(57)【要約】Ｎｒｆ２タンパク質の核移行、および細胞傷害性代謝産物を解毒および除去する遺伝子産物の引き続く増加を刺激する薬剤が、糖尿病性網膜症、または加齢性黄斑変性における結晶腔形成を処置する方法において提供される。Ｎｒｆ２／ＡＲＥ経路に作用する、構造的に多様な薬剤は、化学的に多様な細胞保護特性を有する酵素およびタンパク質の発現を誘導し、そして毒性代謝産物および生体異物に対する防御となる。薬剤としては、特定の求電子物質および抗酸化剤（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ付加アクセプター、ジフェノール、チオカルバメート、キノン、１，２−ジチオール−３−チオン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ゲニステイン以外のフラボノイド、イソチオシアネート、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン、エトキシキン、クマリン）、これらの組み合わせ、またはこれらの薬理学的に活性な誘導体もしくはアナログが挙げられる。
2007515422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において、糖尿病性網膜症を処置するための方法であって、該方法は、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤、および受容可能なキャリアを含有する組成物の有効量を、該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該薬剤が、マイケル付加アクセプター、ジフェノール、チオカルバメート、キノン、１，２−ジチオール−３−チオン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ゲニステイン以外のフラボノイド、イソチオシアネート、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン、エトキシキン、クマリン、これらの組み合わせ、またはこれらの薬理学的に活性な誘導体もしくはアナログを含む、方法。
【請求項２】
前記被験体が、糖尿病性網膜症を発症する危険がある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体が、糖尿病性網膜症の症状を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤が、イソチオシアネートまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記イソチオシアネートが、スルホラファンまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤が、１，２−ジチオール−３−チオンまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１，２−ジチオール−３−チオンが、オルチプラッツまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記投与が、眼内注射、遅延放出送達デバイスの移植、または局所投与、経口投与、もしくは鼻腔内投与によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記投与が、眼内投与によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
被験体において、糖尿病性網膜症を処置するための方法であって、該方法は、糖尿病性網膜症を患う被験体を診断する工程、ならびに、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤、および受容可能なキャリアを含有する組成物の有効量を、該被験体に投与する工程を包含し、
ここで、該薬剤が、マイケル付加アクセプター、ジフェノール、チオカルバメート、キノン、１，２−ジチオール−３−チオン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ゲニステイン以外のフラボノイド、イソチオシアネート、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン、エトキシキン、クマリン、これらの組み合わせ、またはこれらの薬理学的に活性な誘導体もしくはアナログを含む、方法。
【請求項１１】
被験体の網膜下の結晶腔形成を阻害する方法であって、該方法は、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤、および受容可能なキャリアを含有する組成物の有効量を、該被験体に投与する工程を包含し、
ここで、該薬剤が、マイケル付加アクセプター、ジフェノール、チオカルバメート、キノン、１，２−ジチオール−３−チオン、ブチル化ヒドロキシアニソール、フラボノイド、イソチオシアネート、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン、エトキシキン、クマリン、これらの組み合わせ、またはこれらの薬理学的に活性な誘導体もしくはアナログを含む、方法。
【請求項１２】
前記被験体が、網膜下の結晶腔形成を発達させる危険にある、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験体が、網膜下の結晶腔形成を発達させる症状を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が、イソチオシアネートまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記イソチオシアネートが、スルホラファンまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤が、１，２−ジチオール−３−チオンまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記１，２−ジチオール−３−チオンが、オルチプラッツまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与する工程が、眼内注射、遅延放出送達デバイスの移植、または局所投与、経口投与、もしくは鼻腔内投与によるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与する工程が、眼内投与によるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
被験体の、網膜下の結晶腔形成のための処置方法であって、該方法は、網膜下の結晶腔形成を患う被験体を診断する工程、ならびに、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤、および受容可能なキャリアを含有する組成物の有効量を、該被験体に投与する工程を包含し、
ここで、該薬剤が、マイケル付加アクセプター、ジフェノール、チオカルバメート、キノン、１，２−ジチオール−３−チオン、ブチル化ヒドロキシアニソール、フラボノイド、イソチオシアネート、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン、エトキシキン、クマリン、これらの組み合わせ、またはこれらの薬理学的に活性な誘導体もしくはアナログを含む、方法。
【請求項２１】
前記薬剤が、ゲニステイン以外のフラボノイドを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤がケルセチンを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が、ゲニステイン以外のフラボノイドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬剤がケルセチンを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
被験体において、糖尿病性網膜症に対する試験薬剤の治療的応答を予測する方法であって、ここで該試験薬剤はＮｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有し、該方法は、以下：
網膜細胞の第一のサンプルを酸化ストレスに曝露する工程；
網膜細胞の第二のサンプルを、該試験薬剤と組み合わせて、該酸化ストレスに曝露する工程；および
該曝露された第一のサンプルに由来する生細胞数を、該曝露された第二のサンプルに由来する生細胞数と比較する工程；
を包含し、ここで、該第二のサンプルに由来する生細胞数が、該第一のサンプルに由来する生細胞数よりも多い場合、該試験薬剤は、該被験体において糖尿病性網膜症に対する治療的応答を提供すると予測される、方法。
【請求項２６】
前記網膜細胞が、内皮細胞、ニューロン、グリア、または周皮細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記網膜細胞が内皮細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記酸化ストレスが、酸化剤の存在に起因する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記酸化ストレスが、酸化剤除去のインヒビターの存在に起因する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
被験体における、糖尿病性網膜症の処置のための医薬の調製における有効量の組成物の使用であって、該有効量の組成物は、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤、および受容可能なキャリアを含有し、
ここで該薬剤が、マイケル付加アクセプター、ジフェノール、チオカルバメート、キノン、１，２−ジチオール−３−チオン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ゲニステイン以外のフラボノイド、イソチオシアネート、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン、エトキシキン、クマリン、これらの組み合わせ、またはこれらの薬理学的に活性な誘導体もしくはアナログを含む、使用。
【請求項３１】
前記被験体が、糖尿病性網膜症を発症する危険がある、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記被験体が、糖尿病性網膜症の症状を有する、請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
前記薬剤が、イソチオシアネートまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項３０に記載の使用。
【請求項３４】
前記イソチオシアネートが、スルホラファンまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記薬剤が、１，２−ジチオール−３−チオンまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項３０に記載の使用。
【請求項３６】
前記１，２−ジチオール−３−チオンが、オルチプラッツまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記薬剤が、眼内注射、遅延放出送達デバイスの移植、または、局所投与、経口投与、もしくは鼻腔内投与のために調製される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３８】
前記薬剤が、眼内注射のために調製される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３９】
被験体における、網膜下の結晶腔形成の阻害のための医薬の調製における有効量の組成物の使用であって、該有効量の組成物は、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤、および受容可能なキャリアを含有し、
ここで該薬剤が、マイケル付加アクセプター、ジフェノール、チオカルバメート、キノン、１，２−ジチオール−３−チオン、ブチル化ヒドロキシアニソール、フラボノイド、イソチオシアネート、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン、エトキシキン、クマリン、これらの組み合わせ、またはこれらの薬理学的に活性な誘導体もしくはアナログを含む、使用。
【請求項４０】
前記被験体が、網膜下の結晶腔形成を発達させる危険にある、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記被験体が、網膜下の結晶腔形成を発達させる症状を有する、請求項３９に記載の使用。
【請求項４２】
前記薬剤が、イソチオシアネートまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項３９に記載の使用。
【請求項４３】
前記イソチオシアネートが、スルホラファンまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求４２に記載の使用。
【請求項４４】
前記薬剤が、１，２−ジチオール−３−チオンまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項３９に記載の使用。
【請求項４５】
前記１，２−ジチオール−３−チオンが、オルチプラッツまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記医薬が、眼内注射、遅延放出送達デバイスの移植、または、局所投与、経口投与、もしくは鼻腔内投与のために調製される、請求項３９に記載の使用。
【請求項４７】
前記医薬が、眼内投与のために調製される、請求項３９に記載の使用。
【請求項４８】
前記薬剤が、ゲニステイン以外のフラボノイドを含む、請求項３１に記載の使用。
【請求項４９】
前記薬剤がケルセチンを含む、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記薬剤が、ゲニステイン以外のフラボノイドを含む、請求項３２に記載の使用。
【請求項５１】
前記薬剤がケルセチンを含む、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
被験体における、糖尿病性網膜症の処置のための組成物であって、該組成物は、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤、および受容可能なキャリアを含有し、
ここで該薬剤が、マイケル付加アクセプター、ジフェノール、チオカルバメート、キノン、１，２−ジチオール−３−チオン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ゲニステイン以外のフラボノイド、イソチオシアネート、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン、エトキシキン、クマリン、これらの組み合わせ、またはこれらの薬理学的に活性な誘導体もしくはアナログを含む、組成物。
【請求項５３】
前記被験体が、糖尿病性網膜症を発症する危険にある、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記被験体が、糖尿病性網膜症の症状を有する、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５５】
前記薬剤が、イソチオシアネートまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５６】
前記イソチオシアネートが、スルホラファンまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記薬剤が、１，２−ジチオール−３−チオンまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５８】
前記１，２−ジチオール−３−チオンが、オルチプラッツまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記組成物が、眼内注射、遅延放出送達デバイスの移植、または、局所投与、経口投与、もしくは鼻腔内投与のために調製される、請求項５２に記載の組成物。
【請求項６０】
前記組成物が、眼内投与のために調製される、請求項５２に記載の組成物。
【請求項６１】
被験体の、網膜下の結晶腔形成を阻害するための組成物であって、該組成物は、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤の有効量、および受容可能なキャリアを含有し、
ここで該薬剤が、マイケル付加アクセプター、ジフェノール、チオカルバメート、キノン、１，２−ジチオール−３−チオン、ブチル化ヒドロキシアニソール、フラボノイド、イソチオシアネート、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン、エトキシキン、クマリン、これらの組み合わせ、またはこれらの薬理学的に活性な誘導体もしくはアナログを含む、組成物。
【請求項６２】
前記被験体が、網膜下の結晶腔形成を発達させる危険にある、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記被験体が、網膜下の結晶腔形成を発達させる症状を有する、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６４】
前記薬剤が、イソチオシアネートまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６５】
前記イソチオシアネートが、スルホラファンまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記薬剤が、１，２−ジチオール−３−チオンまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６７】
前記１，２−ジチオール−３−チオンが、オルチプラッツまたはその薬理学的に活性な誘導体を含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記組成物が、眼内注射、遅延放出送達デバイスの移植、または、局所投与、経口投与、もしくは鼻腔内投与のために調製される、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６９】
前記組成物が、眼内注射のために調製される、請求項６１に記載の組成物。
【請求項７０】
前記薬剤が、ゲニステイン以外のフラボノイドを含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項７１】
前記薬剤がケルセチンを含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記薬剤が、ゲニステイン以外のフラボノイドを含む、請求項６３に記載の組成物。
【請求項７３】
前記薬剤がケルセチンを含む、請求項７２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性における結晶腔の形成のための予防薬剤および治療剤
の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
糖尿病性網膜症は、血管を裏打ちする細胞における変化に起因して、糖尿病に発達する眼の疾患である。糖尿病におけるように、グルコースのレベルが高い場合、グルコースは多数の方法で損傷の原因となり得る。例えば、グルコース、またはグルコース代謝物は、タンパク質のアミノ酸基に結合して、組織の損傷につながる。さらに、過剰なグルコースがポリオール経路に入り、結果としてソルビトールの蓄積を引き起こす。網膜の細胞はソルビトールを代謝し得ず、そしてソルビトールは、高い細胞内浸透圧、細胞内水腫、障害性拡散、組織の低酸素症、毛細血管細胞損傷、および毛細血管の弱体化の一助となり得る。糖尿病性網膜症は、毛細血管基底膜の肥厚に関与し、そして周皮細胞が毛細血管の内皮細胞へ接触するのを防ぐ。周皮細胞の減少は、毛細血管の漏れを増加させ、そして血液網膜関門の崩壊につながる。弱体化された毛細血管は、動脈瘤の形成およびさらなる漏れにつながる。高血糖のこれらの効果はまた、網膜における神経機能を害し得る。これが、非増殖性糖尿病性網膜症と呼ばれる糖尿病性網膜症の初期ステージである。
【０００３】
網膜毛細血管は、糖尿病において閉塞され得、網膜中の虚血の領域の原因となる。灌流されない組織は、現存する血管からの新たな血管の増殖誘発（新脈管形成）によって応答する。新たな血管は脆弱であり、そして眼に血液を漏出しがちであるので、これらの新たな血管はまた、失明（増殖性糖尿病性網膜症と呼ばれる状態）の原因となり得る。
【０００４】
報告によれば、ゲニステイン（ダイズに見られるイソフラボノイド）の経口投与は、実験的に誘導された糖尿病のラットにおいて網膜血管の漏れを減少させる（非特許文献１）。報告によれば、特許文献１として公開された、Ｇａｏ，Ｘ．らに対するＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／４０４５７号、ヒト網膜色素上皮細胞において、スルホラファン（ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ）によるフェーズＩＩ解毒酵素の誘導を提供する。しかし、上皮細胞は血管内皮細胞とは異なり、そして内皮細胞による特定の治療剤への生物学的応答は、上皮細胞の生物学的応答から予測され得ない。
【０００５】
ヒト糖尿病における良好な糖血症制御を維持することの難しさを考えると、網膜毛細血管細胞および網膜神経の損傷を阻害するか、または遅延する薬剤の開発は、糖尿病性網膜症において生じる初期の細胞性損傷を減少させる手段を提供する。
【０００６】
黄斑変性は、高い明瞭度の視力を担う中央網膜の部分（網膜黄斑と呼ばれる）における、光受容体の減少である。加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、「乾燥した」または「湿った」のいずれかとして記載される。湿った、滲出性の、新生血管の形態のＡＭＤは、ＡＭＤを有する人の約１０％に発症し、そして、網膜色素上皮（ＲＰＥ）を通って増殖する異常な血管によって特徴付けられ、結果として、出血、滲出、瘢痕、または漿液性網膜剥離を引き起こす。ＡＭＤ患者の９０％は乾燥した形態を有し、これは網膜色素上皮の萎縮、および黄斑光受容体の減少により特徴付けられる。現在、ＡＭＤのいずれの形態に対しても治療法は無いが、減衰についてのいくらかの成功が、光ダイナミック療法で得られている。
【０００７】
結晶腔（ドルーセン）は、ＲＰＥの下に、加齢とともに蓄積する残骸様物質である。結晶腔は、眼底検査を用いて観察される。正常な眼は結晶腔を有さない黄斑を有し得るが、しかし結晶腔は網膜末梢に豊富であり得る。黄斑における軟らかい結晶腔の存在は、黄斑の視力のいかなる減少も無く、ＡＭＤの初期ステージと考えられる。結晶腔は、様々な脂質、多糖類、およびグリコサミノグリカンを、いくつかのタンパク質、改変されたタンパク質、またはタンパク質付加物とともに含む。
【０００８】
報告によれば、Ｃｒａｂｂ，Ｊ．Ｗ．ら（非特許文献２）は、正常ドナーの眼およびＡＭＤドナーの眼から単離された結晶腔のプロテオーム解析を提供する。報告によれば、培養されたヒトＲＰＥ細胞の化学的酸化剤からの保護は、オルチプラッツ（ｏｌｔｉｐｒａｚ）、ジチオールエチオン（ｄｉｔｈｉｏｌｅｔｈｉｏｎｅ）（非特許文献３）、スルホラファン、イソチオシアネート（非特許文献４）、およびジメチルフマレート（非特許文献５）によって提供される。しかし、これらの参考文献からは、このような処置によって結晶腔形成が影響されることのいかなる示唆も提供されない。
【特許文献１】国際公開第０３／０５１３１３号パンフレット
【非特許文献１】Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、２００１、４２、２１１０−２１１４
【非特許文献２】Ｃｒａｂｂ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９９：２３、１４６８２−１４６８７
【非特許文献３】Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、２００２、４３、３５５０−３５５４
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、２００１、９８、１５２２１−１５２２６
【非特許文献５】Ｐｒｏｇ  Ｒｅｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ、２０００、１９、２０５−２２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
結晶腔形成を扱い、それによってＡＭＤの進行性質を管理する、一般的に受け入れられている治療的方法は存在しない。健康および福祉におけるＡＭＤの影響、および先行する処置の方法の不備を鑑みて、初期ステージのＡＭＤ、特に結晶腔沈着の形成を扱う、改善された処置の方法を有することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明によれば、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤、ならびに細胞傷害性代謝産物を解毒および排除する、遺伝子産物のその後の増加は、糖尿病性網膜症に起因する網膜血管損傷および神経損傷の遅延または防止に、保護効果または治療効果を提供する。このような薬剤はまた、黄斑変性に付随する結晶腔沈着の形成に阻害的効果を提供する。本明細書中で使用される場合、「Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性」とは、Ｎｒｆ２の利用可能性または核への輸送を増強する薬剤を意味する。Ｎｒｆ２タンパク質の核への移行は、細胞傷害性代謝産物を解毒および排除する遺伝子産物の発現のその後の増加を可能にする。
【００１１】
本発明の方法は、被験体において、糖尿病性網膜症を処置する方法を提供し、この方法は、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤、および受容可能なキャリアを含有する組成物の有効量を、被験体に投与する工程を包含する。被験体は、糖尿病性網膜症もしくは結晶腔形成を発症する危険があり得るか、または、糖尿病性網膜症もしくは結晶腔形成の症状を有し得る。Ｎｒｆ２タンパク質の核移行、ならびに細胞傷害性代謝産物を解毒および排除する遺伝子産物のその後の増加を刺激する本発明の薬剤は、マイケル付加アクセプター、ジフェノール、チオカルバメート、キノン、１，２−ジチオール−３−チオン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ゲニステイン以外のフラボノイド、イソチオシアネート、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン、エトキシキン（ｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎ）、クマリン、これらの組み合わせ、またはこれらの薬理学的に活性な誘導体もしくはアナログを含み得る。１つの実施形態において、この薬剤は、イソチオシアネート（例えば、スルホラファン）またはその薬理学的に活性な誘導体もしくはアナログを含む。別の実施形態において、この薬剤は、１，２−ジチオール−３−チオン（例えば、オルチプラッツ）またはその薬理学的に活性な誘導体もしくはアナログを含む。
【００１２】
本発明の方法はさらに、被験体の網膜下結晶腔形成を阻害する方法を提供し、この方法は、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤、および受容可能なキャリアを含む、有効量の組成物を被験体に投与する工程を包含する。この薬剤は、マイケル付加アクセプター、ジフェノール、チオカルバメート、キノン、１，２−ジチオール−３−チオン、ブチル化ヒドロキシアニソール、フラボノイド、イソチオシアネート、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン、エトキシキン、クマリン、これらの組み合わせ、またはこれらの薬理学的に活性な誘導体もしくはアナログを含む。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態は、被験体における糖尿病性網膜症に対する、試験薬剤の治療応答を予測する方法であり、ここでこの試験薬剤はＮｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する。この方法は、網膜細胞の第一のサンプルを酸化ストレスに曝露する工程、網膜細胞の第二のサンプルを、試験薬剤と併せて酸化ストレスに曝露する工程；そして、曝露された第一のサンプルに由来する生細胞数を、曝露された第二のサンプルに由来する生細胞数と比較する工程を包含する。第二サンプルに由来する生細胞数が、第一のサンプルに由来する生細胞数より多い場合、この試験薬剤は、被験体における糖尿病性網膜症に治療反応を提供することが予測される。
【００１４】
Ｎｒｆ２タンパク質の核移行、および細胞傷害性代謝産物を解毒および排除する遺伝子産物の発現のその後の増加を刺激する薬剤の投与は、眼内注射、徐放性送達デバイスの移植、または局所投与、経口投与、鼻腔内投与、全身性注射、あるいは他の全身性投与によってであり得る。
【００１５】
本発明の方法のさらなる実施形態において、糖尿病性網膜症または結晶腔形成を患う被験体が診断され、そして本発明の別の実施形態において、被験体は糖尿病性網膜症または結晶腔形成の症状を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行、ならびに細胞傷害性代謝産物を解毒および排除する遺伝子産物のその後の増加を刺激する薬剤の、糖尿病性網膜症、および加齢性黄斑変性における結晶腔の形成を処置する方法としての使用に関する。
【００１７】
用語「糖尿病性網膜症を処置する」とは、本明細書中で使用される場合、糖尿病性網膜症またはその症状の発症を遅延もしくは予防するか、その進行を抑制するか、または、その効果を軽減することを意味する。Ｎｒｆ２タンパク質の核移行、ならびに細胞傷害性代謝産物を解毒および排除する遺伝子産物のその後の増加を刺激することは、糖尿病状態における網膜毛細血管および網膜のニューロンの保護のために提供される。
【００１８】
用語「結晶腔形成を処置する」とは、本明細書中で使用される場合、網膜下領域に存在する結晶腔の発症を遅延もしくは予防するか、その進行を抑制するか、または、その効果を軽減することを意味する。Ｎｒｆ２タンパク質の核移行、ならびに細胞障害性代謝産物を解毒および排除する遺伝子産物のその後の増加を刺激することは、結晶腔形成を処置することによる黄斑の保護のために提供される。
【００１９】
Ｎｒｆ２の核移行は、特定の求電子物質および酸化物質に曝露された細胞において誘導される。Ｎｒｆ２の核移行により誘導された遺伝子は、求電子物質に対する保護を増強し、そして損傷を受けたタンパク質の修復または分解を促進する、解毒酵素を生じる。これらの酵素の誘導は、転写レベルで調節され、この酵素をコードする遺伝子のプロモーターに見られる、特定のエンハンサー（抗酸化物質応答エレメント（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）すなわちＡＲＥ）により媒介される。ＡＲＥの配列の前後関係、化学誘発物質の性質、および細胞型は、特定の遺伝子におけるエンハンサーの活性に影響を与える。
【００２０】
転写因子であるＮｒｆ２は、ＮＦ−Ｅ２転写因子ファミリーのメンバーであり、抗酸化物質応答エレメント（ＡＲＥ）媒介性の遺伝子発現をアップレギュレートすることを担っている。Ｎｒｆ２は、プロモーターのＡＲＥ（抗酸化物質応答エレメント）領域に結合することによって遺伝子発現を誘導し、恒常的に、または、酸化ストレスシグナルに応答して、遺伝子の転写を活性化する。通常の条件下では、Ｎｒｆ２は、リプレッサータンパク質Ｋｅａｐ１（アクチン細胞骨格に係留された細胞質タンパク質）により結合されて、細胞質中に存在すると考えられる。理論に束縛されることは望まないが、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤は、Ｎｒｆ２との相互作用のために、細胞質ゾル因子Ｋｅａｐ１のシステインリッチな介在領域と競合し得ると考えられる（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ，Ａ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ，９９：１１９０８−１１９１３（２００２））。特定の化合物（例えば、スルホラファン）によるＮｒｆ２−Ｋｅａｐ１複合体の分裂は、Ｎｒｆ２を遊離して、核へと移行させ得、核において、Ｎｒｆ２は、遺伝子のＡＲＥ領域において他の転写因子（すなわち、Ｍａｆ、ｃ−Ｊｕｎなど）とヘテロ二量体化して、ＡＲＥが調節する遺伝子発現の誘導をもたらし得る。
【００２１】
このＮｒｆ２／ＡＲＥ経路により発現される酵素およびタンパク質は、化学的に可変性の細胞保護的な特性を有し、そして、これらは、毒性の代謝産物および生体異物に対する防御となる。Ｎｒｆ２／ＡＲＥ経路を通って発現されることが知られている酵素およびタンパク質としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ、ＮＡＤＰ（Ｈ）キノンオキシドレダクターゼ、γ−グルタミルシステインシンテターゼ、シャペロン／ストレス応答タンパク質、およびユビキチン／プロテアソームタンパク質が挙げられる。
【００２２】
Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤としては、例えば、以下が挙げられる：
マイケル付加アクセプター（例えば、α，β−不飽和カルボニル化合物）（例えば、マレイン酸ジエチルまたはフマル酸ジメチル）；
ジフェノール（例えば、レスベラトール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ））、
ブチル化ヒドロキシアニソール（例えば、２（３）−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール）、
チオカルバメート（例えば、ピロリジンジチオカルバメート）、
キノン（例えば、ｔｅｒｔ−ブチル−ヒドロキノン）、
イソチオシアネート（例えば、スルホラファン、その前駆体であるグルコシノレート、グルコラファニン、またはフェネチルイソチオシアネート（ＰＥＩＴＣ））、
１，２−ジチオール−３−チオン（例えば、オルチプラッツ）、
３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン、
エトキシキン、
クマリン（例えば、３−ヒドロキシクマリン）、
フラボノイド（例えば、結晶腔形成の処置のために、ケルセチンまたはクルクミン、糖尿病性網膜症の処置のために、ゲニステイン以外のフラボノイド（例えばケルセチンまたはクルクミン））、
硫化ジアリル、
インドール−３−カルビノール、
没食子酸エピガロ−３−カテキン、
エラグ酸、
これらの組み合わせ、または、これらの薬理学的に活性な誘導体もしくはアナログ。
【００２３】
マイケル（Ｍｉｃｈａｅｌ）アクセプターは、電子吸引基に隣接するアルケンを有する分子である。電子吸引基は、通常、カルボニルであるが、ニトリル基またはニトロ基でもあり得る。化学的な多様性により、これらの化合物は、求電子物質であり、そして、求核性のスルフヒドリル基と反応する能力を有する。「その薬理学的に活性な誘導体」とは、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する上記の化合物のいずれかに構造的に関連し、そこから誘導可能な薬剤であり、そして、例えば、そのエステル、アミドもしくは塩であり得る。「その薬理学的に活性ナアナログ」とは、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する上記化合物のいずれかに構造的に類似するが、例えば、異なる元素の１原子での１原子の置き換え、または、特定の官能基の存在のような、組成においてわずかに異なる薬剤である。１つの実施形態において、本発明は、糖尿病性網膜症または加齢性黄斑変性に関連する結晶腔形成の処置方法において、スルホラファン、オルチプラッツ、その薬理学的に活性なアナログ、またはその薬学的に受容可能な塩を提供する。
【００２４】
スルホラファン（製品番号Ｓ６３１７，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、例えば、キノンレダクターゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびグルタチオンレダクターゼを誘導することが知られている。酵素の誘導は、ヒト成人の網膜色素上皮細胞（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８９：２３９９−２４０３（１９９２））を含む、種々の細胞株において観察されている。スルホラファンアナログとしては、例えば、６−（イソチオシアナト−２−ヘキサノン）、エキソ−２−アセチル−６−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−（イソチオシアナト−６−メチルスルホニルノルボルナン）、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノール、１−（イソチオシアナト−４−ジメチルホスホニルブタン、エキソ−２−（１−ヒドロキシエチル）−５−）イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−アセチル−５−イソチオシアナトノルボルナン、１−（イソチオシアナト−５−メチルスルホニルペンタン）、シス−３−（メチルスルホニル）（シクロヘキシルメチルイソチオシアネート）およびトランス−３−（メチルスルホニル）（シクロヘキシルメチルイソチオシアネート）が挙げられる。
【００２５】
用語「酸化ストレス」とは、本明細書中で使用される場合、反応性活性酸素種（ＲＯＳ）（例えば、スーパーオキシドラジカル、水酸化イオンラジカル、過酸化水素、一重項酸素、または脂質過酸化物）のレベルの上昇をもたらす試薬に対する曝露を意味する。酸化ストレスは、ＲＯＳの産生を促進する生理学的条件を誘導することによって、および細胞性抗酸化系の損傷によって達成され、これは、実験的な糖尿病のラットにおいて、実験的なガラクトース血症のラットにおいて、Ｎｒｆ２欠失マウスにおいて、および一連の加齢プロセスとして示された。
【００２６】
細胞培養系において、酸化ストレスはまた、ＲＯＳの産生または添加によって、あるいは抗酸化系の阻害によっても誘導される。例えば、過酸化水素およびｔ−ブチルヒドロペルオキシドが培養培地に添加され得る。メナジオンが添加されて、スーパーオキシドの供給源を提供し得る。４−ヒドロキシノネナルは脂質過酸化の最終産物であり、培地中に含まれ得て、そして、スーパーオキシドの存在下において一酸化窒素ドナーから過酸化亜硝酸が産生され得る。ブチオニン−（Ｓ，Ｒ）−スルホキシイミンは、重要な細胞性抗酸化剤であるグルタチオンの生合成を阻害する。さらに、高グルコース下または高度なグリコシル化最終産物の存在下にて維持された細胞は、内因性ＲＯＳの生成を増加させる。
【００２７】
さらに、虚血性低酸素症および再灌流が、動物モデル、ならびに細胞培養系および器官培養系の双方において用いられて、例えば生物学的系への酸化ストレスを負わせ得る。
【００２８】
用語「網膜細胞」とは、本明細書中で使用される場合、例えば、上皮細胞、ニューロン、グリア、または周皮細胞を含み得る。
【００２９】
（投与様式）
本発明の薬剤は、当業者に周知の技術を用いて、眼に直接（例えば：局所用の眼ドロップまたは眼軟膏；盲嚢内の、または強膜の近くもしくは眼内に移植された、遅延放出デバイス；眼周囲注射、結膜注射、テノン嚢下注射、前房腔内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ）注射、硝子体内注射、または小管内注射）、または、全身性（例えば：経口、静脈内注射、皮下注射または筋肉内注射；非経口送達、経皮送達または鼻腔内送達）に送達され得る。本発明の薬剤は、眼内挿入物または眼内移植デバイス内に処方され得ることがさらに企図される。
【００３０】
（被験体）
本明細書中で記載される、糖尿病性網膜症または結晶腔形成について処置される被験体は、糖尿病性網膜症、または加齢性黄斑変性につながる結晶腔形成を発症する危険のあるヒトまたは別の動物であっても、糖尿病性網膜症、または加齢性黄斑変性に関連する結晶腔形成の症状を有するヒトまたは別の動物であってもよい。
【００３１】
（処方および投薬量）
本発明の薬剤は、適切な眼科用キャリア中の、溶液、懸濁液またはエマルジョン（分散剤）として投与され得る。以下は、本発明により実施される可能な処方の例である。
【００３２】
【表１】
2007515422.tif 000003
【００３３】
【表２】
2007515422.tif 000004
【００３４】
【表３】
2007515422.tif 000005
【００３５】
【表４】
2007515422.tif 000006
さらなる実施形態において、眼科用組成物は、約０．１〜１００ナノモル濃度（ｎＭ）の眼内濃度であるか、または、さらなる実施形態においては、１〜１０ｎＭの眼内濃度で提供されるように処方される。２０μＭまでのピーク血漿濃度が、全身投与について達成され得る。局所用組成物は、当業者の慣用的な指示に従って、１日１〜４回、眼の表面に送達される。処方物のｐＨは、４〜９、または４．５〜７．４であるべきである。全身用処方物は、例えば、約１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜５００ｍｇ、約１０ｍｇ〜１００ｍｇ、または１２５ｍｇまでの、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行、ならびに細胞傷害性代謝産物を解毒および排除する遺伝子産物のその後の増加を刺激する薬剤を含み得る。
【００３６】
「有効量」とは、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行、ならびに細胞傷害性代謝産物を解毒および排除する遺伝子産物のその後の増加を刺激し得る薬剤の量をいう。このような遺伝子発現の誘導は、反応性の求電子物質の毒性および他の毒性代謝産物に対する防御を提供する。従って、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行、ならびに細胞傷害性代謝産物を解毒および排除する遺伝子産物のその後の増加を刺激する薬剤は、細胞傷害性に対する防御のために提供される。このような保護は、糖尿病性網膜症、または加齢性黄斑変性における結晶腔形成を発症する危険のある被験体における、症状の発症を遅延または防止する。処方物の有効量は、例えば、被験体の年齢、種族および性別、あるいは網膜症の重篤度、または結晶腔形成の度合いのような要因に依存し得る。１つの実施形態において、薬剤は、眼に局所的に送達され、治療用量で網膜または結晶腔に達し、それにより、糖尿病性網膜症または結晶腔形成のプロセスを寛解させる。
【００３７】
正確なレジメンは、臨床医の裁量に委ねられるが、得られる溶液は、好ましくは、１日に１〜４回、各眼に各溶液を１滴入れることによるか、または臨床医により指示されるように投与される。
【００３８】
（受容可能なキャリア）
眼科的に受容可能なキャリアは、眼への刺激がせいぜいほとんど〜全く生じず、必要な場合、適切な保存を提供し、そして、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行、ならびに細胞傷害性代謝産物を解毒および排除する遺伝子産物のその後の増加を刺激する、本発明の１種以上薬剤を、均質な投薬形態で送達するキャリアである。眼科用の送達について、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行、ならびに細胞傷害性代謝産物を解毒および排除する遺伝子産物のその後の増加を刺激する薬剤は、眼科的に受容可能な保存料、共溶媒、界面活性剤、増粘剤（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、浸透増強剤（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、緩衝液、塩化ナトリウム、または水と組み合わせて、水性の滅菌眼科用懸濁液、溶液、または粘性もしくは半粘性のゲル、または、他の型の固形もしくは半固形の組成物（例えば、軟膏）を形成し得る。眼科用の溶液処方物は、生理学的に受容可能な等張水溶性緩衝液中にこの薬剤を溶解することによって調製され得る。さらに、眼科用溶液は、薬剤の溶解を補助するために、眼科的に受容可能な界面活性剤を含み得る。粘性成形化合物（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど）が、化合物の保持を改善するために、本発明の組成物に添加され得る。
【００３９】
滅菌眼科用軟膏処方物を調製するために、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行、ならびに細胞傷害性代謝産物を解毒および排除する遺伝子産物のその後の増加を刺激する薬剤は、適切なビヒクル（例えば、鉱油、液体ラノリン、または白色ワセリン）中で、保存剤と組み合わされる。滅菌眼科用ゲル処方物は、他の眼科用処方物についての当該分野で公知の方法に従って、例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ）などの組み合わせから調製した親水性基材中にこの薬剤を懸濁することによって調製され得る。例えば、ＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）は、眼内注射のために使用され得る。本発明の薬剤が、眼にあまり浸透しない場合には、本発明の他の組成物は、浸透増強物質（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））を含有し得る。
【実施例】
【００４０】
（実施例１  Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤）
脈管内皮細胞（例えば、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ，ＶＥＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ，ＮＹ）を使用して、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行のための刺激活性を有する薬剤を決定する。例えば、コンフルエントな単層のウシ大動脈内皮細胞を、１％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中で２４時間まで候補薬剤に曝露する。Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｂ．Ｊ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｍ，３０７：９７３−９７９（２００３））に記載されるように、細胞の溶解物、細胞質抽出物および核抽出物を調製し、イムノブロッティングを行い、定量する。次いで、薬剤なしの対照細胞と比較して、核の分画において検出されるＮｒｆ２の量を増加する薬剤を、実施例２に示すような高血糖模倣内皮細胞において、活性を試験する。
【００４１】
（実施例２  高血糖を模倣する細胞の保護）
高血糖を模倣する条件下で培養したウシ網膜内皮細胞（ＢＲＥＣ）を、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行を刺激する活性を有する薬剤と合わせ、次いでこの曝露した細胞を、例えば以下に記載するように、脂質過酸化物の形成の程度を測定することで、または細胞間細胞接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の発現レベルを測定することでか、高血糖の効果の保護について試験する。薬剤を含まないコントロールの培養物と比較して、試験培養物において、脂質過酸化物の程度がより低いこと、またはＩＣＡＭ−１の発現レベルがより低いことは、その薬剤が高血糖の効果からの保護を提供することを示す。
【００４２】
（脂質過酸化物の形成についてのアッセイ）
単離したウシ網膜微小血管内皮細胞（ＢＲＭＥＣ、ＶＥＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ、ＮＹ）を、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行を刺激する活性を有する薬剤で処理、または前処理する。この薬剤は必要に応じて除く。処理した細胞を、その薬剤への曝露に先立って、その間に、またはその後のいずれかに、培養物中において２５ｍＭのＤ−グルコースに、１０日間まで曝露する。細胞中での脂質過酸化物の形成を、市販されるキット（Ｌｉｐｉｄ  Ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  カタログ番号７０５００２、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて測定し、そして正常な（５ｍＭ）Ｄ−グルコースに曝露した細胞において観察される脂質過酸化物の形成と比較する。この薬剤に曝露しない細胞と比較して、この薬剤に曝露した細胞における脂質過酸化物の形成の度合いがより少ないことは、この薬剤が高血糖の効果からの保護を提供し、そしてこの薬剤が糖尿病性網膜症の処置に有用であることを示す。
【００４３】
（乳酸脱水素酵素活性を用いた、酸化剤に対する保護のアッセイ）
単離したＢＲＥＣを、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行を刺激する活性を有する薬剤で処理、または前処理する。この処理した細胞を、酸化剤のストレス（例えば、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（０．５ｍＭ以下）またはメナジオン（０．２５ｍＭ以下））に、例えば２４時間まで曝露する。細胞生存性を、この薬剤に曝露していない細胞と比較して、この薬剤に曝露した培養物中の、細胞溶解によって培養培地中に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性、および／または生存細胞に残存するＬＤＨ活性を測定することで、決定する。この薬剤に曝露していないコントロールの培養物と比較して、培地中へのＬＤＨの放出量がより低いことは、細胞の生存、この薬剤が酸化剤の効果からの保護を提供すること、およびこの薬剤が糖尿病性網膜症の処置に有用であることを示す。
【００４４】
（ＩＣＡＭ−１レベルのアッセイ）
単離したＢＲＥＣを、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行を刺激する活性を有する薬剤で処理、または前処理する。高血糖のインビトロモデルとして、この処理した細胞を、メチルグリオキサル（ＭＧ）および／またはＭＧ−改変したＢＳＡに曝露し、ここで、この高血糖モデルにおいて、高血糖の結果として、細胞間細胞接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の発現の増加が起きる。増加したＩＣＡＭ−１レベルは、白血球の脈間内皮への接着（白血球停滞）を促進し、そして毛細血管の不灌流（ｎｏｎｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）につながる。ＢｉｏＶｅｎｄｏｒから市販される抗ＩＣＡＭ−１抗体（Ｂｒｎｏ、Ｃｚｅｃｈ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ；Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号ＲＥ  １１２２８Ｃ１００、クローンＭＥＭ−１１１由来の抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体）、またはＺｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販される抗ＩＣＡＭ−１抗体（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；ＭＹ−１３モノクローナル抗ＩＣＡＭ−１、Ｂｕｒａｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓ  ２７８：Ｃ２９２−Ｃ３０２（２０００））を用いた、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、ＩＣＡＭ−１のレベルを測定する。薬剤に曝露されないコントロールの培養物と比較して、ＩＣＡＭ−１のレベルがより低いことは、この薬剤が高血糖の効果からの保護を提供し、そしてこの薬剤が糖尿病性網膜症の処置に有用であることを示す。
【００４５】
上記のアッセイにおいて、Ｎｒｆ２タンパク質の核移行を刺激する活性を有する薬剤（例えば、スルフォラファン、オルチプラッツ、または他のＮｒｆ２経路誘導物質）は、高血糖状態または酸化ストレスに対する処置または前処置として、提供され得る。
【００４６】
（実施例３  Ｎｒｆ２タンパク質の核移行を刺激する活性を有する薬剤の、インビボの保護効果）
Ｎｒｆ２タンパク質の核移行を刺激する活性を有する薬剤を受ける、ストレプトゾトシンで誘導された糖尿病のラットにいて、網膜血管の透過性を試験し、そして、この薬剤を受けないそのラットにおける網膜血管の透過性と比較する。この方法は、Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍら（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｉｃｉｅｎｃｅ  ４２：９、２００１年８月、２１１０〜２１１４頁）から改変する。手短に言うと、非糖尿病性コントロール群のラット、糖尿病性コントロール群のラット、およびＮｒｆ２タンパク質の核移行を刺激する活性を有する薬剤を受ける、糖尿病性群のラットを、灌流後の細胞外空間におけるアルブミンを見ることで、網膜血管の透過性について分析する。糖尿病を、ストレプトゾトシンの注射によって誘導する。網膜血管の透過性を、血管外に遊出したアルブミンのウェスタンブロット分析を用いて測定する。網膜ホスホチロシンのレベル、および核内増殖抗原（ＰＣＮＡ）もまた、ウェスタンブロット分析によって評価され得る。糖尿病性コントロール群のラットと比較して、この薬剤で処理した糖尿病性群のラットにおいて、透過性のレベルがより低いこと、すなわち細胞外に遊出したアルブミンがより少ないことは、この薬剤が高血糖の効果からの保護を提供し、そしてこの薬剤が糖尿病性網膜症の処置に有用であることを示す。
【００４７】
（実施例４  Ｎｒｆ２タンパク質の核移行を刺激する活性を有する薬剤による、結晶腔形成の阻害）
ＡＲＰＥ−１９細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５０２）に由来する、培養されたヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を、Ｎｒｆ２の核移行を刺激する薬剤で処理する。この薬剤による処理は、酸化ストレス状態へのＲＰＥ細胞の曝露に先行し得るか、または同時に行い得る。この酸化ストレスを、インキュベート培地中で、７日間まで、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）、メナジオン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、またはＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン（ＳＮＡＰ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、あるいはこれらの薬剤の組み合わせの包含によって産生する。培養培地へのブチオニンスルホキシイミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の包含による、グルタチオン生合成における律速酵素（γ−グルタミルシステイン合成酵素）の阻害を、単独で、または他の上記の薬剤との組み合わせで用いる。処理の過程の間に、定量的イムノアッセイを行って、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、４−ヒドロキシノネナル（ＨＮＥ）、ニトロチロシン、および、糖化最終産物（ＡＧＥ）のＲＰＥ細胞性タンパク質への改変の形成をモニターする。これらのアッセイは、抗ＭＤＡ抗血清、および抗ＨＮＥ抗血清（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）、抗ＡＧＥ抗体（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）、および抗ニトロチロシン抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）を用いる。この薬剤に曝露しない細胞と比較して、この薬剤に曝露した細胞における、１つ以上のタンパク質改変のレベルの減少は、抗酸化酵素および抗酸化タンパク質、ならびにフェーズＩＩの解毒酵素をコードする遺伝子の発現の増加に起因する、タンパク質改変の形成阻害、または結晶腔に見られる付加生成物の形成阻害を示す。
【００４８】
（実施例５  インビトロの酸化ストレスのアッセイ；ケルセチン前処理の保護効果）
本実施例は、培養された網膜内皮細胞を酸化ストレスに曝露し、ケルセチンによる前処理の保護効果を評価する研究を提供する。さらに、本実施例は、非増殖性糖尿病性網膜症における治療効果について、化合物をスクリーニングするアッセイ系を提供する。
【００４９】
ウシ網膜内皮細胞（ＢＲＥＣ）（ＶＥＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ、ＮＹ）を、ＭＣＤＢ−１３１完全培地（ＶＥＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ、ＮＹ）中において、５％ＣＯ２内で、３７℃において、フィブロネクチン（５０ｍｇ／ｍｌ）でコートしたプラスチック製の器物上で培養した。無血清培地（ＳＦＭ）条件のために、５ｍｌ／５００ｍｌでの１００×抗生物質／抗真菌剤、１０ｍＭのＬ−グルタミン、および０．１％のＢＳＡ（全て、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから入手）を補った、ＭＣＤＢ−１３１を用いた。
【００５０】
１０，０００細胞／ウェルでＢＲＥＣを播種し、そして完全培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））中で、０．２ｍｌ／ウェルにて、３日間、接着させ、そして培養した。次の２４時間を、この完全培地を、２５μＭのケルセチン、１００μＭのＤＬ−ブチオニン−（Ｓ，Ｒ）−スルホキシイミン（ＢＳＯ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、および０．１％のＤＭＳＯを同時に加えたＳＦＭで置換した。翌日、全ての培地を、０〜５００μＭのｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を含むＳＦＭ（０．１ｍｌ／ウェル）で置換した。５％のＣＯ２内で、３７℃での４時間のインキュベート後、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  非放射性細胞増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手した、２０部分のＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩）および１部分のＰＭＳ（フェナジンメトスルフェート（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ））の混合物を２０μｌ添加することで、アッセイを開始した。このプレートを３時間恒温器に戻し、次いで、ブランクの平均の減算から得た正味の４９０ｎｍにおける吸収を記録して、そして生存細胞のレベルの測定として用いた。
【００５１】
１条件あたり６ウェルを用い、このアッセイを３回行った。吸収値を、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドを含まないコントロールのウェルが１００％に等しいように規格化し、そして３回のアッセイからのデータをプールした。全体的な統計的差異を、処理群の間に見出した（図を参照のこと；分散分析、Ｐ＜０．０５）。図のデータに示すように、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドへの曝露は、結果として、全ての濃度において細胞生存性の有意な減少を引き起こした。さらに、ケルセチン単独による前処理から、各々のｔ−ブチルヒドロペルオキシド濃度についてのコントロール群における生細胞数と比較して、より高い生細胞数を得た。ＢＳＯ単独による前処理は、細胞生存性への効果を全く有さなかったが、しかし全てのｔ−ブチルヒドロペルオキシド濃度の毒性を、有意に亢進した。ケルセチンおよびＢＳＯの組み合わせの前処理は結果として、１００μＭのｔ−ブチルヒドロペルオキシド曝露群は除いて、ケルセチン単独による前処理で見られたものと同じ細胞生存性を得た。この群においては、組み合わせの前処理は、細胞生存性を部分的にしか、回復しなかった。
【００５２】
本研究において、ＢＳＯ前処理は、引き続くｔ−ブチルヒドロペルオキシドへの曝露の毒性を亢進した。ｔ−ブチルヒドロペルオキシドはグルタチオンペルオキシダーゼによって大きく除かれるので、そしてＢＳＯは、グルタチオン生合成における律速酵素であるγ−グルタミルシステイン合成酵素を阻害するので、この結果は予測されたものである。ケルセチンは、γ−グルタミルシステイン合成酵素の触媒作用サブユニットのプロモーターをトランス活性化することで、グルタチオンのレベルを増加させることが報告されている（Ｍｙｈｒｓｔａｄら、２００２、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３２：３８６−３９３）。ケルセチンおよびＢＳＯの組み合わせた前処理による、ＢＳＯの毒性亢進の減少は、Ｎｒｆ２／ＡＲＥ経路を解した酵素の発現を通してケルセチンが抗酸化剤効果を有する機構と一致する。
【００５３】
本明細書中に列挙される参考文献は、これらが、本明細書中に示されるものに対して例示的な手順または他の詳細な補足を提供する程度まで、具体的に参考として援用される。
【００５４】
当業者は、本開示を踏まえ、本明細書中に開示される実施形態の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることを理解する。本明細書中に開示される実施形態のすべては、本開示を踏まえて、過度の実験をすることなしに作製かつ実行され得る。本発明の全内容は、本開示およびその等価な実施形態に示される。本明細書は、本発明が権利を与えられる保護の全範囲を不当に狭くするものとして解釈されるべきでない。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、そして、特に示されない限り、用語「ａ」および「ａｎ」は、「１つ」、「少なくとも１つ」、または「１つ以上」を意味するものと理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図は、酸化ストレスであるｔ−ブチルヒドロペルオキシドに曝露した網膜内皮細胞における、ケルセチンの細胞保護効果を示す。記号は以下の通りである：
【数１】
2007515422.tif 000007
【図１】
2007515422.tif 000008
【国際調査報告】
2007515422.tif 000009
2007515422.tif 000010
2007515422.tif 000011
2007515422.tif 000012
2007515422.tif 000013