(57)【要約】  本発明は、プロテオミクスおよびメタボロミクスサンプルなどの生物由来サンプルの複合体の調製、分離、および分析のためのフルオラスベースの方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析のために生物由来サンプルにおいて１つもしくはそれ以上の化合物を調製するための方法であって、前記方法が、
５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオラス部分に結合された化学反応性官能基を含んでなるフルオラス標識試薬を提供するステップと、
前記フルオラス標識試薬を生物由来サンプル中の１つもしくはそれ以上のメンバーの化合物に前記化学反応性官能基を介して結合させ、フルオラス標識サンプルメンバーを産生し、それによって分析のための前記生物由来サンプルを調製するステップ
とを含んでなる方法。
【請求項２】
前記生物由来サンプルがプロテオミクスサンプルを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物由来サンプルがメタボロミクスサンプルを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物由来サンプルが細胞溶解物を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生物由来サンプルが血液、尿、唾液、または組織サンプルを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生物由来サンプルが１つもしくはそれ以上のプレ画分されたサンプルを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１つもしくはそれ以上のプレ画分されたサンプルが、１つもしくはそれ以上のゲル電気泳動バンドを含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１つもしくはそれ以上のプレ画分されたサンプルが、１つもしくはそれ以上のカラムクロマトグラフィー画分を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記フルオラス標識サンプルメンバーを、前記フルオラス標識試薬に対する親和性を有する分離組成物を使用して非修飾メンバーから分離するステップをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記分離組成物がフルオラス液相を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分離組成物がフルオラス部分で官能化された基質の２次元表面を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離組成物がフルオラス親和性基質を含んでなり、かつ前記フルオラス標識サンプルメンバーを前記非修飾メンバーから分離するステップが、固相抽出またはフルオラスカラムクロマトグラフィーを実行するステップと、カラム流出物を収集するステップとを含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記フルオラス親和性基質がフルオラスシリカゲルを含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記フルオラス親和性基質がフルオロ有機ポリマーを含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記カラム流出物を収集するステップが、前記生物由来サンプルの非結合画分を収集するステップを含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記カラム流出物を収集するステップが、前記生物由来サンプルの結合画分を溶出するステップを含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合画分を溶出するステップが、単一標識サンプルメンバーを多重標識サンプルメンバーから分離するステップを含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物由来サンプルの１つもしくはそれ以上のメンバーを分析するステップをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物由来サンプルを分析するステップが、前記生物由来サンプルの分離された画分で質量分析を実行するステップを含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記分離されたサンプル画分が、フルオラス標識サンプルメンバーを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記分離されたサンプル画分が、非フルオラス標識サンプルメンバーを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物由来サンプルを分析するステップが、前記分離された画分のＭＳデータを前記生物由来サンプルの非反応アリコートのＭＳデータと比較するステップを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記質量分析がタンデムＭＳを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記質量分析がレーザー脱離イオン化ＴＯＦ  ＭＳを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記フルオラス標識試薬が、質量分析のための標準イオン化または画分条件下で画分されない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記化学反応性官能基が、マレイミド、ハロゲンβ−ケトン、ジスルフィド交換試薬、フェニルグリオキサル、無水物、アクリレート、アジド、チオール、ジヒドロキシ−ボラン、ボロン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジアルキルピロカーボネート、マイケルドナー、アミノオキシ化合物、またはヒドラジン含有化合物を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記フルオラス標識試薬がアミノ酸コンジュゲーション剤を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記フルオラス部分が、式ＣＦ３（ＣＦ２）ｎ［式中ｎは２〜１０の整数である］を有するフルオロアルキル部分を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記フルオラス部分が、式ＣＦ３（ＣＦ２）ｎ［式中ｎは３〜７の整数である］を有するフルオロアルキル部分を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記フルオラス部分が分岐鎖フルオロアルキル部分を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記フルオラス標識試薬が、フルオロアルキルリンカーによって結合された第１および第２の化学反応性官能基を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記フルオラス標識試薬が、２つもしくはそれ以上の試薬を含んでなり、第１のフルオラス標識試薬および第２のフルオラス標識試薬が分離組成物のその親和性において異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記フルオラス標識試薬が、
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、
ＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、
ＣＦ２Ｈ（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、
（ＣＦ３ＣＦ２）２ＣＦ（ＣＦ２）２ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、
（ＣＦ３ＣＦ２）２ＣＨ（ＣＦ２）２ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、
【化１】
2007515625.tif 000013
、
【化２】
2007515625.tif 000014
、
【化３】
2007515625.tif 000015
、
【化４】
2007515625.tif 000016
、
【化５】
2007515625.tif 000017
、
【化６】
2007515625.tif 000018
、
【化７】
2007515625.tif 000019
、
【化８】
2007515625.tif 000020
、
【化９】
2007515625.tif 000021
、
【化１０】
2007515625.tif 000022
、
【化１１】
2007515625.tif 000023
、
【化１２】
2007515625.tif 000024
、
【化１３】
2007515625.tif 000025
、
【化１４】
2007515625.tif 000026
、
【化１５】
2007515625.tif 000027
、
【化１６】
2007515625.tif 000028
、
【化１７】
2007515625.tif 000029
、
【化１８】
2007515625.tif 000030
、
【化１９】
2007515625.tif 000031
、
【化２０】
2007515625.tif 000032
、
【化２１】
2007515625.tif 000033
、
【化２２】
2007515625.tif 000034
、
ＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３、
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３、
【化２３】
2007515625.tif 000035
、
【化２４】
2007515625.tif 000036
、
【化２５】
2007515625.tif 000037
、
【化２６】
2007515625.tif 000038
、
ＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
【化２７】
2007515625.tif 000039
、
ＣＦ３（ＣＦ２）３ＣＨ２ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＯＮＨ２、
ＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＯＮＨ２、
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＯＮＨ２、
Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２（ＣＦ２）６ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、
【化２８】
2007515625.tif 000040
、
【化２９】
2007515625.tif 000041
、
【化３０】
2007515625.tif 000042
、
【化３１】
2007515625.tif 000043
、および
【化３２】
2007515625.tif 000044
［式中Ａはアミノ酸である。］からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記生物由来サンプルに過ヨウ素酸酸化を実行し、かつ前記フルオラス標識試薬を結合させる前に１つもしくはそれ以上のアルデヒド基を有するサンプル成分を生成させるステップをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記生物由来サンプルにおける１つもしくはそれ以上のメンバーの化合物がリン酸化アミノ酸含有成分を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記リン酸化アミノ酸含有成分が、１つもしくはそれ以上のリン酸化セリン残基、１つもしくはそれ以上のリン酸化トレオニン残基、１つもしくはそれ以上のリン酸化チロシン残基、またはそれの組合せを含んでなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記リン酸化アミノ酸含有成分が少なくとも１つのリン酸化セリン残基またはリン酸化トレオニン残基を含んでなり、かつ
前記フルオラス標識試薬を前記生物由来サンプルにおける１つもしくはそれ以上のリン酸化アミノ酸含有成分に結合させるステップが、
ａ）塩基を前記生物由来サンプルに添加し、塩基性反応混合物を形成するステップと、
ｂ）前記塩基性反応混合物における１つもしくはそれ以上のリン酸化アミノ酸含有成分でβ−脱離反応を実行するステップと、
ｃ）前記フルオラス標識試薬を前記反応混合物に添加し、ここで前記フルオラス標識試薬の化学反応性官能基がチオールを含んでなるステップと、
ｄ）前記β−脱離反応の生成物でマイケル付加反応を実行し、それによってフルオラス部分をリン酸化の以前の部分で結合させるステップと
を含んでなる請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記フルオラス標識試薬が、ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２ＳＨを含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記フルオラス標識試薬を前記生物由来サンプルにおける１つもしくはそれ以上のリン酸化アミノ酸含有成分に結合させるステップが、
ａ）酸性条件下でサンプルメンバーにカルボン酸メチル化を実行するステップと、
ｂ）リン酸化サンプルメンバーのリン酸基にシスタミンを結合させ、それによってホスホラミデート標識メンバーを産生するステップと、
ｃ）前記シスタミンを低減し、前記ホスホラミデート標識メンバーに遊離チオールを生成させるステップと、
ｄ）前記フルオラス標識試薬により前記ホスホラミデート標識メンバーに遊離チオールをアルキル化し、それによってフルオラス標識メンバーを生成させるステップと
を含んでなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記フルオラス標識メンバーを酸で処理するステップと、
前記フルオラス標識を開裂し、こうしてメチル化ホスホペプチドを再生するステップと
をさらに含んでなる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
フルオラス標識サンプルメンバーを前記メチル化ホスホペプチドから放出させる前に前記フルオラス標識サンプルメンバーを非標識サンプルメンバーから分離するステップを含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記生物由来サンプルにおける１つもしくはそれ以上のメンバーの化合物が、グリコシル化サンプルメンバーを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記生物由来サンプルにおける１つもしくはそれ以上のグリコシル化サンプルメンバーに前記フルオラス標識試薬を結合させるステップが、
ａ）前記グリコシル化サンプルメンバーに１つもしくはそれ以上の糖を酸化させ、反応混合物において１つもしくはそれ以上のアルデヒド部分を生成させるステップと、
ｂ）前記フルオラス標識試薬を前記反応混合物に添加し、ここで前記化学反応性官能基がヒドラジンまたはアミノオキシ部分を含んでなるステップと、
ｃ）前記アルデヒド部分を前記ヒドラジンまたは前記アミノオキシ部分と結合させ、それによって前記グリコシル化サンプルメンバーをフルオラス標識するステップと
を含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記１つもしくはそれ以上の糖を酸化するステップが、過ヨウ素酸化反応を実行するステップを含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
生物由来サンプルの１つもしくはそれ以上のメンバーを分離するための方法であって、前記方法が、
５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオラス部分に結合された化学反応性官能基を含んでなる少なくとも１つのフルオラス標識試薬と前記生物由来サンプルを反応させ、それによってフルオラス標識を１つもしくはそれ以上のサンプルメンバーに付着させ、標識サンプルメンバーを形成するステップと、
前記フルオラス標識に対する親和性を有する組成物と使用することにより、前記フルオラス標識サンプルメンバーを非標識サンプルメンバーから分離するステップと
を含んでなる方法。
【請求項４６】
前記フルオラス標識に対する親和性を有する組成物がフルオラス親和性基質を含んでなり、かつ前記フルオラス標識サンプルメンバーを前記非修飾メンバーから分離するステップが、固相抽出またはフルオラスカラムクロマトグラフィーを実行するステップと、カラム流出物を収集するステップとを含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記フルオラス親和性基質がフルオラスシリカゲルを含んでなる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記フルオラス標識に対する親和性を有する組成物が基質の表面に結合されており、かつ前記フルオラス標識サンプルメンバーを前記非標識サンプルメンバーから分離するステップが、前記生物由来サンプルを前記表面に塗布するとともに、前記非標識サンプルメンバーを洗浄によって前記表面から除去するステップを含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記基質がＭＡＬＤＩプレートまたはＤＩＯＳプレートを含んでなる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記生物由来サンプルが複数のアミノ酸含有成分を含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記複数のアミノ酸含有成分がタンパク質分解ペプチドを含んでなる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
フルオラスベースの分離法を使用する生物由来サンプルの成分の分離のための方法であって、前記方法が、
複数のアミノ酸含有成分を含んでなる生物由来サンプルを提供するステップと、
前記生物由来サンプルをフルオラス標識試薬で処理し、１つもしくはそれ以上のフルオラス標識で前記サンプルの１つもしくはそれ以上のメンバー成分を標識し、ここで前記フルオラス標識試薬が、５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオラス部分に結合された化学反応性官能基を含んでなるステップと、
前記処理されたサンプルをフルオラス親和性基質と組合わせるステップと、
結合単一標識成分を別々に結合多重標識成分から選択的に溶出し、それによって生物由来サンプルの成分を分離するステップと
を含んでなる方法。
【請求項５３】
１つもしくはそれ以上のメンバー成分を標識するステップが、前記メンバー成分の末端残基を標識するステップを含んでなる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記生物由来サンプルが１つもしくはそれ以上のユビキチン化成分を含んでなり、かつ前記サンプルを処理するステップが、
前記生物由来サンプルをトリプシンで開裂し、それによって第１の部分と第２の部分を含んでなる複数のタンパク質分解断片を生成し、ここでタンパク質分解断片の第１の部分のメンバーが第１のペプチドＮ末端を有し、かつタンパク質分解断片の第２の部分のメンバーが第１のペプチドＮ末端と第２のユビキチン由来Ｎ末端を有するステップを有するステップと、
前記タンパク質分解断片のリシン残基のイプシロンアミノ基を遮断するステップと、
前記タンパク質分解断片の第１および第２のＮ末端を前記フルオラス標識試薬で標識し、それによって単一標識タンパク質分解断片の第１の部分と多重標識タンパク質分解断片の第２の部分を産生するステップと
をさらに含んでなる請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記遮断するステップが前記リシン残基のグアニジン化を含んでなる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記生物由来サンプルが１つもしくはそれ以上のジスルフィド架橋含有成分を含んでなり、かつ前記サンプルを処理するステップが、
前記ジスルフィド架橋含有成分をトリプシンで開裂し、それによって２つのＮ末端を有する１つもしくはそれ以上のジスルフィド連結タンパク質分解断片を生成させるステップと、
ジスルフィド連結タンパク質分解断片の前記２つのＮ末端を標識するステップと
を含んでなる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記フルオラス親和性基質がフルオラスシリカゲルを含んでなる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
質量分析によって溶出フルオラス標識成分を分析するステップをさらに含んでなる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
フルオラスベースの分離法を使用する一連の生物由来サンプルの成分の多重分離のための方法であって、前記方法が、
一連の生物由来サンプルを提供し、各メンバーサンプルが複数の成分を含んでなるステップと、
５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオロアルキル部分に結合された化学反応性官能基を含んでなる２つもしくはそれ以上のフルオラス標識試薬を提供するステップと、
第１のサンプルを第１のフルオラス標識試薬で処理し、第１のサンプルの１つもしくはそれ以上の成分を標識するステップと、
第２のサンプルを第２のフルオラス標識試薬で処理し、それによって第２のサンプルの１つもしくはそれ以上の成分を標識し、ここで前記第１および第２のフルオラス標識試薬がそれに組込まれた多くのフッ素原子の点で異なるステップと、
第１および第２のサンプルを混合し、混合サンプルを形成するステップと、
前記混合サンプル上でフルオラスベースの分離を実行し、それによって前記一連の生物由来サンプルの成分を分離するステップと
を含んでなる方法。
【請求項６０】
前記一連のサンプルの１つもしくはそれ以上の追加のメンバーを１つもしくはそれ以上の追加のフルオラス標識試薬で処理し、前記試薬が互いに、かつ前記第１および第２のフルオラス標識試薬とそれに組込まれたフッ素原子の数で異なるステップと、
前記追加の処理サンプルを前記フルオラスベースの分離を実行する前に前記第１および第２のサンプルと混合するステップと
をさらに含んでなる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記フルオラスベースの分離法を実行するステップが、前記フルオラス標識成分のフルオラス固相抽出を実行し、それによって非標識成分をフルオラス標識成分から分離するステップを含んでなる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記フルオラスベースの分離法を実行するステップが、フルオラス親和性基質を使用するメンバー成分を画分するステップを含んでなる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記メンバー成分を画分するステップが、前記第１のフルオラス標識試薬で標識された成分を前記第２のフルオラス標識試薬で標識された成分から分離するステップを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記非標識成分または前記フルオラス標識成分を質量分析によって分析するステップをさらに含んでなる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
複数の生物由来成分を含んでなる複合組成物を分析するための方法であって、前記方法が、
そのフルオラス部分が化学反応性官能基に結合されている、５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオラス部分を含んでなるフルオラス標識試薬を提供するステップと、
前記複合組成物の１つもしくはそれ以上のメンバーを前記フルオラス標識試薬で修飾し、フルオラス標識成分および非標識成分を含んでなる修飾組成物を形成するステップと、
前記フルオラス標識試薬の前記フルオラス部分に対する親和性を有する分離組成物を使用する前記修飾組成物を画分するステップと、
分離サンプル画分で質量分析を実行し、かつ質量スペクトルデータを生成し、それによって前記複合組成物を分析するステップと
を含んでなる方法。
【請求項６６】
生物由来サンプルを分析するための方法であって、
５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオロアルキル部分に結合された化学反応性官能基を含んでなるフルオラス標識試薬と前記生物由来サンプルを反応させ、それによってフルオラス標識を前記生物由来サンプルの１つもしくはそれ以上のメンバー成分に組込み、フルオラス修飾成分を形成するステップと、
前記処理サンプルの第１の部分を質量分析によって分析し、第１の一連の質量スペクトルデータを生成させるステップと、
前記処理サンプルの第２の部分を質量分析によって分析し、第２の一連の質量スペクトルデータを生成し、ここで前記第２の部分の前記フルオラス修飾成分が分析前にフルオラス親和性基質を使用して除去されているステップと、
前記第１および第２の一連の質量スペクトルデータを比較し、前記第１の部分に存在し、かつ前記第２の部分に存在しない１つもしくはそれ以上の質量スペクトルピークを測定し、それによって前記生物由来サンプルを分析するステップと
を含んでなる方法。
【請求項６７】
前記第１の部分に存在し、かつ前記第２の部分に存在しない質量スペクトルピークを識別するステップをさらに含んでなる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記生物由来サンプルがプロテオミクスまたはメタボロミクスサンプルを含んでなる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記プロテオミクスまたはメタボロミクスサンプルが複数のアミノ酸含有成分を含んでなり、かつ前記フルオラス標識試薬の前記化学反応性官能基がアミノ酸コンジュゲーション剤を含んでなる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
化学反応性官能基を含んでなるバイオコンジュゲーション剤に結合されたフルオラス部分を含んでなるフルオラス標識試薬であって、前記フルオラス標識試薬が５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなる、フルオラス標識試薬。
【請求項７１】
前記フルオラス部分が隣接炭素原子に結合された５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなる、請求項７０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項７２】
前記フルオラス部分が、非フルオラスリンカー領域によって分離された炭素結合フッ素原子の２つもしくはそれ以上のクラスタを含んでなる、請求項７０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項７３】
前記標識試薬が前記バイオコンジュゲーション剤における第１の位置で結合された第１のフルオラス部分と、前記バイオコンジュゲーション剤における第２の位置で結合された第２のフルオラス部分とを含んでなる、請求項７０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項７４】
前記標識試薬が水性適合試薬を含んでなる、請求項７０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項７５】
前記フルオラス部分が、１つもしくはそれ以上の１３Ｃ原子、１５Ｎ、１８Ｏ原子、またはジュウテリウム原子を含んでなる、請求項７０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項７６】
前記化学反応性官能基が同位体標識を含んでなる、請求項７０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項７７】
前記フルオラス標識試薬が、前記バイオコンジュゲーション剤と１つもしくはそれ以上の前記フッ素部分との間に位置した非フルオラスリンカーヨウ素をさらに含んでなる、請求項７０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項７８】
前記リンカー要素が、長さが２〜２０個の炭素のアルキル鎖を含んでなる、請求項７７に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項７９】
前記リンカー要素が、１つもしくはそれ以上の１３Ｃ原子、１５Ｎ、１８Ｏ原子、またはジュウテリウム原子を含んでなる、請求項７７に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項８０】
前記リンカー要素が放出可能な要素を含んでなる、請求項７７に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項８１】
前記放出可能な要素がペプチド開裂部位を含んでなる、請求項８０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項８２】
前記放出可能な要素がジスルフィド結合を含んでなる、請求項８０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項８３】
前記試薬が、
【化３３】
2007515625.tif 000045
である、請求項８２に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項８４】
前記試薬が、
【化３４】
2007515625.tif 000046
である、請求項８２に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項８５】
前記化学反応性官能基が、マレイミド、ハロゲンβ−ケトン、ジスルフィド交換試薬、フェニルグリオキサル誘導体、無水物、アクリレート、ＮＨＳエステル、チオール、ジアルキルピロカーボネート、アミノオキシ基、またはヒドラジンを含んでなる、請求項７０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項８６】
前記化学反応官能基が同位体標識を含んでなる、請求項７０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項８７】
前記フルオラス標識試薬が、フルオラスアルキルチオール、フルオラスアルコキサミン、フルオラスＮＨＳエステル、フルオラススルホ‐ＮＨＳエステル、またはフルオラスアジドを含んでなる、請求項７０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項８８】
前記フルオラス標識試薬が、第２のバイオコンジュゲーション剤をさらに含んでなる、請求項７０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項８９】
前記フルオラス標識試薬が、第１および第２のアミノ酸結合官能基を誘導体化するための第１および第２のバイオコンジュゲーション剤を含んでなり、かつ前記第１および第２のアミノ酸結合官能基が同様の官能基である、請求項８８に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項９０】
前記フルオラス標識試薬が、
【化３５】
2007515625.tif 000047
である、請求項８９に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項９１】
前記フルオラス標識試薬が、第１および第２のアミノ酸結合官能基を誘導体化するための第１および第２のバイオコンジュゲーション剤を含んでなり、ここで前記第１および第２のアミノ酸結合官能基が異なる官能基である、請求項８８に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項９２】
前記フルオラス標識試薬が質量分析のための標準イオン化および／または断片化条件下で不活性である、請求項７０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項９３】
前記フルオラス標識試薬が、
ＣＦ２Ｈ（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、
（ＣＦ３ＣＦ２）２ＣＦ（ＣＦ２）２ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、
（ＣＦ３ＣＦ２）２ＣＨ（ＣＦ２）２ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、
【化３６】
2007515625.tif 000048
、
【化３７】
2007515625.tif 000049
、
【化３８】
2007515625.tif 000050
、
【化３９】
2007515625.tif 000051
、
【化４０】
2007515625.tif 000052
、
【化４１】
2007515625.tif 000053
、
【化４２】
2007515625.tif 000054
、
【化４３】
2007515625.tif 000055
、
【化４４】
2007515625.tif 000056
、
【化４５】
2007515625.tif 000057
、
【化４６】
2007515625.tif 000058
、
【化４７】
2007515625.tif 000059
、
【化４８】
2007515625.tif 000060
、
【化４９】
2007515625.tif 000061
、
【化５０】
2007515625.tif 000062
、
【化５１】
2007515625.tif 000063
、
【化５２】
2007515625.tif 000064
、
ＣＦ３Ｈ（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３、
ＣＦ３Ｈ（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３、
【化５３】
2007515625.tif 000065
、
【化５４】
2007515625.tif 000066
、
【化５５】
2007515625.tif 000067
、
【化５６】
2007515625.tif 000068
、
【化５７】
2007515625.tif 000069
、
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＯＮＨ２、
ＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＯＮＨ２、
ＣＦ３（ＣＦ２）３ＣＨ２ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＯＮＨ２、
Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２（ＣＦ２）６ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、
【化５８】
2007515625.tif 000070
、
【化５９】
2007515625.tif 000071
、
【化６０】
2007515625.tif 000072
、および
【化６１】
2007515625.tif 000073
［式中Ａはアミノ酸である。］からなる群から選択される、請求項７０に記載のフルオラス標識試薬。
【請求項９４】
生物由来サンプルの分別定量化のための一連のフルオラス標識試薬であって、前記一連が請求項７０に記載の２つもしくはそれ以上のフルオラス標識試薬を含んでなり、前記フルオラス標識試薬が１つもしくはそれ以上の安定したアイソトープで区別をつけて標識される一連のフルオラス標識試薬。
【請求項９５】
前記安定したアイソトープがジュウテリウムを含んでなる、請求項９４に記載の一連のフルオラス標識試薬。
【請求項９６】
前記安定したアイソトープが１３Ｃを含んでなる、請求項９４に記載の一連のフルオラス標識試薬。
【請求項９７】
前記安定したアイソトープが１５Ｎを含んでなる、請求項９４に記載の一連のフルオラス標識試薬。
【請求項９８】
前記安定したアイソトープが１８Ｏを含んでなる、請求項９４に記載の一連のフルオラス標識試薬。
【請求項９９】
基質の表面上でフルオラス標識サンプルのフルオラスおよび非フルオラス成分を画分するための方法であって、前記方法が、
フルオラス標識に対する親和性を有する組成物を提供し、前記組成物が前記基質の表面の第１の部分に結合されるステップと、
フルオラス成分および非フルオラス成分を含んでなるフルオラス標識サンプルを前記基質の表面上へ装填し、かつ前記サンプルの前記フルオラス成分をフルオラス標識に対する親和性を有する前記組成物と結合させるステップと、
前記非フルオラス成分を除去し、それによって前記基質表面上でフルオラス標識サンプルを画分するステップと
を含んでなる方法。
【請求項１００】
前記基質がＭＡＬＤＩプレートまたはＤＩＯＳプレートを含んでなる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記非フルオラス成分を除去するステップが前記基質の表面を洗浄するステップを含んでなる、請求項９９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年１１月１４日出願の米国仮特許出願第６０／５２０，７３６号明細書および２００４年９月２２日出願の同第６０／６１２，３４５号明細書に関する。本特許出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）および他の適用可能な法律または規則に従ってこれらの出願の優先権、および利益を請求する。
【０００２】
技術分野
本発明は、プロテオミクスおよびメタボロミクスサンプルなど複合サンプルの分析のためのフルオラスベースの方法、および関連フルオラス組成物に関する。
【０００３】
著作権通知
３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．７１（ｅ）に従い、出願人は、本開示の一部が著作権保護対象である材料を含むことに言及する。著作権所有者は、特許商標庁の特許ファイルまたは記録に現れているように、特許文献または特許開示のいずれかによる複製に異議はないが、そのほかの点では、すべての著作権を何であれ留保する。
【背景技術】
【０００４】
プロテオミクスは、「さらに生物過程を解明する異なる条件下のプロテオーム（すなわち、ゲノム補完するタンパク質）の質的および量的比較」として定義される（例えば、ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ＿  ｄｅｆ．ｈｔｍｌ  ａｔ  ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇを参照）。したがって、プロテオミクス研究は、いかにタンパク質が互いに、その環境、および他の分子と相互作用するかの検査を含む。同じように、メタボロミクスは、栄養素、ビタミン、抗酸化剤、および他のレドックス成分、シグナル変換、および調節に関与するさまざまな分子（例えば、ヌクレオチド、ホルモン、神経伝達物質など）、代謝の副産物、廃棄物、非内因性成分（例えば、医薬品およびその誘導体）などを含むが、これらに限定されない細胞（または組織もしくは臓器など多細胞構成物）の小分子成分／目録の検査および分析である。細胞タンパク質および／または代謝産物構成要素のプロファイリングから生成される情報は、多くの目的ために使用されうるが、その多くは疾患および健康の基礎をなす特徴の理解の発展に焦点が当てられる。
【０００５】
１９９０年代初期における生物質量分析（ＭＳ）の導入およびその迅速なその後の発展は、細胞組成物およびそれらが関与する過程を特徴づける研究者の能力を大幅に増大させた（例えば、カラス（Ｋａｒａｓ）とヒレンカンプ（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ）（１９８８年）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２２９９−２３０１頁、およびフェン（Ｆｅｎｎ）ら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：６４−７１頁を参照。しかし、所定時間で生物によって発現されたタンパク質のすべての徹底的な分析（すなわち、プロテオーム）、または無数の代謝中間物、シグナル変換、および所定の時点で細胞に存在する他の小分子の状態（メタボローム）は理解しにくいままである。ＲＮＡプロセッシング、タンパク質分解活性化、および無数の（しばしば半化学量論的）翻訳後修飾（ＰＴＭ）などの過程は、結果として限られた数の遺伝子からの独自の構造および機能の無数のタンパク質の生成をもたらし、さらに、無数の生化学経路がさまざまな細胞代謝産物の生成およびプロセッシングに関与しうる。また、検出感度の問題がある。すなわち、例えば、複雑な生体は、酵母では推定値１０４〜血漿で１０９〜１０１２のタンパク質発現レベルのきわめてダイナミックレンジを示す（フッチャー（Ｆｕｔｃｈｅｒ）ら（１９９９年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９：７３５７−７３６８頁、コールタールス（Ｃｏｒｔｈａｌｓ  ）ら（２０００年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：１１０４−１１１５頁）こうして生物サンプルにおいて固有の極端な複雑性により、プロテオミクスおよびメタボロミクス研究は、その代わりに全体的なタンパク質または代謝産物補完物のサブセットのみに焦点を当てる。
【０００６】
サンプル単純化のための無数の方法が積極的に使用されている。例えば、異なる可溶性などその物理特性に基づくタンパク質サンプルの初期画分（ヌーェンス（Ｎｏｕｗｅｎｓ）ら（２０００年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：３７９７−３８０９頁、テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら（２０００年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：３４４１−３４５９頁）、等電点（ヘルベルト（Ｈｅｒｂｅｒｔ）とリゲッティ（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ）（２０００年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：３６３９−３６４８頁）、または細胞内部位（テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら（２００３年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：８２−８８頁）が記載されている。同様に、複合サンプルにおける化学成分によって示される特定の化学官能価に基づく画分スキームも記載されており、一般に２つのクラスに分類される。一部の方法においては、特定の化学官能基と直接相互作用するエンティティは、サンプルの残りからこの官能基を含有するサンプル成分の直接の富化／単離をももたらす。この画分法の実施形態は、リン酸化種の固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）富化（フィカロ（Ｆｉｃａｒｒｏ）ら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：３０１−３０５頁）、無数の官能価の捕捉試薬ベースの富化（パンデイ（Ｐａｎｄｅｙ）ら（２０００年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１７９−１８４頁、ニコフ（Ｎｉｋｏｖ）ら（２００３年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２０：２１４−２２２頁）、または対応するレクチンを使用するさまざまなグリコシル化種の富化（ゲング（Ｇｅｎｇ）ら（２００１年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．、７５２：２９３−３０６頁）を含む。きわめて有効ではあるが、これらの方法は各特定の官能基に対する個別の富化および単離試薬の開発を必要とする。
【０００７】
あるいは、サンプルを化学的に変更し、分析処置を支援することができる。例えば、タンパク質分解サンプルにおけるＮ末端ペプチドの分析は、試薬２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸を使用する内部ペプチドの疎水性を変更することによって着手されうる（例えば、ゲバルト（Ｇｅｖａｅｒｔ）ら「Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｒｔｅｄ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」（２００３年）Ｊ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：５６６−５６９頁に記載）。同じように、２，４−ジニトロフルオロベンゼンを使用し、架橋ペプチドを識別するために加水分解されたリシン保護タンパク質のＮ末端をタギングすることができる（例えば、チェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９９９年）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｓ：  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７３：１９２−２０３頁を参照）。別の方法においては、選択された親和性部分に結合された異なる化学反応性部分を有し、一般的な単離（例えば、親和性ベースの）方法を使用する特定のサンプル画分の容易な富化を可能にする一連の二重官能基試薬が使用される。この方法を使用することにより、特定のアミノ酸を含有する画分の富化（ギジ（Ｇｙｇｉ）ら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９９４−９９９頁）、翻訳後修飾（ゴーシュ（Ｇｏｓｈｅ  ）ら（２００１年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５７８−２５８６頁）、化学架橋（トレスター・ツェードリッツ（Ｔｒｅｓｔｅｒ−Ｚｅｄｌｉｔｚ）ら（２００３年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：２４１６−２４２５頁）、または特定の酵素活性（キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）とサンデニングス（Ｓｚａｒｄｅｎｉｎｇｓ）（２００３年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：２９６−３０３頁）が記載されている。圧倒的多数のプロテオミクスの場合、ビオチン−ストレプトアビジンなど伝統的な生化学親和性ペアが使用され、標準種の単離をもたらす。有効ではあるが、使用されるカスタム試薬は比較的高価であり、生物由来サンプルの使用におけるすべての典型的な制限を受ける。
【０００８】
ビーズ結合化学官能価に基づく追加の単離法が当該技術で周知である。これらには特定の化学官能価、アミノ酸残基など成分要素に特異的な反応、および特定の翻訳後修飾が含まれる。非結合種の除去後、固相で捕捉されるペプチドは捕捉試薬へ化学的にデザインされた特殊放出機構を使用して選択的に回収される。当該技術に記載された開裂法の例としては、光化学開裂（チョウ（Ｚｈｏｕ）ら（２００２年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５１２−５１５頁、チエン（Ｑｉｅｎ）ら（２００３年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５：５４４１−５４５０頁）、酸に不安定な開裂（チエン（Ｑｉｅｎ）ら（２００２年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４：４９６９−４９７９）、または化学試薬誘発開裂（ワング（Ｗａｎｇ）ら（２００２年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  ９４９：  １５３−１６２、シェン（Ｓｈｅｎ）ら（２００３年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２：３１５−３２４頁）が挙げられる。きわめて有効であるが、これらの方法は各特定の官能基に対する個別の固相試薬の開発を必要とする。
【０００９】
フルオラス二相触媒法の導入以来（ホルバス（Ｈｏｒｖａｔｈ）とラバイ（Ｒａｂａｉ）（１９９４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７２−７５頁）、フルオラス化学の分野が急速に拡大した。「フルオラス」という語は、「水性」が水性系を示すのと類似のやり方で高度フッ素化（またはペルフルオロ化）種を示すように創り出された。その最初の出願は、液液分配に基づく触媒からの反応生成物の即座の分離であった。具体的には、１つもしくはそれ以上の高度フッ素化リガンドを有する金属複合体がフルオラス溶媒中で溶解され、有機溶媒中で溶解された反応物質と混合される。室温下に非混合性である２相は加熱とともに混和性となり、均一条件下で生じる反応を可能にする。冷却とともに、相分離が再び起こり、かつ、理想的な条件下、有機相は反応生成物のみを含有するが、フルオラス相は触媒を含有し、これは次いで容易に除去され、かつ再利用される。この概念は迅速にフルオラス合成方法に拡大されたが、ここで反応基質自体は触媒または試薬ではなくフルオラスにされている（スターダー（Ｓｔｕｄｅｒ）ら（１９９７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：８２３−８２６頁）。
【００１０】
有効であるが、これらの液液抽出方法は、きわめて高いフッ素含量を有する化合物の使用を必要とする。例えば、１５０ドルトン未満の分子量を有する「フルオラス」小有機分子を有効に与えるには３９のフッ素分子の存在が必要である（クラン（Ｃｕｒｒａｎ）Ｓｙｎｌｅｔｔ．２００１、１４８８−１４９６頁）。対照的に、液体フルオラス相を固体フルオラス相と置換することによりフルオラス方法の実用性が劇的に拡大される。例えば、フルオラス逆相シリカゲルが適切に標識された過剰な試薬または生成物のフルオラス固相抽出をもたらすために使用されている（例えば、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００２年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５８：３８７１−３８７５頁、マルコビッツ（Ｍａｒｋｏｗｉｃｚ）とデンビンスキー（Ｄｅｍｂｉｎｓｋｉ）（２００２年）Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．４：３７８５−３７８７頁を参照。あるいは、フルオラスクロマトグラフィーが、反応順序中に導入されるタグの主にフッ素に基づく溶液相コンビナトリアルライブラリーのメンバーを分離するために使用されている（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００２年）Ｊ．Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１０４４３−１０４５０頁）。さまざまな伝統的な有機合成に加えて（例えば、ドブス（Ｄｏｂｂｓ）とキンバリー（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ）（２００２年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１８：３−１７頁を参照）、フルオラス方法も最近、小ペプチドおよびオリゴ糖の合成に適用されている（パルマッチ（Ｐａｌｍａｃｃｉ）ら（２００１年）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．  ４０：４４３３−４４３７頁、フィリポフ（Ｆｉｌｉｐｐｏｖ）ら（２００２年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３：７８０９−７８１２頁、ミウラ（Ｍｉｕｒａ）ら（２００３年）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４２：２０４７−２０５１頁、およびミズノ（Ｍｉｚｕｎｏ）ら（２００３年）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ．）９７２−９７３頁）。フルオラス方法は、乾燥疎水性溶媒におけるその触媒活性を維持するリパーゼを使用するラセミカルボン酸およびアルコールの速度論的分割においても使用されている（バイヤー（Ｂｅｉｅｒ）とオーハーガン（Ｏ’Ｈａｇａｎ）（２００２年）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ．）１６８０−１６８１頁）。
【００１１】
したがって、本発明は、フルオラスプロテオミクスおよびメタボロミクス研究の新規の組成物および方法、例えば、フルオラス方法論を使用するプロテオミクスまたはメタボロミクスサンプルの分析を提供することによって当技術分野における必要を満たす。本発明の方法および組成物を使用し、具体的にプロトン性溶媒における生物由来サンプルの複合混合物を高度に標識化し、操作することができる。標識種が、しばしばその最初の分子量よりも相当に小さいフルオラスタグを有するという事実にもかかわらず、標識種は依然として非標識種から、かつ本発明の一部の実施形態においては、異なるフルオラスタグを有する種から容易に分離されうる。本発明のこれらおよび他の利点は、以下の開示の完全な検討により明らかであろう。
【非特許文献１】カラス（Ｋａｒａｓ）とヒレンカンプ（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ）（１９８８年）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２２９９−２３０１頁
【非特許文献２】フェン（Ｆｅｎｎ）ら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：６４−７１頁
【非特許文献３】フッチャー（Ｆｕｔｃｈｅｒ）ら（１９９９年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９：７３５７−７３６８頁
【非特許文献４】コールタールス（Ｃｏｒｔｈａｌｓ  ）ら（２０００年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：１１０４−１１１５頁
【非特許文献５】ヌーェンス（Ｎｏｕｗｅｎｓ）ら（２０００年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：３７９７−３８０９頁
【非特許文献６】テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら（２０００年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：３４４１−３４５９頁
【非特許文献７】ヘルベルト（Ｈｅｒｂｅｒｔ）とリゲッティ（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ）（２０００年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：３６３９−３６４８頁
【非特許文献８】テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら（２００３年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：８２−８８頁
【非特許文献９】フィカロ（Ｆｉｃａｒｒｏ）ら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：３０１−３０５頁
【非特許文献１０】パンデイ（Ｐａｎｄｅｙ）ら（２０００年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１７９−１８４頁
【非特許文献１１】ニコフ（Ｎｉｋｏｖ）ら（２００３年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２０：２１４−２２２頁
【非特許文献１２】ゲング（Ｇｅｎｇ）ら（２００１年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．、７５２：２９３−３０６頁
【非特許文献１３】ゲバルト（Ｇｅｖａｅｒｔ）ら「Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｒｔｅｄ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」（２００３年）Ｊ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：５６６−５６９頁
【非特許文献１４】チェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９９９年）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｓ：  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７３：１９２−２０３頁
【非特許文献１５】ギジ（Ｇｙｇｉ）ら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９９４−９９９頁
【非特許文献１６】ゴーシュ（Ｇｏｓｈｅ  ）ら（２００１年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５７８−２５８６頁
【非特許文献１７】トレスター・ツェードリッツ（Ｔｒｅｓｔｅｒ−Ｚｅｄｌｉｔｚ）ら（２００３年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：２４１６−２４２５頁
【非特許文献１８】キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）とサンデニングス（Ｓｚａｒｄｅｎｉｎｇｓ）（２００３年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：２９６−３０３頁
【非特許文献１９】チョウ（Ｚｈｏｕ）ら（２００２年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５１２−５１５頁
【非特許文献２０】チエン（Ｑｉｅｎ）ら（２００３年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５：５４４１−５４５０頁
【非特許文献２１】チエン（Ｑｉｅｎ）ら（２００２年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４：４９６９−４９７９
【非特許文献２２】ワング（Ｗａｎｇ）ら（２００２年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  ９４９：  １５３−１６２
【非特許文献２３】シェン（Ｓｈｅｎ）ら（２００３年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２：３１５−３２４頁
【非特許文献２４】ホルバス（Ｈｏｒｖａｔｈ）とラバイ（Ｒａｂａｉ）（１９９４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７２−７５頁
【非特許文献２５】スターダー（Ｓｔｕｄｅｒ）ら（１９９７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：８２３−８２６頁
【非特許文献２６】クラン（Ｃｕｒｒａｎ）Ｓｙｎｌｅｔｔ．２００１、１４８８−１４９６頁
【非特許文献２７】チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００２年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５８：３８７１−３８７５頁
【非特許文献２８】マルコビッツ（Ｍａｒｋｏｗｉｃｚ）とデンビンスキー（Ｄｅｍｂｉｎｓｋｉ）（２００２年）Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．４：３７８５−３７８７頁
【非特許文献２９】チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００２年）Ｊ．Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１０４４３−１０４５０頁
【非特許文献３０】ドブス（Ｄｏｂｂｓ）とキンバリー（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ）（２００２年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１８：３−１７頁
【非特許文献３１】パルマッチ（Ｐａｌｍａｃｃｉ）ら（２００１年）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．  ４０：４４３３−４４３７頁
【非特許文献３２】フィリポフ（Ｆｉｌｉｐｐｏｖ）ら（２００２年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３：７８０９−７８１２頁
【非特許文献３３】ミウラ（Ｍｉｕｒａ）ら（２００３年）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４２：２０４７−２０５１頁
【非特許文献３４】ミズノ（Ｍｉｚｕｎｏ）ら（２００３年）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ．）９７２−９７３頁
【非特許文献３５】バイヤー（Ｂｅｉｅｒ）とオーハーガン（Ｏ’Ｈａｇａｎ）（２００２年）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ．）１６８０−１６８１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、プロテオミクスおよびメタボロミクスサンプルなど生物由来サンプルの複合体の調製、分離、および分析のためのフルオラスベースの方法および組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様において、本発明は、分析のために生物由来サンプルにおいて１つもしくはそれ以上の化合物を調製するための方法を提供する。この方法は、ａ）５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオラス部分に結合された化学反応性官能基を含んでなるフルオラス標識試薬を提供するステップと、ｂ）前記フルオラス標識試薬を生物由来サンプル中の１つもしくはそれ以上のメンバーの化合物に前記化学反応性官能基を介して結合させ、フルオラス標識サンプルメンバーを産生し、それによって分析のための前記生物由来サンプルを調製するステップとを含む。生物由来サンプルは、例えば、プロテオミクスサンプルまたはメタボロミクスサンプルでありうる、例となるサンプル源としては、細胞溶解物、細胞分泌物、組織サンプル、血液、尿、または唾液などの体液が挙げられるが、これらに限定されない。場合により、生物由来サンプルは（例えば、ゲル電気泳動またはカラムクロマトグラフィーによって）プレ画分されている。
【００１４】
場合により、本発明の方法は、フルオラス標識試薬に対する親和性を有する分離組成物を使用する非標識メンバーからフルオラス標識サンプルを分離するステップをさらに含む。例えば、一部の実施形態において、フルオラス標識サンプルメンバーは、固相抽出ステップによって「バッチ溶出」される。別の実施形態においては、フルオラス標識サンプルメンバーは、フルオラスシリカゲルなどフルオラス親和性基質を使用するフルオラスカラムクロマトグラフィーを実行し、かつ目的とするカラム流出物（例えば、非結合種またはフルオラス標識種のいずれか、または両方）を収集することによって非標識メンバーから分離される。場合により、結合画分を溶出するステップは、単一標識サンプルメンバーを多重標識サンプルメンバーから分離するステップをも含みうる。別の実施形態においては、フルオラス親和性基質は、ＭＡＬＤＩプレートまたはＤＩＯＳプレートの表面など２次元表面と結合され、フルオラス標識サンプルメンバーを分離するステップが、親和性基質を含有する表面にサンプルを塗布し、かつ非結合サンプルメンバーを洗い流すステップを含むようになっている。
【００１５】
場合により、本発明の方法は、例えば、生物由来サンプルの分離された（標識または非標識）画分上で質量分析を実行することによって生物由来サンプルを分析するステップをさらに含む。一部の実施形態においては、分析するステップは、分離された画分のＭＳデータを生物由来サンプルの非反応アリコートのＭＳデータと比較するステップを含む。
【００１６】
場合により、フルオラス標識試薬は、選択された分析処置中に安定している組成物、例えば、質量分析のための標準イオン化および／または断片化条件下で最小に断片化される組成物である。
【００１７】
マレイミド、ハロゲンβ−ケトン、ジスルフィド交換試薬、フェニルグリオキサル、無水物、アクリレート、アジド、チオール、ジヒドロキシ−ボラン、ボロン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジアルキルピロカーボネート、マイケルドナー、アミノオキシ化合物、またはヒドラジン含有化合物を含むが、これらに限定されないさまざまな化学反応性官能基を本発明のフルオラス標識試薬へ組込むことができる。一部の実施形態においては、化学反応性官能基は、フルオラス標識試薬がアミノ酸コンジュゲーション剤であるように選択される。
【００１８】
フルオラス標識試薬のフルオラス部分は通常、５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなる。多くの実施形態においては、このフルオラス部分は、式ＣＦ３（ＣＦ２）ｎを有するフルオロアルキル基であるが、式中ｎは２〜１０、または場合により３〜１０の整数である。一部の実施形態においては、フルオラス部分は分岐鎖フルオロアルキル部分、または限定された数のフッ素原子が、水素、ジュウテリウム、または他のハロゲンなど他の原子で置換されるフルオロアルキル構造である。場合により、本発明のフルオラス標識試薬は、フルオラス部分（例えば、フルオロアルキルリンカー）によって互いに結合された第１および第２の化学反応性官能基を含む。
【００１９】
場合により、フルオラス標識試薬は試薬の混合物を含んでなる。例えば、標識試薬は、第１のフルオラス部分に結合された第１の化学反応性官能基を有する第１のメンバー、および第２のフルオラス部分に結合された第２の化学反応性官能基を含んでなる第２のメンバーを含みうる。場合により、第１および第２のフルオラス部分は、分離組成物に対するその親和性の点で異なる。
【００２０】
選択サンプルにおける天然由来の化学部分の標的化に加えて、反応官能基を生物由来サンプルへ導入し、フルオラス標識を促進することができる。例えば、本発明の一部の実施形態においては、過ヨウ素酸化を生物由来サンプルで実行し、１つもしくはそれ以上のアルデヒド基を有するサンプル成分を生成させることができる。これは、分析のためのグリコシル化サンプルメンバーを調製するために特に有用である。グリコシル化サンプルメンバーで１つもしくはそれ以上の糖が酸化され、反応混合物中で１つもしくはそれ以上のアルデヒド部分を生成し、これにはヒドラジン型またはアミノオキシ型フルオラス標識試薬が添加される（例えば、ここで化学反応性官能基はヒドラジンまたはアミノオキシ部分である）。アルデヒド部分は、例えば、ヒドラジンと反応し、（フルオラス）ヒドラジド産物を形成し、それによってグリコシル化サンプルメンバーを標識する。あるいは、アルデヒドのアミノオキシ試薬との反応によりフルオラス標識オキシム生成物が生じる。
【００２１】
一部の実施形態において、標識のために選択されるサンプルメンバーはリン酸化アミノ酸含有成分（例えば、リン酸化セリン残基、リン酸化トレオニン残基、および／またはリン酸化チロシン残基）である。リン酸化セリンおよびトレオニンメンバーは、反応混合物を塩基性にし、リン酸化アミノ酸含有成分でβ−脱離反応を実行し、フルオラス標識試薬を反応混合物に添加した後、β−脱離反応の生成物でマイケル付加反応を実行し、それによってリン酸化の以前の部位でフルオラス標識試薬からフルオラス標識を結合させることによって標識されうる。多数の試薬を使用し、β−脱離反応の脱リン酸化生成物と相互作用させることができるが、ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ２などのフルオラス修飾チオール試薬が特に容易に使用される。
【００２２】
あるいは、３つのリン酸化アミノ酸残基すべてを酸性条件下でサンプルにカルボン酸メチル化を実行した後、リン酸基へのシスタミンのＥＤＣ介在結合を実行し、ホスホラミデート種を産生することによって標識されうる。シスタミンは削減され、遊離チオールを形成し、それによってフルオラス標識試薬を結合させることができ、それによってリン酸化サンプルメンバーを標識する。標識種のフルオロ固相抽出（ＦＳＰＥ）後、この方法は場合によりメチル化ホスホペプチドからのフルオラス標識の酸放出を含む。この方法は、ホスホチロシン含有ならびにホスホセリンおよびホスホトレオニン含有サンプル成分の単離および／または富化を提供する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、生物由来サンプルの１つもしくはそれ以上のメンバーを分離するための方法を提供する。この方法は、ａ）５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオラス部分に結合された化学反応性官能基を含んでなる少なくとも１つのフルオラス標識試薬と生物由来サンプルを反応させ、それによってフルオラス標識を１つもしくはそれ以上のサンプルメンバーに付着させ、標識サンプルメンバーを形成するステップと、ｂ）フルオラス標識に対する親和性を有する組成物を使用する非標識サンプルメンバーからフルオラス標識サンプルメンバーを分離するステップとを含む。場合により、標識および非標識サンプルメンバーを分離するステップは、固相（例えば、バッチ）溶出によって実行されうる。あるいは、分離ステップは、例えば、フルオラスシリカゲルなどフルオラス親和性基質を使用し、カラム溶出物を収集するフルオラスカラムクロマトグラフィーによって実行されうる。別の実施形態においては、フルオラス標識に対する親和性を有する組成物は基質（ＭＡＬＤＩまたはＤＩＯＳプレートなど）の表面に結合され、フルオラス標識サンプルメンバーを非標識サンプルメンバーから分離するステップは、生物由来サンプルを基質のフルオラス表面に塗布し、例えば、洗浄によって非標識サンプルメンバーを除去することによって達成されうる。
【００２４】
本発明は、複数のアミノ酸含有成分（例えば、タンパク質、タンパク質分解ペプチドなど）を有するプロテオミクスサンプルまたはメタボロミクスサンプルなど、複数の生物由来成分を含んでなる複合組成物を分析するための方法も提供する。この方法は、ａ）化学反応性官能基に結合された（５個もしくはそれ以上のフッ素原子を有する）フルオラス部分を含んでなるフルオラス標識試薬を提供するステップと、ｂ）複合組成物の１つもしくはそれ以上のメンバーをフルオラス標識試薬で修飾し、フルオラス標識成分および非標識成分を含んでなる修飾組成物を形成するステップと、ｃ）フルオラス標識試薬のフルオラス部分に対する親和性を有する組成物を使用する修飾組成物を画分または分離するステップと、ｄ）分離サンプル画分の質量分析を実行し、質量スペクトルデータを生成し、それによって複合組成物を分析するステップとを含む。
【００２５】
別の実施形態においては、本発明は、ａ）５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオロアルキル部分に結合された化学反応性官能基を含んでなるフルオラス標識試薬と生物由来サンプルを反応させ、処理サンプルを形成し、それによってフルオラス標識を生物由来サンプルの１つもしくはそれ以上のメンバー成分へ組込み、かつフルオラス修飾成分を形成するステップと、ｂ）質量分析によって処理プロテオミクスサンプルの第１の部分を分析し、第１の一連の質量スペクトルデータを形成するステップと、ｃ）質量分析によって処理プロテオミクスサンプルの第２の部分を分析し、第２の一連の質量スペクトルデータを形成し、ここで第２の部分のフルオラス修飾成分が分析前にフルオラス親和性基質を使用するフルオラスベースの分離法によって除去されているステップと、ｄ）第１および第２の一連の質量スペクトルデータを比較し、第１の部分に存在し、第２の部分に存在しない１つもしくはそれ以上の質量スペクトルピークを測定し、それによって生物由来サンプルを分析するステップと、によって生物由来サンプルを分析するための方法を提供する。場合により、データ比較ステップは、第１の部分に存在し、かつ／または第２の部分に存在しない質量スペクトルピークを識別するステップをさらに含む。
【００２６】
別の態様において、本発明は、フルオラスベースの分離法を使用する、プロテオミクスサンプルまたはメタボロミクスサンプルなど生物由来サンプルにおける区別をつけて標識された成分の分離のための方法を提供する。この方法は、複数のアミノ酸含有成分を有する生物由来サンプル提供するステップと、ｂ）生物由来サンプルをフルオラス標識試薬を処理し、１つもしくはそれ以上のメンバー成分を標識し、ここでフルオラス標識試薬が５個もしくはそれ以上のフッ素原子を有するフルオラス部分に結合された化学反応性官能基を含んでなるステップと、ｃ）処理サンプルをフルオラス親和性基質と混合するステップと、ｄ）結合された単一標識成分を別々に結合された多重標識成分から選択的に溶出するステップとを含む。
【００２７】
フルオラス標識試薬の化学反応性官能基（一部の実施形態においては、ペプチド末端コンジュゲーション剤）は、一級アミン遮断試薬（例えば、Ｎ末端標識試薬）またはカルボキシル遮断試薬（例えば、Ｃ末端標識試薬）でありうる。フルオラスシリカゲルを使用し、標識または非標識タンパク質（またはタンパク質断片）を分離し、次いでこれを例えば質量分析によって分析することができる。
【００２８】
ユビキチン化成分の分析を含む実施形態において、サンプルはしばしばさらに（フルオラス標識試薬との相互作用の前に）処理される。通常、非標識（すなわち非ユビキチン化）リシン残基のイプシロンアミノ基は遮断される。サンプルメンバーは場合により（例えば、トリプシンまたは別のタンパク質分解酵素で）開裂され、複数のタンパク質分解断片を生成させる。これはリシンアミノ基遮断ステップの前後のいずれにかに実行されうる。ペプチドのＮ末端はフルオラス標識試薬で標識される。ユビキチン部分の存在により、タンパク質分解断片のプールは、単一ペプチドＮ末端を有するタンパク質分解断片の第１の部分と、２つのＮ末端（第１のペプチド由来Ｎ末端および第２のユビキチン由来Ｎ末端）を有するタンパク質分解断片の第２の部分とを含む。タンパク質分解断片の第１および第２のＮ末端はフルオラス標識試薬で標識され、単一標識タンパク質分解断片の第１の部分および多重タンパク質分解断片の第２の部分を産生する。
【００２９】
同じように、本発明の方法を使用し、プロテオミクスサンプルにおける分子間ジスフィルド架橋含有成分を検査することができる。プロテオミクスサンプルを処理するステップは、場合によりプロテイナーゼによるプロテオミクスサンプルのジスルフィド架橋含有成分を開裂し、それによって２つのＮ末端を有する１つもしくはそれ以上のジスルフィド連結タンパク質分解断片を生成し、かつジスルフィド連結タンパク質分解断片の両方のＮ末端を標識するステップを含みうる。
【００３０】
別の態様において、本発明は、フルオラスベースの分離法を使用する、一連のプロテオミクスまたはメタボロミクスサンプルなど一連の生物由来サンプルの成分を分離する方法を提供する。この分離法は、ａ）一連の生物由来サンプルを提供し、各メンバーサンプルが複数の成分（例えばアミノ酸含有成分）を含んでなるステップと、ｂ）それの中に組込まれたフッ素原子の数が異なる２つもしくはそれ以上のフルオラス標識試薬を提供するステップと、ｃ）一連のサンプルの第１のメンバーを第１のフルオラス標識試薬で処理し、それによって第１のサンプルの１つもしくはそれ以上の成分を標識するステップと、ｄ）一連のサンプルの第２のメンバーを第２のフルオラス標識試薬で処理し、それによって第２のサンプルの１つもしくはそれ以上の成分を標識するステップと、ｅ）第１および第２のサンプルを混合し、混合サンプルを形成するステップと、ｆ）混合サンプルにおけるフルオラス親和性基質を使用するフルオラスベースの分離法（フルオラス固相抽出またはフルオラスカラムクロマトグラフィーなど）を実行し、それによって一連の生物由来サンプルの成分を分離するステップとを含む。
【００３１】
場合により、サンプルセットの追加のメンバーは追加のフルオラス標識試薬を使用しても処理されうるが、その試薬は互いに、かつ第１および第２のフルオラス標識試薬とそれの中に組込まれたフッ素原子の数で異なる。これら追加の標識サンプルは、フルオラスベースの分離ステップにおける分離前に第１および第２のサンプルと混合される。
【００３２】
一部の実施形態において、この方法は非標識成分をフルオラス標識成分から分離するために使用される。場合により、第１のフルオラス標識試薬で標識された成分は、第２のフルオラス標識試薬で標識された成分からも分離されうる。この方法は場合により、質量分析によって（混合または画分された）非標識成分またはフルオラス標識成分を分析するステップをさらに含む。
【００３３】
本発明は、化学反応性官能基に結合された１つもしくはそれ以上のフルオラス部分を有する、新規のフルオラス標識試薬をも提供する（例えば、標的サンプルメンバーにおける化学官能基、例えば、アミノ酸結合基の誘導体化、または翻訳後修飾のためのフルオラスバイオコンジュゲーション剤を形成する）。通常、標識試薬へ組込まれるフルオラス部分は、隣接拡張して、または分子の２つもしくはそれ以上の領域へクラスタ化されて、５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなる。一部の実施形態において、フルオラス標識試薬は多重フルオラス部分（例えば、フルオラス標識試薬内の第１の位置で結合された第１のフルオラス部分と、フルオラス標識試薬における第２の位置で結合された第２のフルオラス部分）を有する。追加の実施形態においては、フルオラス標識試薬は多重化学反応性官能基を有する。
【００３４】
本発明の組成物はしばしばプロテオミクスおよび／またはメタボロミクスサンプルとともに使用されるため、本発明のフルオラス標識試薬の多くの実施形態は水性反応条件と適合性である。さらに、質量分析は一般的にかかるサンプルの分析において使用されるため、フルオラス標識試薬は場合により、質量分析において使用する標準イオン化および／または断片化条件下（例えば、タンデムＭＳにおいて使用される低エネルギー衝突）に不活性である。
【００３５】
本発明の一部の実施形態において、フルオラス部分はリンカー領域によって化学反応性官能基に結合されている。通常、リンカー領域は、長さが２〜２０個の炭素のアルキル鎖である。一部の実施形態においては、標識試薬および／またはリンカー領域のフルオラス部分は、１つもしくはそれ以上の２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、または１８Ｏ原子など同位体標識を含む。場合により、リンカー領域（またはバイオコンジュゲーション剤の別の部分）は放出可能な要素を含み、例えば、標識サンプルメンバーのフルオラス親和性基質または他の分離組成物からの標識サンプルメンバーの解離を促進する。例えば、酵素開裂、化学開裂、光分解、および／または熱変性に感受性の化学部分を本発明の組成物および方法における放出可能な要素として使用されうる。
【００３６】
スルフヒドリル基、チオエーテル基、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、イミダゾール基、グアニジノ基、またはインドール部分を含むが、これらに限定されない多くの反応性基のいずれかを本発明のフルオラス標識試薬を使用して標的化されうる。しばしば、標的化学官能基は、アミノ酸（例えば、側鎖）と結合される。一部の実施形態において、アミノ酸結合官能基は、翻訳後修飾（ＰＭＥ）要素、例えば、リン酸部分またはサッカリド部分である。化学修飾ＰＴＭ要素、および翻訳後修飾の除去に由来する生成物も含まれる。
【００３７】
したがって、本発明の組成物における化学反応性官能基として使用されうる化学官能価としては、マレイミド、ハロゲンβ−ケトン、ジスルフィド交換試薬、フェニルグリオキサル誘導体、無水物、ＮＨＳエステルおよびＮＨＳスルホエステル、ジアルキルピロカーボネート、アルキルアミノオキシ基、ヒドラジン含有化合物などアミノ酸反応性基と反応することが周知の多くの化学種が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明の例となるフルオラス標識試薬としては、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカン−ｌ−チオール（ｌａ）、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロオクタン−１−チオール（ｌｂ），１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロヘキサン−ｌ−チオール（Ｉｆ）、Ｎ−（３−（ペルフルオロオクチル））プロピルマレイミド（２ａ）、Ｎ−（３−（ペルフルオロヘキシル））プロピルマレイミド（２ｂ）、２−ピリジル−２’−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカンジスルフィド（３）、（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロオクチル）アクリレート（４ａ）、（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシル）アクリレート（４ｂ）、Ｎ−スクシンイミジル−２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロヘプタノエート（５ａＮ−スルホスクシンイミジル−２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロヘプタノエート（５ｂ）、Ｎ−スクシンイミジル−２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロウンデカネエート（５ｃ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル−２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロウンデカネエート（５ｄ）、Ｎ−ヨードアセチル−３−（ペルフルオロオクチル）プロピルアミン（６ａ）、Ｎ−ヨードアセチル−３−（ペルフルオロヘキシル）プロピルアミン（６ｃ）、３−（ペルフルオロオクチル）グルタル酸無水物（７）、４−［３−（ペルフルオロオクチル）プロピル−ｌ−オキシ］フェニルグリオキシル（８）、２−ニトロ−４−（Ｎ−（３−（ペルフルオロオクチル）プロピル）カルボキサミド）ベンゼンスルホニルクロリド（９）、２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオノナン酸ヒドラジド（１０）、ビス（スルホスクシンイミジル）−２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ，１０Ｈ，１０Ｈ，１１Ｈ，１１Ｈ−ペルフルオロドデカンジオネート（１１）、スルホスクシンイミジル−１２−［（ヨードアセチル）アミノ］２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ，１０Ｈ，１０Ｈ，１１Ｈ，１１Ｈ，１２Ｈ，１２Ｈ−ペルフルオロドデカノエート（１２）、１−（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロノニル）−ピロール−２，５−ジオン（１３）、２−アミノオキシ−Ｎ−（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）−アセトアミド（１４）、１−アジド−（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロノナン（１５ａ）、１−アジド−（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロウンデカン（１５ｂ）、２−アミノオキシ−Ｎ−（４，４，５，５，６，６，７，７，７−ノナフルオロヘプチル）アセトアミド，（１６ａ）、２−アミノオキシ−Ｎ−（４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１１，１１，１１−ヘプタデカフルオロ−ウンデシル）アセトアミド（１６ｂ）、４，４，５，５，６，６，７，７，７−ノナフルオロ−ヘプタン酸Ｎ’−（２−アミノオキシ−アセチル）ヒドラジド（１６ｃ）、４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１１，１１，１１−ヘプタデカフルオロウンデカン酸Ｎ’−（２−アミノオキシ−アセチル）ヒドラジド（１６ｄ）、１−アミノ−（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロノナン（１７）、ｐ−（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシル）−フェニルボロン酸（１８）、１−アミノオキシ−５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１１，１１，１２，１２，１２−ヘプタデカフルオロ−ドデカン−２−オン（１９）、１−（フルオロエトキシホスフィニル）−３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１０−ヘプタデカフルオロ−デカン（２０）、リン酸モノ−｛４−［フルオロ−（４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１１，１１，１１−ヘプタデカフルオロ−ウンデシルカルバモイル）−メチル］−フェニル｝エステル（２１）、および６−［３−（３，３，４，４，５，５，６，６，６−ノナフルオロ−ヘキシルジスルファニル）−プロピオニルアミノ］−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（２５）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
場合により、本発明のフルオラス標識試薬は、追加のアミノ酸結合官能基を誘導体化するための追加の化学反応性官能基をさらに含んでなりうる。多重化学反応性官能基を有する実施形態において、バイオコンジュゲーション要素は、同じ構造である必要はなく、または同じ標的もしくは型のアミノ酸残基に対する親和性を有する（すなわち、二又のフルオラス標識試薬を使用して異種化学エンティティを結合しうる）。
【００４０】
本発明は、２次元表面で直接、フルオラス標識サンプルのフルオラスおよび非フルオラス成分を画分するための方法も提供する。これらの方法は、フルオラス標識に対する親和性を有する組成物を提供し、その組成物が基質の表面の第１の部分に結合されるステップと、フルオラス成分および非フルオラス成分を含んでなるフルオラス標識サンプルを基質の表面上へ装填し、かつサンプルのフルオラス成分をフルオラス標識に対する親和性を有する組成物と結合させるステップと、非フルオラス成分を除去し、それによって基質表面上でフルオラス標識サンプルを画分するステップとを含む。例となる実施形態において、非フルオラス成分を除去するステップは、基質の表面を洗浄し、それによってフルオラス成分を非フルオラス成分から分離することによって実行される。一部の実施形態において、基質は、基質表面の洗浄により質量分析によるさらなる分析のために適切にフルオラス成分を残すように、ＭＡＬＤＩプレートまたはＤＩＯＳプレートなどのＭＳ基質である。場合により、基質表面の第１の部分は、表面の大部分（または全部）を含む。あるいは、表面の第１の部分は、基質表面上の１つもしくはそれ以上の特定の位置（例えば、マイクロタイターウェルなど、サンプルが得られる配列位置と相関する位置）を含んでなりうる。
【００４１】
別の態様として、本発明は、例えば、プロテオミクスサンプルの分別定量化のために使用されうる一連のフルオラス標識試薬をも提供する。通常、一連のフルオラス標識試薬は、２つもしくはそれ以上の本発明のフルオラス標識試薬を含むが、これらの試薬は１つもしくはそれ以上の安定したアイソトープ（例えば、ジュウテリウムまたは１３Ｃ）で区別をつけて標識される。
【００４２】
本発明のこれらおよび他の目的と特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面と併せて読むとさらに十分に明らかになるであろう。
【００４３】
定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、もちろん変化しうる特定のデバイスまたは生物系に限定されないことが理解されなければならない。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定することが意図されていないことも理解すべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されているように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別段に規定していない限り複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「フルオラス部分（ａ  ｆｌｕｏｒｏｕｓ  ｍｏｉｅｔｙ）」への言及は、２つもしくはそれ以上のフルオラス部分の組合せを含み、「生物由来サンプル」への言及は、サンプルなどの混合物を含む。
【００４４】
別段に規定されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、発明が関係する当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または同等の方法および材料は本発明を試験するための実施に際して使用されうるが、好ましい材料および方法は本明細書に記載されている。本発明の説明および請求に際して、以下の用語を以下に記載された定義に従って使用する。
【００４５】
本明細書で使用される「生物由来サンプル」という語は、真核または原核細胞など生物源から単離、または別の方法で得られる複数の成分を指し、生物からの細胞溶解物および体液（例えば、血液、尿など）または他の細胞分泌物（例えば、細胞または組織に曝露されている培養培地）を含む。例となる実施形態としては、プロテオミクスサンプル、メタボロミクスサンプル、およびグリコミクスサンプルが挙げられるが、これらに限定されない。プロテオミクスサンプルは通常、対応する細胞ゲノム由来の一連のタンパク質組成物を含んでなる。プロテオミクスサンプルは、細胞が生成可能である完全な一連のタンパク質、またはサブセットのタンパク質（例えば、発現パターンまたは画分法に基づき選択）でありうる。同じように、メタボロミクスサンプルは、細胞または他の生物由来サンプルに存在する小分子成分の対応する集団を含んでなるが、グリコミクスサンプルはさまざまな炭水化物を基材とした成分（例えば、単糖、複合体炭水化物、プロテオグリカン、糖タンパク質、糖脂質など）を含有する。
【００４６】
本明細書で使用される「フルオラス」という語はフッ素含有化学部分を指し、かつ部分的および完全にフルオラス（例えば、ペルフルオロ）組成物を含む。
【００４７】
本明細書で使用される「バイオコンジュゲーション剤」という語は、本発明のフルオラス標識試薬において使用するための化学反応性官能基を含んでなる化学部分を指す。例えば、「アミノ酸結合官能基を誘導体化するためのバイオコンジュゲーション剤」（「アミノ酸コンジュゲーション剤」とも呼ばれる）は、アミノ酸における官能基と可逆的または非可逆的に相互作用が可能である反応性剤を指す。反応性官能基は、アミノ酸自体の一部、または翻訳後修飾または化学修飾（例えば、β−脱離反応）などアミノ酸結合官能基のいずれかでありうる。
【００４８】
「アミノ酸含有成分」という語は、生物由来サンプルに存在し、かつペプチド結合によって連結された天然または非天然アミノ酸（例えば、アミノ酸類似体、模倣体など）のいずれかを有する多くの成分のいずれかを含む。本発明のアミノ酸含有成分としては、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
「プロトン性溶媒」は反応性プロトンを有する溶媒であるが、「非プロトン性溶媒」は反応性プロトンを有することがない溶媒である。
【００５０】
フルオラス標識試薬に関して本明細書で使用される「水性適合性」および「水性耐性」という語は、溶媒系によって（例えば、サンプルと相互作用する機会を有する前に）迅速に消費または別の方法で非活性化されない組成物を指す。通常、フルオラス標識試薬は、プロトン性溶媒（例えば、Ｈ２Ｏ）の濃度が実質的に標識される標的種（例えば、生物由来サンプルのメンバー）の濃度よりも実質的に大きい反応条件下で使用される。好ましくは、標識されるサンプルの存在下に新たに調製される場合、水性適合性フルオラス標識試薬における大半（例えば、５０％以上）の化学反応性官能基は、生物由来サンプルのメンバーと相互作用が可能である（すなわち、反応動態は、溶媒分子と比べ生物由来サンプルメンバーとのフルオラス標識試薬の相互作用に有利である）。言い換えれば、水分子はフルオラス試薬との反応に対する標的種を打ち負かすことがない。
【００５１】
水性反応条件および／または溶媒系としては、体積比でわずかに少なくとも１０％、または場合により２５％、５０％もしくはそれ以上のプロトン性溶媒（例えば、水、メタノールなど）を含んでなる。場合により、水性溶媒系は、体積比で７５％もしくはそれ以上のプロトン性溶媒、または９０％もしくはそれ以上のプロトン性溶媒、あるいは一部の実施形態においては１００％のプロトン性溶媒を含んでなる。
【００５２】
本明細書で使用される「フルオラスベースの分離」という語は、液相および固相抽出法（例えば、バルク抽出）のほか、フルオラスクロマトグラフィー（例えば、別々の画分の溶出）を含むが、これらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本発明は、プロテオミクスおよびメタボロミクスサンプルのほか、フルオラス用途において使用するためのフルオラス標識試薬など複合体生物サンプルの分析用の新規の方法を提供する。本発明の方法および組成物は、現在使用されている他のかかる方法に対してきわめて直角のやり方でプロテオミクスおよび／またはメタボロミクス成分の分析を可能にする。本発明の方法は、フルオラス部分の独自の自己結合相互作用を利用し、標識および非標識種の分離を促進し、かつ区別をつけて標識される種の多重分離を可能にする。さらに、当該技術に記載されている他の標識試薬とは異なり、本明細書に提供されているフルオラス標識は通常、処理および分析中に化学的に不活性および／または安定している。
【００５４】
フルオラス部分の特徴
フルオラスベースの分離法の独自の選択性は、複合混合物から標準種の選択的単離のための新規の方法を提供し、生物学的ベースの親和性方法に典型的な非特異的相互作用の多くを削減する。ペルフルオロアルキル基などのフルオラス部分は、主に「似た」または同様の組成物（例えば、それ自体、または他のフルオラス含有組成物）と結合する傾向がある。この特性は、化学合成中、およびフルオラスクロマトグラフィーにおいて、液液および液固抽出のために当業者によって利用されている。フルオラス含有組成物と非フルオラス含有組成物との間の材料分離は、フルオラス標識に付着された化学エンティティの性質（例えば、分子量）と無関係に達成されうる。また、異なる鎖長さのフルオラス標識を有する化学種が互いに分離され、結合種の性質にかかわらず持続する保持特性を証明しうる。
【００５５】
フルオラス方法は、従来の固体および溶液相の方法の代替としてコンビナトリアル合成において使用されている（例えば、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００２年）「Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ５６０−ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐｕｒｅ  ｍａｐｐｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｏｕｓ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１０４４３−１０４５０頁、および米国特許第５，７７７，１２１号明細書、米国特許第５，８５９，２４７号明細書、および米国特許第６，１５６，８９６号明細書（クラン（Ｃｕｒｒａｎ）ら）を参照）。また、フルオラス種は、試薬、スカベンジャー、および有機合成における触媒として使用されている（例えば、リンズレイ（Ｌｉｎｄｓｌｅｙ）ら（２００２年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ４３：６３１９−６３２３頁、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４：２０６５−２０６８頁、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２０００年）Ｊ．Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ６５：８８６６−８８７３頁、およびチャン（Ｚｈａｎｇ）（２００３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５９：４４７５−４４８９頁を参照）。しかし、すべての場合に、これらの方法は、より複雑に実行される混合（例えば、細胞抽出物または他の生物由来サンプルなど）の特定の副画分の単離ではなく、特定の有機分子の標的合成および精製中に使用されている。これらの方法で使用されるフルオラス種は通常、それらが結合され、非プロトン性溶媒とともにのみ使用される化学合成中間体よりも大きい、または同様の分子量を有する。
【００５６】
本発明は、有機反応混合物における低分子量中間体へのフルオラス部分の組込みに限定されないフルオラスベースの方法および組成物を提供する。もっと正確に言えば、本発明の方法および組成物は、生成物が有機または水性（または他のプロトン）溶液に存在しうる、一連のサイズに及ぶ生物学的製剤により使用されうる。例えば、通常、プロテオミクスサンプルに存在するようなペプチドおよび／またはタンパク質のきわめて複雑な混合物が、本発明の１つもしくはそれ以上のフルオラス標識試薬で標識され、その試薬はサンプルに存在する特定の官能基と反応するように選択され、またはデザインされている。フルオラスタグは場合により標識される種よりも相当に小さいが（すなわち、標識は結合種の分子量を劇的に変更しえない）、標識種は依然として、例えば、容易に利用可能なフルオラス固定相を使用して非標識種から容易に分離されうる。多くの実施形態においては、標識試薬はプロトン性溶媒と適合性であり、それらを生物由来サンプルの分析にきわめて適切なものにする。標識種のフルオラス特性に基づく分離法が実行され、これは現在利用可能な伝統的な分離方法に対してきわめて直角である方法であり（例えば、（ストレプト）アビジンとビオチンのそれなど、生物学的ベースの相互作用）、したがって、生物学的ベースの分離法に関連した非特異的相互作用（および莫大な費用）を受けやすくない。また、異なって標識された種はしばしば互いに分離され、特定の分析の多重化、または異なる数のタグを有するフルオラス標識種の分離の可能性につながりうる。
【００５７】
プロテオミクスおよびメタボロミクス分析のフルオラス方法は、当該技術で現在利用可能な方法に対していくつかの追加の利点を有する。例えば、本発明の方法において使用されるフルオラス標識は通常、タンデムＭＳで使用される低エネルギー（例えば、衝突誘発解離）条件下で不活性である。標識断片イオンと非標識断片イオンとの間の質量差は、タンパク質内の修飾部位の決定を補助しうる。また、フッ素の質量欠損およびモノアイソトピック性質により標識ペプチド、またはその正確な質量測定にのみ基づく他の小分子の存在が確認されうる。本明細書に記載されたフルオラス標識サンプルメンバーは通常、エレクトロスプレーイオン化と適合性の移動相において可溶性である。場合により、開裂可能な標識も、それの中に組込まれた安定したアイソトープを有するフルオラス標識試薬として本明細書では提供される。本発明のこれらおよび他の利点は本明細書でさらに詳細に提供される。
【００５８】
本発明は、フルオラス標識試薬を使用する分析のために生物由来サンプルにおける１つもしくはそれ以上の化合物を調製するためのさまざまな方法を提供する。全体として、本発明の方法は、サンプルをフルオラス標識試薬と反応させ、それによってフルオラス標識を組込むことによってサンプル成分を修飾するステップを含む。場合により、これらの方法は、修飾サンプル成分を非標識成分から分離し、例えば、質量分析によって１つもしくはそれ以上の分離された画分を分析するステップをさらに含む。
【００５９】
一態様において、本発明は、分析のために生物由来サンプルにおける１つもしくはそれ以上の化合物を調製するための方法を提供する。これらの方法は、５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオラス部分に結合された化学反応性官能基を含んでなるフルオラス標識試薬を提供し、かつフルオラス標識試薬を化学反応性官能基によって生物由来サンプルにおける１つもしくはそれ以上のメンバー化合物に結合させ、フルオラス標識サンプル成分を産生し、それによってさらに分析のための生物由来サンプルを調製するステップを含む。一部の実施形態において、これらの方法は、フルオラス標識試薬に対する親和性を有する組成物を使用する非標識成分からフルオラス標識サンプル成分を分離するステップをさらに含む。
【００６０】
別の態様において、本発明は、５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオラス部分に結合されたバイオコンジュゲーション剤など化学反応性官能基を含んでなる少なくとも１つのフルオラス標識試薬と生物由来サンプルを反応させ、それによってフルオラス標識を１つもしくはそれ以上のサンプルメンバーに付着させ、修飾サンプルメンバーを形成し、かつフルオラス標識に対する親和性を有する組成物を使用する修飾サンプルメンバーを非標識サンプルメンバーから分離するステップを含む、生物由来サンプルの１つもしくはそれ以上のメンバーを分離するための方法を提供する。
【００６１】
別の実施形態において、複数のアミノ酸含有成分（例えば、プロテオミクスサンプル）を有する生物由来サンプルの成分が、５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオラス部分に結合されたアミノ酸コンジュゲーション剤を含んでなる少なくとも１つのフルオラス標識試薬と複数のアミノ酸含有成分を反応させ、それによってフルオラス標識試薬を１つもしくはそれ以上のアミノ酸含有成分に付着させ、修飾アミノ酸含有成分を形成し、かつフルオラス標識試薬に対する親和性を有する組成物を使用する修飾アミノ酸含有成分を非標識成分から分離することによって分析のために調製されうる。
【００６２】
場合により、生物由来サンプルの成分を調製および／または分離するためのこれら方法の拡充として、複合組成物（またはそれの画分）のメンバーを、例えば、質量分析によってさらに分析されうる。
【００６３】
別の態様において、本発明は、複数の生物由来成分を含んでなる複合組成物を分析するための方法を提供する。これらの分析方法は、ａ）５個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオラス部分に結合された化学反応性官能基を含んでなるフルオラス標識試薬を提供するステップと、ｂ）フルオラス標識試薬で複合組成物の１つもしくはそれ以上のメンバーを修飾し、フルオラス標識成分および非標識成分を含んでなる修飾組成物を形成するステップと、ｃ）フルオラス標識試薬のフルオラス部分に対する親和性を有する分離組成物を使用する修飾組成物を画分するステップと、ｄ）分離サンプル画分の質量分析を実行し、質量スペクトルデータを生成し、それによって複合組成物を分析するステップとを含む。
【００６４】
生物由来サンプル
本発明の方法は、プロテオミクスおよびメタボロミクスサンプルを含むが、これらに限定されない１つもしくはそれ以上の生物由来サンプルで実行される。これらのサンプルは、化学合成中間体の有機反応混合物と異なり、複数の成分を有する複合組成物である。かかるものとして、本発明の方法は、複数のサンプルメンバーを有するサンプル、例えば、少なくとも２５の成分、または少なくとも５０の成分、または少なくとも１００の成分、または少なくとも１，０００の成分、またはさらに何万もの成分（例えば、少なくとも１０，０００の成分、１００，０００の成分、１００万の成分、もしくはそれ以上）の複合集団を有する生物由来製剤により使用されうる。
【００６５】
本発明において使用される生物由来サンプルは、原核または真核由来のいずれかでありうる。サンプルの供給源はほぼ無限であり、動物または植物細胞、酵母、真菌、細菌、ウイルス、および／またはウイルスに感染した細胞、細胞培養、組織培養、または生検サンプル、全細胞または細胞溶解物、未処理細胞、または化学組成物（医薬品）で処理され、または１つもしくはそれ以上の環境因子（熱、光、ｐＨの変化など）に曝露された細胞／生物である。本発明において使用される生物由来サンプルの追加の例となる実施形態としては、細胞／組織／生物に曝露されている細胞培養培地、さまざまな体液、廃棄物、および／または分泌物（例えば、血液、血清、尿、唾液、脳脊髄液、間質液など）に曝露されている細胞培養培地が挙げられるが、これらに限定されない。場合により、サンプルは、化合物ライブラリーの１つもしくはそれ以上のメンバーで処理されている細胞（または生物）から収集されうる。本発明が特定の生物または細胞型からの生物由来サンプルに限定されることは意図されていない。
【００６６】
多くの実施形態において、細胞溶解物が使用され、生物由来サンプルとして使用するためのプロテオミクスまたはメタボロミクスサンプルを提供する。場合により、サンプルは、タンパク質分解酵素または化学開裂試薬を使用して処理され、ペプチド断片を生成し、または化学官能基を分析される種へ導入する。
【００６７】
本発明の一部の実施形態において、生物由来サンプルは、フルオラス標識をサンプルメンバーに結合させる前に１つもしくはそれ以上のプロテイナーゼ処理される。あるいは、プロテイナーゼ処理は、サンプルのフルオラス標識後に実行されうる。本方法において使用するための例となるタンパク質酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテアーゼＡｒｇＣ、ａｓｐＮ、ｇｌｕＣ、およびｌｙｓＣが挙げられるが、これらに限定されない。場合により、これらのプロテイナーゼ（および具体的に示されていない追加の酵素）を組合せて使用し、サンプルタンパク質のタンパク質分解断片を生成させることができる。
【００６８】
あるいは、生物由来サンプルのメンバーは、臭化シアン、ギ酸、トリフルオロ酢酸、またはＳ−エチルトリフルオロチオアセテートなど化学開裂試薬を使用して断片化されうる。なお、ペプチド結合の化学開裂は当該技術で周知の方法であり、記載されている（例えば、ハント（Ｈｕｎｔ）ら、（１９８６年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：６２３３−６２３７頁、およびツギタ（Ｔｓｕｇｉｔａ）ら、（２００１年）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ１：１０８２−１０９１頁）。
【００６９】
本発明の一部の実施形態において、生物由来サンプルのメンバーは、特定の化学官能基を組込み、サンプルメンバーのフルオラス標識への結合を補助するように修飾される。例えば、サンプル成分の翻訳後修飾の程度および型、特にリン酸化およびグリコシル化は、プロテオームおよびメタボロームサンプルの分析において重要である。選択された翻訳後修飾要素（例えば、リン酸部分またはサッカリド部分）を含有するサンプルメンバーを特異的に標識するために、生物由来サンプルは、翻訳後修飾（またはそれの一部）を、次いでフルオラス標識試薬の化学反応性官能基と反応されうる特定の化学官能基に変換する反応条件に曝露されうる。
【００７０】
場合により、本発明の方法において使用されるプロテオミクスサンプルは、フルオラス標識試薬と結合させる前にプレ画分される。例となるプレ画分サンプルとしては、ゲル電気泳動バンド、カラムクロマトグラフィー画分などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
フルオラス標識試薬
本発明の方法では１つもしくはそれ以上のフルオラス標識試薬が使用される。これらのフルオラス組成物は通常、化学反応性官能基および５個もしくはそれ以上のフッ素原子を有するフルオラス部分を含む。場合により、化学反応性官能基は、それにフルオラス部分が付着されるバイオコンジュゲーション剤の一部である。例えば、生物由来サンプルのペプチド成分の標識のための実施形態において、フルオラス標識試薬はしばしばアミノ酸コンジュゲーション剤のフルオラス誘導体である。本発明は新規のフルオラス標識試薬、特に水性適合性フルオラス標識試薬を提供するが、本発明の方法はこれらの薬剤に限定されず、かかるものとして多くの周知のフッ素含有試薬（ルオ（Ｌｕｏ）ら（２００１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：１７６６−１７６９頁に記載されているフッ素結合チオール試薬など）のいずれかで実行されうる。
【００７２】
本発明は、さらに分析のためのプロテオミクスおよび／またはメタボロミクスサンプルの調製を簡単にする端的なさらに新規の方法である。フルオラスタグの結合特性は標的サンプル成分の物理特性（例えば、分子量）によって比較的左右されないため、異なるフルオラス標識試薬で同じように処理（例えば、分離、画分、および／または分析）されうる。追加の特徴として、異なるペルフルオロアルキル鎖は、それらに付着されることによって比較的左右されない異なる保持力を有し、この特性は多重標識反応を実行するために使用され、それによって、他の方法を使用することによって実行できな複合組成物分析の独自の方法を提供することができる。本発明のフルオラス標識試薬は、サンプル分析に関して、フルオラス標識が通常、質量分析において使用される標準イオン化および／または断片化条件下で不活性であり、それによって、標識種の分析中に生成されるデータを簡略化する（例えば、標識断片化によるシグナルの損失がほとんどない）という点で追加の利点を提供する。さらに、フルオラスクロマトグラフィーにおいて使用される移動相（通常ＭｅＯＨ／水）は、ＥＳＩなどの分析法と適合性である。
【００７３】
フルオラス部分
通常、本発明のフルオラス標識試薬は、５個もしくはそれ以上のフッ素原子を有する少なくとも１つのフルオラス部分を含有する。本発明において使用するための例となるフルオラス部分が表１に示されている。場合により、本発明の組成物は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、２０個のもしくはそれ以上のフッ素原子を有する。一部の組成物実施形態において、フッ素原子は隣接炭素原子（例えば、ペルフルオロアルキル鎖）に結合されている。あるいは、フルオラス部分は、非フルオラス化学領域によって分離された炭素結合フッ素原子の２つもしくはそれ以上の「クラスタ」として提供されうる。例えば、本発明のフルオラス部分としては、−ＣＦ２−、−ＣＦ２ＣＨ２−、および−ＣＦＨ−要素、直鎖または分岐鎖のいずれか、および場合により、非フルオラスＣＨ２−要素がちりばめられているさまざまな組合せが挙げられるが、これらに限定されない。場合により、他のハロゲンも（フッ素原子に加えて）本発明の組成物に組込まれうる。
【００７４】
【表１】
2007515625.tif 000002
ここでｎは２〜２０の整数である。
【００７５】
一部の実施形態において、フルオラス標識試薬は、標準バイオコンジュゲーション剤のフルオラス類似体である（すなわち、ここでは試薬に通常存在する多くの炭素−水素結合原子が少なくとも１つの５個のフッ素原子で置換されている）。本発明の他の実施形態において、標識試薬のフルオラス部分の一部は、バイオコンジュゲーション剤（または化学反応性官能基を有するそれの一部）に結合された追加の成分である。場合により、フルオラス部分はリンカー領域によって化学反応性官能基に結合され、フルオラス標識試薬を形成する。通常、リンカー領域は、長さが少なくとも２個、場合により２〜２０個の炭素のアルキル鎖である。直鎖アルキル鎖が例となる実施形態において提供されているが、分岐鎖アルキル鎖および／または芳香族リンカー要素も場合により使用されうる。
【００７６】
さらに、一部の実施形態においては、標識試薬および／または随意的なリンカー領域のフルオラス部分は同位体標識を含む。本発明の組成物における同位体標識として使用するための例となる同位体としては、ジュウテリウム（２Ｈ）、１３Ｃ、１５Ｎ、および／または１８Ｏ原子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
別の実施形態においては、本発明の組成物において使用されるリンカー領域は、修飾サンプルメンバーまたは成分が処理中（例えば、分離または画分ステップ中）の選択時点でフルオラス部分から分離されうるように、放出可能な要素を含みうる。酵素開裂部位を有する生化学構造を本発明の組成物および方法におけるリンカー要素として使用されうる。例えば、例えば、プロテアーゼ認識部位を表すオリゴペプチド、または制限部位を有するオリゴヌクレオチドをコンジュゲーション剤とフルオラス部分との間のリンカーとして使用されうる。あるいは、化学開裂、光分解、または熱変性に感受性である放出可能な要素を使用し、フルオラス部分をフルオラス標識試薬の残りから放出させることができる。
【００７８】
本発明の一部の実施形態において、（付随するリンカー要素の有無による）多重フルオラス部分がフルオラス標識試薬へ組込まれる。例えば、本発明のフルオラス標識試薬は、バイオコンジュゲーション剤における第１の位置（例えば、化学反応性官能基に対する第１の位置）で結合された第１のフルオラス部分、およびバイオコンジュゲーション剤における第２の位置で結合された第２のフルオラス部分を含みうる。
【００７９】
好ましい実施形態において、本発明のフルオラス標識試薬は水性反応条件と適合性である（例えば、標識の反応性は、標識との反応に対する標的種を打ち負かすことがないようになっており、したがって標識試薬をＨ２Ｏの等モル（もしくはそれ以上の）濃度の存在下に使用されうる）。
【００８０】
場合により、フルオラス標識試薬の親水性は、対応する非フルオラスバイオコンジュゲーション剤と比べさらに調節される。これは、例えば、親水性基のフルオラス部分、またはフルオラス部分をバイオコンジュゲーション剤に結合させる随意的なリンカーへの付加によって達成されうる。場合によっては、バイオコンジュゲーション剤自体に修飾を行い、フルオラス標識試薬の水適合性を増大させることができる。例えば、塩基の存在は活性水素種を除去し、β−脱離反応において使用されるフルオラスチオールなど一部の試薬の水適合性を増大させることができる。また、さまざまなモノおよびジカルボン酸含有フルオラス試薬のＮ−ヒドロキシスルホンサクシニミジルエステルを使用し、これらアミン反応性試薬の水適合性を増大させうる。一般に、フルオラス試薬によるペプチド標識は完全に水適合性のままである。
【００８１】
化学反応性官能基
上記の１つもしくはそれ以上のフルオラス部分に加えて、本発明のフルオラス標識試薬は少なくとも１つの化学反応性官能基（一部の実施形態においては、「バイオコンジュゲーション剤」の一部のみを表す）を含む。化学反応性官能基は、フルオラス標識を生物由来サンプルにおける標的種に結合させるために使用される。
【００８２】
生物由来サンプル内の標的種は通常、その構造内に一般的な官能基（「標的化学官能基」または「反応性基」）を含有する。例えば、アミノ酸含有種では、標的化学官能基はアミノ酸自体の一部（例えば、アミノ酸側鎖）、または翻訳後修飾などアミノ酸と連結または別の方法で結合させた官能基のいずれかでありうる。一部の実施形態においては、標的化される官能基は通常、ネイティブ分子の一部であるが、フルオラス標識試薬によるタギングのためのサンプルメンバーの誘導化によって生成される。
【００８３】
本発明のフルオラス標識試薬と反応される標的化学官能基（生物由来サンプルのサンプルメンバー内に存在する一般的な官能基）としては、スルフヒドリル基、チオエーテル基、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ケトンまたはアルデヒド、イミダゾール基、グアニジノ基、インドール部分が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一部の実施形態において、フルオラス標識試薬の化学反応性官能基部分は、アミノ酸の非標識側鎖と反応するように選択される。他の実施形態において、化学反応性官能基は、フルオラス標識を翻訳後修飾要素（例えば、リン酸部分またはサッカリド部分）、または翻訳後修飾の除去または他の化学転換に由来する生成物に標的化する。
【００８４】
これらおよび他のフルオラス標識試薬の例となる実施形態が表２および実施例において示されている。本明細書で例示されている実施形態は実施例としてのみ役立つように意図されており、本発明が本明細書に例示されている特定のフルオラス部分に限定されることは意図されていない。本発明の説明を読んだ後、当業者には、そのすべてが請求された発明の範囲によって包含されているさまざまな実施形態が明らかとなろう。
【００８５】
【表２−１】
2007515625.tif 000003
【表２−２】
2007515625.tif 000004
【表２−３】
2007515625.tif 000005
【表２−４】
2007515625.tif 000006
【表２−５】
2007515625.tif 000007
【表２−６】
2007515625.tif 000008
【表２−７】
2007515625.tif 000009
【００８６】
スルフヒドリル基のフルオラス標識
生体分子に存在する最も高い反応性官能価の中にはスルフヒドリル基がある。アルキル化またはジスルフィド交換反応は通常、スルフヒドリル含有分子（例えば、システイン側鎖）のバイオコンジュゲーションに使用される。例えば、マレイミドおよびアクリレートマイケル受容体は、安定したチオエーテル結合を形成することによってスルフヒドリル基を不可逆的にアルキル化するために使用されうる（例えば、図３２Ｂに示されているホモシステインのフルオラス標識を参照）。かかるものとして、これらの化学反応性官能基は本発明の方法および組成物における使用に適している。本発明において使用するための例となるマレイミド型フルオラス標識試薬としては、Ｎ−（３−（ペルフルオロオクチル））プロピルマレイミド２ａ、およびＮ−（３−（ペルフルオロヘキシル））プロピルマレイミド２ｂが挙げられるが、これらに限定されない。標識スルフヒドラル部分の他のマイケル受容体型フルオラス標識試薬としては、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロオクチルアクリレート４ａ、および１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルアクリレート４ｂが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
別の実施形態において、ハロアセタル、ベンジルハライド、およびアルキルハライド（例えば、ハロゲンβ−ケトン）など活性化ハロゲン誘導体は、本発明の組成物における化学反応性官能基として使用される。本発明において使用するための例となるハロゲンβ−ケトン型フルオラス標識試薬は、Ｎ−ヨードアセチル−３−（ペルフルオロオクチル）プロピルアミン６ａである。
【００８８】
さらに別の実施形態において、ジスルフィド交換試薬は、本発明の組成物における化学反応性官能基として使用される。ジスルフィド交換／相互交換反応は、それの中に組込まれたジスルフィド結合を有するバイオコンジュゲート剤を含み、サンプルメンバーに存在するスルフヒドリル部分は、次いでフルオラス標識試薬のジスルフィド部分を攻撃し、結合を破壊し、かつ標識試薬とサンプルメンバーとの間に新しい、可逆性の（開裂可能な）結合を形成することが可能である。本発明の例となるジスルフィド交換試薬型フルオラス標識試薬は、２−ピリジル−２’−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカンジスルフィド３である。
【００８９】
直鎖および分岐鎖チオール種も本発明におけるフルオラス標識試薬として使用されうる。フルオラス生物物理学的パラメータ（総フッ素含量、フッ素原子の３次元配向、および保持特性間の関係など）の調査におけるその有用性に加えて、表１に示されているもの（例えば、化合物１ｂと１ｃ、および化合物１ｄと１ｅ）などチオール型フルオラス組成物は、「質量コード化親和性タグ」として使用されうる。フルオラス部分内のフッ素原子に対する水素の置換により異なって標識された類似体間の相対保持時間における有意差が生じないとして、区別をつけてのフッ素化標識試薬の使用は、安定した同位体の組込みを必要としない相対定量スキームを可能にし、ここでＭＳピークのペアが１８Ｄａシフトされることになる（すなわち、ＦとＨとの間の質量における差）。
【００９０】
アミノ基および／またはグアニジノ基のフルオラス標識
アミノ基およびグアニジノ基などの窒素含有部分も生物由来（例えば、プロテオミクスまたはメタボロミクス）サンプル内の修飾に対して標的されうる反応性官能価である。
【００９１】
例えば、適切に管理された条件下でのアシル化反応は、アミン含有分子（例えば、リシン側鎖、さらにＮ末端アミノ基）のバイオコンジュゲーションに有効であることが証明されている。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）誘導体、さらに特に親水性スルホ−ＮＨＳ誘導体を使用し、ペプチドまたはタンパク質配列でアミノ基をアシル化することができる。これらのアシル化試薬の例となるフルオラス誘導体としては、スクシンイミジル−２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロヘプタノエート５ａ、およびスルホスクシンイミジル−２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロヘプタノエート５ｂのほか、対応するノナノエートおよびウンデカノエート誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
あるいは、３−（ペルフルオロオクチル）グルタル酸無水物７などフルオラス無水物誘導体も本発明におけるアミノ標的フルオラス標識試薬として使用されうる。
【００９３】
サンプルにおけるグアニジノ型窒素部分を標識するために、４−［３−（ペルフルオロオクチル）プロピル−１−オキシ］フェニルグリオキシル８などフルオラス１，２−ジカルボニル試薬が使用されうる。これらの反応物質は標的グアニジノ部分（アルギニンのグアニジノ側鎖）との縮合反応を受ける。
【００９４】
ケトおよび／またはアルデヒド部分のフルオラス標識
ケトおよび／またはアルデヒド部分は、目的とする一部の生体分子（例えば、ステロイド誘導体、さまざまな医薬中間体、または分解生成物におけるケトン基）に天然に存在するさらに別の反応性官能基であり、または多くの処理によって目的とする選択サンプルメンバーへ導入されうる。これらの化学官能価は、例えば、ヒドラジンの誘導体（フルオラス標識ヒドラジンを形成する）またはアミノオキシ化合物（フルオラス標識オキシムを形成する）を使用することにより、フルオラス標識に対して標的されうる。
【００９５】
例えば、生物由来サンプルにおける炭水化物修飾ペプチドを選択的に標識する１つの方法は、化学酸化（例えば、過ヨウ素ナトリウムを使用）を実行し、または特定の糖オキシダーゼを使用することによって反応性アルデヒド部分を生成させることである。次いで、アルデヒドは、１０（ビオチン−ヒドラジン複合体を使用するのとは対照的に、非特異的相互作用の影響をよい受けやすいより高価な方法）などヒドラジン型フルオラス標識試薬で標識される。別の方法は、アルデヒドをアミノオキシ型フルオラス標識試薬と反応させ、オキシムを形成することである。次いで、フルオラス標識試薬は単離され、さらに分析されうる。
【００９６】
本発明の方法の別の実施形態において、フルオロアミン（すなわち、３−（ペルフルオロオクチル）プロピルアミン１７）またはフルオロアルコール（すなわち、３−（ペルフルオロヘプチル）プロパン−１−オル）と組合せカルボジイミジ誘導体が、生物由来サンプルにおけるカルボキシル部分のフルオラス標識のために使用される。これらの方法において、サンプルメンバーのカルボン酸部分（例えば、アミノ酸含有サンプルメンバー）は、対応するフルオラスアミドまたはエステルへ変換される。
【００９７】
メチオニン側鎖のバイオコンジュゲーション
メチオニン残基を有するアミノ酸配列もフルオラス標識されうる。メチオニン側鎖は、メチオニン標識反応が通常、酸性（２−３）ｐＨで実行されることを除き、システイン残基について記載されたのと同じようにハロゲンβ−ケトンと反応する。場合により、結果として生じる結合は開裂され、β−メルカプトエタノールなどチオールとの反応とともにメチオニン含有ペプチドを元に戻すことができる。メチオニン残基と使用するための例となるフルオラス標識試薬は、Ｎ−ヨードアセチル−３−（ペルフルオロオクチル）プロピルアミン６ａである。
【００９８】
インドール基のバイオコンジュゲーション
トリプトファン残基のインドール部分は、さまざまなスルフェニルハライドと反応され、インドール環における２位でスルフェニル基を導入することができる。本発明のトリプトファン標識フルオラス標識試薬としては、２−ニトロ−４−（Ｎ−（３−（ペルフルオロオクチル）プロピル）カルボキサミド）ベンゼンスルホニルクロリド９などフルオラススルフェニルハライドが挙げられるが、これに限定されない。
【００９９】
他の化学ライゲーション法
追加のフルオラス標識試薬をさまざまな選択的化学ライゲーション反応に基づき調製し、こうしてシス−ジエン、アルキン、および隣接ジオールを含むがこれらに限定されないサンプル集団内の多くの他の（天然または導入）化学官能価を標的しうる。例えば、フルオラス試薬を調製することができる２つのきわめて直角の化学ライゲーション法は「シュタウディンンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）ライゲーション」（ホスパン支持種、検討のために、ケーン（Ｋｏｅｈｎ）ブライバウアー（Ｂｒｅｉｂａｕｅｒ）（２００４年）Ａｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４３：３１０６−３１１６頁を参照）またはフイスゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）１，３−双極子環状付加型ライゲーション反応（アルキン支持基質を標的するための「クリック」化学、ロストフセフ（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ）ら（２００２年）  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４１：２５９６−２５９９頁、および本明細書で引用された文献を参照）。これらの方法は、複合混合物からの特定の種の単離から標的種の順序配置までのさまざまなプロテオミクス用途においてどんどん普及している。アルキン含有生物由来サンプル成分の標的において使用するための例となるフルオラスアジドが表２に示されている。
【０１００】
本発明の別の実施形態においては、化学反応性官能基として「自殺型阻害剤」を含むフルオラス標識試薬が提供されている。これらのフルオラス試薬を使用して生物由来サンプルにおける活性酵素種を選択的に標的することができる（例えば、活性ベースのプロテオミクス研究）。
【０１０１】
自殺型フルオラス標識試薬において使用される化学反応性官能基は通常、２つの一般的カテゴリー、すなわち、小さなペプチド構造と、例えば合理的な医薬品設計によって調製される単純であるが、きわめて直角の小さな分子の１つに分類される。例えば、生物由来サンプルにおけるセリン加水分解酵素は、２０およびさまざまなスルホネートエステル類似体などフルオラス試薬を使用して標的されうる。フルオラス標識試薬２１を使用し、チロシン加水分解酵素を特に標的し、またはシステインプロテアーゼの標的のためにフルオラス標識試薬２２または２３を使用することができる（グリーンバウム（Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ）ら、（２０００年）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５６９頁、ウィンシンガー（Ｗｉｎｓｓｉｎｇｅｒ）ら（２００１年）Ａｎｓ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０：  ３１５２頁を参照）。追加の「自殺型」フルオラス標識試薬のデザインおよび調製において使用するための追加の例となる試薬が、例えば、リュー（Ｌｉｕ）ら（１９９９年）「Ａｃｔｉｖｉｔｙ−  ｂａｓｅｄ  タンパク質  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：ｔｈｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：１４６９４−１４６９９頁によって提供されている。
【０１０２】
多機能標識試薬
場合により、本発明のフルオラス標識試薬は、追加のアミノ酸結合官能基を誘導体化するための追加の化学反応性官能基をさらに含みうる。これらの実施形態において、フルオラス部分は２つの化学反応性官能基間のリンカーとして作用する。同様のまたは異なる官能基のいずれかが第１および第２の官能価によって標的されうる。したがって、多重化学反応性官能基を有する組成物実施形態のために、バイオコンジュゲーション要素は同じ構造であること、またはアミノ酸残基の同じ型に対する親和性を有する必要はない（すなわち、二又フルオラス標識試薬を使用して異種の化学エンティティを結合させることができる）。
【０１０３】
同様の標的特異性を有する例となる同種官能架橋フルオラス標識試薬（すなわち、フルオラス標識試薬における両方の化学反応性官能基が同じ官能基と反応する能力がある）はビス（スルホスクシンイミジル）−２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ，１０Ｈ，１０Ｈ，ｌ１Ｈ，ｌ１Ｈ−ペルフルオロドデカンジオネート１１、アミン標的組成物である。
【０１０４】
サンプルにおける異なる官能基と反応する例となる異種官能架橋フルオラス標識試薬はスルホスクシンイミジル−１２−［（ヨードアセチル）アミノ］２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ，１０Ｈ，１０Ｈ，１１Ｈ，１１Ｈ，１２Ｈ，１２Ｈ−ペルフルオロドデカノエート１２（その化合物はアミンおよびチオール反応性である）。
【０１０５】
プロテオミクスサンプル成分の修飾および分離
プロテオミクスサンプルおよびフルオラス標識試薬を提供した後、本発明の分析方法における次のステップは、プロテオミクスサンプルの１つもしくはそれ以上の成分（例えば、複数のアミノ酸含有成分のメンバー）を修飾するステップを含む。１つもしくはそれ以上のフルオラス標識をプロテオミクスサンプルの標的サンプルへ組込み、かつ修飾プロテオミクスサンプル成分を形成することによって、フルオラス含有化合物の自己結合特性を本明細書で提供されている方法の分離するステップにおいて使用することができる。
【０１０６】
上述したように、多くの一般的なアミノ酸コンジュゲーション剤（例えば、標識試薬）のフルオラスバージョンを合成し、非標識ペプチドの残りのバルクから標識ペプチドを単離するために使用されうる。フルオラス含有アミノ酸コンユゲーション剤は、フルオラス標識を有する薬剤の一部が修飾ペプチドと結合させるようにペプチド成分と相互作用する。本発明の方法の一部の実施形態において、フルオラス標識試薬は複数のフルオラス標識試薬から成る。例えば、標識試薬は、第１のフルオラス部分と結合した第１のアミノ酸コンジュゲーション剤と、別個の化学エンティティとして、第２のフルオラス部分に結合した第２のアミノ酸コンジュゲーションとを有する。複数のフルオラス標識剤を含むかかる実施形態において、好ましくは、第１および第２のフルオラス部分は分離組成物に対する親和性において異なる。
【０１０７】
別の実施形態において、これらの方法において使用されるフルオラス標識試薬は、フルオロアルカンリンカーによって結合された２つのアミノ酸コンジュゲーション剤（例えば、第１のアミノ酸コンジュゲーション剤および第２のアミノ酸コンジュゲーション剤）を有する。例となるフルオロアルカンリンカーは、式
−ＣＨ２ＣＨ２（ＣＦ２）ｎＣＨ２ＣＨ２−
[式中、ｎは３〜２０の整数である。]によって表される。
【０１０８】
フルオラス部分は主に「似た」または同様の組成物と結合する傾向があるため、この特性は本発明の方法の分離するステップにおいて利用される。フルオラス含有と非フルオラス含有組成物間の材料分離は、標識に付着された種の性質（例えば、サイズ）と無関係に適正に生じる。追加の特徴として、異なるフルオラス組成物のフルオラス標識を有する化学種は、結合種の性質と無関係に持続する特定の保持特性で互いに分離されうる。
【０１０９】
本発明の方法における別のステップは、フルオラス標識に対する親和性を有する組成物を使用する非標識成分から修飾（例えば、フルオラス標識）プロテオミクスサンプル成分を分離するステップを含む。フルオラス分離は通常、最小のバックグラウンドできわめて選択的であり、比較的に簡単に実行される。注目すべきは、非標識種からフルオラス標識種を区別する能力も固定相の選択によっても影響されうることである（例えば、図２６−２８を参照）。
【０１１０】
多くの親フルオロ性組成物を使用してフルオラス標識および非標識（非修飾）プロテオミクスサンプル成分を分離することができる。例えば、多くのフルオラス固定相またはフルオラス親和性マトリクスは、フルオラス部分をシリカゲルまたはポリマー基質（例えば、ポリスチレン）に結合させることによって、またはフルオラスモノマーを重合することによって調製されうる。好ましい実施形態において、フルオラス標識に対する親和性を有する組成物はフルオラスシリカゲルである（例えば、フルオロフラッシュ（ＦｌｕｏｒｏＦｌａｓｈ）（登録商標）シリカゲル（フルオラス・テクノロジーズ社（Ｆｌｕｏｒｏｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ペンシルベニア州（ＰＡ））。あるいは、ＦＣ−７２０（登録商標）（３Ｍ（Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ、ミネソタ州（ＭＮ））などのフルオラス溶媒を液体：液体または液体：固体抽出法で使用されうる。
【０１１１】
場合により、修飾プロテオミクスサンプル成分を非修飾成分から分離するステップは、フルオラス親和性基質を使用するフルオラスベースの分離法（例えば、フルオラス官能化固定相、またはフルオラスカラムクロマトグラフィーを使用するバッチスタイルの固相抽出）を実行し、さらに分析されるカラム流出物を収集することによって達成されうる。カラム流出物は、プロテオミクスサンプルの非結合（例えば、非フルオラス）部分またはフルオラス含有画分のいずれかでありうる。
【０１１２】
別の態様において、本発明は、基質（例えば、サンプルプレート上で直接サンプルクリーンアップのためのＭＡＬＤＩまたはＤＩＯＳ）の表面上で直接フルオラス標識サンプルのフルオラスおよび非フルオラス成分を画分するための方法も提供する。フルオラス標識に対する親和性を有する組成物は、基質の表面の第１の部分に結合され、表面上にフルオラス２次元表面を形成する。フルオラス親和性組成物は、基質の全表面、または表面の選択部分（例えば、基質の表面上に広がる数々の位置）のいずれかを覆いうる。別の実施例として、フルオラス修飾多孔性シリコン表面は、ワイ（Ｗｅｉ）ら「Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｎ  Ｐｏｒｏｕｓ  Ｓｉｌｉｃｏｎ」（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９９：２４３−２４６頁によって記載されたＤＩＯＳ（シリコン上での脱離イオン化）方法による使用に調製されうる。
【０１１３】
次いで（非画分）フルオラス標識サンプルは基質表面上に直接配置され、その後、フルオラス成分および非フルオラス成分はフルオラス親和性性組成物に対するその親和性に基づき分離されうる。例えば、フルオラス標識成分を非フルオラス成分から分離するステップは、フルオラス標識に対する親和性を有する組成物とサンプルのフルオラス成分を結合させ、それによってフルオラス成分を表面に配置した後、例えば、洗浄によって任意の非フルオラス成分を除去するステップを含みうる。
【０１１４】
質量分析
本発明の方法は、分離された成分で質量分析を実行し、それによってプロテオミクスサンプルを分析するステップをさらに含む。多くの質量分析法が本発明において使用されうるが、タンデムＭＳが特に有用である。好ましくは、本発明の方法において使用されるフルオラス標識試薬は化学的に安定した組成物であり、フルオラス部分が低エネルギー衝突に対する質量分析条件（例えば、衝突活性化解離（ＣＡＤ）条件）下に不活性であるようになっている。
【０１１５】
本発明の多くの実施形態において、フルオラスベースの分離ステップにおいて使用される移動相は水とメタノールの混合物である。この溶媒系はＥＳＩ法と適合性であり、フルオラスカラムの質量分析計への種の直接溶出の可能性を生じさせる。
【０１１６】
一実施形態において、分析は、プロテオミクスサンプルの分離された画分およびサンプルの未処理部分に対する質量スペクトルデータを収集することによって実行される。次いで、ＭＳデータは比較される。分離された画分はプロテオミクスサンプルの非保持（例えば、非標識）部分、または保持（フルオラス標識）画分である。分離された成分が非修飾プロテオミクスサンプル成分（例えば、フルオラスカラム流入画分）である実施形態では、ＭＳデータを比較するステップは、ＭＳピークが最初の未処理プロテオミクスサンプルに存在するが、非修飾プロテオミクスサンプル成分には存在しない（すなわち、そのピークはフルオラス親和性基質によって保持されている）測定するステップを含みうる。分離された画分がフルオラス含有画分である実施形態では、これらの方法は場合により、多重標識メンバー成分から単一標識メンバー成分を分離するステップをさらに含む。
【０１１７】
本発明の方法の一部の実施形態は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ器具またはＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦ−２器具を使用して実行された。場合により、ブロック（Ｂｒｏｃｋ）らのＰＣＴ公報国際公開第０３／０５４７７２号パンフレット（「プロテオミクスデータ複雑性削減のための方法およびデバイス（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｄａｔａ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」）に記載されたものなど高質量精度質量分析を使用するタンパク質の識別のための方法および系が、本明細書で提供された方法の分析ステップにおいて使用されうる。高質量精度（標識種のシフト同位体分布の分析など）を含む実験は、ホームビルドＭＡＬＤＩ源、新しいオープン円筒型電池、および四極子質量分析計（ＡＢＢ  Ｅｘｔｒｅｌ）を装備した改良型７．０Ｔ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｐｅｘ  ＩＩ  ＦＴ−ＩＣＲ器具を使用して実行された。高質量精度測定はタンパク質識別割当における大きな信頼性を提供し、少ない配列範囲（例えば、少ないペプチド）および少ない追加のタンデムＭＳ実験でタンパク質を識別可能にする。
【０１１８】
確認されたペプチドの正確な質量測定を利用して分析法に役立てることもできる。フッ素は１８．９９８４ａｍｕの質量を有する。正確に測定された場合は、フッ素部分含有誘導体の質量はその計算された見掛けの質量よりも少なくなる。対照的に、同じ見掛けの質量を有する非フルオラス標識化合物の正確な質量は、計算された見掛けの質量よりもわずかに高くなる。したがって、正確な質量測定値は、一連の理論的組成物の計算された見掛けの質量値と比べると、所定のＭＳピークがフルオラス標識種を示すかどうか判定するために使用されうる。正確な質量測定の方法が、例えば、ブロック（Ｂｒｏｃｋ）らによる、「プロテオミクスデータ複雑性削減のための方法およびデバイス（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｄａｔａ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」という名称のＰＣＴ公報国際公開第０３／０５４，７７２号パンフレットに示されている。
【０１１９】
図２９および３０は、タンデムＭＳにおけるフルオラスタグの不活性の２つの比較例を示し、ネイティブシステイン含有ペプチドおよびそのアクリレート標識対照物のタンデムＭＳパターンを比較している。両方の場合、タグの分解による特徴的なピークは確認されなかった（別のネイティブ標識試薬、ＩＣＡＴ試薬とは対照的）。同様に、図７および８は、タンデムＭＳ条件下（異なる標識による質量によりシフトすることを除き同一であるスペクトルを出す異なるサイズのタグを有する２つの同一の種）にフルオラスタグの不活性を示す。
【０１２０】
翻訳後修飾の分析
本発明の方法は、例えば、プロテオミクスまたはメタボロミクスサンプル成分の翻訳後修飾の変化を検査するために使用されうる。翻訳後修飾（ＰＴＭ）としては、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、脂肪酸付着などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
一部の実施形態において、本発明の方法は、少なくとも１つのリン酸化成分を有する複数のアミノ酸含有成分のメンバーを分析するために使用される。リン酸化成分は、１つもしくはそれ以上のリン酸化セリン残基、１つもしくはそれ以上のリン酸化トレオニン残基、またはそれらの組合せを含みうる。複数のアミノ酸含有成分のリン酸化メンバーの修飾は、例えば、ａ）塩基を複数のアミノ酸含有成分に添加し、反応混合物を形成するステップと、ｂ）リン酸化成分においてβ−脱離反応を実行するステップと、ｃ）フルオラス標識試薬を反応混合物に添加するステップと、ｄ）β−脱離反応の生成物でマイケル付加反応を実行するステップとによって実行されうる。この処置は結果として、リン酸化の（以前の）部位でのフルオラス標識の結合をもたらし、フルオラス標識プロテオミクスサンプル成分を生成させる。上記の用途の例となるフルオラス標識試薬は、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカン−１−チオールである。
【０１２２】
本発明の他の実施形態において、これらの方法は１つもしくはそれ以上のグリコシル化プロテオミクス成分を分析するために使用される。例えば、糖ヒドロキシル官能価が、フルオラス含有試薬を使用してアシル化またはアルキル化されうる。一実施形態においては、プロテオミクスサンプルのグリコシル化メンバーを修飾するステップは、ａ）グリコシル化成分における１つもしくはそれ以上の糖を酸化させ、反応混合物において１つもしくはそれ以上のアルデヒド部分を生成させるステップと、ｂ）フルオラス標識試薬を反応混合物に添加し、ここでアミノ酸コンジュゲーション剤がヒドラジド含有化合物を含んでなるステップと、ｃ）アルデヒド部分をヒドラゾン結合によりヒドラジドと結合させるステップとを含む。場合により、ヒドラゾン結合は削減され、それによってフルオラス標識アミノ酸含有成分を生成させる。
【０１２３】
グリコシル化プロテオミクス成分における１つもしくはそれ以上の糖を酸化するステップは、当該技術で周知の多くの方法によって実行されうる。例えば、過ヨウ素酸化反応を使用し、２つの隣接したヒドロキシル基を有する糖においてアルデヒド官能基を導入することができる。上記の用途のための例となるフルオラス標識試薬は、２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオノナン酸ヒドラジドである。
【０１２４】
データセット比較
別の態様において、本発明は、ａ）複数のアミノ酸含有成分（タンパク質、ペプチドなど）を有するプロテオミクスサンプルを提供するステップと、ｂ）５個もしくはそれ以上のフッ素原子を有するフルオラス部分に結合されたアミノ酸コンジュゲーション剤を有するフルオラス標識試薬を提供するステップと、ｃ）プロテオミクスサンプルをフルオラス標識試薬と反応させ、処理プロテオミクスサンプルを形成し、それによってフルオラス標識をプロテオミクスサンプルの１つもしくはそれ以上のメンバー成分へ組込み、かつフルオラス修飾（すなわち標識）成分を形成するステップと、ｄ）処理プロテオミクスサンプルの第１の部分を質量分析によって分析し、第１の一連の質量スペクトルデータを生成させるステップと、ｅ）処理プロテオミクスサンプルの第２の部分を質量分析によって分析し、第２の一連の質量スペクトルデータを生成し、ここで第２の部分のフルオラス修飾成分は分析する前にフルオラス親和性基質を使用するフルオラスベースの分離法によって除去されているステップと、ｆ）第１および第２の一連の質量スペクトルデータを比較し、第１の部分には存在し、第２の部分には存在しない１つもしくはそれ以上の質量スペクトルピークを測定し、それによってプロテオミクスサンプルを分析するステップとを含むプロテオミクスサンプルを分析するための方法を提供する。
【０１２５】
生物由来サンプルのメンバーの分別標識および定量化
例えば、ベースタンパク質またはＰＴＭの量的分別ディスプレイを評価するための化学標識に基づくペアのサンプルの分析のためのさまざまな方法が当該技術において記載されている。これらの方法において使用される化学標識は通常、別々の独立した機能（分別定量化の場合には３つ）を実行する２つの異なる成分から調製される。第１の部分は目的とするペプチドにおける官能基の化学標識を方向づけるが、第２の部分は標識ペプチドの選択的単離を可能にする。かかる化学標識の例としては、同位体コード化親和性タギング（ＩＣＡＴ）方法において使用されるものが挙げられる（ギジ（Ｇｙｇｉ）ら「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｓ」（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：９９４−９９９頁）、および、セリンおよびトレオニンリン酸化分析のために使用されるチオール型マイケル付加試薬（例えば、ゴーシュ（Ｇｏｓｈｅ）ら、上記を参照）が挙げられる。
【０１２６】
複合混合物および／または目的とする特定のタンパク質クラスの濃度の簡略化のためのこれらの方法は、標的分子の徹底的な分析において重要であることが証明された。しかし、これらの一般に使用される方法は、ａ）非特異的相互作用の存在、ｂ）目的とする種の高特異性結合系からの完全な回収の困難、およびｃ）タンデムＭＳなど分析過程中の、それによってタンデムＭＳ法の有効性を低下させる、標識の望ましくない断片化を含む、いくつかの操作上の問題を有する。
【０１２７】
本発明は、フルオラス特性の利用する新しい方法および組成物を提供することによって、当該技術におけるこれらおよび他の問題を克服する。分別標識能もこれらの系に容易に組込まれうる。例えば、表２に示されているフルオラス標識試薬の多くは、短いリンカー要素、例えば、フルオラス部分と化学反応性官能基との間に、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を含む。チオール型フルオラス標識試薬などの試薬では、このリンカー要素は、その求核性を保持するのを補助する。分別標識実施形態では、アルキル鎖の重水素化および正常バージョンが使用され、分別定量化を可能にする（例えば、ヨードアセトアミド型フルオラス標識試薬６ａ〜６ｄを参照）。
【０１２８】
注目すべきは、アルキルおよびペルフルオロアルキル鎖の長さを所望通りに変化されうることである。異なる鎖の長さのペルフルオロアルキル鎖を有する種は、結合種の性質と無関係に持続する特定の保持特性で互いに分離されうる。理論上、この特性は、異なるサンプルから同時に多重分離に使用されるが、これは他の方法によって行うにはきわめて困難である方法である。さらに、（異なるアミノ酸／官能基を標識しうる）異なる標識試薬に付着した（明らかに異なる質量を有する）異なる長さの鎖を有することから生じるデータは、タンデムＭＳ分析前にアミノ酸組成物を解明するために使用されうる。場合により、これらのパラメータはタンデムＭＳソフトウェア分析プログラムへのプログラムも可能であり、ペプチド同定のさらなる信頼性が生じる。
【０１２９】
本発明は、本明細書に開示された化合物および誘導体を使用する分別定量化の方法を提供する。この態様において、比較されるサンプルは、同じ試薬の異なる同位体バージョンと反応され、かつ２つの誘導体化サンプルが混合される。この結果は一連の同位体標識ポリペプチドぺアであり、所定のペアの各メンバーの相対濃度はそのシグナル強度と直接比例している。同位体置換は、１３Ｃ原子の形でフルオラス部分自体内に存在しうるが、リンカー領域内ではさまざまな安定した同位体、またはアミノ酸コンジュゲーション剤自体の一部として存在しうる。あるいは、同位体置換は、それらが開裂可能な試薬が使用される場合には単離ペプチドとともに残存するように組込まれうる。有利には、本発明の方法は分別定量化を提供すると同時に、標識の他の所望の特性を維持する。
【０１３０】
例となる同位体試薬のペアとしては、トリデカフルオロオクチルアクリレートとその３，４，５，６，７，８−ｌ３Ｃ６トリデカフルオロオクチル類似体が挙げられるが、これらに限定されない。比較されるタンパク質サンプル（１ｍｇ）はＴＣＥＰで削減され、トリプシンで消化される。消化物は、２００μＬジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、および２．５μＬ  １００ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ８．０中で脱塩、乾燥、および再構成される。１μＬのトリデカトリデカフルオロオクチルアクリレートまたはそのｌ３Ｃ６を各サンプルに個別に添加し、反応を一夜、室温下に進行させる。サンプルは混合され、非反応アクリテートを、Ｎ−２−メルカプトエチルアミノメチルポリスチレンビーズ（ノバ・バイオケム（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）４ｍｇで室温下に２時間のインキュベーションによって混合物から除去される。ＦＳＰＥは、フルオラス標識（およびシステイン含有）ペプチドのみを単離するために実行され、その各々はシステイン部分当たり６ドルトンで分離された同位体ペアとして存在し、２つのサンプル間の相対濃度はペアのシグナル強度で示される。
【０１３１】
フルオラス含量による分離
別の態様において、本発明は、標識種のフルオラス含量に基づく生物由来サンプル（例えば、プロテオミクスまたはメタボロミクス）サンプルの成分の分離のための方法を提供する。複数のアミノ酸含有成分（タンパク質、ペプチドなど）を有するプロテオミクスまたはメタボロミクスサンプルなど生物由来サンプルは、本明細書に記載された（例えば、５個もしくはそれ以上のフッ素原子を有するフルオラス部分に結合された化学反応性官能基を有する）フルオラス標識試薬で処理される。サンプルのメンバー成分はフルオラス標識試薬で標識され、一部のメンバー成分は単一フルオラス標識に結合されるが、他のメンバー成分は１つ以上のフルオラス標識に結合されるようになっている。次いで、サンプルメンバーはフルオラス含量に従って画分されうるが、処理サンプルはフルオラス分離組成物（例えば、フルオラス親和性基質）と結合しており、結合単一標識成分の結合多重標識成分から別個に選択的溶出を可能にする。
【０１３２】
例えば、本発明の方法を使用し、ユビキチン化成分を有するプロテオミクスまたはメタボロミクスサンプルの分析のために使用されうる。ユビキチンは、（リシン残基によって）細胞タンパク質に結合されると、分解のためにそのタンパク質をタギングする高度保存ポリペプチドである。かかるものとして、ユビキチン化タンパク質は２つのＮ末端を有し、１つはタンパク質自体の一次配列からのものであり、もう１つは結合したユビキチン部分からのものである。この特性はサンプル含有ユビキチン化成分の分析に使用されうる。
【０１３３】
このサンプルは、２つの部分、すなわち、単一Ｎ末端残基を有するタンパク質から成る第１の部分、および少なくとも２つのＮ末端残基を有するユビキチン化タンパク質（付着ユビキチン配列由来）を含む第２の部分を有するとみなされうる。したがって、サンプルメンバーの断片への（トリプシンによる）適切な開裂は、ペプチドの２つの集団、すなわち、単一Ｎ末端を有する１つの部分、および２つのＮ末端を有する第２の部分（すなわち、ユビキチン化リシン残基を含有するペプチド）を生成させる。これらの方法の好ましい実施形態において、任意の非修飾リシン残基のイプシロン−アミノ基は、アミノ基を標的するフルオラス標識試薬でサンプルを処理する前に（例えば、グアニジン化によって）遮断される。
【０１３４】
非末端アミノ基が遮断されると、フルオラス標識試薬によるタンパク質断片の第１および第２のＮ末端の標識により、単一標識タンパク質分解断片の第１の部分および多重標識（例えば、二重標識）タンパク質分解断片の第２の部分が生じる。
【０１３５】
同じように、分子間ジスルフィド連結ペプチドも有効に２つのＮ末端、各ペプチドからのものを有する。本発明の方法は、分子間ジスルフィド連結成分を有するプロテオミクスサンプルの分析のために使用されうる。１つもしくはそれ以上のジスルフィド結合成分を有するプロテオミクスサンプルを処理するステップは、ジスルフィド架橋含有成分をトリプシンで開裂し、それによって２つのＮ末端を有する１つもしくはそれ以上のジスルフィド連結タンパク質断片を生成し、かつタンパク質分解断片のＮ末端を標識するステップを含む。
【０１３６】
多重フルオラスタグを使用する多重化
さらに別の態様において、本発明は、フルオラスベースの分離法を使用するプロテオミクスサンプルの多重分離の追加の方法を提供する。多重分離は、２つもしくはそれ以上のフルオラス標識試薬を使用する、一連の生物由来サンプル（すなわち、各メンバーサンプルが複数の成分を有する２つもしくはそれ以上のプロテオミクスまたはメタボロミクスサンプル）で実行される。通常、フルオラス標識試薬は、５個もしくはそれ以上のフッ素原子を有するフルオラス部分に結合されたアミノ酸コンジュゲーション試薬である。一連のサンプルの第１のメンバー（すなわち、第１の複数の成分）は第１のフルオラス標識試薬で処理され、それによって第１のサンプルにおける１つもしくはそれ以上の成分（例えば、タンパク質、ペプチドなど）を標識する。同じように、一連の第２のメンバーが第２の（異なる）フルオラス標識試薬で処理され、それによって第２のサンプルの１つもしくはそれ以上の成分を標識する。場合により、追加のサンプルセットが、追加のフルオラス標識試薬を使用して標識されうる。場合によりこれらの方法で使用される第１、第２、および追加のフルオラス標識試薬は異なる化学構造を有し、好ましくは、フルオラス標識試薬は、それの中に組込まれたフッ素原子の数において異なる。
【０１３７】
処理された第１および第２のサンプルは混合され、混合サンプルを形成する。次いで、フルオラスベースの分離法は、混合サンプルにおける標識および非標識成分を分離するために使用される。一部の実施形態においては、フルオラス固相抽出が実行され、標識および非標識種を分離する。区別をつけて標識された種は場合によりさらに画分され、またはそれらはいっしょに分析されうる。あるいは、親和性基質を使用するフルオラスカラムクロマトグラフィーを使用し、標識および非標識成分を分離し、第１のフルオラス標識試薬で標識された成分を第２のフルオラス標識試薬で標識された成分から分離する。場合により、この方法は、例えば、質量分析によって、非標識成分またはフルオラス標識成分を分析するステップをさらに含む。
【０１３８】
上述したように、一連のプロテオミクスサンプルの１つもしくはそれ以上の追加のメンバーは、場合により、追加のフルオラス標識試薬で処理されうるが、追加の試薬は、互いに、かつ第１および第２のフルオラス標識試薬と（例えば、それに組込まれたフッ素原子の数において）異なる。これらの追加の処理サンプルも分離するステップ前に第１および第２のサンプルと混合されうる。分析は、例えば、以前の方法で言及されているように、質量分析によって実行されうる。
【０１３９】
分別定量化試薬
本発明は、プロテオミクスまたはメタボロミクスサンプルの分別定量化のための一連のフルオラス標識試薬も提供する。一連のフルオラス標識試薬は通常、本明細書に記載されているように２つもしくはそれ以上のフルオラス標識試薬を含み、これらは１つもしくはそれ以上の安定した同位体で区別をつけて標識される。さまざまな安定した同位体が使用されうるが、一連のフルオラス標識試薬においてより一般的に使用される同位体は、ジュウテリウム（２Ｈ）、炭素−１３（１３Ｃ）、窒素−１５（１５Ｎ）、および酸素−１８（１８Ｏ）である。ペアのフルオラス標識試薬間の同位体の差異は、例えば、フルオラス部分（例えば、１３Ｃ−ペルフルオロアルキル基）、化学反応性官能基の保持部分、またはフルオラスおよびコンジュゲーション部分を結合させる随意的なリンカー領域において配置されうる。分別定量化分析において使用されうる例となるペアのフルオラス標識試薬は、化合物６ａと６ｂ、および６ｃと６ｄである。
【０１４０】
キット
追加の態様において、本発明は、本明細書に示された組成物および／または方法を具体化するキットを提供する。本発明のキットは、場合により、以下の１つもしくはそれ以上を含んでなる。すなわち（１）本明細書に記載された１つもしくはそれ以上のフルオラス標識試薬、（２）フルオラス固相抽出を実行するためのフルオラス基質または他の材料、（３）本明細書に記載された方法を実施するための、および／または本明細書に記載されたフルオラス標識試薬を使用するための説明書、（４）１つもしくはそれ以上の生物由来サンプル成分（例えば、分析中の対象として使用）、（５）成分または組成物を保持するための容器、および（６）包装材料。
【実施例１】
【０１４１】
本発明は、以前に記載されていない独自の試薬の説明を含む、プロテオミクスおよびメタボロミクスサンプル成分のフルオラス標識のさまざまな態様、およびさらに複合混合物からのさまざまな機能的種の調製および単離におけるその用法の実施例を提供する。以下の実施例は、請求された発明を例示するため提供されているが、限定するためではない。例えば、唯一のフルオラス標識試薬が所定の反応スキームまたは実施例で特定されうるが、その型の試薬の同様の標識試薬（例えば、鎖の長さまたは組込まれたフッ素の数が異なる）が暗示されている。本明細書に記載された実施例および実施形態は例示目的だけのためであり、かつそれに照らしてさまざまな修正または変更が当業者には示されるとともに、本出願の精神および範囲および添付の請求項の範囲に含まれることが理解される。
【実施例２】
【０１４２】
実施例１：フルオロ固相抽出（ＦＳＰＥ）
図１に示されているものなど、フルオラス固相抽出処置において使用されるフルオラスカラムは、以下のように調製されうる。溶融シリカキャピラリー（３６０／２００μｍＯ．Ｄ．／Ｌ．Ｄ．、長さ約１５ｃｍ）を最初に「カシール（Ｋａｓｉｌ）」フリットし、次いで高圧下（５００〜１０００ｐｓｉ、社内ビルド圧力容器を使用）、フルオロフラッシュ（Ｆｌｕｏｒｏｆｌａｓｈ）（商標）フルオラス逆相シリカゲル（ＦＲＰＳＧ、ペルフルオロオクタン結合相、５μｍ粒子、フルオラス・テクノロジーズ社（Ｆｌｕｏｒｏｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）から入手可能、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ペンシルベニア州（ＰＡ））のスラリーでパックし、約５〜８ｃｍの総床長さを得た。ＦＲＰＳＧのへら先端を５００μＬ  ＭｅＯＨに磁気攪拌で添加することによって調製した。「カシール（Ｋａｓｉｌ）」材料を４５０μＬ  Ｋａｓｉｌ  Ｎｏ．１ケイ酸カリウム（ザ・ＰＱ社（Ｔｈｅ  ＰＱ  Ｃｏｒｐ．）、Ｖａｌｌｅｙ  Ｆｏｒｇｅ、ペンシルベニア（ＰＡ））を８８μＬホルムアミドと混合した後、ボルテックス混合によって調製した。混合物を１分間（〜５０００ｒｐｍ）遠心分離し、上部２００μＬを除去し、保存した。次いで、溶融シリカキャピラリーを迅速に保存溶液へ浸漬し、１〜２ｃｍの金属をキャピラリーの一端へ入れた。「浸漬」キャピラリーを１００℃で１時間乾燥させ、冷却させ、セラミックカッターで約１〜２ｍｍのＫａｓｉｌフリット長さに切断し、キャピラリーの全長を約１０ｃｍとした。最後に、フリットしたキャピラリーを上記のＦＲＰＳＧスラリーで充填し、２０〜５０カラム体積（ＣＶ）の９９％メタノール／１０ｍＭギ酸アンモニウムで活性化した。
【０１４３】
２０−５０ＣＶの６０％メタノール／１０ｍＭギ酸アンモニウムによる平衡後、サンプルを平衡バッファー中のＦＲＰＳＧカラムへ装填した。その後、使用されたフルオラスタグ（Ｃ６Ｆ１３タグ＝洗浄Ａ、Ｃ８Ｆ１７または２×Ｃ４Ｆ９タグ＝洗浄Ｂ）によって、２０−５０ＣＶの洗浄Ａ（６０％メタノール／１０ｍＭギ酸アンモニウム）または洗浄Ｂ（水中５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ））のいずれかで洗浄ステップを実行した。フルオラス標識ペプチドを２０−５０ＣＶの９９％メタノール／１０ｍＭギ酸アンモニウムを使用して溶出した。画分を０．５ｍＬ微小遠心管へ収集し、その後に真空で乾燥させた。乾燥ＦＳＰＥ溶出液（９９％メタノール／１０ｍＭギ酸アンモニウム画分）を、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＰ  ＭＳまたはキャピラリーＬＣ／ＭＳによって、さらに分析するために２５％メタノール／０．５％酢酸（ｖ／ｖ）中で再構成した。
【０１４４】
実施例２：トリプシンペプチド混合物のグアニジン化およびα−フルオラス誘導体化
Ｏ−メチルイソウレアまたは２−メトキシ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾールを使用するリシンε−アミノ基の選択的反応が図３Ａに示されている。通常、リシン残基を本明細書に記載されたμＣ１８Ｚｉｐｔｉｐｓ（商標）で捕捉後に修飾した。先端をそれぞれの溶液で数回吸引し、先端床を完全に反応溶液に浸漬して５０℃オーブン中でインキュベートした。
【０１４５】
ホモアルギニンへのリシン転換を３７℃下、２時間のインキュベーション中に、０．５Ｍ  Ｏ−メチルイソウレア硫酸水素（２μＬ）と０．２５Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ１１．７（８μｌ）の１：４溶液を使用し、あるいはＯ−メチルイソウレアヘミ硫酸塩（Ｏ−ＭＩＵ、０．２５Ｍ炭酸ナトリウム中約１．１Ｍ  ｐＨ１０．５を使用して実行した。次いで、修飾ペプチドを脱塩し、真空で乾燥させた。
【０１４６】
リシンε−アミノ基の４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾイル誘導体への転換を、２−メトキシ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール（環状−ＯＭｅ、水中約０．８Ｍ）、および４〜５時間のインキュベーション（またはアジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、デラフェア州（ＤＥ）から入手可能なＬｙｓ  Ｔａｇ  ４Ｈ試薬キットにおいて上記の通り）を使用して実行した。
【０１４７】
Ｎ末端基（リシン遮断または未処理サンプルのいずれかで）を同等量の０．２５Ｍ炭酸ナトリウムバッファーを添加してフルオラス標識し、ＴＨＦ中２５０ｍＭ  Ｎ−スクシンイミジル  ３−ペルフルオロブチルプロピオン酸塩（化合物５ａ）で新たに調製し、最終総量を４０μＬとした。標識反応を２時間、室温下に進行させた後、４μＬ５０％ヒドロキシルアミン水溶液を添加した（チロシンおよびヒスチジン残基の望ましくないエステル化を逆行させる）。反応溶液を１０分間放置させ、その後、５％ＴＦＡを５μＬ添加し、反応を終了させた。最後に、反応溶液は真空で乾燥させ、次いで６０％メタノール／１０ｍＭ  ギ酸アンモニウム中で再構成した。
【０１４８】
実施例３：β−脱離およびチオールマイケル付加によるリン酸化またはグリコシル化ペプチドのフルオラス標識
チオール型フルオラス標識試薬を使用するマイケル付加によるリン酸化および／またはグリコシル化セリンまたはトレオニン残基のβ−脱離およびその後の標識を示す例となる反応スキームが図２Ａおよび２Ｂに示されている。
【０１４９】
ウシα−カゼインおよびチキンオボアルブミンをシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、モンタナ州（ＭＯ））から購入した。別に言及されていない限り、タンパク質サンプル（約４０μＭ）を５０ｍＭ炭酸アンモニウム（ｐＨ７．５）中５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）の添加によって低減した。配列グレード修飾トリプシン（Ｔｐ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））によるタンパク質分解を一夜、３７℃下、基質／酵素比５０：１（ｗ／ｗ）を使用して行った。
【０１５０】
サンプル（５μＬ、≦２５０ｐｍｏｌ）を同等量の３：１のＤＭＳＯ／エタノール（ｖ／ｖ）（５μＬ）と混合した後、４．６μＬ飽和Ｂａ（ＯＨ）２および１μＬ  ５００ｍＭ  ＮａＯＨを添加した。最後に、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカン−１−チオール（フルオラス標識試薬１ａ）０．７μＬを添加し、溶液を３７℃下に１時間反応させた。５％ＴＦＡ  ５μＬ（ｖ／ｖ）の添加によって反応を停止し、反応生成物をその後に反応混合物を調節することによって酸化させ、最終濃度を３％Ｈ２Ｏ２（ｖ／ｖ）とし、反応を３０分間、室温（ＲＴ）下に起こさせた。この結果、以前のホスホセリン（ｐＳ）またはホスホトレオニン（ｐＴ）残基の代わりにβ−連結フルオラススルホキシド側鎖を有するフルオラス標識サンプルメンバーが生じる。最後に、サンプルを６０％メタノール（ｖ／ｖ）１０ｍＭギ酸アンモニウムで１００μＬに希釈し、−８０℃下に保存した。
【０１５１】
別の小規模β−脱離／マイケル付加反応（≦１００ｐｍｏｌペプチド）において、水性ペプチド溶液１１．３５μＬをエタノール５．１１μＬ、５Ｍ  ＮａＯＨ  １．８４μＬ、およびジメチルホルムアミド中で１．１８Ｍ  １Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカン−１−チオール（フルオラス標識試薬１ａ）１．７μＬと混合した。反応を室温下、２〜３時間進行させた。
【０１５２】
さらに、場合により、酸化過程の延長により、標識ペプチドのβ−連結フルオラススルホキシド側鎖はそのフルオラススルホン類似体へ変換し、これは改善されたタンデム質量分析断片化特性を示す。
【０１５３】
この反応スキームを使用し、生物由来サンプル由来の多くのβ−脱離生成物を標識することができる。図６〜１１は、α−カゼイン消化（フルオラス標識試薬ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、および１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロヘキサン−１−チオール）のフルオラス標識時に生成された実験データを示す。図６の上パネルは、β−脱離反応およびフルオラス標識を受けた前（第１のパネル）および後（第２のパネル）の（非標識）消化カゼインサンプルに対して生成されたＭＳデータを示す。下パネルは、フルオラス親和性基質による分離時に保持された（第４のパネル）または保持されなかった（第３のパネル）サンプル含量を示す。図７〜１０は、さまざまな識別されたペプチド断片に対して生成されたタンデムＭＳデータを示す。スペクトもタンデムＭＳ条件下のフルオラス標識試薬の不活性の実施例を示し、異なるサイズのタグを有する２つの同一種は、異なる標識による質量シフトを除き同一であるスペクトルを生じる。
【０１５４】
図１２〜１５は、タンパク質オボアルブミンを使用して実行された類似の実験から得られた結果を示し、トリプシン消化およびホスホペプチドのフルオラス標識後のＭＳピーク位置の変化を示すＭＳデータ、および対応するタンデムＭＳデータを含む。別の一連の実験において、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃペプチドは、図１６〜１８に示されているように、同様のβ−脱離／マイケル付加反応でフルオラス標識された。
【０１５５】
関連実施形態において、フルオラス標識ホスホペプチドは同様のβ−脱離／マイケル付加反応によって調製され、次いで非標識カゼインのトリプシン消化物を「スパイク」するために使用された（図１１に図示）。図１９もβ−脱離標識ホスホペプチドの全酵母トリプシン消化物へのスパイクによって調製されたサンプルに対して生成されたデータを示す。両方の実験は、非標識種と比べフルオラス標識のきわめて特異的な保持特徴を示す。
【０１５６】
実施例４：アクリレートマイケル付加によるシステイニルペプチドのフルオラス標識
ＢＳＡからのシステイニルペプチドのアクリレートフルオラス標識試薬へのマイケル付加を示す例となる反応スキームが図４Ａに示されている。この反応スキームを使用して生成された例となるデータは、図２０に示されている比較ＭＳプロフィールを含み、かつ標識ペプチドのタンデムＭＳデータは図２１および図２２に示されている。
【０１５７】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、１ｍｇ）を４Ｍ尿素、０．１Ｍ炭酸アンモニウム、ｐＨ８．０、１００μＬ中に溶解した。水中トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を添加し、最終濃度を１０ｍＭとして混合物を１０分間、室温下に放置した。Ｔｐ（２０μｇ）を添加し、混合物を３７℃下に８時間インキュベートした。１ｎｍｏｌトリプシンペプチドに対応するアリコートをペプチド・マクロトラップ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｃｒｏｔｒａｐ）（マイクローム・バイオリソーシス（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）、Ａｕｂｕｒｎ、カリフォルニア州（ＣＡ））ヘ装填した。脱塩カラムを０．１％酢酸（ｖ／ｖ）１ｍＬで洗浄し、ペプチドを７０％アセトニトリル／０．１％酢酸（ｖ／ｖ）で溶出した。この混合物を真空で蒸発乾固した。
【０１５８】
トリプシンペプチドをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２００μＬ、１００ｍＭ炭酸ナトリウム２．５μＬ、ｐＨ８．０、および３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチルアクリレート４ａ（ＴＤＦＯＡ、３．７μｍｏｌ）１μＬで再構成した。反応を一夜、室温（ＲＴ）下に進行させ、その間にシステインの遊離チオール基をＴＤＦＯＡとマイケル型付加によって結合した。未反応ＴＤＦＯＡをＮ−２−メルカプトエチルアミノメチルポリスチレンビーズ（ノババイオケム（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）２ｍｇを室温下に２時間のインキュベーションによって除去した。反応期間後、上清を除去し、別の処理および／または分析のために希釈した。
【０１５９】
同様の反応をＴＤＦＯＡのＣ８Ｆ１７類似体を使用して実行した。Ｃ６Ｆ１３種は直接のＬＣ／ＭＳ分析の影響をより受けやすいが、Ｃ８Ｆ１７バージョンは標識種の単離（「オン−オフ」捕捉）およびＭＡＬＤＩ分析に関して良好に実行された。
【０１６０】
実施例５：アルキル化によるシステイニルペプチドのフルオラス標識
代替として、フルオロヨードアセトアミドアルキル化剤（Ｎ−［（３−ペルフルオロオクチル）−プロピル］−ヨードアセトアミド（化合物６ａ）をチオール標的フルオラス標識試薬として使用した。ＢＳＡを固定化ＴＣＥＰで低減し、Ｔｐで８時間、３７℃下に消化し、以前に既述したように脱塩した。水２０μＬ中トリプシン消化物１００ｐｍｏｌを１Ｍ炭酸アンモニウム５μＬ、ＴＨＦ  ２０μＬ、および５００ｍＭ  Ｎ−［（３−ペルフルオロオクチル）−プロピル］ヨードアセトアミド５μＬ（５００ｍＭ  ＴＨＦ中保存溶液）と混合し、３０分間、３７℃下に暗所で反応させた。冷却させた後、５０％メタノール／５０  ｍＭ重炭酸アンモニウム４５０μＬを添加し、混合した。過剰なフルオラスヨードアセトアミドを数ｍｇの３−メルカプトプロピル官能化シリカゲル（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ウィスコンシン州（ＷＩ））の添加した後、数時間、暗所において室温下に攪拌して除去した。次いで、スラリーを３Ｋセルロース分子量カットオフフィルタによりろ過した後、ろ過シリカゲルのメタノール洗浄（１００μＬ）を行った。次いで、混合されたろ液および洗浄液を真空で乾燥させ、６０％メタノール／１０ｍＭギ酸アンモニウム中で再構成した。
【０１６１】
本明細書に記載された本実施例および他の実施例は、場合により、固相捕捉剤を使用し、過剰な試薬を除去する。当業者は、樹脂の性質（ポリマー対シリカ）、および使用される洗浄条件７０が、この方法の有効性に影響を及ぼし、かつ必要以上の実験なしにこれらのパラメータの最適化が可能であることを認識するであろう。あるいは、固相捕捉を必要としない試薬除去スキームも適用されうる。
【０１６２】
実施例６：一級アミンのＮＨＳ−エステルアミド化
ＮＨＳ−エステル型フルオラス標識試薬の合成（およびこの試薬を使用する一級アミンのアミド化）を示す例となる反応スキームが図３Ｂに示されている。ペプチドの単一標識（例えば、「直鎖」ペプチドのＮ末端標識）に加えて、本発明の一部の実施形態においては、この標識反応スキームはプロテオミクスサンプルメンバーの二重標識のために使用される（例えば、ユビキチン化または分子間ジスルフィド反応によって形成されるものなど「分岐鎖」ペプチドの場合）。直鎖および分岐鎖標識ペプチドの概略図が図３Ｃに示されているが、比較ＭＳプロフィール（パネルＡ：未処理、Ｂ：フルオラス標識、Ｃ：非保持、およびＤ：フルオラス親和性基質によって保持された種）が図２５に示されている。これらの実験においては、ポリユビキチン鎖（アフィニチ・リサーチ・プロダクツ（Ａｆｆｉｎｉｔｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｅｘｅｔｅｒ、英国（ＵＫ））を１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、４Ｍ尿素、ｐＨ８．０の溶液中トリプシンで消化した。
【０１６３】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロヘプタノエートをホール（Ｈａｌｌ）ら（２００３年、Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．３８：８０９）の方法と同様に、２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈペルフルオロヘプタン酸１７．２ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１４．６ｍｇ、およびエチルジエチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）をＤＭＦ  ５００μＬに添加することによって合成した。７０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ中脱塩ペプチド（約６μＬ）をＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．０  １０μＬ、ＤＭＦ  １０μＬ、およびＰＦＨＡ  ＮＨＳエステル１μＬ（約１００ｎｍｏｌ）の混合物に添加した。
【０１６４】
この反応スキームは、単一アミン標識、および（例えば、分岐鎖ペプチドの）多重アミン標識のために使用されうる。さらに、本明細書で言及されているように、異なる鎖の長さを有するかかる試薬の構造的に関連性のファミリーが使用されうる。また、表２に示されているものなど二官能性架橋剤も使用されうる。長い鎖種は、対応するスルホ‐ＮＨＳエステル誘導体を作ることによって、より水適合性に維持されうる。
【０１６５】
実施例７：アルカリβ−脱離／フルオラスマイケル付加のための酵母およびジャーカット全細胞タンパク質画分の調製：
固形イースト（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をベーカリー用品店から購入し、その後に液体Ｎ２下に粉砕し、−８０℃下に保存した。細胞タンパク質をトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌｅ）（商標）試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州（ＣＡ））を使用して単離し、その後に酸化溶液（例えば、最初に室温（ＲＴ）下に２時間放置し、次いで４℃下に保存された８８％ギ酸４．５ｍＬおよび３０％Ｈ２Ｏ２溶液０．５ｍＬ）５０μＬ中４℃下に一夜のインキュベーションによって酸化した。最後に、酸化タンパク質画分を１００ｍＭ重炭酸アンモニウムへ透析し、上述したようにＴｐで消化した。
【０１６６】
ジャーカットＴ細胞（クローンＥ６−１、ＡＴＣＣＴＩＢ−１５２）を当該技術に記載されているように（例えば、ブリル（Ｂｒｉｌｌ）ら（２００４年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６：２７６３−２７７２頁を参照）成長させて回収した。細胞タンパク質を上述したように単離し、その後に一夜、３７℃下にシークエンシンググレード修飾トリプシン（Ｔｐ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））で、１００ｍＭ炭酸アンモニウム、４Ｍ尿素、ｐＨ８．０の溶液中５０：１の比の基質／酵素（ｗ／ｗ）を使用して消化した。タンパク質分解消化を予備的にＣ１８逆相カートリッジ（ハイシル（Ｈａｉｓｉｌ）、ヒギンズ・アナリティカル（Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォリニア州（ＣＡ））で脱塩し、スピードバック（ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ）で乾燥させた。
【０１６７】
最初に室温下に２時間放置した３０％Ｈ２Ｏ２  １００μＬと８８％ギ酸１ｍＬを混合することによって過ギ酸酸化溶液を調製した。次いで、この溶液３００μＬを乾燥トリプシンペプチド（７．５ｍｇ）に添加し、酸化を室温下に１時間進行させた後、真空で蒸発させた。最後に、トリプシンペプチドを０．１％酢酸（ｖ／ｖ）５００μＬ中で再構成し、予備的にＣ１８逆相カートリッジで画分し、５、１５、２５、および４０％アセトニトリル−０．１％酢酸（ｖ／ｖ）画分ヘ連続的に入れた。次いで、フルオラス標識試薬を使用するアルカリβ−脱離およびマイケル付加を本明細書に記載されているように実行されうる。
【０１６８】
実施例８：ヒト血漿からのオキソステロイドの誘導体化および富化
テストステロン、アンドロステロン、およびプロゲステロンなど中性ステロイド化合物は、骨格筋成長の刺激や生殖および関連組織の維持など多くの代謝的役割を果たす。本発明は、遊離（すなわち、非コンジュゲート）ケトン部分を有するオキソステロイドのフルオラス標識の方法および組成物を提供し、それによって生物由来サンプルにおける複数の代謝産物からの化合物の部分的な精製の機序を提供する。分析されるメタボロミクスサンプルの複雑性の削減に加えて、ステロイドケトン部分の、例えば、アミノオキシ型フルオラス標識試薬との反応により、しばしば開始代謝産物よりも大きなプラスのエレクトロスプレーイオン化効率を有する標識分子が得られ、潜在的に質量分析による分析中の標識種の検出特性を増強（かつこれらの感度を改善）する。
【０１６９】
オキソステロイド化合物、および他の比較的疎水性の代謝産物含有ケトンまたはアルデヒド基は、以下のようにフルオラス標識されうる。生体サンプル（ヒト血漿の場合）を同等量のアセトニトリルに添加し、約３０秒間ボルテックス混合し、１０分間、４℃下に１５００ｇで遠心分離した。上清を除去し、水で（例えば、１０倍に）希釈し、オアシス（Ｏａｓｉｓ）（商標）ＨＬＢ固相抽出樹脂（ウォーターズ・コーポレーション（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｍｉｌｆｏｒｄ，マサチューセッツ州（ＭＡ））の前処置床上に装填した。装填樹脂を３ベッド同等物の各々水とメタノール：水（７０：３０）で洗浄し、保持された成分を３ベッドボリュームの酢酸エチルで溶出した。溶媒を蒸発させ、残留物をメタノール約５０μＬ中に溶解した。
【０１７０】
トリクロロ酢酸０．５ｍｇを含有するメタノール５０μＬ中に溶解した少量（例えば、５μｇ）のアミノオキシ型フルオラス標識試薬（化合物１０または１４、表２を参照）を溶出代謝産物に添加し、混合物を５０℃下に２時間維持する。反応混合物を冷却し、同等量の水で希釈する。図３１Ａは、中性ステロイドテストステロンおよびフルオラス標識試薬１４で証明された例となるフルオラス標識反応を示す。
【０１７１】
場合により、過剰なフルオラス試薬が、４−ベンジルオキシベンズアルデヒドポリスチレン樹脂（ノババイオケム（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）で反応混合物を処理することによって除去される。フルオラス標識サンプル成分は、フルオラス固相抽出カートリッジなどのフルオラス分離組成物を使用して非標識種から分離される。カートリッジの装填後、標識代謝産物はメタノール：水（８０：２０）で完全に洗い流され、フルオラス誘導体化種は１００％メタノール中で溶出される。あるいは、希釈反応混合物はフルオラスＨＰＬＣカラム上へ直接装填され、メタノール：水（８０：２０）で完全に洗い流され、直接ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ分析（例えば、８０〜１００％メタノールの浅い溶出勾配を使用）にかけることができる。
【０１７２】
ケトンまたはアルデヒド基を含有する他の比較的疎水性の代謝産物（例えば、インドールアルカロイド）も同じように標識され、かつ分析される。例えば、リュー（Ｌｉｕ）ら「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｘｉｍｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｋｅｔｏｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｅｓ（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ａｎａｌｙｓｉ）」（２０００年）Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ  １４：３９０頁  、およびルミュー（Ｌｅｍｉｅｕｘ）ら（１９９８年）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６：５０６頁を参照。
【０１７３】
実施例９：ラット脳からの１，２ジオール含有ステロイドの誘導体化および富化
同様の反応スキームが、隣接したヒドロキシル部分を標的する多くの周知の化学のいずれかを使用する、隣接ジオールを有する代謝産物種のフルオラス標識のためにデザインされうる。例えば、ヒガシ（Ｈｉｇａｓｈｉ）ら（２００２年、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉ．１８：１３０１−１３０７頁）によって記載されているものなどのボロン酸含有試薬がフルオラス部分で置換またはさらに修飾され、本発明において使用するためのフルオラス標識試薬を得ることができる。１つの例となる実施形態において、フルオラスボロン酸含有試薬１８が、４−ヒドロキシエストラジオールを誘導体化するために使用される（図３１Ｂ参照）。
【０１７４】
この処置を使用し、メタボロミクスサンプルにおけるさまざまなクラスの１−２−ジオール含有種を標識することができるが、この官能基（すなわち、糖）を有する最も豊富な代謝産物は、場合により、例えば、オアシス（Ｏａｓｉｓ）（商標）カートリッジを使用する固相抽出ステップによって、標識反応を実行する前にサンプルから除去されうる。
【０１７５】
全ラット脳などの組織サンプルをメタノール：酢酸（１００：１）中で超音波ホモゲナイザーを使用して均質化し、ホモジネートの濃度を１００ｍｇ組織／ｍＬ溶液に調節する。約０．５ｍＬのホモジネートを１５００ｇで１０分間、４℃下に遠心分離し、その後に結果として生じる上清を除去し、水２ｍＬで希釈する。この溶液をオアシス（Ｏａｓｉｓ）ＨＬＢ固相抽出樹脂の前処置床上へ装填する。装填樹脂を３ベッド同等物の各々水とメタノール：水（７０：３０）で洗浄し、保持された成分を３ベッドボリュームの酢酸エチルで溶出する。
【０１７６】
溶媒を蒸発させ、フルオラスボロン酸１８  ０．５ｍｇを含有するピリジン５０μＬ中に残留物を溶解する。１時間、５０℃下での反応後、溶媒を蒸発させ、残留物をメタノール：水の５０：５０の溶液中に溶解する。場合により、過剰なフルオラス試薬は最初に混合物を１−グリセロールポリスチレン樹脂（製品番号０１−６４−０４０８ノババイオケム（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ））で、チオールを有する樹脂で過剰なアクリレート試薬を除去するための当該技術で周知のものと同じようにインキュベートすることにより除去される。
【０１７７】
この混合物をフルオラス固相抽出カートリッジへ装填し、メタノール：水（８０：２０）で完全に洗い流し、フルオラス誘導体化種を１００％メタノール中で溶出する。あるいは、希釈反応混合物はフルオラスＨＰＬＣカラム上へ直接装填され、メタノール：水（８０：２０）で完全に洗い流され、８０〜１００％メタノールの浅い勾配を実行する直接ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ分析にかけられる。
【０１７８】
あるいは、目的とする代謝産物の過ヨウ素酸化を使用して、２つのアルデヒド基を生じさせ、これは炭水化物含有サンプルメンバーについて以前に本明細書に記載されたフルオラスアミノオキシ部分でライゲートされうる。場合により、二重標識代謝産物種は分析前（または最中）に単一標識種から分離されうる。
【０１７９】
実施例１０：フルオラス修飾クックソン型試薬によるシス−ジエン含有分子の選択的反応および単離
同じように、ビタミンＤなどシス−ジエン部分を含有する分子を、フルオラス標識に置換または別の方法で結合されているクックソン（Ｃｏｏｋｓｏｎ）型試薬（例えば、マレイミド）を使用して標識することができる。例となる実施形態として、フルオラスクックソン型試薬１３が、シス−ジエン含有分子ビタミンＤ２を誘導体化するために使用される（図３１Ｃを参照）。アミノオキシ型フルオラス標識試薬による中性ステロイド種の標識についても確認されるように、フルオラス標識の添加はエレクトロスプレーイオン化効率を変化させる追加の利点を有する（例えば、標識試薬が荷電能を有さないと仮定して、非標識代謝産物よりも大きなプラスのＥＳイオン化効率を提供する）。例えば、ヤン（Ｙｅｕｎｇ）ら「Ｃｏｏｋｓｏｎ−ｔｙｐｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ＭＳ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」（１９９５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４９：１０９９頁、およびウェルナー（Ｗｅｒｎｅｒ）ら「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｕｓ  ｄｉｅｎｏｐｈｉｌｅｓ  ａｓ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ」（２００３年）Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５：３２９３頁を参照。
【０１８０】
実施例１１：アジド型フルオラス標識試薬による末端アルキン含有分子の選択的反応および単離
「クリック化学」ライゲーションと呼ばれることもある、ユイスゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）１，３−双極子環化付加型ライゲーション反応は、末端アルキン部分を有する（または組込むように修飾されている）生物由来サンプル成分を標的するためにも使用されうる。これらの反応において、アジド型フルオラス標識試薬は、通常、トリアゾールを形成するエクセロゲン（ｅｘｅｒｏｇｅｎｉｃ）過程であるサンプル中のアルキン含有標的種と反応する（例えば、ロストフセフ（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ）ら（２００２年）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４１：２５９６−２５９９頁、および本明細書に引用された文献を参照）。追加の利点が、水性および有機反応条件下でのアジド試薬の安定性であり、こうして非水性環境で生物由来サンプルを生成または調製する必要を削減する。
【０１８１】
図３１Ｄは、ステロイドノルゲストレルの修飾のための反応スキームを示す。ロストフセフ（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ）ら、上記によって言及されているように、生成物の１，４−対１，５−位置選択性は部分的に銅触媒の選択により制御されうる。生物由来サンプルにおけるアルキン含有成分の標的における使用の例となるフルオラスアジドとしては、アジド組成物１５ａおよび１５ｂが挙げられる。一部の以前に記載された標識反応でのように、サンプルメンバーへのフルオラス標識の添加は、開始代謝産物よりも大きなプラスのエレクトロスプレーイオン化効率を有する修飾サンプル成分を産生する追加の利点を有する。
【０１８２】
実施例１２：一級アミン含有分子の選択的反応および単離
二級、三級、および四級アミンとは対照的に一級アミンを含有する生物由来サンプルは、チオール型フルオラス標識試薬およびｏ−フタルアルデヒドを使用してフルオラス標識に選択的に標的されうる（図３２Ａ）。チオールの存在下のｏ−フタルアルデヒドとの一級アミンの反応は、例えば、蛍光誘導体を得るポリペプチド溶解物の誘導体化のために使用される公知の反応である（例えば、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）とギリガン（Ｇｉｌｌｉｇａｎ）（１９８３年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２６６：４７１−４８２頁を参照）。
【０１８３】
実施例１３：遊離チオール含有サンプルメンバーの選択的反応および単離
遊離チオール部分を含有する生物由来サンプルメンバーは、例えば、本明細書に記載された多くのマレイミド型フルオラス標識試薬のいずれかを使用してフルオラス標識されうる。図３２Ｂは、代謝産物ホモシステインがフルオラス標識試薬２Ｂと反応される例となる反応を示す。
【０１８４】
実施例１４：分別標識および定量
例となるペアの同位体試薬としては、トリデカフルオロオクチルアクリレート（化合物４ａ）およびその３，４，５，６，７，８−１３Ｃ６トリデカフルオロオクチル類似体が挙げられるが、これらに限定されない。比較されるタンパク質サンプル（１ｍｇ）をＴＣＥＰで低減し、トリプシンで消化する。消化物をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２００μＬ、および１００ｍＭ炭酸ナトリウム２．５μＬ、ｐＨ８．０中で脱塩、乾燥、および再構成する。トリデカフルオロオクチルアクリレート４ａまたは１３Ｃ６類似体を各サンプルに個別に添加し、反応を一夜、室温で進行させる。サンプルを混合し、未反応アクリレートを、Ｎ−２−メルカプトエチルアミノメチルポリスチレンビーズ（ノバ・バイオケム（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）４ｍｇで室温下に２時間のインキュベーションによって混合物から除去する。フルオラス固相抽出（ＦＳＰＥ）を実施例１に記載されているように実行し、フルオラス標識（およびシステイン含有）ペプチドを単離するが、その各々はシステイン部分当たり６ドルトンで分離された同位体ペアとして存在する。２つのサンプル間の相対濃度はペアのシグナル強度で示される。
【０１８５】
１３Ｃ置換試薬に加えて、ジュウテリウム、フルオラス標識試薬の１８Ｏおよび／または１５Ｎ類似体も本発明の方法において利用されうる（例えば、化合物６ｂを参照）。追加の利点としては、区別をつけて標識されたサンプル成分は通常、同様のイオン化特性を有し、逆相保持時間における最小の変化を示す（２Ｈ標識の場合を除く）。
【０１８６】
実施例１５：３Ｄ構造研究のための架橋試薬
本発明は、同じタンパク質内、またはタンパク質複合体の一部として存在する異なるタンパク質間の２つもしくはそれ以上の化学部分の相対的な３次元配向（例えば、３Ｄマッピング）を測定するための方法も提供する。この態様において、異種または同種多官能性フルオラス標識試薬は、タンパク質における２つの特定の化学部分（アミノ酸官能価）と選択的に反応するために必要な適切な化学反応性官能基を含む。フルオラス標識試薬による架橋に標的される２つの特定の化学官能価は、フルオラス標識試薬における化学反応性官能基によって架けられたものと同等もしくはそれ以下の距離内に存在しなければならない。次いで、異種または同種多官能性フルオラス標識試薬のフルオラス部分は、これら架橋種を選択的に単離するために使用される。
【０１８７】
かかるフルオラス架橋試薬の例としては、同種官能性試薬ビス（スルホスクシンイミジル）−２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ，１０Ｈ，１０Ｈ，１１Ｈ，１１Ｈ−ペルフルオロドデカンジオネート１１が挙げられるが、これに限定されない。このフルオラス標識試薬は選択的に一級アミン（すなわち、リシン残基）と反応し、かつ約１２個の炭素鎖の長さよりも短い距離で（例えば、リンカーおよびフルオラス部分の長さ）位置しているかかる２つの官能価間に架橋を有効に形成しうる。例となる実施形態において、Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．０中で溶解された精製タンパク質複合体は、ＤＭＦ中で溶解された過剰なフルオラス架橋薬に添加され、反応は室温下に約３０分間進行される。次いで、反応混合物は消化され、内容物がＦＳＰＥにかけられる。フルオラスタグを含有するペプチドが非標識種から分離され、架橋部位を測定する質量分析にかけられる。
【０１８８】
関連態様において、本発明の二官能性フルオラス標識試薬は、場合により、（同一または異なる）サンプルメンバー官能基の架橋以外の目的に使用されうる。例えば、フルオラス鎖に直接隣接して位置したカルボン酸部分、およびフッ素原子の誘導効果から保護された第２の化学反応性官能基を有するフルオラス標識試薬は、例えば、タンデムＭＳによる分析のための荷電部分を提供することにおける潜在的な用途を有する。カルボン酸は完全に脱プロトン化され、したがって負電荷をフルオラス標識サンプル成分に提供する。カルボキシレート含有フルオラス標識試薬の例となる実施形態が化合物５ｅとして提供されている。
【０１８９】
別の例として、ペータース（Ｐｅｔｅｒｓ）らの国際ＰＣＴ公報国際公開第０３／０５６２９９号パンフレットに記載されたリシン特異的標識試薬に結合されたフルオラス部分は、きわめて塩基性であるが、永久には荷電されないアミン標的フルオラス標識サンプル成分を産生し、これは追加の利点として、イオン化効率の増大も示しうる。
【０１９０】
実施例１６：分析の多重化
本明細書で開示された化合物および誘導体を使用するさらに別の実施形態において、本発明は多重サンプルの同時分析のための方法を提供する。この態様において、同じ化学反応性官能基を有するが、異なるフルオラス部分を有する一連の試薬が個別に一連のサンプルを標識するために使用され、各サンプルが異なるフルオラスタグと反応されるようになっている。結果として生じるサンプルはプールされ、かつフルオラス標識種はＦＳＰＥを使用して非表紙機種から分離される。次いで、保持種はバッチ溶出され、同時に（すなわち、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによって）分析され、分析物間の質量の差を有し、これはタグの性質とともにそれから生じるサンプルの同一性を示すと同時に、標識種の相対強度がそれぞれの濃度と比例することを示す。あるいは、プールされ、保持されたサンプルはフルオラスクロマトグラフィーにかけられ、標識サンプルがそのフッ素含量と比例した順序でカラムから溶出するようになっている。また、異なるタグがもっぱら異なる反応条件で使用され、所定のペプチドが、アミノ酸官能価および／またはＰＴＭのどの組合せが存在したかを示す異なる長さのいくつかのタグを有しうるようになっている。
【０１９１】
かかる多重分析の例としては、所定の生物由来サンプルメンバーのセリン／トレオニンリン酸化の発見および相対評価が挙げられるが、これらに限定されない。標的基質の３種類のサンプル（例えば、異なる条件下で調製）がβ−脱離反応にかけられ、次いで、各々が個別に１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカン−ｌ−チオール（ｌａ）、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロオクタン−１−チオール（１ｂ）、または１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロヘキサン−１−チオール（１ｆ）で標識される。
【０１９２】
サンプルは混合され、ＦＳＰＥにかけられ、すべてのフルオラス標識種が保持されるようになっている。保持種がバッチ溶出され、ＭＡＬＤＩ分析にかけられた場合は、１００ドルトンで質量が異なる一連の３つのピークが各標識ペプチドで出現し、ペプチド自体の質量は容易に計算されうる。フルオラスクロマトグラフィーにかけられた場合は、Ｃ４Ｆ９タグで標識された個別の分析物は、Ｃ８Ｆ１７で標識されたものより前にカラムから溶出するＣ６Ｆ１３で標識されたものより前にカラムから溶出し、個別の分析ウィンドウを提供する。
【０１９３】
実施例１７：リン酸化種のフルオラス標識の代替方法
図５は、チョウ（Ｚｈｏｕ）ら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３７５−３７８頁によって記載された方法と同様に、リン酸化ペプチドのフルオラス標識の例となる多重ステップ反応スキームを示す。この反応は、酸性条件下のカルボン酸メチル化、ホスホラミデートを示すシスタミンのＥＤＣ介在結合、フルオラスマイケル受容体によるアルキル化、およびＦＳＰＥ後のメチル化ホスホペプチドの酸放出を含み、ホスホセリン、ホスホトレオニン、およびホスホチロシン含有種の単離および／または富化を提供する。
【０１９４】
ペプチドマクロトラップカートリッジ（マイクローム・バイオリソーシス（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）、Ａｕｂｕｒｎ、カリフォルニア州（ＣＡ））を使用してトリプシンペプチドを脱塩し、ブリル（Ｂｒｉｌｌ）ら（２００４年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６：２７６３−２７７２頁に従ってメチル化した。乾燥したメチル化ペプチドを１Ｍイミダゾール５０μＬ中で再構成した。この溶液をＥＤＣ  ４ｍｇに添加し（最終濃度約０．５Ｍ）、混合物を室温下に２時間インキュベートした。混合物をＣ１８カラム（１２ｃｍ  ＰＯＲＯＳ  １０Ｒ２でパックした溶融シリカ３６０／２００μｍ  Ｏ．Ｄ／Ｌ．Ｄ．）へ装填し、水２０μＬで洗浄した。次いで、カラムを以下で洗浄した。１Ｍシスタミン、５６℃下に２時間、２μＬ／分でｐＨ８．０、水２０μＬ、３μＬ／分流量で５０℃下に１時間１０ｍＭ  ＤＴＴおよび水２０μＬ。ペプチドを７０％アセトニトリルでカラムから溶出し、蒸発乾固した。
【０１９５】
乾燥ペプチドをＤＭＦ中２０ｍＭトリデカフルオロオクチルアクリレート２０μＬ中で再構成し、５０ｍＭ炭酸ナトリウムｐＨ８  ０．７５μｌを添加し、混合物を２時間、室温下にインキュベートした。過剰な試薬をＮ−２−メルカプトエチルアミノメチルポリスチレンビーズ（ノバ・バイオケム（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）０．５ｍｇを添加し、室温下に１時間のインキュベーションにより除去した。結果として生じるペプチド混合物を６０％ＭｅＯＨ含有１０ｍＭギ酸アンモニウムで５倍希釈し、上記のようにＦＳＰＥによって富化した。保持されたフルオラス標識画分を乾燥させ、９５％ＴＦＡ中で３０分間、再構成し、ホスホラミデート結合を開裂した。ＴＦＡを真空遠心分離によって除去し、そこでフルオラスを含まないメチル化ホスホペプチドをＭＳ分析のために再構成した。
【０１９６】
実施例１８：無傷タンパク質のフルオラス標識
以下の実施例は、無傷タンパク質がフルオラス標識され、１Ｄゲルおよびゲル中消化など代表的なタンパク質操作において容易に処理されうることを示す。
【０１９７】
ウシ血清アルブミン（約４０μＭ）を６Ｍグアニジン塩素塩、２０ｍＭ  トリス、ｐＨ８．０バッファー中１０ｍＭ  ＴＣＥＰで１０分間、室温下で低減し、同等量のフルオラスヨードアセトアミドのＴＨＦ溶液の添加によって、２０ｍＭ  Ｎ−（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロオクチル）ヨードアセトアミドと１時間暗所で反応させた。バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ｐ６ビーズ（マイクロ・バイオスピンＰ６、バイオ・ラード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州（ＣＡ））でパックした使い捨てゲルろ過スピンカラムを使用して過剰な試薬を除去した。脱塩フルオラス標識タンパク質を遠心分離で適切なろ過画分の収集によって回収した。
【０１９８】
脱塩フルオラス標識タンパク質画分をスピードバックで一時的に乾燥させ、テトラヒドロフランを除去し、同等量のゲルローディングバッファー（１００ｍＭ  トリス、ｐＨ６．８、５０％グリセロール、０．１％ブロモフェノールブルー、１％ＳＤＳ）と混合した。数マイクログラムの誘導体化タンパク質を１２ウェル、１ｍｍ×８ｃｍ×８ｃｍ  １０−２０％トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州（ＣＡ））の各ウェルへ装填後、１５０Ｖ定電圧を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行した。ゲル電気泳動後、ゲルスラブをコロイドクーマシーブルー（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州（ＣＡ））で４時間染色した後、水中で一夜、脱色した。
【０１９９】
ゲル中トリプシン消化を以下のように実行した。切除タンパク質ゲルバンドを新しいかみそりの刃でさいの目（２−３ｍｍ）に切断し、０．５ｍＬ微小遠心管に添加した。ゲル立方体を数回の洗浄および脱水サイクルにかけた（１００ｍＭ炭酸アンモニウム５０μＬで１０分間インキュベーションおよび液体の除去、アセトニトリル２５μＬで１０分間のインキュベーションおよび液体の除去。脱水ゲル立方体を５分間真空乾燥させ、１０ｎｇ／μｌトリプシン（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））を含有する５０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液２０μＬ中で再水和し、３７℃下に一夜インキュベートした。トリプシンペプチドを８０％アセトニトリル／０．２％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）で反復抽出（３回）によって回収した。ペプチド抽出物を混合し、真空で乾燥させた。サンプルをフルオラス固相抽出（他の箇所に記載）の調製として１０ｍＭギ酸アンモニウム含有６０％メタノール中に再構成した。
【０２００】
図２３Ａは、上述したように、ＴＣＥＰによる削減およびＮ−［（３−ペルフルオロオクチル）−プロピル］ヨードアセトアミドとの反応後のＢＳＡのトリプシン消化物に対して生成されたＭＡＬＤＩスペクトルを示す。次いで、サンプルをＦＳＰＥにかけ、保持され、その後に溶出されたペプチドをＭＡＬＤＩ  ＭＳにかけた（図２３Ｂ）。「＊」記号で示されたピークはフルオラス標識システイン含有ペプチドである。図２４は、フルオラス標識ペプチドＧＡＣ＊ＬＬＰＫ（配列番号３５）の２＋荷電状態のタンデムＭＳデータを示す。ピーク標識Ｃ＊Ｉは修飾システイン残基のイモニウムイオンである。
【０２０１】
実施例１９：開裂試薬 
本発明のフルオラス標識試薬は、フルオラス標識は開裂または別の方法で結合生物由来サンプル成分から放出され、例えば、富化または単離過程中に生物由来成分の回収を促進しうる実施形態も含む。  
【０２０２】
本発明の開裂可能なフルオラス標識試薬の例となる実施形態は化合物２５、６−［３−（３，３，４，４，５，５，６，６，６−ノナフルオロ−ヘキシルジスルファニル）−プロピオニルアミノ］−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルである。開裂可能な試薬２５は、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル  ６［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート、５９μｍｏｌ、パース（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州（ＩＬ）から購入）５０ｍｇを９０％ＴＨＦ／１０％５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２中１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈペルフルオロヘキサンチオール３２．９ｍｇに添加することによって合成された。１時間後、溶媒を減圧下に除去した。
【０２０３】
ペプチド修飾を以下のように実行した。１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ７．７（１０μＬ）中１ｎｍｏｌブラジキニンをＤＭＦ  １１０μＬ中フルオラス標識試薬２５  １１０ｎｍｏｌに添加した。２時間後、未反応標識をアミノプロピル官能化ポリスチレンビーズ（ノババイオケム（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ））で２時間のインキュベーションによって除去した。結果として生じる単離修飾ペプチドは、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによって１５３９．６のｍ／ｚを有することがわかった。次いで、修飾ペプチドを１００ｍＭ  ＴＣＥＰでインキュベートし、ジスルフィド結合を開裂した。結果として生じるペプチドは、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによって１２６１．６のｍ／ｚを有し、フルオラスタグの損失を示すことがわかった。
【０２０４】
一般の材料と方法
ペプチド捕捉および脱塩
μＣ１８ジップチップス（Ｚｉｐｔｉｐｓ）（商標）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州（ＭＡ））を使用し、標識前のペプチドを捕捉し、濃縮し、脱塩した。８０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｖ／ｖ）５×１０μＬアリコートを吸引することによって活性化を実行した。チップを同様に０．１％ＴＦＡを使用することによって平衡化した。ペプチドサンプルを０．１〜０．５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）中で調製し、反復吸引によってロードした。フルオラス誘導体化ペプチドのローディングは、好ましくは、ローディング溶液中で最小２０〜２５％メタノールの添加により実行され、沈殿を低減した。次いで、チップを０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）のアリコートで洗浄し、８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）の４〜５μＬアリコート中で反復吸引によってペプチド溶出した。
【０２０５】
「フルオラス」ＨＰＬＣ
フルオロフラッシュ（Ｆｌｕｏｒｏｆｌａｓｈ）、トリデカフルオロシリカ（ＴＤＦ）＆ペンタフルオロフェニルシリカ（ＰＦＰ）（シリサイクル（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ）、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ケベック州（ＱＣ）、カナダ）１８０Å孔径、３μｍ粒子をフリット溶融シリカ（３６０／２００または３６０／１００μｍ  Ｏ．Ｄ．／Ｉ．Ｄ．）へ圧力パックし、約１２ｃｍの長さにした。勾配溶出をギ酸アンモニウム修飾移動相を使用して実行し、ＥＳＩによってＱｑＴＯＦ質量分析計に接続した。
【０２０６】
質量分析およびデータ分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを遅延抽出／リフレクターモードでＢｒｕｋｅｒ  Ｂｉｆｌｅｘ  ＩＩＩを使用して実行した。最初にサンプルを２，５−ジヒドロキシ安息香酸基質の保存溶液（ＤＨＢ、５０％アセトニトリル／０．２％トリフルオロ酢酸ｖ／ｖ中１０ｍｇ／ｍＬ）と混合することによって乾燥液滴法を使用してＭＡＬＤＩ標的上にペプチドを沈殿させた。レーザー減衰を４０〜４５で設定し、平均数百ショットとした。加速電圧を１９ｋＶ（ＩＳ／１）＆１５．２ｋＶ（ＩＳ／２）に設定し、レフレクトロン電圧を１８．７ｋＶで設定した。
【０２０７】
キャピラリーＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳおよびタンデムＭＳを、サーベイスキャンモードで操作するハイブリッド四極子飛行時間（ＱｑＴＯＦ）質量分析計（マイクロマス（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）Ｑ−ＴＯＦ２、ＷＡＴＥＲＳ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州（ＭＡ））に接続したモニターＣ１８パックキャピラリーカラム（３μｍ粒子、１００Å、７５μｍまたは３００μｍ  Ｌ．Ｄ．、長さ８〜１５ｃｍ、カラム・エンジニアリング社（Ｃｏｌｕｍｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．）、Ｏｎｔａｒｉｏ、カリフォルニア州（ＣＡ）から購入）で実行した。１５ｃｍカラムは通常、０．５Ｍ酢酸（Ａ）および０．５Ｍ酢酸を含むアセトニトリル（Ｂ）を使用して生成された勾配を使用する３μＬ／分で実行した。ＥＳＩは衝突ガス（アルゴン）における４ｋＶのスプレー電圧および３０Ｖのコーン電圧を使用して実行した。４５０〜１８００の質量（ｍ／ｚ）範囲を強度閾値ＭＳ／ＭＳトリガリングについて分析した（ＬＭ  Ｒｅｓ、ＨＭ  Ｒｅｓ＝５約５Ｄａ単離ウィンドウに対応）。衝突解離エネルギーを所定の親質量および荷電状態に従って自動的に調節した。
【０２０８】
アルカリβ−脱離／フルオラスマイケル付加によって調製され、キャピラリーＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ｃＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析されたサンプルからのデータ分析をシステインのシステイン酸への可能な転換（残基質量＝１５０．９９３９Ｄａの正確な質量、１５１．１４１１Ｄａの平均質量）、およびメチオニンのメチオニンスルホンへの可能な転換（残基質量＝１６３．０３０３、１６３．１９４９）のほか、以前のｐＳ（残基質量＝４６５．００６８、４６５．２３５２）およびｐＴ残基（残基質量＝４７９．０２２４、４７９．２６２１）への可能なＣ６Ｆ１３スルホキシド側鎖修飾を含めることによって検索した。後者の修飾は、その独自の残基質量、およびタンデムＭＳパターンにおける特徴的な中性損失断片生成物、デヒドロアラニン（ｐＳ）またはβ−メチルデヒドロアラニン（ｐＴ）の存在に基づき確認された。β−連結フルオラススルホンへの酸化を可能にしたフルオラス標識ホスホペプチド誘導体は、はるかに少ない側鎖タンデムＭＳ断片を示し、無傷残基質量の認識によって特徴づけられ、中性損失生成物断片によっては特徴づけられなかった。
【０２０９】
システイニルペプチドのフルオラス誘導体のｃＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータ分析は、ＴＤＦＯＡ（残基質量＝５２１．０３３０、５２１．２９９４）またはフルオロヨードアセトアミド（残基質量＝６２０．０４２６、６２０．３３０３）のいずれかによるシステイン残基のそれぞれの反応によって形成された独自の残留質量の認識によるその確認を可能にした。
【０２１０】
ヨードアセトアミド誘導体化ペプチドのタンデムＭＳスペクトルは、誘導体化システイン残基のイモニウムイオンに対応する５９３のｍ／ｚで特徴的なシグナルイオンを示す。このシグナルは、一部の中性損失種（すなわち、ｐＳ／ｐＴ含有ペプチド）に似たスペクトルを示さず、強度が十分に大きく、かつ質量が十分に高く、その存在は標準条件下で操作するイオントラップでも「診断」シグナルとして役立ちうる。アクリレート官能化種は同様のイモニウムイオンシグナルを示す。
【０２１１】
ε−アミノ「グアニジン化」／α−アミノフルオロ誘導体化によって調製されるサンプル分析には、使用される試薬に左右されるリシンの可変修飾、Ｎ末端（Δ質量＝２７５．０１１，  ２７５．０９３７）のフルオロアシル化、およびポリユビキチンの場合、グリシン−グリシンイソペプチド修飾リシン側鎖（残基質量＝５１６．１４１９、５１６．３６３９）のフルオロアミド化の検索が含まれた。
【０２１２】
上述の発明は、明確さおよび理解を目的に少し詳しく説明されているが、本開示を読むことから、形態および細部のさまざまな変更が本発明の真の範囲を逸脱することなく行われうることが当業者には明らかであろう。例えば、上述された方法および装置のすべてをさまざまな組合せで使用することができる。本出願において引用されたすべての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文書は、それぞれの刊行物、特許、特許出願、および／または他の文書が、すべての目的のために参照することにより援用されることが個別に示されるように、ある程度、すべての目的のためにその全体が参照することにより援用される。
【０２１３】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【図面の簡単な説明】
【０２１４】
【図１】複合体ペプチド混合物からのフルオラス標識ペプチドの単離のフルオラス固相抽出（ＦＳＰＥ）方法を示す概略図である。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは塩基性条件下のβ−脱離の後、選択的反応およびその後のホスホセリン（ｐＳ）／ホスホトレオニン（ｐＴ）修飾またはＯ−ＧｌｃＮａｃ修飾（Ｓ（ＯＧｌｃＮＡｃ）およびＴ（ＯＧｌｃＮＡｃ）ペプチドの単離のためのフルオラスチオールのマイケル付加を含む例となる２つのステップの反応スキームを示す図である。
【図３Ａ】リシンのε−アミン官能基がホモアルギニンまたはイミダゾイル部分への転換によって遮断されうる２つの例となる反応を示す図である。
【図３Ｂ】リシンのホモアルギニン（Ｏ−メチルイソウレアを使用）のε−アミノ基の転換後、ペプチドＮ末端アミノ基のフルオラス標識を示す例となる反応スキームを示す図である。
【図３Ｃ】同様のフルオラス画分スキームによって分岐鎖ペプチドから直鎖を分離するための処置を示す概略図である（ここでＲｆは、標識試薬、例えば、Ｃ４Ｆ９のフルオラス部分の一部である）。
【図４】図４Ａは選択的反応およびその後のシステイン含有ペプチドの単離のためのフルオラスマイケル受容体へのチオール単位のマイケル付加を含む例となる反応スキームを示す図である。図４Ｂはヨードアセトアミド型フルオラス標識試薬とのチオールの反応を示す例となる反応スキームを示す図である。
【図５】フルオラス標識が標識種の単離／富化後に除去されうるホスホチロシン種を含む、ホスホペプチドの単離および／または富化の別の反応スキームを示す図である。
【図６】図６Ａ〜図６Ｄはβ−脱離の前（図６Ａ）および後のα−カゼイントリプシン消化物、およびその後の１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−ペルフルオロデカン−１−チオール（図６Ｂ）との反応から生成されたサンプルのほか、結果として生じるＦＳＰＥ画分ペプチド（図６Ｃ＝非保持の部分、図６Ｄ＝保持および溶出画分、ｕ１＝修飾残基）のＭＡＬＤＩスペクトルを示す図である。
【図７】図６に記載されているＦＳＰＥ後の保持およびその後に溶出された画分に存在するペプチドＶＰＱＬＥＩＶＰＮｕ１ＡＥＥＲ（配列番号７）の＋２荷電状態のタンデムＭＳスペクトルを示す図である（ｕ１＝１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−ペルフルオロデカン−１−チオールで修飾された残基）。
【図８】図７におけるのと同じように標識されているが、フルオラス標識試薬として１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−ペルフルオロヘキサン−１−チオールを使用する同様のペプチドＶＰＱＬＥＩＶＰＮｕ３ＡＥＥＲ（配列番号１０）の＋２荷電状態のタンデムＭＳスペクトルを示す図である（ｕ３＝修飾残基）。
【図９】１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−ペルフルオロヘキサン−１−チオールでフルオラス標識され、その後にＦＳＰＥ中に溶出されたペプチドＤＩＧｕ３Ｅｕ３ＴＥＤＱＡＭＥＤＩＫ（配列番号１１）の＋２荷電状態のタンデムＭＳスペクトルを示す図である（ｕ３＝修飾残基）。
【図１０】１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−ペルフルオロヘキサン−１−チオールで標識され、その後にＦＳＰＥ中に溶出されたペプチドＴＶＤＭＥｕ３ＴＥＶＦＴＫ（配列番号１２）の＋２荷電状態のタンデムＭＳスペクトルを示す図である（ｕ３＝修飾残基）。
【図１１】図１１Ａは最初にβ−脱離にかけられ、その後に１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−ペルフルオロデカン−１−チオールとの反応にかけられ、次いで非修飾ペプチドのトリプシン消化へスパイクされた２つの合成ホスホセリン（ｐＳ）含有ペプチド（ｑＬｕｌＳＧＶＳＥＩＲ、配列番号１３、およびＱＬｕｌＳＧＶＳＥＩＲ、配列番号１４）の混合物のＭＡＬＤＩスペクトルを示す図である。図１１ＢはＦＳＰＥでの非保持部分のデータを示す図である。図１１ＣはＦＳＰＥ後に保持され、その後に溶出された画分のデータを示し、スパイクされたペプチドの回収を示す図である。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄはβ−脱離の前（図１２Ａ）および後のオボアルブミンのトリプシン消化物、およびその後の１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−ペルフルオロデカン−１−チオールとの反応（図１２Ｂ）のほか、ＦＳＰＥ（図１２Ｃ＝非保持部分、図１２Ｄ＝保持され、その後に溶出された画分）でのＭＡＬＤＩスペクトルを示す図である。
【図１３】図１２に記載されているように生成され、ＦＳＰＥ後に保持され、その後に溶出された画分に存在するペプチドＥＶＶＧｕ１ＡＥＡＧＶＤＡＡＳＶＳＥＥＦＲ（配列番号１６）の＋２荷電状態のタンデムＭＳスペクトルを示す図である（ｕ１＝修飾残基）。
【図１４】図１２に記載されているようにＦＳＰＥ後に保持され、その後に溶出された画分に存在するペプチドＬＰＧＦＧＤｕ１ＩＥＡＱｃＧＴＳＶＮＶＨＳＳＬＲ（配列番号１７）の＋３荷電状態のタンデムＭＳスペクトルを示す図である（ｕ１＝修飾残基、ｃ＝システイン酸）。
【図１５】ＦＳＰＥ後に保持され、その後に溶出された画分に存在するペプチドＦＤＫＬＰＧＦＧＤｕ１ＩＥＡＱｃＧＴＳＶＮＶＨＳＳＬＲ（配列番号１８）の＋３荷電状態のタンデムＭＳスペクトルを示す図である（ｕ１＝修飾残基、ｃ＝システイン酸）。
【図１６】２つの合成Ｏ−Ｇ１ｃＮＡｃ含有ペプチド（図１６Ａ）およびＦＳＰＥ後に保持されたペプチドおよびその後に溶出された画分（図１６Ｂ）の混合物でスパイクされた非修飾ペプチドのトリプシン消化物のＭＡＬＤＩスペクトルを示し、最初にスパイクされたトリプシン消化物をβ−脱離にかけ、その後の１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−ペルフルオロデカン−１−チオールとの反応後のスパイクされたペプチドの回収を示す図である。
【図１７】図１６Ｂに示され、ＦＳＰＥ後に保持され、その後に溶出された画分に存在するペプチド  ＰＳＶＰＶｕＧＳＡＰＧＲ（配列番号１９）の＋２荷電状態のタンデムＭＳスペクトルを示す図である（ｕ＝修飾残基）。
【図１８】β−脱離およびその後の１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−ペルフルオロデカン−１−チオールとの反応前のペプチドＰＳＶＰＶＳＧＧＳＡＰＧＲ（配列番号２５）の＋２荷電状態のタンデムＭＳスペクトルを示す図である（ＳＧ＝セリン−Ｏ−ｇｌｃＮＡｃ）。
【図１９】図１９Ａは最初にβ−脱離にかけられ、その後に１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−ペルフルオロデカン−１−チオールとの反応にかけられ、次いで過バナジウム酸塩処理ジャーカット細胞からの全可溶性タンパク質画分のトリプシン消化物へスパイクされた２つの合成ｐＳ含有ペプチドの混合物のＭＡＬＤＩスペクトルを示す図である。図１９ＢはＦＳＰＥでの非保持部分のＭＡＬＤＩスペクトルを示す。図１９ＣはＦＳＰＥ後に保持され、その後に溶出された画分を示し、スパイクされたペプチドの回収を示す（配列番号１３および１４、ｕ１＝修飾残基）。
【図２０】図２０Ａ〜２０ＣはＴＣＥＰによる還元およびトリデカフルオロオクチルアクリレートとのシステイン残基の反応後のウシ血清アルブミンのトリプシン消化物（図２０Ａ）、ＦＳＰＥでの非保持部分（図２０Ｂ）、およびＦＳＰＥ後に保持され、その後に溶出された画分（図２０Ｃ）に対して生成されたＭＡＬＤＩスペクトルを示す図である。
【図２１】図２０によるＦＳＰＥ後に保持され、その後に溶出された画分において存在するペプチドＤＤＰＨＡｃ†ＹＳＴＶＦＤＫ（配列番号３３）の＋２荷電状態のタンデムＭＳスペクトルを示す図である（ｃ†＝修飾残基）。
【図２２】図２０によるＦＳＰＥ後に保持され、その後に溶出された画分において存在するペプチドＹＩｃ†ＤＮＱＴＩＳＳＫ（配列番号３４）の＋２荷電状態のタンデムＭＳスペクトルを示す図である（ｃ†＝修飾残基）。
【図２３】図２３Ａおよび図２３ＢはＴＣＥＰによる還元およびＮ−［（３−ペルフルオロオクチル）−プロピル］ヨードアセトアミドとの反応後のウシ血清アルブミンのトリプシン消化物（図２３Ａ）、およびＦＳＰＥ後に保持され、その後に溶出された画分（図２３Ｂ、＊＝ペプチド含有修飾システイン残基）に対して生成されたＭＡＬＤＩスペクトルを示す図である。
【図２４】図２３Ｂに示されているようにＦＳＰＥ後に保持され、その後に溶出された画分において存在するペプチドＧＡＣ＊ＬＬＰＫ（配列番号３５）の２＋荷電状態のタンデムＭＳを示す図である（Ｃ＊＝修飾残基、Ｃ＊Ｉ＝修飾システイン残基のイモニウムイオン、Ｃ＊ＬおよびＣ＊ＬＬは内部断片である）。
【図２５】２５Ａ〜２５Ｄはリシン残基を選択的に遮断するＯ−メチルイソウレアとの反応の前（図２５Ａ）および後（図２５Ｂ）のポリユビキチンのトリプシン消化物のＭＡＬＤＩスペクトルを示す図である。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−２Ｈ、２Ｈ、３Ｈ、３Ｈ−ペルフルオロヘプタノエートとの反応後（図２５Ｃ、充実円＝フルオラス部分）、単一標識および二重標識種が生成される。ＦＳＰＥは、１つのフルオラスタグを有する種は保持されないが、２つのタグを有する種は保持され、その後に溶出されるような条件下で実行される（図２５Ｄ）。
【図２６】Ｃ８ＦＩ７修飾シリカで分解された、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−２Ｈ、２Ｈ、３Ｈ、３Ｈ−ペルフルオロヘプタノエート、および４つのウシ血清アルブミントリプシンペプチドによるＮ末端で標識された合成ペプチドＬＩＦＡＧＱＫＬＥＤＧＲ（配列番号３７）のＬＣ／ＭＳクロマトグラフ溶出プロフィールを示す図である。
【図２７】Ｃ６Ｆｌ３修飾シリカで分解された、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−２Ｈ、２Ｈ、３Ｈ、３Ｈ−ペルフルオロヘプタノエート、および４つのウシ血清アルブミントリプシンペプチドによるＮ末端で標識された合成ペプチドＬＩＦＡＧＱＫＬＥＤＧＲ（配列番号３７）のＬＣ／ＭＳクロマトグラフ溶出プロフィールを示す図である。
【図２８】Ｃ６Ｆ５ペンタフルオロフェニル修飾シリカで分解された、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−２Ｈ、２Ｈ、３Ｈ、３Ｈ−ペルフルオロヘプタノエート、および４つのウシ血清アルブミントリプシンペプチドによるＮ末端で標識された合成ペプチドＬＩＦＡＧＱＫＬＥＤＧＲ（配列番号３７）のＬＣ／ＭＳクロマトグラフ溶出プロフィールを示す図である。
【図２９】図２９Ａはトリデカフルオロオクチルアクリレート（ｃ†＝修飾残基）とのシステイン残基の反応後、低減ウシ血清アルブミンからのトリプシンペプチドＭＰｃ†ＴＥＤＹＬＳＬＩＬＮＲ（配列番号４５）の＋２荷電状態のタンデムＭＳスペクトルを示す図である。図２９ＢはネイティブペプチドＭＰｃＴＥＤＹＬＳＬＩＬＮＲ（ｃ＝カルバミドメチル化システインである、配列番号３８）のスペクトルを示す図である。
【図３０】図３０Ａおよび図３０Ｂはトリデカフルオロオクチルアクリレート（ｃ†＝修飾残基）とのシステイン残基の反応後の低減ウシ血清アルブミンからのペプチドＹＩｃ†ＤＮＱＴＩＳＳＫ（配列番号４６）、およびネイティブペプチドＹＩｃＤＮＱＴＩＳＳＫ（ｃ＝カルバミドメチル化システインである、配列番号４７）の＋２荷電状態のタンデムＭＳスペクトルを示す図である。
【図３１Ａ】本発明のフルオラス標識試薬を使用する追加の例示的な反応スキームを示す図である。
【図３１Ｂ】本発明のフルオラス標識試薬を使用する追加の例示的な反応スキームを示す図である。
【図３１Ｃ】本発明のフルオラス標識試薬を使用する追加の例示的な反応スキームを示す図である。
【図３１Ｄ】本発明のフルオラス標識試薬を使用する追加の例示的な反応スキームを示す図である。
【図３２】図３２Ａおよび図３２Ｂは本発明のフルオラス標識試薬を使用する追加の例示的な反応スキームを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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