(57)【要約】  検査キットおよび方法は、高い特異性で多重ＰＣＲおよび伸長を可能にすべく選択された増幅用および伸長用のプライマーを含む。好適には、伸長用プライマーは、バイオチップ上の捕捉用プローブにハイブリダイズし、解析すべき標的核酸配列とは異なるタグを含む。さらに好適なキットは、バイオチップおよび様々な使用説明書を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の増幅用プライマー対のそれぞれは、
（ａ）前記複数の増幅用プライマー対を用いて標的核酸から産生される複数のアンプリコンが、それぞれ、標的核酸の変異位置を含むような、
（ｂ）前記複数のアンプリコンが、同一の増幅プロフィールを用いるＰＣＲ反応において産生されるような
配列を有し、
複数の伸長用プライマーのそれぞれは、
（ｃ）前記複数の伸長用プライマーのそれぞれが、同一の伸長温度で前記複数のアンプリコンのそれぞれに特異的にハイブリダイズし、各伸長プライマーの３’末端が、それぞれ、前記変異位置の相補位置に対応するような、
（ｄ）前記複数の伸長用プライマーのそれぞれについて、同一の伸長温度で選択的なプライマー伸長が達成されるような
配列を有する、
複数の増幅用プライマー対および複数の伸長用プライマーを含んでいる多重診断用キット。
【請求項２】
さらに、複数の異なる位置において、複数の異なる捕捉用プローブがそれぞれ結合しているバイオチップを含み、前記複数の捕捉用プローブのそれぞれが、各伸長用プライマーの一部とそれぞれハイブリダイズする、請求項１に記載の多重診断用キット。
【請求項３】
複数の別個の捕捉用プローブのそれぞれが、標的核酸とは異なる独自の配列を有する、請求項１に記載の多重診断用キット。
【請求項４】
さらに、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１に記載の多重診断用キット。
【請求項５】
複数の増幅用プライマー対が、それぞれ、複数のフォワードプライマーおよび複数のバックワードプライマーを有し、キットが、配列番号Ａｘおよび配列番号Ａｙの配列を有する少なくとも２つの増幅用フォワードプライマー、および配列番号Ｂｘおよび配列番号Ｂｙの配列を有する少なくとも２つの増幅用バックワードプライマーを含む（ｘおよびｙは、１から２４までの整数であって同数ではない。）、請求項１に記載の多重診断用キット。
【請求項６】
複数の伸長用プライマーが、配列番号Ｃｘおよび配列番号Ｃｙの配列を有する少なくも２つの伸長用プライマーを含む（ｘおよびｙは、１から２４までの整数であって同数ではない。）、請求項１に記載の多重診断用キット。
【請求項７】
１つの試験管でＰＣＲ反応およびプライマー伸長を行なうための使用説明書をさらに含む、請求項１に記載の多重診断用キット。
【請求項８】
配列番号Ａｘおよび配列番号Ａｙの配列を有する少なくとも２つの増幅用フォワードプライマー、配列番号Ｂｘおよび配列番号Ｂｙの配列を有する少なくとも２つの増幅用バックワードプライマー、および配列番号Ｃｘおよび配列番号Ｃｙの配列を有する少なくとも２つの伸長用プライマーを含んでいる（ｘおよびｙ、１から２４までの整数であって同数ではない。）、請求項１に記載の多重診断用キット。
【請求項９】
同一の増幅プロフィールを用いる、少なくとも２つの増幅用フォワードプライマーおよび少なくとも２つの増幅用バックワードプライマーを用いて多重ＰＣＲを行なうための使用説明書をさらに含む、請求項８に記載の多重診断用キット。
【請求項１０】
同一の伸長温度で少なくとも２つの伸長用プライマーを用いてプライマー伸長反応を行なうための使用説明書をさらに含む、請求項９に記載の多重診断用キット。
【請求項１１】
１つの試験管で多重ＰＣＲ反応およびプライマー伸長反応を行なうための使用説明書をさらに含む、請求項１０に記載の多重診断用キット。
【請求項１２】
複数の別個の位置で複数の別個の捕捉用プローブが、それぞれ結合しているバイオチップをさらに含み、前記複数の捕捉用プローブが、それぞれ、各伸長用プローブのある位置にハイブリダイズする、請求項８に記載の多重診断用キット。
【請求項１３】
複数の別個の捕捉用プローブのそれぞれが、増幅用プライマーが結合する標的核酸とは異なる独自の配列を有する、請求項１２に記載の多重診断用キット。
【請求項１４】
少なくとも試薬および酵素をさらに含む、請求項８に記載の多重診断用キット。
【請求項１５】
増幅用プライマーおよび伸長用プライマーがＨＰＶウイルスに対して特異的である、請求項８に記載の多重診断用キット。
【請求項１６】
６０個よりも少ないヌクレオチドを有し、配列番号Ａｘ、配列番号Ｂｘおよび配列番号Ｃｘよりなるグループから選択されるＨＰＶ認識配列を含み（ｘは１から２４までの整数である。）、ＨＰＶ認識配列内の２個以上のヌクレオチドがＮで置換されていない合成核酸。
【請求項１７】
配列番号Ｃｘを有し、核酸がハイブリダイズする標的配列に対して６０％よりも低い相同性を有する５’末端において複数のヌクレオチドをさらに含む、請求項１６に記載の合成核酸。
【請求項１８】
配列番号Ａｘ、配列番号Ｂｘおよび配列番号Ｃｘが、ＨＰＶ変異体に対して相補的である、請求項１６に記載の合成核酸。
【請求項１９】
４０ヌクレオチドよりも短い、請求項１６に記載の合成核酸。
【請求項２０】
ＨＰＶ認識配列よりなる、請求項１６に記載の合成核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、本発明者らによる米国仮特許出願第６０／５３２，６８１号（２００３年１２月２３日出願）および第６０／５５６，７３７号（２００４年３月２６日出願）の米国特許仮出願の利益を主張するものであり、両者とも参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野は遺伝子診断法であり、特に単一サンプルの多重解析に関する。
【背景技術】
【０００３】
分子診断における近年の進歩にも関わらず、未だ幾多の問題が残されている。とりわけ、ウイルスまたは発癌遺伝子を含んでいると疑われているサンプル中の複数の潜在的な遺伝子変化の解析は、しばしば偽陽性の結果をもたらし、または、変異数が増加すると全ての可能性ある変化を同定することができなくなる。一つまたは複数の生物について遺伝子型解析またはそれ以外の遺伝子解析を行なう場合にも同様の問題が生じる。
【０００４】
例えば、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）は子宮頚癌の主な原因であると考えられており、これにより世界中で毎年２００，０００人より多くのの女性が死亡している。ＨＰＶウイルスは比較的一般的であり、１００より多くの異なったタイプのＨＰＶが同定されており、そのうちの数種が癌発症の原因となっている。このような高リスク型ＨＰＶを検出できれば、ＨＰＶに感染した女性における子宮頚癌の診断、予防、治療および管理に大きな影響を与える。
【０００５】
今までのところ、ＨＰＶを検出および分類する分子法はほとんど、サザンブロット法、ドットブロット法、ラインブロット法およびインサイツハイブリッド形成法などのハイブリダイゼーション技術に依存している。例えば、ダイジーン社（Ｄｉｇｅｎｅ）のＨｙｂｒｉｄＣａｐｔｕｒｅ  ＩＩは、定性的検出を行なって低リスク集団を高リスク集団から識別するための化学的発光法に基づく核酸ハイブリダイゼーションのマイクロプレートアッセイ法である。他の市販の検査法でも、同様の方法を用いて、患者サンプル中に様々なタイプのＨＰＶが存在することを検出することが可能である。しかし、ハイブリダイゼーションに基づく公知のＨＰＶタイピング法は、クロスハイブリダイゼーションのせいでしばしば特異性を欠く。クロスハイブリダイゼーションは、近縁型のＨＰＶに起因する偽陽性シグナルをもたらす可能性がある（例えば、標的ＤＮＡが、用いられるプローブに対して単一または少数のミスマッチを有する場合など）。従って、検査結果の正確さは、近似した配列を有する複数のウイルス型を含むサンプルによって低下する。
【０００６】
クロスハイブリダイゼーションに伴う問題を克服するために、多くの取り組みが為されてきた。一般には、改良点の大部分はストリンジェンシー条件の正確な制御に集中している。例えば、ハイブリダイゼーションの特異性は温度により調節可能である。しかし、プローブが高度の配列類似性を有している場合には、温度特異的ハイブリダイゼーションは偽陽性の結果をもたらす可能性がある。
【０００７】
他の試みには、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ユニバーサル塩基鎖（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ  ｓｔｒｅｔｃｈ）、または修飾塩基（例えば、スーパーＧおよびＣ）を使用して、二重鎖のハイブリダイゼーション／溶解温度を変更するか、またはそれに影響を与えることなどがあった。さらに、既知の方法は、ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）ＤＮＡを（例えば、二重鎖の安定性を高めるために使用することが含まれる。このような方法の大部分は少なくともいくつかの利点を提供してきたが、それでも様々な問題が残っている。とりわけ、現在公知の方法は、完全に一致するハイブリッドと一塩基のミスマッチハイブリッドの溶解温度および／またはハイブリダイゼーション温度に著しい差異があることを示すことができない傾向にある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、ＨＰＶおよび他の病原体を核酸に基づいて検査する方法が数多く当技術分野において知られているが、これらの全てまたはほとんど全てが様々な問題に悩んでおり、このような解析を多重環境（例えば、バイオチップ）において行なう場合に問題はさらに深刻になる。このため、分子診断のための改良された方法および組成物を提供する必要が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本発明は、プライマーの配列が多重反応においてハイブリダイゼーション特異性および伸長選択性が最大になるよう設計されている、選択された多重増幅用プライマーおよび選択された多重伸長用プライマーの組合せを用いて特異性を実質的に向上させた、遺伝子診断のための組成物および方法を対象とするものである。そこでは多重反応においてハイブリダイゼーション特異性および伸長選択性を最大化するようにプライマーの配列が設計されている。
【００１０】
本発明内容の一側面において、多重診断用キットは、複数の増幅用プライマー対のそれぞれは、（ａ）標的核酸から複数の増幅用プライマー対を用いて産生される複数のアンプリコンが、それぞれ、標的核酸の配列に差異（変異位置）を含むような、（ｂ）これら複数のアンプリコンが、同一の増幅プロフィールを用いるＰＣＲ反応において産生するような配列を有し、複数の伸長用プライマーのそれぞれは、（ｃ）上記複数の伸長用プライマーのそれぞれが、同一の伸長温度で上記複数のアンプリコンのそれぞれに特異的にハイブリダイズするような、上記複数の伸長用プライマーのそれぞれについて、同一の伸長プロフィールで選択的なプライマー伸長が達成されるような配列を有する。増幅用プライマーおよび伸長用プライマーは、好ましくは配列番号Ａｘ、配列番号Ｂｘおよび配列番号Ｃｘに記載されたものであり、ここでｘは１から２４の間の整数である。
【００１１】
特に好適なキットは、複数の異なる位置において複数の異なる捕捉用プローブがそれぞれ結合しているバイオチップをさらに含み、複数の捕捉用プローブのそれぞれは、各伸長用プライマーの一部とそれぞれハイブリダイズする。最も好適には、複数の異なる捕捉用プローブのそれぞれは、標的核酸とは異なる独自の配列を有する。加えて、意図されたキットは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、熱安定性であるか、またはプライマー伸長を行なうために特定的に改変および／または単離されたもの）、使用説明書（例えば、一本の試験管でＰＣＲ反応およびプライマー伸長を行なうためのもの）を含むことができる。
【００１２】
本発明内容の別の側面において、多重診断用キットは、配列番号Ａｘおよび配列番号Ａｙの配列を有する少なくとも２つの増幅用フォワードプライマー、配列番号Ｂｘおよび配列番号Ｂｙの配列を有する少なくとも２つの増幅用バックワードプライマー、および配列番号Ｃｘおよび配列番号Ｃｙの配列を有する少なくとも２つの伸長用プライマーを含む（ここでｘおよびｙは１から２４の間の整数であって、同数ではない。）。このようなキットは、さらに、同一の増幅プロフィールを用いる、少なくとも２つの増幅用フォワードプライマー、および少なくとも２つの増幅用バックワードプライマーを用いて多重ＰＣＲ反応を行なうための説明書を含むことが可能であり、場合によっては、少なくとも２つの伸長用プライマーを、同一の伸長プロフィール（一般的には１本の試験管）で用いてプライマー伸長反応を行なうための説明書を含むことも可能である。
【００１３】
加えて、または代わりに、この試験キットには、複数の異なる位置において複数の異なる捕捉用プローブがそれぞれ結合している、複数の捕捉プローブが伸長用プライマーの一部とそれぞれハイブリダイズするバイオチップが含まれる。最も好適には、複数の異なる捕捉用プローブのそれぞれが、増幅用プライマーが結合する標的核酸とは異なる独自の配列を有する。所望であれば、意図されたキットは、試薬および／または酵素を含むことができる。
【００１４】
本発明内容のさらに意図された側面において、合成核酸は、６０個未満（最も好ましくは４０個）のヌクレオチドを有し、配列番号Ａｘ、配列番号Ｂｘおよび配列番号Ｃｘからなるグループから選択されたＨＰＶ認識配列を含む。ただし、ｘは１から２４の間の整数であり、ＨＰＶ認識配列内の２つ以上のヌクレオチドがＮ（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）により置換されていない。このような合成核酸は、特に配列番号Ｃｘを有するものを含み、さらに、核酸がハイブリダイズする標的配列に対して６０％よりも低い相同性を有する、５’末端にある複数のヌクレオチドを含む。
【００１５】
本発明のさまざまな目的、特徴、側面、および利点は、以下の発明の好適な実施側面の詳細な説明から一層明確になる。
【００１６】
詳細な説明
本発明者らは、単一遺伝子の可能性ある変異体の複数が、単一のサンプルにおいて増幅用プライマーを用いて上記遺伝子中の標的配列を特異的に増幅させる多重検査法により特定できることを、思いがけず見出した。この多重検査法において、アンプリコンは可能性ある変異体の少なくとも１つを含み、伸長用プライマーが用いられて上記遺伝子の変異体に特異的な伸長産物が形成される。
【００１７】
このような検査における特異性は、プライマーの選択方法によって、従来の方法よりも実質的に高くなることに留意すべきである。特に、増幅用プライマーは次のようになるように配列を有するよう選択される：（ａ）この増幅プライマーを用いて標的核酸から産生された複数のアンプリコンは、標的核酸中の配列の差異を含み、および（ｂ）前記複数のアンプリコンは、同一の増幅プロフィールを用いてＰＣＲ反応において生産される。同一の検査において、伸長用プライマーは次のようになるように配列を有するよう選択される：（ｃ）この伸長用プライマーは、同一の伸長温度において、対応するアンプリコンにハイブリダイズし（好ましくは、各伸長用プライマーの３’−末端が、変異位置の相補的な位置に対応するように）、および（ｄ）伸長用プライマーの各々について、プライマーの選択的伸長は同一温度で行われる。
【００１８】
最も好ましくは、伸長用プライマーの５’末端は、アンプリコンの配列、および／または標的遺伝子の配列に対して実質的に相補的ではない（一般的には７０％より少なく、最も一般的には５０％より少ない）タグ（ジップコード（ｚｉｐｃｏｄｅ）配列）をさらに含み、上記ジップコード配列を用いて（好ましくは、バイオチップ上の所定の位置にある）捕捉用プローブとハイブリダイズさせる。発明内容を限定するものではないが、ジップコード配列は、一般に、長さ約２から２０ヌクレオチドの間、より好ましくは５から１５ヌクレオチドの間、および、最も好ましくは８から１２ヌクレオチドの間であり、各伸長用プライマーのタグは異なっており（すなわち、独自の配列を有し）、次いで、このジップコード配列（および異なる捕捉用プローブ）は、標的核酸とは異なる独自の配列を有する。
【００１９】
増幅用プライマーおよび伸長用プライマーの具体的配列に関して、全ての配列が適切なものとみなされること、および、特異的配列は、標的核酸の具体的な性質および検出すべき配列の違いのタイプに主に依存していることを認識すべきである。例えば、適切な標的核酸には、天然型および組換え型のＤＮＡ（例えば、直鎖状、環状など）、ＲＮＡ（例えば、ｓｎＲＮＡ、ｈｎＲＮＡなど）、合成核酸（例えば、ホスホロチオエート、ＰＮＡ、など）などがあり、これら全ては、生物学的由来源（例えば、生検、細胞培養、スワブ、濾過物、植物材料など）、非生物学的由来源（例えば、食品、土壌、水、油など）に存在するか、または、これらから単離することができるか、または（例えば、固相上で）完全に合成することができる。このように、想定された標的核酸の長さはかなり変化させることが可能であり、一般的には約５０ヌクレオチドと、ゲノム、染色体、ベクター、染色体フラグメントまたは転写産物の全長との間であると認識されるべきである。最も好ましくは、標的核酸は、ウイルスもしくはバクテリアのゲノムまたは発癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子もしくは疾病の素因または存在に関連した他の遺伝子を含む核酸である。下記の実施例において、特に好適な標的ＤＮＡはウイルスＤＮＡであり、特にＨＰＶのＤＮＡである。
【００２０】
増幅用プライマーは、長さが約１２から５０ヌクレオチドであることが通常好適であり、またより好ましくは約１６から３０ヌクレオチドであり、さらに（または場合によっては）これらの増幅用プライマーは、１つまたは複数の所望の特性を提供する１つまたは複数のヌクレオチドを含むことができる。例えば、意図された増幅用プライマーは、プライマー（および／またはアンプリコン）を定量できるようにする１つまたは複数のヌクレオチドを含むことができ、典型的な実施例には放射性標識ヌクレオチド、蛍光標識ヌクレオチドなどがある。別の例において、意図された増幅用プライマーは、プライマーおよび／またはアンプリコンを特異的に単離するのを容易にする１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、ビオチニル化ヌクレオチド）を含むこともできる。従って、特に検査結果が量的測定値を提供する場合、意図された方法によって生成されるアンプリコンを定量化して、検査結果を標準化することができる。意図された検査によって生成されるアンプリコンは、一般的に、約５０から数千ヌクレオチドの長さになる。
【００２１】
同様に、好適な伸長用プライマーは、長さ約１２から５０ヌクレオチド、およびより好ましくは約１６から３０ヌクレオチドであり、この伸長用プライマーは、さらに（または場合によっては）、１つまたは複数の特性をもたらす、１つまたは複数のヌクレオチドを含むことができる。例えば、具体的に意図された伸長用プライマーは、捕捉用プローブに対する付加的ヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする、いくつかの付加的ヌクレオチドを含むことができる。最も好適には、この付加的配列は、標的核酸（および、さらに一層一般的には、アンプリコン）の配列とは異なる配列を有する。したがって、伸長産物を捕捉することは標的配列と無関係であり、このことが、この検査法の選択性をさらに増加させる。例えば、当技術分野において既知であるさまざまなＳＮＰ特異的検査法は、固相または固定化伸長用プライマーを用いるが、これは、さまざまな変異配列間の配列の差異がクロスハイブリダイゼーションを許容し、偽陽性の結果を生じがちである。当然ながら、伸長用プライマーの配列は、アンプリコン中にある配列から選択されることを認識すべきである。
【００２２】
意図された増幅伸長用プライマーは、具体的な標的核酸によって、修飾ヌクレオチドを含むこともでき、および／または、１つまたは複数の曖昧な位置（すなわち、他の点では一致するプライマーに、異なるヌクレオチドが存在する位置）を有することも可能である。曖昧な位置は、ＩＵＰＡＣ命名法を用いて表される（ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＳはＣまたはＧ、ＷはＡまたはＴ、ＫはＧまたはＴ、ＭはＡまたはＣ、ＢはＣまたはＧまたはＴ、ＤはＡまたはＧまたはＴ、ＨはＡまたはＣまたはＴ、ＶはＡまたはＣまたはＧ、および、ＮはＡまたはＣまたはＧまたはＴである。）。したがって、意図された増幅用プライマーは、特定の溶媒および温度において、単一の決められたＴｍを有するか、または、いくつか異なるＴｍを有することができる。
【００２３】
しかしながら、増幅用プライマーは、次のようになるよう選択されることを認識すべきである：この増幅用プライマーを用いる多重ＰＣＲは、単一の増幅プロフィール（ここで「増幅プロフィール」という用語は、変性する温度および時間、アニールさせる温度および時間、および重合させる温度および時間の具体的な組合せを意味する。）を用いて行われる；および、多重ＰＣＲから産生される全アンプリコンは、単一の伸長温度（ここで「伸長温度」という用語は、ハイブリダイゼーションさせる温度および時間、および重合させる温度および時間の具体的な組合せを意味する。）におけるこの伸長用プライマーを用いるプライマー伸長反応に使用することができる。好適な伸長産物は、一般に約５０から数千塩基の範囲内にあり、および、伸長産物が１つまたは複数の検出可能な（およびより好ましくは定量可能な）標識を含んでいることが特に好適である。例えば、この伸長反応は、１つまたは複数の直接的にまたは間接的に標識されたヌクレオチド（蛍光性、発光性、または放射性の標識を担持するヌクレオチド（ここで、標識されたヌクレオチドのモル分率は、必要に応じて適宜調節することができる。）など）を用いて、および／または標識された化合物または検出および／または定量することができる化合物に結合する親和性マーカー（例えば、ビオチン、ジギトキシン）を担持するヌクレオチドを用いて、行なうことができる。
【００２４】
伸長用プライマーが、配列を有し、伸長用プライマーが標的核酸と適正にハイブリダイズすると（および、特に３個の３’末端塩基が、より好ましくは２個の３’末端塩基が、および、最も好ましくは、１個の３’末端塩基が適正にハイブリダイズすると）検出可能な伸長現象が生じるような位置に存在することが通常好適である。一般に、検出可能な現象は、少なくとも１つのヌクレオチドが標識されているＤＮＡポリメラーゼ依存型ＤＮＡ合成である。あるいは、検出可能な事象は、その５’末端（伸長用プライマーの３’末端）に接する標識断片を用いるＤＮＡライゲーションであってもよい。意図された方法を用いて検出することができる配列の差異のタイプに関して、増幅用プライマーおよび伸長用プライマーの設計を可能にする情報が利用できる限りすべての既知の配列差異が適していると認識されるべきである。従って、意図された差異には、欠失、挿入、転座、および置換（例えば、塩基転換または塩基転移）が含まれる。さらに、意図された配列差異には、異なったウイルス遺伝子型に見られる配列上の差異も含まれる。このように、ウイルス種の様々な遺伝子型におけるヌクレオチド違いも、本明細書においては変異とみなす。
【００２５】
検出は、好適には、伸長用プライマーによる伸長産物の少なくとも一部にハイブリダイズする複数の捕捉用プローブが所定の位置に固定されているバイオチップまたは他の担体上で実施される。したがって、意図された診断キットは、（意図された増幅用プライマー、伸長用プライマーは別として）複数の異なる位置において複数の異なる捕捉用プローブがそれぞれ結合しているバイオチップを含むことができ、ここにおいて、複数の捕捉用プローブの各々が、伸長プローブの各々の少なくとも一部にハイブリダイズする。さらに別の好適な側面において、意図された捕捉用プローブは蛍光標識も含むこともでき、最も好適には、標識の発光が、伸長産物の検出波長とは異なるものである（例えば、捕捉用プローブに対しＣｙ５、および伸長産物に対しＣｙ３）。数ある利点の中で特に、このような構造によって、伸長産物からのシグナルを標準化しおよび／または補正することが可能になる。加えて、または代わりに、適切なキットは、さまざまな酵素（例えば、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼなど）、緩衝剤、および他の試薬（例えば、標識または非標識のヌクレオチド）を含むことができる。
【００２６】
表１Ａは、ＨＰＶの遺伝子変異体を検出するための、典型的なフォワードおよびバックワード増幅用プライマーならびに対応する伸長用プライマーを示しており、表中、フォワードおよびリバース増幅用プライマーと同じ行にある伸長用プライマーは、これらの増幅用プライマーによって産生されるアンプリコンに結合するはずである。表１Ａのプライマーは、縮重ヌクレオチド位置を含むことができることに注意すべきである。したがって、縮重位置を有するプライマーは、個別の配列、ならびに、あいまいなコードにより定義された配列の混合物を意味する（例えば、ＡＳＡは、ＡＧＡまたはＡＣＡのそれぞれを個別に意味することも可能であるが、ＡＣＡおよびＡＧＡの混合物を意味することも可能である）。表１Ｂは、非縮重配列を有する表１Ａの特定のプライマーの例示的選択を示す。
【００２７】
増幅用プライマーおよび伸長用プライマーは、以下の配列表に示した配列に対応する。すなわち、表１Ａの配列番号Ａ１からＡ２４は、配列表の配列番号１から２４にそれぞれ対応し、表１の配列番号Ｂ１からＢ２４は、配列表の配列番号２５から４８にそれぞれ対応し、表１の配列番号Ｃ１からＣ２４は配列表の配列番号４９から７２にそれぞれ対応する。さらに、表１Ｂの配列番号Ａ２５からＡ２６は、それぞれ、配列表の配列番号７３から７４に対応し、および表１Ｂの配列番号Ｂ２５からＢ４１は配列表の配列番号７５から９１にそれぞれ対応する。
【００２８】
表１Ａおよび１Ｂに記載されているプライマー（および上記で意図された他のプライマー）をさらに改変されて、７０個よりも少ない、より好適には６０個よりも少ない、最も好ましくは５０個よりも少ないヌクレオチドを有し、配列番号Ａｘ、配列番号Ｂｘ、および配列番号Ｃｘからなるグループより選択されるＨＰＶ認識配列を含む合成核酸を得ることができる、（ここでｘは１から２４の整数であり、ＨＰＶ認識配列内の３ヌクレオチド以下、最も好適には２ヌクレオチド以下がＮ（命名法で定義されているような）または他の非天然型ヌクレオチドにより置換されている。）。さらに、配列番号Ｃｘに記載されたヌクレオチドは、核酸がハイブリダイズする標的配列に対し、７０％よりも低い、より一般的には６０％よりも低い、最も一般的には４０％より低い相同性を有する複数のヌクレオチドを５’末端に含み得る。
【００２９】
特に、意図されたキットは、少なくとも２つ、より一般的には少なくとも３から５、および最も一般的には少なくとも１０から１２の増幅用プライマー対および／または対応する伸長用プライマーを含む。このようなキットにおいて、好適には、キットに添付された説明書に反映して、単一の試験管内で、ＲＣＲ反応および／またはプライマー伸長を行う。また、ＰＣＲ反応およびプライマー伸長の少なくとも１つを自動解析装置で行なうこともできる。意図された説明書は、さらに、少なくとも２つのフォワード増幅用プライマーおよび少なくとも２つのバックワード増幅用プライマーを用いて、同一の増幅プロフィールを用いる多重ＰＣＲを行なうための情報、および／または同一の伸長温度における少なくとも２つの伸長用プライマーを用いるプライマー伸長反応行なうための情報を提供することができる。
【００３０】
特定の仮設または学説にとらわれたくはないが、本発明者らは、本発明の内容に係る検査法の特異性が、少なくとも一方のハイブリダイゼーション、および、より好ましくは両方のハイブリダイゼーション（すなわち、増幅用および伸長用）を、（ハイブリダイゼーション特異性に干渉すると考えられる）固相上ではなく、溶液中において行なうという事実によってさらに改良されると考えている。さらに、プライマーの具体的な選択によって、および、特に判別配列に他の点では類似または同一の複数の配列の中で判別配列を標的することによって、増幅用および／または伸長用のプライマーのハイブリダイゼーション特異性はさらに増加する。
【実施例】
【００３１】
実験
以下の実験は、ヒトの検体からＨＰＶウイルスを検出して遺伝子型を判定するための検査の例示的な手引きを提供するために実施された。ここでは、ＱｉａｇｅｎＤＮＡ単離キットを用いて、パップスメア（ｐａｐ  ｓｍｅａｒ）からＨＰＶＤＮＡを単離し、溶出液の等量液を、配列番号Ａ１からＡ２４およびＢ１からＢ２４をそれぞれ有するフォワードおよびバックワードの増幅用プライマーを用いたオフライン多重ＰＣＲに供した。ＰＣＲ反応は以下の通りであった。
【００３２】
ＨＰＶ多重ＰＣＲ
１μＬのサンプルに１８．７５μＬのＨＰＶ増幅用溶液、０．２５μＬ（１．２５ユニット）のプラチナＴａｑポリメラーゼ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えて最終容量が２０μＬとなるようにした。ＨＰＶ増幅用溶液は、２１．３４ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ  ８．４）、５３．３５ｍＭのＫＣＬ、２．６７ｍＭのＭｇＣｌ２、３３．３４μＭのｄＡＴＰ、３３．３４μＭのｄＧＴＰ、３３．３４μＭのｄＴＴＰ、６．６７μＭのｄＣＴＰ、および２６．６８から８０．０３ｎＭの各フォワードおよびバックワードの増幅用プライマーである。
【００３３】
以下の増幅プロフィールを用いて、表１Ａのプライマーを用いた２４重ＰＣＲを行った：プラチナＴａｑポリメラーゼの活性化を、９４℃で１分間インキュベートした後、９４℃で５秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で４０秒間の伸長反応を４０回繰り返して行った。次に、この多重ＰＣＲの内容物を、以下のようにして、自動解析装置の中に置かれたマルチウェルプレートの１つのウェルの中での、配列番号Ｃ１からＣ２４の伸長用オリゴを用いた後続のプライマー伸長反応に使用した。
【００３４】
ＨＰＶプライマー伸長
プライマー伸長を、自動解析装置の中の２４ウェルプレートの中で、伸長用混合液および試薬を温度調節したインキュベーションを用いて、以下のとおりに行った。
【００３５】
多重ＰＣＲ反応液から採った２０μＬ容量に、２０μＬのＨＰＶプライマー伸長用溶液を加えて４０μＬにした。このＨＰＶプライマー伸長用溶液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ  ８．４）、５０ｍＭのＫＣＬ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、３１．２５μＭのｄＡＴＰ、３１．２５μＭのｄＧＴＰ、３１．２５μＭのｄＴＴＰ、５μＭのｃｙ５ｄＣＴＰ、および各２５  ｎＭの配列番号Ｃ１からＣ２４の伸長用プライマーである。伸長プロフィールは以下のとおりである：ＰＣＲ反応物を９４℃で１分間変性させた後、９４℃で５秒間および５１℃で１０秒間のサイクルを４０回行なった。
【００３６】
ＨＰＶの検出および遺伝子型決定
次に、本発明者らの同時係属国際出願であって、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ  ０３／０５０５９１号および第ＷＯ  ０２／０５７４１６号に記載されているようにして、伸長反応液の全量を、複数の捕捉用ヌクレオチドを所定の位置に含むバイオチップの上に移した。伸長産物上のＣｙ標識（伸長用プライマーが、標的核酸と完全なハイブリッドを形成した場合にのみ形成される）を用いて蛍光検出法によって伸長産物を検出したが、この方法において、捕捉用プライマーの所定の位置が、所定のＨＰＶ遺伝子型に対応している。遺伝子判定および検出は、ダイジーン社（Ｄｉｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手した参照用検査ＨＣ２  ＨＰＶＤＮＡ検査を用いて確認した。本発明内容に従った検査の結果および市販の検査法の結果は、表２に示すように１００％相関した。表中、ＨＲは「高リスク」遺伝子型（括弧内は具体的な遺伝子型）を、Ｌは「低リスク」遺伝子型（括弧内は具体的な遺伝子型）を、ｎｅｇは陰性結果を示す。
【００３７】
【表１】
2007515967.tif 000002
【００３８】
以上、特異性を向上させたＨＰＶ核酸解析の具体的実施側面および応用法を開示している。しかしながら、当業者にとっては、本明細書に記載されている発明の概念の範囲内で、既に記載されているもの以外にも数多くのさらなる改変が可能であることは明らかである。したがって、本発明の内容は、添付した請求の範囲の趣旨以外によって制約を受けるものではない。さらに、明細書および請求の範囲を解釈する上で、全ての用語は、文脈に適合した、できる限り広い意味に解釈すべきである。特に、「含む」または「含んでいる」という用語は、要素、成分、または工程を非排他的に意味し、言及された要素、成分または工程が存在するか、使用され、または明示的に言及されていない要素、成分または工程と組み合わせることができることを示すものと解されねばならない。さらに、参照により本明細書に組み込まれる参考文献中の用語の定義または使用が、本明細書に示された当該用語の定義と矛盾または相反する場合には、本明細書に記載された当該用語の定義を採用し、参考文献中における当該用語の定義は採用しないこととする。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】表１Ａは、ＨＰＶの遺伝子変異体を検出するための、典型的なフォワードおよびバックワード増幅用プライマーならびに伸長用プライマーを示す。
【図２】表１Ｂは、非縮重配列を有する表１Ａの特定のプライマーの例示的選択を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年7月11日(2005.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の増幅用プライマー対のそれぞれは、
（ａ）前記複数の増幅用プライマー対を用いて標的核酸から産生される複数のアンプリコンが、それぞれ、標的核酸の変異位置を含むような、
（ｂ）前記複数のアンプリコンが、同一の増幅プロフィールを用いるＰＣＲ反応において産生されるような
配列を有し、
複数の伸長用プライマーのそれぞれは、
（ｃ）前記複数の伸長用プライマーのそれぞれが、同一の伸長温度で前記複数のアンプリコンのそれぞれに特異的にハイブリダイズし、各伸長プライマーの３’末端が、それぞれ、前記変異位置の相補位置に対応するような、
（ｄ）前記複数の伸長用プライマーのそれぞれについて、同一の伸長温度で選択的なプライマー伸長が達成されるような
配列を有する、
複数の増幅用プライマー対および複数の伸長用プライマーを含んでいる多重診断用キット。
【請求項２】
さらに、複数の異なる位置において、複数の異なる捕捉用プローブがそれぞれ結合しているバイオチップを含み、前記複数の捕捉用プローブのそれぞれが、各伸長用プライマーの一部とそれぞれハイブリダイズする、請求項１に記載の多重診断用キット。
【請求項３】
複数の別個の捕捉用プローブのそれぞれが、標的核酸とは異なる独自の配列を有する、請求項１に記載の多重診断用キット。
【請求項４】
さらに、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１に記載の多重診断用キット。
【請求項５】
複数の増幅用プライマー対が、それぞれ、複数のフォワードプライマーおよび複数のバックワードプライマーを有し、キットが、配列番号Ａｘおよび配列番号Ａｙの配列を有する少なくとも２つの増幅用フォワードプライマー、および配列番号Ｂｘおよび配列番号Ｂｙの配列を有する少なくとも２つの増幅用バックワードプライマーを含む（ｘおよびｙは、１から２４までの整数であって同数ではない。）、請求項１に記載の多重診断用キット。
【請求項６】
複数の伸長用プライマーが、配列番号Ｃｘおよび配列番号Ｃｙの配列を有する少なくも２つの伸長用プライマーを含む（ｘおよびｙは、１から２４までの整数であって同数ではない。）、請求項１に記載の多重診断用キット。
【請求項７】
１つの試験管でＰＣＲ反応およびプライマー伸長を行なうための使用説明書をさらに含む、請求項１に記載の多重診断用キット。
【請求項８】
配列番号Ａｘおよび配列番号Ａｙの配列を有する少なくとも２つの増幅用フォワードプライマー、配列番号Ｂｘおよび配列番号Ｂｙの配列を有する少なくとも２つの増幅用バックワードプライマー、および配列番号Ｃｘおよび配列番号Ｃｙの配列を有する少なくとも２つの伸長用プライマーを含んでいる（ｘおよびｙ、１から２４までの整数であって同数ではない。）、請求項１に記載の多重診断用キット。
【請求項９】
同一の増幅プロフィールを用いる、少なくとも２つの増幅用フォワードプライマーおよび少なくとも２つの増幅用バックワードプライマーを用いて多重ＰＣＲを行なうための使用説明書をさらに含む、請求項８に記載の多重診断用キット。
【請求項１０】
同一の伸長温度で少なくとも２つの伸長用プライマーを用いてプライマー伸長反応を行なうための使用説明書をさらに含む、請求項９に記載の多重診断用キット。
【請求項１１】
１つの試験管で多重ＰＣＲ反応およびプライマー伸長反応を行なうための使用説明書をさらに含む、請求項１０に記載の多重診断用キット。
【請求項１２】
複数の別個の位置で複数の別個の捕捉用プローブが、それぞれ結合しているバイオチップをさらに含み、前記複数の捕捉用プローブが、それぞれ、各伸長用プローブのある位置にハイブリダイズする、請求項８に記載の多重診断用キット。
【請求項１３】
複数の別個の捕捉用プローブのそれぞれが、増幅用プライマーが結合する標的核酸とは異なる独自の配列を有する、請求項１２に記載の多重診断用キット。
【請求項１４】
少なくとも試薬および酵素をさらに含む、請求項８に記載の多重診断用キット。
【請求項１５】
増幅用プライマーおよび伸長用プライマーがＨＰＶウイルスに対して特異的である、請求項８に記載の多重診断用キット。
【請求項１６】
６０個よりも少ないヌクレオチドを有し、配列番号Ａｘ、配列番号Ｂｘおよび配列番号Ｃｘよりなるグループから選択されるＨＰＶ認識配列を含み（ｘは１から２４までの整数である。）、ＨＰＶ認識配列内の２個以上のヌクレオチドがＮで置換されていない合成核酸。
【請求項１７】
配列番号Ｃｘを有し、核酸がハイブリダイズする標的配列に対して６０％よりも低い相同性を有する５’末端において複数のヌクレオチドをさらに含む、請求項１６に記載の合成核酸。
【請求項１８】
配列番号Ａｘ、配列番号Ｂｘおよび配列番号Ｃｘが、ＨＰＶ変異体に対して相補的である、請求項１６に記載の合成核酸。
【請求項１９】
４０ヌクレオチドよりも短い、請求項１６に記載の合成核酸。
【請求項２０】
ＨＰＶ認識配列よりなる、請求項１６に記載の合成核酸。
【国際調査報告】
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