(57)【要約】  本発明は、哺乳動物におけるコレステロール逆転送をモジュレーションすることができる方法及び化合物、並びに、コレステロール逆転送をモジュレーションすることができる化合物の選択、同定又は特徴付けを可能とするスクリーニング方法に関する。本発明は、アテローム性動脈硬化症の処置のために使用される医薬化合物の外に、該方法を実施するのに使用することができる細胞、ベクター及び遺伝子構築物にも関する。本発明の方法は、ａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターに由来するＬＲＨ−１誘導体応答エレメントに応答するエレメントの使用に基づいている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
唯一のＬＲＨ−１応答エレメントとして、下記の配列（配列番号１）：
５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’を含有するヒトアポリポタンパク質ＡＩ遺伝子のプロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つのコピーを含む核酸構築物と試験化合物を接触させ、そして
該試験化合物の応答エレメントへの起こりうる結合を決定する
ことを含む、コレステロール逆転送をモジュレーションすることができる化合物の選択、同定又は特徴付けのための方法。
【請求項２】
外因性ＬＲＨ−１受容体又はその機能的同等物の存在下に接触を行うこと、及び、ＬＲＨ−１応答エレメントへの該試験化合物の起こりうる結合及び／又はＬＲＨ−１のその応答エレメントへの結合により形成された複合体への該試験化合物の結合を決定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試験化合物を、レポーター遺伝子発現カセットを含有する宿主細胞と接触させ、該カセットは、唯一のＬＲＨ−１応答エレメントとして、下記の配列（配列番号１）：５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’を含有するヒトアポリポタンパク質ＡＩ遺伝子のプロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つのコピーを含むプロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子を含み、そして
応答エレメントへのＬＲＨ−１の結合又はレポーター遺伝子の発現に対する試験化合物の存在の効果を決定する
ことを含む、コレステロール逆転送をモジュレーションすることができる化合物の選択、同定又は特徴付けのための方法。
【請求項４】
宿主細胞が外因性ＬＲＨ−１受容体又はその機能的同等物を含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞がＬＲＨ−１のリガンドを含むことを特徴とする、請求項３又は４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
試験化合物の存在下及び該化合物の不存在下にレポーター遺伝子の発現のレベルを決定することを含み、レポーター遺伝子発現のレベルの増加又は減少は、コレステロール逆転送をモジュレーションする試験化合物の能力を示す、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物細胞がヒト細胞であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
レポーター遺伝子が、生物学的抽出物におけるその活性又は存在を測定することができる産物をコードする遺伝子であり、特にこの遺伝子の１つは、ルシフェラーゼ、分泌されたアルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ又はラクタマーゼをコードすることを特徴とする、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
プロモーターが、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＣＭＶ極初期プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ヒトアポリポタンパク質ＡＩをコードする遺伝子のプロモーター、及びＳＶ４０プロモーターよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
１種以上の化合物を、混合物として又は別々に試験することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
試験化合物がコンビナトリアルライブラリーであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
試験化合物が、１種以上のＤＮＡ結合性ポリペプチドをコードするクローン又は核酸クローンのライブラリーであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
接触を多重ウエルプレートで行うことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法により決定された生じうる効果を、同じ条件下に、しかし下記の配列（配列番号１）：５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’を含有するヒトアポリポタンパク質ＡＩ遺伝子のプロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つの突然変異したコピーを含有する核酸構築物により行われた方法により決定された起こりうる効果と比較することを更に含み、
該突然変異体コピーは、本質的にＬＲＨ−１受容体に結合することができない、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
コレステロール逆転送を増加させることができる化合物の選択、同定又は特徴付けのための、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＤＬの活性をモジュレーションすることができる化合物の選択、同定又は特徴付けのための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
アポリポタンパク質ＡＩの発現をモジュレーションすることができる化合物の選択、同定又は特徴付けのための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
コレステロール逆転送をモジュレーションすることを意図した組成物を製造するための、ヒトアポリポタンパク質遺伝子のプロモーターの応答エレメント又はその機能的変異体へのＬＲＨ−１及び／又はその補因子の結合をモジュレーションすることができる化合物の使用。
【請求項２０】
コレステロール逆転送を増加させることを意図した組成物を製造するための、配列番号１の配列又はその機能的変異体へのＬＲＨ−１及び／又はその補因子の結合を増加させる化合物の使用。
【請求項２１】
ＨＤＬの活性をモジュレーションすることを意図した組成物を製造するための、配列番号１の配列又はその機能的変異体へのＬＲＨ−１及び／又はその補因子の結合をモジュレーションする化合物の使用。
【請求項２２】
ＨＤＬの活性を増加させることを意図した組成物を製造するための、配列番号１の配列又はその機能的変異体へのＬＲＨ−１及び／又はその補因子の結合を増加させる化合物の使用。
【請求項２３】
ＡｐｏＡＩの発現をモジュレーションすることを意図した組成物を製造するための、配列番号１の配列又はその機能的変異体へのＬＲＨ−１及び／又はその補因子の結合をモジュレーションする化合物の使用。
【請求項２４】
コレステロール逆転送をモジュレーションすることを意図した組成物を製造するための、ヒトアポリポタンパク質ＡＩ遺伝子の転写に対するＬＲＨ−１及び／又はその補因子の効果を増加させる化合物の使用。
【請求項２５】
該化合物が生物学的化合物又は化学的化合物である、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
化合物が核因子又は補因子であることを特徴とする、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
化合物が、１種以上のＤＮＡ結合性ポリペプチドを発現するクローンであることを特徴とする、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
化合物が、請求項１〜１８のいずれか１項に従って選択、同定又は特徴付けられる化合物であることを特徴とする、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
下記の配列（配列番号１）：５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’により特徴付けられた核酸断片。
【請求項３０】
請求項２９に記載の核酸断片の少なくとも１つのコピー、並びに、ＣＭＶ極初期プロモーター及びＰＧＫプロモーターの中から選ばれるプロモーターであって、該プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子と関連したプロモーター、を含む発現カセット。
【請求項３１】
ＨＤＬの活性をモジュレーションすることができる化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングのための、請求項３０に記載のカセットの使用。
【請求項３２】
請求項１〜１８のいずれか１項に従って選択、同定又は特徴付けられる化合物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物におけるコレステロール逆転送（reverse cholesterol transport）をモジュレーションすることができる方法及び化合物並びにコレステロール逆転送をモジュレーションすることができる化合物の選択、同定及び／又は特徴付けを可能とするスクリーニング方法に関する。本発明は、アテローム性動脈硬化症の処置を意図する医薬組成物の外に、前記方法を実行するのに使用することができる細胞、ベクター及び遺伝子構築物にも関する。
【０００２】
アテローム性動脈硬化症は、罹病率、死亡率、心筋梗塞、脳虚血、心臓血管疾患及び末梢血管新生の主要な原因である。高コレステロール血症及び血管炎症に関与するマクロファージにおけるコレステロール過負荷は、アテローム性動脈硬化症における主要な寄与因子である。最近、高コレステロール血症は、食餌及び医薬の組み合わせにより、例えば、スタチン又は胆汁酸捕捉剤により処置される。しかしながら、現存の治療の限界を克服するために、新規な治療ストラテジーが開発される必要がある。
【０００３】
ＨＤＬ（高密度リポタンパク質）により行われるコレステロール逆転送は、末梢組織に蓄積されたコレステロールを抽出し、そして肝臓を介するその排除を確実にする。この方法で、ＨＤＬは、アテローム性動脈硬化症に対して身体を保護するのを助ける。アポリポタンパク質ＡＩ（ａｐｏＡＩ）は、ＨＤＬの有効性を担っている、ＨＤＬの基本的成分である。この点で、ａｐｏＡＩの発現の増加は、アテローム性動脈硬化症に対する保護効果を有する。ａｐｏＡＩ発現は、ホルモン又は治療剤、例えば、フィブラートにより調節される。核内受容体、例えば、ＨＮＦ４、ＰＰＡＲα又はＲＯＲαは、ａｐｏＡＩ遺伝子の転写を制御することにおいて決定的に重要な役割を演じることが示された。特に、ＰＰＡＲαは、異常脂質血症の処置のために診療所で使用されるフィブラートによるヒトにおいて誘導されるａｐｏＡＩの増加した発現の責任を担っている。ゆえに、ａｐｏＡＩ発現の制御に関与する新規な細胞内シグナル伝達経路の同定は、コレステロール逆転送の有効性を増加させ、そしてそれによりアテローム性動脈硬化症に対して保護することができる新規な治療ストラテジーを、規定することを可能とするであろう。
【０００４】
核内ホルモン受容体は、天然及び／又は人工的リガンドによりその活性がモジュレーションされる転写因子の大きなファミリーを形成する。一般に、該因子は、特異的シス作用性応答エレメントに結合することにより、そして転写装置の活性化に必要なアクセサリータンパク質を動員することにより、該因子の標的遺伝子の発現を制御する。
【０００５】
ＮＲ５Ａ２、ＣＰＦ、ｈＢ１Ｆ、ＰＨＲ又はＦＴＦとしても知られた核内受容体ＬＲＨ−１（肝臓受容体相同体１（Liver Receptor Homolog-1）は、そのリガンドが同定されていないオーファン受容体である［１］。ＬＲＨ−１は、ヒトにおけるそのパラログ（paralogue）がＳＦ−１受容体であるショウジョウバエＦＴＺ−Ｆ１受容体の相同体である。おそらく特定のポリアデニル化部位の選択的使用から生じる、少なくとも２つのアイソフォームが同定された［２］。ＬＲＨ−１発現は、肝臓、膵臓外分泌腺及び腸並びに卵巣［３］及び前脂肪細胞に制限される。ＬＲＨ−１は胚形成において初期に発現される［４，５］。ＬＲＨ−１は、ＲＸＲとヘテロ二量体化しないが、配列ＹＣＡＧＧＧＹＣＲ（式中、Ｙ＝Ｔ又はＣであり、Ｒ＝Ｇ又はＡである）を有するＤＮＡ応答エレメントにモノマーとして結合する。胆汁酸の合成又は輸送［６］、ステロイド［３］及びリポタンパク質［７，８］の代謝の制御並びに転写又は発生（development）の制御において、いくつかの標的遺伝子が同定された。ＬＲＨ−１は内胚葉の発生にも関与しているようだ［１］。
【０００６】
本発明は、アポリポタンパク質ＡＩ（ａｐｏＡＩ）をコードするヒト遺伝子の発現におけるＬＲＨ−１の役割の観察並びに、ＬＲＨ−１と該遺伝子のプロモーターの断片との間で起こる直接相互作用に基づいている。本発明はまた、ＬＲＨ−１の過剰発現は、ヒトａｐｏＡＩプロモーターの活性の刺激をもたらすという独創的な観察に基づいている。本発明は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの領域ＢとＣの接合部（junction）における機能的ＬＲＨ−１応答エレメント［１６に定義された］の同定及びその配列の特徴付けにも基づいている。
【０００７】
かくして、本発明は、ＬＲＨ−１核内受容体によるａｐｏＡＩ産生のモジュレーションを初めて証明する。それにより本発明は、該タンパク質の発現、ＨＤＬの活性又はコレステロール逆転送を調節することができる化合物の研究のための新規な標的及びアプローチを提供する。
【０００８】
本発明は、ａｐｏＡＩプロモーターへのＬＲＨ−１の結合及び／又はヒトａｐｏＡＩ遺伝子の転写に対するその効果をモジュレーションする化合物の使用に基づいた、コレステロール逆転送を増加させるための方法も提供する。
【０００９】
本発明は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子の発現及び／又はＨＤＬの活性及び／又はコレステロール逆転送をモジュレーションすることができる治療物質の選択、同定又は特徴付けを可能とするスクリーニング方法も提供する。
【００１０】
特定の態様に従えば、本発明のスクリーニング方法は、更に詳しくは、下記の工程：
１種以上の化合物を、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの少なくとも１つのＬＲＨ−１応答エレメント又はその機能的変異体（functional vaiant）を含む核酸構築物と接触させ、
該化合物の該応答エレメントへの起こりうる結合（possible binding）を決定し、そして
場合により、先の測定を、同じ条件で、しかしヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つの突然変異したコピーを含む核酸構築物で行われた測定と比較する、
工程を含む。
【００１１】
一般に、該接触は、該化合物が該応答エレメントに結合することを可能とする条件で行われる。
【００１２】
好ましい様式では、本発明の方法は、
唯一のＬＲＨ−１応答エレメントとして下記の配列（配列番号１）：
５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’を含有するヒトアポリポタンパク質ＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つのコピーを含む核酸構築物と試験化合物を接触させ、そして
該試験化合物の該応答エレメントへの起こりうる結合を決定し、そして
場合により、先の測定を、同じ条件で、しかしヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つの突然変異したコピーを含む核酸構築物で行われた測定と比較する
ことを含む。
【００１３】
本発明の方法の特定の態様に従えば、該化合物が該ＬＲＨ−１応答エレメントに結合することを可能とする条件は、一般に外因性の（例えばモノマー形態にある）ＬＲＨ−１受容体又は機能的同等物の存在並びに該試験化合物のＬＲＨ−１応答エレメントへの起こりうる結合及び／又はＬＲＨ−１のその応答エレメントへの結合により形成された複合体への該試験化合物の起こりうる結合の決定を含む。
【００１４】
他の特定の態様（転写活性の試験）に従えば、場合により外因性ＬＲＨ−１受容体又はその機能的同等物の存在下で、本発明に従う少なくとも１つのＬＲＨ−１応答エレメントを含むプロモーターの転写活性に対する１種以上の試験化合物の効果を測定する。該試験は、好ましくは、細胞系において、特に外因性ＬＲＨ−１若しくはその同等物を含む及び／又はＬＲＨ−１のリガンド若しくはその機能的同等物を含む細胞において、該プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子の発現を決定することにより行われる。他の態様に従えば、試験は、ＬＲＨ−１受容体又はその機能的同等物を含む細胞（例えば、天然又は組換え様式で、発現する）において行われる。
【００１５】
本発明の好ましい態様は、場合により外因性ＬＲＨ−１又はその同等物の存在下での、本発明に従う１つ以上のＬＲＨ−１応答エレメントをレポーター遺伝子と組み合わせた発現カセットの使用である。
【００１６】
有利には、該レポ―ター遺伝子は、該応答エレメントの少なくとも１つのコピーを含むプロモーター、例えば、ａｐｏＡＩプロモーター又はその変異体若しくは断片の制御下に置かれる。生物学的抽出物におけるその活性又は存在を容易に測定することができる当業者に知られているいかなる遺伝子も、スクリーニング方法を行うためにレポーター遺伝子として使用することができる。
【００１７】
本発明の特定の態様に従えば、スクリーニング方法は、
試験化合物を、レポーター遺伝子発現カセットを含有する宿主細胞と接触させ、該カセットは、唯一のＬＲＨ−１応答エレメントとして、下記の配列（配列番号１）：５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’を含有するヒトアポリポタンパク質ＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つのコピー、を含むプロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子を含み、そして
応答エレメントへのＬＲＨ−１の結合又はレポーター遺伝子の発現に対する試験化合物の存在の効果を決定する、
工程を含む。
【００１８】
好ましくは、宿主細胞は、外因性ＬＲＨ−１受容体若しくはその機能的同等物及び／又はＬＲＨ−１のリガンド若しくはその機能的同等物を含有する。
【００１９】
他の特定の態様に従えば、本方法は、試験化合物の存在下及び該化合物の不存在下にレポーター遺伝子の発現のレベルを決定することを含み、発現レベルの増加又は減少は、試験化合物のコレステロール逆転送をモジュレーションする能力を示す。
【００２０】
本発明に従う方法により同定されうる化合物は、ＬＲＨ−１の活性を修飾することができる、異なる性質、構造及び起源の化合物、特に生物学的化合物、核内因子、補因子、化合物、合成化合物等であることができる。それらは、ライブラリー、特にコンビナトリアルライブラリー、化学的ライブラリーあるいはタンパク質、ペプチド又は核酸のライブラリー、例えば、１種以上のＤＮＡ結合性タンパク質、ペプチド又はポリペプチドをコードするクローンであることもできる。
【００２１】
本発明に従う方法は、ＬＲＨ−１及び／又はその補因子の、その応答エレメントの一つ及び／又は他方への結合を修飾することができる化合物及び／又は、ヒトａｐｏＡＩをコードする遺伝子の発現、従ってヒトａｐｏＡＩの発現を修飾する（即ち、増加又は減少させる）ことができる化合物及び／又はＨＤＬの活性をモジュレーションすることができる化合物及び／又はコレステロール逆転送をモジュレーションすることができる化合物の選択、同定又は特徴付けのために使用することができる。
【００２２】
本発明は、更に、コレステロール逆転送又はＨＤＬの活性をモジュレーションするための組成物を製造するためのこの方法で選ばれた化合物の使用及び対応する処置方法を更に記載する。
【００２３】
本願をより容易に理解するために、下記の定義を与えて、その通常の意味を明白にするか又は完全にする。
【００２４】
「アポリポタンパク質ＡＩ」又はａｐｏＡＩ：アポリポタンパク質ＡＩは、脂質に結合することができる全体的（globular）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する２４３アミノ酸を含有するタンパク質である［９］。該タンパク質は、高密度リポタンパク質の主成分であり、そしてコレステロール逆転送における基本的役割を果たす［１０，１１］。ａｐｏＡＩの遺伝子、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡは、クローニングされ、そして配列決定されており［１２−１４］、そして受け入れ番号：ＮＭ＿００００３９、Ｍ２０６５６（プロモーター）及びＪ０００９８の下でＧｅｎｂａｎｋ（登録商標）データベースに（例えば、インターネット：http://www.ncbi.nlm.nih.govに）見出されうる。
【００２５】
「高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）」：ＨＤＬ粒子は、主として末梢細胞からコレステロールを抽出し、そして肝臓へのその返還を促進する（肝臓でコレステロールは排除される）その能力により、アテローム性動脈硬化症に対して保護的役割を有していると推定される高密度リポタンパク質（１．０６３〜１．２１g／ml）である［１０］。ａｐｏＡＩは、このタンパク質の７０％までの割合を占める、ＨＤＬの主要タンパク質成分である。ＨＤＬは、より小さな割合でａｐｏＡＩＩ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ及びａｐｏＥも含む。
【００２６】
「ＬＲＨ−１」：ＬＲＨ−１受容体は、ヒト及びラットにおいて単離され、特徴付けられ、そして配列決定されている。ｍＲＮＡ配列は、それぞれ、ヒト、マウス及びラットについて受け入れ番号ＮＭ＿００３８２２、ＮＭ＿０３０６７６及びＮＭ＿０２１７４２の下にＧｅｎｂａｎｋ（登録商標）データベースにおいても入手可能である。ＤＮＡ結合に関与するＬＲＨ−１の領域（「ＤＮＡ結合ドメイン」）は、主として、ヒトタンパク質の残基Ｇｌｕ３８〜Ａｓｐ１１３間に（ＮＭ＿００３８２２において３１９〜５４６に対応する）又はマウスタンパク質の残基Ｇｌｕ１０５〜Ａｓｐ１８０間に含まれる。
【００２７】
ＬＲＨ−１受容体に言及する「機能的同等物」という用語は、ＬＲＨ−１受容体の構造に由来し、そして応答エレメント、特に、配列番号１の配列又はその機能的変異体を有するいかなる応答エレメントにも結合する能力を保存している、いかなるポリペプチドも示す。機能的同等物は、天然の変異体（多形、スプライシング等）、断片、突然変異体、欠失体（deletants）等であることができる。好ましくは、それらは、ＬＲＨ−１受容体に対する少なくとも６０％の同一性（identity）、好ましくは少なくとも７５％、更に好ましくは少なくとも９０〜９５％を示す少なくとも１つのアミノ酸領域を含むポリペプチドである。この用語は、ＬＲＨ−１受容体の断片、特にＬＲＨ−１受容体のＤＮＡ結合部位を含有する断片も含む。
【００２８】
「逆転送」という用語は、ときには欠陥のある生理学的機構であって、それを介して末梢組織の過剰コレステロールが高密度リポタンパク質又はＨＤＬ（高密度リポタンパク質）により処理され、次いで肝臓に転送されて排除される、生理学的機構を意味するのに使用される。
【００２９】
Ａ．ＬＲＨ−１応答エレメントの同定
本発明は、ａｐｏＡＩ発現の調節におけるＬＲＨ−１の関与及び機構を証明し、そしてコレステロール逆転送の調節においてそのようにすることを証明する。ＬＲＨ−１の過剰発現は、ａｐｏＡＩプロモーターの活性の増加をもたらす。本発明は、ヒトａｐｏＡＩをコードする遺伝子のプロモーターにおけるＬＲＨ−１応答エレメントの正確な配列も示す。
【００３０】
本発明は、特定の構築物、特に、ＬＲＨ−１応答エレメントを含む核酸の構築物並びに、それを含有するカセット、ベクター及び組換え細胞にも関する。
【００３１】
かくして、本発明は、ＬＲＨ−１とａｐｏＡＩプロモーター間の相互作用及びａｐｏＡＩ発現のＬＲＨ−１による調節の責任を担っているヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターにおいて最初に同定されたＬＲＨ−１応答エレメントの配列（配列番号１）を提供する。
【００３２】
３つの異なる機能的領域が、ａｐｏＡＩプロモーターにおいて同定された［１５］。本明細書では、アポリポタンパク質ＡＩ遺伝子プロモーターの機能的ドメインは、先に定義された命名法に従ってＡ、Ｂ及びＣと名付けられる［１６］。
【００３３】
かくして、領域Ｂ及びＣ（配列番号３及び４）の存在は、レポーター遺伝子の発現のＬＲＨ−１による増加を誘発する（実施例１、２、５及び６）。
【００３４】
本発明の特定の目的は、下記する配列番号１の配列：５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’又はその機能的変異体（「ＬＲＨ−１応答エレメント」）を含む核酸である。
【００３５】
本発明の他の目的は、上記した如きＬＲＨ−１応答エレメントを含む核酸構築物に基づいている。特に、それは、上記した如き応答エレメントの少なくとも１つのコピーを含む発現カセットであることができる。
【００３６】
本発明は、配列番号１の下記配列：５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’若しくはその機能的変異体を含むか又は好ましくは、配列番号１の下記配列：５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’若しくはその機能的変異体により特徴付けられた核酸断片の少なくとも１つのコピー及び、ＣＭＶ極初期プロモーター（CMV immediate early promoter）及びＰＫＧプロモーターよりなる群から選ばれるプロモーターであって、該プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子と関連した（associated）プロモーターを含む発現カセットも目的とする。特に、該発現カセットは、ＨＤＬの活性をモジュレーションすることができる化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングのために使用することができる。
【００３７】
本発明は、更に、上記した如きＬＲＨ−１応答エレメントを含むいかなる人工的プロモーター又はキメラプロモーターにも関する。
【００３８】
本発明に従う応答エレメントの機能的変異体は、ＬＲＨ−１受容体に結合する能力を保存するネイティブ配列のいかなる誘導体又は断片であってもよい。一般に、変異体は、本明細書に記載されたネイティブ配列の残基の少なくとも５０％を保存する。古典的には、変異体は、問題の配列において５より少ないヌクレオチドに影響を与える修飾を含有する。好ましくは、それは、本願に記載されたネイティブ配列に対して少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、そして更に好ましくは少なくとも９０％の同一性すら示す配列である。変異体は、種々のタイプの修飾、例えば、１つ以上の点突然変異又はさもなければ、付加、欠失及び／又は置換を含有することができる。
【００３９】
該修飾は、慣用の物理的、化学的又は分子生物学的方法、例えば、部位特異的突然変異誘発又は、更に実際的には、合成器における配列の人工的合成により導入されうる。
【００４０】
変異体は、種々の方法でＬＲＨ−１に結合するその能力について試験されることができ、特に：
（ｉ）試験配列をＬＲＨ−１受容体（例えば、無細胞試験における）と接触させ、そして複合体の形成を検出する（例えば、ゲルシフトにより）こと、
（ｉｉ）最小プロモーター及びレポーター遺伝子を含む発現カセットに試験配列を挿入し、カセットを細胞に導入し、そしてＬＲＨ−１の存在下及び不存在下にレポーター遺伝子の発現を検出する（場合によりアッセイする）こと、
（ｉｉｉ）当業者により知られている任意の他の技術によって、例えば、核酸とタンパク質間の相互作用の証明を可能とすること、
により試験することができる。
【００４１】
本発明は、前記した応答エレメントの不活性変異体、特に、ＬＲＨ−１受容体に本質的に結合することができない変異体を目的として有する。このような変異体は、特に配列番号２の配列により例示される。
【００４２】
該不活性変異体は、機能的変異体について前記した条件で製造し、そして試験することができる。
【００４３】
有利には、本発明に従う変異体は、配列番号１の配列又はその一部とハイブリダイゼーションすることができる。
【００４４】
コレステロール逆転送をモジュレーションする化合物の選択、同定及び特徴付けのための方法
本発明は、コレステロール逆転送をモジュレーションする（即ち、増加又は減少させる）化合物の同定方法を説明する。該化合物は、ＬＲＨ−１のリガンド又はＬＲＨ−１のコリプレッサー及びコアクチベーター等へのＬＲＨ−１の結合を変えることにより作用することができる。さもなければ、それらは、ＬＲＨ−１のみ又はＬＲＨ−１及びその補因子の、その応答エレメントへの結合を修飾又は抑制することができ、かくしてヒトａｐｏＡＩ遺伝子の発現を修飾することができる。それにより、ａｐｏＡＩプロモーターの領域ＢとＣ（配列番号３及び４）の間の接合部（junction）に存在する応答エレメントへのＬＲＨ−１の結合は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子の転写を増加させ、そしてコレステロール逆転送を刺激する。ゆえに、該応答エレメントへのＬＲＨ−１結合を増加させる（この場合、ＬＲＨ−１はアクチベーターの役割を果たす）ことができる化合物の使用は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子の転写を増加させ、そしてコレステロール逆転送を刺激することを可能とする。
【００４５】
かくして、本発明は、コレステロール逆転送を増加させることができる化合物の選択、同定又は特徴付けのための新規な方法を記載する。
【００４６】
１．発現スクリーニングに基づく方法
本発明は、コレステロール逆転送をモジュレーションすることができる化合物の選択、同定又は特徴付けのための方法であって、
（ｉ）レポーター遺伝子発現カセットを含有する宿主細胞と試験化合物を接触させ、該カセットは、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメント又はその機能的変異体の少なくとも１つのコピーを含むプロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子を含み、そして
（ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を決定する
ことを含む方法に関する。
【００４７】
好ましい様式では、本発明の方法は、
（ｉ）レポーター遺伝子発現カセットを含有する宿主細胞と試験化合物を接触させ、該カセットは、唯一のＬＲＨ−１応答エレメントとして、下記の配列（配列番号１）：５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’を含有するヒトアポリポタンパク質ＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つのコピーを含むプロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子を含み、そして
（ｉｉ）応答エレメントへのＬＲＨ−１の結合又はレポーター遺伝子の発現に対する試験化合物の存在の効果を決定する、
ことを含む。
【００４８】
本発明は、コレステロール逆転送をモジュレーションすることができる化合物の選択、同定又は特徴付けのための方法であって、
（ｉ）外因性ＬＲＨ−１受容体又はその機能的同等物の存在下に、レポーター遺伝子発現カセットを含有する宿主細胞と試験化合物を接触させ、該カセットは、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメント又はその機能的変異体の少なくとも１つのコピーを含むプロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子を含み、そして
（ｉｉ）応答エレメントへのＬＲＨ−１の結合又はレポーター遺伝子の発現に対する試験化合物の存在の効果を決定する、
ことを含む。
【００４９】
なお更に好ましくは、本発明は、
（ｉ）外因性ＬＲＨ−１受容体又はその機能的同等物の存在下に、レポーター遺伝子発現カセットを含有する宿主細胞と試験化合物を接触させ、該カセットは、唯一のＬＲＨ−１応答エレメントとして、下記の配列（配列番号１）：５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’を含有するヒトアポリポタンパク質ＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つのコピーを含むプロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子を含み、そして
（ｉｉ）応答エレメントへのＬＲＨ−１の結合又はレポーター遺伝子の発現に対する試験化合物の存在の効果を決定する
ことを含む。
【００５０】
更に詳しくは、本発明に従う方法は、ＬＲＨ−１応答エレメント（配列番号１）の少なくとも１つのコピーを含む核酸構築物又は発現カセットと試験化合物を接触させることを提供する。
【００５１】
本発明の特定の目的は、核酸断片配列番号１の少なくとも１つのコピー、及びプロモーターであって、該プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子と関連した（associated）プロモーターを含む発現カセットに関する。
【００５２】
本発明の他の特定の目的は、核酸断片配列番号１の少なくとも１つの突然変異したコピー、及びプロモーターであって、該プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子と関連したプロモーターを含む発現カセットに関する。
【００５３】
本発明の方法の特定の態様では、前記方法の１つにより決定された生じうる効果を、同じ条件下に、しかしヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つの不活性変異体（例えば、突然変異したコピー）（配列番号２）又はその機能的変異体を含む核酸構築物で行われた方法により決定された生じうる効果と比較することが、追加的に提供される。
【００５４】
本発明の方法の他の特定の態様に従えば、宿主細胞は、ＬＲＨ−１のリガンド又はその機能的同等物を含有する。
【００５５】
本発明の方法は、下記したとおり異なるタイプの細胞、プロモーター、レポーター遺伝子により、そして下記するとおり異なる条件で行うことができる。
ａ）化合物を宿主細胞と接触させること
本発明により記載されたある種のスクリーニング方法は、場合により外因性ＬＲＨ−１受容体又はその機能的同等物の存在下に、試験化合物を、レポーター遺伝子の宿主細胞における発現を決定し、それにより試験化合物の効果に関する情報を得ることを可能とする特異的条件で、宿主細胞と接触させる工程を提供する。
【００５６】
好ましくは、ＬＲＨ−１受容体は、内因性ＬＲＨ−１の量の少なくとも２倍となるように人工的に導入されるか又は加えられる。それは、ＬＲＨ−１の同等物、即ち、ＬＲＨ−１受容体の核酸配列に対して少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７５％、なお更に好ましくは少なくとも９０〜９５％の同一性を示すいかなる核酸配列であってもよい。
【００５７】
古典的には、試験化合物の効果は、該化合物の不存在下に（及び／又は突然変異した応答エレメントで）決定されたレポーター遺伝子の発現のレベルに関して比較される。
【００５８】
特定の態様に従えば、本発明の方法は、試験化合物の存在下及び該化合物の不存在下にレポーター遺伝子発現のレベルを決定することを含み、レポーター遺伝子発現の増加又は減少は、試験化合物の、コレステロール逆転送をモジュレーションする能力を示す。
【００５９】
好ましい態様では、該細胞は、哺乳動物細胞（肝細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、筋肉細胞等）であることができる。なお更に好ましくは、該細胞は、ヒト細胞であることができる。それらは、初代培養物又は樹立された細胞系であることもできる。他の態様では、原核細胞（バクテリア）、酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ等）、植物細胞等を使用することも可能である。
【００６０】
化合物は、それらの効果、それらの濃度、細胞の性質及び技術的考慮に依存して、異なる時間に細胞と接触させることができる。管又はフラスコ内で、いかなる適当な支持体上でも、特にプレート上で接触を行うことができる。一般に、多数の異なる試験を同時に行うことを可能とする多重ウエルプレートで接触を行う。典型的な支持体は、取り扱いが容易であり、そして古典的刺激により可視化を達成することができる、マイクロタイトレーションプレート、更に特定的には９６又は３８４ウエル（又はそれより多い）を有するプレートを含む。
【００６１】
試験化合物の支持体及び性質に依存して、前記した方法を実施する際、可変量の細胞を使用することができる。古典的には、１０３〜１０６個の細胞、好ましくは１０４〜１０５個の細胞を、適当な培養培地中で、あるタイプの試験化合物と接触させる。例として、９６ウエルプレートにおいて、１０５個の細胞を各ウエルにおいて所望の量の試験化合物とインキュベーションさせることができる。３８４ウエルプレートにおいて、１０５個より少ない細胞、典型的には、１×１０４〜４×１０４個の細胞を一般に各ウエルにおいて試験化合物とインキュベーションさせる。
【００６２】
試験化合物の量（又は濃度）は、化合物のタイプ（その毒性、細胞を透過する能力等）、細胞の数、インキュベーション時間等に従って使用者により調節されうる。一般に、細胞を１nM〜１mMの濃度の範囲の試験化合物に暴露する。もちろん、本発明から逸脱することなく他の濃度を試験することが可能である。更に、各化合物は、異なる濃度で平行して試験することができる。
【００６３】
細胞中の化合物の透過を促進する種々のアジュバント及び／又はベクター及び／又は産物、例えば、リポソーム、カチオン性脂質、ポリマー、ペネトラチン（penetratin）、ＴａｔＰＤＴ、アデノウイルスから生じるペプチド（ペントン又はファイバー）又は他のウイルスから生じるペプチド等も、必用ならば使用することができる。
【００６４】
５〜７２時間、一般に、１２〜４８時間接触を維持する。実際に、細胞及び種々の試薬は、好ましくは、レポーター遺伝子の発現産物の新規な合成を可能とするのに十分に長く接触させておくべきである。好ましい様式では、インキュベーション時間は、約３６時間である。
【００６５】
ｂ）化合物の活性の決定
コレステロール逆転送をモジュレーションすることができる化合物の選択、同定又は特徴付けのための本発明で提唱された方法は、レポーター遺伝子発現カセットによる宿主細胞の形質転換を提供する。特に、該レポーター遺伝子は、生物学的抽出物においてその活性又は存在を測定することができる、即ち、検出又はアッセイすることができるか又はその転写産物を測定することができる産物をコードし、そして発現するいかなる遺伝子であることもできる。例は、ヒトａｐｏＡＩ自体をコードする遺伝子又はさもなければルシフェラーゼ、更に特定的にはホタル又はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードする遺伝子、分泌されたアルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｌｕｃ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等をコードする遺伝子を含む。「遺伝子」という用語は、広い意味では、いかなる核酸も意味し、特にｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ等を意味することは理解される。
【００６６】
レポーター遺伝子は、何であっても、上記した如きＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つのコピーを含むプロモーターの制御下に置かれる。
【００６７】
ゆえに、レポーター遺伝子は、その配列が配列番号１の配列又はその機能的変異体を含むいかなるプロモーターの制御下にも置かれることができる。該特定の配列は、プロモーターにおける１つ以上のコピー（好ましくは１〜１０、更に好ましくは１〜６）において同じ配向又は反対の配向において、上流、下流又は中間に存在することができる。好ましくは、本発明に従うプロモーターは、唯一のＬＲＨ−１応答エレメントとして、下記の配列（配列番号１）：５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’又はその機能的変異体を含有するヒトアポリポタンパク質ＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つのコピーを含む。
【００６８】
好ましくは、それは、ＬＲＨ−１又はその機能的同等物の不存在下及び存在下のその活性の差（differential activity）を検出することができるプロモーターである。
【００６９】
本発明のプロモーターを製造するために、ＬＲＨ−１応答エレメントは、転写最小プロモーターと関連させることができる。最小プロモーターは、活性が低いか、又は活性がなく、そして転写アクチベーターの存在下に増加させることができる（領域Ｂ及びＣの接合部とのＬＲＨ−１の相互作用）活性を有する転写プロモーターである。ゆえに、最小プロモーターは、哺乳動物細胞においては天然では弱い、即ち、顕著な生物学的効果を得るのに無毒性の及び／又は不十分な発現を生じさせるプロモーターであることができる。有利には、最小プロモーターは、転写活性に非必須の領域を欠失させることにより、ネイティブプロモーターから製造された構築物である。例えば、それは、好ましくは、一般にサイズが１６０ヌクレオチドより小さく、転写開始コドン周辺に中心を有する、本質的にＴＡＴＡボックスを含むプロモーターである。かくして、最小プロモーターは、例えば、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）のプロモーター、ＣＭＶ極初期プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ヒトアポリポタンパク質ＡＩをコードする遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等の如き強い又は弱いウイルス又は細胞プロモーターから製造することができる。最小プロモーターは、例えば領域Ｂ及びＣを介して、ＬＲＨ−１による活性化を増加させる化合物の同定を可能とするのに十分に高い活性を有することができる。
【００７０】
プロモーター（Ｐ）、ＬＲＨ−１応答エレメント（ＲＥ）、及びレポーター遺伝子（ＲＧ）は、発現カセットにおいて機能的様式で、即ち、最小プロモーターが該遺伝子の発現を制御するようにそしてその活性がＬＲＨ−１により調節されるように配置される。ゆえに、一般に、該領域は、５’→３’配向において下記の順序：ＲＥ−Ｐ−ＲＧ、において配置される。しかしながら、いかなる他の機能的配置も、本発明から逸脱することなく当業者により想定することができる。
【００７１】
更に、異なる前記した機能的ドメインは、互いに直接フランキングする（flank）ことができるか、又は発現カセットの機能的性質に有意に影響を与えないヌクレオチド、又はシステム（増幅器、サイレンサー、イントロン、スプライシング部位等）の改良された特徴若しくは性能を与えるヌクレオチドにより、分離されることができる。
【００７２】
コレステロール逆転送をモジュレーションすることができる化合物の選択、同定及び特徴付けの方法は、レポーター遺伝子の発現を決定する工程を与える。これは、転写活性の決定でありうる。このために、全ＲＮＡは、一方では実験条件で培養された細胞から抽出され、そして他方ではコントロール状況において培養された細胞から抽出される。該ＲＮＡは、例えば、レポーター遺伝子の発現の変化を分析するためのプローブとして使用される。
【００７３】
それは、適当な基質の助けによりレポーター遺伝子の発現を可視化するという問題でもありうる。該可視化は、その性質が使用されるレポーター遺伝子のタイプに依存する種々の技術により行うことができる。例えば、測定値は、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼをコードする遺伝子がレポーター遺伝子として使用される場合には、光学濃度、蛍光又はルミネッセンス発光に相当することができる。
【００７４】
特定の態様では、レポーター遺伝子の発現は、レポーター遺伝子の発現産物の加水分解のレベルとして測定される。例えば、β−ラクタマーゼの発現を評価するのに多くの基質を使用することができる。特にそれらは、β−ラクタム核を含有し、そしてその加水分解を測定することができるいかなる産物であってもよい。好ましい基質は、β−ラクタマーゼの特異的な基質（即ち、それらは、一般にβ−ラクタマーゼの不存在下に哺乳動物細胞において加水分解されない）、哺乳動物に毒性ではない及び／又はその加水分解産物が、例えば蛍光、放射能、酵素活性又はいかなる他の検出方法によっても容易に測定できる基質である。
【００７５】
なお更に好ましい基質は、レシオメトリック基質（ratiometric  substrate）である。該基質の加水分解は、細胞の数によるレポーター遺伝子の発現産物の活性と直接相関させることができる。本発明で使用することができる特異的及び無毒性レシオメトリック基質は、ＣＣＦ２−ＡＭである。
【００７６】
基質の濃度は、例えば、細胞の数に従って当業者により調節されうる。細胞は、一般に、約６０分間基質と接触して保たれる。
【００７７】
レポーター遺伝子産物（又は基質の加水分解産物）の存在は、当業者により知られている慣用の方法（蛍光、ＯＤ、ルミネッセンス、ＦＲＥＴ（ＷＯ  ００３７０７７参照）、ＳＰＡ、バイオチップ、免疫学的方法等により決定されうる。
【００７８】
一般に、細胞における試験化合物の活性を決定し、そしてこの効果を、試験化合物の不存在下における活性のレベル又はいかなる試験化合物も不存在下に決定された平均値と比較する。
【００７９】
加水分解の測定は、主として各反応サンプル中に含有された加水分解産物の測定（又は相対的量を決定すること）を含む。該測定は、蛍光、放射能、色、酵素活性、抗原抗体免疫複合体等の検出を含む、当業者により知られた種々の方法により行うことができる。好ましい様式では、加水分解産物を検出し、そして蛍光検出法により定量する。かくして種々の蛍光色素を使用することができ、そして細胞サンプルによって測定することができる。
【００８０】
化合物の選択を動物において確証することができる第２の試験は、発現されたＨＤＬの量を決定すること又は未処理細胞との比較において該化合物で処理された細胞におけるコレステロール逆転送の有意な変化を決定することにより行うこともできる。血漿コレステロールを測定すること及び／又はａｐｏＡＩの肝臓発現を決定することも可能である。
【００８１】
本発明の好ましい態様に従えば、宿主細胞は、ＬＲＨ−１リガンドも含む。「ＬＲＨ−１リガンド」という用語は、転写因子、コアクチベーター及びコリプレッサー、並びに遺伝子発現の調節装置に関与した他のポリペプチドにも当てはまる。例えば、それは、ＲＸＲ又は核内ホルモン受容体のような他の受容体であることができる。
【００８２】
本発明の他の好ましい態様に従えば、そして以前に記載されたとおり、ＬＲＨ−１受容体又は機能的同等物を含む宿主細胞は、本発明の方法で使用される。ＬＲＨ−１受容体の存在は、生理学的状況を模倣し、そしてＬＲＨ−１と、本発明に開示された如きその応答エレメントの一つ及び／又は他方との間の相互作用、あるいはＬＲＨ−１とＬＲＨ−１の１つ以上のリガンドとの相互作用をモジュレーションすることができる化合物の前記した方法による同定を可能とする。
【００８３】
本発明は、試験化合物の存在下及び試験化合物の不存在下に、上記した当業者により知られている方法の１つに従って、レポーター遺伝子の発現のレベルの決定を可能とし、レポーター遺伝子発現のレベルの増加又は減少は、コレステロール逆転送をモジュレーションする試験化合物の能力を示す。
【００８４】
故に、本発明は、ＨＤＬの活性をモジュレーションすることができる化合物のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングのために使用される本発明に従う構築物、カセット又は細胞の助けにより行うことができる。
【００８５】
以前に示されたとおり、該方法は、１種以上の細胞集団（哺乳動物細胞、ヒト細胞、例えば、肝臓細胞、原核細胞等）に関する多くの試験化合物の迅速且つ同時的なスクリーニングを可能とする。該方法は、予測に役立ち、自動化することができ、そして該化合物の選択、同定及び特徴付けに適応する。
【００８６】
スクリーニング方法の特定の態様は、ＤＮＡ結合性タンパク質を発現するクローンを同定するための古典的方法を使用する。例えば、それは、λｇｔ１１におけるｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすること又はいわゆる「ワンハイブリッド」若しくは「ファージディスプレイ」法を使用すること又はアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行うことであることができる。単離したタンパク質を、次に配列決定する。
【００８７】
２.結合試験に基づく方法
本発明は、１種以上の応答エレメントへの試験化合物の結合を測定することに基づくコレステロール逆転送をモジュレーションする（即ち、増加又は減少させる）ことができる化合物の選択、同定又は特徴付けのための方法にも関する。該方法は、更に詳しくは、
ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメント又はその機能的変異体の少なくとも１つのコピーを含む核酸構築物と試験化合物を接触させ、そして
応答エレメントへの該試験化合物の起こりうる結合を決定する
ことを含む。
【００８８】
好ましくは、本発明の方法は、
唯一のＬＲＨ−１応答エレメントとして、下記の配列（配列番号１）：５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’を含有するヒトアポリポタンパク質ＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つのコピーを含む核酸構築物と試験化合物を接触させ、そして
応答エレメントへの該試験化合物の可能な結合を決定する
ことを含む。
【００８９】
他の本発明の方法は、
外因性ＬＲＨ−１受容体又はその機能的同等物の存在下に、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメント又はその機能的変異体の少なくとも１つのコピーを含む核酸構築物と試験化合物を接触させ、そして
ＬＲＨ−１応答エレメントへの試験化合物の結合、及び／又はＬＲＨ−１のその応答エレメントへの結合により形成された複合体への試験化合物の結合を決定する
ことを含む。
【００９０】
なお更に好ましくは、本発明の方法は、
外因性ＬＲＨ−１受容体又はその機能的同等物の存在下に、唯一のＬＲＨ−１応答エレメントとして、下記の配列（配列番号１）：５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’を含有するヒトアポリポタンパク質ＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つのコピーを含む核酸構築物と試験化合物を接触させ、そして
ＬＲＨ−１応答エレメントへの該試験化合物の起こりうる結合、及び／又はＬＲＨ−１のその応答エレメントへの結合により形成された複合体への該試験化合物の起こりうる結合を決定する
ことを含む。
【００９１】
本発明の好ましい態様は、試験化合物の存在下に結合したＬＲＨ−１の量を、試験化合物の不存在下のこの量と比較して決定することにより、応答エレメントへのＬＲＨ−１の結合をモジュレーションする該試験化合物の能力を確立することからなる。例えば、当業者に知られているＦＰ（蛍光偏向）を使用する競合試験を、該決定のために有効に使用することができる。
【００９２】
ＬＲＨ−１の応答エレメントへの結合をモジュレーションすることができる試験化合物は、その後、上記した方法の１つに従ってレポーター遺伝子及び／又はコレステロール逆転送の発現をモジュレーションするその能力について試験されうる。
【００９３】
少なくとも１つのＬＲＨ−１応答エレメントへの試験化合物の結合は、上記した方法の実施の後形成されたヘテロ二量体の電気泳動により、ゲルシフトにより証明することができる。実際に、いくらかの試験化合物は、ＬＲＨ−１のＤＮＡ結合部位と大部分同一の、それゆえそれと競合するＤＮＡ結合部位を含有することができる。
電気泳動は、ＬＲＨ−１／ＬＲＨ−１応答エレメントからなるヘテロ二量体を、試験化合物／ＬＲＨ−１応答エレメントからなるヘテロ二量体及びＬＲＨ−１応答エレメントから直接区別することを可能とする。
【００９４】
当業者に周知である他のルミネッセンスをベースとする方法又はＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）技術を使用する方法を、本発明において、ＬＲＨ−１応答エレメントの一方及び／又は他方への試験化合物の可能な結合を決定するのに使用することができる。
【００９５】
特定の態様では、核酸構築物は、配列番号１の配列又はその機能的変異体の少なくとも１コピー、好ましくは２〜５コピーを含む。該構築物へのＬＲＨ−１結合を活性化する（即ち、少なくとも部分的に増加させる）ことができる試験化合物は、レポーター遺伝子発現の活性化を可能とし、そしてコレステロール逆転送の刺激のための候補を表す。
【００９６】
本発明の特定の態様に従えは、前記方法の１つにより決定された起こりうる効果を、同じ条件で行われたが、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つの不活性変異体（例えば、突然変異したコピー）（配列番号２）又はその機能的変異体を含む核酸構築物により行われた方法により決定された起こりうる効果と比較することも提供される。好ましい様式では、核酸構築物は、下記の配列（配列番号１）：５’−ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣ−３’を含有するヒトアポリポタンパク質ＡＩ遺伝子のプロモーターのＬＲＨ−１応答エレメントの少なくとも１つの突然変異したコピーを含有し、該突然変異したコピーは、本質的にＬＲＨ−１受容体に結合することができない。
【００９７】
Ｃ．ＨＤＬ及びアポリポタンパク質ＡＩの活性
レポーター遺伝子の発現及び／又はコレステロール逆転送をモジュレーションする（即ち、増加又は減少させる）化合物の選択、同定又は特徴付けについて上記した方法は、好ましくは、コレステロール逆転送を増加させることができる化合物をスクリーニングするために使用され、そして本発明の他の態様に従えは、ＨＤＬの活性及び／又はａｐｏＡＩの発現をモジュレーションすることができる化合物の選択、同定又は特徴付けのために使用することができる。
【００９８】
Ｄ．試験化合物
本発明は、いかなるタイプの試験化合物についても使用することができる。例えば、試験化合物は、単離されているか又は他の産物と混合されているいかなる産物であってもよい。化合物は、その構造及び／又は組成によって定義されることができ又は定義できない。例えば、化合物は、単離され、そして構造的に定義された産物、定義されていない構造を有する単離された産物、既知のそして特徴付けされた産物の混合物又は１種以上の産物を含む定義されていない組成物であることができる。かくして、１種以上の化合物を、混合物において又は別々に試験することができる。例えば、該定義されていない組成物は、組織、生物学的流体、細胞上清、植物調製物等のサンプルであることができる。試験化合物は、無機又は有機産物、特にポリペプチド（又はタンパク質若しくはペプチド）、核酸、脂質、多糖、化合物又は生物学的化合物、例えば、核内因子、補因子又はそのいかなる混合物又は誘導体でもあることができる。化合物は、起源において天然又は合成であることができ、そして、コンビナトリアルライブラリー、１種以上のＤＮＡ結合性ペプチド等を発現するクローン又は核酸クローンのライブラリーを含むことができる。
【００９９】
本発明は、多数の化合物の選択、同定又は特徴付けに特に適している。この簡単で有効なスクリーニングは、非常に短い期間の時間に達成されうる。特に、上記した方法は、部分的に自動化されることができ、それにより混合物の形態で又は別々に、多くの異なる化合物の有効かつ同時的なスクリーニングを可能とする。
【０１００】
Ｅ．同定された化合物の使用
本発明に従って同定された化合物は、特にアテローム性動脈硬化症の分野において治療に使用するための有利な性質を有する。
【０１０１】
かくして、本発明は、コレステロール逆転送をモジュレーションする（即ち、増加又は減少させる）ことを意図した組成物を製造するための、ヒトａｐｏＡＩをコードする遺伝子のプロモーターにおける応答エレメント又はその機能的変異体への（特に、配列番号１の配列又はその機能的変異体への）ＬＲＨ−１及び／又はその補因子の結合をモジュレーションする（増加又は減少させる）ことができる化合物の使用を提供する。本発明の他の態様に従えば、該使用は、ＨＤＬの活性をモジュレーションすること（即ち、増加もしくは減少させること）又は、ａｐｏＡＩの発現をモジュレーションすることを意図することができる。
【０１０２】
本発明の他の態様は、コレステロール逆転送をモジュレーションする（即ち、増加させる）こと又はＨＤＬの活性をモジュレーションする（即ち、増加又は減少させる）ことを意図した組成物を製造するための、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子又はその機能的変異体の転写に対するＬＲＨ−１の効果をモジュレーションする（即ち、増加又は減少させる）ことができる化合物の使用を提供する。
本発明の好ましい態様では、それは化合物又は生物学的化合物である。他の好ましい態様では、それは核因子（nuclear factor）又は補因子である。なお更に好ましい態様では、それは、１種以上のＤＮＡ結合ポリペプチドを発現するクローンである。一般的には、それは、上記した方法の１つに従って選択、同定又は特徴付けされるいかなる化合物であってもよい。
【０１０３】
本発明は、実験的研究の標的として、あるいはコレステロール逆転送を増加させること又は高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、脂質疾患及び／又は心臓血管疾患を処置することを意図した医薬組成物の製造のための、本発明の範囲内の上記した方法の１つに従って選択、同定又は特徴付けされるいかなる化合物（又は該化合物の誘導体）の使用も包含し、そして該医薬組成物も包含する。
【０１０４】
本発明の他の利点及び適用は、下記の実施例で明らかになるが、これらの実施例は説明を目的とし、限定を目的としない。
【０１０５】
【表１】
2007515183.tif 000002
2007515183.tif 000003
2007515183.tif 000004
【０１０６】
実施例
実施例１：ＨｅｐＧ２細胞におけるヒトａｐｏＡＩプロモーターの活性に対するＬＲＨ−１過剰発現の効果
実施例１は、ｈＬＲＨ−１の過剰発現は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にクローニングされたａｐｏＡＩプロモーターの断片−２５４／＋９１（領域Ａ、Ｂ及びＣを含有する）の活性を増加させたことを示す。
【０１０７】
ＨｅｐＧ２細胞を、ＬＲＨ−１過剰発現ベクターｐＣＩ−ｈＬＲＨ−１又はネガティブコントロールとして使用される空のベクターｐＣＩ１００ng、並びにａｐｏＡＩプロモーターの断片−２５４／＋９１（ｈＡｐｏ  ＡＩプロモーターの領域Ａ、Ｂ及びＣを含む）の制御下にルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するレポーターベクターＡＢＣＬｕｃ＋（ＡＢＣＬｕｃ＋）２５０ng又はコントロールとしてプロモーターを含まないレポーターベクター（Ｌｕｃ＋）２５０ngを用いて、リポフェクション技術（供給者の指示に従うＪｅｔＰＥＩ）によりコトランスフェクションした。これらの構築物は、以前に記載された構築物［１６］からのＣＡＴレポーター遺伝子を、以前に記載された［１７］ＰｒｏｍｅｇａプラスミドｐＧＬ３（Madison, WI, USA）から抽出されたルシフェラーゼレポーター遺伝子と交換することにより得られた。トランスフェクションされたＤＮＡの総量は、ｐＢＫＳ＋プラスミドを使用して５００ngに調節した。３時間のトランスフェクションの後に、細胞を培養培地中で３６時間インキュベーションした。次いで、ルシフェラーゼ活性を、ＬＲＨ−１タンパク質の存在又は不存在下に以前に記載のとおりに［１７］測定した。
【０１０８】
図１は、ＬＲＨ−１過剰発現は、ＨｅｐＧ２細胞がＡＢＣＬｕｃ＋構築物でトランスフェクションされると、ルシフェラーゼ活性を２倍増加させたことを示す。この増加は、細胞をプロモーターなしのコントロール構築物Ｌｕｃ＋でトランスフェクションした場合は得られなかった。
【０１０９】
実施例２：ＲＫ１３細胞におけるヒトａｐｏＡＩプロモーターの活性に対するＬＲＨ−１過剰発現の効果
実施例２は、ｈＬＲＨ−１の過剰発現は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流でクローニングされた、ａｐｏＡＩプロモーターの断片−２５４／＋９１（領域Ａ、Ｂ及びＣを含有する）及び−１９２／＋２１（領域Ｂ及びＣを含有する）の活性を増加させたが、断片−１２８／＋９１（領域Ｃを含有する）及び−４０／＋９１（最小プロモーターのみを含有する）の活性を増加させなかったことを示す。
【０１１０】
ＲＫ１３細胞は、ＬＲＨ−１過剰発現ベクターｐＣＩ−ｈＬＲＨ−１又はネガティブコントロールとして使用される空のベクターｐＣＩ１００ng、並びに断片−２５４／＋９１の制御下にルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するレポーターベクターＡＢＣＬｕｃ＋（ｈＡｐｏ  ＡＩプロモーターの領域Ａ、Ｂ及びＣを含む、ＡＢＣＬｕｃ＋）、−１９２／＋９１（領域Ｂ及びＣを含む；ＢＣＬｕｃ＋）、−１２８／＋９１（領域Ｃを含む；ＣＬｕｃ＋）又は−４０／＋９１（最小プロモーターを含む；ｐｍｉｎ）の制御下にルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するレポーターベクター２５０ng又はコントロールとしてプロモーターを含まないレポーターベクター（Ｌｕｃ＋）２５０ngを用いてリポフェクション技術（供給者の指示に従うＪｅｔＰＥＩ）によりコトランスフェクションした。これらの構築物は、以前に記載された構築物［１６］からのＣＡＴレポーター遺伝子を以前に記載された［１７］とおりのＰｒｏｍｅｇａプラスミドｐＧＬ３（Madison, WI, USA）から抽出されたルシフェラーゼレポーター遺伝子と交換することにより得られた。トランスフェクションされたＤＮＡの総量は、ｐＢＫＳ＋プラスミドを使用して５００ngに調節した。３時間のトランスフェクションの後に、細胞を培養培地中で３６時間インキュベーションした。次いで、ルシフェラーゼ活性を、ＬＲＨ−１タンパク質の存在又は不存在下に以前に記載のとおりに［１７］測定した。
【０１１１】
図２は、ＬＲＨ−１の存在下では、領域Ａ、Ｂ及びＣ＋最小プロモーターを含むヒトａｐｏＡＩプロモーターの制御下に置かれたルシフェラーゼ遺伝子の発現（ＡＢＣＬｕｃ＋；断片−２５４／＋９１）は、ＬＲＨ−１受容体を内因的に発現しないＲＫ１３細胞において１２倍増加したことを示す。ヒトａｐｏＡＩプロモーターの領域Ｂ、Ｃ＋最小プロモーターを含む構築物の制御下のルシフェラーゼ発現（ＢＣＬｕｃ＋；断片−１９２／＋９１）は、１５倍増加した。ヒトａｐｏＡＩプロモーターの領域Ｃ＋最小プロモーターを含む構築物の制御下のルシフェラーゼ発現（ＣＬｕｃ＋；断片−１２８／＋９１）は、影響を受けなかった。ヒトａｐｏＡＩプロモーターの最小プロモーター（ｐｍｉｎ；断片−４０／＋９１）のみの制御下のルシフェラーゼ発現は僅かに２倍しか増加しなかった。
【０１１２】
ＲＫ１３細胞が、プロモーターを含まないベクターＬｕｃ＋でトランスフェクションされた場合は、ルシフェラーゼ発現は変化しなかった。
【０１１３】
ゆえに、ａｐｏＡＩ遺伝子の発現は、ＬＲＨ−１タンパク質により調節される。ＬＲＨ−１タンパク質のトランス結合を可能とするヒトａｐｏＡＩ遺伝子の領域Ｂに位置したシス作用性部位がある。
【０１１４】
実施例３：ヒトａｐｏＡＩプロモーターにおけるＬＲＨ−１結合部位の同定
実施例３は、ＬＲＨ−１がヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２に結合することを示す。
ｈＬＲＨ−１タンパク質を、ＰｒｏｍｅｇａからのＴＮＴ−Ｔ７ウサギ網状赤血球溶解物キット（ｒｅｆ．Ｌ４６１０）及びベクターｐＣＩ−ＬＲＨ−１を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生した。ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーター（配列番号５）の、Ｃｙｐ７ａ遺伝子中に存在するＬＲＨ−１応答エレメント（ｈＣｙｐ７ａ  ｗｔ）、
【０１１５】
【表２】
2007515183.tif 000005
【０１１６】
同じ突然変異した応答エレメントｈＣｙｐ７ａ  ｍｕｔ、
【０１１７】
【表３】
2007515183.tif 000006
【０１１８】
断片−１９１／−１７１（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿５）、
【０１１９】
【表４】
2007515183.tif 000007
【０１２０】
断片−１７８／−１４５（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿６）、
【０１２１】
【表５】
2007515183.tif 000008
【０１２２】
断片−１４４／−１２２野生型（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿７）又は突然変異（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡ１  ｍｕｔ）、
【０１２３】
【表６】
2007515183.tif 000009
【０１２４】
並びに断片−１８０／−１５８（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡＩ＿ｈ＿８）、
【０１２５】
【表７】
2007515183.tif 000010
【０１２６】
に相当する二本鎖オリゴヌクレオチドを、以前に記載されたとおりに［１６］製造し、そしてポリヌクレオチドキナーゼを使用して［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰで標識した。
【０１２７】
ｈＬＲＨ−１によりプログラムされたウサギ網状赤血球溶解物２μlを、標識された二本鎖オリゴヌクレオチド（０．５ng）の存在下に、ポリｄＩ−ｄＣ２．５μg及びニシン精子ＤＮＡ１μgと共に、１０mMＨＥＰＥＳ、２．５mMＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、２．５mg/mlＢＳＡ、５０mMＮａＣｌ及び０．５mMＤＴＴを含有する緩衝剤２０μlの最終容積において室温で１５分間インキュベーションした。次いで複合体をＴＢＥ０．２５Ｘ緩衝剤中で非変性ゲル電気泳動により分離した。
【０１２８】
図３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたＬＲＨ−１タンパク質を、Ｃｙｐ７ａ遺伝子におけるＬＲＨ−１応答エレメント（ｈＣｙｐ７ａ  ｗｔ）に相当する標識された二本鎖オリゴヌクレオチドとインキュベーションさせた場合に、特異的ＬＲＨ−１／ＤＮＡ複合体が形成されたことを示す。対照的に、突然変異した応答エレメント（ｈＣｙｐ７ａ  ｍｕｔ）に相当する標識された二本鎖オリゴヌクレオチドの存在下では複合体は検出されなかった。図３は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１９１／−１７１（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿５）、−１７８／−１４５（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿６）及び−１８０／−１５８（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿８）に相当する二本鎖オリゴヌクレオチドでは、ＤＮＡ／ＬＲＨ−１複合体は見られなかったことも示す。他方、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿７）に相当する標識された二本鎖オリゴヌクレオチドでは、特異的ＬＲＨ−１／ＤＮＡ複合体が形成された。該断片は、ヒトａｐｏＡＩプロモーターの領域Ｂ及びＣにまたがり、そしてアンチセンス鎖上に、ＬＲＨ−１応答エレメントのコンセンサス配列ＴＣＡＡＧＧＴＣＡに類似した配列ＴＣＡＡＧＧＡＴＣを含有する。該エレメントは機能的である、何故ならば、図３は、配列ＴＣＡＡＧＧＡＴＣが突然変異されている（ＴＣＡＡＣＡＡＴＣ）対応する二本鎖オリゴヌクレオチドが、ＬＲＨ−１（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡＩ  ｍｕｔ）との複合体を形成することができなかったことを示すからである。
【０１２９】
実施例４：ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２は、低アフィニティーＬＲＨ−１応答エレメントである。
実施例４は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２は、ＬＲＨ−１のための低アフィニティー結合部位であることを示す。
【０１３０】
ｈＬＲＨ−１タンパク質を、ＰｒｏｍｅｇａからのＴＮＴ−Ｔ７ウサギ網状赤血球溶解物キット（ｒｅｆ．Ｌ４６１０）及びベクターｐＣＩ−ＬＲＨ−１を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生した。ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーター（配列番号４）の、Ｃｙｐ７ａ遺伝子中に存在するＬＲＨ−１応答エレメント（ＬＲＨ−１−プローブＣｙｐ７ａ）又は野生型断片−１４４／−１２２（ＡｐｏＡＩ＿ｈ＿７）に相当する二本鎖オリゴヌクレオチドを、以前に記載されたとおりに製造し［１６］、そしてポリヌクレオチドキナーゼを使用して［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰで標識した。ｈＬＲＨ−１によりプログラムされた網状赤血球溶解物２μlを、標識されたプローブ（０．５ng）に対して過剰の（１０Ｘ、５０Ｘ及び１００Ｘ）標識されていない二本鎖オリゴヌクレオチドの存在下にポリｄＩ−ｄＣ２．５μg及びニシン精子ＤＮＡ１μgと共に、１０mMＨＥＰＥＳ、２．５mMＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、２．５mg/mlＢＳＡ、５０mMＮａＣｌ及び０．５mMＤＴＴを含有する緩衝剤２０μlの最終容積において４℃で１５分間インキュベーションした。次いで標識した二本鎖オリゴヌクレオチド（０．５ng）を混合物に加え、そして室温で１５分間インキュベーションした。次いで複合体をＴＢＥ０．２５Ｘ緩衝剤中で非変性ゲル電気泳動により分離した。
【０１３１】
図４Ａは、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２に相当する標識されていない二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＬＲＨ−１とＣｙｐ７ａ遺伝子中のＬＲＨ−１応答エレメントに相当する標識された二本鎖オリゴヌクレオチドとの間で形成された複合体を部分的に置き換えたことを示す。他方、図４Ａは、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの突然変異した断片−１４４／−１２２に相当する標識されていない二本鎖オリゴヌクレオチドによる、ＬＲＨ−１とＣｙｐ７ａ遺伝子におけるＬＲＨ−１応答エレメントに相当する標識された二本鎖オリゴヌクレオチドとの間に形成された複合体の置き換えはなかったことを示す。
【０１３２】
図４Ｂは、Ｃｙｐ７ａ遺伝子におけるＬＲＨ−１応答エレメントに相当する標識されていない二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＬＲＨ−１とヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２に相当する標識された二本鎖オリゴヌクレオチドとの間で形成された複合体を完全に置き換えたことを示す。他方、図４Ｂは、Ｃｙｐ７ａ遺伝子中に存在する突然変異したＬＲＨ−１応答エレメントに相当する標識されていない二本鎖オリゴヌクレオチドによる、ＬＲＨ−１とヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２に相当する標識された二本鎖オリゴヌクレオチドとの間で形成された複合体の置き換えがなかったことを示す。図４Ａ及びＢの比較は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２に対するＬＲＨ−１のアフィニティーはＣｙｐ７ａ遺伝子中に存在するＬＲＨ−１応答エレメントに対するアフィニティーより低かったことを示す。
【０１３３】
実施例５：ＨｕＨ７細胞における突然変異された又はされていないヒトａｐｏＡＩプロモーターの活性に対するＬＲＨ−１過剰発現の効果
実施例５は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２中に存在する部位ＴＣＡＡＧＧＡＴＣの突然変異は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−２５４／＋９１を含有する構築物のＬＲＨ−１に対する感受性を減少させたことを示す。
【０１３４】
ＨｕＨ７細胞は、ＬＲＨ−１過剰発現ベクターｐＣＩ−ｈＬＲＨ−１又はネガティブコントロールとして使用された空のベクターｐＣＩ１００ng及び、ａｐｏＡＩプロモーターの野生型領域Ａ、Ｂ及びＣを含む断片−２５４／＋９１の制御下にルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するレポーターベクターＡＢＣＬｕｃ＋（ＡＢＣＬｕｃ＋）、部位ＴＣＡＡＧＧＡＴＣが突然変異しているａｐｏＡＩプロモーターの領域Ａ、Ｂ及びＣを含む断片−２５４／＋９１の制御下にルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するレポーターベクター（ＡＢＣｍｕｔＬｕｃ＋）、ｈＡｐｏＡＩプロモーターの領域Ｂ及びＣを含む断片−１９２／＋９１の制御下にルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するレポーターベクター（ＢＣＬｕｃ＋）、ａｐｏＡＩプロモーターの領域Ｃを含む断片−１２８／＋９１の制御下にルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するレポーターベクター（ＣＬｕｃ＋）、又は、最小ａｐｏＡＩプロモーターを含む断片−４０／＋９１の制御下にルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するレポーターベクター（ｐｍｉｎ）５０ng、又はコントロールとしてプロモーターを含まないレポーターベクター（Ｌｕｃ＋）５０ngで、コトランスフェクションした。
【０１３５】
突然変異体構築物ＡＢＣｍｕｔＬｕｃ＋は、配列番号１９のセンス配列及び配列番号２０のアンチセンス配列に相当するＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Stratagene）を使用して、野生型ＡＢＣＬｕｃ＋構築物の部位特異的突然変異誘発により得られた。
【０１３６】
図５は、ＬＲＨ−１過剰発現は、ＨｕＨ７細胞がＡＢＣＬｕｃ＋構築物でトランスフェクションされた場合にルシフェラーゼ活性の５．８倍増加及びＢＣＬｕｃ＋構築物がトランスフェクションのために使用された場合に２．６倍の増加をもたらしたことを示す。部位ＴＣＡＡＧＧＡＴＣが突然変異されているａｐｏＡＩプロモーターの領域Ａ、Ｂ及びＣを含む構築物（ＡＢＣｍｕｔＬｕｃ＋）で細胞をトランスフェクションするか、又はａｐｏＡＩプロモーターの領域Ｃを含む構築物（ＣＬｕｃ＋）、最小ａｐｏＡＩプロモーター（ｐｍｉｎ）又はプロモーターを含まない構築物（Ｌｕｃ＋）で細胞をトランスフェクションした場合には、増加は殆どないか又は全然なかった。
【０１３７】
実施例５は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２に存在するＴＣＡＡＧＧＡＴＣ部位はそれをＬＲＨ−１に感作させることを示す。
【０１３８】
実施例６：ＨｕＨ７細胞における異なるヒトａｐｏＡＩプロモーター突然変異体の活性に関するＬＲＨ−１過剰発現の効果
実施例６は、断片−１４４／−１２２に存在するＴＣＡＡＧＧＡＴＣ部位の突然変異は、ヒトａｐｏＡＩプロモーターの隣接ＦＸＲ応答エレメントの突然変異とは対照的に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にクローニングされたヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−２５４／＋９１を含む構築物のＬＲＨ−１に対する感受性を減少させたことを示す。
【０１３９】
ＨｕＨ７細胞は、ＬＲＨ−１過剰発現ベクターｐＣＩ−ｈＬＲＨ−１又はネガティブコントロールとして使用された空のベクターｐＣＩ１００ng、及びａｐｏＡＩプロモーターの野生型領域Ａ、Ｂ及びＣを含む断片−２５４／＋９１の制御下に（ＡＢＣＬｕｃ＋及びＡＢＣｐＧＬ３）、部位ＴＣＡＡＧＧＡＴＣが突然変異しているａｐｏＡＩプロモーターの領域Ａ、Ｂ及びＣを含む断片−２５４／＋９１の制御下に（ＡＢＣｍｕｔＬｕｃ＋  実施例５参照）、ＦＸＲ応答エレメントが突然変異しているａｐｏＡＩプロモーターの領域Ａ、Ｂ及びＣを含む断片−２５４／＋９１の制御下に（ＡＢＣｐＧＬ３ＦＸＲＥＫＯ）、ｈＡｐｏＡＩプロモーターの領域Ｂ及びＣを含む断片−１９２／＋９１の制御下に（ＢＣＬｕｃ＋及びＢＣｐＧＬ３）、ＦＸＲ応答エレメントが突然変異している断片−１９２／＋９１の制御下に（ＢＣｐＧＬ３ＦＸＲＥＫＯ）、ａｐｏＡＩプロモーターの領域Ｃを含む断片−１２８／＋９１の制御下に（Ｃｌｕｃ＋）、最小ａｐｏＡＩプロモーターを含む断片−４０／＋９１の制御下に（ｐｍｉｎ）、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するレポーターベクター５０ngにより、又はコントロールとしてプロモーターを含まないレポーターベクター（Ｌｕｃ＋及びｐＧＬ３）５０ngにより、コトランスフェクションした。
【０１４０】
ＡＢＣＬｕｃ＋ベクターから（ＳａｌＩ／ＳｐｈＩ消化）のａｐｏＡＩプロモーターの断片−２５４／＋９１をＰｒｏｍｅｇａからのｐＧＬ３ベクター（ＸｈｏＩ／ＳｐｈＩ消化）にサブクローニングすることによりＡＢＣｐＧＬ３構築物を得た。ＡＢＣｐＧＬ３ＦＸＲＥＫＯ構築物は、以前に記載された［１８］ＡＢＣＬｕｃ＋ＦＸＲＥＫＯベクター（ＳａｌＩ／ＳｐｈＩ消化）からのａｐｏＡＩプロモーターの突然変異した断片−２５４／＋９１をｐＧＬ３ベクター（ＸｈｏＩ／ＳｐｈＩ消化）にサブクローニングすることにより得られた。ＢＣｐＧＬ３及びＢＣｐＧＬ３ＦＸＲＥＫＯ構築物は、それぞれ、ＡＢＣｐＧＬ３及びＡＢＣｐＧＬ３ＦＸＲＥＫＯの部分的消化及び再ライゲーションにより得られた。
【０１４１】
図６は、ＨｕＨ７細胞がＡＢＣＬｕｃ＋構築物でトランスフェクションされた場合にルシフェラーゼ活性を４．８倍増加させ、ＢＣＬｕｃ＋によるトランスフェクション後に２．１倍、ＡＢＣｐＧＬ３によるトランスフェクション後に８．７倍、ＡＢＣｐＧＬ３ＦＸＲＥＫＯでは１１．５倍、ＢＣｐＧＬ３では１．９倍及びＢＣｐＧＬ３ＦＸＲＥＫＯによるトランスフェクション後には２．４倍増加させたことを示す。ＴＣＡＡＧＧＡＴＣが突然変異しているａｐｏＡＩプロモーターの領域Ａ、Ｂ及びＣを含む構築物（ＡＢＣｍｕｔＬｕｃ＋）で細胞をトランスフェクションした場合又はａｐｏＡＩプロモーターの領域Ｃ（Ｃｌｕｃ＋）、最小ａｐｏＡＩプロモーター（ｐｍｉｎ）又はプロモーターを含まない構築物（ＬＵＣ＋及びｐＧＬ３）で細胞をトランスフェクションした場合には、増加は殆ど又は全然観察されなかった。
【０１４２】
実施例６は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２中に存在するＴＣＡＡＧＧＡＴＣ部位は、ＬＲＨ−１に対してそれを感作させることを示す。ＬＲＨ応答エレメントに隣接したＦＸＲ応答エレメントの存在は、ＬＲＨに対する応答に必要ではないようであった。
【０１４３】
ゆえに、これらの２つの応答エレメントは、物理的にはよく似ているけれども、機能的には異なっている。
【０１４４】
実施例７：ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターにおけるＬＲＨ−１結合部位はヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターにおけるＦＸＲ結合部位とは異なる。
実施例３は、ＬＲＨ−１は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２に結合することを示す。
【０１４５】
実施例７は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーター上のＬＲＨ−１の結合部位は、この同じプロモーター上のＦＸＲの結合部位とは異なることを示す。
【０１４６】
ＬＲＨ−１及びＦＸＲタンパク質は、ＴＮＴ−Ｔ７（ウサギ網状赤血球溶解物、Ｐｒｏｍｅｇａ，ｒｅｆ．Ｌ４６１０）及びベクターｐＣＩ−ＬＲＨ−１及びｐＣＤＮＡ３−ＦＸＲによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生された。
【０１４７】
ゲルシフト実験を、Ｃｙｐ７ａ遺伝子中に存在するＬＲＨ−１応答エレメント（ｈＣｙｐ７ａ  ｗｔ）、
【０１４８】
【表８】
2007515183.tif 000011
【０１４９】
ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターのＦＸＲ応答エレメント（ＦＸＲＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿１）、
【０１５０】
【表９】
2007515183.tif 000012
【０１５１】
突然変異した形態にある同じ応答エレメント（ＦＸＲＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿１＿ｍｕｔ）、
【０１５２】
【表１０】
2007515183.tif 000013
【０１５３】
及び野生型ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿７）又は突然変異（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡ１  ｍｕｔ）、
【０１５４】
【表１１】
2007515183.tif 000014
【０１５５】
に相当する二本鎖オリゴヌクレオチドで実施例３に記載のとおりに行った。
【０１５６】
図３及び７Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたＬＲＨ−１タンパク質を、Ｃｙｐ７ａ遺伝子におけるＬＲＨ−１応答エレメント（ｈＣｙｐ７ａ  ｗｔ）に相当する標識された二本鎖オリゴヌクレオチドとインキュベーションさせた場合に、特異的ＬＲＨ−１／ＤＮＡ複合体が形成されたことを示す。他方、突然変異した応答エレメント（ｈＣｙｐ７ａ  ｍｕｔ）に相当する標識された二本鎖オリゴヌクレオチドでは複合体は検出されなかった（図３）。図３は、ＬＲＨ−１タンパク質がヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿７）に相当する標識された二本鎖オリゴヌクレオチドとインキュベーションされた場合には、特異的ＬＲＨ−１／ＤＮＡ複合体が形成されたが、これに対して、該複合体は、配列ＴＣＡＡＧＧＡＴＣが突然変異されている（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡＩ  ｍｕｔ）対応する二本鎖オリゴヌクレオチドでは、存在しかったことを示す。
【０１５７】
図７Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたＦＸＲタンパク質がヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターの断片−１４４／−１２２（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿７）に相当する標識された二本鎖オリゴヌクレオチド又は突然変異した同じ断片（ＬＲＨＲＥ＿ＡｐｏＡ１  ｍｕｔ）とインキュベーションされた場合に、ＦＸＲ／ＤＮＡ複合体は検出されなかったことを示す。他方、図７Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたＦＸＲタンパク質がヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターのＦＸＲ応答エレメント（ＦＸＲＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿１）に相当する標識された二本鎖オリゴヌクレオチドとインキュベーションされた場合は、特異的ＦＸＲ／ＤＮＡ複合体の存在を示すが、これに対して、ＦＸＲタンパク質を突然変異した同じ応答エレメント（ＦＸＲＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿１＿ｍｕｔ）とインキュベーションした場合には、この複合体はもはや存在しない。
【０１５８】
図７Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたＬＲＨ−１タンパク質をヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターのＦＸＲ応答エレメント（ＦＸＲＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿１）に相当する標識した二本鎖オリゴヌクレオチドとインキュベーションした場合、又は突然変異した同じ応答エレメント（ＦＸＲＲＥ＿ＡｐｏＡ１＿ｈ＿１＿ｍｕｔ）とインキュベーションした場合に、特異的ＬＲＨ−１／ＤＮＡ複合体が形成されことを示す。
【０１５９】
ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターにおけるＦＸＲ応答エレメントの突然変異は、その応答エレメントへのＬＲＨ−１の結合に影響を与えなかったが、これに対して該突然変異は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターにおけるその応答エレメントへのＦＸＲの結合に影響を与えた。ゆえに、実施例７は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターにおけるＬＲＨ−１及びＦＸＲのための結合部位は異なることを証明する。
【０１６０】
【表１２】
2007515183.tif 000015
2007515183.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】ＨｅｐＧ２細胞におけるヒトａｐｏＡＩプロモーターの活性に対するＬＲＨ−１過剰発現の効果（ＲＬＵ：相対的ルミネッセンス単位）。
【図２】ＰＫ１３細胞におけるヒトａｐｏＡＩプロモーターの活性に対するＬＲＨ−１過剰発現の効果（ＲＬＵ：相対的ルミネッセンス単位）。
【図３】ヒトａｐｏＡＩプロモーターの領域Ｂ及びＣの接合部に位置したＬＲＨ−１応答エレメントの同定を示すゲルシフト。電気泳動ゲル上に現れる分離された複合体は、実施例３において同定される。
【図４Ａ】ヒトａｐｏＡＩプロモーターの断片−１４４／−１２２に含まれたＬＲＨ−１応答エレメントの同定を示すゲルシフト。
【図４Ｂ】ヒトａｐｏＡＩプロモーターの断片−１４４／−１２２に含まれたＬＲＨ−１応答エレメントの同定を示すゲルシフト。
【図５】ＨｕＨ７細胞における突然変異した又はしていない、ヒトａｐｏＡＩプロモーターの活性に対するＬＲＨ−１過剰発現の効果（ＲＬＵ：相対的ルミネッセンス単位）。
【図６】ＨｕＨ７細胞におけるヒトａｐｏＡＩプロモーターの異なる突然変異体の活性に対するＬＲＨ−１過剰発現の効果。
【図７Ａ】ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターにおけるＬＲＨ−１結合部位は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターにおけるＦＸＲ結合部位とは異なる。
【図７Ｂ】ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターにおけるＬＲＨ−１結合部位は、ヒトａｐｏＡＩ遺伝子プロモーターにおけるＦＸＲ結合部位とは異なる。
【図１】
2007515183.tif 000017
【図２】
2007515183.tif 000018
【図３】
2007515183.tif 000019
【図４Ａ】
2007515183.tif 000020
【図４Ｂ】
2007515183.tif 000021
【図５】
2007515183.tif 000022
【図６】
2007515183.tif 000023
【図７Ａ】
2007515183.tif 000024
【図７Ｂ】
2007515183.tif 000025
【配列表】
2007515183000001.app
【国際調査報告】
2007515183.tif 000026
2007515183.tif 000027
2007515183.tif 000028
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