては、ＰｒＰScの濃度は、プリオンタイター（力価）に正比例する。げっ歯類にＴＳＥ惹起因子を実験的に接種したのち、疾患発現より何週間か前に、ＰｒＰScが中枢神経系中に検出されるのが普通であり、その濃度は上昇していき、動物が死亡する数か月前に極大に達する。症候期の間は、感染性およびＰｒＰScはともにリンパ細網組織において容易に検出される。最近、ＰｒＰScは、スクレーピーに経口感染させたハムスターの筋組織において、また実験的に感染させた遺伝子導入マウスにおいて、蓄積することも見出されている。
【０００５】
すべてのプリオン病、ヒツジおよびヤギのスクレーピーの原型は、２世紀以上も前から知られているが、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）と呼ばれる新しい形の動物プリオン病が、１９８６年に英国で初めて認知されて以来、人畜共通感染症に発展するに至っている。ＢＳＥ感染ウシがどの程度までヒトの食物連鎖に入っているかは、依然として論議の的であり、多くの研究の主題となっている。ロンドンのインペリアルカレッジによって発表された最近の研究（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ, Ｃ．Ａ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｎ．Ｍ．，Ｇｈａｎｉ，Ａ．Ｃ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，１７７−１９０（２００３））は、新しい疫学データに基づけば、１６０万頭のＢＳＥ感染ウシが既に英国の消費者の皿に達していたかもしれないことを示唆している。
【０００６】
ヒトのプリオン病には、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）およびクールーが包含される。これらの疾患は、プリオン病一般の３つの症状発現、すなわち疾患の散発性形態（すべてのＣＪＤ症例の８０−９０％）、ヒトＰｒＰ遺伝子の変異に関連した遺伝性形態（家族性ＧＳＳ、家族性ＣＪＤおよびＦＦＩ）およびプリオン汚染組織由来の製品の移植、注入または摂取によって獲得される感染性形態（医原性ＣＪＤ、ｖＣＪＤおよびクールー）を例証するものである。１９９６年の英国での新しい形のクロイツフェルト・ヤコブ病の出現とともに、食品媒介性病原体によって惹起されるヒトの疾患に対する戦いの新規な一コマが始まった。今日まで、１４６例の変異型ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）が英国で報告されており、説得力のある科学的証拠が、ＢＳＥとｖＣＪＤとの間の因果関係を示している。これらの患者では明瞭な危険因子は確認されないが、ＢＳＥ汚染食品の曝露との因果関係がおそらくあるのであろうと思われる。患者らが臨床症状を示す前にｖＣＪＤを検出することが、緊急に優先すべきことである。それによって、供給血液および病院用機器の汚染のリスクを劇的に減少させうるであろう。最近、英国で１患者が、供血から３．５年後にｖＣＪＤの症状を発現したドナーから輸血を受けて６．５年後にｖＣＪＤを発症した（Ｌｌｅｗｅｌｙｎら、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３６３、４１７−４２１（２００４））。この例は、ｖＣＪＤが輸血によって伝染する可能性を示したものであり、血液およびその画分中のプリオンを検出する診断試験の必要性を強調している。本発明では、ＴＳＥ感染哺乳動物血漿中の疾患関連形態のＰｒＰを検出する方法を開示する。
【０００７】
ＰｒＰScがプリオン病の唯一の信頼できる分子マーカーであるから、ＰｒＰScのプロテアーゼ抵抗性部分を脳組織内で免疫学的に検出することが、ＢＳＥおよびスクレーピーの積極的な監視に現在用いられている迅速診断試験の基礎となっている。当該疾患の症状発現前段階でのＰｒＰScの蓄積の速度が遅いため、現行の診断能力は、潜伏期の初期に当該疾患を検出することに関しては、きわめて限られている。ここに開示する本発明は、症状発現前段階でプリオン病を検出する方法を提供する。
【０００８】
ＰｒＰScは、もともと、ＰｒＰの部分的にプロテアーゼ抵抗性で、界面活性剤に不溶性のアイソフォームであると定義されたのであるが、古典的プロテアーゼ抵抗性を欠如した異常ＰｒＰと関連したいくつかのプリオン病が確認されている。これらのプリオン病と関連したＰｒＰの形態は「プロテアーゼ感受性」ＰｒＰScと名づけられて、プロテアーゼ抵抗性形態のＰｒＰScと区別されている。
【０００９】
動物またはヒトの組織中のプリオン蛋白質の疾患関連コンフォメーションを検出することは、プリオン病を診断することになると考えられる。疾患関連ＰｒＰをその細胞内前駆物質ＰｒＰC から区別するためには、ＰｒＰC を完全に分解するプロテアーゼ処理であって、ＰｒＰScのプロテアーゼ感受性のＮ末端部を除去するだけのためのプロテアーゼ処理が必要であるか、或いは、ＰｒＰC とＰｒＰScとを区別できる抗体が使用され得る。ネイティブなＰｒＰScとのみ反応するがＰｒＰC とは反応しないことが示されている抗体の１つが、我々の特許出願ＷＯ９８／３７２１０およびＫｏｒｔｈら（Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：７４−７７（１９９７））、表題「プリオンの免疫学的検出」の中で開示されており、後者を引用によりここに挿入し、かかる抗体を開示、記述する。
【００１０】
プリオン病の診断のために現在用いられている試験法のほとんどは、臨床症状を呈するかまたは当該疾患に罹患していることが疑われる動物またはヒトから死後に得られる中枢神経系組織について行なわれる。それらの試験法は、プロテアーゼ感受性形態のプリオン蛋白質を加水分解するための前処理とそれに続いての免疫学的検定によるプロテアーゼ抵抗性形態のプリオン蛋白質の検出を用いることに頼っている。しかし、かかる検定法は、プロテアーゼ感受性形態のＰｒＰScを検出しない。たとえば、特許出願ＷＯ００／５２１９７は、ＴＳＥ感染動物の血清中のＰｒＰScを検出する方法を請求している。この方法の主たる欠点は、プロテアーゼ感受性ＰｒＰを加水分解するためのプロテアーゼによる前処理を用いていることである。
【００１１】
ＴＳＥに関連するプロテアーゼ抵抗性およびプロテアーゼ感受性形態のＰｒＰを検出する簡易かつ強固な方法および生きている哺乳動物における当該疾患の検出を可能にする診断キットを提供することは、緊急に必要なことである。
【特許文献１】ＷＯ９８／３７２１０
【特許文献２】ＷＯ００／５２１９７
【特許文献３】ＷＯ９８／３７２１０
【非特許文献１】Ｄｏｎｎｅｌｌｙ, Ｃ．Ａ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｎ．Ｍ．，Ｇｈａｎｉ，Ａ．Ｃ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，１７７−１９０（２００３）
【非特許文献２】Ｌｌｅｗｅｌｙｎら、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３６３、４１７−４２１（２００４）
【非特許文献３】Ｋｏｒｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：７４−７７（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、先行技術の欠点及び障害を克服し、生きている動物およびヒトにおいてプリオン病を検出するための方法および診断キットを提供することである。
【００１３】
かかる方法は、血液を疾病関連ＰｒＰの存在について検診することによって伝染性海綿状脳症の保因者を検出するという有利な効果を与えるであろうし、たとえばｖＣＪＤが輸血によって偶然に伝染することを予防することができるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
定義
「ＰｒＰ」なる語は、異なるコンフォメーションよりもプリオン蛋白質アイソフォームの共通したアミノ酸配列を言うものとする。
【００１５】
「ＰｒＰC 」なる語は、正常な哺乳動物に豊富に存在し、ＴＳＥには関連しないプリオン蛋白質アイソフォームを言うものとする。
【００１６】
「ＰｒＰD 」なる語は、正常な宿主プリオン蛋白質のコンフォメーションが変化したアイソフォームとして定義される疾患（ＴＳＥ）関連形態のＰｒＰを言うものとする。ＰｒＰD は、プロテアーゼ抵抗性およびプロテアーゼ感受性の形態の疾患関連ＰｒＰを包含する。ＰｒＰD なる語は、若干の例だけを挙げれば、トリ、ウシまたはヒトのコンフォメーションの変化したＰｒＰと同義的に使用される。
【００１７】
「抗体」なる語は、動物の免疫処置によって、あるいはインビトロでの選択／パンニング操作によって生じるいかなる抗体をも言う。該抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよく、Ｆａｂなどのその断片あるいは一本鎖抗体をも包含する。該抗体は、キメラあるいはヒト化抗体などの遺伝子操作されたものであってもよい。
【００１８】
発明の要約
本発明によれば、動物またはヒトにおいてＰｒＰD を検出する方法であって、生きている哺乳動物から容易に得られる試料、好ましくは血液または他の体液を採取し、つぎに該試料をＰｒＰD のみを認識する抗体と接触させ、最後に、免疫検定法を用いて抗体／ＰｒＰD 複合体の量を検出することからなる前記方法が提供される。
【００１９】
本発明の方法は、ＴＳＥに関連するアイソフォームＰｒＰD がプロテアーゼ感受性アイソフォームとしてあるいはプロテアーゼ抵抗性アイソフォームとして存在しうることを考慮に入れている。これに関連して、当該試料を、ＴＳＥ関連アイソフォームＰｒＰD 上のコンフォメーション依存エピトープを認識できる特別な捕捉抗体で処理することが規定される。該エピトープは、ＴＳＥ関連アイソフォームＰｒＰD に特異的であるように選ばれるが、必ずしも該プリオン蛋白質のプロテアーゼ抵抗性アイソフォームを示すものではない。上記コンフォメーション依存エピトープを認識する捕捉抗体を使用することによって、とりわけ、ＴＳＥ関連ＰｒＰD をプロテアーゼ感受性あるいはプロテアーゼ抵抗性アイソフォームとして含有しているかもしれない試料において、最善の結果が得られる。
【００２０】
好ましい一実施態様では、プロテアーゼ感受性アイソフォームの形でのみＰｒＰD を含有する試料を分析するのに、該方法を用いる。かかる試料は、本発明に従った捕捉抗体を用いてはじめて処理することができる。
【００２１】
本発明の好ましい一実施態様では、該ＰｒＰD 検出法を、本発明の一部である操作法に従って血液試料から調製した血漿について実施する。
【００２２】
他の好ましい一実施態様では、該血漿試料を、抗体／ＰｒＰD 複合体を得るための最適結合条件を可能ならしめるべく化学薬品で処理する。
【００２３】
本発明の他の好ましい一実施態様では、抗体１５Ｂ３を用いて、ＰｒＰD のみを検出し、正常な形態のＰｒＰは検出しない。該抗体１５Ｂ３は、スイス国チューリヒのプリオニックス株式会社（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ  ＡＧ）から入手でき、かかる抗体の産生方法は、ＷＯ９８／３７２１０に開示されている。抗体１５Ｂ３を産生できるハイブリドーマ細胞は、ＷＯ９８／３７２１０に関連して、ＤＳＭＺ−ドイツ微生物・細胞培養コレクション（株）に受入れ番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２２９８のもとに寄託されている。
【００２４】
本発明のさらに別の好ましい一実施態様では、該抗体／ＰｒＰD 複合体を、免疫検定法によって直接または間接的に検出する。
【００２５】
本発明の他の好ましい一実施態様は、プリオン蛋白質のＮ−末端を認識する標識抗体を用いてのサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて該抗体／ＰｒＰD 複合体を検出する方法を提供する。
【００２６】
本発明の好ましい一実施態様は、ヒト血液試料を試験して、当該血液が輸血に安全であるかどうかを判定するのに、該ＰｒＰD 検出法を使用することである。
【００２７】
本発明の他の好ましい一実施態様では、生きている哺乳動物におけるＴＳＥの診断のための診断キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明に従えば、ＴＳＥの診断における当該ＰｒＰD 検出方法は、
１）動物またはヒトからの血液試料の採取、
２）血液試料からの全血、血漿、血清、赤血球（ＲＢＣ）または白血球（ＷＢＣ）の調製および分析対象物質ＰｒＰD と抗体との結合のための血漿の処理、
３）血液試料と捕捉抗体としてのＰｒＰD 特異性抗体とのインキュベーション、
４）汚染性蛋白質を除去するための抗体／ＰｒＰD 複合体の洗浄、
５）高感度な免疫検定法による該抗体／ＰｒＰD 複合体の検出
を包含する。
【００２９】
以下に、特定の例に言及しながら、個々の段階をより詳細に記述する。開示される方法および成分は、変更できるものであって、特定の、試料、化学薬品、抗体、標識あるいは検定法に限定されるものではないことを了解されたい。とくに改めて定義しない限り、本明細書で使用する技術用語、科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるところと同じ意味を有する。
【００３０】
哺乳動物から血液試料を抜取り、ＥＤＴＡ，クエン酸ナトリウム、ヘパリンなどの抗凝固剤の入った容器に入れる。好ましい抗凝固剤はＥＤＴＡであるが、他のものを用いても、同様の結果が得られる。血球からの血漿の分離は、１０００ｘｇでの遠心分離によって行なう。他の好ましい試料は、唾液、尿、脳脊髄液などの体液である。血清を用いる場合には、血液を抗凝固剤の入っていない容器中へ取出し、血液を室温で少なくとも３０分間凝固するにまかせ、つぎに、１０００ｘｇで遠心分離して、血清から血餅を分離する。
【００３１】
血漿試料は、抗体へのＰｒＰC の非特異的結合を防止するために、等体積の界面活性剤含有緩衝液と混合する。非特異的結合を阻止するのに適したきわめて多種の界面活性剤が存在し、当業者に知られている。好ましい界面活性剤は、ラウリルサルコシンナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、スルホベタイン、トライトンＸ−１００、ＮＰ−４０、ツヴィッタージェント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）、トゥイーン２０、トゥイーン８０である。特定の検定フォーマットにおいて特定の種のために使用するのに好ましい界面活性剤は異なりうる。好ましい濃度は、０．０５〜１％の間である。
【００３２】
血漿試料を、抗体と接触させる。本発明の好ましい一実施態様では、疾患関連形態のＰｒＰD に特異的な抗体を使用する。好ましい抗体は、ＰｒＰD に対して特異的であることが既に示されている抗体１５Ｂ３であるが、他の抗体も同様に使用してよい。とくに好ましい一実施態様では、抗体をマイクロタイタープレートのウエルあるいはビーズの表面に被覆して、試料中のＰｒＰD を捕捉する。つぎに、抗体とＰｒＰD との複合体を、ＰｒＰを認識する検出用抗体を用いての免疫検定法で検出する。検出は、任意の免疫学的方法によって達成できる。かかる検定法は当業者には周知であり、ウェスタンブロッティング（免疫ブロッティング）、固相酵素免疫検定（ＥＬＩＳＡ）、免疫ＰＣＲあるいは蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を包含しうる。直接検出は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素、蛍光性の分子または核酸と結合するプリオン蛋白質に対する抗体を用いることによって実施できる。別法として、無標識一次抗体（抗プリオン蛋白質抗体）および標識二次抗体を用いて、検出を間接的に行なうこともできる。
【実施例】
【００３３】
以下の非排他的実施例および添付の図面において、本発明を説明する。
実施例１：ＢＳＥ陰性および陽性ウシ由来血漿中のＰｒＰD の測定。
実施例２：スクレーピー陰性および陽性ヒツジ由来血漿中のＰｒＰD の測定。
実施例３：スクレーピー陰性および陽性ヒツジ由来脳ホモジェネート中のＰｒＰD の測定。
実施例４：スクレーピー陰性および陽性ヒツジ由来血清中のＰｒＰD の測定。
実施例５：スクレーピー陰性および陽性ヒツジ由来白血球中のＰｒＰD の測定。
【００３４】
［実施例１］
図１のグラフは、第一の実験の結果を示している。そこに示されているデータは、サンドイッチ免疫検定法を用いて、ＢＳＥ陽性血漿試料を陰性試料から区別できることを明示している。２回ずつの測定の平均値を示したが、誤差を示すバーは高い方の値との差を示している。
【００３５】
９６ウエルのプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で希釈した２μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭ抗体により、室温で１時間かけて被覆した。０．０５％のトゥイーン２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）でプレートを３回洗って、未結合抗体を除去した。その後、プレートを２時間ブロックし、０．０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗った。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中濃度２μｇ／ｍｌのコンフォメーション特異性抗体１５Ｂ３を、室温で１時間、抗ＩｇＭに結合させた。０．０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でプレートを３回洗ったのち、０．４％デオキシコレート（ＤＯＣ）含有トリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ）で１：１希釈したＢＳＥ陰性および陽性ウシ由来血漿１１０μｌをプレートに加え、室温で１．５時間インキュベートした。未結合蛋白質を、０．２％ＤＯＣ含有ＴＢＳで洗い去った。ＰｒＰのアミノ酸２５−４０を認識するペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体８０５を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０２％カゼイン、０．１％トゥイーン２０含有緩衝液で１０ｎｇ／ｍｌに希釈し、ウエルに１時間加えた。未結合抗体を、０．０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗って除去した。化学発光性基質溶液１００ｍｌをウエルに加え、プレートルミノメーターで読取った。それらの値を相対光単位値として示す。
【００３６】
［実施例２］
図２のグラフは、第二の実験の結果を示している。そこに示したデータは、サンドイッチ免疫検定法によって、ヒツジスクレーピー陽性血漿試料を陰性試料から区別できることを明示している。２回ずつの測定の平均値を示したが、誤差を示すバーは高い方の値との差を示している。
【００３７】
１５Ｂ３抗体によるプレートの被覆は実施例１に記載の通りにして行なった。０．２％サルコシル含有ＴＢＳで１：１希釈したスクレーピー陰性および陽性ヒツジ由来の血漿１１０μｌをプレートに加え、室温で１．５時間インキュベートした。０．１％サルコシル含有ＴＢＳで未結合蛋白質を洗い去った。ＰｒＰのアミノ酸２５−４０を認識するＰＯＤ標識モノクローナル抗体８０５を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０２％カゼイン、０．１％トゥイーン２０を含有する緩衝液で１０ｎｇ／ｍｌに希釈し、ウエルに１時間加えた。未結合抗体を、０．０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗って除去した。化学発光性基質溶液１００μｌをウエルに加え、プレートルミノメーターで読取った。それらの値を相対光単位値として示す。
【００３８】
［実施例３］
図３のグラフは、第三の実験の結果を示している。そこに示したデータは、ＦＡＣＳ分析法を用いて、スクレーピー陽性脳ホモジェネートを陰性試料から区別できることを明示している。ヒストグラムが示されているが、ｙ軸は事象回数を、ｘ軸はＦＬ−２検出器によって測定された相対蛍光強度を示す。
【００３９】
０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中において、３μｌの磁性抗ＩｇＭダイナビーズ（ダイナル１１０．１５）上に、モノクローナル１５Ｂ３抗体またはアイソタイプ対照ＩｇＭ抗体（ベクトン・ディッキンソン５５０９６３）６０ｎｇを、室温で１時間、回転ホイール上で被覆した。０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回ビーズを洗って、未結合抗体を除去した。それらのビーズを、０．２５％サルコシル含有トリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ）１ｍｌおよび１０％スクレーピー陽性または陰性脳ホモジェネート１０μｌに加え、回転ホイール上、４℃で一夜インキュベートした。その後、０．２％サルコシル含有ＴＢＳでビーズを３回洗って、未結合蛋白質を除去した。その後、それらのビーズを、２μｇのビオチニル化モノクローナル抗体８０５を含有する２００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％トゥイーン２０、０．０２％カゼインに加え、回転ホイール上、室温で１５分間インキュベートした。０．１％のトゥイーン２０および０．０２％のカゼインを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）２００μｌで３回洗ったのち、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％トゥイーン２０、０．０２％カゼイン２００μｌ中のストレプトアビジン・フィコエリトリン結合体（ベクトン・ディッキンソン５５４０６１）２．５μｇを加え、室温でさらに５分間インキュベートした。未結合の結合体を洗浄、除去したのち、ビーズを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％トゥイーン２０、０．０２％カゼイン４００μｌ中へ取上げ、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）（モフロー）によって分析した。捕捉は、ＦＳＣ／ＳＳＣについては線形モードで、ＦＬ２についてはログモードで行なった。データ取得は、リストモードで行なった。ＦＬ２の基線は、試料の予備インキュベーションなしの１５Ｂ３ビーズに基づいて設定した。
【００４０】
［実施例４］
図４のグラフは、第四の実験の結果を示している。そこに示したデータは、ＦＡＣＳ分析を用いて、スクレーピー陽性血清（Ｂ）を陰性試料（Ａ）から区別できることを明示している。ドットブロットが示されているが、ｙ軸は粒子の寸法（前方散乱）を示し、ｘ軸は、ＦＬ２検出器により測定した相対蛍光強度を示している。
【００４１】
０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で、３μｌの磁性抗ＩｇＭダイナビーズ（ダイナル１１０．１５）上に、モノクローナル１５Ｂ３抗体６０ｎｇを、室温で１時間、回転ホイール上で、被覆した。０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回ビーズを洗って、未結合抗体を除去した。それらのビーズを、０．２％サルコシル含有トリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ）５００μｌおよびスクレーピー感染ないしはスクレーピー未感染動物由来の血清２５０μｌに加え、回転ホイール上、４℃で一夜インキュベートした。その後、０．２％サルコシル含有ＴＢＳでビーズを３回洗って、未結合蛋白質を除去した。その後、それらのビーズを、２μｇのビオチニル化モノクローナル抗体８０５を含有する２００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％トゥイーン２０、０．０２％カゼインに加え、回転ホイール上、室温で１５分間インキュベートした。０．１％のトゥイーン２０および０．０２％のカゼインを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）２００μｌで３回洗ったのち、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％トゥイーン２０、０．０２％カゼイン２００μｌ中のストレプトアビジン・フィコエリトリン結合体（ベクトン・ディッキンソン５５４０６１）２．５μｇをビーズに加え、室温でさらに５分間インキュベートした。未結合の結合体を洗浄、除去したのち、ビーズを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％トゥイーン２０、０．０２％カゼイン４００μｌ中へ取上げ、ＦＡＣＳ（モフロー）によって分析した。捕捉は、ＦＳＣ／ＳＳＣについては線形モードで、ＦＬ２についてはログモードで行なった。データ取得は、リストモードで行なった。ＦＬ２の基線は、試料の予備インキュベーションなしの１５Ｂ３ビーズに基づいて設定した。
【００４２】
［実施例５］
図５のグラフは、第五の実験の結果を示している。そこに示したデータは、ＦＡＣＳ分析を用いて、スクレーピー陽性ヒツジから抽出した白血球（Ｂ）をスクレーピー陰性のもの（Ａ）と区別できることを明示している。ドットブロットが示されているが、ｙ軸は粒子の寸法（前方散乱）を示し、ｘ軸は、ＦＬ２検出器により測定した相対蛍光強度を示している。
【００４３】
０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で、３μｌの磁性抗ＩｇＭダイナビーズ（ダイナル１１０．１５）上に、モノクローナル１５Ｂ３抗体６０ｎｇを、室温で１時間、回転ホイール上で、被覆した。０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回ビーズを洗って、未結合抗体を除去した。それらのビーズを、０．２％サルコシル含有トリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ）５００μｌおよびスクレーピー感染ないしはスクレーピー未感染動物由来の白血球２００万個に加え、回転ホイール上、４℃で一夜インキュベートした。その後、０．２％サルコシル含有ＴＢＳでビーズを３回洗って、未結合蛋白質を除去した。その後、それらのビーズを、２μｇのビオチニル化モノクローナル抗体８０５を含有する２００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％トゥイーン２０、０．０２％カゼインに加え、回転ホイール上、室温で１５分間インキュベートした。０．１％のトゥイーン２０および０．０２％のカゼインを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）２００μｌで３回洗ったのち、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％トゥイーン２０、０．０２％カゼイン２００μｌ中のストレプトアビジン・フィコエリトリン結合体（ベクトン・ディッキンソン５５４０６１）２．５μｇを加え、室温でさらに５分間インキュベートした。未結合の結合体を洗浄、除去したのち、ビーズを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％トゥイーン２０、０．０２％カゼイン４００μｌ中へ取上げ、ＦＡＣＳ（モフロー）によって分析した。捕捉は、ＦＳＣ／ＳＳＣについては線形モードで、ＦＬ２のついてはログモードで行なった。データ取得は、リストモードで行なった。ＦＬ２の基線は、試料の予備インキュベーションなしの１５Ｂ３ビーズに基づいて設定した。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、実施例１の結果を示すグラフである。この実施例では、捕捉抗体として１５Ｂ３を、検出抗体としてＰｒＰのＮ末端を認識する抗体を用い、ＢＳＥ感染ウシ（Ｐｏｓ１−Ｐｏｓ２）対正常ウシ（Ｎｅｇ１−Ｎｅｇ２３）由来の血漿試料について、サンドイッチ免疫検定法を実施した。
【図２】図２は、実施例２の結果を示すグラフである。この実施例では、捕捉抗体として１５Ｂ３を、検出抗体としてＰｒＰのＮ末端を認識する抗体を用い、スクレーピー感染ヒツジ（Ｐｏｓ１−Ｐｏｓ６）対正常ヒツジ（Ｎｅｇ１−Ｎｅｇ１６）由来の血漿試料について、サンドイッチ免疫検定法を実施した。
【図３】図３は、実施例３の結果を示すグラフである。そこに示したデータは、ＦＡＣＳ分析法を用いて、スクレーピー陽性脳ホモジェネート（Ｂ）をスクレーピー陰性脳ホモジェネート（Ａ）から識別できることを明示している。灰色の曲線は、抗体１５Ｂ３で被覆したビーズを用いて受けた蛍光シグナルを示している。黒い線は、アイソタイプ対照ビーズを用いて得られた蛍光シグナルを示している。
【図４】図４は、実施例４の結果を示すグラフである。そこに示したデータは、ＦＡＣＳ分析法を用いて、スクレーピー感染ヒツジ由来の血清（Ｂ）をスクレーピー未感染ヒツジ由来の血清（Ａ）から識別できることを明示している。陰性試料（Ａ）において５％に設定した右上象限を、陽性試料（Ｂ）において採用したが、５％から３２％への移動を明瞭に示している。
【図５】図５は、実施例５の結果を示すグラフである。そこに示したデータは、ＦＡＣＳ分析法を用いて、スクレーピー感染ヒツジ由来の白血球（Ｂ）をスクレーピー未感染ヒツジ由来の白血球（Ａ）から識別できることを明示している。陰性試料（Ａ）において５％に設定した右上象限を、陽性試料（Ｂ）において採用したが、５％から３６．９％への移動を明瞭に示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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