(57)【要約】本明細書中で開示されるのは、サンプル中の生物学的因子の複合検出、例えば、例えば細菌、ウイルス、生物学的毒素などの複合検出のための方法、キットおよびシステムである。この方法は、各因子について２つのマーカーを利用する。１つの因子あたりのこの２つのマーカーの各々の、サンプル中の存在または非存在は、別個の容器内で決定される。しかし、各反応は、複数の因子についての単一のマーカーを検出するために使用される。リアルタイムＰＣＲを使用する複合検出方法も開示される。本発明は、生物学的因子の複合検出のための効率的な、最も経済的な、そして特異的な方法を提供する。
2007535945.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第１および第２の生物学的因子を検出するための方法であって、該第１の因子は、第１および第２のマーカーを含み、そして該第２の因子は、第３および第４のマーカーを含み、該方法は、
（ａ）該試薬を含有すると思われる少なくとも１つのサンプルから第１および第２の混合物を調製する工程；
（ｂ）第１の容器中の該第１の混合物中の該第１および第３のマーカーの存在または非存在を検出する工程；
（ｃ）第２の容器中の該第２の混合物中の該第２および第４のマーカーの存在または非存在を検出する工程、
を包含し、それにより、該第１および第２のマーカーの存在が該サンプル中の該第１の生物学的因子の存在を示し、該第３および第４のマーカーの存在が該サンプル中の該第２の生物学的因子の存在を示す、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記第１、第２、第３および第４のマーカーが、核酸、タンパク質および多糖類からなる群より選択される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記第１の混合物が、前記第１のマーカーを特異的に認識する第１のプローブ、および前記第３のマーカーを特異的に認識する第３のプローブを含み；
前記第２の混合物が、前記第２のマーカーを特異的に認識する第２のプローブ、および前記第４のマーカーを特異的に認識する第４のプローブを含み；
前記検出する工程（ｂ）が、該第１の混合物中の該第１および第３のマーカーに結合する該第１および第３のプローブの存在または非存在を決定する工程を包含し；そして
前記検出する工程（ｃ）が、該第２の混合物中の該第２および第４のマーカーに結合する該第２および第４のプローブの存在または非存在を決定する工程を包含する、
方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記第１、第２、第３または第４のプローブが、核酸および抗体からなる群より選択される、方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、前記プローブの各々が、検出可能な標識を有し、前記第１のプローブの検出可能な標識が、前記第２のプローブの検出可能な標識と同じであり、前記第３のプローブの検出可能な標識が、前記第４のプローブの検出可能な標識とは異なる、方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法であって、前記プローブの各々が、蛍光標識を有し、前記第１および第２のプローブの蛍光標識が、互いの１００ｎｍ以内にそれぞれの最大発光波長を有し、そして前記第３および第４のプローブの蛍光標識が、１００ｎｍよりも大きく異なるそれぞれの最大発光波長を有する、方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、少なくとも前記第１のプローブは核酸プローブであり、少なくとも前記第４のプローブは抗体である、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記第１のマーカーの存在または非存在を検出する工程が、該第１のマーカーを増幅して、前記第１のプローブを該増幅されたマーカーにハイブリダイズさせるＰＣＲを包含する、方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法であって、前記第４のマーカーの存在または非存在を検出する工程が、前記第４のプローブが該第４のマーカーに免疫特異的に結合する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の方法であって、前記プローブおよび前記マーカーが核酸であり、そして前記混合物中の該マーカーを検出する工程が、ＰＣＲを使用して実施される、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記第１および第２の混合物が同じサンプルから調製される、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記第１、第２、第３および第４のマーカーが、第１、第２、第３および第４の核酸配列を含み、前記第１の混合物が、該第１および第３の核酸配列を標識するためのハイブリダイゼーションプローブを含有し、そして前記第２の混合物が、該第２および第４の核酸配列を標識するためのハイブリダイゼーションプローブを含有する、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、少なくとも３つの生物学的因子が前記サンプル中で検出される、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、少なくとも４つの生物学的因子がサンプル中で検出される、方法。
【請求項１５】
生物学的因子の存在または非存在を検出するために使用される色チャネルの数よりも多い数の生物学的因子の存在または非存在を光学的に検出するための方法であって、該生物学的因子の各々は、該生物学的因子をその他の生物学的因子から識別するそれぞれの第１および第２の核酸配列を有し、該方法は、以下の工程：
ａ）生物学的因子を含有すると思われる少なくとも１つのサンプルから、第１および第２の容器中に、それぞれ第１および第２の混合物を形成する工程であって、ここで：
ｉ）該第１の混合物が、該生物学的因子の各々に対して、該生物学的因子の核酸配列を標識するためのそれぞれの第１のプローブセットを含有し；
ｉｉ）該第２の混合物が、該生物学的因子の各々に対して、該生物学的因子の核酸配列を標識するためのそれぞれの第２のプローブセットを含有し；
ｉｉｉ）該第１の混合物中の該第１のプローブセットのうちの少なくとも２つが、同じ色チャネルで検出される同じ発光波長範囲を有し、そして該第２の混合物中の該少なくとも２つの対応する第２のプローブセットが、異なる色チャネルで検出される異なる発光波長範囲を有する、工程；
ｂ）同じ発光波長範囲を有する、該第１の混合物中の該第１のプローブセットのうちの少なくとも２つに由来するプローブシグナルの存在または非存在を光学的に読み取る工程；
ｃ）異なる発光波長範囲を有する、該第２の混合物中の該少なくとも２つの対応する第２のプローブセットに由来するプローブシグナルの存在または非存在を光学的に読み取る工程；ならびに
ｄ）該混合物の各々から受け取られるプローブシグナルの組合せから、生物学的因子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
少なくとも第１および第２の生物学的因子を検出するための方法であって、該第１の因子は、第１および第２のマーカーを含み、そして該第２の因子は、第３および第４のマーカーを含み、該方法は、
ａ）該因子を含有すると思われる少なくとも１つのサンプルから、第１の容器中に第１の混合物を調製する工程；
ｂ）該第１の容器中の該第１および第３のマーカーの存在または非存在を検出する工程；
ｃ）該第１または第３のマーカーのいずれかが存在する場合、該少なくとも１つのサンプルから第２の容器中に第２の混合物を調製する工程；ならびに
ｄ）該第２の容器中の該第２および第４のマーカーの存在または非存在を検出する工程、
を包含し、それにより、該第１および第２のマーカーの存在が該サンプル中の該第１の生物学的因子の存在を示し、該第３および第４のマーカーの存在が該サンプル中の該第２の生物学的因子の存在を示す、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記第１、第２、第３および第４のマーカーが、第１、第２、第３および第４の核酸配列を含み、前記第１の混合物が該第１および第３の核酸配列を増幅して検出するための試薬およびプローブを含有し、そして前記第１の容器中の該第１および第３のマーカーの存在または非存在を検出する工程が、該第１の混合物を核酸増幅条件に供して、該第１の混合物中に該第１または第３の核酸配列のいずれかが存在するかどうかをプローブシグナルから決定する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記第２の混合物が前記第２および第４の核酸配列を増幅して検出するための試薬およびプローブを含有し、そして前記第１の容器中の前記第１および第３のマーカーの存在または非存在を検出する工程が、該第２の混合物を核酸増幅条件に供して、該第２の混合物中に該第２または第４の核酸配列のいずれかが存在するかどうかをプローブシグナルから決定する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
少なくとも第１および第２の生物学的因子を検出するためのキットであって、該第１の因子は、第１および第２のマーカーを含み、そして該第２の因子は、第３および第４のマーカーを含み、該キットは少なくとも第１および第２の容器を備え、ここで該第１の容器は、該第１のマーカーを特異的に認識する第１のプローブおよび該第３のマーカーを特異的に認識する第２のプローブを収容し、そして該第２の容器は、該第２のマーカーを特異的に認識する第３のプローブおよび該第４のマーカーを特異的に認識する第４のプローブを収容する、キット。
【請求項２０】
請求項１９に記載のキットであって、前記第１、第２、第３および第４のマーカーが、核酸、タンパク質および多糖類からなる群より選択される、キット。
【請求項２１】
請求項１９に記載のキットであって、前記第１、第２、第３および第４のプローブが、核酸および抗体からなる群より選択される、キット。
【請求項２２】
請求項１９に記載のキットであって、前記プローブの各々が、検出可能な標識を有し、前記第１のプローブの検出可能な標識が、前記第３のプローブの検出可能な標識と同じであり、前記第２のプローブの検出可能な標識が、前記第４のプローブの検出可能な標識とは異なる、キット。
【請求項２３】
請求項１９に記載のキットであって、前記プローブの各々は、蛍光標識を有し、そして前記第１および第２のプローブの蛍光標識が、互いの１００ｎｍ以内にそれぞれの最大吸収波長を有する、キット。
【請求項２４】
請求項１９に記載のキットであって、前記プローブの各々が、蛍光標識を有し、前記第１および第２のプローブの蛍光標識が、互いの１００ｎｍ以内にそれぞれの最大発光波長を有し、そして前記第３および第４のプローブの蛍光標識が、１００ｎｍよりも大きく異なるそれぞれの最大発光波長を有する、キット。
【請求項２５】
請求項１９に記載のキットであって、少なくとも前記第１のプローブは核酸プローブであり、少なくとも前記第４のプローブは抗体である、キット。
【請求項２６】
請求項１９に記載のキットであって、前記第１、第２、第３および第４のマーカーが、それぞれ、第１、第２、第３および第４の核酸配列を含み、そして前記プローブが、該核酸配列を標識するためのハイブリダイゼーションプローブを含む、キット。
【請求項２７】
請求項２６に記載のキットであって、前記第１の容器が、前記第１および第３の核酸配列を増幅するためのプライマーをさらに含有し、そして前記第２の容器が、第２および第４の核酸配列を増幅するためのプライマーをさらに含有する、キット。
【請求項２８】
請求項１９に記載のキットであって、前記第１、第２、第３および第４のマーカーが、それぞれ、第１、第２、第３および第４の核酸配列を含み、前記第１の容器が、前記第１および第３の核酸配列を増幅するためのプライマーをさらに含有し、そして前記第２の容器が、第２および第４の核酸配列を増幅するためのプライマーをさらに含有する、キット。
【請求項２９】
少なくとも第１および第２の生物学的因子を検出するためのシステムであって、該第１の因子は、第１および第２のマーカーを含み、該第２の因子は、第３および第４のマーカーを含み、該システムは、
（ａ）少なくとも第１および第２の容器であって、該第１の容器は、該第１および第３のマーカーを検出するための試薬を含有し、そして該第２の容器は、該第２および第４のマーカーを検出するための試薬を収容する、少なくとも第１および第２の容器；
（ｂ）該容器中の該マーカーの存在または非存在を検出するように配置された、少なくとも１つの検出器；
（ｃ）該少なくとも１つの検出器と通信している少なくとも１つのコントローラであって、該コントローラは、以下：
ｉ）該第１の容器中の検出反応を開始する工程；
ｉｉ）該検出器からデータを受け取る工程；ならびに
ｉｉｉ）該データから、該第１の容器中の該第１および第３のマーカーの存在または非存在を決定する工程；
を包含する一連の操作を実施し、ここで、該第１または第３のマーカーが該第１の容器の中に存在する場合、該コントローラは、以下：
ｉｖ）該第２の容器中の第２の検出反応を開始する工程；
ｖ）該検出器から追加のデータを受け取る工程；ならびに
ｖｉ）該追加のデータから、該第２の容器中の該第２および第４のマーカーの存在または非存在を決定する工程、
を包含する第２の一連の操作を実施するように、コンピューターで読取り可能な命令でプログラムされており、それにより、該第１および第２のマーカーの存在がサンプル中の該第１の生物学的因子の存在を示し、該第３および第４のマーカーの存在が該サンプル中の該第２の生物学的因子の存在を示す、少なくとも１つのコントローラ；
を備える、システム。
【請求項３０】
請求項２９に記載のシステムであって、前記マーカーが核酸であり、前記第１の容器中に収容される試薬が、前記第１および第３のマーカーを特異的に認識する核酸プローブであり、そして前記第２の容器中に収容される試薬が、前記第２および第４のマーカーを特異的に認識する核酸プローブである、システム。
【請求項３１】
請求項３０に記載のシステムであって、前記検出反応が核酸増幅を含む、システム。
【請求項３２】
請求項２９に記載のシステムであって、該システムが、前記コントローラと通信している少なくとも第１および第２の検出器を備え、該第１の検出器は、前記第１の容器中のマーカーの１つ以上の存在または非存在を検出するように配置されており、該第２の検出器は、前記第２の容器中の存在または非存在を検出するように配置されている、システム。
【請求項３３】
請求項２９に記載のシステムであって、前記第１、第２、第３および第４のマーカーが、第１、第２、第３および第４の核酸配列を含み、そして前記第１および第２の容器が、サンプルから核酸を抽出するため、および検出のために該核酸を保持するためのカートリッジを備える、システム。
【請求項３４】
複数の因子の存在または非存在を決定するための自動化システムであって、該因子の各々は、該因子をその他の因子から識別するそれぞれ第１および第２の核酸配列を有し、該自動化システムは、以下：
ａ）該因子を含有すると思われる第１および第２の反応混合物を核酸増幅条件に供するための、少なくとも１つの温度制御システムであって、該第１の反応混合物は、該因子の各々の第１の核酸配列を増幅して検出するための試薬およびプローブを含有し、そして該第２の反応混合物は、該因子の各々の該第２の核酸配列を増幅して検出するための試薬およびプローブを含有する、少なくとも１つの温度制御システム；
ｂ）該反応混合物からプローブシグナルを検出するように配置された、少なくとも１つの検出機構；ならびに
ｃ）該少なくとも１つの温度制御システムおよび該少なくとも１つの検出機構と通信している、少なくとも１つのコントローラであって、該コントローラは、以下の工程：
ｉ）該第１の反応混合物を核酸増幅条件に供するために、制御シグナルを該温度制御システムに送信する工程；
ｉｉ）該第１の反応混合物から受け取られるプローブシグナルから、該因子のいずれかの該第１の核酸配列が該第１の反応混合物中に存在するかどうかを決定する工程；
ｉｉｉ）該因子のいずれかの該第１の核酸配列が該第１の反応混合物中に存在する場合には、該第２の反応混合物を核酸増幅条件に供するために、制御シグナルを温度制御システムを送信する工程；ならびに
ｉｖ）該第２の反応混合物から受け取られるプローブシグナルから、該因子のいずれかの該第２の核酸配列が該第２の反応混合物中に存在するかどうかを決定する工程；
を実施するようにプログラムされており、それにより、該因子のいずれかの該第１および第２の核酸配列の存在が該因子の存在を示す、少なくとも１つのコントローラ、
を備える、自動化システム。
【請求項３５】
請求項３４に記載のシステムであって、該システムが、前記コントローラと通信している少なくとも第１および第２の検出機構を備え、該第１の検出機構が、前記第１の反応混合物中の該核酸配列の１つ以上の存在または非存在を検出するように配置されており、そして該第２の検出機構が、前記第２の反応混合物中の該核酸配列の１つ以上の存在または非存在を検出するように配置されている、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００４年５月７日出願の米国仮出願第６０／５６９，２０９号の利益を主張する。この特許出願の開示全体は、すべての目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府の支援による研究または開発に関する申告）
適用なし。
【０００３】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、最少数の容器を利用する、複数の生物学的因子の検出のための方法、キットおよびシステムに関する。本発明は、診断アッセイおよび疾患用薬剤のスクリーニグのために有用である。
【背景技術】
【０００４】
（関連技術の説明）
サンプル中の生物学的因子（例えば、病原体）を鋭敏に、特異的にそして素早く検出する診断アッセイは、疾患用および診断用生物因子（ｂｉｏａｇｅｎｔ）モニタリングの両方に対してますます重要になっている。感染性因子または別の様式で有害な因子の存在の早期検出のために、適切なタイムスケールで生理学的または臨床的に関連する生物体を正確に検出できるアッセイはほとんど存在しない。現在のところ、最も鋭敏は検出方法には、ＰＣＲが関与する。単一のサンプル中の複数の生物学的因子の存在または非存在を決定することは、複合された検出方法を使用して実施され得る。複合化リアルタイムＰＣＲは、このタイプの診断アッセイに対して使用され得る１つの方法である。
【０００５】
ＰＣＲに基づくアッセイは、最も経済的な数の反応管中で複数の因子を試験するために、ＰＣＲ反応を最適化することの複雑さによって制限され得る。一般的な通例として、非常に特異的な確認結果を支持するために必要とされるプローブの数は、２つ〜６つという多さの配列に及ぶ。当業者は、検出される因子の数が増加するにつれて、多くの異なるプライマー対およびプローブを用いてＰＣＲ反応を最適化することは、ますます管理不可能となる厖大な仕事になり得ることを認識する。
【０００６】
ＰＣＲに基づくアッセイは、結果の分析のために利用可能な独特の化学標識の数によっても制限され得る。例えば、リアルタイムＰＣＲアッセイは、一般に、蛍光標識を採用する。複合化リアルタイムＰＣＲを実施するとき、単一の反応中で使用され得る数は、使用される光学的検出システム中で利用可能な蛍光色チャネルの数により、制限される。
【０００７】
現在の複合アッセイのこれらの制限および他の制限を克服するための魅力的なアプローチが、本発明により提供される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本明細書中で開示されるのは、単一のサンプル中の複数の生物学的因子の、効率的な、最も経済的な、そして特異的な複合検出、例えば、例えば細菌、ウイルス、生物学的毒素などの生物学的因子の複合検出のための方法である。この方法は、各因子について２つのマーカーを利用する。１つの因子あたりのこの２つのマーカーの各々の存在または非存在は、別個の容器内で決定される。各容器は、複数の因子についての単一のマーカーを検出するために使用される。いずれかの因子についてのマーカーが第１の容器中で検出されない場合、第２の容器は使用される必要はなく、かなりの時間とお金を節約する。好ましい実施形態では、複合化蛍光リアルタイムＰＣＲが使用され、たった２組の反応を使用して、サンプル中の９つ以下の異なる生物学的因子の存在または非存在が決定される。この方法を採用するキットおよびシステムもまた、開示される。
【０００９】
１つの局面によれば、本発明は、少なくとも第１および第２の生物学的因子を検出するための方法を提供し、この第１の因子は、第１および第２のマーカーを含み、そしてこの第２の因子は、第３および第４のマーカーを含み、この方法は、この因子を含有すると思われる少なくとも１つのサンプルから第１および第２の混合物を調製する工程；第１の容器中のこの第１の混合物中の第１および第３のマーカーの存在または非存在を検出する工程；第２の容器中のこの第２の混合物中の該第２および第４のマーカーの存在または非存在を検出する工程、を包含し、それにより、該第１および第２のマーカーの存在が該サンプル中の該第１の生物学的因子の存在を示し、該第３および第４のマーカーの存在が該サンプル中の該第２の生物学的因子の存在を示す。本発明の方法を使用して識別され得る生物学的因子としては、細菌細胞、ウイルス粒子および生物学的毒素が挙げられる。検出され得るマーカーとしては、核酸、タンパク質および多糖類が挙げられる。マーカーは、例えば溶液、懸濁液、乳化剤または粉末が挙げられる混合物中で検出され得る。
【００１０】
別の局面によれば、本発明は、生物学的因子の存在または非存在を検出するために使用される色チャネルの数よりも多い数の生物学的因子の存在または非存在を光学的に検出するための方法を提供する。この生物学的因子の各々は、この生物学的因子をその他の生物学的因子から識別するそれぞれの第１および第２の核酸配列を有する。この方法は、生物学的因子を含有すると思われる少なくとも１つのサンプルから、第１および第２の容器中の、それぞれ第１および第２の混合物を形成する工程を包含する。この第１の混合物は、この生物学的因子の各々に対して、この生物学的因子の核酸配列を標識するためのそれぞれの第１のプローブセットを含有する。この第２の混合物は、この生物学的因子の各々に対して、該生物学的因子の核酸配列を標識するためのそれぞれの第２のプローブセットを含有する。この第１の混合物中の第１のプローブセットのうちの少なくとも２つは、同じ色チャネルで検出される同じ発光波長範囲を有し、そしてこの第２の混合物中の少なくとも２つの対応する第２のプローブセットは、異なる色チャネルで検出される異なる発光波長範囲を有する。この方法は、さらに、同じ発光波長範囲を有する、この第１の混合物中の該第１のプローブセットのうちの少なくとも２つに由来するプローブシグナルの存在または非存在を光学的に読み取る工程；異なる発光波長範囲を有する、この第２の混合物中の該少なくとも２つの対応する第２のプローブセットに由来するプローブシグナルの存在または非存在を光学的に読み取る工程；ならびにこの混合物の各々から受け取られるプローブシグナルの組合せから、生物学的因子の存在または非存在を決定する工程を包含する。
【００１１】
別の局面によれば、本発明は、少なくとも第１および第２の生物学的因子を検出するための方法を提供し、この第１の因子は、第１および第２のマーカーを含み、そしてこの第２の因子は、第３および第４のマーカーを含む。この方法は、この因子を含有すると思われる少なくとも１つのサンプルから、第１の容器中に第１の混合物を調製する工程、およびこの第１の容器中の第１および第３のマーカーの存在または非存在を検出する工程を包含する。第１の容器中にこの第１または第３のマーカーのいずれかが存在する場合、上記少なくとも１つのサンプルから第２の容器中に第２の混合物が調製され、そしてこの第２の容器中の第２および第４のマーカーの存在または非存在が検出される。この第１および第２のマーカーの存在は、このサンプル中の第１の生物学的因子の存在を示し、この第３および第４のマーカーの存在は、このサンプル中の該第２の生物学的因子の存在を示す。
【００１２】
別の局面によれば、本発明は、少なくとも第１および第２の生物学的因子を検出するためのキットを提供し、この第１の因子は、第１および第２のマーカーを含み、そしてこの第２の因子は、第３および第４のマーカーを含む。このキットは少なくとも第１および第２の容器を備える。この第１の容器は、この第１のマーカーを特異的に認識する第１のプローブおよびこの第３のマーカーを特異的に認識する第２のプローブを収容する。この第２の容器は、この第２のマーカーを特異的に認識する第３のプローブおよびこの第４のマーカーを特異的に認識する第４のプローブを収容する。いくつかの実施形態では、上記プローブの各々は、検出可能な標識を有し、上記第１のプローブの検出可能な標識は、上記第３のプローブの検出可能な標識と同じであり、上記第２のプローブの検出可能な標識は、上記第４のプローブの検出可能な標識とは異なる。いくつかの実施形態では、上記プローブの各々は、蛍光標識を有し、上記第１および第２のプローブの蛍光標識は、互いの１００ｎｍ以内にそれぞれの最大発光波長（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｍａｘｉｍａ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）を有し、そして上記第３および第４のプローブの蛍光標識は、１００ｎｍよりも大きく異なるそれぞれの最大発光波長を有する。他の実施形態では、少なくとも上記第１のプローブは核酸プローブであり、少なくとも上記第４のプローブは抗体である。いくつかの実施形態では、上記第１、第２、第３および第４のマーカーは、それぞれ、第１、第２、第３および第４の核酸配列を含み、そして上記プローブは、該核酸配列を標識するためのハイブリダイゼーションプローブを含む。いくつかの実施形態では、上記第１の容器は、上記第１および第３の核酸配列を増幅するためのプライマーをさらに含有し、そして上記第２の容器は、第２および第４の核酸配列を増幅するためのプライマーをさらに含有する。
【００１３】
別の局面によれば、本発明は、少なくとも第１および第２の生物学的因子を検出するためのシステムを提供する。この第１の因子は、第１および第２のマーカーを含み、この第２の因子は、第３および第４のマーカーを含む。このシステムは、少なくとも第１および第２の容器を備え、この第１の容器は、この第１および第３のマーカーを検出するための試薬を含有し、そしてこの第２の容器は、この第２および第４のマーカーを検出するための試薬を収容する。このシステムはまた、この容器中のマーカーの存在または非存在を検出するように配置された、少なくとも１つの検出器を備える。このシステムはさらに、少なくとも１つの検出器と通信している少なくとも１つのコントローラ（例えば、コンピューターまたはマイクロプロセッサー）を備える。このコントローラは、この第１の容器中の検出反応を開始する工程；この検出器からデータを受け取る工程；ならびにこのデータから、この第１の容器中のこの第１および第３のマーカーの存在または非存在を決定する工程という一連の操作を実施するためのコンピューターで読取り可能な命令でプログラムされている。この第１または第３のマーカーがこの第１の容器の中に存在する場合、このコントローラは、この第２の容器中の第２の検出反応を開始する工程、この検出器から追加のデータを受け取る工程；ならびにこの追加のデータから、この第２の容器中の第２および第４のマーカーの存在または非存在を決定する工程、という第２の一連の操作を実施する。この第１および第２のマーカーの存在は、サンプル中の第１の生物学的因子の存在を示し、この第３および第４のマーカーの存在は、このサンプル中の第２の生物学的因子の存在を示す。いくつかの実施形態では、この第１、第２、第３および第４のマーカーは、第１、第２、第３および第４の核酸配列を含み、そして上記第１および第２の容器は、サンプルから核酸を抽出するため、および検出のためにこの核酸を保持するためのカートリッジを備える。
【００１４】
別の局面によれば、本発明は、複数の因子の存在または非存在を決定するための自動化システムを提供し、この因子の各々は、この因子をその他の因子から識別するそれぞれの第１および第２の核酸配列を有する。この自動化システムは、この因子を含有すると思われる第１および第２の反応混合物を核酸増幅条件に供するための、少なくとも１つの温度制御システムを備える。この第１の反応混合物は、この因子の各々の第１の核酸配列を増幅して検出するための試薬およびプローブを含有し、そしてこの第２の反応混合物は、この因子の各々の第２の核酸配列を増幅して検出するための試薬およびプローブを含有する。少なくとも１つの検出機構が、この反応混合物からプローブシグナルを検出するように配置されている。この自動化システムは、この少なくとも１つの温度制御システムおよびこの少なくとも１つの検出機構と通信している、少なくとも１つのコントローラをさらに備える。このコントローラは、この第１の反応混合物を核酸増幅条件に供するために、制御シグナルを温度制御システムを送信する工程、およびこの第１の反応混合物から受け取られるプローブシグナルから、この因子のいずれかの第１の核酸配列がこの第１の反応混合物中に存在するかどうかを決定する工程を実施するようにプログラムされている。この因子のいずれかの第１の核酸配列がこの第１の反応混合物中に存在する場合には、この第２の反応混合物を核酸増幅条件に供するために、制御シグナルを温度制御システムを送信する工程；およびこの第２の反応混合物から受け取られるプローブシグナルから、該因子のいずれかの該第２の核酸配列が該第２の反応混合物中に存在するかどうかを決定する工程を実施するようにプログラムされている。この因子のいずれかの第１および第２の核酸配列の存在が該因子の存在を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
手短に言えば、そして以下により詳細に説明されるように、本明細書中で説明されるのは、複数の因子の効率的な、最も経済的な、そして特異的な複合検出のための方法、キットおよびシステム、例えば、例えば細菌、ウイルス、生物学的毒素などの高度に複合化されたリアルタイムＰＣＲ検出のための方法である。
【００１６】
本発明のアプローチのいくつかの特徴が注目されるべきである。この方法は、各生物学的因子に対してわずか２つのマーカーを使用する。例えば、各細菌株に対して２つの遺伝子配列（マーカー）を検出するために、２つのプローブが使用される。１つの因子あたりの２つのマーカーの各々の存在または非存在は、別個の容器中で実施される。例えば、２つの異なる遺伝子配列の検出は、別個のリアルタイムＰＣＲ反応において実施される。各容器は、複数の因子に対する単一のマーカーを検出するために使用される。分析の二成分性の特徴（例えば、２つの異なる容器（反応）中の２つの異なるプローブ）に起因して、同じ容器中の複数のプローブは、同じ標識を含み得る。任意の因子に対するマーカーが第１の容器中で検出されない場合、第２の容器は、利用される必要がない。
【００１７】
このアプローチの利点は多い。この方法は、単一の因子に対する複数のプローブとの検出反応を最適化すること、例えば、単一の細菌の核酸に方向付けられた複数のプローブとの単一のＰＣＲ反応を最適化することという困難さおよび複雑さを克服する。これは、各因子に対する２つのプローブを２つの別個の容器（例えば、２つの別個の反応）に分離する方法を使用することの結果である。
【００１８】
さらに、この方法は、単一の容器中で検出され得る標識の規定される数により強要される、単一の容器中で検出され得る因子の数に基づく制限を克服する。例えば、標準的な蛍光検出システムを使用するリアルタイムＰＣＲは、４つの異なる蛍光チャネルを備える。
このことは、一般に、複合反応を行うときには使用されねばならない容器の数の増加を導く。本発明の方法は、各因子に対する２つのプローブを別個の容器に分離するので、検出される各標識は、複数のプローブとともに使用され得、両方の容器からの結果の分析により、その因子の同定（存在するかしないか）を提供する。この方法はまた、１つの容器あたりの検出の選択肢の数が制限されている場面、例えば蛍光チャネルの数が制限されている場面に直面したときには、もっとも経済的である。
【００１９】
本発明は、サンプル中の複数の因子の特異的で、効率的な、最も経済的な検出のために有用である。この方法は、サンプル中の因子を鋭敏に、特異的に、そして素早く検出する診断アッセイで採用され得る。検出され得る因子のタイプとしては、例えば、細菌、ウイルスおよび毒素が挙げられる。例えば、本発明の方法は、疾患の病原体に対する診断アッセイにおいて有用である。
【００２０】
（定義）
特許請求の範囲および明細書中で使用される用語は、別様に特定しない限り、以下に示されるように定義される。本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、そうではないと文脈が明示的に物語っていない限り、複数の参照物を含むことが留意されねばならない。
【００２１】
本願で使用される略号としては、以下のものが挙げられる。
【００２２】
「ＰＣＲ」とは、ポリメラーゼ連鎖反応をいう。
【００２３】
「生物学的因子」とは、あらゆる同定されるべきである生物学的物質をいい、例えば、細胞、ウイルス、天然に存在するタンパク質、糖タンパク質、複合糖および単糖、核酸、脂質ならびにリポタンパク質が挙げられる。「生物学的因子」はまた、毒素、特に天然、合成両方の核酸ベースおよびタンパク質ベースの毒素をいう。
【００２４】
「色チャネル」とは、検出波長範囲をいう。
【００２５】
「検出可能な標識」とは、分光学的、放射性同位体的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能なシグナルを、直接的または間接的にのいずれかで生成することができるあらゆる組成物をいう。例としては、同位体標識、免疫標識、および着色されたかまたは蛍光性の色素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
「検出（すること）」とは、サンプル中のマーカーの存在または非存在を決定することをいう。検出（すること）はまた、検出用マーカーの分析に基づいて、サンプル中の生物学的因子の存在または非存在を決定することをいう。
【００２７】
「最大発光」とは、以前に励起された蛍光標識が、その後に光の形態で最大のエネルギーを放出する波長をいう。
【００２８】
「最大吸収」とは、蛍光標識が、光子の形態で最大量のエネルギーを吸収する波長をいう。
【００２９】
「マーカー」とは、生物学的因子を明確に同定する、生物学的因子の高分子的、微視的、または分子的特徴をいう。
【００３０】
（本発明の方法）
本発明は、複合された様式で、複数の生物学的因子の同定が決定される、例えば存在または非存在が決定される方法を提供する。この方法は、単一の生物学的因子に対する複数のマーカーの検出を最適化するという困難さを克服する。この方法はまた、最も経済的な様式で、最少数の容器を利用するように設計されている。各容器は、複数の因子に対する複数のマーカーを検出するための手段を備える。しかし、各容器は、各因子に独特の単一のマーカーのみを検出するための手段のみを備える。単一の容器（結果が完全に陰性である場合）またはすべての容器からの結果の分析により、複数の生物学的因子の同定（存在または不存在）の所望の結果が提供される。一般に、マーカーは、プローブ（例えば、増幅された遺伝子配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）を使用して検出される。このプローブは、検出のために標識される（例えば、蛍光標識される）。
【００３１】
本発明の方法を使用してサンプル中で検出される生物学的因子の最大数（Ｘ）は、単一の容器中で識別されて検出され得る異なるプローブ標識の数（ＰＬ）、使用されるべき容器の数（Ｎ）および内部コントロールの数（ＩＣ）によってのみ制限される。２つの容器を使用して同定され得る生物学的因子の最大数（Ｘ）は、次式：Ｘ＝（ＰＬ−ＩＣ）Ｎにより規定される。
【００３２】
例えば、１つの実施形態では、本発明の方法は、サンプル中の特定の細菌細胞（生物学的因子）の存在または非存在を決定するための遺伝子配列（マーカー）の検出のためのリアルタイムＰＣＲを使用して実施され得る。１つの実施形態では、リアルタイムＰＣＲは、Ｃｅｐｈｅｉｄ  Ｉ−ＣＯＲＥ（登録商標）システムを使用して実施される。このシステムは、４つの光学的色チャネルを利用する（ＰＬ＝４）。１つの実施形態では、単一の内部コントロールが、各容器中で使用される（ＩＣ＝１）。このシステムを使用して、最大９つの異なる生物学的因子が、たった２つの容器を使用するサンプル中で同定され得る。別の実施形態では、２つの内部コントロールが各容器中で使用され、最大４つの異なる生物学的因子が２つの容器を使用して同定され得る。
【００３３】
識別して検出され得るプローブ標識の数が増えるにつれて、同定され得る因子の数は、使用される容器を増やすことなく、増加する。以下の表は、ＰＬおよびＩＣの数ならびに２つの容器に基づく本発明の方法を使用して同定され得る因子の最大数を示す。
【００３４】
【表１】
2007535945.tif 000003
先行技術に対する本発明の改善の例証は、以下の通りである。４つの検出可能な標識を使用する検出方法により、単一反応において４つの別個のマーカーの検出が可能になる。
１つの因子あたり１つより多いマーカーが測定される必要があり、そして少なくとも１つの検出可能な標識を内部コントロール（ＩＣ）のために取っておく場合、４つより少ない因子、例えばせいぜい１つの因子が、単一の反応において検出され得る。さらに、単一の反応において単一の生物学的因子に対して複数のマーカーを検出しようと試みる場合、困難さが発生する。しかし、本発明の方法を使用すると、それらの正確な同定のために１つより多いマーカーが必要とされる場合でさえも、４つより多い因子を同定することが可能である。実際、どれだけ多くのプローブが検出可能な標識を共有するかに依存して、多くの因子が検出され得る。
【００３５】
１つの実施形態では、２つの容器を用いて検出され得る因子の数は、単一の容器中の１つより多いプローブを同じ検出可能な標識で標識することにより、そして２つの容器間で検出可能な標識の割当てをずらす（ｏｆｆｓｅｔｔｉｎｇ）ことにより、拡張される。２つのようきからの結果の分析により、そのサンプル中に存在する生物学的因子の同定が提供される。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、２つの容器の分析は、逐次的に実施される。第１の容器中にマーカーが検出されない場合、それはそのサンプル中に因子が存在しないことを示すので、第２の容器は利用されない。
【００３７】
本発明の方法の以下のモデルは、本発明の方法をより明瞭に例証する。このモデルは、同定されるべき因子の数、プローブを標識するためのシステム、および予想される結果を含む。このモデルは、蛍光リアルタイムＰＣＲを使用して検出される遺伝子配列マーカーの実施形態とともに提示されるが、当業者は、他のマーカー、プローブ、および検出方法が同じ方法内で使用され得ることを容易に理解する。
【００３８】
（４つの検出可能な標識を用いる、３つの因子の同定のためのモデル）
この実施形態では、本方法は、３つの因子（例えば、生物体）についてスクリーニングし、それらを同定するために使用される。各生物体は、２つのマーカー（例えば、遺伝子配列）により同定され得る。このマーカーは、検出可能な標識を有するプローブ（例えば、蛍光標識されたプローブ）により検出される。サンプル中の遺伝子配列の存在または非存在は、リアルタイムＰＣＲおよび４チャネルのＣｅｐｈｅｉｄ  Ｉ−ＣＯＲＥシステムを使用して実施される。２つの容器（例えば、カートリッジ）が使用される。内部コントロールは、両方の容器において検出される。因子に対するプローブの割当ては、次の通りである：因子１＝プローブＡ、Ｂ；因子２＝プローブＣ、Ｄ；因子３＝プローブＥ、Ｆ；コントロール＝プローブＧ。
【００３９】
２つのカートリッジ間の検出可能な標識の割当ておよびプローブの配分（ａｌｌｏｃａｔｉｏｎ）は、以下の表に示される。
【００４０】
【表２】
2007535945.tif 000004
以下の一覧表は、次に、２つのカートリッジの結果に基づきどのように因子が同定されるのかを示す。
【００４１】
【表３】
2007535945.tif 000005
（４つの色チャネルを使用する、４つの因子の同定のためのモデル）
別の実施形態では、本発明の方法は、１つの因子あたり２つのマーカー、および１つのコントロールを使用して、４つの因子を検出し得る。この実施形態では、２つの因子の各々に対する単一のプローブは、同一に標識され、１つのカートリッジ中で検出され、そして２つの因子の各々に対する第２のプローブは、識別して標識され、第２のカートリッジ中で検出される。この実施形態では、本方法は、４つの因子（例えば、生物体）を同定するために使用され得る。各生物体は、２つのマーカー（例えば、遺伝子配列）により同定され得る。このマーカーは、蛍光標識されたプローブにより検出される。サンプル中の遺伝子配列の検出は、リアルタイムＰＣＲおよび４チャネルＣｅｐｈｅｉｄ  Ｉ−ＣＯＲＥシステムを使用して実施される。２つのカートリッジ（例えば、容器）が使用される。内部コントロールは、両方のカートリッジにおいて検出される。因子に対するプローブの割当ては、次の通りである：因子１＝プローブＡ、Ｂ；因子２＝プローブＣ、Ｄ；因子３＝プローブＥ、Ｆ；因子４＝プローブＧおよびＨ、コントロール＝プローブＪ。
【００４２】
２つのカートリッジ間の検出可能な標識の割当ておよびプローブの配分は、以下の表に示される。
【００４３】
【表４】
2007535945.tif 000006
以下の一覧表は、２つのカートリッジの結果に基づきどのように因子が同定されるのかを示す。
【００４４】
【表５】
2007535945.tif 000007
（４つの色チャネルを使用する、５つの因子の同定のためのモデル）
別の実施形態では、本発明の方法は、１因子あたり２つのマーカー、および１つのコントロールを使用して、５つの因子を検出し得る。この実施形態では、２つの因子の各々に対するプローブは、同一に標識され、１つのカートリッジ中で検出され、そして第２のプローブは、異なる標識を用いて標識される。この場合、因子に対するプローブの割当ては、以下の通りである：因子１＝プローブＡ、Ｂ；因子２＝プローブＣ、Ｄ；因子３＝プローブＥ、Ｆ；因子４＝プローブＧ、Ｈ；因子５＝プローブＩ、Ｊ；コントロール＝プローブＫ。
【００４５】
２つのカートリッジ間の検出可能な標識の割当ておよびプローブの配分は、以下の表に示される。
【００４６】
【表６】
2007535945.tif 000008
以下の一覧表は、予測される結果を示す。
【００４７】
【表７】
2007535945.tif 000009
（６色チャネルを使用する、８つの因子の同定のためのモデル）
別の実施形態では、本発明は、６色チャネルを採用するシステムを利用するアッセイのために使用される。この実施形態では、８つの因子が、１つの因子あたり２つの配列を使用し、そして２つの内部コントロールを採用して同定される。
【００４８】
この実施形態では、２つの因子の各々に対する単一のプローブが、同一に標識され、１つのカートリッジ中で検出される。２つの因子の各々に対する第２のプローブは、異なって標識される。この場合、因子に対するプローブの割当ては、以下の通りである：因子１＝Ａ、Ｂ、因子２＝Ｃ、Ｄ、因子３＝Ｅ、Ｆ，因子４＝Ｇ、Ｈ、因子５＝Ｉ、Ｊ、因子６＝Ｋ、Ｌ、因子７＝Ｍ、Ｎ、因子８＝Ｏ、Ｐ、ＩＣ１＝Ｑ、ＩＣ２＝Ｒ。
【００４９】
２つのカートリッジ間の検出可能な標識の割当ておよびプローブの配分は、以下の２つの表に示される。
【００５０】
【表８】
2007535945.tif 000010
以下の一覧表は、予測される結果を示す。
【００５１】
【表９】
2007535945.tif 000011
（４つの色チャネルを使用する、９つの因子の同定のためのモデル）
別の実施形態では、２つより多いプローブが同じ検出可能な標識で標識される。同じ検出可能な標識で標識され得るプローブの数は、識別して検出され得る検出可能な標識の数に等しく、コントロールに割当てられる数より少ない。これらの追加の組合せを利用することにより、利用可能な検出可能な標識よりも多い因子を決定することが可能である。
【００５２】
１つの実施形態では、９つの因子が１因子あたり２つのマーカー、および１つの内部コントロールを使用して検出される。３つの検出可能な標識が、因子の検出のために利用可能であり、そして３つのプローブ（各々は、異なる因子に対してのものである）は、同じ検出可能は標識を有する。この実施形態では、因子に対するプローブの割当ては、以下のとおりである：因子１＝プローブＡ、Ｂ、因子２＝プローブＣ、Ｄ、因子３＝プローブＥ、Ｆ、因子４＝プローブＧ、Ｈ、因子５＝プローブＩ、Ｊ，因子６＝プローブＫ、Ｌ、因子７＝プローブＭ、Ｎ、因子８＝プローブＯ、Ｐ、因子９＝プローブＵおよびＶ、ならびにＩＣ１＝プローブＱ。
【００５３】
２つのカートリッジ間の検出可能な標識の割当ておよびプローブの配分は、以下の２つの表に示される。
【００５４】
【表１０】
2007535945.tif 000012
以下の一覧表は、予測される結果を示す。
【００５５】
【表１１】
2007535945.tif 000013
（検出方法）
本発明の方法は、サンプル中のマーカーの存在または非存在を検出するための多くの異なる検出方法を使用し得る。検出方法は、代表的には、特定のマーカーに結合して（例えば、標的の高分子種に結合する）検出可能なシグナルを生成する、少なくとも１つの分析試薬を採用する。
これらの分析試薬は、代表的には、２つの成分を有する：（１）高度な特異性および親和性で標的高分子（例えば、抗体またはマーカー遺伝子）に結合し得るプローブ高分子（例えば、抗体またはオリゴヌクレオチド）、ならびに（２）放射性同位体または共有結合された蛍光色素分子のような検出可能な標識。一般に、プローブ高分子の結合特性は、検出方法の特異性を規定し、随伴する標識の検出可能性は、その検出方法の感度を決定する。検出の感度は、今度は、採用される標識のタイプならびにそれを検出するため利用可能な設備の品質およびタイプに関連する。
【００５６】
本発明の１つの実施形態では、リアルタイムＰＣＲが、検出方法として使用される。本明細書中でより詳細に説明されるように、マーカー（例えば、遺伝子配列）は、リアルタイムＰＣＲを使用して増幅され、そして生成物は蛍光標識されたプローブを使用して検出される。別の実施形態では、イムノアッセイが検出方法として使用される。この検出方法を用いると、上記マーカーは、例えば、抗体であり、上記プローブは、蛍光標識された抗体である。種々のイムノアッセイが当業者に公知であり、そしてそれは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどを含む。本発明の方法が任意の数のマーカー／プローブ／検出システムの組合せとともに使用され得ることを当業者は容易に理解する。
【００５７】
（検出可能な標識）
本発明における使用に適した検出可能な標識は、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで、検出可能なシグナルを生成することができる化合物である。本発明の方法とともに使用され得る検出可能な標識のタイプの例としては、例えば、蛍光色素または着色色素、同位体標識、酵素、免疫標識（例えば、抗体または抗原）などが挙げられる。この標識は、例えば核酸、タンパク質または抗体を含むプローブの中に組込まれ得る。この標識は、直接的にまたは間接的に、検出可能なシグナルを提供する。この検出可能な標識をプローブまたは他の化合物に結合体化させるための当該分野で公知の任意の方法が使用され得る。
【００５８】
１つの実施形態では、蛍光標識が、本発明の方法において使用される。本発明における有用な標識としては、例えば、フルオレセイン、テキサスレッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから市販されている）、ＬＩＺ（ＡＢＩから市販されている）、ＦＡＭ、ｄＲＯＸ（ＡＢＩから市販されている）、Ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから市販されている）が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得る他の蛍光化合物または化学発光化合物は、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ルシフェリンなどである。別の実施形態では、この検出可能は標識は、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）である。この検出可能な標識が酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、および例えばＥＬＩＳＡで使用される他の酵素）；標識されたストレプトアビジン結合体で染色されたビオチン；磁性ビーズと熱量測定標識（例えば、コロイド状の金、または着色されたガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズ）であり得ることを当業者は理解する。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号，同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９；および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。
【００５９】
（検出デバイス）
標識されたプローブを検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、蛍光標識は、発光された光を検出するための光検出器（ｐｈｏｔｏｄｅｔｅｃｔｏｒ）を使用して検出され得、または放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーション計数器を使用して検出され得る。酵素標識は、代表的には、その酵素に基質を提供し、そしてその基質に対するその酵素の作用により生成される反応生成物を検出することにより、検出される。熱量測定標識は、着色標識を視覚化することにより検出される。
【００６０】
１つの実施形態では、リアルタイムＰＣＲの光学的検出がマーカーの検出のために使用される。マーカーの核酸のＰＣＲ増幅が実施され、そしてその増幅された生成物のリアルタイム検出が蛍光標識されたプローブを使用して実施される。「リアルタイムＰＣＲ」または「ＴａｑＭａｎ」アッセイは、当該分野で公知である。当該分野で公知のように、ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端のレポーター色素（例えば、６−ＦＡＭ）および３’末端のクエンチャ−色素（例えば、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  ＱｕｅｎｃｈｅｒまたはＴＡＭＲＡ）という２つの色素を含有する。反応の間、Ｔａｑポリメラーゼ酵素の５’−３’求核分解活性（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）が、このレポーターとクエンチャーとの間のプローブを切断し、レポーターの蛍光の増加をもたらす。ＰＣＲ生成物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の増加を監視することにより直接的に検出される。適切なＰＣＲプローブとしては、ＴａｑＭａｎプローブ（Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９６  １０月；６（１０）：９８６−９４（この文献は、本明細書中に参考として援用される）、モレキュラービーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）（例えば、ＤＡＢＣＹＬのような消光色素と組み合わせた蛍光ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴまたはＲＯＸ（例えば、本明細書中に参考として援用されるＭａｒｒａｓ  ＳＡＥら、（１９９９）Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ  １４，１５１−１５６を参照のこと））、およびより最近ではＳｃｏｒｐｉｏｎｓ  （ＤｘＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＴａｑＭａｎプローブおよびモレキュラービーコンの両方は、異なるプローブ／ビーコンに対して、異なるレポーターを使用することにより、複数のＤＮＡ種（複合化）の検出を可能にする。
【００６１】
別の実施形態では、本発明の方法は、Ｃｅｐｈｅｉｄ  Ｉ−ＣＯＲＥシステムを採用する。このＣｅｐｈｅｉｄ  Ｉ−ＣＯＲＥシステムは、同時に４つの蛍光レポーター色素を検出することができる４つの別個の光学チャネルを利用する。Ｉ−ＣＯＲＥ技術は、米国特許第６，３６９，８９３号（この特許文献は、本明細書中に参考として援用される）に開示される。
【００６２】
（本発明のキット）
本発明の別の局面は、少なくとも２つの生物学的因子を検出するためのキットを包含する。本発明のキットは、その生物学的サンプルの分析のための少なくとも２つの容器を備える。各容器は、検出されるである各生物学的因子に対するマーカーを検出し得るプローブを有する；それゆえに、各容器は、少なくとも２つのプローブを有する。
【００６３】
１つの実施形態では、少なくとも２つの生物学的因子を検出するためのキットは、２つの容器を備える。各容器は、２つのプローブを含有し、１つのプローブは、第１の生物学的因子の第１のマーカーを検出するためのものであり、第２のプローブは、第２の生物学的因子の第１のマーカーを検出するためのものである。
【００６４】
種々の実施形態では、本発明のキットは、本明細書中で説明されるような生物学的因子の範囲（例えば、細菌細胞、ウイルス粒子、生物学的毒素など）を検出するために使用され得る。企図されるマーカーとしては、本明細書中で説明されるマーカー（例えば、核酸、タンパク質および多糖類）が挙げられる。好ましい実施形態では、このマーカーは、核酸（例えば、遺伝子配列）である。このキット中に含まれ得るプローブとしては、例えば、核酸および抗体が挙げられる。このプローブは、当業者に周知であって本明細書中で詳細に説明される、任意の数の検出可能な標識を使用して標識され得る。好ましい実施形態では、この検出可能な標識は、蛍光標識である。
【００６５】
（本発明のシステム）
図１は、少なくとも第１および第２の生物学的因子を検出するためのシステム１０の概略的なブロック図を示す。第１の因子は、第１および第２のマーカーを含み、そして第２の因子は、第３および第４のマーカーを含む。このシステムは、少なくとも第１および第２の容器の１２Ａおよび１２Ｂを備える。第１の容器１２Ａは、第１および第３のマーカーを検出するための試薬を収容し、第２の容器１２Ｂは、第２および第４のマーカーを検出するための試薬を収容する。適切な容器としては、反応容器、管、キュベットまたはカートリッジが挙げられるが、これらに限定されない。１つの特に好ましい実施形態では、第１、第２、第３および第４のマーカーは、第１、第２、第３および第４の核酸配列を含み、第１および第２の容器は、サンプルから核酸を抽出するため、そして検出のためにその核酸を保持するためのカートリッジである。そのようなカートリッジは、米国特許第６，３７４，６８４号および米国特許第６，３９１，５４１号に開示されている（これらの特許文献の開示は、本明細書中に参考として援用される）。
【００６６】
システム１０はまた、容器１２Ａおよび１２Ｂ中のマーカーの存在または非存在を検出するように配置された少なくとも１つの検出器を備える。好ましい実施形態では、システム２０は、少なくとも第１および第２の検出器１４Ａおよび１４Ｂを備える。第１の検出器１４Ａは、第１の容器１２Ａ中のマーカーの存在または非存在を検出するように配置され、第２の検出器１４Ｂは、第２の容器１２Ｂ中のマーカーの存在または非存在を検出するように配置される。複数の検出器が好ましいが、光ファイバー、導波管、光導波路（ｌｉｇｈｔ  ｐｉｐｅ）などのような光学デバイスを使用して、各容器と光学的に通信している単一の検出器を配置することにより、複数の容器中のマーカーを検出するための単一の検出器が使用され得ることは周知である。検出器１４Ａおよび１４Ｂは、好ましくは、容器１２Ａおよび１２Ｂ中の蛍光標識を検出して測定するための蛍光計である。そのようなデバイスは、一般に、蛍光標識を励起するための少なくとも１つの光源、および発光された蛍光を測定するための少なくとも１つの光検出器を備える。これらのデバイスは、当該分野で周知であり、上で引用された、ＣｅｐｈｅｉｄからのＩ−ＣＯＲＥ（登録商標）モジュールのように、広く市販されている。他の適切な検出器としては、燐光標識、化学発光標識または電子化学発光標識を検出するためのデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
システム１０はまた、上記少なくとも１つの検出器と通信している少なくとも１つのコントローラ１６（例えば、コンピューターまたはマイクロプロセッサー）を備える。このコントローラは、容器１２Ａおよび１２Ｂ中の検出反応を開始する工程を包含する、一連の操作を実施するためのコンピューターで読取り可能な命令でプログラムされている。好ましい実施形態では、因子を同定するマーカーは、核酸であり、第１の容器１２Ａ中に収容される試薬は、第１および第３のマーカーを特異的に認識する核酸プローブであり、第２の容器１２Ｂ中に収容される試薬は、第２および第４のマーカーを特異的に認識する核酸プローブであり、そして検出反応は、核酸増幅を包含する。適切な核酸増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が挙げられる。等温増幅反応が適切であり、本発明の方法に従って使用され得る。等温増幅反応の例としては、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）：１６９１−６（１９９２）；Ｗａｌｋｅｒ  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ  ３（１）：１−６（１９９３））、転写媒介性増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｐｈｙｆｆｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：８３４−８４１（１９９６）；Ｖｕｏｒｉｎｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：１８５６−１８５９（１９９５））、核酸配列ベースの増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）（Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５０（６３１３）：９１−２（１９９１）、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＣＡ）（Ｌｉｓｂｙ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２（１）：７５−９９（１９９９））；Ｈａｔｃｈら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１５（２）：３５−４０（１９９９））、および分岐鎖ＤＮＡシグナル増幅（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ｂＤＮＡ）（例えば、Ｉｑｂａｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  １３（４）：３１５−３２０（１９９９）を参照のこと）が挙げられる。当該分野の当業者に公知の他の増幅方法としては、ＣＰＲ（サイクリングプローブ反応（Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ））、ＳＳＲ（自立配列複製（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ））、ＳＤＡ（鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））、ＱＢＲ（Ｑ−β  レプリカーゼ（Ｑ−Ｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ））、Ｒｅ−ＡＭＰ（かつてのＲＡＭＰ）、ＲＣＲ（修復連鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ））、ＴＡＳ（転写ベースの増幅システム（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ））およびＨＣＳが挙げられる。
【００６８】
システム１０は、必要に応じて、少なくとも１つの温度コントローラを備える。すべての検出反応が反応混合物の温度の制御を必要とするわけではないので、この温度コントローラーは、任意である。しかし、検出反応が核酸の増殖である好ましい実施形態では、システム１０は、容器１２Ａおよび１２Ｂ中の反応混合物を核酸増殖反応に供するための、温度コントローラ１８Ａおよび１８Ｂのような少なくとも１つの温度コントローラを備える。複数の温度コントローラが好ましいが、複数の容器中の反応混合物の温度を制御するための単一の温度コントローラ（例えば、複数のサンプル容器を保持するための金属ブロックまたは複数の容器を加熱／冷却するための強制空気システム）もまた使用され得ることが周知である。検出反応がＰＣＲである特に好ましい実施形態では、この少なくとも１つの温度コントローラは、プログラムされた時間／温度プロフィールに従って容器１２Ａおよび１２Ｂ中の反応混合物を加熱および冷却するための容器熱循環器（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）である。コンピューター制御の下で動作する組込まれた検出器を備える熱循環器は、当該分野で周知であり、例えば、ＣｅｐｈｅｉｄのＳｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）システム（例えば、米国特許第６，３６９，８９３号および同第６，５６５，８１５号）；ＡＢＩ熱循環器（例えば、米国特許第５，６５６，４９３号および同第５，０３８，８５号）；およびＲｏｃｈｅのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（例えば、米国特許第５，４５５，１７５および同第５，９３５，５２２号）が挙げられる。
【００６９】
図２は、複数の生物学的因子の存在または非存在を検出するためにコントローラ１６が実行するようにプログラムされている工程を示す流れ図である。工程１００では、コントローラ１６は、第１の容器１２Ａ中で検出反応を開始する。工程１０２では、コントローラ１６は、検出器１４Ａからデータを受け取る。決定工程１０４では、コントローラ１６は、このデータから、第１の容器１２Ａ中に第１および第３のマーカーの存在または非存在を決定する。これは、好ましくは、各マーカーに対する検出シグナルを最少の閾値と比較することにより達成される。第１のマーカーも第３のマーカーも第１の容器中に存在しない場合、コントローラは、工程１０６で陰性の結果を記録し、第２の容器１２Ｂ中の検出反応は、実行される必要がない。しかし、第１または第３のマーカーのいずれかが第１の容器１２Ａ中に検出される場合、コントローラ１６は、第２の容器中で第２の検出反応を開始する（工程１０８）。工程１１０では、コントローラ１６は、検出器１４Ｂからデータを受け取る。工程１１２では、コントローラは、検出データから、第２の容器中の第２または第４のマーカーの存在または非存在を決定し、従って、第１および第２の因子の存在または非存在を決定する。第１および第２の容器中の、それぞれ、第１および第２のマーカーの存在は、サンプル中の第１の生物学的因子の存在を示し、第１および第２の容器中の、それぞれ、第３および第４のマーカーの存在は、そのサンプル中の第２の生物学的因子の存在を示す。
【００７０】
図３は、本発明の別の実施形態による、複数の生物学的因子の存在または非存在を決定するための自動化システム２０を示す。この因子の各々は、その因子をその他の因子から識別する、それぞれの第１および第２の核酸配列を含む。システム２０は、その因子を含有すると思われる第１および第２の反応混合物を、それぞれ、反応容器２２Ａおよび２２Ｂ中で核酸増幅条件に供するための、温度制御システム２８Ａおよび２８Ｂのような少なくとも１つの温度制御システムを備える。反応容器２２Ａ中の第１の反応混合物は、その因子の各々の第１の核酸配列を増幅して検出するための試薬およびプローブを含有する。反応容器２２Ｂ中の第２の反応混合物は、その因子の各々の第２の核酸配列を増幅して検出するための試薬およびプローブを含有する。複数の温度制御システムが好ましいが、複数の容器中の反応混合物の温度を制御するための単一の温度制御システム（例えば、複数のサンプル容器を保持するための金属ブロックまたは複数の容器を加熱／冷却するための強制空気システム）もまた使用され得ることが周知である。検出反応がＰＣＲである特に好ましい実施形態では、この少なくとも１つの温度制御システムは、プログラムされた時間／温度プロフィールに従って容器２２Ａおよび２２Ｂ中の反応混合物を加熱および冷却するための容器熱循環器である。コンピューター制御の下で動作する組込まれた検出器を備える熱循環器は、当該分野で周知であり、例えば、ＣｅｐｈｅｉｄのＳｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）システム（例えば、米国特許第６，３６９，８９３号および同第６，５６５，８１５号）；ＡＢＩ熱循環器（例えば、米国特許第５，６５６，４９３号および同第５，０３８，８５号）；およびＲｏｃｈｅのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（例えば、米国特許第５，４５５，１７５および同第５，９３５，５２２号）が挙げられる。
【００７１】
適切な核酸増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が挙げられる。等温増幅反応が適切であり、本発明の方法に従って使用され得る。等温増幅反応の例としては、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）：１６９１−６（１９９２）；Ｗａｌｋｅｒ  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ  ３（１）：１−６（１９９３））、転写媒介性増幅（Ｐｈｙｆｆｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：８３４−８４１（１９９６）；Ｖｕｏｒｉｎｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：１８５６−１８５９（１９９５））、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５０（６３１３）：９１−２（１９９１）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｓｂｙ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２（１）：７５−９９（１９９９））；Ｈａｔｃｈら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１５（２）：３５−４０（１９９９））、および分岐鎖ＤＮＡシグナル増幅（ｂＤＮＡ）（例えば、Ｉｑｂａｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  １３（４）：３１５−３２０（１９９９）を参照のこと）が挙げられる。当該分野の当業者に公知の他の増幅方法としては、ＣＰＲ（サイクリングプローブ反応）、ＳＳＲ（自立配列複製）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、ＱＢＲ（Ｑ−β  レプリカーゼ）、Ｒｅ−ＡＭＰ（かつてのＲＡＭＰ）、ＲＣＲ（修復連鎖反応）、ＴＡＳ（転写ベースの増幅システム）およびＨＣＳが挙げられる。
【００７２】
システム２０はまた、容器２２Ａおよび２２Ｂ中の反応混合物に由来するプローブシグナルを検出するように配置された少なくとも１つの検出機構を備える。好ましい実施形態では、システム２０は、少なくとも第１および第２の検出機構２４Ａおよび２４Ｂを備える。第１の検出機構２４Ａは、第１の容器２２Ａ中の標的の核酸配列の存在または非存在を検出するように配置され、第２の検出機構２４Ｂは、第２の容器２２Ｂ中の標的の核酸配列の存在または非存在を検出するように配置される。複数の検出機構が好ましいが、光ファイバー、導波管、光導波路などのような光学デバイスを使用して、各容器と光学的に通信している単一の検出器を配置することにより、複数の容器中のマーカーを検出するための単一の検出器が使用され得ることは周知である。検出機構２４Ａおよび２４Ｂは、好ましくは、反応混合物中の蛍光標識を検出して測定するための蛍光計である。そのようなデバイスは、一般に、蛍光標識を励起するための少なくとも１つの光源、および発光された蛍光を測定するための少なくとも１つの光検出器を備える。これらのデバイスは、当該分野で周知であり、上で引用された、ＣｅｐｈｅｉｄからのＩ−ＣＯＲＥ（登録商標）モジュールのように、広く市販されている。他の適切な検出機構としては、燐光標識、化学発光標識または電子化学発光標識を検出するためのデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
システム２０はまた、温度制御システム２８Ａおよび２８Ｂと、そして検出機構２４Ａおよび２４Ｂと通信している少なくとも１つのコントローラ２６（例えば、コンピューターまたはマイクロプロセッサー）を備える。このコントローラは、複数の生物学的因子の存在または非存在を決定するための工程を実施するようにプログラムされている。
【００７４】
図４は、複数の生物学的因子の存在または非存在を検出するためにコントローラ２６が実行するようにプログラムされている工程を示す流れ図である。工程２００では、コントローラ２６は、第１の容器２２Ａ中の第１の反応混合物を核酸増幅条件に供するために、制御シグナルを第１の温度制御システム２８Ａに送信する。工程２０２では、コントローラ２６は、検出器２４Ａからプローブシグナルデータを受け取る。決定工程２０４では、コントローラ２６は、容器２２Ａ中の第１の反応混合物から受け取られたプローブシグナルから、その因子のいずれかの第１の核酸配列が第１の反応混合物中に存在するかどうかを決定する。これは、好ましくは、各標的の核酸配列に対するプローブシグナルを最少の閾値と比較することにより達成される。標的の核酸配列のいずれも第１の容器中で検出されない場合、コントローラは、工程２０６で陰性の結果を記録し、第２の容器２２Ｂ中の検出反応は、実行される必要がない。しかし、その因子のいずれかの第１の標的の核酸配列が第１の容器２２Ａ中に検出される場合、コントローラ２６は、第２の容器２２Ｂ中の第２の反応混合物を核酸増幅条件に供するために、制御シグナルを第２の温度制御システム２８Ｂに送信する（工程２０８）。工程２１０では、コントローラ２６は、検出器２４Ｂからデータを受け取る。工程２１２では、コントローラは、容器２２Ｂ中の第２の反応混合物から受け取られたプローブシグナルから、その因子のいずれかの第２の核酸配列が第２の反応混合物中に存在するかどうかを決定し、従って、その複数の因子の存在または非存在を決定する。（別個の反応で検出される）その因子のいずれかの第１および第２の核酸配列の存在は、その因子の存在を示す。
【００７５】
（生物学的因子）
本発明の方法は、任意の数の異なる生物学的因子の存在または非存在についてサンプルを分析するために使用される。本発明の方法をしようして同定される例示的な生物学的因子としては、核酸、タンパク質（タンパク質複合体を含む）、細胞（例えば、細菌、ウイルス粒子）、および複合炭水化物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
（サンプル収集および処理）
本発明を用いて検出可能な生物学的因子を恐らく含有するサンプルは、生物学的供給源および環境的供給源の両方において見出され得る。例示的な生物学的培養物としては、細胞培養物（例えば、細菌培養物、細胞抽出物、血液、組織サンプル、身体分泌物および細胞分泌物ならびに身体排泄物および細胞排泄物など）が挙げられる。環境的供給源としては、空気、帯水層、土壌、岩石、氷、海水、ごみなどが挙げられる。
【００７７】
本発明を使用する分析のための生物学的サンプルは、当該分野で公知の任意の適切な技術を使用して収集され得る。例として、血液は、皮下注射針を用いて引き抜かれ得る。組織サンプルは、組織の一部分を掻爬または外科的に取り除くことにより収集される。細胞培養物は、例えば、細胞懸濁液の遠心分離によりペレット化され得る。細胞抽出物は、種々の技術（遠心分離、クロマトグラフィー、ディファレンシャル塩沈殿（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓａｌｔ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）および／または有機溶媒沈殿、電気泳動などが挙げられるが、これらに限定されない）を使用して分画され得る。
【００７８】
環境サンプルは、任意の公知の技術を使用して収集され得る。例えば、空気で運ばれる生物学的因子は、液体溶媒を通して空気を吹き込むか、または浸透させ、それによりその空気で運ばれる生物学的因子をその液相中へ分配し、好ましくは同時の濃縮を受けることにより、溶液の中に分配され得る。液体の環境的供給源中の生物学的因子は、蒸留、または濾過、クロマトグラフィー分離などを通して濃縮および／または精製され得る。環境中の固体表面上の生物学的因子は、その固体表面を拭き取るかまたは掻き取り、その生物学的因子を次いでその拭き取り物または掻き取り物から取り戻すことにより収集され得る。粉末の形態にあるか、または粉末に還元され得る固体はまた、当業者に公知の水性溶媒または有機溶媒を使用して抽出され得る。
【００７９】
いったん回収されると、サンプルは、精製された／部分的に精製された形態にあり得るか、または液体、半液体、もしくは懸濁液（好ましくは、水性の状態）に存在する複雑な混合物中にあり得る。
【００８０】
（生物学的サンプルからの核酸およびタンパク質の抽出）
本発明のいくつかの実施形態では、生物学的因子（例えば、細胞またはウイルス）を含有すると思われるサンプルを、そのサンプルの分析の前に、処理することが望ましい。例えば、核酸の抽出に付随する細胞溶解は、例えばリアルタイムＰＣＲが挙げられる方法による検出を容易にするために、実施され得る。細胞またはウイルスに由来する核酸の抽出は、物理的手段、化学的手段もしくは他の手段により、またはそのような手段の組合せにより実施され得る。
【００８１】
１つの実施形態では、本発明の方法は、Ｃｅｐｈｅｉｄの流体カートリッジを利用する。これらのカートリッジは、米国特許第６，３７４，６８４号；米国特許第６，３９１，５４１号；および米国特許第６，４４０，７２５号（これらのすべては、その全体が本明細書中に参考として援用される）に十分に開示されている。これらの流体カートリッジ（例えば、容器）は、種々のサンプルタイプから核酸抽出を自動的に実施する。このカートリッジは、以下の機能のいくつかまたはすべてを実施する：試薬の収容および送達；サンプルおよび試薬の小分けならびに混合；細胞分離および濃縮；超音波技術を使用する迅速細胞溶解；ＤＮＡまたはＲＮＡの捕捉、富化および精製；ならびに反応混合物の調製および一体化反応管（例えば、容器）の充填。
【００８２】
本発明の方法を使用するための核酸および／またはタンパク質マーカーの抽出のためのサンプル調製の他の方法は、当該分野の当業者に公知である。物理的手段としては、ガラスもしくはプラスチックビーズの振動によるような、標的の細胞もしくはウイルスを鋭い微小構造体に叩きつけることによるような、または高圧下で細菌体の溶液を非常に小さい直径の穴に通し、それにより細胞をこじ開ける圧力機器によるような、細胞の機械的破壊が挙げられる。ウイルス懸濁液を９５℃に加熱することによるような、または細胞壁を破壊するための活性化された細菌の胞子の凍結−解凍の繰り返しによるような、熱エネルギー移動も使用され得る。
【００８３】
標的の細胞またはウイルスの機械的破壊は、せん断または振動によって、標的の細菌の表面膜または細胞壁を引裂くように設計された相互作用領域を用いて達成され得る。振動は、ガラスビーズまたは他のビーズをチャンバの中に含めることにより、およびそのチャンバに、同様にカートリッジの中へ組込まれている圧電膜（ｐｉｅｚｏｍｅｍｂｒａｎｅ）を結合することにより、達成され得る。あるいは、超音波エネルギーを細胞に移動させるために、超音波ホーン（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｈｏｒｎ）のような超音波トランスデューサーが、そのチャンバの壁に結合される。この超音波の周波数および振幅は、標的の細胞の共鳴周波数と対応するように調整され、そして最少の加熱またはキャビテーションで溶解をもたらすように最適化されるが、後者が、効率的な溶解のために必要とされ得る。いくつかの超音波方法は、Ｍｕｒｐｈｙらにより、米国特許第５，３７４，５２２号に、およびＬｉらにより米国特許第４，９８３，５２３号に開示されている。
【００８４】
化学的溶解は、単独で、または物理的溶解もしくは超音波溶解と組合せて採用され得る。代表的な化学的溶解剤は、いくつかの範疇（例えば、酵素、界面活性剤、およびカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）に分類される。リゾチームは、多くの細菌の細胞壁を加水分解的に攻撃する酵素である。トリプシンは、多くの真核細胞の細胞膜を壊すプロテアーゼ酵素である。特定のペプチド配列に対する特異性を有する他のプロテアーゼは採用され得、そして標的部分が特定のプロテアーゼを受けやすい場合には好ましい。プロテイナーゼＫが、しばしば、使用される。なぜなら、それは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と干渉し得る核タンパク質および宿主細胞酵素を消化するからである。真核細胞に対しては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤は、細胞膜を可溶化して、細胞内容物を放出する。グアニジンイソチオシアネートまたは尿素のようなカオトロープは、細胞を溶解するために使用され、そして標的のＲＮＡを破壊し得るＲＮアーゼ（ＲＮＡｓｅ）を阻害するという追加の利益を有する。化学的方法の例は、Ｈｅｎｃｏらに対する米国特許第５，６５２，１４１号およびＬｉｐｓｈｕｔｚらに対する米国特許第５，８５６，１７４号に開示されている。
【００８５】
細胞抽出の他の方法、例えばサンプルが十分に高い圧力でチャネルを通されるときにせん断応力が細胞溶解を引き起こすように、制限された断面寸法を有するチャネルを採用することはまた、使用され得る。あるいは、細胞抽出物および汚染するタンパク質の変性は、交流電流をそのサンプルに印加することにより、実施され得る。
【００８６】
（マーカーおよびプローブ）
本発明の方法は、同定されるべき各生物学的因子からマーカーを検出する工程を包含する。マーカーを検出する工程は、分析下で、生物学的因子の高分子的、微視的、または分子的特徴を明確に同定する工程を含む。本発明のマーカーとして役立つ特徴を明確に同定することは、その生物学的因子を一意に（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）同定する必要はないが、しかしマーカーは、そのマーカーが検出されたときに、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％、９９％またはそれより高い確実さで、その生物学的因子が存在していることを示す。それゆえに、サンプル中の生物学的因子に対する１つより多いマーカー（例えば、少なくとも２つのマーカー）の同定は、ほぼ確実に、その生物学的因子がそのサンプル中に存在していることを示す。従って、ほとんどの状況では、１つの因子あたり２つのマーカーは、２つの因子を識別するためには好ましい。
【００８７】
本発明における使用のために好ましいマーカーとしては、本発明のプローブで認識され得る、任意の分子特徴または高分子特徴が挙げられる。適切なマーカー−プローブの組合せとしては、レセプター−リガンド、酵素−基質、抗原（またはエピトープ）−抗体、および相補的な核酸配列が挙げられる。
【００８８】
本発明の種々の実施形態は、核酸（例えば、相補的なオリゴヌクレオチド）、タンパク質（例えば、リガンド、基質、抗原、抗体）などであるプローブを使用する。プローブが適切な検出システム中で検出可能であるように、本発明で使用される任意のプローブが検出可能な標識で標識されることが企図される。
【００８９】
マーカーおよび／またはプローブは、核酸であり得る。１つの実施形態では、少なくとも１つのマーカーは、その生物学的因子（例えば、細菌細胞またはウイルス）の核酸配列である。従って、このサンプル中では、プローブは、核酸配列にハイブリダイズする相補的なオリゴヌクレオチドである。一般的な通則として、非常に特異的な確認結果を支持するために必要とされる配列の数は、２〜６つの配列に及ぶ。ほとんどの場合、因子（例えば、生物体）を潜在的に稀な最も近い生物体、プラスミドキュアリングされた株、または特徴づけされていないバックグラウンドまたは予想されていないバックグラウンドから識別するために、２つの配列が好ましい。
【００９０】
タンパク質プローブは、好ましくは、目的のマーカーの親和性結合パートナー、好ましくは免疫親和性結合パートナーである。例えば、マーカーが酵素である場合、プローブは、その酵素の天然に存在する基質、または合成により誘導されたアナログ基質であり得る。そのマーカーがレセプターである場合、プローブは、そのレセプターの天然リガンドまたは合成リガンドであり得る。好ましくは、タンパク質プローブは、エピトープマーカーを特異的に認識する抗体、または抗体フラグメントである。従って、代替の実施形態では、少なくとも１つのマーカーはその生物学的因子抗原であり、そしてプローブは抗体である。
【００９１】
（核酸プローブ）
多くの異なる核酸ハイブリダイゼーションプローブが、本発明の実施のために適切である。多くのタイプのプローブが、特定のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズしてそれを検出することができる。いくつかの場合には、このプローブは、発蛍光団または酵素であり、このプローブは、そのプローブのその補体への結合の検出を可能にする。
【００９２】
核酸プローブは、一本鎖または二本鎖であり得る。本発明の核酸は、一般的にリン酸ジエステル結合を含むが、いくつかの場合には、以下に概略が示されるように、代替の骨格を有する核酸アナログが含まれる。この核酸は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡまたはハイブリッドであり得、ここでこの核酸は、デオキシリボ核酸およびリボ核酸の任意の組合せ、ならびに塩基（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなど）の任意の組合せを含み、そしてヌクレオチドアナログ、およびアミノ修飾ヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドを含む。
【００９３】
プローブ濃度は、増殖された配列の量の正確な評価を提供するように、増幅される標的配列またはコントロール配列に結合するに十分であるべきである。当業者は、プローブの濃度の量は、そのプローブの結合親和性および結合されるべき配列の量に従って変動することを認識する。
【００９４】
代表的には、シグナル発生のために、プローブは、発蛍光団と相互作用する分子もしくは部分との間の距離を変化させることにより引き起こされる、他の分子または部分との相互作用の変化に起因する、発蛍光団の蛍光の変化を利用する。あるいは、放射活性標識されたプローブの使用を含む、サンプル中のポリヌクレオチドを検出する他の方法が提供される。
【００９５】
蛍光ベースのアッセイは、シグナル発生のために、蛍光共鳴エネルギー転移すなわち「ＦＲＥＴ」に頼ることができる。ＦＲＥＴは、当該分野で公知である。手短に言えば、この方法は、第１の発蛍光団を相互作用する共鳴エネルギーアクセプター（別の発蛍光団またはクエンチャーのいずれか）から分離する距離の変化によって引き起こされる蛍光の変化を測定する。発蛍光団と、相互作用する分子または部分（消光分子または消光部分を含む）との組合せは、「ＦＲＥＴ対」として公知である。ＦＲＥＴ対相互作用の機構は、その対の１つのメンバーの吸収スペクトルが、他のメンバー（第１の発蛍光団）の発光スペクトルに重なることを必要とする。相互作用する分子または部分がクエンチャーである場合、その吸収スペクトルは、その発蛍光団の発光スペクトルに重ならねばならない（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：８１９−８４６（１９７８）；Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｐａｒｔ  ＩＩ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃ．Ｒ．ＣａｎｔｏｒおよびＰ．Ｒ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，４４８−４５５頁（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８０）；ならびにＳｅｌｖｉｎ，Ｐ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２４６：３００−３３５（１９９５））。例えば、Ｔｙａｇｉら、米国特許第６，１５０，０９７号に記載される非ＦＲＥＴ蛍光プローブのような、非ＦＲＥＴ蛍光プローブもまた使用され得る。
【００９６】
（タンパク質プローブ）
ペプチド配列またはペプチドアナログを使用するアッセイのための方法が、本発明により提供される。タンパク質プローブは、蛍光標識、放射活性標識、または当該分野で公知の任意の受容可能な標識を含み得る。いくつかの実施形態では、標的のタンパク質が、プローブの代わりに標識され得る。
【００９７】
本発明の１つの局面では、検出される標的は、好ましくは、ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチド、タンパク質、もしくは多数のタンパク質の複合体のようなペプチド配列またはペプチド様アナログ配列を含む。１つの局面では、検出される標的は、そのプローブに対する少なくとも１つのレセプター部位を有するタンパク質である。
【００９８】
本発明の検出可能なタンパク質は、アミノ酸またはアミノ酸アナログを含むプローブにより検出され得る。例えば、適切なプローブは、単一のアミノ酸、単一のアミノ酸アナログ、ペプチド様アナログ、ペプチド類似物（ｐｅｐｔｉｄｏｉｄ）、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチド、または多数のタンパク質の複合体を含み得る。
【００９９】
種々の結合複合体が、本発明の方法を用いてアッセイされ得る。いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質と他のアミノ酸ベースの化合物またはアミノ酸アナログベースの化合物との間の結合特性（結合の存在または非存在、および結合親和性が挙げられる）を分析するために使用される。分析のために適切なタンパク質としては、例えば、野生型のもの、変異体、インビトロで翻訳されたものが挙げられる。本発明はまた、タンパク質レセプターに対するリガンドの結合を分析するために使用され得る。
【０１００】
例えば、本発明の方法を実施するために有用であり得る１つの結合複合体としては、蛍光標識されたペプチドの、単一のタンパク質または複数のタンパク質の複合体への特異的結合が挙げられる。この場合、この特異的なタンパク質は、その標識されたタンパク質プローブに直接結合されるか、または複数のタンパク質の複合体中に存在するかのいずれかであり、従って、その複合体中の１つ以上の他のタンパク質と相互作用しているが、必ずしも標識されたプローブと直接相互作用している必要はない。
【０１０１】
同様に、本発明はまた、複合化された化合物の複合体の少なくとも１つのメンバーに対する未標識の化合物の結合を検出することを可能にする。この場合、この複合化された化合物の少なくとも１つは、例えば、蛍光強度測定のために標識されている。この標識された化合物および未標識の化合物は、検出が起こるために、直接的にさえ相互作用する必要はない。従って、本発明は、標的への標識されたプローブの結合特徴に対する間接的または直接的影響を通して、タンパク質を検出することを可能にする。
【０１０２】
（抗体）
１つの実施形態では、マーカーは、抗体を使用して検出される。抗体プローブは、ポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体の両方であり得る。抗体プローブはまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化されたマウス抗体）およびヘテロ結合体抗体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（例えば、二重特異性抗体）のような抗体の遺伝子操作された形態、ならびに抗体の抗原結合性形態であり得る。この抗体の抗原結合性形態としては、抗原結合能力を有するフラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒｌｇＧ）が挙げられる。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＥＬ）も参照のこと。例えば、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）も参照のこと。この用語はまた、組換え型一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）を指す。用語「抗体」はまた、二価でかつ二重特異的な分子、二重抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三重抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）および四重抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）を含み得る。二価でかつ二重特異的な分子は、例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１５４７，ＰａｃｋおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１５７９，Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、１９９３，前出，Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ：５３６８，Ｚｈｕら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ６：７８１，Ｈｕら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５，Ａｄａｍｓら（１９９３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：４０２６，およびＭｃＣａｒｔｎｅｙら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：３０１に記載されている。
【０１０３】
（多糖類プローブ）
別の実施形態は、多糖類マーカーおよびこれらのマーカーを認識するプローブ（例えば、レクチンおよび炭水化物結合性タンパク質）を利用する。多糖類残基は、生物学的因子（例えば、糖タンパク質および糖脂質）中に置かれ得る。これらのマーカーは、標識されたプローブ（例えば、蛍光標識された糖タンパク質）を用いて検出され得る。適切な多糖類ベースのマーカー／プローブ系は、当該分野の当業者には周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから市販されている。
【実施例】
【０１０４】
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの実施例は、例証の目的のみで提示され、本発明の範囲を限定することは決して意図されてはいない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関しては正確さを確実にするための努力をしたが、当然、いくらかの実験誤差および偏差が許容されるはずである。
【０１０５】
本発明の実施では、当該分野の技術の範囲内のタンパク質化学、生化学、変異体ＤＮＡ技術および核酸増幅の従来の方法を採用し得る。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Η．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，最新の追加版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第３版（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ  ＡおよびＢ（１９９２）を参照のこと。
【０１０６】
手短に言えば、以下により詳細に説明されるように、複合４チャネルリアルタイムＰＣＲを使用して、サンプル中の３つの生物学的因子の各々に対して２つの核酸マーカーを検出した。核酸プローブを、４つの異なる蛍光色素のうちの１つで標識した。この方法を、そのサンプル中の生物学的因子を同定するために使用した。当業者は、本明細書中に示される方法が、単一の分子レベルで検出可能な任意の標識（例えば、発蛍光団）を使用する、多くのアッセイシステムに対して広く適用可能であり、そして広い範囲の標的部分の検出において適用可能であることを認識する。
【０１０７】
１つの因子あたり２つのマーカーを検出した。そしてそれらは以下の通りである：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ａｍｅｓ株遺伝子Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００３９８０；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ａｍｅｓ株遺伝子Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００３９８１）；Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ＧＢＳ）遺伝子ＡおよびＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ７２７５４）；ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ（Ｂｇ）遺伝子ＡおよびＢ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｚ２８５９２．１）。各反応混合物はまた、内部コントロールプラスミド（ＩＣ１）の検出を確実にするための試薬（米国特許出願第２００３０２１１５２７号（すべての目的のために、この全体が本明細書中に参考として援用される）を含んでいた。
【０１０８】
マーカー遺伝子の増幅および検出のためのＰＣＲプライマーおよびプローブは、上で開示された配列、および当該分野の当業者に周知であり本明細書中により詳細に説明される原理を使用して設計されている。プローブを、ＬＩＺ（色チャネル１を使用して検出可能）、Ａｌｅｘａ  ６４７（色チャネル１を使用して検出可能）、ＦＡＭ（色チャネル２を使用して検出可能）、ｄＲＯＸ（色チャネル３を使用して検出可能）、またはＶＩＣ（色チャネル４を使用して検出可能）のいずれかを使用して標識した。
【０１０９】
プライマーおよびプローブは、一般的に利用可能なマーカーの遺伝子配列およびプライマー設計ソフトウェア（例えば、Ｏｌｉｇｏ  ６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，  Ｉｎｃ）；Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；およびＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、設計した。当業者は、プライマーの設計は、一組の通則：プライマーは長さが１７−２８塩基であり、塩基組成は、５０−６０％（Ｇ＋Ｃ）であり、プライマーは、ＧもしくはＣ、またはＣＧもしくＧＣで終わり（３’）、Ｔｍは好ましくは５５〜８０°Ｃの間にあり、プライマーの３’末端の３つ以上のＣまたはＧのつながり（ｒｕｎ）（これは、ＧまたはＣに富む配列での誤った開始（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ）を促進し得る）は、好ましくは回避され、プライマーの３’末端は、好ましくは相補的ではなく、プライマーの自己相補性（ヘアピンのような二次構造を形成する能力）は、好ましくは回避され、複合アッセイのために各プライマーのＴｍは、好ましくは類似であり、発生したアンプリコンは、好ましくは同様のサイズであり１００〜２５０ｂｐの間である、に従ったことを認識する。
【０１１０】
ＴａｑＭａｎプローブに対しては、当該分野の当業者に周知である同様の通則に従い、この通則は、プローブの融点（Ｔｍ）は好ましくは６８〜７０°Ｃの間であり、Ｇ−Ｃ含量は好ましくは３０〜８０％の範囲であり、同一のヌクレオチドのつながりは回避され（特にＧについて）、５’末端のＧは、好ましくは回避され、プローブにＧよりも多いＣを与える鎖が好ましくは選択される、ことが含まれる。さらに、このＴａｑＭａｎプローブを対立遺伝子の区別のために設計する場合、多形部位（ミスマッチ）の位置は、その配列のほぼ中央の３分の１にあるべきである。
【０１１１】
（実施例１：サンプル中の３つの異なる生物学的因子の同定）
（反応混合物の調製）
２つの反応混合物を、３つの異なる生物体、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ａｍｅｓ株（Ａｍｅｓ）；Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ＧＢＳ）；およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ（Ｂｇ）、のリアルタイム検出を可能にするために調製した。各反応混合物はまた、内部コントロールであるプラスミド（ＩＣ１）の検出を可能にするための試薬を含有していた。３つの色チャネルを、検出のために使用した。
【０１１２】
反応混合物１（８１μＬのマスター混合容積）は、６００ｎＭの上流プライマー（ｕｐｐｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）、６００ｎＭの下流プライマー（ｌｏｗｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）、および１００ｎＭのＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ遺伝子Ａの検出のためのＦＡＭで標識したプローブ；５００ｎＭの上流プライマー、５００ｎＭの下流プライマー、および３００ｎＭのＧＢＳ遺伝子Ａの検出のためのＦＡＭで標識したプローブ；５００ｎＭの上流プライマー、５００ｎＭの下流プライマーおよび５００ｎＭのＢｇ遺伝子Ａの検出のためのＡｌｅｘａ  ６４７で標識したプローブ；２００ｎＭの上流プライマー、２００ｎＭの下流プライマー、および７５ｎＭのＩＣであるプラスミドの検出のためのｄＲＯＸで標識したプローブ；４ｆｇのＩＣであるプラスミドＤＮＡ；および９．０μＬの４×  Ｃｅｐｈｅｉｄ凍結乾燥緩衝液を含んでいた。このマスター混合物を、１０単位のＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ／Ｔａｑポリメラーゼ抗体複合体を含有する、凍結乾燥した酵素試薬ビーズを再懸濁するために使用した。最終のＭｇＣｌ２濃度は、約６ｍＭであった。
【０１１３】
混合物２（８１μＬのマスター混合容積）は、４００ｎＭの上流プライマー、４００ｎＭの下流プライマー、および７５ｎＭのＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ遺伝子Ｂの検出のためのＬＩＺで標識したプローブ；５００ｎＭの上流プライマー、５００ｎＭの下流プライマー、および２００ｎＭのＧＢＳ遺伝子Ｂの検出のためのＦＡＭで標識したプローブ；５００ｎＭの上流プライマー、５００ｎＭの下流プライマーおよび３００ｎＭのＢｇ遺伝子Ｂの検出のためのＡｌｅｘａ  ６４７で標識したプローブ；２００ｎＭの上流プライマー、２００ｎＭの下流プライマー、および７５ｎＭのＩＣであるプラスミドの検出のためのｄＲＯＸで標識したプローブ；４ｆｇのＩＣであるプラスミドＤＮＡ；および９．０μＬの４×Ｃｅｐｈｅｉｄ凍結乾燥緩衝液を含んでいた。このマスター混合物を、１０単位のＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ／Ｔａｑポリメラーゼ抗体複合体を含有する、凍結乾燥した酵素試薬ビーズを再懸濁するために使用した。最終のＭｇＣｌ２濃度は、約６ｍＭであった。
【０１１４】
以下は、この実験についてのプローブ標識およびカートリッジの割当て、ならびに予想される結果（一覧表）である。
【０１１５】
【表１２】
2007535945.tif 000014
（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ａｍｅｓ株の検出）
Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ａｍｅｓ株の芽胞を、超音波処理してＤＮＡを放出させ、４．０μＬの６３ｃｆｕ／μＬを反応混合物１および反応混合物２に加えた。各反応を、３連で実施し、一組中のすべての３つの反応物について同一の結果を得た。各混合物の３つの２５μＬのアリコートを３つの２５μＬのＩ−ＣＯＲＥチューブに分割した。熱循環を、以下のプロトコルを使用して、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）機器で実施した：９５℃で３分間保持；次いで、９５℃を５秒間；６０℃を１４秒間；７２℃を５秒間を４５サイクル。リアルタイム蛍光データを、６０℃のアニーリング工程の間に収集した。
【０１１６】
結果を以下の表に示す。陽性のシグナルを、反応混合物１のチャネル２および反応混合物２のチャネル１で検出した。この結果は、サンプル中の生物学的因子Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ａｍｅｓ株の存在を確認する。反応混合物２中のチャネル２のシグナルの欠如は、そのサンプル中のＧＢＳの非存在を確認する。反応混合物１中のチャネル１のシグナルの欠如は、そのサンプル中のＢｇの非存在を確認する。両方の反応物中のチャネル３についての陽性シグナルは、両方の反応物中にＩＣ１が存在し、そしてアッセイの阻害がないことを確認する。
【０１１７】
【表１３】
2007535945.tif 000015
（ＧＢＳの検出）
４．０μＬのＧＢＳのＤＮＡ（１０００コピー／μＬ）を反応混合物１および反応混合物２に加えた。各反応を、３連で実施し、一組中のすべての３つの反応物について同一の結果を得た。各混合物の３つの２５μＬのアリコートを３つの２５μＬのＩ−ＣＯＲＥチューブに分割した。熱循環を、以下のプロトコルを使用して、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）機器で実施した：９５℃で３分間保持；次いで、９５℃を５秒間；６０℃を１４秒間；７２℃を５秒間を４５サイクル。リアルタイム蛍光データを、６０℃のアニーリング工程の間に収集した。
【０１１８】
結果を以下の表に示す。チャネル２の陽性のシグナルを、反応混合物１および反応混合物２の両方で検出した。この結果は、サンプル中の生物学的因子ＧＢＳの存在を確認する。反応混合物２中のチャネル１のシグナルの欠如は、そのサンプル中のＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの非存在を確認する。両方の反応物中のチャネル１のシグナルの欠如は、そのサンプル中のＢｇの非存在を確認する。両方の反応物中のチャネル３についての陽性シグナルは、両方の反応物中にＩＣ１が存在し、そしてアッセイの阻害がないことを確認する。
【０１１９】
【表１４】
2007535945.tif 000016
（Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ（Ｂｇ）の検出）
４．０μＬのｇｌｏｂｉｇｉのＤＮＡ（５００コピー／μＬ）を反応混合物１および反応混合物２に加えた。各反応を、３連で実施し、一組中のすべての３つの反応物について同一の結果を得た。各混合物の３つの２５μＬのアリコートを３つの２５μＬのＩ−ＣＯＲＥチューブに分割した。熱循環を、以下のプロトコルを使用して、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）機器で実施した：９５℃で３分間保持；次いで、９５℃を５秒間；６０℃を１４秒間；７２℃を５秒間を４５サイクル。リアルタイム蛍光データを、６０℃のアニーリング工程の間に収集した。
【０１２０】
結果を以下の表に示す。チャネル１の陽性のシグナルを、反応混合物１および反応混合物２の両方で検出した。この結果は、サンプル中の生物学的因子Ｂｇの存在を確認する。反応混合物１中のチャネル２のシグナルの欠如は、そのサンプル中のＡｍｅｓの非存在を確認する。両方の反応物中のチャネル２のシグナルの欠如は、そのサンプル中のＧＢＳの非存在を確認する。両方の反応物中のチャネル３についての陽性シグナルは、両方の反応物中にＩＣ１が存在し、そしてアッセイの阻害がないことを確認する。
【０１２１】
【表１５】
2007535945.tif 000017
（実施例２：１つより多い因子を含有するサンプル中の３つの異なる生物学的因子の検出）
（反応混合物の調製）
２つの反応混合物を、３つの異なる生物体、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ａｍｅｓ株（Ａｍｅｓ）；Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ＧＢＳ）；およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ（Ｂｇ）、のリアルタイム検出を可能にするために調製した。各反応混合物はまた、内部コントロールであるプラスミド（ＩＣ１）、および細胞溶解手順のためのコントロールとしての、内部コントロールである芽胞（ＩＣ２）の検出を可能にするための試薬を含有している。
【０１２２】
反応混合物を、実施例１におけるように調製する。
【０１２３】
以下は、この実験についてのプローブ標識およびカートリッジの割当ての表による表示、ならびに予想される結果（一覧表）である。
【０１２４】
【表１６】
2007535945.tif 000018
（株およびＧＢＳの検出）
Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ａｍｅｓ株の芽胞を、超音波処理してＤＮＡを放出させ、４．０μＬの６３ｃｆｕ／μＬを反応混合物１および反応混合物２に加えた。次いで、４．０μＬのＧＢＳのＤＮＡ（１０００コピー／μＬ）を反応混合物１および反応混合物２に加えた。各反応を、３連で実施し、一組中のすべての３つの反応物について同一の結果を得た。各混合物の３つの２５μＬのアリコートを３つの２５μＬのＩ−ＣＯＲＥチューブに分割した。熱循環を、以下のプロトコルを使用して、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）機器で実施した：９５℃で３分間保持；次いで、９５℃を５秒間；６０℃を１４秒間；７２℃を５秒間を４５サイクル。リアルタイム蛍光データを、６０℃のアニーリング工程の間に収集した。
【０１２５】
結果を以下の表に示す。チャネル２の陽性のシグナルを反応混合物１において検出し、チャネル１の陽性のシグナルを反応混合物２において検出する。この結果は、サンプル中の生物学的因子Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓおよびＧＢＳの両方の存在を確認する。反応混合物１中のチャネル１のシグナルの欠如は、Ｂｇの非存在を確認する。両方の反応物中のチャネル３および４における陽性のシグナルは、両方の反応物中にＩＣ１およびＩＣ２が存在し、そしてアッセイの阻害がないことを確認する。
【０１２６】
【表１７】
2007535945.tif 000019
（ＧＢＳおよびＢｇの検出）
４．０μＬのＧＢＳのＤＮＡ（１０００コピー／μＬ）および４．０μＬのＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉのＤＮＡ（５００コピー／μＬ）を、各々、反応混合物１および反応混合物２に加えた。各反応を、３連で実施し、一組中のすべての３つの反応物について同一の結果を得た。各混合物の３つの２５μＬのアリコートを３つの２５μＬのＩ−ＣＯＲＥチューブに分割した。熱循環を、以下のプロトコルを使用して、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）機器で実施した：９５℃で３分間保持；次いで、９５℃を５秒間；６０℃を１４秒間；７２℃を５秒間を４５サイクル。リアルタイム蛍光データを、６０℃のアニーリング工程の間に収集した。
【０１２７】
結果を以下の表に示す。チャネル２の陽性のシグナルを反応混合物１および２の両方において検出する。この結果は、そのサンプル中の生物学的因子ＧＢＳの存在を確認する。チャネル１の陽性のシグナルを反応混合物１および２の両方において検出する。この結果は、そのサンプル中の生物学的因子Ｂｇの存在を確認する。両方の反応物中のチャネル３および４における陽性のシグナルは、両方の反応物中にＩＣ１およびＩＣ２が存在し、そしてアッセイの阻害がないことを確認する。
【０１２８】
【表１８】
2007535945.tif 000020
（Ａｍｅｓ株およびＢｇの検出）
Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ａｍｅｓ株の芽胞を、超音波処理してＤＮＡを放出させ、４．０μＬの６３ｃｆｕ／μＬを反応混合物１および反応混合物２に加えた。次いで、４．０μＬのＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉのＤＮＡ（５００コピー／μＬ）を反応混合物１および反応混合物２に加えた。各反応を、３連で実施し、一組中のすべての３つの反応物について同一の結果を得た。各混合物の３つの２５μＬのアリコートを３つの２５μＬのＩ−ＣＯＲＥチューブに分割した。熱循環を、以下のプロトコルを使用して、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）機器で実施した：９５℃で３分間保持；次いで、９５℃を５秒間；６０℃を１４秒間；７２℃を５秒間を４５サイクル。リアルタイム蛍光データを、６０℃のアニーリング工程の間に収集した。
【０１２９】
結果を以下の表に示す。チャネル２の陽性のシグナルを反応混合物１において検出し、チャネル１の陽性のシグナルを反応混合物２において検出する。この結果は、サンプル中の生物学的因子Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓおよびＧＢＳの両方の存在を確認する。チャネル１の陽性のシグナルを反応混合物１および２の両方において検出する。この結果は、そのサンプル中の生物学的因子Ｂｇの存在を確認する。反応混合物２中のチャネル２のシグナルの欠如は、ＧＢＳの非存在を確認する。両方の反応物中のチャネル３および４における陽性のシグナルは、両方の反応物中にＩＣ１およびＩＣ２が存在し、そしてアッセイの阻害がないことを確認する。
【０１３０】
【表１９】
2007535945.tif 000021
本発明が、好ましい実施形態および種々の代替の実施形態を参照して具体的に示され、説明されてきたが、形態および詳細における種々の変更が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくそれらの実施形態においてなされ得ることが関連分野の当業者により理解される。
【０１３１】
本明細書の本体内で引用されたすべての参考文献、発行された特許、および特許出願は、すべての目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、本発明の実施形態による、少なくとも第１および第２の生物学的因子を検出するためのシステムの概略的なブロック図を示す。
【図２】図２は、図１のシステムのコントローラにより実行されるプログラム工程を示すフローチャートである。
【図３】図３は、本発明の別の実施形態による、少なくとも第１および第２の生物学的因子を検出するためのシステムの概略的なブロック図を示す。
【図４】図４は、図３のシステムのコントローラにより実行されるプログラム工程を示すフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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