(57)【要約】  本発明は、インシュリン抵抗性を処置するのに有効な薬剤の、Ｓ６キナーゼ１活性の特異的阻害を介するスクリーニング法を提供する。また、有効量のＳ６キナーゼ１の特異的阻害剤を投与することによってインシュリン抵抗性を処置する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インシュリン抵抗性を処置するのに有効な薬剤を同定する方法であって、下記の工程を含む方法：
ｉ）Ｓ６キナーゼと化合物をインキュベートすること；
ｉｉ）Ｓ６キナーゼ活性を測定すること；そして
ｉｉｉ）該化合物が存在しないときと比較して、Ｓ６キナーゼ活性における化合物誘導調節を測定すること、ここで、該化合物の存在下でのＳ６キナーゼ活性の変化は、インシュリン抵抗性を処置するのに有効な薬剤の指標である。
【請求項２】
該調節がＳ６キナーゼ１活性の阻害である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該調節がＳ６キナーゼ２活性の活性化である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｓ６を基質として使用してＳ６キナーゼ活性を測定することを含んでなる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ペプチドを基質として使用してＳ６キナーゼ活性を測定することを含んでなる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
インシュリン抵抗性の処置に有効な薬剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）転写的に活性な細胞内容物を、プロモーター配列と作動可能に連結したＳ６Ｋ遺伝子をコード化する核酸と、またはレポーター遺伝子と作動可能に連結したＳ６Ｋプロモーター配列と、少なくとも１種の化合物の存在下で接触させること；そして
（ｂ）Ｓ６キナーゼ発現またはＳ６キナーゼプロモーター活性に対する該化合物の影響を検出すること、ここで、Ｓ６キナーゼ発現またはプロモーター活性における調節の検出は、インシュリン抵抗性の処置に有効な薬剤の指標である
を含んでなる、方法。
【請求項７】
該転写的に活性な細胞内容物および該核酸が細胞中に存在する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該Ｓ６キナーゼがＳ６キナーゼ１であり、そして該調節がＳ６キナーゼ発現またはプロモーター活性の減少である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
該薬剤のインシュリン抵抗性に対する効果を検出することをさらに含んでなる、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれかによって同定された薬剤。
【請求項１１】
インシュリン抵抗性を減少させる方法であって、該方法が含脂肪細胞、筋細胞または肝細胞を有効量のＳ６キナーゼ１阻害剤と接触させることを含んでなる方法。
【請求項１２】
該Ｓ６Ｋ１阻害剤が、Ｓ６Ｋ２と比較して選択的にＳ６Ｋ１の酵素活性を減少させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
インシュリン抵抗性または糖尿病の進行を処置または予防する方法であって、対象に薬学的に有効量のＳ６キナーゼ調節剤を投与することを含んでなる、方法。
【請求項１４】
該Ｓ６調節剤がＳ６Ｋ２と比較して選択的にＳ６Ｋ１活性を減少させる阻害剤である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該阻害剤がＳ６Ｋ１におけるＡＴＰ結合部位と結合する、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
該阻害剤がＳ６Ｋ１の触媒ドメインと結合する、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
該阻害剤がＳ６キナーゼ１に特異的な抗体または抗体フラグメントである、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
該阻害剤がＳ６キナーゼ２と比較して選択的にＳ６キナーゼ１の発現を減少させるアンチセンス、リボザイムまたはｓｉＲＮＡである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１９】
インシュリン抵抗性またはインシュリン抵抗性の素因を診断する方法であって：
（ａ）哺乳類由来のサンプルにおけるＳ６キナーゼ活性のレベルを検出すること；そして
（ｂ）正常対照値または値の範囲と比較したときの、Ｓ６キナーゼ活性の変化をインシュリン抵抗性またはインシュリン抵抗性の素因と相関させること
を含んでなる、方法。
【請求項２０】
該Ｓ６キナーゼ活性がＳ６Ｋ１酵素活性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
正常の対照と比較したＳ６Ｋ１活性レベルの増加が、該哺乳類がインシュリン抵抗性を有するかまたはそれを発症する素因を有することを示す、請求項１９または２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インシュリン抵抗性および糖尿病、とりわけインシュリン抵抗性または糖尿病のＳ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ）活性の調節剤での処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＩ型糖尿病は、西洋で最も一般的な糖尿病の形態であり、そして肥満と密接に関連している−８０％以上の罹患者が肥満である。ＩＩ型糖尿病を有する患者において、インシュリンはグルコースの筋肉および脂肪への取り込みを促進する能力が低く、インシュリン抵抗性と呼ばれる状態である。肥満がインシュリン作用の障害を導く分子原理は、十分に理解されていない。
【０００３】
インシュリンは通常、それ自身の製造および膵臓β細胞による分泌の制御によって、そして末梢組織でのグルコースの利用を調節することによって、グルコース恒常性を維持するように作用する。近年の研究では、このプロセスにｍＴＯＲ／Ｓ６キナーゼシグナル伝達経路を関連させている。Ｓ６キナーゼは、リボソームタンパク質Ｓ６をリン酸化する酵素である。とりわけ、Ｓ６Ｋ１（ｐ７０／ｐ８５  Ｓ６キナーゼとしても知られる）欠損マウスは、グルコース感受性またはインシュリン生産の障害のためではなく、膵臓内分泌腺重量の減少（これは、β細胞の選択的減少によって計測される）のために、軽度の耐糖能異常（高血糖）および低インシュリン血症である。Ｓ６Ｋ１欠損マウスは、通常の空腹時グルコースレベルを維持し、それらが末梢組織においてインシュリンに超感受性である可能性がが示唆される（Pende et al., 2000, Nature, 408, 994-997）。
【０００４】
この表現型は、タンパク質栄養失調が誘発する低インシュリンが個体をグルコース耐糖能異常にかかりやすくするものである、前臨床の２型糖尿病によく似ている。限られた期間の、ラットにおけるタンパク質栄養失調はまた、β細胞の大きさおよびインシュリン分泌の持続した減少から起こる、軽度の耐糖能異常を導き、影響は一部、末梢組織における軽度のインシュリン過敏症によって減衰される（Swenne et al., 1992, Diabetologia 35, 939-945; Swenne et al., J. Endocrinol. 118, 295-302; Grace et al., 1990, Diabetes Metab. 16, 484-491 (1990)）。
【０００５】
Ｓ６Ｋ１欠損マウスは生存および繁殖可能であるが、胚発生の間明白な体の大きさの減少を示し、影響はほとんど、成体になるまでに克服される。３．５週齢の同型変異マウスの比較は、全組織の重量が体重の減少と正比例することを示した。小さな大きさの同型変異マウスは、一貫して翻訳能力に欠損があった（Shima et al., 1998, EMBO J., 17, 6649-6659）。Ｓ６Ｋ１欠損マウスが成体に達したとき、生誕時に見られた野生型マウスと比較した体重における差異は、２０％から１５％に減少した。かかるマウスは、脂肪を蓄積し得、そして年齢および食餌脂肪の増加の関数として、野生型と同様、インシュリン抵抗性になる。
【０００６】
インシュリン抵抗性におけるＳ６キナーゼ活性の役割は、ヒトの研究において知られている。インシュリン感受性およびインシュリン抵抗性、非糖尿病ピマインディアンを、インシュリンで２時間処置した。基底レベルのＳ６キナーゼ活性は両グループで類似であり、Ｓ６キナーゼは、インシュリン感受性個体における５倍と比較して、インシュリン抵抗性個体において３倍しか活性化されず、インシュリン抵抗性個体においてＳ６キナーゼ活性が損傷していることを示唆した。
【０００７】
Ｓ６Ｋ活性は、以前はがんおよび血管形成と関連付けられていた。ＷＯ９３／１９７５２は、ラパマイシンおよびその誘導体の、ｐ７０  Ｓ６キナーゼの阻害剤としての使用を、そして細胞の増殖または免疫応答を阻害するためのそれらの使用を開示する。ＵＳ２００３／００８３２８４は、ｐ７０  Ｓ６キナーゼの発現阻害のためのアンチセンス化合物を開示する（７０ｋＤａおよび核、８５ｋＤａアイソフォームの両方に関する）。該アンチセンス核酸は、感染症、炎症および腫瘍形成、ならびに代謝障害の処置において有用である可能性が提案されている。ＵＳ２００３／０１４３６５６は、ｐ７０  Ｓ６Ｋの活性を増加させることができる化合物が、糖尿病もしくは肥満の処置において有用であり得ること、あるいはアポトーシスの阻害において有用であり得ることが提案されている。
【０００８】
Attoubら（2001, Faseb J., 14, 2329-2338）は、ラパマイシンがレプチン機能、とりわけ細胞のコラーゲンゲルへのレプチン誘導性侵襲を阻止することを示している（発がんモデルとして）。レプチン治療は、先天性レプチン欠損を有する肥満患者において痩せすぎないようにしながら、体重減少を促進するために使用しされており、肥満または糖尿病の処置におけるレプチンを示唆する。
【０００９】
インシュリン抵抗性、とりわけＩＩ型糖尿病（非インシュリン依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭとも呼ばれる）の新規標的を提供する、そして処置用新規医薬を開発する必要性は残っており、本発明はこの必要性を満たす。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の第１の局面において、インシュリン抵抗性を処置するのに有効な薬剤を同定する方法が提供され、該方法は下記の工程を含む：
ｉ）Ｓ６キナーゼを化合物とインキュベートすること；
ｉｉ）Ｓ６キナーゼ活性を検出すること；そして
ｉｉｉ）該化合物が存在しないときと比較して、Ｓ６キナーゼ活性における化合物誘導調節を測定すること、ここで、該化合物が存在の存在下でのＳ６キナーゼ活性の変化は、インシュリン抵抗性を処置するのに有効な薬剤の指標である。化合物誘導性調節は、好ましくはラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）活性の効果とは独立している。１つの態様において、該調節はＳ６キナーゼ１活性の阻害である。Ｓ６キナーゼ活性は簡便には、基質としてＳ６を使用してアッセイし得、容易にハイスループットアッセイに供し得る。
【００１１】
また本発明によって、インシュリン抵抗性を処置するのに有効な薬剤のスクリーニング方法を提供し、該方法は、転写的に活性な細胞内容物をプロモーター配列と作動可能に連結したＳ６Ｋ遺伝子をコード化する核酸、またはレポーター遺伝子と作動可能に連結したＳ６Ｋプロモーター配列と、少なくとも１種の化合物の存在下で、接触させること；そしてＳ６キナーゼ発現またはＳ６キナーゼプロモーター活性における該化合物の効果を検出することを含み、ここで、Ｓ６キナーゼ発現またはプロモーター活性の減少または増加の検出がインシュリン抵抗性を処置するのに有効な薬剤の指標である。かかるアッセイは細胞に基づくアッセイであり得、該転写的に活性な細胞内容物および核酸は、細胞中に存在する。好ましい態様において、該Ｓ６キナーゼはＳ６キナーゼ１である。
【００１２】
本発明はさらに、インシュリン抵抗性を処置するのに有効な薬剤を同定する方法を提供し、該方法は：
Ｓ６キナーゼ遺伝子を含む非ヒト動物を提供すること；
化合物を該非ヒト動物に投与すること；そして
該化合物が存在しないときと比較して、インシュリン抵抗性が影響を受けるか否かを決定することを含む。該Ｓ６キナーゼ遺伝子は、トランスジェニック動物（たとえば、ヒト配列に由来するＳ６キナーゼ遺伝子を含むマウス）として同一または異なった種に由来し得る。
【００１３】
本発明の方法によって同定された薬剤も包含される。
【００１４】
さらなる局面において、含脂肪細胞の大きさを減少する方法であって、含脂肪細胞を有効量のＳ６キナーゼ１阻害剤と接触させることを含む方法を提供する。
【００１５】
さらに別の局面において、インシュリン抵抗性を処置する方法であって、対象に薬学的に有効量のＳ６キナーゼ調節剤を投与することを含む方法を提供する。該Ｓ６調節剤はＳ６Ｋ１阻害剤であり得る。
【００１６】
したがって、インシュリン抵抗性の処置または予防的処置用医薬の製造のための、Ｓ６キナーゼの特異的調節剤、たとえばＳ６キナーゼ１の選択的調節剤も提供する。
【００１７】
同様に、インシュリン抵抗性の処置において使用するためのＳ６キナーゼ活性の調節剤、たとえばＳ６キナーゼ１の選択的阻害剤も提供する。
【００１８】
本発明のさらなる局面において、インシュリン抵抗性または糖尿病の素因を診断する方法であって：個体からサンプルを得ること、サンプルにおけるＳ６キナーゼ活性、好ましくはＳ６キナーゼ１活性のレベルを測定すること、そして正常対照値または値の範囲と比較したときのサンプルにおけるＳ６キナーゼ活性の変化を、インシュリン抵抗性または糖尿病の素因と相関させることを含む方法を提供する。たとえば、正常対照値または値の範囲と比較したときのＳ６キナーゼ１活性の増加は、インシュリン抵抗性または糖尿病の素因の指標である。
【００１９】
インシュリン抵抗性の処置を評価する方法であって、該方法は治療剤を、Ｓ６キナーゼ遺伝子、とりわけＳ６Ｋ１を含む非ヒト動物に投与すること、そしてインシュリン抵抗性に対する該薬剤の効果を測定することを含む方法も提供する。
【００２０】
発明の詳細な説明
個体において、とりわけ肥満の個体において、インシュリン抵抗性およびＩＩ型糖尿病を処置するより効果的な治療に対する必要性は依然残っている。本発明者らは、本出願以前に公表された研究とは対照的に、Ｓ６Ｋ１活性化がインシュリン抵抗性をもたらすことを発見し、したがって、Ｓ６Ｋ１活性の阻害を通じて糖尿病および関連する疾病を処置するための医薬標的としてのＳ６Ｋ１を提供する。ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳類標的、Ｓ６キナーゼをリン酸化および活性化する）はＳ６Ｋ１活性を調節するための標的であり得るが、Ｓ６Ｋ１の直接標的は、ｍＴＯＲ活性阻害のより一般的な副作用を回避し、そしてインシュリン抵抗性を有する患者の処置のためのさらなる特異性を提供する。とりわけ、ｍＴＯＲはＳ６Ｋ１およびＳ６Ｋ２の両方を活性化することが知られているが、本発明者らは、Ｓ６Ｋ１の選択的阻害が望ましいことを発見した。
【００２１】
したがって、本発明はインシュリン抵抗性または糖尿病（とりわけ高脂肪食または肥満が誘発する状態）を処置するのに有効な薬剤を同定する方法であって、Ｓ６キナーゼ活性、とりわけＳ６キナーゼ１活性の調節に基づく方法を提供する。典型的には、かかる方法は：Ｓ６キナーゼ（または機能的等価物またはその誘導体）を化合物とインキュベートし；Ｓ６キナーゼ活性を測定し；そして該化合物が存在しないときと比較して、Ｓ６キナーゼ活性における化合物誘導調節を測定する工程を含む。該化合物の存在下におけるＳ６キナーゼの変化は、インシュリン抵抗性または糖尿病を処置するのに有効な薬剤の指標である。該化合物が存在しない対照アッセイを平行して行い得る。
【００２２】
文脈から明確に異なるのではない限り、“Ｓ６Ｋ”または“Ｓ６キナーゼ”は、本明細書中でＳ６Ｋ１およびＳ６Ｋ２の両方を含んで使用され（たとえば、Genebank Accession No. M57428, AJ007938, AB019245, NM003952 および関連配列参照）、しかし、Ｓ６Ｋ１が好ましい。Ｓ６Ｋの機能的等価物（変異体）および誘導体の例には、Ｓ６Ｋが置換、化学的、酵素的、または他の適当な方法によって、天然に存在するアミノ酸以外の部分で、共有的に置換されている分子が含まれる。
【００２３】
一般的に、かかる変異体は、“野生型”または本明細書中で特定されている他の配列と実質的に相同であり、すなわち、それと配列類似性または同一性を有する。類似性または同一性とは、ヌクレオチド配列および／またはコード化されたアミノ酸配列レベルであり得、そして好ましくは、少なくとも約５０％、６０％、または７０％、または８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。配列比較はＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＰ（Pearson ＆ Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183： 63-98参照）を使用して行い得る。パラメーターを、初期値マトリックスを使用して、好ましくは下記のとおり設定する：Ｇａｐｏｐｅｎ（ギャップの第１の残基に対するペナルティー）：タンパク質について −１２／ＤＮＡについて −１６；Ｇａｐｅｘｔ（ギャップの付加残基に対するペナルティー）：タンパク質について −２／ＤＮＡについて −４；ＫＴＵＰワード長：タンパク質について２／ＤＮＡについて６。類似性の分析はまた、ハイブリダイゼーションを使用して行い得る。特定の配列相同性の核酸分子間でハイブリダイゼーションを達成するために要求されるストリンジェンシー条件を計算するための１つの公式は：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（Ｇ＋Ｃの％）−０．６３（ホルムアミドの％）−６００／二本鎖の＃ｂｐである（Molecular Cloning： a Laboratory Manual：  2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００２４】
共通の構造的特徴を残している変異体は、Ｓ６Ｋのフラグメント、とりわけ酵素活性またはアイソフォーム特異的特徴を維持しているフラグメントであり得る。たとえば、Ｓ６Ｋ１およびＳ６Ｋ２のカルボキシ末端配列は、約２０％の同一性のみを示し、そしてそれゆえ、それはアイソフォーム特異的アッセイが望まれるとき、フラグメントにおいてかかるアイソフォーム特異的特徴を含むために有用であり得る。同様に、Ｓ６Ｋ１はＴ４４７でリン酸化され得、これは、別のまたは付加的なアイソフォーム特異的特徴を提供するＳ６Ｋ２において存在しない。好ましくは、フラグメントは５０〜３５０アミノ酸長である。
【００２５】
Ｓ６Ｋの変異体はまたその突然変異体を含み、これはＳ６Ｋの少なくとも１つの特徴、好ましくは酵素活性および／または上記アイソフォーム特異的特徴を維持するための要求にしたがって、アミノ酸欠失、付加または置換を含み得る。したがって、保存的アミノ酸置換は、トランケーションで行い得るように、Ｓ６Ｋの性質が実質的に変化することなく行われ得る。さらに、付加および置換は、本発明のスクリーニング方法において使用されるＳ６Ｋのフラグメント、とりわけＳ６Ｋ酵素活性を増強するかまたはいくつかの他の所望の特徴を提供するものを製造し得る。たとえば、マウスＳ６Ｋ１におけるＴ３８９、Ｔ２２９およびＳ３７１（ｐ７０Ｓ６Ｋとしても知られている）は、ショウジョウバエｐ７０Ｓ６ＫにおけるＴ３８９、Ｔ２３８およびＳ３８０と相同である。Ｔ３８９はとりわけ、保存的活性キナーゼを生産するために、酸性アミノ酸残基への突然変異に使用される。上記Ｓ６ＫまたはＳ６Ｋフラグメントを有する融合タンパク質はまた、望まれ得る。
【００２６】
本発明のスクリーニングアッセイは、Ｓ６キナーゼ活性を測定する特定の方法のいずれかに限られない。Ｓ６キナーゼアッセイは当業者に既知である（たとえば、ＵＳＰＮ６，３７２，４６７参照、出典明示により本明細書の一部とする）。簡潔に述べると、Ｓ６キナーゼを、好適な基質、たとえばＳ６と、Ｓ６のリン酸化が可能なバッファー中でインキュベートする。基質のリン酸化を、標識化リン酸基を使用して、たとえばバッファー中のＡＴＰ源として存在する放射性標識３２Ｐを使用し、検出することができる。あるいは、Ｓ６Ｋ酵素活性のリン酸化産物に特異的な抗体を、活性を測定するために使用することができる。当業者には明らかであるとおり、該アッセイは、機械化および自動化方法を使用して、容易にハイスループット技術を利用することができる。
【００２７】
あるいは、Ｓ６キナーゼ活性を合成基質、たとえばＡｒｇ−（Ａｒｇ）−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘ（たとえば、ＫＲＲＲＬＡＳＬＡＡまたはＫＲＲＲＬＳＳＬＲＡＳＴＳＫＳＥＳＳＱＫ）を含むものを使用してアッセイすることができる（Flowtow and Thomas (1992) J. Biol. Chem. 267： 3074-3078）。
【００２８】
Ｓ６Ｋ活性を、該キナーゼの下流標的を検出することによってアッセイすることもできる。たとえば、Ｓ６Ｋは、特異的標的、たとえばポリピリミジン部分を有する遺伝子（５’ＴＯＰ）およびリボソーム遺伝子の、転写および翻訳に影響を及ぼすことが知られている。（Fumagalli S, Thomas G. (1999) Ribosmal Protein S6 Phosphorylation and Signal Transduction. In： Translational Control. Eds. Hershey, J, Mathews, M, Sonenberg, N. Cold Spring Harbor Press. pp 695-717）。
【００２９】
したがって、本発明のさらなる局面においてＳ６Ｋ遺伝子またはＳ６Ｋ制御配列の制御下で発現される遺伝子の発現を調節する化合物を同定することによる、インシュリン抵抗性を処置するのに有効な薬剤をスクリーニングするための方法が提供される。
【００３０】
かかる方法は、好ましくは細胞中で、転写的に活性な細胞内容物を、プロモーター配列と作動可能に連結したＳ６Ｋ遺伝子をコード化する核酸またはレポーター遺伝子と作動可能に連結したＳ６Ｋプロモーター配列（またはレポーター遺伝子の発現を可能にする他のＳ６Ｋ制御領域）と、少なくとも１種の化合物の存在下で接触させること；そして、該化合物の、Ｓ６キナーゼ発現またはレポーター遺伝子発現であるコード領域の発現に対する効果を検出することを含む。Ｓ６キナーゼの発現を、転写レベルで（たとえば、特異的プローブを使用したハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによって）、またはタンパク質レベルで（たとえば、抗体を使用して）検出することができる。Ｓ６キナーゼ発現またはプロモーター活性における減少または増加は、インシュリン抵抗性を処置するのに有効な薬剤の指標である。かかるアッセイは、該転写的に活性な細胞内容物および核酸が細胞中に存在する細胞に基づくアッセイであり得るが、インビトロ転写アッセイも当該技術分野で既知である。好ましい態様において、該Ｓ６キナーゼはＳ６キナーゼ１である。
【００３１】
該レポーター遺伝子は、検出可能な変化を提供することが可能な任意の分子をコード化する。かかるレポーター分子には、蛍光部分（たとえば、蛍光タンパク質、たとえばシアン蛍光タンパク質、ＣＦＰ；黄色蛍光タンパク質、ＹＦＰ；青色蛍光タンパク質、ＢＦＰ；または緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ；全て商業的に入手可能、Clontech Living Colors User Manual）、抗原、レポーター酵素などが含まれる。レポーター酵素には、限定するものではないが、下記のものが含まれる：β−ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、グルコロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、レダクターゼ、デアミナーゼ、カタラーゼおよびウレアーゼ。本発明の方法で使用するためのレポーター分子の選択において、該レポーター分子それ自体は、あらゆる推定される薬剤またはスクリーニングアッセイ中に存在する他の成分によって不活性化されるべきではなく、これには該アッセイ混合物中に存在する任意のプロテアーゼ活性による不活性化を含む。適当なレポーター分子の選択は、当業者には容易に明らかとなるであろう。
【００３２】
該核酸は典型的には、様々な細菌、酵母、および哺乳類細胞について知られているとおり、１種以上の選択された宿主細胞中で、複製を行うことができるベクター中で提供される。たとえば、様々なウイルス性種（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が、哺乳類細胞におけるクローニングベクターとして有用である。該ベクターはたとえば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、ファージ、あるいは細胞によって取り込まれ、興味のある配列あるいはレポーター遺伝子を発現するために使用される、任意の他の好適なベクターまたは構築物の形態であり得る。
【００３３】
発現ベクターは通常、ｍＲＮＡ合成を指示するために、興味のある核酸配列をコード化するタンパク質と作動可能に連結したプロモーターを含む。様々な潜在的な宿主細胞によって認識されるプロモーターが既知であり、Ｓ６Ｋ１およびＳ６Ｋ２プロモーター（上流制御配列）も同様である。“作動可能に連結した”とは、同じ核酸分子の一部として結合し、該プロモーターから開始されるべき転写に関して、好適に配置され、かつ配向していることを意味する。プロモーターと作動可能に連結したＤＮＡは、該プロモーターの“転写制御下”にある。哺乳類宿主細胞中のベクターからの転写は、たとえば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（たとえばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリサルコーマウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、肝炎Ｂウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスの遺伝子から、異種哺乳類プロモーター、たとえばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、そして熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御され、ただし、かかるプロモーターは宿主細胞系に適合可能である。本発明の発現ベクターはまた、１種以上の選択遺伝子、たとえば抗生物質または他の毒素に耐性を付与する遺伝子を含み得る。
【００３４】
本発明の方法は、したがって、さらに該核酸を宿主細胞中に導入することを含む。限定するものではないが一般的に（とりわけインビトロ導入について）“形質転換”と呼ばれ得る該導入は、あらゆる利用可能な技術を使用することができる。真核細胞について、好適な技術には、カルシウムリン酸トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム介在トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは当業者に既知の他のウイルス、たとえば痘疹を使用した形質導入が含まれ得る。たとえば、Keown et al., Methods in Enzymology, 185：527 537 (1990) and Mansour et al., Nature 336：348-352 (1988)参照。
【００３５】
本明細書に記載の発現もしくはクローニングベクターでトランスフェクションまたは形質転換された宿主細胞は、常套の栄養培地中で培養し得る。培養条件、たとえば培地、温度、ｐＨ等は、過度の実験なしに当業者によって選択され得る。一般的には、原則として、細胞培地の生産性を最大化するためのプロトコル、および実施技術は、“Mammalian Cell Biotechnology： a Practical Approach”, M. Butler, ed. JRL Press, (1991) and Sambrook et al, supraに見出すことができる。
【００３６】
Ｓ６Ｋ１に特異的なアッセイはまた、特異的なタンパク質、たとえば当業者に既知の、ネラビンとＳ６Ｋ１のＣ末端ドメインの結合を検出することによって設計され得る（Burnett PE, Blackshaw S, Lai MM, Qureshi IA, Burnett AF, Sabatini DM, Snyder SH. Neurabin is a synaptic protein linking p70 S6 kinase and the neuronal cytoskeleton. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Jul 7;95(14)：8351-6）。
【００３７】
したがって、本発明の他の態様において、Ｓ６Ｋ１と結合パートナーの相互作用の阻害が評価される。これは（ｉ）Ｓ６Ｋ１をその結合パートナーと試験物質の存在下および不存在下で接触させること；そして（ｉｉ）試験物質の存在がＳ６Ｋ１とその結合パートナーとの相互作用を阻害するか否かを決定することを含み得る。
【００３８】
ポリペプチドと結合パートナーとの間の相互作用を評価する方法は、当業者に既知のあらゆる方法であり得、ここで開示される。これらの方法のいずれかは、試験物質がポリペプチド（この場合はＳ６Ｋ１）と結合パートナーの間の相互作用を阻害するか否かを評価するために使用できる。
【００３９】
１つの態様において、アッセイはＳ６Ｋ１およびネウラビンとのその相互作用に基づくものであり、そして該試験物質がＳ６Ｋ１とネウラビンとの間の相互作用を阻害するか否かを決定する工程を含む。これはＳ６Ｋ１とその組合せパートナーの物理的関連性を、検出可能な標識で標識化した一方と固体支持体に不動化した他方にそれを接触させることを通じて検出することによって、達成することができる。好適な検出可能標識には、３５Ｓ−メチオニンが含まれ、これは組み換え生産されたＳ６Ｋ１および／またはその結合パートナー中に組み込むことができる。該組み換え生産されたＳ６Ｋ１および／または結合パートナーはまた、抗体で標識化され得るエピトープを含む融合タンパク質として発現させることができる。あるいは、２重標識を、当業者に既知のように、たとえば放射性標識およびシンチラントを使用して、使用することができる。
【００４０】
一般的に、固体支持体に不動化したタンパク質は、固体支持体に結合するタンパク質に対する抗体を使用して、または自体公知の他の技術を介して不動化され得る。好ましいインビトロ相互作用は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはＨｉｓ６のようなタグを含む融合タンパク質を利用することができる。該タグは、親和性相互作用によって、たとえばグルタチオンアガロースビーズまたはＮｉ−マトリックス上でそれぞれ不動化することができる。
【００４１】
上記タイプのインビトロアッセイ形式において、推定される阻害剤化合物は、標識化されたＳ６Ｋ１、または不動化された結合パートナー、たとえば、場合によってはＧＳＴ結合パートナーもしくはＧＳＴ−Ｓ６Ｋ１と結合する結合パートナーの量を調節する能力を測定することによってアッセイし得る。これは、グルタチオン−アガロースビーズをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画することによって測定することができる。あるいは、該ビーズは結合していないタンパク質を除去するために洗浄し得、そして結合しているタンパク質の量を、たとえば好適なシンチレーションカウンターにおいて、存在する標識の量を計測することによって測定することができる。
【００４２】
あるいは、固体支持体に結合しており、Ｓ６Ｋ１または結合パートナーの一方に対して向けられている抗体を、ＧＳＴの位置で、該分子を固体支持体に結合させるために使用することができる。Ｓ６Ｋ１およびその結合パートナーに対する抗体を、それ自体公知の様々な方法で得ることができる。別の形態において、Ｓ６Ｋ１およびその結合パートナーの一方を、蛍光ドナー部分およびアクセプターで標識化されたその他で標識化することができ、これはドナーからの放出の減少が可能である。これは、本発明のアッセイを蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer）（ＦＲＥＴ）によって行う。この形態において、ドナーの蛍光シグナルはＳ６Ｋ１およびその結合パートナーが相互作用するときに変化する。相互作用を調節する候補阻害剤の存在は、ドナーの蛍光シグナルの量を増加させる。
【００４３】
ＦＲＥＴは当該技術分野において自体公知の技術であり、したがって正確なドナーおよびアクセプター分子、ならびにそれらをＳ６Ｋ１およびその結合パートナーと連結する方法は、文献への参照によって達成され得る。
【００４４】
好適な蛍光ドナー部分は、蛍光発生エネルギーを他の蛍光発生分子または化合物の他の部分に移動することが可能なものであり、そして限定するものではないが、クマリンおよびフルオレセイン、ロードルおよびローダミンのような関連する染色物質、レゾルフィン、シアニン染色物質、ビマン（bimane）、アクリジン、イソインドール、ダンシル染色物質、ルミノールおよびイソルミノール誘導体のようなアミノフタルヒドラジン、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン、およびエウロピウムとテルビウムの複合体、ならびに関連する化合物を含む。
【００４５】
好適なアクセプターには、限定するものではないが、クマリンおよび関連するフルオロフォア、フルオレセイン、ロードルおよびローダミンのようなキサンテン、レゾルフィン、シアニン、ジフルオロボラジアザインダセン、ならびにフタロシアニンが含まれる。
【００４６】
好ましいドナーはフルオレセインであり、そして好ましいアクセプターにはローダミンおよびカルボシアニンが含まれる。これらのフルオレセインおよびローダミン（Aldrich Chemical Company Ltd, Gillingham, Dorset, UKから入手可能である）のイソチオシアネート誘導体を、Ｓ６Ｋ１およびその結合パートナーを標識化するために使用することができる。カルボシアニンの結合について、たとえばGuo et al, J. Biol. Chem., 270; 27562-8, 1995参照。
【００４７】
本発明のアッセイはまた、インビボで行うことができる。かかるアッセイは、任意の好適な宿主細胞、たとえば細菌、酵母、昆虫、または哺乳類宿主細胞中で行うことができる。酵母および哺乳類宿主細胞がとりわけ好適である。かかるインビボアッセイを行うために、Ｓ６Ｋ１およびその結合パートナーを発現することができる構築物、ならびにレポーター遺伝子構築物を、細胞中に導入することができる。これは任意の好適な技術、たとえばカルシウムリン酸沈殿またはエレクトロポレーションによって達成され得る。該構築物は、一時的に、または安定なエピソームとして発現され得、あるいは宿主細胞のゲノムへと統合される。
【００４８】
インビボアッセイはまた、２−ハイブリッドアッセイの形態を取ることができる。２−ハイブリッドアッセイはFields and Song, 1989, Nature 340; 245-246によって開示されたものに従い得る。かかるアッセイにおいて、酵母ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）は、その相互作用が調査される第１および第２の分子にそれぞれ融合する。機能的ＧＡＬ４転写因子は、２つの興味ある分子が相互作用するときのみ復元される。したがって、該分子の相互作用は、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合部位と作動可能に連結したレポーター遺伝子の使用によって測定され得、これは該レポーター遺伝子の転写を活性化することが可能である。他の転写アクチベータードメインは、ＧＡＬ４ ＴＡＤ、たとえばウイルス性ＶＰ１６活性化ドメインの位置で使用され得る。
【００４９】
使用するアッセイの形態と関係なく、それらは典型的には当業者に常用される好適な対照で行い、そして好ましくは小分子ライブラリー、ペプチドライブラリー、ファージディスプレーライブラリーまたは天然産物ライブラリーに存在し得る化合物をスクリーニングするために使用される。推定のもしくは実際の阻害剤または他の調節剤は、スクリーニングすることが望まれている任意の供給源から提供され得、そして天然に存在しても合成であってもよく、そしてペプチドまたはポリペプチド（たとえば抗体）または核酸（たとえばｓｉＲＮＡ）であってもなくてもよい。治療的適用に最も適している好ましい阻害剤は、現在当業者に既知のようなコンビナトリアルライブラリーに由来する小分子である（たとえばNewton (1997) Expert Opinion Therapeutic Patents, 7(10)： 1183-1194参照）。好ましい候補物質には、ＰＫＣ阻害剤のような小分子が含まれ得る。
【００５０】
Ｓ６Ｋ活性の化合物誘導調節は、該化合物が存在しないときと比べて該化合物の存在下で、Ｓ６Ｋ活性（酵素活性、下流標的へのシグナル伝達活性、プロモーター活性または発現）における変化が存在することを意味する。とりわけ、Ｓ６Ｋ活性の阻害を誘導する化合物は、該化合物が存在しないときと比べてＳ６Ｋ活性における減少によって反映される。逆に、Ｓ６活性の活性化を誘導する化合物は、Ｓ６Ｋ活性における増加によって反映される。
【００５１】
アクチベーターおよび阻害剤は本明細書中において、まとめて調節剤と呼び、そして好ましくはＳ６Ｋのキナーゼ活性に直接影響する。再構成した要素を使用して行うアッセイは、直接Ｓ６Ｋ阻害（すなわち、Ｓ６Ｋ触媒活性の選択的阻害、およびたとえばｍＴＯＲの作用を介する活性キナーゼの形態の非阻害）を達成するために容易に設計することができる。典型的には、Ｓ６キナーゼ１活性は、とりわけＳ６キナーゼ１シグナル伝達の阻害のとき選択的に（すなわち、Ｓ６キナーゼ２活性および他のキナーゼおよび酵素に選択的に）阻害され、そしてインシュリン抵抗性または糖尿病の処置が望まれる。あるいは、Ｓ６キナーゼ２活性が同じ目的で特異的に活性化される。
【００５２】
Ｓ６Ｋ阻害剤はＳ６Ｋ活性、たとえば、Ｓ６Ｋ１またはＳ６Ｋ２活性を減少させる化合物である。たとえば、Ｓ６Ｋ酵素活性を阻害する化合物は典型的には、Ｓ６ＫにおけるＡＴＰ結合部位に結合するかまたは、Ｓ６Ｋの触媒ドメインに結合する。該化合物は選択的に、Ｓ６Ｋ２または他のＳ６Ｋアイソフォームと比較してＳ６Ｋ１を阻害し、これはＳ６Ｋ１とＳ６Ｋ２ノックアウトマウスの間に観察される表現型の差異を与える。したがって、Ｓ６Ｋ２またはＳ６Ｋ１とＳ６Ｋ２の両方を阻害する化合物（たとえばラパマイシン、その誘導体または他のｍＴＯＲ阻害剤）は有用であり得るが、インシュリン抵抗性または糖尿病の処置のためにはＳ６Ｋ１の選択的阻害が望まれる。したがって、Ｓ６Ｋ１阻害剤は典型的には、Ｓ６Ｋ２活性の減少レベルと比較して、Ｓ６Ｋ１活性を少なくとも１０％、より好ましくは２０％、５０％、１００％および２００％減少させる。対照アッセイは、したがって、たとえば免疫沈降されたＳ６Ｋ２で行い、そして調節剤の選択性を確立するために免疫沈降されたＳ６Ｋ１と比較する。
【００５３】
本発明のスクリーニング法は所望により、さらに機能アッセイを含み、これはインシュリン抵抗性に対する効果を検出することを含む。好適な方法は、下記の実施例に記載されている。
【００５４】
該スクリーニング法は、所望により、潜在的な調節剤をＳ６キナーゼ遺伝子を有する非ヒト動物に投与する工程、そしてインシュリン抵抗性が、該化合物が存在しないときと比べて影響を受けるか否か、たとえば動物の高脂肪食餌におけるインシュリン感受性に対する効果を測定する工程を含み得る。非ヒト動物は典型的には、マウスまたはラットのような実験用哺乳類であり、様々な投与量を、食物と混合して経口的に、または任意の他の好適な方法によって投与することができ、これは、化合物の性質、たとえば安定性および標的送達に基づいて選択され得る。Ｓ６キナーゼ遺伝子は、実験用哺乳類として異なる種に由来し得、たとえば、マウスＳ６Ｋ遺伝子を置換したヒトＳ６Ｋ遺伝子を含むマウスの使用は、ヒト対象を使用することなくヒトＳ６Ｋに対する薬剤の効果を測定するためにとりわけ有用である。
【００５５】
Ｓ６Ｋ１の阻害に対する化合物の能力および効果を、インシュリン抵抗性について動物モデルを使用し、そしてＳ６Ｋ１ノックアウト動物と比較して評価することができる。
【００５６】
かかる化合物のスクリーニングに有用なキットは、本発明においてまた製造され得、そしてスクリーニングに有用なＳ６Ｋまたはそのフラグメント、および指示書を本質的に含む。典型的には、該Ｓ６Ｋポリペプチドは、Ｓ６Ｋ活性を測定する方法と共に、少なくとも１種の化合物（推定される薬剤）または該スクリーニング法を行うのに有用である本明細書に記載の他の物質を提供する。
【００５７】
本発明のキットにおいて使用するためのＳ６Ｋは、たとえば溶液、懸濁液、または凍結乾燥中のタンパク質の形態で、あるいは、Ｓ６Ｋまたはそのフラグメントの生産が発現系内で、所望によりインサイチュで、可能な核酸配列の形態で、提供され得る。
【００５８】
化合物（たとえば、推定される薬剤）は、無機および有機、たとえば抗生物質、抗体、ポリペプチドまたはペプチドであり得、そして典型的には、単離されまたは精製されている。“単離された”または“精製された”組成物は、実質的に細胞物質またはそれが由来する細胞もしくは組織源からの他の汚染タンパク質を含まず、あるいは、化学的に合成されるときには実質的に化学的前駆体または他の化学物質を含まない。実質的に細胞物質を含まないポリペプチドには、それが単離された細胞の細胞内容物からポリペプチドが分離されているポリペプチドの製造が含まれ、たとえば該ポリペプチドは組み換えによって生産される。好ましくは、治療化合物、たとえばＳ６Ｋ阻害剤の製造は、生産物の乾燥重量の少なくとも７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９８％、そして最も好ましくは９９または１００％である。化合物の混合物はまた、スクリーニングの初期段階で試験され得る。
【００５９】
したがって化合物は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含み得、結合することができるポリペプチドと、それが結合親和性を有さないまたは実質的に有さない（たとえば、少なくとも約１０００倍低い結合親和性）同一種の他のポリペプチドの間で区別することが可能であるという意味で、Ｓ６Ｋ、とりわけＳ６Ｋ１に特異的である。特異的抗体は、他の分子に存在しないかまたは接近できない分子のエピトープと結合する。たとえば、アイソフォーム特異的阻害について（Ｓ６Ｋ２活性に対するＳ６Ｋ１の選択的阻害）、該抗体は、Ｓ６Ｋ１とＳ６Ｋ２の間で高度に保存されていない、Ｓ６ＫのＣ末端ドメインと干渉し得る。抗体は当該分野で標準である技術を使用して得ることができる。たとえば、抗体は、当業者に既知の様々な技術のいずれかを使用して免疫化した動物から得ることができ、そして好ましくは抗体と興味のある抗原の結合を使用してスクリーニングする。たとえば、ウェスタンブロッティング技術または免疫沈降が使用され得る（Armitage et al, Nature, 357：80-82, 1992）。
【００６０】
ペプチドで免疫化した哺乳類に代わり、または補助的に、タンパク質に特異的な抗体を発現された免疫グロブリンの可変ドメインの組み換え生産ライブラリーから、たとえばそれらの表面に機能性免疫グロブリン結合ドメインを示しているλバクテリオファージまたは糸状バクテリオファージを使用して、得ることができる；たとえばＷＯ９２／０１０４７参照。
【００６１】
抗体はいくつかの方法で修飾され得、そして抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能的等価物および相同体を含み、これには合成分子およびその形が抗原またはエピトープと結合し得る抗体のそれを模倣している分子が含まれる。抗原または他の結合パートナーと結合することができる抗体フラグメントの例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣｌおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｂフラグメント；抗体の１つのアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；単離されたＣＤＲ領域およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントである。１本鎖Ｆｖフラグメントも含まれる。
【００６２】
親非ヒト抗体よりも免疫原生が少ない抗体を得るために、非ヒト供給源由来のＣＤＲを、典型的にはフレームワークアミノ酸残基のいくつかの改変を有する、ヒトフレームワーク領域に接いだヒト化抗体も、本発明に含まれる。
【００６３】
当業者には明らかであるとおり、モノクローナル抗体は、元の抗体の特異性を残した他の抗体またキメラ分子を生産するための組み換えＤＮＡ技術の技法に付し得る。かかる技術には、異なる免疫グロブリンの、定常領域または定常領域とフレームワーク領域に対する抗体の、免疫グロブリン可変領域、もしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）をコード化するＤＮＡを導入することを含む。たとえば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ−Ａ−２１８８６３８またはＥＰ−Ａ−０２３９４００参照。キメラ抗体のクローニングおよび発現をＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３において記載している。
【００６４】
ペプチドはまた、さらに新規阻害剤を設計するために使用され得る、推定される自己阻害ドメイン（Ｓ６キナーゼ１残基４００−４３２； Flowtow and Thomas, 1992）または実際、上記合成基質（たとえば、Ｓ６ ２３０〜２４９、Ａｌａ２３５）を含む合成ペプチドのような、Ｓ６Ｋ活性の阻害剤として、使用され得る。
【００６５】
あるいは、細胞中のＳ６Ｋ活性は、核酸を使用して、たとえば転写前または後サイレンシングによって、減少させることができる。したがって、Ｓ６Ｋ配列（とりわけＳ６Ｋ１に特異的な配列）を、上記ベクター中に、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムを生産するために、アンチセンス方向で、挿入することができる。
【００６６】
Ｓ６Ｋ２に対してＳ６Ｋ１に選択的な核酸配列には、アミノ酸３３〜７７およびアミノ酸４５４〜５２５（番号はＵＳ２００３／００８３２８４における配列番号３のものを参照する、出典明示により該文献を本明細書の一部とする）またはその一部が含まれ、これは典型的には、少なくとも１５、１８またはそれ以上のヌクレオチド長である。配列比較は、本質的には上記のとおり、ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＰ（Pearson ＆ Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183： 63-98参照）を使用して該配列の特異性を確立することで、行うことができる。
【００６７】
アンチセンスの代替物は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用することであり、これはアンチセンス単独よりも遺伝子サイレンシングにより有効であることが発見されている（Fire A. et al  Nature, Vol 391, (1998)）。ｄｓＲＮＡ介在サイレンシングは、遺伝子特異的であり、そしてしばしばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる（Fire (1999) Trends Genet. 15： 358-363, Sharp (2001) Genes Dev. 15： 485-490, Hammond et al. (2001) Nature Rev. Genes 2： 1110-1119 and Tuschl (2001) Chem. Biochem. 2： 239-245も参照）。
【００６８】
ＲＮＡ干渉は、２段階プロセスである。第１に、ｄｓＲＮＡが細胞中で切断されて、５’末端リン酸および３’短オーバーハング（〜２ｎｔ）を有する約２１〜２３ｎｔ長の短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が得られる。ｓｉＲＮＡは、破壊に特異的な対応するｍＲＮＡ配列を標的にする（Zamore P.D. Nature Structural Biology, 8, 9, 746-750, (2001)）。したがって、ある態様において、阻害は、たとえば２本鎖ＲＮＡであり得るＳ６Ｋコード化配列を含む２本鎖ＲＮＡ、とりわけＳ６Ｋ１に選択的な配列（これはたとえば上記のとおり、ｓｉＲＮＡに処理される）を使用して達成される。ＰＫＲ経路のような細胞性防御機構を、典型的には、個々の成分に向かっているｓｉＲＮＡを使用して、回避する必要があるだろう。これらのＲＮＡ産物は、インビトロで、たとえば常套の化学合成法によって、合成され得る。
【００６９】
しかし、ＰＫＲ経路を回避するために、３’オーバーハング末端を有する約２１〜２３ヌクレオチド長の化学的に合成されたｓｉＲＮＡ２本鎖が、好ましくは使用される（Zamore PD et al  Cell, 101, 25-33, (2000)）。合成ｓｉＲＮＡ２本鎖は、哺乳類細胞株の広い範囲の内因性および異種遺伝子の発現を特異的に抑制することが示されている（Elbashir SM. et al. Nature, 411, 494-498, (2001)）。
【００７０】
したがって、Ｓ６Ｋ２に対してＳ６Ｋ１に選択的な配列の、２０〜２５ｂｐ、より好ましくは２１〜２３ｂｐを含むｓｉＲＮＡ２本鎖は、たとえば合成的に、所望により、分解を防ぐために保護された形態で生産されるような、本発明の１つの形態の局面を含む。
【００７１】
あるいは、ｓｉＲＮＡを、インビトロ（回収および使用のために）またはインビボで、ベクターから生産することができる。したがって、該ベクターは、当業者に既知のいずれかの方法において、たとえば、本明細書に記載のいずれかの参考文献（参照により、具体的に本明細書の一部とする）に記載のとおりに、ｓｉＲＮＡを細胞中に導入するのに好適な、Ｓ６Ｋをコード化する核酸配列（その変異体またはフラグメントをコード化する核酸配列を含む）を含み得る。
【００７２】
１つの態様において態様、該ベクターは本発明に記載の核酸配列を、センスおよびアンチセンスの両方向で含み得、ＲＮＡとして発現されるとき、センスおよびアンチセンス部分は結合して２本鎖ＲＮＡを形成する。これは、たとえば、長い２本鎖ＲＮＡ（たとえば２３ｎｔより長い）であり得、インビトロでダイサー（Dicer）で処理してｓｉＲＮＡ（たとえばMyers (2003) Nature Biotechnology 21：324-328参照）またはｓｉＲＮＡ、ヘアピン構造を生産することができる。あるいは、該センスおよびアンチセンス配列は、異なるベクター上で提供される。これらのベクターおよびＲＮＡ産物は、たとえば細胞中のＳ６Ｋポリペプチドの新規生産を阻害するために有用である。かかる核酸およびベクターは、宿主細胞中へ導入され得、または哺乳類へ好適な形態で投与され得る。
【００７３】
したがって、ｓｉＲＮＡのような核酸を、Ｓ６Ｋ１活性を阻害するために投与することができる。ｓｉＲＮＡ技術は、Ｓ６Ｋ１に特異的な配列、たとえばＡＧＴＧＴＴＴＧＡＣＡＴＡＧＡＣＣＴＧまたは好ましくはＡＡＧＧＧＧＧＣＴＡＴＧＧＡＡＡＧＧＴＴＴに基づいて日常的に適用され得る。ｓｉＲＮＡの標的化された発現は、脂肪組織、筋肉、肝臓またはインシュリン抵抗性およびグルコース恒常性を仲介する他の組織に特異的なプロモーターのような組織特異的プロモーターを使用して達成することができる。
【００７４】
しかし、投与の簡便のため、該化合物は好ましくは、触媒部位またはＡＴＰ結合部位と結合することのできる小分子である。アイソフォーム特異的阻害のために、該化合物は、Ｓ６Ｋ１とＳ６Ｋ２との間で高度に保存されていない、Ｓ６ＫのＣ末端ドメインで干渉し得る。
【００７５】
潜在的なＳ６Ｋ調節剤を改善するために、単離されたＳ６Ｋを全体のタンパク質の２次もしくは３次構造または少なくとも酵素活性に関与する領域を確立するために使用することができる。該３次構造の同定のための常套の方法は、たとえば、Ｘ−線試験またはＮＭＲ試験である。これらから得られるデータまたは比較方法は、Ｓ６Ｋの調節剤の同定または改善、たとえばＳ６Ｋ１とＳ６Ｋ２の間の選択性を提供するために、直接または間接的に使用され得る。この観点において一般的に使用される方法は、たとえば、コンピューター支援薬剤デザインまたは分子モデリングである。
【００７６】
本発明の化合物は、上記技術を使用したスクリーニングによって同定することができ、そして、天然の、または確立された方法によって遺伝的に修飾された供給源から抽出することによって、またはとりわけ低分子量化学化合物の場合には合成によって、製造される。タンパク性化合物を、組み換え発現系、たとえばバキュロウイルス系中で、または細菌系中で、発現させることによって製造することができる。タンパク性化合物は主に、シグナル伝達経路の機能を調査するために有用であるが、それらはＳ６キナーゼ１に対するヒト化阻害抗体のような治療適用を有し得る。
【００７７】
低分子両化合物は、一方で、確立された方法による化学合成によって製造される。それらは主として治療剤として示される。ＰＫＣ阻害剤、またはその誘導体もしくは修飾体は、Ｓ６Ｋ１を選択的に阻害するのに、そしてインシュリン抵抗性または糖尿病を処置するのに有効な潜在的な薬剤として使用することができる。低分子両化合物および有機化合物は一般的に、インシュリン抵抗性または糖尿病の処置に使用するための薬剤として有用であり得る。
【００７８】
本発明はまた、インシュリン抵抗性を減少させるための方法であって、細胞、とりわけ筋細胞、含脂肪細胞および／または肝細胞を有効量のＳ６キナーゼ１阻害剤と接触させることを含む方法を提供する。したがって、本発明はまた、インシュリン抵抗性および糖尿病の処置において使用するためのＳ６キナーゼ活性を直接調節する化合物を提供する。とりわけ、インシュリン抵抗性または糖尿病を有するかまたは進行のおそれがある個体の処置において使用するための、Ｓ６Ｋ２活性に対してＳ６キナーゼ１活性を選択的に阻害する化合物（たとえば、Ｓ６Ｋ２の阻害をもたらすであろうｍＴＯＲの阻害剤（好ましくは回避される）ではない）を提供する。
【００７９】
本明細書において使用するとき、糖尿病は、脂肪蓄積から、または高い循環脂肪酸からもたらされる肥満または体重過剰状態からもたらされる、ＩＩ型糖尿病を意味する。したがって、減少した膵臓β細胞に帰着する状態よりもむしろ、高脂肪食からもたらされるインシュリン抵抗性または糖尿病が意図される。
【００８０】
インシュリン抵抗性または糖尿病を処置において使用するためのＳ６Ｋ調節剤（たとえば阻害剤）は、調整剤の正確な性質に依存して、常套の方法論にしたがった医薬として製剤され得、そして典型的には該調節剤またはその前駆体を、生物学的に許容される担体と共に含んでなる。様々な治療を考慮すると、かかる治療が、Ｓ６Ｋ１の発現を示す組織、とりわけ脂肪組織、肝臓および筋肉を標的とし得ることが理解される。
【００８１】
化合物は治療的に有効な投与量で投与される。“治療的に有効な量”なる用語は、本明細書において使用するとき、その量の化合物（複数も可）または医薬組成物が組織、系、動物またはヒトにおいて、利益のある生物学的、医薬的反応を誘発させることを意味する。たとえば、Ｓ６Ｋ１阻害化合物の治療的に有効な量は、インシュリン抵抗性または糖尿病において臨床的に検出可能な改善を導く量である。
【００８２】
処置には、インシュリン抵抗性の症状を軽減する目的での個体の管理または治療が含まれる。処置には、障害の症状または合併症の発生の予防、症状または合併症の軽減、あるいは状態または障害の除去のための、化合物の投与が含まれる。
【００８３】
該調節剤の影響を受けている細胞および組織への送達は、適切なパッケージまたは投与系を使用することで達成され得る。たとえば、該調節剤は、医薬投与のために許容される薬剤と、治療的に使用するために製剤され得、そして対象に、所望の生理的な効果を生み出すために許容される経路によって、送達され得る。有効量は、所望の生理的な効果、たとえば減少したインシュリン抵抗性およびＩＩ型糖尿病を生み出す量である。
【００８４】
本発明のさらなる局面において、本発明はまた、インシュリン抵抗性または糖尿病の処置または予防的処置用医薬の製造のための、調節剤（たとえばＳ６キナーゼ１の選択的阻害剤）を提供する。好適な調節剤、とりわけ阻害剤、たとえば機能もしくは上記他のアッセイにおいて同定されたものを、たとえばさらなる毒性についての試験の後に、医薬へと導入することができる。したがって、対応する方法は、疾患用医薬として選択された調節剤、たとえばインシュリン抵抗性または糖尿病を制御することが望まれているものを、製剤する工程をさらに含み得る。これらの疾患の処置において使用するためのかかる阻害剤および医薬は、そしてそれらの使用を含む処置法は、さらなる本発明の局面を形成する。  
【００８５】
上記構成要素にくわえて、該組成物は、薬学的に許容される賦形剤、保存剤、可溶化剤、増粘物質、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、浸透圧を変化させるための塩、バッファー、またはコーティング剤を含む。かかる物質は、無毒であるべきであり、そして有効成分の効果と干渉するべきではない。担体または他の物質の正確な性質は、投与経路に依存し得る。技術およびプロトコルの例は、“Remington's Pharmaceutical Sciences”, 16th edition, Osol, A. (ed.), 1980）において見ることができる。
【００８６】
該組成物が医薬組成物へと製剤されると、その投与は、経口、経鼻（たとえば経鼻スプレーの形態で）または直腸（たとえば座薬の形態で）的のような経腸的(parentally)に達成され得る。しかし、投与はまた、筋肉内、静脈内、皮膚、皮下、または腹腔内のような（たとえば注射溶液の形態で）非経腸的に達成され得る。
【００８７】
したがって、たとえば、該医薬組成物が錠剤の形態であるとき、ゼラチンまたはアジュバントのような固体担体を含み得る。錠剤、コーティング錠、糖衣錠および硬ゼラチンカプセル剤の製造のために、該活性化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩が、薬学的に不活性な、無機または有機賦形剤と共に処理され得る。ラクトース、トウモロコシ、デンプンまたはそれらの誘導体、タルク、ステアリン酸またはその塩等が、たとえば錠剤、糖衣錠および硬ゼラチンカプセル剤のためのかかる賦形剤として使用され得る。軟ゼラチンカプセル剤のための賦形剤は、たとえば、植物油、ワックス、脂肪、半個体および液体ポリオール等である。該組成物が液体医薬組成物の形態であるとき、一般的に、液体担体、たとえば水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油が含まれる。生理食塩水溶液、デキストロースまたは他のサッカライド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのようなグリコール類も含まれ得る。溶液およびシロップ剤の製造のための他の好適な賦形剤は、たとえば、水、ポリオール、サッカロース、転化糖、グルコース、トレハロース(trihalose)等である。注射溶液のための好適な賦形剤は、たとえば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油等である。静脈内、皮膚もしくは皮下注射、または脳へのカテーテル内輸液のため、該有効成分は、ピロゲンを含まない、そして好適なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経腸的に許容される水溶液の形態中にある。当業者は、たとえば、等張ビークル、たとえば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、乳酸加リンガー注射液を使用して、好適な溶液を製造することが十分可能である。保存剤、安定化剤、バッファーおよび／または他の添加物は、所望により含まれ得る。
【００８８】
また、糖尿病およびインシュリン抵抗性のための処置を評価する方法を提供し、該方法は、治療剤（たとえば本発明において提供されるスクリーニング法によって同定された）を、Ｓ６キナーゼ遺伝子、とりわけＳ６Ｋ１を含む非ヒト動物に投与し、そして該薬剤のインシュリン抵抗性に対する効果を測定することを含む。あるいは、脂肪、筋肉もしくは肝臓組織、または末梢血のようなサンプルを、採取し、Ｓ６Ｋに対する調節効果を確立するためのＳ６Ｋレベルまたは活性レベルについて試験することができる。
【００８９】
さらに、インシュリン抵抗性または糖尿病のための処置を評価する方法であって、潜在的な治療剤を、Ｓ６キナーゼ欠損（たとえばノックアウト動物）、とりわけＳ６Ｋ１欠損非ヒト動物に投与すること、そして該薬剤の効果を測定することを含む方法。かかる方法は、同定された治療剤の望ましくない何らかの副作用が存在するか否かを確立するために使用することができる。
【００９０】
本発明は、高脂肪食を与えられた野生型マウスが著しくＳ６Ｋ１活性を上昇させるということを示す（実施例９参照）。したがって本発明はまた、インシュリン抵抗性または糖尿病に対する素因を診断する方法であって：個体からサンプルを得ること、サンプル中のＳ６キナーゼ、好ましくはＳ６キナーゼ１のレベルを検出すること、そして正常対照値または値の範囲と比較したときのサンプル中のＳ６キナーゼの量の変化を、インシュリン抵抗性または糖尿病に対する素因と相関させることを含んでなる方法を提供する。Ｓ６キナーゼの存在は、抗体を使用して、または上記活性アッセイを使用して、容易に測定され得る。Ｓ６Ｋ発現はまた、転写レベルで、たとえばＰＣＲ技術を使用して、検出され得る。タンパク質レベルが検出されるとき、Ｓ６Ｋ１特異的測定が望まれるときには、Ｓ６Ｋ２に特異的な抗体を対照として使用することができる。一般的に、正常対照値または値の範囲と比較したとき、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％のＳ６キナーゼ１活性の増加は、インシュリン抵抗性または糖尿病に対する素因の指標である。最も好ましくは、活性の増加は少なくとも対照値のものより２倍より多い。該サンプルは、任意の組織サンプルまたは体液であり得るが、好ましくは脂肪、筋肉、または肝臓組織である。
【００９１】
Ｓ６Ｋ１（Ｓ６Ｋ２のような他のＳ６Ｋアイソフォームから独立している）のキナーゼ活性を測定するために、サンプルを試験対象から得る。該サンプル中に存在する細胞を、溶解し、タンパク質を抽出し得る。所望により、さらに、精製工程を行うことができる。該サンプルを、次いで、当業者に既知のＳ６Ｋ１特異的抗体を使用して免疫沈降させ得る。Ｓ６Ｋ１の免疫沈降後、標準キナーゼアッセイを上記のとおり行う。
【００９２】
本発明はさらに、説明の目的のみで、下記の実施例において記載される。
【実施例】
【００９３】
本明細書および実施例において言及されているが、明白には記載されていない分子遺伝学、タンパク質およびペプチド生化学、ならびに免疫学の方法は、科学文献において報告されており、当業者に既知である。たとえば、遺伝子工学において標準的な方法は、本質的に、Sambrook et al., Molecular Cloning： A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989において記載のとおりに行う。
【００９４】
実施例１：Ｓ６Ｋ１欠損マウスは野生型よりも小さい。
Ｓ６Ｋ１欠損マウスは、胚発生の間体の大きさの減少を有することは以前に示されていたが、その影響は成体になるまでにほとんど克服され１１週齢で２０から１５％に減少すると考えられていた。本実施例は、それらの加齢のために、Ｓ６Ｋ１欠損マウスが野生型マウスと比べてより低い体重を維持することを示す。通常食餌（ＮＣＤ、全カロリーの４％は脂肪に由来する、３０３５ｋｃａｌ／ｋｇ、 KLIBA-NAFAG, Switzerland）の雄マウスを、１０週齢から１７週間にわたって追跡する。
【００９５】
Ｓ６Ｋ１欠損マウスをＳｈｉｍａら（1998, EMBO J., 17, 6649-6659）の記載のとおりに生み出した。マウスをＣ５７ＢＩ／６および１２９Ｏｉａマウス株に由来するハイブリッドバックグラウンドで維持し、１２匹のグループで飼育し（３つのケージ中で）そして１２時間明／１２時間闇サイクル（０６：００ＧＭＴに点灯）で維持した。体重を、通常食餌を与えられた野生型（ｗｔ）とＳ６Ｋ１欠損マウスにおいて週毎に記録した。予期せぬことに、該結果は、Ｓ６Ｋ１−／−マウスの体重の増加が、野生型のものよりもよりゆっくりであり、１０週と比較したとき、２７週での体重の差は２５％に増加したことを示す。Ｓ６Ｋ１−／−マウスが野生型（ｗｔ）マウスと比較したとき、体重の偏差が少なかったことも注意するべきである。
【００９６】
実施例２：Ｓ６Ｋ１欠損マウスは体脂肪が減少した。
マウスを、実施例１に記載のＳ６Ｋ１欠損マウスによって示されるより低体重の原因を決定するために、解剖した。Ｓ６Ｋ１欠損マウスは腹腔内脂肪体をほとんど有さないことを示した。各脂肪質量および臓器質量を６月齢の雄マウスから除去した組織から秤量した。Ｓ６Ｋ１マウスの解剖は、野生型マウスと比べて、精巣上体白色脂肪組織脂肪の顕著な減少を示した（３．４％＋／−０．１％と比較して０．８％＋／−０．１％；値は平均値＋／−標準平均誤差；Ｓ．Ｅ．Ｍ）。褐色脂肪組織／体重の割合も、Ｓ６Ｋ１欠損マウスにおいて減少した（１．０＋／−０．１％と比較して０．５％＋／−０．０５％）が、一方で臓器の大きさには本質的には影響がなかった。同様の結果が雌マウスにおいても見られた。脂肪の減少は、肝臓または筋肉における脂肪の蓄積の選択的減少とは関係しなかった。
【００９７】
該結果は、Ｓ６Ｋ１−／−マウスが、野生型マウスと比べて白色体脂肪および褐色脂肪が減少したことを確立する。
【００９８】
実施例３：Ｓ６Ｋ１欠損含脂肪細胞はより小さい。
なぜＳ６Ｋ１欠損マウスがより少ない脂肪を示すのかを確立するために、脂肪組織切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、そして組織学顕微鏡を使用して２０倍で可視化した。Ｓ６Ｋ１欠損マウス由来の精巣上体白色脂肪組織（ＷＡＴ）および褐色脂肪組織は、野生型と比較したとき、より小さな細胞の大きさを示した。
【００９９】
電子顕微鏡の精査による、またはヘマトキシリン−エオシン染色のいずれかによる、精査精巣上体脂肪体における脂肪細胞の大きさの分析は、細胞の大きさの顕著な減少を示し、定量はＳ６Ｋ１−／−マウス由来の含脂肪細胞は野生型マウスのものよりも７１％小さいことを示し（ｗｔ：３１２９±９０４、ｎ＝３；Ｓ６Ｋ１−／−：９１８±１８９ｍｍ２、ｎ＝３、Ｐ＜０．０５）、多くの含脂肪細胞は多房性の表現型を示した。これらの試験はまた、細胞の大きさの分布は、体重のように、野生型マウスと比較して、Ｓ６Ｋ１−／−マウスにおいてより均一であったことを示し、そして細胞表面積対全重量の概算は、細胞数にほとんど影響がないことを示唆した。要約すると、電子顕微鏡、組織学、および細胞密度／大きさ分析の結果は、Ｓ６Ｋ１欠損動物における脂肪の減少は脂肪細胞の大きさの減少に起因することを確立する。
【０１００】
実施例４：食餌はＳ６Ｋ１欠損マウスのより少ない脂肪の原因ではない。
Ｓ６Ｋ１マウスが野生型マウスに対して食餌の差を示すか否か（これは、Ｓ６Ｋ１マウスにおける脂肪の減少を説明し得る）を確立するために、マウス１匹毎に摂取した食事を１日おきに１５日間、通常食または高脂肪食を使用して、測定した。通常食または高脂肪食のいずれで飼育したかに関わりなく、Ｓ６Ｋ１欠損マウスは野生型と同様に、同じ合計食物量を食べた（約４．６＋／−０．１ｇ食物／マウス／日）が、体重で比較すると、それらはより多く食べた（約１７％またはそれ以上、言い換えると０．１５ｇ食物／体重ｇ／日と比較して０．１８）。
【０１０１】
さらに、それらの細身の見かけにかかわらず、該マウスはグルコース恒常性が正常であるとおり、飢餓状態ではなく（下記表Ｉ）、これはケトン体形成の増加が存在しなかったという事実と一致した（野生型マウスについてＤ−β−ヒドロキシブチレート値１．３ｍｇ／ｄｌ±０．０５、ｎ＝８；Ｓ６Ｋ１−／−マウスについて１．４ｍｇ／ｄｌ±０．１、ｎ＝７；Ｐ＝０．８）。
【０１０２】
実施例５：Ｓ６Ｋ１欠損マウスは上昇した代謝速度を示す。
増えた食物摂取は、減少したＷＡＴと合わせて、上昇した代謝活性の可能性を高めた。Ｓ６Ｋ１欠損マウスおよび野生型マウスの代謝速度を酸素消費および二酸化炭素生産を１５分ごとに、８時間の絶食期間にわたって、オキシマックス（Ｏｘｙｍａｘ）（Columbus Instruments, Columbus, OH）を使用して観察して、間接熱量測定によって試験した。
【０１０３】
結果は、本試験を通して、野生型マウスに対してＳ６Ｋ１−／−マウスにおける酸素消費速度の２７％の顕著な増加を示す。呼吸交換速度の計算（ＲＥＲ＝Ｏ２消費に対するＣＯ２生産の速度）によって、野生型マウスについて０．７１３±０．００４、そしてＳ６Ｋ１−／−マウスについて０．７０９±０．００３；Ｐ＜０．０１の値を得、これは両動物がエネルギー源として脂肪酸を主に利用したことを立証る。
【０１０４】
代謝アッセイは下記のとおりに行った。血液を、一晩絶食の後、または一晩絶食の後の食事開始１時間後、眼窩洞後部（retroorbital sinus）から採取した。非エステル化脂肪酸、そしてトリグリセリドを酵素アッセイ（Boehringer-Mannheim, Germany）によって測定した。血漿レプチンを、ラットレプチンＲＩＡキット（Rat leptin RIA kit）（Linco Research, St Louis, MO.）を使用して測定した。結果を表Ｉに示す。血漿レプチンレベルは、体重と比べてマウスの食物の消費が増加し続けたが、Ｓ６Ｋ１−／−マウスにおいて顕著に減少した（表Ｉ）。
【０１０５】
表Ｉ    一晩絶食の後の、通常または高脂肪食を与えられた、６月齢の雄野生型マウスおよびＳ６Ｋ１欠損マウスの、食後１時間のインシュリン、トリグリセリド、遊離脂肪酸およびレプチンレベル
【表１】
2007503203.tif 000002
データは平均±ｓ．ｅ．ｍを示す。＊は、野生型と比較してＰ＜０．０５（ｎ＝６〜１８）。
Ｐ値は両側、対応なしスチューデントｔ−検定によって計算される。
【０１０６】
理論によって拘束されることを望むものではないが、脂肪組織重量の減少、代謝速度の上昇、そして体重で補正したとき、血漿トリグリセリドおよび遊離脂肪酸が遺伝型間で類似であることを考慮して（表Ｉ）、Ｓ６Ｋ１の不存在下において、脂肪組織中のトリグリセリドが急速に利用されたか、または遊離脂肪酸が決して貯蔵のために脂肪に到達せず、しかし急速に筋肉によって取り込まれ酸化されると結論付けられた。
【０１０７】
ＷＡＴは通常エネルギー消費組織ではないが、野生型マウスと比較したときＳ６Ｋ１−／−マウスにおける循環脂肪酸の基底レベルに差がないこと（表Ｉ）が、遊離脂肪酸がＷＡＴ中で直接酸化され得ることを示唆した。この仮説と一致して、電子顕微鏡は多くの多房性含脂肪細胞（これはミトコンドリアの大きさおよび数の劇的な増加を示し、野生型マウス由来の含脂肪細胞において全く存在しない表現型である）の存在を示した。その他は、ＷＡＴにおけるＵＣＰ１の過剰発現は同様の表現型を誘導し、そして定量実時間ＰＣＲによって測定されるＵＣＰ１レベルを、野生型マウス由来のＷＡＴと比較してＳ６Ｋ１−／−マウスに由来のＷＡＴにおいて劇的に上方制御したことを示す。
【０１０８】
実施例６：Ｓ６Ｋ１欠損マウスは上昇した基礎脂肪分解を示す。
脂肪組織におけるトリグリセリドの破壊（脂肪分解）を、成熟含脂肪細胞からの脂肪酸またはグリセロールのいずれかの放出を観察することによって測定した。初期の含脂肪細胞を精巣上体脂肪体からコラゲナーゼ消化によって本発明以前に記載のように製造した（Marette et al., 1991）。細胞を３０分、３７℃にて、様々な濃度（１０−８〜１０−５Ｍ）のノルエピネフリン（Sigma-Aldrich SARL, St-Quentin Fallavier, France）有りまたはなしで、インキュベートした。ノルエピネフリンはβ−アドレナリン性アゴニストであり、トリグリセリドのグリセロールおよび遊離脂肪酸への分解（脂肪分解）を刺激し、そして基礎代謝速度を上昇させる（熱発生)。精巣上体含脂肪細胞の細胞の大きさの減少にもかかわらず（実施例３参照）、結果は、脂肪酸放出の基礎速度が野生型マウスと比較したとき、Ｓ６Ｋ１−／−マウス由来の含脂肪細胞において約５倍高かったことを示した。脂肪酸放出の速度は、両遺伝型において、ノルエピネフリンの添加による用量依存法で増加し、同様の最大値を達成し、野生型マウスにおいてより急激に増加した。同様の結果がグリセロールの放出について得られた。したがって、Ｓ６Ｋ１−／−マウスは一部は基礎脂肪分解における鋭い増加のために、脂肪蓄積から保護されている。
【０１０９】
実施例７：Ｓ６Ｋ１欠損マウスは脂質生成の障害を示す。
脂肪分解のための成熟含脂肪細胞の単離の間に、前含脂肪細胞がＳ６Ｋ１−／−マウスの精巣上体にほとんど存在しないことが明らかとなった。このことは、含脂肪細胞がトリグリセリドを貯蔵できないことと共に、含脂肪細胞への分化のための、含脂肪細胞分化混合を使用した、Ｓ６Ｋ１−／−および野生型胚由来のマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）の能力を比較する実験を促した。
【０１１０】
簡潔に記載すると、含脂肪細胞分化は、本質的には野生型またはＳ６Ｋ１欠損マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）を使用した本発明以前の記載のとおりに誘導された（Hansen et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 2386-2393）。ＭＥＦの継代数は１代以内であった。分化のために、２日ポストコンフルエント細胞（０日目）を１μＭデキサメタゾン（Sigma）、０．５ｍＭメチルイソブチルキサンチン（Aldrich）、５μｇ／ｍｌインシュリン（Boehringer Mannheim）、およびシグリタゾン（Ciglitazone）（チアゾリンジオン、ＰＰＡＲアゴニスト：ＢＩＯＭＯＬ、ＧＲ−２０５、０．５μＭ）を含む成長培地で２日間処置した。２日目から、該培地は５μｇ／ｍｌインシュリンおよびシグリタゾンを含み、そして１日おきに交換した。オイルレッドＯ染色：オイルレッドＯ染色液（イソプロピルアルコール溶液−蒸留水（６０：４０）中の０．５％オイルレッドＯ）を濾過した。細胞をＰＢＳで洗浄し、３０分染色し、次いで蒸留水で２度洗浄した。Ｓ６Ｋ１における細胞欠損は、より少ない染色を示した。したがって、Ｓ６Ｋ１を欠くＭＥＦは、オイルレッドＯ脂肪染色の減少によって評価されるように、減少した脂質生成能を有し、これは、Ｐ２ ｍＲＮＡのより低いレベルと一致した。総合すると、該結果は、脂質生成の障害および脂肪の貯蔵ができないことのために、Ｓ６Ｋ１−／−マウスは減少したＷＡＴを有することを示唆する。
【０１１１】
実施例８：Ｓ６Ｋ１欠損マウスは食餌により誘発される肥満に対して保護されている。
Ｓ６Ｋ１−／−マウスの年齢と共に脂肪を蓄積しないことと併せて、それらの全体的な代謝速度の増加は、それらが食餌により誘発される肥満に対して保護され得ることを示唆した。この実施例において、体重を高脂肪食（ＨＦＤ、全カロリーの６０％が脂肪に由来する、４０５７ｋｃａｌ／ｋｇ、 Research diets, USA）を与えられた野生型およびＳ６Ｋ１欠損マウスにおいて、１週間毎に記録した。Ｓ６Ｋ１マウスが高脂肪食で飼育したとき、Ｓ６Ｋ１欠損マウスの絶対的な体重増加は、高脂肪食餌期間（７〜２７週齢）で１０．５ｇであり、それと比べて野生型マウスにおいては約１４．４ｇであった。ＮＣＤ（実施例１）での刺激と同様に、Ｓ６Ｋ１−／−マウスは、野生型マウスと比較して、ＨＦＤにおける体重の変化がわずかであることを示した。ノックアウトのより小さな体の大きさを考えると、相対的な体重増加は遺伝型間で類似であった（高脂肪食餌５ヶ月後、Ｓ６Ｋ１欠損マウスにおいて５８．９％の体重増加であり、これに対し野生型において５８．０％の体重増加）。Ｓ６Ｋ１欠損マウスにおける体重増加の相対的な割合が野生型と類似であったにもかかわらず、それらは野生型マウスと同程度には脂肪がつかなかった。３ヶ月にわたって、Ｓ６Ｋ１欠損マウスでは０．０２ｇ／脂肪ｇ／体重と比較して野生型マウスは０．１ｇ／ｇ増加した。
【０１１２】
両遺伝型のマウスは、おそらくＮＣＤと比較してＨＦＤの高カロリー密度のため、ＮＣＤよりも少ないＨＦＤ食を消費した。絶対的にはＳ６Ｋ１−／−マウスは野生型マウスと同様の量の食物を消費したが、体重で標準化したとき、それらは４４％多い食物を消費する。したがって、Ｓ６Ｋ１マウスはより多く食べたにもかかわらず、野生型マウスと同じ程度には脂肪がつかない。
【０１１３】
間接熱量測定を、ＨＦＤおよびＮＣＤマウスの８時間絶食期間にわたって行った。両遺伝型において、酸素消費がＮＣＤと比較してＨＦＤで増加したが、その効果はＳ６Ｋ１−／−マウスでより顕著であり、Ｓ６Ｋ１−／−マウスと野生型マウスの間の差は２５％〜３０％増加した。該データはさらに、ＨＦＤ対ＮＣＤのＳ６Ｋ１−／−マウスにおいてそれぞれ、０．７０８±０．００２対０．７０９±０．００４と不変のままであったこと、一方で野生型マウスにおいて、ＲＥＲがＮＣＤ食餌での０．７１３±０．００４からＨＦＤ食餌での０．７２９±０．００２（ｎ＝６、Ｐ＜０．０１）へと増加した（これは脂肪酸酸化と比べて炭水化物酸化の増加の指標）ことを示した。いずれかの食餌のＳ６Ｋ１−／−マウスが高い代謝速度を示したにもかかわらず、ＨＦＤでのそれらは循環遊離脂肪レベルの３倍の増加を示したが、一方で野生型マウスにおいては、遊離脂肪酸レベルに顕著な変化は存在しなかった（表Ｉ）。したがって、Ｓ６Ｋ１−／−マウスは、ＨＦＤに挑戦したとき相当の速度での脂肪蓄積ができない。
【０１１４】
実施例９：高脂肪食餌での肥満動物および野生型動物は、脂肪組織において上昇したＳ６Ｋ１リン酸化を示す。
Ｓ６Ｋ１が正常および肥満遺伝モデルに由来の脂肪組織において影響されるか否かを試験するために、Ｓ６Ｋ１のリン酸化を検出した。これは、リン特異的抗体を使用して容易に行うことができる。短い期間絶食の野生型マウスの脂肪組織におけるＳ６Ｋ１ Ｔ３８９およびＳ６ Ｓ２４０／Ｓ２４４リン酸化のレベルを測定した。成長因子刺激のため、Ｓ６は、Ｓｅｒ２３６で始まり、続いて順次、＞Ｓｅｒ２３５＞Ｓｅｒ２４０＞Ｓｅｒ２４４そしてＳｅｒ２４７の規則正しい様式での５つのセリン残基のカルボキシ末端で、複数リン酸化される。Ｓ６Ｋ１ Ｔ３８９およびＳ６ Ｓ２４０／Ｓ２４４リン酸化の基本レベルは、ＮＣＤで維持した後短い期間絶食のマウスにおいて低い。顕著な対比において、ＨＦＤで維持し、同じ条件下で処置した同じマウスは、Ｓ６Ｋ１ Ｔ３８９およびＳ６ Ｓ２４０／Ｓ２４４リン酸化の高く上昇したレベルを維持した。
【０１１５】
本発明者らはまた、ｏｂ／ｏｂマウス（肥満の遺伝モデル）におけるＳ６Ｋ１活性を試験した。該結果は、ＮＣＤで維持したｏｂ／ｏｂマウスは、ＮＣＤの野生型マウスと比較して、上昇したＳ６Ｋ１ Ｔ３８９およびＳ６ Ｓ２４０／Ｓ２４４リン酸化を有することを示す。予備的なヒトデータは、これらのデータと一致し、そしてさらに、肥満を有する患者の処置における見込みのある薬剤標的として、そして潜在的な診断マーカーとしてのＳ６Ｋ１に関する支持を提供する。
【０１１６】
実施例１０：成熟Ｓ６Ｋ１欠損マウスはインシュリン抵抗性を示さない。
Ｓ６Ｋ１欠損マウスは、以前はそれらの末梢組織においてインシュリンに超感受性であると示唆されていた。これは、それらの生まれついての低インシュリン血症および軽度の耐糖能異常にもかかわらず、それらが正常空腹時グルコースレベルを維持するためである（Pende et al., 2000）。
【０１１７】
グルコース耐性試験およびインビボインシュリン分泌を、本発明以前の記載のとおりに行った（Pende et  al., 2000）。インシュリン耐性試験を、０．７５Ｕ／体重ｋｇのインシュリンの腹腔内注射によって、３時間絶食後に行った。血液を注射前、注射後１５、３０、６０および９０分に集めた。
【０１１８】
通常食餌では、より成熟したＳ６Ｋ１欠損マウスは、野生型マウスに対して、インシュリン耐性試験によるグルコースクリアランスの適度に速い速度によって示されるとおり、上昇したインシュリン感受性へのわずかな傾向を示す。しかしながら、その効果は小さい。これは、高脂肪食餌を与えられたＳ６Ｋ１欠損マウスは、野生型マウスのように、高脂肪食餌を与えられたなら、インシュリン抵抗性となることの可能性を上昇させた。
【０１１９】
予期せぬことに、かかる分析の結果は、インシュリン抵抗性の病因に関係する遊離脂肪酸の顕著な増加にもかかわらず（表１）、Ｓ６Ｋ１欠損マウスはインシュリン感受性を残し、一方で野生型マウスは高脂肪食餌から予期されたとおりの強いインシュリン抵抗性を見せることを示す。これと一致して、野生型マウスは、通常食餌のマウスの適合する組と比較して、高脂肪食餌で耐糖能異常となる。しかし、高脂肪食餌のＳ６Ｋ１欠損マウスは、食後（１時間）の循環インシュリンレベルにおいてさらに顕著な減少を示すにもかかわらず（表１）、グルコース耐性のままである。
【０１２０】
実施例１１：高脂肪食餌のＳ６Ｋ１欠損マウスにおけるインシュリン感受性の機構。
この実施例はどのようにＳ６Ｋ１欠損マウスが高脂肪食餌のそれらの末梢組織においてインシュリンに対する超感受性が残るのかを扱う。
【０１２１】
６時間絶食の後、マウスを麻酔し、そして０．７５Ｕ／ｋｇインシュリン（Eli Lilly）または当量のビークルを静脈注射で投与した。肝臓、脂肪（精巣上体脂肪体）および筋肉（腓腹筋）を注射の５分後に、液体窒素中に集めた。インシュリンレセプターのチロシンリン酸化を肝臓において測定した。組織サンプルからのタンパク質抽出物（１ｍｇ）を、免疫沈降のために製造し、そして記載のとおり（Hirosumi, 2002）に分析した。抗体をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（抗−インシュリンレセプターβ）、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（抗リンチロシン）およびＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（抗ＰＫＢ、抗リンＰＫＢ−Ｓｅｒ４７３、抗リンＳ６Ｋ−Ｔｈｒ３８９、抗リンＳ６  ２４０／２４４）、そしてＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（抗リンチロシン）から購入した。
【０１２２】
インシュリン注射後の脂肪組織におけるＰＫＢ活性の試験は、インシュリンシグナル伝達経路のためのレポーターとして、該キナーゼの活性が、通常食餌で生育したマウスに対して高脂肪食餌で維持した野生型マウスで抑制されたことを示した。しかし、野生型マウスとは対照的に、Ｓ６Ｋ１欠損マウスにおいては食餌に関係なく、ＰＫＢ活性の顕著な差が存在しなかった。Ｓ６Ｋ１ノックアウト(ko)マウスにおけるＰＫＢ活性に対する高脂肪食餌の影響がないことはまた、肝臓および筋肉についても事実であった。
【０１２３】
インシュリンレセプター自己リン酸化の試験は、それが野生型マウスの肝臓において高脂肪食餌によっても強力に抑制されるが、Ｓ６Ｋ１−／−マウスにおいてはそうではないということを示し、これはインシュリンレセプターが負のフィードバックループの標的であり得るという可能性を高める。
【０１２４】
これらの発見を考慮して、高脂肪食餌のために、Ｓ６Ｋ１活性が上昇し、そしてこの上昇した活性がインシュリン抵抗性の誘導に関係するという可能性が高まった。この可能性を試験するために、本発明者らは、インシュリンの静脈内投与の５分後に、脂肪および筋肉におけるＳ６Ｋ１  Ｔ３８９リン酸化およびＳ６リン酸化のレベルを試験した。該結果は、Ｓ６Ｋ１  Ｔ３８９リン酸化の基本値は高脂肪食餌および通常食餌の両方で低いが、ＰＫＢ  Ｓｅｒ  ４７３リン酸化とは対照的に、インシュリンはこれらのレベルをより高くさえ刺激し、潜在的にインシュリンシグナル伝達をさらに抑制することを示す。
【０１２５】
これらの発見は、肥満のヒトがインシュリン抵抗性となる潜在的な機構が、負のフィードバックループによってインシュリンシグナル伝達を抑制する栄養誘導性Ｓ６Ｋ１活性化によるものである可能性を上昇させた。この可能性を試験するために、本発明者らは、臨床的痩せ、肥満、または肥満かつ糖尿病である患者において、６時間の絶食期間の後にＳ６Ｋ１活性を試験した。該結果は、肥満および肥満／糖尿病患者は痩せ患者と比較して、上昇したＳ６Ｋ１レベルを有し、このことはＳ６Ｋ１がインシュリンシグナル伝達の主要な負のエフェクターである、フィードバックループと一致する。
【０１２６】
併せて考えた当該結果は、肥満が誘発する糖尿病を有する患者またはそれらの末梢組織においてインシュリン抵抗性を有する患者の処置において、Ｓ６Ｋ１が薬剤干渉の潜在的な標的であり得るということを強く提案する。
【０１２７】
本明細書中で言及したあらゆる文献、ならびに英国出願ＧＢ０２２４３３８．４（２００２年１０月１８日出願）を、参照により、特に本明細書の一部とする。
【国際調査報告】
2007503203.tif 000003
2007503203.tif 000004
2007503203.tif 000005
2007503203.tif 000006
2007503203.tif 000007