(57)【要約】本発明は、再生可能な炭素源、例えば糖を使用する芳香族酸の酵素的生産に関する。芳香族酸、例えば桂皮酸、パラヒドロキシ桂皮酸およびパラヒドロキシ安息香酸を生産することができ、該芳香族酸のための排出ポンプを含む宿主細胞を使用して、発酵性炭素基質から芳香族酸を微生物生産する方法が提供される。好ましい宿主細胞は、プロトン依存性耐性／小結節形成／細胞分割(RND)系統の排出ポンプの一員、好ましくはP.プチダ(Putida)菌株S12の溶媒耐性ポンプsrpABCを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
再生可能な炭素基質からの微生物宿主細胞における芳香族酸の酵素的生産方法であって、該宿主細胞が、該芳香族酸のための排出ポンプを含む方法。
【請求項２】
該排出ポンプが、プロトン依存性耐性／小結節形成／細胞分割(RND)系統の排出ポンプの一員（好ましくは溶媒耐性ポンプ、より好ましくはP.プチダ(Putida)菌株S12の溶媒耐性ポンプsrpABC）である請求項１記載の方法。
【請求項３】
該宿主細胞が、シュードモナス(Pseudomonas)種（好ましくは P.プチダ (putida)、より好ましくはP. プチダ(putida)菌株S12）である 請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該宿主細胞が、該芳香族酸の生合成に関連する少なくとも１種の酵素を発現または過剰発現する請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
該宿主細胞が遺伝子的に変性されて、該芳香族酸またはその前駆体を生産または過剰生産する請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
該芳香族酸が、桂皮酸、パラ-ヒドロキシ桂皮酸およびパラ-ヒドロキシ安息香酸からなる群より選択される請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
該宿主細胞が、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL)（好ましくはチロシンアンモニアリアーゼ(TAL)活性を有するPAL）を過剰発現する請求項６記載の方法。
【請求項８】
該宿主細胞が、芳香族酸の毒性類似体に対して耐性の変異体についてスクリーニングすることによって、フェニルアラニンおよび／またはチロシンの蓄積の増加について選択される請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
該再生可能な炭素基質が、単糖、オリゴ糖、多糖、ポリオール、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルメートおよび炭素含有アミン（好ましくはグルコースおよびグリセロール）からなる群より選択される請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
芳香族酸を過剰生産する宿主細胞を提供するための方法であって、PAL/TAL活性を宿主細胞の集団に導入し、該集団を無作為の突然変異誘発に供し、増加されたm-フルオロ-フェニルアラニン耐性について変異宿主細胞を選択し、増加された芳香族酸の生産について該選択された変異宿主細胞をスクリーニングし、そして無作為の突然変異誘発に供されなかった親宿主細胞に比べて該芳香族酸を過剰生産する少なくとも１種の変異された宿主細胞を選択することを含む方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法により得ることができる宿主細胞。
【請求項１２】
該芳香族酸の分解に関連する少なくとも１種の酵素が無力にされるか、または該芳香族酸の生合成の代謝副経路が無力にされた請求項１１記載の宿主細胞。
【請求項１３】
排出ポンプ（好ましくはプロトン依存性耐性／小結節形成／細胞分割(RND)系統の排出ポンプの一員、より好ましくはP.プチダ(Putida)菌株S12の溶媒耐性ポンプsrpABC）を含む宿主細胞を、再生可能な炭素基質からの芳香族酸の微生物生産のために使用する方法。
【請求項１４】
該宿主細胞が、シュードモナス(Pseudomonas)種（好ましくは P.プチダ (putida)、より好ましくはP. プチダ(putida)菌株S12）である請求項１３記載の使用方法。
【請求項１５】
該芳香族酸が、桂皮酸、パラ-ヒドロキシ桂皮酸およびパラ-ヒドロキシ安息香酸である請求項１３または１４記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生可能な炭素源、例えば糖からの芳香族酸の製造に関する。より詳細には、芳香族酸の微生物生産のための改善された方法であって、宿主細胞から例えば培地へと該芳香族酸を活発に分泌することができる酵素的ポンプを含む宿主細胞を使用する方法に関する。本発明は主として桂皮酸、パラ-ヒドロキシ桂皮酸およびパラ-ヒドロキシ安息香酸の製造に関して記載されているが、本発明の方法はまた、他の芳香族酸の微生物生産のために有利に使用される。
【背景技術】
【０００２】
芳香族化合物の化学合成は、非再生可能炭素基質に基づき、しばしば大きなエネルギーならびに／または高価な化学的活性化および保護基ならびに／または大量の溶媒を必要とする。かくして、多くの場合、芳香族化合物の化学合成は、環境的な観点から望ましくない。その上、芳香族酸の化学合成はしばしば困難である。したがって、芳香族酸の大規模合成は好ましくは、微生物生産系および再生可能な炭素源、例えば糖を使用して行われる。
【０００３】
工業的に重要な芳香族酸の例としては、桂皮酸（CAと称する）、パラ-ヒドロキシ桂皮酸（PHCAと称する）およびパラ-ヒドロキシ安息香酸（PHBと称する）を包含する。PHCAは、液晶ポリマー(LCP)の製造のために有用なモノマーである。LCPは、電子コネクターならびに電気通信および航空宇宙の用途において使用することができる。滅菌放射に対するLCPの耐性はまた、これらの物質を、医療用装置ならびに化学品、および食品包装用途において使用することを可能にした。さらには、PHCAは、日焼け止め製品および化粧品において、および食品材料において酸化防止剤として使用することができる。クマリンまたはオキシ-桂皮酸として知られる、高血圧および卒中防止のための重要な薬剤は、CAの誘導体である。CAおよび関連化合物の産出および代謝の観点については、J.A.ホスキンズ(Hoskins)による概説（1984年;ジャーナル  オブ  アプライド  トキシコロジー(Journal of Applied Toxicology), 4:283-292）を参照。PHBはまた、LPCの合成のためのモノマーとして使用される。それはまた食品防腐剤であり、化粧品調製物において安定剤として使用される。またPHBは、合成薬品、薬剤、染料および可塑剤のための化学中間体として使用される。PHBのエステルは、パラベンとして知られており、これは、脱臭剤、発汗抑制剤および広範囲の他の消費者製品において抗菌防腐剤として使用される。
【０００４】
CAおよびPHCAは共に植物において天然に生じ、植物中でそれらは、リグニン生合成経路の中間体として役立つ（植物生化学(Plant Biochemistry)、P.M.デイ(Dey)編、アカデミック  プレス(Academic Press)、1997年）。CAおよびPHCAの植物からの分離および精製の方法は公知である（R.ベンリーフ(Benrief)ら、Phytochemistry、1998年、47,825-832；国際特許出願公開公報WO 97/2134号）。
【０００５】
PHBの化学合成は、以前に記載されている（特開平05/009,154号公報；米国特許第5,399,178号明細書；米国特許第4,740,614号明細書；米国特許第3,985,797号明細書）。
【０００６】
該芳香族酸を得る方法は時間がかかり、扱いにくく、および／またはエネルギーを必要とし、生物学的製造方法は、簡単でかつ持続可能な解決法を提供することができた。
【０００７】
PHBの微生物生産は、国際特許出願公開公報WO 01/92539号に記載されている。この特許は、PHBが再生可能な供給原料、例えば糖から製造されず、予め形成された基質であるトルエンから製造されるということにおいて、本発明とは異なる。本発明とは違って、このプロセスは、持続可能性に関しての解決法を与えない。
【０００８】
糖発酵経路を使用するCAおよびPHCAの微生物生産は、国際特許出願公開公報WO 02/090523号から公知であり、ここでは、所望の芳香族酸を製造するように、芳香族酸の合成に関して鍵となる酵素を有する微生物宿主細胞が工作される。しかしながら、公知の微生物生産法の生成物収率のさらなる最適化および改善は、一旦生産された芳香族酸が典型的には宿主細胞に蓄積するという事実によって妨げられる。その結果、芳香族酸合成におけるさらなる増加が抑制されるように、蓄積された生成物は、その生産に関連する１種以上の酵素を阻害する。この現象はまた、負のフィードバックコントロールメカニズムと称される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はここで、芳香族酸を細胞から活発に輸送することができる排出ポンプを含む宿主細胞が芳香族酸の微生物生産のために有利に使用されるという洞察を提供する。
【００１０】
芳香族酸を生産することができ、該芳香族酸のための排出ポンプを含む宿主細胞を使用して、再生可能な炭素基質から芳香族酸を微生物生産するための方法が提供される。本発明の方法においては、宿主細胞は芳香族酸を培地に分泌することができ、それで、細胞中の生成物の蓄積および、便利には負のフィードバックが最小にされる。その結果、生産される芳香族酸を効率的に分泌することができない宿主細胞を使用する現行の微生物生産系に比べてより高い生成物収率を達成することができる。そのほかに、本発明の方法は、宿主細胞の収穫およびさらなる加工処理を必要としないで、所望の最終生成物を得る。その代わり、最終生成物に富む宿主細胞の培地を採取し、さらなる加工処理に供して、生成物を分離および／または精製することができる。かくして、連続方式で行うことができる、使用が簡単な方法が提供され、それに対して、バッチ式の培養が同様に可能である。
【００１１】
再生可能な炭素基質は、植物または動物起源の炭素源をいう。それは、増殖の基質として宿主細胞に使用されることができ、典型的には宿主細胞の発酵性培地の一部である。再生可能な炭素基質の例としては、炭水化物、例えばグルコース、フラクトース、ガラクトース、マンノース、マンニトール、ショ糖、デンプン、デンプン加水分解物および糖蜜；アルコール、例えばメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコールおよびグリセリン；ならびに有機酸を包含する。
【００１２】
本発明の方法において使用するのに適当な宿主細胞としては、芳香族酸を生産することができ、かつ疎水性溶媒、例えばトルエンおよびオクタノールに対して耐性の表現型を示す微生物細胞を包含する。しかしながらまた、溶媒耐性でないが、芳香族酸を輸出することができる排出ポンプを含む（微生物）宿主細胞が、本発明において使用される。
【００１３】
溶媒耐性に寄与する多くの異なるメカニズムが記載されており、その１つは、毒性の溶媒を積極的に細胞の内部に入れないエネルギー依存性排出ポンプに関連する。溶媒耐性の宿主細胞は本発明の方法において有利に使用される。というのは、有機溶媒に対して抵抗性または耐性を与えるポンプは、物理化学特性によって微生物膜へと蓄積する有機化合物、例えば芳香族化合物、アルコール、アルカン等を基質として取って、非常に広い特異性を有することが示されているからである（キーブーム(Kieboom)ら、1998年、J.Biol. Chem. 273:85-91）。解離した芳香族酸は、同様の物理化学特性によってまた、それらがそのようなポンプの基質として働く細胞膜へ効率的に分割する。
【００１４】
本発明の１つの実施態様においては、宿主細胞、好ましくはグラム陰性菌は、プロトン依存性耐性／小結節形成／細胞分割(RND)系統の排出ポンプの一員を含む。RND-タイプの排出ポンプは、多剤耐性(MDR)ポンプに属する。それらは、非常に広い基質特異性を有し、細胞質膜の両側で微生物細胞を抗生物質の作用から保護する。この系統の一員は、小結節形成の信号を送ることに関連する抗生物質、金属およびオリゴ糖の輸出に関連することが知られている。RND-タイプの排出ポンプは通常、外および細胞質膜ならびにグラム陰性菌の近原形質(periplasmic)空間に及ぶ、３成分アセンブリとして機能する。本発明の方法において使用するために適当なRND-タイプの排出ポンプの例は、ツエン(Tseng)、T.T.、グラットゥィック(Gratwick)、K.S.、コールマン(Kollman)、J.、パーク(Park)、D.、ニーズ(Nies)、D.H.、ゴフォウ(Goffeau)、A.＆サイエルジュニア(Saier Jr.)、M.H.(1999)、J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1: 107-125において見出すことができる。
【００１５】
１つの実施態様においては、再生可能な炭素源からの芳香族酸を生産するために本明細書において提供された方法は、溶媒耐性のポンプ、好ましくはP.プチダ(Putida)S12の溶媒耐性ポンプsrpABC（イスケン(Isken)ら、1996年、J.Bacteriol. 178:6056；キーブーム(Kieboom)ら、1998年、J. Biol. Chem. 273:85-91）を含む宿主細胞を使用する。srpABC遺伝子によりエンコードされたタンパク質の導き出されたアミノ酸配列は、排出ポンプのRND系統のものと広範囲の相同性を有する。それは、一緒にグラム陰性菌の内および外膜に及ぶ３個のタンパク質成分：内膜輸送体（SrpB類似体）、外膜チャネル（SrpC類似体）および近原形質リンカータンパク質（SrpA類似体）からなる。多剤耐性に関連する他のタンパク質に対するSrpA、SrpBおよびSrpCの系統学的関係を示す系統樹は、キーブーム(Kieboom)ら、1998年、J.Biol. Chem. 273:85-91において示される。srpABC-エンコードされたタンパク質は、シュードモナス  アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)において見出されるmexAB/oprM-エンコードされた多剤耐性ポンプについてのものと最も相同性を示す。SrpA、SrpBおよびSrpCは、MexA、MexBおよびOprMとそれぞれ57.8、64.4および58.5％一致する。本発明の１つの実施態様においては、宿主細胞は、排出ポンプのRND-系統に属する、内膜輸送体、外膜チャネルおよび近原形質リンカータンパク質からなる排出ポンプを含み、ここでは、タンパク質は、P. プチダ(Putida)S12のSrpA、SrpBおよびSrpCタンパク質に対して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも55％の相同性を示す。事実、基質として芳香族酸を使用することができる公知の溶媒排出ポンプの任意の機能的等価物が、本発明の方法において適当に使用される。
【００１６】
キーブーム(Kieboom)らによる論文は、細菌の溶媒耐性に関する。それは、（外因性）毒性分子、例えば細菌により炭素源として使用される毒性炭化水素基質または、細菌に疎水性基質を与えるために精製化学製品の微生物生産において有利に使用される毒性非極性溶媒（例えばトルエン）に対する耐性を仲介することにおいて、プロトン依存性の排出系に関連するタンパク質、例えばP. プチダ(Putida)のSrpABC遺伝子によってエンコードされるタンパク質の役割について論じる。デ  ボン(De Bont)ら（Trends in Biotechnology、1998年、第16巻、493-499頁）はまた、精製化学製品の微生物生産で出くわす毒性の問題に関する。詳細には、発酵中水性相から毒性生成物を抽出するために有機溶媒の使用を可能にする溶媒耐性菌の使用について記載する。ラモス(Ramos)ら（J. of Bacteriology、第180巻、3323頁）はまた、溶媒耐性菌に関する。P. プチダ(Putida)菌株DOT-T1Eにおけるトルエンおよびオクタノール耐性ならびに、トルエン感受性でオクタノール耐性の変異体の生成および特性決定について記載する。変異は、mexB遺伝子に相同の遺伝子において見出され、この遺伝子は、RND-タイプの排出ポンプ系統に属する。かくして従来技術は、本発明に開示されたような再生可能な炭素源から芳香族酸を微生物生産するための方法を開示または示唆しない。彼らは、排出ポンプが、非再生可能な（すなわち化石）炭素源から化学的に合成された、外因的に加えられた毒性分子（基質、基質溶媒または生成物溶媒）の輸出のために有用であることを単に教示するにすぎない。それに比べて、排出ポンプにより輸出されるべき、本発明の宿主細胞によって生産された芳香族酸は、外因的に加えられた毒性分子ではない。むしろ、それらは典型的には、宿主細胞自体により生産される天然に生じる分子である。本発明は驚くべきことに、排出ポンプがまた、再生可能な炭素源から内因的に生産される芳香族酸を輸出するために適当に使用されることを示す。実施例において証明されるように、芳香族酸の輸出は、芳香族酸の生産を有意に増加させる。
【００１７】
好ましい実施態様においては、本発明の方法は、芳香族酸の生産のために宿主細胞として、シュードモナス(Pseudomonas)種、好ましくはシュードモナス  プチダ(Pseudomonas putida)、より好ましくはP. プチダ(putida)菌株S12を使用する。
【００１８】
１つの実施態様においては、発酵可能な炭素基質を、その後芳香族酸のCA、PHCAおよびPHBへと転化される芳香族アミノ酸（フェニルアラニンまたはチロシン）に転化することができる宿主細胞を使用する、CA、PHCAおよびPHBの微生物生産のための方法が提供される。生産されると、これらの芳香族酸は、排出ポンプによって、好ましくは排出ポンプのプロトン依存性耐性／小結節形成／細胞分割(RND)系統の一員によって、より好ましくはsrpABCによって宿主細胞から外へ活発に輸送される。
【００１９】
本発明において芳香族酸の前駆体として役立つフェニルアラニンおよびチロシンは、微生物において天然に存在する。しかしながら、芳香族酸の最適合成のためには、宿主細胞は好ましくは、基質濃度が宿主細胞による芳香族酸の生産を制限しないように、１種以上の芳香族酸前駆体（例えば芳香族アミノ酸）を過剰生産する。微生物における芳香族アミノ酸合成を増加させる方法は従来公知である。１つの実施態様においては、宿主細胞は、芳香族アミノ酸の毒性の類似体に対する耐性を増加するために選択される。例えば、フェニルアラニンまたはチロシンの毒性の（m-フルオロ-）類似体に対する耐性のために、変異体微生物を選択することができる。これらの感受性でない変異体はしばしば、高濃度のフェニルアラニンおよびチロシンを生産する（英国特許第1,071,935号；米国特許明細書第3,709,785号）。
【００２０】
フェニルアラニンおよび／またはチロシンの生合成において１種以上の鍵となる遺伝子の過剰発現によってフェニルアラニンおよびチロシン生産が増加された組み換え宿主細胞を得ることがまた可能である（イケダ(Ikeda)、2003年、アミノ酸生産法(Amino acid production processes.) P.1-35、T.スケパー(Scheper)（編）、アドバンシズ  イン  バイオケミカル  エンジニアリング／バイオテクノロジー(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology)、第79巻、スプリンガー-フェルラーグ(Springer-Verlag)、ベルリン(Berlin)ハイデルベルグ(Heidelberg)）。
【００２１】
m-フルオロ-フェニルアラニンに対する耐性が増加された組み換え微生物は、CA、PHCAおよびPHBの微生物生産のための方法において宿主細胞として有利に使用される。フェニルアラニンは、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL；EC 4.3.1.5）の作用によって、酵素的にCAへと転化される。したがって、本発明の宿主細胞は好ましくは、排出ポンプのほかに、少なくとも１種の、PAL活性をエンコードする遺伝子を含む。「PAL活性」という語は、フェニルアラニンのCAへの転化を触媒するタンパク質の能力をいう。
【００２２】
植物において、CAはその後、シンナメート-4-ヒドロキシラーゼ(C4H)、シトクロームP450-依存性モノオキシゲナーゼ（P450）により、PHCAへと転化される。かくして、PHCAへの１つの可能な経路が、フェニルアラニンからフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL)によることが明らかである。しかしながら、この経路はまた、第２の酵素、シンナメート-4-ヒドロキシラーゼ(C4H)の存在を必要とし、この酵素は、ほとんどの微生物においてまれである。入手可能な情報は、いくつかの植物および微生物からのPALは、フェニルアラニンをシンナメートに転化するその能力の他に、基質としてチロシンを受け入れることができることを示す。そのような反応において、酵素活性は、チロシンアンモニアリアーゼ(TAL)と呼ばれる。TALによるチロシンの転化は、シンナメートの仲介なしにチロシンからPHCAの直接形成を生じる。
【００２３】
したがって、本発明の１つの実施態様においては、PAL活性およびTAL活性の両方を含むタンパク質をいう「PAL/TAL活性」を含む、CAおよびPHCAを生産することができる宿主細胞が使用される。そのようなタンパク質は、酵素基質としてチロシンおよびフェニルアラニンの両方に対する少なくともいくらかの特異性を有する。
【００２４】
しかしながら、すべての天然のPAL/TAL酵素は、その基質としてチロシンよりむしろフェニルアラニンを使用するのを好む。TAL活性の水準は常にPAL活性より低いが、この差の大きさは、広範囲にわたって変化する。この規則の例外は、ロドトルラ(Rhodotorula)種およびロドスポリウム  トルロイデス(Rhodosporium toruloides)からのPAL/TAL酵素であり（米国特許明細書第4,636,466号；ハンソン(Hanson)およびハビル(Havir)、植物の生化学(The Biochemistry of Plants)；アカデミック(Academic)：ニューヨーク、1981年；第7巻、577-625頁）、ここでは、TAL触媒活性対PAL触媒活性の比は約0.58である。その理由のために、宿主細胞は好ましくは、ロドトルラ(Rhodotorula)種またはロドスポリウム  トルロイデス(Rhodosporium toruloides)からのPAL/TAL遺伝子を備える。あるいは、宿主細胞は、野生型PAL酵素から誘導されたものであるが、TAL活性がPAL活性より大きいように遺伝子的に工作されたタンパク質をいう「変性されたPAL/TAL」活性を含む。それ自体、変性されたPAL/TALタンパク質は、フェニルアラニンよりチロシンに対して大きい基質特異性を有する。変性されたPAL/TALタンパク質を得るという方向性は、国際特許出願公開公報WO 02/090,523号に見出すことができる。
【００２５】
CAとは違って、PHCAは、シュードモナス (Pseudomonad)において内因性酵素の作用によって完全に分解され得る。この分解経路は、中間体としてPHBを経て進む（ジメネズ(Jimenez)ら、2002年、Environ. Microbiol. 4:824-841）。本発明は、もはやPHCAまたはPHBを分解することができない変異体が得られる方法を提供する。
【００２６】
かくして、もはやPHCAまたはPHBを分解することができない、シュードモナス (Pseudomonas)のm-フルオロ-フェニルアラニン耐性の変異体においてTAL活性を導入することによって、両方の芳香族酸の効率的な生産が得られる。
【００２７】
１つの実施態様においては、該宿主細胞において生産されない芳香族酸を生産するように、１つ以上の外来酵素活性を有する宿主細胞が、遺伝子的に工作される。１つの実施態様においては、宿主細胞Aは、生物体Cからの酵素Bを備えて、芳香族酸Dを生産することができる排出ポンプを含む宿主細胞を得る。桂皮酸およびPHCAの次に、ベンゾエートおよびPHBがまた、宿主細胞において生産することができる芳香族酸であり得る。
【００２８】
組み換え核酸を有する細胞を提供するための従来公知の方法を用いて、組み換え宿主細胞を得ることができる。これらは、操作的にプロモーター配列に結合されて発現させる、関心のある核酸構築物を含む適当なプラスミド（またベクターと称する）を用いた、宿主細胞の形質転換、トランス接合(transconjugation)、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを包含する。典型的には、プラスミドはまた、選択的な剤例えば抗生物質への耐性を有する宿主細胞を与える選択マーカーを含む。選択的な剤の存在下で、すなわち選択圧下で宿主細胞を培養することは、プラスミドが宿主細胞により維持されることを保証する。
【００２９】
かくして本発明は、芳香族酸を過剰生産する宿主を提供する方法であって、適当なプラスミドの導入および／または宿主細胞の母集団を無作為の突然変異誘発に供することによって、PAL/TAL活性を導入し、その後、m-フルオロ-フェニルアラニン耐性を増加するために宿主細胞を選択し、該耐性宿主細胞を最適化された芳香族酸生産についてスクリーニングし、かつ無作為の突然変異誘発に供されていない親宿主に比べて該芳香族酸を過剰生産する少なくとも1種の変異された宿主を選択することを含む方法を提供する。
【００３０】
しかしながら、選択的な剤は一般に高価である。大規模微生物生産系においては特に、可能なもっとも安価な条件下で、すなわち選択圧を用いずに培養するのが好ましい。その他に、宿主細胞は、選択的な剤に対する耐性を失わずに、染色体外プラスミドを失うことがあり得る。したがって、本発明の方法において使用するための宿主細胞は好ましくは、選択圧下での培養をあてにせず、遺伝子的に安定な組み換え宿主細胞を生じる手順を用いて、遺伝子的に変性される。１つの実施態様においては、宿主細胞は、挿入的突然変異誘発を用いて、関心のある核酸、例えば芳香族酸合成に関連する酵素、例えばPALをエンコードする遺伝子を備える。ここで、分離された核酸は、宿主細胞のゲノム中へ挿入される。挿入は、部位指向または無作為であり得る。好ましい実施態様においては、本発明は、芳香族酸を（過剰）生産する宿主細胞を提供するための方法であって、挿入的突然変異誘発を含む方法を提供する。挿入的突然変異誘発は有利には、トランスポゾンまたはプラスポゾン(plasposon)を使用する。プラスポゾンは、複製の起源を有するミニ-トランスポゾンである（デニス(Dennis)およびジルストラ(Zylstra)、1998年参照）。より好ましい実施態様においては、無作為の挿入的突然変異誘発を使用して、本発明の方法において使用するための遺伝子的に変性された変異宿主細胞を提供する。例えば、それぞれが、それらのゲノムDNAに無作為に挿入されたPAL遺伝子を含むミニ-トランスポゾンを含む変異宿主細胞、好ましくはP.プチダ(putida)の集団が提供される。それぞれの変異宿主細胞において、ゲノムDNAは、トランスポゾンの組み込みの部位に変異を含む。いくつかの場合、変異は、該宿主細胞における芳香族酸の代謝に関連する遺伝要素（例えばコード領域または調節要素）の不活化に至り得る。例えば、正常に分解するか、または宿主細胞により生産される所望の芳香族酸をさらに代謝する酵素が、不活化するようになり得る。これはもちろん、生じる芳香族酸の収率の増加に寄与する。あるいは、芳香族酸の生合成への前駆体の代謝の流れが増加されるように、挿入的突然変異誘発の手順により、代謝の副経路(side-route)が不活化される。
【００３１】
かくして、１つの態様においては、本発明は、芳香族酸を過剰生産する宿主細胞を提供するための方法であって、宿主細胞の母集団を無作為の挿入的突然変異誘発に供し、該変異された宿主細胞（また「変異体」宿主細胞と称する）を最適化された芳香族酸生産についてスクリーニングし、かつ無作為の突然変異誘発に供さなかった親宿主細胞に比べて該芳香族酸を過剰生産する少なくとも１種の変異された宿主細胞を同定することを含む方法を提供する。詳細には、そのような方法は、芳香族アミノ酸の毒性の類似体に対して耐性の変異体についてスクリーニングすることによって、フェニルアラニンおよび／またはチロシンの蓄積の増加について宿主細胞を選択することを含む。
【００３２】
挿入的突然変異誘発が有用な変異体を生じた変異宿主細胞は、所望の化合物の生産水準の増加についてスクリーニングすることによって容易に同定することができる。本発明の宿主細胞は芳香族酸を培地に分泌することができるので、変異宿主細胞を増殖させるのに使用した培地の一部を、芳香族酸生産の増加の存在について容易に分析することができる。特に関心のあるのは、該芳香族酸の分解に関連する少なくとも１種の酵素が妨害されるか、または該芳香族酸の生合成の代謝の副経路が妨害される変異宿主細胞である。本発明の宿主細胞は、標準の微生物培養条件に従って、再生可能な発酵性の炭素基質を含む水性培地で培養される。「発酵性の炭素基質」という語は、宿主細胞によって代謝されることができる炭素源、特に単糖（例えばグルコース）、オリゴ糖、多糖、ポリオール（例えばグリセロール）および１炭素基質またはそれらの混合物からなる群より選択される炭素源をいう。芳香族酸の生産のために本発明の方法において好ましい炭素基質は、グルコースおよびグリセロールである。
【００３３】
従来公知の種々の培養法を使用でき、例えば連続培養、バッチ培養、半バッチ培養または流加培養法を使用できる。バイオテクノロジーの当業者は、どの培養法が最適に使用されるかを選択することができる。１つの実施態様においては、本発明の方法は、流加発酵器(fed batch fermenter)で宿主細胞を培養することを含む。流加発酵器においては、最大液体発酵器体積が達成されるか、または細胞集団が最大密度に達するまで、供給が連続的に加えられる。発酵器は次に、プロセスに依存して、続けるか、または一部もしくは全部空にされることができる。
【００３４】
さらには、本発明は、芳香族酸のための排出ポンプ、好ましくはプロトン依存性耐性／小結節形成／細胞分割(RND)系統の排出ポンプの一員、より好ましくはP.プチダ(Putida)菌株S12の溶媒耐性ポンプsrpABCを含む宿主を、芳香族酸の微生物生産のために使用することを提供する。宿主細胞は遺伝子的に変性されて、例えば芳香族酸の生合成において少なくとも１種の鍵となる酵素の過剰発現によって、芳香族酸を（過剰）生産することができる。
【００３５】
好ましい実施態様においては、使用される宿主細胞は、シュードモナス(Pseudomonas)種、好ましくはP. プチダ(putida)、より好ましくはP. プチダ(putida)菌株S12である。別の好ましい実施態様においては、該宿主は、CA、パラ-ヒドロキシ桂皮酸(PHCA)およびPHBの生産のために使用される。
【００３６】
本発明をさらに、以下の実施例によって説明する。
実施例
【００３７】
実施例１：R.トルロイデス(toruloides)からのフェニルアラニンアンモニアリアーゼをエンコードする核酸配列の大腸菌(E. coli) -P. プチダ(putida)発現プラスミドへのクローニングならびに大腸菌(E. coli)およびP. プチダ(putida)S12への形質転換
サーキシアン(Sarkissian)ら（1999年、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 2:96）により記載されたように、pal DNAの5'-および3'-末端について設計されたオリゴヌクレオチドを使用して、フェニルアラニンアンモニアリアーゼをエンコードするDNA（pal遺伝子；GenBank受け入れ番号X51513）を、R.トルロイデス(toruloides)のmRNAから得られたcDNA集団からのPCRを用いて増幅した。palの5'-末端に相同であるオリゴヌクレオチド（オリゴ１）は、追加のKpnI制限部位を含み、3'-末端に相同なオリゴヌクレオチド（オリゴ２）は、追加のNotI制限部位を含む（表１参照）。
表１：実施例１〜４に記載されたDNAの増幅のために使用されたオリゴヌクレオチドの核酸配列
【表１】
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PCR増幅したpal遺伝子は、KpnIおよびNotIで消化され、プラスミドpTn-1へと連結され（図１）、pTn-1はまたKpnIおよびNotIで消化された。これは、DNA構築物pJWpalTnを生じ（図１）、ここでは、pal遺伝子は、誘導性の調節配列nagR/PnagAαの制御下に置かれた（ヒュスケン(Husken)ら、2001年、Appl.Microbiol. Biotechnol. 55:571-577）。以後、この配置は、nagR/PnagAα::palカセットと称される。
pJWpalTnは、標準の形質転換の手順によって、大腸菌(E. coli)およびP. プチダ(putida) S12宿主細胞へと導入された。フェニルアラニンアンモニアリアーゼを発現するように遺伝子的に工作されたP. プチダ(putida) S12は、S12palと称される。宿主細胞は、選択圧下（大腸菌(E. coli)についてはアンピシリン、およびP. プチダ(putida) S12についてはゲンタマイシン）で培養されて、宿主細胞がプラスミドを維持することを確実にした。
【００３８】
実施例２：m-フルオロフェニルアラニンに耐性のP. プチダ(putida) S12pal変異体の集団の生成ならびにCAおよびPHCAが増加した変異体についてのスクリーニング
S12palにおけるフェニルアラニンおよびチロシンの利用可能性は、CAおよびPHCAの生産を改善するために最適化された。毒性のフェニルアラニン類似体（例えばm-フルオロフェニルアラニン）は、フェニルアラニンおよび／またはチロシンを過剰生産する変異体を選択するために使用できることは、従来公知である。この取り組みを本発明において使用して、CAおよびPHCAの生産について最適化された生産株を得た。S12palは、変異誘発性の剤NTGでの処理によって変異誘発されて、20.000 m-フルオロフェニルアラニン耐性変異体のバンクを得た。
このバンク中の変異体はその後、親株S12palと比較して、CAおよびPHCAを過剰生産するその能力について試験された。CAおよびPHCAそれぞれについて相対的な尺度として、全ての変異体の培地の278nmおよび31nmの波長での光の吸収を測定した。CAまたはPHCAの生産の増加を示す異なる変異体が選択された。CAを過剰生産する変異体（S12pal1と称する）およびPHCAを過剰生産する変異体（S12pal2と称する）が、増殖中再生可能な炭素基質グルコースからのCAおよびPHCAそれぞれの生産についてより詳細に試験された（実施例４）。
【００３９】
実施例３：m-フルオロフェニルアラニン耐性のS12pal変異体のバンクからのPHB生産が増加された変異体の選択
P. プチダ(putida)は、PHCAをPHBに転化することができることが、従来確立されている。PHBはその後、これらの細菌により分解されることができる。このことは、P. プチダ(putida) S12が、唯一の炭素源としてPHBで増殖することができるという事実により、例証される。PHBの生産の増加を示すS12pal変異体について選択するために、実施例２で得られたm-フルオロフェニルアラニン耐性S12pal変異体のバンクがまず、増殖のためにPHBをもはや使用することができない変異体についてスクリーニングされた。このために、バンクの個々の変異体が、20mMのPHBを唯一の炭素源として補われた水性無機培地（ハートマンズ(Hartmans)ら、1989年、Appl. Environ. Microbil. 55:2850-2855）に移された。PHBでもはや増殖できない異なる変異体が得られた。１つのそのような変異体であるS12pal3が、グルコースからのPHBの生産について、より詳細に試験された（実施例４）。
【００４０】
実施例４：バッチ式で培養されたS12pal、S12pal1、S12pal2およびS12pal3によるCA、PHCAおよびPHBの生産
それぞれS12pal1、S12pal2およびS12pal3ならびにそれらの親S12palによるCA、PHCAおよびPHBの生産を決定するために、これらの菌株を、水性無機培地（ハートマンズ(Hartmans)ら、1989年、Appl. Environ. Microbil. 55:2850-2855）で、バッチ式で培養した。この培地は、20mMのグルコースおよび10mg/Lのゲンタマイシンを補われて、プラスミドの維持を保証した。pal遺伝子の機能的フェニルアラニンアンモニアリアーゼへの発現を誘発するために、0.1mMのサリチル酸ナトリウムがまた補われた。S12palにおけるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性の供給源についての対照として、pal遺伝子のないpTn-1プラスミドを備えたP. プチダ(putida)変異体を試験した。全ての菌株は、1mMの外因的に添加されたフェニルアラニンまたはチロシンの存在下または不在下で培養された。培地上清中のCA、PHCAおよびPHBの濃度は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて、種々の時点で決定された。その他に、細胞増殖は、種々の時点での培地中の全細胞タンパク質含量を決定することによって監視された。
加えて、種々の時点で、S12palからの細胞の入らない抽出物を、培地から調製し、これを、タンパク質含量およびフェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性について分析した。ここに、CAおよびPHCAの形成が、1mMのフェニルアラニンまたは1mMのチロシンを細胞の入らない抽出物に添加した後、種々の時点でHPLCを用いて決定された。
これらの測定の結果を使用して、CA、PHCAおよびPHB生産についての以下のパラメータを決定した（表２参照）：
-  培地または細胞の入らない抽出物中の最大濃度
-  培地または細胞の入らない抽出物中の最大特異的生産速度。
表２：フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をエンコードする遺伝子で遺伝子的に変性されたP. プチダ(putida) S12の変異体のバッチ培養物および細胞の入らない抽出物中のCA、PHCAおよびPHBの生産
【表２】
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a)  CVE、細胞の入らない抽出物；S12対照、ベクターTn-1を有するP.プチダ(putida) S12；S12pal、構築物pJWpalTnを有するP. プチダ(putida)S12；S12pal1、CA過剰生産について選択されたS12palから誘導されたm-フルオロフェニルアラニン耐性変異体；S12pal2、PHCA過剰生産について選択されたm-フルオロフェニルアラニン耐性変異体；S12pal3、PHB過剰生産について選択されたm-フルオロフェニルアラニン耐性変異体；；+fen.、添加された1mMのフェニルアラニンを有する；+tyr、添加された1mMのチロシンを有する。
b)  HPLCにより決定した、培地またはCVE中の最大濃度のCAおよびパラヒドロキシ桂皮酸。
c)  最大特異的生産速度が、培地またはCVE中の細胞タンパク質1g当たり１分当たりに蓄積したCA、PHCAまたはPHBの最大量（マイクロモル）として規定される。Nd=決定されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】DNA構築物pTn-1およびpJWpalTnの概略的説明。  使用された略語：nagＲ／PnagAα、コモモナス  テストステロニ(Comomonas testosteroni)からのナフタレン分解のための調節DNA配列；rep、複製機能についてのコード；GmR、ゲンタマイシン耐性マーカー；bla、アンピシリン耐性マーカー；Tn、転写ターミネーター；bp、塩基対。
【図１】
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【国際調査報告】
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