(57)【要約】本発明は、細菌細胞で産生された哺乳動物の、リフォールディングされる能力が増強したグリコシルトランスフェラーゼ変異体を含むグリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする方法、およびこのようなリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼの使用方法を提供する。また、本発明は、単一容器において、１種以上のグリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする方法、このようなリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼを使用する方法、およびリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼを含んでなる反応混合物を提供する。
2007535309.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の不溶性、組換え、真核生物グリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする方法であって、前記グリコシルトランスフェラーゼは、マルトース結合タンパク質ドメイン（ＭＢＤ）を含んでなり、
（ａ）不溶性、組換え、真核生物グリコシルトランスフェラーゼを可溶化緩衝液中に可溶化するステップと；
（ｂ）前記可溶性の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと、レドックス対を含んでなるリフォールディング用緩衝液とを接触させて前記真核生物グリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングし、前記リフォールディングされた真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、供与体基質から受容体基質への糖の移送を触媒するステップと、
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記第１の真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、ステム領域の全部または一部を除去するために切断される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の真核生物グリコシルトランスフェラーゼ中の不対合システインが、非システインアミノ酸との置換により除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、ＧｎＴ１、ＧａｌＴ１、ＳｔＩＩＩ  Ｇａｌ３、Ｓｔ３ＧａｌＩ、Ｓｔ６  ＧａｌＮＡｃＴＩ、コアＧａｌＩＴＩ、ＧａｌＮＡｃＴ２よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、澱粉結合ドメイン、チオレドキシンドメイン、ＳＵＭＯドメイン、ポリ−Ｈｉｓドメイン、ｍｙｃエピトープドメイン、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼドメインよりなる群から選択される精製ドメインをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、自己開裂ドメインをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、不溶性封入体として細菌宿主細胞内に発現される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第２の不溶性組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、前記第１の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと共にリフォールディングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第３の不溶性組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、前記第１の真核生物グリコシルトランスフェラーゼおよび前記第２の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと共にリフォールディングされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記レドックス対が、還元グルタチオン／酸化グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）およびシステイン／シスタミンよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記受容体基質が、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、および糖ペプチドから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、シアリルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記シアリルトランスフェラーゼとしてが、ＳｔＩＩＩ  Ｇａｌ３、Ｓｔ３ＧａｌＩ、Ｓｔ６  ＧａｌＮＡｃＴＩよりなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記供与体基質が、ＣＭＰ−シアリン酸ＰＥＧ分子であり、前記受容体基質が、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、および糖ペプチドから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ステムアンカー領域および膜貫通ドメインが、前記組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼから欠失され、前記グリコシルトランスフェラーゼが、マルトース結合ドメインにインフレームで融合されている、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１６】
前記ステム領域の全部または一部が欠失されている、請求項１５に記載の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１７】
組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ中の不対合システインが、非システインアミノ酸による置換によって除去される、請求項１５に記載の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１８】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、ＧｎＴ１タンパク質、ＧａｌＴ１タンパク質、ＳｔＩＩＩ  Ｇａｌ３タンパク質、Ｓｔ３ＧａｌＩタンパク質、Ｓｔ６  ＧａｌＮＡｃＴＩタンパク質、コアＧａｌＴＩタンパク質、およびＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質よりなる群から選択される、請求項１５に記載の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１９】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、ＧｎＴ１タンパク質である請求項１５に記載の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２０】
前記ＧｎＴ１タンパク質が、ＧｎＴ１Δ３５およびＧｎＴ１Δ１０３から選択される切断ヒトＧｎＴ１タンパク質である、請求項１９に記載のＧｎＴ１タンパク質。
【請求項２１】
前記ＧｎＴ１タンパク質が、ＣＹＳ１２１ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＡＳＰ、およびＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳよりなる群から選択される不対合システイン置換を含んでなるヒトＧｎＴ１タンパク質である、請求項に記載１９のＧｎＴ１タンパク質。
【請求項２２】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、ＧａｌＴ１タンパク質である、請求項１５に記載の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２３】
前記ＧａｌＴ１タンパク質が、ＧａｌＴ１Δ７０およびＧａｌＴ１Δ１２９から選択される切断ウシＧａｌＴ１タンパク質である、請求項２２に記載のＧａｌＴ１タンパク質。
【請求項２４】
前記ＧａｌＴ１タンパク質が、ＣＹＳ３４２ＴＨＲの不対合システイン置換を含んでなるウシＧａｌＴ１タンパク質である請求項２２に記載のＧａｌＴ１タンパク質。
【請求項２５】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質である請求項１５に記載の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２６】
前記ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質が、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩΔ２８、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩΔ７３、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩΔ８５およびＳＴ３ＧａｌＩＩＩΔ８６から選択される切断ラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質である、請求項２５に記載のＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質。
【請求項２７】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、コア１  ＧａｌＴ１タンパク質である、請求項１５に記載の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２８】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質である、請求項１５に記載の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２９】
前記ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質が、ＳＴ３Ｇａｌ１Δ２９、ＳＴ３Ｇａｌ１Δ４５、およびＳＴ３Ｇａｌ１Δ５６から選択される切断ヒトＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質である、請求項２８に記載のＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質。
【請求項３０】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１タンパク質である、請求項１５に記載の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３１】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質である、請求項１５に記載の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３２】
前記ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質が、ＧａｌＮＡｃＴ２Δ４０、ＧａｌＮＡｃＴ２Δ５１、ＧａｌＮＡｃＴ２Δ７４およびＧａｌＴ２Δ９５から選択される切断ヒトＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質である、請求項３１に記載のＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質。
【請求項３３】
請求項１５に記載の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼを用いてタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、または糖ペプチドをリモデリングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年２月４日に出願した米国特許仮出願第６０／５４２，２１０号、および２００４年８月６日に出願した米国特許仮出願第６０／５９９，４０６号、および２００４年１１月１２日に出願した米国特許仮出願第６０／６２７，４０６号の権利を主張する。これらの各々は、あらゆる目的のために本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、細菌細胞で産生された哺乳動物の、リフォールディングされる能力が増強したグリコシルトランスフェラーゼ変異体を含めたグリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする方法、およびこのようなリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼの使用方法を提供する。また、本発明は、単一容器において、１種以上のグリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする方法、このようなリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼを使用する方法、およびリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼを含んでなる反応混合物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
真核生物は、治療上および商業上有用なオリゴ糖構造体または糖脂質もしくは糖タンパク質などの複合多糖類を合成する。オリゴ糖類または複合多糖類のインビトロ合成は、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼを用いて実施できる。オリゴ糖合成のために組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼを産生する最も効率的な方法は、細菌でタンパク質を発現させることである。しかし、細菌において、多くの真核生物のグリコシルトランスフェラーゼは、細菌の封入体中の不溶性タンパク質として発現し、該封入体から活性タンパク質の収量は極めて低いことがあり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、細菌内で真核生物のグリコシルトランスフェラーゼを産生する改善された方法が必要である。本発明は、これを解決し、また、他の必要性を解決する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（本発明の簡単な概要）
本発明は、マルトース結合タンパク質ドメイン（ＭＢＤ）を含んでなる不溶性の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする方法を提供する。不溶性の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼを可溶化緩衝液中に可溶化し、次いで、酸化還元対を含んでなるリフォールディング用緩衝液に接触させ、リフォールディングされた真核生物グリコシルトランスフェラーゼが供与体基質から受容体基質への糖の移送を触媒するようにする。一実施形態において、真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、タンパク質のステム領域の全てまたは一部を除去するために切断される。他の実施形態において、真核生物グリコシルトランスフェラーゼにおける不対合システインが、非システインアミノ酸による置換によって除去される。さらなる一実施形態において、真核生物グリコシルトランスフェラーゼにおける不対合システインが、非システインアミノ酸による置換によって除去され、該真核生物グリコシルトランスフェラーゼはまた、タンパク質のステム領域の全部または一部を除去するために切断される。
【０００６】
一実施形態において、該真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＧｎＴ１、ＧａｌＴ１、ＳｔＩＩＩ  Ｇａｌ３、Ｓｔ３ＧａｌＩ、Ｓｔ６  ＧａｌＮＡｃＴＩ、コアＧａｌＴＩ、ＧａｌＮＡｃＴ２よりなる群から選択される。
【０００７】
一実施形態において、該真核生物グリコシルトランスフェラーゼはさらに、精製ドメイン、例えば、澱粉結合ドメイン（ＳＢＤ）、チオレドキシンドメイン、ＳＵＭＯドメイン、ポリ−Ｈｉｓドメイン、ｍｙｃエピトープドメイン、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼドメインを含んでなる。
【０００８】
一実施形態において、該真核生物グリコシルトランスフェラーゼはさらに、自己開裂ドメインを含んでなる。
【０００９】
一実施形態において、該真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、不溶性封入体として、細菌宿主細胞内に発現する。
【００１０】
一実施形態において、第２の不溶性組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、第１の真核生物グリコシルトランスフェラーゼによってリフォールディングされる。さらなる一実施形態において、第３の不溶性組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、第１の真核生物グリコシルトランスフェラーゼおよび第２の真核生物グリコシルトランスフェラーゼによってリフォールディングされる。使用者の必要に依って、さらなる不溶性組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、一緒に加えられ、リフォールディングでき、例えば、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種のグリコシルトランスフェラーゼを一緒にリフォールディングできる。
【００１１】
一実施形態において、該レドックス対は、還元グルタチオン／酸化グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）およびシステイン／シスタミンよりなる群から選択される。
【００１２】
一実施形態において、該受容体基質は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、および糖ペプチドから選択される。
【００１３】
一実施形態において、該真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼである。シアリルトランスフェラーゼとしては、例えば、ＳｔＩＩＩ  Ｇａｌ３、Ｓｔ３ＧａｌＩ、Ｓｔ６  ＧａｌＮＡｃＴＩを挙げることができる。さらなる一局面において、該供与体基質は、ＣＭＰ−シアリル酸ＰＥＧ分子であり、該受容体基質は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、および糖ペプチドから選択される。
【００１４】
また、本発明は、ステムアンカー領域および膜貫通領域が該タンパク質から欠失しており、該グリコシルトランスフェラーゼがマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）ドメインにインフレームで融合している組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼを提供する。一実施形態において、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼとＭＢＰドメインとの融合は、細菌、例えば、大腸菌における不溶性封入体として発現する。
【００１５】
一実施形態において、ステム領域の全部または一部が、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼから欠失される。他の実施形態において、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ内の不対合システインが、非システインアミノ酸による置換によって除去される。
【００１６】
さらなる一実施形態において、該組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、以下のうちの１つである：ＧｎＴ１タンパク質、ＧａｌＴ１タンパク質、ＳｔＩＩＩ  Ｇａｌ３タンパク質、Ｓｔ３ＧａｌＩタンパク質、Ｓｔ６  ＧａｌＮＡｃＴＩタンパク質、コアＧａｌＴＩタンパク質、またはＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質。
【００１７】
一実施形態において、該組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＧｎＴ１タンパク質である。一局面において、該ＧｎＴ１タンパク質は、ＧｎＴ１Δ３５およびＧｎＴ１Δ１０３から選択される切断ヒトＧｎＴ１タンパク質である。他の局面において、該ＧｎＴ１タンパク質は、ＣＹＳ１２１ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＡＳＰ、およびＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳよりなる群から選択される不対合システイン置換を含んでなるヒトＧｎＴ１タンパク質である。さらなる一局面において、ＧｎＴ１タンパク質は、切断されており、かつ置換変異により不対合システイン残基を除去されているものである。
【００１８】
一実施形態において、該組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＧａｌＴ１タンパク質である。一局面において、該ＧａｌＴ１タンパク質は、ＧａｌＴ１Δ７０およびＧａｌＴ１Δ１２９から選択される切断ウシＧａｌＴ１タンパク質である。他の局面において、該ＧａｌＴ１タンパク質は、ＣＹＳ３４２ＴＨＲの不対合システイン置換を含んでなるウシＧａｌＴ１タンパク質である。さらなる一局面において、該ＧａｌＴ１タンパク質は、切断されており、かつ置換変異により不対合システイン残基を除去されているものである。
【００１９】
一実施形態において、該組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質である。一局面において、該ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質は、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩΔ２８、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩΔ７３、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩΔ８５およびＳＴ３ＧａｌＩＩＩΔ８６から選択される切断ラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質である。他の局面において、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質は、不対合システイン残基に対するアミノ酸置換を含んでなる。さらなる一局面において、該ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質は、切断されており、かつ置換変異により不対合システイン残基を除去されているものである。
【００２０】
一実施形態において、該グリコシルトランスフェラーゼが、コア１  ＧａｌＴ１タンパク質である請求項１５の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。一局面において、コア１ＧａｌＴ１タンパク質は、切断ショウジョウバエタンパク質または切断ヒトタンパク質である。他の局面において、ショウジョウバエまたはヒトのコア１ＧａｌＴ１タンパク質は、不対合システイン残基に対するアミノ酸置換を含んでなる。さらなる一局面において、ショウジョウバエまたはヒトのコア１ＧａｌＴ１タンパク質は、切断されており、かつ置換変異により不対合システイン残基を除去されているものである。
【００２１】
一実施形態において、該組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質である。一局面において、該ＳＴ３ＧａｌＩタンパク質は、ＳＴ３Ｇａｌ１Δ２９、ＳＴ３Ｇａｌ１Δ４５、およびＳＴ３Ｇａｌ１Δ５６から選択される切断ヒトタンパク質である。他の局面において、ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質は、不対合システイン残基に対するアミノ酸置換を含んでなる。さらなる一局面において、該ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質は、切断されており、かつ置換変異により不対合システイン残基を除去されているものである。
【００２２】
一実施形態において、該組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＳＴ６  ＧａｌＮＡｃ１タンパク質である。一局面において、該ＳＴ６  ＧａｌＮＡｃ１タンパク質は、切断マウスタンパク質、切断ニワトリタンパク質または切断ヒトタンパク質であり、例えば、表１４に挙げられた切断体のうちの１つである。他の局面において、他の局面において、マウス、ニワトリ、またはヒトのＳＴ６  ＧａｌＮＡｃ１タンパク質は、不対合システイン残基に対するアミノ酸置換を含んでなる。さらなる一局面において、該マウス、ニワトリ、またはヒトのＳＴ６  ＧａｌＮＡｃ１タンパク質は、切断されており、かつ置換変異により不対合システイン残基を除去されているものである。
【００２３】
一実施形態において、該グリコシルトランスフェラーゼが、ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質である請求項１５の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。一局面において、該ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質は、ＧａｌＮＡｃＴ２Δ４０、ＧａｌＮＡｃＴ２Δ５１、ＧａｌＮＡｃＴ２Δ７４およびＧａｌＮＡｃＴ２Δ９５から選択される切断ヒトタンパク質である。他の局面において、該ヒトＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質は、不対合システイン残基に対するアミノ酸置換を含んでなる。さらなる一局面において、該ヒトＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質は、切断されており、かつ置換変異により不対合システイン残基を除去されているものである。
【００２４】
また本発明は、タンパク質がリフォールディングされ、酵素活性を有した後に、上記に挙げた組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼを用いて、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、または糖ペプチドをリモデリングする方法を提供する。
【００２５】
本発明は、活性形態における不溶性真核生物グリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする改善した方法を提供し、また、リフォールディング特性を増強させたグリコシルトランスフェラーゼ、例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）酵素を提供する。
【００２６】
一局面において、本発明は、変異して、不溶性沈殿物、例えば細菌封入体からの酵素のリフォールディングを増強するアミノ酸により、不対合システイン残基を置換した組換え真核生物Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）酵素を提供する。ＧｎＴ１酵素は、ＧｎＴ１酵素の少なくとも触媒ドメインを含む。ＧｎＴ１酵素酵素は、生物学的に活性であり、すなわち、供与体基質から受容体基質への移送を触媒することができる。
【００２７】
一実施形態において、ＧｎＴＩ酵素はヒトタンパク質である。ヒトＧｎＴ１におけるＣＹＳ１２１残基の幾つかの変異はリフォールディングを増強する。このような変異体としては、例えば、ＣＹＳ１２１ＳＥＲ変異、ＣＹＳ１２１ＡＬＡ変異、ＣＹＳ１２１ＡＳＰ変異、および二重変異体のＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳが挙げられる。ＧｎＴ１変異体の代表的配列は図７〜１１に示されている。他の真核生物において、例えば不対合システイン残基ＣＹＳ１２３の同様な変異はＧｎＴ１酵素のリフォールディングを増強する。
【００２８】
他の実施形態において、ＧｎＴＩ酵素はまた、アミノ酸タグ、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、澱粉結合タンパク質（ＳＢＰ）、およびｍｙｃエピトープを含む。
【００２９】
他の局面において、本発明は、変異して、不溶性沈殿物、例えば細菌封入体からの酵素のリフォールディングを増強するアミノ酸によって不対合システイン残基を置換した組換え真核生物ＧｎＴＩ酵素をコードする核酸を提供する。上記の通り、コードされたＧｎＴ１酵素は、ＧｎＴ１酵素の少なくとも触媒ドメインを含み、そして生物学的に活性である。すなわちそれは、供与体基質から受容体基質への移送を触媒することができる。
【００３０】
一実施形態において、該核酸はヒトＧｎＴＩ酵素をコードする。ヒトＧｎＴ１におけるＣＹＳ１２１残基の幾つかの変異はリフォールディングを増強する。このような変異体としては、例えば、ＣＹＳ１２１ＳＥＲ変異、ＣＹＳ１２１ＡＬＡ変異、ＣＹＳ１２１ＡＳＰ変異、および二重変異体のＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳが挙げられる。ＧｎＴ１変異タンパク質および核酸の代表的核酸配列は、図７〜１１に示されている。他の真核生物において、例えば不対合システイン残基ＣＹＳ１２３の同様な変異はＧｎＴ１酵素のリフォールディングを増強する。
【００３１】
さらなる一実施形態において、コードされたＧｎＴＩ酵素はまた、アミノ酸タグ、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、澱粉結合タンパク質（ＳＢＰ）、およびｍｙｃエピトープを含む。
【００３２】
また本発明は、変異ＧｎＴ１核酸を含む発現ベクター、ＧｎＴ１発現ベクターを含む宿主細胞、および宿主／発現ベクター系を用いて変異ＧｎＴ１酵素を製造する方法を含む。
【００３３】
他の実施形態において、本発明は、末端マンノース残基を有する受容体分子を、活性化Ｎ−アセチルグルコサミン分子、および変異してリフォールディングを増強させた真核生物ＧｎＴＩ酵素に接触させることによって、該受容体分子にＮ−アセチルグルコサミン残基を付加する方法を提供する。該受容体分子としては、例えば、多糖、オリゴ糖、糖脂質、または糖タンパク質であり得る。
【００３４】
他の局面において、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼを、レドックス対を含むリフォールディング用緩衝液に接触させることによって、単一容器内で少なくとも２種の不溶性組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質をリフォールディングする方法を提供する。リフォールディング後、リフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも２種は生物学的活性を有する。例えばそれらは、供与体基質から受容体基質への移送を触媒することができる。
【００３５】
該リフォールディング用緩衝液はまた、界面活性剤、カオトロピック剤、またはアルギニン、またはＰＥＧを含み得る。いくつかの実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、６．０と１０．０との間である。一実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、６．５と８．０との間である。他の実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、８．０と９．０との間である。
【００３６】
他の実施形態において、該グリコシルトランスフェラーゼはアミノ酸タグ、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、澱粉結合タンパク質（ＳＢＰ）、およびｍｙｃエピトープを含む。
【００３７】
一実施形態において、Ｎ−結合グリカン生合成経路の１種超のグリコシルトランスフェラーゼが一緒にリフォールディングされる。
【００３８】
一実施形態において、本発明の方法を用いて、シアリルトランスフェラーゼが他のグリコシルトランスフェラーゼと共にリフォールディングされる。
【００３９】
一実施形態において、本発明の方法を用いて、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが他のグリコシルトランスフェラーゼと共にリフォールディングされる。
【００４０】
一実施形態において、本発明の方法を用いて、ガラクトシルトランスフェラーゼを他のグリコシルトランスフェラーゼと共にリフォールディングされる。
【００４１】
別の一実施形態において、本発明の方法を用いて、シアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、およびガラクトシルトランスフェラーゼが、単一容器内で一緒にリフォールディングされる。
【００４２】
一実施形態において、Ｏ−結合グリカン生合成経路の１種超のグリコシルトランスフェラーゼが一緒にリフォールディングされる。さらなる一実施形態において、第１の酵素はＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼである。好ましい一実施形態において、第１の酵素はＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２（ＧａｌＮＡｃＴ２）である。
【００４３】
また本発明は、変異して、不溶性沈殿物、例えば細菌封入体からの酵素のリフォールディングを増強するアミノ酸によって不対合システイン残基を置換した組換え真核生物ＧｎＴＩ酵素および同一容器内でリフォールディングされた少なくとも１種の他のグリコシルトランスフェラーゼを含む反応混合物を提供する。第２のグリコシルトランスフェラーゼは、例えば、シアリルトランスフェラーゼまたはガラクトシルトランスフェラーゼであり得る。一実施形態において、該反応混合物は、変異真核生物ＧｎＴ１酵素、シアリルトランスフェラーゼ、およびガラクトシルトランスフェラーゼを含む。例えば、多糖、オリゴ糖、糖脂質、または糖タンパク質を製造するために、供与体の糖と受容体分子との反応混合物を使用できる。
【００４４】
他の局面において、本発明は、（ａ）シアリルトランスフェラーゼを可溶化し；次いで（ｂ）該可溶化シアリルトランスフェラーゼを、レドックス対を含むリフォールディング用緩衝液に接触させることによって、不溶性組換え真核生物シアリルトランスフェラーゼをリフォールディングする方法を提供する。リフォールディングされたシアリルトランスフェラーゼは生物学的に活性であり、供与体基質から受容体基質へのシアリン酸の移送を触媒する。一実施形態において、リフォールディングされたシアリルトランスフェラーゼは透析されるかまたはダイアフィルトレートされる。
【００４５】
該リフォールディング用緩衝液はまた、界面活性剤、カオトロピック剤、またはアルギニンを含み得る。いくつかの実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、６．０と１０．０との間である。一実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、６．５と８．０との間である。他の実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、８．０と９．０との間である。他の実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、７．５と８．５との間である。
【００４６】
一実施形態において、該リフォールディング用緩衝液中の該レドックス対は、還元グルタチオン／酸化グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）である。さらなる一実施形態において、ＧＳＨ／ＧＳＳＧのモル比は１００：１と１：１０との間である。好ましい一実施形態において、ＧＳＨ／ＧＳＳＧのモル比は１０：１である。さらなる一実施形態において、該リフォールディング用緩衝液は、約０．０２〜１０ｍＭのＧＳＨ、０．００５〜１０ｍＭのＧＳＳＧ、０．００５〜１０ｍＭのラウリルマルトシド、５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ、２〜１０ｍＭのＫＣｌ、０．０１〜０．０５％のＰＥＧ３３５０、および１５０〜５５０ｍＭのＬ−アルギニンを含んでなる。
【００４７】
他の実施形態において、該シアリルトランスフェラーゼは、アミノ酸タグ、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、澱粉結合タンパク質（ＳＢＰ）、およびｍｙｃエピトープを含む。さらなる一実施形態において、該シアリルトランスフェラーゼは、該アミノ酸タグに結合するタグ結合分子を用いて精製される。例えば、該アミノ酸タグはＭＢＰであり得、該タグ結合分子はアミロース、マルトース、またはシクロデキストリンであり得る。
【００４８】
他の実施形態において、リフォールディングされた該シアリルトランスフェラーゼは、ＣＭＰ−シアリン酸から糖タンパク質へのシアリン酸の移送を触媒する。
【００４９】
さらなる一実施形態において、リフォールディングされた該シアリルトランスフェラーゼは、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）またはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）から糖タンパク質への１０ＫＰＥＧまたは２０Ｋ  ＰＥＧの移送を触媒する。
【００５０】
他の実施形態において、該シアリルトランスフェラーゼは、ラットの肝臓ＳＴ３ＧａｌＩＩＩである。
【００５１】
他の局面において、本発明は、本明細書に開示された方法を用いてリフォールディングされた、哺乳動物のリフォールディングされたシアリルトランスフェラーゼと共にＣＭＰ−シアリン酸に、糖タンパク質を接触させることによって、シアリル部分を糖タンパク質に付加する方法を提供する。
【００５２】
他の局面において、本発明は、糖タンパク質にＰＥＧ部分を付加する方法を提供し、該方法は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）またはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）、および本明細書に開示された方法を用いてリフォールディングされた、哺乳動物のリフォールディングされたシアリルトランスフェラーゼに、糖タンパク質を接触させることを含んでなる。
【００５３】
さらなる一局面において、本発明は、ＧａｌＮＡｃＴ２を可溶化緩衝液に可溶化し；次いで、該ＧａｌＮＡｃＴ２をリフォールディングするために、レドックス対を含むリフォールディング緩衝液に該可溶化ＧａｌＮＡｃＴ２を接触させることによって、不溶性の組換え真核生物Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ２）をリフォールディングする方法を提供する。リフォールディング後、リフォールディングされたＧａｌＮＡｃＴ２は、供与体基質から受容体基質へのＮ−アセチルガラクトサミンの移送を触媒する。該方法は、任意に、リフォールディングされたＧａｌＮＡｃＴ２を透析またはダイアフィルトレートするステップまたはリフォールディングされたＧａｌＮＡｃＴ２のさらなる精製を含む。
【００５４】
幾つかの実施形態において、リフォールディング用緩衝液のレドックス対は還元グルタチオン／酸化グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）またはシステイン／シスタミンである。該リフォールディング用緩衝液はまた以下のものを含み得る：界面活性剤、カオトロピック剤、またはアルギニン。幾つかの実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、６．０と１０．０との間である。好ましい一実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、約８．０である。
【００５５】
好ましい実施形態において、該可溶化緩衝液のｐＨは、６．０と１０．０との間である。より好ましい一実施形態において、該可溶化緩衝液のｐＨは、約８．０である。
【００５６】
組換え発現されたＧａｌＮＡｃＴ２は、アミノ酸タグを含み得る。該アミノ酸タグは、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、澱粉結合タンパク質（ＳＢＰ）、およびｍｙｃエピトープであり得る。リフォールディングされた該ＧａｌＮＡｃＴ２を精製するために、タグ結合分子を使用できる。該アミノ酸タグがＭＢＰの場合、該タグ結合分子は一般に、以下のうちの１つである：アミロース、マルトース、またはシクロデキストリン。
【００５７】
好ましい一実施形態において、リフォールディングされた該ＧａｌＮＡｃＴ２は、供与体基質から、ペプチド、タンパク質、糖ペプチドまたは糖タンパク質へのＮ−アセチルガラクトサミンの移送を触媒する。
【００５８】
（定義）
本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼタンパク質は、供与体基質から受容体基質へのサッカライドの移送に有用である。この付加は一般に、オリゴ糖の非還元端または生体分子の炭水化物部分で生じる。本明細書に定義される生体分子としては、限定はしないが、炭水化物、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、および脂質（例えば、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質およびガングリオシド）のような、生物学的に重要な分子が挙げられる。
【００５９】
以下の略号が本明細書に用いられる：
Ａｒａ＝アラビノシル；
Ｆｒｕ＝フルクトシル；
Ｆｕｃ＝フコシル；
Ｇａｌ＝ガラクトシル；
ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトシルアミノ；
Ｇｌｃ＝グルコシル；
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコシルアミノ；
Ｍａｎ＝マンノシル；および
ＮｅｕＡｃ＝シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）
ＦＴまたはＦｕｃＴ＝フコシルトランスフェラーゼ＊
ＳＴ＝シアリルトランスフェラーゼ＊
ＧａｌＴ＝ガラクトシルトランスフェラーゼ＊。
【００６０】
本明細書では、特定のグリコシルトランスフェラーゼの同一性を示すために、当該分野で慣例的に用いられる命名法にしたがって、算用数字とローマ数字とは交換可能に用いられる（例えば、ＦＴＶＩＩとＦＴ７とは同一のフコシルトランスフェラーゼを言う）。
【００６１】
オリゴ糖は、還元端の糖が実際に還元糖であるか否かを問わず、還元端および非還元端を有すると考えられる。認められた命名法に従い、オリゴ糖は本明細書において、左側に非還元端を、右側に還元端を有して描かれている。
【００６２】
本明細書に記載される全てのオリゴ糖は、非還元糖の名称または略号（例えば、Ｇａｌ）、続いて、グリコシド結合の立体配置（αまたはβ）、環結合、該結合に関与する還元糖の環の位置、次いで還元糖の名称または略号を有して記載されている（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）。２つの糖の間の結合は、例えば、２，３，２→３，または（２，３）として表現できる。糖の各々はピラノースまたはフラノースである。
【００６３】
用語の「シアリン酸」は、炭素９個のカルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーを言う。シアリン酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース−１−オン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略号化されることが多い）である。該ファミリーの第２のメンバーは、Ｎ−グリコシル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、ここでＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基はヒドロキシル化されている。第３のシアリン酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７頁；Ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９頁（１９９０））。また、９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−置換シアリン酸、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃも含まれる。このシアリン酸ファミリーのレビューに関しては、例えば、Ｖａｒｋｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ２：２５−４０頁（１９９２）；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編集（ニューヨーク、スプリンガー−フェアラグ（１９９２））を参照されたい。シアリル化法におけるシアリン酸化後の合成および使用法は、１９９２年１０月１日公開の国際出願公開第９２／１６６４０号に開示されている。
【００６４】
グリコシルトランスフェラーゼに対する「受容体基質」は、特定のグリコシルトランスフェラーゼに対する受容体として働くオリゴ糖部分である。受容体基質を、対応するグリコシルトランスフェラーゼおよび糖供与体基質、ならびに他の必要な反応混合物成分に接触させ、該反応混合物を十分な時間インキュベートする場合、該グリコシルトランスフェラーゼは糖残基を、糖供与体基質から受容体基質へと移送させる。該受容体基質は特定のグリコシルトランスフェラーゼの種々のタイプによって変わることが多い。例えば、哺乳動物ガラクトシド２−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ（α１，２−フコシルトランスフェラーゼ）に対する受容体基質とは、オリゴ糖の非還元末端に、Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを含み、このフコシルトランスフェラーゼは、α１，２結合を介してフコース残基をＧａｌに結合させる。末端Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−ＲおよびＧａｌβ１，３−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒならびにそれらのシアリル化アナログは、それぞれ、α１，３およびα１，４−フコシルトランスフェラーゼに対する受容体基質である。しかし、これらの酵素はフコース残基を受容体基質のＧｌｃＮＡｃ残基に付加させる。したがって、用語の「受容体基質」は、特定の適用に関する特定の対象グリコシルトランスフェラーゼに関連して考慮される。さらなるグリコシルトランスフェラーゼに対する受容体基質が本明細書に記載されている。受容体基質としてはまた、例えば、ペプチド、タンパク質、糖ペプチド、および糖タンパク質が挙げられる。
【００６５】
グリコシルトランスフェラーゼに対する「供与体基質」は、活性化ヌクレオチド糖である。このような活性化糖は、一般に、ヌクレオシド一リン酸またはヌクレオシド二リン酸が遊離基として働く、糖のウリジン、グアノシン、およびシチジンの一リン酸誘導体（それぞれ、ＵＭＰ、ＧＭＰおよびＣＭＰ）または二リン酸誘導体（それぞれ、ＵＤＰ、ＧＤＰおよびＣＤＰ）からなる。例えば、フコシルトランスフェラーゼに対する供与体基質は、ＧＤＰ−フコースである。シアリルトランスフェラーゼに対する供与体基質は、例えば、所望のシアリン酸を含んでなる活性化糖ヌクレオチドである。例えば、ＮｅｕＡｃｎ場合、活性化糖はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃである。他の供与体基質としては、例えば、ＧＤＰマンノース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ−ＰＥＧ（ＣＭＰ−シアリン酸−ＰＥＧとも称される）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコリオン酸、およびＵＤＰ−キシロースが挙げられる。糖としては、例えば、ＮｅｕＡｃ、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、グルコリオン酸、およびキシロースが挙げられる。細菌系、植物系、および真菌系は、時には他の活性化ヌクレオチド糖を使用できる。
【００６６】
本明細書に用いられる「タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、または糖ペプチドをリモデリングする方法」は、グリコシルトランスフェラーゼを用いて、糖残基を、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、または糖ペプチドに付加することを言う。好ましい一実施形態において、糖残基はＰＥＧ分子と共有結合している。
【００６７】
本明細書に用いられる「真核生物グリコシルトランスフェラーゼ」は、真核生物に由来し、供与体基質（すなわち、活性化ヌクレオチド糖）から受容体基質（例えば、オリゴ糖、糖脂質、ペプチド、タンパク質、糖ペプチド、または糖タンパク質）への糖残基の移送を触媒する酵素を言う。好ましい一実施形態において、真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、糖を、供与体基質からペプチド、タンパク質、糖ペプチド、または糖タンパク質へ移送させる。他の好ましい実施形態において、真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＩＩ型膜貫通グリコシルトランスフェラーゼである。真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、真核生物、例えば、多細胞真核生物、植物、ショウジョウバエまたは線虫などの無脊椎動物、脊椎動物、両性類または爬虫類、哺乳動物、齧歯類、霊長類、ヒト、ウサギ、ラット、マウス、ウシ、またはブタなどに由来するものであり得る。
【００６８】
本明細書に用いられる「真核生物Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩまたはＧＮＴＩ）」は、真核生物から単離されたβ−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを言う。該酵素は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ供与体から、マンノース糖を含んでなる受容体分子へのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の移送を触媒する。他の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様に、ＧｎＴＩは膜貫通ドメイン、ステム領域、および触媒ドメインを有する。真核生物ＧｎＴ１タンパク質としては、例えば、各々が参照として本明細書に組み込まれているヒト、登録番号ＮＰ−００２３９７；チャイニーズハムスター、登録番号ＡＡＫ６１８６８；ウサギ、登録番号ＡＡＡ３１４９３；ラット、登録番号ＮＰ−１１０４８８；ゴールデンハムスター、登録番号ＡＡＤ０４１３０；マウス、登録番号Ｐ２７８０８；ゼブラフィッシュ、登録番号ＡＡＨ５８２９７；アフリカツメガエル、登録番号ＣＡＣ５１１１９；ショウジョウバエ、登録番号ＮＰ−５２５１１７；ハマダラカ、登録番号ＸＰ−３１５３５９；線虫、登録番号ＮＰ−４９７７１９；Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、登録番号ＣＡＤ２２１０７；ジャガイモ、登録番号ＣＡＣ８０６９７；タバコ、登録番号ＣＡＣ８０７０２；イネ、登録番号ＣＡＤ３００２２；Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ，登録番号ＣＡＣ８２５０７；およびシロイヌナズナ、登録番号ＮＰ＿１９５５３７が挙げられ、各々が参照として本明細書に組み込まれている。
【００６９】
本明細書に用いられている「真核生物Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ）」は、真核生物から単離されたＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼを言う。該酵素は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ供与体から受容体分子へのＮ−アセチルガラクトサミニン（ＧａｌＮＡｃ）の移送を触媒する。他の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様、ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、膜貫通ドメイン、ステム領域、および触媒ドメインを有する。多数のＧａｌＮＡｃＴ酵素、例えば、ＧａｌＮＡｃＴ１、登録番号Ｘ８５０１８；ＧａｌＮＡｃＴ２、Ｘ８５０１９（双方とも、Ｗｈｉｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４１５６−２４１６５頁（１９９５）に記載されている）；およびＧａｌＮＡｃＴ３、登録番号Ｘ９２６８９（Ｂｅｎｎｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７００６−１７０１２頁（１９９６）に記載されている）が、単離され、特性化されており、これらの各々は、参照として、本明細書に組み込まれている。
【００７０】
本明細書に用いられている「真核生物β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ１）は、真核生物から単離されたβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを言う。該酵素は、ＵＤＰ−Ｇａｌ供与体から受容体分子へのガラクトースの移送を触媒する。他の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様、ＧａｌＴ１酵素は、膜貫通ドメイン、ステム領域、および触媒ドメインを有する。多数のＧａｌＴ１酵素、例えば、完全長ウシ配列、Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１−２１７頁（１９８９）および登録番号ＣＡＡ３２６９５が、単離され、特性化されており、これらの各々は、参照として、本明細書に組み込まれている。
【００７１】
本明細書に用いられている「真核生物α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３Ｇａｌ３）」は、真核生物から単離されたα（２，３）シアリルトランスフェラーゼを言う。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアリン酸の移送を触媒する（例えば、Ｗｅｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１頁；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９頁を参照）。シアリン酸は、２つの糖の間のα結合の形成によりＧａｌに結合する。糖間の結合は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位との間のものである。他の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素は、膜貫通ドメイン、ステム領域、および触媒ドメインを有する。この特定酵素は、ラットの肝臓（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５頁）；ヒトｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２−２２７８７頁；Ｋｉｔａｇａｗａ  ＆  Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４−１４０１頁）から単離でき、組換え発現により、この酵素の産生を促進するゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１−９３８頁）ＤＮＡが知られている。ラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩがクローン化されており、その配列が知られている。例えば、Ｗｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１−２１０１９頁（１９９２）および登録番号Ｍ９７７５４を参照されたい（これらの各々が、参照として、本明細書に組み込まれている）。
【００７２】
本明細書に用いられている「真核生物α−Ｎ−アセチルガラクトサミニドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＴ１）」は、真核生物から単離されたα（２，６）シアリルトランスフェラーゼを言う。該酵素は、ＣＭＰ−シアリン酸供与体から受容体分子へのシアリン酸の移送を触媒する。この移送は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｔｈｒ／Ｓｅｒへのα２，６−結合である。他の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＴ１酵素は、膜貫通ドメイン、ステム領域、および触媒ドメインを有する。多数のＳＴ６ＧａｌＮＡｃＴ１酵素、例えば、完全長マウス配列、Ｋｕｒｏｓａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２７：８４５−８５４頁（２０００）および登録番号ＪＣ７２４８が単離され、特性化されており、これらの各々は、参照として、本明細書に組み込まれている。他の典型的なＳＴ６ＧａｌＮＡｃＴ１アミノ酸配列は、図３８に見られる。
【００７３】
本明細書に用いられている「真核生物ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧａｌＩ）は、真核生物から単離されたｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼを言う。該酵素は、ＣＭＰ−シアリン酸供与体から受容体分子へのシアリン酸の移送を触媒する。この移送は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｏ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒへのα２，３−結合である。他の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様、ＳＴ３ＧａｌＩ酵素は、膜貫通ドメイン、ステム領域、および触媒ドメインを有する。多数のＳＴ３ＧａｌＩ酵素、例えば、完全長ブタ配列、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１００４−２１０１０頁（１９９２）および登録番号Ａ４５０７３が単離され、特性化されており、これらの各々は、参照として、本明細書に組み込まれている。
【００７４】
本明細書に用いられている「真核生物コアＩガラクトシルトランスフェラーゼ（コア１ＧａｌＴ１）は、コアＩβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を言う。他の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様、コア１ＧａｌＴ１酵素は、膜貫通ドメイン、ステム領域、および触媒ドメインを有する。多数のコアＩＧａｌＴ１酵素、例えば、図４１および図４２のショウジョウバエならびにヒトの配列が、単離され、特性化されている。該ヒトタンパク質は、Ｊｕら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１）、１７８−１８６頁（２００２）において特性化されており、これは、全ての目的のために、参照として本明細書に組み込まれている。
【００７５】
本明細書に用いられている「不対合システイン残基」は、正しく折りたたまれたタンパク質（すなわち、生物学的活性を有するタンパク質）において、別のシステイン残基とジスルフィド結合を形成しないシステイン残基を言う。
【００７６】
「不溶性グリコシルトランスフェラーゼ」は、細菌封入体において発現するグリコシルトランスフェラーゼを言う。不溶性グリコシルトランスフェラーゼは、典型的には、例えば、界面活性剤またはカオトロピック剤またはいくつかの組み合わせを用いて、可溶化または変性させる。「リフォールディング」は、生物学的に活性なグリコシルトランスフェラーゼの構造を、可溶化または変性させたグリコシルトランスフェラーゼへと復元させる過程を言う。したがって、リフォールディング用緩衝液とは、グリコシルトランスフェラーゼのリフォールディングを増強または促進させる緩衝液を言う。
【００７７】
「レドックス対」は、還元チオール試薬と酸化チオール試薬との混合物を言い、還元グルタチオンおよび酸化グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ），システイン／シスチン、システアミン／シスタミン、ＤＴＴ／ＧＳＳＧ、およびＤＴＥ／ＧＳＳＧが含まれる（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２０２−２０７頁（２００１）を参照）。
【００７８】
用語の「接触させる」は、本明細書において、以下のものと交換可能に用いられる：と合わせる、に付加する、と混合する、の上を通過させる、とインキュベートする、の上を流す、など。
【００７９】
用語の「ＰＥＧ」は、ポリ（エチレングリコール）を言う。ＰＥＧは、ペプチドに結合されてきた典型的なポリマーである。ペプチド治療薬を誘導体化するためにＰＥＧを使用すると、該ペプチドの免疫原性を減少させ、循環からのクリアランス時間を延長させることが実証されている。例えば、米国特許出願第４，１７９，３３７号（Ｄａｖｉｓら）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコーに結合させた酵素およびペプチドホルモンなどの非免疫原性ペプチドに関するものである。１モルのペプチド当たり、１０モルと１００モルとの間のポリマーが使用され、少なくとも１５％の生理学的活性が維持される。
【００８０】
本明細書に用いられている「特異的活性」は、酵素、例えば、本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質の触媒活性を言い、活性単位で表すことができる。本明細書に用いられている１活性単位は、所与の温度（例えば、３７℃）およびｐＨ値（例えば、ｐＨ７．５で）で１分当たり、１μモルの生成物形成を触媒する。したがって、１０単位の酵素とは、例えば、３７℃の温度、および例えば、７．５のｐＨ値で１分間に、１０μモルの基質が１０μモルの生成物に変換される該酵素の触媒量である。
【００８１】
「Ｎ−結合」オリゴ糖とは、アスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により、アスパラギンを介してペプチド主鎖に結合しているオリゴ糖である。Ｎ−結合オリゴ糖は、「Ｎ−グリカン」とも呼ばれる。Ｎ−結合オリゴ糖は全てＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有する。それらは、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコースおよびシアリン酸などの周辺糖の分枝（アンテナとも呼ばれる）の存在ならびに数が異なっている。この構造はまた、任意に、コアのフコース分子および／またはキシロース分子を含有し得る。
【００８２】
「Ｏ−結合」オリゴ糖とは、トレオニン、セリン、ヒドロキシプロリン、チロシン、または他のヒドロキシ含有アミノ酸を介してペプチド骨格に結合しているオリゴ糖である。
【００８３】
糖タンパク質種について、「実質的に均一な糖形態」または「実質的に均一なグリコシル化パターン」とは、対象のグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）によってグリコシル化されている受容体基質のパーセンテージについてのことである。出発物質がグリコシル化受容体基質を含有し得ることは当業者に理解されるであろう。したがって、グリコシル化の算出量は、本発明の方法によってグリコシル化されている受容体基質、ならびに出発物質においてすでにグリコシル化されていた受容体基質を含む。
【００８４】
用語の「生物学的活性」は、タンパク質の酵素活性を言う。例えば、シアリルトランスフェラーゼの生物学的活性は、供与体分子から受容体分子へシアリン酸部分を移送させる活性を言う。ＧａｌＮＡｃＴ２の生物学的活性は、供与体分子から受容体分子へＮ−アセチルガラクトサミン部分を移送させる活性を言う。ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質に関して、受容体分子は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチドであり得る。ＧｎＴ１タンパク質の生物学的活性は、供与体分子から受容体分子へＮ−アセチルグルコサミン部分を移送させる活性を言う。ガラクトシルトランスフェラーゼの生物学的活性は、供与体分子から受容体分子へガラクトース部分を移送させる活性を言う。
【００８５】
「商業的規模」とは、単一反応において、糖生成物のグラム規模の製造を言う。好ましい実施形態において、商業的規模とは、約５０、７５、８０、９０グラム、または１００、１２５、１５０、１７５グラム、または２００グラム超の製造を言う。
【００８６】
「実質的に均一」の上記定義における用語「実質的に」とは、特定のグリコシルトランスフェラーゼに関する受容体基質の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはより好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％がグリコシル化されていることを、一般に意味する。
【００８７】
用語の「アミノ酸」は、天然および合成アミノ酸、ならびに、ある意味で天然アミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を言う。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたもの、ならびに後に修飾されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを有する化合物を言う。このようなアナログは、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸に類似した様式で機能する化学的化合物を言う。
【００８８】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、または「ペプチド」とは、単量体がアミノ酸であり、アミド結合を介して一緒に結合しているポリマーを言うか、あるいは、ポリペプチドを言う。アミノ酸がα−アミノ酸の場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体が使用できる。また、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシン、およびホモアルギニンもまた含まれる。遺伝子コードされていないアミノ酸もまた、本発明に使用できる。さらに、反応性基を含むように修飾されたアミノ酸もまた本発明に使用できる。本発明に使用されるアミノ酸は全てＤ−異性体またはＬ−異性体のいずれかであり得る。一般にＬ−異性体が好ましい。さらに、他のペプチド模倣物もまた本発明に有用である。一般的レビューに関しては、Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ．、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ、ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編集、ニューヨーク、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、２６７頁（１９８３）を参照されたい。
【００８９】
細胞に関して用いられる場合、用語の「組換え」は、該細胞が異種核酸を複製するか、または異種核酸によってコードされたペプチドまたはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内では見られない遺伝子を含有し得る。組換え細胞はまた、遺伝子が改変され、人工的手段によって該細胞に再導入された、該細胞の天然形態に見られる遺伝子を含有し得る。該用語はまた、細胞から核酸を除去することなく改変された該細胞に、内在的な核酸を含有する細胞を含める；このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異、および関連技法によって得られたものが挙げられる。「組換えタンパク質」とは、組換え細胞によって産生されたものである。好ましい実施形態において、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、組換え細菌細胞によって産生される。
【００９０】
「融合タンパク質」とは、元のタンパク質または天然の完全長タンパク質またはその部分列をコードするアミノ酸配列に追加したアミノ酸配列、その替わりのアミノ酸配列、それ未満のアミノ酸配列、および／またはそれとは異なるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質を言う。
【００９１】
融合タンパク質の構成要素として、「補助酵素」および／または「精製タグ」が挙げられる。本明細書に用いられる「補助酵素」とは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼに対する基質を形成する反応を触媒することに関与する酵素である。補助酵素は、例えば、グリコシルトランスフェラーゼによって供与体部分として用いられるヌクレオチド糖の形成を触媒できる。また、補助酵素は、ヌクレオチド糖の形成に必要なヌクレオチド三リン酸の生成、またはヌクレオチド糖に組み込まれる糖の生成に用いられるものであり得る。本発明の組み換え融合タンパク質は、タンパク質の精製を助ける分子「精製タグ」を一端に有する融合タンパク質として構築および発現させることができる。このようなタグはまた、グリコシル化反応時、対象のタンパク質の固定化にも使用できる。好適なタグとしては、抗体によって特異的に認識されるタンパク質配列である「エピトープタグ」が挙げられる。エピトープタグは、一般に、該融合タンパク質を明確に検出または単離するために容易に利用できる抗体の使用を可能にするために融合タンパク質内に組み込まれる。「ＦＬＡＧタグ」は、ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐ  ＡｓｐＬｙｓの配列またはその実質的に同一な変異体からなるモノクローナル抗−ＦＬＡＧ抗体によって特異的に認識される一般に用いられるエピトープタグである。他の好適なタグは当業者に公知であり、例えば、ニッケルイオンまたはコバルトイオンなどの金属イオンに結合するヘキサヒスチジンペプチドなどのアフィニティータグが挙げられる。精製タグを含んでなるタンパク質は、該精製タグに結合する結合相手、例えば、精製タグに対する抗体、ニッケルイオンまたはコバルトイオンまたはその樹脂、およびアミロース、マルトース、またはシクロデキストリンを用いて精製できる。精製タグはまた、澱粉結合ドメイン、大腸菌チオレドキシンドメイン（例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社およびＡｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社から商品として入手できるベクターおよび抗体）、およびＳＵＭＯタンパク質のカルボキシ末端側半分（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社から商品として入手できるベクターおよび抗体）を含む。マルトース結合ドメインは、不溶性の真核生物グリコシルトランスフェラーゼのリフォールディングを増強するそれらの能力のために好ましく使用されるが、融合タンパク質の精製を助けるために使用することもできる。マルトース結合ドメインタンパク質の精製は、当業者に公知である。澱粉結合ドメインは、国際公開特許出願第９９／１５６３６号（参照として本明細書に組み込まれている）に記載されている。βシクロデキストリン（ＢＣＤ）誘導体化樹脂を用いた澱粉結合ドメインを含んでなる融合タンパク質のアフィニティー精製は、２００３年５月５日出願の米国特許出願第６０／４６８，３７４号（参照としてその全体が本明細書に組み込まれている）に記載されている。
【００９２】
グリコシルトランスフェラーゼに関して、用語の「機能的ドメイン」とは、酵素の活性、例えば、受容体基質特異性、触媒活性、結合親和性、ゴルジ装置内局在化、細胞膜への固定、または他の生物学的または生化学的活性を与えるか、または調節するグリコシルトランスフェラーゼのドメインを言う。グリコシルトランスフェラーゼの機能的ドメインの例としては、限定はしないが、触媒ドメイン、ステムドメイン、およびシグナルアンカードメインが挙げられる。
【００９３】
タンパク質に関して、用語の「発現レベル」または「発現のレベル」とは、細胞によって産生されるタンパク質の量を言う。細胞によって産生されるタンパク質の量は、本明細書に記載されているか、または当業者に公知のアッセイおよび活性単位によって測定できる。当業者は、それぞれ種々のアッセイおよび単位を用いた、細胞によって産生されたタンパク質の量の測定法および記載法を知っているであろう。したがって、タンパク質、例えば、グリコシルトランスフェラーゼの発現レベルの定量化および定量的記述は、それぞれ、活性の測定に用いたアッセイにも、活性の記述に用いた単位にも限定されない。細胞によって産生されたタンパク質の量は、標準的な公知のアッセイ、例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）によるタンパク質アッセイ、Ｐｉｅｒｃｅ（イリノイ州、ロックフォード）の二シンコニン酸タンパク質アッセイキット、または米国特許出願第５，６４１，６６８号に記載されたものによって測定できる。
【００９４】
用語の「酵素活性」とは、酵素の活性を言い、本明細書に記載されたか、または当業者に公知のアッセイおよび単位によって測定できる。グリコシルトランスフェラーゼの活性の例としては、限定はしないが、該酵素の機能的ドメインに関連するもの、例えば、受容体基質特異性、触媒活性、結合親和性、ゴルジ装置内局在化、細胞膜への固定、または他の生物学的もしくは生化学的活性が挙げられる。
【００９５】
グリコシルトランスフェラーゼに関して、「ステム領域」とはタンパク質ドメインまたはその部分配列をいい、天然のグリコシルトランスフェラーゼにおいて、膜貫通ドメインに隣接して位置し、ゴルジ装置内にグリコシルトランスフェラーゼを維持するための保持シグナルとして、また、タンパク質分解性の開裂部位として機能すると報告されている。ステム領域は、一般に、最初、親水性アミノ酸から始まり、続いて疎水性膜貫通ドメイン、そして最後に触媒ドメインがあり、またはいくつかの場合、最初にシステイン残基、続いて膜貫通ドメインがある。典型的なステム領域としては、限定はしないが、フコシルトランスフェラーゼＶＩのステム領域、アミノ酸残基４０〜５４；哺乳動物ＧｎＴ１のステム領域、約３６から約１０３のアミノ酸残基（例えば、ヒト酵素を参照）；哺乳動物ＧａｌＴ１のステム領域、約７１から約１２９のアミノ酸残基（例えば、ウシ酵素を参照）；哺乳動物ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのステム領域、約２９から約８４のアミノ酸残基（例えば、ラット酵素を参照）；無脊椎動物コア１ＧａｌＴ１のステム領域、約３６から約１０２のアミノ酸残基（例えば、ショウジョウバエ酵素を参照）；哺乳動物コア１ＧａｌＴ１、約３２から約９０のアミノ酸残基（例えば、ヒト酵素を参照）；哺乳動物ＳＴ３Ｇａｌ１のステム領域、約２８から約６１のアミノ酸残基（例えば、ブタ酵素を参照）またはヒト酵素では、約１８から約５８のアミノ酸残基；哺乳動物ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのステム領域、約３０から約２０７のアミノ酸残基（例えば、マウス酵素を参照）；ヒト酵素では、アミノ酸３５〜２７８、またはニワトリ酵素では、アミノ酸３７〜２５３；哺乳動物ＧａｌＮＡｃＴ２のステム領域、約７１から約１２９のアミノ酸残基（例えば、ラット酵素を参照）が挙げられる。
【００９６】
「触媒ドメイン」とは、酵素によって行われる酵素反応を触媒するタンパク質ドメイン、またはその部分配列を言う。例えば、シアリルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、供与体から糖受容体へシアリン酸残基を移送させる上で十分なシアリルトランスフェラーゼの部分配列を含む。触媒ドメインは、酵素全体、その部分配列を含み得るか、または天然に見られるような、該酵素に結合していない追加のアミノ酸配列またはその部分配列を含み得る。典型的な触媒領域は、限定はしないが、フコシルトランスフェラーゼＶＩＩの触媒ドメイン、アミノ酸残基３９〜３４２；哺乳動物ＧｎＴ１の触媒ドメイン、約１０４から約４４５のアミノ酸残基（例えば、ヒト酵素を参照）；哺乳動物ＧａｌＴ１の触媒ドメイン、約１３０から約４０２のアミノ酸残基（例えば、ウシ酵素を参照）；哺乳動物ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの触媒ドメイン、約８５から約３７４のアミノ酸残基（例えば、ラット酵素を参照）である。ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質の触媒ドメインおよび切断変異体は、２００４年６月３日出願の米国特許出願第６０／５７６，５３０号；および２００４年８月３日出願の米国仮特許出願（整理番号０４０８５３−０１−５１４９−Ｐ１）に記載されており、双方とも、全ての目的のため、参照として本明細書に組み込まれている。触媒ドメインはまた、公知のグリコシルトランスフェラーゼとのアラインメントによって同定することもできる。
【００９７】
「部分配列」とは、核酸またはアミノ酸（例えば、タンパク質）のより長い配列の一部を含んでなる核酸またはアミノ酸それぞれの配列を言う。
【００９８】
「グリコシルトランスフェラーゼ切断体」もしくは「切断グリコシルトランスフェラーゼ」または変形語は、天然グリコシルトランスフェラーゼより少ないアミノ酸残基を有しているが、酵素活性を保持しているグリコシルトランスフェラーゼを言う。切断グリコシルトランスフェラーゼとしては、例えば、切断ＧｎＴ１酵素、切断ＧａｌＴ１酵素、切断ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素、切断ＧａｌＮＡｃＴ２酵素、切断コア１ＧａｌＴ１酵素、約３２から約９０のアミノ酸残基（例えば、ヒト酵素を参照）；切断ＳＴ３Ｇａｌ１酵素、切断ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ酵素、および切断ＧａｌＮＡｃＴ２酵素が挙げられる。該酵素が活性を保持する限り、任意の数のアミノ酸残基を欠失させることができる。いくつかの実施形態において、ドメインまたはドメインの一部を欠失させることができ、例えば、シグナルアンカードメインを欠失させて、ステム領域および触媒ドメインを含んでなる切断体を残すことができ；シグナルアンカードメインおよびステム領域の一部を欠失させて、残りのステム領域および触媒ドメインを含んでなる切断体を残すことができ；またはシグナルアンカードメインおよびステム領域を欠失させて、触媒ドメインを含んでなる切断体を残すことができる。
【００９９】
用語の「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態におけるデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを言い、別に限定しない限り、天然ヌクレオチドに類似した様式で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含する。別に指示しない限り、特定の核酸配列はその相補配列を含む。
【０１００】
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」は、このような配列に適合性の宿主における構造遺伝子の発現に影響を与えることができる核酸エレメントにより、組換え的にまたは合成的に作出された核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーターおよび任意に、転写終結シグナルを含む。典型的には、組換え発現カセットは転写される核酸（例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸）、およびプロモーターを含む。発現に影響を与える上で必要な、または有用な追加因子もまた、本明細書に記載されているように使用できる。例えば、発現カセットは、宿主細胞からの発現タンパク質の分泌を指令するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含むこともできる。転写終結シグナル、エンハンサー、および遺伝子発現に影響する他の核酸配列を発現カセットに含めることもできる。好ましい実施形態において、真核生物グリコシルトランスフェラーゼを含んでなるアミノ酸配列をコードする組換え発現カセットを細菌宿主細胞において発現させる。
【０１０１】
本明細書に用いられている「異種配列」または「異種核酸」は、特定の宿主細胞とは異なる供給源に由来するか、または同じ供給源であってもその元の形態から改変されているものである。したがって、真核生物宿主細胞における異種糖タンパク質遺伝子は、改変された特定の宿主細胞に内在性の糖タンパク質コード遺伝子を含む。異種配列の改変は、例えば、該ＤＮＡを制限酵素によって処理し、プロモーターに操作可能に結合されることのできるＤＮＡ断片を作成することによって生じ得る。異種配列の改変には、部位指向的変異などの技法もまた有用である。
【０１０２】
用語の「単離された」は、酵素の活性を妨害する成分が実質的にまたは本質的に無い材料を言う。本発明の糖、タンパク質、または核酸に関して、用語の「単離された」は、その天然状態で見られる材料を、通常伴う成分が実質的にまたは本質的に無い材料を言う。典型的には、本発明の単離された糖、タンパク質、または核酸は、銀染色ゲル上のバンド強度または純度決定のための他の方法によって測定した時、少なくとも約８０％純粋であり、通常は少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％純粋である。純度または均一性は、当該分野に周知の多数の手段によって示すことができる。例えば、サンプル中のタンパク質または核酸は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離でき、次いで、該タンパク質または核酸を染色により可視化できる。ある一定の目的には、該タンパク質または核酸の高度の分離が望ましいと考えられ、精製のためには、例えば、ＨＰＬＣまたは類似の手段を利用できる。
【０１０３】
用語の「操作可能に結合した」とは、核酸発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、または転写因子結合部位のアレイなど）と第２の核酸配列との間の機能的結合を言い、該発現制御配列は、第２の配列に相当する核酸の転写および／または翻訳に影響を与える。
【０１０４】
２種以上の核酸またはタンパク質配列に関して、用語の「同一」またはパーセント「同一性」とは、同じである２種以上の配列または部分配列をいうか、または以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いるか、または目視検査によって測定して、比較し、最大対応するように整列させた場合、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有している２種以上の配列または部分配列を言う。
【０１０５】
２種の核酸またはタンパク質に関して、語句の「実質的に同一」とは、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または目視検査によって測定して、比較し、最大対応するように整列させた場合、少なくとも約６０％超の核酸またはアミノ酸配列の同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する、２種以上の配列または部分配列を言う。実質的な同一性は、好ましくは少なくとも約５０残基の長さの配列領域にわたって存在し、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは該配列が少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。最も好ましい一実施形態において、該配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【０１０６】
配列比較では、典型的には、１つの配列が参照配列として働き、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要な場合は部分配列座標を指定し、配列演算プログラムパラメーターを指定する。次いで、指定されたプログラムパラメーターに基づき、配列比較アルゴリズムにより、参照配列に対する試験配列（１つまたは複数）に関する配列同一性パーセントが算出される。
【０１０７】
比較に関する最適な配列アラインメントを、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４頁（１９８８）の類似性法に関する探索により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．、ウィスコンシン州、マジソンのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または目視検査（一般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社との合弁（１９９５  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照）により実施できる。
【０１０８】
配列同一性パーセントおよび配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２頁に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析実施のためのソフトウェアは、バイオテクノロジー情報国立センターを介して、公共利用できる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードと共に整列した際、いくつかの陽性値とされる閾値スコアＴに合致するか満足させる問い合わせ配列における長さＷの短いワードを同定することによって、先ず高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値（上記Ａｌｔｓｃｈｕｌら）と称される。これらの最初の近隣ワードヒットが、探索開始のシードとして働き、それらを含有するより長いＨＳＰを見つける。次いで、それらのワードヒットを、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って双方向に拡張させる。ヌクレオチド配列、パラメーターＭ（対合残基対に関するリワードスコア；常に＞０）およびＮ（誤対合残基に関するペナルティースコア；常に＜０）を用いて累積スコアを算出する。アミノ酸配列に関しては、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの拡張は：累積アラインメントスコアがその最大達成値からＸ量減少する時；累積スコアが、１つ以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積によりゼロ以下になる時；またはどちらかの配列の端に達した時に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーター、Ｗ、Ｔ、およびＸは感度およびアラインメントの速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列レベルに関する）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および双方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５頁（１９８９）を参照）を用いる。
【０１０９】
配列同一性パーセントの算出に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、２種の配列間の類似性の統計的解析が実施される（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７頁（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性基準の１つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２種のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間に偶然生じる対合の確率の指標を提供する。例えば、試験核酸対参照核酸の比較において、最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満の場合、該核酸は参照核酸に類似していると考えられる。
【０１１０】
２種の核酸配列またはタンパク質が実質的に同一であるさらなる指標は、第１の核酸にコードされたタンパク質が、下記の第２の核酸にコードされたタンパク質と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば２種のペプチドが保存的置換基だけで違っている場合、典型的に、タンパク質は実質的に第２のタンパク質と同一である。２種の核酸配列が実質的に同一であるもう１つの指標は、これら２種の分子が下記のストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【０１１１】
語句の「に対して特異的にハイブリダイズする」とは、配列が複雑に混合した（例えば、細胞全体の）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合、ストリンジェントな条件下で、ある分子がある特定のヌクレオチド配列にのみ結合、複合化、またはハイブリダイズすることを言う。
【０１１２】
用語の「ストリンジェントな条件」とは、プローブがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を言う。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況下では異なってくる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度およびｐＨで、特異的配列に関する熱融点（Ｔｍ）より約１５℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列に平衡状態でハイブリダイズする温度（一定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）である。（標的配列は一般に過剰に存在しているため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のＮａイオン、典型的には、ｐＨ７．０から８．３において、約０．０１Ｍから１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）ならびに短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）では、少なくとも約３０℃および長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）では、少なくとも約６０℃のものが典型的である。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成できる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションのためには、陽性シグナルは、典型的に、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションである。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のものであり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ，４２℃でインキュベート、または、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ，６５℃でインキュベートし、６５℃で、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄。ＰＣＲには、約３６℃の温度が、低ストリンジェンシー増幅に典型的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに依って約３２℃〜４８℃の間で変わり得る。高ストリンジェンシーＰＣＲ増幅では、約６２℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度はプライマーの長さおよび特異性に依って、約５０℃から約６５℃の範囲であり得る。高および低ストリンジェンシー増幅双方にとって典型的なサイクル条件としては、３０〜１２０秒間、９０〜９５℃の変性段階、３０〜１２０秒続くアニーリング段階、および１〜２分間、約７２℃の伸長段階が挙げられる。低および高ストリンジェンシー増幅反応に関するプロトコルおよび指針は、例えば、Ｉｎｎｉｓら（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、において入手できる。
【０１１３】
抗体に関して、語句の「タンパク質に特異的に結合する」または「に特異的に免疫反応性である」は、タンパク質および他の生物学的物質の異種集団の存在下、該タンパク質存在を決定する結合反応を言う。したがって、指定された免疫アッセイ条件下、特定の抗体は特定のタンパク質に優先的に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に、有意な量で結合することはない。このような条件下でのタンパク質に対する特異的結合のためには、特定のタンパク質に対するその特異性に関して選択される抗体が必要である。特定のタンパク質に特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、種々の免疫アッセイフォーマットが使用できる。例えば、タンパク質に特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが慣用的に用いられる。特異的免疫反応性を判定するために使用できる免疫アッセイフォーマットおよび条件の説明に関しては、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、ニューヨークを参照されたい。
【０１１４】
特定のポリヌクレオチド配列の「保存的変更改変」とは、ポリヌクレオチドが同一の、または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするもの、またはポリヌクレオチドが本質的に同一の配列に対し、アミノ酸配列をコードしないものを言う。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が所与のタンパク質をコードする。例えば、ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧのコドンは全てアミノ酸のアルギニンをコードする。したがって、あるコドンによってアルギニンが指定されるどの位置においても、そのコドンを、コードされるタンパク質の変更なしに、記載されるいずれの対応コドンにも変更させることができる。このような核酸改変体は、「保存的改変された改変体」の１種である「サイレント改変」である。本明細書に記載された、タンパク質をコードするいずれのポリヌクレオチド配列も別に特記しない限り、全ての可能なサイレント改変を表している。当業者は、標準的方法によって、核酸中の各々のコドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＵＧＧを除いて）を変更させて、機能的に同一の分子を得ることができる。したがって、あるタンパク質をコードする核酸の各々の「サイレント改変」が、記載された各配列に内包されている。
【０１１５】
さらに、当業者は、コードされた配列における単一のアミノ酸または少パーセンテージ（典型的には５％未満、より典型的には１％未満）のアミノ酸を変更、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加は、該変更によって、１つのアミノ酸の化学的に類似したアミノ酸による置換が生じる「保存的改変された改変体」である。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野に周知である。
【０１１６】
タンパク質、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、およびタンパク質をコードする核酸の多くの保存的改変により、本質的に同一の生成物が得られることを当業者は理解されるであろう。例えば、遺伝子コードの縮重により、「サイレント置換」（すなわち、コードされたタンパク質の変更を生じさせない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコードするあらゆる核酸配列に含まれた特徴である。本明細書に記載されるように、キメラグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、酵母、ヒトなど）を生成させるために用いられる特定の宿主細胞における発現に関して、配列を最適化することが好ましい。同様に、類似性の高い性質（上記の定義の節を参照）を有する異なったアミノ酸による、アミノ酸配列の１つまたは２、３個のアミノ酸における「保存的アミノ酸置換」は、特定のアミノ酸配列、またはアミノ酸をコードする特定の核酸配列との類似性が高いため、容易に同定される。任意の特定配列のこのような保存的置換改変体は、本発明の特徴である。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎおよびグループもまた、参照されたい。さらに、コードされた配列における１つのアミノ酸または少パーセンテージのアミノ酸を改変、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加もまた、「保存的改変変異」である。
【０１１７】
本発明の実施は、宿主細胞、好ましくは細菌宿主細胞における組換え核酸の構築および遺伝子の発現を含み得る。これらの結果を達成するための分子クローニング法は当該分野に公知である。発現ベクターなどの組換え核酸の構築に好適な広範なクローニング法およびインビトロ増幅法は当業者に周知である。多くのクローニングの実施により当業者を指示する上で十分なこれらの技法ならびに教示は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５２巻  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、カリフォルニア州、サンディエゴ（Ｂｅｒｇｅｒ）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社との合弁（１９９９補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）に見られる。組換えポリペプチドの発現に好適な宿主細胞は当業者に公知であり、例えば、大腸菌などの原核細胞、および昆虫細胞、哺乳動物細胞および真菌細胞（例えば、クロカビ）などの真核細胞が挙げられる。
【０１１８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＱＢ−レｐリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介法などのインビトロ増幅法により、当業者に指示する上で十分なプロトコルの例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびに、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編集）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、カリフォルニア州、サンディエゴ（１９００）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７頁；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４頁；（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３頁；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４頁；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１８２６頁；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７−１０８０頁；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２９１−２９４頁；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ４：５６０頁；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ８９：１１７頁に見られる。インビトロ増幅核酸クローニングの改善法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１９】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．序文）
本発明は、細菌封入体において不溶性タンパク質として発現される真核生物グリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする条件を提供する。不溶性真核生物グリコシルトランスフェラーゼのリフォールディングを増強させるために、レドックス対を含んでなるリフォールディング緩衝液が用いられる。リフォールディングはまた、マルトース結合ドメインを不溶性真核生物グリコシルトランスフェラーゼに融合させることによって増強できる。いくつかの不溶性真核生物グリコシルトランスフェラーゼでは、不対合システインを除去するために、部位指向性変異によってリフォールディングを増強させることもできる。さらに、リフォールディングの増強は、真核生物グリコシルトランスフェラーゼを切断して、例えば、タンパク質のシグナルアンカードメイン、膜貫通ドメイン、および／またはステム領域の全部または一部を除去することによって提供できる。また本発明は、単一容器において１種超のグリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングし、それによって、タンパク質のリフォールディングを増強し、タンパク質産生の効率を増加させる方法を提供する。リフォールディングされた真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、多糖、オリゴ糖、糖脂質、タンパク質、ペプチド、糖ペプチド、および糖タンパク質を産生またはリモデリングするために使用できる。リフォールディングされた真核生物グリコシルトランスフェラーゼはまた、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６３号（全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている）に記載されているタンパク質、ペプチド、糖ペプチド、または糖タンパク質の糖ＰＥＧ化にも使用できる。
【０１２０】
（ＩＩ．不溶性グリコシルトランスフェラーゼのリフォールディング）
細菌に発現する多くの組換えタンパク質は、細菌の封入体における不溶性凝集体として発現する。封入体は、細菌の細胞質とペリプラズム空間の双方に見られるタンパク質蓄積物である。（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２０２−２０７頁（２００１）を参照）。真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、細菌の封入体において発現することが多い。いくつかの真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、細菌内で可溶性である。すなわち、該タンパク質の触媒ドメインのみが発現される場合は封入体内に産生されない。しかし、多くの真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、たとえ触媒ドメインのみが発現する場合でも不溶性のままであり、細菌の封入体内に発現し、これらのタンパク質をリフォールディングして活性グリコシルトランスフェラーゼを産生する方法が本明細書に提供されている。
【０１２１】
（Ａ．活性グリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする条件）
活性真核生物グリコシルトランスフェラーゼを細菌細胞から産生させるために、真核生物グリコシルトランスフェラーゼを細菌の封入体内に発現させ、該細菌を採集し、破壊し、封入体を単離し洗浄する。次いで、封入体内の該タンパク質を可溶化する。可溶化は、変性剤、例えば、塩化グアニジニウムまたは尿素；酸性またはアルカリ性条件などの極ｐＨ；または界面活性剤を用いて実施できる。
【０１２２】
可溶化後、グリコシルトランスフェラーゼ混合物から変性剤を除去する。変性剤の除去は、リフォールディング用緩衝液への希釈または緩衝液交換法などの種々の方法によって実施できる。緩衝液交換法としては、透析、ダイアフィルトレーション、ゲルろ過、および固体支持体上へのタンパク質固定化（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２０２−２０７頁（２００１）を参照）が挙げられる。変性剤を除去するために任意の上記の方法を組み合わせることができる。
【０１２３】
真核生物グリコシルトランスフェラーゼにおけるジスルフィド結合の形成は、レドックス対を含んでなるリフォールディング用緩衝液の添加によって促進される。レドックス対としては、還元および酸化グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）、システイン／シスチン、システアミン／シスタミン、ＤＴＴ／ＧＳＳＧ、およびＤＴＥ／ＧＳＳＧが挙げられる（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２０２−２０７頁（２００１）（全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている）を参照）。いくつかの実施形態において、レドックス対は、還元成分対酸化成分のある特定の比率、例えば、１／２０、２０／１、１／４、４／１、１／１０、１０／１、１／２、２／１、１／５、５／１、または５／５で添加される。
【０１２４】
リフォールディングは、例えば、６．０〜１０．０の範囲のｐＨで、緩衝液中で実施できる。リフォールディング用緩衝液は、リフォールディングを増強させるために、他の添加物、例えば、Ｌ−アルギニン（０．４〜１Ｍ）；ＰＥＧ；尿素（１〜２Ｍ）および塩化グアニジニウム（０．５〜１．５Ｍ）などの低濃度の変性剤；および界面活性剤（例えば、Ｃｈａｐｓ、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、ラウリルマルトシド、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含み得る。
【０１２５】
リフォールディングは、所与の時間、例えば、１〜４８時間にわたって、または一晩、行うことができる。リフォールディングは、室温を含めて、約４℃から約４０℃までで行うことができる。
【０１２６】
触媒ドメインを含んでなる真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質は、細菌の封入体内で発現させ、次いで、上記の方法を用いてリフォールドされる。ステム領域の全部または一部および触媒ドメインを含んでなる真核生物グリコシルトランスフェラーゼもまた、ＭＢＰタンパク質に融合された触媒ドメインを含んでなる真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様、本明細書に記載された方法に使用できる。
【０１２７】
当業者は、リフォールディングされたタンパク質が検出可能な生物学的活性を有する場合に該タンパク質が正しくリフォールディングされたことを認識されるであろう。グリコシルトランスフェラーゼでは、生物学的活性は、供与体基質から受容体基質への移送を触媒する能力であり、例えば、リフォールディングされたＳＴ３ＧａｌＩＩＩは、シアリン酸を受容体基質へ移送させることができる。生物学的活性としては、少なくとも１、２、５、７、または１０単位の活性の特異的活性が挙げられる。単位は以下の通り定義される：１活性単位は、所与の温度（例えば、３７℃）およびｐＨ（例えば、ｐＨ７．５）で１分当たり、１μモルの生成物の形成を触媒する。したがって、１０単位の酵素は、１０μモルの基質が、例えば、３７℃の温度、および例えば、７．５のｐＨで、１分間に１０μモルの生成物に変換される該酵素の触媒量である。
【０１２８】
一実施形態において、真核生物のＳＴ３ＧａｌＩＩＩが、細菌の封入体内に発現され、可溶化され、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングされる。
【０１２９】
一実施形態において、真核生物のＧｎＴ１が、細菌の封入体内に発現され、可溶化され、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングされる。
【０１３０】
一実施形態において、真核生物のＧａｌＴ１が、細菌の封入体内に発現され、可溶化され、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングされる。
【０１３１】
一実施形態において、真核生物のＳｔ３ＧａｌＩが、細菌の封入体内に発現され、可溶化され、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングされる。
【０１３２】
一実施形態において、真核生物のＳｔ６ＧａｌＮＡｃＴＩが、細菌の封入体内に発現され、可溶化され、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングされる。
【０１３３】
一実施形態において、真核生物のコアＧａｌＩＴＩが、細菌の封入体内に発現され、可溶化され、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングされる。
【０１３４】
一実施形態において、真核生物のＧａｌＮＡｃＴ２が、細菌の封入体内に発現され、可溶化され、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングされる。
【０１３５】
（Ｂ．リフォールディング増強のためのマルトース結合タンパク質ドメインへの真核生物グリコシルトランスフェラーゼの融合）
細胞へのタンパク質溶解度を高めるために、典型的にマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）ドメインをタンパク質に融合させる。例えば、ＫａｐｕｓｔおよびＷａｕｇｈ  Ｐｒｏ．Ｓｃｉ．８：１６６８−１６７４頁（１９９９）を参照されたい。しかし、切断真核生物グリコシルトランスフェラーゼを含めて、多くの真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＭＢＰドメインに融合された後でも、細菌内に発現させた際、不溶性のままである。しかし、本出願は、ＭＢＰドメインが、例えば、封入体からのタンパク質可溶化後の不溶性真核生物グリコシルトランスフェラーゼのリフォールディングを増強できることを開示している。種々の細菌源、例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ、およびＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅのＭＢＰドメインを、本発明に使用できる。例えば、図４３を参照されたい。好ましい一実施形態において、大腸菌のＭＢＰタンパク質を真核生物グリコシルトランスフェラーゼに融合する。ＭＢＰドメインとグリコシルトランスフェラーゼとの間にアミノ酸リンカーを配置できる。他の好ましい実施形態において、ＭＢＰドメインをグリコシルトランスフェラーゼタンパク質のアミノ末端に融合させる。ＭＢＰグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質をリフォールディングするために上記の方法を使用できる。
【０１３６】
一実施形態において、真核生物ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質をＭＢＰドメインに融合させ、細菌の封入体内に発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングする。
【０１３７】
一実施形態において、真核生物ＧｎＴ１タンパク質をＭＢＰドメインに融合させ、細菌の封入体内に発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングする。
【０１３８】
一実施形態において、真核生物ＧａｌＴ１タンパク質をＭＢＰドメインに融合させ、細菌の封入体内に発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングする。
【０１３９】
一実施形態において、真核生物Ｓｔ３ＧａｌＩタンパク質をＭＢＰドメインに融合させ、細菌の封入体内に発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングする。
【０１４０】
一実施形態において、真核生物Ｓｔ６ＧａｌＮＡｃＴＩタンパク質をＭＢＰドメインに融合させ、細菌の封入体内に発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングする。
【０１４１】
一実施形態において、真核生物コアＧａｌＴＩタンパク質をＭＢＰドメインに融合させ、細菌の封入体内に発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングする。
【０１４２】
一実施形態において、真核生物ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質をＭＢＰドメインに融合させ、細菌の封入体内に発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングする。
【０１４３】
さらに、アミノ酸タグをＭＢＰ−グリコシルトランスフェラーゼ融合体に付加できる。例えば、リフォールディングされたタンパク質の精製を高めるために、精製タグを付加できる。精製タグとしては、例えば、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、澱粉結合タンパク質（ＳＢＰ）、大腸菌チオレドキシンドメイン、ＳＵＭＯタンパク質のカルボキシ末端側半分、ＦＬＡＧエピトープ、およびｍｙｃエピトープが挙げられる。リフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼは、精製タグに結合する結合パートナーを用いて、さらに精製できる。好ましい一実施形態において、リフォールディングを増強するために、ＭＢＰタグを真核生物グリコシルトランスフェラーゼに融合させる。精製タグは、例えば、ＧｎＴ１、ＧａｌＴ１、ＳｔＩＩＩ  Ｇａｌ３、Ｓｔ３ＧａｌＩ、Ｓｔ６ＧａｌＮＡｃＴＩ、コアＧａｌＴＩまたはＧａｌＮＡｃＴ２などのＭＢＰグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質に融合させることができる。
【０１４４】
他の実施形態において、タンパク質へのＭＢＰドメインの付加により、該タンパク質の発現を増加させることができる。例えば、ＭＢＰドメインへのＳｉａＡタンパク質の融合により、タンパク質の発現が増加した実施例１２を参照されたい。ＭＢＰに融合して発現が増強した他のタンパク質としては、例えば、ＧｎＴ１、ＧａｌＴ１、ＳｔＩＩＩ  Ｇａｌ３、Ｓｔ３ＧａｌＩ、Ｓｔ６ＧａｌＮＡｃＴＩ、コアＧａｌＴＩまたはＧａｌＮＡｃＴ２が挙げられる。
【０１４５】
別の実施形態において、インテインなどの自己開裂タンパク質タグは、ＭＰＢドメインとグリコシルトランスフェラーゼとの間に含まれ、融合タンパク質がリフォールディングされた後でＭＢＰドメインの除去を促進する。インテイン類およびそれらの使用のためのキット類は、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている。
【０１４６】
（Ｃ．リフォールディングを増強させるためのグリコシルトランスフェラーゼの変異誘発）
グリコシルトランスフェラーゼのリフォールディングはまた、グリコシルトランスフェラーゼアミノ酸配列の変異誘発によって増強させることができる。一実施形態において、不対合システイン残基を同定し、グリコシルトランスフェラーゼのリフォールディングを増強させるために変異誘発する。他の実施形態において、膜貫通ドメインを除去するため、または膜貫通ドメインおよび該タンパク質のステム領域の全部または一部を除去するために、グリコシルトランスフェラーゼのアミノ末端を切断する。さらなる一実施形態において、少なくとも１つの不対合システイン残基を除去するため、および、例えば、膜貫通ドメインを除去する目的で、または膜貫通ドメインおよび該タンパク質のステム領域の全部または一部を除去する目的で、該タンパク質のアミノ末端を切断するために、グリコシルトランスフェラーゼの変異誘発をする。グリコシルトランスフェラーゼの核酸配列を単離したら、核酸配列、したがってコードされたアミノ酸配列を変化させるために、本明細書に記載された方法で標準的な分子生物学的方法を用いることができる。
【０１４７】
（１．リフォールディングを増強させるためのグリコシルトランスフェラーゼにおける不対合システインの変異誘発）
リフォールディングが生じる際、変性タンパク質におけるシステイン残基は、活性タンパク質の構造再生を助けるジスルフィド結合を形成する。システイン残基の誤対合により、タンパク質のミスフォールディングに至り得る。不対合システイン残基を有するタンパク質はミスフォールディングし易い。なぜならば、通常の不対合システインは正しいシステイン対合を作る通常の対合システインと共にジスルフィド結合を形成でき、タンパク質のリフォールディングが不可能になるからである。したがって、ある特定のグリコシルトランスフェラーゼのリフォールディングを増強させるための一方法は、不対合システイン残基を同定し、それらを除去することである。
【０１４８】
不対合システイン残基は、対象のグリコシルトランスフェラーゼの構造決定により同定できる。タンパク質の構造は、対象のグリコシルトランスフェラーゼの実際のデータ、例えば、円二色性、ＮＭＲ、およびＸ線結晶構造解析に基づいて決定できる。タンパク質の構造は、コンピュータモデリングを用いて決定することもできる。コンピュータモデリングは、相同分子の公知の三次元構造に基づいて関連構造をモデル化するために使用できる方法である。標準的なソフトウェアは商品として入手できる（例えば、コンピュータモデリングを行うために利用できる多くのソフトウェアに関して、ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍを参照）。不対合システイン残基が同定されたら、欠失により、または他のアミノ酸残基による置換により不対合システインを除去するために、標準的な分子生物学的方法を用いて、対象のグリコシルトランスフェラーゼをコードしているＤＮＡを変異させることができる。置換用の適切なサイズ、形状、および電荷を有するアミノ酸を選択するために、再度、コンピュータモデリングを用いることができる。不対合システインは、ペプチドマッピングによって決定することもできる。対象のグリコシルトランスフェラーゼが変異したら、細菌封入体において該タンパク質を発現させ、リフォールディング能力を決定する。正しくリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼは生物学的活性を有する。
【０１４９】
好ましい実施形態において、リフォールディングを増強させるために、真核生物グリコシルトランスフェラーゼにおける不対合システイン残基を、以下のアミノ酸残基で置換する：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、またはＶａｌ。不対合システインが螺旋構造でない場合は、Ｇｌｙも使用できる。
【０１５０】
ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ、登録番号ＮＰ−００２３９７）は、不対合システインの変異誘発後にリフォールディングの増強を示したグリコシルトランスフェラーゼの一例である。（例えば、下記の実施例２を参照。）ヒトＧＮＴＩは、多数の真核生物ＧＮＴＩタンパク質、例えば、チャイニーズハムスター、登録番号ＡＡＫ６１８６８；ウサギ登録番号ＡＡＡ３１４９３；ラット、登録番号ＮＰ  １１０４８８；ゴールデンハムスター登録番号、ＡＡＤ０４１３０；マウス、登録番号Ｐ２７８０８；ゼブラフィッシュ、登録番号ＡＡＨ５８２９７；アフリカツメガエル、登録番号ＣＡＣ５１１１９；ショウジョウバエ、登録番号ＮＰ  ５２５１１７；ハマダラカ属、登録番号ＸＰ  ３１５３５９；Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、登録番号ＮＰ  ４９７７１９；Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、登録番号ＣＡＤ２２１０７；ジャガイモ、登録番号ＣＡＣ８０６９７；タバコ、登録番号ＣＡＣ８０７０２；イネ、登録番号ＣＡＤ３００２２；タバコｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、登録番号ＣＡＣ８２５０７；およびシロイヌナズナ、登録番号ＮＰ  １９５５３７とのメンバーと密に関連している。
【０１５１】
ウサギのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）タンパク質の構造が決定されており、ＣＹＳ１２３が不対合であることが示されている。（ＧＮＴＩタンパク質が切断されていた場合でも、アミノ酸残基の数は完全長タンパク質配列を参照する。）ヒトＧｎＴＩタンパク質の構造を決定するために、ウサギのＧｎＴＩに基づいたコンピュータモデリングを用いた。アラインメントは図６に示されている。ヒトＧｎＴＩタンパク質において、ＣＹＳ１２１が不対合であった。ヒトＧｎＴＩにおいて、ＣＹＳ１２１の置換が行われた。ＣＹＳ１２１ＳＥＲ変異体およびＣＹＳ１２１ＡＬＡ変異体は活性であった。対照的に、ＣＹＳ１２１ＴＨＲ変異体は検出可能な活性を有さず、ＣＹＳ１２１ＡＳＰは低活性を有した。線虫ＧＮＴＩタンパク質の予測された構造に基づいて、二重変異体、ＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳが構築され、これは活性を有した。
【０１５２】
コンピュータモデリングに基づいたタンパク質の構造ならびにウサギのＣＹＳ１２３およびヒトのＣＹＳ１２１の保存された機能を判定するために、上記の真核生物ＧｎＴＩタンパク質のアミノ酸配列を使用できる。その分析に基づくと、残基１２３は以下のタンパク質における不対合システインである：チャイニーズハムスターＧｎＴＩ、ウサギＧｎＴＩ、ラットＧｎＴＩ、ゴールデンハムスターＧｎＴＩ、およびマウスＧｎＴＩ。したがって、ＧｎＴＩ酵素の各々において、ＣＹＳ１２３は、セリン、アラニン、またはアルギニンに変異して、リフォールディング活性の増強した活性タンパク質を産生できる。上記タンパク質における以下の二重変異体、ＡＲＧ１２２ＡＬＡ  ＣＹＳ１２３ＨＩＳもまたリフォールディング増強を示す。
【０１５３】
一実施形態において、上記の真核生物ＧｎＴ１タンパク質の任意のものを、不対合システイン残基を除去するために、例えば、ＣＹＳ１２１ＳＥＲ、ＣＹＳ１２１ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＡＳＰ、または二重変異体ＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳへと変異させ、細菌封入体において発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングさせる。
【０１５４】
不対合システイン変異でリフォールディング増強を示す他のグリコシルトランスフェラーゼは、ＧａｌＴ１である。ウシＧａｌＴ１において、システイン３４２をトレオニン残基へ変異させると、変異した酵素は可溶化後、リフォールディング増強を示した。例えば、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３７６６６−３７６７１頁（２００１）を参照されたい。対象となっているＧｎＴＩ酵素におけるトレオニンへの不対合システインの変異では、活性が消えた。
【０１５５】
一実施形態において、不対合システイン残基を除去するために、例えば、ＧａｌＴ１タンパク質をＣＹＳ３４２ＴＨＲに変異させ、細菌封入体において発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングさせる。
【０１５６】
不対合システインの変異でリフォールディング増強を示す他のグリコシルトランスフェラーゼは、ＧａｌＮＡｃＴ２である。多くのアミノ酸残基が、ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質とＧａｌＮＡｃＴ１タンパク質との間で共用である。２つのシステイン残基、ＣＹＳ２１２およびＣＹＳ２１４の変異後、ヒトＧａｌＮＡｃＴ１タンパク質はＣＯＳ細胞内で発現させた際、依然として活性であった。例えば、Ｔｅｎｎｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４３０８−４３１６頁（２００２）を参照されたい。活性変異体としては、ＣＹＳ２１２ＡＬＡ、ＣＹＳ２１４ＡＬＡ、ＣＹＳ２１２ＳＥＲ、ＣＹＳ２１４ＳＥＲ、および二重変異体、ＣＹＳ２１２ＳＥＲ  ＣＹＳ２１４ＳＥＲが挙げられる。ヒトＧａｌＮＡｃＴ１に対応するシステイン残基、ＣＹＳ２１２残基およびＣＹＳ２１４残基は、ヒトＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質において保存され、すなわち、ＣＹＳ２２７残基およびＣＹＳ２２９残基である。例えば、図４４を参照されたい。したがって、以下の変異体の１つを含んでなるＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質を用いて、不溶性タンパク質のリフォールディングを増強させることができる：ＣＹＳ２２７ＡＬＡ、ＣＹＳ２２９ＡＬＡ、ＣＹＳ２２７ＳＥＲ、ＣＹＳ２２９ＳＥＲ、および二重変異体、ＣＹＳ２２７ＳＥＲ  ＣＹＳ２２９ＳＥＲ。残基のナンバリングは、ヒトＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質に適応されるが、ＣＹＳ２２７おびＣＹＳ２２９に相当する保存システイン残基は、他の真核生物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタのＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質において同定でき、リフォールディングを増強させるために変異させることができる。
【０１５７】
一実施形態において、ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質を、不対合システイン残基を除去するために、例えば、ＣＹＳ２２７ＡＬＡ、ＣＹＳ２２９ＡＬＡ、ＣＹＳ２２７ＳＥＲ、ＣＹＳ２２９ＳＥＲ、または二重変異体、ＣＹＳ２２７ＳＥＲ  ＣＹＳ２２９ＳＥＲに変異させ、細菌封入体において発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングさせる。
【０１５８】
不対合システインの変異でリフォールディング増強を示す他のグリコシルトランスフェラーゼは、コア１ＧａｌＴ１である。一実施形態において、ショウジョウバエのコア１ＧａｌＴ１を変異させる。他の実施形態において、ヒトのコア１ＧａｌＴ１を変異させる。ショウジョウバエのコア１ＧａｌＴ１タンパク質は、７つのシステイン残基を有する。各システイン残基を、個々に、セリンまたはアラニンのいずれかに変異させる。変異させたショウジョウバエコア１ＧａｌＴ１タンパク質を大腸菌封入体内で発現させ、可溶化し、リフォールディングする。リフォールディングした変異体のショウジョウバエコア１ＧａｌＴ１の酵素活性をアッセイし、リフォールディングした野生型ショウジョウバエコア１ＧａｌＴ１活性と比較する。野生型タンパク質と比較して、変異体のショウジョウバエコア１ＧａｌＴ１における酵素活性の増加によってリフォールディングの増強が示される。
【０１５９】
一実施形態において、コア１ＧａｌＴ１タンパク質、例えば、ショウジョウバエタンパク質またはヒトタンパク質を、不対合システイン残基を除去するために変異させ、細菌封入体において発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングさせる。ショウジョウバエコア１ＧａｌＴ１における置換に好ましいシステイン残基は、Ｃ１０３、Ｃ１２７、Ｃ２０８、Ｃ２４６、Ｃ２６１、Ｃ３１５およびＣ３１６である。
【０１６０】
（２．リフォールディング増強のためのグリコシルトランスフェラーゼ切断）
真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、一般に以下のドメインを含む：触媒ドメイン、ステム領域、膜貫通ドメイン、およびシグナルアンカードメイン。細菌内での発現の際、シグナルアンカードメイン、および膜貫通ドメインは、典型的に欠失する。本発明の方法に用いられる真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ステム領域の全部または一部および触媒ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、真核生物グリコシルトランスフェラーゼは触媒ドメインのみを含んでなる。
【０１６１】
グリコシルトランスフェラーゼのドメインは、欠失変異に関して同定できる。例えば、当業者は真核生物グリコシルトランスフェラーゼにおけるステム領域を同定し、ステム領域のアミノ酸を１つずつ欠失させて、リフォールディングした際に高活性を有する切断真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質を同定できる。
【０１６２】
本出願における欠失変異体は、２つの方法で参照される。すなわち、ΔまたはＤに続く、天然の完全長アミノ酸配列のアミノ末端から欠失される残基数、または天然の完全長アミノ酸配列から翻訳される最初のアミノ酸残基の記号および残基数。例えば、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩΔ３５またはＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ  Ｄ３５およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ  Ｋ３６の双方は、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質の同じ切断を称す。
【０１６３】
例えば、ラットのＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質は、約２９〜８４のアミノ酸残基のステム領域を含む。このタンパク質の触媒ドメインは、残基約８５〜３７４由来のアミノ酸を含む。したがって、ラットの切断ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質は、例えば、約２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０．７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。
【０１６４】
欠失変異はまた、ＧｎＴ１タンパク質内で作製することができる。例えば、ヒトのＧｎＴ１タンパク質は、アミノ酸残基約３１〜１１２由来のステム領域を含む。したがって、ヒトの切断ＧｎＴ１タンパク質は、例えば、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、または１１１の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。
【０１６５】
欠失変異はまた、ＧａｌＴ１タンパク質内で作製することができる。例えば、ウシのＧａｌＴ１タンパク質は、アミノ酸残基約７１〜１２９由来のステム領域を含む。したがって、ウシの切断ＧａｌＴ１タンパク質は、例えば、約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、または１２８の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。
【０１６６】
欠失変異はまた、コア１  ＧａｌＴ１タンパク質内で作製することができる。例えば、ショウジョウバエのコア１  ＧａｌＴ１タンパク質は、アミノ酸残基約３６〜１０２由来のステム領域を含む。したがって、ショウジョウバエの切断コア１  ＧａｌＴ１タンパク質は、例えば、約３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、または１０２の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。別の実施形態において、ヒトのコア１  ＧａｌＴ１タンパク質は、アミノ酸残基約３２〜９０由来のステム領域を含む。したがって、ヒトの切断コア１  ＧａｌＴ１タンパク質は、例えば、約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。
【０１６７】
欠失変異はまた、ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質内で作製することができる。例えば、ヒトのＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質は、アミノ酸残基約１８〜５８由来のステム領域を含む。したがって、ヒトの切断ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質は、例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。別の例として、ブタのＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質は、アミノ酸残基約２８〜６１由来のステム領域を含む。したがって、ブタの切断ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質は、例えば、約２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、または６１の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。
【０１６８】
欠失変異はまた、ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質内で作製することができる。例えば、ラットのＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質は、アミノ酸残基約４０〜９５由来のステム領域を含む。したがって、ラットの切断ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質は、例えば、約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。
【０１６９】
欠失変異はまた、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質内で作製することができる。例えば、マウスのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質は、アミノ酸残基約３０〜２０７由来のステム領域を含む。したがって、マウスの切断ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質は、例えば、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６，１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９，１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９，１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、または２０７の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。別の例として、ヒトのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質は、アミノ酸残基約３５〜２７８由来のステム領域を含む。したがって、ヒトの切断ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質は、例えば、約３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６，１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９，１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９，１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９，２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９，２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、または２７８の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。さらに別の例として、ニワトリのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質は、アミノ酸残基約３７〜２５３由来のステム領域を含む。したがって、ニワトリの切断ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質は、例えば、約３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６，１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９，１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９，１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９，２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、または２５３の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。
【０１７０】
（Ｄ．グリコシルトランスフェラーゼ類のワンポットリフォールディング）
本発明のこれらの実施形態は、細菌封入体に発現される複数の真核生物のグリコシルトランスフェラーゼ類が、単独容器内、すなわち、ワンポット法でリフォールディングできるという驚くべき観察に基づいている。この方法を用いて、少なくとも２種のグリコシルトランスフェラーゼを、一緒にリフォールディングできることから、時間と材料を節約できる結果となった。リフォールディング条件は上記に記載されている。リフォールディング条件は、グリコシルトランスフェラーゼの混合物に関して最適化され、したがって、条件は、該混合物中のいずれか特定の酵素に関して最適でないことがあり得る。しかし、グリコシルトランスフェラーゼの組み合わせに関して最適化されるため、最終生成物におけるリフォールディングされた各グリコシルトランスフェラーゼは検出可能な生物学的活性を有する。生物学的活性はリフォールディングされた酵素の酵素活性に当てはまり、特異的活性として表すことができる。生物学的活性としては、例えば、少なくとも０．１、０．５、１、２、５、７、または１０単位の活性の特異的活性が挙げられる。単位は以下の通り定義される：１活性単位は、所与の温度（例えば、３７℃）およびｐＨ（例えば、ｐＨ７．５）で１分当たり、１μモルの生成物の形成を触媒する。したがって、１０単位の酵素は、１０μモルの基質が、例えば、３７℃の温度、および例えば、７．５のｐＨで、１分間に１０μモルの生成物に変換される該酵素の触媒量である。次いでリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼを含んでなる反応混合物を、例えば、オリゴ糖を合成するために、糖脂質を合成するために、糖タンパク質をリモデリングするために、および糖タンパク質を糖ＰＥＧ化するために使用することができる。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼを、封入体から個々に可溶化してから、リフォールディングに適切な条件下で組み合わせることができる。他の実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼを含有する封入体を組み合わせ、可溶化してから適切な条件下でリフォールディングする。
【０１７２】
リフォールディング用緩衝液は典型的にレドックス対を含む。リフォールディングは、例えば、６．０〜１０．０の範囲のｐＨで実施できる。リフォールディング用緩衝液は、リフォールディングを増強させるために、他の添加物、例えば、Ｌ−アルギニン（０．４〜１Ｍ）；ＰＥＧ；尿素（１〜２Ｍ）および塩化グアニジニウム（０．５〜１．５Ｍ）などの低濃度の変性剤；および界面活性剤（例えば、Ｃｈａｐｓ、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含み得る。
【０１７３】
幾つかの実施形態において、リフォールディングは静止容器中で、すなわち、混合、攪拌、振蕩せずに、またはそれ以外に反応混合物を動かすことなく実施される。
【０１７４】
リフォールディングされた酵素の組み合わせは、特定のオリゴ糖構造を構築するための酵素を含み得る。所望の最終生成物が同定されたら、当業者は、該混合物中に含めるための適切なグリコシルトランスフェラーゼを同定できよう。
【０１７５】
リフォールディングされた酵素の反応混合物はリフォールディングを増強させるために変異させたグリコシルトランスフェラーゼ、例えば、上記のＧｎＴＩ酵素を含み得る。
【０１７６】
好ましい一実施形態において、Ｎ−結合グリコシル化ステップを実施する酵素は、単一容器内で一緒にリフォールディングされる。例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼＩ（ＧａｌＴＩ）、およびＮ−アセチルラクトサミニドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ）を、細菌封入体内で発現させ、可溶化し、単一容器内で一緒にリフォールディングできる。最終生成物は３種のタンパク質全ての活性を示し、それらが全て正しくリフォールディングされたことを示した。また、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩなしで、ＧｎＴＩとＧａｌＴＩとが一緒にリフォールディングされた場合にもリフォールディングが生じた。これらの実験は、実施例３で詳細に記載されている。
【０１７７】
他の好ましい実施形態において、ペプチドまたはタンパク質のＯ−結合グリコシル化が、細菌で発現され、リフォールディングされた本開示のグリコシルトランスフェラーゼを用いて達成される。例えばポリペプチドにＧａｌＮＡｃを付加させるために、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）酵素を使用できる。例えば、実施例４は、ＧＣＳＦタンパク質にＧａｌＮＡｃを付加するために、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）が使用できる証明を提供している。Ｏ−結合グリコシルトランスフェラーゼの組み合わせを、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質または糖ペプチドをリモデリングするために使用できる。これらの組み合わせとしては、例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２とＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１；ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、コア１ＧａｌＴ１およびＳＴ３Ｇａｌ１またはＳＴ３ＧａｌＴ２が挙げられる。
【０１７８】
（ＩＩＩ．グリコシルトランスフェラーゼ）
本発明の実施に用いられるグリコシルトランスフェラーゼは、真核生物のグリコシルトランスフェラーゼである。このようなグリコシルトランスフェラーゼの例としては、Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ，Ｅ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：３９１−４０８頁、ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／〜ｐｅｄｒｏ／ＣＡＺＹ／ｇｔｆ．ｈｔｍｌおよびｗｗｗ．ｖｅｉ．ｃｏ．ｕｋ／ＴＧＮ／ｇｔ＿ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍに記載されているものが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１７９】
（真核生物グリコシルトランスフェラーゼ）
いくつかのグリコシルトランスフェラーゼは、それらのアミノ末端に、触媒活性には必要ない位相的ドメインを有する（米国特許出願第５，０３２，５１９号を参照）。現在までに特性化されたグリコシルトランスフェラーゼの中で、「細胞質ドメイン」は、最も一般的には長さが約１と約１０との間のアミノ酸であり、最もアミノ末端側のドメインであり；「シグナルアンカードメイン」と称される隣接ドメインは、一般に長さが約１０〜２６の間のアミノ酸であり；シグナルアンカードメインに隣接する「ステム領域」は、一般に長さが約２０〜約６０の間のアミノ酸でありグリコシルトランスフェラーゼをゴルジ装置内に維持するための保持シグナルとして機能することが知られており；該ステム領域のカルボキシル側は触媒ドメインである。
【０１８０】
多くの哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼがクローン化され、発現され、該組換えタンパク質は供与体基質および受容体基質の特異性に関して特性化されており、それらはまた、供与体基質または受容体基質の特異性に関与する残基またはドメインを確定する意図で、部位指向的変異によって調べられている（Ａｏｋｉら（１９９０）ＥＭＢＯ．Ｊ．９：３１７１−３１７８頁；Ｈａｒｄｕｉｎ−Ｌｅｐｅｒｓら（１９９５）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ５（８）：７４１−７５８頁；ＮａｔｓｕｋａおよびＬｏｗｅ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ４：６８３−６９１頁；Ｚｕら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０６（１）：３６２−３６９；Ｓｅｔｏら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３４：３２３−３２８頁；Ｓｅｔｏら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４１３３−１４１３８８頁）。
【０１８１】
一群の実施形態において、本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼタンパク質の機能的ドメインは、公知のシアリルトランスフェラーゼから得られる。本発明の使用に好適なシアリルトランスフェラーゼの例としては、限定はしないが、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、ＳＴ３ＧａｌＩＶ、ＳＴ３ＧａｌＩ、ＳＴ６ＧａｌＩ、ＳＴ３ＧａｌＶ、ＳＴ６ＧａｌＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩ、およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩ（本明細書に用いられるシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Ｔｓｕｊｉら（１９９６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ６：ｖ−ｘｉｖに記載されている通りである）が挙げられる。典型的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）は、シアリン酸をＧａｌβ１の非還元末端Ｇａｌ→４ＧｌｃＮＡｃジサッカライドまたはグリコシドへ移送させる。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６：３１５９頁（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５頁（１９８２）およびＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２１０１１頁（１９９２）を参照されたい。他の典型的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）は、シアリン酸をＧａｌβ１の非還元末端Ｇａｌ→３ＧａｌＮＡｃジサッカライドまたはグリコシドへ移送させる。Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４：４４４４頁（１９７９）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２１００４頁（１９９２）を参照されたい。さらなる典型的酵素として、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃα−２，６シアリルトランスフェラーゼが挙げられる（Ｋｕｒｏｓａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５−３８１（１９９４）を参照）。シアリルトランスフェラーゼの命名法は、Ｔｓｕｊｉ，Ｓら（１９９６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ６：ｖ−ｖｉｉに記載されている。
【０１８２】
特許請求された方法に有用なシアリルトランスフェラーゼの一例は、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩであり、これはα（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）とも称される。この酵素は、シアリン酸を、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃグリコシドのＧａｌ、またはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへ移送させるのを触媒する（例えば、Ｗｅｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１頁；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６：３１５９頁を参照）。シアリン酸は、２つの糖の間にα結合を形成することによってＧａｌに結合する。糖間の結合は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位との間のものである。この特定の酵素は、ラットの肝臓から（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら［１９８２］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５頁）；ヒトｃＤＮＡから（Ｓａｓａｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２−２２７８７頁；Ｋｉｔａｇａｗａ  ＆  Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４−１４０１頁）単離でき、組換え発現によってこの酵素の産生を促進するゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１−９３８頁）ＤＮＡ配列が知られている。好ましい一実施形態において、請求されたシアリル化法では、ラットのＳＴ３ＧａｌＩＩＩが用いられる。ラットのＳＴ３ＧａｌＩＩＩはクローン化されており、その配列は知られている。例えばＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１−２１０１９頁（１９９２）および登録番号Ｍ９７７５４を参照されたい。
【０１８３】
他の実施形態群において、本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼタンパク質の機能的ドメインは、フコシルトランスフェラーゼから得られる。多数のフコシルトランスフェラーゼが当業者に知られている。手短に言うと、フコシルトランスフェラーゼには、ＧＤＰ−フコースから受容体である糖のヒドロキシ位にＬ−フコースを移送させる任意の酵素が含まれる。例えば、いくつかの実施形態において、受容体の糖は、オリゴ糖グリコシドにおけるＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃ基内のＧｌｃＮＡｃである。この反応のための好適なフコシルトランスフェラーゼとしては、ヒト乳汁から得られる公知のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩ、Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）（Ｐａｌｃｉｃら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９０：１−１１頁（１９８９）；Ｐｒｉｅｅｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６−１０４６３頁（１９８１）；およびＮｕｎｅｚら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６−２０９５（１９８１）を参照）およびＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃα（１→３）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、およびＦＴＶＩ，Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）ならびにヒト血清に見られるＮｅｕＡｃα（２，３）βＧａｌ（１→４）βＧｌｃＮＡｃα（１→３）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＶＩＩ）が挙げられる。また、Ｋａｎｅｋｏら（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５２：２３７−２４２頁に記載されているα１，３フコシルトランスフェラーゼＩＸ（ヒトおよびマウスＦＴＩＸのヌクレオチド配列）も利用できる。さらに、Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換え体も利用できる（Ｄｕｍａｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１：４２５−４２８頁（１９９１）およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ４：１２８８−１３０３頁（１９９０）を参照）。他の典型的なフコシルトランスフェラーゼとしては、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６９）が挙げられる。酵素的フコシル化は、Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９−１７６頁（１９９０）または米国特許出願第５，３７４，６５５号に記載された方法により実施できる。
【０１８４】
他の実施形態群において、本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼタンパク質の機能的ドメインは、公知のガラクトシルトランスフェラーゼから得られる。典型的なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼＩ、α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ［Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．１５１、例えば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：２９２１頁（１９９３）およびＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ３４５：２２９−２３３頁（１９９０）、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｊｏ４９８９、Ｊｏｚｉａｓｓｅら［１９８９］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０−１４２９７頁）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ  ｍ２６９２５；Ｌａｒｓｅｎら［１９８９］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２２７−８２３１頁）、ブタ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ３６１５２；Ｓｔｒａｈａｎら［１９９５］Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４１：１０１−１０５）を参照）が挙げられる。他の好適なα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液Ｂ群抗原の合成に関与するものである（ＥＣ２．４．１．３７、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１４６−１１５１頁（ヒト））。また、本発明の融合タンパク質における使用に好適なものは、α１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼであり、これには、例えば、ＥＣ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃシンテターゼ）およびＥＣ２．４．１．２２（ラクトスシンセターゼ）（ウシ（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１−２１７頁）、ヒト（Ｍａｓｒｉら［１９８８］Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：６５７−６６３頁）、マウス（Ｎａｋａｚａｗａら（１９８８）Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：１６５−１６８頁）、ならびにＥ．Ｃ．２．４．１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．４５、Ｓｔａｈｌら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３８：２３４−２４２頁）が挙げられる。他の好適なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、例えば、α１，２−ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅのもの、Ｃｈａｐｅｌｌら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ５：５１９−５２８頁）が挙げられる。
【０１８５】
本発明の組換え融合タンパク質に有用な他のグリコシルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、およびフコシルトランスフェラーゼについて、詳述されている。特に、グリコシルトランスフェラーゼはまた、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、例えば、Ａｌｇ８（Ｓｔａｇｌｊｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：５９７７頁（１９９４））またはＡｌｇ５（ＨｅｅｓｅｎらＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：７１頁（１９９４））、例えば、β（１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（米国特許出願第５，６９１，１８０号、Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８９頁（１９９２）、およびＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２頁（１９９４））およびタンパク質Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９頁（１９９３））などのＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであり得る。好適なＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとしては、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ１７６：６０８頁（１９９１））、ＧｎＴＩＩ、およびＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：６９２頁（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９３２６（１９９２））、Ｎ−アセチルグルコサミニン−１−ホスフェートトランスフェラーゼ（Ｒａｊｐｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８５：９８５（１９９２）、およびヒアルロナンシンターゼが挙げられる。例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＩ（ＥＣ２．４．１．１７４）などのプロテオグリカン合成に関与する酵素、およびＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＥＣ２．４．１．１７５）などの硫酸コンドロイチン合成に関与する酵素もまた興味深い。好適なマンノシルトランスフェラーゼとしては、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈ１、およびＰｍｔ１が挙げられる。キシロシルトランスフェラーゼとしては、例えば、タンパク質キシロシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．２．２６）が挙げられる。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、真核生物Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、細菌内に発現され、本開示の方法を用いてリフォールディングされる。多数のＧａｌＮＡｃＴ酵素、例えば、ＧａｌＮＡｃＴ１、登録番号Ｘ８５０１８；ＧａｌＮＡｃＴ２、登録番号Ｘ８５０１９（双方ともＷｈｉｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４１５６−２４１６５（１９９５）に記載されている）；およびＧａｌＮＡｃＴ３、登録番号Ｘ９２６８９（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７００６−１７０１２（１９９６）に記載されている）が単離され、特性化されている。
【０１８７】
（ＩＶ．核酸）
グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸、およびこのような核酸を得る方法は、当業者に公知である。好適な核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム、または部分配列（プローブ））を、クローン化できるか、または、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）、または自立配列複製システム（ＳＳＲ）などのインビトロ方法により増幅できる。多種多様のクローニングおよびインビトロ増幅方法論が当業者に周知である。多くのクローニングの実施による当業者に指示する上で十分なこれらの方法および教示の例は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、カリフォルニア州、サンディエゴ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社との合弁（１９９４増補）（Ａｕｓｕｂｅｌ）；Ｃａｓｈｉｏｎら、米国特許出願第５，０１７，４７８号；および  Ｃａｒｒ、欧州特許第０，２４６，８６４号に見られる。
【０１８８】
グリコシルトランスフェラーゼ、またはその部分配列をコードするＤＮＡは、例えば、クローニングおよび制限酵素による適切な配列の制限などの上記の任意の好適な方法によって調製できる。好ましい一実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、慣用的クローニング法によって単離される。ゲノムＤＮＡサンプル中のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子、またはＲＮＡサンプル全体中で、グリコシルトランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを提供するために、例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の配列データベースに提供されているグリコシルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列（上記を参照）を使用できる（例えば、サザンブロットまたはノーザンブロットにおいて）。グリコシルトランスフェラーゼをコードしている標的核酸が同定されたら、それを、当業者に公知の標準的方法によって単離できる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、サンディエゴ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社；またはＡｕｓｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ    Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨークを参照）。さらに、単離された核酸を制限酵素によって開裂して、完全長グリコシルトランスフェラーゼ、またはその部分配列をコードする、例えば、グリコシルトランスフェラーゼのステム領域または触媒ドメインの少なくとも１つの部分配列をコードする部分配列を含有する核酸を創製することができる。次いでグリコシルトランスフェラーゼ、またはその部分配列をコードするこれらの制限酵素断片を、例えば、組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質をコードする核酸を作成させるために、結合させ得る。
【０１８９】
グリコシルトランスフェラーゼ、またはその部分配列をコードする核酸を、発現生成物に関してアッセイすることによって特性化できる。発現タンパク質の物理的、化学的、または免疫学的性質の検出に基づいたアッセイを使用できる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質などのクローン化グリコシルトランスフェラーゼを、該核酸によってコードされたタンパク質の、供与体基質から受容体基質への糖の移送を触媒する能力によって同定することができる。好ましい一方法において、反応生成物を検出するために、キャピラリー電気泳動が用いられる。この高感度アッセイには、Ｗａｋａｒｃｈｕｋら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４５）：２８２７１−２７６頁に記載されている蛍光で標識されたサッカライドアミノフェニル誘導体またはジサッカライドアミノフェニル誘導体のいずれかの使用が含まれる。例えば、ナイセリアｌｇｔＣ酵素のアッセイには、ＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−ＬａｃまたはＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−Ｇａｌを使用でき、一方、ナイセリアｌｇｔＢ酵素にとっての適切な試薬は、ＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−ＧｌｃＮＡｃ（上記）である。
【０１９０】
また、グリコシルトランスフェラーゼ、またはその部分配列をコードする核酸を、化学的に合成することもできる。好適な方法としては、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９頁のホスホジエステル法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１頁のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．、２２：１８５９−１８６２頁のジエチルホスホラミダイト法；および米国特許出願第４，４５８，０６６号の固体支持体法が挙げられる。化学的合成では一本鎖オリゴヌクレオチドが生成する。これを、相補的配列によるハイブリダイゼーションによって、または一本鎖をテンプレートとして用いた、ＤＮＡポリメラーゼによる重合によって、二本鎖ＤＮＡへと変換できる。ＤＮＡの化学的合成は、約１００塩基の配列に制限されることが多いが、より長い配列がより短い配列の結合によって得ることができることは、当業者に認識されている。
【０１９１】
グリコシルトランスフェラーゼ、またはその部分配列をコードする核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を用いてクローン化できる。したがって、例えば、該核酸配列または部分配列は、１つの制限酵素部位（例えば、ＮｄｅＩ）を含有するセンスプライマーおよび他の制限酵素部位（例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ）を含有するアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅できる。これによって、所望のグリコシルトランスフェラーゼまたは部分配列をコードし、末端制限酵素部位を有する核酸が生成する。次いで、この核酸を、第２の分子をコードする核酸を含有し、対応する適切な制限酵素部位を有するベクターに、容易に結合できる。好適なＰＣＲプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の供給源から提供される配列情報を用いて、当業者によって決定できる。また、部位指向性変異によって、適切な制限酵素部位を、グリコシルトランスフェラーゼタンパク質またはタンパク質部分配列をコードする核酸に付加できる。グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列または部分配列を含有するプラスミドを、適切な制限エンドヌクレアーゼによって開裂し、次いで標準的方法にしたがって、増幅および／または発現のための適切なベクター内へ結合させる。当業者に指示する上で十分なインビトロ増幅法による方法の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編集）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、カリフォルニア州、サンディエゴ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年、１０月１日）Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７頁；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１〜９４；（Ｋｗｏｈら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７、１８７４頁；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３５：１８２６頁；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２９１−２９４頁；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４：５６０頁；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７頁に見られる。
【０１９２】
特定の核酸から発現させたグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質などのクローン化グリコシルトランスフェラーゼの他の物理的性質を、公知のグリコシルトランスフェラーゼの性質と比較して、受容体基質特異性および／または触媒活性の決定因子である該グリコシルトランスフェラーゼの好適な配列またはドメインを同定する他の方法を提供できる。或いは、推定上のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子または組換えグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を変異させて、グリコシルトランスフェラーゼとしてのその役割、リフォールディングされるその能力、または特定の配列またはドメインの役割を、非変異の、天然の、または対照のグリコシルトランスフェラーゼによって通常作成される炭水化物の構造における変化を検出することによって確認できる。
【０１９３】
クローン化されたグリコシルトランスフェラーゼの機能性ドメインは、グリコシルトランスフェラーゼ類を改変または修飾するための標準的方法、および本明細書に記載されている、受容体基質活性および／または触媒活性などの活性に関して改変または変異したタンパク質を試験することにより同定できる。１種以上のグリコシルトランスフェラーゼ類の機能性ドメインを含んでなる組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質をコードする核酸類を構築するために種々のグリコシルトランスフェラーゼの機能性ドメインを使用できる。次にこれらの融合タンパク質を、所望の受容体基質活性または触媒活性について試験できる。
【０１９４】
組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質をクローン化する典型的な方法において、クローン化グリコシルトランスフェラーゼの公知の核酸またはアミノ酸配列を整列させ、種々のグリコシルトランスフェラーゼ間の配列同一性量を判定するために比較する。この情報により、グリコシルトランスフェラーゼ活性、例えば、対象のグリコシルトランスフェラーゼ類間の配列同一性量に基づく受容体基質活性および／または触媒活性を与えるか、または調節する蛋白ドメインを同定し、選択するために使用できる。例えば、対象のグリコシルトランスフェラーゼ間に配列同一性を有し、公知の活性に関係するドメインは、そのドメインを含有し、そのドメインに関連する活性（例えば、受容体基質特異性および／または触媒活性）を有する、組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質を構築するために使用できる。
【０１９５】
（Ｖ．組換えグリコシルトランスフェラーゼ類の発現）
組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌、他の細菌宿主、酵母、およびＣＯＳ、ＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞系ならびに骨髄腫細胞系などの種々の高等真核生物細胞を含む種々の宿主細胞において発現できる。宿主細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、または例えば、酵母細胞、細菌細胞、もしくは真菌細胞などの微生物であり得る。好適な宿主細胞の例としては、多くのものの中で、例えば、アゾトバクター種（例えば、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、シュードモナス種、リゾビウム種、エルウィニア種、エシェリキア種（例えば、大腸菌）、バチラス、シュードモナス、プロテウス、サルモネラ、セラチア、シゲラ、リゾビア、ビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）、パラコッカス属およびクレブシエラ種が挙げられる。該細胞は、サッカロミセス属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ属（例えば、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ピチア属（例えば、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａおよびＰ．ｏｈｍｅｒｉ）、トルロプシス属（例えば、Ｔ．ｃａｎｄｉｄａ、Ｔ．ｓｐｈａｅｒｉｃａ、Ｔ．ｘｙｌｉｎｕｓ、Ｔ．ｆａｍａｔａ、およびＴ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、デバリオミセス属（例えば、Ｄ．ｓｕｂｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ、Ｄ．ｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ、およびＤ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ジゴサッカロミセス属（例えば、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉおよびＺ．ｂａｉｌｉｉ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ハンゼヌラ属（例えば、Ｈ．ａｎｏｍａｌａおよびＨ．ｊａｄｉｎｉｉ）およびブレッタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｂ．ｌａｍｂｉｃｕｓおよびＢ．ａｎｏｍａｌｕｓ）などのうち、いずれかの属のものであり得る。有用な細菌の例としては、限定はしないが、エシェリキア、エンテロバクター、アゾトバクター、エルウィニア、クレブシエリアが挙げられる。
【０１９６】
典型的に、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞において機能的であるプロモーターの制御下に置かれる。極めて多種多種のプロモーター類が周知であり、特定の適用に依って本発明の発現ベクターに使用できる。通常、選択されたプロモーターは、プロモーターが活性となる細胞に依存する。リボソーム結合部位、転写末端部位などの他の発現制御配列もまた、任意に含まれる。１つ以上のこれらの制御配列を含む構造物は、「発現カセット」と呼ばれる。したがって、本発明は、融合タンパク質をコードする核酸類が所望の宿主細胞における高レベルの発現のために取り込まれる発現カセットを提供する。
【０１９７】
特定の宿主細胞における使用に好適な発現制御配列は、その細胞に発現される遺伝子をクローン化することにより得られることが多い。リボソーム結合部位配列と共に任意にオペレーターによる転写開始のためのプロモーター類を含んで、本明細書に定義される通常使用される原核生物の制御配列としては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）系およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５６頁）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７頁）、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８３）８０：２１−２５頁）；およびラムダ由来ＰＬプロモーターならびにＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８頁）などの一般に使用されているプロモーター類が挙げられる。特定のプロモーター系は、本発明にとって重要ではなく、原核生物において機能する任意の利用できるプロモーターが使用できる。
【０１９８】
大腸菌以外の原核生物における組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ類の発現のためには、特定の原核生物種において機能するプロモーターが必要である。このようなプロモーター類は、その種からクローン化された遺伝子から得ることができるか、または異種のプロモーター類が使用できる。例えば、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターは、大腸菌の他にバチルス属でも機能する。
【０１９９】
リボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、本発明の発現カセットに都合よく含まれている。例えば、大腸菌におけるＲＢＳは、開始コドンの３〜１１のヌクレオチド上流に位置した長さ３〜９のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる（ＳｈｉｎｅおよびＤａｌｇａｒｎｏ、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５４：３４頁；Ｓｔｅｉｔｚ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ）、１巻、３４９頁、１９７９年、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ニューヨーク）。
【０２００】
酵母における組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼの発現のために、好適なプロモーター類としては、ＧＡＬ１−１０（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＤａｖｉｅｓ（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４４０−１４４８頁）ＡＤＨ２（Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４−２６８２頁）、ＰＨＯ５（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８２）６：６７５−６８０頁）、およびＭＦα（ＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚおよびＯｓｈｉｍａ（１９８２）編、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ、Ｊｏｎｅｓ、およびＢｒｏａｃｈ編集）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂ．、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１８１−２０９頁）が挙げられる。酵母における使用に好適な別のプロモーターは、Ｃｏｕｓｅｎｓら、Ｇｅｎｅ６１：２６５−２７５頁（１９８７）に記載されているＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーターである。例えば、真菌アスペルギルス株（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号）などの糸状菌に関して、有用なプロモーター類の例としては、ＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２０９３−２０９９頁（１９８５））およびｔｐｉＡプロモーターなどの偽巣性コウジ菌の解糖遺伝子に由来するものが挙げられる。好適なターミネーターの例は、ＡＤＨ３ターミネーターである（ＭｃＫｎｉｇｈｔら）。
【０２０１】
植物における使用に好適な構成的プロモーター類としては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域と領域ＶＩプロモーター類、アグロバクテリウムチュメファシエンスのＴ−ＤＮＡに由来する１’−または２’−プロモーター、および当業者に公知の植物細胞において活性な他のプロモーター類が挙げられる。他の好適なプロモーター類としては、フィグウォート（Ｆｉｇｗｏｒｔ）モザイクウィルス、アクチンプロモーター類、ヒストンプロモーター類、チューブリンプロモーター類、またはマンノピン合成プロモーター（ＭＡＳ）からの完全長転写プロモーターが挙げられる。他の構成的植物プロモーター類としては、とりわけアラビドプシス（ＳｕｎおよびＣａｌｌｉｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１１（５）：１０１７−１０２７頁（１９９７））に由来する種々のユビキチンまたはポリユビキチン、マス、マックまたはダブルマックプロモーター類（米国特許第５，１０６，７３９号およびＣｏｍａｉらによるＰｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３７３−３８１頁（１９９０）に記載されている）および当業者に公知の種々の植物遺伝子の他の転写開始領域が挙げられる。また、植物に有用なプロモーター類としては、プロモーター類が、植物において機能的であることが見出されている植物細胞、植物ウィルスまたは他の宿主のＴｉ−プラスミドまたはＲｉ−プラスミドから得られたものが挙げられる。植物において機能的で、したがって本発明の方法における使用に好適である細菌プロモーターとしては、オクトピンシンテターゼプロモーター、ノパリン合成プロモーター、およびマノピン合成プロモーターが挙げられる。好適な内因性植物プロモーターとしては、リブロース−１，６−ビホスフェート（ＲＵＢＰ）、カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）プロモーター、（α−コングリシニンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、ＡＤＨプロモーター、およびヒートショックプロモーター類が挙げられる。
【０２０２】
構成的または制御されたプロモーター類を、本発明に使用できる。融合タンパク質の発現が誘導される前に宿主細胞を高密度に増殖できることから、制御されたプロモーター類が有利となり得る。異種のタンパク質の高レベル発現により、幾つかの状況で細胞増殖が遅くなる。誘導性のプロモーターは、遺伝子の発現レベルが、例えば、温度、ｐＨ、嫌気的または好気的条件、光、転写因子および試薬などの環境因子または発生因子により変化する遺伝子発現を方向付けるプロモーターである。このようなプロモーターは、本明細書で「誘導性」プロモーターと称され、ヌクレオチド糖合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼまたは酵素の発現タイミングを制御できる。大腸菌および他の細菌宿主細胞に関して、誘導性プロモーター類は当業者に公知である。これらには、例えば、ｌａｃプロモーター、バクテリオファージラムダＰＬプロモーター、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（Ａｍａｎｎら、（１９８３）Ｇｅｎｅ２５：１６７頁；ｄｅ  Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２１頁）、バクテリオファージＴ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．；Ｔａｂｏｒら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１０７４−８頁）が含まれる。これらのプロモーターと使用法は、前述のＳａｍｂｒｏｏｋらにより考察されている。原核生物における発現のために特に好ましい誘導性プロモーターは、ガラクトース代謝に関与する酵素をコードする遺伝子（１つまたは複数）から得られたプロモーター成分に結合したｔａｃプロモーター成分を含むデュアルプロモーター（例えば、ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）からのプロモーター）である。ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９８／２０１１１号に記載されているデュアルｔａｃ−ｇａｌプロモーターは、いずれかのプロモーター単独により提供されたものよりも大きな発現レベルを提供する。
【０２０３】
植物における使用のための誘導性プロモーター類は、当業者に公知であり（例えば、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｒら（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：２２１頁に記載の参考文献を参照）、光誘導性で光合成組織においてのみ活性であるシロイヌナズナの１，５−リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のもの（「ｓｓｕ」プロモーター）を含む。
【０２０４】
他の生物に関する誘導性プロモーター類もまた、当業者に周知である。これらには、例えば、アラビノースプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、メタロチオネインプロモーター、およびヒートショックプロモーターならびに他の多くのものが含まれる。
【０２０５】
遺伝子発現制御シグナルに操作可能に結合される対象のポリヌクレオチドを含む構造は、適切な宿主細胞に入れられた場合、ポリヌクレオチドの発現を駆動し、「発現カセット」と呼ばれる。本発明の融合タンパク質をコードする発現カセットは、宿主細胞内への導入のために発現ベクターに入れられることが多い。ベクタ類は典型的に、発現カセットに加えて、ベクターが１種以上の選択宿主細胞において独立して複製できる核酸配列を含む。一般に、この配列は、ベクターが宿主の染色体ＤＮＡから独立して複製できるものであり、複製起点または自律的複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌に関して周知である。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切である。あるいは、該ベクターは、宿主細胞のゲノム補体に組み込まれることにより、また細胞がＤＮＡ複製を受けて複製されることによって複製できる。細菌細胞における酵素発現にとって好ましい発現ベクターは、デュアルｔａｃ−ｇａｌプロモーターを含み、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９８／２０１１１号に記載されているｐＴＧＫである。
【０２０６】
また、宿主細胞の増殖に比してポリペプチドの発現調節を可能にする調節配列を加えることが、望ましいと考えられる。調節系の例は、調節化合物の存在を含む、化学または物理的刺激に応答して、作動または遮断される遺伝子発現を生じるものである。原核生物系における調節系としては、ｌａｃオペレーター系、ｔａｃオペレーター系、およびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母において、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系を使用できる。糸状菌において、ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、クロカビのグルコアミラーゼプロモーター、コウジカビのグルコアミラーゼプロモーターを、調節配列として使用できる。
【０２０７】
ポリヌクレオチド構造物の構成は、一般に細菌内で複製できるベクターの使用を必要とする。多くのキットは、細菌のプラスミドの精製用に商品として入手できる（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐＪ、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐＪの双方ともＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＪ；ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを参照）。次いで単離および精製プラスミドを、他のプラスミドを産生するためにさらに操作でき、細胞に形質移入させるために使用できる。ストレプトミセスまたはバチルスにおけるクローン化もまた可能である。
【０２０８】
選択マーカーが、本発明のポリヌクレオチド類を発現するために用いられる発現ベクターに取り込まれることが多い。これらの遺伝子は、選択的培養培地中で増殖される形質移入宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質などの遺伝子産物をコードする。選択遺伝子を含有するベクターにより形質移入されなかった宿主細胞は、培養培地中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンなどの抗生物質または毒素に耐性を与えるタンパク質をコードする。あるいは、選択マーカーは、栄養要求性の欠失を補足するか、または複合培地から利用できない重要な栄養物を供給するタンパク質をコードできる（例えば、桿菌用にＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。該ベクターは、宿主細胞に導入される前に該ベクターが複製される大腸菌または他の細胞において機能的である１つの選択マーカーを有することが多い。多数の選択マーカーが、当業者に公知であり、例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋらに記載されている。細菌細胞の使用に好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性マーカーである（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ１９：２５９頁（１９８２））。カナマイシンの選択使用は、例えば、アンピシリン選択よりも有利である。というのは、アンピシリンは、培養培地中のβ−ラクタマーゼにより速やかに分解され、したがって選択圧が除かれ、その培養物にはベクターを含有しない細胞が過剰増殖するからである。
【０２０９】
上記に掲げた１種以上の成分を含有する好適なベクターの構築物には、上記に引用した参考文献に記載された標準的な連結法が使用される。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片を開裂し、編成し、所望の形態に再結合させて必要なプラスミドを生成する。構築されたプラスミドにおける正しい配列を確認するために、公知の方法に従って制限エンドヌクレアーゼ消化および／または塩基配列決定法など、標準的方法による分析によってこのプラスミドを分析できる。これらの目標を達成する分子クローン化技法は、当該分野に公知である。組換え核酸の構築に好適な多種多様のクローン化法およびインビトロ増幅法は、当業者に周知である。当業者を指導する上で十分な多くのクローン化実施によるこれらの技法および教示の例は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌのＧｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｂｅｒｇｅｒ）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社との共同事業、（１９９８年に補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）に見られる。
【０２１０】
本発明の発現ベクターを構築するための出発原料としての使用に好適な種々の共通のベクターが、当該分野に周知である。細菌におけるクローン化に関して、共通のベクターとしては、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（商標）などのｐＢＲ３２２由来のベクター、およびλ−ファージ由来のベクターが挙げられる。酵母におけるベクターとしては、酵母組込みプラスミド（例えば、ＹＩｐ５）および酵母複製プラスミド（ＹＲｐシリーズプラスミド類）およびｐＧＰＤ−２が挙げられる。哺乳動物細胞における発現は、ｐＳＶ２、ｐＢＣ１２ＢＩおよびｐ９１０２３、ならびに溶解性ウィルスベクター（例えば、ワクシニアウィルス、アデノウィルスおよびバキュロウィルス）、エピソームウィルスベクター（例えば、ウシパピローマウィルス）、レトロベクター（例えば、マウスレトロウィルス類）などの種々の一般に利用できるプラスミドを用いて達成できる。
【０２１１】
発現ベクターを選択された宿主細胞に導入する方法は、特に重要ではなく、このような方法は当業者に公知である。例えば、発現ベクターを、塩化カルシウム形質転換により、大腸菌などの原核生物細胞に導入でき、またリン酸カルシウム処理または電気穿孔により真核生物細胞に導入できる。他の形質転換法もまた好適である。
【０２１２】
翻訳カップリングが、発現を増強させるために使用できる。この方法では、翻訳系に特有の高発現遺伝子由来の短い上流オープンリーディングフレームを使用し、これをプロモーターの下流に配置し、続いて終止コドンによる２、３のアミノ酸コドン後、リボソーム結合部位が位置する。終止コドンの直前に、第２のリボソーム結合部位があり、終止コドン後に翻訳開始のための開始コドンがある。この系は、ＲＮＡにおける二次的構造を分解して翻訳の効率的開始を可能にする。Ｓｑｕｉｒｅｓら（１９８８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２６３：１６２９７−１６３０２頁を参照されたい。
【０２１３】
本発明の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼはまた、他の細菌タンパク質にさらに結合できる。通常の原核生物の制御配列が、転写および翻訳を指令することから、このアプローチは、高収率をもたらすことが多い。大腸菌において、ｌａｃＺ融合が、異種タンパク質を発現するために使用されることが多い。ｐＵＲ、ｐＥＸ、およびｐＭＲ１００シリーズ（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照）などの好適なベクター類を容易に利用できる。ある一定の適用に関しては、精製後の融合タンパク質から非グリコシルトランスフェラーゼおよび／または補助的酵素のアミノ酸を開裂することが望ましいと考えられる。これは、臭化シアン、プロテアーゼ、または因子Ｘａによるなど、当該分野に公知の任意の方法（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋら；Ｉｔａｋｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７７）１９８：１０５６頁；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１０６頁；Ｎａｇａｉら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９：８１０頁；Ｓｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：５６１頁を参照）により達成できる。開裂部位を、所望の開裂部位で融合タンパク質に関して遺伝子内に操作できる。
【０２１４】
１つ以上の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼを、複数の翻訳カセットを単独発現ベクターに入れることによって、またはクローン化法に使用される発現ベクターの各々に対して異なる選択マーカー類を利用することによって単独の宿主細胞に発現することができる。
【０２１５】
Ｎ−末端の完全性を維持する大腸菌から組換えタンパク質を得る好適な方法は、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：６９８−７０４頁（１９８９）に記載されている。この系における対象の遺伝子は、ペプチダーゼ開裂部位を含有する酵母ユビキチン遺伝子の最初の７６の残基とのＣ−末端融合として産生される。２つの部分の結合部における開裂により、無傷の標準的Ｎ−末端残基を有するタンパク質の産生がもたらされる。
【０２１６】
本発明の発現ベクターを、大腸菌については塩化カルシウム形質転換、哺乳動物細胞についてはリン酸カルシウム処理または電気穿孔などの周知の方法により、選択された宿主細胞に移入することができる。プラスミド類によって形質転換された細胞は、ａｍｐ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子およびｈｙｇ遺伝子などのプラスミド上に含まれた遺伝子によって与えられる、抗生物質耐性により選択できる。
【０２１７】
（ＶＩ．タンパク質およびタンパク質の精製）
組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの当該分野の標準的な手法（一般に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク州（１９８２）、Ｄｅｕｔｓｃｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク州（１９９０）を参照）に従って精製できる。好ましい実施形態において、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質の精製は、タンパク質のリフォールディング後に生じる。少なくとも約７０％〜９０％均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく；より好ましくは、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、または９７％であり；９８％〜９９％以上の均一性が最も好ましい。精製タンパク質はまた、例えば、抗体産生の免疫原として使用できる。
【０２１８】
本発明の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質の精製を促進するために、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸類は、アフィニティー結合試薬が利用できるエピトープまたは「タグ」、すなわち精製用タグに関するコード化配列を含み得る。好適なエピトープ類の例としては、ｍｙｃ遺伝子およびＶ−５レポーター遺伝子が挙げられ；これらのエピトープ類を有する融合タンパク質の組換え産生に有用な発現ベクター類は、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓは哺乳動物細胞における発現に好適である）。本発明の融合タンパク質に対するタグの結合に好適なさらなる発現ベクター、および対応する検出システムは、当業者に公知であり、幾つかは市販されている（例えば、ＦＬＡＧ”（Ｋｏｄａｋ、ニューヨーク州ロチェスター））。好適なタグの他の例は、金属キレートアフィニティーリガンドに結合可能なポリヒスチジン配列である。典型的には、６つの隣接ヒスチジンが用いられるが、６つ前後を使用することもできる。ポリヒスチジンタグへの結合部分として役立ち得る好適な金属キレートアフィニティーリガンドとしては、ニトリロ−トリ−酢酸（ＮＴＡ）（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ（１９９０）「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ編集、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｑｉａｇｅｎ（サンタクラリタ、カリフォルニア州）から市販）が挙げられる。
【０２１９】
精製用タグはまた、マルトース結合ドメインおよび澱粉結合ドメインを含む。マルトース結合ドメインタンパク質の精製は、当業者に公知である。澱粉結合ドメインは、ＷＯ９９／１５６３６号（参照として本明細書に組み込まれている）に記載されている。βシクロデキストリン（ＢＣＤ）−誘導化樹脂を用いた澱粉結合ドメインを含んでなる融合タンパク質のアフィニティー精製は、２００３年５月５日に出願された米国特許出願第６０／４６８，３７４号（参照としてその全体が本明細書に組み込まれている）に記載されている。
【０２２０】
タグとしての使用に好適な他のハプテン類は、当該分野に公知であり、例えば、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅオレゴン州）のハンドブックに記載されている。例えば、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニン、バルビツレート類（例えば、米国特許第５，４１４，０８５号を参照）、および幾つかのタイプの蛍光体は、これらの化合物の誘導体であるハプテン類として有用である。ハプテン類および他の部分と、タンパク質および他の分子とを結合するためのキット類は、市販されている。例えば、ハプテンがチオールを含む場合、タグを捕捉剤上に存在するリジン残基に結合させるために、ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性リンカーを用いることができる。
【０２２１】
当業者は、生物活性を消失することなく、グリコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインまたは機能性ドメインおよび／または補助的酵素触媒ドメインに改変を施すことができることを認識されるであろう。クローン化、発現、または融合タンパク質への触媒ドメインの取り込みを促進するために、幾つかの改変を施すことができる。このような改変は、当業者に周知であり、例えば、開始部位を提供するアミノ末端に付加されたメチオニンを提供するために、またはいずれかの末端に位置する追加のアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）を提供して、便利に配置された制限酵素部位あるいは末端コドンまたは精製配列を創製するために、触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドのいずれかの末端におけるコドンの付加が挙げられる。
【０２２２】
（ＶＩＩ．リフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼ類の利用）
本発明は、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質、および糖タンパク質、糖脂質およびオリゴ糖部分を酵素的に合成し、ならびに糖タンパク質を糖ＰＥＧ化するために、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質を用いる方法を提供する。本発明のグリコシルトランスフェラーゼ反応は、少なくとも１種のグリコシルトランスフェラーゼ、受容体基質と供与体基質、および典型的に溶解性二価金属カチオンを含んでなる反応媒体中で行われる。幾つかの実施形態において、補助的酵素が、グリコシルトランスフェラーゼに関する供与体基質を合成できるように、補助的酵素および補助的酵素触媒部分用の基質もまた存在する。本発明の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質および方法は、受容体基質への糖類の付加を触媒する組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質の使用に依存する。
【０２２３】
所望のオリゴ糖部分を有する糖タンパク質および糖脂質を合成するためにグリコシルトランスフェラーゼを用いる多くの方法は公知である。代表的な方法は、例えば、ＷＯ９６／３２４９１、Ｉｔｏら（１９９３）Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３頁、および米国特許第５，３５２，６７０号、米国特許第５，３７４，５４１号および米国特許第５，５４５，５５３号に記載されている。
【０２２４】
本明細書に記載されたとおり調製された組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質は、活性のためにリフォールディングが必要であってもなくてもよいさらなるグリコシルトランスフェラーゼと組み合わせて使用できる。例えば、リフォールディングされた真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質と、宿主細胞から単離後リフォールディングされていても、またはリフォールディングされていなくてもよい細菌のグリコシルトランスフェラーゼとの組み合わせを使用できる。同様に、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、融合タンパク質の一部であっても、なくてもよい組換え補助的酵素と共に使用できる。
【０２２５】
上記の方法によって生成された生成物は、精製することなく使用できる。幾つかの実施形態において、オリゴ糖が生成される。標準的な周知の技法、例えば、薄層または厚層クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、または膜ろ過を、グリコシル化糖類の回収のために使用できる。また、例えば、共通譲渡された豪州国特許第７３５６９５号に記載されているナノろ過または逆浸透膜を利用する膜ろ過を使用できる。さらなる例として、膜が約１０００から約１０，０００の分子量のカットオフを有する膜ろ過を、タンパク質を除去するために使用できる。別の例として、次にナノろ過または逆浸透法は、塩類を除去するために使用できる。ナノフィルタ膜は、使用される膜に依って、一価の塩類を通すが、多価の塩類および約２００ダルトン以上から約１０００ダルトンまでの非電荷溶質を保持する逆浸透膜のクラスである。したがって、例えば、本発明の組成物および方法によって生成されたオリゴ糖は、膜に保持することができ、不純物の塩類は通過する。
【０２２６】
（ＶＩＩＩ．供与体基質／受容体基質）
本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質および方法により用いられた好適な供与体基質としては、限定はしないが、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＧＤＰ−Ｆｕｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ、およびＣＭＰ−シアル酸が挙げられる。Ｇｕｏら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．６８：１−２０頁（１９９７）。
【０２２７】
本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質および方法により用いられた好適な受容体基質としては、限定はしないが、多糖類、オリゴ糖類、タンパク質類、脂質類、ガングリオシド類および本発明の方法により改変できる他の生物学的構造（例えば、細胞全体）が挙げられる。本発明の方法により改変できる典型的な構造としては、表１に記載される当業者に公知の細胞上の任意の多数の糖脂質類、糖タンパク質および炭水化物構造が挙げられる。
【０２２８】
【表１】
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フコシルトランスフェラーゼ触媒反応に使用される好適な受容体基質の例およびシアリルトランスフェラーゼ触媒反応使用される好適な受容体基質の例は、Ｇｕｏら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．６８：１−２０頁（１９９７）に記載されているが、それらに限定されない。
【０２２９】
（ＩＸ．グリコシルトランスフェラーゼ反応）
組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質、受容体基質、供与体基質および他の反応混合物成分を、水性反応媒体中の混合により組み合わされる。一般に媒体は、約５〜約８．５のｐＨ値を有する。媒体の選択は、所望のレベルでｐＨ値を維持する媒体の能力に基づく。したがって、幾つかの実施形態において、媒体は、約７．５のｐＨ値に緩衝化される。緩衝液を使用しない場合、媒体のｐＨは、使用される特定のグリコシルトランスフェラーゼに依って約５〜８．５に維持されるべきである。フコシルトランスフェラーゼに関しては、ｐＨ範囲が、約６．０〜８．０に維持されることが好ましい。シアリルトランスフェラーゼに関しては、その範囲が、約５．５〜７．５に維持されることが好ましい。
【０２３０】
酵素量または酵素濃度は、触媒の初発率の目安である活性単位で表される。１活性単位は、所与の温度（典型的には３７℃）およびｐＨ値（典型的には７．５）で１分当り１μｍｏｌの生成物形成を触媒する。したがって、１０単位の酵素は、１０μｍｏｌの基質が３７℃の温度および７．５のｐＨ値で１分につき１０μｍｏｌの生成物に変換される該酵素の触媒量である。
【０２３１】
反応混合物は、二価の金属カチオン（Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋）を含んでもよい。また反応媒体は、可溶化界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎまたはＳＤＳ）および必要ならば、メタノールまたはエタノールなどの有機溶媒を含んでもよい。酵素は、溶液中で遊離して利用できるか、またはポリマーなどの支持体に結合できる。したがって反応混合物は、初期に実質的に均一性であるが、反応時に沈殿物が幾らか形成する可能性がある。
【０２３２】
上記方法を実施する温度は、凍結温度のすぐ上から最も感受性の酵素が変性する温度までの範囲であり得る。その温度範囲は、約０℃〜約４５℃までが好ましく、約２０℃〜約３７℃までがより好ましい。
【０２３３】
そのように形成された反応混合物は、グリコシリ化される糖タンパク質に結合されたオリゴ糖基に存在する高収率の所望のオリゴ糖決定因子を得るのに十分な時間維持される。大スケールの調製に関して、この反応は、約０．５時間〜２４０時間の間、より典型的には約１時間〜１８時間の間しばしば進行させることが多い。
【０２３４】
１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ反応を、グリコシルトランスフェラーゼサイクルの一部として実施できる。グリコシルトランスフェラーゼサイクルの好ましい条件と説明は既に記載されている。多数のグリコシルトランスフェラーゼサイクル（例えば、シアリルトランスフェラーゼサイクル、ガラクトシルトランスフェラーゼサイクルおよびフコシルトランスフェラーゼサイクル）は、米国特許第５，３７４，５４１号および国際公開第９４２５６１５号に記載されている。他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルは、Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２８３頁（１９９２）、Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：４３４３頁（１９９２）、ＤｅＬｕｃａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：５８６９−５８７０頁（１９９５）、およびＩｃｈｉｋａｗａら、Ｃａｕｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｙａｌｔａｍｉ編集（ＡＴＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年）に記載されている。
【０２３５】
他のグリコシルトランスフェラーゼを、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼに関して詳細に記載されているのと同様のトランスフェラーゼサイクルに置換できる。特に、グリコシルトランスフェラーゼはまた、例えば、グルコシルトランスフェラーゼ、例えば、Ａｌｇ８（Ｓｔａｇｌｊｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：５９７７頁（１９９４））またはＡｌｇ５（Ｈｅｅｓｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：７１頁（１９９４））、例えばα（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２〜１２０８９（１９９２）およびＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２頁（１９９４））およびポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９頁（１９９３））などのＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであり得る。好適なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとしては、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ  １７６：６０８頁（１９９１））、ＧｎＴＩＩ、およびＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：６９２頁（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１頁（１９９３））、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９３２６頁（１９９２））、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェートトランスフェラーゼ（Ｒａｊｐｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８５：９８５頁（１９９２））、およびヒアルロナンシンターゼが挙げられる。好適なマンノシルトランスフェラーゼとしては、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈ１、およびＰｍｔ１が挙げられる。
【０２３６】
上記のグリコシルトランスフェラーゼサイクルに関して、この方法に用いられる種々の反応物の濃度または量は、温度およびｐＨ値などの反応条件、グリコシル化される受容体糖類の選択および量など、多くの因子に依存する。グリコシル化法が、触媒量の酵素の存在下で、活性化ヌクレオチド、活性化供与体糖類の再生および生成されたＰＰｉの除去を可能にすることから、この方法は、先に考察された化学量論的基質の濃度または量により限定される。本発明の方法によって使用できる反応物の濃度についての上限は、このような反応物の溶解度により決定される。
【０２３７】
受容体が消費されるまでグリコシル化が進行するように、活性化ヌクレオチド、ホスフェート供与体、供与体糖および酵素の濃度が選択されることが好ましい。下記に検討された考察は、シアリルトランスフェラーゼに関して、他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルに一般に適用できる。
【０２３８】
各々の酵素は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質濃度ならびに温度、時間およびｐＨ値のような反応条件によって変わる。予め選択された基質濃度および反応条件下で所与の酵素に関する触媒量を決定する手段は、当業者に周知である。
【０２３９】
（Ｘ．多酵素オリゴ糖合成）
上記に考察されたように、幾つかの実施形態において、２種以上の酵素を、糖タンパク質または糖脂質に対する所望のオリゴ糖決定因子を形成するために使用できる。例えば、所望の活性を示すために、特定のオリゴ糖決定因子は、ガラクトース、シアリン酸およびフコースの付加を必要とする。したがって、本発明は、２種以上の酵素、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、トランス−シアリダーゼ、またはスルホトランスフェラーゼが、所望のオリゴ糖決定因子の高収率合成を得るために使用される方法を提供する。
【０２４０】
特に好ましい実施形態において、使用される酵素の１つは、糖またはペプチドをスルホン化するスルホトランスフェラーゼである。セレクチンのためのリガンドを調製するためのスルホトランスフェラーゼの使用がさらにより好ましい（Ｋｉｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６（８）：４５３０−５頁（１９９９））。
【０２４１】
幾つかの場合において、糖タンパク質結合オリゴ糖または糖脂質結合オリゴ糖としては、糖タンパク質または糖脂質のインビボ生合成の際の特定の対象グリコシルトランスフェラーゼに対する受容体基質が挙げられる。このような糖タンパク質または糖脂質は、それぞれ糖タンパク質または糖脂質のグリコシル化パターンの前改変をしないで本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質および方法を用いてグリコシル化できる。しかしながら、他の場合において、対象の糖タンパク質または糖脂質は、好適な受容体基質を欠く。このような場合、本発明の方法を、糖タンパク質または糖脂質のグリコシル化パターンを変化させるために使用でき、その結果、糖タンパク質結合オリゴ糖または糖脂質結合オリゴ糖は、次いで所望のオリゴ糖部分を形成するために対象の予め選択された糖単位のグリコシルトランスフェラーゼ触媒結合用の受容体基質を含むことになる。
【０２４２】
好適な受容体基質を得るために、必要に応じて糖タンパク質結合オリゴ糖または糖脂質結合オリゴ糖を最初に、全体または部分的に「トリミング」して、グリコシルトランスフェラーゼに対する受容体基質、または１つ以上の適切な残基が付加できる部分に曝露させることができる。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼなどの酵素は、結合反応およびトリミング反応に有用である。例えば、「高マンノース」タイプのオリゴ糖を表す糖タンパク質は、１つ以上の予め選択された糖単位の結合時に、所望のオリゴ糖決定因子を形成する受容体基質を得るために、マンノシダーゼによるトリミングに供することができる。
【０２４３】
この方法はまた、天然形体では非グリコシル化のタンパク質または脂質上の所望のオリゴ糖部分の合成に有用である。対応するグリコシルトランスフェラーゼに好適な受容体基質は、本発明の方法を用いてグリコシル化前にこのようなタンパク質または脂質に結合できる。例えば、グリコシル化のために好適な受容体を有するポリペプチド類を得る方法に関して米国特許第５，２７２，０６６号を参照されたい。
【０２４４】
したがって、幾つかの実施形態において、本発明は、好適な受容体を創製する糖結合体を最初に修飾することを含む糖結合体に存在する糖基のインビトロシアリル化法を提供する。
【０２４５】
（ＸＩ．改変された糖のペプチド類への結合）
改変された糖類を、結合を媒介する適切な酵素を用いてグリコシル化または非グリコシル化ペプチドまたはタンパク質に結合させる。受容体が消費されるまでグリコシル化が続くように、改変供与体糖（類）、酵素（類）および受容体ペプチド（類）またはタンパク質（類）の濃度が選択されることが好ましい。、下記に考察されているこれらの検討は、シアリルトランスフェラーゼに関して述べられているが、他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に一般に適用可能である。
【０２４６】
所望のオリゴ糖構造を合成するためにグリコシルトランスフェラーゼ用いる多数の方法は公知であり、一般に当該発明に適用可能である。代表的な方法は、例えば、国際公開第９６／３２４９１号、Ｉｔｏら、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３頁（１９９３）、および米国特許第５，３５２，６７０号、米国特許第５，３７４，５４１号および米国特許第５，５４５，５５３号に記載されている。
【０２４７】
幾つかの実施形態において、エンドグリコシダーゼは、グリコシルトランスフェラーゼと組み合わせる反応に用いられる。これらの酵素は、修飾糖のペプチドへの付加前または付加後の任意の時点でペプチドの糖構造を変えるために用いられる。
【０２４８】
別の実施形態において、この方法は、１種以上のエキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼを使用する。このグリコシダーゼは典型的に、グリコシル結合の断裂よりもむしろグリコシル結合を形成するために操作される変異体である。変異体グリカナーゼとしては、典型的に活性部位の酸性アミノ酸残基に対するアミノ酸残基の置換が挙げられる。例えば、エンドグリカナーゼが、エンド−Ｈである場合、置換活性部位残基は、典型的に１３０位のＡｓｐ、１３２位のＧｌｕまたはそれらの組み合わせである。アミノ酸類は、一般にセリン、アラニン、アスパラギン、またはグルタミンにより置換される。
【０２４９】
変異体酵素は、通常、エンドグリカナーゼの加水分解ステップの逆反応に類似している合成ステップにより反応を触媒する。これらの実施形態において、グリコシル供与体分子（例えば、所望のオリゴ糖構造または単糖構造）は、遊離基を含有し、該反応は、タンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基への供与体分子の付加により進行する。例えば、該遊離残基は、フルオリドなどのハロゲンであり得る。他の実施形態において、遊離基は、Ａｓｎ、またはＡｓｎ−ペプチド部分である。そのうえさらなる実施形態において、グリコシル供与体分子のＧｌｃＮＡｃ残基を改変する。例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基は、１，２−オキサゾリン部を含むことができる。
【０２５０】
好ましい実施形態において、本発明の結合体を生成するために利用された各々の酵素は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質濃度ならびに温度、時間およびｐＨ値などの反応条件によって変わる。予め選択された基質濃度および反応条件下で所与の酵素に関する触媒量を決める手段は、当業者に周知である。
【０２５１】
上記方法を実施する温度は、凍結温度のすぐ上から最も感受性のある酵素が変性する温度までの範囲であり得る。好ましい温度範囲は、約０℃〜約５５℃までであり、約２０℃〜約３０℃までがより好ましい。別の典型的な実施形態において、当該方法の１つ以上の構成要素は、好熱性酵素を用いて高温で実施される。
【０２５２】
反応混合物を、グリコシル化される受容体に対して十分な時間維持することにより、所望の結合体を形成する。結合体の幾つかは、２、３時間後に検出できることが多く、回収できる量は、通常、２４時間以内で得られる。反応速度が、多くの可変因子（例えば、酵素濃度、供与体濃度、受容体濃度、温度、溶媒量）に依存し、選択された系について最適化されることを、当業者により理解される。
【０２５３】
本発明はまた、改変ペプチドの産業スケールの製造を提供する。本明細書に使用されるように、産業スケールは、少なくとも１ｇの最終精製結合体を一般に製造する。
【０２５４】
以下の考察において、本発明は、改変シアリン酸部分のグリコシル化ペプチドへの結合により例示される。代表的な改変シアリン酸は、ＰＥＧにより標識される。ＰＥＧ改変シアリン酸およびグリコシル化ペプチドの使用に対する以下の考察の焦点を絞っていることは、説明を明解にするためで、本発明が、これら２つのパートナーの結合に限定されていることを意味する意図はない。当業者は、この考察が、一般にシアリン酸以外の改変グリコシル部分の付加に適用できることを認識している。さらに、この考察は、他の水溶性ポリマー類、治療用部分および生体分子など、ＰＥＧ以外の試薬によるグリコシル単位の改変に等しく適用可能である。
【０２５５】
酵素的アプローチを、ペプチドまたは糖ペプチド上のＰＥＧ化炭水化物またはＰＰＧ化炭水化物の選択的導入に使用できる。該方法では、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはマスクされた反応性官能基を含有する修飾された糖類が利用され、適切なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと組み合わされる。所望の炭水化物結合を作製するグリコシルトランスフェラーゼを選択することにより、また供与体基質として改変糖を利用することにより、ＰＥＧまたはＰＰＧを、ペプチド主鎖上、既存の糖ペプチドの糖残基上、またはペプチドに付加された糖残基上に直接導入することができる。
【０２５６】
シアリルトランスフェラーゼに関する受容体は、天然構造として、または組換え的、酵素的または化学的にそこに配置されたものとして、本発明の方法により修飾されるペプチド上に存在する。好適な受容体としては、例えば、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）などのガラクトシル受容体、および当業者に公知の他の受容体（例えば、Ｐａｕｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７−５６２４頁（１９７８）を参照）が挙げられる。
【０２５７】
一実施形態において、シアリルトランスフェラーゼに関する受容体は、糖ペプチドのインビボ合成の際に改変される糖ペプチド上に存在する。このような糖ペプチドを、糖ペプチドのグリコシル化パターンの前改変をしないで特許請求される方法を用いてシアリル化できる。あるいは、本発明の方法は、好適な受容体を含まないペプチドをシアリル化するのに使用でき；当業者に公知の方法により受容体を含むペプチドを最初に修飾する。代表的な実施形態において、ＧａｌＮＡｃ残基は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用により付加される。
【０２５８】
代表的な実施形態において、ガラクトシル受容体は、ガラクトース残基を、ペプチド、例えばＧｌｃＮＡｃに結合した適切な受容体に結合させることにより組み立てられる。この方法は、ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）、および好適なガラクトシル供与体（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）の好適な量を含有する反応混合物と共に改変するペプチドをインキュベートすることを含む。該反応は、実質的に完了するまで進行させるか、あるいは、予め選択された量のガラクトース残基が加えられたらこの反応を終了させる。選択された糖受容体を組み立てる他の方法は、当業者にとって明らかである。
【０２５９】
さらに別の実施形態において、好適な受容体基質を得るために、糖ペプチド結合オリゴ糖を最初に、全体または部分的に「トリミング」して、シアリルトランスフェラーゼに対する受容体基質、または１つ以上の適切な残基が付加できる部分に曝露させる。グリコシルトランスフェラーゼ類およびエンドグリコシダーゼ類などの酵素（例えば、米国特許第５，７１６，８１２号を参照）は、結合反応およびトリミング反応に有用である。
【０２６０】
改変された糖類のペプチド類またはタンパク質類への結合方法は、例えば、２００１年１０月１０日に出願された米国特許出願第６０／３２８，５２３号；２００２年６月７日に出願された米国特許出願第６０／３８７，２９２号；２００２年６月２５日に出願された米国特許出願第６０／３９１，７７７号；２００２年８月１６日に出願された米国特許出願第６０／４０４，２４９号；および国際公開ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６３号に見られ、それらの各々は、全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【０２６１】
（実施例１：細菌に発現されるラット肝ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのリフォールディング）
（ラット肝ＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ融合タンパク質のリフォールディング）
ラット肝Ｎ−アセチルラクトサミンα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ）を、ｐＧＥＸ−ＫＴ−Ｅｘｔベクターにクローン化し、大腸菌ＢＬ２１細胞内のＧＳＴ−ＳＴ３−Ｇａｌ  ＩＩＩ封入体として発現させた。封入体を、ＧＳＨ／ＧＳＳＧレドックス系を用いてリフォールディングした。リフォールディングされた酵素、ＧＳＴ−ＳＴ３−Ｇａｌ  ＩＩＩを活性であり、シアリン酸をＬＮｎＴ糖基質およびアシアリル化糖タンパク質、例えばトランスフェリンおよび因子ＩＸに移送させた。
【０２６２】
（ＳＴ３−ＧａｌＩＩＩのｐＧＥＸ−ＸＴ−ＫＴベクターへのクローン化）
ラット肝ＳＴ３−ＧａｌＩＩＩ遺伝子を、以下のプライマー：
【０２６３】
【化１】
2007535309.tif 000004
を用いてＰＣＲ増幅後、ｐＧＥＸ−ＫＴ−ＥｘｔベクターのＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１部位にクローン化した。
【０２６４】
（大腸菌ＢＬ２１細胞中のＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの発現）
ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ  ＧＳＴ融合を含んでなる発現ベクターであるｐＧＥＸ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを、化学的にコンピテントな大腸菌ＢＬ２１細胞に形質転換した。単一のコロニーを取り出し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを有する５ｍｌ  ＬＢ培地でインキュベートし、振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。翌日、１ｍｌの一晩培養液を、１リットルの１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを有するＬＢ培地に移した。細菌を、０．７のＯＤ６２０になるまで増殖させ、次いで１５０μＭ  ＩＰＴＧ（最終）を培地に加えた。細菌を、３７℃で１時間から２時間以上増殖させてから、室温に移し、振とうしながら一晩増殖させた。細胞を遠心分離により採取し；細胞ペレットを、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁してフレンチプレスを用いて溶解した。４℃のＳｏｒｖａｌｌ、ＳＳ３４ローター内で１０，０００ＲＰＭで３０分間遠心分離により、溶解性フラクションと不溶性フラクションとを分離した。
【０２６５】
（封入体の精製）
５０ｍｌのＮｏｖａｇｅｎの洗浄用緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を不溶性フラクション、すなわち、封入体（ＩＢ）に加えた。不溶性フラクションをボルテックスしてペレットを再懸濁した。懸濁させたＩＢを、遠心分離し、上記の洗浄用緩衝液に再懸濁することにより少なくとも２回洗浄した。清浄な沈殿物（ＩＢ）を回収し、使用するまで−２０℃で保存した。
【０２６６】
（封入体のリフォールディング）
ＩＢを秤量し（１４４ｍｇ）、Ｇｅｎｏｔｅｃｈ  ＩＢＳ緩衝液（１．４４ｍｌ）に溶解した。懸濁させたＩＢを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの遠心管内で４℃で１時間インキュベートした。不溶性物質を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機の最大スピードでの遠心分離により除去した。可溶化されたＩＢを、４ｍｌの最終容量に希釈した。ＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのリフォールディングを、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＮＤ  ＳＢ−２０１、またはＧＳＨ／ＧＳＳＧレドックス系を含有するリフォールディング用緩衝液中で試験した。１ｍｌの可溶化ＩＢを、リフォールディング溶液にピペッティングすることにより素早く希釈し、３０〜４０秒間激しく攪拌してから、４℃で２時間緩やかに攪拌した。リフォールディングされたＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ溶液の３ｍｌアリコートを、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒｓ（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤａ）を用いて冷ＰＢＳ緩衝液または５０ｍＭトリスＨＣＬ、ｐＨ７．０；１００ｍＭ  ＮａＣＬ；および１％グリセロールを含有する緩衝液に対して透析した。透析後、ＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ溶液を、４℃の４，０００ｒｐｍでＪｏｕａｎ遠心分離機内のＶｉｖａｓｐｉｎ  ５Ｋ（ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ）の濃縮機を用いて３倍、６倍および１２倍に濃縮した。
【０２６７】
リフォールディングおよび透析後、リフォールディングされたＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。約６３〜６４ｋＤａの分子量を有するＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ融合は、全てのリフォールディング条件下で存在した（データは示していない）。
【０２６８】
（リフォールディングされたＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを用いるオリゴ糖のシアリル化）
オリゴ糖基質を用いる酵素アッセイは、ＣＥ−ＬＩＦ（キャピラリ電気泳動−レーザ誘導蛍光）を用いて実施された。リフォールディングされたＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素は、ＬＳＴｄ−ＡＰＴＳ（ラクトシアリン−テトラサッカリド−ｄ−ＡＰＴＳ）を形成するための、ＣＭＰ−ＮＡＮ（シチジン５−モノホスフェート−β−Ｄ−シアリン酸）からＬＮｎＴ−ＡＰＴＳ（ラクト−Ｎ−ネオテトラオース−９−アミノピレン１，４，６−トリスルホン酸）へのシアリン酸の移動能力についてアッセイした。反応は、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ６．５；０．８ｍＭ  ＣＭＰ−ＮＡＮ；２２．１ｍＭ  ＬＮｎＴ；２５μＭ  ＬＮｎＴ−ＡＰＴＳ；２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含有する１００μｌの緩衝液液中９６ウェルのマイクロタイタープレート内で実施した。反応は、２０μｌのリフォールディングされたＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩの３０℃で３０分間の添加により開始された。反応液を、１〜２５倍の水希釈によりクエンチした。希釈反応液を、製造元のガイドに従ってＮ−ＣＨＯでコーティングされたキャピラリを用いてＣＥ−ＬＩＦにより分析した。活性は、ＬＮｎＴ−ＡＰＴＳ対ＬＳＴｄ−ＡＰＴＳの正規化ピーク面積比として算出された。種々のリフォールディング条件を比較した結果を、表２に示している。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ系を用いる２つの追加実験は、表３に示している。
【０２６９】
【表２】
2007535309.tif 000005
【０２７０】
【表３】
2007535309.tif 000006
（リフォールディングされたＧＳＴ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩを用いる糖タンパク質のシアリル化）
２０μＬのアシアリル化トランスフェリン（２μｇ／μＬ）またはアシアリル化因子ＩＸ（２μｇ／μＬ）を、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０μＬの緩衝液と、１０μＬの１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２；１０μＬの２００ｍＭ  ＣＭＰ−ＮＡＮ；および０．０５％のアジ化ナトリウムに加えた。この反応混合物を、３０μＬのリフォールディングされたＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩと共に、２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で一晩以上インキュベートした。反応停止後、製造元のガイドラインに従って、シアリル化タンパク質をｐＨ７〜３のＩＥＦ（等電点電気泳動ゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、Ｃｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅで染色した。トランスフェリンおよび因子ＩＸの双方は、ＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩによりシアリル化された（データは示していない）。
【０２７１】
（ＭＢＰタグに融合されたラット肝ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのリフォールディング）
ラット肝ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘベクターにクローン化し、大腸菌ＴＢ１細胞の封入体において、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合であるＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩとして発現させた。このリフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩは活性であり、ＬＮｎＴ糖基質およびアシアリル化糖タンパク質、例えばアシアロ−トランスフェリンにシアリン酸を移送させた。
【０２７２】
（ＳＴ３−ＧａｌＩＩＩのｐＭＡＬ−ｃ２ｘベクターへのクローン化）
ラット肝ＳＴ３−ＧａｌＩＩＩ核酸を、以下のプライマー：
【０２７３】
【化２】
2007535309.tif 000007
を用いてＰＣＲ増幅後、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘベクターのＢａｍＨ１およびＸｂａＩ部位にクローン化した。
【０２７４】
アミノ酸２８〜３７４をコードする核酸、例えば、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのステム領域および触媒ドメインを、ＭＢＰアミノ酸タグに融合させた。
【０２７５】
ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの３つの他の切断を構築し、ＭＢＰに融合させた。３つのＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ（Δ７３、Δ８５、Δ８６）挿入体は、それぞれ以下
【０２７６】
【化３】
2007535309.tif 000008
を対で用いるＰＣＲにより、単離された。各ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨ１およびＸｈｏ１により消化し、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化のｐＣＷｉｎ２−ＭＢＰ  Ｋａｎｒベクターにサブクローン化し、ＴＢ１細胞に変換し、正しい構築物をスクリーンした。
【０２７７】
ＰＣＲ反応は、以下の条件下で実施された。９５℃で１分間の１サイクル。１μｌのベントポリメラーゼを加えた。以下のサイクルを１０回実施した：９４℃で１分間；６５℃で１分間；および７２℃で１分間。最終の７２℃で１０分後、反応液を４℃に冷却した。
【０２７８】
ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ切断体の全ては、リフォールディング後、活性を有した。下記の実験は、ＭＢＰΔ７３ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ切断体を用いて実施された。
【０２７９】
（大腸菌ＴＢ１細胞中のＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの発現）
ｐＭＡＬ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを、化学的にコンピテントな大腸菌ＴＢ１細胞に形質転換した。ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ構築物を含有する３つの単離コロニーをＬＢ寒天プレートから取り出した。このコロニーを、６０μｇ／ｍｌのカルベニシリンで補充した５ｍｌ  ＬＢ培地中、液体培養物が０．７のＯＤ６２０に達するまで振とうしながら３７℃で増殖させた。２つの１ｍｌアリコートを、各培養液から取り出し、５００μＭ  ＩＰＴＧ（最終）の有り無しの新鮮な培地にインキュベートするために用いた。この培養物を、３７℃で２時間増殖させた。細菌細胞を遠心分離により採取した。全細胞溶解液は、ＳＤＳおよびＤＴＴの存在下、細胞ペレットを加熱して調製した。ＩＰＴＧは、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの発現を誘導した（データは示していない）。
【０２８０】
（ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの発現および封入体の精製）
ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの一晩培養物の１ｍｌアリコートを、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを有する０．５リットルのＬＢ培地中に接種し、０．７のＯＤ６２０まで増殖させた。ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの発現は、０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加、次いで室温で一晩インキュベートすることにより誘導された。翌日細菌細胞を、遠心分離により採取した。細胞ペレットを、７５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４；１００ｍＭのＮａＣｌ；および１％グリセロールを含有する緩衝液に再懸濁した。細菌細胞を、フレンチプレスを用いて溶解した。４℃のＳｏｒｖａｌｌ、ＳＳ３４ローター内で１０，０００ＲＰＭで３０分間の遠心分離により、溶解性フラクションと不溶性フラクションとを分離した。溶解性フラクションと不溶性フラクションとは、４℃のＳｏｒｖａｌｌ、ＳＳ３４ローター内で１０，０００ＲＰＭで３０分間の遠心分離により分離した。
【０２８１】
（封入体の精製およびＧＳＨ／ＧＳＳＧを用いるＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのリフォールディング）
ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ封入体、上記のＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ融合タンパク質に用いられた同じ方法および緩衝液を用いてを精製し、懸濁した。ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩは、上記のＧＳＨ／ＧＳＳＧを用いてリフォールディングされた。リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析用バッグ（ＭＷＣＯ：７ｋＤａ）を用いて冷６５ｍＭトリスＨＣＬ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％グリセロールに対して透析した。リフォールディングされ、透析されたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを、４℃、４，０００ｒｐｍでＪｏｕａｎ遠心分離機内でのＶｉｖａｓｐｉｎ  ５Ｋ（ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ）濃縮機を用いて３倍〜１４倍に濃縮した。リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。８１ｋＤａのＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを検出した（データは示していない）。
【０２８２】
（ＭＢＰ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩ酵素活性のアッセイ）
リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素を、上記のとおり、シアリン酸をＣＭＰ−ＮＡＮからＬＮｎＴ−ＡＰＴＳに移送させてＬＳＴｄ−ＡＰＴＳを形成する能力について分析した。リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩ酵素は活性であり、シアリン酸をＬＮｎＴ−ＡＰＴＳに移送させてＬＳＴｄ−ＡＰＴＳを形成した（データは示していない）。
【０２８３】
リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素を、シアリン酸をＣＭＰ−ＮＡＮから糖タンパク質に移送させる能力について分析した。シアリン酸のアシアロ−トランスフェリンへの移送を、上記のとおり、ＧＳＴ−ＳＴ３−Ｇａｌ  ＩＩＩ酵素についてアッセイした。リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩ酵素は活性であり、シアリン酸をアシアロ−トランスフェリンに移送させた（データは示していない）。リフォールディングされたＧＳＴ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩ酵素およびＭＢＰ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩ酵素は、シアリン酸の可溶性オリゴ糖受容体分子への移送に関して同様の活性を有したが、リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩ酵素は、シアリン酸の糖タンパク質受容体分子への移送についてはより活性であった。
【０２８４】
（ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩをリフォールディングする条件のさらなるアッセイ）
ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを、図１に示された条件を用いてリフォールディングした。緩衝液、レドックス対および界面活性剤（使用の場合）を、可溶化ＩＢの添加前に混合してリフォールディング反応を開始した。ＩＢを１／２０に希釈した。ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのリフォールディングは、別のレドックス対、例えば、１／４、４／１、１／１０，または５／５のモル比でシスタミン２  ＨＣｌ／システインを用いても成功した（データは示していない）。
【０２８５】
（ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素活性のアッセイ）
リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素を、上記のとおり、シアリン酸をＣＭＰ−ＮＡＮからＬＮｎＴ−ＡＰＴＳに移送させてＬＳＴｄ−ＡＰＴＳを形成する能力についてアッセイした。結果を図1に示す。リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩの最も高い活性は、条件８、１１、１３および１６を用いた場合に見られた。リフォールディングを、５ｍｌにスケールアップすると、条件８および１６を用いてリフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩタンパク質が最高の活性を有した（例えば、表を参照）。
【０２８６】
【表４】
2007535309.tif 000009
（アミロースカラムによるＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの精製）
５ｍｌのリフォールディング調製液からリフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質を合わせ、１００ｍＭトリスＨＣＬ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％グリセロールに対して透析した。リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質を、アミロースカラムに適用した。リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質の大部分を、アミロースカラムに結合させ、１０ｍＭマルトースで溶出した。溶出プロフィールを図２に示す。ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩフラクションの酵素活性は、ＬｎＮＴアッセイを用いて判定され、図３に示している。
【０２８７】
（リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩによるアシアロトランスフェリンの糖ＰＥＧ化）
アシアロ−トランスフェリン（２ｍｇ／ｍｌ）を、２３０μｌの反応液中、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ、１．６ｍＭ）またはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ、１．０６ｍＭ）の存在下、リフォールディングされた１００μｌのＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの精製されたフラクションとインキュベートした。糖ＰＥｇ化反応を、３０℃で一晩または３日間実施した。反応液からアリコートを取り出し、４〜２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析した。結果を図４に示す。精製され、リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩは、１０Ｋまたは２０ＫのＰＥＧ化シアリン酸をアシアロ−トランスフェリンに移送させる。
【０２８８】
（大スケールのＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのリフォールディング）
以下の方法は、大スケールのリフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを作製するために使用された。
【０２８９】
ウェットＩＢ（４７０ｍｇ）を、１５ｍｌの培養管内のＩＢ可溶化緩衝液（１３ｍｌ）に溶解した。ＩＢ可溶化緩衝液は、以下のものを含んでいる：４ＭグアニジンＨＣｌ；１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ９；および１００ｍＭのＮａＣｌ。ＩＢを、ＩＢ可溶化緩衝液中、４℃で約１時間緩やかに振とうさせながらインキュベートした。不溶性物を、１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管内で、４℃、最大スピードで３０分間の遠心分離により除去した。可溶化ＩＢを清浄な管に移し、２８０ｎｍの吸光度を用いてタンパク質濃度を測定した。
【０２９０】
以下のリフォールディング溶液を調製し、４℃に維持した：５５ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５；２６４ｍＭのＮａＣｌ；１１ｍＭのＫＣｌ；０．０５５％のＰＥＧ５５０；５５０ｍＭのアルギニン。緩衝液は、可溶化ＩＢの添加直前に、０．３ｍＭのラウリルマルトシド（ＬＭ）；０．１ｍＭの酸化グルタチオン；１ｍＭの還元グルタチオンにより補足された。２ｍｌの可溶化ＩＢを、５０ｍｌ滅菌培養管内の４３ｍｌのリフォールディング緩衝液中に加えた。この管をロッカー−シェーカ上に置き、４℃で２４時間緩やかに振とうさせた。リフォールディングされたタンパク質を、透析管（ＭＷＣＯ：７ｋＤ）中、透析用緩衝液（１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；５％グリセロール中）に対して２回（１０〜２０容量過剰の緩衝液）透析した。
【０２９１】
大スケール透析のリフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩをＳＴ３ＧａｌＩＩＩ活性について分析し、約５３．６Ｕ／ｇ  ＩＢを示した。
【０２９２】
（実施例２：リフォールディングを増強させるためのヒトＧｎＴＩの部位特異的変異誘発）
切断ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（１０３のアミノ末端アミノ酸が欠失された）は、マルトース結合融合タンパク質（ＧｎＴＩ／ＭＢＰ）として大腸菌に発現した。この融合タンパク質は、不溶性であり、封入体に発現された。可溶化およびリフォールディング後、ＧｎＴＩ／ＭＢＰ融合タンパク質は、活性が低かった。ウサギＧｎＴＩ（１０５のアミノ末端アミノ酸が欠失された）の切断型の結晶構造は、活性部位近辺に不対システイン残基を示す（例えば、Ｕｎｌｉｇｉｌら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：５２６９−５２８０（２０００）を参照）。ヒトＧｎＴＩ中の対応する不対システインは、ＣＹＳ１２１として同定され、サイズおよび化学的特性が類似する一連のアミノ酸により置換された。使用されたアミノ酸としては、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アラニン（Ａｌａ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ）が挙げられる。さらに、二重変異体、ＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳもまた作製された。変異体ＧｎＴＩ／ＭＢＰ融合タンパク質は、大腸菌で発現され、リフォールディングされ、糖タンパク質に対するＧｎＴＩ活性についてアッセイされた。
【０２９３】
変異誘発は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを用いて行われた。さらなる制限部位は、幾つかのＧｎＴＩ変異により導入された。例えば、ＡｐａＩ部位
【０２９４】
【化４】
2007535309.tif 000010
は、ＧｎＴ１  ＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳ変異体、すなわち、
【０２９５】
【化５】
2007535309.tif 000011
（太字が変化）に導入された。以下の変異誘発性オリゴ糖は、二重変異体：
【０２９６】
【化６】
2007535309.tif 000012
（太字が変化を示す）を作製するために用いられた。ＡｓｃＩ部位
【０２９７】
【化７】
2007535309.tif 000013
は、ＧｎＴ１  ＣＹＳ１２１ＡＬＡ変異体、すなわち、
【０２９８】
【化８】
2007535309.tif 000014
（太字が変化）に導入された。以下の変異誘発性オリゴ糖ヌクレオチドは、ＧｎＴ１  ＣＹＳ１２１ＡＬＡ変異体を作製するために用いられた：
【０２９９】
【化９】
2007535309.tif 000015
大腸菌に発現された変異体タンパク質の活性を、バキュロウィルスに発現された野生型ＧｎＴ１の活性と比較した。ＣＹＳ１２１ＳＥＲ  ＧＮＴＩ変異体は、ＴＬＣベースアッセイにおいて活性であった。対照的に、ＣＹＳ１２１ＴＨＲ変異体は、検出可能な活性が無く、ＣＹＳ１２１ＡＳＰ変異体は、活性が低かった。ＣＹＳ１２１ＡＬＡ変異体は、非常に活性であり、二重変異体、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧｎＴ１タンパク質（Ｇｌｙ１４）のアミノ酸配列に基づくＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳもまた、ＧｌｃＮＡｃの糖タンパク質への移送などの活性を示した。アミノ酸およびＧｎＴ１変異体の核酸配列のコード化は、図７〜１１に示している。
【０３００】
第２のＧｎＴ１切断が成され、ＭＢＰに融合された：ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ３５）。図３５は、ＭＢＰ−ＧｎＴ１融合タンパク質の図式を示しており、切断体、例えば、Δ１０３またはΔ３５、およびＣｙｓ１２１Ｓｅｒ変異（上部）を描いている。この図の下側は、完全長ヒトＧｎＴ１タンパク質を示している。Ｃｙｓ１２１の変異体もまた、ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ３５）タンパク質において作製された。
【０３０１】
双方の融合タンパク質は、大腸菌に発現され、双方ともＲＮＡｓｅ  Ｂ糖タンパク質のリモデリング活性を有した。図３６の右のパネルには、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧｎＴ１融合タンパク質：ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ３５）Ｃ１２１Ａ、ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ１０３）Ｒ１２０Ａ＋Ｃ１２１Ｈ、およびＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ１０３）Ｃ１２１Ａを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを提供している。左のパネルは、異なる時点でリフォールディングされたＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ３５）Ｃ１２１Ａの２つの異なるバッチ（Ａ１とＡ２）のＲＮＡｓｅＢ糖タンパク質のリモデリング活性を示す。ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ１０３）Ｃ１２１Ａはまた、ＲＮＡｓｅＢ糖タンパク質をリモデリングした。データは示していない。
【０３０２】
（実施例３：ＧａｌＴ１にＭＢＰの融合）
切断されたウシＧａｌＴ１とＭＢＰとの間の以下の融合が構築された：ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ１２９）ｗｔ、（Ｄ７０）ｗｔまたは（Ｄ１２９Ｃ３４２Ｔ）（完全長ウシ配列に関して、例えば、Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１−２１７（１９８９）および登録番号ＣＡＡ３２６９５を参照）。構築物の各々は、リフォールディング後に活性があった。完全長ウシＧａｌＴ１タンパク質のアミノ酸配列は、図３０に提供される。この変異体は、対照タンパク質ＧａｌＴ１（４０）（Ｓ９６Ａ＋Ｃ３４２Ｔ）と共に図３１に図式的に描く。例えば、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３７６６６−３７６７１頁（２００１）を参照されたい。
【０３０３】
ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）は、大腸菌株ＪＭ１０９に発現された。ＩＰＴＧと一晩誘導後、細胞がフレンチプレスを用いて溶解した後、封入体は、不溶性ペレットから単離された。ＩＢを２回洗浄してから、４ＭのＧｎｄＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ９．０に溶解された。リフォールディングは、ｐＨ６．５でＧＳＳＨ／ＧＳＨ（１０／１）と共にリフォールディング用緩衝液への希釈（１／２０、０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌタンパク質）に次いで、振とうすることなく４℃で一晩インキュベートすることにより行われた。リフォールディングされたタンパク質は、５０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ８．０に対して２回（ＭＷＣＯ：７ｋＤ）透析された。透析されたＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）タンパク質は、アミロースカラムに乗せて；洗浄し；１０ｍＭのマルトースにより溶出した。
【０３０４】
ＧａｌＴ１活性は、受容体としてオリゴ糖を用いてアッセイされた。酵素的アッセイは、ＨＰＬＣ／ＰＡＤ（パルス電流測定検出を有する高性能液体クロマトグラフィ）を用いて実施された。ＧａｌＴＩ酵素によるＵＤＰ−Ｇａｌ（ウリジン５’−ジホスホガラクトース）を用いて、ＬＮＴ２（ラクト−Ｎ−トリオース−２）のＬＮｎＴ（ラクト−Ｎ−ネオテトラオース）への変換は、以下のとおり実施した。この反応は、６ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌ、５ｍＭのＬＮＴ−２、５ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する１００μｌの５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７緩衝液と、１００μｌのリフォールディングされた酵素との中で３７℃で６０分間実施された。この反応を水によりクエンチし（１倍〜１０倍希釈）、１０，０００ＭＷＣＯスピンフィルタを通して遠心分離した。次にろ液を１倍〜１０倍希釈した。この希釈反応液を、Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＸ−５００システムおよびＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラムを用いて水酸化ナトリウム緩衝液によるＨＰＬＣによって分析した。サンプル生成物のピーク面積を、ＬＮｎＴの検量線と比較し、この活性は、反応液中の酵素の１μｌにつき１分当り生成されたＬＮｎＴ量を基準にして算出された。
【０３０５】
精製されたＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）タンパク質は、受容体分子として溶解性オリゴ糖および糖タンパク質（例えば、ＲＮＡｓｅＢ）双方を用いて活性を有した。結果を図３２および図３３に示す。ＲＮＡｓｅＢリモデルリングアッセイにおいて、ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）は、大腸菌にも発現され、リフォールディングされたウシＧａｌＴ１タンパク質の非融合切断体である、対照タンパク質ＧａｌＴ１（４０）（Ｓ９６Ａ＋Ｃ３４２Ｔ）と比較した。ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）タンパク質は、ＲＮＡｓｅＢ糖タンパク質に対してＧａｌＴ１（４０）（Ｓ９６Ａ＋Ｃ３４２Ｔ）よりも活性があった。ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ１２９）切断体もまた、ＲＮＡｓｅＢ糖タンパク質に対してＧａｌＴ１（４０）（Ｓ９６Ａ＋Ｃ３４２Ｔ）タンパク質よりも活性があった（データは示していない）。
【０３０６】
ＲＮＡｓｅＢのグリコシル化に関して、リフォールディングされ、精製されたＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）の反応速度論を測定し、哺乳動物の細胞系で発現されたウシＧａｌＴ１タンパク質の溶解性形態であるＮＳＯ  ＧａｌＴ１と比較した。図３４に示されるように、リフォールディングされ、精製されたＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）は、ＮＳＯ  ＧａｌＴ１タンパク質と比較して反応速度論が改善された。
【０３０７】
（実施例４：複数グリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングするワンポット法）
真核生物のＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素、ＧａｌＴ１酵素、およびＧｎＴ１酵素は、糖タンパク質上にＮ−グリカン鎖を構築する。さらなる改変について、例えば、糖ＰＥＧ化は、供与体基質としてＣＭＰ−ＮＡＮ−ＰＥＧを用いて実施できる。真核生物のＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素、ＧａｌＴ１酵素、およびＧｎＴ１酵素は、典型的に真核生物発現系、例えば、真菌細胞または哺乳動物細胞で発現する。
【０３０８】
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）ドメインに融合された真核生物のＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素、ＧａｌＴ１酵素、およびＧｎＴ１酵素の各々は、単独容器中、可溶化され、合わされ、一緒にリフォールディングされる。融合ＭＢＰ酵素およびリフォールディングされたＭＢＰ酵素は、活性であり、Ｎ−グリカン類を糖タンパク質または糖ＰＥＧ化糖タンパク質に付加させるために使用された。このリフォールディング用緩衝液は、レドックス対、例えば、酸化／還元グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）を含んだ。リフォールディングは、アルギニンおよびポリエチレングリコール３３５０（ＰＥＧ）の添加により増強された。ＩＢを、個々に可溶化でき、種々の割合でリフォールディング用緩衝液に加えるか、またはＩＢから一緒に可溶化でき、リフォールディング用緩衝液に直接加えることができる。これらの酵素のワンステップ精製または固定化もまた、ＭＢＰ融合タグを用いて行うことができる。
【０３０９】
（リフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼ混合物（ＳｕｐｅｒＧｌｙｃｏＭｉｘ）の調製）
（グリコシルトランスフェラーゼＩＢの調製）
真核生物のＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素、ＧａｌＴ１酵素、およびＧｎＴ１酵素を産生するために使用される細菌株を、表５に示す。この表はまた、ＭＢＰ融合タンパク質の推定分子量を示す（アミノ酸組成物に基づくＭＷ、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェア）。真核生物の酵素をコードする全ての核酸は、ＩＰＴＧ誘導性発現ベクターから発現された。
【０３１０】
【表５】
2007535309.tif 000016
大腸菌培養液のＩＰＴＧ誘導後、ＧｎＴ１酵素、ＧａｌＴ１酵素およびＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素は、フレンチプレスを用いる細胞溶解または界面活性剤の溶解（ＮｏｖａｇｅｎのＢｕｇｂｕｓｔｅｒ試薬）により単離された。前述のとおり、遠心分離後、ペレットを回収し、処理してＩＢを得た。ＩＢは、ＮｏｖａｇｅｎのＩＢ洗浄用緩衝液を用いて少なくとも２回洗浄した。洗浄されたＩＢは、リフォールディング実験での使用準備段階まで−２０℃で保存した。
【０３１１】
ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、ＧａｌＴ１、およびＧｎＴ１を含有するＩＢは別々に、６ＭのグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液に４℃で１時間溶解した。透明な上澄液は、遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆのミクロ遠心分離における最大スピード）後得られた。可溶化ＩＢのタンパク質含量は、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより定量された。表６のタンパク質含量は、各ＭＢＰ−グリコシルトランスフェラーゼの吸光係数に基づいて定量された。この吸光係数は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴｉソフトウェアを用いて算出された（表５を参照）。
【０３１２】
【表６】
2007535309.tif 000017
（グリコシルトランスフェラーゼ類のワンポットリフォールディング）
可溶化ＩＢを、表７に示されたように等量で混合した。
【０３１３】
【表７】
2007535309.tif 000018
全可溶化ＩＢ混合物のタンパク質濃度は、４．５ｍｇ／ｍｌであった。この混合物を、リフォールディング用緩衝液中、約１／２０に希釈して、全タンパク質混合物の最終濃度を０．２２ｍｇ／ｍＬにさせた。リフォールディング用緩衝液は、５５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５；５５０ｍＭのアルギニン；０．０５５％のＰＥＧ３３５０；２６４ｍＭのＮａＣｌ；１１ｍＭのＫＣｌ；１ｍＭのＧＳＨ；および０．１ｍＭのＧＳＳＧを含有した。リフォールディングはまた、トリスＨＣｌ、ｐＨ８．２の緩衝液中で実施でき、システイン／シスタミンレドックス対は、ＧＳＨ／ＧＳＳＧに代えることができる。ＩＢ混合物を、リフォールディング用緩衝液中に希釈し、４℃で一晩（１６〜１８時間）インキュベートした。リフォールディング反応におけるグリコトランスフェラーゼ類の推定濃度は：
ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ                        ０．０８１ｍｇ／ｍＬ
ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Δ１２９）Ｃ３４２Ｔ          ０．０８１ｍｇ／ｍＬ
ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Δ１０３）Ｃ１２１Ａ            ０．０６２ｍｇ／ｍＬ
である。
【０３１４】
一晩リフォールディング後、リフォールディングされたグリコトランスフェラーゼ混合物は、カオトロピック剤（すなわち、グアニジンＨＣｌ）を除くために透析した。透析は、透析用バッグ（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ、ＭＷＣＯ：７ｋＤ、Ｐｉｅｒｃｅ）中、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して４℃で２回（１回の透析につき２０倍）実施した。この透析済のリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼ混合物（Ｓｕｐｅｒｇｌｙｃｏｍｉｘ、ＳＧＭ）を、６ｍＬのＶｉｖａＳｐｉｎ（ＭＷＣＯ：１０ｋＤ）遠心濃縮器を用いて６倍に濃縮した。濃縮後、３種の糖タンパク質の全ては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定すると、混合物中に存在した（データは示さず）。ＳＧＭを濃縮後、ＧｎＴ１、ＧａｌＴ１およびＳＴ３ＧａｌＩＩＩの酵素活性が判定された。
【０３１５】
（ＳｕｐｅｒＧｌｙｃｏＭｉｘの酵素活性）
Ｓｕｐｅｒｇｌｙｃｏｍｉｘ（ＳＧＭ）、ワンポットでリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼ混合物は、３種のグリコシルトランスフェラーゼ：ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、ＧａｌＴ１、およびＧｎＴ１を含有する。これらの酵素は、個々に酵素活性についてアッセイし、下記の方法を用いて分析した。酵素活性は、表８に掲げている。
【０３１６】
（ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素活性のアッセイ）
ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのアッセイは、ＨＰＬＣ／ＵＶ（紫外検出器付き高性能液体クロマトグラフィ）を用いて実施された。ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素によるＣＭＰ−ＮＡＮ（シチジン５’−モノホスフェート−β−Ｄ−シアリン酸）を用いたＬＮｎＴ（ラクト−Ｎ−ネオテトラオース）のＬＳＴｄ（ラクトシアリン−テトラサッカリド−ｄ）への変換を、以下のとおり実施した。この反応は、２ｍＭのＣＭＰ−ＮＡＮ、３０ｍＭのＬＮｎＴ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する１００μｌの２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ６．５緩衝液および２０μｌのリフォールディングされた酵素中、９６ウェルマイクロタイタープレート内で３７℃で２０分間実施された。該反応は、９８℃に１分間加熱することによりクエンチした。このマイクロタイタープレートは、沈殿物をいずれもペレットにするため３６００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。７５μｌの上澄液を、７５μｌの水で１：１に希釈した。希釈反応液を、ＹＭＣ−パックポリアミンＩＩカラムを用いてリン酸ナトリウム緩衝液／アセトニトリル勾配および２００ｎｍでの検出によるＬＣ／ＵＶによって分析した。サンプル生成物のピーク面積を、ＬＳＴｄ検量線と比較し、この活性を、反応液中の酵素１μｌにつき１分当りに産生されたＬＳＴｄ量を基準にして算出した。
【０３１７】
（ＧａｌＴ１酵素活性アッセイ）
酵素アッセイは、ＨＰＬＣ／ＰＡＤ（パルス電流測定検出付高性能液体クロマトグラフィ）を用いて実施された。ＧａｌＴＩ酵素によるＵＤＰ−Ｇａｌ（ウリジン５’−ジホスホガラクトース）を用いるＬＮＴ２（ラクト−Ｎ−トリオース−２）のＬＮｎＴ（ラクト−Ｎ−ネオテトラオース）への変換を、以下のとおり実施した。該反応は、６ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌ、５ｍＭのＬＮＴ−２、５ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する１００μｌの５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７緩衝液および１００μｌのリフォールディングされた酵素中、３７℃で６０分間実施された。該反応は、水（１倍〜１０倍希釈）でクエンチし、１０，０００ＭＷＣＯスピンフィルタにより遠心分離した。次いでろ液を、１倍〜１０倍希釈した。この希釈反応液は、Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＸ−５００システムおよびＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラムを用いて水酸化ナトリウム緩衝液によるＨＰＬＣによって分析した。サンプル生成物のピーク面積を、ＬＮｎＴの検量線と比較し、この活性は、反応液中の酵素の１μｌにつき１分当り生成されたＬＮｎＴ量を基準にして算出された。
【０３１８】
（ＧｎＴＩ酵素活性アッセイ）
ＧｎＴＩの活性は、ＵＤＰ−３Ｈ−ＧｌｃＮＡｃ（ウリジンジホスフェートＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン［６−３Ｈ（Ｎ）］）から、オクチル尾部をもつトリマンノシルコアである、ｎ−オクチル３，６−ジ−Ｏ−（α−マンノピラノシル）β−Ｄ−マンノピラノシド（ＯＭ３）へのトリチウム化糖の移送を測定するこよにより判定される。該反応は、３ｍＭのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、０．１ｍＭのＵＤＰ−３Ｈ−ＧｌｃＮＡｃ、０．５ｍＭのＯＭ３、２０ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する２０μｌの１００ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０緩衝液および１０μｌのリフォールディングされた酵素中、３７℃で６０分間実施した。該反応は水（１倍から６倍希釈）でクエンチし、製造元の推奨に従って先に調節された９６ウェルフォーマット中のポリマー逆相樹脂に適用した。この樹脂を２００μｌの水で２回洗浄し、生成物を、５０μｌの１００％ＭｅＯＨにより捕捉プレートに溶出した。シンチレーション液（２００μＬ）を各ウェルに加え、プレートを混合し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴマイクロプレートシンチレーションカウンターを用いてカウントした。この活性は、反応液中の酵素の１μｌにつき１分当り生成物に取り込まれた３Ｈ−ＧｌｃＮＡｃ量を基準にして算出された。
【０３１９】
【表８】
2007535309.tif 000019
上記表に報告された活性は、これらの酵素が別々にリフォールディングされた場合、接近しているかまたはその範囲である。ＧｎＴ１活性およびＧａｌＴ１活性は、哺乳動物発現系またはバキュロウィルス発現系を用いて得られたものに近い。ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ活性は、真菌発現系後に得られたＳＴ３ＧａｌＩＩＩ調製物よりも幾らか低かった。本明細書に用いられたＳＴ３ＧａｌＩＩＩアッセイは、該手法から変更され、値は、ＣＥ−ＬＩＦ（キャピラリ電気泳動−レーザ誘導蛍光）に基づく方法で得られたものよりも約１／４〜１／５倍と報告された。
【０３２０】
（Ｓｕｐｅｒｇｌｙｃｏｍｉｘを用いるＲＮＡｓｅＢ−Ｍａｎ５のリモデリング）
小型糖タンパク質である、１つのＮ結合Ｍａｎ５糖をもつＲＮＡｓｅＢを、ＵＤＰ−糖（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−Ｇａｌ）の存在下、ＳＧＭによりリモデリングした。このリモデリング反応を、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃまたはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−Ｇａｌの双方を用いて実施し、ＧｎＴ１およびＧａｌＴ１双方の活性を試験した。８μｌのＳＧＭを、２５μｌのアッセイ中、５ｍＭのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、および／または５ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌ、９μｇのＲＮＡｓｅＢＭａｎ５、５ｍＭのＭｅＣｌ２を含有する１０ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５に加えて、３３℃で一晩から４８時間インキュベートした。この反応の終末に、１０μｌのアリコートを、Ｈ２Ｏに対して透析し、１．５μｌのサンプルを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプレート上にスポットした。ＴＦＡおよびシンナピン酸で処理後、サンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ上で分析した。
【０３２１】
ＲＮＡｓｅＢＭａｎ５のリモデリングは、ＲＮＡｓｅＢのＭａｎ５上にＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌを移送させることによって行われた。３３℃で４８時間のインキュベート後、リモデリングされたＲＮＡｓｅＢ−Ｍａｎ５のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルが示すように、大部分のＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌのＲＮＡｓｅＢ上への移送を達成した。結果は表９に要約されている。
【０３２２】
【表９】
2007535309.tif 000020
（ＳＧＭを用いる糖ＰＥＧ化ＥＰＯのリモデリング）
糖ＰＥＧ化（２０Ｋ）は、以下の成分：１０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５、５ｍＭのＭｇＣＬ２、５ｍＭのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、０．５ｍＭのＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）、２４μｇのＥＰＯ、８μＬの濃縮ＳＧＭ、からなるワンポット反応において実施された。対照反応において、ＳＧＭは、哺乳動物細胞または昆虫細胞またはアスペルギルス属においてリフォールディングされたか、または発現された個々の酵素によって取替えられた。一晩インキュベート後、該反応液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析された。結果は図５に示す。ＳＧＭは、２０ＫＰＥＧをＥＰＯに加えた。
【０３２３】
（複数グリコシルトランスフェラーゼに対するワンポットリフォールディング条件の評価）
複数グリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする条件は、ｐＨおよび一度に２種または３種の酵素をリフォールディングすることを含めて評価された。
【０３２４】
（グリコシルトランスフェラーゼ封入体の調製）
グリコシルトランスフェラーゼ発現プラスミドにより形質転換された大腸菌株は、一例を除いて先に記載された。ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩは、ｐＣＷｏｒｉ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩプラスミドからＪＭ１０９細胞において発現された。前述のとおり、この封入体を単離し、可溶化させた。タンパク質含量は、上述のとおり評価し、表１０に示す。
【０３２５】
【表１０】
2007535309.tif 000021
（グリコシルトランスフェラーゼＩＢ混合物のワンポットリフォールディング）
タンパク質含量の測定後、可溶化ＩＢを、リフォールディング用緩衝液に希釈される前に示された量で混合した（表１１）。ＧＴのリフォールディング実験は、緩衝液ＡまたはＢ（下記）、ならびに０．１ｍＭのＧＳＳＧおよび１ｍＭのＧＳＨを用いて静置して４℃、４４ｍｌの容量中で実施された。緩衝液Ａ：１ｍＭのＧＳＨ、０．１ｍＭのＧＳＳＧを補充した、５５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５、５５０ｍＭのアルギニン、０．０５５％のＰＥＧ３３５０、２６４ｍＭのＮａＣｌ、１１ｍＭのＫＣｌ。
緩衝液Ｂ：１ｍＭのＧＳＨ、０．１ｍＭのＧＳＳＧを補充した、５５ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８、５５０ｍＭのアルギニン、０．０５５％のＰＥＧ３３５０、２６４ｍＭのＮａＣｌ、１１ｍＭのＫＣｌ。
【０３２６】
【表１１】
2007535309.tif 000022
二重リフォールディング（２×、２種のグリコシルトランスフェラーゼ）に関して、２ｍｌ中１０ｍｇの全タンパク質を、４１ｍＬのリフォールディング用緩衝液（上記）、０．４５ｍＬの１００ｍＭのＧＳＨ、０．４５ｍＬの１０ｍＭのＧＳＳＧに加え、希釈後、全タンパク質が０．４４ｍｇ／ｍｌになった。三重リフォールディング（３×、３種のグリコシルトランスフェラーゼ）に関して、２ｍｌ中１８．７ｍｇの全タンパク質を、４１ｍＬのリフォールディング用緩衝液（上記）、０．４５ｍＬの１００ｍＭのＧＳＨ、０．４５ｍＬの１０ｍＭのＧＳＳＧに加え、希釈後、全タンパク質が０．８３ｍｇ／ｍｌになった。タンパク質濃度は、以前の三重リフォールディング実験（ＳＧＭ中０．２２ｍｇ／ｍＬ）よりも高かった。リフォールディング反応におけるグリシルコトランスフェラーゼ類の推定濃度は：
ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ                        ０．３９ｍｇ／ｍＬ
ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Δ１２９）Ｃ３４２Ｔ          ０．２３ｍｇ／ｍＬ
ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Δ１０３）Ｃ１２１Ｓ            ０．２３ｍｇ／ｍＬ
である。
【０３２７】
一晩リフォールディング後、リフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼ混合物を透析した。透析は、透析用バッグ（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ、ＭＷＣＯ：７ｋＤ、Ｐｉｅｒｃｅ）中、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して４℃で２回実施した。透析後、グリコシルトランスフェラーゼ混合物を、６ｍＬのＶＩＶＡ−Ｓｐｉｎ（ＭＷＣＯ：１０Ｋ）遠心濃縮器を用いて９〜１２倍に濃縮した。
【０３２８】
タンパク質は、リフォールディング、透析、および濃縮後に存在したことをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により立証した。
【０３２９】
（リフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼ混合物の酵素アッセイ）
酵素アッセイを上記のとおり実施した。結果を表１２に示す。
【０３３０】
【表１２】
2007535309.tif 000023
最高の活性は、ＭＢＰ融合ＧｎＴ１およびＧａｌＴ１を等量で混合して緩衝液Ｂ中でリフォールディングされた際に見られた。ＭＢＰ融合ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの非等量の添加は、タンパク質の全量が高いためリフォールディング効率に影響を及ぼした。それにもかかわらず、２種のＧＴまたは３種のＧＴのいずれかを用いた２つの異なるリフォールディング用緩衝液は、活性な溶解性タンパク質を得るために使用できる。
【０３３１】
（実施例５：真核生物のＧａｌＮＡｃＴ２のリフォールディング）
切断されたヒトＧａｌＮＡｃＴ２酵素を、大腸菌で発現し、上記の方法を用いる可溶化およびリフォールディングのための最適条件を決めるために使用した。完全長ヒトＧａｌＮＡｃＴ２核酸およびアミノ酸配列は、図１３Ａおよび１３Ｂに提供されている。変異体タンパク質ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の配列は、図１４Ａおよび１４Ｂに示している。この変異体を、ＭＢＰ融合タンパク質ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）として大腸菌で発現した。他のＧａｌＮＡｃＴ２変異体を作製し、大腸菌で発現し、リフォールディングすることが可能であった：ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ４０）、ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ７３）、およびＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ９４）。データは示していない。さらなる欠失変異体の構築の詳細は、２００４年６月３日に出願された米国特許出願第６０／５７６，５３０号、および２００４年８月３日に出願された米国特許出願第６０／５９８，５８４号に見られ、それら双方は、全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている。
【０３３２】
ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を発現する細菌培養物を増殖し、上記のとおり収穫した。封入体を、上記のとおり細菌から精製した。封入体の可溶化を、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で実施した。可溶化後、ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）タンパク質を、緩衝液ＡおよびＢを用いてｐＨ６．５またはｐＨ８．０のいずれかでリフォールディングした。すなわち、緩衝液Ａ：１ｍＭのＧＳＨ、０．１ｍＭのＧＳＳＧで補充した、５５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５、５５０ｍＭのアルギニン、０．０５５％のＰＥＧ３３５０、２６４ｍＭのＮａＣｌ、１１ｍＭのＫＣｌ；および緩衝液Ｂ：１ｍＭのＧＳＨ、０．１ｍＭのＧＳＳＧを補充した、５５ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８、５５０ｍＭのアルギニン、０．０５５％のＰＥＧ３３５０、２６４ｍＭのＮａＣｌ、１１ｍＭのＫＣｌ、リフォールディング後、ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）タンパク質を透析してから濃縮した。図１５は、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化およびｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後のリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）のタンパク質濃縮の実施を提供している。
【０３３３】
放射標識［３Ｈ］−ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃアッセイは、放射標識ＧａｌＮＡｃのペプチド受容体への付加をモニタリングすることにより、大腸菌発現のリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の活性を測定するために実施された。この受容体は、配列ＭＶＴＰＴＰＴＰＴＣを有するＭｕＣ−２様ペプチドであった。該ペプチドは、１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０に溶解した。例えば、２００４年６月３日に出願された米国特許出願第６０／５７６，５３０号；および２００４年８月３日に出願された、米国仮特許出願の代理人事件整理番号０４０８５３−０１−５１４９−Ｐ１に見られ、それら双方は、全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている。図１６は、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化およびｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後のリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の酵素活性の実施を提供している。図１７は、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化およびｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後のリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の比活性の実施を提供している。最高活性レベルは、ｐＨ８．０で可溶化およびｐＨ８．０でリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）に見られた。最高比活性レベルもまた、ｐＨ８．０で可溶化およびｐＨ８．０でリフォールディングに見られた。
【０３３４】
可溶化およびリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を、ＧａｌＮＡｃをＧ−ＣＳＦタンパク質に付加させる能力についてアッセイした。このアッセイは、酵素のアリコートおよび反応緩衝液（２７ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ＝７、２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＭｎＣｌ２、および０．１％のＴｗｅｅｎ８０）、Ｇ−ＣＳＦタンパク質（Ｈ２Ｏ中２ｍｇ／ｍｌ）、ならびに１００ｍＭのＵＧＰ−ＧａｌＮＡｃから構成された。各リフォールディングされたサンプルに関して、４．４μＬのサンプルを、１５μＬの反応溶液に加えた。陽性対照に関して、１μＬの標準的ＧａｌＮＡｃＴ２バキュロウィルスを、１つの管に３．４μＬのＨ２Ｏと一緒に加えた。反応液を３２℃でロータリーシェーカ上で数日間インキュベートし、その期間、一晩の時点および５日目の時点でＭＡＬＤＩによりアッセイした。例えば、２００４年６月３日に出願された米国特許出願第６０／５７６，５３０号；および２００４年８月３日に出願された、米国仮特許出願の代理人事件整理番号０４０８５３−０１−５１４９−Ｐ１に見られ、それら双方は、全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている。
【０３３５】
図１８Ａおよび１８Ｂは、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化およびｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後のリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を用いて組換え果粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）のリモデリング結果を提供している。陽性対照、すなわち、バキュロウィルスで発現された精製ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）、および陰性対照、すなわち、基質を欠いた反応混合物を含んだ。ＧＣＳＦリモデリング活性の最高レベルは、ｐＨ８．０で可溶化およびｐＨ８．０でリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を用いた際に見られた。
【０３３６】
（実施例６：真核生物ＧａｌＮＡｃＴ２のリフォールディングおよび精製）
組換えＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を発現する４リットルの細菌を増殖させ、収穫した。封入体を単離し、洗浄し、２グラムの乾燥重量の封入体を、２００ｍＬの可溶化緩衝液（７Ｍの尿素／５０ｍＭのトリス／１０ｍＭのＤＴＴ／５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中、４℃で可溶化した。可溶化後、次にこの混合物を、４Ｌのリフォールディング用緩衝液（５０ｍＭのトリス／５５０ｍＭのＬ−アルギニン／２５０ｍＭのＮａＣｌ／１０ｍＭのＫＣｌ／０．５％のＰＥＧ３３５０／４ｍＭのＬ−システイン／二塩酸シスタミン、ｐＨ８．０）に希釈した。リフォールディングは、攪拌しながら４〜１０℃で約２０時間実施した。次にこの混合物を、１０ＳＰ  ＣＵＮＯフィルターを用いてろ過し、４ｆｔ２膜上で５倍に濃縮し、ｐＨ８．０で１０ｍＭのトリス／５ｍＭのＮａＣｌにより４回ダイアフィルトレーションした。最終的なリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）溶液の導電率は、１．４ｍＳ／ｃｍであった。リフォールディングされたタンパク質を、４℃で数日間保存した。
【０３３７】
リフォールディングされたタンパク質を、ＱセファロースＸＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に適用した。溶出プロフィールは、図１９に示され、具体的なカラムフラクションの酵素活性は、図２０に示される。活性なフラクション合わせ、ヒドロキシアパタイトタイプＩ（８０μｍ）（Ｂｉｏｒａｄ、カリフォルニア州ヘルクレス）カラムに適用した。溶出プロフィールは、図２１に示され、ＨＡタイプＩに溶出されたフラクションの活性は、図２２に示される。ＱＸＬとＨＡタイプＩクロマトグラフィの組み合わせにより、活性な高精製ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を生じた。
【０３３８】
（実施例７：真核生物ＭＢＰ−ＳＢＤ  ＳＴ３Ｇａｌ３の精製）
Δ７３  ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ切断を、マルトース結合タンパク質および澱粉結合ドメインにインフレームで融合させて二重タグ化タンパク質：ＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ３（Δ７３）を形成した。ＭＢＰは、アミノ末端にあり、次いでＳＢＤ、次に切断ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質があった。ＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ３（Δ７３）のリフォールディングおよび精製を、単独のタグタンパク質：ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（Δ７３）と比較した。両タンパク質は、不溶性封入体として大腸菌で発現され、本明細書に記載されたとおり可溶化、リフォールディングされた。次にこのタンパク質を透析し、ＭＢＰおよびＳＢＤ双方のタグに結合するシクロデキストリンカラムを用いてアフィニティー精製に供された。結果を表２３に示す。ＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ３（Δ７３）タンパク質は、透析後、より高い比活性があり、カラムからシクロデキストリンによる溶出後、さらに比活性を保持した。
【０３３９】
（実施例８：ＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ１およびＭＢＰＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質のリフォールディング）
真核生物のＳＴ３Ｇａｌ１を、ＭＰＢまたはＭＢＰおよびＳＢＤに融合させた。ブタＳＴ３Ｇａｌ１遺伝子のＤＮＡ配列は、本明細書に記載されたｐｃＷＩＮＭＢＰ−ｐＳＴ３Ｇａｌ１構築物およびｐｃＷＩＮＭＢＰ／ＳＢＤ−ｐＳＴ３Ｇａｌ１構築物のデザイン用テンプレートして用いられた。完全長ブタＳＴ３Ｇａｌ１配列は、図３７に提供される。大腸菌における発現に関して、ｐＳＴ３Ｇａｌ１の最適化コドンおよび切断変種、すなわち、ｐＳＴ３Ｇａｌ１Δ４５を用いた。コード化アミノ酸配列は、図２４に提供されている。次にＳＴ３Ｇａｌ１遺伝子コード化配列を消化し、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩクローニング部位を用いてｐｃＷＩＮ２−ＭＢＰおよびｐｃＷＩＮＭＢＰ／ＳＢＤベクターに移した。これらの構築物は、制限および配列分析により正しいことが確かめられ、次いで５０μｇ／ｍｌのカナマイシン選択を用いて大腸菌株ＪＭ１０９を変換するために用いられた。各々からの個々のコロニーは、Ｍａｒｉｔｏｎｅ−１０μｇ／ｍｌカナマイシンの２ｍｌ培養液を接種するために用いられ、これを３７℃で１６時間インキュベートした。各培養液を、別々に５０％グリセロールと１：１で混合し、−８０℃で凍結し、ストックバイアルと称した。各ストックバイアルの少量を、Ｍａｒｉｔｏｎｅ−Ｋａｎプレートをストリークさせるために用いた。３７℃で１６時間インキュベート後、各々からの単一コロニーを、Ｍａｒｉｔｏｎｅ−１０μｇ／ｍｌカナマイシンの２５ｍｌの培養液を接種するために用いられ、これを３７℃で１６時間インキュベートした。次に２５ｍｌの培養液を、Ｍａｒｉｔｏｎｅ−１０μｇ／ｍｌカナマイシンの１Ｌの培養液を接種するために用いられ、これを３７℃でインキュベートし、ＯＤ６００についてモニターした。ＯＤ６００が０．８に達したら、ＩＰＴＧを１ｍＭまで加え、細胞をさらに１６時間インキュベートした。次いで細胞を、７０００×Ｇで１５分間の遠心分離により収穫した。
【０３４０】
次に封入体を単離し、ＳＴ３Ｇａｌ１融合タンパク質を可溶化し、リフォールディングした。細菌細胞ペレットを、２０ｍＭのトリスｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡの１０ｍＬにつき１ｇのウェット細胞ペレットの比率で再懸濁し、マイクロ流動化装置を２回通過させて機械的破壊により溶解した。不溶性物質、すなわち、封入体すなわちＩＢを、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ３内で４℃、７０００ｘｇで３０分間の遠心分離によりペレット化し、上澄液を廃棄した。典型的な洗浄サイクルは、ペレットを洗浄用緩衝液に完全再懸濁することおよび１５分間の遠心分離の反復から構成された。このペレットを、高塩緩衝液（洗浄Ｉ：１０ｍＭのトリスｐＨ７．４、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ）の過剰容量（元の細胞ペレット１ｇ当り少なくとも１０ｍＬ（２０ｍＬまで））で１回、界面活性剤緩衝液（洗浄ＩＩ：２５ｍＭのトリスｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００，１％Ｎａ−デオキシコレート、５ｍＭのＥＤＴＡ）で１回、（ＩＢの洗浄に加えて微量の界面活性剤を除くために）洗浄用緩衝液（洗浄ＩＩＩ：１０ｍＭのトリスｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ）で３回洗浄した。
【０３４１】
洗浄されたＩＢを、可溶化緩衝液（８Ｍの尿素、５０ｍＭのビストリスｐＨ６．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁して、２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整した。リフォールディングは、リフォールディング用緩衝液（５５ｍＭのトリスｐＨ８．２、１０．５６ｍＭのＮａＣｌ、０．４４ｍＭのＫＣｌ、２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２．２ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５５％のＰｅｇ３３５０、５５０ｍＭのＬ−アルギニン、１ｍＭのＧＳＨ、１００ｍＭのＧＳＳＧ）に素早く２０倍希釈として実施し、４℃で１６時間攪拌した。次にこの緩衝液を、Ｇ５０セファデックスを用いて脱塩して、５０ｍＭのビストリスｐＨ６．５、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ８０に交換した。
【０３４２】
リフォールディングされた酵素が活性であるかどうかを判定するために、シアリルトランスフェラーゼアッセイを実施した。シアリン酸の供与体（アシアロ−ウシ顎下ムチン）への移送を、放射標識ＣＭＰ−ＮＡＮを用いてモニターした。バキュロウィルス系で発現されたニワトリＳＴ６ＧａｌＮａｃ１を、陽性対照として用いた。
【０３４３】
短時間で４０μＬの反応混合物を、１０μＬの酵素サンプルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。１００μＬのホスホタングステン酸／１５％ＴＣＡを反応液に攪拌しながら加えることによって糖タンパク質が沈殿した。遠心分離後、上澄液を吸引して廃棄した。５００μＬの５％ＴＣＡを加えて、ペレットから取り込まれていないＣＭＰ−１４Ｃ−シアリン酸を洗浄した。反応液を再度遠心分離し、上澄液を吸引して廃棄した。ペレットは、１００μＬの１０ＮのＮａＯＨを用いて再懸濁した。１Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ７．５の１ｍＬを、再懸濁されたペレットに加えてから、この混合物をシンチレーションバイアルに移した。５ｍＬのシンチレーション液（Ｅｃｏｌｕｍｅ、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を加え、十分に混合した。反応液に添加された全カウントは、４０μＬの反応混合物をシンチレーションバイアルに加え、１００μＬの１０ＮのＮａＯＨ、１ｍＬの水、および５ｍＬのシンチレーション液を加えて、十分に攪拌して測定された。バイアルを１分間カウントした。反応条件を表１３に提供している。
【０３４４】
【表１３】
2007535309.tif 000024
結果を図２５に示す。リフォールディングされた融合タンパク質、ＭＢＰ−ｐＳＴ３Ｇａｌ１およびＭＢＰ−ＳＢＤ−ｐＳＴ３Ｇａｌ１の双方は、検出可能なシアリルトランスフェラーゼ活性を有した。
【０３４５】
（実施例９：ＭＢＰ−ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１タンパク質のリフォールディング）
真核生物のＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩはＭＰＢに融合させた。短時間で、５種のマウスＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ構築物が生成した：Ｄ３２、Ｅ５２、Ｓ１２７、Ｓ１８６、およびＳ２０１。各構築物は、ベクターｐｃＷｉｎ２−ＭＢＰからのＭＢＰタグの後ろで発現し、構築物に含まれる「ステム」領域の範囲が異なる。Ｄ３２は、予測されたアミノ末端膜貫通ドメインの下流から直ちに出発する最長の形態である。Ｓ２０１は、保存触媒ドメインの予測されたスタート直前から始まる最短の形態である。
【０３４６】
マウス構築物に加えて、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ  Ｋ３６もまた、ＭＢＰによる融合として発現される。ヒト構築物は、膜貫通ドメイン直後かた始まる。Ｋ３６からそのｃ−末端にヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１をコードするＤＮＡは、テンプレートとして既存のバキュロウィルス発現ベクターを用いてＰＣＲにより単離され、ｐｃＷｉｎ２−ＭＢＰ内のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ位置にクローン化される。
【０３４７】
参照のために、ＭＢＰ−ｍＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ  Ｓ１２７の配列およびＭＢＰ−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ  Ｋ３６の配列は、図２６に含まれる。さらに、図３８は、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩおよびニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩに関して完全長アミノ酸配列、および天然のマウスタンパク質の残基３２に始まるマウスＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質の配列を提供している。
【０３４８】
上記のものに加えて欠失変異体が作製され、本発明の使用に好ましいＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの完全なリストは、表１４に見られる。図３９は、多数の好ましいヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ切断変異体の図式を提供している。図４０は、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ切断変異体を含むＭＢＰ融合タンパク質の図式を示す。
【０３４９】
【表１４】
2007535309.tif 000025
図４５は、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質における対合および不対合システイン残基の位置を示す。単独および二重システイン置換もまた、例えば、Ｃ２８０Ｓ、Ｃ３６２Ｓ、Ｃ３６２Ｔ、（Ｃ２８０Ｓ＋Ｃ３６２Ｓ）、および（Ｃ２８０Ｓ＋Ｃ３６２Ｔ）で示される。
【０３５０】
初期の発現研究において、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ融合タンパク質は、不溶性タンパク質として発現されることを示した。活性な組換え酵素を回収するために、記載されるように、不活性な不溶性タンパク質を単離し、リフォールディングした。
【０３５１】
ｐｃＷｉｎ２−ＭＢＰ−ｍＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ  Ｄ３２、Ｅ５２、Ｓ１２７、Ｓ１８６、またはｐｃＷｉｎ２−ＭＢＰ−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ  Ｋ３６のいずれかを有するＪＭ１０９の０．５Ｌ培養の対数的増殖は、１ｍＭのＩＰＴＧにより３７℃で一晩誘導された。細胞を遠心分離により採取し、１００ｍＬの２０ｍＭのトリスｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ中、マイクロ流動化装置で機械的破壊により溶解した。不溶性物質を、７０００×ｇで２０分間の遠心分離により採取した。上澄液を廃棄し、ペレットを、高塩緩衝液（２０ｍＭのトリスｐＨ７．４、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ）、界面活性剤緩衝液（２５ｍＭのトリスｐＨ８、１％Ｎａ−デオキシコレート、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ）、およびＴＥ（１０ｍＭのトリスｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄した。各洗浄液は１００ｍＬであり、ペレットは、上記のとおり遠心分離により採取した。洗浄後、封入体ペレットをアリコートで分けて−８０℃に保存した。
【０３５２】
適切なリフォールディング、したがってＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ活性の回復を可能にする条件についてスクリーニングするために、マウスおよびヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ融合タンパク質の封入体のアリコートを、６Ｍのグアニジン、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｘＴＢＳに可溶化した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより正規化し、可溶化タンパク質を一連の市販のタンパク質リフォールディング用緩衝液に移した。リフォールディングは、９６ウェルプレート内で０．２ｍｇ／ｍｌで０．２５ｍＬ中、４℃で一晩攪拌しながら実施した。リフォールディング体を、９６ウェル透析用プレート（２５０００ＮＷＣＯ）に移し、１ｘＴＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０に対して４℃で４時間透析し、次いで１０ｍＭのビストリスｐＨ７．１、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のツウィーン−８０に対して４℃で一晩透析した。
【０３５３】
リフォールディングされた組換えＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ融合タンパク質を、３８４ウェルの固相活性アッセイにおいて活性を試験した。簡潔に述べると、活性アッセイは、３８４ウェルプレート内で、ビオチン化ＣＭＰ−ＮＡＮからアシアロ−ウシ顎下ムチン−コーティングウェルの表面に、ビオチン化シアリン酸のＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ媒介性移送を検出する。各反応（１３．５μＬリフォールディング＋１．５μＬの１０×反応緩衝液）は、四重反復試験が実施された。１０×反応緩衝液は、０．２Ｍのビストリスｐｈ６．７、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＭｎＣｌ２、０．５％のＴｗｅｅｎ−８０、および１ｍＭの供与体であった。３７℃で一晩インキュベート後、プレートを過剰の１×ＴＢＳ、０．０５％のツウィーン−２０で洗浄し、ビオチンは、製造元の使用説明書（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に従ってユーロピウム標識ストレプトアビジンにより検出した。ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ活性を示すプレートに保持されたユーロピウム蛍光レベルは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ３Ｖプレートリーダーにより記録され、発現および活性結果は、表１５に要約している。３種のリフォールディングされたＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ融合タンパク質は、検出可能な活性を有した。
【０３５４】
【表１５】
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（実施例１０：コア１ＧａｌＴ１タンパク質のリフォールディング）
真核生物のコア１ＧａｌＴ１を、ＭＰＢまたは二重タグ、ＭＢＰＳＰＤに融合させる。ショウジョウバエおよびヒトコア１ＧａｌＴ１タンパク質を使用する。図４１は、ヒトコア１ＧａｌＴ１タンパク質の完全長配列を提供している。図４２は、２種のショウジョウバエコア１ＧａｌＴ１タンパク質の配列を提供している。各酵素の切断体は、最少の切断体が、コア１ＧａｌＴ１触媒ドメインのみを含んでなるように、ステム領域全体にわたって、すなわち完全長ステム領域から出発して一度に１つのアミノ酸を欠失させて作製する。タンパク質の触媒ドメインにわたるシステイン残基もまた、セリンまたはアラニン残基に一度に変異されたものである。ＭＢＰ融合は、切断タンパク質であるシステイン変異体または２つの組み合わせを用いて成される。タンパク質は、本明細書に記載された方法を用いて、封入体として大腸菌で発現され、可溶化され、次いでリフォールディングされる。リフォールディングは、酵素活性を測定することによって判定される。活性酵素は、正しくリフォールディングされている。コア１ＧａｌＴ１の酵素活性は、Ｊｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１７８−１８６頁（２００２）（全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている）に開示されているように測定する。
【０３５５】
（実施例１１：Ｏ−結合グリコシルトランスフェラーゼ類のワンポットリフォールディング）
Ｏ−結合グリコシルトランスフェラーゼ類ＧａｌＮＡｃＴ２、コア１およびＳＴ３Ｇａｌ１は、治療用タンパク質など選択されたタンパク質のセリン残基またはトレオニン残基上の末端シアリン酸またはシアリン酸−ＰＥＧを含むコア１構造を付加させるために集合的に使用できる。大腸菌におけるこれら酵素の発現およびリフォールディング封入体から活性酵素の回収は、コスト的に有効でスケールアップ可能な方法を開発するために有用である。我々は、大腸菌の封入体からこれら酵素（ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２およびＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ１）の２種の同時リフォールディングを本明細書に記載する。同時リフォールディングの利点としては、試薬の使用を減じ、リフォールディング効率を増加させることが挙げられる。
【０３５６】
ＪＭ１０９の２種の株をカナマイシン耐性に関して選択し、ＩＰＴＧによる誘導の際に、ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２およびＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ１の封入体を蓄積する適切な発現プラスミドを担持していることを判定した。
【０３５７】
１ｍＭのＩＰＴＧにより別個に一晩誘導後、細菌細胞のペレットを、２０ｍＭのトリスｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡの１０ｍＬ当たり、１ｇの湿潤細胞ペレットの割合で再懸濁し、マイクロフリューダイザーを２回通して、機械的破壊により溶解させた。不溶性物質、すなわち封入体すなわちＩＢを、３０分間、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ３において、４℃、７０００×Ｇでの遠心分離によりペレット化し、上澄み液は廃棄した。典型的な洗浄サイクルは、洗浄緩衝液中でペレットを完全に再懸濁し、遠心分離を１５分間繰り返すことからなった。該ペレットを、過剰容量（高塩緩衝液（洗浄液Ｉ：１０ｍＭのトリスｐＨ７．４、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ）の元の細胞ペレット１ｇ当たり、少なくとも１０ｍＬ（２０まで））で１回、界面活性緩衝液（洗浄液ＩＩ：２５ｍＭのトリスｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００、１％のＮａ−デオキシコール酸、５ｍＭのＥＤＴＡ）中で１回、および（ＩＢの洗浄に加えて、微量の界面活性剤の混入を除去するために）洗浄緩衝液（洗浄液ＩＩＩ：１０ｍＭのトリスｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ）中で３回洗浄した。
【０３５８】
洗浄したＩＢを、可溶化緩衝液（８Ｍの尿素、５０ｍＭのビストリスｐＨ６．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁し、４ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整した。該尿素タンパク質溶液を、１４０００×Ｇで５分間の遠心分離によって清澄化した。リフォールディング緩衝液（５５ｍＭのトリスｐＨ８．２、１０．５６ｍＭのＮａＣｌ、０．４４ｍＭのＫＣｌ、２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２．２ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５５％のＰｅｇ３３５０、５５０ｍＭのＬ−アルギニン、１ｍＭのＧＳＨ、１００ｍｃＭのＧＳＳＧ）中、０．１ｍｇ／ｍｌへ急速希釈して実施し、４℃で１６時間、攪拌した。
【０３５９】
実験系を以下の通り設定した：ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２およびＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ１のいずれかを個別にリフォールディング、または同じ容器内で同時にリフォールディングする間、リフォールディング条件を一定に保持した。リフォールディング後、該混合物を、５０ｍＭのビストリスｐＨ６．５、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ８０中で平衡化したＧ５０Ｓｅｐｈａｄｅｘを用いて、低速遠心分離により脱塩した。微量遠心管における最高速度での遠心分離後、可溶性物質を回収した。
【０３６０】
リフォールディング後、可溶性酵素の収量を測定するため、各反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供し、続いて、クーマシーブルーにより染色して、ポリペプチドを可視化した（図２７Ａ）。結果は、同時リフォールディングにより可溶性酵素の収量が増加することを示している（同時リフォールディング対個別のレーン）。
【０３６１】
第２の実験において、６μｇの治療用タンパク質、ＩＦα−２ｂを、１ポット３酵素ｐｅｇ化反応に供した。以下の反応用緩衝液（５０ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ６．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２）を用い、０時間または１６時間、２０μｌの反応液中、この反応に用いた酵素の濃度は、１．４μｇのＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２、０．５ｍｕのＢＶコア１、および１．４μｇのＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ１、用いられた糖は、１．２μｇのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよび１．２μｇのＵＤＰ−Ｇａｌならびに１２５μｇの２０Ｋ−Ｐｅｇ−ＣＭＰ−ＮＡＮである。反応液の半分におけるＩＦα−２ｂのｐｅｇ化の程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシーブルー染色によって可視化した（図２７Ｂ）。該実験は、個々にリフォールディングされた酵素のいずれかの組み合わせを用いる１ポットｐｅｇ化を、同時リフォールディング酵素と直接比較し、他の全ての成分および濃度を一定に保つようにデザインされた。結果は、該酵素が同時リフォールディングされた反応におけるｐｅｇ化生成物が、個別にリフォールディングされたものと比較して増加したことを証明している（５レーン対７レーン）。
【０３６２】
（実施例１２：ＭＢＰ−ＳｉａＡ融合タンパク質の発現増強）
非定型インフルエンザ菌のＳｉａＡ遺伝子末端を大腸菌内の発現に関してコドン最適化した。該遺伝子をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩにより消化し、アガロースゲル精製し、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐｃＷｉｎ２に結合してから、大腸菌株ＪＭ１０９またはＷ３１１０内へ形質転換した。プラスミドＤＮＡを組換え体から単離し、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩによりスクリーニングした。正しい構築物を各々含有するＪＭ１０９の１つのコロニーおよびＷ３１１０の１つのコロニーを、１０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを含有する２ｍｌの無動物ＬＢに播種し、２５０ＲＰＭの攪拌で３７℃、６時間増殖させた。１００μｌのアリコートを取り、１０，０００×ｇで２分間、遠心分離し、上澄み液を廃棄した。−２０℃で凍結させたこのペレットは非誘導細胞を表す。残りの培養物に、１ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを加え、３７℃で２時間、２５０ＲＰＭの攪拌でインキュベートした。１００μｌのアリコートを取り、記載された通り処理した（誘導細胞を表す）。
【０３６３】
ＰＣＲを用いて、ＳｉａＡ遺伝子の制限部位を５’ＢａｍＨＩに変化させ，３’端はＥｃｏＲＩ維持した。該ＰＣＲ生成物を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにより消化し、アガロースゲル電気泳動により精製し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐｃＷｉｎ２ＭＢＰに結合した。この結合反応によって形質転換したＪＭ１０９細胞を培養し、プラスミドＤＮＡを単離した。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてプラスミドＤＮＡをスクリーンした。正しい構造を含有する３つのコロニーを、１０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを含有する２ｍｌの無動物ＬＢに播種し、２５０ＲＰＭの攪拌で３７℃、６時間増殖させた。１００μｌのアリコートを取り、１０，０００×ｇで２分間、遠心分離し、上澄み液を廃棄した。−２０℃で凍結させたこのペレットは非誘導細胞を表す。残りの培養物に、１ｍＭ  ＩＰＴＧの最終濃度でＩＰＴＧを加え、３７℃で２時間、２５０ＲＰＭの攪拌でインキュベートした。１００μｌのアリコートを取り、記載された通り処理した（誘導細胞を表す）。
【０３６４】
各１００μｌのアリコートを、５０ｍＭのＤＴＴを含有する１００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で５分間沸騰させた。該サンプルを、４〜２０％のアクリルアミド、トリス−グリシンゲル上に装填し（インビトロゲン）、約２時間電気泳動し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎによって染色し、水で脱染し走査した。図Ｘは、誘導時、天然ＳｉａＡの検出不可能なレベルの発現を示し、一方、図Ｙは、ＩＰＴＧ誘導時、ＭＢＰに融合したＳｉａＡの高レベルの発現を示す。この結果は、ｐｃＷｉｎ２ＭＢＰベクターから供給されたＭＢＰが高レベルのタンパク質発現を駆動することを証明している。
【０３６５】
本明細書に記載された実施例および実施形態は、単に例示が目的であること、およびそれに関して、種々の改変または変更が当業者に考えられ、それらが本出願の精神と範囲内および添付の請求項の範囲内に含まれることが理解される。本明細書に引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために、参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０３６６】
【図１】図１は、細菌封入体からのＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩリフォールディングにおいて試験された緩衝液条件を示している。リフォールディングされた該酵素の活性も示されている。
【図２】図２は、アミロースカラムからのリフォールディングされ、透析されたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの溶出プロフィールを示している。
【図３】図３は、アミロースカラムからの溶出フラクションのＳＴ３ＧａｌＩＩＩ活性を示している。
【図４】図４は、リフォールディングされた精製ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを用いた、トランスフェリンの糖ＰＥＧ化のアッセイ結果を示している。レーンは以下の通りである：（１）ＭＷマーカー〔２５０、１４８、９８、６４、５０ｋＤ〕；（２）酵素なしの対照アシアロトランスフェリン。実線矢印で示されている。；（３）フラクション＃５によるトランスフェリン−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）生成。生成物は矢印で示されている；（４）フラクション＃６によるトランスフェリン−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）生成。生成物は矢印で示されている；（５）リフォールディングされた精製ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ  フラクション＃６。点線矢印で示されている；（６）ＭＷマーカー；（７）２と同じ；（８）フラクション＃４によるトランスフェリン−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）生成。生成物は括弧で示されている；および（９）フラクション＃５によるトランスフェリン−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）生成。生成物は括弧で示されている。
【図５】図５は、リフォールディングされたＳｕｐｅｒＧｌｙｃｏＭｉｘを用いたＥＰＯの糖ＰＥＧ化のアッセイ結果を示している。レーンは以下の通りである：（１）ＭＷマーカー、ＳｅｅＢｌｕｅ２インビトロゲン、（２５０、１４８、９８、６４、５０、３６、２２、１６、６ｋＤ）；（２）ＥＰＯを有する陽性対照、＋ＮＳＯ発現ＧａｌＴ１、ＢＶ  ＧｎＴ１、アスペルギルスＳＴ３ＧａｌＩＩＩおよび糖ヌクレオチド；（３）陰性対照、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃなしで２と同じ；（４）ＥＰＯ、精製され、個別にリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Δ１２９）Ｃ３４２Ｔ、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧｎＴ１（Δ１０３）、および黒色アスペルギルス発現ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ；（５）ＥＰＯ、ＳｕｐｅｒＧｌｙｃｏＭｉｘ（ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Δ１２９）Ｃ３４２Ｔ、ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Δ１０３）Ｃ１２３Ａおよび糖ヌクレオチドの混合物。
【図６】図６は、ヒトＧｎＴ１アミノ酸配列（上位線、ＮＰ−００２３９７）およびウサギＧｎＴ１アミノ酸配列（下位線、Ｐ２７１１５）のアラインメントを示している。保存不対合システインには下線が引かれており太活字になっている。
【図７】図７は、ＧｎＴ１  Ｃｙｓ１２１Ｓｅｒ変異体のアミノ酸配列および変異体のＧｎＴ１タンパク質をコードする核酸配列を示している。描かれているアミノ酸配列は、完全長ヒトタンパク質のアミノ酸残基１０４から始まり、以下の不対合システイン変異を有する哺乳動物ＧｎＴ１タンパク質に典型的であり、式中、太活字の残基が野生型システインから変異している：
【化１０】
2007535309.tif 000027
【図８】図８は、ＧｎＴ１  Ｃｙｓ１２１Ａｓｐ変異体のアミノ酸配列および変異体のＧｎＴ１タンパク質をコードする核酸配列を示している。描かれているアミノ酸配列は、完全長ヒトタンパク質のアミノ酸残基１０４から始まり、以下の不対合システイン変異を有する哺乳動物ＧｎＴ１タンパク質に典型的であり、式中、太活字の残基が野生型システインから変異している：
【化１１】
2007535309.tif 000028
【図９】図９は、ＧｎＴ１  Ｃｙｓ１２１Ｔｈｒ変異体のアミノ酸配列および変異体のＧｎＴ１タンパク質をコードする核酸配列を示している。描かれているアミノ酸配列は、完全長ヒトタンパク質のアミノ酸残基１０４から始まり、以下の不対合システイン変異を有する哺乳動物ＧｎＴ１タンパク質に典型的であり、式中、太活字の残基が野生型システインから変異している：
【化１２】
2007535309.tif 000029
【図１０】図１０は、ＧｎＴ１  Ｃｙｓ１２１Ａｌａ変異体のアミノ酸配列および変異体のＧｎＴ１タンパク質をコードする核酸配列を示している。描かれているアミノ酸配列は、完全長ヒトタンパク質のアミノ酸残基１０４から始まり、以下の不対合システイン変異を有する哺乳動物ＧｎＴ１タンパク質に典型的であり、式中、太活字の残基が野生型システインから変異している：
【化１３】
2007535309.tif 000030
【図１１】図１１は、ＧｎＴ１  Ａｒｇ１２０Ａｌａ、Ｃｙｓ１２Ｈｉｓ変異体のアミノ酸配列および変異体のＧｎＴ１タンパク質をコードする核酸配列を示している。描かれているアミノ酸配列は、完全長ヒトタンパク質のアミノ酸残基１０４から始まり、以下の二重変異を有する哺乳動物ＧｎＴ１タンパク質に典型的であり、式中、太活字の残基が野生型システインから変異している：
【化１４】
2007535309.tif 000031
【図１２】図１２は、ラットの肝臓ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのアミノ酸配列を示している。下線イタリックの配列が欠失し、Δ２８欠失が作成された。
【図１３−１】図１３Ａおよび１３ＢはＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（ＧａｌＮＡｃＴ２）の完全長核酸配列およびアミノ酸配列を示している。核酸およびタンパク質の登録番号は、ＮＭ−００４４８１である。
【図１３−２】（図１３−１の続き）
【図１３−３】図１３Ａおよび１３ＢはＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（ＧａｌＮＡｃＴ２）の完全長核酸配列およびアミノ酸配列を示している。核酸およびタンパク質の登録番号は、ＮＭ−００４４８１である。
【図１４−１】図１４Ａおよび１４Ｂは、Δ５１ＧａｌＮＡｃＴ２の核酸配列およびアミノ酸配列である。ナンバリングは図１３Ａおよび１３Ｂに示した完全長アミノ酸配列および核酸配列に基づいている。
【図１４−２】（図１４−１の続き）
【図１４−３】図１４Ａおよび１４Ｂは、Δ５１ＧａｌＮＡｃＴ２の核酸配列およびアミノ酸配列である。ナンバリングは図１３Ａおよび１３Ｂに示した完全長アミノ酸配列および核酸配列に基づいている。
【図１５】図１５は、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化し、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）のタンパク質濃度を示している。試験されたｐＨ値は、可溶化ｐＨ−リフォールディングｐＨとして表されている。タンパク質濃度は、リフォールディング直後（明るい灰色のバー）、透析後（暗い灰色のバー）、および濃縮後（白色のバー）に測定された。
【図１６】図１６は、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化し、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の酵素活性を示している。試験されたｐＨ値は、可溶化ｐＨ−リフォールディングｐＨとして表されている。活性は、透析後（明るい灰色の棒）、および濃縮後（暗い灰色の棒）に測定された。
【図１７】図１７は、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化し、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の特異的活性を示している。試験されたｐＨ値は、可溶化ｐＨ−リフォールディングｐＨとして表されている。特異的活性は、透析後（白色の棒）、および濃縮後（暗い灰色の棒）に測定された。
【図１８Ａ】図１８Ａおよび１８Ｂは、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化し、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を使用した組換え顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）のリモデリングの結果を示している。図１８Ａは、精製ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）対照を用いた結果、または基質を欠いた陰性対照を用いた結果、またはｐＨ６．５で可溶化し、ｐＨ６．５でリフォールディングされた細菌発現ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を用いた結果を示している。図１８Ｂは実験結果を示している。
【図１８Ｂ】図１８Ａおよび１８Ｂは、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化し、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を使用した組換え顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）のリモデリングの結果を示している。図１８Ａは、精製ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）対照を用いた結果、または基質を欠いた陰性対照を用いた結果、またはｐＨ６．５で可溶化し、ｐＨ６．５でリフォールディングされた細菌発現ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を用いた結果を示している。図１８Ｂは実験結果を示している。
【図１９】図１９は、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（ＱＸＬ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）からの溶出後のリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）タンパク質のプロフィールを示している。図の上側には、ＱＸＬカラムからのＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の溶出を例示するクロマトグラムが示されている。Ｘ軸上にはフラクション番号が示され、Ｙ軸上には、各フラクションの相対的吸光度が示されている。下側には、溶出したフラクションを可視化するために用いられた２つの電気泳動ゲルの画像が示されている。ゲル上の各レーンの内容は図に記載されている。
【図２０】図２０は、図１９に示されたＱＸＬカラムからの特異的カラムフラクションのＧａｌＮＡｃＴ２活性を示している。最も活性のフラクションを、ヒドロキシアパタイトＩ型（８０μｍ）カラム（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）に適用した。
【図２１】図２１は、ＨＡＩ型カラムからの溶出後のリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）タンパク質のプロフィールを示している。図の上側には、ＨＡＩ型カラムからのＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の溶出を例示するクロマトグラムが示されている。Ｘ軸上にはフラクション番号が示され、Ｙ軸上には、各フラクションの相対的吸光度が示されている。下側には、溶出したフラクションを可視化するために用いられた電気泳動ゲルの画像が示されている。ゲル上の各レーンの内容は図に記載されている。
【図２２】図２２は、ＨＡＩ型溶出フラクションのＧａｌＮＡｃＴ２活性を示している。
【図２３】図２３は、ＭＢＰタグまたはＭＢＰ−ＳＢＤタグのいずれかに融合させたＳＴ３Ｇａｌ３タンパク質の精製および活性の比較を示している。
【図２４】図２４は、ＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ１融合タンパク質（Ａ）およびＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ１融合タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列を示している。
【図２５】図２５は、ＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ３融合タンパク質およびＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ３融合タンパク質のシアリルトランスフェラーゼ活性を示している。陽性対照および陰性対照もまた示されている。
【図２６】図２６は、ＭＢＰに融合したマウスおよびヒトのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質のアミノ酸配列を示している。Ａ部分は、マウスの切断融合：ＭＢＰ−ｍＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＳ１２７の配列を示す。Ｂ部分は、ヒトの切断融合：ＭＢＰ−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＫ３６の配列を示す。
【図２７】図２７は、Ｏ−結合グリコシルトランスフェラーゼ酵素（Ａ）同時リフォールディング後の濃縮物および（Ｂ）同時リフォールディング後の酵素アッセイ結果のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２とＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩとは一緒に同時リフォールディングされた。コアＩＧａｌ  Ｔ１酵素の添加後、酵素活性を試験した。基質は、ＩＦα−２ｂおよび２０Ｋ−Ｐｅｇ−ＣＭＰ−ＮＡＮであった。
【図２８】図２８は、ＩＰＴＧによる誘導前後の大腸菌における天然ＳｉａＡタンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。
【図２９】図２９は、ＩＰＴＧによる誘導前後の大腸菌におけるＭＢＰ−ＳｉａＡ融合タンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。
【図３０】図３０は、完全長ウシＧａｌＴ１タンパク質のアミノ酸配列を示している。
【図３１】図３１は、ＧａｌＴ１変異体ならびに対照タンパク質であるＧａｌＴ１（４０）（Ｓ９６Ａ＋Ｃ３４２Ｔ）を図示している。
【図３２】図３２は、リフォールディングされ精製されたＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）タンパク質の酵素アッセイの結果を示している。該アッセイでは、供与体基質として、ＵＤＰ−Ｇａｌ（ウリジン５’−ジホスホガラクトース）を用いて、ＬＮＴ２（ラクト−Ｎ−トリオース−２）からＬＮｎＴ（ラクト−Ｎ−ネオテトラオース）への変換を測定した。
【図３３−１】図３３は、ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）およびＱａｓｂａのＧａｌＴ１とも称される対照タンパク質、ＧａｌＴ１（４０）（Ｓ９６Ａ＋Ｃ３４２Ｔ）のＲＮアーゼＢリモデリングアッセイを示している。
【図３３−２】（図３３−１の続き）
【図３３−３】（図３３−２の続き）
【図３３−４】（図３３−３の続き）
【図３４】図３４は、リフォールディングされ、精製されたＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）タンパク質または哺乳動物細胞系において発現されたウシＧａｌＴ１タンパク質の可溶形態であるＮＳＯ  ＧａｌＴ１を用いたＲＮアーゼＢのグリコシル化動態を示している。
【図３５】図３５は、ＭＢＰ−ＧｎＴ１融合タンパク質の図解を示し、また、切断、例えば、Δ１０３またはΔ３５、およびＣｙｓ１２１Ｓｅｒ変異（上側）を示している。図の下側には、完全長ヒトＧｎＴ１タンパク質が示されている。
【図３６】図３６は、右枠に、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧｎＴ１融合タンパク質：ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ３５）Ｃ１２１Ａ、ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ１０３）Ｒ１２０Ａ＋Ｃ１２１Ｈ、およびＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ１０３）Ｃ１２１Ａを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。左枠は、異なる時点におけるリフォールディングされたＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ３５）Ｃ１２１Ａの２つの異なるバッチ（Ａ１およびＡ２）のＧｎＴ１活性を示している。
【図３７】図３７は、ブタＳＴ３Ｇａｌ１の完全長配列を示している。
【図３８】図３８は、Ａ）ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩに関する完全長アミノ酸配列、およびＢ）ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩに関する完全長アミノ酸配列、ならびにＣ）天然マウスタンパク質の残基３２で開始するマウスＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質の配列を示している。
【図３９】図３９は、多数の好ましいヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ切断変異体の図解を示している。
【図４０】図４０は、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ切断変異体などのＭＢＰ融合タンパク質の図解を示している。
【図４１】図４１は、ヒトのコア１  ＧａｌＴ１タンパク質の完全長配列を示している。
【図４２】図４２は、２種のショウジョウバエのコア１  ＧａｌＴ１タンパク質の配列を示している。
【図４３】図４３は、リフォールディングを増強させるためにグリコシルトランスフェラーゼに融合できる代表的な細菌ＭＢＰタンパク質の配列を示している。エルシニアＭＢＰ；大腸菌ＭＢＰ；Ｃ．パイロコッカスフリオサスＭＢＰ；Ｄ．テルモコッカスマリチムＭＢＰ；およびコレラ菌ＭＢＰ。
【図４４】図４４は、ヒトＧａｌＮＡｃＴ１タンパク質およびＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質のアラインメントを示している。アラインメントプログラムは、配列の挿入または欠失を考慮するため、システイン残基のナンバリングは、記載されたテキストおよび公表された配列と同じではない。ｈＧａｌＮＡｃ−Ｔ２システイン２２７（公表）はアラインメントの２３５位に相当し、システイン２２９（公表）はアラインメントの２３７である。ｈＧａｌＮＡｃ−Ｔ１システインは２１２（公表）であるが、システイン２３５（アラインメント）に相当し、２１４（公表）はシステイン２３７（アラインメント）に相当する。関連システイン残基は大型書体で示されている。
【図４５】図４５は、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質における対システイン残基および不対システイン残基の位置を示している。単一システイン置換および二重システイン置換、例えば、Ｃ２８０Ｓ、Ｃ３６２Ｓ、Ｃ３６２Ｔ、（Ｃ２８０Ｓ＋Ｃ３６２Ｓ）、および（Ｃ２８０Ｓ＋Ｃ３６２Ｔ）もまた、示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
2007535309.tif 000072
【図３３−４】
2007535309.tif 000073
【図３４】
2007535309.tif 000074
【図３５】
2007535309.tif 000075
【図３６】
2007535309.tif 000076
【図３７】
2007535309.tif 000077
【図３８】
2007535309.tif 000078
【図３９】
2007535309.tif 000079
【図４０】
2007535309.tif 000080
【図４１】
2007535309.tif 000081
【図４２】
2007535309.tif 000082
【図４３Ａ】
2007535309.tif 000083
【図４３Ｂ】
2007535309.tif 000084
【図４３Ｃ】
2007535309.tif 000085
【図４３Ｄ】
2007535309.tif 000086
【図４３Ｅ】
2007535309.tif 000087
【図４３Ｆ】
2007535309.tif 000088
【図４４】
2007535309.tif 000089
【図４５】
2007535309.tif 000090
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月18日(2007.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007535309000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月18日(2007.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年２月４日に出願した米国特許仮出願第６０／５４２，２１０号、および２００４年８月６日に出願した米国特許仮出願第６０／５９９，４０６号、および２００４年１１月１２日に出願した米国特許仮出願第６０／６２７，４０６号の権利を主張する。これらの各々は、あらゆる目的のために本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、細菌細胞で産生された哺乳動物の、リフォールディングされる能力が増強したグリコシルトランスフェラーゼ変異体を含めたグリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする方法、およびこのようなリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼの使用方法を提供する。また、本発明は、単一容器において、１種以上のグリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする方法、このようなリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼを使用する方法、およびリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼを含んでなる反応混合物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
真核生物は、治療上および商業上有用なオリゴ糖構造体または糖脂質もしくは糖タンパク質などの複合多糖類を合成する。オリゴ糖類または複合多糖類のインビトロ合成は、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼを用いて実施できる。オリゴ糖合成のために組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼを産生する最も効率的な方法は、細菌でタンパク質を発現させることである。しかし、細菌において、多くの真核生物のグリコシルトランスフェラーゼは、細菌の封入体中の不溶性タンパク質として発現し、該封入体から活性タンパク質の収量は極めて低いことがあり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、細菌内で真核生物のグリコシルトランスフェラーゼを産生する改善された方法が必要である。本発明は、これを解決し、また、他の必要性を解決する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（本発明の簡単な概要）
本発明は、マルトース結合タンパク質ドメイン（ＭＢＤ）を含んでなる不溶性の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする方法を提供する。不溶性の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼを可溶化緩衝液中に可溶化し、次いで、酸化還元対を含んでなるリフォールディング用緩衝液に接触させ、リフォールディングされた真核生物グリコシルトランスフェラーゼが供与体基質から受容体基質への糖の移送を触媒するようにする。一実施形態において、真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、タンパク質のステム領域の全てまたは一部を除去するために切断される。他の実施形態において、真核生物グリコシルトランスフェラーゼにおける不対合システインが、非システインアミノ酸による置換によって除去される。さらなる一実施形態において、真核生物グリコシルトランスフェラーゼにおける不対合システインが、非システインアミノ酸による置換によって除去され、該真核生物グリコシルトランスフェラーゼはまた、タンパク質のステム領域の全部または一部を除去するために切断される。
【０００６】
一実施形態において、該真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＧｎＴ１、ＧａｌＴ１、ＳｔＩＩＩ  Ｇａｌ３、Ｓｔ３ＧａｌＩ、Ｓｔ６  ＧａｌＮＡｃＴＩ、コアＧａｌＴＩ、ＧａｌＮＡｃＴ２よりなる群から選択される。
【０００７】
一実施形態において、該真核生物グリコシルトランスフェラーゼはさらに、精製ドメイン、例えば、澱粉結合ドメイン（ＳＢＤ）、チオレドキシンドメイン、ＳＵＭＯドメイン、ポリ−Ｈｉｓドメイン、ｍｙｃエピトープドメイン、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼドメインを含んでなる。
【０００８】
一実施形態において、該真核生物グリコシルトランスフェラーゼはさらに、自己開裂ドメインを含んでなる。
【０００９】
一実施形態において、該真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、不溶性封入体として、細菌宿主細胞内に発現する。
【００１０】
一実施形態において、第２の不溶性組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、第１の真核生物グリコシルトランスフェラーゼによってリフォールディングされる。さらなる一実施形態において、第３の不溶性組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、第１の真核生物グリコシルトランスフェラーゼおよび第２の真核生物グリコシルトランスフェラーゼによってリフォールディングされる。使用者の必要に依って、さらなる不溶性組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼが、一緒に加えられ、リフォールディングでき、例えば、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種のグリコシルトランスフェラーゼを一緒にリフォールディングできる。
【００１１】
一実施形態において、該レドックス対は、還元グルタチオン／酸化グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）およびシステイン／シスタミンよりなる群から選択される。
【００１２】
一実施形態において、該受容体基質は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、および糖ペプチドから選択される。
【００１３】
一実施形態において、該真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼである。シアリルトランスフェラーゼとしては、例えば、ＳｔＩＩＩ  Ｇａｌ３、Ｓｔ３ＧａｌＩ、Ｓｔ６  ＧａｌＮＡｃＴＩを挙げることができる。さらなる一局面において、該供与体基質は、ＣＭＰ−シアリル酸ＰＥＧ分子であり、該受容体基質は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、および糖ペプチドから選択される。
【００１４】
また、本発明は、ステムアンカー領域および膜貫通領域が該タンパク質から欠失しており、該グリコシルトランスフェラーゼがマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）ドメインにインフレームで融合している組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼを提供する。一実施形態において、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼとＭＢＰドメインとの融合は、細菌、例えば、大腸菌における不溶性封入体として発現する。
【００１５】
一実施形態において、ステム領域の全部または一部が、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼから欠失される。他の実施形態において、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ内の不対合システインが、非システインアミノ酸による置換によって除去される。
【００１６】
さらなる一実施形態において、該組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、以下のうちの１つである：ＧｎＴ１タンパク質、ＧａｌＴ１タンパク質、ＳｔＩＩＩ  Ｇａｌ３タンパク質、Ｓｔ３ＧａｌＩタンパク質、Ｓｔ６  ＧａｌＮＡｃＴＩタンパク質、コアＧａｌＴＩタンパク質、またはＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質。
【００１７】
一実施形態において、該組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＧｎＴ１タンパク質である。一局面において、該ＧｎＴ１タンパク質は、ＧｎＴ１Δ３５およびＧｎＴ１Δ１０３から選択される切断ヒトＧｎＴ１タンパク質である。他の局面において、該ＧｎＴ１タンパク質は、ＣＹＳ１２１ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＡＳＰ、およびＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳよりなる群から選択される不対合システイン置換を含んでなるヒトＧｎＴ１タンパク質である。さらなる一局面において、ＧｎＴ１タンパク質は、切断されており、かつ置換変異により不対合システイン残基を除去されているものである。
【００１８】
一実施形態において、該組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＧａｌＴ１タンパク質である。一局面において、該ＧａｌＴ１タンパク質は、ＧａｌＴ１Δ７０およびＧａｌＴ１Δ１２９から選択される切断ウシＧａｌＴ１タンパク質である。他の局面において、該ＧａｌＴ１タンパク質は、ＣＹＳ３４２ＴＨＲの不対合システイン置換を含んでなるウシＧａｌＴ１タンパク質である。さらなる一局面において、該ＧａｌＴ１タンパク質は、切断されており、かつ置換変異により不対合システイン残基を除去されているものである。
【００１９】
一実施形態において、該組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質である。一局面において、該ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質は、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩΔ２８、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩΔ７３、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩΔ８５およびＳＴ３ＧａｌＩＩＩΔ８６から選択される切断ラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質である。他の局面において、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質は、不対合システイン残基に対するアミノ酸置換を含んでなる。さらなる一局面において、該ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質は、切断されており、かつ置換変異により不対合システイン残基を除去されているものである。
【００２０】
一実施形態において、該グリコシルトランスフェラーゼが、コア１  ＧａｌＴ１タンパク質である請求項１５の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。一局面において、コア１ＧａｌＴ１タンパク質は、切断ショウジョウバエタンパク質または切断ヒトタンパク質である。他の局面において、ショウジョウバエまたはヒトのコア１ＧａｌＴ１タンパク質は、不対合システイン残基に対するアミノ酸置換を含んでなる。さらなる一局面において、ショウジョウバエまたはヒトのコア１ＧａｌＴ１タンパク質は、切断されており、かつ置換変異により不対合システイン残基を除去されているものである。
【００２１】
一実施形態において、該組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質である。一局面において、該ＳＴ３ＧａｌＩタンパク質は、ＳＴ３Ｇａｌ１Δ２９、ＳＴ３Ｇａｌ１Δ４５、およびＳＴ３Ｇａｌ１Δ５６から選択される切断ヒトタンパク質である。他の局面において、ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質は、不対合システイン残基に対するアミノ酸置換を含んでなる。さらなる一局面において、該ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質は、切断されており、かつ置換変異により不対合システイン残基を除去されているものである。
【００２２】
一実施形態において、該組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＳＴ６  ＧａｌＮＡｃ１タンパク質である。一局面において、該ＳＴ６  ＧａｌＮＡｃ１タンパク質は、切断マウスタンパク質、切断ニワトリタンパク質または切断ヒトタンパク質であり、例えば、表１４に挙げられた切断体のうちの１つである。他の局面において、他の局面において、マウス、ニワトリ、またはヒトのＳＴ６  ＧａｌＮＡｃ１タンパク質は、不対合システイン残基に対するアミノ酸置換を含んでなる。さらなる一局面において、該マウス、ニワトリ、またはヒトのＳＴ６  ＧａｌＮＡｃ１タンパク質は、切断されており、かつ置換変異により不対合システイン残基を除去されているものである。
【００２３】
一実施形態において、該グリコシルトランスフェラーゼが、ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質である請求項１５の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ。一局面において、該ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質は、ＧａｌＮＡｃＴ２Δ４０、ＧａｌＮＡｃＴ２Δ５１、ＧａｌＮＡｃＴ２Δ７４およびＧａｌＮＡｃＴ２Δ９５から選択される切断ヒトタンパク質である。他の局面において、該ヒトＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質は、不対合システイン残基に対するアミノ酸置換を含んでなる。さらなる一局面において、該ヒトＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質は、切断されており、かつ置換変異により不対合システイン残基を除去されているものである。
【００２４】
また本発明は、タンパク質がリフォールディングされ、酵素活性を有した後に、上記に挙げた組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼを用いて、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、または糖ペプチドをリモデリングする方法を提供する。
【００２５】
本発明は、活性形態における不溶性真核生物グリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする改善した方法を提供し、また、リフォールディング特性を増強させたグリコシルトランスフェラーゼ、例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）酵素を提供する。
【００２６】
一局面において、本発明は、変異して、不溶性沈殿物、例えば細菌封入体からの酵素のリフォールディングを増強するアミノ酸により、不対合システイン残基を置換した組換え真核生物Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）酵素を提供する。ＧｎＴ１酵素は、ＧｎＴ１酵素の少なくとも触媒ドメインを含む。ＧｎＴ１酵素酵素は、生物学的に活性であり、すなわち、供与体基質から受容体基質への移送を触媒することができる。
【００２７】
一実施形態において、ＧｎＴＩ酵素はヒトタンパク質である。ヒトＧｎＴ１におけるＣＹＳ１２１残基の幾つかの変異はリフォールディングを増強する。このような変異体としては、例えば、ＣＹＳ１２１ＳＥＲ変異、ＣＹＳ１２１ＡＬＡ変異、ＣＹＳ１２１ＡＳＰ変異、および二重変異体のＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳが挙げられる。ＧｎＴ１変異体の代表的配列は図７〜１１に示されている。他の真核生物において、例えば不対合システイン残基ＣＹＳ１２３の同様な変異はＧｎＴ１酵素のリフォールディングを増強する。
【００２８】
他の実施形態において、ＧｎＴＩ酵素はまた、アミノ酸タグ、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、澱粉結合タンパク質（ＳＢＰ）、およびｍｙｃエピトープを含む。
【００２９】
他の局面において、本発明は、変異して、不溶性沈殿物、例えば細菌封入体からの酵素のリフォールディングを増強するアミノ酸によって不対合システイン残基を置換した組換え真核生物ＧｎＴＩ酵素をコードする核酸を提供する。上記の通り、コードされたＧｎＴ１酵素は、ＧｎＴ１酵素の少なくとも触媒ドメインを含み、そして生物学的に活性である。すなわちそれは、供与体基質から受容体基質への移送を触媒することができる。
【００３０】
一実施形態において、該核酸はヒトＧｎＴＩ酵素をコードする。ヒトＧｎＴ１におけるＣＹＳ１２１残基の幾つかの変異はリフォールディングを増強する。このような変異体としては、例えば、ＣＹＳ１２１ＳＥＲ変異、ＣＹＳ１２１ＡＬＡ変異、ＣＹＳ１２１ＡＳＰ変異、および二重変異体のＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳが挙げられる。ＧｎＴ１変異タンパク質および核酸の代表的核酸配列は、図７〜１１に示されている。他の真核生物において、例えば不対合システイン残基ＣＹＳ１２３の同様な変異はＧｎＴ１酵素のリフォールディングを増強する。
【００３１】
さらなる一実施形態において、コードされたＧｎＴＩ酵素はまた、アミノ酸タグ、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、澱粉結合タンパク質（ＳＢＰ）、およびｍｙｃエピトープを含む。
【００３２】
また本発明は、変異ＧｎＴ１核酸を含む発現ベクター、ＧｎＴ１発現ベクターを含む宿主細胞、および宿主／発現ベクター系を用いて変異ＧｎＴ１酵素を製造する方法を含む。
【００３３】
他の実施形態において、本発明は、末端マンノース残基を有する受容体分子を、活性化Ｎ−アセチルグルコサミン分子、および変異してリフォールディングを増強させた真核生物ＧｎＴＩ酵素に接触させることによって、該受容体分子にＮ−アセチルグルコサミン残基を付加する方法を提供する。該受容体分子としては、例えば、多糖、オリゴ糖、糖脂質、または糖タンパク質であり得る。
【００３４】
他の局面において、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼを、レドックス対を含むリフォールディング用緩衝液に接触させることによって、単一容器内で少なくとも２種の不溶性組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質をリフォールディングする方法を提供する。リフォールディング後、リフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも２種は生物学的活性を有する。例えばそれらは、供与体基質から受容体基質への移送を触媒することができる。
【００３５】
該リフォールディング用緩衝液はまた、界面活性剤、カオトロピック剤、またはアルギニン、またはＰＥＧを含み得る。いくつかの実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、６．０と１０．０との間である。一実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、６．５と８．０との間である。他の実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、８．０と９．０との間である。
【００３６】
他の実施形態において、該グリコシルトランスフェラーゼはアミノ酸タグ、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、澱粉結合タンパク質（ＳＢＰ）、およびｍｙｃエピトープを含む。
【００３７】
一実施形態において、Ｎ−結合グリカン生合成経路の１種超のグリコシルトランスフェラーゼが一緒にリフォールディングされる。
【００３８】
一実施形態において、本発明の方法を用いて、シアリルトランスフェラーゼが他のグリコシルトランスフェラーゼと共にリフォールディングされる。
【００３９】
一実施形態において、本発明の方法を用いて、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが他のグリコシルトランスフェラーゼと共にリフォールディングされる。
【００４０】
一実施形態において、本発明の方法を用いて、ガラクトシルトランスフェラーゼを他のグリコシルトランスフェラーゼと共にリフォールディングされる。
【００４１】
別の一実施形態において、本発明の方法を用いて、シアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、およびガラクトシルトランスフェラーゼが、単一容器内で一緒にリフォールディングされる。
【００４２】
一実施形態において、Ｏ−結合グリカン生合成経路の１種超のグリコシルトランスフェラーゼが一緒にリフォールディングされる。さらなる一実施形態において、第１の酵素はＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼである。好ましい一実施形態において、第１の酵素はＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２（ＧａｌＮＡｃＴ２）である。
【００４３】
また本発明は、変異して、不溶性沈殿物、例えば細菌封入体からの酵素のリフォールディングを増強するアミノ酸によって不対合システイン残基を置換した組換え真核生物ＧｎＴＩ酵素および同一容器内でリフォールディングされた少なくとも１種の他のグリコシルトランスフェラーゼを含む反応混合物を提供する。第２のグリコシルトランスフェラーゼは、例えば、シアリルトランスフェラーゼまたはガラクトシルトランスフェラーゼであり得る。一実施形態において、該反応混合物は、変異真核生物ＧｎＴ１酵素、シアリルトランスフェラーゼ、およびガラクトシルトランスフェラーゼを含む。例えば、多糖、オリゴ糖、糖脂質、または糖タンパク質を製造するために、供与体の糖と受容体分子との反応混合物を使用できる。
【００４４】
他の局面において、本発明は、（ａ）シアリルトランスフェラーゼを可溶化し；次いで（ｂ）該可溶化シアリルトランスフェラーゼを、レドックス対を含むリフォールディング用緩衝液に接触させることによって、不溶性組換え真核生物シアリルトランスフェラーゼをリフォールディングする方法を提供する。リフォールディングされたシアリルトランスフェラーゼは生物学的に活性であり、供与体基質から受容体基質へのシアリン酸の移送を触媒する。一実施形態において、リフォールディングされたシアリルトランスフェラーゼは透析されるかまたはダイアフィルトレートされる。
【００４５】
該リフォールディング用緩衝液はまた、界面活性剤、カオトロピック剤、またはアルギニンを含み得る。いくつかの実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、６．０と１０．０との間である。一実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、６．５と８．０との間である。他の実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、８．０と９．０との間である。他の実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、７．５と８．５との間である。
【００４６】
一実施形態において、該リフォールディング用緩衝液中の該レドックス対は、還元グルタチオン／酸化グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）である。さらなる一実施形態において、ＧＳＨ／ＧＳＳＧのモル比は１００：１と１：１０との間である。好ましい一実施形態において、ＧＳＨ／ＧＳＳＧのモル比は１０：１である。さらなる一実施形態において、該リフォールディング用緩衝液は、約０．０２〜１０ｍＭのＧＳＨ、０．００５〜１０ｍＭのＧＳＳＧ、０．００５〜１０ｍＭのラウリルマルトシド、５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ、２〜１０ｍＭのＫＣｌ、０．０１〜０．０５％のＰＥＧ３３５０、および１５０〜５５０ｍＭのＬ−アルギニンを含んでなる。
【００４７】
他の実施形態において、該シアリルトランスフェラーゼは、アミノ酸タグ、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、澱粉結合タンパク質（ＳＢＰ）、およびｍｙｃエピトープを含む。さらなる一実施形態において、該シアリルトランスフェラーゼは、該アミノ酸タグに結合するタグ結合分子を用いて精製される。例えば、該アミノ酸タグはＭＢＰであり得、該タグ結合分子はアミロース、マルトース、またはシクロデキストリンであり得る。
【００４８】
他の実施形態において、リフォールディングされた該シアリルトランスフェラーゼは、ＣＭＰ−シアリン酸から糖タンパク質へのシアリン酸の移送を触媒する。
【００４９】
さらなる一実施形態において、リフォールディングされた該シアリルトランスフェラーゼは、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）またはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）から糖タンパク質への１０ＫＰＥＧまたは２０Ｋ  ＰＥＧの移送を触媒する。
【００５０】
他の実施形態において、該シアリルトランスフェラーゼは、ラットの肝臓ＳＴ３ＧａｌＩＩＩである。
【００５１】
他の局面において、本発明は、本明細書に開示された方法を用いてリフォールディングされた、哺乳動物のリフォールディングされたシアリルトランスフェラーゼと共にＣＭＰ−シアリン酸に、糖タンパク質を接触させることによって、シアリル部分を糖タンパク質に付加する方法を提供する。
【００５２】
他の局面において、本発明は、糖タンパク質にＰＥＧ部分を付加する方法を提供し、該方法は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）またはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）、および本明細書に開示された方法を用いてリフォールディングされた、哺乳動物のリフォールディングされたシアリルトランスフェラーゼに、糖タンパク質を接触させることを含んでなる。
【００５３】
さらなる一局面において、本発明は、ＧａｌＮＡｃＴ２を可溶化緩衝液に可溶化し；次いで、該ＧａｌＮＡｃＴ２をリフォールディングするために、レドックス対を含むリフォールディング緩衝液に該可溶化ＧａｌＮＡｃＴ２を接触させることによって、不溶性の組換え真核生物Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ２）をリフォールディングする方法を提供する。リフォールディング後、リフォールディングされたＧａｌＮＡｃＴ２は、供与体基質から受容体基質へのＮ−アセチルガラクトサミンの移送を触媒する。該方法は、任意に、リフォールディングされたＧａｌＮＡｃＴ２を透析またはダイアフィルトレートするステップまたはリフォールディングされたＧａｌＮＡｃＴ２のさらなる精製を含む。
【００５４】
幾つかの実施形態において、リフォールディング用緩衝液のレドックス対は還元グルタチオン／酸化グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）またはシステイン／シスタミンである。該リフォールディング用緩衝液はまた以下のものを含み得る：界面活性剤、カオトロピック剤、またはアルギニン。幾つかの実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、６．０と１０．０との間である。好ましい一実施形態において、該リフォールディング用緩衝液のｐＨは、約８．０である。
【００５５】
好ましい実施形態において、該可溶化緩衝液のｐＨは、６．０と１０．０との間である。より好ましい一実施形態において、該可溶化緩衝液のｐＨは、約８．０である。
【００５６】
組換え発現されたＧａｌＮＡｃＴ２は、アミノ酸タグを含み得る。該アミノ酸タグは、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、澱粉結合タンパク質（ＳＢＰ）、およびｍｙｃエピトープであり得る。リフォールディングされた該ＧａｌＮＡｃＴ２を精製するために、タグ結合分子を使用できる。該アミノ酸タグがＭＢＰの場合、該タグ結合分子は一般に、以下のうちの１つである：アミロース、マルトース、またはシクロデキストリン。
【００５７】
好ましい一実施形態において、リフォールディングされた該ＧａｌＮＡｃＴ２は、供与体基質から、ペプチド、タンパク質、糖ペプチドまたは糖タンパク質へのＮ−アセチルガラクトサミンの移送を触媒する。
【００５８】
（定義）
本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼタンパク質は、供与体基質から受容体基質へのサッカライドの移送に有用である。この付加は一般に、オリゴ糖の非還元端または生体分子の炭水化物部分で生じる。本明細書に定義される生体分子としては、限定はしないが、炭水化物、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、および脂質（例えば、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質およびガングリオシド）のような、生物学的に重要な分子が挙げられる。
【００５９】
以下の略号が本明細書に用いられる：
Ａｒａ＝アラビノシル；
Ｆｒｕ＝フルクトシル；
Ｆｕｃ＝フコシル；
Ｇａｌ＝ガラクトシル；
ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトシルアミノ；
Ｇｌｃ＝グルコシル；
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコシルアミノ；
Ｍａｎ＝マンノシル；および
ＮｅｕＡｃ＝シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）
ＦＴまたはＦｕｃＴ＝フコシルトランスフェラーゼ＊
ＳＴ＝シアリルトランスフェラーゼ＊
ＧａｌＴ＝ガラクトシルトランスフェラーゼ＊。
【００６０】
本明細書では、特定のグリコシルトランスフェラーゼの同一性を示すために、当該分野で慣例的に用いられる命名法にしたがって、算用数字とローマ数字とは交換可能に用いられる（例えば、ＦＴＶＩＩとＦＴ７とは同一のフコシルトランスフェラーゼを言う）。
【００６１】
オリゴ糖は、還元端の糖が実際に還元糖であるか否かを問わず、還元端および非還元端を有すると考えられる。認められた命名法に従い、オリゴ糖は本明細書において、左側に非還元端を、右側に還元端を有して描かれている。
【００６２】
本明細書に記載される全てのオリゴ糖は、非還元糖の名称または略号（例えば、Ｇａｌ）、続いて、グリコシド結合の立体配置（αまたはβ）、環結合、該結合に関与する還元糖の環の位置、次いで還元糖の名称または略号を有して記載されている（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）。２つの糖の間の結合は、例えば、２，３，２→３，または（２，３）として表現できる。糖の各々はピラノースまたはフラノースである。
【００６３】
用語の「シアリン酸」は、炭素９個のカルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーを言う。シアリン酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース−１−オン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略号化されることが多い）である。該ファミリーの第２のメンバーは、Ｎ−グリコシル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、ここでＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基はヒドロキシル化されている。第３のシアリン酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７頁；Ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９頁（１９９０））。また、９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−置換シアリン酸、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃも含まれる。このシアリン酸ファミリーのレビューに関しては、例えば、Ｖａｒｋｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ２：２５−４０頁（１９９２）；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編集（ニューヨーク、スプリンガー−フェアラグ（１９９２））を参照されたい。シアリル化法におけるシアリン酸化後の合成および使用法は、１９９２年１０月１日公開の国際出願公開第９２／１６６４０号に開示されている。
【００６４】
グリコシルトランスフェラーゼに対する「受容体基質」は、特定のグリコシルトランスフェラーゼに対する受容体として働くオリゴ糖部分である。受容体基質を、対応するグリコシルトランスフェラーゼおよび糖供与体基質、ならびに他の必要な反応混合物成分に接触させ、該反応混合物を十分な時間インキュベートする場合、該グリコシルトランスフェラーゼは糖残基を、糖供与体基質から受容体基質へと移送させる。該受容体基質は特定のグリコシルトランスフェラーゼの種々のタイプによって変わることが多い。例えば、哺乳動物ガラクトシド２−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ（α１，２−フコシルトランスフェラーゼ）に対する受容体基質とは、オリゴ糖の非還元末端に、Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを含み、このフコシルトランスフェラーゼは、α１，２結合を介してフコース残基をＧａｌに結合させる。末端Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−ＲおよびＧａｌβ１，３−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒならびにそれらのシアリル化アナログは、それぞれ、α１，３およびα１，４−フコシルトランスフェラーゼに対する受容体基質である。しかし、これらの酵素はフコース残基を受容体基質のＧｌｃＮＡｃ残基に付加させる。したがって、用語の「受容体基質」は、特定の適用に関する特定の対象グリコシルトランスフェラーゼに関連して考慮される。さらなるグリコシルトランスフェラーゼに対する受容体基質が本明細書に記載されている。受容体基質としてはまた、例えば、ペプチド、タンパク質、糖ペプチド、および糖タンパク質が挙げられる。
【００６５】
グリコシルトランスフェラーゼに対する「供与体基質」は、活性化ヌクレオチド糖である。このような活性化糖は、一般に、ヌクレオシド一リン酸またはヌクレオシド二リン酸が遊離基として働く、糖のウリジン、グアノシン、およびシチジンの一リン酸誘導体（それぞれ、ＵＭＰ、ＧＭＰおよびＣＭＰ）または二リン酸誘導体（それぞれ、ＵＤＰ、ＧＤＰおよびＣＤＰ）からなる。例えば、フコシルトランスフェラーゼに対する供与体基質は、ＧＤＰ−フコースである。シアリルトランスフェラーゼに対する供与体基質は、例えば、所望のシアリン酸を含んでなる活性化糖ヌクレオチドである。例えば、ＮｅｕＡｃｎ場合、活性化糖はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃである。他の供与体基質としては、例えば、ＧＤＰマンノース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ−ＰＥＧ（ＣＭＰ−シアリン酸−ＰＥＧとも称される）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコリオン酸、およびＵＤＰ−キシロースが挙げられる。糖としては、例えば、ＮｅｕＡｃ、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、グルコリオン酸、およびキシロースが挙げられる。細菌系、植物系、および真菌系は、時には他の活性化ヌクレオチド糖を使用できる。
【００６６】
本明細書に用いられる「タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、または糖ペプチドをリモデリングする方法」は、グリコシルトランスフェラーゼを用いて、糖残基を、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、または糖ペプチドに付加することを言う。好ましい一実施形態において、糖残基はＰＥＧ分子と共有結合している。
【００６７】
本明細書に用いられる「真核生物グリコシルトランスフェラーゼ」は、真核生物に由来し、供与体基質（すなわち、活性化ヌクレオチド糖）から受容体基質（例えば、オリゴ糖、糖脂質、ペプチド、タンパク質、糖ペプチド、または糖タンパク質）への糖残基の移送を触媒する酵素を言う。好ましい一実施形態において、真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、糖を、供与体基質からペプチド、タンパク質、糖ペプチド、または糖タンパク質へ移送させる。他の好ましい実施形態において、真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＩＩ型膜貫通グリコシルトランスフェラーゼである。真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、真核生物、例えば、多細胞真核生物、植物、ショウジョウバエまたは線虫などの無脊椎動物、脊椎動物、両性類または爬虫類、哺乳動物、齧歯類、霊長類、ヒト、ウサギ、ラット、マウス、ウシ、またはブタなどに由来するものであり得る。
【００６８】
本明細書に用いられる「真核生物Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩまたはＧＮＴＩ）」は、真核生物から単離されたβ−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを言う。該酵素は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ供与体から、マンノース糖を含んでなる受容体分子へのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の移送を触媒する。他の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様に、ＧｎＴＩは膜貫通ドメイン、ステム領域、および触媒ドメインを有する。真核生物ＧｎＴ１タンパク質としては、例えば、各々が参照として本明細書に組み込まれているヒト、登録番号ＮＰ−００２３９７；チャイニーズハムスター、登録番号ＡＡＫ６１８６８；ウサギ、登録番号ＡＡＡ３１４９３；ラット、登録番号ＮＰ−１１０４８８；ゴールデンハムスター、登録番号ＡＡＤ０４１３０；マウス、登録番号Ｐ２７８０８；ゼブラフィッシュ、登録番号ＡＡＨ５８２９７；アフリカツメガエル、登録番号ＣＡＣ５１１１９；ショウジョウバエ、登録番号ＮＰ−５２５１１７；ハマダラカ、登録番号ＸＰ−３１５３５９；線虫、登録番号ＮＰ−４９７７１９；Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、登録番号ＣＡＤ２２１０７；ジャガイモ、登録番号ＣＡＣ８０６９７；タバコ、登録番号ＣＡＣ８０７０２；イネ、登録番号ＣＡＤ３００２２；Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ，登録番号ＣＡＣ８２５０７；およびシロイヌナズナ、登録番号ＮＰ＿１９５５３７が挙げられ、各々が参照として本明細書に組み込まれている。
【００６９】
本明細書に用いられている「真核生物Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ）」は、真核生物から単離されたＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼを言う。該酵素は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ供与体から受容体分子へのＮ−アセチルガラクトサミニン（ＧａｌＮＡｃ）の移送を触媒する。他の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様、ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、膜貫通ドメイン、ステム領域、および触媒ドメインを有する。多数のＧａｌＮＡｃＴ酵素、例えば、ＧａｌＮＡｃＴ１、登録番号Ｘ８５０１８；ＧａｌＮＡｃＴ２、Ｘ８５０１９（双方とも、Ｗｈｉｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４１５６−２４１６５頁（１９９５）に記載されている）；およびＧａｌＮＡｃＴ３、登録番号Ｘ９２６８９（Ｂｅｎｎｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７００６−１７０１２頁（１９９６）に記載されている）が、単離され、特性化されており、これらの各々は、参照として、本明細書に組み込まれている。
【００７０】
本明細書に用いられている「真核生物β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ１）は、真核生物から単離されたβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを言う。該酵素は、ＵＤＰ−Ｇａｌ供与体から受容体分子へのガラクトースの移送を触媒する。他の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様、ＧａｌＴ１酵素は、膜貫通ドメイン、ステム領域、および触媒ドメインを有する。多数のＧａｌＴ１酵素、例えば、完全長ウシ配列、Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１−２１７頁（１９８９）および登録番号ＣＡＡ３２６９５が、単離され、特性化されており、これらの各々は、参照として、本明細書に組み込まれている。
【００７１】
本明細書に用いられている「真核生物α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３Ｇａｌ３）」は、真核生物から単離されたα（２，３）シアリルトランスフェラーゼを言う。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアリン酸の移送を触媒する（例えば、Ｗｅｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１頁；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９頁を参照）。シアリン酸は、２つの糖の間のα結合の形成によりＧａｌに結合する。糖間の結合は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位との間のものである。他の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素は、膜貫通ドメイン、ステム領域、および触媒ドメインを有する。この特定酵素は、ラットの肝臓（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５頁）；ヒトｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２−２２７８７頁；Ｋｉｔａｇａｗａ  ＆  Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４−１４０１頁）から単離でき、組換え発現により、この酵素の産生を促進するゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１−９３８頁）ＤＮＡが知られている。ラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩがクローン化されており、その配列が知られている。例えば、Ｗｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１−２１０１９頁（１９９２）および登録番号Ｍ９７７５４を参照されたい（これらの各々が、参照として、本明細書に組み込まれている）。
【００７２】
本明細書に用いられている「真核生物α−Ｎ−アセチルガラクトサミニドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＴ１）」は、真核生物から単離されたα（２，６）シアリルトランスフェラーゼを言う。該酵素は、ＣＭＰ−シアリン酸供与体から受容体分子へのシアリン酸の移送を触媒する。この移送は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｔｈｒ／Ｓｅｒへのα２，６−結合である。他の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＴ１酵素は、膜貫通ドメイン、ステム領域、および触媒ドメインを有する。多数のＳＴ６ＧａｌＮＡｃＴ１酵素、例えば、完全長マウス配列、Ｋｕｒｏｓａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２７：８４５−８５４頁（２０００）および登録番号ＪＣ７２４８が単離され、特性化されており、これらの各々は、参照として、本明細書に組み込まれている。他の典型的なＳＴ６ＧａｌＮＡｃＴ１アミノ酸配列は、図３８に見られる。
【００７３】
本明細書に用いられている「真核生物ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧａｌＩ）は、真核生物から単離されたｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼを言う。該酵素は、ＣＭＰ−シアリン酸供与体から受容体分子へのシアリン酸の移送を触媒する。この移送は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｏ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒへのα２，３−結合である。他の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様、ＳＴ３ＧａｌＩ酵素は、膜貫通ドメイン、ステム領域、および触媒ドメインを有する。多数のＳＴ３ＧａｌＩ酵素、例えば、完全長ブタ配列、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１００４−２１０１０頁（１９９２）および登録番号Ａ４５０７３が単離され、特性化されており、これらの各々は、参照として、本明細書に組み込まれている。
【００７４】
本明細書に用いられている「真核生物コアＩガラクトシルトランスフェラーゼ（コア１ＧａｌＴ１）は、コアＩβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を言う。他の真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様、コア１ＧａｌＴ１酵素は、膜貫通ドメイン、ステム領域、および触媒ドメインを有する。多数のコアＩＧａｌＴ１酵素、例えば、図４１および図４２のショウジョウバエならびにヒトの配列が、単離され、特性化されている。該ヒトタンパク質は、Ｊｕら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１）、１７８−１８６頁（２００２）において特性化されており、これは、全ての目的のために、参照として本明細書に組み込まれている。
【００７５】
本明細書に用いられている「不対合システイン残基」は、正しく折りたたまれたタンパク質（すなわち、生物学的活性を有するタンパク質）において、別のシステイン残基とジスルフィド結合を形成しないシステイン残基を言う。
【００７６】
「不溶性グリコシルトランスフェラーゼ」は、細菌封入体において発現するグリコシルトランスフェラーゼを言う。不溶性グリコシルトランスフェラーゼは、典型的には、例えば、界面活性剤またはカオトロピック剤またはいくつかの組み合わせを用いて、可溶化または変性させる。「リフォールディング」は、生物学的に活性なグリコシルトランスフェラーゼの構造を、可溶化または変性させたグリコシルトランスフェラーゼへと復元させる過程を言う。したがって、リフォールディング用緩衝液とは、グリコシルトランスフェラーゼのリフォールディングを増強または促進させる緩衝液を言う。
【００７７】
「レドックス対」は、還元チオール試薬と酸化チオール試薬との混合物を言い、還元グルタチオンおよび酸化グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ），システイン／シスチン、システアミン／シスタミン、ＤＴＴ／ＧＳＳＧ、およびＤＴＥ／ＧＳＳＧが含まれる（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２０２−２０７頁（２００１）を参照）。
【００７８】
用語の「接触させる」は、本明細書において、以下のものと交換可能に用いられる：と合わせる、に付加する、と混合する、の上を通過させる、とインキュベートする、の上を流す、など。
【００７９】
用語の「ＰＥＧ」は、ポリ（エチレングリコール）を言う。ＰＥＧは、ペプチドに結合されてきた典型的なポリマーである。ペプチド治療薬を誘導体化するためにＰＥＧを使用すると、該ペプチドの免疫原性を減少させ、循環からのクリアランス時間を延長させることが実証されている。例えば、米国特許出願第４，１７９，３３７号（Ｄａｖｉｓら）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコーに結合させた酵素およびペプチドホルモンなどの非免疫原性ペプチドに関するものである。１モルのペプチド当たり、１０モルと１００モルとの間のポリマーが使用され、少なくとも１５％の生理学的活性が維持される。
【００８０】
本明細書に用いられている「特異的活性」は、酵素、例えば、本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質の触媒活性を言い、活性単位で表すことができる。本明細書に用いられている１活性単位は、所与の温度（例えば、３７℃）およびｐＨ値（例えば、ｐＨ７．５で）で１分当たり、１μモルの生成物形成を触媒する。したがって、１０単位の酵素とは、例えば、３７℃の温度、および例えば、７．５のｐＨ値で１分間に、１０μモルの基質が１０μモルの生成物に変換される該酵素の触媒量である。
【００８１】
「Ｎ−結合」オリゴ糖とは、アスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により、アスパラギンを介してペプチド主鎖に結合しているオリゴ糖である。Ｎ−結合オリゴ糖は、「Ｎ−グリカン」とも呼ばれる。Ｎ−結合オリゴ糖は全てＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有する。それらは、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコースおよびシアリン酸などの周辺糖の分枝（アンテナとも呼ばれる）の存在ならびに数が異なっている。この構造はまた、任意に、コアのフコース分子および／またはキシロース分子を含有し得る。
【００８２】
「Ｏ−結合」オリゴ糖とは、トレオニン、セリン、ヒドロキシプロリン、チロシン、または他のヒドロキシ含有アミノ酸を介してペプチド骨格に結合しているオリゴ糖である。
【００８３】
糖タンパク質種について、「実質的に均一な糖形態」または「実質的に均一なグリコシル化パターン」とは、対象のグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）によってグリコシル化されている受容体基質のパーセンテージについてのことである。出発物質がグリコシル化受容体基質を含有し得ることは当業者に理解されるであろう。したがって、グリコシル化の算出量は、本発明の方法によってグリコシル化されている受容体基質、ならびに出発物質においてすでにグリコシル化されていた受容体基質を含む。
【００８４】
用語の「生物学的活性」は、タンパク質の酵素活性を言う。例えば、シアリルトランスフェラーゼの生物学的活性は、供与体分子から受容体分子へシアリン酸部分を移送させる活性を言う。ＧａｌＮＡｃＴ２の生物学的活性は、供与体分子から受容体分子へＮ−アセチルガラクトサミン部分を移送させる活性を言う。ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質に関して、受容体分子は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチドであり得る。ＧｎＴ１タンパク質の生物学的活性は、供与体分子から受容体分子へＮ−アセチルグルコサミン部分を移送させる活性を言う。ガラクトシルトランスフェラーゼの生物学的活性は、供与体分子から受容体分子へガラクトース部分を移送させる活性を言う。
【００８５】
「商業的規模」とは、単一反応において、糖生成物のグラム規模の製造を言う。好ましい実施形態において、商業的規模とは、約５０、７５、８０、９０グラム、または１００、１２５、１５０、１７５グラム、または２００グラム超の製造を言う。
【００８６】
「実質的に均一」の上記定義における用語「実質的に」とは、特定のグリコシルトランスフェラーゼに関する受容体基質の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはより好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％がグリコシル化されていることを、一般に意味する。
【００８７】
用語の「アミノ酸」は、天然および合成アミノ酸、ならびに、ある意味で天然アミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を言う。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたもの、ならびに後に修飾されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを有する化合物を言う。このようなアナログは、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸に類似した様式で機能する化学的化合物を言う。
【００８８】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、または「ペプチド」とは、単量体がアミノ酸であり、アミド結合を介して一緒に結合しているポリマーを言うか、あるいは、ポリペプチドを言う。アミノ酸がα−アミノ酸の場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体が使用できる。また、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシン、およびホモアルギニンもまた含まれる。遺伝子コードされていないアミノ酸もまた、本発明に使用できる。さらに、反応性基を含むように修飾されたアミノ酸もまた本発明に使用できる。本発明に使用されるアミノ酸は全てＤ−異性体またはＬ−異性体のいずれかであり得る。一般にＬ−異性体が好ましい。さらに、他のペプチド模倣物もまた本発明に有用である。一般的レビューに関しては、Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ．、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ、ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編集、ニューヨーク、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、２６７頁（１９８３）を参照されたい。
【００８９】
細胞に関して用いられる場合、用語の「組換え」は、該細胞が異種核酸を複製するか、または異種核酸によってコードされたペプチドまたはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内では見られない遺伝子を含有し得る。組換え細胞はまた、遺伝子が改変され、人工的手段によって該細胞に再導入された、該細胞の天然形態に見られる遺伝子を含有し得る。該用語はまた、細胞から核酸を除去することなく改変された該細胞に、内在的な核酸を含有する細胞を含める；このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異、および関連技法によって得られたものが挙げられる。「組換えタンパク質」とは、組換え細胞によって産生されたものである。好ましい実施形態において、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、組換え細菌細胞によって産生される。
【００９０】
「融合タンパク質」とは、元のタンパク質または天然の完全長タンパク質またはその部分列をコードするアミノ酸配列に追加したアミノ酸配列、その替わりのアミノ酸配列、それ未満のアミノ酸配列、および／またはそれとは異なるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質を言う。
【００９１】
融合タンパク質の構成要素として、「補助酵素」および／または「精製タグ」が挙げられる。本明細書に用いられる「補助酵素」とは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼに対する基質を形成する反応を触媒することに関与する酵素である。補助酵素は、例えば、グリコシルトランスフェラーゼによって供与体部分として用いられるヌクレオチド糖の形成を触媒できる。また、補助酵素は、ヌクレオチド糖の形成に必要なヌクレオチド三リン酸の生成、またはヌクレオチド糖に組み込まれる糖の生成に用いられるものであり得る。本発明の組み換え融合タンパク質は、タンパク質の精製を助ける分子「精製タグ」を一端に有する融合タンパク質として構築および発現させることができる。このようなタグはまた、グリコシル化反応時、対象のタンパク質の固定化にも使用できる。好適なタグとしては、抗体によって特異的に認識されるタンパク質配列である「エピトープタグ」が挙げられる。エピトープタグは、一般に、該融合タンパク質を明確に検出または単離するために容易に利用できる抗体の使用を可能にするために融合タンパク質内に組み込まれる。「ＦＬＡＧタグ」は、ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓの配列（配列番号６６）またはその実質的に同一な変異体からなるモノクローナル抗−ＦＬＡＧ抗体によって特異的に認識される一般に用いられるエピトープタグである。他の好適なタグは当業者に公知であり、例えば、ニッケルイオンまたはコバルトイオンなどの金属イオンに結合するヘキサヒスチジンペプチド（配列番号６７）などのアフィニティータグが挙げられる。精製タグを含んでなるタンパク質は、該精製タグに結合する結合相手、例えば、精製タグに対する抗体、ニッケルイオンまたはコバルトイオンまたはその樹脂、およびアミロース、マルトース、またはシクロデキストリンを用いて精製できる。精製タグはまた、澱粉結合ドメイン、大腸菌チオレドキシンドメイン（例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社およびＡｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社から商品として入手できるベクターおよび抗体）、およびＳＵＭＯタンパク質のカルボキシ末端側半分（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社から商品として入手できるベクターおよび抗体）を含む。マルトース結合ドメインは、不溶性の真核生物グリコシルトランスフェラーゼのリフォールディングを増強するそれらの能力のために好ましく使用されるが、融合タンパク質の精製を助けるために使用することもできる。マルトース結合ドメインタンパク質の精製は、当業者に公知である。澱粉結合ドメインは、国際公開特許出願第９９／１５６３６号（参照として本明細書に組み込まれている）に記載されている。βシクロデキストリン（ＢＣＤ）誘導体化樹脂を用いた澱粉結合ドメインを含んでなる融合タンパク質のアフィニティー精製は、２００３年５月５日出願の米国特許出願第６０／４６８，３７４号（参照としてその全体が本明細書に組み込まれている）に記載されている。
【００９２】
グリコシルトランスフェラーゼに関して、用語の「機能的ドメイン」とは、酵素の活性、例えば、受容体基質特異性、触媒活性、結合親和性、ゴルジ装置内局在化、細胞膜への固定、または他の生物学的または生化学的活性を与えるか、または調節するグリコシルトランスフェラーゼのドメインを言う。グリコシルトランスフェラーゼの機能的ドメインの例としては、限定はしないが、触媒ドメイン、ステムドメイン、およびシグナルアンカードメインが挙げられる。
【００９３】
タンパク質に関して、用語の「発現レベル」または「発現のレベル」とは、細胞によって産生されるタンパク質の量を言う。細胞によって産生されるタンパク質の量は、本明細書に記載されているか、または当業者に公知のアッセイおよび活性単位によって測定できる。当業者は、それぞれ種々のアッセイおよび単位を用いた、細胞によって産生されたタンパク質の量の測定法および記載法を知っているであろう。したがって、タンパク質、例えば、グリコシルトランスフェラーゼの発現レベルの定量化および定量的記述は、それぞれ、活性の測定に用いたアッセイにも、活性の記述に用いた単位にも限定されない。細胞によって産生されたタンパク質の量は、標準的な公知のアッセイ、例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）によるタンパク質アッセイ、Ｐｉｅｒｃｅ（イリノイ州、ロックフォード）の二シンコニン酸タンパク質アッセイキット、または米国特許出願第５，６４１，６６８号に記載されたものによって測定できる。
【００９４】
用語の「酵素活性」とは、酵素の活性を言い、本明細書に記載されたか、または当業者に公知のアッセイおよび単位によって測定できる。グリコシルトランスフェラーゼの活性の例としては、限定はしないが、該酵素の機能的ドメインに関連するもの、例えば、受容体基質特異性、触媒活性、結合親和性、ゴルジ装置内局在化、細胞膜への固定、または他の生物学的もしくは生化学的活性が挙げられる。
【００９５】
グリコシルトランスフェラーゼに関して、「ステム領域」とはタンパク質ドメインまたはその部分配列をいい、天然のグリコシルトランスフェラーゼにおいて、膜貫通ドメインに隣接して位置し、ゴルジ装置内にグリコシルトランスフェラーゼを維持するための保持シグナルとして、また、タンパク質分解性の開裂部位として機能すると報告されている。ステム領域は、一般に、最初、親水性アミノ酸から始まり、続いて疎水性膜貫通ドメイン、そして最後に触媒ドメインがあり、またはいくつかの場合、最初にシステイン残基、続いて膜貫通ドメインがある。典型的なステム領域としては、限定はしないが、フコシルトランスフェラーゼＶＩのステム領域、アミノ酸残基４０〜５４；哺乳動物ＧｎＴ１のステム領域、約３６から約１０３のアミノ酸残基（例えば、ヒト酵素を参照）；哺乳動物ＧａｌＴ１のステム領域、約７１から約１２９のアミノ酸残基（例えば、ウシ酵素を参照）；哺乳動物ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのステム領域、約２９から約８４のアミノ酸残基（例えば、ラット酵素を参照）；無脊椎動物コア１ＧａｌＴ１のステム領域、約３６から約１０２のアミノ酸残基（例えば、ショウジョウバエ酵素を参照）；哺乳動物コア１ＧａｌＴ１、約３２から約９０のアミノ酸残基（例えば、ヒト酵素を参照）；哺乳動物ＳＴ３Ｇａｌ１のステム領域、約２８から約６１のアミノ酸残基（例えば、ブタ酵素を参照）またはヒト酵素では、約１８から約５８のアミノ酸残基；哺乳動物ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのステム領域、約３０から約２０７のアミノ酸残基（例えば、マウス酵素を参照）；ヒト酵素では、アミノ酸３５〜２７８、またはニワトリ酵素では、アミノ酸３７〜２５３；哺乳動物ＧａｌＮＡｃＴ２のステム領域、約７１から約１２９のアミノ酸残基（例えば、ラット酵素を参照）が挙げられる。
【００９６】
「触媒ドメイン」とは、酵素によって行われる酵素反応を触媒するタンパク質ドメイン、またはその部分配列を言う。例えば、シアリルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、供与体から糖受容体へシアリン酸残基を移送させる上で十分なシアリルトランスフェラーゼの部分配列を含む。触媒ドメインは、酵素全体、その部分配列を含み得るか、または天然に見られるような、該酵素に結合していない追加のアミノ酸配列またはその部分配列を含み得る。典型的な触媒領域は、限定はしないが、フコシルトランスフェラーゼＶＩＩの触媒ドメイン、アミノ酸残基３９〜３４２；哺乳動物ＧｎＴ１の触媒ドメイン、約１０４から約４４５のアミノ酸残基（例えば、ヒト酵素を参照）；哺乳動物ＧａｌＴ１の触媒ドメイン、約１３０から約４０２のアミノ酸残基（例えば、ウシ酵素を参照）；哺乳動物ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの触媒ドメイン、約８５から約３７４のアミノ酸残基（例えば、ラット酵素を参照）である。ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質の触媒ドメインおよび切断変異体は、２００４年６月３日出願の米国特許出願第６０／５７６，５３０号；および２００４年８月３日出願の米国仮特許出願（整理番号０４０８５３−０１−５１４９−Ｐ１）に記載されており、双方とも、全ての目的のため、参照として本明細書に組み込まれている。触媒ドメインはまた、公知のグリコシルトランスフェラーゼとのアラインメントによって同定することもできる。
【００９７】
「部分配列」とは、核酸またはアミノ酸（例えば、タンパク質）のより長い配列の一部を含んでなる核酸またはアミノ酸それぞれの配列を言う。
【００９８】
「グリコシルトランスフェラーゼ切断体」もしくは「切断グリコシルトランスフェラーゼ」または変形語は、天然グリコシルトランスフェラーゼより少ないアミノ酸残基を有しているが、酵素活性を保持しているグリコシルトランスフェラーゼを言う。切断グリコシルトランスフェラーゼとしては、例えば、切断ＧｎＴ１酵素、切断ＧａｌＴ１酵素、切断ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素、切断ＧａｌＮＡｃＴ２酵素、切断コア１ＧａｌＴ１酵素、約３２から約９０のアミノ酸残基（例えば、ヒト酵素を参照）；切断ＳＴ３Ｇａｌ１酵素、切断ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ酵素、および切断ＧａｌＮＡｃＴ２酵素が挙げられる。該酵素が活性を保持する限り、任意の数のアミノ酸残基を欠失させることができる。いくつかの実施形態において、ドメインまたはドメインの一部を欠失させることができ、例えば、シグナルアンカードメインを欠失させて、ステム領域および触媒ドメインを含んでなる切断体を残すことができ；シグナルアンカードメインおよびステム領域の一部を欠失させて、残りのステム領域および触媒ドメインを含んでなる切断体を残すことができ；またはシグナルアンカードメインおよびステム領域を欠失させて、触媒ドメインを含んでなる切断体を残すことができる。
【００９９】
用語の「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態におけるデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを言い、別に限定しない限り、天然ヌクレオチドに類似した様式で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含する。別に指示しない限り、特定の核酸配列はその相補配列を含む。
【０１００】
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」は、このような配列に適合性の宿主における構造遺伝子の発現に影響を与えることができる核酸エレメントにより、組換え的にまたは合成的に作出された核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーターおよび任意に、転写終結シグナルを含む。典型的には、組換え発現カセットは転写される核酸（例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸）、およびプロモーターを含む。発現に影響を与える上で必要な、または有用な追加因子もまた、本明細書に記載されているように使用できる。例えば、発現カセットは、宿主細胞からの発現タンパク質の分泌を指令するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含むこともできる。転写終結シグナル、エンハンサー、および遺伝子発現に影響する他の核酸配列を発現カセットに含めることもできる。好ましい実施形態において、真核生物グリコシルトランスフェラーゼを含んでなるアミノ酸配列をコードする組換え発現カセットを細菌宿主細胞において発現させる。
【０１０１】
本明細書に用いられている「異種配列」または「異種核酸」は、特定の宿主細胞とは異なる供給源に由来するか、または同じ供給源であってもその元の形態から改変されているものである。したがって、真核生物宿主細胞における異種糖タンパク質遺伝子は、改変された特定の宿主細胞に内在性の糖タンパク質コード遺伝子を含む。異種配列の改変は、例えば、該ＤＮＡを制限酵素によって処理し、プロモーターに操作可能に結合されることのできるＤＮＡ断片を作成することによって生じ得る。異種配列の改変には、部位指向的変異などの技法もまた有用である。
【０１０２】
用語の「単離された」は、酵素の活性を妨害する成分が実質的にまたは本質的に無い材料を言う。本発明の糖、タンパク質、または核酸に関して、用語の「単離された」は、その天然状態で見られる材料を、通常伴う成分が実質的にまたは本質的に無い材料を言う。典型的には、本発明の単離された糖、タンパク質、または核酸は、銀染色ゲル上のバンド強度または純度決定のための他の方法によって測定した時、少なくとも約８０％純粋であり、通常は少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％純粋である。純度または均一性は、当該分野に周知の多数の手段によって示すことができる。例えば、サンプル中のタンパク質または核酸は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離でき、次いで、該タンパク質または核酸を染色により可視化できる。ある一定の目的には、該タンパク質または核酸の高度の分離が望ましいと考えられ、精製のためには、例えば、ＨＰＬＣまたは類似の手段を利用できる。
【０１０３】
用語の「操作可能に結合した」とは、核酸発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、または転写因子結合部位のアレイなど）と第２の核酸配列との間の機能的結合を言い、該発現制御配列は、第２の配列に相当する核酸の転写および／または翻訳に影響を与える。
【０１０４】
２種以上の核酸またはタンパク質配列に関して、用語の「同一」またはパーセント「同一性」とは、同じである２種以上の配列または部分配列をいうか、または以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いるか、または目視検査によって測定して、比較し、最大対応するように整列させた場合、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有している２種以上の配列または部分配列を言う。
【０１０５】
２種の核酸またはタンパク質に関して、語句の「実質的に同一」とは、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または目視検査によって測定して、比較し、最大対応するように整列させた場合、少なくとも約６０％超の核酸またはアミノ酸配列の同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する、２種以上の配列または部分配列を言う。実質的な同一性は、好ましくは少なくとも約５０残基の長さの配列領域にわたって存在し、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは該配列が少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。最も好ましい一実施形態において、該配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【０１０６】
配列比較では、典型的には、１つの配列が参照配列として働き、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要な場合は部分配列座標を指定し、配列演算プログラムパラメーターを指定する。次いで、指定されたプログラムパラメーターに基づき、配列比較アルゴリズムにより、参照配列に対する試験配列（１つまたは複数）に関する配列同一性パーセントが算出される。
【０１０７】
比較に関する最適な配列アラインメントを、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４頁（１９８８）の類似性法に関する探索により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．、ウィスコンシン州、マジソンのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または目視検査（一般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社との合弁（１９９５  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照）により実施できる。
【０１０８】
配列同一性パーセントおよび配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２頁に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析実施のためのソフトウェアは、バイオテクノロジー情報国立センターを介して、公共利用できる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードと共に整列した際、いくつかの陽性値とされる閾値スコアＴに合致するか満足させる問い合わせ配列における長さＷの短いワードを同定することによって、先ず高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値（上記Ａｌｔｓｃｈｕｌら）と称される。これらの最初の近隣ワードヒットが、探索開始のシードとして働き、それらを含有するより長いＨＳＰを見つける。次いで、それらのワードヒットを、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って双方向に拡張させる。ヌクレオチド配列、パラメーターＭ（対合残基対に関するリワードスコア；常に＞０）およびＮ（誤対合残基に関するペナルティースコア；常に＜０）を用いて累積スコアを算出する。アミノ酸配列に関しては、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの拡張は：累積アラインメントスコアがその最大達成値からＸ量減少する時；累積スコアが、１つ以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積によりゼロ以下になる時；またはどちらかの配列の端に達した時に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーター、Ｗ、Ｔ、およびＸは感度およびアラインメントの速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列レベルに関する）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および双方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５頁（１９８９）を参照）を用いる。
【０１０９】
配列同一性パーセントの算出に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、２種の配列間の類似性の統計的解析が実施される（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７頁（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性基準の１つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２種のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間に偶然生じる対合の確率の指標を提供する。例えば、試験核酸対参照核酸の比較において、最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満の場合、該核酸は参照核酸に類似していると考えられる。
【０１１０】
２種の核酸配列またはタンパク質が実質的に同一であるさらなる指標は、第１の核酸にコードされたタンパク質が、下記の第２の核酸にコードされたタンパク質と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば２種のペプチドが保存的置換基だけで違っている場合、典型的に、タンパク質は実質的に第２のタンパク質と同一である。２種の核酸配列が実質的に同一であるもう１つの指標は、これら２種の分子が下記のストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【０１１１】
語句の「に対して特異的にハイブリダイズする」とは、配列が複雑に混合した（例えば、細胞全体の）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合、ストリンジェントな条件下で、ある分子がある特定のヌクレオチド配列にのみ結合、複合化、またはハイブリダイズすることを言う。
【０１１２】
用語の「ストリンジェントな条件」とは、プローブがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を言う。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況下では異なってくる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度およびｐＨで、特異的配列に関する熱融点（Ｔｍ）より約１５℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列に平衡状態でハイブリダイズする温度（一定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）である。（標的配列は一般に過剰に存在しているため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のＮａイオン、典型的には、ｐＨ７．０から８．３において、約０．０１Ｍから１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）ならびに短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）では、少なくとも約３０℃および長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）では、少なくとも約６０℃のものが典型的である。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成できる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションのためには、陽性シグナルは、典型的に、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションである。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のものであり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ，４２℃でインキュベート、または、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ，６５℃でインキュベートし、６５℃で、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄。ＰＣＲには、約３６℃の温度が、低ストリンジェンシー増幅に典型的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに依って約３２℃〜４８℃の間で変わり得る。高ストリンジェンシーＰＣＲ増幅では、約６２℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度はプライマーの長さおよび特異性に依って、約５０℃から約６５℃の範囲であり得る。高および低ストリンジェンシー増幅双方にとって典型的なサイクル条件としては、３０〜１２０秒間、９０〜９５℃の変性段階、３０〜１２０秒続くアニーリング段階、および１〜２分間、約７２℃の伸長段階が挙げられる。低および高ストリンジェンシー増幅反応に関するプロトコルおよび指針は、例えば、Ｉｎｎｉｓら（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、において入手できる。
【０１１３】
抗体に関して、語句の「タンパク質に特異的に結合する」または「に特異的に免疫反応性である」は、タンパク質および他の生物学的物質の異種集団の存在下、該タンパク質存在を決定する結合反応を言う。したがって、指定された免疫アッセイ条件下、特定の抗体は特定のタンパク質に優先的に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に、有意な量で結合することはない。このような条件下でのタンパク質に対する特異的結合のためには、特定のタンパク質に対するその特異性に関して選択される抗体が必要である。特定のタンパク質に特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、種々の免疫アッセイフォーマットが使用できる。例えば、タンパク質に特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが慣用的に用いられる。特異的免疫反応性を判定するために使用できる免疫アッセイフォーマットおよび条件の説明に関しては、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、ニューヨークを参照されたい。
【０１１４】
特定のポリヌクレオチド配列の「保存的変更改変」とは、ポリヌクレオチドが同一の、または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするもの、またはポリヌクレオチドが本質的に同一の配列に対し、アミノ酸配列をコードしないものを言う。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が所与のタンパク質をコードする。例えば、ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧのコドンは全てアミノ酸のアルギニンをコードする。したがって、あるコドンによってアルギニンが指定されるどの位置においても、そのコドンを、コードされるタンパク質の変更なしに、記載されるいずれの対応コドンにも変更させることができる。このような核酸改変体は、「保存的改変された改変体」の１種である「サイレント改変」である。本明細書に記載された、タンパク質をコードするいずれのポリヌクレオチド配列も別に特記しない限り、全ての可能なサイレント改変を表している。当業者は、標準的方法によって、核酸中の各々のコドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＵＧＧを除いて）を変更させて、機能的に同一の分子を得ることができる。したがって、あるタンパク質をコードする核酸の各々の「サイレント改変」が、記載された各配列に内包されている。
【０１１５】
さらに、当業者は、コードされた配列における単一のアミノ酸または少パーセンテージ（典型的には５％未満、より典型的には１％未満）のアミノ酸を変更、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加は、該変更によって、１つのアミノ酸の化学的に類似したアミノ酸による置換が生じる「保存的改変された改変体」である。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野に周知である。
【０１１６】
タンパク質、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、およびタンパク質をコードする核酸の多くの保存的改変により、本質的に同一の生成物が得られることを当業者は理解されるであろう。例えば、遺伝子コードの縮重により、「サイレント置換」（すなわち、コードされたタンパク質の変更を生じさせない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコードするあらゆる核酸配列に含まれた特徴である。本明細書に記載されるように、キメラグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、酵母、ヒトなど）を生成させるために用いられる特定の宿主細胞における発現に関して、配列を最適化することが好ましい。同様に、類似性の高い性質（上記の定義の節を参照）を有する異なったアミノ酸による、アミノ酸配列の１つまたは２、３個のアミノ酸における「保存的アミノ酸置換」は、特定のアミノ酸配列、またはアミノ酸をコードする特定の核酸配列との類似性が高いため、容易に同定される。任意の特定配列のこのような保存的置換改変体は、本発明の特徴である。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎおよびグループもまた、参照されたい。さらに、コードされた配列における１つのアミノ酸または少パーセンテージのアミノ酸を改変、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加もまた、「保存的改変変異」である。
【０１１７】
本発明の実施は、宿主細胞、好ましくは細菌宿主細胞における組換え核酸の構築および遺伝子の発現を含み得る。これらの結果を達成するための分子クローニング法は当該分野に公知である。発現ベクターなどの組換え核酸の構築に好適な広範なクローニング法およびインビトロ増幅法は当業者に周知である。多くのクローニングの実施により当業者を指示する上で十分なこれらの技法ならびに教示は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５２巻  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、カリフォルニア州、サンディエゴ（Ｂｅｒｇｅｒ）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社との合弁（１９９９補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）に見られる。組換えポリペプチドの発現に好適な宿主細胞は当業者に公知であり、例えば、大腸菌などの原核細胞、および昆虫細胞、哺乳動物細胞および真菌細胞（例えば、クロカビ）などの真核細胞が挙げられる。
【０１１８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＱＢ−レｐリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介法などのインビトロ増幅法により、当業者に指示する上で十分なプロトコルの例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびに、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編集）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、カリフォルニア州、サンディエゴ（１９００）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７頁；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４頁；（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３頁；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４頁；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１８２６頁；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７−１０８０頁；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２９１−２９４頁；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ４：５６０頁；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ８９：１１７頁に見られる。インビトロ増幅核酸クローニングの改善法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１９】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．序文）
本発明は、細菌封入体において不溶性タンパク質として発現される真核生物グリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする条件を提供する。不溶性真核生物グリコシルトランスフェラーゼのリフォールディングを増強させるために、レドックス対を含んでなるリフォールディング緩衝液が用いられる。リフォールディングはまた、マルトース結合ドメインを不溶性真核生物グリコシルトランスフェラーゼに融合させることによって増強できる。いくつかの不溶性真核生物グリコシルトランスフェラーゼでは、不対合システインを除去するために、部位指向性変異によってリフォールディングを増強させることもできる。さらに、リフォールディングの増強は、真核生物グリコシルトランスフェラーゼを切断して、例えば、タンパク質のシグナルアンカードメイン、膜貫通ドメイン、および／またはステム領域の全部または一部を除去することによって提供できる。また本発明は、単一容器において１種超のグリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングし、それによって、タンパク質のリフォールディングを増強し、タンパク質産生の効率を増加させる方法を提供する。リフォールディングされた真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、多糖、オリゴ糖、糖脂質、タンパク質、ペプチド、糖ペプチド、および糖タンパク質を産生またはリモデリングするために使用できる。リフォールディングされた真核生物グリコシルトランスフェラーゼはまた、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６３号（全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている）に記載されているタンパク質、ペプチド、糖ペプチド、または糖タンパク質の糖ＰＥＧ化にも使用できる。
【０１２０】
（ＩＩ．不溶性グリコシルトランスフェラーゼのリフォールディング）
細菌に発現する多くの組換えタンパク質は、細菌の封入体における不溶性凝集体として発現する。封入体は、細菌の細胞質とペリプラズム空間の双方に見られるタンパク質蓄積物である。（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２０２−２０７頁（２００１）を参照）。真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、細菌の封入体において発現することが多い。いくつかの真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、細菌内で可溶性である。すなわち、該タンパク質の触媒ドメインのみが発現される場合は封入体内に産生されない。しかし、多くの真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、たとえ触媒ドメインのみが発現する場合でも不溶性のままであり、細菌の封入体内に発現し、これらのタンパク質をリフォールディングして活性グリコシルトランスフェラーゼを産生する方法が本明細書に提供されている。
【０１２１】
（Ａ．活性グリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする条件）
活性真核生物グリコシルトランスフェラーゼを細菌細胞から産生させるために、真核生物グリコシルトランスフェラーゼを細菌の封入体内に発現させ、該細菌を採集し、破壊し、封入体を単離し洗浄する。次いで、封入体内の該タンパク質を可溶化する。可溶化は、変性剤、例えば、塩化グアニジニウムまたは尿素；酸性またはアルカリ性条件などの極ｐＨ；または界面活性剤を用いて実施できる。
【０１２２】
可溶化後、グリコシルトランスフェラーゼ混合物から変性剤を除去する。変性剤の除去は、リフォールディング用緩衝液への希釈または緩衝液交換法などの種々の方法によって実施できる。緩衝液交換法としては、透析、ダイアフィルトレーション、ゲルろ過、および固体支持体上へのタンパク質固定化（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２０２−２０７頁（２００１）を参照）が挙げられる。変性剤を除去するために任意の上記の方法を組み合わせることができる。
【０１２３】
真核生物グリコシルトランスフェラーゼにおけるジスルフィド結合の形成は、レドックス対を含んでなるリフォールディング用緩衝液の添加によって促進される。レドックス対としては、還元および酸化グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）、システイン／シスチン、システアミン／シスタミン、ＤＴＴ／ＧＳＳＧ、およびＤＴＥ／ＧＳＳＧが挙げられる（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２０２−２０７頁（２００１）（全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている）を参照）。いくつかの実施形態において、レドックス対は、還元成分対酸化成分のある特定の比率、例えば、１／２０、２０／１、１／４、４／１、１／１０、１０／１、１／２、２／１、１／５、５／１、または５／５で添加される。
【０１２４】
リフォールディングは、例えば、６．０〜１０．０の範囲のｐＨで、緩衝液中で実施できる。リフォールディング用緩衝液は、リフォールディングを増強させるために、他の添加物、例えば、Ｌ−アルギニン（０．４〜１Ｍ）；ＰＥＧ；尿素（１〜２Ｍ）および塩化グアニジニウム（０．５〜１．５Ｍ）などの低濃度の変性剤；および界面活性剤（例えば、Ｃｈａｐｓ、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、ラウリルマルトシド、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含み得る。
【０１２５】
リフォールディングは、所与の時間、例えば、１〜４８時間にわたって、または一晩、行うことができる。リフォールディングは、室温を含めて、約４℃から約４０℃までで行うことができる。
【０１２６】
触媒ドメインを含んでなる真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質は、細菌の封入体内で発現させ、次いで、上記の方法を用いてリフォールドされる。ステム領域の全部または一部および触媒ドメインを含んでなる真核生物グリコシルトランスフェラーゼもまた、ＭＢＰタンパク質に融合された触媒ドメインを含んでなる真核生物グリコシルトランスフェラーゼと同様、本明細書に記載された方法に使用できる。
【０１２７】
当業者は、リフォールディングされたタンパク質が検出可能な生物学的活性を有する場合に該タンパク質が正しくリフォールディングされたことを認識されるであろう。グリコシルトランスフェラーゼでは、生物学的活性は、供与体基質から受容体基質への移送を触媒する能力であり、例えば、リフォールディングされたＳＴ３ＧａｌＩＩＩは、シアリン酸を受容体基質へ移送させることができる。生物学的活性としては、少なくとも１、２、５、７、または１０単位の活性の特異的活性が挙げられる。単位は以下の通り定義される：１活性単位は、所与の温度（例えば、３７℃）およびｐＨ（例えば、ｐＨ７．５）で１分当たり、１μモルの生成物の形成を触媒する。したがって、１０単位の酵素は、１０μモルの基質が、例えば、３７℃の温度、および例えば、７．５のｐＨで、１分間に１０μモルの生成物に変換される該酵素の触媒量である。
【０１２８】
一実施形態において、真核生物のＳＴ３ＧａｌＩＩＩが、細菌の封入体内に発現され、可溶化され、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングされる。
【０１２９】
一実施形態において、真核生物のＧｎＴ１が、細菌の封入体内に発現され、可溶化され、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングされる。
【０１３０】
一実施形態において、真核生物のＧａｌＴ１が、細菌の封入体内に発現され、可溶化され、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングされる。
【０１３１】
一実施形態において、真核生物のＳｔ３ＧａｌＩが、細菌の封入体内に発現され、可溶化され、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングされる。
【０１３２】
一実施形態において、真核生物のＳｔ６ＧａｌＮＡｃＴＩが、細菌の封入体内に発現され、可溶化され、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングされる。
【０１３３】
一実施形態において、真核生物のコアＧａｌＩＴＩが、細菌の封入体内に発現され、可溶化され、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングされる。
【０１３４】
一実施形態において、真核生物のＧａｌＮＡｃＴ２が、細菌の封入体内に発現され、可溶化され、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングされる。
【０１３５】
（Ｂ．リフォールディング増強のためのマルトース結合タンパク質ドメインへの真核生物グリコシルトランスフェラーゼの融合）
細胞へのタンパク質溶解度を高めるために、典型的にマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）ドメインをタンパク質に融合させる。例えば、ＫａｐｕｓｔおよびＷａｕｇｈ  Ｐｒｏ．Ｓｃｉ．８：１６６８−１６７４頁（１９９９）を参照されたい。しかし、切断真核生物グリコシルトランスフェラーゼを含めて、多くの真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ＭＢＰドメインに融合された後でも、細菌内に発現させた際、不溶性のままである。しかし、本出願は、ＭＢＰドメインが、例えば、封入体からのタンパク質可溶化後の不溶性真核生物グリコシルトランスフェラーゼのリフォールディングを増強できることを開示している。種々の細菌源、例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ、およびＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅのＭＢＰドメインを、本発明に使用できる。例えば、図４３を参照されたい。好ましい一実施形態において、大腸菌のＭＢＰタンパク質を真核生物グリコシルトランスフェラーゼに融合する。ＭＢＰドメインとグリコシルトランスフェラーゼとの間にアミノ酸リンカーを配置できる。他の好ましい実施形態において、ＭＢＰドメインをグリコシルトランスフェラーゼタンパク質のアミノ末端に融合させる。ＭＢＰグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質をリフォールディングするために上記の方法を使用できる。
【０１３６】
一実施形態において、真核生物ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質をＭＢＰドメインに融合させ、細菌の封入体内に発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングする。
【０１３７】
一実施形態において、真核生物ＧｎＴ１タンパク質をＭＢＰドメインに融合させ、細菌の封入体内に発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングする。
【０１３８】
一実施形態において、真核生物ＧａｌＴ１タンパク質をＭＢＰドメインに融合させ、細菌の封入体内に発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングする。
【０１３９】
一実施形態において、真核生物Ｓｔ３ＧａｌＩタンパク質をＭＢＰドメインに融合させ、細菌の封入体内に発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングする。
【０１４０】
一実施形態において、真核生物Ｓｔ６ＧａｌＮＡｃＴＩタンパク質をＭＢＰドメインに融合させ、細菌の封入体内に発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングする。
【０１４１】
一実施形態において、真核生物コアＧａｌＴＩタンパク質をＭＢＰドメインに融合させ、細菌の封入体内に発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングする。
【０１４２】
一実施形態において、真核生物ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質をＭＢＰドメインに融合させ、細菌の封入体内に発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングする。
【０１４３】
さらに、アミノ酸タグをＭＢＰ−グリコシルトランスフェラーゼ融合体に付加できる。例えば、リフォールディングされたタンパク質の精製を高めるために、精製タグを付加できる。精製タグとしては、例えば、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、澱粉結合タンパク質（ＳＢＰ）、大腸菌チオレドキシンドメイン、ＳＵＭＯタンパク質のカルボキシ末端側半分、ＦＬＡＧエピトープ、およびｍｙｃエピトープが挙げられる。リフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼは、精製タグに結合する結合パートナーを用いて、さらに精製できる。好ましい一実施形態において、リフォールディングを増強するために、ＭＢＰタグを真核生物グリコシルトランスフェラーゼに融合させる。精製タグは、例えば、ＧｎＴ１、ＧａｌＴ１、ＳｔＩＩＩ  Ｇａｌ３、Ｓｔ３ＧａｌＩ、Ｓｔ６ＧａｌＮＡｃＴＩ、コアＧａｌＴＩまたはＧａｌＮＡｃＴ２などのＭＢＰグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質に融合させることができる。
【０１４４】
他の実施形態において、タンパク質へのＭＢＰドメインの付加により、該タンパク質の発現を増加させることができる。例えば、ＭＢＰドメインへのＳｉａＡタンパク質の融合により、タンパク質の発現が増加した実施例１２を参照されたい。ＭＢＰに融合して発現が増強した他のタンパク質としては、例えば、ＧｎＴ１、ＧａｌＴ１、ＳｔＩＩＩ  Ｇａｌ３、Ｓｔ３ＧａｌＩ、Ｓｔ６ＧａｌＮＡｃＴＩ、コアＧａｌＴＩまたはＧａｌＮＡｃＴ２が挙げられる。
【０１４５】
別の実施形態において、インテインなどの自己開裂タンパク質タグは、ＭＰＢドメインとグリコシルトランスフェラーゼとの間に含まれ、融合タンパク質がリフォールディングされた後でＭＢＰドメインの除去を促進する。インテイン類およびそれらの使用のためのキット類は、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている。
【０１４６】
（Ｃ．リフォールディングを増強させるためのグリコシルトランスフェラーゼの変異誘発）
グリコシルトランスフェラーゼのリフォールディングはまた、グリコシルトランスフェラーゼアミノ酸配列の変異誘発によって増強させることができる。一実施形態において、不対合システイン残基を同定し、グリコシルトランスフェラーゼのリフォールディングを増強させるために変異誘発する。他の実施形態において、膜貫通ドメインを除去するため、または膜貫通ドメインおよび該タンパク質のステム領域の全部または一部を除去するために、グリコシルトランスフェラーゼのアミノ末端を切断する。さらなる一実施形態において、少なくとも１つの不対合システイン残基を除去するため、および、例えば、膜貫通ドメインを除去する目的で、または膜貫通ドメインおよび該タンパク質のステム領域の全部または一部を除去する目的で、該タンパク質のアミノ末端を切断するために、グリコシルトランスフェラーゼの変異誘発をする。グリコシルトランスフェラーゼの核酸配列を単離したら、核酸配列、したがってコードされたアミノ酸配列を変化させるために、本明細書に記載された方法で標準的な分子生物学的方法を用いることができる。
【０１４７】
（１．リフォールディングを増強させるためのグリコシルトランスフェラーゼにおける不対合システインの変異誘発）
リフォールディングが生じる際、変性タンパク質におけるシステイン残基は、活性タンパク質の構造再生を助けるジスルフィド結合を形成する。システイン残基の誤対合により、タンパク質のミスフォールディングに至り得る。不対合システイン残基を有するタンパク質はミスフォールディングし易い。なぜならば、通常の不対合システインは正しいシステイン対合を作る通常の対合システインと共にジスルフィド結合を形成でき、タンパク質のリフォールディングが不可能になるからである。したがって、ある特定のグリコシルトランスフェラーゼのリフォールディングを増強させるための一方法は、不対合システイン残基を同定し、それらを除去することである。
【０１４８】
不対合システイン残基は、対象のグリコシルトランスフェラーゼの構造決定により同定できる。タンパク質の構造は、対象のグリコシルトランスフェラーゼの実際のデータ、例えば、円二色性、ＮＭＲ、およびＸ線結晶構造解析に基づいて決定できる。タンパク質の構造は、コンピュータモデリングを用いて決定することもできる。コンピュータモデリングは、相同分子の公知の三次元構造に基づいて関連構造をモデル化するために使用できる方法である。標準的なソフトウェアは商品として入手できる（例えば、コンピュータモデリングを行うために利用できる多くのソフトウェアに関して、ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍを参照）。不対合システイン残基が同定されたら、欠失により、または他のアミノ酸残基による置換により不対合システインを除去するために、標準的な分子生物学的方法を用いて、対象のグリコシルトランスフェラーゼをコードしているＤＮＡを変異させることができる。置換用の適切なサイズ、形状、および電荷を有するアミノ酸を選択するために、再度、コンピュータモデリングを用いることができる。不対合システインは、ペプチドマッピングによって決定することもできる。対象のグリコシルトランスフェラーゼが変異したら、細菌封入体において該タンパク質を発現させ、リフォールディング能力を決定する。正しくリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼは生物学的活性を有する。
【０１４９】
好ましい実施形態において、リフォールディングを増強させるために、真核生物グリコシルトランスフェラーゼにおける不対合システイン残基を、以下のアミノ酸残基で置換する：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、またはＶａｌ。不対合システインが螺旋構造でない場合は、Ｇｌｙも使用できる。
【０１５０】
ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ、登録番号ＮＰ−００２３９７）は、不対合システインの変異誘発後にリフォールディングの増強を示したグリコシルトランスフェラーゼの一例である。（例えば、下記の実施例２を参照。）ヒトＧＮＴＩは、多数の真核生物ＧＮＴＩタンパク質、例えば、チャイニーズハムスター、登録番号ＡＡＫ６１８６８；ウサギ登録番号ＡＡＡ３１４９３；ラット、登録番号ＮＰ  １１０４８８；ゴールデンハムスター登録番号、ＡＡＤ０４１３０；マウス、登録番号Ｐ２７８０８；ゼブラフィッシュ、登録番号ＡＡＨ５８２９７；アフリカツメガエル、登録番号ＣＡＣ５１１１９；ショウジョウバエ、登録番号ＮＰ  ５２５１１７；ハマダラカ属、登録番号ＸＰ  ３１５３５９；Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、登録番号ＮＰ  ４９７７１９；Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、登録番号ＣＡＤ２２１０７；ジャガイモ、登録番号ＣＡＣ８０６９７；タバコ、登録番号ＣＡＣ８０７０２；イネ、登録番号ＣＡＤ３００２２；タバコｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、登録番号ＣＡＣ８２５０７；およびシロイヌナズナ、登録番号ＮＰ  １９５５３７とのメンバーと密に関連している。
【０１５１】
ウサギのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）タンパク質の構造が決定されており、ＣＹＳ１２３が不対合であることが示されている。（ＧＮＴＩタンパク質が切断されていた場合でも、アミノ酸残基の数は完全長タンパク質配列を参照する。）ヒトＧｎＴＩタンパク質の構造を決定するために、ウサギのＧｎＴＩに基づいたコンピュータモデリングを用いた。アラインメントは図６に示されている。ヒトＧｎＴＩタンパク質において、ＣＹＳ１２１が不対合であった。ヒトＧｎＴＩにおいて、ＣＹＳ１２１の置換が行われた。ＣＹＳ１２１ＳＥＲ変異体およびＣＹＳ１２１ＡＬＡ変異体は活性であった。対照的に、ＣＹＳ１２１ＴＨＲ変異体は検出可能な活性を有さず、ＣＹＳ１２１ＡＳＰは低活性を有した。線虫ＧＮＴＩタンパク質の予測された構造に基づいて、二重変異体、ＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳが構築され、これは活性を有した。
【０１５２】
コンピュータモデリングに基づいたタンパク質の構造ならびにウサギのＣＹＳ１２３およびヒトのＣＹＳ１２１の保存された機能を判定するために、上記の真核生物ＧｎＴＩタンパク質のアミノ酸配列を使用できる。その分析に基づくと、残基１２３は以下のタンパク質における不対合システインである：チャイニーズハムスターＧｎＴＩ、ウサギＧｎＴＩ、ラットＧｎＴＩ、ゴールデンハムスターＧｎＴＩ、およびマウスＧｎＴＩ。したがって、ＧｎＴＩ酵素の各々において、ＣＹＳ１２３は、セリン、アラニン、またはアルギニンに変異して、リフォールディング活性の増強した活性タンパク質を産生できる。上記タンパク質における以下の二重変異体、ＡＲＧ１２２ＡＬＡ  ＣＹＳ１２３ＨＩＳもまたリフォールディング増強を示す。
【０１５３】
一実施形態において、上記の真核生物ＧｎＴ１タンパク質の任意のものを、不対合システイン残基を除去するために、例えば、ＣＹＳ１２１ＳＥＲ、ＣＹＳ１２１ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＡＳＰ、または二重変異体ＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳへと変異させ、細菌封入体において発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングさせる。
【０１５４】
不対合システイン変異でリフォールディング増強を示す他のグリコシルトランスフェラーゼは、ＧａｌＴ１である。ウシＧａｌＴ１において、システイン３４２をトレオニン残基へ変異させると、変異した酵素は可溶化後、リフォールディング増強を示した。例えば、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３７６６６−３７６７１頁（２００１）を参照されたい。対象となっているＧｎＴＩ酵素におけるトレオニンへの不対合システインの変異では、活性が消えた。
【０１５５】
一実施形態において、不対合システイン残基を除去するために、例えば、ＧａｌＴ１タンパク質をＣＹＳ３４２ＴＨＲに変異させ、細菌封入体において発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングさせる。
【０１５６】
不対合システインの変異でリフォールディング増強を示す他のグリコシルトランスフェラーゼは、ＧａｌＮＡｃＴ２である。多くのアミノ酸残基が、ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質とＧａｌＮＡｃＴ１タンパク質との間で共用である。２つのシステイン残基、ＣＹＳ２１２およびＣＹＳ２１４の変異後、ヒトＧａｌＮＡｃＴ１タンパク質はＣＯＳ細胞内で発現させた際、依然として活性であった。例えば、Ｔｅｎｎｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４３０８−４３１６頁（２００２）を参照されたい。活性変異体としては、ＣＹＳ２１２ＡＬＡ、ＣＹＳ２１４ＡＬＡ、ＣＹＳ２１２ＳＥＲ、ＣＹＳ２１４ＳＥＲ、および二重変異体、ＣＹＳ２１２ＳＥＲ  ＣＹＳ２１４ＳＥＲが挙げられる。ヒトＧａｌＮＡｃＴ１に対応するシステイン残基、ＣＹＳ２１２残基およびＣＹＳ２１４残基は、ヒトＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質において保存され、すなわち、ＣＹＳ２２７残基およびＣＹＳ２２９残基である。例えば、図４４を参照されたい。したがって、以下の変異体の１つを含んでなるＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質を用いて、不溶性タンパク質のリフォールディングを増強させることができる：ＣＹＳ２２７ＡＬＡ、ＣＹＳ２２９ＡＬＡ、ＣＹＳ２２７ＳＥＲ、ＣＹＳ２２９ＳＥＲ、および二重変異体、ＣＹＳ２２７ＳＥＲ  ＣＹＳ２２９ＳＥＲ。残基のナンバリングは、ヒトＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質に適応されるが、ＣＹＳ２２７おびＣＹＳ２２９に相当する保存システイン残基は、他の真核生物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタのＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質において同定でき、リフォールディングを増強させるために変異させることができる。
【０１５７】
一実施形態において、ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質を、不対合システイン残基を除去するために、例えば、ＣＹＳ２２７ＡＬＡ、ＣＹＳ２２９ＡＬＡ、ＣＹＳ２２７ＳＥＲ、ＣＹＳ２２９ＳＥＲ、または二重変異体、ＣＹＳ２２７ＳＥＲ  ＣＹＳ２２９ＳＥＲに変異させ、細菌封入体において発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングさせる。
【０１５８】
不対合システインの変異でリフォールディング増強を示す他のグリコシルトランスフェラーゼは、コア１ＧａｌＴ１である。一実施形態において、ショウジョウバエのコア１ＧａｌＴ１を変異させる。他の実施形態において、ヒトのコア１ＧａｌＴ１を変異させる。ショウジョウバエのコア１ＧａｌＴ１タンパク質は、７つのシステイン残基を有する。各システイン残基を、個々に、セリンまたはアラニンのいずれかに変異させる。変異させたショウジョウバエコア１ＧａｌＴ１タンパク質を大腸菌封入体内で発現させ、可溶化し、リフォールディングする。リフォールディングした変異体のショウジョウバエコア１ＧａｌＴ１の酵素活性をアッセイし、リフォールディングした野生型ショウジョウバエコア１ＧａｌＴ１活性と比較する。野生型タンパク質と比較して、変異体のショウジョウバエコア１ＧａｌＴ１における酵素活性の増加によってリフォールディングの増強が示される。
【０１５９】
一実施形態において、コア１ＧａｌＴ１タンパク質、例えば、ショウジョウバエタンパク質またはヒトタンパク質を、不対合システイン残基を除去するために変異させ、細菌封入体において発現させ、可溶化し、レドックス対、例えば、ＧＳＨ／ＧＳＳＧまたはシスタミン／システインを含んでなる緩衝液中でリフォールディングさせる。ショウジョウバエコア１ＧａｌＴ１における置換に好ましいシステイン残基は、Ｃ１０３、Ｃ１２７、Ｃ２０８、Ｃ２４６、Ｃ２６１、Ｃ３１５およびＣ３１６である。
【０１６０】
（２．リフォールディング増強のためのグリコシルトランスフェラーゼ切断）
真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、一般に以下のドメインを含む：触媒ドメイン、ステム領域、膜貫通ドメイン、およびシグナルアンカードメイン。細菌内での発現の際、シグナルアンカードメイン、および膜貫通ドメインは、典型的に欠失する。本発明の方法に用いられる真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、ステム領域の全部または一部および触媒ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、真核生物グリコシルトランスフェラーゼは触媒ドメインのみを含んでなる。
【０１６１】
グリコシルトランスフェラーゼのドメインは、欠失変異に関して同定できる。例えば、当業者は真核生物グリコシルトランスフェラーゼにおけるステム領域を同定し、ステム領域のアミノ酸を１つずつ欠失させて、リフォールディングした際に高活性を有する切断真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質を同定できる。
【０１６２】
本出願における欠失変異体は、２つの方法で参照される。すなわち、ΔまたはＤに続く、天然の完全長アミノ酸配列のアミノ末端から欠失される残基数、または天然の完全長アミノ酸配列から翻訳される最初のアミノ酸残基の記号および残基数。例えば、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩΔ３５またはＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ  Ｄ３５およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ  Ｋ３６の双方は、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質の同じ切断を称す。
【０１６３】
例えば、ラットのＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質は、約２９〜８４のアミノ酸残基のステム領域を含む。このタンパク質の触媒ドメインは、残基約８５〜３７４由来のアミノ酸を含む。したがって、ラットの切断ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質は、例えば、約２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０．７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。
【０１６４】
欠失変異はまた、ＧｎＴ１タンパク質内で作製することができる。例えば、ヒトのＧｎＴ１タンパク質は、アミノ酸残基約３１〜１１２由来のステム領域を含む。したがって、ヒトの切断ＧｎＴ１タンパク質は、例えば、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、または１１１の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。
【０１６５】
欠失変異はまた、ＧａｌＴ１タンパク質内で作製することができる。例えば、ウシのＧａｌＴ１タンパク質は、アミノ酸残基約７１〜１２９由来のステム領域を含む。したがって、ウシの切断ＧａｌＴ１タンパク質は、例えば、約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、または１２８の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。
【０１６６】
欠失変異はまた、コア１  ＧａｌＴ１タンパク質内で作製することができる。例えば、ショウジョウバエのコア１  ＧａｌＴ１タンパク質は、アミノ酸残基約３６〜１０２由来のステム領域を含む。したがって、ショウジョウバエの切断コア１  ＧａｌＴ１タンパク質は、例えば、約３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、または１０２の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。別の実施形態において、ヒトのコア１  ＧａｌＴ１タンパク質は、アミノ酸残基約３２〜９０由来のステム領域を含む。したがって、ヒトの切断コア１  ＧａｌＴ１タンパク質は、例えば、約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。
【０１６７】
欠失変異はまた、ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質内で作製することができる。例えば、ヒトのＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質は、アミノ酸残基約１８〜５８由来のステム領域を含む。したがって、ヒトの切断ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質は、例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。別の例として、ブタのＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質は、アミノ酸残基約２８〜６１由来のステム領域を含む。したがって、ブタの切断ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質は、例えば、約２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、または６１の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。
【０１６８】
欠失変異はまた、ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質内で作製することができる。例えば、ラットのＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質は、アミノ酸残基約４０〜９５由来のステム領域を含む。したがって、ラットの切断ＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質は、例えば、約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。
【０１６９】
欠失変異はまた、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質内で作製することができる。例えば、マウスのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質は、アミノ酸残基約３０〜２０７由来のステム領域を含む。したがって、マウスの切断ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質は、例えば、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６，１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９，１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９，１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、または２０７の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。別の例として、ヒトのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質は、アミノ酸残基約３５〜２７８由来のステム領域を含む。したがって、ヒトの切断ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質は、例えば、約３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６，１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９，１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９，１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９，２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９，２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、または２７８の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。さらに別の例として、ニワトリのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質は、アミノ酸残基約３７〜２５３由来のステム領域を含む。したがって、ニワトリの切断ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質は、例えば、約３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６，１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９，１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９，１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９，２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、または２５３の残基のアミノ末端における欠失を有することができる。
【０１７０】
（Ｄ．グリコシルトランスフェラーゼ類のワンポットリフォールディング）
本発明のこれらの実施形態は、細菌封入体に発現される複数の真核生物のグリコシルトランスフェラーゼ類が、単独容器内、すなわち、ワンポット法でリフォールディングできるという驚くべき観察に基づいている。この方法を用いて、少なくとも２種のグリコシルトランスフェラーゼを、一緒にリフォールディングできることから、時間と材料を節約できる結果となった。リフォールディング条件は上記に記載されている。リフォールディング条件は、グリコシルトランスフェラーゼの混合物に関して最適化され、したがって、条件は、該混合物中のいずれか特定の酵素に関して最適でないことがあり得る。しかし、グリコシルトランスフェラーゼの組み合わせに関して最適化されるため、最終生成物におけるリフォールディングされた各グリコシルトランスフェラーゼは検出可能な生物学的活性を有する。生物学的活性はリフォールディングされた酵素の酵素活性に当てはまり、特異的活性として表すことができる。生物学的活性としては、例えば、少なくとも０．１、０．５、１、２、５、７、または１０単位の活性の特異的活性が挙げられる。単位は以下の通り定義される：１活性単位は、所与の温度（例えば、３７℃）およびｐＨ（例えば、ｐＨ７．５）で１分当たり、１μモルの生成物の形成を触媒する。したがって、１０単位の酵素は、１０μモルの基質が、例えば、３７℃の温度、および例えば、７．５のｐＨで、１分間に１０μモルの生成物に変換される該酵素の触媒量である。次いでリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼを含んでなる反応混合物を、例えば、オリゴ糖を合成するために、糖脂質を合成するために、糖タンパク質をリモデリングするために、および糖タンパク質を糖ＰＥＧ化するために使用することができる。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼを、封入体から個々に可溶化してから、リフォールディングに適切な条件下で組み合わせることができる。他の実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼを含有する封入体を組み合わせ、可溶化してから適切な条件下でリフォールディングする。
【０１７２】
リフォールディング用緩衝液は典型的にレドックス対を含む。リフォールディングは、例えば、６．０〜１０．０の範囲のｐＨで実施できる。リフォールディング用緩衝液は、リフォールディングを増強させるために、他の添加物、例えば、Ｌ−アルギニン（０．４〜１Ｍ）；ＰＥＧ；尿素（１〜２Ｍ）および塩化グアニジニウム（０．５〜１．５Ｍ）などの低濃度の変性剤；および界面活性剤（例えば、Ｃｈａｐｓ、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含み得る。
【０１７３】
幾つかの実施形態において、リフォールディングは静止容器中で、すなわち、混合、攪拌、振蕩せずに、またはそれ以外に反応混合物を動かすことなく実施される。
【０１７４】
リフォールディングされた酵素の組み合わせは、特定のオリゴ糖構造を構築するための酵素を含み得る。所望の最終生成物が同定されたら、当業者は、該混合物中に含めるための適切なグリコシルトランスフェラーゼを同定できよう。
【０１７５】
リフォールディングされた酵素の反応混合物はリフォールディングを増強させるために変異させたグリコシルトランスフェラーゼ、例えば、上記のＧｎＴＩ酵素を含み得る。
【０１７６】
好ましい一実施形態において、Ｎ−結合グリコシル化ステップを実施する酵素は、単一容器内で一緒にリフォールディングされる。例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼＩ（ＧａｌＴＩ）、およびＮ−アセチルラクトサミニドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ）を、細菌封入体内で発現させ、可溶化し、単一容器内で一緒にリフォールディングできる。最終生成物は３種のタンパク質全ての活性を示し、それらが全て正しくリフォールディングされたことを示した。また、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩなしで、ＧｎＴＩとＧａｌＴＩとが一緒にリフォールディングされた場合にもリフォールディングが生じた。これらの実験は、実施例３で詳細に記載されている。
【０１７７】
他の好ましい実施形態において、ペプチドまたはタンパク質のＯ−結合グリコシル化が、細菌で発現され、リフォールディングされた本開示のグリコシルトランスフェラーゼを用いて達成される。例えばポリペプチドにＧａｌＮＡｃを付加させるために、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）酵素を使用できる。例えば、実施例４は、ＧＣＳＦタンパク質にＧａｌＮＡｃを付加するために、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）が使用できる証明を提供している。Ｏ−結合グリコシルトランスフェラーゼの組み合わせを、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質または糖ペプチドをリモデリングするために使用できる。これらの組み合わせとしては、例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２とＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１；ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、コア１ＧａｌＴ１およびＳＴ３Ｇａｌ１またはＳＴ３ＧａｌＴ２が挙げられる。
【０１７８】
（ＩＩＩ．グリコシルトランスフェラーゼ）
本発明の実施に用いられるグリコシルトランスフェラーゼは、真核生物のグリコシルトランスフェラーゼである。このようなグリコシルトランスフェラーゼの例としては、Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ，Ｅ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：３９１−４０８頁、ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／〜ｐｅｄｒｏ／ＣＡＺＹ／ｇｔｆ．ｈｔｍｌおよびｗｗｗ．ｖｅｉ．ｃｏ．ｕｋ／ＴＧＮ／ｇｔ＿ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍに記載されているものが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１７９】
（真核生物グリコシルトランスフェラーゼ）
いくつかのグリコシルトランスフェラーゼは、それらのアミノ末端に、触媒活性には必要ない位相的ドメインを有する（米国特許出願第５，０３２，５１９号を参照）。現在までに特性化されたグリコシルトランスフェラーゼの中で、「細胞質ドメイン」は、最も一般的には長さが約１と約１０との間のアミノ酸であり、最もアミノ末端側のドメインであり；「シグナルアンカードメイン」と称される隣接ドメインは、一般に長さが約１０〜２６の間のアミノ酸であり；シグナルアンカードメインに隣接する「ステム領域」は、一般に長さが約２０〜約６０の間のアミノ酸でありグリコシルトランスフェラーゼをゴルジ装置内に維持するための保持シグナルとして機能することが知られており；該ステム領域のカルボキシル側は触媒ドメインである。
【０１８０】
多くの哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼがクローン化され、発現され、該組換えタンパク質は供与体基質および受容体基質の特異性に関して特性化されており、それらはまた、供与体基質または受容体基質の特異性に関与する残基またはドメインを確定する意図で、部位指向的変異によって調べられている（Ａｏｋｉら（１９９０）ＥＭＢＯ．Ｊ．９：３１７１−３１７８頁；Ｈａｒｄｕｉｎ−Ｌｅｐｅｒｓら（１９９５）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ５（８）：７４１−７５８頁；ＮａｔｓｕｋａおよびＬｏｗｅ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ４：６８３−６９１頁；Ｚｕら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０６（１）：３６２−３６９；Ｓｅｔｏら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３４：３２３−３２８頁；Ｓｅｔｏら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４１３３−１４１３８８頁）。
【０１８１】
一群の実施形態において、本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼタンパク質の機能的ドメインは、公知のシアリルトランスフェラーゼから得られる。本発明の使用に好適なシアリルトランスフェラーゼの例としては、限定はしないが、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、ＳＴ３ＧａｌＩＶ、ＳＴ３ＧａｌＩ、ＳＴ６ＧａｌＩ、ＳＴ３ＧａｌＶ、ＳＴ６ＧａｌＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩ、およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩ（本明細書に用いられるシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Ｔｓｕｊｉら（１９９６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ６：ｖ−ｘｉｖに記載されている通りである）が挙げられる。典型的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）は、シアリン酸をＧａｌβ１の非還元末端Ｇａｌ→４ＧｌｃＮＡｃジサッカライドまたはグリコシドへ移送させる。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６：３１５９頁（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５頁（１９８２）およびＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２１０１１頁（１９９２）を参照されたい。他の典型的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）は、シアリン酸をＧａｌβ１の非還元末端Ｇａｌ→３ＧａｌＮＡｃジサッカライドまたはグリコシドへ移送させる。Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４：４４４４頁（１９７９）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２１００４頁（１９９２）を参照されたい。さらなる典型的酵素として、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃα−２，６シアリルトランスフェラーゼが挙げられる（Ｋｕｒｏｓａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５−３８１（１９９４）を参照）。シアリルトランスフェラーゼの命名法は、Ｔｓｕｊｉ，Ｓら（１９９６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ６：ｖ−ｖｉｉに記載されている。
【０１８２】
特許請求された方法に有用なシアリルトランスフェラーゼの一例は、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩであり、これはα（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）とも称される。この酵素は、シアリン酸を、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃグリコシドのＧａｌ、またはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへ移送させるのを触媒する（例えば、Ｗｅｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１頁；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６：３１５９頁を参照）。シアリン酸は、２つの糖の間にα結合を形成することによってＧａｌに結合する。糖間の結合は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位との間のものである。この特定の酵素は、ラットの肝臓から（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら［１９８２］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５頁）；ヒトｃＤＮＡから（Ｓａｓａｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２−２２７８７頁；Ｋｉｔａｇａｗａ  ＆  Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４−１４０１頁）単離でき、組換え発現によってこの酵素の産生を促進するゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１−９３８頁）ＤＮＡ配列が知られている。好ましい一実施形態において、請求されたシアリル化法では、ラットのＳＴ３ＧａｌＩＩＩが用いられる。ラットのＳＴ３ＧａｌＩＩＩはクローン化されており、その配列は知られている。例えばＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１−２１０１９頁（１９９２）および登録番号Ｍ９７７５４を参照されたい。
【０１８３】
他の実施形態群において、本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼタンパク質の機能的ドメインは、フコシルトランスフェラーゼから得られる。多数のフコシルトランスフェラーゼが当業者に知られている。手短に言うと、フコシルトランスフェラーゼには、ＧＤＰ−フコースから受容体である糖のヒドロキシ位にＬ−フコースを移送させる任意の酵素が含まれる。例えば、いくつかの実施形態において、受容体の糖は、オリゴ糖グリコシドにおけるＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃ基内のＧｌｃＮＡｃである。この反応のための好適なフコシルトランスフェラーゼとしては、ヒト乳汁から得られる公知のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩ、Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）（Ｐａｌｃｉｃら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９０：１−１１頁（１９８９）；Ｐｒｉｅｅｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６−１０４６３頁（１９８１）；およびＮｕｎｅｚら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６−２０９５（１９８１）を参照）およびＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃα（１→３）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、およびＦＴＶＩ，Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）ならびにヒト血清に見られるＮｅｕＡｃα（２，３）βＧａｌ（１→４）βＧｌｃＮＡｃα（１→３）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＶＩＩ）が挙げられる。また、Ｋａｎｅｋｏら（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５２：２３７−２４２頁に記載されているα１，３フコシルトランスフェラーゼＩＸ（ヒトおよびマウスＦＴＩＸのヌクレオチド配列）も利用できる。さらに、Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換え体も利用できる（Ｄｕｍａｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１：４２５−４２８頁（１９９１）およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ４：１２８８−１３０３頁（１９９０）を参照）。他の典型的なフコシルトランスフェラーゼとしては、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６９）が挙げられる。酵素的フコシル化は、Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９−１７６頁（１９９０）または米国特許出願第５，３７４，６５５号に記載された方法により実施できる。
【０１８４】
他の実施形態群において、本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼタンパク質の機能的ドメインは、公知のガラクトシルトランスフェラーゼから得られる。典型的なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼＩ、α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ［Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．１５１、例えば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：２９２１頁（１９９３）およびＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ３４５：２２９−２３３頁（１９９０）、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｊｏ４９８９、Ｊｏｚｉａｓｓｅら［１９８９］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０−１４２９７頁）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ  ｍ２６９２５；Ｌａｒｓｅｎら［１９８９］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２２７−８２３１頁）、ブタ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ３６１５２；Ｓｔｒａｈａｎら［１９９５］Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４１：１０１−１０５）を参照）が挙げられる。他の好適なα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液Ｂ群抗原の合成に関与するものである（ＥＣ２．４．１．３７、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１４６−１１５１頁（ヒト））。また、本発明の融合タンパク質における使用に好適なものは、α１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼであり、これには、例えば、ＥＣ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃシンテターゼ）およびＥＣ２．４．１．２２（ラクトスシンセターゼ）（ウシ（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１−２１７頁）、ヒト（Ｍａｓｒｉら［１９８８］Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：６５７−６６３頁）、マウス（Ｎａｋａｚａｗａら（１９８８）Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：１６５−１６８頁）、ならびにＥ．Ｃ．２．４．１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．４５、Ｓｔａｈｌら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３８：２３４−２４２頁）が挙げられる。他の好適なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、例えば、α１，２−ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅのもの、Ｃｈａｐｅｌｌら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ５：５１９−５２８頁）が挙げられる。
【０１８５】
本発明の組換え融合タンパク質に有用な他のグリコシルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、およびフコシルトランスフェラーゼについて、詳述されている。特に、グリコシルトランスフェラーゼはまた、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、例えば、Ａｌｇ８（Ｓｔａｇｌｊｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：５９７７頁（１９９４））またはＡｌｇ５（ＨｅｅｓｅｎらＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：７１頁（１９９４））、例えば、β（１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（米国特許出願第５，６９１，１８０号、Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８９頁（１９９２）、およびＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２頁（１９９４））およびタンパク質Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９頁（１９９３））などのＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであり得る。好適なＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとしては、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ１７６：６０８頁（１９９１））、ＧｎＴＩＩ、およびＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：６９２頁（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９３２６（１９９２））、Ｎ−アセチルグルコサミニン−１−ホスフェートトランスフェラーゼ（Ｒａｊｐｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８５：９８５（１９９２）、およびヒアルロナンシンターゼが挙げられる。例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＩ（ＥＣ２．４．１．１７４）などのプロテオグリカン合成に関与する酵素、およびＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＥＣ２．４．１．１７５）などの硫酸コンドロイチン合成に関与する酵素もまた興味深い。好適なマンノシルトランスフェラーゼとしては、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈ１、およびＰｍｔ１が挙げられる。キシロシルトランスフェラーゼとしては、例えば、タンパク質キシロシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．２．２６）が挙げられる。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、真核生物Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、細菌内に発現され、本開示の方法を用いてリフォールディングされる。多数のＧａｌＮＡｃＴ酵素、例えば、ＧａｌＮＡｃＴ１、登録番号Ｘ８５０１８；ＧａｌＮＡｃＴ２、登録番号Ｘ８５０１９（双方ともＷｈｉｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４１５６−２４１６５（１９９５）に記載されている）；およびＧａｌＮＡｃＴ３、登録番号Ｘ９２６８９（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７００６−１７０１２（１９９６）に記載されている）が単離され、特性化されている。
【０１８７】
（ＩＶ．核酸）
グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸、およびこのような核酸を得る方法は、当業者に公知である。好適な核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム、または部分配列（プローブ））を、クローン化できるか、または、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）、または自立配列複製システム（ＳＳＲ）などのインビトロ方法により増幅できる。多種多様のクローニングおよびインビトロ増幅方法論が当業者に周知である。多くのクローニングの実施による当業者に指示する上で十分なこれらの方法および教示の例は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、カリフォルニア州、サンディエゴ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社との合弁（１９９４増補）（Ａｕｓｕｂｅｌ）；Ｃａｓｈｉｏｎら、米国特許出願第５，０１７，４７８号；および  Ｃａｒｒ、欧州特許第０，２４６，８６４号に見られる。
【０１８８】
グリコシルトランスフェラーゼ、またはその部分配列をコードするＤＮＡは、例えば、クローニングおよび制限酵素による適切な配列の制限などの上記の任意の好適な方法によって調製できる。好ましい一実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、慣用的クローニング法によって単離される。ゲノムＤＮＡサンプル中のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子、またはＲＮＡサンプル全体中で、グリコシルトランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを提供するために、例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の配列データベースに提供されているグリコシルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列（上記を参照）を使用できる（例えば、サザンブロットまたはノーザンブロットにおいて）。グリコシルトランスフェラーゼをコードしている標的核酸が同定されたら、それを、当業者に公知の標準的方法によって単離できる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、サンディエゴ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社；またはＡｕｓｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ    Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨークを参照）。さらに、単離された核酸を制限酵素によって開裂して、完全長グリコシルトランスフェラーゼ、またはその部分配列をコードする、例えば、グリコシルトランスフェラーゼのステム領域または触媒ドメインの少なくとも１つの部分配列をコードする部分配列を含有する核酸を創製することができる。次いでグリコシルトランスフェラーゼ、またはその部分配列をコードするこれらの制限酵素断片を、例えば、組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質をコードする核酸を作成させるために、結合させ得る。
【０１８９】
グリコシルトランスフェラーゼ、またはその部分配列をコードする核酸を、発現生成物に関してアッセイすることによって特性化できる。発現タンパク質の物理的、化学的、または免疫学的性質の検出に基づいたアッセイを使用できる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質などのクローン化グリコシルトランスフェラーゼを、該核酸によってコードされたタンパク質の、供与体基質から受容体基質への糖の移送を触媒する能力によって同定することができる。好ましい一方法において、反応生成物を検出するために、キャピラリー電気泳動が用いられる。この高感度アッセイには、Ｗａｋａｒｃｈｕｋら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４５）：２８２７１−２７６頁に記載されている蛍光で標識されたサッカライドアミノフェニル誘導体またはジサッカライドアミノフェニル誘導体のいずれかの使用が含まれる。例えば、ナイセリアｌｇｔＣ酵素のアッセイには、ＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−ＬａｃまたはＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−Ｇａｌを使用でき、一方、ナイセリアｌｇｔＢ酵素にとっての適切な試薬は、ＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−ＧｌｃＮＡｃ（上記）である。
【０１９０】
また、グリコシルトランスフェラーゼ、またはその部分配列をコードする核酸を、化学的に合成することもできる。好適な方法としては、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９頁のホスホジエステル法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１頁のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．、２２：１８５９−１８６２頁のジエチルホスホラミダイト法；および米国特許出願第４，４５８，０６６号の固体支持体法が挙げられる。化学的合成では一本鎖オリゴヌクレオチドが生成する。これを、相補的配列によるハイブリダイゼーションによって、または一本鎖をテンプレートとして用いた、ＤＮＡポリメラーゼによる重合によって、二本鎖ＤＮＡへと変換できる。ＤＮＡの化学的合成は、約１００塩基の配列に制限されることが多いが、より長い配列がより短い配列の結合によって得ることができることは、当業者に認識されている。
【０１９１】
グリコシルトランスフェラーゼ、またはその部分配列をコードする核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を用いてクローン化できる。したがって、例えば、該核酸配列または部分配列は、１つの制限酵素部位（例えば、ＮｄｅＩ）を含有するセンスプライマーおよび他の制限酵素部位（例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ）を含有するアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅できる。これによって、所望のグリコシルトランスフェラーゼまたは部分配列をコードし、末端制限酵素部位を有する核酸が生成する。次いで、この核酸を、第２の分子をコードする核酸を含有し、対応する適切な制限酵素部位を有するベクターに、容易に結合できる。好適なＰＣＲプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の供給源から提供される配列情報を用いて、当業者によって決定できる。また、部位指向性変異によって、適切な制限酵素部位を、グリコシルトランスフェラーゼタンパク質またはタンパク質部分配列をコードする核酸に付加できる。グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列または部分配列を含有するプラスミドを、適切な制限エンドヌクレアーゼによって開裂し、次いで標準的方法にしたがって、増幅および／または発現のための適切なベクター内へ結合させる。当業者に指示する上で十分なインビトロ増幅法による方法の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編集）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、カリフォルニア州、サンディエゴ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年、１０月１日）Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７頁；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１〜９４；（Ｋｗｏｈら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７、１８７４頁；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３５：１８２６頁；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２９１−２９４頁；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４：５６０頁；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７頁に見られる。
【０１９２】
特定の核酸から発現させたグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質などのクローン化グリコシルトランスフェラーゼの他の物理的性質を、公知のグリコシルトランスフェラーゼの性質と比較して、受容体基質特異性および／または触媒活性の決定因子である該グリコシルトランスフェラーゼの好適な配列またはドメインを同定する他の方法を提供できる。或いは、推定上のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子または組換えグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を変異させて、グリコシルトランスフェラーゼとしてのその役割、リフォールディングされるその能力、または特定の配列またはドメインの役割を、非変異の、天然の、または対照のグリコシルトランスフェラーゼによって通常作成される炭水化物の構造における変化を検出することによって確認できる。
【０１９３】
クローン化されたグリコシルトランスフェラーゼの機能性ドメインは、グリコシルトランスフェラーゼ類を改変または修飾するための標準的方法、および本明細書に記載されている、受容体基質活性および／または触媒活性などの活性に関して改変または変異したタンパク質を試験することにより同定できる。１種以上のグリコシルトランスフェラーゼ類の機能性ドメインを含んでなる組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質をコードする核酸類を構築するために種々のグリコシルトランスフェラーゼの機能性ドメインを使用できる。次にこれらの融合タンパク質を、所望の受容体基質活性または触媒活性について試験できる。
【０１９４】
組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質をクローン化する典型的な方法において、クローン化グリコシルトランスフェラーゼの公知の核酸またはアミノ酸配列を整列させ、種々のグリコシルトランスフェラーゼ間の配列同一性量を判定するために比較する。この情報により、グリコシルトランスフェラーゼ活性、例えば、対象のグリコシルトランスフェラーゼ類間の配列同一性量に基づく受容体基質活性および／または触媒活性を与えるか、または調節する蛋白ドメインを同定し、選択するために使用できる。例えば、対象のグリコシルトランスフェラーゼ間に配列同一性を有し、公知の活性に関係するドメインは、そのドメインを含有し、そのドメインに関連する活性（例えば、受容体基質特異性および／または触媒活性）を有する、組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質を構築するために使用できる。
【０１９５】
（Ｖ．組換えグリコシルトランスフェラーゼ類の発現）
組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌、他の細菌宿主、酵母、およびＣＯＳ、ＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞系ならびに骨髄腫細胞系などの種々の高等真核生物細胞を含む種々の宿主細胞において発現できる。宿主細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、または例えば、酵母細胞、細菌細胞、もしくは真菌細胞などの微生物であり得る。好適な宿主細胞の例としては、多くのものの中で、例えば、アゾトバクター種（例えば、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、シュードモナス種、リゾビウム種、エルウィニア種、エシェリキア種（例えば、大腸菌）、バチラス、シュードモナス、プロテウス、サルモネラ、セラチア、シゲラ、リゾビア、ビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）、パラコッカス属およびクレブシエラ種が挙げられる。該細胞は、サッカロミセス属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ属（例えば、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ピチア属（例えば、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａおよびＰ．ｏｈｍｅｒｉ）、トルロプシス属（例えば、Ｔ．ｃａｎｄｉｄａ、Ｔ．ｓｐｈａｅｒｉｃａ、Ｔ．ｘｙｌｉｎｕｓ、Ｔ．ｆａｍａｔａ、およびＴ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、デバリオミセス属（例えば、Ｄ．ｓｕｂｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ、Ｄ．ｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ、およびＤ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ジゴサッカロミセス属（例えば、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉおよびＺ．ｂａｉｌｉｉ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ハンゼヌラ属（例えば、Ｈ．ａｎｏｍａｌａおよびＨ．ｊａｄｉｎｉｉ）およびブレッタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｂ．ｌａｍｂｉｃｕｓおよびＢ．ａｎｏｍａｌｕｓ）などのうち、いずれかの属のものであり得る。有用な細菌の例としては、限定はしないが、エシェリキア、エンテロバクター、アゾトバクター、エルウィニア、クレブシエリアが挙げられる。
【０１９６】
典型的に、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞において機能的であるプロモーターの制御下に置かれる。極めて多種多種のプロモーター類が周知であり、特定の適用に依って本発明の発現ベクターに使用できる。通常、選択されたプロモーターは、プロモーターが活性となる細胞に依存する。リボソーム結合部位、転写末端部位などの他の発現制御配列もまた、任意に含まれる。１つ以上のこれらの制御配列を含む構造物は、「発現カセット」と呼ばれる。したがって、本発明は、融合タンパク質をコードする核酸類が所望の宿主細胞における高レベルの発現のために取り込まれる発現カセットを提供する。
【０１９７】
特定の宿主細胞における使用に好適な発現制御配列は、その細胞に発現される遺伝子をクローン化することにより得られることが多い。リボソーム結合部位配列と共に任意にオペレーターによる転写開始のためのプロモーター類を含んで、本明細書に定義される通常使用される原核生物の制御配列としては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）系およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５６頁）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７頁）、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８３）８０：２１−２５頁）；およびラムダ由来ＰＬプロモーターならびにＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８頁）などの一般に使用されているプロモーター類が挙げられる。特定のプロモーター系は、本発明にとって重要ではなく、原核生物において機能する任意の利用できるプロモーターが使用できる。
【０１９８】
大腸菌以外の原核生物における組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼ類の発現のためには、特定の原核生物種において機能するプロモーターが必要である。このようなプロモーター類は、その種からクローン化された遺伝子から得ることができるか、または異種のプロモーター類が使用できる。例えば、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターは、大腸菌の他にバチルス属でも機能する。
【０１９９】
リボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、本発明の発現カセットに都合よく含まれている。例えば、大腸菌におけるＲＢＳは、開始コドンの３〜１１のヌクレオチド上流に位置した長さ３〜９のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる（ＳｈｉｎｅおよびＤａｌｇａｒｎｏ、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５４：３４頁；Ｓｔｅｉｔｚ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ）、１巻、３４９頁、１９７９年、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ニューヨーク）。
【０２００】
酵母における組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼの発現のために、好適なプロモーター類としては、ＧＡＬ１−１０（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＤａｖｉｅｓ（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４４０−１４４８頁）ＡＤＨ２（Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４−２６８２頁）、ＰＨＯ５（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８２）６：６７５−６８０頁）、およびＭＦα（ＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚおよびＯｓｈｉｍａ（１９８２）編、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ、Ｊｏｎｅｓ、およびＢｒｏａｃｈ編集）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂ．、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１８１−２０９頁）が挙げられる。酵母における使用に好適な別のプロモーターは、Ｃｏｕｓｅｎｓら、Ｇｅｎｅ６１：２６５−２７５頁（１９８７）に記載されているＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーターである。例えば、真菌アスペルギルス株（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号）などの糸状菌に関して、有用なプロモーター類の例としては、ＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２０９３−２０９９頁（１９８５））およびｔｐｉＡプロモーターなどの偽巣性コウジ菌の解糖遺伝子に由来するものが挙げられる。好適なターミネーターの例は、ＡＤＨ３ターミネーターである（ＭｃＫｎｉｇｈｔら）。
【０２０１】
植物における使用に好適な構成的プロモーター類としては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域と領域ＶＩプロモーター類、アグロバクテリウムチュメファシエンスのＴ−ＤＮＡに由来する１’−または２’−プロモーター、および当業者に公知の植物細胞において活性な他のプロモーター類が挙げられる。他の好適なプロモーター類としては、フィグウォート（Ｆｉｇｗｏｒｔ）モザイクウィルス、アクチンプロモーター類、ヒストンプロモーター類、チューブリンプロモーター類、またはマンノピン合成プロモーター（ＭＡＳ）からの完全長転写プロモーターが挙げられる。他の構成的植物プロモーター類としては、とりわけアラビドプシス（ＳｕｎおよびＣａｌｌｉｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１１（５）：１０１７−１０２７頁（１９９７））に由来する種々のユビキチンまたはポリユビキチン、マス、マックまたはダブルマックプロモーター類（米国特許第５，１０６，７３９号およびＣｏｍａｉらによるＰｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３７３−３８１頁（１９９０）に記載されている）および当業者に公知の種々の植物遺伝子の他の転写開始領域が挙げられる。また、植物に有用なプロモーター類としては、プロモーター類が、植物において機能的であることが見出されている植物細胞、植物ウィルスまたは他の宿主のＴｉ−プラスミドまたはＲｉ−プラスミドから得られたものが挙げられる。植物において機能的で、したがって本発明の方法における使用に好適である細菌プロモーターとしては、オクトピンシンテターゼプロモーター、ノパリン合成プロモーター、およびマノピン合成プロモーターが挙げられる。好適な内因性植物プロモーターとしては、リブロース−１，６−ビホスフェート（ＲＵＢＰ）、カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）プロモーター、（α−コングリシニンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、ＡＤＨプロモーター、およびヒートショックプロモーター類が挙げられる。
【０２０２】
構成的または制御されたプロモーター類を、本発明に使用できる。融合タンパク質の発現が誘導される前に宿主細胞を高密度に増殖できることから、制御されたプロモーター類が有利となり得る。異種のタンパク質の高レベル発現により、幾つかの状況で細胞増殖が遅くなる。誘導性のプロモーターは、遺伝子の発現レベルが、例えば、温度、ｐＨ、嫌気的または好気的条件、光、転写因子および試薬などの環境因子または発生因子により変化する遺伝子発現を方向付けるプロモーターである。このようなプロモーターは、本明細書で「誘導性」プロモーターと称され、ヌクレオチド糖合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼまたは酵素の発現タイミングを制御できる。大腸菌および他の細菌宿主細胞に関して、誘導性プロモーター類は当業者に公知である。これらには、例えば、ｌａｃプロモーター、バクテリオファージラムダＰＬプロモーター、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（Ａｍａｎｎら、（１９８３）Ｇｅｎｅ２５：１６７頁；ｄｅ  Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２１頁）、バクテリオファージＴ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．；Ｔａｂｏｒら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１０７４−８頁）が含まれる。これらのプロモーターと使用法は、前述のＳａｍｂｒｏｏｋらにより考察されている。原核生物における発現のために特に好ましい誘導性プロモーターは、ガラクトース代謝に関与する酵素をコードする遺伝子（１つまたは複数）から得られたプロモーター成分に結合したｔａｃプロモーター成分を含むデュアルプロモーター（例えば、ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）からのプロモーター）である。ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９８／２０１１１号に記載されているデュアルｔａｃ−ｇａｌプロモーターは、いずれかのプロモーター単独により提供されたものよりも大きな発現レベルを提供する。
【０２０３】
植物における使用のための誘導性プロモーター類は、当業者に公知であり（例えば、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｒら（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：２２１頁に記載の参考文献を参照）、光誘導性で光合成組織においてのみ活性であるシロイヌナズナの１，５−リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のもの（「ｓｓｕ」プロモーター）を含む。
【０２０４】
他の生物に関する誘導性プロモーター類もまた、当業者に周知である。これらには、例えば、アラビノースプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、メタロチオネインプロモーター、およびヒートショックプロモーターならびに他の多くのものが含まれる。
【０２０５】
遺伝子発現制御シグナルに操作可能に結合される対象のポリヌクレオチドを含む構造は、適切な宿主細胞に入れられた場合、ポリヌクレオチドの発現を駆動し、「発現カセット」と呼ばれる。本発明の融合タンパク質をコードする発現カセットは、宿主細胞内への導入のために発現ベクターに入れられることが多い。ベクタ類は典型的に、発現カセットに加えて、ベクターが１種以上の選択宿主細胞において独立して複製できる核酸配列を含む。一般に、この配列は、ベクターが宿主の染色体ＤＮＡから独立して複製できるものであり、複製起点または自律的複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌に関して周知である。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切である。あるいは、該ベクターは、宿主細胞のゲノム補体に組み込まれることにより、また細胞がＤＮＡ複製を受けて複製されることによって複製できる。細菌細胞における酵素発現にとって好ましい発現ベクターは、デュアルｔａｃ−ｇａｌプロモーターを含み、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９８／２０１１１号に記載されているｐＴＧＫである。
【０２０６】
また、宿主細胞の増殖に比してポリペプチドの発現調節を可能にする調節配列を加えることが、望ましいと考えられる。調節系の例は、調節化合物の存在を含む、化学または物理的刺激に応答して、作動または遮断される遺伝子発現を生じるものである。原核生物系における調節系としては、ｌａｃオペレーター系、ｔａｃオペレーター系、およびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母において、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系を使用できる。糸状菌において、ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、クロカビのグルコアミラーゼプロモーター、コウジカビのグルコアミラーゼプロモーターを、調節配列として使用できる。
【０２０７】
ポリヌクレオチド構造物の構成は、一般に細菌内で複製できるベクターの使用を必要とする。多くのキットは、細菌のプラスミドの精製用に商品として入手できる（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐＪ、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐＪの双方ともＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＪ；ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを参照）。次いで単離および精製プラスミドを、他のプラスミドを産生するためにさらに操作でき、細胞に形質移入させるために使用できる。ストレプトミセスまたはバチルスにおけるクローン化もまた可能である。
【０２０８】
選択マーカーが、本発明のポリヌクレオチド類を発現するために用いられる発現ベクターに取り込まれることが多い。これらの遺伝子は、選択的培養培地中で増殖される形質移入宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質などの遺伝子産物をコードする。選択遺伝子を含有するベクターにより形質移入されなかった宿主細胞は、培養培地中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンなどの抗生物質または毒素に耐性を与えるタンパク質をコードする。あるいは、選択マーカーは、栄養要求性の欠失を補足するか、または複合培地から利用できない重要な栄養物を供給するタンパク質をコードできる（例えば、桿菌用にＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。該ベクターは、宿主細胞に導入される前に該ベクターが複製される大腸菌または他の細胞において機能的である１つの選択マーカーを有することが多い。多数の選択マーカーが、当業者に公知であり、例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋらに記載されている。細菌細胞の使用に好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性マーカーである（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ１９：２５９頁（１９８２））。カナマイシンの選択使用は、例えば、アンピシリン選択よりも有利である。というのは、アンピシリンは、培養培地中のβ−ラクタマーゼにより速やかに分解され、したがって選択圧が除かれ、その培養物にはベクターを含有しない細胞が過剰増殖するからである。
【０２０９】
上記に掲げた１種以上の成分を含有する好適なベクターの構築物には、上記に引用した参考文献に記載された標準的な連結法が使用される。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片を開裂し、編成し、所望の形態に再結合させて必要なプラスミドを生成する。構築されたプラスミドにおける正しい配列を確認するために、公知の方法に従って制限エンドヌクレアーゼ消化および／または塩基配列決定法など、標準的方法による分析によってこのプラスミドを分析できる。これらの目標を達成する分子クローン化技法は、当該分野に公知である。組換え核酸の構築に好適な多種多様のクローン化法およびインビトロ増幅法は、当業者に周知である。当業者を指導する上で十分な多くのクローン化実施によるこれらの技法および教示の例は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌのＧｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｂｅｒｇｅｒ）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社との共同事業、（１９９８年に補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）に見られる。
【０２１０】
本発明の発現ベクターを構築するための出発原料としての使用に好適な種々の共通のベクターが、当該分野に周知である。細菌におけるクローン化に関して、共通のベクターとしては、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（商標）などのｐＢＲ３２２由来のベクター、およびλ−ファージ由来のベクターが挙げられる。酵母におけるベクターとしては、酵母組込みプラスミド（例えば、ＹＩｐ５）および酵母複製プラスミド（ＹＲｐシリーズプラスミド類）およびｐＧＰＤ−２が挙げられる。哺乳動物細胞における発現は、ｐＳＶ２、ｐＢＣ１２ＢＩおよびｐ９１０２３、ならびに溶解性ウィルスベクター（例えば、ワクシニアウィルス、アデノウィルスおよびバキュロウィルス）、エピソームウィルスベクター（例えば、ウシパピローマウィルス）、レトロベクター（例えば、マウスレトロウィルス類）などの種々の一般に利用できるプラスミドを用いて達成できる。
【０２１１】
発現ベクターを選択された宿主細胞に導入する方法は、特に重要ではなく、このような方法は当業者に公知である。例えば、発現ベクターを、塩化カルシウム形質転換により、大腸菌などの原核生物細胞に導入でき、またリン酸カルシウム処理または電気穿孔により真核生物細胞に導入できる。他の形質転換法もまた好適である。
【０２１２】
翻訳カップリングが、発現を増強させるために使用できる。この方法では、翻訳系に特有の高発現遺伝子由来の短い上流オープンリーディングフレームを使用し、これをプロモーターの下流に配置し、続いて終止コドンによる２、３のアミノ酸コドン後、リボソーム結合部位が位置する。終止コドンの直前に、第２のリボソーム結合部位があり、終止コドン後に翻訳開始のための開始コドンがある。この系は、ＲＮＡにおける二次的構造を分解して翻訳の効率的開始を可能にする。Ｓｑｕｉｒｅｓら（１９８８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２６３：１６２９７−１６３０２頁を参照されたい。
【０２１３】
本発明の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼはまた、他の細菌タンパク質にさらに結合できる。通常の原核生物の制御配列が、転写および翻訳を指令することから、このアプローチは、高収率をもたらすことが多い。大腸菌において、ｌａｃＺ融合が、異種タンパク質を発現するために使用されることが多い。ｐＵＲ、ｐＥＸ、およびｐＭＲ１００シリーズ（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照）などの好適なベクター類を容易に利用できる。ある一定の適用に関しては、精製後の融合タンパク質から非グリコシルトランスフェラーゼおよび／または補助的酵素のアミノ酸を開裂することが望ましいと考えられる。これは、臭化シアン、プロテアーゼ、または因子Ｘａによるなど、当該分野に公知の任意の方法（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋら；Ｉｔａｋｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７７）１９８：１０５６頁；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１０６頁；Ｎａｇａｉら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９：８１０頁；Ｓｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：５６１頁を参照）により達成できる。開裂部位を、所望の開裂部位で融合タンパク質に関して遺伝子内に操作できる。
【０２１４】
１つ以上の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼを、複数の翻訳カセットを単独発現ベクターに入れることによって、またはクローン化法に使用される発現ベクターの各々に対して異なる選択マーカー類を利用することによって単独の宿主細胞に発現することができる。
【０２１５】
Ｎ−末端の完全性を維持する大腸菌から組換えタンパク質を得る好適な方法は、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：６９８−７０４頁（１９８９）に記載されている。この系における対象の遺伝子は、ペプチダーゼ開裂部位を含有する酵母ユビキチン遺伝子の最初の７６の残基とのＣ−末端融合として産生される。２つの部分の結合部における開裂により、無傷の標準的Ｎ−末端残基を有するタンパク質の産生がもたらされる。
【０２１６】
本発明の発現ベクターを、大腸菌については塩化カルシウム形質転換、哺乳動物細胞についてはリン酸カルシウム処理または電気穿孔などの周知の方法により、選択された宿主細胞に移入することができる。プラスミド類によって形質転換された細胞は、ａｍｐ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子およびｈｙｇ遺伝子などのプラスミド上に含まれた遺伝子によって与えられる、抗生物質耐性により選択できる。
【０２１７】
（ＶＩ．タンパク質およびタンパク質の精製）
組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの当該分野の標準的な手法（一般に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク州（１９８２）、Ｄｅｕｔｓｃｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク州（１９９０）を参照）に従って精製できる。好ましい実施形態において、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質の精製は、タンパク質のリフォールディング後に生じる。少なくとも約７０％〜９０％均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく；より好ましくは、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、または９７％であり；９８％〜９９％以上の均一性が最も好ましい。精製タンパク質はまた、例えば、抗体産生の免疫原として使用できる。
【０２１８】
本発明の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質の精製を促進するために、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸類は、アフィニティー結合試薬が利用できるエピトープまたは「タグ」、すなわち精製用タグに関するコード化配列を含み得る。好適なエピトープ類の例としては、ｍｙｃ遺伝子およびＶ−５レポーター遺伝子が挙げられ；これらのエピトープ類を有する融合タンパク質の組換え産生に有用な発現ベクター類は、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓは哺乳動物細胞における発現に好適である）。本発明の融合タンパク質に対するタグの結合に好適なさらなる発現ベクター、および対応する検出システムは、当業者に公知であり、幾つかは市販されている（例えば、「ＦＬＡＧ」（Ｋｏｄａｋ、ニューヨーク州ロチェスター））。好適なタグの他の例は、金属キレートアフィニティーリガンドに結合可能なポリヒスチジン配列である。典型的には、６つの隣接ヒスチジン（配列番号６７）が用いられるが、６つ前後を使用することもできる。ポリヒスチジンタグへの結合部分として役立ち得る好適な金属キレートアフィニティーリガンドとしては、ニトリロ−トリ−酢酸（ＮＴＡ）（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ（１９９０）「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ編集、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｑｉａｇｅｎ（サンタクラリタ、カリフォルニア州）から市販）が挙げられる。
【０２１９】
精製用タグはまた、マルトース結合ドメインおよび澱粉結合ドメインを含む。マルトース結合ドメインタンパク質の精製は、当業者に公知である。澱粉結合ドメインは、ＷＯ９９／１５６３６号（参照として本明細書に組み込まれている）に記載されている。βシクロデキストリン（ＢＣＤ）−誘導化樹脂を用いた澱粉結合ドメインを含んでなる融合タンパク質のアフィニティー精製は、２００３年５月５日に出願された米国特許出願第６０／４６８，３７４号（参照としてその全体が本明細書に組み込まれている）に記載されている。
【０２２０】
タグとしての使用に好適な他のハプテン類は、当該分野に公知であり、例えば、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅオレゴン州）のハンドブックに記載されている。例えば、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニン、バルビツレート類（例えば、米国特許第５，４１４，０８５号を参照）、および幾つかのタイプの蛍光体は、これらの化合物の誘導体であるハプテン類として有用である。ハプテン類および他の部分と、タンパク質および他の分子とを結合するためのキット類は、市販されている。例えば、ハプテンがチオールを含む場合、タグを捕捉剤上に存在するリジン残基に結合させるために、ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性リンカーを用いることができる。
【０２２１】
当業者は、生物活性を消失することなく、グリコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインまたは機能性ドメインおよび／または補助的酵素触媒ドメインに改変を施すことができることを認識されるであろう。クローン化、発現、または融合タンパク質への触媒ドメインの取り込みを促進するために、幾つかの改変を施すことができる。このような改変は、当業者に周知であり、例えば、開始部位を提供するアミノ末端に付加されたメチオニンを提供するために、またはいずれかの末端に位置する追加のアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）を提供して、便利に配置された制限酵素部位あるいは末端コドンまたは精製配列を創製するために、触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドのいずれかの末端におけるコドンの付加が挙げられる。
【０２２２】
（ＶＩＩ．リフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼ類の利用）
本発明は、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質、および糖タンパク質、糖脂質およびオリゴ糖部分を酵素的に合成し、ならびに糖タンパク質を糖ＰＥＧ化するために、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質を用いる方法を提供する。本発明のグリコシルトランスフェラーゼ反応は、少なくとも１種のグリコシルトランスフェラーゼ、受容体基質と供与体基質、および典型的に溶解性二価金属カチオンを含んでなる反応媒体中で行われる。幾つかの実施形態において、補助的酵素が、グリコシルトランスフェラーゼに関する供与体基質を合成できるように、補助的酵素および補助的酵素触媒部分用の基質もまた存在する。本発明の組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質および方法は、受容体基質への糖類の付加を触媒する組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質の使用に依存する。
【０２２３】
所望のオリゴ糖部分を有する糖タンパク質および糖脂質を合成するためにグリコシルトランスフェラーゼを用いる多くの方法は公知である。代表的な方法は、例えば、ＷＯ９６／３２４９１、Ｉｔｏら（１９９３）Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３頁、および米国特許第５，３５２，６７０号、米国特許第５，３７４，５４１号および米国特許第５，５４５，５５３号に記載されている。
【０２２４】
本明細書に記載されたとおり調製された組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質は、活性のためにリフォールディングが必要であってもなくてもよいさらなるグリコシルトランスフェラーゼと組み合わせて使用できる。例えば、リフォールディングされた真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質と、宿主細胞から単離後リフォールディングされていても、またはリフォールディングされていなくてもよい細菌のグリコシルトランスフェラーゼとの組み合わせを使用できる。同様に、組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼは、融合タンパク質の一部であっても、なくてもよい組換え補助的酵素と共に使用できる。
【０２２５】
上記の方法によって生成された生成物は、精製することなく使用できる。幾つかの実施形態において、オリゴ糖が生成される。標準的な周知の技法、例えば、薄層または厚層クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、または膜ろ過を、グリコシル化糖類の回収のために使用できる。また、例えば、共通譲渡された豪州国特許第７３５６９５号に記載されているナノろ過または逆浸透膜を利用する膜ろ過を使用できる。さらなる例として、膜が約１０００から約１０，０００の分子量のカットオフを有する膜ろ過を、タンパク質を除去するために使用できる。別の例として、次にナノろ過または逆浸透法は、塩類を除去するために使用できる。ナノフィルタ膜は、使用される膜に依って、一価の塩類を通すが、多価の塩類および約２００ダルトン以上から約１０００ダルトンまでの非電荷溶質を保持する逆浸透膜のクラスである。したがって、例えば、本発明の組成物および方法によって生成されたオリゴ糖は、膜に保持することができ、不純物の塩類は通過する。
【０２２６】
（ＶＩＩＩ．供与体基質／受容体基質）
本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質および方法により用いられた好適な供与体基質としては、限定はしないが、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＧＤＰ−Ｆｕｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ、およびＣＭＰ−シアル酸が挙げられる。Ｇｕｏら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．６８：１−２０頁（１９９７）。
【０２２７】
本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質および方法により用いられた好適な受容体基質としては、限定はしないが、多糖類、オリゴ糖類、タンパク質類、脂質類、ガングリオシド類および本発明の方法により改変できる他の生物学的構造（例えば、細胞全体）が挙げられる。本発明の方法により改変できる典型的な構造としては、表１に記載される当業者に公知の細胞上の任意の多数の糖脂質類、糖タンパク質および炭水化物構造が挙げられる。
【０２２８】
【表１】
2007535309.tif 000091
フコシルトランスフェラーゼ触媒反応に使用される好適な受容体基質の例およびシアリルトランスフェラーゼ触媒反応使用される好適な受容体基質の例は、Ｇｕｏら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．６８：１−２０頁（１９９７）に記載されているが、それらに限定されない。
【０２２９】
（ＩＸ．グリコシルトランスフェラーゼ反応）
組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼタンパク質、受容体基質、供与体基質および他の反応混合物成分を、水性反応媒体中の混合により組み合わされる。一般に媒体は、約５〜約８．５のｐＨ値を有する。媒体の選択は、所望のレベルでｐＨ値を維持する媒体の能力に基づく。したがって、幾つかの実施形態において、媒体は、約７．５のｐＨ値に緩衝化される。緩衝液を使用しない場合、媒体のｐＨは、使用される特定のグリコシルトランスフェラーゼに依って約５〜８．５に維持されるべきである。フコシルトランスフェラーゼに関しては、ｐＨ範囲が、約６．０〜８．０に維持されることが好ましい。シアリルトランスフェラーゼに関しては、その範囲が、約５．５〜７．５に維持されることが好ましい。
【０２３０】
酵素量または酵素濃度は、触媒の初発率の目安である活性単位で表される。１活性単位は、所与の温度（典型的には３７℃）およびｐＨ値（典型的には７．５）で１分当り１μｍｏｌの生成物形成を触媒する。したがって、１０単位の酵素は、１０μｍｏｌの基質が３７℃の温度および７．５のｐＨ値で１分につき１０μｍｏｌの生成物に変換される該酵素の触媒量である。
【０２３１】
反応混合物は、二価の金属カチオン（Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋）を含んでもよい。また反応媒体は、可溶化界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎまたはＳＤＳ）および必要ならば、メタノールまたはエタノールなどの有機溶媒を含んでもよい。酵素は、溶液中で遊離して利用できるか、またはポリマーなどの支持体に結合できる。したがって反応混合物は、初期に実質的に均一性であるが、反応時に沈殿物が幾らか形成する可能性がある。
【０２３２】
上記方法を実施する温度は、凍結温度のすぐ上から最も感受性の酵素が変性する温度までの範囲であり得る。その温度範囲は、約０℃〜約４５℃までが好ましく、約２０℃〜約３７℃までがより好ましい。
【０２３３】
そのように形成された反応混合物は、グリコシリ化される糖タンパク質に結合されたオリゴ糖基に存在する高収率の所望のオリゴ糖決定因子を得るのに十分な時間維持される。大スケールの調製に関して、この反応は、約０．５時間〜２４０時間の間、より典型的には約１時間〜１８時間の間しばしば進行させることが多い。
【０２３４】
１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ反応を、グリコシルトランスフェラーゼサイクルの一部として実施できる。グリコシルトランスフェラーゼサイクルの好ましい条件と説明は既に記載されている。多数のグリコシルトランスフェラーゼサイクル（例えば、シアリルトランスフェラーゼサイクル、ガラクトシルトランスフェラーゼサイクルおよびフコシルトランスフェラーゼサイクル）は、米国特許第５，３７４，５４１号および国際公開第９４２５６１５号に記載されている。他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルは、Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２８３頁（１９９２）、Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：４３４３頁（１９９２）、ＤｅＬｕｃａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：５８６９−５８７０頁（１９９５）、およびＩｃｈｉｋａｗａら、Ｃａｕｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｙａｌｔａｍｉ編集（ＡＴＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年）に記載されている。
【０２３５】
他のグリコシルトランスフェラーゼを、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼに関して詳細に記載されているのと同様のトランスフェラーゼサイクルに置換できる。特に、グリコシルトランスフェラーゼはまた、例えば、グルコシルトランスフェラーゼ、例えば、Ａｌｇ８（Ｓｔａｇｌｊｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：５９７７頁（１９９４））またはＡｌｇ５（Ｈｅｅｓｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：７１頁（１９９４））、例えばα（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２〜１２０８９（１９９２）およびＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２頁（１９９４））およびポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９頁（１９９３））などのＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであり得る。好適なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとしては、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ  １７６：６０８頁（１９９１））、ＧｎＴＩＩ、およびＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：６９２頁（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１頁（１９９３））、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９３２６頁（１９９２））、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェートトランスフェラーゼ（Ｒａｊｐｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８５：９８５頁（１９９２））、およびヒアルロナンシンターゼが挙げられる。好適なマンノシルトランスフェラーゼとしては、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈ１、およびＰｍｔ１が挙げられる。
【０２３６】
上記のグリコシルトランスフェラーゼサイクルに関して、この方法に用いられる種々の反応物の濃度または量は、温度およびｐＨ値などの反応条件、グリコシル化される受容体糖類の選択および量など、多くの因子に依存する。グリコシル化法が、触媒量の酵素の存在下で、活性化ヌクレオチド、活性化供与体糖類の再生および生成されたＰＰｉの除去を可能にすることから、この方法は、先に考察された化学量論的基質の濃度または量により限定される。本発明の方法によって使用できる反応物の濃度についての上限は、このような反応物の溶解度により決定される。
【０２３７】
受容体が消費されるまでグリコシル化が進行するように、活性化ヌクレオチド、ホスフェート供与体、供与体糖および酵素の濃度が選択されることが好ましい。下記に検討された考察は、シアリルトランスフェラーゼに関して、他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルに一般に適用できる。
【０２３８】
各々の酵素は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質濃度ならびに温度、時間およびｐＨ値のような反応条件によって変わる。予め選択された基質濃度および反応条件下で所与の酵素に関する触媒量を決定する手段は、当業者に周知である。
【０２３９】
（Ｘ．多酵素オリゴ糖合成）
上記に考察されたように、幾つかの実施形態において、２種以上の酵素を、糖タンパク質または糖脂質に対する所望のオリゴ糖決定因子を形成するために使用できる。例えば、所望の活性を示すために、特定のオリゴ糖決定因子は、ガラクトース、シアリン酸およびフコースの付加を必要とする。したがって、本発明は、２種以上の酵素、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、トランス−シアリダーゼ、またはスルホトランスフェラーゼが、所望のオリゴ糖決定因子の高収率合成を得るために使用される方法を提供する。
【０２４０】
特に好ましい実施形態において、使用される酵素の１つは、糖またはペプチドをスルホン化するスルホトランスフェラーゼである。セレクチンのためのリガンドを調製するためのスルホトランスフェラーゼの使用がさらにより好ましい（Ｋｉｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６（８）：４５３０−５頁（１９９９））。
【０２４１】
幾つかの場合において、糖タンパク質結合オリゴ糖または糖脂質結合オリゴ糖としては、糖タンパク質または糖脂質のインビボ生合成の際の特定の対象グリコシルトランスフェラーゼに対する受容体基質が挙げられる。このような糖タンパク質または糖脂質は、それぞれ糖タンパク質または糖脂質のグリコシル化パターンの前改変をしないで本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質および方法を用いてグリコシル化できる。しかしながら、他の場合において、対象の糖タンパク質または糖脂質は、好適な受容体基質を欠く。このような場合、本発明の方法を、糖タンパク質または糖脂質のグリコシル化パターンを変化させるために使用でき、その結果、糖タンパク質結合オリゴ糖または糖脂質結合オリゴ糖は、次いで所望のオリゴ糖部分を形成するために対象の予め選択された糖単位のグリコシルトランスフェラーゼ触媒結合用の受容体基質を含むことになる。
【０２４２】
好適な受容体基質を得るために、必要に応じて糖タンパク質結合オリゴ糖または糖脂質結合オリゴ糖を最初に、全体または部分的に「トリミング」して、グリコシルトランスフェラーゼに対する受容体基質、または１つ以上の適切な残基が付加できる部分に曝露させることができる。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼなどの酵素は、結合反応およびトリミング反応に有用である。例えば、「高マンノース」タイプのオリゴ糖を表す糖タンパク質は、１つ以上の予め選択された糖単位の結合時に、所望のオリゴ糖決定因子を形成する受容体基質を得るために、マンノシダーゼによるトリミングに供することができる。
【０２４３】
この方法はまた、天然形体では非グリコシル化のタンパク質または脂質上の所望のオリゴ糖部分の合成に有用である。対応するグリコシルトランスフェラーゼに好適な受容体基質は、本発明の方法を用いてグリコシル化前にこのようなタンパク質または脂質に結合できる。例えば、グリコシル化のために好適な受容体を有するポリペプチド類を得る方法に関して米国特許第５，２７２，０６６号を参照されたい。
【０２４４】
したがって、幾つかの実施形態において、本発明は、好適な受容体を創製する糖結合体を最初に修飾することを含む糖結合体に存在する糖基のインビトロシアリル化法を提供する。
【０２４５】
（ＸＩ．改変された糖のペプチド類への結合）
改変された糖類を、結合を媒介する適切な酵素を用いてグリコシル化または非グリコシル化ペプチドまたはタンパク質に結合させる。受容体が消費されるまでグリコシル化が続くように、改変供与体糖（類）、酵素（類）および受容体ペプチド（類）またはタンパク質（類）の濃度が選択されることが好ましい。、下記に考察されているこれらの検討は、シアリルトランスフェラーゼに関して述べられているが、他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に一般に適用可能である。
【０２４６】
所望のオリゴ糖構造を合成するためにグリコシルトランスフェラーゼ用いる多数の方法は公知であり、一般に当該発明に適用可能である。代表的な方法は、例えば、国際公開第９６／３２４９１号、Ｉｔｏら、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３頁（１９９３）、および米国特許第５，３５２，６７０号、米国特許第５，３７４，５４１号および米国特許第５，５４５，５５３号に記載されている。
【０２４７】
幾つかの実施形態において、エンドグリコシダーゼは、グリコシルトランスフェラーゼと組み合わせる反応に用いられる。これらの酵素は、修飾糖のペプチドへの付加前または付加後の任意の時点でペプチドの糖構造を変えるために用いられる。
【０２４８】
別の実施形態において、この方法は、１種以上のエキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼを使用する。このグリコシダーゼは典型的に、グリコシル結合の断裂よりもむしろグリコシル結合を形成するために操作される変異体である。変異体グリカナーゼとしては、典型的に活性部位の酸性アミノ酸残基に対するアミノ酸残基の置換が挙げられる。例えば、エンドグリカナーゼが、エンド−Ｈである場合、置換活性部位残基は、典型的に１３０位のＡｓｐ、１３２位のＧｌｕまたはそれらの組み合わせである。アミノ酸類は、一般にセリン、アラニン、アスパラギン、またはグルタミンにより置換される。
【０２４９】
変異体酵素は、通常、エンドグリカナーゼの加水分解ステップの逆反応に類似している合成ステップにより反応を触媒する。これらの実施形態において、グリコシル供与体分子（例えば、所望のオリゴ糖構造または単糖構造）は、遊離基を含有し、該反応は、タンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基への供与体分子の付加により進行する。例えば、該遊離残基は、フルオリドなどのハロゲンであり得る。他の実施形態において、遊離基は、Ａｓｎ、またはＡｓｎ−ペプチド部分である。そのうえさらなる実施形態において、グリコシル供与体分子のＧｌｃＮＡｃ残基を改変する。例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基は、１，２−オキサゾリン部を含むことができる。
【０２５０】
好ましい実施形態において、本発明の結合体を生成するために利用された各々の酵素は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質濃度ならびに温度、時間およびｐＨ値などの反応条件によって変わる。予め選択された基質濃度および反応条件下で所与の酵素に関する触媒量を決める手段は、当業者に周知である。
【０２５１】
上記方法を実施する温度は、凍結温度のすぐ上から最も感受性のある酵素が変性する温度までの範囲であり得る。好ましい温度範囲は、約０℃〜約５５℃までであり、約２０℃〜約３０℃までがより好ましい。別の典型的な実施形態において、当該方法の１つ以上の構成要素は、好熱性酵素を用いて高温で実施される。
【０２５２】
反応混合物を、グリコシル化される受容体に対して十分な時間維持することにより、所望の結合体を形成する。結合体の幾つかは、２、３時間後に検出できることが多く、回収できる量は、通常、２４時間以内で得られる。反応速度が、多くの可変因子（例えば、酵素濃度、供与体濃度、受容体濃度、温度、溶媒量）に依存し、選択された系について最適化されることを、当業者により理解される。
【０２５３】
本発明はまた、改変ペプチドの産業スケールの製造を提供する。本明細書に使用されるように、産業スケールは、少なくとも１ｇの最終精製結合体を一般に製造する。
【０２５４】
以下の考察において、本発明は、改変シアリン酸部分のグリコシル化ペプチドへの結合により例示される。代表的な改変シアリン酸は、ＰＥＧにより標識される。ＰＥＧ改変シアリン酸およびグリコシル化ペプチドの使用に対する以下の考察の焦点を絞っていることは、説明を明解にするためで、本発明が、これら２つのパートナーの結合に限定されていることを意味する意図はない。当業者は、この考察が、一般にシアリン酸以外の改変グリコシル部分の付加に適用できることを認識している。さらに、この考察は、他の水溶性ポリマー類、治療用部分および生体分子など、ＰＥＧ以外の試薬によるグリコシル単位の改変に等しく適用可能である。
【０２５５】
酵素的アプローチを、ペプチドまたは糖ペプチド上のＰＥＧ化炭水化物またはＰＰＧ化炭水化物の選択的導入に使用できる。該方法では、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはマスクされた反応性官能基を含有する修飾された糖類が利用され、適切なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと組み合わされる。所望の炭水化物結合を作製するグリコシルトランスフェラーゼを選択することにより、また供与体基質として改変糖を利用することにより、ＰＥＧまたはＰＰＧを、ペプチド主鎖上、既存の糖ペプチドの糖残基上、またはペプチドに付加された糖残基上に直接導入することができる。
【０２５６】
シアリルトランスフェラーゼに関する受容体は、天然構造として、または組換え的、酵素的または化学的にそこに配置されたものとして、本発明の方法により修飾されるペプチド上に存在する。好適な受容体としては、例えば、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）などのガラクトシル受容体、および当業者に公知の他の受容体（例えば、Ｐａｕｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７−５６２４頁（１９７８）を参照）が挙げられる。
【０２５７】
一実施形態において、シアリルトランスフェラーゼに関する受容体は、糖ペプチドのインビボ合成の際に改変される糖ペプチド上に存在する。このような糖ペプチドを、糖ペプチドのグリコシル化パターンの前改変をしないで特許請求される方法を用いてシアリル化できる。あるいは、本発明の方法は、好適な受容体を含まないペプチドをシアリル化するのに使用でき；当業者に公知の方法により受容体を含むペプチドを最初に修飾する。代表的な実施形態において、ＧａｌＮＡｃ残基は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用により付加される。
【０２５８】
代表的な実施形態において、ガラクトシル受容体は、ガラクトース残基を、ペプチド、例えばＧｌｃＮＡｃに結合した適切な受容体に結合させることにより組み立てられる。この方法は、ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）、および好適なガラクトシル供与体（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）の好適な量を含有する反応混合物と共に改変するペプチドをインキュベートすることを含む。該反応は、実質的に完了するまで進行させるか、あるいは、予め選択された量のガラクトース残基が加えられたらこの反応を終了させる。選択された糖受容体を組み立てる他の方法は、当業者にとって明らかである。
【０２５９】
さらに別の実施形態において、好適な受容体基質を得るために、糖ペプチド結合オリゴ糖を最初に、全体または部分的に「トリミング」して、シアリルトランスフェラーゼに対する受容体基質、または１つ以上の適切な残基が付加できる部分に曝露させる。グリコシルトランスフェラーゼ類およびエンドグリコシダーゼ類などの酵素（例えば、米国特許第５，７１６，８１２号を参照）は、結合反応およびトリミング反応に有用である。
【０２６０】
改変された糖類のペプチド類またはタンパク質類への結合方法は、例えば、２００１年１０月１０日に出願された米国特許出願第６０／３２８，５２３号；２００２年６月７日に出願された米国特許出願第６０／３８７，２９２号；２００２年６月２５日に出願された米国特許出願第６０／３９１，７７７号；２００２年８月１６日に出願された米国特許出願第６０／４０４，２４９号；および国際公開ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６３号に見られ、それらの各々は、全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【０２６１】
（実施例１：細菌に発現されるラット肝ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのリフォールディング）
（ラット肝ＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ融合タンパク質のリフォールディング）
ラット肝Ｎ−アセチルラクトサミンα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ）を、ｐＧＥＸ−ＫＴ−Ｅｘｔベクターにクローン化し、大腸菌ＢＬ２１細胞内のＧＳＴ−ＳＴ３−Ｇａｌ  ＩＩＩ封入体として発現させた。封入体を、ＧＳＨ／ＧＳＳＧレドックス系を用いてリフォールディングした。リフォールディングされた酵素、ＧＳＴ−ＳＴ３−Ｇａｌ  ＩＩＩを活性であり、シアリン酸をＬＮｎＴ糖基質およびアシアリル化糖タンパク質、例えばトランスフェリンおよび因子ＩＸに移送させた。
【０２６２】
（ＳＴ３−ＧａｌＩＩＩのｐＧＥＸ−ＸＴ−ＫＴベクターへのクローン化）
ラット肝ＳＴ３−ＧａｌＩＩＩ遺伝子を、以下のプライマー：
【０２６３】
【化１】
2007535309.tif 000092
を用いてＰＣＲ増幅後、ｐＧＥＸ−ＫＴ−ＥｘｔベクターのＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１部位にクローン化した。
【０２６４】
（大腸菌ＢＬ２１細胞中のＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの発現）
ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ  ＧＳＴ融合を含んでなる発現ベクターであるｐＧＥＸ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを、化学的にコンピテントな大腸菌ＢＬ２１細胞に形質転換した。単一のコロニーを取り出し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを有する５ｍｌ  ＬＢ培地でインキュベートし、振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。翌日、１ｍｌの一晩培養液を、１リットルの１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを有するＬＢ培地に移した。細菌を、０．７のＯＤ６２０になるまで増殖させ、次いで１５０μＭ  ＩＰＴＧ（最終）を培地に加えた。細菌を、３７℃で１時間から２時間以上増殖させてから、室温に移し、振とうしながら一晩増殖させた。細胞を遠心分離により採取し；細胞ペレットを、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁してフレンチプレスを用いて溶解した。４℃のＳｏｒｖａｌｌ、ＳＳ３４ローター内で１０，０００ＲＰＭで３０分間遠心分離により、溶解性フラクションと不溶性フラクションとを分離した。
【０２６５】
（封入体の精製）
５０ｍｌのＮｏｖａｇｅｎの洗浄用緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を不溶性フラクション、すなわち、封入体（ＩＢ）に加えた。不溶性フラクションをボルテックスしてペレットを再懸濁した。懸濁させたＩＢを、遠心分離し、上記の洗浄用緩衝液に再懸濁することにより少なくとも２回洗浄した。清浄な沈殿物（ＩＢ）を回収し、使用するまで−２０℃で保存した。
【０２６６】
（封入体のリフォールディング）
ＩＢを秤量し（１４４ｍｇ）、Ｇｅｎｏｔｅｃｈ  ＩＢＳ緩衝液（１．４４ｍｌ）に溶解した。懸濁させたＩＢを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの遠心管内で４℃で１時間インキュベートした。不溶性物質を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機の最大スピードでの遠心分離により除去した。可溶化されたＩＢを、４ｍｌの最終容量に希釈した。ＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのリフォールディングを、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＮＤ  ＳＢ−２０１、またはＧＳＨ／ＧＳＳＧレドックス系を含有するリフォールディング用緩衝液中で試験した。１ｍｌの可溶化ＩＢを、リフォールディング溶液にピペッティングすることにより素早く希釈し、３０〜４０秒間激しく攪拌してから、４℃で２時間緩やかに攪拌した。リフォールディングされたＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ溶液の３ｍｌアリコートを、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒｓ（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤａ）を用いて冷ＰＢＳ緩衝液または５０ｍＭトリスＨＣＬ、ｐＨ７．０；１００ｍＭ  ＮａＣＬ；および１％グリセロールを含有する緩衝液に対して透析した。透析後、ＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ溶液を、４℃の４，０００ｒｐｍでＪｏｕａｎ遠心分離機内のＶｉｖａｓｐｉｎ  ５Ｋ（ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ）の濃縮機を用いて３倍、６倍および１２倍に濃縮した。
【０２６７】
リフォールディングおよび透析後、リフォールディングされたＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。約６３〜６４ｋＤａの分子量を有するＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ融合は、全てのリフォールディング条件下で存在した（データは示していない）。
【０２６８】
（リフォールディングされたＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを用いるオリゴ糖のシアリル化）
オリゴ糖基質を用いる酵素アッセイは、ＣＥ−ＬＩＦ（キャピラリ電気泳動−レーザ誘導蛍光）を用いて実施された。リフォールディングされたＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素は、ＬＳＴｄ−ＡＰＴＳ（ラクトシアリン−テトラサッカリド−ｄ−ＡＰＴＳ）を形成するための、ＣＭＰ−ＮＡＮ（シチジン５−モノホスフェート−β−Ｄ−シアリン酸）からＬＮｎＴ−ＡＰＴＳ（ラクト−Ｎ−ネオテトラオース−９−アミノピレン１，４，６−トリスルホン酸）へのシアリン酸の移動能力についてアッセイした。反応は、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ６．５；０．８ｍＭ  ＣＭＰ−ＮＡＮ；２２．１ｍＭ  ＬＮｎＴ；２５μＭ  ＬＮｎＴ−ＡＰＴＳ；２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含有する１００μｌの緩衝液液中９６ウェルのマイクロタイタープレート内で実施した。反応は、２０μｌのリフォールディングされたＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩの３０℃で３０分間の添加により開始された。反応液を、１〜２５倍の水希釈によりクエンチした。希釈反応液を、製造元のガイドに従ってＮ−ＣＨＯでコーティングされたキャピラリを用いてＣＥ−ＬＩＦにより分析した。活性は、ＬＮｎＴ−ＡＰＴＳ対ＬＳＴｄ−ＡＰＴＳの正規化ピーク面積比として算出された。種々のリフォールディング条件を比較した結果を、表２に示している。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ系を用いる２つの追加実験は、表３に示している。
【０２６９】
【表２】
2007535309.tif 000093
【０２７０】
【表３】
2007535309.tif 000094
（リフォールディングされたＧＳＴ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩを用いる糖タンパク質のシアリル化）
２０μＬのアシアリル化トランスフェリン（２μｇ／μＬ）またはアシアリル化因子ＩＸ（２μｇ／μＬ）を、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０μＬの緩衝液と、１０μＬの１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２；１０μＬの２００ｍＭ  ＣＭＰ−ＮＡＮ；および０．０５％のアジ化ナトリウムに加えた。この反応混合物を、３０μＬのリフォールディングされたＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩと共に、２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で一晩以上インキュベートした。反応停止後、製造元のガイドラインに従って、シアリル化タンパク質をｐＨ７〜３のＩＥＦ（等電点電気泳動ゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、Ｃｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅで染色した。トランスフェリンおよび因子ＩＸの双方は、ＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩによりシアリル化された（データは示していない）。
【０２７１】
（ＭＢＰタグに融合されたラット肝ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのリフォールディング）
ラット肝ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘベクターにクローン化し、大腸菌ＴＢ１細胞の封入体において、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合であるＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩとして発現させた。このリフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩは活性であり、ＬＮｎＴ糖基質およびアシアリル化糖タンパク質、例えばアシアロ−トランスフェリンにシアリン酸を移送させた。
【０２７２】
（ＳＴ３−ＧａｌＩＩＩのｐＭＡＬ−ｃ２ｘベクターへのクローン化）
ラット肝ＳＴ３−ＧａｌＩＩＩ核酸を、以下のプライマー：
【０２７３】
【化２】
2007535309.tif 000095
を用いてＰＣＲ増幅後、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘベクターのＢａｍＨ１およびＸｂａＩ部位にクローン化した。
【０２７４】
アミノ酸２８〜３７４をコードする核酸、例えば、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのステム領域および触媒ドメインを、ＭＢＰアミノ酸タグに融合させた。
【０２７５】
ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの３つの他の切断を構築し、ＭＢＰに融合させた。３つのＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ（Δ７３、Δ８５、Δ８６）挿入体は、それぞれ以下
【０２７６】
【化３】
2007535309.tif 000096
を対で用いるＰＣＲにより、単離された。各ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨ１およびＸｈｏ１により消化し、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化のｐＣＷｉｎ２−ＭＢＰ  Ｋａｎｒベクターにサブクローン化し、ＴＢ１細胞に変換し、正しい構築物をスクリーンした。
【０２７７】
ＰＣＲ反応は、以下の条件下で実施された。９５℃で１分間の１サイクル。１μｌのベントポリメラーゼを加えた。以下のサイクルを１０回実施した：９４℃で１分間；６５℃で１分間；および７２℃で１分間。最終の７２℃で１０分後、反応液を４℃に冷却した。
【０２７８】
ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ切断体の全ては、リフォールディング後、活性を有した。下記の実験は、ＭＢＰΔ７３ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ切断体を用いて実施された。
【０２７９】
（大腸菌ＴＢ１細胞中のＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの発現）
ｐＭＡＬ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを、化学的にコンピテントな大腸菌ＴＢ１細胞に形質転換した。ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ構築物を含有する３つの単離コロニーをＬＢ寒天プレートから取り出した。このコロニーを、６０μｇ／ｍｌのカルベニシリンで補充した５ｍｌ  ＬＢ培地中、液体培養物が０．７のＯＤ６２０に達するまで振とうしながら３７℃で増殖させた。２つの１ｍｌアリコートを、各培養液から取り出し、５００μＭ  ＩＰＴＧ（最終）の有り無しの新鮮な培地にインキュベートするために用いた。この培養物を、３７℃で２時間増殖させた。細菌細胞を遠心分離により採取した。全細胞溶解液は、ＳＤＳおよびＤＴＴの存在下、細胞ペレットを加熱して調製した。ＩＰＴＧは、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの発現を誘導した（データは示していない）。
【０２８０】
（ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの発現および封入体の精製）
ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの一晩培養物の１ｍｌアリコートを、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを有する０．５リットルのＬＢ培地中に接種し、０．７のＯＤ６２０まで増殖させた。ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの発現は、０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加、次いで室温で一晩インキュベートすることにより誘導された。翌日細菌細胞を、遠心分離により採取した。細胞ペレットを、７５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４；１００ｍＭのＮａＣｌ；および１％グリセロールを含有する緩衝液に再懸濁した。細菌細胞を、フレンチプレスを用いて溶解した。４℃のＳｏｒｖａｌｌ、ＳＳ３４ローター内で１０，０００ＲＰＭで３０分間の遠心分離により、溶解性フラクションと不溶性フラクションとを分離した。溶解性フラクションと不溶性フラクションとは、４℃のＳｏｒｖａｌｌ、ＳＳ３４ローター内で１０，０００ＲＰＭで３０分間の遠心分離により分離した。
【０２８１】
（封入体の精製およびＧＳＨ／ＧＳＳＧを用いるＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのリフォールディング）
ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ封入体、上記のＧＳＴ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ融合タンパク質に用いられた同じ方法および緩衝液を用いてを精製し、懸濁した。ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩは、上記のＧＳＨ／ＧＳＳＧを用いてリフォールディングされた。リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析用バッグ（ＭＷＣＯ：７ｋＤａ）を用いて冷６５ｍＭトリスＨＣＬ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％グリセロールに対して透析した。リフォールディングされ、透析されたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを、４℃、４，０００ｒｐｍでＪｏｕａｎ遠心分離機内でのＶｉｖａｓｐｉｎ  ５Ｋ（ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ）濃縮機を用いて３倍〜１４倍に濃縮した。リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。８１ｋＤａのＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを検出した（データは示していない）。
【０２８２】
（ＭＢＰ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩ酵素活性のアッセイ）
リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素を、上記のとおり、シアリン酸をＣＭＰ−ＮＡＮからＬＮｎＴ−ＡＰＴＳに移送させてＬＳＴｄ−ＡＰＴＳを形成する能力について分析した。リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩ酵素は活性であり、シアリン酸をＬＮｎＴ−ＡＰＴＳに移送させてＬＳＴｄ−ＡＰＴＳを形成した（データは示していない）。
【０２８３】
リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素を、シアリン酸をＣＭＰ−ＮＡＮから糖タンパク質に移送させる能力について分析した。シアリン酸のアシアロ−トランスフェリンへの移送を、上記のとおり、ＧＳＴ−ＳＴ３−Ｇａｌ  ＩＩＩ酵素についてアッセイした。リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩ酵素は活性であり、シアリン酸をアシアロ−トランスフェリンに移送させた（データは示していない）。リフォールディングされたＧＳＴ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩ酵素およびＭＢＰ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩ酵素は、シアリン酸の可溶性オリゴ糖受容体分子への移送に関して同様の活性を有したが、リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩ酵素は、シアリン酸の糖タンパク質受容体分子への移送についてはより活性であった。
【０２８４】
（ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩをリフォールディングする条件のさらなるアッセイ）
ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを、図１に示された条件を用いてリフォールディングした。緩衝液、レドックス対および界面活性剤（使用の場合）を、可溶化ＩＢの添加前に混合してリフォールディング反応を開始した。ＩＢを１／２０に希釈した。ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのリフォールディングは、別のレドックス対、例えば、１／４、４／１、１／１０，または５／５のモル比でシスタミン２  ＨＣｌ／システインを用いても成功した（データは示していない）。
【０２８５】
（ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素活性のアッセイ）
リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素を、上記のとおり、シアリン酸をＣＭＰ−ＮＡＮからＬＮｎＴ−ＡＰＴＳに移送させてＬＳＴｄ−ＡＰＴＳを形成する能力についてアッセイした。結果を図1に示す。リフォールディングされたＭＢＰ−Ｓ
Ｔ３  Ｇａｌ  ＩＩＩの最も高い活性は、条件８、１１、１３および１６を用いた場合に見られた。リフォールディングを、５ｍｌにスケールアップすると、条件８および１６を用いてリフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３  Ｇａｌ  ＩＩＩタンパク質が最高の活性を有した（例えば、表を参照）。
【０２８６】
【表４】
2007535309.tif 000097
（アミロースカラムによるＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの精製）
５ｍｌのリフォールディング調製液からリフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質を合わせ、１００ｍＭトリスＨＣＬ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％グリセロールに対して透析した。リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質を、アミロースカラムに適用した。リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質の大部分を、アミロースカラムに結合させ、１０ｍＭマルトースで溶出した。溶出プロフィールを図２に示す。ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩフラクションの酵素活性は、ＬｎＮＴアッセイを用いて判定され、図３に示している。
【０２８７】
（リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩによるアシアロトランスフェリンの糖ＰＥＧ化）
アシアロ−トランスフェリン（２ｍｇ／ｍｌ）を、２３０μｌの反応液中、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ、１．６ｍＭ）またはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ、１．０６ｍＭ）の存在下、リフォールディングされた１００μｌのＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの精製されたフラクションとインキュベートした。糖ＰＥｇ化反応を、３０℃で一晩または３日間実施した。反応液からアリコートを取り出し、４〜２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析した。結果を図４に示す。精製され、リフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩは、１０Ｋまたは２０ＫのＰＥＧ化シアリン酸をアシアロ−トランスフェリンに移送させる。
【０２８８】
（大スケールのＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのリフォールディング）
以下の方法は、大スケールのリフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを作製するために使用された。
【０２８９】
ウェットＩＢ（４７０ｍｇ）を、１５ｍｌの培養管内のＩＢ可溶化緩衝液（１３ｍｌ）に溶解した。ＩＢ可溶化緩衝液は、以下のものを含んでいる：４ＭグアニジンＨＣｌ；１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ９；および１００ｍＭのＮａＣｌ。ＩＢを、ＩＢ可溶化緩衝液中、４℃で約１時間緩やかに振とうさせながらインキュベートした。不溶性物を、１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管内で、４℃、最大スピードで３０分間の遠心分離により除去した。可溶化ＩＢを清浄な管に移し、２８０ｎｍの吸光度を用いてタンパク質濃度を測定した。
【０２９０】
以下のリフォールディング溶液を調製し、４℃に維持した：５５ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５；２６４ｍＭのＮａＣｌ；１１ｍＭのＫＣｌ；０．０５５％のＰＥＧ５５０；５５０ｍＭのアルギニン。緩衝液は、可溶化ＩＢの添加直前に、０．３ｍＭのラウリルマルトシド（ＬＭ）；０．１ｍＭの酸化グルタチオン；１ｍＭの還元グルタチオンにより補足された。２ｍｌの可溶化ＩＢを、５０ｍｌ滅菌培養管内の４３ｍｌのリフォールディング緩衝液中に加えた。この管をロッカー−シェーカ上に置き、４℃で２４時間緩やかに振とうさせた。リフォールディングされたタンパク質を、透析管（ＭＷＣＯ：７ｋＤ）中、透析用緩衝液（１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；５％グリセロール中）に対して２回（１０〜２０容量過剰の緩衝液）透析した。
【０２９１】
大スケール透析のリフォールディングされたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩをＳＴ３ＧａｌＩＩＩ活性について分析し、約５３．６Ｕ／ｇ  ＩＢを示した。
【０２９２】
（実施例２：リフォールディングを増強させるためのヒトＧｎＴＩの部位特異的変異誘発）
切断ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（１０３のアミノ末端アミノ酸が欠失された）は、マルトース結合融合タンパク質（ＧｎＴＩ／ＭＢＰ）として大腸菌に発現した。この融合タンパク質は、不溶性であり、封入体に発現された。可溶化およびリフォールディング後、ＧｎＴＩ／ＭＢＰ融合タンパク質は、活性が低かった。ウサギＧｎＴＩ（１０５のアミノ末端アミノ酸が欠失された）の切断型の結晶構造は、活性部位近辺に不対システイン残基を示す（例えば、Ｕｎｌｉｇｉｌら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：５２６９−５２８０（２０００）を参照）。ヒトＧｎＴＩ中の対応する不対システインは、ＣＹＳ１２１として同定され、サイズおよび化学的特性が類似する一連のアミノ酸により置換された。使用されたアミノ酸としては、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アラニン（Ａｌａ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ）が挙げられる。さらに、二重変異体、ＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳもまた作製された。変異体ＧｎＴＩ／ＭＢＰ融合タンパク質は、大腸菌で発現され、リフォールディングされ、糖タンパク質に対するＧｎＴＩ活性についてアッセイされた。
【０２９３】
変異誘発は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを用いて行われた。さらなる制限部位は、幾つかのＧｎＴＩ変異により導入された。例えば、ＡｐａＩ部位
【０２９４】
【化４】
2007535309.tif 000098
は、ＧｎＴ１  ＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳ変異体、すなわち、
【０２９５】
【化５】
2007535309.tif 000099
（太字が変化）に導入された。以下の変異誘発性オリゴ糖は、二重変異体：
【０２９６】
【化６】
2007535309.tif 000100
（太字が変化を示す）を作製するために用いられた。ＡｓｃＩ部位
【０２９７】
【化７】
2007535309.tif 000101
は、ＧｎＴ１  ＣＹＳ１２１ＡＬＡ変異体、すなわち、
【０２９８】
【化８】
2007535309.tif 000102
（太字が変化）に導入された。以下の変異誘発性オリゴ糖ヌクレオチドは、ＧｎＴ１  ＣＹＳ１２１ＡＬＡ変異体を作製するために用いられた：
【０２９９】
【化９】
2007535309.tif 000103
大腸菌に発現された変異体タンパク質の活性を、バキュロウィルスに発現された野生型ＧｎＴ１の活性と比較した。ＣＹＳ１２１ＳＥＲ  ＧＮＴＩ変異体は、ＴＬＣベースアッセイにおいて活性であった。対照的に、ＣＹＳ１２１ＴＨＲ変異体は、検出可能な活性が無く、ＣＹＳ１２１ＡＳＰ変異体は、活性が低かった。ＣＹＳ１２１ＡＬＡ変異体は、非常に活性であり、二重変異体、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧｎＴ１タンパク質（Ｇｌｙ１４）のアミノ酸配列に基づくＡＲＧ１２０ＡＬＡ、ＣＹＳ１２１ＨＩＳもまた、ＧｌｃＮＡｃの糖タンパク質への移送などの活性を示した。アミノ酸およびＧｎＴ１変異体の核酸配列のコード化は、図７〜１１に示している。
【０３００】
第２のＧｎＴ１切断が成され、ＭＢＰに融合された：ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ３５）。図３５は、ＭＢＰ−ＧｎＴ１融合タンパク質の図式を示しており、切断体、例えば、Δ１０３またはΔ３５、およびＣｙｓ１２１Ｓｅｒ変異（上部）を描いている。この図の下側は、完全長ヒトＧｎＴ１タンパク質を示している。Ｃｙｓ１２１の変異体もまた、ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ３５）タンパク質において作製された。
【０３０１】
双方の融合タンパク質は、大腸菌に発現され、双方ともＲＮＡｓｅ  Ｂ糖タンパク質のリモデリング活性を有した。図３６の右のパネルには、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧｎＴ１融合タンパク質：ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ３５）Ｃ１２１Ａ、ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ１０３）Ｒ１２０Ａ＋Ｃ１２１Ｈ、およびＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ１０３）Ｃ１２１Ａを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを提供している。左のパネルは、異なる時点でリフォールディングされたＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ３５）Ｃ１２１Ａの２つの異なるバッチ（Ａ１とＡ２）のＲＮＡｓｅＢ糖タンパク質のリモデリング活性を示す。ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ１０３）Ｃ１２１Ａはまた、ＲＮＡｓｅＢ糖タンパク質をリモデリングした。データは示していない。
【０３０２】
（実施例３：ＧａｌＴ１にＭＢＰの融合）
切断されたウシＧａｌＴ１とＭＢＰとの間の以下の融合が構築された：ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ１２９）ｗｔ、（Ｄ７０）ｗｔまたは（Ｄ１２９Ｃ３４２Ｔ）（完全長ウシ配列に関して、例えば、Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１−２１７（１９８９）および登録番号ＣＡＡ３２６９５を参照）。構築物の各々は、リフォールディング後に活性があった。完全長ウシＧａｌＴ１タンパク質のアミノ酸配列は、図３０に提供される。この変異体は、対照タンパク質ＧａｌＴ１（４０）（Ｓ９６Ａ＋Ｃ３４２Ｔ）と共に図３１に図式的に描く。例えば、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３７６６６−３７６７１頁（２００１）を参照されたい。
【０３０３】
ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）は、大腸菌株ＪＭ１０９に発現された。ＩＰＴＧと一晩誘導後、細胞がフレンチプレスを用いて溶解した後、封入体は、不溶性ペレットから単離された。ＩＢを２回洗浄してから、４ＭのＧｎｄＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ９．０に溶解された。リフォールディングは、ｐＨ６．５でＧＳＳＨ／ＧＳＨ（１０／１）と共にリフォールディング用緩衝液への希釈（１／２０、０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌタンパク質）に次いで、振とうすることなく４℃で一晩インキュベートすることにより行われた。リフォールディングされたタンパク質は、５０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ８．０に対して２回（ＭＷＣＯ：７ｋＤ）透析された。透析されたＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）タンパク質は、アミロースカラムに乗せて；洗浄し；１０ｍＭのマルトースにより溶出した。
【０３０４】
ＧａｌＴ１活性は、受容体としてオリゴ糖を用いてアッセイされた。酵素的アッセイは、ＨＰＬＣ／ＰＡＤ（パルス電流測定検出を有する高性能液体クロマトグラフィ）を用いて実施された。ＧａｌＴＩ酵素によるＵＤＰ−Ｇａｌ（ウリジン５’−ジホスホガラクトース）を用いて、ＬＮＴ２（ラクト−Ｎ−トリオース−２）のＬＮｎＴ（ラクト−Ｎ−ネオテトラオース）への変換は、以下のとおり実施した。この反応は、６ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌ、５ｍＭのＬＮＴ−２、５ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する１００μｌの５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７緩衝液と、１００μｌのリフォールディングされた酵素との中で３７℃で６０分間実施された。この反応を水によりクエンチし（１倍〜１０倍希釈）、１０，０００ＭＷＣＯスピンフィルタを通して遠心分離した。次にろ液を１倍〜１０倍希釈した。この希釈反応液を、Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＸ−５００システムおよびＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラムを用いて水酸化ナトリウム緩衝液によるＨＰＬＣによって分析した。サンプル生成物のピーク面積を、ＬＮｎＴの検量線と比較し、この活性は、反応液中の酵素の１μｌにつき１分当り生成されたＬＮｎＴ量を基準にして算出された。
【０３０５】
精製されたＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）タンパク質は、受容体分子として溶解性オリゴ糖および糖タンパク質（例えば、ＲＮＡｓｅＢ）双方を用いて活性を有した。結果を図３２および図３３に示す。ＲＮＡｓｅＢリモデルリングアッセイにおいて、ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）は、大腸菌にも発現され、リフォールディングされたウシＧａｌＴ１タンパク質の非融合切断体である、対照タンパク質ＧａｌＴ１（４０）（Ｓ９６Ａ＋Ｃ３４２Ｔ）と比較した。ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）タンパク質は、ＲＮＡｓｅＢ糖タンパク質に対してＧａｌＴ１（４０）（Ｓ９６Ａ＋Ｃ３４２Ｔ）よりも活性があった。ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ１２９）切断体もまた、ＲＮＡｓｅＢ糖タンパク質に対してＧａｌＴ１（４０）（Ｓ９６Ａ＋Ｃ３４２Ｔ）タンパク質よりも活性があった（データは示していない）。
【０３０６】
ＲＮＡｓｅＢのグリコシル化に関して、リフォールディングされ、精製されたＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）の反応速度論を測定し、哺乳動物の細胞系で発現されたウシＧａｌＴ１タンパク質の溶解性形態であるＮＳＯ  ＧａｌＴ１と比較した。図３４に示されるように、リフォールディングされ、精製されたＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）は、ＮＳＯ  ＧａｌＴ１タンパク質と比較して反応速度論が改善された。
【０３０７】
（実施例４：複数グリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングするワンポット法）
真核生物のＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素、ＧａｌＴ１酵素、およびＧｎＴ１酵素は、糖タンパク質上にＮ−グリカン鎖を構築する。さらなる改変について、例えば、糖ＰＥＧ化は、供与体基質としてＣＭＰ−ＮＡＮ−ＰＥＧを用いて実施できる。真核生物のＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素、ＧａｌＴ１酵素、およびＧｎＴ１酵素は、典型的に真核生物発現系、例えば、真菌細胞または哺乳動物細胞で発現する。
【０３０８】
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）ドメインに融合された真核生物のＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素、ＧａｌＴ１酵素、およびＧｎＴ１酵素の各々は、単独容器中、可溶化され、合わされ、一緒にリフォールディングされる。融合ＭＢＰ酵素およびリフォールディングされたＭＢＰ酵素は、活性であり、Ｎ−グリカン類を糖タンパク質または糖ＰＥＧ化糖タンパク質に付加させるために使用された。このリフォールディング用緩衝液は、レドックス対、例えば、酸化／還元グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）を含んだ。リフォールディングは、アルギニンおよびポリエチレングリコール３３５０（ＰＥＧ）の添加により増強された。ＩＢを、個々に可溶化でき、種々の割合でリフォールディング用緩衝液に加えるか、またはＩＢから一緒に可溶化でき、リフォールディング用緩衝液に直接加えることができる。これらの酵素のワンステップ精製または固定化もまた、ＭＢＰ融合タグを用いて行うことができる。
【０３０９】
（リフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼ混合物（ＳｕｐｅｒＧｌｙｃｏＭｉｘ）の調製）
（グリコシルトランスフェラーゼＩＢの調製）
真核生物のＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素、ＧａｌＴ１酵素、およびＧｎＴ１酵素を産生するために使用される細菌株を、表５に示す。この表はまた、ＭＢＰ融合タンパク質の推定分子量を示す（アミノ酸組成物に基づくＭＷ、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェア）。真核生物の酵素をコードする全ての核酸は、ＩＰＴＧ誘導性発現ベクターから発現された。
【０３１０】
【表５】
2007535309.tif 000104
大腸菌培養液のＩＰＴＧ誘導後、ＧｎＴ１酵素、ＧａｌＴ１酵素およびＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素は、フレンチプレスを用いる細胞溶解または界面活性剤の溶解（ＮｏｖａｇｅｎのＢｕｇｂｕｓｔｅｒ試薬）により単離された。前述のとおり、遠心分離後、ペレットを回収し、処理してＩＢを得た。ＩＢは、ＮｏｖａｇｅｎのＩＢ洗浄用緩衝液を用いて少なくとも２回洗浄した。洗浄されたＩＢは、リフォールディング実験での使用準備段階まで−２０℃で保存した。
【０３１１】
ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、ＧａｌＴ１、およびＧｎＴ１を含有するＩＢは別々に、６ＭのグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液に４℃で１時間溶解した。透明な上澄液は、遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆのミクロ遠心分離における最大スピード）後得られた。可溶化ＩＢのタンパク質含量は、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより定量された。表６のタンパク質含量は、各ＭＢＰ−グリコシルトランスフェラーゼの吸光係数に基づいて定量された。この吸光係数は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴｉソフトウェアを用いて算出された（表５を参照）。
【０３１２】
【表６】
2007535309.tif 000105
（グリコシルトランスフェラーゼ類のワンポットリフォールディング）
可溶化ＩＢを、表７に示されたように等量で混合した。
【０３１３】
【表７】
2007535309.tif 000106
全可溶化ＩＢ混合物のタンパク質濃度は、４．５ｍｇ／ｍｌであった。この混合物を、リフォールディング用緩衝液中、約１／２０に希釈して、全タンパク質混合物の最終濃度を０．２２ｍｇ／ｍＬにさせた。リフォールディング用緩衝液は、５５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５；５５０ｍＭのアルギニン；０．０５５％のＰＥＧ３３５０；２６４ｍＭのＮａＣｌ；１１ｍＭのＫＣｌ；１ｍＭのＧＳＨ；および０．１ｍＭのＧＳＳＧを含有した。リフォールディングはまた、トリスＨＣｌ、ｐＨ８．２の緩衝液中で実施でき、システイン／シスタミンレドックス対は、ＧＳＨ／ＧＳＳＧに代えることができる。ＩＢ混合物を、リフォールディング用緩衝液中に希釈し、４℃で一晩（１６〜１８時間）インキュベートした。リフォールディング反応におけるグリコトランスフェラーゼ類の推定濃度は：
ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ                        ０．０８１ｍｇ／ｍＬ
ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Δ１２９）Ｃ３４２Ｔ          ０．０８１ｍｇ／ｍＬ
ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Δ１０３）Ｃ１２１Ａ            ０．０６２ｍｇ／ｍＬ
である。
【０３１４】
一晩リフォールディング後、リフォールディングされたグリコトランスフェラーゼ混合物は、カオトロピック剤（すなわち、グアニジンＨＣｌ）を除くために透析した。透析は、透析用バッグ（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ、ＭＷＣＯ：７ｋＤ、Ｐｉｅｒｃｅ）中、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して４℃で２回（１回の透析につき２０倍）実施した。この透析済のリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼ混合物（Ｓｕｐｅｒｇｌｙｃｏｍｉｘ、ＳＧＭ）を、６ｍＬのＶｉｖａＳｐｉｎ（ＭＷＣＯ：１０ｋＤ）遠心濃縮器を用いて６倍に濃縮した。濃縮後、３種の糖タンパク質の全ては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定すると、混合物中に存在した（データは示さず）。ＳＧＭを濃縮後、ＧｎＴ１、ＧａｌＴ１およびＳＴ３ＧａｌＩＩＩの酵素活性が判定された。
【０３１５】
（ＳｕｐｅｒＧｌｙｃｏＭｉｘの酵素活性）
Ｓｕｐｅｒｇｌｙｃｏｍｉｘ（ＳＧＭ）、ワンポットでリフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼ混合物は、３種のグリコシルトランスフェラーゼ：ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、ＧａｌＴ１、およびＧｎＴ１を含有する。これらの酵素は、個々に酵素活性についてアッセイし、下記の方法を用いて分析した。酵素活性は、表８に掲げている。
【０３１６】
（ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素活性のアッセイ）
ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのアッセイは、ＨＰＬＣ／ＵＶ（紫外検出器付き高性能液体クロマトグラフィ）を用いて実施された。ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素によるＣＭＰ−ＮＡＮ（シチジン５’−モノホスフェート−β−Ｄ−シアリン酸）を用いたＬＮｎＴ（ラクト−Ｎ−ネオテトラオース）のＬＳＴｄ（ラクトシアリン−テトラサッカリド−ｄ）への変換を、以下のとおり実施した。この反応は、２ｍＭのＣＭＰ−ＮＡＮ、３０ｍＭのＬＮｎＴ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する１００μｌの２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ６．５緩衝液および２０μｌのリフォールディングされた酵素中、９６ウェルマイクロタイタープレート内で３７℃で２０分間実施された。該反応は、９８℃に１分間加熱することによりクエンチした。このマイクロタイタープレートは、沈殿物をいずれもペレットにするため３６００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。７５μｌの上澄液を、７５μｌの水で１：１に希釈した。希釈反応液を、ＹＭＣ−パックポリアミンＩＩカラムを用いてリン酸ナトリウム緩衝液／アセトニトリル勾配および２００ｎｍでの検出によるＬＣ／ＵＶによって分析した。サンプル生成物のピーク面積を、ＬＳＴｄ検量線と比較し、この活性を、反応液中の酵素１μｌにつき１分当りに産生されたＬＳＴｄ量を基準にして算出した。
【０３１７】
（ＧａｌＴ１酵素活性アッセイ）
酵素アッセイは、ＨＰＬＣ／ＰＡＤ（パルス電流測定検出付高性能液体クロマトグラフィ）を用いて実施された。ＧａｌＴＩ酵素によるＵＤＰ−Ｇａｌ（ウリジン５’−ジホスホガラクトース）を用いるＬＮＴ２（ラクト−Ｎ−トリオース−２）のＬＮｎＴ（ラクト−Ｎ−ネオテトラオース）への変換を、以下のとおり実施した。該反応は、６ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌ、５ｍＭのＬＮＴ−２、５ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する１００μｌの５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７緩衝液および１００μｌのリフォールディングされた酵素中、３７℃で６０分間実施された。該反応は、水（１倍〜１０倍希釈）でクエンチし、１０，０００ＭＷＣＯスピンフィルタにより遠心分離した。次いでろ液を、１倍〜１０倍希釈した。この希釈反応液は、Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＸ−５００システムおよびＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラムを用いて水酸化ナトリウム緩衝液によるＨＰＬＣによって分析した。サンプル生成物のピーク面積を、ＬＮｎＴの検量線と比較し、この活性は、反応液中の酵素の１μｌにつき１分当り生成されたＬＮｎＴ量を基準にして算出された。
【０３１８】
（ＧｎＴＩ酵素活性アッセイ）
ＧｎＴＩの活性は、ＵＤＰ−３Ｈ−ＧｌｃＮＡｃ（ウリジンジホスフェートＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン［６−３Ｈ（Ｎ）］）から、オクチル尾部をもつトリマンノシルコアである、ｎ−オクチル３，６−ジ−Ｏ−（α−マンノピラノシル）β−Ｄ−マンノピラノシド（ＯＭ３）へのトリチウム化糖の移送を測定するこよにより判定される。該反応は、３ｍＭのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、０．１ｍＭのＵＤＰ−３Ｈ−ＧｌｃＮＡｃ、０．５ｍＭのＯＭ３、２０ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する２０μｌの１００ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０緩衝液および１０μｌのリフォールディングされた酵素中、３７℃で６０分間実施した。該反応は水（１倍から６倍希釈）でクエンチし、製造元の推奨に従って先に調節された９６ウェルフォーマット中のポリマー逆相樹脂に適用した。この樹脂を２００μｌの水で２回洗浄し、生成物を、５０μｌの１００％ＭｅＯＨにより捕捉プレートに溶出した。シンチレーション液（２００μＬ）を各ウェルに加え、プレートを混合し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴマイクロプレートシンチレーションカウンターを用いてカウントした。この活性は、反応液中の酵素の１μｌにつき１分当り生成物に取り込まれた３Ｈ−ＧｌｃＮＡｃ量を基準にして算出された。
【０３１９】
【表８】
2007535309.tif 000107
上記表に報告された活性は、これらの酵素が別々にリフォールディングされた場合、接近しているかまたはその範囲である。ＧｎＴ１活性およびＧａｌＴ１活性は、哺乳動物発現系またはバキュロウィルス発現系を用いて得られたものに近い。ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ活性は、真菌発現系後に得られたＳＴ３ＧａｌＩＩＩ調製物よりも幾らか低かった。本明細書に用いられたＳＴ３ＧａｌＩＩＩアッセイは、該手法から変更され、値は、ＣＥ−ＬＩＦ（キャピラリ電気泳動−レーザ誘導蛍光）に基づく方法で得られたものよりも約１／４〜１／５倍と報告された。
【０３２０】
（Ｓｕｐｅｒｇｌｙｃｏｍｉｘを用いるＲＮＡｓｅＢ−Ｍａｎ５のリモデリング）
小型糖タンパク質である、１つのＮ結合Ｍａｎ５糖をもつＲＮＡｓｅＢを、ＵＤＰ−糖（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−Ｇａｌ）の存在下、ＳＧＭによりリモデリングした。このリモデリング反応を、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃまたはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−Ｇａｌの双方を用いて実施し、ＧｎＴ１およびＧａｌＴ１双方の活性を試験した。８μｌのＳＧＭを、２５μｌのアッセイ中、５ｍＭのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、および／または５ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌ、９μｇのＲＮＡｓｅＢＭａｎ５、５ｍＭのＭｅＣｌ２を含有する１０ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５に加えて、３３℃で一晩から４８時間インキュベートした。この反応の終末に、１０μｌのアリコートを、Ｈ２Ｏに対して透析し、１．５μｌのサンプルを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプレート上にスポットした。ＴＦＡおよびシンナピン酸で処理後、サンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ上で分析した。
【０３２１】
ＲＮＡｓｅＢＭａｎ５のリモデリングは、ＲＮＡｓｅＢのＭａｎ５上にＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌを移送させることによって行われた。３３℃で４８時間のインキュベート後、リモデリングされたＲＮＡｓｅＢ−Ｍａｎ５のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルが示すように、大部分のＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌのＲＮＡｓｅＢ上への移送を達成した。結果は表９に要約されている。
【０３２２】
【表９】
2007535309.tif 000108
（ＳＧＭを用いる糖ＰＥＧ化ＥＰＯのリモデリング）
糖ＰＥＧ化（２０Ｋ）は、以下の成分：１０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５、５ｍＭのＭｇＣＬ２、５ｍＭのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、０．５ｍＭのＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）、２４μｇのＥＰＯ、８μＬの濃縮ＳＧＭ、からなるワンポット反応において実施された。対照反応において、ＳＧＭは、哺乳動物細胞または昆虫細胞またはアスペルギルス属においてリフォールディングされたか、または発現された個々の酵素によって取替えられた。一晩インキュベート後、該反応液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析された。結果は図５に示す。ＳＧＭは、２０ＫＰＥＧをＥＰＯに加えた。
【０３２３】
（複数グリコシルトランスフェラーゼに対するワンポットリフォールディング条件の評価）
複数グリコシルトランスフェラーゼをリフォールディングする条件は、ｐＨおよび一度に２種または３種の酵素をリフォールディングすることを含めて評価された。
【０３２４】
（グリコシルトランスフェラーゼ封入体の調製）
グリコシルトランスフェラーゼ発現プラスミドにより形質転換された大腸菌株は、一例を除いて先に記載された。ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩは、ｐＣＷｏｒｉ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩプラスミドからＪＭ１０９細胞において発現された。前述のとおり、この封入体を単離し、可溶化させた。タンパク質含量は、上述のとおり評価し、表１０に示す。
【０３２５】
【表１０】
2007535309.tif 000109
（グリコシルトランスフェラーゼＩＢ混合物のワンポットリフォールディング）
タンパク質含量の測定後、可溶化ＩＢを、リフォールディング用緩衝液に希釈される前に示された量で混合した（表１１）。ＧＴのリフォールディング実験は、緩衝液ＡまたはＢ（下記）、ならびに０．１ｍＭのＧＳＳＧおよび１ｍＭのＧＳＨを用いて静置して４℃、４４ｍｌの容量中で実施された。緩衝液Ａ：１ｍＭのＧＳＨ、０．１ｍＭのＧＳＳＧを補充した、５５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５、５５０ｍＭのアルギニン、０．０５５％のＰＥＧ３３５０、２６４ｍＭのＮａＣｌ、１１ｍＭのＫＣｌ。
緩衝液Ｂ：１ｍＭのＧＳＨ、０．１ｍＭのＧＳＳＧを補充した、５５ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８、５５０ｍＭのアルギニン、０．０５５％のＰＥＧ３３５０、２６４ｍＭのＮａＣｌ、１１ｍＭのＫＣｌ。
【０３２６】
【表１１】
2007535309.tif 000110
二重リフォールディング（２×、２種のグリコシルトランスフェラーゼ）に関して、２ｍｌ中１０ｍｇの全タンパク質を、４１ｍＬのリフォールディング用緩衝液（上記）、０．４５ｍＬの１００ｍＭのＧＳＨ、０．４５ｍＬの１０ｍＭのＧＳＳＧに加え、希釈後、全タンパク質が０．４４ｍｇ／ｍｌになった。三重リフォールディング（３×、３種のグリコシルトランスフェラーゼ）に関して、２ｍｌ中１８．７ｍｇの全タンパク質を、４１ｍＬのリフォールディング用緩衝液（上記）、０．４５ｍＬの１００ｍＭのＧＳＨ、０．４５ｍＬの１０ｍＭのＧＳＳＧに加え、希釈後、全タンパク質が０．８３ｍｇ／ｍｌになった。タンパク質濃度は、以前の三重リフォールディング実験（ＳＧＭ中０．２２ｍｇ／ｍＬ）よりも高かった。リフォールディング反応におけるグリシルコトランスフェラーゼ類の推定濃度は：
ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ                        ０．３９ｍｇ／ｍＬ
ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Δ１２９）Ｃ３４２Ｔ          ０．２３ｍｇ／ｍＬ
ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Δ１０３）Ｃ１２１Ｓ            ０．２３ｍｇ／ｍＬ
である。
【０３２７】
一晩リフォールディング後、リフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼ混合物を透析した。透析は、透析用バッグ（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ、ＭＷＣＯ：７ｋＤ、Ｐｉｅｒｃｅ）中、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して４℃で２回実施した。透析後、グリコシルトランスフェラーゼ混合物を、６ｍＬのＶＩＶＡ−Ｓｐｉｎ（ＭＷＣＯ：１０Ｋ）遠心濃縮器を用いて９〜１２倍に濃縮した。
【０３２８】
タンパク質は、リフォールディング、透析、および濃縮後に存在したことをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により立証した。
【０３２９】
（リフォールディングされたグリコシルトランスフェラーゼ混合物の酵素アッセイ）
酵素アッセイを上記のとおり実施した。結果を表１２に示す。
【０３３０】
【表１２】
2007535309.tif 000111
最高の活性は、ＭＢＰ融合ＧｎＴ１およびＧａｌＴ１を等量で混合して緩衝液Ｂ中でリフォールディングされた際に見られた。ＭＢＰ融合ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの非等量の添加は、タンパク質の全量が高いためリフォールディング効率に影響を及ぼした。それにもかかわらず、２種のＧＴまたは３種のＧＴのいずれかを用いた２つの異なるリフォールディング用緩衝液は、活性な溶解性タンパク質を得るために使用できる。
【０３３１】
（実施例５：真核生物のＧａｌＮＡｃＴ２のリフォールディング）
切断されたヒトＧａｌＮＡｃＴ２酵素を、大腸菌で発現し、上記の方法を用いる可溶化およびリフォールディングのための最適条件を決めるために使用した。完全長ヒトＧａｌＮＡｃＴ２核酸およびアミノ酸配列は、図１３Ａおよび１３Ｂに提供されている。変異体タンパク質ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の配列は、図１４Ａおよび１４Ｂに示している。この変異体を、ＭＢＰ融合タンパク質ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）として大腸菌で発現した。他のＧａｌＮＡｃＴ２変異体を作製し、大腸菌で発現し、リフォールディングすることが可能であった：ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ４０）、ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ７３）、およびＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ９４）。データは示していない。さらなる欠失変異体の構築の詳細は、２００４年６月３日に出願された米国特許出願第６０／５７６，５３０号、および２００４年８月３日に出願された米国特許出願第６０／５９８，５８４号に見られ、それら双方は、全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている。
【０３３２】
ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を発現する細菌培養物を増殖し、上記のとおり収穫した。封入体を、上記のとおり細菌から精製した。封入体の可溶化を、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で実施した。可溶化後、ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）タンパク質を、緩衝液ＡおよびＢを用いてｐＨ６．５またはｐＨ８．０のいずれかでリフォールディングした。すなわち、緩衝液Ａ：１ｍＭのＧＳＨ、０．１ｍＭのＧＳＳＧで補充した、５５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５、５５０ｍＭのアルギニン、０．０５５％のＰＥＧ３３５０、２６４ｍＭのＮａＣｌ、１１ｍＭのＫＣｌ；および緩衝液Ｂ：１ｍＭのＧＳＨ、０．１ｍＭのＧＳＳＧを補充した、５５ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８、５５０ｍＭのアルギニン、０．０５５％のＰＥＧ３３５０、２６４ｍＭのＮａＣｌ、１１ｍＭのＫＣｌ、リフォールディング後、ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）タンパク質を透析してから濃縮した。図１５は、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化およびｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後のリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）のタンパク質濃縮の実施を提供している。
【０３３３】
放射標識［３Ｈ］−ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃアッセイは、放射標識ＧａｌＮＡｃのペプチド受容体への付加をモニタリングすることにより、大腸菌発現のリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の活性を測定するために実施された。この受容体は、配列ＭＶＴＰＴＰＴＰＴＣ（配列番号８０）を有するＭｕＣ−２様ペプチドであった。該ペプチドは、１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０に溶解した。例えば、２００４年６月３日に出願された米国特許出願第６０／５７６，５３０号；および２００４年８月３日に出願された、米国仮特許出願の代理人事件整理番号０４０８５３−０１−５１４９−Ｐ１に見られ、それら双方は、全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている。図１６は、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化およびｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後のリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の酵素活性の実施を提供している。図１７は、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化およびｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後のリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の比活性の実施を提供している。最高活性レベルは、ｐＨ８．０で可溶化およびｐＨ８．０でリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）に見られた。最高比活性レベルもまた、ｐＨ８．０で可溶化およびｐＨ８．０でリフォールディングに見られた。
【０３３４】
可溶化およびリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を、ＧａｌＮＡｃをＧ−ＣＳＦタンパク質に付加させる能力についてアッセイした。このアッセイは、酵素のアリコートおよび反応緩衝液（２７ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ＝７、２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＭｎＣｌ２、および０．１％のＴｗｅｅｎ８０）、Ｇ−ＣＳＦタンパク質（Ｈ２Ｏ中２ｍｇ／ｍｌ）、ならびに１００ｍＭのＵＧＰ−ＧａｌＮＡｃから構成された。各リフォールディングされたサンプルに関して、４．４μＬのサンプルを、１５μＬの反応溶液に加えた。陽性対照に関して、１μＬの標準的ＧａｌＮＡｃＴ２バキュロウィルスを、１つの管に３．４μＬのＨ２Ｏと一緒に加えた。反応液を３２℃でロータリーシェーカ上で数日間インキュベートし、その期間、一晩の時点および５日目の時点でＭＡＬＤＩによりアッセイした。例えば、２００４年６月３日に出願された米国特許出願第６０／５７６，５３０号；および２００４年８月３日に出願された、米国仮特許出願の代理人事件整理番号０４０８５３−０１−５１４９−Ｐ１に見られ、それら双方は、全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている。
【０３３５】
図１８Ａおよび１８Ｂは、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化およびｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後のリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を用いて組換え果粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）のリモデリング結果を提供している。陽性対照、すなわち、バキュロウィルスで発現された精製ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）、および陰性対照、すなわち、基質を欠いた反応混合物を含んだ。ＧＣＳＦリモデリング活性の最高レベルは、ｐＨ８．０で可溶化およびｐＨ８．０でリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を用いた際に見られた。
【０３３６】
（実施例６：真核生物ＧａｌＮＡｃＴ２のリフォールディングおよび精製）
組換えＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を発現する４リットルの細菌を増殖させ、収穫した。封入体を単離し、洗浄し、２グラムの乾燥重量の封入体を、２００ｍＬの可溶化緩衝液（７Ｍの尿素／５０ｍＭのトリス／１０ｍＭのＤＴＴ／５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中、４℃で可溶化した。可溶化後、次にこの混合物を、４Ｌのリフォールディング用緩衝液（５０ｍＭのトリス／５５０ｍＭのＬ−アルギニン／２５０ｍＭのＮａＣｌ／１０ｍＭのＫＣｌ／０．５％のＰＥＧ３３５０／４ｍＭのＬ−システイン／二塩酸シスタミン、ｐＨ８．０）に希釈した。リフォールディングは、攪拌しながら４〜１０℃で約２０時間実施した。次にこの混合物を、１０ＳＰ  ＣＵＮＯフィルターを用いてろ過し、４ｆｔ２膜上で５倍に濃縮し、ｐＨ８．０で１０ｍＭのトリス／５ｍＭのＮａＣｌにより４回ダイアフィルトレーションした。最終的なリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）溶液の導電率は、１．４ｍＳ／ｃｍであった。リフォールディングされたタンパク質を、４℃で数日間保存した。
【０３３７】
リフォールディングされたタンパク質を、ＱセファロースＸＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に適用した。溶出プロフィールは、図１９に示され、具体的なカラムフラクションの酵素活性は、図２０に示される。活性なフラクション合わせ、ヒドロキシアパタイトタイプＩ（８０μｍ）（Ｂｉｏｒａｄ、カリフォルニア州ヘルクレス）カラムに適用した。溶出プロフィールは、図２１に示され、ＨＡタイプＩに溶出されたフラクションの活性は、図２２に示される。ＱＸＬとＨＡタイプＩクロマトグラフィの組み合わせにより、活性な高精製ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を生じた。
【０３３８】
（実施例７：真核生物ＭＢＰ−ＳＢＤ  ＳＴ３Ｇａｌ３の精製）
Δ７３  ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ切断を、マルトース結合タンパク質および澱粉結合ドメインにインフレームで融合させて二重タグ化タンパク質：ＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ３（Δ７３）を形成した。ＭＢＰは、アミノ末端にあり、次いでＳＢＤ、次に切断ＳＴ３ＧａｌＩＩＩタンパク質があった。ＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ３（Δ７３）のリフォールディングおよび精製を、単独のタグタンパク質：ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（Δ７３）と比較した。両タンパク質は、不溶性封入体として大腸菌で発現され、本明細書に記載されたとおり可溶化、リフォールディングされた。次にこのタンパク質を透析し、ＭＢＰおよびＳＢＤ双方のタグに結合するシクロデキストリンカラムを用いてアフィニティー精製に供された。結果を表２３に示す。ＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ３（Δ７３）タンパク質は、透析後、より高い比活性があり、カラムからシクロデキストリンによる溶出後、さらに比活性を保持した。
【０３３９】
（実施例８：ＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ１およびＭＢＰＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質のリフォールディング）
真核生物のＳＴ３Ｇａｌ１を、ＭＰＢまたはＭＢＰおよびＳＢＤに融合させた。ブタＳＴ３Ｇａｌ１遺伝子のＤＮＡ配列は、本明細書に記載されたｐｃＷＩＮＭＢＰ−ｐＳＴ３Ｇａｌ１構築物およびｐｃＷＩＮＭＢＰ／ＳＢＤ−ｐＳＴ３Ｇａｌ１構築物のデザイン用テンプレートして用いられた。完全長ブタＳＴ３Ｇａｌ１配列は、図３７に提供される。大腸菌における発現に関して、ｐＳＴ３Ｇａｌ１の最適化コドンおよび切断変種、すなわち、ｐＳＴ３Ｇａｌ１Δ４５を用いた。コード化アミノ酸配列は、図２４に提供されている。次にＳＴ３Ｇａｌ１遺伝子コード化配列を消化し、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩクローニング部位を用いてｐｃＷＩＮ２−ＭＢＰおよびｐｃＷＩＮＭＢＰ／ＳＢＤベクターに移した。これらの構築物は、制限および配列分析により正しいことが確かめられ、次いで５０μｇ／ｍｌのカナマイシン選択を用いて大腸菌株ＪＭ１０９を変換するために用いられた。各々からの個々のコロニーは、Ｍａｒｉｔｏｎｅ−１０μｇ／ｍｌカナマイシンの２ｍｌ培養液を接種するために用いられ、これを３７℃で１６時間インキュベートした。各培養液を、別々に５０％グリセロールと１：１で混合し、−８０℃で凍結し、ストックバイアルと称した。各ストックバイアルの少量を、Ｍａｒｉｔｏｎｅ−Ｋａｎプレートをストリークさせるために用いた。３７℃で１６時間インキュベート後、各々からの単一コロニーを、Ｍａｒｉｔｏｎｅ−１０μｇ／ｍｌカナマイシンの２５ｍｌの培養液を接種するために用いられ、これを３７℃で１６時間インキュベートした。次に２５ｍｌの培養液を、Ｍａｒｉｔｏｎｅ−１０μｇ／ｍｌカナマイシンの１Ｌの培養液を接種するために用いられ、これを３７℃でインキュベートし、ＯＤ６００についてモニターした。ＯＤ６００が０．８に達したら、ＩＰＴＧを１ｍＭまで加え、細胞をさらに１６時間インキュベートした。次いで細胞を、７０００×Ｇで１５分間の遠心分離により収穫した。
【０３４０】
次に封入体を単離し、ＳＴ３Ｇａｌ１融合タンパク質を可溶化し、リフォールディングした。細菌細胞ペレットを、２０ｍＭのトリスｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡの１０ｍＬにつき１ｇのウェット細胞ペレットの比率で再懸濁し、マイクロ流動化装置を２回通過させて機械的破壊により溶解した。不溶性物質、すなわち、封入体すなわちＩＢを、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ３内で４℃、７０００ｘｇで３０分間の遠心分離によりペレット化し、上澄液を廃棄した。典型的な洗浄サイクルは、ペレットを洗浄用緩衝液に完全再懸濁することおよび１５分間の遠心分離の反復から構成された。このペレットを、高塩緩衝液（洗浄Ｉ：１０ｍＭのトリスｐＨ７．４、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ）の過剰容量（元の細胞ペレット１ｇ当り少なくとも１０ｍＬ（２０ｍＬまで））で１回、界面活性剤緩衝液（洗浄ＩＩ：２５ｍＭのトリスｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００，１％Ｎａ−デオキシコレート、５ｍＭのＥＤＴＡ）で１回、（ＩＢの洗浄に加えて微量の界面活性剤を除くために）洗浄用緩衝液（洗浄ＩＩＩ：１０ｍＭのトリスｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ）で３回洗浄した。
【０３４１】
洗浄されたＩＢを、可溶化緩衝液（８Ｍの尿素、５０ｍＭのビストリスｐＨ６．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁して、２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整した。リフォールディングは、リフォールディング用緩衝液（５５ｍＭのトリスｐＨ８．２、１０．５６ｍＭのＮａＣｌ、０．４４ｍＭのＫＣｌ、２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２．２ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５５％のＰｅｇ３３５０、５５０ｍＭのＬ−アルギニン、１ｍＭのＧＳＨ、１００ｍＭのＧＳＳＧ）に素早く２０倍希釈として実施し、４℃で１６時間攪拌した。次にこの緩衝液を、Ｇ５０セファデックスを用いて脱塩して、５０ｍＭのビストリスｐＨ６．５、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ８０に交換した。
【０３４２】
リフォールディングされた酵素が活性であるかどうかを判定するために、シアリルトランスフェラーゼアッセイを実施した。シアリン酸の供与体（アシアロ−ウシ顎下ムチン）への移送を、放射標識ＣＭＰ−ＮＡＮを用いてモニターした。バキュロウィルス系で発現されたニワトリＳＴ６ＧａｌＮａｃ１を、陽性対照として用いた。
【０３４３】
短時間で４０μＬの反応混合物を、１０μＬの酵素サンプルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。１００μＬのホスホタングステン酸／１５％ＴＣＡを反応液に攪拌しながら加えることによって糖タンパク質が沈殿した。遠心分離後、上澄液を吸引して廃棄した。５００μＬの５％ＴＣＡを加えて、ペレットから取り込まれていないＣＭＰ−１４Ｃ−シアリン酸を洗浄した。反応液を再度遠心分離し、上澄液を吸引して廃棄した。ペレットは、１００μＬの１０ＮのＮａＯＨを用いて再懸濁した。１Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ７．５の１ｍＬを、再懸濁されたペレットに加えてから、この混合物をシンチレーションバイアルに移した。５ｍＬのシンチレーション液（Ｅｃｏｌｕｍｅ、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を加え、十分に混合した。反応液に添加された全カウントは、４０μＬの反応混合物をシンチレーションバイアルに加え、１００μＬの１０ＮのＮａＯＨ、１ｍＬの水、および５ｍＬのシンチレーション液を加えて、十分に攪拌して測定された。バイアルを１分間カウントした。反応条件を表１３に提供している。
【０３４４】
【表１３】
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結果を図２５に示す。リフォールディングされた融合タンパク質、ＭＢＰ−ｐＳＴ３Ｇａｌ１およびＭＢＰ−ＳＢＤ−ｐＳＴ３Ｇａｌ１の双方は、検出可能なシアリルトランスフェラーゼ活性を有した。
【０３４５】
（実施例９：ＭＢＰ−ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１タンパク質のリフォールディング）
真核生物のＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩはＭＰＢに融合させた。短時間で、５種のマウスＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ構築物が生成した：Ｄ３２、Ｅ５２、Ｓ１２７、Ｓ１８６、およびＳ２０１。各構築物は、ベクターｐｃＷｉｎ２−ＭＢＰからのＭＢＰタグの後ろで発現し、構築物に含まれる「ステム」領域の範囲が異なる。Ｄ３２は、予測されたアミノ末端膜貫通ドメインの下流から直ちに出発する最長の形態である。Ｓ２０１は、保存触媒ドメインの予測されたスタート直前から始まる最短の形態である。
【０３４６】
マウス構築物に加えて、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ  Ｋ３６もまた、ＭＢＰによる融合として発現される。ヒト構築物は、膜貫通ドメイン直後かた始まる。Ｋ３６からそのｃ−末端にヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１をコードするＤＮＡは、テンプレートとして既存のバキュロウィルス発現ベクターを用いてＰＣＲにより単離され、ｐｃＷｉｎ２−ＭＢＰ内のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ位置にクローン化される。
【０３４７】
参照のために、ＭＢＰ−ｍＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ  Ｓ１２７の配列およびＭＢＰ−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ  Ｋ３６の配列は、図２６に含まれる。さらに、図３８は、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩおよびニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩに関して完全長アミノ酸配列、および天然のマウスタンパク質の残基３２に始まるマウスＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質の配列を提供している。
【０３４８】
上記のものに加えて欠失変異体が作製され、本発明の使用に好ましいＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの完全なリストは、表１４に見られる。図３９は、多数の好ましいヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ切断変異体の図式を提供している。図４０は、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ切断変異体を含むＭＢＰ融合タンパク質の図式を示す。
【０３４９】
【表１４】
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図４５は、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質における対合および不対合システイン残基の位置を示す。単独および二重システイン置換もまた、例えば、Ｃ２８０Ｓ、Ｃ３６２Ｓ、Ｃ３６２Ｔ、（Ｃ２８０Ｓ＋Ｃ３６２Ｓ）、および（Ｃ２８０Ｓ＋Ｃ３６２Ｔ）で示される。
【０３５０】
初期の発現研究において、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ融合タンパク質は、不溶性タンパク質として発現されることを示した。活性な組換え酵素を回収するために、記載されるように、不活性な不溶性タンパク質を単離し、リフォールディングした。
【０３５１】
ｐｃＷｉｎ２−ＭＢＰ−ｍＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ  Ｄ３２、Ｅ５２、Ｓ１２７、Ｓ１８６、またはｐｃＷｉｎ２−ＭＢＰ−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ  Ｋ３６のいずれかを有するＪＭ１０９の０．５Ｌ培養の対数的増殖は、１ｍＭのＩＰＴＧにより３７℃で一晩誘導された。細胞を遠心分離により採取し、１００ｍＬの２０ｍＭのトリスｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ中、マイクロ流動化装置で機械的破壊により溶解した。不溶性物質を、７０００×ｇで２０分間の遠心分離により採取した。上澄液を廃棄し、ペレットを、高塩緩衝液（２０ｍＭのトリスｐＨ７．４、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ）、界面活性剤緩衝液（２５ｍＭのトリスｐＨ８、１％Ｎａ−デオキシコレート、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ）、およびＴＥ（１０ｍＭのトリスｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄した。各洗浄液は１００ｍＬであり、ペレットは、上記のとおり遠心分離により採取した。洗浄後、封入体ペレットをアリコートで分けて−８０℃に保存した。
【０３５２】
適切なリフォールディング、したがってＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ活性の回復を可能にする条件についてスクリーニングするために、マウスおよびヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ融合タンパク質の封入体のアリコートを、６Ｍのグアニジン、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｘＴＢＳに可溶化した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより正規化し、可溶化タンパク質を一連の市販のタンパク質リフォールディング用緩衝液に移した。リフォールディングは、９６ウェルプレート内で０．２ｍｇ／ｍｌで０．２５ｍＬ中、４℃で一晩攪拌しながら実施した。リフォールディング体を、９６ウェル透析用プレート（２５０００ＮＷＣＯ）に移し、１ｘＴＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０に対して４℃で４時間透析し、次いで１０ｍＭのビストリスｐＨ７．１、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のツウィーン−８０に対して４℃で一晩透析した。
【０３５３】
リフォールディングされた組換えＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ融合タンパク質を、３８４ウェルの固相活性アッセイにおいて活性を試験した。簡潔に述べると、活性アッセイは、３８４ウェルプレート内で、ビオチン化ＣＭＰ−ＮＡＮからアシアロ−ウシ顎下ムチン−コーティングウェルの表面に、ビオチン化シアリン酸のＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ媒介性移送を検出する。各反応（１３．５μＬリフォールディング＋１．５μＬの１０×反応緩衝液）は、四重反復試験が実施された。１０×反応緩衝液は、０．２Ｍのビストリスｐｈ６．７、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＭｎＣｌ２、０．５％のＴｗｅｅｎ−８０、および１ｍＭの供与体であった。３７℃で一晩インキュベート後、プレートを過剰の１×ＴＢＳ、０．０５％のツウィーン−２０で洗浄し、ビオチンは、製造元の使用説明書（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に従ってユーロピウム標識ストレプトアビジンにより検出した。ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ活性を示すプレートに保持されたユーロピウム蛍光レベルは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ３Ｖプレートリーダーにより記録され、発現および活性結果は、表１５に要約している。３種のリフォールディングされたＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ融合タンパク質は、検出可能な活性を有した。
【０３５４】
【表１５】
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（実施例１０：コア１ＧａｌＴ１タンパク質のリフォールディング）
真核生物のコア１ＧａｌＴ１を、ＭＰＢまたは二重タグ、ＭＢＰＳＰＤに融合させる。ショウジョウバエおよびヒトコア１ＧａｌＴ１タンパク質を使用する。図４１は、ヒトコア１ＧａｌＴ１タンパク質の完全長配列を提供している。図４２は、２種のショウジョウバエコア１ＧａｌＴ１タンパク質の配列を提供している。各酵素の切断体は、最少の切断体が、コア１ＧａｌＴ１触媒ドメインのみを含んでなるように、ステム領域全体にわたって、すなわち完全長ステム領域から出発して一度に１つのアミノ酸を欠失させて作製する。タンパク質の触媒ドメインにわたるシステイン残基もまた、セリンまたはアラニン残基に一度に変異されたものである。ＭＢＰ融合は、切断タンパク質であるシステイン変異体または２つの組み合わせを用いて成される。タンパク質は、本明細書に記載された方法を用いて、封入体として大腸菌で発現され、可溶化され、次いでリフォールディングされる。リフォールディングは、酵素活性を測定することによって判定される。活性酵素は、正しくリフォールディングされている。コア１ＧａｌＴ１の酵素活性は、Ｊｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１７８−１８６頁（２００２）（全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている）に開示されているように測定する。
【０３５５】
（実施例１１：Ｏ−結合グリコシルトランスフェラーゼ類のワンポットリフォールディング）
Ｏ−結合グリコシルトランスフェラーゼ類ＧａｌＮＡｃＴ２、コア１およびＳＴ３Ｇａｌ１は、治療用タンパク質など選択されたタンパク質のセリン残基またはトレオニン残基上の末端シアリン酸またはシアリン酸−ＰＥＧを含むコア１構造を付加させるために集合的に使用できる。大腸菌におけるこれら酵素の発現およびリフォールディング封入体から活性酵素の回収は、コスト的に有効でスケールアップ可能な方法を開発するために有用である。我々は、大腸菌の封入体からこれら酵素（ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２およびＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ１）の２種の同時リフォールディングを本明細書に記載する。同時リフォールディングの利点としては、試薬の使用を減じ、リフォールディング効率を増加させることが挙げられる。
【０３５６】
ＪＭ１０９の２種の株をカナマイシン耐性に関して選択し、ＩＰＴＧによる誘導の際に、ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２およびＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ１の封入体を蓄積する適切な発現プラスミドを担持していることを判定した。
【０３５７】
１ｍＭのＩＰＴＧにより別個に一晩誘導後、細菌細胞のペレットを、２０ｍＭのトリスｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡの１０ｍＬ当たり、１ｇの湿潤細胞ペレットの割合で再懸濁し、マイクロフリューダイザーを２回通して、機械的破壊により溶解させた。不溶性物質、すなわち封入体すなわちＩＢを、３０分間、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ３において、４℃、７０００×Ｇでの遠心分離によりペレット化し、上澄み液は廃棄した。典型的な洗浄サイクルは、洗浄緩衝液中でペレットを完全に再懸濁し、遠心分離を１５分間繰り返すことからなった。該ペレットを、過剰容量（高塩緩衝液（洗浄液Ｉ：１０ｍＭのトリスｐＨ７．４、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ）の元の細胞ペレット１ｇ当たり、少なくとも１０ｍＬ（２０まで））で１回、界面活性緩衝液（洗浄液ＩＩ：２５ｍＭのトリスｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００、１％のＮａ−デオキシコール酸、５ｍＭのＥＤＴＡ）中で１回、および（ＩＢの洗浄に加えて、微量の界面活性剤の混入を除去するために）洗浄緩衝液（洗浄液ＩＩＩ：１０ｍＭのトリスｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ）中で３回洗浄した。
【０３５８】
洗浄したＩＢを、可溶化緩衝液（８Ｍの尿素、５０ｍＭのビストリスｐＨ６．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁し、４ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整した。該尿素タンパク質溶液を、１４０００×Ｇで５分間の遠心分離によって清澄化した。リフォールディング緩衝液（５５ｍＭのトリスｐＨ８．２、１０．５６ｍＭのＮａＣｌ、０．４４ｍＭのＫＣｌ、２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２．２ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５５％のＰｅｇ３３５０、５５０ｍＭのＬ−アルギニン、１ｍＭのＧＳＨ、１００ｍｃＭのＧＳＳＧ）中、０．１ｍｇ／ｍｌへ急速希釈して実施し、４℃で１６時間、攪拌した。
【０３５９】
実験系を以下の通り設定した：ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２およびＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ１のいずれかを個別にリフォールディング、または同じ容器内で同時にリフォールディングする間、リフォールディング条件を一定に保持した。リフォールディング後、該混合物を、５０ｍＭのビストリスｐＨ６．５、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ８０中で平衡化したＧ５０Ｓｅｐｈａｄｅｘを用いて、低速遠心分離により脱塩した。微量遠心管における最高速度での遠心分離後、可溶性物質を回収した。
【０３６０】
リフォールディング後、可溶性酵素の収量を測定するため、各反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供し、続いて、クーマシーブルーにより染色して、ポリペプチドを可視化した（図２７Ａ）。結果は、同時リフォールディングにより可溶性酵素の収量が増加することを示している（同時リフォールディング対個別のレーン）。
【０３６１】
第２の実験において、６μｇの治療用タンパク質、ＩＦα−２ｂを、１ポット３酵素ｐｅｇ化反応に供した。以下の反応用緩衝液（５０ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ６．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２）を用い、０時間または１６時間、２０μｌの反応液中、この反応に用いた酵素の濃度は、１．４μｇのＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２、０．５ｍｕのＢＶコア１、および１．４μｇのＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ１、用いられた糖は、１．２μｇのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよび１．２μｇのＵＤＰ−Ｇａｌならびに１２５μｇの２０Ｋ−Ｐｅｇ−ＣＭＰ−ＮＡＮである。反応液の半分におけるＩＦα−２ｂのｐｅｇ化の程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシーブルー染色によって可視化した（図２７Ｂ）。該実験は、個々にリフォールディングされた酵素のいずれかの組み合わせを用いる１ポットｐｅｇ化を、同時リフォールディング酵素と直接比較し、他の全ての成分および濃度を一定に保つようにデザインされた。結果は、該酵素が同時リフォールディングされた反応におけるｐｅｇ化生成物が、個別にリフォールディングされたものと比較して増加したことを証明している（５レーン対７レーン）。
【０３６２】
（実施例１２：ＭＢＰ−ＳｉａＡ融合タンパク質の発現増強）
非定型インフルエンザ菌のＳｉａＡ遺伝子末端を大腸菌内の発現に関してコドン最適化した。該遺伝子をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩにより消化し、アガロースゲル精製し、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐｃＷｉｎ２に結合してから、大腸菌株ＪＭ１０９またはＷ３１１０内へ形質転換した。プラスミドＤＮＡを組換え体から単離し、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩによりスクリーニングした。正しい構築物を各々含有するＪＭ１０９の１つのコロニーおよびＷ３１１０の１つのコロニーを、１０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを含有する２ｍｌの無動物ＬＢに播種し、２５０ＲＰＭの攪拌で３７℃、６時間増殖させた。１００μｌのアリコートを取り、１０，０００×ｇで２分間、遠心分離し、上澄み液を廃棄した。−２０℃で凍結させたこのペレットは非誘導細胞を表す。残りの培養物に、１ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを加え、３７℃で２時間、２５０ＲＰＭの攪拌でインキュベートした。１００μｌのアリコートを取り、記載された通り処理した（誘導細胞を表す）。
【０３６３】
ＰＣＲを用いて、ＳｉａＡ遺伝子の制限部位を５’ＢａｍＨＩに変化させ，３’端はＥｃｏＲＩ維持した。該ＰＣＲ生成物を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにより消化し、アガロースゲル電気泳動により精製し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐｃＷｉｎ２ＭＢＰに結合した。この結合反応によって形質転換したＪＭ１０９細胞を培養し、プラスミドＤＮＡを単離した。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてプラスミドＤＮＡをスクリーンした。正しい構造を含有する３つのコロニーを、１０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを含有する２ｍｌの無動物ＬＢに播種し、２５０ＲＰＭの攪拌で３７℃、６時間増殖させた。１００μｌのアリコートを取り、１０，０００×ｇで２分間、遠心分離し、上澄み液を廃棄した。−２０℃で凍結させたこのペレットは非誘導細胞を表す。残りの培養物に、１ｍＭ
ＩＰＴＧの最終濃度でＩＰＴＧを加え、３７℃で２時間、２５０ＲＰＭの攪拌でインキュベートした。１００μｌのアリコートを取り、記載された通り処理した（誘導細胞を表す）。
【０３６４】
各１００μｌのアリコートを、５０ｍＭのＤＴＴを含有する１００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で５分間沸騰させた。該サンプルを、４〜２０％のアクリルアミド、トリス−グリシンゲル上に装填し（インビトロゲン）、約２時間電気泳動し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎによって染色し、水で脱染し走査した。図Ｘは、誘導時、天然ＳｉａＡの検出不可能なレベルの発現を示し、一方、図Ｙは、ＩＰＴＧ誘導時、ＭＢＰに融合したＳｉａＡの高レベルの発現を示す。この結果は、ｐｃＷｉｎ２ＭＢＰベクターから供給されたＭＢＰが高レベルのタンパク質発現を駆動することを証明している。
【０３６５】
本明細書に記載された実施例および実施形態は、単に例示が目的であること、およびそれに関して、種々の改変または変更が当業者に考えられ、それらが本出願の精神と範囲内および添付の請求項の範囲内に含まれることが理解される。本明細書に引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために、参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０３６６】
【図１】図１は、細菌封入体からのＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩリフォールディングにおいて試験された緩衝液条件を示している。リフォールディングされた該酵素の活性も示されている。
【図２】図２は、アミロースカラムからのリフォールディングされ、透析されたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩの溶出プロフィールを示している。
【図３】図３は、アミロースカラムからの溶出フラクションのＳＴ３ＧａｌＩＩＩ活性を示している。
【図４】図４は、リフォールディングされた精製ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを用いた、トランスフェリンの糖ＰＥＧ化のアッセイ結果を示している。レーンは以下の通りである：（１）ＭＷマーカー〔２５０、１４８、９８、６４、５０ｋＤ〕；（２）酵素なしの対照アシアロトランスフェリン。実線矢印で示されている。；（３）フラクション＃５によるトランスフェリン−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）生成。生成物は矢印で示されている；（４）フラクション＃６によるトランスフェリン−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）生成。生成物は矢印で示されている；（５）リフォールディングされた精製ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ  フラクション＃６。点線矢印で示されている；（６）ＭＷマーカー；（７）２と同じ；（８）フラクション＃４によるトランスフェリン−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）生成。生成物は括弧で示されている；および（９）フラクション＃５によるトランスフェリン−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）生成。生成物は括弧で示されている。
【図５】図５は、リフォールディングされたＳｕｐｅｒＧｌｙｃｏＭｉｘを用いたＥＰＯの糖ＰＥＧ化のアッセイ結果を示している。レーンは以下の通りである：（１）ＭＷマーカー、ＳｅｅＢｌｕｅ２インビトロゲン、（２５０、１４８、９８、６４、５０、３６、２２、１６、６ｋＤ）；（２）ＥＰＯを有する陽性対照、＋ＮＳＯ発現ＧａｌＴ１、ＢＶ  ＧｎＴ１、アスペルギルスＳＴ３ＧａｌＩＩＩおよび糖ヌクレオチド；（３）陰性対照、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃなしで２と同じ；（４）ＥＰＯ、精製され、個別にリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Δ１２９）Ｃ３４２Ｔ、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧｎＴ１（Δ１０３）、および黒色アスペルギルス発現ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ；（５）ＥＰＯ、ＳｕｐｅｒＧｌｙｃｏＭｉｘ（ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Δ１２９）Ｃ３４２Ｔ、ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Δ１０３）Ｃ１２３Ａおよび糖ヌクレオチドの混合物。
【図６】図６は、ヒトＧｎＴ１アミノ酸配列（上位線、ＮＰ−００２３９７；配列番号１）およびウサギＧｎＴ１アミノ酸配列（下位線、Ｐ２７１１５；配列番号２）のアラインメントを示している。保存不対合システインには下線が引かれており太活字になっている。
【図７】図７は、ＧｎＴ１  Ｃｙｓ１２１Ｓｅｒ変異体のアミノ酸配列（配列番号３）および変異体のＧｎＴ１タンパク質をコードする核酸配列（配列番号４）を示している。描かれているアミノ酸配列は、完全長ヒトタンパク質のアミノ酸残基１０４から始まり、以下の不対合システイン変異を有する哺乳動物ＧｎＴ１タンパク質に典型的であり、式中、太活字の残基が野生型システインから変異している：
【化１０】
2007535309.tif 000115
（配列番号５）。
【図８】図８は、ＧｎＴ１  Ｃｙｓ１２１Ａｓｐ変異体のアミノ酸配列（配列番号６）および変異体のＧｎＴ１タンパク質をコードする核酸配列（配列番号７）を示している。描かれているアミノ酸配列は、完全長ヒトタンパク質のアミノ酸残基１０４から始まり、以下の不対合システイン変異を有する哺乳動物ＧｎＴ１タンパク質に典型的であり、式中、太活字の残基が野生型システインから変異している：
【化１１】
2007535309.tif 000116
（配列番号８）。
【図９】図９は、ＧｎＴ１  Ｃｙｓ１２１Ｔｈｒ変異体のアミノ酸配列（配列番号９）および変異体のＧｎＴ１タンパク質をコードする核酸配列（配列番号１０）を示している。描かれているアミノ酸配列は、完全長ヒトタンパク質のアミノ酸残基１０４から始まり、以下の不対合システイン変異を有する哺乳動物ＧｎＴ１タンパク質に典型的であり、式中、太活字の残基が野生型システインから変異している：
【化１２】
2007535309.tif 000117
（配列番号１１）。
【図１０】図１０は、ＧｎＴ１  Ｃｙｓ１２１Ａｌａ変異体のアミノ酸配列（配列番号１２）および変異体のＧｎＴ１タンパク質をコードする核酸配列（配列番号１３）を示している。描かれているアミノ酸配列は、完全長ヒトタンパク質のアミノ酸残基１０４から始まり、以下の不対合システイン変異を有する哺乳動物ＧｎＴ１タンパク質に典型的であり、式中、太活字の残基が野生型システインから変異している：
【化１３】
2007535309.tif 000118
（配列番号１４）。
【図１１】図１１は、ＧｎＴ１  Ａｒｇ１２０Ａｌａ、Ｃｙｓ１２Ｈｉｓ変異体のアミノ酸配列（配列番号１５）および変異体のＧｎＴ１タンパク質をコードする核酸配列（配列番号１６）を示している。描かれているアミノ酸配列は、完全長ヒトタンパク質のアミノ酸残基１０４から始まり、以下の二重変異を有する哺乳動物ＧｎＴ１タンパク質に典型的であり、式中、太活字の残基が野生型システインから変異している：
【化１４】
2007535309.tif 000119
（配列番号１７）。
【図１２】図１２は、ラットの肝臓ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号１８）を示している。下線イタリックの配列が欠失し、Δ２８欠失が作成された。
【図１３−１】図１３Ａおよび１３ＢはＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（ＧａｌＮＡｃＴ２）の完全長核酸配列（配列番号２０）およびアミノ酸配列（配列番号１９）を示している。核酸およびタンパク質の登録番号は、ＮＭ−００４４８１である。
【図１３−２】（図１３−１の続き）
【図１３−３】図１３Ａおよび１３ＢはＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（ＧａｌＮＡｃＴ２）の完全長核酸配列（配列番号２０）およびアミノ酸配列（配列番号１９）を示している。核酸およびタンパク質の登録番号は、ＮＭ−００４４８１である。
【図１４−１】図１４Ａおよび１４Ｂは、Δ５１ＧａｌＮＡｃＴ２の核酸配列（配列番号２２）およびアミノ酸配列（配列番号２１）である。ナンバリングは図１３Ａおよび１３Ｂに示した完全長アミノ酸配列および核酸配列に基づいている。
【図１４−２】（図１４−１の続き）
【図１４−３】図１４Ａおよび１４Ｂは、Δ５１ＧａｌＮＡｃＴ２の核酸配列（配列番号２２）およびアミノ酸配列（配列番号２１）である。ナンバリングは図１３Ａおよび１３Ｂに示した完全長アミノ酸配列および核酸配列に基づいている。
【図１５】図１５は、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化し、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）のタンパク質濃度を示している。試験されたｐＨ値は、可溶化ｐＨ−リフォールディングｐＨとして表されている。タンパク質濃度は、リフォールディング直後（明るい灰色のバー）、透析後（暗い灰色のバー）、および濃縮後（白色のバー）に測定された。
【図１６】図１６は、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化し、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の酵素活性を示している。試験されたｐＨ値は、可溶化ｐＨ−リフォールディングｐＨとして表されている。活性は、透析後（明るい灰色の棒）、および濃縮後（暗い灰色の棒）に測定された。
【図１７】図１７は、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化し、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の特異的活性を示している。試験されたｐＨ値は、可溶化ｐＨ−リフォールディングｐＨとして表されている。特異的活性は、透析後（白色の棒）、および濃縮後（暗い灰色の棒）に測定された。
【図１８Ａ】図１８Ａおよび１８Ｂは、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化し、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を使用した組換え顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）のリモデリングの結果を示している。図１８Ａは、精製ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）対照を用いた結果、または基質を欠いた陰性対照を用いた結果、またはｐＨ６．５で可溶化し、ｐＨ６．５でリフォールディングされた細菌発現ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を用いた結果を示している。図１８Ｂは実験結果を示している。
【図１８Ｂ】図１８Ａおよび１８Ｂは、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０で可溶化し、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０でリフォールディング後、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を使用した組換え顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）のリモデリングの結果を示している。図１８Ａは、精製ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）対照を用いた結果、または基質を欠いた陰性対照を用いた結果、またはｐＨ６．５で可溶化し、ｐＨ６．５でリフォールディングされた細菌発現ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）を用いた結果を示している。図１８Ｂは実験結果を示している。
【図１９】図１９は、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（ＱＸＬ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）からの溶出後のリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）タンパク質のプロフィールを示している。図の上側には、ＱＸＬカラムからのＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の溶出を例示するクロマトグラムが示されている。Ｘ軸上にはフラクション番号が示され、Ｙ軸上には、各フラクションの相対的吸光度が示されている。下側には、溶出したフラクションを可視化するために用いられた２つの電気泳動ゲルの画像が示されている。ゲル上の各レーンの内容は図に記載されている。
【図２０】図２０は、図１９に示されたＱＸＬカラムからの特異的カラムフラクションのＧａｌＮＡｃＴ２活性を示している。最も活性のフラクションを、ヒドロキシアパタイトＩ型（８０μｍ）カラム（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）に適用した。
【図２１】図２１は、ＨＡＩ型カラムからの溶出後のリフォールディングされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）タンパク質のプロフィールを示している。図の上側には、ＨＡＩ型カラムからのＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（Ｄ５１）の溶出を例示するクロマトグラムが示されている。Ｘ軸上にはフラクション番号が示され、Ｙ軸上には、各フラクションの相対的吸光度が示されている。下側には、溶出したフラクションを可視化するために用いられた電気泳動ゲルの画像が示されている。ゲル上の各レーンの内容は図に記載されている。
【図２２】図２２は、ＨＡＩ型溶出フラクションのＧａｌＮＡｃＴ２活性を示している。
【図２３】図２３は、ＭＢＰタグまたはＭＢＰ−ＳＢＤタグのいずれかに融合させたＳＴ３Ｇａｌ３タンパク質の精製および活性の比較を示している。
【図２４】図２４は、ＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ１融合タンパク質（配列番号２３）（Ａ）およびＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ１融合タンパク質（配列番号２４）（Ｂ）のアミノ酸配列を示している。
【図２５】図２５は、ＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ３融合タンパク質およびＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ３融合タンパク質のシアリルトランスフェラーゼ活性を示している。陽性対照および陰性対照もまた示されている。
【図２６】図２６は、ＭＢＰに融合したマウスおよびヒトのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質のアミノ酸配列を示している。Ａ部分は、マウスの切断融合：ＭＢＰ−ｍＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＳ１２７の配列（配列番号２５）を示す。Ｂ部分は、ヒトの切断融合：ＭＢＰ−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＫ３６の配列（配列番号２６）を示す。
【図２７】図２７は、Ｏ−結合グリコシルトランスフェラーゼ酵素（Ａ）同時リフォールディング後の濃縮物および（Ｂ）同時リフォールディング後の酵素アッセイ結果のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２とＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩとは一緒に同時リフォールディングされた。コアＩＧａｌ  Ｔ１酵素の添加後、酵素活性を試験した。基質は、ＩＦα−２ｂおよび２０Ｋ−Ｐｅｇ−ＣＭＰ−ＮＡＮであった。
【図２８】図２８は、ＩＰＴＧによる誘導前後の大腸菌における天然ＳｉａＡタンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。
【図２９】図２９は、ＩＰＴＧによる誘導前後の大腸菌におけるＭＢＰ−ＳｉａＡ融合タンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。
【図３０】図３０は、完全長ウシＧａｌＴ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２７）を示している。
【図３１】図３１は、ＧａｌＴ１変異体ならびに対照タンパク質であるＧａｌＴ１（４０）（Ｓ９６Ａ＋Ｃ３４２Ｔ）を図示している。
【図３２】図３２は、リフォールディングされ精製されたＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）タンパク質の酵素アッセイの結果を示している。該アッセイでは、供与体基質として、ＵＤＰ−Ｇａｌ（ウリジン５’−ジホスホガラクトース）を用いて、ＬＮＴ２（ラクト−Ｎ−トリオース−２）からＬＮｎＴ（ラクト−Ｎ−ネオテトラオース）への変換を測定した。
【図３３−１】図３３は、ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）およびＱａｓｂａのＧａｌＴ１とも称される対照タンパク質、ＧａｌＴ１（４０）（Ｓ９６Ａ＋Ｃ３４２Ｔ）のＲＮアーゼＢリモデリングアッセイを示している。
【図３３−２】（図３３−１の続き）
【図３３−３】（図３３−２の続き）
【図３３−４】（図３３−３の続き）
【図３４】図３４は、リフォールディングされ、精製されたＭＢＰ−ＧａｌＴ１（Ｄ７０）タンパク質または哺乳動物細胞系において発現されたウシＧａｌＴ１タンパク質の可溶形態であるＮＳＯ  ＧａｌＴ１を用いたＲＮアーゼＢのグリコシル化動態を示している。
【図３５】図３５は、ＭＢＰ−ＧｎＴ１融合タンパク質の図解を示し、また、切断、例えば、Δ１０３またはΔ３５、およびＣｙｓ１２１Ｓｅｒ変異（上側）を示している。図の下側には、完全長ヒトＧｎＴ１タンパク質（配列番号１）が示されている。
【図３６】図３６は、右枠に、リフォールディングされたＭＢＰ−ＧｎＴ１融合タンパク質：ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ３５）Ｃ１２１Ａ、ＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ１０３）Ｒ１２０Ａ＋Ｃ１２１Ｈ、およびＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ１０３）Ｃ１２１Ａを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。左枠は、異なる時点におけるリフォールディングされたＭＢＰ−ＧｎＴ１（Ｄ３５）Ｃ１２１Ａの２つの異なるバッチ（Ａ１およびＡ２）のＧｎＴ１活性を示している。
【図３７】図３７は、ブタＳＴ３Ｇａｌ１の完全長配列（配列番号２８）を示している。
【図３８】図３８は、Ａ）ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＴＩ（配列番号２９）に関する完全長アミノ酸配列、およびＢ）ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃＴＩ（配列番号３０）に関する完全長アミノ酸配列、ならびにＣ）天然マウスタンパク質の残基３２で開始するマウスＳＴ６ＧａｌＮＡｃＴＩタンパク質の配列（配列番号３１）を示している。
【図３９】図３９は、多数の好ましいヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ切断変異体の図解を示している。
【図４０】図４０は、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ切断変異体などのＭＢＰ融合タンパク質の図解を示している。
【図４１】図４１は、ヒトのコア１  ＧａｌＴ１タンパク質の完全長配列（配列番号３２）を示している。
【図４２】図４２は、２種のショウジョウバエのコア１  ＧａｌＴ１タンパク質の配列（配列番号３３および３４）を示している。
【図４３−１】図４３は、リフォールディングを増強させるためにグリコシルトランスフェラーゼに融合できる代表的な細菌ＭＢＰタンパク質の配列を示している。Ａ．エルシニアＭＢＰ（配列番号３５）；Ｂ．大腸菌ＭＢＰ（配列番号３６）；Ｃ．パイロコッカスフリオサスＭＢＰ（配列番号３７）；Ｄ．テルモコッカスマリチムＭＢＰ（配列番号３８）；およびＥ．Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ  ＭＢＰ（配列番号３９）。
【図４３−２】図４３は、リフォールディングを増強させるためにグリコシルトランスフェラーゼに融合できる代表的な細菌ＭＢＰタンパク質の配列を示している。Ｆ．コレラ菌ＭＢＰ（配列番号４０）。
【図４４】図４４は、ヒトＧａｌＮＡｃＴ１タンパク質（配列番号４１）およびＧａｌＮＡｃＴ２タンパク質（配列番号１９）のアラインメントを示している。アラインメントプログラムは、配列の挿入または欠失を考慮するため、システイン残基のナンバリングは、記載されたテキストおよび公表された配列と同じではない。ｈＧａｌＮＡｃ−Ｔ２システイン２２７（公表）はアラインメントの２３５位に相当し、システイン２２９（公表）はアラインメントの２３７である。ｈＧａｌＮＡｃ−Ｔ１システインは２１２（公表）であるが、システイン２３５（アラインメント）に相当し、２１４（公表）はシステイン２３７（アラインメント）に相当する。関連システイン残基は大型書体で示されている。コンセンサスペプチドは、配列番号４２〜６５である。
【図４５】図４５は、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質における対システイン残基および不対システイン残基の位置を示している。単一システイン置換および二重システイン置換、例えば、Ｃ２８０Ｓ、Ｃ３６２Ｓ、Ｃ３６２Ｔ、（Ｃ２８０Ｓ＋Ｃ３６２Ｓ）、および（Ｃ２８０Ｓ＋Ｃ３６２Ｔ）もまた、示されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2007535309.tif 000120
【図２】
2007535309.tif 000121
【図３】
2007535309.tif 000122
【図４】
2007535309.tif 000123
【図５】
2007535309.tif 000124
【図６】
2007535309.tif 000125
【図７】
2007535309.tif 000126
【図８】
2007535309.tif 000127
【図９】
2007535309.tif 000128
【図１０】
2007535309.tif 000129
【図１１】
2007535309.tif 000130
【図１２】
2007535309.tif 000131
【図１３−１】
2007535309.tif 000132
【図１３−２】
2007535309.tif 000133
【図１３−３】
2007535309.tif 000134
【図１４−１】
2007535309.tif 000135
【図１４−２】
2007535309.tif 000136
【図１４−３】
2007535309.tif 000137
【図１５】
2007535309.tif 000138
【図１６】
2007535309.tif 000139
【図１７】
2007535309.tif 000140
【図１８Ａ】
2007535309.tif 000141
【図１８Ｂ】
2007535309.tif 000142
【図１９】
2007535309.tif 000143
【図２０】
2007535309.tif 000144
【図２１】
2007535309.tif 000145
【図２２】
2007535309.tif 000146
【図２３】
2007535309.tif 000147
【図２４】
2007535309.tif 000148
【図２５】
2007535309.tif 000149
【図２６】
2007535309.tif 000150
【図２７】
2007535309.tif 000151
【図２８】
2007535309.tif 000152
【図２９】
2007535309.tif 000153
【図３０】
2007535309.tif 000154
【図３１】
2007535309.tif 000155
【図３２】
2007535309.tif 000156
【図３３−１】
2007535309.tif 000157
【図３３−２】
2007535309.tif 000158
【図３３−３】
2007535309.tif 000159
【図３３−４】
2007535309.tif 000160
【図３４】
2007535309.tif 000161
【図３５】
2007535309.tif 000162
【図３６】
2007535309.tif 000163
【図３７】
2007535309.tif 000164
【図３８】
2007535309.tif 000165
【図３９】
2007535309.tif 000166
【図４０】
2007535309.tif 000167
【図４１】
2007535309.tif 000168
【図４２】
2007535309.tif 000169
【図４３−１】
2007535309.tif 000170
【図４３−２】
2007535309.tif 000171
【図４４】
2007535309.tif 000172
【図４５】
2007535309.tif 000173
【国際調査報告】
2007535309.tif 000174
2007535309.tif 000175
2007535309.tif 000176
2007535309.tif 000177