(57)【要約】  本発明は局所の、経皮的適用のために、リポソーム中に封入された有効成分を基剤にした製薬学的組成物に関する。該リポソームの内部は、好ましくはドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、フィソスチグミン、ヘプチルフィソスチグミン、フェンセリン、トルセリン、シムセリン、チアトルセリン、チアシムセリン、ネオスチグミン、フペルジン、タクリン、メトリフォネート及びジクロルボスあるいは該化合物の少なくとも１種のエナンチオマー又は誘導体を含有する群からの少なくとも１種のコリンエステラーゼインヒビターを含有する、酸性の、水性媒質を含んでなる。更に、本発明は、皮膚の神経障害性疼痛又は神経障害の結果としての皮膚の感覚機能の喪失の予防及び／又は処置のための、場合により滅菌形態の該組成物の製法並びに更に、表皮中にデポー効果をもつ局所の、経皮的適用のための種々の生薬調製物中への、有効成分を充填されたリポソームの使用、に関する。
2007533666.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
局所の、経皮投与のためのリポソーム中に封入された有効物質を基剤にした製薬学的組成物であって、リポソームがそれらの内部に酸の、水性環境を有し、そしてその中に好ましくはドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、フィソスチグミン、ヘプチルフィソスチグミン、フェンセリン、トルセリン、シムセリン、チアトルセリン、チアシムセリン、ネオスチグミン、フペルジン、タクリン、メトリフォネート及びジクロルボス又はこれらの化合物の少なくとも１種のエナンチオマーもしくは誘導体の群からの少なくとも１種のコリンエステラーゼインヒビターを含有することを特徴とする組成物。
【請求項２】
リポソーム内の水性環境のｐＨが２．５〜５．５の範囲内、特には３．５〜４．５の範囲内にあることを特徴とする、請求項１における組成物。
【請求項３】
リポソーム内の水性環境が有機酸、特にクエン酸を含有することを特徴とする、請求項１又は２における組成物。
【請求項４】
リポソームの外部に中性又はアルカリ性ｐＨ値、好ましくは７〜８のｐＨ、特には７．５のｐＨをもつ環境が存在することを特徴とする、請求項１〜３の１項における組成物。
【請求項５】
リポソームが一枚膜であり、脂質二重層を有することを特徴とする、請求項１〜４の１項における組成物。
【請求項６】
リポソームが少なくとも１４個の炭素原子、好ましくは少なくとも１６個の炭素原子のアシル鎖長をもつリン脂質を含有することを特徴とする、請求項１〜５の１項における組成物。
【請求項７】
リポソームが総脂質の０〜５０モル％、好ましくは３０〜４５モル％の量のコレステロールを含有することを特徴とする、請求項１〜６の１項における組成物。
【請求項８】
リポソームが１５０〜５００ｎｍの範囲内の平均サイズを有することを特徴とする、請求項１〜７の１項における組成物。
【請求項９】
リポソームが脂質１μモル当たり、少なくとも１００、特には１５０〜４００ｎモルの濃度の有効物質を含有することを特徴とする、請求項１〜８の１項における組成物。
【請求項１０】
好ましくは滅菌形態にある、懸濁物、ローション、エマルション、チンキ剤、スプレイ、ゲル、クリーム又は軟膏の形態にあることを特徴とする、請求項１〜９の１項における組成物。
【請求項１１】
内部に酸の水性環境をもつリポソームが酸の水相中へのエタノール液相の注入により自動的に生成され、その後水相が中和されるか又はアルカリ性にされ、そのためリポソームの内部と外部間にｐＨの勾配が形成され、そして、そこで有効物質が
ａ）酸の水相中に存在し、自動的なリポソーム形成過程中にリポソーム中に取り込まれるか又は
ｂ）ベシクル形成が完了して、次にｐＨ勾配に沿ってリポソーム中に移動するまで水相に添加されない、
ことを特徴とする、リポソーム内に封入された有効物質を基剤にした製薬学的組成物を調製する方法。
【請求項１２】
中和又はアルカリ化がリポソーム形成の完了直後に実施されることを特徴とする、請求
項１１における方法。
【請求項１３】
中和又はアルカリ化の前の水相が２．５〜５．５、好ましくは３．５〜４．５のｐＨ値をもち、そしてその後７〜８、好ましくは７．５のｐＨ値を有することを特徴とする、請求項１２における方法。
【請求項１４】
酸の水相が有機酸、特にクエン酸を含有し、そして中和又はアルカリ化がアルカリ性バッファー、特に炭酸ナトリウムで水相を希釈することにより実施されることを特徴とする、請求項１１〜１３の１項における方法。
【請求項１５】
脂質相が少なくとも１４個の炭素原子、好ましくは少なくとも１６個の炭素原子のアシル鎖長をもつリン脂質を含有することを特徴とする、請求項１１〜１４の１項における方法。
【請求項１６】
脂質相が総脂質の０〜５０モル％、好ましくは３０〜４５モル％の量のコレステロールを含有することを特徴とする、請求項１１〜１５の１項における方法。
【請求項１７】
好ましくはドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、フィソスチグミン、ヘプチルフィソスチグミン、フェンセリン、トルセリン、シムセリン、チアトルセリン、チアシムセリン、ネオスチグミン、フペルジン、タクリン、メトリフォネート及びジクロルボスあるいはこれらの化合物の少なくとも１種のエナンチオマー又は誘導体の群からの少なくとも１種のコリンエステラーゼインヒビターが水相中の有効物質として存在するかあるいはリポソーム形成完了後に水相に添加されることを特徴とする、請求項１１〜１６の１項における方法。
【請求項１８】
有効物質を充填されたリポソームを含む製薬学的組成物が好ましくは滅菌形態の、懸濁物、ローション、エマルション、チンキ剤、スプレイ、ゲル、クリーム又は軟膏の形態に調製されることを特徴とする、請求項１１〜１７の１項における方法。
【請求項１９】
皮膚に局所適用するための医薬としての請求項１〜１０の１項における製薬学的組成物の使用。
【請求項２０】
皮膚の神経障害性疼痛又は皮膚の感覚機能の神経障害関連の喪失の予防及び／又は治療のための、皮膚中でデポー効果をもつ医薬の調製のための請求項１〜１０の１項における製薬学的組成物の使用。
【請求項２１】
皮膚の神経障害性疼痛又は皮膚の感覚機能の神経障害関連の喪失の予防及び／又は治療のための、皮膚中にデポー効果をもつ、局所適用のための医薬組成物を調製するための、好ましくはドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、フィソスチグミン、ヘプチルフィソスチグミン、フェンセリン、トルセリン、シムセリン、チアトルセリン、チアシムセリン、ネオスチグミン、フペルジン、タクリン、メトリフォネート及びジクロルボスあるいはこれらの化合物の少なくとも１種のエナンチオマー又は誘導体の群からの少なくとも１種のコリンエステラーゼインヒビターの使用。
【請求項２２】
望ましくない全身の副作用を減少又は回避するための請求項１９〜２１の１項における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリポソーム中のコリンエステラーゼインヒビターを基剤にした製薬学的組成物、そのような組成物の調製及び治療における使用のそれらの可能性に関する。
【背景技術】
【０００２】
中枢の（ｃｅｎｔｒａｌ）コリンエステラーゼインヒビターはアルツハイマー病の症状にもたらされる脳内のコリン作用性伝達経路系の減少した機能を部分的に回復するために、軽度及び中程度のアルツハイマー病の薬物療法のために使用される。近年の研究により、多数のコリンエステラーゼインヒビターは種々の機序によりアセチル−及びブチリルコリンエステラーゼをブロックするのみならずまた、ニューロンのニコチンのアセチルコリン受容体に直接効果を有することが示された。その天然のリガンドがアセチルコリンであるこれらの受容体はコリン作用神経上のみならずまた、セロトニン作用性及びグルタミン酸塩作用性神経系中に認められ、そしてそれらはそこでの関連する神経伝達物質の放出を調節する。
【０００３】
この効果は関連物質の極めて異なる濃度によりもたらされ、受容体の異なる結合部位においてもたらされ、そして、場合によりコリンエステラーゼインヒビター自体の濃度及び／又は同時に存在するアセチルコリン濃度に応じてすら、受容体に対するアセチルコリンの効果の阻害又は昂進をもたらすことができる。
【０００４】
原型的役割は、治療的に有効なコリンエステラーゼの阻害をもたらす濃度において、それはアセチルコリン結合部位と区別可能な結合部位でアロステリックとして調節しているリガンドであるために、この点に関して特に詳細に研究されてきたガランタミンに起因される（非特許文献１及び２参照）。これにより、ガランタミンのコリンエステラーゼ阻害により増加されるアセチルコリン濃度の効果が更に増強される。タクリンも同様に、明らかに受容体の種々の結合部位に結合する（非特許文献３参照）。フィソスチグミン（非特許文献４）及びドネペジルに対しても匹敵する証拠が存在する（非特許文献４参照）。ガランタミンに対しては非コリン作用性抗アポトーシス効果（非特許文献５）並びに神経成長因子（ＮＧＦ）の効果に相当する効果（非特許文献６）もまた報告された（非特許文献５及び６参照）。
【０００５】
これらの研究はその特定のコリン作用性欠陥及び関連する神経変性を伴うアルツハイマー病の処置に関して実施されたが、それらはまた、末梢神経系、特に感覚神経の変性及び疼痛性疾患に対しても非常に重要である。一方、ニコチン及び、ニコチン受容体に対する拮抗効果を有する他の物質の抗侵害受容効果は極めて以前から知られている。他方、糖尿病性感覚神経障害の初期の研究及び急性の神経病巣の症例において、皮膚の罹患領域中のＮＧＦの濃度が著しく減少した。ＮＧＦ又はＮＧＦに密接に結合された、直接に又はコリン作用系により仲介される、それに相当する神経向性活性はここで感覚機能を再生することができると考えられる。しかし、この点に関する研究は、恐らく全身的副作用を伴わずには十分に高い局所のＮＧＦ濃度を達成することができなかったために、余り成功しなかった（非特許文献７参照）。更に、ニコチンアゴニストは高血圧及び神経筋肉麻痺のような副作用のためにこれに関するそれらの治療的有用性に不都合な効果を示した。末梢作用性コリンエステラーゼインヒビターはこれも主として副作用の問題のためにヒトにおける沈痛治療には不適であることが判明した（非特許文献８参照）。
【０００６】
皮膚透過促進剤中に溶解又は分配された有効物質を含有するパッチを基剤にしたコリン
エステラーゼインヒビターの経皮的調製物は周知である。以下の文献：フィソスチグミンに対しては特許文献１〜５、リバスチグミンに対しては特許文献６、ガランタミンに対しては特許文献７そしてフペルジンに対しては特許文献８、はこのような受動経皮系の例として挙げることができる（特許文献１〜８参照）。Ｍｏｒｉｅａｒｔｙ等はコリンエステラーゼインヒビターとしてのメトリフォネート又はその加水分解生成物のジクロルボスに対するそしてヘプチルフィソスチグミンに対するこのような系につき記載している（非特許文献９参照）。フィソスチグミン、チアシムセリン及びチアトルセリンの２種の他の合成誘導体は経皮使用に特に適するものとしてそれらの開発者により明白に記載された。
【０００７】
これらの経皮系はすべて、関連した有効物質の全身投与を必要とする用途を意図された。これらの場合の経皮経路は、有効物質を血流中に緩徐に均一に放出し、そして／又は治療的に最適な血漿レベルが長時間存在し続けるために、経口摂取により起る肝臓内の「一次通過」分解を回避する所望のために選択される。全身的効果は受動拡散により皮膚を透過し、そして皮下の毛細血管により血流中に運搬される有効物質により達成される。有効物質はまた、循環中にこの組織から緩徐に洗浄されるために皮下脂肪組織内に一次的に蓄積又は結合されることができる。ごく僅かな有効物質の貯留が皮膚自体中で意図的にもたらされる。従って、該系は神経変性のために、神経障害性疼痛又は皮膚の感覚機能の減少の処置には適さない。
【０００８】
リポソームは製薬学的物質の制御放出のため（例えば、非特許文献１０中の概説を参照されたい）、特に、特別の経皮「パッチ」系中（例えば、特許文献９及び１０中に公開されたもの）そしてゲル中（特許文献１１）への使用のための手段として知られる（非特許文献１０及び特許文献９、１０及び１１参照）。局所的に適用されるリポソーム中の局所麻酔剤の調製物もまた当業者には知られており、例えば、特許文献１２はテトラカイン、リドカイン等のような通常のナトリウムチャンネルブロッカーを含有するリポソームにつき記載している（特許文献１２参照）。
【０００９】
鎮痛剤としての使用のためのコリンエステラーゼインヒビターのネオスチグミンのリポソーム調製物が記載されている（非特許文献１１参照）が、それは鞘内（すなわち、結合組織内に）投与され、そのため観察された鎮痛効果は中枢効果であった。
【特許文献１】欧州特許第０  ３７６  ０６７号明細書
【特許文献２】欧州特許第０  ３７７  １４７号明細書
【特許文献３】欧州特許第０  ６６７  ７７４号明細書
【特許文献４】欧州特許第０  ５９９  ９５２号明細書
【特許文献５】欧州特許第０  ５１７  ８４０号明細書
【特許文献６】国際公開第９９／３４７８２号パンフレット
【特許文献７】欧州特許第０  ６８０  ３２５号明細書
【特許文献８】国際公開第０１／３２１１５号パンフレット
【特許文献９】国際公開第８７／０１９３８号パンフレット
【特許文献１０】米国特許第５，７１８，９１４号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，０６４，６５５号明細書
【特許文献１２】米国特許第４，９３７，０７８号明細書
【非特許文献１】Ｓａｍｏｃｈｏｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃａｎｄ  Ｓｕｐｐｌ．２０００；１７６：６８−７３
【非特許文献２】Ｄａｌａｓ−Ｂａｉｌａｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００３；６４（５）：１２１７−２６
【非特許文献３】Ｓｖｅｎｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｒｄｂｅｒｇ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  １９９６，７（１３）：２２０１−５
【非特許文献４】Ｏｎｋｏｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９１，２００（３）：６７１−７
【非特許文献５】Ａｒｒｏｙｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００２；３４（１１）：１０５７−６５
【非特許文献６】Ｃａｐｓｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２；９９（１９）：１２４３２−７
【非特許文献７】Ａｎａｎｄ，Ｐｒｏｇ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００４；１４６：４７７−９２
【非特許文献８】Ｇｈｅｌａｒｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  Ａｕｔｏ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｉｎ．Ｉｎ：Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，１９９２
【非特許文献９】Ｍｏｒｉｅａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｉｎｄ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９３；１５（６）：４０７−１２
【非特許文献１０】Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｒｅｐ．２００２；２２（２）：１２９−５０
【非特許文献１１】Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ．２００２；４６（１）：９０−４
【発明の開示】
【００１０】
従って、本発明に従う研究は、パッチの適用の知られた欠点（例えば、パッチの適用のためにできるだけ平らな表面の必要性、可能な皮膚刺激、パッチ中の有効物質の濃度は非常に高くなければならないこと、透過促進剤が皮膚損傷を惹起する可能性があること）及び侵襲的投与法及び他の全身的使用法の欠点、とりわけ必要な高用量に伴う望ましくない全身的副作用、の双方を軽減又は回避するために、ニューロンのニコチン受容体及び／又はＮＧＦ−様ニューロン向性活性に対して知られた効果を有するコリンエステラーゼインヒビターを投与するための方法を見いだすことである。
【００１１】
従って、同時にそれらの全身的摂取を大部分回避しながら、皮膚の感覚神経末端の領域のこのような有効物質の全体的に低い、しかし同時に十分に高い局所用量を可能にする、コリンエステラーゼインヒビターを含有する製薬学的組成物を利用可能にすることが本発明の目的である。
【００１２】
本発明のもう１つの目的は、身体、特に、例えば糖尿病神経障害の症例の足又は三叉神経痛の症例の顔面上へのパッチの使用に適さない「平らでない」部位のいずれにも投与することができる組成物を利用可能にすることである。
【００１３】
本発明のもう１つの目的は、例えば糖尿病において、すでに損傷されているそして／又は脆弱な皮膚の症例において特に重要な、皮膚上に侵軟現象（ｍａｃｅｒａｔｉｏｎ）をもたらさない組成物を利用可能にすることである。
【００１４】
本発明のもう１つの目的は、滅菌製品として調製することができ、そして従って例えば、帯状疱疹の症例における水泡段階又は治癒相においてすら、治療剤として適用することができる組成物を利用可能にすることである。
【００１５】
最後に、本発明の目的はまた、そこから物質が連続的に放出され、そのため全身投与との比較により、より良い生体利用能及びより長い半減期も達成される、皮膚中に有効物質のデポーを形成する組成物を利用可能にすることである。
【００１６】
本発明に従うと、これらの目的はコリンエステラーゼインヒビターの局所投与のためのリポソーム系を利用可能にすることにより達成される。
【００１７】
驚くべきことには、特定の組成及びサイズのリポソーム中にコリンエステラーゼインヒビターを封入し、そして次に経皮的投与に適したガレン製薬系中にこれらのリポソームを調製することにより、該目標を達成することができることが判明した。有効物質を含むリポソームの調製及び充填のための国際公開０２／３６２５７号パンフレットに開示された有効物質の封入の拡大縮小可能な（ｓｃａｌａｂｌｅ）方法は、同時に極めて緩和な工程条件をもちながら、その高い効率のために、特に有利であることが判明した。しかし、先行技術からのリポソームの調製及び充填の他の方法も使用することができる。
【００１８】
発明の詳細な説明
有効物質によるリポソームの充填は２種の主要なカテゴリー：膜を充填すること及びリポソーム内の水相を充填すること、に分類することができる。ガランタミン塩基はエタノールに可溶性であるため、リポソーム膜中への有効物質分子の取り込みを当初試みたが、これは成功しなかった。膜中に封入されず、その代わりに濾過により除去されたガランタミンが多いほど、膜により放出して戻される量が多かった。膜結合ガランタミンと未結合ガランタミンの量はほぼ同量であった。このため、次に、ガランタミンによるリポソーム内の水相を充填することを試みた。この方法は２種の異なる方法：能動充填及び受動充填により実施することができる。ＰＢＳ溶液中ガランタミンＨＢｒ／塩基によるリポソームの受動充填による実験に基づくと、この方法では安定なガランタミン−リポソーム懸濁物を調製することができないことが間もなく判明した。先行の膜の実験におけるように、未封入有効物質を周囲の媒質から除去するや否や、有効物質もまた、リポソームの水性環境から拡散した。
【００１９】
この理由のため、有効物質のガランタミンをもう少し詳細に検討することが必要であった。ガランタミンはドキソルビシンに類似の化学的特性を有し、ｐＨ勾配制御充填によりリポソーム中に封入することができることが見いだされた。この種の能動充填のために最も重要な特徴はリポソームの膜／リポソームの媒質の分配係数である。オクタノール／バッファーの分配係数は物質の膜透過拡散の良好な指標を与え、従って有効物質で充填又は放出プロファイルと関連することが見いだされた。更に、有効物質はプロトン化可能なアミノ基を含有しなければならず、そのため有効物質は低ｐＨで親水性であり、そして中性又はアルカリ性ｐＨで親油性である。
【００２０】
この理論的模型に基づき、種々の脂質組成物を含む（好ましくは長鎖のリン脂質及び低いコレステロール濃度をもつ）リポソームを適当な充填バッファー中で、主としてクエン酸／炭酸ナトリウムバッファー中で調製した。リポソームが低ｐＨで調製された後に、周囲の媒質をアルカリ性にし、この方法でｐＨ勾配を形成した。アルカリ化媒質にガランタミンを添加後、このｐＨ勾配のために有効物質がリポソーム中に移動し、そこでプロトン化され、そしてリポソーム中に安定に留まった。
【００２１】
この方法を使用すると、何よりも先に、充填の度合い又は充填能はリポソーム内とそれを伴わないｐＨ値の比率により決定される。実施された実験において、能動充填されたリポソームに対する文献から知られたものと類似の値が、脂質１μモル当たり２００〜４００ｎモルの範囲内の有効物質／脂質の比率で達成される。充填媒質中の有効物質の濃度の増加は充填能の増加をもたらさなかった。
【００２２】
前記の能動充填はベシクルの形成、有効物質の添加及びアルカリ化からなる３段階の操作である。このため、本発明のもう１つの目標は国際公開第０２／３６２５７号パンフレットに開示された直交流型模型を使用して実施することができる１段階調製法を確立することであった。この目的のために、ガランタミンをクエン酸溶液に溶解し、直交流注入法によりリポソーム中に封入し、そして残留クエン酸溶液を希釈バッファー（クエン酸／炭酸ナトリウム、ｐＨ９．０〜９．５）で直後にアルカリ化した。
【００２３】
下記の実施例においては、とりわけ、有効物質充填リポソームの品質を、特に皮膚透過能に対して、ベシクル膜中のコレステロール含量を単に変更、特に減少することにより改善することができることが示される。更に、３段階及び１段階法からの生成物に対する安定性試験は、生成物の安定性及び品質が６カ月の貯蔵後ですら、双方の生成物中で不変に留まったことを確証する。
【００２４】
必要な又は望ましい場合は、充填能は約１５０〜２００（本明細書に記載の大部分の実験におけるように）から３００〜５００ｎｍに平均リポソームサイズを更に増加することにより増加させることができる。更に、方法の効率、すなわち懸濁物１ｎモル当たりのリポソームに封入された有効物質の量はまた、調製中又はベシクルのその後の濾過時のいずれかに脂質濃度を増加することにより更に改善することができる。
【００２５】
本発明をより良く、具体的に示すために、以下の実施例により更に説明される。実験は有効物質として遊離塩基の形態又はＨＢｒ塩としてのいずれかのガランタミンを使用して実施した。しかし、当業者は本発明の範囲内で、ガランタミンはまた、そのエナンチオマー及び薬理学的に許容できるそのすべての塩の形態で使用することができることを当然理解することができる。同様に、ガランタミン及びそのエナンチオマーの化学的誘導体、例えば国際公開第９６／１２６９２号、第９７／４００４９号及び第０１／７４８２０号パンフレット中に請求された分子は、それらがコリンエステラーゼインヒビター及び／又はニコチン受容体モジュレーターであり、そして／又は神経向性ＮＧＦ−様効果をもたらす限り、リポソームの組成及びサイズをこれらの分子の物理化学的特性に調整することができる本発明の範囲内に包含される。
【００２６】
同様な意味で、これらの物質がコリンエステラーゼインヒビター及び／又はニコチン受容体モジュレーターであり、そして／又は神経向性ＮＧＦ−様効果をもたらす程度まで、ガランタミン及びその塩及び誘導体以外の物質も同様に本発明の範囲内に入ることは当業者に明白である。先行技術の付随説明中に挙げたすべての物質以外に、これらの物質はまた、とりわけ、国際公開第０２／０５９０７４号パンフレットに記載の分子並びに国際公開第０１／７８７２８号及び第０１／９８２７１号パンフレットに記載されたドネペジルの誘導体、とりわけそのフッ素誘導体、ＥＲ−１２７５２８を包含する。
［実施例１］
【００２７】
ガランタミンリポソームの調製及び安定性試験
合成ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，スイス）及びコレステロール（Ｓｏｌｖａｙ，オランダ）を使用してベシクルを調製した。幾つかの実験は、リポソームの膜に正又は負の電荷を導入するために、鶏卵のフォスファチジルグリセロール（Ｅ−ＰＧ、Ｌｉｐｏｉｄ  Ｃｏ．，ドイツ）又はステアリルアミン（Ｓｉｇｍａ、米国）のいずれかを使用して実施した。封入実験における遊離塩基又はＨＢｒ塩としてガランタミン（Ｓａｎｏｃｈｅｍｉａ  ＡＧ、オーストリア）を使用した。バッファー溶液として、炭酸ナトリウムと組み合わせたＰＢＳ（リン酸塩バッファー生理食塩水）又はクエン酸を使用した。
【００２８】
リポソームは好ましくは国際公開第０２／３６２５７号パンフレットに従う、剪断を伴わない直交流注入法により調製した。この方法は極めて再現性が高く、任意の有効物質のリポソーム中への封入を可能にする。この連続的な１段階法は工程条件、特に脂質相に対する注入圧を変えることにより、一定の、前以て選択可能な平均サイズ及びサイズ分布を伴う脂質二重層の膜（「二層」）をもつ一枚膜のリポソームを安定に生成させる。更に、それは決定的に緩和な工程条件下で実施することができ、そして有害な可能性のある溶媒
の使用及び特にベシクル形成のための剪断力の使用を完全に排除させることができる。本方法の他の利点は国際公開第０２／３６２５７号パンフレットに詳細に記載されている。
【００２９】
更に、本方法により、有効物質充填リポソームの形態の、滅菌された又は細菌を含まない生成物をもたらすように、すべての試薬を滅菌又は細菌を含まない形態で調製し、そして殺菌条件下でリポソームの調製及び充填を実施させることができる。
【００３０】
封入ガランタミンの検出は撹拌セル（Ａｍｉｃｏｎ、米国）中の限外濾過及び／又はダイアフィルトレーション（ｄｉｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）後あるいはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ）を通すゲル濾過後のｒｐ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）により実施した。自社のｒｐ−ＨＰＬＣ法は１回の実施で膜成分のコレステロール及び有効成分のガランタミンの定量測定を許す。リポソームのサイズ及びサイズ分布を光子相関分光法（ＰＢＳ）により測定した。
【００３１】
リポソームの調製：
リポソームは好ましくは、直交流法により調製される。図１に示すように、リポソーム調製用装置は直交流注入モジュール１、極性相用容器（注入バッファー２及び希釈バッファー３）、エタノール／脂質溶液用容器４及び窒素コンプレッサー５からなる。直交流モジュール中の注入口は約２５０μｍの口径を有する。脂質の混合物は好ましくは、例えば、ＤＰＰＣリポソームの場合は５０〜５５℃の温度で、脂質又は脂質組成物の選択に従って２５〜６０℃の範囲内の温度で９６％エタノール中で撹拌しながら溶解させる。更に、バッファー溶液は好ましくは、同一温度、例えば、５５℃に加熱する。極性相がポンプ６、例えば、蠕動ポンプにより直交流モジュールを通って押し出される間に、エタノール／脂質溶液が同時に、所望の、前以て設定された温度で極性相中に注入される。
【００３２】
変法１：
ＤＰＰＣ、コレステロール及びステアリルアミン（モル比７：２：１）を９６％エタノール中にガランタミンと一緒に溶解し、ＰＢＳバッファー中に注入する。リポソームの自然の形成後、それらを濾過し、残留物及び濾液の双方をｒｐ−ＨＰＬＣにより分析する。図２に認められるように、ガランタミンはこの方法ではリポソーム中に安定に取り込むことができない。濾液（未封入ガランタミン）及び残留物（リポソームにより封入されたガランタミン）は同様な有効物質濃度を示す。
【００３３】
図２において、
第１の棒グラフは供給ガランタミンの総量を表わし、
第２及び第３の棒グラフは第１の（第２の棒グラフ）及び更なる（第３の棒グラフ）ダイアフィルトレーション後の濾液及び残留物中の有効物質の分布を示す。
【００３４】
変法ＩＩ：
再度、脂質をエタノールに溶解した。負に帯電させたリポソームによる実験のために、ステアリルアミンを鶏卵のフォスファチジルグリセロール（Ｅ−ＰＧ）と置き換えた。エタノール／脂質溶液をＰＢＳ／ガランタミン塩基の溶液又はＰＢＳ／ガランタミンＨＢｒ溶液のいずれか中に注入した。
【００３５】
図３Ａ及び図３Ｂから認められるように、ガランタミンはこのいずれの方法によっても、リポソーム中に満足には封入することができなかった。濾過後、濾液及び残留物中に同量のガランタミンを認めた。
【００３６】
図３Ａ及び図３Ｂにおいて、
第１及び第４の棒グラフは各例における供給ガランタミンの総量を示し、
第２と第３又は第５と第６の棒グラフは最初（第２と第５の棒グラフ）又はもう１回のダイアフィルトレーション（第３と第６の棒グラフ）後の濾液及び残留物中の有効物質の分布を表わす。
【００３７】
変法ＩＩＩ：ｐＨ勾配によるガランタミンのリポソームの外部充填。
【００３８】
脂質（ＤＰＰＣ：コレステロールのモル比＝５５：４５）をエタノールに溶解し、この溶液を３００ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．５〜４．５中に注入した。自然のベシクル形成後、ガランタミンＨＢｒを添加し、溶液を５００ｍＭの炭酸ナトリウムでアルカリ性にした。このようにして、脂質ベシクル（リポソーム）の内部と外部間にｐＨ勾配が形成する。発生する加水分解の問題のために、２．５未満のｐＨ値は余り適さず、そして同様に、ｐＨ勾配が次第に急でなくなるために、５．５を超えるｐＨ値も好ましくない。
【００３９】
図４から認められるように、濾液中のガランタミンの量は残留物中より著しく低く、それは大部分のガランタミンがこのｐＨ勾配に沿ってリポソーム中に移動し、そこでプロトン化され、そしてリポソーム内の酸環境中に留まることを確証する。
【００４０】
図４において、
第１の棒グラフは供給ガランタミンの総量を表わし、
第２及び第３の棒グラフは第１のダイアフィルトレーション後（第２の棒グラフ）又は更なるダイアフィルトレーション後（第３の棒グラフ）の濾液及び残留物中の有効物質の分布を示す。
【００４１】
この生成物を幾つかのアリコートに分割し、安定性を試験した。図５は９週間にわたる生成物の安定性を示す。
【００４２】
ガランタミンによるリポソームの能動充填の運動力学を決定するために、充填操作の時間を研究し、最適充填温度を決定した。ガランタミンの総量は約１５分以内にリポソーム中に移動し、室温（１８〜２２℃）の範囲内のインキュベート温度が有効物質の取り込み及びリポソーム内の有効物質貯留の双方に良好であることを図６から認められる。しかし、２２〜４０℃の範囲内に測定された差は小さく、いずれにしても有意な役割は果たさない。より高温のインキュベート温度の否定的効果は、まず第１に、充填リポソームの安定性に影響を与えるように見え、そこで６０℃の温度では、すでにインキュベートの３時間後に有効物質の喪失が約２０〜２５％の範囲内にある（図６）。
【００４３】
リポソームに封入されるガランタミン量の増加を達成するために、１ｍＬの溶液当たり８〜１０ｍｇのガランタミンを含有する溶液を調製した。しかし、図７から認められるように、過剰のガランタミン（黒色棒グラフ、左側のＹ−軸）は、本実験では脂質１μモル当たり約２００〜３００ｎモルのガランタミンで一定に留まる（三角形の記号間の明るい線、右側のＹ−軸）、有効物質／脂質の比を改善することはできない。従って、ｐＨ勾配に対する能動的な外部の充填の場合の有効な充填量は第１に、勾配に、そしてより小規模には、存在する有効物質の濃度に左右されるように見える。
【００４４】
変法ＩＶ：
前記の結果の最初の評価後、１段階調製法を開発した。脂質（ＤＰＰＣ：コレステロール＝５５：４５モル％）をエタノールに溶解し、溶液をガランタミンＨＢｒ／クエン酸溶液（ｐＨ３．５〜４．５）中に注入し、そこで反応混合物、すなわち生成されるリポソーム懸濁物の希釈及びアルカリ化の目的のために炭酸ナトリウム／クエン酸バッファー溶液（ｐＨ９．０〜９．５）を自然のベシクル形成直後に添加した。このｐＨ勾配を形成することにより、ガランタミンは１段階でリポソーム中に取り込まれるのみならずまた、そこ
に安定に滞留する。このようなリポソームに吸収されたガランタミンの量は、ｐＨ値又はｐＨ勾配に応じて脂質１μモル当たりガランタミン少なくとも１００ｎモルの範囲内で、好ましくは少なくとも１５０〜４００の範囲内、例えば、しばしば３．５のｐＨにおいて２５０〜３５０ｎモルの範囲内にある（図８〜１１）。この生成物は６週間の観察期間中、安定であった（図８参照）。
［実施例２］
【００４５】
変動する脂質組成を伴うリポソーム又はミクロエマルションの形態のガラン
タミン調製物の調製及び比較
本実施例において、脂質として合成ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，スイス）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，スイス）及びコレステロール（Ｓｏｌｖａｙ，オランダ）を使用した。リポソーム封入研究のためのＨＢｒ塩としてガランタミン（Ｓａｎｏｃｈｅｍｉａ  ＡＧ、オーストリア）を使用した。バッファー溶液としてはクエン酸／炭酸ナトリウムを使用した。
【００４６】
能動充填のための第２の可能性として硫酸アンモニウム勾配法を使用した。ベシクル調製のための水相として硫酸アンモニウム溶液及びグルコース溶液を使用した。再度、直交流法を使用した。ゲル濾過による未封入ガランタミンの除去後、有効物質及び脂質含有量双方をｒｐ−ＨＰＬＣにより測定した。リポソームサイズ及びサイズ分布を再度、光子相関分光法（ＰＢＳ）により測定した。
【００４７】
リポソームに加えて、幾つかの加熱周期（８０℃に加熱）を使用する段階的加熱を伴って激しく混合することにより、ミクロエマルションの形態の調製物も調製した。油相としてイソプロピルミリステート（ＩＰＭ）を使用した。乳化剤及び共乳化剤としてＴｗｅｅｎ及びＳｐａｎ２０を使用した。
【００４８】
リポソームのデザイン及び安定性：
リポソームの調製、充填及び分析を実施例１におけるように実施した。ＤＰＰＣ：コレステロールのモル脂質比＝５５：４５をもつリポソームサンプルの安定性試験を継続した。結果は図９Ａ及び図９Ｂに与えられる。
【００４９】
図９Ａは能動法（３段階法）によりガランタミンを有効に充填された第１のリポソームサンプルの安定性データを示す。リポソームは０．３モルのクエン酸の存在下で（ｐＨ３．５〜４．５）調製された。ベシクル形成完了後、ガランタミンを添加し、リポソームの外部の溶液のｐＨを同時に７．５に上げた。リポソームの内部及び外部間に形成されるｐＨ勾配がリポソーム内のＨ＋イオン濃度の関数としてリポソーム中へのガランタミンの取り込みをもたらした。
【００５０】
図９Ｂは同様な組成のリポソームサンプルの安定性のデータを示すが、そこではベシクル形成及びガランタミン充填が１段階法における直交流法を使用して実施された。データはｐＨ勾配及び従ってリポソームに封入されたガランタミンの含量が半年超の期間一定に留まったことを示す。
【００５１】
膜の柔軟性及び関連した皮膚透過性に関して最良のリポソーム調製物を決定するために、異なる脂質組成物を含む種々のリポソーム懸濁物を調製し、試験した。最初に、場合によりコレステロールと組み合わせたリン脂質を使用した。しかし、リン脂質を他の脂質と置き換える又は例えば、糖脂質、セレブロシド、スルファチド又はガラクトシドでそれらを補助することは本発明の範囲内にある。使用することができる脂質の典型的な代表は例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲン、グリセロ糖脂質、セラミド、スフィンゴ糖脂質、中性スフィンゴ糖脂質である。
【００５２】
経皮的適用に重要な膜の流動性を改善するための１つの可能性は、主としてリン脂質のアシル鎖長、コレステロールの量及びリン脂質の飽和度により決定されるリポソームの二重層の相移動を減少させることである。このために、１６個の炭素原子のアシル鎖長をもつリン脂質のＤＰＰＣを約４５〜３１℃の融点ＴＭを有するＤＭＰＣ（鎖長１４個の炭素原子）により置き換えた。
【００５３】
図１０はｐＨ勾配３．５〜７．５及び４．０〜７．５により調製されたリポソーム懸濁物の封入速度を示す。満足な封入速度を達成後（ＤＰＰＣを使用して得たものに匹敵する）、サンプルを取り出し、安定性の試験にかけた（図１０）。
【００５４】
膜の硬直性を減少し、流動性を増加するためのもう１つの可能性は膜中のコレステロール量を減少することである。５５：４５モル％のＤＰＰＣ：コレステロール比（リポソーム充填に対する文献に記載されたように）から出発して、コレステロールの量を総脂質含量に対して３８％から３０％に減少することに成功した。図１１において、より高いコレステロール含量に対する先行技術のデータと比較すると、ガランタミン充填の僅かな減少が存在することを認めることができる。しかし、これらのリポソームは下記に説明されるように、改善された皮膚透過性を示した。図１１はまた、充填リポソームが長期の実験中安定であり、ガランタミンを喪失しないことを示す。
【００５５】
以前の研究からの所見に反し、コレステロールを含まないリポソームはまた、安定に調製することができ、本発明に従ってコレステロール含量が総脂質含量に対して０〜５０モル％の範囲内にあるように、有効物質を充填することに成功した。
【００５６】
リポソームの膜をより柔軟性にさせる第３の可能性は、完全に飽和されたＤＰＰＣ又はＤＭＰＣ脂質を、不飽和リン脂質との天然の脂質混合物である鶏卵のフォスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）と置き換えることである。これらの天然の脂質を使用する時の安定性の問題に加えて、更に、窒素雰囲気下でリポソームを調製することが必要であった。それにも拘わらず、これらのベシクルはベシクルのサイズ及び均一性に関して、又は実施例３〜１０に記載の皮膚透過性の改善に関して良好な結果を与えなかった。
【００５７】
ｐＨ勾配を形成するためのクエン酸／炭酸ナトリウム法の外に、硫酸アンモニウム勾配法もしばしば使用される。この方法により、リポソームが硫酸アンモニウムバッファー（１２５ミリモル）中に形成される。ベシクル形成後、リポソームの外側の硫酸アンモニウム溶液はダイアフィルトレーションにより５％グルコース溶液により置き換えられ、それにより小型の両親媒性分子がリポソーム中に充填され、そこでプロトン化され、他方ＮＨ３は向流中にリポソームから逃避する。この操作はクエン酸／炭酸ナトリウム法より緩和な方法である。
【００５８】
しかし、これらの実験はリポソームを充填するための有効物質としてガランタミンを使用する時には、いずれにしても満足な結果を与えなかった。図１２のデータは、同量の有効物質が残留物及び濾液中に認められたので、ガランタミン封入が失敗したことを示す。所望のｐＨ勾配を形成するために、代わりの、周知の官能的当量の酸／塩基系の使用も本発明の範囲内にあるが、これがリポソーム中へのガランタミンの封入のためにクエン酸／炭酸ナトリウム法が外部の能動充填のために好まれる理由である。従って、クエン酸はもう１つの適当な製薬学的に許容できる酸、例えば、リン酸のような鉱酸により、又は好ましくは、有機酸、特にリンゴ酸、フマル酸、酒石酸、場合によりアスコルビン酸すらのような食用有機酸の群からの１種により置き換えることができると考えられる。同様にして
、炭酸ナトリウムはもう１つの塩基により、特にもう１つのアルカリ又はアルカリ土類炭酸塩又は重炭酸塩により置き換えることができると考えられる。
【００５９】
これに関する「官能的に当量」は、封入された、特にプロトン化された有効物質が本明細書に開示された安定性の基準の意味で、リポソーム中に安定に留まるように、リポソームの脂質二重層を通るｐＨ勾配を実施することができ、そうすることにより、膜の保全性を破壊しない能力を意味すると理解される。
【００６０】
ガランタミンリポソームゲルの調製及び安定性試験：
局所治療剤としてのリポソームのガランタミン組成物の使用のために、リポソームを好ましくは、純粋な懸濁物より皮膚に適用し易いヒドロゲル中に混合する。しかし、ガランタミンリポソームに対して他の生薬調製物、特に液剤、ローション、エマルション、チンキ剤、スプレイ、軟膏、クリームの形態の、あるいは場合により含浸織物生地又は包帯材料の形態の調製物を調製し、そしてそれらを局所適用することもまた本発明の範囲内に入る。種々の生薬調製物を調製するために必要な製薬学的に許容できる補助剤及び添加剤を包含する他の可能性は当業者には周知である。
【００６１】
例えば、非常に低濃度で使用することができるヒドロゲルのＣａｒｂｏｐｏｌ  ９８１ＮＦは先行実験で効果を示した。それは製薬学的使用に承認され、比較的安価でそして大量に入手できる。
【００６２】
以下のリポソームゲルをＦｒａｎｚ拡散セルによる透過研究のために調製した：
ＤＰＰＣ：コレステロール＝５５：４５／ｐＨ３．５
ＤＰＰＣ：コレステロール＝６２：３８／ｐＨ３．５
ＤＰＰＣ：コレステロール＝７０：３０／ｐＨ３．５
ＤＭＰＣ：コレステロール＝５５：４５／ｐＨ３．５
Ｅ−ＰＣ：コレステロール＝６２：３８／ｐＨ３．５
Ｅ−ＰＣ：コレステロール＝７０：３０／ｐＨ３．５。
【００６３】
この目的のために、ベシクル懸濁物を限外濾過により濃縮し、次に撹拌しながら、調製された滅菌ゲル基剤と混合した。この方法で、リポソームのガランタミン濃度を限外濾過により又はゲル基剤の最初の濃縮のいずれかにより変えることができ、それを０．５％のカーボポール濃度にベシクル懸濁物で希釈する。
【００６４】
標準試験を生薬生成工程中の膜損傷によりそして／又は長期の保存期間により惹起された可能性がある、有効物質のあらゆる喪失につき実施した。この目的のために、ゲルをバッファーで希釈し、濾過した。膜の損傷が存在する時は、より大量の放出ガランタミンが濾液中に検出可能であると考えられる。図１３Ａ及び１３Ｂに認められるように、生薬調製期間又は１９週間４℃におけるその後の貯蔵期間のいずれでも有意な量の有効物質は放出されない。有効物質はむしろ、カーボポールヒドロゲルによる生薬調製後ですらリポソーム中に留まり、そしてそれは皮膚試験において同等な透過プロファイルを示し、それはリポソーム及びゲルマトリックス中のｐＨ勾配の双方が正常のままであったことを証明する。
【００６５】
皮膚透過性の比較のために、遊離ガランタミンもまた、正確に同様な方法でヒドロゲルと混合し、試験した。結果は実施例３〜１０に提示される。
【００６６】
代わりの概念：
リポソームの外に、ミクロエマルションもまた、特定の有効物質の局所適用のために近年注目を集めてきている。ミクロエマルションは第３の両性成分により安定化された２種
の相互に混和性の成分の分散物である。しかし、乳化剤及び共乳化剤のような界面活性物質の存在のために、ミクロエマルションは経皮パッチに類似の方法で皮膚を損傷する可能性がある。
【００６７】
前記の文献の研究に従うと、多数のミクロエマルション（表１）を有効物質としてガランタミンとともに調製し、次にＦｒａｎｚ拡散セルによる透過試験にかけた（結果、実施例３〜１０参照）。
【００６８】
【表１】
2007533666.tif 000003
【００６９】
本明細書に記載のすべての実験において、リポソーム膜のコレステロール含量の減少のみが経皮透過性の改善をもたらしたことが判明した。調製されたリポソーム懸濁物及びリポソームゲル調製物は半年超、安定で、生成物の特性に何の変化も示さない。
［実施例３〜１０］
【００７０】
種々の脂質基剤のガランタミン調製物の皮膚透過性試験
Ｆｒａｎｚ拡散セル：
拡散セルはＰｅｒｍｅＧｅａｒ，米国から由来した。装置は撹拌装置のブラケット上に固定され、温度調節のために水浴に接続された、それぞれ水充満二重ジャケットをもつ３個の拡散セルからなった。セル自体は各８ｍＬの受容器容量、０．７８ｃｍ２の表面積をもつ皮膚固定装置及び２ｍＬ容量をもつ供与体室を有した。
【００７１】
皮膚保全性試験：
Ｆｒａｎｚ拡散セル中の試験用にブタの皮膚を使用した。そのままの皮膚表面を確保するために、各皮膚片を実験の前後に試験した。拡散セルの皮膚固定装置上に皮膚を固定後、バッファー２ｍＬを皮膚に適用し、３２±１℃に加熱した。３０分後、皮膚の抵抗性及び皮膚の品質の指標である導電率を測定した。測定値は皮膚の由来、その厚さ、使用されるバッファーシステム及び測定に使用された装置により左右される。幾つかの予備実験に基づき、サンプルの適用前の正常な皮膚の導電率に対し≦１ｍＳ／ｃｍ２の限界値が確立された。この条件を満たさない皮膚サンプルは透過性実験に使用しなかった。
【００７２】
透過バッファー：
本発明に従うリポソームは１Ｍの炭酸ナトリウム溶液でｐＨ７．５に調整された０．３Ｍのクエン酸バッファー中で調製されたので、すべての透過性実験に同一バッファーが使用された。
【００７３】
透過性実験後のサンプルの取り扱い：
各実験の終了後、バッファーで表面を洗浄することにより過剰ガランタミンサンプルを除去した。次に導電率を再度測定し、皮膚サンプルを固定装置から外した。真皮（真の皮
膚）から表皮（上部層）を分離する目的で、皮膚サンプルを電気ホットプレート上に置き、６０℃で３０秒間加熱した。この加熱処理後、表皮をピンセットにより極めて単純に持ち上げることができる。その直後に、表皮と真皮をプラスチック試験管中に別々に入れ、−２０℃で冷凍した。ガランタミン抽出のためには、液体窒素の存在下で３００μＬのバッファーを冷凍サンプルに添加し、次に冷凍保存サンプルを冷凍ミル（ｃｒｙｏｍｉｌｌ）中で粉砕した。粉末を遠心分離管に即座に移し、４℃で遠心分離し、その後透明な上澄み液を透明な試験管に移し、分析開始まで−２０℃で再凍結した。
【００７４】
ガランタミン上澄み液の定量：
少量のガランタミンの測定のために修飾された、より感度のよい、そしてより早いｒｐ−ＨＰＬＣ法が確立された。
【００７５】
ＨＰＬＣ：            Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００
カラム：              Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｋｅｙｓｔｏｎｅ
１５０×４．６ｍｍ、５μｍ，１９０Ａ
勾配：                直線勾配
溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ
溶媒Ｂ：ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ
検出：                ＤＡＤ，２３０ｎｍ
定量範囲：            ３０〜１０００ｎｇ／ｍＬ
注入容量：            １００μＬ
【００７６】
試験材料：
異なるガランタミン調製物を含む幾つかの材料を試験した。挿入容量及び透過デザインの変更を実施し、結果に要約する。
【００７７】
材料：
−リポソームのガランタミン懸濁物：
Ｃ１６／３．５（５５／４５）
Ｃ１４／３．５（５５／４５）
−リポソームのガランタミンゲル：
Ｃ１６／３．５（５５／４５）
Ｃ１６／３．５（６２／３８）
Ｃ１６／３．５（７０／３０）
Ｃ１４／３．５（５５／４５）
Ｅ−ＰＣ／３．５（６２／３８）
Ｅ−ＰＣ／３．５（７０／３０）
−遊離ガランタミンゲル：
２〜２０ｍｇ／ゲル１ｇ
−ガランタミンミクロエマルション：
レシチンＭＥ（１ｍｇ／ｍＬ）
水／油（Ｗ／Ｏ）ＭＥ（１ｍｇ／ｍＬ）
油／水（Ｏ／Ｗ）ＭＥ（１．６ｍｇ／ｍＬ）
【００７８】
種々のリポソームのガランタミン調製物を直交流注入法により調製した。材料を懸濁物及びカーボポール（９８１ＮＦ）のゲルマトリックス双方中で試験した。リポソームの膜組成の変更物を異なる脂質及び異なるコレステロール含量の使用により得た（実施例１及び２参照）。
【００７９】
以下の透過性研究は異なるサンプル容量並びに単一及び複数のサンプルインプットで実
施され、そこでガランタミン測定のためのサンプルは定時間隔に採取された。図１４〜２１に示された結果はそれぞれ、３重透過性試験に基づいた。図は分析されたサンプル当たりの純粋なガランタミンｎｇの結果を示す。結果は受容液のＲＥＺ（皮膚を透過し、受容室中に回収された液体）から決定された値及び表皮（ＥＰ）又は真皮（ＤＥＲ）から測定された値に分類される。
［実施例３］
【００８０】
実施例３は異なるコレステロール含量を有する異なるＤＰＰＣ（Ｃ１６）リポソームの結果をＤＭＰＣ（Ｃ１４）のリポソーム及びＥ−ＰＣリポソームのものと比較する。サンプル容量５０μＬを一度にインプットし、４時間にわたり透過させた。すべての試験調製物が匹敵する封入ガランタミン量を有し、０．５％のカーボポール  ９８１ＮＦ中に懸濁させた。この実験でもっとも有効な調製物はＣ１６／７０／３０（アシル鎖長／モル％リン脂質／モル％コレステロール）の脂質組成をもつサンプルであった。このゲルにおいて、リポソーム中のコレステロール濃度は３０モル％であった。他の２種の調製物は著しく高いコレステロール含量（３８及び４５重量％）を有し、従ってこれも著しくより硬かった。この実験から測定されたデータはより高い流動性のリポソーム、すなわち硬度の低い膜が、より効率的に透過するという説を確証した（図１４）。
【００８１】
図１４において
１＝Ｃ１６／５５／４５
２＝Ｃ１６／６２／３８
３＝Ｃ１６／７０／３０
４＝Ｃ１４／５５／４５
５＝Ｅ−ＰＣ／６２／３８
６＝Ｅ−ＰＣ／７０／３０。
［実施例４］
【００８２】
実施例４において、ゲルサンプルの透過性を皮膚に対する反復適用後に試験した。異なる脂質組成物及び同一コレステロール含量を伴う２種の異なるゲルを比較した。サンプルはそれぞれ、特に４時間の間隔で、５０μＬの量で３回適用した。各例において、過剰物質は次回のサンプル適用前に除去した。
【００８３】
図（図１５）から認められるように、最終的にはガランタミン濃度の増加を達成することができたが、表皮中への浸透は３回の材料の適用により、なんらかで妨害又は遅延されるように見える。恐らく、これは高い適用量と組み合わされた、詰め込まれた皮膚片の小さい表面積により惹起された飽和の１種である。匹敵する結果が双方のサンプルで達成されたので、脂質の組成の部分に対する効果は明らかに検出できなかった（図１５）。
【００８４】
図１５において、
（鎖長／リン脂質／コレステロール／サンプルの総量）
１＝Ｃ１６／５５／４５／５０μＬ
２＝Ｃ１６／５５／４５／１００μＬ
３＝Ｃ１６／５５／４５／１５０μＬ
４＝Ｃ１４／５５／４５／５０μＬ
５＝Ｃ１４／５５／４５／１００μＬ
６＝Ｃ１４／５５／４５／１５０μＬ。
［実施例５］
【００８５】
実施例５において、高いコレステロール含量及び低いコレステロール含量を含むＣ１６リポソームを含有するゲルを１回投与後に比較した。１５０μＬ及び５０μＬのサンプル
容量を４時間及び１０時間透過させた。皮膚中最高量のガランタミンが再度、低いコレステロール含有を含むリポソームを使用する時に認めた。ここでもまた、低用量がより有利であるように見える。４時間及び１０時間後に、５０μＬを使用した時に、高いガランタミン量が表皮中に認められた。これらの結果は、実施例３及び４中で達成された値を確証し、すなわち、同時の低適用量を伴う低コレステロール含量をもつリポソームの適用が、全体として、予防的又は治療的使用における本発明に従う調製物の局所使用における好ましい戦略であることができると考えられる（図１６）。
【００８６】
図１６において、
（鎖長／リン脂質／コレステロール／サンプルの量／透過時間）
１＝Ｃ１６／５５／４５／１５０μＬ／４時間
２＝Ｃ１６／７０／３０／１５０μＬ／４時間
３＝Ｃ１６／５５／４５／５０μＬ／４時間
４＝Ｃ１６／７０／３０／５０μＬ／４時間
５＝Ｃ１６／５５／４５／１５０μＬ／１０時間
６＝Ｃ１６／７０／３０／１５０μＬ／１０時間
７＝Ｃ１６／５５／４５／５０μＬ／１０時間
８＝Ｃ１６／７０／３０／５０μＬ／１０時間。
［実施例６］
【００８７】
実施例６において、ゲルの濃度の効果をゲル中に懸濁された遊離ガランタミンに対する３種の異なる濃度と関連して試験した。各５０μＬの調製物を１度に適用し、４時間及び１０時間につき透過実験を実施した（図１７）。図１７における最初の３本の棒グラフは４時間後の１％カーボポール９８１ＮＦによる結果を示し、他方次の３本の棒グラフは１０時間後の０．５％のカーボポール９８１ＮＦによる結果を示す。４時間後の結果は遊離ガランタミンが比較的急速に皮膚組織中に拡散することを示す。確かに１０時間の値から認められるように、遊離物質はまた、受容液中に高濃度に認められ、そのため、無視できる程度のデポー効果のみを期待するべきであることを示す（図１７）。
［実施例７］
【００８８】
実施例７において、異なる適用法を試験した。ミクロエマルションは小型の両親媒性分子の投与のための担体系として有用な手段であることができることが文献から知られている。この考えを試験するために、それぞれ１ｍＬ当たり１ｍｇのガランタミンを含む、種々のミクロエマルション（レシチン、油中水、水中油）を調製した（実施例１及び２参照）。
【００８９】
それぞれ５０μＬのサンプル容量を一度に適用し、４時間にわたり透過させた。図（図１８）から認められるように、皮膚中のガランタミンの絶対量はリポソームを含むヒドロゲルを使用する時に、より低かった。更に、有効物質は真皮（真の皮膚）及び受容液中に均一に分配され、これはせいぜい皮膚組織中の最低限の（ｍａｒｇｉｎａｌ）貯蔵を伴う急速な透過が起ったことを示す（図１８）。これらの結果は他の著者の結果と一致し、経皮的ガランタミンパッチの使用に類似の透過機序を指摘する。
［実施例８］
【００９０】
実施例１８において、ヒドロゲル及びミクロエマルション中の遊離ガランタミンによる結果を好ましいリポソーム組成の結果（低いコレステロール画分を含むＣ１６−リン脂質）と比較した。すべての実験において、匹敵するガランタミン濃度を類似の条件下で試験した。
【００９１】
図（図１９）から認められるように、遊離ガランタミンを含むヒドロゲル調製物を使用
する時に、かなりの量のガランタミンを皮膚中に認めた。更に、リポソーム調製物により許容できる値を得たが、他方ミクロエマルションによりあまり許容できない結果を得た。しかし、先行実施例中ですでに説明されたように、新規の局所用有効物質調製物の目標は第１に急速な皮膚透過ではなく、むしろ皮膚中に有効物質がそこから緩徐に放出されることができる、有効物質のデポーを形成する能力である。このようなデポーは一方で適用頻度を減少し、そして他方で、治療的効果を改善すると考えられる有効物質のより均一な制御された放出をもたらすことができると考えられる。これは本発明に従うリポソーム調製物による場合のように、有効物質が皮膚の深部領域でなく、上部層中に保存される時に達成される。
【００９２】
図１９において、
１＝リポソーム（Ｃ１６／７０／３０）、
２＝１．８ｍｇのガランタミン、ヒドロゲル中遊離
３＝１．８ｍｇの遊離ガランタミン、レシチンミクロエマルション中
４＝１．８ｍｇの遊離ガランタミン、Ｗ／Ｏ  ＭＥ中及び
５＝１．８ｍｇの遊離ガランタミン、Ｏ／Ｗ  ＭＥ中。
［実施例９］
【００９３】
実施例９において、懸濁物中及びヒドロゲル中のリポソーム調製物を相互に比較した。少なくとも２４時間にわたる１ｍＬ過剰のリポソーム懸濁物の投与は低い透過有効度をもたらしたのみであった（図２０）。従って適当なゲルマトリックスはリポソームを安定化し、適用をより容易にそしてより快適にさせるのみならずまた、リポソームを皮膚により近くにもたらし、従って透過効果を増強することを証明するように見える。
【００９４】
図２０において、
（鎖長／リン脂質／コレステロール／サンプルの量／透過時間／種類）
１＝Ｃ１６／５５／４５／１ｍＬ／２４時間／懸濁物
２＝Ｃ１４／５５／４５／１ｍＬ／２４時間／懸濁物
３＝Ｃ１６／５５／４５／１００μＬ／８時間／ゲル
４＝Ｃ１４／５５／４５／１００μＬ／８時間／ゲル
［実施例１０］
【００９５】
概括的に、Ｆｒａｎｚ拡散セルを使用するインビトロ試験は、特にリポソームのゲル調製物を使用する時に、該方法の適用性の特定の限界が公表されたが、種々のリポソーム調製物による透過研究に有用な方法であるように見える。インビボの種々のリポソームゲルによる先行経験に基づいて、各ゲルが皮膚表面上に過剰物を残留せずに、完全に皮膚中に透過することができることが本明細書に記載のインビトロの透過試験に対しても期待された。しかし、Ｆｒａｎｚ拡散セルによる実験において同様な成功を伴ってゲルを投与することができなかった。すべての実験において、かなり過剰なサンプル材料が皮膚表面上に残留した。この欠点は恐らく、透過効率に不都合な効果を有した。従ってインビボではより大量のリポソームガランタミンが皮膚中に透過するであろうことを期待することができる。
【００９６】
更に、本明細書に記載された種々のリポソーム調製物によるインビトロの実験においてすら、０．７８ｃｍ２の皮膚面積当たり１．８×１０１６までの有効物質の分子が皮膚（表皮）中に運搬された。
【００９７】
デルマトームを使用する皮膚の除去又は表皮の前処理が観察された適用の問題の原因である可能性があるかどうかを認めるために、種々の皮膚サンプルを試験した（図２１）。しかし、結果からは明白な効果を確立することはできなかった。従って、皮膚自体は達成
された結果に対して有意な否定的効果をもたないと推定しなければならない。
【００９８】
図２１において、
１＝皮膚、未処置、リポソーム、７０／３０（リン脂質／コレステロール）
２＝エタノールで清浄化した皮膚、リポソーム：７０／３０
３＝油状ガーゼで処理した皮膚、リポソーム：５５／４５
４＝エタノールで清浄化し、油状ガーゼで処理した皮膚、リポソーム：５５／４５。
【００９９】
ともかく、結論として、有効物質が１日２回のみ皮膚に適用される場合ですら、処置部位が真皮組織（真の皮膚）中にある時は、親水性ゲル中のリポソームガランタミン調製物が有利な提供形態であると言うことができる。本発明に従うリポソームに封入された有効物質の、緩和で、非侵襲的でそして皮膚に非刺激的な使用により、表皮中の著しいデポー効果及び下層の真皮組織中への有効物質の緩徐な均一な放出を達成することができる。
略語：
ＡＣＮ          アセトニトリル
ＤＡＤ          ダイオード・アレイ検出装置
ＤＥＲ          真皮（真の皮膚）
ＤＭＰＣ        ジミリストイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ        ジパルミトイルホスファチジルコリン
Ｅ−ＰＣ        卵からの天然のホスファチジルコリン
Ｅ−ＰＧ        卵からの天然のホスファチジルグリセロール
ＥＰ            表皮（上部皮膚）
ＩＰＭ          イソプロピルミリステート
ＮＧＦ          神経成長因子
ＰＢＳ          リン酸塩バッファー生理食塩水
ＲＥＺ          受容器（受容室）
ｒｐ−ＨＰＬＣ  逆走高速液体クロマトグラフィー
ＴＦＡ          トリフルオロ酢酸
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】リポソームの調製用装置のスキーム図を示す。
【図２】リポソーム中のガランタミン封入実験のＨＰＬＣ結果を示す。黒色棒は残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）中のガランタミン（すなわちリポソームのガランタミン）を表わし、灰色棒は濾液中のガランタミン（未封入ガランタミン）を表わし、そして白色棒はガランタミンの総量を表わし、Ｙ−軸はμｇ／ｍＬのガランタミンを表わす。
【図３】リポソーム中のガランタミン封入実験のＨＰＬＣ結果を示す。黒色棒は残留物中のガランタミン（すなわちリポソームのガランタミン）、灰色棒は濾液中のガランタミン（未封入ガランタミン）を表わし、そして白色棒はガランタミンの総量を表わし、最初の３本はステアリルアミンで正に帯電したリポソーム、最後の３本はＥ−ＰＧで負に帯電したリポソーム、（３Ａ）はガランタミンＨＢｒ、（３Ｂ）はガランタミン塩基を表わす。
【図４】リポソーム中のガランタミン封入実験のＨＰＬＣ結果を示す。黒色棒は残留物中のガランタミン（すなわちリポソームのガランタミン）を表わし、灰色棒は濾液中のガランタミン（未封入ガランタミン）を表わし、そして白色棒はガランタミンの総量を表わす。
【図５】種々の水相のｐＨ値における能動充填したガランタミンリポソームによる安定性の実験の結果を示す、Ｙ−軸は脂質１μモル当たりのｎモルの有効物質における有効物質濃度、Ｘ−軸は調製物の製造後の時間（週）を表わす。
【図６】温度及び充填時間の関数としてのガランタミンによる前形成されたリポソームの充填に対するＨＰＬＣデータを示す。供給されたガランタミン濃度のパーセントにおけるデータ。
【図７】過剰のガランタミンの存在下における能動充填されたリポソームに対する２種の調製実験からのＨＰＬＣデータを示す。黒色棒は未封入ガランタミンの量を表わし、灰色棒はリポソームに封入されたガランタミンの量を表わす。三角記号間の明るい線（関連値：右側のＹ−軸）は安定な脂質／有効物質の比率を示す。
【図８】リポソームが１段階法においてガランタミンで能動充填されたリポソーム調製物の安定性のデータを示す。Ｙ−軸は脂質１μモル当たりｎモルの有効物質における有効物質濃度を示し、Ｘ−軸は調製物生成後の期間（週）を表わす。
【図９】Ａ）３段階法で調製された、Ｂ）１段階法で調製された能動充填されたガランタミンリポソームの安定性データを示す。
【図１０】能動充填されたＤＭＰＣリポソームのガランタミン封入速度及び安定性を示す。
【図１１】コレステロール含量の関数としてのＤＰＰＣリポソーム中へのガランタミン取り込みを示す。
【図１２】硫酸アンモニウム勾配法により調製したガランタミンリポソームの安定性試験を示す。Ｆ１、Ｆ２及びＦ３は濾過サンプルを表わし、Ｒは残留物を示す。
【図１３】ヒドロゲル調製物中の異なる鎖長の脂質（Ａ：Ｃ１６及びＢ：Ｃ１４）を含むガランタミンリポソームの安定性を示す。
【図１４】異なる脂質組成物を有するリポソームのガランタミン調製物によるインビトロの皮膚透過研究の結果を示す。Ｙ−軸は関連サンプル中の純粋なガランタミンのｎｇを表わし、Ｘ−軸は種々の脂質組成物を表わす。
【図１５】反復適用後のリポソームのガランタミン調製物によるインビトロの皮膚透過研究の結果を示す。
【図１６】サンプルの量及び透過時間の関数としてのリポソームのガランタミン調製物によるインビトロの皮膚透過研究の結果を示す。
【図１７】ヒドロゲル濃度の関数としてのリポソームのガランタミン調製物によるインビトロの皮膚透過研究の結果を示す。
【図１８】ミクロエマルションの形態のガランタミン調製物によるインビトロの皮膚透過研究の結果を示す。
【図１９】リポソームに封入されたガランタミンに比較した、遊離形態のガランタミン基剤のヒドロゲル調製物によるインビトロの皮膚透過研究の結果を示す。
【図２０】懸濁物の形態又はゲルの形態のリポソームのガランタミン調製物によるインビトロの皮膚透過研究の結果を示す。
【図２１】種々の皮膚サンプルにおける、リポソームのガランタミン調製物によるインビトロの皮膚透過研究の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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