(57)【要約】本発明は、癌細胞を処置する方法を提供し、その方法は、治療上有効量の細胞毒素に結合体化された非特異的抗体を、その処置を必要とする患者に投与する工程を包含する。ここで癌細胞は、非特異的抗体が結合する抗原を発現しない。１つの実施形態では、その非特異的抗体は抗ＣＤ３３抗体（例えばｈｐ６７．６）、抗ＣＤ２２抗体（例えばｇ５／４４）または抗ＣＤ２０抗体（例えばリツキシマブ）である。別の実施形態では、その非特異的抗体は、ヒト抗原に結合しない。処置される癌細胞は、例えば胃癌、結腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、扁平上皮癌、または前立腺癌あり得る。１つの実施形態では、細胞毒素はカリケアマイシンである。このカリケアマイシンは、４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）または（３−アセチルフェニル）酢酸（ＡｃＰＡｃ）リンカーを使用して非特異的抗体に結合体化させられ得る。
2007529535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞を処置するための方法であって、該方法は、細胞毒素に結合体化された治療上有効量の非特異的抗体を、該癌細胞の処置を必要とする患者に投与する工程を包含し、ここで該癌細胞は、非特異的抗体が結合する抗原を発現しない、方法。
【請求項２】
前記非特異的抗体が抗ＣＤ３３抗体であり、そして前記癌細胞がＣＤ３３を発現しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非特異的抗体がｈｐ６７．６である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記非特異的抗体が抗ＣＤ２２抗体であり、そして前記癌細胞がＣＤ２２を発現しない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記非特異的抗体がｇ５／４４である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非特異的抗体が抗ＣＤ２０抗体であり、そして前記癌細胞がＣＤ２０を発現しない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記非特異的抗体がリツキシマブである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記非特異的抗体がヒト抗原に結合しない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記癌細胞が胃癌細胞、結腸癌細胞、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞、乳癌細胞、扁平上皮癌細胞、または前立腺癌細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞毒素がカリケアマイシンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）リンカーまたは（３−アセチルフェニル）酢酸（ＡｃＰＡｃ）リンカーを用いて、カリケアマイシンが前記非特異的抗体に結合体化されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞毒素に結合体化された前記非特異的抗原に対する抗体が、生物活性因子と組み合わせて投与される、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物活性因子が抗癌剤である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非特異的抗体に結合体化された細胞毒性因子の受動的ターゲティングに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
細胞毒性化学療法の使用は、種々の型の癌を患う患者の生存を改善している。例えば若年の急性リンパ球性白血病およびホジキンリンパ腫のような特定の腫瘍性疾患に対して使用する場合、細胞毒性薬のカクテルが完全な治癒を誘起し得る。不幸にも化学療法は、現在適用されるように、大部分の癌において完全な寛解には至らない。多くの理由によりこの相対的な有効性の欠如を説明することができる。とりわけ、たいていの化学療法剤の治療指数の低さが薬学的改善の標的になり得る。治療指数の低さは薬物の有効用量と毒性用量の間の範囲の狭さを反映し、これは腫瘍を壊滅させ、そして治療効果を得るのに必要な十分な高用量の投与を妨げ得る。
【０００３】
この問題を回避するための１つの戦略は、いわゆる特効薬の使用である。特効薬は、抗体に化学的に連結された細胞毒性化合物から成る。細胞毒性抗癌剤の、腫瘍関連抗原を認識する抗体への結合は、薬物の治療指数を改善することができる。この抗体は理想的には腫瘍細胞の表面で独占的に発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識するべきである。この戦略により、正常組織の曝露を最小限にしながら細胞毒性因子の腫瘍部位への投与が可能になる。抗体は、細胞毒性因子を特異的に腫瘍に送達し、そしてそれにより全身的な毒性を低減させることができる。
【０００４】
全身的な薬物療法のために開発された薬物結合体は標的特異的細胞毒性因子である。その概念は、既定の標的細胞集団に関して特異性を有するキャリア分子に治療薬を結合させることを含む。抗原に関して高い親和性を有する抗体は、ターゲティング部分としての当然の選択である。高親和性モノクローナル抗体を利用できることにより、抗体ターゲティング治療は前途有望になっている。モノクローナル抗体に結合体化されている毒性物質としては、毒素、低分子量細胞毒性薬物、生物学的反応調節物質、および放射性核種が挙げられる。抗体−毒素結合体はしばしば免疫毒素と称されるが、抗体および低分子量薬物（例えば、メトトレキサートおよびアドリアマイシン）から成る免疫結合体は化学免疫結合体と称される。免疫調節物質はリンホカイン、成長因子および補体活性化コブラ毒因子（ＣＦＶ）のような調節機能を有することが知られている生物学的反応調節物質を含有する。放射免疫結合体は放射活性同位体から成り、これを治療薬として用いてその放射性により細胞を死滅させるか、または撮像に用いることができる。抗体媒介による細胞毒性薬物の腫瘍細胞への特異的投与は、その抗腫瘍効果を増大させるのみならず、正常組織による標的とされていない取り込みを妨げることが予測され、したがってその治療指数が上昇する。
【０００５】
総称してカリケアマイシンまたはＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の抗菌および抗腫瘍因子の強力なファミリーのメンバーを用いる免疫結合体が、癌の処置に使用するために開発された。最も強力なカリケアマイシンはγ１Ｉと称され、これは本明細書で単にγ（ガンマ）と称する。これらの化合物は、適切なチオールと反応してジスルフィドを形成することができ、同時にヒドラジドような官能基、またはカリケアマイシン誘導体をキャリアに付着させるのに有用な他の官能基を導入するメチルトリスルフィドを含有する。カリケアマイシンは二重鎖ＤＮＡの切断を引き起こす−Ｓ−Ｓ−結合の還元により活性化されるエンジイン弾頭を含有する。
【０００６】
ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）はまたＣＭＡ−６７６またはＣＭＡとも称され、この原理に従って作用する唯一の市販により入手可能な薬物である。ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン）は、現在高齢の患者における急性骨髄性白血病の治療用に承認されている。薬物は、酸加水分解性リンカーによりカリケアマイシンに結合している、ＣＤ３３に対する抗体から成る。半合成Ｎ−アセチルγカリケアマイシンのジスルフィドアナログが、結合体化に使用された（特許文献１および特許文献２、これらはその全体を参考として本明細書中に援用する）。この分子（Ｎ−アセチルγカリケアマイシンジメチルヒドラジド）を、本明細書中で以後省略してＣＭとする。
【０００７】
広範な種類の癌のための治療の開発における標的細胞毒素の使用は、特異的ターゲティング因子（キャリア）の利用性および、キャリアに結合体化されるカリケアマイシン誘導体の量（すなわち薬物負荷）が増加した場合にタンパク質凝集の形成に至る結合体化方法の双方により限定されている。例えば、カリケアマイシンは治療指数の低い強力な化学療法剤であるが、臨床でそれを使用するために腫瘍細胞をターゲティングすることが必要とされる。このターゲティング戦略が腫瘍細胞による特異的抗原発現に依存することにより（能動的ターゲティング）、その適用範囲が狭められる。結果的に、抗体に結合体化される細胞毒素、例えばカリケアマイシンを投与するための新規かつ改善された方法を考案する必要がある。
【特許文献１】米国特許第５，６０６，０４０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７７０，７１０号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、癌細胞を処置する方法を提供し、この方法は、治療上有効量の、細胞毒素に結合体化された非特異的抗体を、癌細胞の処置を必要とする患者に投与する工程を包含する。ここで癌細胞は、非特異的抗体が結合する抗原を発現しない。１つの実施形態では、非特異的抗体は抗ＣＤ３３抗体（例えばｈｐ６７．６）であり、そして癌細胞はＣＤ３３を発現せず、抗ＣＤ２２抗体（例えばｇ５／４４）であり、そして癌細胞はＣＤ２２を発現せず、抗ＣＤ２０抗体（例えばリツキシマブ）であり、癌細胞はＣＤ２０を発現しない。別の実施形態では、非特異的抗体はヒト抗原に結合しない。処置される癌細胞は、例えば胃癌、結腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、扁平上皮癌、または前立腺癌でよい。
【０００９】
本方法の１つの実施形態では細胞毒素はカリケアマイシンである。４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）または（３−アセチルフェニル）酢酸（ＡｃＰＡｃ）リンカーを用いてカリケアマイシンを非特異的抗体に結合体化させることができる。
【００１０】
別の実施形態では、細胞毒素に結合体化された非特異的抗原に対する抗体を生物活性薬剤、例えば抗癌剤と組み合わせて投与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本出願は種々のヒト腫瘍において腫瘍退縮を引き起こす細胞毒素−抗体結合体の能力に関する。これらの腫瘍は抗体により認識される検出可能な量の抗原を表示しなかった。したがって、この処置は受動的ターゲティングと称される。受動的ターゲティングでは、非特異的抗体および細胞毒素の結合体は検出可能な量のターゲティング抗原の非存在下でヒト腫瘍に蓄積する。したがって、例えば抗体または免疫グロブリンキャリアによるカリケアマイシンの受動的ターゲティングは治療上有効量のカリケアマイシンを安全に投与するための有力な戦略である。
【００１２】
受動的ターゲティング戦略は、透過性の増大および浸透維持能力効果（ＥＰＲ）に基づき得る。任意の特定の作用方法に限定することを意図するものではないが、この効果により、不十分なリンパ排液と相まったその血管の有窓内皮の漏れのために、腫瘍における粒子または水溶性高分子の蓄積が可能になり得る。
【００１３】
カリケアマイシン結合体の受動的ターゲティングにより、種々のヒト腫瘍における治療上の利点が生じる。ＩｇＧ分子の分子特性および酸不安定性リンカーの使用は、受動的ターゲティングによる効果を可能にするのに重要であり得る。腫瘍が腫瘍関連抗原を発現しない場合、またはこれらの抗原の腫瘍外発現が能動的にターゲティングされたカリケアマイシン結合体の使用を妨げる場合、受動的ターゲティングのために設計されたカリケアマイシン結合体が標的化送達において臨床的に価値があることが判明し得る。
【００１４】
本発明における使用に適当な治療剤は、チューブリン重合を阻害または崩壊させる細胞毒性因子、ＤＮＡに結合し、崩壊させるアルキル化剤、ならびにタンパク質キナーゼ、酵素およびサイクリンのようなタンパク質合成または必須細胞タンパク質を阻害する薬剤である。そのような細胞毒性因子の例としては、チオテパ、タキサン、ビンクリスチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、タモキシフェン、イダルビシン、ドラスタチン／アウリスタチン、ヘミアステリン、エスペラマイシンおよびメイタンシノイドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
好ましい細胞毒性薬物はカリケアマイシンであり、これはメチルトリスルフィド抗腫瘍性抗生物質の例である。上記で議論ように、カリケアマイシンとは、米国特許第４，９７０，１９８号（米国特許第５，１０８，９１２号もまた参照、いずれもその全体を参考として本明細書中に援用する）に記載されるような抗菌および抗腫瘍剤のファミリーをいう。本方法の１つの好ましい実施形態では、カリケアマイシンは、カリケアマイシンのＮ−アシル誘導体またはカリケアマイシンのジスルフィドアナログである。これらの化合物のジヒドロ誘導体は米国特許第５，０３７，６５１号に記載されており、そしてＮ−アシル化誘導体は米国特許第５，０７９，２３３号に記載されている（いずれもその全体を参考として本明細書中に援用する）。関連化合物（これらもまた、本発明に有用である）としては、米国特許第４，６７５，１８７号、同第４，５３９，２０３号、同第４，５５４，１６２号、および同第４，８３７，２０６号（全てその全体を参考として本明細書中に援用する）に記載されるエスペラマイシンが挙げられる。これらの化合物の全てが、適切なチオールと反応してジスルフィドを形成し、同時にヒドラジドまたは類似の求核試薬のような官能基を導入することができるメチルトリスルフィドを含有する。本発明に有用な２つの化合物は米国特許第５，０５３，３９４号に開示されており、そして米国特許第５，８７７，２９６号の表１に示される、γジメチルヒドラジドおよびＮ−アセチルγジメチルヒドラジドである。上記の特許の引用文献の全ての情報は、参考として本明細書中に援用される。
【００１６】
好ましくは、本発明の局面では、カリケアマイシンはＮ−アセチルγカリケアマイシンジメチルヒドラジド（Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨ）である。Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨは、現在使用されている大部分の細胞毒性化学療法剤よりも少なくとも１０倍〜１００倍強力である。その高い効力により、Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨは抗体標的治療の理想的な候補になっており、それにより正常な器官および組織への非特異的曝露は低減されながら抗腫瘍活性が最大化される。
【００１７】
したがって、１つの実施形態では本発明の結合体は式：
Ｐｒ（−Ｘ−Ｗ）ｍ
を有し、ここで、
Ｐｒは抗体であり；
Ｘはその抗体と反応できる任意の反応基の生成物を含むリンカーであり；
Ｗはカリケアマイシンファミリー由来の細胞毒性薬物であり；
ｍはカリケアマイシンが結合体の３重量％〜９重量％を構成するような精製された結合体化生成物に関する平均負荷であり；そして
（−Ｘ−Ｗ）ｍは細胞毒性薬物誘導体である。
【００１８】
好ましくは、Ｘは式：
（ＣＯ−ＡｌＫ１−Ｓｐ１−Ａｒ−Ｓｐ２−Ａｌｋ２−Ｃ（Ｚ１）＝Ｑ−Ｓｐ）
を有し、ここで、
Ａｌｋ１およびＡｌｋ２は、独立して、結合であるかまたは分岐もしく非分岐（Ｃ１−Ｃ１０）アルキレン鎖であり；
Ｓｐ１は、結合、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＲ−、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２）２Ｎ−または−Ｘ−Ａｒ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚであり、ここでＸ、ＹおよびＺは独立して、結合、−ＮＲ−、−Ｓ−または−Ｏ−であり、ただしｎ＝０である場合には、ＹおよびＺの少なくとも１つは結合でなければならず、そしてＡｒは必要に応じて（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲの１、２または３個の基で置換されていてよい１，２−，１，３−，または１，４−フェニレンであり、ただしＡｌｋ１が結合である場合には、Ｓｐ１は結合であり；
ｎは０から５の整数であり；
Ｒは、必要に応じて、−ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、（Ｃ１−Ｃ３）ジアルキルアミノまたは（Ｃ１−Ｃ３）トリアルキルアンモニウム−Ａ−（ここでＡ−は塩を完成する薬学的に受容可能な陰イオンである）の１または２個の基により置換された分岐または非分岐（Ｃ１−Ｃ５）鎖であり；
Ａｒは、必要に応じて（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲの１、２または３個の基で置換された１，２−フェニレン，１，３−フェニレン，または１，４−フェニレンであり、ここでｎおよびＲは上記で定義したとおりであるか、または１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデンもしくは２，７−ナフチリデンまたは
【００１９】
【化１】
2007529535.tif 000003
であり、各ナフチリデンまたはフェノチアジンは、必要に応じて（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲの１、２、３または４個の基で置換されており、ここでｎおよびＲは上記で定義したとおりであり、ただしＡｒがフェノチアジンである場合には、Ｓｐ１は窒素にのみ結合する結合であり；
Ｓｐ２は結合、−Ｓ−または−Ｏ−であり、ただしＡｌｋ２が結合である場合には、Ｓｐ２は結合であり；
Ｚ１はＨ、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、または必要に応じて（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ、−ＯＮＨＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲの１、２または３個の基で置換されたフェニルであり、ここでｎおよびＲは上記で定義したとおりであり；
Ｓｐは直鎖もしくは分岐鎖の２価もしくは３価（Ｃ１−Ｃ１８）ラジカル、２価もしくは３価アリールもしくはヘテロアリールラジカル、２価もしくは３価（Ｃ３−Ｃ１８）シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルラジカル、２価もしくは３価アリール−もしくはヘテロアリール−アリール（Ｃ１−Ｃ１８）ラジカル、２価もしくは３価シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキル−アリール（Ｃ１−Ｃ１８）ラジカルまたは２価もしくは３価（Ｃ２−Ｃ１８）不飽和アルキルラジカルであり、ここでヘテロアリールは好ましくはフリル、チエニル、Ｎ−メチルピロリル、ピリジニル、Ｎ−メチルイミダゾリル、オキサゾリル、ピリミジニル、キノリル、イソキノリル、Ｎ−メチルカルバゾイル、アミノクマリニル、またはフェナジニルであり、そしてＳｐが３価ラジカルである場合、Ｓｐはさらに低級（Ｃ１−Ｃ５）ジアルキルアミノ、低級（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、ヒドロキシまたは低級（Ｃ１−Ｃ５）アルキルチオ基で置換され得；そして
Ｑは、＝ＮＨＮＣＯ−、＝ＮＨＮＣＳ−、＝ＮＨＮＣＯＮＨ−、＝ＮＨＮＣＳＮＨ−、または＝ＮＨＯ−である。
【００２０】
好ましくは、Ａｌｋ１は分岐または非分岐（Ｃ１−Ｃ１０）アルキレン鎖であり；Ｓｐは結合、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、または−ＮＲ−であり、ここでＲは上記で定義したとおりであり、ただしＡｌｋ１が結合である場合には、Ｓｐ１は結合であり；
Ａｒは、必要に応じて（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ、もしくは−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲの１、２もしくは３個の基で置換された１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、もしくは１，４−フェニレンであり、ここでｎおよびＲは上記で定義したとおりであるか、またはＡｒは各々必要に応じて（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ、もしくは−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲの１、２、３もしくは４個の基で置換されていてよい１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデンもしくは２，７−ナフチリデンである。
【００２１】
Ｚ１は（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、または必要に応じて（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ、もしくは−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲの１、２もしくは３個の基で置換されたフェニルである。
【００２２】
Ａｌｋ２およびＳｐ２は一緒に結合である。
【００２３】
ＳｐおよびＱはすぐ上で定義したとおりである。
【００２４】
１つの実施形態では、本発明の結合体は、抗体と反応する任意の反応基を含むリンカーで誘導体化された細胞毒性薬物カリケアマイシンを利用する。この結合体は、タンパク質様キャリアターゲティング剤として用いられて、細胞毒性薬物誘導体−抗体結合体を形成する。米国特許第５，７７３，００１号；第５，７３９，１１６号および第５，８７７，２９６号（その全体が本明細書中に援用される）は、カリケアマイシンから調製される求核誘導体（特にヒドラジドおよび関連する求核試薬）と共に用いることができるリンカーを開示している。これらのリンカーは、薬物とリンカーとの間で形成される連結が加水分解性である場合により良好な活性が得られる場合に特に有用である。これらのリンカーは２個の官能基を含有する。一方の基は、代表的には、キャリアと反応するのに利用されるカルボン酸である。適切に活性化された場合、酸官能基は、例えば抗体またはその他のタンパク質様キャリアのリジンの側鎖のアミンのような、キャリアの遊離アミン基とアミド連結を形成することができる。他方の官能基は、一般的に、カルボニル基（すなわち、アルデヒドまたはケトン）であり、これは適切に修飾された治療薬と反応する。カルボニル基は薬物のヒドラジド基と反応してヒドラゾン結合を形成することができる。この結合は加水分解性であり（特に、そのリンカーは酸不安定性である）、標的細胞に結合した後、結合体からの治療薬の放出を可能にする。好ましくは、加水分解性のリンカーは、４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）または（３−アセチルフェニル）酢酸（ＡｃＰＡｃ）である。
【００２５】
免疫グロブリンのキャリア機能は別として、酸不安定性リンカーの使用は、カリケアマイシン結合体の有効性に関係する。任意の特定の理論または作用メカニズムに束縛されることを望むわけではないが、腫瘍におけるカリケアマイシン結合体の蓄積の後、細胞周囲の酸性環境はカリケアマイシンの放出に関与し得る。このメカニズムは、インビボでのカリケアマイシン結合体の腫瘍崩壊効果がインビトロでの腫瘍細胞のカリケアマイシンに対する感受性と合致したという事実に関係し得る。加えて、飲作用もまたカリケアマイシン結合体の取り込みのメカニズムに関係し得る。しかしながら、酸安定性リンカーは標的抗原の非存在下で無効であったので、この寄与は関連性が低いかもしれない。
【００２６】
本発明の抗体は非特異的抗体である。そのような抗体は、細胞毒性結合体が投与される腫瘍細胞に存在しない抗原に関して特異的である。例えばＦＡＣＳまたはＢＩＡｃｏｒｅ分析のような任意の公知の方法を用いて、腫瘍細胞由来抗原の存在または非存在を測定することができる。結合体の免疫グロブリンをその他の高分子と置換することにより、カリケアマイシン結合体の治療活性の基礎にあるキャリア特性を同定した。一般的に能動的ターゲティングに適当なキャリアの例は、リポソーム、アルブミン、デキストランまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）重合体である。移植された腫瘍の免疫グロブリンの蓄積がアルブミンの蓄積よりも顕著であったという知見と合致して、結合体の有効性を低減または喪失することなく抗体をアルブミンでもＰＥＧ化Ｆｃフラグメントでも置き換えることは、できなかった。
【００２７】
本発明で用いることができる抗体の例としては、特異性、アイソタイプまたは等電点にかかわらず、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、再表面化抗体（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ヒト抗体およびそれらの生物学的に活性なフラグメントが挙げられる。本明細書で用いる場合、抗体という用語は、特記されない限り、抗体分子および種々の抗体由来分子の双方を指して広範に用いられる。そのような抗体由来分子は、少なくとも１つの可変領域（重鎖または軽鎖可変領域のいずれか）を含み、そしてＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂｃフラグメント、Ｓｃ抗体（一本鎖抗体）、ダイアボディー、個々の抗体軽一本鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖とその他の分子との間のキメラ融合等が挙げられる。
【００２８】
好ましくは、本発明で用いる抗体は２本の重鎖および２本の軽鎖を有する完全免疫グロブリンである。例えばＩｇＧ分子の分子量および一般的なタンパク質構造は、マウスを死なせることなく、十分量のカリケアマイシンを腫瘍にターゲティングするのに必要であり得る。
【００２９】
本発明の抗体は、任意のＴＡＡ（例えば、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ＥＧＦＲ；ＰＳＭＡ；ＰＳＣＡ；ＭＩＲＡＣＬ−２６４５７；ＣＥＡ；ルイスＹ（Ｌｅｙ）または５Ｔ４が挙げられる）に特異的であり得る。例示的な抗体としては、それぞれヒトＣＤ３３またはＣＤ２２を特異的に認識するヒト化ＩｇＧ４抗体である、ｈｐ６７．６およびｇ５／４４が挙げられる（米国特許第５，７７３，００１号ならびに米国特許出願第２００４／００８２７６４Ａ１号および第２００４／０１９２９００Ａ１号参照、これらの全体が参考として本明細書中に援用される）。ＲＩＴＵＸＡＮ（リツシキマブ）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ）はＣＤ２０を認識するキメラＩｇＧ１−κ抗体であり、これもまた例示的な抗体である。別の例は、ｈｕ３Ｓｌ９３と称される抗ルイスＹ抗体（米国特許第６，３１０，１８５号；同第６，５１８，４１５号；同第５，８７４，０６０号を参照のこと、これらはその全体が参考として本明細書中に援用される）またはこれに代えて、Ｇ１９３（これは「Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」（ＡＭ１０１４６２）の標題で同時係属中の出願に記載されている）である。ＴＡＡはたいてい腫瘍細胞の独占的生成物ではなく、そして正常組織におけるこれらの抗原（例えばＬｅｙ、ＥＧＦＲまたはＨｅｒ２／ｎｅｕ）の発現は、これらの抗原を認識するカリケアマイシン結合体の治療用量を制限する毒性をもたらし得るので、任意のヒト抗原を認識できないキャリア抗体とカリケアマイシンとの結合体を用いることにより、これらの問題を回避することができる。
【００３０】
ポリペプチドの生成に有用な種々の方法、例えばインビトロ合成、組換えＤＮＡ生成等により、本発明の抗体を生成することができる。好ましくは、その抗体は、組換えＤＮＡ技術およびタンパク質発現方法により生成される。ＤＮＡ（例えばポリヌクレオチド）を操作するための技術は、分子生物学の分野の当業者に周知である。そのような周知の技術の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に見出すことができる。ヒト化免疫グロブリンを含む免疫グロブリンの組換え発現のための技術もまた、とりわけＧｏｅｄｄｅｌら，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）およびＢｏｒｒｅｂａｃｋ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ（１９９２）に見出すことができる。組換え抗体の産生、設計および発現に関するさらなる情報は、Ｍａｙｆｏｒｔｈ、Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９３）に見出すことができる。従来の分子生物学技術の例としては、インビトロライゲーション、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＰＣＲ、細胞形質転換、ハイブリダイゼーション、電気泳動、ＤＮＡシークエンシング等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
ベクターの構築、宿主細胞を生成するための細胞のトランスフェクション、抗体を生成するための細胞の培養のための一般的な方法は全て、従来の分子生物学的方法である。同様に、一度生成すると、クロスフローろ過、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ダイアフィルトレーション等を含む当該分野の標準的な手順により、組換え抗体を精製することができる。組換え抗体を発現するために用いられる宿主細胞は、大腸菌のような細菌細胞、または好ましくは真核細胞のいずれかであり得る。好ましくは、ＰＥＲ．Ｃ．６細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が使用される。発現ベクターの選択は、宿主細胞の選択に依存し、そして選択された宿主細胞において望ましい発現および調節特性を有するように選択される。
【００３２】
好ましくは、本発明の方法において使用される結合体は、結合動態および裸の抗体の特異性を維持する。例えばＦＡＣＳまたはＢＩＡｃｏｒｅ分析のような任意の公知の方法が、結合体の結合動態および特異性を測定するために使用され得る。
【００３３】
非特異的抗体をヒト抗体またはヒト化モノクローナル抗体のような他の抗体（またはその一部）と組み合わせて、またはそれに結合させて用いることができる。これらの他の抗体は、本発明の抗体が志向する疾患に特徴的な他のマーカー（エピトープ）と反応してもよいし、例えばヒト免疫系の分子または細胞を疾患細胞に動員するために選択される異なる特異性を有してもよい。本発明の抗体（またはその一部）は、そのような抗体（またはその一部）と共に、別個に投与される組成物として投与されてもよいし、従来の化学的または分子生物学的方法により連結された２つの薬剤を含む単一の組成物として投与されてもよい。加えて、（インビトロまたはインビボのいずれかで）検出可能なシグナルを生成する標識で、または治療的特性を有する標識でヒト化抗体を標識することにより、本発明の抗体の診断的価値および治療的価値を高めることができる。いくつかの標識（例えば、放射性核種）は、検出可能なシグナルを生成し、そして治療的特性を有し得る。放射性核種標識の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４Ｃが挙げられる。その他の検出可能な標識の例としては、蛍光顕微鏡用のフルオレセイン、フィコビリタンパク質もしくはテトラエチルローダミンのような蛍光性発色団、電子顕微鏡による実証のための電子密度生成物を生成する蛍光、吸光度可視色もしくは凝集による検出のための蛍光または着色生成物を生成する酵素；または直接的もしくは間接的電子顕微鏡可視化のためのフェリチン、ペルオキシダーゼもしくは金ビーズのような電子密度分子が挙げられる。治療的特性を有する標識には、メトトレキサート等のような癌の処置のための薬物が含まれる。
【００３４】
本方法において使用される結合体は、治療用または診断用組成物／処方物の唯一の活性成分であってもよいし、他の抗体成分、例えば抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３３、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγもしくは抗ＬＰＳ抗体、またはサイトカイン、成長因子、ホルモン、抗ホルモン、細胞毒性薬物およびキサンチンのような非抗体成分を含むその他の活性成分（例えば以下に記載する化学療法剤、ホルモン治療剤、または生物学的治療剤）を伴ってもよい。
【００３５】
これらの組成物／処方物は、癌の処置のために患者に投与され得る。本発明に従って、治療上有効量の細胞毒素に結合体化された非特異的抗体が、処置を必要とする患者に投与される。あるいは、その組成物または処方物が、癌の処置のための医薬品を製造するために使用される。この方法または医薬品は、非特異的抗体が結合する抗原を発現しない癌細胞を有する任意の患者を処置するために使用され得る。しかしながら、処置の有効性と癌細胞のカリケアマイシンに対する感受性との間には相関性があり得る。１つの実施形態では、処置される癌は、胃癌、結腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、扁平上皮癌、または前立腺癌である。
【００３６】
本処置方法は、外科的手術、放射線、化学療法、ホルモン治療、生物学的治療、骨髄移植（白血病および非常に高用量の化学療法を必要とするその他の癌のために）を含む他の癌処置と組み合わせて用いることができる。新しい処置もまた現在開発されており、そして癌の生物学の理解の深まりに基づいて承認されている。
【００３７】
２つの一般的なクラスの放射線治療が存在し、そして本方法において使用され得る。一方のクラスの近接照射療法では、放射性同位元素の直接移植が腫瘍に行われ、高濃度の用量がその領域に送達される。他方のクラスの遠隔照射治療では、ビームを用いて放射線を、身体の広い領域または全身照射（ＴＢＩ）で全身に送達される。
【００３８】
任意の適した化学療法剤が、本方法において使用され得る。これらの化学療法剤は一般的に以下のクラスに入る（各々の例を伴う）：代謝拮抗剤（例えばメトトレキサートのような葉酸アンタゴニスト、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）のようなプリンアンタゴニスト、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のようなピリミジンアンタゴニスト；アルキル化剤（シクロホスファミド）；ＤＮＡ結合剤（シスプラチンまたはオキサリプラチン）；抗腫瘍性抗生物質（ドキソルビシンまたはミトキサントロン）；有糸分列阻害剤（例えばタキサン、またはビンクリスチンのような微小管阻害剤、あるいはトポイソメラーゼ阻害剤（カンプトセカンまたはタキソール）。さらに具体的な例を以下に記載する。
【００３９】
本方法に関係するホルモン治療としては、例えば白血病および骨髄腫のためのコルチコステロイド、乳癌のためのエストロゲンおよび抗エストロゲン、ならびに前立腺癌のためのアンドロゲンおよび抗アンドロゲンが挙げられる。
【００４０】
生物学的治療は、身体に由来する物質を用いる。本方法における適した治療の例としては、抗体（例えばセツキシマブもしくはトラスツズマブのような抗ＥＧＦＲ抗体、またはベバシズマブのような抗ＶＥＧＦ抗体）、Ｔ細胞治療、インターフェロン、インターロイキン、および造血成長因子が挙げられる。
【００４１】
骨髄移植は、いくつかの癌、特に白血病の処置のために使用され得る。白血病を処置するために、患者の骨髄細胞は、化学療法または放射線処置により破壊される。次いで、細胞表面上に適合するかまたはほぼ適合するＨＬＡ抗原を有するドナーからの骨髄を、患者に導入する。腫瘍細胞を死滅させるために非常に高用量の放射線または化学療法を必要とされる患者の骨髄を取り換えるためにも、骨髄移植が使用され得る。移植はドナー供給源に基づいて分類される。同種移植においては、骨髄ドナーはしばしば遺伝的に関連しないが、免疫系（ＨＬＡ抗原）により認識される主要タンパク質である６つの細胞表面抗原のうちの少なくとも５つと適合する。自己移植では、患者は、化学療法または放射線処置の後にその自己の骨髄を受け取る。この型の骨髄移植を、従来の処置用量の有効性が不完全である非骨髄関連の癌に用いることができる。
【００４２】
加えて、本方法において用いることができる新しく生まれた研究法は、そのいくつかが承認されているか、または臨床試験中であり、癌の分子基盤および細胞基盤ならびに疾患の進行の理解の深まりに基づいて開発されている。リン酸化カスケードを阻害するタンパク質キナーゼ阻害剤（低分子および抗体の双方）（例えばエルロチニブまたはメシル酸イマチニブ）が、使用され得る。癌細胞の転移および新しい組織の浸潤を遮断する任意の抗転移剤が使用され得る。腫瘍に栄養を与える血管の発達を遮断する抗血管形成剤（例えばサリドマイド）が使用され得る。使用され得る他の薬剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、これは腫瘍細胞の増殖を引き起こす異常タンパク質の生成を遮断する。遺伝子治療を用いて遺伝子をＴ細胞に導入することもでき、この遺伝子は患者に注射され、そして特定の腫瘍細胞を死滅させるように設計される。また正常なｐ５３遺伝子を変異体癌細胞に導入することによりｐ５３をターゲティングして、例えば化学療法剤に対する感受性を回復させることもできる。
【００４３】
１つの実施形態では、本発明の組成物／処方物は、生物活性因子と組み合わせて使用される。一般的に使用される生物活性因子としては、抗体、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗ホルモン、キサンチン、インターロイキン、インターフェロン、細胞毒性薬物および抗血管形成タンパク質が挙げられる。
【００４４】
癌のような増殖障害を処置するために一般的に使用され、そしてカリケアマイシン−抗ルイスＹ抗体結合体と一緒に使用され得る生体活性細胞毒性薬物としては：ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン、エピルビシン、カルビシン、ノガラマイシン、メノガリル、ピタルビシンおよびバルルビシンのようなアントラサイクリンを３日間まで；シタラビン、ゲムシタビン、トリフルリジン、アンシタビン、エノシタビン、アザシチジン、ドキシフルリジン、ペントスタチン、ブロクスウリジン、カペシタビン、クラドリビン、デシタビン、フロキシウリジン、フルダラビン、グウゲロチン、プロマイシン、テガフル、チアゾフリンのようなピリミジンまたはプリンヌクレオシド；シクロホスファミド、メルファラン、チオテパ、イフォスファミド、カルムスチン、シスプラチン、ＣＫＤ−６０２、レドキサントロン、ルビテカン、塩酸トポテカン、ＬＥ−ＳＮ３８、塩酸アフェレテカン、ＸＲ−１１５７６およびＸＲ−１１６１２のようなアルキル化剤；メトトレキサート、５フルオロウラシル、テガフル／ウラシル（ＵＦＴ）、ラリチトレキセド、カペシタビン、ロイコボリン／ＵＦＴ、Ｓ−１、ペメトレキセド二ナトリウム、テザシタビン、グルクロン酸トリメトレキセート、チメクタシン、デシタビンのような代謝拮抗剤；エドレコロマブ、マイトマイシン、マイトマイシンＣおよびオキサリプラチンのような抗腫瘍抗体；ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、無水ビンブラスチンのようなビンカアルカロイド；コハク酸バタラニブ、オグルファニド、ＲＰＩ−４６１０のような血管形成阻害剤；ゲフィチニブ、３１７６１５．２ＨＣＬ、インジスラム、ラパチニブ、ソラフェニブ、ＷＨＩ−Ｐ１３１のようなシグナル伝達阻害剤；塩酸アルボシジブ、イロフルベン、フェニル酪酸ナトリウム、ボルテゾミブ、エクシスリンド、ＭＳ−２１６７のようなアポトーシスインデューサー；エトポシドのようなエピポドフィロトキシン；ならびにパクリタキセル、ドセルタキセル、ＤＨＡ−パクリタキセル、イキサベピロン、ポリグルタミン酸パクリタキセルまたはエポチロンのようなタキサンが挙げられる。
【００４５】
ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭまたはＣＭＤ−１９３またはＡＧ  Ｇ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭと組み合わせて投与することができるその他の化学療法／抗腫瘍剤としては、アドリアマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、イフォスファミド、ビンデシン、ゲムシタビン、エダトレキサート、イリノテカン、メクロレタミン、アルトレタミン、カルボプラチン、テニポシド、トポテカン、ゲムシタビン、チオテパ、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）、ＭｅＣＣＮＵ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、メクロレタミン、プレドニゾン、プロカルバジン、メトトレキサート、フルロウラシル系、エトポシド、タキソールおよびその種々のアナログ、マイトマイシン、サリドマイドおよびその種々のアナログ、ＧＢＣ−５９０、トロキサシタビン、ＺＹＣ−３００、ＴＡＵ、（Ｒ）フルルビプロフェン、塩酸ヒスタミン、タリキダール、ダバナット−１、ＯＮＴ−０９３が挙げられる。投与は１つまたはそれより多いこれらの治療剤と同時でもよいし、またはこれに代えて１つまたはそれより多いこれらの治療剤と連続的でもよい。
【００４６】
本発明の抗体結合体と共に投与され得る生体活性抗体としては、ヘルセプチン、ゼバリン、ベキサール、キャンパス、セツキシマブ、ベバシズマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＭＤＸ−２１０、ペルツズマブ、トラスツズマブ、Ｉ−１３１  ｃｈ−ＴＮＴ−Ｉ／ｂ、ｈＬＭ６０９、６Ｈ９、ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ  Ｙ９０、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＩＮＧ−１、シブロツズマブ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１  Ｍａｂ、ＹＭＢ−１００３、２Ｃ５、ギバレックスおよびＭＨ−１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
カリケアマイシン−抗ルイスＹ抗体結合体は、単独で、処置レジメンの一部として成長因子、サイトカイン、ステロイド、抗ルイスＹ抗体のような抗体、リツキシマブおよび化学療法剤のようなその他の生物活性因子と組み合わせてと同時にまたは逐次的に投与することもできる。カリケアマイシン−抗ルイスＹ抗体結合体は、単独で、誘導治療フェーズ、強化治療フェーズおよび維持治療フェーズの一部として、上記で同定された処置レジメンのいずれかと同時にまたは逐次的に投与することもできる。
【００４８】
再発性の侵襲性の強い癌の処置のために、本発明の結合体は、組み合わせ化学療法剤処置レジメンの一部として、他の生体活性および化学療法剤と一緒に投与され得る。かかる処置レジメンとしては：ＣＡＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン）、ＰＶ（シスプラチン、ビンブラスチンまたはビンデシン）、ＣＥ（カルボプラチン、エトポシド）、ＥＰ（エトポシド、シスプラチン）、ＭＶＰ（マイトマイシン、ビンブラスチンまたはビンデシン、シスプラチン）、ＰＦＬ（シスプラチン、５−フルオロウラシル、ロイコボリン）、ＩＭ（イフォスファミド、マイトマイシン）、ＩＥ（イフォスファミド、エトポシド）；ＩＰ（イフォスファミド、シスプラチン）；ＭＩＰ（マイトマイシン、イフォスファミド、シスプラチン）、ＩＣＥ（イフォスファミド、カルボプラチン、エトポシド）；ＰＩＥ（シスプラチン、イフォスファミド、エトポシド）；ビオレルビンおよびシスプラチン；カルボプラチンおよびパクリタキセル；ＣＡＶ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ＣＡＥ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド）；ＣＡＶＥ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド）；ＥＰ（エトポシド、シスプラチン）；ＣＭＣｃＶ（シクロホスファミド、メトトレキサート、ロムスチン、ビンクリスチン）；ＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル）；ＣＡＦ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル）；ＣＥＦ（シクロホスファミド、エピルビシン、５−フルオロウラシル）；ＣＭＦＶＰ（シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、プレドニゾン）；ＡＣ（ドキソルビシン、シクロホスファミド）；ＶＡＴ（ビンブラスチン、ドキソルビシン、チオテパ）；ＶＡＴＨ（ビンブラスチン、ドキソルビシン、チオテパ、フルオシメステロン）；ＣＤＤＰ＋ＶＰ−１６（シスプラチン、エトポシド、マイトマイシンＣ＋ビンブラスチン）が挙げられる。
【００４９】
本発明の局面では、処置することとは、腫瘍成長の遅延および転移の阻害を含む癌成長の阻害、防御または遅延を意味することが、理解されるべきである。
【００５０】
本発明の組成物／処方物は、第二次単剤治療（ｓｅｃｏｎｄ−ｌｉｎｅ  ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ）として投与され得る。第二次とは、本組成物／処方物が、異なる抗癌処置（その例は上で記載している）での処置の後に使用されることを意味する。あるいは、本組成物または処方物は、上で記載した別の抗癌処置と一緒に第一次併用治療として投与され得る。
【００５１】
抗体組成物は、種々の方法で患者に投与され得る。組成物の直接送達は、一般的には注射により、皮下、腹腔内、静脈内もしくは筋肉内に行われるか、または組織の間質腔に送達される。好ましくは、薬学的組成物は、非経口的に、すなわち皮下、筋肉内または静脈内に投与され得る。この組成物は、病巣にも投与され得る。投薬処置は、単回投与スケジュールであってもよいし、または多回投与スケジュールであってもよい。
【００５２】
カリケアマイシンの受動的ターゲティングは、能動的ターゲティングより有効性が低いかもしれない。この相対的な差異は、腫瘍寛解の期間の短縮および受動的ターゲティングメカニズムを用いるカリケアマイシン結合体で効果を得るのに必要とされる高用量により明らかになっている。しかし、受動的ターゲティング戦略は、腫瘍関連抗原の相同的発現または過剰発現の必要性を回避するので、特定の環境で指示される。しかしながら、受動的ターゲティングのために設計されたカリケアマイシン結合体の最大耐用量は、能動的ターゲティングのカリケアマイシン結合体よりも高量になり得る
種々の水性キャリア、例えば水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等が使用され得る。これらの溶液は無菌であり、そして一般的に粒子状物質を含まない。これらの組成物は、慣習的な、周知の滅菌技術により滅菌することができる。その組成物は、生理学的な状態に近づけるのに必要とされるような、薬学的に受容可能な、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、毒性調整剤等のような補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム）を含有し得る。これらの処方物中の抗体の濃度は広範に変動し得、例えば約０．５重量％未満、通常または少なくとも約１％から、１５重量％または２０重量％までよく、そして主に液体容量および粘度に基づいて、例えば選択される特定の投与様式に従って選択される。
【００５３】
本発明の方法は、治療上有効量の結合体の投与を包含する。本明細書で用いる場合、治療上有効量という用語は、標的とされる疾患もしくは症状を処置、改善または防御する、または検出可能な治療効果もしくは防御効果を呈するのに必要な治療剤の量を意味する。任意の結合体について、この治療上有効量は、最初は細胞培養アッセイか、または動物モデル（通常、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタもしくは霊長類のいずれか）において推定することができる。この動物モデルは、適切な濃度範囲および投与経路を決定するためにも使用され得る。次いでそのような情報が、ヒトにおいて投与するのに有用な用量および経路を決定するために使用され得る。
【００５４】
ヒト被験体のための正確な有効量はまた疾患状態の特性および重篤度、被験体の全身の健康状態、年齢、体重および対象の性別、食事、投与の時間および頻度、（複数の）薬物の組み合わせ、反応の感受性並びに治療に対する耐性／応答性にも依存する。結合体を予防的に用いて既存の症状を処置している場合、これはまた有効量にも影響する。日常的な実験によってこの量を測定することができ、そして臨床医の判断の範疇である。一般的に、有効用量は、タンパク質様キャリアに基づいて計算すると、０．０１ｍｇ／ｍ２から５０ｍｇ／ｍ２、好ましくは０．１ｍｇ／ｍ２から２０ｍｇ／ｍ２、さらに好ましくは約１０〜１５ｍｇ／ｍ２である。
【００５５】
投与頻度は、上記結合体の半減期およびその効果の持続時間に依存する。その結合体の半減期が短い（例えば２から１０時間）場合、１日１回またはそれより多く投与することが必要であり得る。あるいは、結合体分子の半減期が長い（例えば２から１５日）場合、１日１回、週１回またはさらには１もしくは２か月に１回投与する必要があるだけであるかもしれない。
【００５６】
上記組成物はまた、抗体結合体の投与のための薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。薬学的なキャリアは、モノクローナル抗体を患者に投与するのに適した、任意の適合性のある無毒の物質でよい。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックスおよび不活性固体をキャリアに含めることができる。キャリアは、それ自体組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘起してはならず、そして毒性であってはならない。適したキャリアは、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸重合体、アミノ酸共重合体および不活性ウイルス粒子のような、大きな、緩やかに代謝される高分子であり得る。薬学的に受容可能なアジュバント（緩衝化剤、分散剤）もまた医薬組成物に組み込むことができる。
【００５７】
薬学的に受容可能な塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩のような鉱酸の塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩のような有機酸の塩もまた、使用され得る。
【００５８】
治療用組成物／処方物中の薬学的に受容可能なキャリアはさらに、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含有することができる。湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝化物質のような補助物質が、そのような組成物に存在し得る。そのようなキャリアにより、組成物を患者が摂取するための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリーおよび懸濁液に処方できるようになる。
【００５９】
投与に好ましい形態としては、例えば、ボーラス注射または連続注入による、例えば注射または注入のような非経口投与に適した形態が含まれる。生成物が注射または注入用である場合、それは油性または水性ベヒクル中懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態を取ることができ、そして懸濁剤、保存剤、安定剤および／または分散剤のような製剤用薬剤を含有することができる。
【００６０】
緩衝化結合体溶液の安定性は短期間用には十分であるが、長期間安定性は乏しい。結合体の安定性を増強させ、そしてその貯蔵期間を延長させるために抗体−薬物結合体を、適切な無菌の液体で使用前に再構築するための乾燥形態に凍結乾燥することができる。タンパク質溶液の凍結乾燥に会合される問題は十分に文書化されている。凍結および乾燥過程の間に２次、３次および４次構造の喪失が起こり得る。それらを凍結保護剤、界面活性剤、緩衝化剤および溶液中の電解質と接触させ、そして次に溶液を凍結乾燥することによりこれらの組成物／処方物の生物学的活性を保存することができる。溶解保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を溶液に加えることもできる。
【００６１】
経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経真皮、経皮（ＰＣＴ公開番号：ＷＯ９８／２０７３４）、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内または直腸経路を含むいくつもの経路により、結合体を投与することができる。皮下噴射器を用いて本発明の組成物を投与することもできる。典型的には、組成物を注射用の液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができる。注射の前に液体ベヒクルで溶液または懸濁液に適当な固体形態を調製することもできる。
【実施例】
【００６２】
（実施例１：材料および方法）
（カリケアマイシン結合体）
カリケアマイシンアナログを、酸不安定性または酸安定性のいずれかのリンカーで種々のキャリア分子に結合体化した。酸不安定性４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）または（３−アセチルフェニル）酢酸（ＡｃＰＡｃ）により、リソソーム内でのヒドラゾン基の酸加水分解およびジスルフィド還元が可能になる。酸安定性４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（アミド）は、ジスルフィド基での解離のみを可能にする。カリケアマイシンアナログであるＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＣａｌｉｃｈＤＭＨ）またはＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチル酸（ＣａｌｉｃｈＤＭＡ）を、各々酸不安定性または酸安定性リンカーと結合体化した。
【００６３】
（細胞および培養条件）
Ｎ８７（ＣＲＬ−５８２２）、ＨＴ２９（ＨＴＢ−３８）、ＬＯＶＯ（ＣＣＬ−２２９）、Ａ４３１（ＣＲＬ−１５５５）およびＬＮＣａＰ（ＣＲＬ−１７４０）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から購入した。ＡＴＣＣから入手した細胞系をＡＴＣＣカタログに指示されるように培養培地中で維持した。Ｌ２９８７は、Ｄｒ．Ｃ．Ｓｉｅｇａｌｌ（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）からの寄贈であった。これらの細胞を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  ｇｌｎ、ペニシリン１００  ＩＵおよびストレプトマイシン１００μｇ（本明細書以後ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐと称する）ならびにゲンタマイシン０．０５ｍｇを補充したＲＰＭＩ  １６４０中で成長させた。ＰＣ１４ＰＥ６、ＰＣ３ＭＭ２およびＭＤＡＭＢ４３５は、Ｄｒ．Ｉ．Ｆｉｄｌｅｒ（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から入手した。ＰＣ１４ＰＥ６およびＰＣ３ＭＭ２を、１０容量／容量％のＦＢＳ、２ｍＭ  ｇｌｎ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．２ｍＭ非必須アミノ酸、２％ＭＥＭビタミン溶液およびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充した最小必須培地中で維持した。ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４は、腫瘍胎児性タンパク質５Ｔ４およびネオマイシン抵抗性マーカーをコードするプラスミドでトランスフェクトされたＭＤＡＭＢ４３５細胞である。これらの細胞を、１０容量／容量％ＦＢＳ、２ｍＭ  ｇｌｎ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．２ｍＭ非必須アミノ酸、２％ＭＥＭビタミン溶液ならびに５０％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐおよび１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補充したアール塩を含む最小必須培地中で培養した。Ｄｒ．Ｓｃｏｔｔ  Ａ．（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）が、Ａ４３１のルイスＹ陽性改変体であるＡ４３１／Ｌｅｙ細胞を提供した。それらを、１０容量／容量％ＦＢＳ、２ｍＭ  ｇｌｎおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。ＫＢ８．５細胞をＤｒ．Ｓｈｅｎから入手し、そして２０容量／容量％ＦＢＳ、２ｍＭ  ｇｌｎ、１０μＭピルビン酸ナトリウム、１０％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐおよび０．２５ｍＭコルヒチンを補充したＤＭＥＭ（高グルコース）中で培養した。
【００６４】
（抗体および結合体）
Ｈｐ６７．６およびｇ５／４４は、各々ヒトＣＤ３３またはＣＤ２２を特異的に認識するヒト化ｌｇＧ４抗体である。リツキサン（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、ＣＤ２０を認識するキメラＩｇＧ１−κ抗体である。ＭＯＰＣは、一般的に免疫検出法において陰性対照として用いられる未知の特異性を有するモノクローナルＩｇＧ１−κマウス抗体である。
ＦＡＣＳ分析用に、ヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ，Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）およびマウスＩｇＧおよびＦＩＴＣ標識ヤギ抗ｈｕＩｇＧ（ＦＩＴＣ／α−ｈｕＩｇＧ，Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を、それぞれ対照抗体および２次抗体として用いた。Ｎ，アセチルγ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＣａｌｉｃｈＤＭＨ）の結合体化は、酸不安定性ＡｃＢｕｔ（４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸）またはＡｃＰＡｃ（（３−アセチルフェニル）酢酸）リンカーを用いて行った。酸安定性結合体は、アミド（４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸）リンカーでＮ，アセチルγ−カリケアマイシンジメチルアミド（ＣａｌｉｃｈＤＭＡ）を抗体に結合させることによって得た。カリケアマイシンの抗体に対するモル比は、モル：モルで２：１と６：１との間でバリエーションを示した。カリケアマイシンの抗体への結合体化の過程は、米国特許第５，７７３，００１号；同第５，７３９，１１６号；および同第５，８７７，２９６号に記載されている（これらの特許引用の全情報は、参考として本明細書中に援用される）。
【００６５】
（合成高分子（ＦｃＰＥＧＬおよびＦｃＰＥＧＢ））
抗体２．８ｇを１０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ３．５、３７℃）中ペプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）２．８ｍｇで４０分間消化し、そしてＫ２ＨＰＯ４でｐＨ７まで中和することにより、ｈｐ６７．６の（Ｆａｂ）２フラグメントを作成した。１０ｍＭトリス酢酸塩（ｐＨ８）中Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ｈｉｇｈ  Ｑ  ｃｏｌｕｍｎ（１６０ｍｌ）クロマトグラフィーを用いて消化物を分画した。非結合分画で（Ｆａｂ）２を溶出した。
【００６６】
次いでｈｐ６７．６の（Ｆａｂ）２フラグメントをＰＥＧ化した。１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中（Ｆａｂ）２２０ｍｇを直鎖状２０ｋＤａ  ＰＥＧ（メトキシポリ（エチレングリコール）プロピオン酸のＮ−ヒドロキシサクシンイミジルエステル）４０ｍｇまたは分岐（１０ｋＤａ）２ＰＥＧ（メトキシポリ（エチレングリコール）のＮ−ヒドロキシサクシンイミジルエステル）６０ｍｇのいずれかと混合した。双方のＰＥＧストックを水中で作製し、そして即時使用した。２０℃で６０分間反応を進行させた。
【００６７】
見かけの分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび浸透クロマトグラフィーにより測定した。ＰＥＧ化した（Ｆａｂ）２の溶出位置に基づく平均分子量は分岐（１０ｋＤａ）２ＰＥＧで約２５０ｋＤａであり、そして直鎖状２０ｋＤａ  ＰＥＧ化（Ｆａｂ）２で約３００ｋＤａである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、主要な種は、モル比で（Ｆａｂ）２：ＰＥＧが１：２および１：３であることが示された。
【００６８】
ｈｐ６７．６をＰＥＧ化するために、抗体５０ｍｇを４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中ＰＥＧ（２００ｍｇ／ｍｌの分岐（１０ｋＤａ）２ＰＥＧストック０．５ｍｌ）１００ｍｇと、最終タンパク質濃度１０．６ｍｇ／ｍｌで混合した。２０℃で６０分間反応を進行させた。
【００６９】
（ＦＡＣＳ分析）
１０５個の細胞のアリコートを、１容量／容量％ウシ血清アルブミンを補充したリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ／ＢＳＡ）１００μｌに懸濁した。次いで細胞を、１０μγ／ｍｌの１次抗体（ｈｐ６７．７、ｈｇ５４４、リツキサンまたはＭＯＰＣ）または結果のセクションに特定されるようなこれらの抗体の結合体中で、４℃で３０分間インキュベートした。１次抗体の細胞に対する結合が、ＦＩＴＣ／α−ｈｕＩｇＧにより示された。
【００７０】
（インビトロでのＥＤ５０の測定）
生体染色色素（ＭＴＳ）染色を使用して、種々の処置に曝露した後の生存細胞数を測定した。ＭＴＳ（非放射活性細胞増殖アッセイキット）をＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）から購入し、そして製造者の指示書に従って使用した。各々の細胞系に関して検量線（２時間後の細胞数対光学密度）を確立し、適切な初期播種密度を推定した。次いで細胞を、９６マルチウェル皿に、１ウェルあたり７５０個〜５０００個の細胞の密度で播種した。播種後すぐに細胞を種々の濃度（１ｍｌあたりカリケアマイシン等価物０ｎｇ〜５００ｎｇの範囲）のｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨおよびＣａｌｉｃｈＤＭＨに曝露した。９６時間の薬物曝露で生存した細胞の数を測定した後、用量応答性曲線から誘導したロジスティック回帰パラメーターに基づいてＥＤ５０を計算した。ＥＤ５０を９６時間後の細胞数の５０％減少を引き起こした薬物の濃度（ｎｇ／ｍｌ  ＣａｌｉｃｈＤＭＨ）として定義した。
【００７１】
（実施例２：インビボでのＨＵ３Ｓ１９３−ＤＭＨの有効性）
Ｎ８７、ＬＯＶＯ、Ａ４３１／Ｌｅｙ、ＬＳ１７４ＴおよびＬ２９８７の皮下腫瘍を胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）で成長させた。２ヶ月齢の雌マウスに、各々マウスあたり５×１０６個のＮ８７、ＬＯＶＯ、Ａ４３１／ＬｅｙまたはＬＳ１７４Ｔ細胞を注射した。Ｌ２９８７細胞を７週齢と８週齢の間の雄ヌードマウスに注射した。腫瘍を成長させるために、注射前にＮ８７細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｌｆｏｒｄ，ＭＡ）と混合（１：１、容量／容量）しなければならなかった。結果のセクションで指示する時間間隔で腫瘍の２本の直行する直径をノギスにより測定した。腫瘍容積を、ＡｔｔｉａおよびＷｅｉｓｓの式：Ａ２×Ｂ×０．４に従って計算した。ＡおよびＢは各々小さいおよび大きい腫瘍直径に関する記号である。処置スケジュール、用量および群あたりのマウスの数を結果のセクションおよび図の説明文で指示する。
【００７２】
（実施例３：１２５Ｉ標識結合体のインビボ分配）
ゲムツズマブオゾガマイシンをボルトン−ハンター試薬（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて１２５Ｉで標識した。３０匹の腫瘍保持雌ヌードマウスの群の尾側静脈に、２０μＣｉ／２００ｍｇ１２５Ｉ標識結合体を注射した。注射時の腫瘍の重量はおよそ１ｇであった。５匹のマウスの群を、注射後２時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間にてＣＯ２吸入により屠殺した。図２に示されるような組織におけるγ線放射の量を、３つの時点で測定した。結合体の生体分布を組織グラムあたりの注射用量のパーセンテージとして（ＩＤ／ｇ  ％）、または所定の時点での血中レベルのパーセンテージとして（血液％）表現した。ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの濃度が着実に増加するのが、腫瘍組織において独占的に観察された。蓄積の倍加時間はＡ４３１腫瘍で１５０時間である。
【００７３】
（実施例４：ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの受動的ターゲティング）
腫瘍細胞における標的抗原ＣＤ３３の量が検出不能であるにもかかわらず、ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨは種々の皮下異種移植片の成長を阻害する。
【００７４】
ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの腫瘍崩壊効果を複数の異種移植片モデルで実証した。表１（インビトロで癌細胞でのＣＤ３３発現）はヌードマウスで異種移植片を作成するために用いた細胞系およびフローサイトメトリーにより測定されるそれらのＣＤ３３発現を列挙する。１次抗体としてｈｐ６７．６またはｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨを用いて得られたシグナルは、陰性対照抗体ｈｕＩｇＧ４を用いた後に得られたシグナルとほとんど一致した（ｒｅＭＣＦは１に近い）。図１で説明するように、ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨは、これらの細胞の細胞膜上にＣＤ３３が非存在であるにもかかわらず、Ａ４３１扁平上皮癌異種移植片の腫瘍成長を阻害する。本実験のマウスの全群をマウスあたり１用量の処置レジメンに従って処置し、４日間隔で３回腹腔内投与した（Ｑ４Ｄ×３）。およそ８０ｍｍ３の異種移植片を有するマウスを処置の前に選択した。与えられたＣａｌｉｃｈＤＭＨまたは結合体の量をカリケアマイシン等価物で表現する。処置後２７日まで、ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ  ４μｇの３用量の投与の後にＡ４３１異種移植片の成長は有意に（ｐ＝０．０３）阻害された。対照群の腫瘍サイズが大きくなり過ぎ、そして動物愛護の理由のためにこれらのマウスの屠殺を余儀なくされたので、２７日後の評価はできなかった。
【００７５】
【表１】
2007529535.tif 000004
［ａ］＝１次抗体としてｈｐ６７．６を用いる相対中央値チャネル蛍光（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉａｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）
［ｂ］＝それぞれの測定数
［ｃ］＝ｎ個の測定の最小および最大
［ｄ］＝１次抗体としてＣＭＡ−６７６を用いる相対中央値チャネル蛍光
［ｅ］＝非小細胞肺癌
酸不安定性ＡｃＢｕｔリンカーでのカリケアマイシンのｈｐ６７．６への結合により、有効な腫瘍阻害結合体がもたらされる（図１Ａ）；しかしながら、ＡｃＢｕｔリンカーを酸安定性アミドリンカーに置換すると、結合体の効果は無効になり（図１Ｂ）、かつ遊離カリケアマイシンの投与は腫瘍成長の阻害を誘起しない（図１Ｃ）。具体的には、ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ２μｇ／用量で処置した異種移植片のみが、２１日間で対照よりも有意に（ｐ＝０．００４）小さいままであった（図１Ａ）。ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨと等しいかまたはそれより高用量のｈｐ６７．６−アミド−ＣａｌｉｃｈＤＭＡまたはＣａｌｉｃｈＤＭＨの投与は、腫瘍成長を阻害しなかった（図１Ｂおよび１Ｃ）。図１に示した結果により、ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨによる腫瘍成長の有意な阻害のみならず、この効果の、結合体化に用いたリンカーへの依存性もまた実証される。対照ＣａｌｉｃｈＤＭＨは、効果がない。
【００７６】
ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの有効性が、ＣａｌｉｃｈＤＭＨの腹膜からの緩徐な放出に関係したかどうかを決定するために、同一の用量、処置の頻度および間隔を維持しながら、薬物の投与に静脈内経路を使用して実験を繰り返した。ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨでの処置の後に、有意な成長阻害が観察された。治療開始の２７日後に、この結合体４μｇまたは２μｇで処置されたマウスの平均腫瘍サイズは、それぞれ対照腫瘍の１１％または２３％であった。ｈｐ６７．６−アミド−ＣａｌｉｃｈＤＭＡまたはＣａｌｉｃｈＤＭＨの静脈内投与は、有意な腫瘍成長阻害を生じなかった。
【００７７】
表２（ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨでの処置（Ｔ）後のＣＤ３３腫瘍異種移植片の、そしてベヒクルで処置された対照のパーセンテージ（Ｔ／Ｃ％）として表現される、腫瘍容積低下）で示すように、ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨは、多様な組織型起源のヒト腫瘍異種移植片の腫瘍成長を阻害した。腫瘍成長阻害をＴ／Ｃ値として表す。この値は対照群の平均腫瘍容積（Ｃ）のパーセンテージとして表現される、ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨで処置されたマウスの群の平均腫瘍容積（Ｔ）である。ＴおよびＣの双方を、処置の開始後同一日に測定する。表２のＴ／Ｃ値は、２７回の別個の実験から導かれ、そしてｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの最初の用量の注射の後１７日と３４日との間に測定された。応答の大きさの変動にかかわらず、このデータは、４μｇ／マウスの用量のｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨおよびＱ４Ｄ×３の処置レジメンが大部分の異種移植片における腫瘍成長を有意に阻害することを、明確に実証する。有意な阻害はまた、結合体をより低量で投与した場合にも観察された。
【００７８】
【表２】
2007529535.tif 000005
（実施例５：１２５Ｉ標識ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ結合体の蓄積）
種々のマウス組織およびＣＤ３３陰性Ａ４３１腫瘍異種移植した腫瘍におけるｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの動態を比較した。１２５Ｉ標識結合体２００□ｇ（２０μＣｉ）の注射の後、放射活性標識の量を２時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間にて、種々の組織において測定した（図２）。放射活性材料の量を、測定時の全血に存在する量に相対させて表現した（血液％、図２のＹ１軸）。血液パーセント（血液％）は、式、１００×組織１グラムあたりのＢｑ／血液１グラムあたりのＢｑにより得られる。加えて、また放射活性材料の量を所定の結合体の全量に相対させて表現した（ＩＤ／ｇ％、図２のＹ２軸）。１２５Ｉ標識した結合体の最低限の量しか脳に保持されない。脳における結合体の蓄積は９６時間以内で有意に変化しなかった。血液％は平均３．５％であった。従って、脳血管関門が抗体を透過しないので、この値は組織による結合体の取り込みの結果であると解釈されるべきではない。
【００７９】
９６時間の期間中、全血中の量に相対して腫瘍組織におけるｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの量は、６％〜２８％増加する。この着実な増加は、腫瘍組織において独占的に見出された。心臓、腸および脾臓の血液％値は、注射後２時間で最高であり、その後時間の関数で着実に低下した。肝臓および横紋筋では、血液％値のピークは４８時間であった。皮膚では、この値は２４時間後にプラトーに達した。腫瘍組織における血液％値の増加は単に、血液からのｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨのクリアランスの結果ではなかった。これはＩＤ／ｇ％値の着実な増加により証明され、これは組織中のｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの絶対量の良好な指標である。
【００８０】
腫瘍組織とは対照的に、ＩＤ／ｇ％は、試験したその他の組織全てにおいて時間の関数で低下した。したがって腫瘍組織は、ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨを保持および蓄積するその能力において例外的であった。前の実験により、腫瘍組織における抗体の蓄積が実証された。１２５Ｉ標識は抗体の存在を示したが、結合体のＣａｌｉｃｈＤＭＨ部分が類似の蓄積傾向をたどるかどうかは実証しなかった。３Ｈ標識ＣａｌｉｃｈＤＭＨに結合体化されたｈｐ６７．６の組織分布は、１２５Ｉ標識結合体の組織分布に類似した。したがって、結合体の細胞毒性部分は正常および腫瘍性組織の双方において免疫グロブリンキャリアと同様に分配された。
【００８１】
（実施例６：リツキシマブおよびＧ５／４４結合体の受動的ターゲティング）
リツキシマブおよびｇ５／４４のカリケアマイシン結合体は、ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨと同一の程度まで腫瘍成長を阻害する。
【００８２】
ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨにより引き起こされる腫瘍成長阻害が受動的ターゲティングのキャリアとしてｈｐ６７．６に限定されたかどうかを検証するために、ｈｐ６７．６結合体の有効性を、リツキシマブおよびＧ５／４４結合体の有効性と比較するいくつかの実験を行った。３つの抗体のいずれも、高い親和力ではＮ８７またはＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４と結合しなかった。Ｎ８７またはＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４をリツキシマブでプロービングした後のｒｅＭＣＦ値は、それぞれ０．９６および０．８９であった。これらの細胞をｇ５／４４でプロービングした後、ｒｅＭＣＦ値は０．７６と１．６０との間であった。細胞系に対する抗体の親和力が低いにもかかわらず、そのカリケアマイシン結合体は腫瘍成長の有意な阻害を引き起こした（図３）。図３はまた、結合体化に用いた抗体の特異性、アイソタイプまたは等電点にかかわらず、結合体で同等な効果が達成されたことを示している。ｈｐ６７．６およびｇ５／４４は、完全にヒト化されたＩｇＧ４分子である。リツキシマブは、マウス−ヒトＩｇＧ１キメラである。ｈｐ６７．６、ｇ５／４４およびリツキシマブの等電点は各々７．５、８．４および＞９である。
【００８３】
（実施例７：ヒト血清アルブミンまたはＰＥＧ化Ｆｃ結合体）
抗体をヒト血清アルブミンまたはＰＥＧ化Ｆｃフラグメントのいずれかで置換することにより、カリケアマイシン結合体の有効性が低下する。
【００８４】
図４に表されたデータにより、カリケアマイシン結合体が有効であるためには血清アルブミンまたはＰＥＧ化Ｆｃのいずれもキャリア抗体と置き換えることができないことが示される。図４ＡによりＭＯＰＣ−２１−ＡｃＰＡｃ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ結合体の成長阻害が示される。ＭＯＰＣ−２１は免疫検出方法において陰性対照として通例用いられる未知の特異性を有するマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１）である。カリケアマイシンをこのマウス抗体に結合体化させるために、酸不安定性ＡｃＰＡｃリンカーを用いた。この結合体の有効性により、ＡｃＰＡｃリンカーの使用が結合体の腫瘍崩壊効果を妨げないことが示される。比較して、ＨＳＡ−ＡｃＰＡｃ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの有効性は、同一の実験で最低限であった（図４Ｂ）。この結合体は別の実験でさらに有効であったが（すなわち４μｇ／マウス、Ｑ４Ｄ×３の投与の後２０日でＴ／Ｃ＝３９％）、有効性は対照抗体結合体よりも高くはなかった（すなわちＴ／Ｃ＝２１％）。ＨＳＡ−ＡｃＰＡｃ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨで大きな実験間の変動が観察されたという事実により、受動的ターゲティングを媒介するためには、ＨＳＡが免疫グロブリンほど適切なキャリアではないことが示された。
【００８５】
完全抗体の有用性をさらに図４Ｃで説明した。この実験では、ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨによる腫瘍成長阻害を、ＡｃＢｕｔリンカーによりカリケアマイシンに連結されたＰＥＧ化Ｆｃフラグメントから成る結合体の有効性と比較する。２つの型のＰＥＧを用いて、結合体のストークス半径を増加させた。ＦｃＰＥＧＬ（見かけの分子量＝３００ｋＤａ）を、メトキシポリ（エチレングリコール）プロピオン酸の直鎖状Ｎ−ヒロドキシサクシンイミジルエステルでＰＥＧ化した。ＦｃＰＥＧＢをこの分子の分岐形態（見かけの分子量＝２５０ｋＤａ）でＰＥＧ化した。ＰＥＧ化の特性にかかわらず、Ｆｃ結合体はいずれの成長阻害も引き起こすことができなかった。
【００８６】
代わりに、カリケアマイシンに結合体化された完全ＰＥＧ化（分岐したＰＥＧ）抗体（ｈｐ６７．６ＰＥＧＢ、見かけの分子量＝３００ｋＤａ）で、ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨに類似する成長阻害が観察され、このことはＰＥＧ化自体は結合体の有効性を無効にしなかったことを示している（図４Ｄ）。これらを考慮すると、図４で表した証拠は、カリケアマイシンの有効なキャリアとしての全抗体の独特な傾向を強調している。
【００８７】
（実施例８：カリケアマイシン感受性との相関性）
ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの受動的ターゲティングにより引き起こされる有効性の程度は、インビトロでのカリケアマイシンに対する腫瘍細胞の感受性と相関する。
【００８８】
１１個の腫瘍細胞系のＣａｌｉｃｈＤＭＨまたはｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨに対する感受性をインビトロで試験した。これらの２つの薬物のＥＤ５０を、９６時間後の単層での細胞数を未処置対照培養の５０％まで低下させた最低濃度（ｎｇ／ｍｌ）として定義した。種々の細胞系の順位は、ＣａｌｉｃｈＤＭＨのＥＤ５０またはｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨのＥＤ５０のいずれを順位付けの基準として用いても類似した（図５Ａを図５Ｂと比較する）。皮下異種移植片のｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨに対する感受性にはＴ／Ｃｍｉｎ値が反映された。このパラメーターは所定の実験の間に観察された最低Ｔ／Ｃ値であり、従って、測定された結合体の治療上の最大利点を反映する。故に、Ｔ／Ｃｍｉｎ値により種々の異種移植片におけるｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの有効性を比較することが可能になる。
【００８９】
図５は、これらの異種移植片のＴ／Ｃｍｉｎ値が、ＣａｌｉｃｈＤＭＨ（図Ａ）またはｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ（図５Ｂ）の相互の細胞への添加の後に測定されたＥＤ５０に正比例したことを示す。この相関性により、ＣａｌｉｃｈＤＭＨに対する感受性が、ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの有効性の決定要因であることが示唆された。しかしながら、ＬＯＶＯ結腸癌で見出されたＴ／Ｃｍｉｎ値が例外的に高いことにより、ＣａｌｉｃｈＤＭＨ単独に対する感受性は受動的ターゲティングによる有効性を説明するのには不十分であろうということが強調される。
【００９０】
上で引用した全ての参照文献および特許は、本明細書中に参考として援用される。本発明の多くの改変およびバリエーションは、上記で同定された明細書に包含され、そして当業者に明白であり、そして特許請求の範囲に包含される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、腫瘍容積（ｍｍ３）対腫瘍成長期間（日）のグラフとしてｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨによるＣＤ３３陰性（ＣＤ３３−）扁平上皮癌異種移植片の成長阻害を実証し；図１Ａは酸不安定性のｈｐ６７．６に対するＡｃＢｕｔリンカーで結合体化されたカリケアマイシンを示し、図１Ｂは酸安定性のｈｐ６７．６に対するアミドリンカーで結合体化されたカリケアマイシンを示し、そして図１Ｃは対照として遊離カリケアマイシンを示す。記号は１０匹（ＰＢＳ処置）または５匹（カリケアマイシンまたは結合体処置）の動物の平均腫瘍容積を表し、エラーバーは標準偏差を示す。全群のマウスは、１匹のマウスあたり１用量の処置レジメンを受け、４日間隔で３回腹腔内投与された（Ｑ４Ｄ×３）。図の説明文中の括弧内の数字は、遊離薬物としてかまたは結合体化形態での単回投与で与えられるカリケアマイシン量を示す。
【図２】図２は、ＣＤ３３−腫瘍を担持するマウスにおいて、時間の関数としての１２５Ｉ標識ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの分布を示し；図２Ａは腫瘍を示し、図２Ｂは血液を示し、図２Ｃは肝臓を示し、図２Ｄは脳を示し、図２Ｅは皮膚を示し、図２Ｆは脾臓を示し、図２Ｇは横紋筋を示し、図２Ｈは肺を示し、図２Ｉは腎臓を示し、図２Ｊは心臓を示し、そして図２Ｋは腸を示す。種々の正常な組織および腫瘍（Ａ４３１）異種移植片におけるｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの量は、全血中の結合体の量（白丸、Ｙ１軸、血液％）または注射した量（黒丸、Ｙ２軸、ＩＤ／ｇ％）に相対して存在する。全データの点は５つのサンプルの平均を反映し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図３】図３は、キャリアとしてｈｐ６７．６、ｇ５／４４およびリツキシマブを用いるカリケアマイシンの受動的ターゲティングによる腫瘍成長の阻害を示し；図３ＡはＮ８７異種移植片に対するｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨおよびリツキシマブ−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨを示し；図３ＢはＮ８７に対するｇ５／４４−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨおよびｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨを示し；そして図３ＣはＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４に対するｇ５／４４−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨおよびｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨを示す。結合体で処置された全群のマウスは、マウス１匹あたりＣａｌｉｃｈＤＭＨ４μｇの１用量の処置レジメンを受け、４日間隔で３回腹腔内投与された（Ｑ４Ｄ×３）。各点はｎ個の腫瘍測定値の平均を表し（説明文参照）、エラーバーは標準偏差を反映する。
【図４】図４は、ＨＳＡ、ＰＥＧ化ＦｃおよびＰＥＧ化ｈｐ６７．６のカリケアマイシン結合体による腫瘍成長阻害を実証する。Ａ４３１異種移植片の成長に及ぼすＭＯＰＣ−２１−ＡｃＰＡｃ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの影響（図４Ａ）を、ＨＳＡ−ＡｃＰＡｃ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの影響（図４Ｂ）と比較した。各点は５個（結合体処置）または１０個（ＰＢＳ）の異種移植片の平均腫瘍容積を表す。全群のマウスは、マウスあたり１用量の処置レジメンを受け、４日間隔で３回腹腔内投与された（Ｑ４Ｄ×３）。図の説明文中の括弧内の数字は単回投与で与えられるカリケアマイシンの量（μｇ／マウス）を示す。図４Ｃでは、ＰＥＧ化Ｆｃフラグメントのカリケアマイシン結合体によるＡ４３１異種移植片成長の阻害をｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨの阻害と比較した。各点は５個（結合体処置）または１０個（ＰＢＳ）の異種移植片の平均腫瘍容積を表す。Ｎ８７腫瘍異種移植片に対するｈｐ６７．６および抗体のＰＥＧ化形態の抗体（ｈｐ６７．６ＰＥＧＢ）のカリケアマイシン結合体の有効性もまた示す（図４Ｄ）。各点はＰＢＳまたはｈｐ６７．６ＰＥＧＢ−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨで処置した１０匹のマウスの群に関する腫瘍容積の平均、およびｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨで処置したマウスの群の７匹の平均を表す。図４Ｃおよび図４Ｄでは、全群のマウスは、マウスあたりＣａｌｉｃｈＤＭＨ４μｇの１用量の処置レジメンを受け、４日間隔で３回腹腔内投与された（Ｑ４Ｄ×３）。全パネルのエラーバーは標準偏差を反映する。
【図５】図５は、カリケアマイシンの受動的ターゲティングによる腫瘍成長の阻害がインビトロでカリケアマイシンに対する腫瘍細胞の感受性と相関することを示す。カリケアマイシンに対する腫瘍細胞系の感受性（Ｘ軸、図５Ａおよび５Ｂ）を、ＣａｌｉｃｈＤＭＨ（Ｙ１軸、図５Ａ）またはｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ（Ｙ１軸、図５Ｂ）のいずれかのＥＤ５０値として表す。各バーの最高値は少なくとも３つの別個のＥＤ５０測定値の中央値を反映する。腫瘍異種移植片のｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨに対する感受性をＴ／Ｃｍｉｎとして表現する（Ｙ２軸、図５Ａおよび５Ｂ）。Ｔ／Ｃｍｉｎ値（黒色菱形、波線の指数回帰曲線）は単一の実験（Ａ４３１／Ｌｅｙ、ＰＣ３ＭＭ２、ＫＢ８．５、ＨＴ２９）から得られた測定値または複数の実験（Ｎ８７［ｎ＝６］、ＰＣ１４ＰＥ６［ｎ＝３］、ＬＯＶＯ［ｎ＝３］、Ｌ２９８７［ｎ＝２］、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４［ｎ＝２］、Ａ４３１［ｎ＝３］、ＬＮＣａＰ［ｎ＝２］）の中央値のいずれかである。マウスあたりＣａｌｉｃｈＤＭＨ４μｇの１用量の処置レジメンで、４日間隔で３回腹腔内投与された（Ｑ４Ｄ×３）後に、ｈｐ６７．６−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨに関する全てのＴ／Ｃｍｉｎ−値を測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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