(57)【要約】  本発明は、ワクチン接種のための生物学的製剤又はウイルスの生産に適する不死化トリ細胞株に関する。特に、前記細胞株は、そのうちの１個は細胞周期の進行を引き起こし、他方は複製調節不全によって誘導される細胞の先天性防御機構を妨げる、少なくとも２個のウイルス又は細胞遺伝子で形質転換された初代細胞に由来する。本発明はさらに、前記不死化細胞株の生産及びワクチン接種のための生物学的製剤又はウイルスを生産するためのそれらの使用に関する。
2007510409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス及び／又は細胞遺伝子の組合せ、すなわち網膜芽細胞腫タンパク質の機能に影響を及ぼす少なくとも１個の第一遺伝子とｐ５３タンパク質又はそのファミリー成員に影響を及ぼす少なくとも１個の第二遺伝子の組合せを用いて不死化されたトリ細胞株。
【請求項２】
前記第一遺伝子がＧ１チェックポイント制御を克服し、前記第二遺伝子が第一遺伝子によって誘導されるアポトーシスを阻害する、請求項１に記載のトリ細胞株。
【請求項３】
（ｉ）前記第一遺伝子が、網膜芽細胞腫タンパク質とＥ２Ｆ転写因子の間の複合体の破壊を仲介できる；及び／又は
（ｉｉ）前記第二遺伝子が、ｐ５３による転写活性化を妨げることができ、これに限定されないが、ｐ５３の機能の抑制及びｐ５３の安定性の低下を引き起こすことに関与する、
請求項１又は２に記載のトリ細胞株。
【請求項４】
（ｉ）前記細胞株が、胚又は孵化ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ等、好ましくはニワトリ又はアヒルに由来する；及び／又は
（ｉｉ）不死化に供する細胞が、線維芽細胞を含む初代細胞、すなわち単離された体分節（体節）又は神経、脳、網膜、腎臓、肝臓、心臓、筋肉及び胚を保護する胚体外組織及び膜を含む分離された個別器官からの細胞である；及び／又は
（ｉｉｉ）不死化が、リポソーム及びデンドリマーを介したトランスフェクション及び電気穿孔法を含むがこれらに限定されない、非ウイルス性トランスフェクションによって行われる；及び／又は
（ｉｖ）前記第一遺伝子が、網膜芽細胞腫タンパク質とＥ２Ｆ転写因子の複合体の破壊を仲介するウイルス遺伝子、例えばマストアデノウイルスから、好ましくはＣ群のマストアデノウイルスからのアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子、パピローマウイルス、好ましくは低リスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（ＨＰＶ１、ＨＰＶ６及びＨＰＶ１１など、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８は含まない）のＥ７遺伝子、トリアデノウイルスのｏｒｆ２２遺伝子、ヒツジアットアデノウイルス（ｏｖｉｎｅ  ａｔｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）のＥ４３オープンリーディングフレーム等であるか、又は網膜芽細胞腫タンパク質とＥ２Ｆ転写因子の複合体の破壊を仲介する細胞遺伝子、例えばサイクリンＤ１、Ｄ２又はＤ３、ｐ１６ＩＮＫ４ａによる不活化に感受性でない突然変異型ＣＤＫ４等である；及び／又は
（ｖ）前記第二遺伝子が、ｐ５３による成長停止とアポトーシスの誘導を妨げるタンパク質、例えば全ての群のアデノウイルスＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質、ＣＥＬＯのＧＡＭ−１、パピローマウイルス、好ましくは低リスクＨＰＶ（ＨＰＶ１、ＨＰＶ６及びＨＰＶ１１など、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８は含まない）のＥ６タンパク質をコードするウイルス遺伝子であるか、又はｐ５３による成長停止とアポトーシスを阻害する細胞遺伝子、例えばｍｄｍ２等である；及び／又は
（ｖｉ）前記第一遺伝子と第二遺伝子が、異種配列によって空間的に切り離されているか又は異なる核酸セグメント又はプラスミド上に位置する、
請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項５】
（ｉ）好ましくは、前記Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ領域はアデノウイルス５型に由来し、より好ましくは、前記Ｅ１Ａ領域は配列番号７のｂｐ１１９３−２３０９の配列又は配列番号９のｂｐ４２３０−３１１３に相補的な配列を有し、及び前記Ｅ１Ｂ領域は配列番号８のｂｐ１１４５−３００７の配列又は配列番号９のｂｐ２３４５−５５０に相補的な配列を有する、マストアデノウイルス属からのアデノウイルスのＥ１Ａ（第一遺伝子）及びＥ１Ｂ（第二遺伝子）領域；及び／又は
（ｉｉ）好ましくは、それぞれ配列番号１０のｂｐ１２５２−６３５に相補的な配列及び配列番号１０のｂｐ３１３８−２２９０に相補的な配列によって表わされる配列を有する、アデノウイルス、好ましくはアデノウイルスＣＥＬＯ属からのｏｒｆ２２（第一遺伝子）及びＧＡＭ−１（第二遺伝子）遺伝子；及び／又は
（ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）で定義したＧＡＭ−１及び／又はＯｒｆ２２を有する、Ｅ１Ａ及び／又はＥ１Ｂをコードする核酸の組合せ
で不死化される、請求項４に記載の細胞株。
【請求項６】
（ｉ）導入遺伝子、例えば欠損ウイルスを補う遺伝子（例えばＥＢＮＡ１等）、プロモーター（例えばＰＧＫ−、ＥＦ１．α−、ＣＭＶプロモーター、ｔｋ−プロモーター等）、エンハンサー（例えばＲＳＶ−ＬＴＲ）、選択マーカー、例えばネオマイシン耐性、ピューロマイシン耐性等を含むがこれらに限定されない、非天然機能性配列を付加的に担持する；及び／又は
（ｉｉ）ワクチン株及び組換えウイルスベクターを含む、生物学的製剤又はウイルスの生産に適する、
請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項７】
（ｉ）逆転写酵素活性を持たない；及び／又は
（ｉｉ）アヒル胚又は孵化アヒルを起源とする初代細胞の不死化に由来する；及び／又は
（ｉｉｉ）胚体外膜に由来する；及び／又は
（ｉｖ）好ましくは動物血清を含まない、化学的に規定された培地で培養される、
請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項８】
トリ細胞株１２Ａ０７−Ａ１０（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６９５）である、請求項１又は７に記載の細胞株。
【請求項９】
第一及び第二遺伝子で出発細胞を形質転換／トランスフェクトすることを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞株を作製するための方法。
【請求項１０】
出発細胞の非ウイルス性トランスフェクションを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
生物学的製剤又はウイルスの生産のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞株の使用。
【請求項１２】
（ｉ）前記ウイルスを請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞株と接触させること；及び／又は
（ｉｉ）前記細胞株上で前記ウイルスを培養すること
を含む、ウイルスを生産するための方法。
【請求項１３】
アヒル細胞株、好ましくはアヒル体節又はアヒル神経組織、さらに一層好ましくはアヒル網膜を起源とする細胞株において、好ましくはＭＶＡ株の、ポックスウイルスを生産するための請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）プロモーターに作動可能に連結された、組換えタンパク質をコードする遺伝子を、請求項１から８のいずれかに記載の細胞株に導入すること、
（ｉｉ）前記改変細胞株を培養すること、及び
（ｉｉｉ）組換えタンパク質を回収すること、
を含む、組換えタンパク質を生産するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン接種のための生物学的製剤又はウイルスの生産に適する不死化トリ細胞株に関する。特に、前記細胞株は、そのうちの１個は細胞周期の進行を引き起こし、他方は複製調節不全によって誘導される細胞の先天性防御機構を妨げる、少なくとも２個のウイルス又は細胞遺伝子で形質転換された初代細胞に由来する。本発明はさらに、前記不死化細胞株の生産及びワクチン接種のための生物学的製剤又はウイルスを生産するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
孵化ニワトリ卵は、現在もヒトワクチンの生産のための主要基質の１つである。それらはヒト及び動物ウイルスの広範囲の複製をサポートできる。この範囲には、弱毒化ウイルス、すなわちヒト又は哺乳動物細胞において複製する潜在能が損なわれた欠損ウイルスを含み、それ故ワクチンとして使用することができる。弱毒化は、孵化卵における連続継代によって生成又は維持できる。ヒトワクチン生産のために使用されるニワトリ卵は、規定されたセットのウイルス及び細菌汚染を含まないこと（特定病原体未感染又はＳＰＦ）が証明されていなければならない。ＳＰＦ卵は商業的供給者から入手可能である。広い適用性と長い国際的実績が、明らかな不都合にもかかわらず、この戦略を有効に維持してきた：
ＳＰＦ群のニワトリ及び孵化卵は高価であり、ワクチンのコストの４０％までを構成し得る。さらに、ＳＰＦ群における周期的な疾患の発生によって証明されるように、ＳＰＦ群を絶えず完全に病原体不在に維持することは困難である。ＳＰＦ供給者が、ワクチンロットを製造するために使用した孵化卵の親ニワトリがいかなる疾患にも完全に未感染であったことを証明するまでは、ワクチンロットを発売することができない。この不確実性は、これらのワクチンの製造に大きなコストを追加する。特定ワクチン（例えばインフルエンザ）が突然必要となる汎発流行状況では、ＳＰＦ卵の供給が厳しく制限されることがある。加えて、卵を感染させ、ウイルス増殖を維持するための大規模工程は時間がかかり、時には異なるワクチンバッチ間で一致しない。
【０００３】
細胞培養技術の発達と共に、ワクチン製造業者は孵化卵を単離ニワトリ胚線維芽細胞に置き換えてきた。初代細胞培養の使用は、製造工程の安全性プロフィール、効率及び信頼性を改善するが、同時にコストもさらに上昇させる：ニワトリ線維芽細胞は、成育可能細胞を確立し、増幅するために胚を切り刻むことによってＳＰＦ卵から調製される。初代動物細胞に典型的に、線維芽細胞は老化を受ける：倍加時間は継代と共に上昇し、最終的には全細胞が死滅する。この過程は約２０継代後に起こり、げっ歯動物又はワクチン製造において現在使用される一部のヒト細胞基質（ＭＲＣ−５又はＷＩ−３８など）よりもはるかに早く生ずる。線維芽細胞培養は、製造工程にさらなる危険因子を付加する、５−１０％ウシ胎仔血清の存在下に維持しなければならない。それらはまた、増殖のために固体表面を必要とし、バイオリアクター適用のために好ましい状態である、懸濁液中では成育しない。多層セルファクトリーを使用した場合でも、これはスケールアップ法を実質的に制限する。限られた寿命の故に、ニワトリ線維芽細胞の各々のロットについて完全なセットの安全性試験を適用しなければならない。
【０００４】
線維芽細胞は、良好に増殖する、ニワトリ胚の多種多様な異なる組織からの唯一の細胞型である。卵においては、典型的には上皮細胞層である絨毛尿膜がウイルス増幅の主たる部位であるので、他の細胞型と比較して線維芽細胞の優位性は、一部の場合には、理論的ウイルス収率を低下させる。
【０００５】
上述した問題は、過去２年間（２００３年及び２００４年）の深刻なインフルエンザワクチンの不足に寄与した。これらの制限を克服するために、合成規定培地において、好ましくは懸濁液中又は少なくとも担体上で増殖する永久細胞株が強く求められる。
【０００６】
ニワトリ線維芽細胞において典型的に増殖するウイルスの一部は、ある種の細胞株に適合されてきた。ＢＨＫ−２１（ベビーハムスター腎）細胞は、様々なワクシニア、インフルエンザ及び狂犬病ワクチン株の増殖をサポートし（Drexler, I. et al., J. Gen. Virol. 79 (Pt2): 347-52 (1998); Gumusderelioglu M. et al., Biotechnol.Appl. Biochem. 33: 167-72 (2001); Merten, O.W. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 397: 141-51(1996)）、大型発酵槽において無血清条件下に担体上で容易に増殖する（Pay, T. W. et al., Dev. Biol. Stand 60: 171-4 (1985);Gallegos Gallegos, R. M. et al., Arch. Med. Res. 26: 59-63 (1995) ）。ワクシニアに関しては、これは、ニワトリ細胞に関して開発された高度弱毒化株Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）にも当てはまる。ＢＨＫ−２１細胞株は、家畜動物のための一部のワクチンの生産のためにも受け入れられている（Lubiniecki, A. S. , Bioprocess Technol. 10: 495-513 (1990) ）。しかし、ＨＢＫ−２１系はヒト生ワクチンについての安全性必要条件を満たさない。ＢＨＫ細胞は自然発生的に形成されたものであり、高度に腫瘍形成性であって、それらの歴史は十分には報告されていない。細胞基質に関する２０００年５月１２日からのＦＤＡ、ＣＢＥＲ協議によれば、ヒト及び他の哺乳動物の天然に生じる腫瘍に由来する又は未知の機構によって形質転換されたヒト細胞及び哺乳動物細胞に由来する新生物細胞における「最小精製生弱毒化ウイルスワクチン及びウイルスベクターワクチン」の開発は推奨されていない。
【０００７】
通則に対する例外としてＶＥＲＯ細胞株（アフリカミドリザルを起源とする）は、立証された安全性プロフィール及び規定数の継代に関する形質転換表現型の欠如に基づき、ワクチン製造のための細胞基質として認められている。この細胞株は、臨床使用のためのポリオ及び痘瘡ワクチンの製造のために広く使用されてきた。しかし、ＶＥＲＯ細胞は付着を必要とし、担体ベースの工程しか受け入れない。
【０００８】
加えて、広く記述された歴史を有するＭＤＣＫ細胞（イヌ腎上皮からの自然発生細胞株）は、インフルエンザウイルスの製造に適用されてきた（Tree, J. A. et al., Vaccine19 : 3444-50 (2001)）。
【０００９】
最近、ベクターに基づくワクチン及び遺伝子治療アプローチの開発が引き金となって、ヒト起源の新しい、いわゆるデザイナー細胞株が盛んに論じられ、ワクチン生産のための潜在的細胞基質の範囲に含められている（Vaccines and Related Biological Products advisory committee, session from May 16,2001）。生産系の外では複製欠損である組換えウイルスのために補充遺伝子を提供する新しい永久細胞株が作製された。しかし、補充遺伝子の安定な導入には、初代細胞に使用可能な継代数の天然限界又は完全な形質転換が起こる前のＶＥＲＯ細胞についての継代数の耐容限界を超える、長い培養時間を必要とする。
【００１０】
デザイナー細胞株は、形質転換のために特性決定された遺伝子を使用して、広範な文書調査を行ってインビトロで作製される。例えばそれら自体がアデノウイルスのＥ１領域からの補充遺伝子は、トランスフォーミング特性を示し、ヒト細胞株、例えばＰＥＲ．Ｃ６の樹立を可能にした（Fallaux, F. J. et al., Hum. Gene Ther. 9: 1909-17 (1998) ）。これらの細胞株の適用は、そのために設計されたウイルスベクターだけに限定されず、他のウイルスにも拡大し得る。例えばインフルエンザウイルスはＰＥＲ．Ｃ６上で増殖することができる（Pau, M.G. et al., Vaccine 19: 2716-21 (2001)）。しかし、この所見はワクチン開発に関連する全てのウイルスに当てはまるわけではなく、特にトリウイルス、例えばマレク病、伝染性ファブリーキウス嚢病、ニューカッスル病、シチメンチョウヘルペス又はニワトリ貧血ウイルスには該当しない。これらのウイルスの一部は哺乳動物細胞株で良好に複製するが、ウイルスの生育はしばしば不良である。他のウイルスについては、複製不良であり、特定の極めて適応する株に限定される。
【００１１】
加えて、霊長動物由来細胞基質に適応させると、ウイルス上の受容体結合部位が変化する可能性があり、抗原パターンの改変をもたらし、それ故免疫原性への全般的影響を生じさせることがある。この遺伝的適応は、トリ細胞、例えばＭＶＡ又はニワトリ適応麻疹ウイルスにおける継代によって開発された株の弱毒化を逆転させたり（Escoffier, C., Gerlier,D., J. Virol. 73: 5220-4 (1999)）、野生型単離株と比較してヒト細胞においてより効率よく複製する新しい株を作出することがある。そのようなウイルスは、同時により高い潜在的病原性も獲得し得る。
【００１２】
上記の理由から、ワクチン製造者は哺乳動物細胞株に切り替えることに消極的であり、不死トリ細胞株の必要性が明らかになってきた。
【００１３】
トリαレトロウイルスによる鳥類での腫瘍誘導の検討は、一般的な細胞形質転換に関する最初の分子学的見識を提供した。レトロウイルス癌遺伝子は、必須調節因子ドメインが突然変異した又は欠失した細胞遺伝子に由来する。これらの試験の間に特定された因子の一部、例えばｖ−ｍｙｃ又はｖ−ｒａｓは、網膜芽細胞腫（ＲＢ）及びｐ５３の両方の経路の成分に直接影響を及ぼす。他のタンパク質、例えばｖ−ｓｒｃ又はｖ−ｅｒｂＢは、侵害性（impinging）細胞外マイトジェンを模倣する、構成的に活性化された（それ故調節不全の）シグナル伝達因子である。これらの因子に関する問題は、それらが、効率的な形質転換のために必要ないくつかの経路の１つだけを標的することである。ｖ−ｓｒｃ又はｖ−ｍｙｃの存在は細胞に形質転換の素因を与え、完全な形質転換のためには細胞内の付加的な、自発的で予測不能の変化を必要とする。レトロウイルス癌遺伝子の１つで形質転換された細胞によって課せられる患者のリスクは、それ故、推定が困難である。
【００１４】
また別の場合には、１個の強力な腫瘍抗原（例えばｖ−ｊｕｎ）が直接腫瘍形成を引き起こすことができる（Hartl, M. et al., Curr. Cancer Drug Targets 3: 41-55 (2003)）。多くのトリウイルス癌遺伝子は、哺乳動物細胞においてそれらの潜在的腫瘍形成能を維持する。
【００１５】
これらのウイルスによって作出される細胞株はワクチン製造には適さない。癌遺伝子を担持するレトロウイルスがワクチンと共に活性化され、移入され得る。ウイルスＬＴＲによって囲い込まれていない腫瘍抗原でさえも、相補的抗原の助けを得ずに哺乳動物細胞を形質転換することができる場合には、高いリスクを課すことがある。このリスクは、典型的には形質転換潜在能、ワクチン接種者の数、及びワクチンウイルスと共に移入される細胞核酸の量を考慮して推定される。この量は精製工程の効率によって制限され、現在は１０ｐｇ／用量以下に低減することができない。この判定基準は、健常者集団がしばしば非常に若年で接種されるワクチン生産については特に厳格である。
【００１６】
同じ議論がＤＮＡウイルス、例えばパピローマウイルス及びポリオーマウイルスを形質転換する際にも当てはまる。これらのウイルスは攻撃的な癌遺伝子を備えている：ＳＶ４０ラージＴ抗原は、細胞周期のＧ１におけるチェックポイント制御とｐ５３活性の両方に影響を及ぼす多機能性タンパク質である。それ故、ラージＴは容易に不死化し、げっ歯動物及びヒト起源の複数の哺乳動物組織を形質転換する。スモールＴ抗原の添加により（ラージＴ作用をさらに増強し、ＡＫＴ３経路を付加的に調節する）、鳥類細胞を不死化することが可能となった（米国特許出願第２００１−００１６３４８号の一部）。しかし、洗練された近代的精製方法を用いても、ＳＶ４０ラージＴ抗原は人体医学における適用のために作製される細胞株での使用のためには攻撃的過ぎると考えられる。上記に対し、本発明の遺伝子は、別々の因子によって細胞周期のチェックポイント制御とｐ５３不活化に影響を及ぼす：必要な、形質転換のための２つの異なる因子の同時移入事象は、ワクチン接種者にとっての理論的リスクを劇的に低下させる。
【００１７】
米国特許出願第２００１−００１６３４８号は、本発明とは完全に無関係な抗アポトーシス経路の使用を述べている。前記出願は、第一遺伝子によって引き起こされる強制的細胞周期進行によるアポトーシスについての内部シグナルに対抗する第二遺伝子を提供していない。アポトーシスはまた、様々な外部刺激、例えば成長因子の欠如又は足場（anchorage）の喪失によっても誘導され得る。この種のプロアポトーシスシグナルの伝達は、米国特許出願第２００１−００１６３４８号の焦点である、ｂｃｌ−２ファミリー遺伝子によって阻止され得る。
【００１８】
子宮頸癌の９０％はパピローマウイルス配列を担持するが、Ｃ型アデノウイルス（２型及び５型を含む）はインビボで腫瘍を誘導しないと考えられ、アデノウイルス配列はヒト腫瘍組織では検出されていない。
【００１９】
あるいは、ニワトリ胚線維芽細胞の連続継代によって細胞株を開発することも試みられてきた。げっ歯動物細胞は極めて容易に自発的不死化を受けると思われるが（Curatolo et al., In Vitro 20 : 597-601 (1984) ）、トリ及び霊長動物細胞はこのアプローチに対して高度に抵抗性である（Harvey, et al., Genes and Development 5: 2375-2385 (1991); Pereira-Smith, J. Cell Physiol. 144: 546-9 (1990); Smith et al., Science 273: 63-67 (1996)）。トリ又は霊長動物起源の体細胞はテロメラーゼを持たず、細胞の老化は染色体末端（テロメア）の短縮によって引き起こされる。それにもかかわらず、トリ線維芽細胞株ＵＭＮＳＡＨ−ＤＦ１がこのアプローチを用いて開発された（米国特許第５，６７２，４８５号及び同第６，２０７，４１５号）。このアプローチによる不死化は、複数の癌遺伝子又は癌抑制遺伝子における自然突然変異によって生じる。これは、特に他の組織起源の細胞では再現される可能性が低いまれな事象である。最も重要な点として、そのようなアプローチは、癌遺伝子移入のリスクを評価するために不死化遺伝子について詳細な知識を提示するヒト生ワクチンに関する一般原則としての規定リスク（Defined Risk）アプローチに反する。さらにＦＤＡ（細胞基質に関する２０００年５月１２日からのＣＢＥＲ協議）によれば、天然に生じる腫瘍に由来する新生物細胞又は未知の機構によって形質転換された細胞の使用は、最小精製生弱毒化ウイルスワクチン及びウイルスベクターワクチンの開発のためには推奨されていない。
【００２０】
自然発生的に開発されたＵＭＮＳＡＨ−ＤＦ１ニワトリ線維芽細胞株は、Ｅ２Ｆ及びｐ５３活性の変化を示す（Kim et al., Oncogene 20 : 2671-82 (2001)）。細胞周期活性の増強は活性なＥ２Ｆを必要とし、また高いＥ２Ｆ活性は活性ｐ５３の存在下でアポトーシスを誘導することが哺乳動物細胞試験から知られているので、これは意外ではない。前記試験は、原因となる事象は明らかにしていないが、不死段階を特性決定している：多数の遺伝子の突然変異が不死化を引き起こしたと考えられる。
【００２１】
偶発的形質転換過程は、化学変異原の使用によって増強され得る（米国特許第５，９８９，８０５号）。このアプローチを用いて生成された特定細胞株は、細胞の老化を克服したが、線維芽細胞様の外観を維持し、非腫瘍形成性である。これは重要な安全性特徴であるが、これらの細胞は大規模発酵技術にとっては価値が低い。さらに、この偶発性に基づくアプローチも規定リスクガイドラインに反する。
【００２２】
天然に生じる腫瘍を起源とするトリ細胞株、例えばウズラ線維肉腫（ＷＯ９７／０８３０７）も、バイオ製品製造のために提案された。一方、偶発事象に基づく方法は、ヒトワクチン生産における使用のための規定リスクガイドラインに違反する。
【００２３】
上述した試験で採用されたアプローチは、不死化のための原因因子を定義し、リスクを評価することを可能にし、様々な組織の選択に関して高い柔軟性を提供し、生じる細胞株のある特徴を調節することを可能にする、本発明に従った特異的な群の不死化遺伝子の積極的導入とは際立って対照的である。
【００２４】
ニワトリ卵及び線維芽細胞がかなりの実績を有するという事実にもかかわらず、それらはまた、最近になって初めて大きな注目を集めるようになってきた、非常に特異的な危険因子と関連する：ニワトリ細胞は、少なくとも２種類のレトロウイルス粒子、すなわち内在性トリレトロウイルス（ＥＡＶ）及び内在性トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ−Ｅ）を放出する。この問題は、組換えタンパク質（ＮＳ０など）の製造のために使用されるマウス細胞における内在性レトロウイルス粒子の存在と同様である。しかし、マウス細胞と異なり、ニワトリ細胞は逆転写酵素を含むことが示された。より効率的な検出手法の故に、ＲＴ活性はまた、ニワトリ細胞由来の麻疹、流行性耳下腺炎及び黄熱病ワクチンにおいても検出されている（Hussain, A. I. et al., J. Virol. 77 : 1105-11(2003) ; Shahabuddin, M. et al., 3. Clin. Microbiol. 39: 675-84 (2001)）。逆転写酵素活性の存在が伝染性レトロウイルスを生じさせるかどうかはまだ論議の対象である：より詳細な分析は、ＣＥＦ（白色レグホンの）が組み込まれたＥＡＶに関する５つの遺伝子座を含み、そのうち２つは感染性ＡＬＶ−Ｅを発現することができ、他の３つは欠損であることを示した（Johnson, J. A. , Heneine,W., J. Virol. 75: 3605-12(2001)）。Tsang, S.X. et al., J. Virol. 73: 5843-51 (1999) も、ＲＴ活性とウイルス粒子の放出を見出したが、流行性耳下腺炎ワクチンを接種された小児の血液単核細胞におけるＥＡＶ配列の慎重な探索後、いかなる伝染も認めなかった。ＷＨＯの疫学週報（Weekly Epidemiological Record）（７３）２８（１９９８）によれば、独立した研究所が、広汎な共培養によって様々なヒト及び他の哺乳動物細胞に対する粒子の感染性を検討し、ＲＴ活性の伝播又は増殖性感染を検出することができなかった。この所見は、ニワトリ細胞由来のワクチンの使用と、小児期を含む癌の発生率の間に関連性がないことを明らかにした疫学的試験によって裏付けられる。
【００２５】
さらに、前述した疫学週報において、ＷＨＯは、あるワクチン株の弱毒化を維持するためのニワトリ宿主細胞の重要性を強調している。代替的生産工程は現在のところ使用可能ではなく、この代替策の欠如が、ウイルス夾雑物についての既知の持続的ソースが受け入れられていることの重要な理由である。
【００２６】
しかし、疫学的試験は集団を重ね合わせており、偶発事象又は症例試験を検討していない。疫学的試験は理論的リスクを論破することができず、例えば：認められている内在性ＲＴ活性は、許容されない外因性汚染からのＲＴ活性を覆い隠す可能性があり、パッケージング構築物を細胞に導入した場合、内在性ウイルスが動員され、活性化され得る（Ronfort, C. et al., Virology 207: 271-5 (1995)）。
【００２７】
しかしながら、アヒル及びガチョウの細胞はＥＡＶ及びＡＬＶ関連配列を含まず、日本ウズラは逆転写酵素を持たないことが示された（Smith, LM. et al.,J. Gen.Virol. 80(pt1):261-8(1999) ; Brudno, I. A. et al., Vopr. Virusol. 97-100 (1980)）。
【００２８】
アデノウイルス（ＡＤＶ）は、十分に特性決定された、裸の（エンベロープを持たない）汎存ウイルスである。最も一般的な血清型Ａｄ２及びＡｄ５に関して、ヒト集団における血清有病率は９０％に達する。これらのウイルスの複製不能型が、ヒト患者での治験において遺伝子治療及びワクチンベクターとして使用される。ヒトアデノウイルス５型のＥ１領域の遺伝子が、インビトロで一部の特定ヒト細胞を形質転換するために使用されてきた（２９３及びＰＥＲ．Ｃ６細胞株; Fallaux, F. J. et al., Hum. Gene Ther. 9 : 1909-17 (1998); Graham, F. L. et al., J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977)）。より強力な多機能性癌遺伝子、例えばＳＶ４０ラージＴ抗原と比較すると、全般的工程は非効率的である。２９３がニューロン特異的マーカーを示し、ＰＥＲ．Ｃ６が神経外胚葉起源であるという所見に基づき、Ａｄ５  Ｅ１に基づく形質転換は神経細胞に限定されることが示唆された（Shaw et al. FasebJ 16 (8): 869-71 (2002)）。ヒトとトリ細胞の間の重大な種間障壁を考慮すると、トランスフェクションによる複数のトリ組織の効率的な不死化はさらに一層期待されない。
【００２９】
哺乳動物Ｅ１形質転換細胞株は、臨床試験における生精製アデノウイルスベクターの生産のために使用されてきた。ワクチン製造における細胞ＤＮＡの汚染量及びその大きさの注意深い観測により、Ａｄ５のトランスフォーミング遺伝子は安全性の障害とは考えられない（ワクチン及び関連生物学的製品諮問委員会（Vaccines and Related Biological Products advisory committee）、２００１年５月１６日からの会議）。
【００３０】
アデノウイルスは感染細胞の核内で複製する。静止宿主細胞は完全なウイルス生活環に対して許容状態にないので、アデノウイルスは細胞をＳ期へと進行させる進化した機構を有する。子孫ウイルスのバーストサイズを最大化するために、それらはまた、キャプシドの貫入及びウイルス複製に対する宿主細胞の応答としてのアポトーシスを免れる進化した機構も有する。細胞周期進行及びアポトーシス阻止の両方を仲介するゲノム領域がＥ１領域である。
【００３１】
Ｅ１領域は、実際には、タンデムに配置され、各々がそれ自身のプロモーターとポリアデニル化部位を備えた２つの異なる発現カセット、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂから成る。少なくとも３つのタンパク質が二者択一的スプライシングによってＥ１Ａ一次転写産物から翻訳される。その中でも特に、Ｅ１Ａタンパク質はＲＢ／Ｅ２Ｆ複合体を破壊し、ｐ３００及びＣＢＰ転写コアクチベーターを阻害することが認められた。ＲＢリプレッサーからのＥ２Ｆの解放はＧ１からＳ期への細胞周期の進行を誘導し、一方Ｅ１Ａ／ｐ３００複合体は、アポトーシスの鍵となるセンサー、ｐ５３の負の調節因子であるＭｄＭ２の転写の抑制を含む、いくつかの経路を通してアポトーシスを誘導する（Putzer, B. M. et al., Cell Death Differ. 7: 177-88 (2000)）。
【００３２】
Ｅ１ＡはＴＮＦ誘導性アポトーシスに対して細胞を感受性にするので、抗腫瘍薬とみなされ、腫瘍治療のための実験的アプローチにおいて使用される（Lee, W. P. et al., Cancer Res. 63: 6229-36 (2003)）。
【００３３】
さらに、転写調節因子として働き、潜在的細胞基質にとって有利な特徴である、細胞を脱分化へと駆動する。
【００３４】
Ａｄ５のＥ１Ａの１２Ｓタンパク質のレトロウイルス形質導入はウズラ細胞の不死化を導き得ることがＧｕｉｌｈｏｔら（Guilhot, C. et al., Oncogene 8 : 619-24(1993)）によって示された。これはおそらく、トリＲＢとＥ１Ａの相互作用の結果であると考えられる。しかし、遺伝子がレトロウイルスではなく裸のＤＮＡのトランスフェクションによって導入されるときにはこの過程は起こらない（個人的所見）。本発明者らは、レトロウイルス感染による極めて効率的で安定な形質導入は、通常はＲＢの不活化時に誘導されるアポトーシスをブロックした自発的ゲノム変化を有する個別細胞を保持するのに十分な大きさの細胞プールを創造すると提案する。これらの必要であるが未知の変化は、ワクチン接種者に対するリスクを上昇させ、生じる細胞株はデザイナー細胞株（特定経路における定義されたブロックの結果）とみなすことはできない。さらに、レトロウイルスによって導入されるトランスフォーミング遺伝子は逆方向末端反復配列に隣接し、それ故、動員され得る。そのような事象は、内在性レトロウイルスからの逆転写酵素を発現する細胞株ではより一層顕著であり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
上記に鑑みて、不死化／トランスフォーミング遺伝子の規定された組合せを使用する、大規模製造のために好都合な増殖特性を備えたトリ細胞株を開発することは現在も望ましい。これらの遺伝子のいずれもが、他の遺伝子と無関係に哺乳動物細胞を形質転換することはできないことがさらに望ましい。さらに、単一遺伝子の作用は、不死化／トランスフォーミング作用を及ぼさないか又はそれぞれの遺伝子を発現する細胞のアポトーシスを生じさせるべきである。ワクチン受容者への結合移入のリスクは、それぞれの遺伝子を別々の発現単位上に位置づけることによってさらに最小化されるはずである。最後に、ヒト集団は典型的にはそれぞれの遺伝子に暴露されるので、これらの遺伝子がヒト集団において腫瘍形成に結びつかないことが望ましい。作製される細胞株は、内在性レトロウイルスから感染性ウイルス粒子を放出してはならず、又は全く逆転写酵素活性を示してはならない。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
そのうちの１個が網膜芽細胞腫タンパク質に影響を及ぼし、他方がｐ５３タンパク質に影響を及ぼす、２個の特定のウイルス及び／又は細胞遺伝子によるトリ細胞の形質転換は、ワクチン接種のためのウイルスの生産に良好に適する細胞株を提供することが認められた。
【００３７】
本発明は、それ故、
（１）ウイルス及び／又は細胞遺伝子（以下では簡単に「遺伝子」と称する）の組合せ、すなわち網膜芽細胞腫タンパク質の機能に影響を及ぼす少なくとも１個の第一遺伝子とｐ５３タンパク質又はそのファミリー成員に影響を及ぼす少なくとも１個の第二遺伝子の組合せで不死化され、好ましくは前記第一遺伝子がＧ１チェックポイント制御を克服し、前記第二遺伝子が第一遺伝子によって誘導されるアポトーシスを阻害する、トリ細胞株；
（２）第一及び第二遺伝子で出発細胞を形質転換／トランスフェクトすることを含む、上記（１）で定義した細胞株を作製するための方法；
（３）生物学的製剤又はウイルスの生産のための、好ましくはワクチンの製造又は遺伝子治療のための、上記（１）で定義した細胞株の使用；及び
（４）上記（１）で定義した細胞株を使用する、ウイルス又は生物学的製剤を生産するための方法
を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明の「不死化された」、「不死化細胞」及び「不死化細胞株」は、それぞれの出発細胞に少なくとも２００継代、好ましくは無限数の継代、すなわち不死の潜在能を付与するある機能性ＤＮＡ配列によってトランスフェクト／形質転換された細胞又は細胞株に関する。
【００３９】
本発明の「遺伝子カセット」は、網膜芽細胞腫タンパク質の機能に影響を及ぼす遺伝子を含む、すなわち網膜芽細胞腫タンパク質とＥ２Ｆ転写因子の間の複合体の破壊を直接又は間接的に（例えば発現後に）仲介し、及びそれに加えて、ｐ５３による成長停止とアポトーシスの誘導を阻害するウイルス遺伝子、例えば全ての群のアデノウイルスＥ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質、パピローマウイルスのＥ６タンパク質、好ましくは低リスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６タンパク質（ＨＰＶ１、ＨＰＶ６及びＨＰＶ１１など、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８は含まない）、又はｐ５３による成長停止とアポトーシスを妨げる細胞遺伝子、例えばｍｄｍ２を含む、ＤＮＡ配列と理解されるべきである。
【００４０】
より詳細には、上記遺伝子カセットは、（１）の好ましい態様において網膜芽細胞腫タンパク質とＥ２Ｆ転写因子の間の複合体の破壊を直接又は間接的に（例えば細胞誘導物質によって）仲介する、「第一遺伝子」を含む。この第一遺伝子は、ウイルス遺伝子、例えばマストアデノウイルスＥ１Ａ、ＣＥＬＯのｇａｍ１及びｏｒｆ２２又はパピローマウイルス、好ましくは低リスクヒトパピローマウイルスのＥ７（ＨＰＶ１、ＨＰＶ６及びＨＰＶ１１など、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８は含まない）、又は細胞遺伝子、例えば構成的に活性なＣＤＫ４又は過剰発現Ｄ型サイクリンであってよい。第一遺伝子の活性は、通常は継代を重ねると共にアポトーシスの誘導又は成長停止を犠牲にして細胞周期進行を仲介する。
【００４１】
「第二遺伝子」は、第一遺伝子のこの作用に対抗するために上記遺伝子カセット内に存在する。第二遺伝子はアポトーシス又は成長停止を防止し、好ましくはｐ５３の分解を上昇させる又はｐ５３をトランス活性化因子から転写のリプレッサーへと変換することを通してｐ５３による転写活性化を阻害することによって作用する。好ましくは「第二遺伝子」は、ｐ５３の機能の抑制及びｐ５３の安定性の低下を生じさせることを含む、ｐ５３による転写活性化を妨げることができる。「第二遺伝子」は、ウイルス遺伝子、例えば全ての群のアデノウイルスＥ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質、ＣＥＬＯのｏｒｆ２２、パピローマウイルス、好ましくは低リスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ１、ＨＰＶ６及びＨＰＶ１１など、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８は含まない）のＥ６タンパク質、又はｐ５３による成長停止とアポトーシスを妨げる細胞遺伝子、例えばｍｄｍ２であってよい。好ましくは、「第二遺伝子」はＣＥＬＯのｏｒｆ２２又はアデノウイルスＥ１Ｂ  ５５Ｋである。
【００４２】
これは、未知の機構によるニワトリ線維芽細胞株の生成（米国特許第５，８７９，９２４号）に関連した外来活性野生型ｐ５３の導入とは全く正反対である。
【００４３】
本発明の文中における「生物学的製剤」は、抗体、酵素、ホルモン、受容体又はそれらのリガンド又はそれらの融合物を含む、治療及び組換えタンパク質を包含する。好ましい生物学的製剤は組換えタンパク質である。
【００４４】
実施態様（１）の１つの好ましい態様は、胚又は孵化ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ等、好ましくはニワトリ又はアヒルに由来する細胞株の使用である。（１）の特に好ましい態様では、付加的にこの細胞株は、ニワトリ胚、孵化ニワトリ、アヒル胚又は孵化アヒルから生じる初代細胞の不死化に由来する逆転写活性を有さず、胚体外膜に由来する及び／又は化学的に規定された培地で培養される。前記培地は、好ましくは動物血清を含まない。
【００４５】
実施態様（１）の別の好ましい態様は、不死化に供する細胞が、線維芽細胞を含む初代細胞、すなわち単離された体分節（体節）又は神経、脳、網膜、腎臓、肝臓、心臓、筋肉及び胚を保護する胚体外組織及び膜を含む分離された個別器官からの細胞である。最も好ましくは、細胞は胚体外膜又は網膜からである。
【００４６】
実施態様（１）の細胞を導く不死化は、好ましくは、リポソーム、デンドリマー又はヒドロキシアパタイト（「リン酸カルシウム」）沈殿物によって仲介されるトランスフェクション及び電気穿孔法を含むがこれらに限定されない、非ウイルス性トランスフェクションによって実施される。
【００４７】
好ましくは、実施態様（１）における第一遺伝子は、網膜芽細胞腫タンパク質とＥ２Ｆ転写因子の間の複合体の破壊を仲介するウイルス遺伝子である。これは、マストアデノウイルスから（好ましくはＣ群のマストアデノウイルスから）のアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子、パピローマウイルス、好ましくは低リスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（ＨＰＶ１、ＨＰＶ６及びＨＰＶ１１など、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８は含まない）からのＥ７タンパク質、トリアデノウイルスのｏｒｆ２２遺伝子及び／又はヒツジアットアデノウイルス（ｏｖｉｎｅ  ａｔｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）からのＥ４３オープンリーディングフレームを含むが、これらに限定されない。あるいは、実施態様（１）の第一遺伝子は、網膜芽細胞腫タンパク質とＥ２Ｆ転写因子の間の複合体の破壊を仲介する細胞遺伝子である。これは、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、サイクリンＤ３及び／又はｐ１６ＩＮＫ４ａによる不活化に感受性でない突然変異型ＣＤＫ４を含むが、これらに限定されない。
【００４８】
実施態様（１）の第二遺伝子は、好ましくはｐ５３による成長停止とアポトーシスの誘導を妨げるタンパク質をコードするウイルス遺伝子である。これは、全ての群のアデノウイルスＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質、ＣＥＬＯのＧＡＭ−１、パピローマウイルス、好ましくは低リスクＨＰＶ（ＨＰＶ１、ＨＰＶ６及びＨＰＶ１１など、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８は含まない）のＥ６タンパク質をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。アデノウイルスＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質及びＣＥＬＯのＧＡＭ−１をコードする遺伝子が最も好ましい。あるいは、第二遺伝子は、ｐ５３による成長停止とアポトーシスを妨げる細胞タンパク質、例えばｍｄｍ２をコードする。
【００４９】
実施態様（１）の第一遺伝子と第二遺伝子は、好ましくは異種配列によって空間的に切り離されているか又は異なる核酸セグメント又はプラスミド上に位置する。
【００５０】
実施態様（１）の特に好ましい態様では、第一遺伝子は、マストアデノウイルス属、好ましくはアデノウイルス５型の、アデノウイルスＥ１Ａ領域であり、第二遺伝子はＥ１Ｂ領域である。最も好ましくは、前記Ｅ１Ａ領域は、配列番号７のｂｐ１１９３−２３０９、好ましくはｂｐ１２３９−２３０９の配列又は配列番号９のｂｐ４２３０−３１１３に相補的な配列を有する。さらに、最も好ましくは、前記Ｅ１Ｂ領域は、配列番号８のｂｐ１１４５−３００７、好ましくはｂｐ１１９７−２８１０の配列又は配列番号９のｂｐ２３４５−５５０に相補的な配列を有する。
【００５１】
実施態様（１）のさらなる特に好ましい態様では、第一遺伝子は、アデノウイルスから、好ましくはアデノウイルスＣＥＬＯ属の、ｏｒｆ２２であり、第二遺伝子はＧＡＭ−１であり、それらは、好ましくは、配列番号１０のｂｐ１２５２−６３５に相補的な配列及び配列番号１０のｂｐ３１３８−２２９０に相補的な配列によって表わされる配列を有する。
【００５２】
実施態様（１）及び（２）のさらなる特に好ましい態様では、プラスミド３６Ｅ（配列番号１９）、３７Ｅ（図１）、４９Ｅ（配列番号９）、２５Ｆ（配列番号１０）又は６０Ｅ（配列番号１８）を細胞の不死化のために使用する。
【００５３】
さらに、上記で定義したＧＡＭ−１及び／又はＯｒｆ２２とＥ１Ａ及び／又はＥ１Ｂをコードする核酸の組合せは、実施態様（１）の好ましい態様である。
【００５４】
実施態様（１）の細胞株は、導入遺伝子、例えば欠損ウイルスを補う遺伝子（例えばＥＢＮＡ１等）、プロモーター（例えばＰＧＫ−、ＥＦ１．α−、ＣＭＶプロモーター、Ａｄ５のＥ１プロモーター、ｔｋ−プロモーター等）、エンハンサー（例えばＲＳＶ−ＬＴＲ）、選択マーカー、例えばネオマイシン耐性、ピューロマイシン耐性等を含むがこれらに限定されない、非天然機能性配列を付加的に担持し得る。１つの好ましい態様では、第一遺伝子と第二遺伝子は、ＰＧＫ−、ＣＭＶ−、Ｅ１−及びｔｋ−プロモーターから独立して選択される別々のプロモーターの制御下にある。
【００５５】
実施態様（１）の細胞株は、１つの好ましい態様では、さらに、ワクチン株（マレク病、伝染性ファブリーキウス嚢病、ニューカッスル病、シチメンチョウヘルペス、ニワトリ貧血、インフルエンザ、ワクシニア（ＭＶＡ）、風疹、狂犬病ウイルス等）及び組換えウイルスベクター（例えば組換えＭＶＡ又はアルファウイルス）を含む生物学的製剤又はウイルスの生産に適する。ワクチン接種のための最も好ましいウイルスは、ＭＶＡ及びインフルエンザウイルスである。最も好ましい組換えウイルスベクターはＭＶＡである。
【００５６】
実施態様（１）の１つの態様では、細胞株は、プラスミド４９Ｅによるアヒル胚体外膜細胞の不死化に由来する細胞株１２Ａ０７−Ａ１０（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６９５）である（実施例２）。
【００５７】
細胞株を医薬適用に適したものにするｃＧＭＰ条件下での実施態様（１）に従った細胞株の作製はさらに好ましい。
【００５８】
実施態様（２）の方法は、好ましくは上で列挙したような出発細胞の非ウイルス性トランスフェクションを含む。リポソームトランスフェクション、特にＥｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬によるトランスフェクションが最も好ましい。
【００５９】
実施態様（３）に従った好ましい使用は、ワクチンの製造又は遺伝子治療のための使用である。ウイルスワクチン株又は遺伝子治療ベクターを、実施態様（１）に従った細胞株の細胞株と接触させ、その結果、感染を生じ、ウイルスが前記細胞によって増幅される。ウイルスの連続継代（前記細胞での感染とウイルスの回収の反復サイクル）は、この特定宿主細胞株に対するウイルスの弱毒化又は適応を導く。このようにして、意図するワクチン接種者（アヒルではなく、好ましくは鳥類ではない）に対してより低い毒性を有するウイルスベクター又はワクチン株が生成される。弱毒化ウイルスは、ワクチン接種者の免疫系が、完全に不活化された粒子によるワクチン接種よりも防御的であり、野生型（天然）病原体による感染よりも重症でない応答を生じることを可能にする。この実施態様のための好ましいウイルスは、麻疹及び狂犬病ウイルスである。
【００６０】
実施態様（４）に従ったウイルスを生産するための方法は、好ましくは、前記ウイルスを実施態様（１）に従った細胞株と接触させること及び／又は前記細胞株での前記ウイルスの培養を含む。特に、この方法は、アヒル細胞株、好ましくはアヒル体節又はアヒル神経組織、さらに一層好ましくはアヒル網膜を起源とする細胞株において、好ましくはＭＶＡ株の、ポックスウイルスを生産するために使用することができる。特に、ｃＧＭＰ条件下でのＡｄ５−Ｅ１領域のトランスフェクションによって得られるアヒル網膜及び体節由来細胞は、初代ニワトリ胚線維芽細胞に比肩し得る又はそれよりも良好な効率でＭＶＡの増幅を安定にサポートする（実施例５）。
【００６１】
実施態様（４）に従った、生物学的製剤、特に組換えタンパク質を生産するための方法は、プロモーターに作動可能に連結された、組換えタンパク質をコードする遺伝子を実施態様（１）に従った細胞株に導入すること、前記改変細胞株を培養すること及び組換えタンパク質を回収することを含む。
【００６２】
実施態様（４）の方法は、好ましくは、ワクチン接種又は遺伝子治療のために使用可能なウイルス及び生物学的製剤の生産のために使用される。
【００６３】
歴史的に、ニワトリ卵及びそれぞれの細胞（ニワトリ線維芽細胞）はワクチンの製造のための主要な基質である。医薬目的には、ニワトリは、大規模なモニターシステムによる病原体管理環境から入手可能である。数多くの文献が、ニワトリ卵を細胞株開発のための主要標的として示唆している。それ故、ニワトリ細胞は本発明の出発細胞のための１つの好ましいソースである。しかし、ニワトリ由来細胞及び細胞株はほとんどの場合ＲＴ陽性と考えられる。文献データは、感染性ウイルスの放出に関して低いリスクを示唆する。しかし、製造に使用するあらゆる細胞株に関して伝染性ウイルスの不在をモニターしなければならない。実際に、これまでに樹立されたトリ細胞株の大部分はニワトリを起源とする（米国特許第５，８３０，７２３号、米国特許第５，８７９，９２４号）。トリ白血病ウイルスを含まないニワトリ系統（系統０）を飼育することは可能であったが、内在性トリレトロウイルス（ＥＡＶ−ＨＰ）（Boyce-Jacino et al., J. Virol 66 (8): 4919-29 (1992) ）は、系統０を含むニワトリ細胞中に存在する。ＥＡＶは活性な逆転写酵素を与えるが、発現レベルは実質的に変化する。それ故、より感受性の低いアッセイでＲＴ陰性と判定された初代ニワトリ細胞及び細胞株、例えばＤＦ１でさえも（Crittenden et al., Virology 57(1) : 128-38 (1974)）、おそらく近代的なリアルタイムＰＣＲアプローチでは試験陽性であり、一定の増殖条件下で活性化されるレトロウイルスを保持すると考えられる。
【００６４】
細胞株開発のための本発明の二者択一的に好ましい鳥類種は、内在性レトロウイルスを含まない又は逆転写酵素（ＲＴ）発現しないものである。これはアヒルを含み、アヒルは２つの付加的な理由から適する：アヒル卵も病原体不在モニターストックから入手可能であり、アヒルは、ガチョウと異なり、自然発生腫瘍を発現する可能性が低い。関連ワクチン株の多くがニワトリ（胚）細胞におけると同様にアヒル（胚）細胞において良好に複製することが知られているが（例えばマレク病ウイルス（Witter, R.L., Avian Dis. 46: 925-37 (2002) ）又は風疹（Rocchi, G., Salvadori, A. , Nuovi Ann. Ig Microbiol. 21: 336-40 (1970)）、これは、主要な関心対象であるウイルス株に関して示されたものであ。他のワクチンについてはそのようなデータは得られていない。
【００６５】
本発明者らの知る限り、高度弱毒化ポックスウイルス株ＭＶＡ（改変ワクシニアＡｎｋａｒａ）が、一般的に使用される初代ニワトリ胚線維芽細胞におけると同様の又はより高い効率でアヒル細胞株において複製するというのは、本発明の新規且つ予想外の所見である。本発明者らの１つの目的は、トリ宿主を必要とするウイルスの増幅のための初代細胞、又は非哺乳動物宿主が好ましいワクチン株に対する安全で強固な代替物を提供することであった。好都合な宿主細胞が入手可能でない重要なウイルスは、ＭＶＡ（改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ）である。ＭＶＡは高度弱毒化ポックスウイルスであり、治療及び防御ワクチン適用のための極めて有望なツールである。ＭＶＡは、アヒル細胞の特性決定のためのモデルウイルスとして役立つが、排他的な例と解釈されるべきではない：記述した実験は、病原体又は治療ベクターのいずれかの、一連の他のウイルス、例えば麻疹、風疹、狂犬病又はインフルエンザウイルスに関しても実施することができる。
【００６６】
線維芽細胞は、主として歴史的及び実際的理由から好ましい細胞型として選択されてきた。線維芽細胞は、哺乳動物並びに鳥類種の最も速く成長する初代細胞である。全ニワトリ胚からの細胞懸濁液を培養するとき、これは、唯一ではないが支配的な細胞型である。しかし、線維芽細胞は強力な付着性に成長し、完全な（腫瘍形成性）形質転換後にのみこの特徴を失う。この過程は、強力なトランスフォーミング遺伝子の存在、例えばシグナル伝達経路に干渉するｖ−ｒａｓの存在を必要とする。線維芽細胞培養物の早期老化は、一部には、トリ及びヒトにおけるテロメラーゼ活性の完全な不在によって引き起こされる（Forsyth, N. R. et al., Differentiation 69 (4-5): 188-97 (2002)）。
【００６７】
ヒト初代線維芽細胞は、これらの経路に直接干渉しないアデノウイルス５型のＥ１遺伝子による形質転換に対して不応性である（個人的所見）。懸濁液培養での効率的な不死化及び増殖は、上皮及び神経細胞に関してより高い成功の可能性がある。さらに、線維芽細胞ではなく上皮は、トリ卵の内部でのウイルス複製のための主要部位であると思われる。興味深いことに、ヒトの場合と異なり、トリ腎臓は生涯を通じてテロメラーゼを発現せず、このことがトリ腎細胞を不死化のための良好な標的としている。合わせて考慮すると、腎上皮を含むトリ上皮細胞及び神経細胞は、求められる特徴の細胞株を開発するための最も有望な標的と考えられる。
【００６８】
それ故、トリ細胞株開発がほとんど独占的にこれらの細胞に集中してきたのは、単に線維芽細胞を得ることの容易さのためである（Cowen, B. S. , Braune, M. O. , Avian Dis 32 (2): 282-97 (1988);米国特許第５，８３０，７２３号）。一部の場合には全胚が使用されてきた（米国特許出願第２００１−００１６３４８号）。
【００６９】
ウイルスは、種特異性だけでなく、受容体分布及び複製を支持する細胞因子に基づく器官及び組織特異性も示さない。それ故、典型的なアプローチと異なり、本発明を実施するための好ましい方法は、最も好ましい宿主細胞を得るための培養に先立つ器官の分離である。
【００７０】
そのワクチンの適切な生産が本発明の細胞株の主要適用である、インフルエンザウイルスに関しては、複製の典型的部位は胚自体ではなく胚体外膜である。それ故、１つの明確な目的はまた、胚の保護膜を含む、胚体外物質から細胞株を開発することであった。胚体外膜のものを含む一部の組織特異的初代培養物は、線維芽細胞に比べて非常に短い生存期間を有する。これは、最適化宿主細胞を得るために設計された不死化の必要性をさらに強調する。限られた時間窓の中での多数の組織の不死化の成功には、本発明の中で使用される遺伝子の特定の組合せを必要とする。
【００７１】
いずれのトリ組織がポックスウイルス、例えばＭＶＡ又はカナリアポックスに関して最も高い複製潜在能を有するかは不明であった。ＭＶＡについての典型的製造工程は、崩壊の前に除去される頭部を除く胚からの細胞の混合物を含む。それ故、網膜から開発された神経起源の細胞株がＭＶＡ複製のためのそのような高い能力を有し、他の組織が有していないことは全く予想外である。
【００７２】
同じ組織特異性がタンパク質生産にも当てはまる。転写能力は転写因子の使用可能なセットに依存し、強力な遍在ウイルス及び細胞プロモーターであっても、異なる組織では多様な強さを示す。さらに、分泌タンパク質の収率は、タンパク質を折りたたみ、プロセシングする（例えばグリコシル化する）特定細胞型の能力に強く依存する。
【００７３】
初代細胞の不死化及び形質転換を導く機構は十分に記述されている（Hahn, W. C. et al., Nature 400: 464-8 (1999)）。必要とされる要素は、（１）細胞周期進行の制御、（２）細胞周期調節不全によって誘導されるプログラムされた細胞死、（３）成長因子シグナル伝達、及びヒト及びトリ細胞に関しては（４）染色体の線状末端であるテロメアの短縮、を阻害する。初代細胞を不死化され、形質転換された表現型へと駆動することができる数多くの因子が知られているが、不死化は、宿主において腫瘍形成を最小限にする責任を担う細胞チェックポイントを阻止することを犠牲にする。それ故、細胞株の実験的生成を実施することができるが、デザイナー細胞に由来する生物学的製剤のレシピエントにおける腫瘍誘導のリスクを最小限にとどめるトランスフォーミング因子を選択することが望ましい。この必要条件は、トランスフォーミング因子の強さとバランスをとる必要がある：それらは、付加的な自然突然変異の蓄積を必要とせずに形質転換を引き起こすのに十分な強さでなければならない；すなわち、生じる細胞株を導く分子経路が完全に公知でなければならない（２０００年５月の諮問委員会におけるＦＤＡ  ＣＢＥＲ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ’ｓ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｎｓに従ったカテゴリーＩ及びＩＩ）。さらに、ワクチン又は患者における不慮の形質転換の危険性をさらに最小化する、遺伝物質の同時移入が必要とされるように、個々では初代細胞を形質転換することができない因子の相乗的組合せを選択することが望ましい。最後に、トランスフォーミング因子は、製品適用による腫瘍形成という可能性の低い事象で免疫腫瘍モニターが活性化されるように、生物学的製剤の受容者において免疫応答を惹起することが望ましい。最後の判定基準は、非細胞性であるが外来性の、例えばウイルスの、トランスフォーミングタンパク質を使用する場合に実現できる。
【００７４】
いまや、ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）のＥ１領域は、生じるデザイナー細胞が上記判定基準の全てを満たすようにトリ細胞を形質転換するのに理想的に適することが認められた。
【００７５】
Ｅ１Ｂ領域は、バイシストロン性ｍＲＮＡ上の２つのオープンリーディングフレーム、２１Ｋ及び５５Ｋタンパク質をコードする。５５Ｋタンパク質はｐ５３に結合し、それ故プロアポトーシス転写活性化因子をリプレッサーに転換する。２１Ｋタンパク質は、Ｂａｘに結合することによってこの抗アポトーシス作用を補い、それ故ミトコンドリア膜の完全性を維持し、シトクロムＣの放出を妨げる。このタンパク質は接着細胞を基質独立性増殖へと駆動するために必須であり、それ故懸濁液中での発酵工程に不可欠である。
【００７６】
ヒトアデノウイルスＥ１Ｂ  ５５Ｋがｐ５３のトリホモローグに影響を及ぼし得るかどうかはこれまで明らかにされていなかった。さらに、トリアデノウイルスはＥ１Ｂに類似する遺伝子を備えていないため、干渉も不可能であった。全ての予想に反して、本発明者らは、Ｅ１ＢがＥ１Ａによる不死化を可能にする基本的機能を提供できることを見出した。
【００７７】
ここで述べる成果にとっての新規且つ決定的因子は、Ｅ１Ｂをその弱い天然環境から取り出して、強力な組換えプロモーターの制御下に置くことであった。この新規修飾と組合せは、レトロウイルス形質導入の代わりにトランスフェクションによるアヒル及びニワトリからの複数の組織の効率的不死化を可能にした。
【００７８】
Ｅ１による形質転換のための基礎となる機構は複雑であるが、１つの特質は、最も望ましい特徴である：Ｅ１Ａは細胞増殖とアポトーシスの強力な誘導物質であり、一方Ｅ１Ｂタンパク質はアポトーシスを効率的に妨げるが、細胞周期制御に対する制限を免れることができない。
【００７９】
それ故、実験的に誘導された形質転換表現型を維持するためには、単一因子ではなくＥ１ＡとＥ１Ｂタンパク質の持続的存在が必要である。
【００８０】
１９７０年代のｖ−ｓｒｃの記述（Brugge, J. S. , Erikson, R.L., Nature 269: 346-8 (1977) ）以来、数多くのトランスフォーミング因子が発見され、特性決定された。実際に、最初の分子学的洞察を提供したのはアルファレトロウイルスによる鳥類での腫瘍の誘導試験であった（Martin, G. S. , Nature 227: 1021-3 (1970)）。レトロウイルス癌遺伝子は、突然変異した又は欠失した必須調節因子ドメインを有する細胞遺伝子由来であった。これらの試験の間に特定された因子の一部、例えばｖ−ｍｙｃ又はｖ−ｒａｓは、ＲＢ及びｐ５３経路の成分に直接影響を及ぼす。他のタンパク質、例えばｖ−ｓｒｃ又はｖ−ｅｒｂＢは、侵害性細胞外マイトジェンを模倣する、構成的に活性化された（それ故調節不全の）シグナル伝達因子である。これらの因子に関する問題は、それらが、効率的な形質転換のために必要ないくつかの経路の１つだけを標的することである。ｖ−ｓｒｃ又はｖ−ｍｙｃの存在は細胞に形質転換の素因を与え、完全な形質転換のためには細胞内の付加的な、自発的で予測不能の変化を必要とする。レトロウイルス癌遺伝子の１つで形質転換された細胞によって課せられる患者のリスクは、それ故、推定が困難である。
【００８１】
他のＤＮＡウイルス、例えばパピローマウイルス及びポリオーマウイルスも、インビトロで細胞を形質転換することが知られている。しかし、選択される導入遺伝子は、生物学的製剤のレシピエントにおける不慮の移入細胞ＤＮＡによる腫瘍誘導のリスクを最小限にするために、あまりに攻撃的であってはならない。この判定基準は、健常者集団がしばしば非常に若年で接種されるワクチン生産については特に厳格である。洗練された近代的精製方法を用いても、ポリオーマウイルスラージＴ抗原は、ヒト医学における適用のために作製される細胞株での使用のためには攻撃的過ぎると考えられる。子宮頸癌の９０％はパピローマウイルス配列を担持するが（Munoz, N. et al., N.Engl., J. Med. 34816): 518-27 (2003)）、Ｃ型アデノウイルス（２型及び５型を含む）はインビボで腫瘍を誘導しないと考えられ、アデノウイルスはヒト腫瘍組織では検出されていない。
【００８２】
上に示したトランスフォーミング遺伝子の補足的特徴に基づき、懸濁液中で増殖する遺伝的に安定な細胞株を得るためには、各々が細胞周期とアポトーシスの単一経路を妨げる遺伝子の組合せが必要であることが見出された。
【００８３】
アデノウイルス５型の完全なＥ１領域はこれらの必要条件を満たし得ることが示された。Ａｄ５からのＥ１Ａの１２Ｓタンパク質がトリＲＢを妨げ得ることは示されているが（Guilhot, C. et al., Oncogene 8: 619-24 (1993)）、トリ細胞における５５Ｋ及び２１Ｋタンパク質の機能的作用は本発明において初めて明らかにされる。Ｅ１Ａの１２Ｓタンパク質を発現するウズラ細胞の一部のクローンが形質転換された特徴を示すことは意外ではない（Guilhot,. C. et al., Oncogene 8: 619-24 (1993)）。レトロウイルス感染による極めて効率的で安定な形質導入は、個々の細胞が自発的ゲノム変化によって細胞周期ブロック又はアポトーシス誘導を乗り越えることを可能にするのに十分な大きさの細胞プールを創造する。これらの必要であるが未知の変化は医学的リスクを上昇させ、生じる細胞株は、公知の遺伝子に基づくべきである、デザイナー細胞株とみなすことはできない。さらに、トランスフェクション手法は、自然選択のために必要な大きなクローンプールを創造するのに十分ではない。その代わりとしてレトロウイルス形質導入が必要であった。このアプローチによって導入されたトランスフォーミング遺伝子はＩＴＲに隣接し、それ故、逆転写酵素を発現する細胞株ではなおさら、動員され得る。
【００８４】
最近、トリアデノウイルス１型株ＣＥＬＯ［ニワトリ胚致死オーファン（chick embryo lethal orphan）］と称されるトリアデノウイルスが詳細に記述された（Chiocca, S. et al., J. Virol. 70: 2939-49 (1996)）。ＣＥＬＯの大きな中心ゲノム範囲はＡｄ５に相同であるが、 重要な面で異なる：中でも、ＣＥＬＯはＥ１相同領域を備えていない。さらに、ＣＥＬＯはＥ１Ａに突然変異を生じたＡｄ５を相補できず、逆に、Ａｄ５  Ｅ１タンパク質は後初期（delayed-early）ＣＥＬＯ遺伝子の転写をトランス活性化することができない（Li, P. et al., J. Gen. Virol. 65 (Pt 10):1817-25 (1984)）。それでも、ＣＥＬＯはインビトロでハムスター細胞を形質転換することができる（May, J. T. et al., Virology 68:483-9 (1975)）。細胞周期とアポトーシスを妨げる遺伝子、ｏｒｆ２２及びＧＡＭ−１は、ＣＥＬＯウイルスにおいて同定された（Lehrmann, H., Cotton, M. , J. Virol. 73: 6517-25 (1999)）。ｏｒｆ２２は、ＲＢと相互作用するタンパク質をコードし、ＧＡＭ−１は、原型的な２１Ｋタンパク質と同様の方法でアポトーシスを妨げる（Chiocca, S. et al., J. Virol. 71: 3168-77 (1997)）。
【００８５】
いまや、ＣＥＬＯウイルスからのｏｒｆ２２及びＧＡＭ−１遺伝子はＥ１Ａ及びＥ１Ｂの適切な代用物であることが見出された。トリ細胞の形質転換のために使用可能な導入遺伝子の範囲がそれによって拡大される。これらのタンパク質はこれまでトリ細胞を形質転換するために使用されていなかった。
【００８６】
さらに、ウイルス遺伝子の１個を細胞遺伝子に置換し得る。そのような置換の候補物質は、アデノウイルスのＥ１Ａ領域についてはＥ２Ｆファミリー成員又はＤ群サイクリンであり、Ｅ１Ｂ領域についてはｍｄｍ２である。
【００８７】
以下の細胞株は、ＤＭＳＺ，Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託された:
１．ＤＳＭ  ＡＣＣ２５７７としてＰＢＧ０４、２００２年９月１８日寄託；
２．ＤＳＭ  ＡＣＣ２６９５として１２Ａ０７−Ａ１０、２００４年１０月２０日寄託。
【００８８】
以下の実施例を参照して本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定すると解釈されるべきではない。
（実施例）
【実施例１】
【００８９】
アデノウイルス５型Ｅ１Ａ，Ｂを用いた初代アヒル細胞の不死化
Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂについてのアデノウイルス配列を、ｐｒｏｖｅｓｔａｒｔポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、野生型ウイルスで重度に汚染されたＨＥＫ２９３において増殖させた第一世代（Ｅ１欠失）アデノウイルスＡｄｍｕｃの継代８の培養から増幅した。Ｅ１Ａ領域を増幅するために以下のプライマー：
ＶＳ１８２  ＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＴＧＴＡＧＴＧＴＡＴＴ（配列番号１）
ＶＳ１８３  ＣＡＣＡＣＧＣＡＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴ（配列番号２）
を使用し、Ｅ１Ｂ領域を増幅するために以下のプライマー：
ＶＳ１８４  ＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＧＡＧＴ（配列番号３）
ＶＳ１８５  ＡＣＡＣＡＴＴＴＣＡＧＴＡＣＣＴＣＡ（配列番号４）
を使用した。両方のフラグメントを最初にｐＰＣＲ４ｂｌｕｎｔｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）にクローニングした。
【００９０】
Ｅ１Ｂ構築物は、Ｅ１Ｂメッセージからスプライス供与部位を欠く。それ故、ヒト免疫グロブリン重鎖のリーダーイントロンからのプライマーを用いて増幅した合成構築物に置き換えた。鋳型として、ネズミ−ヒトヘテロハイブリドーマ、ＰＢＧ０４（ＤＭＳＺ  ＡＣＣ２５７７）からのゲノムＤＮＡを使用した。
プライマー：
ＶｉｎｔＳＡ−Ｆ  ＡＡＧＧＴＡＣＣＣＴＣＣＣＴＡＧＴＣＣＣＡＧＴＧＡ（配列番号５）
ＶｉｎｔＳＡ−Ｒ  ＣＡＡＴＧＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧ（配列番号６）
【００９１】
このスプライス供与部位を、融合タンパク質を作製するために、ＥＦ１αプロモーター及びｍｙｃリーダーペプチドを含むｐＥＦｍｙｃに直接クローニングした。ＥｃｏＲ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉ部位を用いてｐｔｏｐｏＥ１ＡからＥ１Ａ領域を切り出し、ｐＥＦｍｙｃに直接クローニングして、ｍｙｃリーダー配列を除去し、Ｅ１Ａをウシ成長ホルモンポリＡに融合した。Ｅ１Ｂ領域を再びＥｃｏＲ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉ制限酵素で切り出し、異種スプライス供与部位を含むｐＥＦｍｙｃＳＡにクローニングした。生じたプラスミドをｐＥＦＡｄ５Ｅ１Ａ（配列番号７）及びｐＥＦＡｄ５Ｅ１ＢＳＡ（配列番号８）と命名した。
【００９２】
孵化アヒル卵を３７℃、６０％空気湿度で１２日間インキュベートした（より古い（older）胚はより多くの細胞を生じたが、同時により高い数の汚染性分化線維芽細胞を含んだ）。外皮を７０％イソプロパノールで滅菌し、大きい末端で開いて、胚を無菌的に滅菌ペトリ皿に取り出した。胎児脳及び腎臓を取り出し、トリプシン／ＥＤＴＡを満たした別のペトリ皿に移して切り刻んだ。短いインキュベーション後、その懸濁液を、１０％ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）及び２％Ｕｌｔｒｏｓｅｒ  Ｇ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）を添加した過剰のＦ１２培地と混合した。この懸濁液をペトリ皿に移し、３７℃（ニワトリの生理的温度４１．６℃より低い）、５％ＣＯ2で培養を実施した。非付着性細片(debris)と共に培地を翌日交換し、少なくとも５×１０5細胞／３．５ｃｍ皿がプラスミドｐＥＦＡｄ５Ｅ１Ａ及びｐＥＦＡｄ５Ｅ１ＢＳＡのトランスフェクションのために使用可能になるまで培養を続けた。
【００９３】
リポソーム（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ；Ｑｉａｇｅｎ）及びデンドリマー（Ｐｏｌｙｆｅｃｔ；Ｑｉａｇｅｎ）トランスフェクション試薬を比較する初期実験は、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅによる最良の効率を示唆した。そこでＥｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬を用いてトランスフェクションを実施した；簡単に述べると、プラスミドＤＮＡ２μｇを、エンハンサー１６μｌを含むＥＣ緩衝液２００μｌに希釈した。５分間のインキュベーション時間後、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ１６μｌを添加した。１０分間のインキュベーション時間後、上清を培養物から３．５ｃｍ皿に取り出し、トランスフェクション混合物を含む新鮮培地１ｍｌに置き換えた。３７℃、５％ＣＯ2で２時間のインキュベーション時間後、さらなる新鮮培地２．５ｍｌを培養物に添加した。
【００９４】
トランスフェクトした細胞をコンフルエントにし、トリプシン処理して、ＦＣＳ／Ｕｌｔｒｏｓｅｒ  Ｇ添加Ｆ１２培地に再懸濁し、２つの６穴プレートに再接種した（１２倍増殖に相当する）。５日及び１０日後、培地を５％ＦＣＳだけを添加したＦ１２に交換した。プレートを、変化した形態（全体的細胞サイズの低下、核のサイズ上昇、位相差顕微鏡下で形質膜の高い可視性）及び高いコンフルエンシーを有する細胞の増殖巣の出現に関してスキャンした。
【００９５】
トランスフェクションの約１４日後、ひとたび細胞増殖巣が直径１−３ｍｍに達すれば、培地を吸引し、培養物をトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄した。トリプシンに浸漬したクローニングディスク（Ｓｉｇｍａ）を、吸引した増殖巣の上に３分間置き、その後５％ＦＣＳを添加したＦ１２培地５００μｌで満たした２４穴プレートの穴に移した。
【００９６】
クローン化して形質転換した細胞をコンフルエントまで増殖させ、トリプシン処理して、５％ＦＣＳを添加したＦ１２培地に再懸濁し、６穴プレートに移した。ひとたび培養が６穴プレートにおいてコンフルエントに達すれば、細胞を連続継代のためにＴ２５フラスコに移した。
【００９７】
規定間隔で冷凍保存するために細胞をトリプシン処理し、５％ＦＣＳを含むＦ１２培地に再懸濁して、１００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、５０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を含むＦ１２培地に約３×１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁して、−７５℃のイソプロパノールベースの冷却装置中のクリオバイアルに入れた。冷却装置は１℃／分の一定冷却速度を保証する。２４時間後、細胞を永久保存のために液体窒素に移した。
【実施例２】
【００９８】
不死化トリ細胞株の改善された作製
ａ）初代細胞の作製
アヒル卵起源の群について、腸炎菌及びネズミチフス菌；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ及びＭ．Ｓｙｎｏｖｉａｅ；白血症、細網内皮症、オウム病、トリインフルエンザ、アヒル肝炎、及びデルジィ病の症例が存在しないことを確認証明した。故意に動物をパルボウイルスに対してワクチン接種せず、パルボウイルスの症例は検出されなかった。起源群の動物は、腸炎菌及びネズミチフス菌；Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｉｃｏｄｉｃａ；メタ肺炎ウイルス性シチメンチョウ鼻気管炎；及びニューカッスル病を引き起こすパラミクソウイルスに対してワクチン接種されていた。
【００９９】
卵を、室温で攪拌せずに平衡させ、２日後、湿ったチェンバー内で３８℃でインキュベートして、交互に＋４５°と−４５°にすることによって頻繁に回転させた。
【０１００】
インキュベーションの１週間又は３週間後、初代細胞の単離のためにアヒル胚を実験に供した。卵をｃＧＭＰユニット（現行適正基準によって概説されているように実施する閉鎖実験室）に移し、外皮を層流フード下に７０％イソプロパノールで拭って滅菌した。その後の全ての工程は、規定溶液及び培地を用いて無菌条件下にＧＭＰユニットにおいて実施した。
【０１０１】
卵を慎重に開き、胚を大きなペトリ皿に移して、断頭によって直ちに屠殺した。以下の器官から試料を採取した：脳、網膜、肝臓、食道、心臓及び胚体外膜。
【０１０２】
加えて、体節からの細胞を８日齢の胚から調製した。
【０１０３】
全ての試料をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水；Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）で洗浄し、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）で１−１０分間処理して、１８Ｇ注射器を繰り返し通過させることにより、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中で粉砕した。均一化した試料を３７℃、５％ＣＯ2で培養した。その翌日、培地を交換することによって接着細胞から細片を除去した。
【０１０４】
ｂ）プラスミドの構築
Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｏｒｆ２２及びＧａｍ１についての発現プラスミドを、ＰＣＲ及びヒト又はマウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ又はｍＰＧＫ）、マウスＣＭＶ（ｍｏＣＭＶ）又はｔｋプロモーターを備えたベクターへの挿入により、それぞれアデノウイルス血清型５又はニワトリ胚致死オーファン（ＣＥＬＯ）野生型ウイルスのゲノムＤＮＡから関連標的領域を抽出することによって構築した（図１）。
【０１０５】
Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂについてのアデノウイルス配列を、ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて野生型ウイルスから増幅した。Ｅ１Ａ領域を増幅するために以下のプライマー：
ＶＳ１８２  ＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＴＧＴＡＧＴＧＴＡＴＴ（配列番号１）
ＶＳ１８３  ＣＡＣＡＣＧＣＡＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴ（配列番号２）
を使用し、Ｅ１Ｂ領域を増幅するために以下のプライマー：
ＶＳ１８４  ＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＧＡＧＴ（配列番号３）
ＶＳ１８５  ＡＣＡＣＡＴＴＴＣＡＧＴＡＣＣＴＣＡ（配列番号４）
を使用した。両方のフラグメントを最初にｐＰＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，ＵＳＡ）にクローニングした。
【０１０６】
Ｅ１Ｂ構築物は、Ｅ１Ｂメッセージからスプライス供与部位を欠く。それ故、ヒト免疫グロブリン重鎖のリーダーイントロンからのプライマーを用いて増幅した合成構築物に置き換えた。鋳型として、マウス−ヒトヘテロハイブリドーマ、ＰＢＧ０４（ＤＭＳＺ  ＡＣＣ２５７７）からのゲノムＤＮＡを使用した。
【０１０７】
増幅のために使用したプライマー：
ＶｉｎｔＳＡ−Ｆ  ＡＡＧＧＴＡＣＣＣＴＣＣＣＴＡＧＴＣＣＣＡＧＴＧＡ（配列番号５）
ＶｉｎｔＳＡ−Ｒ  ＣＡＡＴＧＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧ（配列番号６）
【０１０８】
遺伝子ＧＡＭ−１及びＯＲＦ−２２を、それぞれ、プライマー：
Ｖ２０６  ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＣＴＡ（配列番号１１）及び
Ｖ２０７  ＧＣＣ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＴＧＧ  ＴＴＡ  ＣＡＧ（配列番号１２）、及び
Ｖ２０８  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＡＣＧ（配列番号１３）及び
Ｖ２０９  ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＴＡＴ  ＡＣＡ  Ｇ（配列番号１４）
を使用して野生型ＣＥＬＯから増幅した。
【０１０９】
生じたプラスミドの代表的な例を、プラスミド４９Ｅ（ヒトＰＧＫ及びマウスＣＭＶプロモーターの制御下のアデノウイルス因子；配列番号９）、プラスミド２５Ｆ（マウス及びヒトＰＧＫプロモーターの制御下のＣＥＬＯ因子；配列番号１０）、プラスミド６０Ｅ（ヒトＰＧＫ及びｔｋプロモーターの制御下のアデノウイルス因子；配列番号１８）及びプラスミド３６Ｅ（マウスＰＧＫプロモーターの制御下のＣＥＬＯ因子；配列番号１９）として示す（図１も参照のこと）。
【０１１０】
発現プラスミドの完全性を塩基配列決定によって確認した。これらのプラスミドは、真核細胞において抗生物質（アンピシリンなど）に対する耐性因子を発現する能力を備えていない。
【０１１１】
ｃ）トランスフェクション
初代培養物を、単離後又は単回継代培養後すぐにＥ１又はＯｒｆ２２／Ｇａｍ１についての発現プラスミドでトランスフェクトした。実験に応じて、プラスミドをスーパーコイルとして又はＳｃａ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄｓ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）制限酵素で線状化した後トランスフェクトした。リポソーム（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びデンドリマー（Ｐｏｌｙｆｅｃｔ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）トランスフェクション試薬を比較する初期実験は、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅによる最良の効率を示唆した。以下のようにトランスフェクションを実施した；全ＤＮＡ２μｇをＥＣ緩衝液２００μｌに希釈し、エンハンサー１６μｌと混合した。室温で２−５分間のインキュベーション時間後、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬２０μｌを添加した。室温で５−１０分後、この混合物を培地１ｍｌの下で８ｃｍ2皿の細胞に適用した。２−５時間後、さらなる培地１．５ｍｌを添加した。その翌日、培地を新鮮培地２ｍｌに置き換え、その後週に１回交換した。レポーター遺伝子による平行実験においてトランスフェクションの成功を確認した。
【０１１２】
細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地において連続継代した。
【０１１３】
トランスフェクションの２０日後、一部の培養物の規定亜集団（細胞増殖巣；図２）において形態の変化を認めた；他の培養物では細胞増殖巣は出現しないか又は初代細胞の強固な増殖と競合することができなかった；やはり他の培養物は、トランスフェクション後すぐに大量の細胞死と細胞老化を生じた。
【０１１４】
肝臓、網膜及び胚体外膜由来の細胞に関するプラスミド４９Ｅトランスフェクト培養物からは多数の独立した増殖巣が生じた。継代１０で、例えばプラスミド４９Ｅでトランスフェクトしたアヒル胚体外膜由来の細胞株１２Ａ０７−Ａ１０を単離し、ＤＳＭＺに寄託した。
【０１１５】
網膜及び体節からの細胞に関するプラスミド６０Ｅトランスフェクト培養物からも細胞増殖巣を得た。
【０１１６】
プラスミド４９Ｅでは、ＰＧＫ及びマウスＣＭＶプロモーターがそれぞれＥ１Ａ及びＥ１Ｂの発現を駆動する。プラスミド６０Ｅ（配列番号１８）も完全なＡｄ５−Ｅ１領域をコードするが、防御Ｅ１Ｂ領域の発現はｔｋ、すなわちマウスＣＭＶプロモーターほど強力でない（但し天然Ｅ１Ｂプロモーターよりは強力である）プロモーターによって駆動される。Ｅ１Ｂによって与えられる防御作用と一致して、プラスミド４９Ｅに関する結果と比較したとき、この構築物ではより少ない細胞試料においてはるかに少ない増殖巣を得た。
【０１１７】
ＣＥＬＯプラスミド３６Ｅ（配列番号１９）及び２５Ｆ（配列番号１０）でトランスフェクトした肝臓の培養物においても、初代細胞の外観と形質転換表現型の両方を有する増殖巣の形成を認めた。
【０１１８】
増殖巣を有する培養物を、２−３分間のトリプシン処理及び新鮮培養容器に移すためのＤＭＥＭ：Ｆ１２培地への再懸濁によって拡げた。
【０１１９】
通常の間隔での凍結保存のために、細胞をトリプシンで処理し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に再懸濁して、２００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、５０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に約３×１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁して、１℃／分の速度で−８０℃に冷却した。２４時間後、細胞を永久保存のために液体窒素に移した。
【実施例３】
【０１２０】
安定なトランスフェクションに関する免疫蛍光アッセイ
潜在的不死化細胞の培養物をスライドガラスに接種し、数日間増殖させた後、氷冷メタノールで１０分間固定した。固定細胞を、標準免疫蛍光法に従ってＥ１Ａ及びＥ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質に対する抗体、二次抗体、及び後者に対して特異的な蛍光染料と共にインキュベートした（Ｅ１Ａに対する、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＫ，Ｎｏ．５５４１５５抗体、１：３０希釈；Ｅ１Ｂ５５Ｋに対するＯｎｃｏｇｅｎｅ，ＵＳＡ，Ｎｏ．ＤＰ０８−１００ＵＧ抗体、１：３０希釈；どちらもＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡからの、ビオチンに複合した、それぞれマウス又はラットに対する二次抗体、１：８０希釈；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ，Ｎｏ．０１６−０７０−０８４ストレプトアビジン−テキサスレッド複合体、１：１００希釈で視覚化）。初代細胞は、初期のまだ完全に確立されていない不死化細胞株ではまだ豊富であり、形態によって容易に識別可能であったので、抗体特異性に関する好都合な内部陰性対照を提供した。Ａｄ５  Ｅ１領域を安定に発現する２９３細胞（ヒト胚腎細胞）を陽性対照として使用した。方向付けのために細胞の核を染色するため、１μｇ／ｍｌまでのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール；Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を最終インキュベーション工程に添加した。
【０１２１】
トランスフェクトしたプラスミドによる不死化の成功を確認する、形態の特徴的変化を受けた細胞においてのみＥ１Ａ及び５５Ｋについての強いシグナルを認めた（図３）。さらに、変化した表現型を有する全ての細胞がＥ１陽性であったので、形式的可能性（formal possibility）である自発的形質転換は認めなかった。初代表現型を有するいずれの細胞もＥ１タンパク質を発現しなかった。組込みの過程でプラスミドの線状化がランダムな位置で起こるスーパーコイルのトランスフェクションでは可能であるが、検査した増殖巣のいずれもがＥ１Ｂ発現の不在下ではＥ１Ａ発現を示さず、不死化のために二元経路の破壊が必要条件であることをさらに強調した。
【実施例４】
【０１２２】
内在性及び外来性レトロウイルスに関するアッセイ
初代ニワトリ線維芽細胞においてワクチンを生産するときに遭遇する一般的な問題は、外来性又は内在性レトロウイルスによる汚染である。多種多様なレトロウイルスファミリーはあまりに複雑で、所与の種がレトロウイルスのキャリアであるかどうかを予測することができない。文献からの報告は、それ故、通常はレトロウイルスファミリーの１つのサブセット、例えばＥＡＶ−ＨＰ／ＡＬＶサブグループＪ（Smith,L. M. et al., J. Gen. Virol. 80(pt1) : 261-8 (1999)）に限定され、そこで鳥類種の１つのサブセットだけに限定される。
【０１２３】
レトロウイルスによる汚染の信頼し得る確認は、それ故、これらのウイルス内に存在する共通モチーフに焦点を合わせるべきである。配列多様性は核酸に基づく検出方法を不可能にする。しかし、全てのレトロウイルスに共通するのは逆転写酵素の存在である。プラスミド４９Ｅで不死化したアヒル肝細胞からの増殖巣の上清を、それ故、逆転写酵素に関する定量的プローブベースの産物増強ＰＣＲ（Ｑ−ＰＥＲＴ）によって検定し、内在性レトロウイルス活性又は遊離レトロウイルスによる汚染の両方を検出するために、いくつかの対照、特に陽性対照としてＣＨＯ及び陰性対照として２９３細胞と比較した（以下及び図４参照）。アッセイは文献からの修正法である（Lovatt, A. et al., J. Virol. Methods 82 (2): 185-200 (1999)）。簡単に述べると、ＰＢＳ中２０％スクロースの障壁を通して１０００００×ｇの超遠心分離によって培養上清からレトロウイルスを濃縮し、細胞細片を除去した。ビリオン（存在する場合は）を細胞溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ  ７．８、８０ｍＭ ＫＣＩ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、０．７５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に再懸濁し、基質緩衝液（各々１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；１５μＭ 特異的プライマー［ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＴＴＧ；配列番号１５］；及び試料中にＲＴ活性が存在する場合に逆転写されるモデルＲＮＡ（５μｇ／ｍｌ ブロムモザイクウイルスＲＮＡ［Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ，ＵＳＡ，Ｎｏ．Ｄ１５４１］）を含む０．５ｍｇ／ｍｌの細分化ニシン精子ＤＮＡ［Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ，Ｎｏ．Ｄ１８１１］）と混合した。モデルＲＮＡからのｃＤＮＡをプライマー（ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＣＣＣ  ＧＣＡ  ＴＴ；配列番号１６）及び（ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＴＴＧ；配列番号１７）でのＰＣＲによって増幅し、Ａｂｇｅｎｅ，ＵＫからのＱＰＣＲ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＯＸ  Ｍｉｘ  Ｎｏ．ＡＢ−１１６３を使用して、製造者の指示に従ってＡＢ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍにおいてＳＹＢＲグリーン蛍光によって検出する。
【０１２４】
図４は、文献の報告（例えばAnderson, K. P. et al., Virology 181(1) : 305-311 (1991)）から予想されるようにＣＨＯ細胞における強いＲＴ活性を明らかにする。これらの細胞を陽性対照とし、レトロウイルス活性を持たないヒト２９３細胞を陰性対照として、細胞培養物の上清中の未知のＲＴ活性の解釈を可能にする枠（bracket）が規定される（図４、黒い四角及び黒い三角）。
【０１２５】
本発明者らは、ニワトリ胚線維芽細胞において中等度のＲＴ活性を認めた（図４、黒い菱形記号）。
【０１２６】
アヒル細胞上清中のＲＴ活性のシグナルは２９３細胞におけるＲＴ活性のシグナルと一致し、そしてどちらも、ＲＴと共にインキュベートしなかったモデルＲＮＡから成る本発明者らのアッセイの検出限界である対照と一致する（図４、白及び黒い三角及び灰色の丸による曲線を比較する）。等しいレベルのシグナル強度（デルタＲｎ）は、ＣＨＯ細胞とニワトリ胚線維芽細胞（これらの実験に関しては、ごく弱いＲＴ陽性であることが既知のソースに由来する）からの試料の間は少なくとも２サイクル数によって及びＣＨＯ細胞と２９３陰性対照及びアヒル細胞培養からの試料の間は少なくとも４サイクル数によって分けられた。このように、ニワトリ細胞と異なって、記述したアヒル細胞はＲＴ活性を示さず、それ故医薬用途における適合性のための基本的特性を満たす。
【実施例５】
【０１２７】
改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）
ＭＶＡの増幅のための基質としての増殖巣の適合性を、肝臓、網膜、体節及び胚体外膜系に関して判定した。表１及び図５は、ＣＥＦｐ、初代ニワトリ胚線維芽細胞でのＭＶＡ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−１５０８）の大規模生産から製造した接種材料による細胞株の感染によって得た結果を示す。０．１のＭＯＩ（感染多重度又は宿主細胞当りの感染粒子数）での感染によって得た表１のデータは、網膜及び体節細胞のウイルス生産量がＣＥＦｐ細胞で得られた生産量に比肩し得るか又はそれを超えることを明らかにする。
【０１２８】
【表１】
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２４穴プレートの穴における１−５×１０5細胞の平行感染で得たウイルス力価の比較。注入ウイルスは０．１のＭＯＩに調整した。ＣＥＦｐ、新鮮初代ニワトリ胚線維芽細胞；膜、胚体外膜。
【０１２９】
アヒル細胞でのＭＶＡのプラーク形成単位を以下のように定量した：ＭＶＡウイルスを細胞に感染させた４８時間後の、上清及び反復凍結−解凍によって開いた接着細胞から回収した。ＶＥＲＯ（アフリカミドリザル腎）細胞を９６穴プレートに接種し（２×１０4細胞／穴）、その翌日、ＭＶＡ含有懸濁液の連続１０倍希釈で感染させた。その２日後、培養物をメタノールで固定し、感染細胞をポリクローナルワクシニアウイルス抗体（Ｑｕａｒｔｅｔｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｎｏ．９５０３−２０５７、１％ウシ胎仔血清を含むＰＢＳ中１：１０００希釈）と共に３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐ，ＵＳＡ）を含むＰＢＳで２回の洗浄工程を実施し、ワクシニア特異的抗体に対する二次抗体を、１％ウシ胎仔血清を含むＰＢＳ中１：１０００希釈で添加する。この二次抗体を、ＡＥＣ試薬（３−アミノ−９−エチル−カルバゾール；０．０１５％Ｈ2Ｏ2を含む０．１Ｍ 酢酸緩衝液、ｐＨ５．０中０．３ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートしたとき呈色反応を触媒するペルオキシダーゼ酵素に結合する。感染巣を光学顕微鏡によって特定し、陽性染料反応を生じるＭＶＡ懸濁液の最大希釈からプラーク形成単位を算定する。
【０１３０】
図５は、細胞当りのウイルスの生産量を示す。細胞当りのウイルスの生産量は、特定のウイルスに関する所与の宿主細胞の許容度と相関する。許容度は、生化学的性質、例えば受容体密度又はウイルス構造タンパク質のプロセシングの効率によって影響される。図５は、網膜細胞当り又は体節細胞当りの放出される感染性粒子の数が、ニワトリ胚線維芽細胞当りで得られる感染性粒子と良好に匹敵することを示す。
【０１３１】
「細胞当りのウイルス生産量」を「ＭＯＩ」で割ると、ウイルス注入量対ウイルス生産量の比であるバーストサイズが得られる。バーストサイズはウイルスの増幅に等しく、それ故大規模生産のためのコスト及び必要資源を評価するために重要である。記述した実施例において測定されたバーストサイズは、ＣＥＦｐについては３７４、網膜細胞については５１３、及び体節由来細胞については１１０８である。網膜細胞及び体節細胞は新鮮ニワトリ胚線維芽細胞よりも良好な数値を生じ、それ故ＭＶＡの大規模生産のために優れた基質を提供するはずである。
【０１３２】
肝臓又は胚体外膜由来の細胞に関して得られたＭＶＡ増幅についての不十分な結果を他のウイルスファミリーに拡大適用することはできない；他のウイルス、例えばワクチン関連インフルエンザウイルスの増幅がこれらの細胞に関して極めて好結果であり得ることは当業者には明らかである。
【０１３３】
所与の宿主細胞でのウイルスのその後の継代により、生産力価が低下することが考えられる。そのような事象は、宿主細胞が、感染周期の様々な段階において全部ではないが大部分の工程を支持する場合に起こり得る。この問題を検討するために、プラスミド４９Ｅで形質転換したアヒル網膜細胞でＭＶＡの連続継代を実施した。図６のデータは、ＭＶＡがこれらの細胞での継代によって失われないことを示す：０．３のＭＯＩに調整した同様のレベルの注入ウイルスで（図６中の棒線で示す）、バーストサイズ（黒い四角）は３５から３１５へと９倍に上昇する。バーストサイズの上昇の理由は、継代数が上昇したときの宿主細胞の改善された性質によると考えられる。
【０１３４】
結論として、ｃＧＭＰ条件下でＡｄ５−Ｅ１領域のトランスフェクションによって得られるアヒル網膜及び体節由来細胞は、初代ニワトリ胚線維芽細胞に比肩し得る又はより良好な効率でＭＶＡの増幅を安定に支持する。ＭＶＡの高度に弱毒化された性質の故に、ウイルスの大規模生産のための従来の細胞株は適さない。設計されたアヒル細胞株がＭＶＡの増殖において初代ニワトリ細胞よりも良好に機能し、それ故この重要なワクチン候補物のための新規生産プラットフォームを提供できることは驚くべき所見である。ここで説明した細胞株はｃＧＭＰ条件下で作製されたものであり、それ故医薬適用に適する。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】初代アヒル細胞の不死化促進のために使用する発現プラスミドの概要図（実施例２）。明瞭化のためポリアデニル化シグナルは省いている。左側の英数字は、プラスミドの短い識別名である。ｍＰＧＫ及びｈＰＧＫは、それぞれマウス及びヒトのホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター；ａｄ５は、Ａｄ５のＥ１内在性プロモーター；ｍｏＣＭＶは、マウスＣＭＶ最初期プロモーター；ｔｋは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター；ｏｒｆ２２及びｇａｍ１は、ＣＥＬＯウイルス遺伝子；Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂは、アデノウイルス５型のＥ１領域遺伝子である。
【図２】Ａｄ５−Ｅ１トランスフェクトアヒル胚肝細胞（プラスミド４９Ｅ）における増殖巣形成の例としての位相差顕微鏡写真。Ａ、老化初代細胞に包埋した完全な増殖巣を示すため、初期倍率４×。Ｂ、初期倍率２０×：パネルの右側に見える緻密な単層内に位置する小細胞の大きな丸い増殖巣の周辺、左側に向かって進行した老化状態の初代細胞。
【図３】Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質についての免疫蛍光アッセイ（実施例３）。上の２列は、プラスミド４９Ｅ不死化及び初代アヒル肝細胞の混合物；下の２列は、２９３陽性対照細胞。左の欄、位相差画像；中央の欄、画像に示されているＥ１Ａ又はＥ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質の免疫染色；右の欄、ＤＡＰＩ染色。Ｅ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質は、特徴的に細胞質内に局在し、凝集物に蓄積して不均質な斑点状の分布を生じる。Ｅ１Ａは核タンパク質である。形質転換アヒル細胞においてＤＡＰＩで明るく染まる緻密な核が注目される。
【図４】レトロウイルス活性の検出のための細胞上清に対するＱ−ＰＥＲＴアッセイ（定量的ＰＥＲＴアッセイ）（実施例４）。黒い四角は、ＣＨＯ陽性対照；白い四角は、水陰性対照；黒い菱形は、ニワトリ胚線維芽細胞；黒い三角は、２９３細胞株陰性対照：灰色の丸は、基質だけの陰性対照；白い三角は、プラスミド４９Ｅで不死化したアヒル肝細胞；デルタＲｎは、出発背景蛍光に対するレポーター染料の発光。
【図５】記述したアヒル細胞株の一部及びＣＥＦｐのＭＶＡ増幅（実施例５）。感染は０．１のＭＯＩで実施した。力価測定は、感染の４８時間後にＶＥＲＯ細胞に関して実施した（実施例２）。ＣＥＦｐは、初代ニワトリ胚線維芽細胞。
【図６】プラスミド４９Ｅで不死化したアヒル網膜細胞でのＭＶＡの連続継代（実施例５）。黒い四角は、バーストサイズ；線は、０．１のＭＯＩに調整した注入ウイルス。注入ウイルスは、バーストサイズが細胞数（ＭＯＩによって注入ウイルスを規定する）の実験変動とは無関係であることを明らかにするための標準として示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１３６】
配列番号：  記述−フリーテキスト
１          プライマー  ＶＳ１８２
２          プライマー  ＶＳ１８３
３          プライマー  ＶＳ１８４
４          プライマー  ＶＳ１８５
５          プライマー  ＶｉｎｔＳＡ−Ｆ
６          プライマー  ＶｉｎｔＳＡ−Ｒ
７          プラスミド  ｐＥＦＡｄ５Ｅ１Ａ
８          プラスミド  ｐＥＦＡｄ５Ｅ１ＢＳＡ
９          プラスミド  ４９Ｅ
１０        プラスミド  ２５Ｆ
１１        プライマー  Ｖ２０６
１２        プライマー  Ｖ２０７
１３        プライマー  Ｖ２０８
１４        プライマー  Ｖ２０９
１５        ＲＴ  プライマー
１６        プライマー  ｃＤＮＡ  １
１７        プライマー  ｃＤＮＡ  ２
１８        プラスミド  ６０Ｅ
１９        プラスミド  ３６Ｅ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2007510409.tif 000009
【配列表】
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【国際調査報告】
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