(57)【要約】  患者において新生児てんかん症候群または乳児てんかん症候群をＢＦＮＩＳとして診断するための方法であって、患者のサンプルにおいて、遺伝子の調節領域を含めてＳＣＮ２Ａ遺伝子の変化の存在について検査すること、および、ＳＣＮ２Ａの変化が検出されるときには、ＢＦＮＩＳの可能性が高いことを示す診断を確立すること、または、ＳＣＮ２Ａの変化が検出されないときには、ＢＦＮＩＳの可能性が低いことを示す診断を確立することを含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発作の発症が生後１年以内である患者において新生児てんかん症候群または乳児てんかん症候群をＢＦＮＩＳとして診断するための方法であって、患者のサンプルにおいて、遺伝子の調節領域を含めてＳＣＮ２Ａ遺伝子の変化における存在について検査すること、および、ＳＣＮ２Ａの変化が検出されるときには、ＢＦＮＩＳの可能性が高いことを示す診断を確立すること、または、ＳＣＮ２Ａの変化が検出されないときには、ＢＦＮＩＳの可能性が低いことを示す診断を確立することを含む方法。
【請求項２】
ＳＣＮ２Ａの変化がＢＦＮＩＳに関連していることが既知である場合には、ＢＦＮＩＳの可能性が非常に高いことを示す診断を確立する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳＣＮ２Ａの変化が患者の罹患した親または親族に存在する場合には、ＢＦＮＩＳの可能性が非常に高いことを示す診断を確立する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＳＣＮ２Ａの変化がミスセンス変異である場合には、ＢＦＮＩＳの可能性が非常に高いことを示す診断を確立する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＳＣＮ２Ａの変化の存在について検査し、かつ、その変化の種類を特定するために１つまたは複数のアッセイを行うことを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
以下の工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法：
（１）患者のＳＣＮ２Ａ遺伝子における変化の存在について検査するために１つまたは複数のアッセイを行う工程；および、その結果がＳＣＮ２Ａ遺伝子における変化の存在を示すならば、
（２）ＳＣＮ２Ａの変化の種類を特定するために１つまたは複数のアッセイを行う工程。
【請求項７】
患者のサンプルにおいて、遺伝子の調節領域を含めてＫＣＮＱ２遺伝子および／またはＫＣＮＱ３遺伝子における変化の存在について検査すること、および、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の変化が検出されるときには、ＢＦＮＳの可能性が高いことを示す診断を確立すること、または、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の変化が検出されないときには、ＢＦＩＳの可能性を示す診断を確立することをさらに含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
発作の発症が生後１年以内である患者において、新生児てんかん症候群または乳児てんかん症候群を、ＢＦＮＩＳ、ＢＦＮＳまたはＢＦＩＳのいずれかとして診断するための方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）（ａ）患者のサンプルにおいて、遺伝子の調節領域における変化を含めてＳＣＮ２Ａ遺伝子における変化の存在について検査すること；および／または
（ｂ）患者のサンプルにおいて、遺伝子の調節領域における変化を含めてＫＣＮＱ２遺伝子および／またはＫＣＮＱ３遺伝子における変化の存在について検査すること；および
（２）（ａ）ＳＣＮ２Ａの変化が検出されるときには、ＢＦＮＩＳの可能性が高いことを示す診断を確立すること；
（ｂ）ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の変化が検出されるときには、ＢＦＮＳの可能性が高いことを示す診断を確立すること；または
（ｃ）ＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の変化が検出されないときには、ＢＦＩＳの可能性を示す診断を確立すること。
【請求項９】
ＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２および／またはＫＣＮＱ３における変化の存在について検査し、かつ、その変化の種類を特定するために１つまたは複数のアッセイを行うことを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む、請求項８に記載の方法：
（１）患者のＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＫＣＮＱ２遺伝子および／またはＫＣＮＱ３遺伝子における変化の存在について検査するために１つまたは複数のアッセイを行う工程；および、その結果がこれらの遺伝子のいずれか１つにおける変化の存在を示すならば、
（２）その変化の種類を特定するために１つまたは複数のアッセイを行う工程。
【請求項１１】
アッセイの１つがＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイである請求項４，５，９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２もしくはＫＣＮＱ３の遺伝子プローブ、ＳＣＮ２Ａ，ＫＣＮＱ２もしくはＫＣＮＱ３のエキソン特異的なプローブ、またはＳＣＮ２Ａ，ＫＣＮＱ２もしくはＫＣＮＱ３の対立遺伝子特異的プローブは前記患者から単離されたゲノムＤＮＡにハイブリダイゼーションされる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アッセイの１つが高速液体クロマトグラフィーである請求項４，５，９または１０に記載の方法。
【請求項１４】
アッセイの１つが電気泳動アッセイである請求項４，５，９または１０に記載の方法。
【請求項１５】
検査されるサンプルＤＮＡを、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＫＣＮＱ２遺伝子またはＫＣＮＱ３遺伝子の少なくとも１つのエキソンについて増幅フラグメントを作製するために、定量的に増幅し、そしてそれぞれの増幅されたエキソンについて増幅生成物の長さを、野生型ＳＣＮ２Ａ遺伝子、野生型ＫＣＮＱ２遺伝子または野生型ＫＣＮＱ３遺伝子が同じプライマーを使用して増幅されるときに得られる増幅生成物の長さと比較し、それにより、増幅されたサンプルのエキソンと、対応する増幅された野生型エキソンとの間の長さの違いにより、サンプルのＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＫＣＮＱ２遺伝子またはＫＣＮＱ３遺伝子における短縮化変化の存在が反映される、請求項４，５，９または１０に記載の方法。
【請求項１６】
アッセイの１つがＳＣＮ２Ａ，ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用するＤＮＡ増幅を含む請求項４，５，９または１０に記載の方法。
【請求項１７】
アッセイの１つがＳＳＣＰ分析である請求項４，５，９または１０に記載の方法。
【請求項１８】
アッセイの１つがＲＮａｓｅ保護である請求項４，５，９または１０に記載の方法。
【請求項１９】
アッセイの１つがＤＧＧＥである請求項４，５，９または１０に記載の方法。
【請求項２０】
アッセイの１つが酵素アッセイである請求項４，５，９または１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記アッセイがＭｕｔＳの使用を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
アッセイの１つが患者のＳＣＮ２Ａタンパク質、ＫＣＮＱ２タンパク質またはＫＣＮＱ３タンパク質の電気泳動移動度を調べる請求項４，５，９または１０に記載の方法。
【請求項２３】
アッセイの１つが免疫アッセイである請求項４，５，９または１０に記載の方法。
【請求項２４】
アッセイの１つがＤＮＡ配列決定である請求項４，５，９または１０に記載の方法。
【請求項２５】
以下の工程を含む、ＳＣＮ２Ａ遺伝子におけるＢＦＮＩＳ関連変異について患者を検査するための方法：
ａ）ＳＣＮ２Ａ遺伝子の少なくとも１つのエキソンを各患者の身体サンプルから定量的に増幅して、増幅フラグメントを作製する工程；
ｂ）増幅されたフラグメントの性質を、非変異のＳＣＮ２Ａ遺伝子における同じエキソンの増幅によって生じるフラグメントに基づく標準値と比較する工程；および
ｃ）対応する非変異のＳＣＮ２Ａエキソンと比較して患者において異なる性質を有するｂ）で特定された各エキソンの核酸配列を決定する工程。
【請求項２６】
以下の工程を含む、ＳＣＮ２Ａ遺伝子におけるＢＦＮＩＳ関連変異について患者を検査するための方法：
ａ）ＳＣＮ２Ａ遺伝子の少なくとも１つのエキソンを、それぞれの増幅されたエキソンに隣接するイントロン領域に対して相補的なプライマーを使用して、各患者の身体サンプルから定量的に増幅する工程；
ｂ）それぞれの増幅されたエキソンについて増幅生成物の長さを、野生型ＳＣＮ２Ａ遺伝子が、同じプライマーを使用して増幅されるときに得られる増幅生成物の長さと比較し、それにより、増幅されたサンプルのエキソンと、対応する増幅された野生型エキソンとの間の長さの違いにより、サンプルのＳＣＮ２Ａ遺伝子における短縮化変異の存在が反映される工程；および
ｃ）短縮化変異を含むことがｂ）において特定されたそれぞれのエキソンの核酸配列を決定する工程。
【請求項２７】
以下の工程を含む、ＳＣＮ２Ａ遺伝子におけるＢＦＮＩＳ関連変異について患者を検査するための方法：
ａ）ＳＣＮ２Ａ遺伝子の少なくとも１つのエキソンを、それぞれの増幅されたエキソンに隣接するイントロン領域に対して相補的なプライマーを使用して、各患者の身体サンプルから定量的に増幅する工程；
ｂ）ａ）から得られたフラグメントを、非変異のＳＣＮ２Ａ遺伝子における同じエキソンの増幅によって生じたフラグメントとハイブリダイゼーションさせる工程；
ｃ）対応する野生型フラグメントにハイブリダイゼーションしないか、または、ミスマッチしたヘテロ二重鎖を形成するかのいずれかであることがｂ）において特定されたそれぞれの患者エキソンの核酸配列を決定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新生児てんかん症候群または乳児てんかん症候群についての診断方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
てんかんは、脳障害の多様な集積を構成し、人口のうち約３％に対して、その一生のうちのある時点で影響を与える（Ａｎｎｅｇｅｒｓ，１９９６）。てんかん発作は、中枢神経系のニューロンの集団の神経インパルスの発生の障害によって生じる挙動における突発性の変化として規定することができる。このことは、種々の程度の不随意性の筋収縮、およびしばしば意識の喪失を生じさせる。てんかんの症候群は、特徴的な症状、発作のタイプ、原因、発症年齢、およびＥＥＧパターンに基づいて、４０を超える異なるタイプに分類されている（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ，１９８９）。しかし、全ての症候群に対して共通である単一の特徴は、発作（痙攣）として、ときどき、または予測不能、その両方で発現される、ニューロンの興奮性の持続性の増大である。
【０００３】
罹患した個体の約４０％において、てんかんの病因論に対する遺伝的な寄与が存在すると推定されている（Ｇａｒｄｉｎｅｒ，２０００）。てんかん発作は、最終的にはニューロンの同調性を損なう、多数の分子的異常（逸脱）のエンドポイントであり得るので、てんかんについての遺伝的基礎は、雑多であり得る。表現型の一部としててんかんを含む２００を超えるメンデル（法則）の疾患がある。これらの疾患においては、発作（痙攣）は、脳の構造または機能における妨害のような神経学的関与を裏付ける症状である。対照的に、多数の「純粋な（ｐｕｒｅ）」てんかん症候群がまた存在し、ここではてんかんは、罹患した個体における唯一の兆候である。これらは、特発性と称されて、全てのてんかん症例の６０％より多くを占める。
【０００４】
特発性のてんかんは、さらに部分的に分割されて、サブタイプに一般化されている。部分てんかん（焦点てんかん、または局所てんかん）の発作は、局部的な皮質の放電から生じ、その結果、筋肉の特定の群のみが関与して、意識は保持され得る（Ｓｕｔｔｏｎ，１９９０）。しかし、全身性てんかんでは、ＥＥＧの放電は、焦点を示さず、それによって脳の全ての皮質下領域が関与する。全身性てんかんが、頻繁に遺伝されるという観察は理解できるが、遺伝的欠陥（おそらく脳において恒常的に発現される）が、部分的痙攣（発作）を生じる機構は、ほとんど不明である。新生児および乳児においては、おそらく脳の髄鞘形成が不完全であるために、臨床的および神経生物学的観点からの、全身性てんかんと部分てんかんの間の区別はほとんど不明である。
【０００５】
生後１年以内のてんかんは、以前では、主として後天的な周産期因子のためであると考えられていた。しかし、現在では、２つの良性の常染色体優性てんかん症候群が生後１年において広く認められている。１つは良性の家族性新生児発作（痙攣）（ＢＦＮＳ）であり、これは、通常の場合には生後３日目前後で現れ、強直発作または間代発作によって特徴づけられる。これらの発作（痙攣）は生後２〜３週間以内に止み、５％の個体がその後において熱性痙攣を有し、１１％がその後においててんかんを有する（Ｐｌｏｕｉｎ、１９９４）。研究により、多くの症例におけるこの症候群についての遺伝的基礎がカリウムチャネル遺伝子のＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３における変異のためであることが示されている。
【０００６】
もう１つは良性の家族性乳児発作（痙攣）（ＢＦＩＳ）であり、これは生後４ヶ月〜８ヶ月の間で現れ、様々な一群の強直性または間代性の部分性発作または全身性発作を２日間〜３日間伴う。発作（痙攣）は、通常の場合には１歳前後までに消失し、しかし、一部の個体ではその後の小児期において発作性ジスキネジーを伴うことがある。ＢＦＩＳの原因となる遺伝子は明確には特定されていないが、第１９染色体および第１６染色体に対する連鎖が報告されている（Ｓｚｅｐｅｔｏｗｓｋｉ他、１９９７；Ｇｕｉｐｐｏｎｉ他、１９９７）。
【０００７】
１９８３年において、ＢＦＩＳが認識される以前に、ＢＦＮＳとＢＦＩＳとの中間的な変化型を有するアメリカ人の家族が報告され、これは良性の家族性新生児乳児発作（痙攣）（ＢＦＮＩＳ）と呼ばれ、この場合、発作（痙攣）の発症が生後２日から３．５ヶ月までと変化していた（ＫａｐｌａｎおよびＬａｃｅｙ、１９８３）。最近では、２つのＢＦＮＩＳ家族の遺伝子分析により、ＳＣＮ２Ａ遺伝子においてこの障害に関係していた２つの変異が特定されている（Ｈｅｒｏｎ他、２００２）。
【０００８】
本発明者らは、ＢＦＮＩＳが推定されるか、またはＢＦＮＩＳの可能性があるさらなる家族からの罹患した個体の分析によって本研究をまとめ上げている。これにより、６家族において、進化的に保存されたアミノ酸の変化を生じさせるＳＣＮ２Ａでのさらなるミスセンス変異が特定された。ＢＦＮＩＳが推定されると臨床的に認められた家族、および、ＢＦＮＩＳの可能性があると認められた９家族中４家族の両方がＳＣＮ２Ａの変異を含んでいた。このことから、新生児期および乳児期早期のてんかんにおける遺伝的要因の重要性がさらに強調される。他の形態の小児てんかんが検査された９５家族のうち、１つもＳＣＮ２Ａにおける変異を含んでいなかった。
【０００９】
本発明者らは、罹患した患者におけるＳＣＮ２Ａ遺伝子、ならびに、必要に応じて、ＫＣＮＱ２遺伝子および／またはＫＣＮＱ３遺伝子における変化の存在について調べることに基づいて、ＢＦＮＩＳならびに他の新生児てんかんおよび乳児てんかんを診断するための方法を確立している。新生児てんかんおよび乳児てんかんの診断を助けるための分子的診断検査法の開発は重要である。そのような検査法により、罹患した患者の適正な管理が可能になり、また、患者の過剰検査および過剰処置が回避される。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の１つの局面では、発作（痙攣）の発症が生後１年以内である患者において新生児てんかん症候群または乳児てんかん症候群をＢＦＮＩＳとして診断するための方法が提供され、この場合、この方法は、患者のサンプルにおいて、遺伝子の調節領域を含めてＳＣＮ２Ａ遺伝子における変化の存在について検査すること、および、ＳＣＮ２Ａの変化が検出されるときには、ＢＦＮＩＳの可能性が高いことを示す診断を確立すること、または、ＳＣＮ２Ａの変化が検出されないときには、ＢＦＮＩＳの可能性が低いことを示す診断を確立することを含む。
【００１１】
この情報は、患者に対する正しい処置療法を開始するために重要であり、また、この情報により、患者に対する必要のない検査および関連した外傷が回避される。
【００１２】
ＳＣＮ２Ａ遺伝子における変化の種類には、すべての形態の遺伝子配列変化が包含され得る。これらには、コード領域および非コード領域（例えば、プロモーター、イントロンまたは非翻訳領域など）における欠失、挿入、再配置および点変異が含まれる。しかし、具体的には、ミスセンス変異がＢＦＮＩＳに関連している。欠失は遺伝子全体または遺伝子の一部のみである場合があり、これに対して、点変異は、停止コドン、フレームシフトまたはアミノ酸置換を生じさせる場合がある。ＳＣＮ２Ａの調節領域（例えば、プロモーターなど）において生じる点変異は、ｍＲＮＡの発現の喪失もしくは減少をもたらすか、または、適正なｍＲＮＡプロセシングを無効にすることがあり、これにより、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率の低下が生じる。
【００１３】
ＢＦＮＩＳと以前から関連していた、または、患者の罹患した親もしくは親族に存在する患者におけるＳＣＮ２Ａの変化を特定することにより、その患者がＢＦＮＩＳを有する可能性が増大する。その上、発症年齢に関連する情報は、ＳＣＮ２Ａの変化を特定することができないことによってＢＦＮＩＳが除外されると、ＢＦＩＳまたはＢＦＮＳの診断を示唆するために使用することができる。図１におけるフローチャートは本発明の１つの実施形態を例示する。
【００１４】
本発明の１つの実施形態では、患者において新生児てんかん症候群または乳児てんかん症候群をＢＦＮＩＳとして診断するための方法が提供され、この場合、この方法は、ＳＣＮ２Ａの変化の存在について検査し、かつ、その変化の種類を特定するために１つまたは複数のアッセイを行うことを含む。
【００１５】
さらなる実施形態では、下記の工程を含む、患者において新生児てんかん症候群または乳児てんかん症候群をＢＦＮＩＳとして診断するための方法が提供される：
（１）患者のＳＣＮ２Ａ遺伝子における変化の存在について検査するために１つまたは複数のアッセイを行う工程；および、その結果がＳＣＮ２Ａ遺伝子における変化の存在を示すならば、
（２）ＳＣＮ２Ａの変化の種類を特定するために１つまたは複数のアッセイを行う工程。
【００１６】
本発明のさらなる局面では、発作（痙攣）の発症が生後１年以内である患者において、新生児てんかん症候群または乳児てんかん症候群を、ＢＦＮＩＳ、ＢＦＮＳまたはＢＦＩＳのいずれかとして診断するための方法が提供され、この場合、この方法は、
（１）（ａ）患者のサンプルにおいて、遺伝子の調節領域における変化を含めてＳＣＮ２Ａ遺伝子における変化の存在について検査すること；および／または
（ｂ）患者のサンプルにおいて、遺伝子の調節領域における変化を含めてＫＣＮＱ２遺伝子および／またはＫＣＮＱ３遺伝子における変化の存在について検査すること；および
（２）（ａ）ＳＣＮ２Ａの変化が検出されるときには、ＢＦＮＩＳの可能性が高いことを示す診断を確立すること；
（ｂ）ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の変化が検出されるときには、ＢＦＮＳの可能性が高いことを示す診断を確立すること；または
（ｃ）ＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の変化が検出されないときには、ＢＦＩＳの可能性を示す診断を確立すること
を含む。
【００１７】
図２におけるフローチャートは本発明の１つの実施形態を例示する。様々なサブユニットにおける変化を検出するためのスクリーニングに、例示される順序とは異なる順序で着手することができ、それにもかかわらず、そのようなスクリーニングは最終的には同じ臨床的情報をもたらし得ることが理解される。例えば、ＫＣＮＱ２における変化についてのスクリーニングに着手し、陰性ならば、それに続いて、ＫＣＮＱ３における変化についてのスクリーニングに着手し、陰性ならば、それに続いて、ＳＣＮ２Ａにおける変化についてのスクリーニングに着手することができる。家族歴を伴う臨床的観察結果および臨床的観察結果は、スクリーニングの順序を決定する際に用いることができ、また、診断に達する際にも、特に、陰性の遺伝子検査の後でＢＦＩＳの診断に達する際にも用いることができる。
【００１８】
ＫＣＮＱ２遺伝子およびＫＣＮＱ３遺伝子における変化の種類には、ＳＣＮ２Ａ遺伝子について上記で記載されたようにすべての形態の遺伝子配列変化が包含され得る。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態では、患者において、新生児てんかん症候群または乳児てんかん症候群を、ＢＦＮＩＳ、ＢＦＮＳまたはＢＦＩＳとして診断するための方法が提供され、この場合、この方法は、ＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３における変化の存在について検査し、かつ、その変化の種類を特定するために１つまたは複数のアッセイを行うことを含む。
【００２０】
さらなる実施形態では、下記の工程を含む、患者において、新生児てんかん症候群または乳児てんかん症候群を、ＢＦＮＩＳ、ＢＦＮＳまたはＢＦＩＳとして診断するための方法が提供される：
（１）患者のＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＫＣＮＱ２遺伝子またはＫＣＮＱ３遺伝子における変化の存在について検査するために１つまたは複数のアッセイを行う工程；および、その結果がこれらの遺伝子のいずれか１つにおける変化の存在を示すならば、
（２）その変化の種類を特定するために１つまたは複数のアッセイを行う工程。
【００２１】
数多くのアッセイシステムを、ＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の変化の存在について検査するために使用することができ、従って、本発明は、下記に示される例によって限定されない。
【００２２】
１つの実施形態において、用いられるアッセイシステムは、ＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の野生型ＤＮＡに対する比較での、患者サンプルに由来するＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３のＤＮＡの分析であり得る。ゲノムＤＮＡは診断分析のために使用され、身体の細胞（例えば、血液またはほおに存在する細胞など）、組織生検物、手術試料または検死材料（これらに限定されない）をはじめとする数多くの供給源から得ることができる。ＤＮＡを単離し、診断アッセイのためにそのまま使用することができ、または、分析に先立ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することができる。同様に、ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、ＰＣＲ増幅を伴って、またはＰＣＲ増幅を伴うことなく使用することができる。加えて、出生前診断を、胎児細胞、胎盤細胞または羊水を検査することによって達成することができる。
【００２３】
特定の実施形態では、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを用いることができる。これらは、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＫＣＮＱ２遺伝子またはＫＣＮＱ３遺伝子について特異的なプローブ型アッセイからなり得る。１つのそのようなアッセイでは、１つまたは複数の制限酵素で消化されているＤＮＡの一連のサザンブロットを調べることができる。各ブロットは一連の正常な個体および一連の患者のサンプルを含むことができる。ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＫＣＮＱ２遺伝子またはＫＣＮＱ３遺伝子の近傍の配列、あるいは、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＫＣＮＱ２遺伝子またはＫＣＮＱ３遺伝子を含む配列（ＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の遺伝子プローブ）でプローブされたとき、正常なＤＮＡとは長さが異なるハイブリダイゼーションフラグメントを示すサンプルにより、起こり得るＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の変化が示される。非常に大きい制限フラグメントを生じさせる制限酵素が使用されるならば、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を用いることができる。
【００２４】
ＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３のエキソン特異的なハイブリダイゼーションアッセイもまた用いることができる。このタイプのプローブに基づくアッセイでは、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＫＣＮＱ２遺伝子またはＫＣＮＱ３遺伝子のエキソンにその野生型形態で特異的かつ選択的にハイブリダイゼーションする少なくとも１つのプローブが利用される。従って、核酸プローブを含有する二重鎖核酸ハイブリッドの形成がないことにより、関連した遺伝子における変化の存在が示される。プローブに基づく検査の高い特異性のために、何らかの陰性の結果は、変化の存在を非常に示している。しかし、さらなる究明アッセイを用いて、変化の種類を特定し、それが疾患関連であるという可能性を明らかにしなければならない。
【００２５】
エキソン特異的アッセイ法はまた、ＢＦＮＩＳまたはＢＦＮＳに関係する以前に決定されたＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の変化を特定するために適合することができる。この局面では、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＫＣＮＱ２遺伝子またはＫＣＮＱ３遺伝子のいずれか１つとその変化した形態で特異的かつ選択的にハイブリダイゼーションするプローブが使用される（対立遺伝子特異的プローブ）。この場合、核酸プローブを含有する二重鎖核酸ハイブリッドの形成により、関連した遺伝子における変化の存在が示される。エキソン特異的アッセイ法のそれぞれの変法において、疾患に関連しない遺伝子における既知の多型を考慮に入れることは重要である。二次アッセイ（例えば、ＤＮＡ配列決定など）を用いて、何らかの疑われる変化が既知の多型でないことを確実にしなければならない。
【００２６】
上記アッセイのそれぞれのために使用されるエキソン特異的プローブは下記に由来し得る：（１）各エキソンに隣接するイントロン特異的プライマーを使用する、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＫＣＮＱ２遺伝子またはＫＣＮＱ３遺伝子の各エキソンのＰＣＲ増幅；（２）各エキソンについて特異的なｃＤＮＡプローブ；または（３）ＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３のエキソンをまとめて表す一連のオリゴヌクレオチド。
【００２７】
さらなる実施形態において、ヘテロ二重鎖の形成を分析するためのアッセイを用いることができる。ＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の変性させた野生型ＤＮＡを患者由来のＤＮＡサンプルと混合することによって、検査中の関連した遺伝子における２つのサンプルの間に配列変化があれば、ヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖の混合集団の形成がＤＮＡの再アニーリングのときにもたらされる。この混合集団の分析を、部分的変性温度のもとで行われる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような技術の使用によって達成することができる。この様式では、ヘテロ二重鎖が、その低下した融解温度のために、ホモ二重鎖よりも速くＨＰＬＣカラムから溶出する。
【００２８】
さらなる実施形態において、患者のサンプルを電気泳動に基づくアッセイに供することができる。例えば、ＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３のフラグメント長さの違いを明らかにする電気泳動アッセイを用いることができる。各患者のゲノムＤＮＡのフラグメントが、研究中の関連した遺伝子に対するイントロン特異的プライマーにより増幅される。従って、遺伝子の増幅された領域は、目的とするエキソン、エキソン／イントロン境界におけるスプライス部位接合部、および、増幅生成物のいずれかの末端におけるイントロンの短い部分を含む。増幅生成物は電気泳動サイズ分離ゲルで泳動することができ、増幅されたフラグメントの長さは、挿入変異または欠失変異が患者のサンプルに見出されるかどうかを明らかにするために、野生型遺伝子に由来する既知および予想される標準長さフラグメントと比較される。この手法は、好都合には、「多重化」形式で使用することができ、この場合、多数のエキソン（一般には２個〜８個）に対するプライマーが同時に増幅され、１枚の電気泳動ゲルで同時に評価される。これは、遺伝子の各エキソンについてプライマーを注意深く選択することによって可能になる。各エキソンにまたがる増幅されたフラグメントは、サイズが異なるように、従って、電気泳動／サイズ分離ゲルで識別可能であるように設計される。この技術の使用により、ヘテロ接合の個体において正常な対立遺伝子および変異型対立遺伝子の両方を検出するという利点を有する。さらに、多重化の使用によって、この技術の使用は非常にコスト効果的であり得る。
【００２９】
さらなる方法において、ＢＦＮＩＳまたはＢＦＮＳに関係する以前に特定されたＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の変化を検出するための診断的電気泳動アッセイでは、遺伝子の変化したエキソンに特異的に結合するＰＣＲプライマーを利用することができる。この場合、プライマーのハイブリダイゼーションが生じたならば、生成物が電気泳動ゲルにおいて観測されるだけである。従って、増幅生成物の出現は、変化の存在を示すものであり、一方、増幅生成物の長さは、さらなる変化が存在することを示し得る。
【００３０】
さらなる電気泳動アッセイを用いることができる。これらには、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）法（Ｏｒｉｔａ他、１９８９）が含まれ得る。上記で述べたように、各患者のゲノムＤＮＡのフラグメントが、遺伝子の個々のエキソンが増幅され、個々に分析され得るように、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＫＣＮＱ２遺伝子またはＫＣＮＱ３遺伝子のいずれか１つに対するイントロン特異的プライマーによりＰＣＲ増幅される。エキソン特異的なＰＣＲ生成物は、その後、ＤＮＡフラグメントが、その配列組成により決定されるような立体配座に基づいてゲル中を移動するように、非変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に供される。野生型配列と配列が異なるエキソン特異的フラグメントは、異なる二次構造の立体配座を有しており、従って、ゲル中を他とは異なって移動する。患者のサンプルにおける異常に移動するＰＣＲ生成物は、エキソンにおける変化を示しており、二次アッセイ（例えば、ＤＮＡ配列決定など）でさらに分析して、変化の種類を特定しなければならない。
【００３１】
用いることができるさらなる電気泳動アッセイには、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ他、１９９０；Ｋｉｎｓｚｌｅｒ他、１９９１）および変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｗａｒｔｅｌｌ他、１９９０；Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ他、１９８９）が含まれる。ＲＮａｓｅ保護では、変異ポリヌクレオチドを２つ以上のより小さいフラグメントに切断することを含み、これに対して、ＤＧＧＥでは、変性勾配ゲルを使用して、野生型配列と比較した、変異配列の移動速度の差を検出する。
【００３２】
ＲＮａｓｅ保護アッセイにおいて、ヒト野生型のＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＫＣＮＱ２遺伝子またはＫＣＮＱ３遺伝子のコード配列に対して相補的である標識リボプローブは、患者から単離されたｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとハイブリダイゼーションされ、続いて、二重鎖ＲＮＡ構造におけるいくつかのミスマッチを検出することができる酵素ＲＮａｓｅＡにより消化される。ミスマッチがＲＮａｓｅＡによって検出されるならば、ＲＮａｓｅＡはそのミスマッチの部位において切断する。従って、アニーリングされたＲＮＡ調製物が電気泳動ゲルマトリックスで分離されるとき、ミスマッチがＲＮａｓｅＡによって検出され、切断されたならば、リボプローブおよびｍＲＮＡまたはＤＮＡについて全長の二重鎖ＲＮＡよりも小さいＲＮＡ生成物が認められるであろう。リボプローブは研究中のｍＲＮＡまたは遺伝子の全長である必要はなく、そのどちらかのセグメントであり得る。リボプローブがｍＲＮＡまたは遺伝子のセグメントのみを含むならば、数多くのこれらのプローブを使用して、ｍＲＮＡ配列全体をミスマッチについてスクリーニングすることが望ましい。
【００３３】
さらなる実施形態では、酵素に基づくアッセイ（ＴａｙｌｏｒおよびＤｅｅｂｌｅ、１９９９）を診断適用において使用することができる。そのようなアッセイでは、Ｓ１ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、ＭｕｔＳ（Ｍｏｄｒｉｃｈ、１９９１）、ＣｌｅａｖａｓｅおよびＭｕｔＹの使用が含まれる。ＭｕｔＳアッセイでは、タンパク質が、変異配列と野生型配列との間でのヘテロ二重鎖においてヌクレオチドミスマッチを含有する配列に対してのみ結合する。
【００３４】
アッセイが、ＳＣＮ２Ａタンパク質、ＫＣＮＱ２タンパク質またはＫＣＮＱ３タンパク質に基づくことになる場合、様々な方法が可能である。例えば、診断を、野生型のＳＣＮ２Ａタンパク質、ＫＣＮＱ２タンパク質またはＫＣＮＱ３タンパク質、および、患者のサンプルから単離されたＳＣＮ２Ａタンパク質、ＫＣＮＱ２タンパク質またはＫＣＮＱ３タンパク質の電気泳動移動度における違いをモニターすることによって達成することができる。そのような方法は、電荷置換が存在する変化を特定することにおいて、または、挿入、欠失もしくは置換が、生じたタンパク質の電気泳動移動における著しい変化をもたらしている変化を特定することにおいて特に有用である。あるいは、診断は、正常なタンパク質および変化したタンパク質のタンパク質分解的切断パターンにおける違い、または様々なアミノ酸残基のモル比における違いに基づくことができ、あるいは、遺伝子産物の変化した機能を明らかにする機能的アッセイによって行うことができる。
【００３５】
ＳＣＮ２Ａタンパク質、ＫＣＮＱ２タンパク質またはＫＣＮＱ３タンパク質に基づくさらなるアッセイには免疫アッセイが含まれる。特定の遺伝子産物に対する抗体を惹起させるための様々な手法が、文献に、例えば、米国特許第４１７２１２４号および同第４４７４８９３号（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）に詳しく記載されている。共通する変異部位から離れている遺伝子産物の様々な部分に結合し、その結果、同じ抗体が変異タンパク質および正常なタンパク質の両方に結合するような抗体が、通常の場合には惹起される。本発明において使用される好ましい抗体は、その改善された予測性および特異性のためにモノクローナル抗体である。しかし、所望する高レベルの特異性を有する本質的には任意の抗体を使用することができること、および、高い感度を達成するための最適化が必要とされないことが理解されるであろう。
【００３６】
ＢＦＮＩＳ、ＢＦＮＳおよびＢＦＩＳをはじめとする新生児てんかんまたは乳児てんかんに関与することが以前に特定されたＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の変化の診断的検出のためには、欠陥のある遺伝子産物に対して惹起された抗体が好ましい。抗体が、免疫学的反応が生じ得る条件のもとで患者のサンプルの一部に加えられ、その後、サンプルは、そのような反応が生じているかどうかを見るために評価される。この評価を行うための特定の方法は重要ではなく、そのような方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、これは米国特許第４０１６０４３号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載される；蛍光酵素免疫アッセイ（ＦＥＩＡまたはＥＬＦＡ）、これは、蛍光を発する酵素基質（例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−ガラクトシドなど）が発色性基質の代わりに使用されることを除いて、ＥＬＩＳＡに類似する；および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）が含まれる。
【００３７】
用いることができる最も確定的な診断アッセイはＤＮＡ配列決定であり、究極的には、行われることが必要とされる唯一のアッセイであり得る。ＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３のＤＮＡの野生型配列を、検査患者のＳＣＮ２Ａ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の配列と比較することにより、高い特異性および高い感度の両方がもたらされる。用いられる一般的な方法論では、目的とするＤＮＡフラグメントを患者ＤＮＡから（例えば、ＰＣＲを用いて）増幅すること；増幅されたＤＮＡを、増幅プライマーと同じまたは異なり得る配列決定用プライマーと混ぜること；通常のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）と、取り込まれると、プライマーのさらなる伸長を妨げる鎖停止用ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチドなど）との存在下で配列決定用プライマーを伸長させること；および、得られた伸長フラグメントの長さについて生成物を分析することが伴う。そのような方法は、Ｓａｎｇｅｒ他（１９７７）によって開示された最初のジデオキシ配列決定法に基づいており、本発明において有用であるが、最終アッセイはそのような方法に限定されない。例えば、目的とする遺伝子の配列またはその一部分を決定するための他の方法もまた用いることができる。代わりの方法には、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）によって記載される方法、ならびに、ジデオキシ法の変法、および鎖停止用ヌクレオチドに全く依らない方法（例えば、米国特許第４９７１９０３号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に開示される方法など）が含まれる。野生型の配列と比較されたとき、検査患者のエキソンにおける（良性の多型とは異なる）何らかの配列の違いにより、疾患を引き起こす潜在的な変化が示される。
【００３８】
本発明の特定の実施形態では、下記の工程を含む、ＳＣＮ２Ａ遺伝子におけるＢＦＮＩＳ関連変異について患者を検査するための方法が提供される：
ａ）ＳＣＮ２Ａ遺伝子の少なくとも１つのエキソンを各患者の身体サンプルから定量的に増幅して、増幅フラグメントを作製する工程；
ｂ）増幅されたフラグメントの性質を、非変異のＳＣＮ２Ａ遺伝子における同じエキソンの増幅によって生じるフラグメントに基づく標準値と比較する工程；および
ｃ）対応する非変異のＳＣＮ２Ａエキソンと比較して患者において異なる性質を有することがｂ）で特定された各エキソンの核酸配列を決定する工程。
【００３９】
さらなる特定の実施形態では、下記の工程を含む、ＳＣＮ２Ａ遺伝子におけるＢＦＮＩＳ関連変異について患者を検査するための方法が提供される：
ａ）ＳＣＮ２Ａ遺伝子の少なくとも１つのエキソンを、それぞれの増幅されたエキソンに隣接するイントロン領域に対して相補的なプライマーを使用して、各患者の身体サンプルから定量的に増幅する工程；
ｂ）それぞれの増幅されたエキソンについて増幅生成物の長さを、野生型ＳＣＮ２Ａ遺伝子が、同じプライマーを使用して増幅されるときに得られる増幅生成物の長さと比較し、それにより、増幅されたサンプルのエキソンと、対応する増幅された野生型エキソンとの間の長さの違いにより、サンプルのＳＣＮ２Ａ遺伝子における短縮化変異の存在が反映される工程；および
ｃ）短縮化変異を含むことがｂ）において特定されたそれぞれのエキソンの核酸配列を決定する工程。
【００４０】
さらにさらなる特定の実施形態では、下記の工程を含む、ＳＣＮ２Ａ遺伝子におけるＢＦＮＩＳ関連変異について患者を検査するための方法が提供される：
ａ）ＳＣＮ２Ａ遺伝子の少なくとも１つのエキソンを、それぞれの増幅されたエキソンに隣接するイントロン領域に対して相補的なプライマーを使用して、各患者の身体サンプルから定量的に増幅する工程；
ｂ）ａ）から得られたフラグメントを、非変異のＳＣＮ２Ａ遺伝子における同じエキソンの増幅によって生じたフラグメントとハイブリダイゼーションさせる工程；
ｃ）対応する野生型フラグメントにハイブリダイゼーションしないか、または、ミスマッチしたヘテロ二重鎖を形成するかのいずれかであることがｂ）において特定されたそれぞれの患者エキソンの核酸配列を決定する工程。
【００４１】
本明細書および請求項を通して、表現「含む（“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”、“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”および“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”）は、文脈が別途要求する場合を除き、非排他的意味で使用される。
【００４２】
本発明が、明確化および理解のために少し詳しく記載されているが、本明細書中に記載される実施形態および方法に対する様々な改変および変化が、本明細書において開示される本発明の概念の範囲から逸脱することなく行われ得ることが当業者には明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
現下の研究に先立って、ＳＣＮ２Ａ遺伝子における変異が２つのＢＦＮＩＳ家族において認められていた。この発見は、早期小児てんかんのさらなる家族の分析によってさらに詳しく述べられており、その結果、これらのてんかんタイプにおけるＳＣＮ２Ａの変異の分子的臨床相関を精緻化している。
【実施例１】
【００４４】
新生児てんかんおよび乳児てんかんにおけるＳＣＮ２Ａ変異分析
現下の研究では、３組の対象が、ＳＳＣＰ分析および配列決定を使用してＳＣＮ２Ａの変異について調べられた。これらには、臨床評価に基づいてＢＦＮＩＳと推定される２家族と、ほとんどの個体が発作（痙攣）を生後４ヶ月までで有したという事実に基づいてＢＦＮＩＳの可能性を有し、また、数家族において、新生児発作（痙攣）が認められた９家族と、他の早期小児てんかんを構成するさらなる１０３家族とが含まれた。これらの１０３家族において、１０家族がＢＦＩＳを有し、５９家族が、熱性発作プラスを伴う全身性てんかん（ＧＥＦＳ＋）を有し（これらの家族では、ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ１ＢおよびＧＡＢＲＧ２における変異が検出されなかった）、３２家族が、中心側頭（ｃｅｎｔｒｏｔｅｍｐｏｒａｌ）スパイクを伴う良性の小児てんかんを有する非関連の症例を構成していた。
【００４５】
これらの家族におけるＳＣＮ２Ａの変異分析の結果は、進化的に保存されたアミノ酸での変化を生じさせるミスセンス変異が合計で６家族において見出されたことを示した。ＢＦＮＩＳが推定されるとして類別された２家族、および、ＢＦＮＩＳの可能性があると見なされた９家族中４家族が陽性であった。これらの家族における変異は対照では見出されなかった。
【００４６】
５９のＧＥＦＳ＋家族では変異が見出されなかった。新生児での発症のみを有する２家族はいずれも、ＳＣＮ２Ａの変異を有していなかった。ＢＦＩＳの１０家族のうち、Ａ１８２２Ｖの変化が１つの家族のうち２人で認められ、一方、中心側頭スパイクを伴う良性の小児てんかん群に由来する１人の子供が、正常な集団では認められなかったＳＣＮ２ＡにおけるＴ１２００Ａの変化を有していた。
【００４７】
現下の研究から、ＳＣＮ２Ａの変異を有するさらなる家族の臨床的および分子的な特徴づけにより、今回、ＢＦＮＩＳが乳児期早期の重要なナトリウムチャネル障害として明らかにされる（Ｂｅｒｋｏｖｉｃ他、２００４）。
【実施例２】
【００４８】
診断方法−アッセイシステム例
本研究の知見に基づいて、ＢＦＮＩＳ、ＢＦＮＳまたはＢＦＩＳを患者において診断するための方法が確立されている。図１におけるフローチャートは、ＳＣＮ２Ａ遺伝子における変化がＢＦＮＩＳの原因であるという可能性を決定するために使用することができ、また、さらには、ＢＦＮＳまたはＢＦＩＳの診断を行うために使用することができる本発明発明に基づく方針を例示する。さらに、図２におけるフローチャートは、新生児発作（痙攣）または乳児発作（痙攣）の患者が、ＢＦＮＩＳ、ＢＦＮＳまたはＢＦＩＳを有する可能性を明らかにするために使用することができる、分子生物学に基づく方針を例示する。これは、ＢＦＮＩＳがＳＣＮ２Ａの変化に関連し、ＢＦＮＳがＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の変化に関連し、ＢＦＩＳがこれらの遺伝子のいずれかでの変化にも関連しないという事実に基づいている。
【００４９】
診断方法のために選ばれるアッセイ組合せの前には、調べられる患者集団が選択され、ＤＮＡがサンプル集団から得られる。サンプル集団は、てんかんを有する任意の個体を包含することができるが、サンプル集団では、発作（痙攣）の発症が生後６ヶ月までである患者が注目されると考えられる。
【００５０】
検査患者由来のＤＮＡを数多くの方法で得ることができる。最も一般的な方法は、患者から採取された血液サンプルからＤＮＡを得ることであるが、ＤＮＡはまた、あまり侵襲的でない方法を使用して得ることができ、例えば、ほお細胞塗沫標本などから得ることができる。
【００５１】
現下の研究のために、ＤＮＡを、採取された血液から、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して、または、ＷｙｍａｎおよびＷｈｉｔｅ（１９８０）から適合化された手法によって抽出した。ＱＩＡａｍｐキットを使用して得られたＤＮＡサンプルについては、最終的なエタノール沈殿工程が用いられ、ＤＮＡペレットを滅菌水に再懸濁した。ストックＤＮＡサンプルを２００ｎｇ／μｌの濃度で保存し、１００ｎｇ／μｌの希釈物をその後のＰＣＲ反応のために調製した。
【００５２】
上記で記載されたアッセイシステムの任意の組合せを、この方法を使用して用いることができる。下記には、本研究においてＳＣＮ２Ａ遺伝子における変化を検出するために、また、その種類を決定するために用いられたアッセイの例が示される。ＫＣＮＱ２および／またはＫＣＮＱ３における変化を検出するために用いることができるアッセイが国際特許出願公開ＷＯ９９／２１８７５（その内容は参考として本明細書中に組み込まれる）に記載される。
【００５３】
ＳＳＣＰを使用するＳＣＮ２Ａ電気泳動アッセイ−ＳＣＮ２Ａの変化の存在を特定する
患者由来のＤＮＡが得られると、ＳＣＮ２Ａ遺伝子の個々のエキソンのＰＣＲ増幅を、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析による分析の前に用いた。表１には、ＳＣＮ２Ａ遺伝子の各エキソンを分析するために用いることができ、また、本研究で使用されたプライマーの一覧が示される。
【００５４】
この特定の例では、ＳＳＣＰのために使用されたプライマーはその５’端がＨＥＸにより標識され、典型的なＰＣＲ反応が１０μｌの総体積において行われた。すべてのＰＣＲ反応液は、６７ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）；１６．５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４；６．５μＭのＥＤＴＡ；１．５ｍＭのＭｇＣｌ２；２００μＭの各ｄＮＴＰ；１０％のＤＭＳＯ；０．１７ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ；１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール；５μｇ／ｍｌの各プライマー、および１００Ｕ／ｍｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含有した。ＰＣＲ反応を、典型的には、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の１０サイクル、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の２５サイクルを使用して行った。７２℃で１０分間の最後の伸長反応が続いた。
【００５５】
５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、１２．５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０２％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルーを含む１０μｌ〜２０μｌの負荷用色素を、完了した反応液に加え、続いて、反応液を、架橋比が３５：１（アクリルアミド：ビス−アクリルアミド）であり、２％のグリセロールを含有する非変性の４％ポリアクリルアミドで泳動した。ゲルの厚さは１００μｍであり、幅が１６８ｍｍであり、長さが１６０ｍｍであった。ゲルを１８℃で１２００ボルトおよび約２０ｍＡで泳動し、製造者の説明書に従ってＧｅｌＳｃａｎ２０００システム（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、オーストラリア）で分析した。
【００５６】
ＤＮＡ配列決定アッセイ−ＳＣＮ２Ａの変化の種類を特定する
立体配座の変化を示したＳＳＣＰ分析からのＰＣＲ生成物を、その変化の種類を決定するために二次アッセイ（例えば、ＤＮＡ配列決定）に供した。本実施例で示される例では、最初、バンドシフトを示しているアンプリコンを関連した患者から再増幅することを伴い（この場合に使用されたプライマーは５’ＨＥＸ標識を含有しなかった）、その後、ＰＣＲ増幅されたテンプレートを、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｒｅｐｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の手順に基づいて使用して配列決定のために精製した。精製されたアンプリコンを配列決定するために使用されたプライマーは、最初の増幅工程のために使用されたプライマーと同一であった。それぞれの配列決定反応のために、２５ｎｇのプライマーおよび１００ｎｇの精製されたＰＣＲテンプレートを使用した。ＢｉｇＤｙｅ配列決定キット（ＡＢＩ）を製造者の説明書に従ってすべての配列決定反応のために使用した。生成物をＡＢＩ３７７シーケンサーで泳動し、ＥｄｉｔＶｉｅｗプログラムを使用して分析した。
【００５７】
その後、患者のサンプルから得られたＤＮＡ配列の比較を、ＳＳＣＰによって検出された立体配座の変化をもたらすＤＮＡ変化を検出するために、野生型ＳＣＮ２Ａ配列のＤＮＡ配列と直接に行うことができる。ＤＮＡの変化がＳＣＮ２Ａ遺伝子における既知の多型でないならば、その変化は、疾患を引き起こしている変異であり得ることが考えられ、これにより、本質的には、さらなる家族メンバーの分析によってさらに調査され得る診断がもたらされる。
【００５８】
さらなるアッセイ−ｄＨＰＬＣアッセイ
上記アッセイに加えて、他のアッセイを、ＢＦＮＩＳに関連するＳＣＮ２Ａ遺伝子における変化の存在について検査するために用いることができる。１つのそのようなアッセイが高速液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ）である。この技術では、患者から得られたＤＮＡが最初にＳＣＮ２Ａ遺伝子の個々のエキソンについてＰＣＲ増幅される。ＳＳＣＰ分析のために用いられたプライマー（表１を参照のこと）もまたｄＨＰＬＣ分析のために使用することができる。
【００５９】
ｄＨＰＬＣのＰＣＲ反応およびサイクル処理条件を、ＳＳＣＰ分析について上記で記載されたように行うことができる。しかし、増幅が調査中のアンプリコンのみについて特異的な識別できる生成物をもたらすならば、任意のＰＣＲ反応条件およびサイクル処理条件を用いることができる。
【００６０】
代わりのＰＣＲ反応条件の一例は、反応が、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、３００ｎｇの各プライマー、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｎｇのＤＮＡ、および０．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する２０μｌの総体積において行われる場合である。ＰＣＲサイクル処理条件は、アンプリコンの種類およびプライマー配列に依存して変化するが、典型的には、９４℃で２分間の１サイクル、その後、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間および９４℃で３０秒間の１０サイクル、その後、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間および９４℃で３０秒間の２５サイクルを伴うことができる。５５℃で３０秒間の最後のアニーリング反応、その後、７２℃で１０分間の伸長反応により、通常、サイクル処理が完了する。
【００６１】
ｄＨＰＬＣ分析に先立って、ＰＣＲ生成物は９５℃に５分間加熱され、その後、（２５℃に達するまで）１．５分間あたり−３℃の割合でゆっくり冷却される。これにより、ＰＣＲ生成物のヌクレオチド構成に依存して、ヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖の形成が可能になる。
【００６２】
様々なｄＨＰＬＣシステムをヘテロ二重鎖分析および変異検出のために使用することができる。１つの例がＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  ＷＡＶＥ（登録商標）システムである。ｄＨＰＬＣで変異を検出するために、各生成物は、部分的変性条件のもとで泳動されることが要求される。ＳＣＮ２Ａ遺伝子の各アンプリコンは異なる配列を有するために、各生成物を部分的に変性させる温度を最初に計算する必要がある。
【００６３】
アンプリコンがｄＨＰＬＣカラムに供給され、コンピューターにより作成されたクロマトグラムが患者のサンプルと野生型サンプルとの間で比較される。分析はクロマトグラムの目視検査によって行うことができ、また、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  ＷＡＶＥ（登録商標）システムの場合には、システムとともに供給されるソフトウエアを使用して行うことができる。野生型に対して異なるピークパターンを示すそのような患者サンプルは、調査中のＳＣＮ２Ａアンプリコンに変化を含有すると見なされ、そのような個体に由来するＤＮＡは、ＳＣＮ２Ａの変化の種類を決定するために、また、その変化がＢＦＮＩＳに関係する可能性を予測するために、さらなるアッセイ（すなわち、ＤＮＡ配列決定）に供することができる（上記実施例を参照のこと）。
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【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＳＣＮ２Ａ遺伝子における変化がＢＦＮＩＳの原因であるという可能性を決定するために使用することができ、また、さらには、ＢＦＮＳまたはＢＦＩＳの診断を行うために使用することができる本発明発明に基づく方針を例示する本発明の１つの実施形態によるフローチャートである。
【図２】新生児発作（痙攣）または乳児発作（痙攣）の患者が、ＢＦＮＩＳ、ＢＦＮＳまたはＢＦＩＳを有する可能性を明らかにするために使用することができる、分子生物学に基づく方針を例示する本発明の１つの実施形態によるフローチャートである。
【配列表フリーテキスト】
【００６５】
配列番号１〜配列番号８４は、ＳＣＮ２Ａの変異分析のために使用されるプライマー配列である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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