(57)【要約】  本発明は、ニコチン酸またはその誘導体に関するもので、より詳細にはニコチン酸またはその誘導体を含む癌予防及び治療剤は、メチル化によって不活性化になっている癌抑制遺伝子であるRUNX3遺伝子の発現を促進させる。本発明の癌予防及び治療剤は、胃癌、肺癌、肝臓癌、喉頭癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌または乳癌のようにRUNX3の不活性化と関連した癌に使用できる。
2007537246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式を有するニコチン酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む癌予防及び/または治療剤。
【化１】
2007537246.tif 000008
式中、R1は酸素またはイオウで、R2はH、OH、C1〜C10アルキル、NH2、NH-NH2、NH-C2H4-O-NO2-またはOR3(R3は、C1〜C5アルキルである)で、XはH、NH2またはハロゲン族原子であり、YはHまたはCH3である。
【請求項２】
R1は、C1〜C5アルキルである請求項１に記載の癌予防及び/または治療剤。
【請求項３】
ハロゲン族原子が、フッ素または塩素である請求項１に記載の癌予防及び/または治療剤。
【請求項４】
R2がCH3またはC2H5である請求項１に記載の癌予防及び/または治療剤。
【請求項５】
ニコチン酸誘導体が、ナイアシンアミド(Niacin amide)、ニコチン酸(Nicotinic acid)、6-アミノニコチンアミド(6-Aminonicotinamide)、イソニコチンアミド(Isonicotinamide)、イソニコチノヒドラジド(Isonicotinohydrazide)、N-メチルニコチンアミド(N-Methylnicotinamide)、ニコランジル(Nicorandil)、ピリジン-2-カボキシアミド(Pyridine-2-carboxamide)、チオニコチンアミド(thionicotin amide)または6-クロロニコチンアミド(6-Chloronicotinamide)であることを特徴とする請求項１に記載の癌予防及び/または治療剤。
【請求項６】
癌が、胃癌、肺癌、肝臓癌、喉頭癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌または乳癌であることを特徴とする請求項１に記載の癌予防及び/または治療剤。
【請求項７】
請求項１のニコチン酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を個体に投与する工程を含む癌予防及び/または治療方法。
【請求項８】
ニコチン酸誘導体が、ナイアシンアミド(Niacin amide)、ニコチン酸(Nicotinic acid)、6-アミノニコチンアミド(6-Aminonicotinamide)、イソニコチンアミド(Isonicotinamide)、イソニコチノヒドラジド(Isonicotinohydrazide)、N-メチルニコチンアミド(N-Methylnicotinamide)、ニコランジル(Nicorandil)、ピリジン-2-カボキシアミド(Pyridine-2-carboxamide)、チオニコチンアミド(thionicotin amide)または6-クロロニコチンアミド(6-Chloronicotinamide)であることを特徴とする請求項７に記載の癌予防及び/または治療方法。
【請求項９】
癌が、胃癌、肺癌、肝臓癌、喉頭癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌または乳癌であることを特徴とする請求項７に記載の癌予防及び/または治療方法。
【請求項１０】
請求項１のニコチン酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を癌予防及び/または治療用医薬の製造に使用する用途。
【請求項１１】
ニコチン酸誘導体が、ナイアシンアミド(Niacin amide)、ニコチン酸(Nicotinic acid)、6-アミノニコチンアミド(6-Aminonicotinamide)、イソニコチンアミド(Isonicotinamide)、イソニコチノヒドラジド(Isonicotinohydrazide)、N-メチルニコチンアミド(N-Methylnicotinamide)、ニコランジル(Nicorandil)、ピリジン-2-カボキシアミド(Pyridine-2-carboxamide)、チオニコチンアミド(thionicotin amide)または6-クロロニコチンアミド(6-Chloronicotinamide)であることを特徴とする請求項１0に記載の用途。
【請求項１２】
癌が、胃癌、肺癌、肝臓癌、喉頭癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌及び乳癌であることを特徴とする請求項１0に記載の用途。
【請求項１３】
請求項１のニコチン酸誘導体を癌にかかった個体に投与する工程を含むRUNX3またはRUNX3をコードする遺伝子を活性化させる方法。
【請求項１４】
癌にかかった個体は、RUNX3が脱アセチル化されたことを特徴とする請求項１3に記載の方法。
【請求項１５】
癌にかかった個体は、RUNX3をコードする遺伝子がメチル化されたものであることを特徴とする請求項１3に記載の方法。
【請求項１６】
癌が、胃癌、肺癌、肝臓癌、喉頭癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌または乳癌であることを特徴とする請求項１3に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニコチン酸誘導体を有効成分として含む癌予防及び治療剤に関するもので、より詳細にはメチル化(methylation)よって不活性化している癌抑制遺伝子であるRUNX3遺伝子の発現を促進させてRUNX3タンパク質の脱アセチル化を抑制して、前記RUNX3タンパク質の分解を抑制することよって活性を増加させるニコチン酸誘導体を有効成分として含む癌予防及び治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、癌の主要な3種の治療法としては、外科的治療法、薬物療法、放射線療法があるが、現実的には前記の方法をレーザー療法等と組み合わせた集学的療法が広く行われている。しかし、治療に伴う苦痛や転移可能性等を考慮すると、前記方法の中で薬物療法に対する期待が大きい。したがって、それに答え得る多数の抗癌剤が開発されて使用されているが、その大部分の抗癌剤は、活発に分裂する細胞を選択的に殺すことによって坑癌効果を得る原理に基づいて開発されたものである。このような抗癌剤は、正常に体内で活発に分裂する兔疫細胞、毛根細胞のような正常細胞も一緒に殺すようになるため、深刻な副作用を伴い、長期間の使用が不可能であるという問題点が指摘されている。そのため、癌発病の原因解明を基礎にした新しい抗癌剤の開発が求められている。
【０００３】
癌を誘発する発癌遺伝子の活性化は、細胞の非正常的な増殖を誘導するのに反して、癌抑制遺伝子は反対に細胞の非正常的な増殖を抑制したり、時には細胞死滅プログラム(cell death program)を作動させて特定細胞を死滅させることにより癌細胞の生成を遮断する。一旦、非正常的に活性化した癌遺伝子を有する細胞であっても、癌抑制遺伝子が正常な活性を示すようになればその細胞は癌を形成することができずに死滅する。したがって、癌細胞になるためには癌遺伝子の活性化のみならず癌抑制遺伝子の不活性化が一つの細胞で同時に現われなければならない。
【０００４】
最近、癌細胞で特徴的に現われる細胞の無分別な増殖は、発癌遺伝子の活性化と癌抑制遺伝子の不活性化によるものであることが明確に明らかにされた。詳細には、正常細胞の癌細胞化を防御するのにおいて、細胞のTGF‐β依存性自己死滅起序(apoptosis)は非常に重要な役割をするが、ここで癌抑制遺伝子が不活性化されれば細胞分裂が増加して TGF‐β依存性自己死滅が抑制され、結果的に細胞が癌化される。
【０００５】
癌抑制遺伝子の不活性化が起きる起序の中の一つは、CpG島(CpG island)への非正常的なDNAメチル化(DNA methylation)である(Jones and Laird、Nature genet.  1999年，第21巻，163-167頁)。CpG島のメチル化は、DNAメチラーゼ(DNA methylase)という酵素によってなされ、メチル化が蓄積されるとMeCP2のようなタンパク質がメチル化されたDNAに結合するようになり、それによってヒストンデアセチラーゼ(hidtone deacethylase)が結集するようになる。ヒストンデアセチラーゼは、再びヒストンに結合されたアセチル基(acethyl group)を除去して、その結果その近所のDNA構造が稠密になって遺伝子の発現も抑制されるようになる。DNAメチル化によって遺伝子発現が抑制された場合は、DNAメチルラーゼ阻害剤またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤によって発現が誘導され得る。
【０００６】
一方、アセチル化(acetylation)/脱アセチル化(deacetylation)は、ヒストン以外にも、p53、RUNX3等、何種類かの転写調節タンパク質(transcription factors)でも起きるが、例えば、RUNX3のアセチル化が増加すれば、ユビキチン化(ubiquitination)によるタンパク質の分解が抑制されて、RUNX3の活性が増加する例である(Jin等、J. Biol. Chem. 2004年、第279巻、29409-17頁)。 このように、RUNX3活性の増加は、脱アセチル化を抑制することにより誘導できるので、アセチル化(acetylation)/脱アセチル化(deacetylation)は、タンパク質の機能調節において重要な起序として作用することができる。
【０００７】
実際に、本発明者らによって、癌抑制遺伝子として明らかにされたRUNX3は、人体の多様な癌において、DNAメチル化(methylation)によって発現が抑制されていることが報告されたが、胃癌では60％(Li QL等，Cell. 2002年，第109(1)巻，113-24頁;Oshimo Y.等，Pathobiology. 2004年，第71(3)巻、137-43頁)、肺癌では25〜40％(LI  QL等，BBRC. 2004年，第314(1)巻，223-8頁;Kim TY等，Lab Invest. 2004年，第84(4)巻，479-84頁)、喉頭癌で62％、乳癌で25％(Kim TY等，Lab Invest. 2004年，第84(4)巻，479-84頁)、膵臓癌で70％(Li J等，J Clin Pathol. 2004年，第57(3)巻，294-9頁;Wada M等，Oncogene. 2004年，第23(13)巻，2401-7頁)、肝細胞癌腫で73％(Xiao WH and Liu WW，World J Gastroenterol. 2004年，第10(3)巻，376-80頁;Kim TY等，Lab Invest. 2004年，第84(4)巻，479-84頁)、胆管癌で75％(Wada M 等，Oncogene. 2004年，第23(13)巻，2401-7頁)、前立腺癌で23％(Kang GH等，J. Pathol. 2004年，第202(2)巻，233-40頁; Kim TY等，Lab Invest. 2004年，第84(4)巻，479-84頁)結腸癌で45％(Ku JL等，Oncogene、2004年，第23巻，6736-6742)が、メチル化によって発現が抑制されたと報告されている。
【０００８】
また、RUNX3遺伝子の活性化は、癌細胞の増殖を顕著に抑制することが証明されたことがある(Li等，Cell，2002年，第109(1)巻，113-24頁; Balmain，Nature 2002年，第417(6886)巻，235-7頁)。したがって、前記の研究結果に基づいて、RUNX3遺伝子の活性化による癌予防及び治療剤開発に期待することができるようになった。
【０００９】
以上のことに鑑みて、本発明者らは、癌細胞の不活性化されたRUNX3癌抑制遺伝子を生体内で活性化することができる物質を捜し出す努力をした結果、ニコチン酸誘導体がメチル化によって不活性化になったRUNX3遺伝子を活性化させて、細胞内RUNX3タンパク質の量的増加を起こし、実際に動物モデルに適用した時、前記のニコチン酸誘導体が癌の予防及び治療に効果があることを確認して本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、癌細胞内でメチル化によって不活性化された癌抑制遺伝子であるRUNX3遺伝子を活性化させて、この遺伝子の産物であるRUNX3タンパク質の活性を増加させるニコチン酸誘導体を有効成分として含む癌予防及び治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を果たすために本発明は、ニコチン酸誘導体を有効成分として含む癌予防及び治療剤を提供する。
【００１２】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１３】
本発明は、ニコチン酸誘導体を有効成分として含む癌予防及び治療剤を提供する。
【００１４】
本発明者らは、不活性化されたRUNX3癌抑制遺伝子を生体内で活性化することができる活性話剤が坑癌効果を示すものと期待して、RUNX3遺伝子の活性化効果を有する物質を検索した結果、ナイアシンアミドがRUNX3を活性化させられることを確認した。
【００１５】
まず、癌抑制遺伝子であるRUNX3が癌患者の組織内でメチル化されたかどうかを確認して、癌患者の癌進行様相とメチル化の連関性を調査した。その結果、癌患者の組織では非常に頻繁にRUNX3遺伝子がメチル化されていた。また、RUNX3がメチル化されている患者群は、癌の再発率及び進行率が非常に高いことが示された(表1ないし表3を参照)。
【００１６】
前記した結果は、メチル化によって不活性化されたRUNX3を活性化させることが癌の進行を防ぐことができる方法であることを示している。したがって、本発明者らはRUNX3遺伝子の活性化効果を有する物質を探索することにより、癌の発生及び進行を防ぐことができる物質を捜すことを試みた結果、ナイアシンアミドがメチル化によって不活性化されたRUNX3を活性化させることができることを確認した(図2参照)。
【００１７】
ナイアシンアミドが、RUNX3タンパク質の量的増加を誘導するかどうかを観察した実験で、RUNX3はヒストンデアセチラーゼ(histone deacetylase)によって脱アセチル化(deacetylation)されるにしたがって、分解が誘導されてタンパク質の量が減少したが、ナイアシンアミドの投与によってRUNX3タンパク質のアセチル化が増加してタンパク質の量も増加することを確認した(図3及び図4参照) 
続いて、生体内でのナイアシンアミドの坑癌効果を確認するために、発ガン物質によって癌が誘導されたマウスを使用して、癌形成抑制効果を分析した。発癌物質は、N-ブチル-N-4-ハイドロキシブチルニトロサミン(BBN)を使用した。BBN水溶液を飲用水として20週間提供したマウス群とBBN及びナイアシンアミド水溶液を飲用水として20週間提供したマウス群の癌発病様相を比較することにより、癌形成抑制効果分析を遂行した(図5及び図6参照)。その結果、BBN処理群ではRUNX3エクソン1(exon1)部位のCpG島(island)のメチル化を誘導することによりRUNX3の活性を抑制して100％膀胱癌が発生した。その中で浸潤性癌が80％、表在性癌が20％であることを確認することができた。また、BBNと一緒にナイアシンアミドを投与したマウス群では、RUNX3エクソン1部位のCpG島のメチル化が顕著に低下して、膀胱癌の形成が58％に減少しただけではなく、癌の悪性度も減少して、浸潤性癌が23％、表在性癌が77％と現われた。前記した結果は、BBNによるRUNX3の不活性化をナイアシンアミドが抑制し、それによってBBNによる癌の形成もナイアシンアミドによって抑制されたことを意味する。
【００１８】
前記の結果から本発明のナイアシンアミドが不活性化されたRUNX3を再活性化させることができ、また癌の成長を顕著に抑制することができることを確認することができる。
【００１９】
前記した結果と共に実際的に癌抑制遺伝子RUNX3は、胃癌、肺癌、喉頭癌、乳癌、膵臓癌、肝細胞癌、胆管癌、前立腺癌、結腸癌等多様な人体の癌でメチル化によって不活性化されていて(Li QL等，Cell. 2002年，第109(1)巻，113-24頁;Oshimo Y. 等，Pathobiology. 2004年，第71(3)巻，137-43頁);LI  QL等，BBRC. 2004年，第314(1)巻，223-8頁;Kim TY等，Lab Invest. 2004年，第84(4)巻，479-84頁;Li J等，J Clin Pathol. 2004年，第 57(3)巻，294-9頁;Wada M 等，Oncogene. 2004年，第23(13)巻，2401-7頁;Xiao WH and Liu WW，World J Gastroenterol. 2004年，第10(3)巻，376-80頁;Kang GH等，J. Pathol. 2004年，第202(2)巻，233-40頁;Ku JL等，Oncogene、2004年，第23巻，6736-6742頁)RUNX3遺伝子の活性化は、癌細胞の増殖を顕著に抑制することができることが証明されたことがある(Kim等，Lab Invest. 2004年，第84(4)巻，479-84頁;Wada等，Oncogen、2004年，第23(13)巻，2401-7頁;Li等、Biochem Biophys Res Commun、2004年，第314(1)巻，223-8頁;Li等，Cell、2002年，第109(1)巻，113-24頁;Li等，Cell、2002年，第109(1)巻，113-24頁;Balmain，Nature，2002年，第417(6886)巻，235-7)。したがって、本発明のニコチン酸誘導体を有効成分として含む製薬組成物は、RUNX3遺伝子を再活性化させて、RUNX3遺伝子不活性化による癌である胃癌、肺癌、肝臓癌、喉頭癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮癌または乳癌の予防及び治療剤として使用することができる。
【００２０】
また、本発明の癌予防及び治療剤の有効成分に、ニコチン酸誘導体を使用することができる。ニコチン酸誘導体は、ナイアシンアミド(Niacin amide)、ニコチン酸(Nicotinic acid)、6-アミノニコチンアミド(6-Aminonicotinamide)、イソニコチンアミド(Isonicotinamide)、イソニコチノヒドラジド(Isonicotinohydrazide)、N-メチルニコチンアミド(N-Methylnicotinamide)、ニコランジル(Nicorandil)、ピリジン-2-カボキシアミド(Pyridine-2-carboxamide)、チオニコチンアミド(thionicotin amide)または6-クロロニコチンアミド(6-Chloronicotinamide)を含む。
【００２１】
本発明のニコチン酸誘導体を有効成分として含む製薬組成物は、臨床投与の時に経口または非経口で投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。
【００２２】
すなわち、本発明の製薬組成物は、実際臨床投与時に経口及び非経口の様々な剤形で投与することができ、製剤化する場合には普通に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は一つ以上の化学式1の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルシュムカーボネート(Calcium carbonate)、スクロース(Sucrose)またはラクトース(Lactose)、ゼラチン等を混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアリン酸タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤では、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、芳香剤、保存剤等が含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール(Propylene glycol)、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレイン酸のような注射可能なエステル等が使用できる。座薬の基材には、ハードファット(witepsol)、マクロゴ−ル、ツイーン(tween)61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチン等が使用できる。
【００２３】
本発明のニコチン酸誘導体の有効用量は、1ないし50mg/kgで、好ましいくは10ないし30mg/kgであり、一日に1ないし3回投与することができる。
【００２４】
前記ニコチン酸誘導体は、マウスを対象にした急性毒性検査の結果、ニコチン酸誘導体を投与したマウス群は2g/kgまで毒性変化を現わさず、水を投与したマウス群と比較した時に特別な副作用は観察されないことを確認した。
【００２５】
また、本発明はニコチン酸誘導体を対象体に投与する工程を含む癌予防及び/または治療方法を提供して、ニコチン酸誘導体を癌予防及び/または治療用医薬の製造に使用する用途を提供する。
【００２６】
以下、本発明を実施例にしたがって詳しく説明する。
【００２７】
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
実施例1：RUNX3遺伝子のメチル化と発癌との相関関係分析
まず、癌患者の組織内でRUNX3遺伝子がメチル化しているかどうかの有無を確認するために、膀胱癌患者の組織を摘出して前記組織のメチル化を確認した。詳細には、正常膀胱組織と膀胱癌組織からゲノム(genomic)DNAを分離及び精製して、50℃で16時間3M NaSO2(sodium bisulfite)を処理した。前記過程でメチル化していないDNAはシトシン(Cytosine)がウラシル(Uracil)に変換される。
【００２９】
前記処理後、再びDNAを精製してRUNX3ゲノムDNA CpG島(island)部位の配列を基礎にして製造された配列番号1及び配列番号2のメチル化されたDNA増幅用プライマーセットと配列番号3及び配列番号4のメチル化されていないDNA増幅用プライマーセットの二種類のプライマーを使用して重合酵素連鎖反応(Polymerase Chain Reaction、PCR)を遂行した。反応条件は、94℃で15秒、60℃で50秒、72℃で58秒で、総40回遂行した。
【００３０】
前記プライマーを使用してPCRを遂行すると、RUNX3遺伝子のメチル化による不活性化の有無を確認することができ、配列番号1及び配列番号2のプライマーセットによってDNAが増幅された場合、RUNX3がメチル化によって不活性化されていることを意味し、配列番号3及び配列番号4のプライマーセットによってDNAが増幅された場合、RUNX3がメチル化されていないことを意味する。
【００３１】
その結果、図1に示したように、20個体の正常な膀胱組織ではRUNX3遺伝子のプロモーター地域のメチル化が全く起きず、119個体の膀胱癌患者の組織では、88個体がメチル化され、74％のメチル化程度を示した。また、膀胱癌患者の癌再発率においても、癌細胞のRUNX3遺伝子がメチル化されていない患者では、61.11％の再発率を示したのに比べて、癌細胞のRUNX3遺伝子がメチル化された患者では、88％の再発率を示して癌細胞のRUNX3遺伝子がメチル化された患者の場合、再発率が非常に高いことが示された(表1)。
【００３２】
【表１】
2007537246.tif 000003
【００３３】
p=0.0036、OR=4.6667、95％ CI=1.5774-13.8064
【００３４】
癌の進行率においても下記の表2のように、RUNX3がメチル化されている癌組織で進行率が非常に高く現われた。すなわち、癌が進行した患者の中で 94.74％が癌細胞のRUNX3遺伝子がメチル化されていることが示され、癌の進行度においても、RUNX3遺伝子のメチル化が非常に重要な役割をすることが分かる。
【００３５】
【表２】
2007537246.tif 000004
【００３６】
p=0.0155、OR=9.00、95％CI=1.1236-72.0598
【００３７】
結論的に、細胞内でRUNX3遺伝子のメチル化は、癌の発生率を109倍増加させて、癌の再発及び進行においてもRUNX3遺伝子のメチル化が起きていない癌組織に比べて各々5倍及び9倍増加させることを確認することができた。
【００３８】
実施例2：ナイアシンアミドによるRUNX3の活性化分析
前記の実施例1で確認した結果を基に、本発明者らは癌抑制遺伝子RUNX3のメチル化を抑制することができる物質を検索して、ナイアシンアミド及びその誘導体がRUNX3遺伝子のメチル化を抑制することができることを確認した。
【００３９】
すなわち、RUNX3遺伝子がDNAメチル化によって不活性化された癌細胞株の培養液に、ナイアシンアミドを最終濃度が1mg/mlになるように4日間処理して、RUNX3遺伝子の発現を配列番号5のPs-CA及び配列番号6のPs-CBプライマーを使用して逆転写酵素重合酵素連鎖反応(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction、RT‐PCT)方法で検出した。その結果、図2に見られるように、ナイアシンアミドが胃癌細胞株であるSUN16及びMKN74、肺癌細胞株であるNCI-H226、NCI-H460及びSq-1、膀胱癌細胞株であるT24で不活性化されたRUNX遺伝子を活性化させられることを確認した。
【００４０】
実施例3：脱アセチル化によるRUNX3タンパク質の分解確認
RUNX3タンパク質の分解と脱アセチル化(deacetylation)との関係を調べるために、Sirt2(type III Histone deacetylase)とRUNX3を発現する遺伝子を細胞株に別々にまたは一緒に形質導入して、その効果を免疫沈澱(immunoprecipitation)及びウエスタンブロット(Western bloting)方法で分析した(Janeway等、Immunobiology. 5th ed. Garland Publishing、2001年)。
【００４１】
その結果、RUNX3に対する免疫沈澱(IP:RUNX3、IB:Sirt2)で、Sirt2タンパク質が検出されて、Sirt2に対する免疫沈澱(IP:Sirt2、IB:RUNX3)でRUNX3タンパク質が検出されることにより(図3)RUNX3とSirt2が物理的に結合することを確認した。また、RUNX3タンパク質の量がSirt2によって減少することを確認した(図3、IB:RUNX3)。
【００４２】
実施例4：ナイアシンアミドによるRUNX3タンパク質の量的増加確認
ナイアシンアミドによるRUNX3タンパク質の量的変化を観察するために、RUNX3、アセチル転移酵素(acetyltransferase、p300)、ジアセチラーゼ(deacetylase、Sirt2)を細胞内に発現させて前記細胞培地にナイアシンアミドを添加した。これを免疫沈澱(immunoprecipitation)及びウエスタンブロット(Western bloting)方法で分析した結果、Sirt2の発現によって減少したRUNX3タンパク質の量が(図4、レーン1、2)ナイアシンアミドの投与によって回復することが観察された(図4、レーン 3、4、5)。
【００４３】
実施例5：ナイアシンアミドの生体内での坑癌効果分析
ナイアシンアミドの生体内坑癌効果を確認するために、発ガン物質によって癌が誘導されたマウスを使用した癌形成抑制効果実験を遂行した。癌形成抑制効果分析は、発癌物質である0.05％(W/W)N-ブチル-N-4-ハイドロキシブチルニトロサミン(BBN)水溶液を飲用水として20週間提供したマウス群と0.05％BBN及び1％(W/W)ナイアシンアミド(10mg/ml)水溶液を飲用水として20週間提供したマウス群を比較することによって行った。前記で使用したマウスは、生後6週のC3H/HEマウスである。対照群には、水またはナイアシンアミド1％(W/W)水溶液を20週間投与して使用した。実験最終日にマウスを犠牲にして膀胱を摘出して、BUNX3遺伝子のメチル化様相と癌の形成有無及び癌の大きさを比較した。
【００４４】
前記実験群の膀胱癌発生様相は、図5及び図6のAに示したように肉眼及び顕微鏡で確認することができた。詳細には、BBNは、RUNX3エクソン1(exon1)部位のCpG島(island)のメチル化を誘導してRUNX3の活性を抑制するので、これを処理したマウス群では100％膀胱癌が発生した。BBNによって発生した癌は、浸潤性癌が80％、表在性癌が20％と現われた(表3)。
【００４５】
【表３】
2007537246.tif 000005
【００４６】
BBNと一緒にナイアシンアミドを投与したマウス群では、RUNX3エクソン1部位のCpG島のメチル化が顕著に低下され、膀胱癌の発生率が58％に減少しただけではなく(図5及び図6のB)、癌の悪性度も減少して浸潤性癌が23％、表在性癌が77％と現われた(表4)。前記した結果は、BBNによるRUNX3の不活性化をナイアシンアミドが抑制し、それによってBBNによる癌の形成もナイアシンアミドによって抑制されたことを意味する。
【００４７】
【表４】
2007537246.tif 000006
【００４８】
実施例6：ニコチン酸誘導体の生体内メチル化抑制分析
本発明者らは、ニコチン酸誘導体の生体内メチル化抑制の程度を分析してその結果を次のように示した。
【００４９】
【表５】
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【００５０】
前記実験の結果、BBNを処理したマウス群では、100％RUNX3遺伝子のメチル化が起きた。BBNとニコチン酸誘導体を一緒に投与したマウス群では、表4に示したようにメチル化が抑制された。したがって、前記ニコチン酸誘導体は、坑癌活性を示すと考えられる。
実施例7：マウスに対する経口投与急性毒性実験
マウス(C3H/HE 6マウス)を使用して、本発明のニコチン酸誘導体を含む製薬組成物の急性毒性実験を実施した。一群当たり2匹ずつのマウスに前記の製薬組成物を2g/kgの用量で毎日5ヶ月間飲用水として経口投与した。試験物質投与後の動物の斃死有無、臨床症状、体重変化を観察して血液学的検査と血液生化学的検査を実施した。部検して肉眼で腹腔臓器と胸腔臓器の異常有無を観察した。
【００５１】
試験の結果、試験物質を投与したすべての動物で特記に値する臨床症状や斃死した動物は、なかった。体重変化、血液検査、血液生化学検査、剖検所見等でも毒性変化は観察されなかった。以上の結果、実験された製薬組成物は、マウスにおいて2g/kgまで毒性変化を現わさず、経口投与最小致死量(LD50)は、5g/kg以上の安全な物質であると判断された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、ニコチン酸誘導体を有効成分として含む癌予防及び治療剤に関するもので、癌細胞内でメチル化(methylation)によって不活性化しているRUNX3遺伝子のメチル化を抑制することにより、前記遺伝子を活性化させるニコチン酸誘導体を有効成分として含む癌予防及び治療剤を提供する。本発明の癌予防及び治療剤は、胃癌、肺癌、肝臓癌、喉頭癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮癌または乳癌のようなRUNX3遺伝子の不活性化と関連した固形癌の予防及び治療剤として有用に使用することができ、大部分の既存抗癌剤が活発に分裂する細胞を選択的に殺すことにより坑癌効果を得るのとは異なり、癌細胞の癌抑制遺伝子を活性化させることによって癌を治療する原理を使用するので、既存抗癌剤の副作用を改善した新しい坑癌治療剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】Aは、正常細胞でRUNX3遺伝子のメチル化有無をPCRを通じて確認した電気泳動写真で、  M:メチル化されたDNA増幅  U:非メチル化されたDNA増幅  Bは、膀胱癌細胞でRUNX3遺伝子のメチル化有無をPCRを通じて確認した電気泳動写真で、  M:メチル化されたDNA増幅  U:非メチル化されたDNA増幅
【図２】ナイアシンアミド処理によってメチル化されたRUNX3遺伝子の活性化を示した写真である。
【図３】RUNX3がヒストンデアセチラーゼ(Histone deacetylase、Sirt2)と結合してその結果、RUNX3タンパク質の量が減少することを示した写真である。
【図４】ヒストンデアセチラーゼ(Sirt2)によるRUNX3タンパク質量の減少がRUNX3タンパク質アセチル化減少と相関関係があり、ナイアシンアミドの投与によって細胞内RUNX3タンパク質のアセチル化とRUNX3タンパク質量が増加することを示した写真である。
【図５】発ガン物質であるN-ブチル-N-4-ハイドロキシブチルニトロサミン(BBN)水溶液を飲用水として20週間提供したマウス群と、BBN及びナイアシンアミド水溶液を飲用水として20週間提供したマウス群の癌発病様相を比較した膀胱癌組織の肉眼観察写真である。
【図６】Aは、発ガン物質であるBBN水溶液を飲用水として20週間提供したマウス群の膀胱組織の顕微鏡写真である。
【００５４】
Bは、BBN及びナイアシンアミド水溶液を飲用水として20週間提供したマウス群の膀胱組織の顕微鏡写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号1及び配列番号2は、メチル化されたDNA増幅用プライマーセットで、
配列番号3及び配列番号4は、メチル化されていないDNA増幅用プライマーセットで、
配列番号5は、Ps-CAプライマーで、
配列番号6は、Ps-CBプライマーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年9月12日(2005.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式を有するニコチン酸、その誘導体または薬学的に許容可能な塩を含む腫瘍抑制遺伝子RUNX3の不活性化を通じた癌予防及び治療剤。
【化１】
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式中、R1は酸素またはイオウで、R2はH、OH、C1〜C10アルキル、NH2、NH-NH2、NH-C2H4-O-NO2-またはOR3(R3は、C1〜C5アルキルである)で、XはH、NH2またはハロゲン族原子であり、YはHまたはCH3である。
【請求項２】
R２は、C1〜C5アルキルである請求項１に記載の癌予防及び治療剤。
【請求項３】
ハロゲン族原子が、フッ素または塩素である請求項１に記載の癌予防及び治療剤。
【請求項４】
R2がCH3またはC2H5である請求項１に記載の癌予防及び治療剤。
【請求項５】
ニコチン酸誘導体が、ナイアシンアミド(Niacin amide)、ニコチン酸(Nicotinic acid)、6-アミノニコチンアミド(6-Aminonicotinamide)、イソニコチンアミド(Isonicotinamide)、イソニコチノヒドラジド(Isonicotinohydrazide)、N-メチルニコチンアミド(N-Methylnicotinamide)、ニコランジル(Nicorandil)、ピリジン-2-カボキシアミド(Pyridine-2-carboxamide)、チオニコチンアミド(thionicotin amide)、6-クロロニコチンアミド(6-Chloronicotinamide)からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の癌予防及び治療剤。
【請求項６】
癌が、胃癌、肺癌、肝臓癌、喉頭癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、乳癌からなる群から選択される請求項１に記載の癌予防及び治療剤。
【請求項７】
請求項１のニコチン酸、その誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を個体に投与する工程からなる腫瘍抑制遺伝子RUNX3の不活性化を通じた癌予防及び治療方法。
【請求項８】
ニコチン酸誘導体が、ナイアシンアミド(Niacin amide)、ニコチン酸(Nicotinic acid)、6-アミノニコチンアミド(6-Aminonicotinamide)、イソニコチンアミド(Isonicotinamide)、イソニコチノヒドラジド(Isonicotinohydrazide)、N-メチルニコチンアミド(N-Methylnicotinamide)、ニコランジル(Nicorandil)、ピリジン-2-カボキシアミド(Pyridine-2-carboxamide)、チオニコチンアミド(thionicotin amide)、6-クロロニコチンアミド(6-Chloronicotinamide)からなる群から選択される請求項７に記載の癌予防及び治療方法。
【請求項９】
癌が、胃癌、肺癌、肝臓癌、喉頭癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、乳癌からなる群から選択される請求項７に記載の癌予防及び治療方法。
【請求項１０】
ニコチン酸、その誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を、腫瘍抑制遺伝子RUNX3の不活性化を通じた癌の予防及び治療用医薬の製造に使用する用途。
【請求項１１】
ニコチン酸誘導体が、ナイアシンアミド(Niacin amide)、ニコチン酸(Nicotinic acid)、6-アミノニコチンアミド(6-Aminonicotinamide)、イソニコチンアミド(Isonicotinamide)、イソニコチノヒドラジド(Isonicotinohydrazide)、N-メチルニコチンアミド(N-Methylnicotinamide)、ニコランジル(Nicorandil)、ピリジン-2-カボキシアミド(Pyridine-2-carboxamide)、チオニコチンアミド(thionicotin amide)、6-クロロニコチンアミド(6-Chloronicotinamide)からなる群から選択される請求項１0に記載の用途。
【請求項１２】
癌が、胃癌、肺癌、肝臓癌、喉頭癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、乳癌からなる群から選択される請求項１0に記載の用途。
【請求項１３】
腫瘍抑制遺伝子RUNX3の不活性化による癌にかかった個体にニコチン酸、その誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を投与して、RUNX3またはRUNX3をコードする遺伝子を活性化させる方法。
【請求項１４】
癌にかかった個体は、RUNX3が脱アセチル化されたことを特徴とする請求項１3に記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍抑制遺伝子RUNX3の不活性化が、RUNX3遺伝子のメチル化によるものであることを特徴とする請求項１3に記載の方法。
【請求項１６】
癌が、胃癌、肺癌、肝臓癌、喉頭癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌または乳癌からなる群から選択される請求項１3に記載の方法。
【国際調査報告】
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