(57)【要約】  Ｅ１、Ｅ４欠失アデノウイルスを用いる初回免疫およびＥ１欠失アデノウイルスを用いる追加免疫を含む免疫化方式が提供される。二番目に投与されるアデノウイルスは以前に投与されたアデノウイルスと交差反応性ではない血清型のキャプシドを有する。さらに、免疫化方式を行うために必要なアデノウイルスを含む産物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｅ１およびＥ４欠失領域、および第一の産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫反応を誘導する第一の産物をコードする核酸配列を含む第一の異種発現カセットを含んでなる、第一のキャプシドを有するアデノウイルスおよび
（ｂ）第二の産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫反応を誘導する第二の産物をコードする核酸配列を含む第二の異種発現カセットを含んでなる、第一のキャプシドとは免疫学的に異なる第二のキャプシドを有するＥ１欠失アデノウイルス、
を順次投与する段階を含んでなる、免疫反応を特異的に誘導する方法。
【請求項２】
第一のおよび第二の産物が同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一のおよび第二の産物が、交差反応性である免疫反応を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第一のおよび第二の異種発現カセット中の調節配列が異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）および／または（ｂ）のアデノウイルスがＥ３領域内に欠失をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
第一のまたは第二の発現カセットが欠失されたＥ１領域内に位置する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
第一のまたは第二の発現カセットがＥ３領域内に位置する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
免疫反応が抗原特異的抗体反応である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
免疫反応が抗原特異的ＣＴＬ反応である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
第一のまたは第二のキャプシドが、Ｃ５、Ｃ７およびＣ９から成る群から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
第一のまたは第二のキャプシドが、ヒトＡｄ５またはＣ１である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡワクチンを投与することをさらに含んでなる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該ＤＮＡワクチンが、第一のキャプシドを有するアデノウイルスまたは第二のキャプシドを有するアデノウイルスの投与の前に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質に基づくワクチンを投与することをさらに含んでなる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
該タンパク質に基づく該ワクチンが、第一のキャプシドを有するアデノウイルスおよび第二のキャプシドを有するアデノウイルスの後に送達される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）Ｅ１欠失およびＥ４欠失領域の部位内で産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫反応を誘導する産物をコードする核酸配列を含む異種発現カセットを含んでな
る、第一の血清型のキャプシドを有するアデノウイルス、および
（ｂ）Ｅ１欠失の部位内で産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫反応を誘導する産物をコードする核酸配列を含む異種発現カセットを含んでなる、第一の血清型とは異なる第二の血清型のキャプシドを有するＥ１欠失アデノウイルス、
を順次投与する段階を含んでなる、免疫反応を特異的に誘導する方法。
【請求項１７】
産物のための調節配列が（ａ）および（ｂ）のアデノウイルスで異なる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）および／または（ｂ）のアデノウイルスがＥ３領域内に欠失をさらに含んでなる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｅ１およびＥ４欠失領域、および産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫反応を誘導する産物をコードする核酸配列を含む異種発現カセットを含んでなるアデノウイルスの、対象者内で免疫反応を特異的に誘導するための初回免疫−追加免疫薬剤中の初回免疫アデノウイルスとしての使用であって、該アデノウイルスが第一のキャプシドを有する、上記使用。
【請求項２０】
追加免疫アデノウイルスとしての、第一のキャプシドとは免疫学的に異なる第二のキャプシドを有するＥ１欠失アデノウイルスの使用をさらに含んでなり、該アデノウイルスが産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫反応を誘導する産物をコードする核酸配列を含む異種発現カセットを含んでなる、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
産物のための調節配列が、Ｅ１およびＥ４欠失領域を含んでなるアデノウイルスとＥ１欠失アデノウイルスとで異なる、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
Ｅ１およびＥ４欠失領域を含むアデノウイルスおよび／またはＥ１欠失アデノウイルスがＥ３領域内に欠失をさらに含んでなる、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項２３】
Ｅ１およびＥ４欠失領域を含んでなるアデノウイルスおよび／またはＥ１欠失アデノウイルスの発現カセットが、欠失されたＥ１領域内に位置する、請求項２０〜２２のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
Ｅ１およびＥ４欠失領域を含んでなるアデノウイルスおよび／またはＥ１欠失アデノウイルスの発現カセットが、欠失されたＥ３領域内に位置する、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
免疫反応が抗原特異的抗体反応である、請求項２０〜２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
免疫反応が抗原特異的ＣＴＬ反応である、請求項２０〜２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
第一のおよび第二のキャプシドが、Ｃ５、Ｃ７およびＣ９から成る群から選択される、請求項２０〜２６のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
第一のおよび第二のキャプシドが、Ａｄｈｕ５およびＣ１から成る群から選択される、請求項２０〜２７のいずれかに記載の使用。
【請求項２９】
ＤＮＡワクチンの使用をさらに含んでなる、請求項２０〜２８のいずれかに記載の使用。
【請求項３０】
タンパク質に基づくワクチンの使用をさらに含んでなる、請求項２０〜２９のいずれかに記載の使用。
【請求項３１】
対象者内に免疫反応を特異的に誘導するための初回免疫−追加免疫薬剤中の初回免疫アデノウイルスとしての、第一の血清型のキャプシドを有するアデノウイルスの使用であって、該アデノウイルスがＥ１欠失およびＥ４欠失領域の部位内で産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫反応を誘導する産物をコードする核酸配列を含んでなる異種発現カセットを含んでなる、上記使用。
【請求項３２】
追加免疫アデノウイルスとしての、第一の血清型とは異なる第二の血清型のキャプシドを有するＥ１欠失アデノウイルスの使用をさらに含んでなり、該アデノウイルスがＥ１欠失の部位内で産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫反応を誘導する産物をコードする核酸配列を含む異種発現カセットを含んでなる、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
（ａ）Ｅ１欠失および／またはＥ４欠失領域の部位内で第一の産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫反応を誘導する第一の産物をコードする核酸配列を含む第一の異種発現カセットを含んでなる、第一のキャプシドを有するアデノウイルス、
（ｂ）Ｅ１欠失の部位内で第二の産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫反応を誘導する第二の産物をコードする核酸配列を含む第二の異種発現カセットを含んでなる、第一のキャプシドとは免疫学的に異なる第二のキャプシドを有するＥ１欠失アデノウイルス、および
（ｃ）（ａ）および（ｂ）のアデノウイルスのためのコンテナー
を含んでなる、標的に対して動物を免疫化する産物。
【請求項３２】
産物に対する調節配列が（ａ）および（ｂ）のアデノウイルス内で異なる、請求項３１に記載の産物。
【請求項３３】
（ａ）および／または（ｂ）のアデノウイルスがＥ３領域内に欠失をさらに含んでなる、請求項３１または３２に記載の産物。
【請求項３４】
（ａ）および／または（ｂ）の発現カセットが欠失されたＥ１領域内に位置する、請求項３１〜３３のいずれかに記載の産物。
【請求項３５】
（ａ）および／または（ｂ）の発現カセットが欠失されたＥ３領域内に位置する、請求項３３または３４に記載の産物。
【請求項３６】
免疫反応が抗原特異的抗体反応である、請求項３１〜３５のいずれかに記載の産物。
【請求項３７】
免疫が抗原特異的ＣＴＬ反応である、請求項３１〜３６のいずれかに記載の産物。
【請求項３８】
第一のキャプシドがＣ５、Ｃ６およびＣ７から成る群から選択される、請求項３１〜３７のいずれかに記載の産物。
【請求項３９】
第二のキャプシドがＣ６８およびＣ１から成る群から選択される、請求項３１〜３８のいずれかに記載の産物。
【請求項４０】
ＤＮＡワクチンをさらに含んでなる、請求項３１〜３９のいずれかに記載の産物。
【請求項４１】
タンパク質に基づくワクチンをさらに含んでなる、請求項３１〜４０のいずれかに記載の産物。
【請求項４２】
本発明に従う産物の使用のための説明書をさらに含んでなる、請求項３１〜４１のいずれかに記載の産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
アデノウイルスは、約３６キロベース（ｋｂ）のゲノムサイズを有する二本鎖ＤＮＡウイルスであり、それは各種の標的組織内で高度に効率的な遺伝子導入を達成するその能力および大きい導入遺伝子容量のために、遺伝子導入用途に広く使用されている。都合よく、アデノウイルスのＥ１遺伝子は欠失されそして選択されたプロモーター、関係する遺伝子のｃＤＮＡ配列およびポリＡシグナルから成る導入遺伝子カセットで置換され、複製能欠損組換えウイルスをもたらす。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルスは、３種の主要なタンパク質、ヘキソン（ＩＩ）、ペントンベース（ＩＩＩ）および小塊状繊維（ｋｎｏｂｂｅｄ  ｆｉｂｒｅ）（ＩＶ）から成る正二十面体キャプシド、および多数のその他の小さいタンパク質、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＩＩａおよびＩＶａ２を有する特徴的な形態を有する（非特許文献１）。ウイルスゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）を有する５’末端に共有結合した末端タンパク質を有する線型、二本鎖ＤＮＡである。ウイルスＤＮＡは高度に塩基性のタンパク質ＶＩＩおよびミューと呼ばれる小さいペプチドと密接に会合している。別のタンパク質Ｖは、このＤＮＡタンパク質複合体と共にパッケージングされてタンパク質ＶＩを介してキャプシドへの構造的連結を提供する。このウイルスは、ウイルスでコードされるプロテアーゼも含み、それは、一部の構造タンパク質をプロセシングして成熟した感染性ウイルスを産生するために必要である。
【０００３】
組換えアデノウイルスは、宿主細胞に分子を送達して免疫反応を誘導すると記載されている。２種のチンパンジーアデノウイルス、Ｃ１およびＣ６８（Ｐａｎ９とも呼ばれる）から誘導されるアデノウイルスベクターを提供する特許文献１、および特許文献２〔Ｐａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７−誘導ベクター〕を参照されたい。
【特許文献１】米国特許第６，０８３，７１６号明細書
【特許文献２】国際特許公開番号ＷＯ０２／３３６４５号明細書
【非特許文献１】Ｗ．Ｃ．Ｒｕｓｓｅｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８１：２５７３−２６０４（２０００年１１月）
【発明の開示】
【０００４】
ワクチン分野で必要とされるのは、標的に対して強い免疫反応を誘導し同時にワクチン担体（ｃａｒｒｉｅｒ）への最小の反応を有する免疫化の方法である。
【０００５】
発明の概要
本発明の方法は、Ｅ１、Ｅ４欠失アデノウイルス、次いでＥ１欠失アデノウイルスを投与することによる哺乳動物患者への１種もしくはそれ以上の選択された異種遺伝子の送達を含む。好適には、二番目に投与されるアデノウイルスは、前に投与されたアデノウイルスとは異なるキャプシドを有する。好適には、追加免疫アデノウイルスは、初回免疫組成物を介して送達される産物と同一または交差反応性である産物を含む。
【０００６】
理論に束縛はされないが、第一のベクターはＣＴＬエピトープを含むアデノウイルスＥ４配列を欠失しているので、以後のアデノウイルス投与に対する免疫反応が調節されると考えられる。それにより、本発明の方法は、アデノウイルス担体への免疫反応の付随初回免疫がなく、アデノウイルスにより担持される産物への免疫反応の初回免疫を提供する。
【０００７】
本発明のそれらおよびその他の態様および利益は、さらに詳細に記載される。
【０００８】
発明の詳細な説明
従って、本発明は、機能性Ｅ１およびＥ４領域を欠失するアデノウイルスおよび機能性Ｅ１領域を欠失するアデノウイルスを順次投与することによる細胞性および／または体液性免疫反応を特異的に誘導する方法を提供する。それぞれのアデノウイルスは、産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫反応を誘導する産物をコードする核酸配列を含んでなる異種発現カセットを含む。初回免疫アデノウイルスおよび追加免疫アデノウイルスにより担持される産物は同一であってもよい。あるいは、初回免疫アデノウイルスおよび追加免疫アデノウイルスにより担持される産物は異なってもよいが、しかし追加免疫アデノウイルスの産物に対する免疫反応は以前のアデノウイルスの産物により初回免疫される。
【０００９】
一つの態様では、コードされる産物は、産物に初回免疫／追加免疫作用を提供するために同一であり、それは産物がそれから誘導される標的（例えば疾患を起こす病原体）、または交差反応性標的に免疫性を誘導する。一つの態様では、異種発現カセットの調節制御因子およびその他の因子は、投与されたアデノウイルスで異なる。好適には、第二の投与アデノウイルスは、第一の投与アデノウイルスのキャプシドとは免疫学的に異なるキャプシドを有する。
【００１０】
本明細書中に使用される場合に、Ｅ１領域内に機能欠損を有するアデノウイルスは、複製能欠損性でありそしてＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子産物を含みこの領域の遺伝子産物を発現できない。
【００１１】
「機能的に欠損した」または「機能欠損」の用語は、遺伝子領域が遺伝子発現の機能性産物の産生をもはやできなくなるために十分な遺伝子領域の量が、例えば変異または改変により取去あるいは損傷されることを意味する。所望の場合には、全遺伝子領域が取り去られてもよい。遺伝子破壊または欠失のために適合するその他の部位は、本出願の別の箇所で考察される。
【００１２】
本発明に従って、Ｅ４欠失を有するアデノウイルスは、Ｅ４の１個もしくはそれ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（例えばＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６およびＯＲＦ７）を機能的に欠損されている。一つの態様では、構築物が、Ｅ４  ＯＲＦのそれぞれの機能欠損を含む。別の態様では、１個もしくはそれ以上のそれらのＯＲＦの組合せが機能的に欠損され、そして好ましくは、本発明の方法内で使用されるアデノウイルス構築物内に配列が完全に存在しない。
【００１３】
一つの態様では、本発明の複合方式は、第一の血清型のキャプシドタンパク質を有する第一のアデノウイルスベクターの投与および第一の初回免疫アデノウイルスベクターとは免疫学的に異なるキャプシドタンパク質を有する少なくとも１種の追加のアデノウイルスベクターの引き続く投与を含む。
【００１４】
本明細書中で使用される場合に、キャプシドタンパク質は、第二のキャプシドタンパク質を用いる感染を防止する免疫反応（例えばクリアリング中和性抗体反応）が存在しない標的宿主細胞の十分な感染を許容するレベルで対象者に投与できるならば、他のキャプシドタンパク質と免疫学的に区別される。好適には、追加免疫アデノウイルスベクターのキャプシドタンパク質は、初回免疫アデノウイルスベクターのキャプシドタンパク質とは血清学的に相違する起源由来である。しかし、他の態様では、初回免疫（そして場合により、追加免疫）アデノウイルスベクターのキャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質の本来の抗体エピトープがマスク、改変、あるいは（例えば外因性分子の同時投与により）中和されると、血清学的相違とは無関係に送達できる。
【００１５】
例えば、サルアデノウイルスから誘導されるベクター（例えばＣ５、Ｃ７またはＣ９）は、Ａｄ５ベクターを初回免疫するために使用されてもよく、または逆もまた同様である（すなわち、Ａｄ５初回免疫に対するＣ５、Ｃ７またはＣ９追加免疫）。別の態様では、チンパンジーアデノウイルス血清型Ｃ１から誘導されたベクターは、サルＣ５、Ｃ７またはＣ９ベクターにより送達された初回免疫を追加免疫でき、逆もまた同様である（すなわちＣ１初回免疫にＣ５、Ｃ７またはＣ９追加免疫が続く）。さらにその他の初回免疫追加免疫組合せは、当該技術分野の熟練者には直ちに分かるであろう。
【００１６】
理論により束縛されることを望まないが、本発明者らは、アデノウイルスベクターの初回免疫投与からのアデノウイルス初期遺伝子の除去に続く第二のアデノウイルスベクターの追加免疫投与が、ベクターへの免疫反応を低下または排除を支援することを発見した。好適には、初回免疫段階で送達されるベクターは、アデノウイルスＥ４  ＯＲＦ産物を発現する能力を欠損する。別の態様では、初回免疫ベクターは、アデノウイルスＥ１ａ産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物、およびＥ２ｂ遺伝子産物を発現する能力をさらに欠損する。現在、Ｅ３の排除は、発現カセットの挿入を許容するために望ましい。しかし、Ｅ３はアデノウイルスへの宿主免疫反応の調節に関与すると考えられており、従って、保持されてもよい。一つの態様では、Ｅ３遺伝子産物は異種プロモーターの制御下で発現されて、Ｅ１発現を必要とする本来のＥ３プロモーターのダウンレギュレーションを回避する。
【００１７】
１．アデノウイルスベクター
Ａ．血清型
好適には、本発明のそれらのアデノウイルスベクターは、選択されたアデノウイルスゲノムから誘導される１個もしくはそれ以上のアデノウイルス因子を含む、一つの態様では、該ベクターは一つの選択された血清型からのアデノウイルスＩＴＲおよび同じアデノウイルス血清型からの追加のアデノウイルス配列を含む。別の態様では、ベクターはＩＴＲを提供するものとは異なるアデノウイルス血清型から誘導されるアデノウイルス配列を含む、本明細書中に定義するように、擬似型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）アデノウイルスとは、アデノウイルスのキャプシドタンパク質がＩＴＲを提供する血清型とは異なる血清型であるアデノウイルスを指す。
【００１８】
ＩＴＲの血清型およびベクター内に存在するいずれかの他のアデノウイルス配列の血清型の選択は、本発明の限定ではない。種々のアデノウイルス株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手できるかまたは各種の商業的および公的機関起源から要求に応じて入手できる。さらに、多数のかかる株の配列は、例えばＰｕｂＭｅｄＴＭおよびＧｅｎＢａｎｋＴＭを含む各種のデータベースから入手できる。他のサルまたはヒトアデノウイルスから調製された相同アデノウイルスベクターは、公開された文献中に記載されている〔例えば米国特許第５，２４０，８４６号明細書参照〕。アデノウイルス配列は、いずれかの公知のアデノウイルス血清型、例えば血清型Ｃ、Ｄ、１〜４０、そして殊には２、３、４、５、７、１２および４０から得られてもよく、そしてやがて同定されるであろうヒト型のいずれもさらに含む。多数のアデノウイルス型のＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋＴＭデータベースから入手でき、それにはＡｄ５〔ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７３２６０〕が含まれる。同様にヒト以外の動物（例えばサル）を感染するとして知られるアデノウイルスが本発明のベクター構築物内に使用されてもよい。例えば本明細書中に同定される配列参照、例えば米国特許第６，０８３，７１６号明細書参照。
【００１９】
一つの態様では、本発明中に使用される少なくとも１種のアデノウイルスは、ヒト以外
の霊長類から誘導される。適合するヒト以外の霊長類の配列の例は、サルアデノウイルス、例えばＰａｎ５（またＣ５）、Ｐａｎ６（またＣ６）、Ｐａｎ７（またＣ７）、ＳＶ１、ＳＶ２５、ＳＶ３９〔国際特許出願公開番号ＷＯ０２／３３６４５号明細書参照、引用して編入される〕、Ｐａｎ９（またＣ６８）およびＣ１〔米国特許第６，０８３，７１６号明細書、引用して編入される〕、およびＳＡ１８〔米国特許出願番号１０／４６５，３０２号明細書およびその対応国際特許ＷＯ２００５／００１１０３号明細書、引用して編入される〕を含む。
【００２０】
本発明の方法内で有用であろう他のアデノウイルス血清型の例は、例えば血清型３４〔国際特許ＷＯ２００４／４０９７０１６号明細書〕、血清型２４〔国際特許ＷＯ２００４／０８３４１８号明細書〕、および血清型３５〔欧州特許第１０５４０６４号明細書〕を含む。
【００２１】
本発明は、擬似型アデノウイルス、キメラおよびハイブリッドアデノウイルスベクターをさらに包含する。例えば米国特許出願番号１０／４６５，３０２号明細書およびその対応国際特許ＷＯ２００５／００１１０３号明細書（本明細書に編入される）参照。また米国特許（ＵＳ）２００５／０３２０４５号明細書、国際特許ＷＯ２００４／１０８７５５号明細書、米国特許出願番号（ＵＳ）２００４／０８１６３７号明細書参照。
【００２２】
改変されたキャプシドを有するサルアデノウイルスは、初回免疫または追加免疫として使用できる。一つの態様では、アデノウイルスへの改変は、免疫学的および／または血清学的に親キャプシドとは異なる血清型を与える。従って、かかる改変キャプシドは、親キャプシドを用いる方式（ｒｅｇｉｍｅｎ）内または他のアデノウイルス型を用いる方式内に使用できる。他の態様では、アデノウイルスへの改変は、他の利益、例えば免疫反応の誘導の増加または特定細胞型の標的化を与える。アデノウイルスを改変する方法は、記載されている。例えば、ＴＰ  Ｃｒｉｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（７）：２９５３−６０（２００１年４月）（ファイバー小塊（ｆｉｂｒｅ  ｋｎｏｂ）改変）；ＳＣ  Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（６）：４７８２−９０（改変繊維タンパク質）；Ｃ．Ｖｏｌｐｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（３）：２０９３−１０４（２００３年２月）；Ｓ．Ｗｏｒｇａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８（５）：２５７２−８０（２００４年３月）（改変キャプシドが樹状細胞感染および導入遺伝子特異的細胞免疫反応を促進する）；Ｍ．Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｙｎｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．９６（２）：３４１−８（２００５年２月）参照。
【００２３】
しかし、本発明はキャプシド血清型の選択またはベクター内に存在する他のアデノウイルス因子の起源に限定はされない。
【００２４】
Ｂ．アデノウイルス因子
本発明中に使用されるアデノウイルス粒子またはベクターは、宿主内に発現されるべき産物を担持する発現カセットおよび感染された宿主細胞への発現カセットの送達を許容するために十分なウイルス因子をその中にパッケージングされたアデノウイルスタンパク質キャプシドから成る。望ましくは、それらのアデノウイルスベクターは、複製能欠損性であり、それにより宿主細胞内での複製を回避する。
【００２５】
一つの態様では、それらのアデノウイルス粒子は、５’アデノウイルスシス因子および３’アデノウイルスシス因子をアデノウイルスゲノムのそれぞれ５’最末端および３’最末端に含む。アデノウイルスゲノムの５’末端はパッケージングおよび複製のために必要な５’シス因子を含む；すなわち、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（複製の原点として機能する）および５’パッケージングエンハンサードメイン（Ｅ１プロモーターのための線型Ａｄゲノムおよびエンハンサー因子をパッケージングするために必要な配列を含む）を含む。アデノウイルスゲノムの３’末端は、パッケージングおよびキャプシド化のために必要な３’シス因子（ＩＴＲを含む）を含む。
【００２６】
本発明内で使用されるアデノウイルスベクターは、追加のアデノウイルス配列を含んでもよく、または１個もしくはそれ以上のアデノウイルス遺伝子領域内で少なくとも機能的に欠損されてもよい。一つの態様では、本発明に使用されるアデノウイルスベクターは、Ｅ２領域またはその機能的部分（例えばＥ２ａおよび／またはＥ２ｂをコードする領域）、および１個もしくはそれ以上の後期遺伝子、例えばＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５を含む。いくつかの態様では、本発明に使用されるアデノウイルスベクターは、Ｅ４領域のすべてまたは一部分（例えばＥ４  ＯＲＦ６）を含んでもよい。
【００２７】
例えば、アデノウイルス遅延型（ｄｅｌａｙｅｄ）初期遺伝子Ｅ３の全体または一部分は、ウイルスベクターの一部分を形成するサルアデノウイルス配列から除去されてもよい。サルＥ３の機能は組換えウイルス粒子の機能および産生と無関係と信じられる。
【００２８】
例えば、Ｅ１欠失Ａｄベクターは、少なくともＥ４遺伝子のＯＲＦ６領域、またはさらに望ましくはこの領域の機能の重複性により、全Ｅ４領域の欠失があっても構築できる。本発明のさらに別のベクターは、遅延型初期遺伝子Ｅ２ａ内に欠失を含む。好適には、それらのベクターは後期遺伝子（すなわち、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）、およびウイルス粒子中にアデノウイルスベクターのパッケージングのために必須の他の因子を保持する。欠失は、ある目的のためには、中間遺伝子ＩＸおよびＩＶａ２内で起きてもよい。その他の欠失は、他の構造または非構造アデノウイルス遺伝子内で起きてもよい。以上に考察した欠失は、個別に、すなわち本発明内で使用するアデノウイルス配列が一個の領域内でのみ欠失を含むように使用されてもよい。あるいは、それらの生物学的活性を破壊するために有効な全遺伝子またはそれらの部分の欠失は、どのような組合せで使用されてもよい。例えば、一つの例示的ベクターでは、アデノウイルス配列は，Ｅ１遺伝子および１個もしくはそれ以上のＥ４  ＯＲＦ、またはＥ１遺伝子の欠失を有するか、Ｅ３の欠失を有しても有していなくてもよい。
【００２９】
Ｃ．ベクター因子
抗原および免疫原（すなわち産物）およびそれらをコードする配列の選択のために使用される方法、「異種発現カセット」のクローニング及び選択、およびウイルスベクター内へのその挿入は、本明細書で提供される教示を与えられた当該技術分野の熟練の範囲内である。本発明に従って、異種発現カセットは、どの本来のアデノウイルス領域内にでも位置でき、それは５’および３’アデノウイルスＩＴＲの間に位置される。一つの態様では、異種発現カセットはアデノウイルスベクターの本来のＥ１領域内に位置される。別の態様では、異種発現カセットは本来のＥ３領域内に位置される。別の態様では、遺伝子産物は、アデノウイルスベクターの本来のＥ１領域から、またはアデノウイルスベクターの本来のＥ３領域から発現され、そして遺伝子産物をコードする配列と隣接していない調節制御因子に作動可能に連結されている。
【００３０】
さらに別の態様では、アデノウイルスベクターは２個以上の異種発現カセットを担持し、それらはアデノウイルスゲノム内の複数の欠失部位内に挿入できる。本発明は発現カセットが挿入される方向により限定はされず、それは発現カセットの挿入部位に近接（ｆｌａｎｋ）するアデノウイルスゲノムの正常のリーディングフレームに関して５’−３’、または３’−５’であってもよい。
【００３１】
１．核酸配列
発現カセットは配列に近接するベクター配列とは異種の核酸配列を含み、それは関係するペプチド、タンパク質、またはその他の産物をコードする。好適には、この産物は免疫原または抗原である。配列をコードする核酸は、宿主細胞内で産物の転写、翻訳、および／または発現を許容する様式で調節成分に作動可能に連結される。適合する核酸配列およ
び産物は、当該技術分野の熟練者により容易に選択されるであろう。それらの因子の選択は本発明の限定ではない。場合により、本明細書中に記載の配列をコードする核酸のいずれも、タグまたはその他の標識を伴って供給でき、それは宿主細胞内へのベクターの感染に続く配列（またはコードされた産物）の欠失を可能とする。適合するタグは当該技術分野の熟練者に公知でありそして本発明の限定ではない。
【００３２】
２．調節因子
発現カセットのために上記に同定された主要因子に加えて、ベクターは、本発明中に使用されるウイルスで感染された細胞内の産物の転写、翻訳、および／または発現を許容する様式で産物をコードする配列に作動可能に連結されている通常の制御因子も含む。本明細書中に使用される場合に、「作動可能に連結」された配列は、関係する産物（例えば遺伝子）と隣接している発現制御配列および産物の発現を制御するためにトランスまたはある距離をもって作用する発現制御配列の双方を含む。
【００３３】
発現制御配列は、適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；効果的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増進する配列（すなわちコザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列）；タンパク質安定性を増進する配列；および所望の場合には、コードする産物の分泌を増進する配列を含む。本来的、構成的、誘導可能および／または組織特異的であるプロモーターを含む、多数の発現制御配列が当該技術分野では公知でありそして利用してもよい。
【００３４】
構成的プロモーターの例は、限定ではないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを伴う）〔例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）参照〕、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター〔Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ〕を含む。
【００３５】
別の態様では、遺伝子の本来のプロモーターが使用される。本来のプロモーターは、産物の発現が本来の発現を擬似しなければならない場合に好ましいであろう。本来のプロモーターは、産物の発現が一時的もしくは発生的に、または組織特異的の様式、または特異的転写刺激への応答として調節されなければならない場合に使用されてもよい。さらなる態様では、その他の本来の発現制御因子、例えばエンハンサー因子、ポリアデニル化部位またはコザック・コンセンサス配列も本来の発現を擬似するために使用されてもよい。
【００３６】
発現カセットの別の態様は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結された産物をコードする核酸配列を含む。例えば、骨格筋内の発現が望まれる場合には、筋肉内で活性なプロモーターを使用しなければならない。それらには、骨格性βアクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチン・キナーゼ、ならびに天然に存在するプロモーターおよび高い活性を有する合成筋肉プロモーターをコードする遺伝子からのプロモーターを含む（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，１７：２４１−２４５（１９９９）参照）。組織特異的のプロモーターの例は、なかでも、肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９（１９９６）；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：５０３−１４（１９９６）、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６（１９９７））；骨唾液タンパク質（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体鎖）、ニューロン性、例えば神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５（１９９３））、神経フィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５（１９９１））、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４（１９９５））に対して知られている。
場合により、免疫原性産物をコードする配列を担持するベクターは、当該技術分野の熟練者が各種タンパク質の発現を検出できるようにするためのタグまたは標識が含まれてもよい。それらのエピトープタグの付加は、ある場合にはそれぞれの個別のタンパク質に特異的抗血清を生成する必要性を取り除く。
【００３７】
それらのベクターは、当該技術分野の熟練者に公知の技術と同時に、本明細書中に提供される技術および配列を用いて生成される。かかる技術には、従来のｃＤＮＡのクローニング技術、例えば教科書〔Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ〕に記載のもの、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列をもたらすいずれかの適当な方法の使用を含む。
【００３８】
上記のように、一つの態様では本発明の免疫化方式は異なるアデノウイルスベクターを介する同じ免疫原生産物の順次送達を含むけれども、いずれかの与えられた方式内のベクター内に使用される発現カセットも同一である必要はない。実際に、発現カセットは、異なる免疫原性産物および／またはベクター因子に対する調節配列を含むことができる。従って、それらの調節およびベクター因子の選択は、選択された対照者に対する免疫化方式の接触範囲内であっても本発明の制限ではない。
【００３９】
Ｄ．アデノウイルス粒子の産生
アデノウイルス粒子の種々の産生方法は当該技術分野の熟練者に公知である。適切な産生方法の選択は、本発明の制限ではない。例えば、米国特許第６，０８３，７１６号明細書、国際特許公開番号ＷＯ０２／３３６４５号明細書；および米国特許出願番号１０／４６５，３０２号明細書（それらは引用することにより編入される）参照。要約すると、必須のいずれかのアデノウイルス遺伝子産物（例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４  ＯＲＦ６）を発現する能力を欠失するアデノウイルスベクターは、アデノウイルス粒子のウイルス感染性および繁殖性のために要求される欠損アデノウイルス遺伝子産物の存在下で培養できる。それらのヘルパー機能は、１種もしくはそれ以上のヘルパー構築物（例えばプラスミドもしくはウイルス）またはパッケージング宿主細胞の存在下でアデノウイルスウイルスを培養して提供されてもよい。例えば、１９９６年５月９日付で公開された国際特許公開番号ＷＯ９６／１３５９７号明細書（引用することにより編入される）中の「最小」ヒトＡｄベクターの調製に関して記載された技術参照。
【００４０】
アデノウイルスベクターが、最小のＡｄ配列のみ、またはＥ１および／またはＥ３領域内で機能欠損のみを有する全Ａｄゲノムを含むかどうかに関係なく、一つの態様では、組換えウイルスはサルアデノウイルスから誘導されたキャプシドを含む。或いは、別の態様では、組換え擬似型アデノウイルスが本発明の方法に使用されてもよい。かかる擬似型アデノウイルスは、その中で他の血清型からの核酸分子担持アデノウイルス配列がパッケージングされているアデノウイルスキャプシドタンパク質を利用する。本発明内で有用なそれらのアデノウイルスベクターは、当該技術分野の熟練者に公知の方法を用いて産生され
てもよい。
【００４１】
１．ヘルパーウイルス
従って、発現カセットを担持するために使用されるウイルスベクターのアデノウイルス遺伝子含有量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非反復ウイルスフラグメントが、発現カセットを含む感染性組換えウイルス粒子を産生するために必要な十分なアデノウイルス遺伝子配列をもたらすために必要であろう。有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルス構築物中に存在しないおよび／またはベクターがその中でトランスフェクションされるパッケージング細胞株により発現しない選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含む。一つの態様では、ヘルパーウイルスは複製欠損性でありそして上記の配列に加えて種々のアデノウイルスウイルス遺伝子を含む。かかるヘルパーウイルスは、Ｅ１発現細胞株と組み合わせて使用されることが望ましい。
【００４２】
ヘルパーウイルスは、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６４：１６９８５−１６９８７（１９８９）；Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９９：４９（１９９４年４月１日）に記載のようなポリカチオン接合体内に形成されてもよい。ヘルパーウイルスは、場合により第二のレポーター発現カセットを含んでもよい。多数のかかるレポーター遺伝子が当該技術分野では公知である。アデノウイルスベクター上の遺伝子産物とは異なるヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在は、Ａｄベクターおよびヘルパーウイルスの両者を独立して監視することを可能とする。この第二のリポーターは精製後にもたらされる組換えウイルスとヘルパーウイルスの間の分離を可能とするために使用される。
【００４３】
２．相補性細胞株
上記のいずれかの遺伝子を欠失された組換えアデノウイルス（Ａｄ）を生成するために、ウイルスの複製および感染性に必須の場合には、欠失された遺伝子領域の機能は、ヘルパーウイルスまたは細胞株、すなわち相補性またはパッケージング細胞株により組換えウイルスへ供給されなければならない。多くの場合に、ヒトＥ１を発現する細胞株は、チンパンジーＡｄベクターをトランスコンプリメント（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）するために使用できる。これは、本発明のチンパンジーＡｄ配列と現在利用できるパッケージング細胞内に見られるヒトＡｄＥ１配列との間の差異に起因し、現在のヒトＥ１含有細胞の使用が複製および産生プロセスの間の複製適格アデノウイルスの生成を防止するために、これは特に有利である。しかし、ある場合には、Ｅ１欠失サルアデノウイルスの産生のためにＥ１遺伝子産物を発現する細胞株が使用できることが望ましいであろう。かかる細胞株は記載されている。例えば米国特許第６，０８３，７１６号明細書参照。
【００４４】
所望の場合には、選択された親細胞株内での発現のためのプロモーターの転写的制御下で少なくともアデノウイルスＥ１遺伝子を発現するパッケージング細胞または細胞株を生成するために本明細書中で提供される配列を使用してもよい。誘導可能または構成的プロモーターがこの目的のために使用されてもよい。かかるプロモーターの例は、本明細書の別の箇所に詳細に記載されている。いずれかの所望のＡｄ遺伝子を発現する新規の細胞株の生成のために親細胞が選択される。限定ではなく、かかる親細胞株は、なかでもＨｅＬａ〔ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ２〕、Ａ５４９〔ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ１８５〕、ＨＥＫ２９３、ＫＢ〔ＣＣＬ１７〕、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）〔例えばデトロイト５１０、ＣＣＬ７２〕およびＷＩ−３８〔ＣＣＬ７５〕細胞から誘導されてもよい。それらの細胞株は、すべてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９）から入手できる。その他の適合する親細胞株は他の起源から入手されてもよい。
【００４５】
かかるＥ１発現細胞株は、組換えアデノウイルスＥ１欠失ベクターの生成に有用である。追加的、または改変的に、本発明は、１種もしくはそれ以上のサルアデノウイルス遺伝子産物、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、および／またはＥ４  ＯＲＦ６を発現する細胞株を提供し、それらは組換えサルウイルスベクターの生成に使用されるものと本質的に同様の手順を用いて構築できる。かかる細胞株は、それらの産物をコードする必須遺伝子中で欠失されたトランスコンプリメントアデノウイルスベクターに利用できる。本発明による宿主細胞の調製は、選択されたＤＮＡ配列のアセンブリーのような技術を含む。このアセンブリーは、直接クローニング技術〔Ｇ．Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００３年１０月；１０（２２）：１９２６−１９３０；米国特許公開番号２００３−００９２１６１−Ａ号明細書、２００３年５月１５日付国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１２４０５号明細書〕により達成されてもよい。その他の適合する技術は、ｃＤＮＡおよびゲノムクローニングを含み、それらは周知でありそして上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．中に記載のｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、合成方法、およびいずれかの所定のヌクレオチド配列をもたらすその他の適合する方法と組合せたアデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチドの使用を含む。
【００４６】
さらに別の代替方法では、必須アデノウイルス遺伝子産物は、アデノウイルスベクターおよび／またはヘルパーウイルスによりトランス的にもたらされる。かかる場合に、適合する宿主細胞は、原核（例えば細菌）細胞および昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を含む真核細胞を含むいずれかの生物学的生物体から選択できる。特に望ましい宿主細胞は、いずれかの哺乳動物種から選択され、それには、限定ではないが、例えばＡ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＨＥＫ２９３細胞またはＰＥＲＣ６（これら双方は機能性アデノウイルスＥ１を発現する）〔Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，９：１９０９−１９１７〕、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０，ＨｅｐＧ２およびヒト、サル、マウス、ラット、ラビット、およびハムスターを含む哺乳動物から誘導した初期繊維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞が含まれる。細胞を提供する哺乳動物種の選択も、哺乳動物細胞の型、すなわち繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞なども本発明を限定はしない。
【００４７】
３．ウイルス粒子のアセンブリーおよび細胞株のトランスフェクション
一般に、トランスフェクションにより発現カセットを含んでなるベクターを送達する場合に、ベクターは、約１ｘ１０４細胞〜約１ｘ１０１３細胞そして好ましくは約１０５細胞に対して約５μｇ〜約１００μｇＤＮＡ、そして好ましくは約１０〜約５０μｇＤＮＡの量で送達される。しかし、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択されたベクター、送達方法および選択された宿主細胞などの要因を考慮に入れて調整されてもよい。
【００４８】
ベクターは、裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、ウイルスなどを含み、当該技術分野で公知または上記に開示のいずれのベクターでもよい。ベクターの宿主細胞内への導入は、トランスフェクションおよび感染を含み、当該技術分野で公知または上記に開示のいずれかの手段により達成されてもよい。１個もしくはそれ以上のアデノウイルス遺伝子は、宿主細胞のゲノム内に安定に組み込まれるか、エピソームとして安定に発現されるか、または一時的に発現されてもよい。遺伝子産物は、一時的、エピソーム上もしくは安定に組込まれてすべて発現されてもよいか、または一部の遺伝子産物が安定に発現され他のものが一時的に発現されてもよい。
【００４９】
さらに、それぞれのアデノウイルス遺伝子のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導可能プロモーターまたは本来のアデノウイルスプロモーターから独立して選択されてもよい。プロモーターは、例えば生物体または細胞の特定の生理学的状態により（すなわち分化状態により、または複製もしくは静止細胞中で）または外因的に付加された因子によ
り調節されてもよい。
【００５０】
宿主細胞内への分子（プラスミドまたはウイルスとして）の導入は、熟練者に公知の技術を用いそして本明細書中で考察したようにして達成されてもよい。好ましい態様では、標準トランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ４トランスフェクションまたは電気穿孔法が使用される。
【００５１】
各種中間体プラスミド内へのアデノウイルスの選択されたＤＮＡ配列（ならびに導入遺伝子およびその他のベクター要素）のアセンブリー、および組換えウイルス粒子を産生するプラスミドおよびベクターの使用は、従来の技術を用いてすべて達成される。かかる技術は、記述されたように〔Ｇ．Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００３年１０月；１０（２２）：１９２６−１９３０；米国特許公開番号２００３−００９２１６１−Ａ号明細書、２００３年５月１５日；国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１２４０５号明細書〕直接クローニングを含む。あるいは、例えば教科書〔Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ、上記に引用〕のようなｃＤＮＡのクローニング技術、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の利用、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列をもたらすいずれかの適合する方法がある。標準トランスフェクションおよび同時トランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ４沈降技術が利用される。使用されるその他の従来の方法には、ウイルスゲノムの相同組換え、アガーオーバーレイ内のウイルスのプラーク形成、シグナル生成を測定する方法などが含まれる。
【００５２】
例えば、所望の発現カセットを含むウイルスベクターの構築およびアセンブリーに続いて、ベクターをヘルパーウイルスの存在下でパッケージング細胞株中へ実験室内でトランスフェクションする。相同組換えがヘルパーとベクター配列との間で起き、それはベクター内でのアデノウイルス導入遺伝子配列の複製およびビリオンキャプシド内へのパッケージングを許容して組換えウイルスベクター粒子をもたらす。かかるウイルス粒子を産生する現在の方法は、トランスフェクションに基づくものである。しかし、本発明はかかる方法に限定はされない。
【００５３】
得られた組換えアデノウイルスは、選択された細胞への選択された導入遺伝子の導入のために有用である。
【００５４】
ＩＩ．免疫化のためのウイルスベクターの配合
本発明に従って、組換えベクターは、生体外または生体内投与の後に哺乳動物対象者（例えばヒト、サル、サル以外の獣医的患者）内に免疫反応を誘導するための本発明の免疫化方式に使用される。一つの態様では、免疫反応はウイルスベクターにより発現される産物に対する体液性（すなわち抗体）反応である。発現される抗原産物に応じて、かかる抗体反応は、抗原が誘導またはその他の関連する病原体と交差反応される病原体に対して特異的であり得る。別の態様では、免疫反応は細胞性（例えばＣＴＬ）反応であることができる。発現される免疫原性産物に応じて、かかるＣＴＬ反応は、誘導または他の関連する病原体と交差反応する抗原に特異的であり得る。さらに別の態様では、抗体およびＣＴＬ反応の双方が誘導されてもよい。しかし、本発明の方法は、それが、ウイルスベクターそして特にはアデノウイルスベクターへの免疫反応を最小化、そして一部の場合には排除するという利点を有する。
【００５５】
従って、本発明の免疫化方式は、予防的もしくは治療的の双方のワクチンに適用できる。かかるワクチン性（またはその他の免疫原性）組成物は、上記のような適合する送達ベヒクル内に配合される。一般に、免疫原性組成物の投与量は、治療用組成物に対して上記に定義した範囲内である。選択された遺伝子の免疫性のレベルは、もし使用する場合にはブースターの必要性を決定するために測定できる。血清中の抗体力価の評価の後に、最適ブースター免疫化が望まれるであろう。
【００５６】
場合により、本発明の組成物は、本明細書中に記載のウイルスベクターならびに例えばアジュバント、安定剤、ｐＨ調整剤、保存剤などを含む別の成分を含んで配合されてもよい。適合する例示的な保存剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールを含む。
【００５７】
適合する化学安定化剤は、ゼラチンおよびアルブミンを含む、適合する例示的なアジュバントは、なかでも免疫刺激性複合物（ＩＳＯＣＯＭＳ）、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）を含むＬＰＳ類似体、鉱油および水、水酸化アルミニウム、アンフィゲン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）、アビリジン（Ａｖｉｒｄｉｎｅ）、Ｌ１２１／スクアレン、ムラミルペプチド類、およびサポニン、例えばクイル（Ｑｕｉｌ）Ａ、およびいずれかの生物学的活性因子、例えばサイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、リガンド、およびそれらの最適な組合せを含む。それらの生物学的に活性な因子の一部は、生体内、例えばプラスミドまたはウイルスベクターを介して発現できる。例えば、かかるアジュバントは、初回免疫アデノウイルスベクターと一緒に投与できる。
【００５８】
本発明中に使用されるウイルスベクターは、「免疫原性量」、すなわち、所望の細胞をトランスフェクションするための投与経路で効果的でありそして免疫反応を誘導するために十分なレベルの選択された遺伝子の発現もたらすウイルスの量で投与される。防御的免疫がもたらされる場合に、ウイルスは、疾患感染および／または再発を防止するために有用なワクチン組成物であると考えられる。
【００５９】
あるいはまたは追加として、本発明に使用されるベクターは選択された免疫原に対して免疫反応を誘導する製品（例えばペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質）をコードする核酸配列を含んでもよい。本明細書で提供される免疫原性方式は、ベクターにより発現される挿入異種抗原タンパク質に対する細胞溶解性Ｔ細胞および抗体を誘導することに高度に有効と期待される。
【００６０】
例えば、免疫原は各種のウイルスファミリーから選択されてもよい。それに対して免疫反応が望ましいウイルスファミリーの例は、通常の風邪の原因の約５０％を占めるライノウイルス属、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、およびヒト腸内ウイルス例えばＡ型肝炎ウイルスを含むエンテロウイルス属、主としてヒト以外の動物における足および口疾患の原因となるアフトウイルス属を含むピコルナウイルス科を含む。ウイルスのピコルナウイルス科内で、標的抗原はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、およびＶＰＧを含む。その他のウイルスファミリーは、流行性胃腸炎の重要な原因であるウイルスのノーウオークグループを包含するカルシウイルス科を含む。ヒトおよびヒト以外の動物内で免疫反応を誘導する標的抗原での使用が望ましいさらに別のウイルスファミリーは、シンドビスウイルス、ロスリバー（ＲｏｓｓＲｉｖｅｒ）ウイルス、およびベネズエラ、イースタン＆ウエスタンウマ脳炎を含むアルファウイルス属および風疹ウイルスを含むルビウイルス属を含むトガウイルス科である。フラビウイルス科は、デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）脳炎およびダニ媒介脳炎ウイルスを含む。
【００６１】
その他の標的抗原は、Ｃ型肝炎〔例えば米国特許公開番号ＵＳ２００３／１９０６０６号明細書（２００３年１０月９日）；ＵＳ２００２／０８１５６８号明細書（２００２年６月２７日）または多数の非ヒトウイルス、例えば感染性喘息ウイルス（家禽類）、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ感染
性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）、および通常の風邪および／またはＡ、ＢおよびＣ型以外の肝炎を起こすヒト呼吸器コロナウイルスから成るコロナウイルス科から生成されてもよい。さらに、突然急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の推定原因因子はコロナウイルス科内に見られる。コロナウイルス科の範囲内で、標的抗原はＥ１（Ｍまたはマトリックスタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ２（Ｓまたはスパイクタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥまたはヘマグルチン−エルテロース（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ−ｅｌｔｅｒｏｓｅ）とも呼ばれる）糖タンパク質（すべてのコロナウイルス内には存在しない）、またはＮ（ヌクレオキャプシド）を含む。さらに別の抗原は、ベシクロウイルス属（例えばインディアナ型水疱性口内炎ウイルス）およびリッサウイルス属（例えば狂犬病）を含むラブドウイルス科に対して標的とされてもよい。ラブドウイルス科内で、適切な抗原はＧタンパク質またはＮタンパク質から誘導されてもよい。出血熱ウイルス、例えばマールブルグおよびエボラウイルスを含むフィロウイルス科も抗原の適切な起源であろう。パラミクソウイルス科は、１型パラインフルエンザウイルス、３型パラインフルエンザウイルス、３型ウシパラインフルエンザウイルス、ルブラウイルス（おたふくかぜウイルス）、２型パラインフルエンザウイルス、４型パラインフルエンザウイルス、ニューキャッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹およびネコジステンパーを含む麻疹ウイルス、および呼吸器合胞体ウイルス（例えば糖（Ｇ）タンパク質および融合（Ｆ）タンパク質、その配列はＧｅｎＢａｎｋから入手できる）を含むニューモウイルスを含む。
【００６２】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科内に分類されそして抗原（例えばＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）の適合する起源である。ブニヤウイルス科は、ブニヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、クロス）、フレボウイルス属（リフトヴァレー熱）、ハンタウイルス属（プレマラ（ｐｕｒｅｍａｌａ）はヘマハジン（ｈｅｍａｈａｇｉｎ）熱ウイルスである）、ナイロウイルス属（ナイロビヒツジ病）および種々の帰属されていないブンガ（ｂｕｎｇａ）ウイルスを含む。アレナウイルス科は、ＬＣＭおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原の起源を提供する。レオウイルス科は、レオウイルス属、ロタウイルス属（これは小児に急性胃腸炎を起こす）、オルビウイルス属、およびクルチ（ｃｕｌｔｉ）ウイルス属（コロラドダニ熱ウイルス、レボンボ（Ｌｅｂｏｍｂｏ）（ヒト）、ウマ脳炎、ブルータング）を含む。
【００６３】
レトロウイルス科は、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩのようなヒトおよび獣医的疾患を包含するオンコリ（ｏｎｃｏｒｉ）ウイルス亜科、レンチウイルス亜科（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ感染性貧血症ウイルス、およびスプーマウイルスを含む）を含む。レンチウイルスの中で、多数の適合する抗原が記載されそして容易に選択できる。
【００６４】
適合するＨＩＶおよびＳＩＶ抗原の例は、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、およびＲｅｖタンパク質、ならびにそれらの種々のフラグメントを限定ではなく含む。例えばＥｎｖタンパク質の適合するフラグメントは、その他のサブユニット、例えばｇｐ１２０、ｇｐ１４０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１、またはそれらのより小さいフラグメント、例えば少なくともアミノ酸約８個の長さのもののようないずれかのそのサブユニットを含んでもよい。同様に、ｔａｔタンパク質のフラグメントが選択されてもよい〔米国特許第５，８９１，９９４号明細書および米国特許第６，１９３，９８１号明細書参照〕。また、Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（５）：２４６２−２４６７（２００１年３月）、およびＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９−７４（２００１年４月６日）に記載のＨＩＶおよびＳＩＶタンパク質も参照のこと。別の例では、ＨＩＶおよび／またはＳＩＶ免疫原性タンパク質またはペプチドは、融合タンパク質またはその他の免疫原性分子を形成するために使用されてもよい。例えば、国際特許公開番号ＷＯ０１／５４７１９号明細書、２００１年８月２日公開、および国際特許公開番号ＷＯ９９／１６８８４号明細書、１９９９年４月８日公開、国際特許公開番号ＷＯ０３／０１１３３４号、米国特許（ＵＳ）２００３／１５８１３４号中に記載のＨＩＶ−１  Ｔａｔおよび／またはＮｅｆ融合タンパク質および免疫化方式を参照のこと。本発明は、本明細書中に記載のＨＩＶおよび／またはＳＩＶ免疫原性タンパク質またはペプチドに限定はされない。さらに、それらのタンパク質に対する種々の修飾が記載されるかまたは当該技術分野の熟練者により容易に作製できる。例えば、米国特許第５，９７２，５９６号明細書に記載の改変ｇａｇタンパク質を参照のこと。さらに、いずれかの所望のＨＩＶおよび／またはＳＩＶ免疫原は、単独または組合せて送達されてもよい。かかる組合せは、単一ベクターからまたは複数ベクターからの発現を含んでもよい。場合により、別の組合せは、タンパク質形態での１個もしくはそれ以上の免疫原の送達を伴う１種もしくはそれ以上の発現された免疫原の送達を含んでもよい。かかる組合せは以下にさらに詳細に考察される。
【００６５】
パポーバウイルス科は、ポリオーマウイルス亞科（ＢＫＵおよびＪＣＵウイルス）およびパピローマウイルス亞科（乳頭腫のガンまたは悪性進行に関連する）を含む。免疫原性産物として有用なパピローマウイルスタンパク質の例は、Ｅ１〜Ｅ７、Ｌ１およびＬ２と呼ばれるパピローマウイルス「初期」および「後期」遺伝子から誘導されたものを含む。例えば米国特許出願公開番号２００２／０１３７７２０号明細書〔Ｅｒｔｌ〕参照。その他のパピローマウイルス抗原およびそれらの組合せが記載されている。例えば米国特許出願公開番号２００３／１２９１９９号明細書（２００３年７月１０日）、米国特許出願公開番号２００２／１８２２１号明細書（２００２年１２月１５日）、米国特許第６，３４２，２２４号明細書参照。
【００６６】
アデノウイルス科は呼吸器疾患および／または腸炎を起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を含む。パルボウイルス科は、ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス、およびブタパルボウイルスを含む。ヘルペスウイルス科は、シンプレックスウイルス属（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、ワリセロ（ｖａｒｉｃｅｌｌｏ）ウイルス属（仮狂犬病、水胞性帯状疱疹ウイルス）を包含するアルファヘルペスウイルス亞科およびサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス）を含むベータヘルペスウイルス亞科、およびリンホクリプトウイルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ種）、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルス、およびラジノウイルス（ｒｈａｄｉｎｏｖｉｒｕｓ）を含むガンマヘルベスウイルス亞科を含む。ポックスウイルス科は、オルトポックスウイルス属（痘瘡（天然痘）およびワクチニア（牛痘））、パラポックスウイルス属、アビポックスウイルス属、カプリポックスウイルス属、レポリポックスウイルス属、スイポックスウイルス属を包含するチョルドポックスウイルス亞科、およびエントモポックスウイルス亞科を含む。ヘパドナウイルス科は、Ｂ型肝炎ウイルスを含む。抗原の起源として適合するであろう一つの分類されていないウイルスは、デルタ型肝炎ウイルスである。さらの他のウイルス起源は、トリ感染性嚢性疾患ウイルスおよびブタ呼吸器および生殖器症候群ウイルスを含んでもよい。アルファウイルス科は、ウマ関節炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルスを含む。
【００６７】
本発明は、ヒトまたはヒト以外の動物を、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物に感染する細菌、真菌、寄生微生物もしくは多細胞寄生体、またはガン細胞もしくは腫瘍細胞由来を含む他の病原に対して免疫化するために有用な産物を利用する方式も包含する。細菌性病原の例は、肺炎双球菌、ブドウ球菌および連鎖球菌を含む病原性グラム陽性球菌を含む。病原性グラム陰性球菌は、髄膜炎菌、淋菌を含む。病原性腸内グラム陰性桿菌は、腸内菌科；シュードモナス、アシネト菌およびエイケネラ菌（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）；類鼻疽菌；サルモネラ菌；赤痢菌；ヘモフィルス菌（インフルエンザ菌、ハエモフィルス  ソムヌス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｓｏｍｎｕｓ））；モラクセラ菌；軟性下疳菌（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を起こす）；ブルセラ菌；フラニセラ  ツラレンシス（Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（ツラレミア病を起こす）；エルシニア菌（パスチュレラ（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ））；モニリホルム連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）およびスピリルム菌を含む。グラム陽性桿菌は、リステリア菌（ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；豚丹毒菌（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ菌；炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）；ドノヴァノシス（ｄｏｎｏｖａｎｏｓｉｓ）（鼠蹊肉芽腫）；およびバルトネラ症菌を含む。病原性嫌気細菌により起きる疾患は、破傷風、ボツリヌス中毒、その他のクロストリジウム属細菌、結核、癩病、およびその他のマイコバクテリウム属の細菌を含む。
【００６８】
特定の細菌種の例は、限定ではなく、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、モラクセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ブタコレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、セキリ菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アヴィウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム細胞内複合体（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ボレリア・ブルガドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇａｄｏｒｆｅｒｉ）、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチノバチルス・プルロニュモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマイコプラズマ・ガリセプチクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）である。
【００６９】
病原性スピロヘータ疾患は、梅毒；トレポネーマ症；イチゴ腫、ピンタおよびその他の地方流行性梅毒；およびレプトスピラ症を含む。その他の高次病原性細菌および病原性真菌により起きる感染症は、アクチノミセス症、ノカルジア症、クリプトコックス症（クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））、ブラストミセス症（ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ））、ヒストプラズマ症（ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ））およびコクシヂオイデス症（コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）；カンジダ症（カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ））；アスペルギルス症（アスペルギリス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ））、およびムコール症；スポロトリウム症；パラコクシジオイデス症；ペトリエリジオシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）；トルロプシス症、ミセトーマ（ｍｙｃｅｔｏｍａ）およびクロモミコシス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｏｓｉｓ）；および皮膚糸状菌症を含む。リッケチア感染症は、発疹チフス、ロッキー山紅斑熱、Ｑ熱、および
リッケチア痘を含む。マイコプラズマおよびクラミジア感染症の例は、マイコプラズマ肺炎、リンパ肉芽腫、オウム病、及び周生期クラミジア感染症を含む。病原性真核生物は、病原性原生生物および蠕虫を包含しそしてそれらにより起きる感染症は、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア症（例えばリーシュマニア  マジョール（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ
ｍａｊｏｒ）により起きるもの）、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症（例えばトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）により起きるもの）、カリニ肺炎、トリカンズ（Ｔｒｉｃｈａｎｓ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、バベシア病、ランブル鞭毛虫症（例えばジアルディア（Ｇｉａｒｄｉａ）により起きるもの）、旋毛虫症（トリコモナス（Ｔｒｏｃｈｏｍｏｎａｓ）により起きるもの）、フィラリア症、住血吸虫症（例えば住血吸虫により起きるもの）、線虫類、吸虫類またはフルーク、および条虫（サナダムシ）感染症を含む。その他の寄生生物感染症は、なかでも回虫、鞭虫、クリプトスポリジウム、およびニューモシスチス  カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉ）より起きるであろう。
【００７０】
多数のそれらの生物体および／またはそれらにより産生される毒素は、生物攻撃に使用される可能性がある薬剤として、疾病管理センター〔（ＣＤＣ）、米国保健および社会福祉省〕により同定されている。例えば、生物学的薬剤の一部の例には下記が含まれる：炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびその毒素（ボツリヌス症）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）、大痘瘡（重篤痘瘡）、フランシセラ  ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（ツラレミ菌）、およびウイルス性出血熱〔フィロウイルス（例えばエボラ、マーブルグ）〕、およびアレナウイルス〔例えばラサ、マチュポ〕、これらのすべは現在カテゴリーＡ薬剤に分類されている；コクシエラ  ブルネチ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ）（Ｑ熱）；ブルセラ種（ブルセラ症）、ブルコルデリア  マレイ（Ｂｒｕｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）（鼻疽）、ブルコルデリア  シュドマレイ（Ｂｒｕｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（メロイドーシス（ｍｅｌｏｉｄｏｓｉｓ））、ヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびその毒素（リシン毒素）、ウエルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびその毒素（イプシロン毒素）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種およびそれらの毒素（腸毒素Ｂ）、オウム病クラミジア（Ｃｌａｍｉｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（オウム病）、水の安全への脅威（例えばコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クリトスポルジウム  パルブム（Ｃｒｙｔｏｓｐｒｏｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、チフス熱（リッケチア  ポワゼキ（Ｒｉｃｈｅｔｔｓｉａ  ｐｏｗａｚｅｋｉｉ））、およびウイルス性脳炎（アルファウイルス、例えばベネズエラウマ脳炎、イースタンウマ脳炎、ウエスタンウマ脳炎）；それらのすべては現在カテゴリーＢ薬剤に分類されている；およびナイパン（Ｎｉｐａｎ）ウイルスおよびハンタウイルス、それらは現在カテゴリーＣ薬剤に分類されている。さらに、そのように分類されているかまたは異なって分類されているその他の生物体は、将来同定されるかおよび／またはかかる目的に使用されるであろう。本明細書中に記載のウイルスベクターおよびその他の構築物は、それらの生物体、ウイルス、それらの毒素またはその他の副産物からの抗原を送達するために有用であり、それらはそれらの生物学的薬剤を用いる感染またはその他の不利益な反応を防止および／または処置するであろう。
【００７１】
Ｔ細胞の可変領域に対する免疫原を送達するための本発明によるベクターの投与は、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む免疫反応を誘導してそれらのＴ細胞を排除する。リウマチ性関節炎（ＲＡ）の場合に、疾患に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の数個の特定の可変領域が検討された。それらのＴＣＲには、Ｖ−３、Ｖ−１４、Ｖ−１７およびＶα−１７が含まれる。従って、それらのポリペプチドの少なくとも１個をコードする核酸配列の送達は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とする免疫反応を誘発する。多発性硬化症（ＭＳ）では、疾患に関与するＴＣＲの数個の特定の可変領域が検討された。それらのＴＣＲはＶ−７およびＶα−１０を含む。従って、それらのポリペプチドの少なくとも１個をコードする核酸配列の送達は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とする免疫反応を誘発する。強皮症では、疾患に関与するＴＣＲの数個の特定の可変領域が検討された。それらのＴＣＲは、Ｖ−６、Ｖ−８、Ｖ−１４およびＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７，Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８およびＶα−１２を含む。従って、それらのポリペプチドの少なくとも１個をコードする組換えサルアデノウイルスの送達は、強皮症に関与するＴ細胞を標的とする免疫反応を誘導する。
【００７２】
さらに、望ましい免疫原は脊椎動物宿主、例えば、限定ではないが、前立腺特異的抗原、ガン胎児性抗原、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５およびＭＡＧＥ−３を含み、それらに限定はされないガン抗原または腫瘍関連抗原を用いる産物の内に治療的または予防的抗ガン効果を誘導するように指令するものを含む。
【００７３】
好適には、アデノウイルスベクターは、機能性Ｅ１、Ｅ４欠損アデノウイルスおよび機能性Ｅ１欠損アデノウイルスの順次投与を含む組合せ方式で送達される。本発明の方式は、投与量依存の様式で身体内の種々の部位に投与でき、それは所望の免疫反応が標的とされている徴候に依存する。
【００７４】
一つの態様では、本発明は、対象者内に免疫反応を特異的に誘導するための薬剤の調製における本発明のアデノウイルスベクターの使用を提供する。別の態様では、ベクターは順次投与のために調製される。
【００７５】
本発明は注入の量もしくは部位にもまたは製薬学的担体にも限定されない。本方式は初回免疫段階および追加免疫段階を含む。それぞれの段階は、単回投与量または時間毎、日毎、週毎または月毎または年毎に投与される投与量、または複数の投与を含んでもよい。送達の量または部位は、望ましくは哺乳動物の実体および状態に基づいて選定される。
【００７６】
哺乳動物への抗原の送達のために適するベクターの投与単位は、本細書中に記載されている。ベクターは、かかる投与の熟練者には明らかな製薬学的または生理学的に許容できる担体、例えば等張性食塩水、等張性塩溶液、またその他の配合中に懸濁もしくは溶解されて投与するように調製される。適切な担体は、当該技術分野の熟練者には明らかでありそして投与の経路に大きく依存する。本発明の組成物は、上記の経路に従い、生分解性の生体適合性ポリマーを用いる徐放配合、またはミセル、ゲルおよびリポソームを用いる部位送達により哺乳動物に投与されてもよい。場合により、本発明の初回免疫段階は、本明細書中に規定したように、初回免疫組成物、アジュバントの適量と共に投与することも含む。
【００７７】
好ましくは、第二の組成物は第一の回、または前回の免疫化組成物の投与の約２〜約２７週間後に哺乳動物対象に投与される。追加免疫組成物の投与は、初回免疫組成物により送達されたものと同一、または交差反応性である産物を含む追加免疫組成物の適量を用いて達成される。
【００７８】
別の態様では、本発明のウイルスベクターは各種のその他の免疫化および治療的方式中の使用のためにも適する。かかる使用は当該技術分野の熟練者には直ちに明らかである。
【００７９】
ウイルスベクターの投与は、患者の処置される状態、年齢、体重および健康のような要因に主として依存し、そして（ヒトを含む）哺乳動物患者毎に変動するであろう。有利には、本発明の組換えサル（例えばチンパンジー）アデノウイルスの予期しない効力は、所望の免疫原性効果を誘導（例えば抗体および／または細胞毒性（ＣＴＬ）免疫反応のあらかじめ決定されたレベルを誘導）するために有効な量を提供する組換えチンパンジーアデ
ノウイルスの著しく低い量の使用を可能とする。
【００８０】
例えば、小型動物に対して、アデノウイルスベクターの有効投与量は、アデノウイルスの１０５粒子／動物〜１０１１粒子／動物で提供される。例えば約８０ｋｇの大型動物に対しては、対象者あたりに１０７〜１０１３粒子が有用であろう。しかし、例えば選択された送達経路に依存して、さらに多い投与量も容易に選定できる。例えば、アデノウイルスベクターは担体溶液約１００μＬ〜約１００ｍｌ、およびさらに好ましくは約１ｍＬ〜約１０ｍＬの範囲の量で送達されてもよい。選択された遺伝子の治療的レベル、または免疫のレベルは、使用される場合にはブースターの必要性を決定するために測定されることができる。血清中のＴ細胞反応または抗体力価の評価の後に、選択的な追加のブースター免疫化が望まれる。
【００８１】
一つの態様では、本発明の免疫化方式は、例えば遺伝子ガンまたはプラスミドを介するＤＮＡワクチンの投与をさらに含む。かかるＤＮＡワクチンは初回免疫段階として使用されてもよく、それは本発明による第一のアデノウイルス媒介送達の前に行う。あるいは、かかるＤＮＡワクチンは、本発明による１回もしくはそれ以上のアデノウイルス投与の後に追加免疫として使用されてもよい。
【００８２】
別の態様では、本方式はタンパク質に基づくワクチンの順次または同時投与をさらに含む。かかるワクチンは、本発明によるアデノウイルス媒介送達の後に追加免疫として使用できる。あるいは、かかるタンパク質に基づくワクチンは、初回免疫として、または本発明の方式内の１回もしくはそれ以上のアデノウイルス媒介免疫化の間に使用されてもよい。
【００８３】
一つの例では、本発明の免疫化方式は疾患原因作用物質、例えばウイルス、細菌またはその他の生物体、または交差反応性ウイルス、細菌またはその他の疾患原因作用物質に対する防御性免疫反応を提供する、別の例では、本明細書中に記載の免疫化方式は、多タンパク質方式を含むことができる。例えば、ＨＩＶおよびＳＩＶに対して免疫反応を生成するために有用なタンパク質サブユニットの発現のための多タンパク質方式を記載したＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９−７４（２００１年４月６日）を参照されたい。
【００８４】
別の局面では、本発明は、本明細書中に記載の免疫化方式を実施するために有用な産物を提供する。
【００８５】
かかる産物は、適合するコンテナー内にある本明細書中に記載のアデノウイルスベクターの１個もしくはそれ以上を含むことができる。典型的には、かかる産物はアデノウイルスベクターの投与のための説明書をさらに含むであろう。
【００８６】
さらに、産物は、送達の選択された経路のため、例えばアデノウイルスベクター、シリンジ、バイアルなどの希釈および／または再構成のために生理学的に適する担体を含んでもよい。
【００８７】
下記の実施例は本発明を例示説明するために提供されそしてその範囲を限定はしない。当該技術分野の熟練者は、下記の実施例中に特定の試薬および条件が記載されているけれども、本発明の精神および範囲により包含されると意図される変更が可能であることを認めるであろう。
【実施例１】
【００８８】
Ｅ１領域に欠失を有するＣ７．０００ＣＭＶＧＰ、Ｅ１およびＥ３領域の双方に欠失を
有するＣ７．０１０ＣＭＶＧＰ、およびＥ１およびＥ４領域の双方に欠失を有するＣ７．００１ＣＭＶＧＰを含むＣ７ワクチンベクターのパネルを創成するためのモデル抗原として、エボラ・ザイール（Ｅｂｏｌａ  Ｚａｉｒｅ）ウイルスエンベロープ糖タンパク質（Ｅｂｏ  ＧＰ）を使用した。導入遺伝子発現カセットは、それらのベクターのＥ１領域内に組み込んだ。
【００８９】
Ａ．細胞株
Ａ５４９細胞は、抗生物質および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を用いて補足したＦ−１２Ｋ媒体（Ｇｉｂｃｏ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中に維持した。２９３Ｔ細胞は、抗生物質および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を用いて補足したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に維持した。
【００９０】
Ｂ．プラスミド
エボラウイルス（Ｚａｉｒｅ株）ＶＰ４０またはＧＰをコードする全長ｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターを含む哺乳動物発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内に別々にクローニングした。得られたプラスミドをｐｃＤＮＡＥｂｏＺＶＰ４０およびｐｃＤＮＡＥｂｏＺＧＰと名付けた。
【００９１】
Ｃ．形質転換したＡ５４９細胞からＥｂｏＺ  ＧＰの発現
Ａ５４９細胞は組換えアデノウイルスベクターを用いて形質転換した（細胞あたり１，０００粒子または細胞あたり１０，０００粒子）。４８時間後に、細胞をレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試料緩衝液中に直接採取した。９５℃に５分間加熱した後に、細胞試料を遠心分離しそして上清をＳＤＳ−ポリアクリルミド・ゲル上に負荷した。電気泳動の後、タンパク質を電気ブロットによりニトロセルロース膜に移行した。希釈度１：１，０００のＥｂｏＺ  ＧＰに対するポリクローナル抗体を一次抗体とし、そして希釈度１：５，０００のホースラディシュペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ラビット抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を二次抗体として使用するＥＣＬ  ウエスタンブロティングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によりブロットを可視化した。
【００９２】
Ｄ．ＥｂｏＺウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生
ｐｃＤＮＡＥｂｏＺＶＰ４０の４５μｇおよびｐｃＤＮＡＥｂｏＺＧＰの４５μｇを含み、内毒素を含まないＤＮＡ混合物を、ＣａｌＰｈｏｓ哺乳動物トランスフェクションキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて２９３Ｔ細胞の１５０ｍｍプレートそれぞれの中にトランスフェクションした。次の日に、細胞を新しい培地に変更した。２４時間後に、培地を採取しそして細胞残留物を除去するために５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離した。ＶＬＰを含み細胞を含まない上清を、ＳＷ２８ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用い、４℃で２時間、２０％スクロース・クッションを通して２８，０００ｒｐｍで超遠心分離によりさらに濃縮した。次いで濃縮されたＶＬＰをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、氷上で５時間で再懸濁しそして小アリコート中、−８０℃で保存した。
【００９３】
Ｅ．ＥｂｏＺ発現アデノウイルスベクターの分子クローンの創成
アデノウイルスの種々の種および株から誘導されそしてＥｂｏＺＧＰを発現する組換えアデノウイルスゲノムを、直接結合および緑／白色選択システムを介して創成した。緑／白色選択システムは別の箇所に記載されている（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１０（２２）：１９２６−１９３０（２００３年１０月）およびＲｏｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１５（５）：５１９−５３０（２００４年５月））。要約すると、ＥｂｏＺＧＰ  ｃＤＮＡを、アデノウイルスバックボーンの種々の分子クローン内にＥｂｏＺＧＰを導入するために使用されたＣＭＶプロモーターとウシ成長ホルモンポリＡとの間の汎用ｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドベクター内にサブクローニングした。
【００９４】
アデノウイルスバックボーンの分子クローンは、Ｅ１およびＥ３欠失を有するヒト血清型５（Ｈ５，０４０）、Ｅ１欠失のみ（Ｃ７，０００）、Ｅ１およびＥ３欠失（Ｃ７，０１０）およびＥ１およびＥ４欠失（Ｃ７，００１）のチンパンジー血清型７を含む。それらの分子クローンを創成するクローニングプロセスは、他の箇所（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９（２２）：１９２６−１９３０（２００３年１０月）およびＲｏｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１５（５）：５１９−５３０（２００４年５月））に記載されている。すべてのこれらの分子クローンは、細菌ｌａｃプロモーターから原核ＧＦＰを発現しそして２個のレア（ｒａｒｅ）制限部位、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＣｅｕＩに近接されているカセットを含む。これは、汎用ｐＳｕｔｔｌｅ構築物からのＥｂｏＺ発現カセットに、慣用および効率的な緑／白色選択媒介クローニングプロセスを介してアデノウイルス分子クローン内へスワップされることを許容した（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，２００３、上記に引用）。
【００９５】
１．ＡｄＥｂｏＺベクターのレスキュー、拡大および精製
分子クローンからの組換えウイルスをレスキューするために、プラスミドＤＮＡを適合する制限酵素により線型化してプラスミドバックボーンからベクターゲノムを放出させそして適切な細胞株内にトランスフェクションした。Ｅ１／Ｅ４欠失ベクターに対して、１０−３細胞、すなわち亜鉛誘導下で発現したＥ４ＯＲＦ6 を有する２９３細胞に基づくＥ１／Ｅ４補足細胞株を使用した。その他のすべての構築物に対しては、２９３細胞を使用した。完全な細胞改変効果（ＣＰＥ）、ウイルスレスキューおよび複製の徴候が観察されると、粗ウイルス溶解物を適切な細胞株内での大規模感染に徐々に拡大するために採取した。ウイルスを標準ＣｓＣｌ勾配沈降法により精製した。組換えウイルスの複合体ゲノム構造は、制限酵素分析で確認した。Ｅ１／Ｅ４欠失ベクターを除くすべてのベクターに対して。ウイルスの感染性を２９３細胞上のプラークアッセイにより決定した。しかし、免疫化実験に使用したベクターはＵＶ分光分析計を用いるＯＤ２６０の読みにより測定されたウイルスの物理的粒子数に基づいて投与された。
【００９６】
ウエスタンブロット分析により、Ｃ７，０００ＣＭＶＧＰおよびＣ７，０１０ＣＭＶＧＰベクターは非常に類似したＧＰ発現のレベルを生成し、一方Ｃ７，００１ＣＭＶＧＰベクターは形質導入されたＡ５４９細胞内で著しく少ないＧＰタンパク質を産生した。
【実施例２】
【００９７】
Ｅ４欠失ベクターを用いるマウスの初回免疫、次いでＥ１欠失Ａｄベクターを用いる追加免疫
Ａ．マウス
Ｂ１０ＢＲマウス（６〜８週齢）をＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＡ）から購入しそしてＴｈｅ  Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）の動物施設で飼育した。１００μｌ  ＰＳＢ中で希釈した組換えアデノウイルスベクターまたは組換えアデノ随伴ウイルスベクターで筋肉内注入を用いてマウスを免疫化した。
【００９８】
Ｂ．ペプチド
Ｈ−２ｋハプロタイプのマウスに対するＥｂｏＺ  ＧＰの免疫優性ＭＨＣクラスＩエピトープを担持するＨ−２Ｋ制限ＥｂｏＺ  ＧＰ特異的ペプチド（ＴＥＬＲＴＦＳＩペプチド、配列番号１）がＭｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｉｒａ）により合成された。ペプチドをＤＭＳＯ中で５ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈しそして−８０℃で保存した。ペプチドは２μｇ／ｍｌで使用されそしてＤＭＳＯ濃度はすべての最終アッセイ混
合物中で０．１％（ｖ／ｖ）以下に保持された。
【００９９】
Ｃ．細胞内ＩＦＮ−γ染色
免疫化されたマウスからの脾細胞を、１μｌ／ｍｌブレフェルジン（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）Ａ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ，ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下で３７℃および１０％ＣＯ２で５時間、ＴＥＬＲＴＦＳＩペプチド（配列番号１）を用いて刺激した。対照細胞をペプチドを含まないでインキュベーションした。洗浄した後、ＦＩＴＣ標識  抗マウスＣＤ８抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて細胞を染色した。次いで、細胞を洗浄しそしてサイトフィックス／サイトパーム（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｒｙｔｏｐｅｒｍ、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）中で２０分間、氷上で透過性を上げた。次いで、細胞を再度洗浄しそしてＰＥ標識抗マウスＩＦＮ−γ抗体（ＢＤ
ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて染色した。十分に洗浄した後、細胞を二色フローサイトメトリーにより検査しそしてデータをＷｉｎＭＤＩＴＭ〔Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ〕サイトメトリーデータ解析ソフトウエアにより解析した。ＧＰへのペプチドを用いないでインキュベーションした脾細胞は、０．５％以下のＣＤ８＋Ｔ細胞産生ＩＦＮ−ガンマを示した。
【０１００】
Ｄ．酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によるＥｂｏＺ  ＧＰへの全ＩｇＧ反応の測定
免疫化の種々の時点で眼窩後穿刺によるかまたは終結時に心臓穿刺によるかのいずれかでマウスから採血した。血清を調製しそしてＰＢＳ中で希釈したＥｂｏＺ  ＶＬＰを用いて被覆した９６ウエルプレート上でＥｂｏＺ  ＧＰに対する全ＩｇＧ反応を試験した。プレートを一晩４℃で被覆しそして３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＡを用いて室温で２時間ブロックした。洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で希釈した血清をウエル上に２時間、室温で加えた。洗浄の後、ホースラディシュペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の１：１０．０００希釈液をウエルに１０〜２０分間、室温で加えた。洗浄の後、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を１０〜２０分間で加えそして引き続き反応を停止試薬（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を加えて停止した。光学密度を４５０ｎｍで読み取った。陽性試料に対するカット・オフ値は、１：１００希釈における本来の血清に対する４５０ｎｍでの平均デルタＯＤに標準偏差の３倍を加えて算出した。次いで、試験した各試料の終点抗体力価は、カット・オフ値上で、線型回帰分析に従って内挿された４５０ｎｍでのデルタＯＤを用いて血清の最高希釈の逆数として定義された。
【０１０１】
刺激剤としてのＨ−２ｋ制限ＧＰ特異的ペプチドを用いて染色した細胞内サイトカインにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞産生ＩＦＮ−γの同様の頻度が、Ｃ７．０００ＣＭＶＧＰまたはＣ７．００１ＣＭＶＧＰを用いて接種したＢ１０ＢＲマウス中で観察され、一方Ｃ７．０１０ＣＭＶＧＰを用いて接種したＢ１０ＢＲマウス中ではＣＤ８＋Ｔ細胞産生ＩＦＮ−γの僅かに高い頻度が観察された。ＥＬＩＳＡにより測定されたＧＰに対する全ＩｇＧ反応は、それらのどのベクターを用いて接種したマウスからの血清でも同様であった。
【０１０２】
現在行っている試験は、Ｃ７．０１０ＣＭＶＧＰまたはＣ７．００１ＣＭＶＧＰのどちらかを用いて初回免疫しそしてＨ５ＣＭＶＧＰを用いて追加免疫した方が、Ｃ７．００００ＭＶＧＰを用いて初回免疫しそしてＨ５ＣＭＶＧＰを用いて追加免疫するよりもより良いＧＰ特異的Ｔ細胞およびＢ細胞反応に達し得ることを示している。
【０１０３】
全体として、それらのデータは、マルチ欠失アデノウイルスベクターがより良いワクチン担体であることを示唆した。
【０１０４】
本明細書中に引用したすべての出版物は、引用することにより本明細書に編入される。本発明は特定の態様に関して記載してあるけれども、本発明の精神から離れることなく変
更が可能であることが認められるであろう。かかる変更は添付の請求範囲の範囲内に入ると意図する。
【配列表】
2007535541000001.xml
【国際調査報告】
2007535541.tif 000003
2007535541.tif 000004
2007535541.tif 000005
2007535541.tif 000006
2007535541.tif 000007