(57)【要約】ｐｔｓＧ、ｐｆｌＢおよびｌｄｈＡ遺伝子に突然変異を含む生物体を供給する工程、そのような生物体にバイオマスを蓄積させる工程、およびそのような生物体に加水分解物を代謝させる工程から成る、工業用グレードの加水分解物からコハク酸を生産する方法を提供する。また、０．６：１から１．３：１の間のコハク酸対基質の比で工業用グレードの加水分解物に含まれる基質からコハク酸を生産することを特徴とする細菌変異体も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
工業用グレードの加水分解物からコハク酸を生産する方法であって、
ａ）ｐｔｓＧ、ｐｆｌＢおよびｌｄｈＡ遺伝子に突然変異を含む生物体を供給する工程；
ｂ）前記生物体にバイオマスを蓄積させる工程；および
ｃ）前記生物体に加水分解物を代謝させる工程；
から成る方法。
【請求項２】
生物体は、大腸菌属、クレブシェラ属、エルウィニア属および乳酸桿菌属から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バイオマスは細胞約１０8〜１０11個／ｍＬの間で蓄積する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工業用グレードの加水分解物は、リグノセルロース加水分解物またはトウモロコシ由来の糖液である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
温度は約２５℃から約４５°Ｃの間で選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
バイオマスは好気性雰囲気で蓄積する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｐＨは約５から約９の間で選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記加水分解物は第１の原料量で含まれており、前記方法は第２の原料量を添加して連続的に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の原料量は、コハク酸濃度が約５０ｇ／Ｌの時に添加される、請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
０．６：１から１．３：１の間のコハク酸対基質の比で工業用グレードの加水分解物に含まれる基質からコハク酸を生産することを特徴とする細菌変異体。
【請求項１１】
基質は、グルコース、ラクトース、ソルビトール、キシロース、アラビノース、マンノース、グロクロン酸、ガラクトース、フルクトースまたはそれらの組み合わせから選択された糖である、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１２】
変異体が、無効なホスホトランスフェラーゼ系、無効なピルビン酸ギ酸リアーゼ系、および無効な乳酸脱水素酵素系を有する、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１３】
無効なホスホトランスフェラーゼ系は点変異の結果である、請求項１２に記載の変異体。
【請求項１４】
変異体はコハク酸を同時に生産するために、１よりも多くの基質を利用することができる、請求項１０に記載の変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコハク酸を生産する発酵方法に関し、より詳細には、多数の糖を利用してコハク酸を主な発酵産物として生産することができる菌株を作成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルボン酸は、多くの化学物質の潜在的な前駆物質となる可能性を有している。例えば、コハク酸は、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）テトラヒドロフランやγ−ブチロラクトンのようなプラスチック前駆物質の原料としての役割を果たし得る。コハク酸に由来する新製品が開発中であり、その最も注目に値すべきものとして、コハク酸とＢＤＯの結合により作成されるポリエステルがある。一般に、コハク酸のエステルは、より有害な溶媒に取って代わることが可能な新しい「環境にやさしい（green ）」溶媒となる可能性を有している。合計で、コハク酸は、毎年１０億ドル（約１０００億円）を超える総市場価額で数百万ポンド（百万ポンドは約４５３．６トン）もの化学物質の前駆物質の役割を果たす可能性を有する。コハク酸に加えて、リンゴ酸やフマル酸のような他の４つの炭素から成るジカルボンも、原料となる可能性を有している。
【０００３】
再生可能な原料からの（この場合発酵プロセスによる）そのようなカルボン酸の生産は、再生不可能な供給源からそのような酸を得るよりエネルギー集約的な方法に取って代わる手段である。コハク酸はプロピオン酸生産菌による嫌気的発酵の中間体であるが、そのようなプロセスは収率および濃度が低い。
【０００４】
バクテロイデス・ルミニコラ（Bacteroides ruminicola）やバクテロイデス・アミロフィルス（Bacteroides amylophilus ）のような嫌気性ルーメン細菌もココハク酸を生産するが、ルーメンの生物体は、発酵プロセスに不安定であるという特徴がある。
【０００５】
非特許文献１で詳細に調べられているように、大腸菌の発酵から酸の混合物が生産されることが長い間知られている。しかしながら発酵されたグルコース各１モルに対し、１．２モルのギ酸、０．１−０．２モルの乳酸、および０．３−０．４モルのコハク酸しか生産されない。そのため、発酵によってカルボン酸を生産する努力では、例えばグルコースのような比較的大量の成長基質が、所望の生成物に変換されない。
【０００６】
特許文献１に概説されている発酵プロセスに使用されているアネロビオスピリルム  スクシニシプロデュセンス  (A. succiniciproducens）のような一部の細菌は、約３５−４０グラム／リットル（ｇ／Ｌ）までの適度なリットルで天然にコハク酸を生産する。アネロビオスピリルム  スクシニシプロデュセンスホスト株は、高濃度の塩類には耐えられず、さらには適度な濃度の生成物によって阻害されるという点で、浸透圧に対する耐性が高くないことが示された。結局、アネロビオスピリルム  スクシニシプロデュセンスは、そのような生物体を使用する処置が酸素不在で行われなければならないという点で、偏性嫌気性菌としての取扱いを提示する。また、接種原の培地調製にはトリプトファンの添加を要する。
【０００７】
コハク酸を生産する本発明者による以前の努力により、変異細菌を単離および利用するに至った。ＡＴＣＣ受入番号２０２０２１として利用可能な変異体は、特許文献２の主題である。この特許文献２は、参照により本明細書に組み込まれるが、その前駆株から自発的に変異するコハク酸生産菌株（ＡＦＰ  １１１）を教示している。このような変異体はグルコースを資源として発酵により成長しコハク酸を高収率で生産することができるが、その前駆株はコハク酸を高収率で生産することできない。しかしながら、このコハク酸生
産法を利用する明らかな欠点は、一つの変異体に制限されていることである。
【０００８】
本発明者による他の努力（特許文献３）により、コハク酸生産が増加した菌株を構築する方法に至った。この方法は、大腸菌のホスホトランスフェラーゼ遺伝子の変化によって該細菌がより多くのコハク酸を生産することを教示している。この方法の欠点は、一つの変化にその方法が制限されていることである。
【特許文献１】米国特許第５，１４３，８３４号
【特許文献２】米国特許再発行出願第０９／４２９，６９３号
【特許文献３】米国特許第６，１５９，７３８号
【非特許文献１】Stokes, J.L. 1949,"Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli" J.Bactoriol. 57:147-158
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
コハク酸を発酵により生産する、一つの変異体や遺伝子に制限されない方法が、当該技術分野において必要とされている。そのような方法は、特定の容易に決定される遺伝子型を有する任意の生物体によって実現されるべきである。そのような方法は、丈夫な生物体（すなわち高いフィードバック阻害閾値を有する生物体）を使用して比較的不活性な状態で行なわれることができるべきであり、精巧な環境制御手段の必要性も除去すべきである。そのような方法は、リグノセルロース材料の加水分解から得られた糖の混合物を利用すると優れた結果を生じさせるはずである。なぜなら、それらの基質はより安価な糖供給源を提供するので、それらの基質の使用によりコハク酸の生産コストを縮小できるからである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、先行技術の欠点の多くを克服するコハク酸の生産方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、高収率のコハク酸を生産する発酵プロセスを提供することにある。本発明の特徴は、そのような方法を可能にするために、複数の変異遺伝子を含むバクテリアのゲノムを利用することである。本発明の利点は、複数の変異体を生産するために容易に細菌を操作することができることである。  代わりに、複数の突然変異を既に含む細菌を、それ以上の操作なしで利用することもできる。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、大量のコハク酸を生産するために細菌を操作するプロセスを提供することにある。本発明の特徴は、細菌における糖代謝の正常な調節の破壊（disruption）である。本発明の利点は、コハク酸を生産する発酵プロセスにおいて比較的高い生成物対成長基質の比（すなわち１：１またはそれより高い比）を促進するために、様々な細菌を操作する能力である。本発明の別の利点は、グルコース代謝者および非グルコース代謝者になる細菌を利用する能力である。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、コハク酸を発酵で生産することにある。本発明の特徴は、変化されたホスホトランスフェラーゼ（ｐｔｓ）系、変化されたピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）系、および変化された乳酸脱水素酵素（ｌｄｈ）系を有する細菌の利用である。本発明の利点は、糖発酵のためにこのような酵素系を使用する多くの属から細菌を得ることができることである。
【００１３】
手短に説明すると、ｐｔｓＧ、ｐｆｌＢおよびｌｄｈＡ遺伝子に突然変異を含む生物体の供給する工程；該生物体にバイオマスを蓄積させる工程；および該生物体に加水分解物を代謝させる工程；から成る工業用グレードの加水分解物からコハク酸を生産する方法を提供する。
【００１４】
また、０．６：１から１．３：１の間（例えば消費された総糖１グラム当たり０．６から１．３グラムの間のコハク酸）のコハク酸対基質の比で工業用グレードの加水分解物に含まれる基質からコハク酸を生産することを特徴とする細菌変異体も提供する。
【００１５】
本発明は、上記のおよび他の目的および利点と共に、図面に例証された本発明の実施態様の以下の詳細な説明からより良く理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明者は、高収率のコハク酸を発酵で生産する方法を開発した。この方法は、選択された生物体がグルコースと非グルコース原料の混合物を使用してコハク酸を生産するように、生物体の異化代謝抑制（catabolite repression ）機構の変化を利用する。
【００１７】
本発明について詳細に説明する前に、本明細書に現れる場合の、以下の定義を提供する。
「ベクター」は、プラスミド、ファージ、またはコスミドのような、自身に付着したＤＮＡセグメントの複製をもたらすようＤＮＡセグメントが付着され得るレプリコンである。
【００１８】
「レプリコン」は、インビボでＤＮＡの複製の自律的単位として機能する、すなわち自身の制御下で複製できる、任意の遺伝因子（例えばプラスミド、染色体、ウイルス）である。
【００１９】
「カセット」は、特定の制限部位でベクターに挿入することができるＤＮＡのセグメン
トのことを指す。ＤＮＡのセグメントは対象のポリペプチドをコードし、カセットおよび制限部位は転写および翻訳に適した読み枠へのカセットの挿入を保証するように設計されている。
【００２０】
細胞は、外因性すなわち異種ＤＮＡが細胞内部に導入された場合に、そのようなＤＮＡによって「形質移入」される。形質移入されたＤＮＡが表現型の変化をもたらした場合に、細胞は外因性すなわち異種ＤＮＡにより「形質転換」される。
【００２１】
「異種」ＤＮＡは、細胞または細胞の染色体部位には本来存在しないＤＮＡのことを指す。好ましくは、異種ＤＮＡはその細胞とは無関係の遺伝子を含む。
「核酸分子」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステル重合型であるか、一本鎖型であっても二本鎖ヘリックスであってもよい、ホスホロチオエートおよびチオエステルのようなその任意のホスホエステル類似体のことを指す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡヘリックス、ＤＮＡ−ＲＮＡヘリックスおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、単に分子の一次構造および二次構造を指すのであって、分子のいかなる特定の三次形式も限定しない。したがって、この用語は、特に線形または環状ＤＮＡ分子（例えば制限断片）、プラスミドおよび染色体に見出される二本鎖ＤＮＡ分子を含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について議論する際、ＤＮＡの非転写鎖（つまりｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿った５’から３’方向の配列のみを与えるという従来の慣習に従って、配列を説明することが可能である。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
【００２２】
核酸分子の一本鎖型が適切な温度および溶液イオン強度の条件下で別の核酸分子にアニールすることができる場合に、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのよう
な別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（前掲のSambrookら参照）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同な核酸の予備的スクリーニングの場合、５５℃のＴmに対応する低いストリンジェンシ
ーのハイブリダイゼーション条件を使用することができる。例えば、５Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、０．２５％  ミルク、およびホルムアミド無含有；または３０％  ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳである。適度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴmに対応する。例えば、４０％  ホルムアミド、５Ｘ
または６Ｘ  ＳＣＣである。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴmに対応する。例えば、５０％  ホルムアミド、５Ｘまたは６Ｘ  ＳＣＣであ
る。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、当該技術分野においてよく知られている変数である、核酸の長さおよび相補の程度に依存して決定される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴmの値は大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定
性（より高いＴmに対応する）は、以下の順に減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮ
Ａ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔmを計算するための方程式が導き出されている。（前掲のSambrookら参照、９．５０−０
．５１）。より短い核酸（すなわちオリゴヌクレオチド）のハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（前掲のSambrookら参照、１１．７−１１．８）。
【００２３】
好ましくは、ハイブリダイズが可能な核酸の最小の長さは少なくとも約１２ヌクレオチ
ドであり、好ましくは少なくとも約１８ヌクレオチドであり、より好ましくは長さは少なくとも約２７ヌクレオチドであり、最も好ましくは約３６ヌクレオチドである。
「相同組換え」は、染色体内のベクターへの外来性ＤＮＡ配列の挿入のことを指す。好ましくは、ベクターは、特定の染色体部位を同族組換えのためのターゲットとする。特定の相同組換えの場合、ベクターは、染色体へのベクターの相補的結合と取り込みを可能にすべく、染色体の配列と相同な十分に長い相同領域を含む。相同領域が長く、また、配列類似性が高いと、相同組換えの効率は増加し得る。
【００２４】
ＤＮＡの「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にインビトロまたはインビボで細胞内でポリペプチドに転写および翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の終止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含み得るが、これらに限定されるわけではない。コード配列が真核細胞での発現を意図されている場合、通常ポリアデニル化シグナルおよび転写終了配列がコード配列の３’に位置するだろう。
【００２５】
転写および翻訳調節配列は、宿主細胞におけるコード配列の発現を提供する、プロモータ、エンハンサー、ターミネータ等のＤＮＡ調節配列である。真核細胞では、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
【００２６】
「プロモータ配列」は細胞内でのＲＮＡボリメラーゼの結合と、下流の（３’方向の）コード配列の転写の開始を可能にするＤＮＡ制御領域である。例えば、プロモータ配列は転写開始部位によってその３’末端で結合され、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルの転写を開始するのに必要な塩基または要素の最小数を含むように上流に（５’方向に）延びる。プロモータ配列内には、（例えばヌクレアーゼＳ１でのマッピングにより好都合に定義される）転写開始部位や、ＲＮＡボリメラーゼの結合の原因であるタンパク結
合領域（コンセンサス配列）が見出される。
【００２７】
ＲＮＡボリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡへと転写している際、コード配列は、細胞内の転写および翻訳調節配列の「制御下」にある。ｍＲＮＡは次にｔｒａｎｓＲＮＡでスプライシングされ、コード配列によってコード化されたタンパク質に翻訳される。
【００２８】
本明細書に使用する場合、用語「配列相同性」は、そのいかなる文法形式でも、スーパーファミリー（例えば免疫グロブリンスーパーファミリー）由来のタンパク質および異なる種由来の相同タンパク質（例えばミオシン軽鎖等）を含む、「共通の進化の起源」を有するタンパク質間の関係のことを指す［Reeckら, Cell, 50:667(1987)］。
【００２９】
従って、用語「配列類似性」は、そのいかなる文法形式でも、共通の進化の起源を共有しないタンパク質の核酸またはアミノ酸配列の間の同一性または一致の程度を指す［Reeckら、1987、前掲］。しかしながら、一般的慣習および本願において、用語「相同」とは
、「高度に」のような副詞で修飾された場合には、配列の類似性のことを指しているのであって、共通の進化の起源でなくてもよい。
【００３０】
ＤＮＡ配列の定義された長さにわたるヌクレオチドのマッチ（一致）が少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、および最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％または９９．９％）である場合、２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同」であるかまたは「実質的に類似」である。実質的に相同である配列は、配列データバンクで利用可能な標準ソフトウェアを使用して配列を比較することにより、または例えば特定の系に対して定義されるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で、同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は当該技術分野における慣用技術である。例えばManiatisら、前項；DNA Cloning, Vols.I&II、前掲；Nucleic Acid Hybridization、前掲を参照のこと）。
【００３１】
同様に、３０％よりも多くのアミノ酸が同一であるか、約６０％よりも多くのアミノ酸が類似（機能的に同一）である場合、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」であるかまたは「実質的に類似」である。好ましくは、類似または相同の配列は、例えばＧＣＧ（Genetics Computer Group,Program Manual for the GCG Package, Version 7, ウィスコン
シン州マジソン）のパイルアッププログラムを使用したアライメントによって同定される。
【００３２】
本明細書で用語「〜に対応する」は、類似性または相同性が測定された分子と正確な位置が同一か異なっているかに関わらず、類似または相同の配列のことを指すために使用されている。したがって、用語「〜に対応する」という用語は配列の類似性を指すのであって、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付け列類同を指しているわけではない。
【００３３】
得られる変異体およびプロトコルでは、１．３：１までのコハク酸対原料比、通常０．９：１のコハク酸対原料比となる。６０ｇ／Ｌから７５ｇ／Ｌの間のコハク酸の蓄積が達成される。典型的なプロトコルの持続時間は７０時間より長く、通常、１２０から１７０時間の間である。例えば、１６０時間後に、７０ｇ／Ｌの収率が得られる。プロセスは約２５℃から約４５℃の間で実行可能であり、好ましい範囲は約３０℃から約３９℃である。約５から約９の間のｐＨが適切であり、より好ましい範囲は約６．１から約７．２の間である。
【００３４】
本発明の変異体は、それらの発酵産物に対する耐性が増大しているため、発酵のプロトコルの特に実行可能な要素である。例えば、フィードバック阻害を引き起こさずに、７２ｇ／Ｌのコハク酸濃度、２２ｇ／Ｌの酢酸濃度、１４ｇ／Ｌのエタノール、８ｇ／Ｌの乳
酸濃度を達成することが可能である。
（原料の詳細）
本発明の方法および変異体の顕著な特徴は、工業原料を直接利用することにある。軽度浸漬水(light steep water、原料を軽く浸漬させた後に残った水の意) 、様々な加水分解法により生産されたリグノセルロース加水分解物、トウモロコシ由来の糖液（例えばコーンスティープリカー）、乳清由来のラクトースおよび他の工業用グレードの糖を含むがそれらに限定されない多くの原料を利用することが可能である。例えば、濃酸加水分解または希酸加水分解、酵素加水分解によって生産されたリグノセルロース加水分解物またはそれらのプロセスの組み合わせによって生産された加水分解物は、すべて適している。また、トウモロコシ由来の糖液も適している。
【００３５】
工業原料は、一般にグルコースと他の糖の混合物であり、最も一般的な非グルコース糖はキシロースである。図２は、本発明の変異体のうちの１つによるグルコースとキシロースの利用を示している。
【００３６】
上記に照らせば、グルコースと非グルコース糖の少なくとも一方を含む原料であればいかなるものでも適している。そのようなものとして、グルコース、ソルビトール、キシロース、アラビノース、マンノース、ラクトース、グロクロン酸、ガラクトース、フルクトースおよびそれらの混合物を含む原料が適している。
（生物体の詳細）
本発明の方法は、生物体の異化代謝抑制機構に変化を含む生物体を利用する。すなわち、本発明者は、細菌のホスホトランスフェラーゼ（ｐｔｓ）系、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）系、および乳酸脱水素酵素（ｌｄｈ）系に変化が存在する場合に、そのような細菌が本発明のコハク酸生産プロセスに使用するのに適していることを見出した。ｐｆｌＡＢおよびｌｄｈＡは、ピルビン酸：ギ酸リアーゼおよび発酵の乳酸脱水素酵素をそれぞれコード化する遺伝子である。
【００３７】
したがって、本発明の発酵プロセスに利用される生物体のタイプに対する唯一の制限は、生物体が元々上記の系を備えていなければならないということである。それらの系に変化を本来的に含んでいる生物体（すなわち自発変異体）や、特異的に変化された生物体を、利用することができる。
【００３８】
細菌が変化される例では、コハク酸収率が全く無いか低い（すなわち供給された成長基質１モル当たり０．５モル未満）発酵菌が、コハク酸収率の高い（すなわち供給された成長基質１モル当たりコハク酸１モル以上）菌に変換される。
【００３９】
発酵でコハク酸を生産できるいかなる細菌も形質導入の候補として適しており、それにはグラム陰性およびグラム陽性の発酵菌が含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましくは、適切な菌株には、大腸菌属（E.coli）、クレブシェラ属（Klebsiella）、エルウィニア属（Erwinia ）および乳酸桿菌属（Lactobacillus ）属が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００４０】
３つのノックアウトを含むよう変化される生物体は、バクテリオファージＰ１を使用して、連続的な形質導入により改変される。標準的なＰ１形質導入プロトコルが利用されるが、代表的なプロトコルはJ.H.Miller, ed. Experiments in Molecular Genetics 1972（Cold Spring Harbor Laboraory, Cold Spring Harboor, N.Y. ）に開示されている。この文献は参照により本明細書に組み込む。この方法を使用して、野生型または野生型に近い細菌株（例えば大腸菌のＣ６００菌株；ＡＴＴＣ受入番号第２３７２４）を使用して、ｐｆｌ、ｌｄｈ、ｐｔｓＧから選択された１つ、２つまたは３つの機能遺伝子を欠く変異体亜株を作成することができる。
「遺伝子ノックアウト」は、細胞内の特定遺伝子の発現をサイレントにするプロセスのことを指す。このサイレンシングプロセスには、例えば、ジーンターゲティングまたはアンチセンスブロッキングが含まれ得る。ジーンターゲティングは、核酸構築物を細胞に導入し、標的遺伝子で特異的に組換えることを指す。核酸構築物は標的とされた遺伝子を不活性化する。不活性化は、コード配列への終止コドンの導入または調節配列への抑制部位の導入であり得る。アンチセンスブロッキングは、標的遺伝子の発現をブロックするようにアンチセンスＲＮＡの合成を導く、発現配列の細胞への取り込みのことを指す。アンチセンスＲＮＡは標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズして発現を阻害する。
【００４１】
本発明で使用することができた３つの突然変異を含む大腸菌菌株の一例を、ＡＦＰ  １８４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ５１３２、２００３年４月９日寄託）と命名した。ＡＦＰ
１８４は、野生型に近い大腸菌株に計画的に挿入されたｐｆｌ欠失、ｌｄｈノックアウト、および、ｐｔｓＧの異なる変異型を有している。ＡＦＰ  ４１５と呼ばれる別の菌株も使用可能である。ＡＦＰ  ４１５は、ｐｔｓＧのノックアウトを有している点でのみＡＦＰ  １８４と異なる。ＡＦＰ  ４１５はＡＦＰ  １８４と同様に機能する。
【００４２】
驚いたことに、また、思いがけず、本発明者は、ＡＦＰ  １８４およびＡＦＰ  ４１５の代謝速度および力価（titer ）が、米国特許第５，７７０，４３５号（現再発行出願第０９／４２９，６９３号）および米国特許第６，１５９，７３８号に開示されているＷ１４８５派生体よりも優れていることを見出した。      
【００４３】
表１は、ＡＦＰ  １８４とＷ１４８５派生体（ＡＦＰ  １１１）によるコハク酸生産の比較を提供する。Ｗ１４８５派生体はかなり精製された原料を利用したが、それでもＡＦＰ  １８４の方が工業用グレードの加水分解物を用いてより高い値を与えたことに注目すべきである。
【００４４】
３つのノックアウトをすべて含む突然変異は、遺伝子異常のうちの１つまたは２つを既に含む細菌を利用し、次に残りのノックアウトを引き起こすことによっても生成可能である。この例では、実行可能な開始生物体はＷ１４８５である。ＡＦＰ  ４００（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ５５８３、２００３年１０月１０日寄託）は計画的に作成された３重ノックアウトである。ＡＦＰ４００はAugust Bock によるｐｆｌ欠失を含み、これはイリノイ大学のDavid Clark によりＷ１４８５に挿入され、ＦＭＪ  １２３を生成する。ＦＭＪ  １２３はP.K.Bunch et al.(1997) Microbiology 143, 187-195 で見出されたプロトコル
に従って作製される。この文献は参照により本明細書に組み込む。ＡＦＰ  ４００もｌｄｈＡノックアウトを含み、これはＦＭＪ１２３に挿入され、ＤＣ１３２７を生成する。ＤＣ１３２７はChatterjee et al, Appl. Environ.Microbiol.67, pp148-154 で見出されたプロトコルに従って作製される。この文献は参照により本明細書に組み込む。Chatterjeeの文献で説明されているように、ＡＦＰ  ４００はｐｔｓＧノックアウトを含んでいる。
【００４５】
【表１】
2007535926.tif 000002
【００４６】
菌株Ｃ６００に３つのノックアウトを導入することにより、３重ノックアウトＡＦＰ４０４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ５１３３、２００３年４月９日寄託）も構築された。ＡＦＰ４０４は、ｐｔｓＧ遺伝子の点変異ではなくｐｔｓＧノックアウトを有する点を除いて、ＡＦＰ１８４に類似している。ＡＦＰ４０４も、約１ｍｏｌ／ｍｏｌのグルコースの収率でコハク酸を生産する。
【００４７】
野生株からの３重突然変異の開発のためのプロトコルは、R.Chatterjeeらの文献に同様に見出される。各ノックアウトの存在を示す典型的な抗生物質マーカとしては、Ｃａｍ、Ｔｅｔ、およびＫａｎが含まれるが、それらに限定されるわけではない。ノックアウトおよび抗生物質マーカを含む新たな大腸菌株であるＡＦＰ  ４００およびＡＦＰ  ４０４は、このように生成した。そのプロトコルは以下の通りである。
（挿入による不活性化ｐｔｓＧ遺伝子の構築および導入）
大腸菌の天然のｐｔｓＧ遺伝子を、該ｐｔｓＧ遺伝子のタンパク質のＮ末端とＣ末端をターゲットとするプライマーを使用して、Ｗ１４８５から調製したゲノムＤＮＡからＰＣＲによりクローニングした。追加のゲノム配列は増幅しないようにした。ｐｔｓＧ遺伝子をｐＪＪ１１８ＥＨベクトルに入れてクローニングし、ｐＪＦｐｔｓＧを生じた。ＥｃｏＲＩで切除したｐＵＣ−４Ｋ（Pharmacia 社）のカナマイシン抵抗カセットを、ｐＪＦｐｔｓＧ中のｐｔｓＧ遺伝子のＭｆｅＩ部位に挿入することにより、該遺伝子を分断し、プラスミドｐＴＳＧＫを生じた。ＮＺＮ  １１１は既にカナマイシン抵抗マーカを含んでいるため、ＳＥ１７５２菌株からのＴｎ１０不活性化ｌｄｈＡ遺伝子をＦＭＪ１２３に形質導入することにより、等価な菌株を構築した。得られた菌株であるＤＣ１３２７は、その生理学的特性がＮＺＮ  １１１と判別不能であった。分断されたｐｔｓＧ遺伝子は、ｐＴＳＧＫで細胞を形質転換することによりＤＣ１３２７に移入された。細胞を、カナマイシンの存在下かつアンピシリンの不在下で約３０世代増殖し、次に、グルコースを含むＬＢプレート上に培養物を播き、嫌気的にインキュベートした。以下の実施例で詳細に説明するように、発酵で成長できたコロニーを精製し、２つの抗生物質に対するその感度をスクリーニングした。
【００４８】
ＡＦＰ４００菌株は、グルコースをコハク酸、酢酸およびエタノールに発酵させる、安定なカナマイシン耐性かつアンピシリン感受性の菌株として単離された。分断されたｐｔｓＧ遺伝子の適切な統合はＰＣＲにより確認された。分断された遺伝子は、該遺伝子のコード領域の外側の約１１０塩基対のフランキング配列に一致するプライマーを使用して、ＡＦＰ４００  ＤＮＡから増幅した。それらの配列は、組み込みベクター中には存在しなかった。得られた産物の大きさは３．０ｋｂであり、これは既知のｐｔｓＧ配列、そのフランキング領域、およびカナマイシン挿入断片から予測された通りであった。産物をＣｌａＩ（カナマイシンカセット中の部位）およびＡｇｅＩ（ｐｔｓＧの中の部位）で消化し
、ｐｔｓＧのＭｆｅＩ部位にカセットを挿入するために期待された断片を生成した（ＣｌａＩに対し１．９５および１．０５ｋｂ、ＡｇｅＩに対し２．３および０．７ｋｂ）。
【００４９】
３つのノックアウトを含むさらに別の菌株であるＡＦＰ４０４も、上記の同じプロトコルを使用して、野生型大腸菌Ｋ１２に近い菌株であるＣ６００から得られる。
ノックアウトの位置は、前掲の文献で既に論じた本発明者の以前の研究（米国特許第６，１５９，７３８号およびChatterjeeら）から既に分かっている。ノックアウトは、抵抗マーカを有するノックアウト遺伝子のコピーを用いて、細胞を形質転換することにより導入される。相同組換えの発生が許容され、これは宿主酵素により促進される。次に、マーカを含む染色体が選択される。ｐｔｓＧノックアウトはこのように導入された。ＰＣＲによるその挿入の証拠は、先に参照によって組込んだChatterjeeらの文献に詳述されている。
（成長の詳細）
本発明者によって作られた３重変異生物体は、偏性嫌気性菌ではない。従って、バイオマスの最初の蓄積は好気的に起こり、その後発酵条件が確立される。この２段階（すなわち、好気性の後に嫌気性）プロセスのプロトコルの利点は図２に示してあり、図２において、コハク酸の生産速度は図１の１段階の嫌気性プロトコルの成長曲線と比較して、はるかに大きくなっている。
【００５０】
一般に、バイオマスが細胞約１０8〜１０11個／ｍＬ（または約２〜５ｇ乾燥細胞重量
／Ｌ）の等価点に達すると、発酵槽は嫌気性になる。研究室では、約６時間後にこの濃度の点に到達した。
【００５１】
工業用のプロトコルでは、発酵槽には、軽度浸漬水とリグノセルロース加水分解物とが装填される。抗生物質は必要な場合には以下の濃度で含めた：カルベニシリン  １００μｇ／ｍｌ、カナマイシン  ３０μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン  １０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール  ３０μｇ／ｍｌ。濃縮ブロス（rich broth）は（１リットル当たり）以下を含んでいた：トリプトン  １０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、および酵母エキス  １ｇ。プレート用の固体培地は１．５パーセント（ｗｔ／ｖｏｌ）Difco Bacto-Agarを含んでいた。最少培地ＥをVogel, H.J.1956 Acetylornithinase in E.coli, J. Biol, Chem. 218:97-103に記述されるように調製した。この文献は参照により本明細書に組み込む。
【００５２】
発酵のための実験条件は以下の通りとした：
発酵による成長を、０．５ｇのＭｇＣＯ3 （発酵中に培地のｐＨを維持するために添加）、抗生物質、および約１０ｇ／Ｌのグルコースを補足した１０ｍｌのＬＢ培地を含む密封した血清チューブ中で行なった。多くの成長基質が利用可能であり、それには糖、糖アルコール、糖酸およびそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されるわけではない。以下の糖を嫌気性成長について５ｇ／Ｌ濃度のグルコースの代わりに試験した：トレハロース、マンノース、フルクトース、ソルビトールおよびグロクロン酸。
【００５３】
嫌気性液体培養用の接種原を、抗生物質を補足したＬＢ培地中で菌株を一晩好気的に成長させることにより準備した。一晩培養物のサンプルを新しい培地に１００倍に希釈し、約１のＡ６００になるまで好気的に成長させた。好気性成長培地には１ｍｌの接種原を接種した。
【００５４】
サンプルを、残っているグルコース（または代わりの糖基質）と生成した発酵産物のレベルの分析のために、適時に密封チューブから無酸素下で除去した。固体培地での嫌気的成長のために、寒天プレートをGas-Pak の使用によって生成したＨ2 −ＣＯ2 雰囲気下で嫌気瓶中で３７℃でインキュベートした。
【００５５】
β−ガラクトシダーゼ活性のプレート分析を使用して、菌株中に正常な異化代謝抑制が存在するか否かをテストした。ＬＢまたはＥ−アガー培地は、利用可能ないくつかの培地のうちの２つである。Ｅ−アガー培地はよく使用される最少栄養培地であり、Vogel, H.J.1956 Acetylornithinase in E.coli, J. Biol, Chem. 218:97-103に記述されている。この文献は参照により本明細書に組み込む。典型的なプロトコルでは、ＬＢまたはＥ−アガー培地は、グルコース  ４ｇ／Ｌ、ラクトース  ４ｇ／Ｌ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）  ３ｍｇ／Ｌ、および抗生物質で補足される。これらの培地を以下、Ｘ−ｇａｌ／グルコースアガーと称する。青いコロニーの形成は、正常な異化代謝抑制が欠如するためにグルコースの存在下でβ−ガラクトシダーゼが発現していることを示した。反対に、白いコロニーの形成は、正常な異化代謝抑制が存在し、したがって二糖類であるラクトースを開裂させるβ−ガラクトシダーゼが存在しないことを示した。
【００５６】
本発明者は、連続プロセスで変異体を利用する方法についても考案した。この連続プロセスでは、培養物が約５０ｇ／Ｌのコハク酸を生産した後で、１ｍＬの混合物をＬＢ培地、グルコースおよびＭｇＣＯ3 を含む新鮮な封入物（enclosure ）に加えるという、反復実験を行なった。この新しい接種原はコハク酸を効果的に生産し続けた。このプロセスを３−４回繰り返し、各回でコハク酸を効率的に生産した。
（実施例１−工業用加水分解物を用いたコハク酸の生産）
ＡＦＰ  １８４を、稲わら由来の実際の加水分解物を備えた発酵槽に入れた。典型的な加水分解物は、商業的に調製されたものであり、濃酸加水分解プロセスによりカリフォルニア州ミッションヴィエホ（Mission Viejo ）のArkenol Inc.社より入手可能なものである。稲わら培地は２つの主な糖成分として約６００ｇ／Ｌのグルコースと１６９ｇ／Ｌのキシロースを含み、それに追加して他の糖を少量含んでいた。実験データを表２および図２に示す。
【００５７】
以下はＡＦＰ  １８４に基づく発酵プロセスのプロトコルである：発酵培地は以下の成分を含んでいた：Difco 酵母エキス  ５ｇ／Ｌ、トリプトン  １０ｇ／Ｌ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4   ２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、Ｋ2 
ＨＰＯ4   ７ｇ／Ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4   ３ｇ／Ｌ、Arkenol の加水分解物  １６．５ｍｇ／Ｌおよびカナマイシン  ３０ｍｇ／Ｌ。工業用の加水分解物は、２つの主な糖成分として約６００ｇ／Ｌのグルコースと１６９ｇ／Ｌのキシロースを含み、それに追加して他の糖を少量含んでいた。抗生物質以外の成分をすべてを備えた培地を２０分間、１２１°Ｃでオートクレーブした。その後、冷却後にカナマイシンを加えた。この発酵培地を、接種原フラスコおよび１リットルの発酵槽の両方のために使用した。
【００５８】
接種原については、５０ｍｇの培地を２５０ｍｇのフラスコに入れ、３０％のグリセリン中で−７０°Ｃで維持しておいた０．２ｍｇのＡＦＰ  １８４保存培養物で接種した。フラスコは３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベータ振とう機で一晩（約１６時間）インキュベートした。その後、フラスコ内容物全体を、３７°Ｃで維持した発酵槽に接種するために使用した。発酵槽中の培地は生物体の速い成長を許容するために空気に曝した。６時間後、必要な細胞量に達成したら、以下の処置を取った：１．嫌気条件を働かせるために空気を遮断した。これによりコハク酸の生産が開始したと思われる。２．０．０３ｍｇ／分の割合で培地に炭酸ガスを散布した。３．キシロースとグルコースで合計５００ｇ／Ｌの濃度となるよう脱イオン水で希釈したＡｒｋｅｎｏｌ加水分解物を含む原料溶液を、発酵槽に加え、発酵培地中、５０ｇ／Ｌの糖の合計濃度を達成した。実験の間に、発酵槽中の糖度が低くなると、コハク酸生産に十分な基質を供給するために、より多くの材料を添加した。細胞がコハク酸を生産するにつれてｐＨは低下した。ｐＨは、自動ｐＨ調整機の作用により、１．５Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3 溶液を添加することによりｐＨ  ６．５に維持した
。サンプルを一定間隔で採取し、光学濃度、グルコース、キシロース、コハク酸、酢酸、
乳酸およびエタノールについて分析した。
【００５９】
【表２】
2007535926.tif 000003
【００６０】
（実施例２−合成糖混合物からのコハク酸の生産）
ＡＦＰ  １８４を合成糖原料と組み合わせて利用して、発酵プロトコルを進行させた。図３に表されるように、コハク酸の生産は８０時間までは迅速であるが、約１４０時間後に６０ｇ／Ｌの最終高さに達する前までは幾分平坦であった。
【００６１】
発酵培地は以下の成分を含んでいた：Difco 酵母エキス  ５ｇ／Ｌ、トリプトン  １０ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4   ２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ
１０ｇ／Ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4    ７ｇ／Ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4   ３ｇ／Ｌ、グルコース  ７．
６ｇ／Ｌ、キシロース  １．８５ｇ／Ｌおよびカナマイシン  ３０ｍｇ／Ｌ。抗生物質以外の成分をすべてを備えた培地を２０分間、１２１℃でオートクレーブした。その後、冷却後にカナマイシンを加えた。この発酵培地を、接種原フラスコおよび１リットルの発酵槽の両方のために使用した。接種原については、５０ｍｇの培地を２５０ｍｇのフラスコ
に入れ、３０％のグリセリン中で−７０°Ｃで維持しておいた０．２ｍｇのＡＦＰ１８４保存培養物で接種した。フラスコは３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベータ振とう機で一晩（約１６時間）インキュベートした。その後、フラスコ内容物全体を、３７℃で維持した発酵槽に接種するために使用した。
【００６２】
発酵槽中の培地は生物体の速い成長を許容するために空気に曝した。６時間後、必要な細胞量に達成したら、以下の処置を取った：
１．嫌気条件を働かせるために空気を遮断した。これによりコハク酸の生産が開始したと思われる。
【００６３】
２．０．０３ｍｇ／分の割合で培地に炭酸ガスを散布した。
３．４００ｇ／Ｌのグルコースと８４ｇ／Ｌのキシロースを含む原料溶液を発酵槽に加え、発酵培地中、５０ｇ／Ｌの糖の合計濃度を達成した。
【００６４】
実験の間に、発酵槽中の糖度が低くなると、コハク酸生産に十分な基質を供給するために、より多くの材料を添加した。細胞がコハク酸を生産するにつれてｐＨは低下した。ｐＨは、自動ｐＨ調整機の作用により、１．５Ｍ  Ｎａ2 ＣＯ3 溶液を添加することによりｐＨ  ６．５に維持した。サンプルは一定間隔で採取し、光学濃度、グルコース、キシロース、コハク酸、酢酸、乳酸およびエタノールについて分析した。
【００６５】
以下の表３および図３は、合成糖混合物の利用により生じたコハク酸生産を示す。
実施例１と実施例２を比較すれば留意されるように、工業用加水分解物が使用された時と合成原料が使用された時とでは、変異体によるコハク酸生産は等価であった（表２および３の１２０および１２２の時点をそれぞれ参照のこと）。この結果は、工業用加水分解物にいかなる有毒物質が内在してもそれがコハク酸収率を低下させないという点で、本発明のプロトコルの丈夫な特徴を示している。
【００６６】
【表３】
2007535926.tif 000004
【００６７】
本発明を、例証した実施態様の詳細を参照しながら説明してきたが、これらの詳細は、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の特徴による、突然変異遺伝子による細菌の形質転換後のコハク酸の生産の増強を示すグラフ。
【図２】本発明の特徴による、３重変異生物体による工業的加水分解物の発酵を示すグラフ。
【図３】本発明の特徴による、３重変異生物体による合成糖の発酵を示すグラフ。
【図１】
2007535926.tif 000005
【図２】
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【図３】
2007535926.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月20日(2007.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
工業用グレードの加水分解物からコハク酸を生産する方法であって、
ａ）ｐｔｓＧ、ｐｆｌＢおよびｌｄｈＡ遺伝子に突然変異を含む生物体を供給する工程；
ｂ）前記生物体にバイオマスを蓄積させる工程；および
ｃ）前記生物体に加水分解物を代謝させる工程；
から成る方法。
【請求項２】
生物体は、大腸菌属、クレブシェラ属、エルウィニア属および乳酸桿菌属から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バイオマスは細胞１０8〜１０11個／ｍＬの間で蓄積する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工業用グレードの加水分解物は、リグノセルロース加水分解物またはトウモロコシ由来の糖液である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
温度は２５℃から４５°Ｃの間で選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
バイオマスは好気性雰囲気で蓄積する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｐＨは５から９の間で選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記加水分解物は第１の原料量で含まれており、前記方法は第２の原料量を添加して連続的に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の原料量は、コハク酸濃度が５０ｇ／Ｌの時に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
０．６：１から１．３：１の間のコハク酸対基質の比で工業用グレードの加水分解物に含まれる基質からコハク酸を生産することを特徴とする細菌変異体。
【請求項１１】
基質は、グルコース、ラクトース、ソルビトール、キシロース、アラビノース、マンノース、グロクロン酸、ガラクトース、フルクトースまたはそれらの組み合わせから選択された糖である、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１２】
変異体が、無効なホスホトランスフェラーゼ系、無効なピルビン酸ギ酸リアーゼ系、および無効な乳酸脱水素酵素系を有する、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１３】
無効なホスホトランスフェラーゼ系は点変異の結果である、請求項１２に記載の変異体。
【請求項１４】
変異体はコハク酸を同時に生産するために、１よりも多くの基質を利用することができる、請求項１０に記載の変異体。
【国際調査報告】
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