(57)【要約】  本発明は分析試験システムおよび分析方法に関し、ここでは試料中の検体の定性的および定量的測定のために分子スイッチが用いられ、これらは検体に適した分子スイッチを選択することによって広範な適用性を有する。この分子スイッチは触媒成分、好ましくは酵素、に結合したプローブ、好ましくは核酸または核酸誘導体、を含む。検体は、プローブ中の基質の触媒成分への近接性を変えるような、プローブの構造変化を誘導し、そして触媒活性の変化に対応した、基質の代謝回転の変化が測定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブおよび触媒成分を提示する分子スイッチを含む、分析試験システム。
【請求項２】
プローブが触媒成分と、直接にまたはカップリング成分を介するかのいずれかで共役することを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
分子スイッチの触媒活性が、測定すべき検体をプローブと接触させることで変化することを特徴とする、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
分子スイッチの触媒活性の変化が、検体により引き起こされたプローブの立体構造の変化によるものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５】
核酸または核酸誘導体を、プローブとしてまたはその構成成分として使用することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６】
リボ核酸、デオキシリボ核酸、ペプチド核酸または閉じ込められた核酸を、プローブとしてまたはその構成成分として使用することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７】
プローブとしてまたはプローブ構成成分として使用される核酸または核酸誘導体が、ハイブリダイズした形態で存在していることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドが、プローブとしてまたはプローブ構成成分として使用されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項９】
プローブとしてまたはプローブ構成成分として使用されるオリゴヌクレオチドが、分子内ハイブリダイゼーションを提示することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
酵素、抗体、触媒的に活性な核酸または触媒的に活性な核酸誘導体が、触媒成分としてまたはその構成成分として使用されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１１】
触媒的に活性なリボ核酸、デオキシリボ核酸、ペプチド核酸または閉じ込められた核酸が、触媒成分としてまたはその構成成分として使用されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
酵素が、触媒成分として、またはその構成成分として使用されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の分析試験システムまたは分子スイッチが使用される、試料中の検体の測定方法。
【請求項１４】
試料中の検体を測定するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の分子スイッチの使用。
【請求項１５】
試料中の検体を測定するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の分析試験システムの使用。
【請求項１６】
検体が、核酸または核酸誘導体であることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の分子スイッチ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、調べようとする試料中の検体を特異的に感度良く検出するための分析試験システムおよび方法に関している。
【背景技術】
【０００２】
物質を検出し定量するために多数の分析方法が利用できる。これに関連して、分析すべきまたは検出すべき物質、すなわち検体（analyte）を直接的にまたは間接的に検出する方法を、原理的に、区別することが可能である。直接法の場合、検体の特徴的な物理化学的性質が、検体を可能な限り特異的に感度良く検出するために利用される。例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）またはガスクロマトグラフィー（GC）のようなクロマトグラフィー法が、これに関して使用される。分光測光法、共鳴分光法、質量分析法等の分野の技術もまた用いられる（Becker, Berger等、1993； Hesse, Meier等、1995； Rehm
2002）；参照：明細書の末尾の参考文献リスト。
【０００３】
原理的に、直接分析法の場合に用いられる技術は、間接検出法の場合でも用いられる。しかしながら、後者の場合は、検体をその立体構造的、化学的および物理的性質に応じて、特異的に感度良く検出するために、さらなる特異的な結合過程または化学反応を利用する。この結合過程または化学反応を測定し、続いて検体を検出するために、適切な技術が用いられる。
【０００４】
一般的に、特異性および／または感度を上げるために、化学反応が検体の検出に用いられる。この場合、一般に検体より感度良く検出できる生成物が、選択的反応を用いることによって検体から通常生成される。触媒もまたそれらの反応中で、反応を促進するために用いられる。そうした目的のためには、特に酵素が、その基質特異性およびその高い触媒効率により、使用される（Bergmeyer 1965； Bisswanger 1994）。
【０００５】
必要に応じて、反応生成物の検体特異的な生成もまた、特定の検出技術を適用可能にするために利用される。例えば、適切な波長の範囲で吸収特性を持つ発色性反応生成物の生成は、簡略で感度の良い分光測定的検出のためには優れている。
【０００６】
触媒を化学的または生化学的反応で用いる場合は、次に、以下の方法を利用して、感度および、必要に応じて、特異性をさらに高めることができる。第一の場合は、触媒、好ましくは酵素、は極端に低濃度の検体を選択的に増幅するために使用できる。検体は、それを増幅した後または増幅の間に、初めて特異的かつ高感度で検出される。これは例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の場合である（Saiki, Scharf等、1985； Mullis 1987）。この反応において、ポリメラーゼ、適切な「プライマー」、ヌクレオシド三リン酸および他の補因子の存在下で、特定の核酸配列を増幅するために熱サイクルが使用される。第二の場合は、適切な触媒を、シグナル増幅を行うために使用できる。これは特に検体の存在下で基質を変換する酵素反応を用いて達成できる。これらの方法の特異性は、例えば、免疫学的技術または試験を用いることで達成できる。
【０００７】
これらの免疫学的試験、すなわち酵素免疫測定法（EIA）は、特に生命科学の分野、および生物学的試料中の極微量の検体を測定するための診断において用いられる。最も重要なEIAには、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）および酵素増幅免疫測定法（EMIT）が含まれる。
【０００８】
EMITは均質な液相試験システムであり、主に、様々な医薬品、ホルモン類または代謝物のような低分子量の物質を測定するために用いられる。核酸はEMITを用いては検出されない。 EMITは概してELISAより迅速であるが、一般には, いずれにしてもELISAの高感度を達成することはない。
【０００９】
ELISAは非均質な固相アッセイ法であり、主に抗原および抗体のような高分子を検出するために使用される。いくつかのELISA法はまた核酸を検出するために用いられる。しかしながら、この検出は、一般には抗原−標識化核酸を用いることにより間接的に行われるにすぎない。通常、費用と時間のかかる、例えば、抗原標識化プライマーを使用したPCRによる標的配列の増幅は、こうした場合、最初に行われる。実際に酵素的試験を行うことができるのは、増幅生成物が固定化した相同的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした後、およびさらなる結合過程の後のみである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的はそれゆえに分析試験システム、ならびに多数の異なった検体に対して柔軟に使用でき、そして同時に特異的で経済的な、対応する方法を利用可能にすることである。
【００１１】
本発明の分析試験システムは、迅速に、特異的に、経済的におよび非常に感度の良い方法で、検体を測定できるようにする。本発明は、したがって科学的および診断目的に対して、大きな支援および利益を与える。
【００１２】
本発明はさらに、検体、特に核酸、の迅速で、特異的で、経済的でかつ非常に感度の良い検出の他に、非常に柔軟な方法で、対応する分析系を構築する可能性を提供する。本発明によれば、低分子量の検体および高分子量の検体の両方を測定することが可能である。さらにここで記載された系は多数の触媒系を使用することができ、そして不均質的にも均質的にも操作が可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
新しい分子スイッチシステムはそうした新規な分析系の基盤を形成する。この分子スイッチシステムは触媒成分とプローブとして機能する成分との組合せを基にしている。これに関して、選択された条件下で、特定の検体の存在により分子スイッチシステムの触媒活性が影響を受けそして変えられるような様式で、少なくとも１つの触媒成分と少なくとも１つのプローブが組み合わされる。これに関して、触媒活性の変化は触媒活性の強さまたはその特異性のいずれかに関係付けられる。変化した触媒活性の検出は、続いて検体を特異的で感度良く検出するために用いることができる。
【００１４】
この触媒成分は、１またはそれ以上の基質を１またはそれ以上の生成物に変換するか、またはこの過程に関与するという事実によって特徴付けられる。一方では、このことは触媒成分それ自体が触媒として作用しそして次に反応速度を促進することができることを意味している。順行および逆行反応が等しく加速されるために、触媒は平衡点を変えることはない（Becker, Berger等、1993；Bisswanger 1994）。他方、この触媒成分は、直接の触媒特性を有する必要が無く、触媒過程に関与することができる。
【００１５】
本発明によれば、いかなる触媒も触媒成分として利用することができる。触媒活性を有する無機および有機化合物の両方が触媒成分としての使用に適している。酸および／または塩基として作用する無機および有機化合物が特に適している。好ましいのはルイス酸またはルイス塩基である。さらに、触媒的に活性で、電子伝達に関与しており、それにより酸化還元反応を支えている無機および有機化合物が、特に利用される。
【００１６】
例えば、酸性または塩基性および／または電子伝達性、すなわち酸化還元的に活性である芳香族化合物、複素環式芳香族化合物、有機複合体、タンパク質、特に酵素、ならびに、触媒的に活性な抗体または触媒活性を有する核酸、およびそれらの誘導体、のような有機化合物を用いることができる。
【００１７】
使用可能な無機化合物の例には、金属、合金、金属酸化物、遷移金属錯体および電極系が挙げられる。一般に、鉄、コバルト、ニッケル、パラジウム、白金、銅、銀等の金属、ならびにそれらの合金、塩、酸化物および硫化物、有機金属化合物および遷移金属錯体が、触媒的ルイス酸またはルイス塩基および／または電子担体として機能し、続いて、本発明の触媒成分またはその構成要素として利用することができる（Becker, Berger等、1993）。
【００１８】
適切な無機触媒の選択は触媒される反応に依存する。好ましい実施態様において、例えば、触媒的酸化還元反応と連結した（例えば、フェナジンメトスルフェート（PMS）、ベンゾキノン等のような、変換する酸化還元活性物質と連結した）遷移金属錯体ヘキサシアノ鉄酸IIまたはIIIカリウムを用いることができるが、好ましいのは、例えば、テトラゾリウム塩またはその対応するフォルマザンである。この場合、例えば、ニトロブルーテトラゾリウムのようなテトラゾリウム塩、特にヨードニトロンテトラゾリウム塩化物を用いることができる。
【００１９】
他の好ましい実施態様において、無機化合物、特に金属、合金および金属酸化物は、触媒成分の構成成分として、または触媒成分それ自体として利用できる電極として用いられる。原理的に、いかなる導電性材料をもこれに関して用いることができる。例えば、金属、合金および金属酸化物の使用の他に、導電性プラスチックもしくはセラミックまたは他の複合材料を用いることも可能である。電位に結びついた電極を用いる場合、狭義では必ずしも触媒を扱っているわけではない。この場合、電極は荷電粒子、すなわち電子、を伝達するためにのみ用いられ、これは、例えば、酸化還元系、特に「酸化還元サイクリング」を支えている。この場合もまた、適切な電極の選択は触媒される反応に依存する。好ましい実施態様では、銀、金およびプラチナのような金属が特に利用される。プラチナはその安定性のために特に好ましい。銀および金は、特にカップリング反応を行う電極を用いた場合に用いられる。これに関しては、金の使用が好ましい（Hintsche 1999）。
【００２０】
有機化合物を触媒として用いる場合は、例えば、触媒的に活性な核酸またはその誘導体を、触媒成分としてまたは触媒成分の構成成分として用いることができる。これに関して、リボ核酸、デオキシリボ核酸および核酸誘導体を用いることができる。例えば、糖誘導体、特にペントピラノシル-(2'-4')-オリゴヌクレオチドファミリーの糖誘導体を含む核酸を用いることができる（Beier, Reck等、1999）。これに関して、2' 酸素原子が4' 炭素原子にメチレン架橋を介して結合しているリボース（「閉じ込められた核酸（locked nucleic acids）」）を用いることも考えられる（Kurreck, Wyszko等、2002）。触媒核酸の骨格の変化は、用いられている糖のみに関連するのではなく、糖が互いに結合している様式にも関連し得る。糖リン酸骨格を他の構成要素と完全に置き換えることも当然考えられる。例えば、ペプチド核酸を用いた場合がそうである（NielsenおよびEgholm 1999）。誘導体化骨格を有する核酸を用いる他に、デアミノアデノシン、イノシン等のような異常な塩基、またはビオチン化およびまたジゴキシゲン化塩基、および他の誘導体を含む核酸を用いることもできる。
【００２１】
核酸の他にも、触媒的に活性な抗体および酵素のような、触媒的に活性なタンパク質もまた触媒成分の構成要素または触媒成分それ自体として用いるために適している。原理的に、全ての酵素のクラス（酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素および連結酵素）に属する酵素でも利用できる（Bergmeyer 1965）。これはまた触媒的に活性な抗体または核酸の酵素的活性にも関連している。
【００２２】
酸化還元酵素は一般に酵素分析に非常に適しているので、それらは本発明の適用のために特に有用である。例えば、カタラーゼ等のようなペルオキシダーゼが、特に、ホースラデッシュ・ペルオキシダーゼおよびNADHペルオキシダーゼが使用できる。コレステロール酸化酵素、亜硫酸酸化酵素等のような酸化酵素、特に、キサンチン酸化酵素、アスコルビン酸酸化酵素、グルコース酸化酵素、グルタミン酸酸化酵素、A およびBモノアミン酸化酵素、セミカルバジド感受性アミン酸化酵素、コリン酸化酵素、ならびにガラクトース酸化酵素、を用いることも可能である。グルタチオン還元酵素のような還元酵素を用いることも同様に可能である。この場合、チオレドキシン、グルタレドキシン等のような酸化還元活性タンパク質もまた特に言及できる。酸化還元酵素ルシフェラーゼは特に有用である。他に有用な酸化還元酵素は、例えば、蟻酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、ガラクトース脱水素酵素、グルコース-6-リン酸脱水素酵素、6-ホスホグルコン酸脱水素酵素、ジヒドロリポアミド脱水素酵素、のような脱水素酵素であり、そして、特にジアフォラーゼが適している。ジアフォラーゼのような酵素は、高温のような変性条件に対して高程度の安定性を示し、特に有用である（Vitzthum, Bisswanger等、2000）。
【００２３】
ジアフォラーゼの場合、クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）のジアフォラーゼが、モノマーであることから特に適している。モノマーは、通常、共役体を製造することが容易であり、そして副産物がほとんど生成されないという利点を有している。
【００２４】
シリオルヒヌス・カヌキュラ（Scyliorhinus canicula）のジアフォラーゼのような酵素もまた、特に有用である（Vitzthum, Bisswanger等、2000）。酵素は、高温では、例えば変性する条件では不活性であり、必要に応じて、プローブおよび検体とハイブリダイズしているが、それは不可逆的に変性しているのではない。温度が低下したとき、酵素は再び活性となる。このことは温度が特定の値まで低下したときに始めて反応が顕著に進行するために、基質がこの過程の当初からすでに存在している場合に、有利である。したがって、そうでなければ変性およびハイブリダイゼーションの条件下で生じるある程度の定常活性を減少できる。このことはこのシステムの特異性および感度に対して好ましい効果をもたらす。
【００２５】
使用可能な転移酵素には、例えば、ホスホトランスアセチラーゼ、グルコキナーゼ、酢酸キナーゼ、グルコン酸キナーゼ、グリセロールキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）等が挙げられ、特にヘキソキナーゼが挙げられる。ヘキソキナーゼのような酵素は、基質を変換した場合、かなり大きな構造変化を生じさせるという利点を与え、このことは、検体の、対応する酵素を用いた分子スイッチの活性に対する影響を予想以上に大きくできることを意味している。ヘキソキナーゼの場合、構造変化は「誘導適合」と呼ばれるものに基づいている。
【００２６】
使用できる加水分解酵素は、例えば、ウレアーゼ（ウリカーゼ）、アミラーゼ（アミログルコシダーゼ）、ラクターゼ、β-フルクトシダーゼ（転化酵素、サッカラーゼ）、マルターゼ、β-ガラクトシダーゼ、マルトースホスホリラーゼ、ピロホスファターゼ、ムラミダーゼ（リゾチーム）、ノイラミダーゼ（シアリダーゼ）、PNGアーゼF、エンドグリコシダーゼ（エンド−アルファ−N−アセチルガラクトサミダーゼ）D、エンドグリコシダーゼF、エンドグリコシダーゼH、アセチルコリンエステラーゼ、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、スフィンゴミエリナーゼ等がある。リパーゼ、特にホスホリパーゼ（CおよびDホスホリパーゼならびにホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼC）もまた同様に有用である。しかしホスファターゼ、特にセリン／トレオニンホスファターゼ（PP2A、PP1、PP-2B等）およびチロシンホスファターゼ（CD-45、PTP-1B、LAR等）のようなアルカリ性および酸性ホスファターゼを用いることも可能である。この場合、前立腺酸性ホスファターゼおよびプロテインホスファターゼ１を、特に挙げることができる。さらにメタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、酸性プロテアーゼおよびシステインプロテアーゼのようなプロテアーゼを用いることも可能である。特にサーモリシン、キモトリプシン、トリプシン、プロテイナーゼK、カスパーゼ、エラスターゼ、パパイン、ペプシンおよびカテプシンがこの場合に用いられる。
【００２７】
使用可能な脱離酵素は、例えば、クエン酸脱離酵素またはクエン酸合成酵素およびシュウ酸脱炭酸酵素等である。
【００２８】
使用可能な異性化酵素は、例えば、ホスホグルコース異性化酵素およびムタロターゼ（アルドラーゼ１−エピメラーゼ）等である。
【００２９】
適切な連結酵素の例は、アセチル-CoA合成酵素、NAD合成酵素、グルタミン酸・システイン連結酵素、ホモグルタチオン合成酵素等である。
【００３０】
酵素の他に、触媒としては、低分子量の有機化合物、特に酸化還元活性物質、例えば、ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート（PMS）、2,6-ジクロロフェノールインドフェノール（DCPIP）、メチルビオロゲン、フラビンモノヌクレオチド（FMN）、フラビンアデニンジヌクレオチド、リポ酸、アスコルビン酸、トコフェロール、レソルフィン、レサズリン、ポルフィリン、ヘム化合物、ビリベルジン、およびビリルビンのような芳香族または複素環式芳香族化合物を用いることも可能である。リボ核酸およびデオキシリボ核酸のような核酸、ならびに、ペプチド核酸または閉じ込められた核酸のようなそれらの誘導体は、プローブとして好ましく利用される。誘導体化された骨格を有する核酸を用いる他に、この場合はまた、普通でない塩基を含む核酸を用いることも当然可能である（上記参照）。核酸プローブは好ましくはオリゴヌクレオチドである。原理的に、プローブは２つの形態、すなわちハイブリダイズした形態およびハイブリダイズしていない形態をとっている。例えば、ハイブリダイズした形態は、二本鎖構造の一つ、さもなければ三本鎖または四本鎖構造をとることができる（Rosu, Gabelica 等、2002）。ハイブリダイズした形態は、互いに共有結合していない２つの相同的な核酸一本鎖分子間のハイブリダイゼーションであるか、または二次的構造を形成できるようにする相同的な分子内領域の存在による、一本鎖核酸の分子内のハイブリダイゼーションのいずれかを基にしている。
【００３１】
他の実施態様において、核酸プローブは１またはそれ以上のカップリング基および／または結合成分、すなわち結合パートナーシステムのパートナーを包含するかまたは含有する。これらの構造は、核酸のあらゆる構成成分、すなわち、塩基、骨格または糖もしくはリン酸基を介して共役させることで導入できる。これらのものはプローブの3'末端または5'末端、あるいはその中間領域に組み込むことができる。
【００３２】
原理的に、ここではカップリング成分と結合成分または結合パートナーシステムとの区別をするべきである。カップリング成分は異なった成分を組合せるために用いられ、そして永続的な非共有または共有結合、すなわち異なった成分の共役、組合せまたは連結を導く。カップリング成分は、少なくとも実験またはプロセスの条件下での、成分の安定な共役を確実にする。より正確には、遊離成分と結合カップリング成分との間の平衡は実験または過程の条件下でほとんど変化せず、そして実験または過程の条件には非常にわずかのみ依存しているだけである。それらのカップリング成分の結合は、非常に高いか低いpH値、非常に高いか非常に低いイオン強度、または非常に高い温度のような、通常この試験システムを用いた実験を実施するためには適切でない極端な条件下では、かならずしも安定である必要はない。
【００３３】
逆に、好ましい実験または過程の条件下で、結合パートナーシステムは高い結合の可逆性を示す。すなわち、検体の存在下、および／または、温度および／または溶媒組成のようなパラメータの変化により、既存の結合を切断したり、存在していなかった結合を可能にしたりする。より正確には、遊離および結合している結合パートナーの間の平衡は、実験または過程の条件下でシフトし、そして上記条件に依存している。
【００３４】
したがって、結合パートナーシステムは、可逆的に結合する、プローブ成分、触媒成分および検体に適している。これらの結合パートナーシステムは、特に、核酸に加えて、他の検体が検出される場合に、用いることができる。
【００３５】
この結合パートナーは、特定のリガンドに対して親和性を示す、高分子または高分子の特定のドメインであっていい。例えば、受容体、酵素、抗体またはそれらの結合ドメイン、アフィボデイズR（Affibodies）ならびにアプタマー、アプタマー構造またはアプタマー配列、および特に光アプタマーを使用することできる（Smith, Collins等、2003）。
【００３６】
光アプタマー、原理的に、少なくとも１つの光反応基を提供するどのような他のプローブでも同様に、例えば、共有結合していない検体が光反応の結果として、プローブと共有結合するようになるという利点を提供する。非均質的な試験システムの場合は、特に、このことは非特異的な結合を減少させられるような、ストリンジェントな洗浄を可能にする。このことは結果的に高い感度をもたらす。
【００３７】
これに関しては、分子スイッチが、固相、例えば粒子、特に磁気粒子、またはマイクロタイタープレートのような反応容器の表面へ結合している場合にとりわけ有利である。液相からの固相の分離は効率的な洗浄工程を行うことを可能にする。
【００３８】
アフィボデイズRに加えて、他の設計された反復タンパク質のような抗体様分子、およびそれらの誘導体（Forrer, Stumpp等、2003）、ならびに、アンチカリンまたはジュオカリンのような抗体様タンパク質スカッフォルドを用いることも可能である（Skerra 2000；Skerra 2001）。
【００３９】
設計された反復タンパク質またはタンパク質スカッフォルドは、例えば、アンキリンまたはロイシンに富んだ反復構造から製造することができる。抗原、基質、補基質、阻害物質、置換基等のようなリガンドを、親和性を有する構成要素として、プローブ中に導入することも同様に考えられる。プローブのそれぞれの構成要素または成分は相応して互いに共役される。
【００４０】
結合成分または結合パートナーは検体の結合に関与する。これに対して、カップリング成分は分子スイッチの異なった成分を確実に安定に結合するために使用される。カップリング成分が提供する結合、すなわち化学結合または共役は、共有であっても非共有であってもいい。本発明によれば、全ての可能な共有および非共有結合をこのために利用することができる。
【００４１】
適切な共有結合には、メチレン、メチン、エーテル、チオエーテル、カルボキシルエステル、アミド、アミン、シフ塩基またはアゾメチン、エナミン等による結合が含まれる。好ましいのは、慣用のカップリング反応を用いて簡単、迅速かつ経済的に得られる結合を合成させることである（Becker, Berger 等、1993）。これに関して、この成分の反応基を、直接お互いに、または、カップリング成分もしくは架橋剤を用いて、または、必要な場合は、アビジンおよびビオチンのような結合パートナーを用いても、結合させることができる。アルデヒド、イミデート、特にイミドエステル、カルボキシル無水物、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、特にN-ヒドロキシ-スクシンイミドエステル、マレイミド、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、ヒドラジド、イソシアネート、グリオキサール等のような適切な官能基、またはアリールアジドのような光活性化可能な官能基を含む架橋剤をこの目的で用いることができる。グルタルジアルデヒドおよびジメチルスベルイミデートのような同質官能性の架橋剤、ならびに異なった官能基を有する異質官能性の架橋剤のいずれも用いることができる（ピアス（Pierce）社のカタログ）（Becker, Berger等1993；Rehm 2002）。触媒成分とプローブ成分との間の共有結合の他の化学修飾もまた考えられる。シフ塩基による結合は、例えば、より安定なアミンへと還元できる（Becker, Berger等1993）。
【００４２】
非共有結合はファン・デル・ワールス力、疎水性およびイオン性相互作用、ならびに、水素結合および配位結合を基にすることができる。したがって、本発明によれば、例えば、ニッケル−ヒスチジンキレートのような金属キレート錯体等を用いることができる。さらに、リガンドと高分子の非共有結合、例えば、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンとの結合、およびジゴキシゲニンと対応する抗体との結合を用いることもできる。さらに酵素基質または酵素補基質、補因子または置換基を有するプローブを提供し、それによりプローブを触媒成分として機能する酵素へ結合させることも考えられる。
【００４３】
さらに、もっぱら低分子量の物質の相互作用の利用も考えられる。これに関して、例えば、異なった物質、好ましくはサリチルヒドロキサム酸を1,2-フェニルジボロン酸により、複合化することを引き合いに出すことができる（Stolowitz, Li 等、2002）。
【００４４】
さらに、生物工学的に変換したタンパク質または酵素をカップリングプローブおよび触媒成分として使用することもできる。この場合、適切な発現系と、例えば、プロテインキナーゼA、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、His、Dsb、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、NusA等のようなタグとの融合構築体を考える。さらに、特定部位の変異誘発（分子モデリング）またはランダムな突然変異誘発により変換されたタンパク質を用いることも可能である。これに関して、突然変異誘発により変換したタンパク質は、官能基を特定の位置に導入して、構成成分を適切に連結するようにすることができるという利点を持つ。この場合、必要ならば、インビボ翻訳システムよりも、無細胞インビトロ翻訳システムを使用することが好ましく、それはそのシステムでは非常に特異的なカップリング反応を可能にする非天然性アミノ酸を、特定の部位に導入できるからである。
【００４５】
本発明の分析方法をより詳細に以下に記載する：
新規な分子スイッチを適切な方法を用いて分析目的で用いることができる。この方法では、少なくとも１つの分子スイッチを分析すべき試料と接触させる。適切な実験条件、例えば、温度および／または溶媒の組成を選択することにより、必要な場合に試料中で存在できる検体（検出すべき物質）が、特異的に分子スイッチのプローブ成分に結合する。この結合過程はプローブの立体構造を変換し、それにより触媒成分の、ならびに最終的には分子スイッチの、構造および触媒活性もまた同様に変換する。プローブの重要な立体構造の変化が、核酸成分のハイブリダイゼーション状態を基にしていることから、至適なハイブリダイゼーションン過程を可能にするための適切な温度および溶媒のパラメータを選択する必要がある。
【００４６】
原理的に、少なくとも３つの異なった筋書きが考えられる。第一の場面では、媒体または溶媒の組成および温度は一定のままでありながら、検体の存在により、検体のプローブへの結合が導かれる。第二の場面では、媒体または溶媒の組成は一定のままでありながら、少なくとも１つの温度変化により、検体がプローブと結合できるように、プローブの安定性および／または立体構造を変えることができる。第三の場面では、温度は一定のままでありながら、媒体または溶媒の組成の少なくとも１つの変化により、検体がプローブと結合できるように、プローブの安定性および／または立体構造を変えることができる。原理的に、それらのシナリオを組み合わせることも可能である。この筋書きの結果は、検体のプローブへの結合であり、それにより分子スイッチの活性に測定可能な変化が生起するような、プローブの立体構造の変化である。温度変化を用いた場合、例えば、互いにハイブリダイズしているプローブ領域を、温度の連続的または段階的上昇で融解することが可能である。逆に、相同的なプローブ領域の再会合を、温度の連続的または段階的低下により起こすことができる。これに関して、検体の存在は、融解プロセス、またはそうでなければ、特に、相同的プローブ領域の再会合を変化させ、それにより最終的に分子スイッチの活性の変化を導き、そして検体を検出できるようにする。
【００４７】
相同的プローブ領域の融解および再会合の温度依存性は、次に、溶媒、特に特定の塩および有機成分の存在、およびそれらの濃度、ならびにプローブの組成、特に核酸塩基組成および相同的領域の長さに依存している。さらに、プローブの濃度、したがって分子スイッチの濃度、ならびに、必要な場合は、存在する検体の濃度もまた、速度論的局面という点から考えなければならない。速度論的局面はハイブリダイゼーションにおいても重要であることから、適切なインキュベーション時間を選択することによって過程に影響を与えることも可能である。
【００４８】
特に、二本鎖核酸の融解が一次反応に従って生じるのに対して、会合または再会合は二次反応で記載されるために、速度論的局面もまたハイブリダイゼーション過程に関連して重要である（Smith, Britten等、1975； Galau, Britten等、1977； Torsvik, Goksoyr等、 1990； Torsvik, Daae等、1998）。したがって、二本鎖プローブの融解は、例えば、以下の式に従って起こり：
ｄ[一本鎖プローブ]／dt＝k1[二本鎖プローブ]         (1)
これは分子内二本鎖プローブの濃度と、一次速度定数k1のみに依存している。
【００４９】
反対に、ハイブリダイズしていないプローブは、一本鎖核酸すなわち検体と会合して、プローブ／検体複合体（プローブ×検体）を以下の式に従って形成する：
ｄ[プローブ×検体]／dt＝k2[一本鎖プローブ] [一本鎖検体]       (2)
【００５０】
一本鎖プローブの濃度および一本鎖検体の濃度のいずれもが、プローブ／検体複合体の時間依存的形成または濃度に影響を与える。
【００５１】
速度定数は実験的に決める必要があり、そして温度、溶媒等のような反応条件に依存する。分子スイッチの活性はプローブ／検体複合体の濃度に依存するが、この複合体形成の時間依存性、および、場合によっては、平衡達成は、温度、溶媒、プローブ濃度、検体濃度等のような多くのパラメータに依存しているので、全てに有効な手順の指示を提供することはできない。それらは与えられたシステムに依存する。しかしながら、この過程またはそれぞれの過程要素は、インキュベーション時間により影響されまたは制御されることも明らかである。
【００５２】
連続的に上昇するまたは低下するこの過程の温度の他に、分析過程の温度も好ましくは別々の段階で変えられる。例えば、与えられた最初の温度から出発して、次に温度を可能なかぎり速やかに上昇させ、適切なプローブ領域および、必要に応じて、検体も同様に、「融解した」状態、すなわち一本鎖構造で確実に存在するようにする。次の段階で、温度は次にハイブリダイゼーション温度まで可能な限り速やかに低下させる。次に相同的な領域が、この温度で会合または再会合する。必要に応じて、触媒成分の活性もまたこの温度で測定できる。活性測定のために再度この温度を低下または上昇させることも考えられる。しかしながら、これに関しては、この温度は融解プロセス温度の範囲より必ず低くなければならない。
【００５３】
原理的に、融解および再会合過程もまた、溶媒を変えることによって制御することができ、そうでなければ熱加工の段階はこれを行うことにより保持できる。例えば、所与の量の少なくとも１つの有機溶媒、酸または塩基および補助的物質を添加することによって、融解温度は変えられる（例えば、低下できる）。融解温度は水で適切に希釈することによって再度上昇させることができる。例えば、水で希釈するか塩を加えることによるイオン強度の変化を、同様に用いることができる。この関連で、イオン強度を増大することは主に融解温度を上昇させることにつながる。
【００５４】
したがって、異なった温度および／または溶媒の組成は、適切な構造変化を誘導するために、および／または、適切な触媒活性を得るために、ハイブリダイゼーション過程の前、間および後で設定することができる。この関連で、溶媒は好ましくは水および／または有機溶媒を含み、そしてさらに、追加の成分、緩衝剤、塩、基質、補基質、補因子、触媒成分の阻害剤、追加の触媒、特に酵素、および補助的物質を含んでもいい。特定の実施態様はまた、用いられる異なったサイズおよび／または親和性を有する異なった基質を同時に提供する。これはまた、補基質、補因子および阻害剤にも関する。それぞれの成分は、全て過程の開始時に溶媒中に既に存在してもよく、または別々の過程の段階で逐次的に加えてもいい。
【００５５】
始めは触媒的に活性であり次に検体の存在の結果で不活性になるかまたはその特異性を変えるというシステムの場合、ハイブリダイゼーション過程が終了した後に実際の反応を開始することが有利であるといえる。このことは、なお不足している少なくとも１つの反応物質を添加することによって行うことができる。この反応物質は、例えば、基質、補基質または補因子であっていい。
【００５６】
適切な有機溶媒の例には、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル等が挙げられ、特にジメチルスルホキシドおよびホルムアミドが挙げられる。慣用の緩衝液を異なった濃度でまた組合せて、pHを特定の範囲に安定して維持するために用いることもできる。こうした緩衝液の例には、クエン酸、リン酸の溶液が挙げられるが、好ましくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン溶液である。
【００５７】
緩衝剤の他に、塩、塩の種類および塩濃度も、当然、このシステムに影響を及ぼす。塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムのようなアルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩を、ハイブリダイゼーション反応で利用するのが好ましい。適切な濃度のグアニジウム塩（塩化グアニジウム、塩化水素グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、イソチオシアン酸グアニジウム、ドデシル硫酸グアニジウム等）または尿素のようなカオトロピック剤を用いることも考えられる。場合によっては、塩は触媒反応を引き起こすためにも必要である。マグネシウム塩および他の二価の陽イオンは、時には基質の酵素的変換のために必要である。後者の基質、ならびにそれらの補基質および補因子もまた当然に溶媒中に存在できる。
【００５８】
分子スイッチの実際の触媒成分の基質、補基質および補因子の他に、そうした物質もまた追加の触媒の場合に存在できる。追加の触媒、特に酵素は、例えば、酸化還元サイクリングによって、結合試験を行う場合に利用できる（Bergmeyer 165；Bisswanger 1994）。
【００５９】
酸化還元活性物質、例えば、ジチオスレイトール、グルタチオン、チオクト酸およびβ-メルカプトエタノールのような補助的物質もまた、成分または反応系列を安定化するために利用することができる。アルブミン、例えば、ウシ血清アルブミンのようなタンパク質の添加は、同様に、個々の過程の段階へ有利な影響を与えることができる。特に、熱に対してタンパク質構造を安定化するエクトイン（Rehm 2002）もまた、より高い過程温度でのタンパク質の変性を防止または減少させるために用いることができる。
【００６０】
しかしながら、補助的物質はまた、特定の様式でこのスイッチのプローブ成分の核酸と相互作用し、それによりプローブまたは検体の構造およびハイブリダイゼーションの挙動に影響を与えるような化合物であってもいい。そのような化合物の例には、シアニン色素、フェナントリジン、アクリジン、インドール、イミダゾール、アクチノマイシン、ヒドロキシスチルバミジン（Haugland 2002）およびまたオルニチンおよびスペルミジンが挙げられる。
【００６１】
プローブの立体構造および検体の結合への上記の影響は複雑である。このために、個別のケースのそれぞれに対して至適条件を決定する必要がある。上記の影響、および方法論的適合は、特にそれらに伴う溶媒および温度に関して、以下に、より詳しく記載される。
【００６２】
核酸およびそれらの誘導体が関与するハイブリダイゼーション事象の場合、過程は通常、様々な因子により影響を受ける可逆的過程である。それらの因子には、グアニンおよびシトシン塩基の％含量（％GC）、核酸の長さ、ナトリウムのような一価性陽イオンおよびホルムアミド、DMSO等のような薬剤の濃度が挙げられ、それらは核酸一本鎖または核酸二本鎖の安定性に影響を与えている。これらの因子は、DNAに関して実験的に決定される式に従って、相互に関連している（MeinkothおよびWahl 1984）。この式は二本鎖の融解温度（Tm）を計算するために用いることができる：
Tm＝81.5℃＋0.41(% GC)＋16.6log[Na+]−500/n−0.61(% ホルムアミド)   (3)
【００６３】
(1)に従って、Howley等（Howley, Israel等、1979）由来の式を考慮に入れることができる。この場合、ミスマッチ比もまた考慮に入れる：
Tm＝81.5℃＋0.41(% GC)＋16.6log[M+]ー500/nー0.61(% F)ー1.2 D   (4)
ここで、% GC＝G/C対の含量パーセント、 [M+]＝一価性陽イオンの濃度、n＝ヌクレオチドの数、% F＝緩衝液中のホルムアミドの含量パーセント、D＝ミスマッチ含量パーセント。
【００６４】
しかしながら、最近になり、実際の使用において、それらの式を用いて計算した融解温度は絶対的なものとはみなされなくなり、代わりに、参照のための適切な点を提供するだけである。おそらく、DNA二本鎖は、溶液中での挙動のようにはインサイチュ（in situ）では振る舞わないようだ（Leitch およびHeslop-Harrison 1994）。BrittenおよびKohne
（BrittenおよびKohne 1968）によれば、至適ハイブリダイゼーション温度またはプロセス温度は、以下の(3)を用いて導かれた融解温度から計算することができる：
Th＝Tm−25℃               (5)
【００６５】
ウォリス（Wallace）法則によることも、特にプライマーのような比較的小さなオリゴヌクレオチドの場合には、可能である：
Tm＝2℃×(A＋T)＋4℃×(C＋G)       (6)
【００６６】
この方程式からTm値がオリゴヌクレオチドの長さと配列に依存していることがあきらかである。しかしながら、この規則は特に膜結合型オリゴヌクレオチドへハイブリダイゼーションしている場合に考慮され、そして１Mの塩濃度を基にしている。溶液実験については、8℃を計算された温度に加えるべきである。
【００６７】
最近傍法もまた利用可能である。Tm値を計算する場合に、配列依存性の積重ね効果も考慮に入れて、そして隣接したヌクレオチド対の熱力学データを基にする。この方法は中程度の長さのオリゴヌクレオチド（20~60塩基）に関して信頼できる値を与える：
Tm＝[(1000×dH)／(A＋dS＋R×In(C/4))]−273.15＋16.6×log c(K+)   (5)
ここで、dH＝対のエンタルピーの合計、dS＝対のエントロピーの合計、A＝-10.8cal、ヘリックス形成のエントロピー、R＝1.984cal/℃×モル、ガス定数、C＝オリゴヌクレオチド濃度（250pmol/l）、c(K+)＝オリゴ溶液中のカリウムイオン濃度（50mmol/l）。
【００６８】
まとめると、温度および溶媒の影響は、例えば、(1)および(2)に続いて、以下のように記載できる：
Tm＝81.5＋0.41(% GC)＋16.6log c(M+)＋×log c(M++)＋n log c(Mn)−500/n−0.61(%F)−d (% 補助的物質)−1.2 D     (2)
この場合、異なった原子価を有する追加したイオン（M++; Mn）の影響もまた考慮に入れる。上記の、追加の有機溶媒および他の添加物である補助的物質もまた考慮に入れる。必要な場合は、例えば、イオン強度による、異なったイオンの影響もまた項目（term）の中に組み合わせることができる。ホルムアミドおよび他の添加物は対応する方法で扱うことができる。
【００６９】
検体を検出するための本発明の分析システムの使用は以下に、より詳細に記載される：
検体の存在（定性的）および濃度（定量的）の検出を目的として、各種の検出方法を、分子スイッチの触媒活性および特異性（またはその変化）の程度を測定するために用いることができる。分子スイッチを基にする分析試験システムは柔軟性のあるやり方で用いることができる。基本的に、分子スイッチは結合事象を記録させることができる。これに関して、記録の特性は生じる反応の型に依存する。
【００７０】
ほとんど全ての記載された過程に関連して、例えば、酵素反応に関連してエネルギー変化が起こるので、原理的に、この目的に適合した反応容器を含む熱量測定器を用いた、熱量測定またはミクロ熱量測定を利用することができる。溶液のスペクトル特性の変化が、例えば、発光性の、特に蛍光および吸収性化合物が、特に酵素触媒反応に関与した結果生じる場合に、光学的測定を実施することができる。この場合、光学的測定には、適切な機器および反応容器を用いた、発光分析法、蛍光分析法、光度分析法、偏光分析法、ポーラロメトリー等が含まれる。原理的に、可視的に、すなわち例えば、試験片、簡単なキュベットまたはマイクロタイトレーションプレート等を用いて、検出することも可能である。反応で放射性ヌクレオチドが用いられる場合に、放射分析法を考慮することもできる。マノメトリーのような圧差を記録する方法もまた利用できる。これは、浸透性の過程が生じる場合、およびまたガスが生成しまたは消費される場合、例えば脱炭酸酵素を用いた場合に有益である。アンペア分析法（amperometric method）および対応する機器、例えば、ポーラログラフィーで用いられているようなものを、電極を用いた電気化学プロセスに関連して用いることができる。これにはまた電位差、電流、電気抵抗等、およびそれらのパラメータの変化を測定することも含んでいる。
【００７１】
キュベットシステム、マイクロタータープレートおよびフィルター片、およびまたアレイ、チップ、ビーズ等のような、適切な反応容器は、実施される反応に応じて、ならびに検出方法およびそれと関連する分析器に応じて、用いられる。
【００７２】
吸収測定および発光測定のいずれも分光光度法で用いることができる。吸収測定は、例えば、発色団を検出すること、および濁度を測定することを含む。後者はまた分散光または反射光測定を用いて測定することもできる。蛍光団、燐光団、化学発光団および生物発光団測定が、例えば、発光測定と関連して用いることができる。
【００７３】
本発明によれば、電気的測定方法が特定の酸化還元プロセスと関連して用いることができる。電流フロー、電圧または抵抗の測定、必要な場合は振動数依存性抵抗（電気抵抗）の測定も、全て同様に適している。
【００７４】
一般に、動力学的測定および終点測定のいずれも考えられる。分光光度法の場合は、個別の波長およびスペクトルの両方を、利用するシステムに依存したそれぞれの場合に、記録することが可能である。
【００７５】
結合試験を用いる検出システムは特に有用である。検出を助けそして必要な場合は感度を上げるために、触媒成分の反応を他の反応と共役させることができる。これに関して、酸化還元サイクリングが特に有用である。例えば、触媒成分のピリジンジヌクレオチド依存性反応は、選択された酵素、脱水素酵素（ギ酸脱水素酵素、ジアフォラーゼ等）を用いることにより支持され、対応するピリジンヌクレオチドを再生することができる。必要に応じて、追加で導入された酵素もまた実際の検出反応を触媒することができる。同様に、さらなる酵素をこの過程に組み入れることも考えられる。
【００７６】
もし、電極を、触媒成分、または分子スイッチの触媒成分の部分、または追加の成分としてシステムの中に組み入れた場合には、電気的に支持された酸化還元サイクリングの利点を利用することも可能であり、これを、必要に応じて、電気的検出のために用いることもできる。例えば、p-アミノフェノールガラクトース（検体として）はβ-ガラクトシダーゼ（触媒成分として）により分解され、そして得られたp-アミノフェノールは陽極によりキノンイミンへと酸化できる。反対に、陰極でのキノンイミンの還元はp-アミノフェノールを与え、そうして感度の高い電気的検出を数度のサイクルにわたって生起することができる。さらに、電気化学的検出も、例えば、過酸化酵素（ホースラデッシュ過酸化酵素）を用いたヒドロキノンのベンゾキノンへの過酸化水素依存性変換により行うことができる。プロトンを消費しながら、ヒドロキノンが陰極においてベンゾキノンから再生される。
【００７７】
触媒活性の変化に関する原理を以下に記載する：
触媒活性の変化に関する可能な原理を図１に示す。触媒成分または触媒成分（１）へのアクセスが基質（S）の変換に関して重要である。基質の触媒へのアクセスは、基質自体
の幾何的形状およびサイズ、ならびに触媒成分およびプローブの幾何的形状およびサイズの両方によって決定される。プローブ（２）の特定の領域に関する触媒成分の位置もまた重要である。
【００７８】
図１で特定された相対的な大きさおよび幾何的形状を仮定し、そして個々の成分の間にファン・デル・ワールスおよび静電的相互作用が存在しないと仮定して、次に図２および３に示された触媒活性の局所的勾配関数を導くことができる。これに関して、プローブおよび触媒成分へのアクセスの両方を、簡略化のために、等しい半径を有する円状領域と定義する。基質は球形の幾何的形状であるとする。プローブがｘ*およびｙ*の位置に在るときは、基質が触媒成分にアクセスを得る最も早い点は、少なくとも球形の基質の直径（ds）に対応する限定された距離（ZG）である。プローブによる著しい拡散の制限（Bisswanger 1994）がなお、プローブと触媒成分へのアクセスの間の短い距離に在ることが予期されるので、触媒活性は、最初は順序に従って徐々に増加するのみで、続いて最大値へと近づいていく（図２）。
【００７９】
このことは当然、プローブがｘ*およびｙ*の位置に在るときのみ適用できる。空間座標ｘまたはｙ上での系の依存性は、限定された場合にｚがゼロに等しいようにされる場合に明瞭になり、そしてプローブは重ね合わせ様式でアクセス上に直接置かれることになる。プローブをx*位置を一定にしながらy方向に移動させるか、または逆もまた同様にして、図２からの条件と仮定に基づいて、図３に示される勾配関数を与える。
【００８０】
最終的に、基質が触媒または触媒中心にアクセスする確率により、さらに全ての空間座標、触媒成分、プローブおよび基質の影響を重ね合わせることにより、触媒活性が与えられる。たとえこの分析において静電的およびファン・デル・ワールス相互作用が無視されたとしても、これらはなお効果を有している。しかしながら、勾配関数の過程において、これらはいかなる有意な効果も持つことはない。
【００８１】
今回、顕著な活性の差が相対的に狭い範囲で空間条件を変化させることにより達成できたために、本発明の分子スイッチを検体検出のために使用することは非常に適切である。検体のプローブへの結合は、触媒成分に対するプローブの関連する領域の位置を変化させ、その結果、検体を特異的に感度良く検出することを可能にする有意な程度まで、システム全体の活性も変化させる。
【００８２】
以下に記載する実施例において、分子スイッチ（３）は通常、触媒成分（５）に直接か、またはカップリング成分（６）を介するかのいずれかで共役するプローブ（４）を含む。触媒（１）へのアクセスは触媒成分（５）の構造または表面（９）により制限される。この構造は、分子スイッチを伴うことができる、またはそれに固定できる（固定化分子スイッチ）支持体、膜またはマトリクスであっていい。
【００８３】
担体は、例えば、ガラス、トパーズ、重合体、プラスチック、セラミックおよび他の、実際の触媒にアクセスできるようにする孔を備えた複合材料であっていい。例えば膜またはマトリクスを用いて、適切な孔構造を形成しおよび／または、必要な場合は、順番にプローブ成分とカップリングさせるために、この支持体を被覆することを同様に考えてもいい。これに関して参考になるのは、写真平版プロセスまたはエッチング技術である。
【００８４】
触媒にアクセスする代わりに、触媒それ自体をこの位置に持ってくることもまた考えられる。このことは例えば金属触媒または触媒成分としての電極と関連して考えることができる。これに関しては、例えば、担体が別々の金属領域を示している表面を考える。
【００８５】
示された構造または表面（９）は当然また、例えば、触媒中心またはアロステリックリガンドのための結合部位へのアクセスを囲む酵素の表面でもある。一般的なやり方で、この構造（９）はプローブ領域をスイッチの触媒領域から分離するかまたは触媒もしくは触媒的活性中心へのアクセスを囲む、任意のマトリクスに対応できる。この場合、分子スイッチは通常固定化されず、または反応混合物の移動相に存在している。
【００８６】
検体は好ましくは反応混合物または試験混合物の液体または移動相中に存在している。
【００８７】
ハイブリダイズしていない一本鎖プローブに関する実施例：
最初はハイブリダイズしていない一本鎖プローブを用いた実施例において（図４）、分子スイッチ（３）は、触媒成分（５）と直接に、または必要な場合はカップリング成分（６）を介して結合させることができる一本鎖プローブ（４）から構成されている。適切なハイブリダイゼーション条件下で、一本鎖プローブを有する分子スイッチの構造は、検体（A1）、例えば一本鎖RNAまたはDNAとプローブ成分（４）とを結合させるようにする。検体（A1）がハイブリダイズする場合、触媒中心（１）へのアクセスは制限される。その結果、システムの触媒活性は下降し、このことを検体検出のために利用できる。このシステムが二本鎖核酸、例えば二本鎖DNAを検出するために使用される場合は、後者は最初に全て変性されていなければならない。次に、相同的な鎖がプローブ成分（核酸）とハイブリダイズする。
【００８８】
最初にハイブリダイズしていない一本鎖プローブを有するシステムはまた、点突然変異（単一ヌクレオチド多型(SNPs)）を検出するためにも適している（図５）。適切なハイブリダイゼーション条件下で、検体(10AT)の相同的鎖（10T）のみが分子スイッチ（３）の対応する相同的プローブ（４）とハイブリダイズする。反対に、検体(11CG)の鎖は結合することができず、このことは引用した例のAT/CG SNPが検出できることを意味している。A, T, C およびGは、核酸の慣用的な塩基の命名法に類似した方法で選ばれている。
【００８９】
最初にハイブリダイズした形態で存在しているプローブの実施例
最初に分子間二次構造を有するプローブが記載される：
ハイブリダイズした二本鎖プローブ（図６）を有するシステムにおいて、分子スイッチ（３）は触媒成分（５）と直接にまたは必要な場合はカップリング成分（６）を介して結合できるプローブ（４）を含んでいる。これに関して、プローブ（４）の特定の（部分的）成分（７）のみが触媒成分（５）と共役する。プローブ（４）の結合した相同的（部分的）成分（８）は触媒へのアクセス（１）を制限する。
【００９０】
これに関して、プローブ（４）は、好ましくはプローブ成分（８）の検体（A1）への結合が、プローブ成分（７）および（８）が相互に結合することより安定であるように選択される。このことは、プローブ成分（８）と、２つのプローブ成分（７）および（８）のハイブリッドに比べてより相同的な塩基対を含んでいる検体（A1）から成っているハイブリッドにより達成される。その結果、プローブ成分（８）と検体（A1）とのハイブリッドの安定性または融解温度は、プローブ（４）のものより高くなる。最初に、プローブ成分（７）および（８）は、適切な温度上昇によりおよび／または実験条件（VB1）、例えば塩濃度を変える他の方法により、互いに分離される。次に、実験条件（VB2）のさらなる変化、例えば温度の低下は、プローブ成分（８）と検体（A1）とのハイブリッドの会合安定性または融解温度または再会合温度が、プローブ（４）、すなわちプローブ成分（７）および（８）の互いとのハイブリッドより高いことから、プローブ成分（７）および（８）の再会合が起こる前に、プローブ成分（８）と検体（A1）との会合をもたらす。そうしたシステムの特異性および感度は、融解温度が類似のシステムより高い。
【００９１】
二本鎖核酸、例えば、二本鎖DNAを検出する場合は、プローブ（４）の安定性より高いプローブ成分（８）と検体（A1）とのハイブリッドの安定性の局面は、時には決定的である。その結果、プローブ成分（７）と、検体と相同的な鎖の会合は減少するか妨害される。そうした会合は主にハイブリダイゼーションパートナーの交換を導き、この方法では、プローブの立体構造の変化もしたがって触媒成分の触媒活性の変化も存在しないので、検体のどのような有効な検出も生じさせない。
【００９２】
異なった長さのプローブ成分（７）および（８）を用いる代わりに、同一の長さを有するが少なくとも１つのミスマッチを示すものを用いることを、同様に考えてもいい（図７）。このことは、相同的な領域内で少なくとも１つの部位で塩基対形成が起こらないことを意味している。このミスマッチは好ましくはプローブ（４）の中央領域に位置しているべきである。このミスマッチは続いて検体（１２）の対応する領域に関するプローブ（４）を不安定化する。これに関して、プローブミスマッチは、適切な実験条件下において、プローブ成分（８）が検出すべき相同な12C鎖とハイブリダイズする一方、12G鎖はプローブ成分（７）とはハイブリダイズしないように選択されるべきである。このことは、例えば適切な再ハイブリダイゼーション温度を選択することで確認できる。プローブ成分（８）と鎖12Gが、再ハイブリダイゼーションプロセスにおいて、検体鎖12Cへの結合に関して競合することは真実であるが、この複合プロセスは異なった活性の分子スイッチの対応する比を与え、次にこの比を測定できる。さらに、短いプローブ成分８が12C検体鎖と再会合する速度は、12G検体鎖が12C検体鎖と再会合する速度より高い。その結果、形成されるのは主にプローブ成分（８）と12C鎖から成るハイブリッドである。
【００９３】
分子内二次構造を有するプローブ：
さらに、図８に示されたプローブ構造を用いることが、干渉するハイブリダイゼーション過程を避けるための助けになる。この場合、プローブ（４）は、触媒成分（５）に結合し、そして分子内でハイブリダイズしている領域を有している、１つのプローブ成分から成っているに過ぎない。検体（１３）の存在下で、適切な相同的構造（１４）がプローブとハイブリダイズし、それによりプローブの分子内ハイブリダイゼーションを解離させる。これにより、検体の鎖（１５）がプローブ（４）とハイブリダイズする全ての可能性、およびそれによる干渉を除外できる。
【００９４】
一つの特定の実施態様において（図９）、分子内二次構造を有するプローブ（４）（例えば、核酸）を触媒成分（５）と、直接に、または必要な場合は、カップリング成分（６）を介するかのいずれかで、5'末端および3'末端の両方で、共役させる。この分子内でハイブリダイズした閉ざされた状態において、プローブは触媒（１）へのアクセスを制限する。反対に、プローブが検体と分子間でハイブリダイズしているプローブの開放的な状態では、触媒（５）に対する基質の良好なアクセス（１）が与えられる。
【００９５】
触媒成分（５）が酵素（E）（図１０および１１）の場合、触媒中心（１）へのアクセスに対する影響を除く他の作用、例えば触媒成分それ自体での立体構造変化（CC）を生じさせることができ、これら他の作用は次に触媒活性の変化を導く。酵素（５）は、したがって、異なった触媒活性を有する少なくとも２つの形態、E1およびE2として存在する。図１０および１１で選択されたプローブの実施態様は、当然、本発明の他の実施態様で置き換えることもできる。
【００９６】
そうした分子スイッチの触媒成分における立体構造変化は、特に、いくつかのサブユニットから構築される酵素複合体の場合に生じることができる。例として、図１１は、その触媒活性がサブユニット（U1およびU2）の相互作用により決定される、ジアフォラーゼのホモ二量体への影響を示しており、異なった触媒活性を有する少なくとも２つの形態、E1およびE2をこの場合でも同様に存在させることができる。
【００９７】
これに関して、特定の実施態様において（図１１B）、酵素のサブユニット（U1およびU2）は完全に分離しており、このことは当然に酵素活性への特に劇的な効果を有し、そしてそれにより検体の測定に関しても特別な利点を持つことができる。この場合もまた、図示されたプローブの実施態様は本発明の他の実施態様によって置き換えることができる。
【００９８】
プローブ成分の可能な追加の構成成分を、以下に例によって記載する。
ａ）親和性を示す構造要素（図１２を参照）
抗体、アフィボデイズR、アプタマー等のような、親和性を示す構造要素１６が、プローブ成分（４）（例えば、核酸）中、または少なくとも１つのプローブ鎖（７および／または８）または分子内二次構造を有しているプローブ領域、に組み込まれている場合は、核酸に加えてさらに他の検体（１７）を検出することも可能である（図１２）。親和性を示す構造要素への検体の結合は、部分的にまたは完全にプローブ成分４が（再）会合することを妨げて、このことは触媒に対して自由にアクセスできることを意味している。
【００９９】
ハイブリダイズしない一本鎖プローブが用いられた場合、相同鎖を反応混合物中に加える必要がある。これらの相同鎖は次に一本鎖プローブに対する結合に対して検体と競合する。検体が結合すれば、分子スイッチは触媒的に活性である。相同鎖が結合しまたはハイブリダイズすれば、次に触媒中心（１）へのアクセスが阻止され、その結果分子スイッチは触媒的に不活性になるか、または少なくとも触媒活性が減少している。このことにより、分子スイッチの濃度、相同鎖の濃度および特に検体の濃度に依存して、検体濃度に依存した全体的な活性を有するシステムが得られる。
【０１００】
ｂ）触媒成分へのアクセスに対する影響を有する構造要素（図１３を参照）：
触媒成分への基質のアクセスへの影響を増大させるために、プローブ成分を、適切な領域で、他の成分、すなわち阻止成分（１８）と共役させることができる（図１３Ａ）。この目的で、例えば、タンパク質（アルブミン、ストレプトアビジン等）のような高分子を、適切な部位でプローブと結合させることができる。この目的のために、低分子量物質を用いることを考えてもいい。
【０１０１】
特に、成分（１８）は、次に、他の分子（１９）の結合パートナーとなることができる（図１３Ｂ、Ｃ）。例えば、この場合、結合パートナーは、リガンド／受容体、抗原／抗体、アフィボデイズR、アプタマー、または基質、阻害物質／酵素を含む、結合パートナーまたは複合体であっていい。親和性を示す結合パートナー（１９）の一つをここで触媒成分（５）に結合した場合、その結果として触媒中心へのアクセスがより効率よく阻止されるので、このことにより分子スイッチの効率が改善され得る。検体がプローブへ結合すれば、結合パートナー（１８）と（１９）との間の結合は切断され、その結果再び触媒への自由なアクセスができるようになる。ｂ）で述べられた場合には、プローブ（４）は、例えば、カップリング成分（６）を介してのカップリングに加えて、成分（１８）または（１８）および（１９）を介して触媒成分（５）と結合することもまた好ましい。
【０１０２】
適切な実験条件下で検体がプローブに結合している場合に、解離している結合パートナー（１８）および（１９）の特性によって、これらの非共有結合複合体は、標準的な条件下で、プローブ成分（４）の触媒成分（５）への永続的な結合をもたらす共役またはカップリング成分（６）とは異なっている。
【０１０３】
図１３Ｃに、例として図示された実施態様において、プローブの分子内ハイブリダイゼーションは絶対的に必要ではないことがわかる。したがって、ハイブリダイズしない、カップリング成分（６）を介して直接的にカップリングするかまたは間接的にカップリングすることの他に、結合パートナー（１８）および（１９）の結合を介して触媒成分と結合する、一本鎖プローブを用いることも可能である。
【０１０４】
そうしたシステムを用いることで競合試験を構築することも可能になる。これに関して、検出される検体は、同時に結合パートナー（１８）または（１９）の一つである。それにより、プローブ成分と触媒成分の間の結合の一定の割合が、検体の存在下で阻害され、これがこのシステムの触媒活性へ作用し、検体を定量化できるようになる。
【０１０５】
原理的に、より高い結合の可逆性の程度を示す結合対（１８）および（１９）の結合によって、カップリング成分（６）を置き換えることを考えることもできる。この場合、検体により完全に結合すれば、プローブは最終的に触媒成分から分離される。
【０１０６】
酵素（Ｅ）を用いることで他の可能性が現れ、そのうちのいくつかは図１３Ｄ〜Ｈに示されている。酵素の活性またはアロステリック中心、および、基質、補基質、置換基、阻害物質等のような対応するリガンド（１８）が、この場合の結合パートナーとして適している。これに関して、プローブは少なくとも１のリガンド（１８1）を介して酵素と結合している（図１３Ｄ〜Ｈ）。原理的に、これに関して、本発明のいかなるプローブ構造、すなわち、分子内ハイブリダイズプローブ（図１３Ｄ，Ｅ，Ｇ）、分子内ハイブリダイズプローブおよびハイブリダイズしていないプローブ（図１３Ｆ、Ｈ）でも使用することができる。プローブは触媒成分としての酵素と、追加のカップリング成分（６）（図１３Ｄ）または追加のリガンド（１８2）を介して結合することができる。適切な実験条件下、および立体構造変化および／または活性中心へのアクセス能力の変化により、検体の存在が、次に酵素の触媒活性の変化を導く。
【０１０７】
他の実施態様によれば、触媒成分に共有的に共役していないプローブ成分が以下のやり方で使用される。最初から検定において、触媒成分、特に酵素を有する代わりに、酵素を、検体がプローブと結合するハイブリダイゼーション反応後にのみ加える。触媒成分への結合および続く適当な反応により測定可能な、触媒成分の活性もまた、プローブ成分と検体とのハイブリダイゼーションに依存して影響を受け、検体を定性的または定量的に検出できる。
【０１０８】
これに関して、優先すべきは、可逆的または非可逆的に、少なくとも１つのリガンド、例えば、基質、補基質、置換基、アロステリック活性化物質もしくは阻害物質および／または一般的な阻害物質を保持するプローブ成分の使用である（図１３Ｅ〜Ｈを参照）。
【０１０９】
例えば、プローブ成分と結合し、そして検体とハイブリダイズする活性化物質はもはや、遊離の活性化プローブ成分としての触媒成分、特に酵素を活性化しない。少なくとも１つの適切な反応により測定された触媒成分の活性は、次に検体を検出するために用いられる。同様のことが、対応するやり方で、阻害物質にも適用される。プローブ成分と結合している基質、補基質および／または置換基が用いられる場合、それぞれ遊離のおよび検体に結合している共役体も同様に触媒成分の触媒活性に異なった作用をもたらし、そしてそれにより検体の検出に用いることができる。
【０１１０】
本発明の試験システムとして用いることができる膜システムおよびマトリクスシステムを以下に例を持って記載する。
【０１１１】
図１４：
これらのシステムでは、適切な孔構造および浸透特性（２１）を保持する膜またはマトリクス（２０）は、触媒（２４）が位置している触媒スペース（２３）から試料スペース（２２）を分離する。検体濃度に応じて、試料スペース（２２）および／または触媒スペース（２３）中のプローブ成分（２５／矢印）は、膜またはマトリクス（２０）を通す基質および／または生成物の移動に影響を与える。その結果、検体濃度に依存した試料スペースから触媒スペースへの基質の移動により、触媒スペース中の基質の変換が測定される。検体濃度に依存した触媒スペースから試料スペースへの生成物（反応基質）の移動に影響を与えることも当然考えられる。基質および生成物のそれぞれの移動速度は後者の特性、特にそれらの分子サイズおよび電荷特性および疎水性にも依存する。
【０１１２】
図１４Ａ：
例えば、そうしたシステムは、粒子マトリクス、例えばアクリルアミドまたはアガロースに固定化または埋め込まれた、好ましくは酵素の形態（２４）の触媒から構成することができる。この場合、マトリクスの内部が触媒スペース（２３）に対応し、そしてマトリクスの表面が、孔構造（２１）を有する膜（２０）に対応する。触媒または酵素を必ずしも粒子内部のマトリクスに埋め込まずに、粒子中の触媒または酵素を包含することも同じように考えられる。粒子の表面はプローブ成分（２５）と共役し、検体濃度に応じて、粒子内触媒スペース（２３）と粒子外試料スペース（２２）との間の基質および／または生成物の移動を制御する。そうした粒子の懸濁液を、適切な反応容器中の検体の検出に（懸濁液の液体相において）使用することができる。
【０１１３】
図１４Ｂ：
試料および触媒スペースの顕微鏡的なレベルでの分離に対して、適切な反応容器を用いて、それらの区画を顕微鏡的なレベルで分離することもまた可能である。この場合、試料スペース（２２）および触媒スペース（２３）は、プローブ成分（２５／矢印）と共に提供される有孔膜またはマトリクス（２０）により分離している。ここで示した例において、プローブ成分（２５）は、検体濃度に依存して、試料スペース（２２）から触媒スペース（２３）への基質の通過を制御する。基質（Ｓ）と生成物（Ｐ）（変換された基質）の特性に依存して、生成物の膜を介した移動を制御することもまた当然に考えられる。両方の物質、すなわち基質と生成物の移動に影響を与えることも同様に考えられる。
【０１１４】
基質は触媒スペース（２３）内で変換される。具体的な例では、触媒は反応容器中に組み込まれるかまたは固定化される。触媒、特に酵素が触媒スペース（２３）から試料スペース（２２）へ通過ができない限りにおいて、溶解するかまたは懸濁した触媒を用いることも考えられる。これに関して、触媒はまた、固定化された形態で存在する、溶解するかまたは懸濁した触媒または酵素等であっていい。
【０１１５】
膜上およびプローブ上でのその特性に依存して、産生した生成物（Ｐ）は触媒スペース（２３）中に濃縮されるようになるか（図１４Ｂ）またはさもなければ試料スペース（２２）へと拡散していくかのどちらかである。この場合、用いられたシステムに依存して、光学的検出を、例えば、触媒スペース（２３）のみで行うことが有利である。膜（２０）は試料物質の触媒スペース（２３）への移動を妨げて、干渉する「マトリクス効果」（Zipper, Buta等、2003）が減少する。吸収または発光測定による光学的検出に加えて、記載された構成装置が、当然また、試料スペース（２２）と触媒スペース（２３）との間の比較浸透圧測定の実施、ならびに電流、電圧、抵抗および電気抵抗のような電気的パラメータの適切な使用の可能性を提供する。
【０１１６】
一般に、試料スペース（２２）と触媒スペース（２３）との間の電圧差の適用が、この実施例においては、それにより電気泳動的な特性を使用することが可能になるために有利である。例えば、膜を通る電気泳動的に促進された基質または生成物の移動は、検出に好ましい影響を与えることができる。
【０１１７】
図１５および１６は、本発明による分析試験システムの特別な実施態様を示す。プローブおよび触媒成分を保持している分子スイッチを含む、この試験システムは、さらにプローブのハイブリダイズした形態、およびハイブリダイズしない形態に対して異なった親和性を示す、少なくとも１つの成分を組み込んでいる。このいわゆる選択的成分（２６）は、プローブを触媒成分（５）に結合するカップリング成分（６）の部分（図１５Ａ、Ｃおよび図１６）であるか、またはカップリング成分（６）、プローブ（３）および／または触媒成分（５）を伴っていてもいい（図１５Ｃ）。
【０１１８】
この選択成分は、ハイブリダイズした、またはハイブリダイズしないプローブに対して選択的に結合できるような、異なった結合定数または親和性を示す、いかなる化合物であってもいい。
【０１１９】
例えば、選択化合物は、好ましくは一本鎖もしくは二本鎖核酸と、または三本鎖、四本鎖もしくは他のハイブリダイゼーション状態で存在する核酸と結合する、核酸結合タンパク質またはペプチドであっていい。二本鎖核酸に好ましくは結合するタンパク質の例は、転写因子、特に転写活性因子、例えば、Zif 268のような「亜鉛フィンガータンパク質」のようなDNA結合タンパク質、Lacレプレッサーのようなヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフを有するタンパク質、またはホメオドメインのようなヘリックス−ターン−ヘリックス様モチーフを有するタンパク質等である（NelsonおよびCox 2001）。
【０１２０】
一本鎖核酸に優先的に結合するタンパク質の例は、一本鎖結合タンパク質（SSB）である。二本鎖核酸に優先的に結合する、Ni(II)D/L-Arg-Gly-His、1,2-ジヒドロ-(3 H)-ピロロ[3,2-e]インドール-7-カルボキシレート（Fang等、2004）のようなペプチドも同様に利用できる。
【０１２１】
タンパク質およびペプチド以外の、他の低分子量の物質を用いることもできる。例えば、インターカレーター（intercalator）、セミ−インターカレーター、および核酸表面に結合する物質が、ハイブリダイズしたまたはハイブリダイズしない核酸、例えば、二本鎖または一本鎖核酸と選択的に相互作用する。低分子量物質は、例えば、特別な抗生物質、細胞増殖抑制剤または化学療法剤、例えば、ネトロプシン、抗腫瘍抗生剤(+)-CC-1065、クロモマイシン（クロモマイシンA3）、アクチノマイシン、アントラサイクリン、例えば、アドリアマイシン、ミトラマイシン、ジスタマイシンAおよびブロスタリシン（PNU-166196）である。同様に、異なった成分から構成されたハイブリッド分子、例えば、S-3-ニトロ-2-ピリジンスルフェニルシステイン（Baraldi等、2001；Shim等、2004）を用いることも同じように考えられる。
【０１２２】
他の適切な成分には、フェナントリジン、例えば、臭化エチジウム、エチジウムホモダイマー１、エチジウムホモダイマー１、ヨウ化ヘキシジウム、ヨウ化プロピジウム、およびジヒドロエチジウム；インドールおよびイミダゾール、例えば、DAPI （4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩）およびDIPI（4',6-(ジイミダゾリン-2-イル)-2-フェニルインドール二塩酸塩）；ビスベンズイミド色素、例えば、Hoechst 33258 および33342；アクリジン、例えば、アクリジンオレンジ、アクリジンホモダイマー、AC-MA（9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン）；ならびに、シアニン色素、例えば、SYBR色素、例えば、SYBRグリーンＩおよびSYBRグリーンII、SYBRゴールド、SYBRセーフ、ピコグリーン、オリグリーン、リボグリーン、TO-PRO（1, 3, 5, 等）、PO-PRO（1, 3, 5, 等）、BO-PRO（1, 3, 5, 等）、YO-PRO（1, 3, 5, 等）、シアニンダイマー、例えば、POPO（1, 3, 5, 等）、BOBO（1, 3, 5, 等）、YOYO（1, 3, 5, 等）、TOTO（1, 3, 5, 等）、JOJO（1, 3, 5, 等）、LOLO（1, 3, 5, 等）、SYTOXおよびSYTO色素、 (7-アミノ)アクチノマイシンD、ヒドロキシスチルバミジン、LDS 751等（Haugland 2002；VitzthumおよびBernhagen 2002）、同様に、ポリカチオン性化合物、例えば、オルニチンおよびスペルミジン、ならびに上記の化合物の誘導体、ダイマーおよびポリマーもまた、挙げられる。
【０１２３】
用いられる反応物質の特性、またはそれらの相互作用を基にした試験システムの調節を以下に記載する：
検体の存在下での分子スイッチの活性の変化に関する上記の原理は、異なったサイズの基質を用いた場合、検体検出用に異なった基質特異性を使用するために、記載された立体構造環境が利用されることを明らかにした。より小さい基質は大きな基質より触媒により良くアクセスし、その結果より変換されやすいだろう。検体特異的な立体構造変化が、大きな基質に関して、適切な触媒へのアクセスを可能にし、同時に後者はいかなる有意な程度までも変換される。
【０１２４】
一般的なやり方で、検体が基質の成分であるようにもできるが、好ましくはそうではない。試料中の検体の存在は、検体に特異的な分子スイッチ、および指示システムに合致した基質の両方を加えることにより測定される。次いで、触媒成分（好ましくは、酵素または触媒的に活性な核酸）による基質の変換は、検体の存在の定量的な指示となる。したがって、一般には、基質の変換は測定された補助的な反応または二次反応である。
【０１２５】
これに関して、小さい基質および大きい基質それぞれの反応は、原理的に、同時に、またはそれぞれ別々に実施される。基質が互いに別々に検出できる場合、または競合もしくは阻害という意味で物質の１つの反応をこの過程が検出できるように変換した場合に、２つまたはそれ以上の基質の反応を同時に実施することが適切である。このことは、最初のおよび検体に誘導された立体構造状態の両方の分子スイッチが検出できるという利点を有している。
【０１２６】
このことは、この場合、たった１つの分子スイッチというよりは、普通はむしろ様々な分子スイッチがこのシステムにおいて同時に使用されているために、検体を定量する場合に重要である。理想的な場合には、このシステムのそれぞれの相対的活性の合計は一定のままに維持されるべきである。もしそうでなければ、望ましくない副作用が示される。この副作用は、非特異的な立体構想状態、例えば、触媒の破壊もしくは変性、または、試料中の未知の干渉物質または阻害物質の存在（マトリクス作用）である可能性がある。したがって、この内部対照により、このシステムの感度、特異性および再現性が改善できる。
【０１２７】
例えば、大きい基質の親和性が小さい基質の親和性より大きい場合に、小さい基質と大きい基質の類似した濃度を用いることも考えられる。好ましくはこの濃度は、それぞれの場合に、一次反応を導くような範囲で選択されるべきである。今回、大きい基質が小さい基質より大きな親和性を有していれば、次にこの変換は、触媒へのアクセスを改善するような検体に誘導された立体構造の変化が起こった場合に、基質の間の親和性およびサイズの差違に比例している程度まで、大きい基質の方向へシフトする。検体によって誘導された立体構造の変化が触媒へのアクセスをより困難にする場合は、次にこのシステムは反対の様式で反応する。
【０１２８】
サイズは異なるが匹敵しうる親和性を有する基質を用いることも同様に考えられる。この場合、より小さい基質は好ましくは一次反応に導くような濃度範囲で用いられる。他方、より大きな基質は、好ましくは０次反応に合致して変換するように、過剰に加えられる。これらの条件下で、触媒へのアクセスを改善するような検体が誘導した立体構造の変化が起こった場合、基質間の濃度の違いに比例するような程度まで、または小さい基質の濃度に反比例して、大きな基質の方向へ変換がずれる。検体によって誘導された立体構造の変化が触媒へのアクセスをより困難にする場合は、次にこの系は反対の様式で反応する。両方の基質とも、増大する感度または内部対照、すなわちネガテイブな対照に対するポジテイブな対照の検出と一緒に測定されるので、小さい基質の濃度はあまり低くなり過ぎないようにすべきである。この場合、それぞれの場合に、検出の特性と基質の競合の特性を組合せた場合に、最適に調節される、基質濃度を使用することが必要である。
【０１２９】
上記に合わせて、一次反応に導く濃度範囲で低い親和性を有する小さい基質を使用すること、および基質が、基質の飽和領域、すなわち０次反応をもたらすような領域で使用される高い親和性を有する大きい基質を用いることを考えることも当然できる。
【０１３０】
基質の競合の代わりに、上記の方法の中で、基質の組合せというよりは、基質−阻害物質の組合せを用いた阻害条件を作成することも同様に考えられる。
【０１３１】
大きな基質が入手できないときは、本発明にしたがって、小さい基質から物質との共役により大きな基質を作成することができる。用いられる物質のサイズに応じて、異なったサイズの基質を製造することができる。このことにより、与えられた制限内でこのシステムの触媒活性を調節することが可能になる。これは少なくとも基質から共役体が形成できるかぎり可能であり、そして物質はさらに触媒によって変換されうる。
【０１３２】
大きな基質として、基質共役体または多酵素複合系に由来する酵素のリポ酸−リシル残基のような置換基を使用することも当然できる。例えば、ジハイドロリポアミド脱水素酵素を分子スイッチの触媒成分として用いたとき、遊離のリポ酸およびその誘導体ならびにフォルマザン色素の他に、2-オキソ酸脱水素酵素多酵素複合体のE-2成分を、場合によってはそのE-1成分および対応する基質と組み合わせて用いることもできる。
【０１３３】
酵素、触媒的に活性な抗体および核酸が触媒成分として用いられた場合に、異なってはいるがほぼ同じサイズの基質、補基質または阻害物質を用いることも当然適している。この場合、触媒成分の立体構造の変化もまた、プローブの立体構造の変化と共に生じる可能性がある。これらの立体構造の変化の結果、それらの触媒成分の基質特異性を、この関連で重要な役割を果たす触媒成分へのアクセスの大きさに関係なく、変えられる。実際の活性中心で基質特異性に作用を及ぼす立体構造の変化、および増大する触媒成分へのアクセスの大きさの変化もまた当然考えられる。
【０１３４】
本発明による試験システムで広汎に使用することができる測定、および、特に試験システムの与えられた検体への特異性および感度の両方を増大できる測定が、以下に例を用いて記載される。このことは、検体を定量的に測定することに関連しても、特に重要である。
【０１３５】
さらに検体の検出の特異性および感度を増大するために、一つのタイプの検体に対して一つのタイプより多くの分子スイッチを結合することができる。例えば、異なった酵素活性を有する、およびそれぞれの場合同一の検体の異なった結合部位に結合する、２つの異なったタイプの分子スイッチを用いることが考えられる。したがって、これらの検体は、このタイプの検体に結合している全ての分子スイッチの酵素活性が変えられたときのみ検出される。一つの分子スイッチのみの酵素活性の変化は不十分であろう。これにより、特異性の大幅な増加がもたらされ、このことはまたシグナル／ノイズ比に好ましい影響を与え、したがって感度を増大することができる。
【０１３６】
好ましい実施態様で、一つのタイプの検体に結合する異なった分子スイッチの酵素活性は互いに調節される。この関連で、結合反応を可能にする酵素反応は、特に考慮が与えられる。すなわち、一つの分子スイッチの生成物はさらなる分子スイッチの基質を構成し、次いでこの基質をさらなる反応に付する。反応の最終生成物のみが測定されるから、この測定は２つの結合事象の組合せを含み、その結果、特異的で感度の高い検体の検出を可能にする。好ましいのは、結合反応内で起こりうる生成物−基質サイクル、例えば、酸化還元サイクルの場合である。これはさらに感度の増大を導く。
【０１３７】
例えば、１つは乳酸脱水素酵素活性、および１つはジアフォラーゼ活性を有する２つの分子スイッチを、特定の核酸配列を検出するために用いることができる。これらの分子スイッチは、それらのプローブが測定すべき核酸配列の異なった領域を認識するように設計される。それぞれの酵素活性は、相同的な領域への結合が生じたときに活性化される。乳酸、NADおよびテトラゾリウム化合物が反応混合物中に存在する場合は、両方の分子スイッチが、検体すなわち核酸配列への結合の結果として、酵素的に活性になったときにのみ、テトラゾリウム化合物がフォルマザン色素を産生する。この乳酸脱水素酵素活性は乳酸をピルビン酸に変換し、NADがNADHに還元される。このNADHは、次にジアフォラーゼ触媒反応において、テトラゾリウム塩が還元されてフォルマザン色素になったとき、NADに再生される。このNADは次に再び、酸化還元サイクリング等を介してNADHに変換される。結果として、フォルマザン色素の測定は、検体の特異的で感度の高い測定を可能にする。
【０１３８】
好ましいのは、分子スイッチでの、互いに可能なかぎり近接して位置している異なった結合部位である。これにより酵素間の効率の良い生成物または基質の移動が可能になる。そうした空間的なファクターを考えた場合、分子スイッチの他に、親和性を示す成分を伴いながら、しかし結合事象に関連して酵素活性を変えることのない酵素を用いることができると考えられる。単純に空間的に近接しているというそうした酵素の事実が、反応全体の速度に影響を与え、そして測定に関して対応する効果を有するだろう。
【０１３９】
したがって、本発明の分子スイッチのために好ましいプローブは、検体と接触しまたは結合して立体構造の変化を起こし、その結果、分子スイッチの触媒成分への基質のアクセスの変化が促進されるかまたは損なわれる、核酸または核酸誘導体である。このスイッチの触媒活性の変化、または基質の変換の変化は、原則として、検体の定性的および定量的な検出のために測定されるパラメータである。
【０１４０】
本発明の重要な特徴および要素を以下に要約したが、本発明はこれら特徴および要素に限定はされない：
ａ）一般的な名称／物質のクラスにしたがった、好ましいプローブの記載
ハイブリダイゼーション状態に応じた分類：
・ハイブリダイズしたプローブ
・分子間でハイブリダイズしたプローブ
・分子内でハイブリダイズしたプローブ
・ハイブリダイズしていないプローブ
【０１４１】
それらの構造に応じたプローブの分類に含まれるのは：
・  核酸または核酸誘導体（骨格、塩基）、場合によっては、少なくとも１つのカップリング成分および阻止成分を含むが、結合成分は含まない。これらのプローブは、特に核酸または核酸誘導体を検出するために適している。
・  核酸または核酸誘導体で、少なくとも１つの追加の結合成分（受容体、酵素、抗体またはそれらの結合ドメイン、およびアフィボデイ、設計された反復タンパク質、タンパク質スカフォルド、アプタマー等）と組み合わせているもの。少なくとも１つのカップリング成分および／または阻止成分も必要な場合は存在できる。これらのプローブは特に核酸または核酸誘導体でない検体を検出するために適している。
【０１４２】
ｂ）一般的な名称／物質のクラスにしたがった、好ましい触媒成分の記載
・無機化合物：
無機酸および塩基、金属、合金、金属酸化物、錯体、遷移金属錯体
例：ヘキサシアノ鉄酸カリウム（遷移金属錯体）
・有機化合物：
有機酸及び塩基、タンパク質（酵素、すなわち従来型の酵素およびまた抗体）、
酵素活性を有する核酸、酸化還元芳香族化合物および複素芳香族化合物
例：ジアフォラーゼ、ヘキソキナーゼ、ガラクトース酸化酵素等
・電極系：
無機電極系（金属、セラミド）
有機電極系（導電性プラスチック、複合体／複合材料）
例：金電極
【０１４３】
ｃ）ａ）とｂ）との好ましい組合せの記載
原理的に、あらゆるプローブと触媒の組合せを当然考えることができる。
しかしながら、プローブと酵素触媒の組合せが好ましい。これに関して、特に、簡単な方法で組み立てられたプローブの使用が好ましい。つまり、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、変性に対して安定なモノマーである酵素と結合する。特に好ましいのは分子スイッチの活性に影響を与える分子内ハイブリダイゼーションを示すオリゴヌクレオチドである。この実施態様において、好ましいのは、特に、オリゴヌクレオチドの遊離末端が阻止成分と共に提供される特別なバージョンである。
【０１４４】
例えば、ジアフォラーゼはその5'末端を介してオリゴヌクレオチドと結合できる。カップリングはシッフ塩基を用いて行うことができる。この関係で、ジアフォラーゼのアミノ基と縮合してシッフ塩基を形成した5'アルデヒド官能化オリゴヌクレオチドを考えることができる。場合によっては、シッフ塩基は、また加水分解に感受性を有するシッフ塩基をより安定な結合に変換するために、シアノホウ化水素ナトリウムを用いて還元される。オリゴヌクレオチドはその3'末端がジアフォラーゼに対向するように、分子内ハイブリダイゼーションを示す。3'末端はビオチン基により官能化されている。これにより分子スイッチの活性のさらなる減少が導かれる。アビジンまたはストレプトアビジンがこのビオチン基と結合することが好ましく、分子スイッチの活性がさらに小さくされる。
【０１４５】
ｄ）一般的な名称／物質のクラスにしたがった、好ましい検体の記載
本発明に関連して、核酸およびその誘導体と、核酸またはそれらの誘導体ではない検体とを、区別することが適切である。後者は低分子量の物質または高分子のいずれでもいい。
【０１４６】
原理的に、いかなる物質も検体となりうる。これに関して、非常に異なった分類が可能である。基本的なレベルで、検体は原子と分子に分類できる。分子である物質は、例えば、多かれ少なかれ人為的に、それらの分子サイズに応じて、低分子量物質および高分子量物質、すなわち高分子に分類できる。さらに、機能に応じて、例えば、医薬、ホルモン、代謝物、酵素、構造タンパク質および受容体ｂに分類することもできる。化学的意味合いから無機および有機物質という物質のクラスに分類することができ、後者は官能基によって、すなわちアミドにより（特にペプチドおよびタンパク質）、酸により（カルボン酸またはリン酸）、この場合は好ましくは核酸、例えば、リボ核酸、デオキシリボ核酸および誘導体等へと分類される。
【０１４７】
ｅ）ｃ）とｄ）との好ましい組合せの記載
たとえ他の検体が検出される場合でも、核酸を検出することは特に好ましい。例えば、HIV-1は、オリゴヌクレオチドとして
2007519413.tif 000002
が使用されたときに、ｃ）に記載した分子スイッチを用いて検出できる。下線部は検体、すなわちHIV-1の核酸配列にハイブリダイズする配列に対応する。太字の塩基はプローブの分子内ハイブリダイゼーションのために用いられる。
【０１４８】
核酸または核酸誘導体から構成されたプローブと共に提供された分子スイッチは核酸または核酸誘導体の検出のために好ましく使用される。
【０１４９】
核酸または核酸誘導体ではない検体は、核酸または核酸誘導体を含むプローブを少なくとも１つの結合成分（受容体、酵素、抗体またはそれらの結合ドメイン、およびアフィボデイズ、設計された反復タンパク質、タンパク質スカフォルド、アプタマー等）と組み合わせて、提供された分子スイッチを用いて、好ましく検出される。
【０１５０】
ｆ）好ましい試験システムの構造および操作の記載
分子スイッチを基礎とした分析試験システムは柔軟に使用することができる。基本的に、分子スイッチは結合事象を記録することを可能にする。これに関して、記録の特性は生じる反応の特性に依存する。
【０１５１】
実質的には全ての記載されたプロセスに関連して、例えば、酵素反応に関連してエネルギー変化が生じるから、原則的にこの目的に見合った反応容器を含んだ熱量計を用いた熱量測定または微小熱量測定を利用することが可能である。特に酵素触媒反応に関連して、例えば、発光、特に蛍光、および吸光化合物の関与による結果、液体のスペクトル特性が変化した場合に、光学測定を行うことができる。この場合、光学測定には、適切な器具および反応容器を用いた、発光測定法（luminometry）、蛍光測定法、光度測定法、偏光分析法（polarimetry）、ポーラロメトリー（polarometry）等が含まれる。原則として、可視的に、すなわち、例えば、試験片、簡単なキュベットまたは、マイクロタイタープレート等を用いて検出することもできる。反応で放射性ヌクレオチドが用いられた場合は放射分析方法を考えることもできる。これに加えて、圧力の相違を記録するマノメトリーのような方法を用いることも可能である。このことは浸透圧が生じた場合に有用である一方、気体が生成されるかまたは消費された場合、例えば脱炭酸酵素を使用した場合にも有用である。例えば、ポーラログラフィー分析において用いられるアンペロメリック（Amperometric）法および対応する機器は、電極を用いる電気化学的プロセスと関連して利用される。これはまた電位差圧、電流、電気抵抗等、およびそれらのパラメータの変化を測定することも含んでいる。
【実施例】
【０１５２】
〔実施例１〕
グルコース6-リン酸脱水素酵素 (G6PDH)を
2007519413.tif 000003
を有するオリゴヌクレオチドと共役させる。5'-SH-修飾オリゴヌクレオチドをヘテロ官能性、非分解性、水溶性架橋剤を用いて結合させる。架橋剤のスルホ-EMCSをピアス社の指示書（製品説明書）（2003-2004に与えられた名称）に従って用いる。この共役反応は好ましくはグルコース6-リン酸および／またはβ-NADHの存在下で行われる。上記の配列はバクテリオファージ・ラムダDNA（λ）を検出するために用いられる。
【０１５３】
精製した分子スイッチ、すなわちG6PDH×λを次に以下のようにバクテリオファージDNAを検出するために使用する。G6PDH×λは試料とともにインキュベートする。これらの試料は予め完全に変性させて、それにより一本鎖DNAとして存在している精製DNAを含んでいる。インキュベーションは、5〜500mMトリス塩酸、pH6.5〜10、および5〜500mM NaCl中、特に50mM トリス塩酸、pH9、50mM NaCl中で行う。温度は4〜70℃、特に30〜55℃、好ましくは約35℃である。0.5〜60分間、特に2〜10分、好ましくは約5分のインキュベーションの後、Bergmeyer（Bergmeyer 1965）に従って、検出反応を塩化マグネシウム、グルコース6-リン酸およびβ-NADHを添加することにより開始させる。検出は、波長約340nmで分光光度計を用いて石英キュベット中、分光光度法で行う。吸収の変化を定められた時間間隔で測定し、そしてこのようにして変換、または反応速度を測定する。バクテリオファージDNAが存在する場合は、変換はバクテリオファージDNAの量に依存して比例的に減少する。結合しているバクテリオファージDNAは基質の触媒中心へのアクセスを阻止する。
【０１５４】
〔実施例２〕
例として、ジアフォラーゼ、特にクロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）のジアフォラーゼをオリゴヌクレオチドとその5'末端を介して結合させた。このカップリング反応は、例えば、実施例１で記載された方法で行った。このオリゴヌクレオチドは、分子内ハイブリダイゼーションを有しており、それによりその3'末端がジアフォラーゼに対面する。この3'末端はビオチン基により官能化されている。これにより、分子スイッチの活性にさらなる減少がもたらされる。一つの特定の実施態様において、アビジンまたはストレプトアビジンがこのビオチン基と結合し、分子スイッチの活性をさらに小さくする。
【０１５５】
さらにこれには分子スイッチを効率よく精製できるという利点が存在する。カップリング反応の後に得られたジアフォラーゼとオリゴヌクレオチドから構成された共役体は、ゲル濾過クロマトグラフィーによって過剰のオリゴヌクレオチドから分離される。その後、このスイッチはストレプトアビジンと共役させた。さらにゲル濾過クロマトグラフィーを行って、次にジアフォラーゼ×オリゴヌクレオチド×ストレプトアビジンスイッチを他の物質から分離精製する。ゲル濾過クロマトグラフィーはそれぞれの場合、当該技術の慣用的な規準に従って行われる。
【０１５６】
オリゴヌクレオチド
例えば、
2007519413.tif 000004
を、バクテリオファージDNAを検出するために用いる。小文字で書かれた領域は検体、すなわちバクテリオファージDNAの核酸配列にハイブリダイズする配列に対応する。太字の塩基は分子内ハイブリダイゼーションのために用いられる。
【０１５７】
精製された分子スイッチ・ジアフォラーゼ×λ×ストレプトアビジン（DLS）を以下のようにバクテリファージDNAを検出するために使用する。DLSを試料とインキュベーションする。試料は精製したDNAを含んでいる。インキュベーションは、5〜500mMトリス塩酸、pH6〜10中、特に50mM トリス塩酸、pH 8.6、50mM NaCl中で最初に行う。温度は4〜98℃、特に30〜95℃、好ましくは約80℃である。0.1〜20分間、特に2〜10分、好ましくは約5分のインキュベーションの後、核酸は一本鎖へと変換する。その後、温度は40〜70℃、特に50〜60℃、好ましくは約55℃まで低下させる。バクテリオファージDNAが存在すれば、それは分子スイッチとハイブリダイズする。もしバクテリオファージDNAが存在しなければ、分子内でハイブリダイズしたプローブが再度形成される。
【０１５８】
Bergmeyer（Bergmeyer 1965）に従って、検出反応を塩化ヨウ化ニトロテトラゾリウム（INT）、β-NADHおよびNADを添加することにより行う。他のテトラゾリウム塩、例えば、塩化ネオテトラゾリウム(NT)、チオカルバミルニトロブルー塩化テトラゾリウム（TCNBT）、テトラニトロブルー塩化テトラゾリウム（TNBT）、ニトロブルー塩化テトラゾリウム（NTB）、ベンゾチオゾリルスチリルフタルヒドロジジル塩化テトラゾリウム（BSPT）、WST-1, WST-3, WST-4 および、特に、シアノジトリル塩化テトラゾリウム（CTC）が、必要な場合にINTの代わりに使用される。検出は、適切な波長で、適切な分光光度計または蛍光光度計により、キュベットまたはマイクロタイタープレート中の蛍光の吸収を測定することにより行われる。このシグナルの変化を定められた時間間隔でまたは特定の時点で測定し、そして変換または反応速度を、このようにして測定する。バクテリオファージDNAの存在下で、変換はバクテリオファージDNAの量に応じて比例して増加する。結合しているバクテリオファージDNAは触媒中心に対するアクセスの抑制を取り除く。
【０１５９】
感度を上げるために、必要な場合は、脱水素酵素、特に乳酸脱水素酵素またはギ酸水素化酵素、および対応する基質の乳酸塩およびギ酸塩を反応に加えることにより、NAD/NADH酸化還元サイクルを導入する（Bergmeyer 1965）。
【０１６０】
〔実施例３〕
実施例２を、ジアフォラーゼの代わりにヘキソキナーゼを使用するように変更する。ヘキソキナーゼが基質に結合したときに誘導された適合を受ける結果、この場合の効果は特に大きい。もしバクテリオファージDNAが存在していなければ、分子内でハイブリダイズしたプローブは驚くほど誘導された適合に影響を与え、基質の変換に変化を生じる。反対に、バクテリオファージDNAが存在してプローブに結合しているときは、誘導された適合を起こす立体構造への影響はほとんどみられない。
【０１６１】
〔実施例４〕
一つの特定の実施態様において、実施例３で使用されたヘキソキナーゼが、プローブの
2007519413.tif 000005
と共に使用される。この場合、分子スイッチは次に、
2007519413.tif 000006
の構造を有する。次の分子スイッチがさらに使用される：
2007519413.tif 000007
このスイッチに属するプローブはまた他の配列であるがバクテリオファージDNAを検出するためにも使用される。選択された実験条件は実施例２で用いられたものである。しかしながら、このアッセイ法では、バクテリオファージDNAは２個の分子スイッチによって検出される。これにより期待以上に検出の特異性が増加した。全体の反応：
D-グルコース＋ATP-G6PDH → グルコース6-リン酸＋ADP
グルコース6-リン酸＋NADPH＋H+-G6PDH → グルコン酸6-リン酸＋NAD
は、両方の結合事象が成功裡に行われたときのみ進行できる。Bergmeyer（Bergmeyer 1965）に従って、D-グルコース、ATPおよびNADPHを基質として用いる。NADPHの酸化を光度分析的にまたは蛍光分析的にモニターする。
【０１６２】
この実施例は、多重化（multiplexing）を実施することも可能であることを証明している。それぞれ多少にかかわらず独立して測定できる異なった反応を触媒する酵素および異なった検体を検出するプローブを用いたときは、それにより異なった検体を一つのおよび同一のアッセイ法で測定できる。
【０１６３】
〔実施例５〕
さらなる実施例で、実施例１に詳細に記載したようにして、オリゴヌクレオチドアプタマーの
2007519413.tif 000008
とG6PDHを、ヒトαトロンビン（トロンビン）と結合する目的で共役させる。精製した分子スイッチ、すなわちG6PDH×トロンビン、を4〜70℃の間で、好ましくは約25℃で、約20mM tris/HCl, pH 7.4, 140mM NaCl, 5mM KCl, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2および5%(v/v) グリセロール中でヒトα−トロンビンと接触させる。ヒトα−トロンビンとオリゴヌクレオチドアプタマーとの結合、それにより誘導されたオリゴヌクレオチドアプタマーの立体構造変化は、分子スイッチの活性の変化を導き、その変化は、定められた濃度範囲内で、検体、すなわちヒトα−トロンビンの濃度に比例する。実施例１で指示された方向に沿って、実施例および操作手順に記載された基質を加えることによって、分子スイッチの活性が現れる。
【０１６４】
〔実施例６〕
さらに、上記の結合方法を、バクテリオファージDNA検出のための
2007519413.tif 000009
を構築するために使用する。Bergmeyer（Bergmeyer 1965）または分子プローブ−蛍光マイクロプレートアッセイ法（分子プローブ、1998）の記載に従って、各種の基質を検出反応に用いる。ガラクトシル化タンパク質の変換は、ガラクトースの変換よりバクテリオファージDNAの結合により強く影響される。ガラクトースの変換は、系の全体の活性、または反応条件、例えば、副反応および不活性化によりもたらされるこの活性の変化を推定するための参照として働く。両方の値が、バクテリオファージDNAの濃度を最適に決定するため、考慮される。ガラクトシル化タンパク質の変換は、バクテリオファージDNAの結合に関する実際の指標である。二つの活性の差または商は、例えば、この目的に使用される。
【０１６５】
〔実施例７〕
グルコース6-リン酸脱水素酵素（G6PDH）を、実施例１の記載に従って、
2007519413.tif 000010
の配列を有するオリゴヌクレオチドと共役させる。しかしながらこの場合、共役は3'末端を介して行われる。分子間でハイブリダイズするプローブを作成するために、次にハイブリダイゼーションを
2007519413.tif 000011
を用いて行う。分子間プローブのハイブリダイゼーションは、次に太字で書かれた配列領域を介して行われる。小文字で書かれた配列領域はバクテリオファージDNAを認識するために用いられる。斜字で書かれた領域は分子間プローブのハイブリダイゼーションのためと、バクテリオファージDNAを認識するための両方のために用いられた。特定の実施例において、
2007519413.tif 000012
をその5'末端でビオチンに、そして、必要な場合は、ストレプトアビジンと共役させた。
【０１６６】
他の特定の実施例は、指示物質として機能する追加のヌクレオチドが5'末端で結合している系である。この場合でも使用できる他の阻害物質は、ヌクレオシド一リン酸の他に、ヌクレオシド二リン酸およびヌクレオシド三リン酸、特にATPであり、そしてまた、ミリスチン酸、ジヒドロエピアンドロステロンおよびパルミトイル-CoAである。特定の実施例では、さらにβ-NADH, α-NADH, β-NADPH, α-NADPH, G6Pおよびグルコン酸6リン酸を5'末端で共役させることもできる。
【０１６７】
次に、バクテリオファージDNAを検出するために、精製した分子スイッチ G6PDH×λを、以下のように用いることができる。G6PDH×λを試料と共にインキュベートする。この試料は、予め熱変性して一本鎖DNAとして存在している精製したDNAを含んでいる。インキュベーションは5〜500mM トリス−塩酸、pH 6.5〜10、および5〜500mM NaCl中、特に約50mM トリス−塩酸、pH 9、50mM NaCl中で行う。温度は4〜80℃の間、特に30〜60℃そして好ましくは約50℃である。0.5〜60分間、特に2〜10分間、好ましくは約5分間のインキュベーションの後、検出反応を、Bergmeyer（Bergmeyer 1965）に従って、塩化マグネシウム、グルコース6-リン酸およびβ-NADPを加えて行う。反応は、4〜50℃の間、特に10〜40℃そして好ましくは約37℃で行う。検出は実施例１に記載されたように行う。
【０１６８】
バクテリオファージDNAが存在する場合は、変換はバクテリオファージDNAの量に応じて比例して増加する。バクテリオファージDNAに非共有的に結合したプローブ成分の結合は、ここで基質が触媒中心へのアクセスを得ることを可能にする。配列および実験条件の選択は、プローブ成分のいかなる大きな再会合も、バクテリオファージDNAと共有的に結合したプローブとのハイブリダイゼーションも妨害し、このハイブリダイゼーションは酵素活性にネガテイブな影響を与え得る。
【０１６９】
〔実施例８〕
グルコース6-リン酸脱水素酵素（G6PDH）を配列
2007519413.tif 000013
を有するオリゴヌクレオチドと共役させる。 5-SH-修飾オリゴヌクレオチドの共役を、少なくとも１つの上記の選択的成分、例えば、臭化エチジウムホモダイマー-1を担持する水溶性架橋剤を用いて行う。
【０１７０】
対応するスイッチ［G6PDH×選択的成分×λ プローブ］を次に、以下のようにバクテリオファージDNAを検出するために用いる。この分子スイッチを試料と共にインキュベートする。この試料には、予め熱変性して一本鎖DNAとして存在している精製したDNAを含んでいる。インキュベーションは5〜500mM トリス−塩酸、pH 6.5〜10、および5〜500mM NaCl中、特に約50mM トリス−塩酸、pH 9、50mM NaCl中で行う。温度は4〜70℃の間、特に30〜55℃そして好ましくは約35℃である。0.5〜60分間、特に2〜10分間、好ましくは約5分間のインキュベーションの後、検出反応を、Bergmeyer（Bergmeyer 1965）に従って、塩化マグネシウム、グルコース6-リン酸およびβ-NADPを加えて行う。検出は、約340 nmの波長で分光光度計を用いて、石英キュベット中で分光測定的に行う。定められた時間間隔に渡って吸収の変化を測定し、そしてこのようにして変換または反応速度を測定する。バクテリオファージDNAが存在する場合は、変換はバクテリオファージDNAの量に応じて比例して減少する。
【０１７１】
バクテリオファージDNAがプローブに結合する場合は、劇的な予期しない立体構造の変化が、選択的成分の存在により生じる。この立体構造の変化は、基質の触媒中心へのアクセスを、予期しないほどの極端に効率的な様式で阻止する。この理由は選択的成分の二本鎖DNAに対する親和性である。選択的成分の二本鎖DNAに対する結合は、触媒成分に関連したプローブの立体構造の変化を導き、この変化が効率よく活性中心へのアクセスを阻止する。
【０１７２】
上記のように、選択的成分がハイブリダイズしていない核酸、例えば、一本鎖DNAにより高い親和性を有する系を用いることも当然可能である。この場合、結合プロセス、立体構造変化および分子スイッチの活性は、検体の不在または存在下に対応するやり方で変化する。選択的成分をMA1250に記載された実施例と組み合わせることも当然可能である。
【０１７３】
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【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】触媒活性の変化に関する可能な原理を示す。
【図２】触媒活性の局所的勾配関数を示す。
【図３】触媒活性の局所的勾配関数を示す。
【図４】最初はハイブリダイズしていない一本鎖プローブを用いた実施例を示す。
【図５】最初にハイブリダイズしていない一本鎖プローブを有するシステムが、点突然変異(単一ヌクレオチド多型（SNPs)）を検出するためにも適していることを示す。
【図６】ハイブリダイズした二本鎖プローブを有するシステムにおいて、分子スイッチ（３）は触媒成分（５）と直接に、または必要な場合はカップリング成分（６）を介して結合できるプローブ（４）を含んでいる。
【図７】異なった長さのプローブ成分を用いる代わりに同一の長さを有するか少なくとも１つのミスマッチを示すものを用いうることが考えられることを示す。
【図８】図８に示されたプローブ構造を用いることが、干渉するハイブリダイゼーション過程を避けるための助けになることを示す。
【図９】図９に示された１つの特定の実施態様において、分子内二次構造を有するプローブ（４）を触媒成分（５）と直接に、またはカップリング成分（６）を介するかのいずれかで、５’末端および３’末端の両方で共役させることを示す。
【図１０】触媒成分（５）が酵素（Ｅ）の場合、触媒中心（１）へのアクセスに対する影響を除く他の作用、例えば触媒成分それ自体での立体構造変化（CC）を生じさせることができることを示す。
【図１１】触媒成分（５）が酵素（Ｅ）の場合、触媒中心（１）へのアクセスに対する影響を除く他の作用、例えば触媒成分それ自体での立体構造変化（CC）を生じさせることができることを示す。
【図１２】親和性を示す構造要素（１６）がプローブ成分（４）中、または分子内二次構造を有するプローブ領域に組み込まれている場合は、核酸に加えてさらに他の検体（１７）を検出することも可能であることを示す。
【図１３】触媒成分への基質のアクセスへの影響を増大させるために、プローブ成分は適切な領域で他の成分、すなわち阻止成分（１８）と共役させることができることを示す。
【図１４】本発明の試験システムとして用いることができる膜システムおよびマトリクスシステムを示す。
【図１】
2007519413.tif 000014
【図２】
2007519413.tif 000015
【図３】
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【図４】
2007519413.tif 000017
【図５】
2007519413.tif 000018
【図６】
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【図７】
2007519413.tif 000020
【図８】
2007519413.tif 000021
【図９】
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【図１０】
2007519413.tif 000023
【図１１】
2007519413.tif 000024
【図１２】
2007519413.tif 000025
【図１３】
2007519413.tif 000026
【図１４】
2007519413.tif 000027
【配列表】
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【国際調査報告】
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