(57)【要約】  本発明は、ラクリチン、およびそのフラグメント、誘導体、およびホモログ、ならびに該タンパク質をコードする核酸配列の使用に関する。本発明は、ヒト角膜上皮細胞および他の選択された上皮細胞におけるラクリチンの増殖因子としての使用に関する。本発明はまた、傷害または損傷に対する応答での眼細胞生存の促進、眼炎症に対する保護および眼創傷修復の促進におけるラクリチンの使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮細胞の生存性を増強する方法であって、該細胞と、有効量の配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはホモログおよび医薬上許容される担体を含む組成物とを接触させ、それによって、該上皮細胞の生存性を増強することを含む方法。
【請求項２】
該配列番号４のフラグメントが、配列番号１０、１６、１７、１８、および１９からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アポトーシスを阻害することによって生存を増強する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該細胞が、角膜上皮細胞、涙腺房細胞、および唾液腺導管細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該細胞が、傷害を受けた後に該組成物と接触せしめられる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該傷害が、眼関連疾患、障害、または病態である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該眼関連疾患、障害、または病態が、ドライアイ、結膜炎、シェーグレン症候群、角膜剥離、潰瘍形成、細菌感染、直接的外傷、手術、放射エネルギー、電離エネルギー、ウイルス感染、真菌感染、寄生体感染、角膜炎、全身性皮膚障害、膠原病、ライター病、およびベーチェット病からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該傷害が、細菌またはウイルス感染を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該傷害が、異物によって誘導される炎症を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
該傷害が、炎症性サイトカインによって誘導される炎症である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
該傷害が、十分な涙液産生の欠如によって誘導される炎症である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
該傷害が、眼関連外科手術である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
該細胞が、傷害を受ける前に該組成物と接触せしめられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
眼関連疾患、障害または病態を処置または予防する方法であって、治療有効量の精製ポリペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物を被験体に投与することを含み、該ペプチドが配列番号４またはそのフラグメントもしくはホモログを含む、方法。
【請求項１６】
該被験体がヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該眼関連疾患、障害または病態を処置または予防する方法が、上皮細胞の生存性を増強する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
該眼関連疾患、障害、または病態が、ドライアイ、結膜炎、シェーグレン症候群、角膜剥離、潰瘍形成、細菌感染、直接的外傷、手術、放射エネルギー、電離エネルギー、ウイルス感染、真菌感染、寄生体感染、角膜炎、全身性皮膚障害、膠原病、ライター病、およびベーチェット病からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該医薬組成物が局所的に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
該配列番号４のフラグメントが、配列番号１０、１６、１７、１８、および１９の配列を有するフラグメントの群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
上皮細胞の生存性を増強する方法であって、該細胞と、有効量の発現ベクターおよび医薬上許容される担体を含む組成物とを接触させ、それによって、該上皮細胞の生存性を増強することを含む方法、ここで、該発現ベクターは、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはホモログをコードする核酸配列を含む。
【請求項２２】
眼関連疾患、障害または病態を処置または予防する方法であって、治療有効量の発現ベクターおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物を被験体に投与し、それによって、眼関連疾患、障害または病態を処置または予防することを含む方法、ここで、該発現ベクターは、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはホモログをコードする核酸配列を含む。
【請求項２３】
眼関連疾患、障害または病態を処置または予防するための組成物であって、配列番号４のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはホモログおよび医薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項２４】
眼関連疾患、障害または病態を処置または予防するための組成物であって、発現ベクターおよび医薬上許容される担体を含む組成物、ここで、該ベクターは、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはホモログをコードする核酸配列を含む。
【請求項２５】
該組成物が局所眼科用製剤を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
該組成物が、少なくとも１つの精製抗微生物物質をさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
該少なくとも１つの抗微生物物質が、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、二グルコン酸クロルヘキシジンもしくは二酢酸クロルヘキシジン、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピル（パラベン類）、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀もしくは硝酸フェニル水銀、ソルビン酸、ならびにチメロサールからなる群から選択される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
該抗微生物物質が抗生物質である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
医薬上許容されるリン脂質またはオイルをさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３０】
該フラグメントが、配列番号４のアミノ末端からの１〜２４アミノ酸の欠失を含む配列番号４のフラグメントである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３１】
該フラグメントが、配列番号４のアミノ末端からの２４アミノ酸の欠失を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
該フラグメントが、配列番号１０、１６、１７、１８、および１９のアミノ酸配列を有するフラグメントの群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３３】
該フラグメントが、配列番号１０の配列を有する１１９アミノ酸ポリペプチドの最大２０アミノ酸のＣ末端欠失を含むフラグメントの群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３４】
ラクリチンポリペプチドに応答性の上皮細胞の増殖を誘導する方法であって、該細胞と、有効量の配列番号４を含むラクリチンポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはホモログを含む組成物とを接触させ、それによって、該上皮細胞の増殖を誘導することを含む、方法。
【請求項３５】
該上皮細胞が、唾液腺導管細胞、涙腺房細胞、角膜上皮細胞、および腎上皮細胞からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
該細胞がヒト細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
該配列番号４のフラグメントが、配列番号１０またはそのフラグメントもしくはホモログである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
該上皮細胞の増殖の誘導が、ＰＫＣα依存性シグナル伝達経路を介して誘導される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
該上皮細胞の増殖の誘導が、ホスホリパーゼＤ１依存性シグナル伝達経路を介して誘導される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
該上皮細胞の増殖の誘導が、ＮＦＡＴＣ１依存性シグナル伝達経路を介して誘導される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
該上皮細胞の増殖の誘導が、Ｇαｉ依存性シグナル伝達経路を介して誘導される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
眼関連疾患、障害または病態を処置または予防するための医薬組成物を投与するためのキットであって、治療有効量の配列番号４のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはホモログおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物、アプリケーター、ならびに取扱説明書を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／５７０，８６５号明細書に基づき米国特許法第１１９条（ｅ）項に規定された優先権が与えられる。
【０００２】
米国政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって付与された承認番号Ｒ０１  ＥＹ１３１４３に基づく米国政府の助成によって行われた。米国政府は本発明において所定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
眼表面の健康は、涙腺からの涙液分泌に依存する。涙腺を含んでなる涙腺房細胞は、複雑な腺房周囲基底膜に付着する極性形成し、高度に分化した涙液分泌細胞である。頂端細胞の細胞質の大部分は、涙液タンパク質が詰め込まれた大きな分泌顆粒を含有する。既知の涙液タンパク質として次のものが挙げられる。角膜表面に対して顕著な殺細菌剤としての役割を果たすリゾチーム、殺細菌剤および補体活性化の潜在的インヒビターの両方として機能するラクトフェリン、ＩｇＡの腺房腔への経細胞移動を調節する分泌成分であって、ここで、それは角膜表面に対して作用し、細菌の粘着を阻害する、ならびに涙リポカリン（涙特異的プレアルブミン）および機能が知られていない増殖因子のＴＧＦα、ＴＧＦβおよびＥＧＦ。ラットでは、ペルオキシダーゼは、実験的研究において簡便なマーカーとしての役割を果たしている涙成分である。涙は、重要な殺細菌の役割を有するだけではなく、それらはまた、角膜を清潔かつ潤滑に保ち、角膜上皮の健康に重要である。
【０００４】
眼の表面は、最もアクセス可能かつ傷付き易い組織の１つである。角膜上皮細胞は、次のものを常に含む環境傷害に直面する。ＵＶ照射、広範に変動する空気温度の流動、汚染物質、細菌および他の微生物体。角膜表面を浸漬する涙液は、角膜は、血管がそのような物質を供給する他の組織とは異なり、血液供給を欠くため、細胞保護および抗炎症剤の最も可能な供給源である。実際、涙液は、殺細菌性タンパク質に富む。不十分な涙産生を患うドライアイ患者は、角膜潰瘍形成、感染または炎症に供される。涙供給の容積が制限されるため、コンタクトレンズの長期使用によっても類似の症状が生じる。
【０００５】
涙腺房細胞の涙液流出が集合的に欠損状態である場合、「ドライアイ」（乾性角結膜炎［ＫＣＳ］としても公知である）が結果として生じる。ドライアイは、シェーグレン症候群、世界中で数百万人の人が罹患している不明な病因を伴う自己免疫疾患の一般的な眼の症状である。最も一般的な罹患者は閉経後の女性で、様々な程度の重症度を伴う。処置を行わない場合、ドライアイは、角膜剥離、潰瘍形成、細菌感染および失明をもたらし得る。
【０００６】
主要な涙腺による分泌流出の病的低下の基礎となる分子機構は、潜在的に複合的である。シェーグレン症候群患者の涙腺は、ＢおよびＴリンパ球の病巣を含有し、おそらくウイルス傷害による該リンパ球の病的拡大は、涙腺房を破壊し得る。しかし、腺房の容積の消失は、しばしば、主要な涙腺の理論上の余剰能力に対して不十分であるようである。予想から、潜在的分泌流出は、正常な水性の涙膜層を維持するのに必要とされるより１０倍まで大きいことが示唆される。従って、直接もしくは間接的に涙腺房細胞機能を変更し得るおよび／または神経分布の低下をもたらし得る１つまたはいくらかの共通のサイトカインの異常分泌などの他の機構も注目に値する。涙腺房細胞によって涙膜に放出される新規の自己分泌／傍分泌因子は、涙腺分泌機構、導管系および角膜上皮の健康に必要とされ得る。腺房周囲基底膜はまた、ラミニン−１との見かけの相乗効果が刺激性涙分泌を促進する「ＢＭ１８０」を部分的に介する正常な分泌機能に必要である。ホルモンの変化を伴うかまたは独立したこれらの因子のそれぞれの変更は、分泌能の減少に寄与し得る。
【０００７】
涙腺−角膜の軸は、眼の健康の基本的な調節因子であり、ドライアイ症候群および角膜損傷に関連する眼表面の炎症において重要な役割を果たす。炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびケモカインＩＬ−８のような多数のメディエーターは、角膜炎症の発達および進行に関与する。シクロオキシゲナーゼ（主に、ＰＧＥ２）、リポオキシゲナーゼ（ｌｉｐｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）（１２（ｓ）−ＨＥＴＥ）およびシトクロムＰ４５０（１２（ｒ）−ＨＥＴＥ）の活性によって生成されるアラキドン酸由来エイコサノイドもまた関与する。ラクリチンの作用機序に関する最近の研究によって、収束しているＰＫＣαおよびＮＦｋＢシグナル伝達経路が示され、ラクリチンが眼表面に対して重要な抗炎症性の役割を果たすことが示唆された。最近の臨床研究はこの仮定を支持する。眼瞼炎（まぶたの炎症）を患う１９例の患者対２７例の健康な志願者由来の涙液タンパク質の比較により、患者においてラクリチンが５６％だけ減少することが示された。
【０００８】
緩徐に再生する上皮の調節
上皮再生は、増殖および粘着因子により調節される様式で、器官形成、恒常性、および腫瘍形成を補強する。定常な（しばしば、完全に独立した（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｅｄ））幹細胞およびそれらの移動性の「特質増幅性」細胞の子孫の緩除な循環集団の増殖は、基底膜ラミニン（リ，Ｓ．（Ｌｉ，Ｓ．）ら、Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ、２００３年、４：６１３−６２４）に対するβ１インテグリン粘着性（アロンソ，Ｌ．（Ａｌｏｎｓｏ，Ｌ．）ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２００３年、１７：１１８９−２００）、および細胞コンパートメントを再生する特定の傾向を示すマイトジェンのＷｎｔファミリー（ピント，Ｄ．（Ｐｉｎｔｏ，Ｄ．）ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２００３年、１７：１７０９−１７１３、クーネルト，Ｆ．（Ｋｕｈｎｅｒｔ，Ｆ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００４年、１０１：２６６−２７１）の関与を含むコンパートメント化された細胞外の手掛かり（ｃｕｅ）に依存する。
【０００９】
小腸では、陰窩間充織および上皮によって分泌されるＷｎｔが、各陰窩における単一の幹細胞によって播種される増殖域を作製する傍分泌または自己分泌の様式で作用する。陰窩は、空間的に区別されるが、Ｗｎｔ分泌の中断が細胞周期の進行を終結し、腸機能に必要な吸収上皮、腸内分泌細胞または杯細胞のヘッジホグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）依存性分化を促進する外部に突き出た絨毛を伴って連続的である。皮膚では、幹細胞が毛包バルジ部に存在し、ここで、連続的なＦＧＦ−１８およびＢＭＰ−６増殖抑制は、破壊的な皮膚損傷により表皮の基底部で増殖細胞の補充が要求されるまで、Ｗｎｔシグナル伝達によって、ポジティブな増殖圧と均衡を保つと考えられる。皮膚における上皮再生の等価単位は、１つの毛包および隣接する表皮を含んでなる。Ｗｎｔシグナル伝達は、損傷に応答して角膜上皮増殖を促進するため、類似の原理が眼の表面において稼動し得る。角膜幹細胞は角膜を包囲して、層化した角膜上皮の増殖基底層として中心に移動する子孫に寄与する。従って、幹細胞ニッチェは、上皮を迅速に再生する重要な特徴である。
【００１０】
個別の幹細胞ニッチェは存在しないようであるため、非迅速的に再生しているまたは持続する上皮において、どのようにしてターンオーバーが調節されるかについては、取り組むべきさらなる課題である。正常な条件下で緩除なターンオーバーを示す上皮は、外分泌および内分泌腺、腎臓、ならびに肝臓を含む身体のほとんどの成体器官を含んでなる。最近発見されたヒトタンパク質「ラクリチン」は、新しい見識を付与し得る。ラクリチンは、成体涙腺における腺房細胞および唾液腺における導管細胞のサブ集団によって分泌され、甲状腺および乳腺において、非組織学的方法によって検出されているが、他では認められていない。
【００１１】
涙腺、唾液腺、および乳腺は、長い導管内方成長部がタンパク質産物を分泌性腺房から外部へ運搬する外分泌腺である。唾液腺では、高度に増殖性の挿入された導管細胞は、幹細胞または一過的に増幅中の細胞と同様に作用し、腺房の上流および導管細胞タイプの下流に生存する。重要なことに、すべての上皮細胞タイプもまた、緩除に循環するようであり（マン，Ｙ．Ｇ．（Ｍａｎ，Ｙ．Ｇ．）ら、Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．，２００１年、２６３：２０２−２１４）、分化の早期の異なる段階において幹細胞が上皮全体に配置される成体乳腺に酷似する。涙腺について類似の試験は行われていないが、上皮全体を通しての緩除な増殖能は、外分泌腺および他の非迅速的に再生している上皮の一般的特性であるようである。
【００１２】
多くの上皮細胞は、それが、腺房または導管から下流に流動する場合に、断続的性質がこの外分泌腺上皮の緩除な再生を調節する際に大きな役割を果たす単純な分配機構でラクリチンに接触する。また、眼および口腔の表面において迅速に再生している上皮細胞は潜在的に影響を受け、ここで、ラクリチンが沈積される。組換えラクリチンがヒト角膜上皮細胞によって涙腺房細胞分泌、ヒト唾液腺管細胞増殖、およびカルシウム動員を促進することが可能であることを示すインビトロ研究は、この仮定を支持する（サンギサンギ，Ｓ．（Ｓａｎｇｈｉ，Ｓ．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００１年、３１０：１２７−１３９）。従って、特定の幹細胞ニッチェの非存在下では、ラクリチンの放出が、乳腺および唾液腺の非迅速的に再生している上皮を介して広がる断続的増殖領域を規定する。他の迅速的に再生している上皮は管腔構造を有するため、増殖領域は、非迅速的にまたは持続する上皮の一般的原理であり得る。
【００１３】
眼上皮細胞の生存を促進し、眼の炎症を予防および処置し、損傷または手術処置後の角膜修復を増強する方法は、当該分野において長い間にわたって必要とされている。本発明はこれらの必要性を満たす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、眼細胞生存を促進するため、より詳細には、環境傷害の存在下で眼細胞生存を促進するためのラクリチンの使用に関する。本発明はまた、角膜感染および炎症を予防ならびに処置するためのラクリチンの使用に関する。本発明は、角膜の環境傷害または外科手術（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）後の角膜創傷修復を促進するためのラクリチンの使用にさらに関する。本発明はまた、特定の上皮細胞のみに対するマイトジェンとしてのラクリチンの使用に関する。
【００１５】
本発明の一実施形態では、ラクリチンは、人工的な涙液産物において、活性因子として含まれる。
【００１６】
一態様では、本発明は、眼表面に関する疾患、障害、または病態を処置もしくは予防するための組成物を包含する。一態様では、本発明は、眼表面に関する感染を処置または予防するための組成物を包含し、前記組成物は、治療有効量の配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる精製ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはホモログ、医薬上許容される担体、および精製抗微生物物質を含んでなる。一態様では、フラグメントは配列番号１０である。
【００１７】
一態様では、本発明は、抗微生物物質が、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、二グルコン酸クロルヘキシジンもしくは二酢酸クロルヘキシジン、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピル（パラベン類）、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀もしくは硝酸フェニル水銀、ソルビン酸、ならびにチメロサールからなる群から選択される、組成物を包含する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、眼感染を処置または予防するための組成物を包含し、前記組成物は、治療有効量の配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはホモログをコードする単離核酸、医薬上許容される担体、および精製抗微生物物質を含んでなる。
【００１９】
一態様では、組成物は、局所的眼科用製剤を含んでなる。別の態様では、組成物は、医薬上許容されるリン脂質またはオイルをさらに含んでなる。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、ヒト角膜上皮細胞または涙腺房細胞の生存性を増強する方法に関し、前記方法は、前記細胞と、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメント、誘導体、もしくはホモログを含んでなる組成物とを接触させる工程を含んでなる。一態様では、ペプチドのアミノ酸配列は、１つもしくはそれ以上の保守的アミノ酸置換だけ配列番号４と異なるアミノ酸配列、または単一の変異（ここで、単一の変異は単一のアミノ酸の欠失、挿入または置換を表す）だけ配列番号４と異なるアミノ酸配列である。一態様では、フラグメントは、配列番号１０、１６、１７、１８、および１９、ならびにその誘導体およびフラグメントからなる群から選択される。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、角膜上皮細胞または涙腺房細胞の生存を増強する方法を提供し、前記方法は、眼表面と、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドまたはそのフラグメント、誘導体、もしくはホモログを含んでなる組成物とを接触させる工程を含んでなる。一態様では、ポリペプチドは、１つもしくはそれ以上の保守的アミノ酸置換だけ配列番号４と異なるアミノ酸配列、または単一の変異（ここで、単一の変異は単一のアミノ酸の欠失、挿入または置換を表す）だけ配列番号４と異なるアミノ酸配列である。一態様では、フラグメントは、配列番号１０、１６、１７、１８、および１９、ならびにその誘導体およびフラグメントからなる群から選択される。一態様では、環境傷害は、細菌またはウイルス感染を含んでなる。さらに別の態様では、環境傷害は、異物によって誘導される炎症を含んでなる。一態様では、炎症は、コンタクトレンズによって誘導される。なお別の態様では、炎症は、十分な涙液産生の欠如によって誘導される。
【００２２】
ラクリチンは、所定の上皮細胞のみに対する選択的マイトジェンである。一実施形態では、本発明は、ラクリチンならびにそのフラグメント、誘導体、およびホモログによる増殖の誘導に対して感受性である上皮の増殖を誘導する方法を提供する。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体において、眼関連疾患、障害、または病態を処置または予防する方法を提供する。一態様では、眼の表面が処置される。別の態様では、角膜が処置される。一態様では、被験体は、天然のラクリチンの配列（配列番号４）を含んでなるポリペプチドまたはそのフラグメント、誘導体、もしくはホモログを含んでなる組成物で処置される。別の態様では、被験体は、配列番号４、またはそのフラグメント、誘導体、もしくはホモログをコードする核酸配列を含んでなる単離核酸を含んでなる組成物で処置される。一態様では、フラグメントは、配列番号１０、１６、１７、１８、および１９、ならびにその誘導体およびフラグメントからなる群から選択される。
【００２４】
一態様では、本発明の単離ペプチド、または本発明のペプチドをコードする単離核酸によって処置される眼関連疾患、障害、または病態としては、ドライアイ、結膜炎、シェーグレン症候群、角膜剥離、潰瘍形成、細菌感染、直接的外傷、手術、放射エネルギー、電離エネルギー、ウイルス感染、真菌感染、寄生体感染、角膜炎、全身性皮膚障害、膠原病、ライター病、およびベーチェット病が挙げられるが、これらに限定されない。別の態様では、特定の疾患、病態、もしくは障害に適切なさらなる薬物または物質を組成物の部分として投与してもよい。
【００２５】
本発明は、本発明の組成物を投与するためのキットをさらに提供する。
【００２６】
本発明の多様な態様および実施形態について、以下に詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
略称および頭字語
ＨＳＧはヒト唾液腺を意味する。
ＦＡＣＳは蛍光標示式細胞分取器を意味する。
ＨＣＥはヒト角膜上皮を意味する。
ＩＲＢは治験審査委員会を意味する。
【００２８】
定義
本発明の説明および特許請求の範囲において、以下の用語が下記の定義に従って使用される。
【００２９】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その冠詞の１つもしくは１を超える（即ち、少なくとも１つ）の文法的対象物を指すために本明細書において使用される。例えば、「あるエレメント（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つのエレメントまたは１を超えるエレメントを意味する。
【００３０】
本明細書において使用されるように、アミノ酸は、以下の表に示されるように、その正式名称、それに対応する３文字コード、またはそれに対応する１文字コードによって表される。
【００３１】
2007537260.tif 000003
【００３２】
本明細書において使用される発現「アミノ酸」は、天然および合成のアミノ酸の両方、ならびにＤおよびＬ型アミノ酸の両方を含むことを意味する。「標準的アミノ酸」は、天然に存在するペプチドにおいて一般的に見出される２０種の標準的Ｌ−アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準的アミノ酸残基」は、それが合成的に調製されるかまたは天然の供給源から誘導されるかにかかわらず、標準的アミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。本明細書において使用されるように、「合成アミノ酸」はまた、塩、（アミドのような）アミノ酸誘導体、および置換を含むがそれらに限定されない化学的に修飾されたアミノ酸を包含する。本発明のペプチド内に含有される、特に、カルボキシまたはアミノ末端のアミノ酸は、それらの活性に有害な影響を及ぼすことなく、ペプチドの循環半減期を変更することができるメチル化、アミド化、アセチル化または他の化学基との置換によって、修飾することができる。さらに、ジスルフィド結合は、本発明のペプチドにおいて存在してもよく、または存在しなくてもよい。
【００３３】
用語「アミノ酸」は「アミノ酸残基」と交換可能に使用され、遊離のアミノ酸およびペプチドのアミノ酸残基を指し得る。それが遊離のアミノ酸を指そうとまたはペプチドの残基を指そうといずれにせよ、どの用語が使用されるかについては文脈から理解されよう。
【００３４】
アミノ酸は、以下の一般構造を有する。
【化１】
2007537260.tif 000004
【００３５】
アミノ酸は、側鎖Ｒに基づいて、次の７つのグループに分類され得る。（１）脂肪族側鎖、（２）水酸（ＯＨ）基を含有する側鎖、（３）イオウ原子を含有する側鎖、（４）酸性またはアミド基を含有する側鎖、（５）塩基性基を含有する側鎖、（６）芳香環を含有する側鎖、および（７）プロリン（側鎖がアミノ基に融合したイミノ酸）。
【００３６】
本発明のペプチド化合物を説明するために使用される命名法は、常法に従い、ここで、アミノ基は左側に提示され、カルボキシ基は各アミノ酸残基の右側に提示される。本発明の選択された特定の実施形態を表す定式では、アミノおよびカルボキシ末端基は、特に示さないが、他で特定しない限り、それらが生理学的ｐＨ値で呈する形態にあることが理解されよう。
【００３７】
本明細書において使用する用語「塩基性」または「正に荷電した」アミノ酸は、Ｒ基がｐＨ７．０で正味の正の電荷を有するアミノ酸を指し、限定されないが、標準的アミノ酸であるリジン、アルギニン、およびヒスチジンを含む。
【００３８】
本明細書において使用する用語「抗体」は、抗原上の特異的エピトープに特異的に結合することが可能である免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然の供給源または組換え供給源から誘導される無傷（ｉｎｔａｃｔ）な免疫グロブリンであり得、無傷（ｉｎｔａｃｔ）な免疫グロブリンの免疫反応性の部分であり得る。抗体は、典型的に、免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む様々な形態で存在することができる。
【００３９】
本明細書において使用される「抗微生物物質」は、任意の微生物の増殖を妨害するか、またはそのような微生物を死滅させる任意の化合物を指す。
【００４０】
本明細書において使用する用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」またはアンチセンス核酸は、少なくともその一部が、正常な細胞または罹患した細胞に存在する核酸に相補的である核酸ポリマーを意味する。「アンチセンス」は、特に、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列、または非コーディング鎖に実質的に相同である配列を指す。本明細書において規定されるように、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。必ずしも、アンチセンス配列がＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分にのみ相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖に対して指定される調節配列に相補的であり得、該調節配列は、コーディング配列の発現を制御する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの他の修飾物を含む。
【００４１】
本明細書において使用する用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成の規則に従って関係付けられるポリヌクレオチド（即ち、ヌクレオチドの配列）に関して使用される。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に相補的である。
【００４２】
用語「検出する」および「同定する」は、本明細書において交換可能に使用される。
【００４３】
本明細書において使用される「検出マーカー」または「レポーター分子」は、マーカーを伴わない類似の化合物の存在下でマーカーを含んでなる化合物の特異的検出を可能にする原子または分子である。検出マーカーまたはレポーター分子としては、例えば、放射性同位元素、抗原決定基、酵素、ハイブリダイゼーションに利用可能な核酸、クロモフォア、フルオロフォア、化学発光分子、電気化学的に検出可能な分子、および改変された蛍光偏光または改変された光散乱を提供する分子が挙げられる。
【００４４】
「エンハンサー」は、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または配向にかかわらず、転写の効率を増加することができるＤＮＡ調節エレメントである。
【００４５】
本明細書において使用される語句「生存を増強する」は、細胞集団における死の量、または死の割合を減少すること指す。生存を増強することは、細胞死単独（例えば、アポトーシスに関連する細胞死）を予防すること、または細胞死の割合を減少することにより得る。細胞死の減少はまた、いくらかの細胞増殖を誘導するような間接的効果から生じ得、そのような間接的効果は、細胞が死ぬ時に、細胞の集団の少なくともいくらかまたはすべてを効果的に補充する。細胞の生存を増強することはまた、増殖を誘導することおよび細胞死、または細胞死の割合を減少することの組み合わせによって、達成することができる。「生存を促進する」および「生存性を増強する」は、ここで「生存を増強供する」と交換可能に使用される。
【００４６】
「フラグメント」または「セグメント」は、少なくとも１つのアミノ酸を含んでなるアミノ酸配列の一部、または少なくとも１つのヌクレオチドを含んでなる核酸配列の一部である。用語「フラグメント」および「セグメント」は、本明細書において交換可能に使用される。処置における使用のための組成物の部分としてまたはラクリチン効果を誘発するために本明細書において使用されるラクリチンペプチドのフラグメントは、誘発させようとする応答に対して生物学的な活性なフラグメントであるとみなされる。
【００４７】
本明細書において使用される「機能的な」生物学的分子は、それが特徴付けられる特性または活性を示す形態の生物学的分子である。例えば、機能的酵素は、酵素が特徴付けられる特徴的な触媒活性を示す酵素である。
【００４８】
本明細書において使用される「遺伝子」は、核酸コーディング配列、ならびにＤＮＡ配列がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、次いで、特定のポリペプチドに特有なアミノ酸の配列に翻訳されるのに必要な調節エレメントを指す。
【００４９】
本明細書において使用される「相同な」は、２つのポリマー分子の間、例えば、２つの核酸分子、例えば、２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子の間、または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列類似性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットで占有される場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンで占有される場合、それらは該位置で相同である。２つの配列間の相同性は、一致するまたは相同な位置の数の一次関数であり、例えば、２つの化合物の配列における位置の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマーにおける５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、９０％の位置、例えば、１０のうち９が一致するかまたは相同である場合、２つの配列は９０％の相同性を共有する。例えば、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。
【００５０】
本明細書において使用される「相同性」は、「同一性」と同じ意味で使用される。
【００５１】
２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセンの決定は、数学的アルゴリズムを使用して、達成することができる。例えば、２つの配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、カールリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）のアルゴリズムであり（１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４−２２６８）、カールリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７）におけるように改変される。このアルゴリズムは、アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み入れられ、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）ワールドワイド・ウェブサイトにおいて評価することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、次のパラメータ：ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝２、ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｍａｔｃｈ  ｒｅｗａｒｄ＝１、期待値１０．０、およびｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝１１を使用して、ＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトにおいて「ｂｌａｓｔｎ」と称される）により実施し、本明細書に記載の核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、次のパラメータ：期待値１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２評価マトリックスを使用して、ＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトにおいて「ｂｌａｓｔｎ」と称される）により実施することができる。比較目的のためギャップありのアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）に記載のように利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＰＨＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠い関係（Ｉｄ．）および共通のパターンを共有する分子間の関係を検出する反復検索を実施することができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ、およびＰＨＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。
【００５２】
２つの配列間の同一性パーセントは、上記と類似の技術を使用して、ギャップを認めるかまたは認めずに決定することができる。同一性パーセントを算出する際は、典型的に、正確な一致が計数される。
【００５３】
本明細書において使用する用語「傷害」は、細胞もしくは細胞の集団における正常な細胞の代謝の変更を生じる物質または環境変化との接触を指す。環境傷害として、化学物質、環境汚染、重金属、ウイルスまたは細菌感染、温度の変化、ｐＨの変化、ならびに酸化損傷、ＤＮＡ損傷、または病原を生じる因子を挙げることができるが、これらに限定されない。用語「傷害」は、本明細書では、「環境傷害」と交換可能に使用される。
【００５４】
「単離核酸」は、天然に存在する状態でその側面に配置する（ｆｌａｎｋ）配列から分離されている核酸セグメントまたはフラグメント、例えば、フラグメントに普通に隣接する配列（例えば、それが天然に存在するゲノムにおいてフラグメントに隣接する配列）から取り出されているＤＮＡフラグメントを指す。用語はまた、核酸に天然に付随する他の成分、例えば、細胞においてそれに天然に付随するＲＮＡもしくはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製されている核酸にもあてはまる。従って、用語は、例えば、ベクター、自律複製するプラスミドもしくはウイルス、または原核細胞もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み入れられるか、あるいは他の配列とは独立した個別の分子（例えば、ＰＣＲもしくは制限酵素消化によって生成されるｃＤＮＡまたはゲノムもしくはｃＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡを含む。それはまた、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えＤＮＡを含む。
【００５５】
本明細書において使用する用語「ラクリチンポリペプチド」などの用語は、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドならびにその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、およびホモログを指す。本明細書において使用する用語であるラクリチンポリペプチドの「生物学的に活性なフラグメント」または「生物活性なフラグメント」は、アミノ酸配列ＭＫＦＴＴＬＬＦＬＡＡＶＡＧＡＬＶＹＡＥＤＡＳＳＤＳＴＧＡＤＰＡＱＥＡＧＴＳＫＰＮＥＥＩＳＧＰＡＥＰＡＳＰＰＥＴＴＴＴＡＱＥＴＳＡＡＡＶＱＧＴＡＫＶＴＳＳＲＱＥＬＮＰＬＫＳＩＶＥＫＳＩＬＬＴＥＱＡＬＡＫＡＧＫＧＭＨＧＧＶＰＧＧＫＱＦＩＥＮＧＳＥＦＡＱＫＬＬＫＫＦＳＬＬＫＰＷＡ（配列番号４）の天然または合成部分を包含する。
【００５６】
本明細書において使用される「リガンド」は、標的化合物に特異的に結合する化合物である。リガンドが異種の化合物のサンプルにおいて化合物の存在を決定する結合反応において機能する場合、リガンド（例えば、抗体）は、化合物と「特異的に結合する」または「特異的な免疫反応性である」。従って、指定されたアッセイ（例えば、イムノアッセイ）条件下では、リガンドは、好ましくは、特定の化合物に結合し、サンプル中に存在する他の化合物には有意な程度では結合しない。例えば、抗体は、イムノアッセイ条件下で、抗体が惹起されたエピトープを有する抗原に特異的に結合する。様々なイムノアッセイ形式は、特定の抗原に特異的に免疫反応する抗体を選択するために使用してもよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、抗原に特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために日常的に使用される。特異的免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイ形式および条件の説明については、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ニューヨークを参照のこと。
【００５７】
本明細書において使用する用語「連結」は、２つの基間の接続を指す。接続は、共有結合かまたはイオン結合、水素結合、および疎水性／親水性相互作用を含むがこれらに限定されない非共有結合のいずれかであり得る。
【００５８】
本明細書において使用する用語「リンカー」は、共有結合あるいは非共有結合的のいずれかで、例えば、イオンもしくは水素結合またはファンデルワールス相互作用を介して、他の２つの分子を接合する分子を指す。
【００５９】
本明細書において使用される「眼表面」は、眼の表面、特に、角膜表面を指す。
【００６０】
本明細書において使用する語句「眼表面に関する疾患、傷害、または病態」は、眼表面の疾患、障害、または病態について本明細書に記載の問題または症状のいずれかを直接的または間接的に引き起こすか、あるいは引き起こすことができる任意の疾患、障害または病態を指す。
【００６１】
「作動可能に連結される」は、成分がそれらの機能を実施するように構成される並置を指す。従って、コーディング配列に作動可能に連結された制御配列またはプロモーターは、コーディング配列の発現を生じることが可能である。
【００６２】
「マーカー」は、そのようなマーカーを伴わない類似の分子の存在下で該マーカーを含んでなる分子の特異的検出を可能にする原子または分子である。マーカーとしては、例えば、放射性同位元素、抗原決定基、ハイブリダイゼーションに利用可能な核酸、クロモフォア、フルオロフォア、化学発光分子、電気化学的に検出可能な分子、改変された蛍光偏光または改変された光散乱を提供する分子および細胞または生物体の増強された生存を可能にする分子（即ち、選択マーカー）が挙げられる。レポーター遺伝子は、マーカーをコードする遺伝子である。
【００６３】
「ポリリンカー」は、相互に緊密に配設された（即ち、各部位間は１０ヌクレオチド未満）一連の３つもしくはそれ以上の異なる制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含んでなる核酸配列である。
【００６４】
本明細書において使用する用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要である核酸配列を意味する。ある場合では、この配列は、コアプロモーター配列であってもよく、他の場合では、この配列はまた、エンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要である他の調節エレメントを含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的様式で遺伝子産物を発現する配列であってもよい。
【００６５】
「構成性プロモーター」は、それが、細胞において一定の様式で作動可能に連結される遺伝子の発現を駆動するプロモーターである。例えば、細胞のハウスキーピング遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、構成性プロモーターと考えられる。
【００６６】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドに作動可能に連結される場合、実質的にプロモーターに対応する誘導物質が細胞に存在する場合にのみ、生細胞において遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００６７】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドに作動可能に連結される場合、実質的に細胞が、プロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ、生細胞において遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００６８】
本明細書において使用される「核酸」、「ＤＮＡ」および類似の用語もまた、核酸アナログ、即ち、ホスホジエステル骨格以外を有するアナログを含む。例えば、当該分野において公知であり、骨格においてホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有するいわゆる「ペプチド核酸」も本発明の範囲内にあると考えられる。
【００６９】
核酸にあてはめられる本明細書において使用する用語「フラグメント」は、通例、少なくとも約２０ヌクレオチド長、典型的には、少なくとも約５０ヌクレオチド、より典型的には、約５０〜約１００ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約１００〜約２００ヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも約２００ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチド、なおさらにより好ましくは、少なくとも約３００〜約３５０、さらにより好ましくは、少なくとも約３５０ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、なおさらにより好ましくは、少なくとも約５００〜約６００、さらにより好ましくは、少なくとも約６００ヌクレオチド〜約６２０ヌクレオチド、なおさらにより好ましくは、少なくとも約６２０〜約６５０であってもよく、最も好ましくは、核酸フラグメントは、約６５０ヌクレオチド長を超える。
【００７０】
他で指定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。
【００７１】
用語「ペプチド」は、３もしくはそれ以上のアミノ酸の配列を包含し、ここで、アミノ酸は、天然に存在するかまたは合成の（天然に存在しない）アミノ酸である。ペプチド擬似物は、１つもしくはそれ以上の以下の修飾物を有するペプチドを含む。
１．１つもしくはそれ以上のペプチジル−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−−連結（結合）が  −−ＣＨ２−カルバメート連結（−−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−−）、ホスホン酸連結、−ＣＨ２−スルホンアミド（−ＣＨ２−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−−）連結、尿素（−−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−−）連結、−−ＣＨ２−第二級アミン連結のような非ペプチジル連結、またはアルキル化ペプチジル連結（−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−−）［式中、ＲはＣ１−Ｃ４  アルキル］によって置き換えられているペプチド、
２．Ｎ末端が、−−ＮＲＲ１基、−−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基、−−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ基、−−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基［式中、ＲおよびＲ１は水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであるが、但し、ＲおよびＲ１の両方が同時に水素にはならない］に誘導体化されるペプチド、
３．Ｃ末端が、−−Ｃ（Ｏ）Ｒ２［式中、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシからなる群から選択される］、および−−ＮＲ３Ｒ４［式中、Ｒ３およびＲ４は、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルからなる群から独立して選択される］に誘導体化されるペプチド。
【００７２】
合成または天然に存在しないアミノ酸は、インビボで天然には存在しないが、それにもかかわらず、本明細書に記載のペプチド構造に組み入れられ得るアミノ酸を指す。得られる「合成ペプチド」は、ペプチドの１、２もしくはそれ以上の位置で、天然に存在し、遺伝子によりコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有する。例えば、ナフチルアラニンを、トリプトファンに対して置換し、合成を容易にすることができる。ペプチドに置換することができる他の合成アミノ酸として、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル、Ｌ−α−ヒドロキシリシルおよびＤ−α−メチルアラニル、Ｌ−α−メチルアラニルのようなα−アミノ酸、β−アミノ酸ならびにイソキノリルが挙げられる。Ｄ型アミノ酸および天然に存在しない合成アミノ酸もまた、ペプチドに組み入れることができる。他の誘導体は、遺伝子によりコードされる２０種のアミノ酸（または任意のＬもしくはＤ型アミノ酸）の天然に存在する側鎖の他の側鎖による置き換えを含む。
【００７３】
本明細書において使用する用語「医薬上許容される担体」は、リン酸緩衝食塩溶液の様な標準的な医薬用担体、水、油／水型または水／油型エマルジョンのようなエマルジョン、および多様なタイプの湿潤剤のいずれをも含む。用語はまた、ヒトを含む動物における使用について米国連邦政府の規制当局（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳ  Ｆｅｄｅｒａｌ  ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ）により承認され、米国薬局方（ＵＳ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）に収載されている任意の物質を包含する。
【００７４】
「プロモーター」は、遺伝子の核酸コーディング配列のようなＤＮＡ配列の転写を指令するＤＮＡ配列である。典型的に、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近接する遺伝子の５’領域に配置される。プロモーターは、誘導性（特定の因子に対応して転写の割合が変化する）、組織特異的（いくつかの組織においてのみ発現される）、時間特異的（所定の時間にのみ発現される）または構成性（すべての組織において、一定の割合の転写で発現される）であり得る。
【００７５】
「コアプロモーター」は、ＴＡＴＡボックスおよび転写の開始を含むプロモーター機能に必須のヌクレオチド配列を含有する。この定義によれば、コアプロモーターは、活性を増強するかまたは組織特異的活性を付与する特定の配列の非存在下で検出可能な活性を有してもよく、または有さなくてもよい。
【００７６】
本明細書において使用する用語「精製」などの用語は、生来もしくは天然の環境において分子または化合物に通常関連する混入物を実質的に含まない形態における分子または化合物の単離に関する。用語「精製」は、必ずしも、特定の分子の完全な純度がその工程中に達成されたことを示すものではない。本明細書において使用される「高度に精製された」化合物は、純度９０％を超える化合物を指す。
【００７７】
本明細書において使用される配列番号１は、本明細書において配列番号２として同定されるラクリチンのｃＤＮＡに対応するヒトラクリチンのゲノム遺伝子の核酸配列を指す。
【００７８】
本明細書において使用される配列番号２は、ヒト涙腺ライブラリーからクローニングされるｃＤＮＡの核酸配列を指す。
【００７９】
本明細書において使用される配列番号４は、核酸配列番号２によってコードされる天然のヒトラクリチンタンパク質の１３８アミノ酸配列を指す。配列番号４はまた、天然のラクリチンと称される。
【００８０】
本明細書において使用される配列番号１０は、配列番号４（天然のラクリチン）の１１９カルボキシ末端アミノ酸残基成熟フラグメントを指す。配列番号１０はまた、本明細書において成熟ラクリチンと称される。
【００８１】
本明細書において使用される配列番号１６は、天然のラクリチン（配列番号４）の２４アミノ末端アミノ酸の欠失を含んでなる欠失変異体を指す。配列番号１６はまた、Ｎ−２４と称される。
【００８２】
本明細書において使用される配列番号１７は、成熟ラクリチン（配列番号１０）の５カルボキシ末端アミノ酸の欠失を含んでなる欠失変異体を指す。配列番号１６はまた、Ｃ−５と称される。
【００８３】
本明細書において使用される配列番号１８は、成熟ラクリチン（配列番号１０）の１０カルボキシ末端アミノ酸の欠失を含んでなる欠失変異体を指す。配列番号１８はまた、Ｃ−１０と称される。
【００８４】
本明細書において使用される配列番号１９は、成熟ラクリチン（配列番号１０）の１５カルボキシ末端アミノ酸の欠失を含んでなる欠失変異体を指す。配列番号１９はまた、Ｃ−１５と称される。
【００８５】
本明細書において使用される配列番号２０は、成熟ラクリチン（配列番号１０）の２０カルボキシ末端アミノ酸の欠失を含んでなる欠失変異体を指す。配列番号２０はまた、Ｃ−２０と称される。
【００８６】
本明細書において使用される配列番号２１は、成熟ラクリチン（配列番号１０）の２５カルボキシ末端アミノ酸の欠失を含んでなる欠失変異体を指す。配列番号２１はまた、Ｃ−２５と称される。
【００８７】
本明細書において使用される配列番号２２は、成熟ラクリチン（配列番号１０）の５９カルボキシ末端アミノ酸の欠失を含んでなる欠失変異体を指す。配列番号２２はまた、Ｃ−５９と称される。
【００８８】
実験、診断または処置の「被験体」は、ヒトを含む動物である。
【００８９】
用語「実質的に純粋な」は、それに天然に付随する成分から分離されている化合物、例えば、タンパク質またはポリペプチドを説明する。典型的に、サンプル中の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９９％の全材料（容積、湿もしくは乾燥重量、またはモルパーセントもしくはモル画分による）が目的の化合物である場合、化合物は実質的に純粋である。純度は、任意の適切な方法、例えば、ポリペプチドの場合、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。化合物、例えば、タンパク質はまた、それが、天然に関連する成分を本質的に含まない場合またはそれが、その天然の状態においてそれに付随する天然の混入物から分離される場合、実質的に精製される。
【００９０】
「実質的に純粋な核酸」は、天然に存在する状態でそれの側面に配置する（ｆｌａｎｋ）配列から精製されている核酸配列、セグメントまたはフラグメント、例えば、フラグメントに普通に隣接する配列（例えば、それが天然に存在するゲノムにおいてフラグメントに隣接する配列）から取り出されているＤＮＡフラグメントを指す。用語はまた、核酸に天然に付随する他の成分、例えば、細胞においてそれに天然に付随するＲＮＡもしくはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製されている核酸にもあてはまる。
【００９１】
「治療的」処置は、徴候を縮小または排除する目的のために、病理の徴候を示す被験体に投与される処置である。
【００９２】
化合物の「治療有効量」は、化合物が投与される被験体に有益な効果を提供するのに十分である化合物の量である。
【００９３】
本明細書において使用する用語「処置する」は、特定の障害もしくは病態の予防、特定の障害もしくは病態に関連する症状の緩和および／または前記症状を予防もしくは排除することを含む。「予防的」処置は、疾患に関連する病状を発症する危険性を減少する目的のために、疾患の徴候を示さないかまたは疾患の初期の徴候のみを示す被験体に投与される処置である。本明細書において使用する用語「処置する」は、特定の疾患、障害もしくは病態に関連する症状を緩和することおよび／または前記症状を予防もしくは排除することを含む。
【００９４】
「ベクター」はまた、単離核酸を含んでなり、単離核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる合成物を含む意味である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物、プラスミド、およびウイルスに関連するポリヌクレオチドを含むがこれらに限定されない多数のベクターが公知である。従って、用語「ベクター」は、自律複製するプラスミドまたはウイルスを含む。用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの核酸の細胞への伝達を容易にする非プラスミド性および非ウイルス性化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、プラスミド、コスミド、λファージベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
「発現ベクター」は、発現させようとするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含んでなる組換えポリヌクレオチドを含んでなるベクターを指す。発現ベクターは、発現のためのシス作用性エレメントを含んでなり、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によってかまたはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターは、コスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソームに含有される）および組換えポリヌクレオチドを組み入れるウイルスのような当該分野において公知のすべてのものを含む。
【００９６】
本明細書において使用する用語「創傷」は、組織または細胞層に対する物理的断裂または破断に関する。創傷は、外科手術を含む任意の物理的傷害によって生じ得る。
【００９７】
発明の実施形態
本発明は、ヒト増殖因子様分子、「ラクリチン」、およびラクリチン、またはそのフラグメント、誘導体、もしくはホモログを含んでなる組成物の使用に関する。本発明はまた、ラクリチンをコードする核酸配列、ならびにラクリチンの発現を制御する核酸調節エレメントの使用を包含する。全長「ラクリチン」ｃＤＮＡは、ヒト涙腺ライブラリー（配列番号２）からクローニングされており、ゲノム配列の５．２ｋｂ上流および２．８ｋｂ下流を含む対応するゲノム遺伝子（配列番号１）は、クローニングされ、配列決定されている。
【００９８】
一実施形態では、本発明は、配列番号４、配列番号１０、配列番号４の生物活性フラグメントのアミノ酸配列、または１つもしくはそれ以上の保守的アミノ酸置換だけ配列番号４と異なるアミノ酸配列を含んでなる精製ポリペプチドの使用に関する。より好ましくは、精製ポリペプチドは、２０もしくはそれ以下の保守的アミノ酸置換、より好ましくは、１０もしくはそれ以下の保守的アミノ酸置換だけ配列番号４と異なるアミノ酸配列を含んでなる。あるいは、ポリペプチドは、１〜５変更だけ配列番号４と異なるアミノ酸配列を含んでなり得、ここで、変更は、独立して、単一のアミノ酸欠失、挿入、または置換から選択される。１つの好適な実施形態では、配列番号４または配列番号１０からなる群から選択されるポリペプチドおよび医薬上許容される担体を含んでなる組成物が提供される。好適な別の実施形態では、フラグメントは、Ｃ末端から最大２５アミノ酸が欠失されたフラグメントの群から選択される配列番号１０のフラグメント（成熟処理ラクリチン）である。別の実施形態では、２５アミノ酸までが配列番号４（全長ラクリチン）のＮ末端から欠失される。
【００９９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関連する組換えラクリチン遺伝子を使用して実施された最近の生理学的実験から、ラクリチンは、生存因子であることが示唆され、即ち生理学的量のラクリチンの添加によって、細胞培養の長期生存が促進された。従って、本発明の一実施形態では、ラクリチンは、一般に、眼細胞および組織の長期生存を増強するための生存因子として、より詳細には、環境傷害の存在下で、個体の眼に局所投与される。ラクリチンが細胞増殖を促進することについては先に記載されており、従って、角膜創傷治癒を促進するための有用性を有するが、細胞生存を促進するためにラクリチンを使用することは、驚くべきかつ重要なことであり、ラクリチンの紛れのない機能である。生存可能かつ健康な細胞は必ずしも増殖性である必要はなく、増殖は、しばしば、所定の細胞コンパートメントに限定される。角膜の暴露された表面を形成するほとんどの細胞は、生存可能かつ健康であるが、増殖しない。角膜が負傷する場合、増殖が観察される。創傷治癒を測定するための方法は、当該分野において公知である（ウー（Ｗｏｏ）ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８０：６３３−６４２，２０００年においてレビューされた）。細胞生存を測定するための方法は当該分野において公知であり、多様な細胞、分子、生化学的、および組織学的技術を含む。
【０１００】
ラクリチンは、角膜の涙膜への放出のために、涙腺によって適量が天然に産生され、ここで、それは、ＥＬＩＳＡによって容易に検出することができる。従って、特に、汚染物質への環境暴露およびＵＶ暴露が増加する場合、およびドライアイを患う集団の割合が拡大するため、眼表面の健康を促進する際のラクリチンの治療可能性は重要である。従って、本発明は、さらに、涙液の涙腺分泌の増加を誘導することに関する。
【０１０１】
角膜は眼の主な屈折面であり、暴露（直接的外傷、乾燥、放射材および電離エネルギー）、感染因子（細菌、ウイルス（とりわけ、単純ヘルペスおよび帯状疱疹）、真菌、および寄生体）、ならびに時々、アトピー性皮膚炎、瘢痕性類天疱瘡、酒さ、および多形紅斑（スティーブンス・ジョンソン症候群）のような全身性皮膚障害に関する炎症を含む環境的危険性または傷害を受け易い。細菌は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）を含む。角膜炎は、角膜の炎症または感染である。それは、しばしば、虹彩（虹彩炎）またはぶどう膜（虹彩、毛様体、および脈絡膜）（ぶどう膜炎）の炎症に関連する。ぶどう膜炎または虹彩炎と合併した角膜炎は、一般に、ライター病において、および時折ベーチェット病において認めら得る。角膜炎およびぶどう膜炎はまた、単純ヘルペス感染を伴って、サルコイドーシスにおいて、および膠原病において発症し得る。
【０１０２】
上記のように、炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびケモカインＩＬ−８のような多数のメディエーターは、角膜炎症の発達および進行に関与する。シクロオキシゲナーゼ（主に、ＰＧＥ２）、リポオキシゲナーゼ（ｌｉｐｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）（１２（ｓ）−ＨＥＴＥ）およびシトクロムＰ４５０（１２（ｒ）−ＨＥＴＥ）の活性によって生成されるアラキドン酸由来エイコサノイドもまた関与する。局所的適用されたラクリチンは、眼表面の健康に対して莫大な影響を及ぼし得る。従って、本発明の一実施形態では、ラクリチンは、炎症性サイトカインのような炎症性物質によって誘導または補足されるような炎症プロセスに対するアンタゴニストとして有用である。一態様では、ラクリチンポリペプチド、またはそのフラグメントもしくはホモログは、炎症性サイトカインに対する細胞の生存を増強する。
【０１０３】
一態様では、炎症性サイトカインは、ＥＬＩＳＡによって評価することができる。アラキドン酸誘導体は、ＨＰＬＣを使用する脂質に基づくアッセイを介して代謝物を測定することによって、研究することができる。アポトーシスカスケードは、細胞生存能アッセイ（ＭＴＴおよびフローサイトメトリー）、カスパーゼ（−３、−８および−９）の切断された基質の比色検出、ミトコンドリアなどからのシトクロムｃ放出を使用して、調べることができる。別の態様では、多様な抗体（例えば、ＰＫＣα、ＮＦκＢ、ＮＦＡＴ）を使用する免疫蛍光を調べて、どのシグナル伝達経路が生じているかを決定することができる。ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、ヒト角膜上皮細胞におけるＮＦκＢおよびＮＦＡＴの役割を決定することができる。一態様では、ラクリチンおよびその異なる欠失構築物を、ＰＫＣαインヒビターＧｏ６９７６およびＰＬＣインヒビターＵ７３１２２のような多様な薬理学的インヒビターと共に使用して、炎症性サイトカインに対するラクリチンの阻害効果について試験する。眼の表面の炎症に対する感受性は、ラクリチン−ノックインマウスについて正常なマウスにおいて比較することができる。
【０１０４】
一実施形態に従えば、環境傷害との接触後、または眼関連疾患、障害または病態に対して、哺乳動種において眼の細胞死を減少あるいは予防する方法が提供される。方法はまた、環境傷害に暴露されている細胞を、ラクリチン、またはそのフラグメント、誘導体、もしくはホモログを含んでなる組成物に接触させる工程を含んでなる。本明細書において使用されるように、環境傷害に「暴露される」細胞は、環境傷害に直接接触されている該細胞、ならびに他の細胞と環境傷害との直接的接触の結果として間接的に患っている該細胞を含む。一実施形態では、眼細胞は、角膜上皮細胞を含んでなる。一実施形態では、暴露された細胞は、ラクリチンポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、もしくはホモログを含んでなる局所的に投与された眼科用製剤と接触される。
【０１０５】
本発明のラクリチンを含んでなる組成物は、予防的に投与して、特に、そのようなエレメントに対する過剰な暴露に直面するそれらの個体について、ＵＶ暴露または汚染物質に対する暴露のような一般的な環境傷害の存在下における角膜上皮細胞の生存を促進することができる。別の実施形態では、本発明のラクリチンを含んでなる組成物は、炎症および／または細菌感染に対する免疫応答を調節するために使用される。別の実施形態では、ラクリチンを含んでなる組成物は、眼に対する外科手術、例えば白内障または他の視力補正の外科手術後の治癒プロセスにおける援助のために投与することができる。本発明は、レーザー手術を含む眼のすべての外科手術を包含する。
【０１０６】
一実施形態に従えば、眼の感染を処置するための方法が提供される。方法は、ラクリチンポリペプチドを含んでなる組成物を眼に局所的に投与する工程を含んでなる。一実施形態では、組成物は、抗微生物物質をさらに含んでなる。適切な眼科用抗微生物物質は当業者に公知であり、米国特許第５，３００，２９６号明細書、同第６，３１６，６６９号明細書、同第６，３６５，６３６号明細書および同第６，５９２，９０７号明細書（それらの開示内容は本明細書において援用されている）に記載のものを含む。本発明に従う用途に適切な抗微生物物質の例として、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、二グルコン酸クロルヘキシジンまたは二酢酸クロルヘキシジン、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピル（パラベン類）、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀もしくは硝酸フェニル水銀、ソルビン酸、ならびにチメロサールが挙げられる。
【０１０７】
本発明のラクリチンを含んでなる組成物は、一実施形態において、環境傷害に供される正常な個体における角膜異常の処置および／または予防のために使用される。そのような傷害として、大気汚染、花粉、極端な温度（即ち、鉄鋼労働者）および宇宙旅行が挙げられる。組成物はまた、シェーグレンまたは非シェーグレン症候群から生じるドライアイ角膜上皮欠損および炎症ならびに長期間のコンタクトレンズ使用から生じ得る上皮欠損および炎症を処置および緩和するために使用することができる。さらに、ラクリチンを含んでなる組成物を使用して、角膜移植または角膜手術後の角膜修復の成功を増強することができる。
【０１０８】
本発明はまた、ラクリチンポリペプチド、またはそのフラグメント、ホモログ、および誘導体をコードする核酸配列の使用を包含する。特に、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、またはそのフラグメントの配列を含んでなる核酸配列に関する。一実施形態では、配列番号１の任意の８連続ヌクレオチドに同一である少なくとも８連続ヌクレオチド（即ち、ハイブリダイズ可能な部分）を含んでなる精製核酸が提供される。他の実施形態では、核酸は、配列番号１の少なくとも２５（連続）ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、または５００ヌクレオチドを含んでなる。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号３の配列または配列番号３の連続２５ｂｐ配列に同一である２５ｂｐ核酸配列を含んでなる。それはまた、配列番号４および配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなるペプチドをコードする核酸配列に関する。
【０１０９】
本発明の別の実施形態では、ラクリチンポリペプチド、またはそのフラグメントもしくはホモログをコードする核酸配列は、発現ベクターに挿入し、細胞にトランスフェクトして、標的細胞において組換えラクリチンを発現させるために使用することができる。一実施形態に従えば、配列番号３の核酸配列は、遺伝子配列を適切な調節配列に作動可能に連結する様式で真核生物発現ベクターに挿入され、ラクリチンが真核宿主細胞において発現される。適切な真核宿主細胞およびベクターは、当業者に公知である。特に、ラクリチンをコードする核酸配列は、リポソーム、ウイルスに基づくベクター、またはマイクロインジェクションのような送達機構を使用して、インビトロまたはインビボで細胞に添加することができる。従って、本発明の一態様は、配列番号４のラクリチンポリペプチドを発現する組換え遺伝子を含有するトランスジェニック細胞系統に関する。
【０１１０】
本発明はまた、ラクリチン遺伝子プロモーターの制御下で異種遺伝子を発現するための核酸構築物に関する。一実施形態に従えば、異種遺伝子に作動可能に連結された配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される核酸配列を含んでなる核酸構築物が提供される。一実施形態に従えば、異種遺伝子は、マーカーをコードするレポーター遺伝子である。マーカーは、検出シグナルを生成し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（チャルフィー（Ｃｈａｌｆｉｅ）ら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ１１：２６３：８０２−８０５）またはルシフェラーゼ（グールド（Ｇｏｕｌｄ）ら、１９８８年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５：１７５：５−１３）のような光を発することが可能なタンパク質、ならびに基質に触媒作用し得るタンパク質（例えば、β−ガラクトシダーゼなど）を誘導する任意の遺伝子産物であり得る。マーカーはまた、抗体によって検出可能である細胞内または細胞表面タンパク質を含んでなり得る。レポーター分子は、さらに、またはあるいは、細胞内に通常は含有されない独特な核酸配列によって、検出することができる。
【０１１１】
本明細書において使用されるように、ＧＦＰは、その蛍光がスペクトルの主に緑色領域にある天然に存在する蛍光タンパク質のファミリーのメンバーを指す。用語は、改変または増強された特別な特性を伴うタンパク質の変異形態を含む。これらの変異形態のいくつかについては、コーマック（Ｃｏｒｍａｃｋ）ら、１９９６年、Ｇｅｎｅ１７３：３３−３８およびオルモ（Ｏｒｍｏ）、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７３：１３９２−１３９５（それらの実体は本明細書において参照により援用される）に記載されている。用語はまた、（例えば、欠失、置換または挿入によって）１つもしくはそれ以上アミノ酸残基の同一性または局在だけ天然に存在する形態とは異なり、それらが検出可能なシグナル（例えば、蛍光）を生じる限り、天然に存在する形態のいくつかまたはすべての特性を共有するＧＦＰポリペプチドのポリペプチドアナログ、フラグメントあるいは誘導体を含む。野生型ＧＦＰは３９５ｎｍで最大吸収し、５０９ｎｍで放射する。高レベルのＧＦＰ発現が、酵母〜ヒト細胞の範囲の細胞において得られている。用語はまた、青色蛍光タンパク質（Ｂｌｕｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＢＦＰ）、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１６：８５０８−８５１１（本明細書において参照により援用される）において記載のコーディング配列を含む。
【０１１２】
本発明の別の実施形態は、ラクリチンポリペプチドに対して作製される抗体を含んでなる。これらの抗体は、標準的な担体と共に製剤化され得、場合により、治療または診断用組成物を調製するために標識され得る。ラクリチンに対する抗体は、当該分野において周知である方法を使用して、作製される。そのような抗体として、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ（即ち、「ヒト化」抗体）、単一鎖（組換え）、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメントを挙げることができるが、これらに限定されない。これらの抗体は、ラクリチンの発現もしくは過剰発現によって特徴付けられる病態または疾患の診断のための診断薬として、あるいは不適切なラクリチン発現によって特徴付けられる病体または疾患について処置されている患者をモニターするためのアッセイにおいて、使用することができる。診断目的に有用な抗体は、治療について上記のものと同じ様式で調製してもよい。抗体は、修飾を伴うかまたは伴わずに使用してもよく、それらを、共有結合または非共有結合のいずれかでマーカーと接続することによって、標識してもよい。一実施形態に従えば、配列番号４のタンパク質に特異的に結合する抗体が提供され、より好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。
【０１１３】
本発明はまた、抗イデオタイプ抗体、アンタゴニストおよびアゴニストを含む抗体、ならびにラクリチン遺伝子の発現を阻害する（転写因子インヒビター、アンチセンスおよびリボザイム分子、または遺伝子もしくは調節配列置換構築物）か、あるいはラクリチンの発現を促進する（例えば、発現構築物であって、ここで、配列番号３のようなラクリチンコーディング配列は、プロモーター、プロモーター／エンハンサーなどのような発現制御エレメントと作動可能に会合する）化合物またはヌクレオチド構築物を包含する。
【０１１４】
本発明はまた、ラクリチンに対する抗体を惹起するための抗原性組成物を包含する。一実施形態では、配列番号４のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントを含んでなる抗原性組成物が提供される。
【０１１５】
現在の涙液補充物は、一部に、そのような製品から得られる軽減が極めて短期間（１５分間未満）であるため、患者には普及していない。涙液に代わるアプローチの例には、緩衝化等張性食塩溶液、溶液をより粘性にすることで眼から容易に流出し難くする水溶性ポリマーを含有する水溶液が含まれる。涙液再構成はまた、リン脂質およびオイルのような涙膜の１つもしくはそれ以上の成分を提供することによって試みられる。これらの処置アプローチの例については、米国特許第４，１３１，６５１号明細書（シャー（Ｓｈａｈ）ら）、米国特許第４，３７０，３２５号明細書（パックマン（Ｐａｃｋｍａｎ））、米国特許第４，４０９，２０５号明細書（シャイブリー（Ｓｈｉｖｅｌｙ））、米国特許第４，７４４，９８０号明細書および同第４，８８３，６５８号明細書（ホリー（Ｈｏｌｌｙ））、米国特許第４，９１４，０８８号明細書（グロネック（Ｇｌｏｎｅｋ））、米国特許第５，０７５，１０４号明細書（グレッセル（Ｇｒｅｓｓｅｌ）ら）ならびに米国特許第５，２９４，６０７号明細書（グロネック（Ｇｌｏｎｅｋ）ら）（それらの開示内容は本明細書において援用される）において開示される。現存する眼科用製剤また、ＴＧＦ−β、副腎皮質ステロイド、またはアンドロゲンを含んでもよい。すべて、眼に対して非特異的であり、全身性効果を有する。対照的に、ラクリチンは、高度に眼に限定され、ヒト涙液および涙膜の天然の構成分である。
【０１１６】
ラクリチン、またはそのフラグメント、ホモログ、もしくは誘導体を含んでなる眼科用製剤（例えば、ラクリチンを含有する人工涙液）は、ラクリチンの活性およびその局在化された効果のため、高度に所望される。本発明の一実施形態に従えば、ラクリチンを含んでなる組成物は、角膜創傷治癒を増強する、および／または涙液流出が不十分な患者を処置するために使用される。より詳細には、ラクリチンは、ラクリチンポリペプチドを含んでなる組成物の局所投与によって、シェーグレン症候群を含むドライアイ症候群を処置するため、および角膜創傷治癒を増強するために、一実施形態に従って使用される。一実施形態に従えば、医薬上許容される担体および治療有効量の実質的に純粋な配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは誘導体を含んでなる組成物を使用して、ドライアイ症候群を処置する。さらなる実施形態では、精製ラクリチンポリペプチドおよび精製抗微生物物質を含んでなる眼科用組成物が提供され、眼の微生物感染を処置するために使用される。適切な眼科用抗微生物物質は当業者に公知であり、米国特許第５，３００，２９６号明細書、同第６，３１６，６６９号明細書、同第６，３６５，６３６号明細書および同第６，５９２，９０７号明細書（それらの開示内容は本明細書において援用されている）に記載のものを含む。
【０１１７】
本発明のラクリチン組成物は、標準的な眼科用成分を使用して製剤化することができ、好ましくは、組成物は、局所投与のための溶液、懸濁液、および他の剤形として製剤化される。水溶液は、製剤化の容易性、生物学的適合性（特に、処置しようとする疾病、例えば、ドライアイ型疾患および障害を考慮して）、ならびに罹患した眼に１〜２滴の溶液を点眼することによって、そのような組成物を用意に投与する患者の能力に基づき、一般に好適である。しかし、組成物はまた、懸濁液、粘性もしくは半粘性ゲル、または他のタイプの固体もしくは半固体組成物であってもよい。
【０１１８】
本発明の組成物として、界面活性剤、防腐剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、抗酸化剤、等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）、緩衝液、保存剤、共溶媒および増粘剤（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を挙げることができる。眼科用製剤において有用な多様な界面活性剤を、本発明の組成物において用いることができる。これらの界面活性剤は、ラクリチンの化学的分解を防止することを援助し得、また、組成物が包装される容器にラクリチンが結合することを防止する。界面活性剤の例として次のものが挙げられるが、これらに限定されない。クレモホール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）．ＲＴＭ．ＥＬ、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ポリオキシル４０硬化ヒマシ油、ポリオキシル２３ラウリルエーテルおよびポロキサマー４０７を組成物に使用することができる。貯蔵中に酸化物質からラクリチンポリペプチドを保護するために、抗酸化剤を本発明の組成物に添加してもよい。そのような抗酸化剤の例として、ビタミンＥおよびそのアナログ、アスコルビン酸および誘導体、ならびにブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
現存する人工涙液製剤はまた、ラクリチン活性物質のための医薬上許容される担体として使用することができる。従って、一実施形態では、ドライアイ症候群のための現存の人工涙液製品を改良し、ならびに角膜創傷治癒を援助するための製品を開発するために、ラクリチンが使用される。担体として有用な人工涙液組成物の例として、ティアーズナチュラル（Ｔｅａｒｓ  Ｎａｔｕｒａｌｅ）．ＲＴＭ．、ティアーズナチュラルＩＩ（Ｔｅａｒｓ  Ｎａｔｕｒａｌｅ  ＩＩ）．ＲＴＭ．、ティアーズナチュラルフリー（Ｔｅａｒｓ  Ｎａｔｕｒａｌｅ  Ｆｒｅｅ）．ＲＴＭ．、およびバイオンティアーズ（Ｂｉｏｎ  Ｔｅａｒｓ）．ＲＴＭ．（アルコンラボラトリ社（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、フォートワース（Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ）、テキサス州）のような市販品が挙げられるが、これらに限定されない。他のリン脂質担体製剤の例として、米国特許第４，８０４，５３９号明細書（グオ（Ｇｕｏ）ら）、米国特許第４，８８３，６５８号明細書（ホリー（Ｈｏｌｌｙ））、米国特許第４，９１４，０８８号明細書（グロネック（Ｇｌｏｎｅｋ））、米国特許第５，０７５，１０４号明細書（グレッセル（Ｇｒｅｓｓｅｌ）ら）、米国特許第５，２７８，１５１号明細書（Ｋｏｒｂら）、米国特許第５，２９４，６０７号明細書（グロネック（Ｇｌｏｎｅｋ）ら）、米国特許第５，３７１，１０８号明細書（コルブ（Ｋｏｒｂ）ら）、米国特許第５，５７８，５８６号明細書（グロネック（Ｇｌｏｎｅｋ）ら）において開示されるものが挙げられる、上記の特許は、それらが本発明のリン脂質担体として有用なリン脂質組成物を開示する限り、本明細書において参照により援用される。
【０１２０】
他の化合物もまた、担体の粘性を増加するために、本発明の眼科用組成物に添加することができる。粘性増強剤の例として次のものが挙げられるが、これらに限定されない。ヒアルロン酸およびその塩、コンドロイチン硫酸およびその塩、デキストラン、セルロースファミリーの多様なポリマーのような多糖、ビニルポリマー、ならびにアクリル酸ポリマー。一般に、リン脂質担体または人工涙液担体組成物は、１〜４００センチポアズ（「ｃｐｓ」）の粘度を示す。人工涙液またはリン脂質担体を含有する好適な組成物は、約２５ｃｐｓの粘度を示す。
【０１２１】
局所用眼科用製品は、典型的に、複数用量の形態で包装される。従って、保存剤は、使用中の微生物混入を防止するために必要である。適切な保存剤として次のものが挙げられる。塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、臭化ベンゾドデシニウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、ポリクオタニウム−１、または当業者に公知の他の物質。そのような保存剤は、典型的に、０．００１〜１．０％ｗ／ｖのレベルで用いられる。本発明の単位投与組成物は、無菌的であり、典型的に保存処置がされていない。従って、そのような組成物は、一般に、保存剤を含有しない。
【０１２２】
ラクリチン遺伝子発現を調節する遺伝子プロモーターは、先に記載の任意の涙腺遺伝子に最も特異的であるため、この遺伝子の調節エレメントを使用して、眼における他の遺伝子産物を発現させ得る。特に、ラクリチン遺伝子プロモーターを、広範な外因性遺伝子に作動可能に連結して、涙腺への遺伝子産物の発現を調節する、および／または遺伝子治療として使用して、ドライアイ症候群を処置することができる。
【０１２３】
本発明のペプチドは、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、１９８４年、ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州においてスチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）らにより記載、およびＴｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４年、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨークにおいてボダンズキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）およびボダンズキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）により記載の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）のような標準的な良好に確立された技術によって容易に調製され得る。はじめに、適切に保護されたアミノ酸残基が、そのカルボキシル基を介して、架橋されたポリスチレンまたはポリアミド樹脂のような誘導体化された不溶性のポリマー支持体に付着される。「適切に保護された」は、アミノ酸のα−アミノ基、および任意の側鎖官能基の両方における保護基の存在を指す。側鎖保護基は、一般に、合成全体を通して使用される溶媒、試薬および反応条件に対して安定であり、最終的なペプチド産物に影響を及ぼさない条件下で脱離可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、最初のアミノ酸からのＮ保護基の脱離、所望されるペプチドの配列での次のアミノ酸のカルボキシル末端のそれへの結合によって行われる。このアミノ酸もまた、適切に保護される。次に加わるアミノ酸のカルボキシルを活性化させ、カルボジイミド、対称酸無水物またはヒドロキシベンゾトリアゾールまたはペンタフルオロフェニルエステルのような「活性エステル」基への形成のような反応基への形成によって、支持体結合アミノ酸のＮ末端と反応させることができる。
【０１２４】
固相ペプチド合成方法の例として、α−アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｃａｒｂｏｎｙｌ）を利用したＢＯＣ方法、および９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｃａｒｂｏｎｙｌ）を利用して、アミノ酸残基のα−アミノを保護するＦＭＯＣ方法が挙げられ、両方法とも当業者に周知である。
【０１２５】
Ｎおよび／またはＣブロック基の組み入れもまた、固相ペプチド合成方法に常用のプロトコルを使用して、達成することができる。Ｃ末端ブロック基の組み入れのために、例えば、所望されるペプチドの合成は、典型的に、樹脂からの切断によって所望されるＣ末端ブロック基を有するペプチドが生じるように、化学的に修飾されている支持樹脂を固相として使用して達成される。Ｃ末端が第一級アミノブロック基を有するペプチドを提供するために、ペプチド合成が完了する時に、フッ化水素酸による処置により所望されるＣ末端アミド化ペプチドが遊離されるように、例えば、合成は、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂を使用して、実施される。同様に、Ｃ末端におけるＮ−メチルアミンブロック基の組み入れは、ＨＦ処置時に、Ｎ−メチルアミド化Ｃ末端を有するペプチドを遊離するＮ−メチルアミノエチル誘導体化ＤＶＢ（樹脂）を使用して達成される。エステル化によるＣ末端のブロックもまた、従来の手順を使用して、達成することができる。これは、所望されるアルコールとの以後の反応によりエステル官能基を形成させることを可能にするために、樹脂からの側鎖ペプチドの遊離を可能にする樹脂／ブロック基の組み合わせの使用を必要とする。メトキシアルコキシベンジルまたは等価なリンカーによって誘導体化されたＤＶＢ樹脂と組み合わされたＦＭＯＣ保護基は、この目的のために使用することができ、ジクロロメタン中ＴＦＡによって生じる支持体からの切断を伴う。次いで、例えば、ＤＣＣによる適切に活性化されたカルボキシル官能基のエステル化は、所望されるアルコールの添加、続いて、エステル化されたペプチド産物の脱保護および単離によってプロセスすることができる。
【０１２６】
Ｎ末端ブロック基の組み入れを達成することができる一方、合成されたペプチドはなお、例えば、適切な無水物およびニトリルによる処置によって、樹脂に付着される。Ｎ末端においてアセチル−ブロック基を組み入れるために、例えば、樹脂に結合したペプチドを、アセトニトリル中２０％無水酢酸で処置することができる。次いで、Ｎブロックされたペプチド産物を樹脂から切断し、脱保護し、続いて、単離することができる。
【０１２７】
化学的または生物学的合成技術のいずれかから得られるペプチドが所望されるペプチドであることを確実にするために、ペプチド組成の分析を行うべきである。そのようなアミノ酸組成分析は、ペプチドの分子量を決定するための高分解能質量分析を使用して、行うことができる。あるいは、またはさらに、ペプチドのアミノ酸含有量は、酸性水溶液においてペプチドを加水分解し、ＨＰＬＣ、アミノ酸分析器を使用して、混合物の成分を分離し、同定し、定量することによって、確認することができる。また、ペプチドを配列順に分解し、順にアミノ酸を同定するタンパク質シークエネーターを使用して、ペプチドの配列を明確に決定してもよい。
【０１２８】
その使用の前に、ペプチドを精製して、混入物を除去する。これに関して、ペプチドは、適切な規制当局（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｃｉｅｓ）によって設定された基準を満たすように精製されることが理解されよう。例えば、Ｃ４−、Ｃ８−またはＣ１８−シリカのようなアルキル化シリカカラムを使用する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む多くの従来の精製手順のうちのいずれか１つを使用して、要求されたレベルの純度を達成することができる。増加する有機含有量の勾配移動相、例えば、通常、少量のトリフルオロ酢酸を含有する水性緩衝液中のアセトニトリルを一般に使用して、精製が達成される。また、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、それらの電荷に基づいて、ペプチドを分離することもできる。
【０１２９】
もちろん、ペプチドまたはその抗体、誘導体、もしくはフラグメントは、活性に影響を及ぼさずに修飾されるアミノ酸残基を組み入れ得ることが理解されよう。例えば、末端を、「所望されない分解」（化合物の機能に影響を及ぼす可能性のあるその末端における化合物の任意のタイプの酵素的、化学的または生化学的分解、即ち、その末端における化合物の配列分解を包含することを意味する用語）からのＮおよびＣ末端を保護および／または安定化するのに適切なブロック基、即ち、化学置換基を含むように誘導体化してもよい。
【０１３０】
ブロック基は、インビボで、ペプチドの活性に悪影響を及ぼさないペプチド化学の分野において従来使用される保護基を含む。例えば、適切なＮ末端ブロック基は、Ｎ末端のアルキル化またはアシル化によって、導入することができる。適切なＮ末端ブロック基の例として、Ｃ１〜Ｃ５分岐または非分岐アルキル基、ホルミルおよびアセチル基のようなアシル基、ならびにアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基のようなそれらの置換形態が挙げられる。アミノ酸の脱アミノアナログもまた、有用なＮ末端ブロック基であり、ペプチドのＮ末端に結合され得るかまたはＮ末端残基の代わりに使用され得るかのいずれかである。Ｃ末端のカルボキシル基が組み入れられるかもしくは組み入れなれないかのいずれかである適切なＣ末端ブロック基は、エステル、ケトン、またはアミドを含む。エステルまたはケトンを形成するアルキル基、特に、メチル、エチルおよびプロピルのような低級のアルキル基、ならびに第一級アミン（−ＮＨ２）のようなアミドを形成するアミノ基、ならびにメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノのようなモノ−およびジ−アルキルアミノ基などがＣ末端ブロック基の例である。アグマチンのような脱炭酸化された（Ｄｅｓｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ）アミノ酸アナログもまた、有用なＣ末端ブロック基であり、ペプチドのＣ末端残基に結合することができるかまたはその代わりに使用することができるかのいずれかである。さらに、末端における遊離のアミノおよびカルボキシル基は、ペプチドから完全に取り出して、ペプチド活性に対する影響を伴わないその脱アミノおよび脱炭酸形態を得ることができることが理解されよう。
【０１３１】
他の修飾もまた、活性に悪影響を及ぼさずに組み入れることができ、これらは、天然のＬ型異性体の１つもしくはそれ以上のアミノ酸のＤ型異性体のアミノ酸による置換を含むが、これらに限定されない。従って、ペプチドは、１つもしくはそれ以上のＤ−アミノ酸残基を含み得るか、またはすべてがＤ型であるアミノ酸を含んでなり得る。本発明に従うレトロ逆転（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）型のペプチド、例えば、すべてのアミノ酸がＤ−アミノ酸形態で置換される逆（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ペプチドもまた、考慮される。
【０１３２】
本発明の酸付加塩もまた、機能的等価物として考慮される。従って、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、または酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸（ｔａｔａｒｉｃ）、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などのような有機酸で処置され、ペプチドの水溶性塩を提供する本発明に従うペプチドは、本発明における使用に適切である。
【０１３３】
本発明はまた、タンパク質のアナログを提供する。アナログは、保守的アミノ酸配列の差異もしくは配列に影響を及ぼさない修飾物、または両方により天然に存在するタンパク質またはペプチドと異なり得る。
【０１３４】
例えば、タンパク質またはペプチドの一次配列を変更するが、通常その機能は変更しない保守的アミノ酸の変化が作製される。このため、１０もしくはそれ以上の保守的アミノ酸変化は、典型的に、ペプチド機能に影響を及ぼさない。保守的アミノ酸置換は、典型的に、以下のグループ内の置換を含む。
グリシン、アラニン、
バリン、イソロイシン、ロイシン、
アスパラギン酸、グルタミン酸、
アスパラギン、グルタミン、
セリン、スレオニン、
リジン、アルギニン、
フェニルアラニン、チロシン。
【０１３５】
修飾（通常、一次配列を変更しない）は、インビボ、もしくはインビトロでのポリペプチドの化学的誘導体化、例えば、アセチル化、またはカルボキシル化を含む。また、グリコシル化の修飾、例えば、その合成およびプロセシング中またはさらなるプロセシング工程において、ポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって、例えば、ポリペプチドを、グリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば、哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素に暴露することによって、作製されるものが含まれる。リン酸化されたアミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンを有する配列もまた包持される。
【０１３６】
通常の分子生物学的技術を使用して、タンパク質分解に対するそれらの耐性を改善するかもしくは可溶性特性を最大化するかもしくはそれらを治療用物質としてより適切にするように修飾されているポリペプチドまたは抗体フラグメントもまた含まれる。そのようなポリペプチドのアナログは、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または天然には存在しない合成アミノ酸を含有するものを含む。本発明のペプチドは、本明細書において列挙される特定の例示的プロセスのいずれかの生成物に限定されない。
【０１３７】
本明細書に記載のようにして得られる実質的に純粋なタンパク質は、タンパク質精製のための以下の既知の手順によって精製することができ、ここで、免疫学的、酵素的または他のアッセイを使用して、手順の各段階において精製をモニターする。タンパク質の精製方法は当該分野において周知であり、例えば、ドイッチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）ら（編、１９９０年、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ハーコートブレイスジョバノビッチ（Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ））において記載されている。
【０１３８】
本発明はまた、本発明の組成物および組成物を被験体に投与することを説明する取扱説明書を含んでなるキットを含む。別の実施形態では、このキットは、組成物を投与する前に本発明の組成物を溶解または懸濁するのに適切な（好ましくは無菌の）溶媒を含んでなる。
【０１３９】
本明細書において使用する用語「生理学的に許容される」エステルまたは塩は、組成物を投与しようとする被験体に有害ではない医薬組成物の他の任意の成分に適合性である有効成分のエステルまたは塩の形態を意味する。
【０１４０】
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、任意の既知の方法によって調製され得るか、またはその後、薬理学の分野において開発され得る。一般に、そのような調製方法は、有効成分を担体または１つもしくはそれ以上の他の付属成分とを会合させ、次いで、必要または所望であれば、製品を所望される単一または複数の投与単位に形成または包装する工程を含む。
【０１４１】
本発明書において提供される医薬組成物の記載は、原則として、ヒトに対する倫理的投与に適する医薬組成物に関するが、当業者であれば、そのような組成物はすべての種類の動物への投与に一般に適切であることを理解するであろう。組成物を多様な動物への投与に適切にするためのヒトへの投与に適切な医薬組成物の修飾は、良好に理解されており、熟練した薬学者であれば、単なる通常の（存在すれば）実験を伴うそのような修飾を設計および実施することができる。本発明の医薬組成物の投与が考慮される被験体としては、ヒトおよび他の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、およびイヌのような商業的に関連の哺乳動物ならびにニワトリ、アヒル、ガチョウ、およびシチメンチョウのような商業関連のトリを含むトリが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
本発明の方法において有用である医薬組成物は、調製し、包装し、または経口、直腸、膣、非経口、静脈内、局所、肺、鼻内、口内、眼、髄腔内または別の投与経路に適切な製剤で販売され得る。他の考慮される製剤としては、計画されたナノ粒子、リポソーム調製物、有効成分を含有する放出性赤血球、および免疫学的に基づく製剤が挙げられる。
【０１４３】
本発明の医薬組成物は、単一の単位用量、もしくは単一単位用量の複数としてバルク形態で調整、包装、または販売され得る。本明細書において使用される「単位用量」は、予め決定された量の有効成分を含んでなる医薬組成物の個別の量である。有効成分の量は、一般に、被験体に投与される有効成分の用量または例えば、そのような用量の２分の１または３分の１であるようなそのような量の簡便な分画に等しい。
【０１４４】
本発明の医薬組成物における有効成分、医薬上許容される担体、およびさらなる任意の成分の相対量は、処置される被験体の同一性、サイズ、および病態ならびにさらに組成物が投与されるべき経路に依存して変動する。例えば、組成物は、０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の有効成分を含んでなり得る。
【０１４５】
有効成分に加えて、本発明の医薬組成物は、１つもしくはそれ以上のさらなる医薬上活性な物質をさらに含んでなり得る。特に考慮されるさらなる物質は、制吐剤ならびにシアン化合物およびシアン酸塩のスカベンジャーのようなスカベンジャーを含む。
【０１４６】
本発明の医薬組成物の制御放出または徐放性製剤は、従来の技術を使用して作製され得る。
【０１４７】
経口投与に適切な本発明の医薬組成物の製剤は、錠剤、ハードまたはソフトカプセル、カシェ剤、トローチまたはドロップ（それぞれ、予め決定された量の有効成分を含有する）を含むがこれらに限定されない個別の固体用量単位の形態で、調製、包装、または販売され得る。経口投与に適切な他の製剤としては、散剤または顆粒製剤、水性もしくは油性懸濁液、水性もしくは油性溶液、またはエマルジョンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
本明細書において使用される「油性」液体は、炭素含有液体分子を含んでなり、水よりも乏しい極性特徴を示すものである。
【０１４９】
経口投与に適切である本発明の医薬組成物の液体製剤は、使用前に水もしくは別の適切なビヒクルとの再構成を意図した乾燥生成物の形態で、調製、包装および販売され得る。
【０１５０】
液体懸濁液は、水性または油性ビヒクルにおける有効成分の懸濁を達成するための従来の方法を使用して、調製することができる。水性ビヒクルとしては、例えば、水および等張性食塩水が挙げられる。油性ビヒクルとしては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、落花生、オリーブ、ゴマ、またはココナツ油のような植物油、分画された植物油、および流動パラフィンのような鉱油が挙げられる。液体懸濁液は、懸濁剤、分散または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝液、塩、風味付け、着色剤、および甘味剤を含むが、これらに限定されない１つもしくはそれ以上の追加成分をさらに含んでなり得る。油性懸濁栄は、濃縮剤をさらに含んでなり得る。既知の懸濁剤としては、ソルビトールシロップ、抗化食用脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アカシアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５１】
既知の分散または湿潤剤としては、レシチンのような天然に存在するリン脂質、酸化アルキレンと、脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステル、または脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物（例えば、それぞれ、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、およびモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）が挙げられるが、これらに限定されない。既知の乳化剤としては、レシチンおよびアカシアが挙げられるが、これらに限定されない。既知の保存剤としては、メチル、エチル、またはパラ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル、アスコルビン酸、およびソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。既知の甘味剤としては、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、およびサッカリンが挙げられる。油性懸濁液のための既知の濃縮剤としては、例えば、蜜蝋、固形パラフィン、およびセチルアルコールが挙げられる。
【０１５２】
水性または油性溶媒における有効成分の液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同じ様式で調製され得、主な差異は、有効成分が溶媒において懸濁されるのではなく、溶解することである。本発明の医薬組成物の液体溶液は、液体懸濁液について記載されるそれぞれの組成物を含んでなり得、懸濁剤が溶媒中の有効成分の溶解を必ずしも援助する必要がないことが理解される。水性溶媒としては、例えば、水および等張性食塩水が挙げられる。油性溶媒としては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、落花生、オリーブ、ゴマ、またはココナツ油のような植物油、分画された植物油、および流動パラフィンのような鉱油が挙げられる。
【０１５３】
本発明の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンもしくは油中水型エマルジョンの形態で調製、包装、または販売され得る。油相は、オリーブまたは落花生油のような植物油、流動パラフィンのような鉱油、またはこれらの組み合わせであってもよい。そのような組成物は、アカシアゴムまたはトラガカントゴムのような天然に存在するゴム、ダイズまたはレシチンリン脂質のような天然に存在するリン脂質、モノオレイン酸ソルビタンのような脂肪酸およびヘキシトール無水物の縮合から誘導されるエステルまたは部分エステル、ならびにモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンのような酸化エチレンとのそのような部分エステルの縮合生成物のような１つもしくはそれ以上の乳化剤をさらに含んでなり得る。これらのエマルジョンはまた、例えば、甘味剤または風味付け剤を含む追加成分を含有する。
【０１５４】
本発明において使用されるように、医薬組成物の「非経口投与」は、被験体の組織の物理的破壊および組織における裂け目を介する医薬組成物の投与によって特徴付けられる任意の投与経路を含む。従って、非経口投与としては、組成物の注入、手術的切開を介する組成物の適用、組織貫通非手術的創傷を介する組成物の適用などによる医薬組成物の投与が挙げられるが、これらに限定されない。特に、非経口投与は、限定されないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注入、および腎臓透析輸注技術を含むことが考慮される。
【０１５５】
非経口投与に適切な医薬組成物の製剤は、滅菌水または滅菌等張性食塩水のような医薬上許容される担体と組み合わされた有効成分を含んでなる。そのような製剤は、ボーラス投与もしくは連続投与に適した形態で調製、包装、または販売され得る。注入可能な製剤は、アンプルもしくは保存剤を含有する複数用量の容器におけるような単位剤形で、調製、包装、または販売され得る。非経口投与のための製剤としては、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中のエマルジョン、ペースト、およびインプラント可能な徐放性もしくは生分解性製剤が挙げられるが、これらに限定されない。そのような製剤は、懸濁剤、安定剤、または分散剤を含むが、これらに限定されない１つもしくはそれ以上の追加成分をさらに含んでなり得る。非経口投与のための製剤の一実施形態では、有効成分は、再構成された組成物の非経口投与の前の適切なビヒクル（例えば、滅菌されたパイロジェンを含まない水）による再構成のための乾燥（即ち、散剤または顆粒）形態で提供される。
【０１５６】
医薬組成物は、滅菌された注入可能な水性もしくは油性懸濁液または溶液の形態で、調製、包装、あるいは販売され得る。この懸濁液または溶液は、既知の技術によって製剤化され得、有効成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤、または懸濁剤のような追加成分を含んでなり得る。そのような適切な滅菌された注入可能な製剤は、例えば、水もしくは１，３−ブタンジオールのような非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を使用して、調製され得る。他の許容される希釈剤および溶媒としては、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液、および合成モノまたはジ−グリセリドのような固定油が挙げられるが、これらに限定されない。有用である他の非経口的に（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）投与可能な製剤は、微結晶形態中、リポソーム調製物中、または生分解性ポリマーシステムの成分として有効成分を含んでなり得る製剤を含む。徐放またはインプラントのための組成物は、エマルジョン、イオン交換樹脂、やや溶け難いポリマー、またはやや溶け難い塩のような医薬上許容されるポリマーまたは疎水性材料を含んでなり得る。
【０１５７】
局所投与に適切な製剤としては、リニメント剤、ローション剤、クリーム、軟膏もしくはペーストのような水中油型もしくは油中水型エマルジョン、および溶液または懸濁液のような液体または半液体調製物が挙げられるが、これらに限定されない。局所的投与可能な製剤は、例えば、約１％〜約１０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含んでなり得るが、有効成分の濃度は、溶媒における有効成分の溶解度の限界値ほどに高くあり得る。局所投与のための製剤は、本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の成分をさらに含んでなり得る。
【０１５８】
本発明の医薬組成物は、眼科用投与に適切な製剤で、調製、包装、または販売され得る。そのような製剤は、例えば、水性もしくは油性液体担体において有効成分の０．１〜１．０％（ｗ／ｗ）溶液または懸濁液を含む、例えば、点眼剤の形態であり得る。そのような滴剤は、緩衝化剤、塩、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の他の追加成分をさらに含んでなり得る。有用である他の眼科的に投与可能な製剤は、微結晶形態またはリポソーム調製物において有効成分を含んでなるものを含む。
【０１５９】
本明細書において使用される「追加成分」としては、限定されないが、次の１つもしくはそれ以上のものを含む。賦形剤、表面活性剤、分散剤、不活な希釈剤、顆粒化および崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、風味付け剤、着色剤、保存剤、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物、水性ビヒクルおよび溶媒、油性ビヒクルおよび溶媒、懸濁剤、分散または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、緩衝液、塩、濃縮剤、充填剤、乳化剤、抗酸化剤、抗体、抗真菌剤、安定剤、ならびに医薬上許容されるポリマーまたは疎水性材料。本発明の医薬組成物に含まれ得る他の「追加成分」は、当該分野において公知であり、例えば、ゲナロ（Ｇｅｎａｒｏ）編、１９８５年、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，マックパブリッシング社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、ペンシルバニア州（該文献は本明細書において参照により援用される）において記載されている。
【０１６０】
典型的に、被験体、好ましくは、ヒトに投与され得る本発明の化合物の用量は、被験体の体重の１キログラムあたり１μｇ〜約１００ｇの量の範囲である。一方、投与される正確な用量は、被験体のタイプおよび処置する疾患状態のタイプ、被験体の年齢および投与経路を含むが、これらに限定されない多くの因子に依存して変動する。好ましくは、化合物の用量は、被験体の体重の１キログラムあたり約１ｍｇ〜約１０ｇまで変動する。よりこのましくは、用量は、被験体の体重の１キログラムあたり約１０ｍｇ〜約１ｇまで変動する。
【０１６１】
化合物は、毎日数回の頻度で被験体に投与され得るか、またはそれは、１日１回、１週間に１回、２週間ごとに１回、１月に１回のようなより少ない頻度で、または数箇月に１回もしくはなお１年に１回もしくはそれ以下のようななおより少ない頻度で投与され得る。投与の頻度は、当業者には容易に明らかであり、処置する疾患のタイプおよび重症度、被験体のタイプおよび年齢などであるがそれらに限定されない任意の数の因子に依存するであろう。
【０１６２】
本発明はまた、本発明の組成物および組成物を被験体の細胞または組織に外膜から投与することを説明する取扱説明書を含んでなるキットを含む。別の実施形態では、このキットは、化合物を被験体に投与する前に本発明の組成物を溶解または懸濁するのに適切な（好ましくは無菌の）溶媒を含んでなる。
【０１６３】
本発明において使用される「取扱説明書」は、刊行物、記録、図面、または本明細書において引用される多様な疾患もしくは障害の緩和をもたらすため、キットにおける本発明のペプチドの有用性を伝達するために使用することができる発現の他の任意の媒体を含む。場合により、またはあるいは、取扱説明書は、被験体の細胞もしくは組織における疾患または障害の緩和の１つもしくはそれ以上の方法について説明し得る。本発明のキットの取扱説明書は、例えば、本発明のペプチドを含有する容器に固定され得るか、またはペプチドを含有する容器と共に搬送され得る。あるいは、取扱説明書は、取扱説明書および化合物がレシピエントによって共同で使用されることを意図して、容器とは個別に搬送され得る。
【実施例】
【０１６４】
実施例１
ラクリチン遺伝子の単離
ラクリチンのｃＤＮＡおよびゲノムクローニング
ラクリチン遺伝子の単離については、先に詳細に記載されている（２００４年４月２９日に公開されたラウリー（Ｌａｕｒｉｅ）ら、米国特許出願公開第２００４／００８１９８４号明細書（本明細書においてその全体が参照により援用される）を参照のこと。ヒト涙腺ｃＤＮＡライブラリーの１０のサブライブラリーのそれぞれからのプラーク（フィルターあたり５×１０４）を含有する複製フィルター（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｆｉｌｔｅｒ）を、４２℃で、４時間、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、６．７６×ＳＳＣ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳおよび１８２μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中でプレハイブリダイズさせ、次いで、１晩、４２℃で、２つの重複する２３マーのオリゴヌクレオチド［ＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣ、配列番号１１］および［ＧＧＧＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧ、配列番号１２］のうちの１つとハイブリダイズさせた。すべてのヌクレオチド配列を、ａｆ２３８８６７（ｃＤＮＡ）およびａｙ００５１５０（ｇｅｎｏｍｉｃ）の登録番号でジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）／ＥＢＩ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに提出した。
【０１６５】
ノーザン分析
（２００４年４月２９日に公開されたラウリー（Ｌａｕｒｉｅ）ら、（米国特許出願公開第２００４／００８１９８４号明細書を参照のこと）に先に詳細に記載されているように、自己消化分解を最小限にするために死亡の１８時間内、最も良好には８時間内に、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋの南部管区を介して解剖中にヒト涙腺および顎下腺を入手した。ヘルシンキ宣言の主義に従い、インフォームドコンセントおよび十分なＩＲＢの承認を得た。ドナーは、既知の全身性細菌またはウイルス感染を伴わず、死因、病理報告書および、ほとんどの場合、組織学的検査から決定されるように、組織は正常であった。摘出後、組織を、液体窒素中で急速凍結（ｓｎａｐ  ｆｒｏｚｅｎ）し、ＲＮＡ調製のために使用するまで−８５℃で貯蔵した。市販バージョンの酸性化チオシアン酸グアニジン／フェノール方法（ＲＮａｚｏｌ  Ｂ，Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、ウッドランド（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ）、テキサス州）を使用して、１００〜３００ｍｇの組織から全ＲＮＡを抽出した。精製されたＲＮＡをジエチルピロカーボネート処置水に溶解し、Ａ２６０／２８０吸収値から濃度および純度を決定した。２．０付近の割合を許容可能とみなした。
【０１６６】
ＲＮＡ完全性は、０．２２Ｍホルムアルデヒドを含有するゲルにおける臭化エチジウム複合化ＲＮＡサンプルの電気泳動によって、最初に決定した。ＵＶ光下、１．１〜２．１の割合で顕著な２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡバンドを示さなかったサンプルを拒絶した。ブロッティングのために、ＲＮＡ（５μｇ／レーン）を、変性条件下での０．８％アガロースゲル上で分離し（ラウリー（Ｌａｕｒｉｅ）ら、１９８９年）、ニトロセルロースに移した。また、２つの購入した（カタログ番号７７５６−１および７７５１−１、クロンテックラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ）、パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）、カリフォルニア州）複数のヒト胎児および成人ポリＡ＋ＲＮＡを伴うノーザンブロット、および５０の異なるヒトポリＡ＋ＲＮＡを含有するドットブロット（カタログ番号７７７０−１、クロンテックラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ））を、コントロールＲＮＡおよびＤＮＡと共にアッセイした。ブロットを、［３２Ｐ］標識ラクリチン挿入物とハイブリダイズさせ、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ノーザン）または２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ドットブロット）中、５５℃で洗浄し、Ｘ線フィルムに暴露した。次いで、ドットブロットを、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを使用して、個々のブロットのピクセルのグレー値の測定によって、定量した。
【０１６７】
ＰＣＲ分析および染色体マッピング
選択的スプライシングを、ヒト顎下腺または涙腺の全ＲＮＡおよびオリゴｄＴによる初期プライミングを使用するか、またはラクリチンｃＤＮＡ由来のヌクレオチド５２３〜５０３に対応するラクリチン逆方向プライマーＣＧＣＴＡＣＡＡＧＧＧＴＡＴＴＴＡＡＧＧＣ（配列番号１３）による遺伝子特異的様式で、ＲＴ−ＰＣＲによって、調べた。ラクリチン順方向プライマーＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＡＡＡＧ（配列番号１４、エキソン１由来、ラクリチンｃＤＮＡヌクレオチド３２〜５１）および逆方向プライマーＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＣＣ（配列番号１５、エキソン５由来、ラクリチンｃＤＮＡヌクレオチド４８０〜４６２）による以後の増幅は、２分間、９４℃での変性、３０サイクルの増幅（９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間および７２℃で１分間）、ならびに５分間、７２℃での最終サイクルを要した。ＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて分析した。
【０１６８】
（２００４年４月２９日に公開されたラウリー（Ｌａｕｒｉｅ）ら、（米国特許出願公開第２００４／００８１９８４号明細書を参照のこと）に先に詳細に記載されているように、ＦＩＳＨマッピング（ゲノムシステムズ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州）を実施した。
【０１６９】
結果
涙腺房細胞は極性形成した外分泌細胞であって、遺伝子データバンクにおいて著しく過小評価されながら、かつ豊富な分化因子をコードし得るいくつかのｍＲＮＡを含有する（ほとんど使用されていないヒト涙腺ｃＤＮＡライブラリーの対形成オリゴヌクレオチドスクリーニングの根拠になっている推定）。このアプローチによって同定されるクローンのうち、いくらかの独立したクローンによって表され、７６０ｂｐ転写物および対応するアミノ酸配列（配列番号４）に対応する新規のｃＤＮＡ配列（配列番号２）が存在する。この涙腺特異的転写物の分泌型遺伝子産物は、「ラクリチン」と呼ばれた。
【０１７０】
ラクリチン核酸配列は、５の等電点を伴う１２．３ｋＤａの成熟分泌型コアタンパク質を生じる１９アミノ酸シグナルペプチドを伴う１４．３ｋＤａの親水性タンパク質コアが推定される４１７ｂｐのオープンリーディングフレームを含有する。残基５２と６４との間の６個の推定Ｏ−グリコシル化部位、およびＣ末端付近の単一のＮ−グリコシル化部位を伴う中等度に高いレベルのグリコシル化は注目すべきであり、ラクリチンは、ラクリチンが部分的相同性を有するニューログリカンＣグリコサミノグリカン結合ドメインおよびフィブリン−２アミノ球状ドメインに極めて類似する中等度に良好なグリコシル化コアタンパク質であることを示す。ノーザンブロット分析は、高いレベルの涙腺特異性を示す。
【０１７１】
霊長類データベースのＦＡＳＴＡ検索では、ヒトニューログリカンＣのグリコサミノグリカン結合領域（１０２アミノ酸について３２％同一性、ラクリチンが無作為化された場合、ＢｅｓｔＦｉｔ  ｑｕａｌｉｔｙ＝８３対３７  ５）と、およびヒトフィブリン−２の「システインを含まない」、おそらく、ムチン様、アミノ球状領域（８１アミノ酸について３０％同一性、無作為では、ＢｅｓｔＦｉｔ  ｑｕａｌｉｔｙ＝８１対３８  ５）との部分的相同性が検出される。３つのすべてがＯ−グリコシル化に富むが、セリンおよびスレオニンの位置決定は、厳密には共有されておらず、ラクリチンおよびフィブリン−２は両方ともグリコサミノグリカン結合部位を欠く。ニューログリカンＣ（ａｆ０５９２７４）は、脳細胞外マトリックスの成分である（膜貫通ドメインによってアンカーされる、ヤスダ（Ｙａｓｕｄａ）ら、１９９８年）。フィブリン−２（ｘ８９４９４）は基底膜ならびに胚および成体組織の基質において広範に分散する（ササキ（Ｓａｓａｋｉ）ら、１９９９年）。非霊長類データベースの検索により、クルーズ・トリパノソーマ（Ｔ．Ｃｒｕｚｉ）ムチン様タンパク質（ａｆ０３６４６４、ＢｅｓｔＦｉｔ  ｑｕａｌｉｔｙ＝７８対４６  １０）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）メロゾイド表面抗原２（ｕ９１６５６、ＢｅｓｔＦｉｔ  ｑｕａｌｉｔｙ＝７６対５３  ６）およびタエダマツ（Ｐ．Ｔａｅｄａ）推定アラビノガラクタンタンパク質（ａｆ１０１７９１、ＢｅｓｔＦｉｔ  ｑｕａｌｉｔｙ＝７４対３７  ４）との注意の相同性が指摘された。
【０１７２】
ヒト涙腺においてラクリチンが豊富に存在し、他の場所での発現が制限されている状態では、一致するまたは相同なＥＳＴは検出されなかった。ノーザン分析は、強力な７６０ｂｐの涙腺メッセージ、および同じサイズのより弱い顎下腺および甲状腺メッセージを示した。ヒト成体の副腎、精巣、胸腺、膵臓、小腸、もしくは胃においても、またはヒト胎児の脳、肺、肝臓、もしくは腎臓においてもメッセージは検出されなかった。同様に、５０の異なるヒト組織の市販のドットブロットでは、涙腺、ラクリチン発現を含まないポリＡ＋ＲＮＡは、顎下腺（「唾液腺」）においてのみ認められ、甲状腺ではより低い程度で認められた。ラクリチンコーディング配列を、ｐＥＴ−２８ｂおよびｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）Ｃにサブクローニングして、それぞれ、組換え細菌性および哺乳動物性（２９３−Ｔ細胞）ラクリチンを作製した。両方の形態のラクリチンは、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて異常な泳動を示した。
【０１７３】
実施例２
ラクリチン発現および機能の特徴付け
組換えラクリチンおよび抗ラクリチン抗血清の調製
（２００４年４月２９日に公開されたラウリー（Ｌａｕｒｉｅ）ら、（米国特許出願公開第２００４／００８１９８４号明細書を参照のこと）に先に詳細に記載されているように、これらの試薬を調製した。
【０１７４】
細胞機能分析
新たに単離されたラット涙腺房細胞、およびＨＳＧ（ヒト唾液腺）導管ならびにＨＣＥ（ヒト角膜上皮）細胞系統を使用して、ラクリチン機能を研究した。分泌研究では、ラット腺房細胞を、０．０５μＭラミニン１（粘着を確実にするために）および０〜２０μＭラクリチンで同時被覆したか、あるいは、ラミニン−１（０．０５μＭ）で被覆し、翌日、０〜１６２ｎｇ／ｍｌの可溶性ラクリチンを含有する無血清培地で４時間処置したウェル上で、１晩、プレート（血清不含）した。次いで、非刺激性および刺激性（カルバコール１０−４Ｍ／ＶＩＰ  １０−８Ｍ）分泌を回収し、評価（ペルオキシダーゼアッセイ）し、μｇ細胞ＤＮＡに正規化した。チロシンリン酸化を研究するために、ラット涙腺房およびＨＳＧ細胞両方の１晩の無血清培養物を洗浄し、１０ｎｇ／ｍｌの可溶性ラクリチンで、０．５、２．５、１０、および３０分間処置した。次いで、細胞溶解物のＰｙ（２０）抗ホスホチロシン抗体免疫沈降を、検出のためにＰｙ（２０）およびＥＣＬを使用して、７％ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットにおいて試験した。ヒト角膜上皮細胞におけるカルシウムシグナル伝達を、無血清培養物において同様に行った（トリンカウス−ランダル（Ｔｒｉｎｋａｕｓ−Ｒａｎｄａｌｌ）ら、２０００年、クレペイス（Ｋｌｅｐｅｉｓ）およびトリンカウス−ランダル（Ｔｒｉｎｋａｕｓ−Ｒａｎｄａｌｌ）、執筆中）。ＨＣＥ細胞を、ウシ脳下垂体抽出物（３０μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（０．１ｎｇ／ｍｌ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するケラチノサイト培地（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州）においてカバースリップ上でコンフルエントまで増殖させ、Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（２μＭ、モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）、オレゴン州）で、３７℃、３０分間充填する前に、１８時間休止させる。可視化のために倒置型ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）５１０ＬＳＭを使用し、５０秒間の基準画像を最初に記録した。レーザーを作動させる一方、ラクリチンを添加（最終濃度４および４０ｎｇ／ｍｌ）し、応答を、７８６ミリ秒ごとに、最小で２００秒間、継続的にモニターした。
【０１７５】
ＥＣＭ結合研究
１０μｇ／ウェルのコラーゲンＩＶ、ラミニン−１、エンタクチン／ニドゲン−１、コラーゲンＩ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ＥＧＦ、ヘパリンまたはＢＭＳで被覆した９６ウェルプレートにおいて、結合研究を行った。ウェルを洗浄し、ブロック（ＰＢＳ−Ｔ）し、０〜３０ｎＭラクリチン（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ−Ｔ中）と共に、１時間（４℃）インキュベートし、洗浄し、抗ラクリチン抗体（１／１０００）でＥＬＩＳＡにより検出した。
【０１７６】
結果
細菌性ラクリチンに対して調製した抗体を、ヒト涙腺および唾液腺の切片、ならびに７５の異なるヒト組織および器官のホルマリン固定化、パラフィン包埋切片を含有する組織マイクロアレイに適用した（表Ｉを参照のこと、２００４年４月２９日に公開されたラウリー（Ｌａｕｒｉｅ）ら、（米国特許出願公開第２００４／００８１９８４号明細書に先に公開された）。免疫反応性は、涙腺ならびに大および小唾液腺における腺房細胞の分泌顆粒では明らかに観察されたが、他の上皮または基質では認められなかった。甲状腺における存在は不明確であった（表Ｉ）。腺房細胞染色の頻度は涙腺では高い一方、僅かに散在する唾液腺房細胞は反応性であった。免疫反応性はまた、涙腺および唾液腺導管の管腔内の分泌においても認められた。ＥＬＩＳＡによって、ラクリチンは、ヒト涙液において検出され、より低い程度で唾液において検出された。
【０１７７】
［表Ｉ］
2007537260.tif 000005
【０１７８】
３つのタイプの上皮細胞のラクリチン機能を：１）涙腺房、２）唾液腺導管、および３）角膜上皮細胞の無血清培養物において、分泌（腺房）、増殖（導管）、チロシンリン酸化（腺房、導管）およびカルシウムシグナル伝達（角膜上皮）アッセイを使用して、評価した。新たに単離されたラット涙腺房細胞を、増加量のラクリチン（粘着を確実にするために、一定の少量のラミニン１を伴う）、またはラクリチンを培地に添加したラミニン−１被覆ウェルに対して、プレートした。被覆されたおよび可溶性ラクリチンの両方は、用量依存的様式で、非刺激性分泌を増強した（図１を参照のこと、２００４年４月２９日に公開されたラウリー（Ｌａｕｒｉｅ）ら、（米国特許出願公開第２００４／００８１９８４号明細書に先に公開された）が、アゴニストのカルバコールおよびＶＩＰによって活性化された刺激性分泌経路に対する効果は観察されなかった。これらの結果は、涙腺房細胞表面に対する、おそらく受容体を介する自己分泌または傍分泌の役割を示唆する。ラクリチンが腺房から流動する場合、それは、導管の上皮細胞、および最終的に角膜上皮に接触する。
【０１７９】
休止期のヒト顎下腺導管（「ＨＳＧ」）細胞を、増加量のラクリチンを含有する無血清培地において培養し、細胞増殖について研究した。ラクリチン培養物はより健康に見えた、４日後、ＢＳＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）ネガティブコントロール（図２ｂを参照のこと）の２倍を超えるレベルに到達した導管細胞数の用量依存的増加が認められた（図２Ａを参照のこと、２００４年４月２９日に公開されたラウリー（Ｌａｕｒｉｅ）ら、（米国特許出願公開第２００４／００８１９８４号明細書に先に公開された）。同じレベルのラクリチンは、ＨＳＧおよびラット涙腺細胞の両方において、４８ｋＤａのバンドの一過的なチロシンリン酸化を促進した。
【０１８０】
次に、ヒト角膜上皮細胞におけるカルシウムシグナルについて試験した。基底レベルのシグナル伝達は無視できる一方、ラクリチンの添加により、細胞全体を通して伝播する迅速かつ持続的なカルシウム波が生じた。波の発生は、上皮増殖因子（２０〜４０秒）に対する有用な応答の発生より先に生じ、応答の大きさは、ラクリチンの濃度に依存する。細菌性リポ多糖（組換えタンパク質調製物の可能な混入物）が関与しないことを確実にするために、サンプルを、カブトガニ血球抽出成分によるアッセイにおいて試験したところ、リポ多糖は検出されなかった（＜０．０５ＥＵ／ｍｌ）。最終的に、ラクリチンが涙膜成分のフィブロネクチンまたはビトロネクチンに結合する能力について試験し、ならびに免疫組織学的手順では検出され得ない少量のラクリチンを有し得る腺房周囲基底膜の構成を試験した。ラクリチンは、フィブロネクチンおよびビトロネクチンに対する顕著なアビディティーを示し、フィブリン−２について観察されるものに類似のコラーゲンＩＶ、ニドゲン／エンタクチンおよびラミニン−１に起因する強力な基底膜結合が存在した。コラーゲンＩ、ＥＧＦまたはヘパリンに対する結合は観察されなかった。
【０１８１】
かなり広範なラクリチン涙腺メッセージは、代替的にスプライスされた形態、またはＲＮＡ分解を示唆する。これと同じことは、個別の、但し、より低い強度のシグナルが認められた顎下腺については、あてはまらない。この問題に取り組み、ラクリチン遺伝子がどのようにして整列されるかに関する情報を得るために、１２．４ｋｂのゲノムフラグメント（ラクリチンゲノムクローンから容易に入手可能な最大のラクリチンポジティブフラグメント）を配列決定した。遺伝子は、翻訳開始部位の１０９〜５９まで上流の推定されたプロモーター配列が先行する５つのエキソンからなる（プロモータースコア＝１．０、ＮＮＰＰ／真核細胞）。エキソン１は完全なシグナルペプチドをコードし、３８ｂｐの５’非翻訳配列を含む。エキソン３は、すべての推定Ｏ−グリコシル化部位の配列を含有する。推定されたＮ−グリコシル化部位は、エキソン４／エキソン５スプライス接合部において形成される。エキソン５は５３ｂｐの３’非翻訳配列を含む。３つの可能なポリアデニル化部位は、エキソン５の３６７、４７４および５３４ｂｐ下流で検出され、その第１のものは７６０ｂｐ転写物を伴う状態である。エキソン−イントロン境界での配列は、すべて、エキソン４スプライスアクセプターを除いて、推定されたスプライスドナーまたはアクセプターに順応する。イントロン配列は、共通のイントロン反復エレメントを示した。また、３８ｂｐの５’エキソン１配列を欠くラクリチン偽遺伝子が、個別のゲノムフラグメントに対して独立して発見された。
【０１８２】
可能な代替的スプライシングについて試験するために、ＲＴ−ＰＣＲを、テンプレートとしての顎下腺または涙腺ｃＤＮＡ、ならびにそれぞれエキソン１および５（それぞれ非翻訳フランキング配列を含む）由来の順方向および逆方向プライマーを伴って使用した。単一のＰＣＲ産物は、そのサイズ（４４９ｂｐ）が代替的スプライシングを伴わない５つのすべてのエキソンからの転写を伴う状態である両方の器官において検出された。ＦＩＳＨは、ラクリチン遺伝子が第１２染色体上に局在することを示したが、結果は、１２ｑ１５に対するプローブによる二重標識によって確認される。１０の特異的に標識された染色体の測定により、１２ｑのセントロメアからテロメアまでの約１６％の距離にラクリチン遺伝子が局在された（１２ｑ１３に対応する領域）。また、Ｔｒｉｐｌｅ  Ａ症候群として公知の稀な遺伝子ａｌａｃｒｉｍｉａも１２ｑ１３上に見出された。ラクリチンゲノムプライマーおよびｔｒｉｐｌｅ  Ａ症候群領域を貫通するＢＡＣテンプレートを使用して試みられたＰＣＲでは、ＰＣＲ産物を産生することができなかった。ラクリチン遺伝子は、セントロメアから約６５．１〜６５．９Ｍｂｐの１２ｑ１３位置に位置付けされるドラフト配列ＡＣ０６８７８９．４、ＡＣ０２５６８６．２およびＡＣ０２５５７０．６に部分的に含まれる。
【０１８３】
ラクリチンの本来の発見は、複数の細胞外因子が腺の分化、特に、増殖因子および周囲の細胞外マトリックスの成分を誘発するという仮設から発達した。実際、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーもしくは受容体、ＥｒｂＢ４、プロゲステロン受容体、細胞外マトリックス糖タンパク質オステオポンティン、ＥＧＦ受容体（ＴＧＦαおよびアンフィレギュリンを伴う）、線維芽細胞増殖因子受容体２（ＩＩＩｂ）、または増殖因子ＦＧＦ−１０を欠くマウスでは、腺房の部分的形成あるいは腺房形成の失敗が報告されている。そのような因子を培養物の腺房細胞の分泌機能に連結することは、より複雑であることが証明されている。それにもかかわらず、腺房周囲間葉系およびホルモン環境は腺の発達および機能に影響を及ぼし、自己分泌および傍分泌調節の両方は重要な役割を果たすことは明らかである。新たに単離された外分泌細胞、特に、ラクリマル−１（ｌａｃｒｉｍａｌ−１）ならびに細胞外マトリックスおよびその他から誘導されるより低分子量の因子の非存在下で機能分化する涙腺房細胞の一次培養が最も繊細である。
【０１８４】
涙腺房、唾液腺導管および角膜上皮細胞の培養物への組換えラクリチンの導入により、興味深い機能的見識が提供された。涙腺房細胞は、増強された非刺激性（但し、刺激性ではない）分泌および４８ｋＤａタンパク質の迅速なチロシンリン酸化を示した。導管細胞は、同じ４８ｋＤａのバンドをリン酸化し、増殖性であった。迅速かつ継続的なカルシウムトランジエントが角膜上皮細胞において認められた。従って、ラクリチン流出に寄与するかまたは該ラクリチン流出から利益を得るすべての細胞タイプは、ラクリチン誘導性であると思われる一方、コントロールはネガティブであり、細菌性リポ多糖が混入している証拠も存在しなかった（免疫細胞培養物において増殖性であることが公知である）。ラクリチンがどのように作用するかについてはまだ解明されていない。任意の特定の理論によって制限されることを所望しなければ、おそらく共通の受容体が仲介者であり、その連結は、チロシンリン酸化および神経網膜におけるようなカルシウム放出に共同で連結され得、ここで、チロシンキナーゼは、細胞内カルシウム貯蔵の容量性カルシウム流入およびイノシトール−３−リン酸誘導性放出と関連している。あるいは、３つの細胞タイプにおけるラクリチンシグナル伝達は異なり得る。涙腺房細胞、導管および角膜上皮細胞は、顕著に異なる機能を実施する。いくつかの細胞内シグナル伝達機構は共通であり得るが、他は独特であり、いくつかの機構は、異なる用途に供され得る。涙腺房細胞におけるカルシウムシグナル伝達は、刺激性分泌経路、ラクリチンによって明らかに影響を受けない経路によって涙液タンパク質の放出を仲介するムスカリン性受容体連結の最も頻繁な誘導効果である。今なお、アゴニストの性質および用量に依存するカルシウム振幅、頻度およびに局在おける巧妙さは、劇的に異なる効果を有し得る。対照的なラクリチンは、ＢＭ１８０、刺激性分泌経路に対してのみ作用すると思われる腺房周囲基底膜構成成分である。利用可能なラクリチンおよびＢＭ１８０の量の均衡を保つことで、成体および発達する腺における分泌能が制御され得る単純な機構が付与され得る。
【０１８５】
分泌腺、導管の分泌内容物および涙液におけるラクリチンの免疫局在性を、結合研究によって評価し、涙液構成成分であるフィブロネクチンおよびビトロネクチンに対する顕著な親和性が示された。他で免疫検出されていないが、ラクリチンもまた、一般的な腺房周囲基底膜構成成分ニドゲニン／エンタクチン、コラーゲンＩＶ、およびラミニン−１結合したが、コラーゲンＩ、ＥＧＦまたはヘパリンには結合しなかった。類似の結合特性が、フィブリン−２について報告されている。これらの相互作用の重要性および正確な性質については決定されていないが、基底膜結合は、おそらく、その細胞外マトリックスの蓄積が、機能的に強力であるが、しばしば、信頼できる免疫検出には低すぎる増殖因子に類似する。あるいは、基底膜結合（存在するならば）は、おそらく、組織損傷の後に生じ得る。
【０１８６】
実施例３
ラクリチンプロモーターの特徴付け
ラクリチンプロモーターの特徴付けについては、（２００４年４月２９日に公開されたラウリー（Ｌａｕｒｉｅ）ら、（米国特許出願公開第２００４／００８１９８４号明細書を参照のこと）に先に詳細に記載されている。
【０１８７】
任意の特定の理論によって制限されることを所望しなければ、ラクリチン遺伝子の活性は、適切な転写因子および補調節因子の周囲における独特なエンハンサー（ならびにおそらくリプレッサー）エレメントと共同で稼動する規則性のない制限的かつ強力なプロモーターに起因すると仮定される。そのような組織特異的転写制御は、Ａ−クリスタリン（レンズ）、ロドプシン（網膜）、アルデヒドデヒドロゲナーゼクラス３およびケラトカン遺伝子（角膜）のものに等しいかまたはそれより多く、独特な機会を付与して、ヒト涙腺における遺伝子発現の核の扱いに関する文献の新たな主体を開始する。
【０１８８】
ラクリチン遺伝子調節エレメントのマッピング
ラクリチン遺伝子発現がどのようにして涙腺に標的化されるかを解明することは、涙腺遺伝子調節をより良好に理解するために、以下に記載のように決定される。はじめに、ラクリチン転写開始部位の同定は、実験的に確認される。コンピュータープロモーター解析に基づいて、転写は、ＡＴＧ翻訳開始部位の６９ｂｐ上流（「６９ｂｐ」、「神経ネットワーク」）に局在する単一の部位で開始されることが予想される。コアプロモーターの「ＴＡＴＡボックス」および／または「イニシエーター」（「Ｉｎｒ」）エレメントは、多くの遺伝子、特に、高度に発現される遺伝子において転写の開始部位を確立するのに重要な役割を果たす。例えば、＋１、＋２２０（また、＋１９０ｂｐでのＴＡＴＡボックス）および＋３１６ｂｐ（イントロン）でのＩｎｒエレメントは、ヒトケラトカン遺伝子において転写開始部位と称され、プライマー伸長によって実験的に確認され、ＴＡＴＡボックスは、Ａクリスタリンの転写開始、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターにおいて顕著に出現する。神経ネットワーク推定９４〜４６ｂｐ領域は、実際に、−６９ｂｐ（スコア＝１．０）で転写開始部位を伴うラクリチンコアプロモーターを含んでなり、次いで、推定ＴＡＴＡボックスならびにそれぞれ、−５２および−６７ｂｐでのＩｎｒエレメントは、転写開始において重要な役割を果たすべきである。あるいは、転写は、「ＣｏｒｅＰｒｏｍｏｔｅｒ」によって示唆されるように、−６２ｂｐで開始し得る。プライマー伸長およびＲＮＡリガーゼ仲介５’ＲＡＣＥは、この問題を解決するであろう。
【０１８９】
プライマー伸長について、ラクリチンｍＲＮＡのヌクレオチド６４〜８３ｂｐに相補的である「プライム（Ｐｒｉｍｅ）」（ＧＣＧ、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）によって設計される２０マーの逆方向プライマー（「ＬａｃＰ８３」）が有利である。日常的手順に従って、ＬａｃＰ８３は、［３２Ｐ］ＡＴＰの存在下でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを伴うリン酸化によって末端標識され、全涙腺ＲＮＡ（１０μｇＲＮＡあたり１００ｆｍｏｌプライマー）と、２０分間、５８℃でアニールされ、冷却され、次いで、デオキシヌクレオチドの存在下、３０分間、４１℃で、ＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）と共にインキュベートされる。新たに形成されたｃＤＮＡのサイズ（変性ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析／ラジオグラフィーによって分析される）は、スケールアップされた非放射性伸長反応およびＲＮＡリガーゼ仲介５’ＲＡＣＥからのｃＤＮＡの半自動ＡＢＩ配列決定によって決定される５’末端の同定によるおよその転写開始部位の局在を算出するのに十分な情報を提供する。プライマー伸長コントロールは、涙腺ＲＮＡの全酵母ＲＮＡ（またはＲＮＡなし）による置き換え、および先に確立されているプライマー伸長条件についての付随するプライマー（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）によるインビトロ転写によって調製されるＲＮＡの使用を含む。
【０１９０】
確認のために、ＲＮＡリガーゼ仲介５’ＲＡＣＥ（「ジェネレーサー（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ）」、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））が利用される。これは、プライマー伸長の強力なＰＣＲに基づく修飾である。この目的のために、１〜５μｇの全ヒト涙腺ＲＮＡは、仔ウシ腸ホスファターゼ（１０μｌあたり１Ｕの反応混合物）で処置され、分解されたＲＮＡおよび非ｍＲＮＡ混入物から５’リン酸を取り出す。タバコ酸性ピロホスファターゼ（１０μｌあたり０．５〜１Ｕの反応混合物）を伴うインキュベーションは、真正の５’末端上にのみ存在する５’−ＣＡＰ構造を排除し、キット特異的ＲＮＡオリゴヌクレオチド（「ジェネレーサーＲＮＡオリゴ（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ）」）とＴ４ＲＮＡリガーゼ（１０μｌあたり５Ｕの反応混合物）との連結を可能にする。以後のＬａｃＰ８３プライム化逆転写は、単一鎖ｃＤＮＡを作製する。次いで、ｃＤＮＡを、プライマー対としてＬａｃＰ８３および５’ＲＮＡオリゴに相補的なプライマーを使用してＰＣＲ増幅し、配列決定して、開始部位を同定する。ネガティブＰＣＲコントロールでは、ＬａｃＰ８３またはジェネレーサーＲＮＡオリゴ（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ）の非存在下あるいはテンプレートを伴わずに増幅が試みられ、バンディングまたはスメアリングが観察される場合、さらなるＰＣＲ最適化を行う（即ち、より少ないテンプレートもしくはより少ないＰＣＲサイクルの使用、またはネステッドＰＣＲを行って、アンプリコン量を増加するか、またはタッチダウンＰＣＲを使用する）。
【０１９１】
単一のプライマーにより伸長された１５２（または１４５）ｂｐのｃＤＮＡバンドは、−６９ｂｐ（または−６２ｂｐ）での転写開始部位および翻訳開始部位に対するプライマーの５’末端から８３ｂｐの包含物［６９＋８３ｂｐ（または６２＋８３ｂｐ）］を伴う状態で観察されることが予想される。この予想は、ヒト唾液腺のノーザン分析によって認められる単一の転写物と一致する。広範なヒト涙腺バンドは、いくつかの可能な僅かな分解と組み合わされた多量のｍＲＮＡに起因すると解釈されている。代替的なスプライシングは観察されていないが、第２の転写物の可能性は、完全には否定されていない。
【０１９２】
ルシフェラーゼレポーター構築物もまた作製され、ラクリチン遺伝子調節エレメントのトランスフェクションに基づく領域マッピングが開始される。ヒトおよびマウスラクリチン遺伝子のベイジアン（Ｂａｙｅｓｉａｎ）アラインメントは、レポーター構築物活性の解釈のための非常に優れた製剤を提供し、進化における保存は、同様に、トランスフェクション宿主（任意の種の涙腺由来の唯一の不死化細胞系統）としてのウサギ涙腺房細胞系統の利用を容易にすると仮定される。この探査アプローチは、インビトロおよびインビボの両方でのより詳細な研究のための概念的基礎を置く。
【０１９３】
ラクリチンの組織特異性は、おそらく、その遺伝子プロモーターおよび推定エンハンサー領域を含んでなる天然および各種の転写因子結合性モジュールに基づくようである。Ａ−クリスタリン遺伝子のレンズ好適発現は、例えば、ＣＲＥＢ／ＣＲＥＭ、Ａ−ＣＲＹＢＰ１、Ｐａｘ６、ＴＢＰ、ＵＳＦ、ＡＰ−１（組織特異性に重要なＡＰ−１に関する）および１５０ｂｐＡ−クリスタリンプロモーターに対して核形成するＬ−ｍａｆの転写複合体によって支配される。ルシフェラーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ発現を、無傷（ｉｎｔａｃｔ）なまたは累進的に５’を短縮（または変異した）プロモーター領域の制御下に人工的に配置するトランスフェクトされたプラスミド構築物は、プロモーターのシス作用性調節領域を同定するために先に使用されている。汎用性かつ高感度の「デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）」（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））は、例えば、試験中のトランスフェクトされた遺伝子プロモーター（発現されるホタルルシフェラーゼのレベルによって表される）および一定の基準線レベルで個別の基質特性を伴う合成ウミシイタケ（ｓｅａ  ｐａｎｓｙ）ルシフェラーゼの発現を独立して駆動するように設計された同時トランスフェクトされた内部のポジティブＨＳＶ−ＴＫ制御プロモーターの両方を連続的にアッセイする（以下を参照のこと）。レポーターとしてβ−ガラクトシダーゼを使用するトランスジェニックマウスにおける以後の研究では、染色体関連が利用できるようになる。ウサギ涙腺細胞系統（グエン，Ｄ．（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．）ら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ．，１９９９年、３５（４）：１９８−２０４）が最近利用可能であることおよびラクリチンのゲノムクローニングにより、現在、涙腺分野に対するこの系統の研究が開けてきている。
【０１９４】
転写が実際に−６９または−６２ｂｐで開始される場合、−２４３５〜−１０ｂｐ（「Ｌａｃｒｇｅｎ２．４」）、−１６１９〜−１０ｂｐ（「Ｌａｃｒｇｅｎ１．６」）または−８５６〜−１０ｂｐ（「Ｌａｃｒｇｅｎ０．９」）を貫通する上流のゲノム構築物は、組織特異的および発現の上昇に必要なすべてまたはほとんどのエレメントを含み得る。それぞれの調製には、ＸｈｏＩ部位が組み入れられた逆方向プライマー「ＬａｃＰ−１０／ＸｈｏＩ」（−１０〜−３１ｂｐ）、および順方向プライマー「ＬａｃＰ−２９６０」（−２９６０〜−２９４２ｂｐ）を使用する１２．４ｋｂラクリチンゲノムフラグメントからのＰＣＲによって作製される親のアプリコン「ＬａｃｒｇｅｎＩｎｉｔ」（−２９６０〜−１０ｂｐ）が利用できる。プライマー対は、「プライム（Ｐｒｉｍｅ）」（ＧＣＧ、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）によって設計される。ＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩによるＬａｃｒｇｅｎＩｎｉｔの以後の消化により、プロモーターなしかつエンハンサーなしのルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ＋）のすぐ上流のｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃのマルチクローニング領域への事前の連結（ゲル精製後）に適切な末端を有するそれぞれのフラグメントＬａｃｒｇｅｎ２．４、Ｌａｃｒｇｅｎ１．６またはＬａｃｒｇｅｎ０．９を生じる。
【０１９５】
ウサギ涙腺房細胞系統は、トランスフェクション研究に使用される。細胞は強力な上皮形態学を示し、分泌成分、トランスフェリンおよびトランスフェリン受容体を合成する。重要なことに、それらはまた、ラクリチンを発現し、容易にトランスフェクト可能である。トランスフェクションを行うために、９６ウェルプレート中約８０％コンフルエント血清含有培養物は、約０．８μｌ／ウェルリポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）２０００試薬（インビトロジェンライフテクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ＋内部制御ｐｈＲＬ−ＴＫプラスミド（合計で０．２４μｇのプラスミド／ウェル、５０：１比のｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ対ｐｈＲＬ−ＴＫ）において、Ｌａｃｒｇｅｎ２．４、Ｌａｃｒｇｅｎ１．６またはＬａｃｒｇｅｎ０．９で一過的にトランスフェクトされる。４８時間後、培養物を、ＰＢＳにおいて穏やかに３回洗浄し、１５分間、１×「パッシブライリスバッファー（Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）」（２０μｌ／ウェル、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））において溶解し、Ｌ−Ｍａｘ９６ウェルプレートルミノメーター（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、メンロー（Ｍｅｎｌｏ）、カリフォルニア州、コンピュータによるオンライン）における「ルシフェラーゼアッセイ試薬ＩＩ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＩＩ）」の添加（１００μｌ／ウェル）時にホタルルシフェラーゼについてアッセイする。読み取りは、トランスフェクトしなかった細胞のよう怪物を含有する同様に処置したウェルをゼロとする。その後、ウミシイタケ（ｓｅａ  ｐａｎｓｙ）（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼのアッセイのために「ストップ＆Ｇｌｏ試薬（Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔ）」（１００μｌ／ウェル）を添加する。同一にトランスフェクトされたヒト２９３細胞の包含物はネガティブコントロールとして作用する一方、アラキ−ササキ（Ａｒａｋｉ−Ｓａｓａｋｉ）ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥ−Ｔ）およびＨＳＧヒト唾液腺細胞（両方の分泌ラクリチン）は適切なポジティブコントロールである。至適な涙腺リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）トランスフェクション、および「ブライト−Ｇｌｏ（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ）」ルシフェラーゼアッセイ条件（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））は、ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌベクターを利用し、それによって、トランスフェクトされた細胞は、ＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサー制御下でｌｕｃ＋発現から利益を得る。トランスフェクション効率は７５〜９０％であり、Ｌａｃｒｇｅｎ２．４、Ｌａｃｒｇｅｎ１．６またはＬａｃｒｇｅｎ０．９のうちの１つはＬａｃｒｇｅｎ１．６またはＬａｃｒｇｅｎ０．９と同様に、ラクリチンプロモーター活性に要求される最小配列を最も良好に規定すると予想される。
【０１９６】
この研究経過は、ネステッド欠失によって累進的に５’側が短縮されたＬａｃｒｇｅｎ２．４、Ｌａｃｒｇｅｎ１．６またはＬａｃｒｇｅｎ０．９由来構築物の作製および試験のための理論的出発点を提供しする（ラクリチン遺伝子およびフランキング領域のゲノム配列決定に適用されるアプローチ）。これを可能にするのは、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃのマルチクローニング領域における各挿入物のすぐ上流にある単一のＫｐｎＩおよびＳａｃＩ部位、ならびにＬａｃｒｇｅｎ２．４、Ｌａｃｒｇｅｎ１．６またはＬａｃｒｇｅｎ０．９における任意の内部ＫｐｎＩもしくはＳａｃＩの欠如である（後者はＭａｐ（ＧＣＧ）によって決定される）。従って、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩで消化される場合、ＫｐｎＩ末端はエキソヌクレアーゼＩＩＩ耐性（３’粘着部）であり、ＳａｃＩ末端（３’還元部）は感受性である。Ｌａｃｒｇｅｎ２．４、Ｌａｃｒｇｅｎ１．６またはＬａｃｒｇｅｎ０．９のＳａｃＩ部付近は、それらを、エキソヌクレアーゼの短縮化に対して感受性にする。これを行うために、２μｇのプラスミド構築物はＫｐｎＩおよびＳａｃＩ消化される。酵素不活化（７０℃で１０分間）および表情での冷却後、エキソヌクレアーゼＩＩＩ緩衝液中の線状プラスミドを、３分間隔で連続的な５０〜１００ｂｐ欠失を達成するように、４０μｌの最終容積、２５℃または１５℃で、エキソヌクレアーゼＩＩＩで処置する。各３分間時点の２μｌアリコートを、Ｓ１ヌクレアーゼを含有する氷上のチューブに取り出す。すべての計時されたアリコートを採取した後、プラスミド消化物を氷上から取り出し、オーバーハングのＳ１ヌクレアーゼ消化のために室温で３０分間、インキュベートし、熱不活化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下での平滑末端連結によって再循環し、アガロースゲルにおいて試験し、アンピシリン選択によりコンピテント細胞に形質転換する。次いで、それぞれのプラスミド調製物は、涙腺房細胞のトランスフェクション（内部制御プラスミドによる）、およびルシフェラーゼ発現の評価に適用される。
【０１９７】
実施例４
ラクリチン増強された細胞の生存
はじめに、細胞生存におけるラクリチンの機能を、抗体アレイスクリーニングにおいて評価した。唾液腺管細胞の無血清培養物を、１０ｎｇ／ｍｌでの組換えラクリチンまたは１分間の等容積の１×ＰＢＳ（組換えラクリチンのための透析媒体）のいずれかで処置した。活性の尺度としてチロシンリン酸化を使用することによって、ＦＡＳ／ＡＰＯ−１レベルの大きな減少（約８１％）が存在する一方、ｂｃｌ−２のような細胞生存促進タンパク質の活性が増加した（ｂｃｌ−２：１１％）ことが見出されており、細胞生存因子としてのラクリチンの潜在的機能が示される。
【０１９８】
続いて、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を行って、細胞死およびラクリチンの生存促進機能の時間経過をモニターした。栄養涸渇培地（αｍｅｍ）において培養されたＨＳＧ細胞では、１０ｎｇ／ｍｌでラクリチンに接触された該細胞は、顕著なＤＮＡフラグメント化が認められないことを実証する（図３Ｂを参照のこと）一方、ラクリチンの非存在下で栄養欠損培地において培養された細胞は、有意なＤＮＡ分解を有した（図３Ｂを参照のこと）。サブＧ０／Ｇ１集団の百分率によって測定されるアポトーシスを経験する細胞の量を図３Ａに示す。ラクリチンは、細胞を、栄養涸渇培地（αＭＥＭ）における死から、９６時間もしくはそれ以上まで保護した。ラクリチンの非存在下で培養された細胞は、約２４時間で開始するアポトーシスを経験し、４８時間の培養後は、５０％を超える細胞がアポトーシス性である。
【０１９９】
ラクリチンによって細胞生存をもたらす分子経路について詳細に調べるため、タンパク質キナーゼおよび転写因子を、ウエスタンブロッティングおよび免疫蛍光顕微鏡により研究した。ラクリチン刺激後、従来のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣα）は、細胞膜から移動することが認められ、約５分間の処置後、サブ細胞の分画、それに続くＰＫＣαのウエスタンブロッティングによっては、ＰＫＣαは細胞膜においてほとんど検出されなかった。一方、活性化されたＴ細胞（ＮＦＡＴ）およびＮＦκＢの核因子のような転写因子の活性の増加が認められた。図４において、ＰＫＣαおよびＮＦＡＴの移行は、共焦点顕微鏡画像と合わせた免疫蛍光によって検出された。休止しているＨＳＧ細胞（左側の３つの画像）では、ＰＫＣαは、主に、サイトゾルおよび膜において分散する。同様に、ＮＦＡＴｃ１もまた、サイトゾルにおいて広範に局在することが見出された。ＰＫＣαおよびＮＦＡＴｃ１の細胞同時局在は、２つの免疫蛍光画像を合成する（ｃｙ３およびＦＩＴＣ標識の合併により個別の黄色が生じる）と、認められる。１時間のラクリチン処置後、ＰＫＣαは、核膜の外部に局在し、１つの領域（おそらく、ゴルジネットワーク）に集中するようになる。一方、ＮＦＡＴは、核コンパートメントに移行し、遺伝子の転写を活性化する。
【０２００】
ＰＫＣαの移行およびＮＦＡＴ活性化に関するさらなる証拠が存在している。Ｇｏ６９７６、ＰＫＣαおよびβ１に対する特異的インヒビターは、ウエスタンブロッティング研究を介するＮＦＡＴの変化を廃止することが見出されている（しかし、ＨＳＧ細胞では、ＰＫＣβイソ型がほとんど認められないかまたは全く認められなかった）。また、同じインヒビターが、Ｃａ＋＋シグナル伝達ラクリチン刺激後の早期の事象）を抑制することが見出されたことに留意すること。
【０２０１】
さらに、ＮＦκＢサブユニットの活性型、ＲｅｌＡ（ｐ６５）は、シグナル伝達に関与することが見出された。この転写因子の核移行もまた、ラクリチン処置後に観察されている。休止ＨＳＧ細胞の核コンパートメントでは、ＲｅｌＡは、はじめは、ほとんど観察されなかった。しかし、ラクリチン処置時、１分間もの早期に、核に蓄積された検出可能な量のＲｅｌＡ、および濃度は、継続して増加し、１５分〜１時間までの間に最大に達した。ＲｅｌＡは核に滞在し、ラクリチンとの最初の接触の４時間後もなお、高レベルのＲｅｌＡが観察された。
【０２０２】
実施例５
ラクリチン増殖場を規定するために、そのドメインおよび細胞標的特異性、至適用量、および活性化されたシグナル伝達経路を特徴付けるための実験を実施した。
【０２０３】
一般的方法
細胞系統
ヒト唾液腺管細胞（ＨＳＧ）を、１０％ウシ胎児血清を伴うダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の改変イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地（サンギ，Ｓ．（Ｓａｎｇｈｉ，Ｓ．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１年、３１０：１２７−１３９）、または有糸分裂誘発実験では、最小必須培地イーグル（Ｅａｇｌｅ）のα改変において拡大した。また、１０％ウシ胎児血清を伴うダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の改変イーグル（Ｅａｇｌｅ）の培地において、マウス３Ｔ３線維芽細胞、ＨＳ６８ヒト包皮線維芽細胞およびＷＭ１６４ヒトメラノーマ細胞を増殖させた。２９３Ｔヒト胎児腎臓細胞を、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清を伴う最小必須培地において、Ｋ５６２ヒト赤白血病細胞を、１０％ウシ胎児血清を伴うイスコベ（Ｉｓｃｏｖｅ）の改変ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の培地において、ＴＭ３ならびにＴＭ４マウス精巣レイディヒおよびセルトリ細胞を、それぞれ、ハム（Ｈａｍ）のＦ１２培地と１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の改変イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地との１：１混合物において、ならびにＵ１２４２ＭＧヒト膠芽腫およびＵ２５１ＭＧヒト神経膠腫細胞を、最小必須培地イーグル（Ｅａｇｌｅ）のα改変において培養した。すべての培地は、ギブコインビトロジェン（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク州）から購入した。
【０２０４】
ラクリチン構築物および精製
シグナルペプチドを伴わない無傷（ｉｎｔａｃｔ）な成熟ラクリチンをコードするＤＮＡの３６３ｂｐ領域を、ラクリチンｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し（サンギ，Ｓ．（Ｓａｎｇｈｉ，Ｓ．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１年、３１０：１２７−１３９）、ｐＴＹＢ１（ニューイングランドバイオラボラトリーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州）にサブクローニングして、ラクリチン−インテイン融合プラスミドｐＬＡＣを作製した。制限酵素部位ＳａｐＩを順方向プライマー（５’−ＧＧＴＧＧＴＣＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣ−３’）（配列番号２５）に追加し、ＮｄｅＩを逆方向プライマー（５−ＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧ−３’）（配列番号２６）に追加して、サブクローニングを容易にし、これを配列決定によって確認した。欠失は、成熟ラクリチンペプチド、即ち、配列番号１０を有するペプチドに基づいた。新たな欠失フラグメントは、配列番号１０から欠失されたアミノ酸の数および欠失がＮまたはＣ末端で作製されたかどうかに基づいて、命名した。５、１０、１５、２０、２５および５９アミノ酸のＣ末端欠失を、それぞれ、順方向プライマー５’−ＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＡＣＴＡＴＴＡＴＴＡＣＴＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴ−３’（配列番号２７）ならびにそれぞれの逆方向プライマー５’−ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＡＧＡＣＴＧＡＡＴＴ−３’（配列番号２８）、５’−ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号２９）、５’−ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＡＴＴＣＡＣＴＴＣＣ−３’（配列番号３０），５’−ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣ−３’（配列番号３１）、５’−ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＣＡＣＣＴＧＧＣＡ−３’（配列番号３２）および５’−ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧ−３’（配列番号３３）を使用して作製した。ＳａｐＩおよびＥｃｏＲＩを使用して、アンプリコンを、指向的にｐＴＹＢ１１にサブクローニングし、配列決定によって挿入物を確認した。このシリーズ由来のプラスミドは、それぞれ、ｐＬＡＣ／Ｃ−５〜ｐＬＡＣ／Ｃ−５９と称された。Ｎ−２４末端欠失のための順方向および逆方向プライマーは、それぞれ、５’−ＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣ−３’（配列番号３４）および５−ＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧ−３’（配列番号３５）であり、プラスミドｐＬＡＣ／Ｎ−２４を作製した。
【０２０５】
タンパク質発現のために、目的のプラスミドを所有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６の培養物を、３７℃で対数増殖基中期まで増殖させ、温度を２３℃まで減少させて、誘導前の封入体における分泌を最小限にした。培養物を、０．５ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で、４時間、２３℃で誘導した。細胞を遠心分離によって回収し、−７０℃で貯蔵した。凍結した細胞ペレットを室温で融解し、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．４５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００における音波処理によって溶解し、遠心分離した。澄明にした上清を、０．５Ｍ  ＮａＣｌで平衡化した１０カラム容積の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）で平衡化したキチンカラム（インパクト−ＣＮシステム（ＩＭＰＡＣＴ−ＣＮ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ニューイングランドバイオラボラトリーズ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）、ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州）上に充填し、２０カラム容積の同緩衝液で洗浄した。Ｃ末端インテインからのラクリチンのカラム上切断を、１６時間、室温で、同緩衝液中５０ｍＭジチオスレイトールを伴うインキュベーションにより、実施した。溶出物を濃縮し、ＰＢＳ（４℃）に対して広範に透析し、定量し、評価した。ｐＬＡＣラクリチン活性は、ｐＥＴ２８ｂ構築物から調製されたラクリチンと同一であり（サンギ，Ｓ．（Ｓａｎｇｈｉ，Ｓ．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１年、３１０：１２７−１３９）が、そのうち後者はシグナルペプチドを含んだ。ｐＬＡＣ由来のラクリチンのＳＤＳ  ＰＡＧＥ移動度は、１８ｋＤａ（１２．３ｋＤａと推定された）であり、そしてｐＥＴ２８ｂ由来は２３ｋＤａである（Ｈｉｓタグにより１８．４ｋＤａと推定された、サンギ，Ｓ．（Ｓａｎｇｈｉ，Ｓ．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１年、３１０：１２７−１３９では、先に、誤って、より大きく示された）。質量分析配列決定および免疫ブロッティングによりタンパク質同一性を確認し、ＬＡＬアッセイ（チャールスリバーエンドセーフ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ）、チャールストン（Ｃｈａｒｌｓｔｏｎ）、サウスカロライナ州）により、シグナル伝達活性の供給源として混入するエンドトキシンを排除した。円二色性解析を、ＩｇｏｒＰｒｏ数値解析を駆動するＡＶＩＶ２１５分光偏光計（プロテリオン（Ｐｒｏｔｅｒｉｏｎ）、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）において実施した。
【０２０６】
ホスホチロシンブロッティングおよび有糸分裂誘発
ホスホチロシンブロッティングおよび有糸分裂誘発アッセイでは、血清含有培地中の細胞を、２４ウェルプレートに、細胞接着後２０〜３０％コンフルエンシーに対応する０．５×１０５細胞／ｍｍ２の密度で、１晩播種し、２４時間、補充を伴わずに無血清培地においてインキュベートする（ホスホチロシン）か、または補充を伴わない無血清培地で３回洗浄（有糸分裂誘発）し、ラクリチン（１〜１０００ｎＭ）、もしくはポジティブコントロールＥＧＦ（１．６ｎＭ）および１０％ウシ胎児血清、もしくはネガティブコントロールウシ血清アルブミンもしくは補充を伴わない添加物のない無血清培地と共に、示された時間（ホスホチロシン）あるいは３０時間（有糸分裂誘発）、インキュベートした。ホスホチロシンアッセイでは、細胞を、バナジン酸ナトリウム（２ｍｇ／ｍｌ）、ＤＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）、プロテアーゼ阻害剤、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１％ＮＰ４０において抽出し、次いで、１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離し、トランスファーし、ドットした。以下の抗体（セルシグナリングテクノロジー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州）を試験した。抗ホスホチロシン抗体（Ｐ−Ｔｙｒ−１００）、抗ホスホ−ＰＫＣαＩＩ、抗ＰＫＣα、抗ホスホ−ＰＫＣδ、抗ホスホ−ＰＫＣ（ｐａｎ）、抗ｐ４４／４２ＭＡＰＫ、抗ホスホ−Ｒａｆ、抗ホスホ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、抗ホスホ−ｐ３８Ｍａｐキナーゼ、抗ホスホ−Ｒａｆ、抗ホスホ−Ａｋｔ、抗ホスホ−ＣａＭＫＩＩ、抗ホスホ−ＭＡＲＣＫＳ、または抗チューブリン（充填コントロール）。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識第二抗体およびＥＣＬにより、結合抗体を検出した。Ｐ−Ｔｙｒ−１００ブロット（図１）における少なくとも９タンパク質を除いて、上記で試験したエフェクターのうち、ラクリチンシグナル伝達中にホスホ活性化が認められたものはなかった（示さず）。有糸分裂誘発（フサイン（Ｈｕｓｓａｉｎｉ）ら、’００年）では、［３Ｈ］−チミジン（２ｍＣｉ／ｍｌ）を、次の６時間のために添加した。氷冷リン酸緩衝食塩水で組み入れを停止し、続いて、冷および次いで室温のトリクロロ酢酸（１０％）の各１０分間の添加、リン酸緩衝食塩水による細胞の洗浄、１Ｎ水酸化ナトリウムによる可溶化、１Ｎ塩酸による中和、シンチレーション液の添加、次いで、シンチレーションカウンターにおける定量を行った。ＨＳＧ細胞においてＰＫＣαを涸渇するために、４つのＰＫＣα特異的ｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）のプールを、血清および抗生物質を伴わないＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク州）において、製造者に指示に従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００を介してトランスフェクトした。４つのｓｉＲＮＡのそれぞれもまた、個々にトランスフェクトした。ネガティブコントロールでは、細胞を、４つのラミン特異的ｓｉＲＮＡのプールでトランスフェクトした（アップステートＬＬＣ（Ｕｐｓｔａｔｅ  ＬＬＣ），シャーロッツビル（Ｃｈａ��ｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ）、バージニア州、ダーマコン社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ）、ラファイエット（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）、コロラド州）。トランスフェクションの７２時間後、１０ｎＭラクリチンおよび［３Ｈ］−チミジン（２ｍＣｉ／ｍｌ）の２４時間の同時添加によって、有糸分裂誘発を評価した（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）。ＰＫＣα涸渇を、ウエスタンブロッティングによって確認した。
【０２０７】
カルシウムおよび移行の画像化
細胞を、１．４×１０４ＨＳＧ細胞／ｍｍ２または０．７×１０４ＨＳＧ細胞／ｍｍ２で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆（１００μｇ／ｍｌ、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州）カバースリップ上に播種し、１０％ウシ胎児血清を伴うフェノールレッドを含まないダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改変イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地を含有する６ウェルプレートにおいて、１晩または４８時間増殖後、それぞれ７０〜８０％コンフルエンシーを達成させた。細胞を、２０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ギブコインビトロジェン（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク州）を伴う無カルシウム／無フェノールレッドハンクス（Ｈａｎｋｓ）塩基塩溶液中で反復洗浄し、次いで、１μＭ  Ｕ７３１２２、１μＭ  Ｕ７３３４３（Ｕ７３１２２の不活性アナログ、バイモルリサーチラボラトリーズ（ＢＩＯＭＯＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）、プリマウスミーティング（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ）、ペンシルバニア州）、１μＭ  Ｇｏ６９７６、もしくは１０μＭニフェジピン（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州）を含有する同溶液において、またはコントロールのためにビヒクル（インヒビター溶液において同じレベルに希釈したＤＭＳＯ／プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ））単独において、１０分間、インキュベートした。
【０２０８】
他の細胞を、１０％ウシ胎児血清を伴うフェノールレッドを含まないダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改変イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地中１００ｎｇ／ｍｌ百日咳毒素（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州）、またはビヒクル単独）と共にインキュベートした（０．７×１０４ＨＳＧ細胞／ｍｍ２、１晩、プレーティング）。細胞を、無カルシウム／無フェノールレッドハンクス（Ｈａｎｋｓ）塩基塩溶液、２０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸で洗浄し、次いで、１時間、室温で、４μＭでフルオ−４ＡＭ（フルオロピュアグレード（ＦｌｕｏｒｏＰｕｒｅ  ｇｒａｄｅ）［モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）、オレゴン州］ＤＭＳＯ＋２０％プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−１２７に溶解した）を含有する同溶液と共にインキュベートした。細胞を、３回、６０分間、室温で、５ｍＭ  Ｃａ２＋または５ｍＭ  ＥＧＴＡを伴う無カルシウム／無フェノールレッドハンクス（Ｈａｎｋｓ）塩基塩溶液で洗浄した。温度を、５分間、３７℃で安定化し、カバースリップを、ＴＥ−２００落射蛍光顕微鏡（Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒ６０×ＮＡ１．４Ｏｉｌ  ＩＲ対物レンズを使用するＷ．Ｍ．Ｋｅｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇの一環としてのバイオ−ラッドラディエンス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｒａｄｉａｎｃｅ）２１００共焦点／マルチフォトンシステム［バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ハーキュリース（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、カリフォルニア州］バージニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ））のステージ上に配置し、５２８ｎｍでの放出を伴う４８８ｎｍアルゴンレーザー光源に供した。ベースラインのモニターに続いて、フェノールレッドを含まないハンクス（Ｈａｎｋｓ）塩基塩溶液におけるラクリチンまたは欠失フラグメントの添加を行った。
【０２０９】
画像は、ＬａｓｅｒＳｈａｒｐ２０００ソフトウェア（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を使用して、２〜３秒間の間隔で獲得し、後の分析のためにディスク上に記録した。移行解析のために、インヒビターを伴うあるいは伴わないマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）被覆カバースリップ上のＨＳＧ細胞を、１０ｎＭラクリチンもしくはポジティブコントロールの２００ｎＭホルボール１２−ミリステート１３−アセテート、またはビヒクルで１５分間処置し、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、ホルムアルデヒドで固定し、１％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水および１０％ヤギ血清でブロックし、抗ＰＫＣα（Ｃ−２０）または抗ＮＦＡＴＣ１（ｍａｂ７Ａ６）（両方ともサンタクルーズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ）製、サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、カリフォルニア州）、続いて、第二Ｃｙ３−、ＦＩＴＣ−またはアレクサ（Ａｌｅｘａ）４８８標識抗体と共にインキュベートし、共焦点顕微鏡可視化（バイオ−ラッドラディエンス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｒａｄｉａｎｃｅ）２１００）を行った。
【０２１０】
結果
ラクリチンは高度に細胞選択的な上皮マイトジェンである
本発明者らは、はじめに、特徴的なラクリチンの用量および細胞の特異性を求めた。ラクリチンは、腺房の持続性腺上皮および導管上を流動して、後に、眼または口の表面上に沈着するようになる（図５Ａ）。３Ｈ−チミジン取り込みアッセイを使用して、本発明者らは、ラクリチンに対するヒト唾液腺導管（ＨＳＧ）細胞応答が釣鐘型のであることを見出している。１または１０ｎＭの至適用量は、ＦＢＳポジティブコントロールに一致する増殖のレベルを促進する（図５Ｂ）。この二相応答および用量は、他の細胞系におけるソニックヘッジホッグ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦについて認められるものに等価である（ランキン，Ｓ．（Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４年、２６９：７０４−７１０、ルビンＪ．Ｂ．（Ｒｕｂｉｎ，Ｊ．Ｂ．）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２年、１２９：２２２３−２２３２、ウィリアムズ，Ｅ．Ｊ．（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｅ．Ｊ．）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９４年、１２０：１６８５−１６９３、ソンデル，Ｍ．（Ｓｏｎｄｅｌｌ，Ｍ．）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９９年、１９：５７３１−５７４０、チャン，Ｃ，Ｐ．（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｐ．）ら、Ｃｅｌｌ，２００４年、１１８：６４９−６６３）。ラクリチンによって標的化される他の細胞タイプはほとんど認められない。ラクリチンは、ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）および胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（両者は類似の釣鐘型の応答を表示する）に対して分裂促進性である（図５Ｂ）（示さず）。ラクリチンは、ヒト上皮（Ａ４３１）、頚部（ＨｅＬａ）、包皮線維芽細胞（ＨＳ６８）、線維肉腫（ＨＴ１０８０）、赤白血病（Ｋ−５６２）、非浸潤乳癌腫（ＭＣＦ７）、メラノーマ（ＳＫ−ＭＥＬ、ＷＭ−１６４）、レイディヒ（ＴＭ４）、セルトリ（ＴＭ３）、およびマウス線維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）細胞（図５Ｂ）に対して分裂促進性でなく、また、ヒト神経膠腫（Ｕ−１２４２−ＭＧ、Ｕ−２５１−ＭＧ）細胞に対してはより高い用量であっても分裂促進性ではない（示さず）。ラクリチン標的化は迅速である。シグナル伝達は、少なくとも９つの異なる同定されていないリン酸化タンパク質の異なるかつ一過性のチロシンリン酸化（図５Ｃ）によって、等価な用量応答様式で、最初の１分間以内に認められる（示さず）。２時間以内に、ＨＳＧ細胞における３Ｈ−チミジン取り込みが検出可能である（示さず）。重要なことに、本発明者らは、ｐ４２およびｐ４４ＭＡＰＫ（それぞれＭＡＰＫ１およびＭＡＰＫ３、図５Ｄ）の活性を認めておらず、従って、ラクリチン依存性有糸分裂誘発がＥＧＦ経路、または別のＲａｓ−ＧＴＰ依存性サイトカインもしくは増殖因子経路のトランス活性化に関与する可能性を除外している。これらの結果は、ラクリチンが上皮選択的マイトジェンであることを示す。さらに、唯一の所定の上皮は応答性であり、持続性（ＨＳＧ、ＨＥＫ）および迅速に（ＨＣＥ）上皮を再生する両方由来の細胞を含む。両カテゴリー由来の他の細胞は除外する。同等に限られた（主に下流の）上皮の分裂促進性標的化に対する所定の腺の持続性上皮による制限された放出は、独特のニッチェを規定する（図５Ａ）。
【０２１１】
ラクリチンのＣ末端は上皮制限性有糸分裂誘発を駆動する
この活性の分子レベルの理解のための本発明者らのアプローチは、配列アラインメントを研究することから始まった。非分裂促進性フィブリン−２またはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン５に対するラクリチンの制限された相同性は重要な情報ではなかった。しかし、マイトジェンおよび推定的ホモログのダーミシジンは特に有用であった（ポーター，Ｄ．（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３年、１００：１０９３１−１０９３６）。成熟ラクリチンおよびダーミシジンの同一性は僅か２３％であったため、本発明者らは、ほぼ至適なアラインメントおよび公開されたアラインメントにおいて認められなかったかまたは部分的にのみ認められたカルボキシ末端側の半分における同定された３つの相同領域の両方を比較した（ポーター，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３年、１００：１０９３１−１０９３６）。２つは、ＰＳＩＲＥＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｅｒ、図６）によって推定されたαヘリックスに存在する。いずれのタンパク質も欠失解析に供されていなかったため、本発明者らは、ラクリチンＣ末端トランケーション変異のアレイを作製した（図６Ａ）。１つのＮ末端変異、Ｎ−２４もまた、配列番号４（天然のラクリチン）のアミノ末端の２４アミノ酸を欠失することによって調製した。それぞれを精製し、分裂促進性用量応答実験において、ＨＳＧ細胞を使用して、無傷（ｉｎｔａｃｔ）なラクリチンと比較した。Ｃ末端由来の５および１０アミノ酸、またはＮ末端由来の２４アミノ酸を欠く変異は十分に活性であった。５または１０を超えるＣ末端アミノ酸（Ｃ−１５、Ｃ−２０）の取り出しにより、それぞれ、活性が減少または完全に廃止された（図６Ｂ、１０ｎＭにおいて示される）（推定ラクリチンコア受容体シンデカン−１のコアタンパク質への結合の消失によって反映されるパターン）（示さず）。従って、次いで、Ｃ−１０（成熟ラクリチンのアミノ酸１００〜１０９、図６Ｃ）から欠失させたさらなるＣ末端アミノ酸は、両方の活性に重要である。この領域は、ＰＳＩＲＥＤにより推定されるαへリック内に存在する。それがαヘリックス形成が可能であるかどうかを決定するために、本発明者らは、いくらかのフランキングアミノ酸を伴う活性領域ＫＱＦＩＥＮＧＳＥＦＡＱＫＬＬＫＫＦＳ（配列番号２３）を合成し、それを円二色性に供した。ＰＢＳにおいて、それはランダムコイルを形成し、１０ｍＭドデシルホスホコリンにおいては、αヘリックスを形成した（図６Ｄ）。形質膜挿入はラクリチンの低いナノモル活性および細胞特異性を伴う状態ではないが、同じまたは異なるタンパク質上の疎水面は、αヘリックス形成に適切な環境を作製することができる（マリ，Ｃ．（Ｍｕｒｒｅ，Ｃ．）ら、Ｃｅｌｌ，１９８９年、５８：５３７−５４４）。この領域の疎水性および疎水面がαヘリックス形成によって作製されるかどうかについて研究するために、本発明者らは「ヘリカルウィール（Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｗｈｅｅｌ）」を利用した。活性領域の１０残基のうち５つは疎水的であり、すべてが１つの面に沿ってまとまっている。フランキングアミノ酸���包含は、両親媒性αヘリックスとして公知であるこの構造の分極形成した性質をさらに強調する（図６Ｅ）。両親媒性αヘリックスは、リガンド−受容体またはリガンド−リガンド相互作用において共通である。副甲状腺ホルモン様ホルモンのＣ末端の両親媒性αヘリックスの疎水面は、例えば、副甲状腺ホルモン様ホルモン受容体−１の結合を仲介する（バーディーン，Ｊ．Ａ．（Ｂａｒｄｅｎ，Ｊ．Ａ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７年、２７２：２９５７２−２９５７８）。同じ機構がＦＬＴ１およびＫＤＲ受容体結合性に不可欠のＶＥＧＦ二量体化を指令する（ジーメイスター，Ｇ．（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒ，Ｇ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８年、２７３：１１１１５−１１１２０）。本発明者らは、このこともまた、ラクリチンのＣ末端分裂促進性ドメインが疎水性結合面を伴うＣ末端αヘリックス構造の発達によって形成されるラクリチンにもあてはまることを示唆する。対応するダーミシジンペプチドのヘリカルウィール解析（示さず）により、ラクリチン（ＬＡＦＧＬＦ）（配列番号３７）とは異なる同等に強力な両親媒性ヘリックスおよび疎水結合面（ＶＧＶＬＡＶ）（配列番号３６）が示唆される。
【０２１２】
ＰＫＣαを介する特有のラクリチン分裂促進性シグナル伝達
そのような上皮細胞標的化は、特有の性質を伴う分裂促進性シグナル伝達経路によって反映され得るか？本発明者らは、ラクリチン標的化ヒト角膜上皮細胞が迅速に細胞内カルシウムを動員し（サンギ（Ｓａｎｇｈｉ）ら、’０１）、ＨＳＧ細胞において、少なくとも９つの同定されていないタンパク質のチロシンリン酸化がラクリチン添加の１分間以内に生じることを早くから実証している（図５Ｃ）。ラクリチン分裂促進性シグナル伝達が多くの増殖因子およびサイトカインに共通のＲａｓ−ＧＴＰ依存性経路とは異なることを示すｐ４２およびｐ４４活性化（図５Ｄ）は除外した。本発明者らは、ラクリチンがシンデカン−１に結合することとを見出したが、その実証されたシグナル伝達特性が制限されているため、歴史的に、シンデカン−１は、共受容体としての役割を果たしてきた。本発明者らは、上流エフェクターのためのアッセイとしてのヒト角膜上皮細胞におけるラクリチン依存性カルシウム動員の迅速性（２０〜３０秒）に注目した。しかし、これらの細胞は、ＲＮＡｉ研究のためには、ＨＳＧ細胞ほど容易にトランスフェクトが可能ではない。従って、本発明者らは、ＨＳＧ細胞が同様に応答するかどうか、そうであるならば、有糸分裂誘発に関する可能性のあるカルシウム動員であるかどうかについて求めた。
【０２１３】
ＨＳＧ細胞にカルシウムインジケーターＦｌｕｏ−４を充填することにより、分裂促進用量（１０ｎＭ）のラクリチン（但し、１０ｎＭの非分裂促進性Ｃ−２５欠失変異体ではない）は、通常、添加の３０秒以内にカルシウム動員を促進することが示された。遊離のカルシウムは、核および細胞質性の両方である（図７Ａ）。分裂促進性シグナル伝達に関する他の情報は得られなかったため、本発明者らは、次に、いくらかの共通の薬理学的インヒビターを適用した。百日咳毒素（１００ｎｇ／ｍｌ）によるプレインキュベーションは、ラクリチンにより刺激されたカルシウム動員を完全に阻害したことから、活性なＧタンパク質ＧαｉまたはＧαｏのための上流要件を示す。ポジティブコントロールとして、本発明者らは、ラクリチンをムスカリンアゴニストカルバコールで置き換え、十分なカルシウム動員を観察した（図７Ｂ）。カルバコールのＧαｑ−仲介カルシウム動員は、百日咳毒素に非感受性であることが周知である。投与されたＵ７３１２２は、ＩＰ３およびジアシルグリセロールの形成を触媒するホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）のＧタンパク質仲介活性を阻害する。Ｕ７３１２２（１μＭ）は、ラクリチンおよびカルバコールの両方によるカルシウム動員を阻害し（図３Ｂ）、ＰＬＣ作製ＩＰ３は細胞内貯蔵からのカルシウム放出を指令することが示唆された。ジアシルグリセロールは、下流のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する。さらに、細胞をＰＫＣインヒビターＧｏ６９７６（１μＭ）と共にプレインキュベートした場合、ラクリチンにより刺激されたカルシウム動員が完全に阻害された（図７Ｂ）ことから、活性なタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の独特の上流要件を示唆する。ＰＫＣは、腺房および他の細胞のカルバコール刺激より後のカルシウムの下流にある。同じことがＨＳＧ細胞にもあてはまるかを確認するために、本発明者らは、Ｇｏ６９７６プレインキュベート細胞をカルバコール刺激した。カルシウム動員は、１０μＭＧｏ６９７６（示さず）であっても影響を受けなかった（図３Ｂ）。従って、ラクリチンシグナル伝達は、特有の性質を表示する。
【０２１４】
デイビス，ＳＰ（Ｄａｖｉｅｓ，Ｓ．Ｐ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０００年、３５１：９５−１０５は、タンパク質キナーゼインヒビターの特異性が初期の見込みよりも狭いことを実証している。Ｇｏ６９７６は最も選択的なＰＫＣインヒビターであるが、インビトロアッセイは、ＭＡＰＫ（ＭＫＫ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ）、ＥＲＫ／ｐ３８（ＭＳＫ１）、Ｒｈｏ（ＲＯＣＫ２）、およびＡｋｔ（Ｓ６Ｋ１）経路のエレメント、ならびにＧαｑのＧＳＫ３Ｂ下流を阻害する能力を示す（デイビス，Ｓ．Ｐ．（Ｄａｖｉｅｓ，Ｓ．Ｐ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０００年、３５１：９５−１０５）。従って、本発明者らは、ラクリチンシグナル伝達および有糸分裂誘発におけるＰＫＣの関与を試験するための代替的アプローチを求めた。
【０２１５】
ＨＳＧ細胞は、ＰＫＣα、δ、ε、γ、τ、およびλを抑制することが公知であり（チュン，Ｄ．Ｗ．（Ｊｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２０００年、１８５：２１５−２２５）、これらのうちαイソ型のみが１μＭでＧｏ６９７６によって阻害されるべきである。本発明者らは、ＲＮＡ干渉による分解のためにＰＫＣαｍＲＮＡを標的にすることを選択する（図８ＡおよびＢ）。ＨＳＧ細胞を、ＰＫＣαのための４つの干渉ＲＮＡ断片（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）のプールでトランスフェクトした。ＰＫＣαは、ラクリチンに応答して増殖することができない涸渇およびトランスフェクトされた細胞になった。血清誘発性有糸分裂誘発は、擬似（ｍｏｃｋ）およびネガティブコントロールと比較して僅かに減少した（’Ｄ７〜Ｄ１０’）。次いで、細胞を、個々に、それぞれの４つの干渉ＲＮＡ断片（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）でトランスフェクトした。両方のＰＫＣαＤ７およびＤ１０トランスフェクタントはラクリチン非応答性であったが、増殖アッセイでは完全な血清応答性であった（図８Ａ）。重要なことに、Ｄ７のさらなる試験により、ラクリチン依存性カルシウム動員は示されなかった（図７Ｂ）。カルシウム含有培地においてラクリチンにより刺激された細胞からのカルシウム計測（図７Ｂ）は、迅速な細胞内貯蔵放出、続いて、貯蔵操作性チャンネルを介する細胞外カルシウム流入を伴う状態にある。ラクリチン処置が形質膜上の受容体操作性チャンネルを直接活性化することも同等に妥当である。
【０２１６】
動員されたカルシウムが細胞外もしくは細胞内供給源または両方から駆動するかどうかを求めるため、細胞を、ＥＧＴＡを含有するかまたは名目上カルシウムを含まない培地において１０ｎＭラクリチンで刺激した。ＥＧＴＡ含有培地の細胞は、ラクリチンに応答して内部のカルシウムを動員し（図７Ｃ）、名目上カルシウムを含まない培地の細胞は、釣鐘型のラクリチン用量依存的様式で増殖した（図５Ｂ、挿入図）。任意の特定の理論によって制限されることを所望しなければ、カルシウム動員は内部で阻害され、細胞外カルシウムは有糸分裂誘発には必ずしも必要ではないようである。
【０２１７】
ラクリチンは、ＰＫＣαの核周囲のゴルジ領域への移行を刺激する。
細胞増殖のＰＫＣα調節は、細胞質ＰＫＣαの膜への移行によって阻害される。膜関連ＰＫＣαと他の膜関連エフェクターとの相互作用は、有糸分裂誘発への下流のシグナル伝達を駆動する。従って、ここでは、ラクリチンがＰＫＣα移行を促進するかどうか、そうであれば、どの膜コンパートメントに対してかを決定した。
【０２１８】
本発明者らは、処置１５分後の細胞におけるＰＫＣαを画像化した（図８）。非分裂促進性構築物／フラグメントＣ−２５（１０ｎＭ）は、効果を有さず、ＰＫＣαを細胞質全体に分散的に分布させた。対照的に、１０ｎＭラクリチンまたはＮ−２４構築物／フラグメントは、ＰＫＣαを、主に、核周囲のゴルジ領域にシフトさせた（図８Ｃ）。ポジティブコントロールの４β−ホルボール１２−ミリステート１３−アセテートで処置した細胞は、ＰＫＣαを単独で、形質膜において濃縮した（図８Ｃ）。ＰＫＣαのリン酸化状態は、その移行部位に影響を及ぼす。過剰リン酸化ＰＫＣαが形質膜と関連する一方、低リン酸化または脱リン酸化ＰＫＣαは、核周囲のゴルジ領域に移行することが公知である。後者が事実であるかどうか、そしてそうであれば、さらにどのような時間経過をたどるのかを決定するために、本発明者らは、細胞をラクリチン、Ｎ−２４およびＣ−２５で処置し、次いで、ホスホ−ＰＫＣαについて細胞溶解物をドットした（図８Ｂ）。１０ｎＭラクリチンは、添加の１分間以内にＰＫＣα脱リン酸化を促進する。この形態は、少なくとも１５分間、維持されるが、３０分間までに基底のリン酸化に戻った。増加モルレベルのラクリチンまたはＮ−２４によって誘発される脱リン酸化は、１０ｎＭでの至適脱リン酸化による増殖応答に反映した。非分裂促進性Ｃ−２５は効果を有さなかった一方、ポジティブコントロールの４β−ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート促進性過剰リン酸化は効果を有した。
【０２１９】
従って、核のカルシウム動員は、ＩＰ３の局所作製を介するＰＫＣα核周囲ゴルジ移行の直接的な時間的空間的結果である。実際、ラクリチン依存性核および細胞質カルシウム動員は、ＰＫＣαのｓｉＲＮＡ涸渇によって排除される（図７Ｂ）。ここでは、カルシウム動員に対するラクリチン刺激性シグナル伝達は、ＧαｉまたはＧαｏ／ＰＫＣα／ＰＬＣ経路に従うことが示唆される。そうであれば、百日咳毒素およびＧｏ６９７６（但し、Ｕ７３１２２ではない）は、ＰＫＣα移行を阻害すべきである。本発明者らは、それぞれについて再試験し、ラクリチン依存性ＰＫＣα移行および脱リン酸化が百日咳毒素（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＧｏ６９７６（１μＭ）によって、但し、Ｕ７３１２２（１μＭ、図９）によっても阻害されることを観察した。弱い活性のアナログＵ７３３４３は、しばしば、Ｕ７３１２２に対するネガティブコントロールとして使用される。Ｕ７３３４３（１μＭ）と共にプレインキュベートされた細胞は、十分な移行および脱リン酸化を示した（図９）。このことは、ＰＫＣαおよびＰＬＣの相互依存的複合体がＧαｉまたはＧαｏ活性化とＰＫＣα移行との間の中間にあることを含意する。代替的可能性は、活性型が移行しているＰＫＣαを捕捉する場合、ＰＬＣイソ型が特定のゴルジ領域に配置されることである。ＰＬＣγ２は、抗原刺激前後のマスト細胞における特定のゴルジ領域において濃縮される。ＰＬＣγ２または別のＰＬＣイソ型は、ＨＳＧ細胞の核周囲のゴルジ領域に位置するのか、そうであれば、それはＰＫＣαと複合するのか？本発明者らは、ラクリチン処置細胞由来の内因性ＰＫＣαを免疫沈降させ、次いで、ホスホ−ＰＬＣγ２についてブロットした（図９）。
【０２２０】
ＰＬＤの下流の活性化
本発明者らは、ラクリチン添加後の内因性ＰＬＤ活性を測定し、１０ｎＭラクリチンで至適である釣鐘型の活性化曲線を得、従って、有糸分裂誘発、ＰＫＣα移行およびＰＫＣα脱リン酸化について観察される同じ用量依存性を再現した。ＰＫＣαがラクリチンシグナル伝達においてＰＬＤの上流にあるかどうかを決定するために、細胞をＤ７ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＰＫＣαの涸渇は、ラクリチンに応答するＰＬＤ活性化を完全に廃止した一方、血清によるＰＬＤ活性化は影響を受けなかった（図９Ｄ）。一過的に低リン酸化された核周囲ゴルジのＰＫＣαは、少なくとも２つの役割を有するようである。それは、ＰＬＣγ２と複合し、ＩＰ３作製およびカルシウム動員をもたらす。それはまた、ＰＬＤ１を活性化する。
【０２２１】
下流シグナルの収束
細胞周期進行に対する下流のラクリチンシグナル伝達は、少なくとも２つの異なる経路に従い得る。顕著なカルシウム動員は、細胞質のカルシウムがホスファターゼカルシニューリンを刺激し、細胞質のＮＦＡＴ（活性型Ｔ細胞の核因子）を活性化することができる可能を生じる。脱リン酸化ＮＦＡＴは核に移行する一方、それは、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＧＡＴＡおよびＣ／ＥＢＰを含む他の転写因子との不可欠な協力的相互作用においてＤＮＡと結合する（クラブトリー，Ｇ．Ｒ．（Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｇ．Ｒ．）ら、Ｃｅｌｌ，２００２年、１０９、補遺：Ｓ６７−７９、エラツル，Ｃ．Ｒ．（Ｙｅｌｌａｔｕｒｕ，Ｃ．Ｒ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２００２年、３６８：１８３−１９０）。第２に、ラクリチンシグナル伝達はＰＬＤ１（図５Ｄ）を活性化し、活性なＰＬＤ１はホスファチジン酸を作製するため、ラクリチンは、分裂促進性ホスファチジン酸／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６キナーゼ１経路にシグナル伝達する可能性がある（ファン（Ｆａｎｇ）ら、’０３年）。仮定として、両方の経路は、ＦＧＦ−９に応答する平行進行のＥＲＫおよびｍＴＯＲ分裂促進性シグナル伝達に従って、ラクリチン有糸分裂誘発付加的に必要とされ得る。あるいは、筋肉のＩＧＦ−１シグナル伝達におけるカルシニューリンのＰＩ（３）Ｋ／Ａｋｔ阻害に従って、他のものを調節することができる（ロメル（Ｒｏｍｍｅｌ）ら、’０１年）。涙腺、唾液腺または角膜上皮におけるＮＦＡＴはこれまで研究されていないため、本発明者らは、ＮＦＡＴＣ１（皮膚上皮の増殖性コンパートメントにおいて選択的にアップレギュレートされる唯一のＮＦＡＴイソ型）を選択する（ツンベル（Ｔｕｍｂａｒ）ら、’０４年）。非処置ＨＳＧおよび上流の角膜上皮細胞では、ＮＦＡＴＣ１は、細胞質全体に分散的に分布される。ラクリチンまたはＮ−２４が添加される場合、ＮＦＡＴＣ１は核に移行する。Ｃ−２５は効果を有さなかった。移行は、百日咳毒素、Ｕ７３１２２、Ｇｏ６９７６によって、およびＰＫＣαに対するｓｉＲＮＡによって阻害されたが、ネガティブコントロールＵ７３３４３によっては阻害されなかった。ＮＦＡＴ移行の上流のカルシニューリン活性化を阻害するシクロスポリンについても試験した。シクロスポリン（１μＭ）は、ＮＦＡＴＣ１の移行を阻害したが、ＰＫＣαは阻害しなかった。これらのデータは、ラクリチン誘導性ＮＦＡＴＣ１移行がＧαｉまたはＧαｏ／ＰＫＣα−ＰＬＣ／Ｃａ／カルシニューリンの下流にあることを示唆する。
【０２２２】
核ＮＦＡＴＣ１の相対レベルは、早期に認められるラクリチンの釣鐘型の応答に従ったが、カルシウムを活性化する供給源和不明であった。ＥＧＴＡ含有培地の細胞は、ラクリチントランジエント（図７Ａ）を表示し、カルシウム動員が内部貯蔵から初期化されることを示した。さらに、ＮＦＡＴ活性化は、歴史的に形質膜イオンチャンネル（しばしば、Ｌ型またはＴＲＰ）を介する持続性カルシウム流入に関連している。次に、チャンネル阻害後の活性化を試験した。ニフェジピン（１０μＭ）によるＬ型チャンネルの遮断は、ＮＦＡＴＣ１、ＰＫＣα（図９Ａ）、または有糸分裂誘発のラクリチン依存性移行を干渉しない。また、ＥＧＴＡ、およびランタニドのガドリニウム（Ｇｄ３＋）、容量性カルシウム流入の選択的インヒビターは非阻害的である。対照的に、タプシガーギンは、ＮＦＡＴＣ１およびＰＫＣαの両方の移行を阻害した。タプシガーギンは、細胞内貯蔵（ラクリチン依存性動員のおそらく初期のカルシウム供給源）からのカルシウムの受動的涸渇を生じる。任意の特定の理論によって制限されることを所望しなければ、内部カルシウムは、ＧαｉまたはＧαｏ／ＰＫＣα−ＰＬＣ／Ｃａ／カルシニューリン経路の部分としてのラクリチン刺激性ＨＳＧ細胞におけるＮＦＡＴＣ１経路を活性化することが仮定される。
【０２２３】
最近、活性なＰＬＤ１によって作製されるホスファチジン酸がラパマイシン感受性ｍＴＯＲ／ｐＳ６Ｋ１経路を活性化することが実証された。ｍＴＯＲ／ｐＳ６Ｋ１は、Ｇ１細胞周期移行に必要なタンパク質翻訳を促進することによって、分裂促進性および細胞増殖を調節する（レーン（Ｌａｎｅ）ら、’９３年）。ラクリチンシグナル伝達がＳ６Ｋ１を活性化するかどうかを決定するために、異なるラクリチン用量による処置後のリン酸化Ｓ６Ｋ１についてのアッセイを実施した。タイムコース実験では、ｐＳ６Ｋ１がｍＴＯＲ、ＦＫ５０６結合性タンパク質１２との複合においてラパマイシンにより阻害可能であるセリン／スレオニンキナーゼによってリン酸化されることが見出された。
【０２２４】
各経路の有糸分裂誘発に対する相対的寄与を識別するために、細胞を、シクロスポリンおよび／またはラパマイシンとプレインキュベートすることができる。
【０２２５】
実施例６
前分泌性（Ｐｒｏｓｅｃｒｅｔｏｒｙ）マイトジェン方法のための共受容体としてのシンデカン−１の同定
方法
ビオチン化細胞表面タンパク質をラクリチンアフィニティーカラムに適用した。生理学的塩を含有する緩衝液において広範に洗浄した後、結合タンパク質を１Ｍ  ＮａＣｌで溶出させ、ＥＣＬブロット方法を使用して、アビジン−ペルオキシダーゼで同定した。対照的に、ラクリチンを欠くカラムを使用した。ヒトシンデカン−１プラスミドＤＮＡを、ラクリチン非反応性ＨＥＫ２９３細胞に安定的にトランスフェクトした。ヒトシンデカン−２または−４で安定的にトランスフェクトされた２９３のＴ細胞は、アツシ・ウタニ（Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｕｔａｎｉ）博士（千葉大学（Ｃｈｉｂａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））より贈与された。一連のラクリチンＣ末端およびＮ末端欠失変異体を作製した。プルダウン結合アッセイは、インテインタグ化ラクリチンまたはインテイン欠失変異体と非トランスフェクトまたはトランスフェクトの溶解物とのインキュベーション、続いて、沈殿およびＳＤＳ  ＰＡＧＥを要した。ヒト涙腺におけるシンデカン−１の免疫局在性を、抗ヒトシンデカン−１抗体（ＣＤ１３８）を使用して、実施した。
【０２２６】
結果
ラクリチンアフィニティーカラムから反復的に溶出させた約４つのバンドのうちの最初のバンドを、配列決定により、シンデカン−１と決定した。プルダウンアッセイでは、ラクリチンは哺乳動物シンデカン−１に結合したが、シンデカン−２または４には結合しなかった。結合は、ヘパラン硫酸側鎖に非依存的であるようであり、ヘパリンに対するラクリチン結合性の欠如を伴う状態にある（既に公知である）。ラクリチンの末端の２５アミノ酸（但し、Ｎ末端の５、１０、または２４アミノ酸ではない）の欠失は、結合を排除した。可溶性ラクリチンおよびＮ末端２４欠失変異体（但し、ヘパリンおよびＣ末端欠失変異体）は、競合結合アッセイにおける結合を阻害する。シンデカン−１をヒト涙腺における「頂端付近」および基底側形質膜（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）で欠失させた。
【０２２７】
結論
シンデカン−１、ＦＧＦ、Ｗｎｔおよび他の増殖因子の共受容体は、ラクリチンの同じ能力において、但し、ヘパラン硫酸側鎖に明らかに独立する独特の様式で、役割を果たすようである。結合性に対するラクリチンのＣ末端２５アミノ酸、ならびに有糸分裂誘発およびカルシウムシグナル伝達に対する依存性から、ラクリチン−受容体相互作用におけるラクリチンのＣ末端両親媒性α−ヘリックスの関与を示唆する。
【０２２８】
実施例７
角膜上皮細胞における腫瘍壊死因子誘導性アポトーシスは、ラクリチンによって減弱される。
背景
細胞生存は、感染または損傷後の角膜上皮再生中に必須であり、新規涙腺の糖タンパク質、ラクリチンは、細胞保護および細胞増殖において基本的である。上記で詳述したように、涙腺−角膜の軸は、眼の健康の基本的な調節因子であり、ドライアイ症候群および角膜損傷に関連する眼表面の炎症において重要な役割を果たす。特に、炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびケモカインＩＬ−８のような多数のメディエーターは、角膜炎症の発達および進行に関与する。角膜上皮細胞ターンオーバーを調節する経路に依存的である推定Ｇ−タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）の刺激におけるラクリチンの役割を、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、およびそのヒト角膜上皮細胞系統（ＨＣＥ）における腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）誘導性アポトーシスとの架橋に関与する増加したカルシウムシグナル伝達に関与する機構について、試験した。
【０２２９】
方法
ラクリチン誘導性増殖およびカルシウムシグナル伝達を、ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）細胞系統において研究した。ＨＣＥ細胞を、３７℃、１０％ＦＢＳおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭ  Ｆ／１２において、増殖させた。各実験は、ＴＮＦ−α（５〜２０ｎｇ／ｍｌ）およびラクリチン（１〜１０ｎＭ）を使用する用量および時間依存的様式で、行った。細胞生存能は、ＭＴＴアッセイを使用して、５７０ｎｍの吸収で分光光度計により測定した。カスパーゼ−８活性を、４０５ｎｍの発光波長で蛍光発生基質ＩＥＴＤ−ｐＮＡの切断を測定することによって、蛍光測定により検出した。ラクリチン誘導性細胞増殖は、Ｈ３−チミジン組み入れにより、およびＰＫＣ、ＰＬＣおよびｃＡＭＰの蛍光に基づく検出を介して、研究した。カルシウムシグナル伝達を、Ｆｌｕｏ−４充填細胞の共焦点顕微鏡によって検出した。
【０２３０】
結果
ＨＣＥ細胞におけるＴＮＦ−α−誘導性細胞死（１８時間後３２．２±２．６％および３０時間後７３．７±１０％）を、ラクリチン（１０ｎＭ）前処置によって減弱させた（図１０）。図１０におけるデータは、Ｇｏ６９７６（タンパク質キナーゼＣのインヒビター）、ラクリチン、２４Ｎ末端アミノ酸を欠くラクリチン（Ｎ−２４）、５Ｃ末端アミノ酸を欠くラクリチン（Ｃ−５）、および２５Ｃ末端アミノ酸を欠くラクリチン（Ｃ−２５）に対する１８または３０時間の暴露後の培養におけるヒト角膜上皮細胞の細胞生存能を比較する。右半分側は、炎症性サイトカインＴＮＦの存在下における生存能である。ＴＮＦ単独は、ＨＣＥの生存能を減少させ、アポトーシスを誘導する。Ｇｏ６９７６およびＣ−２５は、生存能消失に対して効果を有さない。対照的に、ラクリチン、Ｎ−２４およびＣ−５はすべて、ＴＮＦ誘導性細胞死からヒト角膜上皮細胞を保護する。
【０２３１】
ＴＮＦ−αは、プロアポトーシスカスパーゼ−８活性の３倍の増加を誘導し、これは、ラクリチン前処置によって、完全に阻止された（図１１）。図１１に示されるデータは、ヒト角膜上皮細胞におけるカスパーゼ−３活性を比較する。カスパーゼ−３を、アポトーシスによる細胞死のマーカーとして使用する。ＴＮＦはアポトーシスを促進する。欠失変異体Ｃ−２５およびＧｏ６９７６は、細胞死に対して保護しない。ラクリチン、およびラクリチン欠失変異体Ｎ−２４、Ｃ−５、およびＣ−１０は、ＴＮＦによる細胞死からヒト角膜上皮細胞を保護する。
【０２３２】
カスパーゼ−８活性を、ＴＮＦ−α、ラクリチンのフラグメント、およびＰＫＣインヒビターＧｏ６９７６の多様な組み合わせで処置されたヒト角膜上皮細胞において測定した。ＴＮＦ−αは、カスパーゼ−８活性を複数倍の増加に誘導したが、それは、ラクリチンおよびその欠失構築物Ｃ−５、Ｃ−１０およびＮ−２４によって阻止される（図１２を参照のこと）。ＰＫＣ−αインヒビターＧｏ６９７６およびＣ−２５は、イニシエーターカスパーゼ−８の上流のこのような増加を阻止することができない。
【０２３３】
カスパーゼ−９活性を、ＴＮＦ−α、ラクリチンのフラグメント、およびＰＫＣインヒビターＧｏ６９７６の多様な組み合わせで処置された細胞において測定した。ＴＮＦ−αは、カスパーゼ−９活性を複数倍の増加に誘導したが、それは、ラクリチン（１０ｎｍ）およびその欠失構築物Ｃ−５、Ｃ−１０およびＮ−２４によって阻止される（図１３を参照のこと）。ＰＫＣ−αインヒビターＧｏ６９７６およびＣ−２５は、イニシエーターカスパーゼ−９の下流のこのような増加を阻止することができない。
【０２３４】
図１４は、上記のような細胞生存／増殖シグナル伝達、死受容体／アポトーシスシグナル伝達、および細胞増殖／増殖に関与する多様なシグナル伝達経路についてまとめた概略図である。
【０２３５】
当業者であれば、ラクリチンポリペプチドがアポトーシスのようなＴＮＦの炎症効果を阻害する能力を、他の炎症性サイトカインおよび因子をも阻害するためのラクリチンポリペプチドの使用に適用できることを理解するであろう。
【０２３６】
ラクリチンおよびその欠失構築物（Ｎ−２４）は、細胞増殖を促進し、これは、ＨＣＥ細胞におけるチミジン組み入れによって測定される（上記を参照のこと）。
【０２３７】
本発明は、ラクリチンが、ヒト角膜上皮細胞によるムチンＭＵＣ１６の合成および分泌を促進することを実証する。ＭＵＣ１６は、眼表面における重要なムチンである。ムチンは、涙膜に寄与し、眼表面を湿潤するのに重要であり、シェーグレン症候群患者において減少する。具体的には、ヒト角膜上皮細胞を、ラクリチン（１０ｎＭ）またはラクリチンの非活性な欠失変異体、Ｃ−２５（１０ｎＭ）のいずれかで処置した。細胞をＭＵＣ１６についてドットした。ＭＵＣ１６分泌は、非活性変異Ｃ−２５で処置したものと比べて、ラクリチン処置細胞において顕著に増強された。
【０２３８】
結論
新規の前分泌性（ｐｒｏｓｅｃｒｅｔｏｒｙ）マイトジェン、ラクリチンは、細胞増殖を促進し、ＴＮＦ−α−誘導性細胞死に対して角膜上皮細胞に細胞保護を付与する。角膜上皮細胞のこのような細胞保護および増殖に関するシグナル伝達事象については研究中である。
【０２３９】
本明細書において引用したそれぞれならびにすべての特許、特許出願、および刊行物の開示内容は、それらの全体が、参照により本明細書に援用される。
【０２４０】
見出しは、参照により本明細書に含まれ、所定のセクションを配置することを援助する。これらの見出しは、本明細書に記載の概念の範囲を制限することを意図しておらず、これらの概念は、明細書全体に渡る他のセクションにおいて適用可能性を有し得る。
【０２４１】
本明細書において飲用したそれぞれならびにすべての特許、特許出願、および刊行物の開示内容は、それらの全体が、参照により本明細書に援用される。
【０２４２】
本発明は、特定の実施形態を参考にして開示しているが、他の実施形態および本発明の多様な改変が、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのようなすべての実施形態および等価な改変を含むものと解釈されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２４３】
【図１】組換えラクリチンが、単離されたラット涙腺房細胞による非刺激性分泌を増強することを示すグラフ図である。非刺激性分泌の増強は、ラクリチン被覆ウェルに対する増加量のラクリチンの存在下で観察された。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、ラクリチン誘導性増殖およびチロシンリン酸化を表す。図２Ａは、無血清培地におけるＨＳＧ細胞に多様な量のラクリチン（０〜ｌ０ｎｇ／ｍｌのラクリチン）を投与して４日後に決定されたヒト唾液腺（ＨＳＧ）細胞の数のグラフ図である。図２Ｂは、同じ期間に追加されたＢＳＡ（レーン１、１０ｎｇ／ｍｌ）または血清（レーン２、１０％）の投与時におけるＨＳＧ細胞の増殖を表す棒グラフである。すべての実験は、ラミニン−１（０．０５μＭ）被覆ウェル上で実施した。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、ラクリチンの存在および非存在下の両方における貧栄養培地中インビトロでのＨＳＧ細胞の培養から獲得したデータを表し、ラクリチンによるＨＳＧ細胞の保護をグラフで実証する。ＨＳＧ細胞を、ラクリチン（０．４ｎＭ）を伴うまたは伴わないα−ＭＥＭ培地において異なる時間培養し、次いで、氷冷７０％エタノールで固定化し、飽和条件においてヨウ化プロピジウムで染色し、ＦＡＣＳにより検査した。図３Ａは、アポトーシスに陥った細胞の数（サブＧ０／Ｇ１集団）対時間をプロットして得られたデータの棒グラフである。２４時間後、ラクリチンを伴わない細胞は、極めて大きなＤＮＡ断片化またはアポトーシスを示す。図３Ｂおよび３Ｃは、ラクリチンの非存在下で培養された細胞において有意なＤＮＡ断片化が生じることを示すフローサイトメトリーの示度のグラフ図である（サブＧ０／Ｇ１集団は、図３Ｂの大きなピークの左肩（但し、図３Ｃには存在しない）として示される）。
【図４】固定化し、免疫蛍光によってＰＫＣａおよびＮＦＡＴｃ１について探査した、１時間のラクリチン（１０ｎｇ／ｍｌ）処置を伴うまたは伴わないＨＳＧ細胞の写真を表す。ＰＫＣａは、ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）製のＣｙ３コンジュゲート、ＮＦＡＴＣ１は、ＦＩＴＣコンジュゲート第二抗体によって検出した。第一抗体はサンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）製であった。処置を伴わない場合、ＰＫＣａおよびＮＦＡＴｃ１はサイトゾルに同時局在する。ラクリチン処置後、ＮＦＡＴｃ１は核に移行する。
【図５】図５Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤを含んでなる図５は、分裂促進性ラクリチンの細胞標的特異性を示す。図５Ａは、涙腺房細胞分泌顆粒から放出されるラクリチンが導管を介して眼の表面に流動することを図式的に例示する。唾液線では、ラクリチンは、導管細胞によって作製され、唾液に流動する。挿入物、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製される成熟組換えラクリチン。３つのパネルを含んでなる図５Ｂは、ヒト導管細胞のラクリチン標的化が、１または１０ｎＭラクリチン（左側のパネル）での最大増殖活性（１０％ＦＢＳポジティブコントロール（中央のパネル）に等価）で釣鐘型の分裂促進応答を促進することを実証する３Ｈ−チミジン取り込みアッセイの結果をグラフで例示する。図５Ｂの右側のパネルに見られるように、ラクリチンもまた、下流のヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥ）、およびより小さな程度で胚性ＨＥＫ２９３細胞を標的化する。反応性でない細胞型としては：Ａ４３１（ヒト表皮）、ヒーラ（ヒト頚部）、ＨＳ６８（ヒト包皮線維芽細胞）、ＨＴ１０８０（ヒト線維肉腫）、Ｋ５６２（ヒト赤白血病）、ＭＣＦ７（乳房上皮）、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＳＫＭＥＬ（ヒトメラノーマ）、ＴＭ３（マウスライジヒ）、ＴＭ４（マウスセルトリ）、およびＷＭ１６４（ヒトメラノーマ）細胞が挙げられる。図５Ｃは、ラクリチン添加前、および１分後のチロシンリン酸化の電気泳動分析の画像を現す。４時間のチロシンリン酸化の後、付随するデンシトメトリースキャンを行う。図５Ｄは、Ｐ４２／ｐ４４活性化の分析を示し、それらがラクリチンによって活性化されないことを示す。すべての実験は、本図面および以後の図面では、ヒト導管細胞において実施した。
【図６】図６Ａ〜６Ｅを含んでなる図６は、ラクリチンのＣ末端αヘリックスが有糸分裂誘発に必要であることを実証する。図６Ａは、成熟ラクリチン対ＮおよびＣ末端欠失構築物を図式的に示す。ＰＳＩＰＲＥＤにより推定されるαヘリックスを四角で示す。図６Ｂは、フラグメント／欠失構築物Ｎ−２４（配列番号１６）、Ｃ−５（配列番号１７）およびＣ−１０（配列番号１８）の試験の結果をグラフで表し、それらが活性であることを示す。Ｃ−１５（配列番号１９）は部分的に活性である。Ｃ−２０（配列番号２０）、Ｃ−２５（配列番号２１）およびＣ−５９（配列番号２２）は不活性である。本図面および以後の図面では、ラクリチンおよびラクリチン欠失構築物の濃度は、１０ｎＭである。図６Ｃは、試験したフラグメントのいくつかを図式的に概略する。Ｃ−１５／Ｃ−３０の区切り点は、２つの推定されるＣ末端αヘリックスのうちより遠方側の近位の３分の２は、有糸分裂誘発に必須であることを示唆する。推定されるＮ−結合型グリコシル化部位（ＮＧＳ）は、遠位のヘリックスのＮ末端に結合する。αヘリックス（Ｈ）またはランダムコイル（Ｃ）に対するＰＳＩＰＲＥＤ信頼度数を示す。図６Ｄは、ＰＢＳまたは１０ｍＭドデシルホスホコリンのいずれかにおける活性領域の円二色性解析の結果を示す。活性領域、ＫＱＦＩＥＮＧＳＥＦＡＱＫＬＬＫＫＦＳ（配列番号２３）は、円二色性によって試験されるとおり、１０ｍＭドデシルホスホコリンでは、ＰＢＳ（実線）およびαヘリックスにおいてランダムコイルを形成する。図６Ｅは、ヘリカルウィール解析を図式的に例示する。従って、Ｃ末端αヘリックス（ＮＧＳＥＦＡＱＫＬＬＫＫＦＳ）（配列番号２４）は、「ヘリカルウィール」によって推定されるように、疎水性結合面「ＡＦＧＬ」をおそらく示す。
【図７】図７Ａ〜Ｄを含んでなる図７は、ラクリチンの分裂促進性Ｃ末端が、ＰＬＣおよびＰＫＣαを必要とする百日咳毒素阻害可能な様式でカルシウム動員を促進することを実証する。図７Ａは、ラクリチン添加（ｌａｃｒｔ）２０〜３０秒後（但し、構築物Ｃ−２５（配列番号２１）の添加後ではない）の細胞内カルシウムの動員の画像を表す（他で示さない限り、本図面および以後の図面についてはカルシウム含有培地）。図７Ｂは、インヒビターの存在または非存在下における、ラクリチン、Ｃ−２５、ビヒクル（ｖｅｈｉｃ）またはポジティブコントロールのカルバコール（ｃｃｈ）の添加（矢印）後のカルシウム蛍光計測をグラフで例示する。ラクリチンに対する応答でのカルシウム動員は、１または１０ｎＭにおける領域あたりのほとんどの細胞において観察され、百日咳毒素（ｐｔｘ）、ＰＬＣインヒビターＵ７３１２２、ＰＫＣインヒビターＧｏ６９７６による前処置によってか、またはＰＫＣαのｓｉＲＮＡ涸渇によって抑制される。カルバコール依存性動員は、他によって先に認められているように、百日咳毒素またはＧｏ６９７６には影響されない。図７Ｃは、ＥＧＴＡを伴うカルシウムを含まない培地におけるカルシウム動員をグラフで例示する。図７Ｄは、プールされたｓｉＲＮＡであるＤ７〜１０、ならびに個々に添加されたＤ７およびＤ１０で観察されるように、ＰＫＣαのｓｉＲＮＡ涸渇がラクリチンの分裂促進応答を排除することを示す実験の結果のグラフ図である。ＦＢＳにより刺激される有糸分裂誘発に対しても、またはネガティブコントロールのラミンＡ／Ｃ  ｓｉＲＮＡに対してもほとんどもしくは全く影響は認められない。ＰＫＣαブロットは、Ｄ７〜１０によるタンパク質涸渇（但し、ｍｏｃｋ（ｍｋ）をトランスフェクトした細胞またはラミンＡ／Ｃ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞（ｎｇ）のいずれにおいてでもない）を例示する。
【図８】ラクリチンＣ末端依存的様式で、ＰＫＣαが核周囲のゴルジ領域に移行し、ＮＦＡＴＣ１が核に移行することを示す細胞の写真画像を表す。写真の画像の頂部の行はＣ−２５（配列番号２１）の使用を示し、第２の行はＮ−２４（配列番号１６）の使用を示し、第３の行はラクリチンの使用を示し、第４（底部）の行はポジティブコントロールのホルボール１２−ミリステート１３−アセテートによる形質膜への移行を示す。左側のカラムはＰＫＣαを示し、中央のカラムはＮＦＡＴＣ１を示し、右側のカラムは併合（ｍｅｒｇｅ）を示す。
【図９】図９Ａおよび９Ｂを含んでなる図９は、ラクリチンにより刺激されたＰＫＣαの移行が、細胞内カルシウム放出の上流にあり、ＮＦＡＴＣ１の移行および有糸分裂誘発に必要であることを実証する。図９Ａは、ＰＫＣα（左側／第１のカラム）およびＮＦＡＴＣ１（中央／第２のカラム）のラクリチン依存性移行は、百日咳毒素（頂部／第１の行）、Ｕ７３１２２（第３の行）およびＧｏ６９７６（第４の行）によって阻害されるが、不活性なＵ７３１２２アナログＵ７３３４３（第２の行）によっても、またはＬ−チャンネルカルシウムブロッカーのニフェジピン（ｎｉｆｅｄ）（底部／第４の行）によっても阻害されないことを実証する写真画像を表す。第３のカラムは併合（ｍｅｒｇｅ）を表す。右端（第４）のカラムは、「＋」または「−」で示されるように、トリチウムチミジンの取り込みに対する影響を示す。図９Ｂは、ラクリチン添加時のＰＫＣのリン酸化分析の画像を示す。
【図１０】腫瘍壊死因子誘導性細胞死からヒト角膜上皮細胞を保護するラクリチンおよびラクリチンのフラグメントの能力をグラフで例示する。グループは、Ｇｏ６９７６（タンパク質キナーゼＣのインヒビター）、ラクリチン、２４Ｎ末端アミノ酸を欠くラクリチン（Ｎ−２４）、５Ｃ末端アミノ酸を欠くラクリチン（Ｃ−５）、および２５Ｃ末端アミノ酸を欠くラクリチン（Ｃ−２５）、腫瘍壊死因子、コントロール（処置なし）ならびにこれらの因子の組み合わせによる処置を含む。縦軸は細胞生存率％を示す。白色バーは１８時間を示し、斜めにハッチングを施されたバーは３０時間を示す。
【図１１】ヒト角膜上皮細胞においてカスパーゼ−３活性を調節する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の能力を阻害するラクリチンおよびラクリチンのフラグメントの能力をグラフで例示する。Ｇｏ６９７６は、タンパク質キナーゼＣのインヒビターである。縦軸は相対的な蛍光単位を表す。白色バーは３時間を示し、斜めにハッチングを施されたバーは６時間を示す。
【図１２】ヒト角膜上皮細胞におけるＴＮＦα誘導性カスパーゼ−８活性を阻止するラクリチンポリペプチドの能力をグラフで例示する。縦軸は相対的な蛍光単位を表す。白色バーは１時間を示し、斜めにハッチングを施されたバーは６時間を示す。
【図１３】ヒト角膜上皮細胞におけるＴＮＦα誘導性カスパーゼ−９活性を阻止するラクリチンポリペプチド（１０ｎＭ）の能力をグラフで例示する。縦軸は相対的な蛍光単位を表す。白色バーは６時間を示し、斜めにハッチングを施されたバーは９時間を示す。
【図１４】上記のような細胞生存／増殖シグナル伝達、死受容体／アポトーシスシグナル伝達、および細胞増殖／増殖に関与する多様なシグナル伝達経路について図式的に概略する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年1月10日(2007.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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