(57)【要約】  本発明は、調節ＲＮＡ−リガンド結合を調整する方法、ならびにＲＮＡ分子の二次構造要素の熱力学的確率を変化する薬剤およびオリゴヌクレオチドを同定するアッセイ法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節ＲＮＡ−リガンド相互作用を調整する方法であって、
(ａ)リガンド、例えばタンパク質による認識に必要なＲＮＡ分子の二次構造要素を規定することおよび選択すること、
(ｂ)当該ＲＮＡの二次構造の集合において工程(ａ)の二次構造要素の熱力学的確率を計算すること、
(ｃ)少なくとも部分的に逆相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる当該ＲＮＡの二次構造の集合において工程(ａ)の二次構造要素の熱力学的確率を計算すること、
(ｄ)規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化させるオリゴヌクレオチドを測定すること、
(ｅ)工程(ｄ)で測定されるようにオリゴヌクレオチドを提供すること、ならびに任意に、
(ｆ)工程(ａ)の当該二次構造要素を含むＲＮＡを工程(ｅ)のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすること、そして
(ｇ)当該二次構造要素の熱力学的確率への当該ハイブリダイゼーションの作用を測定すること
を含む、方法。
【請求項２】
ＲＮＡがＩＬ−２  ｍＲＮＡであり、リガンドがＥＬＡＶＬ１であって、オリゴヌクレオチドが
配列番号１：  ＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＧ、
配列番号２：  ＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴ、
配列番号３：  ＴＡＧＡＧＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＴＡＣＡ、
配列番号４：  ＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＡＧＡＧＣＣＣＣ、
配列番号５：  ＡＡＧＧＣＣＵＧＡＵＡＵＧＵＵＵＵＡＡＧ、
配列番号６：  ＡＡＵＡＵＡＡＡＡＵＵＵＡＡＡＵＡＵＵＵ、
配列番号７：  ＵＡＧＡＧＣＣＣＣＵＡＧＧＧＣＵＵＡＣＡ、
配列番号８：  ＵＧＡＡＡＣＣＡＵＵＵＵＡＧＡＧＣＣＣＣ
からなる群より選択される配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡがＴＮＦ−α  ｍＲＮＡであり、リガンドがＥＬＡＶＬ１であって、オリゴヌクレオチドが
配列番号９：  ＴＣＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＣＣＧ、
配列番号１０：  ＴＣＴＧＧＴＡＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＡＴＧ、
配列番号１１：  ＡＣＧＧＣＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＧＧＴ、
配列番号１２：  ＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴＧＡ、
配列番号１３：  ＡＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＣＡ、および
配列番号１４：  ＡＴＣＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡ
からなる群より選択される配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対応するＲＮＡの二次構造を変更することにより遺伝子の発現を操作するための請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項５】
ＲＮＡ分子のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を調整する薬剤を同定するアッセイ法であって、
(ａ)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むＲＮＡを候補化合物の存在下および不在下に規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化させるオリゴヌクレオチドへハイブリダイズすること、
(ｂ)当該候補化合物の存在下および不在下に当該ＲＮＡの当該オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を測定すること
(ｃ)ハイブリダイゼーションの作用を調整する薬剤を同定すること
を含む、アッセイ法。
【請求項６】
ＲＮＡ分子のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を模倣する薬剤を同定するアッセイ法であって、
(ａ)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むＲＮＡを規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化させるオリゴヌクレオチドへハイブリダイズすること、
(ｂ)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むＲＮＡをオリゴヌクレオチドと同様な作用を有すると期待される候補化合物へハイブリダイズすること、
(ｃ)ハイブリダイゼーションの作用を工程(ａ)および(ｂ)について測定すること、そして
(ｄ)工程(ａ)のハイブリダイゼーションの作用を模倣する薬剤を同定すること
を含む、アッセイ法。
【請求項７】
ハイブリダイゼーションの作用をハイブリダイゼーションの作用に関連するシグナルを測定することにより決定して、その作用はＲＮＡ二次構造、ＲＮＡ三次構造、ＲＮＡ−リガンドの親和性、ＲＮＡのオリゴマー化もしくは多量体化、リガンドのオリゴマー化もしくは多量体化、リガンドの立体配座変化、ＲＮＡ−リガンド認識の下流作用の効率、ＲＮＡのスプライシング、共有ＲＮＡ修飾、ＲＮＡの局在化、ＲＮＡの安定性、ＲＮＡの翻訳およびタンパク質の発現プロフィルにおける変化からなる群より選択される、請求項５または６に記載のアッセイ法。
【請求項８】
ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項５〜７のいずれか１項に記載のアッセイ法。
【請求項９】
ＲＮＡ、リガンドおよびオリゴヌクレオチドが請求項２もしくは３に記載されているものである、請求項５〜８のいずれか１項に記載のアッセイ法。
【請求項１０】
高処理能力スクリーニングのための請求項５〜９のいずれか１項に記載のアッセイ法の使用。
【請求項１１】
医薬品としての使用のための請求項５〜９のいずれか１項に記載のアッセイ法により同定される薬剤。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法により同定される規定の確率閾値を超えて二次構造要素の熱力学的確率を変化させる、オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号１：  ＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＧ、
配列番号２：  ＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴ、
配列番号３：  ＴＡＧＡＧＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＴＡＣＡ、
配列番号４：  ＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＡＧＡＧＣＣＣＣ、
配列番号５：  ＡＡＧＧＣＣＵＧＡＵＡＵＧＵＵＵＵＡＡＧ、
配列番号６：  ＡＡＵＡＵＡＡＡＡＵＵＵＡＡＡＵＡＵＵＵ、
配列番号７：  ＵＡＧＡＧＣＣＣＣＵＡＧＧＧＣＵＵＡＣＡ、
配列番号８：  ＵＧＡＡＡＣＣＡＵＵＵＵＡＧＡＧＣＣＣＣ、
配列番号９：  ＴＣＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＣＣＧ、
配列番号１０：  ＴＣＴＧＧＴＡＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＡＴＧ、
配列番号１１：  ＡＣＧＧＣＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＧＧＴ、
配列番号１２：  ＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴＧＡ、
配列番号１３：  ＡＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＣＡ、および
配列番号１４：  ＡＴＣＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡ
からなる群より選択される配列を有する、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
任意の化学修飾を持つＲＮＡのもしくはＤＮＡ分子である、請求項１に記載の方法により同定されるオリゴヌクレオチドまたは請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
ペプチド核酸もしくはロックド核酸分子である、請求項１に記載の方法により同定されるオリゴヌクレオチドまたは請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
調節ＲＮＡ−リガンド相互作用を操作するための請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１７】
ＲＮＡ分子の安定性に影響するための請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１８】
少なくとも一つの薬学的賦形剤に加えて、請求項５に記載のアッセイにより同定される薬剤もしくは請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、調節ＲＮＡ−リガンド相互作用を調整するための、例えば、ＲＮＡ二次構造の制御された操作のためのオープナーのおよびクローザーの核酸の同定、選択ならびに確認のための、方法を提供する。好ましい実施態様では、本発明のオープナーもしくはクローザーを使用して、ＲＮＡの二次構造依存性ＲＮＡ−リガンド相互作用および遺伝子発現のような関連する下流プロセスを調節する。
【０００２】
本発明は例えば、ＲＮＡ生物学の分野に、特にＲＮＡ二次構造分析および予測に、ならびにＲＮＡの二次構造依存性ＲＮＡ−リガンド相互作用に関する。本発明は、遺伝子調節に、更に具体的には遺伝子発現の転写後調節、特にｍＲＮＡの安定性、例えば、タンパク質ＨｕＲ(ＥＬＡＶＬ１)のｍＲＮＡ類を含有しているＡＵ−富化要素への結合によるｍＲＮＡの安定化の制御に、関与するタンパク質とのＲＮＡの相互作用に特に関連する。本発明は、薬物発見の分野に、更に具体的には医薬的標的の同定および確認に、高処理能力スクリーニングのためのアッセイの開発にならびに化合物のプロファイリングに例えばさらに関する。本発明は、疾患に関連するＲＮＡ−リガンド相互作用の操作に、特にＲＮＡ二次構造の特徴に依存するＲＮＡ−リガンド相互作用、例えば、疾患に関連する遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの安定性を制御しているＲＮＡ−リガンド相互作用、例えば、初期応答遺伝子ｍＲＮＡ類、例えばＴＮＦαもしくはＩＬ−２のｍＲＮＡ類、のようにタンパク質ＨｕＲおよびＡＵ−富化要素ｍＲＮＡ類の間の相互作用、の操作に例えばさらに関連する。本発明は、アンチセンス技法もしくはＲＮＡｉのような他のしかし相補的なアプローチに関連する、遺伝子発現の操作のための核酸ツールの開発を含む。
【０００３】
細胞における多くのＲＮＡに関連する調節プロセスは、特異的なＲＮＡ二次構造の形成に決定的に依存している。本発明の理解では、配列ｓのＲＮＡ分子の二次構造ψは、以下の条件を満足する塩基対(即ち、配列のヌクレオチドの対)のリストである：(i)それぞれのヌクレオチドｓiが、多くて一つの塩基対に関与する;(ii)ψのそれぞれの塩基対(ｓi、ｓｊ)が、規定塩基対のＧＣ、ＣＧ、ＡＵ、ＵＡ、ＧＵおよびＵＧの一つである;(iii)塩基対が、非プソイドノット条件を満足する、即ち、それらは交差しない:二つの塩基が、ψの(ｓi、ｓｊ)および(ｓk、ｓl)とｉ＜ｊ、ｋ＜ｌで対にし、そしてｉ＜ｋはｊ＜ｋもしくはｊ＞ｌのいずれかを意味する。
【０００４】
他の巨大分子のように、等しい配列ｓのＲＮＡ分子は、セットΣ(ｓ)により表示される、多くの異なる構造を形成し得る。Σ(ｓ)の中でそれぞれの二次構造ψについて、積重ね塩基対、ヘアピンループ、内部ループ、隆起および多分枝ループに対するエネルギーの寄与を合計することにより自由エネルギーＦ(ψ)(ランダムコイル構造に比べて)を計算することができる。これらの寄与は、実験的に測定されてきている(Mathews D. H. et al., J. Mol. Biol. 1999, 288 (5): 911-40)。構造は、構造の熱力学的平衡の集合の中で均等に分布されていないが、構造の頻度はその安定性(即ちその自由エネルギー)に依存して、次の式のように計算され得る:
【数１】
2007521813.tif 000002
(式中、
【数２】
2007521813.tif 000003
は、ＲＮＡ分子の分配関数であり、Ｔは温度であって、Ｒは一般気体定数である)。
【０００５】
前述の事項の結果として、特定の生物学的プロセスについて要求される、二次構造モチーフもしくは二次構造要素は、配列の熱力学的平衡の集合の中で全ての構造により形成され得ないで、単にサブセット
【数３】
2007521813.tif 000004
により形成され得る。特定の生物学的目的について要求される二次構造モチーフもしくは要素を形成している構造は、本発明全体を通して活性なまたはアクセス可能な構造として本明細書中で呼称される。もしも特定の二次構造モチーフを二次構造内で唯一回だけ形成することができるとすると、熱力学的集合の中でアクセス可能な構造の確率ｐ＊を、Ａ(ｓ)の中で個別の構造の確率を総合計することにより計算することができる：
【数４】
2007521813.tif 000005
(式中、Ｚ＊は限定分配関数、即ち、アクセス可能な構造に限定された構造の集合の分配関数を意味する)。
【０００６】
ｐ＊の計算は、もしも興味のある二次構造モチーフが一つの構造内で数回形成され得るならば、更に複雑である。この場合には、ｐ＊を少なくとも一つの要求されるモチーフを形成する構造の確率に対して再規定する。モチーフが位置Ｂｉにおいて形成されるおよびモチーフが同一の構造内で位置Ｂｊにおいて形成される確率は独立していない。それ故に、個別の確率の総合計は、統合出現について補正されるべきである。モチーフを形成することができる、配列ｓの中でＭ部位Ｂｉ、ｉ＝１..Ｍについて、ｐ＊を排他−包含原理を用いて計算することができる[例えば、Meisner N. C. et al., Chembiochem 2004, 5 (10): 1432-47; Hackermueller J. et al., Gene, 2005、印刷中、を参照]。
【数５】
2007521813.tif 000006
式中、ｐ(ａ)は、部位
【数６】
2007521813.tif 000007
のサブセットにおいてモチーフを形成する構造の確率であって、それを分配関数
p(a)=Ｚ(a)/Ｚのフラクションとして再び計算することができる。Ｚ(a＝φ)は、集合上で制約条件が何も無い(そしてこの故にp(φ)＝１)ことを意味する一方で、a＝{Ｂ1, Ｂ2,..., ＢM}は、モチーフが全ての可能な部位で形成されることを意味する。
【０００７】
ＲＮＡ分子Ｍの熱力学は、それが短いオリゴヌクレオチドＯとハイブリダイズするときに、劇的に変化し得る。その結果として、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ分子が特定の二次構造モチーフを形成する傾向を変化し得る。更に正確には、興味のある少なくとも一つの構造モチーフを形成する熱力学的集合における構造の確率は、ＲＮＡ分子単独の構造集合と比較して、ＲＮＡ−オリゴヌクレオチドのハイブリッドの構造集合の中で異なり得る。興味のある少なくとも一つのモチーフを形成している二次構造の全体的な確率ｐ＊は、ＲＮＡ分子のアクセス可能な構造の確率ｐ＊Ｍ、ＲＮＡ−オリゴハイブリッドのアクセス可能な構造の確率ｐ＊ＭＯに、ならびにハイブリダイズしたおよびハイブリダイズしていないＲＮＡの間の平衡に、即ち、オリゴヌクレオチド[Ｏ]およびＲＮＡ[Ｍ]の平衡濃度ならびにハイブリダイゼーションの平衡定数、ＫＭＯ、により表されるＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションエネルギー、に依存する。(i)オリゴヌクレオチドがＲＮＡに殆ど相補的である；(ii)オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡが著しく自己相補的では無い；ならびに(iii)オリゴヌクレオチドが過剰に存在する想定の下に、ｐ＊をｐ＊ＭＯにより近似し得る(Hackermueller J. et al., Gene, 2005、印刷中)。
【０００８】
特異的なＲＮＡ−タンパク質相互作用は、数多くの細胞性機構の調節に決定的な重要性を持っている。前ｍＲＮＡプロセッシング、核の(ｍ)ＲＮＡ輸出、ＲＮＡ安定性および分解、遺伝子発現の他の調節レベル、代謝プロセスならびにウイルスのライフサイクルの調節は、タンパク質因子によるＲＮＡ分子の特異的認識に決定的に依存する。これらのプロセスの多くに対して、どちらかのＲＮＡの二次構造モチーフが、(縮重)配列モチーフの認識を増大するかもしくは可能にすること、または配列の制約条件の無い“純粋な”ＲＮＡの二次構造モチーフが、調節タンパク質により認識されることが示されてきている。特定のＲＮＡの二次構造モチーフを要求するＲＮＡタンパク質相互作用の見かけの親和力が、ＲＮＡ配列の熱力学的平衡集合
【数７】
2007521813.tif 000008
(式中、
【数８】
2007521813.tif 000009
は見かけの解離定数であり、そしてＫｄ＝[Ｒ＊][Ｐ]／[ＲＰ]はタンパク質およびアクセス可能なＲＮＡ分子の間の親和力を記載する微視的解離定数である)におけるアクセス可能な(即ちモチーフを形成する)二次構造の確率に直接に依存することが最近示されてきている。[Ｒ]、[Ｒ＊]、[Ｐ]、[ＲＰ]は、ＲＮＡ、アクセス可能なＲＮＡ、タンパク質およびＲＮＡタンパク質複合体のそれぞれの平衡濃度を意味する。
【０００９】
ＲＮＡの二次構造への依存性が、タンパク質ＨｕＲおよびＡＵ−富化要素ｍＲＮＡ類の間の相互作用について最近示されてきている。ＡＵ−富化要素(ＡＲＥ)は、初期応答遺伝子ｍＲＮＡ類の３'非翻訳領域(ＵＴＲ)の中に優先的に存在するシス作用要素である。これらの大ざっぱに規定される要素は、ＡＵＵＵＡおよびＵＵＡＵＵＵＡ(Ｕ／Ａ)(Ｕ／Ａ)モチーフならびにＵ−富化領域の組合せを本質的に特徴とする。それらの存在は、シスにおける迅速な分解に対してメッセンジャーＲＮＡを標的にして、それらの機能は、トランス作用因子との特異的相互作用に依存する。これまでに同定された少なくとも２１個のＡＲＥ−結合タンパク質の中で、正の調節作用は、偏在的に発現されるＨｕＲ(ＥＬＡＶＬ１、RefSeq受入：ＮＰ＿００１４１０)およびそのニューロンのホモログＨｕＢ、ＨｕＣ、ＨｕＤにのみ寄与してきている。ＨｕＲおよびｍＲＮＡを含有するＡＲＥの間の相互作用は、結合ｍＲＮＡの安定化に至って、およそ３,０００個の遺伝子の発現を決定し得る[例えば、数多くの疾患関連タンパク質ならびにがん性の、炎症性の、ウイルス性の、アレルギー性の、血管性のおよび感染性の疾患における薬学的な標的を含む、Bakheet T. et al., Nucleic Acid Res. 2003, 60 (3): 499-511を参照]。
【００１０】
現在知られているＨｕＲ制御遺伝子のリストはMeisner N. C. et al., Chembiochem 2004, 5 (10): 1432-47に示されて、ＢＭＰ６(骨形態形成タンパク質６)、ＣＣＬ１１(ケモカイン(Ｃ−Ｃモチーフ)リガンド１１)、エオタキシン、ＣＳＦ２(コロニー刺激因子２)、ＧＭＣＳＦ(顆粒球単球コロニー刺激因子)、ＦＳＨＢ(濾胞刺激ホルモンベータ)、ＩＬ１ｂ(インターロイキン１ベータ)、ＩＬ２(インターロイキン２)、ＩＬ３(インターロイキン３)、ＩＬ４(インターロイキン４)、ＩＬ６(インターロイキン６)、ＩＬ８(インターロイキン８)、ＭＹＯＤ１(ミオゲン因子３)、ＭＹＯＧ(ミオゲニン)、ＮＦ１(ニューロフィブロミン１)、ＰＩＴＸ２(ペア様ホメオドメイン転写因子２)、ＴＮＦα(腫瘍壊死因子アルファ)、ＶＥＧＦ(血管内皮成長因子)、ＣＣＮＡ２(サイクリンＡ)、ＣＣＮＢ１(サイクリンＢ１)、ＣＣＮＤ１(サイクリンＤ１)、ＣＣＮＤ２(サイクリンＤ２)、ＣＤ８３、ＣＤＫＮ１Ａ(サイクリン−依存性キナーゼ阻害剤１Ａ、即ち、ｐ２１もしくはＣｉｐ１)、ＣＤＫＮ１Ｂ(サイクリン−依存性キナーゼ阻害剤１Ｂ、即ち、ｐ２７もしくはｋｉｐ１)、ＤＥＫ、ＦＯＳ(ｖ−ｆｏｓ  ＦＢＪマウス骨肉腫ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ、ｃ−ｆｏｓ)、ＨＬＦ(肝白血病因子)、ＪＵＮ(ｖ−ｊｕｎ肉腫ウイルス１７腫瘍遺伝子ホモログ(鳥類の)、ｃ−ｊｕｎ)、ＭＹＣ(ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ、ｃ−ｍｙｃ)、ＭＹＣＮ(ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス関連腫瘍遺伝子、神経芽細胞腫由来、ｎ−ｍｙｃ)、ＴＰ５３(腫瘍タンパク質ｐ５３)、ＨＤＡＣ２(ヒストンデアセチラーゼ２)、ＭＭＰ９(マトリックスメタロプロテイナーゼ９)、ＮＤＵＦＢ６(ＮＡＤＨ脱水素酵素(ユビキチン)１ベータ小複合体)、ＮＯＳ２Ａ(一酸化窒素合成酵素２Ａ)、ＰＬＡＵ(ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子)、ＰＴＧＳ２(プロスタグランジン−エンドペルオキシド合成酵素２)、ＣＯＸ２(シクロオキシゲナーゼ２)、ＳＥＲＰＩＮＢ２(セリン(もしくはシステイン)タンパク質分解酵素阻害剤)、ＰＡＩ−２(プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２)、ＵＢＥ２Ｎ(ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｎ)、ＡＤＲＢ１(ベータ−１アドレナリン性受容体)、ＡＤＲＢ２(ベータ−２アドレナリン性受容体)、ＡＲ(アンドロゲン受容体)、ＣＡＬＣＲ(カルシトニン受容体)、ＣＤＨ２(カドヘリン２，１型)、Ｎ−カドヘリン、ＧＡＰ４３(成長関連タンパク質４３)、ＳＬＣ２Ａ１(溶質担体ファミリー２  メンバー１)、ＧＬＵＴ１(グルコース輸送体１)、ＰＬＡＵＲ(ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体)、ＳＬＣ５Ａ１(溶質担体ファミリー５)、ＴＮＦＳＦ５(腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー５、ＣＤ１５４)、ＡＣＴＧ１(アクチン、ガンマ１)、ＣＴＮＮＢ１(カテニン(カドヘリン−関連タンパク質)、ベータ１)、ＭＡＲＣＫＳ(ミリストイル化アラニン富化タンパク質キナーゼＣ基質)、ＭＴＡ１(転移関連１)、ＰＩＴＸ２(ペア様ホメオドメイン転写因子２)、ＳＬＣ７Ａ１(陽イオンアミノ酸輸送体、ＣＡＴ−１)を包含している。正の調節ＨｕＲのＡＲＥ  ｍＲＮＡへの結合は、単鎖立体配座の中でその結合部位ＮＮＵＵＮＮＵＵＵの存在により決定される。
【００１１】
本発明は、前述の態様、即ち、短いオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによりＲＮＡ熱力学に影響する能力およびＲＮＡタンパク質相互作用の特定の二次構造要素の形成への依存性を組合せる。本発明は、特定の生物学的プロセスに要求される特定の二次構造要素、例えば、ＲＮＡ−リガンド相互作用に要求される二次構造要素、を形成する二次構造の確率を操作する短いオリゴヌクレオチドを合理的にデザインするための方法を提供する。
【００１２】
ＲＮＡの二次構造は、翻訳、ｍＲＮＡプロセッシング、代謝経路もしくはＲＮＡ−リガンド相互作用に依存している他の制御機構のような多くの細胞のプロセスの節調において中心的重要性を持っている。本発明は、ＲＮＡの二次構造および関連する調節プロセスの制御された操作の方法を提供する。計算的にデザインされたオリゴヌクレオチドをそれらの標的ＲＮＡ分子にハイブリダイズして、それにより興味ある分子相互作用に決定的である特定の二次構造要素の確率を最大化するかもしくは最小化する。これらのモジュレーター(オープナーもしくはクローザー)核酸は、例えば調節ヘアピンを広げることをだけでなく、任意の機能性ＲＮＡ構造要素を分裂させるかもしくは支持することを許容する。そのような人工的に誘発された立体配座の再編成は、標的ＲＮＡ配列内のハイブリダイゼーション部位に近接するかもしくは離れた領域において起こり得る。それは、調節因子の認識部位を隠すかもしくは提示することを許容して、それにより関連する調節プロセスを操作するために使用され得る。特に、我々は、ＨｕＲ依存性ｍＲＮＡの安定化のレベルにおいて疾患に関連する標的遺伝子の発現を特異的に制御するためのその適用を説明する。多くのＨｕＲ調節遺伝子の疾患関連性があるものとして、本発明の方法によるｍＲＮＡ二次構造の操作によりｍＲＮＡの安定性を標的化することは、治療的介入のための新規なプラットホーム戦略として役立つ可能性がある。それ故に、方法は、(i)特異的標的関連アッセイおよび疾患に関連する標的ｍＲＮＡの上でモジュレーターが誘発する構造変化を阻害するかもしくは強化する化合物を同定するためのＨＴスクリーニングの開発のための、(ii)細胞生物学的なもしくはインビボのアッセイにおける道具として遺伝子発現を増強するかまたは沈黙させるための、(iii)薬物標的の確認においてまたは(iv)化合物のプロファイリングにおいて、ならびに(v)多くの多重結合部位の中で個別に特異的に“開くこと”かもしくは“閉じること”により一つの特定のタンパク質結合部位の生物学的役割の機構的研究のための手段を提供する。
【００１３】
一つの態様において、本発明は、
(ａ)リガンド、例えばタンパク質、による認識に要求されるＲＮＡ分子の二次構造要素を規定することおよび選択すること、
(ｂ)当該ＲＮＡ二次構造の集合において工程(ａ)の二次構造要素の熱力学的確率を計算すること、
(ｃ)少なくとも部分的に逆相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる当該ＲＮＡ二次構造の集合において工程(ａ)の二次構造要素の熱力学的確率を計算すること、
(ｄ)規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化するオリゴヌクレオチドを測定すること、
(ｅ)工程(ｄ)で測定されるようにオリゴヌクレオチドを提供すること、ならびに任意に、
(ｆ)工程(ａ)の当該二次構造要素を含むＲＮＡを工程(e)のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、そして該二次構造要素の熱力学的確率への当該ハイブリダイゼーションの作用を測定すること
を含む調節ＲＮＡ−リガンド相互作用を調整する方法を提供する。
【００１４】
本明細書中でそれ以外に規定されないならば、用語は以下のように規定される：
本発明のＲＮＡは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、リボゾームＲＮＡ(ｒＲＮＡ)、核内低分子ＲＮＡ(ｓｎＲＮＡ)、転移ＲＮＡ(ｔＲＮＡ)、ミクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)、核小体低分子ＲＮＡおよびスプライセオソームＲＮＡからなる群からの、共有的に修飾されたＲＮＡを含む、生物学的機能を持つ任意のＲＮＡ分子を含む。好ましくは、ＲＮＡは、例えば、ＢＭＰ６(骨形態形成タンパク質６)、ＣＣＬ１１(ケモカイン(Ｃ−Ｃモチーフ)リガンド１１)、エオタキシン、ＣＳＦ２(コロニー刺激因子２)、ＧＭＣＳＦ(顆粒球単球コロニー刺激因子)、ＦＳＨＢ(濾胞刺激ホルモンベータ)、ＩＬ１ｂ(インターロイキン１ベータ)、ＩＬ２(インターロイキン２)、ＩＬ３(インターロイキン３)、ＩＬ４(インターロイキン４)、ＩＬ６(インターロイキン６)、ＩＬ８(インターロイキン８)、ＭＹＯＤ１(ミオゲン因子３)、ＭＹＯＧ(ミオゲニン)、ＮＦ１(ニューロフィブロミン１)、ＰＩＴＸ２(ペア様ホメオドメイン転写因子２)、ＴＮＦα(腫瘍壊死因子アルファ)、ＶＥＧＦ(血管内皮成長因子)、ＣＣＮＡ２(サイクリンＡ)、ＣＣＮＢ１(サイクリンＢ１)、ＣＣＮＤ１(サイクリンＤ１)、ＣＣＮＤ２(サイクリンＤ２)、ＣＤ８３、ＣＤＫＮ１Ａ(サイクリン−依存性キナーゼ阻害剤１Ａ、即ち、ｐ２１もしくはＣｉｐ１)、ＣＤＫＮ１Ｂ(サイクリン−依存性キナーゼ阻害剤１Ｂ、即ち、ｐ２７もしくはｋｉｐ１)、ＤＥＫ、ＦＯＳ(ｖ−ｆｏｓ  ＦＢＪマウス骨肉腫ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ、ｃ−ｆｏｓ)、ＨＬＦ(肝白血病因子)、ＪＵＮ(ｖ−ｊｕｎ肉腫ウイルス１７腫瘍遺伝子ホモログ(鳥類の)、ｃ−ｊｕｎ)、ＭＹＣ(ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ、ｃ−ｍｙｃ)、ＭＹＣＮ(ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス関連腫瘍遺伝子、神経芽細胞腫由来、ｎ−ｍｙｃ)、ＴＰ５３(腫瘍タンパク質ｐ５３)、ＨＤＡＣ２(ヒストンデアセチラーゼ２)、ＭＭＰ９(マトリックスメタロプロテイナーゼ９)、ＮＤＵＦＢ６(ＮＡＤＨ脱水素酵素(ユビキチン)１ベータ小複合体)、ＮＯＳ２Ａ(一酸化窒素合成酵素２Ａ)、ＰＬＡＵ(ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子)、ＰＴＧＳ２(プロスタグランジン−エンドペルオキシド合成酵素２)、ＣＯＸ２(シクロオキシゲナーゼ２)、ＳＥＲＰＩＮＢ２(セリン(もしくはシステイン)タンパク質分解酵素阻害剤)、ＰＡＩ−２(プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２)、ＵＢＥ２Ｎ(ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｎ)、ＡＤＲＢ１(ベータ−１アドレナリン性受容体)、ＡＤＲＢ２(ベータ−２アドレナリン性受容体)、ＡＲ(アンドロゲン受容体)、ＣＡＬＣＲ(カルシトニン受容体)、ＣＤＨ２(カドヘリン２，１型)、Ｎ−カドヘリン、ＧＡＰ４３(成長関連タンパク質４３)、ＳＬＣ２Ａ１(溶質担体ファミリー２  メンバー１)、ＧＬＵＴ１(グルコース輸送体１)、ＰＬＡＵＲ(ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体)、ＳＬＣ５Ａ１(溶質担体ファミリー５)、ＴＮＦＳＦ５(腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー５、ＣＤ１５４)、ＡＣＴＧ１(アクチン、ガンマ１)、ＣＴＮＮＢ１(カテニン(カドヘリン−関連タンパク質)、ベータ１)、ＭＡＲＣＫＳ(ミリストイル化アラニン富化タンパク質キナーゼＣ基質)、ＭＴＡ１(転移関連１)、ＰＩＴＸ２(ペア様ホメオドメイン転写因子２)、およびＳＬＣ７Ａ１(陽イオンアミノ��輸送体、ＣＡＴ−１)からなる群よりの、ＡＵ−富化要素ｍＲＮＡのような、ｍＲＮＡであって、例えば、ＲＮＡは、ＩＬ−２  ｍＲＮＡもしくはＴＮＦ−α  ｍＲＮＡのような、ｍＲＮＡである。
【００１５】
本発明のリガンドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド、タンパク質もしくは小分子、例えば、例えばＥＬＡＶＬ１(ＨｕＲ)、ＨｕＢ、ＨｕＣ、ＨｕＤ、のようなＥＬＡＶファミリー、例えばＥＬＡＶＬ１、のＡＲＥ結合タンパク質のようなタンパク質、を例えば含む、ＲＮＡ分子に結合する分子を含む。
【００１６】
本発明の二次構造要素もしくは、同意語的に用いて、二次構造モチーフは、対のおよび不対の位置からなるＲＮＡの二次構造パターン、例えば、５個の塩基のループを閉じている八個の積重ね塩基のヘアピンのような、ヘアピン、を含む。これに代えて、二次構造要素もしくは二次構造モチーフは、二次構造の制約条件を持つ配列パターン、好ましくは、規定の二次構造を持つ配列パターン、例えば完全に単鎖の立体配座における配列パターンＮＮＵＵＮＮＵＵＵ(式中、Ｎは任意のＲＮＡヌクレオチドについてのＩＵＰＡＣコードである)、のような、複合配列／ＲＮＡの二次構造モチーフを含む。好ましくは、二次構造要素もしくは二次構造モチーフは、特定の生物学的機能、例えば、特定のタンパク質のＲＮＡへの結合もしくは分子の自己触媒開裂、に要求されて、好ましくは、二次構造モチーフは、ＨｕＲのｍＲＮＡへの結合に要求される。
【００１７】
完全に単鎖の立体配座における配列モチーフＮＮＵＵＮＮＵＵＵを含有するＲＮＡ二次構造の確率のような、生物学的プロセスに要求されている特定の二次構造要素を形成する特定の配列の熱力学的平衡集合の中のＲＮＡ二次構造の確率は、アクセス可能性として本明細書中でまた呼称される。熱力学的平衡集合は、ｍＲＮＡのような、任意のＲＮＡ分子を、もしくは、下で規定されるように、オープナーもしくはクローザーとハイブリダイズされるｍＲＮＡのような、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされるＲＮＡ分子を、持ち得る。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、規定の配列の全てのヌクレオチドオリゴマー、好ましくは、２'−オキシ−メチルもしくはホスホロチオエート−置換のような任意の２'−またはバックボーン修飾を持つＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ(ペプチド核酸)またはＬＮＡ(ロックド核酸)、を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、ビオチン、コレステロール、ジゴキシゲニン、コロイド、遷移元素複合体、炭水化物、アミノ酸のような、従来のごとき標識化物質と、または蛍光の、放射性の、アルキルの、ペプチドもしくは
他のタグとまたは合成ポリマー、例えばポリリシンもしくは(ポリ)エチレングリコールと、３'もしくは５'末端においてまたは内部の位置において例えば標識される、標識形でまた存在し得る。オリゴヌクレオチドの長さは、ＲＮＡの二次構造および望ましい配列特異性に依存して、好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜１００個のように、１０〜２００個、好ましくは約２０個のヌクレオチドのように、１０〜５０個のヌクレオチドの長さを有する。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、オープナーとしてもしくはクローザーとして作用し得る。本発明のオープナーは、特定のＲＮＡの特定の二次構造要素の当該オープナーとのハイブリッドのアクセス可能性を、当該二次構造要素の当該ＲＮＡのアクセス可能性と比較した規定の閾値、例えば少なくとも２倍より高い値として規定される閾値、を超えて上げるオリゴヌクレオチドを含む。オープナーは、ＲＮＡに対して部分的に逆相補的であって、好ましくは、それは正確に逆相補的である。
【００２０】
本発明のクローザーは、特定のＲＮＡの特定の二次構造要素の当該クローザーとのハイブリッドのアクセス可能性を当該二次構造要素の当該ＲＮＡのアクセス可能性と比較した規定の閾値、例えば少なくとも０.５倍より低い値として規定される閾値、を超えて下げるオリゴヌクレオチドを含む。クローザーは、ＲＮＡに対して部分的に逆相補的であって、好ましくは、それは正確に逆相補的である。
【００２１】
本発明はさらに、特定のＲＮＡおよび特定の二次構造要素のためにオープナーもしくはクローザーとして作用するオリゴヌクレオチドの同定および選択の方法を提供する。前提条件は、興味ある特定の生物学的プロセスのために、例えば、リガンド、例えばタンパク質の結合のために、要求される二次構造要素の先行知識である。二次構造要素は、例えば一般的な知識であるかもしくは文献から同定され得る。ＲＮＡ−リガンド相互作用のためには、例えば親和性データから、例えば、Hackermueller J. et al., 2005, Gene(印刷中)の中に詳細に記載されている、もしくはMeisner N. C. et al. Chembiochem, 2004, 5 (10): 1432-47の中に記載されているように、ＨｕＲおよびｍＲＮＡ類の間の相互作用について例示されている、方法のような、従来のごとき方法を用いて、要求される二次構造要素を同定することができる。
【００２２】
アクセス可能性ｐ＊Ｍを、当該ＲＮＡの二次構造要素および当該ＲＮＡについて、例えば計算プロトコルに示されるように計算方法を用いることにより、計算する。計算方法に依存して、それについてアクセス可能性が計算される温度を設定することが可能であり得る。好ましくは、それにおいてオリゴヌクレオチドを実験的にバリデートするかもしくは適用する環境温度に、例えばインビボの使用では３７°に、温度を設定する。
【００２３】
ＲＮＡ−オリゴヌクレオチドハイブリッドのアクセス可能性ｐ＊ＭＯを、候補のオープナーもしくはクローザーについて計算する。候補のオープナーもしくはクローザーは、ＲＮＡに対して少なくとも部分的に逆相補的である任意に選ばれるオリゴヌクレオチドであり得るか、もしくは当該二次構造要素を形成することができる、位置の近くでＲＮＡにハイブリダイズする部分的に逆相補的なオリゴヌクレオチドとして選ばれ得る。好ましくは、ｐ＊ＭＯを、当該ＲＮＡに正確に逆相補的である、規定の長さ、例えば２０個のヌクレオチド(ｎｔ)、の全てのオリゴヌクレオチドについて評価する。
【００２４】
もしもｐ＊Ｍおよびｐ＊ＭＯの間の相違がある特定の閾値を超えている、例えばｐ＊ＭＯがｐ＊Ｍより二倍高い、ならば、オリゴヌクレオチドがオープナーとして選択される。もしもｐ＊Ｍおよびｐ＊ＭＯの間の相違がある特定の閾値を超えている、例えばｐ＊ＭＯがｐ＊Ｍより半分高い、ならば、オリゴヌクレオチドがクローザーとして選択される。
【００２５】
任意に、そのような同定されたクローザーもしくはオープナーを、それらを当該ＲＮＡとハイブリダイズすることおよび、二次構造要素のアクセス可能性へのハイブリダイゼーションの作用を、例えば、ＥＬＩＳＡ(酵素結合イムノソルベントアッセイ)、免疫沈澱、フィルター結合アッセイ、ＥＭＳＡ(＝電気泳動移動度シフトアッセイ)、ＵＶ／ＶＩＳ分光法、ＮＭＲ(核磁気共鳴分光法)、単一の分子選択性での適用の上で特定の焦点を持つ蛍光分光法、例えば蛍光相関分光法(ＦＣＳ)、蛍光強度分布分析(ＦＩＤＡ)、または蛍光異方性もしくは蛍光共鳴エネルギー転移(ＦＲＥＴ)の測定に基づく適用のような既知の方法により、測定することにより実験的にさらにバリデ−トし得る。
【００２６】
好ましい態様では、本発明は、ＲＮＡがＩＬ−２  ｍＲＮＡであり、リガンドがＥＬＡＶＬ１であって、オリゴヌクレオチドが
配列番号１：  ＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＧ、
配列番号２：  ＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴ、
配列番号３：  ＴＡＧＡＧＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＴＡＣＡ、
配列番号４：  ＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＡＧＡＧＣＣＣＣ、
配列番号５：  ＡＡＧＧＣＣＵＧＡＵＡＵＧＵＵＵＵＡＡＧ、
配列番号６：  ＡＡＵＡＵＡＡＡＡＵＵＵＡＡＡＵＡＵＵＵ、
配列番号７：  ＵＡＧＡＧＣＣＣＣＵＡＧＧＧＣＵＵＡＣＡ，
配列番号８：  ＵＧＡＡＡＣＣＡＵＵＵＵＡＧＡＧＣＣＣＣ
からなる群より選択される配列を有する、本発明の方法を提供する。
【００２７】
もう一つの好ましい態様では、本発明は、ＲＮＡがＴＮＦ−α  ｍＲＮＡであり、リガンドがＥＬＡＶＬ１であって、オリゴヌクレオチドが
配列番号９：  ＴＣＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＣＣＧ、
配列番号１０：  ＴＣＴＧＧＴＡＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＡＴＧ、
配列番号１１：  ＡＣＧＧＣＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＧＧＴ、
配列番号１２：  ＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴＧＡ、
配列番号１３：  ＡＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＣＡ，および
配列番号１４：  ＡＴＣＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡ
からなる群より選択される配列を有する、本発明の方法を提供する。
【００２８】
もう一つの態様では、本発明は、対応するＲＮＡの二次構造を変更することにより遺伝子の発現を操作するための本発明の方法の使用を提供する。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、二次構造要素の熱力学的確率を本発明の方法により同定される規定の確率閾値を超えて変化させるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３０】
もう一つの態様では、本発明は、
配列番号１：  ＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＧ、
配列番号２：  ＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴ、
配列番号３：  ＴＡＧＡＧＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＴＡＣＡ、
配列番号４：  ＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＡＧＡＧＣＣＣＣ、
配列番号５：  ＡＡＧＧＣＣＵＧＡＵＡＵＧＵＵＵＵＡＡＧ、
配列番号６：  ＡＡＵＡＵＡＡＡＡＵＵＵＡＡＡＵＡＵＵＵ、
配列番号７：  ＵＡＧＡＧＣＣＣＣＵＡＧＧＧＣＵＵＡＣＡ、
配列番号８：  ＵＧＡＡＡＣＣＡＵＵＵＵＡＧＡＧＣＣＣＣ、
配列番号９：  ＴＣＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＣＣＧ、
配列番号１０：  ＴＣＴＧＧＴＡＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＡＴＧ、
配列番号１１：  ＡＣＧＧＣＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＧＧＴ、
配列番号１２：  ＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴＧＡ、
配列番号１３：  ＡＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＣＡ、および
配列番号１４：  ＡＴＣＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡ
からなる群より選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する：
【００３１】
好ましい態様では、本発明の方法により同定されるオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子または、任意の化学修飾；
例えば、２'−Ｏ−メチル−ホスホロチオエート−、コレステロール−、ビオチン−および蛍光色素からなる群より選択される修飾を持つ、配列番号１〜配列番号１４のオリゴヌクレオチドである。
もう一つの好ましい態様では、本発明の方法により同定されるオリゴヌクレオチドもしくは配列番号１〜配列番号１４のオリゴヌクレオチドは、ＰＮＡまたはＬＮＡ分子である。
【００３２】
本発明の方法により同定されるオリゴヌクレオチドもしくは配列番号１〜配列番号１４のオリゴヌクレオチドを、“本発明のオリゴヌクレオチド”と以下に呼称する。
【００３３】
もう一つの態様では、本発明は、本発明の方法により同定されるオリゴヌクレオチドもしくは配列番号１〜１４からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドの、例えば、ＲＮＡタンパク質相互作用、好ましくはｍＲＮＡタンパク質相互作用、のようなＲＮＡ−リガンド相互作用、およびこの相互作用に関連する調節作用を調整するために、例えば、ＲＮＡ二次構造の操作における道具として、調節ＲＮＡ−リガンド相互作用を操作するための使用を提供する。特に、本発明の方法により同定されるオリゴヌクレオチドを、好ましくは、図１に図示されるように、ＨｕＲ制御ｍＲＮＡの安定性の操作により、遺伝子発現、例えばＡＵ富化要素制御遺伝子の発現、の操作のために使用し得る。
【００３４】
本発明により提供されるオープナーもしくはクローザーのオリゴヌクレオチドの機能は、その標的ＲＮＡと特異的にハイブリダイズする能力に単に依存している。この故に、それらは、化学修飾に関して大きい適応性を提供する。これは、オープナーもしくはクローザーのオリゴヌクレオチドの物理的および生物学的性質を調整することを許容する。例えば、２'−オキシ−メチルもしくはホスホロチオエート−置換のような任意の２'−または骨格修飾を持つ単鎖のＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ(ペプチド核酸)またはＬＮＡ(ロックド核酸)を使用し得る。また、オープナーもしくはクローザーのオリゴヌクレオチドを、ビオチン、コレステロール、ジゴキシゲニン、コロイド、遷移元素複合体、炭水化物、アミノ酸と、または蛍光の、放射性の、アルキルの、ペプチドもしくは他のタグとまたは合成ポリマー、例えばポリリシンもしくは(ポリ)エチレングリコールと、３'もしくは５'末端においてまたは内部の位置において標識し得る。オープナーもしくはクローザーのオリゴヌクレオチドを、インビトロの、細胞のもしくはインビボの適用に使用し得る。例えば、本発明のオープナーもしくはクローザーのオリゴヌクレオチドを、アジュバント仲介転移、例えば、リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウムもしくは他のアジュバントによる転移、のようなトランスフェクション方法により、ウイルス性ベクター、例えばレトロウイルスのベクター、により、または物理的方法、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクションもしくはオプトインジェクション(optoinjection)、により細胞に送達し得る。インビボアッセイのためには、例えば経口で、注射により、例えば皮下、筋肉内もしくは静脈内に、吸入により、直腸的に、局所的にまたは微粒子アプローチ(“遺伝子銃”)により、オープナーもしくはクローザーを送達し得る。
【００３５】
例えば、本発明のオープナーもしくはクローザーのオリゴヌクレオチドによる遺伝子発現の操作を、薬物標的の確認のために、例えば、疾患関連遺伝子のオープナーで増加した発現に対して本発明のクローザーにより仲介される、同一の遺伝子の正常な発現もしくは減少した発現についての表現型読み出しを比較することにより、または従来の方法、例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンスもしくは他のノックダウン方法により、適用し得る。もう一つの例では、本発明のオープナーもしくはクローザーのオリゴヌクレオチドによる遺伝子発現の操作を、インビボの、細胞の生物学的もしくは生化学的アッセイにおける機構的研究のために、例えば、興味のある遺伝子のオープナーで増加した発現に対して本発明のクローザーにより仲介される、同一の遺伝子の正常な発現もしくは減少した発現についての表現型読み出しを比較することにより、または従来の方法、例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンスもしくは他のノックダウン方法により、使用し得る。当該表現型読み出しは、ＲＮＡの二次構造、ＲＮＡの三次構造、ＲＮＡ−リガンド複合体レベル、ＲＮＡ−リガンド親和性、ＲＮＡのオリゴマー化もしくは多量体化、リガンドのオリゴマー化もしくは多量体化、自己触媒的ＲＮＡ開裂、リガンドの立体配座、ＲＮＡのスプライシング、共有ＲＮＡ修飾、ＲＮＡの局在化、ＲＮＡの安定性、ＲＮＡの発現レベル、タンパク質の発現レベル、ＲＮＡのもしくはタンパク質の局在化、細胞増殖、細胞分化、細胞遊走、炎症、組織血管新生、腫瘍進行、血管新生または本発明のオリゴヌクレオチドにより操作されるＲＮＡ二次構造の任意の他の下流作用における変化からなる群より例えば選択される。
【００３６】
もう一つの例では、本発明のオープナーもしくはクローザーのオリゴヌクレオチドによる遺伝子発現の操作を、薬剤、例えば化学物質、のプロファイリングのために、例えば、興味のある遺伝子のオープナーで増加した発現に対して本発明のクローザーにより仲介される、同一の遺伝子の正常な発現もしくは減少した発現を比較することにより、または従来の方法、例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンスもしくは他のノックダウン方法により、適用し得る。
【００３７】
もう一つの態様では、本発明は、本発明の方法により同定されるオリゴヌクレオチドもしくは配列番号１〜配列番号１４からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ分子の安定性に影響するための使用を提供する。
【００３８】
さらなる態様では、本発明は以下のアッセイ法を提供する：
(Ｉ)ＲＮＡ分子のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を調整する薬剤を同定するアッセイであって、
(ａ)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むＲＮＡを候補化合物の存在下においておよび不在下において規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化オリゴヌクレオチドへハイブリダイズすること、
(ｂ)当該候補化合物の存在下においておよび不在下において当該ＲＮＡの当該オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を測定すること、ならびに
(ｃ)ハイブリダイゼーションの作用を調整する薬剤を同定すること
を含む、アッセイ法。
(ＩＩ)ＲＮＡ分子のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を模倣する薬剤を同定するアッセイ法であって、
(ａ)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むＲＮＡを規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化するオリゴヌクレオチドへハイブリダイズすること、
(ｂ)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むＲＮＡをオリゴヌクレオチドのように同様な作用を有すると期待される候補化合物へハイブリダイズすること、
(ｃ)ハイブリダイゼーションの作用を工程(ａ)および(ｂ)について測定すること、ならびに
(ｄ)工程(ａ)のハイブリダイゼーションの作用を模倣する薬剤を同定すること
を含む、アッセイ法。
【００３９】
候補化合物は、それから本発明にしたがうハイブリダイゼーションが期待され得る化合物(ライブラリー)を含んで、例えば、ＲＮＡフラグメント、ＤＮＡフラグメント、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、模倣体、小分子、例えば低分子量化合物類(ＬＭＷ類)、好ましくはＬＭＷを含む。
【００４０】
薬剤は、それについてハイブリダイズする作用が上記に説明されるように証明された、選ばれた候補化合物である。
小分子もしくは他の化学物質のように薬剤を、例えば、転位の間にｍＲＮＡの構造の中で特異的立体配座に結合することにより、この作用を阻害すること、強化することもしくは刺激することのいずれかについて試験し得る。
【００４１】
好ましい態様では、本発明のアッセイでのハイブリダイゼーションの作用を、ハイブリダイゼーションの作用に関連するシグナルを測定することにより測定して、その作用は、二次のＲＮＡ構造、三次のＲＮＡ構造、ＲＮＡ−リガンド親和性、ＲＮＡのオリゴマー化もしくは多量体化、リガンドのオリゴマー化もしくは多量体化、リガンドの立体配座変化、ＲＮＡ−リガンド認識の下流作用の効率、ＲＮＡのスプライシング、共有ＲＮＡ修飾、ＲＮＡの局在化、ＲＮＡの安定性、ＲＮＡの翻訳およびタンパク質の発現プロフィルにおける変化からなる群より選択される。
【００４２】
そのようなアッセイは、本発明のオリゴヌクレオチドを候補化合物の存在下もしくは不在下において興味のあるＲＮＡにハイブリダイズすることおよび当該作用を調整するかもしくは模倣する薬剤を同定するために当該ハイブリダイゼーションの作用に関連する表現型読み出しを測定することにより実現され得る。当該ハイブリダイゼーションの作用は、上記に説明されるように表現型読み出しに関連するシグナルを測定することにより例えば測定される。例えば、ｍＲＮＡ調節のレベルにおいてＡＲＥ制御遺伝子を薬物可能にするために、当該アッセイを使用することができる。本発明のオープナーもしくはクローザーに強く関連するかもしくは似ているｍＲＮＡ構造の変化を誘発するために、細胞が小分子のＲＮＡ類またはタンパク質のようなモジュレーターを使用することを想定して、本発明のオープナーもしくはクローザーを使用して、標的特異性ｍＲＮＡの安定性アッセイをデザインし得る。本発明のオープナーを用いる例示的アッセイ原理を図１１および１２に図示している。オープナーは、蛍光強度、寿命もしくは蛍光共鳴エネルギー転移(ＦＲＥＴ)の測定のような、標準的な蛍光分光方法により例えば検出される、構造の転位に至る。
【００４３】
図１３に概略されるように、細胞のアッセイフォーマットへの拡張がまた可能である。しかしながら、前提条件は、プローブのおよび／もしくはオープナーのオリゴヌクレオチドの生細胞の中への効率的な導入である。表現型アッセイを確立してきているとすると、３,０００個以下のＡＲＥ遺伝子の標的プラットフォーム内の事実上任意の標的ｍＲＮＡは、一般的なアッセイフォーマットを用いてスクリーニング可能になる。
好ましい態様では、当該アッセイの中のＲＮＡはｍＲＮＡである。
もう一つの好ましい態様では、ＲＮＡ、リガンドおよびオリゴヌクレオチドは、上記で規定されているようである。
もう一つの態様では、本発明は、高処理能力スクリーニングのために本発明のアッセイの使用を提供する。
【００４４】
さらなる態様では、本発明は、医薬品としての使用のために、本発明の方法により同定されるオリゴヌクレオチドもしくは薬剤または配列番号１〜配列番号１４からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００４５】
もう一つの態様では、本発明は、少なくとも一つの薬学的添加物、例えば、充填剤、結合剤、崩壊剤、流れ改良剤、潤滑剤、砂糖および甘味剤、芳香剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤および／もしくは乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩ならびに／または緩衝剤を例えば含む、適切な担体ならびに／または賦形剤の上に、本発明のアッセイにより同定される薬剤または本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。
もう一つの態様では、本発明は、もう一つの医薬的に活性な薬剤をさらに含む、本発明の医薬組成物を提供する。
【００４６】
そのような組成物を、従来のごとき方法にしたがって、例えば類似して、例えば、混合の、顆粒化の、コーティングの、溶解のもしくは凍結乾燥の方法により、製造し得る。単位投与剤型は、例えば、１ｍｇ〜約５００ｍｇのように、約０.５ｍｇ〜約１０００ｍｇを含有し得る。
【００４７】
医薬品としての使用のためには、本発明の薬剤もしくはオリゴヌクレオチドは、一つもしくはそれ以上の薬剤またはオリゴヌクレオチド、例えば薬剤またはオリゴヌクレオチドの組合せ、を含む。
【００４８】
本発明の医薬組成物を、当該オリゴヌクレオチドもしくは薬剤により操作されるＲＮＡ二次構造の下流作用と関連する病因を有している障害の処置に使用し得る。例えば、当該下流効果は、好ましくは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、がん原遺伝子、ウイルス性タンパク質、受容体、ホルモンもしくは酵素からなる群より選択される、ＡＵ富化要素で制御される遺伝子により例えばコード化される、物質、例えば、タンパク質の生産であり得て、好ましくは、そのような物質は、ＢＭＰ６(骨形態形成タンパク質６)、ＣＣＬ１１(ケモカイン(Ｃ−Ｃモチーフ)リガンド１１)、エオタキシン、ＣＳＦ２(コロニー刺激因子２)、ＧＭＣＳＦ(顆粒球単球コロニー刺激因子)、ＦＳＨＢ(濾胞刺激ホルモンベータ)、ＩＬ１ｂ(インターロイキン１ベータ)、ＩＬ２(インターロイキン２)、ＩＬ３(インターロイキン３)、ＩＬ４(インターロイキン４)、ＩＬ６(インターロイキン６)、ＩＬ８(インターロイキン８)、ＭＹＯＤ１(ミオゲン因子３)、ＭＹＯＧ(ミオゲニン)、ＮＦ１(ニューロフィブロミン１)、ＰＩＴＸ２(ペア様ホメオドメイン転写因子２)、ＴＮＦα(腫瘍壊死因子アルファ)、ＶＥＧＦ(血管内皮成長因子)、ＣＣＮＡ２(サイクリンＡ)、ＣＣＮＢ１(サイクリンＢ１)、ＣＣＮＤ１(サイクリンＤ１)、ＣＣＮＤ２(サイクリンＤ２)、ＣＤ８３、ＣＤＫＮ１Ａ(サイクリン−依存性キナーゼ阻害剤１Ａ、即ち、ｐ２１もしくはＣｉｐ１)、ＣＤＫＮ１Ｂ(サイクリン−依存性キナーゼ阻害剤１Ｂ、即ち、ｐ２７もしくはｋｉｐ１)、ＤＥＫ、ＦＯＳ(ｖ−ｆｏｓ  ＦＢＪマウス骨肉腫ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ、ｃ−ｆｏｓ)、ＨＬＦ(肝白血病因子)、ＪＵＮ(ｖ−ｊｕｎ肉腫ウイルス１７腫瘍遺伝子ホモログ(鳥類の)、ｃ−ｊｕｎ)、ＭＹＣ(ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ、ｃ−ｍｙｃ)、ＭＹＣＮ(ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス関連腫瘍遺伝子、神経芽細胞腫由来、ｎ−ｍｙｃ)、ＴＰ５３(腫瘍タンパク質ｐ５３)、ＨＤＡＣ２(ヒストンデアセチラーゼ２)、ＭＭＰ９(マトリックスメタロプロテイナーゼ９)、ＮＤＵＦＢ６(ＮＡＤＨ脱水素酵素(ユビキノン)１ベータ小複合体)、ＮＯＳ２Ａ(一酸化窒素合成酵素２Ａ)、ＰＬＡＵ(ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子)、ＰＴＧＳ２(プロスタグランジン−エンドペルオキシド合成酵素２)、ＣＯＸ２(シクロオキシゲナーゼ２)、ＳＥＲＰＩＮＢ２(セリン(もしくはシステイン)タンパク質分解酵素阻害剤)、ＰＡＩ−２(プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２)、ＵＢＥ２Ｎ(ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｎ)、ＡＤＲＢ１(ベータ−１アドレナリン性受容体)、ＡＤＲＢ２(ベータ−２アドレナリン性受容体)、ＡＲ(アンドロゲン受容体)、ＣＡＬＣＲ(カルシトニン受容体)、ＣＤＨ２(カドヘリン２，１型)、Ｎ−カドヘリン、ＧＡＰ４３(成長関連タンパク質４３)、ＳＬＣ２Ａ１(溶質担体ファミリー２  メンバー１)、ＧＬＵＴ１(グルコース輸送体１)、ＰＬＡＵＲ(ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体)、ＳＬＣ５Ａ１(溶質担体ファミリー５)、ＴＮＦＳＦ５(腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー５、ＣＤ１５４)、ＡＣＴＧ１(アクチン、ガンマ１)、ＣＴＮＮＢ１(カテニン(カドヘリン−関連タンパク質)、ベータ１)、ＭＡＲＣＫＳ(ミリストイル化アラニン富化タンパク質キナーゼＣ基質)、ＭＴＡ１(転移関連１)、ＰＩＴＸ２(ペア様ホメオドメイン転写因子２)およびＳＬＣ７Ａ１(陽イオンアミノ酸輸送体、ＣＡＴ−１)からなる群より選択される。
処置は、処置および予防を含む。
【００４９】
そのような処置のためには、適切な投与量は、例えば、使用される本発明の薬剤もしくはオリゴヌクレオチドの化学的性質および薬物動態学的データ、個別な宿主、投与様式ならびに処置されている異常の性質および重篤度、に依存して、勿論、変動するであろう。しかしながら、一般に、大型哺乳類、例えばヒト、における満足的な結果のためには、指示一日投与量は、本発明の薬剤もしくはオリゴヌクレオチドの約０.０１ｇ〜約１.０ｇの範囲にある；例えば、一日に四回までの分割服用量で、便利に投与される。
【００５０】
本発明の薬剤もしくはオリゴヌクレオチドは、任意の従来の経路により、例えば経腸的に、例えば経鼻、頬側、直腸、経口投与を含んで；非経腸的に、例えば静脈内、筋肉内、皮下投与を含んで；または局所的に、例えば皮膚上、鼻腔内、気管内投与を含んで；例えば、コーティングもしくは非コーティング錠、カプセル、注射液剤もしくは懸濁剤の形で、例えばアンプル、バイアルの形で、クリーム、ゲル剤、ペースト、吸入粉剤、泡剤、チンキ剤、口紅、滴剤、噴霧剤の形で、または坐薬の形で、投与され得る。本発明の薬剤もしくはオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される塩、例えば酸付加塩もしくは金属塩、の形で；または遊離形で；任意に溶媒和物の形で投与され得る。塩の形の本発明の薬剤もしくはオリゴヌクレオチドは、遊離形で；任意に溶媒和物の形で本発明の化合物と同一の程度の活性を呈示する。
【００５１】
本発明の薬剤もしくはオリゴヌクレオチドは、本発明にしたがう医薬的処置のために単独でまたは一つもしくはそれ以上の他の医薬的に活性な薬剤との併用で使用され得る。併用剤には、二つもしくはそれ以上の本発明の薬剤もしくはオリゴヌクレオチドが同一の製剤にある固定併用剤；別々の製剤の中の二つもしくはそれ以上の本発明の薬剤もしくはオリゴヌクレオチドが同一の包装の中で、例えば共投与のための使用説明書と共に、販売されているキット；および本発明の薬剤もしくはオリゴヌクレオチドが別々に包装されているが、同時のもしくは連続した投与のための使用説明書が与えられている自由併用剤が含まれる。
【００５２】
(図の説明)
図１：オープナーの作用の図式的説明図
オープナーの作用無しでは、ＨｕＲの結合は、結合部位(１でマーク)のアクセス不可能性により減退されている。標的ｍＲＮＡ(ｍＲＮＡα)へのオープナー(２でマーク)のハイブリダイゼーション時には、αｍＲＮＡ内で局所二次構造の特異的モジュレーションが、アクセス可能な立体配座にあるＨｕＲの結合部位の提示に至って、他のいずれのＨｕＲ標的ｍＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡβ)に影響を及ぼすこと無しにｍＲＮＡαの安定化をもたらしている。
【００５３】
図２：ＩＬ−２オープナーオリゴヌクレオチドのデザイン
３７°におけるＨｕＲ結合部位のアクセス可能性ｐ＊ＭＯ(即ち、アクセス可能なＲＮＡのフラクション)が、３'ＵＴＲ内で与えられたハイブリダイゼーション部位(開始位置、ｘ軸)において逆相補性の２０マーオリゴヌクレオチドへのＩＬ−２  ３'ＵＴＲのハイブリダイゼーションの依存性を示している。ＩＬ−２  ＡＲＥは白い四角として指し示され、ＮＮＵＵＮＮＵＵＵのＨｕＲ結合部位はオープナー開始位置の約５０および約１５０において連続した黒線でブロックとして示されている。アクセス可能性の著しい増加は、ＨｕＲ結合部位の近くにおいて孤立の“ホットスポット”に限定されている。実験的に試験されたオープナー分子のＯｐ１、Ｏｐ２、Ｏｐ３およびＯｐ４の位置が指し示されて、負の対照(Ｎ１、Ｎ２)がまたマークされている(表１で特定される配列)。オープナーのＯｐ１およびＯｐ３は、ＡＲＥ内でＨｕＲ結合部位を主として標的にし、Ｏｐ２およびＯｐ４は、第二のＮＮＵＵＮＮＵＵＵモチーフに指向されている。
【００５４】
図３：ＩＬ−２  ３'ＵＴＲへのオープナーのハイブリダイゼーションの説明図
ＩＬ−２  ３'ＵＴＲ(左のパネル)のおよびオープナーのＯｐ１にハイブリダイズされたＩＬ−２  ３'ＵＴＲ(右のパネル、Ｏｐ１は黒い実線として表されている)の最小自由エネルギー(ＭＦＥ)二次構造。ＮＮＵＵＮＮＵＵＵ要素は、右のパネルの中で小斑点としてマークされている。複合体のＭＦＥ立体配座の中で図示されるように、オープナーは、図１にスケッチされているモデルに従って―アクセス可能な(即ち、単鎖の)ＮＮＵＵＮＮＵＵＵ要素を持つ立体配座に向かって平衡をシフトしている。重要なことに、オープナーの作用は、構造の集合がオープナーの予測に適切であるので、ＭＦＥの構造に必ずしも反映される必要は無い。３'ＵＴＲ−オープナー複合体についてのＭＦＥ二次構造は、Cofold(ＶiennaのＲＮＡパッケージで入手可能)を用いて計算される。
【００５５】
図４：ＩＬ−２オープナーはＩＬ−２  ３'ＵＴＲへのインビトロのＨｕＲ親和性を増加する
組換えＨｕＲのＩＬ−２  ３'ＵＴＲへの見かけの親和性をオープナーの存在下および不在下において１Ｄ−ＦＩＤＡ検出で測定する。全ての４個の試験されたＩＬ−２特異的オープナーは、見かけの解離定数Ｋｄａｐｐ(Ｏｐ１有りで：Ｋｄａｐｐ＝１１.８０±１.４８ｎＭ；Ｏｐ２有りで：Ｋｄａｐｐ＝１８.９１±１.９１ｎＭ；Ｏｐ３有りで：Ｋｄａｐｐ＝８.３８±１.１８ｎＭ；Ｏｐ４有りで：Ｋｄａｐｐ＝１９.５２＋／−２.２０ｎＭ；オープナー無しで：Ｋｄａｐｐ＝３２.７７±４.４８ｎＭ；０.５ｎＭでのＩＬ−２  ３'ＵＴＲ；それぞれ、２５、２５、５および１ｎＭでのオープナー)の減少により反映された、ＩＬ−２  ３'ＵＴＲとのＨｕＲの会合を強化する。負の対照オリゴヌクレオチドのＩＬ−２  ３'ＵＴＲへのハイブリダイゼーションは、ＨｕＲとの相互作用を影響を受けないままにする(Ｎ１有りで：Ｋｄａｐｐ＝３２.９１±６.３４ｎＭ；Ｎ２有りで：Ｋｄａｐｐ＝３２.７７±３.７２ｎＭ、２５ｎＭ濃度でのＮ１およびＮ２)(Ａ)。オープナーのハイブリダイゼーションにより誘発される親和性の増加は、０.３８ｎＭのオープナー濃度で最大半減飽和を持つ飽和カーブを示している(Ｏｐ３ハイブリダイゼーションの見かけの親和性＝１３４(±５４)ｐＭ)。開かれたＩＬ−２  ３'ＵＴＲへのＨｕＲ結合の見かけの親和性は、両方が１.５６ｎＭで、８.５７±１.３３ｎＭのＫｄａｐｐにおいて最大値に近づいている(全ての実験において０.５ｎＭでのＩＬ−２  ３'ＵＴＲ)(Ｂ)。Ｏｐ１の存在下においては、解離定数は、オープナーの濃度が増加するにつれて１.５６ｎＭのＯｐ１濃度において、Ｋｄａｐｐ＝１１.８０±１.４８ｎＭの最小値に減少している(全ての実験において２.５ｎＭでのＩＬ−２  ３'ＵＴＲ)。Ｏｐ１については、この最適値を超えて濃度を増加させることは、作用を逆戻りさせて、解離定数が再び増加する。
【００５６】
図５：ＩＬ−２  ｍＲＮＡオープナーは内因性のＨｕＲ−ＩＬ−２  ｍＲＮＡの会合を増加する
オープナーもしくは負の対照オリゴヌクレオチドのＯｐ１、Ｏｐ２、Ｎ２およびＯｐＴとの処置無しでまたは後でヒトＰＢＭＣの溶菌液から、ＨｕＲ  ｍＲＮＡ複合体を共−免疫沈澱する。ＨｕＲが結合したＩＬ−２  ｍＲＮＡを実時間ＲＴ−ＰＣＲにより定量化する。ＩＬ−２  ｍＲＮＡの量を、未処理の細胞の中のレベル(白色棒)に正規化する。オープナーを２.５μＭ(斜線の棒)にもしくは１０μＭ(黒色棒)、負対照のＮ２およびＯｐＴに１０μＭ濃度を加える。両方のオープナーは、ＨｕＲ  ｍＲＮＡ複合体化を６.５倍(Ｏｐ１)のもしくは３.１倍(Ｏｐ２)の更に高いレベルにまで増強する。
【００５７】
図６：ＩＬ−２  ｍＲＮＡオープナーはＩＬ−２  ｍＲＮＡの分解を阻害する
内因性のＩＬ−２  ｍＲＮＡの分解をヒトＰＢＭＣの溶菌液の中でモニターする。Ｍｇ２＋の添加時に(ｔ＝０分)、(Ａ)１０μＭ、(Ｂ)２５μＭおよび(Ｃ)４０μＭの濃度でオープナーのＯｐ１、Ｏｐ２もしくはＮ２の存在下においておよび不在下において、残存するＩＬ−２  ｍＲＮＡの量を定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲにより経時的に定量化する。全てのデータは、少なくとも３個の独立した試料からの平均を表して、時点ｔ＝０分でのレベルに正規化されている。データは、単一の指数関数型減衰(実線：オープナーなし；破線：Ｎ２)に当てはめられている。オープナーは何も無しで(白丸)、ｔ１／２＝８.３４±０.９６分(Ａ)、ｔ１／２＝８.４４±１.９８分(Ｂ)、およびｔ１／２＝８.８４±２.１９分(Ｃ)、ならびに１０μＭの負の対照Ｎ２の存在下において(×印)、(Ａ)、ｔ１／２＝６.８２±１.９６分、の半減期で、ＩＬ−２  ｍＲＮＡは急速に分解されている。オープナーのＯｐ１(黒丸)もしくはＯｐ２(黒三角)の添加は、濃度依存様式で((Ａ)の中で１０μＭ、(Ｂ)の中で２５μＭおよび(Ｃ)の中で４０μＭでのオープナー)一過性のＩＬ−２  ｍＲＮＡの安定化を促進している。４０μＭの濃度(Ｃ)で、Ｏｐ１は、７０分のインキュベーション時間全体に亘って分解をブロックしている。Ｏｐ２は同様な安定化作用を、それはもう一つのＨｕＲの結合部位を標的にするけれども、示している(黒三角、(Ｂ)および(Ｃ))。ＥＦ−１α、非ＡＲＥ  ｍＲＮＡ、は、７０分の観察時間全体に亘って安定のままである(Ｂ)。
【００５８】
図７：ＩＬ−２オープナーのオリゴヌクレオチドはＩＬ−２  ｍＲＮＡの安定化を特異的に促進する
オープナーが誘発するｍＲＮＡの安定化の特異性を、サイトカインのｍＲＮＡ類(ＴＮＦ−α(Ａ)およびＩＬ−１β(Ｂ))を含む他のＡＲＥの減衰へのそれらの作用をモニターすることにより試験する。ＴＮＦ−αのおよびＩＬ−１βのｍＲＮＡの分解は、それぞれ、ｔ１／２＝３６.０±２.２分(白丸(Ａ))およびｔ１／２＝３７.６±５.６分(白丸(Ｂ))の半減期を特徴としている。ＩＬ−２特異的オープナーのＯｐ１(黒丸)もしくはＯｐ２(黒三角、両方とも２５μＭで)のいずれかの存在下において、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１β  ｍＲＮＡの減衰のいずれも変化しない。
【００５９】
図８：ＴＮＦ−αのオープナーおよびクローザーのデザイン
３７°におけるＨｕＲ結合部位のアクセス可能性ｐ＊ＭＯ(即ち、アクセス可能なＲＮＡのフラクション)が、ｍＲＮＡ(RefSec  ＮＭ＿０００５９４)内で与えられたハイブリダイゼーション部位(開始位置、ｘ軸)において逆相補性の２０マーオリゴヌクレオチドへのＴＮＦ−α  ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの依存性を示している。ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲは、黒い線により図示され、ＡＲＥは白い四角として指し示され、ＮＮＵＵＮＮＵＵＵ  ＨｕＲ結合部位は、黒い小さな四角として示されている。アクセス可能性の著しい変化を持つハイブリダイゼーション部位は、ＨｕＲ結合部位の主に近くにだがまた遠くにおいて、“ホットスポット”の中に集中している。注目すべきことには、また推定上の“クローザー”の位置が同定されて、ＮＮＵＵＮＮＵＵＵのアクセス可能性を著しく減少すると予測されている。興味あることには、これらの位置は、オープナーのホットスポット領域内に位置している。推定上のオープナー、クローザー及び負の対照オリゴの位置は、それぞれ、小さな四角としてまた示されている。実験的に試験されたＯｐＴ、ＣｌＴおよびＮＴを含む同定されたＴＮＦ−αのオープナー／クローザー(ＯｐＡ、ＯｐＢ、ＣｌＣ、ＯｐＥ、ＯｐＨ)の配列は、表１の中で指定されている。
【００６０】
図９：ＴＮＦ−αオープナーはＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲへのインビトロのＨｕＲ親和性を増加する
組換えＨｕＲのＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲへの見かけの親和性をオープナー、クローザーもしくは負の対照オリゴヌクレオチドの存在下においておよび不在下において１Ｄ−ＦＩＤＡアッセイで測定する。ＴＮＦ−αのクローザーＣｌＴは、見かけの解離定数Ｋｄａｐｐの増加により反映された、ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲとのＨｕＲの会合を明らかに低減する。作用は、クローザーの濃度と相関している。作用は、最高のクローザーの濃度で２.５倍までのＫｄの増加(ＣｌＴ有りで：Ｋｄａｐｐ＝１３.８０±２.４１ｎＭ、クローザー無しで：Ｋｄａｐｐ＝５.６３±０.８７ｎＭ)をもって最高値に近づいている(Ａ)。オープナーのＯｐＴは、ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲへのＨｕＲの親和性を２倍まで増加して(Ｂ)、それは計算で予測された作用と良好な整合性にある(図８)。しかしながら、０.５ｎＭ以上のオープナーの濃度では、作用は、増加した解離定数に向かって再び逆戻りする。負の対照オリゴヌクレオチドＮＴとのハイブリダイゼーションは、実験の全体の濃度範囲に亘ってＨｕＲ−ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲの親和性に影響を及ぼさない(Ｃ)。ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲの濃度は、全ての実験において１ｎＭである。
【００６１】
図１０：ＴＮＦ−αオープナーはＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの安定化を特異的に促進する
ＴＮＦ−αについてデザインされたオープナー(ＯｐＴ、図８および表１を参照)は、ＩＬ−１β  ｍＲＮＡのレベルに影響を及ぼすこと無しに(Ｂ)、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡを特異的に安定化する(Ａ)。(丸印：オープナーなし；星印：２５μＭでのオープナーＯｐＴ)。
【００６２】
図１１：オープナーをベースにするインビトロアッセイのデザインＩ：立体配座スイッチ
ＡＲＥ  ｍＲＮＡの立体配座に作用する化合物の同定のための例示的なアッセイ原理が図式化されている。オープナーにより誘発される立体配座の転位は、ＦＲＥＴ対を構成している、適切に位置する蛍光体により例えば検出される。ｍＲＮＡ内に戦略的に置かれるとすると、それらの距離および、それ故に、ＦＲＥＴの効率は、開かれたもしくは閉鎖されたＨｕＲ結合部位(×によりマークされた)に特徴的になる。(Ａ)にスケッチされているように、計算的にデザインされたオープナーにより誘発されるＨｕＲ結合部位の開口は、ＦＲＥＴの効率の減少により検出される。(Ｂ)低分子量の化合物は、異なる作用機序によりこの転位と干渉するであろう。ｍＲＮＡに結合することにより、それらは、オープナーのハイブリダイゼーションと直接に競争するかもしくは閉鎖された立体配座の中でｍＲＮＡを局所に凍結するかのいずれかであり得る。オープナーの存在下において持続的なエネルギー転移を特徴とする、そのような化合物は、ＨｕＲがｍＲＮＡに結合することを防止して、それにより対応する標的遺伝子を下方調節するであろう。他方において、オープナーの作用は、開かれた立体配座を安定化する化合物により強化され得る。これらの化合物ならびにオープナーに誘発される立体配座のスイッチを模倣するそのような化合物は、それぞれ、オープナーの存在下もしくは不在下において低減されたエネルギー転移により同定される。ＨＴＳフォーマットへの適応のための主な問題点は、十分な量で部位特異的に二重に標識されたｍＲＮＡの作製であろう。それ故に、別の戦略が図１２に概略されている。
【００６３】
図１２：オープナーをベースにするインビトロアッセイのデザインＩＩ：ＨｕＲ結合
これに代えて、アッセイ戦略をｍＲＮＡ上でおよびＨｕＲ上で二つの蛍光体の間のエネルギー転移を測定することによりＨｕＲ結合事象の検出へシフトし得る。ｍＲＮＡのラベルは、(Ａ)３'末端に共役的に付着させる(例えば、Qin P. Z. et al., Methods, 1999, 18 (1): 60-70の中に記載されているように)もしくは(Ｂ)オープナーのオリゴヌクレオチドを介して導入されるかのいずれかであり得る。この設定では、オープナーにより誘発される立体配座の転位を、引き続く工程である、ＨｕＲ  ｍＲＮＡ会合の測定により間接的に測定する。それ故に、ＨｕＲ阻害剤は、ｍＲＮＡの立体配座に作用する化合物と同一のシグナルを生成して、適切な対向スクリーニングにおいて選別される必要があるであろう。
【００６４】
図１３：ｍＲＮＡのオープナーをベースにする細胞のアッセイのための戦略
ＡＲＥ  ｍＲＮＡの立体配座スイッチへの細胞のアッセイデザインのための例示的な戦略が概略されている(Ａ)。標的ｍＲＮＡを、適切にデザインされた蛍光プローブ(例えばＣｙ５)により特異的に視覚化する。プローブを計算的にデザインして、熱力学的ｍＲＮＡの集合への最小の影響を保証して、オープナーが誘発する構造の転位と適合性にする。内因性のＨｕＲを、蛍光性タンパク質(例えばＣＦＰ)への融合により標識する。閉鎖されたｍＲＮＡの立体配座では、二つの蛍光体(ＨｕＲ、ｍＲＮＡ)は、空間的に孤立しているであろう。オープナーにより誘発される、ＨｕＲの結合時に、二つの蛍光性分子は、ｍＲＮＡ上に共局所化するであろうが、それは高分解共焦点映像法により例えば検出され得る(Ｂ)。これに代えて、ｍＲＮＡに特異的な標識を、オープナーのオリゴヌクレオチドの上に直接に置く。この設定では、開かれたｍＲＮＡ分子のみが検出されて、ｍＲＮＡの構造集合は(さらに別の)プローブにより影響を及ぼされない。プローブがＨｕＲ結合部位(×によりマークされた)に十分近くにハイブリダイズするという条件で、エネルギーの転移(即ち、供与体の失活／受容体の感作)が、開かれた(即ちＨｕＲが結合した)から閉鎖された立体配座を区別するための好ましい検出モードである。図１１の図示に類似して、オープナーが誘発する作用を阻害するかもしくは強化する化合物を、開かれた対閉鎖されたｍＲＮＡの立体配座の区別に基づいて同定することができる。構成的に“開かれた”ｍＲＮＡを用いる対向スクリーニングは、ＨｕＲの阻害剤を選別するために適切であり得る。
【００６５】
表の説明文
表１：同定されたオープナー／クローザーのオリゴヌクレオチド
ＩＬ−２もしくはＴＮＦ−αについて同定された推定上のオープナーまたは負の対照オリゴリボヌクレオチドの配列が指定されている。実験的確認のために選択されているオープナー／クローザー、ならびに負の対照オリゴが下線で示されている。配列は、標的ｍＲＮＡの中で指定された領域に逆相補性であって、５'から３'への方向で示されている。
【００６６】
表２：ＲＴ  ＰＣＲに用いられるプライマー
ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの標的ｍＲＮＡのＲＴ  ＰＣＲの定量化にならびに内部対照のｍＲＮＡとしてのＥＦ−１−αに用いられるプライマーの配列が、５'から３'への方向で指定されている。
【００６７】
以下の実施例では、全ての温度は摂氏温度(°)で示されて、未補正である。
以下の略語が使用されている：
ＡＣＮ                アセトニトリル
ＢＳＡ                ウシ血清アルブミン
ｄｓＤＮＡ            二重鎖ＤＮＡ
ＥＤＴＡ              Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−エチレンジアミン四酢酸
ＥＦ−１α            伸長因子−１α
ＦＣＳ                ウシ胎仔血清
ＦＩＤＡ              蛍光強度分布分析
(１Ｄ−ＦＩＤＡ＝一次元のもしくは２Ｄ−ＦＩＤＡ＝２次元のＦＩＤＡ)
ＦＣＳ                蛍光相関分光法
ｈＰＢＭＣ            ヒト末梢血単核細胞
ＩＰＴＧ              イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
ＬＣ／ＥＩ−ＭＳ      液体クロマトグラフィー／電気スプレーイオン化−質量分光法
ＯＤ                  光学濃度
ＯＲＮ                オリゴリボヌクレオチド
ＰＢＳ                リン酸塩緩衝食塩水
ＰＣＲ                ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＭＡ                ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテ−ト
ＲＲＭ                ＲＮＡ認識モチーフ
ｒｔ                  室温
ＲＰ−ＨＰＬＣ        逆相高速液体クロマトマトグラフィー
ＲＴ−ＰＣＲ          逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ      ドデシル硫酸ナトリウム  ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ｓｓ                  単鎖
ＴＥＡＡｃ            酢酸トリエチルアンモニウム
ＴＭＲ                カルボキシテトラメチルローダミン
ＵＴＲ                未翻訳領域。
【００６８】
(実施例)
実施例Ａ―実験プロトコル
ａ)蛍光的に標識したＲＮＡの作製。公表された手順[例えば、Chaix C. et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 1989, (21): 45-6; Scaringe S. A. et al., Nucleic Acids Res. 1990, 18 (18): 5433-41、を参照]および製造業者のプロトコルを採用して、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−Ｏ−トリイソプロピルオキシメチルで保護されたβ'−シアノエチル−(Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−)ヌクレオチド  ホスホラミダイト(Glen Research)を用いる394A合成機(Applied Biosystems)の上で、５'−アミノ−Ｃ６で修飾されたＲＮＡを合成する。ＯＲＮを支持体から開裂し、塩基で、ホスフェートでおよび２'で脱保護して、標準的プロトコルに従って変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する。参考文献(Gray D. M. et al., Methods in Enzymology 1995, 246: 19-34)にしたがって測定するように、２６０ｎｍにおける正確な分子吸光係数を用いて、ブーゲ−ランベルト−ベーアの法則にしたがって２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収から、ＲＮＡの濃度を計算する。解析ＲＰ−ＨＰＬＣ分析(VYDAC  Ｃ１８カラム、５μｍ、３００Å、４.６ｍｍ×２５０ｍｍ、４５分で０〜５０％ＣＨ３ＣＮの勾配溶出でもってＴＥＡＡｃ(０.１Ｍ、ｐＨ７.０)の中で、２６０ｎｍにおけるＵＶ検出)にしたがって、全てのＯＲＮ類は＞９９％純粋である。第一級アミンのサクシニミジルエステルで活性化した蛍光体との標準的反応で、ＴＭＲ(Molecular Probes)を５'アミノリンカーに付着して、安定なカルボキサミドを形成する。未反応の染料を、ヒドロキシルアミン塩酸塩の添加により加水分解する。標識ＲＮＡをゲルろ過により遊離の染料から分離し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより未標識ＲＮＡから精製して、上で説明されるように、ＵＶ吸収分光法によるが、２６０ｎｍにおける染料の吸収を補正して、濃度を測定する。
【００６９】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ(T7 MEGASCRIPTインビトロ転写キット、Ambion)を持つｄｓＤＮＡテンプレートからの流出転写により、３'ＵＴＲ類を作製する。ＩＬ−２およびＴＮＦ−α(ＩＬ−２：ｎｔ  ７０７−１０３５、ＴＮＦ−α：ｎｔ  ８７２−１５６８、それぞれ、GenBank受け入れ番号ＮＭ＿０００５８９およびＮＭ＿０００５９４)の３'ＵＴＲ類を包含しているプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅の間に転写テンプレートの中に、Ｔ７プロモーターを組み込む。本質的に参考文献(Qin P. Z. et al., Methods 1999, 18 (1): 60-70)に記載されているように、転写物をＮa(ｍ−)ＩＯ４で３'末端で酸化して、ヒドラジドで活性化されたＣｙ３(AP Biotech)に結合する。生成物を合成ＯＲＮ類について説明したように、ＲＰ−ＨＰＬＣにより引き続いて精製し、脱塩して、ゲルろ過により水溶液の中に移す。２６０ｎｍにおける染料の吸収を補正するＵＶ／ＶＩＳ吸収分光法によるＣｙ３のおよびＲＮＡの濃度の測定により、１：１の標識付け化学量論を制御する。
【００７０】
組換えヒトＨｕＲの作製。全長ＨｕＲ(アミノ酸１〜３２６、RefSeq受け入れ：ＮＰ＿００１４１０)のためのコード化配列を、活性化ヒトリンパ球から作製されるｃＤＮＡから増幅する。ベクターｐＴＸＢ１(IMPACT[登録商標]−CNシステム、New England Biolabs)のＮｄｅｌおよびＳａｐｌ部位の中に、生成物を指向性にクローン化して、さらに別のアミノ酸の挿入無しでインテイン−キチン結合ドメインタグとのＣ末端融合を許容する。ＩＰＴＧ(１ｍＭ、２８°で６時間)との誘導時に大腸菌のER2566(New England Biolabs)の中で融合タンパク質を発現する。Ｔｒｉｓ／Ｃｌの緩衝液(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、２０ｍＭ、ｐＨ８.０)、ＮａＣｌ(８００ｍＭ)、ＥＤＴＡ(１ｍＭ)およびPluronic F−127(０.２％ｗ／ｖ、Molecular Probes)の中の連続的凍結／解凍により、細菌の細胞を溶菌する。ＤＮＡ消化の後で、溶菌液を超遠心分離により透明にして、融合タンパク質をキチンアガロースビーズ(New England Biolabs)の上に捕獲する。溶菌緩衝液での大量の洗浄の後で、１２時間４°で２−メルカプトエタンスルホン酸でのインテインタグのチオールで誘発するカラム上の自己スプライシング[例えば、Cantor E. J. et al., Protein Expr. Purif. 2001, 22 (1): 135-40、を参照]により、組換えタンパク質を回収する。いかなる共溶出されたインテインタグおよび未開裂の融合タンパク質を、第二の減法親和性工程で溶出液から除去する。タンパク質を、ゲルろ過(ＤＧ−１０カラム、Bio−Rad)により保存緩衝液(Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４(２５ｍＭ)ｐＨ７.２、ＮａＣｌ(８００ｍＭ)、Pluronic F−127(０.２％ｗ／ｖ))の中に移し、液体窒素の中で小アリコートにショック凍結をして、−８０°で保存する。これらの条件下では、全長ＨｕＲは、更に高度の凝集状態の存在無しで可溶性であって(分析用サイズ排除クロマトマトグラフィー)、ＲＲＭドメインについての特徴的なＣＤスペクトル(Manival X. et al., Nucleic Acids Res. 2001, 29 (11): 2223-30)を示している。タンパク質は、ＬＣ／ＥＩ−ＭＳの、ＲＰ−ＨＰＬＣのおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析にしたがって＞９９％純粋である。Ｎ末端シークエンシングは、定量的にＭｅｔ１が欠落している正確なＮ末端を明らかにしている。濃度の正確な測定のために、精製されたＨｕＲを凍結乾燥し、塩酸グアニジニウム(６Ｍ)中に溶解して、濃度を参考文献(Gill S. C. et al., Anal. Biochem. 1989, 182 (2): 319-26を参照)にしたがってＵＶ分光法により測定する。この溶液を、ＲＰ−ＨＰＬＣの定量化によるＨｕＲ濃度の測定のための外部標準として使用する。
【００７１】
２Ｄ−ＦＩＤＡ−異方性ＨｕＲ−ＲＮＡ結合アッセイ。蛍光的に標識されたＲＮＡを、アッセイ緩衝液(ＰＢＳ、Pluronic F−127(０.１％ｗ／ｖ)、ＭｇＣｌ２(５ｍＭ))の中で２分間８０°で変性し、室温に冷却することにより(−１.１３℃／秒)再折りたたみ、０.５ｎＭに希釈すると、それは、記述された設定(Ecotec BA, 2001, 2D-FIDA Quick Guide, Hamburg)において共焦点容積の中で＜１の蛍光粒子の平均を保証する。それぞれの試料の中の正確な濃度を、点広がり関数(EVOTEC BioSystems, 2001)に対する調整パラメーターにより与えられるように、平行のＦＣＳ評価から誘導される粒子数および共焦点容積のサイズに基づいて測定する。蛍光的に標識されたＲＮＡを、増加する濃度の組換えＨｕＲに対して滴定する(少なくとも１１個の滴定点)。それぞれの測定に先立って、少なくとも１５分間室温で、ＨｕＲ−ＲＮＡの試料をインキュベートする。
【００７２】
２Ｄ−ＦＩＤＡでの蛍光異方性の測定により真の平衡条件下に、ＨｕＲ−ＲＮＡの複合体形成をモニターする。EvotecOAI PickoScreen機器の上で９６穴のガラス底マイクロタイタープレート(Whatman)の中で環境温度(２３.５°で一定)で、測定を実施する。Olympusの倒立顕微鏡IX70をベースにする機器は、二つの蛍光検出器、蛍光発光経路の中で偏光ビームスプリッターおよび励起経路の中でさらに別の直線偏光フィルターを備えている。ＨｅＮＥレーザー(λ＝５４３ｎｍ、レーザー出力＝４９５μＷ)を蛍光励起に使用する。励起レーザー光を、ＯＤ＝５を持つ干渉バリヤーフィルターにより光学検出経路からブロックする。アッセイ緩衝液中のＴＭＲの０.５ｎＭ溶液を、共焦点ピンホール(７０μｍ)の調整のためにおよび機器のＧ因子の測定(Lakowitcz J. R. 「蛍光分光法の原理、第２版」(Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2 ed.)、New York, 1999, Plenum Pubisihers)のために使用する。１０回のＦＩＤＡ測定を、それぞれの穴について１０秒の測定時間および４０μ秒の滞留時間で実施する。分子輝度ｑを、ＦＩＤＡアリゴリズム(Kask P. et al., Biophys.J. 2002, 78 (4): 1703-13)を用いて、それぞれの偏光チャネルについての２Ｄ−ＦＩＤＡの粗データから抽出する。適切なパラメーター：緩衝液の別々の測定で測定されるように、両方のチャネルの中でのバックグランド強度(普通は約０.５ｋＨｚ)、ＴＭＲでの調整測定で測定されるように、共焦点容積パラメーターＡ０およびＡ１(普通はＡ０約−０.４およびＡ１約０.０８)、単一の成分適合。異方性γを、平行のおよび垂直の偏光についての分子輝度から方程式[Ｖ](Lakowicz, 1999、上を参照)により計算して、１０回の連続の測定から平均する。
【数９】
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式中、ｑＩＩ、ｑ⊥は：平行のおよび垂直の偏光チャネルの中の分子輝度で、Ｇは機器のＧ因子を意味する。
【００７３】
質量作用の法則(Daly T. J. et al., J. Mol. Biol. 1995, 253 (2): 243-58)から誘導される１：１複合体形成の程度に依存して平均定常状態異方性シグナルγを記載している結合方程式の正確な代数解に基づいて、異方性データを適合して、平衡解離定数Ｋｄａｐｐ(非線形最小二乗回帰、GraFit 5.0.3, Erithacus software, London)を抽出する：
【数１０】
2007521813.tif 000011
式中、[ＲＮＡ０]：ＲＮＡの全濃度、[ＨｕＲ０]：ＨｕＲの全濃度、γｍｉｎ：遊離ＲＮＡの異方性、γｍａｘ：ＲＮＡ−ＨｕＲ複合体の異方性、γ：与えられるＨｕＲ０のおよびＲＮＡ０の濃度での定常状態平衡についての平均異方性；Ｑ：クエンチング，２Ｄ−ＦＩＤＡ異方性測定について、ｑｔｏｔ＝ｑＩＩ＋２ｑ⊥；ｑＩＩにおいてＱ＝ｑｔｏｔ(ｍａｘ)／ｑｔｏｔ(ｍｉｎ)。全ての提示されたデータは、少なくとも三回の独立した実験からの平均である。
【００７４】
１Ｄ−ＦＩＤＡ  ＨｕＲ  ｍＲＮＡ結合アッセイ。標識されたｍＲＮＡもしくは３'ＵＴＲを、アッセイ緩衝液(ＰＢＳ、Pluronic F−127(０.１％ｗ／ｖ)、ＭｇＣｌ２(５ｍＭ))の中で２分間８０°で熱的に変性して、室温に冷却することにより(−１.１３℃／秒)再折りたたみする。オープナー、クローザーもしくは負の対照のＯＲＮ類(MWG Biotech、配列は表１を参照)を、０.５および１００ｎＭの間の最終濃度に加える。Ｃｙ３で標識されたｍＲＮＡの最終濃度は０.５ｎＭであって、正確な粒子数を、２Ｄ−ＦＩＤＡ異方性測定について説明されているように、測定する。
【００７５】
標識されたｍＲＮＡを、オープナーもしくは負の対照のＯＲＮ類の存在下および不在下において増加する濃度のＨｕＲに対して滴定する。ＲＮＡへのＨｕＲ結合により誘発されるＣｙ３の分子輝度の変化の測定によるＩＤ−ＦＩＤＡで、ＨｕＲ−ｍＲＮＡの複合体形成をモニターする。ＨｅＮｅレーザー(λ＝５４３ｎｍ、レーザー出力＝４９５μＷ)を蛍光励起に使用して、光学的な設定は、光学的経路の中で、一つの検出チャネルのみを使用して、偏光ビームスプリッターを何も使用しない、２Ｄ−ＦＩＤＡ異方性測定についての設定と類似している。ＦＩＤＡアリゴリズムを用いて、１Ｄ−ＦＩＤＡの粗データから、分子輝度ｑを抽出して、２０回の連続の測定(それぞれ１０秒)から平均する。蛍光強度測定に適応される、方程式[ＶＩ]に類似の方程式に基づいて、分子輝度データを適合する。
【数１１】
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ｑｍｉｎ：遊離ＲＮＡの分子輝度、ｑｍａｘ：ＲＮＡ  ＨｕＲ複合体の分子輝度、ｑ：与えられるＨｕＲ０のおよびＲＮＡ０の濃度での定常状態平衡についての平均分子輝度。全ての提示されたデータは、少なくとも三回の独立した実験からの平均である。
【００７６】
細胞の作製および刺激。ｈｐＢＭＣをFicoll-Hypaque遠心分離によりヘパリン化血液から単離し、ＢＳＡ(１５％ｗ／ｖ)を含有しているＰＢＳで洗浄し、熱不活性化ＦＣＳ(１０％ｖ／ｖ)、Ｌ−グルタミン(２ｍＭ)、ストレプトマイシン(１００μｇ／ｍｌ)およびペニシリン(１００μｇ／ｍｌ)で補足されたRPMl 1640(Gibco/BRL)の中に２×１０６／ｍｌで再懸濁して、３７°のＣＯ２インキュベーターの中でインキュベートする。ｈｐＢＭＣを、ＰＭＡ(２５ｎｇ／ｍｌ、Sigma-Aldrich)および抗ＣＤ３  ｍＡｂ(１μｇ／ｍｌ、Pharmingen)で４時間刺激する。
【００７７】
ＨｕＲ−ｍＲＮＡ複合体の共−免疫沈澱。それぞれの免疫沈澱について、５×１０６の非刺激細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄して、低張緩衝液(１００μｌ、Ｔｒｉｓ／Ｃｌ(１０ｍＭ)ｐＨ７.５、ＮａＣｌ(１０ｍＭ)、ＥＤＴＡ(１０ｍＭ)、プロテアーゼ阻害剤(完全ミニＥＤＴＡ無しのプロテアーゼ阻害剤カクテル、Roche；溶菌緩衝液５０ｍｌ当り３錠))の中で４℃で溶菌し、そしてNonidet-P-40(０.５％ｖ／ｖ)、ＲＮＡsin(０.４ｕ／ｍｌ、Promega)およびSuperasin(０.２ｕ／ｍｌ、Ambion)を加えて、非特異的なＲＮＡの分解を阻害する。溶菌液を、１５,０００×ｇおよび４℃で４分間ペレット核に遠心分離する。透明にされた溶菌液を、オープナーもしくは負の対照のＯＲＮ類(２.５もしくは１０μＭ)の存在下および不在下において抗ＨｕＲ  ｍＡｂ(５μｇ／ｍｌ、19F12、Molecular Probes)と共に４°で５分間インキュベートする。ビオチン化抗(マウス)ＩｇＧ  ｍＡｂ(１０μｇ／ｍｌ、Amersham Pharmacia)の添加後に、免疫複合体をストレプタビジンセファロースビーズ(Amersham Pharmacia)の上で捕獲する。ビーズを溶菌緩衝液で十分に洗浄する。ＨｕＲおよび複合体化ｍＲＮＡを、酸性条件下(グリシン／ＨＣｌ(５０ｍＭ、ｐＨ２.５)、ＮａＣｌ(５０ｍＭ)、９５℃に予熱)に溶離する。溶出液を、Ｈ２Ｏで予め平衡されたBioSpinゲルろ過カラム(BioRad)を通して遠心分離により通過する。共−沈殿ＲＮＡを実時間ＲＴ−ＰＣＲにより定量化する。
【００７８】
ｍＲＮＡ崩壊。１０、２５もしくは４０μＭでオープナー、クローザーもしくは負の対照のＯＲＮ類の存在下および不在下において、上で説明されるように、溶菌緩衝液(２５０μｌ)の中で、５×１０６の刺激ｈＰＢＭＣを溶菌する。ＭｇＣｌ２(５ｍＭの遊離Ｍｇ２＋の正味濃度)の添加により透明にされた溶菌液の中で、ｍＲＮＡの分解を開始する。分解反応を室温で進行して、２から７０分のインキュベーションの間の種々の時点の後で(それぞれの時点についてアリコート５０μｌ)、ＥＤＴＡおよびイソチアン酸グアニジニウムを含有する緩衝液(Qiagen)の添加により、停止する。残存ＤＮＡの除去のためのデオキシリボヌクレアーゼ１の処理と共に、製造業者のプロトコルにしたがって、RNeasy Miniprep  ＲＮＡ単離キット(Qiagen)を用いて、ＲＮＡを単離する。
【００７９】
定量的実時間ＲＴ  ＰＣＲ。標準的プロトコルに従い、TaqManのＲＴ  ＰＣＲ試薬(Applied Biosystems)およびプライミングのためのランダムへキサマーを用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。ゲノムＤＮＡ汚染のための対照反応を、逆転写酵素の添加無しで実施する。AB17700機器(Applied Biosystems)上のSYBR Green検出でもって、定量的ＲＴ  ＰＣＲを実施する。ＥＦ−１αを内因性の対照として使用する。ＲＴ  ＰＣＲに使用されるプライマーは、表２の中で指定されている。ΔΔＣｔ方法を、検量線作成のためにインビトロで転写したＩＬ−２  ｍＲＮＡ用いて、ｍＲＮＡレベルの相対的定量化に(例えばApplied Biosystems 2000の中で、記載されているように)使用する。全ての提示されたデータは、少なくとも５回の同一の独立した試料からの平均であって、独立した供与体からの細胞を用いる少なくとも二回の独立した実験を代表する。
【００８０】
実施例Ｂ：計算のプロトコル
限定分配関数を用いてＲＮＡのアクセス可能性ｐ＊Ｍを計算すること。我々は、二次構造の制約条件を持つ配列パターン、例えば完全に単鎖の立体配座でのＮＮＵＵＮＮＵＵＵ、により規定される二次構造要素のためのｐ＊Ｍの計算をここで説明する。方程式[ＩＩＩ]の中でｐ＊について述べているように、ｐ＊Ｍを直接に計算することができる。数値の誤差を避けるために、ｐ＊(ａ)を分配関数のフラクションとして計算しないが、集合自由エネルギー、
【数１２】
2007521813.tif 000013
(式中、ＷはＲＮＡ配列の集合自由エネルギーであって、Ｗａは、ａの中の全ての部位が特定の二次構造要素を形成する、構造に限定される熱力学的二次構造の集合自由エネルギーである)、の差としては計算する。標準的なＲＮＡ二次構造の予測ソフトウエアー(Zuker M. Curr. Opin. Struct. Biol. 2000, 10 (3): 303-10)を用いて、集合自由エネルギーを計算し得る。Mathews D.H. et al., J. Mol. Biol. 1999, 288 (5): 911-40の中で記載されている自由エネルギーパラメーターに基づく、ViennaのＲＮＡパッケージ(Hofacker I. L. et al. Monatshefte Chemie 1994, 25: 167-88)と共に配布されているＲＮＡライブラリーを、我々は使用してきている。
【００８１】
二次構造の試料を用いてＲＮＡのアクセス可能性ｐ＊Ｍを計算すること。これに代えて、熱力学的平衡分布を持つ、サイズｎの(次善の)ＲＮＡ二次構造のセットの中でアクセス可能な構造の発生ｎ＊を数えることにより、ｐ＊Ｍを概算することができる。ＲＮＡ二次構造のそのようなセットを、RNAsubopt、ViennaのＲＮＡパッケージ(Hofacker I. L. 1994、上を参照)と共に配布されているプログラム、の中に組み込まれている、確率的後戻り法(Tacker M. et al., Eur. Biophys. J. 1996, 25: 115-30; Ding Y. et al. Nucelic Acids Res. 2003, 31 (24): 7280-301)を用いて作製することができる。次いで、アクセス可能性をｐ＊Ｍ≒ｎ＊／ｎとして概算する。概算のｎ＊／ｎを、ｎが増加すると真のｐ＊Ｍに収束する。
【００８２】
分配関数を用いてオリゴヌクレオチド−ＲＮＡのハイブリッドについてのアクセス可能性ｐ＊ＭＯを計算すること。ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションの熱力学は良く理解されている(Dimitrov R. A. et al. Biophys. J. 2004, 87  (1): 215-26)。しかしながら、ハイブリッドの全ての可能な構造を考慮して、アクセス可能性へのハイブリダイゼーションの影響を直接研究するのに適しているＲＮＡ二次構造の予測の履行は現在何も無い。それ故に、我々は、ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二重らせんの全ての二次構造を、オリゴヌクレオチドの標的部位は内部塩基対を形成できない、即ち、ハイブリダイゼーションに関与するＲＮＡヌクレオチドは単鎖であると限定される、ＲＮＡのそれらの二次構造により概算することができることを仮定する。その結果として、方程式[ＩＩＩ]を用いてｐ＊Ｍのように、しかしハイブリダイゼーションによる単鎖ヌクレオチドのためのさらに別の制約条件ｔをもって、ｐ＊ＭＯを計算することができる：
【数１３】
2007521813.tif 000014
式中、
【数１４】
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は、両方の制約条件が同時に満たされる必要があることを意味する。再び、計算を集合自由エネルギーを用いて実施して、ｐ＊Ｍの計算について詳述されているように、数値の誤差を最少にする。
【００８３】
二次構造の試料を用いてＲＮＡのアクセス可能性ｐ＊ＭＯを計算すること。ｐ＊Ｍの計算に類似して、二次構造の試料を用いてｐ＊ＭＯを概算することができる。ハイブリダイゼーションの作用を、ＲＮＡの中のハイブリダイズされたヌクレオチドを内部塩基の対形成から抑止することに限定することが再び仮定されている。ハイブリダイゼーションの領域で単鎖として限定されるＲＮＡ二次構造のセットの中で、アクセス可能な構造の発生ｎ＊(ｔ)を数える。分離関数アプローチに使用される表示に類似して、アクセス可能性をｐ＊ＭＯ≒ｎ＊(ｔ)／ｎ(ｔ)(式中、ｎ(ｔ)は限定されたセットの中の二次構造の総数である)として概算する。
【００８４】
実施例１：ＨｕＲのＩＬ−２  ｍＲＮＡへの会合およびそれによりＩＬ−２  ｍＲＮＡの安定性を操作すること
オープナー、クローザーおよび負の対照のＯＲＮ類をＩＬ−２およびＴＮＦ−α  ｍＲＮＡから構築され、インビトロでおよびヒトの一次細胞溶菌液の中で実験的にバリデートする。ＩＬ−２のためにオープナーおよび負の対照のＯＲＮ類のデザインについて計算されたアクセス可能なＲＮＡ構造のフラクションへの２０マーＯＲＮ類のハイブリダイゼーションの作用を示しているプロットが図２に示されている。注目すべきことには、著しいアクセス可能性の増加が、ＨｕＲ結合部位の外側であるが近くに主として位置している、ｍＲＮＡ内で“ホットスポット”の限定数に限定されている。大抵の他の位置では、ハイブリダイゼーションは、局部的なＡＲＥ立体配座を大抵は影響を及ぼされないままにする。これらのホットスポットから、４個の顕在的なオープナーＯＲＮならびに２個の負の対照のＯＲＮ類が、実験的特性化のために選択されている(表１)。最初の工程では、我々はｓｓＯＲＮ類を使用する。
【００８５】
オープナーの作用をインビトロで始にバリデートする。１Ｄ−ＦＩＤＡアッセイで測定されるように、ＨｕＲを、オープナーのいずれかの存在下において著しく更に高い親和性を持つＩＬ−２  ３'ＵＴＲ(２８１ｎｔ)に結合する(図４Ａ)。オープナーにより誘発された親和性の増加は、オープナーの濃度と相関している(図４ＢおよびＣ)。これに加えて、Ｏｐ１については、作用は、ある特定の閾値(２.５ｎＭのＩＬ−２  ３'ＵＴＲで１.６ｎＭ)を超える濃度で逆戻りして、ＨｕＲ  ＩＬ−２  ３'ＵＴＲの親和性は、再び低減されている(図４Ｃ)。一つの可能な説明は、ある特定の濃度の上では、この特異的な配列がＩＬ−２  ３'ＵＴＲ内で二次部位にまたハイブリダイズして、それにより逆の立体配座転位を誘発することであろう。アクセス可能性ｐ(ｓｓＮＮＵＵＮＮＵＵＵ)に影響を及ぼさない二つのＩＬ−２  ３'ＵＴＲに特異的な２０マーで、負の対照を実施する。図４に立証されているように、両方のＯＲＮ類は、ＨｕＲ−ＩＬ−２  ３'ＵＴＲの会合に影響しない。
【００８６】
オープナーのＯＲＮ類が更に複雑な細胞の環境においてまた機能することを立証するために、我々は、細胞のシステムにおいて内因性のＨｕＲ−ＩＬ−２  ｍＲＮＡの会合を定量化する。ｈｐＢＭＣの細胞質溶菌液をオープナーのＯＲＮ類で処理する。この実験的アプローチは、オープナーの転写作用を除外することを許容する。規定のオープナー濃度が達成されて、オープナーのトランスフェクションにより誘発された細胞のストレス応答が実験から除外される。ＩＬ−２  ３ｍＲＮＡ−ＨｕＲ複合体を、オープナーの存在下もしくは不在下において共−免疫沈澱して、ＨｕＲが結合したＩＬ−２  ｍＲＮＡを実時間ＲＴ−ＰＣＲにより定量化する。非特異的な免疫沈澱を、対照抗体(ヤギＩｇＧ、データは示されていない)を用いて除外する。両方のオープナーは、ＨｕＲ−ＩＬ−２  ｍＲＮＡの会合のレベルを６.５倍まで濃度依存様式で増加する(図５)。ＨｕＲが結合したＩＬ−２  ｍＲＮＡの増加は、同一の条件での負の対照のＯＲＮ  Ｎ２でもしくＴＮＦ−α特異的オープナーＯｐＴでは何も観察されていない。オープナーがｍＲＮＡのレベルを調整する潜在性をバリデートするために、我々は、ＨｕＲの複合体形成の誘発された増加が、迅速なＡＲＥ依存性のｍＲＮＡの分解にまた拮抗するだろうかどうかを試験する。いずれかのオープナーのＯｐ１、Ｏｐ２ならびにＮ２の存在下および不在下においてｈｐＢＭＣの溶菌液の中で−我々がＭｇ２＋依存性であると観察した−ＩＬ−２  ｍＲＮＡの崩壊を我々はモニターする。Ｍｇ２＋の添加時に、残存するＩＬ−２  ｍＲＮＡの量を実時間ＲＴ−ＰＣＲにより経時的に定量化する。如何なるオープナーの不在下において、内因性のＩＬ−２  ｍＲＮＡは迅速に分解される(ｔ１／２＝８.３４±０.９６分)が、一方で非ＡＲＥ遺伝子(ＥＦ−１α)のｍＲＮＡは、７０分の観測時間全体を通して安定である(図６)。観測された半減期は、以前に説明された値(例えば、Raghavan et al., Nucleic Acids Res. 2002, 30 (24): 5529-38；ヒト一次Ｔ細胞においてｔ１／２(ＩＬ−２  ｍＲＮＡ)＝１７±１０分)に匹敵していて、そのような分解システムがインビボの状況の有効な近似であることを指し示している。オープナーのＯｐ１(ｃ＝１０μＭ)の存在下において、この分解は、１５分の期間に亘り完全に阻止されている(図６Ａ)。その時間には、未処理のＩＬ−２  ｍＲＮＡは、７９.９％だけ既に分解されている。延長されたインキュベーションにおいてまた、崩壊が著しく減速されている。４０μＭの濃度においては(図６Ｃ)、Ｏｐ１は、７０分の全インキュベーション時間に亘り分解をブロックしている。もう一つのＨｕＲの結合部位を標的にする、Ｏｐ２は、同様な安定化作用を示している(図６、２５μＭの濃度(Ｂ)および４０μＭの濃度(Ｃ)におけるＯｐ１ならびにＯｐ２)。ＩＬ−２  ｍＲＮＡの分解速度は、負の対照のＯＲＮのＮ２とのハイブリダイゼーションにより影響を及ぼされないままに残っている(１０μＭでのＮ２；ｔ１／２＝６.８２±１.９６分)。オープナーが誘発するＩＬ−２  ｍＲＮＡの安定化が実に特異的な作用であることを保証するために、我々は、我々のＩＬ−２に特異的なオープナーの存在下もしくは不在下において、ＨｕＲの標的を含有している他のＡＲＥのｍＲＮＡの安定性をモニターする。ＴＮＦ−αのもしくはＩＬ−２いずれのｍＲＮＡの崩壊も、ＩＬ−２に特異的なオープナーにより影響されていない(図７ＡおよびＢ)。
【００８７】
実施例２：ＨｕＲのＴＮＦ−α  ｍＲＮＡへの会合およびそれによりＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの安定性を操作すること
ＴＮＦ−αのためにオープナーおよび負の対照のＯＲＮ類のデザインについて計算されたアクセス可能なＲＮＡの構造のフラクションへの２０マーＯＲＮ類のハイブリダイゼーションの作用を示しているプロットが、図８に示されている。再び、著しいアクセス可能性の変化は、ＨｕＲ結合部位の近くにだがまた遠くに位置する、ｍＲＮＡの中の“ホットスポット”の中に集中している。これらのホットスポットから、一つの潜在的なオープナーのＯＲＮならびに推定上のクローザーおよび負の対照のＯＲＮが実験的特性化のために選択されている(表１)。最初の工程では、我々はｓｓＯＲＮ類を使用する。オープナーの作用をインビトロで確認する。１Ｄ−ＦＩＤＡアッセイで測定されるように、クローザーのＣｌＴは、ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲ(６９７ｎｔ)へのＨｕＲの親和性を著しく減少した。作用は、クローザーの濃度と相関していて、最高のクローザーの濃度(５ｎＭ)において、２.５倍までの親和性の減少をもって、最大の作用に近づいている(図９Ａ)。反対に、親和性は、２倍までオープナーのＯｐＴにより増加されている(０.２５ｎＭでのＯｐＴについて、図９Ｂ)。両方の作用は、予測のアクセス可能性変化と定量的に一致している(図８)。ＯｐＴの更に高い濃度においては、しかしながら、作用は逆戻りして、ＨｕＲ−ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲの親和性は、再び低減されている。一つの可能な説明は、ある特定の濃度の上では、この特異的な配列がＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲ内で二次部位にまたハイブリダイズして、それにより逆の立体配座転位を誘発することであろう。重要なことには、負の対照オリゴのＮＴとのハイブリダイゼーションは、ＨｕＲ−ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲの親和性を変化していない(図９Ｃ)。
【００８８】
最後に、我々は、ＨｕＲの複合体形成で誘発された増加が迅速なＡＲＥ依存性のｍＲＮＡの分解にまた拮抗するだろうかどうかを試験する。ＯｐＴの存在下および不在下においてｈｐＢＭＣの溶菌液の中でＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの崩壊を、我々はモニターする。Ｍｇ２＋の添加時に、残存するＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの量を実時間ＲＴ−ＰＣＲにより経時的に定量化する。対照として、我々は、もう一つのＡＲＥが制御するサイトカインのｍＲＮＡとしてのＩＬ−１βの崩壊へのＯｐＴの作用を測定する。ＯｐＴの不在下において、内因性のＴＮＦ−α  ｍＲＮＡは迅速に分解される(ｔ１／２＝３６.０±２.０分、図１０)。観測された半減期は、以前に説明された値(例えば、Raghavan A. et al., Nucleic Acids Res. 2002, 30 (24): 5529-38、ヒト一次Ｔ細胞においてｔ１／２(ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ)＝２５±１１分)に匹敵していて、そのような分解システムがインビボの状況の有効な近似であることを指し示している。２５μＭでのＯｐＴの存在下において、この分解は、４０分のインキュベーション時間に亘り阻止されている。その時間には、未処理のＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの分解は、５３.１％に既に進行している。延長されたインキュベーションにおいてまた、崩壊が著しく減速されている。重要なことには、ＨｕＲの標的を含有するもう一つのＡＲＥとしてのＩＬ−１β  ｍＲＮＡのｍＲＮＡの崩壊はＯｐＴにより影響されないで、これは、オープナーが誘発するＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの安定化が実に特異的な作用であることを立証している。
【００８９】
表１
【表１】
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【００９０】
表２
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】オープナーの作用の図式的説明図；オープナーの作用無しでは、ＨｕＲの結合は、結合部位(１でマーク)のアクセス不可能性により減退されている。標的ｍＲＮＡ(ｍＲＮＡα)へのオープナー(２でマーク)のハイブリダイゼーション時には、αｍＲＮＡ内で局所二次構造の特異的モジュレーションが、アクセス可能な立体配座にあるＨｕＲの結合部位の提示に至って、他のいずれのＨｕＲ標的ｍＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡβ)に影響を及ぼすこと無しにｍＲＮＡαの安定化をもたらしている。
【００９２】
【図２】ＩＬ−２オープナーオリゴヌクレオチドのデザイン；３７°におけるＨｕＲ結合部位のアクセス可能性ｐ＊ＭＯ(即ち、アクセス可能なＲＮＡのフラクション)が、３'ＵＴＲ内で与えられたハイブリダイゼーション部位(開始位置、ｘ軸)において逆相補性の２０マーオリゴヌクレオチドへのＩＬ−２  ３'ＵＴＲのハイブリダイゼーションの依存性を示している。ＩＬ−２  ＡＲＥは白い四角として指し示され、ＮＮＵＵＮＮＵＵＵのＨｕＲ結合部位はオープナー開始位置の約５０および約１５０において連続した黒線でブロックとして示されている。アクセス可能性の著しい増加は、ＨｕＲ結合部位の近くにおいて孤立の“ホットスポット”に限定されている。実験的に試験されたオープナー分子のＯｐ１、Ｏｐ２、Ｏｐ３およびＯｐ４の位置が指し示されて、負の対照(Ｎ１、Ｎ２)がまたマークされている(表１で特定される配列)。オープナーのＯｐ１およびＯｐ３は、ＡＲＥ内でＨｕＲ結合部位を主として標的にし、Ｏｐ２およびＯｐ４は、第二のＮＮＵＵＮＮＵＵＵモチーフに指向されている。
【００９３】
【図３】ＩＬ−２  ３'ＵＴＲへのオープナーのハイブリダイゼーションの説明図；ＩＬ−２  ３'ＵＴＲ(左のパネル)のおよびオープナーのＯｐ１にハイブリダイズされたＩＬ−２  ３'ＵＴＲ(右のパネル、Ｏｐ１は黒い実線として表されている)の最小自由エネルギー(ＭＦＥ)二次構造。ＮＮＵＵＮＮＵＵＵ要素は、右のパネルの中で小斑点としてマークされている。複合体のＭＦＥ立体配座の中で図示されるように、オープナーは、図１にスケッチされているモデルに従って―アクセス可能な(即ち、単鎖の)ＮＮＵＵＮＮＵＵＵ要素を持つ立体配座に向かって平衡をシフトしている。重要なことに、オープナーの作用は、構造の集合がオープナーの予測に適切であるので、ＭＦＥの構造に必ずしも反映される必要は無い。３'ＵＴＲ−オープナー複合体についてのＭＦＥ二次構造は、Cofold(ＶiennaのＲＮＡパッケージで入手可能)を用いて計算される。
【００９４】
【図４】ＩＬ−２オープナーはＩＬ−２  ３'ＵＴＲへのインビトロのＨｕＲ親和性を増加する；組換えＨｕＲのＩＬ−２  ３'ＵＴＲへの見かけの親和性をオープナーの存在下および不在下において１Ｄ−ＦＩＤＡ検出で測定する。全ての４個の試験されたＩＬ−２特異的オープナーは、見かけの解離定数Ｋｄａｐｐ(Ｏｐ１有りで：Ｋｄａｐｐ＝１１.８０±１.４８ｎＭ；Ｏｐ２有りで：Ｋｄａｐｐ＝１８.９１±１.９１ｎＭ；Ｏｐ３有りで：Ｋｄａｐｐ＝８.３８±１.１８ｎＭ；Ｏｐ４有りで：Ｋｄａｐｐ＝１９.５２＋／−２.２０ｎＭ；オープナー無しで：Ｋｄａｐｐ＝３２.７７±４.４８ｎＭ；０.５ｎＭでのＩＬ−２  ３'ＵＴＲ；それぞれ、２５、２５、５および１ｎＭでのオープナー)の減少により反映された、ＩＬ−２  ３'ＵＴＲとのＨｕＲの会合を強化する。負の対照オリゴヌクレオチドのＩＬ−２  ３'ＵＴＲへのハイブリダイゼーションは、ＨｕＲとの相互作用を影響を受けないままにする(Ｎ１有りで：Ｋｄａｐｐ＝３２.９１±６.３４ｎＭ；Ｎ２有りで：Ｋｄａｐｐ＝３２.７７±３.７２ｎＭ、２５ｎＭ濃度でのＮ１およびＮ２)(Ａ)。オープナーのハイブリダイゼーションにより誘発される親和性の増加は、０.３８ｎＭのオープナー濃度で最大半減飽和を持つ飽和カーブを示している(Ｏｐ３ハイブリダイゼーションの見かけの親和性＝１３４(±５４)ｐＭ)。開かれたＩＬ−２  ３'ＵＴＲへのＨｕＲ結合の見かけの親和性は、両方が１.５６ｎＭで、８.５７±１.３３ｎＭのＫｄａｐｐにおいて最大値に近づいている(全ての実験において０.５ｎＭでのＩＬ−２  ３'ＵＴＲ)(Ｂ)。Ｏｐ１の存在下においては、解離定数は、オープナーの濃度が増加するにつれて１.５６ｎＭのＯｐ１濃度において、Ｋｄａｐｐ＝１１.８０±１.４８ｎＭの最小値に減少している(全ての実験において２．５ｎＭでのＩＬ−２  ３'ＵＴＲ)。Ｏｐ１については、この最適値を超えて濃度を増加させることは、作用を逆戻りさせて、解離定数が再び増加する。
【００９５】
【図５】ＩＬ−２  ｍＲＮＡオープナーは内因性のＨｕＲ−ＩＬ−２  ｍＲＮＡの会合を増加する；オープナーもしくは負の対照オリゴヌクレオチドのＯｐ１、Ｏｐ２、Ｎ２およびＯｐＴとの処置無しでまたは後でヒトＰＢＭＣの溶菌液から、ＨｕＲ  ｍＲＮＡ複合体を共−免疫沈澱する。ＨｕＲが結合したＩＬ−２  ｍＲＮＡを実時間ＲＴ−ＰＣＲにより定量化する。ＩＬ−２  ｍＲＮＡの量を、未処理の細胞の中のレベル(白色棒)に正規化する。オープナーを２.５μＭ(斜線の棒)にもしくは１０μＭ(黒色棒)、負対照のＮ２およびＯｐＴに１０μＭ濃度を加える。両方のオープナーは、ＨｕＲ  ｍＲＮＡ複合体化を６.５倍(Ｏｐ１)のもしくは３.１倍(Ｏｐ２)の更に高いレベルにまで増強する。
【００９６】
【図６】ＩＬ−２  ｍＲＮＡオープナーはＩＬ−２  ｍＲＮＡの分解を阻害する；内因性のＩＬ−２  ｍＲＮＡの分解をヒトＰＢＭＣの溶菌液の中でモニターする。Ｍｇ２＋の添加時に(ｔ＝０分)、(Ａ)１０μＭ、(Ｂ)２５μＭおよび(Ｃ)４０μＭの濃度でオープナーのＯｐ１、Ｏｐ２もしくはＮ２の存在下においておよび不在下において、残存するＩＬ−２  ｍＲＮＡの量を定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲにより経時的に定量化する。全てのデータは、少なくとも３個の独立した試料からの平均を表して、時点ｔ＝０分でのレベルに正規化されている。データは、単一の指数関数型減衰(実線：オープナーなし；破線：Ｎ２)に当てはめられている。オープナーは何も無しで(白丸)、ｔ１／２＝８.３４±０.９６分(Ａ)、ｔ１／２＝８.４４±１.９８分(Ｂ)、およびｔ１／２＝８.８４±２.１９分(Ｃ)、ならびに１０μＭの負の対照Ｎ２の存在下において(×印)、(Ａ)、ｔ１／２＝６.８２±１.９６分、の半減期で、ＩＬ−２  ｍＲＮＡは急速に分解されている。オープナーのＯｐ１(黒丸)もしくはＯｐ２(黒三角)の添加は、濃度依存様式で((Ａ)の中で１０μＭ、(Ｂ)の中で２５μＭおよび(Ｃ)の中で４０μＭでのオープナー)一過性のＩＬ−２  ｍＲＮＡの安定化を促進している。４０μＭの濃度(Ｃ)で、Ｏｐ１は、７０分のインキュベーション時間全体に亘って分解をブロックしている。Ｏｐ２は同様な安定化作用を、それはもう一つのＨｕＲの結合部位を標的にするけれども、示している(黒三角、(Ｂ)および(Ｃ))。ＥＦ−１α、非ＡＲＥ  ｍＲＮＡ、は、７０分の観察時間全体に亘って安定のままである(Ｂ)。
【００９７】
【図７】ＩＬ−２オープナーのオリゴヌクレオチドはＩＬ−２  ｍＲＮＡの安定化を特異的に促進する；オープナーが誘発するｍＲＮＡの安定化の特異性を、サイトカインのｍＲＮＡ類(ＴＮＦ−α(Ａ)およびＩＬ−１β(Ｂ))を含む他のＡＲＥの減衰へのそれらの作用をモニターすることにより試験する。ＴＮＦ−αのおよびＩＬ−１βのｍＲＮＡの分解は、それぞれ、ｔ１／２＝３６.０±２.２分(白丸(Ａ))およびｔ１／２＝３７.６±５.６分(白丸(Ｂ))の半減期を特徴としている。ＩＬ−２特異的オープナーのＯｐ１(黒丸)もしくはＯｐ２(黒三角、両方とも２５μＭで)のいずれかの存在下において、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１β  ｍＲＮＡの減衰のいずれも変化しない。
【００９８】
【図８】ＴＮＦ−αのオープナーおよびクローザーのデザイン；３７°におけるＨｕＲ結合部位のアクセス可能性ｐ＊ＭＯ(即ち、アクセス可能なＲＮＡのフラクション)が、ｍＲＮＡ(RefSec  ＮＭ＿０００５９４)内で与えられたハイブリダイゼーション部位(開始位置、ｘ軸)において逆相補性の２０マーオリゴヌクレオチドへのＴＮＦ−α  ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの依存性を示している。ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲは、黒い線により図示され、ＡＲＥは白い四角として指し示され、ＮＮＵＵＮＮＵＵＵ  ＨｕＲ結合部位は、黒い小さな四角として示されている。アクセス可能性の著しい変化を持つハイブリダイゼーション部位は、ＨｕＲ結合部位の主に近くにだがまた遠くにおいて、“ホットスポット”の中に集中している。注目すべきことには、また推定上の“クローザー”の位置が同定されて、ＮＮＵＵＮＮＵＵＵのアクセス可能性を著しく減少すると予測されている。興味あることには、これらの位置は、オープナーのホットスポット領域内に位置している。推定上のオープナー、クローザー及び負の対照オリゴの位置は、それぞれ、小さな四角としてまた示されている。実験的に試験されたＯｐＴ、ＣｌＴおよびＮＴを含む同定されたＴＮＦ−αのオープナー／クローザー(ＯｐＡ、ＯｐＢ、ＣｌＣ、ＯｐＥ、ＯｐＨ)の配列は、表１の中で指定されている。
【００９９】
【図９】ＴＮＦ−αオープナーはＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲへのインビトロのＨｕＲ親和性を増加する；組換えＨｕＲのＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲへの見かけの親和性をオープナー、クローザーもしくは負の対照オリゴヌクレオチドの存在下においておよび不在下において１Ｄ−ＦＩＤＡアッセイで測定する。ＴＮＦ−αのクローザーＣｌＴは、見かけの解離定数Ｋｄａｐｐの増加により反映された、ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲとのＨｕＲの会合を明らかに低減する。作用は、クローザーの濃度と相関している。作用は、最高のクローザーの濃度で２.５倍までのＫｄの増加(ＣｌＴ有りで：Ｋｄａｐｐ＝１３.８０±２.４１ｎＭ、クローザー無しで：Ｋｄａｐｐ＝５.６３±０.８７ｎＭ)をもって最高値に近づいている(Ａ)。オープナーのＯｐＴは、ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲへのＨｕＲの親和性を２倍まで増加して(Ｂ)、それは計算で予測された作用と良好な整合性にある(図８)。しかしながら、０.５ｎＭ以上のオープナーの濃度では、作用は、増加した解離定数に向かって再び逆戻りする。負の対照オリゴヌクレオチドＮＴとのハイブリダイゼーションは、実験の全体の濃度範囲に亘ってＨｕＲ−ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲの親和性に影響を及ぼさない(Ｃ)。ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲの濃度は、全ての実験において１ｎＭである。
【０１００】
【図１０】ＴＮＦ−αオープナーはＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの安定化を特異的に促進する；ＴＮＦ−αについてデザインされたオープナー(ＯｐＴ、図８および表１を参照)は、ＩＬ−１β  ｍＲＮＡのレベルに影響を及ぼすこと無しに(Ｂ)、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡを特異的に安定化する(Ａ)。(丸印：オープナーなし；星印：２５μＭでのオープナーＯｐＴ)。
【０１０１】
【図１１】オープナーをベースにするインビトロアッセイのデザインＩ：立体配座スイッチ；ＡＲＥ  ｍＲＮＡの立体配座に作用する化合物の同定のための例示的なアッセイ原理が図式化されている。オープナーに誘発される立体配座の転位は、ＦＲＥＴ対を構成している、適切に位置する蛍光体により例えば検出される。ｍＲＮＡ内に戦略的に置かれるとすると、それらの距離および、それ故に、ＦＲＥＴの効率は、開かれたもしくは閉鎖されたＨｕＲ結合部位(×によりマークされた)に特徴的になる。(Ａ)にスケッチされているように、計算的にデザインされたオープナーにより誘発されるＨｕＲ結合部位の開口は、ＦＲＥＴの効率の減少により検出される。(Ｂ)低分子量の化合物は、異なる作用機序によりこの転位と干渉するであろう。ｍＲＮＡに結合することにより、それらは、オープナーのハイブリダイゼーションと直接に競争するかもしくは閉鎖された立体配座の中でｍＲＮＡを局所に凍結するかのいずれかであり得る。オープナーの存在下において持続的なエネルギー転移を特徴とする、そのような化合物は、ＨｕＲがｍＲＮＡに結合することを防止して、それにより対応する標的遺伝子を下方調節するであろう。他方において、オープナーの作用は、開かれた立体配座を安定化する化合物により強化され得る。これらの化合物ならびにオープナーに誘発される立体配座のスイッチを模倣するそのような化合物は、それぞれ、オープナーの存在下もしくは不在下において低減されたエネルギー転移により同定される。ＨＴＳフォーマットへの適応のための主な問題点は、十分な量で部位特異的に二重に標識されたｍＲＮＡの作製であろう。それ故に、別の戦略が図１２に概略されている。
【０１０２】
【図１２】オープナーをベースにするインビトロアッセイのデザインＩＩ：ＨｕＲ結合；これに代えて、アッセイ戦略をｍＲＮＡ上でおよびＨｕＲ上で二つの蛍光体の間のエネルギー転移を測定することによりＨｕＲ結合事象の検出へシフトし得る。ｍＲＮＡのラベルは、(Ａ)３'末端に共役的に付着させる(例えば、Qin P. Z. et al., Methods, 1999, 18 (1): 60-70の中に記載されているように)もしくは(Ｂ)オープナーのオリゴヌクレオチドを介して導入されるかのいずれかであり得る。この設定では、オープナーにより誘発される立体配座の転位を、引き続く工程である、ＨｕＲ  ｍＲＮＡ会合の測定により間接的に測定する。それ故に、ＨｕＲ阻害剤は、ｍＲＮＡの立体配座に作用する化合物と同一のシグナルを生成して、適切な対向スクリーニングにおいて選別される必要があるであろう。
【０１０３】
【図１３】ｍＲＮＡのオープナーをベースにする細胞のアッセイのための戦略；ＡＲＥ  ｍＲＮＡの立体配座スイッチへの細胞のアッセイデザインのための例示的な戦略が概略されている(Ａ)。標的ｍＲＮＡを、適切にデザインされた蛍光プローブ(例えばＣｙ５)により特異的に視覚化する。プローブを計算的にデザインして、熱力学的ｍＲＮＡの集合への最小の影響を保証して、オープナーが誘発する構造の転位と適合性にする。内因性のＨｕＲを、蛍光性タンパク質(例えばＣＦＰ)への融合により標識する。閉鎖されたｍＲＮＡの立体配座では、二つの蛍光体(ＨｕＲ、ｍＲＮＡ)は、空間的に孤立しているであろう。オープナーにより誘発される、ＨｕＲの結合時に、二つの蛍光性分子は、ｍＲＮＡ上に共局所化するであろうが、それは高分解共焦点映像法により例えば検出され得る(Ｂ)。これに代えて、ｍＲＮＡに特異的な標識を、オープナーのオリゴヌクレオチドの上に直接に置く。この設定では、開かれたｍＲＮＡ分子のみが検出されて、ｍＲＮＡの構造集合は(さらに別の)プローブにより影響を及ぼされない。プローブがＨｕＲ結合部位(×によりマークされた)に十分近くにハイブリダイズするという条件で、エネルギーの転移(即ち、供与体の失活／受容体の感作)が、開かれた(即ちＨｕＲが結合した)から閉鎖された立体配座を区別するための好ましい検出モードである。図１１の図示に類似して、オープナーが誘発する作用を阻害するかもしくは強化する化合物を、開かれた対閉鎖されたｍＲＮＡの立体配座の区別に基づいて同定することができる。構成的に“開かれた”ｍＲＮＡを用いる対向スクリーニングは、ＨｕＲの阻害剤を選別するために適切であり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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