(57)【要約】  本発明は、栄養要求性選択マーカーを利用する組換えポリペプチドの産生のための改良発現系を提供する。さらに、本発明は、改良された発現調節による宿主細胞における改良された組換えタンパク質産生法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．組換えポリペプチドをコードする核酸と；
ｂ．原栄養能を栄養要求性宿主細胞へ回復させる少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸と；
を含む核酸構築物を含む細菌発現系で使用するための、栄養要求性シュードモナス（Pseudomonad）細胞。
【請求項２】
シュードモナスが蛍光菌である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記細胞がウラシルに対して栄養要求性である、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記細胞がプロリンに対して栄養要求性である、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記栄養要求性細胞が１つを超える代謝産物に対して栄養要求性である、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞がウラシルおよびプロリンに対して栄養要求性である、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
前記原栄養能回復ポリペプチドが細胞生存に必要な代謝産物の生合成で活性な酵素である、請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
前記酵素がオロトジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼである、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記酵素が配列番号１および３からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記酵素が配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の細胞。
【請求項１１】
前記酵素がΔ1−ピロリン−５−カルボキシラートレダクターゼである、請求項７に記載の細胞。
【請求項１２】
前記酵素が配列番号６および８からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記酵素が配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１４】
前記栄養要求性細胞がｐｙｒＦ遺伝子を無効にすることによって産生される、請求項１に記載の細胞。
【請求項１５】
前記無効にされたｐｙｒＦ遺伝子が、配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸を含む、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記栄養要求性細胞がｐｒｏＣ遺伝子を無効にすることによって産生される、請求項１に記載の細胞。
【請求項１７】
前記無効にされたｐｒｏＣ遺伝子が配列番号６および配列番号８からなる群から選択される核酸を含む、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記栄養要求性細胞がｐｙｒＦ遺伝子およびｐｒｏＣ遺伝子を無効にすることによって産生される、請求項１に記載の細胞。
【請求項１９】
前記無効にされたｐｙｒＦ遺伝子が配列番号１および３からなる群から選択される核酸を含み、無効にされたｐｒｏＣ遺伝子が配列番号６および配列番号９からなる群から選択される核酸を含む、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記細胞がＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外の染色体ｌａｃＩインサートも含有する、請求項１に記載の細胞。
【請求項２１】
前記ｌａｃＩ遺伝子がｌａｃＩ、ｌａｃＩQ、およびｌａｃＩQ1からなる群から選択される、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
前記核酸構築物が少なくとも１つのｌａｃＯｉｄ配列をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項２３】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
前記核酸構築物が１つを超えるｌａｃオペレーター配列をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項２５】
少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がプロモーターの５’側に位置し、少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がプロモーターの３’側に位置する、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がｌａｃＯｉｄ配列である、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
改変がｌａｃＩ遺伝子の少なくとも１つの染色体挿入を含み、ｌａｃＩ遺伝子が完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外である、細菌発現系で使用するための遺伝子改変シュードモナス（Pseudomonad）細胞。
【請求項２９】
前記シュードモナスが蛍光菌である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記ｌａｃＩ遺伝子がｌａｃＩ、ｌａｃＩQ、およびｌａｃＩQ1からなる群から選択される、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３１】
前記ｌａｃＩ遺伝子がレバンスクラーゼ位置に挿入される、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３２】
前記細胞が細胞内で少なくとも１つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３３】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣ遺伝子の両方への改変によって産生される、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３５】
少なくとも１つのｌａｃＯｉｄ配列を含む核酸をさらに含む、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３６】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
１つを超えるｌａｃオペレーター配列を含む核酸をさらに含む、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３８】
少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がｌａｃＯｉｄ配列である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
少なくとも１つのｌａｃＯｉｄオペレーター配列を含む核酸構築物を含む、細菌発現系で使用するためのシュードモナス（Pseudomonad）細胞。
【請求項４１】
前記シュードモナス（Pseudomonad）が蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４２】
前記ｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの３’側に位置する、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４３】
前記ｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの５’側に位置する、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４４】
前記ｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの３’側および５’側に位置する、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４５】
前記細胞が細胞内で少なくとも１つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４６】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、請求項４５に記載の細胞。
【請求項４７】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣ遺伝子の両方への改変によって産生される、請求項４５に記載の細胞。
【請求項４８】
前記細胞がｌａｃＩ遺伝子の染色体挿入を含有し、ｌａｃＩ遺伝子が完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外である、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４９】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項４０に記載の細胞。
【請求項５０】
１つを超えるｌａｃオペレーター配列を含む核酸構築物を含む、細菌発現系で使用するためのシュードモナス（Pseudomonad）細胞。
【請求項５１】
少なくとも１つのｌａｃオペレーターがｌａｃＯｉｄ配列である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５２】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５３】
前記ｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの５’または３’側である、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５４】
前記ｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの５’および３’側である、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５５】
前記細胞が細胞内で少なくとも１つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５６】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５７】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣ遺伝子の両方への改変によって産生される、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５８】
前記細胞がｌａｃＩ遺伝子の染色体挿入を含有し、ｌａｃＩ遺伝子が完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５９】
前記シュードモナス（Pseudomonad）が蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項６０】
組換えポリペプチドを産生するプロセスであって：
ａ．少なくとも１つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するために、遺伝子改変されたシュードモナス（Pseudomonad）細胞において組換えポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程と；
ｂ．原栄養能を栄養要求性細胞に回復させるポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程と；
ｃ．栄養要求性代謝産物の欠乏した培地上で細胞を培養する工程と；
を含むプロセス。
【請求項６１】
前記シュードモナス（Pseudomonad）が蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項６２】
前記細胞がウラシルに対して栄養要求性である、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項６３】
前記細胞がプロリンに対して栄養要求性である、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項６４】
前記栄養要求性細胞が１つを超える代謝産物に対して栄養要求性である、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項６５】
前記細胞がウラシルおよびプロリンに対して栄養要求性である、請求項６４に記載の細胞。
【請求項６６】
前記原栄養能回復ポリペプチドが細胞生存に必要な代謝産物の生合成で活性な酵素である、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項６７】
前記酵素がオロトジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼである、請求項６６に記載のプロセス。
【請求項６８】
前記酵素が配列番号１および３からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項６７に記載のプロセス。
【請求項６９】
前記酵素が配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載のプロセス。
【請求項７０】
前記酵素がΔ1−ピロリン−５−カルボキシラートレダクターゼである、請求項６６に記載のプロセス。
【請求項７１】
前記酵素が配列番号６および８からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項７０に記載のプロセス。
【請求項７２】
前記酵素が配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載のプロセス。
【請求項７３】
前記栄養要求性細胞がｐｙｒＦ遺伝子を無効にすることによって産生される、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項７４】
前記無効にされたｐｙｒＦ遺伝子が配列番号１および３からなる群から選択される核酸を含む、請求項７３に記載のプロセス。
【請求項７５】
前記栄養要求性細胞がｐｒｏＣ遺伝子を無効にすることによって産生される、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項７６】
前記無効にされたｐｒｏＣ遺伝子が配列番号６および配列番号８からなる群から選択される核酸を含む、請求項７５に記載のプロセス。
【請求項７７】
前記栄養要求性細胞がｐｙｒＦ遺伝子およびｐｒｏＣ遺伝子を無効にすることによって産生される、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項７８】
前記無効にされたｐｙｒＦ遺伝子が配列番号１および３からなる群から選択される核酸を含み、無効にされたｐｒｏＣ遺伝子が核酸からなる群から選択される配列番号６および配列番号９を含む、請求項７７に記載のプロセス。
【請求項７９】
前記細胞がＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外の染色体ｌａｃＩインサートも含有する、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項８０】
前記ｌａｃＩ遺伝子がｌａｃＩ、ｌａｃＩQ、およびｌａｃＩQ1からなる群から選択される、請求項７９に記載のプロセス。
【請求項８１】
前記組換えポリペプチドをコードする核酸が少なくとも１つのｌａｃＯｉｄ配列をさらに含む、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項８２】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項８１に記載のプロセス。
【請求項８３】
前記組換えポリペプチドをコードする核酸が１つを超えるｌａｃオペレーター配列をさらに含む、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項８４】
少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がプロモーターの５’側に位置し、少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がプロモーターの３’側に位置する、請求項８３に記載のプロセス。
【請求項８５】
少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がｌａｃＯｉｄ配列である、請求項８４に記載のプロセス。
【請求項８６】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項８５に記載のプロセス。
【請求項８７】
ｌａｃＩ遺伝子の少なくとも１つの染色体挿入を含むシュードモナス（Pseudomonad）において組換えポリペプチドをコードする核酸を発現する工程を含む、組換えポリペプチドを産生するためのプロセスであって、ｌａｃＩ遺伝子が完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外である、プロセス。
【請求項８８】
前記シュードモナス（Pseudomonad）が蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である、請求項８７に記載のプロセス。
【請求項８９】
前記ｌａｃＩ遺伝子がｌａｃＩ、ｌａｃＩQ、およびｌａｃＩQ1からなる群から選択される、請求項８７に記載のプロセス。
【請求項９０】
前記ｌａｃＩ遺伝子がレバンスクラーゼ位置に挿入される、請求項８７に記載のプロセス。
【請求項９１】
前記細胞が細胞内で少なくとも１つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、請求項８７に記載のプロセス。
【請求項９２】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、請求項９１に記載のプロセス。
【請求項９３】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣ遺伝子の両方への改変によって産生される、請求項８７に記載のプロセス。
【請求項９４】
前記組換えポリペプチドをコードする核酸が少なくとも１つのｌａｃＯｉｄ配列を含む、請求項８７に記載のプロセス。
【請求項９５】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項９４に記載のプロセス。
【請求項９６】
前記組換えポリペプチドをコードする核酸が１つを超えるｌａｃオペレーター配列を含む、請求項８７に記載のプロセス。
【請求項９７】
少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がｌａｃＯｉｄ配列である、請求項９６に記載のプロセス。
【請求項９８】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項９７に記載のプロセス。
【請求項９９】
シュードモナス（Pseudomonad）細胞において組換えポリペプチドをコードする核酸を発現する工程を含む、組換えポリペプチドを産生するためのプロセスであって、核酸が少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列をさらに含み、ｌａｃオペレーター配列がｌａｃＯｉｄ配列である、プロセス。
【請求項１００】
前記シュードモナス（Pseudomonad）が蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である、請求項９９に記載のプロセス。
【請求項１０１】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項９９に記載のプロセス。
【請求項１０２】
少なくとも１つのｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの３’側に位置する、請求項９９に記載のプロセス。
【請求項１０３】
少なくとも１つのｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの５’側に位置する、請求項９９に記載のプロセス。
【請求項１０４】
少なくとも１つのｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの３’および５’側に位置する、請求項９９に記載のプロセス。
【請求項１０５】
前記細胞が細胞内で少なくとも１つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、請求項９９に記載のプロセス。
【請求項１０６】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、請求項１０５に記載のプロセス。
【請求項１０７】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣ遺伝子の両方への改変によって産生される、請求項１０５に記載のプロセス。
【請求項１０８】
前記細胞がｌａｃＩ遺伝子の染色体挿入を含有し、ｌａｃＩ遺伝子が完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外である、請求項９９に記載のプロセス。
【請求項１０９】
シュードモナス（Pseudomonad）において組換えポリペプチドをコードする核酸を発現する工程を含む、組換えポリペプチドを産生するためのプロセスであって、核酸が１つを超えるｌａｃオペレーター配列をさらに含む、プロセス。
【請求項１１０】
少なくとも１つのｌａｃオペレーターがｌａｃＯｉｄ配列である、請求項１０９に記載のプロセス。
【請求項１１１】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項１１０に記載のプロセス。
【請求項１１２】
前記ｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの５’または３’側である、請求項１１０に記載のプロセス。
【請求項１１３】
前記ｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの５’および３’側である、請求項１１０に記載のプロセス。
【請求項１１４】
前記細胞が細胞内で少なくとも１つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、請求項１０９に記載のプロセス。
【請求項１１５】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、請求項１１４に記載のプロセス。
【請求項１１６】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣ遺伝子の両方への改変によって産生される、請求項１１４に記載のプロセス。
【請求項１１７】
前記細胞がｌａｃＩ遺伝子の染色体挿入を含有し、ｌａｃＩ遺伝子が完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外である、請求項１０９に記載のプロセス。
【請求項１１８】
前記シュードモナス（Pseudomonad）が蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である、請求項１０９に記載のプロセス。
【請求項１１９】
宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を調節するプロセスであって：
ａ．シュードモナス（Pseudomonad）細胞を選択する工程であって、細胞が細胞にｌａｃＩ遺伝子を染色体的に挿入することによって遺伝子改変され、ｌａｃＩ遺伝子が完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外である、工程と；
ｂ．細胞に組換えポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されたＬａｃＩタンパク質プロモーターを含む核酸構築物を導入する工程と；
を含むプロセス。
【請求項１２０】
前記シュードモナス（Pseudomonad）が蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である、請求項１１９に記載のプロセス。
【請求項１２１】
前記ｌａｃＩ遺伝子がｌａｃＩ、ｌａｃＩQ、およびｌａｃＩQ1からなる群から選択される、請求項１１９に記載のプロセス。
【請求項１２２】
前記ｌａｃＩ遺伝子がレバンスクラーゼ位置に挿入される、請求項１１９に記載のプロセス。
【請求項１２３】
前記細胞が細胞内で少なくとも１つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、請求項１１９に記載のプロセス。
【請求項１２４】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、請求項１２３に記載のプロセス。
【請求項１２５】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣ遺伝子の両方への改変によって産生される、請求項１２３に記載のプロセス。
【請求項１２６】
前記組換えポリペプチドをコードする核酸が少なくとも１つのｌａｃＯｉｄ配列を含む、請求項１１９に記載のプロセス。
【請求項１２７】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項１２６に記載のプロセス。
【請求項１２８】
少なくとも１つのｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの３’側に位置する、請求項１２６に記載のプロセス。
【請求項１２９】
少なくとも１つのｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの５’側に位置する、請求項１２６に記載のプロセス。
【請求項１３０】
前記ｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの３’および５’側に位置する、請求項１２６に記載のプロセス。
【請求項１３１】
前記組換えポリペプチドをコードする核酸が１つを超えるｌａｃオペレーター配列を含む、請求項１１９に記載のプロセス。
【請求項１３２】
少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がｌａｃＯｉｄ配列である、請求項１３１に記載のプロセス。
【請求項１３３】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項１３２に記載のプロセス。
【請求項１３４】
宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を調節するプロセスであって：
ａ．シュードモナス（Pseudomonad）細胞を選択する工程と；
ｂ．核酸構築物であって：
ｉ．組換えポリペプチドをコードする核酸と；
ｉｉ．少なくとも１つのｌａｃＯｉｄオペレーター配列と；
を含む核酸構築物を導入する工程と；
を含むプロセス。
【請求項１３５】
前記シュードモナス（Pseudomonad）が蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である、請求項１３４に記載のプロセス。
【請求項１３６】
前記ｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの３’側に位置する、請求項１３４に記載のプロセス。
【請求項１３７】
前記ｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの５’側に位置する、請求項１３４に記載のプロセス。
【請求項１３８】
前記ｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの３’および５’側に位置する、請求項１３４に記載のプロセス。
【請求項１３９】
前記細胞が細胞内で少なくとも１つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、請求項１３４に記載のプロセス。
【請求項１４０】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、請求項１３９に記載のプロセス。
【請求項１４１】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣ遺伝子の両方への改変によって産生される、請求項１３９に記載のプロセス。
【請求項１４２】
前記細胞がｌａｃＩ遺伝子の染色体挿入を含有し、ｌａｃＩ遺伝子が完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外である、請求項１３４に記載のプロセス。
【請求項１４３】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項１３４に記載のプロセス。
【請求項１４４】
宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を調節するプロセスであって：
ａ．シュードモナス（Pseudomonad）細胞を選択する工程と；
ｂ．核酸構築物であって：
ｉ．組換えポリペプチドをコードする核酸と；
ｉｉ．１つを超えるｌａｃオペレーター配列と；
を含むプロセス。
【請求項１４５】
少なくとも１つのｌａｃオペレーターがｌａｃＯｉｄ配列である、請求項１４４に記載のプロセス。
【請求項１４６】
前記ｌａｃＯｉｄ配列が配列番号１４および配列番号５９からなる群から選択される、請求項１４５に記載のプロセス。
【請求項１４７】
前記ｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの３’および５’側である、請求項１４５に記載のプロセス。
【請求項１４８】
前記ｌａｃＯｉｄ配列がプロモーターの３’および５’側である、請求項１４５に記載のプロセス。
【請求項１４９】
前記細胞が細胞内で少なくとも１つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、請求項１４４に記載のプロセス。
【請求項１５０】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、請求項１４９に記載のプロセス。
【請求項１５１】
前記栄養要求株がｐｙｒＦおよびｐｒｏＣ遺伝子の両方への改変によって産生される、請求項１４９に記載のプロセス。
【請求項１５２】
前記細胞がｌａｃＩ遺伝子の染色体挿入を含有し、ｌａｃＩ遺伝子が完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外である、請求項１４４に記載のプロセス。
【請求項１５３】
前記シュードモナス（Pseudomonad）が蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である、請求項１４４に記載のプロセス。
【請求項１５４】
抗生物質の非存在下での組換えポリペプチドの産生のプロセスであって：
ａ．シュードモナス（Pseudomonad）細胞を選択する工程であって、細胞が少なくとも１つの代謝産物に対する栄養要求株を誘導するように遺伝子改変され、それにより栄養要求性細胞を産生する、工程であって；
ｂ．細胞に：
ｉ．組換えポリペプチドをコードする核酸と；
ｉｉ．原栄養能を栄養要求性宿主細胞に回復させるポリペプチドをコードする核酸と；
を含む核酸構築物を導入する工程と；
ｃ．組換えポリペプチドおよび原栄養能回復ポリペプチドを細胞内で発現させる工程と；
ｄ．栄養要求性代謝産物の欠乏した培地上で細胞を増殖させる工程と；
を含むプロセス。
【請求項１５５】
前記シュードモナス（Pseudomonad）が蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である、請求項１５４に記載のプロセス。
【請求項１５６】
前記細胞がウラシルに対して栄養要求性である、請求項１５４に記載のプロセス。
【請求項１５７】
前記細胞がプロリンに対して栄養要求性である、請求項１５４に記載のプロセス。
【請求項１５８】
前記栄養要求性細胞が１つを超える代謝産物に対して栄養要求性である、請求項１５４に記載のプロセス。
【請求項１５９】
前記細胞がウラシルおよびプロリンに対して栄養要求性である、請求項１５８に記載のプロセス。
【請求項１６０】
前記原栄養能回復ポリペプチドが細胞生存に必要な代謝産物の生合成で活性な酵素である、請求項１５４に記載のプロセス。
【請求項１６１】
前記酵素がオロトジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼである、請求項１６０に記載のプロセス。
【請求項１６２】
前記酵素が配列番号１および３からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項１６１に記載のプロセス。
【請求項１６３】
酵素が配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１６０に記載のプロセス。
【請求項１６４】
前記酵素がΔ1−ピロリン−５−カルボキシラートレダクターゼである、請求項１６０に記載のプロセス。
【請求項１６５】
前記酵素が配列番号６および８からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項１６４に記載のプロセス。
【請求項１６６】
前記酵素が配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１６４に記載のプロセス。
【請求項１６７】
前記栄養要求性細胞がｐｙｒＦ遺伝子を無効にすることによって産生される、請求項１５４に記載のプロセス。
【請求項１６８】
前記無効にされたｐｙｒＦ遺伝子が、配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸を含む、請求項１６７に記載のプロセス。
【請求項１６９】
前記栄養要求性細胞がｐｒｏＣ遺伝子を無効にすることによって産生される、請求項１５４に記載のプロセス。
【請求項１７０】
前記無効にされたｐｒｏＣ遺伝子が配列番号６および配列番号８からなる群から選択される核酸を含む、請求項１６９に記載のプロセス。
【請求項１７１】
前記栄養要求性細胞がｐｙｒＦ遺伝子およびｐｒｏＣ遺伝子を無効にすることによって産生される、請求項１５４に記載のプロセス。
【請求項１７２】
前記無効にされたｐｙｒＦ遺伝子が配列番号１および３からなる群から選択される核酸を含み、無効にされたｐｒｏＣ遺伝子が配列番号６および配列番号９からなる群から選択される核酸を含む、請求項１７１に記載のプロセス。
【請求項１７３】
前記細胞がＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外の染色体ｌａｃＩインサートも含有する、請求項１５４に記載のプロセス。
【請求項１７４】
前記ｌａｃＩ遺伝子がｌａｃＩ、ｌａｃＩQ、およびｌａｃＩQ1からなる群から選択される、請求項１７３に記載のプロセス。
【請求項１７５】
前記核酸構築物が少なくとも１つのｌａｃＯｉｄ配列をさらに含む、請求項１５４に記載のプロセス。
【請求項１７６】
前記核酸構築物が１つを超えるｌａｃオペレーター配列をさらに含む、請求項１５４に記載のプロセス。
【請求項１７７】
少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がプロモーターの５’側であり、少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がプロモーターの３’側である、請求項１７６に記載のプロセス。
【請求項１７８】
少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がｌａｃＯｉｄ配列である、請求項１７７に記載のプロセス。
【請求項１７９】
選択の間に栄養共生阻害が最小限に抑えられる抗生物質の非存在下での組換えポリペプチドの産生のプロセスであって：
ａ．シュードモナス（Pseudomonad）細胞を選択する工程であって、細胞が少なくとも１つの代謝産物に対する栄養要求株を誘導するように遺伝子改変され、それにより栄養要求性細胞を産生する、工程であって；
ｂ．細胞に：
ｉ．組換えポリペプチドをコードする核酸と；
ｉｉ．原栄養能を栄養要求性宿主細胞に回復させるポリペプチドをコードする核酸と；
を含む核酸構築物を導入する工程と；
ｃ．組換えポリペプチドおよび原栄養能回復ポリペプチドを細胞内で発現させる工程と；
ｄ．栄養要求性代謝産物の欠乏した培地上で細胞を増殖させる工程と；
を含むプロセス。
【請求項１８０】
前記シュードモナス（Pseudomonad）が蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である、請求項１７９に記載のプロセス。
【請求項１８１】
前記細胞がウラシルに対して栄養要求性である、請求項１７９に記載のプロセス。
【請求項１８２】
前記細胞がプロリンに対して栄養要求性である、請求項１７９に記載のプロセス。
【請求項１８３】
前記栄養要求性細胞が１つを超える代謝産物に対して栄養要求性である、請求項１７９に記載のプロセス。
【請求項１８４】
前記細胞がウラシルおよびプロリンに対して栄養要求性である、請求項１８３に記載のプロセス。
【請求項１８５】
前記原栄養能回復ポリペプチドが細胞生存に必要な代謝産物の生合成で活性な酵素である、請求項１７９に記載のプロセス。
【請求項１８６】
前記酵素がオロトジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼである、請求項１８５に記載のプロセス。
【請求項１８７】
前記酵素が配列番号１および３からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項１８６に記載のプロセス。
【請求項１８８】
前記酵素が配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１８５に記載のプロセス。
【請求項１８９】
前記酵素がΔ1−ピロリン−５−カルボキシラートレダクターゼである、請求項１８５に記載のプロセス。
【請求項１９０】
前記酵素が配列番号６および８からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項１８９に記載のプロセス。
【請求項１９１】
前記酵素が配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１８９に記載のプロセス。
【請求項１９２】
前記栄養要求性細胞がｐｙｒＦ遺伝子を無効にすることによって産生される、請求項１７９に記載のプロセス。
【請求項１９３】
前記無効にされたｐｙｒＦ遺伝子が配列番号１および３からなる群から選択される核酸含む、請求項１９２に記載のプロセス。
【請求項１９４】
前記栄養要求性細胞がｐｒｏＣ遺伝子を無効にすることによって産生される、請求項１７９に記載のプロセス。
【請求項１９５】
前記無効にされたｐｒｏＣ遺伝子が配列番号６および配列番号８からなる群から選択される核酸を含む、請求項１９４に記載のプロセス。
【請求項１９６】
前記栄養要求性細胞がｐｙｒＦ遺伝子およびｐｒｏＣ遺伝子を無効にすることによって産生される、請求項１７９に記載のプロセス。
【請求項１９７】
前記無効にされたｐｙｒＦ遺伝子が配列番号１および３からなる群から選択される核酸を含み、無効にされたｐｒｏＣ遺伝子が配列番号６および配列番号９からなる群から選択される核酸を含む、請求項１９６に記載のプロセス。
【請求項１９８】
前記細胞がＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外の染色体ｌａｃＩインサートも含有する、請求項１７９に記載のプロセス。
【請求項１９９】
前記ｌａｃＩ遺伝子がｌａｃＩ、ｌａｃＩQ、およびｌａｃＩQ1からなる群から選択される、請求項１９８に記載のプロセス。
【請求項２００】
前記核酸構築物が少なくとも１つのｌａｃＯｉｄ配列をさらに含む、請求項１９９に記載のプロセス。
【請求項２０１】
前記核酸構築物が１つを超えるｌａｃオペレーター配列をさらに含む、請求項１７９に記載のプロセス。
【請求項２０２】
少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がプロモーターの５’側に位置し、少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がプロモーターの３’側に位置する、請求項２０１に記載のプロセス。
【請求項２０３】
少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列がｌａｃＯｉｄ配列である、請求項２０２に記載のプロセス。
【請求項２０４】
配列番号１または３からなる群から選択される核酸配列を含む、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）ｐｙｒＦ遺伝子、またはｐｙｒＦ遺伝子を用いてハイブリダイズする核酸。
【請求項２０５】
前記核酸が配列番号１の配列を含む、請求項２０４に記載の遺伝子。
【請求項２０６】
前記核酸が配列番号３の配列を含む、請求項２０４に記載の遺伝子。
【請求項２０７】
配列番号６または８からなる群から選択される核酸配列を含む、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）ｐｒｏＣ遺伝子、またはｐｒｏＣ遺伝子を用いてハイブリダイズする核酸。
【請求項２０８】
前記核酸が配列番号６の配列を含む、請求項２０７に記載の遺伝子。
【請求項２０９】
前記核酸が配列番号８の配列を含む、請求項２０７に記載の遺伝子。
【請求項２１０】
ａ．組換えポリペプチドをコードする核酸と；
ｂ．蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）から単離されたｐｙｒＦ遺伝子をコードする核酸と；
を含む核酸構築物。
【請求項２１１】
前記ｐｙｒＦ遺伝子が配列番号１の核酸配列を含む、請求項２１０に記載の構築物。
【請求項２１２】
前記ｐｙｒＦ遺伝子が配列番号３の核酸配列を含む、請求項２１０に記載の構築物。
【請求項２１３】
ａ．組換えポリペプチドをコードする核酸と；
ｂ．蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）から単離されたｐｒｏＣ遺伝子をコードする核酸と；
を含む核酸構築物。
【請求項２１４】
前記ｐｒｏＣ遺伝子が配列番号６の配列を含む、請求項２１３に記載の構築物。
【請求項２１５】
前記ｐｒｏＣ遺伝子が配列番号８の配列を含む、請求項２１３に記載の構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、2003年11月19日に出願された、「Improved Pseudomonas Expression Systems with Auxotrophic Selection Markers」と題された米国仮特許出願シリアル番号第60/523,420号および2004年1月16日に出願された、「Bacterial Expressions with Improved Repression」と題された米国仮特許出願第６０／５３７，１４７号に対して優先権を請求する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、栄養要求性選択マーカーを利用する、組換えポリペプチドの産生のための改良発現系を提供する。さらに、本発明は、改良された発現調節による宿主細胞での改良組換えタンパク質の産生も提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
タンパク質ベースの治療薬を製造するための細菌細胞の使用は、商業的な重要性を増している。細菌発現系を開発する目標の１つは、高品質の標的ポリペプチドを迅速、効率的および豊富に産生することである。そのような発現系に理想的な宿主細胞は、標的ポリペプチドの産生に炭素源を効率的に利用し、発酵反応において高い細胞密度まで迅速に増殖して、誘導されたときのみ標的ポリペプチドを発現し、規制および環境上の懸念のない培地上で増殖し得る。
【０００４】
優れた宿主細胞の創出には多くの障害がある。第一に、組換えポリペプチドを産生するために、標的タンパク質をコードする発現ベクターを宿主細胞内へ挿入する必要がある。多くの細菌は、未形質転換状態に戻ることが可能であり、そこで発現ベクターは宿主から除去される。そのような復帰変異体は、所望の組換えポリペプチド産生の発酵効率を低下させ得る。
【０００５】
標的ペプチドをコードする発現ベクターは、典型的には、ベクター内に選択マーカーを含む。選択マーカーはしばしば、その産物が発酵プロセス中の生存のために必要な遺伝子である。選択マーカーを欠く宿主細胞 、例えば、復帰変異体は、生存することができない。発酵プロセス中の選択マーカーの使用は、発現ベクターを含有する細菌のみが生存することを確実にするためであり、復帰変異体と形質転換体との競合を排除し、発酵効率を低下させる。
【０００６】
最も一般的に使用される選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。宿主細胞は、選択された抗生物質耐性遺伝子産物によって分解し得る抗生物質を添加した培地で増殖される。抗生物質耐性遺伝子を持つ発現ベクターを含有しない細胞は、抗生物質によって死滅させられる。代表的な抗生物質耐性遺伝子は、テトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、およびアンピシリンを含む。しかしながら、細菌宿主細胞中の抗生物質耐性遺伝子の存在は、環境上、規制上、および商業上の問題を呈する。例えば、抗生物質耐性遺伝子含有産物（そして抗生物質耐性遺伝子の使用によって産生された産物）は、環境、ヒト、および動物の健康にとって潜在的なバイオセイフティリスクとして認識されている。例えば、M. Droge et al., Horizontal Gene Transfer as a Biosafety issue: A natural phenomenon of public concern, J. Biotechnology. 64(1) : 75-90 (17 Sept. 1998) ; Gallagher, D. M. , and D. P. Sinn. 1983. Penicillin-induced anaphylaxis in a patient under hypotensive anaesthesia.Oral Surg Oral Med. Oral Pathol. 56: 361-364; Jorro, G. , C. Morales, J. V. Braso, and A. Pelaez. 1996. Anaphylaxis to erythromycin. Ann. AllergyAstAtma Immunol. 77: 456-458; F. Gebhard & K. Smalla, Transformation of Acinetobacter sp. strain BD413 by transgenic sugar beet DNA, Appl. & Environ. Microbiol. 64 (4): 1550-54 (Apr. 1998); T. Hoffmann et al., Foreign DNA sequences are received by a wild type strain of Aspergillus niger after co-culture with transgenic higher plants, Curr. Genet. 27(1) : 70-76 (Dec. 1994); DK Mercer et al., Fate of free DNA and transformation of the oral bacterium Streptococcus gordonoii DL1 by plasmid DNA in human saliva, Appl. & Environ. Microbiol. 65(1) : 6-10 (Jan 1999); R. Schubbert et al. , Foreign(M13) DNA ingested by mice reaches peripheral leukocytes, spleen, and liver via the intestinal wall mucosa and can be covalently linked to mouse DNA, PNAS USA 94: 961- 66 (Feb. 4,1997) ;およびAA Salyers, Gene transfer in the mammalian intestinal tract, Curr. Opin.in Biotechnol. 4 (3): 294-98 (Jun 1993)を参照。
【０００７】
これらの懸念の結果として、多くの行政機関の食品、薬物、健康、および環境監督官庁は、多くのエンドユーザと同様に、商業における使用のために、抗生物質耐性遺伝子核酸が製品から除去される、または生物に存在しないことを要求している。加えて、規制当局の認可を確保するために、最終製品からの選択抗生物質の一掃を示す証拠が提供される必要がある。英国、カナダ、フランス、欧州連合、および米国はみな、食品、動物用飼料、薬物および組換え薬物生産を含む薬物生産での抗生物質耐性遺伝子の使用に対処してきた。これらの薬物の一掃、および特にそのような一掃を証明することは高価で、時間がかかり、効率も最小であるに過ぎない。
【０００８】
組換えポリペプチドの産生における選択のための抗生物質耐性遺伝子の使用に特有の懸念のために、別の選択方法が調査されている。
【０００９】
栄養要求性選択マーカー
栄養要求性選択マーカーは、一部の系で抗生物質選択の代案として利用されている。例えば、栄養要求性マーカーは、酵母で幅広く利用されている。主としてこれらの宿主細胞で抗生物質耐性選択マーカーが有効でないためである。例えば、JT Pronk, (2002) 「Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research,」App. & Envirn. Micro. 68 (5): 2095-2100; Boeke et al.,(1984)「A positive selection for mutants lacking orotodine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast; 5-fluoro-orotic acid resistance,」 Mol. Gen. Genet. 197: 345-346; Botstein & Davis, (1982) 「Principles and practice of recombinant DNA research with yeast,」p.607-636, in JNStrathem, EW Jones. And JR Broach (ed.), The molecular biology of the yeast Saccharomycescerevisiae, Metabolism and gene expression, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Cost & Boeke, (1996) 「A useful colony color phenotype associated with the yeastselectable/counter selectable marker MET15,」 Yeast 12: 939-941を参照。しかしながら酵母発現系は、細菌系が提供するように、標的タンパク質を産生する潜在的速度および効率を提供しない。
【００１０】
細菌での栄養要求性マーカー選択も以前に記載されている。例えば、米国特許第４，９２０，０４８号、第５，６９１，１８５号、第６，２９１，２４５号、第６，４１３，７６８号、第６，７５２，９９４号、Struhl et al. (1976) PNAS USA 73; 1471-1475;MacCormick, C. A. , et al.,(1995)「Construction of a food-gradehost/vector system forLactococcus lactis based on the lactoseoperon,」 FEMS Microbiol. Lett. 127: 105-109; Dickely et al.(1995),「Isolationof Lactococcus lactis nonsense suppressors and construction of a food-grade cloning vector,」 Mol. Microbiol. 15: 839-847;Srensen et al.,(2000) 「A food-grade cloning system for industrial strains of Lactococcus lactis,」 Appl. Environ. Microbiol. 66: 1253-1258; Fiedler &Skerra,(2001)「proBA complementation of an auxotrophic E. coli strain improves plasmid stability and expression yield during fermenter production of a recombinant antibody fragment,」 Gene 274: 111-118を参照。
【００１１】
前述の商業スケールの細菌発酵系での栄養要求性選択マーカーの使用は、その使用を制限する欠点を有する。米国特許第６，４１３，７６８に記載されているような主な欠点は、栄養的な栄養要求性選択マーカー系が一般に栄養共生（cross feeding）を被るということである。栄養共生という用語は、特定の代謝産物に対して栄養要求性である第１の細胞が代謝産物の非存在下で、その環境から、典型的には、細胞が栄養要求する培地から、代謝産物の排泄中間生成物、代謝産物自体、または培地に存在しない代謝産物に対して原栄養性である第２の細胞によって産生された原栄養可能分子（prototrophic enabling molecule）を利用して、その代謝産物の供給を得ることによって生存する能力を指す。GR Barker et al., Biochem. J. 157(1) : 221-27 (1976) (cross feeding of thymine in E. coli): TJ Kerr & GJ Tritz, J. Bact. 115 (3): 982-86 (Sep. 1973) (cross feeding of NAD in E. coli auxotrophic for NAD synthesis); GA Sprenger et al. , FEMS Microbiol. Lett. 37 (3): 299-304 (1986) (selection of nalidixic acid to avoid the cross feeding problem)も参照。
【００１２】
栄養共生は復帰変異細菌を生存させるため、栄養共生は、標的タンパク質産生宿主細胞の存在がより少ないために、所望のタンパク質を効率的で最大化されたレベルで産生する発酵プロセスの能力全体を低下させる。
【００１３】
発現ベクター制御
理想的な宿主細胞の作製に対する別の障害は、発酵プロセスでの標的ポリペプチドの非効率的で低いレベルの産生である。最適な宿主細胞密度および発酵条件が達成されるまでの標的タンパク質の発現制御は、ポリペプチドのさらに効率的でより高い収率を可能にする。この理由は、いくつかあり、特定の炭素源のより効率的な利用および宿主細胞に対する拡張した代謝ストレスの低減を含む。
【００１４】
しかしながら多くの場合では、細胞増殖中の標的タンパク質発現の抑制は不完全なことがあり、特定の誘導期前に著しい量の発現が引き起こされる。この「漏出性」の抑制は、宿主細胞ストレス、正常な細胞増殖から導入遺伝子へ転用される代謝エネルギーによる炭素源の非効率的な利用、および細胞密度誘導点への到達遅延を引き起こし、より長く高価な発酵作業、そしてしばしば標的タンパク質の収率低下を引き起こす。
【００１５】
したがって本発明の目的は、効率的で調節可能であり、規制上および環境上の懸念を最小限に抑える培地中で実施される、標的タンパク質の産生のための改良発現系を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、標的タンパク質の産生のための改良発現系における宿主細胞として使用するための生物を提供することである。
【００１７】
本発明のなお別の目的は、標的タンパク質の改良された産生のためのプロセスである。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、標的タンパク質の産生のための改良発現系で使用される新規な構築物および核酸を提供することである。
【発明の開示】
【００１９】
（発明の要旨）
非抗生物質耐性の栄養要求性選択が可能である、および／またはｌａｃＩ遺伝子の染色体インサートまたは誘導体を含有するシュードモナス（Pseudomonad）生物を宿主細胞として選択することによって、細菌タンパク質産生を改良し得ることが発見されている。
【００２０】
特にシュードモナス（Pseudomonad）生物の蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）がこの目的に特に適していることが発見されている。このために、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）が、組換えポリペプチドの高細胞密度発酵中の栄養要求性選択の下で有害な栄養共生阻害を示さないことが驚くべきことに発見されている。そのような発見は、組換えポリペプチドの高レベルでの効率的な産生における栄養要求性蛍光菌（Pseudomoas fluorescens）の宿主細胞としての使用を可能にして、抗生物質耐性選択マーカーの使用に固有の欠点および他の細菌発現系に存在する栄養要求性栄養共生の問題を克服する。
【００２１】
シュードモナス（Pseudomonad）内の完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外のＬａｃＩをコードする遺伝子の使用が、驚くべきことにプレインキュベーション組換えタンパク質発現の実質的に改良された抑制、商業スケールでの発酵におけるより高い細胞密度、および以前に教示されたｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡシュードモナス（Pseudomonad）染色体挿入（米国特許第5,169,760）と比較して所望の産物のより高い収率をもたらすことも、驚くべきことに発見されている。このｌａｃＩ挿入は、Ｐｌａｃ−Ｐｔａｃファミリープロモーター制御導入遺伝子の抑制において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）においてＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードするマルチコピープラスミドと同じくらい有効であり、それによりＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードする独立したプラスミドを細胞内に保持する必要がなくなり、そのような保持によって引き起こされる生産の非効率性が低減される。
【００２２】
デュアルｌａｃオペレーター配列の使用が、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）の続いての誘導収率の同時低下なしに、誘導前に組換えタンパク質発現の優れた抑制を提供することも発見されている。
【００２３】
したがって本発明の１つの態様において、タンパク質の改良産生での宿主細胞として使用するために、シュードモナス（Pseudomonad）生物が提供される。
【００２４】
１つの実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）生物は、栄養要求株を誘導するために遺伝的に改変されている。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）生物は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である。１つの実施形態において、栄養要求株は、少なくとも1つの窒素含有塩基化合物生合成遺伝子、または少なくとも1つのアミノ酸生合成遺伝子への遺伝子改変の結果である。さらなる実施形態において、遺伝子改変は、ウラシル生合成経路、チミジン生合成経路、またはプロリン生合成経路にて活性である酵素をコードする遺伝子に対してである。なおさらなる実施形態において、遺伝子改変は、オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼをコードするｐｙｒＦ遺伝子、チミジラートシンターゼをコードするｔｈｙＡ遺伝子、またはΔ1−プロリン−５−カルボキシラートレダクターゼをコードするｐｒｏＣ遺伝子に対してである。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外の、ゲノムに挿入されたＬａｃＩをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを提供するために、遺伝子改変されたシュードモナス（Pseudomonad）生物を提供する。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である。１つの実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）は、ＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードする天然の大腸菌（E.Coli）ｌａｃＩ遺伝子をコードする。別の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）細胞は、ｌａｃＩQ遺伝子を含有する。なお別の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）細胞は、ｌａｃＩQ1遺伝子を含有する。
【００２６】
別の実施形態において、導入遺伝子発現の抑制に関与する、少なくとも１つのｌａｃＯ配列を含む核酸を含有する核酸構築物を含むシュードモナス（Pseudomonad）生物が提供される。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である。１つの実施形態において、核酸構築物は１つを超えるｌａｃＯ配列を含む。別の実施形態において、核酸構築物は、少なくとも１つの、そして好ましくは１つを超えるｌａｃＯｉｄ配列を含む。１つの実施形態において、核酸構築物はＰｌａｃファミリープロモーターの３’に位置するｌａｃＯ配列、またはその誘導体、そしてＰｌａｃファミリープロモーターの５’に位置するｌａｃＯ配列、またはその誘導体を含む。特定の実施形態において、ｌａｃＯ誘導体はｌａｃＯｉｄ配列である。
【００２７】
さらなる実施形態において、本発明は、栄養要求性を誘導するように遺伝子改変され、完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外の、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ遺伝子、ｌａｃＩQ遺伝子、またはｌａｃＩQ1遺伝子の染色体挿入を含有するようにさらに改変されたシュードモナス（Pseudomonad）生物を提供する。別の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）生物は、導入遺伝子発現の抑制に関与する少なくとも１つのｌａｃＯ配列を含む核酸構築物を含有するようにさらに改変される。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）生物は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である。
【００２８】
本発明の別の態様において、タンパク質の改良産生で使用するための核酸配列が提供される。
【００２９】
１つの実施形態において、栄養要求性シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞で使用するための原栄養性回復酵素をコードする核酸配列が提供される。特定の実施形態において、生物蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）から窒素含有塩基化合物生合成酵素をコードする核酸配列が提供される。１つの実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）中のｐｙｒＦ遺伝子をコードする核酸配列が提供される（配列番号１および３）。別の実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）中のｔｈｙＡ遺伝子をコードする核酸配列が提供される（配列番号４）が提供される。なお別の実施形態において、生物蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）から精製されたアミノ酸生合成化合物をコードする核酸配列が提供される。特定の実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）中のｐｒｏＣ遺伝子をコードする核酸配列が提供される（配列番号６および８）。
【００３０】
別の態様において、本発明は、新規な核酸発現の産物である、新規なアミノ酸配列を産生する。
【００３１】
本発明のなお別の態様において、ペプチドの改良された産生で使用するための核酸構築物が提供される。
【００３２】
１つの実施形態において、ａ）組換えポリペプチドをコードする核酸配列、およびｂ）原栄養可能酵素（prototrophy-enabling enzyme）をコードする核酸配列を含むシュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞の形質転換に使用するための核酸構築物が提供される。別の実施形態において、核酸構築物は、ｃ）Ｐｌａｃ−Ｐｔａｃファミリープロモーターをさらに含む。なお別の実施形態において、核酸構築物は、ｄ）ｌａｃまたはｔａｃファミリープロモーターの３’側の少なくとも１つのｌａｃＯ配列、または誘導体をさらに含む。まだ別の実施形態において、核酸構築物は、ｅ）ｌａｃまたはｔａｃファミリープロモーターの５’側の少なくとも１つのｌａｃＯ配列、または誘導体をさらに含む。１つの実施形態において、ｌａｃＯ配列の誘導体は、ｌａｃＯｉｄ配列でもよい。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）生物は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である。
【００３３】
本発明の１つの実施形態において、ａ）組換えポリペプチドをコードする核酸配列、ｂ）Ｐｌａｃ−Ｐｔａｃファミリープロモーター、ｃ）ｌａｃまたはｔａｃファミリープロモーターの３’側の少なくとも１つのｌａｃＯ配列、または誘導体、ｄ）ｌａｃまたはｔａｃファミリープロモーターの５’側の少なくとも１つのｌａｃＯ配列、または誘導体を含む、シュードモナス（Pseudomonad）生物中の発現ベクターとして使用するための核酸構築物が提供される。１つの実施形態において、誘導体ｌａｃＯ配列は、ｌａｃＯｉｄ配列でもよい。１つの実施形態において、核酸構築物は、ｅ）栄養要求性シュードモナス（Pseudomonad）細胞で使用するための原栄養可能（prototrophy-enabling）選択マーカーをさらに含む。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）生物は蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である。
【００３４】
本発明の別の態様において、タンパク質の改良された産生で使用するための改変細胞が提供される。
【００３５】
１つの実施形態において、ｉ）組換えポリペプチド、ｉｉ）原栄養可能（prototrophy-enabling）核酸を含む核酸構築物を有する、栄養要求性シュードモナス（Pseudomonad）細胞が提供される。別の実施形態において、核酸構築物は、ｉｉｉ）Ｐｌａｃ−Ｐｔａｃファミリープロモーターをさらに含む。なお別の実施形態において、核酸構築物は、ｉｖ）１つを超えるｌａｃＯ配列をさらに含む。１つの実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）は、栄養要求性蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）細胞である。さらなる実施形態において、本発明は、完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外の天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ遺伝子、ｌａｃＩQ遺伝子、またはｌａｃＩQ1遺伝子の染色体挿入を含むようにさらに遺伝子改変された、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）を含めた栄養要求性シュードモナス（Pseudomonad）生物をさらに含む。
【００３６】
別の実施形態において、染色体に挿入された、完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外のｌａｃＩ導入遺伝子、またはその誘導体と、ｂ）ｉ）組換えポリペプチドと、ｉｉ）Ｐｌａｃ−Ｐｔａｃファミリープロモーターとを含む核酸構築物とを含む、シュードモナス（Pseudomonad）細胞が提供される。なお別の実施形態において、核酸構築物は、ｉｉｉ）少なくとも１つのｌａｃＯ配列と、好ましくは１つを超えるｌａｃＯ配列とをさらに含む。つの実施形態において、ｌａｃＯ配列はｌａｃＯｉｄ配列である。１つの実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）は、栄養要求性を誘導するようにさらに改変されている。１つの実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）細胞は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である。
【００３７】
本発明の１つの態様において、改良されたタンパク質産生で使用するための組換えポリペプチドを発現させるプロセスが提供される。
【００３８】
１つの実施形態において、プロセスは、ａ）組換えポリペプチドと、ｂ）少なくとも１つの代謝産物に対して栄養要求性である、シュードモナス（Pseudomonad）内の原栄養回復酵素とをコードする核酸を含む核酸構築物の発現を提供する。代替的な実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）は、１つを超える代謝産物に対して栄養要求性である。１つの実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）細胞である。特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、窒素含有塩基化合物およびアミノ酸からなる群から選択される代謝産物、または代謝産物の組合せに対して栄養要求性であるシュードモナス（Pseudomonad）内で発現される。さらに特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、ウラシル、プロリン、およびチミジンからなる群から選択される代謝産物に対して栄養要求性であるシュードモナス（Pseudomonad）内で発現される。別の実施形態において、栄養要求性は、宿主ｐｙｒＦ、ｐｒｏＣ、またはｔｈｙＡ遺伝子それぞれのノックアウトによって産生し得る。代替的な実施形態である組換えポリペプチドは、ＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外の天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ遺伝子、ｌａｃＩQ遺伝子、またはｌａｃＩQ1遺伝子の宿主細胞染色体への挿入を通じて、遺伝子改変された栄養要求性シュードモナス（Pseudomonad）細胞内で発現される。１つの特定の実施形態において、栄養要求株内で発現される組換えポリペプチドを含有するベクターは、少なくとも１つのｌａｃＯｉｄオペレーター配列を含む。１つの特定の実施形態において、栄養要求性宿主細胞内で発現される組換えポリペプチドを含有するベクターは、少なくとも２つのｌａｃオペレーター配列、またはその誘導体を含む。なおさらなる実施形態において、組換えポリペプチドはＰｌａｃファミリープロモーターによって駆動される。
【００３９】
別の実施形態において、プロセスは、シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞のゲノムへ挿入されたＬａｃＩをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを提供するように遺伝子改変されたシュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞を含み、ここでｌａｃＩをコードする遺伝子は、ＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外である。１つの実施形態において、Ｌａｃリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ遺伝子のそれと同じである。別の実施形態において、Ｌａｃリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、ｌａｃＩQ遺伝子である。なお別の実施形態において、Ｌａｃリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、ｌａｃｌＱ１遺伝子である。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である。別の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）は、栄養要求性細胞を産生するようにさらに遺伝子改変される。別の実施形態において、プロセスは、少なくとも約３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌまたは少なくとも約１０ｇ／Ｌの組換えポリペプチドレベルを産生する。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、３ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌのレベルで発現される。
【発明の詳細な説明】
【００４０】
１つの実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）生物は、栄養要求性を誘導するために遺伝子改変されている。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）生物は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である。１つの実施形態において、栄養要求株は、少なくとも１つの窒素含有塩基化合物生合成遺伝子、または少なくとも１つのアミノ酸生合成遺伝子に対する遺伝子改変の結果である。さらなる実施形態において、遺伝子改変は、ウラシル生合成経路、チミジン生合成経路、またはプロリン生合成経路において活性である酵素をコードする遺伝子に対してである。なおさらなる実施形態において、遺伝子改変は、オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼをコードするｐｙｒＦ遺伝子、チミジラートシンターゼをコードするｔｈｙＡ遺伝子、またはΔ1−プロリン−５−カルボキシラートレダクターゼをコードするｐｒｏＣ遺伝子に対してである。
【００４１】
別の実施形態において、本発明は、完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外の、ゲノムに挿入されたＬａｃＩをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを提供するために、遺伝子改変されたシュードモナス（Pseudomonad）生物を提供する。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である。１つの実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）は、ＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードする天然の大腸菌（E.Coli）ｌａｃＩ遺伝子をコードする。別の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）細胞は、ｌａｃＩQ遺伝子を含有する。なお別の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）細胞は、ｌａｃＩQ1遺伝子を含有する。
【００４２】
別の実施形態において、導入遺伝子発現の抑制に関与する、少なくとも１つのｌａｃＯ配列を含む核酸を含有する核酸構築物を含むシュードモナス（Pseudomonad）生物が提供される。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である。１つの実施形態において、核酸構築物は１つを超えるｌａｃＯ配列を含む。別の実施形態において、核酸構築物は、少なくとも１つの、そして好ましくは１つを超えるｌａｃＯｉｄ配列を含む。１つの実施形態において、核酸構築物はＰｌａｃファミリープロモーターの３’に位置するｌａｃＯ配列、またはその誘導体、そしてＰｌａｃファミリープロモーターの５’に位置するｌａｃＯ配列、またはその誘導体を含む。特定の実施形態において、ｌａｃＯ誘導体はｌａｃＯｉｄ配列である。
【００４３】
さらなる実施形態において、本発明は、栄養要求株を誘導するように遺伝子改変され、完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外の、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ遺伝子、ｌａｃＩＱ遺伝子、またはｌａｃＩＱ１遺伝子の染色体挿入を含有するようにさらに改変されたシュードモナス（Pseudomonad）生物を提供する。別の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）生物は、導入遺伝子発現の抑制に関与する少なくとも１つのｌａｃＯ配列を含む核酸構築物を含有するようにさらに改変される。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）生物は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である。
【００４４】
組換えポリペプチドを産生する発現系で使用するために本発明で提供される宿主細胞は、「シュードモナス（Pseudomonad）および密接に関連する細菌」から、または以下で定義するようなそのサブグループから選択され得る。１つの実施形態において、宿主細胞はシュードモナス（Pseudomonas）属から選択される。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonas）の特定の種は、蛍光菌（P.fluorescens）である。特定の実施形態において、宿主細胞は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）バイオタイプＡまたはビオバルＩである。
【００４５】
定義
「単離された」という用語は、例えば、細胞成分でありうる他の物質成分から実質的にまたは本質的に遊離した核酸、タンパク質、またはペプチドを指す。
【００４６】
「断片」という用語は、ヌクレオチド、タンパク質、またはペプチド配列の一部または部分配列を意味する。
【００４７】
本明細書で使用する場合「細胞タンパク質総パーセント」という用語は、凝集した細胞タンパク質のパーセンテージとしての宿主細胞中のタンパク質またはペプチドの量を意味する。
【００４８】
「作動可能に結合された」という用語は本明細書で使用する場合、転写および任意の翻訳調節要素が、宿主細胞の作用において、または作用によって調節要素がコード配列の発現を指示し得るようなコード配列に対する配置で、コード配列に共有結合される、いずれの構造も指す。
【００４９】
「栄養要求株」という用語は本明細書で使用する場合、増殖および代謝に必要な特定の物質を生成するその能力を除去または低減するように改変された細胞を指す。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「細胞タンパク質総パーセント」という用語は、細胞によって発現された所与のタンパク質の相対量を表す総細胞タンパク質の分率の尺度である。
【００５１】
「原栄養能」という用語は本明細書で使用する場合、細胞が増殖および代謝に必要な特定の物質を生成し得ることを指す。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「相同の」という用語は、ｉ）所与の元のタンパク質またはペプチドの配列と実質的に類似している（すなわち少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９８％）アミノ酸配列を有し、そして元のタンパク質またはペプチドの所望の機能を保持するタンパク質またはペプチド、あるいはｉｉ）所与の核酸の配列と実質的に類似している（すなわち少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９８％）配列を有し、そして元の核酸配列の所望の機能を保持する核酸のいずれかを意味する。本発明および開示の実施形態のすべてにおいて、開示されたタンパク質、ペプチドまたは核酸はいずれも、所望の機能を保持する相同タンパク質または実質的に相同なタンパク質、ペプチドまたは核酸によって置換し得る。本発明および開示の実施形態のすべてにおいて、いずれかの核酸が開示されるとき、本発明が開示された核酸にハイブリダイズするすべての核酸も含むことを前提とすべきである。
【００５３】
１つの非制限的な実施形態において、相同なポリペプチドの同一でないアミノ酸配列は、表１に示す１５の保存的または半保存的グループのいずれか１つの構成要素であるアミノ酸でありうる。
【表１】
2007511238.tif 000002
【００５４】
Ｉ．シュードモナス（Pseudomonad）および関連細菌の宿主細胞としての選択
本発明は、タンパク質の改良された産生における、シュードモナス（Pseudomonad）および関連細菌の宿主細胞としての使用を提供する。
【００５５】
栄養要求性選択効率
シュードモナス（Pseudomonad）が、他の系に通例関連する欠点、例えば、プラスミド不安定性および栄養共生を伴わずに、プラスミドを発現するタンパク質の保持に栄養要求性選択マーカーを利用する能力を有することが発見されている。
【００５６】
他の宿主細胞系の栄養要求性マーカーは、特にプラスミドの消失が無プラスミド細胞に選択的利点を与えて、大量の非増殖細胞の蓄積を引き起こし、産物形成を減少させる発酵の間には、各細胞内にプラスミドを保持するには必ずしも十分であるとは限らない。そのような復帰変異菌株は、栄養要求性代謝産物に原栄養可能細菌（prototrophic enabled bacteria）から栄養共生する能力を有する場合、特に厄介である。例えば、大腸菌（E.coli）トリプトファン栄養要求株内のプラスミドでのｔｒｐオペロンの使用は、ほとんどの無プラスミド細胞がｖａｌＳts宿主内のｖａｌＳ遺伝子（バリルｔ−ＲＮＡシンターゼをコードする）と結合するまで蓄積するのを防止するには十分でない（Skogman, S. G.; Nilsson, J., Temperature-dependent retention of a tryptophanoperon-bearing plasmid in Escherichia coli. Gene 1984,31, (1-3), 117-22）。おそらくプラスミド上にｔｒｐオペロンを含有する細胞は、無プラスミド細胞の増殖を可能にするのに十分なトリプトファンまたは関連分子を分泌した。同様に、ｌｅｕ２ミュータント酵母内のキシリトールレダクターゼ産生プラスミド上のＬＥＵ２遺伝子の使用は、プラスミドの消失を引き起こした；ロイシンはプラスミド含有細胞によってブロス中に分泌されるため、供給バッチ培養物の８０％までが産生プラスミドなしの細胞より構成されていた（Meinander, N. Q.; Hahn-Haegerdal, B., Fed-batch xylitol production with two recombinantSaccharomyces cerevisiae strains expressing XYL1 at different levels, using glucose as a cosubstrate: a comparison of production parameters and strain stability. Biotechnology and Bioengineering 1997,54, (4), 391-399）。
【００５７】
蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）（Pf）が他の宿主細胞系、例えば、大腸菌（E.coli）および酵母で観察された栄養共生に関連する固有の問題を示さないことが発見されている。特定の理論に縛られたくはないが、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）が宿主細胞として使用するのに特に適切な生物であることが考えられる。なぜなら、栄養要求性代謝産物を含有する添加培地上で原栄養可能（prototrophic-enabling）プラスミドを含有する栄養要求性細胞にPf栄養要求性細胞が勝てないことが観察され、Pf栄養要求株が必要な代謝産物を導入することが本来難しいことが示されるからである。このため、選択マーカープラスミドを喪失するPf栄養要求性細胞は、補助代謝産物の存在下でも、選択マーカーを含有するPf栄養要求性細胞に勝る選択的利点を得られず、栄養共生の潜在的影響を大きく低下させる。この栄養共生の影響の低下のため、発酵操作での組換えポリペプチドの産生収率は、非組換えポリペプチド産生細胞の存在により低下しない。
【００５８】
ＬａｃＩインサート
シュードモナス（Pseudomonad）が完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外の単一コピーのｌａｃＩ導入遺伝子、染色体インサートを使用でき、誘導までタンパク質発現を効果的に抑制することが発見されている。
【００５９】
ＲＮＡポリメラーゼによる調節プロモーターからの転写開始は、調節タンパク質の結合または解放によって活性化または脱活性化される。したがって、調節プロモーターは、目的の標的ポリペプチドをコードする遺伝子が、プロモーターが調節タンパク質（すなわち「リプレッサー」タンパク質）を含まないときのみ発現される負の制御に関与するもの（すなわち抑制性プロモーター）、およびプロモーターが調節タンパク質（すなわち「アクチベーター」タンパク質）によって結合されたときのみ遺伝子が発現される正の制御に関与するものを含む。
【００６０】
細菌発現系で使用される抑制性プロモーターの最も一般的なクラスの１つは、Ｐｌａｃベースプロモータの科である。Ｐｌａｃベースプロモータの科は、天然の大腸菌（E.coli）ラクトースオペロンから発して、「ｌａｃ」オペロンと呼ばれ、「ｌａｃＺＹＡ」として記号表示もされ、その発現は、ｌａｃＩ遺伝子の発現産物によって調節される。オペロンの天然の大腸菌（E.coli）構造は、「ＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ＰｌａｃＺ−ｌａｃＺＹＡ」であり、ここで天然の大腸菌（E.coli）Ｐｌａｃプロモーターは「ＰｌａｃＺ」によって表される（「ＰｌａｃＺＹＡ」とも呼ばれる。「ＰｌａｃＩ」は、ｌａｃＩ遺伝子の天然のプロモーターを表し、「ｌａｃＩ」は、ｌａｃリプレッサーをコードする遺伝子、すなわちＬａｃＩタンパク質を表す。「ｌａｃＺＹＡ」は、ラクトース利用経路をコードするオペロンを表す。
【００６１】
ＬａｃＩ調節プロモーターは特に、天然の大腸菌（E.coli）ラクトースオペロンプロモータ（「Ｐｌａｃ」）を含む。加えて改良ミュータントも、Ｐｌａｃのプロモーター内ハイブリッド、例えば、「Ｐｔａｃ」プロモーター、「Ｐｔｒｃ」プロモーター、および「ＰｔａｃＩＩ」プロモーターと同様に発見された。大腸菌（E.coli）中のＰｔａｃプロモーターは例えば、完全に抑制解除されたときにＰｌａｃプロモーターよりも３倍強力である。したがってそれは、大腸菌（E.coli）での高レベルの調節遺伝子発現を促進するために頻繁に使用される。しかしながらＰｌａｃプロモーターはＬａｃＩによって１０００倍抑制されるが、Ｐｔａｃプロモーターは同様の条件下では５０倍のみ抑制される（Lanzer, M. & H. Bujard. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 : 8973）。大腸菌（E.coli）Ｐｔａｃプロモーターまたは他のｌａｃ関連プロモーターの抑制は、リプレッサー、ＬａｃＩの濃度に依存する（De Boer, et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78:21-25）。上記したように抑制からの解放は、その特異性ＤＮＡ結合部位に対するリプレッサー、この場合、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）の親和性を低下させるインデューサの添加によって発生しうる。あるいは、プラスミドの特異性ＤＮＡ結合部位のモル濃度に対するリプレッサーの濃度の低下も、プロモーターを抑制解除し得る。ｌａｃＩ遺伝子が高コピー数クローニングプラスミドに位置する場合、そのような系で産生される大量のリプレッサーのために、発現を開始するためには大量のインデューサが必要である。
【００６２】
市販の産生系において、ｌａｃリプレッサーは、典型的には、発現が構成性、すなわち非調節性である遺伝子によってコードされ、したがって、所望の宿主細胞バイオマスまたは細胞密度が達成されるまで所望の標的タンパク質をコードする所望の導入遺伝子が抑制される細胞内環境を提供する。そのとき、その存在が導入遺伝子からリプレッサーを解離させるのに有効なインデューサとして公知の低分子が細胞培養物に少量添加されて、宿主細胞によって吸収され、それにより導入遺伝子の転写が可能になる。ｌａｃリプレッサータンパク質の場合、インデューサはラクトース、または非代謝性無償性インデューサ、例えば、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオ−ガラクトシド（「IPTG」）でありうる。インデューサが添加される選択された時点は、「誘導期」と呼ばれる。
【００６３】
種々のｌａｃリプレッサー遺伝子が、組換えポリペプチド発現ベクターに存在するＰｌａｃファミリープロモーターの抑制に有用であるとして認識されている。これらは、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ遺伝子および／または同じＬａｃＩタンパク質をコードするが、より高い発現レベルにおいてである、ｌａｃＩQおよびｌａｃＩQ1遺伝子を含むその変異体を含む。例えば、ｌａｃＩQ変異は、プロモーター領域ｌａｃＩの−３５における１回のＣＧからＴＡへの変化（Calos, M. 1978. Nature 274:762）であり、これは大腸菌（E.coli）におけるＬａｃＩ発現の１０倍の上昇を引き起こす（Mueller-Hill, B., et al. 1968. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 59:1259）。野生型大腸菌（E.coli）細胞は、１０-8Ｍまたは細胞当たり分子約１０個のＬａｃＩ濃度を有し、タンパク質の９９％はテトラマーとして存在する（Fickert, R. & B.Mueller-Hill 1992. J. Mol. Biol. 226: 59）。ｌａｃＩQ変異を含有する細胞は、細胞当たり約分子１００個または１０-7Ｍ  ＬａｃＩを含有する。結果として多数の細菌発現系が開発され、そこではプラスミド内に常在するＰｌａｃファミリープロモーター制御導入遺伝子がＬａｃＩタンパク質を発現する宿主細胞内に種々のレベルで保持され、それによって細胞増殖の選択された「誘導期」まで所望の導入遺伝子が抑制される。
【００６４】
しかしながら、多くの場合では、細胞増殖中の標的タンパク質発現の抑制は不完全なことがあり、特定の誘導期前に著しい量の発現が引き起こされる。この「漏出性」の抑制は、宿主細胞ストレス、正常な細胞増殖から導入遺伝子へ転用される代謝エネルギーによる炭素源の非効率的な利用、および細胞密度誘導点への到達遅延を引き起こし、より長く高価な発酵作業、そしてしばしば標的タンパク質の収率低下を引き起こす。
【００６５】
Ｐｌａｃファミリープロモーター駆動導入遺伝子の抑制を改善するための１つの一般的な方法は、Ｐｌａｃファミリープロモーター駆動標的遺伝子を持つプラスミド上にｌａｃＩまたはｌａｃＩQ遺伝子を配置することであった（例えば、MJR Stark in Gene 51: 255-67 (1987) and E Amann et al. in Gene:301-15 (1988)を参照）。しかしながらこれはＬａｃリプレッサータンパク質の過剰産生を引き起こすことが多く、次に導入遺伝子の誘導レベルを回復して組換えタンパク質産生の低下を克服するために、なお一層高いインデューサ濃度の使用を必要とする。その上、Ｐｌａｃファミリープロモーター駆動標的遺伝子を含有するプラスミドとは独立したｌａｃＩ遺伝子を含有する第２のプラスミドの使用は、発現宿主細胞内に両方のプラスミドを保持するために、２つの異なる選択マーカー遺伝子（２つの異なるプラスミドの各々に対して１つの選択マーカー遺伝子）の使用を必要とする。第２の選択マーカー遺伝子、すなわち第２のプラスミドの選択マーカー遺伝子の存在は次に、１）抗生物質耐性選択マーカー遺伝子の場合には独立した抗生物質、これは費用がかかり、健康／安全性規制の観点から不都合である、；または２）栄養要求性選択マーカー遺伝子の場合には宿主細胞ゲノムにおける独立した代謝不全、これは宿主細胞を変異させるというさらなる労力を必要とする、のいずれかの使用を必要とする。
【００６６】
驚くべきことに、完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外のｌａｃＩ挿入が、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）内でＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードする多コピープラスミドとしてのＰｌａｃ−Ｐｔａｃファミリープロモーター制御導入遺伝子を抑制するのに有効であることが発見された。この驚くべき発見は、細胞内でＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードする独立したプラスミドを維持する必要をなくすか、またはさらなる栄養要求性選択マーカーを定義する必要をなくし、ｌａｃＩ含有プラスミドのそのような維持によって引き起こされる潜在的な産生非効率性をさらに減少させる。
【００６７】
シュードモナス（Pseudomonas）における導入遺伝子発現を調節する以前の試みでは、ｌａｃＺプロモーター領域が欠失しているが、構成性ＰｌａｃＩプロモーターを保持する大腸菌（E.coli）ＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンを染色体に挿入した（米国特許第５，１６９，７６０号を参照）。欠失は、ｌａｃオペロンの遺伝産物の構成発現を可能にする。しかしながら、挿入されたオペロンは、ラクトーストランスポータタンパク質ラクトースパーミアーゼをコードする大腸菌（E.coli）ｌａｃＹ遺伝子を含有する。ラクトースパーミアーゼは、ラクトース、または同様の誘導体を培地から宿主細胞内に輸送することが可能である。ラクトースパーミアーゼの存在は、培地からのラクトース様汚染物質の移入増加を引き起こし、最終的に誘導前にＰｌａｃファミリープロモーターの抑制を生じさせる。さらにｌａｃオペロンｌａｃＺ、ｌａｃＹ、およびｌａｃＡ遺伝子産物の発現は、これらの産物への炭素利用源の不十分な利用をもたらして、細胞に対する代謝ストレスの増大を引き起こし、誘導のための高い細胞密度の定着を遅延させる。加えて、より大きなｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡ融合オペロンが、宿主細胞内での単独のｌａｃＩインサートと比較して、メッセージ不安定性の上昇を生じる。
【００６８】
シュードモナス（Pseudomonad）内での完全または切断ＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外のＬａｃＩをコードする遺伝子の使用が、以前に教示されたＺａｃｌ−ｌａｃＺＹＡシュードモナス（Pseudomonad）染色体挿入（米国特許第5,169,760号）と比較して、プレインキュベーション組換えタンパク質発現の実質的に改良された抑制、商業スケール発酵でのより高い細胞密度、および所望の産物のより高い収率を引き起こしたことが、驚くべきことに発見された。
【００６９】
プロモーター改変のためにｌａｃよりも高レベルで発現される誘導体ｌａｃＩ遺伝子、例えば、ｌａｃＩQおよびｌａｃＩQ1を利用するさらなる試みもまた記載されている。CG Glascock & MJ Weickertは、プラスミド保持Ｐｔａｃ駆動標的遺伝子の制御のレベルを評価する試みにおいて、独立したＬａｃＩタンパク質をコードする遺伝子が宿主細胞の染色体内に存在する大腸菌（E.coli）菌株について記載する。CG Glascock & MJ Weickert, 「Using chromosomal lacIQI to control expression of gene on high-copy number プラスミド in Escherichia coli,」 Gene 223 (1-2): 221-31(1998)を参照；ＷＯ  ９７／０４１１０も参照。ＬａｃＩタンパク質をコードする遺伝子のうち、ｌａｃＩ、ｌａｃＩQ、およびｌａｃＩQ1で試験を行った。ｌａｃＩ遺伝子およびｌａｃＩQ遺伝子について得られた結果は、高コピー数プラスミド上に存在するときにＰｔａｃ駆動標的遺伝子の抑制レベルの劣化を示し、プレ誘導標的遺伝子発現の実質的なレベルを生じさせた。高発現ｌａｃＩQ1遺伝子のみが、その系において実質的な抑制を与えた。
【００７０】
しかしながらそのような方法は、誘導時にプロモーターを十分に抑制解除するために必要なインデューサの量を増加させることによって、そしてインデューサが構成発現されたリプレッサータンパク質すべてを十分に結合することができないために収率が低下することによって、費用を増大させる可能性を有する。
【００７１】
比較上、驚くべきことに、単一コピーのｌａｃＩ染色体インサートがＰｌａｃ−Ｐｔａｃファミリープロモーター駆動導入遺伝子発現を抑制するのに十分であることが発見された。そのような発見は、使用されるインデューサの量に関して潜在的な費用節約措置を可能にして、タンパク質の改良された産生における宿主細胞としての蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）の開発にさらに柔軟性を与える。
【００７２】
シュードモナス（Pseudomonad）生物
シュードモナス（Pseudomonad）および密接に関連する細菌は、本明細書で使用する場合、本明細書で「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１」として定義するグループと同じ範囲である。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１」は、さらに詳細には、R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 217-289 (8th ed., 1974) (The Williams & Wilkins Co., ボルチモア、メリーランド州、米国）（以下「Bergey(1974)」）によって「グラム陰性好気性桿菌および球菌」と呼ばれるその分類学上の「パート」に含まれるとして記載されている、科および／または属に属するプロテオバクテリアの群として定義される。表４は、この分類学的「パート」に挙げられた生物の科および属を表す。
2007511238.tif 000003
【００７３】
「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１」は、その分類学的「パート」を形成するのに使用された基準に従って分類されるすべてのプロテオバクテリアと同様に、その下で分類されるすべてのプロテオバクテリアを含有する。結果として、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１」は、例えば、：すべてのグラム陽性細菌；このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）の分類法の１９「パート」のその他に分類される、グラム陰性細菌、例えば、エンテロバクテリアセア（Enterobacteriaceae）；アーキア（Archaea）の非細菌科として以前から認識されてきた科である、このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）の「パート」の全体の「科Ｖ．ハロバクテリアセア（Halobacteriaceae）」；および細菌の非プロテオバクテリア属として以前から認識されてきた属である、このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）の「パート」で挙げられた属サーマス（Thermus）を除外する。
【００７４】
「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１」は、このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）の「パート」で定義された属または科に属する（以前はその種と呼ばれた）プロテオバクテリアをさらに含み、他のプロテオバクテリア分類学的名を以前から与えられている。一部の場合では、このような再命名は、完全に新しいプロテオバクテリア属の作製を引き起こした。例えば、アシドボラックス（Acidovorax）、ブレバンジモナス（Brevundimonas）、ブルクホリデリア（Burkholderia）、ヒドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）、オーシャンイモナス（Oceanimonas）、ラルストニア（Ralstonia）、およびステノトロホモナス（Stenotrophomonas）は、属シュードモナス（Pseudomonas）の属に属する（以前はその種と呼ばれた）生物を、Ｂｅｒｇｅｙ（１９７４）で定義されたように再グループ化することによって作製された。同様に例えば、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属（およびそれから由来するブラストモナス（Blastomonas）属）は、キサントモナス（Xanthomonas）属に属する（以前はその種と呼ばれた）生物をＢｅｒｇｅｙ（１９７４）で定義されたように再グループ化することによって作製された。同様に例えば、アシドモナス（Acidomonas）属は、アセトバクター（Acetobacter）属に属する（そして以前はその種と呼ばれた）生物をＢｅｒｇｅｙ（１９７４）で定義されたように再グループ化することによって作製された。そのように続いて再割当された種も、本明細書で定義する「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１」に含まれる。
【００７５】
他の場合では、このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）の「パート」で定義された属および科に含まれるプロテオバクテリア種は、プロバクテリアの他の既存の属の下で単に再分類された。例えば、シュードモナス（Pseudomonas）属の場合、シュードモナス・エナリア（Pseudomonas enalia）（ATCC 14393）、シュードモナス・ニグリファシエンス（Pseudomonas nigrifaciens）（ATCC 19375）、およびシュードモナス・プトレファシエンス（Pseudomonas putrefaciens）（ATCC 8071）は、アルテロモナス・ハロプランクテイス（Alteromonas haloplanktis）、アルテロモナス・ニグリファシエンス（Alteromonas nigrifaciens）、およびアルテロモナス・プトレファシエンス（Alteromonas putrefaciens）としてそれぞれ以前から再分類されている。同様に例えば、シュードモナス・アシドボランス（Pseudomonas acidovorans）（ATCC 15668）およびシュードモナス・テストステロニ（Pseudomonas testosteroni）（ATCC 11996）は、コマモナス・アシドボランス（Comamonas acidovorans）およびコマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）としてそれぞれ以前から再分類されている；シュードモナス・ニグリファシエンス（Pseudomonas nigrifaciens）（ATCC 19375）およびシュードモナス・ピスキキダ（Pseudomonas piscicida）（ATCC 15057）は、シュードアルテロモナス・ニグリファシエンス（Pseudoalteromonas nigrifaciens）およびシュードアルテロモナス・ピスキキダ（Pseudoalteromonas piscicida）としてそれぞれ以前から再分類されている。そのように続いて再割当された種も、本明細書で定義する「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１」に含まれる。
【００７６】
「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１」は、以前から発見された、または以前からこのＢｅｒｇｅｙ（１９７４）の「パート」の プロテオバクテリア科および／または属の中に属するとして再分類されているプロテオバクテリア種も含む。プロテオバクテリア科に関しては、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１」は、科：シュードモナダセア（Pseudomonadaceae）、アセトバクテラセア（Azotobacteraceae）（今は同義語のシュードモナダセア（Pseudomonadaceae）の「アゾトバクター群」と呼ばれることが多い）、リゾビアセア（Rhizobiaceae）、およびメチロモナダセア（Methylomonadaceae）（今は同義語のメチロモナダセア（Methylomonadaceae）と呼ばれることが多い）のいずれかに属するとして分類されたプロテオバクテリアも含む。結果として、本明細書で記載された以外の属に加えて、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１」に含まれる、さらなるプロテオバクテリア属は：１）アゾリゾフィラス（Azorhizophilus）属のアゾトバクター群細菌；２）セルビブリオ（Cellvibrio）、オリゲラ（Oligella）、およびテレジニバクター（Teredinibacter）属のシュードモナダセア（Pseudomonadaceae）科細菌；３）キレートバクター（Chelatobacter）、エンサイファ（Ensifer）、リベリバクター（Liberibacter）（カンジダタス・リベリバクター（Candidatus Liberibacter）とも呼ばれる）、およびシノリゾビウム（Sinorhizobium）属のリゾビアセア（Rhizobiaceae）科細菌；および４）メチロバクター（Methylobacter）、メチロカルダム（Methylocaldum）、メチロミクロビウム（Methylomicrobium）、メチロサルシナ（Methylosarcina）、およびメチロスフェラ（Methylosphaera）属のメチロコッカセア（Methylococcaceae）科細菌を含む。
【００７７】
１つの実施形態において、宿主細胞は、上で定義したように「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１」から選択される。
【００７８】
別の実施形態において、宿主細胞は「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ２」から選択される。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ２」は、以下の属（カタログに記載され、公に入手可能な、その寄託株の総数をカッコ内に示し、別途示す場合を除いて、すべてATCCに寄託されている）：アシドモナス（Acidomonas）（2）；アセトバクター（Acetobacter）（93）；グルコノバクター（Gluconobacter）（37）；ブレバンジモナス（Brevundimonas）（23）;ベイジェリンキア（Beijerinckia）（13）; デルキシア（Derxia）（2）；ブルセラ（Brucella）（4）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）（79）；キレートバクター（Chelatobacter）（2）；エンサイファ（Ensifer）（3）；リゾビウム（Rhizobium）（144）；シノリゾビウム（Sinorhizobium）（24）；ブラストモナス（Blastomonas）（1）；スフィンゴモナス（Sphingomonas）（27）；アルガリゲネス（Alcaligenes）（88）；ボルデテラ（Bordetella）（43）；ブルクホリデリア（Burkholderia）（73）；ラルストニア（Ralstonia）（33）；アシドボラックス（Acidovorax）（20）；ヒドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）（9）；ゾーグレア（Zoogloea）（9）；メチロバクター（Methylobacter）（2）；メチロカルダム（Methylocaldum）（NCIMBにて１）；メチロコッカス（Methylococcus）（2）；メチロミクロビウム（Methylomicrobium）（2）；メチロモナス（Methylomonas）（9）；メチロサルシナ（Methylosarcina）（１）；メチロスフェラ（Metlaylosphaera）；アゾモナス（Azomonas）（9）；アゾリゾフィラス（Azorhizophilus）（5）；アゾトバクター（Azotobacter）（64）；セルビブリオ（Cellvibrio）（3）；オリゲラ（Oligella）（5）；シュードモナス（Psdudomonas）（1139）；フランシセラ（Francisella）（4）；キサントモナス（Xanthomonas）（229）；ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）（50）；およびオーシャンイモナス（Oceanimonas）（4）のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００７９】
「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ２」の宿主細胞種の例は、これに限定されるわけではないが、以下の細菌（その菌株例のATCCまたは他の寄託番号をカッコ内に示す）：アシドモナス・メタノリカ（Acidomonas methanolica）（ATCC 43581）；アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）（ATCC 15973）；グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）（ATCC 19357）；ブレバンジモナス・ディミヌタ（Brevundimonas diminuta）（ATCC 11568）; Beijerinckia indica（ATCC 9039およびATCC 19361）；デルキシアgummosa（Derxia gummosa）（ATCC 15994）; ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）（ATCC 23456）、ブルセラ・アボルツス（Brucella abortus）（ATCC 23448）；アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ATCC 23308）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）（ATCC 19358）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）（ATCC 11325）；キレートバクターheintzii（Chelatobacter heintzii）（ATCC 29600）；エンサイファ・アドへレンス（Ensifer adhaerens）（ATCC 33212）；リゾビウム・レグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）（ATCC 10004）; シノリゾビウムfredii（Sinorhizobium fredii）（ATCC 35423）；ブラストモナスnatatoria（Blastomonas natatoria）（ATCC 35951）；スフィンゴモナス・パウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）（ATCC 29837）; アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）（ATCC 8750）；ボルデテラ・ペルタシス（Bordetella pertussis）（ATCC 9797）；バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）（ATCC 25416）；ラルストニア・ピックティ（Ralstonia pickettii）（ATCC 27511）；アシドボラックス・ファシリス（Acidovorax facilis）（ATCC 11228）；ヒドロゲノファーガ・フラバ（Hydrogenophaga flava）（ATCC 33667）；ゾーグレア・ラミゲラ（Zoogloea ramigera）（ATCC 19544）；メチロバクター・ルテウス（Methylobacter luteus）（ATCC 49878）；メチロカルダム・グラシル（Methylocaldum gracile）（NCIMB 11912）；メチロコッカス・カプスラタス（Methylococcus capsulatus）（ATCC 19069）；メチロミクロビウムagile（Methylomicrobium agile）（ATCC 35068）；メチロモナス・メタニカ（Methylomonas methanica）（ATCC 35067）；メチロサルシナfibrata（Methylosarcina fibrata）（ATCC 700909）；メチロスフェラ・ハンソニー（Metlaylosphaera hansonii）（ACAM 549）；アゾモナスagilis（Azomonas agilis）（ATCC 7494）；アゾリゾフィラスpaspali（Azorhizophilus paspali）（ATCC 23833）；アゾトバクター・クロロコッカム（Azotobacter Chroococcum）（ATCC 9043）；セルビブリオ・ミクスタス（Cellvibrio mixtus）（UQM 2601）；オリゲラurethralis（Oligella urethralis）（ATCC 17960）；シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）（ATCC 10145）；蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）（ATCC 35858）；フランシセラ・ツラレンシス（Franscisella tularensis）（ATCC 6223）；ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）（ATCC 13637）；キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）（ATCC 33913）；およびオーシャンイモナス・ドウドロッフィ（Oceanimonas doudoroffii）（ATCC 27123）を含む。
【００８０】
別の実施形態において、宿主細胞は「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ３」から選択される。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ３」は、以下の属：ブレバンジモナス（Brevundimonas）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）；リゾビウム（Rhizobium）；シノリゾビウム（Sinorhizobium）；ブラストモナス（Blastomonas）；スフィンゴモナス（Sphingomonas）；アルガリゲネス（Alcaligenes）；ブルクホリデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；アシドボラックス（Acidovorax）；ヒドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）；メチロバクター（Methylobacter）；メチロカルダム（Methylocaldum）；メチロコッカス（Methylococcus）；メチロミクロビウム（Methylomicrobium）；メチロモナス（Methylomonas）；メチロサルシナ（Methylosarcina）；メチロスフェラ（Metlaylosphaera）；アゾモナス（Azomonas）；アゾリゾフィラス（Azorhizophilus）；アゾトバクター（Azotobacter）；セルビブリオ（Cellvibrio）；オリゲラ（Oligella）；シュードモナス（Psdudomonas）；テレジニバクター（Teredinibacter）；フランシセラ（Francisella）；ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）；キサントモナス（Xanthomonas）およびオーシャンイモナス（Oceanimonas）のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００８１】
別の実施形態において、宿主細胞は「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ４」から選択される。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ４」は、以下の属：ブレバンジモナス（Brevundimonas）；ブラストモナス（Blastomonas）；スフィンゴモナス（Sphingomonas）；ブルクホリデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；アシドボラックス（Acidovorax）；ヒドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）；メチロバクター（Methylobacter）；メチロカルダム（Methylocaldum）；メチロコッカス（Methylococcus）；メチロミクロビウム（Methylomicrobium）；メチロモナス（Methylomonas）；メチロサルシナ（Methylosarcina）；メチロスフェラ（Metlaylosphaera）；アゾモナス（Azomonas）；アゾリゾフィラス（Azorhizophilus）；アゾトバクター（Azotobacter）；セルビブリオ（Cellvibrio）；オリゲラ（Oligella）；シュードモナス（Psdudomonas）；テレジニバクター（Teredinibacter）；フランシセラ（Francisella）；ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）；キサントモナス（Xanthomonas）およびオーシャンイモナス（Oceanimonas）のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００８２】
１つの実施形態において、宿主細胞は「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ５」から選択される。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ５」は、以下の属：メチロバクター（Methylobacter）；メチロカルダム（Methylocaldum）；メチロコッカス（Methylococcus）；メチロミクロビウム（Methylomicrobium）；メチロモナス（Methylomonas）；メチロサルシナ（Methylosarcina）；メチロスフェラ（Metlaylosphaera）；アゾモナス（Azomonas）；アゾリゾフィラス（Azorhizophilus）；アゾトバクター（Azotobacter）；セルビブリオ（Cellvibrio）；オリゲラ（Oligella）；シュードモナス（Psdudomonas）；テレジニバクター（Teredinibacter）；フランシセラ（Francisella）；ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）；キサントモナス（ Xanthomonas）およびオーシャンイモナス（Oceanimonas）のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００８３】
宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ６」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ６」は、以下の属：ブレバンジモナス（Brevundimonas）；ブラストモナス（Blastomonas）；スフィンゴモナス（Sphingomonas）；ブルクホリデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；アシドボラックス（Acidovorax）；ヒドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）；アゾモナス（Azomonas）；アゾリゾフィラス（Azorhizophilus）；アゾトバクター（Azotobacter）；セルビブリオ（Cellvibrio）；オリゲラ（Oligella）；シュードモナス（Psdudomonas）；テレジニバクター（Teredinibacter）；ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）；キサントモナス（Xanthomonas）およびオーシャンイモナス（Oceanimonas）のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００８４】
宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ７」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ７」は、以下の属：アゾモナス（Azomonas）；アゾリゾフィラス（Azorhizophilus）；アゾトバクター（Azotobacter）；セルビブリオ（Cellvibrio）；オリゲラ（Oligella）；シュードモナス（Psdudomonas）；テレジニバクター（Teredinibacter）；ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）；キサントモナス（Xanthomonas）；およびオーシャンイモナス（Oceanimonas）のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００８５】
宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ８」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ８」は、以下の属：ブレバンジモナス（Brevundimonas）；ブラストモナス（Blastomonas）；スフィンゴモナス（Sphingomonas）；ブルクホリデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；アシドボラックス（Acidovorax）；ヒドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）；シュードモナス（Psdudomonas）；ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）；キサントモナス（Xanthomonas）およびオーシャンイモナス（Oceanimonas）のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００８６】
宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ９」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ９」は、以下の属：ブレバンジモナス（Brevundimonas）；ブルクホリデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；アシドボラックス（Acidovorax）；ヒドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）；シュードモナス（Psdudomonas）；ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）；およびオーシャンイモナス（Oceanimonas）のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００８７】
宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１０」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１０」は、以下の属：ブルクホリデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；シュードモナス（Psdudomonas）；ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）；およびXanthomonas（キサントモナス）のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００８８】
宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１１」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１１」は、以下の属：シュードモナス（Psdudomonas）；ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）；およびXanthomonas（キサントモナス）のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００８９】
宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１２」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１２」は、以下の属：ブルクホリデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；シュードモナス（Psdudomonas）のプロテオバクテリアの群として定義される。
宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１３」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１３」は、以下の属：ブルクホリデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；シュードモナス（Psdudomonas）およびキサントモナス（Xanthomonas）のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００９０】
宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１４」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１４」は、以下の属：シュードモナス（Psdudomonas）およびキサントモナス（Xanthomonas）のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００９１】
宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１５」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１５」は、シュードモナス（Pseudomonas）属のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００９２】
宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１６」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１６」は、以下のシュードモナス種（その菌株例のATCCまたは他の寄託番号をカッコ内に示す）：シュードモナスabietaniphila（Pseudomonas abietaniphila）（ATCC 700689）；シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）（ATCC 10145）；シュードモナス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）（ATCC 14909）；シュードモナスanguilliseptica（Pseudomonas anguilliseptica）（ATCC 33660）；シュードモナスcitronellolis（Pseudomonas citronellolis）（ATCC 13674）；シュードモナス・フラベセンス（Pseudomonas flavescens）（ATCC 51555）；シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）（ATCC 25411）；シュードモナス・ニトロレデュセンス（Pseudomonas nitroreducens）（ATCC 33634）；シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）（ATCC 8062）；シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）（ATCC 17440）；シュードモナス・レシノボランス（Pseudomonas resinovorans）（ATCC 14235）；シュードモナス・ストラミネア（Pseudomonas straminea）（ATCC 33636）；シュードモナスagarici（Pseudomonas agarici）（ATCC 25941）；シュードモナス・アルカリフィア（Pseudomonas alcaliphila） ; シュードモナスalginovora（Pseudomonas alginovora）;シュードモナス・アンダーソニー（Pseudomonas andersonii）；シュードモナスasplenii（Pseudomonas asplenii）（ATCC 23835）；シュードモナス・アゼライカ（Pseudomonas azelaica）（ATCC 27162）；シュードモナスbeijerinckii（Pseudomonas beijerinckii）（ATCC 19372）；シュードモナス・ボレアリス（Pseudomonas  borealis）；シュードモナス・ボレオポリス（Pseudomonas boreopolis）（ATCC 33662）；シュードモナスbrassicacearum（Pseudomonas brassicacearum）;シュードモナスbutanovora（Pseudomonas butanovora）ATCC 43655）；シュードモナス・セルローサ（Pseudomonas cellulosa）（ATCC 55703）；シュードモナス・オウランチアカ（Pseudomonas aurantiaca）（ATCC 33663）；シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）（ATCC 9446, ATCC 13985, ATCC 17418, ATCC 17461）；シュードモナス・フラギ（Pseudomonas fragi）（ATCC 4973）； シュードモナスlundensis（Pseudomonas lundensis）（ATCC 49968）；シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）（ATCC 4683）；シュードモナスcissicola（Pseudomonas cissicola）（ATCC 33616）；シュードモナス・コロナファシエンス（Pseudomonas coronafaciens）；シュードモナスditerpeniphila（Pseudomonas diterpeniphila）；シュードモナス・エロンガタ（Pseudomonas elongata）（ATCC 10144）；シュードモナスflectens（Pseudomonas flectens）（ATCC 12775）；シュードモナス・アゾトフォルマンス（Pseudomonas azotoformans）；シュードモナスbrenneri（Pseudomonas brenneri）; シュードモナスcedrella（Pseudomonas cedrella）；シュードモナスcorrugata（Pseudomonas corrugata）（ATCC 29736）；シュードモナスextremorientalis（Pseudomonas extremorientalis）；蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）（ATCC 35858）；シュードモナスgessardii（Pseudomonas gessardii）;シュードモナスlibanensis（Pseudomonas libanensis）；シュードモナスmandelii（Pseudomonas mandelii）（ATCC 700871）；シュードモナス・マルギナリス（Pseudomonas marginalis）（ATCC 10844）；シュードモナスmigulae（Pseudomonas migulae）；シュードモナスmucidolens（Pseudomonas mucidolens）（ATCC 4685）；シュードモナス・オリエンタリス（Pseudomonas orientalis）；シュード���ナスrhodesiae（Pseudomonas rhodesiae）；シュードモナスsynxantha（Pseudomonas synxantha）（ATCC 9890）；シュードモナス・トラシイ（Pseudomonas tolaasii）（ATCC 33618）；シュードモナスveronii（Pseudomonas veronii）（ATCC 700474）；シュードモナスfrederiksbergensis（Pseudomonas frederiksbergensis）；シュードモナスgeniculata（Pseudomonas geniculata）（ATCC 19374）；シュードモナスgingers（Pseudomonas gingers）；シュードモナス・グラミニス（Pseudomonas graminis）；シュードモナスgrimontii（Pseudomonas grimontii）；シュードモナス・ハロデニトリフィカンス（Pseudomonas halodenitrificans）；シュードモナス・ハロフィラ（Pseudomonas halophila）；シュードモナスhibiscicola（Pseudomonas hibiscicola）（ATCC 19867）；シュードモナスhuttiensis（Pseudomonas huttiensis）（ATCC 14670）；シュードモナスhydrogenovora（Pseudomonas hydrogenovora）；シュードモナス・ジェッセニイ（Pseudomonas jessenii）（ATCC 700870）；シュードモナスkilonensis（Pseudomonas kilonensis）；シュードモナス・ランセオラータ（Pseudomonas lanceolata）（ATCC 14669）；シュードモナス・リニ（Pseudomonas lini）；シュードモナス・マルギナータ（Pseudomonas marginata）（ATCC 25417）；シュードモナスmephitica（Pseudomonas mephitica）（ATCC 33665）；シュードモナス・デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）（ATCC 19244）；シュードモナスpertucinogena（Pseudomonas pertucinogena）（ATCC 190）；シュードモナスpictorum（Pseudomonas pictorum）（ATCC 23328）；シュードモナス・サイクロフィラム（Pseudomonas psychrophila）；シュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）（ATCC 31418）；シュードモナスmonteilii（Pseudomonas monteilii）（ATCC 700476）；シュードモナスmosselii（Pseudomonas mosselii）；シュードモナス・オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）（ATCC 43272）；シュードモナスplecoglossicida（Pseudomonas plecoglossicida）（ATCC 700383) ；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）（ATCC 12633）；シュードモナス・リアクタンツ（Pseudomonas reactants）; シュードモナス・スピノサ（Pseudomonas spinosa）（ATCC 14606）；シュードモナス・バレアリカ（Pseudomonas balearica）；シュードモナス・ルテオラ（Pseudomonas luteola）（ATCC 43273）；シュードモナス・スツッエリ（Pseudomonas stutzeri）（ATCC 17588）；シュードモナス・amygdali（Pseudomonas amygdali）（ATCC 33614）；シュードモナスavellanae（Pseudomonas avellanae）（ATCC 700331）；シュードモナスcaricapapayae（Pseudomonas caricapapayae）（ATCC 33615) ；シュードモナス・チコリアイ（Pseudomonas cichorii）（ATCC 10857）；シュードモナスficuserectae（Pseudomonas ficuserectae）（ATCC 35104）；シュードモナスfuscovaginae（Pseudomonasfuscovaginae）；シュードモナスmeliae（Pseudomonas meliae）（ATCC 33050）；シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringe）（ATCC 19310）；シュードモナス・ビリジフラバ（Pseudomonas viridiflava）（ATCC 13223）；シュードモナス・サーモカルボキシドボランス（Pseudomonas thermocarboxydovorans）（ATCC 35961）；シュードモナス・サーモトレランス（Pseudomonas thermotolerans）；シュードモナスthivervalensis（Pseudomonas thivervalensis）；シュードモナスvancouverensis（Pseudomonas vancouverensis）（ATCC 700688）；シュードモナスwisconsinensis（Pseudomonas wisconsinensis）；およびシュードモナスxiamenensis（Pseudomonas xiamenensis）のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００９３】
宿主細胞「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１７」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１７」は、例えば、以下のシュードモナス（Pseudomonas）種：シュードモナス・アゾトフォルマンス（Pseudomonas azotoformans）；シュードモナスbrenneri（Pseudomonas brenneri）；シュードモナスcedrella（Pseudomonas cedrella）；シュードモナスcorrugata（Pseudomonas corrugata）；シュードモナスextremorientalis（Pseudomonas extremorientalis）；蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）；シュードモナスgessardii（Pseudomonas gessardii）；シュードモナスlibanensis（Pseudomonas libanensis）；シュードモナスmandelii（Pseudomonas mandelii）；シュードモナス・マルギナリス（Pseudomonas marginalis）；シュードモナスmigulae（Pseudomonas migulae）；シュードモナスmucidolens（Pseudomonas mucidolens）；シュードモナス・オリエンタリス（Pseudomonas orientalis）；シュードモナスrhodesiae（Pseudomonas rhodesiae）；シュードモナスsynxantha（Pseudomonas synxantha）；シュードモナス・トラシイ（Pseudomonas tolaasii）；およびシュードモナスveronii（Pseudomonas veronii）に属するものを含む、「フロオレッセント・シュードモナズ（fluorescent Pseudomonads）」として当該分野で公知のプロテオバクテリアの群として定義される。
【００９４】
宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１８」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１８」は、例えば、以下（菌株例のATCCまたは他の寄託番号をカッコ内に示す）：ビオバル１またはビオバルＩとも呼ばれる、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）バイオタイプＡ（ATCC13525) ；ビオバル２またはビオバルＩＩとも呼ばれる、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）バイオタイプＢ（ATCC 17816）；ビオバル３またはビオバルＩＩＩとも呼ばれる、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）バイオタイプＣ（ATCC 17400）；ビオバル４またはビオバルＩＶとも呼ばれる、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）バイオタイプＦ（ATCC12983）；ビオバル５またはビオバルＶとも呼ばれる、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）バイオタイプＧ（ATCC 17518）；蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）ビオバルＶＩ；蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）ＰｆＯ−１；蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）Ｐｆ−５（ATCC BAA-477）；蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）ＳＢＷ２５；および蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）subsp.cellulosa（NCIMB 10462）に属するものを含む、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）種の亜種、変異体、菌株、および他のサブスペシャル単位すべての群として定義される。
【００９５】
宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１９」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１９」は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）バイオタイプＡのすべての菌株の群として定義し得る。このバイオタイプの特に特別な菌株は、蛍光菌（P. fluorescens）菌株ＭＢ１０１（Wilcoxへの米国特許第5,169,760を参照）、およびその誘導体である。
【００９６】
１つの実施形態において、宿主細胞は、 シュードモナス目（Pseudomonadale）のプロテオバクテリアのいずれかである。特定の実施形態において、宿主細胞は、シュードモナダセア科（Pseudomonadaceae）のプロテオバクテリアのいずれかである。
【００９７】
特定の実施形態において、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１」から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ２」から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ３」から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ５」から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ７」から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１２」から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１５」から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１７」から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１８」から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア・サブグループ１９」から選択される。
【００９８】
本発明で使用され得るさらなる蛍光菌（P.fluorescens）菌株は、以下のATCC呼称：[NCIB 8286]；NRRL B-1244；NCIB 8865菌株CO1；NCIB 8866菌株C02；1291[ATCC 17458；IFO 15837；NCIB 8917；LA；NRRL B-1864；ピロリジン；PW2[ICMP 3966；NCPPB 967；NRRL B-899] ；13475；NCTC 10038；NRRL B-1603[6；IFO 15840]；52-1C；CCEB 488-A[BU140]；CCEB 553[IEM15/47]；IAM 1008[AHH-27]；IAM 1055[AHH-23]；1[IFO15842]；12[ATCC 25323；NIH 11；den Dooren de Jong 216]；18[IFO 15833；WRRL P-7]；93[TR-10]；108[52-22；IFO 15832]；143[IFO15836；PL]；149[2-40-40；IFO 15838]；182[IFO 3081；PJ 73]；184[IFO 15830]；185[W2 L-1]；186[IFO 15829；PJ79]；187[NCPPB 263]；188[NCPPB 316]；189[PJ227；1208]；191[IFO 15834； PJ 236；22/1]；194[Klinge R-60；PJ 253]；196[PJ288]；97[PJ 290]；198[PJ302]；201[PJ 368]；202[PJ 372]；203[PJ 376]；204[IFO 15835；PJ 682]；205[PJ 686]；206[PJ 692]；207[PJ 693]；208[PJ 722]；212[PJ 832]；215[PJ 849]；216[PJ 885]；267[B-9]；271[B-1612]；401[C71A；IFO 15831；PJ 187]；NRRLB-3178[4；IFO 15841]；KY 8521；3081；30-21；[IFO 3081]；N；PYR；PW；D946-B83[BU 2183；FERM-P 3328]；P-2563[FERM-P 2894；IFO 13658]；IAM-1126[43F]；M-1；A506[A5-06]；A505[A5-05-1]；A526[A5-26]；B69；72；NRRL B-4290；PMW6[NCIB 11615]；SC 12936；Al[IFO15839]；F 1847[CDC-EB]；F 1848[CDC 93]；NCIB 10586；P17；F-12；AmMS 257；PRA25；6133D02；6519E01；N1；SC15208；BNL-WVC；NCTC 2583[NCIB 8194]；H13；1013[ATCC 11251；CCEB 295]；IFO 3903；1062；またはPf-5を有する、蛍光菌Migula（Pseudomonas fluorescens Migula）および蛍光菌Loitokitok（Pseudomonas fluorescens Loitokitok）を含む。
【００９９】
ＩＩ．栄養要求性選択マーカー
本発明は、少なくとも１つの代謝産物に対して栄養要求性を誘導するように遺伝子改変されたシュードモナス（Pseudomonads）および関連する細胞を提供する。遺伝子改変は、代謝経路、例えば、同化生合成経路または異化利用経路において作用する酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子に対して可能である。好ましくは、宿主細胞は、生体触媒活性を確実に除去するために、除去または不活性化された所与の生体触媒活性をコードするすべての作用する遺伝子を有する。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）細胞である。
【０１００】
１つまたはそれ以上の代謝活性が、ノックアウトまたは交換のために選択される。（複数の）天然の栄養要求株の場合、追加の代謝ノックアウトまたは交換を提供し得る。複数の活性を選択する場合、栄養要求株回復選択マーカーは、生合成型（同化）または利用型（異化）であり、あるいは、両方の型から選択され得る。選択した化合物の所与の生合成経路での例えば、１つまたはそれ以上の活性をノックアウトし得る；あるいは、それぞれ異なる生合成経路からの１つを超える活性をノックアウトし得る。次に、対応する１つまたは複数の活性は、細胞への形質転換時に細胞に対する原栄養性を回復する少なくとも１つの組換えベクターによって供給される。
【０１０１】
栄養要求性宿主細胞を産生するためにその生合成または利用が標的にし得る化合物および分子は：例えば、脂肪酸を含む脂質；例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、グルコース−６−ホスフェート、およびグルコン酸、ならびにＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆおよびペントースホスフェート経路中間体および生成物も含む、モノおよびジサッカライドならびにその置換誘導体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、ジヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ＦＭＮ、ＦＡＤ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰを含む）、窒素含有塩基（例えば、ピリジン、プリン、ピリミジン、プテリン、およびヒドロ−、デヒドロ−、および／または置換窒素含有塩基誘導体、例えば、コファクター、例えば、ビオチン、コバマミド、リボフラビン、チアミンを含む）；有機酸ならびに解糖およびクエン酸回路中間体および生成物（例えば、ヒドロキシ酸およびアミノ酸を含む）；貯蔵炭水化物および貯蔵ポリ（ヒドロキシアルカノアート）ポリマー（例えば、セルロース、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、ポリヒドロキシブチラート、およびポリラクテートを含む）を含む。
【０１０２】
１つの実施形態において、栄養要求性宿主細胞を産生するためにノックアウトされた生体触媒活性は：脂質；ヌクレオシド、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、窒素含有塩基、および窒素含有塩基誘導体；有機酸ならびに解糖およびクエン酸回路中間体および生成物からなる群から選択される。好ましくは、ノックアウトされた生体触媒活性は：ヌクレオシド、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、窒素含有塩基、および窒素含有塩基誘導体；有機酸ならびに解糖およびクエン酸回路中間体および生成物からなる群から選択される。より好ましくは、ノックアウトされた生体触媒活性は：ピリミジンヌクレオシド、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、窒素含有塩基、および窒素含有塩基誘導体；アミノ酸からなる群から選択される。
【０１０３】
所与のトランスジェニック宿主細胞は、１つまたはそれ以上の選択マーカーまたは選択マーカー系を使用する。例えば、本発明による１つまたはそれ以上の生合成選択マーカーまたは選択マーカー系は、互いに共に使用し得るか、および／または本発明による利用型選択マーカーまたは選択マーカー系と組み合せて使用し得る。これらの原栄養可能（prototrophy-enabling）実施形態のいずれの１つにおいても、宿主細胞は、１つまたはそれ以上の非栄養要求性選択マーカーまたは選択マーカー系も含むことがある。非栄養要求性選択マーカーおよび系の例は、例えば、：毒素耐性マーカー遺伝子、例えば、抗生物質を分解する酵素活性をコードする抗生物質耐性遺伝子；毒素耐性マーカー遺伝子、例えば、酵素をそのような変異を含有しない酵素の変異体によって示された毒素阻害に対して非感受性にする変異が発現される、アセトラクテートシンターゼ（「ＡＬＳ」；EC 2.2.1.6）のイミダゾリノン耐性ミュータントを含む。化合物は、この効果を直接発揮する；または化合物は、例えば、化合物を毒素形態に変換する細胞の代謝作用の結果として、または化合物と少なくとも１つのさらなる化合物との組合せの結果として、この効果を間接的に発揮する。
【０１０４】
そのようなマーカー酵素をコードする細菌性宿主作用遺伝子は、ノックアウト細胞の作製用に選択された細菌宿主細胞株から、他の細菌から、または他の生物から入手可能であり、天然の形態または改変（例えば、変異または配列組換え）形態で使用される。例えば、ノックアウト生体触媒活性を示す酵素のＤＮＡをコードする配列は、１つまたはそれ以上の生物から入手され、次に宿主細胞内で作用するＤＮＡ調節要素に作動可能に結合される。特に、選択された酵素活性をコードする選択された宿主の細胞内遺伝子のすべてがノックアウトされる；次に細菌ノックアウト宿主を、細菌ノックアウトによって活性喪失を示す酵素をコードする、天然のまたは非天然の遺伝子の少なくとも１つの作用コピーを含有するベクターによって形質転換する。
【０１０５】
そのような酵素をコードする細菌および他の遺伝子は、当業者が利用し得る種々の供給源を通じて選択および入手され得る。これらは、酵素をコードする配列および種−作用ＤＮＡ調節要素のヌクレオチド配列を含む。有用なオンライン・インターネットリソースは、例えば：（１）例えば、http://us.expasy.org/で入手され得る、Swiss Institute of Bioinformatics（Batiment Ecole de Pharmacie, Room 3041;Universite de Lausanne ; １０１５  ローザンヌ−ドリニー；スイス）のExPASy proteomics facility（ENZYME and BIOCHEMICAL 経路S MAPS featuresを参照）；および（２）National Center for Biotechnology Information（NCBI, National Library of Medicine, National Institutes of Health, U. S. Dept. of Health & Human Services; Building 38A; ベセズダ、メリーランド州米国）によって提供され、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi.にて入手され得る、GenBank facilityおよび他のEntrezリソース（PUBMED, PROTEIN, NUCLEOTIDE, STRUCTURE, GENOME, et al. featuresを参照）を含む。
【０１０６】
選択したコード配列は、その遺伝子コードを細菌宿主細胞によって利用される遺伝子コードに一致するように変更することによって改変され、そのコドン配列は、宿主によって利用されるコドン配列にさらに近づくように強化され得る。遺伝子コードの選択およびコドン頻度強化は、当業者に公知の種々の方法のいずれか、例えば、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発に従って実施され得る。このプロセスを補助するための有用なオンライン・インターネットリソースは、例えば：（１）かずさＤＮＡ研究所（千葉県木更津市かずさ鎌足２−６−７、２９２−０８１８、日本）の、http://www.kazusa.or.jp/codon/で利用され得る、Codon Usage Database；および（２）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi?mode=c.のNCBI Taxonomy databaseからGenetic Codes tables利用され得るを含む。例えば、シュードモナス（Pseudomonas）種は、NCBI TaxonomyサイトのGenetic Code翻訳 Table 11の利用して、かずさのサイトではhttp://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/.に示された表のコドン使用頻度を示して報告されている。
【０１０７】
特定の実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）は、宿主細胞として使用され得る。１つの実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）は、少なくとも１つの栄養要求性選択マーカー遺伝子を提供する。代替的な実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）は、すべての栄養要求性選択マーカー遺伝子を提供する。特定の実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）は、宿主細胞であるのと同時に、少なくとも１つの、好ましくはすべての栄養要求性選択マーカー遺伝子を提供し得る。
【０１０８】
生合成ヌクレオシドおよび窒素含有塩基選択マーカー
１つの実施形態において、同化代謝に関与する生合成酵素は、栄養要求性選択マーカーとして選択され得る。特に生合成酵素は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、窒素含有塩基、および窒素含有塩基誘導体の生合成に関与するものから選択され得る。
【０１０９】
特定の実施形態において、少なくとも１つのプリン型生合成酵素が栄養要求性選択マーカーとして選択され得る。そのようなプリン生合成酵素は、例えば、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アデニロスクシナートリアーゼ、アデニロスクシナートシンターゼ、ＧＭＰシンターゼ、ＩＭＰシクロヒドロラーゼ、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ、ホスホリボシルアミン−グリシンリガーゼ、ホスホリボシル−アミノイミダゾールカルボキサミドホルミルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンターゼ、ホスホリボシル−ホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼ、ホスホリボシル−ホルミルグリシンアミジンシンターゼ、ホスホリボシル−グリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ、リボース−ホスフェートジホスホキナーゼ、およびリボース−５−ホスフェート−アンモニアリガーゼを含む。
【０１１０】
別の特定の実施形態において、ピリミジン型生合成酵素を栄養要求性選択マーカーとして選択し得る。そのようなピリミジン型生合成は、ＵＭＰの生合成に関与する酵素、例えば、カルバメートキナーゼ（EC 2.7.2.2）、カルバモイル−ホスフェートシンターゼ（EC 6.3.5.5）、アスパルテートカルバモイルトランスフェラーゼ（EC 2.1.3.2）、ジヒドロオロターゼ（EC 3.5.2.3）、ジヒドロオロタートデヒドロゲナーゼ（EC 1.3.3.1）、オロタートホスホリボシルトランスフェラーゼ（「ＯＰＲＴ」；EC 2.4.2.10）、およびオロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ（「ODCase」；EC 4.1.1.23)を含む。
【０１１１】
ピリミジン型生合成酵素をコードする遺伝子の例は周知である。ＵＭＰの細菌合成の場合、有用な遺伝子の例は：カルバメートキナーゼをコードするａｒｃＣ遺伝子；カルバモイル−ホスフェートシンターゼを集合的に（collectively）コードするｃａｒＡおよびｃａｒＢ遺伝子；アスパルテートカルバモイトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＢ遺伝子；ジヒドロオロターゼをコードするｐｙｒＣ遺伝子；ジヒドロオロタートデヒドロゲナーゼを単独でまたは集合的にコードするｐｙｒＤ遺伝子；オロタートホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子；およびオロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼをコードするｐｙｒＦ遺伝子を含む。
【０１１２】
特定の実施形態において、本発明による発現系は、ｐｙｒＦ栄養要求性選択マーカー遺伝子を利用する。ｐｙｒＦ遺伝子は、細菌ピリミジンヌクレオチド生合成経路に必要な酵素であるＯＤＣａｓｅをコードして、それにより細胞は、ピリミジンヌクレオチド（UTP、CTP）ならびにピリミジンデオキシヌクレオチド（ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）のデノボ合成を適正に行う。経路の最初の反応物質は、ＡＴＰ、アミノ基源（すなわちアンモニウムイオンまたはＬ−グルタミン）、およびカルボキシル基源（すなわち二酸化炭素または重炭酸イオン）である；経路の最後の生成物はｄＴＴＰであり、ｄＣＴＰ、ＵＴＰ、およびＣＴＰもプロセスで生成される。特に細菌デノボピリミジンヌクレオチド生合成経路は、カルバモイルホスフェートの生成で開始する。カルバモイルホスフェートは：（ａ）ａｒｃＣ遺伝子によってコードされるカルバメートキナーゼ（EC 2.7.2.2）の作用；またはさらに一般的には、（ｂ）その小および大サブユニットがｃａｒＡおよびｃａｒＢ遺伝子によってそれぞれコードされる、グルタミン加水分解されたカルバモイル−ホスフェートシンターゼ（EC 6.3.5.5）の作用のいずれかによって合成される。次にカルバモイルホスフェートは、以下の６ステップ経路によってＵＤＰに変換される：１）ｐｙｒＢによってコードされるアスパルテートカルバモイルトランスフェラーゼ（EC 2.1.3.2）による、カルバモイルホスフェートからＮ−カルバモイル−Ｌ−アスパルテートへの変換；次に２）ｐｙｒＣによってコードされるジヒドロオロターゼ（EC 3.5.2.3）による、その（Ｓ）−ジヒドロオロタートへの変換；次に３）ｐｙｒＤ遺伝子によってコードされるジヒドロオロタートデヒドロゲナーゼ（EC 1.3.3.1）による、そのオロタートへの変換；次に４）ｐｙｒＥによってコードされるオロタートホスホリボシルトランスフェラーゼ（「ＯＰＲＴ」；EC 2.4.2.10）による、そのオロチジン−５’−モノホスフェート（「ＯＭＰ」）への変換；そして次に５）ｐｙｒＦによってコードされるオロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ（「ＯＤＣａｓｅ」；EC 4.1.1.23）による、そのウリジン−５’−モノホスフェート（「ＵＭＰ」）への変換。次にピリミジンヌクレオチド（ＵＴＰ、ＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）、核酸、核タンパク質、および他の細胞代謝産物の合成のための種々の経路によって、ＵＭＰを利用する。
【０１１３】
ｃａｒＡ、ｃａｒＢ、またはｐｙｒＢ−ｐｙｒＦ遺伝子の１つまたはそれ以上が不活性化または消失する、あるいは非機能性酵素をコードするように変異される細菌において、細胞が機能するウラシル回収経路を含有するという条件で、ウラシルが培地に添加されるならば、細胞はなお増殖し得る。ほとんどの細菌は、シュードモナス（Pseudomonads）および関連種を含めて、天然のウラシル回収経路を含有する。ウラシル回収経路では、細胞は外来性ウラシルをＵＭＰに導入および変換して、必要なピリミジンヌクレオチドを合成する。ここでは、ウラシルは５−ホスホリボシル−１−ピロホスフェートと反応して、ｕｐｐ遺伝子によってコードされるウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（EC 2.4.2.9）、またはｐｙｒＲによってコードされる２官能性ピリミジンオペロン調節タンパク質（「ｐｙｒＲ２官能性タンパク質」）のいずれかの作用によって、ＵＭＰを生成する。得られたＵＭＰは上記したように、次にＵＤＰに、そして続いてピリミジンヌクレオチドに変換される。
【０１１４】
結果として、ｐｙｒＦ（−）シュードモナス（Pseudomonad）または関連細胞は、ウラシル含有培地上で維持され得る。ｐｙｒＦ遺伝子含有ＤＮＡ構築物をｐｙｒＦ（−）細胞にトランスフェクトおよび発現させて、機能するＯＤＣａｓｅ酵素を形成した後、得られた複合ｐｙｒＦ（＋）プラスミド−宿主細胞系は、ウラシルが欠乏した培地で維持され得る。
【０１１５】
シュードモナス（Pseudomonad）または関連宿主細胞で使用するためのｐｙｒＦ遺伝子のコード配列は、機能するＯＤＣａｓｅを生成するために選択されたシュードモナス（Pseudomonad）または関連宿主細胞によってコード配列が転写、翻訳、そしてそうでなければ処理されるという条件で、オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ酵素（「ＯＤＣａｓｅ」）をコードするいずれの遺伝子によっても供給され得る。ｐｙｒＦをコードする配列は天然の配列であるか、または、例えば、当該分野で公知の１つまたはそれ以上の配列変更、配列結合、および／または配列生成技術の利用から得られた操作配列である。ｐｙｒＦ選択マーカー遺伝子の一部として使用する前に、選択したコード配列を選択したシュードモナス（Pseudomonad）または関連宿主細胞の遺伝子コードおよび／または、まずコドン使用頻度に従って改良または最適化され得る。発現可能なコード配列は、選択した宿主細胞内で機能し得る転写プロモーター、ならびに他の必要な転写および翻訳調節要素すべてに作動可能に結合される。上記のｐｙｒＦ遺伝子の天然のコード配列は、それが上記の要件を満足するという条件で、細菌から、または他の任意の生物から入手され得る。
【０１１６】
１つの実施形態において、ｐｙｒＦをコードする配列は、選択マーカーとして使用されることが意図されているシュードモナス（Pseudomonad）または関連宿主細胞から単離される。ｐｙｒＦ遺伝子全体（コード配列および周囲の調節領域を含む）は、そこから単離され得る。特定の実施形態において、ｐｙｒＦ遺伝子またはコード配列を提供する細菌は、シュードモナス目（Pseudomonadales）の構成要素（ｍｅｍｂｅｒ）、シュードモナス亜目（Pseudomonadineae）の構成要素、シュードモナダセア科（Pseudomonadaceae）の構成要素、シュードモナス族（Pseudomonadeae）の構成要素、シュードモナス属（Pseudomonas）の構成要素、および蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）種群の構成要素（すなわち「フルオレッセント・シュードモナズ」）からなる群から選択される。特定の実施形態において、細菌は、種蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）に属する。
【０１１７】
特定の実施形態において、ｐｙｒＦ遺伝子は、配列番号１の核酸配列（表２）、またはその変異体を含有する。あるいは、ｐｙｒＦ遺伝子によってコードされるＯＤＣａｓｅは、本発明による所与の宿主細胞によって使用される遺伝子コードに従って、配列番号２のアミノ酸配列（表３）、その変異体、またはそれと重複するコドン配列を有する変異体を含有する。
【０１１８】
あるいは、ｐｙｒＦ遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、および９５％相同である核酸配列からなる群から選択される、ＯＤＣａｓｅ酵素をコードする核酸配列を含有する。同様にｐｙｒＦ遺伝子は、配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、および９５％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるＯＤＣａｓｅをコードする。
【０１１９】
別の実施形態において、ｐｙｒＦ遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド９７４−１６６９のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同であるヌクレオチド配列を有するコード配列を含有し得る。
【０１２０】
特定の実施形態において、ｐｙｒＦ遺伝子は、ハイブリダイゼーションが高ストリンジェントな条件下で実施されたときに、配列番号３のアンチコドン配列（表４）にハイブリダイズするコドン配列を有するコード配列を含有し得るか、またはそれと重複するコドン配列を有し得る。特に特定の実施形態において、ｐｙｒＦ遺伝子は配列番号３のヌクレオチド配列を含有する。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【０１２１】
代替的な実施形態において、本発明による発現系は、ｔｈｙＡ栄養要求性選択マーカー遺伝子を利用する。ｔｈｙＡ遺伝子は、細菌ピリミジンヌクレオチド生合成経路に必要な酵素の、チミジラートシンターゼ（EC 2.1.1.45）をコードする。ＤＮＡはウラシルの代わりにチミン（５−メチルウラシル）を主要な塩基として含有するため、チミジンモノホスフェート（ｄＴＭＰまたはチミジラート）の合成は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰと共に、ＤＮＡ複製に必要なｄＴＴＰ（チミジントリホスフェート）を供給するために不可欠である。５，１０−メチレンテトラヒドロフォラートをメチル基源として利用する、チミジラートシンターゼによるｄＵＭＰのメチル化は、チミジラートを生成する。チミジラートシンターゼの除去、阻害、または破壊によって、チミジラート合成を中断、そして続いてのＤＮＡの合成を停止させ得る。
【０１２２】
ｔｈｙＡ遺伝子が不活性化または消失する、あるいは非機能性酵素をコードするように変異される細菌において、外来性チミジンが培地に添加されるならば、細胞はなお増殖し得る。
【０１２３】
蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）において、外来性チミジンでの生存のためには、チミジンキナーゼをコードする大腸菌（E.coli）ｔｄｋ遺伝子の添加が必要である。したがって選択の前に、ｔｄｋ遺伝子を含むプラスミドを使用してｔｈｙＡ（−）蛍光菌（P.fluorescens）宿主細胞を形質導入して、ｔｈｙＡ（−）／ｐｔｄｋ細胞を産生させて、チミジン含有培地での生存を可能にし得る。あるいは、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）において外来性チミジンを利用し得る機能性チミジラートシンターゼ酵素を生成するｔｄｋ遺伝子をゲノムに挿入して、ｔｈｙＡ（−）／ｔｄｋ（＋）宿主細胞を産生し得る。ｔｈｙＡ遺伝子含有ＤＮＡ構築物をｔｈｙＡ（−）／ｐｔｄｋ細胞にトランスフェクションして、発現させて機能チミジラートシンターゼ酵素を生成した後に、得られた組み合わせｔｈｙＡ（＋）プラスミド−宿主細胞系は、チミジン欠乏培地中で維持され得る。
【０１２４】
シュードモナス（Pseudomonad）または関連宿主細胞で使用するためのｔｈｙＡ遺伝子のコード配列は、機能性ＴＳを生成するために選択されたシュードモナス（Pseudomonad）または関連宿主細胞によってコード配列が転写、翻訳、そしてそうでなければ処理されるという条件で、チミジラートシンターゼ酵素（「ＴＳ」）をコードするいずれの遺伝子によっても供給され得る。ｔｈｙＡをコードする配列は天然の配列であるか、または、例えば、当該分野で公知の１つまたはそれ以上の配列変更、配列結合、および／または配列生成技術の利用から生じた操作配列である。ｔｈｙＡ選択マーカー遺伝子の一部として使用する前に、選択したコード配列を、まず、選択したシュードモナス（Pseudomonad）または関連宿主細胞の遺伝子コードおよび／またはコドン使用頻度に従って改良または最適化し得る。発現可能なコード配列は、選択した宿主細胞内で機能し得る転写プロモーター、ならびに他の必要な転写および翻訳調節要素すべてに作動可能に結合される。上記のｔｈｙＡ遺伝子の天然のコード配列は、それが上記の要件を満足するという条件で、細菌から、または他の任意の生物から入手され得る。
【０１２５】
１つの実施形態において、ｔｈｙＡをコードする配列は、選択マーカーとして使用されることが意図されているシュードモナス（Pseudomonad）または関連宿主細胞から単離される。ｔｈｙＡ遺伝子全体（コード配列および周囲の調節領域を含む）は、そこから単離され得る。特定の実施形態において、ｔｈｙＡ遺伝子またはコード配列を提供する細菌は、シュードモナス目（Pseudomonadales）の構成要素、シュードモナス亜目（Pseudomonadineae）の構成要素、シュードモナダセア科（Pseudomonadaceae）の構成要素、シュードモナス族（Pseudomonadeae）の構成要素、シュードモナス属（Pseudomonas）の構成要素、および蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）種群の構成要素（すなわち「フルオレッセント・シュードモナズ」）からなる群から選択される。特定の実施形態において、細菌は、種蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）に属する。
【０１２６】
特定の実施形態において、ｔｈｙＡ遺伝子は、配列番号４の核酸配列（表５）を含有する。あるいは、ｔｈｙＡ遺伝子によってコードされるTSは、本発明による所与の宿主細胞によって使用される遺伝子コードに従って、配列番号５のアミノ酸配列（表６）、その変異体、またはそれと重複するコドン配列を有する変異体を含有する。
【表５】
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【表６】
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【０１２７】
生合成アミノ酸選択マーカー
代替的な実施形態において、栄養要求性選択マーカーとして選択された、同化代謝に関与する生合成酵素は、アミノ酸の生合成ものから選択され得る。特定の実施形態において、生合成アミノ酸酵は：グルタメートファミリー（Ｇｌｕ；Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、およびＡｒｇ）；アスパルテートファミリー（Ａｓｐ；Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、およびＩｌｅ）；セリンファミリー（Ｓｅｒ；ＧｌｙおよびＣｙｓ）；ピルベートファミリー（Ａｌａ、Ｖａｌ、およびＬｅｕ）；芳香族ファミリー（Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、およびＴｙｒ）；およびヒスチジンファミリー（Ｈｉｓ）の生合成にて活性な酵素からなる群から選択される。これらの生合成経路に関与する遺伝子および酵素の例は：例えば、ａｒｇＡ−ａｒｇＨ、ｇｄｈＡ、ｇｌｎＡ、ｐｒｏＡ、ｐｒｏＣを含む、グルタメートファミリー構成要素ａｒｇ、ｇｄｈ、ｇｌｎ、およびｐｒｏ遺伝子；例えば、ａｓｎＡ、ａｓｎＢ、ａｓｐＣ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ−ｄａｐＦ、ｌｙｓＡ、ｌｙｓＣ、ｍｅｔＡ−ｍｅｔＣ、ｍｅｔＥ、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＬ、ｔｈｒＡ−ｔｈｒＣを含む、アスパルテートファミリー構成要素ａｓｄ、ａｓｎ、ａｓｐ、ｄａｐ、ｌｙｓ、ｍｅｔ、およびｔｈｒ遺伝子；例えば、ｃｙｓＥ、ｃｙｓＫ、ｇｌｙＡ、ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣを含む、セリンファミリー構成要素ｃｙｓ、ｇｌｙ、およびｓｅｒ遺伝子；例えば、ａｒｏＡ−ａｒｏＨ、ａｒｏＫ、ａｒｏＬ、ｔｒｐＡｔｒｐＥ、ｔｙｒＡ、およびｔｙｒＢを含む、芳香族ファミリー構成要素ａｒｏ、ｐｈｅ、ｔｒｐ、およびｔｙｒ遺伝子；ならびにｈｉｓＡ−ｈｉｓＤ、ｈｉｓＦ−ｈｉｓＨを含む、ヒスチジンファミリー構成要素ｈｉｓ遺伝子を含む。
【０１２８】
さらに特定の実施形態において、栄養要求性選択マーカーは、グルタメートファミリーの構成要素の生合成に関与する酵素から選択され得る。有用なグルタメートファミリー栄養要求性選択マーカーの例は、そのコード遺伝子の代表的な例と共に挙げた以下：Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼ、アミノ酸アセチルトランスフェラーゼをコードする、ａｒｇＡ；アセチルグルタメートキナーゼをコードする、ａｒｇＢ；Ｎ−アセチル−ガンマグルタミルホスフェートレダクターゼをコードする、ａｒｇＣ；アセチルオルニチンデルタ−アミノトランスフェラーゼをコードする、ａｒｇＤ；アセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする、ａｒｇＥ；オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする、ａｒｇＦおよびａｒｇＩ；アルギニンスクシナートシンセターゼをコードする、ａｒｇＧ；アルギニノスクシナートリアーゼをコードする、ａｒｇＨ；グルタメートデヒドロゲナーゼをコードする、ｇｄｈＡ；グルタミンシンセターゼをコードする、ｇｌｎＡ；ガンマグルタミルホスフェートレダクターゼをコードする、ｐｒｏＡ；ガンマグルタメートキナーゼをコードする、ｐｒｏＢ；およびピロリン−５−カルボキシラートレダクターゼをコードするｐｒｏＣを含む。
【０１２９】
１つの実施形態において、アミノ酸生合成選択マーカー遺伝子は、プロリン生合成ファミリーの少なくとも１つの構成要素、例えば、ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢ、またはｐｒｏＣでありうる。特定の実施形態において、プロリン生合成選択マーカー遺伝子は、ｐｒｏＣ遺伝子を含みうる。ｐｒｏＣ遺伝子は、プロリン生合成経路の最終ステップを触媒する酵素をコードする。細菌では、プロリン（すなわちＬ−プロリン）生合成経路は、Ｌ−グルタミン酸で始まる３つの酵素プロセスを含む。このプロセスのステップは：１）ｐｒｏＢによってコードされるグルタメート−５−キナーゼ（「ＧＫ」；EC 2.7.2.11）による、Ｌ−グルタミン酸のＬ−グルタミル−５−ホスフェートへの変換；次に２ａ）proAによってコードされるグルタミル−５−ホスフェートレダクターゼ（「ＧＰＲ」）としても公知の、グルタメート−５−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.41）による、そのＬ−グルタメート−５−セミアルデヒドへの変換、続いて２ｂ）Δ1−ピロリン−５−カルボキシラートを生成するための、その自発的環化；および次に３）ｐｒｏＣによってコードされるΔ1−ピロリン−５−カルボキシラートレダクターゼ（「Ｐ５ＣＲ」；EC 1.5.1.2）による、そのＬ−プロリンへの変換を含む。ほとんどの細菌では、ｐｒｏＣはＰ５ＣＲサブユニットをコードし、活性Ｐ５ＣＲ酵素は、そのホモマルチマーである。
【０１３０】
ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢ、またはｐｒｏＣ遺伝子の１つまたはそれ以上が不活性化または消失する、あるいは非機能性酵素をコードするように変異される細菌において、プロリンが培地に添加されるならば、細胞はなお増殖し得る。結果として、ｐｒｏＣ（−）シュードモナス（Pseudomonad）または関連細胞は、プロリン含有培地上で維持され得る。ｐｒｏＣ遺伝子含有ＤＮＡ構築物をｐｒｏＣ（−）細胞にトランスフェクションし、発現させて機能性Ｐ５ＣＲ酵素を生成した後に、得られた組み合わせたｐｒｏＣ（＋）プラスミド−宿主細胞系は、プロリン欠乏培地中で維持され得る。
【０１３１】
シュードモナス（Pseudomonad）または関連宿主細胞で使用するためのｐｒｏＣ遺伝子のコード配列は、機能性Ｐ５ＣＲを生成するために選択されたシュードモナス（Pseudomonad）または関連宿主細胞によってコード配列が転写、翻訳、そしてそうでなければ処理されるという条件で、Δ1−ピロリン−５−カルボキシラートレダクターゼ酵素（Ｐ５ＣＲ）をコードするいずれの遺伝子によっても供給され得る。ｐｒｏＣをコードする配列は天然の配列であるか、または、例えば、当該分野で公知の１つまたはそれ以上の配列変更、配列結合、および／または配列生成技術の利用から生じた操作配列である。ｐｒｏＣ選択マーカー遺伝子の一部として使用する前に、選択したコード配列を選択したシュードモナス（Pseudomonad）または関連宿主細胞の遺伝子コードおよび／またはコドン使用頻度に従って最初に改良または最適化され得る。発現可能なコード配列は、選択した宿主細胞内で機能し得る転写プロモーター、ならびに他の必要な転写および翻訳調節要素すべてに作動可能に結合される。ｐｒｏＣ遺伝子の天然のコード配列は、それが上記の要件を満足するという条件で、細菌から、または他の任意の生物から入手され得る。
【０１３２】
１つの実施形態において、ｐｒｏＣをコードする配列は、選択マーカーとして使用されることが意図されているシュードモナス（Pseudomonad）または関連宿主細胞から単離される。ｐｒｏＣ遺伝子全体（コード配列および周囲の調節領域を含む）は、そこから単離され得る。特定の実施形態において、ｐｒｏＣ遺伝子またはコード配列を提供する細菌は、シュードモナス目（Pseudomonadales）の構成要素、シュードモナス亜目（Pseudomonadineae）の構成要素、シュードモナダセア科（Pseudomonadaceae）の構成要素、シュードモナス族（Pseudomonadeae）の構成要素、シュードモナス属（Pseudomonas）の構成要素、および蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）種群の構成要素（すなわち「フルオレッセント・シュードモナズ」）からなる群から選択される。特定の実施形態において、細菌は、種蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）に属する。
【０１３３】
特定の実施形態において、ｐｒｏＣ遺伝子は、配列番号６の核酸配列（表７）、またはその変異体を含有する。あるいは、ｐｒｏＣ遺伝子によってコードされるＰ５ＣＲは、本発明による所与の宿主細胞によって使用される遺伝子コードに従って、配列番号７のアミノ酸配列（表８）、その変異体、またはそれと重複するコドン配列を有する変異体を含有する。
【０１３４】
あるいは、ｐｒｏＣ遺伝子は、配列番号６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、および９５％相同であるＰ５ＣＲ酵素をコードする核酸配列を含有する。同様にｐｒｏＣ遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、および９５％相同であるＯＤＣａｓｅをコードする。
【０１３５】
別の実施形態において、ｐｒｏＣ遺伝子は、配列番号８のヌクレオチド配列（表９）に対して少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同であるコード配列を含有し得る。
【０１３６】
特定の実施形態において、ｐｒｏＣ遺伝子は、ハイブリダイゼーションがストリンジェントな条件下で実施されたときに、配列番号８のアンチコドン配列にハイブリダイズするコドン配列を有するコード配列を含有し得るか、またはそれと重複するコドン配列を有し得る。特に特定の実施形態において、ｐｒｏＣ遺伝子は配列番号８のヌクレオチド配列を含有する。
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【０１３７】
選択マーカーの利用
１つの実施形態において、代謝産物の異化利用に関与する酵素は、栄養要求性選択マーカーとして選択され得る。特に酵素は、炭素源の利用に関与するものから選択され得る。そのような酵素の例は、例えば、スクラーゼ、ラクターゼ、マルターゼ、デンプン異化酵素、グリコーゲン異化酵素、セルラーゼ、およびポリ（ヒドロキシアルカノアート）デポリメラーゼを含む。細菌宿主細胞が選択した型の天然の異化活性を示す場合、原栄養回復（prototrophy restoring）ベクターによる形質転換前にノックアウトされ得る。これらの化合物に対して天然の栄養要求性を示す細菌も、その形質転換のための天然の状態で使用され得る。細胞内へ移入または拡散できない化合物が選択され、培地に添加されるこれらの実施形態において、原栄養回復（prototrophy restoring）または原栄養可能（prototrophy-enabling）酵素が使用されるために分泌され得る。そのような場合、分泌された酵素は、選択した宿主細胞内で作用する分泌シグナルペプチドのためのコード配列を含むように酵素のコード配列を選択または設計することによって、化合物を細胞外で分解して、細胞内に拡散または移入可能であるより小さい化合物、例えば、グルコースを生成し得る。このような実施形態では、原栄養回復（prototrophy-restorative）遺伝子は、細胞膜を介した酵素の運搬を達成するために、選択した宿主細胞内で作用する分泌シグナルペプチドのためのコード配列を含むように選択または操作され得る。これらの実施形態、または選択した化合物が細胞内に移入または拡散可能である実施形態のいずれかで、細胞は、選択した化合物は別として、他の炭素源を供給しない培地中で増殖する。
【０１３８】
炭素源利用ベースマーカー系において、各原栄養回復（prototrophy-restorative）または原栄養可能（prototrophy-enabling）炭素源利用酵素は、ただ１つの炭素源の利用に関与し得る。例えば、同じ異化経路からの２つの遺伝子を、１つのベクター上で共に発現させたり、または別のベクター上で別個に同時発現させたりして、原栄養性を提供する。そのような多遺伝子炭素源利用ベースマーカー系の特定の例は、例えば、グリコーゲンホスホリラーゼおよび（アルファ−１，４）グルカントランスフェラーゼの両方のトランスジェニック発現による、唯一の炭素源としてのグリコーゲンの使用；ならびにアルファ−アミラーゼ、およびアルファ（１→６）グルコシダーゼの両方のトランスジェニック発現による、唯一の炭素源としてのデンプンの使用を含む。しかしながら、選択した単遺伝子または多遺伝子炭素源マーカー系は、細胞に供給された唯一の炭素源が炭素源異化選択マーカー系で使用するために選択された化合物であるという条件で、同じ宿主細胞内で他の種類のマーカー系と同時に使用され得る。
【０１３９】
生化学利用型活性に有用な酵素の他の例は、当該分野で周知であり、細胞に供給された有用でないＤ−炭素源を栄養性のＬ−炭素源に供給し得るラセマーゼおよびエピマラーゼを含み得る。これらの系の例は、例えば、：対応するラセマーゼのトランスジェニック発現によって使用されたＤ−酸またはＤ−アシル化合物；およびトランスジェニック発現されたラクテートラセマーゼによって使用されたラクテートを含む。
【０１４０】
同様に、マーカー系で使用するためにアミノ酸生合成活性が選択されている場合、栄養要求性は、細胞に、Ｒ−アミノ酸を、細胞が栄養要求性である対応するＬ−アミノ酸に変換する利用不可Ｒ−アミノ酸およびＲ−アミノ酸ラセマーゼまたはエピマラーゼ（EC 5.1.1）の両方を供給することによっても克服し得る。
【０１４１】
形質スタッキング
本発明による、標的遺伝子発現のための栄養要求性選択マーカー遺伝子の挿入の前後に、複数の表現型変化を宿主細胞に対して行い得る。例えば、細胞は、種々の増強された表現型形質を示すために、同時に、または連続的に遺伝子改変され得る。このプロセスは、「形質スタッキング」と呼ばれる。ｐｒｙＦ欠失は、１つのそのような表現型形質として存在し得る。そのような菌株において、本発明によるｐｙｒＦ遺伝子は、他の所望の形質のクロスイン（across-in）／クロスアウト（cross-out）対立遺伝子交換を行うために、自殺ベクター上で選択マーカーおよび対抗選択マーカーの両方として（５’−フルオロオロチン酸の存在下で）使用され得る。したがって本発明によるｐｙｒＦ遺伝子は、宿主細胞を「形質スタッキングする」プロセスで使用され得る。そのようなプロセスでは、そのようなｐｙｒＦ遺伝子を含有する自殺ベクターを複数の別個の形質転換において宿主細胞菌株に形質転換し得る；そのような各手順では、ｐｙｒＦ表現型の再確立を使用して、次の遺伝的に強化された（genetically-enhancing）表現型変化を無限に作製し得る。したがって、ｐｙｒＦ遺伝子自体は形質を提供され得るだけでなく、形質スタッキングのプロセスでさらなる表現型形質を得るために使用され得る。
【０１４２】
１つの実施形態において、本発明は、追加の栄養要求株を誘導するためにさらに遺伝子改変された栄養要求性シュードモナス（Pseudomonads）および関連細菌を提供する。例えば、ｐｙｒＦ（−）栄養要求株は、例えば、ｐｒｏＣ遺伝子またはｔｈｙＡ遺伝子の不活性化を通じて、同化または異化経路に存在する別の生合成酵素を不活性化するためにさらに改変され得る。このようにして、宿主細胞中に複数の栄養要求株を産生し得る。
【０１４３】
別の実施形態において、宿主細胞での組換えポリペプチドの発現を改良するために、宿主細胞に遺伝子改変を行い得る。さらなる改変は、特定の炭素源のさらに効率的な利用を可能にし、それにより発酵全体の全効率を最適化する遺伝子改変を含み得る。
【０１４４】
１つの特定の実施形態において、栄養要求性宿主細胞は、ｌａｃＩ含有導入遺伝子の宿主染色体への挿入によってさらに改変される。好ましくはｌａｃＩ導入遺伝子、またはその誘導体は、完全または切断ＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡ構築物の一部以外である。
【０１４５】
栄養要求株を誘導するための改変
本発明による発現系で使用するために選択されたシュードモナス（Pseudomonad）または関連宿主細胞は、選択した栄養要求性活性を示す、任意の機能性生体触媒を発現するその能力を欠損していてもよい。例えば、オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ活性を選択した場合、宿主細胞はａ）任意のｐｙｒＦ遺伝子産物（すなわち任意の機能性ＯＤＣａｓｅ酵素）、およびｂ）したがって、任意の有効な置換（すなわちＯＤＣａｓｅ活性を有する他の生体触媒）を発現するその能力が欠損していてもよい。１つの実施形態において、宿主細胞は、標的栄養要求株に関与する機能性酵素（すなわちＯＤＣａｓｅ）を発現できないようにするために、そのゲノム遺伝子を改変することによって、選択した活性が生体触媒によって不足するようにされる。言い換えれば、原栄養細胞（活性（＋）細胞）は、標的原栄養経路に関与する機能性酵素をコードする遺伝子の「ノックアウト」によって栄養要求株となる（すなわち活性（−）細胞）。この改変は、選択した活性をコードする遺伝子の細胞ゲノムコード配列を改変することによって行える。１つの実施形態において、コード配列改変は：コード配列読み枠を変化させる挿入または欠失変異；十分な数のコドンを改変する置換または反転変異；および／またはそこから非機能性酵素を産生し得る近接コドンの十分に大きな群を欠失させる欠失変異を導入することによって実施され得る。
【０１４６】
宿主細胞菌株がその中の選択マーカーとして使用するために栄養要求性遺伝子を提供した１つの実施形態において、好ましくは選択された遺伝子の転写プロモーターおよび／または転写ターミネーター要素はそれぞれ、欠失変異を含む変異の導入によって非活性化され得る。例えば、転写要素不活性化は場合により、上記のコード配列改変に加えて実施され得る。宿主細胞菌株がまた栄養要求性選択マーカー遺伝子を提供した１つの実施形態において、選択した遺伝子のＤＮＡすべてを宿主細胞ゲノムから欠失させ得る。
【０１４７】
そのようなノックアウト菌株は、当該分野で有効であるとして公知の種々の方法のいずれかに従って調製され得る。例えば、所望の核酸欠失配列の相同標的遺伝子配列５’および３’を含有する相同組換えベクターを宿主細胞へ形質転換し得る。理想的には、相同組換え時に、所望の標的酵素遺伝子ノックアウトを産生し得る。
【０１４８】
遺伝子ノックアウト方法の特定の例は、例えば、：以前に記載されたポリヌクレオチドの挿入による遺伝子活性化を含む。例えば、DL Roeder & A Coller, Marker-exchange mutagenesis of a pectate lyase isozyme gene in Erwiniachrysanthemi, J Bacteriol. 164(1) : 51-56 (1985)を含む。あるいは、所望の表現型のためのトランスポゾン突然変異誘発および選択（例えば、ベンゾアートまたはアントラニラートを代謝できないこと）を使用して、標的遺伝子が挿入によって不活性化された細菌株を単離し得る。例えば、K Nida & PP Cleary, Insertional inactivation of streptolysin S expression in Streptococcus pyogenes, J Bacteriol. 155 (3): 1156-61(1983)を参照。特定の遺伝子における特定の変異または欠失は、例えば、JA Wells et al., Cassette mutagenesis : an efficient methaod for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34 (2-3): 315-23(1985) に記載されているように、カセット突然変異誘導を使用して作製し得る；それにより直接またはランダム変異は、遺伝子の選択した部分に行われ、次に相同組換えによる遺伝子の染色体コピー内へ包含させる。
【０１４９】
１つの実施形態において、選択マーカー遺伝子が得られる生物および選択マーカー遺伝子が利用される宿主細胞の両方は、原核生物から選択され得る。特定の実施形態において、選択マーカー遺伝子が得られる生物および選択マーカー遺伝子が利用される宿主細胞の両方が細菌から選択され得る。別の実施形態において、選択マーカー遺伝子が得られる細菌および選択マーカー遺伝子が利用される細菌宿主細胞の両方がプロテオバクテリアから選択される。なお別の実施形態において、選択マーカー遺伝子が得られる細菌および選択マーカー遺伝子が利用される細菌宿主細胞の両方が以下で定義されるように、シュードモナス（Pseudomonads）および密接に関連する細菌から、またはそのサブグループから選択され得る。
【０１５０】
特定の実施形態において、選択マーカー遺伝子源生物および宿主細胞の両方を同じ種から選択し得る。好ましくは、種は、原核生物；より好ましくは細菌、なおより好ましくはプロテオバクテリウムである。別の特定の実施形態において、選択マーカー遺伝子源生物および宿主細胞の両方が、以下で定義するようにシュードモナス（Pseudomonads）および密接に関連付けられる細菌から、またはそのサブグループから選択される属の同じ種から選択され得る。１つの実施形態において、選択マーカー遺伝子源生物および宿主細胞の両方が、シュードモナス（Pseudomonas）俗の種、特に蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）種、そして好ましくは蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）バイオタイプＡ種から選択され得る。
【０１５１】
ＩＩＩ．ＬＡＣＩ挿入
本発明は、完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外の、染色体挿入ｌａｃＩ導入遺伝子または誘導体を含有するように遺伝子改変されたシュードモナス（Pseudomonads）および関連細胞を提供する。１つの実施形態において、ｌａｃＩインサートは、ベクター上のｌａｃＯ配列または誘導体を結合して、ベクター上のＰｌａｃ−Ｐｔａｃファミリープロモーターを阻害する、ＬａｃＩリプレッサータンパク質の発現によって厳密な発現ベクター制御を提供する。結果は、誘導前の組換えポリペプチド発現の低下した基底レベルである。
【０１５２】
１つの実施形態において、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ遺伝子の、またはｌａｃＩ遺伝子誘導体、例えば、ｌａｃＩQまたはｌａｃＩQ1の染色体挿入を含有するシュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞が提供され、ｌａｃＩインサートは、完全または切断構造遺伝子含有ＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡ構築物以外である。本発明で有用な他の誘導体ｌａｃＩ導入遺伝子は；天然のｌａｃＩ遺伝子とは異なる改変コドン配列を有するｌａｃＩ誘導体（例えば、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ遺伝子は「ｇｔｇ」開始コドンを含有し、これは選択した発現宿主細胞での翻訳開始に有効な代わりの開始コドン、例えば、「ａｔｇ」によって置換される）；標的遺伝子誘導を達成するために温度の変化、例えば、４２℃まで変化に反応する、温度感受性ｌａｃＩミュータント、例えば、ｌａｃＩｔｓ（または「ｌａｃＩ（Ｔｓ）」）によってコードされるものを含む、変異アミノ酸配列を有するＬａｃＩタンパク質をコードするｌａｃＩ誘導体（例えば、Bukrinsky et al., Gene 70:415-17(1989);N Hasan & W Szybalski, Gene 163(1):35-40(1995); H Adari et al., DNA cell Biol. 14:945-50(1995)を参照）；誘導を達成するためにラクトース以外の代わりの糖、例えば、アラビノース、リボース、またはガラクトースの存在に反応するＬａｃＩミュータント（例えば、WO 99/27108 for Lac Repressor Proteins with Altered Responsivityを参照）；および少なくともｌａｃオペレーターに対する野生型結合を示すが、インデューサ（例えば、IPTG）に対しては向上した感受性を示す、またはｌａｃオペレーターに対しては向上した結合を示すが、少なくとも野生型脱抑制性を示す、ＬａｃＩミュータント（例えば、L Swint-Kruse et al., Biochemistry 42(47):14004-16(2003)を参照）を含む。
【０１５３】
特定の実施形態において、染色体に挿入されたＬａｃリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ遺伝子のそれと同一であり、配列番号９の核酸配列（表１０）を有する。別の実施形態において、宿主染色体に挿入された遺伝子は、配列番号１０のアミノ酸配列（表１１）を有するＬａｃリプレッサータンパク質をコードする。
【表１０】
2007511238.tif 000012
【表１１】
2007511238.tif 000013
【０１５４】
代替的な実施形態において、挿入されたｌａｃＩ導入遺伝子は、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ遺伝子の誘導体である。１つの特定の実施形態において、ｌａｃＩ誘導体遺伝子は、配列番号１１の核酸配列（表１２）を有するｌａｃＩQ遺伝子である。ｌａｃＩQ変異体は、大腸菌（E.coli）中のｌａｃＩリプレッサーのレベルを１０倍上昇させるプロモーターの−３５領域に単点変異を有することを除いて、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ遺伝子と同じである。例えば、MP Calos, Nature 274 (5673):762-65(1978)を参照。
【表１２】
2007511238.tif 000014
【０１５５】
なお別の実施形態において、ｌａｃＩ誘導体遺伝子は、配列番号１２の核酸配列（表13）を有するｌａｃＩQ1遺伝子である。ｌａｃＩQ1変異体は、そのヌクレオチド配列が大腸菌（E.coli）−３５領域コンセンサス配列と正確に一致する−３５領域を置換する再構成であり、大腸菌（E.coli）での天然のプロモーターより１００倍高い発現を引き起こす。例えば、MP Colas & JH Miller, Mol. & Gen. Genet. 183(3): 559-60(1980)。
【表１３】
2007511238.tif 000015
【０１５６】
本発明において、宿主細胞染色体は、ＬａｃＩタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含有する少なくとも１つの核酸配列の挿入によって改変可能であり、該遺伝子は、好ましくは、コードされるＬａｃＩタンパク質、ならびにＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡ核酸配列以外である遺伝子を含有するポリヌクレオチド（すなわちＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンのＰｌａｃ（−）バージョン）またはＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺポリヌクレオチド（すなわちそのようなＰｌａｃ（−）オペロンの構造ｌａｃ利用オペロン遺伝子含有部分、例えば、ＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡ核酸配列の少なくとも部分的に切断されたバージョン）を構成的に発現するために、細胞による使用が可能である。
【０１５７】
選択したＬａｃＩタンパク質をコードする遺伝子は、好ましくは、構成的に発現される。これは選択した発現宿主細胞で構成的に発現される任意のプロモーターの使用によって達成され得る。例えば、天然の大腸菌（E.coli）ＰｌａｃＩは、選択したＬａｃＩコード配列に作動可能に結合されるか、または別の構成的に発現されたプロモーターはそれに作動可能に結合される。ある場合では、調節されたプロモーターが発酵の間ＬａｃＩタンパク質がそれから連続される発現される状態で維持されるという条件で、調節されたプロモーターが使用され得る。特定の実施形態において、Ｐｌａｃ、Ｐｔａｃ、Ｐｔｒｃ、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５、ｌｐｐ−ＰｌａｃＵＶ５、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｎｐｐＭ−ｌａｃ、Ｔ７ｌａｃ、Ｔ５ｌａｃ、Ｔ３ｌａｃ、およびＰｍａｃを含む、ｌａｃまたはｔａｃファミリープロモーターは、本発明で利用される。
【０１５８】
ゲノム挿入部位
染色体挿入は、当該分野で公知の任意の技術に従って実施され得る。例えば、:DS Toder, 「Gene replacement in Pseudomonas aeruginosa,」 Methods in Enzymology 235: 466-74(1994); and J Quandt & MF Hynes,「Versatile suicide vector which allow direct selection for gene replacement in Gram negative bacteria,」 Gene 127(1):15-21(1993)を参照。当該分野で公知であるようなトランスポン型挿入技術、およびその後の選択も使用され得る：例えば、IY Goryshin & WS Reznikoff, 「Tn5 in vitro transposition,」 Journal of Biological Chemistry 273(13):7367-74(1998)を参照。あるいは、（非溶解）ファージ形質導入によるトランスフェクションも、染色体挿入に使用され得る：例えば、JH Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972) (Cold Spring Harbor Lab., NY)を参照。
【０１５９】
ｌａｃＩ遺伝子、またはその誘導体を挿入するのに有用な場所である細菌発現宿主細胞染色体内の部位は、使用した発酵条件下での細胞機能には必要とされない部位、例えば、存在、転写、または発現が、使用した発酵条件下での細胞の健全な機能にとって重要である任意の遺伝子内の任意の位置を含む。そのような挿入部位の実例は、これに限定されるわけではないが：スクロースインポートおよび代謝遺伝子（例えば、ｓａｃＢ）、フルクトースインポートおよび異化遺伝子（例えば、フルクトキナーゼ遺伝子、１−ホスホフルクトキナーゼ遺伝子）、芳香族炭素源インポートおよび利用遺伝子（例えば、アントラニラートオペロン遺伝子、例えば、ａｎｔＡＢＣ遺伝子、ベンゾアートオペロン遺伝子、ｂｅｎＡＢＣＤ遺伝子）、ベータラクタマーゼ遺伝子（例えば、ａｍｐＣ、ｂｌｌｌ、ｂｌｃ遺伝子、ｂｌｏ遺伝子、ｂｌｐ遺伝子）、アルカリホスファターゼ遺伝子（例えば、ｐｈｏＡ）、ヌクレオベースまたはヌクレオチド生合成遺伝子（例えば、ｐｙｒＢＣＤＥＦ遺伝子）、アミノ酸生合成遺伝子（例えば、ｐｒｏＡＢＣ遺伝子）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（例えば、ａｓｄ）、３−イソプロピルマラートデヒドロゲナーゼ遺伝子（例えば、ｌｅｕＢ）、およびアントラニラートシンターゼ遺伝子（例えば、ｔｒｐＥ）を含む。
【０１６０】
ゲノム挿入が栄養要求株をもたらしたか、または同時に生じる任意の実施形態において、致死効果を克服（および回避する）ために宿主細胞が有効な置換代謝産物を細胞に供給する培地中で培養されるか、または置換遺伝子が対応する原栄養能を回復させるのに有効である生体触媒を発現する宿主細胞内に、例えば、選択マーカー遺伝子として供給される。代謝栄養要求株の作製時に欠失または不活性化（すなわちノックアウト）のために選択された１つまたは複数の遺伝子は、代謝経路で作用する酵素をコードするいずれの遺伝子でもよい。酵素は、細胞生存に必要である分子の同化生合成に関与する酵素である。あるいは、酵素は、細胞生存に必要である分子の異化利用に関与する酵素でありうる。好ましくは、所与の生体触媒活性をコードするすべての作用遺伝子は、栄養要求性宿主細胞の作製時に宿主細胞から標的酵素活性を確実に除去するために、欠失または不活性化される。あるいは、宿主細胞は、先在する栄養要求株（例えば、天然の栄養要求株）を示すことが可能であり、そこでは欠失または不活性化（ノックアウト）を介したさらなる遺伝子改変を実施する必要がない。
【０１６１】
例えば、アミノ酸生合成遺伝子（例えば、ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢまたはｐｒｏＣ遺伝子）または、ヌクレオベースまたはヌクレオチド生合成遺伝子（例えば、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＣ、ｐｙｒＤ、ｐｙｒＥ、またはｐｙｒＦ）は挿入部位として使用され、その場合に必要な生合成活性は通常、妨害されて、したがって栄養要求株を産生する。そのような場合：１）生合成経路への代謝依存を回避するために、プロリンまたはウラシル補給物と同様に、培地に添加されるか、；または２）栄養要求性宿主細胞が発現され、したがって生合成経路から消失する生体触媒を置換するさらなる遺伝子によって形質転換され、それによって代謝選択マーカー遺伝子、例えば、ｐｒｏＣ、ｐｙｒＦ、またはｔｈｙＡと同様に、細胞への原栄養性を回復するかのいずれかである。特定の実施形態において、ｐｙｒＦ、ｔｈｙＡ、およびｐｒｏＣからなる群から選択される遺伝子のノックアウト、または遺伝子の組合せによって同時にまたは続いて栄養要求的に誘導されるｌａｃＩ導入遺伝子、またはその変異体が細胞に挿入される。特定の実施形態において、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ、ｌａｃＩQ、またはｌａｃＩQ1導入遺伝子は、ｐｙｒＦのノックアウトによって同時にまたは続いて栄養要求性にされる細胞内へ挿入される。別の特定の実施形態において、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ、ｌａｃＩQ、またはｌａｃＩQ1導入遺伝子は、ｐｒｏＣのノックアウトによって同時にまたは続いて栄養要求性にされる細胞内に挿入される。なおさらなる実施形態において、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ、ｌａｃＩQ、またはｌａｃＩQ1導入遺伝子は、ｐｙｒＦおよびｐｒｏＣのノックアウトによって、同時にまたは続いて栄養要求性にされる細胞内に挿入される。
【０１６２】
別の実施形態において、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ、ｌａｃＩQ、またはｌａｃＩQ1導入遺伝子、またはその誘導体を、宿主細胞のレバンスクラーゼ位置に挿入し得る。例えば、１つの特定の実施形態において、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ、ｌａｃＩQ、またはｌａｃＩQ1導入遺伝子、またはその誘導体を蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）のレバンスクラーゼ遺伝子位置に挿入し得る。特に天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ、ｌａｃＩQ、またはｌａｃＩQ1導入遺伝子、またはその誘導体を、配列番号１３の核酸配列（表１４）を有する蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）のレバンスクラーゼ遺伝子位置に挿入し得る。
【表１４】
2007511238.tif 000016
【０１６３】
ＩＶ．ＬＡＣＯ配列
プロモーターの漏出性を抑制する試みは、標的組換えポリペプチド発現の潜在的に同時に起こる低下によって平衡を保たせる必要がある。プロモーターをさらに抑制して、プロモーターの漏出性を低下させる１つの手法は、オペレーター配列として公知の調節要素を改変して、誘導時の標的組換えポリペプチドの潜在的発現を低下させることなく、関連するリプレッサータンパク質がオペレーター配列に結合する能力を向上させることである。
【０１６４】
蛍光菌（Pseudomoas fluorescens）におけるデュアルｌａｃオペレーターの使用が、誘導されたタンパク質の収率を同時に低下させることなく、プレインキュベーション組換えタンパク質発現の優れた抑制を提供することが発見されている。
【０１６５】
１つの実施形態において、導入遺伝子発現の抑制に関与する少なくとも１つのｌａｃＯ配列を含む核酸を含有する核酸構築物を含むシュードモナス（Pseudomonad）生物が提供される。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞は、蛍光菌（Pseudomoas fluorescens）である。１つの実施形態において、核酸構築物は１つを超えるｌａｃＯ配列を含む。別の実施形態において、核酸構築物は少なくとも１つの、好ましくは１つを超えるｌａｃＯｉｄ配列を含む。１つの実施形態において、核酸構築物は、プロモーターの３’側に位置するｌａｃＯ配列、またはその誘導体、およびプロモーターの５’側に位置するｌａｃＯ配列、またはその誘導体を含む。特定の実施形態において、ｌａｃＯ誘導体はｌａｃＯｉｄ配列である。
【０１６６】
本発明の別の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞に使用される１つを超えるｌａｃオペレーター配列、またはその誘導体を含む核酸構築物が提供される。１つの実施形態において、少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列はｌａｃＯｉｄ配列である。
【０１６７】
天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃオペレーターは、インデューサの非存在下でｌａｃオペロンの発現をダウンレギュレートするように作用する。このためｌａｃオペレーターは、ＬａｃＩリプレッサータンパク質によって結合され、オペロンの転写を抑制する。ＬａｃＩタンパク質がＤＮＡ分子上の２つのｌａｃオペレーターを同時に結合され得ることが決定されている。例えば、Muller et al.,(1996) 「Repression of lac promotor as a function of distance, phase, and quality of an auxiliary lac operator,」J. Mol. Biol. 257: 21-29を参照。抑制は、is mediated by the プロモーターに隣接するオペレーターＯ1、ならびにｌａｃＺ遺伝子のコード領域内のＯ1の下流の４０１塩基対、およびＯ1上流の９２ｂｐにそれぞれ位置する、２つの補助オペレーターＯ2およびＯ3によって仲介される（図４を参照）。天然の大腸菌（E. coli）ｌａｃオペレーター配列の理想的なｌａｃオペレーター（Ｏid）による置換は、大腸菌（E. coli）における天然のｌａｃオペロンの抑制上昇を引き起こす。Muller et al.,(1996)「Repression of lac promotor as a function of distance, phase, and quality of an auxiliary lac operator, J. Mol. Biol. 257: 21-29を参照。
【０１６８】
ｌａｃＯ配列または誘導体を、プロモーターに対して大腸菌（E.coli）天然のＯ1位置に配置し得る。あるいは、ｌａｃＯ配列または誘導体をプロモーターに対して大腸菌（E.coli）０3位置に配置し得る。別の実施形態において、ｌａｃＯ配列または誘導体をプロモーターに関して大腸菌（E.coli）天然の０1位置、天然の０3位置、または両方に配置し得る。１つの実施形態において、核酸構築物は、プロモーター配列に対して５’側またはプロモーター配列に対して３’側に、少なくとも１つのｌａｃＯｉｄ配列を含有する。特定の実施形態において、核酸構築物は、プロモーターの３’側にｌａｃＯｉｄ配列、プロモーターの５’側に少なくとも１つのｌａｃＯ配列、または誘導体を含有する。代替的な実施形態において、核酸構築物は、プロモーターの５’側にｌａｃＯｉｄ配列、およびプロモーターの３’側に少なくとも１つのｌａｃＯ配列、または誘導体を含有する。なお別の実施形態において、核酸構築物は、プロモーターの５’および３’側の両方のｌａｃＯｉｄ配列を含有する。
【０１６９】
特定の実施形態において、ｌａｃＯ配列は、配列番号１４によって表されるｌａｃＯｉｄ、または実質的に相同な配列である。別の実施形態において、配列番号５９のｌａｃＯｉｄ配列、または配列番号５９に実質的に相同な配列が利用される。
【表１５】
2007511238.tif 000017
【０１７０】
Ｖ．単離核酸およびアミノ酸
本発明の別の態様において、タンパク質の改良された生成法で使用される核酸配列が提供される。
【０１７１】
１つの実施形態において、栄養要求性シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞で使用するための原栄養回復酵素をコードする核酸配列が提供される。特定の実施形態において、生物蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）から生成された窒素含有塩基化合物生合成酵素をコードする核酸配列が提供される。１つの実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）中のｐｙｒＦ遺伝子をコードする核酸配列が提供される（配列番号１および３）。別の実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）内でｔｈｙＡ遺伝子をコードする核酸配列が提供される（配列番号４）。なお別の実施形態において、生物蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）から精製されたアミノ酸生合成化合物をコードする核酸配列が提供される。特定の実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）内でｐｒｏＣ遺伝子をコードする核酸配列が提供される（配列番号６および８）。
【０１７２】
別の態様において、本発明は、タンパク質の改良された生成法に使用される新規なアミノ酸配列を提供する。
【０１７３】
１つの実施形態において、生物蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）から精製された窒素含有塩基化合物生合成酵素のアミノ酸配列が提供される。１つの実施形態において、配列番号２を含有するアミノ酸配列が提供される。別の実施形態において、配列番号５を含有するアミノ酸配列が提供される。なお別の実施形態において、生物蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）から精製されたアミノ酸生合成化合物のアミノ酸配列が提供される。特定の実施形態において、配列番号７を含有するアミノ酸配列が提供される。
【０１７４】
本発明の１つの実施形態は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）ｐｙｒＦ遺伝子の新規な単離核酸配列（表２、配列番号１；表４、配列番号３）である。本発明の別の態様は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）ｐｙｒＦ遺伝子の単離ペプチド配列（表３、配列番号２）を提供する。配列番号１、２、または３に対して少なくとも９０、９５、９８または９９％相同な核酸およびアミノ酸配列が提供される。さらに、配列番号１、２または３の、少なくとも１０、１５、１７、２０または２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２５０、３５０、５００、または１０００個の連続する核酸またはアミノ酸を含有するヌクレオチドおよびペプチド配列も提供される。配列番号１、２または３の断片、誘導体および類似体もさらに提供される。配列番号１、２または３の断片は、少なくとも約１０ｂｐ、１５  ｂｐ、１７  ｂｐ、２０  ｂｐ、５０  ｂｐ、１００  ｂｐ、５００  ｂｐ、１  ｋｂｐ、５ｋｂｐまたは１０ｋｐｂの任意の連続する核酸またはペプチド配列を含み得る。
【０１７５】
本発明の別の実施形態は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）ｔｈｙＡ遺伝子の新規な単離核酸配列（表５、配列番号４）である。本発明の別の態様は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）ｔｈｙＡ遺伝子の単離ペプチド配列（表６、配列番号５）を提供する。配列番号４または５に対して少なくとも９０、９５、９８または９９％相同な核酸およびアミノ酸配列が提供される。さらに、配列番号４または５の少なくとも１０、１５、１７、２０、または２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０，２５０、３５０、５００、または１０００個の連続する核酸またはアミノ酸のヌクレオチドおよびペプチド配列も提供される。さらに、配列番号４および５の断片、誘導体および類似体も提供される。配列番号４または５の断片は、少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、１７ｂｐ、２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、５ｋｂｐまたは１０ｋｐｂを含む連続する核酸またはペプチド配列を含み得る。
【０１７６】
本発明の別の実施形態は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）ｐｒｏＣ遺伝子の新規な単離核酸配列（表７、配列番号６；表９、配列番号８）である。本発明の別の態様は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）ｐｒｏＣ遺伝子の新規な単離ペプチド配列（表８、配列番号７）を提供する。配列番号６、７、または８に対して少なくとも９０、９５、９８または９９％相同な核酸およびアミノ酸配列が提供される。さらに、配列番号６、７、または８の、少なくとも１０、１５、１７、２０または２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２５０、３５０、５００、または１０００個の連続する核酸またはアミノ酸を含有するヌクレオチドおよびペプチド配列も提供される。配列番号６、７、または８の断片、誘導体および類似体も提供される。配列番号６、７、または８の断片は、少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、１７ｂｐ、２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、５ｋｂｐまたは１０ｋｐｂを含む連続する核酸またはペプチド配列を含み得る。
【０１７７】
配列相同性
配列相同性は、当該分野で周知の種々の方法のいずれかに従って決定される。有用な配列アラインメントおよび相同性決定方法の例は、以下で記載するものを含む。
【０１７８】
相同配列のアラインメントおよび検索は、U.S.National Center for Biotechnology Information（NCBI）プログラムのMegaBLAST（現在、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で入手され得る）を使用して実施され得る。アミノ酸配列について７０％に設定された、または９０％に設定されたパーセント同一性のオプションを用いたこのプログラムの使用は、クエリー配列に対して７０％、また９０％、またはそれ以上の相同性を持つ配列を同定する。当該分野で公知の他のソフトウェアも、相同配列、例えば、本発明によるプロモーター塩基配列またはアクチベータ−タンパク質コード塩基配列を含有する情報ストリングに対して少なくとも７０％または９０％相同である配列を配列比較および／または検索するために利用され得る。例えば、クエリー配列に対して少なくとも７０％または９０％相同である配列を同定するための比較に関する配列アラインメントは、そこで規定されたデフォルトパラメータと、７０％または９０％に設定した相同性の程度のパラメータと共に、GCG Sequence Analysis Software Package（Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, マジソン、ウィスコンシン州 53705から入手され得る ）で利用され得るGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、およびTFASTAプログラムを使用することによって実施され得る。または、例えば、CLUSTALプログラム（カリフォルニア州マウンテンビューのIntelligeneticsのPC/Gene software packageで利用され得る）が使用され得る。
【０１７９】
これらおよび他の配列アラインメント方法は当該分野で周知であり、手動アラインメントによって、目視検査によって、あるいは配列アラインメントアルゴリズム、例えば、上記のプログラムによって具現されるアルゴリズムの任意の手動または自動利用によって実施され得る。種々の有用なアルゴリズム、例えば、：W. R. Pearson & D. J. Lipmanによって、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2444-48(Apr 1988)で記載されている類似性検索方法；T. F. Smith & M. S. Watermanによって、Adv. Appl. Math. 2: 482-89 (1981)およびJ. Molec. Biol. 147: 195-97(1981)で記載されている局所相同性方法；S. B. Needleman & C. D. Wunschによって、J. Molec. Biol. 48 (3): 443-53(Mar 1970)で記載されている相同性アライメント方法；例えば、W. R. Pearsonによって、Genoinics 11 (3): 635-50 (Nov 1991)で；W. R. Pearsonによって、Methods Molec. Biol. 24:307-31 and 25: 365-89 (1994)によって；およびD. G. Higgins & P. M. Sharpによって、Comp. Appl'ns in Biosci. 5: 151-53(1989)およびGene 73(1) : 237-44 (15 Dec 1988)で記載されている種々の方法を含む。
【０１８０】
高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施される核酸ハイブリダイゼーションも、本明細書で記載した十分に相同な配列を得るための有用な技術である。
【０１８１】
ＶＩ．核酸構築物
本発明のなお別の態様において、ペプチドの改良された生成法で使用するための核酸構築物が提供される。
１つの実施形態において、ａ）組換えポリペプチドをコードする核酸配列と、ｂ）原栄養可能（prototrophy-enabling）酵素をコードする核酸配列とを含む、シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞を形質転換するために使用する核酸構築物が提供される。別の実施形態において、核酸構築物はｃ）Ｐｌａｃ−Ｐｔａｃファミリープロモーターをさらに含む。なお別の実施形態において、核酸構築物はｄ）ｌａｃまたはｔａｃファミリープロモーターの３’側の少なくとも１つのｌａｃＯ配列、または誘導体をさらに含む。なお別の実施形態において、核酸構築物はｅ）ｌａｃまたはｔａｃファミリープロモーターの５’側の少なくとも１つのｌａｃＯ配列、または誘導体をさらに含む。１つの実施形態において、誘導体ｌａｃＯ配列は、ｌａｃＯｉｄ配列でありうる。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）生物は蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である。
【０１８２】
本発明の１つの実施形態において、ａ）組換えポリペプチドをコードする核酸配列と、ｂ）Ｐｌａｃ−Ｐｔａｃファミリープロモーターと、ｃ）ｌａｃまたはｔａｃファミリープロモーターの３’側の少なくとも１つのｌａｃＯ配列、または誘導体と、ｄ）ｌａｃまたはｔａｃファミリープロモーターの５’側の少なくとも１つのｌａｃＯ配列、または誘導体を含む、シュードモナス（Pseudomonad）生物内で発現ベクターとして使用するための核酸構築物が提供される。１つの実施形態において、誘導体ｌａｃＯ配列は、ｌａｃＯｉｄ配列でありうる。１つの実施形態において、核酸構築物は、ｅ）栄養要求性シュードモナス（Pseudomonad）細胞内で使用するための原栄養可能（prototrophy-enabling）選択マーカーをさらに含む。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）生物は蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）である。
【０１８３】
本発明の１つの実施形態において、栄養要求性宿主細胞を原栄養能に形質転換し得る少なくとも１つの生合成酵素をコードする核酸を含む核酸構築物が提供される。生合成酵素は、生合成酵素の発現なしに宿主細胞が栄養要求性代謝不全のために生存できない選択培地上で、栄養要求性宿主細胞が生存し得るようにするいずれの酵素でもよい。そのようなものとして、生合成酵素は、非栄養要求性代謝産物添加培地上で増殖するために原栄養能力を回復することによって、栄養要求性宿主の代謝不全を補完する酵素でありうる。
【０１８４】
１つの特定の実施形態において、本発明は、ｐｙｒＦ（−）栄養要求性宿主を補完する機能性オロトジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ酵素をコードする核酸構築物を提供する。特定の実施形態において、核酸構築物は、配列番号１または３の核酸配列を含有する。代替的な実施形態において、核酸構築物は配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する。
【０１８５】
別の特定の実施形態において、本発明は、ｔｈｙＡ（−）栄養要求性宿主を補完する機能性チミジラートシンターゼ酵素をコードする核酸構築物を提供する。特定の実施形態において、核酸構築物は配列番号４の核酸配列を含有する。代替的な実施形態において、核酸構築物は、配列番号５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する。
【０１８６】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、ｐｒｏＣ（−）栄養要求性宿主を補完する機能性Δ1−ピロリン−５−カルボキシラートレダクターゼ酵素をコードする、核酸構築物を提供する。特定の実施形態において、核酸構築物は、配列番号６または８の核酸配列を含有する。代替的な実施形態において、核酸構築物は、配列番号７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する。
【０１８７】
代替的な実施形態において、本発明は、栄養要求性宿主細胞を原栄養能および追加の非栄養要求性選択マーカーに形質転換し得る少なくとも１つの生合成酵素をコードする、核酸構築物を提供する。非栄養要求性選択マーカーの例は当該分野で周知であり、比色／発色または蛍光反応を生じさせるマーカー（例えば、ｌａｃＺ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ｌｕｘＡＢ遺伝子）、抗生物質耐性選択マーカー（例えば、アンホテリシンＢ、バシトラシン、カルバペネム、セファロスポリン、エタンブトール、フルオロキノロン、イソニジド、セファロスポリン、メチシリン、オキサシリン、バノマイシン、ストレプトマイシン、キノリン、リファンピン、リファンピシン、スルホンアミド、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、セファロチン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、ペニシリン、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子）、または他の一般に使用される非栄養要求性選択マーカーを含み得る。
【０１８８】
別の実施形態において、発現ベクターは、栄養要求性宿主細胞を原栄養能に形質転換し得る、１つを超える生合成酵素を含み得る。生合成酵素は、生合成酵素の発現なしに宿主細胞が栄養要求性代謝不全のために生存できない選択培地上で、栄養要求性宿主細胞が生存し得るようにするいずれの酵素でもよい。生合成酵素は、非栄養要求性代謝産物添加培地上で増殖するために原栄養能力を回復することによって、栄養要求性宿主の代謝不全を補完する酵素でありうる。例えば、発現ベクターは、第１および第２の原栄養可能（prototrophy-enabling）選択マーカー遺伝子を含み、構築物を含有する宿主細胞が宿主細胞の生存が選択マーカー遺伝子の存在を必要とする条件のいずれか、または両方で維持されるようにする。マーカー−遺伝子依存性生存条件の一方のみが存在する場合、対応するマーカー遺伝子は発現される必要があり、次に他方のマーカー遺伝子は  細胞が栄養要求性である必要なすべての栄養分は培地によってなお供給されるが、活性または不活性のいずれかである。このことは、宿主細胞が異なる条件間で移動されるときに、所望のトランスジェニック産物および／またはトランスジェニック活性をコードする同じ標的遺伝子、または共有結合された標的遺伝子の同じセットが宿主細胞内に連続して維持されるようにする。選択した選択マーカー遺伝子それぞれのコード配列は独立して、構成性または調節プロモーターのいずれかに作動可能に結合され得る。
【０１８９】
特定の実施形態において、核酸ベクターは、ｐｙｒＦ（−）栄養要求性宿主細胞、ｐｒｏＣ（−）栄養要求性宿主細胞、またはｐｙｒＦ（−）／ｐｒｏＣ（−）デュアル栄養要求性宿主細胞を補完し得る機能性オロトジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ酵素および機能性Δ1−ピロリン−５−カルボキシラートレダクターゼ酵素をコードする、核酸構築物を含む。特定の実施形態において、核酸構築物は、配列番号１または３、および配列番号６または８の核酸配列を含む。代替的な実施形態において、核酸構築物は配列番号２および７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する。
【０１９０】
代替的な特定の実施形態において、核酸ベクターは、ｐｙｒＦ（−）栄養要求性宿主細胞、ｔｈｙＡ（−）栄養要求性宿主細胞、またはｐｙｒＦ（−）／ｔｈｙＡ（−）デュアル栄養要求性宿主細胞を補完し得る機能性オロトジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ酵素および機能性チミジラートシンターゼ酵素をコードする、核酸構築物を含む。特定の実施形態において、核酸構築物は、配列番号１または３、および配列番号４の核酸配列を含む。代替的な実施形態において、核酸構築物は、配列番号２および５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する。
【０１９１】
特定の実施形態において、核酸ベクターは、ｐｒｏＣ（−）栄養要求性宿主細胞、ｔｈｙＡ（−）栄養要求性宿主細胞、またはｐｒｏＣ（−）／ｔｈｙＡ（−）デュアル栄養要求性宿主細胞を補完し得る機能性Δ1−ピロリン−５−カルボキシラートレダクターゼ酵素およびチミジラートシンターゼ酵素をコードする、核酸構築物を含む。特定の実施形態において、核酸構築物は、配列番号４、および配列番号６または８の核酸配列を含む。代替的な実施形態において、核酸構築物は、配列番号５および７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する。
【０１９２】
プロモーター
発酵プロセスにおいて、標的組換えポリペプチドの発現が誘導されると、発現系の効率を最大限にするために、高レベルの産生を有することが理想的である。プロモーターは、転写を開始させ、一般にリボソーム結合部位の１０〜１００ヌクレオチド上流に位置する。プロモーターは理想的に、宿主細胞の細胞タンパク質全体の約５０％の組換えポリペプチド蓄積を可能にするのに十分強力となり、厳密な調節を受け、容易に（安価に）誘導される。
【０１９３】
本発明によって使用したプロモーターは、構成性プロモーターまたは調節プロモーターである。一般に使用される誘導性プロモーターおよびその続いてのインデューサは、ｌａｃ（ＩＰＴＧ）、ｌａｃＵＶ５（ＩＰＴＧ）、ｔａｃ（ＩＰＴＧ）、ｔｒｃ（ＩＰＴＧ）、Ｐｓｙｎ（ＩＰＴＧ）、ｔｒｐ（トリプトファン飢餓）、ａｒａＢＡＤ（１−アラビノース）、ｌｐｐa（ＩＰＴＧ）、ｌｐｐ−ｌａｃ（ＩＰＴＧ）、ｐｈｏＡ（ホスフェート飢餓）、ｒｅｃＡ（ナリジクス酸）、ｐｒｏＵ（容量オスモル濃度）、ｃｓｔ−１（グルコース飢餓）、ｔｅｔＡ（テトラサイクリン）、ｃａｄＡ（ｐＨ）、ｎａｒ（嫌気性条件）、ＰＬ（４２℃への熱移動）、ｃｓｐＡ（２０℃への熱移動）、Ｔ７（熱誘導）、Ｔ７−ｌａｃオペレーター(ＩＰＴＧ)、Ｔ３−ｌａｃオペレーター（ＩＰＴＧ）、Ｔ５−ｌａｃオペレーター（ＩＰＴＧ）、Ｔ４遺伝子３２（Ｔ４感染）、ｎｐｒＭ−ｌａｃオペレーター（ＩＰＴＧ）、Ｐｍ（アルキル−またはハロ−ベンゾアート）、Ｐｕ（アルキル−またはハロ−トルエン）、Ｐｓａｌ（サリチラート）、およびＶＨｂ（酸素）を含む。例えば、Makrides, S. C. (1996) Microbiol. Rev. 60,512-538 ; Hannig G. & Makrides, S. C. (1998) TIBTECH 16,54-60 ; Stevens, R. C. (2000) Structures 8,R177-R185を参照。例えば、：J. Sanchez-Romero & V. De Lorenzo, Genetic Engineering of Nonpathogenic Pseudomonas strains as Biocatalysts for Industrial and Environmental ｐｒｏＣesses, in Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (A. Demain & J. Davies, eds.) pp. 460-74 (1999) (ASM Press, Washington, D. C.);H. Schweizer, Vectors to express foreign gene and techniques to monitor gene expression for Pseudomonads, Current Opinion in Biotechnology, 12: 439-445 (2001); and R. Slater & R. Williams, The Expression of Foreign DNA in Bacteria, in Molecular Biology and Biotechnology (J. Walker & R. Rapley, eds.) pp.125-54 (2000) (The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK)を参照。
【０１９４】
選択した細菌宿主細胞に対して天然のプロモーターのヌクレオチド配列を有するプロモーター（例えば、シュードモナス（Pseudomonas）アントラニラートまたはベンゾアートオペロンプロモータ（Ｐａｎｔ、Ｐｂｅｎ））はまた、標的ポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現を制御するために使用され得る。１つを超えるプロモーターが相互に別のプロモーターに共有結合されているタンデムプロモータ、例えば、Ｐａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモータ（プロモーター間ハイブリッド）またはＰｌａｃ−Ｐｌａｃタンデムプロモータも、配列が同じでも異なっていても使用し得る。
【０１９５】
調節プロモーターは、プロモーターが部分である遺伝子の転写を制御するために、プロモーター調節タンパク質を利用する。本明細書で調節プロモーターを使用する場合、対応するプロモーター調節タンパク質も本発明による発現系の部分となる。プロモーター調節タンパク質の例は：アクチベータタンパク質、例えば、大腸菌（E.coli）異化産物アクチベータタンパク質、ＭａＩＴタンパク質；ＡｒａＣファミリー転写アクチベーター；リプレッサータンパク質、例えば、大腸菌（E.coli）ＬａｃＩタンパク質；およびデュアルファクション（dual-faction）調節タンパク質、例えば、大腸菌（E.coli）ＮａｇＣタンパク質を含む。多くの調節プロモーター／プロモーター調節タンパク質の対は当該分野で公知である。
【０１９６】
プロモーター調節タンパク質は、プロモーターの制御下にある遺伝子の少なくとも１つのＤＮＡ転写調節領域を放出させるか、または該領域に結合させて、それにより遺伝子の転写を開始するときトランスクリプターゼ酵素の作用を許容または遮断するために、エフェクタ化合物、すなわち調節タンパク質と可逆的または非可逆的に結合する化合物と相互作用する。エフェクタ化合物は、インデューサまたはコリプレッサーのいずれかとして分類され、これらの化合物は天然のエフェクタ化合物および無償性インデューサ化合物を含む。多くの調節プロモーター／プロモーター調節タンパク質／エフェクタ化合物トリオは、当該分野で公知である。エフェクタ化合物は、細胞培養または発酵の間に使用され得るが、調節プロモーターを使用する特定の実施形態において、宿主細胞バイオマスの所望の量または密度の増殖後、所望の標的遺伝子の発現を直接または間接的に引き起こすために、適切なエフェクタ化合物が培養物に添加される。
【０１９７】
一例として、ｌａｃファミリープロモーターを利用する場合、ｌａｃＩ遺伝子、またはその誘導体、例えば、ｌａｃＩQまたはｌａｃＩQ1遺伝子も系に存在し得る。（通常は）構成的に発現された遺伝子であるｌａｃＩ遺伝子は、これらのプロモーターのｌａｃオペレーターに結合するＬａｃリプレッサータンパク質（ＬａｃＩタンパク質）をコードする。したがってｌａｃファミリープロモーターを利用する場合、ｌａｃＩ遺伝子も発現系に包含させて発現させ得る。ｌａｃプロモータファミリ構成要素、例えば、ｔａｃプロモーターの場合、エフェクタ化合物はインデューサ、好ましくは無償性インデューサ、例えば、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｐ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、「イソプロピルチオガラクトシド」とも呼ばれる）である。
【０１９８】
特定の実施形態において、本発明では、Ｐｌａｃ、Ｐｔａｃ、Ｐｔｒｃ、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５、ｌｐｐ−ＰｌａｃＵＶ５、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｎｐｒＭ−ｌａｃ、Ｔ７１ａｃ、Ｔ５１ａｃ、Ｔ３１ａｃ、およびＰｍａｃを含むｌａｃまたはｔａｃファミリープロモーターが利用される。
【０１９９】
他の要素
上記したようにｌａｃＯ配列および誘導体を含む他の調節要素を、発現構築物に含め得る。そのような要素は、これに限定されるわけではないが、例えば、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、他のプロモーター、アクチベーター、翻訳開始および停止シグナル、転写ターミネーター、シストロン性レギュレーター、ポリシストロン性レギュレーター、ヌクレオチド配列「ｔａｇｓ」および「ｔａｇ」ペプチドコード配列（発現されたポリペプチドの同定、分離、精製、または単離を促進するtag配列、例えば、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｆｌａｇ−ｔａｇ、Ｔ７−ｔａｇ、Ｓ−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｂ−ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇを含む）、ポリアルギニン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、ポリアスパラギン酸（Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ）ｎ、チオレドキシン、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルコノトランスフェラーゼ、ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソナートシチジルトランスフェラーゼ、ｔｒｐＥまたはｔｒｐＬＥ、アビジン、ストレプトアビジン、Ｔ７遺伝子１０、Ｔ４ ｇｐ５５、スタヒロコッカスタンパク質Ａ、ストレプトコッカスタンパク質Ｇ、ＧＳＴ、ＤＨＦＲ、ＣＢＰ、ＭＢＰ、ガラクトース結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、ＧＦＰ、ＫＳＩ、ｃ−ｍｙｃ、ｏｍｐＴ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ＮｕｓＡ、ユビキチン、およびヘモシリンＡを含む。
【０２００】
最低でも、本発明のタンパク質コード遺伝子は、タンパク質コード配列に加えて、それに作動可能に結合した以下の調節要素：プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）転写ターミネーター、翻訳開始および停止シグナルを含み得る。有用なＲＢＳは、本発明による発現系内の宿主細胞として有用な種のいずれかから、好ましくは選択した宿主細胞から得られる。多くの特異的な種々のコンセンサスＲＢＳ、例えば、D.Frishman et al., Starts of bacterial genes: estimating the reliability of computer predictions, Gene 234 (2): 257-65 (8 Jul 1999);およびB. E. Suzek et al., A probabilistic method for identifying start codons in bacterial genomes,Bioinformatics 17 (12): 1123-30 (Dec 2001)によって説明および引用されたものが公知である。さらに、天然のまたは合成ＲＢＳのいずれか、例えば、：EP 0207459（合成ＲＢＳ）;O. Ikehata et al., Primary structure of nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence of a Rhodococcus species and its expession in Escherichia coli, Eur. J. Biochem. 181 (3): 563-70 (1989)（AAGGAAGの天然のRBS配列）に記載されているものが使用される。本発明で有用な方法、ベクター、ならびに翻訳および転写要素、ならびに他の要素のさらなる例が、例えば、：Gilroyへの米国特許第5,055,294およびGilroy et al.への米国特許第５，１２８，１３０号；Rammler et al.への米国特許第５，２８１，５３２号；Barnes et al.へのUS Patent Nos.4,695,455および4,861,595；Gray et al.への米国特許第４，７５５，４６５号；およびWilcoxへの米国特許第５，１６９，７６０号に記載されている。
【０２０１】
ベクター
シュードモナス（Pseudomonad）宿主による本発明の酵素をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターまたはプラスミドに挿入することによってさらに向上させ得る。代表的なエンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を向上させる通常１０〜３００ｂｐのサイズの、ＤＮＡのｃｉｓ作用要素である。
【０２０２】
一般に、組換え発現ベクターは、シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞、例えば、本発明の栄養要求株回復遺伝子の形質転換を可能にする複製起点および選択マーカー、ならびに下流構造配列の転写を指示する、高度に発現された遺伝子に由来するプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、上記されている。非相同配列構造配列は適切な期に翻訳開始および終止配列によって構築され、ある実施形態において、リーダー配列が翻訳ポリペプチドの分泌を指示し得る。場合により本発明に従って、非相同配列は、所望の特徴、例えば、発現された組換え産物の安定化または単純化された精製を付与する、Ｎ末端同定ペプチドを含む融合ポリペプチドをコードし得る。
【０２０３】
酵素の発現で蛍光菌（P. fluorescens）によって使用するための有用な発現ベクターは、所望の標的ポリペプチドをコードする構造ＤＮＡ配列を、適切な翻訳開始および終止シグナルと共に、作動可能な読み取りフェーズ（reading phase）に機能性プロモーターとともに挿入することによって作製される。ベクターは、ベクターを確実に維持して、所望ならば宿主内での増幅を提供するために、１つまたはそれ以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含む。本開示による形質転換に適切な宿主は、シュードモナス（Pseudomonas）属内の多様な種を含み、特に蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）の宿主細胞株である。
【０２０４】
ベクターは当該分野では、宿主細胞内で組換えタンパク質を発現させるのに有用であるとして公知であり、これらのいずれも改変され、本発明による遺伝子を発現するために使用され得る。そのようなベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、およびファージ発現ベクターを含む。本発明で使用するために改変され得る有用なプラスミドベクターの例は、これに限定されるわけではないが、発現プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ、ｐＤＳＫ５１９、ｐＫＴ２４０、ｐＭＬ１２２、ｐＰＳ１０、ＲＫ２、ＲＫ６、ｐＲＯ１６００、およびＲＳＦ１０１０を含む。さらなる例は、ｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ１、ｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ、ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ、ｐＣａｌ−ｎ、ｐＣａｌ−ｎ−ＥＫ、ｐＣａｌ−ｃ、ｐＣａｌ−Ｋｃ、ｐｃＤＮＡ ２．１、ｐＤＵＡＬ、ｐＥＴ−３ａ−ｃ、ｐＥＴ ９ａ−ｄ、ｐＥＴ−１１ａ−ｄ、ｐＥＴ−１２ａ−ｃ、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ１５ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１７ｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ２４ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ２８ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３３ｂ（＋）、ｐＥＴ−３４ｂ（＋）、ｐＥＴ３５ｂ（＋）、ｐＥＴ−３６ｂ（＋）、ｐＥＴ−３７ｂ（＋）、ｐＥＴ−３８ｂ（＋）、ｐＥＴ−３９ｂ（＋）、ｐＥＴ−４０ｂ（＋）、ｐＥＴ−４１ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−４２ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−４３ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴＢｌｕｅ−１、ｐＥＴＢｌｕｅ−２、ｐＥＴＢｌｕｅ−３、ｐＧＥＭＥＸ−１、ｐＧＥＭＥＸ−２、ｐＧＥＸｌλＴ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＧＥＸ−５Ｘ、ｐＧＥＸ−６Ｐ、ｐＨＡＴ１０／１１／１２、ｐＨＡＴ２０、ｐＨＡＴ−ＧＦＰｕｖ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＬＥＸ、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｅ、ｐＭＡＬ−ｃ２ｇ、ｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ、ｐＭＡＬ−ｐ２Ｅ、ｐＭＡＬ−ｐ２Ｇ、ｐＰｒｏＥＸ  ＨＴ、ｐＰＲＯＬａｒ．Ａ、ｐＰＲＯＴｅｔ．Ｅ、ｐＱＥ−９、ｐＱＥ−１６、ｐＱＥ−３０／３１／３２、ｐＱＥ−４０、ｐＱＥ−５０、ｐＱＥ−７０、ｐＱＥ−８０／８１／８２Ｌ、ｐＱＥ−１００、ｐＲＳＥＴ、およびｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、ｐＴｒｉＥｘ−１、  ｐＴｒｉＥｘ−２、ｐＴｒｘＦｕｓを含み得る。そのように有用なベクターの他の例は、例えば、：N. Hayase, in Appl. Envir. Microbiol. 60 (9): 3336-42 (Sep 1994); A. A.Lushnikov et al., in Basic Life Sci. 30: 657-62 (1985); S. Graupner & W. Wackernagel, inBiomolec. Eng. 17(1) : 11-16.(Oct 2000); H. P. Schweizer, in Curr. Opin. Biotech. 12(5): 439-45 (Oct 2001); M. Bagdasarian & K. N. Timmis, in Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 47-67(1982); T. Ishii et al., in FEMS Microbiol. Lett. 116(3): 307-13(Mar1, 1994); I. N.Olekhnovich & Y. K. Fomichev, in Gene 140(1) : 63-65(Mar 11,1994) ; M. Tsuda & T. Nakazawa, in Gene 136(1-2): 257-6(Dec 22, 1993); C. Nieto et al., in Gene 87(1) : 145-49(Mar 1,1990) ; J. D. Jones & N. Gutterson, in Gene 61(3): 299-306(1987); M. Bagdasarian et al., in Gene 16(1-3): 237-47 (Dec 1981); H. P. Schweizer et al. , in Genet. Eng. (NY) 23: 69-81(2001); P. Mukhopadhyay et al., in J. Bact. 172(1) : 477-80(Jan 1990); D. O. Wood et al., in J. Bact. 145(3): 1448-51(Mar 1981); and R. Holtwick et al., in Microbiology 147(Pt 2): 337-44(Feb 2001)に記載されているものを含む。
【０２０５】
シュードモナス（Pseudomonas）宿主細胞で使用され得る発現ベクターのさらなる例は、示されたレプリコンに由来するような、表１６に示した発現ベクターを含む。
【表１６】
2007511238.tif 000018
【０２０６】
発現プラスミドＲＳＦ１０１０は、例えば、F. Heffron et al.によってproC. Nat'l Acad. Sci. USA 72(9):3623-27(Sep 1975)に、K. Nagahari & K. Sakaguchiによって、J. Bact. 133(3): 1527-29(Mar1978)に記載されている。プラスミドＲＳＦ１０１０およびその誘導体は、本発明の特に有用なベクターである。当該分野で公知のＲＳＦ１０１０の有用な誘導体の例は、例えば、ｐＫＴ２１２、ｐＫＴ２１４、ｐＫＴ２３１および関連プラスミド、ならびにｐＭＹＣ１０５０および関連プラスミド（例えば、Thompson et al.へのUS Patent Nos.5,527,883および5,840,554）、例えば、ｐＭＹＣ１８０３を含む。プラスミドpMYC1803は、調節テトラサイクリン耐性マーカーならびにＲＳＦ１０１０プラスミドからの複製および起動位置を保持する、ＲＳＦ１０１０ベースのプラスミドｐＴＪＳ２６０に由来する（WilcoxへのUS Patent No.5,169,760を参照）。他の有用なベクターの例は、Puhler et al.へのUS Patent No.4,680,264に記載されているものを含む。
【０２０７】
１つの実施形態において、発現プラスミドは発現ベクターとして使用される。別の実施形態において、ＲＳＦ１０１０またはその誘導体は、発現ベクターとして使用される。なお別の実施形態において、ｐＭＹＣ１０５０またはその誘導体、あるいはｐＭＹＣ１８０３またはその誘導体は、発現ベクターとして使用される。
【０２０８】
ＶＩＩ．シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞における組換えポリペプチドの発現
本発明の１つの態様において、改良されたタンパク質生成に使用するための、組換えポリペプチドを発現させるプロセスが提供される。
【０２０９】
１つの実施形態において、プロセスは、少なくとも１つの代謝産物に対して栄養要求性であるシュードモナス（Pseudomonad）において、ａ）組換えポリペプチドと、ｂ）原栄養性回復酵素とをコードする核酸を含む核酸構築物の発現を提供する。代替的な実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）は、１つを超える代謝産物に対して栄養要求性である。１つの実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）細胞である。特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、窒素含有塩基化合物およびアミノ酸からなる群から選択される代謝産物、または代謝産物の組合せに対して栄養要求性であるシュードモナス（Pseudomonad）において発現される。さらに特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、ウラシル、プロリン、およびチミジンからなる群から選択される代謝産物に対して栄養要求性であるシュードモナス（Pseudomonad）において発現される。別の実施形態において、栄養要求株は、宿主ｐｙｒＦ、ｐｒｏＣ、またはｔｈｙＡ遺伝子それぞれのノックアウトによって産生され得る。代替的な実施形態、組換えポリペプチドは、ＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外の、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ遺伝子、ｌａｃＩQ遺伝子、またはｌａｃＩQ1遺伝子の、宿主細胞の染色体への挿入によって遺伝子改変された栄養要求性シュードモナス（Pseudomonad）細胞において発現される。１つの特定の実施形態において、栄養要求性宿主細胞で発現された組換えポリペプチドを含有するベクターは、少なくとも２つのｌａｃオペレーター配列、またはその誘導体を含む。なおさらなる実施形態において、組換えポリペプチドはＰｌａｃファミリープロモーターによって駆動される。
【０２１０】
別の実施形態において、プロセスは、シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞ゲノムに挿入されたＬａｃＩコード遺伝子の少なくとも１つのコピーを提供するように遺伝子改変されたシュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞の使用を含み、ここでｌａｃＩコード遺伝子は、ＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外である。１つの実施形態において、Ｌａｃリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ遺伝子のそれと同じである。別の実施形態において、Lacリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、ｌａｃＩQ遺伝子である。なお別の実施形態において、Ｌａｃリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、ｌａｃＩQ1遺伝子である。特定の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）細胞である。別の実施形態において、シュードモナス（Pseudomonad）は、栄養要求性細胞を産生するためにさらに遺伝子改変される。別の実施形態において、プロセスは、少なくとも約３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌまたは少なくとも約１０ｇ／Ｌの組換えポリペプチドレベルを生じる。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、３ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌのレベルで発現される。
【０２１１】
方法は一般に：
ａ）本発明で記載するようなシュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞、好ましくは蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）を提供する工程；
ｂ）ｉ）目的の標的組換えポリペプチド、および栄養要求性宿主を利用する場合には、ｉｉ）発現されたときに宿主細胞の栄養要求性を克服する原栄養可能（prototrophy enabling）酵素をコードする遺伝子、を含む少なくとも１つの核酸発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクションする工程；
ｃ）宿主細胞中に目的の組換えポリペプチドを含有する核酸発現ベクターを維持するために有効な選択圧を供給する増殖培地で宿主細胞を増殖させる工程；ならびに
ｄ）目的の標的組換えポリペプチドを発現させる工程；
を含む。
【０２１２】
方法は、宿主細胞に、ｉｉｉ）Ｐｌａｃファミリープロモーター、および場合によりｉｖ）１つを超えるｌａｃオペレーター配列をさらに含む発現ベクターによって少なくとも１回トランスフェクションする工程をさらに含み得る。１つの実施形態において、少なくとも１つのｌａｃオペレーター配列は、ｌａｃＯｉｄ配列でありうる。好ましくは、発現系は、少なくとも１ｇ／Ｌ〜少なくとも８０ｇ／Ｌのポリペプチド総生産性にて標的ポリペプチドを発現し得る。特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、少なくとも３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、または少なくとも８０ｇ／Ｌのレベルで発現される。特定の実施形態において、Ｐｌａｃ、Ｐｔａｃ、Ｐｔｒｃ、ＰｔａｃＩＩ、ＰＩａｃＵＶ５、ｌｐｐ−ＰｌａｃＵＶ５、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｎｐｒＭ−ｌａｃ、Ｔ７１ａｃ、Ｔ５１ａｃ、Ｔ３１ａｃ、およびＰｍａｃを含む、ｌａｃまたはｔａｃファミリープロモーターが本発明で利用される。
【０２１３】
１つの実施形態において、少なくとも１つの組換えポリペプチドは、１つの代謝産物に対して栄養要求性であるシュードモナス（Pseudomonad）細胞にて発現させることが可能であり、ここで該栄養要求株は、目的のポリペプチおよび原栄養可能（prototrophy-enabling）酵素をコードする核酸発現ベクターの維持のための選択マーカーとして作用する。あるいは、１つを超える組換えポリペプチドは、１つの代謝産物に対して栄養要求性であるシュードモナス（Pseudomonad）細胞にて発現させることが可能であり、ここで組換えポリペプチドをコードする該核酸は、同じベクターに、あるいは複数のベクターに含有されることが可能である。
【０２１４】
なお別の実施形態において、異なる標的ポリペプチドをコードする１つを超える発現ベクターを少なくとも１つの代謝産物に対して栄養要求性であるシュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞内に維持することが可能であり、ここで１つの発現ベクターは、原栄養可能（prototrophic-enabling）酵素および目的の第１の標的ポリペプチドをコードする核酸を含有し、第２の発現ベクターは、代わりの非栄養要求性選択マーカーおよび目的の第２のポリペプチドをコードする核酸を含有する。
【０２１５】
別の実施形態において、少なくとも１つの組換えポリペプチドは、１つを超える代謝産物に対して栄養要求性であるシュードモナス（Pseudomonad）細胞において発現させることが可能であり、ここで複数の原栄養能は、核酸発現ベクターの維持のための選択マーカーとして作用する。例えば、第１および第２の原栄養可能（prototrophy-enabling）選択マーカー遺伝子が存在する発現ベクターが利用され得る。両方のマーカー遺伝子が同じＤＮＡ構築物に存在する場合、構築物を含有する宿主細胞は、宿主細胞の生存が選択マーカー遺伝子の存在を必要とする条件のいずれかまたは両方の下で維持される。マーカー−遺伝子依存性生存条件の一方のみが存在する場合、対応するマーカー遺伝子は発現される必要があり、他方のマーカー遺伝子は、細胞が栄養要求性のままである必要なすべての栄養素はは培地によってなお供給されるが、活性または不活性のいずれかである。このことは、宿主細胞が異なる条件間で移動されるときに、所望のトランスジェニック産物および／または所望のトランスジェニック活性をコードする同じ標的遺伝子、または共有結合された標的遺伝子の同じセットが宿主細胞内に連続して維持されるようにする。２つの選択マーカー遺伝子それぞれが別のＤＮＡ構築物に位置する場合、宿主細胞内にＤＮＡ構築物の両方を維持するために、マーカー−遺伝子依存性生存条件の両方が存在し、対応するマーカー遺伝子の両方が発現される必要がある。このことは、１つを超える非共有結合標的遺伝子または標的遺伝子のセットが宿主細胞内で別個に維持されるようにする。選択した選択マーカー遺伝子それぞれのコード配列は独立して、構成性または調節プロモーターのいずれかに作動可能に結合され得る。
【０２１６】
そのような多標的遺伝子系の二重標的遺伝子の例は、これに限定されるわけではないが：（１）標的遺伝子の一方の発現産物が他方の標的遺伝子事態と相互作用する系；（２）標的遺伝子の一方の発現産物がもう一方の標的遺伝子の発現産物、例えば、タンパク質およびその結合タンパク質またはαｎ−βｎタンパク質のα−およびβ−ポリペプチドと相互作用する系；（３）２つの遺伝子両方の２つの発現産物が第３の成分、例えば、宿主細胞内に存在する第３の成分と相互作用する系；（４）２つの遺伝子両方の発現産物が一般的な生体触媒経路に関与する系；および（５）２つの遺伝子の２つの発現産物が相互に独立して機能する系、例えば、バイクローナル抗体発現系を含む。
【０２１７】
上に挙げたタイプ（１）の二重標的遺伝子系の１つの例において、第１の標的遺伝子は、所望の標的タンパク質をコードし、ここで第１の標的遺伝子は調節プロモーターの制御下にあり；次に第２の標的遺伝子は第１の標的遺伝子のプロモーターの調節に関与するタンパク質をコードし、例えば、第２の標的遺伝子は、第１の標的遺伝子のプロモータアクチベータまたはリプレッサータンパク質をコードする。第２の遺伝子が第１の遺伝子のプロモーター調節タンパク質をコードする例において、第２の遺伝子のコード配列は、構成性プロモーターの制御下にありうる。１つの実施形態において、第２の遺伝子は、細胞内に高コピー数構築物として維持される独立したＤＮＡ構築物の一部となり、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０のコピー数、または５０コピー超が宿主細胞内に維持される。
【０２１８】
別の実施形態において、本発明は、シュードモナス（Pseudomonads）、特に蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）中での組換えポリペプチドの産生における発現ベクター上の１つを超えるlacO配列の使用を提供する。
【０２１９】
別の態様において、本発明は、ｌａｃＩ導入遺伝子、またはその誘導体、例えば、ｌａｃＩQまたはｌａｃＩQ1をコードするＬａｃリプレッサータンパク質の少なくとも１つの染色体挿入されたコピーを有する、シュードモナス（Pseudomonads）および密接に関連した細菌の構成要素である細菌宿主細胞を形質転換する工程を含む、組換えポリペプチドを産生する方法を提供し、該導入遺伝子は、ＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡ構築物を少なくとも１つの標的組換えポリペプチドをコードする核酸構築物と共に含有する完全または切断構造遺伝子の一部以外である。少なくとも１つの標的組換えポリペプチドをコードする核酸は、Ｐｌａｃファミリープロモーターに作動可能に結合することが可能であり、宿主細胞内に存在するＰｌａｃファミリープロモーターはすべて、染色体に挿入されたｌａｃＩ導入遺伝子から唯一発現されるＬａｃリプレッサータンパク質によって調節される。場合により、発現系は、少なくとも３ｇ／Ｌ〜少なくとも１０ｇ／Ｌのポリペプチド総生産性にて標的ポリペプチドを発現し得る。好ましくは発現系は、少なくとも３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｇ／Ｌのポリペプチド総生産性にて標的ポリペプチドを発現し得る。
【０２２０】
１つの実施形態において、本発明は、ＰｌａｃＩ−ｌａｅｌｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外の、細胞のゲノム内に挿入されたＬａｃＩコード遺伝子の少なくとも１つのコピーを提供するようにさらに遺伝子改変された栄養要求性シュードモナス（Pseudomonad）または関連細菌を利用する発現系において組換えポリペプチドを発現させる方法を提供する。特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、ｌａｃＩ導入遺伝子インサートを含有する栄養要求性蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）宿主細胞にて発現される。別の特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、ｌａｃＩQ導入遺伝子インサートを含有する栄養要求性蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）宿主細胞にて発現される。なお別の特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、ｌａｃＩQ1導入遺伝子インサートを含有する栄養要求性蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）宿主細胞にて発現される。蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）宿主は、生存のために細胞によって要求される生化学物質に対して栄養要求性でありうる。特定の実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）細胞は、窒素含有塩基に対して栄養要求性である。特定の実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）は、チミンおよびウラシルからなる群から選択される窒素含有塩基に対して栄養要求性である。特に特定の実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）宿主細胞の栄養要求性は、関連するコード産物を非機能性にするｐｙｒＦまたはｔｈｙＡ遺伝子への遺伝子改変によって誘導される。代替的な実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）細胞は、アミノ酸に対して栄養要求性である。特定の実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）は、アミノ酸プロリンに対して栄養要求性である。特に特定の実施形態において、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）宿主細胞の栄養要求性は、関連するコード産物を非機能性にするｐｒｏＣ遺伝子への遺伝子改変によって誘導される。
【０２２１】
形質転換
シュードモナス（Pseudomonad）宿主細胞のベクターによる形質転換は、当該分野で公知の任意の形質転換方法を使用して実施され、細菌宿主細胞は、無傷の細胞として、またはプロトプラスト（すなわちサイトプラストを含む）として形質転換され得る。形質転換方法の例は、穿孔方法（例えば、電気穿孔）、プロトプラスト融合、細菌結合、および２価カチオン処理（例えば、カルシウムクロライド処理またはＣａＣｌ／Ｍｇ2+処理）、あるいは当該分野で周知の他の方法を含む。例えば、Morrison, J. Bact., 132:349-351(1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology, 101:347-362(Wu et al., eds,1983), Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd ed.1989);Kriegler, Gene Transfer and 発現: A Laboratory Manual(1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994))を参照。
【０２２２】
選択
好ましくは、うまく形質転換されない細胞は、形質転換の後に、および発酵中に連続的に選択される。選択マーカーは、栄養要求性選択マーカーまたは従来の抗生物質選択マーカーでありうる。細胞が多数の栄養化合物に対して栄養要求性である場合、栄養要求性細胞は、原栄養回復ベクターによって形質転換されるまで、これらの栄養化合物すべてが添加された培地上で培養され得る。宿主細胞は、多数の生合成活性を欠いているか、または欠くようにされている場合、原栄養回復マーカー系は、１つまたはそれ以上のまたはすべての生合成活性を回復させるために選択可能であり、残りは、培地中になお欠乏している栄養の供給を継続することによって補償される。１つを超える生合成活性、および／または１つを超える原栄養能が回復される選択マーカー系において、複数の選択マーカー遺伝子が１つのベクター上で共に発現されるか、または異なるベクター上で別個に同時発現される。単一の代謝産物が選択マーカー系の標的である場合、多数の生合成活性を選択マーカー系に包含させ得る。例えば、同じ同化経路から活性をコードする２つまたはそれ以上の遺伝子は、経路の生成物である化合物の生合成に関して原栄養能を回復させるために、１つのベクター上で共に発現されるか、または異なるベクター上で別個に同時発現される。
【０２２３】
選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、当該分野で周知であるように、非形質転換および復帰変異体細胞を淘汰するために関連抗生物質を培地に添加し得る。
【０２２４】
発酵
本明細書で使用する場合、「発酵」という用語は、文字通りの発酵が利用される実施形態および他の非発酵培養方式が利用される実施形態の両方を含む。発酵は、任意のスケールで実施され得る。１つの実施形態において、発酵培地は富栄養培地、最少培地、無機塩培地から選択される；富栄養培地が使用され得るが、好ましくは回避される。別の実施形態では、最少培地または無機塩培地のいずれかが選択される。なお別の実施形態において、最少培地が選択される。また別の実施形態において、無機塩培地が選択される。無機塩培地が特に特別である。
【０２２５】
原栄養可能（prototrophic enabling）酵素をコードする核酸構築物による宿主細胞の形質転換の前に、宿主細胞を、栄養要求株を補完する補助代謝産物、またはその類似体を含む培地中に維持し得る。形質転換の後に、宿主細胞を宿主細胞が栄養要求性である補助代謝産物の欠乏した培地で培養し得る。このようにして、原栄養性を可能にする選択マーカーを含有しない宿主細胞は淘汰される。同様に抗生物質耐性選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクターから組換えタンパク質を発現する細胞を、形質転換の前に選択のために、関連抗生物質が欠乏した培地上に維持し得る。形質転換後および発酵の間に、非形質転換および復帰変異体細胞を淘汰するために、抗生物質を当該分野で公知の濃度で培地に添加し得る。
【０２２６】
無機塩培地は、無機塩および炭素源、例えば、グルコース、スクロース、またはグリセロールから成る。無機塩培地の例は、例えば、Ｍ９培地、シュードモナス（Pseudomonas）培地（ATCC 179)、Davis and Mingioli培地（BD Davis & ES Mingioli, in J. Bact. 60: 17-28 (1950)を参照）を含む。無機塩培地を作製するのに使用する無機塩は、例えば、リン酸カリウム、硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウム、硫酸マグネシウムまたは塩化マグネシウム、および微量無機物、例えば、塩化カルシウム、ホウ酸塩、および鉄、銅、マンガン、および亜鉛の硫酸塩から選択されるものを含む。有機窒素源、例えば、ペントン、トリプトン、アミノ酸、または酵母抽出物は、無機塩培地には含まれていない。代わりに無機窒素源が使用され、例えば、アンモニウム塩、水性アンモニア、およびガス状アンモニアから選択され得る。特定の無機塩培地は、グルコースを炭素源として含有する。無機塩培地と比較すると、最少培地は無機塩および炭素源も含有し得るが、例えば、低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトン、または他の成分を、これらは最小限のレベルで添加されるが添加し得る。
【０２２７】
１つの実施形態において、培地は以下の表１６に挙げた成分を使用して調製され得る。成分は以下の順序で添加され得る：最初に（ＮＨ4）ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4およびクエン酸を蒸留水約３０リットルに溶解させ得る；次に微量元素の溶液を添加して、消泡剤、例えば、Ucolub N 115の添加を続ける。次に加熱滅菌（例えば、約１２１℃にて）の後、グルコースＭｇＳＯ4およびチアミン−ＨＣＬの滅菌溶液を添加され得る。約６．８でのｐＨの制御は、水性アンモニアを使用して実施され得る。次に滅菌蒸留水を添加して、３７１マイナスグリコールストック（１２３ｍＬ）の初期体積まで調整する。化学薬品は、種々の供給者、たとえMerckから入手され得る。この培地は、シュードモナス（Pseudomonas）種および関連細菌の増殖のための高細胞密度培養（ＨＣＤＣ）を可能にし得る。ＨＣＤＣは、バッチプロセスとして開始可能であり、２相バッチ供給培養が続く。バッチ部の制限されない増殖の後、増殖は、低下した比増殖速度にて、バイオマス濃度が数倍上昇可能である３倍増時間の期間に渡って制御され得る。そのような培養プロセスのさらなる詳細は、Riesenberg, D.; Schulz, V.;Knorre, W. A.; Pohl, H. D.; Korz, D.; Sanders, E. A.; Ross, A.; Deckwer, W. D.(1991) 「High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate」J Biotechnol:20(1)17-27によって記載されている。
【０２２８】
本発明による発現系は、いずれの発酵形式でも培養され得る。例えば、本明細書では、バッチ、供給バッチ、半連続、および連続発酵方式が利用され得る。
【０２２９】
本発明による発現系は、いずれの発酵スケール（例えば、体積）でも導入遺伝子発現に有用である。したがって、例えば、マイクロリットルスケール、センチリットルスケール、およびデシリットルスケール発酵体積が使用され得る；そして１リットルスケールおよびそれ以上の発酵体積が使用され得る。１つの実施形態において、発酵体積は、１リットルまたはそれ以上となる。別の実施形態において、発酵体積は約５リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、５０リットル、７５リットル、１００リットル、２００リットル、５００リットル、１，０００リットル、２０００リットル、５，０００リットル、１０，０００リットルあるいは５０，０００リットルまたはそれ以上となる。
【０２３０】
本発明において、形質転換宿主細胞の増殖、培養、および／または発酵は、宿主細胞の生存を可能にする温度範囲、好ましくは約４℃〜約５５℃（その温度を含む）の範囲内の温度で実施される。
【０２３１】
細胞密度
組換えタンパク質の発現で蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）を使用するさらなる利点には、大腸菌（E.coli）または他の細胞発現系と比較して、高い細胞密度で増殖する蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）の能力が含まれる。このために、本発明による蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）発現系は、約２０ｇ／Ｌまたはそれ以上の細胞密度を供給し得る。本発明による蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）発現系は同様に、容量当たりのバイオマスによって示すように、少なくとも約７０ｇ／Ｌの細胞密度を提供することが可能であり、バイオマスは、乾燥細胞重量として測定される。
【０２３２】
１つの実施形態において、細胞密度は、少なくとも２０ｇ／Ｌである。別の実施形態において、細胞密度は少なくとも２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０  ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、または少なくとも１５０ｇ／Ｌである。
【０２３３】
別の実施形態において、誘導時の細胞密度は、２０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌ；２０ｇ／Ｌ〜１２０ｇ／Ｌ；２０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ；２５ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ；３０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ；３５ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ；４０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ；４５ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ；５０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ；５０ｇ／Ｌ〜７５ｇ／Ｌ；５０ｇ／Ｌ〜７０ｇ／Ｌ；４０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌである。
【０２３４】
組換えタンパク質の発現レベル
本発明による発現系は、トランスジェニックポリペプチドを全細胞タンパク質（%tcp）５％〜８０％のレベルで発現し得る。１つの実施形態において、発現レベルは、５％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％，３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％ｔｃｐまたはそれ以上である。
【０２３５】
単離および精製
本発明によって生成された組換えタンパク質は、これに限定されるわけではないが、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分取用電気泳動、界面活性剤可溶化、カラムクロマトグラフィーなどの物質を用いた選択的沈殿、免疫精製法、およびその他を含む、当該分野で周知の標準技術によって単離され、実質的に純粋になるまで精製される。例えば、確立された分子接着特性を有するタンパク質は、ガンドを可逆的に融合し得る。適切なリガンドを用いると、タンパク質は精製カラムに選択的に吸着され、次に比較的純粋な形でカラムから遊離され得る。次に融合タンパク質は、酵素活性によって除去される。さらに、タンパク質は、免疫アフィニティカラムまたはNi-NTAカラムを使用して精製され得る。一般技術はさらに、例えば、R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: N. Y.(1982); Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press(1990); U. S. Pat. No. 4,511, 503; S. Roe, Protein Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press(2001); D. Bollag, et al., Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996); AK Patra et al., Protein Expr Purif, 18(2): p/182-92(2000);およびR. Mukhija, et al., Gene 165(2): p.303-6(1995)に記載されている。例えば、Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements); Deutscher(1990) 「Guide to Protein Purification,」 Methods in Enzymology vol. 182,およびこのシリーズの他の巻; Coligan, et al.(1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein ScienceWiley/Greene, NY;およびタンパク質精製製品の使用に関するメーカーの文献、例えば、Pharmacia, Piscataway, N.J., またはＢｉｏ−Ｒａｄ, Richmond, Califも参照。組換え技術との組合せは、適切なセグメントへの、例えば、FLAG配列またはプロテアーゼ除去型配列を介して融合され得る同等物への融合を可能にする。例えば、Hochuli(1989) Chemische Industrie 12: 69-70; Hochuli(1990)「Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent」in Setlow(ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87-98, Plenum Press, NY; and Crowe, et al.(1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif.も参照。
【０２３６】
発現タンパク質の検出は、当該分野で公知の方法によって実施され、例えば、, ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング技術または免疫沈降を含む。
【０２３７】
組換え生成および発現酵素は、組換え細胞培養物から種々の方法によって回収および精製可能であり、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、必要に応じて最終精製ステップで利用され得る。
【０２３８】
本発明で発現されるあるタンパク質は、不溶性凝集体（「封入体」）を形成する。複数のプロトコルが封入体からのタンパク質の精製に適している。例えば、封入体の精製は、典型的には、宿主細胞の破壊によって、例えば、５０ｍＭ ＴＲＩＳ／ＨＣＬ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＡＴＰ、および１ｍＭ ＰＭＳＦの緩衝液中でのインキュベーションによって、封入体の抽出、分離および／または精製を包含する。細胞懸濁物は、典型的には、フレンチプレスによって２〜３継代を使用して溶解させる。細胞懸濁物は、Polytron（Brinknan Instruments）を使用してホモジナイズするか、または氷上で超音波処理され得る。細菌を溶解する代わりの方法は、当業者には明らかである（例えば、Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra）を参照。
【０２３９】
必要ならば封入体は溶解させることが可能であり、典型的には、溶解された細胞懸濁物を遠心分離にかけて望ましくない不溶性物質を除去する。封入体を形成するタンパク質は、適合性緩衝液を用いた希釈または透析によって復元され得る。適切な溶媒は、これに限定されるわけではないが、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％、体積／体積ベース）、およびグアニジンヒドロクロライド（約４Ｍ〜約８Ｍ）を含む。グアニジンヒドロクロライドおよび同様の薬剤は変性剤であるが、この変性は非可逆的であり、変性は変性剤の除去（例えば、透析による）または希釈時に起こり、免疫および／または生物活性タンパク質の再生成を可能にする。他の適切な緩衝液は当業者に公知である。
【０２４０】
あるいは、宿主周辺質からの組換えタンパク質またはペプチドを精製することが可能である。宿主細胞の溶解後、組換えタンパク質が宿主細胞の周辺質に搬出されるときに、細菌の周辺質画分を、当業者に公知の他の方法に加え、低温浸透圧衝撃によって単離し得る。例えば、周辺質から組換えタンパク質を単離するために、細菌細胞を遠心分離してペレットを作製し得る。ペレットは、２０％スクロースを含有する緩衝液中に再懸濁させ得る。細胞を溶解させるために、細菌を遠心分離することが可能であり、ペレットを氷冷５ｍＭ ＭｇＳＯ4に再懸濁させて、氷浴で約１０分間保持し得る。細胞懸濁物を遠心分離して、上澄みをデカンテーションして、保存し得る。上澄み中に存在する組換えタンパク質は、当業者に周知の標準分離技術によって宿主タンパク質から分離され得る。
【０２４１】
初期塩画分は、望ましくない宿主細胞タンパク質（または細胞培養培地に由来するタンパク質）の多くを目的の組換えタンパク質から分離し得る。１つのそのような例は、硫酸アンモニウムでありうる。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に減少させることによってタンパク質を沈殿させる。次にタンパク質はその溶解度に基づいて沈殿する。タンパク質が疎水性になればなるほど、より低い硫酸アンモニウム濃度でより沈殿しやすくなる。代表的なプロトコルは、得られる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％となるように、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加することを含む。この濃度は、最も疎水性のタンパク質を沈殿させる。次に沈殿物を廃棄して（目的のタンパク質が疎水性でない限り）、硫酸アンモニウムを、目的のタンパク質を沈殿させることが公知である喉まで上澄みに添加する。次に沈殿物を緩衝液に可溶化させて、過剰な塩を必要に応じて透析またはダイアフィルトレーションのいずれかによって除去する。タンパク質の溶解度に依存する他の方法、例えば、冷エタノール沈殿は、当業者に周知であり、複合タンパク質混合物を分画するために使用され得る。
【０２４２】
組換えタンパク質の分子量は、種々の孔径の膜（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜）を通じた限外濾過を通じて、それをより大きいまたはより小さいサイズのタンパク質から単離するために使用され得る。第１のステップとして、タンパク質混合物は、目的のタンパク質の分子量よりも低い分子量カットオフを有する孔径を備えた膜を通じて濾過し得る。次に限外濾過の保持液を目的のタンパク質の分子量よりも大きい分子カットオフを備えた膜に対して限外濾過し得る。組換えタンパク質は、膜を通じて濾液中へ通過する。次に濾液を以下で記載するようにクロマトグラフにかけ得る。
【０２４３】
組換えタンパク質は、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、およびリガンドへの親和性に基づいて、他のタンパク質から分離し得る。さらに、タンパク質に対して産生された抗体は、カラムマトリクスおよび免疫精製されたタンパク質に結合し得る。これらの方法すべては、当該分野で周知である。クロマトグラフ技術がいずれのスケールでも、多くの種々メーカー（例えば、Pharmacia Biotech)からの機器を使用して実施し得ることは、当業者に明らかとなる。
【０２４４】
復元および再折畳み
不溶性タンパク質は、２級または３級タンパク質構造配座を生成するために復元または再折畳みし得る。組換え産物の形態を完成させるために、タンパク質再折畳みステップを必要に応じて使用し得る。再折畳みおよび復元は、タンパク質の解離／会合を促進するために、当該分野で公知の薬剤を使用して実施され得る。例えば、タンパク質は、チオスレイトールを用いてインキュベートすることが可能であり、酸化グルタチオンジナトリウム塩によるインキュベーションが続き、再折畳み剤、例えば、尿素を含有する緩衝液によるインキュベーションが続く。
【０２４５】
組換えタンパク質も、例えば、それをホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）または５０ｍＭ Ｎａ−アセテート、ｐＨ６緩衝液プラス２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析することによって復元され得る。あるいは、タンパク質を再折畳みして、同時にプロテアーゼインヒビタを含有する５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４中の直鎖６Ｍ〜１Ｍ 尿素勾配を使用して、カラム、例えば、Ｎｉ  ＮＴＡカラムに固定化し得る。復元は、１．５時間またはそれ以上の期間に渡って実施され得る。復元後、タンパク質は、２５０ｍＭ イミダゾールの添加によって溶離され得る。イミダゾールは、ＰＢＳまたは５０ｍＭ ナトリウムアセテート、ｐＨ６緩衝液プラス２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終透析ステップによって除去され得る。精製タンパク質は、４℃にて保管または−８０℃にて凍結され得る。
【０２４６】
他の方法は、MH Lee et al., Protein Expr. Purif., 25(1) : p.166-73(2002), W. K. Cho et al., J. Biotechnology, 77(2-3): p.169-78(2000), Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements), Deutscher(1990) 「Guide to Protein Purification,」 Methods in Enzymology vol.182, and other volumes in this series, Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY, S. Roe, Protein Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press(2001); D. Bollag, et al., Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996)に記載されているものを含む。
【０２４７】
ＶＩ．組換えポリペプチド
本発明は、細菌発現系における改良されたタンパク質生成法を提供する。本発明で使用され得る組換えポリペプチドの例は、原核および真核生物に由来するポリペプチドを含む。そのような生物は、原生生物、菌類、植物、および動物界からの生物を含む、古細菌、細菌、真核生物ドメインからの生物が挙げられる。
【０２４８】
本発明で利用され得るタンパク質の種類は、非制限的な例であるが、例えば、生細胞の数千の化学反応の触媒に関与する酵素；構造または支持タンパク質の重要な型であるケラチン、エラスチン、およびコラーゲン；ヘモグロビンおよび他の気体運搬タンパク質；オボアルブミン、カゼイン、および他の栄養分子；免疫系の分子である抗体；代謝を調節するタンパク質ホルモン；および機械的作業を遂行するタンパク質（例えば、収縮筋タンパク質であるアクチンおよびミオシン）が挙げられる。
【０２４９】
他の特定の非制限的なポリペプチドは、分子、例えば、ヒト成長ホルモンを含む成長ホルモンである、レニン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；トロンボポイエチン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子（例えば、因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、およびvon Willebrands因子）；抗凝固因子（例えば、プロテインＣ）；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノゲンアクチベータ（例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ））；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；エンケファリナーゼ；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー阻害物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；細菌性タンパク質、例えば、ベータラクタマーゼ；Ｄｎａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（VEGF）；ホルモンまたは増殖因子のレセプタ；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６））、あるいは神経増殖因子（例えば、ＮＧＦ−ベータ）；カルジオトロピン（心臓肥大因子）（例えば、カルジオトロピン−１（CT-1））；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子（例えば、aFGFおよびbFGF）；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；形質転換増殖因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４、またはＴＧＦ−ベータ５を含む、ＴＧＦ−ベータ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質（例えば、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、およびＣＤ−１９）；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ、−ベータ、および−ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０）；抗ＨＥＲ−２抗体；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプタ；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウィルス抗体、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの部分；輸送タンパク質；ホーミングレセプタ；アドレシン；調節タンパク質；抗体；および上に挙げたポリペプチドのいずれかの断片を含む。
【０２５０】
本発明に従って発現される組換えペプチドは、標的ポリペプチドコード配列が転写および翻訳調節要素に作動可能に結合され、宿主細胞がタンパク質またはペプチドを発現し得る機能性遺伝子を形成するポリヌクレオチドから発現されることが可能である。コード配列は、利用可能な場合には標的ポリペプチドの天然のコード配列でありうるが、より好ましくは、選択した発現宿主細胞で使用するために選択、改良または最適化されたコード配列となる：例えば、シュードモナス（Pseudomonas）種、例えば、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）のコドン使用バイアス（codon use bias）を反映するために遺伝子を合成することによる。生じる遺伝子は、１つまたはそれ以上のベクター内で作製されるか、１つまたはそれ以上のベクター内に挿入され、次に発現宿主細胞に形質転換される。「発現可能な形態」で供給されると記載された核酸またはポリヌクレオチドは、選択した細菌発現宿主細胞によって発現させ得る少なくとも１つの遺伝子を含有する核酸またはポリヌクレオチドを意味する。
【０２５１】
分子遺伝学および遺伝子工学技術に必要な広範囲に渡る配列情報は、幅広く公に入手され得る。ヒトと同様に哺乳類のヌクレオチド配列、遺伝子、ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびゲノムの入手は、GenBankからURLアドレスhttp://www.ncbi.nlm.mih.gov/Entrezにて達成され得る。追加情報も、Weizmann Institute of Science Genome and Bioinformatics（http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/）による、遺伝子およびその産物に関する情報ならびに生物医学用途を統合する電子百科事典であるGeneCardsから得られ、ヌクレオチド配列情報も、EMBLヌクレオチド配列データベース（http://www.ebi.ac.uk/embl/）またはDNA Databank of Japan (DDBJ、http://www.ddbj.nig.ac.ip/から入手され得る；アミノ酸配列に関する情報の追加サイトは、Georgetown's protein information resource website(http://www-nbrf.georgetown.edu/pir/）およびSwiss-Prot (http://au.expasv.org/sprot/sprot-top.html）を含む。
【実施例１】
【０２５２】
蛍光菌（P. fluorescens）宿主細胞発現系のｐｙｒＦ選択マーカー系の作製
試薬は、別途記載しない限りSigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州）より入手した。ＬＢは、ゼラチンカプセル（BIO 101）内の１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母抽出物および５ｇ／Ｌ ＮａＣｌである。必要な場合、ウラシル（BIO 101より、カールスバッド、カリフォルニア州）またはＬ−プロリンを最終濃度２５０ｕｇ／ｍＬまで添加し、テトラサイクリンを１５ｕｇ／ｍＬまで添加した。ＬＢ／５−ＦＯＡプレートは、ＬＢを２５０ｍＭ ウラシルおよび０．５ｍｇ／ｍＬ ５−フルオロオロチン酸（5-FOA）と共に含有している。Ｍ９培地は、６ｇ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4、３ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／Ｌ ＮＨ4Ｃｌ、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、１×ＨｏＬｅ微量元素溶液、ｐＨ７より成る。グルコースを最終濃度１％まで添加した。１０００×ＨｏＬｅ微量元素溶液は、２．８５ｇ／Ｌ Ｈ3ＢＯ3、１．８ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、１．７７ｇ／Ｌ ナトリウムタートレート、１．３６ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０４ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０２７ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０２５ｇ／Ｌ Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ／Ｌ ＺｎＣｌ2である。
【０２５３】
本明細書で使用するオリゴヌクレオチド
ＭＢ２１４ｐｙｒＦ１（ＮｏｔＩ部位は太字）
５’ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＧＧＣＧＣＴＴＣＧＴＴＴＡＣＡＧＧ−３’（配列番号１４）
ＭＢ２１４ｐｙｒＲ１（ＰｖｕＩ部位は太字；ＫｐｎＩ部位は下線付き太字）
５’ＣＧＡＴＣＧＧＧＴＡＣＣＴＧＴＣＧＡＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＴ−３’（配列番号１５）
ｐｙｒＦＰｓｔＦ（ＰｓｔＩ部位は太字）
５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＡＧＴＴＧＣＧＧＡＧＣＣＴＴＧＧ−３’（配列番号１６）
ｐｙｒＦｏｖｅｒｌａｐ
５’−ＴＧＣＴＣＡＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧＣ−３’（配列番号１７）
ｐｙｒＦＸｂａＲ２（ＸｂａＩ部位は太字）
５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＧＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＴＧＡＡ−３’（配列番号１８）
ｐｙｒａｎａｌＦ
５’−ＧＧＣＧＴＣＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＣＣＴＴ−３’（配列番号１９）
ｐｙｒａｎａｌＲ
５’−ＣＴＣＧＣＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＡＴＣＡＡ−３’（配列番号２０）
Ｍ１３Ｆ（−４０）
５’−ＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡ−３’（配列番号２１）
【０２５４】
蛍光菌（P.fluorescens）からのｐｙｒＦ遺伝子のクローニング
ｐｙｒＦ遺伝子は、蛍光菌（P.fluorescens）からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって、それぞれｐｙｒＦ遺伝子開始コドンから２９７ｂｐ上流、およびその停止コドンから２１２ｂｐ下流をそれぞれ結合するプライマーＭＢ２１４ｐｙｒＦ１およびＭＢ２１４ｐｙｒＲ１を使用してクローニングされる。制限部位は、プライマーの５’端に含まれて、クローニング反応をさらに促進する。ｐｙｒＦ読み取り枠（ＯＲＦ）上流の増幅領域は、ｐｙｒＦの上流を含む天然のプロモーターを含むのに十分な長さとして判断される。転写ターミネーターであり得るＯＲＦの１４〜１１７ｂｐ下流の強力なステムループ構造も、下流フランキング領域に含まれていた。
【０２５５】
ｐｙｒＦ遺伝子をＰＣＲ増幅するために、高忠実度PROOFSTART ＤＮＡポリメラーゼを、メーカー（Qiagen、バレンシア、カリフォルニア州）によって供給された緩衝液、０．３ｍＭ ｄＮＴＰ（Promega、マジソン、ウィスコンシン州）、ＭＢ２１４ｐｙｒＦ１およびＭＢ２１４ｐｙｒＲ１プライマー各1ｕＭ、および蛍光菌（P.fluorescens）ＭＢ２１４からのゲノムＤＮＡ約０．３μｇを含有する反応体積５０ｕＬ中で混合した。増幅条件は、９５℃にて５分間、続いて９４℃にて変性３０秒間、５７℃にてアニーリング３０秒間、および７２℃にて伸長２分間の３５サイクル、続いて７２℃にて１０分間の最終ステップであった。反応物をＳＥＡＫＥＭ  ＧＴＧアガロースの１％ゲル（BioWhittaker Molecular Applicationsより、ロックランド、メイン州）上で分離した。予想された１．２ｋｂバンドをゲルから切除して、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ベッドフォード、マサチューセッツ州）カラムからのＵＬＴＲＡＦＲＥＥ−ＤＡ遠心分離ゲルネブライザでの抽出によって精製し、ＭＩＣＲＯＢＩＯＳＰＩＮ６ Ｐ−６ポリアクリルアミドスピンカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄより、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いてＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中へ脱塩した。
【０２５６】
クローニングした遺伝子は、オロチジン５’ホスフェートデカルボキシラーゼをコードする単一のＯＲＦを含有していた。遺伝子の同一性は、以前に報告されているように（Strych et al., 1994）、Ｐ．アエルギノーサ（P.aeruginosa）由来のｐｙｒＦ遺伝子に対する遺伝子全長に沿ったその高い類似性（３．３ｘ１０−７８のＰ値）（２３２残基中２０９）によって、ｐｙｒＦとしてさらに確認された。使用した蛍光菌（P.fluorescens）菌株は、いずれのｐｙｒＦ遺伝子の他のコピーも含有しないことが見出された。
【０２５７】
配列決定は、Dow Chemical Companyが実施した。ｐｙｒＦ配列は、配列番号１内に示される。
【０２５８】
ｐｙｒＦ（−）蛍光菌（P.fluorescens）の作製
ｐｙｒＦ（−）蛍光菌（P.fluorescens）を作製するために、細胞のゲノムｐｙｒＦ遺伝子を、間のORFを欠失させて、遺伝子の開始および停止コドンを含めることにより改変した。欠失は、試験管内で非複製プラスミド上のｐｙｒＦ領域に隣接する上流および下流領域を融合させて、次に対立遺伝子交換、すなわち相同組換えを使用して、ＭＢ１０１内因性ｐｙｒＦ遺伝子を欠失対立遺伝子と置換することによって行った。
【０２５９】
フランキング領域の融合物を作製するために、「メガプライマー」法（Barik 1997）を使用して、それにより所望の欠失の上流、そして次に下流の領域をＰＣＲにより、所望の欠失の両側で相同性を備えた重複プライマーを使用して続いて増幅させて、フランキング領域が結合して、ｐｙｒＦ ＯＲＦを除外させる。上流領域は、Proofstartポリメラーゼ（Qiagen）を上記のように使用して、プライマーｐｙｒＦＰｓｔＦおよびｐｙｒＦｏｖｅｒｌａｐを用いて、伸長時間１分間でＭＢ２１４ゲノムＤＮＡから増幅した。グラスミルク（Bio 1O1によるGENECLEAN Spin Kit 、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）への結合を使用したゲル精製の後、１ｋＢ産物を第２の増幅の「メガプライマー」として使用した。
【０２６０】
この第２のステップで所望の産物を増幅するのが困難であったため、テンプレート品質を向上させるために、ゲノムｐｙｒＦ領域を含有するテンプレートをＰＣＲ増幅によって作製した。ＨＯＴＳＴＡＲＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（Qiagenより、バレンシア、カリフォルニア州）は、蛍光菌（P.fluorescens）ゲノムＤＮＡならびにｐｙｒＦＰｓｔＦおよびｐｙｒＦＸｂａＲ２プライマーと共に使用した。次にメガプライマーおよびｐｙｒＦＸｂａＲ２プライマーをこのテンプレートおよびＨＯＴＳＴＡＲＴＡＱポリメラーゼと共に使用して、欠失産物をＰＣＲによって、９５℃にて１５分間、続いて９４℃にて変性３０秒間、５９℃にてアニーリング３０秒間、および７２℃にて伸長２分間の３０サイクル、続いて７２℃にて３分間の最終ステップの反応条件を使用して増幅された。予想された２ｋＢバンドを多数の他の産物からゲル電気泳動によって分離して、次に上記のようにゲル精製し、メーカーの指示に従ってプラスミドｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ（Invitrogenより、カールスバッド、カリフォルニア州）内へクローニングして、ｐＤＯＷ１２１５−７を形成した。ｐＤＯＷ１２１５−７のＰＣＲ増幅領域の配列決定は、増幅プロセスによって導入された３つの変異があることを示した；３つの変化はすべて、ｐｙｒＦの停止コドンの下流１１２ｂｐ以内であった。この区域の配列決定は、反応プロセスがこの区域内で停止したため困難であった。この区域によってコードされるＲＮＡの２次構造のＭ−ＦＯＬＤ（ＧＣＧ）による解析は、非常に安定なステムループ構造およびｒｈｏ独立転写ターミネーターを特徴とする一連のウリジン残基の存在を示した。読み取り枠内では、変異は発生しなかった。
【０２６１】
ｐＤＯＷ１２１５−７をＭＢ１０１内で染色体ｐｙｒＦ遺伝子を欠失させるために使用した。これをするために、最初に、Artiguenave et al. (1997)の手順に従って作製したエレクトロコンピテント蛍光菌（P.fluorescens）細胞を、精製プラスミド０．５μｇを用いて形質転換した。形質転換体は、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地で平板培養することによって選択した。このプラスミドは、蛍光菌（P.fluorescens）内で複製できず、したがってカナマイシン耐性コロニーは、染色体に組み込まれるプラスミドから生じる。プラスミドの組み込み部位は、ＨＯＴＳＴＡＲＴＡＱポリメラーゼおよびプライマーｐｒｙａｎａ１ＦおよびＭ１３Ｆ（〜４０）を使用して、５７℃でのアニーリングおよび伸長時間４分間でＰＣＲによって解析した。１０個の単離体のうち１個（ＭＢ１０１：：ｐＤＯＷ１２１５−７＃）が下流領域へのｐＤＯＷ１２１５−７の挿入を含有し（２．８ｋｂ解析産物）、残りの９個は上流領域であった（２．１ｋｂ解析産物）。
【０２６２】
第２に、相同領域間の組換えによって組み込みプラスミドを失った菌株を同定するために、以下の解析ＰＣＲ手順を使用した：単一のコロニーからのＭＢ１０１：：ｐＤＯＷ１２１５−７＃２を２５０ｍＭ ウラシルを添加したLBに接種して、一晩増殖させて、次にLB-ウラシルおよび５００μｇ／ｍＬ ５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ−Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、オレンジ、カリフォルニア州）上で平板培養した。８個のコロニーを、５７℃でのアニーリングおよび伸長４分で、ＨＯＴＳＴＡＲＴＡＱならびにプライマーｐｙｒａｎａ１Ｆおよびｐｙｒａｎａ１Ｒを用いてＰＣＲによって解析した。親ＭＢ１０１からの増幅産物の予想サイズは３．２ｋＢであり、ｐｙｒＦ遺伝子が欠失している場合には、２．５ｋｂであった。各コロニーは、ｐｙｒＦの欠失から予想された２．５ｋＢバンドを発生させた。第１の３つの単離体を精製して、ＰＦＧ１１６、ＰＦＧ１１７、およびＰＦＧ１１８（ＤＣ３６としても公知）と命名した。３つの単離体は、ｐｙｒＦ欠失から予想される表現型を示し、すなわちそれらはカナマイシンに感受性であり、ウラシルは増殖に必要であり、それらは５−ＦＯＡに対して耐性である。ＰＦＧ１１８のＤＮＡ配列は、ｐＤＯＷ１２１５−７内の増幅領域の配列と同じであった；すなわち、ｐｙｒＦからすぐ下流のステムループ構造内の３つの変異が、ｐｙｒＦ欠失に沿ってＰＦＧ１１８ゲノム内に包含される。
【０２６３】
蛍光菌（P.fluorescens）発現系における選択マーカーとしてのｐｙｒＦ遺伝子の使用
ｐｙｒＦ遺伝子が選択マーカーとして作用する能力は、ｔａｃプロモーターの制御下で既存のテトラサイクリン耐性マーカーおよび標的酵素コード配列の両方を含有するｐＭＹＣ発現プラスミド内へクローニングすることによって試験した。このために、プラスミドｐＭＹＣ５０８８を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（New England Biolabsより、ビバリー、マサチューセッツ州）のＮＥＢ緩衝液４および０．１ｍｇ／ｍＬを使用して、反応物５０ｕＬ中でＳｎａＢＩを用いて３７℃にて２時間消化した。次に反応混合物を７０℃にて２０分間処理して酵素を不活性化し、次に上記のようにゲル精製した。ＳｎａＢＩ消化ｐＭＹＣ５０８８ ６０ｎｇは、FAST-LINK DNAライゲーションキット（Epicentre Technologies、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して、ＭＢ２１４ｐｙｒＦ１−ＭＢ２１４ｐｙｒＲ１ ＰＣＲ産物 ５０ｎｇに連結させた。２５℃での１時間後、混合物を７０℃にて２０分間処理することによって、反応を停止させた。次に結果は、メーカーが推奨する条件を使用して、ケミカルコンピテントＪＭ１０９ 大腸菌（E.coli）細胞（Promega Corp.、マジソン、ウィスコンシン州）に形質転換した。
【０２６４】
形質転換体は、テトラサイクリンを１５μｇ／ｍＬでを含有するＬＢ培地上で選択した。プラスミドＤＮＡをQiaPrep Spin Miniprep Kit（Qiagen、バレンシア、カリフォルニア州）を使用して１２個の単離体から調製し、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩを用いてスクリーニングして、このことは１個の単離体が所望のクローンｐＤＯＷ１２４９−２を含むことを示した（図２）。プラスミドｐＤＯＷ１２４９−２を、ｌａｃＩリプレッサー発現カセットおよびカナマイシン耐性マーカー遺伝子を含有するｐＣＮプラスミドを含有するｐｙｒＦ（−）蛍光菌（P.fluorescens）内へ形質転換した。単離体を振とうフラスコおよび２０Ｌ発酵槽内で試験した。
【０２６５】
ＤＯＷ１２４９−２プラスミドへの選択圧のみがプラスミドのｐｙｒＦ遺伝子が染色体内のｐｙｒＦ欠失を補完する能力によって供給されるように、単離体をテトラサイクリンを含まない、最小塩培地およびカナマイシン中で培養した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって決定されるように、振盪フラスコ試験で新しい菌株によって産生された標的タンパク質の量は、ｐＤＯＷ１２４９−２内のｐｙｒＦ遺伝子の非存在を除いて、対照菌株である、同じ２つのプラスミドを含有するゲノムｐｙｒＦ（＋）蛍光菌（P.fluorescens）対照系の量と同様であり、同じであるが、プラスミドを維持するためにテトラサイクリンをさらに添加した培地上で増殖した（データは示さず）。２０Ｌスケールでのさらなる解析のために、２つの菌株をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで見られた標的タンパク質の量および振とうフラスコ内でのＯＤ575値に基づいて選択した。両方の菌株が、対照菌株で見られる正常範囲内の標的タンパク質の蓄積レベルを示した（図１）。
【実施例２】
【０２６６】
蛍光菌（P.fluorescens）宿主細胞発現系におけるｐｙｒＦ-ｐｒｏＣデュアル栄養要求性選択マーカー系の作製
本明細書で使用したオリゴヌクレオチド
ｐｒｏＣ１
５’−ＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＣＧＡＣＣＴＴＧＡＧＴＣＧＧＣＣＡＴＴＧ−３’（配列番号２２）
ｐｒｏＣ２
５’−ＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＴＡＣＡＧ−３’（配列番号２３）
ｐｒｏＣ３
５’−ＡＧＣＡＡＣＡＣＧＣＧＴＡＴＴＧＣＣＴＴ−３’（配列番号２４）
ｐｒｏＣ５
５’−ＧＣＣＣＴＴＧＡＧＴＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＴＣＧ−３’（配列番号２５）
５’−ＧＡＴＡＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＴＣＧＧＣＧＡＧＡＴＡ−３’（配列番号２６）
ｐｒｏＣ７
５’−ＣＣＧＡＧＣＡＴＧＴＴＴＧＡＴＴＡＧＡＣＡＧＧＴＣＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡ−３’（配列番号２７）
ｐｒｏＣ８
５’−ＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＣＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＴＣＣＡ−３’（配列番号２８）
ｐｒｏＣ９
５’−ＧＧＡＡＣＧＡＴＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＣＡＴＧＣＴＡ−３’（配列番号２９）
ｇｅｎＦ２
５’−ＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＴＧＣＣＧＴＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＣＡＧＡ−３’（配列番号３０）
ｇｅｎＲ２
５’−ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧＣＧＴＴＧＴＧＡＣＡＡＴＴＴＡＣＣ−３’（配列番号３１）
ＸｂａＮｏｔＤｒａＵ２リンカー
５’−ＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴ−３’（配列番号３２）
ＸｂａＮｏｔＤｒａＬリンカー
５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＣ−３’（配列番号３３）
【０２６７】
蛍光菌（P.fluorescens）からのｐｒｏＣのクローニングおよびｐｒｏＣを含有するｐＣＮ発現プラスミドの作製
ｐｒｏＣを含むｐＣＮ５１ｌａｃＩへの抗生物質耐性遺伝子の配置
ｐｒｏＣ ＯＲＦおよび隣接する上流および下流配列の約１００ｂｐをＭＢ１０１ゲノムＤＮＡから、ｐｒｏＣ１およびｐｒｏＣ２を使用して、アニーリング温度５６℃および伸長１分間で増幅させた。１ｋＢ産物のゲル精製およびSacIを用いた消化の後、断片をＳａｃＩ消化ｄｐＤＯＷ１２４３（ポリリンカーの添加およびｋａｎＲのゲンタマイシン耐性遺伝子との置換による、ｐＣＮ５１ｌａｃＩに由来するプラスミド）内へクローニングして、ｐＤＯＷ１２６４−２を作製した。このプラスミドをｐｒｏＣ（−）ミュータント株ＰＦＧ９３２内で、ｐＤＯＷ１２４９−２からのアミラーゼ合成を調節するその能力について試験した。２０Ｌスケールでの発現標的酵素産生レベルは、デュアル抗生物質耐性マーカー対照菌株ＤＣ８８のレベルと同様であった（データは示さず）。
【０２６８】
次にｇｅｎＲ抗生物質マーカー遺伝子はｐＤＯＷ１２６４−２（図３）から除去して、ｐｒｏＣおよびｌａｃＩを持つ、抗生物質マーカーを含まないプラスミドを作製した。ｇｅｎＲ遺伝子の除去は、ｐＤＯＷ１２６４−２のＢａｍＨＩによる制限消化、６．１ｋＢ断片の精製、それ自体への連結、およびｐｒｏＣ（−）蛍光菌（P.fluorescens）宿主ＰＦＧ１０１６内への電気泳動によって実施される。単離体は、ＥｃｏＲＩを使用した制限消化によって確認した。得られたプラスミドをｐＤＯＷ１３０６−６と命名した。ＥｃｏＲＩを用いた分析制限消化およびＢａｍＨＩ接合部に渡る配列決定は、プラスミドの同一性およびその中の遺伝子の適正な定位を裏付けた。
【０２６９】
配列決定は、ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー（Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）が実施した。ｐｒｏＣ配列は、配列番号４内に示される。
【０２７０】
抗生物質耐性マーカーの代わりにｐｙｒＦマーカーを含有する標的酵素発現プラスミドの作製
ｔａｃプロモーター制御下の標的酵素コード遺伝子を含有する抗生物質マーカーを含まない生成プラスミド、ｐＤＯＷ１２６９−２を、ｔｅｔＲ／ｔｅｔＡ遺伝子を除去するためにＰｖｕＩを用いたｐＤＯＷ１２４９−２の制限消化によって作製した。ＭＢ２１４からのｐｙｒＦ遺伝子の挿入によりｐＭＹＣ５０８８に由来するｐＤＯＷ１２４９−２は、実施例１で記載するように作製した。１０．６ｋＢ ＰｖｕＩ断片をゲル精製して、それ自体に連結させて、電気穿孔によってＰＦＧ１１８／ｐＣＮ５１ｌａｃＩへ形質転換させて、（ｐＣＮ５１ｌａｃＩを維持するために）カナマイシンを含有するＭ９グルコース培地上に広げた。プラスミドＤＮＡを単離して、ＮｃｏＩを用いて解析制限消化を実施した；２つの単離体は、予想されたバンドと一致する制限消化を示した。どちらの単離体もＰｖｕｌ接合部に渡って配列決定し、そのことはプラスミドの同一性およびその中の遺伝子の適正な定位を裏付けた。
【０２７１】
ｐｙｒＦおよびｐｒｏＣのゲノム欠失による蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）菌株の作製
ｐｙｒＦが欠失した蛍光菌（P.fluorescens）ＭＢ１０１菌株であるPFG118は、実施例１で記載した。
【０２７２】
遺伝子交換および欠失のためのベクター、ｐＤＯＷ１２６１−２の作製
ベクターｐＤＯＷ１２６１−２は、以下の特性を組み合せることによって、クロスイン／クロスアウト法（Toder 1994;Davison 2002）によるマーカー交換を使用して、ゲノムＤＮＡの清浄な欠失を作製するように設計された：
・大腸菌（E.coli）のみで機能し、蛍光菌（P.fluorescens）では機能しないColEI複製起点；
・プラスミドの染色体内への組み込みのための選択マーカー（ｔｅｔＲ／ｔｅｔＡ）；
・挿入プラスミドの消失の選択を可能にする対抗選択マーカー（ｐｙｒＦ）（宿主菌株がｐｙｒＦ-である限り）；ｐｙｒＦ遺伝子を失った細胞は、５−ＦＯＡに対して耐性である；
・一般的でない８ｂｐ認識部位を有する平滑末端クローニング部位ＳｒｆＩ−所望のインサートが該部位を欠く場合、インサートなしで連結するベクターを再開裂させるためにＳｒｆＩ（Stratagene、ラホーヤ、カリフォルニア州）を連結反応に添加することによって挿入の効率を上昇させ得る。
【０２７３】
このベクターを作製するために、ｔｅｔＲ、ｔｅｔＡ、およびｐｙｒＦ遺伝子を含有する５ｋＢ ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩによって消化されたpCRScriptCAM（Stratagene、ラホーヤ、カリフォルニア州）内にクローニングして、pDOW1261-2を作製した。
【０２７４】
ｐｒｏＣを染色体から欠失させるベクターの作製
ｐｒｏＣの欠失を作製するために、ｐｒｏＣ遺伝子の上流および下流のフランキング領域のコピーをＰＣＲによって連結して、次にｐＤＯＷ１２６１−２遺伝子置換ベクター内にクローニングした。ATG開始コドンからTAG停止コドンまでのコード配列全体を欠失させるために、ｐｒｏＣ ＯＲＦを架橋するｐｒｏＣ7プライマーが設計された。停止コドンの下流のさらなる１６ｂｐも欠失に含めた。
【０２７５】
ｐｒｏＣから上流および下流の領域のＰＣＲ融合物を作製するために、ＰＣＲ増幅のメガプライマー法を使用した（Barik 1997）。メガプライマーを作製するために、ｐｒｏＣ読み取り枠のすぐ上流の０．５ｋＢ領域を、プライマーｐｒｏＣ５およびｐｒｏＣ７を使用して、ＭＢ２１４ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。プライマーｐｒｏＣ７は、ｐｒｏＣ ＯＲＦの上流および下流の領域と重複する。ポリメラーゼ連鎖反応は、ベンダーが推奨する緩衝液中でプライマー１ｕＭ、４つのｄＮＴＰ各２００ｕＭ、およびHerculaseハイフィディリティポリメラーゼ（Stratagene、ラホーヤ、カリフォルニア州）を用いて実施した。Herculaseは、平滑末端を残す、ほとんどＰｆｕポリメラーゼより成るハイフィディリティ酵素である。増幅プログラムは、９５℃にて２分、ｋＢ当たり９５℃にて３０秒、５０℃にて５０℃、および７２℃にて1分の３０サイクル、続いて７２℃にて１０分であった。増幅産物は、ＴＢＥ中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離して、チジウムブロミドを使用して描出した。ＤＮＡを含有するゲルスライスをゲルから切り出して、上記のように精製した。
【０２７６】
ｐｒｏＣ遺伝子から下流の１．３ｋＢ領域は、プライマーｐｒｏＣ３およびｐｒｏＣ６を使用して増幅され、続いての反応のテンプレートとして作用した。６０℃のアニーリング温度を除いて、同じ増幅プロトコルを使用した。反応物はアガロースゲル上で確認し、StrataPrep ＰＣＲ精製キット（Stratagene、ラホーヤ、カリフォルニア州）を使用して精製した。
【０２７７】
欠失融合物を作製する第２のステップにおいて、ｐｒｏＣ６と共に、そしてテンプレートとしてのｐｒｏＣ３−ｐｒｏＣ６ ＰＣＲ反応物と共に、メガプライマーをＰＣＲ反応におけるプライマーの１つとして使用した。６１℃のアニーリング温度および２分間の伸長時間を使用した。１ｋＢ ＰＣＲ産物を精製し、ＳｒｆＩによって消化された自殺ベクターｐＤＯＷ１２６１−２に平滑末端連結させた。ベクターの再ライゲーションによって引き起こされたバックグラウンドを低下させるために、メーカーからの説明書（pCRScriptCamクローニングキット−Stratagene、ラホーヤ、カリフォルニア州）に従って、ＳｒｆＩをライゲーションに含めた。ライゲーションを電気穿孔DH10（２ｍＭ ギャップキュベット、２５μＦ、２．２５ｋＶ、２００オーム）によって、DH10β（Gibco BRL Life Technologies、現在はInvitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州）に形質転換させて（Artiguenave et al. 1997）、ＤｒａＩＩＩ制限酵素を使用して単離体をスクリーニングした。それぞれの単離体のＰＣＲ増幅領域はザ・ダウ・ケミカル・カンパニー（Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）が配列決定した；単離体ｐＤＯＷ１３０５−６は、正しいゲノムＤＮＡ配列を含有しているとして検証された。
【０２７８】
蛍光菌（P.fluorescens）ｐｙｒＦ−ｐｒｏＣ二重欠失の作製
二重欠失菌株を作製するために、ＰＦＧ１１８をｐＤＯＷ１３０５−６を用いて上記のように電気穿孔によって形質転換した。HotStarTaq（Qiagen、バレンシア、カリフォルニア州）、アニーリング温度５９℃および伸長時間４分間を用いた、プライマーｐｒｏＣ8およびＭ１３／ｐＵＣ逆配列決定プライマー（Reverse Sequencing Primer）（−４８）（プラスミドのみにハイブリダイズする）（New England Biolabs、ビバリー、マサチューセッツ州）を含むコロニーに対する解析ＰＣＲは、２２個の単離体のうち９個がｐｒｏＣの上流の領域に組み込まれたプラスミドを有し、２２個のうち７個が下流に組み込まれたプラスミドを有することを示した（データは示さず）。各定位のうち３つを１個のコロニーまで精製した。３つの単離体ＰＦＧ１１８：：１３０５−６．１、−６．８、−６．１０は、上流の領域に挿入を有し、３つの単離体ＰＦＧ１１８：：１３０５−６．２、−６．３、−６．９は、下流の領域に挿入を有する。
【０２７９】
プラスミドと染色体遺伝子との間で相同組換えを実施して、それにより欠失を残す細胞を選択するために、ＰＦＧ１１８：：１３０５−６．１および−６．２をウラシルおよびプロリン添加を含むＬＢ ５０ｍＬ中で静止期まで増殖させ、次にウラシルおよびプロリン添加を含むＬＢ−５−ＦＯＡ上で平板培養した。組み込まれたプラスミドを組換えによって失う細胞は、ｐｙｒＦ遺伝子も失い、したがってそうでなければ毒性化合物に変換される5-FOAに対して耐性であることが予想される。プラスミドを失って、元の配列を再生させた細胞と、欠失を残した細胞とを区別するために、ｐｒｏＣ８およびｐｒｏＣ９を用いたＰＣＲ解析を実施した。予想された１．３ｋＢを有する２つの単離体を２つの選択物からそれぞれ選択して、ＰＦＧ１０１３、ＰＦＧ１０１４、ＰＦＧ１０１５およびＰＦＧ１０１６（ＤＣ１６４としても公知）と命名した。４つの単離体はすべて、プロリンおよびウラシルが添加されない限りＭ９グルコース上で増殖することができず、テトラサイクリン感受性であった。ＰＦＧ１１８（野生型ｐｒｏＣ）およびＰＦＧ１０１６（ｐｒｏＣ欠失）のゲノム領域をＰＣＲ（プライマーｐｒｏＣ８およびｐｒｏＣ９、HotStarTaqポリメラーゼ、アニーリング６３℃および伸長３分）によって増幅して、配列した。菌株ＰＦＧ１０１のｐｒｏＣ５とｐｒｏＣ６との間の領域は、予想された８３５ｂｐ欠失を除いて、親と同一であった。
【０２８０】
デュアル栄養要求性選択マーカー発現系ＰＦＧ１０１６／ｐＤＯＷ１３０６−６ ｐＤＯＷ１２６９−２の作製
プラスミドを菌株ＰＦＧ１１８ ｐＣＮ５１ｌａｃＩ ｐＤＯＷ１２６９−２からHISPEED Plasmid Midiキット（Qiagen、バレンシア、カリフォルニア州）によって単離した。ｐＤＯＷ１２６９−２をｐＣＮ５１ｌａｃＩからアガロース電気泳動によって部分的に精製して、次にＰＦＧ１０１６ ｐＤＯＷ１３０６−６内へ電気穿孔した。形質転換体を添加物なしのＭ９／グルコース上で選択した。ｐＤＯＷ１２６９−２調製物を汚染するｐＣＮ５１ｌａｃＩの一部が細胞内へ同時形質転換される可能性もあるため、各形質転換からの３つの単離体を、ｐＣＮ５１ｌａｃＩに保持されている抗生物質マーカーであるカナマイシンへの感受性について試験した；６つすべてが感受性であることが見出された。標的酵素活性の試験では、６つの菌株すべてが標的酵素を発現することが見出された。ＰＣＲ解析は、６つすべてが染色体ｐｒｏＣ欠失を含有することを示した。
【０２８１】
形質転換体から単離したプラスミドの制限消化は、予想したパターンと一致した。
【０２８２】
振とうフラスコでのデュアル栄養要求性マーカー発現系の性能試験
次に、６つの菌株を実施例１で記載したように振とうフラスコ内で試験した。標的酵素発現の誘導は、ＩＰＴＧの添加により２６時間にて開始した。６つすべての菌株のＯＤ575は、デュアル抗生物質耐性マーカー発現系対照ＤＣ８８のＯＤ575と匹敵していた。６つすべての標的酵素産生レベルも、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価されるように、対照の産生レベルに匹敵していた。さらなるキャラクタリゼーションのために、最高のＯＤ575を達成した２つの菌株である、菌株１０４６および１０４８を選択した。
【０２８３】
デュアル栄養要求性マーカー発現系の２０Ｌバイオリアクターでの性能試験
続いて、菌株１０４６および１０４８を２０Ｌバイオリアクターで試験した。標的酵素発現の誘導は、ＩＰＴＧの添加により２６時間にて開始した。両方の菌株が、ＯＤ575および標的酵素活性の両方について、ＤＣ８８対照菌株の正常範囲内のレベルを達成した。これらの２つの菌株の性能平均を図１に示す。播種段階および２６時間の誘導開始の直前にに採取したサンプルから調製したプラスミドの制限消化は、予想と一致したパターンを示した。同じサンプルに実施したゲノムＤＮＡの解析ＰＣＲは、ｐｒｏＣ欠失およびｐｙｒＦ欠失の保持を示した。２５時間サンプルの分割量をテトラサイクリン−、ゲンタマイシン、またはカナマイシン−添加培地上で平板培養した；細胞増殖は観察されず、したがって抗生物質耐性遺伝子活性の非存在が確認された。
【０２８４】
２０Ｌバイオリアクターでの菌株１０４６（ＤＣ１６７としても公知）の解析は、同様の結果で２回反復した。播種段階および発酵の２５時間後（誘導の直前）におけるプラスミド安定性は、希釈して完全培地で平板培養したサンプルからのレプリカ平板法によって試験した。どちらのプラスミドも検査したコロニーの９７％超に存在し、プラスミドなしで生存し得る栄養共生復帰変異体の欠如および蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）内での発現ベクターの安定的維持が示された。
【０２８５】
結果
ｐｙｒＦ発現系のどちらも、抗生物質耐性マーカーのみが使用される対照系（図１）と同様に作用した。対照菌株では、溶解細胞からの外来性代謝産物の移入が培地中の抗生物質から供給された選択圧を低減または除去しないため、栄養共生の負の影響はなかった。２つのｐｙｒＦ発現系に対する栄養共生の結果として予想された、性能の予想される低下は驚くべきことに観察されなかった。
【実施例３】
【０２８６】
蛍光菌（P.fluorescens）でのｌａｃＩ、ｌａｃＩQおよびｌａｃＩQ1の染色体組み込み
染色体に組み込まれた３つの異なるdifferentエシェリキア・コリｌａｃＩ対立遺伝子、ｌａｃＩ（配列番号９）、ｌａｃＩQ（配列番号１１）、およびｌａｃＩQ1（配列番号１２）のうちの１つをそれぞれ用いて、３つの蛍光菌（P.fluorescens）菌株を作製した。３つの菌株は、ＬａｃＩリプレッサー蓄積の異なる量を示した。各菌株は、そのｌａｃＩ遺伝子の１個のコピーを、上記のようにそのｐｙｒＦ遺伝子を欠失させることによって形成されたＭＢ１０１誘導体（TD Landry et al.,「Safety evaluation of an α-amylase enzyme preparation derived from the archaeal order Thermococcales as expressed in Pseudonaonas fluorescens biovar I,」 Regulator Toxicology and Pharraacology 37(1) : 149-168 (2003) を参照) である、蛍光菌（P. fluorescens）ＤＣ３６のレバンスクラーゼ位置（配列番号１３）に保持している。
【０２８７】
ベクターまたは他のＤＮＡ配列は、菌株内に残っていない。菌株は抗生物質耐性遺伝子を含まず、ｐｙｒＦ欠失も含み、ウラシル未添加培地での増殖中の、ｐｙｒＦ+遺伝子を持つ発現プラスミドの維持を可能にする。タンパク質産生は、抗生物質耐性遺伝子および抗生物質を完全に含まない。
【０２８８】
MB214は、U.S.Pat.5,169,760で記載されたｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡ染色体インサートを含有する。MB214は、ＬａｃＩリプレッサーの分子量に約１０ｋＤａを添加する、ＬａｃＩタンパク質のＣ末端に重複も含有する。
【０２８９】
レバンスクラーゼ位置への遺伝子挿入のためのベクターｐＤＯＷ１２６６−１の作製
プラスミドｐＤＯＷ１２６６−１を、レバンスクラーゼに関する蛍光菌（P. fluorescens）遺伝子の上流および中の領域（配列番号１３）のＰＣＲ増幅によって作製し、メガプライマー方法を使用して開始コドンをＸｂａＩ部位で置換した、ABarik,「Mutagenesis and Gene Fusion by Megaprimer PCR,」in BA White, PCR Cloning Protocols 173-182 (1997) (Humana)を参照。ＰＣＲは、HERCULASEポリメラーゼ（Stratagene、マジソン、ウィスコンシン州、米国）を使用して、プライマーＬＥＶ１（配列番号３４）およびＬＥＶ２（配列番号３５）、ならびに蛍光菌（P. fluorescens）ＭＢ２１４ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して実施した（オリゴヌクレオチド配列については以下を参照）。プライマーＬＥＶ２（配列番号３５）は、ＸｂａＩ部位を挿入する配列を含有する。反応は、９５℃で２分間、［９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間］の３５サイクル、続いて７２℃で１０分間で実施した。１ｋＢ産物をゲル精製して、次の反応でテンプレートとしてのＭＢ２１４ゲノムＤＮＡおよび伸長時間が２分間であることを除く同じ条件を使用して、ＬＥＶ３（配列番号３６）と共にプライマーの１つとして使用した。品質を向上させるために、２ｋＢ産物をゲル精製して、ＬＥＶ２（配列番号３５）およびLEV3（配列番号３６）を用いて再増幅した。
【０２９０】
使用したオリゴヌクレオチド
ＬＥＶ１（配列番号３４）
５’−ＴＴＣＧＡＡＧＧＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＡ
ＬＥＶ２（配列番号３５）
５’−ＣＧＣＡＡＧＧＴＣＡＧＧＴＡＣＡＡＣＡＣ
ＬＥＶ３（配列番号３６）
５’−ＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＧＡＧＣＣＧＴＴＣＡ
ＬＥＶ７（配列番号３７）
５’−ＣＴＡＣＣＣＡＧＡＡＣＧＡＡＧＡＴＣＡＧ
ＬＥＶ８（配列番号３８）
５’−ＧＡＣＴＣＡＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧＣＡＧＧ
ＢｇｌＸｂａＬａｃＦ（配列番号３９）
５’−ＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＣＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＧ
ｌａｃＩＲ４（配列番号４０）
５’−ＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＣＧＣＧＣＴＡＡＣＴＴＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣ
Ｌａｃｐｒｏ９（配列番号４１）
５’−ＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＴＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＧＴＡＴＧＧＣＡＴＧＡ
ＬａｃＩＱＦ（配列番号４２）
５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＧＣＧＧＣＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＧＴＴＧＡＣＡＣＣ
ＬａｃＩＮＸＲ（配列番号４３）
５’−ＡＧＣＴＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴ
ｌａｃＩＱ１（配列番号４４）
５’−ＡＧＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＧＣＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＧＴＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＧＴＡＴＧＧＣＡＴＧ
【０２９１】
以下のオリゴヌクレオチドは、解析配列決定のみに使用した。
ｌａｃＩＦ１（配列番号４５）
５’−ＡＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＧＣＧＣＡＡＣＧＣ
ｌａｃＩＦ２（配列番号４６）
５’−ＡＴＧＴＴＡＴＡＴＣＣＣＧＣＣＧＴＴＡＡ
ｌａｃＩＲ１（配列番号４７）
５’−ＣＣＧＣＴＡＴＣＧＧＣＴＧＡＡＴＴＴＧＡ
ｌａｃＩＲ２（配列番号４８）
５’−ＴＧＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＡＴＣ
ＳｅｑＬｅｖ５ＡＳ（配列番号４９）
５’−ＴＡＴＣＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣ
ＳｅｑＬｅｖ３Ｓ（配列番号５０）
５’−ＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣ
ＬＥＶ１０（配列番号５１）
５’−ＴＣＴＡＣＴＴＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＧＴＴ
【０２９２】
ＬＥＶ２−ＬＥＶ３増幅産物は、クロスアウトの選択を促進するために、蛍光菌（P.fluorescens）ｐｙｒＦ＋遺伝子を選択マーカーとして含有する自殺ベクターであるｐＤＯＷ１２６１−２のＳｒｆＩ部位内にクローニングした。新しいプラスミドをｐＤＯＷ１２６６−１と命名した。増幅領域を配列した。
【０２９３】
ｌａｃＩ遺伝子の挿入ベクターｐＤＯＷ１２６６−１へのクローニング
大腸菌（E.coli）ｌａｃＩ遺伝子を、プライマーＢｇｌＸｂａＬａｃＦ（配列番号３９）およびｌａｃＩＲ４（配列番号４０）を有するｐＣＮ５１ｌａｃＩから、HERCULASEポリメラーゼ（６２℃でのアニーリングおよび２分間の伸長時間）を使用して増幅した。ゲル精製およびＸｂａＩを用いた消化の後、ｌａｃＩ遺伝子をｐＤＯＷ１２６６−１のＸｂａＩ部位へクローニングして、ｐＤＯＷ１３１０を作製した。ｌａｃＩQ遺伝子は、テンプレートとしてのｐＣＮ５１１ａｃＩを１５のプライマーｌａｃｐｒｏ９（配列番号４１）およびｌａｃＩＲ４（配列番号４０）と共に使用して、HERCULASEポリメラーゼ（６２℃でのアニーリングおよび２分間の伸長時間）を使用して、ＰＣＲ増幅によって作製した。ゲル精製およびＸｂａＩを用いた消化の後、ｌａｃＩ遺伝子をｐＤＯＷ１２６６−１のＸｂａＩ部位へクローニングして、pDOW1311を作製した。
【０２９４】
ｌａｃＩQ1遺伝子は、プライマーｌａｃＩＱ１（配列番号４４）およびＣＶＸＲ（配列番号４３）を用いて大腸菌（E.coli）K12（ATCC47076）からのｌａｃＩ遺伝子を増幅することによって作製し、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ（Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）内へクローニングして、ｐＣＲ２−ｌａｃＩＱ１を作製した。ｌａｃＩQ1遺伝子は、プライマーｌａｃＩＱＦ（配列番号４２）およびｌａｃＩＮＸＲ（配列番号４３）をHerculaseポリメラーゼ（６１℃でのアニーリング、３分間の伸長時間、３５サイクル）と共に使用して、ｐＣＲ２−ｌａｃＩＱ１から再増幅した。ゲル精製およびＸｂａＩを用いた消化の後、ＰＣＲ産物をｐＤＯＷ１２６６−１のＸｂａＩ部位へクローニングして、ｐＤＯＷ１３０９を作製した。
【０２９５】
ｐＣＲ２−ｌａｃＩＱ１内のＰＣＲ増幅インサートpDOW1310、pDOW1311、およびpDOW1309を配列決定して（プライマーｌａｃＩＦ１（配列番号４５）、ｌａｃＩＦ２（配列番号４６）、ｌａｃＩＲ１（配列番号４７）、ｌａｃＩＲ２（配列番号４８）、ＳｅｑＬｅｖ５ＡＳ（配列番号４９）、ＳｅｑＬｅｖ３Ｓ（配列番号５０）、およびＬＥＶ１０（配列番号５１）を使用して）、ＰＣＲ反応によって変異が導入されていないことを確認した。それぞれの場合で、ｌａｃＩがレバンスクラーゼ遺伝子と同じ方向で転写される定位を選択した。レバンスクラーゼプロモータはｌａｃＩの転写を潜在的に制御され得るが、プロモーターは、使用した発酵条件では非存在であるスクロースの存在下のみで活性である。
【０２９６】
レバンスクラーゼ位置に組み込みｌａｃＩ遺伝子を有する蛍光菌菌株の作製
ベクターｐＤＯＷ１３０９、ｐＤＯＷ１３１０、およびｐＤＯＷ１３１１を電気穿孔によってDC36内に導入して、最初にベクターのテトラサイクリン耐性を持つゲノムへの組み込みに関して選択した。コロニーをスクリーニングして、ベクターがプライマーＬＥＶ７（配列番号３７）およびＭ１３Ｒ（New England Biolabsより、グロスター、マサチューセッツ州、米国）を用いたＰＣＲによってレバンスクラーゼ位置に組み込まれたことを決定した。ｌａｃＩ遺伝子をゲノム内に残す第２のクロスオーバーに関して選択するために、単離体を５’−フルオロオロチン酸の存在下で、そしてテトラサイクリンの非存在下で増殖させた。ゲノム内の複製領域間の組換えは、親遺伝子型を復元するか、またはｌａｃＩ遺伝子を残すかのいずれかである。生じた単離体は、ウラシルの非存在下で培養して、プライマーＬＥＶ７（配列番号３７）およびＬＥＶ８（配列番号３８）を用いたＰＣＲによってテトラサイクリンに対する感受性についてスクリーニングした。新しい菌株の名称を表１７に示す。ゲノム領域の配列情報を得るために、ＰＣＲ産物を直接配列決定した、E Werle, 「Direct sequencing of polymerase chain reactionproducts,」 Laboratory Methods for the Detection of Mutations and Polymorphisms in DNA 163-174 (1997)を参照。各菌株では、配列決定がプロモーターの同一性、フランキング領域に対するｌａｃＩ変異体の定位、および親配列に対する点変異の存在または非存在を確認した。DC202およびＤＣ２０６の配列は予想通りであった。ＤＣ２０４の配列は、ｌａｃＩQ下流の、レバンスクラーゼ読み取り枠内に点変異を示し、これはコード配列を変更せず、したがって重要度が低い。
【表１７】
2007511238.tif 000019
【０２９７】
ｐＣＮ５１ＩａｃＩと比較した、ｌａｃＩ組込み体におけるＬａｃＩの相対濃度の解析
UnBlotは、ウェスタン解析と類似した方法であり、フィルタへ移動する必要なしにタンパク質がゲル中で検出される。該技術は、メーカーであるPierce Biotechnology（ロックフォード、イリノイ州、米国）の指示に従って実施した。UnBlotを使用した解析は、新しい組込み体菌株それぞれのＬａｃＩの量はＭＢ２１４より多いことを示した。ＭＢ２１４は、U.S.Pat.5,169,760で記載されたｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡインサートを含有する。ｌａｃＩQおよびｌａｃＩQ1組込み体中のＬａｃＩの相対濃度は、ｌａｃＩを含有する多コピープラスミドである、ｐＣＮ５１ｌａｃＩを保持する菌株とほぼ同じであった。図５を参照。
【０２９８】
ＭＢ２１４、ＤＣ２０２（ｌａｃＩ組込み）およびＤＣ２０６（ｌａｃＩ組込み）中のＬａｃＩ濃度の相対差をより正確に評価するために、希釈シリーズを実施した。ＭＢ１０１ｐＣＮ５１ｌａｃＩ、ＤＣ２０４およびＤＣ２０６は、ＭＢ２１４の約１００倍のＬａｃＩを有するのに対して、ＤＣ２０２は約５倍を有する。
【実施例４】
【０２９９】
ニトリラーゼ発現および転写
菌株ＤＣ１４０は、蛍光菌（P.fluorescens）ＭＢ２１４内に、ニトリラーゼ遺伝子（G DeSanthis et al., J. Amer. Chem. Soc. 125: 11476-77(2003)）がＰｔａｃプロモータの制御下で挿入されたテトラサイクリン耐性広域宿主域プラスミドである、ｐＭＹＣ１８０３（WO 2003/068926）を導入することによって作製された。ＤＣ２０２およびＤＣ２０６内の標的遺伝子のMB214による未誘導発現の調節を比較するために、同じニトリラーゼ遺伝子を、テトラサイクリン耐性遺伝子がｐｙｒＦ選択マーカーによって置換されたｐＭＹＣ１８０３誘導体へクローニングした。次に新しいプラスミドｐＤＯＷ２４１５をＤＣ２０２およびＤＣ２０４内へそれぞれ電気穿孔した。ＤＣ１４０、ＤＣ２３９およびＤＣ２４０を２０Ｌ発酵槽内で、グルコースまたはグリセロールを添加した無機塩培地での増殖によって、最終的に約２０ｇ／Ｌ〜７０ｇ／Ｌ超の乾燥細胞重量の範囲内のバイオマスを与える細胞密度まで培養した（WO2003/068926を参照）。発現を誘導するために、Ｐｔａｃプロモーターの無償性インデューサ、ＩＰＴＧを添加した。
【０３００】
ＤＣ１４０対ＤＣ２３９対ＤＣ２４０のプレインキュベーションニトリラーゼ活性の比は、６：２：１であった。同じサンプルのノザンブロットによるＲＮＡ解析は、抑制解除の同じランキングを明らかにした。濃度測定に基づいて、ＤＣ１４０：ＤＣ２３９：ＤＣ２４０の非誘導転写レベルの比は、２．４：１．４：１．０であった。０．３ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導（３０分間）の直後、すべての菌株の転写レベルは同じであった。誘導後のニトリラーゼ生産性も同程度であった。このことは、使用したインデューサの濃度が、その異なるＬａｃＩタンパク質レベルにもかかわらず、これら３つの菌株においてＰｔａｃプロモーターを完全に誘導するのに十分であったことを示す。しかしながら最も抑制解除された菌株ＤＣ１４０の発酵は、誘導の約２４時間後のニトリラーゼ活性の損失に伴う著しい細胞溶解を被った。改良された、より厳密に調節された菌株ＤＣ２３９およびＤＣ２４０の誘導は、高いニトリラーゼ生産性を維持しながら誘導後４８時間超まで延長可能であり、最終的な結果としてニトリラーゼ収率が２倍となった。図６を参照。
【０３０１】
結果
実施例は、シュードモナス（Pseudomonads）における完全または切断Ｐｌａｃ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡオペロンの一部として以外のＬａｃＩコード遺伝子の使用が、以前に教示したｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡシュードモナス（Pseudomonad）染色体挿入（米国特許第５，１６９，７６０号）と比較して、プレインキュベーション組換えタンパク質発現の実質的に改良された抑制、商業スケール発酵でのより高い細胞密度、および所望の産物のより高い収率をもたらしたことを示している。結果は、ｌａｃＩ挿入が蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）中でのＬａｃＩリプレッサータンパク質の産生にも有効であり、それによって細胞内にＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードする独立したプラスミドを維持する必要がなくなり、そのような維持によって引き起こされる潜在的な産生非効率性が低減されることも示した。
抗生物質を含まないことに加えて、ＤＣ２３９およびＤＣ２４０での増殖段階中の抑制解除は、ＭＢ２１４菌株の１０分の１未満までであった。ＤＣ２３９およびＤＣ２４０のプレインキュベーションニトリラーゼ活性レベルは、１３を超える独立した発酵で平均して０．４Ｕ／ｍｌに達し、ＤＣ２３９およびＤＣ２４０における細胞密度およびニトリラーゼ発現は、ＤＣ１４０のように延長された誘導期の間に低下しなかった。より高い抑制解除を与えると、ＤＣ２３９およびＤＣ２４０発酵作業は、増殖期の時間を３０％超短縮して、発酵コストを低減させた。
【実施例５】
【０３０２】
１個の最適なｌａｃオペレーターを有する、および２個のｌａｃオペレーターを有する、ｔａｃプロモーターの作製
天然のｔａｃプロモーターは、１個の天然のｌａｃオペレーターＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴのみをＯ１位置（図４）に有する。第１の構築物ｐＤＯＷ１４１８において、天然のオペレーターをさらに対称なｌａｃＯｉｄオペレーター配列５’−ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣ  ＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴ−３’（配列番号１４）と置換した（JR. Sadler, H. Sasmor and JL. Betz. PNAS. 1983 Nov; 80 (22): 6785-9）。ｔａｃプロモーターおよび天然のｌａｃＯ配列を含有する２８９ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩ断片をｐＭＹＣ１８０３誘導体のｐＤＯＷ２１１８から除去して、対称ｌａｃＯｉｄ配列を含有するＳＯＥ ＰＣＲ増幅産物から単離したＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩ断片によって置換した。ＳＯＥ ＰＣＲプライマー（ＲＣ−３およびＲＣ−９）は、最適化／対称ｌａｃＯ配列を産生した４つのヌクレオチド変化（３個の塩基対置換および１個の塩基対欠失）を包含していた。得られたプラスミドｐＤＯＷ２２０１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩプロモーター断片をｐＭＹＣ１８０３をベースとするニトリラーゼ発現プラスミド内へクローニングして、天然のｔａｃプロモーターを置換してｐＤＯＷ１４１４を生じさせた。次にこの発現カセットをｐｙｒＦ（＋）プラスミドｐＤＯＷ１２６９上へ移動して、ＤｒａＩ／ＸｈｏＩ断片を交換することによってｐＤＯＷ１４１８を生じさせた。次にプラスミドｐＤＯＷ１４１８を宿主菌株ＤＣ２０６に形質転換させて、菌株ＤＣ２８１を生じさせた（図４を参照）。
【０３０３】
使用したオリゴヌクレオチド
ＲＣ−３（配列番号５２）
５’−ＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧ
ＲＣ−４（配列番号５３）
５’−ＴＴＣＧＧＧＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＧＧＴＧＴＡ
ＲＣ−９（配列番号５４）
５’−ＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＧＣ
ＲＣ−１０（配列番号５５）
５’−ＡＴＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＴＴＣＡＡＣＧＧ
【０３０４】
第２の構築物ｐＤＯＷ１４１６において、ｌａｃＯｉｄオペレーター５’−ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣ  ＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴ−３’（配列番号１４）を既存の天然のｌａｃＯ１の５２ヌクレオチド上流（５’）にＰＣＲによって挿入した。メガプライマー法を使用するプロモーター領域のＰＣＲ増幅は、ｐＭＹＣ１８０３誘導体のｐＭＹＣ５０８８、ならびに以下のプライマーＡＫＢ−１およびＡＫＢ−２を第１段階として使用した。得られたＰＣＲ産物を同じテンプレートを使用する２回目のＰＣＲ増幅において、プライマーＡＫＢ−３と組み合せた。精製ならびにＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩによる消化の後、デュアルオペレーターを含有するプロモーター断片をプラスミドｐＭＹＣ５０８８ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩ部位内へクローニングして、ｐＤＯＷ１４１１を生じた。第２のオペレーターの導入は、独自のＭｆｅＩ部位を最適オペレーターのすぐ上流に導入した。次にｐＤＯＷ１４１１のプロモーター領域を持つＸｈｏＩ／ＳｐｅＩベクター断片をニトリラーゼ遺伝子を保持するｐＭＹＣ１８０３誘導体の適合性断片に連結して、ＤＯＷ１４１３を形成する。ｐＤＯＷ１４１３のＭｆｅＩ／ＸｈｏＩ発現カセット断片の、ｐＤＯＷ１２６９の適合性ベクター断片への続いてのライゲーションは、ｐＤＯＷ１４１６を生じた；これをＤＣ２０６へ形質転換すると、菌株ＤＣ２６２が形成された。
【０３０５】
使用したオリゴヌクレオチド
ＡＫＢ−１（配列番号５６）
５’−ＡＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣ
ＡＫＢ−２（配列番号５７）
５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧＧＴＧＴＴＴＡＴＣＡＴＧＴＴＣ
ＡＫＢ−３（配列番号５８）
５’−ＴＡＣＴＧＣＡＣＧＣＡＣＡＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡ
【０３０６】
ニトリラーゼ抑制解除
ノザンブロット解析を誘導前および誘導後にＭＢ２１４、ＤＣ２０２、およびＤＣ２０６に対して実施した。ＭＢ２１４、ＤＣ２０２、およびＤＣ２０６は上記したように、野生型ｌａｃＯ配列をｔａｃプロモーターの３’側のＯ１位置に含有するニトリラーゼ発現ベクターを用いて形質転換して、ＭＢ２１４ｗｔＯ１、ＤＣ２０２ｗｔＯ1（ＤＣ２３９）、およびＤＣ２０６ｗｔＯ1（ＤＣ２４０）を作製した。ＤＣ２０６は、上記のようなｔａｃプロモーターの３’側のＯ1位置における野生型ｌａｃＯ配列の代わりにｌａｃＯｉｄ配列を含有するニトリラーゼ発現ベクターによって形質転換して、ＤＣ２０６０ｉｄ（ＤＣ２８１）を作製した。ＤＣ２０６もｔａｃプロモーターの３’側のＯ1位置に野生型ｌａｃＯ配列を、ｔａｃプロモーターの５’側のＯ３位置にｌａｃＯｉｄ配列を含有するニトリラーゼ発現ベクターを用いて形質転換して、ＤＣ２０６ｗｔＯ1Ｏ3ｉｄ（ＤＣ２６３）を含有するデュアルｌａｃＯを作製した。
【０３０７】
ノザンブロット解析は、誘導前にデュアルｌａｃＯ配列（ＤＣ２０６ｗｔＯ1Ｏ3ｉｄ（ＤＣ２６３））カセットを含有する菌株による、より大きな抑制を示した。プレインキュベーション発現のより大きな抑制は、プレインキュベーション毒性タンパク質の基底レベルが細胞の増殖期への移行遅延、そして潜在的に産物のより低い全体的な収率を生じさせるため、毒性タンパク質を産生するときに特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０３０８】
【図１】抗生物質耐性マーカー（黒菱形）のみを使用する蛍光菌（P.fluorescens）デュアルプラスミド発現系の性能に対する、ｐｙｒＦ（白抜き三角および白抜き四角）を使用する蛍光菌（P.fluorescens）デュアルプラスミド発現系の性能の比較を表す。示したすべてのデータは、ＩＰＴＧが中対数期の間に標的酵素発現を誘導するために添加された、９回の代表的な２０−Ｌ発酵の平均である。上部の３本の曲線のセットは、左垂直軸に対して読み取られる相対細胞密度データを表す。下部の３本の曲線のセットは、対応する発酵で産生された標的酵素の相対酵素活性データを表し、右垂直軸に対して読み取られる。（黒菱形）−ｔａｃプロモーター制御標的酵素発現カセットおよびテトラサイクリン耐性マーカー遺伝子を有するｐＭＹＣプラスミド、ならびにｌａｃＩリプレッサー発現カセットおよびカナマイシン耐性マーカー遺伝子を有するｐＣＮプラスミドを含有する、蛍光菌（P.fluorescens）。表示された分散バーはこれらのデータ点（ｎ＝４）のためであり、種々の発酵作業のうち、この発現系で通例観察される正規分散を表す。（白抜き三角）−ｔａｃプロモーター制御標的酵素発現カセットおよびｐｙｒＦ栄養要求性マーカー遺伝子を有するｐＭＹＣプラスミドを含有する、ならびにｌａｃＩリプレッサー発現カセットおよびカナマイシン耐性マーカー遺伝子を有するｐＣＮプラスミドを含有する不活性化ゲノムｐｙｒＦを備えた、蛍光菌（P.fluorescens）菌株。（白抜き四角）−ｔａｃプロモーター制御標的酵素発現カセットおよびｐｙｒＦ栄養要求性マーカー遺伝子を有するｐＭＹＣプラスミドを含有する、ならびにｌａｃＩリプレッサー発現カセットおよびｐｒｏＣ栄養要求性マーカー遺伝子を有するｐＣＮプラスミドを含有する不活性化ゲノムｐｙｒＦおよびｐｒｏＣを備えた、蛍光菌（P.fluorescens）菌株。
【図２】プラスミドｐＤＯＷ１２４９−２のマップを表す。
【図３】プラスミドｐＤＯＷ１２６９−２のマップを表す。
【図４】ｌａｃオペレーター構築物の概略図を表す。ＬａｃＺは、天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃＯ配列の位置を表す。ｔａｃ  ＤＣ２３９、ＤＣ２４０は、ｔａｃプロモーターおよびニトリラーゼコード核酸を含む構築物上の天然の大腸菌（E.coli）ｌａｃオペレーターの位置を表す。Ｏｐｔ ｌａｃＯ ＤＣ２８１は、ｔａｃプロモーターおよびニトリラーゼコード核酸を含む構築物上のｌａｃＯｉｄオペレーター配列の位置を表す。デュアルｌａｃＯ  ＤＣ２６２は、ニトリラーゼコード核酸をさらに含む構築物上の、ｔａｃプロモーターのｌａｃＯｉｄオペレーター配列５’、および野生型ｌａｃオペレーター配列３’の位置を表す。
【図５】振盪フラスコ遺伝子発現培地で増殖させたｌａｃＩ成分菌株内のＬａｃＩタンパク質蓄積のウェスタンブロット解析（UnBlot）を表す。ブロスサンプルをLDS NuPAGEサンプル緩衝液（Invitrogen）５０ｍＭ ＤＴＴと合せてＯＤ６００に標準化して、９５℃にて４０分間加熱し、次に短時間遠心分離にかけた。分割量２０ｕＬを内部チャンバ内での、抗酸化剤を含むＭＯＰＳでの１０％、１ｍｍ ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル作業へ装填した。ＬａｃＩタンパク質の検出は、ゲル内ハイブリダイゼーション法（「UnBlot」, Pierce）によって、１：１０００のポリクローナルウサギ抗体を、Ｌａｄ（Stratagene cat. no. 217449-51）に対して１：１０００で、二次抗体安定化ヤギ抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体（Pierce）に対して１：５００で使用して実施した。ホースラディッシュペルオキシダーゼは、UnBlotキットのUnBlot安定ペルオキシドおよびUnBlotルミノールエンハンサを用いて描出した。
【図６】ＤＣ１４０、ＤＣ２３９およびＤＣ２４０のニトリラーゼ蓄積特性の合成を表す。データはＤＣ１４０（ｎ＝５）、ＤＣ２３９（ｎ＝５）およびＤＣ２４０（ｎ＝４）作業から集めた。ＤＣ１４０は、黒四角で表す。ＤＣ２３９は、白抜き四角で表す。ＤＣ２４０は、白抜き四角で表す。発酵作業は４８時間の期間に渡って実施した。
【図１】
2007511238.tif 000020
【図２】
2007511238.tif 000021
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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