(57)【要約】本発明は、式IIIの７−オキソ−５−アンドロステロンステロイドを製造するための二工程の微生物的方法に関する。  【化１】2007515932.tif 000015
2007515932.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）式Ｉ
【化１】
2007515932.tif 000009
（式中、ＲはＨまたは-COR1であり、R1は１〜５個の炭素のアルキルである）
の５−アンドロステンステロイドと、
ステロイド濃度が１Ｌ当り１ｇまたはそれ以上の液体培地中で、微生物的変換を行うことのできるケカビ種とを接触させ、式II
【化２】
2007515932.tif 000010
の７α−ヒドロキシ−５−アンドロステンステロイドを得る工程；
２）工程１）の液体培地から式IIの７α−ヒドロキシ−５−アンドロステンステロイドを単離する工程；
を含む、７−ヒドロキシ−５−アンドロステンステロイドを製造する方法。
【請求項２】
さらに、
３）液体培地中の式IIの７α−ヒドロキシ−５−アンドロステンステロイドと、７α−ヒドロキシ−５−アンドロステンステロイドを酸化して式III
【化３】
2007515932.tif 000011
の７−オキソ−５−アンドロステンステロイドへと変換できる７α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素を含有する、エシェリキア、アルカリゲネス、クロストリジウム、ユーバクテリウム、またはバクテロイド属の細菌のいずれかとを接触させる工程；
４）工程３）の液体培地から式IIIのステロイドを単離する工程；
を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
１）式Ｉ
【化４】
2007515932.tif 000012
（式中、ＲはＨまたは-COR1であり、R1は１〜５個の炭素のアルキルである）
の５−アンドロステンステロイドと、液体培地中で、微生物的変換を行うことのできるケカビ種とを接触させ、式II
【化５】
2007515932.tif 000013
の７α−ヒドロキシ−５−アンドロステンステロイドを得る工程；
２）工程１）の液体培地から式IIの７α−ヒドロキシ−５−アンドロステンステロイドを単離する工程；
３）液体培地中の式IIの７α−ヒドロキシ−５−アンドロステンステロイドと、７α−ヒドロキシ−５−アンドロステンステロイドを酸化して、式III
【化６】
2007515932.tif 000014
の７−オキソ−５−アンドロステンステロイドへと変換できる、エシェリキア種とを接触させる工程；
４）工程３）の液体培地から式IIIのステロイドを単離する工程；
を含む、７−オキソ−５−アンドロステンステロイドを製造する方法。
【請求項４】
ケカビ種がムコール・ルキシーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ケカビ種がムコール・ルキシーATCC4260である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ケカビ種がムコール・ルキシーである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ケカビ種がムコール・ルキシーATCC4260である、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式IIIの７−オキソ−５−アンドロステンステロイドを製造するための二工程の微生物的方法に関する。
【化１】
2007515932.tif 000003
（式中、ＲはＨまたは-COR1であり、R1は１〜５個の炭素のアルキルである）
【背景技術】
【０００２】
５−アンドロステン−３β−オール−７，１７−ジオン（７−ケトDHEA）は、商業的に入手可能なステロイド補助剤であり、心臓疾患、免疫機能、加齢、および全身的な健康状態に好ましい作用を及ぼすと考えられている。
【０００３】
米国特許5,869,709およびLardy等（Steroids 63: 158-165, 1998）には、７−ケトDHEAおよび関連する類似体を合成するための化学的方法が記載されている。７−ケトDHEAを製造するための実用的な微生物的方法を記載している先行技術は存在しない。
【０００４】
DHEAの微生物的な７α−ヒドロキシル化を詳説する各種の方法が存在する。Cotillonおよびその共同研究者（フランス特許2,771,105；J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 62: 467-475, 1997 ；J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 68:229-237, 1999）は糸状真菌であるフザリウム・モリノフォルメ（Fusarium monoliforme）を、DHEAの７α−ヒドロキシル化を行わせるために用いた。彼らはDHEAから所望の生成物への高い割合での変換（80％を超える）を詳説しているが、用いた基質濃度は低い。Kolek（J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 71 : 83-90,1999）は、フザリウム・カルモルム（Fusarium culmorum）を用いた５−エンステロイドのヒドロキシル化を研究している。５−エンステロイドが、DHEAのように、C3およびC17に酸素基を含む場合は、この真菌はもっぱら７α−軸上の位置でヒドロキシル化を行った。ここでもまた、研究に用いたDHEAの濃度は低かった（80mLの培地当り20mg、すなわち0.25ｇ／Ｌ）。Wilson等（Steroids 64: 834-843,1999）は、３β−ヒドロキシ−Δ5ステロイドを７α−ヒドロキシル化することのできるフザリウム・オキシスポルム・var.・クベンセ（Fusarium oxysporum var. cubense）を分離した。しかし、培地１Ｌ当り0.8ｇのDHEAを用いて68％の生成物の収率が達成されたに過ぎなかった。MadyasthaおよびJoseph（Appl. Microbiol. Biotechnol. 44: 339-343, 1995）は、糸状真菌であるムコール・ピリホルミス（Mucor piriformis）をDHEAを変換するために用いた。低い基質濃度（0.5ｇ／Ｌ）において、約25％が未変換のまま残り、そして残余は７α−ヒドロキシル基の導入を含む、各種の異なった酸化型および還元型生成物へと変換した。
【０００５】
エシェリキア、アルカリゲネス、クロストリジウム、ユーバクテリウム、またはバクテロイドのような細菌における、７−ヒドロキシステロイドから７−オキソステロイドへと酸化する、７α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素活性はこれ迄に文献に記載されている（Schmidt, et al., J. Biol. Chemin. 145: 229-236,1942 ; Schmidt and Hughes, United States Patent 2,360,447; MacDonald, et al., Analytical Chemistry 57: 127-136,1974 ; MacDonald, etal., Applied Microbiology 30: 530-535, 1975 ; MacDonald, et al., Journal of Lipid Research 16: 244-246, 1975）。最近の研究は細菌の７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性とクローン化と特性解明に焦点が当てられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の微生物的変換は、１Ｌ当り0.5ｇ未満のステロイド基質濃度を用いて行われてい
る。それゆえに、７−オキソ−５−アンドロステンステロイドを製造するための費用効果に優れた方法を提供するための、１Ｌ当り１ｇまたはそれ以上のステロイド基質濃度を用いる変換に対する要求が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この発明は、７−オキソ−５−アンドロステンステロイドを製造するための二段階の方法に関している。最初の段階は以下の工程：
１）次の式Ｉ
【化２】
2007515932.tif 000004
（式中、ＲはＨまたは-COR1であり、R1は１〜５個の炭素のアルキルである）の５−アンドロステンステロイドと、
ステロイド濃度が１Ｌ当り１ｇまたはそれ以上の液体培地中で、７α−ヒドロキシル化を行うことができるケカビ種と接触させ、次の式II
【化３】
2007515932.tif 000005
の７α−ヒドロキシ−５−アンドロステンステロイドを得る工程；
２）工程１）の液体培地から、式IIの７α−ヒドロキシ−５−アンドロステンステロイドを単離すること、を含んでいる。
【０００８】
第二の工程は以下の工程：
３）液体培地中の式IIの７α−ヒドロキシ−５−アンドロステンステロイドと、７α−ヒドロキシ−５−アンドロステンステロイドを酸化して式III
【化４】
2007515932.tif 000006
の７−オキソ−５−アンドロステンステロイドへと変換できる、７α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素を含有する、エシェリキア、アルカリゲネス、クロストリジウム、ユーバクテリウム、またはバクテロイデス属の細菌のいずれかとを接触させること；
４）液体培地から式IIIのステロイドを単離すること、を含んでいる。
【０００９】
７αヒドロキシル化の工程の説明
式Ｉの５−アンドロステン−３β−オール−１７−オンまたは関連する類似体をヒドロキシル化して、式IIの５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンまたは関連する類似体を、高収率で生産することができるケカビ属のいかなる繊維状真菌でも、本発明の方法において使用することができる。実施例で説明された方法は、ケカビ属の繊維状真菌の適合性を測定するために使用することができる。好ましくはムコール・ルキシー（Mucor rouxii）を用いる。さらに好ましくは、ムコール・ルキシーATCC44260（別名、NRRL1894）を用いる。
【００１０】
式Ｉの化合物と接触させるケカビ属の真菌は、活発に増殖している培養物、全細胞濃縮物、または無細胞抽出物の形態で利用することができる。好ましくは、この真菌は、この技術分野で認識されている方法のいずれかを用いて、好気的条件下で、液内培養で増殖させ、そしてイン・シツ（in situ）で変換を行う。より好ましくは、この所望の真菌は、下記の好気的条件下で、液内培養で増殖させ、そしてさらに特定すれば、実施例１〜４に記載されたように、特定の成分または他の、当業者に知られている適切な炭素および窒素源を用いて増殖させる。適切な炭素源の非限定的な例には、単糖類、二糖類、三糖類ならびにグリセロールおよびグルシトールのような糖アルコール類が挙げられる。適切な有機窒素源の非限定的な例には、カゼイン、コーンスティープリカー、肉抽出物、魚粉、およびダイズタンパク質水解物が挙げられる。適切な無機窒素源の非限定的な例には、硝酸カリウム、塩化アンモニウム、亜硝酸ナトリウム等が挙げられる。一般に、一次および二次栄養シード（vegetative seed）方法が、式Ｉの５−アンドロステンステロイドから式IIの５−アンドロステン−７−ヒドロキシステロイドへの真菌による変換のための製造において用いることができる。
【００１１】
別法として、一次栄養シードを直接生物変換培地に接種するのに使用することができる。
【００１２】
一次栄養シード培地は、20℃と37℃の間の温度（好ましくは28℃）で、最初のpHが3.0と8.0の間で、24から96時間（好ましくは48時間）、培養することができる。二次栄養シード培地に、0.006％から0.1％(v/v)、典型的には0.012％(v/v)、の一次栄養シード培養物を植付け、そして20℃と37℃の間の温度（好ましくは28℃）で、36から72時間（このましくは48〜60時間）、培養する。二次シード培地のpHは3.0と8.0の間で良く、好ましくは3.0と5.0の間である。生物変換用培地は、この二次栄養シード培地と同一でも類似でも良く、１％から10％(v/v)（好ましくは３％から５％）の二次栄養シード培地に接種される。生物変換醗酵条件は、二次栄養シード培地の培養において使用されるものと同一であっていい。
【００１３】
ゼロから72時間まで（好ましくは12から24時間）の初期培養時間の後、式Ｉの５−アンドロステンステロイドは、好ましくは微細化されて、生物変換培地に添加される。微細化された式Ｉの５−アンドロステンステロイドは、乾燥粉末または水性スラリーとして、単回の添加、一連の添加、または連続添加のいずれかで添加することができる。式Ｉの５−アンドロステンステロイドは、１ｇ／Ｌより高い濃度で、より好ましくは５ｇ／Ｌより高い、さらにより好ましくは15ｇ／Ｌより高い濃度で使用することが好ましい。式Ｉの５−アンドロステンステロイドから式IIの５−アンドロステン−７−ヒドロキシステロイドを生成する生物変換は、約２〜約６日間、典型的には約４日間、行うことができる。
【００１４】
一旦、式Ｉの５−アンドロステンステロイドから式IIの５−アンドロステン−７−ヒドロキシステロイドへの変換が完了すれば、式IIの５−アンドロステン−７−ヒドロキシステロイドは、この分野で認められている多数の方法のいずれか一つを用いて単離することができる。好ましくは、式IIの５−アンドロステン−７−ヒドロキシステロイドは、下記の方法を用いて単離され、より特定すれば、実施例５に記載されたように、特定した溶媒、またはその他の当業者に知られた適切な溶媒を用いて単離することができる。濾過し、または遠心分離したビール固形物（beer solids）を、有機溶媒、例えばメタノール、アセトン、酢酸ブチル、または塩化メチレンを用いて抽出し、そして式IIの５−アンドロステン−７−ヒドロキシステロイドを結晶化により単離する。結晶化溶媒の非限定的な例には、水、メタノール、アセトン、酢酸ブチル、塩化メチレン、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい抽出溶媒は塩化メチレンであり、好ましい結晶化溶媒は酢酸ｎ−ブチルである。
【００１５】
７α−ヒドロキシステロイドの酸化工程の説明
エシェリキア、アルカリゲネス、クロストリジウム、ユーバクテリウム、またはバクテロイデス属の細菌で、式IIの５−アンドロステン−７−ヒドロキシステロイドを酸化して式IIIの５−アンドロステン−７−オキソ−ステロイドへと変換しうる７α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素を含むいかなる細菌も、本発明の方法で用いることができる。実施例に記載された方法を、この細菌の適合性を測定するために用いることができる。好ましくは、エシェリキア属の細菌が用いられる。より好ましくは、エシェリキア・コリの菌株が用いられる。よりさらに好ましくは、エシェリキア・コリATCC29532が用いられる。
【００１６】
エシェリキア、アルカリゲネス、クロストリジウム、ユーバクテリウム、またはバクテロイデス属の細菌は、活発に増殖している培養物、全細胞濃縮物、または無細胞抽出物の形態で利用することができる。好ましくは、この細菌は、この技術分野で認識されている方法のいずれかを用いて、好気的条件下で、液内培養で増殖させ、そしてイン・シツ（in situ）で変換を行う。より好ましくは、この所望の細菌は、下記の好気的条件下で、液内培養で増殖させ、そしてさらに特定すれば、実施例６に記載されたように、特定の成分または他の当業者に知られている適切な炭素および窒素源を用いて増殖させる。一般に、一次栄養性シード方法が、式IIの５−アンドロステン−７−ヒドロキシステロイドから式IIIの５−アンドロステン−７−オキソ−ステロイドへの真菌による変換のための調製において使用される。
【００１７】
一次栄養シード培地に、単一の単離した細菌コロニーを接種し、25℃と40℃の間の温度（好ましくは37℃）で、最初のpHが5.0と8.0の間（好ましくは中性）で、６から72時間（好ましくは24から36時間）、培養する。生物変換用培地は、この一次栄養シード培地と同一でも類似でも良く、１％から10％(v/v)（好ましくは３％から５％）の一次栄養シード培養物を接種する。生物変換の培養条件は、一次栄養シード培地の培養において使用されるものと同一であっていい。
【００１８】
ゼロから36時間まで（好ましくは６から12時間）の初期培養時間の後、式IIの５−アンドロステン−３β，7α−ジオール−１７−オンまたは関連する類似体は、好ましくは微細化されて、生物変換培地へ添加される。式IIの５−アンドロステン−７−ヒドロキシステロイドは、乾燥粉末または水性スラリーとして、単回の添加、一連の添加、または連続添加のいずれかで添加することができる。微細化された式IIの５−アンドロステン−７−ヒドロキシステロイドは、１ｇ／Ｌより高い濃度で、より好ましくは５ｇ／Ｌより高い、さらにより好ましくは9.5ｇ／Ｌより高い濃度で使用することが好ましい。式IIの５−アンドロステン−７−ヒドロキシステロイドから式IIIの５−アンドロステン−７−オキソステロイドを生成する生物変換は、約２〜約７日間、典型的には約６日間、行うことができる。
【００１９】
一旦、式IIの５−アンドロステン−７−ヒドロキシステロイドから式IIIの５−アンドロステン−７−オキソステロイドへの変換が完了すれば、式IIIの５−アンドロステン−７−オキソステロイドは、この分野で認められている多数の方法のいずれかを用いて単離することができる。好ましくは、式IIIの５−アンドロステン−７−オキソステロイドは、下記の方法を用いて単離され、より特定すれば、実施例７に記載されたように、特定の溶媒、またはその他の当業者に知られた適切な溶媒を用いて単離することができる。濾過し、または遠心分離したビール固形物を、有機溶媒、例えばメタノール、アセトン、酢酸ブチル、または塩化メチレンを用いて抽出し、そして式IIIの５−アンドロステン−７−オキソステロイドを結晶化により単離する。結晶化溶媒の非限定的な例には、水、メタノール、アセトン、酢酸ブチル、塩化メチレン、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい抽出溶媒は塩化メチレンであり、好ましい結晶化溶媒はメタノールである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下の定義および説明は、明細書および特許請求の範囲の両方を含むこの全文書を通して用いられる用語に適用される。
全ての温度は、摂氏温度である。
r.p.m.は、１分当りの回転数を表す。
TLCは、薄層クロマトグラフィーを表す。
HPLCは、高速液体クロマトグラフィーを表す。
psigは、平方インチゲージ当りのポンドを表す。
DOは、溶存酸素を表す。
ROは、逆浸透を表す。
SLMは、１分当りの標準リッターを表す。
VVMは、１分当りの容量を表す。
OURは、酸素取込み速度を表す。
溶媒混合物を用いた時は、用いられる溶媒の割合は、容量／容量（v/v）である。
溶媒中の固形物の溶解度が用いられる時は、溶媒に対する固形物の割合は、質量／容量（wt/v）である。
【００２１】
さらに尽力することなしに、当業者は、前記の記載に従って本発明を完全に実施することができる。以下の詳細な実施例には、種々の化合物をどのように製造し、および／または、本発明の種々の方法をどのように実行するかが記載されているが、単に説明のためであり、前記の開示をいかなるやり方であれ限定はしない。当業者は、反応物について、ならびに、反応条件および技術について、本発明からの適切な改変を容易に認めることができるであろう。
【実施例１】
【００２２】
ムコール・ルキシーATCC44260の10Ｌ醗酵スケールの液内培養を用いた、５−アンドロステン−３β−オール−１７−オンから５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンへの生物変換
【化５】
2007515932.tif 000007
【００２３】
（Ａ）一次シードの段階
凍結したムコール・ルキシーATCC44260の栄養細胞を解凍し、ポテト−デキストロース−寒天プレート（PDA）に移し、28℃で72時間、培養した。単一の菌糸体プラグ（直径６〜７mm）を、シリコーン処理し点刻のある（stippled）500mL容量の振盪フラスコ中の滅菌した一次シード培地100mLへの植付けに使用した。一次シード培地は、RO水１Ｌ当り；デキストリン、50ｇ；ダイズ粉、35ｇ；セレロース、５ｇ；塩化コバルト６水和物、２mg；シリコーン消泡剤（SAG471）、0.5mLを含み；これを前滅菌処理し、２Ｎの水酸化ナトリウムでpHを7.0〜7.1に調整した。ムコール・ルキシーATCC44260は、環境制御された培養振盪機を275r.p.m.に設定して（１''軌道ストローク）28℃で48時間培養した。
【００２４】
（Ｂ）二次シードの段階
10Ｌの二次シード培地に、1.2mLの栄養一次シード培養物を植付けた（0.012％(v/v)植付率）。二次シード培地は、RO水１Ｌ当り；セレロース、60ｇ；ダイズ粉、25ｇ；ダイズ油、５mL；マグネシウム７水和物、１ｇ；リン酸二水素カリウム、0.74ｇ；シリコーン消泡剤（SAG471）、0.5mLを含み；予備滅菌処理し、濃硫酸でpHを4.95〜5.00に調整した。二次シード培地を入れた培養器は、ジャケットおよび注入蒸気を用いて121℃で20分間、滅菌した。滅菌中の振盪速度は200r.p.m.であった。滅菌後、培地pHは、滅菌した硫酸（５％）を用いて5.0に調整した。ムコール・ルキシーATCC44260を以下の初期パラメータを用いて、28℃で培養した：振盪速度、100r.p.m.；背圧＝５psig；気流＝2.5SLM（0.25VVM）；低DO設定点、50％；pH制御はしない。培地がこの低DO設定点に達したとき、50％DOを振盪の制御により維持した。二次シード培養物を、植付け後約50時間の時点で、OURが８から10mM／Ｌ／時の間の時に採取した。
【００２５】
（Ｃ）ステロイド生物変換
10Ｌのステロイド生物変換培地に、500mLの栄養二次シード培養物を植付けた（５％(v/v)植付率）。ステロイド生物変換用培地は、RO水１Ｌ当り；セレロース、60ｇ；ダイズ粉、25ｇ；マグネシウム７水和物、１ｇ；リン酸二水素カリウム、0.74ｇ；シリコーン消泡剤（SAG471）、0.5mLを含み；予備滅菌処理し、濃硫酸でpHを3.95〜4.00に調整した。ステロイド生物変換用培地を入れた培養器は、ジャケットおよび注入蒸気を用いて121℃で20分間、滅菌した。滅菌中の振盪速度は200r.p.m.であった。滅菌後、培地pHは、滅菌した硫酸（５％）を用いて4.0に調整した。ムコール・ルキシーATCC44260を、実質的に二次シード培養のために用いたものと、初期振盪が200r.p.m.であった他は、同一の初期パラメータを用いて、28℃で培養した。植付け後約19、31、43および55時間の時点で、0.2％オクチルフェノキシポリエトキシエタノールの最小容量でスラリー化した微細化５−アンドロステン−３β−オール−１７−オン50ｇを10Ｌの培地に添加した（総量で200ｇの５−アンドロステン−３β−オール−１７−オン）。
【００２６】
この生物変換培地についてTLCを用いて５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンを毎日測定した。全ビールの１mLを温メタノール10mLで希釈した。細胞をこの水−メタノール混合物から遠心分離（3,000×ｇで10分間）により分離し、５〜10μLをTLCプレートに付した。このTLCプレートを塩化メチレン：メタノール：氷酢酸（95：５：１）で展開し、そしてTLCに50％硫酸を噴霧しオーブンで炭化することで、生成物を可視化した。生成物を、50％硫酸で噴霧した時に青色に変色する、純正標準品と比較した。５−アンドロステン−３β−オール−１７−オンから５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンへの生物変換が約４日間で完了した。
【実施例２】
【００２７】
ムコール・ルキシーATCC44260の10Ｌ培養スケールの液内培地を用いた、５−アンドロステン−３β−オール−１７−オンから５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンへの生物変換
（Ａ）一次シードの段階
一次シード培養物は、実施例１で記載されたように製造した。
（Ｂ）二次シードの段階
10Ｌの二次シード培養物は、実施例１で記載されたように製造した。
（Ｃ）ステロイド生物変換
10Ｌの生物変換を実施例１で記載されたように行ったが、ただし培地のpHは5.0に調整した。この生物変換培地について、TLCを用いて、実施例１に記載されたように、５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンを毎日測定した。５−アンドロステン−３β−オール−１７−オンから５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンへの生物変換が約４日間で完了した。
【実施例３】
【００２８】
ムコール・ルキシーATCC44260の10L培養スケールの液内培地を用いた、５−アンドロステン−３β−オール−１７−オンから５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンへの生物変換
（Ａ）一次シードの段階
一次シード培養物は、実施例１で記載されたように製造した。
（Ｂ）二次シードの段階
10Ｌの二次シード培養物は、実施例１で記載されたように製造した。
（Ｃ）ステロイド生物変換
10Ｌの生物変換を実施例１で記載されたように行ったが、ただし培地は、RO水１Ｌ当り；セレロース、60ｇ；ダイズ粉、35ｇ；デキストリン、50ｇ；シリコーン消泡剤（SAG471）、0.5mLを含み；予備滅菌処理し、濃硫酸でpHを3.95〜4.00に調整した。この生物変換培養物について、TLCを用いて、実施例１に記載されたように、５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オン（II）を毎日測定した。５−アンドロステン−３β−オール−１７−オン（Ｉ）から５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンへの生物変換が約４日で完了した。
【実施例４】
【００２９】
ムコール・ルキシーATCC44260の10Ｌ培養スケールの液内培地を用いた、５−アンドロステン−３β−オール−１７−オンから５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンへの生物変換
（Ａ）一次シードの段階
一次シード培養物は、実施例１で記載されたように製造した。
（Ｂ）二次シードの段階
10Ｌの二次シード培養物は、実施例１で記載されたように製造した。
（Ｃ）ステロイド生物変換
10Ｌの生物変換を実施例３で記載されたように行ったが、ただし培地のpHは5.0に調整した。この生物変換培養物について、TLCを用いて、実施例１に記載されたように、５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンを毎日測定した。５−アンドロステン−３β−オール−１７−オンから５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンへの生物変換が約４日間で完了した。
【実施例５】
【００３０】
５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンの単離
４個の10Ｌ培養（実施例１〜４）から採取した全ビールを遠心分離し、そして富固形物（rich solids）を遠心分離により回収した。この富固形物を、塩化メチレン40Ｌを用いて抽出した。この富有機抽出物を、静置により固形物から分離した。この塩化メチレン抽出物を洗浄し、そして蒸留により約２Ｌまで濃縮し、次に酢酸ｎ−ブチルを２Ｌ添加した。この混合物を約２Ｌまで濃縮し、４℃まで冷却し、生成物の結晶化を完了させた。この結晶を濾過により回収し、冷酢酸ブチルで色が消えるまで洗浄し、そして乾燥して結晶化５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンを496ｇ得た。
【実施例６】
【００３１】
エシェリキア・コリATCC29532の100mL培養スケールの液内培養物を用いた、５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンからの５−アンドロステン−３β−オール−７，１７−ジオンへの生物変換
【化６】
2007515932.tif 000008
【００３２】
（Ａ）一次シードの段階
凍結したエシェリキア・コリATCC29532の栄養細胞を解凍し、ブレイン・ハート・インフュージョン寒天プレート（Brain Heart Infusion agar plate）に移し、そして37℃で24時間、培養した。単一の菌コロニーを、500mL容量の振盪フラスコ中の滅菌した100mLの一次シード培地中に接種した。一次シード培地は、RO水１Ｌ当り；加水分解ダイズタンパク質、12ｇ；自己分解酵母エキス、24ｇ；グリセロール、５mL；リン酸一塩基カリウム（結晶）、2.31ｇ；リン酸二塩基カリウム（無水物）、12.54ｇから成り；pHは中性（調整せず）であった。エシェリキア・コリATCC29532を、環境制御された培養振盪機を270r.p.m.に設定して（2''軌道ストローク）、37℃で約24時間、培養した。
【００３３】
（Ｂ）ステロイド生物変換
100mLの滅菌したステロイド生物変換培地に、３mLの栄養一次シード培養物を植付けた（３％(v/v)植付率）。ステロイド生物変換培地は、一次シード培地と同一であった。エシェリキア・コリATCC29532培養を、環境制御された培養振盪機を270r.p.m.に設定して（2''軌道ストローク）、37℃で培養した。植付から約８時間後に、0.2％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートの最小容量でスラリー化した微細化５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンの１ｇを100mLの培地に添加した。
【００３４】
この生物転換培地について、TLCを用いて５−アンドロステン−３β−オール−７，１７−ジオンを毎日測定した。全ビールの１mLを温メタノール10mLで希釈した。細胞をこの水−メタノール混合物から遠心分離（3,000×ｇで10分間）により分離し、２μLをTLCプレートに付した。このTLCプレートをシクロヘキサン：酢酸エチル：メタノール：氷酢酸（90：60：30：１）で展開し、そして最初にUV254で、次に50％硫酸を噴霧しオーブンで炭化することで、生成物を可視化した。生成物を254nmのUV光を吸収し、硫酸で炭化したときに黄色に変色する純正標準品と比較した。５−アンドロステン−３β，７α−ジオール−１７−オンから５−アンドロステン−３β−オール−７，１７−ジオンへの生物変換が約６日で完了した。
【実施例７】
【００３５】
５−アンドロステン−３β−オール−７，１７−ジオンの単離
40回の100mL培養（実施例６）から採取した全ビールを遠心分離し、そして富固形物（rich solids）を遠心分離により回収した。この富固形物を、塩化メチレン３Ｌを用いて抽出した。富有機抽出物を、遠心分離によって固形物から分離した。この塩化メチレン抽出物を洗浄し、そして蒸留により約250mLまで濃縮し、次にメタノールを500mL加えた。この混合物を約250mLまで濃縮し、−10℃まで冷却し、生成物の結晶化を完了させた。この結晶を濾過により回収し、色を消すために冷メタノールで洗浄し、そして乾燥して結晶化５−アンドロステン−３β−オール−７，１７−ジオンを29ｇ得た。
【国際調査報告】
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