(57)【要約】  本発明は、自閉症および関連疾患の診断、予防および治療、ならびに治療的に活性な薬物のスクリーニングに用いることができる、ヒト自閉症感受性遺伝子の同定を開示する。本発明は、さらに具体的には、第５染色体上のSLC６Ａ７遺伝子およびその所定の対立遺伝子が自閉症への感受性に関連しており、かつ、治療的介入のための新規な標的となることを開示する。本発明はＳＬＣ６Ａ７遺伝子および発現産物における特定の突然変異、ならびにそれらの突然変異に基づく診断ツールに関する。本発明は、アスペルガー症候群、広汎性発達障害、智恵遅れ、不安症、うつ、注意欠陥多動障害、言語の遅れ、癇癪、代謝障害、免疫障害、双極性障害および他の精神医学および神経疾患の、素因の診断、検出、予防および／または治療に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、または関連障害の存在または素因を検出する方法であって、対象からの試料においてＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在を検出することを含む、方法。
【請求項２】
対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、または関連障害の治療に対する対象の反応を検出する方法であって、対象からの試料においてＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在を検出することを含む、方法。
【請求項３】
ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在が、シーケンシング、選択的ハイブリダイゼーションおよび／または選択的増幅によって検出される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異が、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子または対応する発現生成物における、点突然変異、欠失および挿入より、より好ましくは点突然変異および欠失より選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異が、表１に報告されたＳＮＰ３、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１２およびＳＮＰ１４からなる群より選択される、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子におけるＳＮＰであるか、または、該ＳＮＰｓの一つ以上を含むハプロタイプである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
変異したＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドの存在を検出することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
試料を該変異したＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドに特異的な抗体と接触させ、免疫複合体の形成を測定することを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、または関連障害の治療または予防のための医薬組成物の製造における、機能的ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたはそれをコードする核酸の使用。
【請求項９】
（ｉ）ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチド、ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドをコードする核酸、ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターまたはＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドをコードする核酸を含む組換え宿主細胞、および（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体またはベヒクル、を含む医薬組成物。
【請求項１０】
核酸プローブであって、該核酸が変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子に相補的であり、かつ特異的にハイブリダイズし、好ましくはＳＬＣ６Ａ７遺伝子における変異が表１に報告されたＳＮＰ３、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１２およびＳＮＰ１４からなる群より選択される、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子におけるＳＮＰであるか、または、該ＳＮＰｓの一つ以上を含むハプロタイプである、核酸プローブ。
【請求項１１】
配列番号３〜１２から選択される配列の全てまたは特有の部分を含む、請求項１０記載のプローブ。
【請求項１２】
核酸プライマーであって、該核酸が変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子に相補的であり、かつ特異的にハイブリダイズし、好ましくはＳＬＣ６Ａ７遺伝子における変異が表１に報告されたＳＮＰ３、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１２およびＳＮＰ１４からなる群より選択される、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子におけるＳＮＰであるか、または、該ＳＮＰｓの一つ以上を含むハプロタイプである、核酸プライマー。
【請求項１３】
配列番号１３〜５０から選択される配列の全てまたは特有の部分を含む、請求項１２記載のプライマー。
【請求項１４】
変異したＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項１５】
対象からの試料において、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子またはポリペプチドの変異の存在を検出するためのキットであって、請求項１０または１１記載の核酸プローブ、請求項１２または１３記載のプライマーまたは請求項１４記載の抗体、およびハイブリダイゼーション、増幅または抗原−抗体免疫反応を行うためのプロトコルを含む、キット。
【請求項１６】
自閉症、自閉症スペクトル障害、または関連障害についての生物学的活性化合物を選択する方法であって、被験化合物をＳＬＣ６Ａ７ポリペプチド、遺伝子またはその断片と接触させ、該被験化合物がＳＬＣ６Ａ７ポリペプチド、遺伝子またはその断片と結合する能力を測定することを含む、方法。
【請求項１７】
自閉症、自閉症スペクトル障害、または関連障害についての生物学的活性化合物を選択する方法であって、ＳＬＣ６Ａ７を発現する組換え宿主細胞を被験化合物と接触させ、被験化合物が、ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドと結合する能力、およびＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドの活性をモジュレートする能力を測定することを含む、方法。
【請求項１８】
自閉症、自閉症スペクトル障害、または関連障害についての生物学的活性化合物を選択する方法であって、被験化合物をＳＬＣ６Ａ７遺伝子と接触させ、該被験化合物が該ＳＬＣ６Ａ７遺伝子の発現をモジュレートする能力を測定することを含む、方法。
【請求項１９】
自閉症、自閉症スペクトル障害、または関連障害についての生物学的活性化合物を選択する方法であって、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むレポーター構築物、を含む組換え宿主細胞を被験化合物と接触させ、レポーター遺伝子の発現をモジュレート（例えば刺激または低減）する被験化合物を選択することを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１６〜１９のいずれか１項記載の方法であって、該ＳＬＣ６Ａ７遺伝子またはポリペプチドまたはその断片が、変異したまたは突然変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子またはポリペプチドまたはその変異または突然変異を含む断片である、方法。
【請求項２１】
ＳＬＣ６Ａ７遺伝子における変異が表１に報告されたＳＮＰ３、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１２およびＳＮＰ１４からなる群より選択される、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子におけるＳＮＰであるか、または、該ＳＮＰｓの一つ以上を含むハプロタイプである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該モジュレーションが活性化である、請求項１７〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
該モジュレーションが阻害である、請求項１７〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、または関連障害の治療または予防のための医薬組成物の製造における、ＳＬＣ６Ａ７のアゴニストまたはアンタゴニスト、ＳＬＣ６Ａ７のアンチセンスまたはＲＮＡｉ、ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドに特異的な抗体またはその変異体からなる群より選択される化合物の使用。
【請求項２５】
該化合物が、エンケファリンまたはピペコリン塩酸（ＰＩＰ）もしくはこれらの誘導体である、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
該化合物が、Ｃａ（２＋）依存性キナーゼの作用のモジュレーターである、請求項２４記載の使用。
【請求項２７】
Ｃａ（２＋）依存性キナーゼが、ホスホキナーゼＣまたはＣａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩである、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
該化合物がタプシガルギンまたはその誘導体である、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
該化合物がホスファターゼのモジュレーターである、請求項２４記載の使用。
【請求項３０】
該ホスファターゼが、ＰＫＣ、ＣＡＭＫ２ＡまたはＰＫＣもしくはＣＡＭＫ２Ａの標的の一つ、の活性をモジュレートする、請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
配列番号５１、または配列番号５１の少なくとも５つの連続するアミノ酸残基を含むその部分を含むポリペプチド。
【請求項３２】
請求項３１記載のポリペプチドに結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に遺伝学および医学の分野に関するものである。本発明は、さらに詳しくはヒト自閉症感受性遺伝子の同定を開示し、その遺伝子は、自閉症および関連障害の診断、予防および治療、ならびに治療学的活性薬物のスクリーニングに使用できる。本発明は、さらに具体的には自閉症に対する感受性に関係し、治療的介入のための新規な標的となる溶質キャリアファミリー６（solute carrier family 6）（神経伝達物質輸送体、Ｌ−プロリン）メンバー７、言い換えると脳特異的Ｌ−プロリン輸送体（ＳＬＣ６Ａ７）遺伝子のある対立遺伝子を開示する。本発明を、アスペルガー症候群、広汎性発達障害、精神薄弱、不安、抑うつ、注意欠陥多動障害、言語の遅れ、てんかん、代謝障害、免疫障害、双極性疾患、統合失調症ならびに他の精神医学的および神経学的疾患の素因の診断、検出、予防ならびに／または治療に使用できる。
【背景技術】
【０００２】
自閉症は、相互の社会的相互作用と言語および非言語伝達とにおける欠陥、限定された常同パターンの興味および活動、ならびに年齢３歳までの発達異常の存在を特徴とする神経精神医学上の発達障害である（Baileyら、1996）。Kanner（1943）は、先駆的な幼児自閉症の記載に以下の症状：言語障害、視線を合わせないこと、社会的相互作用の欠如、反復性の行動、および常同（行為）の厳格な必要性を含めた。彼は、大部分の場合小児の行動は乳児期から異常であることに注目した。彼は、これに基づいて先天性のおそらく遺伝的な欠陥が存在することを示唆した。その翌年、ドイツのHans Aspergerは、類似の患者について記載し、その状態を「自閉症精神病質」と名付けた。
【０００３】
自閉症は、これまでこの疾患を診断するための特異的生物マーカーが公知ではないことから、行動基準を使用して定義される。自閉症の臨床像は、重症度が多様であり、教育、能力および気質を含めた多くの要因によって修飾されている。さらに、個体での発達過程にわたって臨床像は変化する。自閉症は、追加的に注意欠陥障害、協調運動不能のような他の障害、ならびに不安および抑うつのような精神医学症状に関連することが多い。自閉症は、てんかん障害、代謝障害および免疫障害も包含しうるという証拠もいくつかある。変異性の臨床的な認識と一致して、自閉症障害のスペクトルが存在するという今や一般な合意がある。そのスペクトルは、全ての知能レベルおよび言語能レベルならびに全ての重症度に及ぶ個体を包含する。
【０００４】
自閉症スペクトルの一部であるが特別な亜群とみなされているのは、アスペルガー症候群（ＡＳ）である。ＡＳは、自閉症スペクトル障害（ＡＳＤ）を特徴づける社会的相互作用の障害ならびに限定された反復性の行動、興味および活動が存在する状態で、臨床的に顕著な言語発達の遅れが欠如していることから、自閉症障害と区別される。
【０００５】
広汎性発達障害（ＰＰＤ）は、ＡＳＤの一部でもある。ＰＰＤは、自閉症に関する厳密な基準を満たさないが、非定型自閉症を表すこと、または主な領域のうち二つもしくは三つで診断基準をほぼ満たすことのいずれかで自閉症に近い小児を分類するために使用される。
【０００６】
自閉症の診断を標準化するために、世界保健機関（International Classification of Diseases, 10th Revision (ICD-10), 1992）およびアメリカ精神医学会（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition (DSM-IV), 1994）によって診断基準が定められている。自閉症診断面接（ＡＤＩ）が開発された（Le Couteurら、1989；Lordら、1994）。ＡＤＩは、ＡＳＤの診断に利用できる唯一の診断ツールであり、標準化され、厳しく検査され、一般に承認されている。ＡＤＩは、両親に対するスコア付き半構造化面接であり、自閉症の診断のためのＩＣＤ−１０およびＤＳＭ−ＩＶ基準に基づいている。これは、三つの主領域での行動に焦点を当てており、それらの領域は：反復性の社会的相互作用の質、コミュニケーションと言語、ならびに限定された反復性の常同性の興味および行動である。自閉症は、これらの基準を使用してもはや稀少障害とみなされていない。Kannerの基準に基づき個体１００００人あたり患者４〜５人という以前に報告された有病率（FolsteinおよびRosen-Sheidley、2001）に比べて、個体１００００人あたり１０〜１２例というより高い比率がより最近の研究で報告された（GillbergおよびWing、1999）。全スペクトルの自閉症障害の有病率に関する推定値は１．５〜２．５倍高い。女性に比べて男性に４倍高く発生するという報告は一貫している。ＡＳＤを有する症例の２５%から４０%の間に精神遅滞が存在する（Bairdら、2000；ChakrabartiおよびFombonne、2001）。集団の約１０%に脳が関係する追加の医学的状態がみられる（GillbergおよびColeman、2000）。
【０００７】
自閉症の報告症例の増加の根本となるメカニズムは知られていない。この差異が、自閉症の有病率の増加、診断基準の緩やかな変化、疾患の発現がより大きく変動しているという認識、または障害の意識の増加を反映しているかどうかは、大いに議論されている。さらに、みかけの増加が主に環境要因が原因であるという、広く知られた一般的な認識がある（Nelson、1991；RodierおよびHyman、1998）。しかし、有病率の増加の大部分は、診断基準の幅の広がりと、これらの基準をより幅広く適用することとの組合わせによって説明できるように思われる。
【０００８】
疾患を改善するための有効な治療があるが、利用できる療法はなく、治療の恩恵はあまり大きくない傾向にある。多様な行動戦略および発達戦略を利用するいくつかのプログラムに対して有望な結果が得られた。最も有望なものの中には、応用行動分析（ＡＢＡ）に基づくプログラムがある。いくつかの投薬は、自閉症に関連する多様な症状を改善することによって、個体が教育的および行動的介入から恩恵を受ける能力を高めるようであった。最も広く研究された薬剤は、ドーパミンアンタゴニストである。いくつかの研究は、多様な選択的セロトニン再取込みインヒビターの有用性を示唆している。
【０００９】
自閉症の遺伝率を推定するために双生児の研究三つが行われた（FolsteinおよびRutter、1977；Baileyら、1995；Steffenburgら、1989）。地理的に規定された集団中で生活する全ての双生児が探し出された。組合わせたデータの中で一卵性双生児（ＭＺ）３６人および二卵性双生児（ＤＺ）３０人が研究された。ＤＺの平均合致率が０%であるのに比べ、ＭＺでは７０%である。ＭＺからＤＺへの合致率および約２%〜４%と推定された同胞再発リスクから、９０%を超える遺伝率が計算された（Jorde et al., 1991 Szatmari et al., 1998）。非自閉症親族の研究から、対照の両親よりも自閉症の小児の両親で、人づきあいにおける無口、コミュニケーション困難、常同行為の嗜好および変化困難を含めたＡＳＤのいくつかの特徴がより高頻度にみられることがはっきりと示された（FolsteinおよびRutter、1977）。反復性の抑うつ、不安障害、血小板セロトニンの上昇および頭囲の増加と同様に、話し始めの遅れおよび読解困難も自閉症を有する個体の家族に共通していることが多い（FolsteinおよびRosen-Sheidley、2001）。
【００１０】
自閉症の発生率は、罹患した個体との血縁度が減少するにつれて低下する。これは、単一遺伝子モデルで自閉症の大部分の症例を説明できそうにないことを示している（Jordeら、1990）。報告された分離比分析は、ポリジーンモードの遺伝と最もよく一致した（Jordeら、1991）最も倹約した遺伝子モデルは、いくつかの遺伝子が互いに相互作用して自閉症の表現型を生成するというものである（FolsteinおよびRosen-Sheidley、2001）。
【００１１】
かなりの間接的な証拠が、自閉症に自己免疫が役割を果たしている可能性を示した。ある研究は、対照発端者にくらべ自閉症発端者を有する家族には自己免疫疾患を有する家系員が多いことを発見した（Comiら、1999）。２、３の報告は、自閉症を有する数人の小児またはその母親に存在する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子座のハプロタイプが自閉症の小児に自己免疫の素因を与えているおそれがあると報告した（BurgerおよびWarren、1998）。二つの研究では、ミエリン塩基性タンパク質、ニューロフィラメントタンパク質および血管上皮を含めたある脳組織およびタンパク質に対する自己抗体が、対照に比べて自閉症の小児により多くみられた（Singhら、1993；Connollyら、1999；Weizmanら、1982）。
【００１２】
大部分の自閉症の症例は、オリゴジーン性およびエピスタシスという提案されたメカニズムと一致するが、少数は染色体の異常および特異的原因を有する障害に関連してみられた。Smalley（1997）は、自閉症の症例の約１５〜３７%が、公知の遺伝障害または染色体の異常を伴う５〜１４%を含めた共存する医学的状態を有すると述べた。ほぼ全てのヒト染色体が関係する染色体異常が報告されている。これらには、常染色体異数体、性染色体異常、欠失、重複、転座、環状染色体、逆位およびマーカー染色体がある（Gillberg, 1998）。最もよくみられるのは、第１５染色体上のプラダーウィリ／アンゲルマン症候群領域の異常である。自閉症とメンデル状態または遺伝症候群との関連には、未治療のフェニルケトン尿症、脆弱Ｘ症候群、結節性硬化症および神経線維腫症がある。最近、Carneyら（2003）は、レット症候群の出現を有さない、自閉症を有する女性２人からＭＥＣＰ２（メチルＣｐＧ結合タンパク質２）遺伝子の突然変異を同定した。レット症候群は、８０%の症例でＭＥＣＰ２遺伝子における突然変異によって引き起こされる。
【００１３】
種々のグループが、自閉症またはＡＳＤのより広い表現型に関するゲノムスキャンを実施している。この取組みは、体系的でありモデルが不要という両方の理由から非常に有望と思われる。さらに、この取組みがうまくいくことは、すでに示されている。このように、比較的小さな研究群を分析しても正の連鎖という結果が得られた。さらに重要なことには、いくつかの研究成果がすでに反復されている。最も一貫する結果は、染色体７ｑについて得られたが、染色体２ｑおよび１６ｐにもかなりの重複がある（FolsteinおよびRosen-Sheidley、2001）。染色体領域の同定でのかなりの進歩が、第１５染色体およびＸ染色体にもなされた。ニューロリジン（neuroligin）ＮＬＧＮ３およびＮＬＧＮ４をコードする２つのＸ連鎖遺伝子における突然変異が、自閉症スペクトル障害を有する同胞から同定された（Jamainら、2003）。いくつかの証拠は、ニューロリジンにおける突然変異が自閉症障害に関与しているという事実を支持している。第一に、報告された突然変異は、予測されたタンパク質構造の激しい変異を引き起こす。第二に、ＮＬＧＮ４を含むＸｐ２２．３での欠失が数人の自閉症の小児に報告されている。第三に、ＮＬＧＮ４での突然変異が罹患した個体の母親１人に新たに出現した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、今やヒト自閉症感受性遺伝子の同定を開示し、その遺伝子は、自閉症および関連障害の診断、予防および治療に、ならびに治療学的活性薬物のスクリーニングに使用できる。本発明は、さらに具体的には第５染色体上のＳＬＣ６Ａ７遺伝子のある対立遺伝子が自閉症に対する感受性に関係し、治療的介入のための新規な標的となることを実証している。ＣＡＭＫ２のようなＳＬＣ６Ａ７の活性の調節に関与する任意の遺伝子またはタンパク質も、自閉症および関連障害に対する治療的介入のための新規な標的となる。
【００１５】
本発明は、さらに具体的には自閉症に対する感受性に関係し治療的介入のための新規な標的となる溶質キャリアファミリー６（神経伝達物質輸送体、Ｌ−プロリン）メンバー７、言い換えると脳特異的Ｌ−プロリン輸送体（ＳＬＣ６Ａ７）遺伝子のある対立遺伝子を開示する。本発明は、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子および発現生成物における特定の突然変異、ならびにこれらの突然変異に基づく診断ツールおよびキットに関するものである。
【００１６】
自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害の素因の診断または防御、検出、予防および／または治療に本発明を使用でき、その方法は、対象の試料からＳＬＣ６Ａ７遺伝子またはポリペプチドにおける変異の存在を検出することを含み、該変異の存在は、自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害の存在または素因を示す。該変異の存在は、自閉症からの防御も示しうる。
【００１７】
本発明の特定の目的は、対照における自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害の存在または素因を検出する方法にあり、その方法は、対象の試料からＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在を検出することを含み、該変異の存在は、自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害の存在または素因を示す。
【００１８】
本発明の追加的な特定の目的は、対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害からの防御を検出する方法にあり、その方法は、対象の試料からＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在を検出することを含み、該変異の存在は、自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害からの防御を示す。
【００１９】
本発明の別の特定の目的は、自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害の治療に対する対象の反応を評価する方法にあり、その方法は、対象の試料中からＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在を検出することを含み、該変異の存在は、該治療に対する特定の反応を示す。
【００２０】
本発明のさらなる特定の目的は、自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害の治療に対する対象における有害作用を評価する方法にあり、その方法は、対象の試料からＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在を検出することを含み、該変異の存在は、該治療に対する有害効果を示す。
【００２１】
本発明は、対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害を予防するための方法にも関するものであり、その方法は、対象の試料中からＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在を検出すること、および自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害に対する予防的治療を投与することを含み、該変異の存在は、自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害に対する素因を示す。
【００２２】
本発明は、患者のＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における自閉症、自閉症スペクトルまたは関連障害に関連する変異のスクリーニングにさらに関するものである。そのようなスクリーニングは、自閉症、自閉症スペクトルおよび関連障害の存在、リスクもしくは素因を診断するために、ならびに／またはそのような障害の治療の効能を評価するために有用である。
【００２３】
好ましい態様において、該変異は、自閉症に関連する１つまたは数個のＳＮＰまたはＳＮＰの一ハプロタイプである。より好ましくは、自閉症に関連する該ハプロタイプは、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８およびＳＮＰ１０からなる群より選択される数個のＳＮＰを含むか、またはそれらからなる。尚より好ましくは、該ハプロタイプは、表４および５に開示されるハプロタイプより選択される。より好ましくは、自閉症に関連する該ＳＮＰは、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８およびＳＮＰ１０でありうる。
【００２４】
好ましくは、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異は、ハイブリダイゼーションアッセイ、シーケンシングアッセイ、マイクロシーケンシングアッセイ、または対立遺伝子特異的増幅アッセイを行うことによって決定される。
【００２５】
本発明の特定の局面は、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子を含むゲノム領域から自閉症に関連する少なくとも１つのＳＮＰもしくはハプロタイプ、またはそれらの組合わせを特異的に検出するように設計されたプライマー、プローブ、および／またはオリゴヌクレオチドを含む物質の組成物にある。より好ましくは、自閉症に関連する該ハプロタイプは、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８およびＳＮＰ１０からなる群より選択される数個のＳＮＰを含むか、またはそれらからなる。尚より好ましくは、該ハプロタイプは、表４および５に開示されるハプロタイプより選択される。より好ましくは、自閉症に関連する該ＳＮＰは、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８およびＳＮＰ１０でありうる。
【００２６】
本発明は、ＳＬＣ６Ａ７の発現または活性のモジュレーションにより、対象における自閉症、自閉症スペクトルおよび／または関連障害を治療する方法にもある。そのような治療は、例えばＳＬＣ６Ａ７ポリペプチド、（ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座に向けたアンチセンス配列を含めた）ＳＬＣ６Ａ７  ＤＮＡ配列、抗ＳＬＣ６Ａ７抗体またはＳＬＣ６Ａ７の発現もしくは活性をモジュレートする薬物を使用する。
【００２７】
本発明は、遺伝子療法、タンパク質置換療法によるような、またはＳＬＣ６Ａ７タンパク質の模倣体および／またはインヒビターの投与によるような発症前治療または併用療法を含めた、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子の有害対立遺伝子を有する個体を治療する方法にも関するものである。
【００２８】
本発明のさらなる局面は、自閉症、自閉症スペクトル障害もしくは関連障害に関連するＳＬＣ６Ａ７遺伝子の対立遺伝子、またはその遺伝子生成物のモジュレーションまたはそれとの結合に基づく、自閉症、自閉症スペクトルまたは関連障害の治療法のための薬物のスクリーニングにある。
【００２９】
本発明の追加の局面は、ＳＬＣ６Ａ７の活性の調節に関与する任意の遺伝子またはタンパク質、好ましくはＣＡＭＫ２のモジュレーションまたはそれとの結合に基づく、自閉症、自閉症スペクトルまたは関連障害の治療法のための薬物のスクリーニングにある。
【００３０】
本発明のさらなる局面は、変異したＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドに特異的の抗体、そのような抗体のフラグメントおよび誘導体、そのような抗体を分泌するハイブリドーマ、ならびにそれらの抗体を含む診断キットを含む。より好ましくは該抗体は、変異を含むＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的であり、該変異はＳＬＣ６Ａ７の活性を修飾する。
【００３１】
本発明は、変異を含むＳＬＣ６Ａ７遺伝子またはそのフラグメントにも関するものであり、該変異はＳＬＣ６Ａ７の活性を修飾する。本発明はさらに、変異を含むＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたはそのフラグメントに関するものであり、該変異はＳＬＣ６Ａ７の活性を修飾する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、ヒト自閉症感受性遺伝子としてのＳＬＣ６Ａ７の同定を開示する。自閉症を有する１１４家族からの多様な核酸試料に特定のGenomeHIPプロセスを受けさせた。このプロセスは、自閉症の対象において変異している、該集団中の特定の同祖（identical-by-descent）フラグメントの同定をもたらした。我々は、すぐ隣の領域を含めたＩＢＤフラグメントのスクリーニングによって、自閉症および関連表現型に対する候補として染色体５ｑ３１〜３２遺伝子上の溶質キャリアファミリー６（神経伝達物質輸送体、Ｌ−プロリン）メンバー７（ＳＬＣ６Ａ７）を同定した。この遺伝子は、その区間に実際に存在し、自閉症の遺伝的調節に一致する機能的表現型を発現する。
【００３３】
このように本発明は、自閉症、自閉症スペクトルおよび関連障害の診断、予防および治療のために、ならびに治療学的活性薬物のスクリーニングのために、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子ならびに対応する発現生成物を使用することを提案する。
【００３４】
定義
自閉症および自閉症スペクトル障害（ＡＳＤ）：自閉症は、アスペルガー症候群（ＡＳ）および他の広汎性発達障害（ＰＰＤ）を含めた障害のスペクトル（ＡＳＤ）の一部として典型的には特徴づけられる。健康障害のおそれがある範囲で３歳以前に存在する限定された反復性および常同パターンの行動、興味および活動を伴う社会的相互作用およびコミュニケーションの障害の任意の状態として、自閉症を解釈するものとする。ＡＳは、自閉症スペクトル障害（ＡＳＤ）を特徴づける社会的相互作用の障害および限定された反復性の行動、興味、および活動が存在する状態で、言語の発達の臨床的に有意な遅れが欠如していることから自閉症障害と区別される。ＰＰＤは、自閉症の厳密な基準を満たさないが、非定型自閉症が現れること、または主な領域のうち二つまたは三つで診断基準をほぼ満たすことのいずれかで自閉症に近い小児を分類するために使用される。
【００３５】
自閉症に関連する障害、疾患または病理には、さらに具体的には任意の代謝および免疫障害、てんかん、不安、抑うつ、注意欠陥多動障害、言語の遅れおよび協調運動不能がある。
【００３６】
多様な対象、特に成人、小児および出生前段階を含めたヒトに本発明を使用できる。
【００３７】
本発明に関連してＳＬＣ６Ａ７遺伝子座は、細胞または生物における全てのＳＬＣ６Ａ７配列または生成物を表し、それらにはＳＬＣ６Ａ７コード配列、ＳＬＣ６Ａ７非コード配列（例えばイントロン）、転写および／または翻訳を制御しているＳＬＣ６Ａ７調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）、ならびにＳＬＣ６Ａ７  ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）およびＳＬＣ６Ａ７ポリペプチド（例えばプレタンパク質および成熟タンパク質）のような全ての対応する発現生成物がある。ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座は、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子に位置するＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含めたＳＬＣ６Ａ７遺伝子の周辺配列も含む。例えば、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座は、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ１４を含む周辺配列を含む。
【００３８】
本出願に使用するように用語「ＳＬＣ６Ａ７遺伝子」は、ヒト第５染色体上の溶質キャリアファミリー６（神経伝達物質輸送体、Ｌ−プロリン）メンバー７または脳特異的Ｌ−プロリン輸送体遺伝子、ならびにその対立遺伝子（例えば生殖細胞系突然変異）を含めたその変異体、アナログおよびフラグメントを表し、それらは、自閉症、自閉症スペクトル障害および自閉症関連障害に対する感受性に関係する。ＳＬＣ６Ａ７遺伝子はＰＲＯＴと称されることもある。
【００３９】
用語「遺伝子」は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成または半合成ＤＮＡを含めた任意の種類のコード核酸、ならびに任意の形の対応するＲＮＡを含むと解釈するものとする。用語、遺伝子は、特にＳＬＣ６Ａ７をコードする組換え核酸、すなわち例えば配列を集合、切断、連結または増幅することによって人工的に創造された任意の非天然核酸分子を含む。ＳＬＣ６Ａ７遺伝子は、典型的には二本鎖であるが、一本鎖のような他の形を考えてもよい。多様な供給源から当技術分野において公知の多様な手法に従って、例えばＤＮＡライブラリーのスクリーニングまたは多様な天然起源からの増幅によって、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子を得ることができる。化学合成、遺伝子工学、酵素法またはそれらの組合わせを含めた通常の手法によって組換え核酸を調製できる。適切なＳＬＣ６Ａ７遺伝子配列をＳＬＣ６Ａ７に関するUnigene Cluster（Ｈｓ．２４１５９７）またはＮＣＢＩ参照配列（ＮＭ＿０１４２２８）のような遺伝子バンクから見出すことができる。ＳＬＣ６Ａ７遺伝子の特定の例は、配列番号：１を含む。
【００４０】
用語「ＳＬＣ６Ａ７遺伝子」は、配列番号：１または前記同定された任意のコード配列の任意の変異体、フラグメントまたははアナログを含む。そのような変異体には、例えば個体間の対立遺伝子の変異性（例えば多型）が原因の天然変異体、自閉症に関係する突然変異対立遺伝子、オルタナティブスプライシング形などがある。用語、変異体は、他の供給源または生物からのＳＬＣ６Ａ７遺伝子配列も含む。変異体は、好ましくは配列番号：１と実質的に均一であり、すなわち配列番号：１と少なくとも約６５%、典型的には少なくとも約７５%、好ましくは少なくとも約８５%、より好ましくは少なくとも約９５%のヌクレオチド配列同一性を示す。ＳＬＣ６Ａ７遺伝子の変異体およびアナログは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で上に定義するような配列（またはその相補鎖）とハイブリダイズする核酸配列も含む。
【００４１】
典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、３０℃を超える、好ましくは３５℃を超える、より好ましくは４２℃を上回る温度、および／または約５００mM未満、好ましくは２００mM未満の塩分を含む。当業者は、温度、塩分および／またはＳＤＳ、ＳＳＣなどのような他の試薬の濃度を修飾することによってハイブリダイゼーション条件を調整できる。
【００４２】
ＳＬＣ６Ａ７遺伝子のフラグメントは、上記に開示するような配列の少なくとも約８個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５個、より好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドの任意の部分を表す。フラグメントは、８から１００個のヌクレオチドの間、好ましくは１５から１００個の間、より好ましくは２０から１００個の間の全ての可能なヌクレオチド長を含む。
【００４３】
ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドは、上記に開示するようなＳＬＣ６Ａ７遺伝子によってコードされる任意のタンパク質またはポリペプチドを表す。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のストレッチを含む任意の分子を指す。この用語は、ペプチドおよびタンパク質のような多様な長さの分子を含む。例えばグリコシル化および／またはアセチル化および／または化学反応もしくはカップリングによりそのポリペプチドを修飾できるし、そのポリペプチドは、一つまたは数個の非天然または合成アミノ酸を含有しうる。ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドの特定の例は、配列番号：２の全てまたは一部を含む。
【００４４】
本出願に使用するように、用語「ＣＡＭＫ２Ａ遺伝子」は、ヒト第５染色体上のカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）ＩＩアルファ遺伝子、ならびにその変異体、アナログおよびフラグメントを表す。ＣＡＭＫ２Ａ遺伝子は、ＣＡＭＫＡ、ＫＩＡＡ０９６８とも称されることがある。用語「遺伝子」は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成または半合成ＤＮＡを含めた任意の種類のコード核酸、ならびに任意の形の対応するＲＮＡを含むと解釈するものとする。用語、遺伝子は、ＣＡＭＫ２Ａをコードする組換え核酸、すなわち例えば配列を集合、切断、連結または増幅することにより人工的に創造された任意の非天然核酸分子を特に含む。ＣＡＭＫ２Ａ遺伝子は、典型的には二本鎖であるが、一本鎖のような他の形を考えてもよい。多様な供給源から当技術分野において公知の多様な手法に従って、例えばＤＮＡライブラリーのスクリーニングまたは多様な天然供給源からの増幅によって、ＣＡＭＫ２Ａ遺伝子を得ることができる。化学合成、遺伝子工学、酵素法またはそれらの組合わせを含めた通常の手法によって組換え核酸を調製できる。適切なＣＡＭＫ２Ａ遺伝子配列をＣＡＭＫ２Ａに関するUnigene Cluster（Ｈｓ．１４３５３５）またはＮＣＢＩ参照配列（ＮＭ＿０１５９８１およびＮＭ＿１７１８２５）のような遺伝子バンクから見出すことができる。
【００４５】
ＣＡＭＫ２Ａ遺伝子のフラグメントは、上記に開示されるような配列の少なくとも約８個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５個、より好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドの任意の部分を表す。フラグメントは、８から１００個のヌクレオチドの間、好ましくは１５から１００個の間、より好ましくは２０から１００個の間の全ての可能なヌクレオチド長を含む。
【００４６】
ＣＡＭＫ２Ａポリペプチドは、上記に開示されるＣＡＭＫ２Ａ遺伝子によってコードされる任意のタンパク質またはポリペプチドを表す。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のストレッチを含む任意の分子を指す。この用語は、ペプチドおよびタンパク質のような多様な長さの分子を含む。例えばグリコシル化および／またはアセチル化および／または化学反応もしくはカップリングによってそのポリペプチドを修飾できるし、そのポリペプチドは、一つまたは数個の非天然または合成アミノ酸を含有しうる。ＣＡＭＫ２Ａポリペプチドの特定の例は、配列ＮＰ＿０５７０６５またはその変異体の全てもしくは一部を含む。
【００４７】
用語「治療に対する反応」は、個体での治療用化合物を代謝する能力、プロドラッグを活性薬物に変換する能力、ならびに薬物の薬物動力学（吸収、分布、排泄）および薬力学（受容体関連）を含むがそれに限定されるわけではない治療の効能を指す。
【００４８】
用語「治療の有害作用」は、薬物の主薬理作用の広がりに起因する治療法の有害作用、または薬物と独特の宿主要因との相互作用に起因する特異体質有害反応を指す。「治療に対する副作用」には、皮膚毒性、血液毒性または肝毒性のような有害反応を含むがそれに限定されるわけではなく、さらに胃潰瘍および腸潰瘍形成、血小板機能の撹乱、腎損傷、全身じんま疹、気管支収縮、低血圧症、ならびにショックがある。
【００４９】
診断
本発明は、今や対象におけるＳＬＣ６Ａ７遺伝子座の監視に基づく診断方法を提供する。本発明に関連して、用語「診断」は、成人、小児および出生前における早期、発症前の時期、および後期を含めた多様な時期での検出、監視、投薬、比較などを含む。診断には、典型的には予後、素因または発達リスクの評価、最も適切な治療（薬理遺伝学）を定めるための対象のキャラクタリゼーションなどがある。
【００５０】
本発明の特定の目的は、対象における自閉症、自閉症スペクトルまたは関連障害の存在または素因を検出する方法にあり、その方法は、対象の試料から該試料中のＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在を検出することを含む。該変異の存在は、自閉症、自閉症スペクトルまたは関連障害の存在または素因を示す。好ましくは該変異は、その遺伝子中のＳＮＰまたはそれらの組合わせからなる群より選択される。場合により該方法は、対象の試料を提供するという先行する段階を含む。好ましくは該試料中のＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在は、試料の遺伝子型決定により検出される。
【００５１】
本発明の別の特定の目的は、対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害からの防御を検出する方法にあり、その方法は、対象の試料中のＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在を検出することを含み、該変異の存在は、自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害からの防御を示す。
【００５２】
本発明の別の特定の目的は、自閉症、自閉症スペクトルまたは関連障害の治療に対する対象の反応を評価する方法にあり、その方法は、対象の試料から該試料中のＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在を検出することを含む。該変異の存在は、該治療に対する特定の反応を示す。好ましくは該変異は、その遺伝子中のＳＮＰまたはそれらの組合わせからなる群より選択される。場合により該方法は、対象から試料を提供するという先行する段階を含む。好ましくは、該試料中のＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在は、試料の遺伝子型を決定することにより検出される。
【００５３】
本発明のさらなる特定の目的は、自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害の治療に対する対象の有害作用を評価する方法にあり、その方法は、対象の試料から該試料中のＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在を検出することを含む。該変異の存在は、該治療に対する有害効果を示す。好ましくは該試料中のＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在は、試料の遺伝子型を決定することにより検出される。
【００５４】
追加の態様において本発明は、対象における自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害を予防するための方法に関するものであり、その方法は、対象の試料からＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異の存在を検出すること、および自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害に対する予防的治療を施すことを含み、該変異の存在は、自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害の素因を示す。該予防的治療は薬物投与でありうる。
【００５５】
本発明の診断／検出方法において、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における任意の変異を、他の任意の遺伝子またはタンパク質における他の変異のような他のマーカーと組合わせて評価してもよい。
【００５６】
個体を特定の治療薬で治療すべきかどうかを決定するために、治療もしくは薬物に対する反応、または治療もしくは薬物に対する副作用を分析し予測する診断学を使用できる。例えば、もしも個体が特定の薬物を用いた治療に対して正の反応をするという公算を診断が示すならば、その薬物をその個体に投与できる。逆にもしも個体が特定の薬物を用いた治療に対して負の反応をする公算を診断が示すならば、代替の治療クールを処方できる。有効な反応の不在または有毒副作用の存在のいずれかとして負の反応を定義できる。
【００５７】
薬物の臨床治験は、本発明に関する別の適用となる。薬物に対する反応または薬物に対する副作用を示す１つまたは複数のＳＬＣ６Ａ７  ＳＮＰを、上記の方法を使用して同定できる。その後、そのような薬剤の臨床治験への潜在的参加者をスクリーニングして、その薬物に対して有利に反応する公算が最も高い個体を同定し、副作用を経験する公算を示す参加者を除外できる。このように、正の反応をしそうにない個体を研究に算入する結果として、測定を低下させることなく、かつ望ましくない安全性の問題のリスクを冒すことなく、薬物に正の反応をする個体から薬物治療の有効性を測定できる。
【００５８】
ＳＬＣ６Ａ７のｇＤＮＡ、ＲＮＡまたはポリペプチドのレベルで変異を決定できる。場合によりＳＬＣ６Ａ７遺伝子の全てもしくは一部の配列決定によって、またはＳＬＣ６Ａ７遺伝子の全てもしくは一部の選択的ハイブリダイゼーションもしくは増幅によって検出は行われる。より好ましくは、変異を同定する段階の前にＳＬＣ６Ａ７遺伝子に特異的な増幅を実施する。
【００５９】
ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異は、その遺伝子座のコード領域および／または非コード領域における単独または多様な組合わせでの任意の形の突然変異、欠失、再配列、および／または挿入でありうる。突然変異は、さらに具体的には点突然変異を含む。欠失は、２つの残基から遺伝子または遺伝子座全体までのような遺伝子座のコード部分または非コード部分における２つ以上の残基の任意の領域を包含しうる。典型的な欠失は、約５０個未満の連続する塩基対のドメイン（イントロン）または繰り返し配列またはフラグメントのような比較的小さな領域に影響するが、同様に比較的大きな欠失も生じうる。挿入は、遺伝子座のコード部分または非コード部分における一つまたは数個の残基の付加を包含しうる。挿入は、典型的には遺伝子座への１から５０個の間の塩基対の付加を含みうる。再配列は、配列の逆位を含む。ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座の変異の結果、停止コドンの創造、フレームシフト突然変異、アミノ酸置換、ＲＮＡの特定スプライシングまたはプロセシング、生成物の不安定性、短縮ポリペプチドの生成などがもたらされることがある。その変異の結果、変異した機能、安定性、ターゲッティングまたは構造を有するＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドの生成がもたらされることがある。その変異は、タンパク質発現の減少、またはその代わりに該生成の増加も引き起こすことがある。
【００６０】
本発明による方法の特定の態様において、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異は、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子または対応する発現生成物における点突然変異、欠失および挿入より、より好ましくは点突然変異および欠失より選択される。その変異は、ＳＬＣ６Ａ７のｇＤＮＡ、ＲＮＡまたはポリペプチドのレベルで決定されうる。
【００６１】
これに関して本発明は、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子およびあるハプロタイプにおけるＳＮＰを今や開示し、そのＳＮＰには、自閉症に関連するＳＮＰ３、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１Ｏ、ＳＮＰ１２およびＳＮＰ１４からなる群より選択されるＳＮＰがある。ＳＮＰを以下の表１に報告する。
【００６２】
【表１】
2007503210.tif 000002
【００６３】
好ましい態様においてその変異は、自閉症に関連する一つもしくは数個のＳＮＰまたはＳＮＰの一ハプロタイプである。より好ましくは、自閉症に関連する該ハプロタイプは、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８およびＳＮＰ１０からなる群より選択される数個のＳＮＰを含むか、またはそれらからなる。尚より好ましくは、該ハプロタイプは、表４および表５に開示されるハプロタイプから選択される。より好ましくは、自閉症に関連する該ＳＮＰは、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８およびＳＮＰ１０でありうる。
【００６４】
好ましくはＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異は、ハイブリダイゼーションアッセイ、シーケンシングアッセイ、マイクロシーケンシングアッセイ、または対立遺伝子特異的増幅アッセイを行うことによって決定される。
【００６５】
本発明による任意の方法において、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子中の１つまたは数個のＳＮＰおよびＳＬＣ６Ａ７遺伝子中のＳＮＰ、さらに詳細にはＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８およびＳＮＰ１０を含むあるハプロタイプを、自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害に関連する他のＳＮＰまたはハプロタイプと組合わせて使用できる。これらのＳＮＰを他の遺伝子に局在するＳＮＰとも組合わせることができる。
【００６６】
第一の変形において本発明の方法は、変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子配列の存在を検出することを含む。例えば選択的ハイブリダイゼーションまたは選択的増幅によりＳＬＣ６Ａ７遺伝子、ポリペプチドまたはＲＮＡの全てまたは一部を配列決定することによって、これを行うことができる。
【００６７】
より具体的な態様は、対象のＳＬＣ６Ａ７遺伝子配列中の少なくとも一つのＳＮＰまたはそれらの任意の組合わせの存在を検出することを含む。
【００６８】
別の変形において本方法は、変異したＳＬＣ６Ａ７  ＲＮＡの発現の存在を検出することを含む。変異したＲＮＡの発現には、変異したＲＮＡ配列の存在、変異したＲＮＡスプライシングまたはプロセシングの存在、変異した量のＲＮＡの存在などがある。例えばＳＬＣ６Ａ７  ＲＮＡの全てまたは一部を配列決定すること、または該ＲＮＡの全てまたは一部の選択的ハイブリダイゼーションもしくは選択的増幅を含めた当技術分野で公知である多様な手法によって、これらを検出できる。
【００６９】
さらなる変形において本方法は、変異したＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドの発現の存在を検出することを含む。変異したＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドの発現には、変異したポリペプチド配列の存在、変異した量のＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドの存在、変異した組織分布の存在などがある。例えば配列決定および／または（抗体のような）特異的リガンドとの結合を含めた当技術分野で公知の多様な手法によって、これらを検出できる。
【００７０】
上に述べたように、シーケンシング、ハイブリダイゼーション、増幅および／または（抗体のような）特異的リガンドとの結合を含めた当技術分野で公知の多様な手法を、変異したＳＬＣ６Ａ７の遺伝子またはＲＮＡの発現または配列を検出または定量するために使用できる。他の適切な方法には、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、対立遺伝子特異的増幅、（ＤＮＡに対する）サザンブロット、（ＲＮＡに対する）ノーザンブロット、一本鎖コンホメーション分析（ＳＳＣＡ）、ＰＦＧＥ、蛍光インジツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ゲル泳動、固定変性ゲル電気泳動、ヘテロ二本鎖分析、ＲＮＡアーゼプロテクション、化学的ミスマッチ開裂、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）がある。 
【００７１】
これらの取組みのいくつか（例えばＳＳＣＡおよびＣＧＧＥ）は、変異した配列の存在の結果としての核酸の電気泳動移動度の変化に基づく。これらの手法により、変異した配列はゲル上の移動度の偏位によって可視化される。次に、そのフラグメントを配列決定して変異を確認できる。
【００７２】
他のいくつかは、対象の核酸と、野生型または変異したＳＬＣ６Ａ７の遺伝子またはＲＮＡに特異的なプローブとの間の特異的ハイブリダイゼーションに基づく。そのプローブは、懸濁状態であっても基板に固定化されていてもよい。そのプローブは、ハイブリッドの検出を可能にするために典型的には標識されている。
【００７３】
これらの取組みのいくつかは、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡおよびＲＮＡのようなポリペプチド配列または発現レベルを評価するために特に適している。これら後者は、ポリペプチドに特異的なリガンド、より好ましくは特異的抗体の使用を必要とする。
【００７４】
特定の好ましい態様においてその方法は、対象の試料中の変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子発現プロフィルの存在を検出することを含む。上に述べたように、より好ましくは該試料中に存在する核酸の配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび／または選択的増幅によってこれを果たすことができる。
【００７５】
配列決定
自動シーケンサーを使用して当技術分野で周知の手法を使用して配列決定を実施できる。完全なＳＬＣ６Ａ７遺伝子、またはより好ましくはその特異的ドメイン、典型的には有害な突然変異もしくは他の変異を有することが公知であるか、またはそう疑われるドメインについて配列決定を行うことができる。
【００７６】
増幅
増幅は、核酸の再生成を開始するように働く相補核酸配列の間での特異的ハイブリッドの形成に基づく。
【００７７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）のような当技術分野で公知の多様な手法により増幅を行える。これらの手法を商業的に入手できる試薬およびプロトコルを使用して行える。好ましい手法は、対立遺伝子特異的ＰＣＲまたはＰＣＲ−ＳＳＣＰを使用する。増幅は、普通は反応の開始に特異的核酸プライマーの使用を必要とする。
【００７８】
ＳＬＣ６Ａ７遺伝子または遺伝子座からの配列を増幅するために有用な核酸プライマーは、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座の標的領域に隣接する該遺伝子座の部分と特異的にハイブリダイズでき、該標的領域は、自閉症、自閉症スペクトル障害または関連障害を有するある対象では変異している。
【００７９】
ＳＬＣ６Ａ７標的領域を増幅するために使用できるプライマーを、ＳＬＣ６Ａ７のゲノムまたはＲＮＡ配列、特に配列番号：１の配列に基づいて設計できる。
【００８０】
本発明の別の特定の目的は、周辺領域を含めたＳＬＣ６Ａ７遺伝子または遺伝子座から配列を増幅するために有用な核酸プライマーにある。そのようなプライマーは、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座中の核酸配列に好ましくは相補性であり、それと特異的にハイブリダイズする。特定のプライマーは、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座の標的領域に隣接する該遺伝子座の部分と特異的にハイブリダイズでき、該標的領域は、自閉症、自閉症スペクトル障害、または自閉症関連障害を有するある対象では変異されている。
【００８１】
本発明は、核酸プライマーにも関するものであり、該プライマーは、自閉症、自閉症スペクトル障害または関連障害を有するある対象では変異したＳＬＣ６Ａ７コード配列（例えば遺伝子またはＲＮＡ）の部分に相補性であり、それと特異的にハイブリダイズする。これに関して、本発明の特定のプライマーは、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子またはＲＮＡ中の変異した配列に特異的である。そのようなプライマーを使用することによって、増幅生成物が検出されることは、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座に変異が存在することを示す。対照的に増幅生成物の不在であることは、試料中に特異的変異が存在しないことを示す。
【００８２】
本発明の典型的なプライマーは、長さ約５〜６０個のヌクレオチド、より好ましくは長さ約８〜約２５個のヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座の配列から配列を直接得ることができる。高い特異性を確実にするために完全な相補性が好ましい。しかし、一定のミスマッチは許容できる。
【００８３】
本発明は、対象における自閉症、自閉症スペクトル障害もしくは関連障害の存在もしくは素因を検出する方法、または自閉症、自閉症スペクトル障害もしくは関連障害の治療に対する対象の反応を評価する方法に、上記のような一核酸プライマーまたは一対の核酸プライマーを使用することにも関するものである。
【００８４】
選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションによる検出方法は、核酸配列の変異を検出するように働く相補核酸配列の間の特異的ハイブリッドの形成に基づく。
【００８５】
特定の検出法は、野生型または変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子またはＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用に続く、ハイブリッドの存在の検出を伴う。プローブは、懸濁状態であっても、（核酸アレイまたはチップ法におけるような）基板または支持体上に固定化されていてもよい。プローブは、ハイブリッドの検出を促進するために典型的には標識されている。
【００８６】
これに関して本発明の特定の態様は、対象の試料を、変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子座に特異的な核酸プローブと接触させること、およびハイブリッドの形成を評価することを含む。特定の好ましい態様において本方法は、その試料を、野生型ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座およびその多様な変異型にそれぞれ特異的なプローブのセットと同時に接触させることを含む。この態様において試料中のＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における多様な形の変異の存在を直接検出することが可能である。また、多様な対象からの多様な試料を並行して処理できる。
【００８７】
本発明に関連してプローブは、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子またはＲＮＡに相補性で、それ（の標的部分）と特異的にハイブリダイゼーション可能であり、かつＳＬＣ６Ａ７対立遺伝子に関連するポリヌクレオチド多型を検出するのに適したポリヌクレオチド配列を指す。その対立遺伝子は、自閉症、自閉症スペクトル障害もしくは関連障害の素因をもつか、またそれに関連している。プローブは、好ましくはＳＬＣ６Ａ７の遺伝子、ＲＮＡ、またはその標的部分に完全に相補性である。プローブは、典型的には長さ８〜１０００個の間の、例えば１０〜８００個の間の、より好ましくは１５〜７００個の間の、典型的には２０〜５００個の間のヌクレオチドの一本鎖核酸を含む。より長いプローブも同様に使用できるものとする。本発明の好ましいプローブは、長さ８〜５００個のヌクレオチドの一本鎖核酸分子であり、その核酸分子は、変異を有するＳＬＣ６Ａ７の遺伝子またはＲＮＡの領域に特異的にハイブリダイズできる。
【００８８】
本発明の特定の態様は、変異した（例えば突然変異した）ＳＬＣ６Ａ７の遺伝子またはＲＮＡに特異的な核酸プローブ、すなわち変異した該ＳＬＣ６Ａ７の遺伝子またはＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、該変異を欠くＳＬＣ６Ａ７遺伝子またはＲＮＡと本質的にハイブリダイズしない核酸プローブである。特異性は、標的配列とのハイブリダイゼーションが非特異的ハイブリダイゼーションにより発生したシグナルと区別できる特異的シグナルを発生することを示す。完全に相補性の配列は、本発明によるプローブを設計するのに好ましい。しかし、特異的シグナルを非特異的ハイブリダイゼーションと区別できる限り、一定のミスマッチは許容できるものとする。
【００８９】
そのようなプローブの特定の例は、上記の表１に挙げるような点突然変異を有するＳＬＣ６Ａ７の遺伝子またはＲＮＡの標的部分に相補性の核酸配列である。さらに詳細にはプローブは、ＳＮＰを含む配列番号：３〜１２もしくはそれらのフラグメント、またはそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含みうる。
【００９０】
本出願に提供するように、プローブの配列をＳＬＣ６Ａ７の遺伝子およびＲＮＡの配列から得ることができる。ヌクレオチド置換およびプローブの化学修飾を行ってもよい。ハイブリッド（例えば介在基）の安定性を増加させるために、またはプローブを標識するために、そのような化学修飾を果たすことができる。標識の典型的な例には、放射能、蛍光、ルミネセンス、酵素標識などがあるが、それに限定されるわけではない。
【００９１】
本発明は、対象における自閉症、自閉症スペクトルもしくは関連障害の存在を検出する方法、または自閉症、自閉症スペクトルもしくは関連障害の治療に対する対象の反応を評価する方法に上記のような核酸プローブを使用することにも関するものである。
【００９２】
特異的リガンドの結合
以上に述べたように、ＳＬＣ６Ａ７のポリペプチド配列または発現レベルにおける変異をスクリーニングすることによっても、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子座における変異を検出できる。これに関して本発明の具体的な態様は、試料をＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドに特異的なリガンドと接触させることおよび複合体の形成を決定することを含む。
【００９３】
特異的抗体のような種々の種類のリガンドを使用できる。具体的な態様において試料をＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドに特異的な抗体と接触させ、免疫複合体の形成を決定する。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）のような免疫複合体を検出するための多様な方法を使用できる。
【００９４】
本発明に関連して抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および同様の抗原特異性を実質的に有するそのフラグメントまたは誘導体を表す。フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ部などがある。誘導体には、一本鎖抗体、ヒト化抗体、多機能性抗体などがある。
【００９５】
ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドに特異的な抗体は、ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドに選択的に結合する抗体、すなわちＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたはそのエピトープ含有フラグメントに対して作製された抗体を表す。他の抗原に対する非特異的結合が生じるおそれがあるが、標的ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドに対する結合の方が高い親和性で生じ、確実に非特異的結合と区別できる。
【００９６】
具体的な態様において本方法は、対象の試料を、変異型のＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドに特異的な抗体（をコーティングした支持体）と接触させること、および免疫複合体の存在を測定することを含む。特定の態様において、試料を同時または並行してまたは連続的に、野生型およびその多様な変異型のようなＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドの種々の形に特異的な多様な抗体（でコーティングされた支持体）と接触させることができる。
【００９７】
本発明は、対象における自閉症、自閉症スペクトルもしくは関連障害の存在もしは素因を検出する方法、または自閉症、自閉症スペクトルまたは関連障害の治療に対する対象の反応を評価する方法への、上記のようなリガンド、好ましくは抗体、そのフラグメントまたは誘導体の使用にも関するものである。
【００９８】
本発明は、対象の試料からＳＬＣ６Ａ７の遺伝子もしくはポリペプチド、ＳＬＣ６Ａ７の遺伝子またはポリペプチドの発現、および／またはＳＬＣ６Ａ７の活性における変異の存在を検出するための生成物および試薬を含む診断キットにも関するものである。本発明による該診断キットは、本発明に記載される任意のプライマー、任意のプライマー対、任意の核酸プローブおよび／または任意のリガンド、好ましくは抗体を含む。本発明による該診断キットは、ハイブリダイゼーション、増幅または抗原抗体免疫反応を行うための試薬および／またはプロトコルをさらに含みうる。
【００９９】
インビトロ、エックスビボ、またはインビボで、好ましくはインビトロまたはエックスビボで診断方法を行える。それらの方法は、対象の試料を使用してＳＬＣ６Ａ７遺伝子座の状態を評価する。試料は、核酸またはポリペプチドを含有する、対象から得られた任意の生体試料でありうる。そのような試料の例には、液体、組織、細胞試料、器官、生検などがある。最も好ましい試料は、血液、血漿、唾液、尿、精液などである。例えば胎児細胞または胎盤細胞を検査することによって出生前診断も行える。非観血的手法を含めた通常の手法により試料を採集して診断に直接使用するか保存できるし、また試料を任意の試料コレクションから得ることができる。検査のための核酸もしくはポリペプチドを入手するか、またはその入手性を改善するために、この方法を行う前に試料を処理できる。処理には、例えば溶解（例えば機械的、物理的、化学的など）、遠心分離などがある。また、核酸および／もしくはポリペプチドを通常の手法によって予備精製もしくは濃縮でき、かつ／または複雑性を減らすことができる。核酸およびポリペプチドを酵素または他の化学処理もしくは物理処理を用いて処理してそのフラグメントを生成させることもできる。請求している方法が高い感受性であることを考慮すると、アッセイを行うには非常に少量の試料で十分である。
【０１００】
指摘したように、変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子座の存在を評価するために、試料をプローブ、プライマーまたはリガンドのような試薬と好ましくは接触させる。平板、試験管、ウェル、ガラスなどのような任意の適切な装置に入れて接触を行える。具体的な態様においてその接触は、核酸アレイまたは特異的リガンドアレイのような、試薬をコーティングした基板上で行われる。基板は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の支持体のような固形または半固形の基板でありうる。基板は、スライド、膜、ビーズ、カラム、ゲルなどのような多様な形および大きさでありうる。試薬と試料の核酸またはポリペプチドとの間に複合体が形成するのに適した任意の条件で接触を実施することができる。
【０１０１】
試料中に変異したＳＬＣ６Ａ７のポリペプチド、ＲＮＡまたはＤＮＡが見出されることは、対象に変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子座が存在することを示し、その存在は、自閉症、自閉症スペクトル障害または関連障害の存在、素因または進行段階と相関しうる。例えば、生殖細胞系ＳＬＣ６Ａ７突然変異を有する個体は、自閉症、自閉症スペクトル障害または関連障害を発現するリスクの増加を有する。対象に変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子座が存在すると決定することは、さらに有効で特別注文の適切な治療的介入の設計も可能にする。また、発症前のレベルでこの決定を下すことで、予防方式を適用することが可能になる。
【０１０２】
さらに以上に指摘したようにこれらの診断方法は、ＳＬＣ６Ａ７と組合わせて他の標的遺伝子またはタンパク質を使用して、アッセイまたはキットの信頼性、予測可能性または疾患スペクトルをさらに増加することもできる。
【０１０３】
薬物のスクリーニング
本発明は、薬物候補のスクリーニングのための新規な標的および方法も提供し、また自閉症、自閉症スペクトル障害および関連障害を予防または治療することをもたらす。その方法には結合アッセイおよび／または機能的アッセイがあり、インビトロ、細胞系、動物などでその方法を行える。
【０１０４】
本発明の第一の特定の目的は、生物学的活性化合物、さらに詳細には自閉症、自閉症スペクトルおよび関連障害に活性な化合物を選択する方法にあり、該方法は、インビトロで被験化合物を本発明によるＳＬＣ６Ａ７の遺伝子またはポリペプチドと接触させること、および該被験化合物が該ＳＬＣ６Ａ７の遺伝子またはポリペプチドと結合する能力を決定することを含む。該遺伝子またはポリペプチドとの結合は、その化合物が該標的の活性をモジュレートし、よって対象における自閉症、自閉症スペクトル障害または関連障害に至る経路に影響する能力に関する指標を提供する。好ましい態様においてその方法は、被験化合物をインビトロで本発明によるＳＬＣ６Ａ７のポリペプチドまたはそのフラグメントと接触させること、および該被験化合物が該ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたはフラグメントと結合する能力を決定することを含む。そのフラグメントは、好ましくはＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドの結合部位を含む。好ましくは、該ＳＬＣ６Ａ７の遺伝子もしくはポリペプチドまたはそのフラグメントは、変異または突然変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子もしくはポリペプチドまたは変異もしくは突然変異を含むそのフラグメントである。
【０１０５】
本発明の別の特定の目的は、自閉症、自閉症スペクトル障害および関連障害に対して活性な化合物を選択する方法にあり、該方法は、被験化合物をインビトロで本発明によるＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたは結合部位を含有するそのフラグメントと接触させること、および該被験化合物が該ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたはそのフラグメントと結合する能力を決定することを含む。好ましくは該ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたはそのフラグメントは、変異もしくは突然変異したＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたは変異もしくは突然変異を含むそのフラグメントである。
【０１０６】
さらなる特定の態様において本方法は、本発明によるＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を被験化合物と接触させること、および該被験化合物が該ＳＬＣ６Ａ７と結合しＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドの活性をモジュレートする能力を決定することを含む。好ましくはＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたはそのフラグメントは、変異もしくは突然変異したＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたは変異もしくは突然変異を含むそのフラグメントである。
【０１０７】
被験化合物を標識すること、標識した基準リガンドとの競合などのような多様な手法によって、結合の決定を行える。
【０１０８】
本発明のさらなる目的は、生物学的活性化合物、より詳細には自閉症、自閉症スペクトル障害および関連障害に活性な化合物を選択する方法にあり、該方法は、被験化合物をインビトロで本発明によるＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドと接触させること、および該被験化合物が該ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドの活性をモジュレートする能力を決定することを含む。好ましくは該ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたはそのフラグメントは、変異もしくは突然変異したＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたは変異もしくは突然変異を含むそのフラグメントである。
【０１０９】
本発明のさらなる目的は、生物学的活性化合物、さらに詳細には自閉症、自閉症スペクトル障害および関連障害に活性な化合物を選択する方法にあり、該方法は、被験化合物をインビトロで本発明によるＳＬＣ６Ａ７遺伝子と接触させること、および該被験化合物が該ＳＬＣ６Ａ７遺伝子の発現をモジュレートする能力を決定することを含む。好ましくは該ＳＬＣ６Ａ７遺伝子もしくはそのフラグメントは、変異もしくは突然変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子または変異もしくは突然変異を含むそのフラグメントである。
【０１１０】
他の態様において本発明は、活性化合物、特に自閉症、自閉症スペクトル障害または関連障害に活性な化合物をスクリーニング、選択または同定する方法に関するものであり、その方法は、被験化合物を、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子プロモーターの制御下のレポーター遺伝子を含むレポーターコンストラクトを含む組換え宿主細胞と接触させること、およびそのレポーター遺伝子の発現をモジュレート（例えば刺激または低減する）被験化合物を選択することを含む。好ましくは該ＳＬＣ６Ａ７遺伝子プロモーターまたはそのフラグメントは、変異もしくは突然変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子プロモーターまたは変異もしくは突然変異を含むそのフラグメントである。ＳＬＣ６Ａ７遺伝子プロモーターの配列は、例えばＮＭ＿０１４２２８に開示されている。また、最初または２番目のＡＴＧコドンまでの配列番号：１は、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子プロモーター配列の部分を含む。
【０１１１】
スクリーニング方法の特定の態様において、モジュレーションは阻害である。スクリーニング方法の他の特定の態様において、モジュレーションは活性化である。
【０１１２】
ＳＬＣ６Ａ７遺伝子はアミノ酸輸送体をコードすることから、特定の態様においてスクリーニングアッセイは、特にニューロンにおいて膜を通過して輸送されるアミノ酸の検出または測定を含み、該輸送をモジュレートする化合物が選択される。
【０１１３】
本発明の第二の局面は、生物学的活性化合物、より詳細には自閉症、自閉症スペクトル障害および関連障害に活性な化合物を選択する方法にあり、該方法は、被験化合物をインビトロでＳＬＣ６Ａ７の活性の調節に関与する遺伝子またはポリペプチド、好ましくはＣＡＭＫ２Ａ遺伝子またはポリペプチドと接触させること、および該被験化合物が該遺伝子またはポリペプチドと結合する能力を決定することを含む。該遺伝子またはポリペプチドとの結合は、その化合物が該標的の活性をモジュレートし、よって対象における自閉症、自閉症スペクトル障害または関連障害に至る経路に影響する能力に関する指標を提供する。好ましい態様においてその方法は、被験化合物をインビトロでＳＬＣ６Ａ７の活性の調節に関与するポリペプチドまたはそのフラグメント、好ましくはＣＡＭＫ２Ａポリペプチドまたはそのフラグメントと接触させること、および該被験化合物が該ポリペプチドまたはフラグメントと結合する能力を測定することを含む。そのフラグメントは、好ましくはそのポリペプチドの結合部位を含む。
【０１１４】
本発明の別の特定の目的は、自閉症、自閉症スペクトル障害および関連障害に活性な化合物を選択する方法にあり、該方法は、被験化合物をインビトロでＳＬＣ６Ａ７の活性の調節に関与するポリペプチド、好ましくはＣＡＭＫ２Ａポリペプチド、またはその結合部位含有フラグメントと接触させること、および該被験化合物が該ポリペプチドまたはそのフラグメントと結合する能力を測定することを含む。
【０１１５】
さらなる特定の態様においてその方法は、ＳＬＣ６Ａ７の活性の調節に関与するポリペプチド、好ましくはＣＡＭＫ２Ａポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を被験化合物と接触させること、および該被験化合物が該ポリペプチドと結合し、該ポリペプチドの活性をモジュレートする能力を測定することを含む。
【０１１６】
本発明のさらなる目的は、生物学的活性化合物、より詳細には自閉症、自閉症スペクトル障害および関連障害に活性な化合物を選択する方法にあり、該方法は、被験化合物をインビトロでＳＬＣ６Ａ７の活性の調節に関与するポリペプチド、好ましくはＣＡＭＫ２Ａポリペプチドと接触させること、および該被験化合物が該ポリペプチドの活性をモジュレートする能力を測定することを含む。
【０１１７】
本発明のさらなる目的は、生物学的活性化合物、より詳細には自閉症、自閉症スペクトル障害および関連障害に活性な化合物を選択する方法にあり、該方法は、被験化合物をインビトロでＳＬＣ６Ａ７の活性の調節に関与する遺伝子、好ましくはＣＡＭＫ２Ａ遺伝子と接触させること、および該被験化合物が該遺伝子の発現をモジュレートする能力を測定することを含む。
【０１１８】
他の態様において本発明は、活性化合物、特に自閉症、自閉症スペクトル障害または関連障害に活性な化合物をスクリーニング、選択または同定する方法に関するものであり、その方法は、被験化合物を、ＳＬＣ６Ａ７の活性の調節に関与する遺伝子、好ましくはＣＡＭＫ２Ａ遺伝子のプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むレポーター構築物を含む組換え宿主細胞と接触させること、およびそのレポーター遺伝子の発現をモジュレート（例えば刺激または低減）する被験化合物を選択することを含む。
【０１１９】
スクリーニング方法の特定の態様において、モジュレーションは阻害である。スクリーニング方法の他の特定の態様において、モジュレーションは活性化である。
【０１２０】
上記のスクリーニングアッセイを、平板、試験管、皿、フラスコなどのような任意の適切な装置中で行える。典型的にはアッセイは、マルチウェル平板中で行われる。数個の被験化合物を並行してアッセイできる。さらに被験化合物は、多様な供給源、性質および組成でありうる。被験化合物は、単離された状態または他の物質と混合した状態の脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、低分子などのような任意の有機または無機物でありうる。その化合物は、例えば生成物のコンビナトリアルライブラリーの全てまたは一部でありうる。
【０１２１】
薬学的組成物、治療
本発明のさらなる目的は、（ｉ）ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチド、ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドをコードする核酸、上記のようなベクターまたは組換え宿主細胞、および（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体またはベヒクルを含む薬学的組成物である。
【０１２２】
本発明は、対象における自閉症、自閉症スペクトルまたは関連障害を治療または予防する方法にも関するものであり、その方法は、該対象に機能的（例えば野生型）ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたは同ポリペプチドをコードする核酸を投与することを含む。
【０１２３】
本発明の別の目的は、（ｉ）ＳＬＣ６Ａ７活性の調節に関与するポリペプチド、好ましくはＣＡＭＫ２Ａポリペプチド、同ポリペプチドをコードする核酸、上記のようなベクターまたは組換え宿主細胞、および（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体またはベヒクルを含む薬学的組成物である。
【０１２４】
本発明はさらに、対象における自閉症、自閉症スペクトルまたは関連障害を治療または予防する方法に関するものであり、その方法は、該対象にＳＬＣ６Ａ７活性の調節に関与する機能的（例えば野生型）ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたは同ポリペプチドをコードする核酸を投与することを含む。好ましくは該ポリペプチドは、ＣＡＭＫ２Ａポリペプチドである。
【０１２５】
本発明の他の態様は、対象における自閉症、自閉症スペクトルまたは関連障害を治療または予防する方法にあり、その方法は、該対象に本発明によるＳＬＣ６Ａ７の遺伝子またはタンパク質の発現または活性をモジュレートする化合物を投与することを含む。該化合物は、ＳＬＣ６Ａ７のアゴニストもしくはアンタゴニスト、ＳＬＣ６Ａ７のアンチセンスもしくはＲＮＡｉ、本発明によるＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドに特異的な抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体でありうる。例えば該化合物は、エンケファリンまたはその誘導体の一つ、さらに具体的にはＬｅｕ−およびＭｅｔ−エンケファリンおよびそれらのデス−チロシル誘導体でありうる。該化合物は、ピペコリン酸塩（ＰＩＰ）またはその等価物もしくは誘導体でもありうる。該化合物は、さらにＣａ（２＋）依存性キナーゼのモジュレーター（アクチベーターまたはインヒビター）でありうる。例えば該化合物は、ＰＫＣモジュレーターまたはタプシガルギンのようなＣａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣＡＭＫ２）の作用を仲介するモジュレーターでありうる。該化合物は、ＣＡＭＫ２Ａのアゴニストもしくはアンタゴニスト、ＣＡＭＫ２ＡのアンチセンスもしくはＲＮＡｉ、本発明によるＣＡＭＫ２Ａポリペプチドに特異的な抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体でありうる。例えば該化合物は、オートカムチド（autocamtide）−２、オートカムチド−３、もしくはＣＡＭＫ２の残基２７３〜３０２を含むペプチドのように自己阻害性ドメインをモデル化したペプチド、またはＫＮ６２およびＫＮ９３のような膜透過インヒビターでありうる。そのような化合物は、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）およびプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）のようなＣＡＭＫ２Ａの活性をモジュレートするホスファターゼまたはＣＡＭＫ２Ａの標的でもありうる。治療は、ＰＫＣモジュレーターとＣａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣＡＭＫ２）モジュレーターとの組合わせの投与も含みうる。または該化合物は、Ｃａ（２＋）依存性キナーゼの活性をモジュレートするホスファターゼまたはその標的のモジュレーター（アクチベーターまたはインヒビター）でありうる。この方法の特定の態様においてモジュレーションは阻害である。この方法の他の特定の態様において、モジュレーションは活性化である。
【０１２６】
本発明は、一般に対象における自閉症、自閉症スペクトルまたは関連障害を治療または予防するための薬学的組成物の製造への、機能的ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチド、同ポリペプチドをコードする核酸、または本発明によるＳＬＣ６Ａ７の遺伝子もしくはタンパク質の発現もしくは活性をモジュレートする化合物の使用にも関するものである。該化合物は、ＳＬＣ６Ａ７のアゴニストもしくはアンタゴニスト、ＳＬＣ６Ａ７のアンチセンスもしくはＲＮＡｉ、本発明によるＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドに特異的な抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体でありうる。例えば該化合物は、エンケファリンまたはその誘導体の一つ、さらに具体的にはＬｅｕ−およびＭｅｔ−エンケファリンおよびそれらのデス−チロシル誘導体でありうる。該化合物は、ピペコリン酸塩（ＰＩＰ）またはその等価物もしくは誘導体でもありうる。該化合物は、さらにＣａ（２＋）依存性キナーゼのモジュレーター（アクチベーターまたはインヒビター）でありうる。例えば該化合物は、ＰＫＣモジュレーターまたはタプシガルギンのようなＣａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣＡＭＫ２）の作用を仲介するモジュレーターでありうる。該化合物は、ＣＡＭＫ２Ａのアゴニストもしくはアンタゴニスト、ＣＡＭＫ２ＡのアンチセンスもしくはＲＮＡｉ、本発明によるＣＡＭＫ２Ａポリペプチドに特異的な抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体でありうる。例えば該化合物は、オートカムチド−２、オートカムチド−３、もしくはＣＡＭＫ２の残基２７３〜３０２を含むペプチドのように自己阻害性ドメインをモデル化したペプチド、またはＫＮ６２およびＫＮ９３のような膜透過インヒビターでありうる。そのような化合物は、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）およびプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）のようなＣＡＭＫ２Ａの活性をモジュレートするホスファターゼまたはＣＡＭＫ２Ａの標的でもありうる。化合物は、ＰＫＣモジュレーターとＣａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣＡＭＫ２）モジュレーターとの組合わせでもありうる。または該化合物は、Ｃａ（２＋）依存性キナーゼの活性をモジュレートするホスファターゼまたはその標的のモジュレーター（アクチベーターまたはインヒビター）でありうる。この使用の特定の態様において、該化合物はアクチベーターである。この使用の他の特定の態様において該化合物は、インヒビターである。
【０１２７】
本発明は、自閉症（自閉症スペクトルおよび関連障害）とＳＬＣ６Ａ７遺伝子座との間の相関を実証している。このように本発明は、治療的介入の新規な標的を提供する。対象、特に変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子座を有する対象におけるＳＬＣ６Ａ７の活性または機能を回復またはモジュレートするために多様な取組みを考えることができる。そのような対象に野生型の機能を供給することは、病的細胞または病的生物における自閉症、自閉症スペクトル障害および関連障害の表現型の発現を抑制すると期待される。そのような機能の供給を遺伝子療法もしくはタンパク質療法により、またはＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドの活性をモジュレートもしくは模倣する化合物（例えば上記のスクリーニングアッセイで同定されたアゴニスト）を投与することによって果たすことができる。
【０１２８】
野生型ＳＬＣ６Ａ７遺伝子またはその機能的部分を、上記のようなベクターを使用してそれを必要とする対象の細胞に導入できる。そのベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドでありうる。その遺伝子は、裸のＤＮＡとしても導入できる。その遺伝子をレシピエントの宿主細胞のゲノムに組込むように、または染色体外のままであるようにその遺伝子を提供できる。組込みは、ランダムにまたは相同組換えのような正確に定められた部位に生じうる。特に、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子の機能的コピーを相同組換えにより変異版と置換して細胞に挿入できる。さらなる手法には、遺伝子ガン、リポソーム介在性トランスフェクション、陽イオン脂質介在性トランスフェクションなどがある。遺伝子の直接注入によって、または機能的ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドを発現するエックスビボで調製した遺伝子修飾細胞を投与することによって、遺伝子治療を果たすことができる。
【０１２９】
ＳＬＣ６Ａ７活性をモジュレートする他の分子（例えばペプチド、薬物、ＳＬＣ６Ａ７アゴニストもしくはアンタゴニスト、ＳＬＣ６Ａ７抗体もしくはその誘導体または有機化合物）も対象における機能的ＳＬＣ６Ａ７活性を回復するために、または細胞における有害な表現型を抑制するために使用できる。例えばＳＬＣ６Ａ７活性をモジュレートする分子は、ＳＬＣ６Ａ７活性の調節に関与するポリペプチドまたは遺伝子のモジュレーターでありうる。例えばその分子は、ＣＡＭＫ２Ａ活性のモジュレーター（例えばペプチド、薬物、ＣＡＭＫ２Ａアゴニストもしくはアンタゴニスト、ＣＡＭＫ２Ａ抗体もしくはその誘導体または有機化合物）でもありうる。
【０１３０】
細胞中での機能的ＳＬＣ６Ａ７遺伝子の機能の回復を、自閉症、自閉症スペクトル障害もしくは関連障害の発現を予防するために、または該疾患の進行を低減するために使用できる。そのような治療は、細胞、特に有害な対立遺伝子を有する細胞の異常な表現型を抑制しうる。
【０１３１】
当業者に公知の任意の方法によって、好ましくは経口経路または注射によって、典型的には腹腔内、大脳内、静脈内、動脈内または筋肉内経路によって投与を行える。当業者は、投与する用量を適合させることができる。典型的には性質が化学的である化合物について約０．０１mg〜１００mg/kgが注射される。核の化合物について用量は、例えば単位用量あたり０．０１mg〜１００mgまで変動しうる。他の活性薬剤または任意の薬学的に許容可能な賦形剤（例えば緩衝剤、等張食塩水溶液、安定化剤の存在下など）と場合により組合わせて、反復注射を行えるものとする。
【０１３２】
遺伝子、ベクター、組換え細胞およびポリペプチド
本発明のさらなる局面は、診断、治療法またはスクリーニングに使用するための新規な生成物にある。これらの生成物は、ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチド、同ポリペプチドを含むベクター、組換え宿主細胞および発現されたポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
【０１３３】
さらに詳細には本発明は、変異もしくは突然変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子、または該変異もしくは突然変異を含むそのフラグメントに関するものである。本発明は、変異もしくは突然変異したＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたは該変異もしくは突然変異を含むそのフラグメントをコードする核酸分子にも関するものである。該変異または突然変異は、ＳＬＣ６Ａ７活性を修飾する。修飾された活性は、増加または減少しうる。本発明は、さらに変異もしくは突然変異したＳＬＣ６Ａ７遺伝子または該変異もしくは突然変異を含むそのフラグメント、あるいは変異もしくは突然変異したＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたは該変異もしくは突然変異を含むそのフラグメントをコードする核酸分子を含むベクター、組換え宿主細胞および発現したポリペプチドに関するものである。
【０１３４】
本発明のさらなる目的は、本発明によるＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターである。そのベクターは、クローニングベクター、またはより好ましくは発現ベクター、すなわちコンピテント宿主細胞中に該ベクターからのＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドの発現を引き起こす調節配列を含むベクターでありうる。
【０１３５】
インビトロ、エックスビボ、またはインビボでＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドを発現させるために、トランスジェニックまたは「ノックアウト」の非ヒト動物を創造するために、核酸を増幅させるために、アンチセンスＲＮＡを発現させるためなどに、これらのベクターを使用できる。
【０１３６】
本発明のベクターは、典型的には調節配列、例えばプロモーター、ポリＡなどに「作動可能に連結している」本発明によるＳＬＣ６Ａ７コード配列を含む。用語「作動可能に連結している」は、コード配列および調節配列が機能的に関連して、その調節配列がコード配列の発現（例えば転写）を引き起こすことを示す。ベクターは、さらに一つまたは数個の複製起点および／または選択マーカーを含みうる。プロモーター領域は、コード配列に関して相同または非相同でありえ、インビボ使用を含めた、任意の適切な宿主細胞における遍在性構成性に調節され、かつ／または組織特異的である発現を提供する。プロモーターの例には、細菌プロモーター（Ｔ７、ｐＴＡＣ、Ｔｒｐプロモーターなど）、ウイルスプロモーター（ＬＴＲ、ＴＫ、ＣＭＶ−ＩＥなど）、哺乳動物遺伝子プロモーター（アルブミン、ＰＧＫなど）、その他がある。
【０１３７】
ベクターは、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣなどでありうる。プラスミドベクターを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ、ｐＢＲなどのような商業的に入手可能なベクターから調製できる。ウイルスベクターを、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ法によりバキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶなどから生成させることができる。
【０１３８】
これに関連して本発明の特定の目的は、上に定義するＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドをコードする組換えウイルスにある。組換えウイルスは、好ましくは複製を欠損し、尚より好ましくはＥ１−および／またはＥ４−欠損アデノウイルス、Ｇａｇ−、ｐｏｌ−および／またはｅｎｖ−欠損レトロウイルスならびにＲｅｐ−および／またはＣａｐ−欠損ＡＡＶより選択される。そのような組換えウイルスを、パッケージング細胞にトランスフェクトすることまたはヘルパープラスミドもしくはウイルスの一過性トランスフェクションによるような当技術分野で公知の手法によって生成させることができる。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例には、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などがある。そのような複製欠損組換えウイルスを生成させるための詳細なプロトコルを、例えばＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、ＵＳ５８８２８７７、ＵＳ６０１３５１６、ＵＳ４８６１７１９、ＵＳ５２７８０５６およびＷＯ９４／１９４７８に見出すことができる。
【０１３９】
本発明のさらなる目的は、上に定義されるような組換えＳＬＣ６Ａ７遺伝子またはベクターを含む組換え宿主細胞にある。適切な宿主細胞には（細菌のような）原核細胞および（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などのような）真核細胞があるが、それに限定されるわけではない。具体的な例には大腸菌（E. coli）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）もしくはサッカロミセス（Saccharomyces）酵母、哺乳動物細胞系（例えばＶｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）、または（例えば線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから作成した）初代培養もしくは樹立哺乳動物細胞培養物がある。
【０１４０】
本発明は、本発明によるＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を生成させる方法にも関するものである。該方法は、（ｉ）上記のような組換え核酸またはベクターをコンピテント宿主細胞にインビトロまたはエックスビボで導入すること、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞をインビトロまたはエックスビボで培養することおよび（ｉｉｉ）場合によりＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドを発現する細胞を選択することを含む。
【０１４１】
ＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドまたはそのようなポリペプチドを含む膜調製物の作製、および上記のような活性分子のスクリーニングにそのような組換え宿主細胞を使用できる。自閉症、自閉症スペクトル障害および関連障害を研究するモデル系としても、そのような細胞を使用できる。任意の適切な培養装置（平板、フラスコ、皿、試験管、パウチなど）に入れたＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＨＡＭなどのような適切な培地中で、これらの細胞を維持できる。
【０１４２】
本発明のさらなる局面および利点を以下の実験の部に開示する。この実験の部は、例示であり、本出願の範囲を限定するものではないとみなすべきである。
【０１４３】
実施例
１．  ヒト第５染色体上の自閉症感受性遺伝子座の同定
Ａ．  第５染色体感受性遺伝子を同定するためのGenomeHIPプラットフォーム
自閉症感受性遺伝子の迅速同定を可能にするためにGenomeHIPプラットフォームを使用した。その手法は、簡潔には血縁の個体のＤＮＡから対を形成させることからなる。各ＤＮＡは、特異的標識でマークされ、同定可能となっている。次に、２つのＤＮＡの間でハイブリッドを形成させる。それから多段階手順で２つのＤＮＡから全ての同祖（ＩＢＤ）フラグメントを選択する特定のプロセス（ＷＯ００／５３８０２）を適用する。次に、残ったＩＢＤ濃縮ＤＮＡをＤＮＡマイクロアレイから得られたＢＡＣクローンに対してスコアする。そのクローンは、染色体上のＩＢＤフラクションの位置決定を可能にする。
【０１４４】
多数の異なる家族にこのプロセスを適用した結果、各家族からの各対についてＩＢＤフラクションのマトリックスがもたらされる。次に、検査された全ての家族に共通する最小ＩＢＤ領域を統計解析から計算する。有意な結果（ｐ値）は、対象となる形質（ここでは自閉症）を有する正の領域が連鎖している証拠である。有意なｐ値を示す２つの最も距離の大きいクローンによって、連鎖した区間の境界を定めることができる。
【０１４５】
本研究において（ＡＤＩ−Ｒに定義されるような）厳密な自閉症に一致する米国の１１４家族（１１４組の同胞対）にGenomeHIPプロセスを受けさせた。結果としてもたらされたＩＢＤ濃縮ＤＮＡフラクションを次にＣｙ５蛍光色素で標識し、１．２メガ塩基対の平均間隔でヒトゲノム全体に及ぶ２２６３個のクローンからなるＤＮＡアレイに対してハイブリダイズさせた。シグナル値を標準化し、各クローンについての比を計算するためにＣｙ３で標識された未選択のＤＮＡを使用した。次に、比率の結果のクラスタリングを行って各クローンおよび対についてのＩＢＤ状態を決定した。
【０１４６】
この手順を適用することによって、第５染色体上の約１４８キロ塩基（塩基１４９７７２８５０から１４９９２１２２５）にわたるクローンＦＥ０ＤＢＡＣＡ２８ＺＨ０６（ｐ値１．６×１０−４）を同定した。このクローンは、＜７．０×１０−４のｐ値によって規定されるように自閉症との連鎖を示唆する証拠を示した（LanderおよびKruglyak、1995）。
【０１４７】
表２：  ＳＣＬ６Ａ７遺伝子座を含有する領域における第５染色体に関する連鎖の結果。連鎖についての証拠を有する一つのＢＡＣクローンに対応する領域および隣接領域を示す。クローンの開始一および停止位置は、染色体の開始（ｐ末端）に対するNCBI Build34に基づいたゲノムの局在位置に対応する。 
【０１４８】
【表２】
2007503210.tif 000003
【０１４９】
Ｂ．  第５染色体上の自閉症感受性遺伝子の同定
前記の連鎖する染色体領域の１４８キロ塩基および正のクローンに隣接する領域の２００kbをスクリーニングすることによって、我々は、自閉症および関連表現型についての候補として溶質キャリアファミリー６（神経伝達物質輸送体、Ｌ−プロリン）メンバー７（ＳＬＣ６Ａ７）遺伝子およびカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）ＩＩアルファ（ＣＡＭＫ２Ａ）遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、上に概略を述べたクローンによって境界を定められた連鎖の証拠を有して、隣接区間に実際に存在する。
【０１５０】
ＳＬＣ６Ａ７遺伝子は、予測されるアミノ酸６３６個のポリペプチド（ｍＲＮＡ１．９kb）をコードし、２１．９kbのゲノム配列に分散している。この遺伝子がコードするタンパク質は、神経伝達物質、オスモライト（osmolite）、代謝生成物およびアミノ酸であるプロリンに対するＮａ−およびＣｌ−依存性原形質膜キャリアを含む、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）神経伝達物質遺伝子ファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ナトリウム：神経伝達物質同伴輸送ドメインを有する。この輸送体は、シナプス前終末への高親和性のナトリウム依存性再取込みによりプロリンの作用を直接終止できる。Ｌ−プロリンは、シナプトソーム中でオルニチンから合成される、中枢神経系における推定上のシナプス調節分子である。
【０１５１】
最も重要なことに、この輸送体は、シナプス前軸索終末のサブセットに選択的に局在し、グルタミン酸作動性シナプスに典型的な非対称型の興奮性シナプスを形成する（Renickら、1999）。
【０１５２】
さらに最近の研究の成果は、ＳＬＣ６Ａ７がグルタミン酸作動性終末の分子不均一性に寄与していることを示し、特異的グルタミン作動性シナプスでの興奮伝播にＳＬＣ６Ａ７が新規なシナプス前調節を果たしている役割が示唆されている（Crampら、1999）。
【０１５３】
ＳＬＣ６Ａ７の生理学的役割を研究するためのＬ−プロリンの特異的取込みインヒビターの探索は、 Ｌ−プロリン輸送体タンパク質との直接相互作用を介して高親和性のＬ−プロリン取込みを競合阻害するエンケファリンの同定をもたらした。Ｌｅｕ−およびＭｅｔ−エンケファリンならびにそれらのデス−チロシル誘導体、例えばデス−チロシル−Ｌｅｕ−エンケファリンは、ラット海馬シナプトソームおよびＳＬＣ６Ａ７をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるＬ−プロリンの取込みを強力に選択的に阻害した（Fremeauら、1996）。Galliら（1999）は、ＳＬＣ６Ａ７が電気発生性であり、Ｌ−プロリン、Ｌ−ピペコリン酸塩（ＰＩＰ）、Ｌ−ノルロイシンおよびサルコシンがＳＬＣ６Ａ７の基質であることを示した。ＰＩＰは、輸送体に対する基質または神経伝達物質の取込みの稀少なアンタゴニストのいずれかであることを示した。
【０１５４】
Jayanthiら(2000)は、ＳＬＣ６Ａ７のモジュレーションに果たす［Ｃａ２＋］ＩおよびＣａ（２＋）依存性キナーゼの役割を検討した。彼らは、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のアクチベーターであるベータ−ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）がＬ−プロリンの取込みを阻害することを示した。ベータ−ＰＭＡを用いた慢性治療によるＰＫＣの下方制御は、ＳＬＣ６Ａ７の機能を増強し、これはＰＫＣの持続性活性によりＳＬＣ６Ａ７が調節されることを示している。Ｃａ（２＋）−ＡＴＰアーゼを阻害することにより［Ｃａ２＋］Ｉレベルを増加させるタプシガルギンは、ＳＬＣ６Ａ７を阻害し、ベータ−ＰＭＡと同時治療した場合に相加性の阻害を示す。ＢＩＭ（ＰＫＣインヒビター）ではなく、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣＡＭＫ２）インヒビターは、タプシガルギンによる阻害を防止する。これらのデータは、ＰＫＣおよびＣＡＭＫ２がＳＬＣ６Ａ７をモジュレートし、タプシガルギンがＣＡＭＫ２を介してその作用を仲介することを示唆している。Ｃａ２＋は、ＳＬＣ６Ａ７を分別的に調節しているようである。Ｃａ２＋は、最初にプロリン輸送を増強するが、結局ＣＡＭＫ２経路を介して輸送機能を阻害する。
【０１５５】
ＣＡＭＫ２Ａ遺伝子は、アイソフォーム１についてアミノ酸４８９個のポリペプチド（ｍＲＮＡ４８３６bp、ｃＤＮＡ１４７０bp）が予測され、アイソフォーム２についてアミノ酸４７８個のポリペプチド（ｍＲＮＡ４８０３bp、ｃＤＮＡ１４３７bp）が予測される２つのアイソフォームをコードする。ＣＡＭＫ２Ａ遺伝子は、７０．３kbのゲノム配列に分散している。この遺伝子がコードするタンパク質は、セリン／トレオニンプロテインキナーゼファミリーでＣａ（２＋）／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼサブファミリーのメンバーである。Ｃａ（２＋）／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ２（ＣＡＭＫ２）は、４つの遺伝子（アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタ）から得られる異なるアイソフォームのファミリーを含む。アルファおよびベータサブユニットは、脳における主要なアイソフォームであり、脳で一方または両方の型のサブユニットのいずれかからなる十二量体ホロ酵素を形成する。ＣＡＭＫ２はシナプスで豊富であり、シナプス後肥厚（ＰＳＤ）の主タンパク質である。ＣＡＭＫ２は、グルタミン酸作動性シナプスの調節に中心的である。ＣＡＭＫ２遺伝子がコードするアルファ鎖は、ある形式の学習および記憶の根底にあると考えられている活性に依存したシナプスの強化である、海馬の長期増強（ＬＴＰ）に必要である。最も重要なことには、このキナーゼはシナプスに移行し、そこでＰＳＤ内のグルタミン酸受容体サブタイプであるＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）受容体に直接結合する。結合の結果、ＮＭＤＡ受容体のリン酸化がもたらされる。移行は、グルタミン酸塩によって誘導されるようである（Bayerら、2001）。ＣＡＭＫ２は、ＰＳＤ中の少なくとも２つの他のタンパク質であるデンシン−１８０およびａ−アクチニン４と結合する（Stackら、2000；Walikonisら、2001）。
【０１５６】
Ｃａ２＋シグナルの強度およびキナーゼを脱リン酸するホスファターゼの性質に依存した崩壊時間で、ＣＡＭＫ２を種々の程度に活性化できる。ＣＡＭＫ２は、細胞質においてプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）によって主に脱リン酸され、一方でこのキナーゼは、ＰＳＤではプロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）によってほぼ独占的に脱リン酸される（Strackら、1997）。ＣＡＭＫ２を脱リン酸する能力は、ＰＰ１がスピノフィリン、ニューラビン、ヨチアオ（yotiao）および中間径フィラメントを含めた骨格タンパク質によってＰＳＤに固定化されているという事実に依存すると思われる（Watanabeら、2001）。
【０１５７】
ＬＴＰが、ＡＭＰＡ（ａ−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）受容体介在性伝達を選択的に増強するシナプス後プロセスを伴うという強力な証拠がある（MalenkaおよびNicoll, 1999）。ＣＡＭＫ２は、シナプスにすでに局在するＡＭＰＡ受容体をリン酸化し、それらのコンダクタンスを増強する。ＡＭＰＡ受容体は、他のグルタミン酸塩サブタイプの受容体である。
【０１５８】
ＣＡＭＫ２Ａは、ＬＴＰの持続を直接担い、よって学習および記憶の機能を有するおそれがある。Silvaら（1992a、1992b）は、Ｃａｍｋ２ａ遺伝子に突然変異を有するマウスがＬＴＰおよび海馬依存性空間学習の課題を欠損していることを示し、ＣＡＭＫ２Ａが学習および記憶に関与していることを示した。これらのマウスは、てんかん性発作も患った。
【０１５９】
Ｃａｍｋ２ａのヌル突然変異にヘテロ接合性であるマウスは、正常な海馬ＬＴＰを示すが、皮質ＬＴＰを示さない。これらの動物は、行動課題において正常に学習するが、おそらく海馬から皮質への情報の正常な輸送が不可能であることが原因でその後忘却する（Franklandら(2001)。
【０１６０】
トレオニン−２８６残基での自己リン酸化は、カルモジュリン依存性状態からカルモジュリン非依存性状態に切り換える能力をＣＡＭＫ２Ａに授ける。Gieseら(1998)は、ＣＡＭＫ２Ａのｔｈｒ２８６で自己リン酸化を遮断するｔｈｒ２８６からａｌａへの突然変異を導入した。この突然変異は、カルモジュリン非依存性状態への切り換えが不可能であるキナーゼをもたらしたが、カルモジュリン依存性活性には影響しなかった。Ｔｈｒ２８６のリン酸化の除去はＬＴＰを遮断するだけでなく、インビボの経験依存性可塑性も妨害する。行動検査は、記憶がこの突然変異によって強力に損傷することを示す。このようにＣＡＭＫ２Ａは、行動に関連する情報を貯蔵するシナプスの基本プロセスに関与する。
【０１６１】
さらに、Ｃａｍｋ２ａ遺伝子を欠損したマウスは行動異常を示したことが示されている（Chenら、1994）。ヘテロ接合性マウスは、認知の不足が全く測定されずに恐れ反応の減少および防御性攻撃の増加から主としてなる境界明瞭な症候群を表す。
【０１６２】
ＣＡＭＫ２がＬＴＰ誘導に必要であるかどうかを検査するための特異的インヒビターの探索から、このキナーゼの特異的インヒビターの同定に至った（Malinowら、1989）。自己阻害性領域をモデル化したペプチド（例えばオートカムチド−２またはＣＡＭＫ２の残基２７３〜３０２を含むペプチド）は、他のカルモジュリン依存性プロセスを妨害せずにその酵素のＣａ２＋依存性活性を遮断する（Lismanら、2002）。シナプス後細胞へのオートカムチド−３由来ペプチドインヒビター（ＡＣ３−Ｉ）の導入は、対形成により生成したＬＴＰの誘導を完全に遮断するが、ＬＴＰの維持には影響しない（Otmakhovら、1997）。ＫＮ６２およびＫＮ９３のようなＣＡＭＫ２の膜透過性インヒビターは、カルモジュリンの結合を妨害することによって、その酵素のＣａ２＋依存性活性を遮断し、標準的なＬＴＰ誘導プロトコルであるチタン短時間刺激によるＬＴＰ誘導を防止する（Otmakhovら、1997）。
【０１６３】
Jayanthiら(2000)は、［Ｃａ２＋］ＩおよびＣａ（２＋）依存性キナーゼがＬ−プロリン神経伝達物質輸送体であるＳＬＣ６Ａ７のモジュレーションに果たす役割を検討した。Ｃａ２＋は分別的にＳＬＣ６Ａ７を調節しているようである。Ｃａ２＋は、最初プロリンの輸送を増強するが、結局ＣＡＭＫ２経路を介した輸送機能を阻害する。
【０１６４】
ＣＡＭＫ２は、抗けいれん薬、ベンゾジアゼピン、および抗うつ薬の作用に関係があるとされている。最近、Celanoら(2003)は、ＣＡＭＫ２が精神疾患の治療に採用される種々の薬物の作用にも役割を果たすことを示した。
【０１６５】
自閉症に観察される重度の破壊がＧＡＢＡ作動性阻害に連鎖する結果、グルタミン酸塩を専門にするニューロンの過剰刺激および感覚ゲーティングの欠如がもたらされるおそれがあるという仮説が立てられた（Hussman、2001）。
【０１６６】
低グルタミン酸作動性げっ歯類モデルにおいて、自閉症にみられる認識障害と関連性を有するおそれがある、ある行動が観察された（Nilssonら、2001）。
【０１６７】
グルタミン酸デカルボキシラーゼの６５および６７kDaレベルの減少から、自閉症対象の血液および血小板中のグルタミン酸塩の報告された増加を説明できる（Fatemiら、2002）。グルタミン酸デカルボキシラーゼ欠損は、自閉症の脳におけるグルタミン酸／γアミノ酪酸レベル、または輸送体／受容体密度の異常が原因であるか、またはそれらと関連しているおそれがある。さらに、グルタミン酸受容体密度の減少が、自閉症患者の小脳で観察されている（Purcellら、2001）。
【０１６８】
第５染色体上の自閉症に連鎖した遺伝子変異の区間のごく近傍にヒトＳＬＣ６Ａ７遺伝子を同定した本出願で提供された連鎖の結果と、グルタミン酸作動性シナプスでの調節的な役割とを総合して、我々は、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子またはその調節配列における変異（例えば突然変異および／または多型）が、ヒト自閉症の発現に寄与しているおそれがあり、その変異が診断または治療的介入のための新規な標的となりうると結論する。
【０１６９】
３．  関連の研究
連鎖の研究に使用したのと同じ家族を、伝搬不均衡テスト（ＴＤＴ）を使用して問題となる特定の表現型（ここでは自閉症）と、遺伝子マーカー対立遺伝子または特異的マーカー対立遺伝子を含有するハプロタイプとの間の関連を検査するためにも使用した。ＴＤＴは、被験試料における集団層別問題に非感受性であることから、関連の強力な検査である。簡潔には、ヘテロ接合性の親から、罹患した子孫への対立遺伝子の分離を検査する。伝搬しなかった対立遺伝子に比べて罹患した子孫に伝搬した対立遺伝子の部分を、ランダム分布で期待される比率と比較する。期待値よりも対立遺伝子の伝搬が有意に過剰であることは、それぞれの対立遺伝子またはハプロタイプと、検討された自閉症表現型とが関連している証拠である。
【０１７０】
この分析の結果は、ＳＬＣ６Ａ７遺伝子のある対立遺伝子が自閉症と正の関連性もち、よって疾患に対する感受性が増加させることを示している。被験集団において、ＳＮＰ５の対立遺伝子Ｇ、ＳＮＰ６の対立遺伝子Ａ、ＳＮＰ７の対立遺伝子Ｔ、ＳＮＰ８の対立遺伝子ＣおよびＳＮＰ１０の対立遺伝子Ｇは、ＴＤＴによって決定されるように自閉症と相関する（ｐ値は０．０３〜０．００６の範囲）。対照的に、これらＳＮＰの反対側の対立遺伝子は、自閉症の個体に過少伝搬しており、これらの対立遺伝子がこの疾患の防御を助けていることを示す。
【０１７１】
自閉症患者へのＳＮＰ５〜ＳＮＰ１０の対立遺伝子の伝搬の例を表３に示す。
【０１７２】
【表３】
2007503210.tif 000004
【０１７３】
さらに、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１４についてのハプロタイプを構築し、全てのＳＮＰについての位相を同定した。
【０１７４】
被験集団におけるこの分析の結果は、全てＳＮＰ８の対立遺伝子Ｃが存在することを特徴とするあるハプロタイプが、自閉症と強力に関連しているが、一方ＳＮＰ８に対立遺伝子Ｇを欠如するあるハプロタイプは、自閉症に優先的に伝搬されないことを示した。例は、ＳＮＰ４−ＳＮＰ７−ＳＮＰ８についてのハプロタイプＧ−Ｔ−Ｃ、ｐ＝０．００９７４１および、ＳＮＰ８−ＳＮＰ９−ＳＮＰ１４についてのハプロタイプＣ−Ｃ−Ｇ、ｐ＝０．００２３５である。ＳＮＰ８に対立遺伝子Ｇの代わりに対立遺伝子Ｃを有するハプロタイプは、自閉症対象において実際以下に見積もられている証拠を示す。一例は、ＳＮＰ５−ＳＮＰ６−ＳＮＰ８についてのハプロタイプＣ−Ｇ−Ｇ、ｐ＝０．０２７４２である。
【０１７５】
自閉症患者へのＳＮＰ８の優先的な伝搬および非伝搬を伴うハプロタイプの例を表４および表５に示す。
【０１７６】
【表４】
2007503210.tif 000005
【０１７７】
【表５】
2007503210.tif 000006
【０１７８】
４．  ヌクレオチド変化の同定
突然変異の選別に９６人の血縁のない罹患した個体を含めた。プライマーを設計してＳＣＬ６Ａ７遺伝子のコード領域を増幅させた。各プライマーは、それぞれ大文字でマークしたＭ１３ＦおよびＭ１３Ｒ配列を含む尾部を含有し、Ｍ１３プライマーを使用してＰＣＲ生成物を直接配列決定するのを容易にした。プライマーの配列を以下提供する：
【０１７９】
【表６】
2007503210.tif 000007
2007503210.tif 000008
【０１８０】
色素−ターミネーター配列決定化学反応を使用して、結果としてもたらされた増幅生成物を両方向で直接配列決定して、遺伝子における稀少ヌクレオチド変化（突然変異）および多型（対立遺伝子頻度＞１%）を同定した。
【０１８１】
この遺伝子のコード領域およびスプライス部位にすぐ近接した隣接イントロン領域に合計１２個のヌクレオチド変化を検出した（位置については表６を参照されたい）。これらのうち三つの結果として、表６に例示するようにそれぞれのコドンにおけるアミノ酸の変化がもたらされた。さらに、追加のＡＴＰ（開始コドン、配列番号：１の位置２２９）も公共データベースのコード領域の開始についての基準として使用されるＡＴＧと同フレーム内の上流にも同定された（配列番号：１の位置４７２に局在）。この代替ＡＴＧは、わずかに長いタンパク質をもたらすと考えられる。したがって、変異体に関する位置は、２つの代替タンパク質について示してあり、ここで配列番号：２の基準配列に基づく位置をまず挙げる。
【０１８２】
【表７】
2007503210.tif 000009
【０１８３】
エキソン１のＭｕｔ１は、関連の研究に使用したＳＮＰ６と同一である。ＳＮＰ６は、自閉症に独立して関連し、偶然から期待されるよりも高頻度で自閉症患者に伝搬したハプロタイプＳＮＰ５−ＳＮＰ６−ＳＮＰ８、ＳＮＰ６−ＳＮＰ７−ＳＮＰ８およびＳＮＰ６−ＳＮＰ８−ＳＮＰ１４の部分でもあった。
【０１８４】
Ｍｕｔ２およびＭｕｔ８は、スプライシング部位近くに生じ、よってこれらの部位でスプライシングに影響できた。
【０１８５】
コドン３３８でのＣからＴへの突然変異は、第７膜貫通ドメインに生じ、グリシンからセリンへの非同義アミノ酸変化をもたらした。コドン５８７および６２０における突然変異は、細胞質ドメインに生じ、それぞれアルギニンからトレオニン、およびトレオニンからメチオニンへの非同義アミノ酸変化をもたらした。これらの突然変異の全ては、本出願に開示されるようにスクリーニングまたは診断目的のための価値ある標的となる。さらに、これらの突然変異および対応するポリペプチド配列は、特異的抗体を発生させるための価値あるエピトープとなる。さらに、本発明の特定の目的は、以下のような延長したＮ末端アミノ酸配列を含むＳＬＣ６Ａ７ポリペプチドである：ＭＲＡＱＱＣＴＬＰＱ  ＰＲＡＬＲＲＤＲＱＧ  ＩＲＳＡＬＰＡＬＨＡ  ＲＳＲＱＴＡＡＰＡＳ  ＶＰＡＰＡＧＡＲＥＰ  ＲＧＱＲＲＳＧＱＲＴ  ＩＳＲＡＬＡＬＣＡＰ  ＧＱＬＳＰＧＨＰＬＳ  Ｋ（配列番号：５１）。
【０１８６】
本配列は、本発明者らによって発見されたように上流のＡＴＧ開始コドンの使用に起因する。結果としてもたらされた完全長ＳＬＣＡ６Ａ７ポリペプチドは、７１７個のアミノ酸残基を含む。また、配列番号：５１の全てまたは一部を含むポリペプチドは、本発明の特定の目的となる。そのようなポリペプチドは、より好ましくは配列番号：５１の少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、尚より好ましくは少なくとも７、８、９、１０、１２、１５または２０個を含む。そのポリペプチドは、典型的には一つのエピトープを含む。
【０１８７】
配列１〜１２に関する情報
【０１８８】
【表８】
2007503210.tif 000010
2007503210.tif 000011
2007503210.tif 000012
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【０１８９】
【表９】
2007503210.tif 000021
2007503210.tif 000022
2007503210.tif 000023
2007503210.tif 000024
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】Genomic Hybrid Identity Profiling（GenomeHIP）を使用した高密度マッピングである。ヒトゲノム全体を代表するクローンの間の平均間隔が１．２メガ塩基対である合計２２６３個のＢＡＣクローンを、GenomeHIPを使用して連鎖について検査した。ｘ軸の各点は、クローンに対応する。オリエンテーションをよりよくするためにいくつかのクローンをライブラリー名で示した（例えばＦＥ０ＤＢＡＣＡ１９ＺＧ０４）。ヒト第５染色体上の１４９７７２８５０塩基対から始まり１４９９２１２２５塩基対までの領域にわたるクローンＦＥ０ＤＢＡＣＡ２８ＺＨ０６（ｐ値１．６４×１０−４）について連鎖を示唆する証拠が計算された。ゲノム全体の選別についてLanderおよびKruglyak(1995)によって提唱された連鎖を示唆する有意水準に対応するｐ値７．０×１０−４を有意水準として使用した。
【図１】
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【国際調査報告】
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