(57)【要約】【解決手段】  細胞を支持するおよび／または軟部組織細胞系譜の細胞に分化する能力を有する分娩後組織に由来する細胞、および調整方法およびこれらの分娩後組織由来細胞の利用が本発明で提供される。また本発明は、軟部組織疾患を治療する上でのそのような分娩後由来細胞の利用法とそれに関連する製品を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に血液を含まないヒト分娩後組織由来の細胞を有する分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）であって、前記ＰＰＤＣは培養において自己複製及び増殖し、前記ＰＰＤＣは軟部組織細胞に栄養補助を提供し、前記細胞は増殖にＬ−バリンを必要とし、前記細胞は約５％〜約２０％の酸素存在下で増殖し、前記細胞はさらに以下の特徴、
（ａ）顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）、レチキュロン１、組織因子、ビメチン、及びα−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生、
（ｂ）フローサイトメトリーで検出されるとおり、ＧＲＯ−αまたは酸化低密度リポタンパク質受容体の少なくとも１つの産生の欠如、
（ｃ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、
（ｄ）フローサイトメトリーで検出されるとおり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの少なくとも１つの産生の欠如、
（ｅ）線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連して、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子、α誘導蛋白質３の少なくとも１つに対して増加した発現、若しくは線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連して、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポタンパク質受容体１、タンパク質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、卵巣癌で下方制御された遺伝子１、仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つに対して増加した発現、
（ｆ）線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連して、以下の、低身長感受性ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａ蛋白質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）間葉ホメオボックス２、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス類似体  １、クリスタリンαＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベーター２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０蛋白質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン、ｓｒｃ  ホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ−細胞転座遺伝子１（抗増殖性物質）、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、仮想蛋白質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー、ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７、仮想遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンＶＩＩＩ型、α１、テネイシンＣ、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ８、シナプス小胞糖タンパク質２、ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャンネルサブファミリーＮメンバー４、インテグリンα７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１蛋白質、ＰＤＺ−結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックス類似体２、ＫＩＡＡ１０３４蛋白質、初期成長反応３、ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓホメオボックス５、仮想蛋白質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素ＩＩ型）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７蛋白質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想蛋白質ＦＬＪ１４０５４、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク質５、ＥＧＦ−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞腫の腫瘍原性の抑制１、インスリン様成長因子結合蛋白質２  ３６ｋＤａの少なくとも１つに対して減少した発現、
（ｇ）ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌、
（ｈ）ＥＬＩＳＡで検出されるＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如、
（ｉ）培養において少なくとも４０集団倍加を経る能力
の少なくとも１つを有する細胞。
【請求項２】
マトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及びヒアルロン酸を消化する粘液溶解酵素の少なくとも１つを用いた酵素解離により、分娩後胎盤またはその断片から単離された、請求項１の細胞。
【請求項３】
請求項１の細胞において、
前記細胞は、軟部組織表現型に分化するように誘導されるものである。
【請求項４】
請求項１の細胞において、
前記軟部組織細胞は、軟骨組織、半月組織、靱帯組織、腱組織、椎間板組織、歯周組織、皮膚組織、血管組織、筋肉組織、筋膜組織、骨膜組織、眼組織、心膜組織、肺組織、滑膜組織、神経組織、腎組織、骨髄、泌尿生殖器組織、腸組織、肝組織、膵臓組織、脾臓組織、または脂肪組織の細胞である。
【請求項５】
請求項３の細胞において、
前記軟部組織の表現型は、軟骨組織、半月組織、靱帯組織、腱組織、椎間板組織、歯周組織、皮膚組織、血管組織、筋肉組織、筋膜組織、骨膜組織、眼組織、心膜組織、肺組織、滑膜組織、神経組織、腎組織、骨髄、泌尿生殖器組織、腸組織、肝組織、膵臓組織、脾臓組織、または脂肪組織の細胞の表現型である。
【請求項６】
請求項１の前記分娩後由来細胞を有する、細胞集団。
【請求項７】
請求項６の細胞集団において、
前記細胞集団は、実質的に均一である。
【請求項８】
請求項６の細胞集団において、
前記細胞集団は、不均一である。
【請求項９】
請求項８の細胞集団であって、さらに、
骨髄細胞、脂肪細胞、幹細胞、角化細胞、血管内皮細胞、筋芽細胞、筋細胞、間質細胞、および他の軟部組織前駆細胞の少なくとも１つの細胞タイプを有するものである細胞集団。
【請求項１０】
前記請求項６の前記細胞集団から調整された、細胞溶解物。
【請求項１１】
前記請求項１０の前記細胞溶解物から調整された、可溶性細胞画分。
【請求項１２】
請求項６の前記細胞集団の細胞外基質。
【請求項１３】
請求項６の前記細胞集団と１若しくはそれ以上の生理活性因子とを有する組成物。
【請求項１４】
前記請求項１５の組成物において、
前記生理活性因子は、分化誘導因子、抗アポトーシス薬、抗炎症薬、免疫抑制薬／免疫調節薬、抗増殖薬、コルチコステロイド、抗体、抗血栓形成薬、抗酸化剤、および瘢痕抑制因子の少なくとも１つである。
【請求項１５】
請求項１の細胞と薬学的に許容可能な担体とを有する、薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１０の細胞外基質と薬学的に許容可能な担体とを有する、薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項１２の細胞溶解物と薬学的に許容可能な担体とを有する、薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１５の薬学的組成物において、
前記組成物は、軟部組織疾患を治療するために有効な量の前記細胞を有するものである。
【請求項１９】
請求項１６の薬学的組成物において、
前記組成物は、軟部組織疾患を治療するために有効な量の前記細胞外基質を有するものである。
【請求項２０】
請求項１７の薬学的組成物において、
前記組成物は、軟部組織疾患を治療するために有効な量の前記溶解物を有するものである。
【請求項２１】
請求項１５の薬学的組成物であって、さらに、
幹細胞、上皮細胞、皮膚線維芽細胞、メラニン形成細胞、角化細胞、および他の上皮前駆細胞の少なくとも１つの他の細胞タイプを有するものである。
【請求項２２】
請求項１５の薬学的組成物であって、さらに、
幹細胞、筋細胞、筋芽細胞、および筋細胞の少なくとも１つの他の細胞タイプを有するものである。
【請求項２３】
請求項１５の薬学的組成物であって、さらに、
幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、および間質細胞の少なくとも１つの細胞タイプを有するものである。
【請求項２４】
培地で請求項１の少なくとも１つの細胞を有する、細胞培養。
【請求項２５】
請求項６の細胞集団の条件培地。
【請求項２６】
請求項１の分娩後由来細胞に前記軟部組織を曝露することで、軟部組織細胞に栄養補助を提供する方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法において、
前記軟部組織細胞は、幹細胞、筋細胞、筋芽細胞、角化細胞、メラニン形成細胞、皮膚線維芽細胞、骨髄細胞、脂肪細胞、上皮細胞、内皮細胞、または間質細胞である。
【請求項２８】
請求項２６の方法において、
前記軟部組織細胞は、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、および内皮前駆細胞の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２９】
請求項２８の方法において、
前記曝露する工程は、前記内皮細胞による血管新生を刺激するものである。
【請求項３０】
請求項２５の条件培地に前記軟部組織を曝露することで、軟部組織細胞に栄養補助を提供する方法。
【請求項３１】
請求項３０の方法において、
前記軟部組織細胞は、幹細胞、筋細胞、筋芽細胞、角化細胞、メラニン形成細胞、骨髄細胞、脂肪細胞、上皮細胞、内皮細胞、または間質細胞である。
【請求項３２】
請求項３１の方法において、
前記軟部組織細胞は、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、内皮前駆細胞の少なくとも１つを有するものである。
【請求項３３】
請求項３２の方法において、
前記曝露する工程は、前記内皮細胞による血管新生を刺激するものである。
【請求項３４】
請求項１の細胞に軟部組織細胞の集団を曝露させる工程を有する、血管新生を誘導する方法。
【請求項３５】
請求項３４の方法において、
前記軟部組織細胞の集団は、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞の少なくとも１つの軟部組織細胞を有するものである。
【請求項３６】
請求項３４の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。
【請求項３７】
請求項３４の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏである。
【請求項３８】
請求項２５の条件培地に軟部組織細胞の集団を曝露させる工程を有する、血管新生を誘導する方法。
【請求項３９】
請求項３８の方法において、
前記軟部組織細胞の集団は、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞の少なくとも１つのの軟部組織細胞を有するものである。
【請求項４０】
請求項３９の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。
【請求項４１】
請求項４０の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏである。
【請求項４２】
請求項６の細胞集団を有する基質。
【請求項４３】
３次元骨格を有する、請求項４２の基質。
【請求項４４】
請求項４３の基質において、
前記骨格は、平面である。
【請求項４５】
請求項４３の基質において、
前記骨格は、管状である。
【請求項４６】
請求項４３の基質において、
前記骨格は、多層である。
【請求項４７】
血管新生因子を必要とする患者を治療する方法であって、請求項６の細胞集団を前記患者へ投与する工程を有する方法。
【請求項４８】
血管新生因子を必要とする患者を治療する方法であって、請求項２５の条件培地を前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項４９】
患者における軟部組織疾患を治療する方法であって、請求項６の細胞集団を前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項５０】
請求項４９の方法において、
前記軟部組織疾患は、先天性欠陥、ヘルニア、前記骨盤底の損傷、腱または靱帯の裂傷または破裂、瘢痕、熱傷、潰瘍、外科創傷、外傷、血管疾患、または筋疾患である。
【請求項５１】
患者における軟部組織疾患を治療する方法であって、請求項４２の基質を前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項５２】
請求項５１の方法において、
前記軟部組織疾患は、先天性欠陥、ヘルニア、前記骨盤底の損傷、腱または靱帯の裂傷または破裂、瘢痕、熱傷、潰瘍、外科創傷、外傷、血管疾患、または筋疾患である。
【請求項５３】
請求項４９の方法において、
前記治療は、軟部組織の修復、再構築、充填、美容整形術、治療、組織増加、および組織の密封の少なくとも１つを有するものである。
【請求項５４】
請求項５１の方法において、
前記治療は、軟部組織の修復、再構築、充填、美容整形術、治療、組織増加、および組織の密封の少なくとも１つを有する。
【請求項５５】
請求項４９の方法において、
前記投与する工程は、前記細胞集団の移植または注入を有するものである。
【請求項５６】
請求項５１の方法において、
前記投与する工程は、前記基質の埋め込み、注入または移植を有するものである。
【請求項５７】
患者における軟部組織疾患を治療する方法であって、請求項１２の細胞外基質を前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項５８】
請求項５７の方法において、
前記軟部組織疾患は、先天性欠陥、ヘルニア、前記骨盤底の損傷、腱または靱帯の裂傷または破裂、瘢痕、熱傷、潰瘍、外科創傷、外傷、血管疾患、または筋疾患である。
【請求項５９】
患者における軟部組織疾患を治療する方法であって、請求項１０の細胞溶解物を前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項６０】
請求項５９の方法において、
前記軟部組織疾患は、先天性欠陥、ヘルニア、前記骨盤底の損傷、腱または靱帯の裂傷または破裂、瘢痕、熱傷、潰瘍、外科創傷、外傷、血管疾患、または筋疾患である。
【請求項６１】
患者における軟部組織疾患を治療する方法であって、請求項２５の条件培地を前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項６２】
請求項６１の方法において、
前記軟部組織疾患は、先天性欠陥、ヘルニア、前記骨盤底の損傷、腱または靱帯の裂傷または破裂、瘢痕、熱傷、潰瘍、外科創傷、外傷、血管疾患、または筋疾患である。
【請求項６３】
請求項１の少なくとも１つの細胞、および基質、水和剤、細胞培養基質、生物活性因子、第２の細胞タイプ、分化誘導剤、および細胞培地の少なくとも１つの付加的構成成分を有するキット。
【請求項６４】
請求項６３のキットにおいて、
前記基質は、３次元骨格である。
【請求項６５】
請求項６４のキットにおいて、
前記細胞は、前記骨格に播種されるものである。
【請求項６６】
血管新生を誘導する方法であって、請求項１０の細胞溶解物に軟部組織細胞の集団を曝露させる工程を有する方法。
【請求項６７】
請求項６６の方法において、
前記軟部組織細胞の集団は、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞の少なくとも１つの軟部組織細胞を有するものである。
【請求項６８】
請求項６６の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。
【請求項６９】
請求項６６の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏである。
【請求項７０】
血管新生を誘導する方法であって、請求項１２の前記細胞外基質に軟部組織細胞の集団を曝露させる工程を有する方法。
【請求項７１】
請求項７０の方法において、
前記軟部組織細胞の集団は、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞の少なくとも１つの軟部組織細胞を有するものである。
【請求項７２】
請求項７０の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。
【請求項７３】
請求項７０の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏである。
【請求項７４】
血管ネットワークを産生する方法であって、請求項６の細胞集団に軟部組織細胞の集団を曝露させる工程を有する方法。
【請求項７５】
請求項７４の方法において、
前記軟部組織細胞の集団は、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞の少なくとも１つの軟部組織細胞を有するものである。
【請求項７６】
請求項７４の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。
【請求項７７】
請求項７４の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏである。
【請求項７８】
血管ネットワークを産生する方法であって、請求項１０の細胞溶解物に軟部組織細胞の集団を曝露させる工程を有する方法。
【請求項７９】
請求項７８の方法において、
前記軟部組織細胞の集団は、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞の少なくとも１つの軟部組織細胞を有するものである。
【請求項８０】
請求項７８の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。
【請求項８１】
請求項７８の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏである。
【請求項８２】
血管ネットワークを産生する方法であって、請求項１２の細胞外基質に軟部組織細胞の集団を曝露させる工程を有する方法。
【請求項８３】
請求項８２の方法において、
前記軟部組織細胞の集団は、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞の少なくとも１つの軟部組織細胞を有するものである。
【請求項８４】
請求項８２の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。
【請求項８５】
請求項８２の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏである。
【請求項８６】
血管ネットワークを産生する方法であって、請求項２５の条件培地に軟部組織細胞の集団を曝露させる工程を有する方法。
【請求項８７】
請求項８６の方法において、
前記軟部組織細胞の集団は、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞の少なくとも１つの軟部組織細胞を有するものである。
【請求項８８】
請求項８６の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。
【請求項８９】
請求項８７の方法において、
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏである。
【請求項９０】
請求項７４の方法によって産生された血管ネットワーク。
【請求項９１】
請求項７８の方法によって産生された血管ネットワーク。
【請求項９２】
請求項８２の方法によって産生された血管ネットワーク。
【請求項９３】
請求項８６の方法によって産生された血管ネットワーク。
【請求項９４】
患者における疾患を治療する方法であって、請求項９０の血管ネットワークを前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項９５】
請求項９４の方法において、
前記血管ネットワークは、前記患者に移植によって投与されるものである。
【請求項９６】
請求項９４の方法において、
前記疾患は、軟部組織疾患である。
【請求項９７】
請求項９６の方法において、
前記軟部組織状態は、血管疾患である。
【請求項９８】
請求項９７の方法において、
前記血管疾患は、血管疾患または障害または不適切な血管発達である。
【請求項９９】
患者において疾患を治療する方法であって、請求項９１の血管ネットワークを前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項１００】
請求項９９の方法において、
前記血管ネットワークは、前記患者に移植によって投与されるものである。
【請求項１０１】
請求項９９の方法において、
前記疾患は、軟部組織疾患である。
【請求項１０２】
請求項１０１の方法において、
前記軟部組織疾患は、血管疾患である。
【請求項１０３】
請求項１０２の方法において、
前記血管疾患は、血管疾患または障害または不適切な血管発達である。
【請求項１０４】
患者において疾患を治療する方法であって、請求項９２の血管ネットワークを前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項１０５】
請求項１０４の方法において、
前記血管ネットワークは、前記患者に移植によって投与されるものである。
【請求項１０６】
請求項１０４の方法において、
前記疾患は、軟部組織疾患である。
【請求項１０７】
請求項１０６の方法において、
前記軟部組織疾患は、血管疾患である。
【請求項１０８】
請求項１０７の方法において、
前記血管疾患は、血管疾患または障害または不適切な血管発達である。
【請求項１０９】
患者における疾患を治療する方法であって、請求項９３の血管ネットワークを前記患者に投与する工程を有する方法。
【請求項１１０】
請求項１０９の方法において、
前記血管ネットワークは、前記患者に移植によって投与されるものである。
【請求項１１１】
請求項１０９の方法において、
前記疾患は、軟部組織疾患である。
【請求項１１２】
請求項１１１の方法において、
前記軟部組織状態は、血管疾患である。
【請求項１１３】
請求項１１２の方法において、
前記血管疾患は、血管疾患または障害または不適切な血管発達である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は、２００３年６月２７日に提出された米国仮出願番号第６０／４８３，２６４号に優先権を主張したものであり、その全内容はこの参照により本明細書に組み込まれている。他の関連出願には、２００４年６月２５日に提出された米国出願番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ１］号、２００４年６月２５日に提出された米国出願番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ２］号、２００４年６月２５日に提出された米国出願番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ３］号、２００４年６月２５日に提出された米国出願番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ４］号、２００４年６月２５日に提出された米国出願番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ５］号、２００４年６月２５日に提出された米国出願番号第［ＥＴＨ−５０７３  ＮＰ８］号、２００４年３月２４日に提出された米国仮出願番号第６０／５５５，９０８［ＥＴＨ  ５１２７］号などの同一出願人による同時係属出願を含み、そのそれぞれの内容全体はこの参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
技術分野
本発明は、哺乳類の細胞生物学と細胞培養の分野に関するものである。特に、本発明は軟部組織細胞系譜の細胞を支持し、および/または軟部組織細胞に分化する能力を有する、分娩後組織由来の培養細胞と、調整法およびこれらの分娩後組織由来細胞の利用に関するものである。本発明は、軟部組織の再生と修復で、また軟部組織の疾患に対する細胞を基本とした治療で、そのような分娩後由来細胞を使用する方法に関するものでもある。
【背景技術】
【０００３】
軟部組織、例えば血管、皮膚、または筋骨格組織の障害は、非常に一般的である。かなり一般的な軟部組織障害の１例は、骨盤底の損傷である。これは出産時に発生するか、膀胱膣筋膜の障害につながる可能性があるその合併症から生じると考えられる、重篤な疾患である。そのような障害は膀胱瘤に至る可能性があり、これは膀胱のヘルニア形成である。同様の疾患には、直腸瘤（直腸のヘルニア形成）、腸瘤（直腸膣または膀胱膣嚢からの腸の突出）、腸膀胱瘤（膀胱と腸の両方が突出した二重のヘルニア）を含む。
【０００４】
ヘルニアの基本的な徴候は、臓器の突出が筋膜内で障害となる。ヘルニア修復の外科的アプローチは、腹腔のヘルニア内容物の存在を減少させること、また人工、同種、または自家素材のいずれかを利用することで、筋膜の異常の安定した閉鎖を生み出すことに焦点を当ててきた。自家組織の移動、合成メッシュ製品の利用を含む多数の技術がこの閉鎖を生じるために利用されてきた。これら現在の製品と方法の欠点には、閉鎖が弱まるとヘルニアが再発することを含む。
【０００５】
さらに別の例では、靱帯と腱が正常な関節の運動と安定性を媒介する粘弾性構造であり、加齢または傷害とともに裂傷および脆性が生じやすくなる。これらの構造は複雑で、比較的静的な膠原性構造であり、骨、筋肉、半月板、他の隣接する腱と靱帯との機能的結合を有する。
【０００６】
軟部組織の疾患は、さらに例えば、皮膚の状態（例えば、瘢痕修復または外傷、重度熱傷、皮膚潰瘍（例えば、褥痩性潰瘍（床擦れ）、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍）、皮膚潰瘍の切除に伴うものなど外科創傷の治療、血管状態（例えば、末梢動脈疾患、腹部大動脈瘤、頸動脈疾患、静脈疾患などの血管疾患、血管外傷、血管発達不良）、声帯に影響する疾患、審美的状態（例えば、修復、増強、または美容を含む）、筋疾患（例えば、先天性ミオパシー、重症筋無力症、炎症性、神経性、筋原性筋疾患、またデュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、肢帯筋異栄養症、顔面・肩甲・上腕筋ジストロフィー、先天型筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィー）、これだけに限らないが歯周靱帯、前十字靱帯を含む腱および靱帯を含む結合組織の疾患、臓器および／または筋膜（例えば膀胱、腸、骨盤底）の疾患を含む。
【０００７】
前記身体の軟部組織の異常を治療する外科的アプローチには、一般的に生体適合性の不活性材料の構造様式の移植を含み、機能不全を置換または代用しようとする。非生物分解材料の移植では、異物として体内に残る永久的構造になる。再吸収可能な材料でできたインプラントは、前記物質が前記再吸収された材料を置換する治癒プロセスを可能とする一時的置換術として利用されることが示唆される。しかし、これらのアプローチは、前記体内構造の長期的治療で成功が限られていた。
【０００８】
従って、軟部組織と関連した疾患の新規治療法は、臨床的に非常に意義がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記発明は一般に、実質上血液を含まない、培養で自己複製と増殖が可能な分娩後組織に由来する分娩後由来細胞に関するものであり、例えば軟部組織細胞の表現型など、中胚葉または外胚葉細胞系譜の細胞に分化し、または栄養支持を提供する能力を有する。
【００１０】
いくつかの実施例では、本発明が、実質上血液を含まない培養で自己再生と増殖が可能で、軟部組織の表現型を持った細胞に分化するか、栄養支持を提供する能力を有し、増殖のためにＬ−バリンを必要とし、約５％〜約２０％の酸素存在下で増殖できるヒト分娩後組織に由来する細胞を提供し、さらに、
ＧＣＰ−２、組織因子、ビメチン、α−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生と、 
フローサイトメトリーで検出されるとおり、ＮＯＧＯ−Ａ、ＧＲＯ−αまたは酸化低密度リポ蛋白質受容体の少なくとも１つの産生がない、少なくとも１つの産生がない場合と、
ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生と、
フローサイトメトリーで検出されるとおり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの少なくとも１つの産生がないことと、
線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜（ｉｌｅａｃ  ｃｒｅｓｔ）骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現が、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性蛋白質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子、α誘導蛋白質３の少なくとも１つで発現が上昇すること、または線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現が、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、蛋白質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、卵巣癌で下方制御された遺伝子１、仮想蛋白質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つで発現が上昇することと、
線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現が、少なくとも以下の１つで減少し、これが低身長感受性ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａ蛋白質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間質系ホメオボックス２、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックスホモログ１、クリスタリン、αＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連性活性化因子２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０蛋白質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ−細胞転座遺伝子１、抗増殖性物質、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連転写因子３、仮想蛋白質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７、仮想遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンＶＩＩＩ型、α１、テネイシンＣ、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリン、β８、シナプス小胞糖タンパク質２、ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー４、インテグリン、α７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１蛋白質、ＰＤＺ−結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス相同体２、ＫＩＡＡ１０３４蛋白質、初期成長反応３、ディスタルレス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮想蛋白質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケトレダクターゼファミリー１、メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素ＩＩ型）、ビグリカン、ファブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリン、β様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７蛋白質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（房室ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想蛋白質ＦＬＪ１４０５４、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連性膜タンパク質５、ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞種、腫瘍原性１の抑制、インスリン様増殖因子結合蛋白質２、３６ｋＤａである場合と、
ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌と、
ＥＬＩＳＡで検出されるＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌がない場合と、
培養で少なくとも４０集団倍加を受ける能力の特徴のうち少なくとも１つを有する。
【００１１】
特定の実施例では、前記分娩後由来細胞が臍帯由来細胞である。他の実施例では、これが胎盤由来細胞である。具体的な実施例では、前記細胞が細胞タイプＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ８）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０７４）、細胞タイプＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１１）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０７５）、細胞タイプＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１６）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０７９）、細胞タイプＵＭＢ  ０２２８０３（Ｐ７）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０６７）、または細胞タイプＵＭＢ  ０２２８０３（Ｐ１７）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０６８）のいずれか１つをすべて同定した特徴を有する。前記発明の分娩後由来細胞は好ましくはヒト細胞である。前記細胞は軟部組織の表現型、例えば筋膜、上皮、内皮、皮膚、脈管構造、筋肉、腱、靱帯の細胞に栄養支持を提供してもよい。前記細胞自体は軟部組織の表現型に分化するように誘導されてもよい。
【００１２】
ＰＰＤＣ集団は前記発明によって提供される。いくつかの実施例では、分娩後由来細胞集団が別の細胞集団と混合される。いくつかの実施例では、前記細胞集団が不均一である。本発明の不均一な細胞集団は、本発明の未分化または分化誘導ＰＰＤＣの少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を有してもよい。前記本発明の不均一な細胞集団は、さらに例えば、幹細胞、上皮細胞（例えば口腔粘膜、消化管、鼻上皮、気道上皮、膣上皮、角膜上皮の細胞）、骨髄細胞、脂肪細胞、幹細胞、角化細胞、メラニン形成細胞、皮膚線維芽細胞、血管内皮細胞（例えば、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、血管内皮前駆体（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞））、筋芽細胞、筋細胞、間質細胞、その他の軟部組織細胞または前駆細胞を有してもよい。本発明の細胞集団は実質的に同種でもよい。前記本発明の均一細胞集団は、臍帯または胎盤由来細胞を有してもよい。胎盤由来細胞の同種集団は新生児または母体の細胞系譜であってもよい。細胞集団の均一性は、例えば細胞ソーティング（フローサイトメトリーなど）、ビーズ分離、またはクローン増殖などの当該分野で既知の方法により達成されてもよい。
【００１３】
本発明の一部の実施例では、患者への移植用基質を提供する。一部の実施例では、前記基質に本発明の分娩後由来細胞集団が播種される。前記ＰＰＤＣは分化誘導されるか、未分化であってもよい。前記集団は実質的に均一であっても、不均一であってもよい。例えば、前記基質は、例えば制限なく、上皮細胞（例えば口腔粘膜、消化管、鼻上皮、気道上皮、膣上皮、角膜上皮の細胞）、骨髄細胞、脂肪細胞、幹細胞、角化細胞、メラニン形成細胞、皮膚線維芽細胞、血管内皮細胞（例えば、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、血管内皮前駆体（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞））、筋芽細胞、筋細胞、間質細胞、他の軟部組織細胞または前駆細胞など、別の望ましい細胞タイプの細胞が播種されてもよい。前記基質は、例えば薬物、抗炎症薬、抗アポトーシス薬、増殖因子を含む１若しくはそれ以上の生理活性因子を含むか、事前に処理されてもよい。前記播種または事前に処理された基質は、移植、注入、外科的結合、他の組織の移植、注入などだけに制限なく含まれる、当該分野で既知のいずれかの方法で患者の体内に導入されうる。本発明の前記基質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで組織または臓器の前記形および／またはサイズに設定されてもよい。本発明の前記骨格は平面または管状であってもよく、またはその一部を有してもよい。本発明の前記骨格は多層になっていてもよい。
【００１４】
また、本発明の範囲に網羅されるものは、ＰＰＤＣの細胞外基質（ＥＣＭ）、ＰＰＤＣの細胞分画（例えば可溶性細胞分画）、ＰＰＤＣ条件培地である。本発明の基質は、前記ＰＰＤＣ製剤のいずれか１つを有するか、事前に処理されてもよい。
【００１５】
一部の実施例では、本発明がＰＰＤＣの組成物、および例えば制限なく、増殖因子、抗アポトーシス薬、抗炎症薬、および／または分化誘因子など、１若しくはそれ以上の生理活性因子を提供する。前記組成物は、さらに例えば、上皮細胞（例えば口腔粘膜、消化管、鼻上皮、気道上皮、膣上皮、角膜上皮の細胞）、骨髄細胞、脂肪細胞、幹細胞、角化細胞、メラニン形成細胞、皮膚線維芽細胞、血管内皮細胞（例えば、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、血管内皮前駆体（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞））、筋芽細胞、筋細胞、間質細胞、他の軟部組織細胞または前駆細胞など、１若しくはそれ以上の他の細胞タイプを有してもよい。
【００１６】
前記分娩後由来細胞の薬学的組成物、それによって生産された細胞外基質、細胞溶解物、ＰＰＤＣ条件培地が本発明の範囲に含まれる。前記薬学的組成物は、好ましくは薬学的組成物として認められる担体または賦形剤を含む。
【００１７】
一部の実施例では、本発明の細胞または基質を患者に移植することで、それを必要とする患者で軟部組織を再生する方法が提供される。
【００１８】
さらに本発明で提供されているのは、１若しくはそれ以上の分娩後由来細胞、ＰＰＤＣ集団、ＥＣＭ、基質、細胞溶解物、条件培地、または本発明の組成物を投与することで、患者の軟部組織状態を治療する方法である。本発明に沿った軟部組織状態の治療には、制限なく、組織の修復、組織の復元、組織の充填、審美的治療、治療法、組織の増殖、組織の密閉を含む。前記ＰＰＤＣは、分化または未分化またはその組み合わせであるかによらず、それによって生成された細胞外基質、その細胞溶解物、基質、条件培地、本発明の組成物が例えば制限なく、ヘルニア、骨盤底の障害、熱傷、癌、外傷、瘢痕、皮膚潰瘍（例えば褥痩性潰瘍（床擦れ）、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍）、皮膚癌の切除に伴う外科創傷、末梢動脈疾患、腹部大動脈瘤、頸動脈疾患、静脈疾患などの血管疾患、筋疾患（例えば、先天性ミオパシー、重症筋無力症、炎症性、神経性、筋原性筋疾患、またデュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、肢帯筋異栄養症、顔面・肩甲・上腕筋ジストロフィー、先天型筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィー）、腱および靱帯などの結合組織（例えば前十字靱帯、回旋筋腱板、歯周靱帯）の置換と修復の治療に利用されてもよい。
【００１９】
本発明は、さらに本発明の分娩後由来細胞またはＰＰＤＣ製品に（例えば条件培地、細胞溶解物、細胞外基質）軟部組織軟部組織細胞を曝露させることで、軟部組織細胞に栄養支持を提供する方法を提供する。本発明に沿ってＰＰＤＣが栄養支持を提供しうる軟部組織細胞の例は、幹細胞、筋細胞、筋芽細胞、角化細胞、メラニン形成細胞、皮膚線維芽細胞、骨髄細胞、脂肪細胞、上皮細胞、間質細胞、内皮細胞（例えば大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、血管内皮前駆体（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞））を含む。前記ＰＰＤＣへの軟部組織細胞の曝露は、血管新生を刺激することができる。本発明の方法は、さらにＰＰＤＣまたはＰＰＤＣ製剤に軟部組織細胞を曝露させることで血管新生を誘導する方法を含む。本発明の前記方法による血管内皮ネットワークの軟部組織細胞の例には、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、血管内皮前駆体（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞）を含む。栄養支持を提供するか、血管新生を刺激する方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで生じてもよい。
【００２０】
本発明の方法には、患者に本発明のＰＰＤＣ集団、条件培地、細胞溶解物、または細胞外基質を投与することで、血管新生因子を必要とする患者を治療する方法も含む。
【００２１】
本発明により提供されるものには、血管ネットワークを産生する方法もある。いくつかの実施例では、前記血管ネットワークを産生する方法が、軟部組織細胞をＰＰＤＣ細胞集団、細胞溶解物、細胞外基質または条件培地の曝露を含む。前記軟部組織細胞の集団は、好ましくは大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞の軟部組織細胞の少なくとも１つを含む。前記血管ネットワークを産生する方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施される方法としてもよい。前記発明は、本発明の方法により産生される前記血管ネットワークも含む。前記血管ネットワークを投与することで患者の軟部組織状態などの状態を治療する方法も提供される。いくつかの実施例では、前記軟部組織状態が血管疾患または障害または不適切な血管発達などの血管状態である。本発明のいくつかの観点では、前記血管ネットワークが前記患者に移植することで投与される。
【００２２】
本発明によりさらに提供されるものは、前記ＰＰＤＣおよび／またはＰＰＤＣ製剤のキットである。本発明のキットは、好ましくは基質、水和剤、細胞培養基質、生理活性因子、第２の細胞タイプ、分化誘導薬、細胞培養液、および例えば前記細胞の培養または前記細胞および／または細胞製剤の投与などに関する指示の少なくとも１つの成分を含む。
【００２３】
本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細な説明と例から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
定義
本明細書と請求項で使用される様々な用語は、以下に説明するとおりに定義される。
【００２５】
「幹細胞」は、前記単細胞レベルで、その自己複製および分化し、自己再生前駆細胞、非再生前駆細胞、最終分化細胞を含む後代細胞を生成する能力により定義される未分化細胞である。幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）の様々な細胞系譜の機能的細胞に分化し、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞に注入後、すべてでないとしてもほとんどの組織に実質的に貢献する能力でも特徴付けられる。
【００２６】
幹細胞は、（１）「全能性」−すべての胚細胞および胚体外細胞タイプになることができる、（２）「多能性」−すべての胚細胞タイプになることができる、（３）「多分化能」−細胞系譜のサブセットになることができるが、すべて特定の組織、臓器、または生理学的システム（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）はＨＳＣ（自己再生）、血液細胞限定的な低能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）前駆細胞、および前記血液の正常な成分であるすべての細胞タイプと要素（例えば血小板）を含む後代を産生することができる）の中とする、（４）「低能性」−多分化能幹細胞よりも限定的な細胞系譜のサブセットとなることができる、（５）「単能性」−単細胞系譜（例えば精子形成幹細胞）になることができるとして発達の能力により分類される。
【００２７】
幹細胞も得られる供給源を元に分類される。「成熟幹細胞」は一般に、複数の分化細胞タイプを有する組織に見られる多分化能の未分化細胞である。前記成熟幹細胞はそれ自体、標準的な環境で再生し、それが由来する組織の特殊細胞タイプと、可能性としては他の組織タイプを生じるように分化することができる。「胚幹細胞」は、胚盤胞の段階にある胚の内細胞塊の多分化能細胞である。「胎児」幹細胞は胎児の組織または膜に由来する幹細胞である。「分娩後幹細胞」は、実質的に分娩後に得られる胚外組織、すなわち前記胎盤と前記臍帯に由来する多分化能または多能性細胞である。これらの細胞は、急速な増殖および多数の細胞系譜に分化する能力を含む、多能性幹細胞に特徴的な特性を有することが分かった。分娩後幹細胞は血液由来（例えば臍帯血から得られるものなど）または非血液由来（例えば臍帯血および胎盤の非血液組織から得られるなど）としてもよい。
【００２８】
「胚組織」は、典型的には（ヒトでは受精から発達の約第６週までの期間を指す）胚に由来する組織として定義される。「胎児組織」は、ヒトでは発達の約第６週から分娩までの期間を指す、胎児に由来する組織を指す。「胚体外組織」は前記胚または胎児と関連するが、これらに由来しない組織である。胚体外組織は胚体外膜（絨毛膜、羊膜、卵黄嚢、尿膜）、臍帯、および胎盤（これ自体は前記絨毛膜と前記母体脱落膜）を含む。
【００２９】
「分化」は、未分化（「中立」）またはあまり分化していない細胞が、例えば神経細胞または筋肉細胞などの分化細胞の特徴を獲得するプロセスである。「分化」または「分化誘導細胞」は、前記細胞系譜内でより分化した（「傾倒した」）状態を獲得した細胞である。分化プロセスが適用される場合、「傾倒した」という用語は、標準的な状況下で、特定の細胞タイプまたは細胞タイプのサブセットに分化するまで継続し、標準的な状況下で、異なる細胞タイプに分化することができないか、あまり分化していない細胞タイプに戻ることができない点まで、前記分化経路に進んだ細胞を指す。脱分化は、細胞が前記細胞系譜内であまり分化していない（または傾倒していない）状態に戻るプロセスを指す。ここで用いるとおり、前記細胞系譜とは、前記細胞の遺伝、つまりどの細胞に由来し、どの細胞を生じるかを定義する。前記細胞系譜では、発達および分化の遺伝スキーム内に前記細胞を置く。「細胞系譜特異的マーカー」は、対象細胞系譜の細胞表現型と特に関連した特徴を指し、中立細胞の前記対象細胞系譜への分化を評価するために用いることができる。
【００３０】
広い意味では、「前駆細胞」はそれ自体よりも分化した後代を作る能力を有するが、前駆細胞のプールに活力を与える能力を保有する細胞である。この定義によれば、幹細胞自体も最終分化細胞へのより直前の前駆細胞であるため、前駆細胞である。本発明の細胞を指す場合、以下にさらに詳細を説明するとおり、この前駆細胞の広義の定義が利用されてもよい。狭い意味では、前駆細胞が前記分化経路の中間体である細胞として定義されることが多く、つまりこれは幹細胞から生じ、成熟細胞タイプまたは細胞タイプのサブセットの産生における中間体である。このタイプの前駆細胞は一般に自己複製することができない。従って、このタイプの細胞がここで示される場合は、「非再生前駆細胞」または「中間前駆体または前駆細胞」として示される。
【００３１】
ここで用いるとおり、「中胚葉、外胚葉、または内胚葉細胞系譜に分化する」という言い回しは、それぞれ特定の中胚葉、外胚葉、または内胚葉細胞系譜に傾倒する細胞を指す。中胚葉細胞系譜に分化する、または、特定の中胚葉細胞を生じる細胞の例には、脂肪生成、軟骨形成、心原性、皮膚原性、造血性、内皮、筋原性、腎発生、泌尿生殖器原性（ｕｒｏｇｅｎｉｔｏｇｅｎｉｃ）、骨原性、心膜原性（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｏｇｅｎｉｃ）、または間質性細胞を含むが、これだけに限らない。外胚葉細胞系譜に分化する細胞の例には、上皮細胞、神経細胞、神経膠細胞を含むが、これだけに限らない。内胚葉細胞系譜に分化する細胞の例には、胸膜細胞および肝性細胞、前記腸上皮を生じる細胞、膵原性（ｐａｎｃｒｅｏｇｅｎｉｃ）細胞および内臓原性（ｓｐｌａｎｃｈｏｇｅｎｉｃ）細胞を生じる細胞を含むが、これだけに限らない。
【００３２】
本発明の細胞は、ここで「分娩後由来細胞」または「分娩後細胞（ＰＰＤＣ）」と呼ばれる。本発明の細胞サブセットは、「胎盤由来細胞（ＰＤＣ）」または「臍帯血由来細胞（ＵＤＣ）」と呼ばれる。さらに、前記細胞は幹細胞または前駆細胞として説明されてもよく、前駆細胞は広い意味で使用される。「由来する」という用語は、前記細胞が生物源から入手され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖またはそうでない場合は操作される（例えば増殖培地で培養され、前記個体群を増殖する、および／または細胞株を産生する）細胞を示すために使用される。本発明の分娩後由来細胞と分娩後由来細胞固有の特徴のｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作について以下に詳細に説明されている。
【００３３】
培養中の細胞を説明するため、様々な用語が使用されている。「細胞培養」とは、一般に生体から採取され、制御された条件で（「培養で」）増殖された細胞を指す。「初代細胞培養」は、生物から直接採取される、最初の継代培養前の細胞、組織、または臓器の培養である。細胞は細胞増殖および／または分裂を促す条件で増殖培地に入れられた場合、培養で増殖され、前記細胞群はより大きくなる。細胞が培養で増殖される場合、細胞の増殖率は時に前記細胞数が倍加するために必要な時間で測定される。これは「倍加時間」と呼ばれる。
【００３４】
「細胞株」は、１若しくはそれ以上の初代細胞培養の継代培養で形成される細胞群である。継代培養の各回は「継代」と呼ばれる。細胞が継代培養される場合、その細胞は継代されると呼ばれる。細胞または細胞株の特定集団は、時に継代された時間で言及されるか、特徴付けられる。例えば、１０回継代された培養細胞群は、「Ｐ１０」培養と呼ばれてもよい。前記初代培養、つまり組織からの細胞単離後の初代培養は、Ｐ０に指定される。前記初代培養後、前記細胞は二次培養（Ｐ１または継代１）と説明される。前記二次培養後、前記細胞は三次培養（Ｐ２または継代２）などとなる。継代中に多くの集団が倍加する可能性があることは当業者に理解されるため、培養の集団倍加数は継代数よりも多い。継代と継代の間の細胞の増殖（つまり集団倍加数）は多くの因子に依存し、播種密度、基質、培地、継代間時間を含むが、これだけに限らない。
【００３５】
「条件培地」は、特定細胞または細胞群が培養され、次に除去された培地である。前記細胞は前記培地で培養される間、他の細胞の栄養支持を提供することができる細胞因子を分泌する。そのような栄養因子には、ホルモン、サイトカイン、細胞外基質（ＥＣＭ）、蛋白質、小胞、抗体、顆粒を含むが、これだけに限らない。前記細胞因子を含む培地が前記条件培地である。
【００３６】
一般に、「栄養因子」は細胞の生存、増殖、増殖、成熟、分化、および／または維持を促し、または細胞の活性亢進を刺激する基質として定義される。「栄養支持」は、細胞の生存、増殖、増殖、成熟、分化、および／または維持を促し、または細胞の活性亢進を刺激する能力を指すものとしてここで使用される。
【００３７】
培養された脊椎動物細胞を指す場合、「老化」という用語（「複製老化」または「細胞老化」ともいう）は、限定された細胞培養に起因する特性、つまり限定された集団倍加数を超えて増殖する能力を指す（時にＨａｙｆｌｉｃｋの限界と呼ばれる）。細胞老化は線維芽細胞様細胞を用いて初めて説明されたが、培養で増殖を成功させることができるほとんどの正常ヒト細胞タイプは、細胞の老化を受ける。異なる細胞タイプのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの寿命は異なるが、最高寿命は典型的には１００集団倍加よりも少ない（これは、前記培養ですべての前記細胞の倍加数であり、老化し分割できない培養を与える）。老化は年代時間に依存しないが、むしろ細胞分裂の数、または集団倍加により測定され、前記培養が行われる。従って、重要な増殖因子を除去することで休止させた細胞は、前記増殖因子を再導入した場合に増殖と分裂を再開することができ、その後、同等の細胞が継続して増殖するにつれ、同じ倍加数を実行する。同様に、様々な集団倍加数後に液体窒素で細胞が凍結され、その後解凍、培養された場合、培養中で細胞が凍結されずに維持されている場合と実質的に同等の倍加数となる。老化細胞は死亡しているまたは死亡細胞ではなく、実際はプログラムされた細胞死（アポトーシス）に耐性があり、３年間もの間分裂しない状態で管理された。これらの細胞は非常に活動的で、代謝的に活動的であるが、分裂しない。老化細胞の前記非分裂状態は、生物因子、化学因子、またはウイルス因子によって可逆的であることはまだ分かっていない。
【００３８】
ここで用いるとおり、「増殖培地」という用語は分娩後由来細胞の増殖に十分な培地を指す。増殖培地の培養液は、好ましくはダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む。より好ましくは、増殖培地にグルコースを含む。増殖培地は、好ましくはＤＭＥＭ−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ）（インビトロゲン、カリフォルニア州カールズバッド）を含む。増殖培地は、好ましくは約１５％（ｖ／ｖ）の血清（例えば、ウシ胎仔血清、規定化ウシ血清）を含む。増殖培地は、好ましくは少なくとも１種類の抗生物質および／または抗真菌薬（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチン、好ましくは、５０ユニット／ミリリットルのペニシリンＧナトリウムおよび５０マイクログラム／ミリリットルの硫酸ストレプトマイシン）を含む。増殖培地は好ましくは２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）を含む。より好ましくは、増殖培地がＤＭＥＭ−低グルコース、血清、２−メルカプトエタノール、および抗生物質を含む。
【００３９】
ここで用いるとおり、「標準的な増殖条件」は、約５％ＣＯ２、約３５〜３９℃、より好ましくは３７℃の温度、相対湿度約１００％を有する標準的な大気条件を指す。
【００４０】
「単離される」という用語は、自然環境から除去された細胞、細胞成分、または分子を指す。
【００４１】
「約」という用語は、±１０％の範囲で述べられた値の近似値を指す。
【００４２】
「軟部組織」は、ここで用いるとおり、一般に前記身体中に認められる骨外構造を指し、軟骨組織、半月組織、靱帯組織、腱組織、椎間板組織、歯周組織、皮膚組織、血管組織、筋肉組織、筋膜組織、骨膜組織、眼組織、心膜組織、肺組織、滑膜組織、神経組織、腎組織、骨髄、泌尿生殖器組織、腸組織、肝組織、膵臓組織、脾臓組織、脂肪組織、その組み合わせを含むが、それだけに限らない。
【００４３】
「軟部組織の状態（または障害または疾患）」は、軟部組織の急性および慢性状態、疾患、または疾病を含む総称である。例えば、前記用語は、通常発達する前記組織の疾患または外傷または不全により引き起こされる状態を有する。軟部組織状態の例は、ヘルニア、前記骨盤底の損傷、腱または靱帯の裂傷または破裂、皮膚傷（例えば瘢痕、外傷、重度の熱傷、皮膚潰瘍（例えば褥痩性潰瘍（床擦れ）、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍）、皮膚癌の切除に伴うものなどの外科創傷）、血管状態（例えば末梢動脈疾患、腹部大動脈瘤、頸動脈疾患、静脈疾患などの血管疾患、血管外傷、不適当な血管発達）、筋疾患（例えば先天性ミオパシー、重症筋無力症、炎症性、神経性、筋原性筋疾患、またデュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、肢帯筋異栄養症、顔面・肩甲・上腕筋ジストロフィー、先天型筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィー)を含むが、これだけに限らない。
【００４４】
「軟部組織の状態を治療する（またはその治療）」という用語は、ここで用いるとおり、軟部組織状態の効果の改善または遅延、進行の停止または改善、または発症の遅延または予防を指し、軟部組織の修復、再建、充填、美容整形術、治療、組織の増殖、組織の密閉を含む。
【００４５】
「有効な量」という用語は、ここで用いるとおり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞増殖および／または分化、または軟部組織状態の治療を含む、意図した結果を生み出すために効果的な増殖因子、分化試薬、栄養因子、細胞集団または他の因子などの試薬または薬学的組成物の濃度を指す。増殖因子については、前記有効な量が約１ナノグラム／ミリリットルから約１マイクログラム／ミリリットルの範囲であってもよい。ＰＰＤＣについては、ｉｎ  ｖｉｖｏで患者に投与されるとおり、前記有効な量は数百以下から数百万以上まで幅があってもよい。特定の実施例では、前記有効な量が１０３〜１０１１の範囲であってもよい。投与される細胞数は、薬学的組成物生物学者によく知られた他の因子の中で、これだけに限らないが、投与されるサイズまたは総量／表面積を含む、治療される疾患の詳述、および治療される領域への投与部位の近傍によって変化することは理解されることとする。
【００４６】
「有効な期間（または時間）」および「有効条件」という用語は、意図した結果を達成する試薬または薬学的組成物に必要であるか、好ましい時間または他の制御可能な条件（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ法の温度、湿度）を指す。
【００４７】
「患者」または「被験者」という用語は、前記薬学的組成物を投与したか、ここで示された方法に従った哺乳類、好ましくはヒトを含む動物を指す。
【００４８】
「薬学的に許容可能な担体（または培地）」という用語は、「生物学的に適合した担体または培地」と交代で使用することができ、適切な医学的判断の範囲で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応や、妥当な効果／リスク比に釣り合った他の合併症を引き起こさずに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した試薬、細胞、化合物、物質、組成物、および／または剤型を指す。ここにより詳細を示すとおり、本発明で使用される薬学的に許容可能な担体には、液体、半固体（ゲルなど）、固体物質（細胞骨格）を含む。ここで用いるとおり、「生物分解性」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏで分解（分解、腐食、溶解）される物質の能力を示す。前記用語には前記身体からの除去（再吸収など）の有無によらず、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分解を含む。半固体および固体物質は、前記身体内の分解に抵抗するようにデザインされてもよく（非生分解性）、または前記身体内で分解するようにデザインされてもよい（生物分解性、生腐食性）。生物分解性物質はさらに「生再吸収性または生吸収性」であってもよく、つまり他の物質への変換または自然経路からの除去により、体液に溶解および吸収されてもよく（水溶性インプラントが１例である）、または前記身体から分解および最終的に除去されてもよい。
【００４９】
細胞置換療法について、いくつかの用語がここで使用されている。自己移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、自己移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、自家移植（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）などの用語は、前記細胞ドナーが前記細胞置換療法のレシピエントでもあることを指す。同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、同種移植（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）などの用語は、前記細胞ドナーが前記細胞置換療法のレシピエントと同種である治療を指すが、同じ個人ではないことを指す。前記ドナー細胞がレシピエントと組織化学的にマッチした細胞移植は、時に「同系移植」と呼ばれる。異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）などの用語は、前記細胞ドナーが前記細胞置換療法のレシピエントと異なる種である治療を指す。
【００５０】
「基質」という用語はここで用いるとおり、例えば骨格（例えば、ＶＩＣＲＹＬ、ＰＣＬ／ＰＧＡ、またはＲＡＤ１６）または支持培地（例えば、ヒドロゲル、細胞外膜蛋白質（例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード））などの本発明のＰＰＤＣ支持材を指す。
【００５１】
以下の略語がここで用いられる：
ＡＮＧ２（またはＡｎｇ２）はアンジオポエチン２、
ＡＰＣは抗原提示細胞、
ＢＤＮＦは脳由来神経栄養因子、
ｂＦＧＦは塩基性線維芽細胞増殖因子、
ｂｉｄ（ＢＩＤ）は「１日２回」、
ＢＳＰは骨シアロ蛋白質、
ＣＫ１８はサイトケラチン１８、
ＣＸＣリガンド３はケモカイン受容体リガンド３、
ＤＡＰＩは４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール−２ＨＣｌ、
ＤＭＥＭはダルベッコ変法イーグル培地、
ＤＭＥＭ：ｌｇ（またはＤＭＥＭ：Ｌｇ、ＤＭＥＭ：ＬＧ）はＤＭＥＭと低グルコース、
ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸、
ＥＧＦ（またはＥ）は上皮増殖因子、
ＥＰＯはエリスロポエチン、
ＦＡＣＳは蛍光活性細胞分類
ＦＢＳはウシ胎仔血清、
ＦＧＦ（またはＦ）は線維芽細胞増殖因子、
ＧＣＰ−２は顆粒球走化性蛋白質−２、
ＧＤＦ−５は増殖および分化因子５、
ＧＦＡＰはグリア線維酸性蛋白質、
ＨＢ−ＥＧＦはヘパリン結合上皮増殖因子、
ＨＣＡＥＣはヒト冠動脈内皮細胞、
ＨＧＦは肝細胞増殖因子、
ｈＭＳＣはヒト間葉幹細胞、
ＨＮＦ−１αは、肝細胞特異的転写因子、
ＨＵＶＥＣはヒト臍静脈内皮細胞、
Ｉ３０９はケモカインであって、前記ＣＣＲ８受容体に対するリガンドであり、ＴＨ２型Ｔ細胞の化学親和性の原因である、
ＩＧＦはインスリン様増殖因子、
ＩＬ−６はインターロイキン−６、
ＩＬ−８はインターロイキン８、
Ｋ１９はケラチン１９、
Ｋ８はケラチン８、
ＫＧＦは角化細胞増殖因子、
ＭＣＰ−１は単球走化性蛋白質１、
ＭＤＣはマクロファージ由来ケモカイン、
ＭＩＰ１αはマクロファージ炎症性蛋白質１α、
ＭＩＰ１βはマクロファージ炎症性蛋白質１β、
ＭＭＰはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、
ＭＳＣは間葉幹細胞、
ＮＨＤＦは正常ヒト皮膚線維芽細胞、
ＮＰＥは神経前駆細胞増殖培地、
ＯｘＬＤＬＲは酸化低密度リポ蛋白質受容体、
ＰＢＭＣは末梢血単核球、
ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水、
ＰＤＣは胎盤由来細胞、
ＰＤＧＦｂｂは血小板由来増殖因子、
ＰＤＧＦｒ−αは血小板由来増殖因子受容体α、
ＰＤ−Ｌ２はプログラム死リガンド２、
ＰＥはフィコエリトイン、
ＰＯは「経口」、
ＰＰＤＣは分娩後由来細胞、
Ｒａｎｔｅｓ（またはＲＡＮＴＥＳ）は活性化を調節された、発現および分泌された正常Ｔ細胞、
ｒｂはウサギ、
ｒｈは組み換えヒト、
ＳＣは皮下、
ＳＣＩＤは重度複合免疫不全、
ＳＤＦ−１αは間質由来因子1α、
ＳＨＨはソニック・ヘッジホッグ、
ＳＭＡは平滑筋アクチン、
ＳＯＰは標準操作手順書、
ＴＡＲＣは胸腺および活性化制御ケモカイン、
ＴＣＰは組織培養プラスチック、
ＴＧＦβ２はトランスフォーミング増殖因子β２、
ＴＧＦβ３はトランスフォーミング増殖因子β３、
ＴＩＭＰ１は組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１、
ＴＰＯはトロンボポエチン、
ＴｕＪ１はＢＩＩＩチューブリン、
ＵＤＣは臍帯由来細胞、
ＶＥＧＦは血管内皮増殖因子、
ｖＷＦはフォンウィルブランド因子、
αＦＰはαフェトプロテインである。
【００５２】
説明
様々な特許および他の刊行物はここで、本明細書中に引用され、それぞれその全体が参考文献に盛り込まれている。
【００５３】
１つの観点では、本発明が実質的に血液がない分娩後組織に由来する分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）を提供する。前記ＰＰＤＣはこれだけに限らないが、ヒトを含む哺乳類の胎盤に由来してもよい。前記細胞は、培養において自己複製および増殖が可能である。前記分娩後由来細胞は、他の表現型の細胞に分化する能力を有する。本発明は、臍帯血に対するものとして、いくつかの観点の１つにおいて、臍帯に由来する細胞を提供する。本発明は、いくつかの観点の１つにおいて、胎盤組織に由来する細胞も提供する。
【００５４】
前記細胞は、細胞的、遺伝的、免疫学的、生化学的特徴のいくつかについて特徴付けられた。例えば、前記細胞はその増殖、その細胞表面マーカー、その遺伝子発現、その特定の生化学的栄養因子生産能力、その免疫学的特徴により特徴付けられた。
【００５５】
分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）の派生および増殖
ここで説明された方法によれば、哺乳類の胎盤と臍帯は、満期産または早期産のいずれかの終結点のその直後、例えば出産後の娩出後に回復される。分娩後組織は、経膣的、または他の方法、例えば帝王切開を用いるかによらず、完了した妊娠から満期または満期前のすべてから得られる可能性がある。前記分娩後組織は前記出産施設から実験室に、フラスコ、ビーカー、培養皿、またはバッグなどの無菌容器で輸送されてもよい。前記容器は、これだけに限らないが、例えばダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの塩溶液を含む溶媒または培地、またはウィスコンシン大学溶液またはペルフルオロ化合物溶液など、移植に使用される臓器の輸送に使用するすべての溶液を有してもよい。これだけに限らないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチンなど、１若しくはそれ以上の抗生物質および／または抗真菌剤が培地または緩衝液に追加されてもよい。前記分娩後組織は、ヘパリン含有溶液などの抗凝固溶液で洗い流してもよい。ＰＰＤＣの抽出前に約４〜１０℃で前記組織を保持することが好ましい。前記組織はＰＰＤＣの抽出前に凍結されないことがさらに好ましい。
【００５６】
ＰＰＤＣの単離は、無菌環境で行われることが好ましい。血液および壊死組織片は、ＰＰＤＣの単離前に前記分娩後組織から除去されることが好ましい。例えば、前記分娩後組織は、これだけに限らないが、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝溶液で洗浄されてもよい。前記洗浄緩衝液も、これだけに限らないがペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチンなど、１若しくはそれ以上の抗生物質および／または抗真菌剤を有してもよい。
【００５７】
本発明のいくつかの観点では、前記分娩後組織にある異なる細胞タイプがＰＰＤＣは単離される可能性がある亜集団に分割される。これは、これだけに限らないが、分娩後組織をその成分細胞に分離する酵素治療を含む細胞分離法を用い、その後これだけに限らないが、例えば形態学的および／または生化学的マーカーに基づく選択すなわち望みの細胞の選択的増殖（正の選択）、望まない細胞の選択的破壊（負の選択）、例えば大豆凝集素、凍結−解凍法、前記混合集団中の細胞の差別的接着性、ろ過、従来の遠心分離およびゾーン遠心分離、遠心傾瀉（傾瀉遠心分離）、ユニット重力分離、対向流分布、電気泳動、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリーなど、混合集団で差別的細胞被凝集性による分離など、特定の細胞タイプをクローニングおよび選択することで達成されてもよい。
【００５８】
好ましい実施例では、胎盤全体またはその断片または切片を有する分娩後組織は、機械力（刻みまたは剪断力）、マトリックスメタロプロテアーゼおよび／または例えばコラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、インディアナ州インディアナポリス）、ヒアルロニダーゼ、および／またはペプシン、または機械的、酵素的方法の組み合わせなど中性プロテアーゼなど、蛋白質分解酵素単独またはその組み合わせを用いた酵素消化により脱凝集される。例えば、前記分娩後組織の細胞成分は、コラゲナーゼを介した解離を用いた方法により脱凝集されてもよい。酵素消化法は、好ましくはメタロプロテアーゼと中性プロテアーゼの組み合わせなどの酵素の組み合わせを利用している。前記マトリックスメタロプロテアーゼは、好ましくはコラゼナーゼである。前記中性プロテアーゼは、好ましくはサーモリシンまたはディスパーゼであり、最も好ましくはディスパーゼである。より好ましくは、分娩後組織の酵素消化がコラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼまたはＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、インディアナ州インディアナポリス）とヒアルロニダーゼの組み合わせなど、マトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ヒアルロン酸を消化する粘液溶解酵素の組み合わせを利用している。コラゲナーゼは１、２、３、または４型であってもよい。細胞単離の分野で既知の他の酵素には、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、またはエラスターゼなどのセリンプロテアーゼを含み、これらはマトリックスメタロプロテアーゼ、粘液溶解酵素、中性プロテアーゼなど他の酵素単独またはその組み合わせで使用されてもよい。セリンプロテアーゼは、好ましくは他の酵素使用後に引き続いて使用される。前記温度と組織または細胞がセリンプロテアーゼと接触している時間は特に重要である。セリンプロテアーゼは血清中α２ミクログロブリンで阻害されてもよく、そのため前記消化に用いる培地は通常血清を含まない。ＥＤＴＡおよびＤＮａｓｅは一般的に酵素消化法に利用され、細胞回復の効率を上昇させる。前記消化の希釈度は、細胞が前記粘性消化中で捕捉される際、前記細胞収率にも大きく影響する可能性がある。前記ＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、インディアナ州インディアナポリス）のＢｌｅｎｄｚｙｍｅ（Ｒｏｃｈｅ）シリーズの酵素の組み合わせは非常に有用であり、前記瞬間的方法で利用されてもよい。他の酵素源も既知であり、前記熟練者は自然供給源から直接そのような酵素を入手してもよい。前記熟練者は、本発明の前記細胞の単離に利用するため、新規、または追加の酵素または酵素の組み合わせを評価する設備を十分備えていてもよい。好ましい酵素処理は０．５、１、１．５、または２時間若しくはそれ以上である。より好ましい実施例では、前記崩壊段階の酵素処理中、前記組織が３７℃でインキュベートされる。
【００５９】
前記臍帯および胎盤を有する分娩後組織は、分離せずに使用されてもよい。代わりに、前記臍帯は当業者により周知の方法で前記胎盤から分離されてもよい。本発明のいくつかの実施例では、分娩後組織が臍帯および胎盤などの２若しくはそれ以上の部分に分離される。本発明のいくつかの実施例では、胎盤組織が２若しくはそれ以上の部分に分離され、各部分が主に新生児、新生児と母体、母体側のいずれかを有する。前記分離部分は次に、ここに示された方法に従い、機械的および／または酵素的分離によって分離される。新生児または母体細胞系譜の細胞は、例えば角化細胞分析またはＹ染色体のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、当該分野で既知の方法により同定されてもよい。角化細胞の分析も、正常核型の細胞を同定するために利用されてもよい。
【００６０】
増殖したＰＰＤＣから単離された細胞または分娩後組織は、細胞培養の開始または播種に利用されてもよい。細胞は、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、細胞外膜蛋白質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード））などの細胞外基質またはリガンドでコーティングされていないか、コーティングされている滅菌組織培養容器に移される。ＰＰＤＣは、これだけに限らないが、ＤＭＥＭ（高または低グルコース）、イーグル基本培地、ハムＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムＦ−１２培地（Ｆ１２）、イスコブ変法ダルベッコ培地、間葉系幹細胞基本培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ  １６４０、改変ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ）、ＣＥＬＬ−ＧＲＯ  ＦＲＥＥなどの細胞増殖を維持することができる培地で培養される。前記培地は、例えば血清（例えば好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウマ血清（ＥＳ）、ヒト血清（ＨＳ））、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、１若しくはそれ以上の増殖因子、例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｌ−バリンを含むアミノ酸、例えば、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチンの単独または併用など、微生物汚染を制御するための１若しくはそれ以上の抗生物質および／または抗真菌薬を含む、１若しくはそれ以上の成分が補充されてもよい。前記培地は、好ましくは増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース、血清、ＢＭＥ、抗真菌剤、抗生物質）を有する。
【００６１】
前記細胞は一定の密度で培養容器に播種され、細胞増殖を可能とする。好ましい実施例では、前記細胞が空気中のＣＯ２容積約０〜約５パーセントで培養される。いくつかの好適な実施例では、前記細胞が空気中のＯ２約２〜約２５パーセント、好ましくは空気中のＯ２約５〜約２０パーセントで培養される。前記細胞は好ましくは約２５〜約４０℃、より好ましくは約３５℃〜約３９℃で培養され、より好ましくは３７℃で培養される。前記細胞は好ましくはインキュベーターで培養される。前記培養容器の培地は、例えばバイオリアクターで静止または攪拌されてもよい。ＰＰＤＣは好ましくは低酸化的ストレス下で培養される（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、Ｎ−アセチルシステインを追加する）。ここで用いられる「低酸化的ストレス」は、前記培養細胞にフリーラジカルの障害が全くないか、最小限の状態を指す。
【００６２】
最も適切な培地、培地の調整、細胞培養法の選択法は当該分野で周知であり、ここで参考文献として盛り込まれているＤｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９９５，ＣＥＬＬ  &  ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ：  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，ＣｈｉｃｈｅｓｔｅｒおよびＨｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（ｅｄｓ．），１９９１，ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲＳ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎを含む様々な出典で説明されている。
【００６３】
例えばピペットなどで培養皿から培地を慎重に吸引し、新しい培地で補充することにより、前記培地は必要に応じて変化される。インキュベーションは、前記培養皿に十分な数または密度の細胞が蓄積するまで継続される。前記最初の移植組織片は除去されてもよく、前記残りの細胞は標準的な方法または細胞スクレーパーを用いてトリプシン処理されてもよい。トリプシン処理後、前記の通り前記細胞は回収され、新しい培地に除去され、インキュベートされる。いくつかの実施例では、前記培地はトリプシン処理後、約２４時間で少なくとも１回変更され、すべての浮遊細胞を除去する。培養中に残った前記細胞はＰＰＤＣであると考えられる。
【００６４】
十分な時間で単離細胞または組織断片を培養後、ＰＰＤＣは分娩後組織からの移動または細胞分裂、またはその両方の結果として増殖する。本発明のいくつかの実施例では、ＰＰＤＣが最初に用いたものと同じまたは異なるタイプの新鮮培地を含む別の培養容器に継代または除去され、前記細胞集団は有糸分裂により増殖されうる。ＰＰＤＣは好ましくはおよそ１００％のコンフルエントまで、より好ましくは約７０〜８５％コンフルエントまで継代させる。播種に対してコンフルエントの下限は、当業者に理解される。前記本発明の胎盤由来細胞は、第１継代培養（継代０）から老化まで利用されてもよい。前記好ましい継代数は、特定の適用に十分な細胞数を生じる継代数である。特定の実施例では、前記細胞が２〜２５倍、好ましくは４〜２０倍、より好ましくは８〜１５倍、より好ましくは１０〜１１倍、最も好ましくは１１倍に継代される。クローン細胞集団が単離されたことを確認するため、クローニングおよび／またはサブクローニングが実施されてもよい。
【００６５】
本発明の細胞は凍結保存され、および／または使用前に保存されてもよい。
【００６６】
ＰＰＤＣの特性解析
ＰＰＤＣは例えば増殖特性（例えば集団倍加能、倍加時間、老化までの継代）、核型分析（例えば正常な核型、母体または新生児の細胞系譜）、フローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学および／または免疫細胞化学（例えばこれだけに限らないが、ビメチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォン・ヴィルブランド因子、ＣＤ３４、ＧＲＯα、ＧＣＰ−２、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、ＮＯＧＯ−Ａを含むエピトープの検出）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、従来のＰＣＲ））、蛋白質配列、蛋白質の分泌（例えば、血漿凝固アッセイまたはＰＰＤＣ条件培地の分析により、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による）、抗体分析（例えばＥＬＩＳＡ、これだけに限らないが、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、血小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦｒ−α）、ＨＬＡクラスＩ抗原（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）、ＨＬＡクラスＩＩ抗原（ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ）、Ｂ７−Ｈ２、ＰＤ−Ｌ２を含む細胞表面マーカーの抗体染色）、混合リンパ球反応（例えば、同種ＰＢＭＣ刺激の指標として）、および／または他の当該分野に既知の方法で特徴付けられてもよい。
【００６７】
ＰＰＤＣは培養で少なくとも４０集団倍加を経る能力がある。集団倍加は［ｌｎ（最後の細胞／最初の細胞）／ｌｎ２］として計算されうる。倍加時間は（培養時間（ｈ）／集団倍加）として計算されてもよい。
【００６８】
未分化のＰＰＤＣは、好ましくは少なくともＮＯＧＯ−Ａ、ＧＣＰ−２、組織因子、ビメンチン、α−平滑筋アクチンの１つを産生し、より好ましくはＧＣＰ−２、組織因子、ビメンチン、α−平滑筋アクチンのそれぞれを産生する細胞である。いくつかの実施例では、これらの因子の２、３、４、５種類が前記ＰＰＤＣにより生産される。
【００６９】
いくつかの実施例では、フローサイトメトリーで検出されるとおり、ＰＰＤＣにＮＯＧＯ−Ａ、ＧＲＯ−α、または酸化低密度リポ蛋白質受容体の少なくとも１つの産生がない。いくつかの実施例では、ＰＰＤＣにこれらの因子の少なくとも２種類または３種類の産生がない。
【００７０】
ＰＰＤＣがＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つ細胞表面マーカーを有してもよい。ＰＰＤＣは好ましくはこれらの表面マーカーそれぞれを産生する。ＰＰＤＣはフローサイトメトリーで検出されるとおり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの少なくとも１つの産生がないことで特徴付けられてもよい。ＰＰＤＣは好ましくはこれらの表面マーカーそれぞれを産生しない。いくつかの実施例では、ＰＰＤＣが線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現を示し、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性蛋白質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子、α誘導蛋白質３の少なくとも１つ、またはＣ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、蛋白質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、卵巣癌で下方制御された遺伝子１、仮想蛋白質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つで上昇する。好ましいＰＰＤＣは線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連し、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性蛋白質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子、α誘導蛋白質３のレベルが上昇し、またはＣ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、蛋白質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、卵巣癌で下方制御された遺伝子１、仮想蛋白質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３のレベルが上昇した発現を示す。線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現が、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性蛋白質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子、α誘導蛋白質３の少なくとも１つで上昇するＰＰＤＣでは、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、蛋白質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、卵巣癌で下方制御された遺伝子１、仮想蛋白質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つで相対的レベルが上昇しないことが好ましい。線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜���骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現が、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、蛋白質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、卵巣癌で下方制御された遺伝子１、仮想蛋白質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１つで上昇するＰＰＤＣでは、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性蛋白質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子、α誘導蛋白質３の少なくとも１つの上昇した相対的レベルが上昇しないことが好ましい。
【００７１】
ＰＰＤＣが線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現を有してもよく、少なくとも以下の１つで減少し、これが低身長感受性ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａ蛋白質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間質系ホメオボックス２、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックスホモログ１、クリスタリン、αＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連性活性化因子２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０蛋白質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ−細胞転座遺伝子１、抗増殖性物質、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連転写因子３、仮想蛋白質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７、仮想遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンＶＩＩＩ型、α１、テネイシンＣ、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリン、β８、シナプス小胞糖タンパク質２、ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー４、インテグリン、α７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１蛋白質、ＰＤＺ−結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス相同体２、ＫＩＡＡ１０３４蛋白質、初期成長反応３、ディスタルレス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮想蛋白質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケトレダクターゼファミリー１、メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素ＩＩ型）、ビグリカン、ファブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリン、β様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７蛋白質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（房室ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想蛋白質ＦＬＪ１４０５４、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連性膜タンパク質５、ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞種、腫瘍原性１の抑制、インスリン様増殖因子結合蛋白質２、３６ｋＤａであり、  当業者は、前記様々な遺伝子の発現が、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧＥＮＥＣＨＩＰで遺伝子配列を都合よく特徴付けられることを理解するものである。
【００７２】
ＰＰＤＣは増殖因子、ケモカイン、サイトカインなど、様々な生化学的に活性な因子を分泌することができる。好ましい細胞はＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＩＭＰ１の少なくとも１つを分泌する。ＰＰＤＣはＥＬＩＳＡで検出されるとおり、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌がないことで特徴付けられてもよい。前記細胞を同定し、特徴付けるため、また当該分野で既知のその他の細胞と本発明の細胞を区別するため、これらの特徴を利用できる。
【００７３】
好ましい実施例では、前記細胞が前記特徴の２若しくはそれ以上を有する。より好ましくは、前記特徴の３、４、または５若しくはそれ以上を有する細胞である。さらに好ましくは、前記特徴の６、７、または８若しくはそれ以上の特徴を有する分娩後由来細胞である。さらに好ましくは、現在、前記請求された特徴９つすべてを有する細胞である。
【００７４】
また現在好ましくは、ＧＣＰ−２、ＮＯＧＯ−Ａ、組織因子、ビメンチン、α−平滑筋アクチンの少なくとも２つを産生する細胞である。より好ましくは、前記蛋白質の３、４、または５種類を生産する細胞である。
【００７５】
前記熟練者は、細胞マーカーが非常に異なる増殖条件でやや変化しやすく、一般にここで説明されているものは増殖培地、またはその変化物の特徴であることを理解するものとする。ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１、２、３、４種類を産生する分娩後由来細胞が好ましい。より好ましくは、これらの細胞表面マーカーの５、６、または７種類を産生する細胞である。さらに好ましくは、前記細胞表面マーカー蛋白質の８、９、または１０種類を産生することができる分娩後由来細胞である。
【００７６】
フローサイトメトリーで検出されるとおり、蛋白質ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの少なくとも１、２、３、または４種類が産生されないＰＰＤＣが好ましい。これらのマーカーの少なくとも５、６、７、または８若しくはそれ以上が産生されないＰＰＤＣが好ましい。より好ましくは、前記細胞表面マーカーの少なくとも９または１０種類が産生されない細胞である。最も好ましくは、前記同定蛋白質の１１、１２、または１３種類の産生がない細胞である。
【００７７】
フローサイトメトリーで検出されるとおり、現在の好ましい細胞はＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれを産生し、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれかを産生しない。
【００７８】
線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現を示す分娩後由来細胞で、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性蛋白質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子、α誘導蛋白質３の少なくとも１、２、または３種類、またはＣ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、蛋白質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、卵巣癌で下方制御された遺伝子１、仮想蛋白質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の少なくとも１、２、または３種類のうちの少なくとも１つのレベルが上昇する。より好ましくは、４または５種類の相対的発現上昇を示す細胞であり、さらに好ましくは前記それぞれの遺伝子セットの遺伝子のうち６、７、または８種類の相対的発現を上昇させることができる細胞である。より好ましくは、前記細胞が線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連した発現を示し、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性蛋白質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子、α誘導蛋白質３の組み合わせ、またはＣ型レクチンスーパーファミリーメンバーＡ２、ウィルムス腫瘍１、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２、レニン、酸化低密度リポ蛋白質受容体１、蛋白質キナーゼＣゼータ、クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１、卵巣癌で下方制御された遺伝子１、仮想蛋白質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３、クローンＤＫＦＺｐ５４７Ｋ１１１３の組み合わせが上昇する。
【００７９】
いくつかの実施例では、線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞であるヒト細胞と関連した細胞が好ましく、低身長感受性ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａ蛋白質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間質系ホメオボックス２、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックスホモログ１、クリスタリン、αＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連性活性化因子２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０蛋白質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ−細胞転座遺伝子１、抗増殖性物質、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連転写因子３、仮想蛋白質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７、仮想遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンＶＩＩＩ型、α１、テネイシンＣ、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリン、β８、シナプス小胞糖タンパク質２、ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー４、インテグリン、α７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１蛋白質、ＰＤＺ−結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター、ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ホメオボックス相同体２、ＫＩＡＡ１０３４蛋白質、初期成長反応３、ディスタルレス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮想蛋白質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケトレダクターゼファミリー１、メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素ＩＩ型）、ビグリカン、ファブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリン、β様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７蛋白質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（房室ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想蛋白質ＦＬＪ１４０５４、ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連性膜タンパク質５、ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞種、腫瘍原性１の抑制、インスリン様増殖因子結合蛋白質２、３６ｋＤａに対応する遺伝子の少なくとも１つの発現を低下させた。より好ましくは、ヒト線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞と関連し、上記に対応する少なくとも５、１０、１５、または２０遺伝子の発現が低下した細胞である。現在、より好ましくは、前記配列に対応する遺伝子の少なくとも２５、３０、または３５種類の発現が低下した細胞である。またより好ましくは、ヒト維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞と比べ、前記配列の３５種類若しくはそれ以上、４０種類若しくはそれ以上に��応する遺伝子が低下した発現を有する分娩後由来細胞である。
【００８０】
特定の増殖因子および他の細胞蛋白質の分泌は、特に有用な本発明の細胞を作る可能性がある。好適な分娩後由来細胞はＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＩＭＰ１の少なくとも１、２、３、または４種類を分泌する。前記蛋白質の５、６、７、または８種類を分泌する細胞も好ましい。前記因子の少なくとも９、１０、１１種類若しくはそれ以上を分泌することができる細胞がより好ましく、前記リストで前記蛋白質の１２種類若しくはそれ以上、またはさらに１３種類すべてを分泌できる細胞が好ましい。
【００８１】
そのような因子の分泌は有用であるが、ＰＰＤＣが前記培地に因子を分泌できないことでも特徴付けられる。ＥＬＩＳＡで検出されるとおり、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＶＥＧＦの少なくとも１、２、３、または４種類の分泌がない分娩後由来細胞が現在、使用に好ましい。前記蛋白質の５または６種類の分泌がないことで特徴付けられる細胞は、より好ましい。前記因子の７種類すべての分泌がない細胞も好ましい。
【００８２】
本発明の分娩後由来細胞の例は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、バージニア州、マナッサス）に委託され、（１）系統名ＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ８）は２００４年６月１５日に堆積され、受入番号ＰＴＡ−６０７４が割り当てられ、（２）系統名ＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１１）は２００４年６月１５日に堆積され、受入番号ＰＴＡ−６０７５が割り当てられ、（３）系統名ＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１６）２００４年６月１５日に委託され、受入番号ＰＴＡ−６０７９が割り当てられた。
【００８３】
本発明の臍帯由来細胞の例は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、バージニア州、マナッサス）に委託され、（１）系統名ＵＭＢ  ０２２８０３（Ｐ７）には受入番号ＰＴＡ−６０６７が割り当てられ、（２）系統名ＵＭＢ  ０２２８０３（Ｐ１７）には受入番号ＰＴＡ−６０６８が割り当てられた。
【００８４】
ＰＰＤＣは単離されうる。前記発明はＰＰＤＣの集団を含むＰＰＤＣの組成物も提供する。いくつかの実施例では、前記細胞集団が不均一である。本発明の不均一な細胞集団は、本発明のＰＰＤＣの少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を有してもよい。前記本発明の不均一な細胞集団は、さらに上皮細胞（例えば口腔粘膜、消化管、鼻上皮、気道上皮、膣上皮、角膜上皮の細胞）、骨髄細胞、脂肪細胞、幹細胞、角化細胞、血管内皮細胞（例えば、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、血管内皮前駆体（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞））、筋芽細胞、筋細胞、間質細胞、その他の軟部組織細胞または前記細胞を有してもよい。いくつかの実施例では、前記集団が実質的に均一であり、つまり実質的にＰＰＤＣのみを有する（好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上のＰＰＤＣ）。前記本発明の均一細胞集団は、臍帯または胎盤由来細胞を有してもよい。臍帯由来細胞の均一集団は、母体細胞系譜の細胞がないと考えられる。胎盤由来細胞の均一な集団は新生児または母体の細胞系譜であってもよい。細胞集団の均一性は、例えば細胞ソーティング（フローサイトメトリーなど）、ビーズ分離、またはクローン増殖などの当該分野で既知の方法により達成されてもよい。
【００８５】
本発明の方法は、さらに培養中の本発明の細胞を増殖することにより、分娩後由来細胞の集団を作る方法を有する。前記本発明の分娩後由来細胞は、好ましくは約５％〜約２０％の酸素下で増殖する。前記本発明の分娩後由来細胞は、好ましくはこれだけに限らないが、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、間葉幹細胞増殖培地、アドバンスドＤＭＥＭ（ギブコ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ１６４０、ＣＥＬＬ−ＧＲＯ  ＦＲＥＥ、アドバンスドＤＭＥＭ（ギブコ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ）、ハムのＦ１０培地、ハムのＦ１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、イスコブ変法ダルベッコ培地、またはイーグル基本培地などの培地で増殖される。前記培地は、好ましくは低または高グルコース、約２％〜１５％（ｖ／ｖ）血清、βメルカプトエタノール、抗生物質を含む。前記培地は、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、表皮増殖因子の少なくとも１つを有してもよい。本発明の前記細胞はコーティングされていないか、コーティングされた表面上で増殖されてもよい。前記細胞の増殖した表面は、例えばゼラチン、コラーゲン（例えば未変性または変性）、フィブロネクチン、ラミニン、オルニチン、ビトロネクチン、または細胞外膜蛋白質（例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ）でコーティングされてもよい。いくつかの実施例では、分娩後由来細胞集団が別の細胞集団と混合される。
【００８６】
本発明の前記細胞は、外胚葉、内胚葉、または中胚葉細胞に分化するように誘導される可能性もある。例えば、ＰＰＤＣは分化が誘導される細胞培養条件とすることで、特定の細胞系譜に分化するように誘導されてもよい。またここで提供されるものは、望みの経路に沿って幹細胞の分化を刺激する１つ以上の因子がある状態、またはそのような条件でインキュベートされた細胞集団である。そのような因子は当該分野で既知であり、前記熟練者は適切な分化条件の決定がルーティンな実験で達成される可能性があることを理解するものとする。そのような条件の最適化は、統計学的実験デザインと分析により達成される可能性があり、例えば反応表面の方法論により、例えば生物培養で複数の変数を同時に最適化することができる。現在の好適な因子は、これだけに限らないが、増殖または栄養因子、脱メチル化因子、軟部組織細胞系譜の細胞との共培養または軟部組織細胞系譜の細胞で調整した培地での培養などの因子、また、これらの経路に沿った幹細胞分化を刺激するため、前記分野で既知の他の条件を含む。
【００８７】
本発明のＰＰＤＣから発達する分化細胞を特徴付ける方法には、これだけに限らないが組織学的、形態的、生化学的、免疫組織化学的方法を含み、または前記分化細胞による因子を同定することで、また前記分化ＰＰＤＣの誘導性により、遺伝的または分子的に細胞表面マーカーを用いる。
【００８８】
ＰＰＤＣまたはその成分または製品の利用方法
ＰＰＤＣの遺伝子工学
本発明の前記細胞は設計され、これだけに限らないが、組み込み型ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクター、非組み込み型複製ベクター、例えばパピローマウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノウイルスベクター、または複製欠陥ウイルスベクターを含む様々なベクターのいずれかを利用することができる。細胞にＤＮＡを導入する他の方法には、リポソーム、電気穿孔法、粒子ガムの利用を含み、または直接ＤＮＡ注入法による。
【００８９】
宿主細胞は、特にプロモーターまたはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など、１若しくはそれ以上の適切な発現制御因子により制御されるか、その操作と関連したＤＮＡ、および選択可能なマーカーにより変換または形質移入されることが好ましい。
【００９０】
前記外来ＤＮＡの導入後、設計された細胞は濃縮培地で増殖することができ、次に選択的培地に交換されてもよい。前記外来ＤＮＡの選択的マーカーは前記選択に抵抗性を与え、例えばプラスミド上でその染色体に対し、細胞に前記外来ＤＮＡを安定して組み込み、次に細胞株にクローニングおよび増殖されうる病巣を形成するように増殖させることができる。
【００９１】
この方法は、遺伝子産物を発現する細胞株を設計するため、有利に利用されてもよい。
【００９２】
前記挿入遺伝子の発現を誘導するため、いずれのプロモーターを使用してもよい。例えば、ウイルスプロモーターにはこれだけに限らないが、前記ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ  ４０、パピローマウイルス、ＥＢウイルスまたはエラスチン遺伝子プロモーターを含む。好ましくは、対照遺伝子の発現を制御するために用いた前記制御要素は、前記遺伝子の制御された発現を可能とし、前記産物はｉｎ  ｖｉｖｏで必要なときにだけ合成されるようにする。一時的な発現が望ましい場合、構成プロモーターが非組み込み型および／または複製欠陥ベクターに用いられる。代わりに、誘導性プロモーターを用い、必要に応じて前記挿入遺伝子の発現を誘導することができる。
【００９３】
誘導プロモーターは、メタロチオネインおよび熱ショック蛋白質と関連するものを含むが、これだけに限らない。
【００９４】
説明され、利用されうる組織特異性を示す転写制御領域の例は前記ミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域であり、骨格筋で活性である（Ｓｈａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３）。
【００９５】
本発明の前記細胞は遺伝的に設計され、前記移植部位で炎症または拒絶を促す因子を「ノックアウト」または「ノックダウン」発現させうる。標的遺伝子の発現レベルまたは標的遺伝子産物の活性レベルを低下させる、負の調節法が以下に考察されている。「負の調節」はここで用いるとおり、前記修飾的治療を行わない状態で、前記標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性に対する、標的遺伝子産物の前記レベルおよび／または活性が低下することを指す。未変性遺伝子の発現は、例えば前記相同性組み換え技術を用い、前記遺伝子を完全に不活化することで（一般的には「ノックアウト」と呼ばれる）発現を抑制するなど、多数の方法により低下するか、ノックアウトされる可能性がある。通常は、前記蛋白質の重要な領域をコードするエキソン（またはその領域のエキソン５’）は、例えばｎｅｏなどの正の選択的マーカーにより妨害され、前記標的遺伝子の正常ｍＲＮＡの産生を阻害し、前記遺伝子が不活化される。遺伝子は、遺伝子の一部を欠失させるか、遺伝子全体を欠失させることで不活化されうる。前記ゲノムから離れた前記標的遺伝子に相同的な２つの領域からなる構成物を用いることで、前記２領域に介入する配列は欠失されうる（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：３０８４）。
【００９６】
前記標的遺伝子の発現を抑制するアンチセンス、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、およびリボザイム分子は、前記発明に従って用いられ、標的遺伝子活性のレベルを低下させてもよい。例えば、主要組織適合抗原遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を抑制するアンチセンスＲＮＡ分子は、免疫反応に対して最も多目的に使えることが示された。またさらに、三重らせん分子は標的遺伝子活性のレベルを低下させるために使用される可能性がある。
【００９７】
これらの技術はＬ．Ｇ．Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１９９４，ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  &  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．で詳細に説明され、この参照によりここに組み込まれる。
【００９８】
前記方法のいずれかを用い、例えばＩＬ−１の発現が本発明の細胞でノックアウトまたはノックダウンされ、本発明の細胞により炎症性メディエーターの産生が減少する可能性がある。同様に、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、前記移植組織が拒絶されるリスクを低下させるため、ノックアウトまたはノックダウンされる可能性がある。
【００９９】
本発明の前記細胞が一度遺伝子設計されると、前記患者に直接移植され、軟部組織の状態を治療することが可能となるか、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、または他の炎症性サイトカインの中和抗体のイディオタイプに対応するペプチドまたはポリペプチドなど、抗炎症性遺伝子産物を産生する。
【０１００】
代わりに、前記遺伝子設計された細胞が使用され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで新しい組織を産生してもよく、ここで述べられているとおり、この組織が前記被験者に移植される。
【０１０１】
栄養因子の分泌
ＰＰＤＣによる増殖因子の分泌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで第２の細胞タイプの栄養支持を提供してもよい。ＰＰＤＣは例えば少なくとも単球走化性蛋白質１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、ＧＣＰ−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１ａ）、ＲＡＮＴＥＳ、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）の少なくとも１つを分泌してもよく、化学的に定義された培地における前記細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養を含め、様々な方法により増殖される可能性がある。
【０１０２】
本文の例１４で示されるとおり、ＰＰＤＣは共培養で他の細胞タイプの生存、増殖、分化を支持する能力を有する。従って、別の実施例では、ＰＰＤＣがｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養され、これだけに限らないが、上皮細胞（例えば口腔粘膜、消化管、鼻上皮、気道上皮、膣上皮、角膜上皮の細胞）、骨髄細胞、脂肪細胞、幹細胞、角化細胞、血管内皮細胞（例えば、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、血管内皮前駆体（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞））、筋芽細胞、筋細胞、間質細胞、他の軟部組織細胞または前駆細胞と、その混合物を含む前記望みの他細胞に栄養支持を提供する。共培養では、前記ＰＰＤＣと前記望みの他細胞が前記２つの細胞タイプが接触している条件で共培養されることが望ましい。これは例えば、培地または適当な培養基質での細胞の不均一集団として、前記細胞を播種することにより達成される可能性がある。代わりに、前記ＰＰＤＣはまずコンフルエントまで増殖され、培養で第２の望みの細胞タイプの基質として利用される可能性がある。この後者の実施例では、前記細胞がさらに膜または同様の装置によって物理的に分離されてもよく、前記共培養期間後、前記他の細胞タイプが除去、別に使用されてもよい。他の実施例では、前記望みの他細胞が前記ＰＰＤＣの条件培地、細胞外基質、および／または細胞溶解物と接触して培養される。他の細胞タイプの増殖と分化を促す共培養でＰＰＤＣを使用することで、研究および臨床／治療分野における適用性を見出すことができる。例えば、ＰＰＤＣの共培養が利用され、例えば、薬物スクリーニングアッセイでの基本的な研究目的または利用として、例えば軟部組織表現型の細胞培養で、特定表現型の細胞の増殖と分化を促してもよい。後者の治療目的の投与で、軟部組織の表現型の細胞がｅｘ  ｖｉｖｏで増殖する際に、ＰＰＤＣ共培養が利用されてもよい。例えば、細胞は個体から採取され、ＰＰＤＣを用いた共培養でｅｘ  ｖｉｖｏで増殖され、次に個体（自己転移）または別の個体（同系または同種転移）に戻されてもよい。これらの実施例では、ｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖後、前記ＰＰＤＣを有する細胞の混合集団が、例えばここで示される軟部組織状態の治療を必要とする患者に投与される可能性があることは理解されることとする。代わりに、自己転移が適切であるか望ましい状態では、前記共培養された細胞集団は培養で物理的に分離され、前記患者の投与で前記自己転移の除去を可能としてもよい。
【０１０３】
いくつかの実施例では、ＰＰＤＣがこれだけに限らないが、上皮細胞（例えば口腔粘膜、消化管、鼻上皮、気道上皮、膣上皮、角膜上皮の細胞）、骨髄細胞、脂肪細胞、幹細胞、角化細胞、血管内皮細胞（例えば、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、血管内皮前駆体（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞））、筋芽細胞、筋細胞、間質細胞、その他の軟部組織細胞または前駆細胞などの細胞を用いた共培養で血管新生を誘導する。例えば、これだけに限らないが、ＥＰＯ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＢＥＧＦを含む血管新生因子がＰＰＤＣにより放出される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＰＰＤＣまたはＰＰＤＣ産物に軟部組織細胞を曝露することで血管新生を誘導する方法が実施されてもよい。本発明の前記方法による血管内皮網の軟部組織細胞の例には、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、血管内皮前駆体（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞）を含む。前記方法がｉｎ  ｖｉｖｏで実施されている場合、ＰＰＤＣまたはＰＰＤＣ産物あるいは組成物がここで説明されている患者に投与されてもよい。例えば、ＰＰＤＣ集団、条件培地、細胞溶解物、細胞外基質、または組成物が患者に投与され、必要な血管新生因子を提供してもよい。
【０１０４】
例１４で示されるとおり、本発明の前記ＰＰＤＣ集団、条件培地、細胞溶解物、細胞外基質、または組成物が使用され、血管ネットワークを産生してもよい。血管ネットワークを産生する方法が、軟部組織細胞をＰＰＤＣ細胞集団、細胞溶解物、細胞外基質または条件培地に曝露することを含む。前記軟部組織細胞の集団は、好ましくは大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞の軟部組織細胞の少なくとも１つを含む。前記血管ネットワークを産生する方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施される方法としてもよい。そのように生産された前記血管ネットワークは、治療法として患者に投与されてもよい。いくつかの好ましい実施例では、前記血管ネットワークが、これだけに限らないが、例えば血管疾患または障害または不適切な血管発達などの血管疾患など、軟部組織状態の治療として投与される。本発明のいくつかの観点では、前記血管ネットワークが前記患者に移植することで投与される。好ましい実施例では、本発明の前記血管ネットワークの移植前に、障害または疾患のある脈管構造が除去される。
【０１０５】
ＰＰＤＣの条件培地
本発明の別の実施例では、特定の細胞系譜に分化を刺激する条件でインキュベートされた未分化ＰＰＤＣまたはＰＰＤＣから、条件培地の産生にＰＰＤＣを使用することを特徴としている。そのような条件培地は、例えば幹細胞または軟部組織前駆体細胞、またはこれだけに限らないが、上皮細胞（例えば口腔粘膜、消化管、鼻上皮、気道上皮、膣上皮、角膜上皮の細胞）、骨髄細胞、脂肪細胞、幹細胞、角化細胞、血管内皮細胞（例えば、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、血管内皮前駆体（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞））、筋芽細胞、筋細胞、間質細胞、その他の軟部組織細胞または前駆細胞、およびその混合物を含む軟部組織表現型の細胞などの細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ培養での使用、またはｉｎ  ｖｉｖｏでＰＰＤＣまたは幹細胞または前駆細胞の均一または不均一な集団、および／または軟部組織表現型の細胞、上皮細胞（例えば口腔粘膜、消化管、鼻上皮、気道上皮、膣上皮、角膜上皮の細胞）、骨髄細胞、脂肪細胞、幹細胞、角化細胞、血管内皮細胞（例えば、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、血管内皮前駆体（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞））、筋芽細胞、筋細胞、間質細胞、その他の軟部組織細胞または前駆細胞、およびその混合物を有する移植細胞を支持することが意図される。
【０１０６】
ＰＰＤＣの治療応用
軟部組織状態を有する患者、例えばこれだけに限らないが、正常に発達するため、疾患または前記組織の外傷または不全の結果生じる軟部組織の修復または置換を必要とする患者を治療するため、または前記身体の機能を増加するなど、美容機能を提供するために本発明のＰＰＤＣが用いられてもよく。本発明のＰＰＤＣの治療応用は、ヘルニア、前記骨盤底の損傷、腱または靱帯の裂傷または破裂、皮膚の修復および再生（例えば瘢痕の補正または外傷の治療、重度の熱傷、皮膚潰瘍（例えば褥痩性潰瘍（床擦れ）、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍）、皮膚癌の切除に伴うものなど外科創傷、血管疾患の治療（例えば末梢動脈疾患、腹部大動脈瘤、頸動脈疾患、静脈疾患などの血管疾患、血管外傷、不適切な血管発達）、および筋疾患（例えば先天性ミオパシー、重症筋無力症、炎症性、神経性、筋原性筋疾患、またデュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、肢帯筋異栄養症、顔面・肩甲・上腕筋ジストロフィー、先天型筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィー）の治療を含むが、これだけに限らない。
【０１０７】
本発明の細胞は、単独でまたは他の細胞と混合して投与されてもよい。前記細胞は基質（例えば三次元骨格）により投与されてもよい。前記細胞は従来薬学的に許容可能な担体で投与されてもよい。ＰＰＤＣに他の細胞が投与される場合、前記ＰＰＤＣは前記他の細胞と同時または経時的に投与されてもよい。細胞が他の細胞タイプと同時に投与される場合、前記ＰＰＤＣは第２の表現型の細胞前後に投与されてもよい。ＰＰＤＣと同時に投与されてもよい細胞は、上皮細胞（例えば口腔粘膜、消化管、鼻上皮、気道上皮、膣上皮、角膜上皮の細胞）、骨髄細胞、脂肪細胞、幹細胞、角化細胞、血管内皮細胞（例えば、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、血管内皮前駆体（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞））、筋芽細胞、筋細胞、間質細胞、その他の軟部組織細胞または前駆細胞を含む。
【０１０８】
前記ＰＰＤＣは他の有益な薬物または生体分子（増殖因子、栄養因子）を投与されてもよい。ＰＰＤＣが他の薬物とともに投与される場合、他の生理活性因子と同時にまたは経時時に（他の薬物の投与前後で）単一の薬学的組成物または別の薬学的組成物中に一緒に投与されてもよい。同時に投与されうる生理活性因子には、抗アポトーシス薬（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ  ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害薬）、抗炎症薬（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害薬、ＴＧＦ−β阻害薬、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害薬、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリマス、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬、例えば、テポキサリン、トルメチン、スプロフェン）、免疫抑制剤／免疫調節薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニュリン阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、シロリムス、エベロリムス）などのカルシニュリン阻害薬、抗増殖薬（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３）などの抗体）、抗血栓形成薬（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン・プロリン・アルギニン・クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害薬、抗血小板薬）、抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）、および局所麻酔薬を含む。別の例として、ここで参考文献として盛り込まれている米国特許番号第５，８２７，７３５号で述べられているとおり、前記細胞は瘢痕抑制因子と同時に投与されてもよい。
【０１０９】
いくつかの実施例では、ＰＰＤＣは未分化細胞として、つまり増殖培地で培養されたものとして投与される。
【０１１０】
本発明の前記細胞は、（例えばカテーテルまたはシリンジにより）外科的に移植、注入、送達されてもよく、またそうでなければ修復または増殖を必要とする部位に直接または間接的に投与されてもよい。前記細胞は基質（例えば三次元骨格）により投与されてもよい。前記細胞は従来薬学的に許容可能な担体で投与されてもよい。本発明の細胞またはその組成物または成分（例えばＥＣＭ、細胞溶解物、条件培地）の投与経路には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、口腔、経鼻投与を含む。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に好ましい経路には、カテーテルによる移植、植え込み、注入、送達、または細胞療法を提供する分野で既知の他の方法を含む。
【０１１１】
細胞が半固体または固体装置で投与される場合、前記身体の正確な位置への外科的移植が典型的に望ましい投与方法である。しかし、液体または液体薬学的組成物はより全身的な部位に（例えば、散在した患部中に）投与されてもよく、そこから例えば化学シグナルに応答することで、特定の部位へ移動する。
【０１１２】
他の実施例には、ＰＰＤＣ細胞成分（例えば細胞溶解物またはその成分）または製剤（例えば細胞外基質、他のＰＰＤＣにより天然で産生されるか、遺伝子組み換えによる栄養および他の生物学的因子、ＰＰＤＣ培養の条件培地）を有する薬学的組成物を投与することによる治療法も含む。またこれらの方法には、さらにここで参考文献により盛り込まれる米国特許番号第５，８２７，７３５号で説明されているとおり、抗アポトーシス薬（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ  ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害薬）、抗炎症薬（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害薬、ＴＧＦ−β阻害薬、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害薬、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリマス、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬、例えば、テポキサリン、トルメチン、スプロフェン）、免疫抑制剤／免疫調節薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニュリン阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、シロリムス、エベロリムス）、抗増殖薬（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）などの抗体、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３））、抗血栓形成薬（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン・プロリン・アルギニン・クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害薬、抗血小板薬）、抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）、局所麻酔薬、瘢痕抑制因子など、他の生理活性因子を投与する方法を含む。
【０１１３】
ＰＰＤＣまたはここで説明された他の薬学的組成物のいずれかを投与する剤型と投与法は、良質の医療のための原則（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）に沿って開発され、個々の患者の条件、例えば治療される前記状態の性質と程度、年齢、性別、体重、全身の疾患、医師に既知の他の要因に沿って投与する。従って、患者に投与される薬学的組成物の有効な量は、当該分野で既知のこれらの条件により決定される。
【０１１４】
本発明のいくつかの実施例では、ＰＰＤＣを用いた細胞療法の開始前に患者の免疫反応を抑制することが必要または望ましくないこともある。さらに、ＰＰＤＣは混合リンパ球反応で同種ＰＢＭＣを刺激しないことが示された。従って、同種またはさらに異種のＰＰＤＣを用いた移植が、場合によって耐性があると考えられる。
【０１１５】
しかしながら、その他の場合、細胞療法を開始する前に患者の免疫反応を薬理学的に抑制することが望ましいか適切であると考えられる。これは、全身または局所免疫抑制剤を使用することで達成されてもよく、またはカプセル装置で前記細胞を投与することで達成されてもよい。ＰＰＤＣは、前記細胞と治療因子が必要とする栄養物および酸素に透過性の被膜で覆われていてもよく、前記細胞はまだ免疫ホルモン因子と細胞に不透過性である。好ましくは、前記カプセルの材料は低刺激性で、標的組織に容易に安定して置かれ、前記移植構造に追加保護を提供する。前記移植細胞に対する免疫反応を軽減または除去するこれらと他の方法は、当該分野で知られている。代わりに、ＰＰＤＣは遺伝的に修飾され、その免疫原性を低下させてもよい。
【０１１６】
生存患者における移植ＰＰＤＣの生存は、様々なスキャン方法、例えばコンピューター断層写真（ＣＡＴまたはＣＴ）スキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）またはポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャンを利用することで決定される可能性がある。前記標的組織を除去することで、視覚的または顕微鏡により検討することで、移植生存率の決定は死後行われる可能性がある。代わりに、細胞に、特定細胞系譜の細胞特異的なスタチンが投与される可能性もある。ローダミンまたはフルオレセイン標識ミクロスフィア、ファーストブルー、ビスベンズアミド、第二鉄微粒子、またはβ−ガラクトシダーゼまたはβ−グルクロニダーゼなどの遺伝的に導入されたレポーター遺伝子などのトレーサー色素を事前に組み入れる前に、移植細胞が同定される可能性もある。
【０１１７】
障害または疾患があった前記機能の回復、例えば関節機能、血流、筋収縮などの回復、または機能の増殖を検討することで、移植ＰＰＤＣの被験者への機能的統合は評価される可能性がある。
【０１１８】
組成物と薬学的組成物
例えば薬学的組成物を含む、ＰＰＤＣと関連製品の組成物（例えば細胞外基質、細胞溶解物、可溶性細胞分画、条件培地）は、本発明の範囲内に含まれる。本発明の組成物には、例えばこれだけに限らないが、増殖因子、分化誘導因子、カスパーゼ阻害薬などの細胞生存因子、ｐ３８キナーゼ阻害薬などの抗炎症性因子、またはＶＥＧＦまたはｂＦＧＦなどの血管新生因子など、１若しくはそれ以上の生理活性因子を含んでもよい。生理活性因子のいくつかの例には、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＬＩＦを含む。いくつかの実施例では、未分化または分化誘導ＰＤＰＣが前記生理活性因子と接触して培養される。いくつかの実施例では、未分化ＰＰＤＣが前記生理活性因子と接触した時点でまだ未分化である。他の実施例では、生理活性因子が前記ＰＰＤＣの分化を誘導する。例えば薬学的組成物を含む、ＰＰＤＣと関連製品の組成物（例えば細胞外基質、細胞溶解物、可溶性細胞分画、条件培地）は、本発明の範囲内に含まれる。本発明の組成物には、１若しくはそれ以上の分化誘導因子、カスパーゼ阻害薬などの細胞生存因子、ｐ３８キナーゼ阻害薬などの抗炎症性因子、またはＶＥＧＦまたはｂＦＧＦなどの血管新生因子を含んでもよい。
【０１１９】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体中に分化および／または未分化ＰＰＤＣの均一または不均一集団、その培養、その細胞溶解物、それによって産生された細胞外基質、またはそれに由来するなら培地を有してもよい。
【０１２０】
本発明の前記細胞の薬学的に許容可能な担体は、本発明の前記細胞またはその組成物または成分と有害な反応を生じないことに適した、有機または無機担体物質を含む。生体適合性となる程度まで、適切な薬学的に許容可能な担体には水、（リンゲル液などの）塩溶液、アルコール、オイル、ゼラチン、およびラクトース、アミロース、またはでんぷんなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジンを含む。そのような製剤は消毒される可能性があり、望ましい場合は潤滑剤、保存剤、安定剤、潤滑剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝液、着色剤などの補助試薬と混合される可能性がある。本発明での使用に適した薬学的組成物担体は当該分野で知られており、例えばＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１７ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン）およびＷＯ  ９６／０５３０９で説明され、そのそれぞれがここで参考文献に盛り込まれている。
【０１２１】
前記薬学的組成物の用量（例えば投与される細胞数）および投与頻度が、これだけに限らないが治療される状態の性質、前記状態の症状の程度、前記患者の特徴（例えば年齢、サイズ、性別、健康状態）を含む多数の要因に依存している。
【０１２２】
例えばこれだけに限らないが、ＰＰＤＣ、その細胞外基質または細胞溶解物、条件培地、基質、血管ネットワーク、本発明に沿って産生される組成物が、障害または破壊された軟部組織の修復または置換、既存の軟部組織の増殖、新規または変化された組織の導入、義肢の修正、または生物組織または構造の接合に利用されてもよい。例えば、本発明のいくつかの実施例には、（ｉ）三次元培養で増殖された軟部組織構造物の置換によるヘルニア閉鎖、（ｉｉ）軟部組織構造物を用いた皮膚移植皮片、（ｉｉｉ）義肢、（ｉｖ）血管移植片、（ｖ）腱または靱帯再建術を含んでもよい。本発明の方法に沿って治療される可能性があるそのような疾患の例には、片側顔面小人症、頬骨および頬骨形成不全、片側乳頭形成不全、漏斗胸、胸筋形成不全（ポーランド奇形）、（咽頭後方移植片としての）口蓋裂修復または粘膜下口蓋裂に続発した口蓋帆咽頭機能不全などの先天性奇形、瘢痕、皮下萎縮（例えば、円板状紅斑性狼瘡に続発）、角化性病変、前記顔面の座瘡孔、皮下萎縮による線状強皮症、鞍鼻変形、ロンベルク疾患、片側声帯麻痺などの後天性欠陥（外傷後、手術後、感染後）、眉間皺線、深い鼻唇のしわ、口周囲の地図状のしわ、こけたほお、乳頭形成不全などの美容欠陥、ヘルニア、腱または靱帯の裂傷または破裂、重度の熱傷、皮膚潰瘍（例えば褥痩性潰瘍（床擦れ）、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍）、皮膚癌切除に伴うものなどの外科創傷、末梢動脈疾患、腹部大動脈瘤、頸動脈疾患、静脈疾患などの血管疾患、筋疾患（例えば先天性ミオパシー、重症筋無力症、炎症性、神経性、筋原性筋疾患、またデュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、肢帯筋異栄養症、顔面・肩甲・上腕筋ジストロフィー、先天型筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィー）、および腱および靱帯などの結合組織の置換と修復を含む。
【０１２３】
前記移植された細胞および／または組織が修復部位で固定される可能性がある場合に、障害された組織の修復または置換の成功は増強される可能性がある。積極的な固定法が利用されない場合、移植後の移動により、前記新しい細胞または組織を前記組織から除去させてもよい。新規細胞および／または組織を所定の位置に固定するため、前記部位に留置される可能性がある生体適合性組織由来の継ぎ、生分解性縫合糸またはピン、留め金、画鋲、錨などの他の留め具、縫合糸、ピン、画鋲、錨などの非吸収性固定装置、粘着剤、干渉適合幾何学の利用を含む様々な方法が利用される可能性がある。
【０１２４】
本発明の前記細胞は、薬学的組成物として認められる担体で単独で投与されるか、ここで説明される基質に播種されてもよい。
【０１２５】
ＰＰＤＣまたは移植用ＰＰＤＣ製剤の使用
本題の発明の治療法には、それを必要とする患者にＰＰＤＣ、ＰＰＤＣ製剤、またはトランス分化した細胞の移植が関与する。本発明の細胞は、治療が必要な部位または前記部位の「ホーム」に送達されてもよい。
【０１２６】
本発明の前記細胞はｉｎ  ｓｉｔｕ（原位置）で分化するか、内因性細胞への栄養支持を提供してもよい。ヒトにおける前記適切な細胞移植の用量は、例えば前記細胞活性に関する既存の情報から決定される可能性がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養およびｉｎ  ｖｉｖｏでの動物実験から、産生された因子の量が定量される可能性がある。この情報も移植物質の適切な量を計算する上で有用である。さらに、追加移植が行われるか、移植物質がそれによって低下するか否かを決定するため、前記患者がモニターされる可能性がある。
【０１２７】
前記移植細胞の血管新生および生存を亢進するため、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、またはｂＦＧＦなどの血管新生因子が単独または内皮細胞またはＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞を含むその前駆細胞との組み合わせで追加される可能性がある。
【０１２８】
１若しくはそれ以上の他の成分は、当該分野で既知の１若しくはそれ以上のコラーゲンタイプ、および／または増殖因子、血小板が豊富な血漿、および薬物など、選択された細胞外基質成分を含む移植細胞に追加されてもよい。代わりに、本発明の前記細胞は遺伝的に設計され、増殖因子を発現および産生してもよい。前記細胞製剤に有用に組み込まれうる生理活性因子には、抗アポトーシス薬（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ  ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害薬）、抗炎症薬（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害薬、ＴＧＦ−β阻害薬、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害薬、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリマス、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬、例えば、テポキサリン、トルメチン、スプロフェン）、免疫抑制剤／免疫調節薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニュリン阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、シロリムス、エベロリムス）、抗増殖薬（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３））などの抗体、抗血栓形成薬（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン・プロリン・アルギニン・クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害薬、抗血小板薬）、抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）、および局所麻酔薬を含む。別の例として、ここで参考文献として盛り込まれている米国特許番号第５，８２７，７３５号で述べられているとおり、前記細胞は瘢痕抑制因子と同時に投与されてもよい。
【０１２９】
移植用ＰＰＤＣ製剤
限定しない実施例では、本発明の前記細胞を有する製剤が、新規軟部組織の産生が望ましい部位に直接投与するために調整される。例えば、限定されないが、本発明の前記細胞は注射用ヒドロゲル溶液で懸濁されてもよい。本発明で使用されるために適切なヒドロゲルの例には、ＲＡＤ１６などの自己集合性ペプチドを含む。代わりに、前記細胞を含むヒドロゲル溶液は、例えば鋳型に固めることができ、移植前にそこに分散される細胞を有する基質を形成してもよい。または一度前記基質が固まると、前記細胞が移植前に有糸分裂により増殖されるように、前記細胞構造が培養されてもよい。前記ヒドロゲルは、共有、イオン、または水素結合を介して交差結合され、水分子を包括してゲルを形成する三次元開放型格子構造を形成する、有機ポリマー（天然型または合成型）である。ヒドロゲルを形成するために用いられる可能性がある物質の例には、アルギン酸とその塩、ペプチド、ポリホスファジン、ポリアクリル酸塩などの多糖類を含み、イオンにより架橋されるか、ポリエチレン・オキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのポリマーを遮断し、それぞれ温度またはｐＨにより架橋される。いくつかの実施例では、本発明のＰＰＤＣの支持体が生物分解性である。
【０１３０】
本発明のいくつかの実施例では、前記製剤が例えば米国特許出願第２００２／００２２６７６号公報；Ａｎｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，７８（１〜３）：１９９〜２０９（２００２）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４（２２）：３９６９〜８０（２００３）で説明されるとおり、ｉｎ  ｓｉｔｕで重合可能なゲルを有する。
【０１３１】
いくつかの実施例では、前記ポリマーが少なくとも部分的に、水、緩衝塩溶液、またはアルコール水溶液などの水溶液に溶解性であり、荷電した側鎖、またはその一価イオン塩を有する。陽イオンと反応されうる酸性側鎖を持つポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）、スルホン化ポリスチレンなどのホスホン化ポリマーである。アクリル酸またはメタクリン酸およびビニルエーテルモノマーの反応により形成される、酸性側鎖を有するコポリマーも利用される可能性がある。酸性基の例はカルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ化）アルコール基、フェノールＯＨ基、酸性ＯＨ基である。
【０１３２】
アニオンと反応されうる塩基性側鎖があるポリマーの例は、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）、一部のイミノ置換ポリホスファゼンである。前記ポリマーのアンモニウムまたは第４級塩は、前記中心窒素またはペンダントイミノ基からも形成されうる。塩基性側鎖の例はアミノ基およびイミノ基である。
【０１３３】
アルギン酸塩は、水中、室温において二価陽イオンでイオン的に架橋され、ヒドロゲル基質を形成する可能性がある。これらの軽度の条件では、例えば米国特許番号第４，３５２，８８３号でリムについて説明されているとおり、アルギン酸塩がハイブリドーマ細胞カプセル化に最も一般的に使用されるポリマーであった。前記リムプロセスでは、カプセル化される生体物質を含む水溶液が水溶性ポリマー溶液で懸濁され、前記懸濁液は液滴となり、これが多価陽イオンと接触することで個別のマイクロカプセルに設定され、次に前記マイクロカプセルの表面がポリアミノ酸で架橋され、前記カプセル化物質周囲に半透膜を形成する。
【０１３４】
ポリホスファゼンは、交互の単結合と二重結合により分離された窒素およびリンから成る基幹を持つポリマーである。各リン原子は２つの側鎖に共有結合されている。
【０１３５】
架橋結合に適したポリホスファゼンは側鎖の大部分であり、二価または三価陽イオンによる塩橋を形成することができる。好ましい酸性側鎖の例は、カルボン酸基とスルホン酸基である。加水分解に安定なポリホスファゼンは、Ｃａ２＋またはＡ１３＋などの二価または三価陽イオンで架橋されるカルボン酸側鎖を有するモノマーで形成される。ポリマーが合成され、イミダゾール、アミノ酸エステル、またはグリセロール側鎖を有するモノマーを組み込むことで、加水分解により分解する可能性がある。例えば、ポリアニオン系ポリ［ビス（カルボキシラトフェノキシ）］ホスファゼン（ＰＣＰＰ）は合成される可能性があり、室温またはそれ以下で水性培地中に多価陽イオンを溶解して架橋され、ヒドロゲル基質を形成する。
【０１３６】
生物分解性ポリホスファゼンは少なくとも２種類の側鎖タイプ、多価陽イオンで塩橋を形成することができる酸性側鎖、例えばイミダゾール基、アミノ酸エステル、グリセロール、およびグルコシルなど、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件で加水分解する側鎖を有する。
【０１３７】
前記側鎖の加水分解では、前記ポリマーが腐食する。加水分解側鎖の例は、前記基がアミノ結合を介してリン原子に結合した未置換および置換イミダゾールとアミノ酸エステルである（いずれのＲ基もこのように接合したポリホスファゼンポリマーがポリアミノホスファゼンとして知られている）。ポリイミダゾールホスファゼンとしては、ポリホスファゼン骨格の前記「Ｒ」基の一部がイミダゾール環であり、環の窒素原子により骨格中のリンに結合している。他の「Ｒ」基は、メチルフェノキシ基または科学論文Ａｌｌｃｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  １０：８２４（１９７７）に示されている他の基など、加水分解に参加しない有機残基である可能性がある。前記ヒドロゲル物質の合成法とそのようなヒドロゲルを調整する方法は、当該分野で既知である。
【０１３８】
他の成分が前記製剤に含まれてもよく、以下のいずれかに限定される訳ではないが、（１）適当なｐＨと等張性を提供する緩衝液、（２）潤滑油、（３）例えばアルギン酸塩、寒天、植物ゴムを含む、投与部位またはその付近に細胞を保持する粘稠性の物質、（４）例えば、組織またはその物理化学的特徴の形成増殖または修飾、または前記細胞の活性度の支持として、または炎症または拒絶の抑制など、投与部位で望みの効果を生じることができる他の細胞タイプを含む。前記細胞は、適切な創傷を覆うことでカバーされてもよく、細胞に前記部位を残さないようにする。そのような創傷被覆剤は当業者に周知である。
【０１３９】
前記細胞製剤または本発明の組成物に有用に組み込まれうる生理活性因子には、抗アポトーシス薬（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ  ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害薬）、抗炎症薬（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害薬、ＴＧＦ−β阻害薬、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害薬、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリマス、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬、例えば、テポキサリン、トルメチン、スプロフェン）、免疫抑制剤／免疫調節薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニュリン阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、シロリムス、エベロリムス）、抗増殖薬（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３））などの抗体、抗血栓形成薬（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン・プロリン・アルギニン・クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害薬、抗血小板薬）、抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）、および局所麻酔薬を含む。別の例として、ここで参考文献として盛り込まれている米国特許番号第５，８２７，７３５号で述べられているとおり、前記細胞は瘢痕抑制因子と同時に投与されてもよい。
【０１４０】
軟部組織パッチ製剤
事前に形成されたウェルでのＰＰＤＣの培養または共培養は、事前に定められた厚さと容積の軟部組織パッチの製造を可能とする。前記で得られた組織パッチの容積は、前記ウェルの容積と前記ウェル中のＰＰＤＣ数に依存する。最適な事前に決定された容積の組織は、前記パラメーターのいずれかまたは両方を変化させることで、日常的な実験により調整されてもよい。
【０１４１】
前記ウェルの表面と接触する細胞は、表面に接触する細胞とＰＰＤＣとを接着させないようにする分子でコーティングされてもよい。好ましいコーティング剤には、シリコンを基本とした試薬、つまりジクロロジメチルシランまたはポリテトラフルオロエチレンを基本とした試薬、つまりテフロン（登録商標）を含む。シリコンを基本とした試薬、特にジクロロジメチルシランを用いたコーティング物質の処置は、当該分野で周知である。例えば、ここで開示されたことはこの参照により本明細書に組み込まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。前記ウェル表面への細胞の付着を予防する他の生体適合性試薬は、本発明の履行において有用と考えられることが理解される。
【０１４２】
代わりに、前記ウェルは、それ自体が細胞を接着させない、柔軟または鋳造できる生体適合性物質から鋳造されると考えられる。そのような細胞接着を予防する好ましい物質には、これだけに限らないが、アガロース、ガラス、未処理細胞培養プラスチック、ポリテトラフルオロエチレン、つまりテフロンを含む。未処理細胞培養プラスチック、つまり帯電を有する物質で処理されていない、または作られていないプラスチックが市販されており、例えばＦａｌｃｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ニュージャージー州リンカーンパーク）から購入されてもよい。しかし、前記物質は制限することを意図していない。本質的にＰＰＤＣを接合させない、他のいずれかの柔軟であるか、鋳造できる生体適合性物質は、本発明の履行において有用と考えられることは理解されることとする。
【０１４３】
前記ウェルのサイズと形は、修理される前記組織の欠陥のサイズと形により決定されてもよい。前記ウェルは、前記組織パッチと重なる培地を含むために十分深い必要がある。
【０１４４】
本発明に沿って調整される組織パッチは、前記傷害された組織の外科的修復を実施する外科医により、事前に選択されたサイズおよび／または形に「整えられる」か、設定されてもよいことが意図される。当該分野で周知の方法により、大幅に切除する、つまり外科用メス、１組のはさみまたは刃の先端が合致した関節鏡検査装置を使用することで取り除かれてもよい。
【０１４５】
前記事前に形作られたウェルは、無菌状態でアガロース・ゲルのブロックに鋳造されてもよい。アガロースは、急速および容易に事前に形作られたウェルを鋳造するために利用されうる経済的、生体適合性、柔軟で鋳造できる物質である。前述の通り、前記ウェルの次元は、望みの得られた組織プラグのサイズに依存してもよい。
【０１４６】
事前に形作られたウェルは、溶解ＬＴアガロース（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州リッチモンド）の温溶液を、シリンダーを含む組織培養皿に注ぐことで調整され、前記次元を有するシリンダーは前記ウェルが形成される形を映すことができる。前記ウェルのサイズと形は当業者により選択され、修理される前記組織の欠陥の形により決定されてもよい。前記アガロースが前記シリンダーの周囲で冷却、凝固し、前記シリンダーは鉗子により慎重に除去される。前記シリンダーの除去により曝露される前記組織培養皿の表面は、溶融アガロースでカバーされる。これは前記ウェルの底辺を密閉し、前記ウェルの基底部で細胞接着表面を提供する。前記新たに追加された溶融ＬＴアガロースが冷却し、凝固する際、前記で得られた事前に形作られたウェルが培養とＰＰＤＣの分化誘導に適している。ただし、代わりの方法が利用され、本発明の履行において有用な事前に形作られたウェルを調整してもよいことは理解されることとする。
【０１４７】
懸濁液中のＰＰＤＣは、前記事前に形作られたウェルに播種され、培養されてもよい。前記ＰＰＤＣが前記ウェルの培養で軟部組織表現型に分化するように誘導されるか、前記ウェルの播種前に分化するように誘導されてもよい。前記細胞は、１ミリリットル当たり約１×１０５から１×１０９のＰＰＤＣの細胞密度で培地を追加することで希釈されてもよい。
【０１４８】
前記細胞が粘着性パッチを形成すると、前記細胞の粘着性プラグは前記ウェルから除去され、前記組織の欠陥に外科的に移植されてもよい。未分化ＰＰＤＣがｉｎ  ｓｉｔｕで分化し、それによってｉｎ  ｖｉｖｏで組織を形成することは理解されることとする。 
いくつかの実施例では、ＰＰＤＣが利用され、細胞シートを生成する。前記シートはＳｈｉｍｉｚｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４（１３）：２３０９〜２３１６（２００３）で説明されるとおり、多層としてもよい。
【０１４９】
軟部組織の欠陥は、例えばこれだけに限らないが、コンピューター補助断層撮影（ＣＡＴスキャン）、Ｘ線検査、または核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）など、当該分野で既知の方法により同定されてもよい。また軟部組織の欠陥は、関節鏡検査中または観血手術中に容易に視覚的に同定される。前記欠陥の治療は、前記方法およびここで開示された組成物を用い、オルソスコピック処置または観血手術中に達成される可能性がある。
【０１５０】
従って、前記欠陥が同定されると、前記欠陥が（１）事前に決定された部位において、ここで説明された方法により調整された組織パッチを外科移植する、および（２）前記組織パッチを事前に決定された部位に組み込めるようにする段階によって治療されてもよい。
【０１５１】
前記組織パッチは最適には一定のサイズと形を有し、前記パッチが前記欠陥に移植されるようにし、前記移植組織の端が前記欠陥の端と直接接触する。さらに、前記組織パッチは外科手術中に固定されてもよい。これは生物分解性縫合糸を用いた欠陥に前記パッチを外科的に固定する、および／または前記パッチおよび前記欠陥に干渉する前記領域に生物粘着性を適用することで、履行されうる。
【０１５２】
いくつかの例では、前記合成組織のパッチを移植する前に、障害された組織が外科的に切除されうる。その後、合成組織パッチが前記方法により前記欠陥に移植される。
【０１５３】
骨格を用いたＰＰＤＣの移植
本発明またはその共培養の細胞は、三次元骨格に播種され、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植されてもよく、前記播種細胞は前記骨格で増殖し、前記患者の細胞と協力してｉｎ  ｖｉｖｏで置換組織を形成する。
【０１５４】
三次元骨格におけるＰＰＤＣまたはその共培養の増殖は三次元組織を形成し、修正または補助構造としてｉｎ  ｖｉｖｏで利用される可能性がある。例えば、制限しないが、本発明の前記三次元骨格が、前記消化管と尿生殖路などの環状構造、および血管、ヘルニア修復組織、腱と靱帯を形成するのに利用される可能性がある。
【０１５５】
本発明のいくつかの実施例に沿って、ＰＰＤＣまたはその共培養は三次元骨格で播種、増殖される。前記骨格は望みの修正構造の形に設定されうる。この三次元システムで増殖される場合、前記増殖細胞は適切に成熟、分離し、ｉｎ  ｖｉｖｏで自然に見られる対応物に成熟組織類似の成分を形成する。
【０１５６】
本発明の一部の実施例では、患者への移植用基質を提供する。一部の実施例では、前記基質に本発明の分娩後由来細胞集団が播種される。前記ＰＰＤＣは分化誘導されるか、未分化であってもよい。前記ＰＰＤＣ集団は均一であっても、不均一であってもよい。前記基質は、例えば、制限なく、上皮細胞（例えば口腔粘膜、消化管、鼻上皮、気道上皮、膣上皮、角膜上皮の細胞）、骨髄細胞、脂肪細胞、幹細胞、角化細胞、メラニン形成細胞、皮膚線維芽細胞、血管内皮細胞（例えば、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、血管内皮前駆体（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞））、筋芽細胞、筋細胞、間質細胞、その他の軟部組織細胞または前駆細胞など、別の望ましい細胞タイプの細胞を播種してもよい。前記基質は、例えば薬物、抗炎症薬、抗アポトーシス薬、増殖因子を含む１若しくはそれ以上の生物活性因子を含むか、この生物活性因子で事前に処理されてもよい。本発明のいくつかの観点では、前記基質がＰＰＤＣの細胞外基質または細胞溶解物など、小区画からの組織（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ）を有する。いくつかの実施例では、前記基質が生物分解性である。いくつかの実施例では、前記基質が例えばＭＡＴＲＩＧＥＬなどの細胞外膜タンパク質を有する。本発明のいくつかの実施例では、前記基質が天然または合成ポリマーを有する。本発明の基質には、生体分解性か否か、液体か固体かによらず、生体適合性骨格、格子、自己集合性構造などを含む。そのような基質は、細胞を基本とした治療、外科的修復、組織工学、創傷治癒の分野で既知である。好ましくは、前記基質が本発明の前記細胞、細胞外基質、条件培地、細胞溶解物、その組み合わせで事前に処理（例えば、播種、予防接種、接触）される。より好ましくは、前記基質に、前記基質またはその空間に密接に関連して細胞がある。本発明のいくつかの観点では、前記細胞が前記基質に接着する。いくつかの実施例では、前記細胞が前記基質内に含まれるか、前記基質の間質腔を架橋する。最も好ましくはこれらの播種された基質であり、ここでは前記細胞が前記基質と密接に関連し、治療に利用されると前記患者の細胞および／または適切な血管新生の内植を誘導または支持する。前記播種または事前に処理された基質は、移植、注入、外科的結合、他の組織の移植、注入などを含む、当該分野で既知のいずれかの方法で患者の体内に導入されうる。本発明の前記基質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで組織または臓器の前記形および／またはサイズに設定されてもよい。ここで説明されているとおり、本発明の前記骨格は平面または管状であってもよく、またはその一部を有してもよい。本発明の前記骨格は多層にされていてもよい。
【０１５７】
例えば、これだけに限らないが、前記骨格構造が（１）ＰＰＤＣまたはその共培養を支持し、その後分解されない、（２）播種の時点から前記組織の移植が前記宿主組織によってリモデリングされるまでＰＰＤＣまたはその共培養を支持し、（２）前記播種細胞を十分な機械的統合性を有する組織構造に接着、増殖、発達させることができ、それ自体ｉｎ  ｖｉｔｒｏで支持し、その時点で前記骨格が分解されるように前記骨格がデザインされてもよい。骨格デザインの査読は、Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．，１２（１）：１０７〜１２４（２００１）によって提供されている。
【０１５８】
本発明の骨格は、前述の１若しくはそれ以上の増殖因子、細胞、薬物、または他の成分と併用して移植され、軟部組織の形成を刺激するか、血管新生またはその神経支配を刺激するか、そうでない場合は本発明の履行を増強または改善する可能性がある。
【０１５９】
本発明の前記細胞は、サブコンフルエントまたはコンフルエントまで培養容器で自由に増殖される可能性があり、前記培養から取り上げられ、三次元骨格に播種される可能性がある。例えば約１０６〜５×１０７個／ミリリットルの高濃度細胞を用いた前記三次元骨格の播種は、比較的短期間で前記三次元補助を確立する。
【０１６０】
いくつかの実施例では、培養においてｉｎ  ｖｉｖｏで認められる前記細胞の微小環境を再作成することが重要であり、本発明の細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでの移植またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用前に増殖される程度が変化する可能性がある。例えばロープ、チューブ、フィラメントなど、移植に望ましい形を形成する前後に、ＰＰＤＣまたはその共培養が前記骨格に播種されてもよい。前記骨格に前記細胞が播種された後、前記骨格は適切な増殖培地に播種されることが好ましい。前記播種期間中、前記播種細胞が増殖し、前記骨格を覆い、ここで間質腔を架橋する。前記組織が修復または再生されるｉｎ  ｖｉｖｏ細胞密度を反映した適切な程度まで、前記細胞を増殖させるのを必要とされないことが好ましい。
【０１６１】
本発明で利用されてもよい骨格の例には、不織マット、多孔質の発砲体、または自己集合性ペプチドを含む。不織マットは、例えば商品名ＶＩＣＲＹＬ（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州サマビル）で販売されているグリコールおよび乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性コポリマーから成る繊維を使用して形成されてもよい。例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから成り、米国特許番号第６，３５５，６９９号で議論されている通りに、凍結乾燥などのプロセスにより形成されるか、凍結乾燥される発砲体は、考えられる骨格でもある。自己集合性ペプチドなどのヒドロゲル（例えばＲＡＤ１６）が利用されてもよい。これらの物質は組織の増殖を支持する物として利用されることが多い。好ましい実施例によれば、前記骨格はフェルトであり、これは例えばＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーまたは混合物、またはヒアルロン酸など、生体吸収性材料で作られた多繊維の糸から成る可能性がある。前記糸は、折目、切断、梳綿、穿刺から成る標準的な繊維処理技術を用いて作られる。
【０１６２】
別の好ましい実施例では、本発明の前記細胞が複合構造としてもよい発砲体骨格に播種される。さらに、前記身体の特定構造が修復、置換、増殖されるなど、前記三次元骨格は有用な形に作られてもよい。
【０１６３】
細胞接着を向上させるため、前記骨格は本発明の細胞が播種される前に処理されてもよい。例えば、本発明の前記細胞を用いた播種前に、ナイロン基質が０．１モル酢酸で処理され、ポリリシン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲンに播種され、前記ナイロンをコーティングする可能性がある。硫酸を用いてポリスチレンが同時に処理される可能性がある。
【０１６４】
さらに、前記三次元骨格の外表面が修正され、前記骨格をコーティングする血漿または１若しくはそれ以上のタンパク質（例えばコラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞基質、および／またはこれだけに限らないが、その他の中でもゼラチン、アルギン酸、寒天、アガロース、植物ガムなどの他の物質の追加などにより、細胞接着または細胞増殖と組織の分化を改善してもよい。
【０１６５】
いくつかの実施例では、前記骨格が非血管新生性を与える物質から成り、これで治療される。これらの治療と物質は、内皮増殖、移動、細胞外基質の堆積を促し、維持してもよい。これらの物質と治療の例は、これだけに限らないが、ラミニンとＩＶ型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、ｅＰＴＦＥなどの合成物質、ＰＵＲＳＰＡＮ（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バークリー）などのセグメント化ポリウレタンウレアシリコンなどの天然物質を含む。これらの物質がさらに投与され、前記骨格の非血栓形成性を与えることができる。そのような治療は、ヘパリンなどの抗血栓薬、血漿コーティングなどの前記物質の表面荷電を変化させる治療を含む。
【０１６６】
例えば前記骨格に沈着した様々なタイプのコラーゲンの特性の違いが、組織特異的または他の細胞の増殖に影響する可能性があり、これが前記骨格に後で播種されてもよく、またはｉｎ  ｖｉｖｏで前記構造に増殖されてもよい。例えば、三次元の皮膚培養系では、コラーゲンＩ型およびＩＩＩ型が好ましくは前記最初の基質に沈着されることが好ましい。代わりに、前記骨格に細胞混合物が播種される可能性があり、前記適切な望みのコラーゲンタイプを合成する。従って、培養される組織によって、前記骨格に播種されるか、その上に播種された前記細胞によって産生された、前記適切なコラーゲンタイプが選択されてもよい。例えば、前記骨格に存在するコラーゲン繊維と弾性繊維の相対量は、前記初期接種菌のエラスチン産生細胞に対するコラーゲン産生細胞の比を制御することで調整されうる。例えば、前記動脈の内壁はエラスチンが豊富であるため、動脈骨格がエラスチンを分泌する平滑筋細胞の共培養を含む必要がある。
【０１６７】
本発明の前記播種または接種された三次元骨格は、様々な応用に利用される可能性がある。これには、これだけに限らないが、ｉｎ  ｖｉｖｏで前記基質から得られる前記培養細胞またはその培養基質の移植または埋め込みを含む。前記三次元骨格は前記発明に沿って使用され、既存の組織を置換または増殖し、新規または変化した組織を導入し、義肢を修正し、または生物学的組織または構造を結合してもよい。例えば、制限なく、本発明の特定の実施例が、例えば前記消化管、尿生殖路、血管、筋肉、靱帯、腱、皮膚、骨盤底、筋膜、ヘルニアなどを修復または再生する平面構造および管状三次元組織の移植を含むが、これだけに限らない。
【０１６８】
１．平面構造
ＰＰＤＣは平面骨格に播種される可能性がある。前記骨格は好ましくは移植前に培地に播種される。２若しくはそれ以上の平面骨格が別に上に置かれ、一緒に縫合されて多層骨格を形成する可能性がある。
【０１６９】
２．管状構造
例えば、これだけに限らないが、前記三次元骨格が利用され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単一および多層の管状組織を構築し、これはｉｎ  ｖｉｖｏで障害を受けたか、疾患のある管状組織の置換とすることができる。
【０１７０】
Ａ．単層管
以下の小区分は、播種された骨格を利用し、前記身体に移植されうるチューブを調整する方法を説明している。
【０１７１】
Ａ．１  平面骨格
前記幅が前記管状臓器の内周にほぼ等しく、最終的に管状組織に挿入される細長い一片（例えば、長方形）に骨格が切断されうる。液体培地に浮遊させ、懸濁されることで、前記細胞が前記骨格に播種され、インキュベートされうる。適切なコンフルエントの段階で、長い方の端をつなぐことで、前記骨格がチューブに囲まれてもよい。前記縫い目が、適切な直径で、適切な物質の繊維により２つの端を一緒に縫合することで閉じられてもよい。
【０１７２】
Ａ．２  管状骨格の縫合用物質
本発明に沿って、骨格が管として形成され、ＰＰＤＣで播種され、培養チャンバーで培地に懸濁されうる。細胞の前記管腔を閉塞させないようにするため、前記管状骨格の開口端の１つがノズルに添付されうる。液体培地が前記インキュベーションチャンバーに接続された供給チャンバーから、このノズルを介して推し進められ、前記管状骨格の内部から電流を作ることができる。前記他の開口端は流出開口部に添付され、これが回収チャンバーにつながり、前記培地が前記供給チャンバーから再循環される可能性がある。インキュベーションが終わると、前記管が前記ノズルと流出開口部から分離されうる。この方法はＢａｌｌｅｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．、国際出願番号第ＷＯ  ９４／２５５８４号および米国出願番号第０８／４３０，７６８号で説明され、そのいずれもその全体がこの参照によってここに盛り込まれている。
【０１７３】
Ｂ．多層管
一般に、以下の方法のいずれかを用いて本発明により、２つの三次元骨格が管に組み合わされてもよい。
【０１７４】
Ｂ．１  多層平面骨格
２若しくはそれ以上の平面骨格が別に上に置かれ、一緒に縫合されうる。次にこの２層シートが囲まれ、以下に示すとおり、一緒に接合され、縫合されうる。
【０１７５】
Ｂ．２  管状骨格周囲に巻かれた平面骨格
前記内層とされる１つの管状骨格がＰＰＤＣで播種され、インキュベートされうる。第２の骨格は、前記管状骨格の外周よりもわずかに大きな幅で、平面状の細長い一片として増殖されうる。適切な増殖が得られた後、前記平面骨格が前記管状骨格の外周に巻かれ、次に前記平面骨格の２つの端の継ぎ目を閉じ、好ましくは前記内管に前記平面骨格を固定する。
【０１７６】
Ｂ．３  多層管状骨格
わずかに異なる直径を持つ、２若しくはそれ以上の管状網が別に増殖されうる。前記より小さな直径を持つ骨格がより大きな直径の骨格に挿入され、固定されうる。
【０１７７】
これらの方法それぞれについて、前記二層管に前記方法を再適用することで、より多くの層が追加されうる。前記骨格は前記ＰＰＤＣのいずれかの増殖段階で組み合わされ、望ましい場合は、前記組み合わされた骨格のインキュベーションが継続しうる。
【０１７８】
Ｃ．前記管状骨格の内腔面の組成物
前記管状作成物の内腔面は、前記管状骨格の非血管新生性の内腔表面を与える物質から成り、またはそれにより治療されうる。これらの治療と物質は、内皮増殖、移動、細胞外基質の堆積を促し、維持してもよい。これらの物質と治療の例は、これだけに限らないが、ラミニンとＩＶ型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、ｅＰＴＦＥなどの合成物質、ＰＵＲＳＰＡＮ（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バークリー）などのセグメント化ポリウレタンウレアシリコンなどの天然物質を含む。これらの物質がさらに投与され、前記管状骨格の非血栓形成性の内腔表面を与えることができる。そのような治療は、ヘパリンなどの抗血栓薬、血漿コーティングなどの前記物質の表面荷電を変化させる治療を含む。
【０１７９】
Ｄ．組織工学の多次元系の制御適用
最新式バイオリアクターは、機能的骨格組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ工学の複合要件を満たすために重要である。例えば、強化された環境と流体制御と同時に、三次元基質に対する複合同時機械ひずみを適用する能力を持ったバイオリアクター系が、Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．Ｅｎｇ．，１２４（６）：７４２〜７４９（２００２）、米国特許公開番号第２００２／００６２１５１号により提供されている。例えばこれだけに限らないが、バイオリアクターシステムなどが組織工学的腱または靱帯、例えば前十字靱帯の開発で利用されてもよい。
【０１８０】
本発明によれば、前記三次元培養を形作り、刺激されうる前記天然臓器または組織の構造を確保ため、いずれの適切な方法も利用されうる。例えば、本発明によって調整された骨格は、前記障害組織を外科的に調整するため、事前に選択されたサイズに「整えられ」てもよい。当該分野で周知の方法により、切除は鋭い切除器具、つまり外科用メス、１組のはさみまたは刃の先端が合致した関節鏡検査装置を使用することで成し遂げられてもよい。
【０１８１】
前記三次元骨格が形作られ、これだけに限らないが、骨盤底、膀胱、筋膜、皮膚、筋肉、腱、靱帯、または脈管構造（例えば、動脈、静脈）を含む軟部組織など、自然の臓器または組織の形を刺激する高次構造を確保することができる。これらの構成はｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的構造を刺激し、容易に移植され、ヘルニアを修復するか、ヘルニア、腱、靱帯、皮膚、筋肉、血管、前記消化管成分、尿生殖路（例えば尿道、尿管）を含む障害を受けたか、疾患のある組織を置換してもよい。
【０１８２】
いくつかの実施例では、幹細胞および／または軟部組織表現型の細胞と組み合わせ（例えば共培養または細胞の別の層として）、ＰＰＤＣが前記骨格に播種される。ＰＰＤＣで同時に播種された前記細胞は、刺激される組織に依存する。例えば、ＰＰＤＣは、上皮細胞（例えば口腔粘膜、消化管、鼻上皮、気道上皮、膣上皮、角膜上皮の細胞）、骨髄細胞、脂肪細胞、幹細胞、角化細胞、血管内皮細胞（例えば、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍動脈内皮細胞、臍静脈内皮細胞、血管内皮前駆体（例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞））、筋芽細胞、筋細胞、間質細胞、その他の軟部組織細胞または前駆細胞を持つ前記骨格に播種されてもよい。
【０１８３】
本発明の前記三次元骨格が皮膚移植で利用されてもよい。好ましくは、前記骨格が約０．５〜３ミリメーターの厚さで、平面シートの形である。前記骨格には、好ましくはＰＰＤＣが播種される。前記ＰＰＤＣには、幹細胞、上皮細胞、皮膚線維芽細胞、メラニン形成細胞、角化細胞の少なくとも１つが同時に播種されてもよい。いくつかの実施例では、角化細胞が前記ＰＰＤＣを播種した骨格の上に層を形成する。前記ＰＰＤＣを播種した骨格は、好ましくは少なくとも１つのコラーゲン、エラスチン、細胞間接着分子、神経細胞接着分子、ラミニン、ヘパリン結合増殖因子、フィブロネクチン、プロテオグリカン、テネイシン、Ｅ−ｃａｈｅｄｒｉｎ、フィブリリンを有する。
【０１８４】
別の例としては、前記三次元骨格が使用され、筋組織を生成してもよい。前記骨格には、好ましくはＰＰＤＣが播種される。前記ＰＰＤＣには、幹細胞、筋細胞、筋芽細胞の少なくとも１つが同時に播種されてもよい。
【０１８５】
前記三次元骨格は、前記細胞増殖とその組織産生が増強するか、前記移植の拒絶リスクが低下するように修飾されてもよい。従って、これだけに限らないが、抗アポトーシス薬、抗炎症性、血管新生因子、免疫抑制剤または増殖因子を含む、１若しくはそれ以上の生理活性化合物が前記骨格に追加されてもよい。
【０１８６】
ＰＰＤＣに由来する細胞外基質または細胞溶解物の治療上の使用
本発明の前記細胞を移植する、またはそこから産生される生組織の代わりとして、組織修復、置換、または増殖を必要とする被験者に、前記細胞外基質（ＥＣＭ）またはこれらの細胞によって産生される細胞溶解物など、ＰＰＤＣの成分または産生物の投与から利益が生じてもよい。
【０１８７】
いくつかの実施例では、例えばここで説明された三次元骨格系を用いるなど、本発明の細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された後、ＥＣＭの望みの量が前記骨格に固定された。前記骨格にＥＣＭが固定されると、前記細胞が除去されてもよい。前記ＥＣＭが例えば注入製剤として、さらに使用するために処理されてもよい。
【０１８８】
いくつかの実施例では、前記細胞が死滅し、細胞片（例えば細胞膜）が前記骨格から除去される。このプロセスは多数の異なる方法で実行されてもよい。例えば、前記生組織が凍結保存剤なしで液体窒素中に急速冷凍されうるか、前記組織が滅菌蒸留水中に浸され、浸透圧に反応して前記細胞が破裂するようにする。前記細胞が死滅すると、前記細胞膜が分裂し、細胞片がＥＤＴＡ、ＣＨＡＰＳ、または双性イオン洗剤などの中性洗剤リンスで処理することで除去される。中性洗剤リンスを用いる利点は、膜に結合したタンパク質を可溶化し、そしてしばしば高い抗原性にある。
【０１８９】
代わりに、前記組織が細胞膜を破壊する洗剤で酵素的に消化および／または抽出されうる。そのような酵素の例には、これだけに限らないが、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ（例えばデオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ）を含む。洗剤の例には、例えばアルキルアリルポリエーテルアルコール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）、オクチルフェノキシポリエトキシ−エタノール（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ペンシルバニア州）、ＢＲＩＪ−３５、ポリエトキシエタノールラウリルエーテル（Ａｔｌａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、カリフォルニア州サンディエゴ）、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ  ２０（登録商標））、ポリエトキシエタノールソルビタンモノラウレート（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）、ポリエチレンラウリルエーテル（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）、枝分かれしたか、枝分かれしていない鎖に７〜２２炭素原子を含む、例えばドデシル硫酸ナトリウム、硫酸高級脂肪族アルコール、スルホン化アルカンおよびスルホン化アルキルアレンなどのイオン洗剤など、非イオン洗剤を含む。
【０１９０】
前述の通り、ＥＣＭを有する骨格が治療に用いられてもよい。代わりに、ＥＣＭが前記骨格から収集されうる。例えば、前記骨格が生物分解性または非生物分解性であるか否かにより、様々な方法で前記ＥＣＭの回収が達成されうる。例えば、前記骨格が非生物分解性である場合、前記ＥＣＭが前記骨格に超音波処理、高圧水ジェット、機械的スクレーピング、または洗剤または酵素を用いた中性処理、または前記いずれかの組み合わせを適用することで除去されうる。
【０１９１】
前記骨格が生物分解性である場合、例えば、前記骨格を溶液中で分解または溶解させることにより、前記ＥＣＭが回収されうる。代わりに、前記生物分解性の骨格が前記ＥＣＭとともにそれ自体が注入される可能性がある物質からなる場合、前記骨格と前記ＥＣＭが全体としてその後の注入に処理される可能性がある。代わりに、非生物分解性骨格からＥＣＭを回収するため、前記方法のいずれかにより、前記ＥＣＭが前記生物分解性骨格から除去される可能性がある。すべての回収プロセスは好ましくは、本発明の前記細胞により産生された前記ＥＣＭまたは細胞溶解物を変性させないように設計されている。
【０１９２】
前記ＥＣＭが回収された後、これはさらに加工されてもよい。前記ＥＣＭがホモジナイズされ、例えば超音波処理など、当該分野で周知の技術を用いて細かい粒子にホモジナイズされてもよく、外科的針により貫通する可能性がある。ＥＣＭ成分は望ましい場合、ガンマ照射により架橋されうる。好ましくは、前記ＥＣＭが０．２５〜２メガラドの間で照射され、前記ＥＣＭを殺菌、架橋することができる。グルタルアルデヒドなどの毒性試薬を用いた化学的架橋は可能であるが、一般には好ましくない。
【０１９３】
前記分娩後由来細胞の集団から調整した細胞溶解物にも、多くの効用がある。１つの実施例では、例えばその後細胞分画を分離せずに細胞を分離することで、細胞溶解物全体が調整される。別の実施例では、細胞膜分画が、例えば遠心分離、ろ過、または同様の方法で当該分野に既知のルーティンな方法により、前記細胞の可溶性分画から分離される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの溶解性細胞分画の使用により、拒絶または有害反応を誘導せずに、前記有益な細胞内環境を患者で利用することができる。細胞を溶解する方法は当該分野で周知であり、機械的分裂、酵素的分裂、または化学的分裂、またはその組み合わせの様々な方法を含む。そのような細胞溶解物はその増殖培地で直接細胞から調整されてもよく、そのため分泌された増殖因子などを含むまたは、例えばＰＢＳなどの溶液中で培地を洗い流した細胞から調整されてもよい。洗い流された細胞は、好ましい場合は最初の個体群密度よりも高い濃度で再懸濁されてもよい。分娩後由来細胞の集団から調整される細胞溶解物はそのまま使用してもよく、さらに例えば限外ろ過または凍結乾燥により濃縮、またはさらに乾燥、部分的に精製、当該分野で知られた薬学的に許容可能な担体または希釈液と混合、または例えば薬学的組成物として有用なタンパク質組成物など、生物学的製剤などの他の化合物と組み合わせてもよい。細胞溶解物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、単独または例えば細胞と使用されてもよい。前記細胞溶解物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで導入された場合、治療部位で局所的に、または遠隔で導入され、例えば患者に必要な細胞増殖因子を提供してもよい。
【０１９４】
タンパク質の量および／または比は、本発明の前記細胞から産生される前記ＥＣＭまたは細胞溶解物と１若しくはそれ以上の他の細胞タイプのＥＣＭまたは細胞溶解物とを混合することで調節されうる。さらに、タンパク質、増殖因子、および／または薬物などの生物学的に活性な物質は、前記ＥＣＭまたは細胞溶解物製剤に組み込まれてもよい。典型的な生物活性物質は抗炎症剤および増殖因子を含み、治癒と組織修復を促す。細胞は本発明の前記ＥＣＭまたは細胞溶解物と同時に投与されてもよい。ＥＣＭまたはＰＰＤＣの細胞溶解物は、ＰＰＤＣで前記に示したとおり、投与用に構築されてもよい。
【０１９５】
注入用ＥＣＭまたは細胞溶解物を調整する前記に示されたプロセスは、好ましくは無菌条件で無菌物質を用いて実施される。薬学的に許容可能な担体中の前記処理されたＥＣＭまたは細胞溶解物は、皮内または皮下に注入され、組織を増殖するか、奇形、後天性欠陥、または美容的欠陥を修復または治療することができる。
【０１９６】
そのような状疾患の例は、片側顔面小人症、頬骨および頬骨形成不全、片側乳頭形成不全、漏斗胸、胸筋形成不全（ポーランド奇形）、（咽頭後方移植片としての）口蓋裂修復または粘膜下口蓋裂に続発した口蓋帆咽頭機能不全などの先天性奇形、瘢痕、皮下萎縮（例えば、円板状紅斑性狼瘡に続発）、角化性病変、前記顔面の座瘡孔、皮下萎縮による線状強皮症、鞍鼻変形、ロンベルク疾患、片側声帯麻痺などの後天性欠陥（外傷後、手術後、感染後）、眉間皺線、深い鼻唇のしわ、口周囲の地図状のしわ、こけたほお、乳頭形成不全などの美容欠陥、ヘルニア、腱または靱帯の裂傷または破裂、重度の熱傷、皮膚潰瘍（例えば褥痩性潰瘍（床擦れ）、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍）、皮膚癌切除に伴うものなどの外科創傷、末梢動脈疾患、腹部大動脈瘤、頸動脈疾患、静脈疾患などの血管疾患、筋疾患（例えば先天性ミオパシー、重症筋無力症、炎症性、神経性、筋原性筋疾患、またデュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、肢帯筋異栄養症、顔面・肩甲・上腕筋ジストロフィー、先天型筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィー）、腱および靱帯などの結合組織の置換と修復である。
【０１９７】
薬学的に許容可能な担体中の処理されたＥＣＭは、そのような組織を増殖するため、身体の括約筋を同定する組織など、内部組織に注入される可能性がある。
【０１９８】
薬物効果または毒性のＩｎ  Ｖｉｔｒｏスクリーニングに対するＰＰＤＣの使用
本発明の細胞と組織はｉｎ  ｖｉｔｒｏで利用され、薬学的組成物の効果と細胞毒性、増殖／制御因子、抗炎症薬について、広範な化合物をスクリーニングしてもよい。このため、本発明の細胞、または前記組織培養はｉｎ  ｖｉｔｒｏで管理され、検査すべき化合物に曝露される。細胞毒性化合物の活性は、培養で細胞を障害または死滅させる能力により測定されうる。これは重要な染色法により容易に評価されうる。増殖／制御因子の効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生細胞数を分析することにより、例えば細胞総量と異なる細胞数により評価されうる。これは、タイプ特異的な細胞抗原を定義する抗体を利用した免疫細胞化学的方法を利用するなど、標準的な細胞学的および／または組織学的方法を用いて達成されてもよい。懸濁培養または前述の三次元系における、本発明の細胞に対する様々な薬物の効果が取り上げられてもよい。
【０１９９】
本発明の細胞と組織は、軟部組織状態の研究にモデル系として利用されうる。
【０２００】
また、本発明の細胞と組織はサイトカイン、増殖因子、炎症伝達物質、例えばＩＬ−１、ＴＮＦ、プロスタグランジンなどの作用機序を研究するために用いられてもよい。さらに、特定の患者で最も有効なものとして、細胞障害性および／または薬学的組成物がスクリーニングされうる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで有効であることの証明となる薬物は、患者を治療するために用いることができる。
【０２０１】
生体分子を産生するＰＰＤＣの使用
さらなる実施例では、本発明の細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、高収率で生物学的製剤を産生することができる。例えば、そのような細胞は、特定の対象生物学的製剤（例えば増殖因子、制御因子、またはペプチドホルモン）を自然に産生するか、または生物学的製剤を産生するため遺伝子操作され、例えば上述の三次元培養系を用いてクローン技術により増殖することができる。前記細胞が前記栄養培地に生物学的製剤を分泌する場合、前記製剤が前記使用済みまたは条件培地から、異なるタンパク質沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、電気泳動、高性能液体クロマトグラフィーなどの標準的な分離法を利用し、容易に単離されうる。「バイオリアクター」は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元培養など、栄養補給を行うための流出法を活用するために利用されうる。
【０２０２】
基本的に、前述の通り、新鮮培地が前記三次元培養を通過すると、前記生物学的製剤が前記培養液から洗い流され、次に前記流出物から単離されてもよい。
【０２０３】
代わりに、対象の生物学的製剤が前記細胞内に残り、そのため、その回収では前記細胞が溶解されることが必要となることがある。１若しくはそれ以上の前記方法のいずれかを用い、前記生物学的製剤が次に精製されてもよい。
【０２０４】
キット
前記ＰＰＤＣとその成分および製剤は、例えば培養または移植用キットの一部として好都合に利用されうる。従って、本発明は前記ＰＰＤＣと、基質（例えば骨格）、水和剤（例えば、生理的に適合する食塩水、調整細胞培地）、細胞培養基質（例えば、培養皿、シャーレ、バイアルなど）、細胞培地（液体または粉末形）、抗生物質、ホルモンなどの追加成分を含むキットを提供する。前記キットはそのような成分のいずれかを含むが、好ましくはその意図した使用に必要なすべての成分を含む。望ましい場合は、前記キットが（典型的には凍結保存された）細胞を含む可能性があり、ここで述べられているとおり、前記格子に播種される可能性がある。
【０２０５】
別の観点では、本発明が、前記増殖、再生、修復を行う様々な方法で、ＰＰＤＣ、ＰＰＤＣ個体群、成分、ＰＰＤＣ製剤を利用したキットを提供する。いくつかの実施例では、前記キットが少なくともＰＰＤＣおよび薬学的に許容可能な担体（液体、半固体、または固体）を含む１若しくはそれ以上の細胞集団を含んでもよい。前記キットは、状況に応じて、例えば注入により前記細胞を投与する方法を含んでもよい。前記キットはさらに前記細胞の使用説明書を含んでもよい。軍事行為に使用するような、医療現場で使用するために準備されたキットは、組織骨格、外科縫合などの処置全体の供給品を含んでもよく、前記細胞が急性障害の治療と連動して使用される。ここで説明されるとおり、アッセイとｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に用いるキットには、１若しくはそれ以上の（１）ＰＰＤＣまたはＰＰＤＣの成分または製剤、（２）前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を実行するための試薬、（３）適宜、他の細胞または細胞製剤、（４）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を行うための取扱説明書を含んでもよい。
【０２０６】
凍結保存とＰＰＤＣの貯蔵
本発明のＰＤＣは凍結保存され、「細胞バンク」に維持または保存されてもよい。本発明の細胞の凍結保存は、既知の方法に沿って実行されうる。例えばこれだけに限らないが、５〜１０％のグリセロールがある場合とない場合で、例えば約０．５〜１０×１０６個／ミリリットルの密度で、例えばさらに０〜９５％のＦＢＳ、０〜１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を有する培地など、「凍結培地」で細胞が懸濁されてもよい。前記凍結保存培地は、これだけに限らないがメチルセルロースを含む凍結保存剤を有してもよい。前記細胞は、次に制御された比率の冷凍庫に密閉および移動された、ガラスまたはプラスチックアンプルに分配される。最適な冷凍率は経験的に決定されてもよい。例えばプログラム可能な比率の冷凍庫は、毎分−１〜−１０℃の温度で変化させることができる。前記好ましい凍結保存温度は約−８０℃〜約−１８０℃であり、さらに好ましくは約−９０℃〜約−１６０℃、最も好ましくは約−１２５〜約−１４０℃である。凍結保存された細胞は、使用のために解凍する前に、好ましくは液体窒素に移動される。いくつかの実施例では、例えばアンプルが約−９０℃に達した後、液体窒素の保存域に移動される。凍結保存された細胞は数年間保存されうる。
【０２０７】
本発明の凍結保存された細胞は細胞バンクを構成し、その一部が解凍することで「回収され」、次に必要に応じて使用されうる。例えば、液体窒素から３７℃の水浴にアンプルを移動することで、解凍は一般に急速に実行される必要がある。前記アンプルの解凍内容物は、１０％ＦＢＳで調整したＤＭＥＭなど、適切な培地を含む培養容器に、滅菌条件下で直ちに移動される必要がある。
【０２０８】
さらに別の観点では、本発明が、本発明の組織、細胞、細胞成分、細胞集団のバンク業務も提供する。前述の通り、前記細胞は容易に凍結保存される。従って、本発明はバンクで前記細胞を凍結保存する方法を提供し、前記細胞は凍結保存され、前記細胞の免疫学的、生化学的、遺伝的性質に基づき、前記細胞の完全な特徴と関連している。そのように凍結された細胞は、前記処置の要件、前記患者の必要性に応じて、自己、同系、または同種治療に使用されうる。好ましくは、各凍結保存サンプルの情報がコンピューターに保存され、これは前記外科医、処置、患者の要件をもとに検索可能であり、前記細胞または集団の特徴をもとに適切に整合される。好ましくは、本発明の細胞が望みの細胞量に増殖され、基質または支持の有無によらず、治療用細胞の組成物が個別に、または共培養として調整される。いくつかの応用では、調整されたばかりの細胞を使用することが好ましい場合もあるが、それ以外では、前記細胞を凍結し、前記情報をコンピューターに入力することで凍結保存、貯蔵され、前記サンプルと前記コンピューター入力情報を関連付けることができる。免疫学的目的で、そのような細胞のレシピエントと供給源またはドナーを整合させる必要がある場合でも、例えば、前記バンクシステムが、前記治療の必要性に対して前記貯蔵細胞の望みの生化学的または遺伝的性質を容易に整合させる。貯蔵サンプルの望みの特徴を整合させることで、前記サンプルが検索され、治療用に用意される。ここで説明されるとおりに調整された細胞溶解物または成分は、本発明に沿って保存され（例えば凍結保存、凍結乾燥）、貯蔵されうる。
【０２０９】
以下の例では、本発明の実施例のいくつかの観点について、詳細を説明している。これらの例は、制限なく、ここで説明される本発明の観点をさらに説明するために提供される。  
【実施例１】
【０２１０】
分娩後組織からの細胞誘導
本研究の目的は、胎盤および臍帯組織の細胞集団に由来するものであった。満期または早期妊娠いずれかの出産で、分娩後臍帯および胎盤が入手された。細胞は、臍帯および胎盤組織の５種類のドナーから採取された。１）異なる表現型の細胞に分化する能力、または２）他の細胞および組織に対して有用な、重大な栄養因子を提供する能力がある細胞を得る能力について、様々な細胞単離法が検討された。
【０２１１】
方法と材料
臍帯細胞の誘導：臍帯は国立疾病研究互助組織（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ、ＮＤＲＩ、ペンシルバニア州フィラデルフィア）から入手された。前記組織は正常出産後に入手された。前記細胞単離プロトコールは、流出フードで無菌的に実行された。血液と壊死組織片を除去するため、前記臍帯が抗真菌剤および抗生物質（１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド））存在下、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄された。５０ミリリットルの培地（ＤＭＥＭ低グルコースまたはＤＭＥＭ高グルコース、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下、前記組織が細いパルプに切断されるまで、それから前記組織は１５０ｃｍ２の組織培養皿で機械的に分離された。前記細かく切断された組織は、５０ミリリットルのチューブ（１本当たり約５グラムの組織）に移動された。前記組織は、次に抗真菌剤と抗生物質（１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））および消化酵素をそれぞれ含むＤＭＥＭ低グルコース培地またはＤＭＥＭ高グルコース培地で、消化された。いくつかの実験では、コラゲナーゼとディスパーゼの酵素混合物が使用された（「Ｃ：Ｄ」、ＤＭＥＭ低グルコース培地中、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５００ユニット／ミリリットル、ディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ユニット／ミリリットル）。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）が使用された（ＤＭＥＭ低グルコース中コラゲナーゼ５００ユニット／ミリリットル、ディスパーゼ５０ユニット／ミリリットル、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５ユニット／ミリリットル）。前記組織、培地、消化酵素を含むコニカルチューブが、３７℃、環状シェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎ、ニューヨーク州ブルックリン）で、２２５ｒｐｍ、２時間インキュベートされた。
【０２１２】
消化後、前記組織が１５０ｘｇで５分間遠心分離され、前記上清が吸引された。前記ペレットは２０ミリリットルの増殖培地（ＤＭＥＭ低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、規定化ウシ血清、ロット番号ＡＮＤ１８４７５、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で再懸濁された。前記細胞懸濁液は、７０マイクロメーターのナイロン製細胞ろ過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でろ過された。増殖培地を有するさらに５ミリリットルのリンスが、前記ろ過器を通過された。前記細胞懸濁液は次に４０マイクロメーターのナイロン製細胞ろ過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通過させられ、さらに５ミリリットルの増殖培地ですすがれた。
【０２１３】
前記ろ液は増殖培地に再懸濁され（総量５０ミリリットル）、１５０ｘｇで５分間遠心分離された。前記上清は吸引され、前記細胞は５０ミリリットルの新鮮増殖培地で再懸濁された。このプロセスは２回以上繰り返された。
【０２１４】
前記最終遠心分離の段階で上清が吸引され、前記細胞ペレットが５ミリリットルの新鮮増殖培地中に再懸濁された。生存可能な細胞数はＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ染色により決定された。細胞は標準的な条件下で培養された。
【０２１５】
臍帯細胞から単離された細胞は、増殖培地（ＤＭＥＭ低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％（ｖ／ｖ）の規定化ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン、ロット番号ＡＮＤ１８４７５）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中、ゼラチンでコーティングしたＴ−７５ｃｍ２のフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州コーニング）に、５，０００細胞／ｃｍ２で播種された。約２〜４日後、使用済み培地は前記フラスコから吸引された。細胞はＰＢＳで３回洗浄され、壊死組織片と血液由来細胞を除去した。次に細胞に増殖培地が補充され、コフルエントコンフルエントまで増殖させた（約１０日間、継代０から継代１）。その後の継代では（継代１から２など）、細胞が４〜５日でサブコンフルエントに達した（７５〜８５％コンフルエント）。これらのその後の継代では、細胞が５０００細胞／ｃｍ２で播種された。細胞は、５％二酸化炭素と２０％酸素を用い、３７℃、加湿インキュベーターで増殖された。
【０２１６】
胎盤細胞の単離：胎盤組織がＮＤＲＩ（ペンシルバニア州フィラデルフィア）から入手された。前記組織は妊娠中のもので、通常の外科的出産時に入手された。臍帯細胞の単離で説明されるとおり、胎盤細胞が単離された。
【０２１７】
以下の例は、胎盤組織の母体由来細胞、新生児由来細胞の個別集団の単離に適用される。
【０２１８】
前記細胞単離プロトコールは、流出フードで無菌的に実行された。血液と壊死組織片を除去するため、前記胎盤組織が抗真菌剤および抗生物質（１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）存在下、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄された。次に、前記胎盤組織が上線（新生児側）、中線（混合細胞単離の新生児および母体または絨毛領域）、下線（母体側）の３切片に解剖された。
【０２１９】
前記分離された切片はＰＢＳ中で数回個別に洗浄され、抗生物質／抗真菌剤でさらに血液および壊死組織片を除去した。各切片は、５０ミリリットルのＤＭＥＭ低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）存在下、細かいパルプに１５０ｃｍ２の組織培養皿で機械的に分離された。前記パルプは５０ミリリットルのコニカルチューブに移動された。各チューブには約５グラムの組織を含んでいた。前記組織は、ＰＢＳの抗真菌剤と抗生物質（１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））および消化酵素を含む、ＤＭＥＭ低グルコース培地またはＤＭＥＭ高グルコース培地で、消化された。いくつかの実験では、コラゲナーゼとディスパーゼの酵素混合物（「Ｃ：Ｄ」）が使用され、ＤＭＥＭ低グルコース培地中、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）５００ユニット／ミリリットル、ディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０ユニット／ミリリットルを含む。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）が使用された（ＤＭＥＭ低グルコース中コラゲナーゼ５００ユニット／ミリリットル、ディスパーゼ５０ユニット／ミリリットル、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５ユニット／ミリリットル）。前記組織、培地、消化酵素を含む円錐管が、３７℃、環状シェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎ、ニューヨーク州ブルックリン）で、２２５ｒｐｍ、２時間インキュベートされた。
【０２２０】
消化後、前記組織が１５０ｘｇで５分間遠心分離され、前記で得られた上清が吸引された。前記ペレットは２０ミリリットルの増殖培地（ＤＭＥＭ低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、規定化ウシ血清、ロット番号ＡＮＤ１８４７５、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、抗生物質／抗真菌剤（１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で再懸濁された。前記細胞懸濁液は、次に７０マイクロメーターのナイロン製細胞ろ過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通過させられ、さらに５ミリリットルの増殖培地のリンスで追跡された。前記総細胞懸濁液は、４０マイクロメーターのナイロン製細胞ろ過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通過させられ、次にさらに５ミリリットルの増殖培地で洗い流された。
【０２２１】
前記ろ液は増殖培地に再懸濁され（総量５０ミリリットル）、１５０ｘｇで５分間遠心分離された。前記上清は吸引され、前記細胞は５０ミリリットルの新鮮増殖培地で再懸濁された。このプロセスは２回以上繰り返された。前記最終遠心分離の後で上清が吸引され、前記細胞ペレットが５ミリリットルの新鮮増殖培地中に再懸濁された。トリパンブルー排除試験により細胞数が決定された。次に細胞が標準的な条件下で培養された。
【０２２２】
リベラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、インディアナ州インディアナポリス）による細胞単離：細胞は、リベラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、インディアナ州インディアナポリス）（２．５ミリグラム／ミリリットル、ブレンザイム３、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、インディアナ州インディアナポリス）、ヒアルロニダーゼ（５ユニット／ミリリットル、Ｓｉｇｍａ）を用い、ＤＭＥＭ低グルコース培地で臍帯から単離された。前記組織の消化と前記細胞の単離は、前記Ｃ：ＤまたはＣ：Ｄ：Ｈ酵素の混合物の代わりに、リベラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、インディアナ州インディアナポリス）／ヒアルロニダーゼ混合物を用い、他のプロテアーゼ消化で説明されたとおりであった。リベラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、インディアナ州インディアナポリス）を用いた組織消化では、容易に増殖される分娩後組織から細胞集団を単離した。
【０２２３】
他の酵素の組み合わせを用いた細胞単離：異なる酵素の組み合わせを用い、前記臍帯から細胞を単離する処置が比較された。消化を比較した酵素には、ｉ）コラゲナーゼ、ｉｉ）ディスパーゼ、ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ、ｉｖ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ；Ｄ）、ｖ）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）、ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｄ：Ｈ）、ｖｉｉ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）を含めた。これらの異なる酵素消化条件を利用した細胞単離の差が観察された（表１−１）。
【０２２４】
前記臍帯中の残留血液からの細胞単離：異なるアプローチにより、臍帯から細胞プールを単離する試みがなされた。一例では、臍帯がスライス、増殖培地で洗浄され、血餅とゲル状物質を除去した。血液、ゲル状物質、増殖培地の混合物が１５０ｘｇで回収され、遠心分離された。前記ペレットが増殖培地中に再懸濁され、ゼラチンコーティングフラスコに播種された。これらの実験から、容易に増殖される細胞集団が単離された。
【０２２５】
臍帯血からの細胞単離：ＮＤＲＩから得られた臍帯血サンプルからも、細胞が単離された。ここで用いた単離プロトコールは、Ｈｏらの国際特許出願第ＷＯ０２／２９９７１号のものであった。臍帯血（ＮＤＲＩ、ペンシルバニア州フィラデルフィア）のサンプル（それぞれ５０ミリリットルと１０．５ミリリットル）が溶解緩衝液（フィルターで殺菌された１５５ミリモル塩化アンモニウム、１０ミリモルの炭酸水素カリウム、ｐＨ  ７．２（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイスの全成分）に緩衝された０．１ミリモルのＥＤＴＡ）と混合された。臍帯と溶解緩衝液が１：２０の比で細胞が溶解される。前記で得られた細胞懸濁液は５秒間ボルテックスされ、周囲温度で２分間インキュベートした。前記溶解液は遠心分離された（２００ｘｇで１０分間）。前記細胞ペレットは、１０％の胎仔ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、４ミリモルのグルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、バージニア州ハーンドン）、１００ミリリットル当たり１００ユニットのペニシリン、１００ミリリットル当たり１００マイクログラムのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）を含む最小限の完全基本培地（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）に再懸濁された。前記再懸濁細胞は遠心分離され（２００ｘｇで１０分間）、前記上清は吸引され、前記細胞ペレットは完全培地で洗浄された。Ｔ７５フラスコ（ニューヨーク州コーニング）、Ｔ７５ラミニンでコーティングしたフラスコ、またはＴ１７５フィブロネクチンでコーティングしたフラスコ（いずれもＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、マサチューセッツ州ベッドフォード）に直接細胞が播種される。
【０２２６】
異なる酵素の組み合わせと増殖条件を用いた分娩後由来細胞の単離。細胞集団が異なる条件で単離され、単離直後に様々な条件で増殖される可能性があるか否かを判断するため、上述の方法に沿ってＣ：Ｄ：Ｈの酵素の組み合わせを用い、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）の有無にかかわらず、細胞が増殖培地で消化された。そのように単離された胎盤由来細胞が、様々な条件で播種された。ペニシリン／ストレプトマイシン存在下で、すべての細胞が増殖された。（表１−２）。
【０２２７】
異なる酵素の組み合わせと増殖条件を用いた分娩後由来細胞の単離。すべての条件で、細胞が継代０と１の間で接着され、増殖される（表１−２）。条件５〜８と１３〜１６の細胞は、接種後４継代まで十分増殖することが示され、この時点で凍結保存された。すべての細胞が貯蔵された。
【０２２８】
結果
異なる酵素の組み合わせを用いた細胞単離：Ｃ：Ｄ：Ｈの組み合わせが単離後の最高細胞収率を提供し、前記他の条件よりも培養でより多くの世代を拡大させた細胞を生成した（表１−１）。増殖可能な細胞集団は、コラゲナーゼまたはヒアルロニダーゼのみを用いて達成されなかった。この結果が検討された前記コラーゲンに特異的であるか否かを決定する試みは行われなかった。
【０２２９】
異なる酵素の組み合わせと増殖条件を用いた分娩後由来細胞の単離：酵素の消化と増殖を検討するすべての条件において、継代０〜１で細胞は十分接着、増殖した（表１−２）。実験条件５〜８と１３〜１６の細胞は、接種後４継代まで十分増殖し、この時点で凍結保存された。すべての細胞が貯蔵された。
【０２３０】
前記臍帯中の残留血液からの細胞単離：有核細胞は急速に接着、増殖した。これらの細胞はフローサイトメトリーで分析され、酵素消化によって得られる細胞と同等であった。
【０２３１】
臍帯血からの細胞単離：前記製剤には赤血球細胞と血小板を含んでいた。前記最初の３週間で付着および分裂した有核細胞はなかった。前記培地は播種後３週間で変化し、付着および増殖した細胞は観察されなかった。
【０２３２】
要約：細胞集団は前記酵素の組み合わせであるコラゲナーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）、ヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を分解する粘液溶解酵素）を用い、臍帯および胎盤組織から最も効率的に単離されうる。Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅであるリベラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、インディアナ州インディアナポリス）が使用されてもよい。本研究では、コラゲナーゼ（４  Ｗｕｎｓｃｈユニット／ｇ）とサーモリシン（１７１４カゼインユニット／ｇ）であるＢｌｅｎｄｚｙｍｅ  ３がヒアルロニダーゼと一緒に使用され、細胞を単離した。これらの細胞はゼラチンでコーティングしたプラスチックに載せた増殖培地で培養した場合、多数の継代を容易に増殖した。
【０２３３】
分娩後由来細胞は前記臍帯で残留血液から単離されたが、臍帯血からは単離されなかった。使用される前記条件下で接着し、増殖する前記組織から洗い流される血餅中の細胞の有無は、前記解剖プロセス中に放出された細胞によると考えられる。
【０２３４】
【表１−１】
2007521009.tif 000002
【０２３５】
【表１−２】
2007521009.tif 000003
【０２３６】
参考文献
１．ＨＯ，Ｔｏｎｙ，Ｗ．；ＫＯＰＥＮ，Ｇｅｎｅ，Ｃ．；ＲＩＧＨＴＥＲ，Ｗｉｌｌｉａｍ，Ｆ．；ＲＵＴＫＯＷＳＫＩ，Ｊ．，Ｌｙｎｎ；ＨＥＲＲＩＮＧ，Ｗ．，Ｊｏｓｅｐｈ；ＲＡＧＡＧＬＩＡ，Ｖａｎｅｓｓａ；ＷＡＧＮＥＲ，Ｊｏｓｅｐｈ  国際公開公報第ＷＯ２００３０２５１４９  Ａ２号  ＣＥＬＬ  ＰＯＬＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＷＨＩＣＨ  ＣＯ−ＥＸＰＲＥＳＳ  ＣＤ４９Ｃ  ＡＮＤ  ＣＤ９０，ＮＥＵＲＯＮＹＸ，ＩＮＣ．米国出願番号第０２２９９７１ＵＳ号、２００２年９月２０日出願、２００３年３月２７日Ａ２公開、２００３年１２月１８日Ａ３公開。  
【実施例２】
【０２３７】
分娩後由来細胞の増殖培地の評価
いくつかの細胞培地で、胎盤由来細胞の増殖を支持する能力が評価された。正常（２０％）および低（５％）酸素状態での胎盤由来細胞の増殖は、前記ＭＴＳ比色測定法を用いて３日後に評価された。
【０２３８】
方法と材料
継代８（Ｐ８）における胎盤由来細胞は、増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｃａｔ．＃ＳＨ３００７０．０３、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））中、９６ウェルのプレート、１×１０３細胞／ウェルで播種された。８時間後、表２−１で説明されたとおりに前記培地が変化され、細胞は３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間、正常（２０％、ｖ／ｖ）または低（５％、ｖ／ｖ）酸素状態でインキュベートされた。ＭＴＳは３時間前記培地（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ一溶液細胞増殖アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）に追加され、前記吸光度は４９０ナノメーターで測定された（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）。
【０２３９】
【表２−１】
2007521009.tif 000004
【０２４０】
結果
前記ＭＴＳアッセイの標準曲線は、吸光度の上昇と細胞数の上昇の間で線形相関を確立した。得られた吸光度の値は推定細胞数に変換され、前記最初の播種に対する変化（％）が計算された。
【０２４１】
血清の効果：正常な酸素状態で培地に血清を追加することで、吸光度に再現性のある用量依存性の上昇が得られ、そのため前記生存可能な細胞数が上昇した。完全なＭＳＣＧＭに血清を追加することで、吸光度が用量依存的に低下した。追加する血清がない前記培地では、細胞がＣｅｌｌｇｒｏ、ハムのＦ１０、ＤＭＥＭ培地で増殖した。
【０２４２】
酸素の効果：低下した酸素は、増殖培地、ハムのＦ１０、ＭＳＣＧＭで細胞の増殖率を上昇させるように思われた。
【０２４３】
増殖が抑制される順では、前記細胞の最適な増殖が得られる前記培地は、増殖培地>ＭＳＣＧＭ>イスコブの＋１０％ＦＢＳ＝ＤＭＥＭ−ＨＧ＋１０％ＦＢＳ＝ハムのＦ１２＋１０％ＦＢＳ＝ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳであった。
【０２４４】
要約：分娩後由来細胞は、正常酸素または低酸素状態で様々な培地で増殖されうる。胎盤由来細胞の短期的増殖は、５％または２０％Ｏ２で０、２、１０％（ｖ／ｖ）血清を持つ１２種類の基本培地で測定された。一般的に胎盤由来細胞は無血清条件で増殖しなかったが、ハムのＦ１０、Ｃｅｌｌｇｒｏのない培地は例外とし、これにもタンパク質がない。これらの無血清培地での増殖は、観察される最高増殖の約２５〜３３％であり、増殖培地に１５％の血清を含む。この研究では、胎盤由来細胞が無血清状態で増殖し、増殖培地は胎盤由来細胞の増殖に利用されうるいくつかの培地の１つである（イスコブ、ＲＰＭＩ、またはハムのＦ１２培地中の１０％の血清）ことを示している。
【０２４５】
最も有望な無血清培地は、ホルモンまたは増殖因子を含まない、ＣＥＬＬＧＲＯ−ＦＲＥＥ、血清およびタンパク質のない培地であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳類細胞の増殖用にデザインされている（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ製品情報）。
【０２４６】
無血清培地用にも開発された完全に無血清培地は、前記胎盤由来細胞の増殖を支持する効果がなかった。完全な無血清培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２の５０／５０混合物に基づき、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈによって開発され、ＲＰＭＩ  １６４０とマコイの５Ａの割合は少なかった。この培地も選択された微量元素と高分子量の炭水化物、過剰のビタミン、非動物性タンパク質源、少量のＢＳＡ（１グラム／リットル）を含む。これにはインスリン、トランスフェリン、コレステロール、または増殖または接着因子を含まない。これは５％ＣＯ２を使用し、重炭酸で緩衝されている。これは当初ハイブリドーマと懸濁液の細胞系用にデザインされ、いくつかの固定した依存細胞系に適していると考えられる。  
【実施例３】
【０２４７】
Ｄ−バリンを含む培地中の分娩後由来細胞の増殖
通常のＬ−バリンイソ型の代わりにＤ−バリンを含む培地が利用され、培地で線維芽細胞様の細胞増殖を選択的に抑制させることが報告された（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ、２０００；Ｓｏｒｄｉｌｌｏら、１９８８）。Ｌ−バリンがない状態でＤ−バリンを含む培地において、分娩後由来細胞の増殖が評価された。
【０２４８】
方法と材料
ゼラチンでコーティングしたＴ７５フラスコ中、５×１０３細胞／ｃｍ２で胎盤由来細胞（Ｐ３）、線維芽細胞（Ｐ９）、臍帯由来細胞（Ｐ５）が播種された（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）。２４時間後、前記培地が除去され、前記細胞がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州コーニング）で洗い流され、残りの培地を除去した。前記培地が修正増殖培地（Ｄ−バリン（特注、Ｇｉｂｃｏ）、１５％（ｖ／ｖ）透析ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いたＤＭＥＭ）で置換された。
【０２４９】
結果
透析された血清を含む増殖培地に播種された細胞と異なり、Ｄ−バリン含有培地に播種される胎盤由来細胞、臍帯由来細胞、線維芽細胞は増殖しなかった。線維芽細胞は形態学的に変化し、サイズが増加し、形が変化した。前記細胞のすべてが死滅し、最終的に４週間後、フラスコ表面から剥離した。
【０２５０】
要約：分娩後由来細胞は、細胞増殖と長期的生存可能性のため、Ｌ−バリンを必要とする。Ｌ−バリンは、分娩後由来細胞で前記増殖培地から除去されることが好ましい。
【０２５１】
参考文献
Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ  Ｊ．（２０００）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  Ｄ−ｖａｌｉｎｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｏｍｅｔｒｉｕｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．２４：１〜７．
Ｓｏｒｄｉｌｌｏ  ＬＭ，Ｏｌｉｖｅｒ  ＳＰ，Ａｋｅｒｓ  ＲＭ．（１９８８）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｄ−ｖａｌｉｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ：  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  Ｒｅｐ．１２：３５５〜６４．  
【実施例４】
【０２５２】
分娩後由来細胞の凍結保存培地
本研究の目的は、分娩後由来細胞の凍結保存用に適切な凍結保存培地を決定することであった。
【０２５３】
方法と材料
ゼラチンでコーティングされたＴ７５フラスコ中、増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｃａｔ．＃ＳＨ３００７０．０３、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））で増殖された分娩後由来細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）で洗浄され、１ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いてトリプシン処理された。前記トリプシン処理は１０ミリリットルの増殖培地を追加することで停止された。前記細胞は１５０ｘｇで遠心分離され、上清が除去され、前記細胞ペレットは１ミリリットルの増殖培地に再懸濁された。一定分量の細胞懸濁液６０マイクロリットルが除去され、６０マイクロリットルのトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）に追加された。血球計数板を用い、前記生存能力のある細胞数が推定された。前記細胞懸濁液がそれぞれ８８×１０４細胞を含む４等分量に分割された。前記細胞懸濁液が各培地１ミリリットル未満に遠心分離、再懸濁され、Ｃｒｙｏｖｉａｌｓ（Ｎａｌｇｅｎｅ）に移された。
【０２５４】
１．）増殖培地＋１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ（Ｈｙｂｒｉｍａｘ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）
２．）細胞凍結培地ｗ／ＤＭＳＯ、ｗ／メチルセルロース、血清なし（Ｃ６２９５、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）
３．）細胞凍結培地、血清なし（Ｃ２６３９、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）
４．）細胞凍結培地、ｗ／グリセロール（Ｃ６０３９、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）
【０２５５】
前記細胞は、前記製造業者の使用説明書に沿って、「Ｍｒ  Ｆｒｏｓｔｙ」冷凍庫を用い、約１℃／分で一晩、−８０℃の冷凍庫で冷却した（Ｎａｌｇｅｎｅ、ニューヨーク州ロチェスター）。細胞のバイアルは、３７℃の水浴で急速解凍する前に、２日間液体窒素に移動した。前記細胞は１０ミリリットルの増殖培地に追加され、遠心分離された後、以前に前記細胞数と生存度が推定された。細胞は５，０００細胞／ｃｍ２でゼラチンコーティングしたフラスコ上に播種され、前記細胞が接着および増殖されるか否かを決定した。
【０２５６】
結果
凍結乾燥される前記細胞の最初の生存可能性は、トリパンブルー染色で１００％と評価された。
【０２５７】
細胞溶解によりＣ６２９５の生存可能性がある細胞数が相応に減少した。４種類すべての溶液で凍結保存された前記生存可能な細胞が、３日以内にコンフルエント単層を接着、分割、生産した。推定増殖率に認識できる差はなかった。
【０２５８】
要約：細胞の凍結保存は、細胞バンクまたは細胞産生物の調整に利用できる１つの手順である。４つの凍結保存混合物では、凍害からヒト胎盤由来細胞を保護する能力が比較された。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）と１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、胎盤由来細胞の凍結保存を比較するために好ましい培地である。  
【実施例５】
【０２５９】
分娩後由来細胞の増殖の特徴
単離された幹細胞の他の集団と、分娩後由来細胞の細胞増殖の可能性が比較された。老化に対する細胞増殖の方法は、Ｈａｙｆｌｉｃｋの限度として引用される（Ｈａｙｆｌｉｃｋ  Ｌ．Ｔｈｅ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ．２２（１）：１〜１２，１９７４；Ｈａｙｆｌｉｃｋ  Ｌ．Ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ  １４（１）：３７〜４５），１９７４）。十分な細胞数に容易に増殖されうるため、分娩後由来細胞は治療用として非常に適している。
【０２６０】
材料と方法
ゼラチンコーティングフラスコ：組織培養プラスチック製フラスコは、室温で２０分間、２０ミリリットルの２％（ｗ／ｖ）ブタゼラチン（Ｔｙｐｅ  Ｂ：  ２２５  Ｂｌｏｏｍ；Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）をＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）に追加することでコーティングされた。前記ゼラチン溶液を除去した後、１０ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）が追加され、次に吸引された。
【０２６１】
他の細胞集団に対する分娩後由来細胞が増殖する能力の比較：増殖の能力を比較するため、ｉ）間葉幹細胞（ＭＳＣ；Ｃａｍｂｒｅｘ、メリーランド州ウォーカーズビル）、ｉｉ）脂肪由来細胞（米国特許番号第６，５５５，３７４  Ｂ１号、米国特許出願番号第ＵＳ２００４／００５８４１２号）、ｉｉｉ）正常皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９  ｌｏｔ  ＃  ９Ｆ０８４４；Ｃａｍｂｒｅｘ、メリーランド州ウォーカーズビル）、ｉｖ）臍帯由来細胞、ｖ）胎盤由来細胞の細胞集団を利用した。ＤＭＥＭ−低グルコース増殖培地（（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）規定化ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン、Ｌｏｔ＃ＡＮＤ１８４７５）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド使用）において、ゼラチンでコーティングしたＴ７５フラスコに５，０００細胞／ｃｍ２で細胞を最初に播種した。その後の継代では、細胞培養が以下のように処理された。トリプシン処理後、生存可能な細胞がトリパンブルー染色後に計数された。細胞懸濁液（５０マイクロリットル）がトリパンブルー（５０マイクロリットル、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）と混合された。血球計数板を用い、生存可能細胞数が推定された。
【０２６２】
計数後、細胞が新鮮増殖培地２５ミリリットルの５，０００細胞／ｃｍ２で、ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコに播種された。標準的な大気下、５％二酸化炭素を用い、３７℃で細胞が増殖された。前記増殖培地は週２回変更された。細胞が約８５％コンフルエントに達したときにこれが継代され、このプロセスは前記細胞が老化に達するまで繰り返された。
【０２６３】
各継代で細胞はトリプシン処理され、計数された。前記生存可能な細胞収率、集団倍加［ｌｎ（最終細胞数／最初の細胞数）／ｌｎ  ２］、倍加時間（培養時間（ｈ）／集団倍加）が計算された。最適な細胞増殖を決定する目的として、継代ごとに前記増殖係数で前記継代の総収率を増加させることで（つまり、増殖係数＝最終細胞数／最初の細胞数）、１継代あたりの総細胞収率が決定された。
【０２６４】
低密度での細胞バンクの増殖能力：継代１０で貯蔵した細胞の増殖の能力も検討された。異なる条件セットが利用された。正常な皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９  ｌｏｔ  ＃  ９Ｆ０８４４；Ｃａｍｂｒｅｘ、メリーランド州ウォーカーズビル）、臍帯由来細胞、胎盤由来細胞が検討された。これらの細胞集団はこれまで継代１０で貯蔵され、５，０００細胞／ｃｍ２で播種され、その時点まで各継代でコフルエントまで増殖された。継代１０で細胞解凍後、前記細胞集団で細胞密度の効果が決定された。細胞は標準的な条件で解凍され、トリパンブルー染色により計数された。次に、増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース増殖培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）と、１５％（ｖ／ｖ）規定化ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン、Ｌｏｔ＃ＡＮＤ１８４７５）、０．００１％２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド使用）において、１，０００細胞／ｃｍ２で解凍細胞が播種された。細胞は標準的な大気条件下、３７℃で増殖された。増殖培地は週２回変更され、細胞は約８５％コンフルエントに達するまで継代された。その後細胞は老化まで、つまりそれ以上増殖できなくなるまで継代された。細胞はトリプシン処理され、各継代で計数された。前記細胞収率、集団倍加［ｌｎ（最終細胞数／最初の細胞数）／ｌｎ  ２］、倍加時間（培養時間（ｈ）／集団倍加）が計算された。継代ごとに前記増殖係数で前記継代の総収率を増加させることで（つまり、増殖係数＝最終細胞数／最初の細胞数）、１継代あたりの総細胞収率が決定された。
【０２６５】
最初の細胞播種から低密度での分娩後由来細胞の増殖：低細胞播種条件で単離直後の分娩後由来細胞の増殖の能力が、別の実験で検討された。ここで説明されるとおり、臍帯と胎盤由来細胞が単離された。細胞は１０００細胞／ｃｍ２で播種され、老化まで前述の通り継代された。細胞は標準的な大気条件下、３７℃で増殖された。増殖培地は週２回変更された。細胞は約８５％コンフルエントに達するまで継代された。各継代で細胞がトリプシン処理され、トリパンブルー染色で計数された。各継代で前記細胞収率、集団倍加［ｌｎ（最終細胞数／最初の細胞数）／ｌｎ  ２］、倍加時間（培養時間（ｈ）／集団倍加）が計算された。継代ごとに前記増殖係数で前記継代の総収率を増加させることで（つまり、増殖係数＝最終細胞数／最初の細胞数）、１継代あたりの総細胞収率が決定された。細胞はゼラチンと非ゼラチンコーティングフラスコで増殖された。
【０２６６】
クローン新生児または母体の胎盤由来細胞の増殖：胎盤組織からの新生児または母体細胞集団の増殖を成功させるため、クローニングが利用されてもよい。前記胎盤から３種類の細胞集団が単離された後（新生児側、母体側、絨毛領域）、これらの細胞集団は標準的な増殖条件下で増殖された後、核型が判定され、前記単離細胞集団の識別情報が明らかとなる。男児を出産した母親の細胞を単離することで、有糸分裂期の幅を供給することで、男性と女性の染色体を区別することが可能である。これらの実験が利用され、上線細胞は新生児表現型が陽性の核型であり、中線細胞は新生児および母体表現型両方が陽性の核型であり、下線細胞は母体細胞が陽性の核型である。
【０２６７】
低酸素培養条件での細胞増殖：低Ｏ２細胞培養条件が特定の条件で細胞増殖を改善する能力があることが証明された（Ｃｓｅｔｅ，Ｍａｒｉｅ；Ｄｏｙｌｅ，Ｊｏｈｎ；Ｗｏｌｄ，Ｂａｒｂａｒａ  Ｊ．；ＭｃＫａｙ，Ｒｏｎ；Ｓｔｕｄｅｒ，Ｌｏｒｅｎｚ．Ｌｏｗ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．ＵＳ２００４０００５７０４）。分娩後由来細胞の細胞増殖は細胞増殖条件を変化させることで改善されるか否かを決定するため、臍帯由来細胞の培養が低酸素条件で増殖された。ゼラチンコーティングフラスコで増殖培地に、５，０００細胞／ｃｍ２で細胞が播種された。細胞は最初に標準的な大気条件下、継代５まで培養され、この時点で細胞は低酸素（５％  Ｏ２）培養条件まで移動された。
【０２６８】
他の増殖条件の評価：他の実験では、分娩後由来細胞が非コーティング、コラーゲンコーティング、フィブロネクチンコーティング、ラミニンコーティング、細胞外膜タンパク質（例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード））コーティングプレートで増殖された。培養はこれらの異なる基質で十分増殖することが証明された。
【０２６９】
結果
分娩後由来細胞の増殖の能力と他の幹細胞および非幹細胞集団の比較：臍帯由来および胎盤由来細胞のいずれも、４０継代以上増殖し、６０日間で細胞収率が>１Ｅ１７細胞となった。対照的に、ＭＳＣと線維芽細胞はそれぞれ２５日未満、６０日未満後に老化した。脂肪由来および大網細胞のいずれもほぼ６０日間増殖したが、これらの細胞の総細胞収率はそれぞれ４．５Ｅ１２および４．２４Ｅ１３となった。したがって、利用される前記実験条件下、５，０００細胞／ｃｍ２で播種された場合、分娩後由来細胞は同じ条件で増殖される他の細胞タイプよりもはるかに増殖した（表５−１）。
【０２７０】
低密度での細胞バンクの増殖能力：臍帯由来細胞、胎盤由来細胞、線維芽細胞は、１０継代以上増殖し、６０日間で細胞収率が>１Ｅ１７細胞となった（表５−２）。これらの条件下で６０日後、前記線維芽細胞は老化したが、前記臍帯由来および胎盤由来細胞集団は８０日後に老化し、それぞれ５０超、４０超の集団倍加が完了した。
【０２７１】
最初の細胞播種から低密度での分娩後由来細胞の増殖：低密度（１，０００細胞／ｃｍ２）でゼラチンコーティングおよびコーティングしていないプレートまたはフラスコに分娩後由来細胞が播種された。これらの条件下でこれらの細胞の増殖能力は良好であった。前記細胞では対数増殖期の増殖が容易に増殖した。分娩後由来細胞がゼラチンコーティングフラスコの増殖培地で、５，０００細胞／ｃｍ２で播種された場合、細胞増殖率は観察されたものと同様であった。コーティングされていないフラスコまたはゼラチンコーティングされたフラスコでの培養では、細胞増殖の能力に差は観察されなかった。しかし、細胞は表現型ではゼラチンコーティングフラスコ上ではるかに小さく見え、コーティングされていないフラスコではさらに大きな細胞表現型が観察された。
【０２７２】
クローン新生児または母体の胎盤由来細胞の増殖：クローン新生児または母体の細胞集団は、それぞれ前記胎盤の新生児側または母体側から単離された胎盤由来細胞から増殖されうる。細胞は連続的に希釈され、次に９６ウェルのゼラチンコーティングされたプレート、１細胞／ウェルで増殖させるため、増殖培地のゼラチンコーティングされたプレートに播種される。この最初のクローニングからは、増殖培地の１２ウェルのゼラチンコーティングされたプレートで膨張性クローンが同定、トリプシン処理、再播種され、次に増殖培地において５，０００細胞／ｃｍ２でＴ２５ゼラチンコーティングフラスコに継代される。細胞のクローン集団が同定されたことを確認するため、サブクローニングが行われる。サブクローニングの実験では、０．５細胞／ウェルで細胞がトリプシン処理、再播種される。十分増殖するサブクローンは、５，０００細胞ｃｍ２／フラスコでゼラチンコーティングされたＴ２５フラスコ中で増殖される。細胞は５，０００細胞ｃｍ２／Ｔ７５フラスコで継代される。細胞増殖を証明するため、クローン増殖の特徴はプロットされてもよい。核型分析では、前記クローンが新生児または母体であることを確認できる。
【０２７３】
低酸素培養条件での細胞増殖：分娩後由来細胞は低酸素条件で十分増殖した。低酸素条件下での培養は、分娩後由来細胞で細胞増殖に有意な効果を有するようには見えない。標準的な大気条件は、十分な細胞数に増殖するため、すでに成功することが証明され、低酸素培地は分娩後由来細胞の増殖に必要ない。
【０２７４】
要約：前記治療を必要とする患者に治療を提供するため、市販の生存可能な細胞製剤は十分な量で産生出来ねばならない。分娩後由来細胞はそのような細胞の培養で増殖されうる。間葉幹細胞を含む他の細胞集団と、培養中の分娩後由来細胞の増殖で比較が行われた。ここで開発されるとおり、分娩後由来細胞系は増殖し、４０回以上倍加することができ、例えば前臨床バンクに十分な細胞数を提供することを前記データは証明した。さらに、これらの分娩後由来細胞集団は、低密度または高密度で十分増殖されうる。この研究では、一方で間葉幹細胞が増殖され、大量の細胞を入手することはできないことが示された。
【０２７５】
標準的な大気中の酸素下、ゼラチンでコーティングするか、コーティングされていないフラスコで、増殖培地中約５，０００細胞／ｃｍ２の密度で単離された分娩後由来細胞を増殖させる現在の細胞増殖条件は、継代１１で多数の細胞を発生させるために十分である。さらに、前記データは、低密度培養条件（例えば１，０００細胞／ｃｍ２）を用いて容易に増殖されうることを示している。低酸素状態での分娩後由来細胞の増殖は細胞増殖を促すが、これらの増殖条件を利用する場合、細胞増殖の能力で改善した増加分はまだ観察されなかった。現在、標準的な大気条件下で分娩後由来細胞の培養が細胞の大量プールを発生させるために好まれている。しかし、前記培養条件を変化させると、分娩後由来細胞の増殖は同様に変化される可能性がある。この戦略は、これらの細胞集団の増殖性および分化能を増強させるために利用されうる。
【０２７６】
利用された前記条件下で、ＭＳＣと脂肪由来細胞の増殖の能力が制限されるが、分娩後由来細胞は容易に多数増殖する。
【０２７７】
参考文献
１）Ｈａｙｆｌｉｃｋ  Ｌ．Ｔｈｅ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｓｏｃ．１９７４  Ｊａｎ；２２（１）：１〜１２
２）Ｈａｙｆｌｉｃｋ  Ｌ．Ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ．１９７４  Ｆｅｂ；１４（１）：３７〜４５
３）米国特許第２００４００５８４１２号
４）米国特許第２００４００４８３７２号
６）Ｃｓｅｔｅ，Ｍａｒｉｅ；（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；Ｄｏｙｌｅ，Ｊｏｈｎ；（Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）；Ｗｏｌｄ，Ｂａｒｂａｒａ  Ｊ．；（Ｓａｎ  Ｍａｒｉｎｏ，ＣＡ）；ＭｃＫａｙ，Ｒｏｎ；（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ｓｔｕｄｅｒ，Ｌｏｒｅｎｚ；（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）．Ｌｏｗ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．米国特許第２００４０００５７０４号
【０２７８】
【表５−１】
2007521009.tif 000005
【０２７９】
【表５−２】
2007521009.tif 000006
【実施例６】
【０２８０】
ＰＰＤＣの核型分析
細胞療法で利用される細胞系は好ましくは均一であり、汚染細胞タイプはない。細胞療法で利用されるヒト細胞は、正常な染色体数（４６）と構造を有する必要がある。均一で非分娩後組織由来の分娩後由来胎盤および臍帯細胞系を同定するため、細胞サンプルの核型が分析された。
【０２８１】
材料と方法
男性新生児の分娩後組織のＰＰＤＣは、増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド））で培養された。男性新生児（Ｘ，Ｙ）の分娩後組織は、新生児由来細胞と母体由来細胞（Ｘ，Ｘ）を区別できるように選択された。細胞はＴ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）で増殖培地に５，０００細胞／平方センチメートルで播種され、約８０％コンフルエントに増殖された。細胞を含むＴ２５フラスコは、増殖培地でくびまで充填された。サンプルは宅配業者によって臨床細胞遺伝学研究室に配達された（研究室から研究室への推定移動時間は１時間）。染色体分析は、ニュージャージー州ニューヨーク、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌのＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  &  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓによって実施された。前記染色体は最も可視化される有糸分裂中期で細胞が分析された。計数された中期の２０個の細胞のうち、５個で正常な均一核型数（２）が分析された。２個の核型が観察された場合、細胞サンプルは均一なものとして特徴付けられた。２個以上の核型が観察された場合、細胞サンプルは不均一なものとして特徴付けられた。不均一な核型数（４）が同定されると、追加中期細胞数が計数、分析された。
【０２８２】
結果
染色体分析に送られたすべての細胞サンプルは、細胞遺伝学研究室のスタッフにより正常な形態を示すと解釈された。分析された細胞系１６種類のうち３種類は均一な表現型を示し（ＸＸおよびＸＹ）、新生児および母体由来の細胞の存在を示した（表６−１）。組織胎盤−Ｎ由来の細胞は、胎盤の新生児側から単離された。継代０では、この細胞系がＸＹで均一であるように見えた。しかし、継代９では、細胞系が不均一であり（ＸＸ／ＸＹ）、母体由来細胞でこれまで未検出の細胞の存在を示している。
【０２８３】
【表６−１】
2007521009.tif 000007
【０２８４】
要約：染色体分析では、臨床細胞遺伝学研究室により解釈されるとおり、核型が正常に見える胎盤と臍帯由来ＰＰＤＣを同定した。均一の核型で決定されるとおり、核型分析でも母体細胞がない細胞系を同定した。  
【実施例７】
【０２８５】
フローサイトメトリーによるヒト分娩後由来細胞表面マーカーの評価
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質または「マーカー」の特徴は、細胞系の同定を決定するために利用されうる。発現の一貫性は複数のドナーから、異なる処理と培養条件に曝露された細胞で決定される可能性がある。前記胎盤および臍帯から単離した分娩後由来細胞系はフローサイトメトリーで特徴付けられ、それにより本発明の前記細胞を同定するため、プロフィールを提供した。
【０２８６】
材料と方法
培地。１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）を含むＤＭＥＭ低グルコースの増殖培地（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で細胞が培養された。
【０２８７】
培養容器：細胞は血漿で処理されたＴ７５、Ｔ１５０、Ｔ２２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）でコンフルエントまで培養された。前記フラスコの増殖表面は、室温で２０分間２％（ｗ／ｖ）ゼラチン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）をインキュベートすることで、ゼラチンによりコーティングされた。
【０２８８】
抗体染色：フラスコ中の接着細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡで分離された（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）。１×１０７個／ミリリットルの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで細胞が収集、遠心分離、再懸濁された。前記製造業者の仕様書に沿って、対象の前記細胞表面マーカー抗体（表７−１）が１００マイクロリットルの細胞懸濁液に追加され、前記混合物は４℃で３０分間、暗所でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、遠心分離され、非結合性抗体を除去した。細胞は５００マイクロリットルのＰＢＳ中で再懸濁され、フローサイトメトリーで分析された。
【０２８９】
フローサイトメトリー分析：ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）でフローサイトメトリー分析が実施された。
【０２９０】
細胞表面マーカー抗体：以下の細胞表面マーカー抗体が使用された。
【０２９１】
【表７−１】
2007521009.tif 000008
【０２９２】
胎盤および臍帯由来細胞の比較：胎盤由来細胞は継代８で臍帯由来細胞と比較された。
【０２９３】
継代と継代の比較：胎盤および臍帯細胞は継代８、１５、２０で分析された。
【０２９４】
ドナーとドナーの比較：ドナーの違いを比較するため、異なるドナーの胎盤由来細胞がそれぞれ比較され、異なるドナーの臍帯由来細胞がそれぞれ比較された。
【０２９５】
表面コーティングの比較：ゼラチンコーティングフラスコで培養された胎盤由来細胞は、コーティングされていないフラスコで培養された胎盤由来細胞と比較された。ゼラチンコーティングフラスコで培養された臍帯由来細胞は、コーティングされていないフラスコで培養された臍帯由来細胞と比較された。
【０２９６】
消化酵素の比較：細胞の単離と調整に用いた４種類の治療を比較した。１）コラゲナーゼ、２）コラゲナーゼ／ディスパーゼ、３）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ、４）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼを処理することで、分娩後組織由来細胞が比較された。
【０２９７】
胎盤層比較：胎盤組織の母体側から単離された細胞は、胎盤組織の絨毛領域から単離された細胞、および胎盤の新生胎児側から単離された細胞と比較された。
【０２９８】
結果
胎盤由来細胞は臍帯由来細胞と比較された。ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生で陽性であることが示されたフローサイトメトリーで分析された胎盤および臍帯由来細胞は、前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することで示された。これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの検出可能な産生が陰性であり、前記ＩｇＧコントロールと比較可能な蛍光値が示された。陽性曲線の蛍光値の変化が説明された。前記陽性曲線の平均（つまりＣＤ１３）と範囲（つまりＣＤ９０）はやや変化を示したが、前記曲線は正常に見え、均一な集団であることが確認された。いずれの曲線も、それぞれＩｇＧコントロール以上の値を示した。
【０２９９】
胎盤由来細胞の継代と継代の比較：前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することに反映されるとおり、フローサイトメトリーで分析された継代８、１５、２０の胎盤由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生で陽性あった。これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生が陰性であり、蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致した。
【０３００】
臍帯由来細胞の継代と継代の比較：前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することで示されるとおり、フローサイトメトリーで分析された継代８、１５、２０の胎盤由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現していた。これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱが陰性であり、前記ＩｇＧコントロールと一致した蛍光値によって示された。
【０３０１】
胎盤由来細胞のドナーとドナーの比較：前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することで示されるとおり、フローサイトメトリーで分析され、別のドナーから単離された胎盤由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現していた。蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致していることで示されるとおり、これらの細胞ではＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生が陰性であった。
【０３０２】
臍帯由来細胞のドナーとドナーの比較：前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することに反映されるとおり、フローサイトメトリーで分析され、別のドナーから単離された胎盤由来細胞では、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生がそれぞれ陽性であることが示された。これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生が陰性であり、蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致した。
【０３０３】
胎盤由来細胞に対するゼラチンを用いた表面コーティングの効果：前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することに反映されるとおり、フローサイトメトリーで分析され、ゼラチンでコーティングされたかコーティングされていないフラスコで増殖された胎盤由来細胞は、すべてＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現していた。蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致していることで示されるとおり、これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生が陰性であった。
【０３０４】
臍帯由来細胞に対するゼラチンを用いた表面コーティングの効果：フローサイトメトリーで分析され、ゼラチンおよびコーティングされていないフラスコで増殖された臍帯由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生がすべて陽性であり、前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇した。これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生が陰性であり、蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致した。
【０３０５】
前記細胞表面マーカーのプロフィールで前記細胞の調整と単離に使用される酵素消化法の作用評価：前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することで示されるとおり、フローサイトメトリーで分析された様々な消化酵素により単離された胎盤由来細胞は、すべてＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現していた。蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致していることで示されるとおり、これらの細胞ではＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生が陰性であった。
【０３０６】
胎盤層比較：それぞれＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生で陽性であることが示されたフローサイトメトリーで分析された、前記胎盤の母体、絨毛、新生児層由来の細胞は、前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することで示された。蛍光値は前記ＩｇＧコントロールと一致していることで示されるとおり、これらの細胞ではＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生が陰性であった。
【０３０７】
要約：フローサイトメトリーによる胎盤と臍帯由来分娩後細胞の分析は、これらの細胞系の同一性を確立した。胎盤と臍帯由来分娩後細胞ではＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃが陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱが陰性である。前記ドナー、継代、培養容器の表面コーティング、消化酵素、胎盤層を含む変数の変動によらず、この同一性は一致した。個々の蛍光値のヒストグラム曲線の平均と幅におけるいくつかの変化が観察されたが、すべての検討された条件下ですべての陽性曲線が正常であり、前記ＩｇＧコントロールよりも大きな蛍光値を発現していたため、前記細胞が均一な集団を有し、前記マーカーの陽性発現を有することを確認した。  
【実施例８】
【０３０８】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイによる分娩後由来細胞の分析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイが使用され、臍帯と胎盤由来細胞の遺伝子発現プロフィールをヒト骨髄由来の線維芽細胞、ヒト間質幹細胞、別の細胞系と比較した。この分析では前記分娩後由来細胞の特徴を提供し、これらの細胞に独特の分子マーカーを同定した。
【０３０９】
材料と方法
細胞の単離と培養
分娩後組織由来細胞：ヒトの臍帯と胎盤は、患者の同意を得て、正常な満期出産において国立疾病研究互助組織（ＮＤＲＩ、ペンシルバニア州フィラデルフィア）から得られた。例１で説明されたとおり、前記組織が受理され、細胞が単離された。ゼラチンコーティングされた組織培養プラスチックフラスコにおいて、増殖培地（１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）を用いたダルベッコ変法の基本培地（ＤＭＥＭ低グルコース、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド））で細胞が培養された。標準的な大気で前記培養が３７℃でインキュベートされた。
【０３１０】
線維芽細胞：ヒト皮膚線維芽細胞はＣａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（メリーランド州ウォーカーズビル、ロット番号９Ｆ０８４４）から購入され、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）から入手された。いずれの系も１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）と１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で培養された。前記細胞は標準組織で処理されたプラスチックで増殖された。
【０３１１】
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）：ｈＭＳＣはＣａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（メリーランド州ウォーカーズビル、ロット番号２Ｆ１６５５、２Ｆ１６５６、２Ｆ１６５７）から購入され、ＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）の製造業者の仕様書に沿って培養された。前記細胞は、５％ＣＯ２を用い、３７℃で標準的な組織培養プラスチックに増殖された。
【０３１２】
ヒト回腸稜骨髄細胞（ＩＣＢＭ）：ヒト回腸稜骨髄は、患者の同意を得てＮＤＲＩから受理された。前記骨髄はＨｏらが概要を示した方法に沿って処理された（ＷＯ０３／０２５１４９）。前記骨髄は、２０断片の溶解緩衝液に対して１断片の骨髄の比で、溶解緩衝液（１５５マイクロモルのＮＨ４Ｃｌ、１０マイクロモルのＫＨＣＯ３、０．１マイクロモルのＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．２）と混合された。細胞懸濁液はボルテックスされ、大気温度で２分間インキュベートされ、５００ｘｇで１０分間遠心分離された。前記上清は廃棄され、前記細胞ペレットは、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清と４マイクロモルのグルタミンが補充されたＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で再懸濁された。前記細胞は再び遠心分離され、前記細胞ペレットは新鮮培地に再懸濁された。前記生存可能な単核細胞は、トリパンブルー排除（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）を用いて計数された。前記単核細胞は、５×１０４細胞／ｃｍ２で組織培養プラスチックフラスコに播種された。前記細胞は、標準的な大気Ｏ２または５％Ｏ２で５％ＣＯ２を用い、３７℃でインキュベートされた。細胞は培地を取り替えずに、５日間培養された。培地と非接着細胞は５日間の培養後に除去された。前記接着細胞は培地で管理された。
【０３１３】
ｍＲＮＡと遺伝子チップ分析の単離：細胞の活性増殖培地は、細胞スクレーパーを用い、冷却したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で前記フラスコから除去された。前記細胞は３００ｘｇで５分間遠心分離された。前記上清は除去され、前記細胞は新鮮ＰＢＳ中で再懸濁され、再度遠心分離された。前記上清は除去され、前記細胞ペレットは−８０℃で直ちに冷却、保存された。細胞ｍＲＮＡはｃＤＮＡに抽出、転写された。ｃＤＮＡは次にｃＲＮＡに転写され、ビオチン標識された。前記ビオチン標識ｃＲＮＡは、ＨＧ−Ｕ１３３Ａ（２００３年８月）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘオリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）を用いてハイブリダイズされた。前記ハイブリッド形成とデータ収集は、前記製造業者の仕様書に沿って実施された。
【０３１４】
結果
この研究では、１４種類の異なる細胞集団が分析された。継代情報、培養基質、培地に沿った細胞は表８−１に掲載された。
【０３１５】
【表８】
2007521009.tif 000009
【０３１６】
前記データはＰｒｉｎｃｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓで評価され、前記細胞で異なって発現された前記２９０遺伝子を分析した。この分析は、前記集団の類似性を相対的に比較することができる。表８−２は、前記細胞ペアの比較を計算したユークリッド距離を示す。前記ユークリッド距離は前記細胞の比較に基づき、前記細胞タイプの間で異なって発現された２９０種類の遺伝子に基づいていた。前記ユークリッド距離は、前記２９０遺伝子の発現の類似性に反比例している。
【０３１７】
【表９】
2007521009.tif 000010
【０３１８】
表８−３、８−４、８−５は、胎盤由来細胞画が増加した遺伝子の発現（表８−３）、臍帯由来細胞が増加した遺伝子の発現（表８−４）、臍帯と胎盤由来細胞が減少した遺伝子の発現（表８−５）を示す。「プローブセットＩＤ」と表題をつけたカラムは、前記チップの特定部位に位置したいくつかのオリゴヌクレオチドプローブセットの製造業者識別コードを指し、これは前記名称を付けた遺伝子とハイブリッド形成し（カラム「遺伝子名」）、前記特定の受入番号（カラム「ＮＣＢＩ受入番号」）でＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）データベース内に見ることができる配列を有する。
【０３１９】
【表１０】
2007521009.tif 000011
【０３２０】
【表１１】
2007521009.tif 000012
【０３２１】
【表１２−１】
2007521009.tif 000013
【０３２２】
【表１２−２】
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【０３２３】
【表１２−３】
2007521009.tif 000015
【０３２４】
表８−６、８−７、８−８は、ヒト線維芽細胞（表８−６）、ＩＣＢＭ細胞（表８−７）、ＭＳＣ（表８−８）で上昇した遺伝子の発現を示す。
【０３２５】
【表１３】
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【０３２６】
【表１４】
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【０３２７】
【表１５】
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【０３２８】
要約：前記ＧＥＮＥＣＨＩＰ分析が実施され、臍帯と胎盤に由来する前記分娩後細胞の分子の特徴を提供した。この分析には３種類の臍帯と３種類の胎盤に由来する細胞を含めた。この研究でも、２種類の皮膚線維芽細胞系、３種類の間葉幹細胞、３種類の回腸稜骨髄細胞を含めた。これらの細胞によって発現された前記ｍＲＮＡは、２２，０００遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブを含んだＡｆｆｙＭｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰにより分析された。
【０３２９】
結果は、これらの５種類の細胞タイプで、２９０種類の遺伝子が異なって発現されることを示した。これらの遺伝子には、前記胎盤由来細胞で特異的に上昇する１０種類の遺伝子と、前記臍帯由来細胞で特異的に上昇する７種類の遺伝子を含む。５４種類の遺伝子では、胎盤と臍帯で特異的に発現レベルが低下することが分かった。
【０３３０】
選択された遺伝子の発現は、例９でＰＣＲにより確認された。これらの結果は、前記分娩後由来細胞が、例えば骨髄由来細胞および線維芽細胞と比較し、明らかに異なる遺伝子発現プロフィールを有することを示している。
【０３３１】
参考文献
Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６，１４（１３）：１６７５〜１６８０．  
【実施例９】
【０３３２】
分娩後由来細胞の細胞マーカー
前記ヒト胎盤と前記ヒト臍帯に由来する細胞の類似性と違いは、（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰアレイを用い、）その遺伝子発現プロフィールと他の供給源由来の細胞を比較することで評価された。同定された６種類の「シグネチャー」遺伝子は、酸化ＬＤＬ受容体１、インターロイキン−８、レニン、レチキュロン、ケモカイン受容体リガンド３（ＣＸＣリガンド３）、顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）であった。これらの「シグネチャー」遺伝子は、分娩後由来細胞で比較的高レベルで発現された。
【０３３３】
前記マイクロアレイデータの妥当性を確認し、遺伝子とタンパク質との発現で一致／不一致を同定するため、また胎盤および臍帯由来細胞に特異的な識別子を検出するため、一連の信頼できるアッセイを確立するために本研究は実施された。
【０３３４】
方法と材料
細胞：胎盤由来細胞（核型分析により同定されるとおり、主に新生児の１種類の分離菌を含む３種類の単離株）、臍帯由来細胞（４種類の単離株）、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、新生児および成人）が、ゼラチンでコーティングされたＴ７５フラスコの増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｃａｔ．＃ＳＨ３００７０．０３；Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で増殖された。間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、間葉幹細胞の増殖培地一括キット（ＭＳＣＧＭ；Ｃａｍｂｒｅｘ、メリーランド州ウォーカーズビル）で増殖された。
【０３３５】
前記ＩＬ−８分泌実験では、細胞が液体窒素から解凍され、５，０００細胞／ｃｍ２でゼラチンコーティングされたフラスコに播種され、増殖培地で４８時間増殖され、次にさらに８時間、１０ミリリットルの血清飢餓培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス））で増殖された。この処理後、ＲＮＡは抽出され、前記上清が１５０ｘｇで５分間遠心分離され、細胞片が除去された。ＥＬＩＳＡ分析では−８０℃で上清が凍結された。
【０３３６】
ＥＬＩＳＡアッセイの細胞培養：胎盤と臍帯由来の分娩後細胞、およびヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞が、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ中、増殖培地で培養された。細胞は継代１１で液体窒素中に凍結された。細胞は１５ミリリットルの遠心分離チューブに解凍、移動された。５分間、１５０ｘｇで遠心分離後、前記上清は廃棄された。細胞は４ミリリットルの培地に再懸濁され、計数された。細胞は、３７５，０００細胞／フラスコで２４時間、１５ミリリットルの増殖培地を含む７５ｃｍ２のフラスコで増殖された。前記培地は８時間、血清飢餓培地に変更された。血清飢餓培地はインキュベーションの最後に回収され、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離され、−２０℃で保存された。
【０３３７】
各フラスコで細胞数を推定するため、２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）が各フラスコに追加された。細胞が前記フラスコから分離された後、トリプシン活性が８ミリリットルの増殖培地で中和された。細胞は１５ミリリットルの遠心分離チューブに移され、１５０ｘｇで５分間、遠心分離された。上清は除去され、１ミリリットルの増殖培地が各チューブに追加され、前記細胞を再懸濁した。血球計数板を用い、細胞数が推定された。
【０３３８】
ＥＬＩＳＡアッセイ：前記細胞により血清飢餓培地に分泌されたＩＬ−８の量はＥＬＩＳＡアッセイで分析された（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）。すべての分析は、前記製造業者によって提供された使用説明書に沿って検査された。
【０３３９】
総ＲＮＡ単離：ＲＮＡは、コンフルエント分娩後由来細胞と線維芽細胞から抽出されるか、ＩＬ−８の発現では前述の通り処理された細胞から抽出された。細胞は、製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）に沿って、β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）を含む３５０マイクロリットルの緩衝液ＲＬＴを用いて溶解された。ＲＮＡは製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）に沿って抽出され、ＤＮａｓｅが処理された（２．７Ｕ／サンプル）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）。ＲＮＡは５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水で溶出され、−８０℃で保存された。ＲＮＡはヒト胎盤と臍帯から抽出された。β−メルカプトエタノールを含む７００マイクロリットルの緩衝液ＲＬＴに組織（３０ミリグラム）が懸濁された。サンプルは機械的にホモジナイズされ、前記ＲＮＡ抽出は製造業者の使用説明書に沿って処理された。ＲＮＡは５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水で抽出され、−８０℃で保存された。
【０３４０】
逆転写：ＲＮＡは２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いたランダム六量体を用い、逆転写された。サンプルは−２０℃で保存された。
【０３４１】
分娩後由来細胞（シグネチャー遺伝子−酸化ＬＤＬ受容体、インターロイキン−８、レニン、レチキュロンを含む）で独自に制御されるとおり、ｃＤＮＡマイクロアレイで同定された遺伝子は、さらにリアルタイムおよび従来のＰＣＲで検討された。
【０３４２】
リアルタイムＰＣＲ：ＰＣＲは、ＡＳＳＡＹＳ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤ遺伝子発現産物：酸化ＬＤＬ受容体（Ｈｓ００２３４０２８）、レニン（Ｈｓ００１６６９１５）、レチキュロン（Ｈｓ００３８２５１５）、ＣＸＣリガンド３（Ｈｓ００１７１０６１）、ＧＣＰ−２（Ｈｓ００６０５７４２）、ＩＬ−８（Ｈｓ００１７４１０３）を用いてｃＤＮＡサンプルで実施され、ＧＡＰＤＨは前記製造業者の使用説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）に沿って、７０００配列の検出システムにより、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用い、ｃＤＮＡおよびＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターと混合された。熱サイクル条件は、最初２分間で５０℃、１０分間で９５℃とし、次に９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクルとした。ＰＣＲデータは、製造業者の使用説明書（ＡＢＩプリズム７７００配列検出システムについて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのユーザー掲示板＃２）に沿って分析された。
【０３４３】
従来のＰＣＲ：従来のＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲの結果を確認するため、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州ボストン）を用いて実施された。ＰＣＲは２マイクロリットルのｃＤＮＡ溶液、１×ＴＡＱポリメラーゼ（商品名ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ）ユニバーサルミックスＰＣＲ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）と、９４℃、５分で最初の変性を利用して実施された。ＩＬ−８、ＣＸＣリガンド３、レチキュロン（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル）、レニン（９４℃で１５秒間、５３℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を３８サイクル）、酸化ＬＤＬ受容体とＧＡＰＤＨ（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を３３サイクル）について、増幅は各プライマーセットで最適化された。増幅に用いられたプライマーは表１に掲載されている。最終ＰＣＲ反応でのプライマー濃度は、０．５マイクロモルのＧＡＰＤＨを除き、１マイクロモルであった。前記製造業者のＴａｑＭａｎプローブが前記最終ＰＣＲ反応に追加されなかった場合を除き、ＧＡＰＤＨプライマーはリアルタイムＰＣＲと同じであった。２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルでサンプルが実行され、臭化エチジウムで染色された（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）。画像は焦点距離ＰＯＬＡＲＯＩＤカメラ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）を用い、６６７  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｗｉｎｐａｃｋフィルム（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）を用いて取り込まれた。
【０３４４】
【表１６】
2007521009.tif 000019
【０３４５】
免疫蛍光検査：分娩後由来細胞は、冷却した４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリー州セントルイス）で１０分間、室温で固定された。継代０（Ｐ０）（単離直後）と継代１１（Ｐ１１）（胎盤由来細胞の分離株２種類、臍帯由来細胞の分離株２種類）の臍帯および胎盤由来細胞それぞれの分離株１種類および線維芽細胞（Ｐ１１）が使用された。ビメンチン（１：５００、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、デスミン（１：１５０、Ｓｉｇｍａ−ウサギに対して作成、または１：３００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ−マウスに対して作成）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ）、ＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カーピンテリア）のエピトープに対する抗体を用い、免疫細胞化学検査が実施された。さらに、継代１１の分娩後由来細胞で抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；ａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州サンタクルーズ）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、抗ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）のマーカーが検討された。
【０３４６】
培養はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）を含むタンパク質遮断溶液に３０分間曝露させ、細胞内抗原にアクセスした。対象エピトープが前記細胞表面に位置する場合（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）、エピトープの損失を予防するため、前記処置のすべての段階でＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が省略された。さらに、前記一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）に対して作成された場合、前記プロセスを介してヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）のロバ血清が使用された。ブロッキング溶液に希釈した一次抗体は、次に室温で１時間前記培地に塗布された。ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともにブロックを含む二次抗体溶液（室温で１時間）を適用する前に、前記一次抗体溶液は除去され、前記培地がＰＢＳで洗浄された。次に培養物を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して細胞核を可視化した。
【０３４７】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ逆落射型蛍光顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ニューヨーク州メルビル）で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光が可視化された。すべてのケースで、対照染色の上に陽性染色が蛍光シグナルを示し、上記に概要を示した方法全体が守られたが、一次抗体溶液の適用は例外であった（１゜コントロールなし）。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を用い、代表的な画像が捕らえられた。３回染色したサンプルでは、１度に１回の放射フィルターのみを用い、各画像が取られた。次に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、カリフォルニア州サンホセ）を用いて層状合成が用意された。
【０３４８】
ＦＡＣＳ分析での細胞の調整：フラスコ中の接着細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡで分離された（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）。１×１０７個／ミリリットルの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで細胞が収集、遠心分離、再懸濁された。１００マイクロリットルの分量がコニカルチューブに移された。細胞内抗原で染色された細胞は、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）で透過された。抗体は製造業者の使用説明書により一定分量に追加され、前記細胞が３０分間４℃において暗所でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、遠心分離され、過剰な抗体を除去した。二次抗体を必要とする細胞は１００マイクロモルの３％ＦＢＳに再懸濁された。二次抗体は製造業者の使用説明書により追加され、前記細胞が３０分間４℃において暗所でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、遠心分離され、過剰な二次抗体を除去した。洗浄された細胞は０．５マイクロリットルのＰＢＳ中で再懸濁され、フローサイトメトリーで分析された。酸化ＬＤＬ受容体１（ｓｃ−５８１３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＧＲＯａ（５５５０４２；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、マサチューセッツ州ベッドフォード）、マウスＩｇＧ１κ（Ｐ−４６８５およびＭ−５２８４；Ｓｉｇｍａ）、ロバ抗ヤギＩｇＧ（ｓｃ−３７４３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．）の抗体が使用された。
【０３４９】
ＦＡＣＳ分析：ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）でフローサイトメトリー分析が実施された。
【０３５０】
結果
ヒト胎盤由来細胞のｃＤＮＡ、成人および新生児の線維芽細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）について実施された選択された「シグネチャー」遺伝子のリアルタイムＰＣＲの結果は、他の細胞と比べ、前記胎盤由来細胞が高レベルで、酸化ＬＤＬ受容体およびレニンが発現されたことを示している。リアルタイムＰＣＲから得られたデータは、前記ΔΔＣＴ法によって分析され、対数スケールで表現された。レチキュロンと酸化ＬＤＬ受容体の発現レベルは、他の細胞と比べて臍帯由来細胞で高かった。分娩後由来細胞と対照では、ＣＸＣリガンド３とＧＣＰ−２の発現レベルに有意な差は認められなかった（データは示されていない）。ＣＸＣ−リガンド３は非常に低レベルで発現された。ＧＣＰ−２はヒト成人および新生児の線維芽細胞と同等のレベルで発現された。リアルタイムＰＣＲの結果は従来のＰＣＲで確認された。ＰＣＲ製品の配列決定は、さらにこれらの観察の妥当性を確認した。表９−１に掲載された従来のＰＣＲ  ＣＸＣリガンド３プライマーを用い、分娩後由来細胞と対照との間でＣＸＣリガンド３の発現レベルに有意な差は認められなかった。
【０３５１】
分娩後由来細胞の前記サイトカインＩＬ−８の発現は、増殖培地で培養されたか、血清飢餓分娩後由来細胞で上昇された。すべてのリアルタイムＰＣＲデータは、従来のＰＣＲとＰＣＲ産物の配列決定で妥当性が確認された。
【０３５２】
無血清培地で増殖された細胞の上清でＩＬ−８の有無が検討された場合、臍帯由来細胞由来の培地と胎盤由来細胞の分離株の一部で最も多い量が検出された（表９−２）。ヒト皮膚線維芽細胞由来の培地ではＩＬ−８が検出されなかった
。
【０３５３】
【表１７】
2007521009.tif 000020
【０３５４】
胎盤由来細胞はＦＡＣＳ分析により、酸化ＬＤＬ受容体、ＧＣＰ−２、ＧＲＯαの発現が検討された。細胞の検査ではＧＣＰ−２が陽性であった。酸化ＬＤＬ受容体とＧＲＯがこの方法で検出された。
【０３５５】
免疫細胞化学的分析により、選択されたタンパク質の発現について胎盤由来細胞も検討された。単離直後（継代０）、前記ヒト胎盤由来の細胞が４％パラホルムアルデヒドで固定され、フォン・ヴィルブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、ビメンチンの６種類のタンパク質の抗体に曝露された。細胞染色では、α−平滑筋アクチンとビメンチン両方で陽性であった。このパターンは継代１１から保存された。継代０のわずかな細胞（<５％）の染色では、サイトケラチン１８が陽性であった。
【０３５６】
継代０のヒト臍帯由来の細胞では、免疫細胞化学的分析により選択されたタンパク質の発現がプローブされた。単離直後（継代０）、細胞は４％パラホルムアルデヒドで固定され、フォン・ヴィルブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、ビメンチンの６種類のタンパク質の抗体に曝露された。臍帯由来細胞ではα−平滑筋アクチン、ビメンチンが陽性であり、前記染色パターンは継代１１まで一致した。
【０３５７】
継代１１の胎盤由来細胞も、ＧＲＯαとＧＣＰ−２の発現で免疫細胞化学的分析により検討された。胎盤由来細胞はＧＣＰ−２陽性であったが、ＧＲＯαの発現はこの方法では検出されなかった。
【０３５８】
免疫細胞化学により、継代１１での臍帯由来細胞でＧＲＯα、ＧＣＰ−２、酸化ＬＤＬ受容体１、レチキュロン（ＮＯＧＯ−Ａ）の発現が検討された。臍帯由来細胞はＧＣＰ−２陽性であったが、ＧＲＯαの発現はこの方法では検出されなかった。さらに、細胞がＮＯＧＯ−Ａ陽性であった。
【０３５９】
要約：マイクロアレイと（リアルタイムおよび従来の）ＰＣＲにより測定された遺伝子発現レベル間の一致は、酸化ＬＤＬ受容体１、レニン、レチキュロン、ＩＬ−８の４遺伝子で確立された。これらの遺伝子の発現は、分娩後由来細胞で前記ｍＲＮＡレベルが異なって制御され、ＩＬ−８も前記タンパク質レベルが異なって制御された。酸化ＬＤＬ受容体の有無は、前記胎盤由来細胞でＦＡＣＳ分析によりタンパク質レベルで検出されなかった。ＧＣＰ−２およびＣＸＣリガンド３の異なる発現が前記ｍＲＮＡレベルで確認されなかったが、ＧＣＰ−２は前記胎盤由来細胞のＦＡＣＳ分析により前記タンパク質レベルで検出された。この結果は前記マイクロアレイ実験から当初入手されたデータを支持していないが、これは前記方法論の感受性に差があるためと考えられる。
【０３６０】
単離直後（継代０）では、前記ヒト胎盤由来細胞でα−平滑筋アクチンとビメンチンが陽性と染色された。このパターンも継代１１で細胞に観察された。これらの結果は、少なくともここで使用された増殖培地で、ビメンチンとα−平滑筋アクチンの発現が継代により細胞に保存されてもよいことを示唆している。
【０３６１】
継代０におけるヒト臍帯由来細胞では、α−平滑筋アクチンとビメンチンの発現がプローブされ、いずれも陽性であった。この染色パターンは継代１１から保存された。
【０３６２】
結論として、前記完全なｍＲＮＡデータは、少なくとも部分的に前記マイクロアレイ実験から入手されるデータの妥当性を確認する。  
【実施例１０】
【０３６３】
ＰＰＤＣ表現型の免疫組織化学的特徴
ヒト分娩後組織、つまり臍帯と胎盤内に認められる細胞の表現型は、免疫組織化学的に分析された。
【０３６４】
方法と物質
組織標本：ヒト臍帯および胎盤組織が採取され、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中、一晩４℃で浸漬固定された。ビメンチン（１：５００、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、デスミン（１：１５０、ウサギに対して作成、Ｓｉｇｍａ、または１：３００、マウスに対して作成、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ）、ＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カーピンテリア）のエピトープに対する抗体を用い、免疫組織化学検査が実施された。さらに、抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；ａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州サンタクルーズ）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、抗ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）のマーカーが検討された。固定された標本が外科用メスで切り取られ、エタノールを含むドライアイス浴でＯＣＴ包埋化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ；Ｓａｋｕｒａ、カリフォルニア州トランス）内に入れられた。次に標準的な低温保持装置（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、冷凍ブロックが切片にされ（厚さ１０ミクロン）、染色用ガラススライドに載せられた。
【０３６５】
【表１８】
2007521009.tif 000021
【０３６６】
免疫組織化学：免疫組織化学がこれまでの研究と同様に実施された（例えばＭｅｓｓｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８４：  ８１６〜８２９）。組織切片はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質遮断溶液に１時間曝露させ、細胞内抗原に接近した。対象エピトープが前記細胞表面に位置する場合（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）、エピトープの損失を予防するため、前記処置のすべての段階でｔｒｉｔｏｎが省略された。さらに、前記一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）に対して作成された場合、前記処置を介してヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）のロバ血清が使用された。ブロッキング溶液に希釈された一次抗体は、次に室温で４時間前記切片に塗布された。ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともにブロックを含む二次抗体溶液（室温で１時間）を適用する前に、一次抗体溶液は除去され、培地がＰＢＳで洗浄された。培養物が洗浄され、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して細胞核を可視化した。
【０３６７】
免疫染色後、逆落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ニューヨーク州メルビル）で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光が可視化された。陽性染色は対照染色を上回る蛍光シグナルにより代表された。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を用い、代表的な画像が捕らえられた。３回染色したサンプルでは、１度に１回の放射フィルターのみを用い、各画像が取られた。次に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、カリフォルニア州サンホセ）を用いて層状合成が用意された。
【０３６８】
結果
臍帯の特徴。ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、ＣＤ３４マーカーは、臍帯に認められる細胞のサブセットで表現された（データは示されていない）。特に、ｖＷＦとＣＤ３４の発現は前記臍帯内に含まれる血管に制限された。ＣＤ３４＋細胞は最内の層（内腔側）にあった。ビメンチンの発現は、前記臍帯の基質と血管から認められた。ＳＭＡは前記動脈および静脈の基質と外壁に限定されていたが、それ自体は前記血管に含まれなかった。ＣＫ１８とデスミンは前記血管内のみに観察され、デスミンは前記中間層と外層に限定されていた。
【０３６９】
胎盤の特徴：ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、ＣＤ３４はすべて前記胎盤内に観察され、局所的に特異的であった。
【０３７０】
ＧＲＯα、ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ組織発現：臍帯または胎盤組織内にこれらのマーカーは観察されなかった（データは示されていない）。
【０３７１】
要約：ヒト臍帯および胎盤内の細胞で、ビメンチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォン・ヴィレブランド因子、ＣＤ３４が発現された。ビメンチンとα−平滑筋アクチンのみが発現されることを示したｉｎ  ｖｉｔｒｏの特徴研究をもとに、前記データは、現在の分娩後細胞の単離プロセスで細胞の部分集団を取り入れるか、前記単離細胞がマーカーの発現を変化させ、ビメンチンとα−平滑筋アクチンを発現することを示している。  
【実施例１１】
【０３７２】
分娩後由来細胞のＩｎ  Ｖｉｔｒｏ免疫学：ある場合は、これらの細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ移植で誘発する前記免疫学的反応を予測するため、分娩後由来細胞系はその免疫学的特徴がｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価された。分娩後由来細胞系がＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２の発現について、フローサイトメトリーによりアッセイされた。これらのタンパク質は抗原提示細胞（ＡＰＣ）により発現され、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞の直接刺激が必要とされる（Ａｂｂａｓ  &  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，５ｔｈ  Ｅｄ．（２００３）Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．１７１）。前記細胞系も、ＨＬＡ−Ｇ（Ａｂｂａｓ  &  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，５ｔｈ  Ｅｄ．（２００３）Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．１７１）、ＣＤ  １７８（Ｃｏｕｍａｎｓ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２４，１８５〜１９６）、およびＰＤ−Ｌ２（Ａｂｂａｓ  &  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，５ｔｈ  Ｅｄ．（２００３）Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．１７１；Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ．ａｌ．（２００３）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０，１２５７〜１２６６）の発現でフローサイトメトリーにより分析された。胎盤組織に存在する細胞によるこれらのタンパク質の発現は、子宮内の胎盤組織の免疫に特別の状態を媒介すると考えられる。分娩後胎盤および臍帯由来細胞系がｉｎ  ｖｉｖｏで免疫反応を誘発する程度を予測するため、前記細胞系は一方の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で検査される。
【０３７３】
材料と方法
細胞培養：２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）でコーティングしたＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）で、コンフルエントまで増殖培地（ＤＭＥＭ低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド））で細胞が培養された。
【０３７４】
抗体染色：細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡで分離された（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）。１×１０７個／ミリリットルの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで細胞が収集、遠心分離、再懸濁された。製造業者の仕様書により抗体（表１１−１）は１００マイクロリットルの細胞懸濁液に追加され、４℃で３０分間、暗所でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、遠心分離され、非結合性抗体を除去した。細胞は５００マイクロリットルのＰＢＳで再懸濁され、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）を用い、フローサイトメトリーにより分析された。
【０３７５】
【表１９】
2007521009.tif 000022
【０３７６】
混合リンパ球反応：細胞系Ａと標識された継代１０の臍帯由来ＰＰＤＣと、細胞系Ｂと標識された継代１１の胎盤由来ＰＰＤＣの凍結保存したバイアルは、ＣＴＢＲ（Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ、ケベック）にドライアイスに載せて送付され、ＣＴＢＲ  ＳＯＰ  ｎｏ．ＣＡＣ−０３１を用いた混合リンパ球反応を実施した。末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）が、複数の男性と女性ボランティアドナーから回収された。刺激物（ドナー）の同種ＰＢＭＣ、自家ＰＢＭＣ、分娩後由来細胞系がマイトマイシンＣで処理された。自家およびマイトマイシンＣ処理刺激細胞は応答する（レシピエント）ＰＢＭＣに追加され、４日間培養された。インキュベーション後、［３Ｈ］チミジンが各サンプルに追加され、１８時間培養された。前記細胞の採取後、放射標識したＤＮＡが抽出され、［３Ｈ］−チミジンの取り込みがシンチレーションカウンターで測定された。
【０３７７】
前記レシーバーの増殖の平均とマイトマイシンＣ処理同種ドナーを足し、前記レシーバーのベースラインでの増殖で割って、同種ドナーの刺激指数（ＳＩＡＤ）は計算された。前記レシーバーの増殖の平均とマイトマイシンＣ処理分娩後由来細胞系を足し、前記レシーバーのベースラインでの増殖で割って、分娩後由来細胞の刺激指数が計算された。
【０３７８】
結果
混合リンパ球反応−胎盤：７種類のヒトボランティア血液ドナーがスクリーニングされ、他の６種類の血液ドナーを用いた混合リンパ球反応において、強固な増殖反応を示す単一の同種ドナーを同定した。このドナーは、前記同種ポジティブコントロールドナーとして選択された。前記残りの６種類の血液ドナーはレシピエントとして選択された。前記同種ポジティブコントロールドナーと胎盤由来細胞系がマイトマイシンＣで処理され、前記６種類の個別同種レシーバーを用いた混合リンパ球反応で培養された。１プレート当たり３種類のレシーバーを用いた２種類の細胞培養プレートを用い、反応は３回行われた（表１１−２）。前記平均刺激指数は１．３（プレート２）から３（プレート１）の範囲で、前記同種ドナーのポジティブコントロールは４６．２５（プレート２）から２７９（プレート１）の範囲であった（表１１−３）。
【０３７９】
【表２０−１】
2007521009.tif 000023
【０３８０】
【表２０−２】
2007521009.tif 000024
【０３８１】
【表２１】
2007521009.tif 000025
【０３８２】
混合リンパ球反応−臍帯：６種類のヒトボランティア血液ドナーがスクリーニングされ、他の５種類の血液ドナーを用いた混合リンパ球反応において、強固な増殖反応を示す単一の同種ドナーを同定した。このドナーは、前記同種陽性コントロールドナーとして選択された。前記残りの５種類の血液ドナーはレシピエントとして選択された。前記同種ポジティブコントロールドナーと胎盤由来細胞系がマイトマイシンＣで処理され、前記５種類の個別同種レシーバーを用いた混合リンパ球反応で培養された。１プレート当たり３種類のレシーバーを用いた２種類の細胞培養プレートを用い、反応は３回行われた（表１１−２）。前記平均刺激指数は６．５（プレート１）から９（プレート２）の範囲で、前記同種ドナーのポジティブコントロールは４２．７５（プレート２）から７０（プレート１）の範囲であった（表１１−５）。
【０３８３】
【表２２−１】
2007521009.tif 000026
【０３８４】
【表２２−２】
2007521009.tif 000027
【０３８５】
【表２３】
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【０３８６】
抗原提示細胞マーカー−胎盤：フローサイトメトリーで分析される胎盤由来細胞のヒストグラムは、前記ＩｇＧコントロールと一致した蛍光値に認められるとおり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２の発現が陰性であることを示し、胎盤由来細胞系には同種ＰＢＭＣを直接刺激するために必要な前記細胞表面分子がないことを示している（例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞）。
【０３８７】
免疫調節マーカー−胎盤由来細胞：フローサイトメトリーにより分析された胎盤由来細胞のヒストグラムは、前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値の上昇に認められるとおりＰＤ−Ｌ２の陽性発現を示し、ＩｇＧコントロールと一致した蛍光値で認められるとおりＣＤ１７８とＨＬＡ−Ｇの陰性発現を示す（データは示されていない）。
【０３８８】
抗原提示細胞マーカー−臍帯由来細胞：フローサイトメトリーで分析される胎盤由来細胞のヒストグラムは、前記ＩｇＧコントロールと一致した蛍光値に認められるとおり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２の発現が陰性であることを示し、胎盤由来細胞系には同種ＰＢＭＣを直接刺激するために必要な前記細胞表面分子がないことを示している（例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞）。
【０３８９】
免疫調節マーカー−臍帯由来細胞：フローサイトメトリーにより分析された臍帯由来細胞のヒストグラムは、前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値の上昇に認められるとおりＰＤ−Ｌ２の陽性発現を示し、ＩｇＧコントロールと一致した蛍光値で認められるとおりＣＤ１７８とＨＬＡ−Ｇの陰性発現を示す。
【０３９０】
要約：胎盤由来細胞系を用いて実施された前記混合リンパ球反応では、前記平均刺激指数が１．３〜３の範囲であり、前記同種陽性コントロールの指数は４６．２５〜２７９の範囲であった。胎盤由来細胞系を用いて実施された前記混合リンパ球反応では、前記平均刺激指数が６．５〜９の範囲であり、前記同種陽性コントロールの指数は４２．７５〜７０の範囲であった。フローサイトメトリーにより測定されると、胎盤および臍帯由来細胞系が、前記刺激タンパク質ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２の発現で陰性であった。胎盤および臍帯由来細胞系は、フローサイトメトリーで測定されると、免疫調節タンパク質ＨＬＡ−ＧおよびＣＤ１７８の発現が陰性であり、ＰＤ−Ｌ２の発現が陽性であった。同種ドナーＰＢＭＣはＨＬＡ−ＤＰ、ＤＲ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２を発現した抗原提示細胞を含み、それによって同種ＰＢＭＣの刺激を可能とする（例えば、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞）。同種ＰＢＭＣの直接刺激（例えば、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞）と免疫調節タンパク質であるＰＤ−Ｌ２の存在に必要な、胎盤および臍帯由来細胞に抗原提示細胞の表面分子がないことは、同種対照と比べてＭＬＲのこれらの細胞により前記低刺激指数の原因となっている可能性がある。
【０３９１】
参考文献
Ｂｒｕｄｅｒ  ＳＰ  ｅｔ．ａｌ．ＵＳＰ  ６，３５５，２３９  Ｂ１（２００２）
Ａｂｂａｓ，ＡＫ，Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＡＨ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５ｔｈ  Ｅｄ．（２００３）Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．１７１
Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅｒ  Ｐ．Ｌｅ  ｅｔ．ａｌ．，（２００３）Ｐｌａｃｅｎｔａ  ２４；Ｓ１０〜Ｓ１５
Ｃｏｕｍａｎｓ  Ｂ  ｅｔ．ａｌ．，（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２４，１８５〜１９６］
Ｂｒｏｗｎ，Ｊｕｌｉａ  ｅｔ．ａｌ．（２００３）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０，１２５７〜１２６６  
【実施例１２】
【０３９２】
分娩後由来細胞による栄養因子の分泌
胎盤および臍帯由来ＰＰＤＣから選択された栄養因子の分泌が測定された。血管由来活性（つまり、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２１２：２１５〜２６）、単球走化性因子１（ＭＣＰ−１）（Ｓａｌｃｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９６；３４〜４０）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３３６９〜７６）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７７：８１２〜８）、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、間質由来因子１ａ（ＳＤＦ−１ａ））、神経栄養性／神経保護活性（脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５８；３１９〜３３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、トランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２））、またはケモカイン活性（マクロファージ炎症性タンパク質１ａ（ＭＩＰ１ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１ｂ）、単球遊走因子−１（ＭＣＰ−１）、Ｒａｎｔｅｓ（活性制御、正常Ｔ細胞の発現と分泌）、Ｉ３０９、ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＴＡＲＣ）、Ｅｏｔａｘｉｎ、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、ＩＬ−８）を有する因子が選択された。
【０３９３】
方法と材料
細胞培養：胎盤と臍帯由来のＰＰＤＣ、およびヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞は、ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコで増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＳＨ３００７０．０３；Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））に培養された。細胞は継代１１で凍結保存され、液体窒素に保存された。前記細胞を解凍後、増殖培地が前記細胞に追加された後、１５ミリリットルの遠心分離チューブに移し、１５０ｘｇで５分間、前記細胞を遠心分離した。前記上清は廃棄された。前記細胞ペレットは４ミリリットルの増殖培地に再懸濁され、細胞が計数された。細胞は増殖培地１５ミリリットルを含むＴ７５フラスコに５，０００細胞／ｃｍ２で播種され、２４時間培養された。前記培地は８時間、無血清培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、５０ユニット／ミリリットルのストレプトマイシン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））に変更された。無血清条件培地はインキュベーションの最後に回収され、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離され、−０℃で保存された。各フラスコの細胞数を推定するため、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて分離された。トリプシン活性は８ミリリットルの増殖培地を加えることで抑制された。細胞は１５０ｘｇで５分間遠心分離された。上清は除去され、細胞は１ミリリットルの増殖培地に再懸濁された。血球計数板を用い、細胞数が推定された。
【０３９４】
ＥＬＩＳＡアッセイ：細胞は３７℃で５％二酸化炭素と大気酸素中で増殖された。胎盤由来ＰＰＤＣ（１０１５０３）も、５％酸素またはβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）で増殖された。各細胞サンプルで産生されたＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１ａ、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、ＴＧＦ−β２の量は、ＥＬＩＳＡアッセイで測定された（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）。すべてのアッセイは前記製造業者の使用説明書に沿って実施された。値はピコグラム／ミリリットル／１００万細胞（ｎ＝２、ｓｅｍ）で示している。
【０３９５】
ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ＥＬＩＳＡアッセイ：ケモカイン（ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、Ｅｏｔａｘｉｎ、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、血管新生因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦ）は、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ａｒｒａｙｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を用いて測定された。前記プロテオームアレイは、１ウェル当たり１６タンパク質に対して２つの定量測定を行う多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。前記アレイは、１６ウェルプレートの各ウェルに４〜１６種類の捕捉抗体の２×２、３×３、または４×４パターンをスポットすることで作成された。サンドイッチＥＬＩＳＡ法後、前記プレートの各ウェル内の各スポットで発生した化学蛍光シグナルを捕捉するため、前記プレート全体が画像化される。各スポットで発生したシグナルの量は、前記最初の標準またはサンプルにおいて、標的タンパク質の量と比例する。
【０３９６】
結果
ＥＬＩＳＡアッセイ：ＭＣＰ−１およびＩＬ−６は、胎盤および臍帯由来ＰＰＤＣと皮膚線維芽細胞により分泌された（表１２−１）。臍帯由来細胞は、他の細胞集団よりも少なくとも１０倍多い量のＭＣＰ−１とＩＬ６を分泌した。ＧＣＰ−２およびＩＬ−８は、臍帯由来ＰＰＤＣにより多く発現された。ＴＧＦ−β２は検出されなかった。ＶＥＧＦは線維芽細胞培地で検出された。
【０３９７】
臍帯由来細胞から分泌されたＨＧＦ、ＦＧＦ、ＢＤＮＦの量は、線維芽細胞と胎盤由来細胞よりも著しく高かった（表１２−２および１２−３）。同様に、ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＨＢＥＧＦ、ＭＣＰ−１、ＴＡＲＣ、ＩＬ−８は他の細胞集団よりも臍帯由来細胞で高かった（表１２−３）。ＡＮＧ２またはＰＤＧＦ−ｂｂが検出された。
【０３９８】
【表２４】
2007521009.tif 000029
【０３９９】
【表２５】
2007521009.tif 000030
【０４００】
【表２６】
2007521009.tif 000031
【０４０１】
要約：臍帯細胞は、胎盤由来細胞と線維芽細胞よりも有意に多量の栄養因子を分泌した。これらの栄養因子の一部、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８などは、血管新生に重要な役割を果たしている。ＢＤＮＦおよびＩＬ−６などの他の栄養因子は、神経の再生に重要な役割を果たしている。これらの条件下で、いくつかの因子の発現がＭＩＰ１ｂ、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＦＧＦなど、臍帯由来細胞に限局された。
【０４０２】
参考文献
Ｌｅ  Ｂｅｌｌｅ  ＪＥ，Ｓｖｅｎｄｓｅｎ  ＣＮ．（２００２）Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：  ｗｈｅｒｅ  ｃａｎ  ｗｅ  ｇｏ  ｆｒｏｍ  ｈｅｒｅ？  ＢｉｏＤｒｕｇｓ．１６；３８９〜４０１.
Ｒｏｓｅｎ  ＥＭ，Ｌａｍｓｚｕｓ  Ｋ，Ｌａｔｅｒｒａ  Ｊ，Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ  ＰＪ，Ｒｕｂｉｎ  ＪＳ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＩＤ．（１９９７）ＨＧＦ／ＳＦ  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．２１２；２１５〜２６，．
Ｓａｌｃｅｄｏ  Ｒ，Ｐｏｎｃｅ  ＭＬ，Ｙｏｕｎｇ  ＨＡ，Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  Ｋ，Ｗａｒｄ  ＪＭ，Ｋｌｅｉｎｍａｎ  ＨＫ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ＪＪ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＷＪ．（２０００）Ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ＣＣＲ２  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ＭＣＰ−１：  ｄｉｒｅｃｔ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＭＣＰ−１  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ．９６；３４〜４０．
Ｌｉ  Ａ，Ｄｕｂｅｙ  Ｓ，Ｖａｒｎｅｙ  ＭＬ，Ｄａｖｅ  ＢＪ，Ｓｉｎｇｈ  ＲＫ（２００３）ＩＬ−８  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０；３３６９〜７６．
Ｈｕｇｈｅｓ  ＧＣ，Ｂｉｓｗａｓ  ＳＳ，Ｙｉｎ  Ｂ，Ｃｏｌｅｍａｎ  ＲＥ，ＤｅＧｒａｄｏ  ＴＲ，Ｌａｎｄｏｌｆｏ  ＣＫ，Ｌｏｗｅ  ＪＥ，Ａｎｎｅｘ  ＢＨ，Ｌａｎｄｏｌｆｏ  ＫＰ．（２００４）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂＦＧＦ  ａｎｄ  ＶＥＧＦ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．７７；８１２〜８．
Ｃｈｅｎｇ  Ａ，Ｗａｎｇ  Ｓ，Ｃａｉ  Ｊ，Ｒａｏ  ＭＳ，Ｍａｔｔｓｏｎ  ＭＰ（２００３）Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｃｔｓ  ｉｎ  ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｌｏｏｐ  ｗｉｔｈ  ＢＤＮＦ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２５８；３１９〜３３．
Ｓｅｂｉｒｅ  Ｇ，Ｅｍｉｌｉｅ  Ｄ，Ｗａｌｌｏｎ  Ｃ，Ｈｅｒｙ  Ｃ，Ｄｅｖｅｒｇｎｅ  Ｏ，Ｄｅｌｆｒａｉｓｓｙ  ＪＦ，Ｇａｌａｎａｕｄ  Ｐ，Ｔａｒｄｉｅｕ  Ｍ．（１９９３）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−６，ＩＬ−１  ｂｅｔａ，ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ａｎｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０；１５１７〜２３．  
【実施例１３】
【０４０３】
血漿凝固アッセイ
細胞が前記作用部位を標的とすることができる特定の応用について、細胞療法は全身に注入されてもよい。注入された細胞が、致死的と考えられる血栓症を引き起こさないことが重要である。組織因子、つまり膜結合凝血促進性糖タンパク質は外因性凝固カスケードのイニシエーターであり、これはｉｎ  ｖｉｖｏで主な凝固経路である。組織因子も、例えば、前記原始的血管壁の形成において、胚血管新生に重要な役割を果たす（Ｂｒｏｄｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０：２９９〜３０６）。最初の凝固に対してＰＰＤＣの能力を決定するため、臍帯と胎盤由来ＰＰＤＣで組織因子の発現と血漿凝固を開始するその能力が評価された。
【０４０４】
方法と材料
ヒト組織因子：ヒト組織因子のＳＩＭＰＬＡＳＴＩＮ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋａｉｌｃａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ノースカロライナ州ダラム）は、２０ミリリットルの蒸留水でもどされた。前記原液は８本のチューブで連続的に蒸留された（１：２）。正常なヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ、カンザス州オーバーランドパーク）が水浴中３７℃で解凍され、使用前に氷中に保存された。９６ウェルプレートの各ウェルに、１００マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１０マイクロリットルの希釈Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）（ブランクのウェルを除く）、３０マイクロリットルの０．１モル塩化カルシウム、１００マイクロリットルの正常ヒト血漿が追加された。前記プレートは直ちに温度制御マイクロプレートリーダーに設置され、吸光度は４０５ナノメーター、４０秒間隔で、３０分測定した。
【０４０５】
Ｊ−８２および分娩後由来細胞：Ｊ−８２細胞（ＡＴＣＣ、メリーランド州）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、１マイクロモルのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリー州セントルイス）、２ミリリットルのＬ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｈｅｒｎｄｏｎ、バージニア州）、１×非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｈｅｒｎｄｏｎ、バージニア州）を含むイスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）で増殖された。７０％コンフルエントでは、細胞が１００，０００、５０，０００、２５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートのウェルに移された。胎盤および臍帯の分娩後由来細胞は、ゼラチンでコーティングしたＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）中、増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、０．００１％βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ））で培養された。継代５の胎盤由来細胞と継代５および１１の臍帯由来細胞が５０，０００細胞／ウェルでウェルに移された。１５０ｘｇで５分間遠心分離後、培地は各ウェルから除去された。細胞はカルシウムとマグネシウムを含まないＰＢＳに懸濁された。抗組織因子抗体細胞を用いてインキュベートされた細胞は、３０分間、２０マイクログラム／ミリリットルのＣＮＴＯ  ８５９（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、ペンシルバニア州マルヴァーン）でインキュベートされた。塩化カルシウム（３０マイクロリットル）が各ウェルに追加された。前記プレートは直ちに温度制御マイクロプレートリーダーに設置され、吸光度は４０５ナノメーター、４０秒間隔で、３０分測定された。
【０４０６】
抗体染色：細胞はＰＢＳ中で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いたフラスコから分離された。細胞は採取、遠心分離され、１ミリリットル当たり１ｘ１０７の細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳに再懸濁された。抗体は前記製造業者の仕様書の通り、１００マイクロリットルの細胞懸濁液に追加され、前記細胞は暗所で３０分間、４℃でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、１５０ｘｇで５分間遠心分離され、結合していない抗体を除去した。細胞は１００マイクロリットルの３％ＦＢＳに再懸濁し、二次抗体が前記製造業者の使用説明書の通り追加された。細胞は暗所で３０分間、４℃でインキュベートされた。インキュベーション後、結合していない二次抗体を除去するため、細胞はＰＢＳで洗浄され、遠心分離された。洗浄された細胞は５００マイクロリットルのＰＢＳに再懸濁され、フローサイトメトリーにより分析された。
【０４０７】
フローサイトメトリー分析：フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）で実施された。
【０４０８】
結果
フローサイトメトリー分析では、胎盤および臍帯由来分娩後由来細胞のいずれも組織因子を表現していることが明らかとなった。血漿凝固アッセイは、組織因子が活性であることを証明した。胎盤および臍帯由来細胞のいずれにおいても、半減期吸光度までの時間（Ｔ１／２  ｔｏ  ｍａｘ、表１３−１）で示されるとおり、凝固率が上昇した。凝固は初期（Ｐ５）および後期（Ｐ１８）細胞の両方で観察された。前記Ｔ１／２  ｔｏ  ｍａｘはＪ８２細胞数と反比例している。組織因子に対する抗体であるＣＮＴＯ  ８５９を用いた臍帯細胞のプレインキュベーションは前記凝固反応を抑制し、それによって組織因子が前記凝固の原因となっていることを示した。
【０４０９】
【表２７】
2007521009.tif 000032
【０４１０】
要約：胎盤および臍帯由来ＰＰＤＣは組織因子を発現し、これは凝固を誘導することができる。組織因子に対する抗体を追加すると、組織因子を抑制することができる。組織因子は通常、不活性な高次構造で細胞に認められるが、機械的または化学的（例えばＬＰＳ）ストレスにより活性化される（Ｓａｋａｒｉａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１０４：１４９〜７４；Ｅｎｇｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２：１５８５〜９７）。従って、ＰＰＤＣの調整プロセス中におけるストレスの最小化は、組織因子の活性化を予防することができる。血栓形成活性に加え、組織因子は血管由来活性と関連していた。従って、組織因子の活性は臍帯または胎盤由来ＰＰＤＣが組織に移植される場合に有益と考えられるが、ＰＰＤＣが静脈内に注入される場合に抑制される必要がある。
【０４１１】
参考文献
Ｄｏｓｈｉ  ａｎｄ  Ｍａｒｍｕｒ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，３０：Ｓ２４１〜Ｓ２５０（２００２）
Ｍｏｌｌ  ａｎｄ  Ｏｒｔｅｌ，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１２７：１７７〜１８５（１９９７）  
【実施例１４】
【０４１２】
血管内皮網形成アッセイ
血管新生、または新しい脈管構造の形成は、新しい組織の増殖に必要である。血管新生の誘導は、多くの病的状態に重要な治療目的である。本研究は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで前記分娩後由来細胞に考えられる血管由来活性を同定することを目的としていた。前記研究の後、基底膜抽出液であるＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）でコーティングした培養皿に内皮細胞を播種する、十分に確立された方法を行った（Ｎｉｃｏｓｉａ  ａｎｄ  Ｏｔｔｉｎｅｔｔｉ（１９９０）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２６（２）：１１９〜２８）。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）で内皮細胞に血管新生因子を処理すると前記細胞を刺激し、毛細管現象と同様のネットワークを形成する。血管新生の刺激物質と阻害物質を治療するため、これは一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイである（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６７（１）：１４８〜５２）。本研究では共培養系を利用し、前記分娩後由来細胞を培養ウェルインサートに播種した。これらの透過性インサートでは、前記内皮および前記分娩後由来細胞の培地成分を受動的に交換することが可能である。
【０４１３】
材料と方法
細胞培地：分娩後組織由来細胞。ヒト臍帯および胎盤が受理され、細胞はこれまでの説明どおり単離された（例１）。ゼラチンコーティングした組織培養プラスチックフラスコで、増殖培地（ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス））中、細胞が培養された。前記培地は３７℃で５％ＣＯ２によりインキュベートされた。実験に使用された細胞は、継代４〜１２であった。
【０４１４】
活動的に増殖する分娩後由来細胞は、１インサート当たり１５，０００細胞でＣＯＳＴＡＲ  ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ直径６．５ミリメーターの組織培養インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）にトリプシン処理、計数、播種された。細胞は標準的な増殖条件下、３７℃で増殖培地中、４８〜７２時間前記インサートに培養された。
【０４１５】
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）：ｈＭＳＣはＣａｍｂｒｅｘ（メリーランド州ウォーカーズビル）から購入され、ＭＳＣＧＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ）に培養された。前記培地は標準的な増殖条件下でインキュベートされた。
【０４１６】
活動的に増殖するＭＳＣは、１インサート当たり１５，０００細胞でＣＯＳＴＡＲ  ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ直径６．５ミリメーターの組織培養インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）にトリプシン処理、計数、播種された。細胞は標準的な増殖条件下、増殖培地中、４８〜７２時間前記インサートに培養された。
【０４１７】
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）：ＨＵＶＥＣはＣａｍｂｒｅｘ（メリーランド州ウォーカーズビル）から入手された。細胞はＥＢＭまたはＥＧＭの内皮細胞培地いずれか（Ｃａｍｂｒｅｘ）において、別の培養で増殖された。標準的な増殖条件下、標準的な組織培養プラスチックで細胞が増殖された。前記アッセイに使用された細胞は、継代４〜１０であった。
【０４１８】
ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）：ＨＣＡＥＣはＣａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（メリーランド州ウォーカーズビル）から入手された。ＥＢＭまたはＥＧＭの培地処方において、これらの細胞も別の培地で管理された。標準的な増殖条件下、標準的な組織培養プラスチックで細胞が増殖された。実験に使用された細胞は、継代４〜８であった。
【０４１９】
血管内皮網形成（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）アッセイ：製造業者の仕様書に沿って、培養プレートはＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）でコーティングされた。つまり、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）は４℃で解凍され、約２５０マイクロリットルが冷却された２４ウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに均等に分割、分配された。前記プレートは３７℃で３０分間インキュベートされ、前記物質が凝固された。積極的に増殖した内皮細胞培地は、トリプシン処理、計数された。細胞は、２％  ＦＢＳを用いた増殖培地中で、前記上清の遠心分離、懸濁、吸引により２回洗浄された。約０．５ミリリットルの増殖培地で２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを用い、２０，０００細胞／ウェルのコーティングしたウェルに細胞が播種された。次に、細胞を定着させるため、細胞は約３０分間インキュベートされた。
【０４２０】
次に、内皮細胞反応の陽性コントロールとするため、内皮細胞増殖は１０ナノモルのヒトｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）または１０ナノモルのヒトＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）で処理された。分娩後由来細胞が播種されたトランスウェルインサートは、前記インサートチャンバーに２％ＦＢＳを用いた増殖培地で適切なウェルに追加された。培養は、約２４時間、５％ＣＯ２により３７℃でインキュベートされた。前記ウェルプレートは前記インキュベーターから除去され、前記内皮細胞培地の画像はＯｌｙｍｐｕｓ倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ニューヨーク州メルビル）を用いて回収された。
【０４２１】
結果
胎盤由来細胞または臍帯由来細胞を用いた共培養系で、ＨＵＶＥＣが細胞ネットワークを形成する（データは示されていない）。ＨＵＶＥＣ細胞は、ｈＭＳＣおよび１０ナノモルのｂＦＧＦを用い、共培養実験で限定された細胞ネットワークを形成する（データは示されていない）。治療を行わないＨＵＶＥＣ細胞で示されたネットワークの形成は、非常に少ないか、全くなかった（データは示されていない）。これらの結果は、前記分娩後由来細胞が前記ＨＵＶＥＣを刺激する血管新生因子を放出することを示唆している。
【０４２２】
胎盤由来細胞または臍帯由来細胞を用いた共培養系で、ＣＡＥＣが細胞ネットワークを形成する（データは示されていない）。
【０４２３】
表１４−１は、増殖培地で前記分娩後由来細胞により放出される、既知の血管新生因子のレベルを示している。上述の通り、分娩後由来細胞はインサートに播種された。前記細胞は前記インサートに４８時間、大気中の酸素下、３７℃で培養され、次に２％ＦＢＳ培地に切り替え、３７℃で２４時間戻された。培地は除去され、直ちに凍結、−８０℃で保存され、前記ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）で分析された。示された結果は繰り返し測定の平均である。前記結果は、前記分娩後由来細胞が、検出可能なレベルの血小板由来増殖因子−ｂｂ（ＰＤＧＦ−ｂｂ）またはヘパリン結合表皮性増殖因子（ＨＢＥＧＦ）を放出しないことを示している。前記細胞は、メタロプロテアーゼ組織インヒビター−１（ＴＩＭＰ−１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の測定可能量を実際に放出する。
【０４２４】
【表２８】
2007521009.tif 000033
【０４２５】
表１４−２は、前記分娩後由来細胞により放出される、既知の血管新生因子のレベルを示している。上述の通り、分娩後由来細胞はインサートに播種された。前記細胞は前記インサートに４８時間、５％の酸素、増殖培地で培養され、次に２％ＦＢＳ培地に切り替え、５％Ｏ２インキュベーションに２４時間戻された。培地は除去され、直ちに凍結、−８０℃で保存され、前記ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）で分析された。示された結果は繰り返し測定の平均である。前記結果は、前記分娩後由来細胞が、検出可能なレベルの血小板由来増殖因子−ｂｂ（ＰＤＧＦ−ｂｂ）またはヘパリン結合表皮性増殖因子（ＨＢＥＧＦ）は放出しないことを示している。前記細胞は、メタロプロテアーゼ組織インヒビター−１（ＴＩＭＰ−１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の測定可能量を実際に放出する。
【０４２６】
【表２９】
2007521009.tif 000034
【０４２７】
要約：本研究の結果は、分娩後由来細胞がヒト臍静脈と冠動脈内皮細胞の両方を刺激し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）アッセイでネットワークを形成することを示している。この効果は、このアッセイ系で既知の血管新生因子で認められたものと同様である。これらの結果は、前記分娩後由来細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生を刺激するために有用であることを示唆している。  
【実施例１５】
【０４２８】
ＰＰＤＣの移植
前記分娩後臍帯と胎盤由来の細胞は、再生治療に有用である。生物分解性物質を用い、ＳＣＩＤマウスに移植した分娩後由来細胞で作られた組織が評価された。評価された物質は、ＶＩＣＲＹＬ不織布、３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発砲体、ＲＡＤ  １６自己集合性ペプチドヒドロゲルであった。
【０４２９】
方法と材料
細胞培地：胎盤由来細胞と臍帯由来細胞は、ゼラチンコーティングしたフラスコ中、増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｃａｔ．＃ＳＨ３００７０．０３；Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））で増殖された。
【０４３０】
基質の調整：下記に説明された、従来の針穿刺法により不織布の骨格が調整された。商品名ＶＩＣＲＹＬで販売されている、グリコール酸と乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性コポリマーから成る繊維はＥｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州サマービル）から入手された。前記繊維は直径約２０ミクロンのフィラメントであった。前記繊維は次に切断され、２インチの長さにひだを作り、２インチの短繊維を形成した。前記ＶＩＣＲＹＬ短繊維を用い、乾燥した状態の針穿刺不織基質が次に調整された。前記短繊維は標準的な不織機械で開封され、カードを添付された。前記で得られたマットは、クモの巣状の短繊維の形であった。前記クモの巣状の短繊維は針穿刺され、乾燥した状態の針穿刺不織骨格を形成した。前記不織骨格はエタノール中で別のインキュベーションを行い、次に水ですすがれ、前記製造工程中、残留化学物質または処理した酸を除去した。
【０４３１】
３５／６５ポリ（イプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから成る発砲体は、米国特許番号第６，３５５，６９９号で説明されているとおり、凍結乾燥処理により形成された。
【０４３２】
サンプル調整：１００万個の生存可能な細胞は、５ミリリットルの直径で１５マイクロリットルの増殖培地、２．２５ミリリットルの厚さのＶＩＣＲＹＬ不織骨格（６４．３３ミリグラム／立方センチメートル；Ｌｏｔ＃３５４７−４７−１）、または直径５ミリリットルの３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡの発砲体（Ｌｏｔ＃  ３４１５−５３）に播種された。前記骨格をカバーするためにさらに増殖培地を追加する前に、２時間細胞が付着された。細胞は一晩骨格で増殖された。細胞のない骨格も培地にインキュベートされた。
【０４３３】
滅菌１％（ｗ／ｖ）水溶液としてＲＡＤ１６自己集合性ペプチド（３Ｄ  Ｍａｔｒｉｘ、マサチューセッツ州ケンブリッジ、物質移動同意書に基づく）が入手され、これは使用直後、ダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）中、１０％（ｗ／ｖ）スクロース（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）、１０マイクロモルＨＥＰＥＳで１×１０６個の細胞で１：１に混合された。ＲＡＤ１６ヒドロゲル中、細胞の最終濃度は１×１０６細胞／１００マイクロリットルであった。
【０４３４】
試験物質（Ｎ＝４／Ｒｘ）
１．ＶＩＣＲＹＬ不織布＋１×１０６臍帯由来細胞
２．３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発砲体＋１×１０６臍帯由来細胞
３．ＲＡＤ  １６自己集合性ペプチド＋１×１０６臍帯由来細胞
４．ＶＩＣＲＹＬ不織布＋１×１０６臍帯由来細胞
５．３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発砲体＋１×１０６胎盤由来細胞
６．ＲＡＤ  １６自己集合性ペプチド＋１×１０６胎盤由来細胞
７．３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発砲体
８．ＶＩＣＲＹＬ不織布
【０４３５】
動物調整：動物保護法の現在の要件に従って、本研究で利用される動物が処理され、維持された。前記動物保護規定（９  ＣＦＲ）に順守し、実験動物の治療および使用に関するガイド第７版（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ，７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）で公表されている前記現行の基準に従うことで、前記一般法を用いたコンプライアンスが達成された。
【０４３６】
マウス（ハツカネズミ）／フォックスチェイスＳＣＩＤ／雄（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．、インディアナ州インディアナポリス）、５週齢。前記ＳＣＩＤマウスのすべての取扱いは、フード下で行った。前記マウスは個別に体重を量り、６０ミリグラム／キログラムのＫＥＴＡＳＥＴ（ｋｅｔａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ａｖｅｃｏ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、アイオア州フォートドッジ）および１０ミリグラム／キログラムＲＯＭＰＵＮ（ｘｙｌａｚｉｎｅ，Ｍｏｂａｙ  Ｃｏｒｐ．、カンザス州シャウニー）および生理食塩水の混合物の腹腔内注射で麻酔された。麻酔誘導後、前記背側頚部から前記背側腰仙部への前記動物の背部全体において、動物用電気大ばさみで体毛が刈り込まれた。前記部位は次に二酢酸クロルヘキシジンで磨かれ、アルコールで洗い流され、乾燥、１％利用可能なヨウ素溶液のヨードフォア溶液が塗布された。前記眼に眼軟膏が適用され、麻酔期間中の組織の乾燥を予防した。
【０４３７】
皮下移植法：前記マウスの背側で、それぞれ約１．０ｃｍ長の４箇所の皮膚切開が作成された。２箇所の頭蓋部位は脊柱の左側に１箇所、右側に１箇所で、背側外側胸部にわたり、前記肩甲骨の触診された下縁に向かって約５ｍｍ尾側に横に位置していた。別の２箇所は、触診された腸骨稜に向かって約５ｍｍのところで、正中線の各側に１つずつ、尾側仙腰レベルで殿筋部にかけて横に位置していた。インプラントはこれらの部位でランダムに位置していた。前記皮膚は下層の結合組織から分離され、小さなポケットを作り、前記切開部に向かって約１ｃｍのところに前記インプラントを配置した（またはＲＡＤ１６を注入した）。前記適切な試験物質は前記皮下腔に埋め込まれた。前記皮膚切開は金属クリップで閉じられた。
【０４３８】
動物の飼育：マウスは個別に温度範囲６４°Ｆ〜７９°Ｆ、相対湿度３０％〜７０％で研究経過中、マイクロアイソレーターケージで飼育され、約１２時間／１２時間の明暗サイクルで管理された。前記温度と相対湿度は、前記に述べられた、考えられる最も大きな範囲内に管理された。食事はＩｒｒａｄｉａｔｅｄ  Ｐｉｃｏ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｈｏｗ  ５０５８（Ｐｕｒｉｎａ  Ｃｏ．）から成り、水は自由に摂取させた。
【０４３９】
マウスは二酸化炭素を吸入させることで、指定された間隔で安楽死された。覆っている皮膚を用いた皮下移植部位は、組織像を取るために切除され、凍結された。
【０４４０】
組織像：インプラントで切除された皮膚は、１０％中性緩衝化ホルマリン（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ  Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ミシガン州）で固定された。覆っている、隣接した組織を用いたサンプルは、ルーティンな方法により中心で二等分され、パラフィン処理され、切除した表面に包埋された。マイクロトームにより５ミクロンの組織切片が得られ、ルーティンな方法によりヘマトキシリンとエオシン（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｂａｙ  Ｓｈｏｒｅ、ニューヨーク州）で染色された。
【０４４１】
結果
３０日後、ＳＣＩＤマウスに皮下移植された発砲体に組織が最小限内側に伸びていた（データは示されていない）。対照的に、発砲体で満たされた広範な組織に、臍帯由来細胞または胎盤由来細胞が移植されていた（データは示されていない）。
【０４４２】
ＶＩＣＲＹＬ不織骨格で一部組織が増殖していた。臍帯または胎盤由来細胞が播種された不織骨格は、基質沈着と成熟した血管が増加していることが示された（データは示されていない）。
【０４４３】
要約：本研究の目的は、免疫欠乏性マウスの骨格において、ヒト臍帯または胎盤由来の細胞で形成された細胞タイプを決定することであった。合成吸収性不織布／発砲体ディスク（直径５．０ミリメーター×厚さ１．０ミリメーター）または自己集合性ペプチドヒドロゲルにはヒト臍帯または胎盤由来細胞が播種され、ＳＣＩＤマウスの背側脊柱領域で両側性に皮下移植された。本研究では、分娩後由来細胞が生物分解性骨格で良質の組織形成を劇的に増加させることができることを証明している。
【０４４４】
本発明は特に現在の好ましい実施例と関連して示され、説明されたが、本発明は特別に公開され、ここに実証された実施例に限られていることは理解されることとする。本発明の好ましい実施例には多数の変化と修正を行うことができ、そのような変化と修正は、添付の請求項に示されるとおり、本発明の範囲と精神から離れずに行われてもよい。
【配列表】
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【国際調査報告】
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