(57)【要約】  本発明はウラン−キレートペプチドに関し、ウランで汚染された土壌及び水の汚染を除去するための、ならびに、人々を検出及び治療するためのそれらの使用も同様である。前記ペプチドは、４つのカルモジュリンカルシウム結合部位：部位Ｉ：Ｄ２０、Ｄ２２及びＤ２４残基において選択される残基；部位ＩＩ：Ｄ５６、Ｄ５８及びＮ６０残基において選択される残基；部位ＩＩＩ：Ｄ９３、Ｄ９５及びＮ９７残基において選択される残基；部位ＩＶ：Ｄ１２９、Ｄ１３１及びＤ１３３残基において選択される残基；該位置は参考文献でヒトカルモジュリン配列を示す、の少なくとも一つの、一つ、二つまたは三つの残基の、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｈ、Ｙ、Ｎ及びＱからなる群から選択される中性残基の少なくとも一つの突然変異を含むカルモジュリンループの配列を含むへリックス−ループ−へリックス型構造を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルモジュリンの４つのカルシウム結合部位：
・部位Ｉ：残基Ｄ２０、Ｄ２２及びＤ２４から選択される残基、
・部位ＩＩ：残基Ｄ５６、Ｄ５８及びＮ６０から選択される残基、
・部位ＩＩＩ：残基Ｄ９３、Ｄ９５及びＮ９７から選択される残基、
・部位ＩＶ：残基Ｄ１２９、Ｄ１３１及びＤ１３３から選択される残基、
（前記位置は、ヒトカルモジュリン配列（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ｐ０２５９３）を参照して示される）
の少なくとも１つの、１つ、２つまたは３つの残基の、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）及びＧｌｎ（Ｑ）からなる群から選択される中性残基への少なくとも１つの突然変異を含むカルモジュリンループの配列を含むへリックス−ループ−へリックス型構造を有することを特徴とする、ペプチド。
【請求項２】
該突然変異が好ましくは、トレオニン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）またはアスパラギン（Ａｓｎ）中性残基への突然変異であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
該突然変異が好ましくは、残基Ｄ２０、Ｄ２２またはＤ２４のトレオニン残基への突然変異、２つの残基Ｄ２０及びＤ２４の、２つの残基Ｄ２０及びＤ２２の、または、２つの残基Ｄ２２及びＤ２４の、トレオニン、セリンまたはアスパラギン残基への突然変異、あるいは、３つの残基Ｄ２０、Ｄ２２及びＤ２４の、トレオニン、セリンまたはアスパラギン残基への、突然変異であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
カルモジュリンカルシウム結合部位突然変異であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項５】
それぞれが、アミノ酸残基の化学架橋を許容する残基、特に、システインがジスルフィド架橋を介して結合するシステイン残基への突然変異を含むへリックスを有する環状ペプチドであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項６】
突然変異Ｆ１９Ｃ及びＶ３５Ｃを有することを特徴とする、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
アミノ酸残基の蛍光アミノ酸残基への突然変異も含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項８】
前記蛍光アミノ酸残基がチロシン残基またはトリプトファン残基であることを特徴とする、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
Ｔ２６Ｙ、Ｔ２６Ｗ、Ａ１５Ｗ及びＦ１６Ｗ：からなる群から選択される突然変異を有することを特徴とする、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
配列番号４−７または配列番号９−１２の配列の一つを有することを特徴とする、請求項１から９のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１１】
少なくとも一つのフルオロフォアと結合されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１２】
二つの異なるフルオロフォアと結合されることを特徴とする、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記フルオロフォアがＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＣｏｐＧＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ：から選択される蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項１１または請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記フルオロフォアがダンシル、クマリン、フルオレセイン及びＡｌｅｘａ誘導体から選択されることを特徴とする、請求項１１または請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１５】
腎臓及び／または骨を標的とすることを許容する少なくとも一つの分子と結合することを特徴とする、請求項１から１４のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１６】
ｉｎ  ｖｉｖｏで、その排泄を促進する分子と結合することを特徴とする、請求項１から１４のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一つに記載の少なくとも２つの同じでも異なってもよいペプチドの連結を含むことを特徴とする、ポリペプチド
【請求項１８】
請求項１７に記載の少なくとも一つのポリペプチド及び少なくとも一つの好適なビヒクル含むことを特徴とする、ペプチド組成物。
【請求項１９】
適切なタンパク質の配列との、請求項１から１０のいずれか一つに記載の少なくとも一つのペプチドの配列のイン−フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）融合物からなることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項２０】
前記ペプチドの配列が、カルシウムに結合できる、カルモジュリン、後者由来のカメレオンタンパク質及びへリックス−ループ−へリックス型モチーフを有するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の配列に融合されることを特徴とする、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１３または１４に記載の少なくとも一つのフルオロフォアと結合されることを特徴とする、請求項１９または請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記タンパク質の末端の一つが蛍光供与体と結合し、他方が蛍光受容体と結合することを特徴とする、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
その末端の一つに、ＥＢＦＰまたはＥＣＦＰの配列を、及び、他方の末端に、ＥＧＦＰまたはＥＹＦＰの配列を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
ウランで汚染された土壌及び水を検出するための試薬を調製するための：請求項１から１６のいずれか一つに記載のペプチド、請求項１７に記載のポリペプチド、請求項１８に記載のペプチド組成物及び請求項１９から２３のいずれか一つに記載の融合タンパク質、からなる群から選択されるプロダクトの使用。
【請求項２５】
ウランで汚染された個体を診断するための試薬を調製するための：請求項１から１６のいずれか一つに記載のペプチド、請求項１７に記載のポリペプチド、請求項１８に記載のペプチド組成物及び請求項１９から２３のいずれか一つに記載の融合タンパク質、からなる群から選択されるプロダクトの使用。
【請求項２６】
請求項１から１６のいずれか一つに記載のペプチド、請求項１７に記載のポリペプチド、または請求項１９から２３のいずれか一つに記載の融合タンパク質をコードする配列を含むことを特徴とする、単離した核酸分子。
【請求項２７】
カルシウムイオン結合タンパク質の、へリックス−ループ−へリックス型モチーフに、あるいは、このモチーフの一つのへリックスまたはループに隣接した約１０から３０ヌクレオチドの配列を含み、請求項２６に記載の核酸分子を特異的に検出／増幅できることを特徴とする、プローブ及びプライマー。
【請求項２８】
請求項２６に記載の核酸分子からなるインサートを含むことを特徴とする、真核または原核組換えベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載の組換えベクターで改変されることを特徴とする、真核または原核細胞。
【請求項３０】
請求項２６に記載の核酸分子で改変された細胞を含むことを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３１】
請求項２６に記載の核酸分子で改変された細胞を含むことを特徴とする、トランスジェニック植物。
【請求項３２】
生物発光タンパク質をコードする遺伝子のレギュレーターまたはリプレッサーとしての請求項１から１６のいずれか一つに記載のペプチドを含む調節システムで改変された原核または真核細胞。
【請求項３３】
ウランで汚染された土壌及び水のレメディエーションのための、請求項２９に記載の改変された原核または真核細胞の、または、請求項３１に記載のトランスジェニック植物の使用。
【請求項３４】
ウランで汚染された土壌及び水を検出するための試薬を調製するための、請求項３２に記載の改変された原核または真核細胞の使用。
【請求項３５】
ウランで汚染された個体を診断するための試薬を調製するための、請求項３２に記載の改変された原核または真核細胞の使用。
【請求項３６】
請求項１から１６のいずれか一つに記載のペプチドに選択的に結合することを特徴とする、抗体。
【請求項３７】
少なくとも：請求項１から１６のいずれか一つに記載のペプチド、請求項１７に記載のポリペプチド、請求項１８に記載のペプチド組成物、請求項１９から２３のいずれか一つに記載の融合タンパク質、請求項３６に記載の抗体、あるいは、請求項３２に記載の改変された原核または真核細胞を含むことを特徴とする、ウランによる汚染を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウラン−キレートペプチド、および、土壌及び水の汚染を除去するための、ならびに、ウランで汚染された個体を検出及び処置するための、それらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウランは、通常、非常に低い濃度で環境中に、同位体２３８（９９．２７％）及び２３５（０．７２％）の形態で、存在し、これは弱い放射線毒性のα粒子の放出を介して崩壊し；ウラニル形態（ＵＯ２２＋）は、酸化雰囲気におけるウランの最も一般的な形態を表す。
【０００３】
しかし、特定の場所において、例えばウラン鉱山近く、保管場所（核管理または劣化ウラン弾薬の貯蔵）、あるいは、原子力事故の場合に、この金属の濃度は非常に高くなり得、そして、それが腎臓及び骨に蓄積する：腎組織に対する毒性及び骨組織癌の発生、という事実のために、ヒトに危険性を示す。
【０００４】
汚染された場所及び個体の汚染除去は、第一に、環境中の及び汚染された個体の体内のウランの毒性を中和するための手段を有すること、そして、第二に、この金属に効果的及び特異的な検出試薬を要求する。しかし、特に、それらの汚染除去を行うための、ウランを検出できる（センサー）、ならびに、汚染された環境及び／または生物学的な媒体に存在し得る、この毒性金属をキレートできるウラン−特異的リガンドの欠如のために、ウランを検出する及び汚染を除去するための効果的な手段は現在存在しない。
【０００５】
土壌の汚染を除去するための現在の処置は、単に、堀削、採集及び適当な場所における貯蔵により、または、キレート剤を使用するウランの抽出により行われる；これらの物理化学処理は高価であり、あまり特異的でなく、または、全く特異的ではなく、そして、非常に広い汚染表面の処理にあまり好適でなく、そしてまた、ウランへの繰り返しの暴露のために、操作員に対する汚染の高いリスクが存在する。あるいは、ウランで汚染された土壌及び水の汚染を除去するために、生きている生物体（より高等の植物または微生物）を使用することが提案されている。この方法は、金属の吸収、ゆえに、これらの生物体によるこれらの封印に基づく。例えば、植物は、根より毒性金属を吸収すること及び葉にそれらを蓄積することができ、これは後に適当な場所に採集され及び貯蔵される；現在利用可能な生物体は、高濃度の毒性金属の抽出、耐性及び蓄積に関するそれらの低性能のために、汚染した土壌及び水の効果的な汚染除去を許容しない。
【０００６】
ウランで汚染しているであろう個体中のウランの検出は、ｅｘ  ｓｉｔｅで、プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）により行われる；この技術は、実施することが困難であり、そして高価である。
【０００７】
ウランで汚染された個体の処置は、ウランを結合するキレート剤の投与によって行われ、そして、その排泄を促進し、ゆえに、腎臓及び骨におけるその沈着を減少する。主なウラン−キレート剤の中で：ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、没食子酸、スルホカテコール（ｓｕｌｆｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、カルボキシカテコール（ｃａｒｂｏｘｙｃａｔｅｃｈｏｌ）及びヒドロキシピリジノン、が挙げられ得；これらのキレート剤は、ウラン−特異的でない欠点を有する。
【０００８】
特に水性媒体または生物試料において、特定の金属を特異的に検出するために、様々なアプローチが開発されている：
−蛍光化学センサー（Tsien, 1993: Fluorescent chemosensors for ion and molecule recognition, pages 130-146, Czarnik AW (ed), American Chemical Society, Washington DC）；これらの蛍光センサーは、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムに特異的であり；一方、ウラン−特異的化学センサーは記載されていない；
−少なくとも一つの蛍光基で標識された、ジンクフィンガードメイン由来の、約２６アミノ酸のペプチドからなる蛍光ペプチドセンサー（バイオセンサー）（Walkup et al., 1996, J. Am. Soc., 119, 3443-3450; Godwin et al., 1998, J. Am. Soc., 118, 6514-6515; Walkup et al., 1997, J. Am. Soc., 119, 3443-3540）。亜鉛イオンの存在下、これらのペプチドバイオセンサーは、金属を取り巻く構造を形成し、そして、結果として、金属の濃度に依存する蛍光放出における変動を生じる環境変化に該蛍光基を暴露する。あるいは、該ペプチドが２つの好適な蛍光基と結合される時、亜鉛の該ペプチドとの結合は、結果として２つのフルオロフォアの間のエネルギーの効果的な移動に有利なコンフォーメーション変化を生じ（Fluorescence Resonance Energy Transfer or FRET）、結果として金属の濃度に比例した蛍光シグナルの放出を生じる（上記のWalkup et al., 1996）。「ジンクフィンガー」ドメインの構造のために（これは、亜鉛のように、四面体のジオメトリーを備えたイオンのキレートに適する）、これらのバイオセンサーは、ウランをキレートすることを可能にせず、これは、酸化されたメディウムにおいて最も一般的であるそのウラニル形態（ＵＯ２２＋）において、配位数７−８を備えた五角形のまたは六角形の両錐体ジオメトリー（ウランＶＩ）を示す；
−「カメレオン（ｃｈａｍｅｌｅｏｎｓ）」と呼ばれる、そのＮＨ２末端からそのＣＯＯＨ末端を、連続して含む融合タンパク質からなる、蛍光タンパク質センサー：クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰ蛍光タンパク質の青色またはシアン突然変異体（ＥＢＦＰまたはＥＣＥＰ、蛍光供与体）、Ｎ−及びＣ−末端ドメインならびにカルシウムイオン−結合部位Ｉ及びＩＩを含むカルモジュリン（ＣａＭ）、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）のカルモジュリン−結合ドメインから由来する２６残基のカルモジュリン−結合ペプチド、そして、同じ蛍光タンパク質の別の緑色または黄色突然変異体（ＥＧＦＰまたはＥＹＦＰ、蛍光受容体）（Miyawaki et al., Nature, 1997, 388, 882-887）。カルシウムのカルモジュリンへの結合は、融合タンパク質におけるコンフォーメーション変化の原因であり、これは、ペプチドが結合する新しい部位を形成し、そして、２つの蛍光タンパク質の間の結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）及び蛍光供与体（ＥＢＦＰまたはＥＣＦＰ）から蛍光受容体（ＥＧＦＰまたはＥＹＦＰ）への効果的なエネルギー移動に有利なスペースにおける位置決定をもたらし、ゆえに、該蛍光受容体により放たれた蛍光における増加をもたらす。より広範囲のカルシウム濃度に対してより感受性があり及び特異的である他の「カメレオン」蛍光指示体もまた得られている（Truong et al., Nature Struct. Biol., 2001, 8, 1069-1073）。カルシウムのカルモジュリン−ＭＬＣＫｐ複合体への結合により引き起こされるコンフォーメーション変化に基づく、この蛍光指示体システムは、カルシウム特異的であり、そしてゆえに、他の金属イオン、例えばウラニル、を検出することを可能にしない；
−へリックス−ループ−へリックスモチーフ由来の、重金属に対して選択的なペプチドリガンド（Borin et al., Biopolymer, 1989, 28, 353-369; Dadlez et al., FEBS Lett., 1991, 282, 143, 146; Marsden et al., Biochem. Cell. Biol., 1990, 68, 587-601; Shaw et al., Science, 1990, 249, 280-283; Reid et al., Arch. Biochem. Biophys., 1995, 323, 115-119; Procyshyn et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 1641-1647）；これらのペプチドは水性媒体においてそれらのへリックスの乏しい構造（ｐｏｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）及び二価金属に対して低い親和性を示す（ミリモーラーオーダーのＫｄ）；
−光シグナルとして毒性金属の存在を反映できるプロモータを含む細菌（Bechor et al., Biotechnol., 2002, 94, 125-132; Lee et al., Biosen. Bioelectron., 2003, 18, 571-577）；これらのシステムにおいて、毒物は細胞ストレス因子として作用し、そして生物発光タンパク質の変化した発現を誘導し、これは検出されたシグナルを示す；これらのシステムは、ゆえに、ウラン及び毒性金属に対して一般に特異的ではない。
【０００９】
汚染された環境または生物媒体に存在し得るこの毒性金属を検出（センサー）及びキレートできるウラン−特異的リガンド（それらの汚染除去を行うための）は現在存在しないことが上記から明らかになる。環境中の（土壌、水など）及び生きている生物体中のウランの特異的なキレート化は、かなり過剰の他の金属（ウラン−結合に対する競合物であるアルカリ土類金属またはランタニドのような）の存在のために、やはり、行うことが難しい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ゆえに、本発明者は、彼らに、ウラニル形態（ＵＯ２２＋）において、ウラン（ＶＩ）を特異的にキレートできる薬剤を提供することを目的に与えている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
カルモジュリン（質量１６．７ｋＤａを有する）は真核細胞に広く存在し、そして、カルシウム濃度の変化により媒介される様々な細胞コンパートメント間のシグナル翻訳において重要な役割を担う。細胞内のカルシウム濃度の上昇に応じて、それは、それが様々な細胞タンパク質ターゲットに結合し、そして、活性化することを許容することを許容するコンフォーメーション変化を受ける。この構造変化は、トロポニンＣにおいて観察され、そして、筋収縮に不可欠であるものと類似している。Ｘ線構造は決定され、そして、該タンパク質が２つのＮ−及びＣ−末端ドメインを有することを示し、それぞれは、例えばトロポニンＣ及びパルブアルブミン（ｐａｒｖａｌｂｍｉｎ）のような、多くの他のカルシウム結合タンパク質に存在する、へリックス−ループ−へリックス型の２つのカルシウムイオン−結合部位、カルシウムをキレートすることに関して最も一般的な構造モチーフ、を含む。このモチーフの構造は、全てのタンパク質において高く保存され；１２アミノ酸のループは２つのアルファ−へリックスにより形づくられ；該ループはアスパラギン酸及びグルタミン酸残基を介して、そしてまた、ペプチド骨格のカルボニル基により及び水分子により、金属に配位結合する。ヨツヒメゾウリムシ（Paramecium tetraurelia）カルモジュリン部位Ｉ（図１）の詳細な構造は、該カルシウムが五角形両錐体ジオメトリーにあることを示し；Ｃａ−Ｏ距離は、２．１と２．３Åの間であり、そして、解離定数は、低親和性部位Ｉ及びＩＩに関しては１０μＭ及び高親和性部位ＩＩＩ及びＩＶに関しては１μＭのオーダーにある。これらの部位の間の協同は実証されている；部位Ｉ及びＩＩへのカルシウム結合は、一般的に部位ＩＩＩ及びＩＶの親和性を増加する。キレート化ループの配列は、カルモジュリンにおいて非常に保存される。実際、ヒト及びほとんどの脊椎動物は、このループに同じ配列を有する。
【００１２】
ヨツヒメゾウリムシ（Paramecium tetraurelia）カルモジュリンのカルシウム−結合部位のヘリックス−ループ−へリックスモチーフの配列を基準にして、本発明者は以下の特性を有する突然変異ペプチドを調製している：
−それらは、−単離したペプチドの形態で、及び、特定の金属存在下で−  へリックスヘリックス−ループ−へリックス構造と両立できる秩序あるコンフォーメーションを示す、及び、
−それらは、−単離したペプチドのまたは該ペプチドの少なくとも一つの配列を含むタンパク質の形態で−  他の金属、種々の緩衝液、あるいは、ウランのそれらと類似の配位特性を有する他の生理学的なまたは天然のイオン存在下であっても、高親和性でそのウラニル形態にあるウラン（１μＭオーダーのＫｄ）に選択的に結合する。
【００１３】
一つ以上のこれらのペプチド配列を含むこのようなペプチドまたはタンパク質は：
−この毒性金属の結合、吸収及び蓄積に関して増大した能力を有し、それがウランで汚染された土壌及び液体の生物学的な汚染除去に有用である、このペプチド配列に富むタンパク質を発現する改変された新規微生物及び新規植物種の生産、
−それが、特に汚染され得る個体中の、ウランの特異的検出に有用である、ウランに対する新規蛍光ペプチド及びタンパク質センサーの製造、
−光シグナルとしてウランの存在を反映するための感受性エレメントとして、１つから４つのウラン−選択的部位を含む、ウラン特異的ペプチドまたはカルモジュリンタンパク質を使用する新規の改変された微生物の生産、及び、
−ウランで汚染された個体の処置のための新規薬剤の処方、
における使用を有する。
【００１４】
ゆえに、本発明の主題は、それが、カルモジュリンの４つのカルシウム−結合部位：
．部位Ｉ：残基Ｄ２０、Ｄ２２及びＤ２４から選択される残基、
．部位ＩＩ：残基Ｄ５６、Ｄ５８及びＮ６０から選択される残基、
．部位ＩＩＩ：残基Ｄ９３、Ｄ９５及びＮ９７から選択される残基、
．部位ＩＶ：残基Ｄ１２９、Ｄ１３１及びＤ１３３から選択される残基、
（該位置は、ヒトカルモジュリン配列（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ｐ０２５９３）を参照して示される）
の少なくとも１つの、１つ、２つまたは３つの残基の、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）及びＧｌｎ（Ｑ）からなる群から選択される中性残基への少なくとも１つの突然変異を含むカルモジュリンループの配列を含むへリックス−ループ−へリックス型構造を有することを特徴とする、ペプチドである。
【００１５】
前記ペプチドの有利な実施形態に従うと、該突然変異は、好ましくはトレオニン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）またはアスパラギン（Ａｓｎ）中性残基への突然変異である。
【００１６】
この実施形態の有利なアレンジメントに従うと、突然変異は、好ましくは、残基Ｄ２０、Ｄ２２またはＤ２４のトレオニン残基への突然変異、２つの残基Ｄ２０及びＤ２４の、２つの残基Ｄ２０及びＤ２２の、または、２つの残基Ｄ２２及びＤ２４の、トレオニン、セリンまたはアスパラギン残基への、突然変異、あるいは、３つの残基Ｄ２０、Ｄ２２及びＤ２４の、トレオニン、セリンまたはアスパラギン残基への、突然変異である。
【００１７】
本発明に従うと、ウラニルが配位数７（五角形のまたは六角形の両錐体のジオメトリー）を有する配位錯体を得るために、ウラニルに、頂点位における二つの酸素原子に加えて、該両錐体の「スクエアベース（ｓｑｕａｒｅ  ｂａｓｅ）」の４つの頂点に位置する５または６配位原子を提供するように、本発明に従うペプチドは、少なくとも１つの残基２４または２つの他の残基を１つまたは２つの中性残基で置換することによって、ループ（Ｄ２０、Ｄ２２及びＤ２４、Ｅ３１）に存在するカルボン酸残基の数が、４未満であるような方法で減少するように、対応する天然のペプチドと比較して改変される。
【００１８】
他に示さないかぎり、突然変異の位置は、ヒトカルモジュリン配列（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ｐ０２５９３）を参照して示している。
【００１９】
本発明は、任意の脊椎動物または無脊椎動物カルモジュリンの配列由来のペプチドを包含する。
【００２０】
本発明の目的のために、前記ループは、ヒト配列（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ｐ０２５９３）に関して、位置２０から３１（部位Ｉ）、５６から６７（部位ＩＩ）、９３から１０４（部位ＩＩＩ）及び１２９から１４０（部位ＩＶ）に局在される１２−アミノ酸配列により規定される、カルモジュリンのカルシウム結合部位（部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ）の一つのそれである。
【００２１】
本発明に従うペプチドは、へリックス−ループ−へリックスモチーフのループにおいて少なくとも一つの突然変異を含むカルシウム結合部位突然変異からなる。前記カルシウム結合部位は、一つのカルモジュリン部位か、ループがカルモジュリン部位の一つのそれであり、そして、へリックスが、カルシウムを結合できる、へリックス−ループ−へリックス型モチーフを有する別のタンパク質のそれらであるハイブリッド部位のどちらかである。
【００２２】
ゆえに、本発明に従うヘリックス−ループ−へリックス型構造を有するペプチドは、カルモジュリンから完全にまたは部分的に由来する。
【００２３】
前記ペプチドが完全にカルモジュリンから由来する時、それは、カルシウム結合部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに存在する前記ループに隣接するヘリックスの配列、すなわち、ヒト配列（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ｐ０２５９３）を参照して、それぞれ、位置７から１９及び２９から３８（部位Ｉ）、４４−５５及び６５−７８（部位ＩＩ）、７９−９２及び１０２−１１１（部位ＩＩＩ）、そして１１８−１２８及び１３８−１４７（部位ＩＶ）に位置するものに対応する配列、を含む。
【００２４】
あるいは、前記ペプチドが部分的にカルモジュリンに由来する時、それは、カルシウムを結合できる、へリックス−ループ−へリックス型モチーフを有するタンパク質、例えば、トロポニンＣ、パルブアルブミン、カルビンジン、リカバリン（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ）、ニューロカルシン（ｎｅｕｒｏｃａｌｃｉｎ）、カルパイン、オンコモジュリン（ｏｎｃｏｍｏｄｕｌｉｎ）、または、Ｓ１００タンパク質及びＶ１Ｓタンパク質ファミリー及びミオシンのカルシウム結合ドメインのメンバーである、筋カルシウム結合タンパク質、のヘリックスの配列を含む。
【００２５】
前記ペプチドの別の有利な実施形態に従うと、それは、それぞれがアミノ酸残基のシステイン残基への突然変異を含むへリックスを有する環状ペプチドであり、システインはジスルフィド架橋または化学的架橋を許容する他の残基を介して結合する。好ましくは、前記ペプチドは、カルモジュリン部位Ｉから完全に由来し、そして突然変異Ｆ１９Ｃ及びＶ３５Ｃを有する；環状ペプチドはこのような突然変異を有し、そして、特定の金属の結合後、それらが単離されたペプチドの形態にある時、へリックス−ループ−へリックス型の秩序ある構造を有利に示す。
【００２６】
あるいは、共有結合または非共有結合でさえ含む他の改変は、へリックス−ループ−へリックスモチーフを安定化し得、そして、ジスルフィド架橋を置き換え得る。
【００２７】
前記ペプチドの別の有利な実施形態に従うと、それはまた、−上記の突然変異残基とは異なる−、ウラニルの結合により誘導される化学的な環境における変化に感受性である蛍光アミノ酸残基への残基の突然変異を含む；好ましくは、前記残基は、ウラニル結合部位から２０Å未満の距離で、ループに、または、ヘリックスに、配置され得る。前記蛍光アミノ酸は、有利には、チロシン残基（Ｙ）またはトリプトファン残基（Ｗ）、そして特に次の残基：Ｔ２６Ｙ、Ｔ２６Ｗ、Ａ１５ＷまたはＦ１６Ｗ、である。
【００２８】
上記の実施形態の有利なアレンジメントに従うと、前記ペプチドは次の配列：配列番号４−７または配列番号９−１２、の一つにより定義されるカルモジュリン部位Ｉの突然変異であり；これらのペプチドの突然変異は表１に説明される。
【００２９】
前記ペプチドのまた別の有利な実施形態に従うと、それは、適切なアミノ酸残基で、例えば、コンフォーメーション変化、及び、ウラニルを前記フルオロフォア標識ペプチドに結合することにより誘導される化学的な環境における変化に感受性がある位置１５及び１６で、ダンシル、クマリン、フルオレセイン及びＡｌｅｘａ誘導体のような、少なくとも一つの適切なフルオロフォアと結合される。
【００３０】
前記ペプチドの別の有利な実施形態に従うと、ウラニルが２つのフルオロフォアで標識された前記ペプチドに結合する時、蛍光供与体から蛍光受容体へのエネルギー移動（フルオロフォアは共にさらなる接近をもたらす）に好ましいコンフォーメーション変化を誘導する位置で、それは、二つの異なるフルオロフォア、それぞれ蛍光供与体及び蛍光受容体、に結合される。
【００３１】
フルオロフォアの中で、蛍光タンパク質、特にＧＦＰ及びその突然変異体（ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＧＦＰ）、及び、海洋生物由来の他の蛍光分子、例えば、ＤｓＲｅｄ、熱帯海域の赤色蛍光タンパク質Ｄｉｘｏｓｏｍａ（Bowen B. et al., Photochem. Photobiol., 2003, 77, 4, 362-369）、特にＥｖｒｏｇｅｎ（www.Evrogen.com）により流通されている、ＣｏｐＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質（緑色単量体ＧＦＰ様タンパク質）、またはＰｈｉＹＦＰ、特にＥｖｒｏｇｅｎ（www.Evrogen.com）により流通されている黄色蛍光タンパク質、が挙げられる。
【００３２】
前記ペプチドのまた別の有利な実施形態に従うと、任意の適切な方法によって、それは腎臓及び／または骨を標的とすることを許容する分子、例えば、特異的ｓｃＦｖ分子、特異的成長因子または特異的ペプチド、と連結される。
【００３３】
前記ペプチドのまた別の有利な実施形態に従うと、任意の適切な方法によって、それはｉｎ  ｖｉｖｏでその排泄を促進する分子、例えば、ポリエチレングリコール分子、と連結される。
【００３４】
本発明の主題はまた、上記の少なくとも２つの同一または異なるペプチドの連結を含むことを特徴とする、ポリペプチドである。
【００３５】
様々な結合部位の間の協同のために、このようなポリペプチドは、ウランに対する親和性を高める。
【００３６】
本発明の主題はまた、任意の適切な方法によって互いに連結する、上記の少なくとも２つの同一または異なるペプチドの連結を含む、上記のポリペプチド、及び、少なくとも一つの好適なビヒクルを含むことを特徴とする、ペプチド組成物である。
【００３７】
本発明の主題はまた、適切なタンパク質の配列を備えた、上記の少なくとも一つのペプチドの配列のイン−フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）融合物からなることを特徴とする、融合タンパク質である。
【００３８】
本発明に従うと、前記ペプチドは、前記タンパク質の許された部位で、すなわち、本発明に従う少なくとも一つのペプチドの配列にそれが融合される時、分離したペプチドのそれのオーダーの、ウランＶＩに対する親和性及び特異性を前記融合タンパク質に与えるこのタンパク質の領域で、融合される。
【００３９】
適切なタンパク質の中で、上述した、Miyaki et al.及びTruong et al.に記載される原理に従い、カルシウムを結合できる、へリックス−ループ−へリックスモチーフを有するタンパク質、特にカルモジュリン及び後者のタンパク質由来のタンパク質、特に「カメレオン」センサー、が挙げられ得る。
【００４０】
例えば、前記タンパク質が、カルモジュリンまたは後者由来のカメレオンタンパク質である場合、前記ペプチドの配列が代わりに、そして、カルモジュリンの対応する配列の代わりに、すなわち、天然のループ（突然変異されていない）または天然のへリックス−ループ−へリックスモチーフ（突然変異されていない）の代わりに、挿入される。
【００４１】
前記融合タンパク質の有利な実施形態に従うと、任意の適切な方法により、それは、上記の少なくとも一つのフルオロフォアと結合される。好ましくは、前記タンパク質の一つの末端が、蛍光供与体と結合し、そして、別の末端が蛍光受容体と結合される。好ましくは、前記タンパク質は、その末端の一つで、ＥＢＦＰまたはＥＣＦＰの配列を、及び、他方の末端で、ＥＧＦＰまたはＥＹＦＰの配列を含む。
【００４２】
ウランに高い親和性及び特異性を示す上記の蛍光ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、汚染された土壌及び水中の、そしてまた、ウランで汚染され得る個体由来の、適切な生物試料、特に体液試料中の、ウランを検出及びアッセイに有用なウランＶＩ特異的な蛍光センサーを表す。
【００４３】
ゆえに、本発明の主題はまた、ウランで汚染された土壌及び水を検出するための試薬を調製するための、そしてまた、ウランで汚染された個体を診断するための、上記の、ペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質の、あるいは、カルシウムを結合できるタンパク質のへリックス−ループ−へリックス型構造を有するペプチドからなる群から選択されるペプチド、の使用である。好ましくは、前記ペプチド及び前記融合タンパク質は、上記の、少なくとも一つのフルオロフォアと結合される。
【００４４】
本発明の主題はまた、ウランで汚染された個体の処置において使用するための医薬を調製するための、上記のペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質の、あるいは、カルシウムを結合できるタンパク質のへリックス−ループ−へリックス型構造を有するペプチドからなる群から選択されるペプチドの使用である。
【００４５】
前記使用に従うと、カルシウムを結合できる前記タンパク質は、特にトロポニンＣまたはパルブアルブミンである。このような場合、使用されるペプチドは、タンパク質全体に相当するか、それが各へリックスの少なくとも一つの残基のシステイン残基への突然変異を含むかのいずれかであり、その結果、へリックス−ループ−へリックス型の秩序ある構造を有する環状ペプチドを得る。
【００４６】
本発明に従うペプチドは、当業者のそれらに知られている固相または液相合成の従来技術により調製される。本発明に従うタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により調製され、これは、当業者に知られている。
【００４７】
ゆえに、本発明の主題はまた、上記の、ペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする配列を含むことを特徴とする単離した核酸分子でもある。
【００４８】
本発明の主題はまた、上記のカルシウムイオン結合タンパク質の、へリックス−ループ−へリックス型モチーフに隣接するまたは重なる約１０から３０ヌクレオチドの配列、このモチーフのへリックスまたはループの一つ、特にカルモジュリン、を含むことを特徴とするプローブ及びプライマーであり；これらのプローブ及びこれらのプライマーは、本発明に従うペプチドをコードする前記核酸分子を特異的に検出／増幅することを可能にする。
【００４９】
本発明に従う核酸分子は、Current Protocols in Molecular Biology （Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc., Library of Congress, USA）に記載されるもののような標準プロトコールに従う、それ自身公知の、従来法によって得られる。
【００５０】
本発明に従うペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列は、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによる核酸配列の増幅により、あるいは、相同のプローブを使用するハイブリダイゼーションによるゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得られ得る。例えば、これらは、上記の適切なプラーマー対を使用するＰＣＲにより増幅される。
【００５１】
本発明の主題はまた、上記のペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸分子からなるインサートを含むことを特徴とする真核または原核の組換えベクターである。真核または原核の宿主細胞にそれを導入する、及び、それを保持するために、興味のある核酸分子が挿入され得る多くのベクターは、それ自身公知である；適切なベクターの選択は、このベクターに想定される使用に（例えば、興味ある配列の複製、この配列の発現、染色体外形態における配列の保持、あるいは、宿主の染色体物質への組込み）、そしてまた、宿主細胞の性質に左右される。例えば、ウイルス性ベクターまたはプラスミドのような非ウイルス性ベクターが使用され得る。
【００５２】
好ましくは、前記組換えベクターは、適切な転写または翻訳調節エレメントの制御下で、前記核酸分子またはそれらの断片が配置される発現ベクターである。さらに、前記ベクターは、前記インサートの５’及び／または３’末端でイン−フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で融合された（ｔａｇ）配列を含み得、これは、前記ベクターから発現される融合タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの固定、及び／または、検出、及び／または、精製に有用である。
【００５３】
これらのベクターは、
それ自身公知の従来の組換えＤＮＡ及び遺伝子工学方法により構築され、そして宿主細胞に導入される。
【００５４】
本発明の主題はまた、上記の組換えベクターで改変される真核または原核細胞である。
【００５５】
本発明の主題はまた、上記の核酸分子で改変される細胞を含むことを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物である。
【００５６】
本発明の主題はまた、上記の核酸分子で改変される細胞を含むことを特徴とするトランスジェニック植物でもある。
【００５７】
本発明の主題はまた、調節システムで改変された原核または真核細胞であり、これは、ウラン及び光シグナルの存在を反映する。例えば、本発明に従うペプチドの構造は、生物発光タンパク質をコードする遺伝子、例えば、ｌｕｘ遺伝子、のレギュレータまたはリプレッサーに挿入され得る；このように改変されたこのレギュレータまたはリプレッサーへのウランの結合は、水銀−感受性ｍｅｒＲリプレッサーに関して既に記載されたもの（Summers AO et al., Annu. Rev. Microbiol., 1986, 40, 607-634）と同様のメカニズムに従い、遺伝子の転写、そしてゆえに、生物発光タンパク質の発現を許容する。
【００５８】
上記の核酸分子で改変された原核または真核細胞及び上記のトランスジェニック植物（これは本発明に従うペプチド配列でエンリッチにされたタンパク質を発現する）は、ウランの結合、吸収及び蓄積に関して高まった能力を有する；ゆえに、それらはウランで汚染された土壌及び液体の汚染除去に有用である。
【００５９】
ゆえに、本発明の主題はまた、ウランで汚染された土壌及び水の汚染除去のための、
上記の核酸分子で改変された原核または真核細胞の、または、上記のトランスジェニック植物の使用である。
【００６０】
上記の形質転換細胞はまた、特に、上記のペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質の生産に有用である。
【００６１】
さらに、上記のプロモーターで改変された原核または真核細胞は、ウランＶＩを特異的に検出する上で有用である。
【００６２】
ゆえに、本発明の主題はまた、ウランで汚染された土壌及び水を検出するための、そしてまた、ウランで汚染された個体を診断するための試薬を調製するための、上記のプロモーターで改変された原核または真核細胞の使用である。
【００６３】
本発明の主題はまた、ウラン存在下または非存在下で、上記のペプチドに選択的に結合することを特徴とする抗体であり；このような抗体は、上記の突然変異を有さないへリックス−ループ−へリックス型ペプチドに結合しない。
【００６４】
本発明は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体のようなキメラ抗体及びこれらの断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ）を含む。
【００６５】
このような抗体は、上記のペプチド、ポリペプチド及び融合タンパク質を、適切な支持体において、精製すること及び固定することに、あるいは、上記のペプチドで、ポリペプチドでまたは融合タンパク質と複合化された形態のウランを検出するために有用である。
【００６６】
本発明の主題はまた、少なくとも：上記のペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質または抗体、あるいは、上記のプロモーターで改変された原核または真核細胞を含むことを特徴とするウランによる汚染を検出するためのキットである。
【００６７】
上述のアレンジメントの他に、本発明はまた、以下の記載から明らかになる他のアレンジメントも含み、これは、本発明に従う抗原の及び抗体の使用例、そしてまた、本出願の配列を要約する表Ｉ（ここで、突然変異されているカルモジュリン残基は太字及び下線で示される）及び添付の図面に言及する。
【００６８】
【表１】
2007537695.tif 000002
【実施例】
【００６９】
実施例１：材料及び方法
１）ペプチド合成
ペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ペプチドシンセサイザー、モデル４３３Ａを用い、、Ｆｍｏｃ化学により（これは、アミノ酸のα−アミン官能基の一時的保護のためのフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を使用する）固相合成した。アミノ酸側鎖のために使用される保護基は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒ残基に対するｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ｔＢｕ）；Ａｓｐ、Ｇｌｕに対するｔｅｒｔ−ブチルエステル（ＯｔＢｕ）；Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｃｙｓに対するトリチル（Ｔｒｔ）；Ｌｙｓに対するｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）；及びＡｒｇに対する２、２、５、７、８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）であった。
【００７０】
カップリング反応は、樹脂（０．１ミリモル）に対してアミノ酸１０当量（１ミリモル）の過剰量の存在下で行われた。後者は、第一に、２０％ピペリジン溶液を使用して、Ｆｍｏｃ基について、脱保護された。過剰のピペリジンは、Ｎ−メチル−ピロリドン（ＮＭＰ）で洗浄することにより除去した。脱保護反応は、ジベンゾ−フルベンピペリジン付加物の３０５ｎｍにおけるＵＶ検出によりモニターした。並行して、アミノ酸は、１ｍｌのＮＭＰ及びＮＭＰ中の１−Ｎ−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）の１Ｍ溶液の１ｍｌからなる混合液に溶解した。そして、ＮＭＰ中の１Ｍ  Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の１ｍｌ溶液を添加し、その結果、アミノ酸の活性エステルを形成させた。４０分後、この活性エステルを、脱保護樹脂を含むリアクターに導入した。
【００７１】
合成の最後に、該樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）で数回洗浄した。ペプチドの開裂及びアミノ酸側鎖の保護基の脱保護は、酸性条件下で行われた。該樹脂は、周囲温度で、撹拌しながら、３時間、８１．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％フェノール、５％チオアニソール、５％水、２．５％エタンジチオール及び１％トリイソプロピルシランの溶液に懸濁した（樹脂グラムあたり１００ｍｌ）。焼結ガラス上において濾過後、反応メディウムをジイソプロピルエーテルで沈殿させ、次いで、遠心分離した。ペレットはこの上清から分離し、次いで、ＴＦＡに溶解した。エーテルでの再沈殿及び遠心分離後、該ペレットを２０％の酢酸に再度溶解し、そして凍結乾燥した。
【００７２】
得られた粗反応生産物は、９０分間、０−６０％のアセトニトリルのグラジエントを使用したＶｙｄａｃ  Ｃ１８逆相分離カラム（１．０×２５．０ｃｍ）上で最初に精製した。そして、純粋な直鎖ペプチドを凍結乾燥し、次いで、２００ｍｌの１００ｍＭトリス溶液、ｐＨ８．０に再度溶解した。当量の５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を添加し、その結果、２つのシステイン間の分子内ジスルフィド架橋の特異的な形成をもたらした。そして、該反応メディウムを酸性化し、次いで、粗反応生産物に対する同じ方法を使用して精製した。純粋な生産物のフラクションを混合し、次いで、凍結乾燥した。該生産物の純度は、エレクトロスプレー質量分析法により確認した。
【００７３】
保存溶液は、水に溶解することにより調製し、濃度は、チロシンに関して１２８０Ｍ−１．ｃｍ−１、ジスルフィド架橋に関して１２０Ｍ−１．ｃｍ−１及びトリプトファンに関して５６９０Ｍ−１．ｃｍ−１のモル吸光係数を使用して、分光光度法により決定した。
【００７４】
２）金属
使用した全ての金属塩は、硝酸塩（純度＞９９．９％、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）である。保存溶液は硝酸でｐＨ＝２に酸性化し、水酸化物の形成を抑制した。
【００７５】
３）蛍光
蛍光スペクトルは、サーモスタッドキュベットホルダーを備えたＣａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  分光計（Ｖａｒｉａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）において記録した。使用した励起波長は２８０ｎｍであり、励起において１０ｎｍ及び発光において２．５ｎｍのスロット幅を用いた。スペクトルは、１ｃｍ光路を備えたキュベットにおいて３００ｎｍと４５０ｎｍの間で記録した。
【００７６】
４）時間分解レーザー分光蛍光法（ＴＲＬＳ）
２６６ｎｍで作動し及び周波数２０Ｈｚで４ｎｓパルスにおけるエネルギー１ｍＪを送るＮｄ−ＹＡＧレーザー（ｍｉｎｉｌｉｔｅモデル、Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）を、励起源として使用した。光線は、４ｍｌの石英キュベットに、次いで、石英レンズにより「Ｆｌｏ  ２００１」分光蛍光計（Ｄｉｌｏｒ、Ｆｒａｎｃｅ）の測定セルに向けた。そして、該光線をポリクロメーターの入り口で集束させ、そして、シグナルは、ペルティエ効果（−３０℃）を使用して冷却した１０２４光ダイオードのアレイを使用して検出した。スペクトルは、０．５秒の期間、光ダイオードにより検出されたシグナルを統合することにより記録した。レーザーでシンクロナイズした電子回路は、５０μｓの期間に対して９０μｓの遅延後に検出を行うことを可能にした。アセンブリはコンピューター（Ｄｅｌｌ）により制御した。
【００７７】
５）エレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）
ポジティブ検出モードエレクトロスプレー質量スペクトルは、Ｑ−ＴＯＦ  ＩＩデバイス（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）で記録した。分析するサンプルは、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を介してソースに導入した。窒素は、乾燥用及び８０℃に加熱したソースとの衝突ガスとして使用した。コーン電圧は３０ボルトであり、そして、３５００ｋＶの高電圧をキャピラリーに印加した。サンプル溶液のフローレートは、５μＬ．ｍｉｎ−１に固定した。スペクトルは、スキャン速度６ｓ／ｓｃａｎで、４００と３０００ｍ／ｚの間で記録した４０スキャンの平均を表す。
【００７８】
６）円二色法（ＣＤ）
ＣＤスペクトルは、サーモスタットキュベットホルダーを備え、ＣＤＭａｘプログラムを使用してコンピュータ制御したＣＤ６デバイス（Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ）で記録した。化合物は、ｐＨ６．５、１ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液中、５μＭの濃度で、可溶化した。スペクトルは、０．１ｍｍの光路のキュベットを使用して１８０ｎｍと２５０ｎｍの間で、周囲温度で、記録した。各スペクトルは、積分時間０．５ｓ及びステップ０．５ｎｍで得た４つの連続した蓄積の平均を表す。スペクトルは、ＣＤＭａｘプログラムを含むアルゴリズムを使用してなめらかにした。
【００７９】
実施例２：カルモジュリン部位Ｉ由来の環状ペプチドの調製及び重金属キレート化の分析
１）環状ペプチドの調製
円二色法により試験したカルモジュリン部位Ｉに一致する３３残基の直鎖ペプチド（ＣａＭ：ＥＱＩＡＥＦＫＥＡＦＡＬＦＤＫＤＧＤＧＴＩＴＴＫＥＬＧＴＶＭＲＳＬ、配列番号１）は、過剰のカルシウムイオン存在下に置かれた時でさえ、秩序正しい構造を示さない。高濃度（１００μＭ）において、おそらく非−構造化へリックスの疎水性部分間の分子間相互作用のために、それは溶液中で凝集する。
【００８０】
ゆえに、安定な天然へリックス−ループ−へリックス構造の形成に好ましくないこれらの相互作用を防止するために、前記ペプチドの１３及び２９位を結合するジスルフィド架橋（それぞれカルモジュリン配列における１９及び３５位に対応する）含むペプチドを調製した。ゆえに、突然変異Ｐｈｅ１９Ｃｙｓ及びＶａ１３５Ｃｙｓを含むペプチドが合成された。さらに、金属の結合をモニターするような方法で、蛍光プローブを座標ループに導入することを可能にするために、突然変異Ｔｈｒ２６Ｔｙｒを挿入した。さらに、ペプチドの２５位でまたはカルモジュリンの３１位で、グルタミン酸は必要に応じてアスパラギン酸に突然変異される（Ｇｌｕ３１Ａｓｐ）。
【００８１】
合成されたペプチドは、以下の配列（図２及び表Ｉ）を有し、ここで、突然変異は太字で示す。：
【００８２】
【化１】
2007537695.tif 000003
【００８３】
２）重金属に対する環状ペプチドの構造及び親和性の分析（ペプチドＣａＭ−Ｍ１ｃ及びＣａＭ−Ｍ２ｃ）
ａ）ペプチドＣａＭ−Ｍ１ｃ
対応するペプチドＣａＭ−Ｍ１ｃを合成し、次いで、様々な金属に対するその親和性を質量分析法、円二色法（ＣＤ）及び時間分解蛍光法（ＴＲＬＳ）により試験した。８当量の金属存在下で記録したＣＤスペクトルは、カルシウム、カドミウム、テルビウム、ユーロピウム及びウランに対して良好な親和性を、そしてまた、コバルトに対しては弱い親和性を示す。相互作用は、アルカリ土類金属カラムのほかの元素（Ｍｇ、Ｓｒ、Ｂａ）では検出されない。
【００８４】
ペプチドＣａＭ１ｃの円二色法（ＣＤ）分析は、最小値１９０ｎｍで無秩序な構造に典型的なスペクトルを示す（図３）。二次構造の不在が、プロトン核磁気共鳴分光法（１Ｈ  ＮＭＲ）により確認された。溶解したカルシウムを添加する場合、ＣＤスペクトルは、最小値２０６及び２２２ｎｍで、らせん状コンフォメーションに典型的である形態をとる。そして、ＣＤによるＣａＭ１ｃ滴定を行い、そして、２２２ｎｍにおける二色性シグナルの強度は、添加したカルシウムイオンの濃度の関数として報告された（図４）。実験ポイントを通る結合等温曲線は、Ｃａ／ペプチド化学量論  １／１を実証し、そして、３０μＭの解離定数Ｋｄを算出することを可能にする。
【００８５】
金属不在下のペプチドの質量スペクトルは、それぞれ、５−、４−及び３−倍のプロトン化ペプチドに対応する、７３６．８、９２０．７及び１２７．３ｍ／ｚで３つの主なピークを示す。ペプチドに対するカルシウムの増大する濃度の導入は、同じチャージ状態を示す１：１  ペプチド：カルシウム錯体に矛盾のない、７４４．４、９３０．６及び１２４０．５ｍ／ｚでの新しいピークを伴う、このスペクトルの改変を導く。金属フリーのペプチド及び該錯体が類似のシグナル応答を有すると仮定すると、Whittal et al.により記載されるように（Prot. Sci., 2000, 9, 332-343）、ＣＤ滴定により算出された値に一致する、Ｋｄ＝３０μＭを与える（表ＩＩ）、解離定数が算出でき得る。
【００８６】
ランタニドイオンは、分子の生物学的研究におけるカルシウムモデルとしてしばしは使用されている（Linse et al., J. Biol. Chem., 1991, 266, 8050-8054）。テルビウムの及びユーロピウムの溶液を使用するペプチドＣａＭ−Ｍ１ｃの分光蛍光滴定（１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液中２０μＭ溶液、ｐＨ６．５）は、時間分解レーザー蛍光（ＴＲＬＳ）により行われる（図５）。この分光法は、金属の励起に基づき、蛍光シグナルの時間分解が続き、そして、蛍光は短寿命であるが強い強度であるフルオロフォアの存在のために、制限を克服する（上に記載のWhittal et al.）。励起波長２６６ｎｍを使用すると、二つのランタニドの蛍光放出は、１：１のランタニド：ペプチド比に対応する限界までの金属から放出される蛍光における増加を伴って、ペプチドのＴｙｒ２０を介するエネルギー移動メカニズムにより観察される。テルビウムに関して、より強い放出は５４５ｎｍに位置する。ユーロピウムの場合、スペクトルは、５９３及び６１８ｎｍで蛍光励起最大値を示す。ランタニド濃度の関数としての蛍光放出強度の測定（Ｔｂ３＋に関しては５４５ｎｍ及びＥｕ３＋に関しては６１８ｎｍ）及び結合等温線に対するこれらのデータの適合性は、解離定数Ｋｄ（Ｔｂ３＋）＝３．５μＭ及びＫｄ（Ｅｕ３＋）＝０．６μＭの測定値を導く（表ＩＩ）。
【００８７】
ウラニルイオンの場合、ウラニルイオンのペプチドへの結合の研究は、水中でのこの金属の複雑なスペシエーションにより困難になる（図６）。特に、ｐＨ６．５において、該スペシエーション図は、優先種が（ＵＯ２）３（ＯＨ）５＋（６７％）及び（ＵＯ２）（ＯＨ）＋（１７％）であることを示す。このｐＨにおいて、５％のウラニルイオンＵＯ２２＋のみが残存する。質量分析によるペプチドと形成した錯体の分析は、ウランがＵＯ２２＋形態で配位していることを示す。ここで、全てのウラン種は蛍光性であり、そして、従来の蛍光法を使用して、溶液に存在する複数種のただ一つの種をモニターすることは困難である。この問題は、ＴＲＬＳにより解決され、これは以下の原理に基づく：レーザーパルスによる励起後、ユーザーにより選択された遅延の後、蛍光を検出する；８０μｓの遅延は、検出のためにＵＯ２ＯＨ＋以外の全ての種を除去することを可能にする。これらの装置条件下で、励起波長２６６ｎｍを使用して、ペプチドの水溶液の一部分の連続的な添加により、ＵＯ２（ＮＯ３）２の２μＭの溶液を滴定した。この実験は、解離定数Ｋｄ４．７μＭ、表ＩＩ、を測定することを可能にした。
【００８８】
【表２】
2007537695.tif 000004
【００８９】
ｂ）ペプチドＣａＭ−Ｍ２ｃ
さらなる突然変異を含む第二のペプチド、すなわち：カルモジュリン配列の３１位でのグルタミン酸のアスパラギン酸への置換（Ｇｌｕ３１Ａｓｐ）、もまた合成した。アミノ酸の側鎖はメチレン基により短くされ、ゆえに、ループにより形成された空洞はサイズがより大きい。同じＥＳＩ／ＭＳ、ＣＤ及びＴＲＬＳ研究は、このペプチドは全ての二価金属に対する、及び、ウラニルイオンに対する親和性を失うことを示す。テルビウム及びユーロピウムそれぞれに関する解離定数３．５±１μＭ及び３．２±０．８μＭで、ランタニドイオンに対する親和性のみが保持される。
【００９０】
全ての結果は、突然変異Ｐｈｅ１９Ｃｙｓ、Ｖａｌ３５Ｃｙｓ及びＴｈｒ２６Ｔｙｒ、そして必要に応じて、突然変異Ｇｌｕ３１Ａｓｐを含み、ならびに、システイン１９及び３５がジスルフィド架橋により連結された、検討した環状ペプチドが、以下の特性：
−カルモジュリン部位Ｉ（ペプチドＣａＭ）に対応する直鎖ペプチドと異なり、これは秩序ある構造を示さず、そして、溶液中で凝集し、合成された環状ペプチドは安定したヘリックス−ループ−へリックス型構造を有し、そして、
−これらは、カルシウムイオンに対する天然カルモジュリンのそれに匹敵する親和性で、ウランＶＩ（ペプチドＣａＭ−Ｍ１ｃ）を含む、金属イオンを結合することができる、
を有することを示す。
【００９１】
これらの結果はまた、カルモジュリン部位Ｉのループの配列における点突然変異が、様々な金属イオンに対するペプチドの相対的な親和性を変化することを可能にすることを示す。しかし、検討した突然変異ペプチドのいずれもウランＶＩに特異的に結合しない。
【００９２】
実施例３：ウランＶＩに特異的な環状ペプチドの調製
１）ペプチド合成
合成したペプチドは、実施例２に記載するように、突然変異Ｐｈｅ１９Ｃｙｓ、Ｖａｌ３５Ｃｙｓ及びＴｈｒ２６Ｔｙｒ、そしてまた、以下のさらなる突然変異：
−  Ｄ２０Ｔ（ペプチドＣａＭ−Ｍ９ｃ）
−  Ｄ２４Ｔ（ペプチドＣａＭ−Ｍ１０ｃ）
−  Ｄ２０Ｔ及びＤ２４Ｔ（ペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃ）
−  Ｄ２０Ｓ及びＤ２４Ｓ（ペプチドＣａＭ−Ｍ７ｃ）
−  Ｄ２０Ｔ及びＤ２２Ｔ（ペプチドＣａＭ−Ｍ６ｃ）
−  Ｄ２２Ｔ及びＤ２４Ｔ（ペプチドＣａＭ−Ｍ５ｃ）
−  Ｄ２０Ｎ、Ｄ２２Ｎ及びＤ２４Ｎ（ペプチドＣａＭ−Ｍ４ｃ）
−  Ｄ２０Ｔ、Ｄ２２Ｔ及びＤ２４Ｔ（ペプチドＣａＭ−Ｍ８ｃ）
を含む環状ペプチドに一致する。
【００９３】
さらに詳細には、これらのペプチドの配列は（ここで、突然変異した残基は太字で示す）図２及び表Ｉに表す。
【００９４】
カルモジュリンループの３次元構造（ＰＤＢコード：１ＥＸＲ）から得た、突然変異されたカルモジュリン（ペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃ）の座標ループにおけるウラニルの概略図を、図７に示す。
【００９５】
２）様々な金属イオンに対するペプチドの親和性の分析（ペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃ、ＣａＭ−Ｍ４ｃ及びＣａＭ−Ｍ５ｃ）
様々な金属イオン（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｔｂ３＋、Ｅｕ３＋、ＵＯ２２＋）に対するペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃの親和性を、２つの分光法：円二色法（ＣＤ）及びエレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を使用して試験した。
【００９６】
ＣＤスペクトル及びポジティブ検出モードエレクトロスプレー質量スペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）は、実施例１に記載したように記録した。
【００９７】
図８は、過剰のウラニルの添加のみでペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃの二色性スペクトルの改変が生じることを示す。この場合、２０７ｎｍ及び２２２ｎｍで二つの新しい最小値が観察される。これらは、α−らせん状の秩序ある二次構造の特徴を有する。この結果は、ＥＳＩ−ＭＳ分析：溶液へのウラニルの添加のみで、結果として１／１  ペプチド／ＵＯ２錯体の形成と矛盾しない質量ピークが現われる、
により確認される。
【００９８】
ペプチドＣａＭ−Ｍ４ｃ、ＣａＭ−Ｍ５ｃ、ＣａＭ−Ｍ６ｃ、ＣａＭ−Ｍ７ｃ、ＣａＭ−Ｍ８ｃ、ＣａＭ−Ｍ９ｃ及びＣａＭ−Ｍ１０ｃは、円二色分光法及び質量分光法（ＥＳＩ−ＭＳ）において同じ結果を示し、これは、これらのペプチドがカルシウム、ランタニド及び試験した他のイオンと結合せず、ウラン（ＶＩ）のみに結合することを示す。
【００９９】
３）ペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃによるウラン配位結合の分析
ａ）解決されるべき問題（スペシエーション）
生物分子によるウラニルイオンの配位の分析は、生理学的な値に近いｐＨ、例えば６と８の間で予想する。現在、このｐＨにおいて、ウラニルイオンはもはや溶液中でただ一つの形態、ＵＯ２２＋ではなく、この金属コア由来の様々な複合体の形態：例えば、ヒドロキソ及びカーボネート錯体、にある。この現象は、スペシエーションとして言及される。水溶液に存在するそれぞれの種の量は、ウランの濃度、溶存ガス（カーボネート）の濃度に及び金属イオンに関連する熱力学的パラメーターに依存する。ウランについて１μＭの濃度において、スペシエーション図（図６）は、ｐＨ６．５における優先種が、それぞれ、溶液中のＵ（ＶＩ）の５２．１、１６及び２５．３％に相当する、種（ＵＯ２）３（ＯＨ）５＋、ＵＯ２（ＯＨ）２及びＵＯ２（ＯＨ）＋であることを示す。より少量の種はＵＯ２２＋、ＵＯ２（ＯＨ）３−及びウラン／カーボネート錯体である。
【０１００】
従来の蛍光による滴定実験において、これらのウラン種のそれぞれは、励起後に検出される蛍光の全体の強度に寄与する。溶液中に存在するそれぞれの種の寄与を分離することが可能でないため、解離定数の算出は、ゆえに不可能である。この理由に対して、時間分解、すなわち、実施例１に記載された、関係するそれぞれの種の蛍光の寿命の違い、を使用して滴定を行った。レーザーショット（励起）と検出の間が７０μｓより長いか等しい遅延を使用すると、検出される唯一の種はモノヒドロオキソ複合体ＵＯ２（ＯＨ）＋である。
【０１０１】
ｂ）様々な媒体におけるペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃによるウラン配位の分析
ｂ１）水中のウラン配位の分析
２μＭウランを純粋な水性媒体中のペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃで滴定し、このｐＨは水性アンモニアで６．５に調整した。時間分解パラメーター（７０μｓ遅延、１００μｓゲート幅、０．５ｓ積分）は、モノヒドロキシレート化されたウラン種のみを可視化することを可能にした。
【０１０２】
ペプチドの増加量がウランの最初の溶液に添加された場合、ＵＯ２（ＯＨ）＋の蛍光強度は減少し、これはペプチドとの金属の配位を証明する。溶液中のＵＯ２（ＯＨ）＋の濃度は導入されたＵ（ＶＩ）の１７．２１％に等しいという事実を考慮すると、添加したペプチドの濃度の関数として５２０ｎｍにおける強度のグラフは、関係する化学平衡に一致する理論式によりシミュレートされ得る。平衡ＵＯ２（ＯＨ）＋ＣａＭ−Ｍ３ｃ→（ＣａＭ−Ｍ３ｃ）（ＵＯ２）＋ＯＨ−に対応する解離定数は、シミュレーション：Ｋｄ＝３．８±０．３μＭから算出される（図９）。
【０１０３】
ｂ２）ホスフェート媒体中のウラン配位の分析
第二の実験では、１ｍＭホスフェート緩衝液媒体、ｐＨ６．５において、ペプチドによるウランキレート化を検討した。この媒体において、ウラニルは最初ホスフェートイオンとの複合体の形態であり、これらの熱力学的なデータは以下：
【０１０４】
【化２】
2007537695.tif 000005
【０１０５】
のようである。
【０１０６】
ウラン／ホスフェート錯体は、金属イオンの蛍光強度を増加する特徴を有するが、他の知られているリガンドは蛍光の弱化をもたらす。
【０１０７】
ペプチドの水溶液のフラクションを、ｐＨ６．５、１ｍＭホスフェート緩衝液中のＵＯ２（ＮＯ３）２の２．０μＭ溶液に、連続的に添加した。ウラニルイオンの蛍光スペクトル（λｅｘ＝２６６ｎｍ）を、それぞれ添加後に記録した。得られた全てのスペクトルを図１０に表す。
【０１０８】
そして、添加したウランの濃度の関数としての５２０ｎｍでの強度のグラフは、解離定数：
【０１０９】
【化３】
2007537695.tif 000006
【０１１０】
（ここで、［Ｕ］０＝２．０μＭ、Ｋｄは錯体の解離定数、そして［Ｐ］は溶液に添加したペプチドの量を示す）
の式から導き出した関係に従い、ウランとペプチドの間の１／１錯体の形成に一致する結合等温線によりシミュレートされる。実験データ、そしてまた、式（１）によるこれらの解釈を図１１に表す。このアプローチにより算出した解離定数は１８μＭである。
【０１１１】
ｂ３）他のイオン存在下のウラン配位の分析
ペプチドによるウラン配位はまた、他のイオンの混合物存在下で検討した。反応媒体の組成物は、ウラニル蛍光を阻害剤である、カーボネートイオンを除いた、幾つかのフランスの湧き水の平均イオン組成に一致する。試験したメディウムの正確な組成は以下のよう：
［Ｃａ２＋］＝［Ｍｇ２＋］＝２．０ｍＭ
［Ｎａ＋］＝０．４ｍＭ
［ＮＯ３−］＝［ＳＯ４２−］＝４．０ｍＭ
ｐＨ＝６．５
である。
【０１１２】
この媒体は、低濃度のウラン（２０μＭ、２μＭ、０．２μＭ）で人工的に徐々に汚染させる。それぞれの場合、ウラン蛍光の完全な消滅が得られるまで、ペプチドを添加した（図１２）。
【０１１３】
これらの滴定のそれぞれに対して算出した見かけの解離定数は、１０±１μＭである。これらは、ｐＨ６．５の脱イオン水において、及び、ホスフェート緩衝液において算出した解離定数と同じオーダーの大きさにある。これは、第一に、Ｕ（ＶＩ）と他の金属カチオンの間の、及び、第二に、ペプチドと他のウランリガンドの間の競合の不在を実証する：ゆえに、ペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃは、これらの条件下でウランに対して選択的である。
【０１１４】
得られた結果は、突然変異Ｄ２０Ｔ及びＤ２４Ｔを有する、ペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃが、ウランＶＩに選択的であることを示す。検討した濃度範囲（金属に関して０．１μＭから２．０ｍＭ）において、ペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃは、試験した様々な媒体中で、解離定数３．８と１８μＭの間で、ウランに配位する。Ｍｇ、Ｃａ，Ｓｒ、Ｂａ、ＥｕまたはＴｂに対する測定可能な親和性は検出されない。
【０１１５】
実施例４：ウランと天然ウシ脳カルモジュリンの相互作用の分析
１）ウシ脳カルモジュリンタンパク質によるウラン配位の分析
１ｍＭホスフェート媒体中の天然タンパク質によるウランの配位（ウラニル形態において、２．０μＭ）もまた検討した。ウランと該タンパク質の錯形成は、ウラニル蛍光強度の低下により反映される。滴定スペクトルを図１３に示す。他の実験において、１．０ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ７．０）中の硝酸ウラニルの０．４μＭ溶液を、８μＭのタンパク質濃度までカルモジュリンの溶液で滴定した。８μＭのカルモジュリン添加後、カルシウムイオンを８ｍＭの濃度まで添加した（図１４）。カルモジュリンによるウラニルの滴定値は、実験データを、ウランの１つ、２つ、３つまたは４つの独立した部位に対応する式のシステムを使用してシミュレートすることにより解釈した（図１６）。これらのシミュレーションのために、ダイナフィットソフトウェア（Kuzmic, P. 1996, Anal. Biochem. 237, 260-273）を使用した。２つの高親和性部位を考慮したシステムのみ、２つの部位のそれぞれに関して、解離定数３．３±０．４μＭ及び０．７２±０．２μＭを伴って、受け入れ可能なシミュレーションを提示した。カルシウムイオンとの競合の値はまた、好適な式のシステムで解釈し、そして、このシステムを使用した実験ポイントのシミュレーションは、図１７に与えられる。該シミュレーションは、８μＭのカルモジュリン及び０．４μＭのウラニル存在下で、２つの高親和性部位のそれぞれが、同程度の蓋然性のある方法でウランに占められることを考慮して、行った。仮説として、これらの２つの部位のそれぞれが、他と独立しているということもまた考えられる。ゆえに、シミュレーションは、４つの化学平衡：２つは「部位−ウラン（ｓｉｔｅ−ｕｒａｎｉｕｍ）」錯体の解離平衡に一致し、そして、２つは、それぞれの部位におけるカルシウムによるウランの置換に一致する、のシステムを使用して行われる。該シミュレーションは、ウランと錯形成した２つの部位のただ一つのみが、カルシウムで置換され得たことを確認している。これは、カルモジュリンタンパク質がカルシウム錯形成部位でウランに結合し得ることを示す。
【０１１６】
２）  ウラン存在下におけるタンパク質とそのリガンドの相互作用
カルシウム存在下において、カルモジュリンは非常に多様なターゲットに結合し、活性化し得る。これらの中で、１７残基を有し、そして、ウサギ筋ミオシン軽鎖キナーゼ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）のカルモジュリン−結合ドメイン由来である、ＭＬＣＫｐペプチドは、以下の配列：
Ａｃ−ＲＲＫＷＱＫＴＧＨＡＶＲＡＩＧＲＬ−ＮＨ２  （配列番号８）
を有する。
【０１１７】
二つの系統の実験は、ウラニルイオン存在下で、タンパク質がこのリガンドとまだ相互作用し得ることを確かめるために行った。
【０１１８】
第一の系統において、ｐＨ６．５で、１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液中の５μＭの濃度で溶解した、該リガンドのトリプトファンについての蛍光スペクトルは、実施例１に記載するように記録した。
【０１１９】
２８０ｎｍにおける溶液の励起は、水性溶媒に曝されたトリプトファン独特の、３５０ｎｍにおける発光を検出することを可能にする。金属非存在下における、１当量のカルモジュリンの添加は、結果として、３３０ｎｍにおける最大発光の移動及び強度の２５％の増加を生じる。これは、該タンパク質が該リガンドと相互作用し、そして、後者のトリプトファンがより疎水性媒体にあることを示す。１０当量のカルシウムの溶液への添加は、強度における増加（＋２０％）及び３３０ｎｍにおける同じ最大値を示す蛍光発光スペクトルを与える。これらのデータは、カルシウム（ＰＤＢ  １ＣＤＬ）存在下で得たペプチド／カルモジュリン錯体の結晶構造に類似しているという得られた構造に一致する。
【０１２０】
ウラニルの存在下で行われる同じ実験は、結果として、リガンドトリプトファンの蛍光の完全な消滅を生じる（図１５）。これは、カルシウムの場合に得られるものに類似の構造に矛盾しない。実際、後者はフルシェルの金属であり、これは可能な蛍光遷移を示さない。一方、ウランを伴うと、トリプトファンは金属を介して脱励起し、これは蛍光遷移に一致するエネルギーレベルを示す。そして、検出される発光は金属のそれであり（λ＞４５０ｎｍ）、そして、もはやトリプトファンのそれではない。このエネルギー移動現象は、さらに、ウランが、この錯体において、トリプトファンから１５Å（エネルギー移動の最大距離）未満に配置されており、これはペプチドのトリプトファンと４つのカルシウムの２つの間のＸ線構造において測定した距離（１０Å及び６．５Å）に一致することを示す。
【０１２１】
これらの結果は、ウラン存在下で、本発明に従う少なくとも一つのペプチドの配列を含むカルモジュリン由来のカメレオンタンパク質が、ＭＬＣＫ基質ペプチドに結合し、ゆえに、ウランＶＩ特異的バイオセンサーとして使用し得ることを示す。
【０１２２】
実施例５：ウラン及びテルビウムに対するペプチドの親和性及び特異性の比較分析
以下の表ＩＩＩに示すような残基において突然変異した、カルモジュリン部位Ｉ由来のペプチドのＵＯ２２＋及びＴｂ３＋に関する比較親和性は、実験１に記載した技術により、ｐＨ＝７、１ｍＭホスフェート媒体において測定した。
【０１２３】
結果を以下の表ＩＩＩに示す。
【０１２４】
【表３】
2007537695.tif 000007
【０１２５】
これらの結果は、カルモジュリンの錯形成ループにおける、残基Ｄ２４の中性残基での、例えばトレオニン、あるいは、残基Ｄ２０、Ｄ２２及びＤ２４の２つの残基の２つの中性残基での、例えばトレオニンまたはセリン、あるいは、最終的には３つの残基Ｄ２０、Ｄ２２及びＤ２４の中性残基での、例えば、トレオニン、セリンまたはアスパラギンでの置換が、ウラニルに対する特異性を誘導することを実証する。これらの突然変異に関して、カルシウムイオンまたはランタニドに対する親和性は、一般的に、検出限界まで大きく減少する。
【０１２６】
上述から明らかなように、本発明は、まさにより明確に記載している遂行、実施及び適用のその方法のこれらに全く制限されず；反対に、本発明の目的の内容から離れない、当業者に行われ得るこれらの全ての変形を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１は、頂点における、ヨツヒメゾウリムシ（Paramecium tetraurelia）カルモジュリン部位Ｉの三次元構造及びカルシウムイオンの配位；底部における、４部位におけるカルシウム−配位残基を示す。
【図２】図２は、検討したカルシウム部位Ｉ由来のペプチドの配列を示す。
【図３】図３は、０、０．２、０．５、１．０、２．０、５．０及び２０当量に等しい濃度で添加した、１０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）中、カルシウムイオン存在下、環状ペプチドＣａＭ１ｃの５０μＭ溶液の円二色性スペクトルを示す。
【図４】図４は、モル濃度のカルシウムの関数として、ペプチドＣａＭ−Ｍ１ｃの２２２ｎｍにおける円二色性強度の変化、及び、結合等温線へのその適合性を示す。
【図５】図５は、ペプチドＣａＭ−Ｍ１ｃに添加された、モル濃度のテルビウムイオン（５４５ｎｍにおける）及びユーロピウムイオン（６１８ｎｍにおける）の関数として、最大発光における蛍光強度の変化を示す。該曲線は、実験ポイントに適合する結合等温線を表す。
【図６】図６は、１μＭ濃度におけるウラン（ＶＩ）のスペシエーション図を表す。
【図７】図７は、カルモジュリンループの三次元構造（ＰＤＢコード：１ＥＸＲ）から得た、突然変異したカルモジュリン（ペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃ）の座標ループにおけるウラニルの図示である。
【図８】図８は、８当量の様々な金属存在下における、１ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液中のペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃの２０μＭ溶液の二色性スペクトルを示す。
【図９】図９は、ｐＨ６．５における、水中の硝酸ウラニルの２．０μＭ溶液の、ペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃでの、滴定に対応する蛍光スペクトルを示す。
【図１０】図１０は、ｐＨ６．５、１ｍＭホスフェート緩衝液中の硝酸ウラニルの２．０μＭ溶液の、ペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃでの、滴定に対応する蛍光スペクトルを示す。
【図１１】図１１は、ペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃの量の関数としての、１．０ｍＭホスフェート緩衝液中の硝酸ウラニルの２．０μＭ溶液の蛍光発光（５２０ｎｍにおける）の強度における変化、及び、相対的な結合等温式とのその適合性を示す。
【図１２】図１２は、ペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃの量の関数としての、２．０ｍＭカルシウム、２．０ｍＭマグネシウム及び０．４ｍＭナトリウム金属イオン（及び１．０ｍＭホスフェート緩衝液）存在下における、２０．０、２．０及び０．２μＭ硝酸ウラニル溶液の蛍光の減少を示す。この実験は、湧き水における汚染物質として存在するウランの滴定を真似ている。
【図１３】図１３は、１．０ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ６．５）中の硝酸ウラニルの２．０μＭ溶液の、カルモジュリンタンパク質での、滴定のスペクトルを示す。
【図１４】図１４は、カルモジュリンの溶液（０から８μＭ）を使用する、１．０ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ７．０）中の硝酸ウラニルの０．４μＭ溶液の、ＴＲＬＳによる、滴定、そして、カルシウム（０から８ｍＭ）との最終混合物の滴定を示す。各点は、レーザーショットの強度における変化について補正した、溶液中の遊離ウラニルイオンの最大のスペクトルで記録した強度の値を表す。
【図１５】図１５は、カルシウムを伴う（ダッシュ及びドット曲線）またはウランを伴う（ドット曲線）、タンパク質非存在下（ダッシュ曲線）、１当量のカルモジュリン存在下（連続曲線）におけるカルモジュリンリガンドペプチドの蛍光スペクトルを示す。
【図１６】図１６は、ダイナフィット（Ｄｙｎａｆｉｔ）プログラムを使用した、カルモジュリンを伴う０．４μＭウラニル溶液の滴定実験において得られた実験ポイントのシミュレーションを示す。４つのシミュレーションは、タンパク質分子あたりのウランの１から４の高親和性部位を考慮して、プログラムに提案した。結果としてそれだけが実験の正確なシミュレーションであったため、２部位に対応する曲線のみをここに表した。
【図１７】図１７は、各カルモジュリンタンパク質モノマーが互いに独立した２つの部位を含むことを考慮して、ダイナフィットプログラムで得た、カルモジュリンにおけるカルシウムとウラニルの間の競合実験において得た実験ポイントのシミュレーションに一致する。
【配列表フリーテキスト】
【０１２８】
配列番号１はペプチドＣａＭである。
配列番号２はペプチドＣａＭ−Ｍ１ｃである。
配列番号３はペプチドＣａＭ−Ｍ２ｃである。
配列番号４はペプチドＣａＭ−Ｍ３ｃである。
配列番号５はペプチドＣａＭ−Ｍ４ｃである。
配列番号６はペプチドＣａＭ−Ｍ５ｃである。
配列番号７はペプチドＣａＭ−Ｍ６ｃである。
配列番号８はペプチドＭＬＣＫｐである。
配列番号９はペプチドＣａＭ−Ｍ７ｃである。
配列番号１０はペプチドＣａＭ−Ｍ８ｃである。
配列番号１１はペプチドＣａＭ−Ｍ９ｃである。
配列番号１２はペプチドＣａＭ−Ｍ１０ｃである。
【図１】
2007537695.tif 000008
【図２】
2007537695.tif 000009
【図３】
2007537695.tif 000010
【図４】
2007537695.tif 000011
【図５】
2007537695.tif 000012
【図６】
2007537695.tif 000013
【図７】
2007537695.tif 000014
【図８】
2007537695.tif 000015
【図９】
2007537695.tif 000016
【図１０】
2007537695.tif 000017
【図１１】
2007537695.tif 000018
【図１２】
2007537695.tif 000019
【図１３】
2007537695.tif 000020
【図１４】
2007537695.tif 000021
【図１５】
2007537695.tif 000022
【図１６】
2007537695.tif 000023
【図１７】
2007537695.tif 000024
【配列表】
2007537695000001.xml
【国際調査報告】
2007537695.tif 000031
2007537695.tif 000032
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