(57)【要約】肝臓期特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作された、生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体を、脊椎動物宿主に投与することによって、その宿主をマラリアに対して接種するための方法。生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体であって、肝臓期特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作された、生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体。ワクチン組成物であって、該ワクチン組成物は、肝臓期特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作された、生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体を含む、ワクチン組成物。
2007515170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体であって、肝臓期特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作された、生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体。
【請求項２】
脊椎動物宿主をマラリアに対して接種するための方法であって、該方法は、肝臓期特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作された、生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体を該宿主に投与することによる、方法。
【請求項３】
ワクチン組成物であって、該ワクチン組成物は、肝臓期特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作された、生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体を含む、ワクチン組成物。
【請求項４】
肝臓期特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作された、生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体の、マラリアワクチンとしての使用。
【請求項５】
ワクチン組成物を産生する方法であって、該方法は、肝臓期特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作された、生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体を、薬学的に受容可能なキャリア溶液中に懸濁することによる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２００４年１１月２６日に提出された米国仮出願番号６０／６３１，２２８、および２００３年１２月１９日に提出された米国仮出願番号６０／５３１，４７９の利益を主張し、これらの三つの出願の全ては、その全体が、参考として援用される。
【０００２】
（政府のライセンスの権利の宣言）
米国政府は、本発明における支払済みのライセンス、および、制限された状況において、国立保健研究所によって与えられたＲＯ１  Ａ０５３７０９の条項によって提供されたような適切な条項で、他人に実施権を与えることを特許所有者に要求する権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子改変された生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体、および、ワクチン接種目的での免疫特異的な免疫エフェクターとしての、遺伝子改変された生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
マラリアは、ヒトの健康に非常に強い影響を与え、毎年数百万人を殺し、そしてこの疾患は、マラリアが風土病である地域、特にサハラ以下のアフリカの諸国の社会的および経済的な発展についての主要な障害である（１（非特許文献１）、添付される引用文献を参照）。マラリアは、蚊によって運ばれる疾患であり、この疾患は、スポロゾイト期のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫の接種によって伝播される。スポロゾイトは肝細胞に侵入し（２（非特許文献２））、肝臓期のものへと変化し、そしてその後の肝臓期発育が病原性分裂小体の放出を最終的にもたらす（３（非特許文献３））。
【０００５】
効果的な「サブユニット」のマラリアワクチンは未だとらえどころがなく、またマラリア寄生虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの複雑性がそのようなワクチンの開発の成功を妨げ得るので、マラリアに対する生物体全体のワクチン（ｗｈｏｌｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｖａｃｃｉｎｅ）のアプローチが、最近、新たな関心を得ている（４（非特許文献４））。そのようなワクチンの実施可能性は、動物モデル、およびその後にヒトにおいて、照射によって弱毒化された寄生虫を用いた接種を通じた不生殖（ｓｔｅｒｉｌｅ）防御免疫の誘導によって示されている（５（非特許文献５）、６（非特許文献６））。肝臓期のものは、第一のマラリアワクチン標的である。なぜならば、肝臓期のものは、不生殖にする免疫応答によって完全に取り除かれ得、それによってマラリア感染を防止し得るからである（７（非特許文献７））。最近では完全なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍゲノム配列（８（非特許文献８）、９（非特許文献９））を利用し得ることにより、現在、より正確でありかつ規定された遺伝子操作による、生きている弱毒化された寄生虫の開発が許容され得る。
【０００６】
発現プロファイリングを用いて、本発明者らは以前に、寄生虫の生活環の前赤内期の部分の間に特異的に発現される遺伝子を同定した（１１（非特許文献１０）、１２（非特許文献１１））。ＵＩＳ（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ）と称される多数の前赤内期遺伝子は、スポロゾイトにおいても、そのスポロゾイトが哺乳類宿主について感染性を得た場合において、アップレギュレーションを示した（１１）。
【非特許文献１】Ｓａｃｈｓ，Ｊ．およびＭａｌａｎｅｙ，Ｐ．，Ｔｈｅ  ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｓｏｃｉａｌ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｍａｌａｒｉａ．Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、第４１５巻、６８０−６８５頁
【非特許文献２】Ｋａｐｐｅ，Ｓ．Ｈ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｋ．およびＭａｔｕｓｃｈｅｗｓｋｉ，Ｋ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｊｏｕｒｎｅｙ：ａ  ｒｉｔｅ  ｏｆ  ｐａｓｓａｇｅ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２００３年、第１９巻、１３５−１４３頁
【非特許文献３】Ｓｈｏｒｔｔ，Ｈ．Ｅ．およびＧａｒｎｈａｍ，Ｐ．Ｃ．Ｃ．，Ｐｒｅ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ  ｓｔａｇｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ、１９４８年、第１６１巻、１２６頁
【非特許文献４】Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｓａｖｅ  ｔｈｅ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｎａｔｕｒｅ、２００４年、第４３０巻、９４０−９４１頁
【非特許文献５】Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｘ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ．Ｎａｔｕｒｅ、１９６７年、第２１６巻、１６０−１６２頁
【非特許文献６】Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｓｐｏｒｏｚｉｔｅｓ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００２年、第１８５巻、１１５５−１１６４頁
【非特許文献７】Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．およびＤｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２０００年、第６巻、１２１８−１２１９頁
【非特許文献８】Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ．Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、第４１９巻、４９８−５１１頁
【非特許文献９】Ｃａｒｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｄｅｌ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ．Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、第４１９巻、５１２−５１９頁
【非特許文献１０】Ｍａｔｕｓｃｈｅｗｓｋｉ，Ｋ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｔａｇｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００２年、第２７７巻、４１９４８−４１９５３頁
【非特許文献１１】Ｋａｉｓｅｒ，Ｋ．，Ｍａｔｕｓｃｈｅｗｓｋｉ、Ｋ．，Ｃａｍａｒｇｏ，Ｎ．，Ｒｏｓｓ，Ｊ．＆  Ｋａｐｐｅ，Ｓ．Ｈ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐｒｅ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ  ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４年、第５１巻、１２２１−１２３２頁
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
ここで、本発明者らは、逆方向遺伝学によって、ＵＩＳ３（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ  ｇｅｎｅ  ３）およびＵＩＳ４によって例示される、選択される個々の遺伝子が、初期肝臓期発育のために不可欠であることを示す：ｕｉｓ３（−）スポロゾイトおよびｕｉｓ４（−）スポロゾイトは、肝細胞に感染するが、もはやインビボで血中期感染を確立することはできず、従って、疾患をもたらさない。このことによって、本発明は、肝臓期特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作された、最初の生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体を提供する。
【０００８】
驚いたことに、ｕｉｓ３（−）スポロゾイトまたはｕｉｓ４（−）スポロゾイトのいずれかを用いる免疫は、げっ歯類のマラリアモデルにおいて、感染性スポロゾイト抗原投与に対する完全な防御を与える。この防御は維持され、かつ、期特異的である。これらの知見は、最初の遺伝子的に弱毒化された、生物体全体のマラリアワクチンを提供する。
【０００９】
従って、本発明は、肝臓期特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作された生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体を脊椎動物宿主に投与することによって、この宿主をマラリアに対して接種するための方法を提供する。本発明はさらに、肝臓期特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作された生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体を含む、ワクチン組成物を提供する。加えて、本発明は、肝臓期特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作された生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体を含むワクチン組成物の使用を、提供する。本発明はまた、操作された対象のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体を適切な薬学的に受容可能なキャリア溶液中に懸濁することによる、ワクチン組成物の産生を提供する。
【００１０】
本発明の上記の局面および付随する利点の多くは、付随する図面と共に考慮した場合に、以下の詳細な説明の参照によって上記の局面および付随する利点の多くがよりよく理解されるようになるにつれ、より容易に理解されるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、肝臓期に特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作された、生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体を脊椎動物宿主に投与することによって、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫に対してこの宿主に接種するための方法を提供する。
【００１２】
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫によって、ヒトマラリアを引き起こす４つの種：Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、およびＰ．ｏｖａｌｅを含む、原生動物Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属の任意のメンバーが意味される。これらに対応する脊椎動物宿主は、ヒト、もしくは野生型Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫による感染が可能な他の二次宿主である。
【００１３】
抗マラリア生ワクチン（ｌｉｖｅ  ａｎｔｉ−ｍａｌａｒｉａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ）としての使用のために、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫は、肝臓期特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作される。用語「肝臓期特異的な遺伝子の機能を破壊する」もしくは「ＬＳ特異的な遺伝子の機能を破壊する」とは、例えば、遺伝子破壊によって、または、転写、翻訳、タンパク質のフォールディングおよび／もしくはタンパク質の活性に影響を与えることによって、ＬＳ特異的な遺伝子の機能を妨げること（例えば、ＬＳ特異的な遺伝子の機能を、完全にもしくは部分的に、阻害するか、不活性化するか、弱めるか、もしくは遮断すること）を意味する。用語「肝臓期特異的な遺伝子の機能」もしくは「ＬＳ特異的な遺伝子の機能」とは、感染性分裂小体を最終的に産生し上記の生活環の赤内期を確立するために肝臓期の寄生虫において必要とされるが、宿主肝細胞への侵入もしくは無性血球内期における寄生虫の維持および感染性スポロゾイトの産生のためには必要とされない機能を指す。マラリア感染は、蚊の唾液腺中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトによって開始される。これらのスポロゾイトは、脊椎動物宿主の肝細胞に侵入し、そして肝臓期（ＬＳ）型へ分化する。数日後にＬＳ寄生虫は数千個の分裂小体を産生し、これらの分裂小体は肝細胞から放出され、そして赤血球に侵入して、マラリア疾患を引き起こす血中期のサイクルを開始する。本発明に従えば、このＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫は、少なくとも一つのＬＳ特異的な遺伝子の機能を破壊するように遺伝子操作されており、その結果、遺伝子操作された寄生虫は、肝細胞に侵入する能力は維持するが、血中期感染を確立し得る分裂小体を産生することが出来ない。
【００１４】
ＬＳ特異的な遺伝子の機能は、当該分野において標準的である慣用的な方法論を用いて同定され得る。例えば、ＬＳ特異的な遺伝子の機能は、肝臓期の寄生虫において発現がアップレギュレーションされる遺伝子（ＬＳにおいてアップレギュレーションされる遺伝子）の機能を評価することによって、同定され得る。例えば、肝臓期の寄生虫において発現がアップレギュレーションされる遺伝子は、肝臓期の寄生虫において、蚊の中腸オーシストから現われるスポロゾイト集団においてよりも高いレベルで発現され得る。そのような遺伝子の発現のアップレギュレーションはまた、成熟感染性唾液腺スポロゾイトにおいても（以下の実施例において論議されるＵＩＳ４遺伝子およびＵＩＳ３遺伝子においてのように）観察され得る。ディファレンシャル転写プロファイリング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）のための周知の方法は、肝臓期の寄生虫において発現がアップレギュレーションされる遺伝子を同定するために用いられ得、ディファレンシャル転写プロファイリングのための周知の方法としては、差引きハイブリダイゼーションスクリーニング、ディファレンシャルディスプレイ、および全ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ）マイクロアレイ解析が挙げられるが、それらに限定されない。そのような方法は、スポロゾイト期の寄生虫の転写レパートリーにおける感染性に関連する変化を解析するために（１１）、および、前赤内期特異的なタンパク質をコードするＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ遺伝子を同定するために（１２）、以前に用いられている。例えば、抑制差引きハイブリダイゼーションは、ｃＤＮＡの集団の同時正規化および差引きを可能にする、ハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のプロトコルの組合せによって、異なって調節される豊富なｃＤＮＡおよび乏しいｃＤＮＡの選択的な富化を許容する。抑制差引きハイブリダイゼーションは、非感染性スポロゾイトと感染性スポロゾイトとの間の転写の相違を解析するために、および哺乳類宿主への感染性を制御する遺伝子を同定するために、用いられている（１１）。この手順は、ＬＳにおいてアップレギュレーションされる遺伝子の同定を許容しており、ＬＳにおいてアップレギュレーションされる遺伝子としては、以下の実施例においてさらに記載されるように、ＵＩＳ３およびＵＩＳ４が挙げられるが、それらに限定されない。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの唾液腺スポロゾイトの分裂小体に対する抑制差引きハイブリダイゼーションはまた、期特異的な前赤内期転写産物を同定するためにも用いられている（１２）。候補であるＬＳ特異的な遺伝子の識別的発現は、以前に記載されたように（１１，１２）、当該分野において標準的である方法（ドットブロット法、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、免疫ブロット法、免疫蛍光顕微鏡法、および／もしくはマイクロアレイ発現解析が挙げられる）を用いて確認され得る。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態において、ＬＳ特異的な遺伝子の機能は、以下にさらに記載されるように、ＬＳにおいてアップレギュレーションされる遺伝子の機能を解析することによって同定される。しかし、ＬＳ特異的な遺伝子の機能を有する遺伝子の全てが、必ずしもＬＳによってアップレギュレーションされる遺伝子というわけではない。従って、ＬＳ形態において発現がアップレギュレーションされない遺伝子は、それにもかかわらず、ＬＳ特異的な遺伝子の機能を保有し得る。
【００１６】
肝臓特異的な機能の妨害はまた、阻害因子のＬＳ特異的な過剰発現によってももたらされ得る。この因子は、逆方向遺伝学の方法によって、偽遺伝子、すなわち、生活環中の任意の時点において寄生虫の生存のために必須ではない遺伝子へ挿入され得る（４７）。この阻害因子は、この寄生虫に毒性を与えるべきではなく、むしろＬＳ発育を停止することにおいて作用するべきである。そのような因子としては、細胞周期の進行のインヒビター、および／もしくはユビキチン媒介性タンパク質分解のインヒビター、ならびに／または、遺伝子発現の転写後制御を妨害する因子が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００１７】
ＬＳ特異的な遺伝子の機能は、一つ以上の遺伝子の機能が破壊されている寄生虫の表現型を解析することによって、同定され得る。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍにおいて遺伝子の機能を破壊するためのいくつかの方法は、当該分野において周知であり、本発明の実施において用いられ得る。そのような方法としては、相同組換えによる遺伝子置換、アンチセンス技術、およびＲＮＡ干渉が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、相同組換えによるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ遺伝子の不活性化もしくは改変のための遺伝子ターゲティングの方法は、以前に記載されている（１３）。そのような方法は、本明細書中において、実施例１および実施例２において記載されるように、ＬＳ特異的な遺伝子の機能を破壊するために、首尾よく用いられる。アンチセンス技術もまた、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの遺伝子の機能を破壊するために首尾よく用いられている。例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのトポイソメラーゼＩＩ遺伝子の異なる領域に対するホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの外因性送達は、寄生虫の増殖の配列特異的な阻害をもたらす（１４）。同様に、ターゲティングされた遺伝子破壊によって細胞接着のために必須であることが示されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのｃｌａｇ９遺伝子へのアンチセンス構築物のトランスフェクションは、トランスフェクションされていないコントロール寄生虫に比べて１５倍の細胞接着の低下をもたらした（１５）。
【００１８】
ＬＳ特異的な遺伝子の機能を破壊するために本発明の実施において使用され得る別の例示的技術は、遺伝子内に表現型変異を生じさせるために短い干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）を使用する、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。ＲＮＡｉは、植物、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、蚊、マウス、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍを含む多様な生物体において、遺伝子の機能を調査するおよび／もしくは確認するための方法として用いられている（例えば、３７〜４４を参照）。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍにおいて、ＲＮＡｉは、例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来のＰＰＩセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ（ＰｆＰＰ１）の必須の役割を示すために、用いられている（４１）。ＲＮＡｉはまた、ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現レベルを低下させることによって（４２）、および、システインプロテアーゼ遺伝子の発現を遮断することによって（４３）、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの増殖を阻害するためにも、用いられている。マウスのマラリアモデルにおいて、ＲＮＡｉは、循環するＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ寄生虫の遺伝子発現をインビボで阻害するために用いられている（４４）。これらの研究は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体において遺伝子の機能を破壊するための効果的な道具としての、ＲＮＡｉの用途を示している。
【００１９】
上記に記載される遺伝子破壊のアプローチ（例えば、相同的組換えによる遺伝子ターゲティング、アンチセンス、およびＲＮＡｉ）は、生物体のゲノム内の実質的にすべての遺伝子の機能を調査するために、首尾よく用いられている。例えば、配列決定されたゲノムを入手し得ることにより、発育経路もしくは発育段階のような多様なプロセスに関与している遺伝子についてスクリーニングするための大規模なＲＮＡｉ研究において使用するための、ｓｉＲＮＡライブラリーの作製が可能となっている（例えば、４５および４６を参照）。そのようなスクリーニングは、本発明の実施において、ＰｌａｓｍｏｄｉｕｍにおけるＬＳ特異的な遺伝子の機能を同定するために用いられてもよい。ＬＳ特異的な遺伝子の機能を同定するために用いられ得るアッセイとしては、実施例１および実施例２において記載される表現型アッセイのような表現型解析が挙げられるが、これらに限定されない。用語「表現型解析」は、野生型、蛍光、もしくは任意の他のトランスジェニックレポーターのバックグラウンドにおいて生成された、生きている組換え寄生虫を用いる全てのアッセイを包含する。アッセイはインビボで培養細胞を用いて行われてもよく、インビトロの発達アッセイもしくはＬＳ発育についての指標（ｒｅａｄ−ｏｕｔ）を提供する任意の他の系において行われてもよい。
【００２０】
ＬＳ特異的な遺伝子の機能が破壊されている、操作されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体は、代表的には、細胞培養もしくは動物において増殖され、蚊宿主において増幅（ｅｘｐａｎｄ）され、そしてワクチンの用途のためのスポロゾイトとして収穫される（例えば、１６を参照）。
【００２１】
本発明のワクチン組成物は、弱毒化された生きているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体を薬学的に受容可能なキャリア中に懸濁することによって産生される。適切な薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において周知であるように、滅菌水もしくは滅菌生理食塩溶液、特にリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。
【００２２】
本発明によるワクチンは、例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、および静脈内で、投与されてもよい。
【００２３】
投与量は、宿主において望ましい免疫応答をもたらすように、経験的に選択される。免疫応答によって、その後の野生型Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトへの暴露に対する、獲得され高められた程度の防御免疫、好ましくは完全な防御もしくは不生殖防御が、意味される。以下の作用実施例において、接種１回につき１０，０００個の遺伝子的に弱毒化された生きたスポロゾイトを用いた三回のワクチン接種の後に、不生殖防御がもたらされた。
【００２４】
（詳細な技術的説明）
（背景）照射によって弱毒化されたスポロゾイトは、マラリア感染に対して不生殖防御的免疫をもたらす、並外れたモデルである。
【００２５】
マラリアは、毎年３億より多い臨床例および１００万人より多い死亡を引き起こす。この疾患は、発展途上諸国の社会的および経済的進展に、著しい負の影響を与える。マラリア寄生虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの哺乳類宿主への伝播は、感染した蚊が吸血し、スポロゾイト期のもの（ｓｐｚ）を接種する場合に起こる。血流に入った後、ｓｐｚは素早く肝臓へ運搬され、肝臓において、ｓｐｚは溢出し肝細胞に侵入する（２）。肝細胞内で、ｓｐｚは肝臓期のもの（ＬＳ）（赤外型（ＥＥＦ）とも称される）へ変化する。ＬＳ寄生虫は増殖し、複数回の核分裂をおこない、そして数千個の分裂小体を最終的に生じる（１７、１８）。肝臓から放出される分裂小体は、赤血球に急速に侵入し、マラリア疾患を引き起こす赤内サイクルを開始する。防御的マラリアワクチンは、全世界の保健に非常に大きな影響を与えるであろうが、一世紀を超える努力に関わらず、長期の防御を与えるワクチンは開発されていない。しかし、本発明者らは、３５年間より長きにわたって、マラリア感染に対する、不生殖の、長期の防御が可能であることを知っている。
【００２６】
照射によって弱毒化されたげっ歯類モデルのマラリアｓｐｚ（ガンマ−ｓｐｚ）を用いるマウスの免疫は、その後の感染性ｓｐｚ抗原投与に対する不生殖免疫を誘導し、従って、肝臓からの血中期感染の開始を完全に防止する（５）。重大なことに、これらの知見に基づき、ガンマ−Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｓｐｚを用いるヒトの免疫が、９３％より多くのヒトのレシピエントを、感染性ｓｐｚの抗原投与に対して完全に防御すること（１３、１４）、および、防御は少なくとも１０ヶ月の間持続し得ること（６）が、後に示された。ガンマ−ｓｐｚは、哺乳類宿主の肝臓に感染し肝細胞に侵入する能力を保持する（１９〜２０）。しかし、ガンマ−ｓｐｚ由来のＬＳは、発育の停止を被り、従って、赤血球感染性の分裂小体を生じない。しかし、接種される期はｓｐｚであり、主要な免疫標的は、ＬＳを保有する感染した肝細胞である（２１）。防御免疫は、ｓｐｚ用量および照射用量に依存的である：感染性ｓｐｚの抗原投与に曝された被験体の大部分を防御するために、１５，０００ラド〜２０，０００ラドのガンマ照射に曝されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに感染した蚊によって、１０００回より多く咬まれることによる免疫（ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ  ｂｉｔｅ）が必要である（６）。蚊は、一回の咬む間に１０個〜１００個の間のｓｐｚを接種する（２２〜２３）。それゆえ、完全な防御のための総ｓｐｚ用量は、１０，０００個〜１００，０００個になる。重要なことに、過剰照射されたｓｐｚもしくは熱によって不活性化されたｓｐｚを用いる免疫は、防御を誘導することが出来ない。このことは、ｓｐｚが接種の後しばらくの間生育可能であり続けねばならず、防御を誘導する肝臓期へ進行せねばならない（６、２４）ことを示す。げっ歯類マラリアモデルにおける観察に基づくと、長期の防御免疫は、ＬＳ抗原（Ａｇ）の十分な発現に依存し得る。なぜならば、プリマキン（ＬＳを殺す薬物）を用いる処置が防御の発達を頓挫させる（２１）からである。重要なことに、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのガンマ−ｓｐｚによって誘導される防御は、株を超える：一つの寄生虫株のガンマ−ｓｐｚを用いる接種は、異種の株に対する防御を与える（６）。
【００２７】
本発明者らは過去数年においてｓｐｚ遺伝子発現について多くを学んでいるが（２５〜２７）、ガンマ−ｓｐｚ誘導性防御の真の免疫学的標的としてのＬＳは、遺伝子発現解析に固有の実験的な行い難さゆえに、遺伝子発現解析をこれまで完全に逃れてきた。本発明者らは、現在では肝臓期特異的Ａｇを一つのみ知っている（肝臓期抗原−１（ＬＳＡ−１））（２８）。従って、ＬＳ寄生虫によって発現されるＡｇが未知のままであるために、防御的免疫に関わるリンパ球の微細なＡｇ特異性は、ヒトにおいて未知のままである。
【００２８】
（遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍの肝臓期のものを作製する実行可能性）  ＬＳ発育においてのみ欠陥がある、遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍのＬＳを生成するために、この期において必須かつ独占的な役割を有する期特異的な遺伝子が破壊される必要がある。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍが半数体であり、トランスフェクションが無性の血中期のものを用いて行われ、変異体寄生虫は血中期のものとして維持される（１３）ことを考慮すると、この遺伝子は血中期サイクルの間は必須であり得ない。本発明者らは、以前に、蚊の唾液腺に存在する感染性のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍのｓｐｚが肝細胞侵入およびその後のＬＳの発育のために必要とされる転写産物を独特に備えているという予測に基づく、転写プロファイリングを用いた（１１）。次に、本発明者らは、破壊され得る遺伝子の部分集合を作るために、前赤内期に特異的であって、赤血球期に存在しない転写産物についてのスクリーニングを行った（１２）。これらの組み合わされたスクリーニングにより、唾液腺ｓｐｚに豊富であって血中期のものに存在しない、二つの豊富な転写産物が同定され、これらの転写産物は（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｓｐｚｓにより）ＵＩＳ３およびＵＩＳ４と称された。細胞の生物学的な研究は、両方のコードされるタンパク質が寄生体胞（複製および分裂生殖が起こる、寄生虫由来の小器官）に局在することを示した（データは示さず）。
【００２９】
挿入および置換の戦略を用いる遺伝子ノックアウトは、今や、両方の遺伝子がＬＳ発育のために必要であることを明らかにしている（以下の実施例１および実施例２を参照）。両方のタンパク質は、ｓｐｚにおいて既に発現されている（データは示さず）が、ｕｉｓ３（−）寄生虫およびｕｉｓ４（−）寄生虫は、正常なｓｐｚに発育し、これらのｓｐｚは肝細胞に正常に侵入する。しかし、ｕｉｓ３（−）のＬＳおよびｕｉｓ４（−）のＬＳは、ＬＳ発育中期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ＬＳ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）において停止し、後期ＬＳを生じない（データは示さず）。従って、ＵＩＳ３およびＵＩＳ４はどちらもＬＳ特異的な遺伝子の機能を有する。重要なことに、自然に蚊に咬まれることによって感染した動物もしくは１０，０００個までのｓｐｚの用量を用いて静脈内で感染した動物は、顕性にならず、このことは、両方の遺伝子がＰｌａｓｍｏｄｉｕｍの生活環の首尾よい完了において重要な役割を果たすことを確認する（以下の表１および表２を参照）。従って、本発明者らは、最初の遺伝子的に弱毒化されたＬＳを生成することに成功した。これらの発見に基づいて、本発明者らおよび他者はここで、前進し得、そして、マイクロアレイ解析によってＬＳ発育における重要性が同定されたＬＳにおいてアップレギュレーションされる多様な遺伝子を試験し得る。本発明者らは、ＬＳにおいてアップレギュレーションされるさらに多くの遺伝子、特に、寄生虫を一つのｓｐｚから１０，０００個より多い娘分裂小体に発育させるという著しい能力を与えられた、特有に発現される遺伝子が、ＬＳ発育に必須である（すなわち、ＬＳ特異的な遺伝子の機能を保有する）と分かることを、予測する。ＬＳにおいてアップレギュレーションされるそのような遺伝子は、同様に破壊され得、本明細書において記載されるように、さらなる生ワクチンの候補を生じ得る。
【００３０】
本発明の代表的な実施形態は、以下の二つの作用実施例において記載される。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）
第一の実施例はＮａｔｕｒｅ  ＡＯＰによって２００４年１２月５日に公開された（２９）。
【００３２】
本発明者らは、発現が前赤内期のものに制限されるＵＩＳ遺伝子の不活化が、血中期のものもしくは蚊中期（ｍｏｓｑｕｉｔｏ  ｓｔａｇｅ）のものに影響を及ぼすことなく肝臓期の寄生虫の弱毒化をもたらし得ると仮定した。本発明者らは、低分子の保存された膜貫通タンパク質をコードするＵＩＳ３と称される遺伝子に焦点を合わせた（図１）。ＵＩＳ３は、感染性スポロゾイトにおいて発現されており（１２）、本発明者らは、ＵＩＳ３がインビボで肝臓のスポロゾイト感染の後においても発現されることを決定した（データは示さず）。げっ歯類マラリア寄生虫（登録番号ＥＡＡ２２５３７）のＵＩＳ３およびヒトマラリア寄生虫Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐｆｌ３＿００１２）のＵＩＳ３は、３４％のアミノ酸配列同一性を示す（図１）。げっ歯類マラリア寄生虫（例えば、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ（Ｐｂ））は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの肝臓期および前赤内期の免疫を研究するための優れたモデルであるので、本発明者らは、この種におけるＵＩＳ３の調査を続けた。
【００３３】
内因性ＰｂＵＩＳ３遺伝子を、置換戦略（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）（１３）を用いて欠失させた（図２）。トランスフェクションの後、親の血中期寄生虫を用いて、ｕｉｓ３（−）と称される推定された遺伝子座の欠失をもっぱら含むクローン性寄生虫系統を得た（データは示さず）。期待されたように、ｕｉｓ３（−）寄生虫は、正常な血中期のものの無性増殖、およびＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊ベクターへの正常な伝播を示した（データは示さず）。蚊の内部において、ｕｉｓ３（−）スポロゾイトは、中腸のオーシストにおいて正常に発達し、そして野生型（ＷＴ）スポロゾイトに匹敵する数において唾液腺に感染した（データは示さず）。逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲは、ｕｉｓ３（−）スポロゾイトにおけるＵＩＳ３の発現の欠如を確認した（データ示さず）。ｕｉｓ３（−）スポロゾイトは、スポロゾイトの伝播および感染性にとって決定的である基質依存的な運動の形態である、代表的な、滑走運動を示した（３０）（データは示さず）。ｕｉｓ３（−）スポロゾイトはまた、培養された肝細胞へのその宿主細胞侵入能力を、ＷＴ寄生虫に匹敵するレベルで維持した（データは示さず）。
【００３４】
細胞内ｕｉｓ３（−）スポロゾイトは、バナナ形状の細長いスポロゾイトの、球形の肝臓栄養体への脱分化をもたらす、代表的な細胞変化のプロセスを開始した（１７，３１）（データは示さず）。著しく対照的に、ｕｉｓ３（−）寄生虫は、その肝臓栄養体への変化を完了する能力の重大な欠損を示した（データは示さず）。ｕｉｓ３（−）寄生虫のごく一部のみが、球形の初期肝臓期のものへと発育し、この球形の初期肝臓期のものもまた、対応するＷＴ型より終始一貫して小さいようであった。その結果として、変異寄生虫は、成熟肝臓分裂体へと進む能力を欠如した（データは示さず）。本発明者らは次に、インビトロで観察される発育上のこの極度の欠損に基づき、インビボでｕｉｓ３（−）スポロゾイトがその肝臓期発育を通って進んで血中期感染をもたらす能力を失ったかどうかを試験した。実際に、１００，０００までのｕｉｓ３（−）スポロゾイトの静脈注入は、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイト感染に対して高感受性である幼若Ｓｐｒａｇｕｅ／Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、血中期寄生虫血症を誘導することができなかった（データは示さず）。コントロールＷＴスポロゾイトは、ラットにおいて注射後３〜４日の間に血中期寄生虫血症を誘発した。
【００３５】
従って、ｕｉｓ３（−）寄生虫の観察された表現型の特徴、すなわちｕｉｓ３（−）寄生虫の肝細胞に侵入する能力およびｕｉｓ３（−）寄生虫の完全な肝臓期発育の欠損は、本発明者らが、ｕｉｓ３（−）寄生虫を生物体全体のワクチンとしてマウス／スポロゾイト抗原投与モデルにおいて試験することを、可能にした。本発明者らは、異なる初回免疫−追加免疫（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ）レジメンを用いて、ｕｉｓ３（−）スポロゾイトによって、マウスを静脈内で免疫し、その後、感染性ＷＴスポロゾイトの静脈内注射によって、マウスに抗原投与した（表１）。マラリア感染に対する不生殖防御についての最も厳しい指標（ｒｅａｄｏｕｔ）である、スポロゾイト抗原投与の二日後に始める血中期寄生虫血症の発症を検出するための血液スミアによって、防御を評価した。５０，０００個のｕｉｓ３（−）スポロゾイトを用いる初回免疫とその後の２５，０００個のｕｉｓ３（−）スポロゾイトを用いる２回の追加免疫は、全ての免疫化されたマウスを、最後の追加免疫の７日後に与えられた１０，０００個のＷＴスポロゾイトを用いた抗原投与に対して、完全に防御した（表１）。同じスポロゾイト抗原投与用量に対する完全な不生殖防御も、１０，０００個のｕｉｓ３（−）スポロゾイトを用いる同様の初回免疫−２回追加免疫のプロトコルによって達成された（表１）。本発明者らは次に、同じ初回免疫−追加免疫プロトコルを用いてマウスを免疫したが、最後の追加免疫の４週間後にＷＴスポロゾイトを用いて抗原投与した。抗原投与されたマウスのうちで、血中期感染を発症したものはなく、従って長期の不生殖防御を享受した（表１）。防御された動物を２ヶ月後に５０，０００個の感染性スポロゾイトの高接種物を用いて再び抗原投与する再抗原投与実験によって、長期の防御が確認された。全ての動物が完全に防御されたままであった。ｕｉｓ３（−）スポロゾイトを用いて免疫されたマウスは、感染性の蚊に刺されることによる再抗原投与に対しても完全に防御された（表１）。減少された免疫用量を用いた防御のレベルを測定するために、本発明者らは、１０，０００個のｕｉｓ３（−）スポロゾイトを用いて初回免疫−１回追加免疫プロトコルを試験した。１０個体の動物のうち７個体が完全な防御を享受したが、残る３個体の動物は顕性となるのが長期間遅延した後で顕性となった。次に、免疫されたマウスの部分集合を、血中期寄生虫を用いて直接接種によって抗原投与した。全ての動物は、抗原投与の二日後に血中期寄生虫血症を発症し、このことは、観察された防御的免疫が血中期のものに対しては作用せず、従って、前赤内期のものに特異的であることを示す。最後に、よりワクチンに適切な送達経路を評価するために、本発明者らは、それぞれ５０，０００個のｕｉｓ３（−）スポロゾイトおよび２５，０００個のｕｉｓ３（−）スポロゾイトを用いる初回免疫−２回追加免疫プロトコルを用いて、マウスを皮下で免疫した。全てのマウスは、その後の静脈内ＷＴスポロゾイト抗原投与に対して完全に防御された。
【００３６】
本発明者らの結果は、通常は蚊による伝播の後に哺乳類宿主の感染をもたらす肝臓期において完全に弱毒化された、遺伝子改変されたマラリア寄生虫を開発することが可能であることを示す。この弱毒化を、一つの寄生虫遺伝子であるＵＩＳ３の欠失によって達成した。ＵＩＳ３の機能は不明のままであるが、ｕｉｓ３（−）寄生虫は、明らかにＵＩＳ３の欠失を補う能力を欠如した。マウス／スポロゾイト抗原投与モデルにおいて、ｕｉｓ３（−）スポロゾイトを用いた免疫の後で本発明者らが観察したマラリアに対する長期の不生殖防御は、遺伝子改変されたマラリアワクチンが実施可能であるという原理の証拠を提供した。本発明者らは、ＵＩＳ３オルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）（登録番号ＰＦ１３＿００１２）を、最も致死性のヒトマラリア寄生虫であるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのゲノム内で同定した。このことは、本発明者らが、ヒト／スポロゾイト抗原投与モデルにおいてワクチンとして試験され得る、遺伝子的に弱毒化されたｕｉｓ３（−）ヒト寄生虫を作製することを許容する。本発明者らの知見を総合することにより、蚊に刺されることによる自然感染を防止する、遺伝子的に弱毒化された防御的な生物体全体のマラリアワクチンの開発への道が拓かれる。
【００３７】
方法：Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉトランスフェクション。ＰｂＵＩＳ３の置換のために二つの断片を以下のプライマーを用いて増幅した：Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉのゲノムＤＮＡを鋳型として用いる、８００  ｂｐの３’断片のためのＵＩＳ３ｒｅｐ１ｆｏｒ（５’ＧＧＧＴＡＣＣＣＧＣＡＴＴＡＧＣＡＴＡＡＣＡＴＣＴＣＡＴＴＧＧ  ３’）（配列番号１）およびＵＩＳ３ｒｅｐ２ｒｅｖ（５’ＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＡＴＴＴＧＴＣ  ３’）（配列番号２）；ならびに：７６０  ｂｐの５’断片のためのＵＩＳ３ｒｅｐ３ｆｏｒ（５’ＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＧＴＡＡＣＡＴＣ  ３’）（配列番号３）およびＵＩＳ３ｒｅｐ４ｒｅｖ（５’ＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＴＧＣＴＴＡＡＡＴＧＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＣ  ３’）（配列番号４）。Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉターゲティングベクター（１３）へのクローニングにより、プラスミドｐＡＫＭ１９を得た。クローン性寄生虫集団を得るために、連続限界希釈（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｓｅｒｉｅｓ）、そして１５個体のレシピエントＮＭＲＩマウス各々への一つの寄生虫の静脈内注射を行った。本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲ解析のために、６×１０５個のｕｉｓ３（−）の唾液腺スポロゾイトおよび６×１０５個のＷＴ唾液腺スポロゾイトを解剖し、ポリＡ＋  ＲＮＡをオリゴｄＴカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。本発明者らは、ｃＤＮＡ合成およびｃＤＮＡ増幅のために、ランダムデカマープライマー（Ａｍｂｉｏｎ）を用いる二段階ＰＣＲを行い、その後に標準的なＰＣＲ反応を行った。
【００３８】
ｕｉｓ３（−）寄生虫の表現型解析。Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ蚊の飼育および維持は、１４ｈ明期／１０ｈ暗期の周期の下で、７５％の湿度下であって、そしてそれぞれ２８℃または２０℃であった。各々の実験について、蚊は、野生型Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ  ＮＫ６５もしくは上記のｕｉｓ３（−）クローンに感染している麻酔されたＮＭＲＩマウスを１５分間にわたり吸血することが出来た。そしてこの蚊を、べん毛放出が可能な、分化した生殖母細胞期および小生殖母細胞期の寄生虫の高い割合についてアッセイした。蚊を１０日目、１４日目、および１７日目に解剖し、それぞれ、感染性、中腸スポロゾイト数、および唾液腺スポロゾイト数を測定した。スポロゾイトの運動性の解析のために、スポロゾイトを、前もってコーティングされた（３％  ＢＳＡ／ＲＰＭＩ  １６４０）カバーガラスの上に載せ、４％パラホルムアルデヒドを用いて１０分間室温で固定し、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉのスポロゾイト周囲タンパク質に対する一次抗体（抗ＰｂＣＳＰ）（３２）を用いてインキュベートした。肝細胞における肝臓期のものを検出するために、１０３個のＨｕｈ７細胞を８個のチャンバースライド（ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ）内に播き（ｓｅｅｄ）、半コンフルエンシーになるまで増殖させた。Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉのスポロゾイトを加え、９０分間、３７℃でインキュベートし、そして洗い流した。８時間後、１２時間後、１５時間後、２４時間後、３６時間後、および４８時間後に、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉの熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）（３３）に対する一次抗体を用いて、肝臓期のものを示した。スポロゾイトの侵入を解析するために、抗ＣＳＰ抗体を用いる二重染色プロトコルを用いた（３４）。インビボでのクローン性スポロゾイト集団の感染性を決定するために、幼若Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、１００マイクロリットルのＲＰＭＩ  １６４０中スポロゾイト懸濁液を静脈内注射した。この動物の寄生虫血症を、ギムザ染色した血液スミアによって毎日検査した。一つの血内期のものの出現は、顕性の第一日目を表す。
【００３９】
免疫および寄生虫抗原投与実験。全ての実験について、５０日齢〜８０日齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。免疫のために、ｕｉｓ３（−）スポロゾイトを、感染した蚊由来の唾液腺から抽出した。代表的には、一個体の感染された蚊は、２０，０００個のｕｉｓ３（−）スポロゾイトを含んでいた。スポロゾイトを、１００マイクロリットルの容積において、静脈内で尾の静脈へ、もしくは皮下で動物の頚へ注射した。動物を、１×１０４個もしくは５×１０４個のｕｉｓ３（−）スポロゾイトの単回用量を用いて免疫し、その後、静脈内もしくは皮下で投与される１×１０４個または２．５×１０４個のいずれかのｕｉｓ３（−）スポロゾイトの二回の追加免疫を行った。一回目の追加免疫を免疫の１４日後に与え、そして二回目の追加免疫をその７日後に与えたか、もしくは指示される時間間隔をおいて与えた。１セットの動物を免疫した後、各々１×１０４個のｕｉｓ３（−）スポロゾイトを用いて一回追加免疫した。それから、寄生虫血症について、毎日の血液スミアによって、これらの動物をモニタリングした。全ての動物は、一回目の免疫およびその後の追加免疫の後、血中期寄生虫陰性であり続けた。動物を、５×１０４または１×１０４の感染性Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉのＷＴスポロゾイト静脈内注射もしくは皮下注射によるｕｉｓ３（−）スポロゾイトの最後の追加免疫を受けさせた後、７日間から１ヶ月間まで抗原投与した。各々のセットの実験については、そのスポロゾイト抗原投与用量の感染性を確認するために、同じ齢の群の少なくとも３個体の未刺激の動物を含めた。各々の未刺激の動物において、寄生虫血症は、注射後３日目〜５日目に、ギムザ染色した血液スミアによって容易に検出され得た。少なくとも１４日間にわたって、代表的には１ヶ月間までにわたって、防御された動物をモニタリングした。５×１０４の感染性Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉのＷＴスポロゾイトの単回用量を用いた一回目の抗原投与の二ヶ月後の、一つの免疫実験について、再抗原投与研究を行った。ｕｉｓ３（−）で免疫されたマウスが自然伝播による再抗原投与に対して防御されたかを試験するために、１０個体の防御されたマウスおよび５個体の未刺激のコントロールマウスを、１０分間にわたり、各々平均４０，０００個のＷＴ唾液腺スポロゾイトを含む、高感染した１０個体の蚊に曝した。吸血の成功を、抗原投与後に蚊の解剖によって確認した。防御の期特異性を確認するために、感染性のスポロゾイトを用いた抗原投与に対して完全に防御された１０個体のマウスを用いて、追加の実験を行った。全ての免疫されたマウスおよび３個体の未刺激のコントロールマウスを、５×１０４個のＰ．ｂｅｒｇｈｅｉのＷＴ血中期寄生虫の静脈内注射によって、抗原投与した。全てのマウスは、血中期の接種物に対して完全に感受性であって、顕性に相違はなかった。
【００４０】
結果：以下の表１は、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉのｕｉｓ３（−）スポロゾイトを用いて免疫化したＣ５７Ｂｌ／６マウスが、ＷＴのＰ．ｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイトを用いた抗原投与に対して完全に防御されたことを示す。
【００４１】
【表１】
2007515170.tif 000003
注記：マウスをＰ．ｂｅｒｇｈｅｉのｕｉｓ３（−）スポロゾイトで免疫した。マウスを、感染性Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉのＷＴスポロゾイトもしくは血中期のもので抗原投与した。マウスは同じ齢の群（５０日齢〜８０日齢）からであり、スポロゾイトは、同じ蚊のバッチからである。第４列中の時間点は、最後の追加免疫の後の抗原投与の日を示す。前顕性期を、ギムザ染色した血液スミア内での一つの赤内期のものの最初の出現までの時間として定義する。実験Ｉの群の５個体のマウスを、５０，０００個のＷＴスポロゾイトの１用量を用いて、第一の抗原投与の二ヶ月後に再抗原投与したところ、これらのマウスは防御されたままであった。
【００４２】
（実施例２）
ここで、本発明者らは、完全な肝臓期発育のための不可欠の機能を有する別のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍタンパク質を破壊（ｄｉｓｒｕｐｔ）する。ＵＩＳ４（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ  ｇｅｎｅ  ４）は、感染性スポロゾイトおよび発育中の肝臓期のものにおいてもっぱら発現される。げっ歯類のモデルマラリア寄生虫であるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉにおけるＵＩＳ４の標的化遺伝子破壊から、肝細胞侵入後までのマラリアの生活環を完了するノックアウト寄生虫を得た。ＵＩＳ４ノックアウト寄生虫は、初期肝臓期のものへと変化する。しかし、このＵＩＳ４ノックアウト寄生虫は、さらなる肝臓期発育において著しく損なわれており、高スポロゾイト用量で接種された場合においてのみ、血中期感染を開始し得る。ＵＩＳ４ノックアウトスポロゾイトを用いる免疫は、その後の感染性野生型スポロゾイト抗原投与に対して、マウスを完全に防御する。スポロゾイトの肝細胞侵入の後、ＵＩＳ４は、寄生虫−宿主細胞の界面を構成し管状−小胞網として肝細胞の細胞質の中へと拡がる、新たに形成された寄生体胞膜に局在する。本発明者らのデータを総合することにより、ＵＩＳ４の除去が弱毒化された肝臓期寄生虫をもたらすことが示される。遺伝子的に弱毒化された肝臓期のものは、免疫応答を誘導し得、この免疫反応は、野生型寄生虫によるその後の肝臓の感染を阻害する。
【００４３】
ｕｉｓ４（−）寄生虫の生成。ＵＩＳ４はスポロゾイトにおいて発現されるが血中期のものにおいては発現されないことを考慮に入れて、本発明者らは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの前赤内期生活環の各期にとってのＵＩＳ４の重要性を研究するために、血中期のものでの標的化遺伝子破壊を行うことが出来た。内因性のＰｂＵＩＳ４遺伝子を、上記に記載された挿入および置換の戦略を用いて破壊した（データは示さず）。成功したトランスフェクション由来の親の血中期集団を、遺伝子が破壊されたクローン性寄生虫株の選択のために用いた。本発明者らは、推定された変異遺伝子座をもっぱら含む、ｕｉｓ４（−）と称される挿入／破壊クローン、およびｕｉｓ４ＲＥＰ（−）と称される置換クローンを得た。正確な置換の結果を、挿入特異的なＰＣＲによって確認した（データは示さず）。変異寄生虫のＰｂＵＩＳ４欠損を確認するために、本発明者らは、唾液腺スポロゾイトからのポリＡ＋ＲＮＡを鋳型として用いて、ＲＴ−ＰＣＲおよびｃＤＮＡ増幅をおこなった（データは示さず）。さらに、ｕｉｓ４ＲＥＰ（−）スポロゾイトのウェスタンブロット解析は、ＰｂＵＩＳ４を検出しなかった（データは示さず）。
【００４４】
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉのトランスフェクションおよび遺伝子型解析。ＰｂＵＩＳ４の遺伝子ターゲティングのために、５８２ｂｐの断片を、プライマーＵＩＳ４ＩＮＴｆｏｒ（５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＴＡＣＴＡＡＴＴＴＴＣＧＧＧＧＧ  ３’）（配列番号５）およびＵＩＳ４ＩＮＴｒｅｖ（５’ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＴＴＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＡＴＡＡＡＣＧＴＴＡＴＴＴＣＣ  ３’）（配列番号６）を用いて、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉのゲノムＤＮＡを鋳型として用いて増幅した。Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉターゲティングベクター（１３）へのクローニングにより、プラスミドｐＡＫＭ１５を得た。寄生虫の形質転換および選択を、以前に記載されているように（１３）おこなった。ｕｉｓ４（−）遺伝子座の組込み特異的ＰＣＲ増幅を、以下のプライマーを用いて達成した：試験１、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ  ＤＨＦＲ−ＴＳ  ｆｏｒ（５’ＣＣＣＧＣＡＣＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧ  ３’）（配列番号７）およびＵＩＳ４  ｔｅｓｔ  ｒｅｖ（５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＧＧＣＴＧＣＴＴＣＣ  ３’）（配列番号８）；試験２、ＵＩＳ４  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ（５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＡＴＧＣＡＴＧＣ  ３’）（配列番号９）およびＴ７（５’ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣ  ３’）（配列番号１０）。ＰｂＵＩＳ４の置換のために、１ｋｂおよび６００ｂｐの二つの断片を、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉのゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、以下のプライマーを用いて増幅した：１ｋｂの断片のための、ＵＩＳ４ｒｅｐ１ｆｏｒ（５’ＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＡＴＧＣＡＴＧＣ  ３’）（配列番号１１）およびＵＩＳ４ｒｅｐ２ｒｅｖ（５’ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＴＡＴＴＣＡＧＡＣＧＴＡＡＴＡＡＴＴＡＴＧＴＧＣ  ３’）（配列番号１２）、ならびに、６００ｂｐの断片のための、ＵＩＳ４ｒｅｐ３ｆｏｒ（５’ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＧＡＧＴＡＧＴＧＴＡＡＴＴＣＡＧ  ３’）（配列番号１３）およびＵＩＳ４ｒｅｐ４ｒｅｖ（５’ＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＧＧＣＴＧＣＴＴＣＣ  ３’）（配列番号１４）。ｈＤＨＦＲターゲティングベクター（３４）へのクローニングにより、プラスミドｐＡＫＭ１７を得た。ＷＴ  Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ寄生虫および変異Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ寄生虫におけるＵＩＳ４の発現を検出するために、１×１０５個の唾液腺スポロゾイトを、１０マイクロリットルのＳＤＳサンプル緩衝液中で溶解した。ＵＩＳ４を、ウェスタンブロットで、ポリクローナルのＵＩＳ４抗血清（１２）および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて可視化した。本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲ解析のために、８×１０５個のｕｉｓ４（−）唾液腺スポロゾイト、８×１０５個のｕｉｓ４ＲＥＰ（−）唾液腺スポロゾイト、および４×１０５個のＷＴ唾液腺スポロゾイトを解剖し、ポリＡ＋ＲＮＡをオリゴｄＴカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。本発明者らは、ｃＤＮＡ合成およびｃＤＮＡ増幅のために、ランダムデカマープライマー（Ａｍｂｉｏｎ）を用いる二段階ＰＣＲを行い、その後に標準���なＰＣＲ反応を行った。
【００４５】
ｕｉｓ４（−）寄生虫の表現型解析。Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ蚊を、１４ｈ明期／１０ｈ暗期の周期下で、２８℃、湿度７５％で飼育し、１０％ショ糖溶液を与えた。吸血および蚊の解剖は、記載されたとおりであった（３５）。感染した蚊あたりのスポロゾイト数を、血球計内で測定した。スポロゾイトの運動性を解析するために、スポロゾイトを前もってコーティングされたカバーガラス上に載せ、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉのスポロゾイト周囲タンパク質に対する一次抗体（抗ＰｂＣＳＰ）（３５）を用いてインキュベートした。結合した抗体を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合抗マウス抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて検出した。肝細胞における肝臓期のものを検出するために、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイトをサブコンフルエントな肝細胞に加え、３７℃で２時間インキュベートし、洗い流した。１２時間後、２４時間後、３６時間後、および４８時間後に、寄生虫の熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）に対する一次抗体およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８と結合した二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、肝臓期のものを示した。スポロゾイトの侵入を解析するため、３×１０４個の唾液腺スポロゾイトをサブコンフルエントなＨｅｐＧ２細胞に加え、３７℃で９０分間インキュベートした。細胞内寄生虫と細胞外寄生虫との間の比率を、抗ＣＳＰ抗体（３６）を用いた二重染色プロトコルおよび共焦点顕微鏡法を用いて可視化した。インビボでのクローン性スポロゾイト集団の感染性を決定するために、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに、ＷＴ寄生虫もしくはノックアウト寄生虫の１００マイクロリットルのＲＰＭＩ  １６４０中スポロゾイト懸濁液を、静脈内もしくは皮下で注射した。これらの動物の寄生虫血症を、ギムザ染色した血液スミアの試験によって毎日検査した。一つの血内期のものの出現は、顕性の第一日目を表す。
【００４６】
免疫および寄生虫抗原投与実験。全ての実験について、５０日齢〜８０日齢の間のメスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。免疫のために、ｕｉｓ４ＲＥＰ（−）スポロゾイトを、感染した蚊由来の唾液腺から抽出した。スポロゾイトを、１００マイクロリットルの容積において、動物の尾の静脈へ静脈内注射した。動物を、１０，０００個もしくは５０，０００個のいずれかのｕｉｓ４ＲＥＰ（−）スポロゾイトの単回用量を用いて免疫し、その後、１０，０００個または２５，０００個のｕｉｓ４ＲＥＰ（−）スポロゾイトの二回の追加投与を静脈内投与した。一回目の追加投与を免疫の１４日後に与え、そして二回目の追加投与をその１４日後に与えた。それから、寄生虫血症について、毎日の血液スミアによって、これらの動物をモニタリングした。一回目の免疫およびその後の追加投与の後に血中期寄生虫陰性を維持した動物のみを、ＷＴスポロゾイトを用いる抗原投与に曝した。最後のｕｉｓ４ＲＥＰ（−）スポロゾイトの追加投与を受けさせた１０日後に、静脈内注射によって動物に抗原投与した。全ての抗原投与は、５０，０００個の感染性Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ  ＷＴスポロゾイトからなった。このスポロゾイト抗原投与用量の感染性を確認するために、両方の実験のセットについて、５個体の未刺激の動物を含めた。各々の未刺激の動物において、寄生虫血症は、注射後３日目に容易に検出され得た。ＷＴ抗原投与後３日目からはじめて、このｕｉｓ４ＲＥＰ（−）スポロゾイトで免疫された動物を、ギムザ染色された血液スミアにおいて検出し得る寄生虫血症について試験した。動物は、抗原投与後５０日以内には、検出し得る寄生虫血症を示さず、完全に防御されたと考えられた。
【００４７】
結果を以下の表２において示す。ｕｉｓ４ＲＥＰ（−）スポロゾイトを用いた免疫は、不生殖防御を与える。大部分のマウスがｕｉｓ４ＲＥＰ（−）スポロゾイトを用いた接種後に血中期のものについて陰性を維持した事実から、本発明者らは、これらの弱毒化されたスポロゾイトを用いた免疫がマウスをＷＴスポロゾイト抗原投与に対して防御するかを試験することが出来た。従って、本発明者らは、Ｃ５７／ｂｌ６マウスを５０，０００個もしくは１０，０００個のｕｉｓ４ＲＥＰ（−）スポロゾイトの３回用量を用いて免疫し、その後このマウスに抗原投与した。このマウスは、５０，０００個の感染性ＷＴスポロゾイトを用いた免疫の後、血中期のものについて陰性を維持した（表２）。免疫したマウスのうちで、抗原投与の後で血中期のものの感染を発症したものはなく、従って、完全な不生殖防御を享受した。５０，０００個のＷＴスポロゾイトを用いて抗原投与された未刺激のマウスは、接種の３日後に血中期感染を発症した。
【００４８】
表２。ｕｉｓ４ＲＥＰ（−）スポロゾイトを用いて免疫されたＣ５７Ｂｌ／６マウスは、ＷＴスポロゾイトを用いる抗原投与に対して完全に防御される。
【００４９】
【表２】
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注記：１免疫されたマウスに、免疫後３８日目に、５０，０００個のＷＴ  Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイトを用いて抗原投与した。マウスは同じ齢の群由来であり、スポロゾイトは同じ蚊のバッチ由来である。血液スミアを抗原投与後５０日目まで確認した。２未刺激のコントロールマウスは同じ齢の群由来であって、５０，０００個のＷＴ  Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイトを用いて抗原投与された。
【００５０】
本発明者らの知見は、マラリア寄生虫が、肝細胞内で、哺乳類への前赤内期感染の完了の成功のためにのみ必要である遺伝子を保有することを示す。本発明者らは、そのような遺伝子の欠失が、哺乳類宿主の肝臓に感染するがその生活環をさらに進んでマラリア疾患を引き起こす能力が著しく損ねられた、遺伝子的に弱毒化したマラリア寄生虫を効果的に作製することを示した。肝臓期発育のために不可欠である、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍゲノム中の他の遺伝子は、本明細書において記載される材料および方法を用いて同定され得る。
【００５１】
最後に、本発明者らは、ここで、マウスのモデルにおいて、ＵＩＳ４ノックアウトスポロゾイトを用いた免疫が、その後の感染性スポロゾイト抗原投与に対して完全な不生殖防御を与えることを示している。このことは、遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫の生実験的ワクチンとしての成功した使用を示す。遺伝子的に弱毒化されたヒトＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫を、マラリアに対する生物体全体のワクチンとして、同様に調製し得る。
【００５２】
（実施例３）
この第３の実施例は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍにおいてＵＩＳ３様ノックアウトを作製するための代表的なプロトコルを記載する。
【００５３】
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＵＩＳ３遺伝子を、周知の二重交差（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）組換え戦略を用いる置換による破壊のために標的化する。ＵＩＳ３遺伝子座を、各々がヒトのジヒドロ葉酸還元酵素（ｈｄｈｆｒ）選択マーカーの近傍に位置する、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＵＩＳ３オープンリーディングフレームの５’非翻訳領域および３’非翻訳領域を含む断片によって置換する。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＵＩＳ３遺伝子座についての配列データを、ＰｌａｓｍｏＤＢデータベース（ｗｗｗ．ｐｌａｓｍｏｄｂ．ｏｒｇ）から得た。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＵＩＳ３のコード配列についての登録番号はＰＦ１３＿００１２（１２）であり、１３番染色体中のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＵＩＳ３のエクソンの位置はマイナス鎖上の１２３９３０〜１２４６１９である。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＵＩＳ３  ｒｅｐ１断片は、ヌクレオチド１２４６０９〜１２５５９４に拡がり、ｒｅｐ２断片はヌクレオチド１２２８７２〜１２３９２１に拡がる。
【００５４】
ＰｆＵＩＳ３  ｒｅｐ１断片およびＰｆＵＩＳ３  ｒｅｐ２断片を、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの３Ｄ７ゲノムＤＮＡから、Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼおよび以下のプライマーを用いて増幅する：ＰｆＵＩＳ３  ｒｅｐ１順方向５’−ＧＡＧＴＡＡＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＴＧＣＡＴＡＴＧＧ−３’（配列番号１５）および逆方向５’−ＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１６）；ＰｆＵＩＳ３  ｒｅｐ２順方向５’−ＣＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＣＧＡＧ−３’（配列番号１７）および逆方向５’−ＧＴＡＴＴＡＴＧＣＴＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＧＡＡＧ−３’（配列番号１８）。増幅されるｒｅｐ１断片およびｒｅｐ２断片の大きさは、それぞれ９８６塩基対および１０５１塩基対である。ＰＣＲの条件は：９４℃で３分間の１サイクルに続けて、９４℃で３０秒間、５４．５℃で１分間、そして６５℃で３分間の３０サイクルである。
【００５５】
このＰＣＲ産物を消化し、ｐＨＴＫ（４７）ベクターへクローニングする。Ｒｅｐ１をＢｇｌＩＩ制限部位およびＳａｃＩＩ制限部位へ、ｒｅｐ２をＥｃｏＩ部位およびＳｆｏＩ部位へ、クローニングする。このＰｆＵＩＳ３置換構築物を、正確なクローニングの確認のために塩基配列決定する。薬物ＷＲ９９２１０を用いて、上記のｄｈｆｒ遺伝子を運ぶトランスフェクションされた寄生虫についての正の選択を行う。ｐＨＴＫはチミジンキナーゼに関する遺伝子を含み、エピソームとしてプラスミドを運ぶ寄生虫の負の選択を可能にする。
【００５６】
同様のプロトコルを、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍにおいて任意の目的の遺伝子（例えば、ＵＩＳ４様遺伝子、登録番号ＮＰ＿７００６３８、ＰＦ１０＿０１６４）のノックアウトを作製するため、もしくは、他のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体においてそのような遺伝子のノックアウトを作製するために用いてもよい。多数のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物体（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉ、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ、Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ、Ｐ．ｒｅｉｃｈｅｎｏｗｉ、およびＰ．ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｍ）についてのゲノムの情報（例えば、ゲノム配列、ＥＳＴ、アノテーション、自動予測、ＳＡＧＥタグ、マイクロアレイのデータ、マッピングのデータ、およびオープンリーディングフレームが挙げられる）は、公開データベース（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｐｌａｓｍｏｄｂ．ｏｒｇ）、およびＳａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ））において、容易に入手し得る。
【００５７】
（引用文献）
以下の刊行物の各々の内容は、本明細書において参考として援用される。
【００５８】
【表３−１】
2007515170.tif 000005
【００５９】
【表３−２】
2007515170.tif 000006
【００６０】
【表３−３】
2007515170.tif 000007
【００６１】
【表３−４】
2007515170.tif 000008
本発明の好ましい実施形態は説明され記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多様な変更が本明細書において行われ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、実施例１において記載されるように、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ＵＩＳ３タンパク質の一次構造を表す。
【図２】図２は、実施例１において記載されるｕｉｓ３（−）寄生虫を生成するために用いられる置換戦略を表す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
2007515170000001.app
【国際調査報告】
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