【手続補正書】
【提出日】平成28年6月22日(2016.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質を接触させた細胞及び被検物質を接触させていない細胞の核膜異常状態を評価し、被検物質を接触させた細胞及び被検物質を接触させていない細胞の核膜異常状態の差を指標として、抗老化作用を有する成分を選別することを特徴とする、抗老化作用のある成分のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記細胞が、核膜異常が生じた細胞である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記核膜異常が生じた細胞が、下記（ａ）〜（ｃ）の何れかの細胞である、請求項２に記載のスクリーニング方法。
（ａ）核膜異常が生じている患者から採取した細胞
（ｂ）圧力を加えることによって核膜異常を生じさせた細胞
（ｃ）アンチセンスオリゴを接触させることによって核膜異常を生じさせた細胞
【請求項４】
前記細胞が、ヒト線維芽細胞である、請求項１〜３の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
核膜異常因子の量を測定すること及び／又は核形態を定量することによって細胞の核膜異常状態を評価する、請求項１〜４の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記核膜異常因子が、プロジェリン（Ｐｒｏｇｅｒｉｎ）である、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
プロジェリンタンパクの量を測定することによって核膜異常因子の量を測定する、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
プロジェリンｍＲＮＡの発現量を測定することによって核膜異常因子の量を測定する、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
細胞の核染色像を画像解析することによって核形態を定量する、請求項５〜８の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記核染色像が、ラミンＡタンパクの免疫染色による染色像又はＤＡＰＩによる染色像である、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
被検物質を接触させていない細胞に比べて、被検物質を接触させた細胞の核膜異常が抑制されている場合に、前記被検物質を抗老化作用を有する成分として選別する、請求項１〜１０の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
皮膚の抗老化作用を有する成分を選別するものである、請求項１〜１１の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
シワの予防作用又は改善作用を有する成分を選別するものである、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
［実施例１］
＜試験例１：プロジェリン量の変化を指標とした核膜異常状態評価＞
正常ヒト皮膚線維芽細胞を、２４穴プレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）に７００００
ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになる様に播種し、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（ＦＢＳ：ハナ・ネスコバイオ社製、ＤＭＥＭ：シグマアルドリッチ社製）で２４時間培養した。次いで核膜異常誘導のため、１００ｎＭのラミンＡアンチセンスオリゴ（ＧＴＧＡＣＧＴＧＣＡＣＴＧＡ：シグマジェノシス合成品）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（ライフテクノロジーズ製）を用いてトランスフェクションした。なお、コントロールとしてスクランブルオリゴ（ＴＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＴＣＡ：シグマジェノシス合成品）を同手法にてトランスフェクションした細胞も用意した。その後それぞれの被検物質を所定濃度加え、７日間培養した。
培養後に得られた細胞を、Ｌｙｓｉｓバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０％ ＮＰ−４０、１錠 Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ／５０ｍＬ超純水）にて溶解し、ＤＣプロテインア
ッセイ（バイオラッド製）にてタンパク量を調整後、Ｅ−ＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ製）を用いて電気泳動を行った。泳動により分離されたタンパクを、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（ミリポア製）に電圧をかけることで転写し、４００倍希釈したヤギ抗ＬａｍｉｎＡ／Ｃ抗体（サンタクルズ製）及び内在性コントロールとしてウサギ抗β-アクチン抗体(アブカム製)を反応させた。ＴＢＳバッファー（ミリポア製）にて洗浄後、５０００倍希釈したＨＲ
Ｐ含有抗ヤギＩｇＧ抗体（ＺｙＭａｘ製）及び抗ウサギＩｇＧ抗体（ＺｙＭａｘ製）を反応させ、洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＷｅｓｔＦｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓ
ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモサイエンティフィック製）にてＨＲ
Ｐを発色させた。その後ＣｏｏｌＳａｖｅｒ（ＡＴＴＯ製）にて画像を取得し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ製）にてプロジェリン及びβ-アクチンのバンド強度を計測
した。プロジェリンのバンド強度／β-アクチンのバンド強度を求め、さらにアンチセン
スオリゴをトランスフェクションした核膜異常細胞の値を１とした時の比を算出した。
また、同様に、ラミンＡアンチセンスオリゴもしくはスクランブルオリゴをトランスフェクションして７日間培養した細胞を、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いｍＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ製、配列非公開）を用い、cDNAを合成し、リア
ルタイムＰＣＲ（ライフテクノロジーズ製）にてプロジェリンｍＲＮＡ（プライマー配列
：(1)５’−ＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＧＧＧＧ−３’，(2)５’−ＴＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＧＣ−３’，プローブ配列：５’−ＦＡＭ−ＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＡＡＣＣＴ−ＭＧＢ−３’、ライフテクノロジーズ合成品）の発現量を測定した。
スクランブルオリゴとラミンＡアンチセンスオリゴ導入細胞のプロジェリン量を比較した結果を図１に、プロジェリンｍＲＮＡ発現量を比較した結果を図２に、アンチセンスオリゴ導入細胞に対して被検物質もしくは溶媒対照を添加した際のプロジェリン量を比較した結果を表１に示す。表１の結果より、プロジェリンの産生を抑制する植物抽出物が存在することが判る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
［実施例２］
＜試験例２：核形態の変化を指標とした核膜異常状態評価＞
正常ヒト皮膚線維芽細胞を、２４穴プレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）に７００００
ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになる様に播種し、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（ＦＢＳ：ハナ・ネスコバイオ社製、ＤＭＥＭ：シグマアルドリッチ社製）で２４時間培養した。次いで核膜異常誘導のため、１００ｎＭのラミンＡアンチセンスオリゴ（ＧＴＧＡＣＧＴＧＣＡＣＴＧＡ：シグマジェノシス合成品）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（ライフテクノロジーズ製）を用いてトランスフェクションした。なお、コントロールとしてスクランブルオリゴ（ＴＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＴＣＡ：シグマジェノシス合成品）を同手法にてトランスフェクションした細胞も用意した。その後それぞれの被検物質を所定濃度加え、７日間培養した。培養後に得られた細胞を、アセトン（和光純薬製）にて固定し、１５０倍希釈したマウス抗ＬａｍｉｎＡ／Ｃ抗体（Ａｂｃａｍ製）を４℃で一昼夜反応させた。続いてＰＢＳ（−）（和光純薬製）にて洗浄後、２００倍希釈した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｌｅｘａ４８８）（ライフテクノロジーズ製）を３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳ（−）で洗浄後、１００００倍希釈したＤＡＰＩ（シグマアルドリッチ製）を室温で５分反応させた。ＰＢＳ（−）で洗浄後、フルオロマウントＧ（コスモバイオ製）にて封入し、共焦点顕微鏡ＬＭＳ５１０（カールツァイス製）にて画像を取得した。得られた画像から、画像解析ソフトＩＰ−Ｌａｂ（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ製）を用いて１細胞核あたりの周辺長及び面積を計測し、式（４π×面積／周辺長2）にてコンター比を算出した。スクラン
ブルオリゴとラミンＡアンチセンスオリゴ導入細胞のコンター比を比較した結果を図３に、アンチセンスオリゴ導入細胞に対して被検物質もしくは溶媒対照を添加した際のコンター比を比較した結果を表２に示す。表２の結果より、核膜異常を抑制する植物抽出物が存在することが判る。