(57)【要約】本発明は、装置または装置表面をコーティング/含浸してバイオフィルム増殖形成を予防するためのガリウム含有組成物を提供する。本発明はまた、バイオフィルム増殖形成を予防または阻害する方法も提供する。本発明はまた、確立されたバイオフィルムを死滅させるための方法も提供する。2007521112.tif 000008
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
装置または装置表面でのバイオフィルム増殖形成（biofilm growth formation）を阻害するのに十分な濃度のガリウム含有組成物でコーティングされた、装置または装置表面。
【請求項２】
医療装置である、請求項1記載の装置。
【請求項３】
医療装置が医療留置装置である、請求項2記載の装置。
【請求項４】
医療留置装置がカテーテルである、請求項3記載の装置。
【請求項５】
カテーテルが、血管カテーテル、硬膜外カテーテル、腹腔カテーテル、または尿カテーテルである、請求項4記載の装置。
【請求項６】
血管カテーテルが、中枢神経系カテーテル、動脈ライン、肺動脈カテーテル、末梢挿入中心カテーテル（PICC）、または正中線カテーテルである、請求項5記載の装置。
【請求項７】
中枢神経系カテーテルが心室内短絡である、請求項6記載の装置。
【請求項８】
医療装置が矯正装置である、請求項2記載の装置。
【請求項９】
医療装置が人工器官である、請求項2記載の装置。
【請求項１０】
医療装置が気管内装置である、請求項2記載の装置。
【請求項１１】
医療装置がステントまたはガイドワイヤである、請求項2記載の装置。
【請求項１２】
ステントが、血管ステント、胆汁ステント、または尿ステントである、請求項11記載の装置。
【請求項１３】
医療装置がペースメーカーである、請求項2記載の装置。
【請求項１４】
医療装置が医療用インプラントである、請求項2記載の装置。
【請求項１５】
医療装置が光学レンズまたは接眼レンズである、請求項2記載の装置。
【請求項１６】
光学レンズがコンタクトレンズである、請求項15記載の装置。
【請求項１７】
歯科用装置である、請求項1記載の装置。
【請求項１８】
歯科用装置が歯科用インプラントである、請求項17記載の装置。
【請求項１９】
人工呼吸器または吸入器である、請求項1記載の装置。
【請求項２０】
排液管である、請求項1記載の装置。
【請求項２１】
医療装置が手術用装置である、請求項2記載の装置。
【請求項２２】
生物学的流体送達装置または容器である、請求項1記載の装置。
【請求項２３】
生物学的流体送達装置または容器が、予め充填されたシリンジ、IVバッグ、瓶、またはアンプルである、請求項22記載の装置。
【請求項２４】
ドラッグデリバリー装置である、請求項1記載の装置。
【請求項２５】
ドラッグデリバリー装置がパッチである、請求項24記載の装置。
【請求項２６】
パッチが、薬物含有装置、システム、組成物、包帯、または絆創膏である、請求項25記載の装置。
【請求項２７】
符号化装置を含む、請求項1記載の装置。
【請求項２８】
符号化装置がコンピュータチップである、請求項27記載の装置。
【請求項２９】
産業装置である、請求項1記載の装置。
【請求項３０】
産業装置が食品加工装置である、請求項29記載の装置。
【請求項３１】
産業装置が食品収集装置（food collecting）である、請求項29記載の装置。
【請求項３２】
産業装置が水含有装置である、請求項29記載の装置。
【請求項３３】
水含有装置が、プール、浴槽、シンク、貯蔵タンク、井戸、瓶、または温泉である、請求項32記載の装置。
【請求項３４】
産業装置が水処理装置である、請求項29記載の装置。
【請求項３５】
産業装置が水冷装置である、請求項29記載の装置。
【請求項３６】
産業装置が水噴射ジェット装置（water injection jet device）である、請求項29記載の装置。
【請求項３７】
産業装置が、紙およびパルプの製造装置である、請求項29記載の装置。
【請求項３８】
バイオフィルム増殖形成を阻害するのに十分な濃度のガリウム含有組成物で装置またはその表面を含浸またはコーティングする段階を含む、装置上でのバイオフィルム増殖形成を予防する方法。
【請求項３９】
含浸またはコーティングする段階が、装置または装置表面をガリウム含有組成物に浸漬する段階を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
装置または装置表面を乾燥させる段階を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
装置または装置表面から過剰な組成物を濯ぐ段階を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
バイオフィルム増殖形成が細菌性バイオフィルム増殖形成である、請求項38記載の方法。
【請求項４３】
細菌性バイオフィルム増殖形成が、シュードモナス（Pseudomonas）種によって引き起こされる、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
シュードモナス種が緑膿菌（P. aeruginosa）である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
装置が医療装置である、請求項38記載の方法。
【請求項４６】
医療装置が医療留置装置である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
医療留置装置がカテーテルである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
カテーテルが、血管カテーテル、硬膜外カテーテル、腹腔カテーテル、または尿カテーテルである、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
血管カテーテルが、中枢神経系カテーテル、動脈ライン、肺動脈カテーテル、末梢挿入中心カテーテル（PICC）、または正中線カテーテルである、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
中枢神経系カテーテルが心室内短絡である、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
医療装置が矯正装置である、請求項45記載の方法。
【請求項５２】
医療装置が人工器官である、請求項45記載の方法。
【請求項５３】
医療装置が気管内装置である、請求項45記載の方法。
【請求項５４】
医療装置がステントまたはガイドワイヤである、請求項45記載の方法。
【請求項５５】
ステントが、血管ステント、胆汁ステント、または尿ステントである、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
医療装置がペースメーカーである、請求項45記載の方法。
【請求項５７】
医療装置が医療用インプラントである、請求項45記載の方法。
【請求項５８】
医療装置が光学レンズまたは接眼レンズである、請求項45記載の方法。
【請求項５９】
光学レンズがコンタクトレンズである、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
医療装置が歯科用装置である、請求項45記載の方法。
【請求項６１】
歯科用装置が歯科用インプラントである、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
医療装置が人工呼吸器または吸入器である、請求項45記載の方法。
【請求項６３】
医療装置が排液管である、請求項45記載の方法。
【請求項６４】
医療装置が生物学的流体送達装置または容器である、請求項45記載の方法。
【請求項６５】
生物学的流体送達装置または容器が、予め充填されたシリンジ、IVバッグ、瓶、またはアンプルである、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
医療装置がドラッグデリバリー装置である、請求項45記載の方法。
【請求項６７】
ドラッグデリバリー装置がパッチである、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
パッチが、薬物含有装置、システム、組成物、包帯、または絆創膏である、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
装置が符号化装置である、請求項38記載の方法。
【請求項７０】
符号化装置がコンピュータチップである、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
装置が産業装置である、請求項38記載の方法。
【請求項７２】
産業装置が食品加工装置である、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
産業装置が食品収集装置である、請求項71記載の方法。
【請求項７４】
産業装置が、水処理システムまたは工場内の装置である、請求項71記載の方法。
【請求項７５】
産業装置が水冷システムまたは装置である、請求項71記載の方法。
【請求項７６】
産業装置が水分配システムまたは装置である、請求項71記載の方法。
【請求項７７】
産業装置が水噴射ジェットシステムまたは装置である、請求項71記載の方法。
【請求項７８】
産業装置が水含有装置である、請求項71記載の方法。
【請求項７９】
水含有装置が、プール、泉、浴槽、タンク、井戸、または温泉である、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
産業装置が、フィルタ、チューブ、パイプ、貯蔵タンク、またはレザバー（reservoir）である、請求項71記載の方法。
【請求項８１】
産業装置が、食品加工システムまたは工場内の装置である、請求項71記載の方法。
【請求項８２】
産業装置が、紙およびパルプの製造工場内の装置である、請求項71記載の方法。
【請求項８３】
ガリウム含有組成物を表面に適用する段階を含む、表面上でのバイオフィルム増殖形成を予防または阻害する方法。
【請求項８４】
表面が、調理台、テーブル上面、床、まな板、壁、または天井である、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
ガリウム含有組成物を含む、バイオフィルム増殖形成を阻害または予防するためのキット。
【請求項８６】
確立されたバイオフィルムを死滅させるのに十分な濃度のガリウム含有組成物に装置を曝露する段階を含む、装置上の確立されたバイオフィルムを死滅させる方法。
【請求項８７】
確立されたバイオフィルムを死滅させるのに十分な濃度のガリウム含有組成物に表面を曝露する段階を含む、表面上の確立されたバイオフィルムを死滅させる方法。
【請求項８８】
ガリウム含有組成物を含む、確立されたバイオフィルムを死滅させるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1. 発明の分野
本発明は概して、医療分野および産業分野に関する。より詳しくは、本発明は、バイオフィルム増殖形成（biofilm growth formation）およびそこから生じる感染症を予防または阻害するための、ガリウム含有組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2003年12月4日に出願された米国特許仮出願第60/526,907号に対する優先権の恩典を主張する。米国政府は、国立衛生研究所からの助成金番号RO1 A134954およびKO8HL-041173に従い、本発明において権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
2. 関連技術の記載
医療装置の細菌汚染は一般に、バイオフィルム形成によって引き起こされ、これは、院内感染などの感染症につながる。院内肺炎は、2番目に一般的な院内感染であり、最も高い寄与死亡率および罹患率を伴う。例えば、院内肺炎のリスクは、機械的人工換気設備の使用からの何年かで劇的に増大した（American Thoracic Societyの公式声明）。院内感染、特に血流または肺を巻き込む院内感染は、死をもたらすことが多い。
【０００４】
米国の病院における院内感染の、集団に基づく監視試験により、患者1,000例/日あたりの5種類の感染症の5%罹患率または発生率が示されている（Wenzel et al., 2001）。米国病院における院内血流感染の、疫学的重要病原体の監視および制御（The Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiologic Importance；SCOPE)監視システムにより、粗死亡率27%が同定されたが、これは病原体により大きく変動する。SCOPEデータベースに由来する院内血流感染症の評価により、中心静脈カテーテルを用いた患者の70%において発生することが示されている(Wenzel et al., 1999)。細菌がバイオフィルムを形成していることが多い人工呼吸器および/またはカテーテルがしばしば患者に使用されており、かつ患者の免疫系が弱まっていることが多い集中治療室内で、全院内血流感染症の49%が生じることが、SCOPEにより示されている。
【０００５】
また一般に、院内肺炎は、バイオフィルム増殖形成につながる細菌コロニー形成/汚染の一般的な媒介体である、気管内チューブによって引き起こされる。気管内チューブは、口咽頭環境と無菌の気管支肺胞間隙を連結させ、これにより、院内肺炎のリスクが著しく増大する。気管内チューブ内部でのバイオフィルムの形成は、人工呼吸器に関連する肺炎の開始において役割を果たし、かつ、そのような感染症を引き起こす細菌種の中で、抗生物質耐性を選択し得る(Sottile et al., 1986; Inglis et al., 1989; Adair et al., 1993; Koerner et al., 1998; Gorman et al., 2001; Adair et al., 1999)。
【０００６】
院内血流感染症の主な原因とは、血管カテーテルである。約400,000例の血管カテーテル関連の血流感染症（CRBSI）が、米国において毎年生じると推定されている(Raad, 1998)。院内感染のもう一つのよくある原因とは、全院内感染症の34%の一因となる尿路感染症（UTI）である(Klempner et al., 1998)。院内UTIは通常、尿カテーテルの汚染に関連する。
【０００７】
さらに、バイオフィルム増殖形成による院内感染は、特に、癌患者および組織が失活し免疫が減少した免疫無防備状態の患者における、外科手術手順の一般的な合併症である。手術創感染症は、全院内感染症の17%の一因となる(Platt and Bucknall, 1988)。多くの手術創感染症は、縫合糸の細菌汚染と関連している。
【０００８】
抗生物質および防腐剤は、細菌がその上で成長してバイオフィルムを形成し、院内感染などの感染につながる装置をコーティング/含浸するために使用されている。これらの感染症は抗生物質によって何年も制御することができるが、しかし、最終的には、細菌（例えば緑膿菌（P. aeruginosa））は、抗生物質処置に対して耐性を有するバイオフィルムを形成し、従ってこれらの薬剤が治療的に無効にされる。バイオフィルム形成の制御における既存の防腐剤の耐久性もまた、限定されている。
【０００９】
いくつかの試験により、装置上でのバイオフィルム形成の制御における、様々な種類の抗菌処置の効果が調べられている。例えば、血管カテーテルの表面の含浸におけるクロルヘキシジン/スルファジアジン銀の使用により、シュードモナス（Pseudomonas）などのグラム陰性細菌に対する限定的な活性がもたらされた。ミノサイクリンおよびリファンピンと共に含浸されたカテーテルは、細菌コロニー形成の予防においていくらか効果的だった(Darouiche et al., 1999)。Anwarら（1992）は、MICをはるかに上回るレベルのトブラマイシンによる処置が緑膿菌のバイオフィルム細胞数を約2 log減少させ、その一方で、同じ用量により、この生物の浮遊（planktonic）細胞の＞8 logの減少が提供されたことを示した。ブドウ糖-ヘパリンフラッシュへのメタ重亜硫酸ナトリウムの添加によって、心房カテーテルの微生物コロニー形成が排除された（Freeman and Gould（1985））。陽イオン表面活性剤（塩化トリドデシルメチルアンモニウム）（これは次にセファロスポリンを表面に結合させるために用いられる）でコーティングされたカテーテルは、未処置のカテーテルよりも、汚染される可能性およびバイオフィルムを成長させる可能性が低いことが見出された（Kamal et al., 1991）。Flowersら（1989）は、ポリ抗生物質（polyantibiotic）軟膏の局所適用後に挿入された取り付け可能な銀イオン含有皮下カフが、カテーテルに保護効果を与え、これによって低い汚染率がもたらされたことを見出した。Maki(1994)により、中心静脈カテーテル上でバイオフィルムを制御するための、以下を含むいくつかの方法が示唆された：
移植の際の無菌技術の使用；
局所抗生物質の使用；
カテーテル導入の期間の最小化；
静脈内補液（intravenous fluid）用のインライン（in-line）フィルタの使用；
外科手術により移植されたカフにカテーテルを取り付けることによって、生物の流入を予防するための物理的な障壁の作製；
カテーテルの内側管腔の抗菌剤でのコーティング；および
汚染された装置の除去。
【００１０】
また、産業的適用において使用される防腐剤も、細菌生物のバイオフィルム増殖形成を予防することができなかった。例えば、緑膿菌腹膜炎の大発生による工業用水汚染および公衆衛生問題は、汚染されたポロキサマーヨード液（腹腔カテーテルを処置するために使用された消毒薬）が原因であると突き止められた。緑膿菌は、ヨード液を製造する工場において使用された配水パイプおよび水フィルタを汚染したことがわかった。一旦生物が成熟してバイオフィルムになると、ヨードフォア溶液の殺菌活性に耐性となった。それ故、バイオフィルム増殖形成は、産業環境において機械的な問題を引き起こし、場合によっては、ヒトにおける感染症につながる場合がある。
【００１１】
医療環境および産業環境においてバイオフィルム形成を阻害するその他の方法は、以前、金属キレート化剤を用いて開発されていた（米国特許出願第60/373,461号）。これらの方法により、バイオフィルムの阻害のための低分子キレート化剤、すなわちEDTA、EGTA、デフェロキサミン、ジエチレントリアミン5酢酸、およびエチドロネートの使用が開示された。米国特許第6,267,979号には、水処置、パルプおよび紙の製造、ならびに油田水攻法（oil field water flooding）における生物付着の予防のための、抗真菌性組成物または抗生物質性組成物と組み合わされた金属キレート化剤の使用が開示されている。米国特許第6,086,921号には、殺菌剤としての重金属と組み合わせたチオール含有化合物の使用が開示されており、米国特許第5,688,516号には、医療留置装置の処置および調製において使用するための、二価金属キレート剤と組み合わせた非グリコペプチド抗菌剤の使用が開示されている。
【００１２】
バイオフィルム増殖形成を制御するために使用される現在の方法はいくらか効果的ではあるが、バイオフィルム増殖形成は、医療環境および産業環境などの様々な環境において問題を含んだままである。従って、より良好なバイオフィルム増殖形成標的化手段が、当技術分野において必要である。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明は、当技術分野に欠けている、細菌生物によるバイオフィルム増殖形成の予防を克服するものである。したがって、本発明は、装置または装置表面上でのバイオフィルム増殖形成を阻害するのに十分な濃度のガリウム含有組成物でコーティング/含浸された、医療装置および産業装置などの装置を提供する。特定の態様において、本発明は、バイオフィルム増殖形成を阻害するのに十分な濃度のガリウム含有組成物で装置またはその表面を含浸またはコーティングする段階を含む、装置上でのバイオフィルム増殖形成を予防する方法を提供する。
【００１４】
本発明は、バイオフィルム増殖形成のための媒介体である場合があり、かつそれ故、機械的人工換気装置の使用に起因することが多い院内肺炎などの院内感染を引き起こす場合がある、医療留置装置などの任意の医療装置を包含する。したがって、本発明の一部の態様において、バイオフィルム増殖形成を阻害するのに十分な濃度のガリウム含有組成物でコーティング/含浸された人工換気装置が提供される。
【００１５】
気管内チューブ内部でのバイオフィルムの形成は、人工呼吸器に関連する肺炎の開始において役割を果たす。したがって、本発明の一部の態様において、バイオフィルム増殖形成を阻害するのに十分な濃度のガリウム含有組成物でコーティング/含浸された気管内チューブが提供される。
【００１６】
血管カテーテルは、バイオフィルム増殖形成に起因する院内血流感染症の主な原因である。したがって、本発明の一部の態様において、バイオフィルム増殖形成を阻害するのに十分な濃度のガリウム含有組成物でコーティング/含浸された血管カテーテルが提供される。血管カテーテルは、中枢神経系カテーテル、動脈ライン、肺動脈カテーテル、末梢挿入中心カテーテル（PICC）、または正中線カテーテルを含み得る。中枢神経系カテーテルは、心室内短絡である場合がある。
【００１７】
バイオフィルム増殖形成によって一般的に院内感染の原因となる別の種類のカテーテルは、尿カテーテルである。したがって、本発明の一部の態様において、バイオフィルム増殖形成を阻害するのに十分な濃度のガリウム含有組成物でコーティング/含浸された尿カテーテルが提供される。
【００１８】
また、バイオフィルム増殖形成は、外科手術装置上でも起こり得る。したがって、本発明の一部の態様において、バイオフィルム増殖形成を阻害するのに十分な濃度のガリウム含有組成物でコーティング/含浸された外科手術装置が提供される。
【００１９】
本発明はさらに、これらに制限される訳ではないが、バイオフィルム増殖形成を阻害するのに十分な濃度のガリウム含有組成物でコーティングされた硬膜外カテーテルまたは腹腔カテーテルなどの、その他の医療留置装置を包含する。本発明のその他の装置は、矯正装置；人工器官；血管ステント、胆汁ステント、もしくは尿ステントなどのステント；ガイドワイヤ；腎瘻チューブ；ペースメーカー；医療用インプラント；コンタクトレンズなどの、光学レンズもしくは接眼レンズ；または排液管を非制限的に含み得る。本発明のガリウム含有組成物でコーティング可能/含浸可能なその他の医療装置には、少し例を挙げると、血液交換装置、血管アクセスポート、心血管カテーテル、体外循環回路、植込み型人工器官、血管移植片、ポンプ、心臓弁、および心血管縫合糸が含まれる。
【００２０】
本発明のもう一つの態様において、本装置は、これらに限定される訳ではないが、予め充填されたシリンジ、IVバッグ、瓶、またはアンプルなどの、生物学的流体送達装置または容器であり得る。さらに別の態様において、本発明の装置は、パッチなどのドラッグデリバリー装置であり得る。パッチは、薬物含有装置、システム、組成物、包帯、または絆創膏であり得る。本発明のまたさらに別の態様において、本装置は、コンピュータチップなどの符号化装置であり得る。
【００２１】
本発明の別の特定の態様において、バイオフィルム増殖形成を阻害するのに十分な濃度のガリウム含有組成物で装置またはその表面を含浸/コーティングする段階を含む、医療装置上でのバイオフィルム増殖形成を予防する方法が提供される。含浸またはコーティングする段階は、以下の段階を含んでもよい：
医療装置または装置表面をガリウム含有組成物に浸漬する段階；
装置または装置表面を乾燥させる段階；および
装置または装置表面から過剰な組成物を濯ぐ段階。
【００２２】
さらなる特定の態様において、本発明のガリウム含有組成物は、ガリウムの抗バイオフィルム活性に関する非医療的適用において使用され得る。細菌バイオフィルムによる生物付着は、歯科機器、冷暖房装置、食品サービスおよび水処理産業、ならびにその他多くなどの、多くの環境における主要な問題である。したがって、本発明のさらなる態様において、本装置は、これに限定される訳ではないが歯科用インプラントのような歯科用装置であってよく、かつ、その他の歯科用装置または機器を含み得る。
【００２３】
さらにその他の態様において、本発明は、装置またはその表面上でのバイオフィルム増殖形成を阻害するのに十分な濃度のガリウム含有組成物でコーティング/含浸された、産業装置を提供する。産業装置は、食品加工装置、食品収集装置（food collecting）、または水含有装置を含み得るが、これらに限定される訳ではない。水含有装置とは、プール、浴槽、シンク、貯蔵タンク、井戸、瓶、または温泉であり得る。またさらなる態様において、産業装置とは、水処理装置、水冷装置、水噴射ジェット装置（water injection jet device）、または紙およびパルプの製造装置であり得る。
【００２４】
本発明のまたさらに別の態様において、バイオフィルム増殖形成を阻害するのに十分な濃度のガリウム含有組成物で装置またはその表面を含浸/コーティングする段階を含む、産業装置上でのバイオフィルム増殖形成を予防する方法が提供される。含浸またはコーティングする段階は、以下の段階を含んでもよい：
産業装置または装置表面をガリウム含有組成物に浸漬する段階；
装置または装置表面を乾燥させる段階；および
装置または装置表面から過剰な組成物を濯ぐ段階。
【００２５】
バイオフィルム増殖形成を予防または阻害するために、任意の傷つきやすい表面にガリウム含有組成物を適用し得ることが、本発明において意図される。このような表面は、調理台、テーブル上面、床、まな板、壁、または天井を含み得る。
【００２６】
またさらなる態様において、本発明は、ガリウム含有組成物を含む、バイオフィルム増殖形成を阻害または予防するためのキットを提供する。
【００２７】
本発明は、例えばグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌などの多種多様な生物によるバイオフィルム増殖形成を阻害または予防するために、本明細書に記載のガリウム含有組成物が用いられ得ることを意図する。特定の態様において、バイオフィルム増殖形成は、緑膿菌などのシュードモナス種によって引き起こされ得る。
【００２８】
本発明のガリウム含有組成物が、動物モデルにおけるまたはヒト被験者におけるバイオフィルム形成を予防するために使用され得ることもまた、意図される。
【００２９】
バイオフィルム増殖形成による院内細菌感染症が、菌血症、肺炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、副鼻腔炎、関節炎、尿路感染症、破傷風、壊疽、大腸炎、急性胃腸炎、気管支炎、および様々な膿瘍などの疾患、ならびに日和見感染症をもたらし得るので、本発明はさらに、その必要がある被験者に有効量のガリウム含有組成物を提供する段階を含む、そのような疾患を予防する方法を意図する。
【００３０】
緑膿菌によって引き起こされたバイオフィルム形成は、嚢胞性線維症肺感染症（cystic fibrosis lung infection）において明らかになっている。したがって、さらなる態様において、本発明は、治療的有効量のガリウム組成物を被験者に提供する段階を含む、嚢胞性線維症を有する被験者におけるバイオフィルム増殖形成を予防する方法を意図する。全身に、エアゾールによって、局所的に、または、対象への治療剤の送達または投与のための当技術分野において公知の任意の手段によって、本発明のガリウム含有組成物は送達され得る。
【００３１】
また、本発明のガリウム含有組成物は、肺以外の部位での緑膿菌感染症によって引き起こされるバイオフィルム増殖形成の予防にも適用可能であり得る。例えば、熱傷創が緑膿菌に感染することが多く、これによって、命にかかわる血流浸潤および敗血症性ショックが起こる可能性がある。これらの感染症は、バイオフィルムの形成を伴うと考えられる。したがって、創傷に対する本発明のガリウム含有組成物の局所適用は、バイオフィルム増殖形成を予防または阻害することによって、感染の開始を予防できる。
【００３２】
本発明のさらなる態様において、確立されたバイオフィルムを死滅させるのに十分な濃度のガリウム含有組成物に装置を曝露する段階を含む、装置上の確立されたバイオフィルムを死滅させる方法が提供される。別の態様において、確立されたバイオフィルムを死滅させるのに十分な濃度のガリウム含有組成物に表面を曝露する段階を含む、表面上の確立されたバイオフィルムを死滅させる方法が提供される。
【００３３】
またさらなる態様において、本発明は、ガリウム含有組成物を含む、確立されたバイオフィルムを死滅させるためのキットを提供する。
【００３４】
「医療留置装置」という用語は、ヒトの体内に移植または挿入される任意の医療装置を意味する。このような装置を、一時的にまたは永久に、移植または挿入することができる。
【００３５】
したがって、本発明は、これらに限定される訳ではないが、産業用途、医療用途、および公衆衛生用途などの様々な用途において使用され得る。詳細な態様に関係なく、本発明の適用可能性を制限することを意味するものではない。
【００３６】
添付の特許請求の範囲および/または明細書において「含む」という用語と共に用いられる「一つの」または「ある」という用語の使用は、「一つの」を意味する可能性もあるが、「一つ以上の」、「少なくとも一つの」、および「一つまたは複数の」という意味にも一致する。
【００３７】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになると考えられるので、詳細な説明および具体例は、本発明の具体的態様を示すものではあるが、例証としてのみ示されるものであることが理解されるべきである。
【００３８】
例示的態様の説明
I. 本発明
本発明は、バイオフィルム増殖形成を予防する際の当技術分野における欠陥を克服するものである。バイオフィルム関連細胞への抗菌分子の大量輸送速度の低下のために(Suci et al., 1994)、または、バイオフィルム細胞が浮遊細胞と生理的に異なるので(Evans et al., 1991)、バイオフィルム内部の細菌は、抗生物質およびその他の外因性毒素（例えば過酸化水素）による殺傷に対して、浮遊細胞よりも本質的に強い耐性を有することが見出されている(Costerton et al., 1999; Stewart et al., 2000; Elkins et al., 1999; Drenkard et al., 2002; Mah et al., 2001)。浮遊生物を不活性化するのに十分な抗菌濃度は、通常、耐性の亜集団を潜在的に選択するバイオフィルム生物（特にバイオフィルム深部のもの）を不活性化するには不十分である。また、バイオフィルム増殖形成により、宿主食細胞が生物に接近することおよびそれを死滅させることも困難になる。したがって、緑膿菌のような生物によって引き起こされたバイオフィルム形成を予防および/または崩壊させる薬剤を開発することが必要である。
【００３９】
本発明者らは、これらの生物によるバイオフィルム形成に至る緑膿菌への感染症の発病におけるいくつかの段階で、鉄（Fe）の利用率（availability）が重大であることを示した。ガリウム（Ga）は、細胞性取り込みに関してFeと競合することが可能であり、かつ、Fe含有酵素においてFeをガリウムに置換することによって、それらを不活性にする。ガリウムが、緑膿菌により使用される戦略との多くの類似点を有する戦略である結核菌（M. tuberculosis）のシデロホア媒介性のFe獲得戦略を崩壊させることができることもまた、本発明者らによって生成された実質的なデータによって示されている。得られた予備データは、ガリウムが緑膿菌の増殖に与える同様の阻害効果と一致していた。最も重要なことに、他の目的のためにガリウムを投与されたヒトにおいて達成可能なことが公知である濃度を十分下回りかつ細菌増殖を阻害しない濃度において、ガリウムが、緑膿菌によるインビトロにおけるバイオフィルムの形成を効果的に予防することが、データにより示されている。ガリウムが緑膿菌のFe代謝を崩壊させることができ、それによって、この生物によるバイオフィルムの確立において鍵となる段階を改変することが、データによって示唆される。
【００４０】
ガリウムが、確立されたバイオフィルムを、時間および濃度依存的な様式で効果的に死滅させること、ならびに、臨床的に達成されるピークレベル内の濃度でそれが行われることもまた、本発明者らによって示された。
【００４１】
したがって、本発明は、バイオフィルム増殖形成を予防または阻害するためにガリウム含有組成物でコーティング/含浸された装置またはその表面を提供する。本発明はまた、装置またはその表面上でのバイオフィルム増殖形成を予防するための方法も提供する。好ましい態様において、気管内チューブ、人工呼吸器、その他の医療装置、または産業装置などの装置上での緑膿菌バイオフィルム形成を予防するために、装置を組成物でコーティング/含浸することにより、ガリウム含有組成物が利用される。本発明のガリウム含有組成物が、緑膿菌と類似のFe依存性を有するその他の生物によって形成されるバイオフィルムの予防において使用され得ることもまた、意図される。また、本発明のガリウム含有組成物は、嚢胞性線維症患者およびその他の緑膿菌感染患者などの被験者におけるバイオフィルム増殖形成の予防においても使用され得る。さらに、本発明のガリウム含有組成物は、装置または表面上の確立されたバイオフィルムを死滅させるために使用され得る。
【００４２】
II. 細菌生物およびバイオフィルム形成
微生物が浸水（submerged）表面に不可逆的に付着し、付着を容易にする細胞外ポリマーを産生して、構造マトリクスを提供する場合に、バイオフィルム増殖形成が起こる。この表面は、不活性な非生体材料または生体組織であり得る。バイオフィルム関連微生物は、増殖速度に関して、浮遊（自由懸濁された（freely-suspended））生物とは異なる挙動をする。加えて、バイオフィルムは、抗菌処置に対して次第に耐性となる能力（感受性が1/1000〜1/1500に低下）により、特徴づけられる。場合によっては、バイオフィルムは、装置、および、患者内でのまたは患者によるその使用期間に応じて、単一種または複数種から構成され得る。
【００４３】
抗菌剤に対するバイオフィルムの耐性は、細菌細胞が包埋され、殺菌剤による浸透に対して障壁を提供する、細胞外マトリクスに起因すると考えられる(Costerton et al., 1999)。しかし、バイオフィルム中の大多数の細胞が遅生育（slow-growing）で栄養飢餓の状態にあり、かつしたがって抗菌剤の効果に対して感受性でない、という可能性もある。加えて、抗菌剤に対する耐性は、例えば薬物排出ポンプの高発現により、保護された異なるバイオフィルム表現型を採用しているバイオフィルム中の細胞に起因し得る。
【００４４】
バイオフィルムは、細菌、真菌、酵母、原生動物、およびその他の微生物からなることができる。最も一般的なバイオフィルムは細菌バイオフィルムであることが分かっている。グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌はどちらも、バイオフィルムを形成することができる。バイオフィルムを形成することができるグラム陽性細菌の例には、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）などのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）(A群)、連鎖球菌（Streptococcus）種(ビリダンス群)、ストレプトコッカス アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）(B群)、ストレプトコッカス ボビス（S. bovis）、ストレプトコッカス（Streptococcus）(嫌気種)、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumonias）、およびエンテロコッカス（Enterococcus）種が含まれるが、これらに限定される訳ではない。その他のグラム陽性杆菌には、炭疽菌（Bacillus anthracis）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）および、類ジフテリア菌(好気性および嫌気性)であるコリネバクテリウム（Corynebacterium）種、リステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ならびにクロストリジウム ディフィシレ（Clostridium difficile）が含まれる。バイオフィルムを形成することができるグラム陰性細菌の例は、大腸菌（Escherichia coli）属、エンテロバクター（Enterobacter）種、プロテウス ミラビリス（Proteus mirablis）およびその他の種、緑膿菌、肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、サルモネラ菌（Salmonella）、赤痢菌（Shigella）、セラチア菌（Serratia）、ならびにカンピロバクター ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カタル球菌（Neisseria and Branhamella catarrhalis）由来の細菌である。
【００４５】
バイオフィルムを形成することができるさらなる生物には、皮膚糸状菌(イヌ小胞子菌（Microsporum canis）およびその他小胞子菌種；ならびに紅色白癬菌（T. rubrum）および毛瘡白癬菌（T. mentagrophytes）などの白癬菌種)、酵母(例えば、カンジダ アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ パラシローシス（C. Parapsilosis）、カンジダ グラブラタ（C. glabrata）、カンジダ トロピカリス（C. tropicalis）、または、薬物耐性カンジダ（Candida）種を含むその他のカンジダ種)、エピデルモフィトン フロッコーズム（Epidermophyton floccosum）、癜風菌（Malassezia furfur）(ピチロスポルム オルビクラーレ（Pityrosporum orbiculare）またはピチロスポルム オバーレ（P. ovale）)、クリプトコックス ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、アスペルギルス フミガータス （Aspergillus fumigatus）およびその他のアスペルギルス（Aspergillus）種、接合菌類（Zygomycetes）(クモノスカビ属（Rhizopus）、ケカビ属（Mucor）)、ヒアロヒフォミコーシス（hyalohyphomycosis）(フザリウム（Fusarium）種)、ブラジルパラコクシジオイデス（Paracoccidioides brasiliensis）、ブラストミセス デルマティティディス（Blastomyces dermatitides）、ヒストプラスマ カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス イミチス（Coccidioides immitis）、ならびにスポロトリックス シェンキィ（Sporothrix schenckii）が含まれ得る。
【００４６】
最も一般的には留置装置から単離される、バイオフィルム増殖形成を引き起こす生物には、表皮ブドウ球菌および黄色ブドウ球菌などのブドウ球菌（Staphylococcus ）種；カンジダ アルビカンスなどのカンジダ種；エンテロコッカス フェカーリス（Enterococcus faecalis）などのエンテロコッカス種、ストレプトコッカス種；緑膿菌；肺炎杆菌；ならびに類ジフテリア菌が含まれる。これらの生物は、患者または医療労働者の皮膚、進入口が曝露される水道水、または環境（特に医療設備）におけるその他の供給源に由来し得る。
【００４７】
緑膿菌がバイオフィルムを形成する傾向が強いことは、医療環境および産業環境におけるバイオフィルム増殖形成の問題に対する主な要因である。緑膿菌は、バイオフィルム増殖およびカテーテル閉塞と強く関連している。例えば、緑膿菌のバイオフィルムは、例えば尿道留置カテーテル、静脈留置カテーテル、または腹腔留置カテーテルなどの医療用インプラントから単離された（Stickler et al., 1998）。
【００４８】
緑膿菌はまた、機械的人工換気を受けている患者における肺炎の最も一般的な原因でもあり(Lode et al., 1992; Adair et al., 1999)、かつこれは、重症になりやすい最も破壊的な感染症に含まれる（Chastre et al., 2002; Bergmans et al., 1998）。人工呼吸器に関連する肺炎の発達において鍵となる要素が、バイオフィルム中で生きている細菌による気管内チューブおよび中咽頭のコロニー形成であることが、最近の研究により示されている(Inglis et al., 1989; Koerner, 1997; Levine et al., 1991; Sottile et al., 1986; Bauer et al., 2002)。また、緑膿菌は、エイズ末期の患者における市中感染性肺炎の一因でもある(Shepp et al., 1994; Schuster et al., 1994)。これらの患者はしばしば、細菌由来のバイオフィルム増殖形成に起因する感染症に対して感受性になる(Meynard et al., 1999)。
【００４９】
これらの急性感染症に加えて、緑膿菌は、嚢胞性線維症（CF）または慢性気管支拡張症の患者における肺の慢性感染症を引き起こす（Fick et al., 1989; Marshall et al., 1991; Pollack et al., 2000）が、これは、バイオフィルム増殖形成に起因する（Costerton et al., 1999）。持続性緑膿菌感染症に関連する肺損傷は、現在、CFにおける主要な死因である(Fick et al., 1989)。
【００５０】
したがって、さらなる態様において、本発明は、治療的有効量のガリウム組成物を被験者に提供する段階を含む、嚢胞性線維症を有する被験者におけるバイオフィルム増殖形成を予防する方法を意図する。全身に、エアゾールによって、局所的に、または、被験者への治療剤の送達または投与のための当技術分野において公知の任意の手段によって、本発明のガリウム含有組成物は送達され得る。
【００５１】
また、本発明のガリウム含有組成物は、肺以外の部位での緑膿菌感染症の予防にも適用可能であり得る。例えば、熱傷創は緑膿菌に感染することが多く、これによって、命にかかわる血流浸潤および敗血症性ショックが起こる可能性がある。これらの感染症は、バイオフィルムの形成を伴うと考えられる。したがって、創傷に対する本発明のガリウム含有組成物の局所適用は、バイオフィルム形成を予防または阻害することによって、感染の開始を予防できる。
【００５２】
また、緑膿菌などのバイオフィルムは、産業的な懸念の問題も提起する(Bitton, 1994; Steelhammer et al., 1995)。この生物は凝集状態でバイオフィルムを増殖させるが、それによって、多くの水処理工場における問題が生じる。
【００５３】
III. ガリウム含有組成物およびその使用
ガリウムは、新生物および炎症性部位を局在化させるための手段として核医学において使用されている、IIIa群遷移金属である。特定の新生細胞および炎症性細胞に対するガリウムの傾向が強いために、ガリウムは、これらの部位に局在化する。Ga3+の生物学的効果および治療的効果は、それが、多くの生体分子過程においてFe3+を置換でき、それによりそれらを崩壊させることができることに関連するようである(Chitambar et al., 1988; Hubbard et al., 1986)。Fe3+同様、Ga3+は、トランスフェリン依存的な、およびトランスフェリン非依存的なFe取り込み機構を介して、マクロファージを含む哺乳動物細胞に入る（Chitatambar et al., 1987; Olakanmi et al., 1994）。（マクロファージなどの最終分化細胞とは対照的に）急速に分裂している腫瘍細胞において、ガリウムは、リボヌクレオチドレダクターゼ中の鉄を置換するその能力を介して細胞性DNA複製に干渉し、その結果、鉄と異なりガリウムは酸化還元循環（redox cycling）を受けることができないという事実のために酵素不活化をもたらす(Chitambar et al., 1988)。
【００５４】
また、ガリウムは、悪性新生物および悪性腫瘍関連高カルシウム血症に関しても治療的に用いられている(Foster, et al., 1986; Todd et al., 1991; Jonkoff et al., 1993; Chitambar et al., 2003)。ガリウムが肝臓、腎臓、脾臓、およびリンパ系における単核起源の細胞中に蓄積できることも既知である。癌関連高カルシウム血症患者における臨床体験により、硝酸ガリウムは十分に許容され、臨床的に関連する副作用をほとんど産生しないことが示されている(Todd, et al., 1991; Leyland-Jones, 1991; Chitambar et al., 2003)。Ga(NO3)3の形のガリウムは、現在、悪性の高カルシウム血症の治療のための、ヒトにおける静脈内投与に関して承認されている。ガリウムマルトレート（gallium maltolate）の形のガリウムの経口製剤は、現在、転移性前立腺癌、抗療性多発性骨髄腫、転移性膀胱癌、および抗療性リンパ腫の治療に関して臨床試験中である。この薬物は、Titan Pharmaceutical(San Francisco, CA)により開発中である。
【００５５】
ガリウム含有化合物および硝酸ガリウムが、慢性肺感染症を引き起こす細胞内病原体を阻害することも示されている（例えば、国際公開公報第98/09622号、米国特許第5,997,912号および同第6,203,822号を参照されたい）が、それぞれはその全体が参照によって本明細書に組み入れられている。
【００５６】
本発明は、バイオフィルム増殖形成を阻害または予防するのに効果的な濃度のガリウム含有組成物を提供する。バイオフィルム増殖形成を阻害するために必要なガリウムの量は、細菌生物を死滅させるまたは阻害するために必要な量を下回る。したがって、一部の態様において、ガリウムの濃度は少なくとも約1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM、またはそれ以上であってよい。本発明のさらなる態様において、ガリウム濃度は、約1μM〜約10μM、約2μM〜約15μM、約4μM〜約12μM、約5μM〜約20μM、約10μM〜約30μM、約15μM〜約40μM、約20μM〜約50μM、またはそれ以上であってよい。一部の好ましい態様において、ガリウム濃度は約16.25μM〜約100μMであってよい。ガリウムが鉄を置換できるという条件で、本発明のガリウム濃度は、組成物中で利用可能な鉄の量に依存し得る。当業者は、当技術分野において、鉄の利用率に基づいてガリウム濃度を決定する方法を知っていると考えられる。
【００５７】
さらに本発明は、確立されたバイオフィルムを死滅させるのに効果的な濃度のガリウム含有組成物を提供する。一部の態様において、ガリウムの濃度は約10μM〜約1000μMであってよい。本発明のさらなる態様において、ガリウム濃度は約140μM〜約700μMであってよい。その他の態様において、ガリウム濃度は約10μM〜約100μMであってよい。その他の態様において、ガリウム濃度は約100μM〜約1000μMであってよい。ガリウムが鉄を置換できるという条件で、本発明のガリウム濃度は、組成物中で利用可能な鉄の量に依存し得る。当業者は、当技術分野において、鉄の利用率に基づいてガリウム濃度を決定する方法を知っていると考えられる。
【００５８】
IV. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれるものである。後述の実施例に開示される技術が、本発明の実践において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を示すものであり、かつ従ってその実践のために好ましい様式を構成するとみなされ得ることを、当業者は認識すべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的態様に多くの変更を加えることが可能でありかつ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく類似または同様の結果が未だ得られることを認識すべきである。
【００５９】
実施例1
Fe利用率および緑膿菌バイオフィルム増殖形成
綿密に調節された過程を介して緑膿菌がバイオフィルムを形成することは、当技術分野において公知である。バイオフィルム形成は、緑膿菌クオラムセンシングシステムによって調節されることが示されている（Davis et al., 1998）。本発明者らによる以前の研究によって、緑膿菌によるバイオフィルムの確立段階においてFe利用率が重大な役割を果たすことが示された。加えて、本発明者らにより、ガリウムが細菌のFe依存的代謝を崩壊させることができることが示された。下位阻害濃度（sub-inhibitory concentration）のガリウムが、インビトロにおける緑膿菌によるバイオフィルム形成を予防することが見出された。
【００６０】
以前開発されたフローセルモデルのバイオフィルム形成において顕微鏡によって決定されたように、緑膿菌増殖を改変しなかったFe結合タンパク質ラクトフェリン（LF）の濃度が、緑膿菌によるバイオフィルム形成を著しく阻害したことが、予備研究によって示された(Singh et al., 2002; 図1A〜図1H)。この効果は、Feの存在によって逆転し、かつ、図2A〜図2Bに示すように、Feキレート化剤であるデフェロキサミンまたはコナルブミンを用いても再現された(Singh et al., 2002)。この結果は、緑膿菌バイオフィルム形成が、細菌増殖よりも、環境Feレベルに感受性であったという結論につながる。
【００６１】
また、Fe制限は、おそらくLFがバイオフィルム形成を崩壊させたために、トブラマイシンまたはH2O2による殺傷に対する緑膿菌の感受性の増大も導いた(Singh et al., 2002; 図2A〜図2B)。しかし、一旦バイオフィルムが確立されると、LFはバイオフィルムを改変することができなかった。バイオフィルム形成に対するFe制限の効果が、緑膿菌運動性の改変と相関したこと-低いFe利用率が単収縮運動性を刺激したことが、さらなる研究により示されたが、これはおそらく、生物が浮遊状態からバイオフィルムの開始へと進行することを妨げるのに役立つ(Singh et al., 2002)。
【００６２】
緑膿菌による使用に関してFeの利用率を改変するか、または、Fe制限環境にあると考えられるような方法でそのシグナル伝達系を崩壊させる、Feキレート化剤以外の要素により、生物がバイオフィルムを形成する傾向が減少されると考えられることが、これらのデータにより示唆される。
【００６３】
実施例2
病原性マイコバクテリアに対するガリウムの抗菌活性
以前に本発明者らは、ガリウムが、細胞外でおよびヒトマクロファージ内で、結核菌および、トリ結核菌複合体(Mycobacterium Avium Complex；MAC) の増殖を阻害することを示した(Olakanmi et al., 2000)。マイコバクテリアを、BACTEC 12Bブロス培養瓶中、Ga(NO3)3の非存在下または存在下でインキュベートした。BACTECシステムは、マイコバクテリア細胞壁への[14C]パルミチン酸塩の細菌取込みの間に生成される14CO2の放出として、マイコバクテリア増殖をモニタリングする。各マイコバクテリア株の濃度依存的な増殖阻害は、Ga(NO3)3を用いて観察された(Olakanmi et al., 2000)。その感度および速度のために、BACTECシステムが使用された。しかし、その培地には最大で1.6mMのFeが含まれている（フェロジン（ferrozine）アッセイ法）。比較すると、インビボにおける細胞外Feの濃度は、5〜10μMである。Feを追加せずに（2μM Fe）作製された7H9ブロス中のガリウムに、結核菌Erdman（Erdman M. tuberculosis）を曝露した場合、予想通り、ずっと低いガリウム濃度において結核菌の有意な増殖阻害が見られた（図3A）。IC50は、ガリウム曝露の72時間時点において約1.25〜2.5μMであった。ガリウム媒介性の増殖阻害は、Fe3+濃度
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Ga3+濃度において逆転した（図3B）。
【００６４】
ガリウムが、マイコバクテリアFe獲得を崩壊させることによって、その抗菌効果を部分的に媒介することが、これらのデータによって示唆される。驚くべきことに、67Gaまたは59Feを使用して評価されたように、細菌は、Ga蓄積よりも大きな容量をFe蓄積に関して有しているようである。最後に、結核菌の59Fe獲得に関する競合においてガリウムが非常に効果的だったのに対して、67Ga獲得の妨害においてFeは比較的効果がなかった(図4; Olakanmi et al., 2000)。
【００６５】
実施例3
マクロファージ内の病原性マイコバクテリアに対するガリウムの抗菌活性
インビボにおけるマイコバクテリアの増殖の重大部位は、宿主マクロファージ内部に存在する。Ga類は、これらの細胞内での結核菌増殖を阻害することが見出されている(Olakanmi et al., 2000; 図5A)。NaNO3はマイコバクテリア増殖に対して影響を及ぼさず、このことにより、ガリウムが原因となっていることが確認された。マイコバクテリア増殖は24時間の時点で最高50%まで阻害されたが、より顕著な阻害（＞70%）が48時間後に観察された（図5B）。これは、マクロファージへの、およびその後バクテリアへの、ガリウムの取り込みおよび輸送のために必要な時間に関し得る。ガリウムの効果は、単球由来マクロファージ（MDM）単層の損失に起因しなかった。事実、ガリウムは、結核菌倍加により経時的に単層の損失を防止した。
【００６６】
Ga(NO3)3を静脈内に投与すると、大多数のガリウムが、血清トランスフェリン（TF）によってキレート化される(Seligman et al., 1992; Bernstein, 1998)。Ga-TFは、液体培地中のおよびヒトマクロファージ内部でのマイコバクテリア増殖の阻害において、Ga(NO3)3と同程度に効果的であることが見出された(Olakanmi et al., 2000)。ガリウムは、細胞外で結核菌に対して殺菌性であり、ましてや細菌がマクロファージ中で細胞内増殖していた場合にはなおさら、殺菌性であった(Olakanmi et al., 2000)。
【００６７】
実施例4
細胞内結核菌によるFe蓄積を減少させるガリウム
Fe-TFは細胞外Feの主な形であり、ヒトマクロファージの結核菌含有貪食空胞に外因的に加えられたTFの輸送が観察されている(Clemens et al., 1996)。従って、ガリウムは、貪食空胞内で分裂している細菌によるFe取り込みと競合すると仮定された。本発明者らは、その実験室で開発されたアッセイ法を使用して、マクロファージ貪食空胞内に位置する結核菌が、TFに結合した細胞外59Feを獲得することを示した(Olakanmi et al., 2000)。しかし、10μM Ga(NO3)3の存在は、貪食空胞内結核菌による59Fe獲得を顕著に減少させた(図6; Olakanmi et al., 2000)。これは、総MDM 59Feの違いに起因するものではなかった。
【００６８】
2回の最近の予備実験において、MDM単層に、59Feもしくは67Gaまたは両方のいずれかを前負荷した（パルス/チェイス、それぞれ24時間）。次に、結核菌Erdmanを加えた。48時間後、貪食空胞から単離した細菌を、関連する鉄またはガリウムについて評価した。各金属は、特異的に細菌に関連することが見出された。ガリウムおよび鉄を両方加えた場合、鉄獲得は71%および67%まで阻害され（n=2）、対照的に、ガリウム獲得は可変的に増大された（52%および22%）。
【００６９】
実施例5
Feリプレッサー調節タンパク質IdeRに対するガリウムの効果
鉄調節エレメントであるIdeRは、緑膿菌Furに類似した様式で、マイコバクテリアにおけるカタラーゼ、SOD、およびシデロホアの生成を調節する(Dussurget et al., 1996)。DNA結合を起こすために、IdeRは、Fe2+またはNi2+などの二価金属と複合体を形成しなければならない。Ga(NO3)3がIdeRの結合に与える効果（ゲル移動度シフトアッセイ）を、高親和性IdeR結合部位を含む結核菌に由来するHisEプロモータ領域を使用して調べた(Schmitt et al., 1995)。ガリウム(200 μM)は、このDNA断片に結合しているIdeRをもたらさなかったが、200μM Ni2+との結合が観察された。ガリウムは、IdeR結合のNi2+またはFe2+の活性化に干渉しなかった。IdeRはガリウムの標的ではないようであるが、これは、IdeRが選択的に二価金属と結合すること、およびガリウムが三価であることを考えれば、驚くことではない(Schmitt et al., 1995)。Ga3+が同様に緑膿菌Furに結合しないことは、これらの知見に基づいて予想される。
【００７０】
実施例6
結核菌リボヌクレオチドレダクターゼ活性を阻害するガリウム
次に、細菌によるガリウムの内部移行が、リボヌクレオチドレダクターゼ（RR）などのFe依存的な代謝活性の崩壊につながり得ると仮定した。このことと一致して、ガリウムはRR活性の強力な阻害剤であることが、他の研究者により見出された；RR活性に関する放射標識CDP還元アッセイ法（radiolabeled CDP reduction assay）、およびII型RRである結核菌RR(Yang et al., 1994; 1997)が使用された。450μMのガリウムは、RR活性を50%阻害した（n=2）が、このことにより、ガリウムが、酵素の活性部位からFeを直接置き換えることによって酵素を阻害し得ることが示唆された。このアッセイ法におけるガリウムの強度は、RRを阻害するために実験的に用いられる基準物質であるヒドロキシ尿素（IC50=3〜5mM）より、10倍大きい(Yang et al., 1997)。上述したように、緑膿菌は、その増殖、およびヒドロキシ尿素によるDNA産生の阻害に対して、他の細菌種よりもずっと高い感受性を有することが報告されている(Gale et al., 1964)。精製された哺乳動物RRに対するガリウムのIC50についてのデータは存在しないが、哺乳動物L1210細胞の細胞非含有抽出物においてRRチロシル遊離基の特徴的なEPRピークを50%まで減少させるのに、16mMガリウム（結核菌RRに対するガリウムのIC50よりも約35倍高い）が必要であったことが報告されている(Narasimhan et al., 1992)。無傷の細菌という文脈においてRRを阻害するのに必要なガリウムの濃度は、これらの試験において使用された精製酵素を阻害するのに必要な濃度よりもずっと低い可能性がある。
【００７１】
実施例7
緑膿菌の増殖に対するガリウムの効果
ガリウムが効率的にマイコバクテリア鉄代謝を崩壊させることを示唆している上記のデータによって、スクシネート培地において増殖した緑膿菌の鉄代謝に対するガリウムの潜在的影響の検査が促された。緑膿菌増殖は、外因性Feの添加に依存的である（図7）。緑膿菌PAO1株のスクシネート培地に1μM FeCl3を含めることによって、6時間にわたって緑膿菌濃度（A600）が＞10倍増加したが、鉄が添加されない場合にはごくわずかな増加が見られた。Ga(NO3)3またはGa-TFのいずれかの形のガリウムを、濃度
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1μMで鉄補足スクシネート培地に加えた場合、緑膿菌増殖のガリウム濃度依存的阻害が観察された（図7）。100nMのガリウムは増殖を阻害しなかった（図示せず）。同様の結果が、別の条件下で観察された（下記参照）。
【００７２】
実施例8
緑膿菌バイオフィルム形成を阻害するガリウム
ラクトフェリンによる鉄のキレート化が緑膿菌バイオフィルム発達を阻害すること、およびガリウムが微生物鉄獲得を崩壊できることが、データにより示された。これらの結果により、ガリウムが抗バイオフィルム活性を有し得ることが示唆された。従って、インビボにおける効果的な鉄キレート化が多くの理由により非常に困難な可能性があるならば、バイオフィルム形成を妨害するためにガリウムを投与することによって潜在的な治療的アプローチが提供される。
【００７３】
第一に、多くの病原性細菌は非常に効果的な鉄獲得機構を有する。従って、効果的なキレート化剤は、極めて高い親和性を有する鉄を結合させねばならないと考えられる。第二に、生物学的に利用可能な（bio-available）鉄は既に、細胞外液中に存在する宿主鉄結合タンパク質に大きく制限されている。このことによって、薬学的キレート化剤が、利用可能な鉄を還元できる見込みがさらにずっと低くなる。第三に、緑膿菌のような病原性生物は、鉄キレート化剤を分解できる酵素を産生する。最後に、ヒト細胞は、多くの生理学的過程のために鉄を必要とする。したがって、効果的な鉄制限が可能であったとしても、これは宿主に対する有害効果を有し得る。
【００７４】
ガリウムがバイオフィルム発達を阻害するという可能性を調査するために、（バイオフィルム実験において使用された培地（1:100強度のTSB）中で緑膿菌の増殖を損なわなかった）Ga(NO3)3の下位阻害濃度を決定した。これは、増殖阻害を含む効果ではなく、ガリウムの特異的な抗バイオフィルム活性を評価するために重要であった。図8に示すように、Ga(NO3)3は、濃度が1μMを上回るまで、（バッチ培養における）緑膿菌の増殖速度を有意に低下させなかった。
【００７５】
最初のバイオフィルム実験においては、この培地中の緑膿菌に対する阻害濃度の1/3である、濃度0.3μMのGa(NO3)3を使用した。バイオフィルム形成に対するラクトフェリンの効果を評価するために、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現している緑膿菌を連続培養フローセルにおいて増殖させ、その後経時的にバイオフィルム発達を続けた。Ga(NO3)3を含むまたは含まないバイオフィルム培地で、フローセルチャンバを連続的に灌流した。
【００７６】
ガリウム非含有培地において（図9）、バイオフィルム発達の典型的なステージが観察された。最初に、細菌が表面に付着した。増殖の2日後には、ミクロコロニー（バイオフィルム発達の初期に形成する細胞のクラスタ）が明白であった。4日目までに、柱状のバイオフィルムが形成された。ガリウムは、この発達パターンを崩壊させた。Ga(NO3)3の存在下では、細菌は付着したが、バイオフィルム形成におけるその後の段階が阻害された（図9）。長期のインキュベーション後であってさえ、細菌は、集合して分化したバイオフィルム構造とならず、ガリウムの存在下では薄層のままであった。
【００７７】
バイオフィルム形成に対するガリウムの劇的な効果のために、その他の抗菌剤の下位阻害濃度が類似の挙動を示すかどうかを試験するためのさらなる実験を実施した。図9は、抗シュードモナス抗生物質であるセフタジジムの下位阻害濃度がバイオフィルム発達を阻害しなかったことを示す。このことは、バイオフィルム阻害が、下位阻害濃度における抗生物質の一般的な効果ではないことを示唆している。ガリウムがこの効果を発揮する機構は、研究されるであろう。
【００７８】
実施例9
確立されたバイオフィルムを死滅させるガリウム
ガリウムがバイオフィルム形成を阻害することを示唆している上記のデータによって、確立されたバイオフィルムに対するガリウムの潜在的影響の検査が促された。3日齢の（three-day-old）バイオフィルムを、濃度10μM、100μM、および1000μMのガリウムに曝露させた。バイオフィルム生存度をヨウ化プロピジウムによって評価し、観察を、12時間（図10A）、24時間（図10B）、48時間（図10C）、および72時間（図10D）の時点で記録した。ガリウムが、確立されたバイオフィルムを、時間および濃度依存的な様式で死滅させること、ならびに、臨床的に達成されるピークレベル内の濃度（140〜700μM）でそれが行われることが、図10A〜図10Dにより示されている。
【００７９】
本明細書において開示および請求されるすべての組成物および/または方法および/または装置は、本開示に照らして、必要以上の実験を行うことなく、作製および実施が可能である。本発明の組成物および方法は、好ましい態様の観点から説明されているが、当業者には、組成物および/または方法および/または装置に対して、ならびに本明細書に記載の方法の段階または一連の段階において、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、変更を加えることができることが明らかであろう。より具体的には、同一または類似の結果を達成すると同時に、化学的および生理学的に関連する特定の物質が、本明細書に記載の物質に置換され得ることが明らかであろう。当業者に明らかであるそのような類似の置換および修正はすべて、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
【００８０】
参考文献
以下の参考文献は、それらが例示的な手順の詳細または本明細書の記載を補足するその他の詳細を示す限り、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
米国特許第5,997,912号
米国特許第6,203,822号
米国特許第6,267,979号
米国特許第6,086,921号
米国特許第5,688,516号
2007521112.tif 000005
2007521112.tif 000006
2007521112.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００８１】
本特許または本出願の資料は、色付きで作成された図面を少なくとも一つ含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、要請および必要な料金の支払いに応じて、庁により提供されるであろう。
【００８２】
添付の図面は本明細書の一部であり、本発明の一部の局面をさらに示すために含められる。本発明は、これらの図面の一つまたは複数を、本明細書に示される具体的態様の詳細な説明と併せて参照することによって、より適切に理解することができる。
【図１】図1A〜図1H。ラクトフェリン非含有培地（図1A〜図1D）およびラクトフェリン含有（20μg/ml）培地（図1D〜図1H）によって灌流されたバイオフィルムフローセルにおける、GFP標識された緑膿菌の共焦顕微鏡画像。画像は、フローセルの接種から4時間後（図1Aおよび図1E）、24時間後（図1B〜図1F）、3日後（図1C〜図1G）、および7日後（図1D〜図1H）に得られた。図1A、図1B、図1E、および図1Fは上面図(x-y平面)であり、スケールバーは10μmである。図1C、図1D、図1G、および図1Hは側面図(x-z平面)であり、スケールバーは50μmである。結果は6回の実験の代表である。
【図２】図2A〜図2B。コナルブミンが、トブラマイシン（図2A）およびH2O2（図2B）に対する緑膿菌バイオフィルムの抗菌感受性に与える効果。データは、3回の異なる実験に由来する平均±SEM（n=6）である。
【図３】図3A〜図3B。低濃度のGa(NO3)3は、生理的Fe条件下では結核菌の増殖を阻害するが、増殖阻害は、過剰なFeの存在下では妨げられる。（図3A）示された濃度のGa(NO3)3の存在下、OADCおよびFeを添加していない7H9培地中で、結核菌Erdman （106/ml）をインキュベートした。規定された時点で、細菌懸濁液のアリコートを2つ組のBACTEC 12Bボトルに接種し、その後の増殖指標を決定した。24時間、48時間、および72時間の時点における示された濃度のGa(NO3)3に関する累積データが示され、3回の独立した実験の平均±SEMを表す。（図3B）10μMのGa(NO3)3および増加濃度のFe-クエン酸が添加されたがODACおよびGaを添加していない7H9培地中で、結核菌Erdman （106/ml）をインキュベートした。72時間の時点において、細菌懸濁液をBACTEC 12Bボトルに接種し、その後の増殖指標を決定した。示された結果（平均±SD）は、代表的な実験（n=2）に由来する。BACTECボトル（高Fe含有培地）中で実験が実施された場合、Feが、結核菌ErdmanおよびMACに対するGa(NO3)3の増殖阻害効果を逆転させることも見出された（データは示さず）。
【図４】図4A〜図4B。結核菌によるFe取り込みは、ガリウムの存在下で顕著に阻害されるが、ガリウム取り込みは、過剰なFeによって小程度しか阻害されない。結核菌Erdman（2×107ml）を、示された濃度の冷競合金属（cold competing metal）の存在下または非存在下、500nM 59Fe-クエン酸（図4A）または67Ga-クエン酸（図4B）を含む7H9培地（FeおよびOADC非添加）中で、6時間インキュベートした。その後、細菌を繰り返し洗浄し、細菌に付随する67Gaまたは59Feのレベルを決定した。結果は、冷競合金属の増加濃度の関数として得られた金属の量として示される。実験群は三つ組で実施し、示されたデータは3回の独立実験（平均±SEM）を表す。
【図５】図5A〜図5B。Ga(NO3)3は、濃度依存的な様式でヒトマクロファージ内の結核菌の増殖を阻害する。マイコバクテリア（結核菌Erdman、H37Ra、およびMDR）を、1:1〜5:1（結果は同様であった）の多重度（細菌/マクロファージ）で、ヒト単球由来マクロファージ（MDM）またはヒト肺胞マクロファージ（HAM）の単層に加えた。2時間後、単層を洗浄し、充満培地（repletion medium）を添加した。示された濃度のGa(NO3)3を、24時間後に加えた。対照単層は、Ga(NO3)3を欠いている。2つ組または3つ組のウェルから組み合わされた上清および細胞溶解物の増殖指標測定値を、Ga(NO3)3の示された濃度と共に3日目に記録した。MDMを使用した代表的な実験は、図5Aに示される（平均±SD）。図5Bにおいて、累積データを対照のパーセントとして表す（平均±SEM、n=2〜5）HAM（n=2）を使用した結果は、MDMを使用した結果と同様であった。
【図６】Ga-トランスフェリンは、濃度依存的な様式で、マクロファージ貪食空胞内部の結核菌によるFe獲得を阻害する。59Feトランスフェリン(10 μM)を、示された濃度のGa-トランスフェリンの非存在下（対照）または存在下で結核菌含有MDMに24時間加えて、MDMを溶解させ、溶解物を、0.22μm（孔径）フィルタを介して濾過した。フィルタ上の結核菌に付随する放射能（cpmで表される）を、決定した。代表的な実験から加えられたGa濃度の関数として、cpm値が示される。挿入図は、対照59Fe獲得のパーセントとしてプロットされた3回の別々の実験の平均±SEM結果を示す。
【図７】緑膿菌を、単独で、またはFeCl3 +/- Gaキレートと共に、OD（A600）が約0.010となるまで、スクシネート培地に接種した。その後、37℃でのインキュベーション6時間にわたり、A600の変化として増殖をモニタリングした。Ga(NO3)3を用いたより長期間のインキュベーションは、同様の効果を示した（データは示さず）。
【図８】緑膿菌の増殖に対するガリウムの効果。示された濃度のガリウムを有する1:100強度のTSB培地に細菌を接種し、振とうしながら37℃で増殖させた。15時間にわたり、A600の変化として増殖をモニタリングした。
【図９】対照培地（上図）、および0.3μM Ga(NO3)3含有培地(中図)、および0.25 μg/mlセフタジジム含有培地(下図)によって灌流されたバイオフィルムフローセルにおける、GFP標識された緑膿菌の共焦顕微鏡画像。画像は、フローセル接種後1日目、2日目、および4日目に得た。画像は俯瞰（top-down）図である（x-y平面）。
【図１０】図10A〜図10D。ガリウムは、確立されたバイオフィルムを死滅させる。3日齢のバイオフィルムを、濃度10μM、100μM、および1000μMのガリウムに曝露させた。バイオフィルム生存度はヨウ化プロピジウムによって評価し、観察を、12時間（図10A）、24時間（図10B）、48時間（図10C）、および72時間（図10D）の時点で記録した。ガリウムが、確立されたバイオフィルムを、時間および濃度依存的な様式で死滅させること、ならびに、臨床的に達成されるピークレベル内の濃度（140〜700μM）でそれが行われることが、図10A〜図10Dにより示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【国際調査報告】
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