(57)【要約】エレクトロポレーションの方法および装置は、細菌懸濁物と形質転換ＤＮＡとの混合物を、エレクトロポレーションキュベット中に配置する工程を包含する。生じるサンプルは、電流制限抵抗器を介して複雑な波形（高電圧無線周波数電流のバーストを含む）に供される。いくつかの実施形態において、この複雑な波形は、二相高電圧ＤＣパルスに重ね合わされ、他の実施形態において、高電圧低周波数ＡＣバーストに重ね合わされる。総計波形は、電極間隔１ｃｍ当たり１１，０００Ｖよりも大きな初期部分を少なくとも有する。いくつかの実施形態において、より遅い部分は、その初期部分の絶対値（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）の１０％〜３０％までに低減される。形質転換された細菌は、選択培地における培養によって選択される。上記の高電圧無線周波数電流は、３ＭＨｚ〜１２５ＭＨｚであり、一実施形態においては２４ＭＨｚである。
2007535943.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エレクトロポレーションにより細菌を形質転換するための方法であって、該方法は、
所望のＤＮＡの溶液中に細菌の懸濁物を調製する工程であって、該所望のＤＮＡは、マーカー遺伝子および他の所望の遺伝子を含む、工程；
該細菌の懸濁物を、第１の電極と第２の電極とに接触させて、容器に入れる工程；
該細菌の懸濁物を冷却する工程；
該第１の電極と該第２の電極との間に電圧によるバーストを印加し、その結果、電場が該細菌の懸濁物に印加されて、形質転換された細菌を生成する工程であって、該電圧によるバーストは、初期部分および後期部分から構成され、該初期部分は、該第１の電極と該第２の電極との間の距離１ｃｍあたり１１キロボルト以上の総計絶対値を有し、該後期部分は、該初期部分の該総計絶対値の３０％未満であるＤＣ成分と、該初期部分の該総計絶対値の６．５％より大きいピーク間振幅を有するＡＣ成分とを有し；ここで該電圧によるバーストの該ＡＣ成分は、３メガヘルツ〜１２５メガヘルツの間の周波数を有し；ここで該電圧によるバーストは、３ミリ秒〜２５ミリ秒の間の継続時間を有する、工程；
該形質転換された細菌を培養する工程；ならびに
形質転換された細菌を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記電圧によるバーストの前記初期部分は、該電圧によるバーストの前記継続時間の２０％未満で持続する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電圧によるバーストの周波数の前記ＡＣ成分は、約２４メガヘルツの２０％以内である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記電圧によるバーストの前記ＡＣ成分は、前記初期部分に重なる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記形質転換された細菌を選択する工程は、形質転換された細菌は耐性であるが形質転換されていない細菌は感受性である少なくとも１種の抗生物質を含む培地上で、前記形質転換された細菌を培養する工程を行うことによって行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌の懸濁物を冷却する工程は、氷塊中に前記容器の一部を配置することによって行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌は、内生胞子を形成し得る細菌から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｂａｃｔｅｒ属からなる細菌群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記電圧によるバーストの周波数の前記ＡＣ成分は、約２４メガヘルツの２０％以内である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記電圧によるバーストの前記ＡＣ成分は、前記初期部分に重なる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記形質転換された細菌を選択する工程は、形質転換された細菌は耐性であるが形質転換されていない細菌は感受性である少なくとも１種の抗生物質を含む培地上で、前記形質転換された細菌を培養する工程を行うことによって行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記電圧によるバーストは、８ミリ秒〜１０ミリ秒の間の総継続時間を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
エレクトロポレーションにより細菌を形質転換するための方法であって、該方法は、
所望のＤＮＡの溶液中に細菌の懸濁物を調製する工程であって、該所望のＤＮＡは、マーカー遺伝子および他の所望の遺伝子を含む、工程；
該細菌の懸濁物を、第１の電極および第２の電極を備える容器に入れて、電流制限デバイスを該第２の電極と直列に接続し、該細菌の懸濁物を冷却する工程；
該第１の電極と該電流制限デバイスとの間で、該細菌の懸濁物に対して電圧によるバーストを印加し、その結果、電場が、該細菌の懸濁物に印加されて、形質転換された細菌を生成する工程であって、該電圧によるバーストは、該第１の電極と該第２の電極との距離１ｃｍあたり１１キロボルト〜２５キロボルトの間の総計絶対値を有し、該バーストは、該総計絶対値の６．５％より大きいピーク間絶対値を有するＡＣ成分と、該ＡＣ成分の絶対値より大きいＤＣ成分とを有し；ここで該電圧によるバーストの該ＡＣ成分は、３メガヘルツ〜１２５メガヘルツの間の周波数を有し；ここで該電圧によるバーストは、３ミリ秒〜２５ミリ秒の間の継続時間を有する、工程；
該形質転換された細菌を培養する工程；ならびに
形質転換された細菌を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記電圧によるバーストの周波数の前記ＡＣ成分は、約２４メガヘルツの２０％以内である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記形質転換された細菌を選択する工程は、形質転換された細菌は耐性であるが形質転換されていない細菌は感受性である少なくとも１種の抗生物質を含む培地上で、前記形質転換された細菌を培養する工程を行うことによって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌の懸濁物を冷却する工程は、氷塊中に前記容器の一部を配置することによって行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌は、内生胞子を形成し得る細菌から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｂａｃｔｅｒ属からなる細菌群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記電圧によるバーストの周波数の前記ＡＣ成分は、約２４メガヘルツの２０％以内である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
エレクトロポレーションにより細菌を形質転換するための装置であって、該装置は、以下：
ＤＮＡ溶液中の細菌懸濁物のための容器を備えるエレクトロポレーションキュベットであって、該キュベットは、電極間隔距離だけ分離している第１の電極および第２の電極をさらに備える、キュベット；
該第１の電極と該第２の電極との間に電気的バーストを発生させるためのバースト発生器であって、該発生した電気的バーストは、ＤＣ成分とＡＣ成分とを有し、該バーストは、該バーストのパルス幅の少なくとも５％に対して、該第１の電極と該第２の電極との間の間隔距離１ｃｍあたり１１キロボルト〜２５キロボルトの間のピーク絶対値、３ミリ秒〜２５ミリ秒の間の該バーストのパルス幅を有し、該電気的バーストは、３メガヘルツ〜１２５メガヘルツの間の周波数を有しかつ該バーストのピーク絶対値の６．５％より大きい振幅を有するＡＣ成分をさらに含む、バースト発生器、
を備える、装置。
【請求項２１】
前記バーストの前記ＤＣ成分は、初期部分および後期部分から構成され、該後期部分は、該初期部分の総計絶対値の１０％〜３０％の間のＤＣ成分を有する、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
前記ＡＣ成分は、２４メガヘルツの約２０％以内の周波数を有する、請求項２０に記載の装置。
【請求項２３】
エレクトロポレーションにより細菌を形質転換するための方法であって、該方法は、
所望のＤＮＡの溶液中に細菌の懸濁物を調製する工程であって、該所望のＤＮＡは、マーカー遺伝子および他の所望の遺伝子を含む、工程；
該細菌の懸濁物を、第１の電極および第２の電極を備える容器に入れて、電流制限デバイスを該第２の電極と直列に接続し、該細菌の懸濁物を冷却する工程；
該第１の電極と該電流制限デバイスとの間で、該細菌の懸濁物に対して電圧によるバーストを印加し、その結果、電場が、該細菌の懸濁物に印加されて、形質転換された細菌を生成する工程であって、該電圧によるバーストは、第１のＡＣシグナルおよび第２のＡＣシグナルの重ね合わせを含みかつ該第１の電極と該第２の電極との間の距離１ｃｍあたり１１キロボルト以上の総計絶対値を有し、該第２のＡＣ成分は、該総計絶対値の６％〜３０％の間のピーク間振幅を有し；ここで該電圧によるバーストの該第２のＡＣ成分は、３メガヘルツ〜１２５メガヘルツの間の周波数を有し；ここで該電圧によるバーストの第１のＡＣ成分は、２０キロヘルツ〜５００キロヘルツの間の周波数を有し、ここで該電圧によるバーストは、３ミリ秒〜２５ミリ秒の間の継続時間を有する、工程；
該形質転換された細菌を培養する工程；ならびに
形質転換された細菌を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
エレクトロポレーションにより細菌を形質転換するための方法であって、該方法は、
所望のＤＮＡの溶液中に細菌の懸濁物を調製する工程であって、該所望のＤＮＡは、マーカー遺伝子および他の所望の遺伝子を含む、工程；
該細菌の懸濁物を、第１の電極と第２の電極とに接触させて、容器に入れる工程；
該細菌の懸濁物の冷却する工程；
該第１の電極と該第２の電極との間に電圧によるバーストを印加し、その結果、電場が該細菌の懸濁物に印加されて、形質転換された細菌を生成する工程であって、該電圧によるバーストは、３メガヘルツ〜１２５メガヘルツの間の周波数を有するＡＣシグナルを含み、該ＡＣシグナルは、該電圧によるバーストの総計絶対値の少なくとも６％を構成し；ここで該電圧によるバーストは、３ミリ秒〜２５ミリ秒の間の継続時間を有する、工程；
該形質転換された細菌を培養する工程；ならびに
形質転換された細菌を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項２５】
前記ＡＣシグナルは、２４メガヘルツの約２０％以内である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記電圧によるバーストは、少なくとも初期部分を含み、該初期部分は、前記第１の電極と前記第２の電極との間の間隔１ｃｍあたり１１キロボルトより大きい絶対値を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記電圧によるバーストは、前記初期部分の後に後期部分を有し、該後期部分は、該初期部分の絶対値の３０％未満の絶対値を有し、該後期部分は、該バーストの長さの少なくとも半分を構成する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記電圧によるバーストは、少なくとも初期ＤＣ成分を有し、該初期ＤＣ成分は、前記第１の電極と前記第２の電極との間の間隔１ｃｍあたり１１キロボルトより大きい絶対値を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｂａｃｔｅｒ属からなる細菌群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記電圧によるバーストは、２０キロヘルツ〜５００キロヘルツの間の周波数を有する第２のＡＣ成分を有し、ここで前記第２のＡＣ成分は、前記ＡＣシグナルより大きい絶対値を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｂａｃｔｅｒ属からなる細菌群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記形質転換された細菌を選択する工程は、形質転換された細菌は耐性であるが形質転換されていない細菌は感受性である少なくとも１種の抗生物質を含む培地上で、前記形質転換された細菌を培養する工程を行うことによって行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
エレクトロポレーションを行うための装置であって、該装置は、以下：
第１の電極と第２の電極とに接触させて、ＤＮＡ溶液中の細菌懸濁物を保持することができる容器；ならびに
該第１の電極と該第２の電極との間に電圧によるバーストを印加するための装置であって、該電圧によるバーストは、３メガヘルツ〜１２５メガヘルツの間の周波数を有するＡＣシグナルを含み、該ＡＣシグナルは、該電圧によるバーストの総計絶対値の少なくとも６％を構成し；ここで該電圧によるバーストは、３ミリ秒〜２５ミリ秒の間の継続時間を有し、そしてここで該電圧によるバーストは、少なくとも初期部分を有し、該初期部分は、該第１の電極と該第２の電極との間の間隔１ｃｍあたり１１キロボルトより大きい絶対値を有する、装置、
を備える、装置。
【請求項３５】
前記電圧によるバーストは、前記初期部分の後に後期部分を有し、該後期部分は、該初期部分の絶対値の３０％未満の絶対値を有し、該後期部分は、バースト長の少なくとも半分を構成する、請求項３３に記載の装置。
【請求項３６】
前記電圧によるバーストは、少なくとも初期ＤＣ成分を有し、該初期ＤＣ成分は、前記第１の電極と前記第２の電極との間の間隔１ｃｍあたり１１キロボルトより大きい絶対値を有する、請求項３３に記載の装置。
【請求項３７】
前記電圧によるバーストは、前記初期部分の後に後期部分を有し、該後期部分は、該初期部分の絶対値の３０％未満の絶対値を有し、該後期部分は、該バーストの長さの少なくとも半分を構成する、請求項３６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００４年５月６日に出願された、発明の名称が「ＵＳＥ  ＯＦ  ＩＮＤＵＣＥＤ  ＯＳＣＩＬＬＡＴＩＯＮＳ  ＴＯ  ＡＣＨＩＥＶＥ  ＨＩＧＨ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＤＩＦＦＩＣＵＬＴ  ＴＯ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭ  ＢＡＣＴＥＲＩＡ」である米国特許出願第６０／５６８，７５６号（その開示は、本明細書中に参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（米国政府の権利）
米国政府は、エネルギー省により授与される規約Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ＳＢＩＲ  ＤＥ−ＦＧ０２−０３ＥＲ８３５９３に従って、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本開示は、微生物のゲノムを操作するための方法および装置に関する。特に、本開示は、電場を用いて細菌細胞膜を通るようにＤＮＡセグメントを駆動することによる、細菌の形質転換に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
（細菌ゲノムの操作）
細菌は、代表的には、数千個のセグメント（遺伝子として公知である）を有する一本または２〜３本のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）染色体鎖を含むゲノムを有する。各遺伝子は、１つ以上のペプチドまたはタンパク質をコードする一連のヌクレオチドを、調節ヌクレオチド配列（例えば、プロモーター、開始コドン、および終止コドン）と一緒に含む。細菌はまた、それより短いＤＮＡセグメント（例えば、プラスミドおよび休止（ｄｏｒｍａｎｔ）バクテリオファージ）を組み込み得る。これらのＤＮＡセグメントはまた、遺伝子を含み得、かつ細胞質のみに存在しても、細菌ゲノム中に組み込まれてもよい。
【０００５】
代表的に細菌種は、その種が通常存在する環境中におけるその種の必要性に従って進化したタンパク質をコードする。これらのタンパク質としては、代表的には、細菌細胞の再生のためのタンパク質、エネルギー産生のためのタンパク質、細胞の基本的構造ブロック（ヌクレオチドなど）を産生するためのタンパク質、運動構造（鞭毛など）を生成するためのタンパク質、および同じ環境中にある他の種を上回る生存上の利点をその種に提供する毒素のためのタンパク質が、挙げられる。
【０００６】
細菌は、その種の生存のために不必要であるがヒトにとっては興味深いタンパク質を産生するように、操作されてきた。これは、望ましいタンパク質をコードするＤＮＡの新規セグメントを単離もしくは作製すること、そしてその新規セグメントを細菌ゲノム中に挿入することによってなされてきた。一旦挿入されると、その新規セグメントは、その細菌により再生され、適切に設計されて挿入された場合には、その望ましいタンパク質を産生し得る。この新規ＤＮＡセグメントを挿入するプロセスは、形質転換として公知である。
【０００７】
同様に、形質転換は、その細菌のゲノム中に通常は存在する選択された遺伝子を無能にするため、または好ましい生成物の産生を増加するために、使用され得る。
【０００８】
細菌ゲノムの変更は、異なる環境において生存するように生物を適合させる場合、その生物の代謝経路をヒトにとって興味深い非タンパク質代謝産物を産生するように改変するように生物を適合させる場合に、有用であり得る。
【０００９】
（エレクトロポレーション）
エレクトロポレーションとは、電気的に形成される細孔（エレクトロポア）を介して疎水性膜を通る親水性分子の輸送を記載する用語である。
【００１０】
細菌には、新たなＤＮＡの溶液を培養培地に単に添加するだけで、形質転換され得るものがあるが、ほとんどの細菌には、そのＤＮＡを細菌の細胞壁および細胞膜を通って細菌細胞内部へと輸送するためのさらなる操作が必要である。そのような技術の１つが、エレクトロポレーションである。
【００１１】
ＤＮＡは、一般的には、水溶液中で負電荷を有する。ＤＮＡは、酸であり、生理的ｐＨにおいて溶液中で水素イオンを遊離する。従って、ＤＮＡは、ＤＮＡ溶液に対して電場が印加された場合には、正に荷電した電極に向って移動する傾向がある（電気泳動として公知の現象である）。
【００１２】
望ましい新規ＤＮＡプラスミドが、低イオン強度の水溶液中で調製され、エレクトロポレーション緩衝液中に懸濁された細菌細胞に添加される。その混合物は、代表的には、エレクトロポレーションの間のＤＮＡ分解を防ぎ細菌の過熱を回避するために、氷上で維持される。エレクトロポレーションは、ＤＮＡ溶液と懸濁された細菌との混合物を、高強度短期間電場に対して曝露することによって、実施される。この強い電場は、電気泳動によって、ＤＮＡ分子を親水性細胞を通るように運ぶ。この強い電場はまた、ＤＮＡ分子を、疎水性細胞膜中の一時的エレクトロポアを通してその細菌のうちのいくつか（しかし、すべてには程遠い）中に運ぶ。
【００１３】
望ましい新規ＤＮＡプラスミドは、細菌染色体中に挿入し得る細菌染色体部分に対して相同な配列を含み得る。その新規プラスミドは、あるいは、そのプラスミドの一部を細菌染色体中に組み込むインテグラーゼをコードする部分を含み得る。その新規プラスミドは、その細菌中で生存して複製することが可能であり得る。
【００１４】
その後、その細菌は、望ましい新規ＤＮＡを組み込んだ細菌の増殖にとって都合が良い条件下で培養される。代表的には、抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が、この新規ＤＮＡ中に含まれる。その同じ抗生物質が、エレクトロポレーション後の培養培地中に含まれる。形質転換された細菌は、その細菌がこの培地において非形質転換細菌を上回る生存上の利点を有するので選択される。
【００１５】
代表的には、エレクトロポレーションは、その細菌懸濁物および形質転換ＤＮＡを、冷却したエレクトロポレーションキュベットの電極間に配置すること、およびそのキュベットに電気パルスを印加することによって、実施される。高いＤＣ電圧パルスまたはＲＦ調節されたＤＣ電圧パルスが、代表的には数ダースのミリ秒までの事前設定時間の間、上記電極に印加される。
【００１６】
（細菌を形質転換するのは困難である）
複雑な細胞内形態および／または複雑な細胞発生周期を有する数種の細菌は、「電気形質転換するのが困難である」として公知である。これらの細菌を形質転換する場合、正しい増殖培地、培養物の特定の増殖段階、および他のいくつかの生物学的条件を同定して、エレクトロポレーションを実施する前に可能な限りその細胞が「エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」になるようにすることが、重要である。
【００１７】
ある種の細菌がストレスの多い条件に供された場合、その細菌は、丈夫な内生胞子を形成し得る。内生胞子は、一般的には、通常の栄養細胞よりも小さく、通常の栄養細胞よりも、化学的障害、熱障害、乾燥障害、および他の環境障害に対してかなり抵抗性である。エレクトロポレーションは、ある細菌においては、胞子形成を誘発するために十分な化学的、電気的、および熱的なストレスを提供し得る。胞子が形成した場合、細胞含有物の多く（胞子形成がエレクトロポレーション直後に生じた場合、しばしば、新たに挿入された望ましいＤＮＡプラスミドを含む）は、その胞子から排除される。従って、複雑な生活環を有する胞子形成細菌は、形質転換するのが困難である。
【００１８】
ある種の細菌（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種）は、挿入されたＤＮＡプラスミドが、ゲノムおよびＤＮＡ複製酵素が位置する細胞の核封入体領域に到達するのをブロックし得る、細胞内顆粒または小胞を有する。これらの細菌はまた、形質転換するのが困難である。なぜなら、その細胞の適切な部分に挿入されたＤＮＡのみが、発現される可能性があるからであり、そしてこれらの顆粒および小胞は、その細胞の適切な部分にプラスミドが到達するのをブロックし得るからである。
【００１９】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍは、グラム陽性の胞子形成嫌気性細菌の属である。これは、形質転換するのが困難であり、代表的にはエネルギーを発酵を介して誘導し、遊離酸素が毒性である、いくつかの種を含む。この属の例示的メンバーとしては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（動物およびヒトにおいて病原性である）；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（強力な毒素の産生について着目されている）；ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ（６０℃においてセルロースを発酵可能である）が挙げられる。
【００２０】
形質転換するのが困難である細菌の形質転換のための先行技術は、その細菌を、発生中の細胞壁に損傷を与える成分を含む培地中で増殖させることによって、またはその細胞壁を部分消化することによって、その細菌細胞壁を改変することを包含する。その後、弱体化された細胞壁は、望ましいＤＮＡプラスミドがその細胞膜により迅速に到達するのを可能にし、その結果、プラスミドは、エレクトロポアを通って細胞中に達する可能性が高くなる。細胞壁を弱体化することは、しばしば、細菌の生存能に有害な影響を与え、生存能はしばしば非常に弱くなってエレクトロポレーション収率は受容不能な程低いままになることが、見出されている。
【００２１】
形質転換するのが困難である細菌の形質転換収率を改善して、そのような細菌を用いて実施される研究を加速することが、望ましい。
【００２２】
（形質転換された細菌の選択）
一旦、エレクトロポレーションが実施された後、形質転換された細菌は、選択培地中でその細菌を培養することによって、選択され得る。選択培地は、少なくとも１種の抗生物質を含み、この抗生物質に対する耐性遺伝子が、望ましいＤＮＡプラスミド中に含まれる。そのような培地において、形質転換された細菌のみが、成長する。
【００２３】
あるいは、エレクトロポレーションされた細菌は、寒天プレート上でコロニーとなるように培養され得、そして細菌の生成物が、膜上にブロッティングされ得る。その後、その膜は、その望ましいＤＮＡプラスミド上にコードされるタンパク質に対する蛍光抗体を用いて染色され得る。その後、それらのタンパク質を発現するコロニーは、その膜上に蛍光マークを結合させ、それによって、それらのタンパク質を発現するコロニーの同定が可能になる。
【００２４】
（改変型Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍは、生物燃料を生成するのを補助し得る）
ほとんどの植物は、光合成によって糖を豊富に生成する。代表的な植物は、その植物が生成する糖の大部分をセルロースへと処理して、細胞壁および被子植物の支持繊維のうちの多くを形成する。糖のほんの一部だけが、種子中でデンプンになる。
【００２５】
トウモロコシ種子、小麦種子、オーツ麦種子、または他の穀物の種子について、食物、動物飼料のため、およびアルコールへの発酵のための両方のために、多くの用途が存在する。多くの生物（ヒトを含む）は、デンプンを加水分解可能なアミラーゼ酵素を生成する。
【００２６】
哺乳動物、酵母、および他の真核生物は、セルロースを加水分解するための酵素を欠く。セルロース中にてβ−グルコシド結合で結合した糖は、十分には使用されず、しばしば廃棄物になる。草、木、農業残留物（トウモロコシの茎、小麦およびオーツ麦のわら、および肥料が挙げられる）および地方自治体の固体廃棄物（紙）は、高セルロース含量を有する。
【００２７】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍは、セルロースを加水分解する能力を有し、このＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍは、生じる糖を、アルコールと有機酸（酢酸を含む）との混合物へと発酵する。
【００２８】
セルロースからのエタノールの工業的生産における使用のために適切なＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの株は、エレクトロポレーションによる形質転換に対するこの生物の抵抗性が克服され得た場合に、より容易に操作し得ることが、提唱されている。なぜなら、そのゲノムの複数の実質的改変が必要であるからである。特に、有機酸産生を低減させ、エタノール生産およびエタノール耐性の両方を増加させることが、望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２９】
（要旨）
エレクトロポレーションの方法は、細菌懸濁物と形質転換ＤＮＡとの混合物を、エレクトロポレーションキュベット中に配置する工程を包含する。生じるサンプルは、電流制限抵抗器を介して複雑な波形（高電圧無線周波数電流のバーストを含む）に供される。いくつかの実施形態において、この複雑な波形は、二相（ｂｉｐｈａｓｉｃ）高電圧ＤＣパルスに重ね合わされる。総計波形は、電極間隔１ｃｍ当たり１１，０００Ｖよりも大きな初期部分（ｉｎｉｔｉａｌ  ｐｏｒｔｉｏｎ）を少なくとも有する。いくつかの実施形態において、後期部分（ｌａｔｅｒ  ｐｏｒｔｉｏｎ）における波形は、その初期部分の絶対値（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）の１０％〜３０％までに低減される。形質転換された細菌は、選択培地における培養によって選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（実施形態の詳細な説明）
図１は、Ｔｙｕｒｉｎ  Ｍ．Ｖ．，Ｐａｄｄａ  Ｒ．，Ｋｅ−ｘｕｅ  Ｈｕａｎｇ，Ｗａｒｄｗｅｌｌ  Ｓ．，Ｃａｐｒｅｔｔｅ  Ｄ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｇ．Ｎ．（２０００）：Ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４  Ｕｓｉｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｕｌｓｅｓ／／  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．８８（２）：２２０〜２２７（本明細書中で以後はＴｙｒｉｎ，２０００）（その本文は、本明細書によって参考として援用される）において記載されるものと類似する、先行技術のエレクトロポレーション装置を示す。望ましい配列のＤＮＡの溶液１０２中の培養細菌懸濁物が、エレクトロポレーションキュベット１０４中に配置される。この溶液１０２が可能な限り塩を含まないのを確実にするように注意が払われ、非イオン性溶質が、適切な浸透圧モル濃度を提供するために使用される。このキュベット１０４は、第一電極１０６および第二電極１０８を備え、これらの電極は、両方とも、上記溶液１０２に対して露出されて間隔を空けているが、ポリプロピレン微量遠心管１１０によって周囲の氷塊１１２らは絶縁されている。嫌気性細菌を用いて作業する場合、キュベット１０４全体および氷塊１１２が、無酸素グローブボックス１１４中に配置される。上記の第一電極１０６および第二電極１０８は、高電圧電気関数発生器（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）１２０の出力に接続されるか、またはパルスタイミング回路１２２の制御下で作動する。
【００３１】
報告された装置は、直流ＤＣ出力を備える高電圧電気関数発生器１２０と、ＤＣパルスに重ね合わされた１００ＫＨｚ  ＡＣバーストを有する高電圧電気関数発生器とを備える。特に、Ｔｙｕｒｉｎ（２０００）は、その図３において、ＤＣパルスに重ね合わせした１００ＫＨｚ  ＡＣを用いると、１５０ＫＨｚ〜３５０ＫＨｚの範囲内にあるより高周波数よりも良好な結果が得られたことを教示した。
【００３２】
図１の先行技術の装置が使用される場合、操作者は、パルスタイミング回路１２２を誘発させ、パルス発生器は、示されるような方形波１２４、指数関数的に減衰するパルス、またはキュベットの第一電極１０６と第二電極１０８との間のＤＣパルスの絶対値（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）の１／１０〜１／３の振幅の１００ＫＨｚ  ＡＣとの高電圧ＤＣパルスとの重ね合わせのいずれかを提供する。ＤＣパルスが当該分野において標準的であるが、Ｔｙｕｒｉｎ（２０００）は、ＤＣパルスに重ね合わせした１００ＫＨｚのＡＣシグナルを有するパルスを使用する、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種の形質転換を開示した。１ｋＶよりも大きな高電圧パルスが、代表的には使用される。  
【００３３】
電極１０６，１０８の間に印加される高電圧電場は、懸濁された細菌２０４を含む望ましいＤＮＡプラスミド２０２（図２）の溶液１０２を通って、電流が流れるのを引き起こす。ＤＮＡプラスミド２０２は、代表的には、複製開始部位を有するＤＮＡの環である。その電流（これは、細胞内塩類溶液を容易に流れる）は、細菌細胞壁２０６中に微小な孔を焼き、その溶液中のＤＮＡ分子を、細胞壁を通して電気泳動的に移動させ、いくつかの分子は、その微小な孔を通って移動し得る。高電圧電流パルスの後、いくつかの望ましいＤＮＡ分子２１０は、最終的には、形質転換された細菌２１２の内側にあり、その望ましいＤＮＡ分子２１０は、発現され得、細菌ゲノム中にさらに組み込まれ得る。
【００３４】
図３において示される本発明のエレクトロポレーション装置において、望ましい配列のＤＮＡの溶液中の培養細菌懸濁物が、エレクトロポレーションキュベット３０２中に配置される。この望ましい配列のＤＮＡは、好ましくは、プラスミドの形態である。このキュベットは、研磨された平行なプレートのステンレス鋼の第一電極３０４および第二電極３０６を有し、これらの電極は、２ｍｌのポリプロピレン製の廃棄可能な遠心管３０７中に約２ｍｌ（距離Ｄ）間隔を空けて配置されている。これらの電極の両方およびキュベットの内容物は、電気的に絶縁された形態であるが、周囲の氷塊３０８に熱的に接続されている。そうすることで、上記管３０７の一部が、氷塊３０８内の空洞中に配置される。嫌気性細菌（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）を用いて作業する場合、キュベット３０２および氷水浴３０８は、無酸素グローブボックス３１０中に維持される。このキュベットの電極３０４，３０６は、パルス発生器３１４によって制御される高電圧によるバースト発生器３１２に接続される。
【００３５】
本発明のエレクトロポレーション装置が作動される場合、操作者は、パルス発生器３１４が高電圧によるバースト発生器３１２を作動するように誘発する。その後、この高電圧によるバースト発生器は、電流制限抵抗器３１８を介して高電圧によるバースト３１６を提供する。
【００３６】
高電圧によるバースト（ｖｏｌｔａｇｅ  ｂｕｒｓｔ）３１６は、図４において示されるように、ＤＣ成分振幅４０２を有する直流（ＤＣ）パルスの高電圧初期スパイクを、重ね合わされた正弦高無線周波数交流（ＡＣ）ピーク間振幅（ｐｅａｋ−ｔｏ−ｐｅａｋ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）４０４との重ね合わせとして、記載される。この結果、初期スパイク総計振幅４０６は、電極間隔Ｄの１ｃｍ当たり１２ｋＶ〜２５ｋＶの範囲内にあるようになっている。このエレクトロポレーションパルスは、約５％〜約２０％の初期スパイクパルス幅４０８を有し、これは、一実施形態においては、初期スパイクおよびプラトーの総計パルス幅４１０の約１０％である。この総計パルス幅４１０は、３ミリ秒〜２５ミリ秒の範囲であり、好ましくは、８ミリ秒〜１０ミリ秒である。従って、このプラトーは、総計パルス幅４１０の半分よりも大きい長さである。このプラトーは、初期スパイクの間とほぼ同じピーク間振幅４０４にて、無線周波数交流を継続する。このプラトーは、初期スパイクＤＣ成分の１０％〜３０％であるプラトーＤＣ成分４１２を有し、そしてＡＣピーク間振幅の半分よりも大きな絶対値（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）を有する。この電圧によるバーストのプラトーの総計絶対値（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）４１４は、（ＤＣ成分４１２）＋（ＡＣピーク間振幅４０４の半分）の総計である。正弦ＡＣ成分は、３ＭＨｚ〜１２５ＭＨｚ（好ましくは、２４ＭＨｚの２０％以内である）周波数を有し、初期スパイク総計振幅４０６の６．５％よりも大きなピーク間絶対値を有する。この高電圧によるバーストは、いずれかの極性であり得る。なぜなら、電極３０４，３０６の間の相対的電圧は、エレクトロポレーションセル中にて電流を誘導するからである。ＡＣ成分およびＤＣ成分の合成は、本明細書において高電圧によるバーストとして知られている。
【００３７】
図４の実施形態において、ＡＣ成分は、初期スパイクで始まるので、ＡＣ成分は、初期スパイクと重複する。
【００３８】
初期スパイクは、細菌細胞膜中に孔を作製してキュベットを通して放電を開始するように作用し、一方で、そのプラトー部分は、細胞壁および孔を通して細胞中へと、望ましいＤＮＡプラスミドを電気泳動するように作用すると、考えられる。ＡＣ成分は、細菌サンプルを通る電流経路を変化させ、その結果、細胞の損傷は広がって、その細胞のどの一箇所にも集中されないこともまた、考えられる。
【００３９】
図４において記載されるパルスと類似するパルス（例えば、初期スパイクＤＣ成分からプラトーレベルまでの急速な指数関数的減衰を有するパルス）は、同様の結果を生じると予測される。
【００４０】
特定の細菌（特に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の形質転換するのが困難なメンバー）に関して、図４の波形を使用する本発明のエレクトロポレーターは、他の研究者および他の装置によって達成されるよりも実質的に良好な、形質転換細菌収率を生じると、予測される。従来のエレクトロポレーションを用いる場合よりも大きな割合の細菌が、エレクトロポレーション後にほぼインタクトであるようであることもまた、見いだされた。
【００４１】
本発明のエレクトロポレーターはまた、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種由来の細菌株およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｂａｃｔｅｒ種由来の細菌株、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種の特徴と類似する特徴を有する他の細菌を用いると成功すると予測される。本発明のエレクトロポレーターは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒを用いて成功することもまた、予測される。
【００４２】
ＡＣ成分が欠いた実験は、大いに低減した形質転換効率を示す。
【００４３】
別の高電圧によるバーストが、電極間隔Ｄの１ｃｍ当たり１２ｋＶ〜２４ｋＶまたは２ｍｌ間隔を空けて配置された電極について２４００Ｖ〜４８００Ｖの範囲内のＤＣ成分振幅５０２を有する直流（ＤＣ）パルスの高電圧初期スパイクの重ね合わせとして、図５において示される。エレクトロポレーションパルスは、初期スパイクおよびプラトーの総計パルス幅５０６の約１０％の初期スパイクパルス幅５０４を有する。総計パルス幅５０６は、３ミリ秒〜２５ミリ秒の範囲であり、好ましくは、８ミリ秒〜１０ミリ秒である。このプラトーは、重ね合わされた正弦無線周波数交流（ＡＣ）５０８成分を有し、初期スパイクＤＣ成分の１０％〜３０％の間であるプラトーＤＣ成分５１０を有し、そしてＡＣピーク間振幅５０８の半分よりも大きな絶対値（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）を有する。電圧によるバーストの総計絶対値５１２は、（ＤＣ成分５１０）＋（ＡＣピーク間振幅５０８の半分）の総計である。ＡＣ成分は、３ＭＨｚ〜１２５ＭＨｚ（好ましくは、約２４ＭＨｚである）の周波数を有し、初期スパイク５０２のピーク振幅の６．５％よりも大きなピーク間絶対値を有する。
【００４４】
図５の実施形態において、ＡＣ成分は、初期スパイクが終わるときに始まる。
【００４５】
まとめると、形質転換された細菌を生成するプロセスは、細菌培養物を精製（６０２）して、培養培地からほとんどの混入塩を除去することによって、始まる。望ましいＤＮＡプラスミドの溶液が、調製される（６０４）。これは、精製された細菌と組み合わされ（６０６）、ＤＮＡプラスミド溶液中の細菌懸濁物を生じる。この細菌は、塩を含まない溶媒中に懸濁されてＤＮＡ溶液が添加され得るか、または細菌は、ＤＮＡ溶液中に直接懸濁され得る。
【００４６】
ＤＮＡ溶液中の細菌懸濁物は、エレクトロポレーションキュベット３０２中に配置され（６０８）、その結果、電極３０４、３０６がこの溶液と接触する。図４または図５を参照して上記されたようなバーストが、この懸濁物に印加される（６１０）。生存している細菌が、培養され（６１２）、選択されて（６１４）、形質転換された細菌の培養物を提供する。
【００４７】
培養６１２および選択６１４は、第一の実施形態において、ＤＮＡプラスミド中に抗生物質耐性遺伝子を含めること、および生存する細菌が培養される（６１２）培養培地中に、関連する抗生物質を含めることによって、実施される。
【００４８】
代替的な実施形態において、選択６１４は、ブロッティングによって実施される。
【００４９】
図７は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ細菌を形質転換するために首尾よく使用されている、代替的バーストを示す。このバーストは、３ミリ秒〜２５ミリ秒のパルス幅７０４を有するＤＣ成分７０２として示される、方形ＤＣパルスの重ね合わせである。一実施形態において、このパルス幅は、８ミリ秒〜１２ミリ秒である。ＤＣ成分７０２は、ＤＣ成分７０２の絶対値（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）の６．５％よりも大きなピーク間絶対値（一実施形態において、２４ＭＨｚの周波数）を有するＡＣ成分７０６に重ね合わされる。電圧によるバーストの総計絶対値（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）７１０は、（ＤＣ成分７０２）＋（ＡＣピーク間振幅７０６）の総計である。ＡＣ成分は、３ＭＨｚ〜１２５ＭＨｚの（好ましくは、２４ＭＨｚの２０％以内である）周波数を有する。図７のバーストは、エレクトロポレーションキュベット中の電極間隔１ｃｍ当たり１１ｋＶ〜２４ｋＶの範囲内にある、総計絶対値７１０を有する。
【００５０】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属のメンバーを形質転換することは困難であったが、図７の波形を用いる本発明のエレクトロポレーターは、他の研究者により、他の装置で達成されたものより高い形質転換細菌収率を与えることが分かった。より大きなパーセンテージの細菌が、従来のエレクトロポレーションを用いたものより、エレクトロポレーション後に大幅に無傷であるように見えることもまた分かった。
【００５１】
図８に図示される代替的実施形態において、上記第１のＡＣシグナルと第２のＡＣシグナルとが重ね合わされたバーストは、エレクトロポレーションキュベットにおける電極間の間隔１ｃｍあたり１１キロボルト〜２４キロボルトの間に達する、合わせて０からピークまでの絶対値８０２を有する。上記第１のＡＣシグナルは、２０キロヘルツ〜５００キロヘルツの間、好ましくは、約１００キロヘルツの周波数を有し、第２のＡＣシグナルは、３メガヘルツ〜１２５メガヘルツの間、好ましくは、約２４メガヘルツの周波数を有する。上記第２のＡＣシグナルは、上記第１のＡＣシグナルの絶対値の６〜３０％の間の絶対値を有する。上記バーストは、３ミリ秒〜２５ミリ秒の間の幅８０４を有し、一実施形態において、上記幅は、８ミリ秒〜１２ミリ秒の間である。
【００５２】
図９に図示されるなお別の代替的実施形態において、減衰（ｄａｍｐ）させたＡＣバーストは、３〜１２５メガヘルツの間、好ましくは、約２４メガヘルツの中心周波数を有する。上記減衰させたバーストは、エレクトロポレーションキュベットにおける電極間の間隔１ｃｍあたり１１キロボルト〜２４キロボルトの間に達する、初期の０からピークまでの間の絶対値９０２を有する。上記バーストは、３〜２５ミリ秒の間の幅９０４にわたって、初期絶対値の約１０％のレベルへと振幅が漸減（ｔａｐｅｒ）し、一実施形態においては、上記幅は、８〜１２ミリ秒である。
【００５３】
上記電流制限抵抗器３１８は、印加される波形に適した別の形態の電流制限デバイスによって置換され得ることが認識される。特に、インダクターのような反応性要素、すなわち、１以上のインダクター、抵抗器、およびキャパシターを組み込む反応性ネットワーク（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ）は、本明細書に記載されるＡＣ要素を組み込む波形を有する電流制限デバイスとしての使用に特に適していることが予期される。いくつかの実施形態において、能動的フィードバックを介する電流制限による電流感知もまた使用され得る。
【００５４】
本明細書に記載される形質転換パルスにおいて実質的ＡＣ成分を使用することにより、いくつかの実施形態が、バースト発生器とキュベットとの間の電圧を増大させるように働くＲＦまたはパルス変圧器（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ）に、上記電流制限デバイスを埋め込み得る。
【００５５】
本発明は、その好ましい実施形態を参照しながら具体的に示されかつ記載されてきたが、その形態および詳細において種々の他の変更が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に理解される。本明細書に開示されかつ添付の特許請求の範囲によって包含される、より広い範囲の発明の概念から逸脱することなく、本発明を、種々の実施形態に合わせる際に種々の変更が行われ得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、先行技術のエレクトロポレーション装置のブロック図である。
【図２】図２は、エレクトロポレーションの原理を示す。
【図３】図３は、本発明のエレクトロポレーション装置のブロック図である。
【図４】図４は、高電圧によるバーストのＤＣ成分およびＡＣ成分の図示である。
【図５】図５は、別の高電圧によるバーストのＤＣ成分およびＡＣ成分の図示である。
【図６】図６は、細菌形質転換方法の簡略なフローチャートである。
【図７】図７は、別の高電圧によるバーストのＤＣ成分およびＡＣ成分の図示である。
【図８】図８は、複合ＡＣ高電圧によるバーストの図示である。
【図９】記載なし。
【図１】
2007535943.tif 000003
【図２】
2007535943.tif 000004
【図３】
2007535943.tif 000005
【図４】
2007535943.tif 000006
【図５】
2007535943.tif 000007
【図６】
2007535943.tif 000008
【図７】
2007535943.tif 000009
【図８】
2007535943.tif 000010
【図９】
2007535943.tif 000011
【国際調査報告】
2007535943.tif 000012
2007535943.tif 000013
2007535943.tif 000014