(57)【要約】  アミロイド形成的ペプチドの生成を調節する方法が開示されている。アミロイドーシスを含む疾患、例えば、アルツハイマー病の治療におけるこのような方法の使用も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイド形成的ペプチドの生成を調節する方法であって、
ａ）アミロイド形成的ペプチドを誘導する前駆体；および
ｂ）Ｎｏｇｏポリペプチド
を発現する細胞とＮｏｇｏアンタゴニストとを接触させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記前駆体がＡＰＰである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミロイド形成的ペプチドがＡβである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮｏｇｏポリペプチドがＮｏｇｏＡである請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｎｏｇｏアンタゴニストがモノクローナル抗体である請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が機能阻害抗ＮｏｇｏＡモノクローナル抗体である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アミロイドーシスを含む疾患の治療または予防のための医薬の製造におけるＮｏｇｏアンタゴニストの使用。
【請求項８】
前記アミロイドーシスがＡＰＰ由来のアミロイド形成的ペプチドにより誘発されるものである請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記アミロイド形成的ペプチドがＡβである請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記疾患がアルツハイマー病である請求項７から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＮｏｇｏアンタゴニストがＮｏｇｏＡアンタゴニストである請求項７から１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＮｏｇｏＡアンタゴニストがモノクローナル抗体である請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記モノクローナル抗体が機能阻害抗ＮｏｇｏＡ抗体である請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記機能阻害抗ＮｏｇｏＡ抗体がヒトＮｏｇｏの５８６から７８５（ＮｏｇｏＡアミノ酸番号）の部位に結合する抗体である請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記抗ＮｏｇｏＡ抗体が以下のＣＤＲの１または２以上を含むものである請求項１２に記載の使用：
軽鎖ＣＤＲ
2007537145.tif 000040
重鎖ＣＤＲ
2007537145.tif 000041
【請求項１６】
前記抗ＮｏｇｏＡ抗体が以下のＣＤＲの１または２以上を含むものである請求項１２に記載の使用：
軽鎖ＣＤＲ
2007537145.tif 000042
重鎖ＣＤＲ
2007537145.tif 000043
【請求項１７】
前記抗ＮｏｇｏＡ抗体が以下のＣＤＲの１または２以上を含むものである請求項１２に記載の使用：
軽鎖ＣＤＲ
2007537145.tif 000044
重鎖ＣＤＲ
2007537145.tif 000045
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体がヒト型の抗体である請求項１２に記載の使用。
【請求項１９】
請求項１３から１８のいずれか一項に記載の抗Ｎｏｇｏ抗体の有効量をそれが必要なヒトに投与する工程を含むアルツハイマー病の治療または予防方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解プロセシングを調節する方法、および、アルツハイマー病のようなアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の異常プロセシングが含まれる状態の治療方法に関する
【０００２】
（従来技術）
アルツハイマー病（ＡＤ）は、病理の２つの診断上の特徴により特徴づけられる。それらは、凝集したベータアミロイドペプチド（Ａβ４０およびＡβ４２）および過度にリン酸化されたタウそれぞれからなるアミロイド斑および神経原線維変化である(DawbarnおよびAllen 2001 Neurobiology of Alzheimer's Disease OUP)。
【０００３】
広範囲の研究により、患者におけるベータアミロイドの蓄積と認識力の低下との間に強いつながりがあることが示されている(Naslundら  2000)。これは、ＡＰＰおよびプレセニリン（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）遺伝子におけるある種の変異がＡＤを早期に始まりやすくさせることを示唆する遺伝学的および疫学的な研究で一致しており、そして変異はまた、Ａβ４０およびＡβ４２ペプチドの、その比率を含めて量を増やす。
【０００４】
ベータアミロイドペプチドの形成には、ベータおよびガンマセクレターゼと呼ばれる２つの異なるプロテアーゼによるI型の膜貫通のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断が必要である。ベータセクレターゼは、アスパルチルプロテアーゼＡｓｐ２／ＢＡＣＥ１との分子同一性が確認されている(Hussainら  1999; Vassarら  1999)。ガンマセクレターゼの性質には、議論の原因が残っており、少なくとも以下のタンパク質から構成される高分子量複合体からなるようである：プレセニリン、Ａｐｈ１、Ｐｅｎ２およびニカストリン（ｎｉｃａｓｔｒｉｎ）(MedinaおよびDotti Cell Signalling 2003 15(9):829-41に総説されている)。
【０００５】
中枢神経系内のＡＰＰプロセシングは、神経細胞、乏突起膠細胞、星状細胞および小膠細胞を含む多くの細胞種内で起こりやすい。一方、これらの細胞におけるＡＰＰプロセシングの全体的な速度は、ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１／Ａｓｐ２、プレセニリン−１および−２、Ａｐｈ１、Ｐｅｎ２ならびにニカストリンの相対的な発現量に影響されうる。
【０００６】
さらに、そのエンドサイトシスを阻害するＡＰＰの細胞質ドメインにおけるＹＥＮＰモチーフの変異がベータアミロイドの生成を減少させることを見出したことにより示されるように、ＡＰＰの細胞内局在を調節する付加的な因子も、そのプロセシングに影響する(Perezら  1999 J Biol Chem 274 (27) 18851-6)。ＫＫＱＮ保持モチーフの添加により小胞体にＡＰＰ−ベータ−ＣＴＦが保持されると、形質移入された細胞におけるアミロイドの生成が減少する(Malteseら  2001 J Biol Chem 276 (23) 20267-20279)。逆にＲａｂ５の過剰発現によりエンドサイトシスが増加すると、形質移入された細胞からのアミロイドの分泌が増加する(Grbovicら  2003 J Biol Chem 278 (33) 31261-31268)。
【０００７】
これらの発見と一致しているが、更なる研究は、細胞のコレステロール量（よく知られているＡＤの危険因子）の減少がベータアミロイドの形成を減少させることを示した。この変化は、優勢阻害（ドミナントネガティブ）ダイナミン変異体（Ｋ４４Ａ）の使用およびＲａｂ５  ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質ＲＮ−Ｔｒｅの過剰発現によるエンドサイトシスの変化によるものである(Ehehaltら  2003 J Cell Biol 160 (1) 113-123)。
【０００８】
コレステロールに富んだ微小ドメインまたはラフトも、ベータアミロイドの生成に重要な細胞部位であり、そして、ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１およびガンマセクレターゼ複合体の構成要素は全て、一過的にラフト内に存在することが示されている。コレステロールに富んだラフトに向かうＡＰＰおよびＢＡＣＥ１と架橋結合した抗体は、ベータアミロイドの生成を高めることができた(Ehehaltら  2003 J Cell Biol 160 (1) 113-123)。ＧＰＩを固着したＢＡＣＥ１、これはもっぱら脂質ラフトを標的にしているのだが、この発現は同様にＡＰＰの切断およびベータアミロイドの生成を高めることができる(Cordyら  2003 PNAS 100(20) 11735-11740)。
【０００９】
神経細胞の成長は、ＮＧＦのようなニューロトロフィンおよびラミニンのようなマトリックスタンパク質などの正の因子の活性ならびにエフリン、ＭＡＧ、セマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）−３ＡおよびＮｏｇｏＡなどの阻害因子の反対の活性により精密にバランスが保たれている(Tessier-LavigneおよびGoodman  2000 Science 287(5454):813-4に総説されている)。これらの因子からのシグナルの拮抗的な性質は、高められた神経細胞の成長がＲｈｏＡ活性化の減少と関連付けられること(Nusserら  2002 J Biol Chem 277 (39) 35840)、および、神経細胞の成長の阻害がＲｈｏＡ活性化の増大に帰着すること(Niederostら  2002 J Neuroscience 22(23) 10368-10376)の発見により説明される。
【００１０】
Ｎｏｇｏは、ミエリン鞘で見出されたタンパク質であり、軸索の成長における阻害活性を有する(Prinjha, Rら  (2000) Nature 403, 383-384; GrandPre, Tら  (2000) Nature 403, 439-444およびChen, MSら  (2000) Nature 403, 434-439)。 
【００１１】
ＮｏｇｏＡ遺伝子由来の転写物の別々のスプライシングにより、少なくとも３つのＮｏｇｏのアイソフォームが生じる。全てのアイソフォームのＣ末端の３分の１は、レティキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）タンパク質ファミリーと高い相同性（アミノ酸レベルで約７０％）を有する。最も大きなアイソフォームであるＮｏｇｏＡは、培地において軸索の再生を阻害することが示されている。Ｎｏｇｏタンパク質の正常な役割は、未損傷の中枢神経系において軸索の成長を阻害することであると考えられている。ＮｏｇｏＡは、中枢神経系のミエリンに局在化しており、乏突起膠細胞で多量に発現する；ＮｏｇｏＢおよびＮｏｇｏＣは、ある種の神経細胞および数種の非神経組織で発現する。全てのＮｏｇｏアイソフォームは、驚くべきことにＣ末端に小胞体保持モチーフを有するが、少なくともＮｏｇｏＡタンパク質の中には、細胞表面に到達するものがあると考えられている。３つのＮｏｇｏアイソフォームは全て、２つの潜在的な膜貫通ドメインを有する。ＣおよびＮ末端は両方とも細胞質内に露出しており、ＴＭドメインにより分離される６６アミノ酸のループは、細胞外に存在する場合もある。
【００１２】
ＢＡＣＥとＮｏｇｏとが物理的な意味で結合することができることは報告されていたが、このような報告は、単に免疫沈降実験に基づくものである（例えば、ＷＯ０２／０５８３２３およびＷＯ０３／０８８９２６）。この結合のさらなる確証はなく、ＢＡＣＥおよびＮｏｇｏの間の機能的な相互作用の実験的な根拠はない。
【００１３】
ＷＯ０３／０８８９２６は、レティキュロンファミリーのメンバーであるＲＴＮ３を発現する細胞において、ネガティブコントロールと比較してＡβの放出量が変化したことを開示している。しかしながら、この変化はＡβ量の増加であるのか減少であるのかの示唆がなく、それゆえＲＴＮ３のアンタゴニストまたはアゴニストの探索が研究の有益な手段であるのかどうかの示唆はない。彼ら（Nature Medicine 2004 10(9) 959-965）は次いで、ヒトＡＰＰを過剰発現する細胞にスウェーデン変異を形質移入することによりレティキュロン３Ｃの発現を高めると、Ａβ１−４０の生成を減少させることができたことを示唆している。Ａβ１−４２に関する効果についてデータの提示が全くなく、そして、非特異的な効果を除くための培地の生育能力の測定についての提示がない。本発明と全く対照的なことに、これらの研究は、アミロイドの生成を阻害するためにレティキュロンのアゴニストを特定するのが必要であることを示した。さらに、この研究はＮｏｇｏＡ（レティキュロン４Ａ）がアミロイドペプチドの形成を調節する能力を見ていない。
【００１４】
ＷＯ０４／０９３８９３は、ＡＰＰ（およびＡβペプチド）がＮｏｇｏ受容体と相互作用することを示唆する実験証拠を開示している。これらの同様の実験は、ＡＰＰとＮｏｇｏＡとの間の相互作用について何ら示していない。ＷＯ０４／０９３８９３に提示されているさらなる実験データは、Ｎｏｇｏ受容体アンタゴニストであるｓＮｇＲ３１０を用いたＡＰＰｓｗ／ＰＳＥＮ−１（Ｄｅｌｔａ  Ｅ９）ダブルトランスジェニックマウスの治療が、斑へのＡβ沈着量を減少させたことを示している。この示されたデータは、ＮｏｇｏＡ断片もＮｏｇｏＡアンタゴニストのいずれも、Ａβの生成に対して、Ｎｏｇｏ受容体ポリペプチドおよびＮｏｇｏ受容体アンタゴニストについて観察されたような同様の効果を有しないことを示唆している。
【００１５】
アルツハイマー病、前頭側頭骨痴呆（タウオパシー）、抹消神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症および封入体筋炎を含む慢性疾患だけでなく、脳卒中、外傷性脳障害および脊椎損傷などの急性疾患を含むがこれらに限定されない多くの神経性の疾患／障害の根底には、神経変性の過程が存在する。
【００１６】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療および予防方法の同定は、医薬産業および医薬提供者の高度に望ましい目標として残っている。
【００１７】
（発明の開示）
本発明は、Ｎｏｇｏのアンタゴニストがアミロイド形成的Ａβペプチドの生成に影響を及ぼすことを見出したことに基づくものである。この新規な発見は、Ａβペプチドの異常生成が原因となる疾患、特にアルツハイマー病の治療処置のための予想外の経路を提供する。
【００１８】
（発明の詳細な記載）
本発明は、Ｎｏｇｏのアンタゴニストを用いてＡβペプチドの生成を調節する方法を提供する。さらに本発明は、ＢＡＣＥ活性を調節する方法、アミロイド沈着を調節する方法、アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療のための医薬組成物および方法を提供する。
【００１９】
発明の詳細な記述
好ましい態様において、本発明は、ａ）アミロイド形成的ペプチドがそれに由来する前駆体；および
ｂ）Ｎｏｇｏポリペプチド
を発現する細胞とＮｏｇｏアンタゴニストとを接触させる工程を含むアミロイド形成的ペプチドの生成を調節する方法を提供する。
【００２０】
好ましい実施形態においては、上記前駆体がＡＰＰである。好ましくは、上記アミロイド形成的ペプチドがＡβであり、最も好ましくはＡβ４０、Ａβ４２または両方の併用である。
【００２１】
さらに好ましい実施形態では、上記ＮｏｇｏポリペプチドがＮｏｇｏＡである。
【００２２】
上記Ｎｏｇｏアンタゴニストは、Ｎｏｇｏに結合し、そしてそれによってＮｏｇｏ活性を阻害または失わせる有機低分子、ペプチド、ポリペプチドまたは抗体であってもよい。別の態様においては、上記Ｎｏｇｏアンタゴニストは抗体以外のどんなこのような分子であってもよい。他の可能なＮｏｇｏアンタゴニストとしては、Ｎｏｇｏ受容体分子上でＮｏｇｏポリペプチドと同じ部位に結合するが、Ｎｏｇｏ受容体に誘導される活性を引き起こさず、それによって、Ｎｏｇｏが結合するのを防ぐことによりＮｏｇｏ受容体の作用を妨げる、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド(例えばアプタマー)が挙げられる。
【００２３】
さらに可能なアンタゴニストには、Ｎｏｇｏポリペプチド上の結合部位に結合してその部位を占め、それによって受容体分子などの細胞結合分子の結合を妨げるので正常なＮｏｇｏの生物学的活性が阻害されるかまたは減少するような小さな分子も含まれる。このような小さな分子の例としては特に限定されないが、有機低分子、ペプチドまたはペプチド様分子、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド(例えば、アプタマー)が挙げられる。
【００２４】
さらに別のアプローチでは、内因性のＮｏｇｏポリペプチドをコードしている遺伝子の発現は、発現阻害技術を用いることによって阻害することができる。公知のこのような技術として、内部で産生されたまたは別々に投与されたアンチセンス配列の使用が挙げられる(例えば、O'Connor, J Neurochem (1991) 56:560 in Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)を参照)。別の方法として、遺伝子と三重へリックス（“トリプレックス”）を形成するオリゴヌクレオチドを提供することもできる(例えば、Leeら、Nucleic Acids Res (1979) 6:3073; Cooneyら、Science (1988) 241:456; Dervanら、Science (1991) 251:1360を参照)。これらのオリゴマーは、それ自体が投与されてもよく、または、インビボで適当なオリゴマーを発現させてもよい。合成アンチセンスまたはトリプレックス（三重の）オリゴヌクレオチドは、修飾された塩基または修飾されたバックボーンを含んでいてもよい。後者の例として、メチルホスホネート、ホスホロチオエートまたはペプチド核酸バックボーンが挙げられる。このようなバックボーンは、ヌクレアーゼによる分解からの保護作用を提供するためにアンチセンスまたはトリプレックスオリゴヌクレオチドに取り込まれており、当該技術分野においてよく知られている。これらのまたは他の修飾されたバックボーンを用いて合成されたアンチセンスおよびトリプレックス分子もまた、本発明の部分をなす。
【００２５】
さらに、Ｎｏｇｏポリペプチドの発現は、ＮｏｇｏのｍＲＮＡ配列に特異的なリボザイムを使用することにより阻害することができる。リボザイムは触媒的に活性なＲＮＡであり、天然物でも合成物でもよい(例えば、Usman, Nら、Curr. Opin. Struct. Biol (1996) 6(4), 527-33を参照。)。合成リボザイムは、ＮｏｇｏのｍＲＮＡを選択的な位置で特異的に切断するよう設計することができ、それによってＮｏｇｏのｍＲＮＡが機能的なポリペプチドに翻訳されるのを阻害することができる。リボザイムは、通常のＲＮＡ分子において見られるのと同様に、天然のリボースリン酸バックボーンおよび天然の塩基を用いて合成することができる。また、リボザイムは、リボヌクレアーゼの分解からの保護作用を付与するために非天然のバックボーン、例えば、２'−Ｏ−メチルＲＮＡを用いて合成されてもよく、修飾された塩基を含んでいてもよい。
【００２６】
さらに、Ｎｏｇｏポリペプチドの発現は、合成された短い妨害（ｓｉ）二重らせんＲＮＡ分子を用いて一過的にＮｏｇｏ遺伝子の機能を抑制して、阻害することができる。このＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の技術は、初めに線虫の研究から創り出されたのだが(A. Fire, Trends Genet., 1999, 15(9), 358)、後に哺乳類の細胞に適用して使用することができるように開発された(S. M. Elbashir, J. Harborth, W. Lendeckel, A. Yalcin, K. Weber, T. Tuschl, Nature, 2001, 411, 494)。一旦正確に局在化すると、ＲＮＡの二重鎖アンチセンスは標的メッセンジャー（ｍ）ＲＮＡ（興味の対象をコードしている）の相補的領域に結合し、ｍＲＮＡの加水分解およびそれに続く分解を導く。このｍＲＮＡの一過的な減少は、標的遺伝子の発現の一過的な減少を導く。
【００２７】
好ましくは、上記Ｎｏｇｏアンタゴニストが抗体であることであり、より好ましくはモノクローナル抗体であることである。
【００２８】
好ましくは、上記モノクローナル抗体が機能阻害抗Ｎｏｇｏモノクローナル抗体であることであり、より好ましくは、機能阻害抗ＮｏｇｏＡモノクローナル抗体であることである。
【００２９】
好ましくは、上記機能阻害抗ＮｏｇｏＡモノクローナル抗体が、表１から６に示すＣＤＲを含むものであることである。表１から６は、３つの別個に単離された抗Ｎｏｇｏ抗体：２Ａ１０／３、２Ｃ４／１および１５Ｃ３／３のＣＤＲを示す。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔにより記載されているように同定された(Kabatら  (1991) "Sequences of proteins of immunological interest"; Fifth Edition; US Department of Health and Human Services;  NIH publication No 91-3242)。ＣＤＲは、好ましくはＫａｂａｔにより定義されるが、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓに定義されるようにタンパク質の構造と折りたたみの法則に従い(Chothiaら、(1989) "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions"; Nature 342, p877-883)、付加的な残基もまた抗原結合部位の部分であると考えられると認識される。
【００３０】
【表１】
2007537145.tif 000002
【００３１】
【表２】
2007537145.tif 000003
【００３２】
【表３】
2007537145.tif 000004
【００３３】
【表４】
2007537145.tif 000005
【００３４】
【表５】
2007537145.tif 000006
【００３５】
【表６】
2007537145.tif 000007
【００３６】
上記抗Ｎｏｇｏ抗体は、Ｎｏｇｏポリペプチド上の、上述したＣＤＲを有する抗体と同じ抗原決定基に結合する抗体であってもよい。好ましくは、抗原決定基が５８６から７８５（ＮｏｇｏＡアミノ酸番号）の部位を含むことである。より好ましくは、抗原決定基が５８６から６８５または６８６から７８５の部位内を含むことである。抗原上の抗原決定基のマッピングには、競争阻害アッセイが使用される。
【００３７】
上記抗Ｎｏｇｏ抗体は、表１から６に開示したようなＣＤＲを含み、Ｎｏｇｏ、好ましくはヒトのＮｏｇｏに結合して中和するキメラ抗体であってもよい。好ましくは、キメラ抗体はマウスおよびヒトの配列を含む。
【００３８】
好ましくは、上記抗Ｎｏｇｏ抗体は、Ｎｏｇｏ、好ましくはヒトのＮｏｇｏに結合して中和するヒト型の抗体である。
【００３９】
好ましくは、上記抗Ｎｏｇｏ抗体は、表２のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３から選択される１または２以上のＣＤＲを含む、好ましくは少なくともＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、および／または表１のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３から選択される１または２以上のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその機能性断片；表４のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３から選択される１または２以上のＣＤＲを含む、好ましくは少なくともＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、および／または表３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３から選択される１または２以上のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその機能性断片；または表６のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３から選択される１または２以上のＣＤＲを含む、好ましくは少なくともＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、および／または表５のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３から選択される１または２以上のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその機能性断片である。
【００４０】
より好ましくは、上記抗Ｎｏｇｏ抗体またはその機能性断片は、以下のものを含む：
ａ）配列中に表２のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
および／または
ｂ）配列中に表１のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ａ）配列中に表４のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
および／または
ｂ）配列中に表３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗Ｎｏｇｏ抗体またはその機能性断片；または
ａ）配列中に表６のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
および／または
ｃ）配列中に表５のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗Ｎｏｇｏ抗体またはその機能性断片。
【００４１】
上記抗Ｎｏｇｏ抗体またはその機能性断片は、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含む重鎖可変部を含むことが好ましい：−
【００４２】
【化１】
2007537145.tif 000008
【００４３】
【化２】
2007537145.tif 000009
【００４４】
【化３】
2007537145.tif 000010
【００４５】
さらに、上記抗Ｎｏｇｏ抗体またはその機能性断片は、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含む軽鎖可変部を含むことが好ましい：−
【００４６】
【化４】
2007537145.tif 000011
【００４７】
【化５】
2007537145.tif 000012
【００４８】
【化６】
2007537145.tif 000013
【００４９】
配列番号３７から４２において箱で囲った配列は、Ｋａｂａｔらｓｕｐｒａに従うＣＤＲ配列を表す。
【００５０】
好ましい実施形態において、上記抗Ｎｏｇｏ抗体は以下を含む：
ａ）配列番号：３７の重鎖可変部と配列番号：４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部；または
ｂ）配列番号：３８の重鎖可変部と配列番号：４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部；または
ｃ）配列番号：３９の重鎖可変部と配列番号：４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部。
【００５１】
より好ましくは、抗Ｎｏｇｏ抗体またはその機能性断片は、以下のいずれかを含む：
ヒトの重鎖の配列番号：３７を含む重鎖可変断片および定常部またはその断片；および
ヒトの軽鎖の配列番号：４０を含む軽鎖可変断片および定常部またはその断片；または
ヒトの重鎖の配列番号：３８を含む重鎖可変断片および定常部またはその断片；および
ヒトの軽鎖の配列番号：４１を含む軽鎖可変断片および定常部またはその断片；または
ヒトの重鎖の配列番号：３９を含む重鎖可変断片および定常部またはその断片；および
ヒトの軽鎖の配列番号：４２を含む軽鎖可変断片および定常部またはその断片。
【００５２】
さらにより好ましくは、上記抗Ｎｏｇｏ抗体が２Ａ１０／３、２Ｃ４／１または１５Ｃ３／３から選択されるものであり、好ましくはそのヒト型のものである。最も好ましくは、上記抗Ｎｏｇｏ抗体が２Ａ１０／３またはそのヒト型のものである。
【００５３】
抗Ｎｏｇｏ抗体２Ａ１０／３は、配列番号：３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変部および配列番号：４０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変部を含むものである。
【００５４】
抗Ｎｏｇｏ抗体２Ｃ４／１は、配列番号：３８のアミノ酸配列を有する重鎖可変部および配列番号：４１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変部を含むものである。
【００５５】
抗Ｎｏｇｏ抗体１５Ｃ３／３は、配列番号：３９のアミノ酸配列を有する重鎖可変部および配列番号：４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変部を含むものである。
【００５６】
上記抗Ｎｏｇｏ抗体は、標準的な方法を用いて調製することができる。特にＮｏｇｏ抗体は、以下に述べるポリヌクレオチドを用いて調製することができる。例えば、表１から６に記載されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３をコードしている好ましいポリヌクレオチドは、以下の表７から１２に示されるものである。
【００５７】
【表７】
2007537145.tif 000014
【００５８】
【表８】
2007537145.tif 000015
【００５９】
【表９】
2007537145.tif 000016
【００６０】
【表１０】
2007537145.tif 000017
【００６１】
【表１１】
2007537145.tif 000018
【００６２】
【表１２】
2007537145.tif 000019
【００６３】
さらに、配列番号３７から３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号４０から４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部をコードしている好ましいポリヌクレオチドを以下に示す。
【００６４】
配列番号：３７のアミノ酸配列をコードしている好ましいポリヌクレオチド配列は、以下である：
【化７】
2007537145.tif 000020
【００６５】
配列番号：３８のアミノ酸配列をコードしている好ましいポリヌクレオチド配列は、以下である：
【化８】
2007537145.tif 000021
【００６６】
配列番号：３９のアミノ酸配列をコードしている好ましいポリヌクレオチド配列は、以下である：
【化９】
2007537145.tif 000022
【００６７】
配列番号：４０のアミノ酸配列をコードしている好ましいポリヌクレオチド配列は、以下である：
【００６８】
【化１０】
2007537145.tif 000023
【００６９】
配列番号：４１のアミノ酸配列をコードしている好ましいポリヌクレオチド配列は、以下である：
【化１１】
2007537145.tif 000024
【００７０】
配列番号：４２のアミノ酸配列をコードしている好ましいポリヌクレオチド配列は、以下である：
【化１２】
2007537145.tif 000025
【００７１】
本発明の方法は、インビトロまたはインビボで行うことができる。インビトロで行う場合、この方法は、アミロイド沈着、ＡＰＰプロセシングまたはＢＡＣＥ活性のモデルとなりうる、あるいは、アルツハイマー病などの神経性疾患の治療において有益な化合物の選別のための手段を提供することができる。
【００７２】
インビボで行われる場合、本発明の方法は、アルツハイマー病、前頭側頭骨痴呆（タウオパシー）、抹消神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症および封入体筋炎を含む慢性疾患だけでなく、脳卒中、外傷性脳障害および脊椎損傷などの急性疾患を含むがこれらに限定されない、神経性の疾患／障害の予防または治療の方法となりうる。
【００７３】
好ましい実施形態では、上記方法がアミロイドーシスを含む神経性疾患の予防または治療方法である。より好ましい実施形態では、アミロイドーシスがＡＰＰ、好ましくはＡβ；すなわちＡβ４０、Ａβ４２、または、Ａβ４０およびＡβ４２両方由来のアミロイド形成的ペプチドにより誘発されるものである。さらにより好ましくは、本発明がアルツハイマー病、前頭側頭骨痴呆（タウオパシー）、抹消神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症または封入体筋炎の予防または治療方法に関するものであることである。最も好ましくは、本発明がアルツハイマー病の予防または治療に関するものであることである。
【００７４】
上記予防または治療方法は、これ以降に記載するような疾患の治療における治療薬または医薬組成物の使用を含む。
【００７５】
別の態様では、本発明はアルツハイマー病、前頭側頭骨痴呆（タウオパシー）、抹消神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症および封入体筋炎を含む慢性疾患だけでなく、脳卒中、外傷性脳障害および脊椎損傷などの急性疾患を含むがこれらに限定されない、神経性の疾患／障害の予防または治療のための医薬の製造におけるＮｏｇｏアンタゴニストの使用を提供する。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明はアミロイドーシスを含む神経性疾患の治療または予防のための医薬の製造におけるＮｏｇｏアンタゴニストの使用を提供する。より好ましい実施形態では、上記アミロイドーシスがＡＰＰ、好ましくはＡβ；すなわちＡβ４０、Ａβ４２、または、Ａβ４０およびＡβ４２の両方由来のアミロイド形成的ペプチドにより誘発されるものである。さらにより好ましくは、本発明は、アルツハイマー病、前頭側頭骨痴呆（タウオパシー）、抹消神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症または封入体筋炎の予防または治療のための医薬の製造におけるＮｏｇｏアンタゴニストの使用に関する。最も好ましくは、本発明は、アルツハイマー病の予防または治療のための医薬の製造におけるＮｏｇｏアンタゴニストの使用に関する。
【００７７】
上述したような治療方法または医薬の製造のための使用を含む、本発明の方法において使用するＮｏｇｏアンタゴニストは、好ましくはＮｏｇｏＡアンタゴニストであり、最も好ましくはモノクローナル抗体である。
【００７８】
好ましくは、上記モノクローナル抗体は、上述したような機能阻害抗ＮｏｇｏＡ抗体である。このような好ましい機能阻害抗ＮｏｇｏＡ抗体の例は、上述した２Ａ１０／３であり、または、最も好ましくはそのヒト型のものである。その他の例としては、２Ｃ４／１および１５Ｃ３／３、または、これらのヒト型のものである。
【００７９】
上記抗ＮｏｇｏＡ抗体は、ＮｏｇｏＡポリペプチド上の、上述したＣＤＲを有する抗体と同じ抗原決定基に結合する抗体であってもよい。好ましくは、抗原決定基が５８６から７８５（ＮｏｇｏＡアミノ酸番号）の部位を含むことである。より好ましくは、抗原決定基が５８６から６８５または６８６から７８５の部位内を含むことである。
【００８０】
上記Ｎｏｇｏアンタゴニスト予防薬としてまたは傷害後に、またはその他必要に応じて投与することができる。治療の用量および持続時間は、ヒトの循環における本発明の分子の相対的な持続時間に関連し、治療条件および患者の通常の健康に応じて当業者が調節することができる。
【００８１】
上記Ｎｏｇｏアンタゴニストの投与様式としては、薬剤をホストに届けることができる適当な経路であればよい。Ｎｏｇｏアンタゴニストおよびその医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、くも膜下腔内、腹腔内、筋肉内、静脈内または鼻腔内への投与に特に有益である。
【００８２】
Ｎｏｇｏアンタゴニストは、医薬上許容される担体中に活性成分としてＮｏｇｏアンタゴニストの有効量を含む医薬組成物として調製されうる。本発明の予防薬においては、上記アゴニストを含む水性の懸濁液または溶液が、好ましくは生理的ｐＨに緩衝されて、注入の用意ができている形態が好ましい。非経口投与のための組成物は、一般に医薬上許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解したアンタゴニストまたはその混合物の溶液を含む。種々の水性キャリアを用いることができ、例えば、０．９％生理食塩水、０．３％グリシンなどが挙げられる。これらの溶液は無菌で、通常は粒子状物質を含まない。これらの溶液は、通常のよく知られた無菌技術（例えば、ろ過）によって無菌化することができる。上記組成物は、生理的な条件に近づけるために必要とされるｐＨ調節剤や緩衝剤のような医薬上許容される補助的な物質を含んでいてもよい。このような医薬製剤におけるアンタゴニストの濃度は広範囲に変えることができ、すなわち、重量で約０．５％未満から、通常約１％または少なくとも約１％から、１５または２０％までであり、選択される特定の投与方法に応じて、主に液体体積、粘性などに基づき選択される。
【００８３】
このように、筋肉内注射のための医薬組成物は、１ｍＬの無菌の緩衝された水および約１ｎｇから約１００ｍｇ、例えば、約５０ｎｇから約３０ｍｇまたはより好ましくは約５ｍｇから約２５ｍｇのＮｏｇｏアンタゴニストを含むよう調製することができる。同様に、静脈点滴のための本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌの無菌のリンゲル液、および、約１から約３０、好ましくは５ｍｇから約２５ｍｇのアンタゴニストを含むよう調製することができる。非経口投与の組成物の実際の調製方法は、この技術分野における当業者によく知られているか、または、明白な事項であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaに詳細に記載されている。
【００８４】
医薬製剤の場合には、上記Ｎｏｇｏアンタゴニストが単位投与の形態であることが好ましい。適切な治療上効果的な用量は、この技術分野の当業者によって容易に決められる。ヒトにおける神経性の疾患を効果的に治療するためには、１回の用量は体重７０ｋｇあたりアンタゴニストを７００ｍｇまでを非経口的に、好ましくはｉ．ｖまたはｉ．ｍ（筋肉内）に投与すべきである。このような用量は、もし必要であれば、医者によって適当であると選ばれる適当な回数、間隔で繰り返されてもよい。
【００８５】
ここに記載されたＮｏｇｏアンタゴニストは、貯蔵のために凍結乾燥し、使用に先立って適当な担体中で再構成することができる。Ｎｏｇｏアンタゴニストが抗体であれば、この技術は通常の免疫グロブリンを用いて有効であることが示されており、技術分野で公知の凍結乾燥および再構成技術を利用することができる。
【００８６】
以下に実施例を挙げて、本発明を説明する。
【実施例】
【００８７】
実施例１−ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰ細胞へのＮｏｇｏＡ  ｃＤＮＡの形質移入
形質移入の前日、ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞はトリプシン処理され、計測され、要求される細胞密度、６または９６穴のプレート（Ｎｕｎｃ（ヌンク）社）の１穴あたり通常０．２−１×１０６の細胞数で再度プレートに蒔かれた。
【００８８】
Ｎｏｇｏ発現コンストラクト（ｐＣＤＮＡ３中のＦＬＡＧタグＮｏｇｏＡ  ｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン）社）；ｐＣＤＮＡ３．１Ａ中のＭＹＣタグＮｏｇｏ−ＢおよびＮｏｇｏ−Ｃ）は、ＤＮＡを血清を含まない培養液（ＯｐｔｉＭＥＭ−１）に希釈し、プラス（PlusTM）試薬を添加し、混合し、室温で１５分間インキュベートすることによりプラス（PlusTM）試薬と複合体を形成させた。（穴あたり、６μｌのプラス試薬を２μｇのＤＮＡおよびＯｐｔｉＭＥＭ−１を用いて総体積１００μｌにした）
【００８９】
２つ目のチューブ中でリポフェクタミン（LipofectAMINETM）試薬を血清を含まない培養液（Ｏｐｔｉｍｅｍ−Ｉ）に希釈し、混合した（穴あたり、体積１００μｌ中リポフェクタミン４μｌ）。
【００９０】
予め複合化したＤＮＡ（上記から）を希釈したリポフェクタミンと併せて混合し、室温で１５分間インキュベートした。
【００９１】
一方、細胞を血清を含まない培養液（ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ）で洗浄し、その後新しい血清を含まない培養液を細胞に加えた（穴あたり８００μｌ）。
【００９２】
その後、ＤＮＡ−プラス−リポフェクタミン試薬複合体を細胞（２００μｌ）に添加し、ゆっくりと混合し、この細胞を５％ＣＯ２中で、３７℃で５時間インキュベートした。
【００９３】
５時間後、血清を含む成長培養液１ｍｌを細胞に添加し、この細胞を終夜または２時間インキュベートした。
【００９４】
１４時間（または２時間）後、全ての培養液を除去し、穴あたり１ｍｌ（ＯｐｔｉＭＥＭ−１）で置換した。
【００９５】
培養液の順化を４８時間行った後、培養液を集め、実施例２に記載するようにアミロイド含有量を測定した。
【００９６】
実施例２−Ｂｉｏ  Ｖｅｒｉｓ（バイオベリス）社（ＢＶ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ＥＬＩＳＡによるＡβペプチドの検出
ヒトＡＰＰｗｔまたはアミロイド前駆体タンパク質スウェーデン変異配列（ＡＰＰｓｗｅ）を過剰発現するＳＨＳＹ５Ｙ細胞は、１×１０５細胞／穴の密度で９６穴ヌンクプレートに蒔かれた。
【００９７】
２４時間後、試験のための試薬（例えば、抗体、ペプチド、化合物など）を、１２０μｌの最終体積で細胞に加え、そして細胞を２４時間インキュベートした。
【００９８】
培養液を細胞から除去し、５０μｌについてＡβｘ−４０の測定を、５０μｌについてＡβｘ−４２の測定をＡβのＣ末端に特異的な抗体を使用する終夜のＢＩＯＶＥＲＩＳ（バイオベリス）社の免疫測定法で行った。簡潔にいうと、Ａβペプチドはビオチン標識された６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ  Ｌａｂｓ社）を用いて捕獲された。ＢＶタグでラベルされたＡβのＣ末端特異的抗体は、Ａβｘ−４０およびＡβｘ−４２種を検出するために用いられた。抗体−Ａβ複合体は、ストレプトアビジンで覆われたダイナビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）で捕獲され、ＢＩＯＶＥＲＩＳ社Ｍ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｍ３８４分析機器において測定された。
【００９９】
細胞の生存率は、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、チアゾリルブルー）試薬を用いてチェックした。簡潔に言うと、ＭＴＴ試薬（リン酸で緩衝した生理食塩水中に５ｍｇ／ｍｌ）を培養液で１：１０に希釈し、各穴に１００μｌ加えた。次いで３７ｏＣで４時間インキュベートし、１００μｌの可溶化溶液（２０％  ＳＤＳ／５０％  ジメチルホルムアミド）を添加した。プレートの吸光度は、Ｄｅｌｆｉａ  Ｗａｌｌａｃ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒを用いて５９０ｎＭで測定した。
結果を図１から１４に示す。
【０１００】
ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）ＡＰＰを発現する。ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｓｗｅ細胞は、ＡＰＰのスウェーデン変異体型を発現する。
【０１０１】
実施例３−Ａβ４０およびＡβ４２ペプチドの分泌量に対するＮｏｇｏＡの発現の効果
ＮｏｇｏＡを発現する発現コンストラクトをＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞またはＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｓｗｅ細胞に導入すると、Ａβ４０およびＡβ４２の量が意味深い増加を示し、このことはＮｏｇｏＡが何らかの方法で、直接的または間接的に、ＡＰＰのタンパク質分解プロセシングおよび／またはＡβペプチドの分解を調節していることを示唆している。この変化したＡＰＰプロセシングの生成物がＡβ４０およびＡβ４２ペプチド両方であるという事実は、Ｎｏｇｏの効果は、β−セクレターゼ活性を調節する、または、ペプチド分泌を変化させる、もしくは安定性に影響を与える、もしくは現在あまりよく特徴付けられていないメカニズムを経る、段階のものであると示唆される。
【０１０２】
図１から、ＮｏｇｏＡが発現ベクターから発現されると、Ａβ４０の分泌量が増加することがわかる。左の２つのバーはコントロールであり（ベクターのみ、および、コントロールタンパク質である緑色発光タンパク質（ＧＦＰ）を担持しているベクター）、この細胞株におけるＡβ４０の生成量のバックグランドを示す。残りのバーから、ＦＬＡＧペプチドと融合したＮｏｇｏＡが細胞で発現すると、Ａβ４０ペプチドの意味深い増加量が検出されたことがわかり、ｍｙｃと融合したＮｏｇｏＢが発現すると、それほど顕著ではないが、同様の上昇が起こることもわかる。
【０１０３】
同様の実験を、Ａβ４２に特異的なＥＬＩＳＡを使用して繰り返した。結果から、Ａβ４０  ＥＬＩＳＡを用いた先の実験において観察されたのと同様に、Ａβ４２ペプチドの分泌量が増加することがわかった。さらにＮｏｇｏＢも、Ａβ４２ペプチドの分泌の増加を示し、さらにその増加は、ＮｏｇｏＡを用いた場合ほど顕著ではなかった。結果を図２に示す。
【０１０４】
ベクターｐＣＤＮＡ３のみを形質移入した細胞に対して、ＮｏｇｏＡを形質移入した細胞から分泌されたペプチドの量を比較する繰り返し実験を図３（Ａβ４０について）および４（Ａβ４２について）に示す。
【０１０５】
図５に、Ａβ４０およびＡβ４２ペプチドの生成におけるＮｏｇｏの発現の効果の再現性を評価するための３（Ｎｏｇｏ−Ｃ）から５（ベクター、ＧＦＰ、ＮｏｇｏＡおよび−Ｂ）の別個の実験のデータの標準化され、平均化された一覧を示す。
【０１０６】
実施例４−抗Ｎｏｇｏ抗体の調製
ハイブリドーマの調製と選択
抗Ｎｏｇｏモノクローナル抗体は、マウスの骨髄腫細胞と、標的抗体で免疫されたマウス由来のＢリンパ球とを融合させたハイブリドーマ細胞により生成される。ハイブリドーマ細胞は、骨髄腫融合パートナーにより不死化されているが、Ｂリンパ球により抗体産生能が付与されている。各ハイブリドーマ細胞は、独特の特異性を有する単一の、それゆえモノクローナルと呼ばれる１種の抗体だけを産生する。
【０１０７】
ＳＪＬマウスを総タンパク質１０μｇ（１：１、ヒトＮｏｇｏＡスプライス（アミノ酸１８６−１００４）およびラットＮｏｇｏＡスプライス（アミノ酸１７３−９７５）、イー・コリＢＬ２１においてＧＳＴ−融合タンパク質として産生された）で、皮下にＣＦＡおよびＲＩＢＩ両方の免疫賦活剤を用いて免疫した。マウスはその後４および８日後に、ＲＩＢＩ免疫賦活剤を用いて５ｕｇの同じタンパク質で追加免疫された。さらに３日後、免疫細胞を局在的な流入領域リンパ節から収集し、ＰＥＧ１５００を用いてマウス骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマが生成した。各ハイブリドーマ細胞株を、２周の限界希釈によりクローン化した。
【０１０８】
最初のハイブリドーマ抗体の選択は、マイクロタイタープレート上のＮｏｇｏタンパク質への直接結合を根拠として行った。その後、ｃａ．６０ハイブリドーマが、可溶性タンパク質（プレセッションプロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）を用いてＧＳＴ部分から切断されたヒトＮｏｇｏＡ配列からなる）がＥＬＩＳＡ測定法におけるこの結合活性を競争する能力を基に選択された。
【０１０９】
可変部のクローニング
選択された２Ａ１０／３、２Ｃ４／１および１５Ｃ３／３ハイブリドーマ細胞から全てのＲＮＡを抽出し、重鎖および軽鎖可変領域のｃＤＮＡ配列を抽出するために、続けて逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。ＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマーは、マウスの免疫グロブリン遺伝子リーダー配列に特異的な縮重プライマーの混合物であり、そしてリバースプライマーは、定常部に作用するアイソタイプ特異的抗体である。ＰＣＲプライマーは、ＤＮＡシークエンスのためにｐＵＣ１９にクローニングできるように、５’制限酵素の認識部位を運搬するように設計されていた。
【０１１０】
ＲＮＡ抽出
Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ）社のＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用い、製造会社の説明書に従って、各ハイブリドーマクローンの１０６細胞のペレットから全てのＲＮＡを抽出した。
【０１１１】
逆転写
マウスのリーダー配列に特異的なフォワードプライマーおよびマウスのＩｇＧκ定常部に特異的なリバースプライマーを用いて、重鎖および軽鎖可変領域のｃＤＮＡを製造するためにＲＮＡを逆転写した。ＩｇＧγ１リバースプライマーがハイブリドーマ２Ｃ４／１および１５Ｃ３／３のために用いられ、ＩｇＧγ２ｂが２Ａ１０／３のために用いられた。フォワードプライマーは、５’末端にＳａｌＩ制限酵素認識部位と、効率的に限定分解するためにこの５’に付加された４つの追加ヌクレオチドとを運搬する。これらのプライマーは、Ｊｏｎｅｓ  ＳＴおよびＢｅｎｄｉｇ  ＭＭ  １９９１（Biotechnology 9、88-89）を作り変えたものである。リバースプライマーは、ＸｍａＩ制限酵素認識部位に加えて５’末端の追加の４つの追加ヌクレオチドを運搬する。
【０１１２】
プライマー：
マウス  ＶＨリーダー配列フォワードプライマー：
AG77:  5'-ACT AGT CGA CAT GAA ATG CAG CTG GGT CAT STT CTT C-3'
AG78:  5'-ACT AGT CGA CAT GGG ATG GAG CTR TAT CAT SYT CTT-3'
AG79:  5'-ACT AGT CGA CAT GAA GWT GTG GTT AAA CTG GGT TTT T-3'
AG80: 5'-ACT AGT CGA CAT GRA CTT TGG GYT CAG CTT GRT TT-3'
AG81:  5'-ACT AGT CGA CAT GGA CTC CAG GCT CAA TTT AGT TTT CCT T-3'
AG82:  5'-ACT AGT CGA CAT GGC TGT CYT RGS GCT RCT CTT CTG C-3'
AG83: 5'-ACT AGT CGA CAT GGR ATG GAG CKG GRT CTT TMT CTT-3'
AG84: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG AGT GCT GAT TCT TTT GTG-3'
AG85: 5'-ACT AGT CGA CAT GGM TTG GGT GTG GAM CTT GCT ATT CCT G-3'
AG86:  5'-ACT AGT CGA CAT GGG CAG ACT TAC ATT CTC ATT CCT G-3'
AG87: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA TTT TGG GCT GAT TTT TTT TAT TG-3'
AG89: 5'-ACT AGT CGA CAT GAT GGT GTT AAG TCT TCT GTA CCT G-3'
【０１１３】
マウス  ＶＬリーダー配列フォワードプライマー：
AG90:  5'-ACT AGT CGA CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT GGT GCT G-3'
AG91:  5'-ACT AGT CGA CAT GGA GWC AGA CAC ACT CCT GYT ATG GGT-3'
AG92:  5'-ACT AGT CGA CAT GAG TGT GCT CAC TCA GGT CCT GGC GTT G-3'
AG93: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG GRC CCC TGC TCA GWT TYT TGG MWT CTT G-3'
AG94:  5'-ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA GGT GCA GAT TWT CAG CTT C-3'
AG95: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG GTK CYY TGY TSA GYT YCT GRG G-3'
AG96: 5'-ACT AGT CGA CAT GGG CWT CAA GAT GGA GTC ACA KWY YCW GG-3'
AG97:  5'-ACT AGT CGA CAT GTG GGG AYC TKT TTY CMM TTT TTC AAT TG-3'
AG98:  5'-ACT AGT CGA CAT GGT RTC CWC ASC TCA GTT CCT TG-3'
AG99:  5'-ACT AGT CGA CAT GTA TAT ATG TTT GTT GTC TAT TTC T-3'
AG100: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA AGC CCC AGC TCA GCT TCT CTT CC-3'
MKV12: 5'-ACT AGT CGA CAT GAA GTT TCC TTC TCA ACT TCT GCT C-3'
【０１１４】
マウス  γ１定常部リバースプライマー:
AG102: 5'-GGA TCC CGG GCC AGT GGA TAG ACA GAT G-3'
【０１１５】
マウス  γ２ｂ定常部リバースプライマー：
AG104: 5'-GGA TCC CGG GAG TGG ATA GAC TGA TGG-3'
【０１１６】
マウス  κ定常部リバースプライマー：
AG101: 5'-GGA TCC CGG GTG GAT GGT GGG AAG ATG-3'
【０１１７】
マウス  ＶＨまたはＶＬリーダー配列フォワードプライマーのプールを５０μＭで調製した。マウスγまたは定常部リバースプライマーも５０μＭで調製した。
【０１１８】
ＲＴ−ＰＣＲ
重鎖および軽鎖の可変部をコードしているＲＮＡの逆転写を、Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ）社のＡｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用い、製造会社の説明書に従って繰り返して行った。約２００ｎｇのＲＮＡを、供給されたＲＴ−ＰＣＲバッファー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｕＭの各プライマーセット、１μＭ  ＭｇＳ０４および、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ各５Ｕを含む５０μｌの反応液中でインキュベートした。
ＲＴ−ＰＣＲサイクル：１−４８℃  ４５分
２−９４℃  ２分
３−９４℃  ３０秒    
４−５０℃  １分            
５−６８℃  ２分    
６−６８℃  ７分
ステップ３から５：３０回繰り返す。
【０１１９】
ｐＵＣ１９  クローニング
可変部のＲＴ−ＰＣＲ生成物を、Qiagen（キアゲン）社のMinElut Qiagen PCR Purifcation kitを用いて、その説明書にしたがって精製し、次にNew England Biolabs（ニューイングランドバイオラボ）社のＸｍａＩおよびＳａｌＩを用いて製造会社の説明書にしたがって消化した。その後それらを０．５％エチジウムブロマイドを含む調製用の１％アガロースゲル上にロードし、ＴＡＥバッファー中で５０ｍＡで１時間動かし、紫外線の下でＶ部位のバンドを切り取った。ＤＮＡ断片は、Qiagen（キアゲン）社のMinElute Gel extraction kitを用いて、製造会社の説明書に従ってゲルから精製した。ｐＵＣ１９ベクターのアーム（ａｒｍ）は、製造会社の説明書にしたがって、ｐＵＣ１９をＳａｌＩおよびＸｍａＩで消化し、その後Qiagen（キアゲン）社のMinElute Reaction Clean up kitを用いて精製し、エビ  アルカリフォスファターゼ（ＵＳＢ社）を用いて、脱リン酸化することにより調製した。ベクターのアームおよびＶ部位断片の濃度を分析用１％アガロース／エチジウムブロマイドゲルから推定し、モル比１：２で混合し、Promega（プロメガ）社のQuick Ligation kitを用いて、製造会社の説明書にしたがって連結させた。
【０１２０】
連結したプラスミドは、製造会社の説明書にしたがってＤＨ５ａ細胞（Invitrogen（インビトロジェン）社）に形質転換された。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−寒天プレート上に生育したコロニーが、ＤＮＡシークエンス分析のために選択された。
【０１２１】
可変領域の配列
コロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した５ｍｌのＬＢ培地中で、３７℃で終夜培養し、プラスミドＤＮＡを、Qiagen（キアゲン）社のQIAprep Spin Miniprep kitを用いて、製造会社の説明書にしたがって抽出し、精製した。標準Ｍ１３フォワードおよびリバースプライマーを用いてＶＨおよびＶＬ部位のＤＮＡ配列を決定した。
配列決定の結果を配列番号４３から４８として示す。
【０１２２】
【化１３】
2007537145.tif 000026
【０１２３】
【化１４】
2007537145.tif 000027
【０１２４】
【化１５】
2007537145.tif 000028
【０１２５】
【化１６】
2007537145.tif 000029
【０１２６】
【化１７】
2007537145.tif 000030
【０１２７】
【化１８】
2007537145.tif 000031
【０１２８】
【化１９】
2007537145.tif 000032
【０１２９】
【化２０】
2007537145.tif 000033
【０１３０】
【化２１】
2007537145.tif 000034
【０１３１】
【化２２】
2007537145.tif 000035
【０１３２】
【化２３】
2007537145.tif 000036
【０１３３】
【化２４】
2007537145.tif 000037
【０１３４】
軽鎖または重鎖部位のＤＮＡ配列は、抗体２Ａ１０／３、２Ｃ４／１および１５Ｃ３／３に対して与えられる。各ＤＮＡ配列の下の記載は、該ＤＮＡによりコードされると予想されるアミノ酸配列であり、ＣＤＲは箱で囲って示されている。
【０１３５】
組換え抗Ｎｏｇｏ抗体
マウス２ａ／ｋ定常部を有する組換え抗体は、マウスＩｇＧ２ａ／ｋ定常部遺伝子セグメントにクローニングされた軽鎖および重鎖可変部を含むプラスミドを用いて形質移入した細胞から精製された。クローニングしたマウスのＶ部位を、哺乳類の発現ベクターＲｌｄおよびＲｌｎにクローニングするために必要な制限部位を導入するために、ＰＣＲにより増幅させた。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩ部位は、マウスγ２ａ定常部を含む変更されたＲｌｄベクターにクローニングできるように、ＶＨ領域と共にインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）に設計された。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｉＷＩ部位は、ＶＬ領域にインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）に設計され、マウスκ定常部を含む変更されたＲｌｎベクターにクローニングできる。
【０１３６】
ＰＣＲプライマー
２Ａ１０  ＶＨ  フォワードプライマー：
5'- ACTCATAAGCTTGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAG -3'
ＶＨ  リバースプライマー：
5'-ACTATGACTAGTGTGCCTTGGCCCCAGTAG-3'
ＶＬ  フォワードプライマー：
5'- ACTCATAAGCTTGCCACCATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTG -3'
ＶＬ  リバースプライマー：
5'- ACTATGCGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGG -3'
【０１３７】
ＰＣＲは、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ストラタジーン）社）を用いて、製造会社の説明書にしたがって、Ｖ−部位、２％  ＤＭＳＯ、４００μＭ  ｄＮＴＰｓ、１μＭ  各プライマーおよび提供されたバッファーを含む約１０ｎｇのｐＵＣ１９のミニプレップを含む、体積５０μｌで行われた。ＰＣＲは、次のように行われた：１−９５℃  ２分、２−９５℃  １分、３−５６℃  １分、４−７２℃  １分。工程２−４  ３０サイクル。
【０１３８】
発現ベクターへのクローニング
ＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン）社のＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、製造会社の説明書にしたがって精製された。ＶＨ  ＰＣＲ生成物およびＲｌｄ（ＩｇＧ２ａ）哺乳類発現ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩで消化された。ＶＬ  ＰＣＲ生成物およびＲｌｎ（ｋ）哺乳類発現ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｉＷＩ（ＮＥＢ社）で製造会社の説明書にしたがって消化された。ベクターは、Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ）社のＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、モル比１：２で挿入するために連結された。ライゲーション混合物をＤＨ５ａ細胞に形質移入し、アンピシリン選択培地上に生育したコロニーを増殖させ、そしてＤＮＡ配列確認に送った。
【０１３９】
組換え抗Ｎｏｇｏ抗体２Ａ１０／３の配列
ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩクローニング部位の間の２Ａ１０重鎖の配列が決定された：
【化２５】
2007537145.tif 000038
【０１４０】
ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩクローニング部位の間の２Ａ１０軽鎖配列が決定された：
【化２６】
2007537145.tif 000039
【０１４１】
実施例５−抗ＮｏｇｏＡ抗体はＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔおよびＳＨＳＹ５Ｙｓｗｅ細胞からのＡβ４０およびＡβ４２ペプチドの分泌を阻害する
図６から、抗Ｎｏｇｏ抗体２Ａ１０が培地に導入されると、内因性ＮｏｇｏＡを発現するＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞から分泌されるＡβ４０およびＡβ４２ペプチド量が劇的に減少することがわかる。
【０１４２】
効果は、用量依存的であり、３０μｇ／ｍｌでは阻害レベルが約９０％に達した。Ａβ４０およびＡβ４２ペプチド（それぞれ図６中の白いバーおよび黒いバー）の間に明瞭な効果の差はない、言い換えれば、ＡＰＰプロセシングにおける抗Ｎｏｇｏ抗体のいかなる効果も、Ａβ４０またはＡβ４２ペプチドのいずれにも優先的でない。
【０１４３】
図７は図６と同様の実験を示すが、無関係のＩｇＧ１抗体を用いている。この図から、無関係の（非抗ＮｏｇｏＡ）モノクローナル抗体は、細胞からのＡβ４０およびＡβ４２ペプチドの分泌量に阻害効果を示さないことが明確にわかる。
【０１４４】
図８から、同じ無関係のＩｇＧ１抗体は、同様にＮｏｇｏＡを発現するＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｓｗｅ細胞からのＡβ４０およびＡβ４２ペプチドの分泌量への阻害効果をほとんど示さないか、または、示さないことがわかる。
【０１４５】
同様に図９は、図６について上述したのと同じ実験の結果を示すが、ＮｏｇｏＡに結合するが機能阻害剤でない抗Ｎｏｇｏモノクローナル抗体（６Ｄ５）を用いている。非機能阻害の抗ＮｏｇｏＡモノクローナル抗体は、ＮｏｇｏＡを発現するＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞からのＡβ４０およびＡβ４２ペプチドの分泌量に極めて小さい効果（１０％未満）を示す。この結果から、図６に示された結果は、抗Ｎｏｇｏ抗体によるＮｏｇｏの機能活性の阻害の結果であることが示唆される。
【０１４６】
図１０は、図９と同じ実験の結果を示し、非機能阻害抗Ｎｏｇｏモノクローナル抗体（６Ｄ５）を用いるが、内因性ＮｏｇｏＡを発現するＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｓｗｅ細胞を用いている。前（図９）と同様に、この細胞株から分泌されるＡβ４０およびＡβ４２量に対する効果は極めて小さく、１０％未満の阻害である。
【０１４７】
図１１は、図６の実験結果を伸展させた実験結果を示す。図１１から、機能阻害抗体２Ａ１０／３により示される阻害効果の濃度依存性効果は、高い濃度において持続し、抗体濃度５０μｇ／ｍｌで９０％より高いレベルの阻害が達成されたことがわかる。
【０１４８】
図１２は、ＳＨＳＹ５Ｙｓｗｅ細胞が用いられる以外は図１１と同じ実験の結果を示す。抗体２Ａ１０／３の濃度依存性阻害効果は、５０μｇ／ｍｌの高い濃度において継続して観察される。
【０１４９】
図１３は、別の機能阻害抗ＮｏｇｏＡ抗体である２Ｃ４の、ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞からのＡβ４０およびＡβ４２ペプチドの分泌に対する影響を示す。結果から、Ａβ４０およびＡβ４２ペプチドの分泌量への濃度依存性阻害効果は、濃度２０μｇ／ｍｌで３６％のレベルであることがわかる。さらにこの効果は、Ａβ４０およびＡβ４２ペプチド両方について観察される。
【０１５０】
図１４は、抗ＮｏｇｏＡ機能阻害抗体である２Ａ１０、２Ｃ４および１５Ｃ３（図に示された濃度で）と、他のコントロールの抗体である１０Ａ４、ＩｇＧ２ｂおよび１４Ｄ１２の阻害効果を比較している。この図から、Ａβ４０およびＡβ４２の分泌に対する阻害効果は、機能阻害抗ＮｏｇｏＡモノクローナル抗体に特異的なものであることがわかる。
【０１５１】
実施例６−ＮｏｇｏＡの発現の増加は、用量依存的にＡβ量を増加させる
Ａβ量に対するＮｏｇｏＡの発現の効果を調べるために、Ｃ末端をｍｙｃでタグしたＮｏｇｏＡのｃＤＮＡの量を増加させてＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞に一過的に形質移入した。ｃＤＮＡの総量（５μｇ）は、ｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃ  ｃＤＮＡを用いる各形質移入において一定とした。形質移入の４８時間後、培地を除去し、Ａβ４０を測定した。さらに、細胞を回収し、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびコンプリートプロテアーゼインヒビター（Complete protease inhibitors）（Roche（ロシュ）社）を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌに溶解させた。細胞の溶解液は、１０％のＮｏｖｅｘ（ノーベックス）社のトリス−グリシンゲル上で分離させ、抗ＮｏｇｏＡ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。ＮｏｇｏＡタンパク質の発現の増加が、ＮｏｇｏＡ  ｃＤＮＡ濃度の増加と共に観察された（図１５）。このことは、これらの細胞からの培養液中のＡβ４０量が対応して増加していることに伴っていた。このように、ＮｏｇｏＡの発現の増加は、Ａβ４０量の用量依存的な増加を引き起こす。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】ＮｏｇｏＡ形質移入は、ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞におけるＡβ４０ペプチド量の増加を導く
【図２】ＮｏｇｏＡ形質移入は、ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞におけるＡβ４２ペプチド量の増加を導く
【図３】Ａβ４０ペプチド量に対するＮｏｇｏＡの発現の効果
【図４】Ａβ４２ペプチド量に対するＮｏｇｏＡの発現の効果
【図５】Ａβ４０およびＡβ４２に対するＮｏｇｏＡ、Ｎｏｇｏ−ＢおよびＮｏｇｏ−Ｃの発現の効果
【図６】抗ＮｏｇｏＡ抗体２Ａ１０−ＢＲは、ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞からのＡβ分泌を阻害する
【図７】ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞からのＡβの分泌に対するＣｈｅｍｉｃｏｎ  ＩｇＧ１の効果
【図８】ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｓｗｅ細胞からのＡβの分泌に対するＣｈｅｍｉｃｏｎ  ＩｇＧ１の効果
【図９】ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞からのＡβの分泌に対するコントロールの抗Ｎｏｇｏ（非機能阻害）抗体６Ｄ５の効果
【図１０】ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｓｗｅ細胞からのＡβの分泌に対するコントロールの抗Ｎｏｇｏ（非機能阻害）抗体６Ｄ５の効果
【図１１】機能阻害抗ＮｏｇｏＡモノクローナル抗体２Ａ１０は、ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞からのＡβの分泌を阻害する
【図１２】機能阻害抗ＮｏｇｏＡモノクローナル抗体２Ａ１０は、ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｓｗｅ細胞からのＡβの分泌を阻害する
【図１３】機能阻害抗ＮｏｇｏＡモノクローナル抗体２Ｃ４は、ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞からのＡβの分泌を阻害する
【図１４】ＳＨＳＹ５Ｙ−ＡＰＰｗｔ細胞からのＡβの分泌に対する抗ＮｏｇｏＡ静地培養抗体調製物および追加のコントロール抗体の効果。２Ａ１０、２Ｃ４および１５Ｃ３は、静地培養抗体である。他は全てＢＲ（バイオリアクター）で精製されたコントロールまたは商業的に利用可能なコントロールである。
【図１５】ＮｏｇｏＡ発現の増加は、用量依存的なＡβ量の増加を引き起こす。グラフのＹ軸は、Ａβの増加％である。Ｘ軸は、ｍｙｃ−タグＮｏｇｏＡ  ｃＤＮＡの濃度の増加を示す。グラフ上部は、抗ＮｏｇｏＡ抗体を用いたウェスタンブロットにより示されるＮｏｇｏＡタンパク質発現量の増加を示すゲルである。
【図１】
2007537145.tif 000046
【図２】
2007537145.tif 000047
【図３】
2007537145.tif 000048
【図４】
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【図５】
2007537145.tif 000050
【図６】
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【図７】
2007537145.tif 000052
【図８】
2007537145.tif 000053
【図９】
2007537145.tif 000054
【図１０】
2007537145.tif 000055
【図１１】
2007537145.tif 000056
【図１２】
2007537145.tif 000057
【図１３】
2007537145.tif 000058
【図１４】
2007537145.tif 000059
【図１５】
2007537145.tif 000060
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月23日(2006.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007537145000001.app
【国際調査報告】
2007537145.tif 000061
2007537145.tif 000062
2007537145.tif 000063
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