(57)【要約】  本発明は、フラグメント中の重鎖が軽鎖に共有結合しておらず、且つＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの両方が別のアミノ酸で置換されていることを特徴とする、少なくとも１個のエフェクター分子が結合している抗体のＦａｂ及びＦａｂ’フラグメントを提供する。
2007535472.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラグメント中の重鎖が軽鎖に共有結合しておらず、且つＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの両方が別のアミノ酸で置換されていることを特徴とする、少なくとも１個のエフェクター分子が結合している抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメント。
【請求項２】
ＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインがチオールを含まないアミノ酸で置換されている、請求項１記載の抗体フラグメント。
【請求項３】
ＣＬの鎖間システインがセリンで置換されている、請求項２記載の抗体フラグメント。
【請求項４】
ＣＨ１の鎖間システインがセリンで置換されている、請求項２記載の抗体フラグメント。
【請求項５】
ＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの両方がセリンで置換されている、請求項２記載の抗体フラグメント。
【請求項６】
ＣＬの鎖間システインが軽鎖の２１４位にあり、且つＣＨ１の鎖間システインが重鎖の２３３位にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
【請求項７】
少なくとも１個のエフェクター分子が重鎖又は軽鎖の定常領域に結合している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
【請求項８】
エフェクター分子が軽鎖定常領域中のシステイン及び重鎖定常領域中のシステインに結合している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
【請求項９】
エフェクター分子に結合している重鎖中のシステイン残基及び軽鎖中のシステイン残基が、エフェクター分子が結合していないならば、ジスルフィド結合を介して互いに連結されていると見込まれる、請求項８記載の抗体フラグメント。
【請求項１０】
修飾ヒンジ領域を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１１】
修飾ヒンジが１個のシステイン残基を含む、請求項１０記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１２】
ヒンジが配列番号１又は配列番号２における配列を含む、請求項１１記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１３】
修飾ヒンジが２個のシステイン残基を含む、請求項１０に記載の抗体フラグメント。
【請求項１４】
ヒンジが配列番号３又は配列番号４における配列を含む、請求項１３記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１５】
少なくとも１個のエフェクター分子がヒンジ領域に結合している、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１６】
２つのエフェクター分子がヒンジ領域に結合している、請求項１５記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１７】
フラグメントに結合したすべてのエフェクター分子がヒンジ領域に結合している、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１８】
フラグメントに結合した各エフェクター分子がヒンジ領域中のシステインに結合している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを産生する方法であって、
ａ．ＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの両方が別のアミノ酸で置換されている抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを、フラグメント中に少なくとも１つの遊離チオール基を生成できる還元剤で処理し、
ｂ．処理したフラグメントをエフェクター分子と反応させる、
ことを含む方法。
【請求項２０】
還元剤が非チオール系還元剤である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
還元剤がトリアルキルホスフィンである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
トリアルキルホスフィン還元剤がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
トリアルキルホスフィン還元剤がトリス（３−ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
工程（ａ）及び（ｂ）のいずれか又はその両方をキレート剤の存在下で実行する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
キレート剤がＥＤＴＡである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
工程（ａ）及び（ｂ）の両方をＥＤＴＡの存在下で実行する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
混合物がＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントで富化されており、前記フラグメント中の軽鎖が重鎖に共有結合しておらず、ＣＬとＣＨ１の両方の鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており、少なくとも１個のエフェクター分子が前記フラグメントに結合していることを特徴とする、２つ以上のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを含む混合物。
【請求項２８】
混合物の５０％超がＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを含み、ここで前記フラグメント中の軽鎖が重鎖に共有結合しておらず、ＣＬとＣＨ１の両方の鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており、且つ少なくとも１個のエフェクター分子が前記フラグメントに結合している、請求項２７記載の混合物。
【請求項２９】
エフェクター分子がＰＥＧである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の抗体フラグメントを、１種又は複数の医薬として許容可能な賦形剤、希釈剤又は担体とともに含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良された抗体フラグメント、より詳細には、２つ以上のエフェクター分子が結合する改良された抗体フラグメント、及びそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体可変領域は特異性及び親和性が高いので、該領域は、特にタンパク質間相互作用を調節するための理想的な診断剤及び治療剤になる。抗体フラグメントは、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）などの製品の最近の成功に見られるように、多用途の治療剤となることが判明しつつある。Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、及び他の抗体フラグメントにコードされている標的対応官能基は、直接使用できるか、或いは効力を増加させるために、細胞毒性薬剤、毒素、又はポリマー分子などの１種又は複数のエフェクター分子に複合できる。例えば、これらのフラグメントはＦｃ領域を欠くために、動物中で短い循環半減期を有するが、これは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの特定の型のポリマーへの複合によって改良できる。複合したＰＥＧのサイズを増加させると、数分間から何時間までも循環半減期が増加することが判明しており、５ｋＤａから１００ｋＤａまでの範囲のＰＥＧを用いるＦａｂ’の修飾が実証された（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，７８０−７８３；Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１６，１０６−１１９；Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５）。ＰＥＧ化された抗体フラグメント（例えば、ＣＤＰ８７０）は現在臨床試験を受けており、ここでは、複合ＰＥＧの効果は、循環半減期を、治療のために許容可能なレベルにまで導くことである。
【０００３】
エフェクター分子は、多数の異なる方法によって抗体フラグメントに結合していることが可能であり、これには、アルデヒド糖を経由するもの、又はより一般的には、抗体フラグメント中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖、又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を経由するものが含まれる。エフェクター分子の結合の部位は、ランダムであるか、又は部位特異的のいずれかであってもよい。
【０００４】
ランダム結合は、しばしば、リジンのようなアミノ酸を経由して達成され、そしてこれは、リジンの位置に依存して、抗体フラグメント全体を通して多数の部位において結合しているエフェクター分子を生じる。これは、いくつかの場合において成功したが、結合するエフェクター分子の正確な位置及び数は制御不可能であり、且つこれは活性の損失（例えば、結合するエフェクター分子が少なすぎる場合）及び／又は親和性の損失（例えば、エフェクター分子が結合部位を妨害する）をもたらす可能性がある（Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５）。その結果、エフェクター分子の制御された部位特異的結合は、通常、選択方法である。
【０００５】
エフェクター分子の部位特異的結合は、最も一般的には、システイン残基に対する結合によって達成される。なぜなら、このような残基は、抗体フラグメントにおいて比較的一般的ではないからである。抗体のヒンジは、部位特異的結合のためのよく知られた領域である。なぜなら、これらはシステイン残基を含み、且つ抗原結合に関与するらしい抗体の他の領域から離れているからである。適切なヒンジはフラグメント中に天然に存在するか、又は組換えＤＮＡ技術を使用して作製できるかのいずれかである（例えば、米国特許第５，６７７，４２５号；国際公開第９８／２５９７１号；Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１６，１０６−１１９；Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，７８０−７８３を参照のこと）。或いは、部位特異的システインは、例えば、表面に露出したシステインを作製するために抗体フラグメントに操作できる（米国特許第５，２１９，９９６号）。
【０００６】
エフェクター分子をシステインを介して部位特異的に結合しようとする場合、抗体フラグメント中の標的チオールは、しばしば、グルタチオンなどの小さな発酵関連ペプチド産物によってキャップするか、又は抗体フラグメントの抽出及び精製の間に使用する５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）などの化学的添加物によって意図的にキャップする。これらのキャッピング剤は、標的（ヒンジ又は表面）チオールを活性化するために除去する必要がある。抗体フラグメントは、重鎖の定常領域と軽鎖の定常領域（ＣＨ１及びＣＬ）の間の未変性の鎖間ジスルフィド結合を有し、これは一般的には、抗体の安定性及び結合特性を維持する上で必須であると見なされてきた。その結果、ＣＬ：ＣＨ１間のジスルフィドが損なわれないように、標的ヒンジ又は表面チオールの活性化は、ある程度の注意を払って実行しなければならない。それゆえに「穏和な」還元条件を、エフェクター分子との反応の前に、チオールキャッピング剤を除去するために使用するのが都合が良い。これは通常、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、β−メルカプトエチルアミン（β−ＭＡ）、及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）などのチオール系還元剤を使用することによって達成される。しかし、これらの還元剤の各々は、還元するつもりのシステインと反応し、且つそれに結合したままとなり得るため、（Ｂｅｇｇ及びＳｐｅｉｃｈｅｒ，１９９９  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１０，１７−２０）エフェクター分子の結合効率を低下させることが知られている。したがって、還元及びエフェクター分子との反応の後、高い比率の抗体フラグメントが、エフェクター分子を全く結合せず、これらは、適数のエフェクター分子を結合した抗体フラグメントから除去しなければならない。この乏しい修飾効率は、最大限の生産効率を実現することが重要である、修飾された治療用抗体フラグメントの大規模生産中には明確に欠点となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、重鎖及び軽鎖が共有結合していない少なくとも１つのエフェクター分子を含む新規なクラスの修飾抗体フラグメントを提供する。重鎖と軽鎖の間に全く共有結合がなく、しかも１つ又は複数のエフェクター分子が結合しているにも関わらず、本発明のフラグメントは、多数のインビトロ及びインビボの試験において野生型フラグメントと比較し得る性能を示す。驚くべきことに、これらの新規なフラグメントは、野生型フラグメントと抗原に対する同じ親和性、及び野生型フラグメントと同様のインビボ及びインビトロ安定性を有する。本発明のフラグメントの特定の利点は、それらの製造の容易さ、及び特に、それらの製造の効率にある。したがって、本発明のフラグメントは、鎖間共有結合を有する現在利用可能なフラグメントに対する低コストの代替物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明によれば、本発明は、フラグメント中の重鎖が軽鎖に結合しておらず、且つＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの両方が別のアミノ酸で置換されていることを特徴とする、少なくとも１個のエフェクター分子が結合している抗体のＦａｂ及びＦａｂ’フラグメントを提供する。
【０００９】
本発明の抗体フラグメントは、可変領域（ＶＨ／ＶＬ）及び定常領域（ＣＨ／ＣＬ）を有する任意の重鎖及び軽鎖の対を含むことができる。この重鎖及び／又は軽鎖の定常領域は、そのＣ末端において１つ以上のアミノ酸が延長されてもよい。特定の例には、Ｆａｂ及びＦａｂ’フラグメントが含まれる。
【００１０】
本発明に使用するための抗体フラグメントの出発物質は、任意の適切な酵素的な切断及び／又は消化の技術を使用して、例えば、ペプシンを用いる処理によって、任意の全体の抗体、とりわけ、全体のモノクローナル抗体から入手できる。代替的に、又は更に、抗体の出発物質は、抗体の可変領域及び／又は定常領域をコードするＤＮＡの操作及び再発現を含む組換えＤＮＡ技術の使用によって調製できる。標準的な分子生物学的技術が、所望されるようなアミノ酸又はドメインを修飾し、付加し、又は欠失させるために使用できる。可変領域又は定常領域に対する任意の変更が、本明細書で使用される用語「可変」領域及び「定常」領域によってなお包含される。
【００１１】
抗体フラグメントの出発物質は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ、又はヒトを含む任意の種から入手できる。抗体フラグメントの部分は１種又は複数の種から入手でき、例えば、抗体フラグメントはキメラであってもよい。一例では、定常領域は１つの種由来であり、且つ可変領域は別の種由来である。抗体フラグメントの出発物質はまた、修飾されてもよい。一例では、抗体フラグメントの可変領域は組換えＤＮＡ操作技術を使用して作製される。このような操作して得た改変体には、例えば、天然の抗体のアミノ酸配列における又はそれに対する挿入、欠失、又は置換によって天然の抗体の可変領域から作製されたものが含まれる。この型の特定の例には、少なくとも１つのＣＤＲ、並びに場合により、１つの抗体からの１つ以上のフレームワークアミノ酸、及び第２の抗体からの可変領域ドメインの残りの部分を含む、可変領域ドメインが操作して得たものが含まれる。これらの抗体フラグメントを作製及び製造するための方法は当該技術分野において周知である（例えば、以下を参照のこと：Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，３３１，４１５号；Ｓｈｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第９２／０２５５１号；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４；Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３２２，３２３；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号；Ａｄａｉｒ、国際公開第９１／０９９６７号；Ｍｏｕｎｔａｉｎ及びＡｄａｉｒ、１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ，１０，１−１４２；Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１）。
【００１２】
本発明に使用するためのＦａｂ’フラグメントは、重鎖のＣ末端が１アミノ酸以上延長される。代表的には、本発明に使用するためのＦａｂ’フラグメントは、未変性の又は修飾されたヒンジ領域を有する。未変性のヒンジ領域は、抗体分子のＣＨ１ドメインに通常結合しているヒンジ領域である。修飾ヒンジ領域は、未変性のヒンジ領域とは長さ及び／又は組成が異なる任意のヒンジである。このようなヒンジは、任意の他の種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ、又はヤギのヒンジ領域からのヒンジ領域を含み得る。他の修飾ヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのそれとは異なるクラス又はサブクラスの抗体に由来する完全なヒンジ領域を含んでもよい。したがって、例えば、クラスγ１のＣＨ１ドメインはクラスγ４のヒンジ領域に結合できる。或いは、修飾ヒンジ領域は、天然のヒンジ又は反復単位の部分を含むことが可能であり、この反復中の各単位は、天然のヒンジ領域に由来する。さらなる代替において、この天然のヒンジ領域は、１つ以上のシステイン若しくは他の残基をアラニンなどの中性塩基に変換することによって、又は適切に配置された残基をシステイン残基に変換することによって変化できる。このような手段によって、ヒンジ領域中のシステイン残基の数は、増加又は減少できる。更に、ヒンジの他の特性、例えば、軽鎖の鎖間システインからのヒンジシステインの距離、ヒンジのシステイン間の距離、及び可動性などのヒンジの特性に影響を与える可能性があるヒンジ中の他のアミノ酸の組成（例えば、グリシンは回転可動性を増加させるためにヒンジに取り込まれることが可能であり、又はプロリンは可動性を減少させるために取り込まれることが可能である）が制御できる。或いは、荷電した残基又は疎水性残基の組み合わせがヒンジに取り込まれてマルチマー化特性を付与できる。他の修飾ヒンジ領域は全体的に合成性であってもよく、且つ長さ、組成、及び可動性などの所望の特性を有するように設計されてもよい。
【００１３】
多数の修飾ヒンジ領域が、例えば、米国特許第５，６７７，４２５号、国際公開第９９１５５４９号、及び国際公開第９８２５９７１号においてすでに記載されており、これらは参照として本明細書に援用される。代表的には、本発明に使用するためのヒンジ領域は、１から１１個の間のシステインを含む。好ましくは、１から４個の間のシステイン、より好ましくは１個又は２個のシステインである。特に有用なヒンジには、１つのみのシステインが存在し、配列ＤＫＴＨＴＣＰＰ（配列番号１）又はＤＫＴＨＴＣＡＡ（配列番号２）を含む修飾ヒトγ１ヒンジ、及び２つのシステインを含み、配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡ（配列番号３）又はＤＫＴＨＴＣＡＡＣＰＡ（配列番号４）を含むものが含まれる。
【００１４】
本発明の抗体フラグメントは、一般的に、抗原に選択的に結合可能であろう。該抗原は、任意の細胞関連抗原、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、若しくは腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面抗原であってもよく、又は可溶性抗原であってもよい。抗原はまた、疾患又は感染の間にアップレギュレートされた抗原などの任意の医学関連抗原、例えば、レセプター及び／又はそれらの対応するリガンドであってもよい。細胞表面抗原の特定の例には、接着分子、例えば、β１インテグリンなどのインテグリン（例えば、ＶＬＡ−４）、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン若しくはＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、並びにＶＥＧＦ、並びに適切な場合、これらのレセプターが含まれる。可溶性抗原には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、又はＩＬ−１７などのインターロイキン、ウイルス抗原、例えば、呼吸器合胞体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ、又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、並びにＰＤＧＦα及びＰＤＧＦβなどの血小板由来成長因子、並びに適切な場合、これらのレセプターが含まれる。用語エフェクター分子は、本明細書で使用される場合には、例えば、抗新生物剤、薬物、毒素（例えば、細菌又は植物起源の酵素的に活性な毒素及びそのフラグメント、例えば、リシン及びそのフラグメント）、生物活性タンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成又は天然ポリマー、核酸及びそのフラグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位元素、キレートされた金属、ナノ粒子、並びにレポーター基、例えば、蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲスペクトル測定によって検出できる化合物を含む。
【００１５】
特定の抗新生物剤には、細胞毒性剤及び細胞増殖抑制剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロランブシル、メルファラン、メクロレタミン、シクロホスファミド、又はウラシルマスタード）及びその誘導体、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、ブスルファン、又はシスプラチンなどのアルキル化剤；メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルオロ酢酸又はフルオロクエン酸などの代謝拮抗剤、ブレオマイシン（例えば、硫酸ブレオマイシン）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、アクチノマイシン（例えば、ダクチノマイシン）、プリカマイシン、カリキマイシン及びその誘導体、又はエスペラマイシン及びその誘導体などの抗生物質、エトポシド、ビンクリスチン又はビンブラスチン、及びその誘導体などの分裂抑制剤；エリプシチンなどのアルカロイド；タキシン−Ｉ又はタキシン−ＩＩなどのポリオール；アンドロゲンなどのホルモン（例えば、ドロモスタノロン若しくはテストステロン）、プロゲスチン（例えば、酢酸メゲストロール若しくは酢酸メドロキシプロゲステロン）、エストロゲン（例えば、ジメチルスチルベストロール二リン酸、リン酸ポリエストラジオール、若しくはリン酸エストラムスチン）又は抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；ミトキサントロンなどのアントラキノン、ヒドロキシウレアなどのウレア；プロカルバジンなどのヒドラジン；又はデカルバジンなどのイミダゾールが含まれる。
【００１６】
キレートされた金属には、２から８まで（両端を含む）配位数を有する、２価又は３価の正電荷を有する金属のキレートが含まれる。このような金属の特定の例には、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ガリウム（Ｇａ）、イットリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、及びスカンジウム（Ｓｃ）が含まれる。一般的に、この金属は好ましくは放射性核種である。特定の放射性核種には、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５８Ｃｏ、６０Ｃｏ、６７Ｃｕ、１９５Ａｕ、１９９Ａｕ、１１０Ａｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、２０７Ｂｉ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８８Ｙ、９０Ｙ、１６０Ｔｂ、１５３Ｇｄ、及び４７Ｓｃが含まれる。
【００１７】
キレートされた金属は、例えば、任意の適切な多座（ｐｏｌｙａｄｅｎｔａｔｅ）キレート剤、例えば、非環状又は環状ポリアミン、ポリエーテル（例えば、クラウンエーテル及びその誘導体）；ポリアミド；ポルフィリン；及び炭素環誘導体でキレートされた上記の型の金属の１つであってもよい。
【００１８】
一般的に、キレート剤の型は、使用する金属に依存する。しかし、本発明による結合体における、１つの特に有用なキレート剤の群は、非環状及び環状ポリアミン、とりわけポリアミノカルボン酸、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸及びその誘導体、並びに大環状アミン、例えば、環状トリアザ及びテトラアザ誘導体（例えば、国際特許明細書の国際特許公開第９２／２２５８３号に記載されているようなもの）；並びにポリアミド、とりわけデスフェリオックス−アミン及びその誘導体である。
【００１９】
他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド、及び酵素が含まれる。対象とする酵素には、タンパク質分解性酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれるがこれらに限定されない。対象とするタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドには、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、若しくはジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、若しくは組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、血栓剤若しくは血管形成剤（例えば、アンギオスタチン若しくはエンドスタチン）、又はリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、若しくは他の成長因子及び免疫グロブリンなどの生物学的応答調節剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
他のエフェクター分子は、例えば、診断において有用である検出可能な物質を含んでもよい。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射活性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影に使用するため）、及び非放射活性常磁性金属イオンが含まれる。一般的には、診断剤としての使用のために抗体に複合され得る金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジン、及びビオチンが含まれ；適切な蛍光物質には、アンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、及びフィコエリトリンが含まれ；適切な発光物質にはルミノールが含まれ；適切な生物発光物質には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエオクリンが含まれ；並びに適切な放射活性核種には１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９９Ｔｃが含まれる。
【００２１】
エフェクター分子としての使用のための合成又は天然ポリマーには、例えば、任意選択で置換された直鎖若しくは分枝鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン、若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は直鎖若しくは分枝鎖の多糖類（例えば、ラクトース、アミロース、デキストラン、又はグリコーゲンなどのホモ若しくはヘテロ多糖類）が含まれる。
【００２２】
上述の合成ポリマー上に存在する可能性のある特定の任意選択の置換基には、１つ以上のヒドロキシ基、メチル基、又はメトキシ基が含まれる。合成ポリマーの特定の例には、任意選択で置換された直鎖若しくは分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、又はその誘導体、とりわけ、メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体などの任意選択で置換されたポリ（エチレングリコール）が含まれる。
【００２３】
「誘導体」は、本明細書で使用される場合には、反応性誘導体、例えば、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセトアミドなどのチオール選択性反応基、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、又はジスルフィドマレイミドなどを含むことを意図する。反応基は、直接的に、又はポリマーへのリンカーセグメントを通して結合できる。このような基の残基は、いくつかの例においては、抗体フラグメントとポリマーとの間の連結基としての生成物の一部を形成することが理解されよう。
【００２４】
各ポリマー分子のサイズは、所望通りに変化させてもよいが、一般的には、５００Ｄａから５０，０００Ｄａまで、好ましくは５，０００から４０，０００Ｄａまで、並びにより好ましくは１０，０００から４０，０００Ｄａまで、及び２０，０００から４０，０００Ｄａまでの範囲の平均分子量である。ポリマーのサイズは、特に、生成物の意図する用途、例えば、腫瘍などの特定の組織に局在するか、又は循環半減期を延長する能力に基づいて選択してもよい（概説としては、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５を参照のこと）。したがって、例えば、生成物が循環系を出て、組織に浸透することを意図する場合、例えば、腫瘍の治療に使用するために、低分子量ポリマー、例えば、約５，０００Ｄａの分子量を有するポリマーを使用することが有利となり得る。生成物が循環中に留まる用途に対しては、より高分子量ポリマー、例えば、２５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａまでの範囲の分子量を有するポリマーを使用することが有利となり得る。
【００２５】
特定の好ましいポリマーには、ポリ（エチレングリコール）などのポリアルキレンポリマー、又は、とりわけ、メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体、及びとりわけ、約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有するポリマーが含まれる。
【００２６】
本発明のポリマーは、市販品を入手してもよいし（例えば、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｆａｔｓ；Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓより）、又は市販の出発物質から、便利な化学的手順を使用して調製してもよい。
【００２７】
本発明のエフェクター分子は、該タンパク質を直接、又はカップリング剤を介してエフェクター分子へ連結する、標準的な化学的手順又は組換えＤＮＡ手順を使用して結合してもよい。このようなエフェクター分子を抗体に複合するための技術は当該分野において周知である（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，制御薬物送達（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ），第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７，６２３〜５３頁；Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８、及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７−１２３）。特定の化学的手順には、例えば、国際特許明細書の国際公開第９３／０６２３１号、国際公開第９２／２２５８３号、国際公開第９０／０９１９５号、国際公開第８９／０１４７６号、国際公開第９９１５５４９号、及び国際公開第０３０３１５８１号に記載されるものが含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、結合は、例えば、欧州特許明細書第３９２７４５号に記載のような組換えＤＮＡ手順を使用して達成できる。
【００２８】
一例では、本発明のエフェクター分子は、抗体フラグメント中にある任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を通してタンパク質に結合できる。このようなアミノ酸は抗体フラグメント中に天然に存在してもよく、又は組換えＤＮＡ法を使用してフラグメントに操作して得られてもよい。例えば、米国特許第５，２１９，９９６号を参照されたい。本発明の好ましい態様では、エフェクター分子は、フラグメント中にあるシステイン残基のチオール基を通して共有結合している。この共有結合は、一般的にはジスルフィド結合であり、又は特に、硫黄−炭素結合である。一例では、チオール基が適切に活性化されたエフェクター分子の結合点として使用される場合、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体が使用できる。
【００２９】
抗体フラグメントに結合する２つ以上のエフェクター分子が存在する場合、これらは同一であってもよく若しくは異なっていてもよく、且つ異なる部位で抗体フラグメントに結合してもよいことが理解されよう。２つ以上のエフェクター分子は、例えば、２つ以上のエフェクター分子を連結し、且つ結合の単一の部位を提供するために、分枝状結合構造の使用により単一の部位で抗体フラグメントに結合できることもまた、理解されよう。
【００３０】
本発明の好ましい態様において、抗体フラグメントに結合した少なくとも１個のエフェクター分子は、ポリマー分子、好ましくはＰＥＧ又はその誘導体である。結合するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に関しては、一般的に、「ポリエチレングリコールの化学、生物技術的及び生物医学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９２、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；「ポリエチレングリコールの化学及び生物学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、並びに「生物医科学のための生物複合タンパク質カップリング技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９９８、Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００３１】
本発明の一例では、フラグメントに結合したすべてのエフェクター分子はＰＥＧであり、且つ各分子が、マレイミド基を介して、抗体フラグメント中の１個又は複数のチオール基に共有結合している。このＰＥＧは任意の直鎖又は分枝状分子であってもよい。分枝状ＰＥＧ分子を結合するために、リジン残基が、好ましくはマレイミド基に共有結合している。リジン残基上のアミン基の各々に、好ましくはメトキシ（ポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合している。一例では、各ポリマーの分子量は約２０，０００Ｄａであり、それゆえに全ポリマー分子の全分子量は約４０，０００Ｄａである。
【００３２】
用語鎖間システインとは、本明細書で使用されるときには、天然の抗体分子における対応する重鎖又は軽鎖の定常領域中のシステインにジスルフィド結合すると思われる、重鎖又は軽鎖中の定常領域中のシステインをいう。特に、本明細書の鎖間システインは、天然の抗体において互いにジスルフィド結合している、軽鎖（ＣＬ）定常領域中のシステイン、及び重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）中のシステインである。このようなシステインの例は、代表的には、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７、免疫学的に興味が持たれるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡによって規定されるように、ヒトＩｇＧ１の軽鎖の２１４位及び重鎖の２３３位において、ヒトＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖の１２７位、並びにヒトＩｇＤ及びＩｇＡ２Ｂの重鎖の１２８位において見い出すことができる。これらのシステインの正確な位置は、任意の修飾、例えば、欠失、挿入、及び／又は置換が抗体出発物質になされた場合には、天然の抗体の位置から変化し得ることが理解されよう。
【００３３】
本発明の修飾フラグメントにおいて、ＣＬの鎖間システイン及びＣＨ１の鎖間システインの間のジスルフィド結合は存在しない。その結果、この抗体フラグメント中の重鎖は軽鎖に共有結合しない。本発明において抗体フラグメント出発物質における鎖間システインは、両方とも別のアミノ酸、好ましくは、チオール基を含まないアミノ酸によって置換されている。置換することによって、本発明者らは、鎖間システインが通常抗体フラグメントにおいて見い出される場合、別のアミノ酸がその場所にあることを意味する。適切なアミノ酸の例は、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン、又は任意の極性アミノ酸を含む。特に好ましいアミノ酸はセリンである。鎖間システインを置換するために使用されるアミノ酸は、両方の鎖において同じであってもよいし、又は互いに異なっていてもよい。アミノ酸を置換するための方法は分子生物学の分野において周知である。このような方法には、例えば、ＰＣＲなどの方法を使用して、アミノ酸を欠失若しくは置換するための方法、又は合成配列の新規な設計などの方法を使用する部位特異的変異誘発が含まれる。鎖間システインの両方がセリンによって置換されているＦａｂ’及びＦ（ａｂ’）２はすでに記載されている（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０９，１９３−２０２；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５１，６９５４−６９６１）。
【００３４】
本発明において、少なくとも１個のエフェクター分子が抗体フラグメントに結合している。このエフェクター分子は、本明細書に記載される手段のいずれかによって結合できる。
【００３５】
本発明の一例では、少なくとも１個のエフェクター分子が抗体フラグメント定常領域中のシステイン残基に結合している。追加のエフェクター分子は抗体フラグメント中の他の箇所、特に定常領域及び／又はヒンジ領域に、本明細書に記載される方法を使用して結合している。結合のために適切なシステインには、天然に存在するシステイン、及び組換えＤＮＡ技術を使用してフラグメントに操作して得たシステインが含まれる。一例では、２個のシステインは、重鎖及び軽鎖の定常領域に１個ずつ、抗体フラグメント中に操作して導入される。特定の一例では、これらのシステインは、抗体出発物質中で互いにジスルフィド結合を形成できるような位置に操作して導入される。
【００３６】
本発明のこの態様に従う特定のフラグメントは以下のようなものである：
（ｉ）少なくとも１個のエフェクター分子が重鎖若しくは軽鎖の定常領域に結合している、又は
（ｉｉ）エフェクター分子が軽鎖定常領域及び重鎖定常領域においてシステインに結合している、又は
（ｉｉｉ）エフェクター分子に結合している重鎖及び軽鎖の定常領域中のシステイン残基は、エフェクター分子が結合していない場合、ジスルフィド結合を介して互いに結合する。
【００３７】
本発明の別の例において、抗体フラグメントはＦａｂ’フラグメントであり、且つ少なくとも１個のエフェクター分子がヒンジ領域を介して、好ましくはヒンジ領域に存在するシステインを介してフラグメントに結合する。追加のエフェクター分子は、抗体フラグメント中の他の箇所、特に定常領域及び／又はヒンジ領域に、本明細書に記載される方法を使用して結合している。
【００３８】
本発明のこの態様に従う特定のフラグメントは以下のようなものである：
（ｉ）１個のエフェクター分子がヒンジ領域に結合している、又は
（ｉｉ）２つのエフェクター分子がヒンジ領域に結合している、又は
（ｉｉｉ）フラグメントに結合するすべてのエフェクター分子がヒンジ領域に結合している。
【００３９】
１個又は複数のエフェクター分子を、本発明の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントに結合させるための方法もまた、本発明によって提供され、この方法は以下の工程を含む：
ａ）ＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの両方が別のアミノ酸で置換されている抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを、フラグメント中に少なくとも１つの遊離チオール基を生成できる還元剤で処理する工程、
ｂ）処理したフラグメントをエフェクター分子と反応させる工程。
【００４０】
本発明によって提供される方法は、１個又は複数のエフェクター分子が抗体フラグメント中のシステイン、特に定常領域及び／又はヒンジ中のシステインに結合していることを可能にする。２つ以上のエフェクター分子は、この方法を同時又は連続的にのいずれかで反復することによって、抗体フラグメントに結合できる。
【００４１】
本発明の方法はまた、上記の還元方法の前及び／又は後で１つ又は複数の工程に拡張され、ここでは、追加のエフェクター分子が、以前に記載された方法を使用して、例えば、アミノ基又はイミノ基などの他の利用可能なアミノ酸側鎖を介して抗体フラグメントに結合している。
【００４２】
本発明の方法に使用するための還元剤は、抗体フラグメント出発物質中のシステインを還元して、遊離チオールを産生できる任意の還元剤である。好ましくは、この還元剤はすべての利用可能なチオールを効率的に還元する。本発明の一態様において、還元剤は、システインへのエフェクター分子の結合を可能にするために、重鎖定常領域のシステインと軽鎖定常領域のシステインとの間の、例えば、ＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインとの間の鎖間ジスルフィド結合を還元するために十分に強力である必要がある。鎖間ジスルフィド結合が鎖間システインの一方の非存在に起因して存在しない場合、還元剤は、ジスルフィド結合を形成していない抗体フラグメント中に残存しているシステインから、例えば、ヒンジ領域中のシステインから遊離チオールを効率的に遊離させることが可能でなければならない。本発明の抗体分子は、鎖間ジスルフィド結合についての要求性を有していないので、野生型抗体フラグメントで従来使用されるものよりも強力な還元剤が使用できる。その結果、より多くの数の遊離チオールが産生され、且つより高い割合の抗体フラグメントが正確に修飾され、即ち、正確な数のエフェクター分子が結合している。したがって、本発明の抗体フラグメントは、通常の抗体フラグメントよりも効率的且つ高いコスト効果で製造できる。適切な還元剤が、抗体フラグメントが還元剤で処理される後で産生される遊離チオールの数を決定することによって同定できることは当業者には明らかである。遊離チオールの数を決定するための方法は当該分野において周知であり、例えば、Ｌｙｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｅｅｒｉｎｇ，３，７０３を参照のこと。本発明に使用するための還元剤は当該分野において広範に公知である（例えば、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５１，１６７−７３に記載されるもの）。特定の例には、還元グルタチオン（ＧＳＨ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、β−メルカプトエチルアミン（β−ＭＡ）、及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）などのチオール系還元剤が含まれる。或いは、本発明の抗体フラグメントは、電気分解的方法を使用すること（例えば、Ｌｅａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９６５，Ｄｉｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｈｅｍ，４，２３−２７において記載される方法）、及び光還元的方法を使用すること（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２８（２），３２４−３２６に記載される方法）によって還元してもよい。しかし、好ましくは、本発明に使用するための還元剤は、抗体フラグメント中の１つ以上のチオールを遊離させることが可能である非チオール系還元剤である。好ましくは、非チオール系還元剤は、抗体フラグメント中のすべての利用可能なチオールを遊離させることが可能である。本発明に使用するための好ましい還元剤は、トリアルキルホスフィン還元剤である（Ｒｕｅｇｇ  ＵＴ及びＲｕｄｉｎｇｅｒ，Ｊ．，１９７７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，４７，１１１−１２６；Ｂｕｒｎｓ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，５６，２６４８−２６５０；Ｇｅｔｚ  ���ｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，７３−８０；Ｈａｎ及びＨａｎ、１９９４，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２０，５−１０；Ｓｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６，１２６５−１２７３）。これらの特定の例には、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリスブチルホスフィン（ＴＢＰ）、トリス−（２−シアノエチル）ホスフィン、トリス−（３−ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）、及びトリス−（２−ヒドロキシエチル）ホスフィンが含まれる。最も好ましくは、本発明に使用するため還元剤は、ＴＣＥＰ又はＴＨＰのいずれかである。本発明に使用するための還元剤の濃度は、例えば、還元剤の濃度を変化させること、及び産生した遊離チオールの数を測定することによって経験的に決定できることは当業者には明らかである。代表的には、本発明に使用するための還元剤は、抗体フラグメントよりも過剰で、例えば、２倍から１０００倍モル濃度過剰で使用される。好ましくは、この還元剤は、２、３、４、５、１０、１００、又は１０００倍過剰である。１つの好ましい例において、還元剤は４倍モル濃度過剰である。
【００４３】
本発明の一態様による修飾抗体フラグメントは、エフェクター分子、好ましくは、チオール選択性活性化エフェクター分子と、少なくとも１つの反応性システイン残基を含む抗体フラグメント（本明細書に記載されるようなもの）を反応細胞させることによって調製できる。上記の工程（ａ）及び（ｂ）における反応は、一般的に、溶媒、例えば、酢酸又はリン酸などの水性緩衝溶液中で、中性ｐＨ、例えば、約ｐＨ４．５から約ｐＨ８．０において実行できる。反応は、一般的に、任意の適切な温度、例えば、約５℃から約７０℃の間、例えば、室温で実行できる。溶媒は、場合により、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、又はＤＴＰＡなどのキレート剤を含んでもよい。好ましくは、溶媒は、ＥＤＴＡを、１から５ｍＭの間、好ましくは２ｍＭで含む。或いは、又は更に、溶媒は、クエン酸、シュウ酸、葉酸、ビシン、トリシン、トリス、又はＡＤＡなどのキレート剤緩衝液であってもよい。エフェクター分子は、一般的に、抗体フラグメントの濃度に比較して過剰の濃度で利用される。代表的には、エフェクター分子は、２から１００倍モル濃度過剰、好ましくは５、１０、又は５０倍過剰である。
【００４４】
必要である場合、所望の数のエフェクター分子を含む所望の生成物は、製造工程の間に生成され且つ望ましくない数のエフェクター分子を含む任意の他の生成物から、通常の手段によって、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー技術によって分離できる。
【００４５】
混合物がＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントで富化されており、このフラグメント中の軽鎖が重鎖に共有結合しておらず、ＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの両方が別のアミノ酸で置換されており、且つ少なくとも１個のエフェクター分子がフラグメントに結合していることを特徴とする、２つ以上の抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを含む混合物もまた提供される。この混合物は、本発明によって提供される方法を使用して産生できる。「富化される」によって、本発明者らは、結合したエフェクター分子の所望の数を有する抗体フラグメントが、この混合物の５０％以上を占めることを意味する。好ましくは、結合したエフェクター分子の所望の数を有する抗体フラグメントは、この混合物の５０％から９９％の間を占める。好ましくは、この混合物は、５０％超、好ましくは６０％超、より好ましくは７０％超を占める。所望の数のエフェクター分子を有する抗体フラグメントを含むこのような混合物の割合は、本明細書に記載されるようなサイズ排除ＨＰＬＣ法を使用することによって決定できる。一例では、混合物がＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントで富化されており、このフラグメント中の軽鎖が重鎖に共有結合しておらず、ＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの両方が別のアミノ酸で置換されており、１個のエフェクター分子がヒンジ領域に結合している。別の例において、混合物がＦａｂ’フラグメントで富化されており、このフラグメント中の軽鎖が重鎖に共有結合しておらず、ＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの両方が別のアミノ酸で置換されており、２つのエフェクター分子がヒンジ領域に結合している。
【００４６】
可溶性でフォールディングの適正な抗体フラグメントの単離を促進するために使用できるプロセスも、本発明によって提供されるが、この場合、このフラグメント中の軽鎖が重鎖に共有結合しておらず、ＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの両方が別のアミノ酸で置換されている。本発明のこの態様は、宿主細胞中での抗体フラグメントの組換え産生に関し、この抗体をコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換した細菌細胞中で発現される抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントに特に適している。高温熱抽出は、正しくフォールディングされ、アセンブルされた抗体フラグメントを得るために、宿主タンパク質及び抗体に関連した物質（例えば、遊離の重鎖及び軽鎖又はそのフラグメント）を含まない、細菌細胞において発現された通常の抗体の抽出において一般的に使用される（本明細書に参照として援用される米国特許第５，６６５，８６６号を参照のこと）。重鎖及び軽鎖の定常領域の間の鎖間ジスルフィド結合を含む通常の抗体フラグメントは、代表的には、約６０から６５℃で抽出される。しかし、本発明の一例では、Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメント出発物質は、重鎖と軽鎖との間の共有結合を有さない。驚くべきことに、本発明者らは、熱抽出がなお、ジスルフィド結合がないにも関わらず、これらの抗体フラグメントを得るために使用できることを実証することができた。したがって、本発明はまた、細菌細胞において抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントの単離を容易にするためのプロセスを提供し、このフラグメント中の軽鎖は重鎖に共有結合しておらず、ＣＬとＣＨ１の両方の鎖間システインが別のアミノ酸によって置換され、この方法は、この抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを含む調製物を、３４℃から５９℃の範囲の温度上昇に供する工程、及びこの調製物からの抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを回収する工程を含む。好ましくは、このプロセスに使用するための温度は４５から５９℃の範囲内であり、より好ましくは５０℃から５６℃の範囲内である。このプロセスに使用するための好ましい温度は、５０、５１、５２、５３、５４、５５、及び５６℃である。
【００４７】
本発明による抗体フラグメントは、多数の疾患又は障害の検出又は治療において有用であってもよい。このような疾患又は障害には、感染性疾患、例えば、細菌感染；真菌感染；炎症性疾患／自己免疫、例えば、関節リウマチ、骨関節炎、炎症性腸疾患；癌；アレルギー性／アトピー性疾患、例えば、喘息、湿疹；先天性疾患、例えば、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血；皮膚科学的疾患、例えば、乾癬；神経学的疾患、例えば、多発性硬化症；移植、例えば、移植臓器拒絶、移植片対宿主疾患；及び代謝性／特発性疾患、例えば、糖尿病の一般的な標題の下で記載されるものが含まれる可能性がある。
【００４８】
本発明による抗体フラグメントは、治療及び／又は診断に使用するために製剤化でき、本発明のさらなる態様によれば、本発明者らは、フラグメント中の重鎖が軽鎖に共有結合しておらず、且つＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの両方が別のアミノ酸で置換されていることを特徴とする、少なくとも１個のエフェクター分子を結合している抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを、１種又は複数の医薬として許容可能な賦形剤、希釈剤、又は担体とともに含む、医薬組成物を提供する。
【実施例】
【００４９】
以下の図を参照して、本発明を例示のみのために以下に説明する。
【００５０】
Ｆａｂ’命名法及び一般的方法
以下の実施例において使用されるＦａｂ’分子は、ヒト細胞表面レセプターに結合するｇ１６５Ｆａｂ’及びヒトサイトカインＩＬ−１βに結合するｇ８５１６である。各フラグメントについての命名法は、一文字コード、システインについてのＣ及びセリンについてのＳを使用して、軽鎖（ＬＣ）におけるＣＬの鎖間システインの部位、及び重鎖（ＨＣ）におけるＣＨ１の鎖間システインの部位におけるアミノ酸を示す。例えば、通常のＦａｂ’は「ｇ１６５  Ｆａｂ’  ＬＣ−Ｃ、ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＡＡ’」であるのに対して、両方の鎖間システインがセリンで置換され、したがって、ＣＬとＣＨ１の間に鎖間ジスルフィドが存在しない改変体は、例えば、「ｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡ’」である。完全なγ１中間ヒンジを有する類似のＦａｂ’は、「ｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＰＰＣＰＡ’」と表される。以下の実施例において使用されたプラスミドのリストを表１に示す。
【００５１】
【表１】
2007535472.tif 000003
【００５２】
Ｆａｂ’の産生
ＰＣＲ変異誘発は、Ｆａｂ’フラグメント中のＣＬ及びＣＨ１の鎖間システインをセリンに変更するために使用した。Ｆａｂ’分子は、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０中で産生され、標準的な方法を使用して精製した（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２６，３０９−３２０）。
【００５３】
Ｆａｂ’フラグメントの還元及びＰＥＧ化
すべての還元及びＰＥＧ化を、０．１Ｍリン酸ｐＨ６．０；２ｍＭ  ＥＤＴＡ中で実行した。Ｆａｂ’及び還元剤の濃度は各実施例に記載される通りであった。すべての場合において、還元を室温（約２４℃）で３０分間行い、タンパク質をＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で脱塩し、次いでＦａｂ’に対して５倍モル濃度過剰のＰＥＧ−マレイミドと混合した。４０ｋＤａ  ＰＥＧはＮｅｋｔａｒからであり、２０ｋＤａ及び３０ｋＤａ  ＰＥＧはＮｉｐｐｏｎ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｆａｔｓからであった。ＰＥＧ化したＦａｂ’を、ＰＥＧ化されていないＦａｂ’から、サイズ排除ＨＰＬＣによって、分析用Ｚｏｒｂａｘ  ＧＦ−４５０カラム及びＧＦ−２５０カラム上で、順次に分離した。これらを、０．２Ｍリン酸ｐＨ７．０＋１０％エタノールの３０分間の定組成グラジエントで、１ｍｌ／分にて展開し、Ｆａｂ’を２１４ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸収を使用して検出した。
【００５４】
実施例１：新規なＰＥＧ化Ｆａｂ’フラグメントの作製
抗体Ｆａｂ’フラグメントｇ１６５Ｆａｂ’  ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジＣＡＡ及びｇ８５１６  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジＣＡＡを、ＰＣＲ変異誘発によって、ＣＬ及びＣＨ１の鎖内システインをセリンに置換することによって産生した。単一のＰＥＧフラグメントを、ヒンジシステインを還元し、システインにＰＥＧ−マレイミドを結合させることによって、各フラグメントのヒンジに結合させた。ｇ１６５Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジＣＡＡの場合には、多数の異なる還元剤をＦａｂ’に対して４倍モル濃度過剰で試験したが、これらは、チオール系還元剤、還元グルタチオン（ＧＳＨ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、β−メルカプトエチルアミン（β−ＭＡ）、及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）、並びに非チオール系還元剤、トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）であった。還元及びＰＥＧ化の後、Ｆａｂ’フラグメントに結合したＰＥＧ分子の数をサイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。
【００５５】
ＴＣＥＰが還元剤として使用されたときに非常に高レベルのモノ−ＰＥＧ化が得られ、ＰＥＧ化対非ＰＥＧ化の物質の比率は約７５：２５であった（図１）。これらの条件下で、チオール系還元剤についての比率は以下の通りであった。ＤＴＴ  ６４：３６、β−ＭＡ  ５０：５０、β−ＭＡ  ２０：８０及びＧＳＨ２５：７５。ＴＣＥＰは、試験されたうちで最も効率的な還元剤であり、ＤＴＴよりもＰＥＧ化物質が１０％増加した。ＣＬとＣＨ１との間の鎖間ジスルフィドがない場合、通常のＦａｂ’フラグメント中の鎖内ジスルフィドを普通なら減少させると思われる、より強力な還元剤を使用できる。同じ抗体フラグメントであるが、未変性の鎖内ジスルフィドを用いる（ｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ  ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＡＡ）ＰＥＧ化が本発明者らの手の内にあり、チオール系還元剤を使用することは、代表的には、低効率のモノＰＥＧ化を生じ、ＤＴＴについては５５％、βＭＡについては５２％、βＭＥについては２０％、及びＧＳＨについては２２％を生じた（本発明者らの同時係属出願ＧＢ０３１５４５７．２も参照のこと）。したがって、本発明の新規なフラグメントは、通常の抗体フラグメントより効率的に製造できる。ＴＣＥＰは、本発明の抗体フラグメントを製造するための有用な還元剤の１つの例である。
【００５６】
図２ａ及び２ｂは、単一のＰＥＧ分子がフラグメントに結合したことを示す。図２ａは、精製されたＦａｂ’フラグメントｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジＣＡＡを示し、レーン２における単一バンドは、遊離の重鎖と軽鎖の両方を表す。図２ｂは、ヒンジへの単一のＰＥＧ分子の結合後のｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジＣＡＡ（レーン２）の重鎖の分子量の増加を示す（レーン２における最大分子量のバンド）。レーン２におけるより低分子量のバンドは遊離の軽鎖である。
【００５７】
ｇ１６５Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジ  ＣＰＰＣＰＡ、ｇ８５１６Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジＣＰＰＣＰＡ及びｇ８５１６  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジＣＰＳＣＰＡのヒンジを効率的にＰＥＧ化するために、ＴＥＣＰも使用した。
【００５８】
以下の実施例は、これらの新規なフラグメントが鎖間ジスルフィド結合を含む従来のフラグメントと類似した特性を有することを実証する。
【００５９】
実施例２：ＣＬ：ＣＨ１間ジスルフィドを欠くＦａｂ’の安定性試験
精製したＦａｂ’に対する温度の影響
抽出時に鎖間ジスルフィドの有無でＦａｂ’分子の温度安定性を比較するために、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に精製Ｆａｂ’を添加した。精製ｇ１６５  Ｆａｂ  ＬＣ−Ｃ  ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＡＡ又はｇ１６５  Ｆａｂ  ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡを、プラスミドを含まないＷ３１１０Ｅ．ｃｏｌｉ、３０  ＯＤ６００／ｍｌの懸濁液を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ  ｐＨ  ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で２ｍｇ／ｍｌ  Ｆａｂ’の最終濃度に作製した。２０μｌの分量を、５００μｌエッペンドルフチューブ中で、加熱ブロック中で一晩、室温、３７℃、４５℃、５０℃、５５℃、及び６５℃でインキュベートした。インキュベーション後、チューブを１３０００ｇ×１分間遠心分離し、沈殿したタンパク質及び細胞細片をペレット化し、５μｌの試料を上清（可溶性画分）からとり、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離し、その後Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅで染色した（図３）。１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ  ＨＣ−Ｃヒンジ−ＣＡＡは６５℃で安定であった（レーン１〜７、主要なバンドは約５０ｋＤａ）。それに対して、１６５Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ  ヒンジ−ＣＡＡは６０℃まで安定であった（レーン８〜１３、上のバンドは重鎖ダイマー、下のバンドは遊離の重鎖及び軽鎖）。その後タンパク質のレベルを減少した（レーン１４）。
【００６０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは変性能を有するので、ゲル上で見られるＬＣ、ＨＣ、及びＦａｂ’のバンドが正しくフォールディングされたタンパク質を表すという保証はない。したがって、異なる温度インキュベーションの後でイオン交換及びプロテインＧのカラムマトリックスに正常に結合することができるか否かを見るための試験を行った。１６５Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓヒンジ−ＣＡＡの発酵細胞ペーストを、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ中で、３０℃、３７℃、４７℃、５２℃、５６℃、及び６０℃で一晩振盪し、次いで、ＳＰセファロース又はプロテインＧへの結合によってＦａｂ’回収について試験した。図４は、ＳＰセファロースフロースルー（レーン３〜８）及び溶離液（レーン９〜１４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、ＬＣ及びＨＣの回収が、５６℃まで、及び５６℃を含む温度によって影響されないことを実証する（レーン９から１３）。６０℃においては、カチオン交換カラムから回収されるＦａｂ’のレベルは減少した（レーン１４）。同様に、これらのＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出物中のＦａｂ’は、５２℃までの温度の上昇した一晩のインキュベーションの後でさえ、プロテインＧに結合することが見い出された。このことは、外部表面は、これらの温度の上昇への曝露の後でさえ、正確にフォールディングすることを示唆する。
【００６１】
１６５Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−ＳヒンジＣＡＡからのＦａｂ’の首尾よい回収に関係する臨界温度に取り組み且つそれを指摘するために、３０℃における発酵細胞ペーストの一晩抽出を実行した。試料を参照として取った。その後、抽出物を振盪しながら１時間、漸進的に温度を上昇させながら（５０℃、５３℃、５６℃、５９℃、６２℃、６５℃、及び６８℃）インキュベートした。図６におけるプロテインＧへの結合分析は、５９℃が、このようなＦａｂ’のために１時間の耐容性につての累積的な温度であることを示した。
【００６２】
これらのデータは、明確に、ｃカッパとＦｄとの間の非共有結合性交互作用が非常に強力であること、及び驚くべきことに、５０℃から５９℃まででの熱抽出が、本発明の抗体フラグメントを調製するためになお使用可能であることを示す。
【００６３】
Ｆａｂ’及びＦａｂ−ＰＥＧの物理的性能に対する、ＣＬ：ＣＨ１間ジスルフィド結合の欠如の効果
ｉ）Ｆａｂ’の精製
ＣＬ：ＣＨ１間のジスルフィド結合を欠くように操作して得たＦａｂ’は、ＣＬ：ＣＨ１間のジスルフィド結合を含むＦａｂ’と正確に同じ様式で、プロテインＧ又はイオン交換を使用して精製された。これらは、ｐＨ  ２．７において溶出を（プロテインＧ）、又はｐＨ  ４．５において平衡を（イオン交換）含んだので、ＣＬ：ＣＨ１間のＦａｂ’相互作用は明確に物理化学的に安定であった。
【００６４】
ｉｉ）インビトロにおける抗原結合親和性
ＬＣとＨＣの間の共有結合の存在下又は非存在下における結合したＰＥＧ分子を有するｇ８１６５  Ｆａｂ’を、表面プラズモンを使用して抗原親和性について分析した。表２は、ＣＬ：ＣＨ１間のジスルフィドの欠如、又はジ−ＰＥＧ化はいずれも実質的に結合親和性に影響を与えないことを示す。
【００６５】
【表２】
2007535472.tif 000004
【００６６】
実施例３：ラットにおけるＦａｂ−ＰＥＧの薬物動態
ｉ）ヒンジ上のＰＥＧ化Ｆａｂの動物における循環半減期
Ｆａｂ’のＰＥＧ化、その後の１２５Ｉ標識、及びラットへの静脈内又は皮下注射により、潜在的治療薬Ｆａｂ’の血清保留性の分析が可能になる。ＰＥＧ化されていないＦａｂ’の循環半減期は非常に短く（ｔ１／２βは約３０分間）、遊離のＬＣ又はＨＣの該半減期は一層短いようである。タンパク質の１２５Ｉ標識はランダムである。したがって、ＨＣ上でのみＰＥＧ化され、且つＣＬ：ＣＨ１間のジスルフィド結合を欠くＦａｂ’は、ＬＣがインビボでＨＣと解離するのであれば、数時間以内に注射された１２５Ｉ血液中の放射活性の約半分を失う。
【００６７】
動物群あたり３００μｇのＦａｂ’−ＰＥＧを、Ｂｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、０．２２〜０．３３μＣｉ／μｇの比活性まで、１２５Ｉ標識した。
【００６８】
２２０〜２５０ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ）を、ハロタン麻酔下に配置しながら、２０μｇの１２５Ｉ−標識Ｆａｂ’−ＰＥＧ変異体を静脈内又は皮下に注射した（群あたりｎ＝６）。投与後、０．５、２、４、６、２４、４８、７２、及び１４４時間後に尾からの連続的動脈出血を採取した。試料を、ＣＯＢＲＡ（商標）Ａｕｔｏｇａｍｍａカウンター（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して計数した。データをプロットし、曲線の下の面積を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を使用して計算し、％注射用量．時間（％ｉ．ｄ／時間）として表現する。ｔ１／２αを、０．５、２、４、及び６の時点で規定するのに対し、ｔ１／２βは、２４、４８、７２、及び１４４の時点で規定する。６匹のすべての動物についての平均及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表３に示す。
【００６９】
ｇ８５１６  Ｆａｂ’  ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓヒンジ−ＣＡＡ及びｇ８５１６  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ  ＨＣ−Ｃヒンジ−ＣＡＡを、単一のヒンジ分枝４０ｋＤａ  ＰＥＧを用いて、還元剤としてＴＤＥＰを使用して修飾し、そしてラットにおいてこのような薬物動態分析に供した。
【００７０】
Ｆａｂ’が静脈内注射された実験において、これらの２つの物質の半減期及び曲線形状は、本質的に同一であった（表３及び図７）。このことは、ＬＣ及びＨＣが、ラット循環中への注射の後で６日間までさえ一緒に残っていることを示唆する。
【００７１】
再度、Ｆａｂ’が皮下注射された実験において、血液から採取された放射能、及びＬＣとＨＣとの間の共有結合的相互作用の欠如は、循環半減期に影響を与えなかった（表３及び図８）。
【００７２】
Ｆａｂ’ヒンジがヒトγ１アイソトープ抗体の中間ヒンジを含むように拡張されるとき、ＰＥＧの結合のために利用可能な２つのシステインが存在する。ヒンジが２×２０ｋＤａ直鎖ＰＥＧでジ−ＰＥＧ化されたこのデータは（表３、図９）、薬物動態が、モノ−ＰＥＧ化Ｆａｂ’対照と非常に類似している。ジ−ＰＥＧ化Ｆａｂ’についての曲線形状においては、モノ−ＰＥＧ化Ｆａｂ’に対してわずかな違いがあり、したがって、その結果、ジ−ＰＥＧ化物質のα相半減期を計算することが不可能である。ジ−ＰＥＧ化Ｆａｂ’の半減期は、ＬＣ及びＨＣが共有結合しているか否かと同じく無関係である。
【００７３】
【表３】
2007535472.tif 000005
【００７４】
実施例４：マウス抗原結合効力モデル：動物モデルにおけるインビボ効力
ＬＣとＨＣとの間の相互作用の回復性のさらなる証拠は、マウスモデルにおける抗原を中和する、ＣＬ：ＣＨ１間ジスルフィド結合を欠くＦａｂ’の能力において見い出される。ｇ８５１６Ｆａｂ’に対するヒトサイトカインＩＬ−１β抗原は、静脈内注射時（ＩＬ−６産生）又は腹腔内注射時（好中球遊走）にマウスから生物学的応答を誘発し、これらは、ｇ８５１６  Ｆａｂ−ＰＥＧで中和することによって阻止又は阻害できる。抗体は、通常抗原結合に関与する６ＣＤＲ（各ポリペプチド上に３つ）を有する。したがって、モノＰＥＧ化型のｇ８５１６  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ  ヒンジ−ＣＡＡ及びｇ８５１６  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ  ＨＣ−Ｃヒンジ−ＣＡＡの投与によって、ＬＣ及びＨＣが相互の結合を保っているならば、これらの抗原推進事象を阻止すると予想される。対合せずに、その後非ＰＥＧ化ＬＣが循環系から失われれば、中和能も失われると予想されよう。
【００７５】
ｉ）静脈内投与されたｇ８５１６Ｆａｂ’−ＰＥＧ及び静脈内投与されたｈＩＬ−１β
ｔ＝−１５分において；雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（１９．９ｇ）マウスは、試験ｍＡｂを、１００μｌ  ＰＢＳ中、１、３、及び１０ｍｇ／ｋｇ、又はＰＢＳビヒクル単独で静脈内注射された（ハロタン麻酔下で）。ｔ＝０において；マウスは、１００μｌ  ＰＢＳビヒクル中、抗原（３０μｇ／ｋｇ）、又はＰＢＳ（単独、ハロタン麻酔下）で静脈内注射された。ｔ＝９０分において；心臓穿刺を実行し、血液を、ヘパリン処理生理食塩水（１００Ｕ／ｍｌヘパリン）に流した。次いで、マウスを頸部脱臼によって屠殺した。
【００７６】
血漿を、採取した血液から、遠心分離によって調製し（１４０００×ｇ、２分間、ＲＴ）、ＥＬＩＳＡによるＩＬ−６レベルの決定の前に−２０℃で保存した。ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡを、製造業者の指示書（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＯＰＴ−ＥＩＡ  ｍＩＬ−６）に従って実行した。試料を１／１６に希釈した。
【００７７】
図１０は、ｇ８５１６Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓヒンジ−ＣＡＡが、すべての試験された用量において静脈内投与されたときに、抗原を中和する際に、ｇ８５１６Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ  ＨＣ−Ｃヒンジ−ＣＡＡと同様の効力であったことを示す。
【００７８】
ｉｉ）静脈内投与されたｇ８５１６Ｆａｂ’−ＰＥＧ及び腹腔内投与されたｈＩＬ−１β
Ｆａｂ’−ＰＥＧの静脈内前投与は、異なる効力モデルにおいて、抗原の腹腔内の前１日、３日、及び７日に拡張された。
【００７９】
雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（２１ｇ）に、単回用量（１００μｌ  ＰＢＳ中３ｍｇ／ｋｇ）のｇ８５１６  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ  ＨＣ−Ｃヒンジ−ＣＡＡ−４０ｋＤａ  ＰＥＧ、ｇ８５１６Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓヒンジ−ＣＡＡ−４０ｋＤａ  ＰＥＧ、又はｇｈＡ３３  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ  ＨＣ−Ｃヒンジ−ＣＡＡ−４０ｋＤａ  ＰＥＧ（関連性のない対照）を、ｈＩＬ−１β（１００μｌ  ＰＢＳビヒクル中３ｎｇ／ｋｇ）の腹腔内注射の１日、３日又は７日前に、静脈内注射（ｉ．ｖ．）した。１２０分後、頸部脱臼によりマウスを屠殺し、腹腔洗浄を実行した（３ｍｌ  ＰＢＳ＋０．２５％  ＢＳＡ、１２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）。全体の白血球計数を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して実行した。好中球の同定のために、５０μｌの腹腔洗浄液を、抗ＣＤ４５−ＣｙＣｈｒｏｍｅ  ｍＡｂの１：３００希釈、及び抗ＧＲ−１−ＰＥ  ｍＡｂ（抗Ｌｙ６Ｇ／Ｌｙ６Ｃ）の１：３００希釈で２０分間（４℃、暗所で）染色した。白血球を１回ＰＢＳ（０．２５％  ＢＳＡ、１２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中で洗浄し、３００μＬ  ＰＢＳ（０．２５％  ＢＳＡ、１２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中に再懸濁し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。好中球をＣＤ４５＋ＧＲ−１ＨＩＧＨとして同定した。
【００８０】
図１１は、いずれかの時点において、ＣＬ：ＣＨ１間のジスルフィド結合を有するか、又はそれを欠くｇ８５１６  Ｆａｂ−ＰＥＧの間で違いが存在しなかったことを示す。これは、効力が、１週間の間マウス循環中に保持されることを示し、ＬＣ及びＨＣがこの時間の間に結合したままであることの暗示を伴う。これらの動物モデルにおいて使用されるｇ８５１６Ｆａｂ’−ＰＥＧ物質の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、図１２に示される。この図は、ＬＣ及びＨＣの結合が、ｇ８５１６Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ  ＨＣ−Ｃ、ヒンジＣＡＡにおいて観察された共有結合と比較して（レーン１及び２、共有結合を実証する単一の高分子量バンド）、ｇ８５１６Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡ−ＰＥＧについては非共有結合性であることを実証する（レーン３及び４、より大きな分子量バンドがヒンジに結合したＰＥＧを有する重鎖であり、より小さな分子量のバンドが遊離の軽鎖である）。
【００８１】
上記の実施例より、本発明の新規なＰＥＧ化分子は、ＣＬ：ＣＨ１ジスルフィド結合を含むＰＥＧ化抗体より効率的に製造可能であることが明白に理解できる。このような実施例は、鎖間ジスルフィド結合を欠くＦａｂ’のＰＥＧ化は、抗体Ｆａｂ’の生物活性又は安定性に有害作用を示さず、通常のＦａｂ’よりもより効率的に製造できるこのような有用な治療用分子が製造されることも実証している。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】サイズ排除ＨＰＬＣによって決定された、種々の還元剤を使用して製造されたモノ−ＰＥＧ化、対、ＰＥＧ化されていないｇ１６５Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡの割合を示す図である。
【図２ａ】精製ｇ１６５  Ｆａｂ’変異体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。レーン２はＦａｂ’フラグメントｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡを示す。レーン６は対照Ｆａｂ’フラグメントｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡを示す。
【図２ｂ】ＰＥＧ化ｇ１６５  Ｆａｂ’変異体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。レーン２はＰＥＧ化Ｆａｂ’フラグメントｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡを示す。レーン６は対照Ｆａｂ’フラグメントｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＳＡＡを示す。
【図３】Ｅ．ｃｏｌｉペリフェラル抽出物中での種々の温度における一晩インキュベーション後の精製ｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ  ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＡＡ（レーン１〜７）及びｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡ（レーン８〜１４）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。温度はＲＴ、３７℃、４５℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、及び６５℃であった（レーン１〜７及びレーン８〜１４）。
【図４】一定の範囲の温度でのＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ（Ｔ．Ｅ．）中での一晩のペリフェラル抽出後のｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡのカチオン交換回収を示す非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。レーン１は粗Ｔ．Ｅ．抽出物を示す；レーン２は粗Ｔ．Ｅ．抽出物、ｐＨ４．５を示す；レーン３〜８は、それぞれ、３０℃、３７℃、４７℃、５２℃、５６℃、及び６０℃で作製した抽出物のカチオン交換カラムからのフロースルーを示す；レーン９〜１４は、３０℃、３７℃、４７℃、５２℃、５６℃、及び６０℃で作製した抽出物のカチオン交換カラムからの溶離物を示す。
【図５】一定の範囲の温度でのＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ中の一晩ペリプラズム抽出後のｇ１６５Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓヒンジ−ＣＡＡのプロテインＧ回収の図である。
【図６】Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡペリプラズム抽出において増加温度での一時間連続インキュベーション後のｇ１６５Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓヒンジ−ＣＡＡのプロテインＧ回収の図である。
【図７】ラットにおいて静脈内投与された１２５標識モノ−ＰＥＧ化ｇ８５１６  Ｆａｂ’の薬物動態。
【図８】ラットにおいて皮下投与された１２５標識モノ−ＰＥＧ化ｇ８５１６  Ｆａｂ’の薬物動態。
【図９】ラットにおいて静脈内投与された１２５標識ジ−ＰＥＧ化ｇ８５１６  Ｆａｂ’の薬物動態。
【図１０】マウスにおいて静脈内投与されたＦａｂ’−ＰＥＧによる静脈内投与された抗原誘導性ＩＬ−６生成の中和。
【図１１】マウスにおいて静脈内投与されたｇ８５１６  Ｆａｂ’−ＰＥＧの静脈内前投薬による腹腔内投薬抗原誘導性好中球蓄積の中和。
【図１２】モノ−及びジ−ＰＥＧ化ｇ８５１６  Ｆａｂ’の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。レーン１、ｇ８５１６  Ｆａｂ  ＬＣ−Ｃ  ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＡＡ−１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ；レーン２、ｇ８５１６Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ  ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＰＰＣＰＡ−２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ；レーン３、ｇ８５１６  Ｆａｂ  ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡ−１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ；レーン４  ｇ８５１６  Ｆａｂ  ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ、ヒンジＣＰＰＣＰＡ−２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ。
【図１】
2007535472.tif 000006
2007535472.tif 000007
【図３】
2007535472.tif 000008
【図４】
2007535472.tif 000009
【図５】
2007535472.tif 000010
【図６】
2007535472.tif 000011
【図７】
2007535472.tif 000012
【図８】
2007535472.tif 000013
【図９】
2007535472.tif 000014
【図１０】
2007535472.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
2007535472.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月29日(2007.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラグメント中の重鎖が軽鎖に共有結合しておらず、且つＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの両方が別のアミノ酸で置換されていることを特徴とする、少なくとも１個のエフェクター分子が結合している抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメント。
【請求項２】
ＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインがチオールを含まないアミノ酸で置換されている、請求項１記載の抗体フラグメント。
【請求項３】
ＣＬの鎖間システインがセリンで置換されている、請求項２記載の抗体フラグメント。
【請求項４】
ＣＨ１の鎖間システインがセリンで置換されている、請求項２記載の抗体フラグメント。
【請求項５】
ＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの両方がセリンで置換されている、請求項２記載の抗体フラグメント。
【請求項６】
ＣＬの鎖間システインが軽鎖の２１４位にあり、且つＣＨ１の鎖間システインが重鎖の２３３位にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
【請求項７】
少なくとも１個のエフェクター分子が重鎖又は軽鎖の定常領域に結合している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
【請求項８】
エフェクター分子が軽鎖定常領域中のシステイン及び重鎖定常領域中のシステインに結合している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
【請求項９】
エフェクター分子に結合している重鎖及び軽鎖定常領域中のシステイン残基が、エフェクター分子が結合していないならば、ジスルフィド結合を介して互いに連結されていると見込まれる、請求項８記載の抗体フラグメント。
【請求項１０】
修飾ヒンジ領域を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１１】
修飾ヒンジが１個のシステイン残基を含む、請求項１０記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１２】
ヒンジが配列番号１又は配列番号２における配列を含む、請求項１１記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１３】
修飾ヒンジが２個のシステイン残基を含む、請求項１０に記載の抗体フラグメント。
【請求項１４】
ヒンジが配列番号３又は配列番号４における配列を含む、請求項１３記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１５】
少なくとも１個のエフェクター分子がヒンジ領域に結合している、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１６】
２つのエフェクター分子がヒンジ領域に結合している、請求項１５記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１７】
フラグメントに結合したすべてのエフェクター分子がヒンジ領域に結合している、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１８】
フラグメントに結合した各エフェクター分子がヒンジ領域中のシステインに結合している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを産生する方法であって、
ａ．ＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインの両方が別のアミノ酸で置換されている抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを、フラグメント中に少なくとも１つの遊離チオール基を生成できる還元剤で処理し、
ｂ．処理したフラグメントをエフェクター分子と反応させる、
ことを含む上記方法。
【請求項２０】
還元剤が非チオール系還元剤である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
還元剤がトリアルキルホスフィンである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
トリアルキルホスフィン還元剤がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
トリアルキルホスフィン還元剤がトリス（３−ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
工程（ａ）及び（ｂ）のいずれか又はその両方をキレート剤の存在下で実行する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
キレート剤がＥＤＴＡである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
工程（ａ）及び（ｂ）の両方をＥＤＴＡの存在下で実行する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
２つ以上のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを含む混合物であって、該混合物がＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントで富化されており、前記フラグメント中の軽鎖が重鎖に共有結合しておらず、ＣＬとＣＨ１の両方の鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており、少なくとも１個のエフェクター分子が前記フラグメントに結合していることを特徴とする、上記混合物。
【請求項２８】
混合物の５０％超がＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを含み、ここで前記フラグメント中の軽鎖が重鎖に共有結合しておらず、ＣＬとＣＨ１の両方の鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており、且つ少なくとも１個のエフェクター分子が前記フラグメントに結合している、請求項２７記載の混合物。
【請求項２９】
エフェクター分子がＰＥＧである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の抗体フラグメントを、１種又は複数の医薬として許容可能な賦形剤、希釈剤又は担体とともに含む、医薬組成物。
【国際調査報告】
2007535472.tif 000018
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