(57)【要約】本発明は、望ましいエフェクター機能を有する、非グリコシル化Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体）を産生する方法を提供する。本発明はまた、上記方法により産生された非グリコシル化抗体、ならびにそのような抗体を治療法として使用する方法を提供する。本発明は、Ｆｃ領域を含む親ポリペプチドの改変体ポリペプチドを提供する。このＦｃ領域は、好ましい側鎖化学を有する改変された第一のアミノ酸残基と、グリコシル化が減少した第二のアミノ酸残基とを含み、この改変体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して減少したエフェクター機能を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ領域を含む親ポリペプチドの改変体ポリペプチドであって、該Ｆｃ領域は、好ましい側鎖化学を有する改変された第一のアミノ酸残基と、グリコシル化が減少した第二のアミノ酸残基とを含み、該改変体ポリペプチドは、該親ポリペプチドと比較して減少したエフェクター機能を有する、改変体ポリペプチド。
【請求項２】
Ｆｃ領域を含む親ポリペプチドの改変体ポリペプチドであって、該Ｆｃ領域は、システインチオールを含む好ましい側鎖化学を有する改変された第一のアミノ酸残基と、グリコシル化が減少した第二のアミノ酸残基とを含み、該改変体ポリペプチドは、該親ポリペプチドと比較して減少したエフェクター機能を有する、改変体ポリペプチド。
【請求項３】
Ｆｃ領域を含むポリペプチドであって、該Ｆｃ領域は、好ましい側鎖化学を有する改変された第一のアミノ酸残基と、該第一のアミノ酸残基の改変を伴わないポリペプチドと比較してグリコシル化が減少した第二のアミノ酸残基とを含む、ポリペプチド。
【請求項４】
Ｆｃ領域を含む親ポリペプチドの改変体ポリペプチドであって、該Ｆｃ領域は、改変された第一のアミノ酸残基を含み、該改変された第一のアミノ酸は、第二のアミノ酸におけるグリコシル化の減少が達成されるように空間的に位置し、それによって、該改変体ポリペプチドは、該親ポリペプチドと比較して減少したエフェクター機能を有する、改変体ポリペプチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリペプチドであって、前記改変された第一のアミノ酸は、少なくとも１アミノ酸位置以上、少なくとも２アミノ酸位置以上、少なくとも３アミノ酸位置以上、少なくとも４アミノ酸位置以上、少なくとも５アミノ酸位置以上、少なくとも６アミノ酸位置以上、少なくとも７アミノ酸位置以上、少なくとも８アミノ酸位置以上、少なくとも９アミノ酸位置以上、および少なくとも１０アミノ酸位置以上からなる群より選択される間隔の分、前記第二のアミノ酸から離れて空間的に位置する、ポリペプチド。
【請求項６】
請求項４に記載のポリペプチドであって、前記改変された第一のアミノ酸残基は、好ましい側鎖化学を有する、ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜請求項３および請求項６のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記好ましい側鎖化学は、該ポリペプチドが減少したエフェクター機能を示すように、十分に立体的にかさ高い、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリペプチドであって、前記十分に立体的にかさ高い好ましい側鎖化学は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、およびＴｙｒからなる群より選択されるアミノ酸残基の側鎖化学である、ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜請求項３および請求項６のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記好ましい側鎖化学は、該ポリペプチドが減少したエフェクター機能を示すように、十分な静電荷を有す、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリペプチドであって、前記好ましい側鎖化学は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓからなる群より選択されたアミノ酸残基の側鎖化学である、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項３に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、減少したエフェクター機能を示す、ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１、請求項２、請求項４、および請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記減少したエフェクター機能は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）に対する減少した結合である、ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリペプチドであって、前記結合は、約１／１以下、約１／２以下、約１／３以下、約１／４以下、約１／５以下、約１／６以下、約１／７以下、約１／８以下、約１／９以下、約１／１０以下、約１／１５以下、約１／５０以下、および約１／１００以下からなる群より選択される度合いまで減少されている、ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリペプチドであって、前記Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩからなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１、請求項２、請求項４、および請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記減少したエフェクター機能は、補体タンパク質に対する減少した結合である、ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリペプチドであって、前記補体タンパク質は、Ｃ１ｑである、ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１５に記載のポリペプチドであって、前記補体タンパク質に対する減少した結合は、約１／１以下、約１／２以下、約１／３以下、約１／４以下、約１／５以下、約１／６以下、約１／７以下、約１／８以下、約１／９以下、約１／１０以下、および約１／１５以下からなる群より選択される度合いまでである、ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記第一のアミノ酸残基および第二のアミノ酸残基は、Ｎ結合グリコシル化モチーフの近くかまたはＮ結合グリコシル化モチーフ中にある、ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のポリペプチドであって、前記Ｎ結合グリコシル化モチーフはアミノ酸配列ＮＸＴまたはアミノ酸配列ＮＸＳを含む、ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリペプチドであって、前記Ｎ結合グリコシル化モチーフは、アミノ酸配列ＮＸＴを含む、ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記第一のアミノ酸残基は、アミノ酸置換によって改変されている、ポリペプチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載のポリペプチドであって、前記アミノ酸置換は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓからなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項２１に記載のポリペプチドであって、前記アミノ酸置換は、非伝統的なアミノ酸残基である、ポリペプチド。
【請求項２４】
請求項１〜請求項３および請求項６のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記好ましい鎖化学を有する第一のアミノ酸残基は、機能的部分に結合され得る、ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項２４に記載のポリペプチドであって、前記機能的部分は、遮断部分、検出可能部分、診断部分、および治療部分からなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項２６】
請求項２５に記載のポリペプチドであって、前記遮断部分は、システイン付加体、混合ジスルフィド、ポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコールマレイミドからなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項２７】
請求項２５に記載のポリペプチドであって、前記検出可能部分は、蛍光部分および同位体部分からなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２５に記載のポリペプチドであって、前記診断剤は、疾患または障害の存在を解明し得る、ポリペプチド。
【請求項２９】
請求項２５に記載のポリペプチドであって、前記治療部分は、抗炎症剤、抗癌剤、抗神経変性剤、および抗感染剤からなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記第二のアミノ酸残基は、カバット番号付けによるアミノ酸２９７である、ポリペプチド。
【請求項３１】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記改変された第一のアミノ酸残基は、カバット番号付けによるアミノ酸２９９である、ポリペプチド。
【請求項３２】
請求項２１に記載のポリペプチドであって、前記アミノ酸置換は、カバット番号付けによるＴ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｙ、Ｔ２９９Ｃ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９ＷおよびＴ２９９Ｖからなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項３３】
請求項３２に記載のポリペプチドであって、前記アミノ酸置換は、Ｔ２９９Ｃである、ポリペプチド。
【請求項３４】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、前記改変された第一のアミノ酸残基においてペグ化されている、ポリペプチド。
【請求項３５】
請求項３４に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、ＰＥＧ−マレイミドによってペグ化されている、ポリペプチド。
【請求項３６】
請求項１、および請求項３〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記改変された第一のアミノ酸残基は、システインまたは混合ジスルフィド付加体によって改変された、システイン残基である、ポリペプチド。
【請求項３７】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、抗体である、ポリペプチド。
【請求項３８】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選択される抗体から得られる、ポリペプチド。
【請求項３９】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、リガンド、サイトカイン、レセプター、細胞表面抗原、および癌細胞抗原からなる群より選択される抗原に結合する、ポリペプチド。
【請求項４０】
適切な薬学的キャリア中において請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項４１】
ヒト障害またはヒト疾患を処置または予防するための方法であって、該方法は、請求項４０に記載の治療有効量の薬学的組成物を投与し、該ヒト疾患またはヒト障害の治療または予防が達成されるようにする工程、方法。
【請求項４２】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項４３】
請求項４２に記載の核酸であって、前記コードされた第一のアミノ酸残基および第二のアミノ酸残基は、Ｎ結合グリコシル化モチーフの一部である、核酸。
【請求項４４】
請求項４３に記載の核酸であって、前記Ｎ結合グリコシル化モチーフは、アミノ酸配列ＮＸＴまたはアミノ酸配列ＮＸＳを含む、核酸。
【請求項４５】
請求項４２に記載の核酸であって、前記第二のアミノ酸残基は、カバット番号付けによるアミノ酸２９７である、核酸。
【請求項４６】
請求項４２に記載の核酸であって、前記グリコシル化され得る第二のアミノ酸残基は、２９７位にある、核酸。
【請求項４７】
請求項４２に記載の核酸であって、前記改変された第一のアミノ酸残基は、カバット番号付けによるアミノ酸２９９である、核酸。
【請求項４８】
請求項１６に記載の核酸であって、前記コードされた第一のアミノ酸残基は、アミノ酸置換によって改変されている、核酸。
【請求項４９】
請求項４８に記載の核酸であって、前記アミノ酸置換は、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｙ、Ｔ２９９Ｃ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９Ｗ、およびＴ２９９Ｖからなる群より選択される、核酸。
【請求項５０】
請求項４９に記載の核酸であって、前記改変された第一のアミノ酸残基は、Ｔ２９９Ｃである、核酸。
【請求項５１】
請求項４２に記載の核酸であって、前記好ましい側鎖化学を有するコードされた第一のアミノ酸残基は、機能的部分に結合され得る、核酸。
【請求項５２】
請求項４８に記載の核酸であって、前記機能的部分は、遮断部分、検出可能部分、診断部分、および治療部分からなる群より選択される、核酸。
【請求項５３】
請求項４２に記載の核酸であって、前記コードされたポリペプチドが、抗体である、核酸。
【請求項５４】
請求項５３に記載の核酸であって、前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選択される、核酸。
【請求項５５】
請求項４２に記載の核酸であって、前記コードされたポリペプチドは、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）に対する減少した結合を示す、核酸。
【請求項５６】
請求項５５に記載の核酸であって、前記Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩからなる群より選択される、核酸。
【請求項５７】
請求項４２に記載の核酸であって、前記コードされたポリペプチドは、補体タンパク質のＣ１ｑに対する減少した結合を示す、核酸。
【請求項５８】
請求項４２に記載の核酸であって、前記コードされたポリペプチドは、リガンド、サイトカイン、レセプター、細胞表面抗原、および癌細胞抗原からなる群より選択される抗原に結合する、核酸。
【請求項５９】
請求項４２に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項６０】
請求項４２に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項６１】
抗原結合ポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、請求項６０に記載の宿主細胞を、該宿主細胞によって該ポリペプチドを産生するために適切な条件下で培養する工程を包含する、方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、該方法は、前記宿主細胞培養から前記ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
【請求項６３】
Ｆｃ領域中でグリコシル化が減少した改変された抗原結合ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、
元のポリペプチド中の第一のアミノ酸残基と、該元のポリペプチドのＦｃ領域中でグリコシル化され得る第二のアミノ酸残基とを同定する工程であって、該第一のアミノ酸の改変は、第二のアミノ酸におけるグリコシル化を減少する、工程；
アミノ酸をその好ましい側鎖化学に関して選択する工程、および
該好ましい側鎖化学を含むように該第一のアミノ酸残基を改変して、改変されたポリペプチドを産生する工程であって、該Ｆｃ領域の第二のアミノ酸残基のグリコシル化は、該元のポリペプチドと比較して該改変されたポリペプチドにおいて減少される、工程、
を包含する、方法。
【請求項６４】
抗体のエフェクター機能を減少させる方法であって、該方法は、
該抗体のＦｃ領域中の第二のアミノ酸残基のグリコシル化を変更し得る、該抗体中の第一のアミノ酸残基を同定する工程；および
該第一のアミノ酸残基を、改変されていない抗体と比較して該改変されたポリペプチドにおいて該Ｆｃ領域の第二のアミノ酸残基のグリコシル化が減少されるように、かつ該改変されたアミノ酸が好ましい側鎖化学を有するように、改変する工程、
を包含する、方法。
【請求項６５】
請求項６３に記載の方法であって、該方法は、前記改変された抗原結合ポリペプチドが、変更されたエフェクター機能を示すか否かを確定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項６６】
請求項６３または請求項６４に記載の方法であって、前記同定する工程は、前記第一のアミノ酸が改変された場合に、前記Ｆｃ領域のアミノ酸の空間的な表示を決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項６７】
請求項６３または請求項６４に記載の方法であって、１つ以上の工程が、コンピューターによって補助される、方法。
【請求項６８】
請求項６３または請求項６４に記載の方法であって、前記第一のアミノ酸残基および第二のアミノ酸残基は、グリコシル化モチーフの中にあるかまたはグリコシル化モチーフに近い、方法。
【請求項６９】
請求項６８に記載の方法であって、前記グリコシル化モチーフは、アミノ酸配列ＮＸＴまたはアミノ酸配列ＮＸＳを含む、Ｎ結合グリコシル化モチーフである、方法。
【請求項７０】
請求項６３または請求項６４に記載の方法であって、前記第一のアミノ酸残基の改変は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、およびアミノ酸化学改変からなる群より選択される、方法。
【請求項７１】
請求項６３または請求項６４に記載の方法であって、好ましい側鎖化学に関して選択された前記第一のアミノ酸残基は、機能的エフェクター部分に結合され得る、方法。
【請求項７２】
請求項７１に記載の方法であって、前記機能的部分は、システイン付加体、ＰＥＧ−マレイミド、および治療部分からなる群より選択される、方法。
【請求項７３】
請求項６３または請求項６４に記載の方法であって、前記第二のアミノ酸残基は、カバット番号付けによるアミノ酸２９７である、方法。
【請求項７４】
請求項６３または請求項６４に記載の方法であって、前記改変された第一のアミノ酸残基は、カバット番号付けによるアミノ酸２９９である、方法。
【請求項７５】
請求項７０に記載の方法であって、前記アミノ酸残基置換は、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｙ、Ｔ２９９Ｃ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９Ｗ、およびＴ２９９Ｖからなる群より選択される、方法。
【請求項７６】
請求項７０に記載の方法であって、前記改変された第一のアミノ酸残基は、Ｔ２９９Ｃである、方法。
【請求項７７】
請求項６３または請求項６４に記載の方法であって、前記ポリペプチドは、変更されたエフェクター機能を示す、方法。
【請求項７８】
請求項７７に記載の方法であって、前記変更されたエフェクター機能は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）に対する減少した結合である、方法。
【請求項７９】
請求項７８に記載の方法であって、前記Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩからなる群より選択される、方法。
【請求項８０】
請求項７８に記載の方法であって、前記変更されたエフェクター機能は、補体タンパク質のＣ１ｑに対する減少した結合である、方法。
【請求項８１】
請求項６３〜請求項８０のいずれか１項に記載の方法によって産生された、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連情報）
本出願は、米国仮特許出願第６０／４９７，１９３号（２００３年８月２２日に申請）の優先権を主張し、この仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本明細書の全体にわたって引用されたいずれの特許、特許出願、および参考文献の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用されている。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
免疫応答は、体に侵入し、感染または疾患をもたらす外来物質に対して体がそれ自身を防御するメカニズムである。このメカニズムは、宿主の可変領域を通して抗原に結合するために、産生されまたは宿主に投与された、抗体の能力に基づく。一度抗原が抗体によって結合される場合、この抗原は、抗体の定常領域またはＦｃドメインによって、多くの場合部分的に媒介され、破壊の標的となる
例えば、上記抗体のＦｃドメインの活動の１つは、標的抗原（例えば、細胞病原体）を溶解することを補助し得る、補体タンパク質に結合することである。Ｆｃ領域の別の活動は、免疫細胞（または、いわゆるエフェクター細胞）の表面のＦｃレセプター（ＦｃＲ）に結合することであり、このエフェクター細胞は、他の免疫効果を誘発する能力を有する。これらの免疫効果としては、例えば、免疫活性物質の放出、抗体産生の調節、エンドサイトーシス、食菌作用、および細胞の死滅が挙げられる。いくつかの臨床上の適用において、これらの応答は、抗体の効力にとって重要であるが、他の場合において、これらは、望まれない副作用を引き起こす。エフェクターによって媒介された副作用の１つの例は、急性発熱反応をもたらす炎症サイトカインの放出である。別の例は、抗原保有細胞の長期欠失である。
【０００４】
抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、または単鎖抗体（ｓＦｖ））を欠く抗体フラグメントを使用することにより避けられ得るが、これらのフラグメントは、半減期の減少、２つの抗原結合部位の代わりに１つだけの抗原結合部位（例えば、Ｆａｂ抗体フラグメントおよび単鎖抗体（ｓＦｖ）の場合）を有し、そしてこれらのフラグメントを精製することは、より難しい。
【０００５】
現在、Ｆｃ領域の他の価値のある特質を保持しながら、抗体のエフェクター機能を減少させるには限定された方法がある。１つのアプローチは、エフェクター結合相互作用に関与する抗体の表面のアミノ酸を変異することである。ある変異は、エフェクター機能の減少に結び付くが、残りの活動は通常そのままである。その上、これらの添加された変異は、抗体を免疫原性にし得る。
【０００６】
エフェクター機能を減少させる別のアプローチは、Ｆｃ領域の特定の残基に結合される糖を、例えば、その糖が付着している残基を除去するかまたは変更することによってか、酵素的にその糖を除去することによってか、グリコシル化インヒビターの存在下で培養された細胞中に抗体を産生することによってか、あるいはタンパク質をグリコシル化し得ない細胞中で抗体を発現することによって、除去することである。しかし、前述のアプローチは、残基のエフェクター機能を補体依存性細胞溶解活性とＦｃレセプター結合との両方の形態のままにする。従って、エフェクター機能のさらなる減少が、活動の完全な除去を保証するために重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それゆえ、変更されたまたは減少したエフェクター機能を有する非グリコシル化抗体を産生する改良された方法に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、最小限の変更のみを導入し、非グリコシル化抗原結合タンパク質（例えば、非グリコシル化抗体、より具体的には、非グリコシル化ＩｇＧ抗体）を産生するための改良された方法を提供することによって、グリコシル化された抗体の（実際には、任意のＦｃ含有タンパク質の）前述の問題を解決する。特に、本発明は、第一のアミノ酸残基位においてアミン酸変更を導入し、異なるまたは第二のアミノ酸残基位におけるポリペプチドのグリコシル化の減少を生じるための方法を提供する。この第一のアミノ酸は、望ましい側鎖化学を含むように改変され得、それゆえ、それは、例えば、付加的機能的部分（例えば、遮断部分、検出可能部分、診断部分、または治療部分）に結合され得る。この結果として生じる非グリコシル化抗原結合ポリペプチド（例えば、非グリコシル化ＩｇＧ抗体）は、例えば、変更されたまたは減少したエフェクター機能を有する。このポリペプチドおよび本発明の方法によって提供された望まれないエフェクター機能の減少は、驚くべきことに、Ｆｃ領域をグリコシル化させない他の従来の手段よりも実質的であった。
【０００９】
それゆえ、本発明は、いくつかの利点を有し、この利点は、限定されないが、以下を含むものである：
−減少されたエフェクター機能のため、治療法として適切な、非グリコシル化抗原結合ポリペプチド（例えば、非グリコシル化ＩｇＧ抗体）を提供すること；
−ポリペプチドへ最小限の変更を伴い非グリコシル化抗体を産生する効率的な方法；
−望ましい機能的部分（例えば、遮断部分、検出可能部分、診断部分、または治療部分）に結合するための部位を提供しながらも、非グリコシル化抗体を産生する効率的な方法；
−免疫原性のいかなる増加を避けながら、抗体のエフェクター機能を変更する方法；および
−非グリコシル化抗原結合ポリペプチド治療を必要とする被験体を処置するための方法。
【００１０】
それゆえ、１つの局面において、本発明は、Ｆｃ領域を含むポリペプチド（または改変体ポリペプチド）を提供し、このＦｃ領域は、好ましい側鎖化学を有する改変された第一のアミノ酸残基と、改変されないポリペプチドまたは親ポリペプチドと比較してグリコシル化の減少した第二のアミノ酸残基とを有する。
【００１１】
ある実施形態において、第一のアミノ酸残基の側鎖化学は、付加的部分（すなわち、機能的部分（例えば、遮断部分、検出可能部分、診断部分、および／または治療部分））に結合（例えば、共有結合）され得る。
【００１２】
１つの実施形態において、機能的部分は、遮断部分であり、この部分は、第二のアミノ酸残基におけるポリペプチドのグリコシル化を阻害または遮断する。この遮断部分はまた、エフェクター機能を遮断するために（例えば、ポリペプチドのＦｃ領域のＦｃレセプターまたは補体タンパク質への結合を遮断することにより）機能し得る。
【００１３】
好ましい実施形態において、遮断部分は、システイン付加体であり、このシステイン付加体は、第一のアミノ酸残基が、システインであるかまたはチオールを含む側鎖化学を有する場合に形成される。
【００１４】
ある実施形態において、第一のアミノ酸は、システイン、システイン付加体、シスチン、混合ジスルフィド付加体、またはジスルフィド結合を含む。
【００１５】
別の好ましい実施形態において、遮断部分は、ポリアルキレングリコール部分（例えばＰＥＧ部分および、好ましくはＰＥＧ−マレイミド部分）である。
【００１６】
関連する実施形態において、ポリペプチドの第一のアミノ酸には、システインがあり、またはチオールを含む側鎖化学を有し、そしてＰＥＧ部分がそこに付着される。
【００１７】
ある実施形態において、システインまたはチオール側鎖化学は、そのようなシステイン付加体、シスチン、混合ジスルフィド付加体、またはジスルフィド結合を除去するように減少され、そしてＰＥＧ部分が、続いて、システイン残基またはチオール側鎖に付着される。
【００１８】
別の実施形態において、機能的部分は、検出可能部分（例えば、限定されないが、蛍光部分または同位体部分）である。
【００１９】
別の実施形態において、機能的部分は、疾患または障害の存在を解明し得る部分である、診断部分である。
【００２０】
別の実施形態において、機能的部分は、治療部分（例えば、限定されないが、抗炎症剤、抗癌剤、抗神経変性剤、または抗感染剤）である。
【００２１】
別の局面において、親ポリペプチドの改変体ポリペプチドは、改変された第一のアミノ酸残基を有するＦｃ領域を含み、この改変された第一のアミノ酸は、第二のアミノ酸におけるグリコシル化の減少が達成されるように、空間的に位置する。好ましい実施形態において、非グリコシル化改変体ポリペプチドはまた、親ポリペプチドと比較して減少したエフェクター機能を有する。
【００２２】
関連する実施形態において、改変された第一のアミノ酸は、少なくとも１アミノ酸位置以上（例えば、約２アミノ酸残基位以上、約３アミノ酸残基位以上、約４アミノ酸残基位以上、約５アミノ酸残基位以上、約６アミノ酸残基位以上、約７アミノ酸残基位以上、約８アミノ酸残基位以上、約９アミノ酸残基位以上、または約１０アミノ酸残基位以上）の間隔の分、第二のアミノ酸から離れて空間的に位置する。
【００２３】
１つの実施形態において、改変された第一のアミノ酸残基は、好ましい側鎖化学を有する。関連する実施形態において、好ましい側鎖化学は、十分に立体的にかさ高くおよび／または十分な電荷を有し、それゆえこのポリペプチドは、グリコシル化の減少および／またはエフェクター機能の減少を示す。
【００２４】
１つの実施形態において、減少したエフェクター機能は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、および／またはＦｃγＲＩＩＩｂ）に対する減少した結合である。
【００２５】
別の実施形態において、減少したエフェクター機能は、補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に対する減少した結合である。
【００２６】
関連する実施形態において、減少した結合は、約１／１から約１／１５以下の度合いまでである。
【００２７】
別の実施形態において、ポリペプチドは、グリコシル化モチーフ（例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはアミノ酸配列ＮＸＳを含むＮ結合グリコシル化モチーフ）の近くかまたはその中にある第一のアミノ酸残基および第二のアミノ酸残基を有する。特定の実施形態において、本方法のポリペプチドは、アミノ酸置換によって改変された第一のアミノ酸残基を有する。関連する実施形態において、カバット番号付けによると、第一のアミノ酸残基は、アミノ酸２９９であり、そして第二のアミノ酸残基は、アミノ酸２９７である。
【００２８】
別の実施形態において、アミノ酸置換は、カバット番号付けによるＴ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｙ、Ｔ２９９Ｃ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９Ｗ、およびＴ２９９Ｖからなる群より選択される。
【００２９】
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｔ２９９ＣまたはＴ２９９Ａである。
【００３０】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、改変された第一のアミノ酸残基（例えば、システイン残基）において、および特にＰＥＧ−マレイミドによって、ペグ化される。
【００３１】
好ましい実施形態において、ポリペプチドは、抗体（例えば、抗体（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４、および好ましくは、ＩｇＧｌまたはＩｇＧ４）から得られたＦｃ領域を有する抗体）である。
【００３２】
なお別の実施形態において、前述のポリペプチドは、変更されたエフェクター機能（例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）に対する減少した結合、または補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に対する減少した結合）を示す。
【００３３】
別の実施形態において、前述のポリペプチドは、抗原（例えば、リガンド、サイトカイン、レセプター、細胞表面抗原、または癌細胞抗原）に結合する。
【００３４】
別の実施形態において、前述のポリペプチドは、適切な薬学的キャリア中にある。
【００３５】
別の局面において、本発明は、前述のポリペプチドのいずれか１つをコードする単離された核酸を提供し、この核酸は、ベクター中でコードされ得、それゆえ、例えば、同一のものをコードする核酸またはベクターが、宿主細胞中に発現され得る。
【００３６】
別の局面において、本発明は、ポリペプチドを産生するために適切な培養条件下で、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む外来宿主細胞を培養することによる、抗原結合ポリペプチドを産生するための方法を提供し、この方法に、例えば、この宿主細胞培養由来のポリペプチドを回収する工程が後に続く。
【００３７】
別の局面において、本発明は、Ｆｃ領域においてグリコシル化が減少した、改変された抗原結合ポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法において、元のポリペプチド中の元の第一のアミノ酸残基と元のポリペプチドのＦｃ領域においてグリコシル化され得る第二のアミノ酸残基とを同定し、そして改変されたポリペプチド中に改変された第一のアミノ酸を産生するために元のポリペプチド中の元の第一のアミノ酸残基を改変し、それゆえＦｃ領域の第二のアミノ酸残基のグリコシル化が、元のポリペプチドまたは親ポリペプチドと比較して改変されたポリペプチドまたは改変体ポリペプチドにおいて減少する。
【００３８】
１つの実施形態において、上記方法は、改変された抗原結合ポリペプチドが変更されたエフェクター機能を示すか否かを確定する工程を包含し得る。
【００３９】
別の局面において、本発明は、改変された場合に抗体のＦｃ領域の第二のアミノ酸残基のグリコシル化を変更し得る、抗体の第一のアミノ酸残基を同定することにより、エフェクター機能を減少する方法を提供する。改変される第一のアミノ酸残基の同定は、例えば、モデル化のためのソフトを認識する技術を使用して、コンピューターによって補助され得る。次いで、この第一のアミノ酸残基は、Ｆｃ領域の第二のアミノ酸残基のグリコシル化が、改変されていない親抗体と比較して改変された抗体中で減少されるように、改変される。
【００４０】
別の局面において、本発明は、いずれかの１つの前述の方法によって産生されたポリペプチドを提供する。
【００４１】
別の局面において、本発明は、グリコシル化が減少したおよび／またはエフェクター機能が減少した本発明のポリペプチドを投与することによって動物（例えば、ヒト患者）の疾患または障害を診断、処置、または予防する方法を提供する。
【００４２】
本発明の他の特徴および利点は、添付の詳細な説明および特許請求の範囲から明白である。
【００４３】
（発明の詳細な説明）
本明細書および特許請求の範囲の明確な理解を提供するために、次ぎの定義が、以下に便宜上提供される。
【００４４】
（定義）
用語「抗体」とは、モノクローナル抗体（全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、およびこれらのフラグメント（、グリコシル化の減少および／またはエフェクター機能の減少が、望ましい）、例えば、抗体軽鎖（ＶＬ）、抗体重鎖（ＶＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、および単一ドメイン抗体フラグメント（ＤＡｂ）を含む。
【００４５】
用語「親抗体」とは、グリコシル化、エフェクター機能の改変が望まれており、および／または例えば、機能的部分を添加するために好ましいまたは望ましい側鎖化学の提供が望まれている、任意の抗体を含む。従って、親抗体は、本発明の方法が実行される元の抗体を示す。この親ポリペプチドは、ネイティブの配列（すなわち、天然に存在する）抗体（天然に存在する対立改変体を含む）、または天然に存在する配列のうちの既に存在するアミノ酸配列の改変を有する抗体（例えば、挿入、欠失および／または他の変更）を含み得る。親抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。
【００４６】
用語「抗体改変体」または「改変された抗体」とは、本明細書において記載されるように少なくとも1つのアミノ酸またはアミノ酸改変によって、親抗体のアミノ酸配列またはアミノ酸側鎖化学と異なるアミノ酸配列またはアミノ酸側鎖化学を有する抗体を含む。好ましい実施形態において、抗体改変体は、親抗体と比較してグリコシル化が減少しおよび、必要に応じて、エフェクター機能が減少し、ならびに／あるいはさらに１つ以上の機能的部分を含む。
【００４７】
用語「第一のアミノ酸残基」とは、アミノ酸残基の挿入、置換、もしくは欠失によってか、または存在するアミノ酸残基の側鎖化学を直接的に変更することによって改変される、ポリペプチドのアミノ酸残基（または位）をいい、それゆえこの改変されたアミノ酸残基（または残基位）は、異なり、そしてそれによって、第二のアミノ酸残基のグリコシル化を減少するかまたは除去する。好ましくは、第一のアミノ酸の改変は、ポリペプチドのグリコシル化および／またはエフェクター機能に影響を与えながら（そして必要に応じて機能的部分に結合するための部位を提供しながら）、この改変は、ポリペプチドの他の望ましい機能を顕著に変更せず、それに付着した機能的部分もポリペプチドの他の望ましい機能を顕著に変更しない。例えば、Ｆｃ含有ポリペプチドが抗体である場合、第一のアミノ酸の改変は、抗体の抗原結合活性を顕著に変更しない。
【００４８】
用語「第二のアミノ酸残基」とは、１以上の（例えば、グリコシル化された）炭水化物に共有結合し得るポリペプチドのアミノ酸残基をいう。
【００４９】
用語「好ましい側鎖化学」とは、ポリペプチドに望ましい特徴を与える化学（例えば、アミノ酸残基側鎖またはＲ基化学）をいう。好ましい側鎖化学は、アミノ酸置換によって、化学的置換によって第一のアミノ酸位置に導入され、それゆえその側鎖化学は改変され、あるいは好ましい側鎖化学は、アミノ酸付加または欠失によって第一のアミノ酸位置に導入され、それゆえ異なるアミノ酸側鎖化学は、第一のアミノ酸位置に提供される。本明細書に記載されるように、親抗体の側鎖化学の改変（それゆえ、好ましい側鎖化学を含む）は、第二のアミノ酸位置におけるグリコシル化を減少し、エフェクター機能の減少をもたらす。この改変はまた、望ましい機能的部分に結合するための部位を提供する。ある実施形態において、好ましい側鎖化学に関する確定は、インシリコによってか、または第一のアミノ酸位置に導入される（例えば、置換によって）側鎖化学の立体的かさ高さおよび／もしくは電荷を確定するためのコンピューターに基づくアプローチによって伝えられ得る。
【００５０】
用語「アミノ酸」とは、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リジン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；およびバリン（ＶａｌまたはＶ）を含む。非伝統的アミノ酸はまた、本発明の範囲内であり、そしてノルロイシン、オミチン（ｏｍｉｔｈｉｎｅ）、ノルバリン、ホモセリン、および他のアミン酸残基類似体（例えば、Ｅｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１））を含む。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）およびＥｌｌｍａｎら、（前出）の手順が使用され得る。簡潔に、これらの手順は、天然に存在しないアミノ酸残基とともにサプレッサｔＲＮＡを化学的に活性し、そのＲＮＡのインビトロ転写および翻訳が続くことに関与する。非伝統的なアミノ酸の導入はまた、当該分野において公知のペプチド化学を使用して達成され得る。
【００５１】
用語「好ましい側鎖化学は、十分に立体的にかさ高い」とは、Ｆｃ含有ポリペプチドのグリコシル化および／またはそのエフェクター機能を阻害するために、十分に立体的にかさ高いアミノ酸残基の側鎖化学を含む。そのような残基としては、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、グルタミン、およびメチオニン、またはこれらの類似体またはこれらの模倣体が挙げられる。
【００５２】
用語「好ましい側鎖化学は、十分な電荷を有する」または「静電荷」とは、Ｆｃ含有ポリペプチドのグリコシル化および／またはそのエフェクター機能を阻害するために、十分な電荷を有するアミノ酸残基の側鎖化学を含む。そのような残基としては、例えば、負に荷電したアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはこれらの類似体またはこれらの模倣体）および正に荷電したアミノ酸残基（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、およびこれらの類似体またはこれらの模倣体）が挙げられる。
【００５３】
用語「好ましい側鎖化学は、十分に立体的にかさ高く、そして十分な電荷を有する」とは、Ｆｃ含有ポリペプチドのグリコシル化および／またはそのエフェクター機能を阻害するために、十分に立体的にかさ高くおよび十分な電荷を有するアミノ酸残基の側鎖化学を含む。そのような残基としては、例えば、リジン、アルギニン、チロシン、およびこれらの類似体またはこれらの模倣体が挙げられる。
【００５４】
本明細書において使用される場合、用語「十分に」とは、概して、Ｆｃ含有ポリペプチド中の以下の少なくとも１つを達成する、本明細書において記載される好ましい改変をいう：ポリペプチドのグリコシル化の減少；ポリペプチドのエフェクター機能の減少；および／または機能的部分に結合するための部位の提供。
【００５５】
用語「機能的部分」とは、好ましくは、改変体ポリペプチドに望ましい機能を添加する部分を含む。好ましくは、この機能は、ペプチドの内因的な望ましい活性（例えば、抗体の場合、分子の抗原結合活性）を顕著に変更することなし添加される。本発明の改変体ポリペプチドは、同じかまたは異なり得る１つ以上の機能的部分を含み得る。有用な機能的部分の例としては、限定されるのではなく、遮断部分、検出可能部分、診断部分、および治療部分が挙げられる。模範的な遮断部分は、十分に立体的にかさ高いおよび／または十分な電荷を有する部分を含み、それゆえグリコシル化の減少は、例えば、ポリペプチドをグリコシル化するグリコシダーゼの能力を遮断することによって起こる。遮断部分は、さらにまたは代替的に、例えば、レセプターまたは補体タンパク質に結合するＦｃ領域の能力を阻害することによりエフェクター機能を減少し得る。好ましい遮断部分は、システイン付加体、シスチン、混合ジスルフィド付加体、およびＰＥＧ部分を含む。模範的な検出可能部分としては、蛍光部分、ラジオ同位体部分、ラジオパク部分などが挙げられる。模範的な診断部分は、疾患または障害の指標の存在を解明するために適切な部分を含む。模範的な治療部分は、例えば、抗炎症剤、抗癌剤、抗神経変性剤、および抗感染剤を含む。機能的部分はまた、１つ以上の上に述べた機能を有し得る。他の有用な機能的部分は、当該分野において公知であり、以下に説明される。
【００５６】
用語「ペグ化」、「ポリエチレングリコール」、または「ＰＥＧ」とは、カップリング剤を有するかもしくは有さない、またはカップリング部分もしくは活性化部分（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アジリジン、オキシラン、または好ましくはマレイミド部分（例えば、ＰＥＧ−マレイミド））との誘導体化を有するかもしくは有さない、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を含む。他の適切なポリアルキレングリコール化合物は、限定されないが、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｏ）モノメトキシＰＥＧ、活性化ＰＥＧポリプロピレングリコールを含み、そしてまた以下のタイプの荷電したポリマーまたは中性ポリマーを含む：デキストラン、コロミン酸、または他の炭水化物に基づくポリマー、アミノ酸のポリマー、およびビオチン誘導体。
【００５７】
用語「空間的に位置する」とは、ポリペプチド中の改変された第一のアミノ酸位置と第二のアミノ酸位置との間の相対位または相対距離を含み、第一のアミノ酸位置を改変することにより第二のアミノ酸位置におけるグリコシル化を変更するかまたは減少することが望ましい。約１アミノ酸位置以上、約２アミノ酸位置以上、約３アミノ酸位置以上、約４アミノ酸位置以上、約５アミノ酸位置以上、約６アミノ酸位置以上、約７アミノ酸位置以上、約８アミノ酸位置以上、約９アミノ酸位置以上、約１０アミノ酸位置以上、約１０〜２０アミノ酸位置以上のアミノ酸の距離、または前述の範囲の任意の間隔は、本発明の範囲内である。第一のアミノ酸および第二のアミノ酸の望ましい空間的位置付けが望ましい効果（例えば、グリコシル化の減少および／またはエフェクター機能の減少）を達成することを確定する方法は、当該分野において公知であり、そして本明細書において記載される（例えば、実施例１および実施例４を参照のこと）。
【００５８】
用語「エフェクター機能」とは、免疫系のタンパク質および／または細胞を結合する抗体のＦｃ領域または定常領域の機能的能力をいう。代表的なエフェクター機能は、補体タンパク質（例えば、補体タンパク質Ｃ１ｑ）、および／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、および／またはＦｃγＲＩＩＩｂ）に結合する能力を含む。１つ以上の前述のものに結合し得る機能的結果としては、オプソニン作用、食菌作用、抗原依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）および／またはエフェクター細胞調節が挙げられる。エフェクター機能の減少とは、抗体（またはそのフラグメント）の可変領域の抗原結合活性を維持しながら、１つ以上の生化学的活性または細胞活性の減少をいう。エフェクター機能（例えば、Ｆｃレセプターまたは補体タンパク質へのＦｃ結合）の減少は、減少の度合い（例えば、１／１、１／２、など、まで減少される）の見地から表され得、そして例えば、本明細書において記載されるアッセイ（例えば、実施例４を参照のこと）または当該分野において公知のアッセイを使用して決定させる結合活性のパーセント減少に基づいて計算され得る。
【００５９】
用語「グリコシル化」とは、ポリペプチドへの１つ以上の炭水化物の共有結合をいう。代表的には、グリコシル化は、翻訳後の事象であり、これは、細胞またはそこからの抽出物の細胞内の環境中で起こり得る。用語、グリコシル化とは、例えば、Ｎ結合グリコシル化（１つ以上の糖がアスパラギン残基に結合される場合）および／またはＯ結合グリコシル化（１つ以上の糖がヒドロキシル基（例えば、セリンまたはスレオニン）を有するアミノ酸残基に結合される場合）を含む。
【００６０】
本明細書において、ポリペプチドのＦｃ領域に関する全てのアミノ酸の番号付けは、例えば、Ｋａｂａｔら、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ"、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９８３および１９８７に記載されるカバット番号付けシステムに対応する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
（詳細な説明）
方法が、第二のアミノ酸残基におけるグリコシル化を阻害する第一のアミノ酸残基を変更することにより、非グリコシル化抗原結合ポリペプチド（例えば、抗体またはＦｃ含有融合タンパク質）を産生するために発展してきた。この方法は本質的に、ポリペプチドへ最小限のアミノ酸変更のみを有する真核生物細胞の治療用の非グリコシル化Ｆｃ含有ポリペプチドを産生するために特によく適している。それによって、本発明の方法は、免疫原であり得るポリペプチドアミノ酸配列に導入することを避ける。
【００６２】
好ましくは、第一のアミノ酸の改変は、ポリペプチドのグリコシル化および／またはエフェクター機能に影響を与えながら（および必要に応じて機能的部分に結合するための部位を提供しながら）、ポリペプチドの他の望ましい機能を顕著に変更せず、そこに付着した機能的部分も変更しない。例えば、Ｆｃ含有ポリペプチドが抗体である場合、第一のアミノ酸の改変は、抗体の抗原結合活性を顕著に変更しない。
【００６３】
それゆえ、変更されたまたは減少したエフェクター機能が望ましい場合、本方法は、治療用の抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）を産生するために適切である。変更したまたは減少したエフェクター機能は、本発明の方法（図１）を使用して、抗体のＦｃ領域のグリコシル化を減少または除去することによって達成される。特に、第一のアミノ酸残基は、第二のアミノ酸残基のグリコシル化を阻害する改変（例えば、置換、挿入、欠失、または化学的改変による）の標的にされる。結果として生じる抗体は、第二のアミノ酸残基においてグリコシル化されず、そして変更したまたは減少したエフェクター機能（例えば、補体結合活性またはエフェクター細胞活性（例えば、Ｆｃレセプターへの結合））を有する。
【００６４】
ある実施形態において、減少したエフェクター機能は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）（例えば、ＦｃγＲＩレセプター、ＦｃγＲＩＩレセプター、ＦｃγＲＩＩＩレセプター、および／またはＦｃγＲＩＩＩｂレセプター）または補体タンパク質（例えば、補体タンパク質Ｃ１ｑ）に対する減少した結合である。結合に関するこの変化は、約１／１以下（例えば、約１／２以下、約１／３以下、約１／４以下、約１／５以下、約１／６以下、約１／７以下、約１／８以下、約１／９以下、約１／１０以下、約１／１５以下、約１／５０以下、または約１／１００以下）の度合いまでかまたはその間隔もしくはその範囲までであり得る。
【００６５】
エフェクター機能（例えば、Ｆｃレセプターまたは補体タンパク質に対するＦｃ結合）におけるこれらの減少は、例えば、本明細書において記載されるアッセイ（例えば、実施例４を参照のこと）または当該分野において公知のアッセイを使用して決定させる結合活性のパーセント減少に基づいて容易に計算される。
【００６６】
別の実施形態において、第一のアミノ酸残基は、十分に立体的にかさ高いおよび／または十分な電荷を有する好ましい側鎖化学を含むように改変されまたは置換され、それゆえグリコシル化の減少およびまたはエフェクター機能の減少が達成される。
【００６７】
十分に立体的にかさ高い側鎖化学を有する模範的なアミノ酸残基としては、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、グルタミン、およびメチオニン、またはこれらの類似体またはこれらの模倣体が挙げられる。
【００６８】
十分な電荷を有する模範的なアミノ酸残基としては、例えば、負に荷電したアミノ残基（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸類似体またはこれらの模倣体）および正に荷電したアミノ酸残基（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、およびこれらの類似体またはこれらの模倣体）が挙げられる。
【００６９】
さらに、生理的ｐＨを変更する環境に存在する場合、生理的ｐＨにて荷電されていないアミノ酸残基は、荷電し得る（例えば、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、およびこれらの類似体またはこれらの模倣体）。例えば、荷電されていないアミノ酸残基は、折りたたまれたタンパク質の内側に埋められ、そしてｐＫａの移動を経験し得、それによって生理的ｐＨにおける電荷と比較して、残基の電荷を変更し得る。
【００７０】
１つの実施形態において、好ましいアミノ酸残基は、十分に立体的にかさ高くそして十分な電荷を有し、それゆえこの残基は、第二のアミノ酸位置におけるグリコシル化を阻害する。そのようなアミノ酸としては、例えば、リジン、アルギニン、およびチロシンが挙げられる。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態において、改変されるアミノ酸残基は、付加的特性（例えば、ポリペプチドに対して望ましい特性を与える望ましい機能的部分を結合するための部位として役立つ）に関して選択され得る。そのような好ましい部分の例としては、例えば、遮断部分、検出可能部分、診断部分、および治療部分が挙げられる。
【００７２】
別の実施形態としては、親ポリペプチドの改変体ポリペプチドは、改変された第一のアミノ酸残基を含むＦｃ領域を含み、この改変された第一のアミノ酸は、空間的に位置し、それゆえ第二のアミノ酸においてグリコシル化の減少が達成され、それによって改変体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して減少したエフェクター機能を有する。
【００７３】
好ましい空間的位置付けは、第一のアミノ酸の第二のアミノ酸に対する予測された近接性ならびに第一のアミノ酸位置に導入される好ましい側鎖化学の立体的かさ高さおよび／または電荷に基づき得る。あるいは、最適な空間的位置付けに関する確定は、１位以上の好ましいアミノ酸側鎖化学の置換後の経験的な観察によるか、ならびに／あるいはインシリコまたは立体的かさ高さ、電荷、および／または第二のアミノ酸位置からの第一のアミノ酸位置の距離を確定するためのコンピューターに基づくアプローチを認識する技術を使用して、伝えられ得る。約１残基位以上、約２残基位以上、約３残基位以上、約４残基位以上、約５残基位以上、約６残基位以上、約７残基位以上、約８残基位以上、約９残基位以上、約１０残基位以上、約１０〜２０残基位以上のアミノ酸の距離、または前述の範囲の任意の間隔は、本発明の範囲内である。従って、ある好ましい実施形態において、改変された第一のアミノ酸は、少なくとも１アミノ酸位置以上（例えば、２アミノ酸位置以上、３アミノ酸位置以上、４アミノ酸位置以上、５アミノ酸位置以上、６アミノ酸位置以上、７アミノ酸位置以上、８アミノ酸位置以上、９アミノ酸位置以上、または１０アミノ酸位置以上）の間隔の分、第二のアミノ酸から離れて空間的に位置する。
【００７４】
第一のアミノ酸および第二のアミノ酸の望ましい空間的位置付けが、望ましい効果（例えば、グリコシル化の減少および／またはエフェクター機能の減少）を達成することを確定する方法が、本明細書において記載される（例えば、実施例１および実施例４を参照のこと）。
【００７５】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば抗体、そして好ましくはＩｇＧ免疫グロブリン（例えば、そのサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４、そして好ましくはサブタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４））である。好ましい実施形態において、前述のポリペプチドは、抗原（例えば、リガンド、サイトカイン、レセプター、細胞表面抗原、または癌細胞抗原）に結合する。
【００７６】
本発明は前述のポリペプチドのいずれか１つをコードする単離された核酸を提供するので、この核酸は、ベクターに導入され得、そして宿主細胞中に発現され得る。それゆえ、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドを産生するための適切な培養条件下で、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む適切な宿主細胞を培養することによって産生され得る。
【００７７】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、システイン残基またはその側鎖化学（すなわち、チオール）を有するように改変された第一のアミノ酸を有し、それゆえこのポリペプチドは、上記培養条件下で、その培養条件下において提供された遊離システインを有する付加体を形成し得る。好ましい実施形態において、その結果として生じるポリぺプチドは、等価の減少およびエフェクター機能の減少を有する。
【００７８】
関連する実施形態において、上記ポリペプチドは、さらに操作され得（例えば、還元条件を受ける）、それゆえシステイン付加体、シスチン、混合ジスルフィド付加体、またはジスルフィド結合は除去され、それによって機能的部分（例えば、ペグ化部分）を有するポリペプチドをさらに改変するための部位を提供する。
【００７９】
別の実施形態において、ポリペプチドは、グリコシル化モチーフ（例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはアミノ酸配列ＮＸＳを含むＮ結合グリコシル化モチーフ）の近くかまたはその中の第一のアミノ酸残基および第二のアミノ酸残基を有する。特定の実施形態において、本方法のポリペプチドは、アミノ酸置換によって改変された第一のアミノ酸残基を有する。関連する実施形態において、カバット番号付けによると、第一のアミノ酸残基は、アミノ酸２９９であり、そして第二のアミノ酸残基は、アミノ酸２９７である。
【００８０】
別の実施形態において、アミノ酸置換は、カバット番号付けによるＴ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｙ、Ｔ２９９Ｃ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９Ｗ、およびＴ２９９Ｖからなる群より選択される。
【００８１】
特定の実施形態によると、アミノ酸置換は、Ｔ２９９ＣまたはＴ２９９Ａである。
【００８２】
本明細書において記載される本発明の方法は、Ｆｃ領域（アミノ酸２９７）（図１〜２）の特定の残基において通常Ｎグリコシル化されるＩｇＧ抗体を使用するが、この方法は、任意のポリペプチド中のＦｃ領域に平等に適用され得ると理解される。ポリペプチドが抗体である場合、この抗体は、人工のものか、天然に由来するか（例えば、血清から）、細胞株によって産生されるか（例えば、ハイブリドーマ）、またはトランスジェニック生物体中に産生され得る。なおさらに、この方法はまた、ポリペピチドが少なくとも１つのグリコシル化部位を含む場合、Ｆｃ領域を含まないポリペプチドに適用され得る。
【００８３】
上記方法は、現在の変異誘発方法においていくつかの利点を提供するのは、例えば、この方法は、最小限に混乱を起こさせる方法で（図２、左のパネル）（例えば、通常グリコシル化される残基の変異、グリコシル化部位の欠失、または糖部分の酵素的除去を伴わない）、ポリペプチドのグリコシル化を阻害するように使用され得るからである。それゆえ、このポリペプチドの構造は維持され、このポリペプチドの抗原に対する結合親和性が維持され、このポリペプチドの免疫原性が回避され、そしてこのポリペプチドは、もし所望ならば、望ましい機能的部分に結合され得る（図２、右のパネル）。そのような機能的部分はさらに、エフェクター機能を排除し得、またはポリペプチドの半減期を改良し得、または望ましい治療機能を達成し得る。その上、本発明の方法は、標準的な遺伝子操作技術を使用して実行され得る。
【００８４】
（１．グリコシル化部位の同定）
本方法は、Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体、１つの実施形態においてはＩｇＧ抗体）のグリコシル化部位を同定することによって実行される。グリコシル化部位の同定は、実験的であり得るかまたは配列分析もしくはモデル化のためのデータに基づき得る。コンセンサスモチーフ（すなわち、種々のグリコシルトランスフェラーゼによって認識されるアミノ酸配列）が、説明されている。例えば、Ｎ結合グリコシル化モチーフのためのコンセンサスモチーフは、頻繁にＮＸＴまたはＮＸＳであり、Ｘは、プロリンを除いた任意のアミノ酸であり得る（図２）。潜在的なグリコシル化モチーフを位置付けるためのいくつかのアルゴリズムがまた、記載されている。それゆえ、抗体またはＦｃ含有フラグメント中の潜在的なグリコシル化部位を同定するために、抗体の配列が、例えば、公に入手可能なデータベース（例えば、ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓによって提供されるウェブサイト(Ｎ結合グリコシル化部位を予測するためにｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／およびＯ結合グリコシル化部位を予測するためにｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ／を参照のこと)）を使用することによって調べられる。抗体のグリコシル化部位を変更するためのさらなる方法は、例えば、米国特許第６，３５０，８６１号および同第５，７１４，３５０号に記載されている。
【００８５】
ある場合には、所定のモチーフのグリコシル化は、タンパク質の他の特性、細胞または細胞抽出物の種類、および抗体が産生されるまたは抗体がそのような細胞もしくは抽出物と接触される条件に依存する。所定の細胞または抽出物が所定のモチーフのグリコシル化をもたらす程度に、このモチーフがグリコシル化されているか否かを確定するための技術を認識する技術は、例えば、本明細書中に記載されたようなゲル電気泳動および／または質量分光法を使用して、入手可能である。
【００８６】
実際のまたは潜在的なグリコシル化モチーフの同定はまた、糖が共有結合される残基を解明する。例えば、Ｎ結合グリコシル化は、アスパラギン残基における末端側鎖窒素への糖残基（グリカン）の結合をもたらす。別の例において、Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシル側基（例えば、セリンまたはスレオニン）を有するアミノ酸残基への糖残基（グリカン）の共有結合をもたらす。どちらかの場合においても、本発明の方法は、１つ以上の糖が共有結合される残基を変更しない。むしろ、本発明の方法は、シスにおいて作動するメカニズムによって糖残基に通常共有結合される残基と異なる残基の変更を利用し、それによって糖への結合し得る（すなわち、グリコシル化された）実際の残基の変更を必要とすることなしに、残基への１つ以上の糖の連結を阻害する。
【００８７】
本発明の方法は、真核生物細胞を使用した非グリコシル化ポリペプチドの生物生産を含む、種々の使用へ適用可能である。そのような非グリコシル化ポリペプチド（例えば、抗体）は、ヒト疾患の処置のための望ましい治療法である。
【００８８】
（２．変更されたＦｃ領域を有する抗体の産生）
改良される抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または人工抗体）を選択し、種々の方法が、そのような抗体を産生するために入手可能である。コードの変質のため、種々の核酸配列が、各抗体アミノ酸配列をコードする。望ましい核酸配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成によってかまたは抗体をコードする早期に調製されたポリヌクレオチドのＰＣＲ突然変異誘発によって産生され得る。オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発は、第二の（通常、近接した）アミノ酸のグリコシル化を減少する変更（例えば、変更されたコドン）の置換、欠失、または挿入を調製するための１つの方法である。例えば、標的ポリペプチドＤＮＡは、単鎖ＤＮＡテンプレートに望ましい変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブッド形成することによって変更される。ハイブリッド形成の後、ＤＮＡポリメラーゼが、オリゴヌクレオチドプライマーを取り込むテンプレートの全体の第二の相補鎖を合成するために使用され、そして改変体ポリペプチドＤＮＡ中に選択された変更をコードする。１つの実施形態において、遺伝子工学（例えば、プライマーに基づくＰＣＲ突然変異誘発）は、真核生物細胞中において発現される場合、非グリコシル化領域（例えば、非グリコシル化Ｆｃ領域）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを産生するための、本明細書に規定されるような第一のアミノ酸を変更するのに差し支えない。上述のように産生された抗体は、代表的には、ヒト定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部（代表的には、ヒト免疫グロブリンの一部）を含む。通常、抗体は、軽鎖定常領域と重鎖定常領域との両方を含む。この重鎖定常領域は、通常ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む。しかし、本明細書において記載された抗体は、全てのタイプの定常領域（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む）および任意のアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）を有する抗体を含む。１つの実施形態において、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が、使用される。別の実施形態において、ヒトアイソタイプＩｇＧ４が使用される。軽鎖定常領域は、λまたはκであり得る。ヒト化抗体は、１を超えるクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含み得る。抗体は、別個の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖとして、または単鎖抗体（ｓＦｖ）として、２つの軽鎖および２つの重鎖を含むテトラマーとして発現され得、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、スペーサーを通じて結合される。
【００８９】
Ｆｃ領域（例えば、抗体）を含むポリペプチドのエフェクター機能を確定するための方法は、本明細書において記載され、そしてＦｃレセプターへ結合するための改変されたＦｃ領域の能力の変化を確定するための細胞に基づく架橋アッセイを含む。他の結合アッセイは、補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ補体タンパク質）へ結合するためのＦｃ領域の能力を確定するために使用され得る。改変されたＦｃ領域のエフェクター機能を確定するためのさらなる技術は、当該分野において説明される。
【００９０】
（３．機能的部分およびそのような部分をＦｃ含有ポリペプチドへ結合する化学）
本発明は、抗体およびＦｃ含有ポリペプチドを提供し、この抗体およびＦｃ含有ポリペプチドは、さらに望ましい効果を提供するために改変され得る。例えば、好ましい実施形態において、第一のアミノ酸は、第二の部位におけるポリペプチドのグリコシル化を改変するだけでなく望ましい側鎖化学の提供もする残基へ改変される。
【００９１】
ある好ましい実施形態において、アミノ酸残基の側鎖化学は、付加的部分（すなわち、機能的部分（例えば、遮断部分、検出可能部分、診断部分、および／または治療部分））へ結合（例えば、共有結合）され得る。模範的な機能的部分は、始め以下に記載され、そのような機能的部分を異なるアミノ酸側鎖化学へ結合するための有用な化学が続けられる。
【００９２】
（３．１  機能的部分）
有用な機能的部分の例としては、限定されないが、遮断部分、検出可能部分、診断部分、および治療部分が挙げられる。
【００９３】
模範的な遮断部分は、十分に立体的にかさ高いおよび／または十分な電荷を有する部分を含み、それゆえ糖下の減少が例えば、グリコシダーゼのポリペプチドをグリコシル化する能力を遮断することによって起こる。この遮断部分は、付加的にまたは代替的に、例えば、Ｆｃ領域のレセプターまたは補体タンパク質へ結合する能力を阻害することによってエフェクター機能を減少し得る。好ましい遮断部分は、システイン付加体およびＰＥＧ部分を含む。
【００９４】
好ましい実施形態において、遮断部分は、システインであり、好ましくは、例えば、細胞培養中において、Ｆｃ含有ポリペプチドの、例えば翻訳の間かまたは翻訳後に、遊離システインと関連するシステインである。他の遮断システイン付加体としては、シスチン、混合ジスルフィド付加体、またはジスルフィド結合が挙げられる。
【００９５】
別の好ましい実施形態において、遮断部分は、ポリアルキレングリコール部分（例えばＰＥＧ部分、そして好ましくはＰＥＧ−マレイミド部分）である。好ましいペグ化部分（または関連するポリマー）は、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール（「ＰＰＧ」）、ポリオキシエチル化グリセロール（「ＰＯＧ」）および他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール（「ＰＶＡ」）および他のポリアルキレン酸化物、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオキシエチル化グルコースであり得る。上記ポリマーは、それが少なくとも１つの活性スルホン部分を有する限り、ホモポリマー、ランダムコポリマーまたはブロックコポリマー、上に一覧にされたモノマーに基づくターポリマー、直鎖または分岐鎖、置換鎖または非置換鎖であり得る。ポリマー部分は、任意の長さまたは分子量であり得るが、これらの特徴は、生物学的特性を影響し得る。薬学的適用においてクリアランス速度を減少するために特に有用なポリマーの平均分子量は、２，０００〜３５，０００  ｄａｌｔｏｎの範囲にある。さらに、２つの基がポリマーに結合される場合（１つの基が各末端に結合される）、ポリマーの長さは、２つの基の間の有効距離および他の空間的関係に影響し得る。従って、当業者は、望ましい生物活性を最適化するためかまたは与えるためにポリマーの長さを変動し得る。ＰＥＧは、いくつかの理由で生物学的適応において有用である。ＰＥＧは、代表的に、透明、無色、無臭、水に溶け、熱に対して安定、多くの化学的試薬に対して不活性であり、加水分解せず、そして無毒である。ペグ化は、分子の外見上の分子量を増加させることによって分子の薬物動態学上の性能を改良し得る。この増加された外見上の分子量は、皮下投与または全身投与に続く体からのクリアランス速度を減少する。多くの場合、ペグ化は、抗原性および免疫原性を減少し得る。さらに、ペグ化は、生物活性分子の溶解度を増加し得る。
【００９６】
ペグ化された抗体および抗体フラグメントは、概して、本明細書において記載される抗体および抗体フラグメントの投与により軽減または調節され得る条件を処置するために使用され得る。概して、ペグ化された非グリコシル化抗体および抗体フラグメントは、ペグ化されず非グリコシル化抗体および抗体フラグメントと比較して、半減期を増加する。ペグ化され非グリコシル化抗体および抗体フラグメントは、単独で、ともに、または他の薬学的組成物と組み合わせて使用され得る。
【００９７】
本発明の方法およびポリペプチドにおいて有用な検出可能部分の例としては、蛍光部分、ラジオ同位体部分、ラジオパク部分、など（例えば、検出可能標識（例えば、ビオチン、発蛍団、発色団、スピン共鳴プローブ、またはラジオ標識））が挙げられる。模範的な発蛍団としては、蛍光染色（例えば、フルオレセイン、ローダミン、など）および他のルミネセント分子（例えば、ルミナール）が挙げられる。発蛍団は、環境に敏感であり得、それゆえ、それが基質（例えば、ダンシルプローブ）に結合する際に構造的変化を受ける改変されるタンパク質中の１つ以上の残基の近くに位置付けされる場合、その蛍光は変化する。模範的なラジオ標識は、１つ以上の感受性の低い核を有する低分子含有原子(１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎなど)を含む。他の有用な部分は、当該分野において公知である。
【００９８】
本発明の方法およびポリペプチドにおいて有用である診断部分の例としては、疾患または障害の存在を解明するために適切な検出可能部分が挙げられる。代表的には、診断部分は、分子（例えば、疾患または障害に関連する標的ペプチド、タンパク質、または複数のタンパク質）の存在、非存在、またはレベルを確定することを可能にする。そのような診断はまた、疾患または障害およびその進行の予後診断および／または診断するために適している。
【００９９】
本発明の方法およびポリペプチドにおいて有用である治療部分の例としては、例えば、抗炎症剤、抗癌剤、抗神経変性剤、および抗感染剤が挙げられる。この機能的部分はまた、１つ以上の上に述べられた機能を有する。
【０１００】
模範的な治療法としては、核ＤＮＡに複数の鎖切断をもたらし得る高エネルギー電離放射線を有する放射性核種が挙げられ、それゆえ（例えば、癌の）細胞死を誘導するために適切である。模範的な高エネルギー放射性核種としては、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅおよび１８８Ｒｅが挙げられる。これらのアイソトープは、代表的に、短い道程を有する高エネルギーα粒子またはβ粒子を産生する。そのような放射性核種は、それが非常に近接にある細胞（例えば、接合が付着したかまたは入った腫瘍性細胞）を死滅させる。この放射性核種は、局在化されていない細胞に対しわずかな影響かまたは影響がなく、そして本質的に非免疫原性である。
【０１０１】
模範的な治療法としてはまた、細胞障害剤（例えば、細胞増殖抑制剤（例えば、アルキル化剤、ＤＮＡ合成インヒビター、ＤＮＡ挿入剤または架橋剤、またはＤＮＡ−ＲＮＡ転写調節因子）、酵素インヒビター、遺伝子調節因子、細胞障害ヌクレオシド、チューブリン結合剤、ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト、抗新脈管形成剤、など）が挙げられる。
【０１０２】
模範的な治療法としてはまた、アルキル化剤（例えば、アントラサイクリン族の治療薬（例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、シクロスポリンＡ、クロロキン、メトプテリン、ミトラマイシン、ポルフィロマイシン（ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ポルフィロマイシン、アントラセンジオンおよびアジリジン）が挙げられる。別の実施形態において、化学療法部分は、細胞増殖抑制剤（例えば、ＤＮＡ合成インヒビター）である。ＤＮＡ合成インヒビターの例としては、制限されないが、メトトレキサート、およびジクロロメトトレキサート、３−アミノ−１，２，４−ベンゾトリアジン１，４−ジオキシド、アミノプテリン、シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド、５−フルオロ−５’−デオキシウリジン、５−フルオロウラシル、ガンシクロビル、ヒドロキシ尿素、アクチノマイシン−Ｄ、およびマイトマイシン−Ｃが挙げられる。模範的なＤＮＡ挿入剤または架橋剤としては、限定されないが、ブレオマイシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、シス−ジアミン白金（ＩＩ）ニ塩化物（シスプラチン）、メルファラン、ミトザントロン、およびオキサリプラチンが挙げられる
模範的な治療法としてはまた、転写調節因子（例えば、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ホモハリングトニン（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ）、およびイダルビシンが挙げられる。本発明と両立する他の模範的な細胞障害剤としては、アンサマイシンベンゾキノン、キノイド誘導体（例えば、キノロン、ゲニステイン、バクタサイクリン（ｂａｃｔａｃｙｃｌｉｎ））、ブスルファン、イホスファミド、メクロレタミン、トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、カルバジルキノン、インドールキノンＥＯ９、ジアジリジニル（ｄｉａｚｉｒｉｄｉｎｙｌ）−ベンゾキノンメチルＤＺＱ、トリエチレンホスホラミド、およびニトロソ尿素類化合物（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン）が挙げられる。
【０１０３】
模範的な治療法としてはまた、細胞障害ヌクレオシド（例えば、アデノシンアラビノシド、シタラビン、シトシンアラビノシド、５−フルオロウラシル、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、フロクスウリジン、フトラファー（ｆｔｏｒａｆｕｒ）、および６−メルカプトプリン；チューブリン結合剤（例えば、タキソイド（ｔａｘｏｉｄｓ）(例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、タキサン類)、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）（例えば、ドラスタチン−１０、−１１、または−１５）、コルヒチンおよびコルヒチノイド（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｏｉｄ）（例えば、ＺＤ６１２６）、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）（例えば、コンブレタスタチンＡ−４、ＡＶＥ−６０３２）、およびビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）（ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ））；抗血管形成化合物（例えば、アンジオスタチンＫ１−３、ＤＬ−α−ジフルオロメチル−オルニチン、エンドスタチン、フマギリン、ゲニステイン、ミノサイクリン、スタウロスポリン、および（±）−サリドマイドが挙げられる
模範的な治療法としてはまた、ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト（例えば、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロンまたはメドロプロゲステロン）、エストロゲン、（例えば、ジエチルスチルベストロール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（例えば、テストステロン）、アロマターゼインヒビター（例えば、アミノグルテチミド）、１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン、４−アミノ−１，８−ナフサリミド、アピゲニン、ブレフェルジン（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）Ａ、シメチジン、ジクロロメチレン−二リン酸、ロイプロリド（ロイプロレリン（ｌｅｕｐｒｏｒｅｌｉｎ））、黄体化ホルモン放出ホルモン、ピフィスリン（ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ）−α、ラパマイシン、性ホルモン結合グロブリン、およびタプシガルジン）が挙げられる。
【０１０４】
模範的な治療法としてはまた、酵素インヒビター（例えば、Ｓ（＋）−カンプトセシン、クルクミン、（−）−デグエリン（ｄｅｇｕｅｌｉｎ）、５，６−ジクロロベンズ−イミダゾール１−β−Ｄ−リボフラノシド、エトポシド、ホルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｅ）、ホストリエシン（ｆｏｓｔｒｉｅｃｉｎ）、ヒスピジン（ｈｉｓｐｉｄｉｎ）、２−イミノ−１−イミダゾリジン酢酸（シクロクレアチン）、メビノリン、トリコスタチンＡ、チルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）ＡＧ  ３４、およびチルホスチンＡＧ  ８７９）が挙げられる。
【０１０５】
模範的な治療法としてはまた、遺伝子調節因子（例えば、５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−アザシチジン、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、４−ヒドロキシタモキシフェン、メラトニン、ミフェプリストーン、ラロキシフェン、トランス−レチナール（ビタミンＡアルデヒド）、レチン酸、ビタミンＡ酸、９−シス−レチン酸、１３−シス−レチン酸、レチノール（ビタミンＡ）、タモキシフェン、およびトログリタゾン）が挙げられる。
【０１０６】
模範的な治療法としてはまた、細胞障害剤（例えば、プテリジン族の治療薬、ジイネン（ｄｉｙｎｅｎｅ）、およびポドフィロトキシン）が挙げられる。これらのクラスの特に有用なメンバーとしては、例えば、メトプテリン、ポドフィロトキシン、またはポドフィロトキシン誘導体（例えば、エトポシドまたはエトポシドリン酸、リューロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ビンデシン、リューロイシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）など）が挙げられる。
【０１０７】
本明細書の教義と両立するさらに他の細胞毒性としては、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）（例えば、アウリスタチンＥおよびモノメチルアウリスタンＥ）、カリーチアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、グラミシジンＤ、メイタンサノイド（例えば、メイタンシン）、ネオカルチノスタチン、トポテカン、タキサン類、サイトカラシンＢ、エチジウム臭化物、エメチン、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトザントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、プロマイシン、およびこれらの類似体またはこれらの相同体が挙げられる。
【０１０８】
機能的部分の他のタイプは、当該分野において公知であり、そして本明細書に含まれる教義に基づく本発明の方法および組成物において容易に使用され得る。
【０１０９】
（３．２．機能的部分をアミノ酸側鎖に結合するための化学）
前述の機能的部分（それは、低分子、核酸、ポリマー、ペプチド、タンパク質、化学治療法剤、または他のタイプの分子）を特定のアミノ酸側鎖に結合するための化学は、当該分野において公知である（特定のリンカーの詳細な概説に関しては、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと)。
【０１１０】
スルフヒドリル部分（例えば、システイン、またはチオール側鎖化学）に関する基を結合すると認識される模範的な技術は、限定されないが、活性化アシル基（例えば、α−ハロアセテート、クロロ酢酸、またはクロロアセトアミド）、活性化アルキル基、Ｍｉｃｈａｅｌアクセプター（例えば、マレイミド）またはアクリル基、レドックス反応を介してスルフヒドリル部分と反応する基、および活性化ジスルフィド基を含む。スルフヒドリル部分はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミダゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎアルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル−２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロマーキュリベンゾアート、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって結合され得る。
【０１１１】
好ましい実施形態において、システイン側鎖化学またはチオール側鎖化学は、Ｆｃ含有ポリペプチドの生成の間またはその生成後に結合される。例えば、細胞培養を使用して改変されたＦｃ含有ポリペプチドを産生する場合、溶液中の遊離システインが、Ｆｃ含有ポリペプチドのチオール側鎖を有するシステイン付加体を形成し得るような条件が提供される。そのように形成された付加体は、グリコシル化および／またはエフェクター機能を阻害するために使用され得、または続いてこの付加体を除去するための還元条件を受け、そしてそれによって１つの前述のスルフヒドリル化学の使用を可能にする。
【０１１２】
ヒドロキシル部分（例えば、セリン、スレオニン、またはチロシン側鎖化学）に関する基を結合すると認識される模範的な技術は、スルフヒドリル部分（活性化アシル基、活性化アルキル基、およびＭｉｃｈａｅｌアクセプターを含む）に関する上述の部分を含む。
【０１１３】
アミン部分（例えば、アスパラギンまたはアルギニン側鎖化学）に関する基を結合すると認識される模範的な技術としては、限定されないが、Ｎ−スクシニミジル、Ｎ−スルホスクシニミジル、Ｎ−フタリミジル、Ｎ−スルホフタリミジル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、３−スルフォニル−４−ニトロフェニル、３−カルボキシ−４−ニトロフェニル、イミドエステル（例えば、メチルピコリニミデート）、ピリドキサルリン酸、ピリドキサル、クロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイオ尿素（ｍｅｔｈｙｌｉｏｓｕｒｅａ）、および２，４−ペンタンジオンが挙げられる。
【０１１４】
酸部分（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン側鎖化学）に関する基を結合すると認識される模範的な技術は、活性化エステルおよび活性化カルボニルを含む。酸部分はまた、カルボジイミド（Ｒ’Ｎ‐Ｃ‐Ｎ‐Ｒ’）（例えば、１−シクロヘキシル−３−［２‐モルホリニル−（４‐エチル）］カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応によって選択的に改変され得る。
【０１１５】
望ましい機能的部分が、ペグ化部分である場合、当該分野において公知のペグ化反応が、利用され、または本明細書において記載されるようなものである（例えば、実施例３も参照のこと）。例えば、１つの方法において、ペグ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実行される。本発明の抗体および抗体フラグメントのペグ化のための水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。別の実施形態において、ペグ化のためのポリマーは、ポリエチレングリコール−マレイミド（すなわち、ＰＥＧ−マレイミド）である。
【０１１６】
本発明のペグ化抗体および抗体フラグメントを調製するための方法は、概して、ａ）抗体または抗体フラグメントが１つ以上のＰＥＧ基に付着されるような条件下で、抗体または抗体フラグメントをポリエチレングリコール（例えば、反応性エステルまたはＰＥＧのアルデヒド誘導体）と反応させる工程、およびｂ）この反応産生物を得る工程を包含する。公知のパラメーターおよび望ましい結果に基づく最適な反応条件またはアシル化反応を選択することは、当業者にとって明白である。１つの実施形態において、特定のアミノ酸残基は、例えば、第二のアミノ酸残基のグリコシル化を阻害するために変更された、標的とされる第一のアミノ酸残基（そして好ましくは第一のアミノ酸がシステインであるかまたはチオール化学を有する場合）であり得る。
【０１１７】
（４．組み換え抗体の発現）
本発明の改変された抗体は、代表的には、組み換え発現によって産生される。必要に応じて定常領域に結合される、軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする核酸が、発現ベクターに挿入される。この軽鎖および重鎖は、同じかまたは異なる発現ベクター中にクローニングされ得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター中の制御配列へ実施可能に結合される。発現制御配列としては、制限されないが、プロモーター（例えば、天然に関連するまたは異種のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント、および転写終止配列が挙げられる。好ましくは、発現制御配列は、真核生物の宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし得るベクター中の真核生物のプロモーター系である。一度このベクターが適切な宿主中に取り込まれた場合、この宿主は、ヌクレオチド配列の高レベルの発現に適切な条件下で、および交差反応している抗体の収集および精製に適切な条件下で維持される。
【０１１８】
これらの発現ベクターは、代表的に、エピソームとしてかまたは宿主染色体ＤＮＡの一体部分としてのどちらかで宿主生物体中において複製可能である。一般に、発現ベクターは、選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、望ましいＤＮＡ配列を伴って形質転換されたそれらの細胞の検出を可能にする（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号を参照のこと）。
【０１１９】
Ｅ．ｃｏｌｉは、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列）をクローニングするために特に有用である原核生物宿主の１つである。使用に適切な他の細菌宿主は、バシルス属（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）および他の腸内細菌科（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、および種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種）を含む。
【０１２０】
他の微生物（例えば、酵母）もまた、発現のために有用である。ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａは、望まれるような発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製の起源、終止配列などを有する適切なベクターを有する模範的な酵母宿主である。代表的なプロモーターは、３−ホスホグリセラートキナーゼおよび他の解糖酵素を含む。誘導酵母プロモーターは、中でも、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロームＣ、ならびにメタノール、マルトース、およびガラクトース利用の原因となる酵素由来のプロモーターを含む。
【０１２１】
微生物に加えて、哺乳動物組織培養もまた、本発明のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）を発現および産生するために使用され得る。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎ．Ｙ．、Ｎ．Ｙ．（１９８７）を参照のこと。異種のタンパク質（例えば、無処理の免疫グロブリン）を分泌し得る多数の適切な宿主細胞株が当該分野において発展され、そしてこの宿主細胞株には、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、骨髄腫細胞株、形質転換されたＢ細胞、およびハイブリドーマを含むため、真核生物細胞が、実際には好ましい。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列（例えば、複製の起源、プロモーター、およびエンハンサー）（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、および重要なプロセシング情報部位（例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列）を含み得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０，アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照のこと。
【０１２２】
あるいは、抗体コード配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入およびその後のトランスジェニック動物の乳中での発現のためにトランスジーンの中に取り込まれ得る(例えば、Ｄｅｂｏｅｒら、ＵＳ  ５，７４１，９５７、Ｒｏｓｅｎ、ＵＳ  ５，３０４，４８９、およびＭｅａｄｅら、ＵＳ  ５，８４９，９９２を参照のこと)。適切なトランスジーンは、乳腺に特異的な遺伝子（例えば、カゼインまたはβラクトグロブリン）由来のプロモーターとエンハンサーとの実施可能な結合における軽鎖および／または重鎖のためのコード配列を含む。
【０１２３】
所定のポリヌクレオチド配列（例えば、重鎖および軽鎖コード配列および発現制御配列）を含むベクターは、細胞宿主のタイプに依存して変化する周知の方法によって宿主細胞中に移転され得る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核生物細胞に対して一般に利用されるが、リン酸カルシウム処置、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃、またはウイルスに基づくトランスフェクションが、他の細胞宿主に対し使用され得る（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９を参照のこと）。哺乳動物細胞を形質転換するために使用される他の方法は、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクタの使用を含む（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、を参照のこと）。トランスジェニック動物の産生のために、トランスジーンが、受精した卵細胞に微量注入され得るか、または胚幹細胞のゲノムに取り込まれ得、そしてそのような細胞の核は、摘出された卵細胞に移転される。
【０１２４】
本発明の抗体は、１つのベクターまたは２つのベクターを使用して発現され得る。抗体重鎖および軽鎖が別個の発現ベクターにクローニングされる場合、これらのベクターは、無処理の免疫グロブリンの発現および集団を得るために同時トランスフェクトされる。発現された場合、本発明の全体の抗体、これらのダイマー、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリンの形態が、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動など（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、（１９８２）を参照のこと）を含む技術の標準的な手順によって精製され得る。実質的に、純粋な免疫グロブリンの少なくとも約９０％〜９５％の同一性が、薬学的な使用のために好ましく、９８％〜９９％以上の同一性が最も好ましい。
【０１２５】
（５．予防方法、診断方法、および治療方法）
本発明はまた、免疫障害（例えば、治療用抗体を使用して抗原に結合することが望ましいが、エフェクター機能を誘発することを避ける場合の障害を含む）に関連する疾患の予後診断、診断または処置のために適切な非グリコシル化抗体の産生に特に導かれる。
【０１２６】
それゆえ、ある実施形態において、本発明の非グリコシル化抗体または抗原結合フラグメントは、例えば糸球体腎炎、強皮症、肝硬変、多発硬化症、ループス腎炎、アテローム硬化症、炎症性腸疾患、または慢性関節リウマチを含む免疫障害の予防または処置において有用である。別の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、限定されないが、アルツハイマー病、重度の喘息、アトピー皮膚炎、悪液質、ＣＨＦ虚血、冠動脈再狭窄、クローン病、糖尿病性腎症、リンパ腫、乾癬、放射線誘導線維症、若年性関節炎、脳卒中、外傷によってもたらされた脳または中枢神経系の炎症、および潰瘍性大腸炎を含む炎症障害を処置または予防するために使用され得る。
【０１２７】
本発明の非グリコシル化抗体または抗原結合フラグメントにより予防され得または処置され得る他の炎症障害は、角膜移植、慢性閉塞性肺疾患、肝炎Ｃ、多発骨髄腫、および変形性関節症に起因する炎症を含む。
【０１２８】
別の実施形態において、本発明の抗体またはＦｃ含有フラグメントは、限定されないが、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、カポジ肉腫、黒色腫、卵巣癌、小細胞肺癌、胃癌、白血病／リンパ腫、および多発骨髄腫を含む新形成を予防または処置するために使用され得る。さらなる新形成条件は、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、非扁平細胞肺癌、および前立腺癌を含む。
【０１２９】
別の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、限定されないが、アルツハイマー病、脳卒中、および外傷性脳または中枢神経系損傷を含む神経変性障害を予防または処置するために使用され得る。さらなる神経変性障害は、ＡＬＳ／運動ニューロン疾患、糖尿病性末梢神経障害、糖尿病性網膜症、ハンティングトン病、筋肉変性、およびパーキンソン病を含む。
【０１３０】
さらに別の実施形態において、本発明の抗体またはＦｃ含有フラグメントは、病原体（例えば、ウイルス、原核生物生物体、また真核生物生物体）によってもたらされた感染を予防または処置するために使用され得る。
【０１３１】
臨床適用において、被験体は、疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状を表すことによって上に述べられた条件の１つを発展したかまたは発展する危険があると同定される。本発明の少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントあるいは本発明の少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物が、例えば、上に述べられたような疾患または障害の少なくとも１つの症状を処置するのに十分な量で投与される。１つの実施形態において、被験体は、有害なＣＤ１５４活性（ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ４０Ｌとしても公知である；例えば、Ｙａｍａｄａら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、７３：Ｓ３６−９（２００２）；Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５８：４−４３（２００１）；Ｋｉｒｋら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｓｃｉ．３５６：６９１−７０２（２００１）；Ｆｉｕｍａｒａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１３：２６５−７４（２００１）；およびＢｉａｎｃｏｎｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３（４）：３４３−５３（１９９９）参照のこと）に関連する疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状を表すように同定される。
【０１３２】
それゆえ、本発明の非グリコシル化抗体は、例えば、本明細書において記載されるような、例えば、疾患または障害の予防または処置のために被験体に有益な治療応答を生み出す条件下で、被験体への治療用の免疫学的な試薬として投与するために適切である。
【０１３３】
本発明の治療試薬は、代表的に、望ましくない汚染から実質的に純粋である。このことは、試薬は代表的に、少なくとも約５０重量％純度であること、ならびに干渉するタンパク質および汚染が実質的にないことを意味する。時々、この試薬は、少なくとも約８０重量％純度、より好ましくは、少なくとも９０重量％純度または約９５重量％純度である。しかし、従来のタンパク質精製技術を使用して、例えば、本明細書に記載されるように、少なくとも９９重量％の同質のペプチドが、得られ得る。
【０１３４】
本方法は、無症状の被験体と現在疾患の症状を表している被験体との両方に使用され得る。そのような方法で使用される抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または非ヒト抗体、またはこれらのフラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）であり得、そしてモノクローナルかまたはポリクローナルであり得る。
【０１３５】
別の局面において、本発明は、薬学的組成物としての薬学的キャリアと共に抗体を投与することを特徴とする。あるいは、この抗体は、少なくとも１つの抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを投与することによって被験体に投与され得る。このポリヌクレオチドは、被験体中に抗体鎖を産生するために発現される。必要に応じて、このポリヌクレオチドは、抗体の重鎖および軽鎖をコードする。このポリヌクレオチドは、被験体中に重鎖および軽鎖を産生するために発現される。模範的な実施形態において、この被験体は、被験体の血液に投与された抗体のレベルに関してモニターされる。
【０１３６】
従って、本発明は、免疫条件（例えば、ＣＤ１５４関連免疫条件）を予防または回復するための治療体制のための積年の必要性を充足する。
【０１３７】
本発明の抗体は、診断上の適用または調査上の適用（特に例えば、エフェクター機能の減少が望ましい場合の細胞に基づくアッセイを含む診断上の適用または調査上の適用）に関して適切であることも理解される。
【０１３８】
（６．非グリコシル化抗体の有効性をテストするための動物モデル）
本発明の抗体は、例えば、獣医の目的か、またはヒト疾患（例えば、上に述べられた免疫疾患または条件）の動物モデルとしてのいずれかで、非グリコシル化抗体治療の必要がある非ヒト哺乳動物に投与され得る。後者に関して、そのような動物モデルは、本発明の抗体の治療上の有効性を評価するために有用であり得る（例えば、投与のエフェクター機能、量、および時間経過をテストすること）。
【０１３９】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）を予防または処置するための本発明の抗体または抗原結合フラグメントの治療有効性を評価するために使用され得る動物モデルの例としては、アジュバント誘導ＲＡ、コラーゲン誘導ＲＡ、およびコラーゲンｍＡｂ誘導ＲＡが挙げられる
（Ｈｏｌｍｄａｈｌら、（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８４：１８４；Ｈｏｌｍｄａｈｌら、（２００２）Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１：１３５；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｒｅｐ．４：２３２）。
【０１４０】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を予防または処置するための本発明の抗体または抗原結合フラグメントの治療有効性を評価するために使用され得る動物モデルの例としては、ＴＮＢＳ誘導ＩＢＤ、ＤＳＳ誘導ＩＢＤ、が挙げられる（Ｐａｄｏｌら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｌｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１２：２５７；Ｍｕｒｔｈｙら（１９９３）Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．３８：１７２２）。
【０１４１】
糸球体腎炎を予防または処置するための本発明の抗体または抗原結合フラグメントの治療有効性を評価するために使用され得る動物モデルの例としては、抗ＧＢＭ誘導糸球体腎炎（Ｗａｄａら（１９９６）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４９：７６１−７６７）および抗ｔｈｙ１誘導糸球体腎炎（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９９）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５６：１３５−１４４）が挙げられる。
【０１４２】
多発硬化症を予防または処置するための本発明の抗体または抗原結合フラグメントの治療有効性を評価するために使用され得る動物モデルの例としては、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）が挙げられる（ＬｉｎｋおよびＸｉａｏ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８４：１１７−１２８）。
【０１４３】
動物モデルはまた、例えば、ＭＲＬ−Ｆａｓｌｐｒマウスを使用して、ＣＤ１５４関連状態（例えば、全身紅斑性狼蒼（ＳＬＥ））を予防または処置するための本発明の抗体または抗体結合フラグメントの治療有効性を評価するために使用され得る（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、前出；Ｔｅｓｃｈら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０）。
【０１４４】
（７．処置の体制および量）
予防用の適用において、薬学的組成物または医薬が、Ｆｃ領域を有するポリペプチドによって処置され得る障害（例えば、免疫系障害）に苦しむ被験体に、障害の危険を除去または減少させ、重症度を軽減し、障害（障害、その合併症および障害の発展中に表れる中間の病態学上の表現型の生化学的、組織学的および／または行動に現れる症状を含む）の発生を遅らせるのに十分な量で、投与される。治療用の適用において、組成物または医薬が、そのような障害の疑いのある、またはそのような障害に既に罹っている被験体に、（生化学的、組織学的および／または行動に現れる）障害の症状（その合併症および障害の発展段階における中間の病態学上の表現型を含む）を治癒、または少なくとも部分的に押さえるのに十分な量で投与される。本発明のポリペプチドは、特に、血液中に存在する細胞表面抗原の生物活性を調節するために有用であり、処置または予防される疾患は、少なくとも部分的には抗原の異常に高いかまたは低い生物活性によってもたらされる。
【０１４５】
いくつかの方法において、試薬の投与は、免疫障害（例えば、ＣＤ１５４活性に関連する炎症）を減少または除去する。治療処置または予防処置を達成する適切な量は、治療有効量または予防有効量として規定される。予防体制と治療体制との両方において、試薬は、通常十分な免疫応答が達成されるまで、何回かの投薬によって投与される。
【０１４６】
上述の条件の処置に関する本発明の組成物の有効量は、多くの異なる要因（投与方法、標的部位、被験体の生理状態、被験体がヒトかまたは動物か、他の医薬が投与されたか、および処置が予防用かまたは治療用か）に依存して変動する。通常、被験体は、ヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物もまた処置され得る。
【０１４７】
抗体を用いる受動的な免疫に関して、投与量は、宿主の体重の約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、そしてより一般には０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。被験体は、そのような量を毎日、一日置きに、毎週または実証的分析によって決定された任意の他のスケジュールによって投与され得る。模範的な処置は、長期（例えば、少なくとも６ヶ月）にわたる複数回の投与を必要とする。さらなる模範的な処置体制は、２週間ごとに１度、または１ヶ月に１度、または３〜６ヶ月に１度の投与を必要とする。模範的な投与のスケジュールとしては、連続した日において１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、一日置きにおいて３０ｍｇ／ｋｇ、または毎週６０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体は、同時に投与され、この場合において、投与される各抗体の量は、指摘された範囲内に収まる。
【０１４８】
抗体は、通常複数の回数において投与される。単一の投与の間の間隔は、週毎、月毎、または年毎であり得る。ある方法において、投与量は、血しょう抗体濃度の１〜１０００μｇ／ｍｌになるよう調節され、そしてある方法においては、２５〜３００μｇ／ｍｌである。あるいは、抗体は、持効性処方物として投与され得、この場合、より少ない回数の投与が必要とされる。投与量および回数は、被験体中の抗体の半減期に依存して変動する。概して、ヒト抗体が、最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体が続く。
【０１４９】
投与の量および回数は、上記処置が、予防用かまたは治療用かに依存して変動し得る。予防用の適用において、本抗体またはそのカクテルを含む組成物は、被験体の抵抗を促進するために、既に疾患状態にない被験体に投与される。そのような量は、「予防有効量」として規定される。この使用において、正確な量はまた、被験体の健康状態および一般的な免疫に依存するが、概して１回の投与につき０．１ｍｇ〜２５ｍｇ（特に、１回の投与につき０．５ｍｇ〜２．５ｍｇ）の範囲である。比較的少ない量が、長期間にわたって比較的まれな間隔で投与される。何人かの被験体は、その残りの人生の間、処置を受けることを続ける。
【０１５０】
治療用の適用において、比較的短い間隔において比較的多い量（例えば、１回の投与につき約１ｍｇ〜２００ｍｇの抗体、５ｍｇ〜２５ｍｇの量がより一般的には使用される）が、疾患の進行が減少または止まるまで、そして好ましくは被験体が疾患の症状の部分的な回復または完全な回復を示すまで、時々必要とされる。その後、この特許が、予防体制に与えられ得る。
【０１５１】
抗体をコードする核酸の量は、１人の被験体につき約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇまたは３０μｇ〜３００μｇのＤＮＡの範囲である。感染ウイルスベクターの量は、１回の投与につき１０〜１００ビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）以上に変動する。
【０１５２】
治療剤は、予防処置および／または治療処置のために非経口的手段、局所的手段、静脈的手段、経口的手段、皮下的手段、動脈的手段、頭蓋内手段、腹膜腔的手段、鼻腔的手段、または筋肉内手段によって投与され得る。タンパク質医薬品の投与の最も代表的な経路は、血管内、皮膚下、または筋肉内であるが、他の経路も効果的であり得る。ある方法において、試薬は、特定の組織に直接的に注射される（沈着物が、例えば頭蓋内注射剤を蓄積した場合）。ある方法において、抗体は、持効性組成物または装置（例えば、ＭｅｄｉｐａｄＴＭ装置）として投与される。タンパク質医薬品はまた、例えば、乾燥粉末吸入装置を使用して、気道を介して投与され得る。
【０１５３】
本発明の試薬は、必要に応じて、免疫障害の処置に少なくとも部分的には有効である他の試薬と組み合わせて投与され得る。
【０１５４】
（８．薬学的組成物）
本発明の治療組成物は、薬学的に受容可能なキャリアの中に、本発明の少なくとも１つの非グリコシル化抗体または抗体フラグメントを含む。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、通常活性成分の投与のために使用される薬学的調整物の少なくとも一部分をいう。そのようなものとして、キャリアは、当該分野において使用される任意の薬学的賦形剤および投与のための任意の形態のビヒクルを含み得る。組成物は、例えば、注射可能な溶液、水溶性懸濁液または水溶液、非水溶性懸濁液または非水溶液、固形および液体経口処方物、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、皮内斑、クリーム、ローション、錠剤、カプセル、持効性処方物などであり得る。さらなる賦形剤としては、例えば、着色料、味遮蔽試薬、溶解補助剤、懸濁試薬、圧縮試薬、エンテリックコーティング、持効性補助剤などが挙げられる。
【０１５５】
本発明の試薬は、多くの場合、いわゆる活性治療試薬および種々の他の薬学的に受容可能な成分を含む薬学的組成物として投与される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０））を参照のこと。好ましい形態は、投与および治療用の適用の意図される様式に依存する。この組成物はまた、望ましい処方物に依存して、動物またはヒト投与のための薬学的組成物を処方するために通常使用されるビヒクルとして規定される、薬学的に受容可能な、非中毒性キャリアまたは希釈液を含み得る。この希釈液は、組み合わせの生物活性を影響しないように選択される。そのような希釈液の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デクストロース溶液、およびハンク溶液である。さらに、薬学的組成物または薬学的処方物としてはまた、他のキャリア、アジュバント、または非中毒、非治療、非免疫原性安定剤などが挙げられ得る。
【０１５６】
抗体は、蓄積注射または移植製剤の形態で投与され得、この蓄積注射または移植製剤は、活性成分の持効性を可能とするような様式で処方され得る。模範的な組成物は、ＨＣｌでｐＨの６．０に調節された５０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌからなる緩衝水溶液中に処方される、５ｍｇ/ｍＬのモノクローナル抗体を含む。
【０１５７】
代表的に、組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとしての注射可能物質として調整される。注射前の液体ビヒクルの溶液または懸濁液に適切な固体形態もまた、調整され得る。この調整物はまた、上で考察されたように、リポソーム中かまたは微粒子（例えば、促進されたアジュバント効果のためのポリ乳酸、ポリグリコリド、またはコポリマー）中に乳化され得るかまたは被包され得る（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７（１９９０）およびＨａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８：９７（１９９７）を参照のこと）。
【０１５８】
（９．処置の経過をモニターすること）
疾患または障害（例えば、免疫障害）に苦しむ被験体の処置は、標準的な方法を使用してモニターされ得る。いくつかの方法は、ある量の試薬を投与する前に、例えば、抗体レベルのベースライン値または被験体のプロフィールのベースライン値を確定することを必要とし、そしてこれを、処置後のプロフィールまたはレベルの値と比較することを必要とする。このレベルまたはプロフィールの値の有意な増加（すなわち、同じサンプルの反復測定における実験誤差の代表的な限度よりも大きく、そのような測定の平均から１標準偏差として表現される）は、正の処置結果を示す（すなわち、この試薬の投与は、望ましい応答を達成した）。免疫応答の値が有意に変化しない、または減少する場合、負の処置結果が示される。
【０１５９】
他の方法において、レベルまたはプロフィールのコントロール値（すなわち、平均および標準偏差）が、コントロール集団に関して決定される。代表的には、コントロール集団の中の個体は、前処置を受けない。治療試薬を投与した後の被験体のレベルまたはプロフィールの測定された値は、次いで、コントロール値と比較される。コントロール値と比較して有意な増加（例えば、平均から１標準偏差大きい）は、正のまたは十分な処置結果を示す。有意な増加の欠如または減少は、負のまたは不十分な処置結果を示す。上記レベルがコントロール値と比較して増加している一方で、試薬の投与は、一般に続けられる。以前のように、コントロール値と比較して水平状態の到達は、処置の投与が中止され得るかまたは投与量および／もしくは回数において減少し得ることの指標である。
【０１６０】
他の方法において、コントロール値の上記レベルまたはプロフィール（例えば、平均および標準偏差）が、治療試薬の処置を受け、そしてそのレベルまたはプロフィールが処置に対する応答において水平状態になった、個体のコントロール集団から決定される。被験体のレベルまたはプロフィールの測定された値が、コントロール値と比較される。被験体の測定されたレベルが、コントロール値から有意に異ならない場合（例えば、１標準偏差を超える）、処置は中止され得る。被験体のレベルが有意にコントロール値以下である場合、試薬の投与の継続は保証される。次いで、被験体のレベルが、コントロール値以下を持続する場合、処置の変化が指摘され得る。
【０１６１】
他の方法において、現在処置を受けていないが以前処置の経過を受けた被験体は、処置の再開が必要とされるか否かを確定するために抗体レベルまたはプロフィールに関してモニターされる。この被験体の測定されたレベルまたはプロフィールは、前の処置の経過の後に被験体において以前達成された値と比較され得る。以前の測定と比較して有意な減少は（すなわち、同じサンプルの反復測定における代表的な許容限界を超える）、処置が再開され得るという指標である。あるいは、被験体の測定された値は、処置の経過を受けた後の被験体の集団において確定されたコントロール値（平均および標準偏差）と比較され得る。あるいは、被験体の測定された値は、疾患の症状がないままの予防的に処置された被験体の集団、または疾患の特徴の回復を示す治療的に処置された被験体の集団のコントロール値と比較され得る。これらすべての場合において、コントロールレベルと比較した有意な減少は（すなわち、標準誤差を超える）、処置が被験体におけて再開されるべきであるという指標である。
【０１６２】
投与に続く抗体のプロフィールは、代表的には、抗体濃度の即時のピークを示し、指数関数的な減退が後に続く。さらなる投与なしに、この減退は、投与される抗体の半減期に依存して、数日から数ヶ月の期間のうちに処置以前のレベルに近付く。例えば、あるヒト抗体の半減期は、ほぼ２０日間程度である。
【０１６３】
いくつかの方法において、被験体の所定の抗原に対する抗体のベースライン測定は、投与前になされ、第二の測定は、ピーク抗体レベルを確定するためにその後直ぐになされ、そして一回以上のさらなる測定は、抗体レベルの減退をモニターするための間隔でなされる。抗体レベルが、ベースラインまたはベースラインよりも少ないピークの所定のパーセンテージに減少した場合（例えば、５０％、２５％または１０％）、さらなる量の抗体の投与がなされる。いくつかの方法において、基礎値よりも少ないピークまたはその後の測定されたレベルが、他の被験体における有益な予防または治療処置体制を形成するために既に確定された基準レベルと比較される。測定した抗体レベルが、基準レベルよりも有意に少ない場合（例えば、平均から、処置により利益を受ける被験体の集団の基準レベルの１標準偏差を引いた値よりも少ない）、さらなる量の抗体の投与が指摘される。
【０１６４】
付加的方法は、処置の経過にわたって障害を診断またはモニターするために研究者または医者によって日常的に依存されている生理学的症状（例えば、肉体的または精神的症状）を認識する任意の技術をモニターすることを含む。
【０１６５】
以下の実施例が説明の目的で含められるが、本発明を制限するものと解釈されるべきではない。
【０１６６】
（例示）
実施例全体を通して、他に述べられない限り、以下の材料および方法を使用した。
【０１６７】
（材料と方法）
概して、本発明の実施には、他に指摘されない限り、化学、分子生物学、組み換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば、抗体技術）および電気泳動の標準技術を利用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ,Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄｓ．，Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗら，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照のこと。
【０１６８】
（改変された抗体の産生）
本発明の改変された抗体を産生するために、モデルヒト抗体（ｈｕ５ｃ８）、その改変体抗体、または対応するＦｃ領域のいずれかをコードするポリヌクレオチドを標準的な発現ベクターの中に導入した。このヒト抗体ｈｕ５ｃ８およびその改変体は、例えば、米国特許第５，４７４，７７１号および同第６，３３１，６１５号に記載される。ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、ｈｕ５ｃ８  ＩｇＧ１重鎖（配列番号：１〜２）、ｈｕ５ｃ８軽鎖（配列番号：３〜４）、ｈｕ５ｃ８  ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号：５〜６）、ｈｕ５Ｃ８  ＩｇＧ４重鎖（配列番号：７〜８）、ｈｕ５ｃ８  ＩｇＧ４改変体（Ｓ２２８Ｐ）（配列番号：９〜１０）、およびｈｕ５ｃ８  ＩｇＧ４改変体（Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ）（配列番号：１１〜１２）に関する配列表に提供する。次いで、ベクターを、大規模一過性トランスフェクション技術を使用してＥＢＮＡ  ２９３細胞中に導入した。このトランスフェクトされた２９３細胞を、標準培地およびインキュベーション条件を使用して培養した。細胞に、代表的に、トランスフェクトした１日後に再度栄養を与え、次いで、１〜３日間組み換えタンパク質の発現および分泌を可能にした。分泌された組み換え抗体またはＦｃ領域を含む培養培地を、次いで精製のために収集した。
【０１６９】
（改変された抗体の精製）
抗体精製を実行するために、真核生物細胞中に産生された組み換え非グリコシル化抗体を細胞培養培地から収集し、そしてその後のクロマトグラフィー技術を受けさせた。特に、組み換えプロテインＡカラム（５ｍＬ）を調整し、そして１００ｍＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨで洗浄し、次いで、中和されるまでＰＢＳを用いて平衡化した。馴化培地（約１．５Ｌ）を次いで、１０ｍＬ／分にてカラムを通してポンプで汲み出した。ロード後、このカラムを１００ｍＬの３Ｘ  ＰＢＳで洗浄し、次いで１０ｍＬの１Ｘ  ＰＢＳで洗浄した。この抗体を、即時の中和反応のために０．３ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）を含む収集管の中へ１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ２．８）の１．３ｍＬ画分で溶出した。溶出された抗体を含む画分を、各画分の１：１０希釈溶液の光吸収度（Ａ２８０）を使用して濃度をモニターすることによって同定した。この精製工程を、一過性トランスフェクションの規模に比例して拡大または縮小した。
【０１７０】
結果として生じたプロテインＡプールを、さらに１．６ｍＬ  Ｐｏｒｏｓ  ＨＳカラム上のクロマトグラフィーによって精製した。この組み換えプロテインプール（約８ｍＬ）を、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で１０倍に希釈し、そしてＢｉｏＣａｄ  ＨＰＬＣを使用して２つの各精製ランに、半分ずつロードした。このタンパク質を、５ｍＬ／分の流速でロードし、このカラムを希釈緩衝液の１０カラム体積で洗浄し、次いで、希釈緩衝液の２５カラム体積勾配の０〜１Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。０．８ｍＬの画分を収集し、そして光吸収度（Ａ２８０）によってタンパク質濃度に関してモニターした。
【０１７１】
あるいは、小規模調製から結果として生じたプロテインＡプールを、プロテインＬクロマトグラフィーによって精製した。プロテインＬカラム（１ｍＬ）を調整し、そして１０ｍＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨで洗浄し、次いで中和するまでＰＢＳで平衡化した。中和されたプロテインＡプール（３ｍＬ）を次いで１ｍＬアリコートにロードした。ロード後、このカラムを１０ｍＬの３Ｘ  ＰＢＳで洗浄し、次いで１０ｍＬの１Ｘ  ＰＢＳで洗浄した。この抗体を、即時の中和反応のために０．１ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）を含む収集管の中へ１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ２．８）の０．４ｍＬ画分で溶出した。溶出された抗体を含む画分を、各画分の１：５希釈溶液の光吸収度（Ａ２８０）を使用して濃度をモニターすることによって同定した。
【０１７２】
光吸収度に加えて、組み換えタンパク質を含む溶出物質をまた、屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ）およびＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ＰＤ２０２０光散乱機器を用いてモニターした。分子量を、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒソフトウェアを用いて計算した。全ての改変体抗体（ｈｕ５ｃ８の４つの形態）が、１つの主要なピークと軽微な量の高分子量物質（ダイマー）を示しながら、ＳＥＣカラムから等しく溶出した。１４８，３００の分子量を、Ｔ２９９Ｃ  ｈｕ５ｃ８改変体の主要ピークに関して光散乱によって確定した。ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ改変体のサイズ排除クロマトグラフィーを、全長抗体と等しく実行した。４つのＦｃタンパク質の全てが、５３，０００〜５５，０００Ｄａｌｔｏｎの範囲の計算された分子量の主要ピークを生じながら、等しく作動した。最終的に、組み換えタンパク質サンプルを得て、ＰＢＳに対して透析し、無菌ろ過し、そしてさらなる分析のために必要とされるまで、１０ｍｇアリコートの中で４℃にて組み換えタンパク質サンプルを保存した。
【０１７３】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行するために、タンパク質サンプルを、代表的に、還元条件のための２５ｍＭ  ＤＴＴかまたは非還元条件のための２５ｍＭ  ＮＥＭのいずれかを含むＬａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で２００μｇ／ｍＬまで希釈した。２．５μｌおよび１０μｌのアリコートを、４〜２０％勾配ゲルにロードした。
【０１７４】
（質量分光法）
質量分光法を実行するために、タンパク質サンプルを、分析の前に、ｐＨ７．８にて９ｍＭ  ＤＴＴ中で還元した。このサンプルを、Ｃ４ガードカラム（Ｃ４  ｇｕａｒｄ  ｃｏｌｕｍｎ）を用いて脱塩し、そして三倍四極（ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）機器を使用してＥＳＭＳによってオンラインで分析した。このＥＳＭＳの原データを、荷電されていない質量スペクトルを産生するために、ＭａｘＥｎｔプログラムによって逆重畳積分した。この手順は、分子量の確定のための１つのピークに分解するために、複数の荷電したシグナルを可能にする。
【０１７５】
（ペグ化）
本発明の非グリコシル化ポリペプチドのペグ化を実行するために、Ｔ２９９ＡおよびＴ２９９Ｃ改変体Ｆｃの０．９４ｍｇ／ｍＬ溶液の５０μＬアリコートを、一晩−２０℃にて、１ｍＬのエタノールを用いて始めに沈殿した。結果として生じる沈殿物を、次いで、ペレット化し、そしてエタノールを除去し、そして６．４Ｍ尿素、２％  ＳＤＳおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）の５０μＬの溶液を添加し、そしてこの溶液を５分間１００℃まで加熱した。還元のため、サンプルの半分を、３０分間室温で４ｍＭ  ＴＣＥＰで処置した。ｐＨ６．５にて１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液の５μＬのアリコートを次いで添加し、続いて５０μＬのＨ２Ｏまたは５ｍＭのＰＥＧ（５Ｋ）−マレイミド溶液のいずれかを添加した。室温にて３０分後、Ｌａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液の４Ｘ溶液の１０μＬアリコートを３０μＬの反応混合物に添加し、そしてこの溶液を５分間１００℃まで加熱した。次いで、５μＬおよび１５μＬアリコートの組み換えタンパク質を、発生したペグ化の相対量の確定のために４〜２０％勾配ゲルにロードした。
【実施例】
【０１７６】
（実施例１：非グリコシル化抗体を産生および特徴付けるための方法）
以下の実施例は、真核生物細胞における非グリコシル化抗体の産生およびその結果として生じる抗体の特徴付けを記載する。
【０１７７】
ＣＤ１５４リガンドに対する結合親和性を有するＩｇＧ１サブタイプのモデルヒト抗体（ｈｕ５ｃ８）をコードする核酸は、いくつかの変更の１つを有するように遺伝子的に操作された。第一の変更は、野生型アミノ酸残基（すなわち、２９９位のスレオチン、アラニン（Ｔ２９９Ａ））の代わりにコードするコドンを含む。別の変更において、２９９位のスレオニンをコードするコドンを、システイン（Ｔ２９９Ａ）をコードするように変化させた。コントロール変更もまた含め、その中で、グリコシル化される特定のアスパラギンが変異される（Ｎ２９７Ｑ）（図３、図５〜図７）。さらに、このＴ２９９Ａ変異を、ＩｇＧ４サブタイプのモデルヒト抗体ｈｕ５Ｃ８中へ導入した。このＩｇＧ４配列は、分子間鎖ジスルフィドを安定化するために（非グリコシル改変と関連のない問題点）、ヒンジペプチド（Ｓ２２８Ｐ）にさらなる改変を有していた（図４）。各改変を、発現ベクター中に取り込み、そして本明細書に記載される方法を使用して、真核生物細胞株の中に導入した。さらに、前述の変更をまた、対応する可変領域から離れたＦｃ領域の状況に関してテストした。対応するコントロール抗体または抗体フラグメントに共に各改変された抗体またはそのＦｃフラグメントを、次いで細胞培養中で発現し、細胞培養培地から収集し、そして標準的な技術を使用して精製した。各抗体または抗体フラグメントを、次いで、その非グリコシル化および結合活性について特徴付けた。
【０１７８】
各抗体または抗体フラグメントに関する非グリコシル化を、標準ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー技術を使用して特徴付けた。特に、ネイティブ条件下で、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにサイズ排除クロマトグラフィーを実行し、そしてテスト抗体（ｈｕ５ｃ８）およびそのフラグメント（すなわち、ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ）のＴ２９９ＡおよびＴ２９９Ｃ改変体は、予測された分子サイズおよびサブユニット機構であったことを示した。Ｔ２９９ＡおよびＴ２９９Ｃ抗体改変体のグリコシル化の欠如を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質の重鎖のより急速な移動によって示した（図３）。さらに、還元条件下の質量分光法はまた、構築物の予想された質量およびＴ２９９ＡおよびＴ２９９Ｃ改変体におけるグリカンの欠如を確定した（図８〜図１１）。還元条件下の質量分光法はまた、ｈｕＩｇＧ１  Ｔ２９９Ｃ  Ｆｃ改変体上のシステイン付加体の存在を示した（図８〜図１１）。
【０１７９】
Ｔ２９９Ａ改変体の質量は、予測したタンパク質ダイマーに対応した（予測値５１，８２４．７、測定値５１，８２６）。対照的に、Ｔ２９９Ｃ改変体の質量は、予測値より２４６Ｄａｌｔｏｎ大きかった（予測値５１，８８６、測定値５２，１３２）（図３）。これは、Ｆｃダイマーへの２つのシステイン付加体の付加に対応する（２×１２０＝２４０）（図５）。
【０１８０】
それゆえ、グリコシル化モチーフへ近接する第一のアミノ酸の変更は、第二のアミノ酸残基における抗体のグリコシル化を阻害し、それによって真核生物細胞における非グリコシル化抗体を産生するための効率的なおよび依存できるアプローチを提供したと結論した。
【０１８１】
（実施例２：十分に立体的にかさ高いおよび／または十分な電荷のアミノ酸置換を使用して減少したエフェクター機能を有する非グリコシル化抗体を産生するための方法）
以下の実施例は、グリコシル化を阻害するために十分に立体的にかさ高いおよび／または十分な電荷の残基を有する第一のアミン酸残基における抗体を変更することによる非グリコシル化抗体の産生を記載する。
【０１８２】
候補抗体（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４サブタイプの抗体）をコードする核酸を、グリコシル化および／またはエフェクター機能を阻害するように予測されたいくつかの変更の１つを有するように遺伝子的に操作した。理論に束縛されることは望まないが、システイン付加体に関して上で得られた結果は、十分にかさ高いおよび／または十分に荷電した残基は、Ｆｃ含有ポリペプチドをグリコシル化することからグリコシダーゼを阻害し、そして望ましくないエフェクター機能を減少するという理論的説明を支持する。例えば、かさ高いまたは電荷した残基を有するカバット位の２９９（例えば、Ｔ２９９）における置換は、例えば、２９７位における抗体をグリコシル化することからグリコシダーゼを阻害すると予測される。さらに、そのようなアミノ酸置換はまた、Ｆｃレセプターへの抗体の結合を調節すると予測される。抗体Ｆｃ領域とＦｃレセプター（例えば、ＦｃγＩＩＩｂレセプター）との間の結合複合体において、抗体Ｆｃ領域の残基Ｔ２９９を、ＦｃγＩＩＩｂレセプターとの結合界面に非常に近接するように配置する。特に、ＦｃγＩＩＩｂレセプターのＹ１５０およびＨ１５２残基へのＴ２９９残基の側鎖化学の距離は、それぞれ、４．２Åおよび５．６Åである。従って、Ｔ２９９を十分に立体的にかさ高さを有する残基（例えば、Ｆ、Ｈ、Ｑ、Ｗ、またはＹ）と置換することによって、この抗体は、好ましくない立体的相互作用に起因して、非グリコシル化だけではなく、Ｆｃレセプターへの減少したＦｃ結合親和性を有する。
【０１８３】
なおさらに、グリコシル化およびＦｃ結合の阻害を、荷電した側鎖化学（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｋ、またはＲ）を有するＴ２９９で置換することによって調節し得る。結果として生じる抗体改変体は、好ましくない静電気相互作用に起因して、グリコシル化が減少するだけでなく、Ｆｃレセプターへの減少したＦｃ結合親和性を有する。
【０１８４】
それゆえ、第一のアミノ酸残基側鎖化学を十分に立体的なかさ高さおよび／または十分な電荷を有するアミノ酸側鎖化学に改変することは、第二のアミノ酸残基における抗体のグリコシル化を阻害し、ならびにＦｃレセプターへのＦｃ結合を減少すると予測される。従って、本発明は、真核生物細胞において減少したエフェクター機能を有する非グリコシル化抗体を産生するための効率的なおよび依存的なアプローチを提供する。
【０１８５】
（実施例３：非グリコシル化抗体をペグ化するための方法）
以下の実施例は、真核生物細胞における非グリコシル化抗体の産生および結果として生じる抗体のペグ化を記載する。
【０１８６】
特に、Ｔ２９９Ｃ抗体改変体を、始めにＴＣＥＰでタンパク質を還元し、システイン付加体を除去し、何日にもわたってタンパク質を透析することによってヒンジジスルフィドを再形成することを可能にし、そしてＰＥＧ−マレイミドと反応させることによって、非変性条件下でＰｅｇ−マレイミドを用いて特異的に改変されたと確定した。Ｔ２９９Ａ抗体改変体を、これらの条件下でＰＥＧを用いて改変し得なかった（図６）。
【０１８７】
簡潔に、テストタンパク質を還元するために、２００μＬの０．９４ｍｇ／ｍＬのＴ２９９ＡおよびＴ２９９Ｃ  Ｆｃ抗体改変体調製物を、３時間室温にて、４μＬの５００ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）（最終濃度１０ｍＭ)および１０μＬの１００ｍＭ  ＴＣＥＰ（最終濃度５ｍＭ)で処置した。この還元されたタンパク質を、４日間にわたって、１：１０００の体積比率において５回の変更を伴い、ＰＢＳに対して透析した。アリコート（５μＬ）のタンパク質調製物を、次いで非変性条件において１時間、５μＬの５ｍＭ  ＰＥＧ−マレイミド（５，０００ｍｗ）で処置し、そして次いで、１００ｍＭ  ＤＴＴを含む５μＬの４Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を付加することによってＳＤＳ−ＰＡＧＥを調製した。Ｔ２９９Ｃ抗体改変体のみが、ＰＥＧ付加体を有すると観察した（図７）。
【０１８８】
Ｔ２９９Ｃシステインがシステインジスルフィド結合を形成したとの確証を、Ｆｃをチオール特異性改変試薬のＰＥＧ−マレイミドと反応するよう試みることによって得た。非還元条件ではなく、変性条件下（６．４Ｍ尿素、２％ＳＤＳ）において、ＰＥＧ−マレイミドとの反応は起きなかった。還元条件下において、Ｔ２９９Ｃ改変体は、ＰＥＧ−マレイミドと反応し、Ｔ２９９Ａ改変体よりも大きい産生物を産生し、余分のシステインの存在を示した（図３）。
【０１８９】
それゆえ、第二のアミノ酸残基における抗体のグリコシル化を阻害し得るグリコシル化モチーフに近接する第一のアミノ酸の変更（システイン残基に変更した場合）はまた、効率的なおよび依存的なペグ化残基を提供すると結論した。
【０１９０】
（実施例４：非グリコシル化抗体の変更されたエフェクター機能を確定する方法）
以下の実施例は、本発明の非グリコシル化抗体の変更されたエフェクター機能を確定するためのアッセイを記載する。
【０１９１】
本発明の非グリコシル化改変体抗体のエフェクター機能を、抗体を結合し、そしてまたＦｃレセプターまたは補体分子（例えば、Ｃ１ｑ）も結合する能力によって特徴付けた。特に、ＦｃγＲ結合親和性を、ＣＤ１５４抗原とＦｃレセプターを保有する細胞との間に「橋」を形成する抗体の能力に基づくアッセイを用いて測定した。Ｃ１ｑ結合親和性を、ＣＤ１５４抗原とＣ１ｑとの間に「橋」を形成する抗体の能力に基いて測定した（図１４〜図１５）。
【０１９２】
簡潔に、ＦｃγＲ架橋アッセイを、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）を、組み換え可溶性ヒトＣＤ１５４リガンドでコーティングすることによって実行した（すなわち、ＰＢＳ中に４℃にて一晩１μｇ／ｍｌの濃度にて；Ｋａｒｐｕｓａｓ、Ｈｓｕら、１９９５）。抗ＣＤ１５４抗体（ｈｕ５ｃ８）のグリコシル化されたまたは非グリコシル化形態の滴定を次いで、３７℃にて３０分間、ＣＤ１５４へ結合し、次いで、このプレートを洗浄し、そして蛍光標識化Ｕ９３７（ＣＤ６４＋）細胞の結合を測定した。Ｕ９３７細胞を、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ培地で増殖し、１：２に分割し、そしてＦｃレセプター（ＦｃγＲＩ）発現を増加させるために１０００ユニット／ｍｌのＩＦＮγとのアッセイの前に１日、活性した。
【０１９３】
上記アッセイの別の改変において、本発明の抗体のさらに別のＦｃレセプター（特に、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））に結合する（または、むしろ結合しない）能力を、ＣＤ１６発現構築物でトランスフェクトされた蛍光標識化ヒトＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）に対して上記の架橋アッセイを使用して実行した。上記リガンドを、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｃｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）において増殖された一層のＣＤ１５４発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生した。このＣＨＯ−ＣＤ１５４＋細胞を、１×１０５細胞／ｍｌにて９６ウェルプレートに接種し、そして１０％の透析されたＦＢＳ、１００ｎＭメトトレキサート、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ)を伴うα−ＭＥＭ中の集密度まで増殖した。このＣＤ１６＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、４００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を伴うＲＰＭＩ中にて増殖し、そしてこのアッセイを実行する１日前に１：２に分割した。
【０１９４】
両方のレセプターに関するアッセイにおいて、Ｆｃレセプター保有細胞を、２０分間３７℃にて２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオロセインアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）で標識化した。過剰の標識を除去するために洗浄した後、１×１０５の標識化細胞を、３０分間３７℃にてアッセイにおいてインキュベートした。結合されていないＦｃγＲ陽性細胞を、数回洗浄することによって除去し、そしてプレートを、４８５ｎｍの興奮波長および５３０ｎｍの放出波長にてマイクロプレートリーダー（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ２３５０Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）上で読み取った。
【０１９５】
各架橋アッセイにおいて、ＦｃｙＲＩ（上のパネル）またはＦｃγＲＩＩＩ（下のパネル）結合の機能として本発明の非グリコシル化ＩｇＧ１抗体改変体のエフェクター機能の減少を、観察した（図１２〜図１３）。特に、グリコシル化されずおよびシステイン付加体を形成し得るＴ２９９Ｃ改変体を、単に非グリコシル化抗体（図１２、上のパネル）と比較して少ないエフェクター機能（ＦｃγＲＩ結合）を有することを観察した。この非グリコシルＩｇＧ４  Ｔ２９９Ａ抗体改変体をまた、例外的に低いＦｃＲγＩへの結合（ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ａ改変体よりも低い）を見い出した。このことは、グリコシル化されたＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体はこのアッセイにおいて類似の結合を示すので（図１３）、予測されなかった。
【０１９６】
Ｃ１ｑ結合アッセイを、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）を、ＰＢＳ中で一晩４℃にて１０μｇ／ｍｌの５０μｌの組み換え可溶性ヒトＣＤ１５４リガンド（Ｋａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１５；３（１２）：１４２６（１９９５））で、コーティングすることによって実行した。このウェルを、吸引し、そして３回洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で洗浄し、そして１時間以上、２００μｌ／ウェルの遮断／希釈緩衝液（０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．１％ゼラチン）で遮断した。テストされる抗体を、３倍の希釈溶液を用いた遮断／希釈緩衝液中で、１５μｇ／ｍｌで開始して、希釈した。１ウェルにつき５０μｌを添加し、そしてこのプレートを、２時間室温にてインキュベートした。上記のように吸引および洗浄後、遮断／希釈緩衝液中で希釈した５０μｌ／ウェルの２μｇ／ｍｌのＳｉｇｍａヒトＣ１ｑ（Ｃ０６６０）を添加し、そして１．５時間室温にてインキュベートした。上記のように吸引および洗浄後、遮断／希釈緩衝液中で３，５６０倍に希釈した５０μｌ／ウェルのヒツジ抗Ｃ１ｑ（Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＡＨＰ０３３）を添加した。１時間室温にてインキュベートした後、このウェルを上記のように吸引しそして洗浄した。遮断液／希釈液で１：１０，０００に希釈された５０μｌ／ウェルのロバ抗ヒツジＩｇＧ  ＨＲＰ接合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ７１３−０３５−１４７）を、次いで添加し、そしてこのウェルを１時間室温にてインキュベートした。上記のように吸引および洗浄後、１００μｌのＴＭＢ基質（４２０μＭ  ＴＭＢ、０．１Ｍの酢酸ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．９、中の０．００４％  Ｈ２Ｏ２)を添加し、そして１００μｌの２Ｎ硫酸との反応を止める前に２分間インキュベートした。吸収度を、Ｓｏｆｔｍａｘ  ＰＲＯ機器を用いて４５０ｎｍと読み取り、そしてＳｏｆｔｍａｘソフトウェアを、４−パラメータフィット（４−ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｉｔ）を用いて相対結合親和力（Ｃ値）を確定するために使用した。
【０１９７】
図１４〜図１５に示されるように、Ｔ２９９Ｃ変異体は、ｈｕ５ｃ８抗体以下だけではなく非グリコシル化Ｎ２９７ＱおよびＴ２９９Ａ改変体以下のＣ１ｑ結合親和性を有し、このことは、システインへの変異は、予想外に有益であることを指摘する。ＩｇＧ４  Ｔ２９９Ａ変異体は、非グリコシル化ＩｇＧ４と類似してＣ１ｑへの結合を示さなかった。
【０１９８】
それゆえ、グリコシル化モチーフに近接する第一のアミノ酸の変更は、第二のアミノ酸残基における抗体のグリコシル化を阻害し、そして第一のアミノ酸がシステイン残基である場合、この抗体はエフェクター機能をより減少したと結論した。さらに、ＩｇＧ４サブタイプの抗体のグリコシル化の阻害は、予想したよりもＦｃγＲＩ結合に著しい影響を与えた。
【０１９９】
（等価物）
当業者にとって、日常の実験法だけを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に相当する物は多い。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】図１は、代表的な抗原結合ポリペプチド（ＩｇＧ抗体）の構造および抗体の抗原結合およびエフェクター機能（例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合）の機能的特性を示す。また、どのように抗体のＣＨ２ドメインにおける糖の存在（グリコシル化）が、エフェクター機能（ＦｃＲ結合）を変更するかを示し、抗原結合に影響しないことを示す。
【図２】図２は、本発明の抗体のＦｃ領域の構造および配列を示し、グリコシル化されたアミノ酸残基に近接している残基は、グリコシル化を阻害するために変更し得る（左のパネル）。また、第一のアミノ酸残基がシステインである場合、グリコシル化が阻害されるだけでなく、システイン残基は機能的部分（例えば、遮断部分（例えば、システイン付加体またはペグ化部分（図示されている）あるいは他の機能的部分（図示されず））を結合するための部位を提供することも示す（右のパネル）。
【図３】図３は、非還元条件（レーン１〜５）および還元条件（レーン７〜１１）下の、グリコシル化された抗体および非グリコシル化抗体ＩｇＧ１改変体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のデジタル画像を示す。この非グリコシル化抗体改変体（またはそのＦｃ領域）は、グリコシル化されたコントロールよりも早く移動する。なぜなら、この改変体は、添加された糖部分を欠くからである（レーン２とレーン３〜５とおよびレーン８とレーン９〜１１とを比較すること）。特に、レーン１は、コントロ−ルである全長の抗体（モノクローナルＩｇＧ１）を含み、レーン２は、コントロールである野生型（グリコシル化された）Ｆｃ領域（ＩｇＧ１）を含み、レーン３は、非グリコシル化Ｆｃ改変体（Ｎ２９７ＱヒトＩｇＧ１）を含み、レーン４は、非グリコシル化Ｆｃ改変体（Ｔ２９９ＡヒトＩｇＧ１）を含み、レーン５は、非グリコシル化Ｆｃ改変体（Ｔ２９９ＣヒトＩｇＧ１）を含み、レーン６は、分子量標準（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｔａｎｄａｒｄ）を含み、レーン７は、コントロールである全長の抗体（モノクローナルＩｇＧ１）を含み、レーン８は、コントロールである野生型（グリコシル化された）Ｆｃ領域（ＩｇＧ１）を含み、レーン９は、非グリコシル化Ｆｃ改変体（Ｎ２９７ＱヒトＩｇＧ１）を含み、レーン１０は、非グリコシル化Ｆｃ改変体（Ｔ２９９ＡヒトＩｇＧ１）を含み、そしてレーン１１は、非グリコシル化Ｆｃ改変体（Ｔ２９９ＣヒトＩｇＧ１）を含む。
【図４】図４は、非還元条件（レーン１〜３）および還元条件（レーン５〜７）下の、グリコシル化された抗体および非グリコシル抗体ＩｇＧ４改変体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のデジタル画像を示す。ＩｇＧ４非グリコシル抗体改変体は、グリコシル化されたコントロールよりも早く移動する。なぜなら、この改変体は、添加された糖部分を欠くからである（レーン２とレーン３とおよびレーン６とレーン７とを比較すること）。特に、レーン１とレーン５は、コントロ−ルであるＩｇＧ１を含み、レーン２およびレーン６は、コントロールであるＩｇＧ４抗体を含み、そしてレーン３およびレーン７は、ＩｇＧ４非グリコシル改変体（Ｔ２９９Ａ）を含む。レーン４は、分子量標準を含む。
【図５】図５は、ペグ−マレイミドの存在下（レーン３、レーン４、レーン８、およびレーン９）およびペグ−マレイミドの非存在下（レーン１、レーン２、レーン６、およびレーン７）でシステインが遮断されることを示している非還元条件下の、非グリコシル化抗体改変体（Ｆｃ領域）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のデジタル画像を示す。特に、レーン１０で分子量標準を有しており、レーン１〜４は、Ｔ２９９Ｃを含み、そしてレーン６〜９は、Ｔ２９９Ａを含む。
【図６】図６は、減少した移動性によって証拠付けされた、導入されたシステイン（Ｔ２９９Ｃ）はペグ化されるが、アラニン残基（Ｔ２９９Ａ）はペグ化されないことを示す還元条件下で、非グリコシル化抗体改変体（Ｆｃ領域）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のデジタル画像を示す。特に、レーン１〜２は、増加する量（２．５μｇ、７．５μｇ）のＦｃ  Ｔ２９９Ｃをロードされ、レーン３〜４は、ペグ化されたＦｃ  Ｔ２９９Ｃをロードされ、レーン５〜６は、増加する量のＦｃ  Ｔ２９９Ａをロードされ、レーン７〜８は、ペグ化されたＦｃ  Ｔ２９９Ａをロードされ、そしてレーン９は、タンパク質分子量マーカーをロードされた。
【図７】図７は、始めにシステイン付加体を除去するためにＴＣＥＰを用いてテストタンパク質を還元した後、減少した移動性によって証拠付けされた、導入したシステイン（Ｔ２９９Ｃ）はペグ化されるが、アラニン残基（Ｔ２９９Ａ）はペグ化されないことを示すペグ化が続く、非還元および非変性条件下で、抗体改変体Ｔ２９９Ａ（Ｆｃ領域）と比較した抗体改変体Ｔ２９９Ｃ（Ｆｃ領域）のペグ化のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のデジタル画像を示す。特に、レーン１は、還元および再酸化後に非還元ゲルの条件でＦｃ  Ｔ２９９Ａをロードされ、レーン２は、還元および再酸化後に非還元ゲルの条件でＦｃ  Ｔ２９９Ｃをロードされ、レーン３は、タンパク質分子量マーカーをロードされ、レーン４は、還元されるゲルの条件でペグ−マレイミドを伴わないＦｃ  Ｔ２９９Ａをロードされ、レーン５は、還元されるゲルの条件でペグ−マレイミドを伴わないＦｃ  Ｔ２９９Ｃをロードされ、レーン６は、還元されるゲルの条件でＦｃ  Ｔ２９９Ａおよびペグ−マレイミドをロードされ、そしてレーン７は、還元されるゲルの条件でＦｃ  Ｔ２９９Ｃおよびペグ−マレイミドをロードされた。
【図８】図８〜１１は、還元条件および非還元条件下で、システイン（Ｔ２９９Ｃ）変異またはアラニン（Ｔ２９９Ａ）変異を有する非グリコシル化抗体改変体の質量分光法ヒストグラム分析を示す。この質量分光法データは、非還元条件下において、Ｔ２９９Ｃ抗体改変体は、２９９位においてシステインと連結したシステイン付加体の形成に起因して質量を添加したことを示すが、アラニンが存在する場合（すなわち、Ｔ２９９Ａ）、そのような付加体は形成されないことを示す。
【図９】図８〜１１は、還元条件および非還元条件下で、システイン（Ｔ２９９Ｃ）変異またはアラニン（Ｔ２９９Ａ）変異を有する非グリコシル化抗体改変体の質量分光法ヒストグラム分析を示す。この質量分光法データは、非還元条件下において、Ｔ２９９Ｃ抗体改変体は、２９９位においてシステインと連結したシステイン付加体の形成に起因して質量を添加したことを示すが、アラニンが存在する場合（すなわち、Ｔ２９９Ａ）、そのような付加体は形成されないことを示す。
【図１０】図８〜１１は、還元条件および非還元条件下で、システイン（Ｔ２９９Ｃ）変異またはアラニン（Ｔ２９９Ａ）変異を有する非グリコシル化抗体改変体の質量分光法ヒストグラム分析を示す。この質量分光法データは、非還元条件下において、Ｔ２９９Ｃ抗体改変体は、２９９位においてシステインと連結したシステイン付加体の形成に起因して質量を添加したことを示すが、アラニンが存在する場合（すなわち、Ｔ２９９Ａ）、そのような付加体は形成されないことを示す。
【図１１】図８〜１１は、還元条件および非還元条件下で、システイン（Ｔ２９９Ｃ）変異またはアラニン（Ｔ２９９Ａ）変異を有する非グリコシル化抗体改変体の質量分光法ヒストグラム分析を示す。この質量分光法データは、非還元条件下において、Ｔ２９９Ｃ抗体改変体は、２９９位においてシステインと連結したシステイン付加体の形成に起因して質量を添加したことを示すが、アラニンが存在する場合（すなわち、Ｔ２９９Ａ）、そのような付加体は形成されないことを示す。
【図１２】図１２は、ＦｃγＲＩ（上のパネル）またはＦｃγＲＩＩＩ（下のパネル）結合の機能として、本発明の非グリコシル化抗体ＩｇＧ１改変体のエフェクター機能の減少を示す。グリコシル化されずそしてシステイン付加体により改変されるＴ２９９Ｃ改変体は、単に非グリコシル化抗体（上のパネル）と比較して、より弱いエフェクター機能（ＦｃγＲＩ結合）を有する。
【図１３】図１３は、ＦｃγＲＩ（上のパネル）またはＦｃγＲＩＩＩ（下のパネル）結合の機能として、本発明の非グリコシル化抗体ＩｇＧ４改変体のエフェクター機能の減少を示す。Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４改変体は、非グリコシル化ＩｇＧｌ形態と比較して、より弱いエフェクター機能（ＦｃγＲＩ結合）を有する。
【図１４】図１４は、補体タンパク質であるＣ１ｑに対する結合の機能として、非グリコシルＩｇＧ１抗体（すなわち、ｈｕ５ｃ８）のエフェクター機能の減少を示す。グリコシル化されずそしてシステイン付加体により改変されるＴ２９９Ｃ改変体は、非グリコシル化形態と比較して、より弱いエフェクター機能（すなわち、Ｃ１ｑ結合）を有する。
【図１５】図１５は、補体タンパク質であるＣ１ｑに対する結合の機能として、非グリコシルＩｇＧ４抗体（すなわち、ｈｕ５ｃ８）のエフェクター機能の減少を示す。Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４改変体は、非グリコシル化ＩｇＧ１改変体と比較して、より弱いエフェクター機能（すなわち、Ｃ１ｑ結合）を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年4月24日(2006.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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