(57)【要約】  本発明は、アクリル酸の分解活性を有し、且つ、アクリル酸に耐性を有する新規なロドコッカス・エリスロポリス菌株及びこれを用いてアクリル酸を含む汚染物質からアクリル酸を除去する方法に関する。本発明による菌株は、アクリル酸の分解活性と共に、高濃度のアクリル酸への耐性を有していることから、アクリル酸を含む汚染物質からアクリル酸を効率よく除去する上で有効である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクリル酸分解活性を有するアクリル酸耐性のロドコッカス・エリスロポリス菌株。
【請求項２】
寄託番号がＫＣＴＣ １８１０２Ｐである請求項１に記載のロドコッカス・エリスロポリス菌株。
【請求項３】
１〜５重量％のアクリル酸の濃度下で生育することができる請求項１に記載のロドコッカス・エリスロポリス菌株。
【請求項４】
アクリル酸を含む汚染物質と請求項１乃至３の何れか一項によるロドコッカス・エリスロポリス菌株またはその培養液を混合した後、培養することを特徴とするアクリル酸を含む汚染物質からアクリル酸を除去する方法。
【請求項５】
前記アクリル酸を含む汚染物質が、アクリル酸を含む下水または廃水であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクリル酸の分解活性を有し、且つ、アクリル酸に耐性を有する新規なロドコッカス・エリスロポリス菌株、及びこれを用いてアクリル酸を含む汚染物質からアクリル酸を除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、アクリル酸を分解する微生物としては、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)のバクテリア、ジオトリカム属(Geotrichum sp.)、トリコデルマ属(Trichoderma sp.)、カンジダルゴサ(Candida rugosa)、及びビソクラミス属(Byssochlamys sp.)のカビが知られている。バクテリアは生育条件が比較的に単純であり、且つ、培養し易いとはいえども、高濃度のアクリル酸、例えば、１０ｇ／Ｌ（１重量％）以上のアクリル酸濃度下では生育できないことが知られている。例えば、シュードモナス属のバクテリアは、１．５ｇ／Ｌ以上のアクリル酸の濃度下では生長が阻害される(Shanker, R., Arch. Microbiol., 154:192, 1990; Bringmann & Kuhn, Water Research, 14:231, 1980)。
【０００３】
カビの場合、比較的に高いアクリル酸の濃度下で生長することが知られている。例えば、ジオトリカム属及びトリコデルマ属のカビは、１重量％のアクリル酸を１０日以内に分解することが知られている(Heena Dave, Biotechnology letters, 18:963, 1996)。また、カンジダルゴサは、２重量％のアクリル酸を４日内に分解し(Hasegawa, J., J. Ferment. Technol., 60:591, 1992)、ビソクラミス属のカビは、７重量％のアクリル酸を１４日以内に分解することが知られている(Kazuhiro Takamizawa, Appl. Microbiol. Biotech., 40:196, 1993)。これらのカビによるアクリル酸の分解はやや分解時間が長く、菌株生長の条件が厳しい他、しかも、培養時間が長いという欠点がある。さらに、カビの場合、形質転換の仕方がまだ確立されておらず、組換え菌株を製造することが決して容易ではないという欠点がある。
【０００４】
一方、ロドコッカス属(Rhodococcus sp.)のバクテリアはグラム陽性であり、ノカルジオホルム・アクチノミセテス(Nocardioform Actinomycetes)に属する微生物である。従来、ロドコッカス属のバクテリアは、アクリロニトリルなどのニトリル化合物をアクリル酸などのその酸に転換するのに用いられている。例えば、米国特許第５，１３５，８５８号公報には、ロドコッカス・ロドクロス(Rhodococcus rhodochrous) J-1 Ferm ＢＰ−１４７８及びＡＴＣＣ ３３２７８を用いてアクリロニトリルなどのニトリル化合物をアクリル酸などのその酸に転換する方法が開示されている。しかしながら、アクリル酸は培地に蓄積され、ロドコッカス・ロドクロスJ-1 Ferm ＢＰ−１４７８及びＡＴＣＣ ３３２７８によって分解されうるものではない。このため、アクリル酸を分解するロドコッカス属の微生物は、何ら知られていない。
【０００５】
そこで、バクテリアのように生育条件が単純であり、素早く生育しながらも、高濃度のアクリル酸に耐性を有しており、しかも、アクリル酸を素早く分解可能な微生物への要求は依然として強いのが現状である。そこで、本発明者らは、アクリル酸を炭素源としてアクリル酸を分解可能な菌株を見出すために鋭意努力した結果、高濃度のアクリル酸下でも生長可能であり、しかも、アクリル酸を素早く分解可能なロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)種に属する菌株を見出し、本発明を完成するに至った。
【特許文献１】米国特許第５，１３５，８５８号公報
【非特許文献１】Shanker, R., Arch. Microbiol., 154:192, 1990; Bringmann & Kuhn, Water Research, 14:231, 1980
【非特許文献２】Heena Dave, Biotechnology letters, 18:963, 1996
【非特許文献３】Hasegawa, J., J. Ferment. Technol., 60:591, 1992
【非特許文献４】Kazuhiro Takamizawa, Appl. Microbiol. Biotech., 40:196, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、アクリル酸の分解活性を有しており、しかも、高濃度のアクリル酸に対する耐性を有するロドコッカス・エリスロポリス種に属する菌株を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記菌株を用いてアクリル酸を含む汚染物質からアクリル酸を除去する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、アクリル酸分解活性を有するアクリル酸耐性のロドコッカス・エリスロポリス菌株を提供する。本発明において、前記菌株は、寄託番号がＫＣＴＣ １８１０２Ｐであることを特徴とする。
【０００９】
本発明はまた、アクリル酸を含む汚染物質と前記ロドコッカス・エリスロポリス菌株またはその培養液を混合した後、培養することを特徴とするアクリル酸を含む汚染物質からアクリル酸を除去する方法を提供する。
【００１０】
本発明の他の特徴及び実施態様は、後述する実施例及び特許請求の範囲から一層明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、アクリル酸の分解活性を有するアクリル酸耐性ロドコッカス・エリスロポリス菌株に関する。本発明において、前記菌株は、寄託番号がＫＣＴＣ  １８１０２Ｐであることが好ましい。
【００１２】
本発明の微生物は、ロドコッカス・エリスロポリス種に属する菌株であって、アクリル酸に対して耐性があり、且つ、アクリル酸を分解する活性を有している。本発明の菌株は、他の属に属する微生物、例えば、エシェリキア属(Escherichia   sp.)、シュードモナス属、バチルス属(Bacillus sp.)、及びカンジダ属(Candidasp.)に比べて顕著に高いアクリル酸の分解活性を有している。また、本発明の菌株は、アクリル酸に対して耐性を有し、しかも、高いアクリル酸の濃度下でも生育することができる。本発明の菌株は、５重量％以下、好ましくは、１〜４重量％のアクリル酸の濃度下でも生育可能である。
【００１３】
本発明において、「アクリル酸の分解活性」とは、アクリル酸を含む培地において、アクリル酸を炭素源として同化または異化することが可能であって、培地中のアクリル酸の濃度を低下可能であることを意味する。
【００１４】
本発明はまた、アクリル酸を含む汚染物質と前記ロドコッカス・エリスロポリス菌株またはその培養液を混合した後、培養することを特徴とするアクリル酸を含む汚染物質からアクリル酸を除去する方法に関する。
【００１５】
本発明によるアクリル酸の除去方法において、前記菌株の培養に用いられる条件は、培地中にアクリル酸を含むことを除いては、当業界における周知の条件と同様にすることができる。前記アクリル酸を含む汚染物質は、アクリル酸を含むものであれば、いずれも採用可能である。前記アクリル酸を含む汚染物質としては、例えば、アクリル酸そのもの、アクリル酸を含有する溶液、下水及び廃水などがある。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例を挙げて本発明を一層詳細に説明する。但し、これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されるものではない。
【００１７】
実施例1:土壌からアクリル酸を炭素源とする微生物の分離
韓国のジョルラプクドのジョンウプ地域の高速道路近くの土壌を採取し、常温下、２４時間乾燥した。乾燥させた前記土壌試料１．０ｇを５ｍｌのアクリル酸（２ｍＭ）を含む液体培地（表１及び表２参照；以下、実施例においても同様）２０ｍｌを含む５０ｍｌバッフルフラスコに加え、振とう培養器中で２００ｒｐｍ、３０℃において３日間培養した。次に、前記培養物１ｍｌを新鮮な液体培地２０ｍｌに加え、上記と同じ条件下で培養した。この過程を３回繰り返し行った後、培養物をＬＢ平板固体培地に塗抹し、３０℃下で静置して培養した。培養の結果、前記ＬＢ平板培地のコロニーからアクリル酸を炭素源とする新規な微生物を分離し、これを１２ＨＰＬと命名した。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
【表２】
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【００２０】
液体培地にアクリル酸を加える場合、水酸化カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ： Ｃａ（ＯＨ）２）により中和し、０．２２μmのろ過膜を用いてろ過した後、投入した。
【００２１】
実施例２：分離された１２ＨＰＬ菌株の同定
この実施例においては、実施例１において分離された１２ＨＰＬ菌株を電子顕微鏡と分子生物学的な方法を用いて同定した。
【００２２】
（１）電子顕微鏡による形態学的な特徴
先ず、１２ＨＰＬ菌株をＬＢ平板培地に塗抹し、３０℃下で３日間静置、培養した後、走査電子顕微鏡を用いて形態学的な特徴を観察した（図１）。図１は、１２ＨＰＬ菌株の走査電子顕微鏡写真である。図１に示すように、１２ＨＰＬ菌株は長い筒状をなしており、これは、従来周知のロドコッカス属の種から共通して見られる特徴である。
【００２３】
（２）１６Ｓｒ ＲＮＡヌクレオチド配列の相同性の比較による分類
先ず、Wizard Genomic ＤＮＡ Purification Kit （Ｐｒｏｍｅｇａ社製、カタログ番号：Ａ１１２０）を用い、１２ＨＰＬ菌株から染色体を分離した。次に、ＨＫ１２（配列番号１）及びＨＫ１３（配列番号２）をプライマーとして用い、前記分離された染色体を主型として１６Ｓｒ ＲＮＡを増幅した（Qiong Cheng, J.Bacteriol., 182:4744, 2000）。ＰＣＲ条件は、先ず、ＨＫ１２プライマーのみを加えて９５℃、５分間初期変性過程を行った後、９５℃、１分間変性、５０℃、１分間アニール及び７２℃、１分３０秒間重合過程を１０回繰り返し行った。次いで、ＨＫ１３プライマーを加え、さらに３０回繰り返し行った。ＰＣＲ反応混合物には、２００μＭ ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｘバッファ１０μl、主型ＤＮＡ ５０ｎｇ、Ｔａｑポリマラーゼ５ｕｎｉｔｓ、ｐｆｕポリマラーゼ０．１ｕｎｉｔｓ、プライマーそれぞれ２０ｐｍｏｌｅ、水を最終体積１００μlになるように加えた。
【００２４】
得られた１６Ｓｒ ＲＮＡ ＰＣＲ産物をｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入した後、組換えられたｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクターから１６Ｓｒ ＲＮＡ中の１４５４ｂｐのヌクレオチド配列を決めた。次に、前記１４５４ｂｐのヌクレオチド配列に対し、クラスタルＸＴＭというプログラムを用いて系統樹を分析した（図２）。図２は、本発明により分離された１２ＨＰＬ菌株の１６Ｓｒ ＲＮＡ中の１４５４ｂｐのヌクレオチド配列との相同性の検索を通じて類縁関係を示す系統樹を示している。図２に示すように、本発明により分離された１２ＨＰＬ菌株は、ロドコッカス・エリスロポリス菌株と９９％以上の類縁関係を有することが明らかになった。
【００２５】
以上の電子顕微鏡による形態学的な特徴及び１６Ｓｒ ＲＮＡ相同性の検索による類縁関係の分類の結果、本発明の１２ＨＰＬ菌株は、ロドコッカス・エリスロポリス種に属し、アクリル酸を同化してアクリル酸に対する耐性を有している新規な菌株であることが確認された。その結果、本発明の１２ＨＰＬ菌株をロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２と命名し、国際寄託機関である韓国生命工学研究院遺伝子銀行に２００４年５月１９日付けで寄託した（受託番号ＫＣＴＣ １８１０２Ｐ）。
【００２６】
実施例３：ロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２のアクリル酸分解活性の測定
この実施例においては、ロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２のアクリル酸の分解活性を他の多数の微生物のアクリル酸の分解活性と比較分析した。
【００２７】
先ず、ＬＢ平板培地において培養された各微生物のコロニーを３ｍｌのＹＥＰＤ液体培地（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、バクトペプトン２０ｇ／Ｌ、葡萄糖２０ｇ／Ｌ）に接種して培養した。得られた培養物０．３ｍｌを３ｍｌのＹＥＰＤ液体培地入り１５ｍｌ用の使い捨てチューブ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に加え、振とう培養器中で２００ｒｐｍ、３０℃下で２日間培養した。次に、最終的な濃度が１％になるようにアクリル酸を投与し、１日後、残留アクリル酸の濃度を液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて分析した。液体クロマトグラフィ分析に用いられた移動相は、水とアセトニトリルを７：３の割合にて混合して得られ、溶媒の流速は、１ｍｌ／分であり、Ｃ１８Ｃａｐｃｅｌパックカラムを用いた。また、検出は２１０ｎｍにおいて行われた。アクリル酸の分解活性の分析結果を表３に示した。
【００２８】
下記表３は、各種の微生物のアクリル酸の分解活性を本発明のロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２の活性を１００として相対的に示している。下記表３に示すように、ロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２菌株は、シュードモナス、カンジダ、エシェリキア、及びバチルスなどの他の属に属する微生物に比べて顕著に高いアクリル酸の分解活性を有しているだけではなく、ロドコッカス属の他の種に比べても一段と高いアクリル酸の分解活性を有している。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
実施例４：ロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２のアクリル酸の分解活性の測定
この実施例においては、ロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２のアクリル酸の分解活性を各種の条件下で調べた。
【００３１】
先ず、本発明のロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２をＹＥＰＤ固体培地において生育した単一コロニーの１ループをＹＥＰＤ液体培地（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、バクトペプトン２０ｇ／Ｌ、葡萄糖２０ｇ／Ｌ）３ｍｌを含んでいる１５ｍｌ培養チューブ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に加えて接種し、振とう培養器（Ｊｅｉｏ Ｔｅｃｈ社製）中において、２００ｒｐｍ、３０℃下で１〜２日間培養し、ＯＤ６００値が３０に達したとき、それぞれ最終濃度が１重量％、２重量％、及び４重量％になるようにアクリル酸を培地に投与して培養し続けながら、アクリル酸の残留量を反応時間別に分析した。
【００３２】
また、アクリル酸による誘導効果(induction effect)がアクリル酸の分解活性に及ぼす影響を確かめるために、ＹＥＰＤ液体培地における培養中に、培養液のＯＤ６００値が１５に達したときに、最終濃度が０．１重量％になるようにアクリル酸を投与し、 培養液のＯＤ６００値が３０に達するまで培養し続けることを除いては、他の条件は同様にした。アクリル酸の分析は、ＨＰＬＣを用いて実施例３の方法と同様にして行った（図３）。
【００３３】
図３は、それぞれ１重量％、２重量％及び４重量％のアクリル酸を含む培地における、本発明のロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２のアクリル酸の分解活性を示している。図３に示すように、本発明の菌株は、前記菌株の培養中にアクリル酸を加えることにより、アクリル酸の分解が促されるという誘導効果が得られ、４重量％のアクリル酸の濃度下でも耐性を有し、且つ、約４日以内に分解することができた。
【００３４】
実施例５：ロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２のアクリル酸の分解活性の特異性の確認
この実施例においては、本発明のロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２が各種の化合物のうちアクリル酸を特異的に分解するかどうかを調べてみた。
【００３５】
本発明のロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２菌株をＹＥＰＤ固体培地において生育した単一コロニーの１ループをＹＥＰＤ液体培地（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、バクトペプトン２０ｇ／Ｌ、葡萄糖２０ｇ／Ｌ）３ｍｌを含んでいる１５ｍｌ培養チューブ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に加えて接種し、振とう培養器（Ｊｅｉｏ Ｔｅｃｈ社製）中において、２００ｒｐｍ、３０℃下でＯＤ６００値が３０になるまで培養した。次いで、アクリル酸、クロトン酸、メタアクリル酸及び２−クロロアクリル酸をそれぞれ最終濃度が０．５重量％になるように加えた。この後、一定の時間置きに残留する前記化合物の濃度を測定した。前記化合物の濃度は、ＨＰＬＣを用い、実施例３の方法と同様にして測定した（図４）。
【００３６】
図４は、本発明のロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２菌株の培養物にアクリル酸、クロトン酸、メタアクリル酸及び２−クロロアクリル酸をそれぞれ加えてその残留量を測定した結果を示している。図４に示すように、類似する化学構造を有する化合物のうち、アクリル酸の残留量が特異的に顕著に低減されていることが分かる。これより、本発明のロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２菌株がアクリル酸を特異的に分解することが分かる。
【００３７】
以上、本発明の特定の内容部分を詳細に記述したところ、当業者にとって、このような具体的な技術は単に望ましい実施例であり、これによって本発明の範囲が制限されないという点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義される。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
以上、上述したように、本発明によるロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２菌株は、アクリル酸の分解活性と共に、高濃度のアクリル酸への耐性を有していることから、アクリル酸を含む汚染物質からアクリル酸を効率よく除去する上で有効である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、本発明により分離された１２ＨＰＬ菌株の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。
【図２】図２は、本発明により分離された１２ＨＰＬ菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ中の１４５４ｂｐのヌクレオチド配列との相同性の検索を通じて類縁関係を示す系統樹を示す図である。
【図３】図３は、それぞれ１重量％、２重量％及び４重量％のアクリル酸を含む培地における、本発明によるロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２（Rhodococcus erythropolis ＬＧ１２）菌株のアクリル酸の分解活性を示す図である。
【図４】図４は、本発明のロドコッカス・エリスロポリスＬＧ１２菌株の培養物にアクリル酸、クロトン酸、メタアクリル酸及び２−クロロアクリル酸をそれぞれ加えてその残留量を測定した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2007519419.tif 000010
2007519419.tif 000011
2007519419.tif 000012