(57)【要約】  本発明は、環境中で限定された増殖および生存率を有する、ラクトバシラス・サリバリウスLactobacillus salivariusの組換え菌株に関するものである。より詳しくは、本発明は、チミジンが存在する培地中でのみ生存することができるにすぎない組換えラクトバシラスに関するものである。チミジンへのこの厳格な依存性によって、この組換え菌株には、チミジン欠乏死が急速に誘導される。好適実施態様は、チミジンが存在する宿主生物内でのみ生存し得るにすぎないが、この培地化合物が不在である宿主生物外では生存することができないラクトバシラスである。その上、該ラクトバシラス株は、予防および／または治療用の分子で形質転換することができ、そのようなものとして、炎症性腸疾患のような、しかしそれに限られない疾患を処置するのに用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え欠陥遺伝子ｔｈｙＡを含むラクトバシラス種の単離株であって、該株の生存がチミジンの存在に厳格に依存する菌株。
【請求項２】
該ラクトバシラス種がラクトバシラス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）である、請求項１記載のラクトバシラス種の単離株。
【請求項３】
該ラクトバシラス種がラクトバシラス・サリバリウス亜種サリバリウス（salivarius）ＵＣＣ１１８株である、請求項１または２記載のラクトバシラス種の単離株。
【請求項４】
さらに、１６時間で少なくとも２logｃｆｕである、チミジンの不在下での生存率の初期低下を特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のラクトバシラス種の単離株。
【請求項５】
予防および／または治療用の分子の送達のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のラクトバシラス種の単離株の使用。
【請求項６】
該送達が、チミジンおよび／またはチミン濃度を厳密に制御することができない条件下での生物学的閉じ込めを必要とする、請求項５記載のラクトバシラス種の単離株の使用。
【請求項７】
該予防および／または治療用の分子がインターロイキン１０である、請求項５または６記載のラクトバシラス種の単離株の使用。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のラクトバシラス種の単離株を含む薬学的組成物。
【請求項９】
医薬を製造するための、請求項５〜７のいずれか一項に記載のラクトバシラス種の単離株の使用。
【請求項１０】
炎症性腸疾患の処置のための医薬を製造するための、請求項５〜７のいずれか一項に記載のラクトバシラス種の単離株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、環境中で限定された増殖および生存率を有する、組換えラクトバシラス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）菌株に関する。より詳しくは、本発明は、チミジンが存在する培地中でのみ生存することができるにすぎない組換えラクトバシラスに関するものである。チミジンへのこの厳格な依存性によって、この組換え菌株には、チミジン欠乏死が急速に誘導される。好適実施態様は、チミジンが存在する宿主生物内でのみ生存し得るにすぎないが、この培地化合物が不在である宿主生物外では、生存することができないラクトバシラスである。その上、該ラクトバシラス株は、予防および／または治療用の分子で形質転換することができ、そのようなものとして、炎症性腸疾患のような、しかしそれに限られない疾患を処置するのに用いることができる。
【０００２】
発明の背景
乳酸菌は、長い間、非常に様々な工業的発酵法に用いられてきた。それらは、安全であると広く考えられている状態を有して、商業的に重要なタンパク質を生産するのに潜在的に役立つ生物となっている。実際、いくつかの異種タンパク質、たとえばインターロイキン２は、乳酸球菌内で成功裡に産生される［Steidlerら（1995）］。しかし、そのような遺伝的に改変された微生物が環境中で生存かつ拡散することは、望ましくない。
【０００３】
遺伝的に改変された微生物の意図されない放出を避けるには、物理的閉じ込めのための安全な取扱いおよび技術的要件のための特別な指針が用いられる。これは、工業的な発酵には役立つものの、物理的閉じ込めは、充分であるとは一般に考えられず、追加的な生物学的閉じ込めの手段が講じられて、遺伝的に改変された微生物が環境中で生存する可能性を低減している。生物学的閉じ込めは、物理的閉じ込めが困難であるか、または適用不能でさえある場合に、極めて重要である。とりわけ、このことは、遺伝的に改変された微生物が生ワクチンとしてか、または治療化合物の送達のための担体として用いられる用途に該当する。そのような用途は、たとえば、生物学的活性を有するペプチド、たとえばサイトカインを非侵襲性または非病原性の組換え細菌による対象者への送達を開示する、国際公開第９７／１４８０８号公報（WO 97/14806）に記載されている。国際公開第９６／１１２７７号公報（WO 96/11277）は、治療用タンパク質をコード化している組換え細菌の投与による、動物（ヒトを包含する）への治療用化合物の送達を記載している。Steidlerら（2000）は、インターロイキン１０を分泌する組換えラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）の投与による大腸炎の処置を記載している。そのような送達は、実際に、冒されたヒトまたは動物の疾患を処置するのに極めて有用であるが、組換え細菌は、冒されていない対象者に侵入したときは、有害かつ病原性の微生物として作用することがあり、微生物のそのような意図されない拡散を回避する、効率的な生物学的閉じ込めが必要とされる。
【０００４】
乳酸球菌を用いれば、充分な処置を達成することができるものの、それは、該細菌がコロニーを形成せず、効果を確保するには、投薬を連続的な方法で適用しなければならないことを主な短所として有する。ラクトバシラスのようなコロニー形成菌株は、一回の投与分、または限られた数の投与分で、類似の効果を用いることができるという利点を有するであろう。しかし、乳酸球菌の場合と同様に、環境中での細菌の拡散を避けるには、厳格な生物学的閉じ込めシステムを必要とする。
【０００５】
宿主生物のための生物学的閉じ込めシステムは、外部環境に存在しないか、または低濃度で存在する、特異的な増殖因子もしくは栄養素に対する宿主の厳格な必要条件に基づいて受動的であるか、あるいは特異的な環境条件下でのみ発現されるにすぎないプロモーターの制御下にある遺伝子がコード化している、細胞致死機能によって外部環境中で宿主を殺す、宿主内のいわゆる自殺性遺伝的要素に基づいて能動的であり得る。
【０００６】
受動的な生物学的閉じ込めシステムは、大腸菌Escherichia coliまたはサッカロミセス・セレビシエSaccharomyces cerevisiaeのような微生物では周知である。そのような大腸菌株は、たとえば米国特許第４１００４９５号明細書（US4100495）に開示されている。国際公開第９５／１０６２１号公報（WO 95/10621）は、乳酸菌のサプレッサー突然変異株、および乳酸菌における閉じ込めの手段としてのその使用を開示しているが、その場合、閉じ込めは、宿主菌株のレベルではなくて、プラスミドのレベルでのものであり、宿主菌株のプラスミドを安定化するが、遺伝的に改変された宿主菌株自体に対する閉じ込めを与えない。
【０００７】
能動的な自殺システムは、数名の著者が記載している。そのようなシステムは、二つの要素；すなわち、致死遺伝子、および許されない条件下で致死遺伝子の発現を起動する制御配列からなる。国際公開第９５／１０６１４号公報（WO 95/10614）は、細胞質レベルで活性を有する、断端された、かつ／または突然変異させた黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusのヌクレアーゼを致死遺伝子として用いることを開示している。国際公開第９６／４０９４７号公報（WO 96/40957）は、必須遺伝子（許された環境中に細胞が存在するときに発現され、許されない環境中に細胞が存在するときには発現されないか、または一時的に発現される）および／または致死遺伝子（遺伝子の発現が、細胞に対して致死的であり、その発現は、許されない環境中に細胞が存在するときに発現されるが、許された環境中に細胞が存在するときは発現されない）のいずれかの発現に基づいて、環境的に制限された生存率を有する、組換え細菌系を開示している。国際公開第９９／５８６５２号公報（WO 99/58652）は、ｒｅｌＥなる細胞毒素に基づく生物学的閉じ込めシステムを記載している。しかし、ほとんどのシステムは、大腸菌に対して［Tedinら（1995）；Knudsenら（1995）；Schwederら（1995）］か、またはシュードモナス属Pseudomonasに対して［Kaplanら（1999）；Molinaら（1998）］工夫されている。
【０００８】
興味深い代替策は、チミジル酸シンターゼの遺伝子における突然変異を閉じ込めシステムとして用いることである。そのような突然変異を有する原核細胞および真核細胞は、ともに、低濃度のチミジンまたはチミンでは増殖することができず、この飢餓に応答して細胞死を生じる。この現象は、チミン欠乏死として公知である［Goulianら（1986）；Ahmadら（1998）］。この突然変異に基づく閉じ込めシステムは、FuおよびXu（2000）が、ラクトバシラス・カゼイL. caseiからのｔｈｙＡなる遺伝子を選別マーカーとして用いる、ラクトバシラス・アシドフィルスL. acidophilusについて記載している。用いられたｔｈｙＡ突然変異株は、自然突然変異およびトリメトプリム選別によって選別された。そのような突然変異は、復帰しやすく、もう一つのラクトバシラス種のｔｈｙＡ遺伝子を用いて、マーカー遺伝子のインリコンビネーションによる突然変異の復帰を回避している。実際、ｔｈｙＡ突然変異の復帰は、問題であり、特に培地中のチミンまたはチミジンの不在下では、突然変異は、高い頻度で復帰することになって、この菌株は、その閉じ込めの特徴性を失いつつある。許容され得る生物学的閉じ込めのためには、復帰しない突然変異株が求められている。
【０００９】
非復帰性突然変異株は、遺伝子破壊によって得ることができる。この破壊に基づく閉じ込めシステムは、乳酸球菌について記載されている［Steidlerら（2003）］。しかし、ラクトバシラス・カゼイのｔｈｙＡ遺伝子は、クローニングされ、部位指定突然変異誘発によって突然変異されているものの、大腸菌でのみ試験されたにすぎず、ラクトバシラス株における遺伝子交換には決して用いられていない。ラクトバシラスのための形質転換手法は、当業者に公知であるが、ラクトバシラスにおけるｔｈｙＡの遺伝子破壊は、成功したことがなく、明らかに証拠付けられいない。
【００１０】
驚異的にも、本発明者らは、ラクトバシラスにおけるｔｈｙＡ破壊を構成することができた。はるかに驚異的にも、本発明者らは、この破壊突然変異株の生存は、厳格にチミジン依存性であり、該突然変異株は、培地へのチミンの添加によっては救済できないことを見出した。後者は、ｔｈｙＡ突然変異株は、培地へのチミジンまたはチミンのいずれかの添加によって救済できることが一般的に容認されている［FuおよびXu（2000）；Ahmadら（1998）］ことから、特に驚異的である。そのような菌株の生存率は、チミジンの不在下で（チミンの存在下であってさえ）急速に低下し、そのため、生物学的閉じ込めが必要なときは理想的な宿主菌株となる。チミジン欠乏死の急速な誘導（以前に記載された乳酸球菌株に対してより高速である）、および該菌株がチミンによっては救済できないことの双方によって、それは、ヒトをはじめとする生存動物体内への予防および／または治療用の分子の送達のための理想的な菌株となる。
【００１１】
発明の説明
ラクトバシラスのための適切な生物学的閉じ込めシステムを提供することが、本発明の目的である。
【００１２】
本発明の第一の態様は、チミジル酸シンターゼの組換え欠陥遺伝子（ｔｈｙＡ）を含むラクトバシラス種の単離株であって、その生存がチミジンの存在に厳格に依存する菌株である。好ましくは、該組換え欠陥遺伝子は、染色体中に位置し、遺伝子破壊によって不活性化される。遺伝子破壊は、本明細書に用いられる限りで、ＤＮＡフラグメントの挿入による破壊、遺伝子またはその一部の欠失はもとより、もう一つのＤＮＡフラグメントによる遺伝子またはその一部の交換による破壊を包含し、該破壊は、組換えＤＮＡの手法によって誘導され、自然突然変異によって誘導されない。好ましくは、破壊は、もう一つの機能的遺伝子による遺伝子またはその一部の交換である。好ましくは、チミジル酸シンターゼの組換え欠陥遺伝子は、非復帰性突然変異株の遺伝子である。
【００１３】
本明細書に用いられる限りでの非復帰性突然変異株は、復帰頻度が１０-8未満であり、好ましくは復帰頻度が１０-10未満であり、はるかに好ましくは該復帰頻度が１０-12未満であり、はるかに好ましくは該復帰頻度が１０-14未満であり、最も好ましくは該復帰頻度が、当業者には公知の常套的方法を用いて検出できないことを意味する。好ましくは、該ラクトバシラス種は、ラクトバシラス・サリバリウスである。はるかに好ましくは、該ラクトバシラスは、ラクトバシラス・サリバリウス亜種サリバリウスＵＣＣ１１８株である。非復帰性ｔｈｙＡ突然変異株は、チミジン飢餓に応答して細胞死を生じる［Ahmadら（1998）］ことから、能動的な閉じ込めの一形態と考えることができる。
【００１４】
以前に記載されたすべてのｔｈｙＡ突然変異株とは対照的に、該突然変異株は、チミンによって救済することができず、たとえチミンが培地中に存在しても細胞死を生じることになる。救済されるとは、本明細書に用いられる限りで、該菌株が、その増殖に必要な、チミジン以外のすべての化合物が存在する場合に、一定濃度のチミンを培地に添加しても増殖できないことを意味する。好ましくは、該突然変異株は、２５μg/ml、より好ましくは３０μg/ml、より好ましくは４０μg/ml、はるかに好ましくは５０μg/ml、最も好ましくは１００μg/mlの濃度でのチミンの存在下でさえ、チミジン欠乏死を生じることになる。この突然変異株は、更に、培地中のチミジンの不在下での生存率の急速な低下を特徴とする。好ましくは、チミジンの不在下での生存率の初期低下は、１６時間で２log単位のコロニー形成単位（ｃｆｕ）という速さであり、はるかに好ましくは、初期低下は、１２時間で２log単位のｃｆｕであり、最も好ましくは、初期低下は、８時間で２log単位のｃｆｕという速さである。生存率の初期低下は、菌株を、チミジンを欠くＭＲＳ培地中で３７℃に保ったとき、０時間でのコロニー形成単位と比しての、Ｘ時間（ここではそれぞれ１６、１２または８）後のｃｆｕとして測定される。
【００１５】
以前に記載されたラクトバシラスのｔｈｙＡ突然変異株は、他のｔｈｙＡ突然変異株と同様に、培地へのチミンまたはチミジンの添加によって常に救済することができた。しかし、特にチミンおよび／またはチミジンの濃度を注意深く制御することができない場合に、培地中のチミジンへの厳格な依存は、生物学的閉じ込めのための強力な利点である。非限定的な例として、これは、痕跡量のチミンが混入し得る大量の培地を用いる工業的発酵に該当得る。更に、本発明は、そのような菌株は、それを人体をはじめとする動物体内への送達担体として用いるような場合には、特に役立つ。そのような形質転換された菌株が、たとえば経口的に動物（ヒトを包含する）に与えられたとき、それは、腸内で生存し、該動物に有益であり得る同種および／または異種タンパク質、非限定的にたとえば、ヒトインターロイキン１０を産生する。この突然変異株がチミジンによって救済できないという事実は、特に、糞便中のチミジンまたはチミンの残留濃度を制御することができない、人体および動物体に用いたとき、より優れた閉じ込めを与える。
【００１６】
したがって、本発明のもう一つの態様は、予防および／または治療用の子を送達するための生物学的な閉じ込められた菌株としての、本発明による乳酸菌株の使用である。好ましくは、該送達は、チミジンおよび／またはチミン濃度を厳密に制御することができない条件、非限定的にたとえば、疾患を予防かつ／または治療するための、ヒトを包含する動物への該予防用および／または治療用の分子の送達の下での生物学的閉じ込めを必要とする。チミジンおよび／またはチミン濃度を厳密に制御することができない条件とは、本明細書に用いられる限りで、該濃度に対する直接的な制御、たとえばチミンまたはチミジンの能動的な、かつ制御された添加または除去による濃度の制御が皆無であることを意味する。好ましくは、チミンまたはチミジン欠乏状態は、自然な過程、たとえば腸内でのチミジンの摂取によるチミジンの枯渇によって形成される。予防および／または治療用の分子の送達は、非限定的な例として、国際公開第９７／１４８０６号公報（WO 97/14806）および国際公開第９８／３１７８６号公報（WO 98/31786）に開示されている。予防および／または治療用の分子は、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、第１群サイトカイン、第２群サイトカイン、第３群サイトカイン、神経ペプチドおよび抗体、ならびに病原性細菌からの多糖類抗体のようなポリペプチドを非限定的に包含する。
【００１７】
好適実施態様では、ラクトバシラス種の株、好ましくはラクトバシラス・サリバリウスのｔｈｙＡ遺伝子を、破壊し、機能的なヒトインターロイキン１０発現カセットで置き換え、この菌株は、ＩＬ−１０の送達に用いることができる。該インターロイキン１０発現ユニットは、好ましくは、ヒトのインターロイキン１０発現ユニット、またはヒトインターロイキン１０をコード化している遺伝子であるが、これらに限られない。したがって、好適実施態様は、ヒトインターロイキン１０を送達するための本発明によるラクトバシラス種の株の使用である。該分子を送達する方法、および炎症性腸疾患のような疾患を処置する方法は、Steidlerらへの国際公開第９７／１４８０８号および第００／２３４７１（WO 00/23471）、ならびにSteidlerら（2000）に詳しく説明されている（引用によって本明細書に援用される）。本発明は、本発明による菌株が、驚異的にも、対照菌株と同じ速度で消化管を通過し、その生存率の減損が、対照菌株のそれと実際上異ならないことを示すことを立証している。しかし、該菌株は、環境中、たとえば糞便中に分泌されたならば、もはやそれ以上生存することができない。欠失突然変異種が腸内、より具体的には回腸でも生存することができ、そのようなものとして、生物学的に閉じ込められた送達菌株として用いることができるという事実は、それがもっぱらチミジンにのみ依存することから、特に驚異的である。
【００１８】
本発明のもう一つの態様は、ラクトバシラス種の本発明によるｔｈｙＡ破壊突然変異株を含む薬学的組成物である。非限定的な例として、該細菌は、腸への送達を改善するために、カプセルに封入してもよい。カプセル封入の方法は、当業者に公知であり、とりわけ欧州特許出願公開第０４５０１７６号公報（EP 0450176）に開示されている。
【００１９】
本発明の更にもう一つの態様は、医薬を製造するための本発明による菌株の使用である。好ましくは、該医薬は、クローン病または炎症性腸疾患を処置するのに用いられる。
【００２０】
実施例
実施例のための材料および方法
培地
別途記述されない限り、ラクトバシラス株は、ＭＲＳ（Merck）中で培養した。
【００２１】
用いた特別な培地：
ＢＭ９：Ｎａ2ＨＰＯ4６g／ＫＨ2ＰＯ4３g／ＮＨ4Ｃｌ１g／ＮａＣｌ０．５g／１mmolのＭｇＳＯ4／０．１mmolのＣａＣｌ2／０．５％のグルコース／カシトン（casitone、difco）で強化した、pH８．５の５０mMＣＯ3-緩衝液１リットル。
ＭＲＳΔＴ（チミジンを欠くＭＲＳ）：ＭＲＳ粉末（Merck）を、適切な量（製造者による）の蒸留水に溶解した。溶液を、１００℃に１分間加熱し、室温まで冷えるに任せた。チミジンホスホリラーゼ（SIGMA）１．２単位を、１mlについて加えた。溶液を、３７℃に２０時間温置し、次いでオートクレーブ処理した。
【００２２】
菌株
ラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８株［Dunneら（2001）］を、ｔｈｙＡ突然変異株を構成するための受容菌株として用いた。
【００２３】
実施例１：ｔｈｙＡ突然変異株の構成
ラクトバシラス・サリバリウスｔｈｙＡ突然変異株の構成は、基本的には、ラクトコッカス・ラクチスについて記載されたとおりに［Steidlerら（2003）］、変更を加えて実施した。この構成は、図１に要約されている。ラクトバシラス・サリバリウス亜種サリバリウスのＵＣＣ１１８株を、コーディング配列の上流および下流配列も含めて配列決定した。これらの配列の知識は、下記に記載するような方法でのいかなるラクトバシラス株の遺伝子工学についても決定的に重要なものであって、それは、この方針が、ｔｈｙＡの５’末端の１，０００bpおよび３’末端の１，０００bpの部域、すなわち「ｔｈｙＡ標的」における二重相同組換えを用いることになるからである。
【００２４】
ＵＣＣ１１８株で、ｔｈｙＡ遺伝子を、分泌リーダーを有するタンパク質をコード化している合成遺伝子と置き換えたが、この分泌リーダーは、２位のプロリンが、ラクトコッカス・ラクチスのｔｈｙＡプロモーター（ＰｔｈｙＡ；Genバンク、AF462070）に機能的に結合した、アラニンと置き換えられた、ｈＩＬ−１０の成熟部分と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質と融合させた、ラクトバシラス中で機能を有する。プロモーターおよびｈＩＬ−１０遺伝子のいかなる組合せも、ｈＩＬ−１０発現カセットと呼ばれる。形質転換は、１．５kV、２５mF、４００Ω、２mmの間隙長での電気穿孔法によった。
【００２５】
ｔｈｙＡ置換えは、基本的にはBiwasら（1993）が記載したとおりに、相同組換えによって実施した。下記に記載されるとおり、ｔｈｙＡ標的のプラスミド保有バージョン内での適切な置換えを実施した。
【００２６】
この方針は、予め標的となるラクトバシラス株に持ち込まれたヘルパープラスミド（クロラムフェニコール選別マーカーを有する）と、上記のとおり、染色体ｔｈｙＡ遺伝子の上流および下流配列が隣接するｈＩＬ−１０発現カセットをコード化しているキャリアープラスミド（エリスロマイシン耐性マーカーを有する）とを必要とする。
【００２７】
ヘルパープラスミドのｐＴＧＢ０１９は、ｐＶＥ６００７の修正バージョンである。ｐＴＧＢ０１９を構成するために、オリゴヌクレオチドＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣおよびＧＣＧＡＣＴＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＴＣＣＡＴＡＣＣＣを用い、３，２２１bpの挿入断片を、ＰＣＲ増幅によってｐＫＤ２０から生成し、ＨｉｎｄIIIおよびＳｐｅＩで切断した。このフラグメントは、大腸菌アラビノースプロモーターの制御下で、Ｒｅｄγ、βおよびエキソ遺伝子をコード化しており、ＨｉｎｄIII−ＳｐｅＩ開放ｐＶＥ６００７内に結合させた。しかし、この発現系は、Ｌ．サリバリウス内では機能的であることを示さなかった。様々なＲＥＤ組換え酵素遺伝子のｍｙｃタグ標識化バージョンを有する菌株へのアラビノースの添加は、ウエスタンブロット分析によって顕在化したとき、いかなる発現も示さず、ｐＴＧＢ０１９を有するラクトバシラスも、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルー染色による細胞内タンパク質分析によって判定される限りで、ＲＥＤ遺伝子のいずれか一方の発現も示さなかった。挿入断片は、むしろ、ヘルパープラスミドｐＴＧＢ０１９を、ｐＶＥ６００７と比較したとき、ラクトバシラス中での複製に対して、より不安定にさせることになった。
【００２８】
キャリアープラスミドを、ｐＴＧＢ０１９を保持するラクトバシラス株内に電気穿孔させた。両プラスミドとも、安定的に共存しなかった。この時点では、組込みの機序が機能する仕方が不明確であった。電気穿孔混合物を、１０μg/mlでのエリスロマイシンおよび２００μMでのチミジンを含有する固体寒天ＭＲＳプレートに播種し、４２℃で２４時間温置した。
【００２９】
キャリアープラスミドは、ラクトバシラス内で複製することができない。したがって、与えられた菌株にエリスロマイシン耐性を移転するための唯一の方途は、ｔｈｙＡ標的の５’の１，０００bpまたは３’の１，０００bpのいずれかでの最初の相同組換えを実施するときである。エリスロマイシン陽性のコロニーは、図１に示したとおり、そのような相同組換えの発生についてのＰＣＲによって確認した。
【００３０】
エリスロマイシン耐性クローンの一サブセットは、依然としてｐＴＧＢ０１９を保有した。これらのクローンを、第二のクロスオーバーを示すクローンを単離するのに利用した。適切な希釈を、ＭＲＳ固体寒天プレート上で４２℃で平板培養し、これらのコロニーから、エリスロマイシンおよびクロラムフェニコール感受性クローンを、チミジン不在ＭＲＳ中での増殖不能、上流および下流双方での組換えはもとより、ｔｈｙＡ遺伝子の不在についてふるい分けした。
【００３１】
ｔｈｙＡ標的の３’の１，０００bpまたは５’の１，０００bpでの第二の相同組換えは、望みの菌株を生じた。エリスロマイシンの不在下、および５０μg/mlのチミジンの存在下での反復的増殖によって、第二の組換えについての選別を実施した。コロニーは、図１に示したようなＰＣＲによって試験した。
【００３２】
得られた菌株を、ＴＧＢ０７８（ヒトＩＬ−１０）およびＴＧＢ（ｔｈｙＡプロモーターに機能的に結合したヒトＩＬ−１０）と呼んだ。
【００３３】
実施例２：ｔｈｙＡ-およびＩＬ−１０+ラクトバシラスの同定
ＰＣＲによる第一次ｔｈｙＡ-およびＩＬ−１０+の確認
ｈＩＬ−１０挿入断片を有するラクトバシラスコロニーの第一次確認を、図２に提示したとおり、ＰＣＲ試験によって実施した。ｔｈｙＡ（図２、１）またはＩＬ−１０（図２，２）の検出、ＩＬ−１０のフランキング配列（図２、３〜６）およびｔｈｙＡのフランキング配列（図２、７および８）の検出のために、数セットのプライマーを用いた。
【００３４】
結果は、突然変異菌株ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２では、ｔｈｙＡのコーディング配列が、ヒトＩＬ−１０配列に置き換えられていることを明確に示している。
【００３５】
【表１】
2007537741.tif 000002
【００３６】
サザンブロット分析によるラクトバシラスのｔｈｙＡ-およびＩＬ−１０+特性の確認
ゲノム以外のどこにもｔｈｙＡまたはＩＬ−１０のコピーが存在しないことを確かめるため、サザンブロット分析によって組込みを試験した。ラクトバシラスの異なる菌株から、ゲノムＤＮＡ標品を作成した。ラクトバシラスのゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩによって消化し、サザンブロット分析に付した。ブロットは、ｔｈｙＡ（ｔｈｙＡプローブ；ＰＣＲプライマー対１で得た）またはｈＩＬ−１０（ＩＬ−１０プローブ；ＰＣＲプライマー対２で得た）を同定するためのジゴキシゲニン標識化プローブを用いて顕在化した。ＰＣＲの結果に基づいて予測されたとおり、突然変異株についてのブロット上のｔｈｙＡプローブのシグナルは陰性であり、ｈＩＬ−１０プローブのシグナルは陽性であったのに対し、親株についてのｔｈｙＡプローブのシグナルは陽性であり、ｈＩＬ−１０のシグナルは陰性であった。結果を表２に要約する。
【００３７】
【表２】
2007537741.tif 000003
【００３８】
実施例３：ｔｈｙＡ-およびＩＬ−１０+ラクトバシラスによるヒトＩＬ−１０の産生
ｈＩＬ−１０分泌を評価するため、各菌株の単一コロニーを、５０μg/mlのチミジンで強化したＭＲＳ中で増殖させた。３７℃での増殖の４０時間後に、細菌を遠心単離によって採集し、５０μg/mlのチミジンで強化した緩衝Ｍ９（ＢＭ９）に再懸濁させた。懸濁液を３７℃で５時間温置し、次いで、ヒトＩＬ−１０の普及をＥＬＩＳＡ（Becton Dickinson）によって決定した。結果を図４に要約する。ヒトＩＬ−１０コーディング配列を含む両菌株は、確かにＩＬ−１０を産生したが、ヒトＩＬ−１０コーディング配列を、ラクトコッカス・ラクチスのｔｈｙＡプロモーターに機能的に結合したときは、産生がはるかに高まった。ＩＬ−１０の産生は、ラクトコッカス・ラクチスについて記載された［Steidlerら（2003）］のより低かったが、量は、慢性腸炎症を処置するためにin vivoで効果的であるには充分に多かった。
【００３９】
実施例４：チミジン不在下での生存
チミジン不在培地中での生存を、二つの突然変異菌株および親菌株について試験した。生存は、培養体１mlあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）として、時間の関数として測定した。結果を図５および６に提示する。
【００４０】
すべての菌株の単一コロニーを、２５μg/mlのチミジンで強化したＭＲＳΔＴ中に接種し、３７℃で２０時間温置した。細菌を、遠心単離によって採集し、１容のＭＲＳΔＴで２回洗浄し、１容のＭＲＳΔＴに再懸濁させ、ＭＲＳΔＴ中で１：２０に希釈し、３７℃で温置した。適切な時点で、１mlあたりのＣＦＵを、５０μg/mlのチミジンで強化したＭＲＳ固体寒天プレート上で平板培養することによって決定した。
【００４１】
理解できるとおり、ＣＦＵは、５００分後には２log単位を上回って減少した。１，０００分未満の後には、３log単位の減少が達成された。これらの結果は、ラクトコッカス・ラクチスについてSteidlerら（2003）が達成したもの（２log単位での減少を達成するのに約２倍の時間を要し、３log単位での減少を達成するのに５０時間を要した）よりはるかに優れている。これらの結果は、チミンの存在下で得られたことに注目するのが重要である。実際、チミジンは、チミジンをチミンに転換する酵素処理によって培地から除去されている。チミンの残留濃度にもかかわらず、チミジン飢餓によって誘導される死は、極めて迅速であって、この菌株がチミンの存在によって救済できないことを示している。
【００４２】
実施例５：ラクトバシラスＴｈｙＡ突然変異株は、チミンによって救済することができない
ラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８（ｔｈｙＡ野生型）、ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２（ともにｔｈｙＡ欠如）を、ＭＲＳ、２００μMのチミジンを加えたＭＲＳ（ＭＲＳＴｄ）、または８００μMのチミンを加えたＭＲＳ（ＭＲＳＴｍ）中で増殖させた。３７℃での２９時間の増殖後に、６００nmにおける光学密度を測定した。
【００４３】
得られたデータ（図７）は、ＵＣＣ１１８は、増殖培地にかかわりなく、匹敵する光学密度に到達することを示す。ＭＲＳ中のチミジンの濃度は、ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２の増殖を限定する。２００μMのチミジンをＭＲＳに加えたとき、ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２は、ＵＣＣ１１８と同じ光学密度に到達する。ＭＲＳへの８００μMのチミンの添加は、より高い光学密度へのＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２の増殖を支援することができない。
【００４４】
図７から認識することができるとおり、ＭＲＳは、実質的な量のチミジンを含有する。チミジンは、チミジンホスホリラーゼによってチミンに転換することができる。したがって、チミジンホスホリラーゼで消化されたＭＲＳは、ＭＲＳΔＴを与える。ラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８（ｔｈｙＡ野生型）、ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２（ともにｔｈｙＡ欠如）を、ある範囲のチミジンまたはチミン濃度を加えたＭＲＳΔＴ中で増殖させた。３７℃での増殖の２４時間後、培養体は、飽和に達した。２４時間におけるＯＤ600を、チミジンまたはチミン濃度に対してプロットした（図８および９）。
【００４５】
これらの結果は、両ｔｈｙＡ欠如株ともに、増殖のために外来性チミジンを用いることができるが、チミンについてはそれができないのに対し、野生型の増殖は、チミジンまたはチミンのいずれの添加によっても影響されない（図１０）ことを示して、増殖の欠如は、チミン毒性によらないことを証明している。
【００４６】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ラクトバシラス・サリバリウスのすべての菌株は、該当する場合にその菌株コード（ＵＣＣ１１８、ＴＧＢ０７８、ＴＧＢ０９２）で示される。  パネルＡ：ＵＣＣ１１８ｔｈｙＡ（斜線）とｈＩＬ−１０（黒）との間の遺伝子交換の模式的全体図である。大きさが１Kbの相同組換えの標的ＤＮＡ（灰色）は、ＵＣＣ１１８の染色体はもとより、複製しない、エリスロマイシン（Ｅｍ）耐性マーカー陽性プラスミドにも、それぞれ、ｔｈｙＡおよびｈＩＬ−１０の上流および下流の双方に存在する。ＵＣＣ１１８の染色体ＤＮＡ（太い黒線）は、上流および下流双方の標的ＤＮＡに隣接している。複製しないプラスミドをＵＣＣ１１８に導入した後（１）、形質転換混合物をＥｍの存在下で温置した。これは、１Ｆ／１Ｒまたは２Ｆ／２Ｒのオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって区別することができる、上流または下流のいずれかの標的における相同組換え事象の選択を可能にする（２）。Ｅｍの不在下、および５０μg/mlのチミジンの存在下での反復的な増殖は、組み合わせた１Ｆ／１Ｒおよび２Ｆ／２ＲのＰＣＲによって検出することができる、第二の組換えが発生するのを可能にする（３）。Ｅｍ陰性である、１Ｆ／１Ｒ２Ｆ／２ＲのＰＣＲで陽性のクローンが、望みの遺伝的構造を有する（４）。  パネルＢ：親菌株のラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８、ならびに得られる菌株のラクトバシラス・サリバリウスＴＧＢ０７８およびラクトバシラス・サリバリウスＴＧＢ０９２の詳細を示す。ＴＧＢ０９２は、ラクトコッカス・ラクチスのｔｈｙＡプロモーターを保有する（ＰｔｈｙＡ、GenBank第ＡＦ４６２０７０番）。
【図２】ラクトバシラス・サリバリウスＴＧＢ０７８およびラクトバシラス・サリバリウスＴＧＢ０９２なる菌株を生じる、ラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８のｔｈｙＡ（斜線）とｈＩＬ−１０（黒）との間の遺伝子交換のＰＣＲによる同定を示す。菌株は、すべて、その菌株コード（ＵＣＣ１１８、ＴＧＢ０７８、ＴＧＢ０９２）によって示されている。パネルＡは、異なるＰＣＲ反応の模式的全体図を示す。パネルＢは、該当する分子サイズ間隔のアガロースゲル電気泳動によるデータを示す。１〜８の数字は、両パネルにおける異なるＰＣＲ反応を示す。  ＰＣＲ１：ＵＣＣ１１８におけるｔｈｙＡの検出（ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２では検出されない）。  ＰＣＲ２：ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２におけるｈＩＬ１０の検出（ＵＣＣ１１８では検出されない）。  ＰＣＲ３：ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２の標的領域外の上流ゲノムＤＮＡに結合したｈＩＬ１０の検出（ＵＣＣ１１８では検出されない）。大きさの差は、図１Ｂで詳述したとおり、ｈＩＬ−１０プロモーター領域の差の結果である。  ＰＣＲ４：ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２の標的領域外の下流ゲノムＤＮＡに結合したｈＩＬ−１０の検出（ＵＣＣ１１８では検出されない）。  ＰＣＲ５：ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２の標的領域外の上流ゲノムＤＮＡに結合したｈＩＬ−１０の検出（ＵＣＣ１１８では検出されない）。大きさの差は、図１Ｂで詳述したとおり、ｈＩＬ−１０プロモーター領域の差の結果である。  ＰＣＲ６：ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２の標的領域外の下流ゲノムＤＮＡに結合したｈＩＬ−１０の検出（ＵＣＣ１１８では検出されない）。  ＰＣＲ７：ＵＣＣ１１８の標的領域外の上流ゲノムＤＮＡに結合したｔｈｙＡの検出（ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２では検出されない）。  ＰＣＲ８：ＵＣＣ１１８の標的領域外の下流ゲノムＤＮＡに結合したｔｈｙＡの検出（ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２では検出されない）
【図３】ラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８、ラクトバシラス・サリバリウスＴＧＢ０７８およびラクトバシラス・サリバリウスＴＧＢ０９２のサザンブロットハイブリダイゼーションを示す。菌株は、すべて、その菌株コード（ＵＣＣ１１８、ＴＧＢ０７８、ＴＧＢ０９２）によって示されている。完全な染色体ＤＮＡは、製造者が記載したとおりにQiagen Dneasy組織キットを用い、プロトコールの最初の工程の間に、細菌の細胞壁をリゾチームで消化するよう適合させて製造した。このＤＮＡ標品を、ＥｃｏＲＩで切断し、RocheのＤＩＧ標識化ＤＮＡ分子量マーカーVIIとともに１．２％アガロースゲル上で単離した。ＤＮＡを、ナイロン膜に移し、ＤＩＧ標識化ｔｈｙＡおよびｈＩＬ−１０プローブで顕在化した。ＤＩＧ標識化および検出は、すべて、製造者（Roche）が記載したとおりに実施した。ＵＣＣ１１８は、ｔｈｙＡプローブによる適切な大きさのシグナルを示し、ｈＩＬ−１０プローブでは示さない。ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２は、ｔｈｙＡプローブではシグナルを示さないが、ｈＩＬ−１０プローブでは適切な大きさのシグナルを示す。後者の大きさの差は、図１に概説したとおり、ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２の双方のプロモーター構造の差に起因する。
【図４】ラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８、ラクトバシラス・サリバリウスＴＧＢ０７８およびラクトバシラス・サリバリウスＴＧＢ０９２によるＩＬ−１０産生を示す。菌株は、すべて、その菌株コード（ＵＣＣ１１８、ＴＧＢ０７８、ＴＧＢ０９２）によって示されている。すべての菌株の単一コロニーを、５０μg/mlのチミジンで強化したＭＲＳに接種し、３７℃で４０時間温置した。細菌を、遠心単離によって採集し、５０μg/mlのチミジンで強化したＢＭ９（緩衝Ｍ９増殖培地）に再懸濁させ、３７℃で５時間温置した。培養上清中のＩＬ−１０を、ＥＬＩＳＡ（Becton Dickinson）によって決定した。
【図５】ラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８、ラクトバシラス・サリバリウスＴＧＢ０７８およびラクトバシラス・サリバリウスＴＧＢ０９２のチミジンの不在下での生存を示す。菌株は、すべて、その菌株コード（ＵＣＣ１１８、ＴＧＢ０７８、ＴＧＢ０９２）によって示されている。培養体の１mlあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を、時間に対してプロットした。
【図６Ａ】ラクトコッカス・ラクチスＭＧ１３６３およびそのＴｈｙＡ突然変異株であるＴｈｙ１２と比較した、ラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８およびラクトバシラス・サリバリウスＴＧＢ０９２のチミジンの不在下での生存を示す。図示された菌株のいずれかの１８コロニーを、（Ａ）ラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８（野生型）またはＬ．サリバリウスＴＧＢ０９２（ｔｈｙＡ欠如）の場合に、ラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８ＭＲＳΔＴ（チミジン不在ＭＲＳ；すべてのチミジンのチミンへの転換によって酵素的に調製）、（Ｂ）Ｌ．ラクチスＭＧ１３６３（野生型）またはＬ．ラクチスＴｈｙ１２（ｔｈｙＡ欠如）の場合に、ＧＭ１７ΔＴ（チミジンおよびチミン不在ＧＭ１７；ｔｈｙＡ欠如ラクトコッカス・ラクチスによるＧＭ１７からのチミジンおよびチミンの細菌学的枯渇、濾過、ならびにオートクレーブ処理およびグルコース再添加によって調製）のそれぞれ８７ml中に接種した。  懸濁液を分割し、いずれか一方の懸濁液の半分に、チミジンを１μMに達するよう加えた。  懸濁液を、すべて、適切数のバイアルにアリコートとして採り、これらのバイアルを、３７℃（ラクトバシラス）または３０℃（乳酸球菌）でインキュベーションした。適切な希釈の三重平板培養によって実施される限りでの１mlあたりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）を決定するため、バイアルを一度だけ開いた。この実験の途中で、ｔｈｙＡ欠如株は、すべて、０ｃｆｕに達した（すなわち、１：１希釈１００μlを平板培養した３枚のプレートに、０個のコロニーが存在した）。ＴＧＢ０９２は、２４時間および４８時間後に、ほぼ０ｃｆｕの値に達し（１：１希釈１００μlを平板培養したときの最大値は、１プレートあたり１コロニー）、０μMおよび１μMのチミジンの設定では、それぞれ、９６時間および７２時間後に０ｃｆｕの値に達した。
【図６Ｂ】ラクトコッカス・ラクチスＭＧ１３６３およびそのＴｈｙＡ突然変異株であるＴｈｙ１２と比較した、ラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８およびラクトバシラス・サリバリウスＴＧＢ０９２のチミジンの不在下での生存を示す。図示された菌株のいずれかの１８コロニーを、（Ａ）ラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８（野生型）またはＬ．サリバリウスＴＧＢ０９２（ｔｈｙＡ欠如）の場合に、ラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８ＭＲＳΔＴ（チミジン不在ＭＲＳ；すべてのチミジンのチミンへの転換によって酵素的に調製）、（Ｂ）Ｌ．ラクチスＭＧ１３６３（野生型）またはＬ．ラクチスＴｈｙ１２（ｔｈｙＡ欠如）の場合に、ＧＭ１７ΔＴ（チミジンおよびチミン不在ＧＭ１７；ｔｈｙＡ欠如ラクトコッカス・ラクチスによるＧＭ１７からのチミジンおよびチミンの細菌学的枯渇、濾過、ならびにオートクレーブ処理およびグルコース再添加によって調製）のそれぞれ８７ml中に接種した。  懸濁液を分割し、いずれか一方の懸濁液の半分に、チミジンを１μMに達するよう加えた。  懸濁液を、すべて、適切数のバイアルにアリコートとして採り、これらのバイアルを、３７℃（ラクトバシラス）または３０℃（乳酸球菌）でインキュベーションした。適切な希釈の三重平板培養によって実施される限りでの１mlあたりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）を決定するため、バイアルを一度だけ開いた。この実験の途中で、ｔｈｙＡ欠如株は、すべて、０ｃｆｕに達した（すなわち、１：１希釈１００μlを平板培養した３枚のプレートに、０個のコロニーが存在した）。ＴＧＢ０９２は、２４時間および４８時間後に、ほぼ０ｃｆｕの値に達し（１：１希釈１００μlを平板培養したときの最大値は、１プレートあたり１コロニー）、０μMおよび１μMのチミジンの設定では、それぞれ、９６時間および７２時間後に０ｃｆｕの値に達した。
【図７】チミンおよびチミジンの存在下での、ラクトバシラスの野生型およびＴｈｙＡ突然変異株の２９時間後の成長を示す。ＭＲＳ、２００μMのチミジンを加えたＭＲＳ（ＭＲＳＴｄ）、または８００μMのチミンを加えたＭＲＳ（ＭＲＳＴｍ）中のＵＣＣ１１８、ＴＧＢ０７８およびＴＧＢ０９２の６００nmにおける光学密度（ＯＤ600）を、３７℃での増殖の２９時間後に測定した。３７℃での増殖の２９時間後のＭＲＳ、ＭＲＳＴｄおよびＭＲＳＴｍのＯＤ600は、０．０００であった。
【図８】上昇する濃度のチミンおよびチミジンの存在下での、異なる二つのラクトバシラスＴｈｙＡ突然変異株の成長曲線である。２４時間におけるＯＤ600を、チミジンまたはチミンの濃度に対してプロットした。同じ濃度範囲にわたって測定したときのＵＣＣ１１８の２４時間におけるＯＤ600は、チミジンまたはチミン濃度と無関係に完全な飽和に到達した。
【図９】上昇する濃度のチミンおよびチミジンの存在下での、異なる二つのラクトバシラスＴｈｙＡ突然変異株の成長曲線：低濃度での詳細を示す。２４時間におけるＯＤ600を、チミジンまたはチミンの濃度に対してプロットした。同じ濃度範囲にわたって測定したときのＵＣＣ１１８の２４時間におけるＯＤ600は、チミジンまたはチミン濃度と無関係に完全な飽和に到達した。
【図１０】チミンおよびチミジンの異なる濃度におけるラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８の増殖（２４時間におけるＯＤ600）であって、突然変異株の増殖の欠如が、チミン毒性によらないことを示す。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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