(57)【要約】【課題】現在において利用可能な技術の制限を克服すると共に安全な制御様式で局所的もしくは全身的に治療物質を供与する効率的な全身的／局所的薬剤供与システムを提供すること。【解決手段】治療および薬剤供与システムは、生体内における循環前駆細胞もしくは遺伝子的に改変された哺乳動物細胞などの目標細胞を捕捉して固定化する被覆を備えた医療デバイスの形態で提供される。上記遺伝子的に改変された細胞は、構成的にまたは制御様式でマーカ遺伝子および少なくとも一種類の治療的遺伝子を発現する遺伝物質を以て遺伝子導入される。上記マーカ遺伝子は血流内における循環細胞には見出されない細胞膜抗原であり、且つ、治療的遺伝子は血管疾患および癌などの疾患を治療するペプチドをコード化する。上記医療デバイス上の上記被覆は、目標細胞を認識して結合する抗体、抗体断片、他のペプチドおよび小寸分子などの少なくとも一種類の配位子を備える生体適合性基質とされ得る。上記治療および／または薬剤供与システムは、改変細胞を刺激して所望のマーカおよび治療的遺伝子産物を発現かつ分泌させる活性化分子などの信号源を備え得る。【選択図】図１Ｃ
2007535389.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子的に設計された細胞膜マーカ分子と少なくとも一種類の治療的遺伝子産物とをコード化する外因性核酸を備えた遺伝子的に改変された哺乳動物細胞と、少なくとも一種類の配位子を担持する基質を備えた被覆を備えると共に患者に植設される医療デバイスであって、上記配位子は上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞の上記細胞膜マーカ分子を認識して結合するという医療デバイスとを備え、上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞は上記医療デバイスに結合し、上記少なくとも一種類の治療的遺伝子産物を発現して分泌する患者における疾患を治療する治療システム。
【請求項２】
前記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を刺激して前記治療的遺伝子産物を発現および／または分泌させる薬剤もしくは化合物を更に備えて成る請求項１記載の治療システム。
【請求項３】
前記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞は自己由来、同種間または異種間である請求項１記載の治療システム。
【請求項４】
前記自己由来、同種間または異種間の細胞は前駆内皮細胞または成熟内皮細胞である請求項３記載の治療システム。
【請求項５】
前記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞内に存在する前記外因性核酸は、少なくとも一種類の治療的遺伝子産物をコード化する少なくとも一個の遺伝子を備えるＤＮＡまたはＲＮＡ分子から成る請求項１記載の治療システム。
【請求項６】
前記外因性核酸は染色体外ＤＮＡである請求項１記載の治療システム。
【請求項７】
前記ＤＮＡ分子はプラスミドから成る請求項５記載の治療システム。
【請求項８】
前記染色体外ＤＮＡは、調節カセットと、細胞膜特異遺伝子と、疾患を治療するペプチドをコード化する少なくとも一個の遺伝子とを備える請求項６記載の治療システム。
【請求項９】
前記細胞膜特異遺伝子は、骨形成蛋白質、前立腺細胞膜蛋白質またはＨ−２Ｋｋ表面蛋白質をコード化する請求項８記載の治療システム。
【請求項１０】
前記少なくとも一個の遺伝子は、プロスタサイクリン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、血管内皮成長因子、アンギオゲニン、抗血管新生因子、および、繊維芽細胞成長因子から成る群から選択された治療的遺伝子産物をコード化する請求項５記載の治療システム。
【請求項１１】
前記配位子は、抗体、抗体断片、抗体と抗体断片との組み合わせ、ペプチド又は小寸分子である請求項１記載の治療システム。
【請求項１２】
遺伝子的に設計された細胞膜マーカと少なくとも一種類の治療的遺伝子産物とをコード化する外因性核酸を備えた遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を、患者に対して提供する段階と、少なくとも一種類の配位子を担持する基質を備えた被覆であって上記配位子は上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞の上記細胞膜マーカを認識して結合するという被覆を備えた医療デバイスを、上記患者に植設する段階とを備え、上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞は上記医療デバイスに結合し、上記少なくとも一種類の治療的遺伝子産物を発現して分泌する患者における疾患を治療する方法。
【請求項１３】
前記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を刺激して特異的遺伝子産物を発現および／または分泌させる薬剤もしくは化合物を前記患者に対して投与する段階を更に備えて成る請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞は自己由来、同種間または異種間である請求項１２記載のシステム。
【請求項１５】
遺伝子的に設計された細胞膜マーカと少なくとも一種類の治療的遺伝子産物とをコード化する外因性核酸を備えた遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を、患者に対して提供する段階と、少なくとも一種類の配位子を担持する基質を備えた被覆であって上記配位子は上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞の上記細胞膜マーカを認識して結合するという被覆を備えた医療デバイスを、上記患者に植設する段階とを備え、上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞は上記医療デバイスに結合し、上記少なくとも一種類の治療的遺伝子産物を発現して分泌する患者における癌を治療する方法。
【請求項１６】
前記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を刺激して前記治療的遺伝子産物を発現および／または分泌させる段階を更に備えて成る請求項１5記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞は自己由来、同種間または異種間である請求項15記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を刺激して治療的遺伝子産物を発現および／または分泌させる前記段階は、上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞と相互作用する化合物を血流内へと放出する段階を備える請求項16記載の方法。
【請求項１９】
前記自己由来、同種間または異種間細胞は成熟内皮細胞である請求項17記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子的に改変された細胞は、外因的に投与されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子であって少なくとも一種類の治療的遺伝子産物をコード化する少なくとも一個の遺伝子を備えるＤＮＡまたはＲＮＡ分子を備える請求項15記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ分子はプラスミドである請求項５記載の治療システム。
【請求項２２】
前記染色体外ＤＮＡは、調節カセットと、細胞膜特異遺伝子と、疾患を治療するペプチドをコード化する少なくとも一個の遺伝子とを備える請求項６記載の治療システム。
【請求項２３】
前記細胞膜特異遺伝子は、骨形成蛋白質、前立腺細胞膜蛋白質またはＨ−２Ｋｋ表面蛋白質をコード化する、請求項８記載の治療システム。
【請求項２４】
前記少なくとも一個の遺伝子は、プロスタサイクリン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、血管内皮成長因子、アンギオゲニン、抗血管新生因子、および、繊維芽細胞成長因子から成る群から選択された治療的遺伝子産物をコード化する請求項５記載の治療システム。
【請求項２５】
前記遺伝子産物は、プロスタサイクリン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、血管内皮成長因子、アンギオゲニン、抗血管新生因子、および、繊維芽細胞成長因子から成る群から選択される請求項１５記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子的に設計された細胞膜マーカと少なくとも一種類の治療的遺伝子産物とをコード化する外因性核酸を備えた遺伝子的に改変された哺乳動物細胞と、少なくとも一種類の配位子を担持する基質を備えた被覆を備えると共に患者に植設される医療デバイスであって、上記配位子は上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞の上記細胞膜マーカを認識して結合するという医療デバイスとを備え、上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞は上記医療デバイスに結合し、上記少なくとも一種類の治療的遺伝子産物を発現して分泌する薬剤供与システム。
【請求項２７】
前記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を刺激して前記治療的遺伝子産物を発現および／または分泌させる活性化分子または誘発可能促進因子を更に備えて成る請求項26記載の薬剤供与システム。
【請求項２８】
前記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞は自己由来、同種間または異種間である請求項26記載の薬剤供与システム。
【請求項２９】
前記自己由来、同種間または異種間細胞は成熟内皮細胞である請求項28記載の薬剤供与システム。
【請求項３０】
前記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞内に存在する前記外因性核酸は、少なくとも一種類の治療的遺伝子産物をコード化する少なくとも一個の遺伝子を備える外因性ＤＮＡまたはＲＮＡ分子から成る請求項26記載の薬剤供与システム。
【請求項３１】
前記外因性核酸は染色体外ＤＮＡである請求項26記載の薬剤供与システム。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ分子はプラスミドから成る請求項26記載の薬剤供与システム。
【請求項３３】
前記染色体外ＤＮＡは、調節カセットと、細胞膜特異遺伝子と、疾患を治療するペプチドをコード化する少なくとも一個の遺伝子とを備える請求項31記載の薬剤供与システム。
【請求項３４】
前記細胞膜特異遺伝子は、プロスタサイクリン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、血管内皮成長因子、アンギオゲニン、抗血管新生因子、および、繊維芽細胞成長因子をコード化する請求項33記載の薬剤供与システム。
【請求項３５】
前記少なくとも一個の遺伝子は、プロスタサイクリン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、血管内皮成長因子、アンギオゲニン、抗血管新生因子、および、繊維芽細胞成長因子から成る群から選択された治療的遺伝子産物をコード化する請求項30記載の薬剤供与システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年４月３０日に出願された米国仮出願第６０／５６６，８２９号および２００４年４月３０日に出願された米国出願第１０／８３５，７６７号の特典を主張する。
本発明は、種々の疾患を治療するために患者の血管または中空器官内に植設される被覆済みステント、ステント・グラフト、合成血管グラフト、心臓弁、カテーテルおよび血管用人工フィルタなどの医療デバイスに関する。特に本発明は、血液に接触する表面上の被覆であって当該医療デバイスの表面上に細胞を捕捉すべく設計された被覆を備える医療デバイスに関する。捕捉された細胞は上記デバイスの表面上に単層を形成すると共に、薬剤供与システムなどの多くの治療用途および／または血管疾患の治療において有用である。たとえば、植設された医療デバイスに結合する細胞は、循環血液からの生来の前駆内皮細胞および／または試験管内で遺伝子的に修飾された細胞とされることで、患者の体内で局所的または包括的な治療効果を有する分子もしくは物質を生体内で発現かつ分泌し得る。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症および癌などの疾患は、世界における死亡および障害の２大要因である。アテローム性動脈硬化症は動脈の管腔側表面（ｌｕｍｉｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ）上における脂肪プラークの進展を伴う。こられの脂肪プラークは、動脈の断面積の狭幅化を引き起こす。最終的に、病巣の遠位側における血液流は減少され、動脈により供給が行われる組織に対する虚血性損傷を引き起こす。
【０００３】
冠状動脈は、心臓に対して血液を供給する。冠状動脈のアテローム性動脈硬化症または冠状動脈疾患（ＣＡＤ）は、米国において１，１００万人以上に影響する最も一般的で深刻かつ慢性的な、命に関わる病気である。冠状動脈のアテローム性動脈硬化症による社会的および経済的な損失は、他の殆どの疾患による損失を大きく上回る。冠状動脈内腔が狭幅化すると心筋が影響され、先ず狭心症となり、次に心筋硬塞となり、最後に死亡する結果となり、且つ、これらの患者の内の３０万人以上が病院に行く前に死亡している（非特許文献１）。
【０００４】
ＣＡＤは、経皮的かつ経管腔的な冠状動脈の血管形成術（ＰＴＣＡ）を用いて治療され得る。米国では毎年、４００，０００件を超えるＰＴＣＡ処置が実施されている。ＰＴＣＡにおいては、バルーン・カテーテルが末梢動脈内に挿入されると共に、閉塞された冠状動脈内へと動脈系を通して挿通される。次にバルーンが膨張され、動脈が拡張され、かつ、障害物となる脂肪プラークが平坦化されることから、冒された動脈を通る血液の断面積流が増大される。しかし上記治療は通常は、冒された冠状動脈の持続的な開成には帰着しない。ＰＴＣＡにより治療された患者の５０％もが、冠状動脈の再狭幅化を矯正するために６ヶ月以内に反復処置を必要とする。ＰＴＣＡによる治療の後における動脈のこの再狭幅化は医学的には、再狭窄と称される。急性的に、再狭窄は血管の反動および収縮を伴う。引き続き、血管の反動および収縮には、ＰＴＣＡによる動脈の損傷に応じた中央平滑筋細胞の増殖が追随する。部分的に、平滑筋細胞の増殖は、トロンボキサンＡ２、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）および繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などの種々の炎症因子を損傷領域から放出することにより媒介される。再狭窄の問題を克服するために、種々の薬理学的作用物質による患者の治療、または、動脈をステントにより機械的に開成保持するなどの多数の異なる技術が使用されてきた（非特許文献１）。
【０００５】
再狭窄を克服すべく用いられる種々の処置の内、ステントが最も有効であると判明した。ステントは、罹患した血管セグメント内に位置されて正常な血管内腔を生成する金属製の枠材（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）である。冒された動脈セグメント内にステントを載置すると、動脈の反動および引き続く閉成が防止される。ステントはまた、動脈の中央層に沿う該動脈の局部的解離も防止し得る。ＰＴＣＡのみを用いて生成されるよりも大寸の内腔を維持することにより、ステントは再狭窄を３０％も多く減少する。それらの好結果にも関わらず、ステントは再狭窄を完全には排除していない。（非特許文献２）
【０００６】
動脈の狭幅化は、冠状動脈以外に、大動脈回腸動脈、鼠径下部（ｉｎｆｒａｉｎｇｕｉｎａｌ）動脈、末梢大腿深動脈、末梢膝窩動脈、脛骨動脈、鎖骨下動脈および腸間膜動脈などの血管でも生じ得る。末梢動脈アテローム性動脈硬化症疾患（ＰＡＤ）の有症率は、冒された特定の解剖学的部位、ならびに、閉塞の診断に対して使用される判断基準に依存する。習用的に医師は、ＰＡＤが存在するか否かを決定するために、間欠跛行（かんけつはこう）の試験を用いてきた。しかしこの手段は、個体群における実際の発生率を大幅に過小評価し得る。ＰＡＤの割合は年齢により変化し、高齢者においてＰＡＤの発生率は高いと思われる。国立病院の退院調査からのデータによれば、毎年、５５，０００人の男性および４４，０００人の女性が慢性ＰＡＤであると初めて診断され、かつ、６０，０００人の男性および５０，０００人の女性が急性ＰＡＤであると初めて診断されたと見積もられる。急性ＰＡＤの場合の９１％は、下肢が関与していた。ＰＡＤである患者における合併ＣＡＤの有症率は、５０％を超え得る。これに加え、ＰＡＤである患者においては脳血管障害の有症率が増大している。
【０００７】
ＰＡＤは、経皮的かつ経管腔的なバルーン式血管形成術（ＰＴＡ）を用いて治療され得る。ＰＴＡに関してステントを用いると、再狭窄の発生率は低下する。しかし、ステントなどの医療デバイスにより得られた術後結果は、標準的な手術による血管再生処置、すなわち静脈または人工バイパス材料を使用する処置を用いて得られた結果に匹敵しない。（非特許文献３）
【０００８】
好適にはＰＡＤは、閉塞された動脈の区画がグラフトを用いてバイパスされるというバイパス処置を用いて治療される。（ニューヨーク、マックグローヒル医療従事者部門、１９９９年、第７版、シュワルツ等編、手術の原理、第２０章、動脈疾患。）グラフトは、伏在静脈などの自己由来の静脈セグメント、または、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、または、発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、あるいは、他のポリマ材料などで作成された合成グラフトから成り得る。術後の開存率は、バイパス・グラフトの管腔的寸法、グラフトに対して用いられた合成材料の種類、および、流出の部位などの多数の異なる要因に依存する。しかし、過剰な内膜過形成および血栓症は、バイパス・グラフトを使用してさえも、依然として相当な問題である。たとえば、ｅＰＴＦＥバイパス・グラフトを用いた３年後の鼠径下部バイパス処置の開存性は、大腿骨／膝窩バイパスでは５４％であり、かつ、大腿骨／脛骨バイパスでは僅かに１２％である。
【０００９】
故に、ＣＡＤおよびＰＡＤの罹病率および死亡率を更に減少すべく、ステント、合成バイパス・グラフト、および、他の長期的血液接触表面および／またはデバイスの性能を改良するという相当な要望が在る。たとえば、血管の径方向拡大（外方へのもしくは正の再構成）を引き起こし得る処置はアテローム硬化性プラークの漸進的成長を補償し得ることから、流れを制限する狭窄の進展を順延するはずである。
【００１０】
ステントに依ると上記手法は、血栓症および再狭窄を減少するために種々の血栓症防止作用物質または再狭窄防止作用物質で該ステントを被覆するものとされてきた。たとえば、ステントを放射性物質で含浸すると、筋線維芽細胞の移動および増殖を抑制することにより再狭窄が抑制されると思われる。（特許文献１、特許文献２、特許文献３。）しかし、治療される血管に照射を行うと、患者に対する深刻な縁部再狭窄の問題が生じ得る。これに加えて照射は、冒された血管の均一な治療を許容するものでない。
【００１１】
代替的にステントは、その全てが血栓症および／または再狭窄を低減すると思われるヘパリン、ホスホリルコリン、ラパマイシンおよびタキソールなどの化学物質でも被覆されてきた。ヘパリンおよびホスホリルコリンは動物モデルにおいて短期では血栓症を顕著に低減すると思われるが、これらの作用物質による治療は再狭窄を防止する長期的効果は有さないと思われる。これに加え、ヘパリンは血小板減少症を伴うことから、脳卒中などの深刻な血栓塞栓症の合併症に繋がり得る。故に、この様な再狭窄の治療を実用的とするためにヘパリンまたはホスホリルコリンのいずれかを十分に治療的に有効な量でステントに装填することは実現可能ではない。
【００１２】
術後の再狭窄および血栓症を低減するために、合成グラフトは種々の様式で処理されてきた。（ボス等の“小径の血管グラフト・プロテーゼ：現況”、物理生化学文書、１９９８年、第１０６巻、１００−１１５頁［Ｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｓｍａｌｌ−Ｄｉａｍｅｔｅｒ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｇｒａｆｔ  Ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｐｈｙｓｉｏ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０６：１００−１１５］。）たとえば、ｅＰＴＦＥグラフトと比較してメッシュ形状のポリカーボネート・ウレタンなどのポリウレタンの複合材料は再狭窄を低減すると報告されている。上記グラフトの表面は、ポリテレフタレート・グラフトをフッ素化するために高周波グロー放電を用いて改変されてもいる。合成グラフトは、コラーゲンなどの生体分子に含浸されてもいる。しかし、これらの手法のいずれも、長期に亙る血栓症または再狭窄の発生率を相当に減少してはいない。
【００１３】
内皮細胞（ＥＣ）層は、血流と、血管壁の周囲組織との間の界面を提供する正常な血管壁の重要な構成要素である。内皮細胞はまた、血管新生、炎症、および、血栓症の防止などの生理学的事象にも関与する（ロジャース・ジー・エム、雑誌ＦＡＳＥＢ、１９８８年、第２巻、１１６−１２３頁［Ｒｏｄｇｅｒｓ  ＧＭ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １９８８；２：１１６−１２３］）。血管系を構成する内皮細胞に加え、最近の研究では、出生後にＥＣおよび内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が末梢血内で循環することが分かった（アサハラ等、サイエンス、１９９７年、第２７５巻、９６４〜７頁［（Ａｓａｈａｒａ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７：２７５：９６４−７］；イン・アー等、血液、１９９７年、第９０巻、５００２〜５０１２頁［Ｙｉｎ  ＡＨ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  １９９７；９０：５００２−５０１２］；シー・キュー等、血液、１９９８年、第３６２巻、３６２〜３６７頁［Ｓｈｉ  Ｑ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  １９９８：９２：３６２−３６７］；ゲーリング・ユーエム等、血液、２０００年、第９５巻、３１０６〜３１１２頁［Ｇｅｈｌｉｎｇ  ＵＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  ２０００：９５：３１０６−３１１２］；リン・ワイ等、雑誌“臨床研究”、２０００年、第１０５巻、７１〜７７頁［Ｌｉｎ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０００：１０５：７１−７７］）。ＥＰＣは、外傷および虚血性の損傷の部位を含め、損傷された内皮層を有する循環系の領域を移動すると確信される（テイー・タカニシ等、自然薬品、１９９９年、第５巻、４３４〜４３８頁［Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９９；５：４３４−４３８］）。正常な成人において末梢血のＥＰＣの濃度は３〜１０細胞／ｍｍ３である（テイー・タカニシ等、自然薬品、１９９９年、第５巻、４３４〜４３８頁；カルカ・シー等、胸部手術年報、２０００年、第７０巻、８２９〜８３４頁［Ｋａｌｋａ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．  ２０００：７０：８２９−８３４］）。今や、損傷に対する血管応答の各段階は（制御されなければ）内皮により影響されることは明らかである。損傷されると共にステント設置された血管セグメント上に機能的内皮層を迅速に再確立すれば、循環するサイトカインに対する障壁を提供することにより血栓の悪影響を防止すると共に、それらの能力により下側に位置する平滑筋細胞層を不動態化する物質を生成することで、これらの可能的に深刻な合併症の防止が助力され得ると確信される。（ヴァン・ベル等、１９９７年、ステント内皮化、血液循環、第９５巻、４３８〜４４８頁［Ｖａｎ  Ｂｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｓｔｅｎｔ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９５：４３８−４４８］；ボス等の“小径の血管グラフト・プロテーゼ：現況”、物理生化学文書、１９９８年、第１０６巻、１００−１１５頁。）
【００１４】
内皮細胞は、ステントの植設の後で血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）すなわち内皮細胞分裂促進因子の局部的な供与により、ステントの表面上に成長することが奨励されてきた（ヴァン・ベル等、１９９７年、ステント内皮化、血液循環、第９５巻、４３８〜４４８頁）。塩水溶液内における組換え蛋白質成長因子すなわちＶＥＧＦを負傷の部位にて付与すると望ましい効果が誘発されるが、ＶＥＧＦはステント植設の後でチャネル式バルーン・カテーテルを用いて供与される。この技術は望ましくない、と言うのも、単一回分の供与の効率は低く、一貫しない結果を生み出すことが例証されたからである。故に、この処置は毎回正確には再現され得ない。
【００１５】
内皮細胞と共に合成グラフトも播種されたが、おそらくは、細胞がグラフトに対して適切には付着せず且つ／又は生体外操作による該細胞のＥＣ機能の喪失により、内皮播種による臨床結果は概略的に不十分、すなわち、術後の開存率が低いものであった（リオ等、１９９８年、微小血管グラフト設置における新たな概念および材料；人工グラフト内皮細胞播種および遺伝子治療、顕微手術、第１８巻、２６３〜２５６頁［Ｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ：  Ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  Ｇｒａｆｔ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  １８：２６３−２５６］）。
【００１６】
故に、血管負傷の部位における内皮細胞の付着、成長および分化を調節する上では、原位置での内皮細胞成長因子および周囲条件が本質的である。従って、再狭窄および他の血管疾患に関し、目標血管セグメントまたはグラフト設置された内腔上に融合性のＥＣ単層が形成されることで新内膜過形成が抑制される様に、植設されたデバイスの表面上における機能的内皮の形成を促進および加速するという新規な方法、ならびに、ステントおよび合成グラフトなどの医療デバイスを被覆する組成物に対する要望が在る。
【００１７】
癌などの疾患に関し、今日まで使用された殆どの治療物質は患者に関する概略的な全身効果を有することから、習用の経口的もしくは静脈内的な処方による薬剤を使用すると、体内における癌細胞だけでなく一切の分裂細胞にも影響する。更に、治療を必要とする疾患の性質、ならびに、溶解度、生体内安定性、生物学的利用能などの薬剤の特性の故に、多くの場合において全身的投与は有効でない。全身的投与時に薬剤は、正常組織を含む身体領域まで血液循環により搬送されて分散される。疾患部位において薬剤濃度は最初は低いが多くの場合に毒性レベルまで増加する一方、非疾患領域においては上記薬剤の存在により不都合な副作用が引き起こされる。一定の場合、投与の後で薬剤は容易に代謝分解され得る。故に、薬理学的効力を達成すると共に持続時間を延長すべく多くの場合に薬剤の回分量は増大され、正常組織に対する全身的負担ならびに患者に対するコスト問題が引き起こされる。他の場合、一定の強力な薬剤の治療可能性は、該薬剤の毒性的な副作用の故に満足され得ない。
【００１８】
故に、薬剤供与システムの効力および目標限定性を改善すべく、多くの努力が為されてきた。たとえば薬剤を供与すべくリポソームを使用することは好適とされてきた、と言うのも、概略的にリポソームは、血液内における薬剤循環時間を増加し、血流における自由薬剤の濃度制限により副作用を減少し、薬剤分解を低減し、投与後における治療効果を延長し、頻繁な投与の必要性を減少し、かつ、必要な薬剤の量を減少するからである。しかし、現在において利用可能なリポソーム・システムは、生体内の目標部位に対する薬剤供与効率は限られることが分かっている。特許文献４および特許文献５を参照されたい。
【００１９】
治療用化合物を高度に効率的に供与するために、遺伝子導入ＤＮＡを取入れ得るウィルス・ベクタが開発されたが、好首尾な臨床応用の数は限られている。故に、試験管内および動物モデルにおける好結果の件数に関わらず、遺伝子導入技術は細胞治療と結合することが提案される。種々の細胞種に対する遺伝子組合せ物の生体外での導入は、直接的な生体内でのベクタ導入よりも治療的に更に実現可能なことを立証する可能性がある。１９８７年におけるコーン等［Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．］、１９９７年におけるビルバオ等［Ｂｉｌｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．］および２００３年におけるグラノウカキス等［Ｇｌａｎｎｏｕｋａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．］を参照されたい。
【００２０】
更に最近、薬剤溶出ステント（ＤＥＳ）などの局所的薬剤供与搬送体が開発された。特許文献６、特許文献７および特許文献８を参照されたい。しかし先行技術の薬剤溶出ステントは、薬剤の種類、放出されるべき薬剤の量、および、薬剤を放出するために必要とされる時間長などの多くの要因により制限される。薬剤溶出ステントに関して考慮される必要がある他の要因は、ポリマ基質などの他のステント被覆成分に対する薬剤相互作用、および、疎水性、分子量、殺菌後の非分解性および活性、ならびに、効力および毒性などの個々の薬剤特性である。薬剤溶出ステントのポリマ基質に関しては、ポリマ種類、ポリマ比率、薬剤積荷能力、および、ポリマの生体適合性、ならびに、薬剤の薬理学的反応速度などの薬剤／ポリマ適合性を考慮せねばならない。
【００２１】
更に、薬剤溶出ステントにおける薬剤回分量は事前装填されると共に、個々の状態および必要性に関する薬剤回分量の調節は達成され得ない。また薬剤放出時間に関し、薬剤溶出ステントは植設すると同時に薬剤の放出を即時的に開始し、理想的なリアルタイムの放出は達成され得ない。
【特許文献１】米国特許第５，０５９，１６６号
【特許文献２】米国特許第５，１９９，９３９号
【特許文献３】米国特許第５，３０２，１６８号
【特許文献４】米国特許第５，０４３，１６５号
【特許文献５】米国特許第４，９２０，０１６号
【特許文献６】米国特許第６，２７３，９１３号
【特許文献７】米国特許第６，２５８，１２１号
【特許文献８】米国特許第６，２３１，６００号
【非特許文献１】ハリソンによる内科の原理［Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ］、第１４版、１９９８年
【非特許文献２】１９９８年のスリャプラナタ等による“選択された急性心筋梗塞の患者におけるバルーン式血管形成による冠状動脈ステント設置の無作為比較”。血液循環、第９７巻：２５０２〜２５０２頁［Ｓｕｒｙａｐｒａｎａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｔｅｎｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｂａｌｌｏｏｎ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ  ｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７：２５０２−２５０２］
【非特許文献３】ニューヨーク、マックグローヒル医療従事者部門、１９９９年、第７版、シュワルツ等編、手術の原理、第２０章、動脈疾患［Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，  Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２０，  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９９］
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
故に、現在において利用可能な技術の制限を克服する効率的な全身的／局所的薬剤供与システムを開発することが待ち望まれている。本発明は、安全な制御様式で局所的もしくは全身的に治療物質を供与するシステムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の目的は、患者の疾患を治療する治療薬剤供与システムおよび方法を提供するに在る。治療または薬剤供与システムは、前駆内皮細胞または遺伝子的に改変された哺乳動物細胞、および、少なくとも単一的にまたは二重に遺伝子導入された遺伝子的に改変された哺乳動物細胞などの目標細胞を認識して結合する少なくとも一種類の配位子を備える基質を備える被覆を有する医療デバイスを備える。
【００２４】
本発明の医療デバイスは、患者の体内に植設可能な任意のデバイスとされ得る。たとえば一実施例において上記デバイスは、血管もしくは中空器官の内腔内に挿入されるステント、ステント・グラフト、心臓弁、カテーテル、血管用人工フィルタ、人工心臓、外部および内部の左心室支援デバイス（ＬＶＡＤ）など、ならびに、癌、および、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、血栓症、血管障害などの血管疾患の治療、もしくは、これらのデバイスにより付加的に対処される他の任意の用途に対する合成血管グラフトである。
【００２５】
一実施例において本発明の医療デバイスの上記被覆は、生体適合性基質と、少なくとも一種類の物質もしくは配位子であって、再狭窄の防止もしくは治療などにおける前駆内皮細胞、または、血管再構成および癌の治療などにおける遺伝子的に改変された哺乳動物細胞などの目標細胞を特異的に認識して該デバイスの表面上へと結合させるという少なくとも一種類の物質または配位子とを備える。
【００２６】
付加的に、上記医療デバイスの被覆は選択的に、上記遺伝子的に改変された細胞の設計済み遺伝子の発現かつ分泌を調節する少なくとも一種類の活性化化合物を備え得る。活性化刺激化合物の例としては、限定的なものとしてで無く、化学的部分、および、成長因子などのペプチドが挙げられる。上記被覆が少なくとも一種類の化合物を備えるという実施例において、上記刺激活性化分子もしくは化合物は、上記細胞を刺激して疾患の治療のための少なくとも一種類の治療物質を発現および／または分泌させるべく機能し得る。
【００２７】
一実施例において上記医療デバイス上の上記被覆は、抗体、抗体断片、または、抗体および抗体断片の組み合わせなどの少なくとも一種類の配位子、あるいは、上記遺伝子的に修飾された細胞の表面の設計マーカに結合する少なくとも一種類の分子、の治療的有効量を付着させる外側面を備える生体適合性基質を備える。本発明の抗体または抗体断片は、目標細胞が上記デバイスの表面上に固定化される様に、目標細胞の細胞膜または表面上の抗原または特異的な遺伝子的に設計された細胞表面マーカを認識して結合する。一実施例において上記被覆は、固定化された前駆内皮細胞を刺激する有効量の少なくとも一種類の化合物であって、目標細胞が循環前駆細胞ならば成熟した機能的内皮の形成を加速し、または、目標が医療デバイスの表面の遺伝子的に改変された細胞ならば結合された細胞を刺激して所望の遺伝子産物を発現かつ分泌させるという有効量の少なくとも一種類の化合物を備え得る。
【００２８】
本発明の上記医療デバイスは内腔を備える器官もしくは身体部分内へと植設される任意のデバイスとされ得ると共に、限定的なものとしてで無く、ステント、ステント・グラフト、合成血管グラフト、心臓弁、カテーテル、血管用人工フィルタ、ペースメーカ、ペースメーカ・リード線、除細動器、卵円孔開存（ＰＦＯ）隔膜閉塞デバイス、血管クリップ、血管動脈瘤咬合器、血液透析グラフト、血液透析カテーテル、房室シャント、大動脈瘤グラフト・デバイスもしくは構成要素、静脈弁、縫合糸、血管吻合クリップ、留置式の静脈もしくは動脈カテーテル、血管鞘体、および、薬剤供与ポートとされ得る。上記医療デバイスは、該デバイスに依存して多数の材料で作成され得る。たとえば本発明のステントは、ステンレス鋼、ニチノール（ＮｉＴｉ）またはクロム合金および生分解可能物質から作成され得る。合成血管グラフトは、架橋ＰＶＡヒドロゲル、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、孔性高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリウレタン、および、ポリエチレン・テレフタレートまたは生分解可能物質から作成され得る。
【００２９】
本発明の医療デバイスの被覆を形成する生体適合性基質は、限定的なものとしてで無く、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン−尿素／ヘパリン、ポリＬ乳酸、セルロース・エステル、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニル、デキストランおよびゼラチンなどの合成材料、および／または、コラーゲン、エラスチン、トロポエラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン、フィブリンの如き基底膜成分、セルロース、および、非晶質カーボン、または、フラーレンなどの天然物質から成る。
【００３０】
本発明の一実施例において、上記医療デバイスはフラーレンを備える生体適合性基質を備える。この実施例においてフラーレンは、炭素原子数が約Ｃ２０〜約Ｃ１５０の範囲とされ得ると共に、より詳細にはフラーレンはＣ６０またはＣ７０である。本発明のフラーレンはまた、医療デバイスの表面上のナノチューブとしても配置され得る。
【００３１】
本発明の一実施例において、上記配位子は上記医療デバイスの血液接触表面に適用され、且つ、該配位子は循環血液中における目標細胞の表面上の所望の化合物もしくはエピトープを特異的に認識して結合する。一実施例において上記配位子は特に、遺伝子的に改変された細胞の細胞膜上の遺伝子的に設計されたマーカ分子のみを認識することで遺伝子的に改変された哺乳動物細胞のみを認識して結合すべく設計される。目標細胞を結合すると、該細胞は上記デバイスの表面に固定化される。
【００３２】
一実施例において、上記医療デバイスの表面上の配位子であって遺伝子的に改変された細胞を結合するための配位子は、遺伝子的に設計された細胞膜マーカ分子に依存して選択される。すなわち上記配位子は、医療デバイスの表面上の該配位子により、遺伝子的に修飾された細胞のみが認識され得る様に、該細胞に対して提供された染色体外遺伝物質に起因して該細胞により発現される細胞膜マーカ分子もしくは抗原に対してのみ結合する。この様にして、医療デバイスの表面に対しては遺伝子的に修飾された細胞のみが結合し得る。たとえば、上記哺乳動物細胞が内皮細胞ならば上記配位子は少なくとも一種類の抗体、抗体断片またはそれらの組み合わせとされ得ると共に、上記抗体は、目標細胞の表面上の特異的な目標エピトープもしくはマーカ分子に対して特異的に提起される。本発明のこの見地において上記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体とされ得るが、該抗体は、表面マーカ分子と相互作用することにより遺伝子的に改変された内皮細胞のみを認識して結合することで、医療デバイスの表面に対する上記細胞の付着を調節する。本発明の抗体または抗体断片は、上記基質の表面に対して共有結合的にまたは非共有結合的に付着されるか、または、医療デバイスの基質被覆の最外側層に対してリンカ分子により共有結合的に束縛され得る。この実施例において、たとえば、上記モノクローナル抗体はＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を更に備え得る。本発明の抗体断片は、抗体として、目標抗原を認識して結合する特性を保持する大寸または小寸の分子などの任意の断片サイズを備える。
【００３３】
別実施例において本発明の抗体または抗体断片は、治療されつつある哺乳動物に対する特異性を以て抗原を認識して結合すると共に、その特異性は細胞系統に依存しない。特異的細胞膜マーカ分子を含む様には細胞が遺伝子的に修飾されない場合に再狭窄を治療するという一実施例において、上記抗体または断片は、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤｗ９０、ＣＤ１１７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、Ｍｕｃ−１８（ＣＤ１４６）、ＣＤ１３０、幹細胞抗原（Ｓｃａ−１）、幹細胞因子１（ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ配位子）、Ｔｉｅ−２、Ｈ−２ＫｋなどのＭＨＣ、および、ＨＡＤ−ＤＲなどの、循環する前駆内皮細胞表面抗原を特異的に選択して結合する。
【００３４】
別実施例において上記医療デバイスの被覆は上述された如く少なくとも一層の生体適合性基質を備え、該基質は、治療的有効量の天然または合成由来の少なくとも一種類の小寸分子を付着させる外側面を備える。上記小寸分子は、たとえば再狭窄の治療においては前駆内皮細胞を認識して相互作用し、該細胞を上記デバイスの表面上に固定化して内皮層を形成する。上記小寸分子は、種々の疾患の治療のために上記医療デバイスと併せて使用可能であり、且つ、脂肪酸、蛋白質、核酸、糖類などの細胞成分などの種々の供給源から供与され得ると共に、抗体と同一の結果もしくは効果を以て、前駆内皮細胞の表面上の抗原と相互作用し得る。本発明のこの見地において上記医療デバイス上の上記被覆は、抗体もしくは抗体断片を備える被覆と併せて本明細書で記述された如く成長因子などの化合物を更に備え得る。
【００３５】
一実施例において、たとえば再狭窄を治療する場合に本発明の被覆の化合物は、前駆細胞が成長および分化して成熟した機能的内皮細胞となるのを刺激もしくは加速する任意の化合物を備える。別実施例において上記化合物は、遺伝子的に修飾された細胞を刺激し、所望の遺伝子産物を発現かつ分泌させる。たとえば、本発明で使用される化合物は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子、血小板起因成長因子、形質転換成長因子β１、酸性繊維芽細胞成長因子、アンジオポエチン１（Ａｎｇ−１）、アンジオポエチン２（Ａｎｇ−２）、インスリン状成長因子、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＢＢ、血小板由来成長因子ＡＢ、および、内皮ＰＡＳ蛋白質１などの成長因子とされ得る。
【００３６】
たとえば遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を用いる別実施例において、細胞を刺激して、遺伝子的に設計された遺伝子産物を発現かつ分泌させるために有用な活性作用物質もしくは化合物としては、限定的なものとしてで無く、エストロゲン、テトラサイクリンおよび他の抗体、タモキシフェンなどが挙げられると共に、パッチを介して皮膚を通し且つ皮下的などの種々の投与経路を介して患者に提供され得る。
【００３７】
本発明はまた、血管疾患、癌、血管再構成、深刻な冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、血栓症、動脈瘤および血管障害などの種々の疾患を治療する方法も提供する。一実施例においては、ステントもしくは合成血管グラフト、心臓弁、腹部大動脈瘤デバイスおよびそれらの構成要素などの血管壁に対する医療デバイス挿入物を保持もしくはシールし、且つ、血管の恒常性を確立することで、再狭窄における如き過剰な内膜過形成を防止する方法が提供される。アテローム性動脈硬化症を治療する本発明の方法において動脈は、冠状動脈、または、大腿動脈などの末梢動脈のいずれかとされ得る。これらの技術および医療デバイスを用いて、静脈も治療され得る。
【００３８】
再狭窄の治療に関して本発明は、治癒応答を誘起すべく設計された方法も提供する。一実施例においては、植設された血管の目標病巣において植設されたデバイスの管腔側表面において内皮の融合層の形成を迅速に誘起する方法が提供され、その場合に内皮細胞は、窒素酸化物シンテターゼならびに他の抗炎症因子および炎症調節因子を発現する。本発明はまた、先行技術のデバイスと比較して大きな生体適合性を有する医療デバイスであって、該医療デバイスの植設の部位における内側管腔表面（ｉｎｎｅｒ  ｌｕｍｉｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ）に沿う平滑筋細胞の移動、平滑筋細胞の分化、および、コラーゲン析出を低減もしくは抑制することにより、組織による過剰な内膜過形成および再狭窄を低減もしくは抑制するという医療デバイスも提供する。
【００３９】
一実施例において、医療デバイスを被覆する方法は、医療デバイスの表面に対して少なくとも一層の生体適合性基質を適用する段階であって、上記生体適合性基質は、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン−尿素／ヘパリン、ポリＬ乳酸、セルロース・エステル、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニル、デキストラン、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、トロポエラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン、フィブリン、セルロースおよび炭素およびフラーレンから成る群から選択された少なくとも一種類の成分を備え得るという段階と、治療的有効量の少なくとも一種類の抗体、抗体断片またはそれらの組み合わせ、および、内皮細胞の成長および分化を刺激する少なくとも一種類の化合物を、上記生体適合性基質に対して同時にまたは順次的に適用する段階とを備える。
【００４０】
本発明は更に、哺乳動物の血管もしくは管状器官の内腔内に医療デバイスを植設する段階を備える哺乳動物における血管疾患を治療する方法であって、上記医療デバイスは、（ａ）生体適合性基質、（ｂ）治療的有効量の少なくとも一種類の抗体、抗体断片またはそれらの組み合わせ、および、（ｃ）少なくとも一種類の化合物により被覆され、上記抗体または抗体断片は前駆内皮細胞が上記基質の表面上に固定化される様に前駆内皮細胞上の抗原を認識して結合し、且つ、上記化合物は固定化された前駆内皮細胞を刺激して上記医療デバイスの表面上に内皮を形成するという方法を提供する。
【００４１】
一実施例においては、患者における疾患を治療する治療／薬剤供与システムも提供される。該治療または薬剤供与システムは、遺伝子的に設計された細胞膜マーカと少なくとも一種類の治療的遺伝子産物とをコード化する外因性核酸を備えた遺伝子的に改変された哺乳動物細胞と、患者に植設される医療デバイスとを備える。一実施例において上記遺伝子的に設計された細胞は、該細胞に対して所望の遺伝子を提供する外因性遺伝物質を備える適切な遺伝子導入ベクタにより試験管内で遺伝子導入される。この実施例において上記細胞は、内皮細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞などの自己由来、同種間または異種間のいずれかの任意の哺乳動物細胞とされ得る。この実施例において上記医療デバイスは、遺伝子的に改変された哺乳動物細胞の表面上の遺伝子的に設計された細胞膜マーカ分子もしくは抗原に対して結合することで上記細胞に対してのみ結合する配位子を備える生体適合性基質により被覆される。
【００４２】
この実施例の治療および／または薬剤供与システムにおいて、遺伝子的に改変された細胞に対しては、細胞表面マーカ分子をコード化する少なくとも一種類の所望遺伝子と、治療的遺伝子産物をコード化する少なくとも一個の遺伝子とを導入する外因性遺伝物質が提供される。上記システムは選択的に、上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を刺激することで所望の遺伝子産物および／またはマーカ遺伝子を発現および／または分泌させる活性化化合物もしくは分子などの信号システムを備える。
【００４３】
故に、一実施例において、哺乳動物細胞内に導入される外因性遺伝物質は、上記デバイス上の配位子に対して特異的に結合する細胞膜マーカをコード化すべく設計される。たとえば、上記デバイスが血管内腔内に植設されるなら、患者に対して提供される上記遺伝子的に設計された細胞を除き、血流内を循環する一切の細胞においては見出されない細胞膜マーカをコード化する。
【００４４】
また、限定的なものとしてで無く、アテローム性動脈硬化症、癌および慢性関節リウマチなどの血管疾患の如き種々の疾患の治療のための被覆済み医療デバイスおよび方法も提供される。本発明の医療デバイスは、患者に対する該被覆済み医療デバイスの植設時に同時にまたは順次的に導入される遺伝子的に改変された哺乳動物細胞の生体内での特異的な捕捉および固定化のための被覆を備える。
【００４５】
また、特定の疾患を治療する少なくとも一種類の物質もしくは治療物質を発現および／または分泌すべく固定化された遺伝子的に改変された細胞も提供される。たとえば癌を治療する本発明のこの見地において、たとえば内皮細胞などの細胞は、該細胞内に外因性遺伝物質を導入することにより遺伝子的に改変される。一実施例において上記遺伝物質は、上記細胞の核内に導入されると共に、染色体外ＤＮＡなどのＤＮＡである。該染色体外ＤＮＡは、アデノウイルス・ベクタなどのベクタ、裸のプラスミドなどのプラスミド、線状もしくは短寸のＤＮＡなどとされ得る。一実施例において上記ＤＮＡは、所望のマーカおよび／または治療的遺伝子の発現を制御する調節／発現カセットから成る。一実施例において上記調節カセットは、治療的遺伝子の構成性発現に対する調節要素から成り得るか、または、必要に応じて患者により制御もしくは発現され得る要素から成り得る。
【００４６】
一実施例において、患者に植設される医療デバイスは被覆を備え、該被覆は、目標細胞を認識して結合する少なくとも一種類の配位子を担持する基質を備える。細胞が遺伝子的に改変されるという実施例において、上記配位子は、細胞内へと設計された特異的な細胞膜マーカ分子もしくは抗原のみを認識して結合する。故にこの実施例において、斯かる配位子は患者に導入された遺伝子的に改変された哺乳動物細胞のみを認識し、且つ、遺伝子的に改変された哺乳動物細胞は上記医療デバイスに結合すると共に、マーカ分子もしくは抗原ならびに少なくとも一種類の治療的遺伝子産物を発現かつ分泌する。
【００４７】
別実施例において上記治療もしくは薬剤供与システムは更に、上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を刺激して所望の治療的遺伝子産物を発現および／または分泌させる活性化分子も備え得る。本発明のこの見地においては患者に対し、経口経路、熱的パッチ、静脈内的、皮内的などの幾つかの方法により、化学的興奮剤またはペプチドなどの化合物が提供され得る。この実施例において上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞は、成熟内皮細胞、繊維芽細胞、筋細胞、上皮細胞などの内因的または異種間とされ得ると共に、染色体外ＤＮＡとされ得る外因性核酸を備え得る。一実施例において上記ＤＮＡは、アデノウイルス・ベクタ、裸のプラスミドＤＮＡ、線状ＤＮＡなどのベクタの形態で提供される。一実施例において上記染色体外ＤＮＡは、調節カセットと、細胞膜抗原をコード化する遺伝子と、疾患を治療するペプチドをコード化する少なくとも一個の遺伝子とを備える。この実施例のひとつの見地において、上記細胞膜特異遺伝子は、たとえば骨形成蛋白質もしくは前立腺細胞膜蛋白質をコード化する。
【００４８】
一実施例において上記染色体外遺伝物質は、血管再構成に使用される血管内皮成長因子およびアンギオゲニン、または、癌の治療における抗血管新生因子などの治療／薬剤生成物をコード化する遺伝子を備える。
【００４９】
別実施例においては、患者の疾患を治療する方法が提供される。該方法は、
遺伝子的に設計された細胞膜マーカ分子と少なくとも一種類の治療的遺伝子産物とをコード化する外因性核酸を備えた遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を、患者に対して提供する段階と、
少なくとも一種類の配位子を担持する基質を備えた被覆であって上記配位子は上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞上の上記細胞膜マーカ分子を認識して結合するという被覆を備えた医療デバイスを、上記患者に植設する段階とを備え、
上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞は上記医療デバイスに結合し、上記治療的遺伝子産物を発現して分泌する。本発明の実施例において上記治療的遺伝子および遺伝子産物は、たとえば、血管内皮成長因子、アンギオゲニン、抗血管新生因子、および、繊維芽細胞成長因子などから成る。
【００５０】
本発明は、患者における疾患を治療する方法も提供し、該方法は、遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を患者に対して提供する段階と、医療デバイスを上記患者に植設する段階とを備え、上記医療デバイスは少なくとも一種類の配位子を担持する基質を備える被覆を備え、上記配位子は、上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞上の受容体などの少なくとも一種類のマーカ分子を特異的に認識して結合し、且つ、上記遺伝子的に改変された哺乳動物細胞は、上記医療デバイスに結合すると共に、治療的遺伝子産物を発現かつ分泌する外因性核酸を備える。
【００５１】
別実施例においては、生体内で血液接触表面に対して細胞を収集する方法が提供される。該方法は、対象体の血流内に位置された血液接触表面を提供する段階であって、該血液接触表面は上記対象体の血流内を循環する目標細胞を該血液接触表面に対して収集すべく構成されるという段階と、上記血液接触表面に対して目標細胞を収集する段階とを備える。この実施例において上記血液接触表面は、対象体に植設された医療デバイスの管腔側表面から成る。本発明のこの実施例において、たとえばステントもしくはグラフトなどの上記血液接触表面上に収集された目標細胞は、血管損傷の部位において正常な内皮を復元する上で上記デバイスの表面を自己内皮化（ｓｅｌｆ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚｅ）し得る。上記血液接触表面は生分解可能な枠材とされ得るか、または、生分解可能で生体適合性の材料で被覆され得る。本発明のこの見地において、上記生分解可能な枠材は血管内に植設されたときにその場で分解され、且つ、デバイスの管腔側表面上に形成された新内皮は、機能的な新血管を形成すべく損傷部位の全体に亙り血管連続性を復元する。
【００５２】
別実施例において本発明は、（ａ）外側表面および血液接触表面を有する支持部材と、（ｂ）上記支持部材の上記血液接触表面上に被覆された架橋ポリマ化合物の第１層と、（ｃ）上記第１層上に被覆されると共に、生体内で目標細胞に対する親和力を有する少なくとも一種類の配位子を備える第２層とを備えて成るプロテーゼから成る。
【００５３】
別実施例においては、（ａ）血管グラフトとして機能すべく構成されると共に内孔表面および外側表面を有する枠材であって、上記内孔表面は内皮前駆細胞に対して特異的に結合する配位子を備えるという枠材を配備する段階と、（ｂ）上記枠材を対象体の血管内に植設する段階と、（ｃ）循環する内皮前駆細胞を上記枠材の上記内孔表面に対して収集することにより新内皮を形成する段階とを備えて成る、生体内で自己内皮化するグラフトを作成する方法。
【００５４】
更に別の実施例においては、（ａ）循環血液に対して露出される表面を有するプロテーゼ構造を配備する段階と、（ｂ）該プロテーゼ構造を対象体内に植設する段階と、（ｃ）血液から内皮前駆細胞および遺伝子的に改変された哺乳動物細胞などの循環細胞を収集して上記プロテーゼ構造の上記表面上に結合することで該構造上に新内皮を形成する段階とを備える、原位置において自己内皮化するグラフトを作成する方法が提供される。
【００５５】
別実施例においては、（ａ）一時的な血管グラフトとして機能すべく構成されると共に内孔表面および外側表面を有する生分解可能な枠材を配備する段階と、（ｂ）上記生分解可能な枠材を血管内に植設する段階と、（ｃ）前駆内皮細胞および遺伝子的に改変された哺乳動物細胞などの循環細胞を収集して、グラフト、ステントまたは生分解可能な枠材などのプロテーゼの管腔側表面に結合させることで新内皮を形成する段階と、（ｄ）上記枠材の外側表面を血管組織により被包することで外側止血用血管構造を形成する段階と、（ｅ）上記新内皮および上記外側血管構造が機能的新血管を形成するのを許容する時間枠内において生体内条件下で上記生分解可能な枠材を分解する段階とを備えて成る、原位置で自己内皮化するグラフトを作成する方法。
【００５６】
一実施例においては、原位置で自己内皮化する血管グラフトを形成する生分解可能な枠材であって、（ａ）内孔および外側表面を有する孔性の生分解可能支持部材と、（ｂ）上記支持部材に対して被覆された少なくともひとつの種のポリマ化合物の第１層を備える内孔表面であって、上記化合物は、生体内条件下で酵素的切断もしくは非酵素的加水分解に委ねられる共有結合を形成する架橋剤により該化合物自体が架橋されるという内孔表面と、（ｃ）遺伝子的に改変された哺乳動物細胞に対して生体内で結合する特異的親和力を有する配位子とを備えて成る、生分解可能な枠材が提供される。
【００５７】
別実施例においては、（ａ）循環血液に露出される表面を有するプロテーゼ構造を配備する段階と、（ｂ）上記プロテーゼ構造を対象体または患者に対して植設する段階と、（ｃ）遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を上記患者に対して投与する段階と、（ｄ）遺伝子的に改変された哺乳動物細胞などの細胞を血液から収集して上記プロテーゼ構造の表面に結合させ、上記プロテーゼ構造の表面上に遺伝子的に改変された細胞の層を形成する段階とを備えて成る、原位置において自己内皮化するグラフト。
【００５８】
更に別の実施例においては、損傷血管の内方へのもしくは負の再構成を防止もしくは抑制すべく、外方へのもしくは正の再構成により動脈の円周を増大し、動脈損傷の後でアテローム硬化性プラークの形成によりまたは内膜過形成により引き起こされる内腔の侵食を部分的にまたは全体的に補償する方法が提供される。この実施例においては、たとえばプロスタグランジン１２すなわちＰＧ１２などのプロスタサイクリン、α−ＣＧＲＰなどのカルシトニン遺伝子関連ペプチドなどの少なくとも一種類の強力な抗凝血剤および血管拡張因子を分泌し得る内皮前駆細胞などの遺伝子的に修飾された自己由来細胞を捕捉するために、たとえば、遺伝子的に設計された細胞と併せて上述された如く基質および配位子により被覆されたステントが提供される。上記細胞により生成されるべく設計され得る他の生成物としては、窒素酸化物（窒素酸化物シンテターゼ遺伝子）、基質メタロプロテアーゼ、アセチルコリン、アデノシン、５−ヒドロキシトリプタミン、Ｐ物質、アドレノメジュリンなどが挙げられる。その生成物が血管拡張因子および／または抗凝血剤として作用しまたは斯かる特性を有するという一切の遺伝子が使用され得ると共に、たとえば、血管拡張因子は血管平滑筋の弛緩を引き起こし得る。前駆内皮細胞もしくは内皮細胞に対しては、たとえばシストロン遺伝子構造を用いるウィルス的遺伝子導入などの遺伝子導入技術により、たとえば血管拡張因子をコード化するプロスタサイクリン・シンテターゼ遺伝子などの遺伝子が提供可能であり、たとえばプロスタサイクリンの場合、シストロン性シクロオキシゲナーゼ−１／プロスタサイクリン・シンテターゼ遺伝子構造はプロスタサイクリンを局所的に連続的に供与し得る。この実施例において、プロスタサイクリンに対する局所的供与システムは、たとえば脳梗塞および冠状動脈血管疾患を治療すべく使用され得る。動脈硬化を調節するための治療としては、血管の正の再構成すなわち成人における小動脈および動脈などの成熟血管の形成を使用して、側枝血管も形成され得る。
【００５９】
別実施例においては、繊維芽細胞、内皮細胞または前駆内皮細胞などの適切な細胞が、血管内プロテーゼ上に固定化された抗体などの配位子により認識され得る血管拡張化合物、および、短小化ＭＨＣ−Ｉなどの固有細胞表面マーカの両方をコード化するバイシストロン性ベクタを以て遺伝子導入され得る。たとえば、抗体などの配位子により被覆されたステントが患者の冠状動脈内に植設され得ると共に、血管疾患の治療を必要とする上記患者に対し、遺伝子的に修飾された内皮細胞などの遺伝子的に修飾された細胞の移植が追随する。この実施例、および、遺伝子的に修飾された細胞を用いる他の実施例においては、たとえばバイシストロン性ｐＭＡＣＳＫＫ．ＩＩプラスミド・ベクタ（ドイツ、ミルテニ・バイオテック社）などのプラスミド・ベクタであって、マルチクローニング部位を含むと共に、たとえばプロスタサイクリン・シンテターゼなどの関心遺伝子、ならびに、使用される哺乳動物細胞系統に対する選択マーカとしての短小化ＭＨＣクラスＩ分子Ｈ−２ＫＫなどのマーカ遺伝子が挿入され得るというプラスミド・ベクタを用いる標準的な遺伝子設計技術を使用して、細胞の移植に先立ち該細胞内に外因性遺伝子が供与され得る。
【００６０】
更に別の実施例において、治療に使用される哺乳動物細胞に遺伝子導入を行う外因性遺伝子供与システムは、たとえば、短小化ＭＨＣクラスＩ抗原、および、血管疾患を治療するプロスタサイクリン・シンテターゼおよび／またはα−ＣＧＲＰ遺伝子などの血管拡張因子導入遺伝子を含み得るレンチウィルス・ベクタを備え得る。この実施例において、遺伝子導入されるべき哺乳動物細胞は自己由来の内皮細胞もしくは内皮前駆細胞とされ得ると共に、上記人工デバイスは、短小化ＭＨＣクラスＩ抗原に対して特異的である抗Ｈ−２Ｋｋ抗体などの配位子により被覆され得る。
【発明の効果】
【００６１】
本発明によれば、現在において利用可能な技術の制限を克服すると共に安全な制御様式で局所的もしくは全身的に治療物質を供与する効率的な全身的／局所的薬剤供与システムが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
本発明は、ステントもしくはグラフトなどの植設可能な被覆済み医療デバイス、該医療デバイスを被覆する方法および組成物、および、上記被覆済み医療デバイスにより血管疾患を治療する方法を提供する。また、再狭窄および癌などの疾患を治療する方法であって、治療を必要とする患者に対して被覆を備えた医療デバイスを植設する段階と、上記医療デバイスの表面に対して生体内で結合すべく遺伝子的に設計された哺乳動物細胞であって遺伝子産物などの所望の設計治療物質を生成し得るという哺乳動物細胞を患者に対して供与する段階とを備えた方法も提供される。図１Ａ乃至図１Ｃは、本発明の医療デバイスの表面被覆の概略図を示している。上記医療デバイス上の被覆は、抗血管新生因子もしくは血栓症防止作用物質を生成し、または、再狭窄および／または血栓症を防止する上で過剰な内膜過形成を抑制する生成物を生成するなどの、患者における所望の治療事象を調節しまたは引き起こすべく、当該デバイスの表面上に内皮細胞もしくは繊維芽細胞などの遺伝子的に改変された哺乳動物細胞の如き細胞の融合層の形成を促進する生体適合性基質を備える。一実施例において上記人工デバイス上の上記被覆は、合成もしくは天然の物質であって治療的有効量の少なくとも一種類の抗体が、上記医療デバイスに対する内皮前駆細胞もしくは幹細胞などの遺伝子的に改変された哺乳動物細胞などの循環細胞の付着を促進するという合成もしくは天然の物質と、内皮細胞の成長および分化を刺激する成長因子などの少なくとも一種類の化合物とを備えた基質（ｍａｔｒｉｘ）を備える。上記デバイスの植設時に、該デバイスの表面に対して付着する細胞は、該医療デバイスの管腔側表面上の内皮の如き成熟細胞の融合機能層へと形質転換する。たとえば、上記医療デバイス上に内皮細胞の融合層が存在すると、植設の部位における再狭窄および血栓症の発生頻度が減少され得る。
【００６３】
本明細書中で用いられる如く“医療デバイス”とは、病状の予防処置または治療のために哺乳動物の体内に一時的もしくは永続的に導入されるデバイスを指す。これらのデバイスとしては、動脈、静脈、心臓の心室または心房などの、器官内、組織内または器官の内腔内に着座すべく皮下的、経皮的または手術的に導入される任意のデバイスが挙げられる。医療デバイスとしては、ステント、ステント・グラフト、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）または他の天然もしくは合成カバーによりカバーされたステントなどのカバー付きステント、または、合成血管グラフト、人工心臓弁、人工心臓、および、血管循環系に対して人工器官を接続する固定具、静脈弁、腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）グラフト、下大動脈フィルタ、永続的薬剤注入カテーテル、塞栓用コイル、血管塞栓で使用される塞栓用物質（たとえば架橋ＰＶＡヒドロゲル）、血管縫合糸、血管吻合用固定具、経心筋層血管再生用ステントおよび／または他の管路が挙げられる。
【００６４】
本発明の組成物および方法による医療デバイスの被覆は、該デバイスの表面において生体内で哺乳動物細胞の融合層の発育を刺激する。たとえば上記医療デバイスの表面上の内皮細胞層は、提供された配位子が内皮細胞に結合して上記デバイスの血液接触表面上に機能的内皮層を形成するときに形成されることで、再狭窄を防止すると共に、上記医療デバイスの植設から帰着する局所的な慢性的炎症性反応および血栓塞栓症合併症を調節する。
【００６５】
上記医療デバイスを被覆する上記基質は、ポリビニル・アルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリＬ乳酸、セルロース・エステル、または、ポリエチレングリコールから作成されたヒドロゲルなどのポリマ性ゲル発泡体などの合成材料から構成され得る。一実施例においては、デキストラン化合物などの非常に親水性の化合物が、上記基質を作成する合成材料を構成し得る。別実施例において上記基質は、コラーゲン、フィブリン、エラスチン、トロポエラスチンおよび／または非晶質カーボンなどの天然物質から構成され得る。上記基質は数層から成り得ることも可能であり、第１層は合成もしくは天然の物質から構成され、且つ、第２層はたとえば抗体などの配位子から構成される。上記各層は順次的に順序付けされ得ると共に、上記第１層はステントもしくは合成グラフトなどの医療デバイスの表面に対して直接接触すると共に、上記第２層は上記第１層に接触する一方の表面と血管内腔に接触する他方の表面とを有する。
【００６６】
上記基質は更に、少なくとも、成長因子、サイトカイン、血管拡張因子、抗凝血剤などを備え得る。内皮細胞の増殖および分化を刺激し得る成長因子は、たとえば、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）およびイソ型、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板起因成長因子（ＰＩＧＦ）、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ．ｂ１）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、オステオネクチン、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、インスリン状成長因子（ＩＬＧＦ）、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、血小板由来成長因子ＡＢ（ＰＤＧＦ−ＡＢ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などであり、本発明においてはその機能的断片が使用され得る。血管拡張因子としては、プロスタサイクリン、α−ＣＧＲＰなどが挙げられる。
【００６７】
別実施例において上記基質はフラーレンを備え得るものであり、その場合にフラーレンの炭素数は約Ｃ２０〜約Ｃ１５０の範囲である。上記フラーレンはまた、分子もしくは蛋白質を取入れるナノチューブとしても配置され得る。上記フラーレン基質はまた、ステンレス鋼、ＰＴＦＥまたはｅＰＴＦＥの医療デバイスの表面に対して適用され得ると共に、この層は次に、その表面上で抗体および成長因子により官能化かつ被覆される。代替的に上記ＰＴＦＥまたはｅＰＴＦＥは先ず、たとえばステンレス鋼製の医療デバイス上に層状化されてから、フラーレンの第２層により追随され、次に抗体および成長因子が加えられる。
【００６８】
上記基質は、上記医療デバイスに対して非共有結合的にまたは共有結合的に付着され得る。抗体および成長因子は、ヘテロまたはホモ二官能性架橋試薬を用いて上記基質に対して共有結合的に付着され得る。上記成長因子は、抗体と共に、または、抗体の結合の後で、標準的技術を用いて上記基質に加えられ得る。
【００６９】
本明細書中で用いられる如く“抗体”という語句は、モノクローナル、ポリクローナル、ヒト化もしくはキメラ抗体またはそれらの組み合わせなどの一種類の抗体を指し、その場合にモノクローナル、ポリクローナル、ヒト化もしくはキメラ抗体は、ひとつの抗原、または、その抗原の機能的同等物に対して結合する。また抗体断片という語句は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などの抗体の任意の断片を包含すると共に、抗体として同一の結果もしくは効果を有する任意のサイズの、すなわち更に大寸もしくは小寸の分子とされ得る。（抗体とは、１モルの抗体当たりで６．０２２×１０２３個の分子に等しい複数種の個別抗体分子を包含する。）
【００７０】
一実施例においては、たとえば、ステントまたは合成グラフトは、治療用に遺伝子的に改変された哺乳動物細胞および前駆内皮細胞などの循環細胞が医療デバイスに付着するのを調節する抗体、抗体断片、または、それらの組み合わせを備える生体適合性基質により被覆され得る。たとえば本発明の抗体は、循環血液中の遺伝子的に修飾された哺乳動物細胞が上記デバイスの表面上に固定化されて該デバイス上に機能的内皮などの機能的細胞層を形成する様に、上記哺乳動物細胞により生成された前駆内皮細胞の表面抗原および／または細胞膜分子などの特異的細胞膜マーカ分子を認識して結合する。一実施例において上記抗体は、血管内皮成長因子受容体−１、−２および−３（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３、および、ＶＥＧＦＲ受容体群のイソ型）、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ２、ＣＤ３４、Ｔｈｙ−１、Ｔｈｙ−２、Ｍｕｃ−１８（ＣＤ１４６）、ＣＤ３０、幹細胞抗原−１（Ｓｃａ−１）、幹細胞因子（ＳＣＦまたはｃ−Ｋｉｔ配位子）、ＣＤ１３３抗原、ＶＥ−カドヘリン、Ｐ１Ｈ１２、ＴＥＫ、ＣＤ３１、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、または、当該細胞の表面上に発現した抗原などの、遺伝子的に改変された哺乳動物細胞の表面分子、前駆内皮細胞の表面抗原、または、前駆細胞もしくは幹細胞の表面抗原と反応する（認識して結合する）モノクローナル抗体から成る。一実施例においては、ひとつの抗原と反応する単一種類の抗体が使用され得る。代替的に、異なる前駆内皮細胞の表面抗原に対して企図された複数の異なる抗体が相互に混合されて上記基質に加えられ得る。別実施例においては複数のモノクローナル抗体の混合物が使用され、特定の細胞表面抗原を目標限定することにより、上皮形成の速度が増大される。この実施例においては、たとえば抗ＣＤ３４および抗ＣＤ１３３が組み合わせて使用され得るか、または、これらを上記に列挙された抗原のいずれかもしくは幾つかと組み合わせて使用され、たとえばステントまたはグラフトなどの医療デバイス上の基質の表面に対して付着され得る。
【００７１】
本明細書中で用いられる如く、“治療的有効量の抗体”とは、医療デバイスに対する内皮細胞、前駆細胞または幹細胞などの生来のまたは遺伝子的に改変された哺乳動物細胞の付着を促進する量の抗体を意味する。本発明を実施するために必要な抗体の量は、使用される抗体の性質により変化する。たとえば、用いられる抗体の量は、その抗体と、それが反応する抗原との間の結合定数および／または親和力に依存する。当業者であれば、特定の抗原と共に使用する治療的有効量の抗体を決定する方法は公知であろう。
【００７２】
本明細書中で用いられる如く、“化合物”という語句は、遺伝子的に改変された哺乳動物細胞が治療的遺伝子産物を発現および／または分泌するのを刺激する任意の物質を指す。
【００７３】
本明細書中で用いられる如く、“成長因子”という語句は、内皮細胞、幹細胞または前駆細胞などの細胞を刺激すると共に、遺伝子的に改変されまたはされずに、成熟した機能的内皮細胞へと成長かつ分化し得るというペプチド、蛋白質、糖蛋白質、リポ蛋白質、または、その断片もしくは改変物、あるいは、合成分子を指す。成熟内皮細胞は、窒素酸化物シンテターゼを発現することで、組織内に窒素酸化物を放出する。以下の表１は、上記医療デバイスを被覆すべく使用され得る成長因子の幾つかを列挙している。
【００７４】
【表１】
2007535389.tif 000003
【００７５】
本明細書中で用いられる如く、“ＶＥＧＦ”という語句は、当該イソ型がその数値またはアルファベット省略形を以て特に特定されるのでなければ、上記の表１に列挙された血管内皮成長因子のイソ型の任意のものを意味する。
【００７６】
本明細書中で用いられる如く、“治療的有効量の成長因子”という語句は、たとえば生来のまたは修飾された内皮細胞、前駆細胞または幹細胞などの特定の細胞群が成長かつ分化することを刺激もしくは誘発することで、医療デバイスの管腔側表面上に機能的内皮を形成する内皮細胞などの成熟した機能的細胞層の融合層を形成するという成長因子の量を意味する。本発明を実施するために必要な成長因子の量は、使用される成長因子の性質と、該成長因子と目標細胞上の受容体との間の結合反応速度とにより変化する。たとえば、１００μｇのＶＥＧＦは医療デバイス上の内皮細胞の付着を刺激して上皮の融合層を形成することが示されている。当業者であれば、たとえば内皮細胞などの細胞成長および細胞の分化を刺激する上で使用される成長因子の治療的有効量を決定する方法は公知であろう。
【００７７】
本明細書中で用いられる如く“内膜過形成”とは、血管壁における平滑筋細胞増殖および／または基質堆積の不都合な増加である。また本明細書中で用いられる如く“再狭窄”とは、血管内腔の再発的狭幅化を指している。再狭窄によれば、血管は閉塞され得る。ＰＴＣＡまたはＰＴＡの後、通常は内膜内に存在しない中膜および外膜からの平滑筋細胞が増殖すると共に内膜へと移動して蛋白質を分泌し、内膜内に平滑筋細胞および基質蛋白質の蓄積物を形成する。この蓄積物は動脈の内腔の狭幅化を引き起こし、該狭幅部の遠位に対する血液流を低減する。本明細書中で用いられる如く“再狭窄の抑制”とは、再狭窄およびそれから生ずる合併症を防止すべく蛋白質分泌の防止に伴い、平滑筋細胞の移動および増殖を抑制することを指している。
【００７８】
本発明の医療デバイス、方法および組成物を用いて治療され得る対象体は哺乳動物であり、人間、犬、猫、豚、馬、齧歯（げっし）動物および猿が挙げられる。
【００７９】
本発明の治療方法は、生体内または試験管内で実施され得る。
【００８０】
“前駆内皮細胞”という語句は、骨髄、血液または局所的組織に由来すると共に非悪性である内皮細胞であって、前駆細胞または幹細胞から、成熟した機能的上皮細胞に至る任意の発育段階における内皮細胞を指す。
【００８１】
被覆された医療デバイスは、試験管内で所望の核酸構造により遺伝子的に改変された人間の臍帯静脈などの外植された動脈もしくは静脈から分離され得る遺伝子的に改変された分化内皮細胞などの遺伝子的に修飾された哺乳動物細胞を完全に備え得る一方、前駆内皮細胞は末梢血または骨髄から分離され得る。一実施例においては、抗体と、選択的に少なくとも一種類の成長因子、または、内皮細胞に付着する他の配位子とを取入れた基質により被覆された医療デバイスに対し、内皮細胞は該内皮細胞の温置により結合され得る。別実施例において内皮細胞は、形質転換内皮細胞とされ得る。遺伝子導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）された内皮細胞は、血栓症、再狭窄、または他の一切の治療的結果を直接的もしくは間接的に抑制する成長因子または他のペプチドもしくは蛋白質を発現するベクタを含み得る。
【００８２】
別実施例において、内皮細胞、または、繊維芽細胞などの他の任意の種類の安定的な哺乳動物細胞は、特定用途に適した蛋白質もしくはペプチドをコード化する任意のクローン化遺伝子を含む任意の哺乳動物発現ベクタを以て遺伝子導入され得る。たとえば上記ベクタは、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）または窒素酸化物シンテターゼ（ＮＯＳ）をコード化する遺伝子から成る発現カセットから成るべく構成可能であり、且つ、該発現カセットは習用の方法と市販供給源からの供給物とを用いて構成され得る。（たとえば、カリフォルニア州、サンディエゴのストラタゲン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から市販されている哺乳動物発現ベクタおよび遺伝子導入キットを参照されたい。）たとえば、精製された豚の前駆内皮細胞は、ローゼンガート等（Ｒｏｓｅｎｇａｒｔ  ｅｔ  ａｌ）の方法に従いＶＥＧＦ  ｃＤＮＡを発現するアデノウイルス発現ベクタを用いて血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を以て遺伝子導入される。（ＶＥＧＦ１２１  ｃＤＮＡを発現するアデノウイルス・ベクタの直接的な心筋内投与を用いた冠状動脈疾患の治療に対する血管新生遺伝子の段階Ｉ試行の６ヶ月評価。言及したことにより本明細書中に援用される１９９９年の手術年鑑、第２３０（４）巻；４６６−４７７頁［Ａｎｎ．  Ｓｕｒｇ．  ２３０（４）：４６６−４７０，  １９９９］。）この実施例において哺乳動物細胞は、由来が自己由来、同種間または異種間とされ得る。細胞が、所望の遺伝子を備える外因性のＤＮＡまたはＲＮＡ発現カセットの遺伝子導入により遺伝子的に改変されたなら、該細胞は標準的な組織培養技術を用いて成長され得る。所望の遺伝子を発現して分泌する細胞のサンプルは、標準的技術を用いて液体窒素内に凍結保存され得る。凍結された細胞は、使用前に標準的な組織培養技術を用いて再生され得る。遺伝子的に改変された哺乳動物細胞は、被覆済み医療デバイスの植設時に、好適にはデバイスが植設された後、植設部位において局所的に、または、静脈内的または動脈内的に患者に対して投与され得る。形質転換細胞は更に、患者に対する細胞投与に先立ち、該細胞の正確な検出および特定のために、マーカまたはレポータ遺伝子を備え得る。
【００８３】
本発明の血管疾患の治療方法は、任意の動脈または静脈に関して実施され得る。本発明の有効範囲内には、冠状動脈、鼠径下部動脈、大動脈回腸動脈、鎖骨下部動脈、腸間膜動脈および腎動脈が含まれる。本発明によれば、解離性動脈瘤から帰着するなどの他の種類の血管障害も包含される。
【００８４】
血管疾患がある哺乳動物を治療する上記方法は、たとえば血管形成術の間における被覆済みステントの場合などにおいて患者の器官もしくは血管内に被覆済み医療デバイスを植設する段階を備える。一旦原位置とされたなら、抗体のみ又は上記デバイスの被覆上に存在する他の配位子との組み合わせにより、たとえば遺伝子的に修飾された哺乳動物細胞または前駆細胞表面上の細胞抗原を認識して結合することで、被覆済みステントの表面上には前駆内皮細胞が捕捉される。上記基質に対して前駆細胞が一旦付着されたなら、上記被覆上の成長因子は新たに結合した前駆内皮細胞が成長かつ分化してステントの管腔側表面上に融合性で成熟した機能的内皮を形成することを促進する。代替的に上記医療デバイスは、該医療デバイスの植設の前に、患者の血液、骨髄または血管から分離された前駆細胞、幹細胞または成熟内皮細胞とされ得る内皮細胞の如き生来のまたは遺伝子的に修飾された哺乳動物細胞により試験管内で被覆され得る。いずれの場合でも、医療デバイスの管腔側表面上に機能的細胞が存在すると、過剰な内膜過形成および血栓症を抑制もしくは防止するなどの所望のまたは設計された機能が達成され得る。
【００８５】
内皮細胞
幾つかの実施例において、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、その開示内容が言及したことにより本明細書中に援用されるジャッフェ等の雑誌“臨床研究”、１９７３年、第５２巻、２７４５−２７５７頁（Ｊａｆｆｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ５２：２７４５−２７５７，  １９７３）の方法に従い臍帯から獲得され得ると共に、実験で使用された。簡潔には、コラゲナーゼによる処理により血管壁から細胞が剥離されると共に、該細胞は、ゼラチン被覆された組織培養フラスコ内で、１０％の低エンドトキシン胎児子牛血清と、９０μｇ／ｍｌの防腐剤なし豚ヘパリンと、２０μｇ／ｍｌの内皮細胞成長補助栄養（ＥＣＧＳ）と、グルタミンとを含むＭ１９９培地において培養される。
【００８６】
前駆内皮細胞（ＥＰＣ）は、アサハラ等（“血管新生に対する推定前駆内皮細胞の分離”、サイエンス、１９９７年、第２７５巻、９６４〜９６７頁［Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：９６４−９６７，  １９９７］、言及したことにより本明細書中に援用される）の方法に従い、人間の末梢血から分離され得る。ＣＤ３４に対する抗体で被覆された磁性ビーズは、分画された人間の末梢血と共に温置される。温置の後、結合した細胞は溶出されると共に、ＥＢＭ−２培養培地（カリフォルニア州、サンディエゴのクローンティクス社（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ））において培養され得る。代替的に、これらの細胞を分離すべく富化培地分離が使用され得る。簡潔には、末梢静脈血はボランティアから採取されて密度勾配遠心分離により単核細胞画分が分離され、且つ、該細胞は、５％の胎児牛血清、ヒトＶＥＧＦ−Ａ、ヒト繊維芽細胞成長因子２、ヒト表皮成長因子、インスリン状成長因子１およびアスコルビン酸が追加されたＥＣ塩基培地２（ＥＢＭ−２）（クローンティクス社）内でフィブロネクチンが被覆された培養スライド（ベクトン・ディキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））上に塗付された。ＥＰＣは、培養培地を４８時間毎に交換して７日間に亙り成長される。各細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＶＥＧＦＲ−２およびＥセレクチンに対する蛍光抗体により特徴付けられた。
【００８７】
別実施例において、哺乳動物細胞は、循環細胞内において通常は見出されない前立腺特異性抗原または骨細胞抗原などの特異的マーカ分子をコード化する任意のクローン化遺伝子であって習用の方法を用いて血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）または窒素酸化物シンテターゼ（ＮＯＳ）などのペプチドおよび／または蛋白質も発現し得るという任意のクローン化遺伝子を含み得る任意の発現カセットを以て遺伝子導入され得る。（たとえば、カリフォルニア州、サンディエゴのストラタゲン社から市販されている哺乳動物発現ベクタおよび遺伝子導入キットを参照されたい。）たとえば、精製された豚の前駆内皮細胞は、ローゼンガート等（Ｒｏｓｅｎｇａｒｔ  ｅｔ  ａｌ）の方法に従いＶＥＧＦ  ｃＤＮＡを発現する哺乳動物発現カセットを用いて血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を以て遺伝子導入される。（ＶＥＧＦ１２１  ｃＤＮＡを発現するアデノウイルス・ベクタの直接的な心筋内投与を用いた冠状動脈疾患の治療に対する血管新生遺伝子の段階Ｉ試行の６ヶ月評価。言及したことにより本明細書中に援用される１９９９年の手術年鑑、第２３０（４）巻；４６６−４７７頁［Ａｎｎ．  Ｓｕｒｇ．  ２３０（４）：４６６−４７０，  １９９９］。）
【００８８】
抗体
本発明の方法において有用なモノクローナル抗体は、キューラおよびミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の標準技術（言及したことにより本明細書中に援用される“所定特異性の融合細胞分泌抗体の連続培養”、ネーチャー、第２６５巻、４９５〜４９７頁、１９７５年［Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２６５：４９５−４９７，  １９７５］）に従い生成され得るか、または、市販供給源から獲得され得る。内皮細胞は免疫原として使用されることで、内皮細胞表面抗原に対して指向されたモノクローナル抗体を生成し得る。
【００８９】
内皮細胞に指向されたモノクローナル抗体は、ＨＵＶＥＣまたは精製された前駆内皮細胞をマウスまたはラットに注入することにより調製される。十分な時間の後、マウスは犠牲とされて脾臓細胞が獲得される。脾臓細胞は、概略的にはたとえばポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤の存在下で、骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞と共に融合されることで不死化される。融合ハイブリドーマを含む結果的な細胞は、ＨＡＴ培地などの選択的培地において成長が許容されると共に、生き残り細胞は、限界希釈条件を用いて斯かる培地で成長される。上記細胞はたとえば微量滴定ウェルなどの適切な容器内で成長され、且つ、上澄みは、所望の特異性すなわち内皮細胞抗原に対する反応性を有するモノクローナル抗体に対してスクリーニングされる。
【００９０】
モノクローナル抗体の歩留まりを増進すべく、細胞を受け入れる哺乳動物ホストの腹膜腔内にハイブリドーマ細胞を注入するなどの種々の技術が存在する。腹水液に不十分な量のモノクローナル抗体が溜まる場合、抗体はホストの血液から収穫される。他の蛋白質および他の汚染物質からモノクローナル抗体を遊離すべくモノクローナル抗体を分離かつ精製する習用の種々の手法が存在する。
【００９１】
本発明の有効範囲には、これらのモノクローナル抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などの抗内皮細胞モノクローナル抗体などの抗体の有用な結合断片も含まれる。抗体断片は、習用技術により獲得される。たとえば有用な結合断片は、パパインまたはペプシンを用いて抗体をペプチターゼ消化することで調製され得ると共に、単独で、または、その由来の抗体と組み合わされもしくは他の種類の抗体およびその断片と組み合わされて使用され得る。
【００９２】
上記抗体はネズミ供給源からのＩｇＧクラスの抗体に指向され得るが、これは限定を意味するものではない。ネズミ供給源、ヒトを含む哺乳動物供給源、または、他の供給源、または、それらの組み合わせのいずれからであれ、上記の抗体、および、該抗体と機能的等価性を有する抗体などの特異的抗体、ならびに、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥなどの他のクラス内のイソタイプを含め斯かるクラスは、本発明の有効範囲内に含まれる。斯かる抗体は、生来の分子上であれ遺伝子的に設計された抗原上であれ、目標細胞の細胞膜上の目標抗原を特異的に認識すると共に高親和力を以て結合する。抗体の場合に“機能的等価性”という語句は、２つの異なる抗体が各々、抗原上の同一の抗原決定部位に結合すること、換言すると、これらの抗体が同一抗原に対する結合を競うことを意味する。抗原とは、同一のまたは異なる分子上とされ得る。
【００９３】
一実施例においては、たとえばＣＤ３４などの内皮細胞表面抗原と反応するモノクローナル抗体および／またはその断片が使用され得る。固形担体に取付けられた抗ＣＤ３４モノクローナル抗体は、ヒト末梢血から前駆内皮細胞を捕捉することが示されている。捕捉の後、これらの前駆細胞は内皮細胞へと分化し得る。（アサハラ等、“血管新生に対する推定前駆内皮細胞の分離”、サイエンス、１９９７年、第２７５巻、９６４〜９６７頁。）ＣＤ３４に対して指向されたハイブリドーマ生成モノクローナル抗体は、米国細胞バンク（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（メリーランド州、ロックビル）から獲得され得る。別実施例においては、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ１３３またはＴｉｅ−２などの内皮細胞表面抗原と反応するモノクローナル抗体が使用される。遺伝子的に改変された細胞を用いる実施例において、抗体は、上述と同一様式の標準的技術を用いて遺伝子的に設計された遺伝子産物に対して生成されてから、基質適用に続いて医療デバイスの血液接触表面に適用される。
【００９４】
医療デバイス植設を受けるのと同一の種から分離された内皮細胞に対して反応するポリクローナル抗体も使用され得る。
【００９５】
ステント：
本明細書における“ステント”という語句は、血管の内腔内に挿入もしくは植設されたときに血管の断面内腔を拡開させる任意の医療デバイスを意味する。また“ステント”という語句は、本発明の方法により被覆されると共にステンレス鋼または他の合金から製造された市販のステント、ＰＴＦＥまたはｅＰＴＦＥでカバーされたステントなどのカバー付きステントを含む。一実施例においてこれは、冠状動脈閉塞を治療すべく又は脾臓血管、頚動脈、腸骨血管および膝窩血管の解離または動脈瘤をシールすべく経皮的に投入されるステントを含む。別実施例においてステントは、静脈血管内へと投入される。ステントは、医薬物質を備える基質である生体侵食性、生分解可能、生体適合性のポリマと、抗体などの配位子とが適用されるというポリマ性または金属的の構造要素から成り得るか、または、ステントはポリマと相互混合された基質の複合材料とされ得る。たとえば、言及したことにより開示内容全体が本明細書中に援用されるというウィクトルに対する米国特許第４，８８６，０６２号に開示された如き変形可能な金属ワイヤ・ステントが使用され得る。また、それらの全ての開示内容全体が言及したことにより本明細書中に援用されると共に“腔内薬剤溶出プロテーゼ”と称された国際公開公報ＷＯ９１／１２７７９および米国特許第５，８７１，５３５号に開示された如き弾性ポリマ材料製の自己拡開性ステントも使用され得る。使用され得る他のステントは、それらの全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用されるという米国特許第６，４３２，１３２号および第６，８２１，２９２号に開示されている。ステントはまた、ステンレス鋼、ポリマ、ニッケル−チタン、タンタル、金、白金−イリジウム、コバルト系合金、または、エルジロイおよびＭＰ３５Ｎおよび他の鉄系材料を用いて製造されても良い。ステントはカテーテル上で体腔を通して治療部位へと投入され、其処でステントはカテーテルから解放されることで、血管の内腔壁と直接接触すべく拡開され得る。別実施例においてステントは、生分解可能ステントから成る（ピーダブリュ・セルイスおよびエムジェービー・クツリック、マーティン・ダニス編、冠状動脈ステント便覧（２０００年）、第２９７頁、エイチ・タマイ［Ｈ．  Ｔａｍａｉ，  ｐｐ  ２９７  ｉｎ  ＨａｎｄｂｏｏＫ  ｏｆ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ＿Ｓｔｅｎｔｓ＿３ｒｄ＿Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅｄｓ．  ＰＷ  Ｓｅｒｒｕｙｓ  ａｎｄ  ＭＪＢ  Ｋｕｔｒｙｋ，  Ｍａｒｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ  （２０００）］）。当業者であれば、本発明の抗体、成長因子および基質と共に（弾性金属ステント設計態様などの）他の自己拡開性ステント設計態様が使用され得ることは明らかであろう。
【００９６】
合成グラフト
“合成グラフト”という語句は、生体適合特性を有する任意の人工プロテーゼを意味する。一実施例において合成グラフトは、ポリエチレン・テレフタレート（Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）、ＰＥＴ）またはポリテトラフルオロエチレン（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、ｅＰＴＦＥ）から作成され得る。別実施例において合成グラフトは、ポリウレタン、架橋ＰＶＡヒドロゲルおよび／またはヒドロゲルの生体適合性発泡体から成る。更に別の実施例において合成グラフトは、メッシュ状とされたポリカーボネートウレタンの内側層と、メッシュ状とされたポリエチレン・テレフタレートの外側層から成る。当業者であれば、抗体、成長因子および基質などの本発明の被覆成分と共に任意の生体適合性の合成グラフトが使用され得ることは明らかであろう。（言及したことにより本明細書中に援用されるボス等の“小径の血管グラフト・プロテーゼ：現況”、物理生化学文書、１９９８年、第１０６巻、１００−１１５頁［Ｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｓｍａｌｌ−Ｄｉａｍｅｔｅｒ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｇｒａｆｔ  Ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｐｈｙｓｉｏ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０６：１００−１１５］。）合成グラフトはたとえば腹部大動脈瘤デバイスとして、たとえば血管の端部／端部、端部／側部、側部／端部、側部／側部もしくは腔内および吻合に対してまたは疾患血管セグメントのバイパスに対して使用され得る。
【００９７】
基質
（Ａ）合成材料−上記ステントまたは合成グラフトを被覆すべく使用される基質は、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン−尿素／ヘパリン、ポリＬ乳酸、セルロース・エステル、ポリエチレングリコール、架橋ＰＶＡヒドロゲル、ヒドロゲルの生体適合性発泡体、または、カルボキシメチルデキストランなどの親水性デキストランなどの合成材料から選択され得る。
【００９８】
（Ｂ）天然材料−上記基質は、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、ラミニン、ヘパリン、フィブリン、セルロースまたはカーボンなどの天然の物質から選択され得る。上記基質に対する主要な要件は、該基質が、露出されたステントまたは合成グラフトの表面上で非裂開のまま維持されるべく、十分に弾性的かつ撓曲可能なことである。
【００９９】
（Ｃ）フラーレン−上記基質はフラーレンも備え得る（“フラーレン”という語句は複数種のフラーレン分子を包含する）。フラーレンは、カーボン−ケージ分子である。フラーレン種におけるカーボン（Ｃ）分子の個数は、約Ｃ２０〜約Ｃ１５０で変化する。フラーレンは、たとえば炭素のレーザ気化、電気アーク内における炭素加熱、または、煤煙火炎内での炭化水素の燃焼などの、当業者に公知のプロセスにより、元素状炭素または炭素含有種の高温反応により生成される。（全ての開示内容が言及したことにより本明細書中に援用されるというパテル等に対する米国特許第５，２９２，８１３号およびブーシャン等に対する米国特許第５，５５８，９０３号。）いずれの場合でも、炭素質の析出物または煤が生成される。この煤から、トルエンなどの適切な溶媒による抽出により種々のフラーレンが得られる。フラーレンは、公知の方法、特に高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分離される。フラーレンは、合成されるか、または、英国、バークシャーのダイナミック・エンタープライズ社、または、ジョージア州、タッカーのサザン・ケミカル・グループ社、または、米国、テキサス州、ヒューストンのバッキー（Ｂｕｃｋｙ）社から商的に獲得され得る。
【０１００】
フラーレンは、その全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用される米国特許第５，５５８，９０３号に開示された如く昇華、レーザ気化、スパッタリング、イオンビーム、噴射被覆、浸漬被覆、ローラまたはブラシ被覆などの種々の異なる手法で、または、ステントの表面の被覆により、表面上に載置され得る。
【０１０１】
フラーレンの重要な特徴は、“活性炭”を形成する該フラーレンの能力である。フラーレンの電子的構造は、分子の表面の回りに複数の結合電子が協働して存在する如く、π軌道が重なり合うシステムである。（言及したことにより本明細書中に援用される１９９１年４月８日の“化学および工学技術ニュース”、第５９頁［Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎａｉｎｅｅｒｉｎａ  Ｎｅｗｓ，  Ａｐｒ．  ８，  １９９１，  ｐａｇｅ  ５９］。）活性炭の形態としてフラーレンは、弱い相互作用に対する相当のファン・デル・ワールス力を呈する。フラーレン表面の吸着性によれば、フラーレン自体が、特異的な細胞膜相互作用に指向するための付加的改変に役立つ。たとえばフラーレン表面に対しては、特定の細胞種の細胞膜に対し又は細胞膜の特定の成分に対して選択的に結合する化学特性を保有するレクチンまたは抗体などの特定分子が吸着され得る。フラーレン表面に対する異なる分子の付着が操作されることで、たとえば前駆内皮細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、一次的外植片またはＴ細胞亜集団などの種々の細胞種に対して選択的に結合する表面を生成し得る。その全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用されるリッチモンド等に対する米国特許第５，３１０，６６９号；言及したことにより本明細書中に援用されるニューヨーク、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社、２０００年のカディッシュ等編、“フラーレン：化学、物理および技術”、スティーブン・アール・ウィルソンの“フラーレンの生物学的側面”［Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｒ．  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｆｕｌｌｅｒｅｎｅｓ，  Ｆｕｌｌｅｒｅｎｅｓ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｐｙ，  Ｋａｄｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ  ２０００］。
【０１０２】
フラーレンはまた、他の原子もしくは分子を取入れるナノチューブも形成し得る。（その開示内容は言及したことにより本明細書に援用されるリュウ等のサイエンス、２８０巻、１２５３〜１２５６頁（１９９８年）［Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１２５３−１２５６  （１９９８）］。）炭素ナノチューブの合成および調製は業界公知である。（両者共にそれらの全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用されるというオルク等に対する米国特許第５，７５３，０８８号およびエッブソン等に対する米国特許第５，６４１，４６６号。）炭素ナノチューブの内側には、蛋白質などの分子も取入れられ得る。たとえばナノチューブは、該ナノチューブの端部を切断した後で、たとえばＺｎ２Ｃｄ２メタロチオネン、チトクロームＣおよびＣ３、および、β−ラクタマーゼなどの酵素により充填され得る。（両者ともに言及したことにより本明細書中に援用されるデービス等のＩｎｏｒｇａｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、２７２：２６１、（１９９８）、クック等のＦｕｌｌ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈ、５（４）：６９５（１９９７）。）
【０１０３】
３次元フラーレン構造も使用され得る。その全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用されるマーキン等に対する米国特許第５，３３８，５７１号は、（ｉ）フラーレンを化学的に改変することで結合形成種を提供する；（ｉｉ）基材の表面を化学的に処理ことで、溶液内においてフラーレンの結合形成種と共有結合するに有効な結合形成種を提供する；および、（ｉｉｉ）改変されたフラーレンの溶液を上記処理済み基材の表面に接触させ、該処理済み基材の表面に共有結合されたフラーレン層を形成する；ことにより基材表面上に形成される３次元の多層フラーレン構造を開示している。
【０１０４】
（Ｄ）医療デバイスに対する基質の適用
上記基質は、ステントまたは合成グラフトなどの医療デバイスの表面に対して緊密に付着せねばならない。一実施例においてこれは、上記基質を順次的な薄層で適用することで達成される。代替的に、血管内腔に直接接続する外側層の表面に対してのみ、抗体および成長因子が適用される。連続する層において、異なる種類の基質が順次的に適用され得る。抗体は、ステントに対する基質の適用の後、該基質上に共有結合的にまたは非共有結合的に被覆され得る。
【０１０５】
ステントなどの医療デバイスを被覆するために、該ステントは、たとえば中程度の粘度の基質の液体溶液に浸漬され又はそれにより噴射され得る。各層が塗付された後、上記ステントは次の層が塗付される前に乾燥される。一実施例においては、薄寸で塗料状の基質被覆は約１００ミクロンの全厚を超えない。
【０１０６】
一実施例においては、たとえばステント表面などの医療デバイスの表面が先ず官能化されてから、基質層の付加が追随する。その後、上記基質の表面に対しては、抗体、ならびに、成長因子などの上記被覆の他の成分が結合される。この側面において、たとえばステント表面などに上記基質を適用すべく使用される技術は、官能的な化学基を生成する。たとえば該化学基は、目標細胞を特定して捕捉する抗体、ペプチドおよび／または成長因子などの配位子に対する支持部の役割を果たす基質の中間層を固定化すべくポリマの官能基と反応し得るアミンとされ得る。
【０１０７】
別実施例においては、無菌状態下で３ミリリットル（ｍｌ）のクロロホルムに対して（ドイツ、インゲルハイムのベーリンガ社［Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｃ．，  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ］からＲ２０３として入手可能な）ポリＤ，Ｌラクチドなどの薬剤担体を４８０ミリグラム（ｍｇ）溶解することで、適切な基質被覆用溶液が調製される。但し基本的には、血液および組織に適合する（生体適合性である）と共に溶解、分散または乳化され得る任意の生分解可能な（または生分解可能でない）基質が塗付の後で比較的に迅速に乾燥されることで医療デバイス上で自己接着性のラッカーまたは塗料状の被覆となるのであれば、該基質は基質として使用され得る。
【０１０８】
たとえば、ステントをフィブリンで被覆することは当業者に公知である。その全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用されるというミューラ等に対する米国特許第４，５４８，７３６号においては、トロンビンに対してフィブリノゲンを接触させることでフィブリンが凝固されている。好適には、本発明のフィブリン含有ステントにおけるフィブリンは、その全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用されるというゲレンダスに対して発行された米国特許第３，５２３，８０７号に記述された如く、または、その全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用される欧州特許出願公報第０３６６５６４号に記述された如く、植設されたデバイスの機械的特性および生体安定性を改善するために、凝固の間に存在する因子ＸＩＩＩおよびカルシウムを有する。この実施例において、本発明においてフィブリンを作成すべく用いられるフィブリノゲンおよびトロンビンは、たとえば人間対牛などの一切の異種間免疫反応を回避すべく、ステントが植設されるのと同一の動物もしくは人間種に由来する。上記フィブリン生成物は、組み合わされたフィブリノゲンおよびトロンビンをフィルム状に注型した後、半透膜を通して浸透的に該フィルムから湿気を除去することで、繊細なフィブリン・フィルムの形態とされ得る。その全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用される欧州特許出願第０３６６５６４号においては、（好適には高い気孔率、または、トロンビンもしくはフィブリノゲンのいずれかに対する高い親和力を有する）基材が、フィブリノゲン溶液およびトロンビン溶液と接触される。結果は、医療デバイスの表面におけるフィブリノゲンの重合により形成されたフィブリン層である。この方法により適用されたフィブリンの多層は、任意の所望の厚みのフィブリン層を提供し得る。代替的に、フィブリンが先ず凝固されてから粉末へと粉砕され得ると共に、該粉末は水と混合されて加熱鋳型内で所望の形状へとスタンプ成形される（米国特許第３，５２３，８０７号）。成形されたフィブリンにおいては、グルタルアルデヒドもしくはホルムアルデヒドなどの固定作用物質に対してフィブリンを接触させることで大きな安定性も達成され得る。本発明においては、これらの方法、および、フィブリンを作成かつ成形する当業者に公知の他の方法が使用され得る。
【０１０９】
もし合成グラフトがコラーゲンにより被覆されるならば、コラーゲンを調製してそれを合成グラフト・デバイス上に形成する方法は、その全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用されるというウィードック等に対する米国特許第５，８５１，２３０号に示された如く公知である。この特許は、合成グラフトにコラーゲンを被覆する方法を記述している。孔性のグラフト表面に対してコラーゲンを付着させる方法は典型的に、コラーゲン分散液を基材に対して適用する段階と、それが乾燥するのを許容する段階と、該プロセスを反復する段階とを含む。コラーゲン分散液は典型的に、酸性ｐＨ（２〜４の範囲のｐＨ）の分散液内に（約１〜２重量％の）不溶性のコラーゲンを配合することにより作成される。該分散液は典型的には注入器によりグラフトの内孔内に注入されると共に、手動的に揉まれることで内側面領域の全体がコラーゲン・スラリで覆われる。過剰なコラーゲン・スラリは、上記グラフトの一方の開放端部を通して除去される。被覆および乾燥段階は数回反復されることで、十分な処理が提供される。
【０１１０】
更に別の実施例において、ステントまたは合成グラフトは非晶質カーボンにより被覆される。その全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用される米国特許第５，１９８，２６３号においては、フッ素化または他のハロゲン化ガスの存在下で高速、低温で析出された非晶質カーボン・フィルムを生成する方法が記述されている。この発明の方法に依る析出は、高周波でプラズマ支援式の化学蒸着プロセスにより周囲室温を含む１００℃未満で実施され得る。この発明の方法を用いて生成される非晶質カーボン・フィルムは、たとえばガラス、金属、半導体およびプラスチックなどの多くの種類の物質に対して良好に付着する。
【０１１１】
アミン含有ポリマの反応性のアミノ基部位に対してフラーレン部分を付着させ、フラーレンが接合されたアミノ含有ポリマを形成することは、その全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用される米国特許第５，２９２，８１３号に記述された如く実施される。この様にして化学的に改変を行うと、ステントに対してフラーレンが直接的に取入れられ得る。別実施例においてフラーレンは上述された如くステントまたは合成グラフトの表面上に析出され得る。（その全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用されるレオーネ等に対するＷＯ  ９９／３２１８４を参照されたい。）たとえばフラーレンＣ６０は、ステンレス鋼の表面に対してエポキシ結合によっても付着され得る（その全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用される雑誌、有機化学、第５８巻、４７９６〜４７９８頁（１９９８年）におけるヤマゴ等の“酸化、還元およびＣ−ＯおよびＣ−Ｃ結合形成反応によるオルガノフラーレンの化学的被覆［Ｙａｍａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｏｆｕｌｌｅｒｅｎｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ，  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃ−Ｏ  ａｎｄ  Ｃ−Ｃ  Ｂｏｎｄ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．  Ｊ．  Ｏｒａ．  Ｃｈｅｍ．，  ５８  ４７９６−４７９８  （１９９８）］）。上記付着は、酸素に対する共有結合によるものである。この化合物および結合のプロトコルは、バッキーＵＳＡ社（テキサス州、ヒューストン、ＢｕｃｋｙＵＳＡ）から市販されている。
【０１１２】
（Ｅ）基質に対する抗体、ペプチドおよび／または成長因子などの配位子の付加−前駆内皮細胞の付着を促進する抗体、および、細胞の成長および分化を促進する成長因子は、共有結合的または非共有結合的に上記基質に取入れられる。抗体、抗体断片、ホルモン、ペプチド、成長因子などの被覆の配位子は、該配位子を基質被覆溶液と混合してから該溶液をデバイスの表面に対して塗付することで、基質層内に取入れられ得る。一定の実施例において、抗体、その断片もしくは組み合わせおよび／または成長因子は、デバイスの管腔側表面上に塗付された基質の最外側層の表面に対して付着されることから、抗体などの配位子は循環血液と接触する表面上で突出して目標細胞に対する結合親和力を維持する。これらの実施例において、抗体などの配位子は標準的技術を用いて基質の表面に適用される。
【０１１３】
一実施例において抗体は、基質を含む溶液に加えられる。たとえば、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体上のＦａｂ断片が、５００〜８００ｍｇ／ｄｌの濃度のヒト・フィブリノゲンを含む溶液と共に温置される。抗ＣＤ３４Ｆａｂ断片の濃度は変更されること、および、当業者であれば不当な実験なしで最適な濃度を決定し得ることは理解される。Ｆａｂ／フィブリン混合物に対してはステントが加えられると共に、（少なくとも１，０００Ｕ／ｍｌの濃度の）濃縮トロンビンの添加によりフィブリンが活性化される。基質に対して直接的に取入れられたＦａｂ断片を含む結果的な重合フィブリン混合物は加圧され、ステントまたは合成グラフトの表面上の（１００μｍ未満の）薄膜となる。この様にして、ステントまたは合成グラフトの被覆に先立ち、実質的に任意の種類の抗体または抗体断片が基質溶液に取入れられ得る。
【０１１４】
たとえば別実施例においては、抗体断片ありでまたは無しで、全抗体および成長因子が、基質に対して共有結合で結合され得る。一実施例においては抗体および成長因子が、ヘテロまたはホモ二官能性リンカ分子を用いて基質に対し共有結合的に束縛される。本明細書中で用いられる如く、“束縛される”という語句は、基質に対するリンカ分子による抗体の共有結合を指している。本発明に関するリンカ分子の使用は典型的に、基質がステントに付着された後に該基質に対してリンカ分子を共有結合させる段階を含む。上記基質に対する共有結合の後、リンカ分子は基質に対し、一種類以上の抗体に対して共有結合すべく使用され得る多数の官能的活性基を提供する。図１Ａは、架橋分子を介した結合の図示を提供する。内皮細胞１．０１は、細胞表面抗原１．０２により抗体１．０３に対して結合する。上記抗体は、架橋分子１．０４により基質１．０５−１．０６に束縛される。基質１．０５−１．０６はステント１．０７に対して付着する。上記リンカ分子は基質に対し、直接的に（すなわちカルボキシル基を介して）、または、エステル化、アミド化およびアシル化などの公知の結合化学作用を介して結合され得る。上記リンカ分子は、アミド結合の直接的形成を介して基質に対し結合されるジアミンまたはトリアミン官能化合物とされ得ると共に、抗体との反応に利用可能なアミン官能基を提供する。たとえば上記リンカ分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアリルアミン（ＰＡＬＬＡ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリアミン官能ポリマとされ得る。アラバマ州、バーミンガムのシアウォータ社（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，  Ａｌａｂａｍａ）からは、共有結合に対するプロトコルと共に、たとえばｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオン酸またはｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの種々のＰＥＧ誘導体が市販されている。（言及したことにより本明細書中に援用されるというウィーナ等の“固定化された抗体による抗原捕捉に関するポリエチレングリコール・スペーサの影響”、雑誌“生化学、生物物理方法”、第４５巻、２１１〜２１９頁（２０００年）［Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙ−ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ  ｓｐａｃｅｒ  ｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｂｙ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４５：２１１−２１９  （２０００）］も参照されたい。）特定の結合物質の選択は使用される抗体の種類に依存し得ると共に、斯かる選択は不当な実験なしで為され得ることは理解される。これらのポリマの混合物も使用され得る。これらの分子は、一種類以上の抗体、ペプチド、蛋白質、ホルモン、および、他の被覆成分を表面固定化すべく使用され得る複数の垂下アミン官能基を含む。
【０１１５】
一実施例において抗体は、ステントの表面上に直接的に析出されているＣ６０フラーレン層に対して付着され得る。該フラーレンに対しては、架橋作用物質が共有結合的に付着され得る。その場合に抗体は、ステントに対して付着された架橋作用物質に対して付着される。図１Ｂは、フラーレンＣ６０による結合の図示を提供する。内皮細胞２．０１は、基質２．０４に対して共有結合的または非共有結合的に結合された抗体２．０３に対して細胞表面抗原２．０２を介して結合される。基質２．０４は、Ｃ６０２．０５を介してステント２．０６に対し共有結合的に結合される。
【０１１６】
本発明の小寸分子は、抗体、抗体断片、成長因子などの代わりに使用され得るという合成または天然の分子もしくはペプチドから成り得る。たとえばレクチンは、天然の非免疫由来の糖結合ペプチドである。内皮細胞特異的レクチン抗原（Ｕｌｅｘ  Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ｕｅａ  １）（シャッツ等の“ヒト子宮内膜内皮細胞：組織因子およびタイプ１プラスミノゲン活性化因子抑制因子の分離、特徴付けおよび炎症媒介発現”、生物再生、２０００年、第６２巻、６９１〜６９７頁［Ｓｃｈａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００  Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｔｙｐｅ  １  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｏｒｏｄ  ６２：  ６９１−６９７］）は、たとえば前駆内皮細胞の細胞表面に対して選択的に結合し得る。
【０１１７】
合成“小寸分子”は、種々の細胞表面、蛋白質、糖蛋白質、多糖類および受容体を目標限定すべく生成された。これらの分子は特定の表面部分に対して選択的に結合すると共に、前駆内皮細胞などの特定の細胞種類を目標限定し得る。小寸分子は、ＶＥＧＦなどの内皮細胞表面マーカを認識すべく合成され得る。ＳＵ１１２４８（スーゲン社［Ｓｕｇｅｎ  Ｉｎｃ．］）（メンデル等の“ＳＵ１１２４８の生体内抗腫瘍活性、血管内皮成長因子受容体および血小板由来成長因子受容体を目標限定する新規なチロシンキナーゼ抑制因子：薬理学的反応速度／薬理学的動力学の関係”、臨床ガン研究、２００３年１月、第９（１）巻、３２７〜３７頁［Ｍｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｓ１１２４８，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ／ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｊａｎ；９（１）：３２７−３７］）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４（ドレブス等の“受容体チロシンキナーゼ：新たな抗ガン治療の主要目標”、現在の薬剤目標、２００３年２月、第４（２）巻、１１３〜２１頁［Ｄｒｅｖｓ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００３  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ：  ｔｈｅ  ｍａｉｎ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．  Ｆｅｂ；４（２）：１１３−２１］）、および、ＳＵ６６６８（レアード・エーディー等の“ＳＵ６６６８はマウスの生体内でＦｌｋ−１／ＫＤＲおよびＰＤＧＦＲベータを抑制し腫瘍血管の迅速なアポトーシスおよび腫瘍の退化に帰着する”、雑誌ＦＡＳＥＢ、２００２年５月、第１６（７）巻、６８１〜９０頁［Ｌａｉｒｄ，  ＡＤ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２  ＳＵ６６６８  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ  ａｎｄ  ＰＤＧＦＲｂｅｔａ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｉｎ  ｒａｐｉｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  Ｍａｙ；１６（７）：６８１−９０］）は、ＶＥＧＦＲ−２に結合する小寸分子である。
【０１１８】
内皮細胞表面を目標限定する合成小寸分子の他の部分集合は、アルファ（ｖ）ベータ（３）インテグリン抑制因子である。ＳＭ２５６およびＳＤ９８３（カール・ジェーエス等の“新規な小寸分子アルファｖインテグリン拮抗物質：公知の血管新生抑制因子と比較した抗ガン効力”、抗ガン研究、１９９９年３〜４月、第１９（２Ａ）巻、９５９〜６８頁［Ｋｅｒｒ  ＪＳ．  ｅｔ  ａｌ．  １９９９  Ｎｏｖｅｌ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｌｐｈａ  Ｖ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ：  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｗｉｔｈ  ｋｎｏｗｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｍａｒ−Ａｐｒ；１９（２Ａ）：９５９−６８］）は両者ともに、内皮細胞の表面上に存在するアルファ（ｖ）ベータ（３）を目標限定して結合する合成分子である。
【０１１９】
本発明は、ステント、ステント・グラフト、心臓弁、カテーテル、血管用人工フィルタ、人工心臓、外部および内部の左心室支援デバイス（ＬＶＡＤ）、ならびに、腫瘍、および、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、血栓症、血管障害などの血管疾患などの疾患を治療する合成血管グラフトなどの被覆済み医療デバイスを備えた薬剤供与システムを提供する。一実施例において本発明の医療デバイス上の被覆は、生体適合性基質、少なくとも一種類の抗体、抗体断片またはその組み合わせ、および／または、配位子などの少なくとも一種類の化合物もしくはエストラジオール、アンギオゲニン、ＦＧＦなどの治療物質を備える。
【０１２０】
一実施例において遺伝子導入細胞は、ウィルス的または非ウィルス的な遺伝子的処置により該細胞内に導入される少なくとも一種類の導入遺伝子を取入れる。上記導入遺伝子は、少なくとも一種類の治療的薬剤に対する遺伝暗号を指定し得ると共に、連続的に又は刺激による誘発時に発現され得る。一実施例において上記治療的薬剤は、ホルモン、ペプチド、蛋白質などとされ得る。上記遺伝子導入細胞はまた、その細胞表面上に、上記医療デバイスの表面上に被覆された抗体により認識かつ結合され得る少なくとも一種類の抗原も呈する。
【０１２１】
本明細書中で用いられる如く、“抗体”とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、または、ヒト化抗体とされ得る抗体もしくは抗体断片、または、抗体および断片の組み合わせを指す。本発明の抗体断片は、たとえば、抗体として、目標抗原を認識して結合する特性を保持する大寸または小寸の分子などの任意の断片サイズを備える（図１Ａ、図１Ｂおよび図１１）。
【０１２２】
本明細書中で用いられる如く、“配位子”とは、哺乳動物細胞上の受容体などの他の分子に結合する分子を指している。たとえば配位子は、抗体、抗体断片（図１Ａ、図１Ｂ、図１１および図１７）、細胞付着分子、または、目標細胞の膜上の特異的なエピトープもしくは構造を認識して結合する基底膜成分とされ得る。遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を使用する実施例において、医療デバイスの被覆上に使用されるべき配位子は、遺伝子導入細胞内に導入された外因性ＤＮＡにより生成された遺伝子産物を認識して結合すべく特異的に選択され得る。
【０１２３】
本明細書中で用いられる如く、“蛋白質”とは、任意の長さのアミノ酸のポリマを指している。該ポリマは、直鎖状もしくは分枝状とされ得ると共に、修飾されたアミノ酸を備え、且つ、非アミノ酸により中断され得る。上記ポリマは、天然のペプチド、蛋白質、または、それらの修飾された合成形態であって生物学的に活性な断片、誘導体、類似物、擬態物、および、非官能的もしくは優勢ネガティブな変異体などの、それらの修飾された合成形態とされ得る。
【０１２４】
上記医療デバイスは内腔を備える器官もしくは身体部分内へと植設される任意のデバイスとされ得ると共に、限定的なものとしてで無く、ステント、ステント・グラフト、合成血管グラフト、心臓弁、カテーテル、血管用人工フィルタ、ペースメーカ、ペースメーカ・リード線、除細動器、卵円孔開存（ＰＦＯ）隔膜閉塞デバイス、血管クリップ、血管動脈瘤咬合器、血液透析グラフト、血液透析カテーテル、房室シャント、大動脈瘤グラフト・デバイスもしくは構成要素、静脈弁、縫合糸、血管吻合クリップ、留置式の静脈もしくは動脈カテーテル、血管鞘体、および、薬剤供与ポートとされ得る。上記医療デバイスは、該デバイスに依存して多数の材料で作成され得る。たとえば本発明のステントは、ステンレス鋼、ニチノール（ＮｉＴｉ）またはクロム合金から作成され得る。合成血管グラフトは、架橋ＰＶＡヒドロゲル、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、孔性高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリウレタン、および、ポリエチレン・テレフタレートから作成され得る。
【０１２５】
本発明のデバイスの被覆を形成する生体適合性基質は、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン−尿素／ヘパリン、ポリＬ乳酸、セルロース・エステル、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニル、デキストランおよびゼラチンなどの合成材料、コラーゲン、エラスチン、トロポエラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン、フィブリンの如き基底膜成分、セルロース、および、非晶質カーボン、または、フラーレンなどの天然物質から成る。
【０１２６】
一実施例において上記医療デバイスは、フラーレンから成る生体適合性基質を備える。この実施例においてフラーレンは、炭素原子数が約Ｃ２０〜約Ｃ１５０の範囲とされ得ると共に、より詳細にはフラーレンはＣ６０またはＣ７０である。本発明のフラーレンはまた、医療デバイスの表面上のナノチューブとしても配置され得る。
【０１２７】
医療デバイスの被覆を提供する上記抗体は、内因性遺伝子によりまたは導入遺伝子により発現され得る遺伝子導入細胞の表面抗原を認識して結合する少なくとも一種類の抗体であって医療デバイスの表面上への上記細胞の付着力を調節する少なくとも一種類の抗体を備える。該抗体は、上記基質の表面に対して共有結合的もしくは非共有結合的に付着され得るか、または、医療デバイスを被覆する上記基質の最外側層に対してリンカ分子により共有結合的に束縛され得る。本発明のこの側面において、たとえばモノクローナル抗体は更にＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を備え得る。
【０１２８】
上記抗体は、治療されつつある哺乳動物に対する特異性を以て抗原を認識して結合し得ると共に、その特異性は細胞系統に依存しない。一実施例において上記抗体は、抗Ｈ−２Ｋｋ抗体の如く、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤｗ９０、ＣＤ１１７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、Ｍｕｃ−１８（ＣＤ１４６）、ＣＤ１３０、幹細胞抗原（Ｓｃａ−１）、幹細胞因子１（ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ配位子）、Ｔｉｅ−２、ＨＡＤ−ＤＲなどのヒト前駆内皮細胞表面抗原に対して特異的である。
【０１２９】
別実施例において上記医療デバイスの被覆は上述された如く少なくとも一層の生体適合性基質を備え、該基質は、治療的有効量の天然または合成由来の少なくとも一種類の小寸分子を付着させる外側面を備える。上記小寸分子は遺伝子導入細胞表面上の抗原を認識して相互作用し、該遺伝子導入細胞を上記デバイスの表面上に固定化して導入遺伝子発現を誘発する。上記小寸分子は、脂肪酸、蛋白質、核酸、糖類などの細胞成分などの種々の供給源から供与され得ると共に、遺伝子導入細胞の表面上の受容体と相互作用し得る。本発明のこの実施例において上記医療デバイスの被覆は、抗体を備える上記被覆と協働する配位子などの化合物を備え得る。
【０１３０】
遺伝子導入細胞を生成するために導入遺伝子を導入するためには、ウィルス的および非ウィルス的な両方の遺伝子的処置が使用され得る。本発明の遺伝子導入細胞は、過渡的もしくは安定的に取入れられた導入遺伝子によりコード化された治療的薬剤を発現かつ分泌する。生存、選択および／または成長の利点を付与するために、付加的な導入遺伝子が取入れられ得る。内皮細胞、または、好中球、好酸球、好塩基球、単核白血球およびリンパ球などの白血球、または、体細胞、または、これらの細胞の組み合わせなどの種々の細胞は、再増殖しないもしくは再増殖し得る遺伝子導入細胞を生成すべく改変され得る。遺伝子導入細胞は、試験管内で培養され、収集かつ保存され得る。種々の治療的薬剤を生成する遺伝子導入細胞は、異なる治療目的に資するために異なる導入遺伝子を取入れることで生成され得る。遺伝子導入細胞は、全身的もしくは局所的な経路を介して単一もしくは混合された個体群として投与され得る。個々の状態に依存して異なる量の治療的薬剤を放出するために、種々の量の遺伝子導入細胞が投与され得る。一実施例において遺伝子導入細胞は、前駆内皮細胞を再増殖し得る。更なる実施例においては、カテーテル式供与または二重バルーン膨張方法により局所的に、遺伝子導入前駆内皮細胞が投与され得る。
【０１３１】
一実施例において遺伝子導入細胞は、上記医療デバイスの基質に被覆された抗体により特異的に認識して結合され得る外因性細胞表面抗原を発現する付加的導入遺伝子を備える。導入遺伝子の発現および生成物分泌は、連続的とされ得るか、または、外因性刺激により誘発可能な促進因子の活性化を条件とし得る。
【０１３２】
本発明の導入遺伝子によりコード化される治療用化合物は、所望の生理学的効果を有する任意の分子とされ得ると共に、限定的なものとしてで無く、成長因子、ケモカインおよびサイトカイン、配位子および受容体を包含すると定義された蛋白質、および、他の官能的蛋白質、および、蛋白質排出不能化合物とされ得る。一実施例において治療用化合物は、内皮窒素酸化物シンテターゼ（ｅＮＯＳ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、抗炎症因子および炎症調節因子から成る群から選択された蛋白質である。
【０１３３】
遺伝子的に改変された哺乳動物細胞を用いる実施例において導入遺伝子発現および目標生成物分泌を刺激し得る化合物などの薬剤は、医療デバイスの被覆の配位子または他の成分とされ得るが、該配位子または成分は、遺伝子導入細胞表面抗原に結合すると共に、たとえば目標細胞内に導入されたＤＮＡ構造などの染色体外核酸の下流情報伝達経路活性化をトリガする。別実施例において、遺伝子的に改変された哺乳動物細胞の導入遺伝子発現は、たとえば、該遺伝子導入細胞により取り上げられて誘発可能促進因子を介して遺伝子発現を刺激し得る配位子または薬剤により刺激され得る。一実施例において上記配位子または薬剤は、全身的に投与される。別実施例において上記配位子または薬剤は、植設されたデバイスの基質に被覆されて局所的に投与される。
【０１３４】
本発明は、限定的なものとしてで無く、腫瘍、血管疾患などとされ得る種々の疾患を治療すると共に治癒応答に対する方法を提供する。該方法は、要求時に所望量の種々の薬剤を目標部位に供与することに関し先行技術との比較において優れている。
【０１３５】
本発明は、腫瘍およびその転移を治療する方法を提供する。この実施例において導入遺伝子は、（１）インターフェロン（ＩＦＮ）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、アンギオスタチン、エンドスタチン、腫瘍スタチンＭ（ＯＳＭ）、および、腫瘍の漸進的成長に対する必要条件である新血管形成を抑制するＲｈｏなどの抗血管新生因子；または、（２）ｐ５３、Ｒｂ、Ｅ１、ＢＲＣＡ１、抗体、または、成長因子などの細胞成長活性化因子の優勢ネガティブ変異体、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）またはサイクリン、Ｅ２Ｆ、ＮＦｋＢ；または、これらの遺伝子の組み合わせ；に対する遺伝暗号を指定し得る。一実施例において導入遺伝子は、たとえば、プロスタサイクリンおよび／またはシクロオキシゲナーゼ、α−ＣＧＲＰ、基質金属蛋白質、および／または、内皮窒素酸化物シンテターゼなどをコード化する遺伝子を備え得る。
【０１３６】
本明細書中で用いられる如く、“抗血管新生因子”という表現は、血管新生または血管成長を抑制し得る分子を指す。
【０１３７】
本発明は、血管疾患を治療する方法も提供する。一実施例においては虚血性状態を治療する方法が提供され、その場合に導入遺伝子は、プレイオトロフィン、アンギオゲニン、アンギオポレチン、インテグリン刺激因子などの血管新生因子、および／または、抗血管新生因子の抗体もしくは優勢ネガティブ変異体に対する遺伝暗号を指定する。
【０１３８】
本明細書中で用いられる如く、“血管新生因子”という表現は、血管新生または血管成長を刺激し得る分子を指す。
【０１３９】
別実施例において本発明は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、血栓症、動脈瘤または血管障害を治療すべく使用される。本発明のこの実施例において導入遺伝子は、（ａ）内皮再形成を促進するｅＮＯＳもしくはＶＥＧＦ；または、（ｂ）ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、ＴＧＦ−βまたはインターロイキン１０（ＩＬ−１０）などの抗炎症因子もしくは炎症調節因子；または、（ｃ）平滑筋細胞の成長、移動または分化の抑制因子であって内膜過形成を抑制する抑制因子；または、これらの遺伝子の組み合わせ；に対する遺伝暗号を指定し得る。
【０１４０】
本発明は、治癒応答を誘起すべく設計された方法も提供する。一実施例においては、植設された血管の目標病巣において植設されたデバイスの管腔側表面において内皮の融合層の形成を迅速に誘起する方法が提供され、その場合に遺伝子導入細胞は、ｅＮＯＳ、ＶＥＧＦ、または、抗炎症因子もしくは炎症調節因子を発現する前駆内皮細胞である。この実施例において医療デバイスは先行技術のデバイスと比較して大きな生体適合性が提供されると共に、該医療デバイスの植設の部位における内側管腔表面に沿う平滑筋細胞の移動、平滑筋細胞の分化、および、コラーゲン析出を低減もしくは抑制することにより、組織による過剰な内膜過形成および再狭窄を低減もしくは抑制する。
【０１４１】
一実施例において、医療デバイスを被覆する方法は、医療デバイスの表面に対して少なくとも一層の生体適合性基質を適用する段階であって、上記生体適合性基質は、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン−尿素／ヘパリン、ポリＬ乳酸、セルロース・エステル、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニル、デキストランなどの多糖類、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、トロポエラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン、フィブリン、セルロースおよび炭素およびフラーレンから成る群から選択された少なくとも一種類の成分を備え得るという段階と、上記生体適合性基質に対して同時にまたは順次的に、少なくとも一種類の抗体と、導入遺伝子発現を誘起する選択的な一種類の化合物とを適用する段階とを備える。
【０１４２】
本発明は更に、哺乳動物における腫瘍、血管疾患を治療すると共に創傷治癒に対する方法を提供する。該方法は、哺乳動物の血管もしくは管状器官内に医療デバイスを植設する段階であって、上記医療デバイスは、（ａ）生体適合性基質、（ｂ）少なくとも一種類の抗体、および選択的に、（ｃ）一種類の化合物により被覆されるという段階と、治療を必要とする哺乳動物に遺伝子導入細胞を導入する段階と、選択的に化合物を投与する段階とを備え、上記医療デバイスの基質に被覆された抗体は遺伝子導入細胞表面上に発現された抗原を認識して結合することから上記遺伝子導入細胞は上記基質の表面上に固定化され、且つ、導入遺伝子によりコード化された少なくとも一種類の治療的薬剤は、薬剤などの化合物による上記固定化細胞の刺激時に該細胞により発現されると共に、治療的遺伝子産物は指定部位において分泌される。
【０１４３】
本発明は更に、哺乳動物における血管疾患を治療する方法であって、哺乳動物の血管もしくは管状器官内に医療デバイスを植設する段階であって、上記医療デバイスは、（ａ）生体適合性基質、（ｂ）少なくとも一種類の抗体、および選択的に、（ｃ）一種類の化合物により被覆されるという段階と、治療を必要とする哺乳動物に遺伝子導入細胞を導入する段階と、選択的に化合物を投与する段階とを備え、上記医療デバイスの基質に被覆された抗体は、該医療デバイスを被覆する上記基質の表面上に遺伝子導入細胞が固定化される様に、遺伝子導入細胞の細胞膜表面上でのみ発現された抗原を認識して結合するという方法を提供する。上記遺伝子導入（遺伝子的に改変された）細胞は、構成的に、または、ホルモンおよびペプチドなどの化合物の如き信号による活性化時に発現され得る少なくとも一種類の治療的遺伝子産物をコード化する遺伝物質も含み得る。
【０１４４】
本発明の遺伝子導入細胞は、限定的なものとしてで無く、（１）血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン状成長因子（ＩＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヘパリン結合成長因子、肝臓癌由来成長因子（ＨＤＧＦ）、肝細胞成長因子／細胞分散因子（ＨＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、および、それらの他の蛋白質形態；（２）ＣＸＣ系統群、ＣＣ系統群、Ｃ系統群、および、それらの他の蛋白質形態；（３）ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）などのサイトカイン、アネキシンＶ、Ｂ７＆ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４受容体系統群、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）、カスパーゼ、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｈ、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、ｅｐｈ、赤血球生成促進因子（Ｅｐｏ）、細胞間接着分子−３／ＣＤ５０（ＩＣＡＭ−３）、マクロファージ刺激蛋白質（ＭＳＰ）、基質メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、神経栄養因子、内皮窒素酸化物シンテターゼ（ｅＮＯＳ）、ＮＫＧ２Ｄ、血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１／ＣＤ３１）、プレイオトロフィン／ミドキン（ＰＴＮ／ＭＫ）、トランスフェリン受容体（ｓＴｆＲ）、ヘッジホッグ・ペプチド、ＳＴＡＴ、幹細胞マーカ、Ｔｈ１／Ｔｈ２、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、腫瘍壊死因子系統群、ＶＣＡＭ−１／ＣＤ１６、モノクローナル非特異的サプレッサ因子ベータ（ＭＮＳＦベータ）、６Ｃキン（ＳＬＣ）、Ｂ−リンパ球化学誘引物質（ＢＣＡ−１／ＢＬＣ）、白血病抑制因子、単核白血球由来好中球活性化ペプチド（ＧＲＱ）、および、それらの他の蛋白質形態；（４）信号伝達、細胞周期調節、細胞分裂、および／または、細胞分化の調節に関与する他の機能蛋白質であって、配位子、受容体、ホスホリラーゼ、キナーゼ、転写因子、それらの他の蛋白質形態；に対する遺伝暗号を指定し得る少なくとも一種類の発現可能な導入遺伝子を含み得る。
【０１４５】
一実施例において、本発明において使用される抗血管新生因子は、たとえば、インターフェロン（ＩＦＮ）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、アンギオスタチン、エンドスタチン、腫瘍スタチンＭ（ＯＳＭ）、インテグリン関与の遮断抗体、メタロプロテアーゼ抑制因子、内皮細胞燐酸化の抑制因子、血管新生誘発因子に対する優勢ネガティブ受容体、血管新生誘発因子の抗体、他の手段により作用する他の蛋白質、および、それらの他の蛋白質形態である。他の血管新生因子としては、アンギオゲニン、アンギオポレチン、Ｄｅｌ−１などのインテグリン刺激因子、および、それらの他の蛋白質形態が挙げられる。
【０１４６】
本発明において使用される付加的な成長因子は、たとえば、プレイオトロフィン、ミドキン、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄを含むＶＥＧＦ系統群、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５およびＦＧＦ−１８を含むＦＧＦ系統群、肝臓癌由来成長因子（ＨＤＧＦ）、肝細胞成長因子／細胞分散因子（ＨＧＦ）、形質転換成長因子アルファ、ＥＧＦおよびＴＧＦ−アルファ−Ｈｉｌｌを含む表皮成長因子（ＥＧＦ）系統群、および、ＡＡ、ＡＢおよびＢＢイソ型を含む血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）である。
【０１４７】
実験例
本発明は、以下に続く実験詳細セクションにおいて例証される。以下においてこれらのセクションは発明の理解を与えるが、如何にしても、添付の各請求項に示された発明を制限することは意図されず且つその様に解釈されるべきでない。
【０１４８】
実験例１
内皮前駆細胞の表現型の検査
内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が、ＣＤ３４＋磁性ビーズ分離（ダイナール・バイオテック［Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ］社）、または、最近記述された如く富化培地分離により分離された（サイエンス、１９９７年、２７５巻、９６４〜７頁、アサハラ  Ｔ、ムロハラ  Ｔ、サリバン  Ａ等による“血管新生に対する推定的な前駆内皮細胞の分離［Ａｓａｈａｒａ  Ｔ，  Ｍｕｒｏｈａｒａ  Ｔ，  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉ  ９９７；２７５：９６４−７］）。簡潔には、末梢静脈血は健康な男性ボランティアから採取されて密度勾配遠心分離により単核細胞画分が分離され、且つ、該細胞は、５％の胎児牛血清、ヒトＶＥＧＦ−Ａ、ヒト繊維芽細胞成長因子２、ヒト表皮成長因子、インスリン状成長因子１およびアスコルビン酸が追加されたＥＣ塩基培地２（ＥＢＭ−２）（クローンティクス社）内でフィブロネクチンが被覆された培養スライド（ベクトン・ディキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））上に塗付された。ＥＰＣは、培養培地を４８時間毎に交換して７日間に亙り成長された。これらの実験の結果は、図２Ａおよび図２Ｂに示される。図２Ａおよび図２Ｂは抗ＣＤ３４により分離された細胞は更にスピンドル状であることを示しており、細胞が内皮細胞へと分化していることを示している。
【０１４９】
ＥＣ表現型は免疫組織化学により決定された。簡潔にはＥＰＣは、リン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）（シグマ社［Ｓｉｇｍａ］）中の２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）内で１０分間固定され、ＰＢＳにより３回洗浄され、且つ、種々のＥＣ特異的マーカにより着色された：ウサギ抗ヒトＶＥＧＦＲ−２（アルファ・ダイアグノスティックス・インターナショナル社［Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｔｌ．  Ｉｎｃ．］）、マウス抗ヒトＴｉｅ−２（クローン  Ａｂ３３、アップステート・バイオテクノロジ社［Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］）、マウス抗ヒトＣＤ３４（ベクトン・ディキンソン社）、ＥＣ−レクチン（Ｕｌｅｘ  Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ｕｅａ  １）（シグマ社）、および、マウス抗ヒト因子８（シグマ社）。抗体の存在は、フルオレセイン・イソチオシアネート共役（ＦＩＴＣ）二次的抗体に対して細胞を露出することで確認された。核マーカとしては沃化プロピジウム（ＰＩ）が使用された。これらの実験の結果は図２Ｃ乃至図２Ｇに示される。図２Ｃは、培養液内で２４時間後にＶＥＧＦＲ−２が発現され、細胞は内皮細胞であることが確認されることを示している。図２Ｄおよび図２Ｆは７日間の温置後における結合細胞の核着色を示し、且つ、図２Ｅおよび図２Ｇは、ＦＩＴＣ共役抗Ｔｉｅ−２抗体により着色された細胞の同一視野を示している。
【０１５０】
ＥＣ機能の顕著な特徴である内皮窒素酸化物シンテターゼ（ｅＮＯＳ）を発現する能力は、ｅＮＯＳのｍＲＮＡに対する逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ−ＰＣＲ）により決定された。ＥＰＣはＥＢＭ−２培地において７日間成長された後、ＧｅｎＥｌｕｔｅ哺乳動物総ＲＮＡキット（シグマ社）を用いて総ＲＮＡが分離され、２６０ｎｍにおける吸収により定量された。総ＲＮＡは、１μｇのランダム・プライマと共にＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（キアゲン社［Ｑｉａｇｅｎ］）を用いて２０μＬ容積内で逆転写された。各ＲＴ生成物に対し、最終反応体積の部分標本が、ｅＮＯＳ（２９９塩基対の生成物、センス５’−ＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＴＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧ−３’、配列ＩＤ番号１、アンチセンス５’−ＧＣＣＡＴＧＧＴＡＡＣＡＴＣＧＣＣＧＣＡＧ−３’、配列ＩＤ番号２）またはＧＡＰＤＨ（３４３塩基対の生成物、センス５’−ＣＴＣＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＴ−３’、配列ＩＤ番号３、アンチセンス５’−ＧＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’配列ＩＤ番号４）に特異的なプライマおよびＴａｑポリメラーゼ（ファーマシア・バイオテック・アメルシャーム社［Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａｍｅｒｓｈａｍ］）を用いて２つの並列なＰＣＲ反応で増幅された。ＰＣＲサイクルは以下の如くであった：９４℃で５分間、６５℃で４５秒、７２℃で３０秒（ｅＮＯＳに対しては３５サイクルおよびＧＡＰＤＨに対しては２５サイクル）。ｒｔ−ＰＣＲ生成物は、２％のアガロース・ゲル電気泳動により分析され、臭化エチジウムを用いて視覚化され且つ密度計測により定量された。この実験の結果は図３Ａおよび図３Ｂに示される。図３Ａおよび図３Ｂに見られる如く、酸素の存在下または不在下で細胞が培地において３日間培養液内で温置された後、窒素酸化物シンテターゼ（ｅＮＯＳ）が発現される。ｅＮＯＳのｍＲＮＡ発現は、培養液内における７日後に存在し続ける。ｅＮＯＳのｍＲＮＡの存在は、細胞が３日目までに成熟内皮細胞へと分化すると共に完全に分化された内皮細胞の様に機能し始めたことを示している。
【０１５１】
実験例２
抗ＣＤ３４が被覆されたステンレス鋼ディスクによる内皮細胞の捕捉：当該実験の存続時間に亙り、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（米国細胞バンク）が内皮細胞増殖培地で増殖された。細胞は、抗体が表面上に在るもしくは無いＣＭＤＸおよびゼラチンにより被覆されたサンプル、または、剥き出しのステンレス鋼（ＳＳＴ）サンプルと共に温置される。温置の後、増殖培地が取り外され、各サンプルはＰＢＳ内で２回洗浄される。細胞は１０分に亙り２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定されると共に、ＰＢＳ内で洗浄毎に１０分として３回洗浄され、全ての固定作用物質が除去されることが確実とされる。各サンプルは室温にて３０分に亙り遮断溶液と共に温置され、全ての非特異的結合が遮断される。各サンプルは、ＰＢＳにより一旦洗浄され、１：１００のＶＥＧＦＲ−２抗体の希釈液に晒され、且つ、一晩中温置される。各サンプルは引き続きＰＢＳにより３回洗浄されることで、全ての一次抗体が除去されることが確実とされる。夫々のサンプルに対しては、１：１００の希釈にて遮断溶液内のＦＩＴＣ共役二次抗体が加えられ、ベリーダンサ装置上で室温にて４５分温置された。温置の後でサンプルは、一旦は０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにより且つその後は再びＰＢＳ内として、ＰＢＳ内で三回洗浄される。上記サンプルに対しては沃化プロピジウム（ＰＩ）が組み込まれ、共焦点顕微鏡下で視覚化される。
【０１５２】
図４Ａ乃至図４Ｅは、上述された如くＣＭＤＸおよび抗ＣＤ３４抗体により被覆されたＳＳＴサンプル（図４Ａ）、ゼラチンおよび抗ＣＤ３４抗体により被覆されたＳＳＴサンプル（図４Ｂ）、剥き出しのＳＳＴ（図４Ｃ）、ＣＭＤＸにより被覆されたが抗体なしのＳＳＴサンプル（図４Ｄ）、および、ゼラチン被覆されたが抗体なしのＳＳＴサンプル（図４Ｅ）の顕微鏡写真である。各図は、ＰＩ着色により示された如く、抗体被覆されたサンプルのみが該サンプルの表面に対して付着した多数の細胞を含むことを示している。剥き出しのＳＳＴ比較対照ディスクは、その表面に付着した細胞を殆ど示さない。
【０１５３】
図５Ａ乃至図５Ｃは、表面に対して抗体を結合せずにＣＭＤＸ被覆された比較対照サンプルの顕微鏡写真である。図５Ａは、ＰＩ着色により理解される如くサンプルの表面に付着した非常に少ない細胞を示している。図５Ｂは付着細胞がＶＥＧＦＲ−２陽性であることからそれらは内皮細胞であることを示すと共に、図５Ｃは着色核とＶＥＧＦＲ−２陽性の緑色蛍光との組み合わせを示している。図５Ｄ乃至図５Ｆは、表面上の抗体なしでゼラチンにより被覆された比較対照サンプルの顕微鏡写真である。図５Ｄは細胞の存在を示さない、と言うのも、ＰＩ着色は該サンプルに存在せず且つ該サンプルから緑色蛍光は発せられないからである（図５Ｅおよび図５Ｆを参照）。
【０１５４】
図６Ａ乃至図６Ｃは、表面に抗ＣＤ３４抗体が結合されたＣＭＤＸ被覆ＳＳＴサンプルの顕微鏡写真である。各図は、サンプルが略々融合性の単層を確立する多数の付着細胞を含む（図６Ａ）と共に、緑色蛍光により示される如くＶＥＧＦＲ−２陽性（図６Ｂおよび図６Ｃ）であることを示している。同様に図６Ｄ乃至図６Ｆは、表面に抗ＣＤ３４抗体が結合されたゼラチン被覆サンプルの顕微鏡写真である。これらの図もまた、多数の赤着色された核およびＶＥＧＦＲ−２／ＦＩＴＣ抗体からの緑色蛍光（図６Ｅおよび図６Ｆ）により示される如く、サンプルの表面にＨＵＶＥＣが付着したことを示している。
【０１５５】
実験例３
前駆内皮細胞のＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２着色：
実験例１に記述された如く人間血液から前駆細胞が分離されると共に、増殖培地内で２４時間、７日間、および、試験管内で３週間温置される。温置の後、増殖培地が取り外され、各サンプルはＰＢＳ内で２回洗浄される。細胞は１０分に亙り２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定されると共に、ＰＢＳ内で洗浄毎に１０分として３回洗浄され、全ての固定作用物質が除去されることが確実とされる。各サンプルは室温にて３０分に亙り、（ＶＥＧＦＲ−２に対しては）４４０μｌのヤギおよび（Ｔｉｅ−２に対しては）ウマの遮断溶液と共に温置され、全ての非特異的結合が遮断される。各サンプルはＰＢＳにより一旦洗浄され、遮断溶液内で１：１００の希釈にてＶＥＧＦＲ−２またはＴｉｅ−２抗体が付加され、且つ、サンプルは一晩中温置される。各サンプルは次にＰＢＳにより３回洗浄されることで、全ての一次抗体が除去されることが確実とされる。夫々のサンプルに対しては、１：１００の希釈にてウマもしくはヤギの遮断溶液内のＦＩＴＣ共役二次抗体（２００μｌ）が加えられ、ベリーダンサ装置上で室温にて４５分温置された。温置の後でサンプルは、一旦は０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにより且つその後は再びＰＢＳ内として、ＰＢＳ内で三回洗浄される。上記サンプルに対しては沃化プロピジウム（ＰＩ）が組み込まれ、共焦点顕微鏡下で視覚化される。
【０１５６】
図７は、細胞と共に２４時間温置されたＣＤ３４抗体を表面上に含むＣＭＤＸ被覆サンプルの顕微鏡写真であり、サンプルの表面上に存在する赤着色核により例証される如く、サンプルの表面上に前駆細胞が捕捉されたことを示している。この図はまた、丸形形態により細胞の約７５％がＶＥＧＦＲ−２陽性であることも示している。
【０１５７】
図８Ａおよび図８Ｂは、細胞と共に７日間温置されたサンプルからのものである。図８Ａに見られる様に赤着色された核により示される如くサンプル上には細胞が存在し、これは、ＶＥＧＦＲ−２陽性（図８Ｂ、１００％）であると共に、細胞のスピンドル形状により示される如く構造的に更に内皮的である。図９Ａおよび図９Ｂは、表面上にＣＤ３４抗体を含むＣＭＤＸ被覆サンプルであって細胞と共に７日間に亙り温置され且つ温置後にサンプルはＴｉｅ−２抗体に対して露出されたというサンプルの顕微鏡写真である。図９Ａに見られる様に、赤着色された核により示される如くサンプルの表面には多数の細胞が付着している。上記サンプルに付着した細胞は、該細胞から発せられる緑色蛍光（図９Ｂ）により見られる如くＴｉｅ−２陽性（１００％）でもある。要約すると、サンプルと共に細胞を７日間温置した後、サンプルの表面に付着した多数の細胞と、付着した細胞の表面上におけるＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２受容体の存在とにより見られる如く、ＣＤ３４抗体により被覆されたサンプルはその表面上に内皮細胞を捕捉し得る。これに加え、７日目においてサンプルの表面上に１００％の内皮細胞が存在することは、非内皮細胞は引き離され得ること、または、全ての付着細胞は第７日目までに内皮細胞マーカを発現し始めたことを示している。
【０１５８】
図１０Ａ乃至図１０Ｃは、内皮細胞増殖培地において３週間に亙り増殖された前駆内皮細胞の位相差顕微鏡写真である。図１０Ａは、矢印における血管の内腔を思わせる２次元の管状構造（矢印）により示される如く、細胞が成熟内皮細胞へと分化したことを例証している。図１０Ｂは細胞が多層で３次元的に構築されたことを示しており、すなわち、ひとつの層が他の層の上となり、長期に亙り増殖された内皮細胞は相互に重なり合う層を形成し始めるとの報告を立証している。図１０Ｃは、塗付後において培養液内で３週間増殖されると共に内皮細胞の外観を有する前駆細胞を示し、同図は、該細胞の表面上に存在するＣＤ３４／ＦＩＴＣ抗体の緑色蛍光により例証される如く該細胞は内皮細胞であることを立証している。
【０１５９】
上記データは、人間血液から分離された白血球はＣＤ３４陽性の前駆細胞を有すること、および、これらの細胞は成熟内皮細胞へと発育して容易に内皮細胞表面抗原（ＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２）を発現することを例証している。上記データはまた、前駆細胞または幹細胞の表面抗原に対する抗体は、これらの細胞を本発明の被覆済み医療デバイスの表面に捕捉すべく使用され得ることも示している。
【０１６０】
実験例４
フラーレン被覆されたステンレス鋼、および、抗ＣＤ３４抗体および／または内皮細胞成長因子（Ａｎｇ−２、ＶＥＧＦ）と共にフラーレン被覆されたステンレス鋼
以下の手順を用い、抗体および／または成長因子（すなわちＶＥＧＦまたはＡｎｇ−２）を付着させる機能的フラーレン層により、ステンレス鋼製のステントおよびディスクが被覆された：
【０１６１】
第１段階においては、ＳＳＴステントもしくはディスクの表面が、一切の被覆汚染物質の表面も清浄化するという０．５ＭのＨＣｌにより活性化される。上記金属サンプルは活性化浴から取出され、蒸留水により濯がれ、メタノールにより乾燥され、且つ、７５℃で加熱炉乾燥される。ステントは次に２４時間までの期間に亙り、酸化フラーレン（Ｃ６０−Ｏ）と共に被覆用のトルエン溶液に浸漬される。酸化フラーレンは、ステント上に見出されるＦｅ−Ｏ、Ｃｒ−ＯおよびＮｉ−Ｏを介して該ステントに結合する。上記ステントは被覆浴から取出され、トルエンにより濯がれ、および、新たなトルエンと共にソックスレー抽出器内に１６時間載置されて一切の物理吸着Ｃ６０を除去する。ステントが取出され、１０５℃で一晩中、加熱炉乾燥される。この反応によれば、フラーレンの単層により完全に被覆されたステントまたはディスクが得られる。
【０１６２】
段階２においては、セバシン酸を塩化チオニルまたは硫黄オキシクロライド（ＳＯＣｌ２）と溶液内で反応させて塩化セバシン酸を形成する。結果的な塩化セバシン酸はＬｉＡｌ［ｔ−ＯＢｕｔｙｌ］３Ｈおよびダイグライムと反応され、以下に示される如く１，１０−デカンジオールが得られる：
【０１６３】
【化１】
2007535389.tif 000004
【０１６４】
段階３においては、（段階１からの）ステントまたはディスクの表面上にＮ−メチル・ピロリジン誘導体が形成される。フラーレン分子は更に、窒素下で還流トルエン溶液内で等モル量のフラーレンおよびＮ−メチルグリシンを段階２の反応の１，１０−デカンジオール生成物と４８時間反応させて被覆されることで、以下に示される如くＮ−メチル・ピロリジンにより被覆されたフラーレンを有するステンレス鋼製ステントもしくはディスクが得られる。
【０１６５】
【化２】
2007535389.tif 000005
【０１６６】
【化３】
2007535389.tif 000006
【０１６７】
被覆されたステンレス鋼製ステントもしくはディスクは洗浄されることで一切の化学的残渣を除去すると共に、標準的手順を用いて抗体および／または（ＶＥＧＦもしくはＡｎｇ−２）を結合すべく用いられる。実験例１に記述された如く人間血液から前駆細胞が分離され、抗ＣＤ３４抗体により被覆された上記フラーレン・ディスクに対して露出された。温置後、増殖培地は除去され且つサンプルはＰＢＳ内で２回洗浄される。細胞は１０分に亙り２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定されると共に、ＰＢＳ内で洗浄毎に１０分として３回洗浄され、全ての固定作用物質が除去されることが確実とされる。各サンプルは室温にて３０分に亙り遮断溶液と共に温置され、全ての非特異的結合が遮断される。各サンプルは、ＰＢＳにより一旦洗浄され、１：１００のＶＥＧＦＲ−２抗体の希釈液に晒され、且つ、一晩中温置される。各サンプルは引き続きＰＢＳにより３回洗浄されることで、全ての一次抗体が除去されることが確実とされる。夫々のサンプルに対しては、１：１００の希釈にて遮断溶液内のＦＩＴＣ共役二次抗体が加えられ、ベリーダンサ装置上で室温にて４５分温置された。温置の後でサンプルは、一旦は０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにより且つその後は再びＰＢＳ内として、ＰＢＳ内で三回洗浄される。上記サンプルに対しては沃化プロピジウム（ＰＩ）が組み込まれ、共焦点顕微鏡下で視覚化される。図１１は、前駆細胞を結合させるべく官能的フラーレンにより被覆された本発明のステント表面の概略図を示している。図１２Ａおよび図１２Ｂは夫々、抗体なしのフラーレン被覆サンプルであってＰＩ（図１２Ａ）により且つ抗ＶＥＧＦＲ−２／ＦＩＴＣ共役抗体により着色されたサンプルの顕微鏡写真である。図１２Ｃおよび図１２Ｄは、フラーレン／抗ＣＤ３４抗体被覆により被覆されたサンプルの顕微鏡写真である。これらの図に示される如く、抗ＣＤ３４抗体で被覆されたサンプルは表面に更なる細胞を含み、ＶＥＧＦＲ−２陽性である。
【０１６８】
実験例５に記述される如く、抗体あり及びなしのフラーレン被覆サンプルがヨークシャー豚に植設される。ステントは組織学のために外植され、且つ、ステント設置されたセグメントは１０％に緩衝されたホルマリンにより３０秒間洗流されてから、処理されるまで、１０％に緩衝されたホルマリンにより固定される。各ステントからは５個の区画が切断される：ステントの近位側に１ｍｍ、ステントの基端から１ｍｍ、ステントの中央、ステントの末端から１ｍｍ、および、ステントの遠位側に１ｍｍ。各区画は、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）およびエラスチン・トリクロームにより着色される。図１３Ａ乃至図１３Ｄは、４週間植設されたステントの冠状動脈外植片を通る断面の顕微鏡写真である。該データは、フラーレン被覆（図１３Ｂおよび図１３Ｄ）されたステントは、比較対照物（剥き出しステント、図１３Ａおよび図１３Ｃ）と比較してステント部位における過剰な内膜過形成を抑制することを示している。
【０１６９】
実験例５
豚のバルーン損傷の研究：
２５〜３０ｋｇ重量の若いヨークシャー豚において、抗体により覆われたステントの植設が実施される。動物の世話は、“実験室用動物の世話および使用法の指針”（ＮＩＨ出版、第８０−２３、１９８５改訂）［Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  （ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ８０−２３，  ｒｅｖｉｓｅｄ  １９８５）］に従う。一晩に亙る睡眠の後、動物はケタミン塩酸塩（２０ｍｇ／ｋｇ）により鎮静される。チオペンタール（１２ｍｇ／ｋｇ）による麻酔の誘起に続き、動物は挿管されると共に、酸素と亜酸化窒素との混合物（１：２［体積：体積］）を付与する人工呼吸器に接続される。麻酔は、０．５〜２．５体積％のイソフルレンにより維持される。プロカインペニシリン−ＧとベンザチンペニシリンＧの混合物（ストレプトマイシン）を１，０００ｍｇだけ筋肉内注射することにより、抗生物質予防が行われる。
【０１７０】
殺菌状態下で、左頚動脈の動脈切開が実施され、左頚動脈内には８Ｆの導入鞘体が載置される。全ての動物は、体重１キログラムにつき１００ＩＵのヘパリンが与えられる。活性凝固時間を３００秒より長く維持するために、処置の全体に亙り、付加的な２，５００ＩＵ丸薬のヘパリンが定期的に投与される。上記頚動脈用鞘体を通して６Ｆの案内カテーテルが導入されると共に、冠状動脈の心門へと受け渡される。冠状動脈内に２００μｇのニトログリセリンを投与した後で血管造影が実施され、画像は定量的冠状動脈血管造影システムを用いて分析される。冠状動脈の基端部分内へと３Ｆの塞栓摘出用カテーテルが挿入されると共に、ステント植設に対して選択されたセグメントの遠位側へと受け渡され、内皮が露出される。抗ＣＤ３４抗体を取入れた被覆Ｒステントが上記案内カテーテルを通して挿入されると共に、冠状動脈の露出セグメント内で展開される。比較対照物としては、剥き出しのステンレス鋼ステント、または、基質により被覆されたが抗体なしのステントが使用される。各ステントは、ステント対動脈の比率を１．１として、左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）または右冠状動脈（ＲＣＡ）または冠動脈回旋枝（Ｃｘ）のいずれかに植設される。各ステントの寸法設定および載置は血管造影により評価されると共に、導入鞘体が除去されて皮膚は２層に閉じられる。動物は、実験の期間に亙り３００ｍｇのＡＳＡ上に載置される。
【０１７１】
動物は、ステント植設の後、１、３、７、１４および２８日目に犠牲とされる。動物は先ず、上述された如く鎮静され且つ麻酔される。ステント設置された冠状動脈は、ステントの近位側および遠位側においてステント設置されない１ｃｍの血管と共に外植された。ステント設置された動脈は、組織学的、免疫組織化学、および、走査型電子顕微鏡の３通りで処理される。
【０１７２】
免疫組織化学のために、切開されたステントは１０％ホルマリンにより３０秒に亙り穏やかに洗流されてから、処理されるまで１０％ホルマリン／ＰＢＳ溶液内に載置される。免疫組織化学に宛てられたステントは、ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により３０秒間洗流されてから、２％ＰＦＡ溶液内に１５分間載置され、洗浄され、且つ、ウサギの抗ヒトＶＥＧＦＲ−２またはマウスの抗ヒトＴｉｅ−２抗体による免疫組織化学が実施されるまで保存される。
【０１７３】
各ステントは、１０％に緩衝されたホルマリンにより３０秒間洗流されてから、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液内の２．５％のグルタルアルデヒドおよび２％ＰＦＡにより一晩中固定されることで、ＳＥＭに対して準備される。各サンプルは次に、カコジル酸塩緩衝液により３回洗浄され、一晩中洗浄放置された。固定後処理は、０．１Ｍのカコジル酸塩緩衝液内における１％の四酸化オスミウム（シグマ社）により完了されてから、エタノール（３０％エタノール、５０％、７０％、８５％、９５％、１００％、１００％）による脱水および引き続くＣＯ２による臨界点乾燥が行われる。乾燥の後、各サンプルは金スパッタされ且つＳＥＭ下で視覚化される。（言及したことにより本明細書中に援用される１９９３年、血液循環、４２３〜４３０頁、“正常な豚の冠状動脈におけるヘパリン被覆Ｐａｌｍａｚ−Ｓｈａｔｚステントによる血栓事象の減少［Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｅｖｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｃｏａｔｅｄ  Ｐａｌｍａｚ−Ｓｃｈａｔｚ  ｓｔｅｎｔｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉｅｓ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９３：４２３−４３０］。）
【０１７４】
組織学のために、上記ステント設置セグメントは１０％に緩衝されたホルマリンにより３０秒間に亙り洗流され、処理されるまで、１０％に緩衝されたホルマリンによる固定が追随する。各ステントからは５個の区画が切断される：ステントの近位側に１ｍｍ、ステントの基端から１ｍｍ、ステントの中央、ステントの末端から１ｍｍ、および、ステントの遠位側に１ｍｍ。各区画は、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）およびエラスチン・トリクロームにより着色される。
【０１７５】
図１４Ａ乃至図１４Ｇは、植設の１時間後（図１４Ａおよび図１４Ｂ）および４８時間後（図１４Ｃ乃至図１４Ｃ）に採取されると共に走査型電子顕微鏡下で観察された外植片を示している。顕微鏡写真は、デキストラン被覆された比較対照物（図１４Ａ、図１４Ｃおよび図１４Ｄ）と比較して、デキストラン／抗ＣＤ３４抗体で被覆されたステント（図１４Ｂ、図１４Ｅ乃至図１４Ｇ）は、４８時間における高倍率（４００×）の細胞のスピンドル形状外観により示される如く前駆内皮細胞を捕捉したことを明らかに示している。
【０１７６】
豚の冠状動脈からの外植片の断面はまた、デキストラン−抗ＣＤ３４抗体被覆（図１４Ｌ、図１４Ｍ）は、比較対照物（剥き出しステンレス鋼、図１４Ｈおよび図１４Ｉ；デキストラン被覆、図１４Ｊおよび図１４Ｋ）と比較して、内膜過形成（動脈の平滑筋層の厚み）の顕著な抑制を引き起こすことも示した。フラーレン被覆されたステント植設片はまた、図１３Ｂ乃至図１３Ｄに示される如き剥き出しの比較対照ステンレス鋼ステントよりも良好に内膜過形成を抑制する。
【０１７７】
図１５Ａおよび図１５Ｂは夫々、１８ｍｍ長であって表面上の抗体なしでデキストラン−プラズマ被覆されたステントと、デキストラン−プラズマ被覆された抗ＣＤ３４抗体ステントの４８時間外植の共焦点顕微鏡写真である。各ステントは、若い雄のヨークシャー豚の冠状動脈に植設された。各外植片は免疫組織化学的に処理されてＶＥＧＦＲ−２に対して着色され、ＦＩＴＣ共役二次的抗体処理が追随して共焦点顕微鏡下で研究された。図１５Ｂおよび図１５Ｃは、抗体無しのステント（図１５Ａ）上には内皮が完全に欠如しているのと比較して、抗体を含むステントは断面の緑色蛍光により例証される如く内皮細胞により覆われることを示している。
【０１７８】
実験例６
ステントに適用されて固定化された抗体基質に対する内皮成長因子の取入れ：
以下の内容は、内皮前駆細胞表面抗原に指向された抗体を、血管内ステントに適用された生体適合性基質に対して固定化する段階であって、血液との接触時には循環内皮前駆細胞の付着と機能的内皮への成熟とを増進するために該基質には内皮成長因子が吸収されるという段階を記述している。
【０１７９】
基質の析出：当業者に公知の方法を用い、ステンレス鋼ステントはプラズマ析出技術により処理され、ステント表面上にアミン官能性が導入される。ステント上に析出されたアミン官能層に対しては、プラズマ析出層上のアミン基がプラズマ層と機能的ＣＤＭＸとの間にアミド結合を形成するという水性条件下で、水溶性カルボジイミド結合化学作用として知られた標準的手順を用いたＣＭＤＸカルボキシル基の活性化により、カルボキシ官能性デキストラン（ＣＭＤＸ）の層が結合される。
【０１８０】
抗体の固定化：ＣＤＭＸ被覆されたステントに対しては、たとえばネズミのモノクローナル抗ヒトＣＤ３４などの内皮前駆細胞表面抗原に指向された抗体が、緩衝された酸性溶液内で水性の水溶性カルボジイミド化学作用を以て温置されることで共有結合的に結合される。
【０１８１】
成長因子の吸収：ステントに適用されたＣＭＤＸ基質に対するモノクローナル抗ヒトＣＤ３４の固定化に続き、上記デバイスは、ＣＭＤＸ基質内に成長因子が吸収される如く、適切な濃度でたとえばアンジオポエチン２などの内皮成長因子の水溶液内で温置される。処理されたデバイスは、生理学的に緩衝された塩水溶液で濯がれ且つアジ化ナトリウム保存溶液内に保存される。
【０１８２】
標準的な血管造影技術を用いると、上述のデバイスは豚の冠状動脈内に植設されて人間血液に露出されたときに、処理もしくは被覆されたステント表面に対する循環内皮前駆細胞の取り込みおよび付着を増進すると共に、機能的内皮への細胞成熟を加速する。機能的内皮が迅速に確立されると、デバイスによる血栓形成（ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が低減され且つ内膜過形成の程度が調節され得る。
【０１８３】
実験例７
ステント上への内皮成長因子および抗体の固定化：
以下の内容は、血液との接触時に循環する内皮前駆細胞の付着と機能的内皮への成熟とを増進するために、内皮前駆細胞の細胞表面抗原に指向された抗体および内皮成長因子を、血管内ステントに適用された生体適合性基質に対して固定化する段階を記述している。
【０１８４】
基質の析出：当業者に公知の方法を用い、ステンレス鋼ステントはプラズマ析出技術により処理され、ステント表面上にアミン官能性が導入される。ステント上に析出されたアミン官能層に対しては、プラズマ析出層上のアミン基がプラズマ層と機能的ＣＤＭＸとの間にアミド結合を形成するという水性条件下で、水溶性カルボジイミド結合化学作用として知られた標準的手順を用いたＣＭＤＸカルボキシル基の活性化により、カルボキシ官能性デキストラン（ＣＭＤＸ）の層が結合される。
【０１８５】
抗体および成長因子の固定化：ＣＤＭＸ被覆されたステントに対しては、たとえばネズミのモノクローナル抗ヒトＣＤ３４などの内皮前駆細胞表面抗原に指向された抗体、および、たとえばアンジオポエチン２などの内皮成長因子が、酸性条件下で水溶性のカルボジイミド溶液中での等モル濃度での温置により共有結合的に結合される。処理されたデバイスは、生理学的に緩衝された塩水溶液で濯がれ且つアジ化ナトリウム保存溶液内に保存される。
【０１８６】
標準的な血管造影技術を用いると、上述のデバイスは豚の冠状動脈内に植設されて人間血液に露出されたときに、処理もしくは被覆されたステント表面に対する循環内皮前駆細胞の取り込みおよび付着を増進すると共に、機能的内皮への細胞成熟を加速する。機能的内皮が迅速に確立されると、デバイスによる血栓形成が低減され且つ内膜過形成の程度が調節され得る。
【０１８７】
実験例８
ステントの小寸分子官能化：
実験例１に記述された如く、前駆内皮細胞が分離された。細胞はフィブロネクチン被覆スライドに塗付され、ＥＢＭ−２培養培地内で７日間に亙り増殖された。細胞は、沃化プロピジウム（ＰＩ）およびＦＩＴＣ共役内皮細胞特異的レクチン（Ｕｌｅｘ  Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ｕｅａ  １）により固定および着色された。これらの実験の結果は、図１６Ａおよび図１６Ｂに示される。これらの図は、フィブロネクチン被覆スライドに対して前駆内皮細胞が結合されたこと、および、該細胞はその表面上でレクチンに対する配位子を発現することを示している。
【０１８８】
実験例９
血管拡張化合物および固有細胞表面マーカ（短小化ＭＨＣ−Ｉ）の両方をコード化するバイシストロン性ベクタによる豚の内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の遺伝子導入
ＭＨＣ−Ｉは、血管内プロテーゼ上に固定化された特異的抗体により認識され得る。抗体により被覆されたステントは豚の冠状動脈内に植設され、次に、豚に対し、遺伝子的に修飾されたＥＰＣの移植が追随する。ＥＰＣは抗体／抗原の相互作用を以て、被覆済みステントにより捕捉され、ステント・ストラットの全体に亙り内皮単層が形成される。捕捉された細胞は過剰発現された血管拡張因子を分泌し、末端側の流れを増大し、正の再構成をトリガし得る。
【０１８９】
プラスミド選択：ミルテニ・バイオテック社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）（ドイツ）によれば、ｐＭＡＳＣＳＫｋプラスミド・ベクタから成るＭＡＣＳｅｌｅｃｔ  Ｋシステムが開発されている。ｐＭＡＣＳＫ．ＩＩプラスミド・ベクタは、プロスタサイクリン・シンテターゼ遺伝子をコード化するｃＤＮＡならびに短小化マウスＭＨＣクラスＩ分子であるＨ−２Ｋをコード化する遺伝子がクローン化されるというマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含むバイシストロン性ベクタ（５２２９塩基対）である。上記システムは遺伝子導入細胞を選択するために開発されたものであり、短小化ＭＨＣ分子が選択マーカとして作用する。生来のＨ−２Ｋ発現は一定の希なネズミ系統（たとえばＡＫＲＩＪＡまたはＣＢＮＪ）に限られることから、Ｈ−２Ｋｋ表面蛋白質（ミルテニ・バイオテック社）に対するモノクローナル抗体は実質的に、他の表面抗原に対する外生反応性が無い。
【０１９０】
全血に対する交差反応性の評価：抗Ｈ−２Ｋｋ抗体は豚の全血の細胞成分と交差反応しないことを確認すべく、全血はＦＩＴＣ共役抗Ｈ−２Ｋ抗体と反応されると共に、全血ＦＡＣＳ分析（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００）に委ねられる。陽性対照物として、全血は、Ｈ−２Ｋｋ表面抗原を発現するマウスの脾臓繊維芽細胞ラインＡＫＲＩＪＡＳｐ（米国細胞バンク（ＡＴＣＣ））により“スパイク”される。
【０１９１】
繊維芽細胞の培養：ＡＫＲ／ＪＡ．Ｓｐ繊維芽細胞は、４ｍＬのＬグルタミン、４５００ｍｇ／Ｌのグルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１５００ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、および、１０％の胎児牛血清により調製されたダルベッコス社の改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）を用いて、非被覆のＴ−７５プラスチック・フラスコ（モントリオール、サーステット社［Ｓａｒｓｔｅｄｔ］）内で培養される。細胞の解離は、トリプシン／ＥＤＴＡ（インビトロゲン社［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）を用いて実施される。Ｈ−２Ｋｋ発現は、蛍光標識されたＨ−２Ｋｋ抗体を用いる免疫組織化学的分析により確認される。簡潔には、２ウェル式の被覆なしチャンバ・スライドにおいて０．５×１０６細胞／ｃｍ２にて、細胞が塗付される。培養液は、１、２、３および４日目に２％パラホルムアルデヒドで固定されると共にＦＩＴＣ共役Ｈ−２Ｋ抗体（ドイツ、ミルテニ・バイオテック社）および核マーカである沃化プロピジウム（ＰＩ）（ベクタシールド封入剤［Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ］、ベクタラボラトリ社［Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］）により着色される。分析および定量は、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００−Ｂｉｏｒａｄ  Ｒａｄｉａｎｃｅ  ２  １００）を用いて実施される。陰性対照物としては、人間の繊維芽細胞が使用される。
【０１９２】
非付着細胞の分析：血液の存在下でこのシステムを使用する実施可能性を確認するために、Ｈ−２Ｋｋ表面蛋白質の保持に対して非付着形態のＡＫＲＩＪＡ．Ｓｐ細胞が特徴付けられる。細胞は、Ｔ−７５非被覆フラスコ内で上述された如く培養される。４日目における付着細胞がトリプシン／ＥＤＴＡを用いて解離されると共に、Ｈ−２Ｋｋ表面蛋白質を発現している細胞の個数は、ＦＩＴＣ共役Ｈ−２Ｋｋ抗体およびＦＡＣＳ分析（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００）を用いて決定される。陰性対照物としては、ＦＩＴＣ標識されたマウスのＩｇＧ２ａイソタイプが使用される。
【０１９３】
プラスミド構造：プロスタサイクリン・シンテターゼをコード化するｃＤＮＡは、マルチクローニング部位におけるＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限配列を用いてバイシストロン性プラスミド・ベクタｐＭＡＣＳＫｋ．ＩＩ（ドイツ、ミルテニ・バイオテック社）へとクローン化される。プラスミド構造内にプロスタサイクリン・シンテターゼ遺伝子およびｐＶＡＸ−１を含む１１５３塩基対のｃＤＮＡが使用される。選択作用物質としてアンピシリン（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＨＧ７０  Ｅｃｏｌｉの形質転換が実施される。
【０１９４】
ヒトのα−ＣＧＲＰに対する完全なｃＤＮＡは、プラスミド・ベクタｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）においてオープン・バイオシステムズ社（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から求められた（アラバマ州、ハンツビル、カタログ番号ＭＨＳ  １７６８−９  １４４１  １７）。断片は次に、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩと共にバイシストロン性プラスミド・ベクタｐＭＡＣＳＫ．ＩＩへと結紮（けっさつ）される。ＪＭ１０９  Ｅ  ｃｏｌｉが形質転換され、大量のプラスミドが得られる。
【０１９５】
ＥＰＣ遺伝子導入：豚の単核細胞はフィコールの密度遠心法により豚の全血から富化されると共に、上述された如く富化培養液からＥＰＣが分離される。培養液内で７日後にＥＰＣは、核穿孔（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ドイツ）を用い、α−ＣＧＲＰまたはプロスタサイクリン・シンテターゼを含む導入遺伝子を含むバイシストロン性プラスミド・ベクタを以て遺伝子導入される。ｐＶＡＸｔプラスミドにおいてレポータ遺伝子および内皮窒素酸化物シンテターゼ（ｅＮＯＳ）の両方を用いることで、ＥＰＣの＞７０％の電気穿孔遺伝子導入効率が得られた（データは示されない）。好首尾に遺伝子導入されてＨ−２Ｋｋ表面蛋白質を発現するＥＰＣは、ＭＡＣＳ死滅細胞除去キット、ＭＡＣＳｅｌｅｃｔ  ＫｋマイクロビーズおよびＭＳ分離カラム（ミルテニ・バイオテック社）を用いて精製かつ分離された。ＭＡＣＳｅｌｅｃｔ  Ｋｋマイクロビーズは生分解可能であり、細胞培養により２４時間以内に喪失される。
【０１９６】
血管拡張因子発現の測定：
プロスタサイクリン・シンテターゼ活性の測定：遺伝子導入されたＥＰＣは遺伝子導入後、２日間に亙り培養液内に維持される。培地は交換され、製造者の指示に従い放射線免疫検定（アメルシャム社［Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．］）により培地におけるプロスタサイクリン・シンテターゼの代謝生成物、６−ケトプロスタグランジンＦｌａ（６−ケト−ＰＧＦｌｃｕ）のレベルを測定することで評価される。
【０１９７】
α−ＣＧＲＰ活性の測定：遺伝子導入細胞におけるα−ＣＧＲＰ発現は、免疫組織化学染色キット（米国、ベイケム社［Ｂａｃｈｅｍ］）を用いて決定される。培養液内で３日間に亙り遺伝子導入されたＥＰＣは、−１０℃のメタノール中に５分間固定される。細胞は洗浄され、空気乾燥される。内因性の過酸化物活性を低下させるために、固定された細胞は、ＰＢＳ中の０．５％過酸化水素溶液中に７分間に亙り温置される。非特異的な結合を遮断すべく、上記細胞は血清遮断液内で２０分間に亙り温置される。細胞は次に、３種類の希釈１：１００、１：２００および１：５００にて一次抗体である抗α−ＣＧＲＰ（ウサギモノクローナル、ベイケム社）により２時間に亙り処理される。次にスライドが洗浄され、ビオチン化二次抗体に対して３０分間に亙り露出される。細胞は次に、濯がれ、ＨＲＰ−ストレプトアビジン錯体により３０分間に亙り処理される。ＰＢＳ洗浄の後、細胞は基質−色素原混合物に対し３分間に亙り露出される。反応は、脱イオン水の付加により停止される。スライドは、メイヤのヘマトキシリンにより３分間に亙り対比染色される。スライドは次に水道水中で洗浄され、青色に変わるまでＰＢＳ内に載置されてから、蒸留水により濯がれる。スライドは次に、９５％および１００％のエタノールおよびキシレンを用いて脱水される。スライドはカバーガラスが付され、光学顕微鏡下で検証される。
【０１９８】
抗体により被覆されたステント：前述された如く、ステンレス鋼ステント（９ｍｍ長）が、デキストランおよび抗Ｈ−２Ｋｋ抗体により被覆される。
【０１９９】
生体内の細胞捕捉：全ての実験は、雄の若いヨークシャー豚（＞３０ｋｇ）において実施される。動脈アクセスは、左頚動脈における動脈切開により行われる。冠状動脈内に２００ｐｇのニトログリセリンを投与した後、冠状動脈の血管造影が行われ、オンラインでの定量的な冠状動脈血管造影評価が実施される。ステントは、ＬＡＤ、冠動脈回旋枝または右冠状動脈のいずれかの近位側セグメントに対してランダムに１．１：１のステント対血管比で展開される。一旦植設されたなら、冠状動脈内に２００ｐｇのニトログリセリンが投与される。次に血管内超音波（ＩＶＵＳ）が実施されることで、遠位側および近位側の基準として遠位側側枝および展開ステントの遠位側マージンを用いて血管口径が決定される。プロスタサイクリン・シンテターゼまたはα−ＣＧＲＰ細胞のいずれかをコード化するバイシストロン性ベクタを以て遺伝子導入された細胞の投与は、試作品のタンデム・バルーン・カテーテル（コーディス社［Ｃｏｒｄｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ］）を用いて達成される。該カテーテルは、該デバイスの末端の近傍に配置された高度に弾性的な２個のバルーンであって単一の膨張ポートを通して膨張されるバルーンを備えていた。一旦膨張されたなら、各バルーン間における１．０ｃｍ長の血管が分離され、局在化された注入チャンバが生成される。遠位側の血液流は中央内孔により提供され、且つ、分離された２つの内孔を介して上記チャンバの全体に亙り溶液が注入または吸引される。注入用内孔は遠位側バルーンの近傍で終端し、且つ、排出用内孔は近位側バルーンの近傍の１個のポートにて終端する。上記タンデム・バルーン・カテーテルは、ステント植設の部位へと前進され、各バルーンは２５ｐｓｉ（１．７気圧）へと膨張される。分離されたセグメントから血液がなくなるまで、滴注ポートを通して塩水が供与される。ステント設置された動脈セグメントは、塩水注入もしくは細胞供与のいずれかを受けるべくランダム化される。１０分間に亙る２００ｐＬ／分の注入速度による２ｍｌの細胞懸濁液において合計で３×１０個のＥＰＣが与えられ、１０分の温置時間が追随する。次に動脈切開部位が閉じられ、動物の回復が許容される。動物は、細胞治療の後、２８日間に亙り収容される。合計で３４匹の動物が治療される（１０匹は塩水比較対照物、１４匹はプロスタサイクリン・シンテターゼ、１４匹はα−ＣＧＲＰ）。各群からの２匹の動物は、細胞供与の後、１時間後に犠牲とされる。ステント設置セグメントは外植されると共に洗流され、１０％に緩衝されたホルマリンＰＢＳ内における３０秒間に亙る固定と、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（シグマ社）内の２．５％のグルタルアルデヒド（ＢＤＨ社）を有する２％ＰＦＡによる一晩に亙る更なる固定とにより、ＳＥＭに対して準備される。固定後処理は、０．１Ｍのカコジル酸塩緩衝液内における１％の四酸化オスミウム（シグマ社）により完了されてから、エタノールによる連続的な脱水および引き続くＣＯ２による臨界点乾燥が行われる。乾燥の後で各サンプルは、ステント・ストラットに結合した細胞の存在のために、金スパッタされ且つＳＥＭ下で視覚化される。ステント植設の５日後、プロスタサイクリン・シンテ���ーゼの群からの２匹の動物、および、α−ＣＧＲＰの群からは２匹の動物が犠牲とされる。外植されたステント設置動脈セグメントは、標準的な組織化学分析に対して処理されるまで、１０％ホルマリン／ＰＢＳ溶液内に載置される。各ステントからは５個の区画が切断される：ステントの近位側に１ｍｍ、ステントの基端から１ｍｍ、ステントの中央、ステントの末端から１ｍｍ、および、ステントの遠位側に１ｍｍ。各区画は、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）およびエラスチン・トリクロームにより着色される。供与された細胞の排除の証拠を評価するために、炎症スコア［Ｋｏｒｎｏｗｋｉ  Ｓｃｏｒｅ  （０−３）］が決定される。指標手順（約２８日）の後、動物は麻酔されると共に、右頚動脈における動脈切開を介して冠状動脈血管造影が実施される。定量的な冠状動脈血管造影が実施されると共に血管はＩＶＵＳを用いて調べられ、血管口径の変化は標準的な臨床的アルゴリズムを用いて記録される。
【０２００】
実験例１０
血管再構成における使用のための試験管内での哺乳動物細胞の遺伝子導入：
アデノシンを生成する役割を果たす蛋白質と、前立腺特異的な細胞膜蛋白質とをコード化する遺伝子を含むバイシストロン性プラスミドの電気穿孔を用いて、前駆内皮細胞が遺伝子導入される。両方の遺伝子はそれら自身の促進因子の制御下であることから、各遺伝子は構成的に発現される。
【０２０１】
上述されたのと同様にして、前立腺特異的な細胞膜蛋白質をコード化する遺伝子であってそれ自身の生来の促進因子を備える遺伝子と、同一の発現ベクタ内に直列に配置された遺伝子であってＶＥＧＦをコード化する遺伝子とを備えるベクタが構成される。実験例９において記述された如く被検体において使用されるために哺乳動物細胞に遺伝子導入すべく、プラスミド構造が使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１Ａ】基質に対して架橋分子により共有結合的に束縛された抗体の概略図である。
【図１Ｂ】基質を繋止するＣ６０Ｏ分子を示す図である。
【図１Ｃ】本発明の基質により被覆されたステントの概略図である。
【図２】図２Ａは、富化培地により分離された細胞を含むフィブロネクチン被覆スライドに対して付着された前駆内皮細胞の位相差顕微鏡写真である。図２Ｂは、抗ＣＤ３４抗体が被覆された磁性ビーズにより分離された細胞を含むフィブロネクチン被覆スライドに対して付着された前駆内皮細胞の位相差顕微鏡写真である。図２Ｄおよび図２Ｆは、７日間に亙り温置されると共にＰＩ核着色により着色された前駆内皮細胞の顕微鏡写真図である。これらの図において見られる如く上記細胞は、Ｔｉｅ−２（図２Ｅおよび図２Ｇ）およびＶＥＧＦＲ−２（図２Ｃ）の抗体反応性に対する抗体蛍光により示される如く、成熟内皮細胞マーカを発現している。
【図３】内皮窒素酸化物シンテターゼすなわちｅＮＯＳおよびグリセルアルデヒド・リン酸デヒドロゲナーゼすなわちＧＡＰＤＨに対する半定量的ＲＴ−ＰＣＲに関して臭化エチジウムにより着色された２％アガロース・ゲルの写真である。フィブロネクチン被覆スライド上の培養液内での３日後（図３Ｂ）および７日後（図３Ａ）、前駆内皮細胞はｅＮＯＳのｍＲＮＡを発現し始めた。
【図４】ＨＵＶＥＣ細胞と共に温置され且つ沃化プロピジウムにより着色された、ＣＭＤｘおよび抗ＣＤ３４抗体（図４Ａ）、ゼラチンおよび抗ＣＤ３４抗体（図４Ｂ）、剥き出しのステンレス鋼ディスク（図４Ｃ）、ＣＭＤｘ被覆（図４Ｄ）およびゼラチン被覆（図４Ｅ）されたステンレス鋼ディスクに対して付着したＨＵＶＥＣの顕微鏡写真である。
【図５】図５Ａ乃至図５Ｃは、抗体なしでＣＭＤｘにより被覆され且つ人間血液の白血球画分と共に温置された比較対照物の顕微鏡写真である。白血球は、沃化プロピジウム、および、ＦＩＴＣ標識された抗ＫＤＲ抗体により着色された。図５Ｄ乃至図５Ｆは、表面に抗体が結合されないゼラチンで被覆され且つ人間血液の白血球画分と共に温置された比較対照ステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。白血球は、沃化プロピジウム、および、ＦＩＴＣ標識された抗ＫＤＲ抗体により着色された。
【図６】図６Ａ乃至図６Ｃは、表面に抗ＣＤ３４抗体が結合されたＣＭＤｘ基質により被覆され且つＨＵＶＥＣと共に温置されたステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。細胞は、沃化プロピジウム、および、ＦＩＴＣ標識された抗ＫＤＲ抗体により着色された。図６Ｄ乃至図６Ｆは、表面に抗体が結合されたゼラチン基質により被覆され且つＨＵＶＥＣと共に温置されたステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。細胞は、沃化プロピジウム、および、ＦＩＴＣ標識された抗ＫＤＲ抗体により着色された。
【図７】表面に抗体が結合されたＣＭＤｘ基質により被覆され且つ前駆細胞と共に２４時間温置されたステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。細胞は、沃化プロピジウム、および、ＦＩＴＣ標識された抗ＫＤＲ抗体により着色された。
【図８】表面に結合された抗ＣＤ３４抗体を含むＣＭＤｘ基質により被覆され且つ前駆細胞と共に７日間温置されたステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。細胞は、沃化プロピジウム、および、ＦＩＴＣ標識された抗ＫＤＲ抗体により着色された。
【図９】表面に結合された抗ＣＤ３４抗体を含むＣＭＤｘ基質により被覆され且つ前駆細胞と共に７日間温置されたステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。細胞は、沃化プロピジウム、および、ＦＩＴＣ標識された抗Ｔｉｅ−２抗体により着色された。
【図１０Ａ】ＣＭＤｘ被覆され且つ前駆細胞と共に内皮増殖培地において３週間温置されて成熟内皮細胞を示すステンレス鋼ディスクの位相差顕微鏡写真である。
【図１０Ｂ】ＣＭＤｘ被覆され且つ前駆細胞と共に内皮増殖培地において３週間温置されて成熟内皮細胞を示すステンレス鋼ディスクの位相差顕微鏡写真である。
【図１０Ｃ】ＣＭＤｘ被覆され且つ前駆細胞と共に内皮増殖培地において３週間温置されて成熟内皮細胞を示すステンレス鋼ディスクの位相差顕微鏡写真である。
【図１１】前駆細胞を結合させるべく官能的フラーレンにより被覆された本発明のステント表面の概略図である。
【図１２】抗ＣＤ３４抗体なしで又はありでフラーレン被覆されたサンプルの顕微鏡写真である。各サンプルは、人間の白血球細胞画分と共に温置され、且つ、沃化プロピジウム、および、ＦＩＴＣ標識された抗ＶＥＧＦＲ−２抗体により着色された。
【図１３】剥き出しのステンレス鋼ステント（図１３Ａおよび図１３Ｃ）およびフラーレン被覆されたサンプル（図１３Ｂおよび図１３Ｄ）と共に４週間植設された冠状動脈の外植片の低倍率および高倍率の組織学的断面の顕微鏡写真である。各断面は、ヘマトキシリンエオシン着色法により着色された。
【図１４】図１４Ａ乃至図１４Ｇは、雄のヨークシャー豚における植設の１時間後および４８時間後のステントの走査型電子顕微鏡写真である。デキストラン被覆（図１４Ａ）およびデキストラン／抗ＣＤ３４抗体被覆（図１４Ｂ）されたステントの植設の１時間後における外植片である。図１４Ｃおよび図１４Ｄは比較対照サンプルの外植片を示し、かつ、図１４Ｅ乃至図１４Ｇは植設の４８時間後におけるデキストラン／抗ＣＤ３４抗体被覆ステントである。図１４Ｈ乃至図１４Ｍは、４週間植設された雄のヨークシャー豚からの外植片の冠状動脈を通る断面の組織学的顕微鏡写真であり、未被覆（剥き出しステンレス鋼）（図１４Ｈおよび図１４Ｉ）、デキストラン被覆された比較対照物（図１４Ｊおよび図１４Ｋ）、および、デキストラン／抗ＣＤ３４抗体による被覆（図１４Ｌおよび図１４Ｍ）である。
【図１５】夫々、１８ｍｍ長であって表面上の抗体なしでデキストラン／プラズマ被覆されたステントおよびデキストラン／プラズマ被覆／抗ＣＤ３４抗体被覆されたステントの４８時間の外植時における蛍光顕微鏡写真である。
【図１６】沃化プロピジウムおよび抗レクチン／ＦＩＴＣ共役サンプルの顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【０２０３】
１．０１  内皮細胞
１．０２  細胞表面抗原
１．０３  抗体
１．０４  架橋分子
１．０５、１．０６  基質
１．０７  ステント
２．０１  内皮細胞
２．０２  細胞表面抗原
２．０３  抗体
２．０４  基質
２．０５  Ｃ６０
２．０６  ステント
【図１Ａ】
2007535389.tif 000007
【図１Ｂ】
2007535389.tif 000008
【図１Ｃ】
2007535389.tif 000009
【図２】
2007535389.tif 000010
【図３】
2007535389.tif 000011
【図４】
2007535389.tif 000012
【図５】
2007535389.tif 000013
【図６】
2007535389.tif 000014
【図７】
2007535389.tif 000015
【図８】
2007535389.tif 000016
【図９】
2007535389.tif 000017
【図１０Ａ】
2007535389.tif 000018
【図１０Ｂ】
2007535389.tif 000019
【図１０Ｃ】
2007535389.tif 000020
【図１１】
2007535389.tif 000021
【図１２】
2007535389.tif 000022
【図１３Ａ】
2007535389.tif 000023
【図１４】
2007535389.tif 000024
【図１５】
2007535389.tif 000025
【図１６】
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【配列表】
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