(57)【要約】  本発明は、非有機シリコン化合物もしくは金属(IV)化合物、アミノシラン(aminosilanes)およびシラザン(silazanes)からのアモルファス二酸化ケイ素(ケイ酸のシリカおよび縮合生成物)およびその他の高分子金属(IV)化合物の合成のための方法に関する。それによって(1)テンプレート(オルトケイ酸もしくは高分子ケイ酸およびそれの塩類もしくはその他の金属(IV)化合物と相互に作用するコラーゲンまたは別の分子)および(2)シリカーゼ(silicase)/炭酸脱水酵素、もしくはシリカテイン(silicatein)、もしくは類似ポリペプチドは、合成に使用される。前記発明は、さらにそれの技術的な使用に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アモルファス二酸化ケイ素（amorphous silicon dioxide）とその他の高分子金属（IV）化合物の合成方法であって、（１）テンプレートと、（２）基質として、非有機シリコン化合物又は金属（IV）化合物及び／又はアミノシラン（aminosilane）及びシラザン（silazane）と、（３）ポリペプチド（polypeptide）又はポリペプチドの金属錯体とを合わせて合成し、前記ポリペプチドが、配列番号1に示す配列と少なくとも２５％の割合で配列が一致する動物、植物、バクテリア、真菌の炭酸脱水酵素（carbonic anhydrase）ドメインを備えるか、或いは、前記ポリペプチドが配列番号3又は配列番号5に示す配列と少なくとも２５％の割合で配列が一致する動物、植物、バクテリア、真菌のシリカテインα（silicatein α）ドメインもしくはシリカテインβ（silicatein β）ドメインを備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
オルトケイ酸（orthosilicic acid）、オリゴマーケイ酸もしくは高分子ケイ酸（oligomeric or polymeric silicic acid）、並びにそれらの塩と相互作用する官能基、又はその他の純非有機金属（IV）化合物もしくはアミノシランもしくはシラザンと相互作用する官能基を備えたテンプレートが前記合成に使用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オルトケイ酸、オリゴマーケイ酸もしくは高分子ケイ酸、並びにそれらの塩などの化合物、又はその他の金属（IV）化合物が基質として使用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上のSi-N結合を含むアミノシランもしくはシラザンが、前記合成の基質として使用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記テンプレートが、水酸基を含む分子、分子集合体、又は表面であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記水酸基を含む分子が、コラーゲン（collagen）及び／又はシリカテイン（silicatein）であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記コラーゲンが、海綿由来コラーゲンであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記コラーゲンが、配列番号7に従う海綿由来のコラーゲン、又はそのアミノ酸配列が配列番号7に示す配列もくしはその一部と少なくとも２５％の割合で一致する前記コラーゲンに相同性のあるポリペプチドであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記シリカテインが配列番号3に従う海綿由来のシリカテイン、又はそのアミノ酸配列が配列番号3又は配列番号5に示す配列もしくはその一部と少なくとも２５％の割合で一致する前記シリカテインに相同性のあるポリペプチドであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
１つ以上のテンプレートの混合物を使用する請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号1に従うスベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）を由来とするシリカーゼ（silicase）のポリペプチド、又はその炭酸脱水酵素ドメインのアミノ酸配列が配列番号1に示す配列と少なくとも２５％の割合で一致する前記シリカーゼ（silicase）に相同性のあるポリペプチド、前記ポリペプチドの金属錯体、もしくはその一部を使用することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号1によるスベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）を由来とするシリカーゼ（silicase）のポリペプチド、又はその炭酸脱水酵素ドメインのアミノ酸配列が配列番号1に示す配列と少なくとも２５％の割合で一致する前記シリカーゼ（silicase）に相同性のあるポリペプチドをin vivo、細胞抽出物、細胞溶解物、もしくは精製状態にて得ることができることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号7に従う海綿を由来とするコラーゲン、又はそのアミノ酸配列が配列番号7に示す配列もくしはその一部と少なくとも２５％の割合で一致する前記コラーゲンに相同性のあるポリペプチドを、in vivo、細胞抽出物、細胞溶解物、もしくは精製状態にて得ることができることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
ガラス、金属、金属酸化物、プラスチック、バイオポリマー、又はその他の材料が表面として改変されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
アモルファス二酸化ケイ素又はその他の高分子金属（IV）化合物の特定の二次元構造及び三次元構造を合成することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
１．従来技術
シリコン化合物は、極めて経済的に重要である。シリコン化合物は特に、ガラス，繊維ガラスおよび磁器産業、セメント生産、セラミックス製造、塗料，ゴム，プラスチックおよび紙産業、洗剤産業、染料，石鹸および化粧品の製造、並びに歯科用製品の製造／修理等の医療／歯科分野において使用されている。一部のケイ酸塩（silicate）は、分子櫛・イオン交換特性と触媒特性とを有する（特に、CD Roempp Chemie Lexikon - version 1.0, Stuttgart/New York; Georg Thieme Verlag 1995を参照）。
【０００２】
オルトケイ酸（Orthosilicic acid (H4SiO4)）は、極く弱酸である。希薄溶液は、低pH（pH２〜３）において短時間しか安定しない。pHの増減によって、水分子が脱離して（縮合）、ジケイ酸（disilicic acid）（ピロケイ酸（pyrosilicic acid;H6Si2O7）が第１縮合生成物として生成される。結合数が幾分少ない(n＝３、４、もしくは６)その他の第１縮合生成物としては、環状ケイ酸（cyclic silicic acid）、ケージ状ケイ酸（cage-like silicic acid）、及びポリケイ酸（polysilicic acid）が挙げられる。これらのメタケイ酸（metasilicic acid）は、全体組成(H2SiO3)nを有する。鎖の伸張プロセスと分岐プロセスとが同時に不規則に発生するので、縮合の最終生成物は、アモルファス状の高分子二酸化ケイ素（polymeric silicon dioxide (SiO2)x）である。すべてのケイ酸において、シリコン原子は正４面体の中心に存在し、この正４面体の各角には４個の酸素原子が形成される。ポリケイ酸又はアモルファス二酸化ケイ素において、酸素原子は同時に、不規則的に相互連結する隣接４面体に属する。
【０００３】
１．１バイオシリカ（biosilica）
ケイ酸含有藻（珪藻）やケイ酸含有海綿の骨格は、アモルファスSiO2(「バイオシリカ」)からなる。これらの有機体におけるSiO2合成は、高い(構造的な)特異性と規則性といった特徴を有するので、特定の構造を微視的及び超微視的範囲(ナノ構造)で合成することができる。更に、ケイ酸含有海綿は、穏やかな状態下で、すなわち比較的低温低圧下でケイ酸塩構造を形成することができる。これは、これらの合成には特定の酵素が関与していることに基づく。これに対して、ケイ酸塩の化学合成には通常、高圧高温等の極端な状態が必要とされる。したがって、従来方法による多くのシリコン化合物の生成は、高コストでかつあまり環境を考慮した方法ではない。
【０００４】
SiO2骨格の合成において、ケイ酸塩形成有機体に関与する２つの酵素並びにそれらの技術使用については、これまでに開示例がある。第１の酵素は、シリカテインα（silicatein α）、シリカテインβ（silicatein β）、シリカテインγ（silicatein γ）の３つの型をとるシリカテイン（silicatein）に関する（PCT/US99/30601、環境的に無害な状態における、シリカ、ポリシロキサン、ポリメタロ−オキサン、及びポリ(シリコン／メタロ)オキサン混合材を生成するための方法、組成、並びにかかる生成のために、シリコンアルコキシド、金属アルコキシド、及びそれらの有機共役化合物に対して触媒し、重縮合を空間的に方向付けるために使用されるシリカテインやブロックコポリペプチド等のバイオメトリック触媒、発明者／出願人：DE Morse, GD Stucky, TD Deming, J Cha, K Shimizu, Y Zhou(特許文献１)。DE 10037270 A1、Silicatein-vermittelte Synthese von amorphen Silicaten und Siloxanen und ihre Verwendung、ドイツ特許庁、2000年、発明者／出願人：WEG Mueller, B Lorenz, A Krasko, HC Schroeder(特許文献２)。PCT/EP 01/08423、アモルファスケイ酸塩とシロキサンのシリカテインを媒体とした合成、及びその使用、発明者／出願人：WEG Mueller, B Lorenz, A Krasko, HC Schroeder(特許文献３)。シリカテインαは、海洋性ケイ酸含有海綿スベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）からクローニングされたものである（A Krasko, R Batel, HC Schroeder, IM Mueller, WEG Mueller (2000)、海洋性海綿S.ドムンクラ（S. domuncula）におけるシリカテインとコラーゲンの遺伝子の発現は、ケイ酸塩とミオトロフィンによりコントロールされる、Europ. J. Biochem. 267:4878-4887）(非特許文献１)。シリカテインβも同様にS.ドムンクラ（S. domuncula）からクローニングされたものであり、触媒能力と技術／医療適用性に関してシリカテインαと比べて若干有利な特性を有するという特徴がある（DE 103 52 433.9、「Enzymatische Synthese, Modifikation und Abbau von Silicium(IV)- und anderer Metall(IV)-Verbindungen」、ドイツ特許庁、2003年、出願人： Johannes Gutenberg University Mainz; 発明者: WEG Mueller, H Schwertner, HC Schroeder）(特許文献４)。
【０００５】
シリカテインαとシリカテインβとの両シリカテインとも、有機シリコン化合物(アルコキシシラン（alkoxysilane）)からアモルファス二酸化ケイ素(ポリケイ酸及びポリケイ酸塩（polysilicate）)を生成する技術分野の状態によってのみ可能である（JN Cha, K Shimizu, Y Zhou, SC Christianssen, BF Chmelka, GD Stucky, DE Morse (1999)、in vitroにてシリカとシリコンの重合が方向付けられる海洋性海綿由来シリカテイン糸状体とサブユニット、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:361-365(非特許文献２)、並びに上記の引用特許）。
【０００６】
第２の酵素はシリカーゼ（silicase）である（DE 102 46 186.4、「Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reverisiblen Enzyms」ドイツ特許庁 2002年、出願者：Johannes Gutenberg University Mainz. 発明者: WEG Mueller, A Krasko, HC Schroeder(特許文献５)。PCT/EP03/10983「Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms」欧州特許庁 2003年、出願人：Johannes Gutenberg University Mainz. 発明者：WEG Mueller, A Krasko, HC Schroeder(特許文献６); HC Schroeder, A Krasko, G Le Pennec, T Adell, M Wiens, H Hassanein, IM Mueller, WEG Mueller (2003)、生物由来のアモルファスシリカを分解する酵素、シリカーゼ（silicase）：デモ海綿体スベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）におけるシリカ分解の代謝への寄与、Prog. Mol. Subcell. Biol. 33:250-268(非特許文献３)）。シリカーゼ（silicase）、特に海洋海綿体S.ドムンクラ（S. domuncula）由来酵素は、アモルファスおよび結晶状の二酸化ケイ素を溶解することができる。この結果、ケイ酸が分離する。更にシリカーゼ（silicase）は炭酸脱水酵素（carbonic anhydrase）と同様に石灰材を溶解することができる。
【０００７】
この酵素が、適切なテンプレート(コラーゲン（collagen）など)の存在下において、非有機短鎖メタケイ酸塩（non-organic short-chain metasilicate）から又は１つ以上のSi-N結合を含むアミノシラン（aminosilane）もしくはシラザン（silazane）からアモルファス二酸化ケイ素(シリカ)を合成することに寄与可能なことはこれまで開示されていない。
【０００８】
１．２コラーゲン
コラーゲンは、エラスチン（elastin）、ポリアニオンプロテオグリカン（polyanionic proteoglycan）、構造糖タンパク（structural glycoprotein）に加えて、組織と臓器の細胞外マトリックスの主成分である。コラーゲン原繊維は、極めて大きな引張り強さを有する。したがってコラーゲン原繊維は特に、結合組織と支持組織に機械的安定性を付与することができる。更に、コラーゲン原繊維の形成は、創傷治癒において重要なプロセスの１つである。
【０００９】
脊椎動物において、コラーゲンはタンパク質スーパーファミリーを形成する。コラーゲンは１９種類の型に分類され、これらは少なくとも３３の異なる遺伝子からコードされている（Prockop and Kivinrikko (1995) Annu. Rev. Biochem. 64:403-434(非特許文献４）。コラーゲンファミリーには線維性タンパク質、非線維性タンパク質が含まれる。線維性コラーゲンであるI型、II型、III型、V型、XI型は、任意のバンド型（band pattern）で原繊維を形成することができる。いわゆる非線維性コラーゲンは、線維性コラーゲンと共に存在する(原繊維連結コラーゲン)場合や、基底膜内に存在する(IV型、基底膜コラーゲン)場合がある。さらに、短鎖コラーゲンもこのグループに属する。XV型やXVIII型等の一部のコラーゲンは、そのcDNAに基づいてのみ公知である。
【００１０】
すべてのコラーゲンに共通する構造特性は、三重らせん構造である。この三重らせん構造は、繰返し配列G-x-y(xは通常プロリン（proline）、yは多くの場合ヒドロキシプロリン（hydroxyproline）)を有する３本の織り合わさったポリペプチド鎖(α鎖)からなる。このトリプレットにより、コラーゲンαへリックスの特徴的ヘリカル構造と、類似ポリペプチド鎖を三重らせん構造に組み合わせるその特性とが定まる（Brodska and Ramshaw (1997), Matrix Biol. 15:545-554(非特許文献５))。三重らせんは通常、異なる型のコラーゲン(α１、α２、α３)のポリペプチド鎖からなる。結果として得られる構造は、らせん軸近傍のグリシン（glycine(小アミノ酸)）の位置、プロリンの安定化作用および水素架橋結合形成のために非常に安定している（Bella et al. (1994), Science 266:75-81(非特許文献６)）。
【００１１】
I型のコラーゲンは、有機体におけるコラーゲンの主量をなす。II型のコラーゲンは、軟骨の原繊維形成コラーゲンである。これらの型のコラーゲンは、３つのα鎖が互いにはめ合った状態をなす。この場合、トロポコラーゲン（tropocollagen）分子の長さは、２８０nmである。コラーゲン原繊維にはこれらのコンポーネントのオフセット配置がみられる。これらの分子のねじれ配置の結果として、コラーゲン繊維内の横ストリップは６８nmごとに存在する。
【００１２】
いわゆる少数派コラーゲンにおいては、三重らせんは分子の一部の部分にしか見られず、その他の部分は球状ドメインを有する。これらにはIV〜XIX型のコラーゲンが含まれる。ただし、V型とXI型の少数派コラーゲンも、繊維構造を形成する。IV型のコラーゲンは、空間的市松模様構成を有し、基底膜に存在することで特徴付けられている。間質性結合組織にみられるVI型のコラーゲンは、比較的短い三重らせんのみを有し、この型のダンベル状コラーゲンの末端における２つの球状ドメインは、I型のコラーゲン及び膜内におけるインテグリン（integrin）と相互に作用する。VII型のコラーゲンは、扁平上皮下の基底膜を固定するよう働く。VIII型とX型のコラーゲンは、短鎖コラーゲンである。VIII型のコラーゲンは、６面網状に結合する。IX型のコラーゲンは、原繊維関連コラーゲンに属し、内軟骨組織の石灰化領域においてII型のコラーゲンと共に存在する。
【００１３】
１．２．１海綿由来コラーゲンのクローニングとシーケンシング
コラーゲンは、海綿の細胞外マトリックスの主要タンパク質でもあり、骨片形成(海綿の針の形成)のマトリックスとして機能する（Krasko et al. (2000), Eur. J. Biochem. 267:4878-4887(非特許文献１)）。海綿のコラーゲン繊維は、脊椎動物のコラーゲン繊維と非常に似ている（Gross et al. (1956), J. Histochem. Cytochem. 4:227-246(非特許文献７); Garrone et al. (1975), J. Ultrastruct. Res. 52: 261-275(非特許文献８); Garrone (1978)、結合組織の系統発生(Phylogenesis of connective tissue)、Karger, Basel(非特許文献９)）。海洋性海綿ジオジア・シドニウム（Geodia cydonium）由来コラーゲンの電子顕微鏡的調査によれば、コラーゲン繊維は厚さ２０〜２５nmで周期は１９．５nmである（Diehl-Seifert et al. (1985), J. Cell Sci. 79:271-285(非特許文献１０); Gramzow et al. (1988), J. Histochem. Cytochem. 36:205-212(非特許文献１１)）。海洋性海綿S.ドムンクラ（S. domuncula）により我々がクローニングしたコラーゲン（Schroeder et al. (2000), FASEB J. 14:2022-2031(非特許文献１２)）は、（i）非コラーゲンN末端ドメイン、（ii）コラーゲン内部ドメイン、（iii）非コラーゲンC末端ドメインからなる。S.ドムンクラ（S. domuncula）において内部ドメインは、著しく短く、わずか２４個のG-x-yコラーゲントリプレットを有する。これに対して、淡水性海綿エフィダチア・ムレリ（Ephydatia muelleri）のコラーゲンは、２つの内部ドメインを有し、７９個のG-x-yトリプレットを有する（Exposito et al. (1991), J. Biol. Chem. 266:21923-21928(非特許文献１３)）。したがって、線維性海綿コラーゲンの遺伝子コード構造は、脊椎動物コラーゲンの遺伝子コード構造と非常に似ている。
【００１４】
海綿の細胞におけるコラーゲンの発現(個々の海綿細胞から形成された特別な形態である３D細胞集合体であるプリモルフ（primmorph）を使用。DE 19824384、 Herstellung von Primmorphe aus dissoziierten Zellen von Schwaemmen, Korallen und weiteren Invertebraten: Verfahren zur Kultivierung von Zellen und Schwaemmen und weiteren Invertebraten zur Produktion und Detektion von bioaktiven Substanzen, zur Detektion von Umweltgiften und zur Kultivierung dieer Tiere in Aquarien und im Freiland、発明者及び出願人：WEG Mueller, F Bruemmer(特許文献７); Mueller et al. (1999), Mar. Ecol. Prog. Ser. 178:205-219(非特許文献１１))は、ミオトロフィン（myotrophin）によって刺激される(Schroeder et al. (2000) FASEB J. 14:2022-2031(非特許文献１２); Krasko et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267:4878-4887(非特許文献１))。ミオトロフィンは、同じくS.ドムンクラ（S. domuncula）から本発明者らがクローニングした成長促進タンパク質である。
【特許文献１】国際公開第00/035993号パンフレット
【特許文献２】独国特許出願公開第10037270A1号明細書
【特許文献３】国際公開第02/010420号パンフレット
【特許文献４】独国特許出願公開第10352433A1号明細書
【特許文献５】独国特許出願公開第10246186B4号明細書
【特許文献６】国際公開第04/033679号パンフレット
【特許文献７】独国特許出願公開第19824384B4号明細書
【非特許文献１】Krasko et al. (2000),Europ. J. Biochem. 267:4878-4887
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:361-365
【非特許文献３】Prog. Mol. Subcell. Biol. 33:250-268
【非特許文献４】Prockop and Kivinrikko (1995) Annu. Rev. Biochem. 64:403-434
【非特許文献５】Brodska and Ramshaw (1997), Matrix Biol. 15:545-554
【非特許文献６】Bella et al. (1994), Science 266:75-81
【非特許文献７】Gross et al. (1956), J. Histochem. Cytochem. 4:227-246
【非特許文献８】Garrone et al. (1975), J. Ultrastruct. Res. 52: 261-275
【非特許文献９】Garrone (1978)、結合組織の系統発生(Phylogenesis of connective tissue)、Karger, Basel
【非特許文献１０】Diehl-Seifert et al. (1985), J. Cell Sci. 79:271-285
【非特許文献１１】Gramzow et al. (1988), J. Histochem. Cytochem. 36:205-212
【非特許文献１２】Schroeder et al. (2000), FASEB J. 14:2022-2031
【非特許文献１３】Exposito et al. (1991), J. Biol. Chem. 266:21923-21928
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
２．発明の主題
驚くべきことに、本発明者らは今回、シリカーゼ（silicase）およびその他の炭酸脱水酵素、シリカテインが、コラーゲン等の適切なテンプレートの存在下で非有機シリコン化合物、特にメタケイ酸塩（metasilicate）、１つ以上のSi-N結合を有するアミノシラン、もしくはシラザンをシリカに変換することができることを示すことができた。これまでは、シリカテインは、１つ以上のSi-O 結合を有する有機シリコン化合物（アルコキシシラン（alkoxysilane））の加水分解を触媒することのみしか知られていなかった（続いて、アモルファス二酸化ケイ素（amorphous silicon dioxide）生成下で分離したシラノール（silanol）の縮合が起きる。Zhou et al. (1999), Angew. Chem. [int. ed.] 38:780-782; PCT/US99/30601(特許文献１); DE 10037270 A1(特許文献２); PCT/EP01/08423(特許文献３)を参照）。炭酸脱水酵素ドメインを含む酵素については、ケイ酸(silicate acid)の分離下において、アモルファス及び結晶性の二酸化ケイ素のみならず無機ポリケイ酸塩（ポリケイ酸（polysilicic acid））を分裂できることが知られている（Schroeder et al. (2003), Prog. Mol. Subcell. Biol. 33:250-268(非特許文献３); DE 102 46 108.4; PCT/EP 03/10983(特許文献６)）。しかしながら、それに対して、炭酸脱水酵素ドメインを含む酵素が、オルトケイ酸塩（orthosilicate）やメタケイ酸塩（metasilicate）からのアモルファス二酸化ケイ素（シリカ）のテンプレート制御合成を触媒できることについては知られていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第一態様によれば、アモルファス二酸化ケイ素（シリカ、ケイ酸の縮合生成物）及びその他の金属（IV）化合物のin vitro 又はin vivoでの合成方法を広く利用可能ならしめる。この方法においては、ポリペプチドもしくはポリペプチドの金属錯体が使用され、これらは以下のいずれかの特徴を有する。すなわち、前記ポリペプチドは、配列番号1に示す配列と少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％の割合で配列が一致する動物、植物、バクテリア、真菌の炭酸脱水酵素ドメインを備えるか、又は、前記ポリペプチドは、配列番号3もしくは配列番号5に示す配列と少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％の割合で配列が一致する動物、植物、バクテリア、真菌のシリカテインαドメインもしくはシリカテインβドメインを備える。
【００１７】
本発明の他の一態様は、配列番号7によるS.ドムンクラ（S. domuncula）由来コラーゲンのポリペプチド、又はそのアミノ酸配列が配列番号7に示す配列と少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％の割合で一致するか、もしくはその一部を含むか、もしくはその構成からなる前記コラーゲンに相同性のあるポリペプチドを有するテンプレートの使用に関する。
【００１８】
本発明によるテンプレート（コラーゲンもしくはその他のポリペプチド）は、合成的に生成されたもの、又は原核細胞／真核細胞からの抽出物もしくは細胞溶解物において存在するものであるという特徴を有する。細胞抽出物もしくは細胞溶解物は、例えば組換え細菌細胞もしくは海洋性海綿等から、ex vivoもしくはex vitroにて細胞から得ることができる。
【００１９】
本発明によるテンプレート（コラーゲン又はその他のポリペプチド）は、従来技術で公知の従来方法に従って精製することができる。したがって、実質的に他のタンパク質を含まない。
【００２０】
本発明による方法は、ケイ酸（オルトケイ酸及びメタケイ酸）もしくはそれらの塩（オルトケイ酸塩及びメタケイ酸塩）等の化合物、又はその他の金属（IV）化合物を反応物質（基質）として合成に使用する特徴を有することが好ましい。
【００２１】
更に、本発明による方法は、１つ以上のSi-N結合を含む特徴を有する、アルキルアミノシラン（alkylaminosilane）及びジアルキルアミノシラン（dialkylaminosilane）、ビス(アルキルアミノ)シラン（bis(alkylamino)silane）もしくはビス(ジアルキルアミノ)シラン（bis(dialkylamino)silane）、トリス（アルキルアミノ）シラン（tris(alkylamino)silane）もしくはトリス（ジアルキルアミノ）シラン（tris(dialkylamino)silane）、テトラキス（アルキルアミノ）シラン（tetrakis(alkylamino)silane）もしくは（ジアルキルアミノ）シラン（(dialkylamino)silane）等の化合物、並びにこれらの化合物のアルキル置換又はアリル置換誘導体（通常アミノシラン）を、合成に使用する特徴を有することが好ましい。
【００２２】
更に、本発明による方法は、ジシラザン（disilazane）、トリシラザン（trisilazane）、テトラシラザン（tetrasilazane）、ポリシラザン（polysilazane）、並びにこれらの化合物のアルキル置換又はアリル置換誘導体（通常シラザン（silazane））、さらに環式化合物（シクロトリシラザン（cyclotrisilazane）、シクロテトラシラザン（cyclotetrasilazane）、及びその他の誘導体）を合成に使用する特徴を有することが好ましい。
【００２３】
本発明の他の態様は、ガラス、金属、金属酸化物、プラスチック、バイオポリマー、又はその他の材料の表面の改変のための方法の使用である。
【００２４】
本発明の他の態様によれば、前記方法は、アモルファス二酸化ケイ素（シリカ、ケイ酸縮合生成物）及びその他の高分子金属（IV）化合物の特定の二次元構造及び三次元構造を合成するために使用することができる。
【００２５】
本発明の更に他の態様は、本発明による方法で得られた、化合物、又はシリカ（アモルファス二酸化ケイ素）含有構造、又は表面に関する。
【００２６】
配列番号2は、海綿シリカーゼ（silicase）cDNAのヌクレオチド配列を示す。配列番号1は、ヌクレオチド配列由来の海綿シリカーゼ（silicase）（SIA_SUBDO）のポリペプチドを示す。得られた海綿シリカーゼ（silicase）のアミノ酸配列は、炭酸脱水酵素ファミリーのアミノ酸配列に非常に似ている。海綿シリカーゼ（silicase）には、真核型炭酸脱水酵素ドメイン（PFAM00194 [www. ncbi.nim.nig.gov]）がアミノ酸範囲aa87〜aa335においてみられる。海綿シリカーゼ（silicase）には、真核型炭酸脱水酵素の特性をなす特徴的アミノ酸も多く存在する（Fujikawa-Adachi et al. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1431:518-524; Okamoto et al. (2001) Biochim. Biophys. Acta 1518:311-316。
【００２７】
炭酸脱水酵素は、亜鉛金属酵素ファミリーを形成する（Sly and Hu (1995) Annu. Rev. Biochem. 64:375-401）。アミノ酸（aa181, aa183, aa206）中のシリカーゼ（silicase）には、３つの亜鉛結合保存ヒスチジン（histidine）グループがみられる（配列番号1を参照）。
【００２８】
本発明による方法においては、海綿シリカーゼ（silicase）に加えて、（部分的に市販で手に入る）他の有機体由来の炭酸脱水酵素も使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明を更に詳細に、以下に添付の実施形態を挙げて説明を行うが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。添付の配列と図面の内容は下記のとおりである。
【００３０】
配列番号1：本発明により使用されたS.ドムクラ（S. domucula）（SIA_SUBDO）由来シリカーゼ（silicase）のアミノ酸配列である。
配列番号2：本発明により使用されたS.ドムンクラ（S. domuncula）由来シリカーゼ（silicase）の核酸配列である。
配列番号3：本発明により使用されたS.ドムンクラ（S. domuncula）（SIA_SUBDO）由来シリカテインαのアミノ酸配列である。
配列番号4：本発明により使用されたS.ドムンクラ（S. domuncula）由来シリカテインαの核酸配列である。
配列番号5：本発明により使用されたS.ドムンクラ（S. domuncula）（SIA_SUBDO）由来シリカテインβのアミノ酸配列である。
配列番号6：本発明により使用されたS.ドムンクラ（S. domuncula）由来シリカターゼ（silicatase）βの核酸配列である。
配列番号7：本発明により使用されたS.ドムンクラ（S. domuncula）（SIA_SUBDO）由来コラーゲン３のアミノ酸配列である。
配列番号8：本発明により使用されたS.ドムンクラ（S. domuncula）由来コラーゲン３の核酸配列である。
【００３１】
３．本方法に必要な化合物の生成と実証
３．１．シリカーゼ（silicase）の生成
組織もしくは細胞等の天然資源由来シリカーゼ（silicase）の精製、並びに酵素の組換え生成についてはこれまで記載例があり、従来技術は以下のとおりである。（DE 102 46 186.4、Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms、ドイツ特許庁2002年、出願人：Johannes Gutenberg University Mainz、発明者：WEG Mueller, A Krasko, HC Schroeder(特許文献５)。PCT/EP03/10983、Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms、欧州特許庁2003年、出願人：Johannes Gutenberg University Mainz、発明者：WEG Mueller, A Krasko, HC Schroeder(特許文献６)。）
【００３２】
海洋性海綿S.ドムンクラ（S. domuncula）由来シリカーゼ（silicase）のcDNA（SDSIA）コード、並びにヌクレオチド配列に由来するポリペプチド（SIA_SUBDO）は、以下の特性を有する。cDNAの長さ：１３９５ヌクレオチド（nt）、読取り枠：nt122 - nt124からnt1259 - nt1261（終止コドン）、ポリペプチドの長さ：３７９アミノ酸、ポリペプチドの相対分子量（Mr）：４３１３１、等電点（pl）：６．５。
【００３３】
組換えS.ドムンクラ（S. domuncula）シリカーゼ（silicase）は、本実施形態で説明する実験用にグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質（glutathione S transferase（GST）fusion protein）として生成した。S.ドムンクラ（S. domuncula）シリカーゼ（silicase）のcDNA（SDSIAと呼ばれる）コードの長断片及び短断片は、GST遺伝子を含むpGEX-4T-2プラスミドにクローニングした（図２）。３２kDaサイズのシリカーゼ（silicase）の精製短型の結果を以下に示す。長型（Mr 43 kDa）についても同様な結果を得たが、低効率であった。
【００３４】
別の代替法として、オリゴヒスチジン（oligo-histidine）発現ベクターpBAD/gIIIA（インビトロジェン（Invitrogen））を用いたE.coliにおける組換えシリカーゼ（silicase）の生成を行った。この場合、組換えタンパク質は、III型遺伝子シグナル配列により細胞膜周辺腔に分泌される（図３-１、３-２）。シリカーゼ（silicase）（短型）のcDNA配列コードは、プライマー（フォワードプライマー：ATACTC GAG TCG AAA TGC CAC CGT CAC TTC TCC ACA TCA、リバースプライマー：ATATCT AGA AA CCA ATA TAT CTT CCT GAC CAG CTC TCT）を使ってPCRで増幅し、pBAD/gIIIAにクローニングする（発現ベクターに挿入するための制限核酸分解酵素：Xhol、Xbal）。E.Coli XL1-blueの形質転換後、Lアラビノース（L-arabinose）で融合タンパク質の発現を誘発する。
【００３５】
同様に、誘導シリカーゼ（silicase）タンパク質（長型）全体についても挿入手法を適用することができる。
【００３６】
３．２．シリカテインの生成
組織や細胞等の天然資源由来シリカーゼ（silicase）α及びシリカテインβの精製、並びに酵素の組換え生成についてはこれまで開示例がある。従来技術は以下のとおりである。（DE 10037270 A 1、Silicatein-vermittelte Snythese von amorphen Silicaten und Siloxanen und ihre Verwendung、ドイツ特許庁 2000年、出願人及び発明者：WEG Mueller, B Lorenz, A Krasko, HC Schroeder(特許文献２)；PCT/EP 01/08423、アモルファスケイ酸塩とシロキサンのシリカテインを媒体とした合成、並びにその使用、発明者／出願人：WEG Mueller, B Lorenz, A Krasko, HC Schroeder(特許文献３)；DE 103 52 433.9、Enzymatische Synthese, Modifikation und Abbau von Silicium(IV)- und anderer Metall(IV)-Verbindungen、 ドイツ特許庁 2003年、出願人：Johannes Gutenberg University Mainz、発明者：WEG Mueller, H Schwertner, HC Schroeder(特許文献４)）。
【００３７】
本実施形態の実験用に、オリゴヒスチジン発現ベクターpBAD/gIIIA（インビトロジェン）を用いたE.coliにおける組換えシリカテインαの生成を行った。この場合、組換えタンパク質は、III型遺伝子シグナル配列により細胞膜周辺腔に分泌される。シリカーゼ（silicase）（短型）のcDNA配列コードは、プライマー（フォワードプライマー：TAT CC ATG GAC TAC CCT GAA GCT GTA GAC TGG AGA ACC、リバースプライマー：TAT T CTA GA A TTA TAG GGT GGG ATA AGA TGC ATC GGT AGC）を使ってPCRで増幅し、pBAD/gIIIAにクローニングする（発現ベクターに挿入するための制限核酸分解酵素：NcolとXbal）。E.Coli XL1-blueの形質転換後、Lアラビノースで融合タンパク質の発現を誘発する。
【００３８】
組換え海綿シリカテインポリペプチド（短型）は、分子量が最大28.5 kDa（〜26 kDaはシリカテイン、2 kDaはベクター）で、等電点plは６．１６である。
【００３９】
同様に、誘導シリカテインαタンパク質（長型）全体についても挿入手法を適用することができる。
【００４０】
３．３．海綿コラーゲンの生成
天然コラーゲン（例えばウシのコラーゲン等の脊椎動物由来、並びに（海洋性デモ海綿等の）無脊椎動物由来）と、組換えコラーゲン（特に、海洋性海綿S.ドムンクラ（S.domuncula）由来）とは共にテンプレートとして使用することができる。以下、これらを生成する方法をいくつか説明する。
【００４１】
３．３．１．天然海綿コラーゲンの単離
様々な海洋性海綿由来コラーゲンを単離する簡単な方法については、これまで開示例がある。（DE 100 10 113 A 1、Verfahren zur Isolierung von Schwammkollagen sowie Herstllung von nanopartikulaerem Kollagen、出願人：W. Schatton、発明者：J Kreuter, WEG Mueller, W. Schatton, D Swatschek, M Schatton; Swatschek et al. (2002) Eur. J. Pharm. Biopharm. 53:107-113）。海綿コラーゲンは、高収率（＜30％）で得られる。
【００４２】
３．３．２．組換え海綿コラーゲンの生成
組換えコラーゲンの生成に使用されるクローンは、海洋性海綿スベリテス・ドムンクラ（Suberites Domuncula）由来非線維性コラーゲン（コラーゲン３）をコードする。このコラーゲンは（１）比較的低分子量、（２）翻訳後に更なる組換えが行われないという利点を有する。
【００４３】
コラーゲン３のcDNA配列コードは、適切なプライマーを使用してPCRで増幅し、適切な発現ベクターにサブクローニングすることができる。発現は特に、オリゴヒスチジン発現ベクターであるpBAD/gIIIA（インビトロジェン）とpQTK_1（キアジェン（Qiagen））を使用して成功裏に実施した。PCRのプライマーとしては以下のものを使用することができる。（pBAD/gIIIAを使用）。フォワードプライマー：TAT cc atg gTG GCA ATA TCA GGT CAG GCT ATA GGA CCT C、リバースプライマー：TAT AA GC TT CGC TTT GTG CAG ACA ACA CAG TTC AGT TC、発現ベクターに挿入するための制限核酸分解酵素：NcoIとHindIII。エシェリキア・コライ（Escherichia coli）株XL1-blueをプラスミド（発現ベクター）で形質転換した後、L‐アラビノースで（pBAD/gIIIA使用時）又はイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノサイド（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）（IPTG、pQTK_1使用時）で融合タンパク質の発現を誘発する。発現ベクターpBAD/gIIIAの利点としては、組換えタンパク質がIII型遺伝子のシグナル配列により細胞膜周辺腔に分泌されている点が挙げられる。シグナル配列は、膜通過後に除去される。pQTK_1を使用すると、バクテリアがPBS/8 M尿素で抽出される。超音波処理後、懸濁液を遠心分離機にかける。上澄みからの融合タンパク質の精製は、Hochuliら（J. Chromatogr. 411:177-184; 1987）の説明に従ってNi-NTA アガロース（agarose）マトリックス（キアジェン）を用いて金属キレート親和性クロマトグラフィーにて行う。抽出物をカラムに置いた後、PBS/尿素で洗浄し、融合タンパク質はPBS/尿素中イミダゾル（imidazol）150 mMでカラムから溶離する。
【００４４】
コラーゲン調製物の特性付けは、SDS-PAGE、アミノ酸組成や等電点の測定、並びに電子顕微鏡検査を使用して特定する。
【００４５】
分子量、等電点：分子量の測定は、SDS-PAGEによって行うことができる。上記プライマーを使用して増幅されたcDNAの発現後得られるタンパク質の分子量は、最大２８．５ kDaである。
【００４６】
等電点（IEP）は、水溶液滴定によって測定することができる。海綿コラーゲンのIEPは、おおむね約pH ６．５〜８．５（参考までに、ウシのコラーゲンのIEPはpH７．０±０．０９）である。配列番号8に示したcDNA由来ペプチド（配列番号7を参照）は、上記の等電点８．１８５を有する。pH７．０における電荷は４．９４６である。
【００４７】
アミノ酸組成：アミノ酸組成の測定は、自動アミノ酸アナライザを使用して行うことができる。
【００４８】
電子顕微鏡検査：単離海綿コラーゲンの電子顕微鏡による特性付けは、透過型電子顕微鏡（TEM）により行うことができる。このために、凍結乾燥コラーゲンのサンプルを、２％リン−タングステン酸（phosphorus-tungsten acid）を使用し陰性造影する（Harris、逆染色法と極低温顕微鏡検査(Negative staining and cryoelectron microscopy)、Royal Microscopical Society Microscopy Handbook No. 35. BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford, UK）。
【００４９】
３．４．シリカーゼ（silicase）活性の実証
（市販の）炭酸脱水酵素の調製品（例えばCalbiochem company のウシの赤血球）のシリカーゼ（silicase）活性の実証方法、及び／又は組換え海綿シリカーゼ（silicase）の実証方法については、これまでに開示例がある（DE 102 46 186.4(特許文献５); PCT/EP03/10983(特許文献６)）。
【００５０】
３．５．シリカテイン活性の実証
シリカテイン活性（シリカテインαとシリカテインβ）の実証方法については、これまでに開示例がある（PCT/US99/30601(特許文献１); DE 10037270 A 1(特許文献２); PCT/EP01/08423(特許文献３); DE 103 52 433.9(特許文献４)）。
【００５１】
ケイ酸は、定量的に測定することができる。これは例えば、比色シリコン試験等のモリブデン支援実証法によって可能である（Merck; 1.14794）。ケイ酸の量は、８１０nmでの吸光度からシリコンスタンダード（Merck 1.09947）の較正曲線を用いて計算することができる。
【００５２】
４．シリカ合成方法の説明
本発明による方法において、ケイ酸は、テンプレートおよび酵素と共に、メタケイ酸塩（ナトリウム塩（sodium salt）もしくはその他のアルカリ、アルカリ土類、金属イオンの塩）、シリコン錯体（シリコンカテコレート[ジカリウムトリカテコレートシリコン]（silicon catecholate [dipotassiumtricatecholateosilicon]）等の遊離オルトケイ酸（orthosilicic acid）、もしくはオルトケイ酸塩（orthosilicate）と平衡である）の形、又はオルトケイ酸、オルトケイ酸塩の形をとってインキュベートされ、そのインキュベーションは適切な緩衝液（例えば、トリスHCl（tris-HCl）５０mM（pH ７．０）、 NaCl  １００mM、ZnSO4  ０．１mM、βメルカプトエタノール（β mercaptoethanol）０．１mM又はその他の緩衝液；Zn酵素を構成するシリカーゼ（silicase）もしくは炭酸脱水酵素を用いたインキュベーション時にはZnの存在下が有利）中で、シリカ（アモルファス二酸化ケイ素（amorphous silicon dioxide））の生成要求量に応じた時間、行われた。インキュベーションは、様々な温度で実施することができる。室温（２２℃）は有利であることが分っているが、より高温（例えば３７℃）もしくは低温（１５℃）でも成功裏に使用可能である。
【００５３】
このためには、メタケイ酸塩を使用緩衝液に溶解させてもよいし、又は事前に（比較的高濃度の原液として）アルカリ溶液（例えば０．０１NのNaOH）に溶解させてもよい。後者の場合、得たメタケイ酸塩溶液は中和しなければならない（pH：７．２がより有利）。
【００５４】
テンプレートは、オルトケイ酸、オリゴマーもしくは高分子ケイ酸、並びにそれらの塩（オルトケイ酸塩、メタケイ酸塩）と相互に作用する官能基を備えた１つ以上の様々な分子、分子集合体、もしくは表面である。
【００５５】
水酸基を含む分子がコラーゲン又はシリカテインである場合有利であることが分った（図７〜１０を参照）。
【００５６】
コラーゲンが海綿由来コラーゲンである場合、特に、配列番号7によるコラーゲン、又はそのアミノ酸配列が配列番号7に示す配列もしくはその一部と少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％の割合で一致する前記コラーゲンに相同性のあるポリペプチドである場合に特に有利であることが分った。配列番号7に示すコラーゲンは、海洋性海綿S.ドムンクラ（S.domuncula）由来非線維性コラーゲン（コラーゲン３）である。このコラーゲンは、線維性のウシのコラーゲンよりもより有効であることが分った（図１０参照）。
【００５７】
更に、シリカテインが配列番号3による海綿由来シリカテイン、又は、そのアミノ酸配列が配列番号3に示す配列もしくはその一部と少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％の割合で一致する前記シリカテインに相同性のあるポリペプチドである場合に特に有利であることが分った。（図７〜１０参照）。
【００５８】
シリカテインα（配列番号3）の他に、シリカテインβ（配列番号5）、又はそのアミノ酸配列が配列番号5に示される配列もしくはその一部と少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％の割合で一致する前記シリカテインβに相同性のあるポリペプチドも使用可能である。
【００５９】
１つ以上のテンプレートの混合物（例えばコラーゲンとシリカテインとの混合物）も使用可能である（図７〜１０を参照）。
【００６０】
配列番号7による海綿由来コラーゲン、又はそのアミノ酸配列が配列番号7に示す配列もしくはその一部と少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％の割合で一致する前記コラーゲンに相同性のあるポリペプチドを、in vivo、細胞抽出物、細胞溶解物、もしくは精製状態にて得ることができる。
【００６１】
酵素は、配列番号1によるスベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）を由来とするシリカーゼ（silicase）のポリペプチド、又はその炭酸脱水酵素ドメインのアミノ酸配列が配列番号1に示される配列と少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％の割合で一致する前記シリカーゼ（silicase）に相同性のあるポリペプチド、ポリペプチドの金属錯体もしくはその一部である（図７〜１０を参照）。
【００６２】
配列番号1によるS.ドムンクラ（S.domuncula）を由来とするシリカーゼ（silicase）のポリペプチド、又はその炭酸脱水酵素ドメインのアミノ酸配列が配列番号1に示す配列と少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％の割合で一致する前記シリカーゼ（silicase）に相同性のあるポリペプチドをin vivo、細胞抽出物、細胞溶解物、もしくは精製状態にて得ることができる。
【００６３】
ウシの赤血球由来の炭酸脱水酵素等の市販の炭酸脱水酵素も有利に使用可能である（図７〜１０を参照）。
【００６４】
遊離ケイ酸を合成するカテコールを添加することによって、非水溶性SiO2の量が減少する（図７及び１０を参照）。
【００６５】
コラーゲン、シリカテイン、及び炭酸脱水酵素の存在下で、並びに、コラーゲンとシリカテインの存在下で、最大量のアモルファスシリカが合成される（図７を参照）。コラーゲンと炭酸脱水酵素の存在下で、非水溶性SiO2の量が減少するより少量の非水溶性SiO2が得られる（図７を参照）。シリカテインを用いた事前インキュベーションによっても、適用条件（インキュベーション時間）に応じてSiO2の生成が減少する（図８を参照）。コラーゲンが存在しない場合であって、シリカテイン、もしくは炭酸脱水酵素、又は両方の酵素を用いた場合には、わずかに若干量の非水溶性SiO2が生成される（図７を参照）。テンプレートとしてシリカテインとコラーゲンの代わりにＢＳＡを用いた対照実験では、わずかに若干量の非水溶性SiO2が生成された（図７〜９を参照）。
【００６６】
非水溶性SiO2の生成量は、炭酸脱水酵素の濃度が増大するにつれて増大する（図８、９を参照）。
【００６７】
更に、SiO2の生成量は、使用テンプレートの濃度に依存する。例えばシリカテインα（図８を参照）又はコラーゲン（図９を参照）の濃度が増大すると、SiO2の生成量も増大する。
【００６８】
Naメタケイ酸塩の濃度が増大しても、SiO2の生成量が更に増大することはなく、むしろ減少する（図９を参照）。
【００６９】
メタケイ酸塩の他にも、シリコン錯体（例えばシリコン−カテコール錯体）を使用することができる。この場合も同じく、コラーゲンの量が増大すると、SiO2の生成量も増大する（図１０を参照）。ただし、メタケイ酸塩の代わりにシリコン−カテコール錯体を使用した場合、非水溶性SiO2の収率はより少なくなる（図７〜９、図１０を参照）。
【００７０】
没食子酸（gallic acid）もしくはトロポロン（tropolone）（塩化トリストロポロナトシリコン（tristropolonatosilicon chloride））を有する、シリコン錯体等のその他のシリコン錯体を使用することもできる。
【００７１】
シリカテイン、炭酸脱水酵素を用いたインキュベーションは同時に行ってもよいし（図９を参照）、連続的に行ってもよい（図７、８、１０）。
【００７２】
コラーゲンの他にも、複数の他のバイオ材料や複合材料をテンプレートとして使用して、開示されている方法に従って得る線維性キチン（fibrillary chitin）等のシリカを生成することができる（DE 102 10 571.5. Zusammensetzung und Verfahren zur Herstellung von modifiziertes fibrillaeres Chitin und poenzierende Zusatzstoffe enthaltenden, biologisch hochaktiven Praeparaten und ihre Anwendung als Protektions- und Nahrungsergaenzungsmittel waehrend der prae- und postnatalen Entwicklung und adulter Lebensphasen bei Mensch und Tier、出願人及び発明者：WEG Mueller, HC Schroeder, B Lorenz, OF Senyuk, LF Gorowoj）。
【００７３】
本方法は、この他にも、純無機金属（IV）化合物から他の高分子金属（IV）化合物を合成する際にも適している。ただしこのとき、（１）テンプレート（分子、分子集合体、又もしくは表面）及び（２）ポリペプチドもしくはポリペプチドの金属錯体を同様に使用して合成を行う。このとき、以下のいずれかの特徴を有する。すなわち、ポリペプチドは配列番号1に示す配列と少なくとも２５％一致する動物、植物、バクテリア、真菌の炭酸脱水酵素ドメインを備える。又は、ポリペプチドは配列番号3もしくは配列番号5に示す配列と少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％一致する動物、植物、バクテリア、真菌のシリカテインαドメイン又はシリカテインβドメインを備える。
【００７４】
４．１．生成二酸化ケイ素の実証
生成物（生成アモルファス二酸化ケイ素）を実証するために、材料（もしくは反応バッチ）を卓上遠心分離機（１２，０００×g、１５分、４℃）で遠心分離し、エタノールで洗浄し、空気乾燥させることができる。続いて、沈殿物は１MのNaOHで加水分解することができる。分離したケイ酸塩は例えば、Merck社の比色シリコン試験等のモリブデン支援実証法を使用して生成溶液中で定量的に測定する。
【００７５】
生成物シリカの実証（元素分析）も、高性能電界放出電子プローブマイクロアナライザー（High Performance Field Emission Electron Probe Microanalyzer）（EPMA）を使用して行うことができる。図１１に示した実験では、JXA-8900RL電子プローブマイクロアナライザー（JXA-8900RL Electron Probe Microanalyzer）（JEOL, Inc, Peabody, MA, USA）を使用した。この装置においては、高解像度走査電子顕微鏡（REM）を併用して高品質x線解析が行われる。
【００７６】
高性能電界放出電子プローブマイクロアナライザーを用いた分析のバッチはpH７．０のトリスHCl５０mM中のナトリウムメタケイ酸塩１mM、NaCl  １００mM、ZnSO4  ０．１Mm、βメルカプトエタノール  ０．１mMを含有していた。インキュベーションは、室温で４時間、炭酸脱水酵素５０μg/ml （ウシの赤血球由来、Calbiochem company）とコラーゲン３０μg/mlの非存在下（対照群）又は存在下で行った。
【００７７】
サンプル１００μl（インキュベーション後のバッチ）を各キャリアに載せた。調製物を載せたキャリアに、真空下（１０−４mbar）でカーボン蒸着（Emitech K959）を施した。Siに加えてCa、Na、Clが測定された。
【００７８】
結果から以下のことが分った。すなわち、炭酸脱水酵素とコラーゲンとを含有するバッチにおいてはシリコン集合体が明らかに形成されていることが実証された。それに対して、対照群（炭酸脱水酵素とコラーゲンが存在しない）においては実証されなかった（図１１を参照）。
【００７９】
Si、Ca、Na、Clのシグナルの局在につながる一致性は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
５．本方法の使用
無機（非有機）シリコン化合物からのアモルファスシリカの酵素的合成に関する上記の方法については、下記のとおり、複数の多様な業用・技術使用が可能である。
【００８１】
１．）上記のテンプレート材料（水酸基を含む分子）自体もしくはそれらでコーティングされた材料のいずれかからなるバイオ材料の表面改質に関する使用。これは、ガラス、金属、金属酸化物、プラスチック、バイオポリマー、もしくはその他の材料の表面にもなり得る。表面改質バイオ材料に関する文献の概要は、BD Ratner et al.（編集者）、バイオ材料科学−医学における材料概論(Biomaterials Science - An Introduction to Materials in Medicine)、Academic Press, San Diego, 1996を参照することができる。これらの改変を行うための従来の物理的／化学的方法で使用される状態は、バイオ材料に対して劣化（破壊的）影響を及ぼすことがよくある。従来の方法と比べて本発明による方法では、生化学／酵素的反応にのみ基づいているため、バイオ材料に対して「穏やかな」状態を使用する。特に、本発明による方法を使用すれば、組織、骨、歯の代替材料として働くコラーゲン及びコラーゲンフリースの表面改変（コーティング）を実施することができる（組織工学）。表面改変は、安定性や気孔率の向上、並びに吸収力の向上に役立つ。
【００８２】
バイオ材料としての海綿コラーゲンの利点は、その他のコラーゲンと同様に、生分解性、低毒性、免疫原性である。更に、海綿コラーゲンは、病原菌による感染症のおそれを排除できないといった、動物の皮膚や、ブタ、子牛、牛の骨から従来主に得ていたコラーゲンの不利点を有さない。
【００８３】
この方法の更なる利点は、使用する一次基質（ケイ酸、メタケイ酸塩、それらの塩）を溶解させるために有機溶媒を使用する必要がないことである。これは、有機シリコン化合物（例：TEOS）と同様である。これによって、コラーゲンのみならず改変されるバイオポリマーが損傷することが回避される。
【００８４】
２．）シリカ（アモルファス二酸化ケイ素）のナノ構造の改変又は合成に関する使用。本発明による方法を使用することにより、純無機一次基質（ケイ酸、メタケイ酸、及びそれらの塩）から、ナノスケールでシリカ（又はその他の高分子金属（IV）化合物）の特定の二次元構造及び三次元構造を合成することができる。形成された構造は、ナノテクノロジーにおいて使用可能である。
【００８５】
３．）本発明による方法を使用して、特定の物理的・化学的特性を有するコラーゲンの三次元シリカコーティングマトリックスを生成し、ひいては腫瘍による欠損部、外傷後器官、組織損傷、火傷、血管閉塞、手術損の治療用の代替組織として使用可能な自家体細胞を有する人体の組織／器官を形成することができる。本発明による方法の特別な利点は、（１）受取り側の人体による不適合反応及び拒絶反応が、シリカコーティングによって回避されること、並びに（２）有機溶媒によるマトリックス（コラーゲン）の損傷が発生しないこと）（従来技術によって使用されるTEOS等の有機シリコン化合物と対照的に、一次基質は水溶性）である。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１Aは、ジオジア・シドニウム（Geodia cydonium）由来単離コラーゲンの顕微鏡写真である。図１A-aは、コラーゲン原繊維束を示す。図１A-bは、逆染色を施した原繊維を示す。図１Bは、海綿SiO2の骨格要素の走査電子顕微鏡写真である。上段左から右の順に、タイロスタイル（tylostyle）（スベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula））、スフェラスタ（spheraster）（ジオジア・シドニウム（Geodia cydonium））、ステラスタ（sterraster）（ジオジア・シドニウム（Geodia cydonium））を示す。下段左から右の順に、ステラスタ（sterraster）(ジオジア・シドニウム（Geodia cydonium））を示す（倍率は左から右の順に増大）。
【図２】炭酸脱水酵素（シリカーゼ（silicase））クローン（S.ドムンクラ（S.domuncula））のヌクレオチド配列と、発現ベクターpGEX-4T-2にクローニングするため長型・短型シリカーゼ（silicase）のcDNAコードを増幅するために用いるフォワードプライマー（ポジティブ１、２）とリバースプライマー（ネガティブ１）と、組換えタンパク質（長型・短型シリカーゼ（silicase））のアミノ酸配列を示す。タンパク質情報は以下のとおりである。CAexpresL.prt（長型）のタンパク質情報：分子量：４３１３０．７４daltons + ２５０００ DaGST ~~> ６８kDa。アミノ酸：３７９。強塩基性（＋）アミノ酸（K、R）：４６。強酸性（−）アミノ酸（D、E）：４６。疎水性アミノ酸（A、I、L、F、W、V）：１２０。極性アミノ酸（N、C、Q、S、T、Y）：１０３。等電点：７．６６６。pH７．０における電荷：２．８７１。CAexpresS.PRO(1,24)（短型）のタンパク質情報：分子量：３２２７１．２８daltons + ２５０００daltons GST ~~> ５７kDa。アミノ酸：２８４。強塩基性（＋）アミノ酸（K、R）：３５。強酸性（−）アミノ酸（D、E）：３９。疎水性アミノ酸（A、I、L、F、W、V）：９１。極性アミノ酸（N、C、Q、S、T、Y）：７０。等電点：６．７０１。pH７．０における電荷：−１．７９５。
【図３】炭酸脱水酵素（シリカーゼ（silicase））クローン（S.ドムンクラ（S.domuncula））のヌクレオチド配列と、発現ベクターpBAD/gIIIにクローニングするため長型・短型シリカーゼ（silicase）のcDNAコードを増幅するために用いるフォワードプライマー（ポジティブ１、２）とリバースプライマー（ネガティブ１）と、組換えタンパク質（長型・短型シリカーゼ（silicase））のアミノ酸配列を示す。タンパク質情報は以下のとおりである。組換えタンパク質（長型・短型シリカーゼ（silicase））のアミノ酸配列を示す。タンパク質情報は以下のとおりである。長型：分子量：４８４３０．７８daltons。アミノ酸：４２４。強塩基性（＋）アミノ酸（K、R）：４９。強酸性（−）アミノ酸（D、E）：５３。疎水性アミノ酸（A、I、L、F、W、V）：１３７。極性アミノ酸（N、C、Q、S、T、Y）：１１１。等電点：７．００５。pH７．０における電荷：０．０４５。短型：分子量：３３７０２．５２daltons。アミノ酸：３３０。pH６．５２における電荷：０．０４５。
【図４】pBAD/gIII発現ベクターにおけるS.ドムンクラ（S. domuncula）由来非線維性コラーゲン３の発現を示す。上から下へ順に以下を表している。フォワードプライマーとリバースプライマーとの結合部位を付したコラーゲン３クローンのヌクレオチド配列。発現ベクターpBAD/gIIIにおけるS.ドムンクラ（S. domuncula）由来非線維性コラーゲン３の挿入配列（制限酵素認識部位NcolとHindIIIは下線で示した）。pBAD/gIIにおける発現で使用されるプライマー（フォワードプライマーはCol3_f、リバースプライマーはCol_r。制限酵素認識部位NcolとHindIIIは印を付した）。ヌクレオチド配列から得た組換えタンパク質のアミノ酸配列。
【図５】海綿コラーゲンを示す。図５Aは、S.ドムンクラ（S.domuncula）コラーゲン（COL1_SUBDO）のcDNAの推定アミノ酸配列と、E.ムレリ（E.muelleri）由来コラーゲン（COL4_EPHMU）の推定アミノ酸配列との比較を示す。配列中、保存アミノ酸グループ（その物理化学特性について同様もしくは関係するもの）は黒に白抜きで表されている。NC1：非コラーゲン性Ｎ−端末ドメイン。COL：コラーゲン性内部ドメイン。NC2：非コラーゲン性Ｃ−端末ドメイン。図５B、S.ドムンクラ（S.domuncula）コラーゲンとE.ムレリ（E.muelleri）由来コラーゲンとの比較を示す。NC1：非コラーゲン性Ｃ−端末ドメイン。 COL：コラーゲン性内部ドメイン。NC2：非コラーゲン性Ｃ−端末ドメイン。数：アミノ酸の数。
【図６】図６Aは組換えシリカテインαの生成を示し、図６Bは組換えシリカーゼ（silicase）の生成を示す。
【図７】本図で示す実験においては、１００μMのNaメタケイ酸塩（Na metasilicate）を、室温にて１０分間、緩衝液（pH ７．０のトリスHCl （tris-HCl）５０mM、NaCl  １００mM、ZnSO4  ０．１mM、及びβメルカプトエタノール（β mercaptoethanol）0.1 mM）中にて組換えシリカテインα２０μg/ml又はウシの血清アルブミン（bovine serum albumin）（BSA）の有無別にインキュベートした。次に、図示したように、組換え海綿コラーゲン４μg/ml、炭酸脱水酵素（ウシの赤血球由来）１０μg/ml、及び／又は、カタコール（catachol）10 mMを加えて室温で更に２時間インキュベートした。すべての図示した濃度は、すべての要素をバッチに加えた後における最終濃度である。アモルファス二酸化ケイ素の生成を実証するため、反応バッチを卓上遠心分離機にかけ（１０，０００×g、１５分、４ C）、エタノール（ethanol）で洗浄し空気乾燥させた。続いて沈殿物を１MのNaOHで加水分解し、分離したケイ酸塩をモリブデン支援実証法（Merck社の比色シリコン試験）を使用して定量的に測定した。試験から以下のことが分った。すなわち、コラーゲン、シリカテインα、炭酸脱水酵素の存在下（０．０９８〜０．１１７  OD単位）、並びにコラーゲン、シリカテインαの存在下（０．１３８  OD単位）において、最大量のアモルファスシリカが合成される。炭酸脱水酵素の非存在下（０．０５７  OD単位）、並びにシリカテインαの非存在下（０．０３７  OD及び０．０４８  OD単位）に、より少ない量の不溶性SiO2が測定された。コラーゲンのみ非存在下においては、ごく少ない量（０．０１４〜０．０１９、又は０．０２２又は０〜０．０１８又は０．００８  OD単位）の不溶性SiO2が測定され、これはシリカテイン又は炭酸脱水酵素又は両酵素の存在下及び非存在下で測定された。同様に、コラーゲン単独の存在下においてさえ、ごく少ない量（０．００８及び０．０３２  OD単位）の不溶性SiO2が形成された。シリカテインとコラーゲンの代わりにBSAの存在下においては、ごく少ない量（０．０１５  OD単位）のSiO2が測定され、これは炭酸脱水酵素の存在下及び非存在下で測定された。カタコールを添加した場合、不溶性SiO2の量が減少した。
【図８】本図で示す実験においては、１００μMのNaメタケイ酸塩を、室温にて１０分間、緩衝液（pH ７．０のトリスHCl  ５０mM、NaCl  １００mM、ZnSO4  ０．１mM、及びβメルカプトエタノール０．１mM）中にて組換えシリカテインα２０〜４００μg/ml又はウシの血清アルブミン（BSA：２０μg/ml）の有無別にインキュベートした。次に、図示したように、組換え海綿コラーゲン４μg/ml、炭酸脱水酵素（ウシの赤血球由来）１０μg/ml、及び／又は、カタコール10mMを加えて室温で更に５時間インキュベートした。すべての図示した濃度は、すべての要素をバッチに加えた後における最終濃度である。アモルファス二酸化ケイ素の生成を実証するため、更に反応バッチを図５に記載のように処理し、不溶性SiO2の生成量を測定した。不溶性SiO2の生成量は、炭酸脱水酵素の濃度が増大するにつれ増大することが分った（０．００２〜００５０  OD単位）。シリカテインαによる前インキュベーション（１０分間）によって更なる増大は見られず、むしろ、使用した条件下ではSiO2の生成量は減少した（０．０１５及び０．０３０）。シリカテインとコラーゲンの代わりにBSAの存在下においては、ごく少ない量（０．０２０  OD単位）のSiO2が測定された。カタコールを添加しなかった場合、不溶性SiO2の量が増大した。
【図９】本図で示す実験においては、１００μMのNaメタケイ酸塩と４μg/mlの組換え海綿コラーゲンを、室温にて２時間、カテコール１０mMの存在下において緩衝液（pH ７．０のトリスHCl  ５０mM、NaCl  １００mM、ZnSO4  ０．１mM、及びβメルカプトエタノール０．１mM）中にて（ウシの赤血球由来）炭酸脱水酵素の濃度を増大させながら（２〜２０μg/ml）インキュベートした。不溶性SiO2の生成量は、急激に増大した（０．０１５  OD単位から０．０６０  OD単位へ）。同様に、コラーゲンの量が増大すると（１．２〜１０μg/ml）、SiO2の生成量は急激に増大した（０．０２２／０．２２３  単位から０．０６８／０．０７０  OD単位へ）。Naメタケイ酸塩の濃度が増大しても更なる増大は見られず、むしろSiO2の生成量は減少した（最大０．０２７  OD単位）。コラーゲンの代わりにウシの血清アルブミン（BSA、２０μg/ml）の存在下では、ごく少量のSiO2が形成された（０．００８  OD単位）。一方、炭酸脱水酵素のみの存在下では、SiO2の生成量は約０．０１９〜０．０２９  OD単位であった。カテコールを添加しなかった場合、SiO2の量は幾分少なかった。表示の濃度は、すべての要素をバッチに加えた後における最終濃度である。アモルファス二酸化ケイ素の生成を実証するため、更に反応バッチを図５に記載のように処理し、不溶性SiO2の生成量を測定した。
【図１０】本図で示す実験においては、１００μMのSi−カテコレート錯体（Si-catecholate complex）を、室温にて１０分間、緩衝液（pH ７．０のトリスHCl  ５０mM、NaCl  １００mM、ZnSO4  ０．１mM、及びβメルカプトエタノール0.1 mM）中にて組換えシリカテインα２０μg/mlの有無別にインキュベートした。次に、図示したように、組換え海綿コラーゲン（１〜４μg/ml）又は、精製ウシコラーゲン（２〜１０μg/ml）、並びに炭酸脱水酵素（ウシの赤血球由来）１０μg/mlを加えて室温で更に３時間インキュベートした。図示した濃度は、すべての要素をバッチに加えた後における最終濃度である。アモルファス二酸化ケイ素の生成を実証するため、更に反応バッチを図５に記載のように処理し、不溶性SiO2の生成量を測定した。結果から、組換え非線維性海綿コラーゲンと対照的に、線維性コラーゲン（ウシ）の添加量を増大させると、不溶性SiO2の生成量は、最初増大し、その後再び低下することが分る。Naメタケイ酸塩（図７を参照）を使用したときのように、SiO2の生成量は、海綿コラーゲンの量が増大するにつれて（１〜４μg/ml）急激に増大した（０．００２  OD単位から〜０．０１０  OD単位へ）。Naメタケイ酸塩（図５を参照）を使用して得た結果と同様の方法では、カテコールの存在下でSiO2の生成量は減少する。これは、Si−カテコレート錯体の方へ平衡点がシフトすることによって説明可能である。炭酸脱水酵素単独の存在下では不溶性SiO2は生成されなかった（図示せず）。組換えシリカテインαの濃度が４０μg/ml及び４００μg/mlに増大すると、SiO2の生成量は減少する（図示せず）。
【図１１】高性能電界放出電子プローブマイクロアナライザー（High Performance Field Emission Electron Probe Microanalyzer）（EPMA）を使用した生成物シリカの実証を示す。インキュベーションは、室温でNaメタケイ酸塩１mMと共に緩衝液（pH ７．０のトリスHCl  ５０mM、NaCl  １００mM、ZnSO4  ０．１mM、及びβメルカプトエタノール0.1  mM）中にて炭酸脱水酵素５０μg/ml （ウシの赤血球由来、Calbiochem company）とコラーゲン３０μg/mlの非存在下（対照群）と存在下で行った。インキュベーションは４時間行った。炭酸脱水酵素とコラーゲンが存在するバッチにおけるSiの元素分析結果（Ａ）と、対照（炭酸脱水酵素とコラーゲンが存在しない）バッチにおけるSiの元素分析結果（Ｂ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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