(57)【要約】本発明は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞外ポリペプチドに、これらのポリペプチドの断片に、そのようなポリペプチドおよび断片を含む組成物ならびにこれらのポリペプチドの露出ドメインおよびエピトープに関するものである。本発明は、抗体の免疫付与および産生へのこれらのポリペプチドおよび断片の使用に、そしてポリペプチドを認識および結合する抗体に関する。さらに本発明は、結合パートナーおよび阻害物質を同定する方法に、そしてコウジカビ感染を防止、処置および診断する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）からなる群より選択される細胞外Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓポリペプチドを結合し得る、単離抗体。
【請求項２】
前記抗体が、前記ポリペプチドを、１０−７Ｍ未満の、例えば１０−８Ｍ未満などの５×１０−８Ｍ未満の、例えば１０−９Ｍ未満などの５×１０−９Ｍ未満の、例えば１０−１０Ｍ未満などの５×１０−１０Ｍ未満の、例えば１０−１１Ｍ未満などの５×１０−１１Ｍ未満の、例えば１０−１２Ｍ未満などの５×１０−１２Ｍ未満の、例えば１０−１３Ｍ未満などの５×１０−１３Ｍ未満の、例えば１０−１４Ｍ未満などの５×１０−１４Ｍ未満の、例えば１０−１５Ｍ未満などの５×１０−１５Ｍ未満の解離定数で結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤからなる群より選択され、ＩｇＧが好ましくはＩｇＧ１である、請求項１または２のいずれかに記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、インタクトなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞を結合し得る、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体または少なくともそのＦａｂ断片が、インビトロアッセイにおいてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子の肺上皮への接着を、好ましくは少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、または少なくとも６０％低減させ得る、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体または少なくともそのＦａｂ断片が、インビトロアッセイにおいてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子の発芽を、好ましくは少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、または少なくとも６０％低減させ得る、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体がポリクローナルである、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体がモノクローナルである、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体がヒト抗体である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が精製されている、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体がさらに相同ポリペプチドを結合し得、該相同ポリペプチドが、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）からなる群より選択されるポリペプチドに対して、４２％以上などの３９％以上の、例えば６８％以上などの４８％以上の、例えば９０％以上などの８０％以上の配列同一性を有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体。
【請求項１３】
前記相同ポリペプチドが、
−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｅａなどのコウジカビ種、
−Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、
−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
−Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓなどのカンジダ種、
−Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、またはＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓなどのＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、
−Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓなどのＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、
−Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、
−Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ種、
−アオカビ種、
または
−Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ
を起源とする、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
前記相同ポリペプチドが、
−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｅａなどのコウジカビ種、
−Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、
−Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、
または
−Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ
を起源とする、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
前記相同ポリペプチドが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｅａなどのコウジカビ種を起源とする、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
前記相同ポリペプチドが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓを起源とする、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記相同ポリペプチドが、配列番号４１のポリペプチドである、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
前記相同ポリペプチドが細胞外である、請求項１２〜１７のいずれかに記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、さらに、
−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｅａなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ以外のコウジカビ種、
−Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、
−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
−Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓなどのカンジダ種、
−Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、またはＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓなどのＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、
−Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓなどのＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、
−Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、
−Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ種、
−アオカビ種、
または
−Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ
のいずれか１種以上のインタクトな細胞を結合し得る、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、
−Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、
−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
−Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、
−Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、またはＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、
−Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、または
−Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ
のいずれかのインタクトな細胞を結合し得ない、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）およびカタラーゼＡ（配列番号６）からなる群より選択されるポリペプチドを結合し得る、請求項１〜２０のいずれかに記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）およびＣｓｓＩ（配列番号１）からなる群より選択されるポリペプチドを結合し得る、請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体が、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）を結合し得る、請求項１〜２２のいずれかに記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体が、以下：Ｓｅｒ６７−Ｌｅｕ７１、Ａｌａ７４−Ｔｒｐ８０、Ｓｅｒ１９１−Ａｒｇ２０５、Ｌｅｕ２６８−Ｌｅｕ２７３、Ｈｉｓ２９２−Ｐｒｏ２９６、Ｇｌｕ３５５−Ｉｌｅ３６０、Ａｓｐｌ９３−Ｇｌｕ２０９、Ａｓｐ１９３−Ａｌａ１９９、Ｉｌｅ１５−Ｖａｌ１９、Ｖａｌ７５−Ｔｒｐ８０、Ｐｒｏ１１−Ｇｌｕ１８からなる群より選択される配列番号３６の領域および配列番号３７によって定義される領域の残基の１つ以上を含むエピトープ、好ましくは該領域内に含まれる残基から完全になるエピトープを結合し得る、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれかに定義される抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項２６】
医薬として使用するための、請求項１〜２４のいずれかに定義される抗体、または請求項２５に定義される組成物。
【請求項２７】
真菌感染の処置または予防用の医薬の製造のための、請求項１〜２４のいずれかに定義される抗体、または請求項２５に定義される組成物の使用。
【請求項２８】
前記医薬が、コウジカビ感染、好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ感染の処置または予防用の医薬である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記医薬が：侵襲性アスペルギルス症、アスペルギルス腫、およびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症などのアレルギー性アスペルギルス症からなる群より選択される真菌疾患の処置または予防用の医薬である、請求項２７に記載の使用。
【請求項３０】
以下の群：
配列番号３６を含むポリペプチド、それらの断片およびそれらの改変体、
配列番号７、８、１７、２６、２８、２９および／または３０で示したアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、例えば２００未満などの２５９未満のアミノ酸残基長、好ましくは１００未満などの１５０未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの５０未満のアミノ酸残基長の、配列番号１の断片および該断片の改変体；
配列番号９、１０、１８および／または１９で示したアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、例えば７５未満などの１０６未満のアミノ酸残基長、好ましくは２５未満などの５０未満のアミノ酸残基長の、配列番号２の断片および該断片の改変体；
配列番号３を含むポリペプチド、それらの断片およびそれらの改変体であって、但し、該ポリペプチドが配列番号３の断片である場合、この断片は、配列番号３５に示した断片ではない、ポリペプチド、それらの断片およびそれらの改変体；
配列番号１３、１４、２３、２４および／または２５で示されるアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、例えば２００未満などの４３７未満のアミノ酸残基長、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの、５０未満のアミノ酸残基長の、配列番号４の断片および該断片の改変体；
配列番号１５、１６および／または２７に示されるアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、７２７未満の、例えば２００未満などの４００未満のアミノ酸残基長、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の、配列番号５の断片および該断片の改変体；
ならびに、
配列番号３４で示されるアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、７４８未満の、例えば２００未満などの４００未満のアミノ酸残基長、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の、配列番号６の断片および該断片の改変体；
より選択される１種以上のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓポリペプチドを含有する、組成物。
【請求項３１】
以下の群：
配列番号３６を含むポリペプチド、それらの断片およびそれらの改変体、
配列番号７、８、１７、２６、２８、２９および／または３０で示したアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、例えば２００未満などの２５９未満のアミノ酸残基長、好ましくは１００未満などの１５０未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの５０未満のアミノ酸残基長の、配列番号１の断片および該断片の改変体；
配列番号９、１０、１８および／または１９で示したアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、例えば７５未満などの１０６未満のアミノ酸残基長、好ましくは２５未満などの５０未満の残基長の、配列番号２の断片および該断片の改変体；
配列番号３を含むポリペプチド、それらの断片およびそれらの改変体であって、但し、該ポリペプチドが配列番号３の断片である場合、この断片は、配列番号３５に示した断片ではない、ポリペプチド、それらの断片およびそれらの改変体；
配列番号１３、１４、２３、２４および／または２５で示されるアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、例えば２００未満などの４３７未満のアミノ酸残基長、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの、５０未満のアミノ酸残基長の、配列番号４の断片および該断片の改変体；
配列番号１５、１６および／または２７に示されるアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、７２７未満の、例えば２００未満などの４００未満のアミノ酸残基長、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の、配列番号５の断片および該断片の改変体；
ならびに、
配列番号３４で示されるアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、７４８未満の、例えば２００未満などの４００未満のアミノ酸残基長、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の、配列番号６の断片および該断片の改変体；
より選択される、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが、配列番号７〜２７および／または３７で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む断片、または該断片の改変体である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、配列番号７〜１６で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む断片、または該断片の改変体である、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、配列番号１７〜２５および／または配列番号１４で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む断片、または該断片の改変体である、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、配列番号１８、１９、２６、２７、および／または３７で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む断片、または該断片の改変体である、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
請求項３１〜３５のいずれかに定義されるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
請求項３６に定義されるポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項３８】
請求項３６に定義されるポリヌクレオチドおよび／または請求項３７に定義される発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項３９】
請求項３１〜３５のいずれかに定義されるポリペプチドまたは請求項３６に定義されるポリヌクレオチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項４０】
医薬として使用するための、請求項３１〜３５のいずれかに定義されるポリペプチド、または請求項３６に定義されるポリヌクレオチド。
【請求項４１】
真菌感染に対する哺乳動物の免疫化用の医薬製造のための、請求項３１〜３５のいずれかに定義されるポリペプチド、請求項３６に定義されるポリヌクレオチドの使用。
【請求項４２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
非ヒト哺乳類における配列番号１、２、３、６および３６で示されたポリペプチドの群より選択されるポリペプチドに対する特異的抗体を惹起するための方法であって、以下、
ａ．イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）、または請求項３１〜３５のいずれかに定義されるポリペプチドの群より選択されたポリペプチド、またはこれらのポリペプチドのいずれかを発現する細胞を提供する工程、
ｂ．該ポリペプチドまたは該細胞を含有する組成物を動物に導入する工程、
ｃ．該動物において抗体を惹起する工程、ならびに
ｄ．該抗体を単離して、必要に応じて精製する工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
前記抗体を惹起する工程が、ヒト抗体を生成し得るトランスジェニック動物において行われる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記提供されるポリペプチドが、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）もしくはその断片、または該ポリペプチドの改変体である、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記提供されるポリペプチドが、ＣｓｓＩ（配列番号１）もしくはその断片、または該ポリペプチドの改変体である、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記提供されるポリペプチドが、ハイドロフォビン（配列番号２）もしくはその断片、または該ポリペプチドの改変体である、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記提供されるポリペプチドが、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）もしくはその断片、または該ポリペプチドの改変体である、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記提供されるポリペプチドが、カタラーゼＡ（配列番号６）もしくはその断片、または該ポリペプチドの改変体である、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項５０】
イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、エノラーゼ（配列番号４）、カタラーゼＢ（配列番号５）およびカタラーゼＡ（配列番号６）の群より選択されるポリペプチドの結合パートナーを同定するための方法であって、以下：
ａ．請求項３１〜３５のいずれかに定義されるポリペプチドまたはイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、カタラーゼＢ（配列番号５）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）の群より選択されるポリペプチドを提供する工程、
ｂ．該ポリペプチドを推定上の結合パートナーに接触させる工程、ならびに
ｃ．該推定上の結合パートナーが該ポリペプチドに結合し得るか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５１】
前記推定上の結合パートナーが宿主由来分子である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法が複数の推定上の結合パートナーについて繰り返される、請求項５０〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
抗真菌活性を備える化合物を同定するための方法であって、以下：
ａ．低下したレベルの、配列番号１、２、３、５、６、および３６の群より選択されるポリペプチドを有する感作細胞を提供する工程、ならびに、
ｂ．推定上の抗真菌化合物に対する該細胞の感受性を、例えば増殖アッセイによって決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５４】
イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ＧＡＰＤＨ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）の群より選択される細胞外コウジカビポリペプチドのインヒビターを同定するための方法であって、以下：
ａ．イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ＧＡＰＤＨ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）の群より選択されるポリペプチドのレベルが異なる２つの細胞を提供する工程、
ｂ．推定上のインヒビターに対する該細胞の感受性を、例えば増殖アッセイによって決定する工程、ならびに、
ｃ．該２つの細胞が該推定上のインヒビターの存在によって異なる影響を受けるか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５５】
前記２つの細胞は、前記ポリペプチドのコピー数が異なる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記２つの細胞は、前記ポリペプチドの活性が異なる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
真菌感染、好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ感染を診断する方法であって、以下：
ａ．個体からのサンプルを提供する工程、
ｂ．該サンプルを、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）の群より選択されるポリペプチドを特異的に認識および結合し得るインジケータ部分に接触させる工程、ならびに、
ｃ．シグナルが該インジケータ部分によって産生されたか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５８】
前記インジケータ部分が、請求項１〜２４のいずれかに定義される抗体などの抗体であるか、それらの抗体を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
生物学的サンプルにおいて真菌物質、好ましくはインタクトな真菌細胞、最も好ましくはインタクトなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞を検出するためのキットであって、以下：
ａ．イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）の群より選択されるポリペプチドを特異的に認識および結合し得るインジケータ部分、ならびに
ｂ．該インジケータ部分の真菌物質への結合を促進するための緩衝液；検出可能なシグナルを発生するための試薬；ユーザに対する記載された説明書の１つ以上；
を備える、キット。
【請求項６０】
前記インジケータが、請求項１〜２４のいずれかに定義される抗体などの抗体であるか、またはそれらの抗体を含む、請求項５９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、２００３年６月１１日に提出されたＵ．Ｓ．ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．６０／４７７，３５５および２００３年６月２６日に提出されたＳｅｒｉａｌ  Ｎｏ．６０／４８２，４５１の本出願である。
【０００２】
本出願に引用されたすべての特許および非特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞外ポリペプチドに、これらのポリペプチドの断片に、そのようなポリペプチドおよび断片を含む組成物ならびにこれらのポリペプチドの露出ドメインおよびエピトープに関するものである。本発明は、抗体の免疫付与および産生へのこれらのポリペプチドおよび断片の使用に、そしてポリペプチドを認識および結合する抗体に関する。さらに本発明は、結合パートナーおよび阻害物質を同定する方法に、そしてコウジカビ感染を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
免疫系を攻撃する疾患、例えばＡＩＤＳの発生、および免疫系を抑制する医療処置、例えば癌化学療法または臓器移植は、真菌感染によって引き起こされた死亡率の上昇をもたらした。１９８０年代半ばから、真菌病原体は多くの各種の医療施設にて、その細菌相対物と拮抗し始めた。アスペルギルスファミリーの種は、これらの真菌感染の相当な数を占め、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓは実質的にすべての主要な医療センターにおける院内感染のよくある理由として、世界的に出現してきた。ほぼ３０年間に渡って、アンホテリシンＢは、著しい腎臓毒性にもかかわらず重篤な真菌感染を処置するために承認された唯一の薬剤であった。アゾールは真菌感染の約５０％の原因である最も一般的な真菌病原体、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓを処置するために、１９８０年代に採り入れられた。アゾールの広範囲におよぶ使用は、この薬剤に対する耐性菌株の発生を促した。運の悪いことに、ごく最近発売されたアゾールは、真菌疾患の最も重篤な形、例えばアスペルギルスによって引き起こされた感染に対して概して無効である。真菌病原体の薬剤耐性菌株の増加はさらに、新しい抗菌処置への要求を強調する。
【０００５】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓは、環境、特に土壌中および水中で遍在的に見出される腐生細菌であり、乾草、穀物および腐りかけている有機物に非常に多くの数がただちに見出される。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓは、環境中の炭素および窒素をリサイクルするのに不可欠な役割を果たす。病院の貯水槽および他の施設は、未濾過の空気、換気システム、建設工事中の汚染ダスト、カーペット類、食物、観賞用植物ならびに水および給水システムを含む。一般に、アスペルギルス症は胞子の外因性獲得の結果として発生すると考えられている；それらは吸入時に肺胞に達するのに十分な小ささ（２．５〜３．０μｍ）であり、媒介物中で長期間に渡って生存するのに十分な耐久性である。これはおそらく宿主の免疫状態によって変わるであろうが、どれくらいのサイズの感染性接種原が必要であるか不明なままである。約６００の認識された種があるが、少数のみが病原性であるとして同定されている。この中で８０％を超えるヒト感染を引き起こすＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓは、アスペルギルス種によって生じた。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓは日和見病原体であり、正常な個体は大量の胞子の吸入後を除いて、疾患に感染しにくい。アスペルギルスは、少なくとも３つの方法：喘息におけるアレルギー性反応（アレルギー性アスペルギルス症）；瘢痕化肺組織でのコロニー形成（アスペルギルス腫）；および心臓、肺、脳および腎臓に影響を及ぼしうる肺炎による侵襲性感染（侵襲性アスペルギルス症）で疾病を引き起こすことができる。
【０００６】
（アレルギー性アスペルギルス症）
第１のタイプのアスペルギルス症疾病において、アレルギー性喘息または遺伝性素因を持つ人々は、アスペルギルス種に感作されるようになるとこの形の喘息を発症することがある。喘息患者は、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓへの暴露時にその喘息状態がさらに悪化することを見出す。一部の人々は、アスペルギルス胞子が発芽して、これに伴う菌糸の増殖が潜在的に気管支を閉塞させうるアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）を発症する。患者は、菌糸の小型褐色栓を喀出することがある。組織の侵襲はない。しかしながら患者は肺線維症を被り、時間が経つにつれて他の肺疾患にさらに罹患しやすくなる。現在、ＡＢＰＡは、アスペルギルス種によって引き起こされる最も重篤なアレルギー性肺合併症である。それはアトピー性喘息または嚢胞性線維症を被っている患者に発生する。免疫介在性であるためだけでＡＢＰＡに関連する別の疾患実体である、過敏性肺炎（外因性アレルギー性肺胞炎とも呼ばれる）は、特定された−−多くは職業上の−−高レベルの抗原源への反復暴露に関連していることが多い。
【０００７】
（アスペルギルス腫）
普通は「真菌球」と呼ばれるアスペルギルス腫は、結核、サルコイドーシスによって引き起こされた前から存在する肺空洞、または他の水疱性肺障害および慢性副鼻腔閉塞にて発生する。
【０００８】
（侵襲性アスペルギルス症（ＩＡ））
侵襲性アスペルギルス症（ＩＡ）は、正常な免疫系が他の深刻な疾患、例えば白血病、リンパ腫、癌腫、結核、気腫、糖尿病、ＨＩＶ／ＡＩＤＳによって、または免疫抑制薬（臓器または骨髄移植手術に関連して使用されることが多い）の使用によって；または高用量のコルチコステロイドに脅かされた人々に見られる。ＩＡでは、肺組織または皮膚の実際の侵襲がある。感染は多くの臓器または組織、例えば心臓、肝臓、目、鼻、耳および骨格筋でも発生しうる。病的な侵襲性感染は、最終的に隣接構造への血流転移または接触蔓延につながる、下にある組織の明らかな侵襲を示す。ＩＡの予後は、深刻な疾病および死亡である。
【０００９】
過去１２年間において、ＩＡの４倍の増加が観察された。１９９２年にＩＡは、癌で死亡する患者における約３０％の真菌感染に関与しており、ＩＡはすべての白血病患者の１０〜２５％で発生することが推定され、その死亡率は処置されても８０〜９０％である。ＩＡの平均発病率は、急性白血病患者の５〜２５％、同種骨髄移植（ＢＭＴ）後の５〜１０％、そして血液疾患の細胞傷害処置または自家ＢＭＴ後の０．５〜５％であると推定される。固形臓器移植に続くＩＡは、心肺移植患者で最も一般的であり（１９〜２６％）、減少順に肝臓、心臓、肺、および腎臓レシピエントに見出される（１〜１０％）（Ｐａｔｅｌ  ａｎｄ  Ｐａｙａ，１９９７，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０：８６−１２４）。ＩＡは非造血性基礎症状を持つ患者でも発生する；それは近年、ＡＩＤＳ患者において１〜１２％と報告されており）（Ｄｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２４：６５４−６６２）、慢性肉芽腫性疾患の一般的な感染性合併症でもある（２５〜４０％）４つのタイプのＩＡが説明されている（Ｄｅｎｎｉｎｇ，１９９８，Ｃｌｉｎ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２６：７８１−８０５）：（ｉ）ＩＡの最も一般的な形である、急性または慢性肺アスペルギルス症；（ｉｉ）主にＡＩＤＳ患者に見られる、粘膜および軟骨の各種の侵襲度はもちろんのこと、偽膜形成も伴う気管気管支炎および閉塞性気管支疾患；（ｉｉｉ）急性侵襲性鼻副鼻腔炎；および（ｉｖ）一般に脳（ＢＭＴ患者において１０〜４０％）および他の臓器（例えば皮膚、腎臓、心臓、および目）を含む播種性疾患。
【００１０】
（コウジカビ感染の診断）
細菌感染とは異なり、血液または脳脊髄液または他の無菌体液からの培養物は−心内膜炎および播種性疾患の患者においても、アスペルギルス種について陽性であることはめったにない。胞子の遍在的性質を考えると、気道の培養物からのアスペルギルスの回収は、真の感染、コロニー形成または汚染を識別しない。多数の臨床所見は、侵襲性アスペルギルス症、例えば広範囲に渡る抗生物質に反応しない好中球減少性熱、胸部Ｘ線での新しい肺浸潤物の出現および侵襲性真菌症を示唆する臨床的症状（例えば胸膜炎性胸痛、喀血など）の存在の診断のきっかけとなる。運の悪いことに、これらのきっかけの大半は、低い予測値を有する。したがって精密な早期診断に達する唯一の方法は、培養および組織病理学検査（生検または針吸引による）のための検体を収集するために極度の努力をすることである。しかしながらこの標準手法は、血球減少によって、または患者の危機状態によって妨げられることが多い集中的な手順（開胸的肺生検、脳生検など）を含む。それゆえ最終的な診断は、真菌増殖が不可抗力的となる前にめったに行われず、治療はもはや成功しない。
【００１１】
抗アスペルギルス抗体の検出は、これらの個体群が十分な抗体反応を起こすことができないため、好中球減少性患者および造血幹細胞移植レシピエントでのアスペルギルス症の診断に入る余地がない。現在使用されている診断ツールは、ガラクトマンナン検出（増殖中に放出される主要な細胞壁構成要素）、高解像度肺ＣＴスキャン法およびアスペルギルスＤＮＡの検出である。高い感度および高い選択性の両方を得ることは問題のままであり、新規な信頼性の高い診断マーカーへの要求がある。
【００１２】
（現在利用できる抗アスペルギルス剤）
侵襲性アスペルギルス症の処置で現在利用できる抗真菌への装備は、数に限りがある。それは：
１．ポリエンマクロリド、アンホテリシンＢおよびその脂質ベース調合物；
２．トリアゾール、イトラコナゾール；
３．フッ素化ピリミジン、５−フルオロシトシン；および
４．アリルアミン、テルビナフィン；
を含む。
他の真核細胞に存在しない高い選択性の真菌標的の欠如は、新しい薬剤の開発を長期に渡って妨げてきた。５−フルオロシトシンを除いて、利用できるすべての薬剤は、物理的阻害によって、あるいは膜ステロール生合成の遮断のどちらかによって、真菌原形質膜の構造的および機能的完全性を妨害することによって作用する。この方法は、治療標的の非選択的性質が哺乳類細胞での同時に生じる交互阻害（または毒性）をもたらすため、理想とは程遠いままである。
【００１３】
抗真菌薬、例えばアンホテリシンＢおよび／またはイトラコナゾールにより処置は、多くの問題点を含んでいる。アンホテリシンＢ、フルシトシンおよびイトラコナゾールは、低い成功率と関連しており、深刻な輸液または薬剤関連毒性によって、危険な薬剤間相互作用によって、薬物動態学的問題によって、そして耐性の発現によって阻害される。アンホテリシンＢは、静脈により高用量で投与する必要がある。一部の患者では、腎臓および他の臓器を損傷することがある。ＩＡのアンホテリシンＢ治療の全体の成功率は３４％である。加えて、大半のＩＡ症例は、抗菌剤に非反応性の熱に対応したアンホテリシンＢの経験的投与にも関わらず発生する。イトラコナゾールは概して経口投与され（また高用量、例えば１日に少なくとも４００ｍｇで）、処置として長年使用されているが、それでも死亡率はなお８５％の高さである。
【００１４】
（ワクチン接種）
ワクチン接種は、コウジカビ感染と戦う別の手法である。上で説明したように、ＩＡは、その後天的免疫反応すべてを失い、本質的に記憶力のない免疫不全患者、特に好中球減少性患者には深刻な問題であり、コウジカビ感染は大半の症例で致命的である。免疫抑制前のこれらの患者へのワクチン接種は、実行可能な方法でないように思われる。しかしながら骨髄ドナーのワクチン接種は、提供後感染のクリアランスを補助できる。免疫グロブリンによる受動免疫付与も選択肢である。現在までに、特異的免疫グロブリンの有効性に関する広範囲に渡る前臨床および／または臨床データは利用できない。しかしながら活性ワクチン接種がその死亡率に影響を及ぼした、マウスの侵襲性アスペルギルス症試験による報告がある（Ｉｔｏ  ａｎｄ  Ｌｙｏｎｓ（２００２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８６，８６９−８７１）。
【００１５】
（標的）
Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓはヒトの主要な真菌病原体になりつつあるため、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓにおける適切な生化学標的の同定に対する、そしてそのような生化学標的に対して活性である新しい有効な抗真菌剤の発見および開発に対する差し迫った要求がある。近年、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓゲノムがランダムショットガンＤＮＡ配列決定によって解析された。生存のために不可欠であることが既知のＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ遺伝子との配列比較により、多数の潜在的に不可欠なＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ遺伝子が同定された（ＷＯ  ０２／０８６０９０）。そのような遺伝子は潜在的に興味のある薬剤標的であるかもしれないが、大半のコード化遺伝子産物の構造、機能または細胞内局在はまだ利用できない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
主な態様において、本出願はＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞外ポリペプチドに関する。本出願の文脈では、「細胞外ポリペプチド」は、真菌細胞の原形質膜の外側に全体的または部分的に（すなわちポリペプチド鎖の部分またはポリペプチド分子の個体群の一部）局在するポリペプチドとして定義される。細胞外ポリペプチドは、細胞外部分を有する原形質膜ポリペプチド、細胞壁ポリペプチド、周辺質ポリペプチド、分泌ポリペプチドおよび原形質膜外側の空間に十分にまたは部分的に暴露または放出された他のすべてのポリペプチドを含む。細胞外ポリペプチドはさらに、本明細書で述べるように単離された細胞壁−、細胞表面露出−および透析物画分に見出せるすべてのポリペプチドまたはポリペプチド断片を含む。
【００１７】
細胞外ポリペプチドは、抗真菌治療および／または診断にとって魅力的な標的である。そのようなポリペプチドの細胞外空間への暴露は、これらのペプチドと相互作用する化合物（例えば真菌感染を防止、処置または診断するために使用される化合物）が有効となるためにしばしば原形質膜を通過する必要がないことを意味する。原形質膜は大半のタイプの化合物の主要な障壁を構成するため、このことは相当な利点である。
【００１８】
真菌タンパク質の細胞外局在は通常は、そのアミノ酸配列から予測できない。分泌経路へのタンパク質の侵入に介在するシグナル配列の存在は、高度の確実性で予測できるが、そのような配列を持つ多くのタンパク質は、細胞内でコンパートメント、例えば小胞体、ゴルジ複合体、エンドソームおよびリソソーム内に残存している。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓにおける局在化シグナルについては、ほとんど知られてない。
【００１９】
原則として、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓタンパク質の局在は、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓよりもはるかに良好に特徴付けられている他の真菌、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは病原性酵母Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓにおける、相同タンパク質の既知の局在から推測できる。しかしながら実際には、そのような推測は、非常に不確実性である。近年実施された推定上の輸送Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓタンパク質に関する遺伝子スクリーニングは、その最も近い相同体が細胞内タンパク質である、多数のそのようなタンパク質を同定した（Ｍｏｎｔｅｏｌｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  １，５１４−５２５）。それゆえ利用できるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのゲノム配列を用いても、細胞外に見出せるポリペプチドを予測することは容易ではない。
【００２０】
発明者らは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞壁−、細胞表面露出−および透析物画分を単離および解析して、それゆえ以下のポリペプチドの細胞外局在を決定した：
１．配列番号１で示されたポリペプチド。このポリペプチドは、ヌクレオチド配列に基づいて推定上の遺伝子産物として以前に提唱されただけであるため、以前はＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ内で検出されなかった。本明細書では、分生子表面および分泌タンパク質（Ｃｏｎｉｄｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｉにちなんで、このポリペプチドをＣｓｓＩと命名することを提唱する。
２．ハイドロフォビン（配列番号２）。Ｐａｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２，４３８９−４３９５で以前に述べられた。
３．ＧＡＰＤＨ−Ｂ、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（配列番号３）。この配列の１７２アミノ酸断片は、ＮＣＢＩデータベースに受託番号ＡＡＬ２５８１９（配列番号３５）で述べられている。しかしながら全長ポリペプチドは、以前に述べられていない。
４．エノラーゼ（配列番号４）。ＮＣＢＩデータベースに受託番号ＡＡＫ４９４５１で述べられた。
５．カタラーゼＢ（配列番号５）。ＮＣＢＩデータベースに受託番号ＡＡＢ７１２２３で、およびＣａｌｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５，４７１８−４７２４で述べられた。
６．カタラーゼＡ（配列番号６）。ＮＣＢＩデータベースに受託番号Ｕ８７６３０で述べられている。
７．イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（ＩＭＤＨ  Ｂ）（配列番号３６）。このＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓポリペプチドは、以前に述べられていない。
【００２１】
これらのポリペプチドのいくつかでは、局在は以前には知られていなかった。すべてのポリペプチドで、発明者らによってコウジカビ感染の防止、治療または診断に有用である新規なポリペプチド断片が同定された。これらの断片のいくつかは、細胞外空間から比較的アクセス可能であるか、細胞外空間に放出される。
【００２２】
第１の主要な態様において、本発明は、断片が配列番号３５で示された配列より成らないという条件で、配列番号３で示されたポリペプチドならびにその変異体および断片に関する。
【００２３】
別の主要な態様において、本発明は、配列番号３６で示されたポリペプチドならびにその変異体および断片に関する。
【００２４】
さらなる主要な態様において、本発明は、配列番号１−６および３６で示されたポリペプチドに由来して、配列番号７−３４および３７で示された配列からの１つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチド断片に関する。本発明は、これらのポリペプチド断片の変異体にも関する。
【００２５】
本発明は、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド断片の部分に含まれる、または部分を含む、露出されたドメインおよびエピトープにも関する。
【００２６】
さらに本発明は、本発明の１つ以上の細胞外アスペルギルスポリペプチドまたはポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【００２７】
各種の細胞壁−、細胞表面露出−および／または透析物画分におけるポリペプチドの同定において発明者らによって使用された技法は、高度に発現されたタンパク質の同定に好都合である。それゆえ識別されたポリペプチドは比較的豊富である。これは、それらが細胞の細胞外環境に露出されるという決定に加えて、それらを生化学標的または診断マーカーとして高度に適切にした。それゆえ発明者によるこれらの画分中のこれらのポリペプチドの同定は、コウジカビ感染の防止、処置および／または診断を目的とする方法の開発のための基礎を作成した。
【００２８】
したがって主要な態様において、本発明は、医薬を生成するための本発明のポリペプチドまたは断片の使用に関する。好ましくは、好ましくは保護免疫反応を生成するための、哺乳類、好ましくはヒトの免疫付与またはワクチン接種に使用できる医薬。
【００２９】
さらに別の主要な態様において、本発明は、ヒト以外の哺乳類において、これらのポリペプチドまたはその断片に対して抗体を産生させる方法に関する。
【００３０】
本発明はまた、さらなる主要な態様において、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）からなる群より選択された細胞外Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓポリペプチドを結合できる抗体に関する。アスペルギルスによる感染の処置または予防用の医薬を製造するための、そのような抗体の使用も、本発明の態様である。それゆえ本発明は、本発明の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物にも関する。
【００３１】
その上、本発明は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ感染および／または他の真菌感染を処置または防止する方法であって、本発明の抗体をその必要のある個体に投与するステップを含む方法に関する。
【００３２】
さらに本発明は、これらの細胞外ポリペプチドの結合パートナーおよび／または阻害物質をスクリーニングする方法に、抗真菌剤をスクリーニングする方法に、およびコウジカビ感染の診断を目的とする方法に関する。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
（定義）
「断片」または「ポリペプチド断片」は、ポリペプチドの非全長部分として定義される。断片の長さは、２アミノ酸残基から全長ポリペプチド−１アミノ酸残基まで変化する。断片は好ましくは、長さが例えば５０未満のアミノ酸などの１００未満のアミノ酸、例えば３０未満のアミノ酸などの４０未満のアミノ酸、例えば２０未満のアミノ酸などの２５未満のアミノ酸である。それゆえ、例えば断片は長さが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸でありうる。さらなる実施形態において、断片は、９を超えるアミノ酸などの５を超えるアミノ酸、例えば１５を超えるアミノ酸などの１０を超えるアミノ酸、例えば３０を超えるアミノ酸などの２０を超えるアミノ酸を含む。別の方法で表現すると、断片は、全長ポリペプチドと比較して長さが１００％未満であるアミノ酸配列の部分より成る。断片の長さは、全長ポリペプチドの長さの２５％未満など、１０％未満など、５０％未満でもよい。他の実施形態において、断片の長さは、全長ポリペプチドの長さの１０％を超えるなど、２５％を超えるなど、５％を超えてもよい。
【００３４】
所与のポリペプチドまたは断片の「変異体」は、前記ポリペプチドまたは断片に対するある程度の配列同一性を示すポリペプチドまたはペプチドである。変異体は好ましくは、所与のポリペプチドまたは断片と、少なくとも７５％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性などの少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９１％の配列同一性などの、少なくとも９２％の配列同一性などの少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９４％の配列同一性などの少なくとも９３％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性などの少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性などの少なくとも９７％の配列同一性、例えば９９％の配列同一性を有する。配列同一性は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０のアルゴリズムＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、またはＦＡＳＴＡのいずれかによって、デフォルトギャップ重み付けを使用して決定される。
【００３５】
所与のポリペプチドまたは断片の好ましい変異体は、変異体と所与のポリペプチドまたは断片との間のすべてのアミノ酸置換が保存的置換である変異体である。保存的アミノ酸置換は、同様の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンである；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンである；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンである；そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００３６】
ポリペプチドまたはその断片の変異体は、１つ以上のアミノ酸が削除または挿入されたポリペプチドまたは断片の形も含む。好ましくは４未満などの５未満の、例えば２未満などの３未満の、例えば１個のみのアミノ酸が挿入または削除されている。ポリペプチドまたはその断片の「変異体」は、アミノ酸配列の翻訳後修飾によって修飾されたこれらのポリペプチドまたは断片の形も含む。所与のポリペプチドまたはその断片が（遺伝子レベルで、または翻訳後に）別のペプチドまたはポリペプチドに融合された、融合タンパク質も含まれる。
【００３７】
「露出ドメイン」は、外部環境に露出されたポリペプチドの部分として定義される。細胞結合されていないポリペプチドの分泌または放出部分は、露出ドメインの例である。露出ドメインは、細胞結合されたポリペプチドにも見出すことができる。これは例えば、本明細書の実施例で述べたようにプロテアーゼ処理によって決定できる。すなわちポリペプチドの露出ドメインは、同じポリペプチドの他の部分よりも、プロテアーゼにより接近しやすい、トリプシンまたはキモトリプシンなどのポリペプチドの部分であり、細胞の完全性を混乱させることなく、プロテアーゼ処理によって細胞結合から放出可能である。ドメインの表面露出も、例えばＳａｎｊｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２，２２５５−２２６２によって述べられたような間接免疫蛍光解析を使用して決定できる。原形質膜結合ポリペプチドの露出ドメインは、膜貫通領域に直接隣接して位置し、原形質膜の細胞外側に位置する、そのようなポリペプチドの一部である。露出ドメインは、膜貫通領域の両方に、または片側のみに隣接できる。膜貫通領域は、Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７，６４６−６５３で検討された各種の方法によって予測できる。好ましい実施形態において、原形質膜結合ポリペプチドの露出ドメインは、原形質膜の細胞外側に位置するポリペプチドの一部であり、ＴＭＨＭＭ  ｐｒｏｇｒａｍ  ２．０（Ｋｒｏｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０５，５６７−５８０によって予測される膜貫通領域（膜貫通らせん）に直接隣接している。
【００３８】
「エピトープ」はこの文脈で、抗体またはその機能的同等物によって認識可能なポリペプチドのすべての部分を含む。エピトープは、連続アミノ酸残基の、またはポリペプチドの非連続部分の伸展より成る。通例、エピトープは、３〜１０のアミノ酸などの２〜２０のアミノ酸、好ましくは３、４、５、６、７または８のアミノ酸などの３〜８のアミノ酸より成る。
【００３９】
「発現ベクター」は、ポリヌクレオチド配列からポリペプチドを生成するためのプラスミドまたはファージまたはウィルスを指す。発現ベクターは、（１）遺伝子発現においてレギュレータの役割を有する１個または複数の遺伝子要素、例えばプロモータまたはエンハンサと、（２）ｍＲＮＡ内に転写され、タンパク質へ翻訳される、そして（１）の要素に動作可能に接続される、構造またはコード化配列と；（３）適切な転写開始および終結配列とのアセンブリを含む、発現コンストラクトを含む。
【００４０】
「ワクチン」は、ヒトまたは動物における微生物に対して保護免疫反応誘発できる組成物を示すのに使用する。
【００４１】
「保護免疫反応」は、生物に記憶を誘起して、一次反応よりもむしろ二次反応によって処理される感染因子を生じさせて、それゆえ宿主生物へのその影響を低減する免疫反応（液性／抗体および／または細胞）を示すのに使用される。
【００４２】
ポリペプチドの「結合パートナー」は、前記ポリペプチドに結合可能な分子を指す。そのような結合は、別の分子を通じて間接的であることも可能であるが、好ましくは直接である。結合パートナーは、どのタイプの分子でも、例えば小型疎水性分子あるいは例えばタンパク質、炭水化物または核酸などの細胞または細胞外巨大分子でもよい。好ましいタイプの結合パートナーは、抗体、リガンドまたは阻害物質を含む。
【００４３】
「複数」という用語は、１を超える、好ましくは１０を超えることを指す。
【００４４】
「分泌された」は本文脈において、細胞結合しておらず、それゆえ原則として周囲の溶媒に自由に拡散する可溶性ポリペプチドまたはその断片を指す。これは、例えばタンパク質分解によって、細胞結合から放出されたポリペプチドの断片を含む。
【００４５】
「インジケータ部分」という用語は、検出可能であるか、検出可能な信号を生成する分子または分子の複合体を含む。好ましくは、インジケータ部分は抗体であるか、抗体分子を含む。それゆえ好ましいインジケータ部分は、検出可能な物質に結合された抗体である。検出可能な物質はある実施形態では、第２の抗体を含むことができる。
【００４６】
「宿主由来分子」または「宿主分子」は、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓによって感染可能な宿主生物に通常見出される分子を指す。宿主由来分子は好ましくは、宿主ポリペプチド、好ましくはヒトポリペプチドである。病原性菌類と相互作用する宿主由来分子の例は、血清アルブミンおよびトランスフェリン、フィブリノゲン、補体断片Ｃ３ｄ、補体断片ｉＣ３ｂ、ラミニン、フィブロネクチン、エンタクチン、ビトロネクチン、マンナンアドヘシン、上皮結合レクチン様タンパク質、およびアグルチニン様タンパク質である。
【００４７】
「抗体」という用語は本明細書で使用する場合、抗体はもちろんのこと、その機能的同等物を含むものとする。それゆえこれは、ポリクローナル抗体、これに限定されるわけではないがマウス、ラット、ハムスター、ウサギおよびラマ、ヒトを含むいずれかの種に由来するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ））、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、およびＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって作成された断片、抗イディオタイプ抗体、抗体断片を含むハイブリッド、ならびにこれらのいずれかのエピトープ結合断片も含む。用語は、モノクローナル抗体の混合物も含む。
【００４８】
本明細書で開示したポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関連して使用される「単離された」は、同定および分離されたおよび／またはその自然環境の成分から回収されたものを指す。その自然環境の汚染物質成分は、通例、ポリペプチドのための診断および治療用途を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性または非タンパク性溶質を含む。
【００４９】
（本発明のポリペプチド）
（細胞外アスペルギルスポリペプチドの断片）
発明者らが実施した３つの異なるアスペルギルス画分（透析物、細胞表面露出および細胞壁）の解析は、同じポリペプチドから画分のそれぞれについて、異なるタイプおよび数の断片の同定に至った。例えば実施例１で述べるように、５つのＣｓｓＩペプチドが細胞壁画分で同定されたが、これに対して透析物および細胞表面露出画分では１つのみ同定された。この相違は、タンパク質の構造的特徴を示す。特定の理論に制限されることなく、これに関しての考えられる説明は、ＣｓｓＩの部分が細胞壁から開裂可能であり、タンパク質の一部が周囲環境に放出されて、同時にタンパク質の残りが細胞壁に埋め込まれたままであるということである。同様に他の説明が可能であるが、１つのペプチドのみが細胞表面画分で検出されたという事実は、そのペプチドを含むタンパク質のエリアが露出されており、これに対してタンパク質の残りが露出されていないことを示唆する。細胞壁などの他の細胞構造に埋め込まれていないポリペプチドの領域さえ、他の部分よりもさらに接近しやすい部分をなお含有している。例えばポリペプチドの表面は、第３級タンパク質構造内に埋められたポリペプチドの部分よりも接近しやすい。プロテアーゼ処理も、そのようなタンパク質表面領域を同定する。それゆえ発明者は、特に興味のあるタンパク質領域を同定した。露出ドメインはその接近のしやすさにより、診断のために、または抗真菌処置のために特に魅力的な標的である。その上、露出ポリペプチド断片またはドメインはエピトープに寄与しやすく、またはエピトープを含みやすく、それゆえ抗体認識に非常に適切である。以下で述べる用途の多くでは、発明者によって同定された断片よりも大きい断片で作業することが好都合である。このことは、場合によっては小さい断片ではうまくいかない、結合パートナーを同定する方法および免疫付与などの抗体を産生させる方法に特に当てはまる。
【００５０】
主要な態様において、本発明は、露出ドメインおよび／またはエピトープを含む、細胞外アスペルギルスポリペプチドの断片に関する。本発明は、全長ＧＡＰＤＨ−Ｂポリペプチド（配列番号３）に、そして全長イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂポリペプチド（配列番号３６）にも関する。
【００５１】
したがって主要な態様において、本発明は、アスペルギルスポリペプチドであって
配列番号７、８、１７、２６、２８、２９および／または３０で示したアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、長さが２００未満などの２５９未満の、好ましくは１００未満などの１５０未満のアミノ酸残基、例えば長さが２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の、配列番号１の断片および前記断片の変異体；
配列番号９、１０、１８および／または１９で示したアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、長さが例えば７５未満などの１０６未満のアミノ酸残基、好ましくは長さ２５未満などの５０未満の残基の、配列番号２の断片および前記断片の変異体；
ポリペプチドが配列番号３の断片ならば、この断片が配列番号３５に示した断片であるという条件で、配列番号３、その断片およびその変異体を含むポリペプチド；
配列番号１３、１４、２３、２４および／または２５で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、長さが２００未満などの４３７未満の、好ましくは７５未満のなどの１００未満などのアミノ酸残基、長さが例えば２５未満などの、５０未満のアミノ酸残基の、配列番号４の断片および前記断片の変異体；
配列番号１５、１６および／または２７に示されたアミノ酸配列を含む、長さが７２７未満の、例えば２００未満などの４００未満の、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基、例えば長さが２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の、配列番号５の断片および前記断片の変異体；
配列番号３４で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、長さが７４８未満の、例えば２００未満などの４００未満の、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基、例えば長さが２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の、配列番号６の断片および前記断片の変異体；
および
配列番号３６、その断片およびその変異体を含むポリペプチド；
からなる群より選択されるアスペルギルスポリペプチドに関する。
【００５２】
好ましい実施形態において、上の断片は配列番号７−２７および３７で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む。さらに好ましい実施形態において、断片は、配列番号７−１６で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む。別のさらに好ましい実施形態において、断片は配列番号１７−２５および／または配列番号１４で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む。なお別のさらに好ましい実施形態において、断片は配列番号１８、１９、２６、２７、および／または３７で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む。
【００５３】
さらに好ましいポリペプチドは、配列番号７で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号７、８、１７、２６、２８、２９および／または３０で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基、例えば配列番号１７で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号８に示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基、例えば配列番号２８で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号２６で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基、例えば配列番号３０で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号２９で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、長さが２００未満のなどの２５９未満の、好ましくは１００未満などの１５０未満のアミノ酸残基の、例えば長さが２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の配列番号１の断片である。
【００５４】
さらに好ましいポリペプチドは、配列番号９で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号９、１０、１８および／または１９で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基、例えば配列番号１８で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号１０で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基、例えば配列番号１９で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、長さが７５未満などの１０６未満のアミノ酸残基の、好ましくは長さが２５未満などの５０未満の残基の配列番号２の断片である。
【００５５】
好ましいポリペプチドは、ポリペプチドが配列番号３の断片ならば、この断片が配列番号３５で示された断片でないという条件で、配列番号３の断片を含む。好ましいのは、配列番号１１で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号１１、１２、２０、２１、２２、３１、３２および／または３３で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基、例えば配列番号２０で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号１２で示されたアミノ酸の１つ以上の残基、例えば配列番号２２で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号２１で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基、例えば配列番号３２で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号３１で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基、例えば配列番号３３で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、長さが１５０未満などの１７１未満の、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸の、例えば長さが２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の配列番号３の断片である。配列番号３の他の好ましい断片は、配列番号１１、１２、２０、２１および／または２２で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、長さが１７３残基〜３１７残基の断片または前記断片の変異体である。
【００５６】
さらに好ましいポリペプチドは、配列番号１３で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号１３、１４、２３、２４および／または２５で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基、例えば配列番号２３で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号１４で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基、例えば配列番号２５で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号２４で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、長さが２００未満などの４３７未満の、好ましく７５未満などの１００未満のアミノ酸残基の、例えば長さが２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の配列番号４の断片である。
【００５７】
さらに好ましいポリペプチドは、配列番号１５で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号１５、１６および／または２７で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基、例えば配列番号２７に示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基などの配列番号１６に示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、長さが７２７未満の、例えば２００未満などの４００未満の、好ましく７５未満などの１００未満のアミノ酸残基の、例えば長さが２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の配列番号５の断片である。
【００５８】
さらに好ましいポリペプチドは、配列番号３４で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、長さが７４８未満の、例えば２００未満などの４００未満の、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基の、例えば長さが２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の配列番号６の断片である。
【００５９】
好ましいポリペプチドは、配列番号３６を含む、または配列番号３６より成るポリペプチドを含む。さらに好ましいのは、配列番号３７で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、長さが２００未満などの３６７未満の、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基、例えば長さが２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の配列番号３６の断片である。１つの実施形態において、配列番号３６および配列番号３７におけるＸ１はセリンである。別の実施形態において、配列番号３６および配列番号３７におけるＸ１はアラニンである。さらなる実施形態において、配列番号３６および配列番号３７におけるＸ２はロイシンである。別の実施形態において、配列番号３６および配列番号３７のＸ２はイソロイシンである。それゆえ配列番号３７および配列番号３６の同等部分の異なる配列実施形態は、ＬＡＡＥＬＡＬＲ、ＬＳＡＥＬＡＬＲ、ＬＡＡＥＩＡＬＲ、ＬＳＡＥＩＡＬＲを含む。
【００６０】
好ましくは、配列番号の１−６および３６の上で定義したポリペプチド断片は、規定されたアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８または９残基などの、規定されたアミノ酸配列の１つを超える残基を含む。そのような好ましい断片の非制限的な例は、配列番号７で示されたアミノ酸配列の９残基を含む、配列番号１の断片である。最も好ましくは、上のポリペプチド断片は、規定されたアミノ酸配列のすべての残基を含む。最も好ましい断片の非制限的な例は、配列番号７で示されたアミノ酸配列の１６残基すべてを含む配列番号１の断片である。
【００６１】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは好ましくは、配列番号７−３４および３７の群、好ましくは配列番号７−２７および３７の群、さらに好ましくは配列番号１７−２７、配列番号１４および配列番号３７の群より選択されるアミノ酸配列を含むドメインなどの露出ドメイン、またはその変異体より成る。露出ドメインは、定義の節で上述したように決定される。
【００６２】
さらに好ましいポリペプチドは、配列番号７−２７および３７の群より選択されるペプチドからの少なくとも１つのアミノ酸を含む、配列番号１−６および３６の群より選択されるポリペプチドのエピトープ、および前記エピトープの断片または変異体より成る。１つの好ましい実施形態において、エピトープのアミノ酸残基は、ポリペプチドの連続残基である。別の好ましい実施形態において、エピトープのアミノ酸残基は、ポリペプチドからの非連続残基である。さらに好ましい実施形態は、２を超えるなどの１を超える、好ましくは４を超えるなどの３を超える、配列番号７−２７および３７の配列の連続または非連続アミノ酸を含む。本発明は、本発明の方法のいずれかまたは好ましい方法における、そのようなエピトープの使用にも関する。
【００６３】
（配列番号７−３４および３７の群より選択されるアミノ酸配列より成る、または本質的に成る断片）
本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号７−３４および３７で示された断片の１つより本質的に成る、配列番号１−６および３６で示されたポリペプチドの１つの断片である。「本質的に成る」は、断片が配列番号７−３４および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列の実質的な部分を含み、それに加えてより小さい断片の片側または両側（Ｎ末端および／またはＣ末端）にあるポリペプチドからの１０以下の隣接残基を含有することを示すものである。「実質的な部分」は本明細書では、配列番号７−３４および３７で示されたアミノ酸配列のいずれかの、少なくとも５などの少なくとも２のアミノ酸を意味する。それゆえそのような断片は、配列番号７−３４および３７の群より選択される対応する断片と重複する。好ましくは、配列番号７−３４および３７で示されたアミノ酸配列のいずれかより本質的に成る断片は、その配列のアミノ酸配列全体を含む。それゆえ本発明の好ましい断片は、配列番号７−３４および３７で示された断片の１つを含み、それより本質的に成る、配列番号１−６および３６で示されたポリペプチドの１つの断片である。それゆえそのような断片は、配列番号７−３４および３７の群より選択される対応する断片よりも大きい。「含み、本質的に成る」は、より大きい断片が配列番号７−３４および３７の群より選択されるより小さいペプチドを含み、それに加えて小さい断片の片側または両側（Ｎ末端および／またはＣ末端）にあるポリペプチドからの１０以下の隣接残基を含有することを示すものである。好ましくは、より大きい断片は、より小さい断片の片側または両側に、６未満などの８未満の、例えば４未満、例えば２またはわずか１などの３未満の残基を含有する。
【００６４】
本発明の最も好ましいポリペプチドは、配列番号７−３４および３７の群より選択される断片である。それゆえそのような最も好ましいポリペプチドは、配列番号７で示された断片、または配列番号８で示された断片、または配列番号９で示された断片、または配列番号１０で示された断片、または配列番号１１で示された断片、または配列番号１２で示された断片、配列番号１３で示された断片、または配列番号１４で示された断片、または配列番号１５で示された断片、または配列番号１６で示された断片、または配列番号１７で示された断片、または配列番号１８で示された断片、または配列番号１９で示された断片、または配列番号２０で示された断片、または配列番号２１で示された断片、または配列番号２２で示された断片、または配列番号２３で示された断片、または配列番号２４で示された断片、または配列番号２５で示された断片、または配列番号２６で示された断片、または配列番号２７で示された断片、または配列番号２８で示された断片、または配列番号２９で示された断片、または配列番号３０で示された断片、または配列番号３１で示された断片、または配列番号３２で示された断片、または配列番号３３で示された断片、または配列番号３４で示された断片、または配列番号３７で示された断片などの、配列番号７−３４および３７で示された断片の群からの断片のいずれかを含む。本発明は、上の断片または本明細書で述べる他の断片のいずれかの変異体にも関する。
【００６５】
好ましくは、断片は、配列番号７で示された断片、または配列番号８で示された断片、または配列番号９で示された断片、または配列番号１０で示された断片、または配列番号１１で示された断片、または配列番号１２で示された断片、または配列番号１３で示された断片、または配列番号１４で示された断片、または配列番号１５で示された断片、または配列番号１６で示された断片、または配列番号３７などの配列番号７−１６および３７で示された断片の群、あるいはこれらの断片のいずれかの変異体より選択される。
【００６６】
（本発明の組成物）
本発明の１つ以上のポリペプチドを含む本発明の組成物は、各種の方法で、下で述べるような各種の用途に使用できる。１を超える本発明のポリペプチドをそのような組成物に含めると、重要な利点を備えることができる。例えば免疫付与またはワクチン接種は、複数のポリペプチドまたは断片が同時に導入されるときにさらに有効である。それゆえ主要な態様において、本発明は、本発明の１つ以上の細胞外アスペルギルスポリペプチドまたはポリペプチド断片を含む組成物に関する。本発明の好ましい組成物は、本発明の１つ以上の好ましいポリペプチド、すなわち上述のポリペプチドを含む組成物である。それゆえ本発明のいずれの好ましいポリペプチドも、本発明の好ましい組成物を生成するために使用できる。本発明の好ましい組成物は、本発明の１つ以上のポリペプチドおよび／または１つ以上のポリペプチド断片および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物である。
【００６７】
（ＣｓｓＩ、イソプロピルマレートデヒドロギナーゼＢおよびＧＡＰＤＨ−Ｂ）
発明者によって同定された３つの細胞外ポリペプチド、すなわちＣｓｓＩ、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ、およびＧＡＰＤＨ−Ｂは特に興味深い。
【００６８】
（ＣｓｓＩ）
本文書は、ＣｓｓＩ、新規な細胞表面露出／分泌タンパク質の最初の同定を示すデータを紹介する。このタンパク質は以前に、遺伝子予測プログラムの出力に基づいて仮定されていた。しかしながら発明者の研究は、このタンパク質の存在を確認し、表面に露出され、同時に周囲環境に分泌／放出も行われる分生子細胞壁結合タンパク質であることを明らかにした。このタンパク質の機能はまだ決定されていない。しかしながら透析物内でのその位置は、免疫反応を抑制する透析物の記録された能力の観点から興味深い（Ｈｏｂｓｏｎ  ＲＰ（２０００）Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．３８，１３３−１４１）。この抑制活性に関与するタンパク質を同定する試みは現在までに成功していない。特定の理論に制限されることなく、ＣｓｓＩがこれらの機能に関与すると考えられたが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓにおける分子生物学研究を実施する基本的な問題点のために、これらの機能がＣｓｓＩに帰するとは考えられなかった。タンパク質がＬＡＮＡ、すなわちヘルペスウィルスの転写レギュレータに相同性を示すことに注目するのは興味深い（以下実施例で参照）。再び特定の理論への制限なしに、ＣｓｓＩが同様の機能を所有する可能性が存在する。そうであるならば、ＣｓｓＩが真菌の内部にシグナルを送信する細胞外センサとして機能すると考えられる。あるいは、このタンパク質は宿主細胞への摂取時に活性となり、そこでその転写活性を利用して、真菌の利益のために宿主プロセスを妨害する。このタンパク質の他の考えられる機能は、宿主タンパク質の接着、侵襲、分生子細胞壁処理または酵素消化における役割を含む。
【００６９】
（イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ）
イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（ＩＭＤＨ  Ｂ）は、ロイシンの生合成に関与する酵素である。それは以前に、他の微生物にて細胞内で発見された。発明者は今や、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞表面画分中でこのタンパク質を同定した。酵素の一次配列は、これまでのシグナル配列を明らかにせず、それゆえ酵素が細胞表面に輸送される方法に関して疑問が生じる。特定の理論に制限されることなく、タンパク質熱ショックタンパク質と相互作用することと、熱ショックタンパク質が膜でのＩＭＤＨ  Ｂの転位置を仲介することが考えられる。同様の機構がＹｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ  １１２：４１−５０で他のタンパク質について述べられている。
【００７０】
（ＧＡＰＤＨ−Ｂ）
発明者は、ＧＡＰＤＨ−Ｂ、すなわち配列番号３のポリペプチドを最初に同定した。１つの態様において、本発明は配列番号３で示された配列、およびその変異体に関する。さらに本発明は、本発明の方法または好ましい方法のいずれかにおける配列番号３で示されたポリペプチドの使用に関する。
【００７１】
ＧＡＰＤＨは、解糖で機能することが記録されている。特定の理論に制限されることなく、ＧＡＰＤＨ−Ｂの細胞表面局在は、発芽の開始におけるこのタンパク質の役割を示唆しうる。環境条件が種の成長および繁殖とってさらに好ましくなったときに、休眠中の分生子がより発芽しやすいと仮定することは、論理的に見える。成長の１つの要求事項は、炭素源、例えばグルコースである。しかしながら休眠中の分生子は、その低代謝活性状態中に、外部環境条件を検知するある方法を持つ必要がある。細胞表面での解糖酵素の存在が細胞に外部環境が種の繁殖を支持するのに十分な状態であることを知らせるグルコース副生成物の生成を引き起こせることが考えられる。代わりに、または加えてタンパク質は、接着、侵襲、細胞内運動または細胞内生存などの他のプロセスで機能する。ＧＡＰＤＨタンパク質が細胞骨格成分に結合する能力を有することに注目するのも興味深い（例えばＴｉｓｄａｌｅ（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３３３４−３３４１を参照）。この機能は、基底膜に到達して、侵襲性疾患を引き起こすために、分生子に宿主細胞を横断できる機構を提供する。
【００７２】
（ポリペプチドおよび断片の生成）
本発明のポリペプチドおよび断片は、当業界で既知の従来技法によって合成によって生成できる。あるいはそれらは異種宿主細胞で組換えによって生成できる。それゆえ本発明は、本発明のポリペプチドおよび断片をコード化するポリヌクレオチド配列、そのようなポリヌクレオチド発現ベクター、およびそのようなポリヌクレオチドまたは発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞も含む。本発明のポリヌクレオチドの包括的な例は、配列番号３８および配列番号３９のポリヌクレオチドである。適切な宿主細胞は哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳまたはＨＥＫ２９３細胞でありうる。あるいは、昆虫細胞、細菌細胞または真菌細胞を使用できる。好ましい実施形態において、酵母細胞またはＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ以外の他のアスペルギルス種による細胞が使用される。上に挙げた細胞タイプでのポリヌクレオチド配列の異種発現および続いての生成ポリペプチドの精製の方法は、当業者に周知である。
【００７３】
好ましくは、本発明のポリペプチド、断片およびポリヌクレオチドが単離される。
【００７４】
（ワクチン接種）
真菌ポリペプチドまたはその断片の細胞外スペースへの露出は、宿主生物の免疫系によって検出されるようにすることが多い。さらにそのようなポリペプチドが本発明の細胞外ポリペプチドの場合などのように、比較的大きいコピー数を有する場合、そのようなポリペプチドまたはその断片は、抗体への標的として特に適切となる。
【００７５】
重要な態様において、本発明は、医薬、好ましくはワクチンの製造について本明細書で定義したポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物のいずれか１つ以上に関する。そのような医薬は好ましくは、哺乳類におけるコウジカビ感染の防止（すなわち予防処置）に使用できる。そのような使用において、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物は、活性免疫付与またはワクチン接種に使用される。したがって本発明は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を活性成分として含む、コウジカビ感染を処置するための医薬にも関する。
【００７６】
それゆえ本発明は、薬学的に受容可能なキャリアと
−配列番号１−６の細胞外Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ配列の群から選択される配列を含むポリペプチド、または前記配列のいずれかの抗原断片、あるいは
−前記ポリペプチドまたは断片をコード化する配列を含むポリヌクレオチド
を含むワクチンに関する。
【００７７】
さらに本発明は、個体に本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物のいずれかの製薬的有効量を投与するステップを含む、処置の方法に関する。好ましくは、処置は、保護免疫反応を生成する。好ましくは、医薬はヒトの処置または予防処置に使用される。好ましい実施形態は、前記医薬の前記製造または処置の前記方法のための、配列番号１、２、３または３６で示されたポリペプチドまたはこれらのポリペプチドの断片のいずれかの使用を含む。好ましくは本明細書で定義した好ましいポリペプチド断片のすべてを含む。
【００７８】
本方法の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは配列番号１、２、３、５、６、および３６の群より選択される。さらに好ましい実施形態において、提供されるポリペプチドは、ＣｓｓＩ（配列番号１）またはその断片、好ましくは配列番号７、８、１７、２６、２８、２９および／または３０で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む断片、あるいは前記ポリペプチドの変異体である。別のさらに好ましい実施形態において、提供されるポリペプチドはハイドロフォビン（配列番号２）またはその断片、好ましくは配列番号９、１０、１８および／または１９で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む断片、あるいは前記ポリペプチドの変異体である。よりさらに好ましい実施形態において、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）またはその断片、好ましくは配列番号１１、１２、２０、２１、２２、３１、３２および／または３３で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む断片、あるいはＧＡＰＤＨ−３の変異体または断片が提供される。なおよりさらに好ましい実施形態において、提供されるポリペプチドは、カタラーゼＡ（配列番号６）またはその断片、好ましくは配列番号３４で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む断片、あるいは前記ポリペプチドの変異体である。よりさらに好ましい実施形態において、提供されるポリペプチドは、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）あるいはその変異体または断片、好ましくは配列番号３７で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む断片である。
【００７９】
他の好ましい実施形態において、配列番号７で示された断片、または配列番号８で示された断片、または配列番号９で示された断片、または配列番号１０で示された断片、または配列番号１１で示された断片、または配列番号１２で示された断片、または配列番号１３で示された断片、または配列番号１４で示された断片、または配列番号１５で示された断片、または配列番号１６で示された断片などの、配列番号７−３４および３７の群から選択される断片、好ましくは配列番号７−１６の群から選択される断片が提供される。
【００８０】
活性免疫付与またはワクチン接種は、ＤＮＡ免疫付与技法を使用して間接的に、またはポリペプチドまたはその断片を使用して直接的に抗タンパク質抗体を産生することなどの、各種の方法で行われる。ポリペプチドは、前記哺乳類に２回などの１回超、例えば３〜５回などの３回、例えば１０〜２０回などの５〜１０回、例えば５０回超などの２０〜５０回投与される。各種のポリペプチドまたは断片は、同じ哺乳類に同時に、あるいは任意の順序で連続して投与することも考えられる。投与はいずれの方法によっても、例えば非経口的に、経口的にまたは局所的に行われる。好ましくは、しかしながらそれは注射、例えば筋肉内、皮内、静脈内または皮下注射によって、さらに好ましくは皮下または静脈内注射によって投与される。
【００８１】
投薬量の決定、アジュバントおよび／または薬学的に受容可能なキャリアの使用などの、活性免疫付与のための適切なプロトコルを決定するための方法は、当業者に既知である。これに限定されるわけではないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメットゲラン菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含む各種のアジュバントを使用して、宿主種に応じて免疫反応を向上させることができる。
【００８２】
（抗体）
別の主要な態様において、本発明は、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）から選択される細胞外Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓポリペプチドを結合できる単離抗体に関する。
【００８３】
好ましい実施形態において、抗体は、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）およびカタラーゼＡ（配列番号６）からなる群より選択されるポリペプチドを結合できる。さらに好ましくは、抗体は、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）およびＣｓｓＩ（配列番号１）からなる群より選択されるポリペプチドを結合できる。最も好ましくは、抗体はイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）を結合できる。
【００８４】
抗体の標的ポリペプチドへの結合の好ましい親和性は、１０−４Ｍ未満などの５×１０−４Ｍ未満の、例えば１０−５Ｍ未満などの５×１０−５Ｍの、例えば１０−６Ｍ未満などの５×１０−６Ｍ未満の、例えば１０−７Ｍ未満などの５×１０−７Ｍ未満の、例えば１０−８Ｍ未満などの５×１０−８Ｍ未満の、例えば１０−９Ｍ未満などの５×１０−９Ｍ未満の、例えば１０−１０Ｍ未満などの５×１０−１０Ｍ未満の、例えば１０−１１Ｍ未満などの５×１０−１１Ｍ未満の、例えば１０−１２Ｍ未満などの５×１０−１２Ｍ未満の、例えば１０−１３Ｍ未満などの５×１０−１３Ｍ未満の、例えば１０−１４Ｍ未満などの５×１０−１４Ｍ未満の、例えば５×１０−１５Ｍ未満、または１０−１５Ｍ未満の、解離定数またはＫｄを持つものを含む。結合定数は、ＥＬＩＳＡ（例えばＯｒｏｓｚ  ａｎｄ  Ｏｖａｄｉ（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７０：１５５−１６２に述べられているような）または表面プラスモン共鳴解析などの、当業界で周知の方法を使用して決定できる。
【００８５】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、インタクトなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞を結合できる、すなわちその構造完全性を維持した生きたまたは死んだアスペルギルス細胞、好ましくは原形質膜の完全性を維持する（すなわち原形質膜が膜透過されていない）細胞を結合できる。抗体のインタクトな細胞への結合は例えば、本明細書の実施例で述べるように試験できる。
【００８６】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の抗体または少なくともそのＦａｂ断片は、本明細書の実施例で述べたようなインビトロアッセイ構成において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子の肺上皮への接着を低減でき、好ましくは前記接着を少なくとも４０％などの少なくとも２０％、例えば少なくとも６０％または少なくとも８０％低減させる。
【００８７】
さらに、本発明の抗体、または少なくともそのＦａｂ断片は、本明細書の実施例で述べたようなインビトロアッセイ構成において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子の発芽を低減できることが好ましく、好ましくは前記接着を少なくとも４０％などの少なくとも２０％、例えば少なくとも６０％または少なくとも８０％低減させる。
【００８８】
本発明の抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号６および配列番号３６の群より選択されるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ標的ポリペプチドを特異的に認識および結合できる。「特異的に」はこの文脈において、絶対特異性を意味するものではない。それゆえ「種特異的な」は、他の真菌からの相同ポリペプチドに結合できないことを示すときに使用される。
【００８９】
ある実施形態において、本発明の抗体はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓポリペプチドを結合できることに加えて、別の真菌からの相同ポリペプチドを結合できる。例えばこれらの実施形態において、本発明の抗体はさらに相同ポリペプチドを結合可能であり、ここで相同ポリペプチドは、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）からなる群より選択されるポリペプチドに対する４２％以上などの３９％以上の、例えば６８％以上などの４８％以上の、例えば９０％以上などの８０％以上を有する。好ましいのは、以下の種の１つを起源とする相同ポリペプチドを結合できる抗体である：
−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｅａなどのコウジカビ種、
−Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、
−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
−Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓなどのカンジダ種、
−Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、またはＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓなどのＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、
−Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓなどのＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、
−Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、
−Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ種、
−アオカビ種、
−Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ。
さらに好ましくは、相同ポリペプチドは
−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｅａなどのコウジカビ種、
−Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、
−Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ
または
−Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ
を起源とする。
【００９０】
１つの詳細な実施形態において、本発明の抗体はさらに、配列番号４１のポリペプチドなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓも起源とする相同ポリペプチドを認識する。
【００９１】
上述の実施形態のタイプの好ましい実施例において、前記相同ポリペプチドは細胞外でもある。それゆえＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓポリペプチドと相同ポリペプチドの両者に結合できる抗体は、相同ポリペプチドが発生する種のいずれか１つ以上のインタクトな細胞、すなわち：
−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｅａなどの、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ以外のコウジカビ種、
−Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、
−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
−Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓなどのカンジダ種
−Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、またはＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓなどのＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、
−Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓなどのＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、
−Ｆｕｓａｒｉｕｍ種
−Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ種、
−アオカビ種、
および
−Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ
の１つを結合することができる。
【００９２】
本発明の抗体の、相同ポリペプチドおよび／または他の真菌の他のインタクトな細胞への結合は、本明細書で実施例に述べた方法によって、または当業界で既知の他の標準方法によって試験できる。
【００９３】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、４、５、６、７、８以上の連続アミノ酸の相同ポリペプチドとの同一性を有する配列番号３６の領域などの、他の真菌からの相同ポリペプチドに対して著しい同一性を有する配列番号３６の領域内に含まれる１つ以上のアミノ酸残基を結合できる。最も好ましくは、本発明の抗体は、完全に配列番号３６のこれらの領域の１つに含まれる残基より成るエピトープを含む。特に以下の領域が好ましい：Ｓｅｒ６７−Ｌｅｕ７１、Ａｌａ７４−Ｔｒｐ８０、Ｓｅｒ１９１−Ａｒｇ２０５、Ｌｅｕ２６８−Ｌｅｕ２７３、Ｈｉｓ２９２−Ｐｒｏ２９６、Ｇｌｕ３５５−Ｉｌｅ３６０、Ａｓｐ１９３−Ｇｌｕ２０９、Ａｓｐ１９３−Ａｌａ１９９、Ｉｌｅ１５−Ｖａｌ１９、Ｖａｌ７５−Ｔｒｐ８０、およびＰｒｏ１１−Ｇｌｕ１８。さらに好ましいのは、配列番号３７の１つ以上の残基を含む−配列番号３６のエピトープに結合する抗体である。エピトープマッピングの方法は、当業界で周知である。
【００９４】
実施形態の別のセットにおいて、本発明の抗体は１つ以上の別の真菌からのインタクトな細胞を結合できない。例えば１つのそのような実施形態において、抗体は
−Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、
−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
−Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、
−Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、またはＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、
−Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、または
−Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ
のいずれのインタクトな細胞も結合できない。
さらに好ましくは、本発明の抗体は
−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ
−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ
−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｅａ、
−Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、
−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
−Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、
−Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、またはＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、
−Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、
または
−Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ
のいずれのインタクトな細胞も結合できない。
１つの詳細な実施形態において、本発明の抗体は、種特異的である、すなわちＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ以外の他の真菌からの相同ポリペプチドまたはインタクトな細胞を結合できない。
【００９５】
本発明は、本発明の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物にも関する。
【００９６】
（抗体および機能的同等物の産生）
別の態様において、本発明は、非ヒト動物での配列番号１−６および３６で示されたポリペプチドの群より選択されるポリペプチドに対する特異的抗体を産生する方法であって、
ａ．配列番号１−６および３６で示されたポリペプチドの群より選択されるポリペプチドまたは本出願で定義したポリペプチド断片の群より選択されるポリペプチド、あるいはこれらのポリペプチドのいずれかを発現する細胞を提供するステップと、
ｂ．前記ポリペプチドまたは前記細胞を含む組成物を前記動物に導入するステップと、
ｃ．前記動物において抗体を産生するステップと、
ｄ．抗体を単離して、場合により精製するステップと、
を含む方法に関する。
【００９７】
上の方法の１つの実施形態において、提供されるポリペプチドはＣｓｓＩ（配列番号１）またはその断片、あるいは前記ポリペプチドの変異体である。上の方法の別の実施形態において、提供されるポリペプチドは、ハイドロフォビン（配列番号２）またはその断片、あるいは前記ポリペプチドの変異体である。上の方法のなお別の実施形態において、提供されるポリペプチドはＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）またはその断片、あるいは前記ポリペプチドの変異体である。上の方法のなおさらなる実施形態において、提供されるポリペプチドはカタラーゼＡ（配列番号６）またはその断片、あるいは前記ポリペプチドの変異体である。そして上の方法のよりさらなる実施形態において、提供されるポリペプチドはイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）またはその断片、または前記ポリペプチドの変異体である。
【００９８】
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、およびＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって作成された断片、抗イディオタイプ抗体、抗体断片を含むハイブリッド、ならびにこれらのいずれかのエピトープ結合断片も含む。用語は、モノクローナル抗体の混合物も含む。
【００９９】
ある実施形態において、本発明の抗体はポリクローナルである。ポリクローナル抗体は、発明者によって同定された細胞外ポリペプチドの１つ、あるいはその断片、エピトープまたは変異体などの、抗原によって免疫付与された動物の血清に由来する抗体分子の非相同的個体群である。ポリクローナル抗体の生成では、宿主動物はアジュバントを添加したポリペプチドを用いた注射によって免疫付与できる。免疫付与動物の抗体力価は、固定化ポリペプチドを使用したＥＬＩＳＡなどの標準技法によって経時的に監視できる。所望ならば、抗体分子はＩｇＧ画分を得るために、動物から、例えば血液から単離して、タンパク質Ａクロマトグラフィーなどの周知の技法によってさらに精製できる。
【０１００】
それゆえ好ましい実施形態において、免疫反応を産生する上述の方法は、前記免疫反応で産生された抗体を単離および精製するステップｄを含む。
【０１０１】
他の実施形態において、本発明の抗体はモノクローナルである。特定のエピトープに対する抗体の非相同性個体群であるモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞系による抗体分子の生成を規定するどの技法によっても得られる。これらは、これに限定されるわけではないが、Ｋｏｈｌｅｒ  およびＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技法（（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７；およびＵ．Ｓ．４，３７６，１１０）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０，２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）を含む。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのすべてのサブクラスを含むいずれの免疫グロブリンクラスの抗体でもよい。好ましいクラスは、ＩｇＧ１である。本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、試験管内または生体内で培養できる。
【０１０２】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを作成する代わりに、本発明のポリペプチドに対して作られたモノクローナル抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（例えば抗体ファージディスプレイライブラリ）を興味のあるポリペプチドまたはその断片によりスクリーニングすることによって、同定および単離できる。ファージディスプレイライブラリを産生およびスクリーニングするためのキットが市販されている（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰＴＭ  Ｐｈａｒｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２４０６１２）。加えて、抗体ディスプレイライブラリの産生およびスクリーニングでの使用に特に適した方法および試薬の例は例えばＵ．Ｓ．５，２２３，４０９；ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９１／１７２７１；ＷＯ  ９２／２０７９１；ＷＯ  ９２／１５６７９；ＷＯ  ９３／０１２８８；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／０９６９０；ＷＯ  ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３，８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６，１２７５−１２８１；およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，７２５−７３４に見出せる。
【０１０３】
加えて、標準組換えＤＮＡ技法を使用して作成できる、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体は、本発明の範囲内である。
【０１０４】
キメラ抗体は、マウスｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子などの、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である（例えば参照によりその全体が本明細書に組み入れられているＵ．Ｓ．４，８１６，５６７；およびＵ．Ｓ．４，８１６，３９７を参照）。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する非ヒト種からの抗体分子である（例えば参照によりその全体が本明細書に組み入れられているＵ．Ｓ．５，５８５，０８９を参照）。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えばＷＯ  ８７／０２６７１；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １８４，１８７；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １７１，４９６；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １７３，４９４；ＷＯ  ８６／０１５３３；Ｕ．Ｓ．４，８１６，５６７；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １２５，０２３．Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎｉｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎａｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２２５，５３９；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｂｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０；ａｎｄ  Ｗｅｓｔｉｎ  Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，２０１−２０４に述べられている方法を使用して、当業界で既知の組換えＤＮＡ技法によって生成できる。
【０１０５】
非常に好ましい実施形態において、本発明の抗体はヒト抗体である。完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療処置に特に望ましい。そのような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖遺伝子を発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使用して生成できる。トランスジェニックマウスは、選択した抗原、例えば本発明のポリペプチドのすべてまたは断片によって、通常の方法で免疫付与される。抗原に対して作られたモノクローナル抗体は、例えば従来のハイブリドーマ技術を使用して得られる。トランスジェニックマウスによって内包されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子はＢ細胞分化中に転位し、続いてクラス転換および体細胞変異を受ける。それゆえそのような技法を使用すると、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を生成することが可能である。ヒト抗体を生成するこの技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）を参照。
【０１０６】
ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するこの技術ならびにそのような抗体を生成するプロトコルの詳細な議論については、例えばＷＯ  ０２／４３４７８；Ｕ．Ｓ．５，６２５，１２６；Ｕ．Ｓ．５，６３３，４２５；Ｕ．Ｓ．５，５６９，８２５；Ｕ．Ｓ．５，６６１，０１６；およびＵ．Ｓ．５，５４５，８０６を参照。選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技法を使用して産生できる。この手法では、選択した非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，８９９−９０３を参照）。
【０１０７】
ヒトモノクローナル抗体の生成に非常に適切な方法は、ＷＯ  ０４／０３５６０７（Ｇｅｎｍａｂ）およびＷＯ  ０４／０４３９８９（Ｍｅｄａｒｅｘ）に述べられている。さらに同様の方法がＷＯ  ０３／０１７９３５（Ｇｅｎｍａｂ）、ＷＯ  ０２／１００３４８（Ｇｅｎｍａｂ）、ＷＯ０２／０６４６３４（Ｍｅｄａｒｅｘ）およびＷＯ  ０３／０４０１６９（Ｍｅｄａｒｅｘ）に述べられている。
【０１０８】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の技法によって産生できる。例えばそのような断片は、これに限定されるわけではないが：抗体分子のペプシン消化によって生成できるＦ（ａｂ’）２断片およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成できるＦａｂ断片を含む。あるいはＦａｂ発現ライブラリを作成すると（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６，１２７５−１２８１）、所望の特異性を備えたモノクローナルＦａｂ断片の迅速で容易な同定が可能となる。
【０１０９】
本発明の抗体は、２つの結合特異性を有する二重特異性抗体も含み、その少なくとも１つは、配列番号１−６および３６の群より選択される、好ましくは配列番号１−４および３６の群より選択されるポリペプチドに対する特異性である。
【０１１０】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は精製される。
【０１１１】
（抗体処置）
抗体は、哺乳類、好ましくはヒト、さらに好ましくは免疫不全患者の受動免疫付与に使用できる。抗体による処置は、コウジカビ感染を治療または防止するために行える。それゆえ本発明は、医薬、好ましくは真菌感染の処置または、好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ感染などのコウジカビ感染の予防処置（防止）のための医薬の製造への本明細書で定義した抗体の使用に関する。真菌感染の例は、侵襲性アスペルギルス症、アスペルギルス腫、およびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症などのアレルギー性アスペルギルス症である。
【０１１２】
別の方法で表現すると、本発明は、医薬として使用するための本明細書で定義したような抗体および本明細書で定義したような組成物に関する。本発明は、個体に本明細書で定義したような本発明の抗体の製薬的有効量を投与するステップを含む方法、および本発明の抗体を活性成分として含む、コウジカビ感染を処置するための医薬に関する。
【０１１３】
本発明の抗体は、以下の好ましい群に機械的に分割される：
１．抗真菌剤として作用する機能抑制抗体（すなわち真菌の生存度に影響を及ぼし、殺真菌および静真菌効果の両方を含む）。そのような抗体は、患者の免疫状態に関わらず有効なはずである。抗体のこのカテゴリは、疾患に必要なタンパク質を遮断する病原抑制抗体（接着／侵襲）、および発芽および／または胞子形成に必要なタンパク質を遮断する成長抑制抗体を含む。
２．食細胞殺菌を向上させるために設計されたオプソナイズ化抗体。そのような抗体の有効性は、患者の免疫状態によって変わるが、易感染性患者においてさえ食細胞殺菌を向上させることが確実に可能である。オプソナイズ化抗体は、補体および食菌を介した免疫系による排除を向上させる抗体も含む。
３．真菌表面成分に対して作られた、毒素または殺真菌剤などの治療部分、例えばリシンまたは放射性同位体に結合した抗体。治療部分を抗体に結合する技法は周知であり、例えばＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２，１１９−１５８を参照。これらの抗体も、患者の免疫状態に関わらず有効なはずである。
【０１１４】
標的および抗体のバリデーションは、当業界で既知の以下の方法によって行える：
−侵襲アッセイ−肺細胞中へのアスペルギルスの侵襲が防止されるかどうかを試験
−接着アッセイ−肺細胞への接着および肺細胞のコロニー形成が防止されるかどうかを試験
−発芽アッセイ−成長および発芽が防止されるかどうかを試験
−オプソナイズ化アッセイ−機能が阻害されるかどうか、そして排除が容易になるかどうかを試験
−凝集アッセイ−クランピングが防止されるかどうか、そして排除が容易になるかどうかを試験
−侵襲性疾患動物モデル−疾患が防止されるかどうかを試験
別の態様において、本発明は、抗体、例えば本発明のヒトモノクローナル抗体を含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤はもちろんのこと、その他の既知のアジュバントおよび賦形剤を用いて、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に開示されている方法などの従来技法に従って調合できる。
【０１１５】
薬学的組成物は、いずれの適切な経路および方式によっても投与できる。当業者によって認識されるように、投与の経路および／または方式は、所望の結果によって変化するであろう。本発明の薬学的組成物は、経口、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、経直腸、経膣および／または非経口投与に適切な薬学的組成物を含む。経膣投与に適切な本発明の剤形は、当業界で適切であることが既知であるそのようなキャリアを含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー剤形である。本発明の組成物の局所または経皮投与のための投薬形は、粉剤、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、液剤、パッチおよび吸入薬を含む。
【０１１６】
薬学的組成物は好ましくは、非経口的に投与される。「非経口投与」および経口的に投与される」という表現は本明細書で使用するように、経腸および局所投与を除く、通常は注射による投与方式を意味し、制限なく静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および輸液を含む。１つの実施形態において、薬学的組成物は静脈内または皮下注射または輸液によって投与される。１つの実施形態において、本発明の抗体は、皮下注射によって結晶形で投与される、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ，１００（１２）：６９３４−６９３９を参照。
【０１１７】
選択した投与経路に関わらず、薬学的に受容可能な塩の形または適切な水和形で使用される本発明の化合物、および／または本発明の薬学的組成物は、当業者に既知の従来方法によって薬学的に受容可能な投薬形に処方される。
【０１１８】
本明細書で使用されるように、「薬学的に受容可能なキャリア」は、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤、抗酸化剤および吸収遅延剤、生理的に適合するそのようなものを含む。薬学的に受容可能なキャリアは、無菌注射液剤または分散剤を即時に調製するための、無菌水溶液または分散物および無菌粉末を含む。製薬的活性物質のためのそのような溶媒または薬剤の使用は、当業界で既知である。従来の溶媒または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の薬学的組成物でのその使用が考慮される。好ましくは、キャリアは非経口投与、例えば静脈内または皮下注射または輸液に適切である。薬学的組成物は通例、製造および保管条件下で滅菌および安定でなければならない。組成物は、液剤、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬剤濃度に適した他の秩序構造として処方できる。本発明の薬学的組成物で利用される適切な水性または非水性キャリアの例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにエチルオレアートなどの注射用有機エステルを含む。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング材料の使用により、分散物の場合には必要な粒径の維持により、そして界面活性剤の使用により維持できる。薬学的組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有する。微生物の存在の防止は、滅菌手順と、各種の抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの包含との両方によって確実になる。糖、マンニトール、ソルビトール、グリセロールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含むことも望ましい。薬学的に受容可能な抗酸化剤、例えば（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システインヒドロクロライド、ナトリウムビサルフェート、ナトリウムメタビスルファイト、ナトリウムスルファイトなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えばアスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガラート、アルファトコフェロールなど；（３）金属キレート化剤、例えばクエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸なども含まれる。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアレート塩およびゼラチンを含めることによって引き起こすことができる。無菌注射溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて例えば上に挙げたような成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒に包含させることと、それに続く滅菌精密濾過によって調製できる。一般に、分散物は、塩基性分散媒および例えば上に挙げたものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに活性化合物を包含させることによって調製である。無菌注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、前に滅菌濾過したその溶液から活性成分および追加の所望の成分の粉末を与える、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１１９】
適切な場合、抗体は、適切な水和形または薬学的に受容可能な塩の形で使用される。「薬学的に受容可能な塩」は、親化合物の所望の生物活性を保持して、望ましくない毒性効果を一切付与しない塩を指す（例えばＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。そのような塩の例は、酸添加塩および塩基添加塩を含む。酸添加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸はもちろんのこと、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来するものもを含む。塩基添加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属はもちろんのこと、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどのアミンに由来するものも含む。
【０１２０】
投与経路によって、活性化合物、すなわち抗体、および二重特異性／多重特異性分子は、化合物を不活性化する酸または他の自然条件から化合物を保護する物質内にコーティングできる。例えば化合物は、適切なキャリア、例えばリポソーム内で対象に投与できる。リポソームは、従来のリポソームと同様に、ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ  ＣＧＦ乳濁剤も含む（Ｓｔｒｅｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）。活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化システムを含む制御放出剤形などの、急速放出から化合物を保護するキャリアを用いて調製できる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用できる。そのような剤形の調製方法は概して、当業者に既知である。例えばＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．  Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照。
【０１２１】
薬学的組成物は、当業界で既知の医療器具を用いて投与できる。例えば好ましい実施形態において、本発明の治療用組成物はＵＳ  ５，３９９，１６３、ＵＳ  ５，３８３，８５１、ＵＳ  ５，３１２，３３５、ＵＳ  ５，０６４，４１３、ＵＳ  ４，９４１，８８０、ＵＳ  ４，７９０，８２４、またはＵＳ  ４，５９６，５５６で開示された器具などの皮下注射器具の必要なしに投与できる。本発明で有用な周知のインプラントおよびモジュールの例は：制御された速度で医薬を投薬するためのインプラント型マイクロ輸液ポンプを開示する、ＵＳ  ４，４８７，６０３；皮膚を通じて医薬を投与するための治療器具を開示する、ＵＳ  ４，４８６，１９４；正確な輸液速度にて医薬を送達するための医薬輸液ポンプを開示する、ＵＳ  ４，４４７，２３３；連続薬剤送達のための可変流インプラント型輸液装置を開示する、ＵＳ  ４，４４７，２２４；多室コンパートメントを有する浸透圧薬剤送達システムを開示する、ＵＳ  ４，４３９，１９６；および浸透圧薬剤送達システムを開示する、ＵＳ  ４，４７５，１９６を含む。多くの他のそのようなインプラント、送達システム、およびモジュールは当業者に既知である。
【０１２２】
ある実施形態において、本発明の抗体は生体内での適正な分布を確実にするように処方できる。例えば血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高度親水性化合物を排除する。本発明の治療用化合物に（所望ならば）ＢＢＢを通過させるために、それらは例えばリポソーム中に処方することができる。リポソームを製造する方法については、例えばＵＳ  ４，５２２，８１１；ＵＳ  ５，３７４，５４８；およびＵＳ  ５，３９９，３３１を参照。リポソームは、特異性細胞または器官内に選択的に送達される１つ以上の部分を含み、それゆえ標的化薬剤送達を向上させる（例えばＶ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５）。標的部分の例は、葉酸塩またはビオチン（例えばＬｏｗ  ｅｔ  ａｌへのＵＳ  ５，４１６，０１６を参照）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；表面活性剤タンパク質Ａレセプタ（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）、本発明の分子の成分と同様に、本発明の調合物を含む異なる種；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）を含む；Ｋ  Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３も参照。本発明の１つの実施形態において、本発明の治療化合物はリポソーム中で処方される；さらに好ましい実施形態において、リポソームは標的部分を含む。最も好ましい実施形態において、リポソーム内の治療化合物は、ボーラス注射によって所望のエリアに隣接した部位、例えば感染部位に送達される。組成物は容易な注射可能性が存在する程度まで流動性でなければならない。製造および保管の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されねばならない。
【０１２３】
さらなる実施形態において、本発明の抗体は、胎盤を介したその輸送を防止または低減するために処方できる。これは当業界で既知の方法によって、例えば抗体のＰＥＧ化によってまたはＦ（ａｂ’）２断片の使用によって行える。さらなる参照は「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ−Ｒｕｎｄｌｅｓ」  Ｃ，  Ｚｈｕｏ  Ｚ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｂ，Ｋｅｅｎａｎ  Ｊ．（１９９２）  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１５２：１７７−１９０；およびＬａｎｄｏｒ  Ｍ．（１９９５）Ｍａｔｅｒｎａｌ−ｆｅｔａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ａｎｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７４：２７９−２８３に行える。
【０１２４】
投薬計画は、最適な所望の反応（例えば治療反応）を提供するように調整される。例えばシングルボーラスが投与され、複数に分割された用量が経時的に投与されるか、または用量は治療状況の要求によって指示されるように比例的に削減または増加される。投与の容易さおよび投薬の均一性のために、非経口組成物を投薬単位形で処方することが特に好都合である。本明細書で使用するように投薬単位形は、処置される対象の１回投薬量に適した物理的に別個の単位を指す；各単位は、要求された製薬的キャリアと共に要求された治療効果を生成するように計算された活性化合物の規定量を含有する。本発明の投薬単位形についての明細は、（ａ）活性化合物の独自の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに（ｂ）そのような活性化合物を個体の感受性の処置のために調合する業界において固有の制限によって指示されるか、直接それらに依存する。本発明の薬学的組成物における実際の投薬レベルは、患者に対して毒性とならずに、特定の患者、組成物、および投与方式に関して要求された治療反応を達成するために有効な活性成分の量を得るため変更できる。選択した投薬レベルは、利用される本発明の特定の組成物、あるいはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、利用される特定の化合物の排出速度、利用される特定の組成物と併せて使用される処置、他の薬剤化合物および／または物質の持続時間、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般健康状態および以前の病歴、ならびに医療界で周知の同様の因子を含む、各種の薬物動態学的因子に依存するであろう。当業界の医師または獣医師は、要求された薬学的組成物の有効量をただちに決定および処方できる。例えば医師または獣医師は、薬学的組成物中で利用される本発明の化合物の用量を、要求された治療効果を達成するために要求された用量よりも低いレベルで開始して、要求された効果が達成されるまでその投薬量を徐々に増加することができる。一般に、本発明の組成物の適切な１日用量は、治療効果を生成するのに有効である最も少ない用量である化合物のその量となるであろう。そのような有効な用量は概して、上述の因子に依存するであろう。投与は静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であることが好ましく、好ましくは標的部位に隣接して投与される。所望ならば、治療組成物の有効な１日用量は、その日の間に適切な間隔で個別に投与される２、３、４、５または６回以上のサブ用量として、場合により単位投薬形で投与できる。本発明の化合物は単独で投与することが可能であるが、化合物を製薬剤形（組成物）として投与することが好ましい。
【０１２５】
１つの実施形態において、本発明による抗体は、２００〜４００ｍｇ／ｍ２などの１０〜５００ｍｇ／ｍ２の１週または１日投薬量で輸液によって投与できる。そのような投与は、例えば３〜５回などの１〜８回反復できる。投与は、２〜１２時間などの２〜２４時間の期間に渡る連続輸液によって実施できる。別の実施形態において、毒性副作用を低減するために、ヒトモノクローナル抗体を低速の連続輸液によって、２４時間超などの長期間に渡って投与できる。なお別の実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、例えば３００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇまたは２０００ｍｇなどの２５０ｍｇ〜２０００ｍｇの１週用量で、４〜６回などの最大８回に渡って投与できる。投与は、２〜１２時間などの２〜２４時間の期間に渡って、連続輸液によって実施される。そのような投与計画は、例えば６ヶ月または１２ヶ月後に１回以上反復される。まだ別の実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は維持療法によって、６ヶ月以上の期間に渡って例えば週１回などで投与できる。
【０１２６】
（併用処置）
本発明の薬学的組成物は、本発明の抗体の１つまたは組合せを含有する。それゆえさらなる実施形態において、薬学的組成物は、異なる機構で作用する本発明の複数の（例えば２つ以上の）単離された抗体の組合せを含む。
【０１２７】
本明細書で定義する抗真菌感染の処置、例えば本明細書で定義する細胞外アスペルギルスポリペプチドを特異的に認識および結合する抗体による受動免疫付与も、他のタイプの療法、例えば他の抗真菌療法と併用できる。それゆえそれに結合した治療部分を持つまたは持たない抗体は、単独でまたは抗真菌化学療法薬または他の治療剤と組合せて投与される治療薬として使用できる。例えば本明細書で定義する抗体を用いた処置は、アゾール（例えばフルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール）、アンホテリシンＢ、フルシトシンなどの抗真菌化合物、またはカスポファンギンなどのエキノカンジンを用いた処置と併用できる。あるいはまたは加えて、本明細書で定義する抗体を用いた処置は、他の抗真菌抗体、例えばＭｙｃｏｇｒａｂなどのＨＳＰ９０に対して作られた抗体を用いた処置と併用できる（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ａｎｔｉｍｉｃｒ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４７：２２０８−２２１６）。
【０１２８】
併用療法はある状況においては、単一成分療法よりも効果的でありうる。併用療法は、複数の真菌種による感染に苦しむ患者、例えばＣａｎｄｉｄａおよびコウジカビ感染の両方を有する患者にとって特に有用でありうる。
【０１２９】
（細胞外ポリペプチドの結合パートナーおよび阻害物質）
抗体に加えて、細胞外ポリペプチドに対する他のタイプの結合パートナーを同定することが興味深い。病原性真菌の細胞外ポリペプチドは、宿主生物と相互作用することが多い。細胞外ポリペプチドの結合パートナーはいずれのタイプも宿主−病原菌相互作用を妨害する。それゆえ結合パートナーは、真菌の病原性をアンタゴナイズする。
【０１３０】
配列番号１−６および３６で示された細胞外ポリペプチド、またはその断片の結合パートナーの同定は、本発明の別の主要な態様である。これは生化学的または細胞ベースの方法を使用して行われる。
【０１３１】
（生化学的方法）
主要な態様において、本発明は、本発明のポリペプチドおよび／または配列番号１−６および３６の群より選択されるポリペプチドの結合パートナーを同定する方法であって、
ａ．本発明で定義した本発明のポリペプチドまたは配列番号１−６および３６の群より選択されるポリペプチドを提供するステップと、
ｂ．前記ポリペプチドを推定上の結合パートナーに接触させるステップと、
ｃ．前記推定上の結合パートナーが前記ポリペプチドに結合できるかどうかを判定するステップと
を含む方法に関する。
【０１３２】
それゆえ上の方法の１つの実施形態において、提供されるポリペプチドはＣｓｓＩ（配列番号１）またはその断片、あるいは前記ポリペプチドの変異体である。別の実施形態において、提供されるポリペプチドはハイドロフォビン（配列番号２）またはその断片、あるいは前記ポリペプチドの変異体である。別の実施形態において、提供されるポリペプチドはＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）またはその断片、あるいは前記ポリペプチドの変異体である。なお他の実施形態において、提供されるポリペプチドはカタラーゼＢ（配列番号５）またはその断片、あるいは前記ポリペプチドの変異体である。さらなる実施形態において、提供されるポリペプチドはカタラーゼＡ（配列番号６）またはその断片、あるいは前記ポリペプチドの変異体である。よりさらなる実施形態において、提供されるポリペプチドはイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）またはその断片、あるいは前記ポリペプチドの変異体である。
【０１３３】
本発明の本方法の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号１で示されたポリペプチド、または配列番号２で示されたポリペプチド、または配列番号３で示されたポリペプチド、または配列番号５で示されたポリペプチド、または配列番号６で示されたポリペプチド、または配列番号３６で示されたポリペプチドなどの、配列番号１，２、３、５、６、および３６の群より選択される。他の好ましい実施形態において、配列番号７−３４および３７で示された配列の１つ以上のアミノ酸残基を含む配列番号１−６および３６で示されたポリペプチドの１つの露出ドメイン、エピトープまたは断片がステップａで提供される。さらなる好ましい実施形態において、配列番号７−３４および３７の群より選択される断片、好ましくは配列番号７−２７および３７の群から選択される断片、または配列番号７−２７および３７で示されたアミノ酸配列のいずれかの断片の変異体が提供される。
【０１３４】
本方法の好ましい実施形態において、例えばカラムまたはマイクロタイタープレートなどの固体担体に固定化されたポリペプチドまたはその断片が提供され、接触ステップの後に、推定上の結合パートナーが固体担体に結合されたかどうかが判定される。ポリペプチドまたはその断片の固定化は、固体担体への直接結合によるか、または例えば特異的抗体を使用した間接結合による。検出の特異性を改善するために、好ましい実施形態において、接触ステップと判定ステップの間に洗浄ステップが実施される。さらなる好ましい実施形態において、推定上の結合パートナーが標識される。推定上のパートナーは、接触が行われる前に標識できる。あるいは標識は接触ステップの後にも実施できる。さらに本方法のある実施形態において、ポリペプチドまたはその断片が結合パートナーに結合された後に、固定化が実施される。好ましい実施形態において、方法は複数の推定上の結合パートナーについて反復される。推定上の結合パートナーは宿主由来分子を含む。
【０１３５】
あるいは本発明のポリペプチドまたは配列番号１、２、４、５、６および３６の群より選択されるポリペプチドの結合パートナーは、以下のように同定される：精製された宿主膜は電気泳動によって分離され、膜へブロットされて、興味のあるポリペプチドまたはその断片を用いて培養される。次に結合は、興味のあるポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を使用して検出できる。ポリペプチドまたはその断片が結合した宿主結合パートナーは続いて、ブロットからの溶離および質量分析法による、または当業界で既知の他の技法による続いての解析によって同定できる。
【０１３６】
病原性生物の細胞外ポリペプチドの結合パートナーが宿主由来分子である場合、細胞外ポリペプチドと宿主とのそのような相互作用は真菌の病原性にとって重要である。それゆえ細胞外ポリペプチドと宿主結合パートナーとの相互作用を妨害する化合物は、真菌感染の防止または処置に適切である。したがって本発明の別の方法は、配列番号１−６および３６の群より選択される細胞外アスペルギルスポリペプチドまたはその断片と宿主結合パートナーとの相互作用のインヒビターを同定する方法であって：
ａ．配列番号１−６および３６の群より選択されるポリペプチド、またはその断片を提供するステップと、
ｂ．前記ポリペプチドの宿主由来結合パートナーを提供するステップと、
ｃ．前記相互作用の推定上のインヒビターの非存在下で、前記ポリペプチドを前記宿主由来結合パートナーと接触させるステップと、
ｄ．前記推定上のインヒビターの存在下で前記ポリペプチドを前記宿主由来結合パートナーと接触させるステップと、
ｅ．ステップｄから発生した前記ポリペプチドの前記宿主由来結合パートナーへの結合強度が、ステップｃから生じた結合強度と比較して低下したかどうかを判定するステップと、
を含む方法に関する。
【０１３７】
ある実施形態において、ステップｃおよびｄは、２つの異なるサンプルコンパートメントにて実施される。他の実施形態において、ステップｄは、推定上のインヒビターをステップｃの混合物を添加することによって実施される。好ましい実施形態において、配列番号７−３４および３７の群より選択される断片は、ステップａにおいて提供される。他の好ましい実施形態において、配列番号１、２、３、５、６、または３６のポリペプチドが提供される。さらなる好ましい実施形態において、方法は複数の推定上の阻害物質について反復される。さらに特に興味深いのは、細胞外ポリペプチドの活性を阻害する結合パートナーである。そのような活性は、酵素活性、輸送活性、またはいずれかのタイプの他の生化学または細胞活性、好ましくは酵素活性である。ＩＭＤＨ  Ｂ、ＧＡＰＤＨ、エノラーゼまたはカタラーゼの阻害物質は、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ，ｃａｔ．ｎｏ．２１９２６３のカタラーゼアッセイキットなどの酵素の既知の生化学アッセイ、そして例えばＰｉｒｒｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ６１，４５２７−４５３１；Ｂａｒｔｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．９８７，３３１−３４０；Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６，７８７−７９５；Ｍａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６０，１６１−１６３；およびＭａｉｔｒａ  ａｎｄ  Ｌｏｂｏ（１９７１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４６，４７５−８８に述べられているアッセイを使用してスクリーニングされる。
【０１３８】
（細胞ベースの方法）
それに対する構造遺伝子の削除または破壊による、または遺伝子発現のダウンレギュレーション（以下を参照）による細胞外ポリペプチドのレベルの低下は、真菌細胞に影響を及ぼす。細胞は、細胞傷害性化合物に対してより感受性になる。細胞外ポリペプチドでは特に、そのレベルの低下は、原形質膜または細胞壁などの細胞の外部の部分が細胞への化合物の侵入を防止する機能に影響を及ぼす。それゆえ細胞外ポリペプチドのレベルの低下は、各種の化合物に対して細胞をさらに浸透性にすることができる。
【０１３９】
本発明の態様は、抗Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ活性を備えた化合物を同定する方法であって、
ａ．配列番号１−６および３６の群より選択されたポリペプチドの低下したレベルを有する感作細胞を提供するステップと、
ｂ．推定上のインヒビターに対する前記細胞の感受性を例えば増殖アッセイによって判定するステップと、
を含む方法に関する。
【０１４０】
好ましい実施形態において、配列番号１、２、３、５、６、および３６の群より選択されるポリペプチドの低下したレベルを有する感作細胞は、ステップａで提供される。本方法のなおさらに好ましい実施形態において、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ（配列番号３）、カタラーゼＡ（配列番号６）、またはイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）の低下したレベルを有する感作細胞が提供される。
【０１４１】
本手法に隠れた原理は、より低いレベルの細胞外ポリペプチドを備えた細胞が細胞傷害性化合物に対する感受性の上昇を示して、本アッセイに野生種細胞を使用したときに見落とされる低い有効性を備えた抗真菌化合物の同定を可能にするということである。本方法により同定された化合物は、有効性を改善するために修飾する必要があることが多い。これは、化学修飾によって行える。好ましい実施形態において、方法は複数の推定上の結合パートナーについて反復される。
【０１４２】
細胞外ポリペプチドの活性の阻害は、真菌の生存度（すなわち生存、成長および／または増殖）に影響を及ぼす。特に興味深いのは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの生存度に不可欠である細胞外ポリペプチドの阻害である。アスペルギルス遺伝子の不可欠性は、例えば、ＷＯ  ０２／０８６０９０に述べられているような調節可能な発現を使用して調査できる。必須細胞外ポリペプチドの阻害物質は、その生存度に影響を及ぼせるようになるために、真菌細胞に侵入する必要はない。それゆえ抗真菌剤として有効となるために、概して細胞内標的のインヒビターよりも少ない要求事項が、必須細胞外標的ポリペプチドのインヒビターの構造に負わされる。
【０１４３】
それゆえ本発明は、配列番号１−６および３６の群より選択される細胞外Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓポリペプチドのインヒビターを同定する方法であって、
ａ．配列番号１−６および３６の群より選択されるポリペプチドのレベルが異なる２つの細胞を提供するステップと、
ｂ．推定上のインヒビターに対する前記細胞の感受性を例えば増殖アッセイによって判定するステップと、
ｃ．前記２つの細胞が前記推定上のインヒビターの存在下によって受ける影響が異なるかどうかを判定するステップと、
を含む方法に関する。
本手法に隠れた原理は、必須ポリペプチドの活性がより低い細胞の生存度は、より高いレベルを備えた細胞の生存度よりも、ポリペプチドのインヒビターによって影響されるであろうということである。２つの細胞が異なる影響を受ける場合、これはインヒビターが標的に対して、または同じ生化学経路で作用する表れである。本方法の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドはＣｓｓＩ（配列番号１）、ＧＡＰＤＨ（配列番号３）、カタラーゼＡ（配列番号６）、またはイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）である。
【０１４４】
本方法のある実施形態において、興味のあるポリペプチドの異なる活性を備えた２つの細胞は、野生種細胞（興味のある遺伝子の野生種活性を備えた他の細胞）および興味のあるポリペプチドの低下した活性を備えた感作細胞である。ある実施形態において、感作細胞中の異なるまたは低下したレベルは、（ポリペプチドの異なるまたは減少したコピー数を生じる）興味のある遺伝子の異なるまたは低下した発現レベルでありうる。これは、遺伝子を調節可能なプロモータの制御下に置くことによって、または必須ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスＲＮＡによる調節可能な発現によって実施できる。他の実施形態において、異なるまたは低下した活性は、例えば温度感受性変異などの変異のために、興味のあるポリペプチドの異なるまたは低下した活性でありうる。好ましい実施形態において、方法は複数の推定上の結合パートナーについて反復される。
【０１４５】
感作細胞を産生する、および阻害物質のスクリーニングでのこれらを使用する適切な方法は、ＷＯ  ０２／０８６０９０に述べられている。感作細胞は、真菌生存度に必要な遺伝子産物のレベルを供給するインデューサまたはリプレッサの濃度の存在下で、その機能の存在または非存在が生存度の速度決定ステップとなるように条件発現Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ突然変異株を成長させることによって得られる。アスペルギルスのそのような条件発現突然変異体を作成するための多数の適切な調節可能なプロモータが、ＷＯ  ０２／０８６０９０、７６ページ３４行〜８５ページ４行に述べられている。例えば調節可能なプロモータがテトラサイクリンによって抑圧される場合、条件発現Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ突然変異株は、テトラサイクリンの部分的に抑制された濃度の存在下で成長する。インデューサまたはリプレッサの致死量未満の濃度は、アッセイの目的とする使用と一致するいずれの濃度でもよい。例えばインデューサまたはリプレッサの致死量未満の濃度は、成長阻害が、少なくとも約２５％などの少なくとも約１０％、例えば少なくとも約７５％などの少なくとも約５０％、例えば少なくとも９５％などの少なくとも９０％であるようになる。
【０１４６】
同様に、毒性または病原性に必要とされる遺伝子産物の速度制限量を発現する候補化合物に暴露された細胞の毒性または病原性は、毒性または病原性に必要とされる遺伝子産物の発現のレベルが速度制限的でない候補化合物に暴露された細胞の毒性または病原性に比較される。そのような方法において、試験動物は、条件発現Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ突然変異株を用いて攻撃され、テトラサイクリンおよび候補化合物の要求された量を含有する食餌を与えられる。それゆえ試験動物を感染させる条件発現突然変異株は、毒性または病原性に必要とされる遺伝子産物の速度制限量を発現する（すなわち試験動物中の条件発現突然変異細胞は感作される）。対照動物は、条件発現突然変異株によって攻撃され、候補化合物を含有するが、テトラサイクリンが欠如した食餌を与えられる。試験動物中の条件発現Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ突然変異株の毒性または病原性は、対照動物と比較される。例えば成長の著しい相違が感作された条件発現突然変異細胞（すなわち食餌がテトラサイクリンを含んでいた動物中の細胞）と非感作細胞（すなわち食餌がテトラサイクリンを含んでいなかった動物中の条件発現突然変異細胞）との間で見られる場合、候補化合物を使用して生物の毒性または病原性を阻害できるか、またはさらに最適化して生物の毒性または病原性を阻害するなおさらに優れた能力を有する化合物を同定できる。毒性または病原性は、当業界で既知の技法を使用して測定される。
【０１４７】
本発明の細胞ベースのアッセイの別の実施形態において、感作細胞は、ポリペプチドにおける温度感受性変異などの変異を使用して、真菌生存度に必要とされるポリペプチドのレベル活性を低下させることによって得られる。そのような細胞を許容温度と制限温度との間の中間温度で成長させることは、遺伝子産物の低下した活性を備えた細胞を生成する。上の方法は、真菌生存度に必要とされる遺伝子産物の活性またはレベルを低下させるが、排除しないいずれの変異によっても実施されることが認識されるであろう。本手法は、条件発現手法と併用してもよい。本併用手法において、興味のある遺伝子において温度感受性変異があり、この遺伝子も条件的に発現される細胞が作成される。
【０１４８】
必須ポリペプチドの阻害物質をスクリーニングするときに、成長阻害を実験サンプルにおける未播種成長培地に対する培養物の光学密度によって測定された成長の量を、対照サンプルと直接比較することによって測定される。細胞増殖をアッセイする代わりの方法は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）リポーターコンストラクト発光の測定、各種の酵素活性アッセイ、および当業界で周知の他の方法を含む。生存度を測定するために使用される他のパラメータは例えば、コロニー形成単位を含む。上の方法は固相、液相、２つの先行する培地の併用、または生体内で実施される。複数の化合物を寒天プレートに移動して、自動および半自動機器を使用して同時に試験できる。
【０１４９】
本発明の細胞ベースのアッセイが、興味のある標的分子に対する低いまたは中程度の有効性を示す化合物を検出できるのは、そのような化合物が非感作細胞に対してよりも感作細胞に対して実質的により有効であるからである。感作細胞に対して試験したときに非感作細胞と比較して、効果は、試験化合物は２〜数倍強力であり、例えば少なくとも２０倍強力であるなどの少なくとも１０倍強力であり、例えば少なくとも１００倍強力であるなどの少なくとも５０倍強力であり、例えば少なくとも１０００倍強力であり、なお１０００倍を超えて強力であるような効果である。
【０１５０】
細胞外ポリペプチドを過剰発現するＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ突然変異株は、そのようなポリペプチドを阻害する化合物を同定するのにも使用できる。化合物が細胞傷害性である場合、標的ポリペプチドの過剰発現は、細胞をさらに耐性にすることができる。それゆえ本発明は、配列番号１−６および３６の群より選択される細胞外アスペルギルスポリペプチドのインヒビターを同定する方法であって、
ａ．配列番号１−６および３６の群より選択されるポリペプチドの活性が異なる２つの細胞であって、一方の細胞が前記ポリペプチドの実質的に野生種コピー数を含有し、もう一方の細胞が前記ポリペプチドの野生種活性より大きい数を含有する、２つの細胞を提供するステップと、
ｂ．推定上のインヒビターに対する前記細胞の感受性を、例えば増殖アッセイによって判定するステップと、
ｃ．前記２つの細胞が前記推定上のインヒビターの存在によって異なる影響を受けるかどうかを判定するステップと；
を含む方法にも関する。
【０１５１】
好ましくは２つの細胞は、配列番号１のポリペプチド、配列番号２のポリペプチド、または配列番号３のポリペプチド、または配列番号５のポリペプチド、または配列番号６のポリペプチドまたは配列番号３６のポリペプチドなどの、配列番号１、２、３、５、６、および３６の群より選択されるポリペプチドの活性が異なる。
【０１５２】
インヒビターの細胞標的でないポリペプチドの過剰発現もインヒビターに対する細胞耐性を生成できるため、前記インヒビターによる興味のある標的ポリペプチドの阻害は、例えば生化学アッセイなどの他の手段によって検証する必要がある。
【０１５３】
過剰発現は、強力なプロモータ、例えばＡ．ｎｉｇｅｒ  Ｐｇｌａ  Ａプロモータ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓプロモータａｌｃＡ（ｐ）、または構成プロモータＰＧＫ−（ホスホグリセロ−キナーゼ）、ＧＰＤ−（グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）またはＥＮＯ（エノラーゼ）プロモータあるいはＡＤＨ２、ＰＨＯ５、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＣＵＰ１またはＨＳＰ７０などの調節プロモータを使用して実施できる。他の有用なプロモータは、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２，３５−５４  ；  Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５４，３５３−３６２  ；Ａｎｄｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３，７４７−７４８；Ｇｗｙｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５１：２０５−２１６；Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｇｅｎｅ  ３３：１３７−１４９に述べられているものを含む。
【０１５４】
細胞外ポリペプチドの生化学または他の細胞活性の阻害物質に加えて、上述の細胞方法は、例えば遺伝子調節を妨害することによって標的の発現レベル、それによりそのコピー数を低減する化合物を同定する。
【０１５５】
結合パートナーまたは阻害物質を同定する細胞ベースまたは生化学的方法のいずれの好ましい実施形態においても、方法は複数の候補化合物について反復される。
【０１５６】
さらなる態様において、本発明は、細胞外ポリペプチドをコード化する遺伝子が異種調節可能なプロモータの制御下に置かれた菌株、細胞外ポリペプチドの温度感受性の対立遺伝子を持つ菌株、および細胞外ポリペプチドを過剰発現する菌株などの、本明細書で述べた細胞ベースの方法で使用されるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ突然変異株に関する。
【０１５７】
必須細胞外ポリペプチドを標的化することによって真菌成長を妨害する他の方法は、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡなどの特異的アンチセンス分子を使用する、および必須細胞外ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡに対して特異的なリボザイム分子を使用する、遺伝子発現の抑制を含む。
【０１５８】
（診断）
さらなる主要な態様において、本発明は、コウジカビ感染を診断する方法であって、
ａ．個体からのサンプルを提供するステップと、
ｂ．前記サンプルに本明細書で述べた本発明のポリペプチドに特異的な、またはＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ（配列番号３）、カタラーゼＡ（配列番号６）およびイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）の群より選択されるポリペプチドに特異的なインジケータ部分を接触させるステップと、
ｃ．シグナルがインジケータ部分によって発生されたかどうかを判定するステップと、
を含む方法に関する。
【０１５９】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１のポリペプチド、または配列番号２のポリペプチド、または配列番号３のポリペプチド、または配列番号５のポリペプチド、または配列番号６のポリペプチド、または配列番号３６のポリペプチドなどの配列番号１、２、３、５、６および３６の群より選択されるポリペプチドである。本方法の他の好ましい実施形態において、インジケータ部分は、配列番号７−３４および３７で示された断片の群より選択される断片に特異的である。
【０１６０】
インジケータ部分は、興味のある標的ポリペプチドに結合することができる。好ましい実施形態において、前記インジケータ部分は抗体であるか、抗体を含む。各種の環境条件下にて、異なる形態的形式（菌糸体、酵母、胞子）および生物のライフサイクルの段階でのポリペプチドの発現の豊富さおよびパターンを評価するために、標的細胞外ポリペプチドまたはその断片に対して作られた抗体を使用して、ポリペプチドを検出できる。
【０１６１】
好ましくは、しかしながら、標的ポリペプチドまたはその断片に対して作られた抗体は、例えば患者をコウジカビ感染に関して診断するために、または所与の処置計画の有効性を判定するために、臨床試験手順の一部として感染した宿主の組織において標的遺伝子産物のレベルを監視するために診断的に使用できる。特にＣｓｓＩは、診断目的でかなり興味深い。免疫学的または配列ベースの手順の使用によってタンパク質に対する重要な相同体がなお検出されていないため、そのタンパク質はＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓに対して独特であるように思われる。さらにタンパク質の細胞表面および分泌性質も、ヒト体液中でタンパク質を検出する観点から好都合な特徴である。
【０１６２】
抗体を使用する検出は、抗体を検出可能な物質に結合させることによって促進できる。検出可能な物質の例は、各種の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質を含む。適切な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む；適切な補欠分子団複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含む；適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンを含む；発光物質の例はルミノールを含む；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み、そして適切な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈである。
【０１６３】
上のインジケータ部分を利用する各種の診断アッセイは、アスペルギルスのサンプルを試験するために調整できる。アッセイの例は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８で詳細に述べられている。そのようなアッセイの代表的な例は：向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、放射免疫アッセイ、放射免疫沈澱、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ、イムノスティック（ディップスティック）アッセイ、同時免疫アッセイ、免疫クロマトグラフアッセイ、免疫濾過アッセイ、ラテックスビーズ凝集アッセイ、免疫蛍光アッセイ、バイオセンサアッセイ、微光検出アッセイを含む（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，３７６，１１０および４，４８６，５３０を参照；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８．も参照。
【実施例】
【０１６４】
（実施例１  Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの抽出物中でのペプチドの同定）
多数のタンパク質精製手順を使用して、分泌、細胞表面露出、または細胞壁結合されるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓタンパク質の同定を促進した。タンパク質は次に、質量分析技法によってこれらの抽出物から同定された。
【０１６５】
Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの培養。菌株ＮＣＰＦ  ２１４０またはＡＴＣＣ  ４６６４０のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子（ＡｆＣ）は、麦芽寒天プレートへのＡｆＣの播種およびそれに続く３０℃での１０日間の増殖によって、規定どおりに調製した。
【０１６６】
Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子からの拡散性抽出物の調製。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ透析物（ＡｆＤ）は次のように規定どおりに調製した。ＡｆＣ（２ｘ１０８）をプロテアーゼ阻害物質（Ｒｏｃｈｅ，ｃａｔ．ｎｏ．１  ６９７  ４９８）を含有する水（０．５ｍｌ）に添加して、混合物をボルテックスにかけ、次に超音波処理してＡｆＣを溶解させて得られた溶液を振とうしながら３７℃にて１時間インキュベートした。次に０．２μｍフィルタへの通過により、または洗浄胞子の遠心分離（３０００ｘｇ）および０．２μｍフィルタへのＡｆＤの通過により、ＡｆＤを洗浄した胞子から分離した。
【０１６７】
Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子からの表面露出タンパク質抽出物の調製。洗浄したＡｆＣ（２．０ｘ１０１０）を、還元剤（１０ｍＭ  トリス２−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ））を含有するＰＢＳ（０．０１Ｍ  リン酸緩衝液、０．００２７Ｍ  塩化カリウム、０．１３７Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）１ｍｌ中に再懸濁させ、室温にて２０分間インキュベートした。ＡｆＣを遠心分離（２００００ｘｇ、３０分）によってペレット化して、ＰＢＳ中で洗浄し、ＴＣＥＰを除去してから、トリプシン溶液（配列決定用修飾ブタトリプシン、Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔ．ｎｏ．Ｖ５１１１，２０μｇ／ｍｌ  ＰＢＳ）中で再懸濁させて、室温にて３０分間インキュベートした。次にＡｆＣを遠心分離および濾過によって除去した。上澄み中の分生子をすべて除去するために、上澄みはＹＭ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅより、ｃａｔ．ｎｏ．４２０６、５０００ｘｇ、４℃にて３０分間）を使用して精製し、上澄みを４０ｒｐｍで振とうしながら３７℃にて一晩インキュベートした。ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮装置を用いて上澄みを濃縮し、１μｌを５％ギ酸  ６μｌに添加して、得られた溶液を質量分析法により解析した。
【０１６８】
Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子からの細胞壁抽出物の調製。ＡｆＣ溶液（２０ｍｌ；１．８ｘ１０８分生子／ｍｌ）は、ＰＹＧ（Ｃ豊富）（ペプトン−酵母抽出物およびグルコース：０．１％  ペプトン、０．１％  ｇ  酵母抽出物および０．３％  グルコース）およびＨＢＳＳ（Ｃ不十分）（Ｇｉｂｃｏ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＨＡＮＫＳ  １Ｘ（ｃａｔ．ｎｏ．２４０２０−０８３））培地の両方で調製した。これらの溶液を３分間ボルテックスにかけ、５分間超音波処理して、次に振とう（１６０ｒｐｍ）しながら３７℃にて４時間インキュベートした。ＡｆＣを遠心分離（６０００ｘｇ、３０分）によってペレット化し、ＨＢＳＳインキュベーションからの上澄みを収集して、０．２μｍフィルタを通過させた。ＰＹＧからの上澄みは廃棄した。どちらのＡｆＣペレットもＨＢＳＳ  ５ｍｌで洗浄して、前と同様にペレット化した。各ペレットに溶解緩衝液（２％  トリトン、１％  ＳＤＳ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝２）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、プロテイナーゼインヒビター錠剤１（Ｒｏｃｈｅ，ｃａｔ．ｎｏ．１  ６９７  ４９８）およびガラスビーズ（２００〜３００ミクロン）約５００μｌを添加した。得られた溶液を次に水浴超音波処理装置で４０分間インキュベートし、３０分間ボルテックスにかけ、氷上で５分間冷却して、最後にさらに３０分間ボルテックスにかけた。次にガラスビーズをサンプルから除去して、分生子壁を１２００ｘｇでの１０分間の遠心分離によって沈殿させた。上澄みを除去して、後で使用するために貯蔵した。
【０１６９】
分生子壁濃厚ペレットを冷蒸留水  １ｍｌで３回洗浄し、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１％（ｗ／ｖ）２−メルカプトエタノール溶液  ２５０μｌに再懸濁させて、５分間沸騰させた。得られた溶液を遠心分離（１０，０００ｘｇで１５分間）にかけ、上澄みを新しい管に移して、氷冷アセトン  １ｍｌに添加してから、−３０℃にて一晩インキュベートした。沈殿したタンパク質をペレット化して（２０，８１０ｘｇで４５分間）、ＳｐｅｅｄＶａｃで１５分間乾燥させて、残留アセトンを除去した。ペレットをｄｄＨ２Ｏ中で再懸濁させ、タンパク質を標準手順に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。得られたゲルを次に、銀染色によって描出した。
【０１７０】
Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓタンパク質抽出物の質量分析法による解析。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓタンパク質の解析は以下のように実施した。特異的タンパク質バンドに相当するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの断片を抽出して、重炭酸ナトリウム溶液（５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）に入れた。これらのゲル栓を次に５０％  エタノール中の５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で３０分間に渡って２回洗浄して、９６％  エタノールでの１０分間のインキュベーションによって脱水した。還元およびアルキル化は、５６℃にて還元溶液（５０ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）で４５分間でのインキュベーションと、それに続く暗所におけるアルキル化溶液（５５ｍＭ  ヨードアセトアミド、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）中の室温での３０分間のインキュベーションによって実施した。次に洗浄および脱水の２サイクルを実施してから、トリプシン溶液（５０ｍ  ＭＮＨ４ＨＣＯ３中の１２．５ｎｇ／μｌ  トリプシン（配列決定用修飾ブタトリプシン、Ｐｒｏｍｅｇａ  ｂａｔｃｈ  ｎｏ．Ｖ５１１Ｘ  １４７５５００７））１０μｌを添加した。１５分後、追加の重炭酸ナトリウム溶液２０μｌを添加して、消化物を３７℃にて一晩インキュベートした。次にサンプルを、２０％トリフルオロ酢酸  ３μｌ、ならびにアセトニトリル（１０％）およびトリフルオロ酢酸（１％）を含有する溶液  ２０μｌ中での、３０分間の振とうしながらのインキュベーションによって２回抽出した。両方の抽出物をためて、吸引乾燥して、５％ギ酸の９％に再懸濁させてから、ＬＣ−ＭＳによって解析した。
【０１７１】
ペプチドおよび断片の質量公差はそれぞれ２００ｐｐｍおよび０．５Ｄａに設定した。サーチパラメータを、Ｍｅｔの酸化、Ｃｙｓへのポリアクリルアミド基のアルキルの添加を含むように調整し、トリプシンにはペプチド当たり１個の開裂部位を失わせた。
【０１７２】
細胞表面ペプチド断片の解析のサーチパラメータを、Ｍｅｔの酸化を含むように調整し、トリプシンには各ペプチドの１個の開裂部位を失わせた；そしてペプチドおよび断片の質量公差はそれぞれ１００ｐｐｍおよび０．３Ｄａに設定した。
【０１７３】
ペプチド配列の同定の後に、ＴＢＬＡＳＴＮをパブリックドメインにおけるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓショットガン配列に対して実施した。これは、ペプチド断片をコード化できるすべてのショットガン配列を同定した。次にこれらのショットガン配列を使用して、９０％もの同一性で少なくとも長さ４０ｂｐの相同性の領域を共有する、他のすべてのショットガン配列を抽出した。次にすべての適切なショットガン配列は、Ｓｅｑｍａｎを使用してコンティグ配列に形成した。得られたコンティグをトウモロコシ、シロイヌナズナ、およびヒトパラメータを使用してＧｅｎＳｃａｎサーチに送信した。潜在的にさらに正確なタンパク質配列の予測を容易にするために、出力された予測タンパク質配列を次に、コード化ヌクレオチド配列と、そしてタンパク質相同体の配列と比較した。得られた予測ヌクレオチドおよびペプチド配列を次に適切な組織内データベースに入力して、次にこれらの新たに予測されたタンパク質を含有するデータベースに対してＭＡＳＣＯＴサーチを再実行した。イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂでは、ペプチド配列決定によって見出されたペプチドとデータベース内のヌクレオチド配列から予測された対応するポリペプチドとの間にミスマッチが見出された。ミスマッチは、変異による、または配列決定エラーによる菌株間の相違による。さらにＭＳ機器は、ロイシンとイソロイシンとを識別しない。この領域における変異は、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの相同性酵素について述べられているように、重要な構造的な意味を有し、酵素の熱安定性を変化させる（Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０，４５−５２）。
【０１７４】
透析物、細胞表面露出、および細胞壁画分中で同定されたペプチドを表１に示す。対応する予測タンパク質配列を図１に与える。配列番号３８および配列番号３９は、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂをコード化するポリヌクレオチド配列（配列番号３６）を予測した。
【０１７５】
ハイドロフォビンおよび機能未知タンパク質の両方からのペプチドは、３つすべての画分中で同定され、両者がＡｆＣの表面に露出されている細胞壁結合タンパク質であることと、同時に周囲環境に分泌／放出されていることも示している。これらのデータに基づいて、我々は新たに同定された、以前は機能未知のタンパク質を分生子表面および分泌タンパク質Ｉ（Ｃｏｎｄｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ）ＣｓｓＩと命名することを提案する。ＡｆＤおよび細胞壁中のＧＡＰＤＨの；ＡＦＤ中のエノラーゼの；細胞表面露出画分中の、および位置する細胞壁のＩＭＤＨ  Ｂの、ならびにカタラーゼの表面露出変異体の存在に注目することも興味深い。これらのペプチドを精製および同定するために使用した手順は非常に豊富なタンパク質に偏っているため、それらが比較的多いコピー数で発現すると結論付けることもできる。
【０１７６】
（実施例２  バイオインフォマティック解析）
シグナルＰ予測は、真核タンパク質に推奨されるパラメータを使用して実施したが、抗原性指数研究は、ＤＮＡＳｔａｒによって決定されたデフォルトパラメータを使用して実施した。ＢＬＡＳＴサーチは、デフォルトパラメータを使用して実施した。
【０１７７】
シグナルペプチドの存在についてのＣｓｓＩの解析。元の機能未知配列を報告したグループは、２４残基のＮ末端シグナルペプチドを予測した（ＮＣＢＩ  ｅｎｔｒｙ  ＣＡＤ２９６００。タンパク質ＡｆＡ３５Ｇ１０．０７）。しかしながらシグナルＰプログラムをデフォルトパラメータと共に使用するこれらの研究の反復（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０，１−６）は、Ａ４７とＲ４８との間に予測シグナル開裂のある４７残基シグナルペプチドの存在を示している。
【０１７８】
（ＣｓｓＩの予測タンパク質配列の解析）
このタンパク質の配列の簡単な概要は、２つの最も豊富な残基が、タンパク質中の残基すべてのそれぞれ９．６２％および８．６４％を構成するＥおよびＱであることを明らかにする。より精密な解析は、荷電残基（Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ）の６７％がタンパク質のＣ末端側半分に位置し（表２を参照）、疎水性残基（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）の６２％がＮ末端側半分に位置することを明らかにした。
【０１７９】
ＣｓｓＩの配列は、ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ（１９８８）の抗原性指数プログラムによって解析した。このプログラムは、タンパク質のＣ末端側半分が最も抗原性であることを予測した（図２を参照）。
【０１８０】
ＣｓｓＩのＢＬＡＳＴ解析は、高い相同性のタンパク質の非存在を明らかにした。しかしながら多数のタンパク質は、低いが、なお重要なレベルの相同性を示した。１つのそのようなタンパク質、ヒトヘルペスウィルス８のＯＲＦ７３は、カポジ肉腫のマーカーとして使用される潜伏期関連核抗原（ＬＡＮ／ＬＡＮＡ）である。それはＣｓｓＩのＣ末端側半分に対して２６％の同一性および４６％の類似性を示す。ＬＡＮＡのこの領域は、ＱおよびＥ反復において豊富であり、タンパク質の中間に位置する。酸性反復の類似領域はウィルスおよび細胞転写因子中の転写活性化にしばしば機能することが示唆されている（Ｓｔｒｕｈｌ，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２９，６５１−６７４）。ＬＡＮＡは、ウィルスおよび細胞遺伝子発現の両方を調節できることが示されている（Ｒｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５，４５８−４６８）。
【０１８１】
ＧＡＰＤＨ配列。このタンパク質の遺伝子配列を作成する試みは、ＧＡＰＤＨ関連タンパク質を発現できるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ中の少なくとも３つの遺伝子の存在を明らかにした。これらの予測されたタンパク質は、標識化ＧＡＰＤＨ−Ａ、ＧＡＰＤＨ−Ｂ、およびＧＡＰＤＨ−Ｃであった。これらの２つのタンパク質間に多数の相違が存在する（図３を参照）。しかしながら、今日までにＧＡＰＤＨ−Ｂのみが同定されていると結論付けることが可能である。今日までにＧＡＰＤＨ−Ａまたは−Ｃを同定できないことは、多数の理由、例えば実験室条件下での発現の失敗；またはデータベース内に適切な予測タンパク質配列が存在しないことによる。ＧＡＰＤＨ−Ｂのみが細胞壁および分泌調製物中で同定されたという事実は、この種類のタンパク質がおそらく主に細胞壁変異体であり、そしてことによるとＧＡＰＤＨ−Ａおよび−Ｃが細胞質変異体であることを示している。
【０１８２】
ＧＡＰＤＨ−ＡおよびＧＡＰＤＨ−Ｂは、２６９残基のストレッチに関して７３％の同一性および８５％の類似性を共有している。さらに相違するＧＡＰＤＨ−Ｃは、ＧＡＰＤＨ−ＡおよびＧＡＰＤＨ−Ｂの両方とわずか４３％の同一性を共有している。ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎによる３つすべての配列の解析は、３つすべてがＧＡＰＤＨ配列であることを明らかにした。しかしながらタンパク質ＡおよびＢのみが活性部位モチーフ（［ＡＳＶ］−Ｓ−Ｃ−［ＮＴ］−Ｔ−ｘ（２）−［ＬＩＭ］）に一致する配列を有していた。このことは、真のＧＡＰＤＨタンパク質として機能しないことを示唆しうる。配列のより精密な解析により、Ｃがモチーフ内の最後の位置に、［ＬＩＭ］の代わりにＶ残基を含有することが明らかである。Ｖ、Ｌ、Ｍ、およびＩがすべて疎水性残基であることを考慮すると、相違が非機能性ＧＡＰＤＨ活性部位を生じることはありそうもない。
【０１８３】
（イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ配列）
予測イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素配列の最も近い相同体は、Ａ．ｎｉｇｅｒ（ＮＣＢＩデータベースでの受託番号Ｐ８７２５７（３６３ａａについて７７％の同一性））およびＡ．ｏｒｙｚａｅ（ＮＣＢＩデータベースでの受託番号ＢＡＣ５５９０６（３６７ａａについて５２％の同一性））からの以前に述べた酵素であった。
【０１８４】
ヒトタンパク質に対する相同性およびＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓに対する必須性。上述のタンパク質のうち、ＣｓｓＩ、ＩＭＤＨ  Ｂまたはハイドロフォビンも重要なヒト相同体を持っていない。これに対してエノラーゼ（６１％同一、７７％類似）およびＧＡＰＤＨ（７７％同一／８３％類似）はどちらも、タンパク質全長に渡るヒト相同体を有する。しかしながら所与のエピトープの小さいサイズのために、そして一般に抗体の特異性のために、適切な抗体を見出して、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの種類をヒトの種類から識別できる見込みがある。
【０１８５】
（抗体生成用のペプチド）
質量分析で見出されたペプチドを抗体生成に使用した。その一部は予測または既知配列からの隣接配列によって伸長させた。
【０１８６】
（実施例３  抗ＡｆＭおよび抗ＩＭＤＨ抗体の産生および特性）
（方法）
（リン酸緩衝生理食塩水）
ＰＢＳ錠剤（Ｓｉｇｍａ）を使用して、２５℃にてｐＨ７．４の、０．０１Ｍ  リン酸緩衝液、０．００２７Ｍ  ＫＣｌおよび０．１３７ＮａＣｌの最終溶液を作成した。
【０１８７】
（抗Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ菌糸（抗ＡｆＭ）抗体の産生）
ＡｆＭが豊富な調製物を以下のように成長させた：１０Ｅ５  ＡｆＣをＲＰＭＩ  １０ｍｌに添加して、３７℃にて約１０時間インキュベートした。次にＡｆＭを遠心分離によって収集し、ＰＢＳで２回洗浄した。これらの調製物を３％  ホルムアルデヒド中での室温にて３０分間のインキュベーションによって固定して、１００μｇの量を以下のプロトコルに従ってウサギに注射した。
【０１８８】
ニュージーランド白色メスウサギ（４〜６月齢、約３ｋｇ）からヌル血清を、１００μｇのＡｆＭおよびフロイント完全アジュバントでの免疫付与の前に採取した。ブースターは、第１４日にフロイント不完全アジュバントと併せて、そして第２８日に再度投与した。第１および第２の出血を第４２日および第７２日にそれぞれ収集してから、第９３日に最終出血を採取した。免疫蛍光顕微鏡法およびウェスタンブロッティングによる続いての分析は、ウサギがＡｆＭに対するＡｂベースの免疫反応を産生することを証明した。
【０１８９】
（ＩｇＧ精製）
次にＭａｂＴｒａｐ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を製造者の説明書に従って使用して、この血清からＩｇＧを精製した。Ｆａｂ断片はＩｇＧからＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  Ｆａｂ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって、再度製造者の説明に従って精製した。
【０１９０】
（接着アッセイプロトコル）
Ａ５４９細胞（１ｘ１０５）（ＤｅＨａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１７５（１）：１４６−１５０）をＬａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ  ８ウェルチャンバスライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に播種して、一晩培養した。ＡｆＣ（１ｘ１０８／ｍｌ）の溶液をＲＰＭＩ培地中で調製し、１０分間ボルテックスにかけ、１０秒間超音波処理して、ＡｆＣを懸濁させた（施設内での研究は、９９％を超えるＡｆＣがこのステップの後に実行可能であることを証明した）。次にＡｆＣ個体群を等分して、適切な場合にはＩｇＧ調製物を添加し、サンプルを振とうしながら３７℃にて３０分間インキュベートした。Ｆ１２Ｋ培地  ４００μｌで３回洗浄することによって、Ａ５４９細胞を調製した。必要ならば、精製したタンパク質をＡ５４９細胞によって３７℃にて３０分間プレインキュベートしてから、細胞をＦ１２Ｋ培地  ４００μｌで３回洗浄した。最後に、Ｆ１２Ｋ  １９０μｌを各ウェルに添加してから、適切なＡｆＣ溶液  １０μｌ（１ｘ１０６ＡｆＣ）を添加した。次にサンプルを３７℃にて６０分間インキュベートした。Ｆ１２Ｋ培地で４回洗浄することによって未結合ＡｆＣを除去して、トリプシンＥＤＴＡ  ４００μｌを使用してＡ５４９細胞を分離した。分離の後、溶液をウェルから除去して、エッペンドルフに保管して、中程度の強度で１０秒間超音波処理をして、哺乳類細胞を溶解させた。最後に、０．０３％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を各溶液に添加して、ＡｆＣが単細胞形で存在するようにした。次に各サンプル中のＡｆＣの量を、血球計算器を使用して決定した。すべてのアッセイは３通り実施した。
【０１９１】
（抗ＡｆＭ抗体を用いたＩＰによる抗原同定）
得られたＩｇＧ調製物をＡｆｆｉｇｅｌ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ）と併せて使用して、抗ＡｆＭ親和性カラムを調製した。これは製造者の説明書に従って実施した。それゆえ抗ＡｆＭ  ＩｇＧ  ２０ｍｇをＡｆｆｉｇｅｌ  ２００μｌに結合させて、得られたカラムをＰＢＳ中で調製した全ＡｆＭ溶解物  １００ｍｇと共に一晩回転させた。ＩｇＧを含まないＡｆｆｉｇｅｌ  ２００μｌを含有するカラムも同じ方法で処理した。次に上澄みを除去して、ゲルを０．５Ｍ  ＮａＣｌに調整したＰＢＳ  ０．５ｍｌで２回洗浄した。次に０．２５Ｍ  ＮａＣｌに調整したＰＢＳ  ０．５ｍｌで洗浄を実施し、サンプルを０．２Ｍ  グリシン−ＨＣｌ  １００μｌ、ｐＨ２．５で溶出させた。氷上での５分間の保管の後、サンプルを１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２４μｌ、ｐＨ８．５の添加によって中和し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。
【０１９２】
（ＩＭＤＨ  ＢのｃＤＮＡコピーの増幅およびクローニング）
全ＲＮＡは、製造者の説明に従ってＲＮＡＥａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して１ｘ１０９  ＡｆＣから精製した。ｃＤＮＡの増幅を補助するオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために、ＩＭＤＨ  Ｂの配列を多数の生物情報ステップを使用して予測した。最初にＬＣＭＳによって同定したペプチドを、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓショットガンデータベースに対してＢＬＡＳＴを行った。次にペプチドに一致するすべての配列を整列させて大型のコンティグ配列を生成し、次にこれを遺伝子予測プログラムＧｅｎｓｃａｎに入力した。これは多数の予測遺伝子配列を生成し、ＬＣＭＳによって同定されたペプチドをコード化することが予測された配列をさらなる研究のために選択した。最も有望な停止および開始コドンの選択を補助するために、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ配列に相同性を示した他の生物からのＩＭＤＨ  Ｂ遺伝子も使用した。それゆえ１８−ｍｅｒオリゴ（Ｆ：５’−ＡＴＧＧＴＡＡＣＴＡＣＴＴＡＣＡＡＣ−３’（配列番号４４）；Ｒ：５’−ＴＧＡＡＣＴＡＣＣＣＴＧＣＡＡＣＧＣ−３’（配列番号４５））を設計し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐキットを製造者の説明に従って使用して、Ａｆ  ＩＭＤＨ  Ｂ遺伝子のｃＤＮＡコピーを増幅するのに用いた。増幅の後、生成物はＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＢＡＤ内にクローニングして、配列決定を使用してインサートの配列および向きを確認した。
【０１９３】
（配列決定）
配列反応は、ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）キットを製造者の説明書に従って使用して実施した。
【０１９４】
（異種タンパク質の発現）
要求された配列を含有するクローンの同定時に、異種タンパク質にとって最適な発現条件を識別するために多数の実験を実施した。これらは０．０２％  アラビノースを用いて４時間に渡って誘発したときに最適発現を明らかにした。次にタンパク質をＢＡＤコード化ｈｉｓタグ配列の利用によって精製した。
【０１９５】
（細菌溶解物の調製）
Ｅ  ｃｏｌｉ培養物の各リットルは０．０２％  アラビノースを用いて４時間に渡って誘発させ、細菌細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分間）によって収集した。次に細菌ペレットを冷未変性緩衝液２５ｍｌ（２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４）に再懸濁させて、溶液にプロテアーゼインヒビター錠剤２個（ＲＯＣＨＥ、完全無ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害物質）およびリゾチーム  ６２５μｌ（２５μｇ／μｌ）を添加してから、氷上で１時間インキュベートした。次に溶液４分間超音波処理して、凍結融解サイクルを受けさせ、ベンゾナーゼ  ７．５μｌ（３６２単位／μｌ）を添加してから、氷上で２０分間インキュベートした。不溶性成分の除去を補助するために、溶液を５０００ｘｇで２０分間遠心分離して、上澄みを収集した。このステップをさらに２回繰り返して、次に透明な溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。
【０１９６】
（ｈｉｓタグタンパク質精製用のニッケルセファロースカラムの調製）
組換えタンパク質の精製は、Ｐｒｏｂｏｎｄ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、すなわち異種発現組換えタンパク質に対してｐＢＡＤコード化ｈｉｓタグを利用するニッケルセファロースベースの樹脂を使用して実施した。すべての遠心分離ステップは、８００ｘｇにて２分間実施した。容器を転倒させ、静かにたたくことによって樹脂を再懸濁させ、平衡のために樹脂のスラリー  ２ｍｌをＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＢｉｏＲａｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．７３２−１０１０）に添加した。カラムを遠心分離にかけ、上澄みを廃棄した。次に樹脂を無菌水  １０ｍｌで洗浄して、遠心分離の後、上澄みを再度廃棄した。次に樹脂を未変性緩衝液  １０ｍｌ（２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４）に再懸濁させ、遠心分離にかけて、上澄みを廃棄した。この工程を２回反復した。最後に樹脂を未変性緩衝液  １ｍｌに懸濁させて、最終体積  ２ｍｌを得た。
【０１９７】
（溶解物の利用、精製タンパク質の洗浄および溶出）
組換えタンパク質を含有する細菌溶解物を、平衡させた樹脂を含有するカラムに添加して、混合物をローラー上で４℃にて１００分間インキュベートした。次に混合物を８００ｘｇで２分間遠心分離にかけ、上澄みを流出させて保管した。次に樹脂を沈降させて、カラム栓を除去して、液体を貫流させた。このステップ、そして続くすべてのステップによる流出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析用に収集した。次にカラムを未変性緩衝液  ２０ｍｌ（２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４）を用いて合計５回洗浄して、未変性溶出緩衝液  ２０ｍｌ（２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４）を利用することによってタンパク質を溶出させ、２ｍｌの分割量１０個を収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を実施して、手順の結果を判定した。
【０１９８】
（ニッケルセファロース精製ＩＭＤＨ  Ｂのゲル濾過精製）
Ｐｒｏｂｏｎｄ精製ＩＭＤＨ  ＢをＰＢＳ中での透析によって最初に脱塩した（透析チュービング１２−１４０００ダルトン、Ｖｉｓｋｉｎｇ）。ゲル濾過は、ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００高分解能カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。カラムの調製、平衡、および洗浄は、製造者の説明書に従って完了した。タンパク質精製は、Ｔｒｉｓランニング緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）を用いて、０．２５ｍｌ／分の適切な流速で実施した。ｈｉｓタグタンパク質（１０〜２０ｍｇ）のバッチをカラムに添加して、ランニング緩衝液８０ｍｌを使用して放出させ、約４０ｍｌの無効体積を計算して、１８ｘ２ｍｌの画分を収集した。
【０１９９】
（抗ＩＭＤＨ  Ｂ抗血清の産生）
Ｐｒｏｂｏｎｄ精製タンパク質を使用して、ニュージーランド白色メスウサギ（４〜６月齢、３ｋｇ）に免疫付与した。免疫前血清は、フロイント完全アジュバントの存在下でのタンパク質１００μｇによる免疫付与の前に、第１日に免疫前血清を収集した。さらなる免疫付与も、フロイント不完全アジュバントの存在下で第２８日および第４９日に実施した。血液サンプルは、第２８日、第４２日、第６９日、最後に第８７日に採取した。ＩｇＧおよびＦａｂ断片は前述したように調製した。
【０２００】
（免疫蛍光顕微鏡法）
免疫蛍光顕微鏡スライドは、洗剤溶液中で最初に洗浄し、蒸留水ですすいだ。次にスライドをコーティング溶液（０．１％  ゼラチン［ｗ／ｖ］、０．０１％［ｗ／ｖ］クロムミョウバン）中でインキュベートして、室温にて乾燥させた。収集したＡｆＣ胞子を処理した免疫蛍光顕微鏡スライドのウェル上に置き、スライドをＰＢＳによって３回洗浄して、未結合ＡｆＣを除去した。ＡｆＭが必要な場合、ＲＰＭＩ  ３０μｌをウェルの表面に添加し、スライドを３７℃にて１２〜１４時間インキュベートしてから、ＰＢＳによって洗浄した。次にＩｇＧ（３０μｌ、ＰＢＳの１：５００希釈物）を各ウェルに添加し、湿潤環境内で３７℃にて３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳによって３回洗浄してから、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ラビットＩｇＧ（ＰＢＳで調製した１：４００希釈物の３０μｌ）を各ウェルに添加した。再びスライドを湿潤環境内で３７℃にて３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄して、次に３％  ホルムアルデヒド中で室温にて３０分間固定した。スライドをＰＢＳ中で３回洗浄して、乾燥させ、次にＳｉｇｍａオイル１滴を表面に添加して、カバースリップを当てた。これをマニキュア液で密封し、スライドを使用するまで暗所で４℃にて保管した。すべてのウェルは、明野および蛍光野の両方で走査した。
【０２０１】
（ＩｇＧが分生子発芽を阻害する能力の判定）
ＡｆＣをＲＰＭＩ培地に再懸濁させ、濃度を調整して、１ｘ１０６  ＡｆＣ  ｍｌを含有する溶液を得た。次にこの溶液の０．５ｍｌをエッペンドルフに添加し、各ＩｇＧ／血清サンプル  １０μｌをＡｆＣの３つの分割量に添加した。正常な新しいラビット血清を１つの分割量に、熱不活性化（６０℃で３０分間）血清を第２に、そしてＰＢＳ  １０μｌを第３に添加した。次にサンプルを２００ｒｐｍで７時間インキュベートした。次に細胞の総数をカウントし、発芽した、または発芽管を生成し始めた分生子の数を決定した。フィラメント化パーセントは、細胞の総数で割った発芽管を持つ細胞の数に等しい。
【０２０２】
（標的タンパク質の予測抗原ペプチドに対する血清の産生）
標的タンパク質の解析は、各標的配列内で多数の抗原ペプチドを同定する目的で実施した。選択したペプチド（以下の表３を参照）は、表面露出ペプチド（表１を参照）を同定するために使用された質量分析手順中に同定されたペプチドおよび最も抗原性であると予測されたペプチドと一致する（Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｂ．Ａ．＆  Ｗｏｌｆ，Ｈ（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ４，１８１−１８６）。
【０２０３】
ペプチドおよび抗血清は、Ｓｉｇｍａの標準カスタムペプチド合成およびウサギ免疫付与プロトコルに従って産生された。ペプチドはその複数の抗原ペプチド（ＭＡＰ）サービスの一部として産生された。使用した免疫付与プロトコルは以下の通りである：第０日に免疫前血清をニュージーランド白色ウサギから収集し、次に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のＭＡＰの２００μｇによって免疫付与した。２回目の免疫付与は、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の１００μｇを用いて第１４日に実施した。この免疫付与は第２８日、第４２日、第５６日および第７０日に反復した。出血は第３５日、第４９日、第６３日、最後に第７７日に採取した。
【０２０４】
（ＭＳ解析）
（ゲル内消化）
ゲルバンドを２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３／５０％  エタノールによって２回洗浄する。システイン残基を還元（ＤＴＴ）およびアルキル化（ヨードアセトアミド）して、ゲルバンドの洗浄および脱水を２サイクル続ける。洗浄緩衝液は５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３であり、脱水剤はエタノールである。最後の脱水ステップの後、プロテアーゼの添加によって消化を開始し、適切な消化緩衝液中に溶解させる。デフォルトの酵素は、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３／１０％  アセトニトリル消化緩衝液が使用されるトリプシンである。消化は３７℃にて一晩実施する。得られたペプチドプールはＴＦＡおよびギ酸によって抽出し、質量分析法によって解析する。すべてのサンプルの取扱いは、ケラチン汚染を回避するために手での取扱いを最小限にして、無じん環境にて行う。
【０２０５】
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦサンプル調製および解析）
ゲル内消化後に抽出したペプチド混合物は、Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  Ｂｒｕｋｅｒ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置での完全自動化手順によって解析する。ペプチドマスフィンガープリントを記録して、各スペクトルには注釈を付け、トリプシン自動消化ピークを使用して内部的に校正する。サンプル調製：
１．９６チップロボットを使用して、ニトロセルロース／□−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ）マトリクスを備えたＢｒｕｋｅｒ  ３８４研磨スチール標的を調製する。
２．約５％のサンプルをマトリクスに添加する（１，５□ｌ）。
３．サンプルが完全に乾燥したら、０．１％  ＴＦＡで洗浄し、これで、Ｂｒｕｋｅｒ質量分析装置で解析する準備が整う。
【０２０６】
（データベース検索）
Ｍａｓｃｏｔソフトウェア（ＭＡＴＲＩＸ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を用いて実施されるデータベース検索では、得られたピークリストを使用する。データベースは、ＮＣＢＩからのデータに基づく非冗長性データベース（ＮＲＤＢ）である。
【０２０７】
（結果）
（抗ＡｆＭ抗体を用いたＩＰによる抗原同定）
抗ＡｆＭ  ＩｇＧより成る親和性カラムを使用して、ＡｆＭ溶解物から最も抗原性のタンパク質を免疫沈澱させた。溶出されたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次にＬＣ  ＭＳＭＳ解析によって解析して、このことは３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（ＩＭＤＨ  Ｂ）が抗ＡｆＭ抗体の主標的であることを明らかにし、ＩＭＤＨ  ＢがＡｆＭの主抗原であることを示唆した（図４）。
【０２０８】
（ヌル血清よりもかなり高いシグナルを与えるＡｆＭの表面に結合する抗ＡｆＭ抗体）
ＩＦＭ研究により、ＡｆＭおよびＡｆＣの両方に結合した抗ＡｆＭ抗体がヌル血清によって観察されたよりも高いシグナルを与えることを明らかにした。これは再度、ＩＭＤＨ  Ｂが分生子および菌糸の両方の主要な表面抗原であることを示唆する（図５）。
【０２０９】
（Ａ５４９細胞に接着するＡｆＣの割合を低下させる抗ＡｆＭ  Ｆａｂ断片）
ＩＭＤＨ  ＢがＡｆＣおよびＡｆＭの両方の主表面抗原であることが立証されて、（抗ＡｆＭ抗血清の形の）抗ＩＭＤＨ  Ｂ抗体がＡｆＣの病原性を妨害する潜在的能力を分析することが決定された。それゆえは、ＩｇＧ中でプレインキュベートされたＡｆＣが肺上皮に結合する能力が測定される接着アッセイを実施した。これらの研究は、Ｆａｂ断片の形の抗体が実際に、肺上皮への生物の接着を低減できることを示した（図６）。理論に縛られることなく、接着因子を結合して、その機能を防止すること、あるいはＡｆＣ表面へ結合して、基礎を成す接着因子の機能を立体的に阻害することのどちらかによって、Ｆａｂｓがレセプタとそのリガンドとの間の相互作用を妨害することによって肺上皮への接着を低減する能力を所有することが考えられる。ＩｇＧ分子もそのような特性を所有するが、Ｆｃ領域は、哺乳類細胞の表面上のＦｃレセプタを結合可能であり、ＡｆＣの接着を向上させる可能性を有する現象である。
【０２１０】
（組換えＩＭＤＨ  Ｂのクローニング、発現および精製）
ＩＭＤＨ  Ｂをコード化するｃＤＮＡのコピーは、ｐＢＡＤ内に正しくクローニングされ、インサートの配列が確認された（配列番号４６および配列番号４７を参照）。タンパク質は、０．０２％  アラビノースによる４時間の誘発後に発現され、ニッケルセファロースおよびゲル濾過カラムを使用して高度の純度まで精製した（図７）。ニッケルセファロース精製画分を使用してウサギに免疫付与し、この手順は抗ＩＭＤＨ  Ｂ抗体の産生において成功であった（図８）。ＩＦＭ解析は、抗ＩＭＤＨ  Ｂ  ＩｇＧがＡｆＣおよびＡｆＭの表面に結合されたことも確認し（図９）、それゆえＩＭＤＨ  Ｂの表面局在を確認した。
【０２１１】
（臨床アイソレートのＩＦＭ解析）
表面発現ＩＭＤＨ  Ｂの存在または非存在を確認するために、多数の臨床アイソレートに対してＩＦＭ解析を実施した。すべての臨床アイソレートは、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭＴＭ）から購入した。それらの特徴および抗ＩＭＤＨ  Ｂ  ＩｇＧに対する反応性を表４に示す。
【０２１２】
（翻訳後修飾）
組換えＩＭＤＨ  Ｂタンパク質における翻訳後修飾の存在を確認する目的で、多数の研究が実施した。これらの研究は、多数の形式を取った。最初に、タンパク質の予測トリプシン断片のすべてを確認する目的で、ＭＡＬＤＩ解析を実施した。それゆえタンパク質をトリプシンによって消化し、ＭＳで解析した。この方法を使用して、８４％配列被覆度を得ることが可能である：（配列番号４７（ベクトル由来配列はイタリック体、ＭＡＬＤＩ解析によって同定された配列は下線））。
【０２１３】
【化１】
2007535897.tif 000002
予測４４２３３Ｄａタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび飛行時間解析は、それぞれ４５０００Ｄａおよび４４２３５Ｄａの見かけの質量を明らかにした。全体として、これらの研究は、翻訳後修飾の存在を示す証拠を一切与えなかった。
【０２１４】
（接着アッセイの結果）
多数の研究は、ＩＭＤＨ  Ｂが接着因子として作用する理論を裏付けている。それゆえ抗ＩＭＤＨ  ＢＦａｂ断片を用いたＡｆＣのプレインキュベーションは、免疫前血清から単離されたＦａｂ断片の存在下でプレインキュベートされたＡｆＣと比較して、接着性ＡｆＣの数の減少を引き起こした（図１０を参照）。さらに組換えＩＭＤＨ  Ｂの可変量を用いたＡ５４９上皮のプレインキュベーションと、それに続く未結合タンパク質を除去するための洗浄は、タンパク質がＡ５４９細胞の表面のレセプタを封鎖し、それゆえＡｆＣの接着を防止したことを示唆した（図１１を参照）。
【０２１５】
（発芽阻害実験）
抗ＩＭＤＨ  Ｂ抗体が正常または熱不活性化ウサギ血清の存在下でＡｆＣの発芽を低下させる能力を判定するために、多数の実験を実施した。これらの実験は、新しいウサギ血清の存在下の抗ＩＭＤＨ  Ｂ熱不活性化血清のみが、ＡｆＣの発芽速度を低下させる能力を明らかにした（図１２を参照）。さらなる研究は、正常ウサギ血清の存在下の精製抗ＩＭＤＨ  Ｂ  ＩｇＧも、ヌルＩｇＧと比較してＡｆＣの発芽を低減する能力を所有していることを明らかにした（図１３を参照）。
【０２１６】
（ＩＭＤＨ  Ｂの第２のコピーの同定）
さらなる生物情報解析は、ＩＭＤＨ  Ｂ遺伝子に対する相同性を示し、ＩＭＤＨ  Ｂ１に対して５０％同一および６３％類似であるタンパク質をコード化することが予測されるＡｆゲノムの第２の領域の存在を明らかにした（配列比較については、図１４）。各遺伝子およびタンパク質の配列は、ＢＬＡＳＴ解析によって予測された。このタンパク質の特徴を以下に示す。
【０２１７】
【化２】
2007535897.tif 000003
ＩＭＤＨ  Ｂ２は最終予測ＯＲＦ配列（配列番号４０）を含有する：
【０２１８】
【化３】
2007535897.tif 000004
これは以下のタンパク質をコード化する（配列番号４１）：
【０２１９】
【化４】
2007535897.tif 000005
（実施例４  追加のＡＣＥ標的に行った研究）
（標的タンパク質の予測抗原ペプチドに対する血清の産生）
ＡｆＣ表面上の多数の新規なタンパク質の同定の後、新規な分子の多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）に対して産生された抗血清の生成を通じてこれらの研究を進めることを決定した。それゆえ各選択された標的からの２つのペプチドを選択して（以下の表を参照）、その情報は、そのカスタムペプチド合成およびウサギ免疫付与プロトコルに従ってペプチドおよび抗血清を生成したＳｉｇｍａに伝えた。選択したペプチド（表３を参照）は、質量分析手段中に同定されたもの（表１を参照）およびＳｉｇｍａによって提供された指針を使用して最も抗原性であることが予測されたものに対応する。
【０２２０】
（ＭＡＰ分子に対して産生された血清を用いたＩＦＭ解析）
ＭＡＰおよび対応する抗血清の生成の後、ＩｇＧを精製して、各種の標的分子の表面発現の確認にて補助するために、ＩＦＭ実験で使用した。これらのＩＦＭ実験の結果を表３にまとめ、図１５でＧＡＰ−Ｂ−２について例示した。ＧＡＰＤＨ２のＧＡＰ−Ｂ−２分子に対して産生された血清は、多数の臨床アイソレートに対しても試験した。臨床アイソレートの表面に対するこの血清の反応性（図１６に例示、他は示さず）は、ＡＴＣＣ  ４６６４０以外のアイソレート内でのＧＡＰＤＨ２の表面局在を裏付けている。
【０２２１】
（組換えエノラーゼのクローニング、発現および精製；ならびに未変性エノラーゼの検出）
Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのエノラーゼ遺伝子をクローニングして、タンパク質をＩＭＤＨ  Ｂについて詳説したのと同じプロトコルを使用して発現させたが、唯一の相違はフォワード（５’−ＡＴＧＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＴＣ−３’（配列番号４２））およびリバースプライマー（５’−ＣＡＧＧＴＴＧＡＣＧＧＣＡＧＴ−３’（配列番号４３））の配列であった。クローニングされたｃＤＮＡ分子の配列は、標準手段を使用して確認した）（配列番号４８および配列番号４９）。組換えタンパク質の発現は、抗ｈｉｓ抗体（図１７（Ａ））を使用して確認した。さらにタンパク質がＥＮＯ−２に対して産生された抗ＭＡＰ血清と反応することが示された（図１７（Ａ））。抗ＭＡＰ血清が組換えエノラーゼと結合することを確認して、ＡｆＣからの単離膜および壁画分に対する血清を試験することを決定した。これらの研究は、タンパク質がＡｆＣの細胞膜中に存在することを明らかにした（図１７（Ｂ））。
【０２２２】
（実施例５  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ＩＭＤＨ  Ｂと他の真菌からの相同ポリペプチドとの配列比較）
高い配列同一性のエリアを発見するために、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ＩＭＤＨ  Ｂの配列（配列番号３６）を他の真菌からの相同性配列と比較した。図１８−２５は、配列番号３６の相同ポリペプチドとの配列結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１Ａ】表１は、ＡｆＣ画分にて同定されたペプチドの配列を示す。ポリペプチド（ＣｓｓＩ、ハイドロフォビン、ＧＡＰＤＨ、エノラーゼ、カタラーゼ（Ａ＋Ｂ）およびイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ）それぞれについて、３つの異なる画分（透析物、細胞表面露出、および細胞壁）中で同定されたペプチド、そして抗体産生に使用されたペプチドの配列を示す。Ｘ１はセリンまたはアラニンであり、Ｘ２はロイシンまたはイソロイシンである。
【図１Ｂ】表２は、全長ＣｓｓＩポリペプチドの、そしてそのＮ末端およびそのＣ末端半分のある生化学的特徴を示す。「ＭＷ」は分子量を示す。「残基」は残基の数を示す。
【図１Ｃ】選択した標的タンパク質に対する多重抗原ペプチドおよび抗血清の産生のために選択されたペプチドの配列。
【図１Ｄ】抗ＩＭＤＨ  Ｂ  ＩｇＧが臨床アイソレートの表面に結合する能力の解析。
【図１】図１は、ＣｓｓＩ（Ａ）（配列番号１）、ハイドロフォビン（Ｂ）（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（Ｃ）（配列番号３）、エノラーゼ（Ｄ）（配列番号４）、カタラーゼＢ（Ｅ）（配列番号５）、カタラーゼＡ（Ｆ）（配列番号６）、およびイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（Ｇ）（配列番号３６）の予測全長ポリペプチド配列を示す。
【図２】図２は、Ｊａｍｅｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ（１９８８）によって予測された、ＣｓｓＩ（Ａ）およびハイドロフォビン（Ｂ）残基の予測抗原性指数を示す。
【図３】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓからのＧＡＰＤＨ−Ａ（ＡｆＡ）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（ＡｆＢ）、およびＧＡＰＤＨ−Ｃ（ＡｆＣ）の予測タンパク質配列の配列比較。３つすべてのタンパク質において同一である残基は、黒い背景上に示す。ＭＳによって同定されたＧＡＰＤＨ−Ｂのペプチドには下線が付けてある。
【図４】抗ＡｆＭ  ＩｇＧを用いて（レーン２−５）または用いずに（レーン６−１０）調製した、Ａｆｆｉｇｅｌ免疫親和カラムに添加されたＡｆＭ溶解物サンプル（レーン２および７）の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１および６は、徹底的な洗浄ステップの後にこれらのカラムから溶出したサンプルを示す（レーン３−５および８−１０）。９７、６４および５１のおおよその重量にて溶出されるタンパク質は、質量分析法によって、すべてＩＭＤＨ  Ｂとして同定された。
【図５】抗ＡｆＭ血清（Ｃ）によって、そして二次抗体のみ（Ｄ）によって標識されたＡｆＭの位相差（Ａ）および免疫蛍光顕微鏡写真（Ｂ）。
【図６】抗ＡｆＭ  Ｆａｂ断片がＡｆＣのＡ５４９細胞への接着を低減する能力を示す、肺上皮へのＡｆＣの接着。
【図７】ＩＭＤＨ  Ｂの精製に含まれるステップを示す、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１、ＭＷ標準；レーン２、ニッケルセファロースカラムによって精製された組換えＩＭＤＨ  Ｂ；レーン３、Ｓ２００ゲル濾過カラムによる精製後の組換えタンパク質；レーン４、レーン４と同様であるが、１０倍の量のタンパク質を添加する。
【図８】ウサギを免疫付与するのに使用したニッケルセファロース精製組換えＩＭＤＨ  Ｂ（１）；免疫前血清の反応性（２）、ウェスタンブロッティングによって検出された組換えタンパク質に対する免疫後第１出血（３）および免疫後第２出血を示す、クマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図９】ＩＭＤＨ  Ｂによって免疫付与されたウサギから単離した免疫前または免疫後ＩｇＧを用いて染色したＡＴＣＣ  ４６６４０からのＡｆＣおよびＡｆＭの免疫蛍光顕微鏡写真。
【図１０】抗ＩＭＤＨ  Ｂ反応性免疫後Ｆａｂ断片を用いたＡｆＣのプレインキュベーションは、Ａ５４９細胞へのＡｆＣ接着を低下させる。
【図１１】Ａ５４９細胞を用いたｒＩＭＤＨ  Ｂのプレインキュベーションと、それに続く洗浄は、線形的な方法でＡｆＣの続いての接着を低下させる。
【図１２】抗ＩＭＤＨ  Ｂ血清および通常補体（サンプル２）の存在下でのＡｆＣのインキュベーションは、免疫前または無関係な血清（それぞれサンプル５および８）の存在下でインキュベートされたサンプルと比較して発芽の低減を引き起こす。
【図１３】抗ＩＭＤＨ  Ｂ  ＩｇＧおよび通常補体の存在下でのＡｆＣのインキュベーションは、免疫前または抗ＫＬＨ  ＩｇＧの存在下でインキュベートされたサンプルと比較して発芽の低減を引き起こす。
【図１４】ＩＭＤＨ  Ｂ１対ＩＭＤＨ  Ｂ２の配列比較。
【図１５】ＭＡＰ分子に対して産生された抗血清を用いて実施されたＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ＡＴＣＣ  ４６６４０の免疫蛍光顕微鏡解析。ＡｆＣおよびＡｆＭは、免疫前および免疫後血清を用いて染色した。
【図１６】ＧＡＰ−Ｂ−２に対して産生された抗血清を使用して、臨床アイソレートを用いて実施された免疫蛍光顕微鏡解析。ＡｆＣは、免疫前および免疫後血清の両方を用いて染色した。
【図１７】（Ａ）抗ｈｉｓ（レーン１）および抗エノラーゼ（レーン３；ＥＮＯ−２、表３を参照）抗体を用いたが、抗エノラーゼ血清を生成するために使用した動物からの免疫前血清を用いない、（レーン４）組換えエノラーゼ；（Ｂ）抗エノラーゼ（ＥＮＯ−２、表３を参照）抗体によるＡｆＣの細胞膜中の未変性エノラーゼ（レーン６）の検出を示す、ウェスタンブロット実験。
【図１８】配列番号３６の一部と、広く入手できるヌクレオチド配列（Ｃａ−アセンブリ１９．コンティグ中のコンティグ１９−１０２６２）に由来する、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓからの相同配列との配列比較。
【図１９】配列番号３６の一部と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ相同体（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＡｎｒＰ４３７４９２５−ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ：ＬＥ３Ｂ  ＡＳＰＮＧ  ３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（ベータ−ＩＰＭデヒドロゲナーゼＢ）（ＩＭＤＨ  Ｂ）（３−ＩＰＭ−ＤＨ  Ｂ）［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＦＧＳＣ  Ａ４］ＤＢＸＲＥＦ：ｇｉ｜４０７４４０４５｜ｇｂ｜ＥＡＡ６３２２７．１）との配列比較。
【図２０】配列番号３６の一部と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ相同体（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＡｎｒＰ３７１１４７４−ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ：機能未知タンパク質［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ］ＤＢＸＲＥＦ：ｇｉ｜２７９０１５５８｜ｄｂｊ｜ＢＡＣ５５９０６．１）との配列比較。
【図２１】配列番号３６の一部と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ相同体（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＡｎｒＰ４３７９９８６−ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  保存機能未知タンパク質［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓＦＧＳＣＡ４］ＤＢＸＲＥＦ：ｇｉ｜４０７４１２０２｜ｇｂ｜ＥＡＡ６０３９２．１）との配列比較。
【図２２】配列番号３６の一部と、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ相同体：ＴＩＧＲ  ２２２９２９／コンティグ１７７２  Ｃ．ｐｏｓａｄａｓｉｉ  Ｃ７３５との配列比較。
【図２３】配列番号３６の一部とＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ相同体Ｒｅｆ．ｎｒ．：ｃｈｒ０１ｂ．ｂ３５０１．０３１２２０．ｃ１１．との配列比較。
【図２４】図１８−２２からのＩＭＤＨ  Ｂ相同体のＣｌｕｓｔａｌＷ。
【図２５】図２４の続き。
【図１Ａ】
2007535897.tif 000006
【図１Ｂ】
2007535897.tif 000007
【図１Ｃ】
2007535897.tif 000008
【図１Ｄ】
2007535897.tif 000009
【図１】
2007535897.tif 000010
【図２】
2007535897.tif 000011
【図３】
2007535897.tif 000012
【図４】
2007535897.tif 000013
【図５】
2007535897.tif 000014
【図６】
2007535897.tif 000015
【図７】
2007535897.tif 000016
【図８】
2007535897.tif 000017
【図９】
2007535897.tif 000018
【図１０】
2007535897.tif 000019
【図１１】
2007535897.tif 000020
【図１２】
2007535897.tif 000021
【図１３】
2007535897.tif 000022
【図１４】
2007535897.tif 000023
【図１５】
2007535897.tif 000024
【図１６】
2007535897.tif 000025
【図１７】
2007535897.tif 000026
【図１８】
2007535897.tif 000027
【図１９】
2007535897.tif 000028
【図２０】
2007535897.tif 000029
【図２１】
2007535897.tif 000030
【図２２】
2007535897.tif 000031
【図２３】
2007535897.tif 000032
【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年2月16日(2006.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）からなる群より選択される細胞外Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓポリペプチドを結合し得る、単離抗体。
【請求項２】
前記抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤからなる群より選択され、ＩｇＧが好ましくはＩｇＧ１である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、インタクトなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞を結合し得る、請求項１または２のいずれかに記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体がポリクローナルである、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナルである、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体がヒト抗体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が精製されている、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体がさらに相同ポリペプチドを結合し得、該相同ポリペプチドが、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）からなる群より選択されるポリペプチドに対して、４２％以上などの３９％以上の、例えば６８％以上などの４８％以上の、例えば９０％以上などの８０％以上の配列同一性を有する、請求項１〜８いずれかに記載の抗体。
【請求項１０】
前記相同ポリペプチドが、
−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｅａなどのコウジカビ種、
−Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、
−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
−Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓなどのカンジダ種、
−Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、またはＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓなどのＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、
−Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓなどのＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、
−Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、
−Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ種、
−アオカビ種、
または
−Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ
を起源とする、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記相同ポリペプチドが、
−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｅａなどのコウジカビ種、
−Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、
−Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、
または
−Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ
を起源とする、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記相同ポリペプチドが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｅａなどのコウジカビ種を起源とする、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記相同ポリペプチドが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓを起源とする、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
前記相同ポリペプチドが、配列番号４１のポリペプチドである、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）およびカタラーゼＡ（配列番号６）からなる群より選択されるポリペプチドを結合し得る、請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）およびＣｓｓＩ（配列番号１）からなる群より選択されるポリペプチドを結合し得る、請求項１〜１５のいずれかに記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）を結合し得る、請求項１〜１６のいずれかに記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、以下：Ｓｅｒ６７−Ｌｅｕ７１、Ａｌａ７４−Ｔｒｐ８０、Ｓｅｒ１９１−Ａｒｇ２０５、Ｌｅｕ２６８−Ｌｅｕ２７３、Ｈｉｓ２９２−Ｐｒｏ２９６、Ｇｌｕ３５５−Ｉｌｅ３６０、Ａｓｐｌ９３−Ｇｌｕ２０９、Ａｓｐ１９３−Ａｌａ１９９、Ｉｌｅ１５−Ｖａｌ１９、Ｖａｌ７５−Ｔｒｐ８０、Ｐｒｏ１１−Ｇｌｕ１８からなる群より選択される配列番号３６の領域および配列番号３７によって定義される領域の残基の１つ以上を含むエピトープ、好ましくは該領域内に含まれる残基から完全になるエピトープを結合し得る、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに定義される抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項２０】
医薬として使用するための、請求項１〜１８のいずれかに定義される抗体、または請求項１９に定義される組成物。
【請求項２１】
真菌感染の処置または予防用の医薬の製造のための、請求項１〜１８のいずれかに定義される抗体、または請求項１９に定義される組成物の使用。
【請求項２２】
前記医薬が、コウジカビ感染、好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ感染の処置または予防用の医薬である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記医薬が：侵襲性アスペルギルス症、アスペルギルス腫、およびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症などのアレルギー性アスペルギルス症からなる群より選択される真菌疾患の処置または予防用の医薬である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
以下の群：
配列番号３６を含むポリペプチド、それらの断片およびそれらの改変体、
配列番号７、８、１７、２６、２８、２９および／または３０で示したアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、例えば２００未満などの２５９未満のアミノ酸残基長、好ましくは１００未満などの１５０未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの５０未満のアミノ酸残基長の、配列番号１の断片および該断片の改変体；
配列番号９、１０、１８および／または１９で示したアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、例えば７５未満などの１０６未満のアミノ酸残基長、好ましくは２５未満などの５０未満のアミノ酸残基長の、配列番号２の断片および該断片の改変体；
配列番号３を含むポリペプチド、それらの断片およびそれらの改変体であって、但し、該ポリペプチドが配列番号３の断片である場合、この断片は、配列番号３５に示した断片ではない、ポリペプチド、それらの断片およびそれらの改変体；
配列番号１３、１４、２３、２４および／または２５で示されるアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、例えば２００未満などの４３７未満のアミノ酸残基長、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの、５０未満のアミノ酸残基長の、配列番号４の断片および該断片の改変体；
配列番号１５、１６および／または２７に示されるアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、７２７未満の、例えば２００未満などの４００未満のアミノ酸残基長、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の、配列番号５の断片および該断片の改変体；
ならびに、
配列番号３４で示されるアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、７４８未満の、例えば２００未満などの４００未満のアミノ酸残基長、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の、配列番号６の断片および該断片の改変体；
より選択される１種以上のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓポリペプチドを含有する、組成物。
【請求項２５】
以下の群：
配列番号３６を含むポリペプチド、それらの断片およびそれらの改変体、
配列番号７、８、１７、２６、２８、２９および／または３０で示したアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、例えば２００未満などの２５９未満のアミノ酸残基長、好ましくは１００未満などの１５０未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの５０未満のアミノ酸残基長の、配列番号１の断片および該断片の改変体；
配列番号９、１０、１８および／または１９で示したアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、例えば７５未満などの１０６未満のアミノ酸残基長、好ましくは２５未満などの５０未満の残基長の、配列番号２の断片および該断片の改変体；
配列番号３を含むポリペプチド、それらの断片およびそれらの改変体であって、但し、該ポリペプチドが配列番号３の断片である場合、この断片は、配列番号３５に示した断片ではない、ポリペプチド、それらの断片およびそれらの改変体；
配列番号１３、１４、２３、２４および／または２５で示されるアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、例えば２００未満などの４３７未満のアミノ酸残基長、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの、５０未満のアミノ酸残基長の、配列番号４の断片および該断片の改変体；
配列番号１５、１６および／または２７に示されるアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、７２７未満の、例えば２００未満などの４００未満のアミノ酸残基長、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の、配列番号５の断片および該断片の改変体；
ならびに、
配列番号３４で示されるアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む、７４８未満の、例えば２００未満などの４００未満のアミノ酸残基長、好ましくは７５未満などの１００未満のアミノ酸残基長、例えば２５未満などの５０未満のアミノ酸残基の、配列番号６の断片および該断片の改変体；
より選択される、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、配列番号７〜２７および／または３７で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む断片、または該断片の改変体である、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、配列番号７〜１６で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む断片、または該断片の改変体である、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、配列番号１７〜２５および／または配列番号１４で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む断片、または該断片の改変体である、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、配列番号１８、１９、２６、２７、および／または３７で示されたアミノ酸配列の１つ以上の残基を含む断片、または該断片の改変体である、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
請求項２５〜２９のいずれかに定義されるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項３０に定義されるポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項３２】
請求項３０に定義されるポリヌクレオチドおよび／または請求項３１に定義される発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項３３】
請求項２５〜２９のいずれかに定義されるポリペプチドまたは請求項３０に定義されるポリヌクレオチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３４】
医薬として使用するための、請求項２５〜２９のいずれかに定義されるポリペプチド、または請求項３０に定義されるポリヌクレオチド。
【請求項３５】
真菌感染に対する哺乳動物の免疫化用の医薬製造のための、請求項２５〜２９のいずれかに定義されるポリペプチド、請求項３０に定義されるポリヌクレオチドの使用。
【請求項３６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
非ヒト哺乳動物における配列番号１、２、３、６および３６で示されたポリペプチドの群より選択されるポリペプチドに対する特異的抗体を惹起するための方法であって、以下の工程、
ａ．イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）、または請求項２５〜２９のいずれかに定義されるポリペプチドの群より選択されたポリペプチド、またはこれらのポリペプチドのいずれかを発現する細胞を提供する工程、
ｂ．該ポリペプチドまたは該細胞を含有する組成物を該動物に導入する工程、
ｃ．該動物において抗体を惹起する工程、ならびに
ｄ．該抗体を単離して、必要に応じて精製する工程、
を包含する、方法。
【請求項３８】
前記抗体を惹起する工程が、ヒト抗体を生成し得るトランスジェニック動物において行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記提供されるポリペプチドが、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）もしくはその断片、または該ポリペプチドの改変体である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記提供されるポリペプチドが、ＣｓｓＩ（配列番号１）もしくはその断片、または該ポリペプチドの改変体である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記提供されるポリペプチドが、ハイドロフォビン（配列番号２）もしくはその断片、または該ポリペプチドの改変体である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記提供されるポリペプチドが、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）もしくはその断片、または該ポリペプチドの改変体である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記提供されるポリペプチドが、カタラーゼＡ（配列番号６）もしくはその断片、または該ポリペプチドの改変体である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４４】
イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、エノラーゼ（配列番号４）、カタラーゼＢ（配列番号５）およびカタラーゼＡ（配列番号６）の群より選択されるポリペプチドの結合パートナーを同定するための方法であって、以下の工程：
ａ．請求項２５〜２９のいずれかに定義されるポリペプチドまたはイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、カタラーゼＢ（配列番号５）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）の群より選択されるポリペプチドを提供する工程、
ｂ．該ポリペプチドを推定上の結合パートナーに接触させる工程、ならびに
ｃ．該推定上の結合パートナーが該ポリペプチドに結合し得るか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４５】
前記推定上の結合パートナーが宿主由来分子である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が複数の推定上の結合パートナーについて繰り返される、請求項４４〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
抗真菌活性を備える化合物を同定するための方法であって、以下：
ａ．低下したレベルの、配列番号１、２、３、５、６、および３６の群より選択されるポリペプチドを有する感作細胞を提供する工程、ならびに、
ｂ．推定上の抗真菌化合物に対する該細胞の感受性を、例えば増殖アッセイによって決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４８】
イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ＧＡＰＤＨ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）の群より選択される細胞外コウジカビポリペプチドのインヒビターを同定するための方法であって、以下：
ａ．イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ＧＡＰＤＨ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）の群より選択されるポリペプチドのレベルが異なる２つの細胞を提供する工程、
ｂ．推定上のインヒビターに対する該細胞の感受性を、例えば増殖アッセイによって決定する工程、ならびに、
ｃ．該２つの細胞が該推定上のインヒビターの存在によって異なる影響を受けるか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
前記２つの細胞は、前記ポリペプチドのコピー数が異なる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記２つの細胞は、前記ポリペプチドの活性が異なる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
真菌感染、好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ感染を診断するためのキットであって、以下：
ａ．イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）の群より選択されるポリペプチドを特異的に認識および結合し得るインジケータ部分、
を備える、キット。
【請求項５２】
前記インジケータ部分が、請求項１〜１８のいずれかに定義される抗体などの抗体であるか、それらの抗体を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
生物学的サンプルにおいて真菌物質、好ましくはインタクトな真菌細胞、最も好ましくはインタクトなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞を検出するためのキットであって、以下：
ａ．イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素Ｂ（配列番号３６）、ＣｓｓＩ（配列番号１）、ハイドロフォビン（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｂ（配列番号３）、およびカタラーゼＡ（配列番号６）の群より選択されるポリペプチドを特異的に認識および結合し得るインジケータ部分、ならびに
ｂ．該インジケータ部分の該真菌物質への結合を促進するための緩衝液；検出可能なシグナルを発生するための試薬；およびユーザに対する記載された説明書のうちの１つ以上；
を備える、キット。
【請求項５４】
前記インジケータが、請求項１〜１８のいずれかに定義される抗体などの抗体であるか、またはそれらの抗体を含む、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記抗体が、例えば、毒素または殺菌因子のような治療部分に接合されるか、または、例えば、放射性物質のような検出可能な物質に連結される、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体。
【請求項５６】
前記方法が、他の抗真菌治療と併用される、請求項２１に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007535897000001.app
【国際調査報告】
2007535897.tif 000072
2007535897.tif 000073
2007535897.tif 000074
2007535897.tif 000075
2007535897.tif 000076
2007535897.tif 000077