(57)【要約】  OX-2/CD200のレベルがアップレギュレートされる特徴を有する病状、例えば癌及びCLLの治療に関する。OX-2/CD200及び/又はOX-2/CD200レセプターへ結合できる抗体等のポリペプチドを投与する方法。
2007535471.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
OX-2/CD200が被験者中でアップレギュレートされるかを決定するステップ、及びその被験者へOX-2/CD200又はOX-2/CD200レセプターへ結合するポリペプチドを投与するステップを含有する方法。
【請求項２】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200へ結合する抗体を投与することを含有する請求項１の方法。
【請求項３】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200へ結合するモノクローナル抗体を投与することを含有する請求項１の方法。
【請求項４】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200レセプターへ結合する抗体を投与することを含有する請求項１の方法。
【請求項５】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200レセプターへ結合するモノクローナル抗体を投与することを含有する請求項１の方法。
【請求項６】
上記ポリペプチド投与ステップは、SEQ.ID.No:１、SEQ.ID.No:２、SEQ.ID.No:３、SEQ.ID.No:４、SEQ.ID.No:５、SEQ.ID.No:６、SEQ.ID.No:７、SEQ.ID.No:８、SEQ.ID.No:９、SEQ.ID.No:１０、SEQ.ID.No:１１、SEQ.ID.No:１２、SEQ.ID.No:１３、SEQ.ID.No:１４、SEQ.ID.No:１５、SEQ.ID.No:１６、SEQ.ID.No:１７、SEQ.ID.No:１８、SEQ.ID.No:１９、SEQ.ID.No:２０、SEQ.ID.No:２１、SEQ.ID.No:２２、SEQ.ID.No:２３、SEQ.ID.No:２４、及びSEQ.ID.No:２５の群から選ばれる１以上のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを、被験者へ投与することを含有する請求項１の方法。
【請求項７】
OX-2/CD200がアップレギュレートされる症状に悩む被験者へ、OX-2/CD200へ又はOX-2/CD200レセプターへ結合するポリペプチドを投与することを含むOX-2/CD200がアップレギュレートされる症状の治療方法。
【請求項８】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200へ結合する抗体を投与することを含有する請求項７の方法。
【請求項９】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200へ結合するモノクローナル抗体を投与することを含有する請求項７の方法。
【請求項１０】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200レセプターへ結合する抗体を投与することを含有する請求項７の方法。
【請求項１１】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200レセプターへ結合するモノクローナル抗体を投与することを含有する請求項７の方法。
【請求項１２】
上記ポリペプチド投与ステップは、SEQ.ID.No:１、SEQ.ID.No:２、SEQ.ID.No:３、SEQ.ID.No:４、SEQ.ID.No:５、SEQ.ID.No:６、SEQ.ID.No:７、SEQ.ID.No:８、SEQ.ID.No:９、SEQ.ID.No:１０、SEQ.ID.No:１１、SEQ.ID.No:１２、SEQ.ID.No:１３、SEQ.ID.No:１４、SEQ.ID.No:１５、SEQ.ID.No:１６、SEQ.ID.No:１７、SEQ.ID.No:１８、SEQ.ID.No:１９、SEQ.ID.No:２０、SEQ.ID.No:２１、SEQ.ID.No:２２、SEQ.ID.No:２３、SEQ.ID.No:２４、及びSEQ.ID.No:２５の群から選ばれる１以上のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを、被験者へ投与することを含有する請求項７の方法。
【請求項１３】
OX-2/CD200が癌に悩む被験者中でアップレギュレートされるかを決定するステップ、及びその被験者へOX-2/CD200又はOX-2/CD200レセプターへ結合するポリペプチドを投与するステップを含有する癌治療方法。
【請求項１４】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200へ結合する抗体を投与することを含有する請求項１３の方法。
【請求項１５】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200へ結合するモノクローナル抗体を投与することを含有する請求項１３の方法。
【請求項１６】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200レセプターへ結合する抗体を投与することを含有する請求項１３の方法。
【請求項１７】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200レセプターへ結合するモノクローナル抗体を投与することを含有する請求項１３の方法。
【請求項１８】
上記ポリペプチド投与ステップは、SEQ.ID.No:１、SEQ.ID.No:２、SEQ.ID.No:３、SEQ.ID.No:４、SEQ.ID.No:５、SEQ.ID.No:６、SEQ.ID.No:７、SEQ.ID.No:８、SEQ.ID.No:９、SEQ.ID.No:１０、SEQ.ID.No:１１、SEQ.ID.No:１２、SEQ.ID.No:１３、SEQ.ID.No:１４、SEQ.ID.No:１５、SEQ.ID.No:１６、SEQ.ID.No:１７、SEQ.ID.No:１８、SEQ.ID.No:１９、SEQ.ID.No:２０、SEQ.ID.No:２１、SEQ.ID.No:２２、SEQ.ID.No:２３、SEQ.ID.No:２４、及びSEQ.ID.No:２５の群から選ばれる１以上のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを、被験者へ投与することを含有する請求項１３の方法。
【請求項１９】
OX-2/CD200がCLL（慢性リンパ性白血病）に悩む被験者中でアップレギュレートされるかを決定するステップ、及びその被験者へOX-2/CD200又はOX-2/CD200レセプターへ結合するポリペプチドを投与するステップを含有するCLL治療方法。
【請求項２０】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200へ結合する抗体を投与することを含有する請求項１９の方法。
【請求項２１】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200へ結合するモノクローナル抗体を投与するステップを含有する請求項１９の方法。
【請求項２２】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200レセプターへ結合する抗体を投与することを含有する請求項１９の方法。
【請求項２３】
上記ポリペプチド投与ステップは、被験者へOX-2/CD200レセプターへ結合するモノクローナル抗体を投与することを含有する請求項１９の方法。
【請求項２４】
上記ポリペプチド投与ステップは、SEQ.ID.No:１、SEQ.ID.No:２、SEQ.ID.No:３、SEQ.ID.No:４、SEQ.ID.No:５、SEQ.ID.No:６、SEQ.ID.No:７、SEQ.ID.No:８、SEQ.ID.No:９、SEQ.ID.No:１０、SEQ.ID.No:１１、SEQ.ID.No:１２、SEQ.ID.No:１３、SEQ.ID.No:１４、SEQ.ID.No:１５、SEQ.ID.No:１６、SEQ.ID.No:１７、SEQ.ID.No:１８、SEQ.ID.No:１９、SEQ.ID.No:２０、SEQ.ID.No:２１、SEQ.ID.No:２２、SEQ.ID.No:２３、SEQ.ID.No:２４、及びSEQ.ID.No:２５の群から選ばれる１以上のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを、被験者へ投与することを含有する請求項１９の方法。
【請求項２５】
抗体が結合する抗原を決定する方法であり、
CLL患者から採取した組織を使用して得られる抗体ライブラリーを作成するステップ；
上記ライブラリーの１以上の構成員を、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３９２０として寄託された細胞系CLL-AATの溶解産物と接触させるステップ；及び
上記ライブラリーの少なくとも１の構成員へ結合する抗原の特徴付けをするステップ
を有する方法。
【請求項２６】
上記ライブラリー作成ステップは、CLL細胞を有する有機体又はその一部を免疫化することを含む請求項２５の方法。
【請求項２７】
上記ライブラリー作成ステップは、合成抗体ライブラリーをCLL細胞又は細胞系とパンニングすることを含む請求項２５の方法。
【請求項２８】
ライブラリーはライブラリー構成員を単離する能力を発揮するファージによりスクリーニングされる請求項２７の方法。
【請求項２９】
ライブラリーは、１以上のCLL患者から単離された原発性（primary）CLL細胞とパンニングされる請求項２７の方法。
【請求項３０】
更にCLL細胞上でアップレギュレートされる抗原へ結合する抗体ライブラリーの構成員を特定するステップを含む請求項２５の方法。
【請求項３１】
上記抗体ライブラリーの構成員はOX-2/CD200へ結合する請求項３０の方法。
【請求項３２】
CLL細胞によりアップレギュレートされる抗原へ結合する抗体。
【請求項３３】
抗原はOX-2/CD200である請求項３２の抗体。
【請求項３４】
SEQ.ID.No:１、SEQ.ID.No:２、SEQ.ID.No:３、SEQ.ID.No:４、SEQ.ID.No:５、SEQ.ID.No:６、SEQ.ID.No:７、SEQ.ID.No:８、SEQ.ID.No:９、SEQ.ID.No:１０、SEQ.ID.No:１１、SEQ.ID.No:１２、SEQ.ID.No:１３、SEQ.ID.No:１４、SEQ.ID.No:１５、SEQ.ID.No:１６、SEQ.ID.No:１７、SEQ.ID.No:１８、SEQ.ID.No:１９、SEQ.ID.No:２０、SEQ.ID.No:２１、SEQ.ID.No:２２、SEQ.ID.No:２３、SEQ.ID.No:２４、及びSEQ.ID.No:２５の群から選ばれる配列と少なくとも７０％ホモロジーを有するアミノ酸配列を含有する請求項３２の抗体。
【請求項３５】
抗体が結合する抗原を決定する方法であり、
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３９２０として寄託された細胞系CLL-AAT中の細胞を使用して得られる抗体ライブラリーを作成するステップ；
ライブラリーの１以上の構成員をCLL患者から採取した組織からの細胞の溶解産物を接触させるステップ；及び
上記ライブラリーの少なくとも１の構成員へ結合する抗原の特徴付けをするステップ
を有する方法。
【請求項３６】
抗体が結合する抗原を決定する方法であり、
有機体をCLL患者から採取した組織からのCLL細胞の少なくとも一部で免疫化するステップ；
有機体の免疫化に対する免疫反応を基礎として抗体ライブラリーを構築するステップ；
上記ライブラリーの１以上の構成員とCLL細胞とを接触させるステップ；及び
上記ライブラリーの少なくとも１の構成員へ結合する抗原の特徴付けをするステップ
を含む方法。
【請求項３７】
上記ライブラリーの１以上の構成員とCLL細胞とを接触させるステップは、上記ライブラリーの１以上の構成員とCLL患者から採取した組織からの細胞の溶解産物とを接触させることを含有する請求項３６の方法。
【請求項３８】
抗体が結合する抗原を決定する方法であり、
有機体をCLL細胞の少なくとも一部で免疫化させるステップ；
有機体の免疫化に対する免疫反応を基礎として抗体ライブラリーを構築するステップ；
上記ライブラリーの１以上の構成員を、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３９２０として寄託された細胞系CLL-AATの溶解産物と接触させるステップ；及び
上記ライブラリーの少なくとも１の構成員へ結合する抗原の特徴付けをするステップ
を含有する方法。
【請求項３９】
悪性癌細胞によりアップレギュレートされるポリペプチドの代謝経路を抑制(interfere)する抗体を投与するステップを含む癌治療方法。
【請求項４０】
上記抗体はアップレギュレートされるポリペプチドへ結合する請求項３９の方法。
【請求項４１】
上記抗体は、アップレギュレートされるポリペプチドが相互作用するレセプターへ結合する請求項３９の方法。
【請求項４２】
抗体はポリペプチドの発現を調節する抗原へ結合する請求項３９の方法。
【請求項４３】
ポリペプチドはOX-2/CD200である請求項３９の方法。
【請求項４４】
抗体は、SEQ.ID.No:１、SEQ.ID.No:２、SEQ.ID.No:３、SEQ.ID.No:４、SEQ.ID.No:５、SEQ.ID.No:６、SEQ.ID.No:７、SEQ.ID.No:８、SEQ.ID.No:９、SEQ.ID.No:１０、SEQ.ID.No:１１、SEQ.ID.No:１２、SEQ.ID.No:１３、SEQ.ID.No:１４、SEQ.ID.No:１５、SEQ.ID.No:１６、SEQ.ID.No:１７、SEQ.ID.No:１８、SEQ.ID.No:１９、SEQ.ID.No:２０、SEQ.ID.No:２１、SEQ.ID.No:２２、SEQ.ID.No:２３、SEQ.ID.No:２４、及びSEQ.ID.No:２５の群から選ばれる配列と少なくとも７０％ホモロジーを有するアミノ酸配列を含有する請求項３９の方法。
【請求項４５】
ポリペプチドの発現が悪性癌細胞によりアップレギュレートされることを特定するために癌患者をスクリーニングするステップ；及び
アップレギュレートされるポリペプチドの代謝経路を抑制する抗体を、アップレギュレーションが観察される患者へ投与するステップ
を含有する方法。
【請求項４６】
患者のスクリーニングステップは、CLL患者のスクリーニングを含む請求項４５の方法。
【請求項４７】
患者のスクリーニングステップは、OX-2/CD200のアップレギュレーションの検出を含む請求項４５の方法。
【請求項４８】
抗体投与ステップは、OX-2/CD200へ結合する抗体の投与を含む請求項４５の方法。
【請求項４９】
抗体投与ステップは、OX-2/CD200が相互作用するレセプターへ結合する抗体の投与を含む請求項４５の方法。
【請求項５０】
抗体投与ステップは、OX-2/CD200の発現を調節する抗原へ結合する抗体の投与を含む請求項４５の方法。
【請求項５１】
抗体投与ステップは、SEQ.ID.No:１、SEQ.ID.No:２、SEQ.ID.No:３、SEQ.ID.No:４、SEQ.ID.No:５、SEQ.ID.No:６、SEQ.ID.No:７、SEQ.ID.No:８、SEQ.ID.No:９、SEQ.ID.No:１０、SEQ.ID.No:１１、SEQ.ID.No:１２、SEQ.ID.No:１３、SEQ.ID.No:１４、SEQ.ID.No:１５、SEQ.ID.No:１６、SEQ.ID.No:１７、SEQ.ID.No:１８、SEQ.ID.No:１９、SEQ.ID.No:２０、SEQ.ID.No:２１、SEQ.ID.No:２２、SEQ.ID.No:２３、SEQ.ID.No:２４、及びSEQ.ID.No:２５の群から選ばれる配列と少なくとも７０％ホモロジーを有するアミノ酸配列を含有する抗体の投与を含む請求項４５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国予備出願第60/254113号(2000年12月8日出願)を基礎に優先権主張した国際出願であるPCT/US01/47931号(2001年12月10日出願)の一部継続出願である、米国出願番号第10/379151号(2003年3月4日出願)の一部継続出願である、米国出願番号第10/736188号(2003年12月15日出願）の一部継続出願である。上記米国出願、国際出願及び米国予備出願の開示の全てをここで資料として使用する。
【０００２】
技術分野
本発明は、慢性リンパ性白血病（CLL）細胞由来の細胞系及びCLL及び他の疾患の研究及び治療におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、２００１年１１月２８日にアメリカ培養コレクション（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア、ＵＳＡ）へ、ブダペスト条約に基づきＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３９２０として寄託されたCLL細胞系指定記号「CLL-AAT」に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景分野
慢性リンパ性白血病（CLL）は白血球の病気であり、西半球でもっとも一般的な白血病種である。CLLは、徐々に成長するが寿命の長い悪性リンパ球の成長に関連する多様な群の疾患を表す。CLLは、種々のカテゴリーに分類され、例えば、典型的及び混合種のＢ細胞慢性リンパ性白血病（B-CLL）、Ｂ細胞及びＴ細胞前駆細胞性白血病、毛様細胞性白血病、並びに巨大顆粒リンパ性白血病が挙げられる。
【０００４】
CLLの全ての異なる種類中、B-CLLは全ての白血病の約３０パーセントを占める。それは５０歳以上の患者で最もしばしば発生するが、若者でも増加している。B-CLLは、形態的に正常であるが生物学的に未熟であり、機能を喪失しているB-リンパ球の蓄積に特徴付けられる。リンパ球は通常感染に対して戦う機能がある。しかしB-CLLに罹患すると、リンパ球は血液及び骨髄中に蓄積し、リンパ節の肥大を引き起こす。正常骨髄及び血液細胞の製造が減少し、患者はしばしば重度の貧血症及び低血小板値を示す。これは致命的な出血の危険性及び、白血球数の減少による重度の感染の進行の危険性を提起する。
【０００５】
白血病等の病気を更に理解するために、それらの病因、発病及び生物学の研究のためのツールとして使用できる適切な細胞系を持つことが重要である。悪性ヒトB-リンパ球の細胞系の例として、例えば、前Ｂ急性リンパ芽球性白血病（Ｒｅｈ）、びまん性巨大細胞リンパ腫（ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２）、及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＳＵ−ＷＭ）が挙げられる。残念ながら、多くの公知の細胞系は、臨床的に最もありふれている種類の白血病及びリンパ腫を代表するものではない。
【０００６】
in vitro感染のエプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）の使用は、細胞系、特に悪性細胞の代表であるB-CLL細胞系由来のいくつかのCLLを生じる。これら細胞系の表現型はin vivo腫瘍のそれとは異なり、むしろB-CLLラインの特徴はリンパ芽球状の細胞系のそれと類似する傾向にある。B-CLL細胞をＥＢＶ感染の助けにより不死化する試みは、ほとんど成功していない。その理由は不明であるが、ＥＢＶレセプターの発現、結合又は取り込みの欠如によるためではないことは知られている。ウェルズらはB-CLL細胞は細胞サイクルのＧ１／Ｓ相中でくい止められ、ＥＢＶ  ＤＮＡを伴う形質転換は発現しなかったことを発見した。これは、ＥＢＶのB-CLL細胞との相互作用は、正常Ｂ細胞とのそれとは異なることを示す。ＥＢＶ−形質転換したCLL細胞系は更に、ＥＢＶにより不死化されたリンパ芽球状の細胞系（ＬＣＬ）とより類似する形態を有するように分化することが判明した。
【０００７】
ＥＢＶ−陰性CLL細胞系であるＷＳＵ−CLLが以前に構築されている（Mohammadら、(1996)Leukemia 10(1)：130−7）。しかし、これ以外の細胞系は知られていない。
癌及びCLLを含む病状への体の応答中で役割を果たす種々の機構がある。例えば、ＣＤ４+Ｔヘルパー細胞は、促進因子を効果（器）細胞へ提供することにより、種々の悪性疾患に対する効果的免疫反応における重要な役割を果たす。細胞毒性Ｔ細胞は、癌細胞の排除に最も効果的な細胞であると信じられており、Ｔヘルパー細胞はIL−２及びIFN−γ等のTh1サイトカインを分泌することにより細胞毒性Ｔ細胞を特発(prime)する。種々の悪性疾患中、Ｔヘルパー細胞は、健康な個人中に発見される細胞に比べ変容した表現型を有することが示された。顕著な変容した特徴の一つは減少したTh1サイトカイン製造及びTh2サイトカイン製造へのシフトである（参照、例えば、Kianiら、Haematologica 88,754-761(2003);Maggioら、Ann Oncol 13 Suppl, 1,52-56(2002);Itoら、Cancer 85, 2359-2367(1999);Podhoreckaら、Leuk Res 26,657-660(2002);Tatsumiら、J Exp Med 196,619-628(2002);Agarwalら、Immunol Invest 32,17-30(2003);Smythら、Ann Surg Oncol 10,455-462(2003);Contastaら、Cancer Biother Radiopharm 18,549-557(2003);Lauerovaら、Neoplasma49:159-166(2002)）。サイトカインがThlプロファイルへシフトする逆転(Reversing)は、Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強することを示した（参照Winterら、Immunology108:409-419(2003);Inagawaら、Anticancer Res18,3957-3964(1998)）。
【０００８】
Th1からTh2へのＴヘルパー細胞のサイトカイン発現を引き起こす腫瘍細胞の能力の基礎となる機構は、ＩＩ−１０又はＴＧＦ−β等のサイトカインの分泌及び、免疫系細胞と相互作用する表面分子の発現を含む。OX-2/CD200は、免疫グロブリン遺伝子ファミリーの分子と高度のホモロジーを有する樹状細胞の表面上に発現した分子であり、免疫抑制に関係し(Gorczynskiら、Transplantation 65,1106-1114(1998))、OX-2/CD200−発現細胞はTh1サイトカイン製造の刺激を阻害できる証拠が示された。Gorczinskiらはマウスモデルにおいて、OX-2/CD200Ｆｃの注入投与は、白血病腫瘍細胞を使用した動物モデル中で腫瘍細胞の拒絶（反応）を抑制することを示した(Clin Exp Immunol 126,220-229(2001))。
【非特許文献１】Mohammadら、(1996)Leukemia 10(1)：130−7
【非特許文献２】Kianiら、Haematologica 88,754-761(2003)
【非特許文献３】Maggioら、Ann Oncol 13 Suppl, 1,52-56(2002)
【非特許文献４】Itoら、Cancer 85, 2359-2367(1999)
【非特許文献５】Podhoreckaら、Leuk Res 26,657-660(2002)
【非特許文献６】Tatsumiら、J Exp Med 196,619-628(2002)
【非特許文献７】Agarwalら、Immunol Invest 32,17-30(2003)
【非特許文献８】Smythら、Ann Surg Oncol 10,455-462(2003)
【非特許文献９】Contastaら、Cancer Biother Radiopharm 18,549-557(2003)
【非特許文献１０】Lauerovaら、Neoplasma 49、159-166(2002)
【非特許文献１１】Winterら、Immunology 108、409-419(2003)
【非特許文献１２】Inagawaら、Anticancer Res18,3957-3964(1998)
【非特許文献１３】Gorczynskiら、Transplantation 65,1106-1114(1998)
【非特許文献１４】Clin Exp Immunol 126,220-229(2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
癌又はCLLの罹患患者の、特にＴ細胞の活性を強化することの出来る範囲まで改良された治療方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
まとめ
本発明は例えば、ＥＢＶによる不死化によっては確立されていない、悪性起源のCLL細胞系を提供する。上記細胞系は原発性CLL細胞に由来し、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３９２０として寄託された。好ましくは、この細胞系はCLL-AATである。CLL-AATは、B-CLL原発性細胞由来のB-CLL細胞系である。
更に、このCLL-AAT細胞系は、CLLの診断及び／又は治療に有用なモノクローナル抗体の作成に使用される。抗体はここで免疫原として開示された細胞を使用して作成され、その結果それからモノクローナル抗体が単離される動物中の免疫反応を引き起こす。これら抗体の配列が決定でき、抗体又はそれらの変異体は組み換え型技術により作成できる。ここで「変異体」とは、モノクローナル抗体の配列を基礎とする、キメラ抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）−グラフト化抗体、ヒト化抗体及び完全ヒト抗体を含む。
更に、組み換え型ライブラリー（ファージ抗体）由来の抗体は、標的特異性を利用して抗体を単離するための対象物として、ここで記載された細胞又はそれら由来のポリペプチドを使用して選択される。
【００１１】
本発明では又、抗体は、原発性CLL細胞又はそれら由来の抗原を使用して抗体ライブラリーをパンニングして生産でき、更に、例えばここで記載されたCLL細胞系等のCLL細胞系を使用して、スクリーニングされ及び／又は特徴付けられる。従って、本発明は、抗体のCLL細胞系への結合の評価を含む、CLLに特異的な抗体を特徴付ける方法を提供する。
本発明では又、免疫沈降及びその後の質量分光分析等の当業者に公知の方法により、CLL-AAT細胞系を使用してCLL細胞中で特異的に発現した蛋白質の特定方法を提供する。これらの蛋白質は、CLL-AAT細胞系中又はCLL患者由来の原発性細胞中で特異的に発現される。
【００１２】
小分子ライブラリー（多くのものが市場で入手可能である）は、細胞の成長特性を調整可能な試薬を特定するために、細胞ベースのアッセイ中でCLL-AAT細胞系を使用してスクリーニングされる。例えば、CLL-AAT細胞系中のアポトーシスを調節し、又はそれらの成長及び／又は増殖を阻害する試薬が特定される。これら試薬は、治療用化合物の開発用候補である。
CLL-AAT細胞系から単離された核酸は、CLL特異的遺伝子を特定する減法(subtractive)ハイブリダイゼーション実験中で、又はマイクロアレイ分析（例えば、遺伝子チップ実験）中で使用できる。その転写がCLL細胞中で調節される遺伝子が特定できる。この方法で特定されたポリペプチド又は核酸遺伝子生成物は、抗体の発達又はCLL用の小分子治療法への指標として使用できる。
好ましくは、CLL-AAT細胞系は、細胞により内在化された細胞表面成分へ結合する内在性抗体を特定するために使用される。これら抗体は治療用用途の候補である。特に、細胞質中に安定して留まって、細胞内結合活性を保持する単鎖抗体がこの方法でスクリーニングされる。
【００１３】
本発明は又、患者は悪性癌細胞によりアップレギュレートされるポリペプチドの存在をスクリーニングされ、アップレギュレートされるポリペプチドの代謝経路を抑制する抗体を患者へ投与される治療用処置に関する。
本発明は更に、OX-2/CD200が被験者中でアップレギュレートされるかが決定され、そうであれば、被験者へOX-2/CD200へ結合するポリペプチドを投与する方法に関する。例えば、上記ポリペプチドはOX-2/CD200レセプターへ結合してもよい。
本発明の方法は又、OX-2/CD200又はOX-2/CD200レセプターへ結合するポリペプチドをその病状を示す被験者へ投与することにより、被験者中のOX-2/CD200がアップレギュレートされる症状を治療するために使用される。例えば、これら方法により治療される病状として、癌、特にCLLが挙げられる。
【００１４】
図面の簡単な説明
図１は、磁気活性化細胞分離（ＭＡＣＳ）による抗体ライブラリーの細胞表面パンニング中に含まれる代表的ステップを概略的に図示する。
図２は、選択されたscFvクローンの、原発性B-CLL細胞への結合の存在及び正常ヒトＰＢＭＣへの結合の不在を示す、全細胞ELISAの結果を示すグラフである。この図及び他の図中の表示「２°＋３°」は、マウス抗−ＨＡで染色され、抗マウス抗体単独を検知する陰性コントロールウェルを示す。この図及び他の図中の表示「ＲＳＣ−Ｓライブラリー」は、オリジナルウサギscFvパンニングされないライブラリーから作成された可溶性抗体を言う。この図及び他の図中の表示「Ｒ３／ＲＳＣ−Ｓプール」は、パンニングの第３回目から得られるscFv抗体の完全なプールから作成された可溶性抗体を言う。抗−ＣＤ５抗体を確認のための陽性コントロールとして使用し、同数のB-CLL及びＰＢＭＣ細胞をそれぞれのウェル中にプレートした。
【００１５】
図３ａ及び３ｂは、選択されたscFv抗体の、原発性B-CLL細胞、及び正常原発性ヒトＢ細胞への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。抗−ＣＤ１９抗体を、同数のB-CLL及び正常Ｂ細胞がそれぞれのウェル中にプレートされたかの確認のための陽性コントロールとして使用した。他のコントロールは、図２での説明で記載されたとおりである。
図４ａ及び４ｂは、scFvクローンが患者特異的（即ちイディオタイプ）又は血液タイプ特異的（即ちＨＬＡ）に抗原へ結合するか否かを決定するために使用される全細胞ELISAの結果を示す。それぞれのクローンを、３人の異なるB-CLL患者から単離されたＰＢＭＣへ結合するか試験した。１の患者サンプルへ結合するクローンは、患者特異的又は血液タイプ特異的であると見なされる。
【００１６】
図５ａ及び５ｂは、scFvクローンの、原発性B-CLL細胞及び３種のヒト白血病細胞系への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。「Ｒａｍｏｓ」は、バーキットリンパ腫由来の成熟Ｂ細胞系である。「ＲＬ」は、非ホジキンリンパ腫由来の成熟Ｂ細胞系である。「ＴＦ−１」は、赤白血病由来の赤芽球症細胞系である。
図６ａ、６ｂ及び６ｃは、scFvクローンの、原発性B-CLL細胞及びCLL-AAT、B-CLL患者由来の細胞系への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。ＴＦ−１細胞は、陰性コントロールとして含まれた。
【００１７】
図７は、３色フローサイトメトリーにより分析した、本発明のscFv抗体の結合特異性を示す。正常末梢血単核球中で、scFv-9により認識される抗原は、Ｂリンパ球上で中程度に発現し、Ｔリンパ球の部分母集団上で弱く発現する。正常ドナーからのＰＢＭＣを３色フローサイトメトリーにより、抗−ＣＤ５−ＦＩＴＣ、抗−ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ、及びscFv-9／抗−ＨＡ−ビオチン／ストレプトアビジン（ＳＡ）−ＰＥを使用して分析した。ＦＬ２はscFv-9／ＨＡ−ビオチン／ストレプトアビジン（ＳＡ）−ＰＥ、ＦＬ１はＣＤ５−ＦＩＴＣ、ＦＬ３はＣＤ１９−ＰｅｒＣＰを表す。
図８ａ、８ｂ及び８ｃは、本発明のscFv抗体により認識される抗原の発現レベルを示す。scFv-3及びscFv-9により認識される抗原は、そこからCLL-AAT細胞系が由来する原発性CLL腫瘍上で過発現する。CLL-AAT細胞系を構築するために使用されたCLL患者からの原発性ＰＢＭＣ、又は正常ドナーからのＰＢＭＣをscFv抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。ScFv−３及びscFv-9は、CLL細胞を平均蛍光輝度により測定すると正常ＰＢＭＣよりも明るく染色する。
【００１８】
図９ａ及び９ｂは、ＣＤＲ配列の概要（表１）及び選択されたscFv抗体の結合特異性を示す。
【００１９】
図１０は、正常PBMCと比較した、図８ａ〜８ｃに記載されている原発性CLL細胞でのscFv抗原の発現レベルのフローサイトメトリー結果の概要を示す表２である。抗原及びCLL/PBMC比を示す。
図１１は、１０人のCLL患者から単離された末梢血単核球上での、scFv-9抗原とCD38+細胞の発現レベル割合を比較した、フローサイトメトリー結果の概要を示す表である。
【００２０】
図１２は、免疫沈降及び質量分析法によるscFv抗原の特定を示す。CLL-AAT細胞を０．５ｍｇ／ｍｌスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Pierce社製）のＰＢＳ溶液（ｐＨ８．０）で３０分標識した。未反応のビオチンを除去するためにＰＢＳで充分洗浄後、細胞を窒素キャビテーションにより分解し、ミクロソームフラクションを分画遠心分離により単離した。ミクロソームフラクションをNP40 Lysis バッファ中で再懸濁し、正常ウサギ血清及びプロテインAsepharoseを使用して予め充分に精製した(precleared)。抗原をラット抗−ＨＡアガロースビーズ（Roche社製）と結合したＨＡ−標識化scFv抗体で免疫沈降した。免疫沈降の次に、抗原をSDS-PAGEにより分離し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を使用したウェスタンブロット法により、又はクマシーG-250染色により検出した。CLL-AAT細胞へ結合しない抗体であるScFv−７を陰性コントロールとして使用した。抗原帯をクマシー染色されたゲルから切除し、質量分析法（ＭＳ）により特定した。MALDI−MSはthe Proteomics Core Facility of The Scripps 研究所(ラホーヤ、CA)で実施した。μＬＣ／ＭＳ／ＭＳをハーバード微量化学機関(ケンブリッジ、MA)で実施した。
【００２１】
図１３は、３種のscFv抗体がヒトOX-2/CD200ｃＤＮＡクローンで一時的にトランスフェクトされた２９３−ＥＢＮＡ細胞へ特異的に結合することを示す。OX-2/CD200ｃＤＮＡをRT-PCR法によりCLL細胞からクローンし、哺乳動物の発現ベクターｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）中へ挿入した。ＰＣＥＰ４−ＣＤ２００プラスミド又は対応するエンプティベクターｐＣＥＰ４を「Polyfect」試薬（QIAGEN社製）を使用して２９３−ＥＢＮＡ細胞中へトランスフェクトした。トランスフェクション２日後、細胞をフローサイトメトリーによりscFv抗体への結合を分析した。
図１４は、OX-2/CD200トランスフェクト細胞の存在は、IL−２及びIFN−γ等のTh1サイトカインのダウンレギュレーションを生じることを示した。抗−OX-2/CD200抗体の３０μｇ／ｍｌでの添加はTh1応答を完全に修復した。
【００２２】
図１５は、混合リンパ球反応中のCLL細胞の存在は、IL−２へのTh1応答のダウンレギュレーションを生じたことを示す。
図１６は、混合リンパ球反応中のCLL細胞の存在は、IFN−γへのTh1応答のダウンレギュレーションを生じたことを示す。
図１７Ａ及びＢは、ヒト（細胞）の存在又は不存在のいずれかで、４×１０6RAJI細胞を皮下注射した全ての群のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腫瘍体積の平均＋／−ＳＤを示す。
図１８は、２種のパラメトリック検定（スチューデントｔ−法及びWelch法）並びに１種のノンパラメトリック検定、Wilcox法を使用して実施した統計的分析の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
詳細な説明
本発明では、被験者中でOX-2/CD200がアップレギュレートされるかを決定し、その場合には被験者へOX-2/CD200へ結合するポリペプチドを投与する方法を開示する。一般的に、本発明で使用されるポリペプチドは、当業者に公知の複数の異なる技術を使用して構成できる。例えば、ポリペプチドは、化学的合成により得られる。又例えば、ポリペプチドは抗体でもよく、１以上の抗体の１又は数個のフラグメントから構成されてもよい。
【００２４】
好ましくは、本発明の方法で使用されるポリペプチドは、CLL細胞系から得られる。ここで使用される「CLL」は、本発明を限定するものではないが、Ｂ細胞CLL（B-CLL）等のＢ細胞及びＴ細胞の種々の発生段階を含むいずれかのリンパ球等の慢性リンパ性白血病をいう。ここで使用されるB-CLLは、ＣＤ５+、ＣＤ２３+、ＣＤ２０dim+、ｓＩｇdim+であり、細胞サイクルのＧ０／Ｇ１中で捕捉された成熟Ｂ細胞表現型を有する白血病を言う。本発明では又、CLL細胞系は、癌及びCLL等の、OX-2/CD200がアップレギュレートされる症状の診断及び／又は治療に有用な抗体を含むポリペプチドの作成に使用される。
【００２５】
ここで使用される用語「抗体」は、選択された標的へ結合可能な完全抗体又は抗体フラグメントを言う。例示として挙げられるのは、Fv、scFv、Fab’及びF(ab’)2、モノクローナル及びポリクローナル抗体、設計された抗体（キメラの、ＣＤＲ−グラフトされた、ヒト化、完全なヒト抗体、及び人工的に選択された抗体を含む）、並びにファージディスプレイ又は代わりの技術を使用して作成された合成的又は半合成的抗体である。Ｆｖ及びscFv等の小フラグメントは、それらの小サイズ及びその結果の優れた組織分布性のために診断用及び治療用応用に有利な性質を有する。
【００２６】
ここで使用されるポリペプチド及び／又は抗体は、特に診断用及び治療用応用のために示された。従って、それらは毒素又は標識等のエフェクター蛋白質で変容される。好ましくは、in vivoでのポリペプチド又は抗体の分布の画像化を可能とする標識である。これらの標識は、金属粒子等の放射性標識又は放射線不透過性標識でもよく、それらは容易に患者の体内中で画像化できる。更に、標識は、蛍光性標識又は、患者から取り出された組織サンプルにおいて画像化できる他の標識でもよい。
【００２７】
抗体は、ここで免疫原として開示された細胞を使用して作成され、モノクローナル抗体が単離できる動物中の免疫反応を引き起こす。これら抗体の配列は決定され、抗体又はその変異体が組み換え型技術により作成できる。ここで「変異体」とは、モノクローナル抗体の配列を基礎とする、キメラ化、ＣＤＲ−グラフト化、ヒト化及び完全なヒト抗体、並びにOX-2/CD200へ結合できるポリペプチドをいう。
更に、組み換え型ライブラリー（ファージ抗体）由来の抗体は、標的特異性を利用して抗体またはポリペプチドを単離するための対象として、ここで記載された細胞又はそれら由来のポリペプチドを使用して、選択できる。
【００２８】
本発明では又、抗体又はポリペプチドは、原発性CLL細胞又はそれら由来の抗原を使用して抗体ライブラリーをパンニングして生産でき、更に、例えば上記CLL細胞系等のCLL細胞系を使用して、スクリーニングされ、及び／又は特徴付けられてもよい。従って、本発明はCLLに特異的な抗体又はポリペプチドを特徴付ける方法を提供し、その方法は抗体又はポリペプチドのCLL細胞系への結合の評価を含む。
【００２９】
細胞系の構築
細胞系は、当業者に公知の確立した方法に従い作成できる。一般的に、細胞系は、患者由来の原発性細胞を不死化細胞が自然に培養物中に生じるまで培養して作成する。これら細胞を次に単離し、更に培養してクローン細胞母集団又はアポトーシス耐性を示す細胞を作成する。
【００３０】
例えば、CLL細胞は、CLL患者から採取された末梢血から単離されてもよい。細胞は洗浄され、存在する細胞の型を決定するために、任意で免疫型が決定される。次に、細胞はIL−４含有媒体等の媒体中で培養されてもよい。好ましくは媒体の全部又は一部は、培養プロセス中で１以上の回数で交換される。そして細胞系が単離され、培養物中の成長増加により特定される。
【００３１】
本発明では又、ＥＢＶによる不死化では確立されていない悪性起源のCLL細胞系も提供される。「悪性起源」は、例えばＥＢＶで形質転換した非増殖性細胞とは異なる、悪性CLL原発性細胞からの細胞系の派生物を言う。本発明で使用できる細胞系は、それ自身の表現型は悪性でもそうでなくてもよい。「悪性」表現型を有するCLL細胞は、基質媒体に接触していない細胞成長を包含し、細胞成長サイクルの繰り返しを特徴とし、アポトーシス耐性を示す。原発性CLL細胞由来の細胞系は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３９２０として寄託された。好ましくは、細胞系はCLL-AATである。CLL-AATは、B-CLL原発性細胞由来のB-CLL細胞系である。
【００３２】
例えば、CLL細胞中で特異的に発現する蛋白質は、免疫沈降及びその後の質量分光分析等の当業者に公知の方法により、CLL-AAT細胞系を使用して特定される。これら蛋白質は、CLL-AAT細胞系中、又はCLL患者由来の原発性細胞中で特異的に発現する。
【００３３】
小分子ライブラリー（市場で多くのものが入手可能である）が、細胞の成長特性を調整可能な試薬を特定するために細胞ベースのアッセイ中でCLL-AAT細胞系を使用してスクリーニングされる。例えば、CLL-AAT細胞系中のアポトーシスを調節するか、又はそれらの成長及び／又は増殖を阻害する試薬が特定できる。これら試薬は、治療用化合物の開発対象の候補である。
【００３４】
CLL-AAT細胞系から単離された核酸は、CLL特異的遺伝子を特定する減法(subtractive)ハイブリダイゼーション実験中で、又はマイクロアレイ分析（例えば、遺伝子チップ実験）中で使用できる。転写がCLL細胞中で調節される遺伝子が、特定できる。この方法で特定されたポリペプチド又は核酸遺伝子製品は、抗体の開発又はCLL用の小分子治療法用に指標として使用できる。
【００３５】
例えば、CLL-AAT細胞系は、細胞表面成分へ結合し、次に細胞により内在化される内在性抗体を特定するために使用できる。これら抗体は治療用製品の候補である。特に、細胞質中に安定して留まり、細胞内結合活性を保持する単鎖抗体が、この方法でスクリーニングできる。
【００３６】
モノクローナル抗体の作成
本発明で作成される抗体を改良するために、組み換え型ＤＮＡ技術が使用できる。その場合、診断用又は治療用応用においてその免疫原性を減少させるために、キメラ抗体を構成できる。更に、免疫原性は、ＣＤＲグラフト法及び、任意の構造修飾により抗体をヒト化して最小化される。米国特許第５２２５５３９号を参照し、その内容をここで資料として使用する。
抗体は、動物血清から得られるか、モノクローナル抗体又はそのフラグメントの場合は細胞培養物中で生産される。組み換え型ＤＮＡ技術が、細菌性又は好ましくは哺乳動物の細胞培養物中で確立された手順に従い、抗体を生産するために使用できる。選択された細胞培養系は、好ましく抗体生成物を分泌する。
【００３７】
又例えば、本発明の抗体の作成方法は、ホスト、例えばE.coli、又はハイブリッドベクターで形質転換された哺乳動物細胞、を培養するステップを含むこともある。ベクターは、適切なリーディングフレーム中で抗体蛋白質をエンコードする第二ＤＮＡ配列へリンクしたシグナルペプチドをエンコードする第一ＤＮＡ配列へ、作動可能なようにリンクしたプロモーターを含有する、１以上の発現カセットを含む。次に抗体蛋白質を採取し、単離する。任意で、発現カセットは、それぞれ個々に適切なリーディングフレーム中で作動可能なようにシグナルペプチドへリンクされた、抗体蛋白質をエンコードする、ポリシストロニック、例えばバイシストロニックなＤＮＡ配列へ作動可能なようにリンクしたプロモーターを含む。
【００３８】
ハイブリドーマ細胞又は哺乳動物のホスト細胞のin vitro増殖は、通常の標準的培養媒体（例えば商標「Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)又はRPMI 1640 Medium」）等の適切な培養媒体中で行われ、任意で、哺乳動物の血清（例えばウシ胎仔血清）、又は微量元素及び成長維持用補充剤（例えば正常マウス腹膜性滲出細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ等の支持細胞、２−アミノエタノール、インシュリン、トランスフェリン、低比重リポ蛋白、オレイン酸等）を補充してもよい。細菌細胞又は酵母菌であるホスト細胞の増殖は、公知の適切な培養媒体中で同様に実施できる。例えば、細菌用の適切な培養媒体として、Medium LE、NZCYM、NZYM、NZM、terrific broth、SOB、SOC、2xyt、又はM9 Minimal Medium が挙げられる。酵母用の適切な培養媒体として、Medium YPD、YEPD、Minimal Medium 、又はcomplete minimal dropout Mediumが挙げられる。
【００３９】
In vitro生産は、比較的純粋な抗体製剤を提供し、規模拡大して大量の目的とする抗体を得ることが出来る。細菌細胞、酵母、植物、又は哺乳動物細胞の培養技術は公知であり、均質の懸濁液培養物（例えば、気泡式反応器中又は連続的攪拌反応器中）、及び固定化した又は捕捉化した細胞培養物（例えば、中空繊維中、マイクロカプ細胞中、アガロースマイクロビーズ上又は磁器カートリッジ上）が挙げられる。
【００４０】
大量の目的とする抗体も又、哺乳動物細胞のin vivo増殖により得ることができる。この目的のため、目的とする抗体を生産するハイブリドーマ細胞を、組織適合性哺乳動物中に注射し、抗体生産腫瘍の成長を引き起こす。任意で、動物は注射前に炭化水素、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）等の鉱物油を予め投与した(primed)。１〜３週間後、抗体はこれら哺乳動物の体液から単離される。例えば、ハイブリドーマ細胞は、適切な骨髄腫細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウスからの抗体生産脾臓細胞との融合、又は目的とする抗体を生産するハイブリドーマ細胞系Ｓｐ２／０由来のトランスフェクトされた細胞、により得られ、任意でpristineで予備処理したＢａｌｂ／ｃマウスへ腹膜内注射した。１〜２週間後、腹水流体が上記動物から得られる。
【００４１】
上記及び他の技術は、下記試料に記載されている：例えば、Kohler及びMilstein、(1975)Nature256,495-497;米国特許第4376110号;Harlow及びLane、Antibodies:Laboratory Manual、(1988)Cold Spring Harborであり、それらの全ての開示をここで資料として使用する。組み換え型抗体分子の製造技術は、上記資料及び例えば下記に記載されている:国際公開WO97/08320号;米国特許第5427908号;米国特許第5508717号;Smith、1985、Science、Vol.225、pp1315-1317;Parmley及びSmith1988、Gene 73、pp305-318;De La Cruzら、1988、Journal of Biological Chemistry、263pp4318-4322;米国特許第5403484号;米国特許第5223409号;国際公開WO88/06630号;国際公開WO92/15679号;米国特許第5780279号;米国特許第5571698号;米国特許第6040136号;Davisら、Cancer Metastasis Rev.、1999,18(4):421-5;Taylorら、Nucleic Acids Research20(1992), 6287-6295;Tomizukaら、Proc.Nat.Academy of Sciences USA 97(2)(2000);722-727。これら開示の全てをここで資料として使用する。
【００４２】
細胞培養物上澄みは、好ましくは、CLL細胞の免疫蛍光性染色法により、免疫ブロット法により、サンドイッチアッセイ又はドットアッセイ等の酵素免疫アッセイ、又は放射性免疫アッセイにより目的とする抗体をスクリーニングされる。
抗体の単離用に、培養物上澄み中又は腹水流体中の免疫グロブリンが、例えばアンモニウム硫酸塩での沈殿、ポリエチレングリコール等の吸湿性材料に対する透析、選択膜を通すろ過等により濃縮されてもよい。必要な場合及び／又は目的とする場合、抗体は、通常のクロマトグラフィー方法、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィー及び／又は（免疫）アフィニティクロマトグラフィー、例えば本発明のCLL細胞系由来の１以上の表面ポリペプチドを有する又はプロテイン−Ａ又はＧを備えたアフィニティクロマトグラフィーにより精製できる。
【００４３】
本発明は又、細胞系に対する抗体を分泌する細菌細胞系の調製プロセスを提供し、それはウサギ等の適切な哺乳動物が、プールされたCLL患者サンプルで免疫化されることに特徴付けられる。免疫化されたウサギから生産されるファージディスプレイライブラリーは、当分野で公知の方法（例えば、ここで資料として使用する種々の資料中に開示された方法）に従い構築され、目的とする抗体をパンニングされる。
【００４４】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞も又、本発明の範囲内である。好ましいハイブリドーマ細胞は、遺伝子的に安定で、上記目的とする特異性のモノクローナル抗体を分泌し、急速冷凍培養物から解凍及び再クローン化により活性化出来る。本発明は又、CLL細胞系に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を作成する方法を提供する。このプロセス中、適切な哺乳動物、例えばＢａｌｂ／ｃマウスは、本発明の細胞、それ自身の細胞系、又は上記精製されたポリペプチドを含有する抗原性キャリアから由来する、１以上のポリペプチド又はそれらの抗原性フラグメントで免疫化される。免疫化された哺乳動物の抗体生産細胞は、一時的に培養物中で増殖され、又は適切な骨髄腫細胞系の細胞と融合される。融合で得られたハイブリッド細胞はクローン化され、目的とする抗体を分泌する細胞クローンが選択される。例えば、本発明の細胞系で免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞が、骨髄腫細胞系ＰＡＩ又は骨髄腫細胞系Ｓｐ２／０−Ａｇ１４の細胞と融合され、得られたハイブリッド細胞は目的とする抗体を分泌するかスクリーニングされ、陽性ハイブリドーマ細胞がクローン化される。
【００４５】
好ましくは、Ｂａｌｂ／ｃマウスが、本発明の細胞系の１０6〜１０7細胞を、数回、例えば４〜６回、数月間、例えば２〜４月間の皮下注射及び／又は腹膜内注射により免疫化されることを特徴とするハイブリドーマ細胞系の作成プロセスである。免疫化されたマウスからの脾臓細胞は、最後の注射２〜４日後に取り出され、融合プロモーター、好ましくはポリエチレングリコールの存在下で骨髄腫細胞系ＰＡＩの細胞と融合される。好ましくは、骨髄腫細胞は、分子量約４０００のポリエチレングリコール約３０％〜約５０％を含有する溶液中で、３〜１２倍過剰の、免疫化されたマウスからの脾臓細胞と融合される。融合後、細胞は適切な上記の培養媒体中で膨張され、正常骨髄腫細胞を目的とするハイブリドーマ細胞への過度の成長から防止するために、選択培地、例えばＨＡＴ培地を一定の間隔で補充される。
【００４６】
本発明では更に、本発明の細胞系に対する抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする挿入部分を含有する組み換え型ＤＮＡが生産される。用語ＤＮＡは、コーディング単鎖ＤＮＡ、上記コーディングＤＮＡ及びその相補的ＤＮＡから構成される二重鎖ＤＮＡ、又はこれら相補的（単鎖）ＤＮＡ自身を含有する。
【００４７】
更に、本発明の細胞系に対する抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をエンコードするＤＮＡは、酵素的に又は化学合成された、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードするオーセンティックＤＮＡ配列、又はそれらの突然変異体を有するＤＮＡでもよい。オーセンティックＤＮＡの突然変異体は、その中の１以上のアミノ酸が欠落するか１以上の他のアミノ酸と置換されている、上記抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をエンコードするＤＮＡである。好ましくは上記改質部は、ヒト化及び発現最適化適用における抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲの外側にある。用語「突然変異ＤＮＡ」は又、１以上のヌクレオチドが同じアミノ酸をコードする新しいコドンを有する他のヌクレオチドで置換されているサイレント突然変異体を含む。用語「突然変異配列」は又、縮重(degenerated)配列を含む。縮重配列は、無制限の数のヌクレオチドが最初にエンコードされたアミノ酸配列の変化を生じずに他のヌクレオチドにより置換されている遺伝暗号の意味の範囲内で変性している。これら縮重配列は、重鎖ネズミ可変領域及び／又は軽鎖ネズミ可変領域の最適の発現を得るために、特異的ホスト、好ましくはE.coliに適している、それらの異なる制限酵素認識部位及び／又は特定のコドンの頻度のために有用である。
【００４８】
用語「突然変異体」は、当分野で公知の方法に従いオーセンティックＤＮＡのin vitro突然変異誘発により得られるＤＮＡ突然変異体を含むことを意図する。
完全四分割型免疫グロブリン分子の組み立て及びキメラ抗体の発現のために、重鎖及び軽鎖可変領域をコードする組み換え型ＤＮＡ挿入部分は、重鎖及び軽鎖定常領域をコードする対応するＤＮＡと融合され、次に例えばハイブリッドベクターへの組み込み後、適切なホスト細胞中へ転移される。
【００４９】
本発明は又、ヒト定常領域ｇ、例えばγ１、γ２、γ３又はγ４、好ましくはγ１又はγ４へ融合される、本発明の細胞系に対する抗体の重鎖ネズミ可変領域をコードする挿入物を含む組み換え型ＤＮＡも提供する。又本発明は、ヒト定常領域Ｋ又はλ、好ましくはＫへ融合される、本発明の細胞系に対する抗体の軽鎖ネズミ可変領域をコードする挿入物を含む組み換え型ＤＮＡも提供する。
【００５０】
本発明は又、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はスペーサーグループによりリンクされており、任意でホスト細胞中の抗体のプロセシングを促進するシグナル配列、及び／又は抗体の精製を促進するペプチドをコードするＤＮＡ、及び／又は切断部位、及び／又はペプチドスペーサー及び／又はエフェクター分子を含有する、組み換え型ポリペプチドをコードする組み換え型ＤＮＡに関する。
エフェクター分子をコードするＤＮＡは、診断用又は治療用応用に使用できるエフェクター分子をコードするＤＮＡであることを意図する。従って、毒素又は酵素、特にプロドラッグの活性化を触媒できる酵素であるエフェクター分子が好ましいものとして挙げられる。エフェクター分子等をエンコードするＤＮＡは、ＤＮＡをエンコードする天然酵素又は毒素の配列、又はそれらの突然変異体を有し、当分野で公知の方法により調製できる。
【００５１】
本発明の抗体及び抗体フラグメントは診断及び治療法に有用である。従って、本発明の抗体を含有する治療法又は診断用組成物も提供される。
診断用組成物の場合、抗体は好ましくは酵素、蛍光性、放射性同位体又は他の手段でもよい抗体検出手段と共に提供される。抗体及び検出手段は、診断に用いられる診断用キット中での同時、分離的又は逐次的使用のために提供される。
上記開示は抗体に対するが、ある場合にはこれら抗体由来のポリペプチドも本発明の開示に従い使用できる。
【００５２】
CLL細胞系の使用
CLL細胞系の開発には、CLL、癌、及び、OX-2/CD200のレベルがアップレギュレートされる特徴を有する、例えば黒色腫等の他の病状の診断及び治療開発のための重要なツールを提供するような多くの利点がある。
本発明の細胞系は、CLL、及びOX-2/CD200のレベルがアップレギュレートされる特徴を有する他の病状の病因、発病及び生物学に関するin vitro研究用に使用できる。これはこれら疾患の治療法に有用な適切な試薬の特定を補助する。
【００５３】
本発明の細胞系は又、CLL、癌、及び上記OX-2/CD200のレベルがアップレギュレートされる特徴を有する他の病状（例えば、黒色腫）のin vitro及びin vivo診断用、並びに、抗体ライブラリーを原発性細胞及び／又はCLL患者由来の抗原を使用してパンニングする等の他の方法により生産された抗体のスクリーニング及び／又は分析用ポリペプチド及び／又はモノクローナル抗体を生産するのに使用できる。
本発明の細胞系はこの様に使用でき、抗原はそれらから由来できる。都合の良いことに、これら抗原は、CLLに特異的な細胞−表面抗原である。それらは本発明の細胞系から直接に単離できる。一方、本発明の細胞系から作成されたｃＤＮＡ発現ライブラリーはCLL特異的抗原の発現に使用でき、抗−CLL抗体の選択及び分析並びに新規なCLL特異的抗原の特定に使用できる。
【００５４】
モノクローナル抗体治療法を使用したCLLの治療が当分野で提案された。近年、Hainsworth (Oncologist 5(5)(2000)376-384)は、モノクローナル抗体由来の最新の治療法を示した。特にリンパ性白血病は、リンパ球腫瘍上の複数のリンパ球特異的抗原の存在を理由として、この治療用アプローチの良い候補となると考えられる。
現在の抗体治療法（B-リンパ球の表面に発現するＣＤ２０−抗原に対するRituximabTM等）が、ある種のリンパ球性疾患に対し成功して使用されている。しかし、低密度ＣＤ２０抗原が、CLL中のB-リンパ球表面上に発現する(Almasriら、Am.J.Hematol、40(4)(1992)259-263)。
従って、本発明のCLL細胞系は、本発明のCLL細胞系の１以上の抗原性決定基に対する特異性を有する新規な抗−CLL抗体及びポリペプチドの開発、並びに、CLL、癌、及びOX-2/CD200のレベルがアップレギュレートされる特徴を有する他の病状の治療法及び診断におけるそれらの使用を可能とする。
【００５５】
抗体又はポリペプチドは、OX-2/CD200が通常相互作用するレセプターへ結合し、その結果、OX-2/CD200のレセプターへの結合を防止又は阻害する。一方、抗体はOX-2/CD200の発現を調節する抗原へも結合でき、その結果OX-2/CD200の正常な又は増加した発現を防止又は阻害できる。OX-2/CD200の存在は免疫反応の減少と関連するために、OX-2/CD200の代謝経路を抑制して、患者の免疫系が癌又はCLL等の病状をより効果的に防御できるようにすることが望まれる。
【００５６】
好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドはOX-2/CD200へ結合する。例えば、本発明のポリペプチドは、OX-2/CD200へ結合する抗体でもよく、OX-2/CD200が他の分子又はレセプターと相互作用することを防止又は阻害する。CLL細胞及び、OX-2/CD200を過発現する別の細胞はTh1サイトカインの製造を非常に減少させるために、OX-2/CD200へ結合する抗−CD200抗体又はポリペプチドの、アップレギュレートされたOX-2/CD200レベルを有する被験者への投与は、Th1サイトカインプロファイルを回復する。従って、これらポリペプチド及び／又は抗体は、CLL及び、OX-2/CD200を過発現する他の癌又は疾患の治療における治療用試薬に使用できる。
【００５７】
従って又、本発明の方法は、OX-2/CD200が存在するか被験者をスクリーニングするステップ及びOX-2/CD200へ結合するポリペプチドの投与ステップを含有してもよい。好ましい実施態様では、CLL患者は過OX-2/CD200の発現をスクリーニングされ、OX-2/CD200へ結合する抗体が患者へ投与される。下記に詳細に記載されるように、これら抗体の１種は、OX-2/CD200へ結合するscFv-9（参照図９Ｂ）である。
【実施例】
【００５８】
当業者が本発明の組成物及び方法をよりよく実施できるように、下記実施例を例示のために示す。
実施例１：
細胞系CLL-AATの単離（細胞系の構築）
CLLと診断された患者から末梢血を得た。ＷＢＣ値は１．６×１０8／ｍｌだった。単核球をHistopaque-1077密度勾配遠心機（Sigma Diagnostics、セントルイス、MO)により単離した。細胞を、１０％熱不活性化胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を補充したIscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM)で２回洗浄し、５ｍｌの氷冷ＩＭＤＭ／１０％ＦＢＳ中で再懸濁した。生存細胞をトリパンブルーで染色して計測した。細胞を同体積の８５％ＦＢＳ／１５％ＤＭＳＯと混合し、液体窒素中で貯蔵用１ｍｌアリコートで冷凍した。
【００５９】
免疫表現型は、＞９０％のＣＤ４５＋リンパ球母集団は、ＩｇＤ、カッパ軽鎖、ＣＤ５、ＣＤ１９、及びＣＤ２３を発現したことを示した。この母集団も又低レベルのＩｇＭ及びＣＤ２０を発現した。約５０％の細胞は、高レベルのＣＤ３８を発現した。細胞は、ラムダ軽鎖、ＣＤ１０及びＣＤ１３８陰性だった。細胞のアリコートを、解凍し、洗浄し、２０％熱不活性化ＦＢＳ、２mMのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノール、及び５ｎｇ／ｍｌ組み換え型ヒトIL−４（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、ミネアポリス、ＭＮ）を補充した密度１０7／ｍＬでＩＭＤＭで再懸濁された。細胞を３７℃、湿性５％ＣＯ2雰囲気中で培養した。媒体を安定した成長が観察されるまで部分的に４日ごとに交換した。５週間後、培養物中の細胞数は、約４日毎に二倍になり始めた。この細胞系をCLL-AATとした。
【００６０】
細胞系の特徴付け（分析）
フローサイトメトリーによる細胞系の免疫表現型は、ＩｇＭ、カッパ軽鎖、ＣＤ２３、ＣＤ３８、及びＣＤ１３８の高い発現、ＣＤ１９及びＣＤ２０の中程度の発現、並びにＩｇＤ及びＣＤ５の弱い発現を示した。細胞系は、ラムダ軽鎖、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ１０に陰性だった。
細胞系の免疫表現型決定も又、原発性B-CLL細胞へ特異的に結合するように選択されたウサギscFv抗体のパネルを使用して全細胞ELISAにより行われた。これらCLL特異的scFv抗体の全ても又、CLL-AAT細胞系を認識した。反対に、scFvの大部分は、Ｂ細胞リンパ腫由来の２個の細胞系（Ramos、バーキットリンパ腫細胞系）及びＲＬ（非ホジキン病リンパ腫細胞系）へは結合しなかった。
【００６１】
実施例２：抗体ファージディスプレイ及び細胞表面パンニングを使用したB-CLL特異的細胞表面抗原用scFv抗体の選択（免疫化及びscFv抗体ライブラリー構築）
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Scripps病院（ラホーヤ、ＣＡ）でCLL患者から採取された血液から単離した。２頭のウサギを、１０人の異なるCLL患者ドナーからプールされた２×１０7ＰＢＭＣで免疫化した。３回の免疫化（２回の皮下注射の次に１回の静脈内注射）を、３週間間隔で行った。血清タイターをフローサイトメトリーを使用して原発性CLL細胞への血清ＩｇＧの結合を測定することにより調査した。最終免疫化５日後、脾臓、骨髄、及びＰＢＭＣを動物から採取した。合計ＲＮＡは、これら組織から商品名Tri−Reagent（Molecular Research Center社製）を使用して単離した。単鎖Fv(scFv)抗体ファージディスプレイライブラリーを、先の文献(Barbasら、(2001)ファージディスプレイ:「実験マニュアル」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York)記載のとおりに構築した。細胞表面パンニング用に、再増幅したライブラリーからのファージミド粒子をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で沈降させ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、一晩ＰＢＳに対し透析した。
【００６２】
細胞表面パンニングによる抗体選択
Siegelら(1997、J.Immunol.Methods 206:73-85)が記載したように、磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ）で陽性−陰性の選択により、ライブラリーをCLL細胞表面−特異的抗体で集積（培養）した。簡潔に言うと、scFv抗体ライブラリーからのファージミド粒子をＭＰＢＳ（２％非脂肪乾燥乳、０．０２％アジ化ナトリウムＰＢＳ溶液、ｐＨ７．４）中で１時間、２５℃でプレインキュベートし、非特異的結合部位をブロックした。約１０7の原発性CLL細胞を、常磁性マイクロビーズ（Miltenyi Biotec社製、サニーベール、ＣＡ）と複合したマウス抗ＣＤ５  ＩｇＧ及びマウス抗−ＣＤ１９  ＩｇＧで標識化した。結合していないマイクロビーズを洗浄により除去した。標識化したCLL細胞（標的細胞）を過剰の「抗原−陰性吸収細胞」と混合し、ペレット化し、５０μｌ（１０10〜１０11ｃｆｕ）のファージ粒子中に再懸濁した。吸収細胞は、非特異的に細胞表面へ結合するファージ並びに、標的細胞及び吸収細胞の両方に存在する「通常の」抗原に特異的なファージを吸収する作用を有する。使用された吸収細胞は、ＴＦ−１細胞（ヒト赤白血病細胞系）又は免疫磁性陰性選択法（商標「Stem Sepsystem」、Stem Cell Technologies社製、バンクーバー、カナダ）により末端血から単離された正常ヒトＢ細胞のいずれかである。吸収細胞の標的細胞に対する割合は、体積で約１０倍である。２５℃でインキュベーション３０分後、細胞／ファージ混合物を、商標「MiniMACSMS+」分離カラムへ移動した。カラムを０．５ｍｌのＭＰＢＳで２回、０．５ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、結合していないファージ及び吸収細胞を除去した。標的細胞を１ｍｌのＰＢＳでカラムから溶離し、最大速度で１５秒間、マイクロ遠心機中でペレット化した。捕捉されたファージ粒子を、２００μｌの酸溶離バッファ（０．１ＮＨＣｌ、ｐＨはグリシンで２．２に調整した、及び１μｇ／ｍｌのＢＳＡ）中で標的細胞を再懸濁することにより溶離した。２５℃で１０分間のインキュベーション後、バッファを１２μＬの２Ｍの商品名「Trisbase」（ｐＨ１０．５）で中和し、溶離したファージをE.coli中で次回のパンニングのために増幅した。それぞれの回のパンニングでは、インプット及びアウトプットファージタイターを決定した。インプットタイターは標的細胞／吸収細胞混合物へ添加された再増幅したファージ粒子の数であり、アウトプットタイターは標的細胞から溶離した捕捉されたファージの数である。集積係数(enrichment factor)（Ｅ）は、式Ｅ＝（Ｒnアウトプット／Ｒ1インプット）／（Ｒ1アウトプット／Ｒ1インプット）を使用して計算する。多くの場合、集積係数の１０2〜１０3倍が第３又は第４回により達成される。
【００６３】
パンニング後の集積化（培養）した抗体プールの分析
３〜５回のパンニング後、捕捉されたファージのプールをフローサイトメトリー及び／又は全細胞ELISAによりCLL細胞への結合をアッセイした：
１．ＨＡ−標識化可溶性抗体の形の完全なプールを生産するために、E.coli（例えば商品名TOP10F’）の非サプレッサ系統(strain)２ｍｌを１μｌ（１０9〜１０10ｃｆｕ）のファージミド粒子で感染させた。オリジナルの、パンニングされていないライブラリーを陰性コントロールとして使用した。カルベニシリンを最終濃度１０μＭまで添加し、培養物を３７℃で２５０ｒｐｍ、１時間振とうしてインキュベートした。５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有するＳＢ媒体８ｍｌを添加し、培養物を〜０．８のＯＤ６００まで増殖させた。ＬａｃプロモーターからのscFv発現を誘起するためにＩＰＴＧを添加して最終濃度１ｍＭとし、３７℃での振とうを４時間連続した。培養物を３０００×ｇで１５分間遠心分離した。可溶性抗体を含有する上澄みをろ過し、１ｍｌアリコート中−２０℃で貯蔵した。
２．scFv抗体プールの、吸収細胞への結合に対する標的細胞への結合を、フローサイトメトリーにより高親和性ラット抗−ＨＡ（商品名「クローン3F10」Roche Molecular Biochemicals社製）を第２抗体として使用して、ＰＥ−複合ロバ抗−ラットを第３抗体として使用して決定した。
３．抗体プールの、吸収細胞への結合に対する標的細胞への結合を、同様に下記全細胞ELISA法により決定した。
【００６４】
パンニング後の個々のscFvクローンのスクリーニング
パンニング後の個々のscFvクローンをスクリーニングするために、商品名TOP10F’細胞を上記ファージプールで感染させ、カルベニシリン及びテトラサイクリンを含有するＬＢプレート上に広げ、一晩３７℃でインキュベートした。個々のコロニーを、ウェル当たり０．６〜１．０ｍｌのSB-カルベニシリン媒体を含む深型９６−ウェルプレート中でインキュベートした。培養物を、６〜８時間商品名「HiGro振とう培養器」（Gene Machines社製、サンカルロス、ＣＡ）中で５２０ｒｐｍで３７℃で成長させた。この時点で、それぞれのウェルから９０μｌアリコートを、１０μｌのＤＭＳＯを含有する深型９６−ウェルプレートへ移した。このレプリカプレートを−８０℃で貯蔵した。ＩＰＴＧを元のプレートへ添加し、最終濃度１ｍＭとし、振とうを３時間続けた。このプレートを３０００×ｇで１５分間遠心分離した。可溶性scFv抗体を含有する上澄みを別の深型９６−ウェルプレートへ移動して−２０℃で貯蔵した。
【００６５】
ＨＡ−標識化scFv抗体をスクリーニングするための高感度全細胞ELISA法が開発された。
１．ELISAプレートをコンカナバリンＡで被覆した（１０ｍｇ／ｍｌ溶液、０．１ＭのＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．６、０．１ｍＭのＣａＣｌ2）。
２．プレートをＰＢＳで洗浄後、５０μｌのＰＢＳ中の０．５〜１×１０5標的細胞又は吸収細胞をそれぞれのウェルへ添加し、そのプレートを２５０×ｇで１０分間遠心分離する。
３．５０μｌの０．０２％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液を添加し、細胞を一晩４℃で固定化する。
４．ＰＢＳで洗浄後、非特異的結合部位を４％非脂肪乾燥乳含有ＰＢＳで３時間室温でブロックする。
５．細胞は５０μｌの可溶性、ＨＡ−標識化scFv又はFab抗体（商品名TOP10F’上澄み）と共に２時間室温でインキュベートされ、次に６回ＰＢＳで洗浄される。
６．結合した抗体は、マウス抗−ＨＡ第二抗体（クローン１２ＣＡ５）及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）−複合−抗マウスＩｇＧ第三抗体を使用して検出される。シグナルの約１０−倍増幅は、第三抗体としてＡＭＤＥＸＡＰ−複合ヒツジ抗−マウスＩｇＧ（Amersham Pharmacia Biotech社製）により得られる。ＡＭＤＥＸ抗体は、デキストラン鎖を介して複数のＡＰ分子へ接合される。染色はアルカリホスファターゼ基質ＰＮＰＰで実行され、４０５ｎｍでマイクロプレートリーダーを使用して測定される。
【００６６】
scFvクローンの主なスクリーニングは、原発性CLL細胞を正常ヒトＰＢＭＣと比較するELISAにより行った。CLL細胞で陽性であり正常ＰＢＭＣでは陰性であったクローンを、正常ヒトＢ細胞、ヒトＢ細胞系、ＴＦ−１細胞、及びCLL-AAT細胞系に関するELISAで再スクリーニングした。クローンも又３人の異なる患者から単離されたCLL細胞をELISAにより再スクリーンして、患者特異的又は血液タイプ特異的抗原と認められるクローンを排除した。代表的ELISA結果を図２〜６に示し、図９にまとめた。
得られた特定のscFv抗体クローンの数をＤＮＡフィンガープリント法及び塩基配列決定法により決定した。scFvＤＮＡ挿入部分をPCR法によりプラスミドから増幅し、制限酵素BstNIで消化した。得られたフラグメントを４％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色した。異なる制限フラグメントパターンを有するクローンは、当然異なるアミノ酸配列を有する。同一のパターンを有するクローンは、類似又は同一の配列を有すると予想される。特定のBstNIフィンガープリントを有するクローンを、更にＤＮＡ塩基配列決定法により分析した。密接に関係する相補性決定領域を有する抗体の１６グループへクラスター化できる、２５の異なる配列が発見された（図９）。
【００６７】
フローサイトメトリーによるscFv抗体の分析
数個のscFv抗体の結合特異性を３色フローサイトメトリーにより分析した（図７）。正常ドナーから単離されたＰＢＭＣをＦＩＴＣ複合−抗ＣＤ５及びＰｅｒＣＰ−複合−抗ＣＤ１９で染色した。scFv抗体の染色を、第二抗体としてビオチン−複合−抗ＨＡ並びにＰＥ−複合ストレプトアビジンを使用して行った。３種の抗体、scFv−２、scFv-3及びscFv-6が、特にＣＤ１９+Ｂリンパ球母集団（データは記載しない）を確認することが認められた。第４の抗体、scFv-9は、２種の明らかな細胞集団（ＣＤ１９+Ｂリンパ球及びＣＤ５+Ｔリンパ球のサブセットを認識した（図７）。Ｔ細胞サブセットの更なる分析は、それがＣＤ４+ＣＤ８-ＴH細胞の部分母集団であることを示した（データは記載しない）。
【００６８】
scFv抗体により認識された抗原が原発性CLL細胞で過発現するかどうかを決定するために、５人のCLL患者及び５人の正常ドナーからのＰＢＭＣをscFvで染色し、フローサイトメトリーで比較した（図８及び表２）。陽性細胞集団の平均蛍光強度（輝度）を比較することにより、CLL細胞に対する抗原の対応する発現レベルと正常細胞のそれとを決定できた。１の抗体、scFv−２は、常にCLL細胞を正常ＰＢＭＣよりも低い強度に染色する一方、scFv-3及びscFv-6の両方は常にCLL細胞を正常ＰＢＭＣよりも高い輝度に染色した。第４抗体、scFv-9、は、５個中２個のCLLサンプルを正常ＰＢＭＣよりも低い強度で染色したが、残りの３個のCLLサンプルでは中程度の輝度に染色したに過ぎなかった（図８及び表２）。これはscFv-3及びscFv-6の抗原は、全てのでなくても多くのCLL腫瘍で約２倍過発現される一方、scFv-9がCLL腫瘍のサブセットで３〜６倍過発現したことを示す。
【００６９】
CLL患者は、予後不良（生存期間中央値８年）の群及び予後良好（生存期間中央値２６年）の群の２個のほぼ同じ（同数の）グループへ分割できる。数種の予後不良のインジケーターが、CLL用、とりわけＶＨ遺伝子欠損体細胞突然変異の存在及び高パーセンテージのCD38+Ｂ細胞の存在用に特定された。scFv-9がCLL患者のたった１種のサブセットで過発現した抗原を認識するかのために、scFv-9抗原の過発現は、１０人のCLL患者からの血液サンプル中のCD38+細胞のパーセンテージと相関関係があるか否かの決定を試みた（図１１）。その結果、scFv-9抗原の過発現及びCD38+細胞の割合は、互いに完全に独立することを示した。
【００７０】
免疫沈降（ＩＰ）及び質量分析法（ＭＳ）によるscFv抗体により認識される抗原の特定
これら抗体に対する抗原を特定するために、scFvを、細胞表面ビオチン化CLL-AAT細胞のミクロソームフラクションから調製された溶解産物からの、抗原の免疫沈降に使用した（図１２）。免疫沈降された抗原は、SDS-PAGEにより精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（MALDI−MS）又はマイクロキャピラリー逆相ＨＰＬＣナノエレクトロスプレータンデム質量分析法（μＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により特定した（データは記載しない）。この抗原はMALDI−MSにより、CLL及び活性化Ｂ細胞用マーカーとして公知のCD２３として特定された。scFv-9は、CLL-AAT細胞から５０kｄ抗体を免疫沈降した（図１２）。この抗原はμＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより、Ｂ細胞用マーカーとして公知でありＣＤ４+Ｔ細胞及び胸腺細胞を活性化させるOX-2/CD200として特定された。OX-2/CD200は又、ニューロン及び内皮細胞などのいくつかの非リンパ球細胞上でも発現される。
【００７１】
実施例３
OX-2/CD200を過発現して、サイトカイン応答をTh1応答（IL−２、IFN−γ）からTh2応答（IL−４、IL−１０）へシフトさせる細胞の能力を、１人のドナーからの単球由来マクロファージ／樹状細胞及び異なるドナーからの血液由来のＴ細胞を使用して、混合されたリンパ球反応で評価した。OX-2/CD200発現細胞の源として、下記OX-2/CD200トランスフェクトされたＥＢＮＡ細胞又はCLL患者サンプルのいずれかを使用した。
【００７２】
２９３−ＥＢＮＡ細胞のトランスフェクション
２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社製）を１００ｍｍ皿当たり２．５×１０6で接種した。２４時間後に細胞を、製造者の取り扱い説明書に従い商標「Polyfect reagent」（QIAGEN社製）を使用して一時的にトランスフェクトした。細胞を７．２μｇのベクターｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）中のOX-2/CD200ｃＤＮＡ及び０．８μｇのpAdVAntageベクター（Promega社製）で共トランスフェクトした。陰性コントロールとして、細胞を空ｐＣＥＰ４ベクター及びpAdVAntageで共トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、約９０％の細胞がそれらの表面にOX-2/CD200を発現したことがscFv-9抗体を使用してフローサイトメトリーにより決定された。
【００７３】
血液単球からの樹状細胞／マクロファージの成熟
バフィコートをサンディエゴ血液銀行から得て、原発性血液リンパ球（ＰＢＬ）をFicoll（フィコール−ハイパーク法）を使用して単離した。細胞を１時間、２％ヒト血清を含有する商標「Eagles Minimal Essential Medium」(EMEM)中で接着し、次にＰＢＳで激しく洗浄した。細胞を５日間、ＧＭ−ＣＳＦ、IL−４及びIFN−γ又はＭ−ＣＳＦいずれかの存在下で、３日後にリポ多糖類（ＬＰＳ）を添加するか又は無添加で培養した。成熟した細胞を採取し、γ線照射装置（Shepherd社製、型番MarkIモデル３０照射器（Csl37））を使用して２０００ＲＡＤで照射した。
【００７４】
混合リンパ球反応
混合リンパ球反応を、５０００００樹状細胞／マクロファージ及び１×１０6レスポンダー細胞（responder cell）を使用して２４ウェルプレート中にセットした。レスポンダー細胞は、Ficollを使用して末梢血から精製したＴ細胞集積化（培養）リンパ球である。Ｔ細胞は、細胞を１時間組織培養フラスコ中でインキュベートし、非接着Ｔ細胞フラクションを採取して集積（培養）した。５０００００のOX-2/CD200トランスフェクトされたＥＢＮＡ細胞又はCLL細胞を、マクロファージ／樹状細胞中へ３０μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ２００抗体（完全ＩｇＧへ転換されたscFv-9）の存在下又は不存在下で、リンパ球添加の２〜４時間前に添加した。上澄みを４８及び６８時間後に採取し、サイトカインの存在を分析した。
【００７５】
scFv-9から完全ＩｇＧへの転換
scFv-9の軽鎖及び重鎖Ｖ型遺伝子を、それぞれの遺伝子の可変領域を、ヒトラムダ軽鎖不変領域遺伝子、及びヒトＩｇＧ１重鎖不変領域ＣＨ１遺伝子と、それぞれ結合するプライマーを使用したオーバーラップPCR法により増幅した。scFv-9の軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子の可変領域を、特定のプライマーで増幅し、ヒトラムダ軽鎖不変領域遺伝子及びＩｇＧ１重鎖不変領域ＣＨ１遺伝子を、下記特定のプライマーで分離的に増幅した：
R9VL-F1 QP: 5' GGC CTC TAG ACA GCC TGT GCT GAC TCA GTC GCC CTG 3'(SEQ ID No:26)
R9VL/hCL2-rev: 5' CGA GGG GGC AGC CTT GGG CTG ACC TGT GAC GGT CAG CTG GGT C 3'(SEQ ID No:27) 
R9VL/hCL2-F: 5' GAC CCA GCT GAC CGT CAC AGG TCA GCC CAA GGC TGC CCC CTC G 3'(SEQ ID No:28) 
R9VH-F1: 5' TCT AAT CTC GAG CAG CAG CAG CTG ATG GAG TCC G 3'(SEQ ID No:29)
R9VH/hCG-rev: 5' GAC CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GC 3'(SEQ ID No:30)
R9VH/hCG-F: 5' GCA CCC TGG TCA CCG TCT CCT CAG CCT CCA CCA AGG GCC CAT CGG TG 3'(SEQ ID No:31)
hCL2-rev: 5' CCA CTG TCA GAG CTC CCG GGT AGA AGT C 3'(SEQ ID No:32) 
hCG-rev: 5' GTC ACC GGT TCG GGG AAG TAG TC 3'(SEQ ID No:33) 
増幅した生成物を精製し、オーバーラップPCR法を実施した。
【００７６】
最終生成物をXba I／Sac I（軽鎖）及びXho I／Pin Al（重鎖）で消化し、ヒトFab発現ベクター、ＰＡＸ２４３ｈＧＬ中へクローンした。ＤＮＡクローンをＤＮＡ塩基配列決定によりＰＣＲエラーについて分析した。hCMV  ＩＥプロモーター遺伝子をNot I／Xho I部位（重鎖の前方）に挿入した。ベクターをXba I／Pin Al／EcoRI／Nhe Iで消化し、軽鎖プラスhCMVＩＥプロモーター及び重鎖遺伝子を含有する３４７２ｂｐフラグメントをXba I／Pin Al部位で、ＩｇＧ１発現ベクターへ転移させた。
【００７７】
サイトカイン分析
混合リンパ球反応中のサイトカインプロファイルにおけるscFv-9の完全IgGへの変化の効果を決定した。
組織培養上澄み中に発見されるIL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10及びIL-6等のサイトカインを、ELISAを使用して定量化した。それぞれのサイトカインに対するマッチした捕捉及び検出抗体ペアを、R+Dシステム社(ミネアポリス、MN)から得て、それぞれのサイトカイン用の標準曲線を組み換え型ヒトサイトカインを使用して生産した。抗-サイトカイン捕捉抗体を、最適の濃度でPBS中のプレート上に被覆した。インキュベーション一晩後、プレートを洗浄し、１％BSA及び５％スクロースを含有するPBSで1時間ブロックした。０．０５％Tweenを含有するPBSで3回の洗浄後に上澄みへ、１％BSAを含有する２倍又は１０倍のPBS希釈液を添加した。捕捉されたサイトカインを適切なビオチン化抗-サイトカイン抗体で検出し、次にアルカリホスファターゼ複合ストレプトアビジン及び「Sigma S substrate」を添加した。着色をELISAプレートリーダー(Molecular Devices社製)で評価した。
【００７８】
図１４に示されるように、OX-2/CD200でトランスフェクトされ、アントランスフェクトではない細胞の存在は、IL-2及びIFN-γ等のTh1サイトカインのダウンレギュレーションを生じた。30μｇ/mlでの抗-CD200抗体の添加は、完全にTh1応答を回復し、この抗体がOX-2/CD200とそのレセプターとの相互作用をブロックしたことを示した。
図１５及び１６に示されるように、混合リンパ球反応中のCLL細胞の存在はTh1応答のダウンレギュレーションを生じた。(図１５はIL-2の結果を示し;図１６はIFN-γの結果を示す。)これはOX-2/CD200を過発現する細胞(IB、EM、HS、BH)の場合だけでなく、OX-2/CD200を過発現しなかったCLL細胞(JR、JG及びGB)(これら細胞の発現レベルは、図１１中に示される。)の場合でも同様である。しかし、抗-CD200抗体は、OX-2/CD200を過発現する細胞中のTh1応答を回復しただけであり、OX-2/CD200を過発現する患者では、マクロファージ上のそのレセプターと相互作用するOX-2/CD200を阻止すれば、Th1応答の回復に充分であることを示した。OX-2/CD200を過発現しない患者では、他の機構がTh1応答のダウンレギュレーションに含まれることが明らかになった。
【００７９】
腫瘍拒絶に対する抗-CD200の効果を試験するための動物モデル
ＰＢＬの同時注射によりRAJIリンパ腫の成長が防止されるモデルを確立した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへ４×１０6RAJI細胞を、異なるドナーからのヒトＰＢＬの１×１０6、５×１０6又は１０×１０6細胞での存在下又は不存在下のいずれかで、皮下注射した。腫瘍長さ及び幅並びに体重を１週間３回測定した。全てのグループの腫瘍体積の平均＋／−ＳＤを、図１７Ａ及びＢに示す。統計的分析を、２種のパラメトリック検定（スチューデントｔ−法及びWelch法）並びに１種のノンパラメトリック検定（Wilcox試験）を使用して行った。統計的分析の結果を図１８に示す。RAJI細胞は、許容変動内で皮下腫瘍を形成した。（腫瘍）拒絶は、特定のドナー及びＰＢＬ細胞数に依存する。１×１０6ＰＢＬは腫瘍成長の防止に不充分であった。２２〜４３日からの５×１０6ＰＢＬドナー２、３６日で開始した５×１０6又は１×１０7ＰＢＬのドナー３では、腫瘍成長は非常に減少した。ドナー４は、４８日後でほとんど顕著（有意）であった。
【００８０】
抗-CD200の効果を試験するために、RAJI細胞をCD200でしっかりとトランスフェクトした。動物を上記段落記載のように注射する。CD200-トランスフェクトされた細胞の存在下では、腫瘍はヒトPBLの存在下でさえ成長する。抗-CD200抗体はこのモデルでの腫瘍拒絶を評価するために投与される。
同様に、液体腫瘍モデルも確立された。RAJI細胞はNOD/SCIDマウス腹膜内へ注射される。細胞は骨髄、脾臓、リンパ節及び他の器官へ分散し、麻痺を生じる。ヒトPBLの同時注射は、腫瘍成長を防止又は遅延する。腫瘍成長は、マウスの運動障害及び麻痺の徴候を評価することによりモニターされる。これら徴候が観察された場合、そのマウスを犠牲にして骨髄、脾臓、リンパ節及び血液等の種々の器官中の腫瘍細胞の数をFACS分析及びPCR法により評価する。
皮下モデルと同様に、CD200トランスフェクトされた細胞を腹膜内へ注射する。それらはヒトPBLの存在下でさえ成長する。抗-CD200による治療は、腫瘍の拒絶又はより遅い腫瘍成長を生じた。
【００８１】
資料
本発明に関する当分野の水準をより完全に記載するために、下記資料をここで資料として使用する。これら下記刊行物又は資料として使用するものと本発明の開示に不一致がある場合、上記及び本明細書の開示は本発明の開示に従う。
2007535471.tif 000003
【００８２】
ここで開示された態様に種々の改変が行われてもよいことは当然である。例えば、当業者が認識するように、本発明の特定の配列は、OX-2/CD200結合で使用されるポリペプチド、抗体又は抗体フラグメントの機能に悪影響を及ぼすことなしに、変容してもよい。例えば、抗体配列中の１以上のアミノ酸の置換は、抗体又はフラグメントの機能を破壊すること無しにしばしば発生することができる。従って、本発明の特定の抗体と７０％を超えるホモロジー割合を有するポリペプチド又は抗体は、本発明の範囲内であることは理解される。好ましくは、本発明の特定の抗体と８０％を超えるホモロジー割合を有する抗体が意図される。更に好ましくは、本発明の特定の抗体と９０％を超えるホモロジー割合を有する抗体が意図される。このように、上記明細書の記載は本発明を限定するものではなく、好ましい例示に過ぎない。当業者は、本発明の範囲及びその技術的思想の範囲内で他の改変まで含むことを認識できる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】磁気活性化細胞分離(MACS)による抗体ライブラリーの細胞表面パンニング中に含まれる代表的ステップを概略的に図示する。
【図２】選択された（ウサギ）scFvクローンの、原発性B-CLL細胞への結合の存在及び正常ヒトPBMCへの結合の不在を示す、全細胞ELISAの結果を示すグラフである。
【図３】図3a及び3bは、選択された（ウサギ）scFv抗体の、原発性B-CLL細胞、及び正常原発性ヒトＢ細胞への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。
【図４】図4a及び4bは、scFvクローンが患者特異的(即ちイディオタイプ)又は血液タイプ特異的(即ちHLA)抗原へ結合するか否かを決定するために使用される全細胞ELISAの結果を示す。
【図５】図5a及び5bは、（ウサギ）scFvクローンの、原発性B-CLL細胞及び３種のヒト白血病細胞系への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。
【図６】図6a、6b及び6cは、（ウサギ）scFvクローンの、原発性B-CLL細胞及びCLL-AAT、B-CLL患者由来の細胞系への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。
【図７】３色フローサイトメトリーにより分析した本発明のscFv抗体結合特異性を示す。
【図８】図8a、8b及び8cは、本発明のscFv抗体により認識される抗原の発現レベルを示す。
【図９ａ】図９ａ（表１：CLL scFvクローンのまとめ）は、CDR配列の概要及び選択されたscFv抗体の結合特異性を提供する。
【図９ｂ】図９ｂ（CLL特異的ウサギscFv抗体のCDR配列）は、CDR配列の概要及び選択されたscFv抗体の結合特異性を提供する。
【図１０】正常PBMCと比較した、図８ａ〜８ｃに記載されている原発性CLL細胞でのscFv抗原の発現レベルのフローサイトメトリー結果の概要を示す表２（scFv抗原で標識された、B-CLL細胞及び正常PBMCの平均蛍光強度）である。
【図１１】１０人のCLL患者から単離された末梢血単核球上での、scFv-9抗原とCD38+細胞の発現レベル割合を比較した、フローサイトメトリー結果の概要を示す表（CLL細胞上の、scFv-9抗原及びCD38発現の比較）である。
【図１２】免疫沈降及び質量分析法によるscFv抗原の特定を示す。
【図１３】３種のscFv抗体がヒトOX-2/CD200cDNAクローンで一時的にトランスフェクトされた293-EBNA細胞へ特異的に結合することを示す。
【図１４】OX-2/CD200トランスフェクト細胞の存在は、IL-2及びIFN-γ等のTh1サイトカインのダウンレギュレーションを生じることを示す。
【図１５】混合リンパ球反応中のCLL細胞の存在は、IL-2へのTh1応答のダウンレギュレーションを生じたことを示す。
【図１６】混合リンパ球反応中のCLL細胞の存在は、IFN-γへのTh1応答のダウンレギュレーションを生じたことを示す。
【図１７Ａ】ヒト（細胞）の存在又は不存在のいずれかの下で、４×１０6RAJI細胞を皮下注射した全ての群のNOD/SCIDマウスの腫瘍体積の平均＋／−ＳＤを示す（グループ１〜５）。
【図１７Ｂ】ヒト（細胞）の存在又は不存在のいずれかの下で、４×１０6RAJI細胞を皮下注射した全ての群のNOD/SCIDマウスの腫瘍体積の平均＋／−ＳＤを示す（グループ６〜１１）。
【図１８】２種のパラメトリック検定(スチューデントt-法及びWelch法)並びに１種のノンパラメトリック検定、Wilcox法を使用して実施した統計的分析の結果を示す。
【図１】
2007535471.tif 000004
【図２】
2007535471.tif 000005
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【図７】
2007535471.tif 000015
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2007535471.tif 000026
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【図１８】
2007535471.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成17年10月27日(2005.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
OX-2/CD200が被験者中でアップレギュレートされるかを決定するステップ、及びその被験者へOX-2/CD200又はOX-2/CD200レセプターへ結合するポリペプチドを投与するステップを含有する方法。
【請求項２】
OX-2/CD200がアップレギュレートされる症状に悩む被験者へ、OX-2/CD200へ又はOX-2/CD200レセプターへ結合するポリペプチドを投与することを含むOX-2/CD200がアップレギュレートされる症状の治療方法。
【請求項３】
癌に悩む被験者中でOX-2/CD200がアップレギュレートされるかを決定するステップ、及びその被験者へOX-2/CD200又はOX-2/CD200レセプターへ結合するポリペプチドを投与するステップを含有する癌治療方法。
【請求項４】
CLLに悩む被験者中でOX-2/CD200がアップレギュレートされるかを決定するステップ、及びその被験者へOX-2/CD200又はOX-2/CD200レセプターへ結合するポリペプチドを投与するステップを含有するCLL治療方法。
【請求項５】
被験者へOX-2/CD200へ結合する抗体を投与するステップを含有する請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
被験者へOX-2/CD200へ結合するモノクローナル抗体を投与するステップを含有する請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
被験者へOX-2/CD200レセプターへ結合する抗体を投与するステップを含有する請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
被験者へOX-2/CD200レセプターへ結合するモノクローナル抗体を投与するステップを含有する請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
悪性癌細胞によりアップレギュレートされるポリペプチドの代謝経路を抑制する抗体を投与するステップを含有する癌治療方法。
【請求項１０】
上記抗体はアップレギュレートされるポリペプチドへ結合する請求項９の方法。
【請求項１１】
上記抗体は、アップレギュレートされるポリペプチドが相互作用するレセプターへ結合する請求項９の方法。
【請求項１２】
上記抗体はポリペプチドの発現を調節する抗原へ結合する請求項９の方法。
【請求項１３】
上記ポリペプチドはOX-2/CD200である請求項９の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドの発現が悪性癌細胞によりアップレギュレートされることを特定するために癌患者をスクリーニングするステップ；及びアップレギュレートされるポリペプチドの代謝経路を抑制する抗体を、アップレギュレーションが観察される患者へ投与するステップを含有する方法。
【請求項１５】
患者のスクリーニングステップは、CLL患者のスクリーニングを含む請求項１４の方法。
【請求項１６】
患者のスクリーニングステップは、OX-2/CD200のアップレギュレーションの検出を含む請求項１４の方法。
【請求項１７】
抗体投与ステップは、OX-2/CD200へ結合する抗体の投与を含む請求項１４の方法。
【請求項１８】
抗体投与ステップは、OX-2/CD200が相互作用するレセプターへ結合する抗体の投与を含む請求項１４の方法。
【請求項１９】
抗体投与ステップは、OX-2/CD200の発現を調節する抗原へ結合する抗体の投与を含む請求項１４の方法。
【請求項２０】
SEQ.ID.Nos：５、１２及び１３の群から選ばれる配列を有する軽鎖ＣＤＲ１領域を有する抗体の投与ステップを含有する請求項１〜４、９及び１４いずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
SEQ.ID.Nos：２１及び２３の群から選ばれる配列を有する軽鎖ＣＤＲ２領域を有する抗体の投与ステップを含有する請求項１〜４、９及び１４いずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
SEQ.ID.Nos：２９、３７及び３８の群から選ばれる配列を有する軽鎖ＣＤＲ３領域を有する抗体の投与ステップを含有する請求項１〜４、９及び１４いずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
SEQ.ID.Nos：５０、５５及び５６の群から選ばれる配列を有する重鎖ＣＤＲ１領域を有する抗体の投与ステップを含有する請求項１〜４、９及び１４いずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
SEQ.ID.Nos：６９、７４及び７５の群から選ばれる配列を有する重鎖ＣＤＲ２領域を有する抗体の投与ステップを含有する請求項１〜４、９及び１４いずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
SEQ.ID.Nos：８８、９３及び９４の群から選ばれる配列を有する重鎖ＣＤＲ３領域を有する抗体の投与ステップを含有する請求項１〜４、９及び１４いずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
SEQ.ID.Nos：５、１２、１３、２１、２３、２９、３７、３８、５０、５５、５６、６９、７４、７５、８８、９３及び９４の群から選ばれる１以上の配列を有する抗体の投与ステップを含有する請求項１〜４、９及び１４いずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
ヒト化抗体の投与ステップを含有する請求項１〜４、９及び１４いずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
Fv、scFv、Fab'又はF(ab')2の投与ステップを含有する請求項１〜４、９及び１４いずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
抗体が結合する抗原を特定する方法であり、CLL患者から採取した組織を使用して得られる抗体ライブラリーを作成するステップ；上記ライブラリーの１以上の構成員を、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３９２０として寄託された細胞系CLL-AATの溶解産物と接触させるステップ；及び上記ライブラリーの少なくとも１の構成員へ結合する抗原の特徴付けをするステップ；を含有する方法。
【請求項３０】
上記ライブラリー作成ステップは、CLL細胞を有する有機体又はその一部を免疫化することを含む請求項２９の方法。
【請求項３１】
上記ライブラリー作成ステップは、合成抗体ライブラリーをCLL細胞又は細胞系とパンニングすることを含む請求項２９の方法。
【請求項３２】
ライブラリーはライブラリー構成員を単離する能力を発揮するファージによりスクリーニングされる請求項３１の方法。
【請求項３３】
ライブラリーは、１以上のCLL患者から単離された原発性CLL細胞とパンニングされる請求項３１の方法。
【請求項３４】
更にCLL細胞上でアップレギュレートされる抗原へ結合する抗体ライブラリーの構成員を特定するステップを含有する請求項２９の方法。
【請求項３５】
上記抗体ライブラリーの構成員はOX-2/CD200へ結合する請求項３４の方法。
【請求項３６】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３９２０として寄託された細胞系CLL-AAT中の細胞を使用して得られる抗体ライブラリーを作成するステップ；上記ライブラリーの１以上の構成員とCLL患者から採取した組織からの細胞の溶解産物とを接触させるステップ；及び上記ライブラリーの少なくとも１の構成員へ結合する抗原の特徴付けをするステップを含有する抗体が結合する抗原を特定する方法。
【請求項３７】
有機体をCLL患者から採取した組織からのCLL細胞の少なくとも一部で免疫化するステップ；有機体の免疫化に対する免疫反応を基礎として抗体ライブラリーを構築するステップ；上記ライブラリーの１以上の構成員とCLL細胞とを接触させるステップ；及び上記ライブラリーの少なくとも１の構成員へ結合する抗原の特徴付けをするステップ；を含有する抗体が結合する抗原を特定する方法。
【請求項３８】
上記ライブラリーの１以上の構成員とCLL細胞とを接触させるステップは、上記ライブラリーの１以上の構成員とCLL患者から採取した組織からの細胞の溶解産物とを接触させることを含む請求項３６の方法。
【請求項３９】
抗体が結合する抗原を特定する方法であり、
有機体をCLL細胞の少なくとも一部で免疫化させるステップ；
有機体の免疫化に対する免疫反応を基礎として抗体ライブラリーを構築するステップ；
上記ライブラリーの１以上の構成員をＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３９２０として寄託された細胞系CLL-AATの溶解産物と接触させるステップ；及び
上記ライブラリーの少なくとも１の構成員へ結合する抗原の特徴付けをするステップ
を含有する方法。
【請求項４０】
CLL細胞によりアップレギュレートされる抗原へ結合する抗体。
【請求項４１】
抗原はOX-2/CD200である請求項４０の抗体。
【請求項４２】
SEQ.ID.Nos：５、１２及び１３の群から選ばれる配列を有する軽鎖ＣＤＲ１領域を含有する請求項４０の抗体。
【請求項４３】
SEQ.ID.Nos：２１及び２３の群から選ばれる配列を有する軽鎖ＣＤＲ２領域を含有する請求項４０の抗体。
【請求項４４】
SEQ.ID.Nos：２９、３７及び３８の群から選ばれる配列を有する軽鎖ＣＤＲ３領域を含有する請求項４０の抗体。
【請求項４５】
SEQ.ID.Nos：５０、５５及び５６の群から選ばれる配列を有する重鎖ＣＤＲ１領域を含有する請求項４０の抗体。
【請求項４６】
SEQ.ID.Nos：６９、７４及び７５の群から選ばれる配列を有する重鎖ＣＤＲ２領域を含有する請求項４０の抗体。
【請求項４７】
SEQ.ID.Nos：８８、９３及び９４の群から選ばれる配列を有する重鎖ＣＤＲ３領域を含有する請求項４０の抗体。
【請求項４８】
SEQ.ID.Nos：５、１２、１３、２１、２３、２９、３７、３８、５０、５５、５６、６９、７４、７５、８８、９３及び９４の群から選ばれる１以上の配列を含有する請求項４０の抗体。
【請求項４９】
上記抗体はヒト化抗体である請求項４０の抗体。
【請求項５０】
上記抗体はFv、scFv、Fab'又はF(ab')2である請求項４０の抗体。
【手続補正書】
【提出日】平成17年10月28日(2005.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
図９ａ〜９ｃは、ＣＤＲ配列の概要（表１）及び選択されたscFv抗体の結合特異性を示す。図９ｂにおいて、左欄のクローン番号は、下記scFv番号と対応する： A2c (scFv-1), G12.1c (scFv-2), B4.2a (scFv-17), E1c (scFv-3), F2d (scFv-18), E5e (scFv-4), H6.2b (scFv-5), G10.1 (scFv-19), D11.1c (scFv-6), A5.2c (scFv-20), F1d (scFv-7), F1e (scFv-8), E4.2 (scFv-21), E2c (scFv-9), A9c (scFv-9), E11e (scFv-10), A1.1 (scFv-11), F5.2 (scFv-12), F10b (scFv-22), F7a (scFv-23), F6b (scFv-13), C12b (scFv-24), D2.1b (scFv-14), D1.1 (scFv-25), D2.2a (scFv-15), 及び D2.2b (scFv-16)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
scFvクローンの主要なスクリーニングは、原発性CLL細胞を正常ヒトＰＢＭＣと比較するELISAにより行った。CLL細胞で陽性であり正常ＰＢＭＣでは陰性であったクローンを、正常ヒトＢ細胞、ヒトＢ細胞系、ＴＦ−１細胞、及びCLL-AAT細胞系に関するELISAで再スクリーニングした。クローンも又３人の異なる患者から単離されたCLL細胞でELISAにより再スクリーンして、患者特異的又は血液タイプ特異的抗原と認められるクローンを排除した。代表的ELISAからの結果を図２〜６に示し、図９ａ〜ｃにまとめた。
得られた特異的scFv抗体クローンの数をＤＮＡフィンガープリント法及び塩基配列決定法により決定した。scFvＤＮＡ挿入部分をPCR法によりプラスミドから増幅し、制限酵素BstNIで消化した。得られたフラグメントを４％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色した。異なる制限フラグメントパターンを有するクローンは、当然異なるアミノ酸配列を有する。同一のパターンを有するクローンは、類似又は同一の配列を有すると予想される。特異的なBstNIフィンガープリントを有するクローンを、更にＤＮＡ塩基配列決定法により分析した。非常に関係する相補性決定領域を有する抗体の１６グループへクラスター化できる２５の異なる配列が発見された（図９ａ〜ｃ）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
scFv−９から完全ＩｇＧへの転換
scFv−９の軽鎖及び重鎖Ｖ遺伝子を、それぞれの遺伝子の可変領域を、ヒトラムダ軽鎖不変領域遺伝子、及びヒトＩｇＧ１重鎖不変領域ＣＨ１遺伝子と、それぞれ結合するプライマーを使用したオーバーラップPCR法により増幅した。scFv−９の軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子の可変領域を、特異的プライマーで増幅し、ヒトラムダ軽鎖不変領域遺伝子及びＩｇＧ１重鎖不変領域ＣＨ１遺伝子を分離的に特異的プライマーで下記の通り増幅した：
R9VL-F1 QP: 5' GGC CTC TAG ACA GCC TGT GCT GAC TCA GTC GCC CTG 3' (SEQ ID No: 103) 
R9VL/hCL2-rev: 5' CGA GGG GGC AGC CTT GGG CTG ACC TGT GAC GGT CAG CTG GGT C 3' (SEQ ID No: 104) 
R9VL/hCL2-F: 5' GAC CCA GCT GAC CGT CAC AGG TCA GCC CAA GGC TGC CCC CTC G 3' (SEQ ID No: 105) 
R9VH-F1: 5' TCT AAT CTC GAG CAG CAG CAG CTG ATG GAG TCC G 3' (SEQ ID No: 106) 
R9VH/hGG-rev: 5' GAC CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GC 3' (SEQ ID No: 107) 
R9VH/hCG-F: 5' GCA CCC TGG TCA CCG TCT CCT CAG CCT CCA CCA AGG GCC CAT CGG TG 3' (SEQ ID No: 108) 
hCL2-rev: 5' CCA CTG TCA GAG CTC CCG GGT AGA AGT C 3' (SEQ ID No: 109) 
hCG-rev: 5' GTC ACC GGT TCG GGG AAG TAG TC 3' (SEQ ID No: 110) 
増幅した生成物を精製し、オーバーラップPCR法を実施した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
【図１】磁気活性化細胞分離(MACS)による抗体ライブラリーの細胞表面パンニング中に含まれる代表的ステップを概略的に図示する。
【図２】選択された（ウサギ）scFvクローンの、原発性B-CLL細胞への結合の存在及び正常ヒトPBMCへの結合の不在を示す、全細胞ELISAの結果を示すグラフである。
【図３】図3a及び3bは、選択された（ウサギ）scFv抗体の、原発性B-CLL細胞、及び正常原発性ヒトＢ細胞への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。
【図４】図4a及び4bは、scFvクローンが患者特異的(即ちイディオタイプ)又は血液タイプ特異的(即ちHLA)抗原へ結合するか否かを決定するために使用される全細胞ELISAの結果を示す。
【図５】図5a及び5bは、（ウサギ）scFvクローンの、原発性B-CLL細胞及び３種のヒト白血病細胞系への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。
【図６】図6a、6b及び6cは、（ウサギ）scFvクローンの、原発性B-CLL細胞及びCLL-AAT、B-CLL患者由来の細胞系への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。
【図７】３色フローサイトメトリーにより分析した本発明のscFv抗体結合特異性を示す。
【図８】図8a、8b及び8cは、本発明のscFv抗体により認識される抗原の発現レベルを示す。
【図９ａ】図9a（表１：CLL scFvクローンのまとめ）は、CDR配列の概要及び選択されたscFv抗体の結合特異性を提供する。
【図９ｂ】図9b（CLL特異的ウサギscFv抗体のCDR配列）は、CDR配列の概要及び選択されたscFv抗体の結合特異性を提供する。
【図９ｃ】図9cは、代表的クローンの発現パターンを提供する。
【図１０】正常PBMCと比較した、図８ａ〜８ｃに記載されている原発性CLL細胞でのscFv抗原の発現レベルのフローサイトメトリー結果の概要を示す表２（scFv抗原で標識された、B-CLL細胞及び正常PBMCの平均蛍光強度）である。
【図１１】１０人のCLL患者から単離された末梢血単核球上での、scFv-9抗原とCD38+細胞の発現レベル割合を比較した、フローサイトメトリー結果の概要を示す表（CLL細胞上の、scFv-9抗原及びCD38発現の比較）である。
【図１２】免疫沈降及び質量分析法によるscFv抗原の特定を示す。
【図１３】３種のscFv抗体がヒトOX-2/CD200cDNAクローンで一時的にトランスフェクトされた293-EBNA細胞へ特異的に結合することを示す。
【図１４】OX-2/CD200トランスフェクト細胞の存在は、IL-2及びIFN-γ等のTh1サイトカインのダウンレギュレーションを生じることを示す。
【図１５】混合リンパ球反応中のCLL細胞の存在は、IL-2へのTh1応答のダウンレギュレーションを生じたことを示す。
【図１６】混合リンパ球反応中のCLL細胞の存在は、IFN-γへのTh1応答のダウンレギュレーションを生じたことを示す。
【図１７Ａ】ヒト（細胞）の存在又は不存在のいずれかの下で、４×１０6RAJI細胞を皮下注射した全ての群のNOD/SCIDマウスの腫瘍体積の平均＋／−ＳＤを示す（グループ１〜５）。
【図１７Ｂ】ヒト（細胞）の存在又は不存在のいずれかの下で、４×１０6RAJI細胞を皮下注射した全ての群のNOD/SCIDマウスの腫瘍体積の平均＋／−ＳＤを示す（グループ６〜１１）。
【図１８】２種のパラメトリック検定(スチューデントt-法及びWelch法)並びに１種のノンパラメトリック検定、Wilcox法を使用して実施した統計的分析の結果を示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９ｂ】
2007535471.tif 000031
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９ｃ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図９ｃ】
2007535471.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月22日(2007.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
OX-2/CD200が被験者中でアップレギュレートされるかを決定するための組成物であって、該組成物は、OX-2/CD200又はOX-2/CD200レセプターへ結合するポリペプチドを含有する、組成物。
【請求項２】
OX-2/CD200又はOX-2/CD200レセプターへ結合するポリペプチドを含有する、OX-2/CD200がアップレギュレートされる症状を治療するための組成物。
【請求項３】
OX-2/CD200又はOX-2/CD200レセプターへ結合するポリペプチドを含有する、癌を治療するための組成物。
【請求項４】
OX-2/CD200又はOX-2/CD200レセプターへ結合するポリペプチドを含有する、CLLを治療するための組成物。
【請求項５】
OX-2/CD200へ結合する抗体を含有する、請求項１〜４いずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
OX-2/CD200へ結合するモノクローナル抗体を含有する、請求項１〜４いずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
OX-2/CD200レセプターへ結合する抗体を含有する、請求項１〜４いずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
OX-2/CD200レセプターへ結合するモノクローナル抗体を含有する、請求項１〜４いずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
悪性癌細胞によりアップレギュレートされるポリペプチドの代謝経路を妨害する抗体を含有する、癌を治療するための組成物。
【請求項１０】
上記抗体はアップレギュレートされるポリペプチドへ結合する、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
上記抗体は、アップレギュレートされるポリペプチドが相互作用するレセプターへ結合する、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
上記抗体はポリペプチドの発現を調節する抗原へ結合する、請求項９記載の組成物。
【請求項１３】
上記ポリペプチドはOX-2/CD200である、請求項９記載の組成物。
【請求項１４】
ポリペプチドの発現が悪性癌細胞によりアップレギュレートされることを特定するために癌患者をスクリーニングするための組成物であって、該組成物は、アップレギュレートされるポリペプチドの代謝経路を妨害する抗体を含有する、組成物。
【請求項１５】
前記患者は、CLL患者を含む、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
前記患者のスクリーニングは、OX-2/CD200のアップレギュレーションの検出を含む、請求項１４記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗体は、OX-2/CD200へ結合する、請求項１４記載の組成物。
【請求項１８】
前記抗体は、OX-2/CD200が相互作用するレセプターへ結合する、請求項１４記載の組成物。
【請求項１９】
前記抗体は、OX-2/CD200の発現を調節する抗原へ結合する、請求項１４記載の組成物。
【請求項２０】
SEQ.ID.Nos：５、１２及び１３からなる群から選ばれる配列を含む軽鎖ＣＤＲ１領域を有する抗体を含有する、請求項１〜４、９又は１４いずれか１項記載の組成物。
【請求項２１】
SEQ.ID.Nos：２１及び２３からなる群から選ばれる配列を含む軽鎖ＣＤＲ２領域を有する抗体を含有する、請求項１〜４、９又は１４いずれか１項記載の組成物。
【請求項２２】
SEQ.ID.Nos：２９、３７及び３８からなる群から選ばれる配列を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を有する抗体を含有する、請求項１〜４、９又は１４いずれか１項記載の組成物。
【請求項２３】
SEQ.ID.Nos：５０、５５及び５６からなる群から選ばれる配列を含む軽鎖ＣＤＲ１領域を有する抗体を含有する、請求項１〜４、９又は１４いずれか１項記載の組成物。
【請求項２４】
SEQ.ID.Nos：６９、７４及び７５からなる群から選ばれる配列を含む軽鎖ＣＤＲ２領域を有する抗体を含有する、請求項１〜４、９又は１４いずれか１項記載の組成物。
【請求項２５】
SEQ.ID.Nos：８８、９３及び９４からなる群から選ばれる配列を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を有する抗体を含有する、請求項１〜４、９又は１４いずれか１項記載の組成物。
【請求項２６】
SEQ.ID.Nos：５、１２、１３、２１、２３、２９、３７、３８、５０、５５、５６、６９、７４、７５、８８、９３及び９４からなる群から選ばれる一以上の配列を含む抗体を含有する、請求項１〜４、９又は１４いずれか１項記載の組成物。
【請求項２７】
ヒト化抗体を含有する、請求項１〜４、９又は１４いずれか１項記載の組成物。
【請求項２８】
Fv、scFv、Fab'又はF(ab')2を含有する、請求項１〜４、９又は１４いずれか１項記載の組成物。
【請求項２９】
抗体が結合する抗原を特定する方法であり、CLL患者から採取した組織を使用して得られる抗体ライブラリーを作成するステップ；
上記ライブラリーの１以上の構成員を、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３９２０として寄託された細胞系CLL-AATの溶解産物と接触させるステップ；及び
上記ライブラリーの少なくとも１の構成員へ結合する抗原の特徴付けをするステップ；
を含有する、方法。
【請求項３０】
上記ライブラリー作成ステップは、CLL細胞を有する非ヒト有機体又はその一部を免疫化することを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
上記ライブラリー作成ステップは、合成抗体ライブラリーをCLL細胞又はCLL細胞系とパンニングすることを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
上記ライブラリーは、ファージディスプレイによりスクリーニングされ、ライブラリー構成員を単離する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
上記ライブラリーは、１以上のCLL患者から単離された原発性CLL細胞とパンニングされる、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
更にCLL細胞上でアップレギュレートされる抗原へ結合する抗体ライブラリーの構成員を特定するステップを含有する、請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
上記抗体ライブラリーの構成員はOX-2/CD200へ結合する、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３９２０として寄託された細胞系ＣＬＬ−ＡＡＴ中の細胞を使用して得られる抗体ライブラリーを作成するステップ；
上記ライブラリーの１以上の構成員とCLL患者から採取した組織からの細胞の溶解産物とを接触させるステップ；及び
上記ライブラリーの少なくとも１の構成員へ結合する抗原の特徴付けをするステップ；
を含有する、抗体が結合する抗原を特定する方法。
【請求項３７】
非ヒト有機体をCLL患者から採取した組織からのCLL細胞の少なくとも一部で免疫化するステップ；
上記非ヒト有機体の免疫化に対する免疫反応を基礎として抗体ライブラリーを構築するステップ；
上記ライブラリーの１以上の構成員とCLL細胞とを接触させるステップ；及び
上記ライブラリーの少なくとも１の構成員へ結合する抗原の特徴付けをするステップ；
を含有する、抗体が結合する抗原を特定する方法。
【請求項３８】
上記ライブラリーの１以上の構成員とCLL細胞とを接触させるステップは、上記ライブラリーの１以上の構成員とCLL患者から採取した組織からの細胞の溶解産物とを接触させることを含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
抗体が結合する抗原を特定する方法であり、
非ヒト有機体をCLL細胞の少なくとも一部で免疫化するステップ；
上記非ヒト有機体の免疫化に対する免疫反応を基礎として抗体ライブラリーを構築するステップ；
上記ライブラリーの１以上の構成員とCLL細胞とを接触させるステップ；及び
上記ライブラリーの少なくとも１の構成員へ結合する抗原の特徴付けをするステップ
を含有する、方法。
【請求項４０】
CLL細胞によりアップレギュレートされる抗原へ結合する抗体。
【請求項４１】
上記抗原はOX-2/CD200である、請求項４０記載の抗体。
【請求項４２】
SEQ.ID.Nos：５、１２及び１３からなる群から選ばれる配列を含む軽鎖ＣＤＲ１領域を含有する、請求項４０記載の抗体。
【請求項４３】
SEQ.ID.Nos：２１及び２３からなる群から選ばれる配列を含む軽鎖ＣＤＲ２領域を含有する請求項４０記載の抗体。
【請求項４４】
SEQ.ID.Nos：２９、３７及び３８からなる群から選ばれる配列を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含有する、請求項４０記載の抗体。
【請求項４５】
SEQ.ID.Nos：５０、５５及び５６からなる群から選ばれる配列を含む軽鎖ＣＤＲ１領域を含有する、請求項４０記載の抗体。
【請求項４６】
SEQ.ID.Nos：６９、７４及び７５からなる群から選ばれる配列を含む軽鎖ＣＤＲ２領域を含有する、請求項４０記載の抗体。
【請求項４７】
SEQ.ID.Nos：８８、９３及び９４からなる群から選ばれる配列を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含有する、請求項４０記載の抗体。
【請求項４８】
SEQ.ID.Nos：５、１２、１３、２１、２３、２９、３７、３８、５０、５５、５６、６９、７４、７５、８８、９３及び９４からなる群から選ばれる一以上の配列を含有する、請求項４０記載の抗体。
【請求項４９】
上記抗体はヒト化抗体である、請求項４０記載の抗体。
【請求項５０】
上記抗体はFv、scFv、Fab'又はF(ab')2である、請求項４０記載の抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
技術分野
本発明は、慢性リンパ球性白血病（CLL）細胞由来の細胞系ならびにCLL及び他の疾患の研究及び治療におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、２００１年１２月１１日にアメリカ培養コレクション（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア、ＵＳＡ）へ、ブダペスト条約に基づきＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３９２０として寄託されたCLL細胞系指定記号「CLL-AAT」に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
【図１】磁気活性化細胞分離(MACS)による抗体ライブラリーの細胞表面パンニング中に含まれる代表的ステップを概略的に図示する。
【図２】選択された（ウサギ）scFvクローンの、原発性B-CLL細胞への結合の存在及び正常ヒトPBMCへの結合の不在を示す、全細胞ELISAの結果を示すグラフである。
【図３ａ】図3a及び3bは、選択された（ウサギ）scFv抗体の、原発性B-CLL細胞、及び正常原発性Ｂ細胞への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。
【図３ｂ】図3a及び3bは、選択された（ウサギ）scFv抗体の、原発性B-CLL細胞、及び正常原発性Ｂ細胞への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。
【図４ａ】図4a及び4bは、scFvクローンが患者特異的（即ちイディオタイプ）又は血液タイプ特異的(即ちHLA)抗原へ結合するか否かを決定するために使用される全細胞ELISAの結果を示す。
【図４ｂ】図4a及び4bは、scFvクローンが患者特異的（即ちイディオタイプ）又は血液タイプ特異的(即ちHLA)抗原へ結合するか否かを決定するために使用される全細胞ELISAの結果を示す。
【図５ａ】図5a及び5bは、（ウサギ）scFvクローンの、原発性B-CLL細胞及び３種のヒト赤血球細胞系への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。
【図５ｂ】図5a及び5bは、（ウサギ）scFvクローンの、原発性B-CLL細胞及び３種のヒト赤血球細胞系への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。
【図６ａ】図6a、6b及び6cは、（ウサギ）scFvクローンの、原発性B-CLL細胞及びCLL-AAT、B-CLL患者由来の細胞系への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。
【図６ｂ】図6a、6b及び6cは、（ウサギ）scFvクローンの、原発性B-CLL細胞及びCLL-AAT、B-CLL患者由来の細胞系への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。
【図６ｃ】図6a、6b及び6cは、（ウサギ）scFvクローンの、原発性B-CLL細胞及びCLL-AAT、B-CLL患者由来の細胞系への結合を比較する、全細胞ELISAの結果を示す。
【図７】３色フローサイトメトリーにより分析した本発明のscFv抗体結合特異性を示す。
【図８ａ】図8a、8b及び8cは、本発明のscFv抗体により認識される抗原の発現レベルを示す。
【図８ｂ】図8a、8b及び8cは、本発明のscFv抗体により認識される抗原の発現レベルを示す。
【図８ｃ】図8a、8b及び8cは、本発明のscFv抗体により認識される抗原の発現レベルを示す。
【図９ａ】図9a（表１：CLLscFvクローンのまとめ）は、CDR配列の概要及び選択されたscFv抗体の結合特異性を提供する。
【図９ｂ】図9b（CLL特異的ウサギscFv抗体のCDR配列）は、CDR配列の概要及び選択されたscFv抗体の結合特異性を提供する。
【図９ｃ】図9cは、代表的クローンの発現パターンを提供する。
【図１０】正常PBMCと比較した、図８ａ〜８ｃに記載されている原発性CLL細胞でのscFv抗体の発現レベルのフローサイトメトリー結果の概要を示す表２（scFv抗体で標識された、B-CLL細胞及び正常PBMCの平均蛍光強度）である。
【図１１】１０人のCLL患者から単離された末梢血単核球上での、scFv-9抗原とCD38+細胞の発現レベル割合を比較した、フローサイトメトリー結果の概要を示す表（CLL細胞上の、scFv-9抗原及びCD38発現の比較）である。
【図１２】免疫沈降及び質量分析法によるscFv抗原の特定を示す。
【図１３】３種のscFv抗体がヒトOX-2/CD200cDNAクローンで一時的にトランスフェクトされた293-EBNA細胞へ特異的に結合することを示す。
【図１４】OX-2/CD200トランスフェクト細胞の存在は、IL-2及びIFN-γ等のTh1サイトカインのダウンレギュレーションを生じることを示す。
【図１５】混合リンパ球反応中のCLL細胞の存在は、IL-2へのTH1応答のダウンレギュレーションを生じたことを示す。
【図１６】混合リンパ球反応中のCLL細胞の存在は、IFN-γへのTH1応答のダウンレギュレーションを生じたことを示す。
【図１７Ａ】ヒト（細胞）の存在又は不存在のいずれかの下で、４×１０６RAJI細胞を皮下注射した全ての群のNOD/SCIDマウスの腫瘍体積の平均＋／−ＳＤを示す（グループ１〜５）。
【図１７Ｂ】ヒト（細胞）の存在又は不存在のいずれかの下で、４×１０６RAJI細胞を皮下注射した全ての群のNOD/SCIDマウスの腫瘍体積の平均＋／−ＳＤを示す（グループ６〜１１）。
【図１８】２種のパラメトリック検定(スチューデントt-法及びWelch法)並びに１種のノンパラメトリック検定、Wilcox法を使用して実施した統計的分析の結果を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2007535471.tif 000033
【図２】
2007535471.tif 000034
【図３ａ】
2007535471.tif 000035
【図３ｂ】
2007535471.tif 000036
【図４ａ】
2007535471.tif 000037
【図４ｂ】
2007535471.tif 000038
【図５ａ】
2007535471.tif 000039
【図５ｂ】
2007535471.tif 000040
【図６ａ】
2007535471.tif 000041
【図６ｂ】
2007535471.tif 000042
【図６ｃ】
2007535471.tif 000043
【図７】
2007535471.tif 000044
【図８ａ】
2007535471.tif 000045
【図８ｂ】
2007535471.tif 000046
【図８ｃ】
2007535471.tif 000047
【図９ａ】
2007535471.tif 000048
【図９ｂ】
2007535471.tif 000049
【図９ｃ】
2007535471.tif 000050
【図１０】
2007535471.tif 000051
【図１１】
2007535471.tif 000052
【図１２】
2007535471.tif 000053
【図１３】
2007535471.tif 000054
【図１４】
2007535471.tif 000055
【図１５】
2007535471.tif 000056
【図１６】
2007535471.tif 000057
【図１７Ａ】
2007535471.tif 000058
【図１７Ｂ】
2007535471.tif 000059
【図１８】
2007535471.tif 000060