(57)【要約】  異種ポリペプチドが細菌細胞壁を標的とするための方法および組成物を提供する。本発明は、発現カセットを含む乳酸杆菌属細菌を提供する。この発現カセットは、シグナル配列と生物活性ポリペプチドとをコードするポリヌクレオチドと作動可能に結合するプロモーターを含み、この生物活性ポリペプチドは、異種カルボキシル末端細胞壁標的領域と結合し、この異種カルボキシル末端細胞壁標的領域は、以下の順番で以下：細胞壁関連配列；ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）；および疎水性配列を含む。
2007503845.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現カセットを含む乳酸杆菌属細菌であって、該発現カセットはシグナル配列および生物活性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に結合するプロモーターを含み、該生物活性ポリペプチドは異種カルボキシル末端細胞壁標的領域と結合し、該異種カルボキシル末端細胞壁標的領域は、以下の順番で、以下：
細胞壁関連配列；
ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）；および
疎水性配列、
を含む、乳酸杆菌属細菌。
【請求項２】
前記細胞壁関連配列が、少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項３】
前記細胞壁関連配列が、少なくとも２００個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項４】
前記異種カルボキシル末端細胞壁標的領域が、該領域のカルボキシル末端において、荷電した配列をさらに含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項５】
前記乳酸杆菌属細菌が、膣コロニー形成株である、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項６】
前記乳酸杆菌属細菌が、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、およびＬ．ｃａｓｅｉからなる群より選択される、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項７】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＳＧを含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項８】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＡＧを含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項９】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＴＧを含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１０】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＴＡを含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１１】
前記細胞壁標的領域が、配列番号７を含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１２】
前記細胞壁標的領域が、配列番号８を含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１３】
前記生物活性ポリペプチドが、細菌の細胞壁において発現される、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１４】
前記生物活性ポリペプチドが、１０アミノ酸と６００アミノ酸との間である、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１５】
前記生物活性タンパク質が病原体と接触する場合、該生物活性タンパク質が該病原体と結合する、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１６】
前記病原体が、細菌病原体である、請求項１５に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１７】
前記病原体が、真菌病原体である、請求項１５に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１８】
前記病原体が、ウイルス病原体である、請求項１５に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１９】
前記ウイルス病原体が、ＨＩＶである、請求項１８に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２０】
前記生物活性タンパク質が、ＣＤ４またはＣＤ４のＨＩＶ結合フラグメントである、請求項１９に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２１】
前記生物活性タンパク質が、２Ｄ−ＣＤ４である、請求項１９に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２２】
前記生物活性タンパク質が、シアノビリン−Ｎまたはシアノビリン−Ｎのウイルス結合フラグメントである、請求項１８に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２３】
前記ウイルス病原体が、単純疱疹ウイルスである、請求項１８に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２４】
前記生物活性タンパク質が、単純疱疹ウイルス侵入媒体Ｃ（ＨｖｅＣ）であるか、またはＨｖｅＣのウイルス結合フラグメントである、請求項１８に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２５】
前記生物活性ポリペプチドが、乳酸杆菌属細菌から放出される、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２６】
前記生物活性ポリペプチドが、乳酸杆菌属細菌の細胞壁に固定される、請求項４に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２７】
乳酸杆菌属細菌の細胞壁中において生物活性ポリペプチドを発現する方法であって、該方法は、以下：
発現カセットを含む乳酸杆菌属細菌を提供する工程であって、該発現カセットは、シグナル配列および生物活性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に結合するプロモーターを含み、該生物活性ポリペプチドは異種カルボキシル末端細胞壁標的領域と結合し、そして該異種カルボキシル末端細胞壁標的領域は、以下の順番で、以下：
細胞壁関連配列；
ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）；および
疎水性配列
を含む、工程；ならびに
該ポリペプチドの発現を誘導するための条件下で細菌を培養する工程であって、該工程により、乳酸杆菌属細菌の細胞壁中で生物活性ポリペプチドを発現する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記細胞壁関連配列が、少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞壁関連配列が、少なくとも２００個のアミノ酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記異種カルボキシル末端細胞壁標的領域が、該領域のカルボキシル末端において、荷電した配列をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記提供する工程が、前記発現カセットを前記細菌中に輸送する工程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＳＧを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＡＧを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＴＧを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＴＡを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞壁標的領域が、配列番号７を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞壁標的領域が、配列番号８を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞壁標的領域が、少なくとも２００個のアミノ酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記乳酸杆菌属細菌が、膣コロニー形成株である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記乳酸杆菌属細菌が、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、およびＬ．ｃａｓｅｉからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物活性ポリペプチドが、１０アミノ酸と６００アミノ酸との間である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】
前記生物活性タンパク質が病原体と接触する場合、該生物活性タンパク質が該病原体に結合する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
前記病原体が、細菌病原体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記病原体が、真菌病原体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記病原体が、ウイルス病原体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルス病原体が、ＨＩＶである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物活性タンパク質が、ＣＤ４またはＣＤ４のＨＩＶ結合フラグメントである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記生物活性タンパク質が、２Ｄ−ＣＤ４である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記生物活性タンパク質が、シアノビリン−Ｎまたはシアノビリン−Ｎのウイルス結合フラグメントである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記ウイルス病原体が、単純疱疹ウイルスである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記生物活性タンパク質が、単純疱疹ウイルス侵入媒体Ｃ（ＨｖｅＣ）またはＨｖｅＣのウイルス結合フラグメントである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記生物活性ポリペプチドが、乳酸杆菌属細菌から放出される、請求項２７に記載の方法。
【請求項５３】
前記生物活性ポリペプチドが、乳酸杆菌属細菌の細胞壁に固定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項５４】
生物活性タンパク質を哺乳動物粘膜表面に提供する方法であって、該方法は、以下：
粘膜表面と、異種カルボキシル末端細胞壁標的領域に結合された生物活性ポリペプチドに結合されたシグナル配列を発現するように組み換えで変化した乳酸杆菌属細菌とを、接触させる工程を包含し、該異種カルボキシル末端細胞壁標的領域は、以下の順番で、以下：
細胞壁関連配列；
ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）；および
疎水性配列
を含み、
ここで、該生物活性ポリペプチドは、該粘膜表面から収集されたサンプル中で、検出可能な量で発現される、方法。
【請求項５５】
前記細胞壁関連配列が、少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞壁関連配列が、少なくとも２００個のアミノ酸を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記異種カルボキシル末端細胞壁標的領域が、該領域のカルボキシル末端において、荷電した配列をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記乳酸杆菌属細菌が、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、およびＬ．ｃａｓｅｉからなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記粘膜表面が、膣内に存在する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
前記粘膜表面が、胃腸管内に存在する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記接触させる工程が、前記乳酸杆菌属細菌を経口投与する工程を包含する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記接触させる工程が、前記乳酸杆菌属細菌を膣投与する工程を包含する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
前記接触工程が、前記乳酸杆菌属細菌を直腸投与する工程を包含する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
シグナル配列および生物活性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合するプロモーターを含む発現カセットであって、ここで、該生物活性ポリペプチドが、配列番号７または配列番号８に結合する、発現カセット。
【請求項６５】
請求項６４に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は２００３年１月２９日出願の米国特許仮出願番号６０／４４３，６１９に対する優先権の利益を請求する。米国特許仮出願番号６０／４４３，６１９は、全ての目的でその全体を参考として援用する。
【０００２】
（連邦政府後援研究開発下で行われた発明に対する権利に関する記載）
本発明はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより認可された補助金番号２  Ｒ４４  ＡＩ４６２０３−０２の下で政府支援により行われた。政府は、本発明に一部権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
グラム陽性菌におけるペプチドグリカンとの共有結合を介するタンパク質の表面発現は、独自の識別信号とソルターゼ依存性機構とに関与する（Ｍａｚｍａｎｉａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７６０−７６３（１９９９））。最も良く研究されたシステムの一つは、Ｍ６構造タンパク質をコードするＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのｅｍｍ６遺伝子である（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：１６０３−１６０５（１９９０））。Ｍ６タンパク質は、標示（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）細胞壁識別信号、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ（ＬＰＸＴＧ）モチーフ、それに続く疎水性アミノ酸伸長、および最後に荷電残基を含む配列（ＫＲＫＥＥＮ）を有し、これは細胞表面保持信号として働く。これらの細胞壁識別モチーフは、Ｓｔａｐｈｌｙｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ、ならびに乳酸杆菌属を含む他のグラム陽性菌において同定されている（ＮａｖａｒｒｅおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：１７４−２２９（１９９９））が、ヒトの膣でコロニーを形成する乳酸杆菌属種においては同定されていない。
【０００４】
全てのヒトの粘膜には自然に細菌がコロニーを形成している（Ｔａｎｎｏｃｋ、Ｃｌｉｎ．Ｒｅｖ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：２３１−５３（２００２））。最近の科学的証明は、これらの細菌が体の細胞および組織と緊密に相互作用し、天然の生物学的プロセスを調節しているという事実を示した。この粘膜微生物叢がまた、ヒトの細胞および組織に影響する多くの疾病に実質的に寄与することが次第に明らかとなっている。
【０００５】
一般に、膣および消化管内で乳酸桿菌および関連する細菌による微生物叢が優位になることは、良い健康状態と関連している（Ｒｅｄｏｎｄｏ−Ｌｏｐｅｚら、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２：８５６−７２（１９９０）；Ｔａｎｎｏｃｋ、Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：２３１−５３（２００２））。乳酸桿菌の天然株は、これらの場所内で健康な微生物叢を保ち、感染を防止するために、「プロバイオティクス」として長年投与されてきた。これらの「健康な細菌」が細菌、ウイルスおよび真菌等の病原性微生物と競合し、病気に関連する病因の発生と進行を制限するということが十分に確立されている。それにもかかわらず、この微生物叢は脆弱であり、健康な微生物叢の自然な代謝回転、および破壊を伴う動的環境が、日和見感染の発症と関連付けられている。結果として、疾患を予防するかまたは処置する手段として、微生物叢の完全性および天然の性質を維持、またはさらには増強するためのアプローチは、生物医学界が切望するところである。
【０００６】
粘膜微生物叢は粘膜表面に影響する多くの局所疾患に寄与する。例えば、ＨＩＶおよび他の性感染病原体は膣粘膜を迂回しなければならない。さらに、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患の病因は、破壊された粘膜微生物叢と宿主の細胞および組織との間の不適切な相互作用から生じ得る。粘膜叢内の細菌の性質を調節する手段は、これらの疾患ばかりでなく、粘膜表面に影響する関連する病状の予防または処置の助けになり得る。生物活性タンパク質がこれらおよび他の微生物の細胞壁を標的とすることは、この様な疾患の処置に役立ち得る。
【０００７】
本発明はこれらおよび他の問題に取り組む。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、発現カセットを含む乳酸杆菌属細菌を提供する。この発現カセットは、シグナル配列と生物活性ポリペプチドとをコードするポリヌクレオチドと作動可能に結合するプロモーターを含み、この生物活性ポリペプチドは、異種カルボキシル末端細胞壁標的領域と結合し、この異種カルボキシル末端細胞壁標的領域は、以下の順番で以下：細胞壁関連配列；ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）；および疎水性配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、上記細胞壁関連配列は、少なくとも５０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁関連配列は、少なくとも２００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、上記異種カルボキシル末端細胞壁標的領域は、その領域のカルボキシル末端に荷電した配列をさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、乳酸杆菌属細菌は、膣コロニー形成株である。いくつかの実施形態では、この細菌は、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｃａｓｅｉおよびＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓからなる群より選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、上記細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＳＧを含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＡＧを含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＴＧを有する。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＴＡを有する。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、配列番号８を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、上記生物活性ポリペプチドは、細菌の細胞壁で発現される。いくつかの実施形態では、この生物活性ポリペプチドは、１０アミノ酸〜６００アミノ酸の間である。いくつかの実施形態では、上記生物活性ポリペプチドが病原体と接触した場合、この生物活性ポリペプチドが病原体と結合する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、上記病原体は、細菌病原体である。いくつかの実施形態では、この病原体は、真菌病原体である。いくつかの実施形態では、この病原体は、ウイルス病原体である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、上記ウイルス病原体は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。いくつかの実施形態では、上記生物活性タンパク質は、ＣＤ４またはＣＤ４のＨＩＶ結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、上記生物活性タンパク質は、２Ｄ−ＣＤ４である。いくつかの実施形態では、上記生物活性タンパク質は、シアノビリン−Ｎ（ＣＶ−Ｎ）またはＣＶ−Ｎのウイルス結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、上記ウイルス病原体は、単純疱疹ウイルスである。いくつかの実施形態では、上記生物活性タンパク質は、単純疱疹ウイルス侵入媒体Ｃ（ＨｖｅＣ）またはＨｖｅＣのウイルス結合フラグメントである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、上記生物活性ポリペプチドは、乳酸杆菌属細菌から放出される。いくつかの実施形態では、この生物活性ポリペプチドは乳酸杆菌属細菌の細胞壁に固定される。
【００１６】
本発明はまた、乳酸杆菌属細菌の細胞壁中で生物活性ポリペプチドを発現する方法を提供する。いくつかの実施形態では、その方法は以下を包含する：発現カセットを含む乳酸杆菌属細菌を提供する工程であって、この発現カセットはシグナル配列および生物活性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に結合するプロモーターを含み、この生物活性ポリペプチドは、異種カルボキシル末端細胞壁標的領域と結合し、この異種カルボキシル末端細胞壁標的領域は、以下の順番で、以下：細胞壁関連配列；ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）；および疎水性配列を含む工程；ならびにこのポリペプチドの発現を誘導する条件下で細菌を培養する工程であって、該工程により、乳酸杆菌属細菌の細胞壁中で生物活性ポリペプチドを発現する工程、を有する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、上記細胞壁関連配列は、少なくとも５０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁関連配列は、少なくとも２００個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、上記異種カルボキシル末端細胞壁標的領域は、この領域のカルボキシル末端に荷電した配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記提供する工程は、上記発現カセットを上記細菌中に輸送する工程を包含する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、上記細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＳＧを含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＡＧを含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＴＧを含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＴＡを有する。いくつかの実施形態では、細胞壁標的領域は配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は配列番号８を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、少なくとも２００個のアミノ酸を有する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、上記細菌は、膣コロニー形成株である。いくつかの実施形態では、この細菌はＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｃａｓｅｉおよびＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、上記生物活性ポリペプチドは１０〜６００アミノ酸の間である。いくつかの実施形態では、上記生物活性ポリペプチドが病原体と接触した場合、この生物活性ポリペプチドが病原体に結合する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、上記病原体は、細菌病原体である。いくつかの実施形態では、この病原体は、真菌病原体である。いくつかの実施形態では、この病原体は、ウイルス病原体である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、上記ウイルス病原体は、ＨＩＶである。いくつかの実施形態では、上記生物活性タンパク質は、ＣＤ４またはＣＤ４のＨＩＶ結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、この生物活性タンパク質は、２Ｄ−ＣＤ４である。いくつかの実施形態では、上記生物活性タンパク質は、シアノビリン−Ｎまたはシアノビリン−Ｎのウイルス結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、上記ウイルス病原体は、単純疱疹ウイルスである。いくつかの実施形態では、上記生物活性タンパク質は、単純疱疹ウイルス侵入媒体Ｃ（ＨｖｅＣ）またはＨｖｅＣのウイルス結合フラグメントである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、上記生物活性ポリペプチドは、乳酸杆菌属細菌から放出される。いくつかの実施形態では、この生物活性ポリペプチドは、乳酸杆菌属細菌の細胞壁に固定される。
【００２４】
本発明はまた、生物活性タンパク質を哺乳動物粘膜表面に提供する方法を提供する。いくつかの実施形態では、その方法は、粘膜表面と、異種カルボキシル末端細胞壁標的領域に結合された生物活性ポリペプチドに結合されたシグナル配列を発現するように組み換えで変化した乳酸杆菌属細菌とを、接触させる工程を包含し、この異種カルボキシル末端細胞壁標的領域は、以下の順番で以下：細胞壁関連配列；ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）；および疎水性配列を含み、ここで、この生物活性ポリペプチドが、粘膜表面から収集されたサンプル中で、検出可能な量で発現される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、上記細胞壁関連配列は、少なくとも５０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁関連配列は、少なくとも２００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、上記異種カルボキシル末端細胞壁標的領域は、カルボキシル末端領域に荷電した配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記乳酸杆菌属細菌は、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｃａｓｅｉおよびＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓからなる群より選択される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、上記粘膜表面は、膣内に存在する。いくつかの実施形態では、この粘膜表面は、消化管内に存在する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、上記接触させる工程は乳酸杆菌属細菌を経口投与する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この接触させる工程は、乳酸杆菌属細菌を膣投与する工程を包含する。いくつかの実施形態では、この接触させる工程は乳酸杆菌属細菌を直腸投与する工程を包含する。
【００２８】
本発明は、シグナル配列と生物活性ポリペプチドとをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーターを含む発現カセットを提供し、ここで、この生物活性ポリペプチドは、異種カルボキシル末端細胞壁標的領域と結合し、この異種カルボキシル末端細胞壁標的領域が以下の順番で以下：細胞壁関連配列；ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）；および疎水性配列を含む。いくつかの実施形態では、上記細胞壁関連配列は、少なくとも５０個のアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、この細胞壁関連配列は、少なくとも２００個のアミノ酸を有する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、上記異種カルボキシル末端細胞壁標的領域はさらに領域のカルボキシル末端に荷電配列を有する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、細胞壁標的領域はアミノ酸配列ＬＰＱＳＧを含む。いくつかの実施形態では、細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＡＧを含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＴＧを含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＴＡを含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は配列番号８を含む。いくつかの実施形態では、上記生物活性ポリペプチドは１０〜６００アミノ酸の間である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、上記生物活性タンパク質が病原体と接触した場合、この生物活性タンパク質は病原体と結合する。いくつかの実施形態では、上記病原体は、細菌病原体である。いくつかの実施形態では、この病原体は、真菌病原体である。いくつかの実施形態では、病原体はウイルス病原体である。いくつかの実施形態では、このウイルス病原体は、ＨＩＶである。
【００３２】
いくつかの実施形態では、上記生物活性タンパク質は、ＣＤ４またはＣＤ４のＨＩＶ結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、上記生物活性タンパク質は、２Ｄ−ＣＤ４である。いくつかの実施形態では、この生物活性タンパク質は、シアノビリン−Ｎまたはシアノビリン−Ｎのウイルス結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、この生物活性タンパク質は、単純疱疹ウイルス侵入媒体Ｃ（ＨｅｖＣ）またはＨｖｅＣのウイルス結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、上記細胞壁標的領域は、乳酸杆菌属中で機能する。
【００３３】
本発明はまた、異種カルボキシル末端細胞壁標的領域に結合した生物活性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合するプロモーターを含む発現カセットを有するベクターであって、この異種カルボキシル末端細胞壁標的領域が、以下の順番で、以下：細胞壁関連配列；ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）；および疎水性配列を含むベクターを、提供する。
【００３４】
（定義）
「生物活性タンパク質」とは、天然の細胞の内または外でアミノ酸配列の生物活性を有する（すなわち分子機構に関与し得る）アミノ酸配列をいう。タンパク質の活性としては例えばその免疫原性、触媒活性、結合親和性等が挙げられる。ポリペプチドワクチンは用語「生物活性タンパク質」に包含される。代表的には、このアミノ酸配列は、天然細胞の内または外でアミノ酸配列により形成される３次元構造を形成する。
【００３５】
「２Ｄ  ＣＤ４」とは、ヒトＣＤ４の最初の約１８３アミノ酸をいう（Ａｒｔｈｏｓら、Ｃｅｌｌ、１９８９、５７：４６９−８１（１９８９））。ＣＤ４は、成熟ヘルパーＴ細胞および未成熟胸腺細胞、ならびに単球およびマクロファージ上に見出される、細胞表面糖タンパク質である。２Ｄ−ＣＤ４は、インタクトタンパク質と同じ親和性でＨＩＶ−１  ｇｐ１２０と結合し、ｇｐ１２０に対する結合部位を含む。ＣＤ４は、アミノ末端細胞外ドメイン（アミノ酸残基１〜３７１）、膜貫通領域（３７２〜３９５）、および細胞質内末端（ｔａｉｌ）テール（３９６〜４３３）を含む。
【００３６】
「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子（単数または複数）で実質的にコードされるポリペプチド、または分析物（抗原）と特異的に結合して、その分析物を認識するそれらのフラグメントをいう。認められた免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεに分類され、それぞれ免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。
【００３７】
例示的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、４量体を含む。各４量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、各対は１個の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１個の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のＮ−末端は、抗原認識を主として担う、約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００３８】
抗体は、例えば、インタクト免疫グロブリン、または様々なペプチダーゼでの消化により生成される、性質が十分特徴付けられた多くのフラグメントとして存在する。従って、例えば、ペプシンはヒンジ領域中のジスルフィド結合下で抗体を消化し、Ｆ（ａｂ’）２（それ自体がジスルフィド結合でＶＨ−ＣＨ１に連結した軽鎖であるＦａｂの２量体である）を生成する。Ｆ（ａｂ’）２は、緩やかな条件下で還元されてヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し得、それによって、Ｆ（ａｂ’）２ダイマーをＦａｂ’モノマーに変える。Ｆａｂ’モノマーは、本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｐａｕｌ（編）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９３）参照）。様々な抗体フラグメントが、インタクト抗体の消化の観点から定義されているが、当業者は、このようなフラグメントを、化学的に、または組み換えＤＮＡ方法論を利用して、新たに合成し得ることを理解する。従って、本明細書で用いる場合、抗体という用語には、抗体全体の改変により生成されるか、または組み換えＤＮＡ方法論を用いて新たに合成されるかのいずれかである抗体フラグメント（例えば１本鎖ＦＶ）も含まれる。
【００３９】
「単離された」という用語は核酸またはタンパク質に応用する場合、核酸またはタンパク質が本質的に自然状態で結合する他の細胞成分を含まないことを意味する。均一な状態が好ましいが、乾燥状態でも水溶液でも良い。代表的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー等の分析化学技術を用いて、純度および均一性が測定される。調製物中に存在する優勢な種であるタンパク質が、実質的に精製される。特に、単離される遺伝子は、その遺伝子に隣接し、目的の遺伝子以外のタンパク質をコードする、オープンリーディングフレームから、分離される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲル中で本質的に１個のバンドを生じることを意味する。特に、この用語は、核酸またはタンパク質が、少なくとも純度８５％であり、より好ましくは少なくとも純度９５％であり、最も好ましくは少なくとも純度９９％であることを意味する。
【００４０】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および１本鎖または２本鎖の形態のそれらのポリマーをいう。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含する。特に示さない限り、ある特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたその変異体（例えば縮重コドン置換）、および相補配列、ならびに明示された配列もまた暗黙のうちに含む。具体的には、１つ以上の選択された１個の（または全ての）選ばれたコドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより、縮重コドン置換が行われ得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。「核酸」という用語は「ポリヌクレオチド」と互換的に使用される。
【００４１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で用いる場合、この用語は、全長タンパク質（すなわち抗原）を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここでこのアミノ酸残基は共有ペプチド結合で連結している。
【００４２】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体をいう。天然に存在するアミノ酸は遺伝子暗号でコードされるものならびに、その後改変されるアミノ酸（たとえばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合するα炭素）を有する化合物（例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をいう。このようなアナログは、改変されたＲ基（例えばノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保有している。「アミノ酸模倣体」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能する化合物をいう。
【００４３】
本明細書では、アミノ酸は、一般的に知られた３文字記号で表され得か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号で表され得る。ヌクレオチドも同ように、その一般に受け入れられている１文字表記で表され得る。
【００４４】
以下に述べるように、最大一致のために整列させた場合に、２つの配列中でヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列がそれぞれ同じであるならば、２個の核酸配列またはポリペプチドは「同一」であると言われる。２個以上の核酸またはポリペプチド配列に関して、用語「同一」または「同一性」パーセントとは、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いるか、または手動整列および目視検査によって測定して比較ウインドウ上での最大一致のために比較し整列させた場合、同一であるか、あるいは特定のパーセントの同一なアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列または部分配列をいう。配列同一性パーセントをタンパク質またはペプチドに関連して用いる場合、同一でない残基の位置が、多くの場合保存的アミノ酸置換により異なり、その場所では、アミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば荷電または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、従って分子の機能的性質を変化させないことが認識される。保存的置換で配列が異なる場合、配列同一性パーセントを上方に調節して置換の保守的性質について補正鏑し得る。この調整を行うための手段は当業者に公知である。代表的に、これは保存的置換を完全なミスマッチでなく部分ミスマッチとして採点し、それによって配列同一性パーセントを増加させる工程に関する。従って、例えば、同一アミノ酸に得点１を与え、非保存的置換に得点ゼロを与える場合、保存的置換には０と１の間の得点が与えられる。保存的置換の採点は、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）で実行されるＭｅｙｅｒおよびＭｉｌｌｅｒ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムに従って計算される。
【００４５】
２個の核酸またはポリペプチドについての「実質的に同一」という語句は、参照配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列または部分配列をいう。または、同一性パーセントは４０％〜１００％の任意の整数であり得る。より好ましい実施形態としては、以下に述べる標準パラメーターを用いるＢＬＡＳＴ等の本明細書に記載のプログラムを用いて、参照配列（例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８、またはそのフラグメント）と比較して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が挙げられる。
【００４６】
配列比較のため、代表的には、１つの配列が参照配列として働き、それと試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要あれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用することができるか、または別なパラメーターを指定することができる。次いでプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する配列比較アルゴリズムが試験配列についての現在の配列同一性パーセントを計算する。
【００４７】
本明細書で用いる場合、「比較窓」には、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０個からなる群より選ばれた連続位置数のいずれか一つのセグメントに対する参照が含まれ、その中で２つの配列を最適に整列した後、一つの配列が、連続位置が、同数の参照配列と比較され得る。比較のための配列の整列法は当該分野で周知である。比較のために最適な配列の整列は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ中におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または手動整列および目視検査により行われ得る。
【００４８】
配列同一性パーセントと配列類似性の決定に適したアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公に入手可能である。このアルゴリズムには、最初にクエリ（ｑｕｅｒｙ）配列中の長さＷのショートワードを同定することによってハイスコア配列対（ＨＳＰ）を同定する工程を包含する。データベース配列中の同じ長さのワードと整列した場合、ＨＳＰは、ある正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たすかのいずれかである。Ｔは、近隣ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａｌｔｓｈｕｌら、前出）。最初の近接ワードヒットは、それらのワードを含むより長いＨＰＳを見出すための検索を開始するシードとして働く。累積整列スコアが増加し得る限り、ワードヒットは各配列に沿って両方の方向に延長される。累積整列スコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下した場合、１つ以上の負スコア残基整列の蓄積のために累積スコアがゼロ以下になった場合、またはいずれかの配列の末端に達した場合、各方向へのワードヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは整列の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）  １１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）参照）整列（Ｂ）  ５０、期待値（Ｅ）  １０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００４９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の基準の１つは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率を示す最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、その核酸は参照配列に類似すると考えられる。
【００５０】
例えば細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関して用いられる場合、「組み換え」または「組み換えで変化された」という用語は、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸もしくは異種タンパク質の導入によってかまたはネイティブ核酸もしくはネイティブタンパク質の変化によって改変されたか、あるいは細胞がそのようにして改変された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組み換え細胞は、その細胞のネイティブ（非組み換え）形態に見出されない遺伝子を発現するか、さもなければ異常発現するか、発現量が少ないか、またはまったく発現しないネイティブ遺伝子を発現する。
【００５１】
核酸またはポリペプチドの部分に関して使用される「異種」という用語は、核酸またはポリペプチドが天然で相互に同じ関係で見出されない２個以上の部分配列を有することを示す。例えば、その核酸は、代表的には組み換えで製造され、新しい機能性核酸を生成するように配置された無関係の遺伝子由来の２個以上の配列（例えばある起源由来のプロモーターおよび別の起源由来のコード領域）を有する。同ように、異種タンパク質とは、タンパク質が天然で相互に同じ関係で見出されない２以上の部分配列を含むことを示す（例えば融合タンパク質）。
【００５２】
「発現カセット」とは、宿主細胞内における特定の核酸の転写が可能である一連の特定核酸要素を有する、組み換えまたは合成で生成される核酸である。発現カセットはプラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメントの一部であり得る。代表的には、発現ベクターとしては、プロモーターに作動可能に結合して転写されるべき核酸が挙げられる。
【００５３】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．はじめに）
本発明は乳酸杆菌属等のグラム陽性菌の細胞壁上に異種ポリペプチドを発現するための新規なモチーフおよび方法を提供する。本発明のモチーフを目的のタンパク質と融合され、次いで細菌中の融合タンパク質として発現され、その結果、融合タンパク質が、細胞壁の標的となるか、埋め込まれるか、および／または表面に提示されるか、あるいは生物学的に活性であり、かつ安定な融合タンパク質が、細胞外マトリックスに放出され得る。
【００５４】
モチーフは、例えば、膣を含むヒト粘膜でコロニーを形成する乳酸杆菌属細菌の細胞壁上にタンパク質を発現するために有用である。例示的な粘膜細菌としては、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉおよびＬ．ｃａｓｅｉ等の乳酸杆菌属種が挙げられる。
【００５５】
（ＩＩ．細胞壁標的領域）
乳酸杆菌属等のグラム陽性菌の細胞壁に共有結合された目的のポリペプチドを発現し、標的とするために、細胞壁標的領域は、目的の異種ポリペプチドにＣ−末端で結合している。膣関連乳酸桿菌および他の乳酸桿菌において異種タンパク質を表面提示し得る細胞壁標的領域は、４つの部分：細胞壁関連領域、ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）配列、および疎水性配列から、代表的にはこの順番で構成される。必要に応じて細胞壁標的領域は、カルボキシル末端またはその近くに荷電領域を含む。この荷電領域は、細胞膜中で移動停止配列として作用し、それによって培地中への放出を阻止する。もちろん、アンカー配列がタンパク質の残りの部分から切り取られた場合、やはり培地中への放出が生じ得る。
【００５６】
（Ａ．細胞壁関連領域）
細胞壁関連領域は、ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）識別シグナルに先行する。細胞壁関連領域の長さは変化し得る。細胞壁関連領域は代表的には、４０アミノ酸と１，０００アミノ酸との間である。いくつかの実施形態では、細胞壁関連領域は、少なくとも約３０、５０、８０、１００、１５０および２００アミノ酸または、それより大きい。いくつかの実施形態では、細胞壁関連領域は約５００、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００またはそれ未満のアミノ酸を有する。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉでは、ｐＯＳＥＬ２６８中のＣ−末端細胞壁識別シグナルと融合する一縦列反復を含む９５アミノ酸伸長（実施例に記載）により、ＣＤ４の表面提示が可能になる。しかしながら、フィブロネクチン結合タンパク質の約９０アミノ酸がＳ．ｃａｒｎｏｓｕｓ中で想定されている（ＳｔｒａｕｓｓおよびＧｏｔｚ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１：４９１−５００（１９９６））一方で、ペプチドマッピングに基づいてＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＭ６タンパク質中の約５０アミノ酸長が同定された（ＰａｎｃｈｏｌｉおよびＦｉｓｃｈｅｔｔｉ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２６１８−２６２４（１９８８））。従って、約５０アミノ酸以下の配列が、乳酸杆菌属中で機能性であり得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、細胞壁関連領域は疎水性である。いくつかの実施形態では、細胞壁関連領域は長さと配列が変化し得る不完全縦列反復を含む。例えば、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  Ｃ３７０の細胞壁関連領域は、２．５個の縦列反復を含む。しかし、縦列反復は、細胞壁関連領域に起こり得るが、必要ではない。例えばＣ１４の細胞壁関連領域は、反復を含まない。機能的には、細胞壁関連領域は、ペプチドグリカン層と相互作用して、それを貫通（ｓｐａｎ）する。従って、その領域は細胞壁貫通（ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメインまたは細胞壁付着ドメインとも呼ばれ、膜結合ソルターゼで固定されるタンパク質と細胞壁識別シグナルとの間のスペーサーとして作用する。
【００５８】
本発明は、Ｃ３７０配列：
【００５９】
【化１】
2007503845.tif 000003
と実質的に同一の細胞壁関連領域を提供する。ある場合は、細胞壁関連領域は少なくともＣ３７０配列の約４０、５０、７５、９０、１００、１２０、１５０、１７５、２００アミノ酸フラグメントを有する。例えば、活性細胞壁関連フラグメントは、以下の配列：
【００６０】
【化２】
2007503845.tif 000004
を有し得る。Ｃ３７０配列（配列番号４）は、７５個の荷電アミノ酸残基（Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ）を含み、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ富化配列が欠失している。
【００６１】
いくつかの実施形態では、細胞壁関連領域は、実質的にＣ１４配列：
【００６２】
【化３】
2007503845.tif 000005
と同一である。ある場合は、細胞壁関連領域は、Ｃ３７０配列の少なくとも約４０、５０、７５、９０、１００、１２０、１５０、１７５、２００アミノ酸フラグメントを含む。配列番号６は、５１個の荷電アミノ酸残基（Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ）を含む。
【００６３】
ある場合は、細胞壁関連領域は、乳酸杆菌属以外の細菌、または膣と関連しない乳酸杆菌属株由来である。
【００６４】
（Ｂ．ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ））
配列ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）は乳酸杆菌属の膣関連株において細胞壁局在化シグナルとして作用する。モチーフＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）の少なくとも１個のコピーは細胞壁標的領域内にある。モチーフ中の括弧はその位置の別なアミノ酸を示す（例えばＬＰＱＳＧ、ＬＰＱＡＧ、ＬＰＱＴＧ、ＬＰＱＳＡ、ＬＰＱＡＡ、ＬＰＱＴＡ）。
【００６５】
（Ｃ．疎水性配列）
細胞壁に固定されるポリペプチドのカルボキシル末端は細菌膜（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を貫通するように機能する疎水性領域を含む。疎水性領域は少なくとも約５０％、ある実施形態では少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の疎水性アミノ酸を含む。天然起源疎水性アミノ酸にはアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンが含まれる。グリシン、トレオニンおよびセリンを含む、より疎水性の少ないアミノ酸もこれらの配列の一部を構成し得る（例えばＰａｌｌｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：９７−１０１（２００１）参照）。ソルターゼ様タンパク質の可変ＬＰＸＴＧ含有基質の間で疎水性配列は一般に長さが約１０〜約３０アミノ酸、場合によっては１３〜２４アミノ酸の間である（Ｐａｌｌｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：９７−１０１（２００１））。典型的な疎水性配列には例えばＣ１４中のＶ１７４０ＧＩＬＧＬＡＩＡＴＶＧＳＬＬＧＬＧＬＶ１７５８、およびＣ３７０中のＰ１８７７ＬＴＡＩＧＩＧＬＭＡＬＧＡＧＩＦＡ１８９４が含まれる。
【００６６】
または、グラム陽性細菌由来の任意の細胞壁アンカータンパク質の疎水性領域を用いることができる。他の疎水性配列には例えば米国特許第５，８２１，０８８号の図１に記載のもの、またはそれと実質的に同一の配列が含まれる。さらに別な配列がＰａｌｌｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：９７−１００（２００１）の表２にも示されている。
【００６７】
（Ｄ．荷電配列）
荷電領域が細胞壁標的タンパク質のカルボキシル末端、代表的には疎水性膜貫通領域の直後に任意に存在し得る。カルボキシル末端荷電領域の存在によりポリペプチドが膜に固定され、その結果膜から解離し培地中へ漏れ出すタンパク質の量が大いに減少する。荷電領域は少なくとも４０％、ある実施形態では少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の荷電アミノ酸を有する。天然起源荷電アミノ酸にはアルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。荷電配列は例えば長さで２〜２０アミノ酸残基の間、ある実施形態では４〜１２または５〜１１アミノ酸の間である。典型的な荷電配列には例えばＣ１９１中のＫ９６９ＫＲＫＥＤ９７４、Ｃ１４中のＲ１７６０ＫＫＲＱＫ１７６５およびＣ３７０中のＫ１８９５ＫＫＲＫＤＤＥＡ１９０３が含まれる。
【００６８】
または、グラム陽性細菌由来の任意の細胞壁アンカータンパク質の荷電領域を使用できる。別な荷電配列には例えば米国特許第５，８２１，０８８号の図１に記載のもの、およびそれと実質的に同一の配列が含まれる。また別な配列がＰａｌｌｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：９７−１００（２００１）の表２にも示される。
【００６９】
（ＩＩＩ．組み換え技術）
（Ａ．分子生物学法）
本発明は組み換え遺伝子学の分野における慣用的な技術に依存している。本発明において使用する一般的な方法を開示する基本的なテキストにはＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編集、１９９４）が含まれる。
【００７０】
核酸では、サイズはキロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）で与えられる。これらはアガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸、または公開されたＤＮＡ配列から見積もられる。タンパク質では、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質のサイズはゲル電気泳動、配列決定されたタンパク質、導かれたアミノ酸配列、または公開されたタンパク質配列から見積もられる。
【００７１】
市販されていないオリゴヌクレオチドを、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２（１９８１）に最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って、Ｖａｎ  Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載の様に自動合成装置を用いて化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製はＰｅａｒｓｏｎおよびＲｅａｎｉｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７−１４９（１９８３）に記載の通りに天然アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換ＨＰＬＣによって行われる。
【００７２】
クローン化された遺伝子、および合成オリゴヌクレオチドの配列を、例えばＷａｌｌａｃｅら、Ｇｅｎｅ  １６：２１−２６（１９８１）の二重鎖テンプレートの配列決定のための鎖停止法を用いてクローニング後に確認することができる。
【００７３】
（Ｂ．所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を単離するためのクローニング法）
一般に、目的とするタンパク質をコードする核酸を、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから作製したＤＮＡライブラリーからクローニングする。特定の配列の位置をオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることにより決定することができるが、その配列は本明細書に開示した配列または当該分野で公知の配列から導かれ、ＰＣＲプライマーの参考となり、遺伝子特異的プローブを単離するために適当な領域を規定する。または、配列が発現ライブラリー中にクローニングされる場合は、本明細書に開示されるポリペプチドを含め目的のポリペプチドに対して作製された抗血清または精製抗体を用いて発現組み換えタンパク質を免疫学的に検出し得る。
【００７４】
ゲノムおよびｃＤＮＡライブラリーを作製およびスクリーニングする方法は当業者に周知である（例えばＧｕｌｂｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ  ２５：２６３−２６９（１９８３）；ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６：１８０−１８２（１９７７）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ、前出参照）。目的のタンパク質を発現する細胞はｃＤＮＡライブラリーを作製するための有用なＲＮＡ源である。
【００７５】
簡単に言えば、ｃＤＮＡライブラリーを作製するため、ｍＲＮＡに富んだ起源を選ばなければならない。次いでｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、組み換えベクター中に連結し、増殖、スクリーニングおよびクローニングのために組み換え宿主中に形質導入する。ゲノムライブラリーでは、ＤＮＡを適当な組織または細胞から抽出し、機械的に剪断するか酵素的に消化して好ましくは約５〜１００ｋｂの断片を生成する。次いで断片を望ましくないサイズのものから濃度勾配遠心で分離し、バクテリオファージラムダベクター中に構築させる。これらのベクターおよびファージはインビトロでパッケージングされ、組み換えファージをプラクーハイブリダイゼーションで分析する。コロニーハイブリダイゼーションはＧｒｕｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７２：３９６１−３９６５（１９７５）に一般的に記載されている様に行われる。
【００７６】
別な方法では、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用と、ｍＲＮＡまたはＤＮＡテンプレート上でのポリメラーゼ延長とが組み合わされる。このポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法では、目的のタンパク質をコードする核酸がｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから直接増幅される。プライマー中には制限エンドヌクレアーゼ部位が組み込まれ得る。ポリメラーゼ連鎖反応法、または他のインビトロ増幅法も、例えば特定のタンパク質をコードする核酸のクローニングおよびそのタンパク質の発現、生理学試料中で本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在を検出し、核酸の配列を決定する、または他の目的ためのプローブとして使用される核酸の合成に有用であり得る（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号参照）。ＰＣＲ反応によって増幅された遺伝子はアガロースゲルから精製され、そして適当なベクター中にクローン化され得る。
【００７７】
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を組織または細胞試料から同定するための適当なプライマーおよびプローブを、当該分野で記載の配列から導くことができる。ＰＣＲの概説としてはＩｎｎｉｓら、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０）参照。
【００７８】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、乳酸杆菌属中に形質転換する前に中間ベクターを使用してクローニングすることができる。これらの中間ベクターは代表的には原核生物ベクターまたはシャトルベクターである。
【００７９】
（Ｃ．形質転換技術）
適当な細菌宿主株を、例えばその形質転換能、異種タンパク質発現能、および／または粘膜表面でのコロニー形成能で選択される。細菌宿主を塩化ルビジュウム法またはエレクトロポーレーション等の標準技術を用いて形質転換受容性にする（例えばＷｅｉら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．２１：９７−１０９（１９９５）参照）。
【００８０】
エレクトロポーレーションによるＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉの形質転換を、例えばＬｕｃｈａｎｓｋｙら（Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．７４：３２９３−３３０２（１９９１））；Ｃｈａｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１００：１１６７２−１１６７７（２００３））に規定される様な標準法を改変して行うことができる。簡単に言えば、新しく接種したＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉをブロス中で培養する（例えば３７℃、５％ＣＯ２でＯＤ６００が０．６〜０．７まで）。細菌細胞を収集し、洗浄し、スクロースとＭｇＣｌ２の冷溶液（例えば４℃）中に再懸濁する。コンピテント細胞を次いでＤＮＡと混合し、冷却したギャップキュベット中にいれ、エレクトロポーレーションする。その後、選択試薬以外の抗生物質を含む選択寒天プレート上に接種する前に、予め加熱したブロス中で細胞を回収する（例えば３７℃で約２時間）。
【００８１】
（Ｄ．発現）
本発明の発現カセットは、本発明のポリペプチドの発現と位置決めを制御するための様々な成分を含み得る。例えば、発現カセットはプロモーター要素、シグナル配列をコードする配列、目的のポリペプチドに対するコード配列、およびアンカー配列を含むことができる。
【００８２】
異種ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現は構成的であり得る（例えばＰ５９（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｏｓｓｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：３１４２−３１４９（１９９２））もしくはＰ２３（Ｅｌｌｉｏｔら、Ｃｅｌｌ、３６：２１１−２１９（１９８４））プロモーター、またはより高い強度を有する乳酸杆菌属由来の天然プロモーターを用いて）。または、発現は誘導性プロモーターの制御下に行うことができる。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓアミラーゼ（Ｗｅｉｃｋｅｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３６５６−３６６６（１９８９））またはキシロース（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ、１８１：７１−７６（１９９６））プロモーターの他、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓナイシンプロモーター（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２７６３−２７６９（１９９８））を誘導性発現を推進するために使用することができる。さらに、酸またはアルカリ誘導プロモーターを使用することもできる。例えば、膣の比較的酸性の条件下で活性なプロモーターを使用し得る。または、精子に反応する膣内の変化で誘導されるプロモーターも使用し得る。例えば、精子の導入の結果である膣のアルカリ条件の増大に反応して発現を誘導するために、アルカリ誘導プロモーターを使用する。
【００８３】
様々なシグナル配列がポリペプチドの発現を膜、細胞外空間または細胞壁に導くことが知られている（例えばペプチドグリカンへの共有結合付着により）。例示的なシグナル配列にはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓのα−アミラーゼ由来のシグナル配列（ＧｉｒａｕｄおよびＣｕｎｙ、Ｇｅｎｅ、１９８：１４９−１５７（１９９７））またはＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓのＳ−層遺伝子（ｃｂｓＡ）由来のシグナル配列（例えばＭＫＫＮＬＲＩＶＳＡＡＡＡＡＬＬＡＶＡＰＶＡＡまたはＭＫＫＮＬＲＩＶＳＡＡＡＡＡＬＬＡＶＡＴＶＳＡ）が含まれる。シグナル配列は代表的にはポリペプチドのアミノ末端に位置している。
【００８４】
ポリペプチドの正確な位置と折り畳みを標準法を用いて決定し得る。例えば、細菌を緩衝液（例えば２５％スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁し、次いで細胞壁分解酵素（例えばリゾチームおよびムタノリシン）で処理し、次いで得られたプロトプラストを分画遠心法で分離することにより、乳酸杆菌属の細胞壁富化画分を得ることができる。画分をウエスタンブロッティングでスクリーニングして細胞壁内の発現を確認し得る。
【００８５】
発現したポリペプチドの折り畳みと生物活性も、標準法を用いて決定し得る。例えば、天然の折り畳みポリペプチド特異性抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイを用いてポリペプチドの折り畳みと３次元構造を確認することができる。生物活性アッセイも、ポリペプチドの活性に応じて当然変化する。例えば、ウイルスタンパク質に結合するポリペプチドでは、標準結合アッセイを用いて発現したポリペプチドのウイルスタンパク質結合能を試験することができる。抗炎症分子では、発現したポリペプチドの炎症促進する物質との拮抗能をアッセイすることができる。
【００８６】
宿主細胞中の発現を改善するための遺伝子を合成する場合、そのコドン利用頻度を宿主細胞の好ましいコドン利用頻度に近づける様に遺伝子を設計することが望ましい。合成遺伝子に対する好ましいコドン利用頻度の、宿主細胞が使用する頻度からの偏差率が、１個のコドンの利用頻度の宿主細胞の利用頻度からの偏差率をまず測定し、次いでコドン全体の平均偏差を得て計算される。
【００８７】
特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、特定の宿主のコドン利用と一致する様に変化させることができる。例えば、乳酸杆菌属のコドン利用を使用して、本発明のポリペプチドをコードし、好ましい乳酸杆菌属のコドンを有するポリヌクレオチドを誘導することができる。宿主細胞が提示する好ましいコドンの利用頻度を、宿主細胞が発現する多数の遺伝子中の好ましいコドンの利用頻度を平均して計算することができる。この解析は宿主細胞で高度に発現する遺伝子に限定することが好ましい。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：９２９−９３６（１９９４））は様々な乳酸杆菌属種が示す高度発現遺伝子によるコドン利用頻度を提供している。コドン利用表はインターネットを通じても入手できる。
【００８８】
（ＩＶ．本発明のタンパク質）
本発明のポリペプチド、例えば本発明の細胞壁標的領域に融合する生物活性ポリペプチドは、任意のポリペプチドであり得る。代表的には、本発明のポリペプチドはポリペプチドの生物活性を考慮した条件下で発現する。ある実施形態では、発現ポリペプチド中にジスルフィド結合が存在する。ある実施形態では、ポリペプチドの生物活性にジスルフィド結合が必要である。
【００８９】
本発明のポリペプチドは任意のサイズの分子量であり得る。例えば、ポリペプチドは約１００〜２００，０００ダルトンの間、約５００〜４０，０００ダルトンの間、約５００〜１０，０００ダルトンの間、約１０，０００〜５０，０００ダルトンの間、または約５０，０００〜２００，０００ダルトンの間であり得る。
【００９０】
病原体感染を予防または治療するために本発明の方法に従って使用し得るポリペプチドクラスの例には、例えば抗体、抗体断片、または１本鎖抗原を含め抗ウイルスポリペプチド、抗菌ポリペプチド、抗真菌ポリペプチド、およびウイルス、細菌または真菌に結合するポリペプチドが含まれる。
【００９１】
ある場合は、本発明のポリペプチドはウイルスまたは細菌病原体が結合して宿主を感染させるレセプターである。または、ポリペプチドは例えば病原体の複製、生存率、侵入またはさもなければ病原体への結合を阻害する薬剤である。ある実施形態では、本発明のポリペプチドは性的に伝播する病原体、および膣から伝播、または膣へ伝播する他の病原体に結合またはそれらを阻害する。例えば、ウイルスは感染のために標的細胞表面上のレセプターに結合することが必要であるので、ウイルスとその宿主レセプターとの相互作用を阻害することを目的とする戦略は、感染防止に有効である。
【００９２】
典型的な抗ウイルスポリペプチドには例えばＣＤ４またはそのウイルス結合断片（例えば２Ｄ−ＣＤ４：例えばＯｒｌｏｆｆら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１４６１−１４７１（１９９３））、３量体モチーフを経由して生成する安定なＣＤ４の３量体（例えばＹａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：４６３４−４６４２（２００２））、ＣＤ４−Ｉｇ融合タンパク質１２量体（Ａｒｔｈｏｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１１４５６−１１４６４（２００２））、α−デフェンシン（例えばＺｈａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８：９９５−１０００（２００２））、１７ｂｍＡｂの１本鎖可変領域と融合したＣＤ４（Ｄｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：２８５９−２８６５（２００３））、シアノビリン−Ｎまたは改変体（例えばＢｏｌｍｓｔｅｄｔら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９：９４９−９５４（２００１）；Ｍｏｒｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２６：４２−４９（２００２））、単純疱疹ウイルス侵入メディエーターＣ（ＨｖｅＣ：例えばＣｏｃｃｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５：１５７００−１５７０５（１９９８））、およびＩＣＡＭ−１が含まれる。他の実施形態には例えばウイルスレセプターまたはヘパリンまたはヘパリン様分子、樹状細胞特異性ＩＣＡＭ−３グラビングノンインテグリン（例えばＧｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、Ｃｅｌｌ、１００：５８７−５９７（２０００）；Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４：２１６３−２１６６（２００１））を含むマンノース結合レクチン、抗ＨＳＶ−１  ｇｐ１２０  １本鎖抗体（例えばＭａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：７８８９−７８９３（１９９３）；ＭｃＨｕｇｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３４３８３−３４３９０（２００２））、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を認識するヒトｍＡｂ  ｂ１２（例えばＳａｐｈｉｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：１１５５−１１５９（２００１））、またはＨＳＶに結合する中和抗体を含む同様な特異性を有する他の分子（例えばＢｕｒｉｏｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：３５５−３５９（１９９４））、およびＨＩＶ−１侵入阻害タンパク質（例えばＲｏｏｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９１：８８４−８８８（２００１）；Ｓｉａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９：１４６６４−１４６６９（２００２））が含まれる。
【００９３】
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）による感染は頚部癌の発症に関連する因子である（例えばｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８４：９−１３（１９９１）；Ｓｔａｎｌｅｙ、Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．１５：６６３−６７６（２００１））。従って、ＨＰＶを阻害する、またはそれに結合する分子の存在は、ＨＰＶ感染と頚部癌の発症の両方の阻止に有用である。典型的な抗ＨＰＶポリペプチドには例えばヒト乳頭腫ウイルス１６型タンパク質Ｅ６またはＥ７に結合する中和抗体（例えばＭａｎｎｈａｒｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０：６４８３−６４９５（２０００））、ＨＰＶ−結合タンパク質、またはウイルス指向免疫反応を誘発するために使用し得るＨＰＶタンパク質が含まれる。
【００９４】
ウイルスまたは細菌等の病原体に結合する能力を、少なくとも数個の方法で本発明の細菌に授け得る。その第１はヒトライノウイルスＨＲＶ（主要グループ）に対するＩＣＡＭ−１およびＨＩＶに対するＣＤ４等の、ウイルスに対する正常な宿主レセプターを細菌の表面に発現させることである。これらは正常なヒトタンパク質であり、これらの遺伝子の完全な配列の多くが決定され、データベースＧｅｎＢａｎｋに保存されている。
第２の方法は、ポリオウイルス上のＶＰ４またはＨＩＶ上のｇｐ１２０等のウイルス表面上の保存性抗原決定基に結合する抗体断片または他のポリペプチドを細菌表面に発現することである。本質的に任意の抗原に特異性のある抗体断片（およびペプチド）を、例えばファージ提示ライブラリー（Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０（１９９２））から選ぶことができる。抗体を任意の病原体上のエピトープまたは病原体と結合するエピトープの他、以下に議論するエピトープ等の他のエピトープを指向させることができる。
【００９５】
第３の方法には、細菌表面上の炭水化物結合ポリペプチドの発現が含まれる。これらの分子の例にはヘパリン結合ポリペプチド、またはマンノース結合ポリペプチドが含まれる。
【００９６】
抗細菌ポリペプチドには尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉに結合する、またはその生育もしくはそれによるコロニー形成を阻害するポリペプチドが含まれる。典型的な抗細菌ポリペプチドには例えばグラム陰性細菌に対する透過性増大タンパク質（Ｌｅｖｙ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ、１１：１５９−１６７（２００２））、哺乳動物抗微生物ペプチド、β−デフェンシン（ＧａｒｚおよびＬｅｈｒｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６６：１９１−２０５（１９９５））、バクテリオシン（例えばＬｏｅｆｆｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４：２１７０−２１７２（２００１））、および細菌に特異的に結合する抗体が含まれる。
【００９７】
抗真菌ポリペプチドにはＣａｎｄｉｄａ等の真菌に結合する、またはその生育もしくはそれによるコロニー形成を阻害するポリペプチドが含まれる。
【００９８】
本発明に記載の有用な生物活性ポリペプチドのさらに別な例には抗炎症分子、成長因子、成長因子に結合するかまたはそれに拮抗する分子、治療用酵素、抗体（例えば抗体断片または１本鎖抗体を含む）、および子宮頚部癌を含む癌を阻害するかまたは治療する分子等の治療用ポリペプチドまたは薬剤が含まれる。数多くの他の治療活性ポリペプチドを容易に引用することができるので、これらの例は制限的であることを意図するものではない。
【００９９】
抗炎症分子には例えばＴＮＦまたはＩＬ−８に特異的に結合する抗体または他の分子が含まれる。他の例示的な抗炎症分子には、ＩＬ−１０およびＩＬ−１１が含まれる。
【０１００】
本発明で有用な成長因子には例えばＫＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦおよびＴＧＦ−β等の局所組織修復に係わる因子、またはこれらの分子の拮抗剤が含まれる。
【０１０１】
治療用酵素には例えば一酸化窒素（ＮＯ）シンターゼが含まれる。
【０１０２】
抗癌性分子にはアポトーシスを誘導する分子、ｐ５３等の細胞周期を調節する分子、または癌特異性エピトープを標的とするワクチンとして作用する分子が含まれる。
【０１０３】
本発明で有用なワクチン分子にはウイルス、細菌または真菌に対する免疫反応を誘起するポリペプチドが含まれる。典型的なウイルスワクチンは例えばＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ−２または天然痘に対する反応を誘発する。典型的な抗原にはＨＳＶ−２の糖タンパク質Ｄ、ヒト乳頭腫ウイルスのタンパク質Ｅ６およびＥ７、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの主要外膜タンパク質（ＫｉｍおよびＤｅＭａｒｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：４２９−４３６（２００１））、およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのアスパルチルプロテアーゼ（Ｄｅ  Ｂｅｒｎａｒｄｉｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：２７２５−２７２９（２００２））；尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉのＦｉｍＨ（Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：６０７−６１１（１９９７））；腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉのＩｒｏＮ（Ｒｕｓｓｏら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：７１６４−９（２００３））が含まれる。
【０１０４】
（Ｖ．送達）
遺伝子組み換え細菌の所望の粘膜表面への送達は、その領域への近づき易さと局部条件に依存する。例えば、遺伝子組み換え細菌を食塩水、または膣粘膜上へ送達するための発泡体の中に入れ得る。発泡体には例えば１種以上の疎水性に修飾したセルロース誘導体またはキトサン等の多糖が含まれ得る。セルロース誘導体には例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース等が含まれる。キトサンには例えば以下のキトサン塩：乳酸キトサン、サリシル酸キトサン、ピロリドンカルボン酸キトサン、イタコン酸キトサン、ナイアシン酸キトサン、蟻酸キトサン、酢酸キトサン、没食子酸キトサン、グルタミン酸キトサン、マロン酸キトサン、アスパルギン酸キトサン、グリコール酸キトサン、および４級アミン置換キトサンおよびその塩などが含まれる。発泡体にはまた水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、グリセリン、グリセロール、プロピレングリコールおよびソルビトール等の他の成分も含まれ得る。殺精子剤は細菌組成物に任意に含まれる。発泡体および発泡体送達ビヒクルのさらに別な例は例えば米国特許第５，５９５，９８０号および同第４，９２２，９１８号に記載されている。
【０１０５】
または、細菌を坐薬またはペッサリーとして送達することもできる。例えば米国特許第４，３２２，３９９号を参照のこと。ある実施形態では、本発明の細菌は溶解性で選ばれた可溶性ポリマー材料および／または複合炭水化物材料で製造された可溶性要素として送達されるが、それは使用前は実質的に固形物のままであり、使用中にヒトの体温と水分で溶解して所望の徐放および投与量で薬剤物質が放出される。例えば米国特許第５，５２９，７８２号参照。細菌はまた、米国特許第４，６９３，７０５号に記載の様にスポンジ送達ビヒクル中で送達される。
【０１０６】
ある実施形態では、細菌は経口投与される。例えば、約１０８個の乳酸桿菌の毎日の用量を、正常な泌尿生殖器微生物相を回復するために使用し得る。例えばＲｅｉｄら、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：３７−４１（２００１）参照。
【０１０７】
ある実施形態では、遺伝子組み換え細菌の粘膜表面への投与には定期的な繰り返しが必要である：最適投薬間隔は日常的に決定されるが、粘膜環境と細菌株によって異なる。投薬間隔は１日１回から２〜４週ごとに１回まで変化し得る。
【０１０８】
天然型乳酸杆菌属を形質転換するためにバクテリオファージが導入される場合、選択したバクテリオファージの核酸を操作して、異種遺伝子がバクテリオファージ被覆タンパク質をコードする遺伝子を置換し、バクテリオファージを複製不能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）とすることができる。これらの組み換えＤＮＡ分子を機能性バクテリオファージタンパク質を含む細胞溶解物に加えることにより、異種遺伝子を含む機能性バクテリオファージ粒子を組み立てることができる。次いでこれらの複製不能バクテリオファージ粒子を所望の粘膜表面上に導入し、選択した細菌叢に感染させることができる。粘膜表面への典型的な投薬量は１０８〜１０１２ＰＦＵ／ｍｌであると思われる。処置表面に対する溶液の割合は、粘膜表面平方センチあたり約０．１〜１．０ｍｌである必要がある。ビヒクルは細菌に対する上記ビヒクルと同様である。
【実施例】
【０１０９】
以下の実施例は説明のために提供されるものであり、本発明を制限するものではない。
【０１１０】
ほとんどのウイルスは鼻、口、消化器または泌尿生殖器等の粘膜を通して感染する。これらの粘膜には、健康な女性の膣腔内のＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉおよびＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓを含む膨大な数の共生細菌が自然にコロニーを形成している。細菌表面に固定された生物活性ウイルス結合タンパク質を発現する遺伝子組み換えＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉが粘膜内でウイルスを捕捉し、従ってウイルスが下層の上皮細胞やリンパ球に接近することを妨害するものと、本発明者らは予想している。これらの捕捉されたウイルスは感染を中止し、そして／または乳酸桿菌が分泌する乳酸および過酸化水素等の抗ウイルス化合物で局所的に不活性化され、その結果感染性ウイルス粒子の数をかなり減少する。従って、遺伝子組み換え乳酸杆菌属がＨＩＶ結合リガンド、２−ドメインＣＤ４およびシアノビリンＮを高濃度で表面に発現するためのモジュール発現アプローチを行った。１０〜６００アミノ酸のポリペプチドが効果的に細胞壁に固定されて提示されることは、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉの天然タンパク質由来のタンパク質ドメインへ融合することにより達成され得ることを本発明者らは見出した。
【０１１１】
Ｍ６タンパク質は標示細胞壁識別シグナルであるＬＰＸＴＧモチーフと、その後に一続きの疎水性アミノ酸、最後に臨界細胞表面保持シグナルとなる荷電残基（ＫＲＫＥＥＮ）を有する。２個の良く性質が分かったＳ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓのＭ６タンパク質（ｅｍｍ６）またはＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉのＰｒｔＰプロテアーゼ由来の細胞壁アンカーモチーフ、またはＳ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓのＭ６タンパク質由来のアンカーモチーフ、さらにＭ６タンパク質の天然配列由来のＮ−末端１００アミノ酸伸長部（ＣＷＡ１００）を利用して、Ｌ．ｊｅｍｓｅｎｉｉ表面にＣＤ４を発現するためのプラスミドベースのモジュールアプローチを本発明者らは最初に試みた。Ｍ６タンパク質と異なり、ＰｒｔＰに対する局在化シグナルはＬＰＫＴＡである。大量の２Ｄ  ＣＤ４が馴化培地中に放出されたが、馴化培地中のタンパク質、および細胞壁アンカーとしてのＭ６またはＰｒｔＰまたはＣＷＡ１００を有する修飾Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の細胞壁またはプロトプラスト会合タンパク質プールのウエスタン分析により、検出し得る細胞壁関連２Ｄ  ＣＤ４は見出されなかった。フローサイトメトリー分析でも、陽性の表面露出２Ｄ  ＣＤ４は同定されなかった。
【０１１２】
（推定細胞壁アンカー配列の同定）
Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉのゲノム配列のデータベース検索により、推定細胞壁アンカーモチーフを有する約３０個のコンティグが同定された。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのウエブサイトで利用し得る非冗長データベース中のより詳細な配列相同性検索に基づき、本発明者らはＣ１４，Ｃ１９１およびＣ３７０と名付けられる３個の配列を選択した。それらはそれぞれ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍのＲ１ｐ（Ｔｕｒｎｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：５８５５−５８６３（２００３））、またはストレプトコッカル表面タンパク質のファミリー（Ｗａｓｔｆｅｌｔら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７１：１８８９２−１８８９７（１９９６））であるＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ中の粘膜結合タンパク質（ＲｏｏｓおよびＪｏｎｓｓｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８：４３３−４４２（２００２））、およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中の細胞壁アンカータンパク質（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｅｓｐｌａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：４７７２−４７７８（２０００））と低い配列類似性（２３〜２７％の同一性）を共有していた。３個の配列の全ては疎水性領域に先行するＬＰＱＴＧ局在化シグナルと、荷電Ｃ末端テイルを有する（図１参照）。これらの特徴はグラム陽性細菌中のソルターゼ認識Ｃ末端細胞壁アンカー配列間に共通である（ＮａｖａｒｒｅおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｖ．６３：１７４−２２９（１９９９））。グラム陽性細菌中に見出されるＬＰＸＴＧ細胞アンカーモチーフ間で、これらのＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉタンパク質中ではわずか７％のＬＰＱＴＧ配列の一致が見出された。Ｃ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０タンパク質はすべて細胞壁アンカー領域に隣接したタンデム反復ドメインを含み、既知の細胞壁アンカータンパク質中にしばしば存在する構造上の特徴である（ＮａｖａｒｒｅおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｖ．６３：１７４−２２９（１９９９））。Ｃ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０の配列を図２Ａ〜Ｃに示す。
【０１１３】
（推定細胞壁アンカー配列のエピトープタグ化）
Ｃ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０が異種融合タンパク質をＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉの細胞壁に固定する効率を決定するため、本発明者らは約２００個のアミノ酸を直接的にＬＰＱＴＧ局在化シグナルのＮ−末端に選んだ。しばしば細胞壁アンカータンパク質中の細胞壁関連（ＣＷＡ）ドメインと定義されるこの領域は、基質配列の保持または延長、従って膜会合ソルターゼによる適切なタンパク質分解性の切断を促進し得る。免疫検出を促進するため、ｃ−Ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）をｐＯＳＥＬ２３９、２４０および２４１それぞれのＣ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０のＣＷＡ２００領域のＮ−末端と融合した。ウエスタンおよびフローサイトメトリー分析を用いて、ｃ−Ｍｙｃタグ化タンパク質が生成され、細胞壁を標的としたかどうかを検討した。ウエスタン分析を行うため、ｐＯＳＥＬ１７５、２３９、２４０および２４１を有する修飾Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉをＭＲＳおよびＲｏｇｏｓａＳＬブロスの両方の中で対数期まで生育させた。次いでβ１−４グリコシル結合を成熟ペプチドグリカン中のグリカン鎖のＭｕｒＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ間で切断するＮ−アセチルムラミダーゼであるムタノリシンで細胞壁を消化した。代表的には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー後に細胞壁アンカータンパク質は大きなスペクトルの断片として移動する（Ｐｅｒｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、１６２４１−１６２４８（２００２））。ｐＯＳＥＬ２３９（Ｃ１４アンカー）および２４１（Ｃ３７０アンカー）を有する細菌細胞中の細胞壁富化画分中のタンパク質のウエスタン分析から、細菌細胞をＭＲＳおよびＲｏｇｏｓａブロスの両方の中で培養した場合、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でｃ−Ｍｙｃタンパク質のラダーを示した（図３）。これらのパターンはｐＯＳＥＬ２４０（Ｃ１９１アンカー）を有する細菌細胞中の細胞壁富化画分中には見られず、試験したＬＰＱＴＧ含有配列間で異なったアンカー効率を示している。
【０１１４】
ウエスタンブロット陽性ｃ−ＭｙｃエピトープがｐＯＳＥＬ２３９および２４１を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ細胞中で表面に露出しているかどうかを決定するため、コントロールプラスミドｐＯＳＥＬ１７５を有する細菌細胞を参照して抗ｃ−Ｍｙｃ抗体結合のフローサイトメトリー分析を行った。ｐＯＳＥＬ２３９を有する細菌細胞中の平均蛍光強度はコントロールプラスミドｐＯＳＥＬ１７５を有する細菌細胞中の平均蛍光強度と区別できなかったが、ｐＯＳＥＬ２４１を有する細菌細胞中では１６０倍に増加した。Ｃ１４配列のｃ−ＭｙｃタグＣＷＡ２００領域の表面接近性に立体傷害が影響するかどうかは不明であるが、本発明者らの分析によりＣ３７０配列のＣＷＡ２００領域のＮ−末端における表面露出が明らかに示された。この結果は、異種ペプチドとタンパク質とを細菌細胞表面に共有結合で固定するためにＣ３７０のこの特定の領域を利用し得ることを示している。
【０１１５】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉの細菌表面上の２Ｄ  ＣＤ４の表面発現）
２Ｄ  ＣＤ４がＣ１４のＣＷＡ２００領域およびＣ３７０配列を経由して表面発現し得るかどうかを決定するため、本発明者らはウエスタンブロットとフローサイトメトリー分析を行った。ウエスタン分析を行うため、ｐＯＳＥＬ１７５（コントロールプラスミド）、６５１（細胞アンカーのない２Ｄ  ＣＤ４プラスミド；Ｃｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１００：１１６７２−１１６７７（２００３））、２３７（Ｃ１４アンカーに融合した２Ｄ  ＣＤ４）、２４２（Ｃ１９１アンカーに融合した２Ｄ  ＣＤ４）、および２４９（Ｃ３７０アンカーに融合した２Ｄ  ＣＤ４）を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ細胞中のタンパク質を細胞壁消化により細胞壁富化画分に分画した。細胞壁富化タンパク質画分では、ｐＯＳＥＬ２３７および２４９を有する細菌細胞の双方でより大きな分子量の種のスペクトルがｐＡｂ  Ｔ４−４に対し免疫反応性であったが、ｐＯＳＥＬ６５１ではそうでなかった（図４）。ムタノリシン消化後に観測されるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のこの様な梯子状パターンは、他のグラム陽性細菌の細菌表面由来の既知の細胞壁アンカータンパク質のパターンと類似している（Ｐｅｒｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１６２４１−１６２４８（２００２））。
【０１１６】
２Ｄ  ＣＤ４が細胞表面上に発現するかどうかを決定するため、ｐＯＳＥＬ１７５、６５１、２３７および２４９を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ株をｐＡｂ  Ｔ４−４で探索し、次いでフローサイトメトリー分析により抗体結合を分析した。期待された通り、この分析によりｐＯＳＥＬ１７５および６５１を有する細菌細胞における平均蛍光強度が区別できないことが明らかとなった。対照的に、ｐＯＳＥＬ１７５および６５１に対してｐＯＳＥＬ２３７および２４９を有する細菌細胞で平均蛍光強度の有意な増加が見られ、２Ｄ  ＣＤ４分子の共有結合および表面露出に結果であると思われる（図５Ａ）。上記アプローチをさらに確認するため、乳酸杆菌属の好ましいコドンを含む再コードしたシアノビリンＮ（ＣＶ−Ｎ）遺伝子を２Ｄ  ＣＤ４の成功した固定に用いたものと同じＣ末端アンカードメインに融合した。ＣＶ−Ｎ発現プラスミドを有する修飾Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉのフローサイトメトリー分析により、ｐＯＳＥＬ１７５を有する細菌に対し平均蛍光強度で３０〜５０倍の増加が検出された（データ示さず）。静電相互作用により抗体反応性ＣＶ−Ｎ分子が表面会合している可能性を調べるため、修飾細菌を５Ｍ  ＬｉＣｌで抽出した。フローサイトメトリー分析により、ＰＢＳおよび２％ＦＢＳで洗浄した細胞を参照して、ＣＶ−Ｎ発現プラスミドを有する塩抽出Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の平均蛍光強度が区別できないことが明らかとなった。表面提示ＣＶ−Ｎ分子の５Ｍ  ＬｉＣｌ抽出に対する耐性は、細菌表面上の共有結合で固定されたタンパク質の挙動を反映している。
【０１１７】
表面に発現した２Ｄ  ＣＤ４分子がｇｐ１２０を結合するために正しい折り畳み立体構造をとっているか否かを確認するため、ｐＯＳＥＬ１７５、２３７および２４９を有する細菌細胞を立体構造依存性エピトープを認識する抗ＣＤ４モノクローナル抗体Ｓｉｍ．４で探索した後に、さらにＦＡＣＳ分析を行った。ｐＯＳＥＬ１７５と比較してｐＯＳＥＬ２３７および２４９を有する細菌細胞中で平均蛍光強度の有意な増加が見られ、２Ｄ  ＣＤ４が機能的な形でＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉの表面に発現していることが示された（図５Ｂ）。
【０１１８】
モジュール発現アプローチにおいて２Ｄ  ＣＤ４の表面発現が修飾Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の天然細胞表面会合タンパク質の発現に影響するかどうかは不明であった。この問題を解決するため、ｐＯＳＥＬ１７５および２３７を有する細菌細胞をスルホＮＨＳ−ビオチンで探索し、次いで細胞表面会合タンパク質を０．４％ＳＤＳおよび１０ｍＭ  ＤＴＴを含む緩衝液中で抽出した。アルカリホスファターゼ共役アビジンによるプローブ後のＳＤＳ抽出タンパク質のウエスタン分析により、見かけの分子量１０〜２００ｋＤａ未満のビオチン化タンパク質のスペクトルが検出された。ｐＯＳＥＬ２３７を有する細菌細胞中の可溶性ビオチン化タンパク質種のパターンは、ｐＯＳＥＬ１７５中のものと類似しており、天然の細胞表面発現が影響を受けていないことを示している。
【０１１９】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の広いｐＨ範囲における活性２Ｄ  ＣＤ４の表面発現）
乳酸菌が自然にコロニーを形成している場合、ヒト膣腔のｐＨはほとんどの女性で３．６〜４．５の間で変化し（Ｂｏｓｋｅｙら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５１７０−５１７５（１９９９））、男性の射出物が存在する場合、一時的に中性または弱アルカリ性になる。修飾Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉでｐＨ変化がどの様に活性２Ｄ  ＣＤ４分子の表面発現に影響するかを調べるために実験を行った。細菌細胞をＲｏｇｏｓａ  ＳＬブロス中に、その通常用いられるｐＨ（５．４）または１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳでｐＨ７．４に緩衝して接種した。ＯＤ６００約０．４までの活性生育中、培地のｐＨは実質的に変化しなかった。ｐＯＳＥＬ２３７および２４９を有する細菌細胞へのｍＡｂ  Ｓｉｍ．４の結合のフローサイトメトリー分析により、ｐＨ５．４および７．４の双方でｐＯＳＥＬ１７５中のコントロールバックグラウンドを超える有意に高い平均蛍光強度が検出された。さらに、修飾Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉをヒト膣腔内のｐＨに類似する酸性ｐＨで培養した場合、表面に発現したＣＶ−Ｎのレベルは上昇したままであった（データを示さず）。
【０１２０】
（長さ３６アミノ酸のＣ末端アンカーモチーフのみを経由する融合で発現する２Ｄ  ＣＤ４の表面提示の欠失）
ＬＰＱＴＧシグナル、疎水性領域およびＣ１４またはＣ３７０配列の荷電テールを含む３６アミノ酸Ｃ末端アンカーモチーフが、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の２Ｄ  ＣＤ４の効率的な表面発現を支持するに十分であるかどうかは不明である。この疑問を解決するため、Ｃ１４のＣ末端アンカーモチーフを有するｐＯＳＥＬ２３８、およびＣ３７０のＣ末端アンカーモチーフを有するｐＯＳＥＬ２６２として設計された２個の構築物を調製し、ネガティブコントロールｐＯＳＥＬ１７５および６５１、ならびにポジティブコントロールｐＯＳＥＬ２３７を参照して分析した。ｐＡｂ  Ｔ４−４でプローブ後のｐＯＳＥＬ２３８を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の細胞壁富化画分のウエスタン分析で、ｐＯＳＥＬ２３７に類似する梯子状パターンが検出されなかった。さらに、ｐＯＳＥＬ２３８を有する細菌細胞へのｍＡｂ  Ｓｉｍ．４の結合のフローサイトメトリー分析により、ｐＯＳＥＬ１７５を有する細胞中のバックグラウンドコントロールと比較して平均蛍光強度の増加は全く検出されなかった（図６）。同様に、ｐＯＳＥＬ１７５を有する細胞およびポジティブコントロールｐＯＳＥＬ２４９と比較して、ｐＯＳＥＬ２６２を有する細菌細胞のＦＡＣＳ分析は同様な負の結果をもたらした。これらの観察と一致して、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ由来の同様な長さのＣ末端アンカーモチーフを用いた場合、２Ｄ  ＣＤ４の表面発現は行われなかった。このことは特徴的なＬＰＱＴＧモチーフの上流のタンパク質配列が細胞壁固定プロセスに有意に寄与し、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉの細胞壁上に生物活性タンパク質を提示するために必要であることを示唆している。
【０１２１】
（生物活性タンパク質の最適表面提示のための、ＬＰＱＴＧモチーフ上流の反復細胞壁貫通配列の規定の長さの必要性）
天然のＣ３７０配列は、ＬＰＱＴＧモチーフの上流のＣ末端領域中にグラム陽性細菌中の多くの細胞壁アンカータンパク質の特性である８個のほぼ同一の縦列反復を含む（図１）。２．５回反復配列がｐＯＳＥＬ２４９のアンカー配列中に含まれるが、異なった長さの上流配列が表面タンパク質提示を最大にするために使用し得るかどうかは、決定しなければならないことである。従って、Ｃ３７０配列の０、１、２、４、７および８個の反復を有する数個の構築物を調製した。それらはそれぞれ、ｐＯＳＥＬ２６２、２６８、２７８、２８０、２８１および２７６と名付けられた。正しく折り畳まれた立体構造をとる２Ｄ  ＣＤ４分子のレベルを決定するため、形質転換細菌をフローサイトメトリー分析のためにｍＡｂ  Ｓｉｍ．４で探索した（図７）。細菌を有するｐＯＳＥＬ２６２（ゼロ反復）では、平均蛍光強度はネガティブコントロールｐＯＳＥＬ１７５と区別できず、異種タンパク質を適切に表面発現するためには反復配列が必要であることを示唆している。さらに、反復数をｐＯＳＥＬ２６２の０からｐＯＳＥＬ２７８の３へ増加すると、蛍光強度が有意に増加した。反復数をさらに増加しても、蛍光強度は一定のままであった。
【０１２２】
（様々な乳酸杆菌種におけるタンパク質の表面提示を支持するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉのネイティブアンカー配列の利用）
Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３に由来するＣ３７０のアンカー配列が、他のＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ株またはヒト起源の乳酸杆菌種中でタンパク質の表面提示を提供するか否かを決定するため、ｃ−ＭｙｃエピトープをＣ３７０配列のＣＷＡ２００に融合するために設計されたｐＯＳＥＬ１７５またはｐＯＳＥＬ２４１（図８Ａ）をＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  Ｘｎａ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ  １１５１、およびＬ．ｃａｓｅｉ  Ｑ中にエレクトロポレーションにより導入した。ｐＯＳＥＬ２４１を有するポジティブコントロールＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３を参照して、形質転換細菌をウエスタン分析およびフローサイトメトリー分析で分析した。ｃ−Ｍｙｃに対するｍＡｂによる探索後の細胞壁消化物のウエスタン分析により、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３中のパターンと類似しているがＬ．ｃａｓｅｉ  Ｑ中のパターンとはあまり似ていない、ｐＯＳＥＬ２４１を有する形質転換Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  ＸｎａおよびＬ．ｇａｓｓｅｒｉ  １１５１におけるラダーパターンを検出した（図８Ｂ）。細菌細胞をｃ−Ｍｙｃに対するｍＡｂで免疫染色した後のフローサイトメトリー分析により、ｐＯＳＥＬ１７５を有する全ての乳酸杆菌種で低レベルの蛍光を検出したが（図８Ｃ）、表面提示ｃ−Ｍｙｃエピトープに結合する抗体への結合の結果、ｐＯＳＥＬ２４１を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  ＸｎａおよびＬ．ｇａｓｓｅｒｉ  １１５１中での蛍光強度の上昇を検出した。さらに、ｐＯＳＥＬ１７５を有するＬ．ｃａｓｅｉと比較して、２４１を有するＬ．ｃａｓｅｉ  Ｑの蛍光強度は、さらに約１９倍増加していた。これらのデータをまとめると、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３に由来するアンカー配列は、ヒト起源の乳酸杆菌種も含めた多様な乳酸杆菌種中で、タンパク質の表面提示の支持に広く有用であることを明らかに示す。
【０１２３】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の２Ｄ  ＣＤ４の表面発現に対するＬＰＸＴＧモチーフの突然変異誘発の効果）
よく研究された細胞壁アンカータンパク質であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのプロテインＡが、ＬＰＥＴＧ細胞壁分類モチーフ上で突然変異した場合、ＬＰＱＴＧ中のアミノ酸プロリン（Ｐ）をアミノ酸アスパラギン（Ｎ）で置換することによりタンパク質表面提示の効率が減少したが、トレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換は、タンパク質表面提示の効率にほとんど影響がないことが見出された（ＮａｖａｒｒｅおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：１７４−２２９（１９９９））。この研究は、Ｐ残基がＬＰＸＴＧモチーフ中でおそらく最も重要な残基であり、Ｔ残基を類似のアミノ酸であるＳで置換し得ることを示した。Ｃ１４およびＣ３７０中のＬＰＱＴＧモチーフが実際に重要な分類信号であるか否かを決定するため、ＬＰＱＴＧ配列中のＰおよびＴの重要性を検討した。Ｃ１４配列およびＣ３７０配列双方上のＬＰＱＴＧモチーフ内に点突然変異をＰＣＲにより生じさせた。Ｐ残基をアラニン（Ａ）またはアスパラギン（Ｎ）に突然変異させ；アミノ酸Ｔを、Ａ、Ｓまたはグリシン（Ｇ）に突然変異させ；ＬＰＸＴＧモチーフ中のアミノ酸ＧをＡに突然変異させた。変化したＬＰＱＴＧモチーフを有するプラスミドをそれぞれｐＯＳＥＬ２３７Ｐ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２３７Ｐ（Ｎ）、ｐＯＳＥＬ２３７Ｔ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２３７Ｔ（Ｇ）、ｐＯＳＥＬ２３７Ｔ（Ｓ）、ｐＯＳＥＬ２３７Ｇ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２４９Ｐ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２４９Ｐ（Ｎ）、ｐＯＳＥＬ２４９Ｔ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２４９Ｔ（Ｇ）、ｐＯＳＥＬ２４９Ｔ（Ｓ）およびｐＯＳＥＬ２４９Ｇ（Ａ）と名付けた。突然変異した構築物を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のウエスタン分析およびフローサイトメトリー分析を行った。親ｐＯＳＥＬ２３７およびｐＯＳＥＬ２４９を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉと比較して、ｐＯＳＥＬ２３７Ｐ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２３７Ｐ（Ｎ）、ｐＯＳＥＬ２４９Ｐ（Ａ）およびｐＯＳＥＬ２４９Ｐ（Ｎ）を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉは、ｐＡｂ  Ｔ４−４による細胞壁富化タンパク質画分のウエスタンブロットにおいて、特徴的な、より高分子量種のスペクトルを示さなかった。一方、２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００融合タンパク質の馴化培地中への分泌は顕著に増加し、２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００融合タンパク質が細胞壁に共有結合していないことを示した。野生型ｐＯＳＥＬ２３７およびｐＯＳＥＬ２４９で観察された結果と同様に、ｐＯＳＥＬ２３７Ｔ（Ｓ）およびｐＯＳＥＬ２４９Ｔ（Ｓ）を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉの細胞壁消化において、より高分子量種の特徴的なスペクトルは明瞭であり、このことは、Ｃ１４およびＣ３７０由来のＬＰＱＴＧ内のアミノ酸Ｔを、Ｓによって効果的に置換し得ることを示唆していた（データ示さず）。
【０１２４】
ＬＰＸＴＧの突然変異誘発のＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ表面タンパク質提示に対する効果をさらに決定するため、ｐＯＳＥＬ１７５、６５１、２３７、２４９を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ株と一緒に様々な突然変異構築物をｐＡｂ  Ｔ４−４またはｍＡｂ  Ｓｉｍ．４で探索し、次いでフローサイトメトリーで抗体結合を分析した。ｐＯＳＥＬ２３７を有する細菌細胞と比較してｐＯＳＥＬ２３７Ｐ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２３７Ｐ（Ｎ）を有する細菌細胞、およびｐＯＳＥＬ２４９を有する細菌細胞と比較してｐＯＳＥＬ２４９Ｐ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２４９Ｐ（Ｎ）を有する細菌細胞では平均蛍光強度がかなり減少し、このことは、細胞表面の２Ｄ  ＣＤ４タンパク質の提示が、あったとしても、はるかに少ないことを示していた。しかしながら、ｐＯＳＥＬ２３７Ｔ（Ｓ）、ｐＯＳＥＬ２３７（Ｔ）Ａ、ｐＯＳＥＬ２４９Ｔ（Ｓ）およびｐＯＳＥＬ２４９（Ｔ）Ａを有する細菌細胞の平均蛍光強度はｐＯＳＥＬ２３７および２４９を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉに匹敵し、このことは、ＴをＳまたはＡに置換することが細胞壁固定の効率にほとんど効果がないことを示した（図９）。
【０１２５】
ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリー分析のデータは、Ｃ１４およびＣ３７０のＬＰＱＴＧモチーフ内に含まれるアミノ酸Ｐは容易に置換され得ないことを示す。対照的に、アミノ酸Ｔは、ＳまたはＡで置換され得、乳酸杆菌属の細胞壁に効率的に固定されるタンパク質を生成する。
【０１２６】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉにおける２Ｄ  ＣＤ４の表面発現に対するＣ末端正荷電テールの欠失の効果）
グラム陽性細胞壁アンカードメインの特徴の一つは、正に荷電したアミノ酸がタンパク質のＣ末端極に伸びていることである。Ｍ６タンパク質では、この配列（ＫＲＫＥＥＮ）が重要な細胞表面保持信号として働く。これらの標示配列は、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｌｙｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属、リステリア属および乳酸杆菌属を含む他のグラム陽性細菌でも見出されている（ＮａｖａｒｒｅおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：１７４−２２９（１９９９））。２つの配列ＲＫＫＲＱＫ１７６５およびＫＫＫＲＫＤＤＥＡ１９０３がそれぞれ、Ｃ１４推定アンカー配列およびＣ３７０推定アンカー配列中の正に荷電したテールとして同定された（図１）。これらの２個の配列が細胞表面保持信号として働くか否かを決めるため、一連の欠失構築物を作製した（図１０）。それらは、それぞれｐＯＳＥＬ２３７−５、ｐＯＳＥＬ２３７−６、ｐＯＳＥＬ２３７−７、ｐＯＳＥＬ２４９−８、ｐＯＳＥＬ２４９−９およびｐＯＳＥＬ２４９−１０と名付けられた。
【０１２７】
これらの構築物を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉのウエスタン分析およびフローサイトメトリー分析を行った。ＣＷＡ２００と融合して２Ｄ  ＣＤ４を表す、４８ｋＤａで移動するタンパク質種、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ｐＡｂ  Ｔ４−４によって、荷電テールノックアウト構築物を有する全てのＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉで検出され得る。分泌タンパク質は、ｐＯＳＥＬ２３７−５、ｐＯＳＥＬ２３７−６、ｐＯＳＥＬ２３７−７、ｐＯＳＥＬ２４９−８、ｐＯＳＥＬ２４９−９およびｐＯＳＥＬ２４９−１０を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ細胞において、親のｐＯＳＥＬ２３７およびｐＯＳＥＬ２４９を有する細胞よりも多かった。全欠失突然変異体に由来する細胞壁富化画分中のタンパク質のウエスタン分析は、ｐＯＳＥＬ２３７または２４９を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉで観察された特徴的なラダーパターンを検出しなかった（データを示さず）。これらのデータは、２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００融合タンパク質が細胞壁に共有結合していないことを示唆した。
【０１２８】
抗ＣＤ４  ｐＡｂ  Ｔ４−４またはｍＡｂ  Ｓｉｍ．４による探索後の改変Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉのフローサイトメトリー分析は、親のｐＯＳＥＬ２３７または２４９を有する細菌細胞と比較して、これらの突然変異プラスミドを有する細菌細胞における平均蛍光強度の顕著な減少を検出した（図１１）。これらのデータは、Ｃ１４およびＣ３７０双方の正に荷電したＣ末端の欠失が、細胞壁に固着して異種タンパク質を提示するそれらの能力を阻害したことを、結論として示した。
【０１２９】
（細胞壁アンカーシグナルとしてのＬＰＱＴＧモチーフの柔軟性）
グラム陽性細菌由来のほとんどの細胞壁に固定されたタンパク質は、同じ識別信号ＬＰＸＴＧを共有するが、一部タンパク質は、異なったモチーフを有する。例えば、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉのＰｒｔＰに対する識別信号は、ＬＰＫＴＡである（ＨｏｌｃｋおよびＮａｅｓ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：１３５３−１３６４（１９９２））。ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓのプロテインＬおよびヒト血清アルブミン結合タンパク質は、ＬＰＸＡＧのモチーフを共有する（ｄｅ  ＣｈａｔｅａｕおよびＬ．Ｂｊｏｒｃｋ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２１４７−１２１５１（１９９４）；Ｋｅｌｌｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：８６３−８７４（１９９２）；Ｍｕｒｐｈｙら、ＤＮＡ  Ｓｅｑ．４：２５９−２６５（１９９４））。Ｃ１４アンカータンパク質またはＣ３７０アンカータンパク質中でＬＰＱＴＧがＬＰＱＡＧまたはＬＰＱＳＧに突然変異した場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にフローサイトメトリーまたはウエスタンブロットで測定した２Ｄ  ＣＤ４の表面提示の減少は僅かであった。しかしながら、以下の証拠に基づくように、これらの配列のみでは、膣由来の乳酸桿菌の細胞壁へタンパク質を固定するには不十分である：１）３６アミノ酸のＣ末端アンカードメイン単独では、ｃ−Ｍｙｃエピトープまたは２Ｄ  ＣＤ４を細胞表面に固定しなかった、２）２００アミノ酸までの上流配列が含まれる場合でさえも、プロトタイプＭ６細胞壁アンカー配列（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのｅｍｍ６遺伝子によりコードされる）は膣由来乳酸桿菌の細胞壁へ異種タンパク質を固定しなかった（本発明者らは、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ由来のＬＰＸＴＡモチーフを用いて同様な結果を見出した）、および３）Ｃ１９１タンパク質は、有効なアンカーではなかった。これらの知見は、Ｃ１４およびＣ３７０のＣＷＡ２００領域内に含まれる他の上流配列もまた、細胞壁固定プロセスに大きく寄与することを示している。
【０１３０】
（Ｃ１４およびＣ３７０のＣＷＡ２００と融合した場合の２Ｄ  ＣＤ４生物活性の増大）
生物活性を評価するため、ｐＯＳＥＬ２３７−７およびｐＯＳＥＬ２４９−１０を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３から放出されたＣ１４タンパク質およびＣ３７０タンパク質の２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００を、ＣＤ４  ＥＬＩＳＡにより分析した。ｐＯＳＥＬ６５１、ｐＯＳＥＬ２３７−７およびｐＯＳＥＬ２４９−１０を有する細菌細胞を、Ｒｏｇｏｓａ  ＳＬブロス中で種々の細胞密度に生育させた。次いで、無細胞馴化培地を回収した。ＯＤ６００＝０．８で、ウエスタンブロットで測定した培地中に放出されたｐＯＳＥＬ６５１からの２Ｄ  ＣＤ４の量とｐＯＳＥＬ２３７−７または２４９−１０からの２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００の量とは類似していた。それにもかかわらず、ｐＯＳＥＬ２３７−７およびｐＯＳＥＬ２４９−１０を有する細菌細胞から放出された２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００は、ｐＯＳＥＬ６５１を有する細菌細胞からの２Ｄ  ＣＤ４タンパク質と比較した場合、約２〜３倍高い活性を示した。Ｃ１４またはＣ３７０のＣＷＡ２００領域の２Ｄ  ＣＤ４への融合は、おそらくはタンパク質折り畳みプロセスを補助することにより、このタンパク質の生物活性を増強する様にみえた。この同じ知見は、ｇｐ１２０結合アッセイを用いて確認された（データ示さず）。これらのタンパク質のウエスタンブロット分析は、２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００が、２Ｄ  ＣＤ４よりも有意に安定であり、おそらくその生物活性の増強に寄与しているということを示唆する。
【０１３１】
（材料および方法）
（細菌株および培養）
Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉおよびＬ．ｃａｓｅｉのヒト膣株を健康な女性から得た膣サンプルの細菌培養により単離した。乳酸杆菌ｒＲＮＡに特異的な２つのプライマーを用いて、１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域の増幅後に、ＧｅｎＢａｎｋに保存された参照株のＤＮＡ配列に対して細菌株の遺伝型決定した（Ｔａｎｎｏｃｋら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：４２６４−４２６７（１９９９））。株をＭＲＳまたはＲｏｇｏｓａ  ＳＬブロス（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）中、またはＭＲＳ寒天プレート上で、３７℃、５％ＣＯ２で常法により生育させた。
【０１３２】
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のゲノムＤＮＡの単離）
Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ  ＪＣＭ  ５８１０から染色体ＤＮＡを単離するために先に用いたプロトコール（Ｓｉｌｌａｎｐａａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：６４４０−６４５０（２０００））の改変に基づいて、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３の染色体ＤＮＡを単離した。Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ細菌を２００ｍｌのＭＲＳ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で６００ｎｍにおける光学密度１．０（ＯＤ６００＝１．０）まで増殖させた。６，６００×ｇ、１０分間の遠心により細胞を収集し、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース中で１回洗浄し、細菌培養液１００ｍｌあたり２．５ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５ｍｌの２４％エチレングリコール８０００、および２．５ｍｌのリゾチーム（４ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）を加えた後に懸濁した。得られた細胞懸濁液を３７℃で１時間インキュベーションした。０．２Ｍ  ＥＤＴＡを５ｍｌ添加し、細胞を４℃、１０００×ｇで１０分間遠心し、５０μｌのムタノリシン（１５，０００Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）１０ｍｌ中に再懸濁した。３７℃で１時間インキュベーショした後、１．５ｍｌの９％Ｓａｒｋｏｓｙｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）および３ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌを添加して細胞を溶解した。次いで細胞溶解液を２．９ｍｌの５Ｍ過塩素酸ナトリウムと混合した。染色体ＤＮＡを、１７．５ｍｌのクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１  ｖ／ｖ）で抽出し、エタノールで沈殿し、風乾し、１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁した。最後にゲノムＤＮＡ調製物をＤＮａｓｅを含まないＲＮａｓｅで処理した。
【０１３３】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉゲノムライブラリーの構築）
Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のゲノムＤＮＡをＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ（ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）を用いて所望のサイズ範囲に機械的に剪断した。剪断ＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼとＫｌｅｎｏｗ酵素で平滑断端化し、３Ｋｂおよび８ＫｂのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動後に単離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製した。得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１８ベクター中に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に形質転換して３Ｋｂおよび８Ｋｂゲノムライブラリーを作製した。細菌形質転換体をＸ−ｇａｌの存在下でＬＢプレート上で選択し、得られたコロニーをＱ−ｐｉｘロボット（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）を用いて９６ウエルプレート中に配列した。９６クローンからなるプレートを挿入サイズの均一性および非組み換え体の割合について試験して、ライブラリーの品質を決定した。どちらのライブラリーも、５％未満の非組み替え体を含み、９０％を超える挿入体は、期待サイズの２０％以内であった。
【０１３４】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉゲノムの配列決定および組み立て）
Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉゲノム配列を、全ゲノムショットガン法を用いて決定した。ゲノムライブラリーから選択したクローンのプラスミドＤＮＡを、磁気ビーズまたはローリングサークル（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ）法のいずれかで精製し、ＡＢＩ  ＢｉｇＤｙｅターミネーターキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて両端から配列決定した。全ての配列決定反応を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００自動ＤＮＡ配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で行った。合計１５，３６０個の配列の読み、または１６０個の配列プレートを行って、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３ゲノムの３倍カバレージを得た。５０塩基を越えるＱ２０（１００塩基あたり予測誤差１）を生成する場合、またはより高い精度を満たす場合のみ、配列決定の読みが成功したと考えられる。配列クロマトグラフを、Ｐｈｒｅｄ（Ｅｗｉｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８：１７５−１８５（１９９８））を用いる塩基呼び出しおよび品質評価のために、自動的にＵＮＩＸ（登録商標）システムに転送した。合格率は８０％以上であり、平均読み取り長さは４００〜５００塩基の範囲である。配列アセンブリをＰａｒａｃｅｌ  ＧｅｎｏｍｅＡｓｓｅｍｂｌｅｒまたはＣＡＰ４を用いて行った（Ｐａｒａｃｅｌ、Ｉｎｃ．、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）。合計４８４のコンティグを組み立てた。
【０１３５】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３ゲノム中の細胞壁アンカーモチーフを有するタンパク質配列の同定）
グラム陽性細菌の細胞壁固定タンパク質は、保存的Ｃ末端ＬＰＸＴＧＸモチーフを有する（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：１６０３−１６０５（１９９０））。このヘキサペプチドの後には、アミノ酸の疎水性伸長と、短い荷電テールとがあり停止転送配列として知られる（Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄら、Ｃｅｌｌ、７０：２６７−２８１（１９９２））。さらに、別の独自のＬＰＸＴＡ識別モチーフがＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ中で同定された（ＨｏｌｃｋおよびＮａｅｓ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：１３５３−１３６４（１９９２））。ネイティブの細胞壁アンカー配列を同定するため、組み立てられたコンティグ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３の、推定７５％完全なゲノム配列から得られる）の全てのリーディングフレーム中のＬＰＸＴＧおよびＬＰＸＴＡに類似のモチーフを同定するためのコンピュータースクリプトが作成された。推定細胞壁アンカーモチーフを有する得られたコンティグを、グラム陽性細菌中の細胞壁アンカータンパク質に対する配列相同性に対するＢＬＡＳＴ検索によりさらに検証した。
【０１３６】
（シャトルベクターの構築）
これらの研究に用いられた１次シャトルベクターは、ｐＬＥＭ７（Ｆｏｎｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ、３７：１９９−２０３（１９９７））の改変バージョンであるｐＯＳＥＬ１７５であった。部分ＩＳ要素を、まずＳｍａＩで切断することによって除去し、ＮｄｅＩで部分的に消化し、Ｋｌｅｎｏｗ断片で平滑末端化し、再連結した。最後に、ｐＯＳＥＬ１４４のｅｒｍ遺伝子内の２個のＭｆｅＩ部位を除去するため、プラスミドを部位指向性突然変異誘発に供した（Ｃｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：１１６７２−１１６７７（２００３））。得られたｐＯＳＥＬ１７５プラスミドはＥ．ｃｏｌｉ中の複製開始点（ＣｏｌＥ１）と乳酸杆菌属中の複製開始点（ｒｅｐＡ）の双方を有し、従って様々な乳酸杆菌属種中の異種タンパク質の発現のために用いられるシャトルベクターの骨格を含む。
【０１３７】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の発現カセットの構築）
Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉにおいてアンカータンパク質を都合よく表在化するために、発現カセットを構築し、ｐＯＳＥＬ１７５のＳａｃＩ部位およびＸｂａＩ部位中にサブクローニングした。このカセットは、乳酸杆菌適合性Ｐ２３プロモーター、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓのＣｂｓＡシグナル配列、異種タンパク質をコードするＤＮＡ、およびグラム陽性細菌中の既知、または推定細胞表面タンパク質由来の共有結合性細胞壁アンカードメインを含む４つの構成要素を含む。本発明者らの、一連のプロモーターおよびシグナル配列を有する構築物の詳細な分析により、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ由来のＰ２３プロモーター（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｏｓｓｅｎｅｔら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：２４５２−２４５７（１９８７））と、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓのＣｂｓＡ由来のシグナル配列（ＣｂｓＡｓｓ）との組み合わせにより、ｐＯＳＥＬ６５１として設計された構築物中で２Ｄ  ＣＤ４の最高レベルのタンパク質発現が駆動されることが示された（Ｃｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：１１６７２−１１６７７（２００３））。ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｈｅＩ、ＭｆｅＩおよびＸｂａＩを含む独自の制限部位は、それぞれ５’末端から３’末端へと各構成要素の間に置かれた。ＰＣＲによる各構成要素の増幅は、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われた。本研究で詳細に述べられる融合構築物の様々な部分のＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーとしては、以下が挙げられる：
【０１３８】
【化４】
2007503845.tif 000006
表面発現のために設計されたタンパク質としては、１０アミノ酸ｃ−Ｍｙｃペプチド（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）およびヒトＣＤ４のＮ末端の２個の細胞外ドメイン（２Ｄ  ＣＤ４）を含む最初の１８３残基が含まれる。２Ｄ  ＣＤ４タンパク質は、好ましい乳酸杆菌コドンの使用に従うように再コード化された。全ての発現構築物は、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中へ形質転換する前にＤＮＡ配列分析により確認された。
【０１３９】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉの推定細胞壁アンカー配列へのｃ−Ｍｙｃ融合の構築）
タンパク質発現レベル、および生物活性タンパク質の表面提示のために規定の長さの推定細胞壁アンカー配列を使用することが実行可能であるか否かを決定するため、本発明者らは、最初にエピトープタグ化を選んだ。Ｃ末端分類モチーフの機能を乱さないために、５’末端に１０アミノ酸ｃ−Ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）を含むオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のゲノム由来のＣ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０を含む推定細胞壁アンカー配列のＮ末端にｃ−Ｍｙｃエピトープを融合させた。ｃ−Ｍｙｃ配列をこれらのタンパク質（Ｃ１４、Ｃ１９１またはＣ３７０のＣ末端３０アミノ酸）の細胞壁アンカーモチーフに直接融合するか、またはＣ末端細胞壁アンカードメインを含む配列および様々な長さの隣接上流アミノ酸に融合させた。最も注目すべきは、ｃ−Ｍｙｃが細胞壁アンカードメインと上流アミノ酸（ＣＷＡ２００と命名）とを含む２００アミノ酸配列と融合したことである。
【０１４０】
【化５】
2007503845.tif 000007
期待したサイズを有する全てのＰＣＲ産物をゲルで精製し、ＭｆｅＩおよびＮｈｅＩの両方で消化した。得られた断片を、ＭｆｅＩ／ＮｈｅＩ二重消化ｐＯＳＥＬ６５１と連結し、ｐＯＳＥＬ２３９（Ｃ１４配列のＣＷＡ２００経由）、ｐＯＳＥＬ２４０（Ｃ１９１配列のＣＷＡ２００経由）およびｐＯＳＥＬ２４１（Ｃ３７０配列経由）それぞれの中にｃ−Ｍｙｃ融合体を作製した。得られたプラスミドはＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３中へエレクトロポレーションした。
【０１４１】
（細胞壁固定配列のシャトルベクター中へのサブクローニング）
Ｃ末端ＬＰＱＴＧアンカーモチーフを含む３個の推定表面タンパク質を選び、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３の細胞壁上に外来タンパク質を発現する能力を決定した。これらの表面タンパク質のＣ末端ＬＰＱＴＧドメインを含むＤＮＡ領域、およびその上流の２００アミノ酸（暫定的にＣＷＡ２００領域と呼ぶ）を、下記の３組のプライマーによって増幅した：
【０１４２】
【化６】
2007503845.tif 000008
Ｃ１４アンカードメインの内部ＭｆｅＩ部位とＣ３７０ドメインの内部ＸｂａＩ部位を、酵素的制限の前に部位指向性突然変異誘発により突然変異させた。予期されたサイズのＰＣＲ産物の全てをゲルで精製し、ＭｆｅＩおよびＸｂａＩの両方で消化した。得られた断片を、Ｐ２３−調節性分泌２Ｄ  ＣＤ４を含むＭｆｅＩ／ＸｂａＩ二重消化ｐＯＳＥＬ６５１と連結し、プラスミドｐＯＳＥＬ２３７（Ｃ１４配列のＣＷＡ２００経由）、ｐＯＳＥＬ２４２（Ｃ１９１配列のＣＷＡ２００経由）およびｐＯＳＥＬ２４９（Ｃ３７０配列のＣＷＡ３００経由）をそれぞれ作製した。あるいは、以下の２個のプライマーを用いてＣ１４配列のＣ末端３６アミノ酸アンカーモチーフを、同様にシャトルベクター中にクローニングした。
【０１４３】
【化７】
2007503845.tif 000009
ＤＮＡ配列の検証後に得られたプラスミドの全てを、Ｌ．ｊｅｓｎｅｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉおよびＬ．ｃａｓｅｉ中にエレクトロポレーションした。
【０１４４】
（Ｃ３７０配列の反復細胞壁貫通領域のサブクローニング）
Ｃ３７０ＬＰＱＴＧモチーフの上流の種々の反復細胞壁貫通領域を、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のゲノムＤＮＡから増幅した。各ＰＣＲ反応について同じ３’プライマー（５’−ＣＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＴ−３’）を、以下の５’プライマーと対で使用した。
【０１４５】
【化８】
2007503845.tif 000010
これらのプライマー中のＭｆｅＩ部位およびＸｂａＩ部位の両方に下線が引かれている。
【０１４６】
予想したサイズのＰＣＲ産物の全てをゲル精製し、ＭｆｅＩおよびＸｂａＩの双方で消化した。得られた断片を、Ｐ２３調節性分泌２Ｄ  ＣＤ４を含むＭｆｅＩ／ＸｂａＩ二重消化ｐＯＳＥＬ２３７と連結し、プラスミドｐＯＳＥＬ２６２（反復無し）、ｐＯＳＥＬ２６８（１反復）、ｐＯＳＥＬ２７８（２反復）、ｐＯＳＥＬ２８４（３反復）、ｐＯＳＥＬ２８０（４反復）、ｐＯＳＥＬ２７５（６反復）、ｐＯＳＥＬ２８１（７反復）およびｐＯＳＥＬ２７６（８反復）をそれぞれ作製した。
【０１４７】
（細菌形質転換）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１２Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に、プラスミドをエレクトロポレーションにより導入した。シャトルプラスミドを構築し維持するため、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１２Ｓ細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは３００μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを補充したＬＢブロス（Ｄｉｆｃｏ）中で、３７℃で増殖させた。ＤＮＡ配列検証後、Ｅ．ｃｏｌｉ由来プラスミドを、改変したＬｕｃｈａｎｓｋｙら（Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．７４：３２９３−３３０２（１９９１））の方法に従ってＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉおよびＬ．ｃａｓｅｉ中に形質転換した。簡単に言えば、新たに播種したＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉを、ＭＲＳブロス中、３７℃および５％ＣＯ２でＯＤ６００  ０．６〜０．７まで培養した。細菌細胞を収集し、洗浄して９５２ｍＭスクロースおよび３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中に、４℃で再懸濁した。予冷した０．２ｃｍギャップキュベットを用いて、コンピテント細胞に１〜２μｇのＤＮＡを添加し、直ちにＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、２．５ｋＶ／ｃｍおよび２００オームでエレクトロポレーションした。その後、２０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（液体培地中で形質転換Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉを常法で増殖させるためにも使用される濃度である）を含む選択ＭＲＳ寒天プレート上に播種する前に、３７℃で２時間予め温めたＭＲＳブロス中で細胞を回復させた。
【０１４８】
（推定細胞壁アンカー配列のＬＰＸＴＧモチーフの部位指向性突然変異誘発）
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ提供のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて点突然変異を生じさせた。プラスミドｐＯＳＥＬ２３７（Ｃ１４配列のＣＷＡ２００を経由して固定した２Ｄ  ＣＤ４を発現）とプラスミドｐＯＳＥＬ２４９（Ｃ３７０配列のＣＷＡ２００を経由して固定した２Ｄ  ＣＤ４を発現）をテンプレートとして使用した。ＬＰＱＴＧ、およびそのＣ１４およびＣ３７０上の隣接配列に対応するヌクレオチド配列に基づき、突然変異誘発プライマーを設計した。
【０１４９】
【化９】
2007503845.tif 000011
Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３の好ましいコドンを用いて置換ヌクレオチドを選択した。
【０１５０】
２３７Ｐ（Ａ）：Ｃ１４のＬＰＱＴＧ上のプロリンをアラニンで置換した。
【０１５１】
【化１０】
2007503845.tif 000012
２３７Ｐ（Ｎ）：Ｃ１４のＬＰＱＴＧ上のプロリンをアスパラギンで置換した。
【０１５２】
【化１１】
2007503845.tif 000013
２３７Ｔ（Ａ）：Ｃ１４のＬＰＱＴＧ上のトレオニンをアラニンで置換した。
【０１５３】
【化１２】
2007503845.tif 000014
２３７Ｔ（Ｇ）：Ｃ１４のＬＰＱＴＧ上のトレオニンをグリシンで置換した。
【０１５４】
【化１３】
2007503845.tif 000015
２３７Ｔ（Ｓ）：Ｃ１４のＬＰＱＴＧ上のトレオニンをセリンで置換した。
【０１５５】
【化１４】
2007503845.tif 000016
２３７Ｇ（Ａ）：Ｃ１４のＬＰＱＴＧ上のグリシンをアラニン（Ａｌａｎｉｅ）で置換した。
【０１５６】
【化１５】
2007503845.tif 000017
２４９Ｐ（Ａ）：Ｃ３７０のＬＰＱＴＧ上のプロリンをアラニン（Ａｌａｉｎｅ）で置換した。
【０１５７】
【化１６】
2007503845.tif 000018
２４９Ｐ（Ｎ）：Ｃ３７０のＬＰＱＴＧ上のプロリンをアスパラギンで置換した。
【０１５８】
【化１７】
2007503845.tif 000019
２４９Ｔ（Ａ）：Ｃ３７０のＬＰＱＴＧ上のトレオニンをアラニンで置換した。
【０１５９】
【化１８】
2007503845.tif 000020
２４９Ｔ（Ｇ）：Ｃ３７０のＬＰＱＴＧ上のトレオニンをグリシンで置換した。
【０１６０】
【化１９】
2007503845.tif 000021
２４９Ｔ（Ｓ）：Ｃ３７０のＬＰＱＴＧ上のトレオニンをセリンで置換した。
【０１６１】
【化２０】
2007503845.tif 000022
２４９Ｇ（Ａ）：Ｃ３７０のＬＰＱＴＧ上のグリシンをアラニンで置換した。
【０１６２】
【化２１】
2007503845.tif 000023
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）サイクル条件は９５℃で５０秒、６０℃で５０秒、および６８℃で１２分、全体で１６サイクルであった。
【０１６３】
ＰＣＲ反応後にＤｐｎＩ酵素を、増幅混合物に添加し、親プラスミドを分解した。新たに合成されたプラスミドを製造業者の推奨に従って化学コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に導入した。２００μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを補充したＬＢブロス（Ｄｉｆｃｏ）中でプラスミドを維持し、増幅した。ＤＮＡ配列を検証後、改変したＬｕｃｈａｎｓｋｙらの方法（Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．７４：３２９３−３３０２（１９９１））に従ってＥ．ｃｏｌｉ由来のプラスミドをＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中へ形質転換した。突然変異原性プラスミドを含む形質転換Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉを選択し、増殖するために、２０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＭＲＳを使用した。
【０１６４】
（推定細胞壁アンカータンパク質の正に荷電したＣ末端配列の欠失の分析）
正に荷電したアミノ酸がＣ１４およびＣ３７０のＣ末端に位置する一連の欠失突然変異体を、ＰＣＲ増幅により作製した。プラスミドｐＯＳＥＬ２３７およびｐＯＳＥＬ２４９を、テンプレートとして使用した。ｐＯＳＥＬ２３７およびｐＯＳＥＬ２４９上の２Ｄ  ＣＤ４配列に相補性のオリゴヌクレオチド（ＣＤ４Ｆ  ５’−ＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＴＴＣＡＣＧＴＣＧＴ−３’）をフォワードプライマーとして使用した。以下のオリゴヌクレオチド（制限部位に下線）を、２Ｄ  ＣＤ４  ｃＤＮＡのＣ末端および完全Ｃ１４およびＣ３７０  ＣＷＡ２００配列を増幅するためのリバースプライマーとして使用した：
【０１６５】
【化２２】
2007503845.tif 000024
全てのリバースプライマーは、ＸｂａＩ制限部位を含んでいた。サイクル条件は、９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で９０秒、合計１８サイクルであった。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＭｆｅＩおよびＸｂａＩの両方で消化し、次いでＭｆｅＩ／ＸｂａＩ二重消化ｐＯＳＥＬ２３７およびｐＯＳＥＬ２４９中へ、それぞれサブクローニングした。配列をヌクレオチド配列決定によって検証し、タンパク質分析のために、構築物をＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中へエレクトロポレーションした。
【０１６６】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の異種タンパク質発現のウエスタン分析）
遺伝的に改変したＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ細胞を、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で緩衝したＲｏｇｏｓａ  ＳＬブロス中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。可溶性タンパク質のレベルを決定するため、１２，０００×ｇで遠心後に馴化培地を集め、最終濃度２０％のＴＣＡでタンパク質を沈殿させた。ＴＣＡ沈殿物をエタノールで洗浄し、風乾し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．４％ＳＤＳ、６％スクロース、１０ｍＭジチオトレイトールおよび０．０１％ブロモフェノールブルー（１×還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液）中で熱変性させた。Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の細胞結合タンパク質の相対量を決めるため、細胞溶解を誘起することなく、ＯＤ６００単位あたり１００μＬの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中、３７℃、３０分間で細菌細胞を抽出した。１２，０００×ｇで５分間遠心して収集した抽出タンパク質を、次いで熱変性した。１４，０００×ｇで遠心して可溶性タンパク質を細菌細胞から分離し、製造業者の推奨に従い、抗酸化剤の存在下で、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。電気泳動による分離後、２０％メタノール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび５０ｍＭグリシン中の２フッ化ポリビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にタンパク質をエレクトロブロッティングした。次いで、このブロットをポリクローナルウサギ抗ＣＤ４抗体、Ｔ４−４（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）またはウサギ抗ＣＶ−Ｎ  ｐＡｂ、およびｃ−Ｍｙｃに対するモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で探索した。抗原−抗体反応を、アルカリホスファーゼ結合抗ウサギＩｇＧ用（ＣＤ４検出用）に対する色素生成検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、またはセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役抗マウスＩｇＧ用（ｃ−Ｍｙｃ検出用）の増強化学発光試薬（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて可視化した。同様に、ｃ−Ｍｙｃタグ化タンパク質のレベルを抗ｃ−Ｍｙｃに対するｍＡｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で探索し、結合抗体を、ＨＲＰ結合抗マウス２次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。
【０１６７】
（ムラミダーゼによるＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ細胞壁の酵素消化）
１０９個の細菌を含む細菌培養液を、１２，０００×ｇで５分間遠心した。得られた細胞ペレットを、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）で１回洗浄し、１００μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５％スクロース中に懸濁した（Ｐｉａｒｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：３０６８−３０７２（１９９７））。細菌細胞壁を、最終濃度１５単位／ｍｌのムラミダーゼ、ムタノリシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）の存在下で、３７℃で１時間消化した。その後、細胞を、２，５００×ｇで１０分間遠心し、プロトプラスト富化画分から細胞壁富化画分を単離した。細胞壁またはプロトプラスト富化画分それぞれに、２５μｌの４×還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液または１２５μｌの１×還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液を添加後、得られたサンプルを熱変性した。あるいは、さらなるサンプル処理なしに細胞壁富化画分中のタンパク質を分析するため、ＣＤ４  ＥＬＩＳＡを用いた。
【０１６８】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の表面露出タンパク質のスルホ−ＮＨＳ−ビオチンによる標識）
Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の表面タンパク質の表面露出リシル残基を、膜不透過スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−ビオチンの使用によって探索した。ＮＨＳ−ビオチンによるグラム陰性細菌Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉの表面標識により、真の細胞表面タンパク質の同定が可能になる（Ｓａｂａｒｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７０：２７８９６−２７９０２（２００２））。対数期の約１０９個のＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ細菌を１回洗浄し、ＰＢＳ中に懸濁した。スルホ−ＮＨＳ−ビオチンを１ｍｌの細胞懸濁液に最終濃度１ｍＭで加え、連続的に回転させながら室温で３０分間インキュベーションした。その後、ビオチン化反応を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を加えてクエンチし、細胞を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２で１回洗浄した。細胞溶解を誘起することなく、細胞に結合したタンパク質を、１２５μｌの０．４％ＳＤＳ、６％スクロース、１０ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）中で、３７℃で３０分間抽出した。抽出されたタンパク質を、１４，０００×ｇ、５分間の遠心により細菌細胞から分離した。熱変性後、タンパク質を、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で分離した。ビオチン化タンパク質およびその移動度シフトを決定し、その後アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）または他の免疫プローブで探索した。
【０１６９】
（フローサイトメトリーによる２Ｄ  ＣＤ４の表面発現の分析）
ｐＯＳＥＬ６５１中に表面タンパク質発現またはタンパク質分泌のためのプラスミドを有する形質転換Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉを、２０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンの存在下で、３７℃、５％ＣＯ２で、ＭＲＳブロス中で一晩増殖させた（ＯＤ６００＞３）。特に指定しない限り、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１で緩衝したエリスロマイシン含有ＭＲＳまたはＲｏｇｏｓａ  ＳＬブロス中、１：５０〜１００希釈で一晩培養物を培養し、次いで、継代培養した。ＯＤ６００〜＝０．４の１ｍｌの細胞培養液を、１２，０００×ｇで５分間遠心した。得られた細胞ペレットを２回洗浄し、２％ＦＢＳを含む１×ＰＢＳ中に懸濁した。その後、特異性抗体（２×１０８個の細胞あたりウサギポリクローナルＴ４．４に対し１：１０００希釈、またはモノクローナルＳｉｍ．４に対し５０μｇ／ｍｌ）を用いて、細胞を、１×ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ中で３０分間表面染色し、その後ＦＩＴＣまたはフィコエリスリン結合抗ウサギ抗体またはフィコエリスリン結合抗マウス抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）で表面染色した。表面発現ＣＶ−Ｎの検出のため、同様なプロトコールを開発した。コントロールはアイソタイプが適合するモノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）から構成した。標識細胞を、１％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアと共に作動するＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒシステム（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析した。バックグラウンドコントロール中の密度プロット出力（側方散乱または前方散乱  対  蛍光）を、ｐＯＳＥＬ１７５を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉから得た。プロット間の平均蛍光強度の変化を、細菌表面に結合する抗体の基準とし、ＦＬＯＷＪＯソフトウエアを用いて計算した。
【０１７０】
（酵素結合免疫吸着アッセイ）
正しく折り畳まれた２Ｄ  ＣＤ４タンパク質の濃度を、ＭｃＣａｌｌｕｓら（Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２０９−２１９（１９９２））に従って改変したＣＤ４捕捉酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）で決定した。細菌馴化培地中の正しい立体配座を有する２Ｄ  ＣＤ４タンパク質を、２．５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体Ｓｉｍ．４により、ＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウエルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上に捕捉した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１×Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水中での洗浄後、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のリフォールディングされた２Ｄ  ＣＤ４標準を参照して、結合ＣＤ４分子を、ウサギポリクローナル抗体で探索し、次いで、Ｔ４−４を、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｎｅｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）の存在下で、室温で暗所に３０分間置いて、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。１００μｌの０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加した後反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０１７１】
上記実施例は、本発明を説明するために提供されるが、その範囲を制限するものではない。本発明の他の変法は当業者に容易に明らかであり、かつ添付の特許請求の範囲によって包含される。本明細書において引用する全ての刊行物、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許および特許出願は、本明細書によって参考として援用される。
【０１７２】
（配列表）
【０１７３】
【化２３】
2007503845.tif 000025
【０１７４】
【化２４】
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【０１７５】
【化２５】
2007503845.tif 000027
【０１７６】
【化２６】
2007503845.tif 000028
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１はＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のゲノム配列決定後に同定された３種の細胞壁アンカータンパク質の構造を示す。３つのタンパク質の全ては疎水性領域および荷電Ｃ−末端テールに先行するＬＰＱＴＧ識別シグナルを有し、独自の長い繰り返し配列を有する。ＣＷＡはＬＰＱＴＧモチーフの上流の推定細胞壁関連領域を示す。
【図２Ａ】図２ＡはＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のゲノム配列決定から得られた細胞壁アンカー配列（Ｃ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０）を示す。ＣＷＡ２００領域と共にアンカーモチーフに下線が引かれている。ＣＷＡ２００はＬＰＱＴＧモチーフの上流の約２００アミノ酸の推定細胞壁関連領域または推定細胞壁貫通領域を表す。
【図２Ｂ】図２ＢはＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のゲノム配列決定から得られた細胞壁アンカー配列（Ｃ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０）を示す。ＣＷＡ２００領域と共にアンカーモチーフに下線が引かれている。ＣＷＡ２００はＬＰＱＴＧモチーフの上流の約２００アミノ酸の推定細胞壁関連領域または推定細胞壁貫通領域を表す。
【図２Ｃ】図２ＣはＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のゲノム配列決定から得られた細胞壁アンカー配列（Ｃ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０）を示す。ＣＷＡ２００領域と共にアンカーモチーフに下線が引かれている。ＣＷＡ２００はＬＰＱＴＧモチーフの上流の約２００アミノ酸の推定細胞壁関連領域または推定細胞壁貫通領域を表す。
【図３】図３は、ＭＲＳブロス（Ａ）またはＲｏｇｏｓａ  ＳＬブロス（Ｂ）中、３７℃および５％ＣＯ２で培養した場合の、形質転換Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のムタノリシン消化後の、ＳＤＳ抽出可能タンパク質および細胞壁富化画分のウエスタン分析の結果を示す。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離後、これらのタンパク質をｃ−Ｍｙｃに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて探索するために、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングした。
【図４】図４は、Ｒｏｇｏｓａ  ＳＬブロス中で３７℃、５％ＣＯ２で培養した場合の、形質転換Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のムタノリシン消化後の、細胞壁富化画分のウエスタン分析の結果を示す。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離後、ＣＤ４（Ｔ４−４）に対するポリクローナル抗体（ｐＡｂ）で探索するために、タンパク質をＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングした。発現構築物は以下の要素を含んでいた：ｐＯＳＥＬ６５１中のＰ２３プロモーター−ＣｂｓＡシグナル配列（ＣｂｓＡｓｓ）−２Ｄ  ＣＤ４；ｐ２３７中のＣ１４配列のＰ２３プロモーター−ＣｂｓＡｓｓ−２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００−アンカー；ｐＯＳＥＬ２４２中のＣ１９１配列のＰ２３プロモーター−ＣｂｓＡｓｓ−２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００−アンカー；ｐＯＳＥＬ２４９中のＣ３７０配列のＰ２３プロモーター−ＣｂｓＡｓｓ−２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００−アンカー。ＣＷＡ２００は、Ｃ−末端アンカードメインの上流の約２００アミノ酸を表す。
【図５】図５は、２Ｄ  ＣＤ４の分泌または表面固定のために設計したＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３を有するプラスミドのフローサイトメトリー分析の結果を示す。細菌細胞を、ＣＤ４に対する（Ｔ４−４）ウサギｐＡｂで探索し、次いでＦＩＴＣ結合抗ウサギ抗体（Ａ）で探索した。あるいは細菌細胞を、ｍＡｂ  Ｓｉｍ．４で探索し、次いでＰＥ結合抗マウスＩｇＧ（Ｂ）で探索した。コントロールは、未染色細胞またはフルオロクローム結合２次抗体で探索した細胞である。細菌表面へ結合する抗体の基準としての蛍光濃度を、ＦＬＯＷＪＯソフトウエアを用いて計算した。
【図６】図６は、長さが３６アミノ酸であるＣ−末端アンカーモチーフが、２Ｄ  ＣＤ４の表面発現を駆動するのは不十分であることを示す。（Ａ）Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中のネイティブアンカー配列を用いる２Ｄ  ＣＤ４の表面発現用に設計された構築物。（Ｂ）ｐＯＳＥＬ２３８またはｐＯＳＥＬ２３７を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のフローサイトメトリー分析。細菌細胞をＣＤ４に対するｍＡｂ  Ｓｉｍ．４で探索し、次いでフィコエリスリン（ＰＥ）結合抗マウス抗体で探索した。コントロールは無染色細胞またはＰＥ結合２次抗体で探索した細胞である。
【図７】図７は、Ｃ３７０配列中のＬＰＱＴＧ識別シグナルの上流の種々の数の繰り返し細胞壁貫通配列により影響を受ける場合のＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３中における２Ｄ  ＣＤ４の表面発現を示す。正しく折り畳まれた立体構造をとる表面露出２Ｄ  ＣＤ４分子を、以下のプラスミドを有する細菌細胞中のフローサイトメトリー分析のために、ｍＡｂ  Ｓｉｍ．４で探索した：１７５、陰性コントロール；２４９、２．５回反復；２６２、反復なし；２６８、１回反復；２７８、２回反復；２８０、４回反復；２８１、７回反復；２７６、８回反復。
【図８】図８は、ヒト起源の様々な乳酸桿菌種におけるｃ−Ｍｙｃタグ化タンパク質の表面提示を示す。（Ａ）Ｐ２３プロモーターおよびＣｂｓＡシグナル配列（ＣｂｓＡｓｓ）の制御下におけるＣ３７０配列のｃ−Ｍｙｃタグ化ＣＷＡ２００の発現のために設計されたｐＯＳＥＬ２４１の概念図。（Ｂ）形質転換されたＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉおよびＬ．ｃａｓｅｉのムタノリシン消化後の細胞壁富化画分のウエスタン分析。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離後、ｃ−Ｍｙｃに対するｍＡｂで探索するためにタンパク質をＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングした。（Ｃ）ｐＯＳＥＬ２４１を有するヒト膣の乳酸桿菌単離物のフローサイトメトリー分析。細菌細胞をｃ−Ｍｙｃに対するｍＡｂで探索し、次いでフィコエリスリン（ＰＥ）結合抗マウス抗体で探索した。コントロールは、非染色細胞またはＰＥ結合２次抗体で探索した細胞から構成された。
【図９】図９は、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３中の２Ｄ−ＣＤ４−ＣＷＡ２００の表面提示上のＣ１４配列およびＣ３７０配列のＬＰＱＴＧモチーフにおける点突然変異の効果を示す。細菌細胞を、あらかじめ力価を測定したｍＡｂ  Ｓｉｍ．４（Ａ）またはｐＡｂ  Ｔ４−４（Ｂ）を用いて表面染色し、次いでＰＥ結合抗マウス抗体またはＦＩＴＣ結合抗ウサギ抗体で探索した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒシステム中で行った。ｐＯＳＥＬ２３７およびｐＯＳＥＬ２４９の細胞表面上に提示されたタンパク質と、突然変異誘発性構築物を有する細菌細胞中のタンパク質との間の差を、平均蛍光強度で表した。ｐＯＳＥＬ２３７またはｐＯＳＥＬ２４９を有する細菌細胞中の２Ｄ  ＣＤ４の表面提示を、任意に１００％と設定した。
【図１０】図１０は、Ｃ１４配列およびＣ３７０配列のＣ−末端荷電テール中の欠失構築物の概念図を示す。
【図１１】図１１は、２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００の表面提示上のＣ１４およびＣ３７０のＣ−末端荷電テール中の配列欠失の影響を示す。細菌細胞をあらかじめ力価を測定したｐＡｂ  Ｔ４−４（Ａ）またはｍＡｂ  Ｓｉｍ．４（Ｂ）を用いて表面染色し、次いでＦＩＴＣ結合抗ウサギまたはＰＥ結合抗マウス抗体で探索した。細胞壁アンカータンパク質への抗体の結合をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒシステムを用いるフローサイトメトリーで分析した。ｐＯＳＥＬ２３７またはｐＯＳＥＬ２４９の細胞表面上に提示されるタンパク質と、突然変異誘発構築物を有する細菌細胞中のタンパク質との間の差を、平均蛍光強度として表した。ｐＯＳＥＬ２３７およびｐＯＳＥＬ２４９を有する細菌細胞中の２Ｄ  ＣＤ４の表面提示を、任意に１００％と設定した。
【図１２】図１２は、ｐＯＳＥＬ６５１を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３由来の２Ｄ  ＣＤ４に対する、ｐＯＳＥＬ２３７−７およびｐＯＳＥＬ２４９−１０を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３中の分泌２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００の活性の比較を示す。無細胞馴化培地中で正しく、適切に折り畳まれた立体構造をとるタンパク質を認識するために、ＣＤ４  ＥＬＩＳＡを設計した。タンパク質量を、そのｐＡｂ  Ｔ４−４に対する免疫応答性に基づいて正規化した。ｐＯＳＥＬ６５１を有する細菌細胞から放出される可溶性２Ｄ  ＣＤ４タンパク質を、任意に１００％に設定した。
【図１】
2007503845.tif 000029
【図２Ａ】
2007503845.tif 000030
【図２Ｂ】
2007503845.tif 000031
【図２Ｃ】
2007503845.tif 000032
【図３】
2007503845.tif 000033
【図４】
2007503845.tif 000034
【図５】
2007503845.tif 000035
【図６】
2007503845.tif 000036
【図７】
2007503845.tif 000037
【図８】
2007503845.tif 000038
【図９】
2007503845.tif 000039
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年10月4日(2005.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現カセットを含む乳酸杆菌属細菌であって、該発現カセットはシグナル配列および生物活性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に結合するプロモーターを含み、該生物活性ポリペプチドは異種カルボキシル末端細胞壁標的領域と結合し、該異種カルボキシル末端細胞壁標的領域は、以下の順番で、以下：
細胞壁関連配列；
ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）；および
疎水性配列、
を含む、乳酸杆菌属細菌。
【請求項２】
前記細胞壁関連配列が、少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項３】
前記細胞壁関連配列が、少なくとも２００個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項４】
前記異種カルボキシル末端細胞壁標的領域が、該領域のカルボキシル末端において、荷電した配列をさらに含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項５】
前記乳酸杆菌属細菌が、膣コロニー形成株である、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項６】
前記乳酸杆菌属細菌が、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、およびＬ．ｃａｓｅｉからなる群より選択される、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項７】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＳＧ（配列番号１１）を含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項８】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＡＧ（配列番号１２）を含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項９】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＴＧ（配列番号１３）を含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１０】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＴＡ（配列番号１４）を含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１１】
前記細胞壁標的領域が、配列番号７を含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１２】
前記細胞壁標的領域が、配列番号８を含む、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１３】
前記生物活性ポリペプチドが、細菌の細胞壁において発現される、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１４】
前記生物活性ポリペプチドが、１０アミノ酸と６００アミノ酸との間である、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１５】
前記生物活性タンパク質が病原体と接触する場合、該生物活性タンパク質が該病原体と結合する、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１６】
前記病原体が、細菌病原体である、請求項１５に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１７】
前記病原体が、真菌病原体である、請求項１５に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１８】
前記病原体が、ウイルス病原体である、請求項１５に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項１９】
前記ウイルス病原体が、ＨＩＶである、請求項１８に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２０】
前記生物活性タンパク質が、ＣＤ４またはＣＤ４のＨＩＶ結合フラグメントである、請求項１９に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２１】
前記生物活性タンパク質が、２Ｄ−ＣＤ４である、請求項１９に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２２】
前記生物活性タンパク質が、シアノビリン−Ｎまたはシアノビリン−Ｎのウイルス結合フラグメントである、請求項１８に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２３】
前記ウイルス病原体が、単純疱疹ウイルスである、請求項１８に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２４】
前記生物活性タンパク質が、単純疱疹ウイルス侵入媒体Ｃ（ＨｖｅＣ）であるか、またはＨｖｅＣのウイルス結合フラグメントである、請求項１８に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２５】
前記生物活性ポリペプチドが、乳酸杆菌属細菌から放出される、請求項１に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２６】
前記生物活性ポリペプチドが、乳酸杆菌属細菌の細胞壁に固定される、請求項４に記載の乳酸杆菌属細菌。
【請求項２７】
乳酸杆菌属細菌の細胞壁中において生物活性ポリペプチドを発現する方法であって、該方法は、以下：
発現カセットを含む乳酸杆菌属細菌を提供する工程であって、該発現カセットは、シグナル配列および生物活性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に結合するプロモーターを含み、該生物活性ポリペプチドは異種カルボキシル末端細胞壁標的領域と結合し、そして該異種カルボキシル末端細胞壁標的  領域は、以下の順番で、以下：
細胞壁関連配列；
ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）；および
疎水性配列
を含む、工程；ならびに
該ポリペプチドの発現を誘導するための条件下で細菌を培養する工程であって、該工程により、乳酸杆菌属細菌の細胞壁中で生物活性ポリペプチドを発現する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記細胞壁関連配列が、少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞壁関連配列が、少なくとも２００個のアミノ酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記異種カルボキシル末端細胞壁標的領域が、該領域のカルボキシル末端において、荷電した配列をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記提供する工程が、前記発現カセットを前記細菌中に輸送する工程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＳＧ（配列番号１１）を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＡＧ（配列番号１２）を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＴＧ（配列番号１３）を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞壁標的領域が、アミノ酸配列ＬＰＱＴＡ（配列番号１４）を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞壁標的領域が、配列番号７を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞壁標的領域が、配列番号８を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞壁標的領域が、少なくとも２００個のアミノ酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記乳酸杆菌属細菌が、膣コロニー形成株である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記乳酸杆菌属細菌が、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、およびＬ．ｃａｓｅｉからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物活性ポリペプチドが、１０アミノ酸と６００アミノ酸との間である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】
前記生物活性タンパク質が病原体と接触する場合、該生物活性タンパク質が該病原体に結合する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
前記病原体が、細菌病原体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記病原体が、真菌病原体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記病原体が、ウイルス病原体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルス病原体が、ＨＩＶである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物活性タンパク質が、ＣＤ４またはＣＤ４のＨＩＶ結合フラグメントである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記生物活性タンパク質が、２Ｄ−ＣＤ４である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記生物活性タンパク質が、シアノビリン−Ｎまたはシアノビリン−Ｎのウイルス結合フラグメントである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記ウイルス病原体が、単純疱疹ウイルスである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記生物活性タンパク質が、単純疱疹ウイルス侵入媒体Ｃ（ＨｖｅＣ）またはＨｖｅＣのウイルス結合フラグメントである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記生物活性ポリペプチドが、乳酸杆菌属細菌から放出される、請求項２７に記載の方法。
【請求項５３】
前記生物活性ポリペプチドが、乳酸杆菌属細菌の細胞壁に固定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項５４】
生物活性タンパク質を哺乳動物粘膜表面に提供する方法であって、該方法は、以下：
粘膜表面と、異種カルボキシル末端細胞壁標的領域に結合された生物活性ポリペプチドに結合されたシグナル配列を発現するように組み換えで変化した乳酸杆菌属細菌とを、接触させる工程を包含し、該異種カルボキシル末端細胞壁標的領域は、以下の順番で、以下：
細胞壁関連配列；
ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）；および
疎水性配列
を含み、
ここで、該生物活性ポリペプチドは、該粘膜表面から収集されたサンプル中で、検出可能な量で発現される、方法。
【請求項５５】
前記細胞壁関連配列が、少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞壁関連配列が、少なくとも２００個のアミノ酸を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記異種カルボキシル末端細胞壁標的領域が、該領域のカルボキシル末端において、荷電した配列をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記乳酸杆菌属細菌が、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、およびＬ．ｃａｓｅｉからなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記粘膜表面が、膣内に存在する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
前記粘膜表面が、胃腸管内に存在する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記接触させる工程が、前記乳酸杆菌属細菌を経口投与する工程を包含する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記接触させる工程が、前記乳酸杆菌属細菌を膣投与する工程を包含する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
前記接触工程が、前記乳酸杆菌属細菌を直腸投与する工程を包含する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
シグナル配列および生物活性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合するプロモーターを含む発現カセットであって、ここで、該生物活性ポリペプチドが、配列番号７または配列番号８に結合する、発現カセット。
【請求項６５】
請求項６４に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
（発明の背景）
グラム陽性菌におけるペプチドグリカンとの共有結合を介するタンパク質の表面発現は、独自の識別信号とソルターゼ依存性機構とに関与する  （Ｍａｚｍａｎｉａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７６０−７６３（１９９９））。最も良く研究されたシステムの一つは、Ｍ６構造タンパク質をコードするＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのｅｍｍ６遺伝子である（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：１６０３−  １６０５（１９９０））。Ｍ６タンパク質は、標示（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）細胞壁識別信号、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ（ＬＰＸＴＧ；配列番号９）モチーフ、それに続く疎水性アミノ酸伸長、および最後に荷電残基を含む配列（ＫＲＫＥＥＮ；配列番号１０）を有し、これは細胞表面保持信号として働く。これらの細胞壁識別モチーフは、Ｓｔａｐｈｌｙｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ、ならびに乳酸杆菌属を含む他のグラム陽性菌において同定されている（ＮａｖａｒｒｅおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：１７４−２２９（１９９９））が、ヒトの膣でコロニーを形成する乳酸杆菌属種においては同定されていない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
いくつかの実施形態では、上記細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＳＧ（配列番号１１）を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＡＧ（配列番号１２）を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＴＧ（配列番号１３）を有する。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＴＡ（配列番号１４）を有する。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、配列番号８を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
いくつかの実施形態では、上記細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＳＧ（配列番号１１）を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＡＧ（配列番号１２）を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＴＧ（配列番号１３）を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＴＡ（配列番号１４）を有する。いくつかの実施形態では、細胞壁標的領域は配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は配列番号８を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
いくつかの実施形態では、細胞壁標的領域はアミノ酸配列ＬＰＱＳＧ（配列番号１１）を含む。いくつかの実施形態では、細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＡＧ（配列番号１２）を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＴＧ（配列番号１３）を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、アミノ酸配列ＬＰＱＴＡ（配列番号１４）を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は、配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、この細胞壁標的領域は配列番号８を含む。いくつかの実施形態では、上記生物活性ポリペプチドは１０〜６００アミノ酸の間である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
（Ｂ．ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ））
配列ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）は乳酸杆菌属の膣関連株において細胞壁標識シグナルとして作用する。モチーフＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）の少なくとも１個のコピーは細胞壁標的領域内にある。モチーフ中の括弧はその位置の別なアミノ酸を示す（例えばＬＰＱＳＧ、ＬＰＱＡＧ、ＬＰＱＴＧ、ＬＰＱＳＡ、ＬＰＱＡＡ、ＬＰＱＴＡ（それぞれ、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１８、および配列番号１９））。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
（Ｃ．疎水性配列）
細胞壁に固定されるポリペプチドのカルボキシル末端は細菌膜（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を貫通するように機能する疎水性領域を含む。疎水性領域は少なくとも約５０％、ある実施形態では少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の疎水性アミノ酸を含む。天然起源疎水性アミノ酸にはアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンが含まれる。グリシン、トレオニンおよびセリンを含む、より疎水性の少ないアミノ酸もこれらの配列の一部を構成し得る（例えばＰａｌｌｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：９７−１０１（２００１）参照）。ソルターゼ様タンパク質の可変ＬＰＸＴＧ（配列番号９）含有基質の間で疎水性配列は一般に長さが約１０〜約３０アミノ酸、場合によっては１３〜２４アミノ酸の間である（Ｐａｌｌｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：９７−１０１（２００１））。典型的な疎水性配列には例えばＣ１４中のＶ１７４０ＧＩＬＧＬＡＩＡＴＶＧＳＬＬＧＬＧＬＶ１７５８（配列番号２０）、およびＣ３７０中のＰ１８７７ＬＴＡＩＧＩＧＬＭＡＬＧＡＧＩＦＡ１８９４（配列番号２１）が含まれる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
（Ｄ．荷電配列）
荷電領域が細胞壁標的タンパク質のカルボキシル末端、代表的には疎水性膜貫通領域の直後に任意に存在し得る。カルボキシル末端荷電領域の存在によりポリペプチドが膜に固定され、その結果膜から解離し培地中へ漏れ出すタンパク質の量が大いに減少する。荷電領域は少なくとも４０％、ある実施形態では少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の荷電アミノ酸を有する。天然起源荷電アミノ酸にはアルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。荷電配列は例えば長さで２〜２０アミノ酸残基の間、ある実施形態では４〜１２または５〜１１アミノ酸の間である。典型的な荷電配列には例えばＣ１９１中のＫ９６９ＫＲＫＥＤ９７４（配列番号２２）、Ｃ１４中のＲ１７６０ＫＫＲＱＫ１７６５（配列番号２３）およびＣ３７０中のＫ１８９５ＫＫＲＫＤＤＥＡ１９０３（配列番号２４）が含まれる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
様々なシグナル配列がポリペプチドの発現を膜、細胞外空間または細胞壁に導くことが知られている（例えばペプチドグリカンへの共有結合付着により）。例示的なシグナル配列にはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓのα−アミラーゼ由来のシグナル配列（ＧｉｒａｕｄおよびＣｕｎｙ、Ｇｅｎｅ、１９８：１４９−１５７（１９９７））またはＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓのＳ−層遺伝子（ｃｂｓＡ）由来のシグナル配列（例えばＭＫＫＮＬＲＩＶＳＡＡＡＡＡＬＬＡＶＡＰＶＡＡ（配列番号２５）またはＭＫＫＮＬＲＩＶＳＡＡＡＡＡＬＬＡＶＡＴＶＳＡ（配列番号２６））が含まれる。シグナル配列は代表的にはポリペプチドのアミノ末端に位置している。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
Ｍ６タンパク質は標示細胞壁識別シグナルであるＬＰＸＴＧ（配列番号９）モチーフと、その後に一続きの疎水性アミノ酸、最後に臨界細胞表面保持シグナルとなる荷電残基（ＫＲＫＥＥＮ；配列番号１０）を有する。２個の良く性質が分かったＳ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓのＭ６タンパク質（ｅｍｍ６）またはＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉのＰｒｔＰプロテアーゼ由来の細胞壁アンカーモチーフ、またはＳ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓのＭ６タンパク質由来のアンカーモチーフ、さらにＭ６タンパク質の天然配列由来のＮ−末端１００アミノ酸伸長部（ＣＷＡ１００）を利用して、Ｌ．ｊｅｍｓｅｎｉｉ表面にＣＤ４を発現するためのプラスミドベースのモジュールアプローチを本発明者らは最初に試みた。Ｍ６タンパク質と異なり、ＰｒｔＰに対する識別シグナルはＬＰＫＴＡ（配列番号２７）である。大量の２Ｄ  ＣＤ４が馴化培地中に放出されたが、馴化培地中のタンパク質、および細胞壁アンカーとしてのＭ６またはＰｒｔＰまたはＣＷＡ１００を有する修飾Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の細胞壁またはプロトプラスト会合タンパク質プールのウエスタン分析により、検出し得る細胞壁関連２Ｄ  ＣＤ４は見出されなかった。フローサイトメトリー分析でも、陽性の表面露出２Ｄ  ＣＤ４は同定されなかった。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
（推定細胞壁アンカー配列の同定）
Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉのゲノム配列のデータベース検索により、推定細胞壁アンカーモチーフを有する約３０個のコンティグが同定された。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのウエブサイトで利用し得る非冗長データベース中のより詳細な配列相同性検索に基づき、本発明者らはＣ１４，Ｃ１９１およびＣ３７０と名付けられる３個の配列を選択した。それらはそれぞれ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍのＲ１ｐ（Ｔｕｒｎｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：５８５５−５８６３（２００３））、またはストレプトコッカル表面タンパク質のファミリー（Ｗａｓｔｆｅｌｔら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７１：１８８９２−１８８９７（１９９６））であるＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ中の粘膜結合タンパク質（ＲｏｏｓおよびＪｏｎｓｓｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８：４３３−４４２（２００２））、およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中の細胞壁アンカータンパク質（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｅｓｐｌａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：４７７２−４７７８（２０００））と低い配列類似性（２３〜２７％の同一性）を共有していた。３個の配列の全ては疎水性領域に先行するＬＰＱＴＧ（配列番号１３）識別シグナルと、荷電Ｃ末端テイルを有する（図１参照）。これらの特徴はグラム陽性細菌中のソルターゼ認識Ｃ末端細胞壁アンカー配列間に共通である（ＮａｖａｒｒｅおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｖ．６３：１７４−２２９（１９９９））。グラム陽性細菌中に見出されるＬＰＸＴＧ（配列番号９）細胞アンカーモチーフ間で、これらのＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉタンパク質中ではわずか７％のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）配列の一致が見出された。Ｃ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０タンパク質はすべて細胞壁アンカー領域に隣接したタンデム反復ドメインを含み、既知の細胞壁アンカータンパク質中にしばしば存在する構造上の特徴である（ＮａｖａｒｒｅおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｖ．６３：１７４−２２９（１９９９））。Ｃ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０の配列を図２Ａ〜Ｃに示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
（推定細胞壁アンカー配列のエピトープタグ化）
Ｃ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０が異種融合タンパク質をＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉの細胞壁に固定する効率を決定するため、本発明者らは約２００個のアミノ酸を直接的にＬＰＱＴＧ（配列番号１３）識別シグナルのＮ−末端に選んだ。しばしば細胞壁アンカータンパク質中の細胞壁関連（ＣＷＡ）ドメインと定義されるこの領域は、基質配列の保持または延長、従って膜会合ソルターゼによる適切なタンパク質分解性の切断を促進し得る。免疫検出を促進するため、ｃ−Ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号１５）をｐＯＳＥＬ２３９、２４０および２４１それぞれのＣ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０のＣＷＡ２００領域のＮ−末端と融合した。ウエスタンおよびフローサイトメトリー分析を用いて、ｃ−Ｍｙｃタグ化タンパク質が生成され、細胞壁を標的としたかどうかを検討した。ウエスタン分析を行うため、ｐＯＳＥＬ１７５、２３９、２４０および２４１を有する修飾Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉをＭＲＳおよびＲｏｇｏｓａＳＬブロスの両方の中で対数期まで生育させた。次いでβ１−４グリコシル結合を成熟ペプチドグリカン中のグリカン鎖のＭｕｒＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ間で切断するＮ−アセチルムラミダーゼであるムタノリシンで細胞壁を消化した。代表的には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー後に細胞壁アンカータンパク質は大きなスペクトルの断片として移動する（Ｐｅｒｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、１６２４１−１６２４８（２００２））。ｐＯＳＥＬ２３９（Ｃ１４アンカー）および２４１（Ｃ３７０アンカー）を有する細菌細胞中の細胞壁富化画分中のタンパク質のウエスタン分析から、細菌細胞をＭＲＳおよびＲｏｇｏｓａブロスの両方の中で培養した場合、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でｃ−Ｍｙｃタンパク質のラダーを示した（図３）。これらのパターンはｐＯＳＥＬ２４０（Ｃ１９１アンカー）を有する細菌細胞中の細胞壁富化画分中には見られず、試験したＬＰＱＴＧ（配列番号１３）含有配列間で異なったアンカー効率を示している。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
（長さ３６アミノ酸のＣ末端アンカーモチーフのみを経由する融合で発現する２Ｄ  ＣＤ４の表面提示の欠失）
ＬＰＱＴＧ（配列番号１３）シグナル、疎水性領域およびＣ１４またはＣ３７０配列の荷電テールを含む３６アミノ酸Ｃ末端アンカーモチーフが、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の２Ｄ  ＣＤ４の効率的な表面発現を支持するに十分であるかどうかは不明である。この疑問を解決するため、Ｃ１４のＣ末端アンカーモチーフを有するｐＯＳＥＬ２３８、およびＣ３７０のＣ末端アンカーモチーフを有するｐＯＳＥＬ２６２として設計された２個の構築物を調製し、ネガティブコントロール  ｐＯＳＥＬ１７５および６５１、ならびにポジティブコントロールｐＯＳＥＬ２３７を参照して分析した。ｐＡｂ  Ｔ４−４でプローブ後のｐＯＳＥＬ２３８を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の細胞壁富化画分のウエスタン分析で、ｐＯＳＥＬ２３７に類似する梯子状パターンが検出されなかった。さらに、ｐＯＳＥＬ２３８を有する細菌細胞へのｍＡｂ  Ｓｉｍ．４の結合のフローサイトメトリー分析により、ｐＯＳＥＬ１７５を有する細胞中のバックグラウンドコントロールと比較して平均蛍光強度の増加は全く検出されなかった（図６）。同様に、ｐＯＳＥＬ１７５を有する細胞およびポジティブコントロールｐＯＳＥＬ２４９と比較して、ｐＯＳＥＬ２６２を有する細菌細胞のＦＡＣＳ分析は同様な負の結果をもたらした。これらの観察と一致して、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ由来の同様な長さのＣ末端アンカーモチーフを用いた場合、２Ｄ  ＣＤ４の表面発現は行われなかった。このことは特徴的なＬＰＱＴＧ（配列番号１３）モチーフの上流のタンパク質配列が細胞壁固定プロセスに有意に寄与し、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉの細胞壁上に生物活性タンパク質を提示するために必要であることを示唆している。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
（生物活性タンパク質の最適表面提示のための、ＬＰＱＴＧモチーフ上流の反復細胞壁貫通配列の規定の長さの必要性）
天然のＣ３７０配列は、ＬＰＱＴＧ（配列番号１３）モチーフの上流のＣ末端領域中にグラム陽性細菌中の多くの細胞壁アンカータンパク質の特性である８個のほぼ同一の縦列反復を含む（図１）。２．５回反復配列がｐＯＳＥＬ２４９のアンカー配列中に含まれるが、異なった長さの上流配列が表面タンパク質提示を最大にするために使用し得るかどうかは、決定しなければならないことである。従って、Ｃ３７０配列の０、１、２、４、７および８個の反復を有する数個の構築物を調製した。それらはそれぞれ、ｐＯＳＥＬ２６２、２６８、２７８、２８０、２８１および２７６と名付けられた。正しく折り畳まれた立体構造をとる２Ｄ  ＣＤ４分子のレベルを決定するため、形質転換細菌をフローサイトメトリー分析のためにｍＡｂ  Ｓｉｍ．４で探索した（図７）。細菌を有するｐＯＳＥＬ２６２（ゼロ反復）では、平均蛍光強度はネガティブコントロールｐＯＳＥＬ１７５と区別できず、異種タンパク質を適切に表面発現するためには反復配列が必要であることを示唆している。さらに、反復数をｐＯＳＥＬ２６２の０からｐＯＳＥＬ２７８の３へ増加すると、蛍光強度が有意に増加した。反復数をさらに増加しても、蛍光強度は一定のままであった。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の２Ｄ  ＣＤ４の表面発現に対するＬＰＸＴＧ（配列番号９）モチーフの突然変異誘発の効果）
よく研究された細胞壁アンカータンパク質であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのプロテインＡが、ＬＰＥＴＧ（配列番号２８）細胞壁分類モチーフ上で突然変異した場合、ＬＰＱＴＧ（配列番号１３）中のアミノ酸プロリン（Ｐ）をアミノ酸アスパラギン（Ｎ）で置換することによりタンパク質表面提示の効率が減少したが、トレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換は、タンパク質表面提示の効率にほとんど影響がないことが見出された（ＮａｖａｒｒｅおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：１７４−２２９（１９９９））。この研究は、Ｐ残基がＬＰＸＴＧ（配列番号９）モチーフ中でおそらく最も重要な残基であり、Ｔ残基を類似のアミノ酸であるＳで置換し得ることを示した。Ｃ１４およびＣ３７０中のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）モチーフが実際に重要な分類信号であるか否かを決定するため、ＬＰＱＴＧ（配列番号１３）配列中のＰおよびＴの重要性を検討した。Ｃ１４配列およびＣ３７０配列双方上のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）モチーフ内に点突然変異をＰＣＲにより生じさせた。Ｐ残基をアラニン（Ａ）またはアスパラギン（Ｎ）に突然変異させ；アミノ酸Ｔを、Ａ、Ｓまたはグリシン（Ｇ）に突然変異させ；ＬＰＸＴＧ（配列番号９）モチーフ中のアミノ酸ＧをＡに突然変異させた。変化したＬＰＱＴＧ（配列番号１３）モチーフを有するプラスミドをそれぞれｐＯＳＥＬ２３７Ｐ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２３７Ｐ（Ｎ）、ｐＯＳＥＬ２３７Ｔ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２３７Ｔ（Ｇ）、ｐＯＳＥＬ２３７Ｔ（Ｓ）、ｐＯＳＥＬ２３７Ｇ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２４９Ｐ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２４９Ｐ（Ｎ）、ｐＯＳＥＬ２４９Ｔ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２４９Ｔ（Ｇ）、ｐＯＳＥＬ２４９Ｔ（Ｓ）およびｐＯＳＥＬ２４９Ｇ（Ａ）と名付けた。突然変異した構築物を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のウエスタン分析およびフローサイトメトリー分析を行った。親ｐＯＳＥＬ２３７およびｐＯＳＥＬ２４９を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉと比較して、ｐＯＳＥＬ２３７Ｐ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２３７Ｐ（Ｎ）、ｐＯＳＥＬ２４９Ｐ（Ａ）およびｐＯＳＥＬ２４９Ｐ（Ｎ）を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉは、ｐＡｂ  Ｔ４−４による細胞壁富化タンパク質画分のウエスタンブロットにおいて、特徴的な、より高分子量種のスペクトルを示さなかった。一方、２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００融合タンパク質の馴化培地中への分泌は顕著に増加し、２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００融合タンパク質が細胞壁に共有結合していないことを示した。野生型ｐＯＳＥＬ２３７およびｐＯＳＥＬ２４９で観察された結果と同様に、ｐＯＳＥＬ２３７Ｔ（Ｓ）およびｐＯＳＥＬ２４９Ｔ（Ｓ）を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉの細胞壁消化において、より高分子量種の特徴的なスペクトルは明瞭であり、このことは、Ｃ１４およびＣ３７０由来のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）内のアミノ酸Ｔを、Ｓによって効果的に置換し得ることを示唆していた（データ示さず）。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
ＬＰＸＴＧ（配列番号９）の突然変異誘発のＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ表面タンパク質提示に対する効果をさらに決定するため、ｐＯＳＥＬ１７５、６５１、２３７、２４９を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ株と一緒に様々な突然変異構築物をｐＡｂ  Ｔ４−４またはｍＡｂ  Ｓｉｍ．４で探索し、次いでフローサイトメトリーで抗体結合を分析した。ｐＯＳＥＬ２３７を有する細菌細胞と比較してｐＯＳＥＬ２３７Ｐ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２３７Ｐ（Ｎ）を有する細菌細胞、およびｐＯＳＥＬ２４９を有する細菌細胞と比較してｐＯＳＥＬ２４９Ｐ（Ａ）、ｐＯＳＥＬ２４９Ｐ（Ｎ）を有する細菌細胞では平均蛍光強度がかなり減少し、このことは、細胞表面の２Ｄ  ＣＤ４タンパク質の提示が、あったとしても、はるかに少ないことを示していた。しかしながら、ｐＯＳＥＬ２３７Ｔ（Ｓ）、ｐＯＳＥＬ２３７（Ｔ）Ａ、ｐＯＳＥＬ２４９Ｔ（Ｓ）およびｐＯＳＥＬ２４９（Ｔ）Ａを有する細菌細胞の平均蛍光強度はｐＯＳＥＬ２３７および２４９を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉに匹敵し、このことは、ＴをＳまたはＡに置換することが細胞壁固定の効率にほとんど効果がないことを示した（図９）。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリー分析のデータは、Ｃ１４およびＣ３７０のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）モチーフ内に含まれるアミノ酸Ｐは容易に置換され得ないことを示す。対照的に、アミノ酸Ｔは、ＳまたはＡで置換され得、乳酸杆菌属の細胞壁に効率的に固定されるタンパク質を生成する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉにおける２Ｄ  ＣＤ４の表面発現に対するＣ末端正荷電テールの欠失の効果）
グラム陽性細胞壁アンカードメインの特徴の一つは、正に荷電したアミノ酸がタンパク質のＣ末端極に伸びていることである。Ｍ６タンパク質では、この配列（ＫＲＫＥＥＮ；配列番号１０）が重要な細胞表面保持信号として働く。これらの標示配列は、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｌｙｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属、リステリア属および乳酸杆菌属を含む他のグラム陽性細菌でも見出されている（ＮａｖａｒｒｅおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：１７４−２２９（１９９９））。２つの配列ＲＫＫＲＱＫ１７６５（配列番号２３）およびＫＫＫＲＫＤＤＥＡ１９０３（配列番号２４）がそれぞれ、Ｃ１４推定アンカー配列およびＣ３７０推定アンカー配列中の正に荷電したテールとして同定された（図１）。これらの２個の配列が細胞表面保持信号として働くか否かを決めるため、一連の欠失構築物を作製した（図１０）。それらは、それぞれｐＯＳＥＬ２３７−５、ｐＯＳＥＬ２３７−６、ｐＯＳＥＬ２３７−７、ｐＯＳＥＬ２４９−８、ｐＯＳＥＬ２４９−９およびｐＯＳＥＬ２４９−１０と名付けられた。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
（細胞壁アンカーシグナルとしてのＬＰＱＴＧモチーフの柔軟性）
グラム陽性細菌由来のほとんどの細胞壁に固定されたタンパク質は、同じ識別信号ＬＰＸＴＧ（配列番号９）を共有するが、一部タンパク質は、異なったモチーフを有する。例えば、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉのＰｒｔＰに対する識別信号は、ＬＰＫＴＡ（配列番号２７）である（ＨｏｌｃｋおよびＮａｅｓ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：１３５３−１３６４（１９９２））。Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓのプロテインＬおよびヒト血清アルブミン結合タンパク質は、ＬＰＸＡＧ（配列番号２９）のモチーフを共有する（ｄｅ  ＣｈａｔｅａｕおよびＬ．Ｂｊｏｒｃｋ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２１４７−１２１５１（１９９４）；Ｋｅｌｌｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：８６３−８７４（１９９２）；Ｍｕｒｐｈｙら、ＤＮＡ  Ｓｅｑ．４：２５９−２６５（１９９４））。Ｃ１４アンカータンパク質またはＣ３７０アンカータンパク質中でＬＰＱＴＧ（配列番号１３）がＬＰＱＡＧ（配列番号１２）またはＬＰＱＳＧ（配列番号１１）に突然変異した場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にフローサイトメトリーまたはウエスタンブロットで測定した２Ｄ  ＣＤ４の表面提示の減少は僅かであった。しかしながら、以下の証拠に基づくように、これらの配列のみでは、膣由来の乳酸桿菌の細胞壁へタンパク質を固定するには不十分である：１）３６アミノ酸のＣ末端アンカードメイン単独では、ｃ−Ｍｙｃエピトープまたは２Ｄ  ＣＤ４を細胞表面に固定しなかった、２）２００アミノ酸までの上流配列が含まれる場合でさえも、プロトタイプＭ６細胞壁アンカー配列（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのｅｍｍ６遺伝子によりコードされる）は膣由来乳酸桿菌の細胞壁へ異種タンパク質を固定しなかった（本発明者らは、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ由来のＬＰＸＴＡ（配列番号３０）モチーフを用いて同様な結果を見出した）、および３）Ｃ１９１タンパク質は、有効なアンカーではなかった。これらの知見は、Ｃ１４およびＣ３７０のＣＷＡ２００領域内に含まれる他の上流配列もまた、細胞壁固定プロセスに大きく寄与することを示している。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３ゲノム中の細胞壁アンカーモチーフを有するタンパク質配列の同定）
グラム陽性細菌の細胞壁固定タンパク質は、保存的Ｃ末端ＬＰＸＴＧＸ（配列番号３１）モチーフを有する（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：１６０３−１６０５（１９９０））。このヘキサペプチドの後には、アミノ酸の疎水性伸長と、短い荷電テールとがあり停止転送配列として知られる（Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄら、Ｃｅｌｌ、７０：２６７−２８１（１９９２））。さらに、別の独自のＬＰＸＴＡ（配列番号３０）識別モチーフがＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ中で同定された（ＨｏｌｃｋおよびＮａｅｓ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：１３５３−１３６４（１９９２））。ネイティブの細胞壁アンカー配列を同定するため、組み立てられたコンティグ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３の、推定７５％完全なゲノム配列から得られる）の全てのリーディングフレーム中のＬＰＸＴＧ（配列番号９）およびＬＰＸＴＡ（配列番号３０）に類似のモチーフを同定するためのコンピュータースクリプトが作成された。推定細胞壁アンカーモチーフを有する得られたコンティグを、グラム陽性細菌中の細胞壁アンカータンパク質に対する配列相同性に対するＢＬＡＳＴ検索によりさらに検証した。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中の発現カセットの構築）
Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉにおいてアンカータンパク質を都合よく表在化するために、発現カセットを構築し、ｐＯＳＥＬ１７５のＳａｃＩ部位およびＸｂａＩ部位中にサブクローニングした。このカセットは、乳酸杆菌適合性Ｐ２３プロモーター、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓのＣｂｓＡシグナル配列、異種タンパク質をコードするＤＮＡ、およびグラム陽性細菌中の既知、または推定細胞表面タンパク質由来の共有結合性細胞壁アンカードメインを含む４つの構成要素を含む。本発明者らの、一連のプロモーターおよびシグナル配列を有する構築物の詳細な分析により、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ由来のＰ２３プロモーター（ｖａｎｄｅｒ  Ｖｏｓｓｅｎｅｔら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：２４５２−２４５７（１９８７））と、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓのＣｂｓＡ由来のシグナル配列（ＣｂｓＡｓｓ）との組み合わせにより、ｐＯＳＥＬ６５１として設計された構築物中で２Ｄ  ＣＤ４の最高レベルのタンパク質発現が駆動されることが示された（Ｃｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：１１６７２−１１６７７（２００３））。ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｈｅＩ、ＭｆｅＩおよびＸｂａＩを含む独自の制限部位は、それぞれ５’末端から３’末端へと各構成要素の間に置かれた。ＰＣＲによる各構成要素の増幅は、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われた。本研究で詳細に述べられる融合構築物の様々な部分のＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーとしては、以下（配列番号３２〜配列番号３７）が挙げられる：
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
【化４】
2007503845.tif 000046
表面発現のために設計されたタンパク質としては、１０アミノ酸ｃ−Ｍｙｃペプチド（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号１５）およびヒトＣＤ４のＮ末端の２個の細胞外ドメイン（２Ｄ  ＣＤ４）を含む最初の１８３残基が含まれる。２Ｄ  ＣＤ４タンパク質は、好ましい乳酸杆菌コドンの使用に従うように再コード化された。全ての発現構築物は、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中へ形質転換する前にＤＮＡ配列分析により確認された。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉの推定細胞壁アンカー配列へのｃ−Ｍｙｃ融合の構築）
タンパク質発現レベル、および生物活性タンパク質の表面提示のために規定の長さの推定細胞壁アンカー配列を使用することが実行可能であるか否かを決定するため、本発明者らは、最初にエピトープタグ化を選んだ。Ｃ末端分類モチーフの機能を乱さないために、５’末端に１０アミノ酸ｃ−Ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号１５）を含むオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のゲノム由来のＣ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０を含む推定細胞壁アンカー配列のＮ末端にｃ−Ｍｙｃエピトープを融合させた。ｃ−Ｍｙｃ配列をこれらのタンパク質（Ｃ１４、Ｃ１９１またはＣ３７０のＣ末端３０アミノ酸）の細胞壁アンカーモチーフに直接融合するか、またはＣ末端細胞壁アンカードメインを含む配列および様々な長さの隣接上流アミノ酸に融合させた。最も注目すべきは、ｃ−Ｍｙｃが細胞壁アンカードメインと上流アミノ酸（ＣＷＡ２００と命名）とを含む２００アミノ酸配列と融合したことである。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
【化５】
2007503845.tif 000047
期待したサイズを有する全てのＰＣＲ産物をゲルで精製し、ＭｆｅＩおよびＮｈｅＩの両方で消化した。得られた断片を、ＭｆｅＩ／ＮｈｅＩ二重消化ｐＯＳＥＬ６５１と連結し、ｐＯＳＥＬ２３９（Ｃ１４配列のＣＷＡ２００経由）、ｐＯＳＥＬ２４０（Ｃ１９１配列のＣＷＡ２００経由）およびｐＯＳＥＬ２４１（Ｃ３７０配列経由）それぞれの中にｃ−Ｍｙｃ融合体を作製した。得られたプラスミドはＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３中へエレクトロポレーションした。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
（細胞壁固定配列のシャトルベクター中へのサブクローニング）
Ｃ末端ＬＰＱＴＧ（配列番号１３）アンカーモチーフを含む３個の推定表面タンパク質を選び、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３の細胞壁上に外来タンパク質を発現する能力を決定した。これらの表面タンパク質のＣ末端ＬＰＱＴＧ（配列番号１３）ドメインを含むＤＮＡ領域、およびその上流の２００アミノ酸（暫定的にＣＷＡ２００領域と呼ぶ）を、下記の３組のプライマー（配列番号４４〜配列番号４９）によって増幅した：
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
【化６】
2007503845.tif 000048
Ｃ１４アンカードメインの内部ＭｆｅＩ部位とＣ３７０ドメインの内部ＸｂａＩ部位を、酵素的制限の前に部位指向性突然変異誘発により突然変異させた。予期されたサイズのＰＣＲ産物の全てをゲルで精製し、ＭｆｅＩおよびＸｂａＩの両方で消化した。得られた断片を、Ｐ２３−調節性分泌２Ｄ  ＣＤ４を含むＭｆｅＩ／ＸｂａＩ二重消化ｐＯＳＥＬ６５１と連結し、プラスミドｐＯＳＥＬ２３７（Ｃ１４配列のＣＷＡ２００経由）、ｐＯＳＥＬ２４２（Ｃ１９１配列のＣＷＡ２００経由）およびｐＯＳＥＬ２４９（Ｃ３７０配列のＣＷＡ３００経由）をそれぞれ作製した。あるいは、以下の２個のプライマー（配列番号５０および配列番号５１）を用いてＣ１４配列のＣ末端３６アミノ酸アンカーモチーフを、同様にシャトルベクター中にクローニングした。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
【化７】
2007503845.tif 000049
ＤＮＡ配列の検証後に得られたプラスミドの全てを、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉおよびＬ．ｃａｓｅｉ中にエレクトロポレーションした。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
（Ｃ３７０配列の反復細胞壁貫通領域のサブクローニング）
Ｃ３７０ＬＰＱＴＧモチーフの上流の種々の反復細胞壁貫通領域を、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のゲノムＤＮＡから増幅した。各ＰＣＲ反応について同じ３’プライマー（５’−ＣＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＴ−３’；配列番号４９）を、以下の５’プライマー（配列番号５２〜配列番号５６）と対で使用した。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
（推定細胞壁アンカー配列のＬＰＸＴＧ（配列番号９）モチーフの部位指向性突然変異誘発）
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ提供のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて点突然変異を生じさせた。プラスミドｐＯＳＥＬ２３７（Ｃ１４配列のＣＷＡ２００を経由して固定した２Ｄ  ＣＤ４を発現）とプラスミドｐＯＳＥＬ２４９（Ｃ３７０配列のＣＷＡ２００を経由して固定した２Ｄ  ＣＤ４を発現）をテンプレートとして使用した。ＬＰＱＴＧ（配列番号１３）、およびそのＣ１４およびＣ３７０（配列番号５７および配列番号５８）上の隣接配列に対応するヌクレオチド配列に基づき、突然変異誘発プライマーを設計した。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
２３７Ｐ（Ａ）（配列番号５９および配列番号６０）：Ｃ１４のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）上のプロリンをアラニンで置換した。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
【化１０】
2007503845.tif 000050
２３７Ｐ（Ｎ）（配列番号６１および配列番号６２）：Ｃ１４のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）上のプロリンをアスパラギンで置換した。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
【化１１】
2007503845.tif 000051
２３７Ｔ（Ａ）（配列番号６３および配列番号６４）：Ｃ１４のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）上のトレオニンをアラニンで置換した。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
【化１２】
2007503845.tif 000052
２３７Ｔ（Ｇ）（配列番号６５および配列番号６６）：Ｃ１４のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）上のトレオニンをグリシンで置換した。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
【化１３】
2007503845.tif 000053
２３７Ｔ（Ｓ）（配列番号６７および配列番号６８）：Ｃ１４のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）上のトレオニンをセリンで置換した。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
【化１４】
2007503845.tif 000054
２３７Ｇ（Ａ）（配列番号６９および配列番号７０）：Ｃ１４のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）上のグリシンをアラニンで置換した。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
【化１５】
2007503845.tif 000055
２４９Ｐ（Ａ）（配列番号７１および配列番号７２）：Ｃ３７０のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）上のプロリンをアラニンで置換した。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
【化１６】
2007503845.tif 000056
２４９Ｐ（Ｎ）（配列番号７３および配列番号７４）：Ｃ３７０のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）上のプロリンをアスパラギンで置換した。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
【化１７】
2007503845.tif 000057
２４９Ｔ（Ａ）（配列番号７５および配列番号７６）：Ｃ３７０のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）上のトレオニンをアラニンで置換した。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
【化１８】
2007503845.tif 000058
２４９Ｔ（Ｇ）（配列番号７７および配列番号７８）：Ｃ３７０のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）上のトレオニンをグリシンで置換した。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
【化１９】
2007503845.tif 000059
２４９Ｔ（Ｓ）（配列番号７９および配列番号８０）：Ｃ３７０のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）上のトレオニンをセリンで置換した。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
【化２０】
2007503845.tif 000060
２４９Ｇ（Ａ）（配列番号８１および配列番号８２）：Ｃ３７０のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）上のグリシンをアラニンで置換した。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
（推定細胞壁アンカータンパク質の正に荷電したＣ末端配列の欠失の分析）
正に荷電したアミノ酸がＣ１４およびＣ３７０のＣ末端に位置する一連の欠失突然変異体を、ＰＣＲ増幅により作製した。プラスミドｐＯＳＥＬ２３７およびｐＯＳＥＬ２４９を、テンプレートとして使用した。ｐＯＳＥＬ２３７およびｐＯＳＥＬ２４９上の２Ｄ  ＣＤ４配列に相補性のオリゴヌクレオチド（ＣＤ４Ｆ  ５’−ＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＴＴＣＡＣＧＴＣＧＴ−３’；配列番号８３）をフォワードプライマーとして使用した。以下のオリゴヌクレオチド（配列番号８４〜配列番号８９）（制限部位に下線）を、２Ｄ  ＣＤ４  ｃＤＮＡのＣ末端および完全Ｃ１４およびＣ３７０  ＣＷＡ２００配列を増幅するためのリバースプライマーとして使用した：
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
【図１】図１はＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のゲノム配列決定後に同定された３種の細胞壁アンカータンパク質の構造を示す。３つのタンパク質の全ては疎水性領域および荷電Ｃ−末端テールに先行するＬＰＱＴＧ（配列番号１３）識別シグナルを有し、独自の長い繰り返し配列を有する。ＣＷＡはＬＰＱＴＧ（配列番号１３）モチーフの上流の推定細胞壁関連領域を示す。
【図２Ａ】図２ＡはＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のゲノム配列決定から得られた細胞壁アンカー配列（Ｃ１４（配列番号１）、Ｃ１９１（配列番号２）およびＣ３７０（配列番号３））を示す。ＣＷＡ２００領域と共にアンカーモチーフに下線が引かれている。ＣＷＡ２００はＬＰＱＴＧ（配列番号１３）モチーフの上流の約２００アミノ酸の推定細胞壁関連領域または推定細胞壁貫通領域を表す。
【図２Ｂ】図２ＢはＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のゲノム配列決定から得られた細胞壁アンカー配列（Ｃ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０）を示す。ＣＷＡ２００領域と共にアンカーモチーフに下線が引かれている。ＣＷＡ２００はＬＰＱＴＧモチーフの上流の約２００アミノ酸の推定細胞壁関連領域または推定細胞壁貫通領域を表す。
【図２Ｃ】図２ＣはＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のゲノム配列決定から得られた細胞壁アンカー配列（Ｃ１４、Ｃ１９１およびＣ３７０）を示す。ＣＷＡ２００領域と共にアンカーモチーフに下線が引かれている。ＣＷＡ２００はＬＰＱＴＧモチーフの上流の約２００アミノ酸の推定細胞壁関連領域または推定細胞壁貫通領域を表す。
【図３】図３は、ＭＲＳブロス（Ａ）またはＲｏｇｏｓａ  ＳＬブロス（Ｂ）中、３７℃および５％ＣＯ２で培養した場合の、形質転換Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のムタノリシン消化後の、ＳＤＳ抽出可能タンパク質および細胞壁富化画分のウエスタン分析の結果を示す。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離後、これらのタンパク質をｃ−Ｍｙｃに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて探索するために、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングした。
【図４】図４は、Ｒｏｇｏｓａ  ＳＬブロス中で３７℃、５％ＣＯ２で培養した場合の、形質転換Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のムタノリシン消化後の、細胞壁富化画分のウエスタン分析の結果を示す。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離後、ＣＤ４（Ｔ４−４）に対するポリクローナル抗体（ｐＡｂ）で探索するために、タンパク質をＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングした。発現構築物は以下の要素を含んでいた：ｐＯＳＥＬ６５１中のＰ２３プロモーター−ＣｂｓＡシグナル配列（ＣｂｓＡｓｓ）−２Ｄ  ＣＤ４；ｐ２３７中のＣ１４配列のＰ２３プロモーター−ＣｂｓＡｓｓ−２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００−アンカー；ｐＯＳＥＬ２４２中のＣ１９１配列のＰ２３プロモーター−ＣｂｓＡｓｓ−２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００−アンカー；ｐＯＳＥＬ２４９中のＣ３７０配列のＰ２３プロモーター−ＣｂｓＡｓｓ−２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００−アンカー。ＣＷＡ２００は、Ｃ−末端アンカードメインの上流の約２００アミノ酸を表す。
【図５】図５は、２Ｄ  ＣＤ４の分泌または表面固定のために設計したＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３を有するプラスミドのフローサイトメトリー分析の結果を示す。細菌細胞を、ＣＤ４に対する（Ｔ４−４）ウサギｐＡｂで探索し、次いでＦＩＴＣ結合抗ウサギ抗体（Ａ）で探索した。あるいは細菌細胞を、ｍＡｂ  Ｓｉｍ．４で探索し、次いでＰＥ結合抗マウスＩｇＧ（Ｂ）で探索した。コントロールは、未染色細胞またはフルオロクローム結合２次抗体で探索した細胞である。細菌表面へ結合する抗体の基準としての蛍光濃度を、ＦＬＯＷＪＯソフトウエアを用いて計算した。
【図６】図６は、長さが３６アミノ酸であるＣ−末端アンカーモチーフが、２Ｄ  ＣＤ４の表面発現を駆動するのは不十分であることを示す。（Ａ）Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ中のネイティブアンカー配列を用いる２Ｄ  ＣＤ４の表面発現用に設計された構築物。（Ｂ）ｐＯＳＥＬ２３８またはｐＯＳＥＬ２３７を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３のフローサイトメトリー分析。細菌細胞をＣＤ４に対するｍＡｂ  Ｓｉｍ．４で探索し、次いでフィコエリスリン（ＰＥ）結合抗マウス抗体で探索した。コントロールは無染色細胞またはＰＥ結合２次抗体で探索した細胞である。
【図７】図７は、Ｃ３７０配列中のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）識別シグナルの上流の種々の数の繰り返し細胞壁貫通配列により影響を受ける場合のＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３中における２Ｄ  ＣＤ４の表面発現を示す。正しく折り畳まれた立体構造をとる表面露出２Ｄ  ＣＤ４分子を、以下のプラスミドを有する細菌細胞中のフローサイトメトリー分析のために、ｍＡｂ  Ｓｉｍ．４で探索した：１７５、陰性コントロール；２４９、２．５回反復；２６２、反復なし；２６８、１回反復；２７８、２回反復；２８０、４回反復；２８１、７回反復；２７６、８回反復。
【図８】図８は、ヒト起源の様々な乳酸桿菌種におけるｃ−Ｍｙｃタグ化タンパク質の表面提示を示す。（Ａ）Ｐ２３プロモーターおよびＣｂｓＡシグナル配列（ＣｂｓＡｓｓ）ｃ−ＭｙｃタグＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号１５）の制御下におけるＣ３７０配列のｃ−Ｍｙｃタグ化ＣＷＡ２００の発現のために設計されたｐＯＳＥＬ２４１の概念図。（Ｂ）形質転換されたＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉおよびＬ．ｃａｓｅｉのムタノリシン消化後の細胞壁富化画分のウエスタン分析。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離後、ｃ−Ｍｙｃに対するｍＡｂで探索するためにタンパク質をＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングした。（Ｃ）ｐＯＳＥＬ２４１を有するヒト膣の乳酸桿菌単離物のフローサイトメトリー分析。細菌細胞をｃ−Ｍｙｃに対するｍＡｂで探索し、次いでフィコエリスリン（ＰＥ）結合抗マウス抗体で探索した。コントロールは、非染色細胞またはＰＥ結合２次抗体で探索した細胞から構成された。
【図９】図９は、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３中の２Ｄ−ＣＤ４−ＣＷＡ２００の表面提示上のＣ１４配列およびＣ３７０配列のＬＰＱＴＧ（配列番号１３）モチーフにおける点突然変異の効果を示す。細菌細胞を、あらかじめ力価を測定したｍＡｂ  Ｓｉｍ．４（Ａ）またはｐＡｂ  Ｔ４−４（Ｂ）を用いて表面染色し、次いでＰＥ結合抗マウス抗体またはＦＩＴＣ結合抗ウサギ抗体で探索した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒシステム中で行った。ｐＯＳＥＬ２３７およびｐＯＳＥＬ２４９の細胞表面上に提示されたタンパク質と、突然変異誘発性構築物を有する細菌細胞中のタンパク質との間の差を、平均蛍光強度で表した。ｐＯＳＥＬ２３７またはｐＯＳＥＬ２４９を有する細菌細胞中の２Ｄ  ＣＤ４の表面提示を、任意に１００％と設定した。
【図１０】図１０は、Ｃ１４配列およびＣ３７０配列ＬＰＱＴＧ（配列番号１３）のＣ−末端荷電テール（配列番号１６および配列番号１７）中の欠失構築物の概念図を示す。
【図１１】図１１は、２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００の表面提示上のＣ１４およびＣ３７０のＣ−末端荷電テール中の配列欠失の影響を示す。細菌細胞をあらかじめ力価を測定したｐＡｂ  Ｔ４−４（Ａ）またはｍＡｂ  Ｓｉｍ．４（Ｂ）を用いて表面染色し、次いでＦＩＴＣ結合抗ウサギまたはＰＥ結合抗マウス抗体で探索した。細胞壁アンカータンパク質への抗体の結合をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒシステムを用いるフローサイトメトリーで分析した。ｐＯＳＥＬ２３７またはｐＯＳＥＬ２４９の細胞表面上に提示されるタンパク質と、突然変異誘発構築物を有する細菌細胞中のタンパク質との間の差を、平均蛍光強度として表した。ｐＯＳＥＬ２３７およびｐＯＳＥＬ２４９を有する細菌細胞中の２Ｄ  ＣＤ４の表面提示を、任意に１００％と設定した。
【図１２】図１２は、ｐＯＳＥＬ６５１を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３由来の２Ｄ  ＣＤ４に対する、ｐＯＳＥＬ２３７−７およびｐＯＳＥＬ２４９−１０を有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ  １１５３中の分泌２Ｄ  ＣＤ４−ＣＷＡ２００の活性の比較を示す。無細胞馴化培地中で正しく、適切に折り畳まれた立体構造をとるタンパク質を認識するために、ＣＤ４  ＥＬＩＳＡを設計した。タンパク質量を、そのｐＡｂ  Ｔ４−４に対する免疫応答性に基づいて正規化した。ｐＯＳＥＬ６５１を有する細菌細胞から放出される可溶性２Ｄ  ＣＤ４タンパク質を、任意に１００％に設定した。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2007503845.tif 000061
【図２Ａ】
2007503845.tif 000062
【図２Ｂ】
2007503845.tif 000063
【図２Ｃ】
2007503845.tif 000064
【図３】
2007503845.tif 000065
【図４】
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【図５】
2007503845.tif 000067
【図６】
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【図７】
2007503845.tif 000069
【図８】
2007503845.tif 000070
【図９】
2007503845.tif 000071
【図１０】
2007503845.tif 000072
【図１１】
2007503845.tif 000073
【図１２】
2007503845.tif 000074
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月11日(2007.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007503845000001.app
【国際調査報告】
2007503845.tif 000075
2007503845.tif 000076
2007503845.tif 000077