(57)【要約】  本明細書に記載されているのは、亜硝酸酸化細菌である。本発明の特定の細菌は、塩水環境、淡水環境、及びその両方の環境に耐性である。さらに、様々な実施態様において、各種の本発明の細菌が、凍結過程又は凍結乾燥過程で生き残ることができ、その後も生存能力を維持できる。さらに、本発明の亜硝酸酸化細菌を用いて、水性環境における亜硝酸塩の蓄積を防止又は軽減する方法も提供されている。本発明の細菌を検出する方法も提供されている。本発明の亜硝酸酸化細菌及び、とりわけアンモニア酸化細菌を含む組成物も提供されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する単離された菌株であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、菌株。
【請求項２】
ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８と同一である、請求項１記載の菌株。
【請求項３】
亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する菌株の生物学的に純粋な培養物であって、前記菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、培養物。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８と同一である、請求項３記載の生物学的に純粋な培養物。
【請求項５】
亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する単離された菌株を含む組成物であって、前記菌株が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表されるヌクレオチド配列を含む、組成物。
【請求項６】
前記組成物が液体形態、凍結形態、凍結乾燥形態及び粉末形態からなる群より選択される形態である請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物がポリマーに含まれている、請求項５記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリマーがアクリルアミド、アルギン酸、カラギナン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
アンモニア酸化生物体、亜硝酸酸化微生物、硝酸還元微生物、従属栄養微生物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される微生物をさらに含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１０】
亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する濃縮された菌株を含む組成物であって、前記菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組成物。
【請求項１１】
前記菌株が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８と同一である１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
アンモニア酸化生物体、亜硝酸酸化微生物、硝酸還元微生物、従属栄養微生物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される微生物をさらに含む、請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する、少なくとも２つの単離された菌株を含む組成物であって、この少なくとも２つの菌株はそれぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より独立して選択されるヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する、組成物。
【請求項１４】
アンモニア酸化生物体、亜硝酸酸化微生物、硝酸還元微生物、従属栄養微生物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される微生物をさらに含む、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記の少なくとも２つの菌株が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含し、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含し、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含し、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含し、配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含し、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含し、配列番号７に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含し、かつ配列番号８に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含する、請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】
以下の工程を含む凍結乾燥工程によって製造された請求項１３記載の組成物：
前記少なくとも２つの菌株を抗凍結剤とともに処理する工程；
フリーザー中に前記処理された菌株を置く工程；
フリーザーから前記処理された菌株を取り出す工程；及び
減圧下で前記菌株を乾燥する工程。
【請求項１７】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む、単離された核酸。
【請求項１８】
前記配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される配列と同一である、請求項１７記載の単離された核酸。
【請求項１９】
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２０】
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有するオリゴヌクレオチドプローブであって、前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する１６Ｓ ｒＤＮＡを有する細菌の核酸に対してハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２１】
配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー。
【請求項２２】
配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２からなる群より選択されるヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーであって、前記ＰＣＲプライマーが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する１６Ｓ ｒＤＮＡを有する細菌の核酸に対してハイブリダイズする、ＰＣＲプライマー。
【請求項２３】
媒体における亜硝酸塩の蓄積を軽減又は防止する方法であって、以下の工程：
亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する菌株を準備する工程（前記菌株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む）；及び
前記媒体における亜硝酸塩の蓄積を軽減又は防止するのに十分な量の前記菌株を前記媒体中へ導入する工程、
を含む方法。
【請求項２４】
前記媒体が、塩水水槽、淡水水槽、廃水及び水産養殖施設の液体からなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記媒体中に導入する工程が、回転生物接触器、バイオフィルター及びポリマーからなる群より選択される媒介体上に、前記媒体中に導入する菌株を置くことをさらに含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
媒体における亜硝酸塩の蓄積を軽減又は防止する方法であって、以下の工程：
亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する菌株を準備する工程（前記菌株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に記載のヌクレオチド配列を含む）；及び
前記媒体における亜硝酸塩の蓄積を軽減又は防止するのに十分な量の前記菌株を前記媒体中へ導入する工程、
を含む方法。
【請求項２７】
媒体における亜硝酸塩の蓄積を軽減又は防止するバイオレメディエーションプロセスであって、以下の工程：
亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する菌株を準備する工程（前記菌株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む）；及び
前記媒体を改善するのに十分な量の前記菌株を前記媒体中へ導入する工程、
を含むプロセス。
【請求項２８】
媒体における亜硝酸塩の蓄積を軽減又は防止する方法であって、以下の工程：
亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する、少なくとも２つの単離された菌株を含む組成物を準備する工程（前記少なくとも２つの菌株はそれぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より独立して選択されるヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する）；及び
前記媒体における亜硝酸塩の蓄積を軽減又は防止するのに十分な量の前記組成物を前記媒体中へ導入する工程、
を含む方法。
【請求項２９】
前記の少なくとも２つの単離された菌株が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含し、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含し、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含し、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含し、配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含し、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含し、配列番号７に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含し、かつ配列番号８に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を包含する、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物が、アンモニア酸化生物体、亜硝酸酸化微生物、硝酸還元微生物、従属栄養微生物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される微生物をさらに含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
媒体中で亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する細菌（前記細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む）の量を検出し決定する方法であって、以下の工程：
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、検出可能に標識されたプローブを準備する工程；
前記媒体から総ＤＮＡを単離する工程；
前記ヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する細菌の核酸のみに前記プローブがハイブリダイズする条件下で、前記検出可能に標識されたプローブに対して前記単離された総ＤＮＡを曝露させる工程；
前記ハイブリダイズされたプローブの量を検出及び測定する工程、
を含む方法。
【請求項３２】
前記媒体が、塩水水槽、淡水水槽、廃水及び水産養殖施設の液体からなる群より選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記媒体がその中に、水槽用砂利、フィルタースポンジ、フィルターフロス及びプラスチックフィルター媒体からなる群より選択される物質を包含する、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記媒体から総ＤＮＡを単離する工程が、前記物質から総ＤＮＡを単離する工程を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
検出可能に標識されたプローブを準備する工程が、ＤＮＡチップ上に前記検出可能に標識されたプローブを配置する工程をさらに包含する、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、自動化されたプロセスを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
前記自動化されたプロセスが、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、バイオセンサー、バイオプローブ、キャピラリー電気泳動及びリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応からなる群より選択される、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記ハイブリダイズされたプローブの存在が、亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する細菌の存在の指標であり、かつハイブリダイズされたプローブの量が前記媒体において亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する前記細菌の量の指標である、請求項３１記載の方法。
【請求項３９】
媒体中で亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する細菌（前記細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む）の量を検出し決定する方法であって、以下の工程：
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有する、検出可能に標識されたプローブを準備する工程；
前記媒体から総ＤＮＡを単離する工程；
前記ヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する細菌の核酸のみに前記プローブがハイブリダイズする条件下で、前記検出可能に標識されたプローブに対して、前記単離された総ＤＮＡを曝露させる工程；
前記ハイブリダイズされたプローブの量を検出及び測定する工程、
を含む方法。
【請求項４０】
前記媒体が、塩水水槽、淡水水槽、廃水及び水産養殖施設の液体からなる群より選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記媒体がその中に、水槽用砂利、フィルタースポンジ、フィルターフロス及びプラスチックフィルター媒体からなる群より選択される物質を包含する、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
前記媒体から総ＤＮＡを単離する工程が、前記物質から総ＤＮＡを単離する工程を含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
検出可能に標識されたプローブを準備する工程が、ＤＮＡチップ上に前記検出可能に標識されたプローブを配置する工程をさらに含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が、自動化されたプロセスを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
前記自動化されたプロセスが、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、バイオセンサー、バイオプローブ、キャピラリー電気泳動及びリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応からなる群より選択される、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記ハイブリダイズされたプローブの存在が、亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する細菌の存在の指標であり、かつハイブリダイズされたプローブの量が前記媒体において亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する前記細菌の量の指標である、請求項３９記載の方法。
【請求項４７】
固体基材、並びに前記固体基材上に構成される配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを含む、ＤＮＡチップ。
【請求項４８】
前記プローブが共有結合によって前記固体基材に結合される、請求項４７記載のＤＮＡチップ。
【請求項４９】
約１：３の割合で存在する亜硝酸酸化細菌とアンモニア酸化細菌とを含む組成物であって、前記亜硝酸酸化細菌が、配列番号１と同一のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を含み、配列番号２と同一のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を含み、配列番号３と同一のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を含み、配列番号４と同一のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を含み、配列番号５と同一のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を含み、配列番号６と同一のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を含み、配列番号７と同一のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を含み、かつ配列番号８と同一のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、優先権を主張しない２００３年９月１０日に出願された米国特許出願番号［Atty. Docket No. 81289-284779］、２００３年９月１０日に出願された米国特許出願番号［Atty. Docket No. 81289-284781］、２００３年９月１０日に出願された米国特許出願番号［Atty. Docket No. 81289-294309］及び２００３年９月１０日に出願された米国特許出願番号［Atty. Docket No. 81289-305694］に関連するものであり、その全ての内容が参照として本明細書に援用される。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は概して亜硝酸酸化因子に、詳細には亜硝酸塩を硝酸塩に酸化し得る細菌に関する。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
アンモニアは、淡水及び海水の両方における硬骨類及び多くの無脊椎動物による主要な窒素排泄物である。アンモニアは、生物体がその食餌から取り込むタンパク質の脱アミノ化又はアミノ基転移により生じる。しかし、高いアンモニア濃度はこれらと同じ水生生物体の多くにとって毒となり得る。自然の系、例えば湖、川及び海では、水量あたりの魚（及び他の生物体）の密度が低いので、アンモニア濃度が有毒なレベルに達することはめったにない。
【０００４】
しかし、人工的な水系、例えば水産養殖の囲い、タンク、導水路及び生簀並びに水槽では、公共物及び私有物のいずれにおいても、アンモニアは、時には極めて急速に有毒な濃度に達する可能性がある。その理由の１つは、上述の系では、少ない水量に対して魚類密度が極めて高くなり得るということである。別の理由として、これらの系の多くでは、水が連続的に交換されず；むしろ定期的に一部の水しか交換せず、水がこの系を再循環していることである。
【０００５】
従って、ほとんどの水産養殖系及び水槽では、何らかの形態の濾過を行い、水生生物体の保全及び生育に適切であるように、水質の程度を維持する。このような濾過ユニットの主な構成要素は、生物学的フィルターである。生物学的フィルターは、酸化によりアンモニアを他の化合物（亜硝酸塩）に変換する能力を有する細菌を増殖させるための基材又は部位として機能するという事実から名付けられている。高濃度の亜硝酸塩はまた有毒になり得るが、生物学的フィルター上で増殖し、かつ亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する他の細菌種が存在する。例えば、各々があたかも完全に記載されているかのようにその全体が本明細書に援用され、米国特許第６，２６８，１５４号、同第６，２６５，２０６号及び同第６，２０７，４４０号に記載の細菌種である。硝酸塩は非常に高濃度の極端な場合を除いて、水生生物体に対して無毒であると考えられている。
【０００６】
生物学的フィルターを使用する他の状況又は利用が存在する。これらとしては下水処理施設、廃水処理施設及び飲料水濾過設備が挙げられる。各々が生物学的フィルターを使用する独自の具体的な理由を有するが、その目的は同じであり：毒性の無機窒素化合物をより無害な窒素物質に変換することである。アメリカ合衆国環境保護局（Environmental Protection Agency）（ＥＰＡ）により規定された国際推奨水質判定基準（National Recommended Water Quality Criteria）を満たすために、多くの施設が生物学的フィルターを必要としている。
【０００７】
アンモニアの亜硝酸塩への酸化は、アンモニア酸化細菌（ＡＯＢ）が介在するプロセスである。詳細には、以下の式で示されるアンモニアの亜硝酸塩への変換を含む二段階酸化プロセスである：
【０００８】
【化１】
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【０００９】
亜硝酸塩の硝酸塩への酸化も細菌が介在するプロセスである。詳細には、以下の式で示される亜硝酸塩から硝酸塩への変換を含む一段階酸化プロセスである：
【００１０】
【化２】
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【００１１】
最も一般に研究されている亜硝酸酸化細菌（ＮＯＢ）は、Nitrobacter winogradskyiである。これは元々土壌から単離され、水産養殖施設（Wheaton, F. W. 1977. Aquacultural Engineering. John Wiley & Sons, Inc. New York）、廃水処理施設（Painter, H. A. 1986. Nitrification in the treatment of sewage and waste-waters. In Nitrification J. I. Prosser ed. IRL Press. Oxford.）及び水槽（Spotte, S. 1979. Seawater Aquariums-The Captive Environment. Wiley Interscience. New York）において、活性ＮＯＢと称されている。本明細書で引用されているこれらの参考文献、及び他の全ての参考文献は、あたかも完全に記載されているかのようにその全体が参照として本明細書に援用される。
【００１２】
しかし、生物体（又は生物体の群）のＤＮＡ配列の独自性を用いる現代的な分子方法により実施された近年の研究では、N. winogradskyi及びその近縁種が淡水水槽環境において検出限界を下回ることが見出されている（Hovance, T. A. and E. F. Delong. 1996. Comparative analysis of nitrifying bacteria associated with freshwater and marine aquaria. Appl. Environ. Microbiol. 62:2888-2896.）。さらに、研究により、Nitrospira門の細菌が、水槽（Hovanec, T. A., L. T. Taylor, A. Blakis and E. F. Delong. 1998. Nitrospira-like bacteria associated with nitrite oxidation in freshwater aquaria. Appl. Environ. Microbiol. 64:258-264.）及び廃水処理施設（Burrell, P. C., J. Keller and L. L. Blackall. 1998. Microbiology of a nitrite-oxidizing bioreactor. Appl. Environ. Microbiol. 64:1878-1883.）における亜硝酸塩から硝酸塩への酸化に関与することが見出されている。しかし、淡水水槽における亜硝酸酸化に関与すると判断されたNitrospira株は、海水水槽では発見されていない（Hovanec et al., 1998）。
【００１３】
Nitrospira marinaはWatsonによって１９８６年に初めて発見された（Watson, S. W., E. Bock, F. W. Valois, J. B. Waterbury, and U. Schlosser; 1986. Nitrospira marina gen. nov., sp. nov.: A chemolithotrophic nitrite oxidizing bacterium. Archives Microbiology, 144:1-7）。しかし、Nitrospira marinaは自然界（土壌、海、又は貯水池ではない淡水）又は人工的環境（廃水処理施設）において重要な又は主要な亜硝酸酸化生物体とは考えられていなかった（Abeliovich, A. 2003. The Nitrite Oxidizing Bacteria. In M. Dworkin et al. Eds. The Prokaryotes: An Evolving Electronic Resource for the Microbiological Community, third edition, release 3. 13, March 2003. Spinger-Verlag, New York）。Nitrospiraの第２の種（Nitrospira moscoviensis）が、ロシアのモスクワに位置する建物内加熱システム中に存在する部分的に腐食した鉄製パイプから単離された。この細菌は、非海水媒体中で３９度の至適温度で増殖した（Abeliovich, A. 2003）。海洋移動床リアクター（marine moving bed reactor; ＭＢＢ）の細菌共同体には、多数の従属栄養細菌に加えて、ＡＯＢ（Nitrosomonas cryotolerans）及びＮＯＢ（Nitrospira marina）が共に含まれることも報告されている（Y. Tal, J. E. M. Watts, S. Schreier, K. R. Sowers and H. J. Schreier, 2003. Characterization of the microbial community and nitrogen transformation process ass
ociated with moving bed bioreactors in a closed recirculated mariculture system. Aquaculture 215 (2003) 187-202.）。
【００１４】
水槽の環境及び廃水処理において特に重要な環境的要因は、塩分であり、さらに詳細には、淡水と塩水環境との間の多くの生理化学的相違である。局所環境においてこのような劇的な変化に耐える能力における種々のＮＯＢ間の相違は、これらのシステムの設計及びその中でのＮＯＢの実行において重要である。従って、塩水環境に対する特別なＮＯＢによって示された耐性により、特別な水槽及び廃水の環境における使用に最適なＮＯＢが提供され得る。さらに、淡水と塩水環境との間での変化に耐える能力は、より広範な意味、例えば、淡水と塩水の両方の環境での使用に特別なＮＯＢが適しているという意味を有し得る。
【００１５】
さらに、ＮＯＢの保存及び輸送はしばしば、凍結乾燥処理に種々のＮＯＢ株が耐えられないことに少なくとも一部は起因して、液体に、そして同様の潜在的に不便な媒体に限定される。凍結乾燥は、ある容積のＮＯＢを、固体、凍結乾燥粉末又は同様の組成物に処方することができ、それによりＮＯＢは、例えば温度などにおいてのさらに大きな変動に耐えることが可能となり、市販品の輸送及び取り扱いの目的のため、及び長い保存期間を維持するために対応してさらに実際的となり得る。
【特許文献１】米国特許第６，２６８，１５４号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２６５，２０６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，２０７，４４０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、塩水環境及び／又は塩水と淡水環境との両方に耐えることができるＮＯＢの同定が当該技術において必要である。凍結乾燥処理に供した後にも生存したままであるＮＯＢも当該技術で必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
［発明の要旨］
本発明の実施態様では、亜硝酸塩を硝酸塩に酸化することができる単離された細菌又は菌株が提供される。１つの実施態様では、この細菌又は菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のヌクレオチド配列を有する。配列番号１及び配列番号２に記載のヌクレオチド配列は、Nitrococcus様NＯＢの例示であり、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８に記載のヌクレオチド配列は、Nitrospira様ＮＯＢの例示である。配列番号１及び配列番号２によって表されるNitrococcus様NＯＢは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されており、寄託番号ＰＴＡ−５４２４が付与されている。配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表されるNitrospira様ＮＯＢは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されており、寄託番号ＰＴＡ−５４２２が付与されている。
【００１８】
種々の実施態様では、細菌又は菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８のヌクレオチド配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８に対して少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似又は少なくとも９９％類似であるその変異体を有する。
【００１９】
本発明はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８のヌクレオチド配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８に対して少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似又は少なくとも９９％類似であるその変異体を有する核酸配列及びその配列を有する細菌を包含する。
【００２０】
本出願の目的に関して、「９６％類似」とは、単一の塩基置換が塩基の最大４％まで生じてもよいことを意味し、「９７％類似」とは、単一の塩基置換が塩基の最大３％まで生じてもよいことを意味し、「９８％類似」とは、単一の塩基置換が塩基の最大２％まで生じてもよいことを意味し、かつ「９９％類似」とは、単一の塩基置換が塩基の最大１％まで生じてもよいことを意味する。
【００２１】
本発明はまた、媒体における亜硝酸塩の蓄積をとりわけ軽減することができる組成物を包含する。ここでこの組成物は１以上の本発明の菌株を含み、この菌株（単数又は複数）の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８のヌクレオチド配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８に対して少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似又は少なくとも９９％類似であるその変異体を有する。
【００２２】
本発明はまた、本明細書で開示された細菌又は菌株を凍結乾燥する方法を包含する。本方法は、抗凍結剤と共に細菌又は菌株を処理し、それらをフリーザー中に置き、減圧下で細菌又は菌株を乾燥するという工程を含む。本発明の凍結乾燥法は、ＮＯＢの生存能力及び亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する能力を維持しながら凍結乾燥形態で保存できる凍結乾燥ＮＯＢを製造する。
【００２３】
本発明はまた、媒体における亜硝酸塩の蓄積を軽減する方法を包含する。本方法は、菌株又は菌株を含む組成物の十分な量をこの媒体に入れる工程を包含し、ここでこの菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８のヌクレオチド配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８に対して少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似又は少なくとも９９％類似であるその変異体を有する。
【００２４】
本発明はまた、亜硝酸塩を硝酸塩へ酸化し得る細菌の媒体中の量を検出及び決定するための方法を包含する。この方法は、本発明の検出可能に標識されたプローブを準備する工程と、媒体から総ＤＮＡを単離する工程と、この細菌の１６ ｒＤＮＡが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８のヌクレオチド配列を有する場合、細菌の核酸にのみプローブがハイブリダイズする条件下でプローブに対して単離されたＤＮＡを曝露させる工程と、細菌の量を検出及び測定するためにプローブを検出及び測定する工程とを包含する。
【００２５】
本発明はまた、本発明の細菌及び核酸配列を検出するために使用され得るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーも包含する。
【００２６】
［本発明の詳細な説明］
本発明は、塩水及び／又は淡水の環境において亜硝酸塩を酸化でき、かつ凍結処理又は凍結乾燥処理後にも生存して生存可能なままであり得る新規な菌株の発見に基づく。本発明の実施態様は、この菌株の使用方法及び検出方法を記載する。
【００２７】
本発明は、亜硝酸塩を硝酸塩に酸化し得る、単離された菌株又は生物学的に純粋な菌株の培養物を提供しており、ここでこの菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡは、表１〜８に表される配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のヌクレオチド配列を含む。
【００２８】
【表１】
2007510402.tif 000005
【００２９】
【表２】
2007510402.tif 000006
【００３０】
【表３】
2007510402.tif 000007
【００３１】
【表４】
2007510402.tif 000008
【００３２】
【表５】
2007510402.tif 000009
【００３３】
【表６】
2007510402.tif 000010
【００３４】
【表７】
2007510402.tif 000011
【００３５】
【表８】
2007510402.tif 000012
【００３６】
本発明の目的に関して、単離された菌株とは、天然環境からある程度精製された１つの株を意味する。細菌の少なくとも２０％が１つの菌株に由来する場合、細菌培養物は生物学的に純粋であると見なされる。しかし、培養物は少なくとも３３％純粋であるのが好ましく、培養物が少なくとも４５％純粋であればより好ましく、少なくとも９０％純粋であることが最も好ましい。
【００３７】
本発明の菌株はまた、水性媒体を維持又は精製するための組成物を提供するために、他の細菌種、栄養分、及び／又は他の成分と互いに組み合わせてもよい。例えば本発明の細菌を、水性媒体から汚染物質又は所望しない化合物を除去することができる細菌と組み合わせることが望まれ得る。このような細菌の例としては、アンモニア酸化細菌（アンモニアを亜硝酸塩に酸化する化学無機独立栄養細菌（chemolithoautotrophic bacteria））、従属栄養細菌（有機物質をアンモニア及び他の物質に無機化する）、及び当業者に既知の別の細菌が挙げられる。アンモニア酸化細菌は、Proteobacteriaのβ及びγ亜門から公知である。その例としてはNitrosomonas、Nitrosospira、Nitrosolobus及びNitrosococcus属の種が挙げられる。硝酸還元細菌は、Azoarcus、Pseudomonas及びAlcaligenes属から公知である。従属栄養細菌は、Bacillus、Pseudomonas及びAlcaligenes属から公知である。本発明の菌株と組み合わせてよい細菌の他のグループとしては、Planctomycesの一員が挙げられる。このような菌は公知の供給源から入手可能であり（例えばAmierican Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas VA 20100, USA）又は水槽バイオフィルターから直接単離され得る。
【００３８】
例えば、本発明の菌株は、水系に存在するアンモニアを亜硝酸塩に酸化し、亜硝酸塩を硝酸塩に酸化するように、アンモニア酸化細菌と組み合わされてもよい。追加されるアンモニア酸化細菌は、当技術分野で公知のアンモニア酸化細菌のいずれでもよく、非限定的な例として、以下の同一出願人による特許出願で開示されているアンモニア酸化細菌が挙げられる：２００３年９月１０日に出願された米国特許出願番号［Atty. Docket No. 81289-284779］、２００３年９月１０日に出願された米国特許出願番号［Atty. Docket No. 81289-284781］、２００３年９月１０日に出願された米国特許出願番号［Atty. Docket No. 81289-294309］及び２００３年９月１０日に出願された米国特許出願番号［Atty. Docket No. 81289-305694］。
【００３９】
別の例は、本発明の菌株と好気性又は嫌気性の脱窒細菌とを混合することである。この場合、本発明の菌株と脱窒細菌との相互作用により生成される硝酸塩は、二窒素又は他の窒素をベースとする生成物に還元される。第３の例は、本発明の菌株と従属栄養細菌とを組み合わせることであり、この従属栄養細菌は有機物質をより単純な無機物質に無機化し、それにより続いて、本発明の菌株がこれを基質として利用できる。
【００４０】
複数の実施態様では、水性媒体を維持又は精製するための組成物が提供されており、組成物には亜硝酸酸化細菌及びアンモニア酸化細菌が含まれている。１つの実施態様では、組成物は、家庭用水槽を維持するために提供されており、本組成物は塩水ＡＯＢに加えて本発明の塩水ＮＯＢを含む。１つの実施態様では、０．５〜１．５ｍＬ、好ましくは約１ｍＬの本発明の濃塩水ＮＯＢと、２．２５ｍＬ〜３．２５ｍＬ、好ましくは約２．７５ｍＬの濃塩水ＡＯＢとを混合する。この濃縮された混合物は、その後、人工海水で２．５〜３．５液量オンス、好ましくは約３液量オンス（８８．７ｍＬ）に希釈される。この量は、５０〜６０ガロン、好ましくは約５５ガロンの水槽の水を処理できるように設計されたものである。本組成物は、本発明の塩水ＮＯＢ株を複数含有してもよく、ここでこの菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のヌクレオチド配列を有する。１つの実施態様では、組成物は、本発明の塩水ＮＯＢ株を全て含んでおり、この場合、配列番号６、配列番号７及び配列番号８で表される菌株が組成物の大部分を占めている（ここで使用されている「大部分」という用語は少なくとも５０％を意味する）。
【００４１】
別の実施態様では、組成物は公共の水槽及び水産養殖施設を維持するために提供されており、本組成物は塩水ＡＯＢと共に本発明の塩水ＮＯＢを含む。１つの実施態様では、４０〜５０ｍＬ、好ましくは約４５ｍＬの本発明の濃塩水ＮＯＢと、１１８〜１２８ｍＬ、好ましくは約１２３ｍＬの濃塩水ＡＯＢとを混合する。この濃縮された混合物は、その後、脱塩素化された濾水で０．９〜１．１ガロン、好ましくは約1ガロン（３．７９Ｌ）に希釈される。この量は、２４１０〜２５１０ガロン、好ましくは約２４６０ガロンの水槽又は水産養殖施設の水を処理できるように設計されたものである。本組成物は、本発明の塩水ＮＯＢ株を複数含有してもよく、ここでこの菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のヌクレオチド配列を有する。１つの実施態様では、組成物は、本発明の塩水ＮＯＢ株を全て含んでおり、この場合、配列番号６、配列番号７及び配列番号８で表される菌株が組成物の大部分を占めている（ここで使用されている「大部分」という用語は少なくとも５０％を意味する）。
【００４２】
本発明はまた、亜硝酸塩を硝酸塩に酸化し得る濃縮された菌株を含む混合物を提供しており、この細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８のヌクレオチド配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８に対して少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似又は少なくとも９９％類似であるその変異体を有する。本発明の実施態様によれば、菌株は、この菌株が天然に存在する濃度よりも高い濃度で存在する場合、濃縮されているとみなされる。一般には、菌株の濃度は、適切なコントロール及び列挙法を用い、当業者に既知である蛍光in situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）技術を用いた分子プロービングのような標準的技術によって決定した場合、サンプル中の総細胞の少なくとも２０％である。さらに好ましくは、菌株の濃度は、総細胞の３３％以上、より好ましくは総細胞の４５％以上、そして最も好ましくは総細胞の９０％以上である。しかし、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のヌクレオチド配列を有する細菌の２つ以上を混合物中に有することが好ましい場合があり得る。この場合、上記のパーセンテージは、細胞集団のバランスがアンモニア酸化細菌又は他のタイプの細菌から構成され得るということを理解した上で、混合物中の総ＮＯＢのパーセンテージに関するものである。
【００４３】
詳細には、ただしいかなる理論によっても束縛されることは望まないが、本発明によって記載される種々の菌株のうち配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８で表される株は、塩水環境に特に耐性であると考えられる；とはいえ、これらの株は、淡水環境においても同様に利用することができ、かつその中で有効に機能すると考えられる。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表される株以外の菌株及び株を含む混合物はまた、適切な程度まで塩水環境に耐性であり得るが、本発明のさらに好ましい実施態様では、これは、亜硝酸塩を硝酸塩に酸化するために塩水環境に含まれる配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８によって表される株である。
【００４４】
さらに、本発明に関連して言及される菌株のいずれが凍結乾燥されてもよいが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表される株は、このような処理の後にそれらが生存可能なままである能力、及びこのような処理の後に亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する能力によって証明されるように、凍結乾燥処理に特に耐性であると考えられる。従って、本発明の実施態様では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８によって表される菌株は、凍結乾燥されてもよく、その後に塩水環境で亜硝酸塩を硝酸塩に酸化するために用いられてもよい。
【００４５】
別の実施態様では、本明細書で開示されている細菌又は菌株を凍結乾燥する方法が提供されている。本方法は、抗凍結剤と共に細菌又は菌株を処理し、それらをフリーザー中に置き、減圧下で細菌又は菌株を乾燥するという工程を含む。本発明の凍結乾燥法は、解凍後の、細菌又は菌株の生存能力及び亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する能力を維持しながら凍結乾燥形態で保存可能な凍結乾燥ＮＯＢを製造する。
【００４６】
複数の実施態様では、本発明の細菌及び菌株を凍結乾燥する方法は特別な凍結乾燥条件を含む。１つの実施態様では、本発明のＮＯＢ株を、３０ｐｐｔの塩濃度を含む媒体中で増殖させる。このＮＯＢをその後、抗凍結剤であるトレハロースで処理し、約５％トレハロース含有ＮＯＢ溶液になるよう、４０〜６０ｇのトレハロース、好ましくは約５０ｇのトレハロースと、９００〜１１００ｍＬ、好ましくは約１０００ｍＬのＮＯＢとを混合する。上記ＮＯＢ溶液は、処理工程前まで約４℃で保存しておき、それから、予め冷却しておいたトレイに移し、約−４０℃で約３時間凍らせる。その後、凍結溶液をドライヤー中に入れ、穏やかな昇華速度（mild primary sublimation rate）で約１２時間一次乾燥させ、約２７℃の最終温度で総乾燥時間が約３５時間になるようにさらに乾燥させる。別の実施態様では、凍結溶液をドライヤー中に入れ、急激な昇華速度（aggressive primary sublimation rate）で約２時間一次乾燥させ、約２７℃の最終温度で総乾燥時間が約２８時間になるようにさらに乾燥させるが、それ以外の凍結乾燥条件は同一である。
【００４７】
別の実施態様では、本発明のＮＯＢ株を、３０ｐｐｔの塩濃度を含む媒体で増殖させる。このＮＯＢをその後、抗凍結剤であるトレハロースで処理し、約１０％トレハロース含有ＮＯＢ溶液になるよう、９０〜１１０ｇのトレハロース、好ましくは約１００ｇのトレハロースと、９００〜１１００ｍＬ、好ましくは約１０００ｍＬのＮＯＢとを混合する。上記ＮＯＢ溶液は、処理工程前まで約４℃で保存しておき、それから、予め冷却しておいたトレイに移し、約−４０℃で約３時間凍らせる。その後、凍結溶液をドライヤー中に入れ、穏やかな昇華速度（mild primary sublimation rate）で約１２時間一次乾燥させ、約２７℃の最終温度でさらに乾燥させる。別の実施態様では、凍結溶液をドライヤー中に入れ、急激な昇華速度（aggressive primary sublimation rate）で約２時間一次乾燥させ、約２７℃の最終温度でさらに乾燥させるが、それ以外の凍結乾燥条件は同一である。
【００４８】
本発明の菌株、混合物及び組成物は、粉末形態、液体形態、凍結形態、凍結乾燥形態又はその他の適切な形態であってもよいことが理解され、それは当業者に容易に認識されよう。これらは一般的に「市販の添加物」と呼ばれ、以下が挙げられるがこれらに全く限定されない：
（１）細胞の生存能力が保存期間中に損なわれないように、無機塩又は有機化合物を含有する液体溶液中に１以上の株、混合物又は組成物が存在する、液体形態；
（２）細胞の溶解を防止するため任意選択で抗凍結化合物を含有する上記の液体混合物中に１以上の株、混合物又は組成物が存在し、これを凍結させ、３２°Ｆ以下の温度で凍結させて保存する、凍結形態；ならびに
（３）凍結乾燥又は他の方法で製造され、ここで１以上の株、混合物又は組成物の脱水形態が、通常の室温で生存能力を損なうことなく保存可能である、粉末形態。
【００４９】
本発明の菌株及び混合物を適当な形態で取得することは、本開示から考えると当業者が精通していることである。本発明の菌株及び混合物は、単独で使用されてもよく、又は他の成分と組み合わせて使用されてもよいことも理解される。このような成分の例としては、アンモニア酸化細菌、従属栄養亜硝酸酸化細菌、従属栄養アンモニア酸化細菌及び同種のものが挙げられるがこれらに限定されない。生物学的に純粋な菌株の全ての形態はまた、栄養分、アミノ酸、ビタミン、及び菌株の増殖を維持しかつ促進する働きをする他の化合物を含有してよい。本発明の菌株及び混合物及び組成物は、亜硝酸塩の蓄積を軽減するために、淡水水槽、塩水水槽及び廃水に使用され得る。これらはまた、亜硝酸塩により引き起こされる汚染レベルを低減するために、バイオレメディエーションプロセスに利用されてもよい。バイオレメディエーションプロセスは、バイオオーグメンテーションともいわれ、これには、元の系に存在する１以上の形態の化合物の変化を生じさせる、生物学的及び／又は化学的プロセスを促進又は確立するために、ある系（例えば、生物学的又は化学的な汚染の生じている場所）へ微生物を補足的に添加することが挙げられるが、これに限定されない。
【００５０】
従って、本発明の１つの局面は、媒体中の亜硝酸塩の蓄積を軽減する方法を提供することである。本方法は、媒体中の亜硝酸塩の蓄積を軽減するために、亜硝酸塩を硝酸塩へ酸化できる１以上の本発明の菌株を、この媒体に十分な量導入する工程を含み、ここで、この菌株（単数又は複数）の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８のヌクレオチド配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８に対して少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似又は少なくとも９９％類似であるその変異体を有する。添加した細菌が媒体中の亜硝酸塩の蓄積を軽減又は防止できる場合、この菌株（単数又は複数）の量は十分である。一般的に、本発明の１以上の菌株を淡水水槽又は塩水水槽へ添加することによって、最大亜硝酸塩濃度は、菌株（単数又は複数）の非存在下で到達するであろうレベルと比較して少なくとも５０％低下することが予想される。
【００５１】
本発明の別の実施態様では、媒体中の亜硝酸塩の蓄積を軽減する方法は、この目的のために、本明細書に開示されるような組成物の十分量を媒体に導入する工程を含む。この組成物は、亜硝酸塩を硝酸塩へ酸化できる１以上の本発明の菌株を含んでもよく、ここで、この菌株（単数又は複数）の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８のヌクレオチド配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８に対して少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似又は少なくとも９９％類似であるその変異体を有する。
【００５２】
様々な実施態様では、水性媒体を維持又は精製する方法が提供されており、本方法は、この目的のために、本明細書に開示されているような組成物の十分量をこの媒体に導入する工程を含む。上記組成物において、本発明の菌株は、水系に存在するアンモニアを亜硝酸塩に酸化し、亜硝酸塩を硝酸塩に酸化するようにアンモニア酸化細菌と組み合わされてもよい。別の例では、本発明の菌株を好気性又は嫌気性の脱窒細菌と混合してもよい。この場合、本発明の菌株と脱窒細菌との相互作用により生成される硝酸塩は、二窒素又は他の窒素をベースとする生成物に還元され得る。第３の例では、本発明の菌株と従属栄養細菌とを組み合わせてもよく、この従属栄養細菌は有機物質をより単純な無機物質に無機化し、それにより続いて、本発明の菌株がこれを基質として利用できる。
【００５３】
複数の実施態様では、水性媒体を維持又は精製する方法が提供されており、本方法は、亜硝酸酸化細菌及びアンモニア酸化細菌を含む組成物の十分量をこの媒体に導入する工程を含む。１つの実施態様では、家庭用水槽を維持する方法が提供されており、この方法は組成物の十分量を水槽へ導入する工程を含んでおり、上記組成物は、塩水ＡＯＢに加えて本発明の塩水ＮＯＢを含む。１つの実施態様では、組成物は、０．５〜１．５ｍＬ、好ましくは約１ｍＬの本発明の濃塩水ＮＯＢと、２．２５〜３．２５ｍＬ、好ましくは２．７５ｍＬの濃塩水ＡＯＢとを混合することによって形成されている。この濃縮された混合物は、その後、人工海水で２．５〜３．５液量オンス、好ましくは約３液量オンス（８８．７ｍＬ）に希釈される。この量は、５０〜６０ガロン、好ましくは約５５ガロンの水槽の水を処理できるように設計されたものである。本組成物は、本発明の塩水ＮＯＢ株を複数含有してもよく、ここでこの菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のヌクレオチド配列を有する。１つの実施態様では、組成物は、本発明の塩水ＮＯＢ株を全て含んでおり、この場合、配列番号６、配列番号７及び配列番号８で表される菌株が組成物の大部分を占めている（ここで使用されている「大部分」という用語は少なくとも５０％を意味する）。
【００５４】
別の実施態様では、公共の水槽及び水産養殖施設を維持する方法が提供されており、本方法は、組成物の十分量を水槽又は水産養殖施設に導入する工程を含み、上記組成物は塩水ＡＯＢと共に本発明の塩水ＮＯＢを含む。１つの実施態様では、組成物は、４０〜５０ｍＬ、好ましくは約４５ｍＬの本発明の濃塩水ＮＯＢと、１１８〜１２８ｍＬ、好ましくは約１２３ｍＬの濃塩水ＡＯＢとを混合することによって形成されている。この濃縮された混合物は、その後、脱塩素化された濾水で０．９〜１．１ガロン、好ましくは約1ガロン（３．７９Ｌ）に希釈される。この量は、２４１０〜２５１０ガロン、好ましくは約２４６０ガロンの水槽又は水産養殖施設の水を処理できるように設計されたものである。本組成物は、本発明の塩水ＮＯＢ株を複数含有してもよく、ここでこの菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のヌクレオチド配列を有する。１つの実施態様では、組成物は、本発明の塩水ＮＯＢ株を全て含んでおり、この場合、配列番号６、配列番号７及び配列番号８で表される菌株が組成物の大部分を占めている（ここで使用されている「大部分」という用語は少なくとも５０％を意味する）。
【００５５】
所定の設定で達成される実際のレベルは、系の大きさと内容（すなわち魚類、植物等の数）の関数であることが理解されよう。新規の設定では、１０匹の魚がいる３７リットルの水槽で、亜硝酸塩濃度は菌株の添加なしでは１４ｍｇ／Ｌ以上に達し得、これに対して１以上の菌株を添加することによって最大レベルを約５ｍｇ／Ｌまで低下させることができる。通常、１以上の本発明の菌株をこのような系へ添加する場合、最大亜硝酸塩濃度が３ｍｇ／Ｌを超えるとは予想されない。系が定常状態に達すると、亜硝酸塩のレベルは０．５ｍｇ／Ｌ未満まで戻り、１以上の本発明の菌株が存在すればこの過程はより急速になる。
【００５６】
本発明の１つの実施態様では、本発明の菌株及び組成物を、限定はしないが淡水水槽、海水水槽及び廃水のような媒体へ直接導入する。本発明の別の実施態様では、菌株及び組成物を回転生物接触器で増殖させて、その後、媒体へ導入してもよい。異なる実施態様では、本発明の菌株及び組成物は、媒体中に存在するバイオフィルターユニットに導入できる。別の実施態様では、本発明の菌株及び組成物を、限定はしないがアクリルアミド、アルギネート又はカラギナンのような固定化ポリマー中に固定してもよい。次いでこの細菌を固定したポリマー物質をフィルター中に導入してもよいし、又はそれ自体を適切な設備のフィルター流中に導入してもよい。
【００５７】
「水槽」という用語は、本明細書では、水を保持しかつその中で水生生物体（例えば魚類、植物、細菌及び無脊椎動物）が生存する容器であって、限定はしないがガラス、プラスチック若しくは木材を組み合わせて、又はそれ自体で製造され得る容器、並びにその内容物を意味する。水槽は、水生生物体の展示、短時間又は長時間の保持、科学的調査、輸送及び他の目的を意図してもよい。淡水水槽は一般的に、液体媒体が１０００分の１５部未満の塩濃度を有する水槽である。塩水水槽は一般的に、液体媒体が１０００分の１５部を超える塩濃度を有する水槽である。「水槽の水」という用語は、中に水槽生物体が生息している水槽及びそれに付随したフィルターシステム中に含まれる媒体を称するために使用される。水槽の水は広い範囲の無機又は有機化学物質を含有してよく、従って、例えば、塩濃度、ｐＨ、全溶解固体、及び温度などのパラメーターを広範囲に有してもよい。
【００５８】
本明細書では、「廃水」とは一般的に、工業的又は人為的プロセスの産物である液体媒体を意味する。廃水は環境に与える害を少なくするために１回以上の濾過法による処理を必要とするかもしれず、これによって政府機関が規定した廃棄規準を満たす必要があるかもしれない。廃水はまた、環境に廃棄されないようにリサイクルされてもよい。
【００５９】
本明細書では、「バイオフィルター」とも称される「生物学的フィルター」は、一般的に、その目的が微生物の増殖を促進することであるか、又は微生物の付着及び増殖のための基材を提供することであるようなタイプのフィルターを意味する。バイオフィルターは水槽の濾過システム又は廃水の濾過システムの一部であってよい。本明細書では、「回転生物接触器」という用語は、一般的に、水中又は媒体中で回転するある種のバイオフィルターを意味する。これは水中又は媒体中に完全に又は部分的に浸漬されてもよい。当業者は、あたかも完全に記載されているかのように本明細書において参照として各々が援用される、米国特許第２，０８５，２１７号；同第２，１７２，０６７号；同第５，４２３，９７８号；同第５，４１９，８３１号；同第５，６７９，２５３号；同第５，７７９，８８５号、並びに全ての継続出願、改良出願及び対応する外国出願において具現化されているものとして回転生物接触器を認識する。
【００６０】
本明細書では、「フィルターフロス」とは、バイオフィルター、メカニカルフィルター又はそれらの組み合わせ物として機能し得る、不規則な形状をした天然又は合成のマルチストランド物質（multi-stranded material）を意味する。
【００６１】
本明細書では、「水槽用砂利」とは、水槽の内部の底に通常敷かれている物質を意味する。それは、岩、サンゴ、プラスチック又は他の物質の不規則な又は規則的な形状の破片から構成されてもよい。それはバイオフィルター、メカニカルフィルターとして、装飾目的で、又はそれらの組み合わせとして機能し得る。
【００６２】
本明細書では、「フィルタースポンジ」という用語は、水槽中で使用されるか又は水槽濾過システムの一部として使用される場合に、メカニカルフィルター若しくはバイオフィルター、又はその両方として機能し得る天然又は合成の物質を意味する。
【００６３】
本明細書では、「プラスチックフィルター媒体」とは、バイオフィルター若しくはメカニカルフィルター、又はその両方として機能する人工の物質を意味する。これは成形又は射出成形されたプラスチックでもよい。
【００６４】
別の実施態様では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８のヌクレオチド配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８に対して少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似又は少なくとも９９％類似であるその変異体を有する核酸配列及び配列を有する細菌も提供される。
【００６５】
別の実施態様では、媒体に存在する本発明の細菌の量を検出及び測定するためのオリゴヌクレオチドプローブが提供される。このプローブは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１８に記載されるヌクレオチド配列を有する。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは当該技術で公知の方法によって合成され得る。
【００６６】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、検出可能な任意の標識で標識され得る。好適な標識の例としては、放射性標識、蛍光標識などが挙げられるがこれらに限定されない。好適な標識物質は市販されており、当業者に既知である。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの標識法はまた、当業者に既知である（例えば、Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. Molecular Cloning-A Laboratory Manual, second edition, 1989, Cold Spring Harbor Press参照）。
【００６７】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、本発明の菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡとハイブリダイズし得る。従って、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、本発明の細菌の量を検出及び決定するための方法における使用に十分適している。
【００６８】
本発明の１つの局面では、媒体中で亜硝酸塩を硝酸塩へ酸化できる細菌の量を検出及び決定するための方法が提供されるが、ここでこの細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のヌクレオチド配列を有する。この方法は以下の工程を含み得る：
（ａ）配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１８に記載されるヌクレオチド配列を有する、本発明の検出可能に標識されたプローブを準備する工程；
（ｂ）媒体から総ＤＮＡを単離する工程；
（ｃ）プローブがこの細菌の核酸とのみハイブリダイズする条件下で、単離した総ＤＮＡを検出可能に標識されたプローブに対して曝露する工程（ここで、この細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のヌクレオチド配列を有する）；
（ｄ）細菌の量を検出及び測定するためにハイブリダイズしたプローブを検出及び測定する工程。
【００６９】
本発明のプローブは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１８によって表される。上述のプローブのいずれかの全長にわたって少なくとも９６％類似である配列を用いて、本発明の細菌を検出することもできる。これらのプローブは以下の実施例にさらに記載される。
【００７０】
媒体は水槽水であってよく、この場合そこからＤＮＡを単離する。媒体はまた、例えば、水槽用砂利、スポンジフィルター物質、フィルターフロス、又はプラスチックフィルター媒体などの物質を含んでもよいが、これに限定されるものではない。従って、ＤＮＡは、そのような細菌が存在すると予想され得る上記の供給源及び他の供給源から単離され得る。
【００７１】
本発明の方法は、ＤＮＡチップ又は当業者に既知の同様のツールと組み合わせて行なうことができる。ＤＮＡチップは、固体キャリア、及び共有結合によってこの固体キャリアに固定されたヌクレオチド誘導体又はそれらのアナログの群を含んでもよい。ＤＮＡチップを用いた核酸フラグメントの検出は一般に、検出されるべき核酸フラグメントに相補的なプローブオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーションによって行なわれる。このプローブオリゴヌクレオチドは一般にこの固体キャリア（例えば固体基材）上に固定される。この検出過程では、サンプル液中の核酸フラグメントは、蛍光標識又はラジオアイソトープ標識を備えてもよく、次いでサンプル液はＤＮＡチップのプローブオリゴヌクレオチドと接触されてもよい。サンプル液中のこの標識された核酸フラグメントがプローブオリゴヌクレオチドに対して相補的である場合、この標識された核酸フラグメントは、ハイブリダイゼーションによって上記プローブオリゴヌクレオチドと結合される。次いで、このプローブオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップに固定された上記の標識された核酸フラグメントは、適切な検出方法によって、例えば、フルオロメトリー（蛍光光度法）又はオートラジオグラフィーによって、検出され得るが、他の検出方法が利用されてもよい。
【００７２】
この方法は代替的には、当業者によって容易に認識され、慣用的な実験によって行なわれる広範な自動化されたプロセスと組み合わせて行なわれてもよい。例えば、本発明の方法は、いくつかの一般的な手順である、ＤＮＡ若しくはタンパク質のマイクロアレイ、バイオセンサー、バイオプローブ、キャピラリー電気泳動及びリアルタイムＰＣＲで行なうことができる；しかしこの列挙が全てを包括するわけではないということは当業者によって容易に理解されよう。
【００７３】
本発明の検出方法は、媒体中で亜硝酸塩を硝酸塩に酸化し得る細菌の存在をモニター及び検出するための有効なツールを提供する。この方法はまた、本発明の細菌の存在又は量を測定することにより、市販の添加物を確認して、この添加物の有効性を判断するためのツールを提供する。
【００７４】
別の実施態様では、本発明の細菌及び核酸配列を検出するために使用され得るＰＣＲプライマーが提供される。このプライマー対は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２によって表される。上述のＰＣＲプライマーのいずれかの全長にわたって少なくとも９６％類似である配列を使用して、本発明の細菌を検出することもできる。これらのＰＣＲプライマーは以下の例においてさらに記載されている。
【００７５】
本発明の細菌及び核酸配列を検出するために用いられ得る上述のオリゴヌクレオチドプローブ及びＰＣＲプライマーの変異体は、本発明の範囲内であることが当業者には容易に理解される。例えば、１つ以上のヌクレオチド付加、欠損又は置換に起因して配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２とは異なる任意のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの変異体は、本発明の細菌及び核酸配列を検出するために依然として用いることができ、本発明に包含される。
【００７６】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８として本明細書において同定される配列、又はそれらの配列の変異体を含む、単離された細菌、単離された菌株、細菌培養物及びヌクレオチド配列を含む。特に好ましい変異体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に対して高い程度の類似性を有する変異体である。本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に対して少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似又は少なくとも９９％類似である変異体を含む。参照配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８）の作製法及び使用法の開示は、当業者に対して上述の変異体の作製法及び使用法を教示するのに十分であるということが当該分野では理解される。
【００７７】
亜硝酸酸化細菌、この細菌の使用方法及び検出用法を記載する３つの同一出願人による特許が米国で発行されている（米国特許第６，２０７，４４０号、同第６，２６５，２０６号及び同第６，２６８，１５４号参照）。３つ全ての特許が、あるヌクレオチド配列及びその配列に対して９６．１％を超える相同性を有する任意の変異体を記載している。これらの特許の発行により、特定の配列を示し特定の変異体を記載する明細書によって、当業者がこの配列及びその記載された変異体を作製及び使用できるようになるということが実証される。さらに、ヌクレオチド配列を開示する特許はまた、それらの配列の変異体を開示し且つ特許請求することが当該分野では一般的である（例えば、米国特許第６，４６５，６２１号、同第６，５０９，１７０号及び同第６，５７３，０６６号参照）。
【００７８】
特定のヌクレオチド配列の変異体は、天然に存在する多型性の配列変異、又は合成の配列変異であってもよい（例えば、米国特許第６，４８５，９３８号参照）。天然及び合成の両方のヌクレオチド配列に対する非常に多様な修飾は、合成変異体を作製するための方法とともに当分野で一般的かつ周知である（例えば、米国特許第６，４４８，０４４号及び同第６，５０９，１７０号参照）。２つ以上のヌクレオチド配列の類似性を比較するための方法は当分野で周知である。類似した配列はしばしばＢＥＳＴＦＩＴ及びＢＬＡＳＴなどのコンピュータープログラムを使用して同定される（例えば、米国特許第６，４６１，８３６号参照）。さらに、ハイブリダイゼーションを用いて、変異体配列と参照配列との間の類似性を検出してもよい（例えば、米国特許第６，５７３，０６６号参照）。従って、当業者は、既知の技術を用いることによって、参照配列の変異体であるヌクレオチド配列を容易に合成及び同定することができる。それ故、ヌクレオチド配列及びその変異体を記載する明細書によって、当業者はその配列及びその変異体を作製及び使用することが可能になる。
【００７９】
［実施例］
一連のアッセイ及び実験を、本明細書において報告する菌株を単離し、同定し、かつその菌株の有効性を示すために実施した。それらは、様々な細菌培養技術、培養のサンプルから抽出したＤＮＡの分子生物学的分析、菌株の分子生物学的分析、並びに液体形態及び凍結乾燥形態である菌株の濃縮培養物を水槽へ適用することによって亜硝酸塩濃度を調整する能力を測定することを含む。
【００８０】
［実施例１］
細菌培養
細菌培養容器（リアクターと称する）を構築して、使用中の水槽から収集した細菌バイオマスを播種した。各リアクターに、ＫＨ２ＰＯ４ ５０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ５０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １８．７５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １．２５ｇ及びＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇを含有する無機塩溶液（蒸留水中で製造する）を４．９５Ｌ入れた。溶存酸素が７．５ｍｇ／Ｌ以上になるように空気を供給し、攪拌しながら、このリアクターを約２８℃の暗いキャビネット中に放置した。
【００８１】
塩水環境における本発明のＮＯＢ株を単離及び培養するために、２８〜３３ｐｐｔの塩濃度になるまで、合成の海塩（INSTANT OCEAN, Aquarium Systems Inc., Mentor, OH）を添加した。
【００８２】
アンモニア及び亜硝酸塩濃度を、電極（Denver Instruments Model 225 pH/ISE meter及び付属のpH/ATC電極）を用いてｐＨを測定しながら、フローインジェクション分析（FIA, Tecator FIASTAR 5010 system）を用いて毎日測定した。塩濃度は、ＹＳＩ Ｍｏｄｅｌ ３０ 塩濃度，温度，伝導度プローブを用いて測定した。硝酸塩を定期的に測定し、いつ水の交換をすべきかを決定する際にこのデータを使用した。細菌バイオマスは本質的にまさに綿状であるので、水の交換中もリアクターに保持された。従って、適当なサンプリングポートを介してリアクターの容積の５０％をデカントする前に、空気を送る装置及び攪拌装置を１時間停止することにより、バイオマスを沈殿させた。さらに、リアクターを定期的にこすって表面からバイオマスを取り除き、それによってバイオマスを懸濁液に戻した。ＤＮＡ抽出（ＰＣＲ用）及び細胞固定（ＦＩＳＨ用）のために、微生物サンプルを定期的に回収しさらに分析した。
【００８３】
［実施例２］
核酸のサンプリング及び抽出
ＤＮＡ抽出のために、適当な生物学的濾過媒体のサンプルを回収し、細胞溶解バッファー（４０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）中に再懸濁した。サンプルを、抽出を行うまで−２０℃又は−７４℃で保存した。処理に際し、最終濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるようにリゾチームをサンプルへ添加した。３７℃で９０分間インキュベートした後、２０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度が１％になるように添加した。次いでこのサンプルを４回の凍結／解凍サイクルに供して、それに続いてプロテイナーゼＫ（保存濃度、１０ｍｇ／ｍｌ）を最終濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、７０℃で３５分間インキュベートした。場合によっては、プロテイナーゼＫ及びＳＤＳを追加して添加し、サンプルを５５℃でさらに３０分間インキュベートした。
【００８４】
細胞溶解後に、Ｅａｓｙ ＤＮＡ抽出キット（Qiagen Inc., Santa Clarita, CA；本明細書ではこれ以降「Qiagen」と記す）を用いてＤＮＡを抽出した。ＤＮＡを５０μｌ容積に溶出し、Ｈｏｅｃｈｓｔタイプ３３２５８ 染料結合及びフルオロメトリー（DYNAQUANT 200, Hoefer Pharmacia Biotech Inc., San Francisco, CA）により定量した。
【００８５】
［実施例３］
ＰＣＲ増幅ｒＲＮＡ遺伝子のクローンライブラリー
クローンライブラリーは、リアクター及び水槽から回収したバイオマスサンプルからのＤＮＡ抽出物に由来する。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８という配列によって表される細菌由来の細菌リボソームＲＮＡ遺伝子フラグメントを、プライマー Ｓ−Ｄ−Ｂａｃｔ−００１１−ａ−Ｓ−１７（８ｆ；ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ＣＴＣ ＡＧ）（配列番号９）及び１４９２ｒ（真正細菌；ＧＧＴ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ Ｔ）（配列番号１０）を用いて増幅した。ＰＣＲ条件、サイクルパラメーター、及び反応成分はこれまでの記載に従った（DeLong, E. F. 1992. Archaea in coastal marine environments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5685-5689.）。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により評価した。ＴＥバッファーでリンスし、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ濃縮装置（Amicon, Inc. Beverly, MA）で３０μｌまで濃縮した後、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて、製造業者の指示書に記載のとおり、ＰＣＲフラグメントをクローニングした。
【００８６】
［実施例４］
配列解析及び系統発生解析
クローンライブラリーを含む各クローン由来の１６Ｓ ｒＤＮＡ挿入物を、制限酵素ＨａｅIIIを用いた制限酵素分析（ＲＥＡ）によりスクリーニングし、１６Ｓ ｒＤＮＡ挿入物が増幅可能であることを確認し、１６Ｓ ｒＤＮＡが、ＨａｅIII酵素で切断される場合にユニークなＲＥＡパターンを保有するかどうかを決定した。クローンが増幅可能で、ユニークなＲＥＡパターンを有する場合は、その後、目的の１６Ｓ ｒＤＮＡ挿入物を含むクローンのプラスミドを部分的に配列決定した。配列決定のために選択された、各クローンのＰＣＲ増幅１６Ｓ ｒＤＮＡテンプレートを、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット カタログ番号２８１４２（Qiagen）を用いて精製した。蛍光標識プライマー及びＳＥＱＵＩＴＨＥＲＭ ＥＸＣＥＬ II ＤＮＡ シークエンシングキット（Epicentre Technologies, Madison, WI）を用いてサイクルシークエンスしたテンプレートを、ＬＩＣＯＲ ４０００Ｌ自動ＤＮＡシークエンサーにより配列決定した。
【００８７】
同一のＲＥＡパターンである２又は３種までのクローンを部分的に配列決定し、それらが同一であることを確認した。多くのクローンを完全に配列決定して、ＰＡＵＰ（Phylogenetic Analysis Using Parsimony ver 4.0b2a, D. L. Swofford）（ブートストラップ値及び距離分析）、ＡＲＢ（A Software Environment for Sequence Date, W. Ludwig and O. Strunk）（系統樹）及びＰｈｙｌｉｐ（Phylogeny Inference Package J. Felsentein）（類型マトリックス）により系統発生解析を行った。クローンライブラリーに由来する目的のクローンのためのプライマー及びプローブの開発には、ＡＲＢプローブ設計及びＡＲＢプローブマッチプログラム並びにアフターマニュアルアラインメント（after manual alignment）を使用した。プライマー及びプローブをＢＬＡＳＴ（S. F. Altschul et al. 1990. Basic local alignment tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410）を使用して再確認した。プライマーの特異性は、プライマーをクローン及び公知の細菌の純粋培養物由来のＤＮＡ抽出物に用いることによって決定した。プローブの特異性は、プローブを公知の細菌の純粋培養物及びリアクター由来のサンプルに用いて検証した。
【００８８】
［実施例５］
ＤＧＧＥ解析及びプロファイリング
一般的な真正細菌ＤＧＧＥ解析のため、Ｍｕｒｒａｙらが記載するように（A. Murray et al. 1996. Phylogenetic compositions of bacterioplankton from two California estuaries compared by denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rDNA fragments. Appl. Environ. Microbiol. 62: 2676-2680）、５’末端に４０ｂｐのＧＣクランプを有するフォワード３５８ｆ（真正細菌；ＣＣＴ ＡＣＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＧＣ ＡＧ）（配列番号１１）及びリバースプライマーＳ−＊−Ｕｎｉｖ−０５１９−ａ−Ａ−１８（５１９ｒ：ＧＷＡ ＴＴＡ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＫＧ ＣＴＧ）（配列番号１２）を用いてｒＤＮＡフラグメントを増幅した。特異的なＮＯＢ ＤＧＧＥ解析のために、５’末端に４０ｂｐのＧＣクランプを有するフォワードプライマー３５８ｆ（配列番号１１）をリバースプライマーＮＳＰ６８５（ＮＳＰ６８５：ＣＡＣ ＣＧＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＣ ＧＣＴ ＣＣＴ Ｃ）（配列番号１３）とともに使用した。ＰＣＲ条件は同一であり、ＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ ＧＲＡＤＩＥＮＴ ９６（Stratagene, La Jolla, CA）を使用し、ＴＡＱ ＰＣＲコアキット（Qiagen）を用いて実施した。ＰＣＲ条件には、ホットスタート（８０℃）手順及びタッチダウン手順を含めた。最初の変性を９４℃で３分間実施した後、それに続いて９４℃で１分間変性し、タッチダウンアニーリングを６５℃から５５℃で１分２９秒間実施し（タッチダウン中、１サイクル毎に１．４秒間ずつアニーリング時間を延長した）、プライマー伸長を７２℃で５６秒間実施した（サイクル毎に１．４秒間ずつ伸長時間を延長する）。上記の熱サイクルの最後の温度系列を全部で２０サイクル繰り返し、それに続いて７２℃で５分間、最後の伸長を行った。単位複製配列をアガロースゲル電気泳動により検討した。
【００８９】
ＤＧＧＥをＢｉｏ−Ｒａｄ Ｄ−ＧＥＮＥ Ｓｙｓｔｅｍ（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA；本明細書において以降では「Bio-Rad」と記す）を用いて行なった。ゲルは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ試薬（D GENE Electrophoresis Reagent Kit, Bio-Rad）を用いた８．５％のアクリルアミド／ビスアクリルアミドであった。２５〜５５％の変性勾配（１００％の変性は４０％の脱イオン化ホルムアミドと７Ｍ 尿素との混合物である）を有するＢｉｏ−Ｒａｄ試薬（D GENE Electrophoresis Reagent Kit, Bio-Rad）及びＢｉｏ−Ｒａｄ勾配送達システム（Model 475, Bio-Rad）を特記のない限り用いて、ゲル勾配をかけた。全てのゲルを２００ボルトで６時間泳動した。書類作成目的で、いくつかのゲルをＶｉｓｔｒａ Ｇｒｅｅｎ（１：１０，０００希釈）（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA；本明細書において以降では「Molecular Dynamics」と記す）で２０分間染色し、それに続いて１×ＴＡＥバッファーで２０分間洗浄し、次いでＦＬＵＯＲＩＭＡＧＥＲ ＳＩ（Molecular Dynamics）を用いてスキャンした。
【００９０】
個々のバンドをアルコール滅菌したメスを用いてＤＧＧＥゲルから切り出した。ゲルからのＤＮＡの抽出にはＦｅｒｒｉｓらの方法に従った（M. J. Ferris et al. 1996. Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA-defined population inhabiting a hot spring microbial mat community. Appl. Environ. Microbiol. 62: 340-346.）。切り出したバンドを５００μｌの滅菌脱イオン水の入った２ｍｌの滅菌スクリューキャップチューブに入れた。このチューブの半分をガラスビーズ（カタログ番号１１０７９−１０１、Biospec Products Inc., Bartlesville, OK；本明細書において以降では「Biospec」と記す）で満たし、最も高い設定で３分間、機械的なビーズビーター（ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲ−８，Biospec）に入れた。処理したＤＮＡを４℃で一晩チューブ中に放置した。一晩放置した後、このチューブを３，２００×ｇ、４℃で８分間遠心分離し、ゲルフラグメントを濃縮した。上清を清潔なエッペンドルフチューブに移した。
【００９１】
抽出効率を確認するために、この上清を時々ＤＧＧＥプライマーで再増幅し、ＤＧＧＥによって再解析した。混合した集団サンプル中で元のＤＧＧＥバンドと同時に移動する単一バンドがＤＧＧＥ解析で生じた場合に、抽出は許容可能レベルであると考えた。切り出したバンドのヌクレオチド配列を、蛍光標識プライマー用いて、先に記載した方法に従い配列決定した。
【００９２】
［実施例６］
オリゴヌクレオチドプローブの開発
蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、本研究におけるリアクター由来の近縁の細菌から単離された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と特異的にハイブリダイズするように設計した。第１のプローブである、ＳＮＯＢＴＰ（ＧＴＴ ＧＣＣ ＣＣＧ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＧＴ ＴＣ）（配列番号１４）は、配列番号１及び配列番号２の配列によって表される他の亜硝酸酸化細菌（Nitrococcus様細菌）でもなく、Nitrobacter winogradskyiによって代表されるProteobacteria亜硝酸酸化細菌のα亜門でもない、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の配列によって表される、本研究で発見された全てのNitrospira様細菌を標的としている。このプローブは、蛍光色素であるＣｙ−３又はフルオレセイン−ＯＮ（Qiagen Inc., USA）のいずれかと、２０％のホルムアミドとともに、成功裏に使用されている。
【００９３】
第２のプローブである、ＮＳＰ６８５（ＣＡＣ ＣＧＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＣ ＧＣＴ ＣＣＴ Ｃ）（配列番号１５）は、配列番号３、配列番号４及び配列番号５の配列によって表されるNitrospira様細菌の特定の系統（クレード１と称される）を標的とするために使用され得る。プローブＮＳＰ６８５（配列番号１５）は、蛍光色素であるＣｙ−３で標識されており、ハイブリダイゼーションを行っている間に、さらに２つのプローブがこの反応に追加して添加される。追加して添加されるこれらの２つのプローブは、フルオレセイン−ＯＮ（Qiagen Inc., USA）で標識されたＳＮＴＳＰ２（ＣＡＣ ＣＧＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＣ ＡＣＴ ＣＣＴ Ｃ）（配列番号１６）及びフルオレセイン−ＯＮで標識されたＥＵＢＡＣ３３８（ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＣＣ ＣＧＴ ＡＧＧ ＡＧＴ）（配列番号１７）である。ホルムアミドの割合は、５５％である。この場合、Nitrospira様亜硝酸酸化細菌のクレード１のみが、顕微鏡の視野内で見ることのできる生物体となる。
【００９４】
第３のプローブは、プローブを組み合わせるものであり、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の配列によって表されるNitrospira様細菌の別の特定の系統（クレード２と称される）を標的とするために使用され得る。これには、フルオレセイン−ＯＮで標識されたプローブＳＮＴＳＰ２（配列番号１６）と以下に挙げる２つの別のプローブとを組み合わせたものが使用される：Ｃｙ−３で標識されたＮＳＰ６８５（配列番号１５）及び同じくＣｙ−３で標識されたＥＵＢＡＣ３３８（配列番号１７）。ホルムアミドの割合は、５５％である。この場合、Nitrospira様亜硝酸酸化細菌のクレード２のみが、顕微鏡の視野内で見ることのできる生物体となる。
【００９５】
第４のプローブである、ＭＯＢＰ（ＣＴＣ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＴＴ ＴＣＣ ＧＡＡ）（配列番号１８）は、全てのNitrospira様亜硝酸酸化生物体でもなく、Nitrobacter winogradskyiによって代表されるProteobacteria亜硝酸酸化生物体のα亜門でもない、配列番号１及び配列番号２によって表されるNitrococcus様亜硝酸酸化生物体を標的としている。このプローブを用いる場合、ホルムアミドの割合は２０％であり、用いた染料はＣｙ−３である。
【００９６】
プローブのマッチングをＢＬＡＳＴ（S. F. Altschul et al. 1990. Basic local alignment tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410）及びＣＨＥＣＫ＿ＰＲＯＢＥ（B. L. Maidak et al. 1994. The ribosomal database project. Nucleic Acids Res. 22: 3485-3487.）を用いて初めにスクリーニングした。プローブは、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Alameda, CA）により合成された。プローブのヌクレオチド配列を表９に示す。
【００９７】
【表９】
2007510402.tif 000013
【００９８】
リアクターバイオマスを本明細書の細菌配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８）のポジティブコントロールとして使用した、異なるホルムアミド濃度での一連のＦＩＳＨ実験によって、プローブ（配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１８）のストリンジェンシーを判断した。固定し動かなくした細胞のin situハイブリダイゼーションを、０．９Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２５ｎｇ オリゴヌクレオチドプローブ及び各種量のホルムアミドから構成されるハイブリダイゼーション溶液中で行なった。スライドを、平衡化した湿度チャンバー内に置き、４６℃で、９０〜１２０分間インキュベートした。ハイブリダイゼーション溶液を予め加熱（４８℃）した洗浄溶液で洗い流した。次いで、スライドを洗浄溶液中でインキュベートした（４８℃、１５分間）。洗浄工程の間、ハイブリダイゼーション工程と同様のストリンジェンシーを得るために、洗浄溶液には２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０１％ ＳＤＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ及びＮａＣｌを含有させた。ＮａＣｌの濃度は、溶液で使用するホルムアルデヒドの割合に応じて変化させた。２０％ホルムアルデヒドの場合、ＮａＣｌ濃度は２１５ｍＭであり、３０％では１２０ｍＭであり、４０％ではＮａＣｌ濃度は４６ｍＭであった。細胞は、ＦＩＴＣ／ＦＬＵＯ３及びＨＱ ＣＹ３のフィルターセットを装備したＡＸＩＯＳＫＯＰ ２エピ蛍光顕微鏡（Carl Zeiss, Jena, Germany）を用いて検出した。最適のストリンジェンシーは、ＳＮＯＢＴＰプローブ（配列番号１４）については２０％ホルムアミドであると判断された。３種類の標識がされたプローブを使用する際に用いられるＮＳＰ６８５及びＳＮＴＳＰ２プローブ（それぞれ配列番号１５及び配列番号１６）については、最適のストリンジェンシーはそれぞれ５５％ホルムアミドであると判断された。最適のストリンジェンシーは、配列番号１８によって表されるＭＯＢＰプローブについては２０％ホルムアミドであると判断された。
【００９９】
［実施例７］
ＰＣＲプライマーの開発
本発明の配列を有するNitrospira様細菌を特異的に検出する１セットのＰＣＲプライマー（配列番号１９及び配列番号２０）を開発した（表９）。本発明の配列を有するNitrococcus様細菌を特異的に検出する第２の１セットのＰＣＲプライマー（配列番号２１及び配列番号２２）を開発した（表９）。第１のセット（配列番号１９及び配列番号２０）は、他の亜硝酸酸化細菌ではなく、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８に記載されている１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有するNitrospira様細菌を特異的に検出する（表１０）。第２のセット（配列番号２１及び配列番号２２）は、他の亜硝酸酸化細菌ではなく、配列番号１及び配列番号２に記載されている１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有するNitrococcus様細菌を特異的に検出する（表１０）。ＰＣＲ条件は、アニーリング温度を表１０に記載したとおりに変更した以外、前述の実施例５の条件と同一であった。
【０１００】
【表１０】
2007510402.tif 000014
【０１０１】
各々のプライマーセットの特異性は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲの温度勾配モードを使用し、各プライマーセットを用いたＰＣＲ実験に供することにより最適化された。このモードでは、最大１２の異なるアニーリング温度を用いた全ての反応を１回の実験で実施できる。主として、２℃ずつの間隔で上昇させた４〜６の異なる温度で実験を行なった。各ＰＣＲプライマーセットを、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のヌクレオチド配列を有するクローン生成物に対して試験した。表９にＰＣＲプライマーセットを提示しており、最適のアニーリング温度の結果を表１０に示す。
【０１０２】
［実施例８］
類似性分析
亜硝酸塩から硝酸塩への酸化を担う亜硝酸酸化生物体（単数又は複数）の同一性を決定するために、塩水の硝化バイオマスから３つのクローンライブラリーを構築した。このバイオマスの詳細を表１１に表す。
【０１０３】
【表１１】
2007510402.tif 000015
【０１０４】
このクローンライブラリーデータによって、試験したアンモニア供給リアクターに存在する２群の亜硝酸酸化細菌の存在が示される。亜硝酸酸化細菌の２つのタイプとは、Nitrospira様生物体及びNitrococcus様微生物である（表１２）。しかし、３つの全てのクローンライブラリーから見出されているのはNitrospira様ＮＯＢのみである。Nitrospira様ＮＯＢとして同定されたクローンの割合は、スクリーニングされた総クローンに対して３．１１％から３３．３３％であった。Nitrococcus様ＮＯＢは３つのクローンライブラリーのうち２つで見出され、その割合は、スクリーニングされた総クローンに対して２．５６％及び８．７０％であった（表１２）。
【０１０５】
【表１２】
2007510402.tif 000016
【０１０６】
本明細書に記載されている８種のクローン配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８）について、ＲＤＰを使用し、類似性のランク付けを行った（Maidak, B. L., J. R. Cole, C. T. Parker, Jr, G. M. Garrity, N. Larsen, B. Li, T. G. Lilburn, M. J. McCaughey, G. J. Olsen, R. Overbeek, S. Pramanik, T. M. Schmidt, J. M. Tiedje and C. R. Woese. A new version of the RDP (Ribosomal Database Project). Nucleic Acids Res. 27: 171-173(1999)）（表１３）。
【０１０７】
【表１３】
2007510402.tif 000017
【０１０８】
類似性分析により、Nitrococcus mobilisに対して９８．９％類似である１群のクローン（配列番号１及び配列番号２によって表される）が明らかとなった（表１３）。
【０１０９】
類似性分析により、本発明のNitrospira様ＮＯＢ（配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表される）は２つの系統に大別されることが明らかとなった。クレード１には、配列番号３、配列番号４及び配列番号５によって表されるＮＯＢが含まれる。クレード１の中でも、配列番号３及び配列番号４によって表されるＮＯＢは、Nitrospira marinaに対して９９．２％類似であり、配列番号５によって表されるＮＯＢは、Nitrospira marinaに対して９８．７％類似である。クレード２には、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表されるＮＯＢが含まれる。クレード２の中でも、配列番号６によって表されるＮＯＢは、Nitrospira marinaに対して９２．２％類似であり、配列番号７によって表されるＮＯＢは、Nitrospira marinaに対して９１．６％類似であり、配列番号８によって表されるＮＯＢは、Nitrospira marinaに対して９４．０％類似である。
【０１１０】
近隣結合距離分析及びブートストラップ分析を用いて系統樹を構築することによる配列の系統発生解析により、類似性分析の結果が支持される（図１）。系統発生解析の結果、配列番号１及び配列番号２は互いに類似しており、その近縁種はNitrococcus mobilisである可能性が非常に高いことが示される。しかし、この結果はまた、配列番号１及び配列番号２がNitrococcus mobilisそのものではないことも実証している。
【０１１１】
系統発生解析の結果はまた、公知のNitrospira細菌とは異なる塩水Nitrospira様ＮＯＢの２つの別々のクレードがあるという結論を支持している（図１）。配列番号３、配列番号４及び配列番号５によって表されるクレード１は、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表されるクレード２とは明らかに異なっている。塩水Nitrospira様ＮＯＢのクレード１の近縁種は、Nitrospira marinaである。
【０１１２】
例として、塩水Nitrospira様ＮＯＢのクレード２（配列番号６、配列番号７及び配列番号８）は、細菌の少なくとも１の新種であることに疑う余地はない。類似性分析により、それらの近縁種（Nitrospira marina）との類似性は高くても９４％（配列番号８の場合）であることが示されている。系統発生解析により、これらの３つの配列は、公知の全てのNitrospira細菌とは明らかに異なっていることが示されている（図１）。ＢＬＡＳＴ分析により、これらの配列と最も近縁なデータベース内の細菌はNitrospira marinaであることが示されているが、Nitrospira marinaの配列は、類似性分析及び系統発生解析によって実証されているように、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表される配列とは明らかに異なっている。
【０１１３】
表１３に示した類似性のランク付けは、菌株の特異性を決定するのに役立つ。どの程度で新種とみなすかについて、厳格な規則はない。しかし、例えば、アンモニア酸化細菌であるNitrosolobus multiformis及びNitrosovibrio tenuisは０．９８９の類似性ランクを有するが、あらゆる微生物の権威から異種であると認識されており、Nitrosolobus multiformis及びNitrosospira briensis（類似性ランク０．９８０）も同様である。配列番号３及び配列番号４によって表される菌株は、Nitrospira marinaと比較した場合、０．９９２の類似性ランクを有する。この類似性ランクは、上述した類似性ランク０．９８９よりもわずかに高いが、配列番号３及び配列番号４は、Nitrospira marinaとは十分に異なっており、新規かつユニークな種を構成する。
【０１１４】
従って、クローンデータ、ＰＣＲの結果、系統発生解析、ＤＧＧＥデータ及び類似性のランク付けという全体から、本明細書で報告される菌株がユニークなものであり、公知の亜硝酸酸化細菌とは異なることが実証される。
【０１１５】
［実施例９］
細菌の分析及び実験結果
Nitrospira様ＮＯＢのクローンメンバーが、３つの塩水濃縮物の全てから見出され、クローンライブラリーが構築された（表１２）。Nitrospira様ＮＯＢは、同定された総クローンのかなりの部分を占めており、その割合は、総クローンに対して３％強（ＳＢ７）から３３％を超えるものである。
【０１１６】
Nitrococcus様ＮＯＢは、３つのクローンライブラリーのうち２つでのみ見出されており（表１２）、Nitrospira様ＮＯＢに比べて数が少なかった。サンプルＢ７で同定されたNitrococcus様ＮＯＢは、総クローンに対して３％未満であり、一方、サンプルＳＢ７で同定されたNitrococcus様ＮＯＢの割合は１４％であった。サンプルＰ４では、Nitrococcus様ＮＯＢは見出されなかった（表１２）。
【０１１７】
［実施例１０］
クローン及びリアクターの変性勾配ゲル電気泳動調査
本明細書で報告される各種の菌株の新規性は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）試験の結果によりさらに実証される。図２に、以下のサンプルのＤＤＧＥ結果をしめす：アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌の濃縮物、Nitrococcus様ＮＯＢ（配列番号１及び配列番号２）の代表となるクローン、並びにNitrospira様ＮＯＢのクレード１（配列番号３、配列番号４及び配列番号５）及びクレード２（配列番号６、配列番号７及び配列番号８）両方の代表となる各クローン。この結果により、配列番号１と配列番号２（Nitrococcus様ＮＯＢ）との間で、ゲルの泳動距離がわずかに異なることが示される。Nitrospira様ＮＯＢのクレード２である３つのクローン（配列番号６、配列番号７及び配列番号８）のバンドの位置もまた異なっているが、それらの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列にはわずかな差異が見られるので（表６〜８）、これは予期されたことである。さらに、図２中に示される４つの濃縮物のバンド位置を比較した場合（レーンＥ，Ｆ、Ｇ及びＨ）、これらの濃縮物のゲルのバンドが、配列番号１（Nitrococcus様ＮＯＢ）又は配列番号７（Nitrospira様ＮＯＢ）のバンドと同一の泳動距離を示すかどうかを識別するのは困難である。
【０１１８】
従って、第２のタイプのＤＧＧＥ分析を実施した。このＤＧＧＥ分析では、標準的な２５〜５５％の変性勾配を、３０〜６０％の変性勾配へと変化させ、このゲルを２００ボルトで３６０分間泳動した。図３に、以下のサンプルのバンド移動パターンを示す：配列番号１、配列番号２（共にNitrococcus様ＮＯＢ）及び配列番号７（Nitrospira様ＮＯＢ）の単独の各クローン、ＮＯＢ濃縮物（レーンＡ）、並びに配列番号１、配列番号２及び配列番号７の標準的な各クローンを含む１組の混合物。この結果により、第２のタイプのＤＧＧＥを用いて、これらの３つのクローンのバンドが明らかに分離されたことが示される。さらに、濃縮物中の（レーンＡ）２つのバンドを前述したように切り出し、処理し、配列を決定した。我々の方法及び結果の有効性をさらに確認するために、上部のバンドはクローンＳＢ７ｃ３２（配列番号１）のバンドと同一の位置にあり、下部のバンドはクローンＢ７ｃ１０（配列番号７）のバンドと同一の位置にある。
【０１１９】
図４は別のＤＤＧＥ分析結果を表しており、図２と同様の濃縮サンプルを示しているが、ゲルの条件を変えたことによって（上記参照）、さらに大きな分解能である。この結果は、環境中に存在するサンプルのNitrospira様ＮＯＢとNitrococcus様ＮＯＢ（レーンＧ〜Ｋ）とを区別できることを明らかに示している。
【０１２０】
［実施例１１］
細菌添加試験
一連の実験を行って、本発明の菌株を含有する種々の細菌混合物の有効性を、１）混合物を供給されなかったコントロールの水槽、２）熱帯魚水槽用に細菌混合物を接種した水槽、及び３）保持又は保存された本発明の菌株の細菌混合物：と比較して決定した。
【０１２１】
本発明の亜硝酸酸化菌株が水槽の亜硝酸を酸化すること、及びさらに、他の菌株（例えば、アンモニア酸化細菌）と組み合わせた場合にこの細菌が水槽での硝化の確立を促進することが示されることにより、混合物の効果が実証される。硝化の確立は少なくとも３つの異なる方法で測定され得る。第１の方法は、新しい水槽を設置した後、水槽水のアンモニア及び亜硝酸塩の濃度がほぼ０ｍｇ／Ｌ濃度に到達するまでにかかる日数を計測するものである。新規に設置した塩水水槽においては概して、アンモニア濃度が０ｍｇ／Ｌに達するには約１４日を要し、亜硝酸塩が０ｍｇ／Ｌに達するには約３０〜３５日を要す。
【０１２２】
水槽へ添加した硝化菌株の有益な作用を測定する第２の方法は、０ｍｇ／Ｌまで濃度が低下する前に達するアンモニア又は亜硝酸塩の最大濃度を比較するものである。硝化細菌を添加した水槽で達するアンモニア又は亜硝酸塩の最大濃度が、コントロール水槽で達する最大濃度よりもかなり低いものならば、ある程度の有効性が実証される。
【０１２３】
［実施例１２］
細菌添加試験
この試験の目的は、「現実世界」の設定で行われ得るように、亜硝酸塩を硝酸塩へ酸化する本発明ＮＯＢ株の各種混合物の能力を評価することであった。本発明の混合物の能力を、淡水水槽又は塩水水槽のいずれかにおける使用に適切であると主張する市販の細菌混合物と比較した。
【０１２４】
この試験のために、１５個の１０ガロン水槽及び１５個のＰｅｎｇｕｉｎ １７０Ｂ（Marineland Aquarium Products）ハングオンザバック（hang-on-the-back）形式のパワーフィルターを滅菌し、十分に洗浄し、空気乾燥させた。翌日、１０ ｌｂｓ．の洗浄したＴｉｄｅｌｉｎｅ Ｃｒｕｓｈｅｄ Ｃｏｒａｌ ＃５を各々のタンクに充填し、滅菌したパワーフィルター（ＰＦ ０１７０Ｂ）及び洗浄したカーボンカートリッジを取り付けた。各タンクに３５Ｌの人工海水を満たした。この海水は、塩濃度が３０ｐｐｔとなるように、Ｔｒｏｐｉｃ Ｍａｒｉｎｅ塩混合物とポストＧＡＣ水（post GAC water）とを組み合わせたものであった。細菌添加物及び魚類を添加する前にフィルターを一晩稼動させた。
【０１２５】
水サンプルの採取及び蒸発を補填するために、翌朝、各タンクを超純水で一杯まで満たした。各タンクに１つの細菌学的処理を施したが、コントロール群には細菌混合物を添加しなかった。
【０１２６】
この試験には以下の４種類の処理を用いた：配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８によって表される本発明の全てのNitrospira様ＮＯＢ株をともに含む、リアクター２１及びリアクター２９、ＣＹＣＬＥ（淡水又は塩水用の市販の細菌混合物）；並びにＳＴＲＥＳＳ ＺＹＭＥ（淡水又は塩水用の別の市販の細菌混合物）。各処理は３つの複製を有した。リアクター２１及びリアクター２９の処理を導入する水槽には、試験初日に１００ｍｌのいずれかの混合物を１回投与した。ＣＹＣＬＥ又はＳＴＲＥＳＳ ＺＹＭＥの処理を導入する水槽には、試験初日に、１０ｍｌのいずれかの処理を投与し、試験７日目にさらに１０ｍｌ投与し、その後、試験期間中７日毎にさらに５ｍｌ投与した。試験初日に、４匹の種々雑多なスズメダイ科の魚（ダムゼル）（Pomacentrus spp.）を各タンクへ添加し、１日に２回給餌した。
【０１２７】
毎日水サンプルを回収し、ｐＨ、アンモニア、亜硝酸塩及び伝導率を分析した。月曜日、水曜日及び金曜日に、水を硝酸塩及び濁度について試験した。ｐＨの測定は、Ｄｅｎｖｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ｐＨ組み合わせ電極を装備したＤｅｎｖｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｍｏｄｅｌ ２２５ ｐＨ／Ｉｏｎメーターを用いて行った。Ｔｅｃａｔｏｒ ＦＩＡＳＴＡＲ ５０１０ Ａｎａｌｙｚｅｒを用い、Ｔｅｃａｔｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅｓに記載の方法に従って、アンモニア、亜硝酸塩及び硝酸塩（すなわち窒素）を測定した。ＹＳＩ Ｍｏｄｅｌ ３０携帯型の塩濃度、伝導率及び温度システムを用いて、毎日、各タンクにおける塩濃度を直接測定した。濁度のデータは、ＤＲＴ−１００濁度メーター（HF Scientific）を用いて決定した。
【０１２８】
４種類の処理及びコントロールについての平均亜硝酸塩濃度を図５に示す。配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表されるＮＯＢ株を含む、リアクター２１及びリアクター２９の処理は、他の処理よりも非常に急速に亜硝酸塩を酸化した。リアクター処理を導入した場合の亜硝酸塩濃度は、他の処理を用いた場合よりも、すぐにピークに達し０ｍｇ／Ｌまで低下した（図５）。リアクター２１は２１日目に０ｍｇ／Ｌに達し、リアクター２９は２９日目に０ｍｇ／Ｌに達したが、コントロール及び市販の添加物は３７日目以降まで０ｍｇ／Ｌに達しなかった（図５）。
【０１２９】
この結果は、以下を実証している：１）本発明のＮＯＢ株は、新規に設置された塩水水槽において、亜硝酸塩酸化を加速する、２）ＮＯＢであるNitrobacter winogradskyiを含むとされる市販の添加物は、新規の海水水槽の開始時に亜硝酸を制御することに対して有効ではない。
【０１３０】
［実施例１３］
細菌添加試験
この試験の目的は、「現実世界」の設定で行われ得るように、亜硝酸塩を硝酸塩へ酸化する本発明ＮＯＢ株の各種混合物の能力を評価することであった。リアクターＳＢ７（本発明のNitrospira様ＮＯＢ株及びNitrococcus様ＮＯＢ株をともに含む）由来の物質を水槽に導入し、この系の能力を、細菌接種されていない水槽と比較した。
【０１３１】
この試験のために、８個の１０ガロン水槽及び８個のＰｅｎｇｕｉｎ １７０Ｂ（Marineland Aquarium Products）ハングオンザバック形式のパワーフィルターを滅菌し、十分に洗浄し、空気乾燥させた。翌日、１０ ｌｂｓ．の洗浄したＴｉｄｅｌｉｎｅ Ｃｒｕｓｈｅｄ Ｃｏｒａｌ ＃５を各々のタンクに充填し、滅菌したパワーフィルター（ＰＦ ０１７０Ｂ）及び洗浄したカーボンカートリッジを取り付けた。各タンクに３５Ｌの人工海水を満たした。塩濃度が３０ｐｐｔになるまで、カーボン濾過した水道水にＩＮＳＴＡＮＴ ＯＣＥＡＮ ＳｅａＳａｌｔｓ（Aquarium Systems, Mentor, Ohio）を添加することによって人工的な海水を作製した。水槽にこの海水を充填し、細菌添加物及び魚類を添加する前にフィルターを一晩稼動させた。
【０１３２】
水サンプルの採取及び蒸発を補填するために、翌朝、各タンクを超純水で満たした。その後、４つのタンクに１５０ｍＬのＳＢ７リアクター細菌混合物を投与した。別の４つのタンクには細菌混合物を投与しなかった。ＳＢ７リアクター混合物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表される、本発明のNitrococcus様ＮＯＢ株及びNitrospira様ＮＯＢ株から構成された。試験初日に、６匹のカクレクマノミ（Amphiprion ocellaris）を各タンクへ添加し、１日に２回給餌した。この魚の餌は、凍結ブラインシュリンプとSpirulina魚用フレークとの混合物であった。試験の３日目に、４匹のさらなるカクレクマノミ（Amphiprion ocellaris）を各水槽に添加した。
【０１３３】
毎日水サンプルを回収し、ｐＨ、アンモニア、亜硝酸塩及び伝導率について試験した。月曜日、水曜日及び金曜日に、水を硝酸塩及び濁度について試験した。ｐＨの測定を、Ｄｅｎｖｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ｐＨ組み合わせ電極を装備したＤｅｎｖｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｍｏｄｅｌ ２２５ ｐＨ／Ｉｏｎメーターを用いて行った。Ｔｅｃａｔｏｒ ＦＩＡＳＴＡＲ ５０１０ Ａｎａｌｙｚｅｒを用い、Ｔｅｃａｔｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅｓに記載の方法に従って、アンモニア、亜硝酸塩及び硝酸塩（すなわち窒素）を測定した。ＹＳＩ Ｍｏｄｅｌ ３０携帯型の塩濃度、伝導率及び温度システムを用いて、毎日、各タンクにおける塩濃度を直接測定した。濁度のデータは、ＤＲＴ−１００濁度メーター（HF Scientific）を用いて決定した。
【０１３４】
ＳＢ７処理及びコントロールについての平均亜硝酸塩濃度を図６に示す。ＳＢ７処理は、コントロールよりも顕著に急速に亜硝酸塩を酸化した。ＳＢ７処理されたタンクの平均亜硝酸塩濃度は、２４日目に０ｍｇ／Ｌに達したが、コントロール水槽では、亜硝酸塩値が同じレベルである０ｍｇ／Ｌに達するまでに３８日を要した。さらに、ＳＢ７処理の平均最大亜硝酸塩濃度（約２．４ｍｇ／Ｌ−Ｎ）は、コントロール処理の平均最大亜硝酸塩濃度（７．２ｍｇ／Ｌ−Ｎ）よりも有意に低かった（図６）。
【０１３５】
この結果によって、本発明のＮＯＢ株が、新規に設置された海水水槽において亜硝酸塩酸化を加速すること、及びこの期間において毒性濃度を下回る亜硝酸塩を保持することに対して有効であると実証された。
【０１３６】
［実施例１４］
細菌添加試験
この試験の目的は、５．５ヶ月間保存されていた、凍結乾燥した塩水亜硝酸酸化細菌の生存能力を評価することであった。この試験の目的はまた、本明細書に記載されている、水性媒体を維持するための各種組成物の有効性を試験することでもあった。
【０１３７】
方法：細菌の準備
６００ＬのリアクターＳＢ１由来のＮＯＢと、６００ＬのリアクターＳＢ２由来のＮＯＢとを混合し、Ｈａｒｖｅｓｔ Ｏｎｌｙ Ｔａｎｋ（ＨＯＴ）中に一晩沈殿させた。リアクターＳＢ１及びリアクターＳＢ２ともに、本発明のＮＯＢ株（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表される）を全て含んでおり、両方とも、３０ｐｐｔの塩濃度で維持された。翌日、できるだけ多量の上清をタンクから除去した。２回目の濃縮は、再びできるだけ多量の上清を除去するまで、より小さな容器で実施された。残った細菌を回収し、５Ｌの容器に入れ、４〜５時間沈殿させた。再び、できるだけ多量の上清を除去し、この溶液を２部に分けた。この時点で、抗凍結剤である各種量のトレハロースを、細菌溶液に添加した。１つの溶液には、５％トレハロース溶液となるように、５０ｇのトレハロースを１０００ｍＬのＮＯＢと混合し、もう１つの溶液には、１０％トレハロース溶液となるように、１００ｇのトレハロースを１０００ｍＬのＮＯＢと混合した（表１４）。２つの塩水リアクター由来のＡＯＢを凍結乾燥するために、同様に準備した。さらに処理する前に、サンプルを４℃で保存した。余剰量のＮＯＢ及びＡＯＢをポジティブコントロールとして用いるために、抗凍結剤を混合せず４℃で保存した。
【０１３８】
【表１４】
2007510402.tif 000018
【０１３９】
凍結乾燥に関して、一次乾燥における２つの昇華速度（ＰＳＲ；primary sublimation rate）（穏やかな速度及び急激な速度）を試験するために、サンプルを分割した。全てのサンプルを予め冷却しておいたトレイに移し、フリーザー中に放置した。このフリーザーは−４０℃に冷却されていた。サンプルを３時間凍結させ、次いでドライヤー中に置いた。サンプルを、穏やかな又は急激なＰＳＲで乾燥させた。凍結乾燥処理に供したこのサンプルを、凍結乾燥形態で５．５ヶ月間、４℃で保存した。
【０１４０】
試験設定：２８個の５ガロン水槽及びフィルターをＳａｎａｑｕａで滅菌し、洗浄し、空気乾燥させた。水槽を、新たに準備した１９Ｌの人工海水（塩濃度が２９ｐｐｔになるように、ポストＧＡＣ水にＩＮＳＴＡＮＴ ＯＣＥＡＮ ＳｅａＳａｌｔｓを溶解することで作製した）で満たした。洗浄したてのカーボンカートリッジ及び新しいＢＩＯＷＨＥＥＬを装備したＰｅｎｇｕｉｎ １２５パワーフィルターを各水槽に取り付け、プラグで接続し、一晩稼動させた。Ａｃｃｅｓｓ Ｔｅｓｔ Ｄａｔａｂａｓｅを用いて、それぞれ４つの複製で構成される特定の処理を、不規則に水槽に導入した（表１５）。
【０１４１】
【表１５】
2007510402.tif 000019
【０１４２】
試験開始時に、蒸発による水損失を補うために水槽を脱イオン水で満たし、ベースラインのサンプルを採取した。細菌を午前１１：００に添加し、第２のベースラインサンプル採取前に、３０分間循環させたままにした。午後１２：３０に、９匹のドミノダムゼルを各水槽に入れた。毎朝、水槽を脱イオン水で満たし、その後サンプルを採取した。
【０１４３】
毎日、ｐＨ、アンモニア、亜硝酸塩及び濁度についてサンプルを分析した。試験の間中、硝酸塩を断続的に測定した。Ｆｏｓｓ ＦＩＡＳＴＡＲ ５０００を用い、Ｆｏｓｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅｓに記載の方法に従って、アンモニア及び亜硝酸塩を測定した。Ｔｅｃａｔｏｒ ＦＩＡＳＴＡＲ ５０１０を用い、Ｔｅｃａｔｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅｓに記載の方法に従って、硝酸塩（すなわち窒素として）を測定した。濁度のデータは、ＨＦ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｉｃｒｏ １００濁度メーターを用いて決定した。
【０１４４】
結果：表１６に、それぞれの凍結乾燥処理に供し凍結乾燥した、細菌とトレハロースとの混合物の初めの湿重量、及び凍結乾燥後の乾燥重量の収量を示す。
【０１４５】
【表１６】
2007510402.tif 000020
【０１４６】
凍結乾燥工程の間、以下に留意した：穏やかなＰＳＲの場合、最終温度を２７℃とし、約３５時間乾燥させた。急激なＰＳＲの場合、最終温度を２７℃とし、約２８時間乾燥させた。ＮＯＢはＡＯＢよりも急速に乾燥した。１０％トレハロース溶液は、乾燥物上に、薄い糖質の層として残った。内部で沸騰が起こらないように注意した。
【０１４７】
図７には、本試験の各種処理における平均アンモニア値（Ｎ＝４）を示す。ネガティブコントロール（細菌を添加していない）は、アンモニア濃度が０ｍｇ／Ｌに達するのに２０日を要した。この処理でのアンモニアは７日目にほぼ７ｍｇ／Ｌの値でピークに達した。これらの値とは対照的に、添加される硝化細菌が液体形態（ポジティブコントロール）であるか凍結乾燥形態であるかにかかわらず、それら全ての処理でのアンモニア濃度は、顕著に急速に０ｍｇ／Ｌに達した（図７）。
【０１４８】
凍結乾燥処理に対する平均アンモニア濃度値は、ポジティブコントロール濃度値とネガティブコントロール濃度値との間であった（図７）。概して、凍結乾燥処理を受けた水槽では、最大アンモニア濃度が約４〜６ｍｇ／Ｌに達し、１０日目〜１３日目に０ｍｇ／Ｌに達した。
【０１４９】
この試験の各種の処理における平均亜硝酸塩濃度を図８に示す。これらの結果は、アンモニアのデータから得られた結果を反映している。ポジティブコントロールであるか凍結乾燥されているかに関わらず、細菌接種を受けた水槽は全て、接種を受けていないネガティブコントロールよりも顕著に急速に硝化作用を示した（図８）。
【０１５０】
アンモニア及び亜硝酸塩の消失が、これらの化合物の硝酸塩への酸化に起因することを図９は裏付ける。時間とともに、全ての処理で硝酸塩濃度の上昇が起こったことをこの図は明らかに示している。ポジティブコントロール処理では、試験開始後ほぼすぐに、硝酸塩の生成を開始した。凍結乾燥処理では、約１０〜１５日目までに硝酸塩の生成を開始した。このことから、細菌接種されていない水槽と比較して、本発明の菌株が接種された水槽ではより急速に硝化が確立されたことが裏付けられる。
【０１５１】
本試験の結果は以下を実証している：本発明菌株の凍結乾燥処理工程は、凍結乾燥形態で長期保存した後も、それら菌株の生存能力を維持し、かつ亜硝酸を硝酸塩に酸化する能力を維持する。本試験の結果はまた、以下も実証している：本発明菌株の液体処理工程及び凍結乾燥処理工程は、新規に設置された水槽において、細菌接種されていない水槽よりも急速に硝化を確立できる。本試験の結果はまた、以下も実証している：本明細書に記載されている、水性媒体を維持するための組成物は、この水性媒体において、アンモニアを亜硝酸に酸化し、亜硝酸塩を硝酸塩に酸化することができる。
【０１５２】
［実施例１５］
細菌添加試験
この試験の目的は、１１ヶ月間保存されていた、凍結乾燥した塩水亜硝酸酸化細菌の生存能力を評価し、水性媒体における亜硝酸塩濃度を減少させる目的で亜硝酸酸化細菌の最適な投与を決定することであった。この試験の目的はまた、本明細書に記載されている、水性媒体を維持するための各種組成物の有効性を試験することでもあった。
【０１５３】
方法：細菌の準備
６００ＬのリアクターＳＢ１由来のＮＯＢと、６００ＬのリアクターＳＢ２由来のＮＯＢとを混合し、Ｈａｒｖｅｓｔ Ｏｎｌｙ Ｔａｎｋ（ＨＯＴ）中に一晩沈殿させた。リアクターＳＢ１及びリアクターＳＢ２ともに、本発明のＮＯＢ株（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表される）を全て含んでおり、両方とも、３０ｐｐｔの塩濃度で維持された。翌日、できるだけ多量の上清をタンクから除去した。２回目の濃縮は、再びできるだけ多量の上清を除去するまで、より小さな容器で実施された。残った細菌を回収し、５Ｌの容器に入れ、４〜５時間沈殿させた。再び、できるだけ多量の上清を除去し、この溶液を２部に分けた。この時点で、抗凍結剤である各種量のトレハロースを、細菌溶液に添加した。１つの溶液には、５％トレハロース溶液となるように、５０ｇのトレハロースを１０００ｍＬのＮＯＢと混合し、もう１つの溶液には、１０％トレハロース溶液となるように、１００ｇのトレハロースを１０００ｍＬのＮＯＢと混合した（表１７）。２つの塩水リアクター由来のＡＯＢを凍結乾燥するために、同様に準備した。さらに処理する前に、サンプルを４℃で保存した。余剰量のＮＯＢ及びＡＯＢをポジティブコントロールとして用いるために、抗凍結剤を混合せず４℃で保存した。
【０１５４】
【表１７】
2007510402.tif 000021
【０１５５】
凍結乾燥に関して、一次乾燥における２つの昇華速度（ＰＳＲ；primary sublimation rate）（穏やかな速度及び急激な速度）で試験するために、サンプルを分割した。全てのサンプルを予め冷却しておいたトレイに移し、フリーザー中に放置した。このフリーザーは−４０℃に冷却されていた。サンプルを３時間凍結させ、次いでドライヤー中に置いた。サンプルを、穏やかな又は急激なＰＳＲで乾燥させた。凍結乾燥処理に供したこのサンプルを、凍結乾燥形態で１１ヶ月間、４℃で保存した。
【０１５６】
比較試験のために、２Ｌの新鮮細胞を両方の塩水ＮＯＢリアクター（ＳＢ１及びＳＢ２）から採取し、５Ｌの新鮮細胞を２つの塩水ＡＯＢリアクターから採取した。ＮＯＢを別々に組み合わせ、放置することで一晩沈殿させた。翌日、上清を取り除き、残った細菌の濃度を決定するためにＩｍｈｏｆｆ沈殿コーン中に置いた。この濃度に基づき、高用量の濃度（表１８）になるように、新たに作製した塩水（塩濃度が２８ｐｐｔになるように、脱イオン水にＩＮＳＴＡＮＴ ＯＣＥＡＮ ＳｅａＳａｌｔｓを混合することで作製した）で希釈した。本試験で使用する中用量及び低用量を得るために、塩水を用いて高用量ストックを段階希釈した（表１８）。
【０１５７】
試験設定：３２個の１０ガロン水槽及びフィルターをＳａｎａｑｕａで滅菌し、洗浄し、空気乾燥させた。水槽を、新たに準備した３７Ｌの人工海水（塩濃度が２９ｐｐｔになるように、ポストＧＡＣ水にＩＮＳＴＡＮＴ ＯＣＥＡＮ ＳｅａＳａｌｔｓを溶解することで作製した）で満たした。洗浄し立てのカーボンカートリッジ及び新しいＢＩＯＷＨＥＥＬを装備したＰｅｎｇｕｉｎ １２５パワーフィルターを各水槽に取り付け、プラグで接続し、一晩稼動させた。Ａｃｃｅｓｓ Ｔｅｓｔ Ｄａｔａｂａｓｅを用いて、それぞれ４つの複製で構成される特定の処理を、不規則に水槽に導入した（表１８）。
【０１５８】
【表１８】
2007510402.tif 000022
【０１５９】
試験開始時に、蒸発による水損失を補うために水槽を脱イオン水で満たし、ベースラインのサンプルを採取した。細菌を午前１０：００に添加し、第２のベースラインサンプル採取前に、３０分間循環させたままにした。毎朝、水槽を脱イオン水で満たし、その後サンプルを採取した。魚の排泄物をシミュレートするために、サンプル採取後、毎日水槽にアンモニア（０．５ｍｇ／Ｌ）を手作業で添加した。
【０１６０】
毎日、ｐＨ、アンモニア、亜硝酸塩及び濁度についてサンプルを分析した。試験の間中、硝酸塩を断続的に測定した。Ｆｏｓｓ ＦＩＡＳＴＡＲ ５０００を用い、Ｆｏｓｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅｓに記載の方法に従って、アンモニア及び亜硝酸塩を測定した。Ｔｅｃａｔｏｒ ＦＩＡＳＴＡＲ ５０１０を用い、Ｔｅｃａｔｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅｓに記載の方法に従って、硝酸塩（すなわち窒素）を測定した。濁度のデータは、ＨＦ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｉｃｒｏ １００濁度メーターを用いて決定した。
【０１６１】
結果：表１９に、それぞれの凍結乾燥処理に供し凍結乾燥した、細菌とトレハロースとの混合物の初めの湿重量、及び凍結乾燥後の乾燥重量の収量を示す。
【０１６２】
【表１９】
2007510402.tif 000023
【０１６３】
凍結乾燥工程の間、以下に留意した：穏やかなＰＳＲの場合、最終温度を２７℃とし、約３５時間乾燥させた。急激なＰＳＲの場合、最終温度を２７℃とし、約２８時間乾燥させた。ＮＯＢはＡＯＢよりも急速に乾燥した。１０％トレハロース溶液は、乾燥物上に、薄い糖質の層として残った。内部で沸騰が起こらないように注意した。
【０１６４】
図１０には、本試験の各種処理における平均アンモニア値（Ｎ＝４）を示す。コントロール（細菌を添加していない）は、アンモニア濃度が０ｍｇ／Ｌに達するのに２０日を要した。この処理でのアンモニアは１２日目にほぼ７ｍｇ／Ｌの値でピークに達した。これらの値とは対照的に、添加される硝化細菌が液体形態であるか凍結乾燥形態であるかにかかわらず、それら全ての処理でのアンモニア濃度は、顕著に急速に０ｍｇ／Ｌに達した（図１０）。
【０１６５】
液体形態では、高用量が急速な硝化を確立する明らかな傾向があった。高容量処理における平均アンモニア値は０．３ｍｇ／Ｌを超えることがなく、水槽は、４日目までにＮＨ３−Ｎが０ｍｇ／Ｌに達した。中用量処理では、平均アンモニア濃度が約１ｍｇ／Ｌの最大値に達し、５日目までに０ｍｇ／Ｌに達した（図１０）。低用量処理では、平均アンモニア濃度が１．５ｍｇ／Ｌの最大値に達し、６日目までに０ｍｇ／Ｌに達した。
【０１６６】
凍結乾燥処理に対する平均アンモニア濃度の値は、互いに非常に近く、かつ液体処理濃度値とコントロール処理濃度値との間であった（図１０）。概して、凍結乾燥処理を受けた水槽では、最大アンモニア濃度が約４ｍｇ／Ｌに達し、１０日目〜１２日目に０ｍｇ／Ｌに達した。
【０１６７】
この試験の各種の処理における平均亜硝酸塩濃度を図１１に示す。これらの結果は、アンモニアのデータから得られた結果を反映している。細菌接種されていない水槽は、ＮＯ２−Ｎの最大濃度がほぼ２６ｍｇ／Ｌに達した後、ＮＯ２−Ｎが０ｍｇ／Ｌに達するまで、平均して５０日を超える日数を要した。液体であるか凍結乾燥されているかに関わらず、細菌接種を受けた水槽は全て、接種を受けていないネガティブコントロールよりも顕著に急速に硝化作用を示した（図１１）。
【０１６８】
アンモニア及び亜硝酸塩の消失が、これらの化合物の硝酸塩への酸化に起因することを図１２は裏付ける。時間とともに、全ての処理で硝酸塩濃度の上昇が起こったことをこの図は明らかに示している。液体処理では、試験開始後ほぼすぐに、硝酸塩の生成を開始した。凍結乾燥処理では、約１７日目までに硝酸塩の生成を開始したのに対し、細菌接種されていない水槽では、約４０日目まで硝酸塩の生成が開始されなかった。このことから、細菌接種されていない水槽と比較して、本発明の菌株が接種された水槽ではより急速に硝化が確立されたことが裏付けられる。
【０１６９】
本試験の結果は以下を実証している：本発明菌株の凍結乾燥処理工程は、凍結乾燥形態で長期保存した後も、それら菌株の生存能力を維持し、かつ亜硝酸を硝酸塩に酸化する能力を維持する。本試験の結果はまた、以下も実証している：本発明菌株の液体処理工程及び凍結乾燥処理工程は、新規に設定された水槽において、細菌接種されていない水槽よりも急速に硝化を確立できる。本試験の結果はまた、以下も実証している：本明細書に記載されている、水性媒体を維持するための組成物は、この水性媒体において、アンモニアを亜硝酸に酸化し、亜硝酸塩を硝酸塩に酸化することができる。
【０１７０】
［実施例１６］
細菌添加試験
この試験の目的は、５ヶ月間保存されていた、凍結した塩水亜硝酸酸化細菌の生存能力を評価し、かつ異なる温度で１４ヶ月間、液体形態で保存されていた細菌の生存能力を評価することであった。この試験の目的はまた、本明細書に記載されている、水性媒体を維持するための各種組成物の有効性を試験することでもあった。
【０１７１】
方法：細菌の準備
リアクターＳＢ１及びＳＢ２由来の塩水ＮＯＢを本試験のために集菌した。リアクターＳＢ１及びリアクターＳＢ２ともに、本発明のＮＯＢ株（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表される）を全て含んでおり、両方とも、３０ｐｐｔの塩濃度で維持された。２つの塩水リアクター由来のＡＯＢも本試験のために集菌した。ＡＯＢ及びＮＯＢの３種類のストック溶液を、０％、５％及び１０％のトレハロースを抗凍結剤として各々含むように作製した。サンプルを４℃で１時間放置し、その後−８０℃で７２時間放置した。最後に、サンプルを３つに分け、異なる以下の３種類の保存温度で放置した：−１５℃、−２０℃及び−８０℃。このサンプルは、これらの温度で５ヶ月間保存された。
【０１７２】
約１１ヶ月前に、リアクターＳＢ１及びＳＢ２由来のＮＯＢ、並びにＡＯＢリアクター由来のＡＯＢを３種類の異なる温度で保存した：４℃、室温及び３７℃。これらの液体サンプルを１４ヶ月間保存した。保存期間が終わる時、各保存条件で異なる細胞密度となった。従って、各サンプルが等量の細胞を含むように希釈した（表２０）。最後に、細菌添加５１試験の直前に、リアクターＳＢ１及びＳＢ２、並びにＡＯＢリアクター由来の細菌サンプルを集菌することによって、ＮＯＢ及びＡＯＢのポジティブコントロールを選択した。
【０１７３】
【表２０】
2007510402.tif 000024
【０１７４】
試験設定：３６個の５ガロン水槽及びフィルターをＳａｎａｑｕａで滅菌し、洗浄し、空気乾燥させた。水槽を、新たに準備した１９Ｌの人工海水（塩濃度が３０ｐｐｔになるように、ポストＧＡＣ水にＩＮＳＴＡＮＴ ＯＣＥＡＮ ＳｅａＳａｌｔｓを溶解することで作製した）で満たした。洗浄したてのカーボンカートリッジ及び新しいＢＩＯＷＨＥＥＬを装備したＰｅｎｇｕｉｎ １７０パワーフィルターを各水槽に取り付け、プラグで接続し、一晩稼動させた。Ａｃｃｅｓｓ Ｔｅｓｔ Ｄａｔａｂａｓｅを用いて、それぞれ４つの複製で構成される特別な処理を、不規則に水槽に導入した（表２１）。この試験の処理条件は、細菌の保存条件のより大きな群から選択され（各種濃度のトレハロースとともに、−８０℃、−２０℃及び−１５℃で凍結した凍結細菌、並びに４℃、室温及び３７℃の液体細菌）、これは、各種の保存された凍結細菌及び液体細菌で実施された初めの生存能力試験に基づいている。
【０１７５】
【表２１】
2007510402.tif 000025
【０１７６】
試験開始時に、蒸発による水損失を補うために水槽を脱イオン水で満たし、ベースラインのサンプルを採取した。細菌を添加し、第２のベースラインサンプル採取前に、３０分間循環させたままにした。毎朝、水槽を脱イオン水で満たし、その後サンプルを採取した。魚の排泄物をシミュレートするために、サンプル採取後、毎日水槽にアンモニア（０．５ｍｇ／Ｌ）を手作業で添加した。
【０１７７】
毎日、ｐＨ、アンモニア、亜硝酸塩及び濁度についてサンプルを分析した。試験の間中、硝酸塩を間隔をおいて測定した。Ｆｏｓｓ ＦＩＡＳＴＡＲ ５０００を用い、Ｆｏｓｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅｓに記載の方法に従って、アンモニア及び亜硝酸塩を測定した。Ｔｅｃａｔｏｒ ＦＩＡＳＴＡＲ ５０１０を用い、Ｔｅｃａｔｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅｓに記載の方法に従って、硝酸塩（すなわち窒素）を測定した。濁度のデータは、ＨＦ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｉｃｒｏ １００濁度メーターを用いて決定した。
【０１７８】
図１３には、本試験の各種処理における平均アンモニア値（Ｎ＝４）を示す。ネガティブコントロール（細菌を添加していない）は、アンモニア濃度が０ｍｇ／Ｌに達するのに２５日を要した。この処理でのアンモニアは１４日目にほぼ７ｍｇ／Ｌの値でピークに達した。これらの値とは対照的に、凍結処理を受けるか液体処理を受けるかに関わらず、それら全ての実験水槽において、アンモニア濃度は、顕著に急速に０ｍｇ／Ｌに達した（図１３）。
【０１７９】
図１４には、本試験の各種処理における平均亜硝酸塩値（Ｎ＝４）を示す。ネガティブコントロールの水槽及び３７℃で保存された液体細菌処理を導入された水槽では、亜硝酸塩レベルの上昇がみられ、そのレベルは３０日目を過ぎても減少しなかった。これらの値とは対照的に、凍結処理を受けるか液体処理を受けるかに関わらず、残りの実験水槽では、亜硝酸塩濃度の減少がみられた（図１４）。
【０１８０】
図１５には、本試験の各種処理における平均硝酸塩値（Ｎ＝４）を示す。試験の間、全ての水槽で、硝酸塩濃度のいくらかの上昇がみられた。３７℃で保存された液体細胞を除いて、凍結処理及び液体処理を導入された全ての水槽で、硝酸塩濃度の一貫して上昇する傾向がみられた。
【０１８１】
この試験の結果により以下が実証される：本発明ＮＯＢの凍結処理は、５ヶ月間凍結保存した後も、亜硝酸塩から硝酸塩へと酸化する能力を維持する。この試験の結果はまた、以下も実証している：本発明ＮＯＢの最適な凍結保存温度は−８０℃であるが、−２０℃及び−１５℃もまた有効な温度である。
【０１８２】
上記の説明は、本発明の特定の実施形態に言及しているが、本発明の趣旨から逸脱することなく多数の変異がなされ得るということが当業者には容易に明らかであるはずである。添付の特許請求の範囲は、このような変異があたかも本発明の趣旨及び範囲内におさまるとして包含することを意図する。従って、本明細書に開示された実施形態は、あらゆる点で例示的なものであり、制限しないものとして解釈され、本発明の範囲は、前述の詳細な説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の意義及びその等価な範囲内にある全ての変異は、本明細書に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】図１は、本発明の実施態様による１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の比較分析から推測される８種の菌株（すなわち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表される菌株）の系統的関係を図示する。この系統樹は、最低１４４５ヌクレオチドを含む配列の近隣結合距離分析に基づく。
【図２】図２は、本発明の実施態様による、選択された濃縮物、並びに配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表される亜硝酸酸化細菌由来のバイオマスの変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を図示する。
【図３】図３は、本発明の実施態様により、選択された濃縮物、並びに配列番号１、配列番号２及び配列番号７によって表される亜硝酸酸化細菌のバイオマスの変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を図示する。
【図４】図４は、本発明の実施態様による、選択された濃縮物、並びに配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって表される亜硝酸酸化細菌由来のバイオマスの変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を図示する。
【図５】図５は、塩水菌株及び２つの市販の添加物についての細菌添加試験による、平均亜硝酸塩濃度の傾向を図示する。
【図６】図６は、細菌接種されていないコントロールに対する塩水菌株について細菌添加試験による、平均亜硝酸塩濃度の傾向を図示する。
【図７】図７は、５．５ヶ月間保存されていた凍結乾燥形態の塩水菌株の生存能力を評価するための細菌添加試験による、平均アンモニア濃度の傾向を図示する。
【図８】図８は、５．５ヶ月間保存されていた凍結乾燥形態の塩水菌株の生存能力を評価するための細菌添加試験による、平均亜硝酸塩濃度の傾向を図示する。
【図９】図９は、５．５ヶ月間保存されていた凍結乾燥形態の塩水菌株の生存能力を評価するための細菌添加試験による、平均硝酸塩濃度の傾向を図示する。
【図１０】図１０は、１１ヶ月間保存されていた凍結乾燥形態の塩水菌株の生存能力を評価するための細菌添加試験による、平均アンモニア濃度の傾向を図示する。
【図１１】図１１は、１１ヶ月間保存されていた凍結乾燥形態の塩水菌株の生存能力を評価するための細菌添加試験による、平均亜硝酸塩濃度の傾向を図示する。
【図１２】図１２は、１１ヶ月間保存されていた凍結乾燥形態の塩水菌株の生存能力を評価するための細菌添加試験による、平均硝酸塩濃度の傾向を図示する。
【図１３】図１３は、５ヶ月間保存されていた凍結形態の塩水菌株、及び１４ヶ月間保存されていた液体形態の塩水菌株の生存能力を評価するための細菌添加試験による、平均アンモニア濃度の傾向を図示する。
【図１４】図１４は、５ヶ月間保存されていた凍結形態の塩水菌株、及び１４ヶ月間保存されていた液体形態の塩水菌株の生存能力を評価するための細菌添加試験による、平均亜硝酸塩濃度の傾向を図示する。
【図１５】図１５は、５ヶ月間保存されていた凍結形態の塩水菌株、及び１４ヶ月間保存されていた液体形態の塩水菌株の生存能力を評価するための細菌添加試験による、平均硝酸塩濃度の傾向を図示する。
【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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