(57)【要約】  富化された膵臓幹細胞および前駆細胞集団、ならびに細胞表面マーカーに結合する試薬を用いて、膵臓幹細胞を同定、単離および富化するための方法が提供される。
2007503815.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された膵臓組織に由来する集団を産生する方法であって：
ａ）膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞を、ＣＤ１３３またはＣＤ４９ｆを認識するモノクローナル抗体に接触させること；次いで
ｂ）該モノクローナル抗体に結合する膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞を選択すること； 
を含んでなる方法であり、選択された細胞が、ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化される、方法。
【請求項２】
膵臓幹／前駆細胞を含む集団が浮遊培養または接着培養から得られる、請求項１の方法。
【請求項３】
膵臓幹／前駆細胞を含む集団が膵臓組織を生じる任意の組織から得られる、請求項１の方法。
【請求項４】
膵臓幹／前駆細胞を含む集団が初代の胃腸組織または胃腸に由来する外植片から得られる、請求項１の方法。
【請求項５】
ｃ）選択された細胞を、ＣＤ３４またはＣＤ４５を認識する第二のモノクローナル抗体に接触させること；次いで
ｄ）ＣＤ３４＋またはＣＤ４５＋である細胞を除去すること；
により、膵臓または胃腸組織に由来する集団を、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについてさらに富化する工程をさらに含んでなる方法であって、ここで、集団中に残存する細胞はＣＤ３４−またはＣＤ４５−であり、そして膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化される、請求項１の方法。
【請求項６】
膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞が、抗−ＣＤ３４モノクローナル抗体もしくは抗−ＣＤ４５モノクローナル抗体に接触され、そして結合した細胞が工程ａ）の接触前に除去される、請求項１の方法。
【請求項７】
ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生するための方法であって、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団から、ＣＤ１３３＋またはＣＤ４９ｆ＋またはＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋である細胞を選択することを含んでなる、方法。
【請求項８】
選択が、細胞集団をモノクローナル抗体ＡＣ１３３などの抗−ＣＤ１３３抗体に接触させて、そして抗−ＣＤ１３３抗体に結合しない細胞を除去することにより達成される、請求項７の方法。
【請求項９】
選択が、細胞集団をモノクローナル抗体ＧｏＨ３およびモノクローナル抗体４Ｆ１０からなる群より選択される抗−ＣＤ４９ｆ抗体に接触させて、そして抗−ＣＤ４９ｆ抗体に結合しない細胞を除去することにより達成される、請求項７の方法。
【請求項１０】
ＣＤ３４＋である細胞を、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の残存集団から除去することにより、膵臓組織から得られた集団を膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについてさらに富化する工程をさらに含んでなる、請求項８または９の方法。
【請求項１１】
ＣＤ３４を認識するモノクローナル抗体に結合する細胞を除去することにより、集団をさらに富化する工程をさらに含んでなる、請求項１０の方法。
【請求項１２】
ＣＤ４５＋である細胞を、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の残存集団から除去することにより、膵臓組織から得られた集団を膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについてさらに富化する工程をさらに含んでなる、請求項８または９の方法。
【請求項１３】
ＣＤ４５を認識するモノクローナル抗体に結合する細胞を除去することにより、集団をさらに富化する工程をさらに含んでなる、請求項１２の方法。
【請求項１４】
膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団から、膵臓幹細胞または前駆細胞の画分の集団について富化するための方法であって、モノクローナル抗体ＡＣ１３３との結合により、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞から、ＣＤ１３３を発現する細胞を選択することを含んでなり、ここで、選択された細胞は、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団と比べて、膵臓幹細胞の画分において富化される、方法。
【請求項１５】
膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団を、膵臓幹細胞または前駆細胞の画分について富化するための方法であって、モノクローナル抗体ＧｏＨ３またはモノクローナル抗体４Ｆ１０との結合により、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞から、ＣＤ４９ｆを発現する細胞を選択することを含んでなり、ここで、選択された細胞は、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団と比べて、膵臓幹細胞の画分において富化される、方法。
【請求項１６】
ＣＤ３４＋である細胞を除去することにより、初代の組織に由来する膵臓幹細胞の画分についてさらに富化する工程をさらに含んでなる、請求項１４または１５の方法。
【請求項１７】
ＣＤ４５＋である細胞を除去することにより、初代の組織に由来する膵臓幹細胞の画分についてさらに富化する工程をさらに含んでなる、請求項１４または１５の方法。
【請求項１８】
ＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋である細胞を除去することにより、初代の組織に由来する膵臓幹細胞の画分についてさらに富化する工程をさらに含んでなる、請求項１４または１５の方法。
【請求項１９】
膵臓幹細胞を初代の膵臓組織から単離するための方法であって：
ａ）膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または胃腸に由来する細胞の集団から、ＣＤ１３３＋またはＣＤ４９ｆ＋またはＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋である細胞を選択すること；
ｂ）ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋またはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋である細胞を除去すること、ここで、残存する細胞はＣＤ３４−、ＣＤ４５−またはＣＤ３４−ＣＤ４５−であり；
ｃ）工程ｂ）の後に残存する細胞を、１またはそれ以上の成長因子を含有する無血清培養培地へ導入すること；次いで
ｄ）培養培地中に残存する細胞を増殖させること；
を含んでなる方法。
【請求項２０】
ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生するための方法であって、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞から、モノクローナル抗体ＡＣ１３３などの、ＣＤ１３３＋であり、かつ抗−ＣＤ１３３抗体に結合する細胞を選択して、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生することを含んでなり、選択は固相への結合および固相からの脱結合によるものである、方法。
【請求項２１】
ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生するための方法であって、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞から、ＣＤ４９ｆ＋であり、かつモノクローナル抗体ＧｏＨ３およびモノクローナル抗体４Ｆ１０からなる群より選択される抗−ＣＤ４９ｆ抗体に結合する細胞を選択して、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生することを含んでなり、選択は固相への結合および固相からの脱結合によるものである、方法。
【請求項２２】
モノクローナル抗体ＧｏＨ３またはモノクローナル抗体４Ｆ１０へ特異的に結合するＣＤ４９ｆ抗原に特異的に結合する、抗体。
【請求項２３】
抗体がハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体である、請求項２２の抗体。
【請求項２４】
モノクローナル抗体が、ＧｏＨ３抗体または４Ｆ１０抗体により検出されるようなＣＤ４９ｆ抗原へ結合する、請求項２３記載の抗体。
【請求項２５】
モノクローナル抗体ＡＣ１３３へ特異的に結合するＣＤ１３３抗原に特異的に結合する、抗体。
【請求項２６】
抗体がハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体である、請求項２５の抗体。
【請求項２７】
モノクローナル抗体が、ＡＣ１３３抗体により検出されるようなＣＤ１３３抗原へ結合する、請求項２６記載の抗体。
【請求項２８】
ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化するための方法であって：
ａ）膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団を、ＣＤ１３３抗原、ＣＤ４９ｆ抗原またはＣＤ１３３およびＣＤ４９ｆ抗原の両方に特異的に結合する試薬と合わせること；次いで
ｂ）その試薬に結合する細胞を選択すること；
を含んでなる方法であり、選択された細胞は、該集団と比べて、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化される、方法。
【請求項２９】
試薬が少なくとも一の抗体である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生するための方法であって、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞から、ＣＤ１３３を発現し、かつモノクローナル抗体ＡＣ１３３に結合する細胞を選択して、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生することを含んでなる、方法。
【請求項３１】
ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生するための方法であって、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞から、ＣＤ４９ｆを発現し、かつモノクローナル抗体ＧｏＨ３またはモノクローナル抗体４Ｆ１０へ結合する細胞を選択して、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生することを含んでなる、方法。
【請求項３２】
抗体がモノクローナル抗体ＧｏＨ３である、請求項３１の方法。
【請求項３３】
抗体がモノクローナル抗体４Ｆ１０である、請求項３１の方法。
【請求項３４】
抗体がモノクローナル抗体ＡＣ１３３である、請求項３０の方法。
【請求項３５】
膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞を含む集団が、浮遊培養、接着単層培養、膵臓外植片または胃腸外植片から得られる、請求項１の方法。
【請求項３６】
膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞を含む集団が、初代の膵臓組織または初代の胃腸組織から得られる、請求項１の方法。
【請求項３７】
ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生するための方法であって、ここで、該集団は初代の膵臓組織から得られるものであり、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団から、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４９ｆ＋またはＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋である細胞を選択することを含んでなる方法であって、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−またはＣＤ３４−ＣＤ４５−である細胞をさらに選択することにより、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについてさらに富化する工程をさらに含んでなる、方法。
【請求項３８】
膵臓幹細胞を単離するための方法であって：
ａ）初代の膵臓組織の集団から、ＡＣ１３３、ＧｏＨ３および４Ｆ１０からなる群より選択されたモノクローナル抗体に結合する少なくとも１個の選択された細胞を選択すること、ここで、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団からの選択を含み；
ｂ）少なくとも１個の選択された細胞を、１またはそれ以上の成長因子を含有する無血清培養培地へ導入すること；次いで
ｃ）その培養培地中で少なくとも１個の選択された細胞を増殖させること；
を含んでなる方法。
【請求項３９】
初代の膵臓組織を含む集団が浮遊培養または接着培養から得られる方法であって、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団からの選択を含む、請求項３８の方法。
【請求項４０】
初代の膵臓組織が、ヒト胎児、新生児、未成体、成体の膵臓組織から得られる方法であって、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団からの選択を含む、請求項３８の方法。
【請求項４１】
ｄ）選択された細胞を、ＣＤ３４抗原またはＣＤ４５抗原に結合する第二のモノクローナル抗体に接触させること；次いで
ｅ）ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋またはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋である細胞を集団から除去すること； 
により、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて集団をさらに富化する工程をさらに含んでなる方法であって、集団中に残存する細胞は、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化される、請求項３８の方法。
【請求項４２】
初代の膵臓組織が、ＣＤ３４抗原に結合するモノクローナル抗体またはＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体に接触され、かつ結合した細胞が工程ａ）の接触前に除去される方法であって、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団からの選択を含む、請求項３８の方法。
【請求項４３】
ヒト膵臓系譜に決定された前駆細胞および成熟細胞について富化された、膵臓組織に由来する集団を産生する方法であって、
ａ）膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または胃腸に由来する細胞を、ＣＤ９に結合するモノクローナル抗体に接触させること；次いで
ｂ）モノクローナル抗体に結合する初代の膵臓組織を選択すること、ここで、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団からの選択を含む；
を含んでなる方法であって、選択されたＣＤ９＋細胞が、インスリン＋β細胞へ分化し得るヒト膵臓系譜に決定された前駆細胞または成熟細胞について富化される、方法。
【請求項４４】
ｃ）選択された細胞をＣＤ１５へ結合する第二のモノクローナル抗体へ接触させること；次いで
ｄ）ＣＤ１５＋である細胞を除去すること；
により、膵臓組織に由来する集団を、ヒト膵臓系譜に決定された前駆細胞についてさらに富化する工程をさらに含んでなる方法であって、ここで、集団中に残存する細胞が、ＣＤ１５−であり、そしてインスリン＋β細胞へ分化し得るヒト膵臓系譜に決定された前駆細胞について富化される、請求項４３の方法。
【請求項４５】
初代の膵臓組織が抗−ＣＤ１５モノクローナル抗体に接触され、そして結合した細胞が工程ａ）の接触前に除去される方法であって、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団からの選択を含む、請求項４３の方法。
【請求項４６】
ヒト膵臓系譜に決定された前駆細胞について富化された集団を産生するための方法であって、初代の膵臓組織の集団から、ＣＤ４９ｆ＋＋ＣＤ９＋またはＣＤ１３３＋ＣＤ９＋である細胞を選択することを含んでなる方法であり、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団からの選択を含む、方法。
【請求項４７】
初代の膵臓組織から膵臓幹細胞を単離するための方法であって：
ａ）膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または胃腸に由来する細胞の集団から、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４９ｆ＋またはＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋である細胞を選択すること；
ｂ）ＣＤ１５＋である細胞を除去すること、ここで、残存する細胞はＣＤ１５−であり；
ｃ）工程ｂ）の後に残存する細胞を、１またはそれ以上の成長因子を含有する無血清培養培地へ導入すること；次いで
ｄ）培養培地中に残存する細胞を増殖させること；
を含んでなる方法。
【請求項４８】
ヒト膵臓幹細胞について富化された集団を産生するための方法であって、ここで、集団は初代の組織から得られるものであり、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４９ｆ＋またはＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋である、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団からの選択を含んでなる方法であって、ＣＤ１５−である細胞をさらに選択することにより、膵臓幹細胞についてさらに富化する工程をさらに含んでなる、方法。
【請求項４９】
ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋である、膵臓幹細胞。
【請求項５０】
前駆細胞がＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９＋である、内分泌β−細胞系譜に決定された膵臓前駆細胞。
【請求項５１】
前駆細胞がＣＤ１５−でもある、請求項５０の、内分泌β−細胞系譜に決定された膵臓前駆細胞。
【請求項５２】
前駆細胞がＣＤ４９ｆ＋である、内分泌β−細胞系譜に決定された膵臓前駆細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
一般的には、本発明は、富化された膵臓幹細胞および前駆細胞集団、ならびに膵臓幹および前駆細胞を同定、単離および富化するための方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
米国には約１０３０万人の糖尿病と診断された患者がおり、そして７９８、０００件の新たな症例が毎年診断されている。糖尿病には２つの主要な型がある：Ｉ型または未成人で発症する糖尿病、およびＩＩ型または成人で発症する糖尿病。全症例の５−１０％を占めるＩ型糖尿病は、身体が自身のインスリン産生細胞を攻撃および破壊する、自己免疫疾患である。
【０００３】
糖尿病患者のために選択される処置は、症例の重篤度に従い異なる。Ｉ型糖尿病患者は、通常、インスリンを毎日数回注射する必要がある。糖尿病患者は、糖尿病でない人々と比べて２ないし４倍も心臓発作により死亡しやすくまたは脳卒中を被りやすい。彼らは、腎臓疾患、神経系疾患および失明を含む、多数の他の疾患を被る増大した危険性も有する。米国におけるＩ型糖尿病への年間総費用は、直接的な医療費、ならびに身体障害および労働損失などの間接的な費用において、５０億ドルと見積もられている。
【０００４】
幹細胞およびその前駆細胞を用いる細胞治療は、大部分は満たされていない、この医療ニーズに対処し得る、有望な新しいアプローチである。幹細胞分野を取り巻く大きな出来事は、これらの細胞の特有な生物学的性質：自身で再生し、かつ属する器官を構成する細胞型となり得る能力に基づく。
【０００５】
幹細胞集団は、身体中の全細胞数のうちわずかな割合しか占めていないが、身体を再構成する能力のために非常に興味深い。幹細胞の寿命および幹細胞の子孫の散在（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）は望ましい特徴である。幹細胞は多数の臨床用途を有するので、これらの方法には有意な商業的利益がある。遺伝子治療のための媒体としての幹細胞の使用には医療的利益もある。
【０００６】
幹細胞および前駆細胞集団上で見出された蛋白質および他の細胞表面マーカーは、これらの集団の分離および単離のための試薬を調製する際に有用である。細胞表面マーカーは、これらの重要な細胞をさらに特徴付ける際にも有用である。
【０００７】
膵臓幹細胞により発現される「特有の」遺伝子産物の同定は、これらの重要な細胞の理解を広げ、インビボにてそれらを同定する際に役立ち、そして研究および用途のためにインビトロにおける積極的な富化を可能にするだろう。一の有用なマーカーは、幹細胞の局在化および純化を可能とする細胞表面分子であろう。故に、ヒト非造血系前駆細胞および幹細胞、そして特に膵臓幹細胞および前駆細胞を単離および特徴付ける際に有用である、モノクローナル抗体などのツールが依然として必要とされている。
【０００８】
（発明の概略）
本発明は、ヒト非造血系前駆細胞および幹細胞、そして特に、グルコース応答性インスリン分泌細胞を含む、膵臓系譜の体細胞へ分化し得る膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせを同定、単離および富化するための方法を提供する。本発明は、膵臓幹細胞および前駆細胞を含む富化された集団も提供する。
【０００９】
非造血系幹細胞および前駆細胞、好ましくは、膵臓幹細胞および／または前駆細胞の富化された集団、ならびにかかる細胞を同定、単離または富化する方法は、少なくとも１個の幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４９ｆ（「抗−ＣＤ４９ｆ抗体」）に特異的に結合する抗体により認識されている表面マーカー糖蛋白質抗原（「ＣＤ４９ｆ抗原」）、或いはＣＤ１３３（「抗−ＣＤ１３３抗体」）と特異的に結合する抗体により認識されている細胞表面マーカー抗原（「ＣＤ１３３抗原」）に結合する試薬と接触させることにより、達成される。本明細書中、用語「試薬」は、一の抗原と結合するか、関連するか、またはそれを認識し得る任意の組成物または化合物を包含することが意図される。かかる試薬の例は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、小分子、受容体、リガンド、蛋白質、蛋白質フラグメント、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、核酸、核酸フラグメント、抗体フラグメントおよび当業者に知られている任意の他の「試薬」を包含するが、これらに限定されない。
【００１０】
本明細書に記載する方法は、膵臓細胞または胃腸細胞の集団を膵臓幹細胞もしくは前駆細胞または胃腸幹細胞もしくは前駆細胞について富化するための、ＣＤ４９ｆ抗原および／またはＣＤ１３３抗原の使用に言及しているが、当業者は、膵臓幹細胞もしくは前駆細胞上に存在する任意の他の細胞表面マーカーも本発明の方法において用いられ得ることを認めるだろう。さらに、当業者は、任意の適当な細胞表面マーカーが、任意の順番および／または任意の組み合わせで用いられ得ることを認めるだろう。ＣＤ１３３＋細胞は、ＣＤ１３３抗原を含む細胞として定義され、そしてＣＤ４９ｆ＋細胞は、ＣＤ４９ｆ抗原を含む細胞として定義される。さらに、当業者は、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ１３３および／または抗原の任意の組み合わせが、任意の順番で、膵臓幹細胞について富化された膵臓細胞の集団を産生するために用いられ得ることを認めるだろう。当業者は、抗−ＣＤ１３３および／または抗−ＣＤ４９ｆ抗体に対する任意の記載が、ヒト、ネズミ、ラット、ヒツジ、ウマ、ヤギ、トリ、ウサギ、モルモットおよび／またはブタ抗体を包含することも認めるだろう。
【００１１】
免疫選択（例えばＦＡＣＳ）などによる、細胞選別のための伝統的な技法を用いることにより、試薬とＣＤ４９ｆ抗原および／またはＣＤ１３３抗原の間の接触が検出された細胞を同定、単離および／または富化することが可能となる。試薬は、抗−ＣＤ４９ｆ抗体（２つのかかる抗−ＣＤ抗体は本明細書中「ＧｏＨ３」および「４Ｆ１０」と言う）または抗−ＣＤ１３３抗体（１つのかかる抗−ＣＤ１３３抗体は本明細書中「ＡＣ１３３」と言う）であり得る。
【００１２】
本発明は、非造血系幹細胞および前駆細胞、好ましくは、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせの富化された集団を提供するために、抗体を用いる方法も提供し、該抗体は、少なくとも１個の幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、抗−ＣＤ４９ｆ抗体または抗−ＣＤ１３３抗体と接触させることにより、かかる細胞を同定、単離または富化するための方法において用いられてもよい。本発明の方法は、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞を、例えば抗体などの適当な試薬に接触させることにより、ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化するために用いられ得る。
【００１３】
本発明の細胞、好ましくは、膵臓幹細胞もしくは前駆細胞は、ＣＤ４５およびＣＤ３４を欠失している細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４５−およびＣＤ３４−表現型）としてさらに特徴付けられる。そのようなものとして、純化された集団は、ＣＤ４５−およびＣＤ３４−である細胞を、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞から除去するか、或いはＣＤ４５＋およびＣＤ３４＋である細胞を選択することにより獲得され得る。
【００１４】
ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された膵臓組織に由来する集団を産生する方法が提供される。かかる方法は、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞を、ＣＤ１３３またはＣＤ４９ｆを認識するモノクローナル抗体に接触させ、そしてモノクローナル抗体に結合した、前記した膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞を選択する工程を含み、ここで、選択された細胞は、ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化されている。膵臓幹／前駆細胞を含む集団は、浮遊培養もしくは接着培養、膵臓組織を生じる任意の組織、および／または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する外植片から得られる。
【００１５】
さらに、かかる方法は、選択された細胞をＣＤ３４もしくはＣＤ４５を認識する第二のモノクローナル抗体に接触させ；そしてＣＤ３４＋またはＣＤ４５＋である細胞を除去することにより、膵臓または胃腸組織由来の集団を、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについてさらに富化させる工程も包含してよく、ここで、集団中に残存する細胞は、ＣＤ３４−もしくはＣＤ４５−であり、かつ膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化されている。さらに、当業者は、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞が、抗−ＣＤ３４モノクローナル抗体もしくは抗−ＣＤ４５モノクローナル抗体に接触され、そして結合した細胞が、ＣＤ１３３もしくはＣＤ４９ｆを認識するモノクローナル抗体との接触前に除去されることを認めるだろう。
【００１６】
本発明は、ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生するための方法であって、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団から、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４９ｆ＋もしくはＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋である細胞を選択することを含んでなる方法も提供する。かかる選択は、細胞集団をモノクローナル抗体ＡＣ１３３などの抗−ＣＤ１３３抗体に接触させ、そして抗−ＣＤ１３３抗体と結合しない細胞を除去することによるか、或いは、細胞集団をモノクローナル抗体ＧｏＨ３およびモノクローナル抗体４Ｆ１０からなる群より選択される抗−ＣＤ４９ｆ抗体に接触させ、そして抗−ＣＤ４９ｆ抗体に結合しない細胞を除去することにより、達成されてもよい。残存する集団は、ＣＤ３４＋である細胞（すなわち、ＣＤ３４を認識するモノクローナル抗体に結合する細胞）を除去することによるか、および／またはＣＤ４５＋である細胞（すなわち、ＣＤ３４を認識するモノクローナル抗体に結合する細胞）を除去することにより、さらに富化され得る。
【００１７】
本発明は、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団から、膵臓幹細胞もしくは前駆細胞の画分について富化するための方法であって、モノクローナル抗体ＡＣ１３３との結合により、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞から、ＣＤ１３３を発現する細胞を選択することを含んでなり、ここで、選択された細胞は、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団と比べて、膵臓幹細胞の画分において富化される、方法も提供する。さらに、この画分は、ＣＤ３４＋である細胞を除去することにより、および／またはＣＤ４５＋である細胞を除去することにより、さらに富化され得る。
【００１８】
さらに、膵臓幹細胞もしくは前駆細胞の画分について富化させるための方法であって、モノクローナル抗体ＧｏＨ３もしくはモノクローナル抗体４Ｆ１０に結合させることにより、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞から、ＣＤ４９ｆを発現する細胞を選択することを含んでなり、ここで、選択された細胞は、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団と比べて、膵臓幹細胞の画分において富化される、方法が提供される。さらに、この画分は、ＣＤ３４＋である細胞を除去することにより、および／またはＣＤ４５＋である細胞を除去することにより、さらに富化され得る。
【００１９】
初代の膵臓組織から膵臓幹細胞を単離するための方法は、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞もしくは胃腸に由来する細胞から、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４９ｆ＋もしくはＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋である細胞を選択し、そしてＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋もしくはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋である細胞を除去し、ここで、残存する細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−もしくはＣＤ３４−ＣＤ４５−であり；残存する細胞を、１またはそれ以上の成長因子を含有する無血清培養培地へ導入し；そして培養培地中に残存する細胞を増殖させる、工程を含んでもよい。
【００２０】
本発明は、ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生するための方法であって、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞から、ＣＤ１３３＋であり、かつモノクローナル抗体ＡＣ１３３などの抗−ＣＤ１３３抗体に結合する細胞を選択して、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生することを含んでなる方法も提供し、ここで、選択は固相への結合および固相からの脱結合による。同様に、かかる方法は、ＣＤ４９＋であり、かつモノクローナル抗体ＧｏＨ３およびモノクローナル抗体４Ｆ１０からなる群より選択された抗−ＣＤ４９ｆ抗体に結合する細胞を選択することを含んでもよい。
【００２１】
本発明は、モノクローナル抗体ＧｏＨ３もしくはモノクローナル抗体４Ｆ１０に特異的に結合するＣＤ４９ｆ抗原へ特異的に結合する抗体も提供する。このモノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞株により産生されてもよく、そしてＧｏＨ３抗体もしくは４Ｆ１０抗体により検出されるようなＣＤ４９ｆ抗原を認識してもよい。同様に、モノクローナル抗体ＡＣ１３３に特異的に結合するＣＤ１３３抗原に特異的に結合する抗体も提供される。このモノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞株により産生されてもよく、そしてＡＣ１３３抗体により検出されるようなＣＤ１３３抗原を認識してもよい。
【００２２】
さらに、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団を、ＣＤ１３３抗原、ＣＤ４９ｆ抗原もしくはＣＤ１３３およびＣＤ４９ｆ抗原の両方に特異的に結合する試薬と合わせること；そして、その試薬に結合する細胞を選択すること、ここで、選択された細胞は、集団と比べて、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化されている；により、ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化するための方法が提供される。例えば、試薬は少なくとも１つの抗体であってもよい。
【００２３】
膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞から、ＣＤ１３３を発現し、かつモノクローナル抗体ＡＣ１３３に結合する細胞（またはＣＤ４９ｆを発現し、かつモノクローナル抗体ＧｏＨ３もしくは４Ｆ１０に結合する細胞）を選択して、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生することにより、ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生するための方法も提供される。
【００２４】
本明細書中に記載する任意の方法において、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞を含む集団は、浮遊培養、接着単層培養、膵臓の外植片、胃腸の外植片、初代の膵臓組織または初代の胃腸組織から得られる。
【００２５】
さらに、ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化された集団を産生するための方法であって、ここで、該集団は、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団から、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４９ｆ＋またはＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋である細胞を選択することにより、初代の膵臓組織から得られるものであり、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−もしくはＣＤ３４−ＣＤ４５−である細胞をさらに選択することにより、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについてさらに富化する工程をさらに含んでなる方法が包含される。
【００２６】
膵臓幹細胞の単離は、初代の膵臓組織の集団から、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団から、ＡＣ１３３、ＧｏＨ３および４Ｆ１０から成る群より選択されたモノクローナル抗体に結合する少なくとも１個の選択された細胞を選択し；少なくとも１個の選択された細胞を、１またはそれ以上の成長因子を含有する無血清培養培地へ導入し；そして、培養培地中で少なくとも１個の選択された細胞を増殖させることにより、達成されてもよい。組織または細胞は、浮遊培養または接着培養から得られてもよい。さらに、組織または細胞は、ヒト胎児、新生児、未成体、成体または死後の膵臓組織から得られてもよい。さらに、選択された細胞は、選択された細胞をＣＤ３４抗原もしくはＣＤ４５抗原に結合する第二のモノクローナル抗体に接触させ；そして、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋もしくはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋である細胞を集団から除去することにより、さらに富化され得、ここで、集団中に残存する細胞は、膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化される。例えば、組織または細胞は、ＣＤ３４抗原に結合するモノクローナル抗体またはＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体に接触され得る。
【００２７】
本発明は、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞もしくは胃腸に由来する細胞を、ＣＤ９を認識するモノクローナル抗体に接触させ、そしてその初代の膵臓組織を選択することにより、ヒト膵臓系譜へ決定された前駆細胞および成熟細胞について富化された、膵臓組織由来の集団を産生する方法であって、モノクローナル抗体に結合する、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団からの選択を含む方法であり、ここで、選択されたＣＤ９＋細胞は、インスリン＋β細胞へ分化し得るヒト膵臓β−細胞系譜へ決定された前駆細胞または成熟細胞について富化される、方法も提供する。残存する細胞は、選択された細胞を、ＣＤ１５を認識する第二のモノクローナル抗体に接触させ、そしてＣＤ１５＋である細胞を除去することにより、さらに富化され得、ここで、集団中に残存する細胞はＣＤ１５−であり、かつインスリン＋β細胞へ分化し得るヒト膵臓β−細胞系譜へ決定された前駆細胞について富化される。かかる選択は、抗−ＣＤ１５モノクローナル抗体を用いて達成され得、さらに、結合した細胞は除去される。
【００２８】
本発明は、ヒト膵臓系譜へ決定された前駆細胞について富化された集団を産生するための方法であって、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞から、ＣＤ４９ｆ＋＋ＣＤ９＋もしくはＣＤ１３３＋ＣＤ９＋である細胞を選択することにより、初代の膵臓組織の集団から選択することを含んでなる方法も提供する。
【００２９】
初代の膵臓組織からの膵臓幹細胞の単離は、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞もしくは胃腸に由来する細胞から、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４９ｆ＋もしくはＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋である細胞を選択すること；ＣＤ１５＋である細胞を除去すること、ここで、残存する細胞はＣＤ１５−であり；残存する細胞を、１またはそれ以上の成長因子を含有する無血清培養培地へ導入すること；そして、培養培地中に残存する細胞を増殖させることにより、生じ得る。
【００３０】
ＣＤ１３３＋、ＣＤ４９ｆ＋もしくはＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋である、膵臓組織、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞または初代の胃腸組織もしくは胃腸に由来する細胞の集団から選択し、そして、ＣＤ１５−である細胞をさらに選択することにより、膵臓幹細胞についてさらに富化させることにより、初代の組織から得られる、ヒト膵臓幹細胞について富化された集団を産生するための方法も提供される。
【００３１】
ヒト膵臓幹細胞、前駆細胞もしくはそれらの組み合わせについて富化された集団の産生は、ＣＤ４９ｆ−である細胞を除去することにより、集団をさらに富化させることによっても達成され得、ここで、集団中に残存する細胞はＣＤ４９ｆ＋であり、かつ膵臓幹細胞、前駆細胞またはそれらの組み合わせについて富化されている。
【００３２】
本発明は、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋である膵臓幹細胞も提供する。前駆細胞がＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９＋である、内分泌β−細胞系譜に決定された膵臓前駆細胞も提供される。この細胞は、ＣＤ１５−であってもよい。前駆細胞がＣＤ４９ｆ＋である、内分泌β−細胞系譜に決定された膵臓前駆細胞も提供される。本発明は、膵臓細胞がＣＤ１３３−ＣＤ４９ｆ−ＣＤ９−ＣＤ１５−である、成熟β−細胞系譜の膵臓細胞も提供する。この細胞はインスリン＋である。
【００３３】
膵臓幹細胞は、様々な型の前駆細胞を含む子孫を産生し得る。内分泌系譜の幾つかの膵臓前駆細胞はＣＤ９抗原を発現し、一方でＣＤ１５抗原を発現するものもある。内分泌β系譜に決定された前駆細胞は、ＣＤ１３３抗原およびＣＤ１５抗原を欠損しており、そしてＣＤ４９ｆ抗原およびＣＤ９抗原を発現する前駆細胞（すなわち、ＣＤ１３３−ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１５−ＣＤ９＋表現型）を含む。ＣＤ１３３−ＣＤ４９ｆ−ＣＤ９−ＣＤ１５−である膵臓細胞は、成熟インスリン産生細胞である。
【００３４】
本発明は、膵臓細胞もしくは膵臓に由来する細胞を、ＣＤ４９ｆに結合するモノクローナル抗体もしくはＣＤ１３３に結合するモノクローナル抗体と接触させ；そして、このモノクローナル抗体に結合する細胞を選択することにより、ヒト膵臓幹細胞および／または前駆細胞について富化された集団を産生するための方法も包含し、ここで、選択された細胞はヒト膵臓幹細胞および／または前駆細胞について富化されている。様々な実施態様において、モノクローナル抗体は、蛍光色素にコンジュゲートされるか、または磁気粒子にコンジュゲートされていてもよい。さらに、選択は、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）、高勾配磁気分離によるか、または固相への結合および固相からの脱結合によりなされてもよい。膵臓細胞または膵臓に由来する細胞を含む集団は、浮遊培養または接着培養から得られ得る。
【００３５】
或いは、本発明の選択方法は、除去された細胞をＣＤ４５もしくはＣＤ３４に結合するモノクローナル抗体に接触させ、そしてそのモノクローナル抗体に結合する細胞を除去して、膵臓幹細胞および／または前駆細胞について富化された集団を産生することにより、初代の膵臓組織から得られた集団を、膵臓幹細胞および／または前駆細胞について富化させる工程も含んでもよい。かかる方法は、残存する細胞を抗−ＣＤ１３３もしくは抗−ＣＤ４９ｆモノクローナル抗体に接触させ、そしてそのモノクローナル抗体に結合する細胞を選択して、膵臓幹細胞および／または前駆細胞について富化された集団を得ることにより、集団を膵臓幹細胞および／または前駆細胞についてさらに富化させる工程も含んでもよい。
【００３６】
特記しない限り、本明細書中で用いる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているものと同意義である。本明細書に記載するものと同様なまたは均等な方法および物質が、本発明を実施する際に用いられ得るが、適当な方法および物質を以下に記載する。本明細書に記載する全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、出典明示によりその全てを本明細書の一部とする。コンフリクトの場合には、定義を含めて、本明細書は支配的であろう。加えて、物質、方法および実施例は、例示を目的としており、それらに限定されない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および請求の範囲から明白であろう。
【００３７】
（発明の詳細な記載）
膵臓の外分泌および内分泌細胞は、膵臓または胃腸管中に存在する前駆型の細胞より発達する。胚性内分泌細胞は凝集して、そしてランゲルハンス島を形成し、これは、マウスでは、出生後に典型的な成体のコンフィギュレーションに達する。インスリン含有β−細胞は、成熟した島のコアを形成し、一方で、その周辺は、より少数の他の内分泌細胞型：それぞれグルカゴン、ソマトスタチンおよび膵臓ポリペプチドを合成するα、βおよびＰＰ細胞を含有する。
【００３８】
幹細胞の特性を示す細胞集団は、成体の膵臓内に存在する。それらは、自身で再生し、かつ成体膵臓組織もしくは胃腸組織の分化成熟細胞の表現型を産生する能力を有する。
【００３９】
未分化の、多型潜在性の、自身で再生する膵臓細胞は「膵臓幹細胞」と言われる。膵臓幹細胞は、分化能および適当な条件下では自身で再生する能力を有する、クローン原性、多型潜在性の幹細胞であり、そして、膵臓の成熟細胞へ最終的に分化し得る、その子孫の娘細胞を含み得る。故に、膵臓幹細胞は「多型潜在性」であり、それは幹細胞の子孫が複数の分化経路を有するからである。膵臓幹細胞は自己維持をし得、このことは、細胞分裂ごとに、１個の娘細胞は平均して１個の幹細胞でもあることを意味する。
【００４０】
膵臓幹細胞の幹細胞でない子孫は、典型的に「前駆（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）」細胞と言われ、これは、１またはそれ以上の系譜内に様々な細胞型を生じ得る。用語「膵臓前駆細胞」は、膵臓幹細胞に由来する未分化細胞を言い、そしてそれ自身は幹細胞でない。幾つかの前駆細胞は、１またはそれ以上の細胞型に分化し得る子孫を産生し得る。前駆細胞の顕著な特徴は、幹細胞と違って自己維持を示さず、そして典型的には特定の分化経路に付されると考えられる。
【００４１】
膵臓前駆細胞は、１またはそれ以上の：ＳＴＦ−１などのホメオドメイン型転写因子；およびＰＡＸ６などのＰＡＸ遺伝子、ＰＴＦ−１、ｈＸＢＰ−１、ＨＮＦ遺伝子、ビリン、チロシン水酸化酵素、インスリン、グルカゴンおよび／またはニューロペプチドＹ、の発現により特徴付けられてもよい。本発明の膵臓前駆細胞は、植物レクチンまたはピーナッツアグルチニンなどのレクチンに結合することにより特徴付けられてもよい。前駆細胞は、ＰＤＸ１  ｍＲＮＡおよび蛋白質を発現してもよく、およびグルコース応答性インスリン分泌細胞へ分化し得る。或いは、前駆細胞はＧｌｕｔ２  ｍＲＮＡおよび蛋白質を発現してもよい。
【００４２】
一般に、本発明の前駆細胞は、膵臓または胃腸管組織を構成する細胞へ分化し得る増殖性細胞である。すなわち、その前駆細胞は膵臓系譜の分化細胞を生じ得る。例えば、前駆細胞は、膵臓島細胞、例えば、β島細胞、α島細胞、δ島細胞またはΦ島細胞（またはＰＰ細胞）への分化を誘発できる。
【００４３】
本明細書中、用語「前駆型の細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」は、膵臓幹細胞の子孫をいい、そしてそれ故に、前駆細胞および娘幹細胞の両方を包含する。
【００４４】
細胞マーカー。本発明は、膵臓幹細胞および／または前駆細胞の同定、単離、富化および培養を提供する。膵臓幹細胞および／または前駆細胞は、膵臓幹細胞および／または前駆細胞の表面上にある抗原と、細胞表面抗原と特異的に結合する試薬の結合を介して、同定または選択される。グルカゴン産生（グルカゴン＋）細胞およびインスリン産生（インスリン＋）細胞を同定、単離、富化および培養するための方法も提供される。
【００４５】
対照に対する分布を正規化するために、各細胞は、特定の染色強度を有するデータポイントとして記録される。これらのデータポイントは、ログスケールに従って示されてもよく、ここで、測定単位は任意の測定強度である。一の実施態様において、集団中、最も明るい細胞は、最も低い染色レベルを有する細胞よりも４ログ強いものとして表される。この様式で表される場合に、最も高いログの染色強度をもつ細胞は明るく、一方、最も低い強度をもつものはネガティブであることが明白である。２―３ログの染色強度となる、「低い（ｌｏｗ）」染色細胞は、ネガティブおよびポジティブな細胞とは異なる特性を有してもよい。別の対照は、予め決定された密度の表面マーカーを有する基質、例えば、加工ビーズまたは細胞株を利用してもよく、これは強度について正対照を与える。表示「ｌｏｗ」は、染色のレベルが、アイソタイプを適合した対照よりは明るいが、集団中で通常見られる、最も明るく染色された細胞ほどは強くはないことを示す。
【００４６】
本明細書中、用語ＣＤ１３３ｌｏ、ＣＤ１３３１ｏｗおよび／またはＣＤ１３３−／ｌｏは、ｌｓｔ−２ｎｄログの染色強度をもつ「低い」染色細胞を言う。特定の抗原において小数の分子（＜１００−５００）しか細胞表面上で発現されなかった場合には、ノイズ比に対するシグナルは、特定の抗原が細胞表面上で発現しているかどうかを決定できない程に弱くてもよい。当業者は、本明細書に記載する任意の抗体が、意図された意味を変更することなく、表示「ｌｏ」または「ｌｏｗ」（すなわち、抗体Ｘｌｏまたは抗体Ｘｌｏｗ）を用いて、記載され得ることも認めるだろう。同様に、本明細書中、用語ＣＤ１３３ｈｉ、ＣＤ１３３ｈｉｇｈおよび／またはＣＤ１３３ｂｒｉｇｈｔは、最も低い染色レベルを有する細胞よりも３ログ強いものとして表される、集団中の細胞を言う。さらに、当業者は、任意の抗体が、意図された意味を変更することなく、これらの表示（すなわち、抗体Ｘｈｉ、抗体Ｘｈｉｇｈまたは抗体Ｘｂｒｉｇｈｔ）を用いて、記載され得ることを認めるだろう。表示、抗体Ｘｍｅｄは、「ｌｏｗ」および「ｂｒｉｇｈｔ」の間の染色強度を有する抗体を言うことが意図される。さらに、本明細書中、抗体Ｘ＋および抗体Ｘｈｉの表示は同義的に用いられる。
【００４７】
膵臓幹細胞および／または前駆細胞の表面上に見られる抗原の１つは、ＡＣ１３３モノクローナル抗体に結合する抗原（すなわち、ＣＤ１３３抗原）である。Ｙｉｎら、米国特許第５，８４３，６３３号（参照により本明細書に組み込まれる）は、造血幹および前駆細胞上の表面マーカー糖蛋白質に結合する、ＡＣ１３３と呼ばれるモノクローナル抗体を記載している。ＡＣ１３３抗原（本明細書中、「ＣＤ１３３抗原」または「ＣＤ１３３」とも言われる）は、分子量１１７ｋＤａの、５回膜貫通型の細胞表面抗原である。この抗原の発現は、高度に組織特異的であり、そして、ヒト骨髄、胎児骨髄および肝臓、臍帯血ならびに成体末梢血に由来する造血系前駆細胞のサブセット上で検出される。ＡＣ１３３抗体により認識される細胞のサブセットは、ＣＤ３４ｂｒｉｇｈｔであり、そしてＣＤ３４＋集団中に存在するＣＦＵ−ＧＭ活性の全てを実質的に含んでおり、それにより、ＡＣ１３３はヒト造血系前駆細胞および幹細胞を単離および特徴付けるための試薬として有用になる。
【００４８】
ＡＣ１３３抗体（本明細書中、５Ｆ３抗体とも言われる）は、プロミニンと言われるヒト細胞マーカーを認識する抗体試薬の一例である。プロミニンは、様々な上皮細胞で発現する多局所性（ｐｏｌｙｔｏｐｉｃ）膜蛋白質である（Ｗｅｉｇｍａｎｎら，９４（２３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１２４２５−３０（１９９７）；Ｃｏｒｂｅｉｌら，１１２（Ｐｔ７）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０２３−３３（１９９９）；Ｃｏｒｂｅｉｌら．，９１（７）Ｂｌｏｏｄ  ２６２５−６（１９９８）；Ｍｉｒｉｇｌｉａら，９１（１１）Ｂｌｏｏｄ  ４３９０−１（１９９８））。様々なＡＣ１３３抗体が米国特許第５，８４３，６３３に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる）。ネズミハイブリドーマ細胞株ＡＣ１３３の寄託が、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ  ２０８５２（１９９７年４月２４日）になされ、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３４６が与えられた。これらのＡＣ１３３抗体は、本発明において目的とするヒト細胞のサブセットについて免疫選択され得る。好ましいＡＣ１３３モノクローナル抗体は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ  ＣＡ）から購入でき、ＡＣ１３３／１−ＰＥ抗体（カタログ番号８０８−０１）およびＡＣ１３３／２−ＰＥ抗体（カタログ番号８０９−０１）を含むがこれらに限定されない。ＭＡＣＳ分離のために、モノクローナル抗体の５０：５０混合物が好ましい。高度に組織特異的なＡＣ１３３発現は、高度に純化された膵臓幹細胞および／または前駆細胞集団についての富化の間に、特に有利である。ＮＳ−ＩＣを選択するためのＡＣ１３３抗原の使用についての論考は、米国特許第６，４６８，７９４号（参照により本明細書に組み込まれる）にて見出される。
【００４９】
ＣＤ４５は、Ｔ２００／白血球に共通の抗原である。ＣＤ４５に対する抗体は、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）（カタログ番号１３０−０８０−２０１；１３０−０８０−２０２）；およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）（カタログ番号ＲＤＩ−Ｍ１３４３ｃｌｂ；ＲＤＩ−ＣＢＬ１２４；ＲＤＩ−ＣＢＬ１４８；ＲＤＩ−ＣＢＬ４６４など）から購入できる。一の好ましい実施態様において、本発明の細胞およびそれらを含む培養物は、（プロミンポジティブであることに加えて）ＣＤ４５などの細胞表面マーカーを欠失しているとして、さらに特徴付けられる。典型的に、膵臓幹細胞または前駆細胞はＣＤ４５−である。
【００５０】
ＣＤ３４は、ｇｐｌ０５−１２０としても知られている。ＣＤ３４に対するモノクローナル抗体は、例えばＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）（カタログ番号１３０−０９０−９５４）；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）（カタログ番号ＲＤＩ−Ｍ１６３６ｃｌｂ；ＲＤＩ−ＣＢＬ１２８；ＲＤＩ−ＣＢＬ４９６ＦＴ；ＲＤＩ−Ｍ２２８１ｃｌｂ；ＲＤＩ−ＣＤ３４−５８１など）；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（カタログ番号５５０７６０）から購入できる。抗−ＣＤ３４モノクローナル抗体は、研究および臨床的な骨髄移植のために、リンパ球造血系幹／前駆細胞を定量化および純化するために用いられてきた。ＣＤ３４は、ヒト前駆細胞で選択的に発現される、分子量が約１１０ｋＤａの単量体細胞表面抗原である。その遺伝子は、小血管内皮細胞ならびに造血系前駆細胞により発現され、そして一本鎖、１０５−１２０ｋＤａの、多量にＯ−グリコシル化された、膜貫通型の糖蛋白質である。その配列はＳｉｍｏｎｓら．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４８：２６７−２７１により開示されている。典型的に、膵臓幹細胞または前駆細胞はＣＤ３４−である。
【００５１】
ＣＤ４９ｆ（インテグリンα−６としても知られている）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５３５８６；ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ２３２２９）は、上皮細胞により優先的に発現されているインテグリンヘテロダイマーの一部分である、１５０ｋＤａの膜貫通型蛋白質である。インテグリンα−６は、インテグリンβ−１（ＣＤ２９）鎖と結合してＶＬＡＡ−６を形成するか、インテグリンβ−４鎖と結合してラミニンおよびカリーニン（ｋａｌｉｎｉｎ）受容体を形成する。ＣＤ４９ｆは、Ｔ細胞、単球、血小板、上皮および内皮細胞、神経細胞周囲ならびに胎盤の栄養膜で主に発現される。ＣＤ４９ｆの配列は、例えば、Ｔａｍｕｒａら．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１１：１５９３−６０４（１９９０）にて見出されてもよく、これは、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ４９ｆ  ｃＤＮＡの選択的スプライスによる２つの形態があり、これは、異なる細胞質ドメインを有するとして記載されている。Ａ型のみが、肺、肝臓、脾臓および頸部で発現される。Ｂ型のみが、脳、卵巣および腎臓で観察され、そして両方の型が他の組織で検出されている。ＣＤ４９ｆ／ＣＤ２９  α６β１は、血小板、単球およびＴリンパ球上にあるラミニン受容体であり、そしてＣＤ４９ｆ／ＣＤ２９に仲介されるＴ細胞とラミニンの結合は、活性化および増殖についての、Ｔ細胞に対する共シグナルである。
【００５２】
ＣＤ４９ｆに対する抗体は、非造血系幹細胞もしくは前駆細胞、特に、膵臓幹細胞および前駆細胞を同定、単離または富化させるための方法において用いられていない。膵臓幹細胞または前駆細胞はＣＤ４９ｆ＋として分類されてもよい。
【００５３】
ＣＤ４９ｆの配列は、以下の表Ａで示される。α−６は、インテグリンβ−１（ＣＤ２９）鎖と結合してＶＬＡＡ−６を形成するか、インテグリンβ−４鎖と結合してラミニンおよびカリーニン受容体を形成する。ＣＤ４９ｆを認識する抗体は、ＧｏＨ３［Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ（カタログ番号ＲＤＩ−Ｍ１５６６およびＲＤＩ−Ｍ１６７２ｃｌｂ）；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）（カタログ番号５５７１０、５５７５１１、５５１１４０、５５１１２９、５５５７３４、５５５７３５、５５５７３６）；およびＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄ（ｗｗｗ．ｉｎｃｂｉｏｍｅｄ．ｃｏｍ）］および４Ｆ１０［Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ（カタログ番号ＲＤＩ−ＣＢＬ４５８）］を包含する。
【００５４】
【表１】
2007503815.tif 000003
【００５５】
ＣＤ１５（Ｌｅｗｉｓ  ＸまたはＬｅＸとしても知られている）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００２０３３）は、２２０ｋＤａの分岐した五糖である。ＣＤ１５の糖エピトープは、成熟ヒト好中球、単球および好酸球ならびに成体マウス脳室下帯（ＳＶＺ）幹細胞で発現される。それは、胚性組織および腺癌、骨髄性白血病ならびにリード・シュテルンベルク細胞においても見出され得る。かかる組織において、Ｌｅｗｉｓ  Ｘエピトープは、細胞−細胞相互作用への関与が考えられる。ＣＤ１５は、ＣＤ１１／ＣＤ１８およびＣＤ６６糖蛋白質によりもたらされる。ＣＤ１５抗体は、末端の三糖構造Ｇａｌβｌ→４［Ｆｕｃαｌ→３］ＧｌｃＮＡｃ（ＬｅＸ抗原）を認識する。ＣＤ１５抗体の大部分はＩｇＭであり、そしてそれらはシアル酸付加形態のＣＤ１５、ＣＤ１５ｓと交差反応しない。ＣＤ１５は、多数の組織に広く分布している、フコース含有の三糖であり、そして、幾つかの齧歯類およびヒト組織、すなわち、脳および肺ならびにマウスの初期胚において発達に伴って発現される。さらに、ＣＤ１５は、マウス胚性幹細胞および前駆生殖細胞などの多能性幹細胞の表面に存在する。ＣＤ１５の配列は、表Ｂに示される。ＣＤ１５は、幹細胞の位置決定および純化を可能にするので、細胞型マーカーとして有用である。ヒトＣＤ１５を認識する抗体は、ＭＭＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）（カタログ番号３４０７０３、３４０８５０、３４７４２０、３４７４２３、５５９０４５））を包含する。
【００５６】
細胞表面の糖部分は、有用な細胞型マーカーである（Ｊｅｓｓｅｌｌら．，（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １３，２２７−５５）。三糖３−フコシル−Ｎ−アセチルラクトサミンまたはＦＡＬ（Ｇｏｏｉら，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２，１５６−５８）であるＬｅＸ抗原は、ＳＳＥＡ−１（段階特異的な胚性抗原１）またはＣＤ１５（分化１５の白血球クラスター）としても知られているが、これは、多能性幹細胞で高度に発現されている：それは、マウスおよびヒト胚性癌細胞、マウス着床前胚、胚性幹細胞、奇形癌細胞および前駆生殖細胞でも見出される（ＳｏｌｔｅｒおよびＫｎｏｗｌｅｓ，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５，５５６５−６９；Ｆｏｘら．，（１９８１）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．８３，３９１−９８；ＢｉｒｄおよびＫｉｍｂｅｒ，（１９８４）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１０４，４４９−６０；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，（１９９４）Ｎａｇｏｙａ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．５７，９５−１０８；Ｍａｒａｎｉら，（１９８６）Ａｃｔａ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．Ｎｅｅｒｌ．Ｓｃａｎｄ．２４，１０３−１１０；Ｇｏｍｐｅｒｔｓら．，（１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０，１３５−４１）。興味深いことに、様々な種におけるＣＮＳ細胞サブ集団も、発達中および成体期においてこのマーカーを発現する。ＬｅＸは、ネズミ胚性終脳（Ｙａｍａｍｏｔｏら．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，３０４５−４９；Ａｌｌｅｎｄｏｅｒｆｅｒら．，（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６，３８１−９５；Ａｌｌｅｎｄｏｅｒｆｅｒら．，（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１１，２０８−１９；Ｔｏｌｅら．，（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １５，６２４−２７；ＡｓｈｗｅｌｌおよびＭａｉ，（１９９７）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２８９，１７−２３）および脊髄（ＤｏｄｄおよびＪｅｓｓｅｌｌ，（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１２９，２２５−３８）中の胚域、ならびに小脳外顆粒層（ＭａｒａｎｉおよびＴｅｔｔｅｒｏｏ，（１９８３）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７８，１５７−６１）中で発現される。成体マウスＣＮＳにおいて、Ｌｅｘは、星状細胞、タン細胞およびわずかなニューロンのサブ集団により発現される（ＢａｒｔｓｃｈおよびＭａｉ，（１９９１）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２６３，３５３−６６；Ｇｏｃｈｔら，（１９９６）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１１，１００７−２８；ＡｓｈｗｅｌｌおよびＭａｉ，（１９９７）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２８９，１７−２３）。
【００５７】
【表２】
2007503815.tif 000004
【００５８】
ＣＤ１５＋細胞は膵臓に存在する。大部分の場合において、ＣＤ１５抗原は内分泌細胞、恐らくグルカゴン−産生細胞上で発現される。図５を参照のこと。大部分の膵臓管細胞はＣＤ１５を発現しないが、管が開口部を有する場合には、管腔表面はＣＤ１５抗原で染まる。ＣＤ１３３＋発現と違って、ＣＤ１５は閉管では観察されない。膵臓幹細胞はＣＤ１５−である。対照的に、幾つかの膵臓前駆細胞集団がある。幾つかの膵臓前駆細胞はＣＤ１５＋であり、幾つかはＣＤ１５−である。
【００５９】
ＣＤ９抗原は２４ないし２７ｋＤａの糖蛋白質であり、発達中のＢリンパ球、血小板、単球、好酸球、好塩基球、刺激されたＴリンパ球の表面で、ならびに末梢神経系のニューロンおよびグリア細胞により発現される。それは、膜を４回貫通する、テトラスパニンと言われる、膜蛋白質のファミリーに属する。プレＢ細胞および血小板において、ＣＤ９抗原は、恐らくインテグリンＣＤ４１／ＣＤ６１（ＧＰＩＩｂ／ＧＰＥａ）との結合を介して、細胞活性化および凝集を調節する。それは、様々な細胞株における細胞運動も調節し、そして末梢神経におけるシュワン細胞の挙動の重要な調節因子であるようである。黒色腫および乳癌において、発現は、初期の非転移性腫瘍で優先的に生じることが示されるために、ＣＤ９抗原の発現は、好ましい予後を示してもよい。
【００６０】
ＣＤ９を認識する抗体は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ、例えば、ＣＬＢ−ｔｒｏｍ／８，４Ｅ１（カタログ番号ＲＤＩ−Ｍ１３６２ｃｌｂおよびＲＤＩ−Ｍ１６６６ｃｌｂ）、ＭＭ２／５７（カタログ番号ＲＤＩ−ＣＢＬ１６２、ＲＤＩ−ＣＢＬ１６２ＦＴおよびＲＤＩ−ＣＢＬ１６２ＰＥ）、ＢＵ１６（カタログ番号ＲＤＩ−ＣＢＬ５６０）および７２Ｆ６（カタログ番号ＲＤＩ−ＣＤ９ａｂｍ−７２）から購入できる。
【００６１】
幹および前駆細胞サブセットの単離
今、特定細胞の予定運命図の階層の構築が、マウス造血系幹細胞およびその子孫について、完成された。この予定運命図は、本発明において適用されている技法を利用しており、そしてこれは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９４  Ｎｏｖ；１（８）：６６１−７３；ＫｏｎｄｏＭら．，Ｃｅｌｌ１９９７  Ｎｏｖ  ２８；９１（５）：６６１−７２；Ａｋａｓｈｉら．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００  Ｍａｒ  ９；４０４（６７７４）：１９３−７においてより詳細に見出され得る。初めに記載されたマウス造血系幹細胞集団のさらなる分析は、表面表現型を用いて達成され、造血系幹細胞集団を、短期および長期の再生フラクションの両方へさらに分けた。この技法は、ついで、造血系幹細胞の子孫へ適用され、リンパ性骨髄性前駆細胞；骨髄限定の前駆細胞およびリンパ共通の前駆細胞を同定した。
【００６２】
膵臓幹細胞および前駆細胞の単離
本発明は、幹細胞および前駆細胞を含む膵臓細胞または胃腸細胞のサブセットを単離するために用いられ得る、細胞マーカーＣＤ４９ｆおよびＣＤ１３３を用いる、ポジティブセレクション法を提供する。単離されたサブセットは、ＣＤ４９ｆ＋細胞およびＣＤ１３３＋細胞を含む。本発明は、膵臓前駆細胞のサブセットを単離するために用いられ得る細胞マーカーＣＤ９およびＣＤ１５を用いる、ポジティブセレクション法も提供する。本発明は、膵臓細胞または胃腸細胞のサブセットを単離するために用いられ得る細胞マーカーＣＤ３４およびＣＤ４５を用いる、ネガティブセレクション法も提供する。単離されたサブセットは、ＣＤ３４−およびＣＤ４５−細胞を含む。本発明は、膵臓幹細胞を単離するために用いられ得る細胞マーカーＣＤ９およびＣＤ１５を用いる、ネガティブセレクション法も提供する。かかるサブセットの単離は、個々に、または連続（任意の順）を含んでなる組み合わせにて、行われ得る。
【００６３】
細胞寄託。米国特許第５，８４３，６３３号の記載のように、ネズミハイブリドーマ細胞株ＡＣ１３３は、ブタペスト条約に従って、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ２０８５２（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３４６）へ寄託された。
【００６４】
細胞の単離、富化および選択。膵臓幹細胞もしくは前駆細胞または胃腸幹細胞もしくは前駆細胞が単離される細胞集団は、膵臓組織、ランゲルハンス島、膵臓に由来する細胞、胃腸組織から分離された細胞集団、胃腸組織、胃腸に由来する細胞または胃腸に由来する外植片から分離された細胞集団であり得る。細胞は、胎児、新生児、未成体、成体または死後の組織から得られ得る。細胞は、インビトロ、例えば、浮遊培養または接着培養にて培養され得る。
【００６５】
本発明は、膵臓幹細胞および／または前駆細胞の単離および同定を提供する。膵臓幹細胞もしくは前駆細胞の同定は、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞、胃腸細胞もしくは胃腸に由来する細胞の集団を、ＣＤ４９ｆ抗原に結合する試薬および／またはＣＤ１３３抗原に結合する試薬と接触させ、そして、細胞表面にて、ＣＤ４９ｆおよび／またはＣＤ１３３抗原に結合する試薬とＣＤ４９ｆおよび／またはＣＤ１３３抗原との接触を検出することを含む。ＣＤ４９ｆおよび／またはＣＤ１３３試薬が結合するこれらの細胞は、膵臓幹細胞および／または前駆細胞として同定される。これらの細胞の独自性は、細胞が実際に自己再生能、多分化能を有する膵臓幹細胞であるかどうかを決定するアッセイにより確かめられ得る。膵臓幹細胞もしくは前駆細胞の同定は、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞、胃腸細胞もしくは胃腸に由来する細胞の集団を、ＣＤ３４抗原に結合する試薬および／またはＣＤ４５抗原に結合する試薬と接触させ、そして、細胞表面にて、ＣＤ３４および／またはＣＤ４５抗原に結合する試薬とＣＤ３４および／またはＣＤ４５抗原との接触を検出することを含む。ＣＤ３４および／またはＣＤ４５試薬に結合しないこれらの細胞は、膵臓幹細胞および／または前駆細胞として同定されるか、またはそれについて富化される。これらの細胞の独自性は、細胞が実際に自己再生能、多分化能を有する膵臓幹細胞であるかどうかを決定するアッセイにより確かめられ得る。
【００６６】
本発明の方法は、抗−ＣＤ４９ｆ抗体を用いて、ＣＤ４９ｆ／−ｌｏ細胞からＣＤ４９ｆ＋細胞を単離するか、または抗−ＣＤ１３３抗体を用いて、ＣＤ１３３−／ｌｏからＣＤ１３３＋である細胞を単離するためにも用いられ得、これは、膵臓幹細胞および／または前駆細胞の画分を含む膵臓細胞の集団を、ＣＤ４９ｆ抗原もしくはＣＤ１３３抗原に特異的に結合する試薬と合わせ、ついで、ＣＤ４９ｆ＋である細胞もしくはＣＤ１３３＋である細胞を選択し、選択前の膵臓細胞もしくは胃腸細胞の集団と比べて、ＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋膵臓幹細胞および／または前駆細胞において富化された、選択された集団を産生するというポジティブセレクション技法による。抗−ＣＤ３４抗体および／または抗−ＣＤ４５抗体を用いて、ＣＤ４９ｆ／−ｌｏである細胞からＣＤ４９ｆ＋である細胞を、またはＣＤ１３３／−ｌｏである細胞からＣＤ１３３＋である細胞を、単離または富化させるための方法も提供され、これは、膵臓幹細胞および／または前駆細胞の画分を含む膵臓細胞の集団を、ＣＤ３４抗原もしくはＣＤ４５抗原に特異的に結合する試薬と合わせ、そして、ＣＤ３４＋および／またはＣＤ４５＋である細胞を除去し、選択前の膵臓細胞もしくは胃腸細胞の集団と比べて、ＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋である膵臓幹細胞および／または前駆細胞において富化された、選択された集団を産生するというネガティブセレクション技法による。
【００６７】
従って、本発明は、膵臓組織または胃腸組織もしくは胃腸に由来する外植片または膵臓幹細胞培養物（例えば、浮遊培養もしくは接着培養）に由来する膵臓幹細胞および／または前駆細胞の富化もさらに提供する。故に、本発明は、膵臓組織または胃腸組織もしくは胃腸に由来する外植片に由来する膵臓幹細胞および／または前駆細胞の富化について有用であり、上記組織もしくは外植片において、幹細胞および前駆細胞は、後期胚、胎児、新生児、未成体、成体および／または死後の組織のように、低い頻度で存在しているか、または枯渇されていてもよい。当業者は、膵臓幹細胞画分および／または前駆細胞を含む膵臓細胞もしくは胃腸細胞の集団を、ＣＤ４９ｆ抗原またはＣＤ１３３抗原に特異的に結合する試薬と合わせ、そしてＣＤ４９ｆ＋もしくはＣＤ１３３＋である細胞を選択し得る。この様式で、選択されたＣＤ４９ｆ＋もしくはＣＤ１３３＋である細胞は、膵臓細胞もしくは胃腸細胞の集団と比べて、膵臓幹細胞および／または前駆細胞の画分において富化される。
【００６８】
本発明は、ＧｏＨ３および／または４Ｆ１０抗体に特異的に結合するＣＤ４９ｆ抗原に特異的に結合する抗体も提供する。この抗体は、ハイブリドーマ細胞株により産生されてもよい。このモノクローナル抗体は、抗体ＧｏＨ３および／または抗体４Ｆ１０によるＣＤ４９ｆ抗原への同時の結合を遮断してもよい。ＣＤ４９ｆ抗原に結合する抗体、交差反応性抗体（すなわち、ＧｏＨ３および／または４Ｆ１０抗体と同じエピトープに結合し、かつ同時の結合を実質的に阻害するもの）、その種アナログ、その結合フラグメントおよびそのコンジュゲートは、特に興味深い。
【００６９】
同様に、本発明は、ＡＣ１３３抗体に特異的に結合するＣＤ１３３抗原に特異的に結合する抗体も提供する。この抗体は、ハイブリドーマ細胞株により産生されてもよい。このモノクローナル抗体は、抗体ＡＣ１３３によるＣＤ１３３抗原への同時の結合を遮断してもよい。ＣＤ１３３抗原に結合する抗体、交差反応性抗体（すなわち、ＡＣ１３３抗体と同じエピトープに結合し、かつ同時の結合を実質的に阻害するもの）、その種アナログ、その結合フラグメントおよびそのコンジュゲートは、特に興味深い。
【００７０】
同様に、本発明は、ＭＭＡ抗体に特異的に結合するＣＤ１５抗原に特異的に結合する抗体も提供する。この抗体は、ハイブリドーマ細胞株により産生されてもよい。このモノクローナル抗体は、抗体ＭＭＡによるＣＤ１５抗原への同時の結合を遮断してもよい。ＣＤ１５抗原に結合する抗体、交差反応性抗体（すなわち、ＭＭＡ抗体と同じエピトープに結合し、そして同時の結合を実質的に阻害するもの）、その種アナログ、その結合フラグメントおよびそのコンジュゲートは、特に興味深い。
【００７１】
ＣＤ４９ｆ＋の集団またはＣＤ１３３＋である膵臓細胞、膵臓に由来する細胞、胃腸細胞もしくは胃腸に由来する細胞の集団を、ＣＤ３４抗原もしくはＣＤ４５抗原と特異的に結合する試薬と合わせ、そしてＣＤ３４抗原もしくはＣＤ４５抗原に結合する細胞を除去することにより、ヒト膵臓幹細胞および／または前駆細胞をさらに富化させるための方法も提供され、ここで、残存する細胞は、膵臓幹細胞および／または前駆細胞について富化されている。幾つかの態様において、この試薬は一の抗体である。ＣＤ３４−の集団またはＣＤ４５−である膵臓細胞、膵臓に由来する細胞、胃腸細胞もしくは胃腸に由来する細胞の集団を、ＣＤ４９ｆ抗原もしくはＣＤ１３３抗原に特異的に結合する試薬と合わせ、そしてＣＤ４９ｆ抗原もしくはＣＤ１３３抗原に結合する細胞を選択することによる、ヒト膵臓幹細胞および／または前駆細胞をさらに富化させるための方法も包含され、ここで、選択された細胞は、膵臓幹細胞および／または前駆細胞について富化されている。
【００７２】
本発明の方法のいずれかにおいて、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞、胃腸細胞もしくは胃腸に由来する細胞の集団は、細胞をＣＤ１３３抗原に特異的に結合する試薬と接触させ、その前、その間および／またはその後に、細胞をＣＤ４９ｆ抗原に結合する試薬に接触させることにより、富化され得る。同様に、本発明の方法のいずれかにおいて、膵臓細胞、膵臓に由来する細胞、胃腸細胞もしくは胃腸に由来する細胞の集団は、細胞をＣＤ４９ｆ抗原に特異的に結合する試薬に接触させ、その前、その間および／またはその後に、細胞をＣＤ１３３抗原に結合する試薬に接触させることにより、富化され得る。
【００７３】
本発明に記載の細胞選別は、蛍光色素がコンジュゲートした抗体を用いる蛍光活性化セルソーティングなどによるフローサイトメトリーを含む、当該分野で知られている任意の適当な手段により、達成され得る。選別は、磁気粒子にコンジュゲートされた抗体を用いる高勾配磁気分離によってもなされ得る。固相への結合および固相からの脱結合を含む、任意の他の適当な方法も、本発明の範囲内にあると熟慮される。
【００７４】
細胞集団は、抗−ＣＤ４９ｆ抗体もしくは抗−ＣＤ１３３抗体を用いる免疫選択により、得られ得る。細胞集団は、少なくとも３０％のＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋膵臓幹細胞もしくは前駆細胞、好ましくは、少なくとも５０−７０％のＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋膵臓幹細胞もしくは前駆細胞、およびより好ましくは、９０％より大きいＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋膵臓幹細胞もしくは前駆細胞を含むはずである。少なくとも９５％のＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋膵臓幹細胞もしくは前駆細胞を含む、ＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋膵臓幹細胞もしくは前駆細胞の実質的に純粋な集団は、最も好ましいだろう。得られて実際に用いられる富化の程度は、例えば、選択の方法、成長の方法および培養物中に置かれた細胞の細胞数を含む、多数の因子に依存する。
【００７５】
細胞集団は、後期胚、胎児、新生児、未成体、成体および／または死後の哺乳類膵臓組織または胃腸組織もしくは胃腸に由来する外植片から得られ得る。最も好ましい実施態様において、膵臓幹細胞もしくは前駆細胞はヒトである。幾つかの実施態様において、集団中のＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋細胞は、内皮細胞に複合体化され得る。
【００７６】
膵臓幹細胞もしくは前駆細胞または他の細胞の富化された集団を含む、本明細書に記載のインビトロにおける細胞培養は、インスリン、グルカゴンもしくはソマトスタチンについてポジティブに染色され、そして、分化を誘導する条件下において、β島細胞、α島細胞、δ島細胞もしくはΦ島細胞（ＰＰ細胞）、特にグルコース応答性インスリン分泌細胞およびグルカゴン産生細胞を含む、成熟膵臓細胞へ分化する子孫細胞を産生する子孫を産生するとして特徴付けられてもよい。
【００７７】
当業者は、単離されたＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋細胞を培養培地へ導入し、培養下で、単離されたＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋細胞を増殖し；単離されたＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋細胞が成熟膵臓細胞へ分化する条件下で、単離されたＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋細胞の子孫を培養し；ついで、β島細胞、α島細胞、δ島細胞もしくはΦ島細胞（ＰＰ細胞）を含む成熟膵臓細胞の存在を検出し得る。成熟膵臓細胞の成熟形態の存在は、単離されたＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋細胞を膵臓幹細胞として特徴付ける。
【００７８】
単離されたＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋細胞が増殖させる培養は、多型潜在性の膵臓幹細胞の増殖を誘導するために有効な、１またはそれ以上の予め決定された成長因子を含有する、無血清培地であり得る。培養培地は、成長因子で補完され得る。ＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋細胞がβ島細胞、α島細胞、δ島細胞もしくはΦ島細胞（ＰＰ細胞）へ分化する条件は、成長因子を含有する培養培地表面にあるＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１３３＋細胞の子孫を培養することを含み得る。
【００７９】
本発明は、膵臓幹細胞もしくは前駆細胞の成長に作用する成長因子の存在を同定するための方法も提供する。当業者は、膵臓幹細胞もしくは前駆細胞の成長に作用する少なくとも１つの成長因子を含むと思われる組成物を、膵臓幹細胞もしくは前駆細胞を含む組成物と合わせ、ついで、組成物の存在の関数として、膵臓幹細胞もしくは前駆細胞の成長を決定し得る。変化された（例えば、増大した、減少したなど）膵臓幹細胞もしくは前駆細胞の成長は、膵臓幹細胞もしくは前駆細胞の成長に作用する成長因子が組成物中に存在することを示す。成長因子の同一性は、当該分野にて知られている技法を用いて決定され得る。
【００８０】
ＣＤ１３３に対する抗体。ＣＤ１３３に対する抗体は、米国特許第５，８４３，６３３号に記載のように得られるかまたは調製されてもよく、これは参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ１３３抗原は、ＣＤ１３３抗原に特異性を有する、ＡＣ１３３を含むがこれに限定されない様々な抗−ＣＤ１３３モノクローナル抗体などの抗体に接触され得る。「抗−ＣＤ１３３抗体」は、ＦＡＣＳおよび免疫沈降実験においては天然のコンフォメーション、ならびにウェスタンブロット実験においては変性したコンフォメーションにあるＣＤ１３３蛋白質に結合することにより、特徴付けられる。ＣＤ１３３抗原は、米国特許第５，８４３，６３３号によれば１２５ｋＤａないし１２７ｋＤの、および米国特許出願公開第２００１００５１３７２号によれば１１５ｋＤａないし１２７ｋＤａの範囲にある、幾つかの減じられた分子量を有することが報告されている。
【００８１】
ＣＤ４９ｆに対する抗体。ＣＤ４９ｆに対する抗体は、購入により得られるか、または当業者に知られている方法に従い調製されてもよい。ＣＤ４９ｆ抗原は、ＣＤ４９ｆ抗原に特異性を有する、様々な抗−ＣＤ４９ｆモノクローナル抗体などの抗体に接触され得る。抗−ＣＤ４９ｆ抗体は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに由来するウェスタンブロット条件下でＣＤ４９ｆ抗原に結合することにより、特徴付けられる。本明細書中、用語「抗−ＣＤ４９ｆ抗体」は、ＣＤ４９ｆ抗原に特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を言う。抗−ＣＤ４９ｆ抗体の例は、ＧｏＨ３および４Ｆ１０を含むが、これらに限定されない。ＣＤ４９ｆ抗原は、市販基準に基づいて、約１４０ｋＤａの範囲の分子量を有する。ＣＤ４９ｆ抗原は、胸腺細胞、Ｔリンパ球および単球で発現される。発現の増大は、活性化されたおよび記憶Ｔ細胞で見られる。Ａスプライス変異は単独で、肺、肝臓、脾臓および頸部で発現される。Ｂスプライス変異は単独で、脳、卵巣および腎臓で発現される。両形態は、他の組織においても検出される。
【００８２】
ＣＤ１５に対する抗体。ヒトＣＤ１５に対する抗体は、購入により得られるか、または当業者に知られている方法に従い調製されてもよい。ＣＤ１５抗原は、ＣＤ１５抗原に特異性を有する、様々な抗−ＣＤ１５モノクローナル抗体などの抗体に接触され得る。抗−ＣＤ１５抗体は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに由来するウェスタンブロット条件下でＣＤ１５抗原に結合することにより、特徴付けられる。本明細書中、用語「抗−ＣＤ１５抗体」は、ＣＤ１５抗原に特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を言う。抗−ＣＤ１５抗体の例は、ＭＭＡを含むが、これらに限定されない。ＣＤ１５抗原は、市販基準に基づいて、約２２０ｋＤａの範囲の分子量を有する。ＣＤ１５抗原は、成熟ヒト好中球、単球および好酸球において発現される。それは、胚性組織および腺癌、骨髄性白血病およびリード・シュテルンベルク細胞に存在することも見出され得る。
【００８３】
ＣＤ１３３、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５、ＣＤ９、ＣＤ３４および／またはＣＤ４５抗原に対する抗体は、異種移植免疫適格の哺乳類宿主（ネズミ、齧歯類、ウサギ目、ヒツジ、ブタ、ウシなどを含む）をヒト前駆細胞で免疫することにより、得られ得る。特定の宿主の選択は主に簡便なものである。免疫付与のために適当な前駆細胞集団は、膵臓幹細胞から得られ得る。免疫付与は、細胞が皮下、筋内、腹膜内、血管内などに注入されてもよい場合に、慣用法に従って実施される。通常は、約１０６ないし１０８個の細胞が用いられ、それらは、約１ないし約３週間にわたって、１またはそれ以上の注入、通常、多くても約８回の注入に分けられてもよい。注入は、例えば、フロイント完全もしくは不完全アジュバント、スペコール（ｓｐｅｃｏｌ）、ミョウバンなどのアジュバントを伴って、または伴わなくともよい。
【００８４】
免疫付与計画が完了した後に、抗血清は慣用法に従って収集され、ＣＤ１３３、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５、ＣＤ９、ＣＤ３４および／またはＣＤ４５抗原を含む前駆細胞の膜表面蛋白質に特異的な多角形の抗血清を提供してもよい。リンパ球は、例えば脾臓、流入領域リンパ節などの適切なリンパ系組織から収集され、そして、特定のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生する適切な融合パートナー、通常はミエローマ株と融合される。目的の抗原特異性についてのハイブリドーマクローンのスクリーニングは、慣用法に従って実施される。
【００８５】
抗−ＣＤ１３３、抗−ＣＤ４９ｆ、抗−ＣＤ１５、抗−ＣＤ９、抗−ＣＤ３４および／または抗−ＣＤ４５抗体は、一般的な多量体構造の代わりに一本鎖として産生され得る。一本鎖抗体は、例えば、Ｊｏｓｔら．，２６９Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２６２６７−７３（１９９４）に記載され、これは参照により本明細書に組み込まれる。重鎖可変部および軽鎖可変部をコードするＤＮＡ配列は、グリシンまたはセリンを含む、少なくとも約４個のアミノ酸の小さな中性アミノ酸をコードするスペーサーに連結されている。この融合によりコードされる蛋白質によって、元々の抗体の特異性および親和性を保持する機能的な可変部のアセンブリを可能にする。抗−ＣＤ１３３、抗−Ｃ４９ｆ、抗−ＣＤ１５、抗−ＣＤ９、抗−ＣＤ３４および／または抗−ＣＤ４５抗体は、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇ  ｃＤＮＡを用いることによっても産生され得る［（Ｌｉｕら，８４ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｃｉ．３４３９（１９８７）および１３９Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．３５２１（１９８７）、参照により本明細書に組み込まれる］。ｍＲＮＡは、抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞から単離され、そしてｃＤＮＡを産生するために用いられる。目的のｃＤＮＡは、特定のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅されてもよい（米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号を参照のこと）。
【００８６】
或いは、一のライブラリーが作成され、そして、目的配列を単離するためにスクリーニングされる。抗体の可変部をコードするＤＮＡ配列は、ついで、ヒト定常部配列へ融合される。ヒト定常部の遺伝子配列は、Ｋａｂａｔら．，Ｎ．Ｉ．Ｈ．ＰＵＢＬＩＣＡＴＩＯＮＮｏ．９１−３２４２（１９９１）において見出されてもよい。ヒトＣ領域の遺伝子は、既知のクローンから容易に入手できる。キメラ、ヒト化抗体は、ついで、慣用法により発現される。
【００８７】
抗−ＣＤ１３３、抗−ＣＤ４９ｆ、抗−ＣＤ１５、抗−ＣＤ９、抗−ＣＤ３４および／または抗−ＣＤ４５抗体は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂなどの抗体フラグメントとしても産生され得る。抗体フラグメントは、インタクトな蛋白質の切断により、例えばプロテアーゼまたは化学的な切断により調製されてもよい。或いは、切断型遺伝子も設計され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの部分をコードするキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列、その後ろに切断型分子を産生するための翻訳終止コドンを含むであろう。
【００８８】
免疫染色。生物試料は、対象抗体に結合された表面分子を発現する細胞の存在についての、任意の簡便な免疫アッセイ法により、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１５＋、ＣＤ９＋、ＣＤ３４＋および／またはＣＤ４５＋細胞の存在についてアッセイされる。アッセイは、細胞溶解物、インタクト細胞、凍結切片上などで実施されてもよい。任意の市販の抗体は、細胞の直接免疫蛍光染色に適当である。
【００８９】
セルソーティング。膵臓幹細胞および前駆細胞上に見られる細胞表面抗原の使用は、幹細胞もしくは前駆細胞集団のポジティブ免疫選択のための手段、ならびにフローサイトメトリーを用いる幹細胞もしくは前駆細胞の表現型分析のための手段を提供する。ＣＤ４９ｆおよび／またはＣＤ１３３抗原の発現について選択された細胞は、他の幹細胞および前駆細胞マーカーについての選択によりさらに純化されてもよい。例えば、前駆細胞は、ＣＤ９またはＣＤ１５についてのポジティブ免疫選択によりさらに分離され得る。実質的に純粋な前駆細胞および幹細胞の調製のために、前駆細胞のサブセットが、ＣＤ４９ｆおよび／またはＣＤ１３３への結合に基づいて、他の細胞から分離される。これらのマーカーでの選択は、任意の組み合わせおよび／または任意の順で遂行され得る。分離操作は、抗体でコーティングされた磁性ビーズを用いた磁気分離、アフィニティクロマトグラフィー、およびプレートなどの固体マトリックスに結合された抗体を用いた「パニング」、または他の簡便な技法を包含してもよい。正確な分離を提供する技法は、マルチカラーチャネル、鋭角および鈍角の光の散乱を検出するチャネル、インピーダンスチャネルなどの、様々な程度の精巧性を有し得る蛍光標識セルソーターを含む。死細胞は、死細胞に関連する色素（例えば、ヨウ化プロピジウム［ＰＩ］、ＬＤＳ）での選択により除去されてもよい。選択された細胞の生存能に過度に有害ではない、当業者に知られている任意の技法が用いられてもよい。
【００９０】
簡便には、抗体は標識にコンジュゲートされて、例えば、磁性ビーズ；アビジンまたはストレプトアビジンと高親和性で結合するビオチン；蛍光標識セルソーターで用いられ得る蛍光色素；ハプテン；などの特定の細胞型の分離が容易になり得る。マルチカラー分析が、ＦＡＣＳと一緒に、または免疫磁気分離およびフローサイトメトリーと組み合わせて用いられてもよい。マルチカラー分析は、例えば、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３４−ＣＤ４５−、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３４−、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ４５−、ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３４−、ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ４５−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４−、ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−、ＣＤ３４−ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−ＣＤ４９ｆ−ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３−ＣＤ４９ｆ−ＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋、ＣＤ１３３−ＣＤ４９ｆ−ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９−ＣＤ１５−、ＣＤ９−ＣＤ１５−、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９−ＣＤ１５＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９＋ＣＤ１５−などの複数の表面抗原に基づく細胞の分離のために興味深い。マルチカラー分析で用いられる蛍光色素は、フィコビリン蛋白質、例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン；フルオレセインおよびテキサスレッドを包含する。ネガティブな指示は、染色のレベルが、アイソタイプを適合した負対照の明るさと同じかまたはそれより低いことを示す。弱いまたは低い指示は、染色のレベルが負の染色のレベル近くにあってもよいが、アイソタイプを適合した対照よりは明るくてもよいことを示す。
【００９１】
一の実施態様において、抗体は、超常磁性微粒子（微粒子）などの磁性試薬に直接的または間接的にコンジュゲートされる。微粒子への直接コンジュゲーションは、当該分野で知られているような、様々な化学連結基を用いて、達成され得る。抗体は、側鎖のアミノ基またはスルフヒドリル基およびヘテロ官能性の架橋試薬を介して、微粒子にカップリングされ得る。多数のヘテロ官能性の化合物が、実体への連結のために利用され得る。好ましい連結基は、抗体上の反応性スルフヒドリル基および磁気粒子上の反応性アミノ基を用いる、３−（２−ピリジジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニイミドエステル（ＳＰＤＰ）または４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニイミドエステル（ＳＭＣＣ）である。
【００９２】
或いは、抗体は磁気粒子に間接的にカップリングされ得る。抗体はハプテンに直接コンジュゲートされ、そしてハプテン特異的な２段階目の抗体が粒子にコンジュゲートされる。適当なハプテンは、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ、ジニトロフェニル、ニトロフェニル、アビジン、ビオチンなどを包含する。一の蛋白質へのハプテンのコンジュゲーションのための方法は、当該分野において知られており、そしてかかるコンジュゲーションのためのキットは市販されている。
【００９３】
本発明の方法を実施するために、抗体は細胞試料へ添加される。特定の細胞サブセットへ結合するために必要である抗体の量は、一の試験分離および分析を行うことにより、実験的に決定される。細胞および抗体は、複合体形成のために十分な時間、一般的には少なくとも約５分間、より一般的には少なくとも約１０分間、および一般的には長くても１時間であり、より一般的には長くても約３０分間インキュベーションされる。
【００９４】
細胞は、前駆細胞または幹細胞上に存在するかまたは存在しないことが知られている細胞表面マーカーに対して特異的な抗体または結合分子とともにさらにインキュベーションされてもよい。標識された細胞は、特異的な抗体の調製に従って、分離される。蛍光標識された抗体は、ＦＡＣＳ分離、免疫磁気分離、特に高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）用の磁気粒子などに有用である。磁気分離装置の例は、例えば、ＷＯ９０／０７３８０、ＰＣＴ／ＵＳ９６／００９５３およびＥＰ４３８，５２０に記載されている。ＡＣ１３３細胞分離用キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ  ＣＡ）は、ＡＣ１３３＋細胞のポジティブセレクションに用いられ得る。該キットは、ＡＣ１３３＋細胞（すなわち、ＣＤ１３３抗原を有する細胞）の単一工程の分離のためのツールを提供する。ＡＣ１３３細胞分離用キットは、ＦｃＲ阻害剤およびモノクローナルマウス抗−ヒトＡＣ１３３抗体にコンジュゲートされた、ＭＡＣＳコロイド性マイクロビーズを含む。
【００９５】
純化された細胞集団は、任意の適切な培地中で収集されてもよい。様々な市販の培地が用いられてもよく、これは、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハンクス塩基性塩溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコリン酸バッファー生理食塩水（ＤＰＢＳ）、ＲＰＭＩ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、５ｍＭ  ＥＤＴＡリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）などを含み、頻繁には、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などで補完される。
【００９６】
ヒト前駆細胞もしくは幹細胞について高度に富化された集団は、この様式で達成される。所望の細胞は、細胞組成の３０％以上、好ましくは、細胞組成の５０％以上、より好ましくは、細胞集団の９０％以上、および最も好ましくは、細胞集団の９５％以上（例えば、実質的に純粋な）であろう。
【００９７】
純化された幹細胞／前駆細胞の使用。ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３４−、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ４５−、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３４−ＣＤ４５−、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９−ＣＤ１５−、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９−ＣＤ１５＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９＋ＣＤ１５−である幹細胞もしくは前駆細胞は、様々な様式において有用である。ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３４−、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ４５−、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３４−ＣＤ４５−、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９−ＣＤ１５−、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９−ＣＤ１５＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９＋ＣＤ１５−である細胞は、細胞が疾患または傷害を通じて失われている宿主を再構成するために用いられ得る。細胞に関連する遺伝病は、自己または同種異系の幹細胞の遺伝子修飾により処置されて、遺伝子欠失を修正されるかまたは疾患に対して予防処置が施されてもよい。或いは、一般的な同種異系の前駆細胞が移植される。疾患が、ホルモン、酵素、成長因子などの特定の分泌産物の欠損に関連する場合には、細胞に関連しない疾患も処置されてよい。
【００９８】
本発明の単離された細胞は、外分泌性および内分泌性両方の、様々な膵臓疾患の処置において用いられ得る。例えば、幹細胞もしくは前駆細胞は、例えば、膵臓の部分摘出などの、局部膵切除後の修復のために、分化した膵臓細胞の集団を産生するために用いられ得る。同様に、かかる細胞集団は、膵組織崩壊、例えば、膵炎などの膵臓組織の崩壊に起因する膵臓組織の欠損、例えば、実体への酵素流出により惹起される膵臓組織の自己分解に起因する状態を再生または置換するために用いられ得る。
【００９９】
単離された膵臓幹細胞もしくは前駆細胞は、糖尿病を含む、任意のインスリン−欠乏疾患を患っている患者に提供され得る。糖尿病は、糖調節の損失に至る膵臓島の破壊または機能不全により特徴付けられる。真性糖尿病は、慢性的に高いレベルの血糖（高血糖）の存在により定められる、代謝性疾患である。インスリン依存性（１型）真性糖尿病（「ＩＤＤＭ」）は、膵臓β−細胞の自己免疫が介する破壊に起因し、結果としてインスリン産生の損失を生じ、高血糖をもたらす。１型糖尿病は、生存を確実にするために、インスリン補充療法を必要とする。インスリン非依存性（２型）真性糖尿病（「ＮＩＤＤＭ」）は初期に、標準レベルより高い血漿インスリンレベル（高インスリン血症）が存在する高血糖により、特徴付けられる。２型糖尿病において、炭水化物代謝を制御する組織過程は、インスリンに対する感受性の減少と考えられている。２型糖尿病状態の進行は、血糖濃度の増大に関連しており、かつ糖に誘発されるインスリン分泌の割合を相対的に減じることに関連している。
【０１００】
本発明の膵臓幹細胞もしくは前駆細胞は、それらが膵臓系譜の細胞、例えばβ島細胞へ分化する能力を有するために、糖尿病の処置のために用いられ得る。本発明の前駆細胞は、これらの細胞をさらに誘導して成熟膵臓細胞へ分化し得る条件下でインビトロにおいて培養され得るか、或いは、それらは、一旦対象へ導入されたならば、インビボにて分化され得る。
【０１０１】
幹細胞集団、前駆細胞集団またはその分化された子孫のいずれかの形態にある、移植可能な細胞のソースを提供することに加えて、対象の細胞は、分泌された因子の産生および純化のために、膵臓細胞の培養物を生じるために用いられ得る。例えば、培養された細胞は、インスリンのソースとして提供され得る。同様に、外分泌性培養物は、パンクレアチンのソースとして提供され得る。
【０１０２】
ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９−ＣＤ１５−、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９−ＣＤ１５＋および／またはＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９＋ＣＤ１５−細胞は、細胞の分化および成熟に関連する因子の単離および評価において用いられてもよい。故に、細胞は、条件培地などの培地の活性を決定するため；成長因子の活性、系譜との関連性などに関して体液を評価するために、アッセイにおいて用いられてもよい。
【０１０３】
ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９−ＣＤ１５−、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９−ＣＤ１５＋および／またはＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９＋ＣＤ１５−細胞は、液体窒素温度にて凍結されて長期間貯蔵されてもよく、これは、融解されて再度使用され得る。通常、細胞は５％のＤＭＳＯおよび９５％のウシ胎児血清中で貯蔵されよう。一旦解凍されたならば、細胞は、幹細胞の増殖および分化に関連する成長因子またはストロマ細胞の使用により、増殖されてもよい。
【０１０４】
他の実施態様
本発明は、その詳細な記載と併せて記載されているが、以下の記載は単なる例示であって、添付の請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定しないことが理解されるはずである。他の態様、利点および修飾も、添付の請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、ＣＤ１３３およびＣＤ４９ｆ細胞表面マーカーに関する、胎児膵臓組織の免疫組織化学染色の写真である。ＣＤ１３３は、管細胞の管腔面で発現される。ＣＤ４９ｆは、管細胞の先端面で発現される。
【図２】図２は、成体膵臓組織の免疫組織化学染色の写真である。ＣＤ１３３発現は、管細胞の管腔面で観察される。
【図３】図３は、胎児膵臓組織の免疫組織化学染色の写真であり、大部分の実施態様において、ＣＤ１３３発現およびインスリン発現は相互に排他的であることを示す。
【図４】図４は、胎児膵臓組織の免疫組織化学染色の写真であり、幾つかの実施態様において、顕微鏡分析（矢印）により確認されるように、同じ細胞がインスリンおよびＣＤ４９を共に発現することを示す。
【図５】図５は、胎児膵臓組織の免疫組織化学染色の写真であり、幾つかの実施態様において、顕微鏡分析（矢印）により確認されるように、同じ細胞がインスリンおよびＣＫ１９を共に発現することを示す。
【図６】図６は、胎児膵臓組織の免疫組織化学染色の写真であり、幾つかの実施態様において、顕微鏡分析（矢印）により確認されるように、同じ細胞がインスリンおよびＣＤ９を共に発現することを示す。
【図７】図７は、ＣＤ１５細胞表面マーカーおよびインスリンに関する、胎児膵臓組織の免疫組織化学的な共染色の写真である。ＣＤ１５＋細胞およびインスリン＋細胞は相互に排他的である。
【図８】図８は、ＣＤ９細胞表面マーカーおよびインスリンに関する、胎児膵臓組織の免疫組織化学的な共染色の写真である。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、細胞表面マーカーに基づく膵臓細胞のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋細胞は、膵臓幹／前駆細胞について富化されている（図９Ａ）。分化中のα−細胞およびβ−細胞は、それぞれＣＤ１５＋ＣＤ９−およびＣＤ９＋ＣＤ１５−細胞集団へ分離される（図９Ｂ）。これらの膵臓細胞は、ＣＤ３４およびＣＤ４５に対する抗体で染色され、そしてＣＤ４５＋造血系細胞およびＣＤ３４＋内皮細胞がこれらの分析から除去される。
【図１０】図１０は、内分泌系譜の成熟幹細胞、前駆細胞および最終分化細胞を含む、膵臓幹細胞およびその前駆細胞のための抗原マーカーを描いたダイアグラムである。
【図１】
2007503815.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2007503815.tif 000009
【図６】
2007503815.tif 000010
【図７】
2007503815.tif 000011
【図８】
2007503815.tif 000012
【図９Ａ】
2007503815.tif 000013
【図９Ｂ】
2007503815.tif 000014
【図１０】
2007503815.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月30日(2006.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007503815000001.app
【国際調査報告】
2007503815.tif 000016
2007503815.tif 000017