(57)【要約】  マスト細胞、好酸球および／または好塩基球を阻害し、これによりアレルギー性反応を阻害することを目的とする二重特異性複合体が開示される。特に、前記複合体は二重特異性抗体によって最も良く例示され、これは同一細胞中に存在する二つの標的に結合する。一つの標的は阻害性受容体ＩＲｐ６０である。第２の標的は例えばＩｇＥ，ｃＫＩＴ，Ｆｃ  ＲＩ，ＩＬ５ＲまたはＣＣＲ３の如き細胞特異的な活性化因子である。二重特異性抗体のその標的への結合は、活性化因子からのシグナル伝達の阻害を通して阻害経路の誘導を生ずる。組成物および二重特異性複合体の使用も記述される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの異なる標的認識成分を含む、標的細胞を標的化するための二重特異性複合体であって、前記成分のそれぞれは、前記標的細胞上に位置する第１および第２の標的に特異的にそれぞれ結合する分子またはその任意の機能的フラグメントを含み、１つの標的が阻害性受容体ＩＲｐ６０またはその相同体であり、第２の標的が、前記阻害性受容体により媒介される阻害性経路を活性化する細胞特異的な活性化因子である二重特異性複合体。
【請求項２】
前記複合体が前記標的細胞に結合することにより、アレルギー性反応が阻害される請求項１に記載の二重特異性複合体。
【請求項３】
前記標的認識成分は、架橋剤、リンカー化合物、キャリア、合成スペーサー、固定化基質、および、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３モチーフに基づく柔軟な領域のいずれか１つを介して連結される請求項２に記載の二重特異性複合体。
【請求項４】
前記標的認識成分は架橋される請求項３に記載の二重特異性複合体。
【請求項５】
前記細胞は造血系譜に由来する請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異性複合体。
【請求項６】
前記細胞はマスト細胞、好酸球および好塩基球のいずれか１つである請求項５に記載の二重特異性複合体。
【請求項７】
前記第２の標的は、免疫グロブリン、Ｆｃ受容体、サイトカイン受容体、増殖因子受容体、接着分子、Ｉｇスーパーファミリー受容体、ケモカイン受容体、炎症性媒介因子受容体、ホルモン受容体、補体因子受容体、プロテアーゼにより活性化された受容体、および、酵素からなる群から選択されることができる請求項１〜６のいずれか一項に記載の二重特異性複合体。
【請求項８】
前記認識成分は、天然に存在する抗体、合成抗体または組換え抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二機能性ｓｃＦｖ、ジアボディー、Ｆ（ａｂ）ユニット、Ｆ（ａｂ’）ユニット、二重特異性Ｆ（ａｂ’）コンジュゲート、化学的に架橋された二機能性抗体、線状抗体、抗体のＦ（ａｂ’）２抗原結合性フラグメント、あるいはそれらの任意の機能性フラグメントのいずれか１つから選択される請求項１〜７のいずれか一項に記載の二重特異性複合体。
【請求項９】
前記認識成分はＦ（ａｂ’）ユニットである請求項８に記載の二重特異性複合体。
【請求項１０】
前記標的細胞はマスト細胞である請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性複合体。
【請求項１１】
前記第２の標的は、ＩｇＥ、ｃＫＩＴまたはＦｃεＲＩのいずれかである請求項１０に記載の二重特異性複合体。
【請求項１２】
２つの架橋されたＦ（ａｂ’）ユニットを含む、標的細胞を標的化するための二重特異性複合体であって、前記Ｆ（ａｂ’）ユニットのうちの１つがＩＲｐ６０またはその任意の相同体を認識し、第２のものがＩｇＥを認識する二重特異性複合体。
【請求項１３】
２つの架橋されたＦ（ａｂ’）ユニットを含む、標的細胞を標的化するための二重特異性複合体であって、前記Ｆ（ａｂ’）ユニットのうちの１つがＩＲｐ６０またはその任意の相同体を認識し、第２のものがｃＫＩＴを認識する二重特異性複合体。
【請求項１４】
２つの架橋されたＦ（ａｂ’）ユニットを含む、標的細胞を標的化するための二重特異性複合体であって、前記Ｆ（ａｂ’）ユニットのうちの１つがＩＲｐ６０またはその任意の相同体を認識し、第２のものがＦｃεＲＩを認識する二重特異性複合体。
【請求項１５】
前記複合体はマスト細胞活性の阻害剤として機能することができる請求項１〜１４のいずれか一項に記載の二重特異性複合体。
【請求項１６】
前記標的細胞は好酸球である請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性複合体。
【請求項１７】
前記第２の標的は、ＩＬ−５受容体（ＩＬ−５Ｒ）、および、エオタキシンに対する受容体（ＣＣＲ３）のいずれかである請求項１６に記載の二重特異性複合体。
【請求項１８】
２つの架橋されたＦ（ａｂ’）ユニットを含む、標的細胞を標的化するための二重特異性複合体であって、前記Ｆ（ａｂ’）ユニットのうちの１つがＩＲｐ６０またはその任意の相同体を認識し、第２のものがＩＬ−５Ｒを認識する二重特異性複合体。
【請求項１９】
２つの架橋されたＦ（ａｂ’）ユニットを含む、標的細胞を標的化するための二重特異性複合体であって、前記Ｆ（ａｂ’）ユニットのうちの１つがＩＲｐ６０またはその任意の相同体を認識し、第２のものがＣＣＲ３を認識する二重特異性複合体。
【請求項２０】
前記複合体は好酸球活性の阻害剤として機能することができる請求項１〜９および請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の二重特異性複合体。
【請求項２１】
前記複合体はアレルギーエフェクター細胞活性の阻害剤として機能することができる請求項１〜２０のいずれか一項に記載の二重特異性複合体。
【請求項２２】
アレルギー性反応、ならびに、マスト細胞および／または好酸球および／または好塩基球により媒介される反応のいずれかによって誘導される状態を治療するための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の二重特異性複合体。
【請求項２３】
前記状態は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、季節性アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎およびアトピー性湿疹、様々なアレルゲンに対するアレルギー性の障害および応答、全身性アナフィラキシー、全身性肥満細胞過剰増殖、限局性強皮症／色素性じんま疹、マスト細胞白血病、アテローム性動脈硬化、移植片拒絶、多発性硬化症、線維形成性肺疾患、神経線維腫症、ケロイド、強皮症、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、急性痛風、眼の瘢痕性類天疱瘡、クローン病、腹膜癒着、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、好酸球増多筋痛症候群、外因性気管支喘息、鼻ポリープ症、ヴェーゲナー肉芽腫症、内因性気管支喘息、間質性肺疾患および他の肺疾患、慢性好酸球性肺炎、過敏性肺臓炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、類肉腫症、特発性肺線維症、トキソカラ症、フィラリア症、住血吸虫症、旋毛虫症、新生物疾患および骨髄増殖性疾患、Ｔ細胞リンパ腫およびホジキン病からなる群から選択される請求項２２に記載の二重特異性複合体。
【請求項２４】
マスト細胞に関連した状態の治療における薬剤としての使用するための、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性複合体であって、前記状態は特に、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、季節性アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎およびアトピー性湿疹、様々なアレルゲンに対するアレルギー性の障害および応答、全身性アナフィラキシー、全身性肥満細胞過剰増殖、限局性強皮症／色素性じんま疹、マスト細胞白血病、アテローム性動脈硬化、移植片拒絶、多発性硬化症、線維形成性肺疾患、神経線維腫症、ケロイド、強皮症、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、急性痛風、眼の瘢痕性類天疱瘡、クローン病、腹膜癒着、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である二重特異性複合体。
【請求項２５】
好酸球に関連した状態の治療における薬剤としての使用するための、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性複合体であって、前記状態は特に、外因性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、オンコセルカ皮膚炎、アトピー性皮膚炎、鼻ポリープ症、小結節、好酸球増加症、リウマチ、皮膚炎および腫れ（ＮＥＲＤＳ）、脈管炎性肉芽腫性疾患、一時的脈管炎、チャーグ・ストラウス症候群、多関節炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性硬化症、移植片拒絶、気管支喘息、間質性肺疾患および他の肺疾患、好酸球性胸膜滲出、一過性肺好酸球浸潤物（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ）、組織球症、慢性好酸球性肺炎、過敏性肺臓炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、類肉腫症、特発性肺線維症、局所的好酸球増加症、ネコひっかき病、無熱性結核、幼児期におけるクラミジア肺炎、新生物疾患および骨髄増殖性疾患、気管支原性ガン、好酸球増加症候群、Ｔ細胞リンパ腫およびホジキン病、クローン病、春季角結膜炎母斑、木村病、グレイヒ病である二重特異性複合体。
【請求項２６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性複合体を活性な薬剤として含む医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１〜９および請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の二重特異性複合体を活性な薬剤として含む医薬組成物。
【請求項２８】
医療のために使用するための請求項２６または２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
マスト細胞の過活性または過形成に由来する任意の疾患または状態の治療における使用のための請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記疾患は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎およびアトピー性湿疹、様々なアレルゲンに対するアレルギー性の障害および応答、全身性アナフィラキシー、全身性肥満細胞過剰増殖、限局性強皮症／色素性じんま疹、マスト細胞白血病、アテローム性動脈硬化、移植片拒絶、多発性硬化症、線維形成性肺疾患、神経線維腫症、ケロイド、強皮症、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、急性痛風、眼の瘢痕性類天疱瘡、クローン病、腹膜癒着、慢性ＧＶＨＤ、気管支喘息、鼻ポリープ症、ヴェーゲナー肉芽腫症、間質性肺疾患および他の肺疾患、慢性好酸球性肺炎、過敏性肺臓炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、特発性肺線維症、新生物疾患および骨髄増殖性疾患、Ｔ細胞リンパ腫およびホジキン病からなる群から選択される請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
好酸球の過活性または過形成に由来する任意の疾患または状態の治療における使用のための請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記状態は、外因性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、オンコセルカ皮膚炎、アトピー性皮膚炎、鼻ポリープ症、小結節、好酸球増加症、リウマチ、皮膚炎および腫れ（ＮＥＲＤＳ）、脈管炎性肉芽腫性疾患、一時的脈管炎、チャーグ・ストラウス症候群、多関節炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性硬化症、移植片拒絶、気管支喘息、間質性肺疾患および他の肺疾患、好酸球性胸膜滲出、一過性肺好酸球浸潤物（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ）、組織球症、慢性好酸球性肺炎、過敏性肺臓炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、特発性肺線維症、局所的好酸球増加症、ネコひっかき病、無熱性結核、幼児期におけるクラミジア肺炎、新生物疾患および骨髄増殖性疾患、気管支原性ガン、好酸球増加症候群、Ｔ細胞リンパ腫およびホジキン病、クローン病、春季角結膜炎母斑、若年性炎症結膜炎母斑、木村病、グレイヒ病からなる群から選択される請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
緩衝剤、添加剤、安定化剤、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
マスト細胞および／または好酸球の過活性または過形成に関連した任意の疾患または状態を治療するための医薬組成物の調製における請求項１〜２５のいずれか一項に記載の二重特異性複合体の使用。
【請求項３５】
前記疾患は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎およびアトピー性湿疹、様々なアレルゲンに対するアレルギー性の障害および応答、全身性アナフィラキシー、全身性肥満細胞過剰増殖、限局性強皮症／色素性じんま疹、マスト細胞白血病、アテローム性動脈硬化、移植片拒絶、多発性硬化症、線維形成性肺疾患、神経線維腫症、ケロイド、強皮症、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、急性痛風、眼の瘢痕性類天疱瘡、クローン病、腹膜癒着、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、好酸球増多筋痛症候群、気管支喘息、鼻ポリープ症、ヴェーゲナー肉芽腫症、間質性肺疾患および他の肺疾患、慢性好酸球性肺炎、過敏性肺臓炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、類肉腫症、特発性肺線維症、新生物疾患および骨髄増殖性疾患、Ｔ細胞リンパ腫およびホジキン病からなる群から選択される請求項２７に記載の使用。
【請求項３６】
マスト細胞の機能を阻害することにおける、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性複合体、または、そのような二重特異性複合体を含む医薬組成物の使用。
【請求項３７】
好酸球の機能を阻害することにおける、請求項１〜９および請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の二重特異性複合体の、または、そのような二重特異性複合体を含む医薬組成物の使用。
【請求項３８】
マスト細胞の過活性および過形成に関連した任意の疾患または状態を治療する方法であって、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性複合体の治療効果的な量、または、そのような二重特異性複合体を含む組成物の治療効果的な量を、それを必要としている対象に投与することを含む方法。
【請求項３９】
好酸球の過活性および過形成に由来する任意の疾患または状態を治療する方法であって、請求項１〜９または請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の二重特異性複合体の治療効果的な量、または、そのような二重特異性複合体を含む組成物の治療効果的な量を、それを必要としている対象に投与することを含む方法。
【請求項４０】
マスト細胞の活性を阻害する方法であって、マスト細胞を、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性複合体、または、そのような二重特異性複合体を含む組成物と、好適な量の時間、接触させることを含む方法。
【請求項４１】
好酸球の活性を阻害する方法が提供であって、好酸球を、請求項１〜９または請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の二重特異性複合体、または、そのような二重特異性複合体を含む組成物と、好適な量の時間、接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫薬理学の分野に関連する。より具体的には、本発明は、予防手段および治療手段の両方である、アレルギー性炎症の調節因子として機能する二重特異性分子に関連する。
【背景技術】
【０００２】
本出願全体を通して言及されるすべての刊行物は、それにおけるすべての引用参考文献を含めて、全体が参考として本明細書中に組み込まれる。
【０００３】
Ａ．アレルギー性炎症
アレルギー性炎症は、様々な細胞タイプ（例えば、炎症性細胞および構造的細胞など）を伴う複雑な現象である。マスト細胞はアレルギー性炎症の十分に確立された開始因子であり、炎症性細胞（主として、好酸球）を引き寄せ、活性化し、最終的にはその炎症性細胞と相互に作用する。アレルギー性炎症は様々な病状（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性湿疹など）を構成する。これらの疾患の中で、また、一例として、喘息は幼児期の最も一般的な病気であり、西欧諸国では２０％にまで達すると考えられ、現在増加している［Ｂｕｓｓｅ  ＷＷ、Ｌｅｍａｎｓｋｅ  ＲＦ  Ｊｒ．（２００１）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、３４４：３５０１］。
【０００４】
アレルギーの分野における実験により、これらの病理の基礎となる細胞的機構および分子的機構への洞察がもたらされている。これらの研究は、アレルギー性応答が、多くの場合、二相的であるという理解をもたらしている。第１の早期段階がマスト細胞の活性化によって開始され（下記参照）、その一方で、第２の後期段階が炎症性細胞（主に、Ｔ細胞、好酸球および一部の好塩基球）の浸潤によってもたらされる［Ｂｒｏｉｄｅ  ＤＨ、Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ  ＧＳ．（１９９１）、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．、８８：１０４８２］。しかしながら、知識は有効な治療的手段を未だもたらしていない。現在使用されている方法では、症状の緩和（すなわち、抗ヒスタミン剤および抗ロイコトリエン剤）または非選択的な抗炎症治療（すなわち、グルココルチコイド）のいずれかが提供される。加えて、１つだけの抗体（例えば、ＩｇＥ）、Ｔ細胞サイトカイン（例えば、抗ＩＬ−５）またはいくつかの転写因子（例えば、ＳＴＡＴ−６、ＧＡＴＡ−３またはＦＯＧ−１）を標的とする新しく開発された免疫薬理学的治療は、いまのところ、有効であるとは判明していない。
【０００５】
Ｂ．マスト細胞
マスト細胞は、顕著な細胞質顆粒を含有する、組織に存在するＦｃεＲＩ保有細胞である。アレルギー性反応における非常に重要な役割を有することのほかに、マスト細胞はまた、線維症、腫瘍、自己免疫疾患および生来的免疫にも関与している。マスト細胞は、身体中至るところ、結合組織および粘膜表面に広く分布し、通常、血管および末梢神経の非常に近いところに存在する。従って、マスト細胞は、マスト細胞が数分以内および／または数時間の期間の両方で反応し得る環境刺激（例えば、微生物およびアレルゲンなど）にさらされ、事前に形成された媒介因子および新たに合成された媒介因子の調節された分泌を受ける。
【０００６】
活性化されたとき、マスト細胞は、事前に形成された顆粒構成成分（例えば、ヒスタミン、プロテオグリカンおよびプロテアーゼ）、ＰＧＤ２、ＬＴＣ４、ＰＡＦ、および、より少ない程度ではあるが、ＬＴＢ４、および、様々なサイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦ）をはじめとする様々な炎症性媒介因子を放出する［Ｐｕｘｅｄｄｕ  Ｉ．他（２００３）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、３５：１６０１３］。
【０００７】
アレルゲンが、ＦｃεＲＩに結合した２つの隣接するＩｇＥ分子に結合することによって引き起こされる古典的な「アレルギー性」ＩｇＥ依存的マスト細胞活性化に加えて、マスト細胞を刺激する他の方法が存在する。ＩｇＥに依存しないマスト細胞活性化が後期段階の状況および慢性的炎症では特に重要である場合がある。特筆すべきことに、抗ＩｇＥ治療が現在、喘息の治療のために承認されているが、そのような抗ＩｇＥ治療は少しの改善を誘導するにすぎない。このことは、喘息の発症におけるＩｇＥ以外に依存する経路の関与、ならびに、治療的介入のための新しい標的の必要性を強調している。実際、本発明者らの研究室（ならびに他の研究室）で行われた研究は、数多くの媒介因子がマスト細胞を活性化することができることを示している［Ｐｉｌｉｐｏｎｓｋｙ  Ａ．Ｍ．他（２００３）、Ｂｌｏｏｄ、１０１：１８９８〜４；Ｆｅｌｄｗｅｇ，Ａ．Ｍ．他（２００３）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３３：２２６２〜８］。なかでも、幹細胞因子（ＳＣＦ）（これは、活性化だけでなく、マスト細胞の分化、生存、増殖、成熟化、走化性、接着に非常に関わっている）、および、神経増殖因子（ＮＧＦ）（これはまた、マスト細胞の活性化を誘導する）。
【０００８】
マスト細胞のＩｇＥ独立刺激はまた、その活性のために不可欠な類似する構造的特徴をともに有する多塩基性化合物（例えば、化合物４８／８０、ニューロペプチド（ＶＩＰ、ＣＧＲＰ、サブスタンスＰ、ニューロテンシン）、および、好酸球由来の主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）によっても引き起こされ得る［Ｐｉｌｉｐｏｎｓｋｙ  Ａ．Ｍ．他（２００３）、同上同頁］。
【０００９】
好酸球は、転写因子（ＧＡＴＡ−１＆２およびｃ／ＥＢＲ）およびサイトカイン（ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５）（「好酸球生存サイトカイン」）の調節のもとで分化する骨髄由来の顆粒球である［Ｋａａｔｚ  Ｍａａ他（２００４）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、１４：１０５５〜１６０］。特筆すべきことに、ＣＤ４＋のＴｈ２細胞がこれらのサイトカインの主要な産生体である［Ｕｍｌａｎｄ  ＳＰ他（１９８８）、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、１８：６３１〜４２］。好酸球は、通常、血液に入り、胃腸管内に遊走するが、炎症性状態では、様々な組織に集積し得る。そのような組織において、好酸球は、局所的に放出された「生存サイトカイン」の作用のために、プログラム化細胞死が始まる前の数日間生存することができる。好酸球は寄生虫感染における宿主の防御機構に関連し、また、様々な特発性好酸球増加症候群だけでなく、アレルギー性の免疫学的障害および悪性障害の病理発生に関係している［Ｂａｉｎ，Ｂ．Ｊ．（２００４）、Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ．、７７：８２〜５；Ｋｌｉｏｎ，Ａ．Ｄ．他（２００４）、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｍｕｎｏｌ．、１１３：３０〜７］。ＬＡＲ（遅発型喘息反応）において、好酸球はその細胞毒性顆粒タンパク質の放出によって組織損傷（大部分は上皮の損傷）に関わり得る。加えて、喘息に関連した組織修復および線維症に関与するエフェクタ−細胞として好酸球を暗示する証拠が現れつつある［Ｌｅｖｉ−Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｆ．他（１９９９）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６：９６６０〜５］。
【００１０】
好酸球は、事前に形成された顆粒媒介因子（主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）、好酸球由来ニューロトキシン（ＥＤＮ）および好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）など）を貯蔵し、脂質媒介因子（ＰＡＦ、ＬＴＣ４およびＰＧＥ２など）、ならびに、前炎症性および免疫調節性のサイトカインおよびケモカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＮＧＦ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＮＦ−γ、ＭＩＰ−１、ＲＡＮＴＥＳおよびエオタキシンなど）を合成する［Ｐｉｌｉｐｏｎｓｋｙ，Ａ．Ｍ．他（２００２）、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、３８：１３６９］。好酸球の塩基性タンパク質は、喘息患者から得られた生物学的流体に検出される濃度で気道上皮細胞に対してインビトロで非常に毒性であることが見出されていた。さらに、好酸球はマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−９およびマトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）−１／２を産生する。好酸球はまた、ヘパラナーゼを含有し、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）およびｂ−繊維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）のための供給源である［Ｍｕｎｉｔｚ，Ａ．他（２００４）、Ａｌｌｅｒｇｙ、５９：２６８〜７５］。このことは、喘息関連および喘息を伴う線維症における好酸球の役割を明瞭に示している。
【００１１】
好酸球の活性化およびその後の媒介因子放出が、アレルギー性状況および他の疾患の両方で、一連のアゴニストによって誘導され得る。実際、いくつかの前炎症性の媒介因子（すなわち、Ｃ５ａ、ＰＡＦ）、サイトカイン（すなわち、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−２、ＩＮＦγなど）、免疫グロブリン（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＡ）およびケモカイン（すなわち、ＣＣＲ３）に対する受容体［Ｍｕｎｉｔｚ（２００４）、同上同頁］が好酸球の表面に発現する。しかしながら、好酸球の活性化をインビボで（特に、慢性アレルギー性気道炎症の状況で）促進することにおけるこれらの受容体の役割は不明である。好酸球活性化の阻止が現在、喘息の治療のために続行中であるので、これは、単に学術的な疑問ではない。抗ＩＬ−５治療による近年の結果は、好酸球活性化の基本的機構を特定する必要性を再確認させている。これは、この試薬が喘息患者における好酸球の脱顆粒化に対する著しい影響を有していなかったからである［Ｋａｙ，Ａ．Ｂ．他（２００３）、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、１６７：１５８６〜７］。好酸球はまた、マスト細胞においてもまた発現されるいくつかのさらなる阻害性／活性化因子様のＩｇスーパーファミリー細胞表面受容体（例えば、ＬＩＲ−３／ＩＬＴ−５、ＬＩＲ−１／ＩＬＴ−２、ＬＩＲ−２／ＩＬＴ−４、ＬＩＲ−７／ＩＬＴ−１など）を発現することが見出され［Ｔｅｄｌａ  Ｎ．他（２００３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：１１７４〜９］、また、様々なシグレクト（ｓｉｇｌｅｃｔ）を発現することが見出されている［Ｎｕｔｋｕ，Ｅ．他（２００３）、Ｂｌｏｏｄ、１０１：５０１４〜２０］。
【００１２】
好酸球はアレルギー性炎症プロセスの後期段階のときに組織におけるマスト細胞と接触する。近年、これら２つの細胞の間での重要なクロストークが存在することを示す証拠が現れている。本発明者らの研究室で行われた研究では、好酸球の生存がＴＮＦ−αＲＩおよびＴＮＦ−αＲＩＩを介してマスト細胞由来のＴＮＦ−αによって高まることが示されている［Ｔｅｍｋｉｎ，Ｖ．他（２００１）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１５：２０〜６］。さらに、事前に形成されたマスト細胞由来のトリプターゼにより、ＩＬ−６およびＩＬ−８の産生およびヒト末梢血好酸球からの放出が、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）／ＡＰ−１経路を開始するＰＡＲ−ＩＩによって誘導され、その一方で、ＩｇＥ活性化マスト細胞により産生されたＧＭ−ＣＳＦにより、好酸球の生存および好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）の放出が誘導される。ヒトの肺由来マスト細胞は、繊維芽細胞と同時培養されたとき、膜結合型ＳＣＦに依存するプロセスによってＭＢＰに対して応答性になる。特筆すべきことに、好酸球もまたＳＣＦおよびＮＧＦを合成する。まとめると、このことはすべて、アレルギー性炎症の後期段階および慢性的段階におけるマスト細胞および好酸球の重要性を強化している［Ｔｅｍｋｉｎ，Ｖ．他（２００２）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６９：２６６２；Ｈａｒｔｍａｎ  Ｍ．他（２００１）、Ｂｌｏｏｄ、９７：１０８６５〜６；Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ａ．他（１９９８）、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０２：４５６〜６０］。
【００１３】
近年、マスト細胞の脱顆粒化が、マスト細胞に発現し、かつ、マウスおよびヒトのマスト細胞に対して機能的である、表面のさらなる活性化因子様および阻害性の受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ、ｇｐ４９Ａ／Ｂ１／Ｂ２、ＰＩＲ−Ｂ、様々なＬＩＲ／ＩＬＴおよびシアル酸結合性Ｉｇ様レクチン（ｓｉｇｌｅｃ）など）によって調節されることが明らかになっている［Ｋａｔｚ  ＨＲ（２００２）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４：６９８７］。
【００１４】
Ｃ．阻害性受容体
マスト細胞および好酸球がともに、Ｉｇ受容体スーパーファミリー（これは細胞外部分における１つだけのＶタイプＩｇ様ドメインによって特徴づけられる；例えば、ＫＩＲ、ＬＩＲ／ＩＬＴ、ＬＡＩＲ、ｇｐ４９Ｂ１など）またはｃ型（カルシウム依存性）レクチンスーパーファミリー（例えば、ＭＡＦＡ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａなど）のいずれかに属するいくつかの阻害性受容体を発現することがますます明らかになってきている。この大きなファミリーの免疫阻害性受容体は、コンセンサスなアミノ酸配列、すなわち、免疫受容体のチロシン型阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）によって特定することができる。ＩＴＩＭはこれらの分子の細胞質ドメインに存在する。原型となるＩＴＩＭ配列は６個のアミノ酸から構成される：（Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ／Ｓｅｒ）−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｘ−（Ｌｅｕ／Ｖａｌ）、式中、Ｘは任意のアミノ酸を表す。活性化されたとき、これらの阻害性受容体は、多くの場合にはＳｒｃファミリーのキナーゼによるチロシンのリン酸化を受け、これにより、Ｓｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメインを有する細胞質ホスファターゼ（例えば、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、ＳＨＩＰ−１およびＳＨＩＰ−２など）を動員するための結合部位を提供する［Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ、Ｌａｎｉｅｒ  ＬＬ（２０００）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０：８４８］。
【００１５】
以前に記載されたように、マスト細胞はＩｇＥ依存性（ＦｃεＲＩ媒介）の刺激物質またはＩｇＥ非依存性の刺激物質によって活性化され得る。ＩｇＥ依存性の機構を介するマスト細胞の活性化は、ＩＴＡＭ（免疫受容体のチロシン型活性化因子様モチーフ）と呼ばれるＦｃεＲＩ受容体の細胞内成分におけるチロシンリン酸化残基へのｓｙｋおよびｌｙｎの迅速な動員をもたらす。この作用の結果は、ヒスタミンおよび他の事前に形成された媒介因子の放出および合成、ならびに、３０分未満で完了する迅速なプロセスによる脂質媒介因子の放出である。加えて、ＳＣＦおよびＮＧＦ（これらはマスト細胞を活性化する）がＳｒｃファミリーのキナーゼに依存している。興味深いことに、ＩｇＥ依存性刺激物質およびＩｇＥ非依存性刺激物質はともに、マウスモデルにおいて少なくともインビボでは阻害性受容体によって調節される。従って、ＩＴＡＭドメインまたはキナーゼ活性を脱リン酸化するＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、ＳＨＩＰ−１およびＳＨＩＰ−２の動員により、マスト細胞活性化のダウンレギュレーションがもたらされる。この阻害は、マウスのマスト細胞におけるｇｐ４９Ｂ１阻害性受容体について十分に詳しく記載されており、この場合、阻害性受容体がＦｃεＲＩと同時連結することにより、分泌顆粒媒介因子（ヒスタミン、β−ヘキソサミニダーゼ）およびＬＴＣ４の放出の阻害がもたらされた［Ｋａｔｚ  Ｈ．Ｒ．他（１９９６）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９３：１０８０９］。
【００１６】
ＩＲｐ６０（阻害性受容体タンパク質６０）は、Ｉｇスーパーファミリーに属する阻害性受容体である。ＩＲｐ６０は多くの細胞タイプ（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および顆粒球など）において発現する。ＮＫ細胞上におけるＩＲｐ６０の架橋はＮＫ細胞溶解活性のダウンレギュレーションをもたらす。加えて、過バナジン酸ナトリウムによるＩＲｐ６０の処理は、顕著なＩＲｐ６０チロシンリン酸化、ならびに、ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２の両方との会合をもたらした［Ｃａｎｔｏｎｉ  Ｃ．他（１９９９）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２９：３１４８］。さらに、ＩＲｐ６０の架橋は、抗ＣＤ３ｍＡｂを使用するリディレクテド（ｒｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）殺傷アッセイにおけるＴ細胞クローンの細胞溶解活性を阻害した。重要なことに、ＩＲｐ６０のリガンドは未だ不明である。
【００１７】
Ｄ．二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）
近年では、抗体治療が非常に様々な疾患（例えば、ガン、マラリアおよび喘息など）のための新しい治療様式になってきている。それにもかかわらず、抗体の効力はさらなる改善を必要とすることが広く認められている。
【００１８】
二重特異性抗体は、２つの異なる結合特異性を有するタンパク質であり、これは、通常、異なる細胞における２つの異なる抗原を認識するように設計される。従って、１つの結合部位は標的細胞（すなわち、感染細胞またはガン細胞）上における抗原に対して特異的であり、その一方で、もう一方の結合部位が免疫エフェクター細胞上における抗原を特異的に認識する。従って、エフェクター細胞機構が標的細胞上において発揮され、これにより、適切な免疫応答がもたらされる［Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．他（２００３）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、９：１２９〜３４］。
【００１９】
第一世代の二重特異性抗体が、２つの確立されたハイブリドーマ細胞株を融合して、クアドローマを形成すること［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ、Ｃｕｅｌｌｏ  ＡＣ（１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ、３０５、５３７］によって、または、それぞれのＦ（ａｂ’）フラグメントを化学的に架橋すること［Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ  Ｂ．他（１９８４）、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．、１６０：１６８６］によって作製された。そのような二重特異性抗体を用いて行われたインビトロ研究、インビボ研究および臨床研究では、そのような処置の治療的可能性が確認された［ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ  Ｊ．Ｇ．他（１９９７）、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ、１８：５６２］。
【００２０】
二重特異性抗体を用いた新規な方法はこれまで、認識される２つの異なる抗原を同じ細胞に存在させなければならなかった。Ｄａｅｒｏｎ他［米国特許出願公開第２００４／００３８８９４号］は、阻害性ＫＩＲ、すなわち、キラー細胞細胞免疫グロブリン受容体（これは主としてＮＫ細胞において発現され、ＭＨＣクラスＩ分子に対する細胞表面受容体として機能する）、および、同時に、刺激性受容体（例えば、ＩＴＡＭ保有受容体、例えば、活性化しているＩｇ受容体、ＦｃεＲＩ、ＣＤ３／ＴＣＲなど）を認識する二重特異性抗体が、この刺激性受容体をＫＩＲと細胞外または細胞内で架橋する能力を有するという可能性を記載する。この架橋は、この場合、この刺激性受容体の活性化の調節をもたらし、その最終的な結果が免疫応答および炎症性応答の調節である。この予測は、ヒトＩｇＥおよびヒトＦｃγＲＩＩに対する二重特異性抗体の作製を記載したＴａｍ他によって実際に確認されている［Ｔａｍ，Ｓ．Ｗ．他（２００４）、Ａｌｌｅｒｇｙ、５９（７）：７７２］。この抗体は、ヒトのマスト細胞および好塩基球による抗原誘導されたヒスタミン放出を阻害することができた。
【００２１】
本発明者らは、マスト細胞および好酸球における阻害性受容体の発現、具体的には、これらの細胞における阻害性受容体ＩＲｐ６０の発現を特徴づけている（下記の実施例を参照のこと）。
【００２２】
本発明において、本発明者らは、その標的細胞特異的なモジュールのために細胞特異的な様式で、阻害性受容体ＩＲｐ６０と結合し、これを活性化することができる二重特異性抗体の作製を記載する。
【００２３】
本研究の具体的な焦点は、マスト細胞、好酸球および好塩基球のような、アレルギー性応答に関与する細胞を標的化することであり、従って、アレルギー関連疾患を治療するための新しいより効率的な細胞特異的薬剤を提供することである。
【００２４】
従って、阻害性受容体ＩＲｐ６０（ＢｓＡｂの第１の成分）と、マスト細胞、好酸球または好塩基球に対して特異的である１つの他のマーカー（ＢｓＡｂの第２の成分）とを認識し、これらを活性化するＢｓＡｂであって、このマーカーが、阻害性受容体（すなわち、ＢｓＡｂの第１の成分）の活性化によってそのシグナル伝達経路が阻害される活性化因子（または受容体）であるＢｓＡｂを提供することが本発明の１つの目的である。
【００２５】
本発明の他の使用および目的が、説明が進むに従い明らかになる。
【発明の開示】
【００２６】
第１の態様において、本発明は、２つの異なる標的認識成分を含む、標的細胞を標的化するための二重特異性複合体に関連し、この成分のそれぞれは、標的細胞上に位置する第１および第２の標的に特異的にそれぞれ結合する分子またはその任意の機能的フラグメントを含み、１つの標的が阻害性受容体ＩＲｐ６０またはその相同体であり、第２の標的が、阻害性受容体により媒介される阻害性経路を活性化する細胞特異的な活性化因子である。最も重要なことに、この複合体が標的細胞に結合することにより、アレルギー性反応が阻害される。
【００２７】
１つの実施形態において、この標的認識成分は、架橋剤、リンカー化合物、キャリア、合成スペーサー、固定化基質、および、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３モチーフに基づく柔軟な領域のいずれか１つを介して連結される。好ましくは、この標的認識成分は架橋される。
【００２８】
別の実施形態において、この細胞は造血系譜に由来し、好ましくは、マスト細胞、好酸球および好塩基球のいずれかである。
【００２９】
さらなる実施形態において、この二重特異性複合体の標的は、免疫グロブリン、Ｆｃ受容体、サイトカイン受容体、増殖因子受容体、接着分子、Ｉｇスーパーファミリー受容体、ケモカイン受容体、炎症性媒介因子受容体、ホルモン受容体、補体因子受容体、プロテアーゼにより活性化された受容体、および、酵素からなる群から選択されることができる。
【００３０】
二重特異性複合体の認識成分は、天然に存在する抗体、合成抗体または組換え抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二機能性ｓｃＦｖ、ジアボディー、Ｆ（ａｂ）ユニット、Ｆ（ａｂ’）ユニット、二重特異性Ｆ（ａｂ’）コンジュゲート、化学的に架橋された二機能性抗体、線状抗体、抗体のＦ（ａｂ’）２抗原結合性フラグメント、あるいはそれらの任意の機能性フラグメントのいずれか１つから選択することができる。好ましくは、認識成分は二重特異性Ｆ（ａｂ’）コンジュゲート（すなわち、一緒に連結されている２つのＦ（ａｂ’）ユニット）である。
【００３１】
１つの特定の実施形態において、二重特異性複合体の標的細胞はマスト細胞であり、第２の標的は、ＩｇＥ、ｃＫＩＴまたはＦｃεＲＩのいずれかである。
【００３２】
１つの具体的な実施形態において、本発明は、ＩＲｐ６０またはその任意の相同体およびＩｇＥを認識する二重特異性Ｆ（ａｂ’）コンジュゲートを含む、標的細胞を標的化するための二重特異性複合体を提供する。
【００３３】
この具体的な実施形態において、Ｆ（ａｂ’）ユニットは、２つの異なる抗体（ＩＲｐ６０に対する抗体およびＩｇＥに対する抗体）のＦ（ａｂ’）フラグメントに対応する。
【００３４】
別の具体的な実施形態において、本発明は、ＩＲｐ６０またはその任意の相同体およびｃＫＩＴを認識する二重特異性Ｆ（ａｂ’）コンジュゲートを含む、標的細胞を標的化するための二重特異性複合体を提供する。
【００３５】
さらなる具体的な実施形態において、本発明は、ＩＲｐ６０またはその任意の相同体およびＦｃεＲＩを認識する二重特異性Ｆ（ａｂ’）コンジュゲートを含む、標的細胞を標的化するための二重特異性複合体を提供する。
【００３６】
上記の二重特異性複合体のいずれか１つはマスト細胞活性の阻害剤として機能することができる。
【００３７】
別の特定の実施形態において、標的細胞は好酸球であり、第２の標的は、ＩＬ−５受容体（ＩＬ−５Ｒ）、および、エオタキシンに対する受容体（ＣＣＲ３）のいずれかである。従って、本発明の二重特異性複合体は、ＩＲｐ６０またはその任意の相同体およびＩＬ−５ＲまたはＣＣＲ３を認識する二重特異性Ｆ（ａｂ’）コンジュゲートを含む複合体であり得る。この複合体は好酸球活性の阻害剤として機能することができる。
【００３８】
本発明において記載される二重特異性複合体はアレルギーエフェクター細胞活性の阻害剤として機能することができ、アレルギー性反応、ならびに、マスト細胞および／または好酸球および／または好塩基球により媒介される反応のいずれかによって誘導される状態を治療するために特に好適である。この状態は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、季節性アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎およびアトピー性湿疹、様々なアレルゲンに対するアレルギー性の障害および応答、全身性アナフィラキシー、全身性肥満細胞過剰増殖、限局性強皮症／色素性じんま疹、マスト細胞白血病、アテローム性動脈硬化、移植片拒絶、多発性硬化症、線維形成性肺疾患、神経線維腫症、ケロイド、強皮症、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、急性痛風、眼の瘢痕性類天疱瘡、クローン病、腹膜癒着、慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）、好酸球増多筋痛症候群、外因性気管支喘息、鼻ポリープ症、ヴェーゲナー肉芽腫症、内因性気管支喘息、間質性肺疾患および他の肺疾患、慢性好酸球性肺炎、過敏性肺臓炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、類肉腫症、特発性肺線維症、新生物疾患および骨髄増殖性疾患、Ｔ細胞リンパ腫およびホジキン病からなる群から選択される。
【００３９】
第２の認識標的がＩｇＥまたはｃＫＩＴまたはＦｃεＲＩである二重特異性複合体は、マスト細胞に関連した状態の治療における薬剤としての使用に特に好適であり、この場合、この状態は特に、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、季節性アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎およびアトピー性湿疹、様々なアレルゲンに対するアレルギー性の障害および応答、全身性アナフィラキシー、全身性肥満細胞過剰増殖、限局性強皮症／色素性じんま疹、マスト細胞白血病、アテローム性動脈硬化、移植片拒絶、多発性硬化症、線維形成性肺疾患、神経線維腫症、ケロイド、強皮症、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、急性痛風、眼の瘢痕性類天疱瘡、クローン病、腹膜癒着、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。
【００４０】
第２の認識標的がＩＬ−５ＲまたはＣＣＲ３である二重特異性複合体は、好酸球に関連した状態の治療における薬剤としての使用に特に好適であり、この場合、この状態は特に、外因性気管支喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、オンコセルカ皮膚炎、アトピー性皮膚炎、鼻ポリープ症、小結節、好酸球増加症、リウマチ、皮膚炎および腫れ（ＮＥＲＤＳ）、脈管炎性肉芽腫性疾患、一時的脈管炎、チャーグ・ストラウス症候群、多関節炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性硬化症、移植片拒絶、内因性気管支喘息、間質性肺疾患および他の肺疾患、好酸球性胸膜滲出、一過性肺好酸球浸潤物（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ）、組織球症、慢性好酸球性肺炎、過敏性肺臓炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、類肉腫症、特発性肺線維症、局所的好酸球増加症、ネコひっかき病、無熱性結核、幼児期におけるクラミジア肺炎、新生物疾患および骨髄増殖性疾患、気管支原性ガン、好酸球増加症候群、Ｔ細胞リンパ腫およびホジキン病、クローン病、春季角結膜炎、若年性炎症結膜炎母斑、木村病、グレイヒ病である。
【００４１】
別の態様において、本発明は、本明細書中に記載されるような二重特異性複合体を活性な薬剤として含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は医療のために使用することができる。
【００４２】
１つの実施形態において、この医薬組成物は、第２の認識標的がＩｇＥまたはｃＫＩＴまたはＦｃεＲＩのいずれかであり、かつ、マスト細胞の過活性または過形成に由来する任意の疾患または状態の治療における使用のために特に好適である二重特異性複合体を活性な薬剤として含む。この疾患は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎およびアトピー性湿疹、様々なアレルゲンに対するアレルギー性の障害および応答、全身性アナフィラキシー、全身性肥満細胞過剰増殖、限局性強皮症／色素性じんま疹、マスト細胞白血病、アテローム性動脈硬化、移植片拒絶、多発性硬化症、線維形成性肺疾患、神経線維腫症、ケロイド、強皮症、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、急性痛風、眼の瘢痕性類天疱瘡、クローン病、腹膜癒着、慢性ＧＶＨＤ、気管支喘息、鼻ポリープ症、ヴェーゲナー肉芽腫症、間質性肺疾患および他の肺疾患、慢性好酸球性肺炎、過敏性肺臓炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、類肉腫症、特発性肺線維症、新生物疾患および骨髄増殖性疾患、Ｔ細胞リンパ腫およびホジキン病からなる群から選択される。
【００４３】
別の実施形態において、この医薬組成物は、第２の認識標的がＩＬ−５ＲまたはＣＣＲ３であり、かつ、好酸球の過活性または過形成に由来する任意の疾患または状態の治療における使用のために特に好適である二重特異性複合体を活性な薬剤として含む。この状態は、外因性気管支喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、オンコセルカ皮膚炎、アトピー性皮膚炎、鼻ポリープ症、小結節、好酸球増加症、リウマチ、皮膚炎および腫れ（ＮＥＲＤＳ）、脈管炎性肉芽腫性疾患、一時的脈管炎、チャーグ・ストラウス症候群、多関節炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性硬化症、移植片拒絶、気管支喘息、間質性肺疾患および他の肺疾患、好酸球性胸膜滲出、一過性肺好酸球浸潤物（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ）、組織球症、慢性好酸球性肺炎、過敏性肺臓炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、類肉腫症、特発性肺線維症、局所的好酸球増加症、ネコひっかき病、無熱性結核、幼児期におけるクラミジア肺炎、新生物疾患および骨髄増殖性疾患、気管支原性ガン、好酸球増加症候群、Ｔ細胞リンパ腫およびホジキン病、クローン病、春季角結膜炎母斑、木村病、グレイヒ病からなる群から選択される。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、緩衝剤、添加剤、安定化剤、希釈剤および／または賦形剤をさらに含むことができ、本発明の医薬組成物はまた医薬配合物と呼ぶことができる。
【００４５】
さらなる態様において、本発明は、マスト細胞および／または好酸球の過活性または過形成に関連した任意の疾患または状態を治療するための医薬組成物の調製における本発明において記載される二重特異性複合体の使用に関係し、この場合、この疾患は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎およびアトピー性湿疹、様々なアレルゲンに対するアレルギー性の障害および応答、全身性アナフィラキシー、全身性肥満細胞過剰増殖、限局性強皮症／色素性じんま疹、マスト細胞白血病、アテローム性動脈硬化、移植片拒絶、多発性硬化症、線維形成性肺疾患、神経線維腫症、ケロイド、強皮症、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、急性痛風、眼の瘢痕性類天疱瘡、クローン病、腹膜癒着、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、好酸球増多筋痛症候群、気管支喘息、鼻ポリープ症、ヴェーゲナー肉芽腫症、間質性肺疾患および他の肺疾患、慢性好酸球性肺炎、過敏性肺臓炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、類肉腫症、特発性肺線維症、新生物疾患および骨髄増殖性疾患、Ｔ細胞リンパ腫およびホジキン病からなる群から選択される。
【００４６】
本発明のこの態様の１つの特定の実施形態は、第２の認識標的がＩｇＥまたはｃＫＩＴまたはＦｃεＲＩである二重特異性複合体、あるいは、そのような二重特異性複合体を含む医薬組成物の、マスト細胞の機能を阻害することにおける使用である。
【００４７】
本発明のこの態様の別の特定の実施形態は、第２の認識標的がＩＬ−５ＲまたはＣＣＲ３である二重特異性複合体の、あるいは、そのような二重特異性複合体を含む医薬組成物の、好酸球の機能を阻害することにおける使用である。
【００４８】
本発明のさらにさらなる態様において、本発明は、マスト細胞の過活性および過形成に関連した任意の疾患または状態を治療する方法を提供し、この場合、この方法は、第２の認識標的がＩｇＥまたはｃＫＩＴまたはＦｃεＲＩである本発明の二重特異性複合体の治療効果的な量、または、そのような二重特異性複合体を含む医薬組成物の治療効果的な量を、それを必要としている対象に投与することを含む。
【００４９】
別のさらなる態様において、本発明は、好酸球の過活性および過形成に由来する任意の疾患または状態を治療する方法を提供し、この場合、この方法は、第２の認識標的がＩＬ−５ＲまたはＣＣＲ３である本発明の二重特異性複合体の治療効果的な量、または、そのような二重特異性複合体を含む医薬組成物の治療効果的な量を、それを必要としている対象に投与することを含む。
【００５０】
加えて、本発明は、マスト細胞の活性を阻害する方法を提供し、この場合、この方法は、マスト細胞を、第２の認識標的がＩｇＥまたはｃＫＩＴまたはＦｃεＲＩである本発明の二重特異性複合体、または、そのような二重特異性複合体を含む医薬組成物と、好適な量の時間、接触させることを含む。
【００５１】
あるいは、好酸球の活性を阻害する方法が提供され、この場合、この方法は、好酸球を、第２の認識標的がＩＬ−５ＲまたはＣＣＲ３である本発明の二重特異性複合体、または、そのような二重特異性複合体を含む医薬組成物と、好適な量の時間、接触させることを含む。
【００５２】
本発明は、下記の図面を参照して、より詳細に記載される。
図面の簡略説明
図１は阻害性ＮＫ受容体についてのヒトマスト細胞のスクリーニングを示す。ＮＫ細胞に対する阻害性機能が知られている受容体の大きな集団のＦＡＣＳ分析により、ヒトマスト細胞がＩＲｐ６０を高レベルで発現することが明らかにされた。この発現は、他の阻害性受容体が発現していなかった［ｎ＝４］ので特異である。
図２はＩＲｐ６０がマスト細胞および好酸球において発現することを示す。
図２Ａ：ヒトマスト細胞はＩＲｐ６０を発現する。ＣＢＭＣおよびＨＬＭＣにおけるＩＲｐ６０発現のＦＡＣＳ分析。ＩＲｐ６０が、モノクローナル抗ＩＲｐ６０抗体を使用し、その後、抗マウスＦＩＴＣを使用して、ＣＢＭＣ［左側］およびＨＬＭＣ［右側］において検出された。黒色ピークは陰性のイソ型コントロールを表す。白色ピークは抗ＩＲｐ６０染色を表す。ｎ＝１０［ＣＢＭＣ］およびｎ＝３［ＨＬＭＣ］を表す。
図２Ｂ：ＩＲｐ６０の発現が好酸球の主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）によって調節される。ＣＢＭＣを好酸球由来ＭＢＰ［左側］またはポリ−Ｌ−アルギニン［右側］と２４時間インキュベーションし、ＩＲｐ６０の発現をＦＡＣＳによって分析した。黒色ピーク［ｉｓｏ］は、ＩｇＧを使用する陰性のイソ型コントロールを表す。灰色ピーク［ＥＭ］は、富化培地単独により処理されたＣＢＭＣの抗ＩＲｐ６０染色を表す。白色ピークはＭＢＰ処理ＣＢＭＣ［左側］またはポリ−Ｌ−アルギニン処理ＣＢＭＣ［右側］の抗ＩＲｐ６０染色を表す。
図３はＩＲｐ６０の架橋はＩｇＥ媒介による放出を阻害することを示す。
図３Ａ：抗ＩＲｐ６０による刺激の後におけるＩｇＥ活性化ＣＢＭＣからのβ−ヘキソサミニダーゼおよびトリプターゼのパーセント放出。
図３Ｂ：抗ＩＲｐ６０による刺激の後におけるＩｇＥ活性化ＣＢＭＣからのＩＬ−４のパーセント放出。
ＣＢＭＣを抗ＩＲｐ６０被覆プレートでインキュベーションし、抗ＩｇＥ抗体により３０分間活性化した。β−ヘキソサミニダーゼおよびトリプターゼの放出レベルを、記載されるような酵素発色法アッセイによって評価し、％放出として表した。ＩＬ−４の放出レベルをＥＬＩＳＡによって評価し、ｐｇ／ｍＬで表した。β−ヘキソサミニダーゼの放出を記載されるように評価した。ＥＭ、富化培地単独；Ｘ、架橋剤［ヒツジ抗マウス、ヤギ抗マウスＩｇＥ］；抗ＩＲｐ６０、抗ＩＲｐ６０により被覆されたプレート；ＩｇＧ、イソ型により被覆されたプレート。
図４はＩＲｐ６０の架橋はＳＣＦ誘導によるＣＢＭＣの生存を阻害することを示す。ＣＢＭＣを、ＳＣＦ［１００ｎｇ／ｍＬ］とともに、または、ＳＣＦを伴うことなく、抗ＩＲｐ６０被覆プレートで２４時間および４８時間インキュベーションし、ヨウ化プロピジウム［ＰＩ］について染色し、ＰＩについて陽性の細胞をＦＡＣＳによって分析した。データは全細胞のＰＩ陽性細胞の％として示される。ＥＭ、富化培地単独；Ｘ、架橋剤［ヒツジ抗マウス、ヤギ抗マウスＩｇＥ］；ＩＲｐ６０、抗ＩＲｐ６０により被覆されたウェル；Ｉｓｏ、イソ型により被覆されたウェル。
図５はＩＲｐ６０の架橋はＩｇＥ誘導による［Ｃａ２＋］流入を阻害することを示す。ＣＢＭＣ上のＩＲｐ６０を抗ＩＲｐ６０抗体およびヒツジ抗マウス抗体とのインキュベーションによって架橋し、細胞にカルシウムＧｒｅｅｎ−１ＡＭを負荷した。［Ｃａ２＋］がＦＬ−１の幾何平均によって表される。ＥＭ、富化培地単独；Ｘ、架橋剤［ヒツジ抗マウス、ヤギ抗マウスＩｇＥ］；ＩＲｐ６０、抗ＩＲｐ６０；Ｉｓｏ、イソ型。
図６はＩＲｐ６０チロシンリン酸化およびホスファターゼ動員を示す。
図６Ａ：ＣＢＭＣをオルトバナジン酸ナトリウムで処理した。ＩＲｐ６０を、抗ＩＲｐ６０またはＩｇＧ１［陰性コントロール］を使用して沈殿させ、ホスホチロシン［ｐＹ９９］、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２およびＳＨＩＰ−１に対してブロットした。
図６Ｂ：ＩＲｐ６０チロシンリン酸化は受容体架橋に依存的である。ＣＢＭＣを、抗ＩＲｐ６０／ＩｇＧ１被覆プレートにおいて０秒間、１５秒間、３０秒間、６０秒間および１２０秒間、または、ＩｇＧ被覆ウェルにおいて３０秒間および６０秒間インキュベーションし、その後、沈殿させ、ウェスタンブロットをホスホチロシン［ｐＹ９９］に対して、または、タンパク質量のためのコントロールとしてのＩＲｐ６０に対して行った。
図７はマウスマスト細胞はＬＭＩＲ１を発現することを示す。ＢＡＬＢ／マウス由来の骨髄マスト細胞および新しく単離された腹膜マスト細胞をモノクローナル抗体により染色し、ＦＡＣＳによって分析した。ＢＭＭＣ、骨髄マスト細胞；ＭＰＭＣ、腹膜マスト細胞。
図８はＬＭＩＲ１の中和はアレルギー性腹膜炎のマウスモデルにおける強化されたマスト細胞活性化およびその後の好酸球浸潤をもたらすことを示す。ＯＶＡ誘導によるアレルギー性腹膜炎を記載されたように誘導し、ＯＶＡによる抗原攻撃後４５分または４８時間で屠殺し、腹膜腔を媒介因子分析および細胞計数ならびにフローサイトメトリーのためにそれぞれ洗浄した。トリプターゼおよびβ−ヘキソサミニダーゼのレベルを、記載されるような酵素発色アッセイを使用して評価した。抗原攻撃後４８時間で集められた洗浄液からの細胞をＣＣＲ３について染色し、ＦＡＣＳにより分析した。
図８Ａ：ＬＭＩＲ１の中和は抗原攻撃後４５分において腹膜トリプターゼレベルにおける劇的な増大をもたらした。
図８Ｂ：ＬＭＩＲ１の中和は抗原攻撃後４５分において腹膜β−ヘキソサミニダーゼレベルにおける劇的な増大をもたらした。
図８Ｃ：増大した数の好酸球が、ＬＭＩＲ１中和後（抗原攻撃後２４時間）、腹膜腔に浸潤した。
図８Ｄ：ＬＭＩＲ１の中和は抗原攻撃後２４時間において腹膜エオタキシン−２レベルにおける劇的な増大をもたらした。
図９はＩＲｐ６０がヒト好酸球において発現することを示す。
図９Ａ：ヒトマスト細胞上における阻害性受容体の発現パターン。ＩＲｐ６０、ｐ１４０、ＬＩＲ３／ＩＬＴ５、ＦｃγＲＩＩＢ、ＬＩＲ１／ＩＬＴ２、ＬＩＲ３／ＩＬＴ５、ｐ５８．１、ｐ５８．２、ｐ７０およびＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４の、ＣＢＭＣにおける発現を示すＦＡＣＳ分析（ｎ＝１０）。
図９Ｂ：鼻ポリープの好酸球は著しいレベルのＩＲｐ６０を発現する。左側のピークは、イソ型コントロールと一致した抗体に対応し、一方、右側のピークはＩＲｐ６０についての染色を示す。
図１０はＩＲｐ６０はヒト好酸球のｇＭ−ＣＳＦ媒介による生存を阻害することを示す。グラフは、抗ＩＲｐ６０またはイソ型一致コントロールおよびヒツジ抗マウスによる架橋、ならびに、様々な時点での示された濃度のＧＭ−ＣＳＦによる処置の後におけるアポトーシス好酸球の割合を示す。
図１０Ａ：ＧＭ−ＣＳＦとの１８時間のインキュベーションの後。
図１０Ｂ：ＧＭ−ＣＳＦとの３６時間のインキュベーションの後。
図１１はＩＲｐ６０はヒト好酸球のＧＭ−ＣＳＦ媒介による活性化を阻害することを示す。
図１１Ａ：ＩＲｐ６０を架橋したときに著しく阻害された、ＩＬ−１β、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γのＧＭ−ＣＳＦ媒介による放出を示すヒストグラム。
図１１Ｂ：ＩＲｐ６０を架橋したときに完全に阻止された、ＩＬ−８のＧＭ−ＣＳＦ媒介による放出を示すヒストグラム。
図１２はＩＲｐ６０はヒト好酸球のエオタキシン依存的走化性を阻害することを示す。
図１２Ａ：グラフは、エオタキシンの異なる濃度に向かって移動した、抗ＩＲｐ６０、抗ＣＣＲ３、イソ型（Ｉｓｏ）または富化培地単独（ＥＭ）による処理の後における好酸球の数を示す。
図１２Ｂ：ヒストグラムは、抗ＩＲｐ６０、抗ＣＣＲ３、イソ型（Ｉｓｏ）または富化培地単独（ＥＭ）とのインキュベーションの後、ＦＡＣＳによって測定された、好酸球におけるエオタキシン誘導による形状変化を示す。
図１３は二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの作製および特徴づけを示す。
図１３Ａ：起こり得る物質損失をモニターするために、二重特異性Ｆ（ａｂ’）の合成における各段階から得られたサンプルを非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した［Ｆａｂ’作製：ｋＤａ、サイズマーカー；ＩｇＧ、出発抗体；ｉｎｔ、３回のゲルろ過からのサンプル；Ｆａｂ’、カップリングのための準備ができた得られたＦａｂ’フラグメント］。カップリング後、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、ＢｓＡｂ複合化を確認した［ＢｓＡｂ：ｋＤａ、サイズマーカー；ＢｓＡｂ、二重特異性抗体；ＩｇＧ、完全な抗体のコントロール］。ＢｓＡｂの重鎖は約３７ｋＤａにおいて明らかに三量体化している。
図１３Ｂ：ＦＡＣＳによるＢｓＡｂ二重特異性の評価。抗ヒトＩｇＥ、抗ヒトＩＲｐ６０またはＩＥ１を使用して、新しい非感作ヒトマスト細胞［ＣＢＭＣ］、および、ヒトＩｇＥにより感作されたＲＢＬ細胞［ＩｇＥ−ＲＢＬ］の両方を染色し、その後、抗マウスＦＩＴＣにより染色した。染色がＦＬ−１チャネルでの平均蛍光強度［ＭＦＩ］として表された。
図１４はＩＥ１はインビトロでＩｇＥ誘導によるマスト細胞脱顆粒化を阻害することを示す。ＩｇＥ感作のヒトマスト細胞を、抗ＩｇＥ媒介による活性化の前に、５μｇ／ｍＬのＩＥ１またはイソ型コントロールと３０分間インキュベーションした。β−ヘキソサミニダーゼの放出を、発色酵素アッセイを使用して測定した［ＥＭ、富化培地により処理された細胞；Ｘ、抗ＩｇＥ処理；ｉｓｏ、一致するイソ型コントロール］。
図１５はＬＥ１はアレルギー性腹膜炎のマウスモデルにおいてトリプターゼ放出を阻害することを示す。
図１５Ａ：オバルブミン感作マウスに３μｇのＬＥ１またはイソ型コントロールを注射し、続いて、３０分後にオバルブミンにより抗原攻撃した。４５分後、マウスを屠殺し、トリプターゼを、発色酵素アッセイを使用して腹膜洗浄液において測定した［Ｓａｌ．、生理的食塩水攻撃のマウス；ＯＶＡ、オバルブミン攻撃のマウス；ＬＥ１、ＬＥ１による前処理、その後、オバルブミン攻撃；Ｉｓｏ、イソ型による前処理、その後、オバルブミン攻撃］。
図１５Ｂ：ＬＥ１はアレルギー性腹膜炎のマウスモデルにおいてエオタキシン−２放出を阻害する。オバルブミン感作マウスに３μｇのＬＥ１またはイソ型コントロールを注射し、続いて、３０分後にオバルブミンにより抗原攻撃した。２４時間後、マウスを屠殺し、エオタキシン−２をＥＬＩＳＡによって腹膜洗浄液において測定した［Ｓａｌ．、生理的食塩水抗原のマウス；ＯＶＡ、オバルブミン攻撃のマウス；ＬＥ１、ＬＥ１による前処理、その後、オバルブミン攻撃；Ｉｓｏ、イソ型による前処理、その後、オバルブミン攻撃］。
図１６はＬＥ１はアレルギー性腹膜炎のマウスモデルにおいて好酸球の動員を阻害することを示す。オバルブミン感作マウスに３μｇのＬＥ１またはイソ型コントロールを注射し、続いて、３０分後にオバルブミンにより抗原攻撃した。４８時間後、マウスを屠殺し、腹膜洗浄液中の細胞を２ｘ１０５個の細胞に正規化し、好酸球集団をより良好に明らかにするためにＣＣＲ３−ＦＩＴＣおよびＣＤ４８−ＰＥについて染色した。
図１６Ａ：ＦＡＣＳ分析を、腹膜腔における好酸球の割合を定量するために行った。
図１６Ｂ：ＦＡＣＳ分析で得られた結果を表すヒストグラム［Ｓａｌｉｎｅ、生理的食塩水攻撃のマウス；ＯＶＡ、オバルブミン攻撃のマウス；ＬＥ１、ＬＥ１による前処理、その後、オバルブミン攻撃；Ｉｓｏ、イソ型による前処理、その後、オバルブミン攻撃］。
図１７はＬＥ１は受動的皮膚アナフィラキシーのマウスモデルにおいてマスト細胞の脱顆粒化を阻害することを示す。マウスを、ＬＥ１またはイソ型コントロールによる前処理と同時にＩｇＥ抗ＤＮＰにより感作した。２時間後、マウスをエバンスブルー溶液と一緒に静脈内ＤＮＰボーラスによって抗原攻撃した。皮膚のアナフィラキシーを青色色素のスポットサイズによって目視評価した［Ｓａｌｉｎｅ＋ＤＮＡ、ＩｇＥなし；ＩｇＥ＋ＤＮＰ、ＩｇＥのみ；ＩｇＥ＋ＬＥ１＋ＤＮＰ、ＬＥ１前処理部位；ＩｇＥ＋ｉｓｏｔｙｐｅ＋ＤＮＰ、イソ型前処理部位］。
図１７Ａ：青色色素スポットアッセイを示す皮膚の区域。
図１７Ｂ：異なる試料を用いた図１７Ａと同じ図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
下記の略号が本明細書全体を通して使用される：
・ＢｓＡｂ：二重特異性抗体
・ＣＢＭＣ：ヒト臍帯血マスト細胞
・ＥＣＰ：好酸球カチオン性タンパク質
・ＦＣＳ：ウシ胎児血清
・ＨＬＭＣ：ヒト肺マスト細胞
・ＩＥ１：ＩＲｐ６０およびＩｇＥを認識する二重特異性抗体
・ＩＴＡＭ：免疫受容体のチロシン型活性化モチーフ
・ＩＴＩＭ：免疫受容体のチロシン型阻害性モチーフ
・ＬＥ１：ＬＭＩＲ−１およびＩｇＥを認識する二重特異性抗体
・ｍＡｂ：モノクローナル抗体
・ＭＡＰＫ：マイトジェン活性化プロテインキナーゼ
・ＭＢＰ：好酸球由来主の要塩基性タンパク質
・ＮＧＦ：神経増殖因子
・ＳＣＦ：幹細胞因子
・ＳＨ２：Ｓｒｃ相同性２
・Ｓｉｇｌｅｃ：シアル酸結合性Ｉｇ様レクチン
【００５４】
アレルギー、特に、喘息は、主要な増大しつつある健康問題となっている一方で、有効かつ選択的な、副作用のない治療はそれらについて未だない。
【００５５】
本発明者らは、副作用が事実上なく、かつ、下記の実施例において明らかにされるようにアレルギー性反応を特異的に阻害することにおいて効果的である、アレルギーおよび喘息を治療するための新規な方法を提供する。
【００５６】
本発明は、マスト細胞および好酸球を選択的に標的化および阻害する二重特異性複合体を提供する。アレルギー性応答に関与する２つの重要な細胞、すなわち、マスト細胞および好酸球を標的化することによって、本発明の二重特異性複合体は、既知または未知であっても、どのアレルゲンに対しても有用であり、また、任意のアレルギー性状態（例えば、喘息、アトピー性湿疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎）に対しても有用である。
【００５７】
従って、本発明の二重特異性複合体は２つの異なる標的認識成分を含む。この成分は、好ましくは、任意の好適な手段を介して連結される抗体またはその誘導体（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、抗原結合性フラグメントなど）である。１つの特定の例において、実験手順（「二重特異性抗体の作製」）で記載されるように、認識成分は、記載されるように、架橋剤の５’，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＮＴＢ）を使用して化学的に架橋される［Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆ．およびＧｕｐｔｉｌｌ，Ｐ．（２００４）、二重特異性抗体の化学的作製、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｌｏｇｙ、第２８３巻、Ｃ．Ｍ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ］。
【００５８】
最も重要なことは、両方の認識成分の標的が同じ細胞において突き止められる。一方の標的が阻害性受容体ＩＲｐ６０またはその任意の相同体（例えば、ＬＭＩＲ１、マウスの相同体［Ｋｕｍａｇａｉ，Ｈ．他（２００３）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３０７：７１９〜７２９］）である。認識成分が阻害性受容体に結合することにより、標的細胞の活性の阻害をもたらす阻害性経路の引き金が引かれる。複合体の特異性が、第２の認識成分の標的（これは常に細胞特異的標的である）によって提供される。選ばれた１つの標的が、例えば、ＩｇＥ（これはマスト細胞において特異的に発現する）である。マスト細胞特異的である他の好ましい標的がｃＫＩＴおよびＦｃεＲＩである。同様に、好酸球に向けられる複合体は、例えば、ＩＬ−５ＲまたはＣＣＲ３を標的とする第２の認識成分を有する。ＩｇＥの場合、この免疫グロブリンは通常、その受容体ＦｃεＲＩに結合し、従って、抗ＩｇＥ抗体がその標的に結合することにより、その受容体の活性化がもたらされる。
【００５９】
従って、本発明の二重特異性複合体は、好ましくは、ＩＲｐ６０と、マスト細胞および好酸球ならびに好塩基球に対して特異的である第２の標的とを標的とする二重特異性の抗体である。
【００６０】
そのような二重特異性抗体を得るために、本発明者らは、最初に、ＩＲｐ６０の発現およびその作用機構を調べた（実施例１〜実施例１１を参照のこと）。
【００６１】
ＩＲｐ６０は、最初、ＮＫ細胞において機能的および分子的に特徴づけられた［Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｃ．他（１９９９）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２９（１０）：３１４８〜５９］。この場合、特異的な抗体によるＩＲｐ６０の架橋はＮＫ細胞の細胞毒性および細胞溶解活性を強く阻害したこともまた示された。本発明者らは、マスト細胞におけるＩＲｐ６０の架橋がＣａ２＋の流入および媒介因子の放出を阻害することを示している。同様に、好酸球におけるＩＲｐ６０の架橋により、この阻害性受容体が、好酸球の活性化、生存および走化性を調節することが明らかにされた。（ｉ）ＩＲｐ６０がアレルギーのエフェクター細胞上において発現し、かつ機能的であり、かつ、（ｉｉ）ＩＲｐ６０が、アレルギー応答をインビボで調節することに関与するという事実は全く予想外であったことに留意することは、特に、この阻害性受容体がリンパ球／ＮＫ集団に特有であるとして最初に記載されたので、重要である。さらに、本明細書中に記載される結果は、ＩＲｐ６０が、ＦｃγＲＩＩＢとは対照的に、非常に強力な阻害性受容体であることを示している。この性質は、おそらくは、ＩＲｐ６０が４つのＩＴＩＭを有し、一方、ＦｃγＲＩＩＢは１つだけしか有しないという事実によって説明される。加えて、ＩＲｐ６０は、ヒトの原始的なマスト細胞および好酸球に対して機能的である唯一のＩｇスーパーファミリー阻害性受容体である。その上、本明細書中に記載されるインビボ実験では、アレルギー性炎症時におけるこの阻害性受容体の関連性が明らかにされる。
【００６２】
図１に示されるように、ＩＲｐ６０が肺組織のマスト細胞で発現しており、このことは、ＩＲｐ６０が健康および疾患においてマスト細胞の調節における機能的重要性を有し得ることを示している。ＩＲｐ６０はまた、ＮＫ細胞［Ｃａｎｔｏｎｉ（１９９９）、同上同頁；データは示されず］、Ｔ細胞、単球、顆粒球および好塩基球［データは示されず］でも発現する。従って、ＩＲｐ６０は様々な細胞タイプの強力な調節因子であるかもしれない。マスト細胞上におけるＩＲｐ６０の発現は、炎症性環境におけるこれらの細胞の応答がこの受容体によって調節され得ることを示唆する。実際、本発明者らは、マスト細胞上におけるＩＲｐ６０の発現が、様々なサイトカインまたは媒介因子［例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＮＧＦおよび単量体ＩｇＥ］とのその培養の後で変化していないことを見出した。図２は、驚くべきことに、ＩＲｐ６０が亜活性化濃度で好酸球由来のＭＢＰによってダウンレギュレーションされたことを示している。さらに、ＭＢＰは、ＦｃγＲＩＩＢを含むいくつかの受容体のダウンレギュレーションを誘導するが、ＩｇＥにより感作されたヒトマスト細胞ではｃ−ｋｉｔまたはＦｃεＲＩのダウンレギュレーションを誘導しなかった［データは示されず］。この発見は、マスト細胞および好酸球が相互作用する慢性的なアレルギー性炎症の状況では極めて重要である。実際、本発明者らおよび他の研究者らは、ＭＢＰがマスト細胞の活性化を調節し得ることを示している［Ｐｉｌｉｐｏｎｓｋｙ（２００３）、同上同頁］。ＭＢＰは、繊維芽細胞と同時培養されたＣＢＭＣを活性化することが示されているが、繊維芽細胞が存在しない懸濁状態ではＣＢＭＣを著しく活性化しない。ＭＢＰは、阻害性受容体の発現を操作することによってマスト細胞活性化の閾値を調節していることが仮定され得る。以前に述べられたように、マスト細胞の活性化は、ＦｃεＲＩおよびｃ−ｋｉｔなどの受容体により媒介される活性化シグナルと、ＦｃγＲＩＩＢおよびＩＲｐ６０などの受容体によって媒介される阻害性シグナルとの間での微妙なバランスで保たれている可能性が非常に高い。阻害性シグナルを低下させることによって、ＭＢＰはこのバランスをマスト細胞の活性化に向かって変化させるかもしれない。
【００６３】
マスト細胞は、主としてＩｇＥを介してアレルギーにおいて活性化されることが知られているが、マスト細胞はまた、ＩｇＥに依存しない活性化のときに脱顆粒化することができる。従って、ＩＲｐ６０の影響を両方の様式で調べた。ＩＲｐ６０の架橋は、ＩｇＥにより活性化されたＣＢＭＣからのβ−ヘキソサミニダーゼ、トリプターゼおよびＩＬ−４の放出を阻害するが、化合物４８／８０により媒介されるＣＢＭＣの活性を阻害しない。このことは、ＩＲｐ６０が、チロシンリン酸化を伴う経路を妨害するが、ＧＴＰ依存性のＧタンパク質経路はおそらくは妨害しないことを示している。加えて、ＦｃεＲＩ媒介によるカルシウム可動化、脱顆粒化、ならびに、エイコサノイドおよびサイトカインの合成が、早い段階でのチロシンキナーゼ活性化事象（特に、Ｓｙｋの活性化）に依存することが明らかである［Ｓｉｍｏｎ  Ｍ他（２００５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０：４５１０〜７］。これに一致して、ＩＲｐ６０の架橋はＩｇＥ媒介のカルシウム流入を完全に阻止することができた。加えて、ＩＲｐ６０の架橋はＣＢＭＣのＳＣＦ媒介による生存を阻害する。このデータは、いくつかの報告が、マスト細胞に対するＳＣＦ媒介作用を阻止する阻害性受容体の能力を明らかにしているので、驚くほどのことではない。例えば、ＦｃγＲＩＩＢは、ＳＣＦ媒介による生存を阻止することが示された［Ｍａｌｂｅｃ  Ｏ他（２００２）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３８：１２９５〜９］。そのうえ、ｇｐ４９Ｂ１は、ＳＣＦを介してマスト細胞の活性化を低下させることが報告された［Ｆｅｌｄｗｅｇ  Ａ．Ｍ．他（２００３）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３３：２２６２〜８］。まとめると、これらのデータは、ＩＲｐ６０による阻害を受けやすい他のマスト細胞機能の予測を可能にする。しかし、さらなる機能（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体によるパターン認識）および他の免疫機能などに対するその作用は未だ調べられていない。
【００６４】
最も重要なことは、ＩＲｐ６０の観測された作用機構が、いくつかの重要な態様では、ヒトマスト細胞におけるＦｃγＲＩＩＢの作用機構と著しく異なるので、今回の結果は予想外であった。ＦｃγＲＩＩＢは１つだけのＩＴＩＭ配列を含有し、これに対して、ＩＲｐ６０は４つのＩＴＩＭを含有し、そのうちの３つが正統的であり（Ｉ／Ｓ／Ｌ／Ｖ−ｘ−Ｙ−ｘ−ｘ−Ｌ／Ｖのコンセンサスに従う）であり、その一方で、４番目は正統的でない［Ｃａｎｔｏｎｉ（１９９９）、同上同頁］。その後のホスファターゼ動員のための結合部位としてのこのＩＴＩＭの実際の役割は依然として不明である。だが、この部位はチロシンリン酸化を受けることができる［データは示されず］。別の違いは、ＩＲｐ６０はＳＨＰ−１およびＳＨＩＰ−１のみを動員するだけで、ＳＨＰ−２を動員しないことが示されていることである。この観測結果は、ＩｇＳＦ１３（ＩＲｐ６０の近縁ファミリーのメンバー）が同じホスファターゼ配置パターンに従っているという最近報告されたデータ［Ｓｕｉ  Ｌ．他（２００４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３１９：９２０〜８］を裏付けている。様々な阻害性受容体による差のあるホスファターゼ動員の可能性が存在するが、この結果の意味は依然として調べる必要がある。
【００６５】
従って、本発明において記載される二重特異性抗体、または、そのような二重特異性抗体を含む組成物は、マスト細胞および好酸球、すなわち、アレルギーの２つの重要なエフェクター細胞に対する阻害性機構（経路）を選択的に活性化するために設計され、従って、これらの標的細胞のみにおいて阻害性経路を選択的に開始させる。この阻害は、下記で詳しく記載されるように、それらの機能または活性の阻害によって行われる。
【００６６】
マスト細胞または好酸球の活性（または機能）として、下記のプロセスのいずれか１つが理解される：成熟化、生存、脱顆粒化、プライミング（細胞を作用のために調製し、細胞を待機状態に変化させること）、走化性、接着、増殖、ならびに、サイトカイン、増殖因子、アラキドン酸代謝物、ケモカインおよびリン脂質代謝物などの合成。これらのプロセスの活性化は、これらの細胞に対して特異的である受容体の刺激（すなわち、誘導または活性化）に依存する。さらに、これらのプロセスはどれも、マスト細胞または好酸球の活性を阻害し、また、アレルギー性の反応およびマスト細胞／好酸球媒介による反応により誘導される状態を治療する二重特異性複合体の能力を明らかにするためのパラメーターとして使用することができる。
【００６７】
従って、二重特異性複合体（例えば、本発明において記載される二重特異性抗体）がその２つの標的（すなわち、阻害性受容体ＩＲｐ６０および第２の活性化因子標的）に結合することにより活性化される阻害性経路は、連続または同時に起こる下記の事象カスケードによって記載することができる：（ａ）阻害性受容体の細胞内ＩＴＩＭドメインのリン酸化；（ｂ）細胞内ホスファターゼ（例えば、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、ＳＨＩＰ−１、ＳＨＩＰ−２またはＰＴＥＮ）の動員；（ｃ）活性化された標的に存在するＩＴＡＭまたはチロシンリン酸化ドメインの脱リン酸化。
【００６８】
従って、本明細書中に記載される二重特異性抗体は、アレルギー性の反応およびマスト細胞／好酸球媒介による反応の治療、ならびに、マスト細胞／好酸球の過活性または過形成に由来する任意の状態の治療においてインビボまたはエクスビボで使用することができる。
【００６９】
ＩＲｐ６０活性化の生物学的関連性をインビボで調べるために、本発明者らはアレルギー性腹膜炎のマウスモデルにおいてこの受容体を中和した（実施例７および実施例１４）。ＩＲｐ６０はＣＭＲＦ−３５Ｈの対立遺伝子イソ型である［Ｃａｎｔｏｎｉ  Ｃ他（１９９９）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２９：３１４８〜５９］。インビボ機能はどれも、今のところ、ＩＲｐ６０に帰属されていないので、マウスＣＭＲＦ−３５Ｈファミリーのメンバー［ＣＬＭ−１と呼ばれる］が、ＳＨＰ−１の動員を介して破骨細胞形成を阻害することが示された［Ｃｈｕｎｇ，Ｄ．Ｈ．他（２００３）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７１（１２）：６５４１〜８］。近年、マウスのマスト細胞が、ＶタイプＩｇフォールド配列およびＩＴＩＭ配列における重要な機能性残基がよく保存されてヒトＩＲｐ６０と８０％同一であり、かつ、チロシンリン酸化を介してＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２を動員することができるＬＭＩＲ１と呼ばれるＩｇスーパーファミリー受容体を発現することが報告されている［Ｋｕｍａｇａｉ（２００３）、同上同頁］。今回の結果は、ＬＭＩＲ１の中和がＬＭＩＲ１処置マウスの腹膜洗浄液におけるトリプターゼおよびβ−ヘキソサミニダーゼのレベルを高めることを示している。加えて、その後の好酸球性炎症が強くなった。このことは、ＩＲｐ６０（およびその未だ明らかにされていないリガンド）がインビボでのアレルギー性環境において同様に役割を有することを示している。
【００７０】
最後に、ＩＲｐ６０およびＩｇＥの架橋の影響をインビトロおよびインビボの両方で調べるために、本発明者らは２組の二重特異性構築物（ＩＥ１、二重特異性の抗ＩＲｐ６０−抗ＩｇＥ；ＬＥ１、二重特異性の抗ＬＭＩＲ１−抗ＩｇＥ）およびそれらの一致するイソ型コントロールを作製している。ＩＥ１はヒトマスト細胞のＩｇＥ媒介による脱顆粒化をインビボで阻害し、一方、ＬＥ１は、アレルギー性腹膜炎のマウスモデルにおいて、トリプターゼおよびエオタキシン−２の放出、ならびに好酸球の浸潤を阻害した。さらに、ＬＥ１はマウスＰＣＡモデルにおいて皮膚アナフィラキシーを阻害した。このことは、ＩＲｐ６０およびＩｇＥ（またはＬＭＩＲ１およびＩｇＥ）の架橋が、マスト細胞および好酸球の機能および活性をアレルギー性炎症性の状況で阻害するための効率的な方法であることを証明している。
【００７１】
本明細書中において本明細書および下記の請求項の節で使用される用語「治療する」（“ｔｒｅａｔ”またはｔｒｅａｔｉｎｇおよびそれらの派生語）は、状態の進行を実質的に阻害すること、または、遅くすること、または、逆戻りさせること、あるいは、状態の臨床的症状を実質的に緩和すること、あるいは、状態の臨床的症状の出現を実質的に予防することを包含する。
【００７２】
本発明の方法によって使用される医薬組成物は投薬単位形態物で調製することができ、または、製薬の分野で広く知られている方法のいずれかによって調製され得る。加えて、医薬組成物は、医薬的に許容され得る添加剤、例えば、医薬用の許容され得るキャリア、賦形剤または安定化剤、および、場合により、他の治療的構成成分をさらに含むことができる。当然のこととして、許容され得るキャリア、賦形剤または安定化剤は、用いられる投薬量および濃度において被投与者に対して非毒性である。
【００７３】
本発明の組成物の治療的用量の大きさは、当然のことではあるが、患者群（年齢、性別など）、治療すべき状態の性質、および、投与経路（これらのすべてが主治医によって決定されなけばならない）により変化する。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、全身的に、例えば、非経口注射（例えば、静脈内注射、腹腔内注射または筋肉内注射）によって投与することができる。あるいは、医薬組成物は、皮下投与、経皮投与、局所的投与、関節内投与、結膜下投与または粘膜投与をはじめとする任意の好適軟経路によって、例えば、経口投与、鼻腔内投与、吸入投与または眼内投与によって送達することができる。治療を必要としている領域への局部的投与を、例えば、手術時または局所的適用時における局部的注入によって達成することができる。
【００７５】
経口投与の場合、医薬調製物は液体形態（例えば、溶液、シロップまたは懸濁物）であり得るか、または、錠剤およびカプセルなどのような固体形態であり得る。吸入による投与の場合、組成物は、好都合には、滴剤またはエアロゾル噴霧剤の形態で送達される。注射による投与の場合、配合物は、例えば、アンプルにおけるか、または、保存剤が添加された多回服用容器における単位投薬形態物で提供される場合がある。
【００７６】
従って、本発明の二重特異性抗体は、併存する２つの大きな治療的および経済的な利点を有する。第１に、本発明の二重特異性抗体はアレルゲン特異的でなく、従って、２つ以上のアレルゲンに対してアレルギー性である患者において使用することができ、また、臨床的状況では頻繁に発生するように、アレルゲンがたとえ不明であっても使用することができる。第２に、将来の治療的使用において、本発明の二重特異性抗体は、面倒な静脈内経路によってではなく、スプレー剤、クリーム、点眼薬および点鼻薬などによって局所的に送達することができる。静脈内経路はまた、（１）副作用に対する危険性がより大きいために、（２）薬物動態学的に、通常、薬物が排除され、排出され、分解するので、薬物の半減期がより短いために、また、（３）局部的に投与されるならば、著しくより少ない薬物が必要とされるために、できることなら避けられる。
【００７７】
特定の疾患、状態または障害の治療において効果的である本発明の治療用組成物または医薬組成物の量は、疾患、状態または障害の性質に依存するが、標準的な臨床的技術によって決定することができる。加えて、インビトロアッセイを、インビボ実験と同様に、最適な投薬量範囲を特定することを助けるために、場合により用いることができる。配合物において用いられる正確な用量はまた、投与経路、および、疾患、状態または障害の重篤度に依存し、医師の判断および各患者の状況に従って決定されなければならない。効果的な用量を、インビトロ試験系または動物モデル試験系から得られる用量応答曲線から外挿することができる。量は、マスト細胞または好酸球がアレルギー性反応を引き起こすことを可能するプロセスの１つを阻害するために十分でなければならない。本明細書中に記載されるマウスモデルの場合、３μｇの二重特異性抗体ＬＥ１が、この応答を誘導するために十分であった。これは、約２７ｐｍｏｌｅに相当する量である。
【００７８】
本明細書中で使用される「効果的な量」は、選択された結果を達成するために必要な量を意味する。例えば、本発明の組成物の効果的な量は、マスト細胞または好酸球の活性を阻害するために、従って、アレルギー性反応、ならびに、マスト細胞および／または好酸球および／または好塩基球により媒介される反応を治療するために有用である。
【００７９】
本発明の抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得ることを理解しなければならない。
【００８０】
タンパク質に対するポリクローナル抗体の作製が、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）の第２章に記載される。
【００８１】
モノクローナル抗体を、免疫化された動物（特に、ラットまたはマウス）の脾臓またはリンパ節から採取されたＢ細胞から、ハイブリッド細胞の成長に有利である条件のもとでの不死化Ｂ細胞との融合によって調製することができる。モノクローナル抗体を作製する技術が多くの論文および書籍に記載される（例えば、上記のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙの第２章など）。このような動物の脾臓細胞またはリンパ節細胞を、その第２章に記載されるようなモノクローナル抗体の作製のために、タンパク質より免疫化された動物の脾臓細胞またはリンパ節細胞と同じ方法で使用することができる。モノクローナル抗体を作製する際に使用される技術が、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ［ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７］によって、また、米国特許出願４３７６１１０号においてさらに記載される。
【００８２】
抗体のＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントならびに他のフラグメントが、典型的には、酵素を使用するタンパク質分解切断によって、例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを作製するために）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを作製するために）などを使用して作製される。
【００８３】
構造的には、本発明において記載される二重特異性抗体は下記にように定義することができる。下記の３工程のプロセスによって作製された合成Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（すなわち、それぞれが異なる決定基を認識する２つのＦ（ａｂ’）フラグメントのコンジュゲート）：（１）マウスまたはラットの完全なＩｇＧ分子（これは、本明細書中で定義されるように、目的とする標的のそれぞれ１つに対して特異的である）をペプシンにより処理し、従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを作製する工程；（２）各Ｆ（ａｂ’）２を２−メルカプトエチルアミンとの処理によって還元し、Ｆ（ａｂ’）フラグメントを作製する工程；および（３）各抗体のＦ（ａｂ’）フラグメントをもう一方のフラグメントと再コンンジュゲート化し、従って、二重特異性のハイブリッドＦ（ａｂ’）２を作製する工程。従って、前述の二重特異性抗体は、Ｆ（ａｂ’）２分子がＩｇＧ分子のペプシン処理の生成物として定義されることを考慮すれば、すべての面で、完全なＦ（ａｂ’）２分子（約１１０ＫＤａの重量）である。
【００８４】
将来の臨床的適用のために、本発明の二重特異性抗体は、マウス抗体の応答に対するヒト抗体を抑えるために、ヒト化プロセスによって改良することができる。迅速な新しい方策が、近年、そのような抗体のために適用され得る抗体ヒト化のために開発されている。これらの技術は親和性を維持し、かつ、元の抗体の抗原特異性およびエピトープ特異性を保持する［Ｒａｄｅｒ、Ｃ．他（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：８９１０〜８９１５；Ｍａｔｅｏ，Ｃ．他（１９９７）、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：７１〜８１］。例えば、動物由来の抗体とは異なり、「ヒト化」抗体は、多くの場合、対象の免疫系との望ましくない反応を受けない。
【００８５】
従って、本明細書中で使用される用語「ヒト化（された）」およびその派生語は、ゼロを越えて、１００％までの任意のパーセントのヒト抗体物質を、そのような抗体がヒトに投与されたとき、その抗体が免疫原性となる可能性をより小さくするために十分な量および組成で含む抗体を示す。用語「ヒト化（された）」は、ヒト由来の抗体についてもまた解釈されるか、または、ヒトの免疫系をコードする遺伝子の機能的な部分を含むように遺伝子操作された非ヒト細胞（従って、完全にヒト型である抗体を産生する）に由来する抗体についてもまた解釈されることが理解されつつある。
【００８６】
まとめると、本明細書中に記載される二重特異性抗体は、一般にはアレルギー性の炎症性疾患において、また、マスト細胞／好酸球に関連した疾患（下記参照）においてマスト細胞および好酸球のエフェクター機能を下方調節するための新規な方法を表す：マスト細胞／好酸球に関連した疾患は、例えば、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、季節性アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎およびアトピー性湿疹、様々なアレルゲンに対するアレルギー性の障害および応答、全身性アナフィラキシー、全身性肥満細胞過剰増殖、限局性強皮症／色素性じんま疹、マスト細胞白血病、アテローム性動脈硬化、移植片拒絶、多発性硬化症、線維形成性肺疾患、神経線維腫症、ケロイド、強皮症、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、急性痛風、眼の瘢痕性類天疱瘡、クローン病、腹膜癒着、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、好酸球増多筋痛症候群、外因性気管支喘息、鼻ポリープ症、ヴェーゲナー肉芽腫症、内因性気管支喘息、間質性肺疾患および他の肺疾患、慢性好酸球性肺炎、過敏性肺臓炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、類肉腫症、特発性肺線維症、トキソカラ症、フィラリア症、住血吸虫症、旋毛虫症、新生物疾患および骨髄増殖性疾患、Ｔ細胞リンパ腫およびホジキン病などである。
【００８７】
本発明から利益を受け得る１つの特定の集団が、肥満細胞過剰増殖を患う個体の集団である。肥満細胞過剰増殖は、多すぎるマスト細胞が体内に存在することによって特徴づけられる一群の障害である。肥満細胞過剰増殖は皮膚性または全身性である場合がある。過度なマスト細胞およびそれらのシグナル伝達は、骨および筋肉の痛み、腹部不快感、悪心および嘔吐、胃潰瘍、下痢、皮膚損傷、非常に低い血圧および失神およびショックの症状発現をもたらす。これまで、肥満細胞過剰増殖のための治療はどれも特異的ではない。治療は通常、疾患の症状発現を緩和するための抗ヒスタミン剤または医薬品に基づいている。しかしながら、マスト細胞に特異的な治療は１つも見出されていない。従って、マスト細胞を標的とする本発明の二重特異性抗体、または、そのような二重特異性抗体を含む組成物は、この疾患を治療するために使用される理想的な薬剤である。
【００８８】
好塩基球の活性化により媒介される状態もまた、本発明の二重特異性抗体により治療される潜在的な標的である。これは、好塩基球細胞が、マスト細胞の機能と重なる機能を果たしていると考えられるからである。好塩基球は、マスト細胞と共通する多くの特徴（特に、高親和性ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩの発現、ならびに、高含有量のヒスタミンおよび顆粒貯蔵トリプターゼ）を示す。さらに、好塩基球は高レベルのＩＲｐ６０を発現する（本発明者らのデータは示されず）。好塩基球のＩｇＥ依存的活性化が阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢによって阻害され得るので、二重特異性抗体がＩＲｐ６０／ＩｇＥに結合することによりまた、阻害性経路がこれらの細胞において引き起こされる可能性が非常に高い。本発明の二重特異性抗体を用いて治療され得る特定の状態は、造影剤に対するアナフィラキシー応答、筋弛緩剤に対するアナフィラキシー応答、および、好塩基球白血病である。
【００８９】
本明細書中に記載される二重特異性抗体の潜在的可能性は、上記で議論された範囲を越えることさえあり得る。他の細胞に対する適正なエフェクター機構を考えると、特定の細胞タイプのピンポイント標的化が所望される、自己免疫疾患などの他の疾患が治療され得ることが考えられる。
【００９０】
本発明は請求項によって定義され、その内容は、本明細書の開示に含まれるとして解釈しなければならない。
【００９１】
開示および記載される場合、本発明は、本明細書中に開示される特定の例、プロセス工程および材料に限定されないことを理解しなければならない。これは、そのようなプロセス工程および材料はいくらか異なる場合があるからである。本発明の範囲は、添付されている請求項およびその均等物によってのみ限定されるので、本明細書中で使用される用語法は、特定の実施形態を記載するという目的のためだけであり、限定であることを意図しないこともまた理解しなければならない。
【００９２】
本明細書および添付された請求項において使用されるように、“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”の単数形は、文脈がそうでないことを明瞭に示さない限り、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。
【００９３】
本明細書および下記の請求項の全体を通して、文脈を別途要求しない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および変化体（例えば、“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”および“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”など）は、言及された完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）もしくは工程または完全体もしくは工程の群を包含することを意味し、しかし、任意の他の完全体もしくは工程または完全体もしくは工程の群を排除することを意味しないことが理解される。
【００９４】
下記の実施例は、本発明の様々な態様を実施する際に本発明者らによって用いられる技術を表す。これらの技術は、本発明を実施するための好ましい実施形態の例示である一方で、当業者は、本開示に照らして、数多くの改変が、本発明の精神および意図された範囲から逸脱することなくなされ得ることを認識することを理解しなければならない。
【実施例】
【００９５】
実験手順
・抗体および試薬
すべての細胞培養培地、試薬および緩衝液をＢｉｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）から購入した。ＳＣＦはＡｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．［Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、カリフォルニア州、米国］からの譲渡である。様々な阻害性受容体を認識する下記のｍＡｂを、文献に記載される標準的な手順によって調製し、使用した：Ｐ１９２およびＥ５９［抗ＩＲｐ６０］、ＸＡ−１８５［抗ＣＤ９４］、１１ＰＢ６［抗ｐ５８．１］、ＧＬ１８３［抗ｐ５８．２］、Ｚ２７［抗ｐ７０］、Ｑ６６［抗ｐ１４０］、ＡＺ１５８［抗ｐ７０／ｐ１４０］、Ｆ２７８［抗ＬＩＲ１／ＩＬＴ２］。ＬＩＲ３／ＩＬＴ５を認識する抗体［１５Ｆ３］はＣｏｌｏｎｎａ  Ｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、米国）によって譲渡された。抗ＬＭＩＲ１をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ［Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州、米国］から購入した。ヒト肺マスト細胞の精製のための抗ヒトＣＤ１１７抗体をＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ［Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国］から購入した。抗ヒトトリプターゼ抗体［クローンＡＡ１］およびイソ型コントロール抗体［ＩｇＧ１およびＩｇＧ２Ａ］をＤａｋｏ［Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク］から購入した。ヒツジ抗マウスＦ［ａｂ’］２抗体をＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ［Ａｕｒｏｒａ、オハイオ州、米国］から購入した。キメラマウス／ヒトＩｇＥ抗ＮＰ抗体をＳｅｒｏｔｅｃ［Ｒａｌｅｉｇｈ、ノースカロライナ州、米国］から購入した。ヤギ抗マウスλ鎖特異的抗体をＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ［Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、アラバマ州、米国］から購入した。ポリクローナル抗ヒトホスホチロシン［ｐＹ９９］抗体、ＳＨＰ−１／２抗体およびＳＨＩＰ−１抗体をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ［Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カリフォルニア州、米国］から購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化された抗ウサギ抗体および抗マウス抗体、フルオレセインイソチオシアナート［ＦＩＴＣ］コンジュゲート化抗マウス抗体、Ｃｙ５コンジュゲート化抗マウス抗体およびフィコエリトリンコンジュゲート化抗マウス抗体をすべてＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ペンシルバニア州、米国］から購入した。発色性基質をＳｉｇｍａ［Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国］から購入した。カルシウムグリーン−１ＡＭをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ［Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州、米国］から購入した。Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅをＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ［Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン］から購入した。すべての他の試薬は、別途言及されない限り、Ｓｉｇｍａから購入され、入手可能な最高の化学規格であった。
【００９６】
・二重特異性抗体［ＢｓＡｂ］の作製
別個のエピトープを認識する完全なマウスＩｇＧ抗体またはラットＩｇＧ抗体に由来する二重特異性のＦ（ａｂ’）２フラグメントを、わずかな改変とともに、基本的にはＢｒｅｎｎａｎおよびＧｒａｚｉａｎｏによって記載されるように作製した。マウスの抗ヒトＩｇＥおよび抗ヒトＩＲｐ６０を、固定化ペプシンビーズを製造者のプロトコルに従って使用して、記載されるように、３７℃で４時間、振とう浴において消化した。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、ｖｉｖａｓｐｉｎカラムでの遠心分離ゲルろ過を使用して精製し、還元性緩衝液［１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭの２−メルカプトエチルアミン、１０ｍＭの亜ヒ酸ナトリウム、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８］において２５℃で一晩インキュベーションすることによってＦａｂ’フラグメントに還元した。抗ＩＲｐ６０のみには、５’，５−ジチオビス［２−ニトロ安息香酸］［Ｅｌｌｍａｎ試薬］を１０ｍＭの最終濃度に加え、インキュベーションを２５℃で４時間続けた。その後、両方の抗体をゲルろ過によって清浄化し、カップリング緩衝液［１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８］に移し、混合し、２５℃で一晩インキュベーションした。得られたＦ（ａｂ’）２をゲルろ過によって精製し、ＰＢＳにおいて回収し、分光光度法を使用して定量した。特異性をＦＡＣＳによって評価した。マウスのＩｇＥおよびＬＭＩＲ１について、ラットＩｇＧは、固定化ペプシンとの５時間のインキュベーションを除いて同じプロセスを受けた。下記の標的組を認識するＢｓＡｂを作製した：ＩＥ１［ｈＩｇＥ−ＩＲｐ６０］、ｈＩｇＥ−イソ型［コントロール］、ＬＥ１［ｍＩｇＥ−ＬＭＩＲ１］、ｍＩｇＥ−イソ型［コントロール］。
【００９７】
・マスト細胞を用いたアッセイのための方法
ａ．マスト細胞の精製および培養
今日までのマスト細胞に関する知識のほとんどが、齧歯類のマスト細胞およびヒトのマスト細胞株に対して行われた研究に依ることは注目に値する。本発明者らの研究室では、ヒト治療に集中しており、臍帯血、肺、皮膚および腸からヒトマスト細胞を精製し、ヒトマスト細胞を特異的に培養するための技術が開発されている。
【００９８】
従って、ヒト臍帯血マスト細胞［ＣＢＭＣ］を、臍帯血単核前駆体を以前に記載されたように培養することによって得た［Ｐｉｌｉｐｏｎｓｋｙ（２００３）、同上同頁］。簡単に記載すると、新鮮な臍帯血をハンクス溶液により希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅに載せ、遠心分離した［３５０ｘｇ、２５分間］。単核細胞をハンクス溶液により２回洗浄し、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎児血清［ＦＣＳ］、ペニシリン［１００Ｕ／ｍＬ］、ストレプトマイシン［１００μｇ／ｍＬ］、リボヌクレオシド／デオキシリボヌクレオシド、ＳＣＦ［１００ｎｇ／ｍＬ］、ＩＬ−６［１０ｎｇ／ｍＬ］［Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ニュージャージー州、米国］およびＰＧＥ２［０．３μＭ］［Ｓｉｇｍａ］を含有する１００ｍＬの最少必須培地［ＭＥＭ］−Ａｌｐｈａにより再懸濁した。培養培地を毎週取り替えた。ＣＢＭＣを、８週間〜１２週間の培養の後、９７％を越える細胞が、細胞内フローサイトメトリー［ＦＡＣＳ、下記参照］によってアッセイされるようにトリプターゼについて陽性であるとき、使用した。ヒト肺マスト細胞［ＨＬＭＣ］を、肺ガン患者から手術により摘出された健全そうに見える肺試料から、タンパク質溶解、グラジエントおよび陽性の磁石分取を記載されるように使用して精製した［Ｐｉｌｉｐｏｎｓｋｙ  ＡＭ、他（２００３）、同上同頁］。肺サンプルおよび臍帯血を、Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）の施設内ヘルシンキ委員会のガイドラインに従って得た。それらの使用は委員会によって承認された。
【００９９】
ｂ．フローサイトメトリー［ＦＡＣＳ］
フローサイトメトリーを、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを使用して行った。すべての段階を１００μＬの体積で丸底９６ウェル培養プレート［Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク］において行った。大部分の細胞［約１０５個／サンプル］を氷冷のＨＢＡ緩衝液［ＢＳＡ［０．１％（ｗ／ｖ）］およびＮａＮ３「０．０１％（ｗ／ｖ）」を含有するハンクス溶液］により洗浄し、その後、抗ＩＲｐ６０または適切なイソ型コントロールのいずれかとインキュベーションし［４℃、３０分間］、その後、冷ＨＢＡにより２回洗浄した。その後、細胞を二次抗体とインキュベーションし［推奨される希釈度でのＦＩＴＣコンジュゲート化抗マウスまたはＣｙ５コンジュゲート化抗マウス、４℃、３０分間］、その後、さらに２回洗浄し、ＦＡＣＳによって直ちに分析した。細胞内ＦＡＣＳを、一次抗体を加える前の２つの段階を除いて本質的には同じに行った。この場合、細胞を、最初に２％ホルムアルデヒドにおいて固定処理し［４℃、１０分間］、ＢＳＡ［１０％（ｗ／ｖ）］、ヤギ血清［０．１％（ｗ／ｖ）］、サポニン［０．１％（ｗ／ｖ）］およびＨＥＰＥＳ［１０ｍＭ］を含有するＨＢＡによりブロッキング処理した［４℃、１０分間］。サポニン［０．１％（ｗ／ｖ）］およびＨＥＰＥＳ［１０ｍＭ］を含有するＨＢＡもまた、インキュベーションおよび洗浄のために用いた。
【０１００】
ｃ．マスト細胞の活性化および阻害
活性化の５日前に、ＣＢＭＣをキメラマウス／ヒトＩｇＥ抗ＮＰ抗体［５μｇ／ｍＬ］とインキュベーションした。活性化のために、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ−２ＨＢ  ９６ウェルプレート［ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、マサチューセッツ州、米国］をヒツジ抗マウスＦ［ａｂ’］２［ＰＢＳにおいて２５μｇ／ｍＬ］の存在下または非存在下でインキュベーションし［３７℃、４時間］、その後、ＰＢＳにより２回洗浄した。次いで、プレートを、抗ＩＲｐ６０［２０μｇ／ｍＬ］、イソ型コントロールまたはＰＢＳとインキュベーションし［３７℃、４時間］、ＰＢＳにより２回洗浄した。活性化の当日において、細胞［２ｘ１０５細胞／サンプル］を、ＳＣＦ［１００ｎｇ／ｍＬ］が補充された温いＴｙｒｏｄｅゼラチン−カルシウム緩衝液［１３７ｍＭのＮａＣｌ、１２ｍＭのＮａＨＣＯ３、５．５ｍＭのＬ−グルコース、２ｍＭのＫＣｌ、０．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、０．９ｍＭのＭｇＣｌ２］で２回洗浄した。その後、細胞を被覆プレートに移し、抗マウスＩｇＥのλ鎖特異的抗体［５μｇ／ｍＬ］または化合物４８／８０［１０μｇ／ｍＬ］のいずれかを加え、細胞を３７℃で３０分間インキュベーションした。最後に、細胞を直ちに遠心分離し［１５００ｘｇ、１分間］、上清から分離し、３回の凍結／融解サイクルによって溶解し、溶解物を回収して、放出された媒介因子の量について評価されるまで−８０℃で保存した。
【０１０１】
ｄ．媒介因子放出アッセイ
β−ヘキソサミニダーゼおよびトリプターゼを、わずかな改変とともに、記載されるように発色性アッセイによって測定した［Ｗｏｏｌｈｉｓｅｒ，Ｍ．Ｒ．他（２００４）、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１０（２）：１７２〜８０；Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ  Ｓ．他（２００３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３４（５）：９１０〜２、９１４］。β−ヘキソサミニダーゼについては、１８μＬのサンプル［上清または細胞溶解物］を４２μＬの基質溶液［４８ｍＭのクエン酸および５６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ４．５）における８ｍＭのｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド］と混合し、３７℃で２時間インキュベーションした。反応を１２０μＬの氷冷グリシン［０．２Ｍ］（ｐＨ１０．７）の添加によって停止させ、Ｏ．Ｄ．を４１０ｎｍの吸光度において標準的な分光光度計で直ちに読み取った。トリプターゼについては、４８μＬのサンプルを２μＬの基質溶液［１００％ＤＭＳＯにおける２５ｍＭのＮ−ｐ−トシル−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド］と十分に混合し、発色するまで３７℃でインキュベーションし、上記のように直ちに読み取った。パーセント放出を、Ｏ．Ｄ．曲線の直線範囲内で、下記の式を使用して計算した：％Ｒ＝１００ｘ上清／［溶解物＋上清］。ＩＬ−４の放出を市販のＥＬＩＳＡキット［Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、フランス］によって測定した。
【０１０２】
ｅ．生存アッセイ
ＣＢＭＣ［２ｘ１０５細胞／サンプル］を、増殖因子を含まないＭＥＭ−Ａｌｐｈａにより洗浄し、上記で記載されたように被覆された培養プレートにおいて、ＳＣＦ［１００ｎｇ／ｍＬ］を含むＭＥＭ−ＡｌｐｈａまたはＳＣＦを含まないＭＥＭ−Ａｌｐｈａの２００μＬにおいてインキュベーションした。２４時間および４８時間で、サンプルをＰＢＳにおけるヨウ化プロピジウム溶液［１０％（ｖ／ｖ）］の５μＬの添加によって染色し、直ちにＦＡＣＳによって分析した。
【０１０３】
ｆ．受容体発現の調節
ＣＢＭＣ［３ｘ１０５細胞／サンプル］を、ＴＮＦ−α［２０ｎｇ／ｍＬ］、ＩＬ−３［２０ｎｇ／ｍＬ］、ＩＬ−４［２０ｎｇ／ｍＬ］、ＮＧＦ［５０ｎｇ／ｍＬ］［すべてをＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ニュージャージー州、米国）から購入した］、キメラＩｇＥ［５μｇ／ｍＬ］［Ｓｅｒｏｔｅｃ］、好酸球ＭＢＰ［０．０１μＭ〜０．１μＭ］（これは記載されたように精製された；Ｐｉｌｉｐｏｎｓｋｙ（２００３）、同上同頁）またはポリ−Ｌ−アルギニン［２５μＭ〜１００μＭ］のいずれかの存在下、３７℃で、０時間、４時間、１２時間および２４時間培養した。これらの時点でＩＲｐ６０の発現をＦＡＣＳによって評価した。
【０１０４】
ｇ．細胞内Ｃａ２＋の可動化
カルシウムセンサーを負荷する前に、ＣＢＭＣ［３ｘ１０５細胞／サンプル］上のＩＲｐ６０を抗ＩＲｐ６０またはイソ型とのインキュベーション［１０μｇ／ｍＬ、氷上で３０分間］によって架橋し、その後、洗浄し、ＭＥＭ−Ａｌｐｈａにおけるヒツジ抗マウスＦ［ａｂ’］２とインキュベーションした［２５μｇ／ｍＬ、氷上で３０分］。細胞にＭＥＭ−Ａｌｐｈａ［ＦＣＳ、２％（ｖ／ｖ）］におけるカルシウムグリーン−１ＡＭを負荷し［５μＭ、４５分間、３７℃］、洗浄し、３７℃に暖められた４００μＬのＴｙｒｏｄｅゼラチン−カルシウム緩衝液に懸濁した。細胞を、１００秒間、サイトメーター内を自由に流れさせ、そのとき、抗ＩｇＥ［５μｇ／ｍＬ］を加えた。ＦＬ−１の幾何平均の変化を合計で５分間にわたって記録した。
【０１０５】
ｈ．免疫沈殿およびウェスタンブロット
ＣＢＭＣを、市販の溶解緩衝液［Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国］を使用して溶解し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ＰＶＤＦメンブレン［Ｐｉｅｒｃｅ］に転写し、ＩＲｐ６０［抗ＩＲｐ６０、１μｇ／ｍＬ］に対してブロットした。ＩＲｐ６０沈殿のために、ＣＢＭＣ［８ｘ１０６細胞／サンプル］をオルトバナジン酸ナトリウム［４ｍＭ、１０分間、３７℃］で処理し、または、被覆プレートにおいて様々な時間インキュベーションした。ＩＲｐ６０を、市販のキット［ＳｅｉｚｅＴＭ  Ｃｌａｓｓｉｃ  Ｍａｍｍａｌｉａｎキット、Ｐｉｅｒｃｅ］を製造者の説明書に従って使用してＣＢＭＣから沈殿させた。サンプルを記載されるように泳動し、ホスホチロシン［ｐＹ９９］、ＳＨＰ−１／２およびＳＨＩＰ−１に対してブロットした。検出のために、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化された抗マウス抗体または抗ウサギ抗体を、製造者によって推奨されるように使用した。
【０１０６】
・好酸球を用いたアッセイのための方法
ａ．好酸球の精製
好酸球を軽度のアトピー性者（血中好酸球レベル、５％〜１０％）の末梢血から精製した。書面によるインフォームドコンセントを、Ｈａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのヒト実験ヘルシンキ委員会により制定されたガイドラインに従ってすべての志願者から得た。簡単に記載すると、静脈血（５０ｍｌ〜１００ｍｌ）をヘパリン添加シリンジに集め、６％デキストラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｎｅｃｅｓ）において沈降させた。白血球をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅでの遠心分離（密度、１．０７７；２５分間、７００ｇ、２２℃；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｎｅｃｅｓ）に供した。好中球および混入しているリンパ球を、抗ＣＤ１６Ａｂおよび抗ＣＤ３Ａｂに結合させた微小磁石ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて顆粒球濃縮ペレットに捕捉した。好酸球を、細胞懸濁物を磁石カラム（ＭＡＣＳ）に通すことによって精製した。細胞を、Ｋｉｍｕｒａ染色によって少なくとも９８％の純度で回収し、生存性はトリパンブルー染色により少なくとも９８％であった。ＣＤ５６＋細胞またはＣＤ３＋細胞はいずれも、ＦＡＣＳ分析によって、混入画分において観測されなかった（データは示されず）。
【０１０７】
ｂ．フローサイトメトリー
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析のために、細胞（１Ｘ１０５個）を、０．１％のＢＳＡおよび０．０２％のアジ化ナトリウムが補充されたＨＢＳＳ（ＨＢＡ）の１００μｌの最終体積において氷上で３０分間、（ＦｃＲをブロッキングするために）１５％のヒト血清とインキュベーションした。好酸球を、様々な阻害性受容体を認識する種々のＡｂと一緒に培養し、その後、ヤギ抗マウスＦＩＴＣＡｂ（１／２００）と一緒に培養した。生存実験のために、アネキシン−ＰＩ染色を、Ｒ＆Ｄアネキシン−ＰＩキットを製造者の説明書に従って使用して行った。
【０１０８】
染色後、細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。それぞれの染色について、少なくとも１００００個の事象を集め、データ分析を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。
【０１０９】
ｃ．細胞の培養および活性化
９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）をＰＢＳにおけるヒツジ抗マウスＦ（ａｂ’）２によりプレコーティングした（２５μｇ／ｍｌ、２時間、３７℃、５％ＣＯ２）。その後、プレートをＰＢＳにより３回洗浄し、Ｐ１９２（抗ＩＲｐ６０）Ａｂまたは関連性のないイソ型一致のコントロールＡｂとインキュベーションし（１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ、２時間、３７℃、５％ＣＯ２）、再び３回洗浄した。新しく分離された好酸球を、ＲＰＭＩ１６４０、２００Ｕ／ｍｌのペニシリン、２００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび５％（ｖ／ｖ）の熱不活化ＦＣＳを含有する培地（富化培地（ＥＭ））においてこれらのプレコーティングされたウェルに播種し（２Ｘ１０５個／２００μｌ）、ＩＬ−５またはＧＭ−ＣＳＦを種々の濃度で加えた（１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）。細胞を１８時間〜２４時間インキュベーションした（３７℃、５％ＣＯ２）。インキュベーションが終了したとき、細胞を遠心分離し（２５０ｇ、５分間、４℃）、上清を集め、小分けし、サイトカインまたは繊維芽細胞増殖アッセイについて評価されるまで−８０℃で保存した。
【０１１０】
生存アッセイのために、細胞を下記のように懸濁状態で活性化した：Ｐ１９２（抗ＩＲｐ６０）Ａｂまたは関連性のないイソ型一致のコントロールＡｂを細胞に加えた（２Ｘ１０５個、１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ、３０分間、４℃）。細胞を洗浄し、ヒツジ抗マウスＦ（ａｂ’）２を加えた（２５μｇ／ｍｌ、３０分間、４℃）。その後、細胞を３回洗浄し（２５０ｇ、５分間、４℃）、ＩＬ−５またはＧＭ−ＣＳＦを異なる時点（１２時間〜４８時間）について加えた（１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）。生存性を、上記で記載されたようにフローサイトメトリーによって評価した。
【０１１１】
ｄ．サイトカインの定量
ＩＬ−８を、ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して好酸球培養上清において定量した。アッセイ感度についての下限はＩＬ−８について７ｐｇ／ｍｌであった。ＩＬ−１ｂ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を、１０個の異なるサイトカインを検出するＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘキットを製造者の説明書に従って使用して検出した。
【０１１２】
ｅ．走化性アッセイ
好酸球の遊走を、マイクロウェル二重チャンバーシステム（ＣｈｅｍｏＴｘチャンバー：フィルター細孔サイズ  ５μｍ、直径６０ｍｍのウェル；Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して測定した。組換えヒトエオタキシン（１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）を三連で底部チャンバー内のウェルに加え、枠取られたフィルターで覆った。次いで、抗ＩＲｐ６０またはイソ型一致コントロールによって活性化された好酸球の懸濁物（３００００細胞／３０μｌ）を、各ウェルを覆っているフィルターの上に置き、チャンバーシステムを９０分間インキュベーションした（３７℃、５％ＣＯ２）。インキュベーション後、フィルターの上における非遊走の好酸球の懸濁物を、ティッシュペーパーを使用して除き、下部チャンバーにおける細胞をフローサイトメトリーによって計数した（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。簡単に記載すると、相対的な細胞カウント数を、事象を６０秒間にわたって取得することによって得た。
【０１１３】
ｆ．形状変化アッセイ
エオタキシン誘導による好酸球の形状変化を、フローサイトメトリー分析を使用することによって評価した。抗ＩＲｐ６０またはイソ型一致コントロールによって活性化された好酸球の懸濁物を組換えヒトエオタキシン（１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）と５分間〜１０分間インキュベーションした（３７℃、５％ＣＯ２）。その後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析し、１００００細胞のＦＳＣを取得した。
【０１１４】
ｇ．繊維芽細胞増殖アッセイ
サブコンフルエントの繊維芽細胞単層物の増殖を［３Ｈ］−チミジン取り込みによって評価した。繊維芽細胞を、２００ｍｌの補充されたＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳにおいて、一晩、９６ウェルプレートに播種し（５Ｘ１０３細胞／ウェル）、補充されたＤＭＥＭ／０．５％ＦＣＳにより２回洗浄し、ＩＲｐ６０またはイソ型一致コントロールによって２４時間活性化された好酸球の上清を用いて刺激した。［３Ｈ］−チミジン（ＮＥＮＴＭ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を最後の２４時間のパルス（１μＣｉ／ウェル）として加え、サンプルを以前に記載されたように処理した。
【０１１５】
・動物およびアレルギー性腹膜炎モデル
アレルギー性腹膜炎を、オバルブミン［ＯＶＡ］を記載［Ｚｕａｎｙ−Ａｍｏｒｉｍ他（１９９４）、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、７２５：３４〜４３］のように使用して８週齢〜１０週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて誘導した。簡単に記載すると、０日目および７日目に、マウスを、３００μＬの生理的食塩水における１．６ｍｇのミョウバン水酸化物に吸着させた１００μｇのＯＶＡにより皮内に感作した。マウスを、１１日目に、３００μＬの生理的食塩水における３０μｇのＯＶにより腹腔内に抗原攻撃し、その後、マウスを媒介因子分析および好酸球定量のために４５分後または４８時間後のいずれかでそれぞれ屠殺した。腹膜腔を、カルシウムを含まないＴｙｒｏｄｅゼラチン緩衝液の５ｍＬにより洗浄した。腹腔洗浄液を遠心分離し［１５０ｘｇ、５分間］、細胞ペレットを媒介因子分析および好酸球定量のために２ｍＬのＴｙｒｏｄｅゼラチン緩衝液に再懸濁した。すべての実験において、抗ＬＭＩＲ１をアレルゲン攻撃の３０分前に投与した［１μｇ／マウス〜２０μｇ／マウス、腹腔内］。すべての実験プロトコルがＨｅｂｒｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）の動物実験委員会により承認された。
【０１１６】
二重特異性抗体を試験するためのアレルギー性腹膜炎モデルは、マウスを１１日目に３００μＬの生理的食塩水における３０μｇのオバルブミンにより腹腔内に抗原攻撃することを伴った。抗原攻撃の３０分前に、ＢｓＡｂ［ＬＥ１またはコントロール、１００μＬの生理的食塩水における３μｇ］を反対側に注射した。マウスを、媒介因子分析または好酸球計数のために、抗原攻撃の４５分後または４８時間後に吸入イソフルランによりそれぞれ屠殺した。洗浄液を記載されるようにトリプターゼについて評価した。好酸球計数のために、洗浄液を遠心分離し、細胞数を正規化し、細胞を、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗マウスＣＣＲ３およびＰＥコンジュゲート化抗マウスＣＤ４８を使用して染色し、最後にＦＡＣＳによって分析した。
【０１１７】
受動的皮膚アナフィラキシーを、わずかな改変を伴って記載されるように生じさせた［Ｆｕｎｇ−Ｌｅｕｎｇ他（１９９６）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３：４９〜５６］。簡単に記載すると、８週齢〜１０週齢の健康なメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに生理的食塩水またはＩｇＥ抗ジニトロフェノール［クローンＳＰＥ７、２５μＬの生理的食塩水における０．５μｇ］を背中の４カ所で皮下注射した。同時に、ＢｓＡｂ［ＬＥ１またはコントロール、２５μＬの生理的食塩水における３μｇ］をＩｇＥ感作部位の２つに注射した。２時間後、マウスを２００μＬの生理的食塩水における１ｍｇのジニトロフェニル−ＨＳＡ＋０．７５％のエバンスブルーにより皮下に抗原攻撃した。皮膚アナフィラキシーを血管から皮膚内への色素漏出によって目視評価した。
【０１１８】
統計学的分析
活性化アッセイ、生存アッセイおよび媒介因子放出アッセイを、三連または四連で、かつ、常に少なくとも３つの異なるドナーから行った。データは平均±Ｓ．Ｄとして表される。データをＡＮＯＶＡによって分析し、その後、ペアードスチューデントｔ検定［分散が等しいと仮定して］およびＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒポストホクによって分析した。
【０１１９】
実施例１
ＣＢＭＣはＩＲｐ６０を発現する
ヒトマスト細胞における阻害性受容体の発現パターンを調べるために、様々な阻害性受容体を認識するｍＡｂの大きなパネルを使用するスクリーニング法を用いた。図１Ａに示されるように、ＦＡＣＳ分析は、ＣＢＭＣが高レベルのＩＲｐ６０を発現し、ＬＩＲ１／ＩＬＴ２、ＬＩＲ３／ＩＬＴ５、ｐ５８．１、ｐ５８．２、ｐ７０、ｐ１４０またはＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４を発現していないことを明らかにした［ｎ＝１０］。１０個のドナーのうちの１つがＣＤ９４を発現し、ＮＫＧ２Ａを発現していなかった。加えて、ＣＢＭＣはＦｃγＲＩＩＢ（知られている阻害性受容体）について陽性に染色された［データは示されず］。
【０１２０】
成熟組織のマスト細胞がＩＲｐ６０を発現するかどうかを評価するために、ＨＬＭＣをＩＲｐ６０発現について染色した。図１Ｂに示されるように、ＨＬＭＣは著しいレベルのＩＲｐ６０を同様に発現する［ｎ＝３］。次に、これらの細胞を、この発現パターンが抗体依存的であるかどうかを調べるために、ＩＲｐ６０を認識する異なるｍＡｂ［すなわち、Ｐ１９２およびＥ５９］を用いてスクリーニングした。両方の抗体は、同じようなレベルのＩＲｐ６０をＣＢＭＣおよびＨＬＭＣの表面において認識した［それぞれ、ｎ＝３、５、データは示されず］。ＩＲｐ６０は、［ＦｃγＲＩＩＢを除いては］ＣＢＭＣ上において発現する唯一の阻害性受容体であったので、ＦＡＣＳデータはウェスタンブロット分析により確認された。抗ＩＲｐ６０は、以前に報告されたように［Ｃａｎｔｏｎｉ  Ｃ他（１９９９）、同上同頁］、ヒトマスト細胞上における約６０ｋＤａのタンパク質を認識する［データは示されず］［ｎ＝３］。
【０１２１】
実施例２
好酸球由来ＭＢＰはＣＢＭＣ上におけるＩＲｐ６０の発現をダウンレギュレーションする
本発明者らは次に、ＣＢＭＣ上におけるＩＲｐ６０の発現を調節する、アレルギー性の炎症環境において見出される様々な媒介因子の能力を調べた。このために、ＣＢＭＣを、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、単量体ＩｇＥ、ＮＧＦおよび好酸球由来ＭＢＰの存在下で様々な時点について培養した。ＭＢＰを除いて、これらの媒介因子はどれも、ＩＲｐ６０の発現に著しい影響を及ぼさなかった。図２に示されるように、ＭＢＰは、１２時間から始まり、２４時間後に著しい影響に達したＩＲｐ６０の発現レベルにおける低下を誘導した［ｎ＝３、ｐ＜０．０１］。等モル濃度範囲［２５ｎＭ〜１００ｎＭ］でのポリ−Ｌ−アルギニンはＩＲｐ６０の発現に影響しなかったので、ＭＢＰの影響は電荷依存的であった。
【０１２２】
実施例３
ＩＲｐ６０の架橋はＣＢＭＣからのＩｇＥ依存的な媒介因子放出を阻害する
ＣＢＭＣの表面におけるＩＲｐ６０の発現は、それらの応答がこの受容体によって調節され得ることを示唆する。ＣＢＭＣの脱顆粒化を阻害するＩＲｐ６０の能力を評価するために、ＣＢＭＣをＩｇＥにより感作し、抗ＩＲｐ６０被覆プレートにおいて抗ＩｇＥ抗体または化合物４８／８０を使用して脱顆粒させるために誘発した。図３Ａおよび図３Ｂに示されるように、ＩＲｐ６０の架橋は、β−ヘキソサミニダーゼ、トリプターゼおよびＩＬ−４のＩｇＥ媒介による放出を強く、かつ、著しく阻害した：β−ヘキソサミニダーゼ［４７．６１±２．００％対１１．７１±１．１２％（抗ＩＲｐ６０に関して）、ｐ＜０．００１］；トリプターゼ［６０．９０±７．３５％対１４．１１±１．４５％（抗ＩＲｐ６０に関して）、ｐ＜０．００１］およびＩＬ−４［８．４１±１．１９％対０．３２±０．０９％（抗ＩＲｐ６０に関して）、ｐ＜０．００１］。興味深いことに、図３Ｃに示されるように、ＩＲｐ６０の架橋は、β−ヘキソサミニダーゼ、トリプターゼおよびＩＬ−４の化合物４８／８０媒介による放出を阻害しなかった［データは示されず］。
【０１２３】
実施例４
ＩＲｐ６０の架橋はＩｇＥ誘導による［Ｃａ２＋］流入を阻害する
ＣＢＭＣのＦｃεＲＩ依存的活性化における初期工程の１つは細胞内カルシウム流入である。従って、カルシウム流入に対するＩＲｐ６０架橋の影響を、カルシウムセンサーのカルシウムグリーン−１ＡＭを使用して調べた。図４に示されるように、抗ＩｇＥ添加の１０秒〜２０秒のうちに、顕著な［Ｃａ２＋］の増大が観測された。この増大は、ＩＲｐ６０の架橋に応答して完全になくなった［ｎ＝３］。
【０１２４】
実施例５
ＩＲｐ６０の架橋はＳＣＦ媒介によるＣＢＭＣ生存を阻害する
ＳＣＦはこれまで、ヒトマスト細胞のための最も重要な生存因子である。ＳＣＦのシグナル伝達は、ｃ−ｋｉｔに結合し、Ｓｒｃキナーゼおよびホスファチジルイノシトール−３−キナーゼのリン酸化を伴うシグナル伝達カスケードを開始したときにその作用を発揮する。ｃ−ｋｉｔのシグナル伝達を妨害するＩＲｐ６０の能力を調べるために、ＣＢＭＣを、架橋された抗ＩＲｐ６０被覆プレートにおいてＳＣＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］の存在下または非存在で培養し、その後、ヨウ化プロピジウム［ＰＩ］陽性細胞のＦＡＣＳ分析を行った。図５に示されるように、ＩＲｐ６０の架橋は両方の時点でマスト細胞の生存を著しく阻害した［２４時間および４８時間でそれぞれ、１０．０２±０．７９％および３７．６８±０．６９％のＰＩ＋細胞、これに対して、１．８３±０．３８％および３．６５±０．３３％のＰＩ＋細胞、ｐ＜０．００１］［ｎ＝３］。
【０１２５】
実施例６
ＩＲｐ６０はチロシンのリン酸化を受け、ＳＨＰ−１およびＳＨＩＰ−１を動員する
上記で述べられたように、ＮＫ細胞上におけるＩＲｐ６０の阻害性作用はＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２の動員を介して媒介される。ヒトマスト細胞上におけるＩＲｐ６０の阻害性活性の機構を明らかにするために、ＣＢＭＣをオルトバナジン酸ナトリウムで処理し、あるいは、架橋し、沈殿させ、ホスホチロシン、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２およびＳＨＩＰ−１についてブロットした。図６Ａに示されるように、オルトバナジン酸塩の前処理およびＩＲｐ６０の架橋を行ったとき、ＩＲｐ６０はチロシンのリン酸化を受けた。加えて、図６Ｂにおいて明らかにされるように、ＩＲｐ６０はＳＨＰ−１およびＳＨＩＰ−１と共沈殿し、ＳＨＰ−２とは共沈殿しなかった［ｎ＝３］。
【０１２６】
実施例７
ＩＲｐ６０はアレルギー性腹膜炎マウスモデルにおいてマスト細胞の活性化およびその後の炎症性応答を調節する
ＩＲｐ６０が、マスト細胞の活性化をインビボで調節する際において役割を有するかどうかを理解するために、アレルギー性炎症のマウスモデルを使用した。マスト細胞の役割が不明確である実験的な喘息プロトコルとは異なり、マウスのアレルギー性腹膜炎モデルにおけるマスト細胞の役割は十分に明らかにされている［Ｚｕａｎｙ−Ａｍｏｒｉｍ（１９９４）、同上同頁］。バイオインフォマティク分析により、ＬＭＩＲ１がＩＲｐ６０のマウス相同体であることが明らかにされた［データは示されず］。従って、本発明者らは、マウスのマスト細胞がＬＭＩＲ１を発現するかどうかを調べた。図７に示されるように、ＢＭＭＣおよび腹膜マスト細胞はともに著しいレベルのＬＭＩＲ１を発現する。続いて、ＬＭＩＲ１の調節作用を、この受容体を認識する中和抗体を加えることによって調べた。図８Ａに示されるように、マイクロモル濃度での抗ＬＭＩＲ１モノクローナル抗体で前処理されたマウスは、アレルゲンの抗原攻撃に対する応答において高まったマスト細胞活性化を示し、また、増大したトリプターゼレベルおよびβヘキソサミニダーゼレベルが腹膜洗浄液において測定された。加えて、図８Ｂに示されるように、腹膜洗浄における生じた好酸球性炎症が強くなり、全体的な好酸球性炎症が、オバルブミン処理マウス群およびオバルブミン／イソ型コントロール群に対する比較では増大していた。
【０１２７】
実施例８
ＩＲｐ６０がヒト好酸球において発現する
ヒトマスト細胞上における阻害性受容体の発現パターンを調べるために、様々な阻害性受容体を認識するｍＡｂの大きなパネルを使用するスクリーニング法を用いた。図９Ａに示されるように、ＦＡＣＳ分析により、好酸球が、高レベルのＩＲｐ６０、ｐ１４０、ＬＩＲ３／ＩＬＴ５およびＦｃγＲＩＩＢを発現し、ＬＩＭ１／ＩＬＴ２、ＬＩＲ３／ＩＬＴ５、ｐ５８．１、ｐ５８．２、ｐ７０またはＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４を発現していないことが明らかにされた（ｎ＝１０）。興味深いことに、分析された好酸球の３０％のみがｐ１４０を発現していた。
【０１２８】
成熟組織の好酸球がＩＲｐ６０を発現するかどうかを評価するために、鼻ポリープの好酸球をＩＲｐ６０発現について染色した。図９Ｂに示されるように、鼻ポリープの好酸球もまた同様に著しいレベルのＩＲｐ６０を発現する（ｎ＝３）。次に、これらの細胞を、この発現パターンが抗体依存的であるかどうかを調べるために、ＩＲｐ６０を認識する異なるｍＡｂ（すなわち、Ｐ１９２およびＥ５９）を用いてスクリーニングした。両方の抗体は、類似するレベルのＩＲｐ６０を末梢血好酸球および鼻ポリープ好酸球の表面において認識した（それぞれ、ｎ＝３および５）（データは示されず）。
【０１２９】
実施例９
ＩＲｐ６０はヒト好酸球のＩＬ−５媒介およびＧＭ−ＣＳＦ媒介の生存を阻害する
ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３は、好酸球の生物学における重要なサイトカインであり、「好酸球生存因子」と呼ばれることが多い。ヒトにおいて、低親和性のα鎖に結合したとき、３つのサイトカインのすべてが、それらのシグナル伝達経路を働かせる共通のβ鎖を動員する。このシグナル伝達経路はチロシンのリン酸化およびＳｒｃファミリーのキナーゼ（例えば、ＬｙｎおよびＳｙｋなど）の動員に依存する。従って、本発明者らは、ＩＲｐ６０が、これらのサイトカインが伝達する抗アポトーシス作用を調節し得るかどうかを評価することを目指した。このために、新しく単離された好酸球を抗ＩＲｐ６０またはイソ型一致コントロールおよびヒツジ抗マウスにより架橋した。その後、ＩＬ−５またはＧＭ−ＣＳＦを異なる濃度で様々な時点について加えた。図１０Ａおよび図１０Ｂに示されるように、ＩＲｐ６０はＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５の抗アポトーシス作用を阻害した（データは示されず）。例えば、１８時間のインキュベーションおよび５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦで、非処理群におけるアポトーシス細胞の割合は２３．１６±０．６５％であり、これに対して、ＧＭ−ＣＳＦで処理された細胞は１．２５±０．２３％でしかなかった。抗ＩＲｐ６０の架橋およびＧＭ−ＣＳＦにより処理された細胞は１５．６２±３．９％がアポトーシス性であった。この作用はまた、３６時間でも認められ、この場合、ＧＭ−ＣＳＦで処理された細胞は１３．８５±０．６％がアポトーシス性であり、ＩＲｐ６０で処理された細胞は３６．７±０．４５％がアポトーシス性であった。興味深いことに、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦの抗アポトーシス作用を阻害するＩＲｐ６０の能力は、両方の時点で、濃度が５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌに増大するに従って高まった（６．７±１．７％、９．４５±１．９５％、１５．６±３．９％、それぞれ、５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、１８時間、１９．６±０．２１％、２７．５±０．６３％、３６．７±０．４５％、それぞれ、５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、３６時間）。
【０１３０】
実施例１０
ＩＲｐ６０はヒト好酸球のＩＬ−５媒介およびＧＭ−ＣＳＦ媒介の活性化を阻害する
ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３はまた、好酸球を活性化することができる。従って、本発明者らは、ＩＲｐ６０の架橋が活性化因子様作用を同様に阻害するかどうかを調べた。図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるように、ＩＲｐ６０の架橋は、ＩＬ−８、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γのＧＭ−ＣＳＦ媒介による放出を完全に阻止した。
【０１３１】
実施例１１
ＩＲｐ６０はヒト好酸球のエオタキシン依存的走化性を阻害する
好酸球が炎症組織に移動することを調節する非常に重要な因子の１つがエオタキシンである。多くのことがエオタキシンのシグナル伝達に関して知られていないが、いくつかの報告では、エオタキシンがチロシンのリン酸化およびＳｒｃファミリーのキナーゼ（例えば、ＨｃｋおよびＦｇｒなど）の動員を誘導することが明らかにされている。従って、本発明者らは、ＩＲｐ６０が好酸球のエオタキシン依存的活性化を阻止し得るかどうかを評価した。２つのパラメーターを調べた（走化性および形状変化）。
【０１３２】
走化性アッセイ（図１２Ａ）のために、３ｘ１０５個の好酸球を、抗ＩＲｐ６０、抗ＣＣＲ３またはイソ型とインキュベーションし（すべて５μｇ／ｍＬで、氷上で３０分間）、その後、ヒツジ抗マウスとインキュベーションし（２５μｇ／ｍＬ、氷上で３０分間）、徹底的に洗浄した。細胞を１００μＬの体積の培地においてトランスウェルプレート（ポリカーボネートフィルター、３μｍの細孔、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ−Ｃｏｒｐ）の上部チャンバーに置き、ヒトエオタキシン（ＨＢＳＳ＋０．５％ＢＳＡにおいて）を、０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍＬで下部チャンバーに置いた。インキュベーション後、下部チャンバーにおける細胞をフローサイトメトリーによって計数した：相対的な細胞カウント数を、事象を６０秒間にわたって取得することによって得た。
【０１３３】
形状変化アッセイ（図１２Ｂ）のために、３ｘ１０５個の好酸球を、抗ＩＲｐ６０、抗ＣＣＲ３またはイソ型とインキュベーションし（すべて５μｇ／ｍＬで、氷上で３０分間）、その後、ヒツジ抗マウスとインキュベーションし（２５μｇ／ｍＬ、氷上で３０分間）、徹底的に洗浄した。エオタキシン誘導による好酸球の形状変化を、ゲート処理された自己蛍光／前方散乱（ＦＳＣ）を使用して評価した。このアッセイでは、差のある自己蛍光が、白血球タイプおよび変化をＦＳＣで特定して、アゴニストに対する応答での形状変化を測定するために使用される。簡単に記載すると、顆粒球を、デキストラン沈降、Ｐｅｒｃｏｌｌグラジエント遠心分離および低浸透圧赤血球溶解によって単離し、形状変化緩衝液（０．９ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／Ｌのグルコース、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳおよび０．１％のＢＳＡを伴うＰＢＳ）において３７℃で３０分間プレインキュベーションした。細胞を振とう水浴において３７℃でインキュベーションし、反応を、細胞を氷上に置き、形状変化緩衝液における冷たい４％パラホルムアルデヒドの６００μＬにより固定処理することによって停止させた。細胞をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーによってさらに分析した。好酸球をＦＬ２チャンネル（５８５ｎｍ）でのそれらの高い自己蛍光によって識別し、５０００細胞のＦＳＣを取得した。細胞形状における変化率を下記のように計算した：１００ｘ｛［ＦＳＣ（ケモカイン）−ＦＳＣ（培地）］／ＦＳＣ（培地）｝。阻害剤による前処理は基礎ＦＳＣを著しく変化させなかった。
【０１３４】
図１２Ａおよび図１２Ｂに示されるように、ＩＲｐ６０の架橋は、エオタキシンにより誘発される好酸球の走化性応答を阻害した（図１２Ａ）。加えて、ＩＲｐ６０はエオタキシン誘導による形状変化を完全に阻止した（図１２Ｂ）。
【０１３５】
実施例１２
ＩｇＥ−ＩＲｐ６０ＢｓＡｂの作製
ＢｓＡｂ作製プロセスの各工程をモニターするために、サンプルを、起こり得る物質喪失を評価するために、それぞれのゲルろ過の後で採取した。サンプルを、カップリング前の反応物Ｆａｂ’フラグメントおよびカップリング後のＦ（ａｂ’）２生成物を評価するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。図１３Ａに示されるように、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＦａｂ’反応物の１つを約５０ｋＤａにおいてカップリング前に示す。カップリング後、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、２つのＩｇＧサイズコントロールに隣接して、２つの約３７ｋＤａの重鎖フラグメントおよび２つの約２５ｋＤａの軽鎖に分離したＢｓＡｂを示す。ＩＥ１の二重特異性認識をＦＡＣＳによって評価した。図１３Ｂに示されるように、ＩＥ１は、ＩｇＥ感作のＲＢＬ細胞を、抗ヒトＩＲｐ６０とではなく、抗ヒトＩｇＥと同様に認識し、これに対して、新鮮なヒトマスト細胞を、抗ヒトＩｇＥとではなく、抗ヒトＩＲｐ６０と同様に認識した。作製プロセスの平均見かけ収率は約４０％であった。
【０１３６】
実施例１３
インビトロでのマスト細胞脱顆粒化の阻害
マスト細胞の活性化を阻害するＩＥ１の潜在的能力を評価するために、ＩｇＥ感作のヒトマスト細胞をＩＥ１または一致するイソ型コントロールとインキュベーションし、その後、抗ＩｇＥ抗体を使用して活性化した。図１４に示されるように、ＩＥ１はマスト細胞からのβ−ヘキソサミニダーゼの放出をほぼ完全に阻害した。
【０１３７】
実施例１４
インビボでのアレルギー性応答の阻害
単離されたヒトマスト細胞においてインビトロで認められた作用がまたインビボでも認められるかどうかを明らかにするために、マウスのＩｇＥおよびＬＭＩＲ１（マウスのＩＲｐ６０相同体）を認識するＢｓＡｂを作製した（これはＬＥ１と称される）。ＬＥ１またはその一致するイソ型コントロールを、２つのアレルギー性応答モデルにおいて動物にさらに投与した。アレルギー性腹膜炎では、図１５に示されるように、ＬＥ１は、アレルゲン攻撃の後、脱顆粒化途中の腹膜マスト細胞からのトリプターゼの放出を完全に阻害した。そのうえ、図１６Ａおよび図１６Ｂに示されるように、好酸球カウント数が、アレルゲン攻撃の前にＬＥ１により処理された群では劇的に低下した。このことは、より少ない好酸球がマスト細胞によって腹膜に動員されたことを意味する。受動的皮膚アナフィラキシーでは、ＬＥ１は、ヒスタミンに由来する色素漏出、および、皮膚マスト細胞からのロイコトリエン放出を完全に阻害した（図１７Ａ〜図１７Ｂ）。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】阻害性ＮＫ受容体についてのヒトマスト細胞のスクリーニングを示す。
【図１ｃｏｎｔ．】阻害性ＮＫ受容体についてのヒトマスト細胞のスクリーニングを示す。
【図２Ａ】ＩＲｐ６０がマスト細胞において発現することを示す。図２Ａ：ヒトマスト細胞はＩＲｐ６０を発現する。
【図２Ｂ】ＩＲｐ６０が好酸球において発現することを示す。図２Ｂ：ＩＲｐ６０の発現が好酸球の主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）によって調節される。
【図３】ＩＲｐ６０の架橋はＩｇＥ媒介による放出を阻害することを示す。図３Ａ：抗ＩＲｐ６０による刺激の後におけるＩｇＥ活性化ＣＢＭＣからのβ−ヘキソサミニダーゼおよびトリプターゼのパーセント放出。図３Ｂ：抗ＩＲｐ６０による刺激の後におけるＩｇＥ活性化ＣＢＭＣからのＩＬ−４のパーセント放出。
【図４】ＩＲｐ６０の架橋はＳＣＦ誘導によるＣＢＭＣの生存を阻害することを示す。
【図５】ＩＲｐ６０の架橋はＩｇＥ誘導による［Ｃａ２＋］流入を阻害することを示す。
【図６】ＩＲｐ６０チロシンリン酸化およびホスファターゼ動員を示す。図６Ａ：ＣＢＭＣをオルトバナジン酸ナトリウムで処理した。図６Ｂ：ＩＲｐ６０チロシンリン酸化は受容体架橋に依存的である。
【図７】マウスマスト細胞はＬＭＩＲ１を発現することを示す。
【図８Ａ−Ｂ】ＬＭＩＲ１の中和はアレルギー性腹膜炎のマウスモデルにおける強化されたマスト細胞活性化およびその後の好酸球浸潤をもたらすことを示す。図８Ａ：ＬＭＩＲ１の中和は抗原攻撃後４５分において腹膜トリプターゼレベルにおける劇的な増大をもたらした。図８Ｂ：ＬＭＩＲ１の中和は抗原攻撃後４５分において腹膜β−ヘキソサミニダーゼレベルにおける劇的な増大をもたらした。
【図８Ｃ−Ｄ】ＬＭＩＲ１の中和はアレルギー性腹膜炎のマウスモデルにおける強化されたマスト細胞活性化およびその後の好酸球浸潤をもたらすことを示す。図８Ｃ：増大した数の好酸球が、ＬＭＩＲ１中和後（抗原攻撃後２４時間）、腹膜腔に浸潤した。図８Ｄ：ＬＭＩＲ１の中和は抗原攻撃後２４時間において腹膜エオタキシン−２レベルにおける劇的な増大をもたらした。
【図９Ａ】ＩＲｐ６０がヒト好酸球において発現することを示す。図９Ａ：ヒトマスト細胞上における阻害性受容体の発現パターン。
【図９Ａｃｏｎｔ．】ＩＲｐ６０がヒト好酸球において発現することを示す。図９Ａ：ヒトマスト細胞上における阻害性受容体の発現パターン。
【図９Ｂ】図９Ｂ：鼻ポリープの好酸球は著しいレベルのＩＲｐ６０を発現する。左側のピークは、イソ型コントロールと一致した抗体に対応し、一方、右側のピークはＩＲｐ６０についての染色を示す。
【図１０】ＩＲｐ６０はヒト好酸球のｇＭ−ＣＳＦ媒介による生存を阻害することを示す。図１０Ａ：ＧＭ−ＣＳＦとの１８時間のインキュベーションの後。図１０Ｂ：ＧＭ−ＣＳＦとの３６時間のインキュベーションの後。
【図１１】ＩＲｐ６０はヒト好酸球のＧＭ−ＣＳＦ媒介による活性化を阻害することを示す。図１１Ａ：ＩＲｐ６０を架橋したときに著しく阻害された、ＩＬ−１β、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γのＧＭ−ＣＳＦ媒介による放出を示すヒストグラム。図１１Ｂ：ＩＲｐ６０を架橋したときに完全に阻止された、ＩＬ−８のＧＭ−ＣＳＦ媒介による放出を示すヒストグラム。
【図１２】ＩＲｐ６０はヒト好酸球のエオタキシン依存的走化性を阻害することを示す。図１２Ａ：グラフは、エオタキシンの異なる濃度に向かって移動した、抗ＩＲｐ６０、抗ＣＣＲ３、イソ型（Ｉｓｏ）または富化培地単独（ＥＭ）による処理の後における好酸球の数を示す。図１２Ｂ：ヒストグラムは、抗ＩＲｐ６０、抗ＣＣＲ３、イソ型（Ｉｓｏ）または富化培地単独（ＥＭ）とのインキュベーションの後、ＦＡＣＳによって測定された、好酸球におけるエオタキシン誘導による形状変化を示す。
【図１３】二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの作製および特徴づけを示す。図１３Ａ：起こり得る物質損失をモニターするために、二重特異性Ｆ（ａｂ’）の合成における各段階から得られたサンプルを非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した［Ｆａｂ’作製：ｋＤａ、サイズマーカー；ＩｇＧ、出発抗体；ｉｎｔ、３回のゲルろ過からのサンプル；Ｆａｂ’、カップリングのための準備ができた得られたＦａｂ’フラグメント］。図１３Ｂ：ＦＡＣＳによるＢｓＡｂ二重特異性の評価。
【図１４】ＩＥ１はインビトロでＩｇＥ誘導によるマスト細胞脱顆粒化を阻害することを示す。
【図１５】ＬＥ１はアレルギー性腹膜炎のマウスモデルにおいてトリプターゼ放出を阻害することを示す。図１５Ａ：オバルブミン感作マウスに３μｇのＬＥ１またはイソ型コントロールを注射し、続いて、３０分後にオバルブミンにより抗原攻撃した。図１５Ｂ：ＬＥ１はアレルギー性腹膜炎のマウスモデルにおいてエオタキシン−２放出を阻害する。
【図１６Ａ】ＬＥ１はアレルギー性腹膜炎のマウスモデルにおいて好酸球の動員を阻害することを示す。図１６Ａ：ＦＡＣＳ分析を、腹膜腔における好酸球の割合を定量するために行った。
【図１６Ｂ】ＬＥ１はアレルギー性腹膜炎のマウスモデルにおいて好酸球の動員を阻害することを示す。図１６Ｂ：ＦＡＣＳ分析で得られた結果を表すヒストグラム［Ｓａｌｉｎｅ、生理的食塩水攻撃のマウス；ＯＶＡ、オバルブミン攻撃のマウス；ＬＥ１、ＬＥ１による前処理、その後、オバルブミン攻撃；Ｉｓｏ、イソ型による前処理、その後、オバルブミン攻撃］。
【図１７】ＬＥ１は受動的皮膚アナフィラキシーのマウスモデルにおいてマスト細胞の脱顆粒化を阻害することを示す。図１７Ａ：青色色素スポットアッセイを示す皮膚の区域。図１７Ｂ：異なる試料を用いた図１７Ａと同じ図。
【図１】
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【図１ｃｏｎｔ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ−Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ａｃｏｎｔ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年5月15日(2006.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のものを含む、二重特異性抗体またはその任意の機能的フラグメント：
（ｉ）阻害性受容体ＩＲｐ６０またはその相同体に特異的に結合する第１の標的認識成分；および
（ｉｉ）マスト細胞、好酸球および／または好塩基球に対して特異的なマーカーに特異的に結合する第２の標的認識成分。
【請求項２】
前記抗体が前記細胞に結合することにより、アレルギー性反応が阻害される請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
前記第１および第２の標的認識成分は、架橋剤、リンカー化合物、キャリア、合成スペーサー、固定化基質、および、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３モチーフに基づく柔軟な領域のいずれか１つを介して連結される請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
前記第１および第２の標的認識成分は架橋される請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
前記マーカーは、免疫グロブリン、Ｆｃ受容体、サイトカイン受容体、増殖因子受容体、接着分子、Ｉｇスーパーファミリー受容体、ケモカイン受容体、炎症性媒介因子受容体、ホルモン受容体、補体因子受容体、プロテアーゼにより活性化された受容体、および、酵素からなる群から選択されることができる請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
前記認識成分は、天然に存在する抗体、合成抗体または組換え抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二機能性ｓｃＦｖ、ジアボディー、Ｆ（ａｂ）ユニット、Ｆ（ａｂ’）ユニット、二重特異性Ｆ（ａｂ’）コンジュゲート、化学的に架橋された二機能性抗体、線状抗体、抗体のＦ（ａｂ’）２抗原結合性フラグメント、あるいはそれらの任意の機能性フラグメントのいずれか１つから選択される請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
前記認識成分はＦ（ａｂ’）ユニットである請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
前記マーカーは、ＩｇＥ、ｃＫＩＴ、ＩＬ−５Ｒ、ＣＣＲ３およびＦｃεＲＩのいずれかである請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
以下のものを含む、二重特異性抗体またはその任意の機能的フラグメント：
（ｉ）阻害性受容体ＩＲｐ６０またはその相同体に特異的に結合する第１の標的認識成分；および
（ｉｉ）ＩｇＥに特異的に結合する第２の標的認識成分。
【請求項１０】
以下のものを含む、二重特異性抗体またはその任意の機能的フラグメント：
（ｉ）阻害性受容体ＩＲｐ６０またはその相同体に特異的に結合する第１の標的認識成分；および
（ｉｉ）ｃＫＩＴに特異的に結合する第２の標的認識成分。
【請求項１１】
以下のものを含む、二重特異性抗体またはその任意の機能的フラグメント：
（ｉ）阻害性受容体ＩＲｐ６０またはその相同体に特異的に結合する第１の標的認識成分；および
（ｉｉ）ＦｃεＲＩに特異的に結合する第２の標的認識成分。
【請求項１２】
以下のものを含む、二重特異性抗体またはその任意の機能的フラグメント：
（ｉ）阻害性受容体ＩＲｐ６０またはその相同体に特異的に結合する第１の標的認識成分；および
（ｉｉ）ＣＣＲ３に特異的に結合する第２の標的認識成分。
【請求項１３】
以下のものを含む、二重特異性抗体またはその任意の機能的フラグメント：
（ｉ）阻害性受容体ＩＲｐ６０またはその相同体に特異的に結合する第１の標的認識成分；および
（ｉｉ）ＩＬ−５Ｒに特異的に結合する第２の標的認識成分。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を活性な薬剤として含む医薬組成物。
【請求項１５】
緩衝剤、添加剤、安定化剤、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
マスト細胞および／または好酸球および／または好塩基球に関連した任意の疾患または状態を治療するための医薬組成物の調製における請求項１〜１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の少なくとも一つの使用。
【請求項１７】
前記疾患は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎およびアトピー性湿疹、様々なアレルゲンに対するアレルギー性の障害および応答、全身性アナフィラキシー、全身性肥満細胞過剰増殖、限局性強皮症／色素性じんま疹、マスト細胞白血病、アテローム性動脈硬化、移植片拒絶、多発性硬化症、線維形成性肺疾患、神経線維腫症、ケロイド、強皮症、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、急性痛風、眼の瘢痕性類天疱瘡、クローン病、腹膜癒着、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、好酸球増多筋痛症候群、気管支喘息、鼻ポリープ症、ヴェーゲナー肉芽腫症、間質性肺疾患および他の肺疾患、慢性好酸球性肺炎、過敏性肺臓炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、類肉腫症、特発性肺線維症、新生物疾患および骨髄増殖性疾患、Ｔ細胞リンパ腫およびホジキン病からなる群から選択される請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
好酸球の過活性または過形成に由来する任意の疾患または状態の治療における使用のための請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記状態は、外因性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、オンコセルカ皮膚炎、アトピー性皮膚炎、鼻ポリープ症、小結節、好酸球増加症、リウマチ、皮膚炎および腫れ（ＮＥＲＤＳ）、脈管炎性肉芽腫性疾患、一時的脈管炎、チャーグ・ストラウス症候群、多関節炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性硬化症、移植片拒絶、気管支喘息、間質性肺疾患および他の肺疾患、好酸球性胸膜滲出、一過性肺好酸球浸潤物（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ）、組織球症、慢性好酸球性肺炎、過敏性肺臓炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、特発性肺線維症、局所的好酸球増加症、ネコひっかき病、無熱性結核、幼児期におけるクラミジア肺炎、新生物疾患および骨髄増殖性疾患、気管支原性ガン、好酸球増加症候群、Ｔ細胞リンパ腫およびホジキン病、クローン病、春季角結膜炎母斑、若年性炎症結膜炎母斑、木村病、グレイヒ病からなる群から選択される請求項１６に記載の使用。
【国際調査報告】
2007537157.tif 000025
2007537157.tif 000026
2007537157.tif 000027
2007537157.tif 000028
2007537157.tif 000029