(57)【要約】本発明は、動物精子細胞中におけるＤＮＡ断片化の決定のための方法を述べている。特に、変性ＤＮＡ溶液と次に適宜染色によるサンプル処理、たんぱく質変性界面活性剤を含まない溶解溶液と次に適宜染色によるその後の処理、およびクロマチン／ＤＮＡの完全性の評価による精子細胞のクロマチン／ＤＮＡの完全性の評価方法に関する。本発明はさらに、動物精子細胞の品質を評価するためのキットに関し、前記キットは、変性ＤＮＡ溶液とたんぱく質変性界面活性剤を含まない溶解溶液とを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマチン／ＤＮＡおよび動物精子の完全性を評価する方法であって、
ａ）精子を含むサンプルをＤＮＡ変性溶液の溶液で処理する段階と、
ｂ）核たんぱく質類を抽出するための溶解溶液により一回処理する段階と、
ｃ）前記精子のクロマチン／ＤＮＡの完全性を評価する段階と、
を含み、前記溶解溶液は、たんぱく質変性界面活性剤を含まず、必然的に前記精子の尾部を破壊しないことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記段階ａ）がｂ）より前であるかまたはそれがｂ）およびｃ）の前であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記溶解溶液が、非イオン性、非たんぱく質変性界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記非イオン性界面活性剤が、トクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−１００）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド（ｂｉｇＣＨＡＰ）、Ｂｒｉｊ（ｒ）３５Ｐ、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ジギトニン、ドデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、分枝オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール（イゲパルＣＡ−６３０）、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ノニデットＰ４０、Ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミン、スパン２０溶液、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）およびそれらの混合物類から選択され、好適にはトリトンＸ−１００であることを特徴とする請求項１〜３記載の方法。
【請求項５】
前記溶解溶液が、１〜３Ｍの塩化ナトリウム、０．００１〜２Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．００１Ｍ〜２Ｍの２−アミノ−２（ハイドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）および０．１％〜３％のトリトンＸ−１００を含むことを特徴とする請求項１〜４記載の方法。
【請求項６】
前記溶解溶液が、２．５ＭのＮａＣｌ、約０．２ＭのＤＴＴ、約０．２ＭのＴｒｉｓ、約１％でトリトンＸ−１００を含みかつ約７．５のｐＨを有することを特徴とする請求項１〜５記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ変性溶液が酸性であることを特徴とする請求項１〜６記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ変性溶液が、塩酸、酢酸、硝酸群またはこれらの混合物類から選択した酸を含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡ変性溶液が塩酸を含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記段階ａ）およびｂ）の後にサンプル染色段階があることを特徴とする請求項１〜９記載の方法。
【請求項１１】
前記染色がライト（Ｗｒｉｇｈｔ）タイプ溶液により行われることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記精子を含むサンプルが、懸濁液に類似の媒体、好適にはミクロゲル中に含まれることを特徴とする請求項１〜１１記載の方法。
【請求項１３】
前記精子を含むサンプルがアガロースミクロゲル中に含まれることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
動物精子の品質を評価するためのキットであって、
ａ）ＤＮＡ変性溶液と、
ｂ）核たんぱく質類を抽出するための溶解溶液と、
を含み、前記溶解溶液は、たんぱく質変性界面活性剤を含まず、必然的に前記精子の尾部を破壊しないことを特徴とするキット。
【請求項１５】
前記溶解溶液が、１Ｍ〜３Ｍの塩化ナトリウム、０．００１Ｍ〜２Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．００１Ｍ〜２Ｍの２−アミノ−２（ハイドロキシメチル）−１，３プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）および０．１％〜３％のトリトンＸ−１００を含むことを特徴とする請求項１４記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に生物繁殖に関連する保健部門において適用分野を有し、特に、それは、動物における精液の品質（ｑｕａｌｉｔｙ）の決定のための操作類と方法類に関する。
【背景技術】
【０００２】
西欧諸国における受精年齢の男性の６％が、現在、正常な生殖を妨げるなんらかの疾病を有している。世界保健機構（ＷＨＯ）は、この影響に対して、国際的環境において精液の品質分析を標準化する一連の実験操作をひとつのプロトコールにまとめている。これらの研究では、ある機能試験の評価や精液の生化学的および酵素的パラメータの決定により補足しながら精子の濃度、形態および運動性を決定することを中心としている（ＷＨＯ，１９９９）。この試験群では、その総量と１ミリリットル当たりの精子の濃度を推定でき、男性の不妊が、不在（無精子症）または明らかな低下（精子減少）によるかどうかを射精精液中における精子の品質により診断できる。また、それにより、これらの細胞が子宮腔を横断してファローピウス管の外部サード（ｔｈｉｒｄ）にうまく到達できなくする運動性問題（精子無力症）の存在可能性が決定される。また、それは、それらの成分類（頭部、頸部、尾部）に重篤な運動性問題（奇形精子症）があるかどうかを、女性卵の効率的受精のためのその能力にこれらの変化が影響を有していることを考慮し、分析する。さらに、同様に、それは、前立腺および精嚢のような腺類の関与（感染、無発育）を探索する。最後に、ＨＯＳ試験（細胞膜のイオン透過性）またはインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）における精子の進行能力のような機能的試験により、それらは、精液の受精能力についての認識を示してくれる。最後に、これらの実験研究は、ホルモン像、精巣生検および／または核型（各人の男性または女性の遺伝的状態を決定するクロマチン試験）の決定および／または分子遺伝試験により補足しなければならないことも時にはある。
【０００３】
臨床的および実験研究にもかかわらず、不妊の原因が、不妊男性の約３０〜５０％で決定できず、それは、特発性不妊と称されている。最近、精子ＤＮＡの傷害によりこれらの症例のかなりの割合を説明できることがわかってきており（エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）ら，１９９９、ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）ら，２０００）、精子のＤＮＡ断片化の研究は、活発な研究主題となっており、専門雑誌で途切れることなく刊行物がある（エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）ら，２００２）。クロマチン異常または精子の核ＤＮＡの傷害ですらも起こりえ、さらに、精子産生時に起こるＤＮＡパッケージングにおける異常の結果でさえもありうる（セイラー（Ｓａｉｌｅｒ）ら，１９９５）。また、それらは、酸化的ストレスをもたらすフリーラジカルによってもたらされた傷害の結果であることもあり（エイトケン（Ａｉｔｋｅｎ）ら，１９９８）、それは、起こりうるアポトーシスプロセスの結果である（ゴルチカ（Ｇｏｒｃｚｙｃａ）ら，１９９３）。
【０００４】
ヒト精子のクロマチン／ＤＮＡの完全性を評価するための異なる方法がある。それらの中でも、末端トランスフェラーゼ（ＴＵＮＥＬ）またはＤＮＡポリメラーゼ（インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）  ニックトランスレーションＩＳＮＴ）のような酵素を用いてそれらに標識ヌクレオチド類を導入することによるインサイチュにおけるＤＮＡの断裂に注目が集まっている（ゴルチカ（Ｇｏｒｃｚｙｃａ）ら，１９９３）。これらの方法類は、スライドに固定した精子上で酵素類を使用することに基づいている。その理由のため、それらの効率は余り高くなく、前記酵素に標識断裂のみがアクセスでき、それにより結果の再現性が実質的に低くなる。また、前記試薬類は高価で、それゆえに、この技術は研究でのみ使用され、精液の臨床的評価にそれらを使用できない。別の技術はコメットアッセイ（ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ）ら，１９９６）である。精子を、スライド上のアガロースミクロゲル中に含め、溶解液に供し、膜とたんぱく質を抽出する。したがって、ヌクレオイド類すなわち脱たんぱく質核が得られ、その中では、ＤＮＡループが伸長により巻き戻されている。緩衝液を満たしたタンク中で前記ヌクレオイド類を電気泳動に供し、ＤＮＡ鎖がアノードに移動し、コメット像を作成し、頭部と尾部が電気泳動移動の方向にある。これらのコメットは、蛍光色素により染色し、蛍光顕微鏡下で観察する。それはかなり感度のよい試験であるが、また、実質的に高価で従来の臨床実験室で行うには複雑である。実際、それは、特に一般的でない装置、電気泳動電源およびタンク、蛍光顕微鏡、およびイメージ捕捉システムを必要としかつその分析を必要とする。これら全ての理由のため、精液の臨床研究にも適用できず、研究目的のためのみ使用される。
【０００５】
精子のＤＮＡ断片化研究のための現在の標準的技術は、エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）（ＳＣＳＡ：精子クロマチン構造アッセイ（Ｓｐｅｒｍ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｓｓａｙ）、エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）ら，１９８０、２０００、エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）およびヨースト（Ｊｏｓｔ），１９９４）によるクロマチン構造アッセイである。この技術において、懸濁液中の精子を酸変性溶液に添加する。そのＤＮＡに断裂のない精子はこの酸変性に対して耐性であり、二重鎖ＤＮＡのままである。しかし、断片化ＤＮＡを有する精子は、それ自身がＤＮＡを変性させ、一重鎖ＤＮＡに変換される。次にそれらをアクリジンオレンジで染色する。この染色物質は、二重鎖ＤＮＡに結合すると緑色の蛍光を発する。しかし一重鎖の変性ＤＮＡを有する精子中において、この蛍光色素は、赤色蛍光を発する。変性ＤＮＡを有する精子を、フローサイトメトリを用いて定量し、両タイプの蛍光を識別する。ＳＣＳＡは広い臨床範囲を有する技術であり、多数の患者で評価されている。このシステムを用いて、断片化ＤＮＡを有する精子を３０％以上個人が有すると、臨月にいたる妊娠確率は、１％未満であり、これは、自然の受精ならびに補助生殖にも適用される（エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）ら，１９９９、ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）ら，２０００）。
【０００６】
断片化ＤＮＡを有する精子の百分率は、個人の異なる精子産生サイクルにおいてほぼ一定であるが、外来性の因子により、または例えばインフルエンザのような高い発熱性エピソード後に変動することもある（エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）ら，２０００）。このように、連続的研究を行い、低レベルの断片化しか有していないサンプルを選択し、その後、補助生殖技術において使用する。液体窒素中で精液サンプルを凍結させてもＤＮＡ断片化のレベルが変化しないので、この試験を凍結サンプルで行うこともでき、後日、授精、ＩＶＦ（インビトロ受精）またはＩＣＳＩ（細胞質間精子注入）に使用できる。これは、患者および研究室にとって非常に操作上有効である。
【０００７】
ＳＣＳＡ技術はすばらしく、再現性も高いが、高価なシステムであり、実施が難しく、日常的ラボラトリにとって非常にアクセスしやすいということはない（デ・ヨンゲ（Ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ），２００２）。この理由のため、精子ＤＮＡの品質は、不妊研究で臨床的価値が確認されているにもかかわらずまだ日常的に評価されていない。
【０００８】
最近、我々の研究グループは、ヒト精子のクロマチンをインサイチュで分散させることができる技術を予備的に記載し、クロマチンを分散できない精子が断片化ＤＮＡを含んでいることを明らかにした（フェルナンデス，Ｊ．Ｌ．（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．Ｌ．）ら，ジャーナル・オブ・アンドロロジィ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ），２００３年、２４巻、第１号，ｐｐ．５９−６６、「精子ＤＮＡ断片化決定のための簡易方法（Ｔｈｅ  Ｓｐｅｒｍ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  Ｔｅｓｔ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」）。この方法を用いて、精液サンプルをアガロースミクロゲル中で順次、酸変性溶液、２種の溶解溶液類および洗浄液で処理し、それらを乾燥させ、その後染色できるようにする。この技術は精子クロマチン分散（ＳＣＤ）試験と称され、極めて強い試薬類と条件を用いる。上述の方法は、一定の結果を生じず、繰り返し評価が困難となる。一方、得られたイメージの品質およびコントラストならびに結果の再現性は、商業的に適用できるほど十分に良好ではない。また、精子構造が影響を受け、かつ、尾部はサンプル中で可視できない。精子はサンプル中の他の細胞とは簡単には識別できないので、この問題は重大であり、傷害クロマチン／ＤＮＡを有する精子の数を数える際それに伴ってエラーが生じる。
【０００９】
したがって、動物における精液の品質研究に日常的にしかも簡単に使用でき、かつ特にクロマチン／ＤＮＡの完全性評価に使用できる信頼性あるプロセスが今もって必要とされている。このプロセスはすばらしく、実施が容易で、安価でしかも基本的研究室でアクセス可能でなければならない。それは、これまでにいわれてきた問題を解決しなければならない。それはまた、実験室間で一定の結果をもたらし、しかも、自動化に適していなければならない。
【００１０】
【非特許文献１】世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ），「ＷＨＯ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｍｅｎ  ａｎｄ  ｓｅｍｅｎ−ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｍｕｃｕｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ」，第４版，ケンブリッジ・ユニバーシティ・プレス（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ），ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ），英国（ＵＫ），１９９９年
【非特許文献２】エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）  ＤＰ，ヨースト（Ｊｏｓｔ）  ＬＫ，マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）  Ｄ，ジナマン（Ｚｉｎａｍａｎ）  ＭＪ，クレッグ（Ｃｌｅｇｇ）  Ｅ，パービス（Ｐｕｒｖｉｓ）  Ｋ，デ・アンゲリス（ｄｅ  Ａｎｇｅｌｉｓ）  Ｐ，クラウセン（Ｃｌａｕｓｓｅｎ）  ＯＰ，「Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｅｒｍ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｓｓａｙ  ａｓ  ａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｃｌｉｎｉｃ」，ヒューマン・リプロダクション（Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．），１９９９年，１４巻，ｐｐ．１０３９−１０４９
【非特許文献３】ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）  ＫＬ，デヨング（ＤｅＪｏｎｇｅ）  Ｃ，バルネス（Ｂａｒｎｅｓ）  Ａ，ヨースト（Ｊｏｓｔ）  Ｌ，およびエベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）  ＤＰ，「Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＡＲＴ）  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｎｄ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ａｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｒｍ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｓｓａｙ（ＳＣＳＡ）」，ヒューマン・リプロダクション（Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．），２０００年，１５巻，ｐｐ．１７１７−１７２２
【非特許文献４】エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）  ＤＰ，ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）  ＮＪ，ヨースト（Ｊｏｓｔ）  ＬＫ，「Ｓｐｅｒｍ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｓｓａｙ:ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｌｅ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，ジャーナル・オブ・アンドロロジィ（Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ），２００２年，２３巻，ｐｐ．２５−４３
【非特許文献５】セイラー（Ｓａｉｌｅｒ）  ＢＬ，ヨースト（Ｊｏｓｔ）  ＬＫ，エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）  ＤＰ，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ａｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ」，ジャーナル・オブ・アンドロロジィ（Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ．），１９９５年，１６巻，ｐｐ．８０−８７
【非特許文献６】エイトケン（Ａｉｔｋｅｎ）  ＲＪ，ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）  Ｅ，ハーキス（Ｈａｒｋｉｓｓ）  Ｄ，「Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  １５  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ」，バイオロジ・オブ・リプロダクション（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．），１９９８年，５９巻，ｐｐ．１０３７−１０４６
【非特許文献７】ゴルチカ（Ｇｏｒｃｚｙｃａ）  Ｗ，ゴング（Ｇｏｎｇ）  Ｊ，ダージンキービックス（Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ）  Ｚ，「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｎｉｃｋ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ」，キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），１９９３年，５３巻，ｐｐ．９４５−９５１
【非特許文献８】ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ）  ＣＭ，ルイス（Ｌｅｗｉｓ）  ＳＥ，マクケルビー−マーチン（ＭｃＫｅｌｖｅｙ−Ｍａｒｔｉｎ）  ＶＪ，トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）  Ｗ，「Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｂａｓｅｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ  ｆｒｏｍ  ｆｅｒｔｉｌｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｅ  ｍｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｏｍｅｔ  ａｓｓａｙ」，モレキュラ・ヒューマン・リプロダクション（Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．），１９９６年，２巻，ｐｐ．６１３−６１９
【非特許文献９】エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）  ＤＰ，ダージンキービックス（Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ）  Ｚ，およびメラメド（Ｍｅｌａｍｅｄ），ＭＲ，「Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｅｒｍ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｔｏ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ」，サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９８０年，２１０巻，ｐｐ．１１３１−１１３３
【非特許文献１０】エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）  ＤＰ，ヨースト（Ｊｏｓｔ）  ＬＫ，コルゼット（Ｃｏｒｚｅｔｔ）  Ｍ，バルホーン（Ｂａｌｈｏｒｎ）  Ｒ，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｎ  ｅｐｉｓｏｄｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｆｅｖｅｒ:ａ  ｃａｓｅ  ｓｔｕｄｙ」，ジャーナル・オブ・アンドロロジィ（Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．），２０００年，２１巻，ｐｐ．７３９−７４６
【非特許文献１１】エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）  ＤＰおよびヨースト（Ｊｏｓｔ）  ＬＫ，「Ｓｐｅｒｍ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｓｓａｙ：ＤＮＡ  ｄｅｎａｔｕｒａｂｉｌｉｔｙ」，Ｉｎ：ダージンキービックス（Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ）  Ｚ，ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）  ＪＰ，クリスマン（Ｃｒｉｓｓｍａｎ）  ＨＡ．著，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２巻，フロウ  サイトメトリィ（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）」，第２版，オーランド（Ｏｒｌａｎｄｏ），フロリダ（Ｆｌａ），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），１９９４年，４２巻，ｐｐ．１５９−１７６
【非特許文献１２】デ・ヨンゲ（Ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ）  Ｃ，「Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｓｐｅｒｍ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＤＮＡ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ」，ヒューマン・ファーティリティ（Ｈｕｍ．Ｆｅｒｔｉｌ．），２００２年，５巻，ｐｐ．５１−５３
【非特許文献１３】フェルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）  ＪＬ，ムリエル（Ｍｕｒｉｅｌ）  Ｌ，リベロ（Ｒｉｖｅｒｏ）  ＭＴ，ゴヤネス（Ｇｏｙａｎｅｓ）  Ｙ，バスケス（Ｖａｚｑｕｅｚ）  Ｒ，アルバレス（Ａｌｖａｒｅｚ）  ＪＧ，「Ｔｈｅ  ｓｐｅｒｍ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｔｅｓｔ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ」，ジャーナル・オブ・アンドロロジィ（Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ），２００３年，２４巻，ｐｐ．５９−６６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、動物における精子細胞のクロマチン／ＤＮＡの完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を評価するための迅速かつ精密な方法で、それは、いかなる分析的、獣医学的またはヒト受精に特化した研究室の日常的活動にも取り入れることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明の目的は、動物の精子のクロマチン／ＤＮＡの完全性を評価する方法であって、
ａ）精子を含むサンプルをＤＮＡ変性溶液で処理する段階と、
ｂ）核たんぱく質類を抽出するための溶解溶液（ａ  ｌｙｓｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）により一回処理する段階（ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｔｅｐ）と、
ｃ）精子のクロマチン／ＤＮＡの完全性を評価する段階と、
を含み、前記溶解溶液は、たんぱく質変性界面活性剤を含まず、必然的に精子の尾部を破壊しないことを特徴とする。
【００１３】
一般的に、段階ａ）がｂ）より前であることが好ましい。
【００１４】
記載されているように、溶解溶液の選択が、本発明の目的を達成するために重要である。使用してはいけないたんぱく質変性界面活性剤には、陰イオン性および陽イオン性界面活性剤類があり、例えば、ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホネート、グリコール酸脱水塩等がある。それらは、膜類を強く破壊する界面活性剤類であり、溶解効果を有しており、同時に、たんぱく質類の変性において活性である。それらは、たんぱく質類を移動させる変性電気泳動で使用され、完全変性を確保する（３次元構造の喪失）。それらは、好適にはグラム陽性細菌類で、酸ｐＨで特に活性である。界面活性剤内部におけるそれらの活性は、高い。
【００１５】
本発明の方法において、好適には、非イオン性非たんぱく質変性界面活性剤が使用され、すなわち、たんぱく質類を可溶化させるが変性はさせない界面活性剤である。それらの中でも、トクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド（ｂｉｇＣＨＡＰ）、Ｂｒｉｊ（ｒ）３５Ｐ、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ジギトニン、ドデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、分枝オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール（イゲパル（Ｉｇｅｐａｌ）ＣＡ−６３０）、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０，Ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミン、スパン（Ｓｐａｎ）２０溶液、ポリソルベート（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）２０（トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０）が好適である。トリトンＸ−１００は、それがもたらす優れた結果と簡単に入手可能であることから、特に優れている。
【００１６】
前記溶解溶液は変性させずに溶解プロセスを促進するための十分なイオン強度を有しているのが、好適である。我々は、有効な溶液は、１Ｍ〜３Ｍの塩化ナトリウム、０．００１Ｍ〜２Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．００１Ｍ〜２Ｍの２−アミノ−２（ハイドロキシメチル）−１，３プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）および０．１％〜３％のトリトンＸ−１００を含むものであることを確認した。特に適しているのは、約２．５ＭのＮａＣｌ、約０．２ＭのＤＴＴ、約０．２ＭのＴｒｉｓ、約１％トリトンＸ−１００を含みかつ約７．５のｐＨを有する溶液である。
【００１７】
ＤＮＡの変性溶液は、好適には酸であり、例えば、塩酸、酢酸、硝酸群またはこれらの混合物類から選択した酸である。好適には、それは、塩酸溶液である。
【００１８】
本発明の方法は、段階ａ）およびｂ）の後に精子のクロマチン／ＤＮＡの完全性評価段階を有する。この評価にはいくつか別法があるが、目で見えることが望ましい。この目的のため、前記操作は、好適には、段階ａ）およびｂ）の後にサンプル染色段階を含む。良好な結果をもたらし、精子の尾部を見えるようにし、かつ特徴的なハロ（ｈａｌｏ）が形成されるようにする染色は、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）のそれに類似の溶液である。
【００１９】
好適なバリエーションにおいて、前記精子は、好適にはミクロゲル状であり特にアガロースミクロゲル状である懸濁液に類似の媒体に含ませる。
【００２０】
本発明はまた、動物精子の品質を評価するためのキットに関し、それは、
ａ）ＤＮＡ変性溶液と、
ｂ）核たんぱく質類抽出のための溶解溶液と、
を含み、前記溶解溶液は、たんぱく質変性界面活性剤を含まず、必然的に精子の尾部を破壊しないことを特徴とする。前記キットは、述べたばかりの本発明による操作の実行を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の操作およびキットは、詳細に説明するであろうが、断片化ＤＮＡを有する精子の頻度決定のための簡易でかつ信頼できるシステムである。本方法論は、男性学研究室や補助生殖クリニックおよび動物繁殖研究室において適用できる。また、分析結果に変化をもたらすことなく、サンプルを凍結してそれらを必要に応じて分析できるので、それは、非常に有用なシステムである。
【００２２】
動物由来のクロマチン／ＤＮＡおよび精子の完全性を評価できる本発明の操作は、
ａ）ＤＮＡ変性溶液による精子含有サンプルの処理段階と、
ｂ）核たんぱく質類を抽出するための溶解溶液による１回処理段階であって、前記溶解溶液はたんぱく質変性界面活性剤を含まず必然的に精子の尾部を破壊しない段階と、
ｃ）精子のクロマチン／ＤＮＡの完全性の評価段階と、
を含む。
【００２３】
従来技術の状態に関して、および具体的にはフェルナンデス，Ｊ．Ｌ．（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．Ｌ．）ら、ジャーナル・オブ・アンドロロジィ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ）、２００３年、２４巻、第１号、ｐｐ．５９−６６に関して、本発明の操作の主な違いは、基本的に溶解および染色の分野にある。したがって、２つの連続的ものの代わりに１つの溶解溶液を使用する。前記組成は、ＳＤＳ（陰イオン性たんぱく質変性界面活性剤）またはＥＤＴＡ（キレート剤）を含まないので、異なる。それはまた、トリトンＸ−１００のような実質的に穏やかで、中性で非変性界面活性剤を取り込むことができる。
【００２４】
技術的には、これらの差異は、精子の尾部を保存することにつながる。それらの検出は、ヌクレオイド類のイメージが現実的に精子から由来しているか、または例えば尿生殖器由来の脱扁平細胞、炎症性細胞、血液等のような存在しうる他の細胞タイプに対応しているかを識別できる欠くべからざるデータ片であるので、重要な改善点である。はるかに強度の劣る溶解を用いて、ならびにＳＤＳ使用を排除して、この持続性が達成される。
【００２５】
また、より温和な溶解は、クロマチンストランドの折りたたみ解除を成し遂げ、頭部またはコアの形態をよりよく保存し、さらに、高密度のクロマチン物質を有する分散ハロを得て、その結果、より染色が強度になる。結果として、異なる大きさのハロのコントラストおよび視覚化がはるかによく改善され、特にライト溶液を使用するとそのようになる。
【００２６】
別の重要な利点としては、ＳＤＳのようなたんぱく質変性界面活性剤がないことで、本文に記載の技術を他の細胞性成分類を視覚化させることができる他の物と順次に使用できるようになることである。したがって、記載の方法論により、得られたヌクレオイド類について、たんぱく質類、ラミニンたんぱく質タイプ類および他の核たんぱく質類の免疫検出方法類、ＤＮＡ伸張に伴う核マトリックス会合ＲＮＡの検出が適用でき、核構造の品質が可能な限り最大限維持される。これは、精子の核構造についてのある研究課題において重要である。
【００２７】
別の付加的利点とは、少量の試薬類しか使用しないことであり、その結果、経済的コストも少なくなる。例えば、ＤＴＴは特に高価であり、実施例における濃度の低下（論文に記載のそれの４分の１）は、コストにとって重要である。
【００２８】
これまで述べた全てについて述べられることは、特許操作が、従来技術状態に関して、精子のヌクレオイド類についてはるかに改善されかつ再現性のすぐれた結果が得られることである。前記ヌクレオイド類が成熟精子から由来するかまたは他の細胞タイプから由来するか識別でき、ハロの大きさの分類がはるかに精密でかつ信頼できる。結果として、特許操作により、サンプルのＤＮＡ断片化レベルの決定がはるかに信頼できるようになり、そのことは、それが低コストで日常的にしかも簡便に使用できることを意味している。その適用は、異なる実験室、臨床状況およびヒトサンプルについてならびに動物サンプルの研究のための獣医学実験室に関連している。このことは、それが患者に対する可能な臨床適用を有するテストであるので、非常に重要である。
【００２９】
サンプル処理の段階の順序はいかなる順番でもよく、最初にＤＮＡ変性溶液により、次に溶解溶液などによる処理段階が続くが、その逆でも良い。しかし、先にサンプルをＤＮＡ変性溶液で処理し、その後溶解溶液で処理するのが望ましく、そのほうがよい結果が得られるからである。別のバリエーション（溶解の後にＤＮＡ変性が続く）では、断片化ＤＮＡを有する精子が異なるように挙動する。この場合、それらは、クロマチン／ＤＮＡの断片を分散させ、大きいサイズのハロ類を生じる。ハロの大きさの識別はあまり精密ではないものの、溶解溶液による１回処理だけでこの挙動を観察するには十分である。
【００３０】
本発明の操作を、いくつかのバリエーションならびに任意の段階とともに下記で詳細に記載する。当該技術の専門家は、記載の基本的側面が維持されれば現実化にはいくつか方法があり他の可能性もあることを理解するであろう。
【００３１】
第１段階は、サンプル調製である。それは、この分野に一般的な操作を用いて得られ、サンプル中の精子の濃度を決定する。この分析に適した濃度は、１ミリリットル当たり０．１〜２０００万細胞の間で変動する。もしサンプルが極めて濃縮されているならば、それを培養培地で希釈するかまたはリン酸緩衝液／生理食塩水（ＰＢＳ）等の溶液で希釈することによって、適当な濃度に調整する。
【００３２】
精液サンプルを、本発明の操作に従い、その処理のために支持体上に置き、その評価を容易にせねばならない。これは、好適には、標準的なアガロースのフィルムでカバーできるガラススライドである。このため、０．２％〜１％の間の標準的アガロース溶液を、コプリン瓶等の中の精製水で調製する。それにプラスチック製のカバーをして、マイクロウェーブオーブンに入れる。このマイクロウェーブオーブンを３００Ｗ〜１０００Ｗ、例えば５００Ｗの電源にセットし、容器を撹拌して、アガロースの溶解を向上させ、それが沸騰するまでそのままにしておく。この操作は、恒温浴を用いて行うことができる。アガロース溶液が完全に透明になったら、次に、それを１０ｍｌと２５０ｍｌの間の垂直容器に入れて調製するであろう。これらの受け皿は、浴中であらかじめ、６０℃〜１００℃、例えば７０℃に加熱して、アガロース溶液を液体状態に保持する。
【００３３】
アガロース溶液にスライドを導入する前に、これらを布でこすり、あるかもしれない不純物を取り除き、清浄にする。スライドを垂直に沈め（ｓｕｂｍｅｒｇｅ）、それらをピンセットで氷結領域に、例えば１〜６０秒間保持して回収し、それらを戻してスライド上に均質フィルムを形成させるまで１〜１０回さらに沈める。これらを、例えばガラスまたは金属のような平滑表面に水平に置き、１℃〜１５℃の間まで、好適には４℃に冷却する。スライドを有するこのプレートを、アガロースがスライド表面でゲル化するのを確認されるまで、４℃の冷蔵庫に３０分間入れる。トレイを冷蔵庫から取り出し、プレートに接触していたスライド表面を吸い取り紙で清浄にする。次に、アガロースが完全に乾燥しガラスに固着した薄いフィルムが形成されるまで、スライドを水平に温度範囲３７℃〜１００℃の乾燥チェンバーに入れる。このように処理したスライドをすぐに用いるか、または数ヶ月間、常温（室温）で十分に密封したボックス内部に保存する。
【００３４】
精子を含むサンプルの処理を容易にするため、これを、例えばアガロースミクロゲルのような懸濁液に類似の特徴を有する媒体に入れることもできる。この場合、精製水中０．５％〜２％の濃度で低融点／低ゲル化アガロースの溶液を調製する。この寒天のゲル化は、マイクロウェーブオーブンまたは恒温浴で行われ、次に高温浴または乾燥チェンバー中に入れた試験管中で３０℃〜３７℃に保持する。精液とアガロール溶液を注意深くエッペンドルフ試験管等で混合し、後者が濃度０．３％〜１％の間にあるようにする。例えば、アガロース溶液７０マイクロリットル＋サンプル３０マイクロリットルである。アガロース溶液は、細胞が破壊されないように３７℃を超えないようにすることが重要である。
【００３５】
最終的に、サンプルを支持体上に置き、カバースライドをガラスまたは金属の平滑で冷たい表面上に置き、温度は１℃〜１５℃の間で変動させ、気泡が形成されないようにする。マイクロピペットで５〜２００マイクロリットルの混合物の液滴を置くのが望ましく、液滴上にカバースリップを置く。念のため、各サンプルを二重に処理するのが望ましく、本法を適用する都度、対照サンプルを使用するのが望ましい。アガロースの適切なゲル化がもたらされるまで、スライド付のプレートを４℃の冷蔵庫に２〜３０分間入れる。いったんゲル化が起こると、次にスライドを非常にスムーズにこの冷蔵庫から取り出し、ミクロゲルが破壊されないようにする。
【００３６】
簡便かつ反復取り扱いのため、いったんサンプルを適当に調製すると、それらを次に本発明の操作によりＤＮＡ変性溶液による処理段階および核たんぱく質抽出のための溶解段階により、処理する。
【００３７】
好適なバリエーションにおいて、サンプルを有するスライドを、最初に、変性溶液を含む受け皿に水平位置で置く。ＤＮＡ変性溶液は、低濃度の酢酸、硝酸、硫酸溶液のような酸であるか、または例えば水酸化ナトリウム、水酸化バリウム、水酸化カリウム溶液のようなアルカリであることができる。好適なバリエーションにおいて、塩酸溶液は、０．０１Ｎ〜０．５Ｎ、好適には０．１Ｎ〜０．３Ｎの間の濃度で使用でき、特に、濃度約０．２Ｎが好適である。この溶液を試験実施と同一日に調製するのが望ましく、前記スライドを１℃〜３７℃、好適には１８℃〜２５℃、好適には２０〜２２℃の温度で１〜１５分間、ＤＮＡ変性溶液中でインキュベーションし続ける。
【００３８】
いったんこのプロセス部分が完了すれば、次にサンプルの溶解を、十分に緩和で精子の尾部を破壊しない単一の（ｓｉｎｇｌｅ）溶解溶液で行う。このため、それを含む別の容器中に各スライドを水平方向に沈める。
【００３９】
先にも述べたように、前記溶解溶液を、それが、クロマチンストランドの折りたたみ構造解除を達成し、頭部の形態をよりよく保存し、それによりクロマチン物質が高密度の特徴的ハロ形成を保存するように、選択する。また、それは、精子の尾部の保存のために十分に緩和でなければならない。これは、強い界面活性剤類を確保することによって達成され、たんぱく質変性剤類を避ける。さらに、イオン濃度の制御は、また、この効果が調節されるようにできる。
【００４０】
好適なバリエーションにおいて、この溶液は、１Ｍ〜３Ｍの、好適には２Ｍ〜３Ｍの間の塩化ナトリウム、０．００１Ｍ〜２Ｍの、好適には０．０１Ｍ〜０．８Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．００１Ｍ〜２Ｍの、好適には０．０１Ｍ〜０．４Ｍの２−アミノ−２−（ハイドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）、および０．１％〜３％の、好適には０．５％〜１．５％のトリトンＸ−１００から構成されている。この溶液は、６．５〜８．５の、好適には７〜７．５のｐＨに調整される。
【００４１】
他の別の溶解溶液類もあり、または、前記溶液の濃度および時間およびインキュベーション温度は、その機能的特徴が維持される限りにおいて変化させることができる。また、ＤＴＴに対する別法として、ベータ−メルカプトエタノールのような化合物類および他の還元剤類がある。Ｔｒｉｓに対する代替品として、Ｈｅｐｅｓ，Ｍｏｐｓ、およびＰｉｐｅｓのような他の緩衝溶液類も使用できる。トリトンＸ−１００に対する代替として、他の中性界面活性剤類も上記に述べたように使用できる。
【００４２】
使用した溶液とサンプルタイプに応じて、前記調製物を、溶解溶液中で１〜６０分間、好適には１５〜３５分間インキュベーションするが、約２５分の時間が特に好適であり、１℃〜３７℃の温度、好適には１８℃〜２５℃、２０℃〜２２℃の温度は特に好適である。
【００４３】
先に述べたプロセス類に対する全くの別物として、変性溶液および溶解溶液中におけるインキュベーション順序を逆にすることもできる。精子のクロマチンに及ぼす効果により、傷害クロマチン／ＤＮＡを有する精子を残りの精子から識別できるようになる。得られた差の詳細は、実施例６に述べるであろう。
【００４４】
ＤＮＡ変性溶液によりおよび溶解溶液により処理した後、前記調製物を洗浄し、これらの溶液類の残りを除去する。このため、可能な限り温和な洗浄溶液を用い、キレート剤類または界面活性剤類を避ける。例えば、それらは、精製水を豊富に含むかまたは緩衝液または生理食塩水を含む受け皿中に水平方向に１〜６０分間沈めておく。
【００４５】
サンプルを次に脱水する。このため、濃度を増加させたアルコールを使用する。例えば、前記スライドを取り上げ、５％〜１００％の間で濃度を増加させた一連のエタノールを有する受け皿中にそれぞれ３０秒間〜６０分間、水平方向に沈め、前記調製物をその都度空気中で乾燥させておく。一連のエタノールによるインキュベーションの別法として、前記調製物をメタノールのような異なるアルコール中でインキュベーションすることによって脱水でき、または、風乾させるかまたは乾燥チェンバー中で乾燥させる。
【００４６】
いったん乾燥したら、すでに処理した精液サンプルを含むスライドを、常温（室温）で何ヶ月も保存ボックス中で保存できる。これは、本発明による処理プロセスと、精子のクロマチン／ＤＮＡの完全性評価の次の段階とを分離するのに役立つ。保存により、同一個人からの数種のサンプルを異なる時間間隔で繰り返し評価できる。
【００４７】
いったんサンプルを本発明により処理した後、それらを評価段階に渡す。先に述べたように精子のクロマチン／ＤＮＡの完全性評価には、いくつかの可能なプロセスがある。利点は、本発明により処理したサンプルがはるかに明らかな視覚化ハロを有しており、精子の構造が維持され、特に尾部の完全性が維持され、それらにより他の細胞タイプと明確に識別できるようにしている。
【００４８】
好適なバリエーションにおいて、サンプルに染色を行い、肉眼による評価を容易にする。適切な染色条件を選択することで高品質のイメージを得て、評価結果は非常に一致することになる。従来のクリアフィールド顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用するかどうかにより、染色には数種の手段がある。
【００４９】
＜クリアフィールド顕微鏡下で観察するための染色＞
この場合、使用できる染色には、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）、ギムザ（Ｇｉｅｍｓａ）、オルセイン（Ｏｒｃｅｉｎ）、シッフ（Ｓｃｈｉｆｆ）試薬、酢酸カーマイン、チアジンタイプ類およびロマノフスキ（Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｙ）タイプ類の混合物類または上述の誘導体類がある（ＡＴ  サムナー（ＡＴ  Ｓｕｍｎｅｒ）によるクロモゾームバンディング（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｂａｎｄｉｎｇ）、ｐｐ．９０−９１を参照）。
【００５０】
ライトのそれのような染色がサンプルのより強い染色および特にハロ類により、好適である。これらの染色により、異なる大きさのハロ類のコントラストおよび視覚的識別が有意に改善される。それらはまた、低コストといかなるタイプの実験室でも容易に入手できるという利点を有している。それらの使用により尾部を視覚化でき、これらは通常、蛍光顕微鏡に使用される蛍光色素によるＤＮＡ染色で視覚化できない。この染色が適切な染色レベル達成のために容易に取り扱いできることを強調するのは重要で、この事実は、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋまたは類似のものでは可能ではない。
【００５１】
ジャーナル・オブ・アンドロロジィ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ），２００３年、２４巻、第１号、ｐｐ５９−６６においてフェルナンデス，Ｊ．Ｌ．（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．Ｌ．）らによって記載されたＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋのような他の染色はかなり弱く、バックグランドに関してはハロの適切なコントラストを達成しない。その結果、ハロが非常に分散していると、その周辺概略を視覚化するのは通常難しく、時には小さなハロについて間違いが生じ、したがって、未改変ＤＮＡを含む精子に対して断片化カテゴリーを振り分けてしまう。すなわち、前記刊行物の操作は、断片化レベルを過剰推定してしまう傾向があり、特にクリアフィールド染色においてその傾向がある。これは、個人に対して適用可能性のある試験については実質的におかしい。したがって、この改良が前記技術の信頼性にすばらしい関連性を有していることは明らかである。
【００５２】
サンプル染色のバリエーションにおいて、ライト溶液（メルク（Ｍｅｒｃｋ）  １．０１３８３．０５００）は例えば、ｐＨ６．８８のリン酸緩衝液（メルク（Ｍｅｒｃｋ）  １．０７９２４．１０００）と１：３０〜３０：１（ｖ／ｖ）で混合する。染色層を水平に置き、それは、乾燥ミクロゲルをカバーしなければならない。最適コントラスト達成のための染色時間は、３０秒から６０分の間で変動する。染色層に時々風を吹き付けることを薦める。過剰の染色をデカントし、スライドを水道水で静かに洗浄し風乾する。もし染色が過剰であるならば、同一強度で水中で洗浄する。別の可能性は、エタノール中で脱染色し、乾燥させ、再度染色することである。もし染色が特にクロマチンの分散ハロ領域で弱いならば、再度ライト溶液で直接染色する。
【００５３】
別法として、ヘマカラー２（Ｈｅｍａｃｏｌｏｒ  ２）（メルク（Ｍｅｒｃｋ）  １．１１９５６）およびヘマカラー３（メルク（Ｍｅｒｃｋ）  １．１１９５７）、ギムザ（Ｇｉｅｍｓａ）、同一族の他の染色溶液のような他の染色を、用いることができる。
【００５４】
＜蛍光顕微鏡下観察のための染色＞
蛍光フィルター類の入手可能性に応じて、サンプルを抗退色媒体（例えば、ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）  Ｈ−１０００）中でＤＡＰＩタイプのＤＮＡに特異的な蛍光色素類、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）  ３３２５８、エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド等で染色できる。
【００５５】
もし永久調製物を望むならば、処理した染色スライド類を装備媒体（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）中に含めることができる（例えば、エンテラン（Ｅｎｔｅｌｌａｎ），メルク（Ｍｅｒｃｋ）  １．０７９６１）。
【００５６】
最後に、精子のクロマチン／ＤＮＡの完全性を、細胞タイプの識別に進むことによって評価する。すでに述べたように、本発明の操作は、従来技術状態に関してこの評価をはるかに容易にする。
【００５７】
得られたイメージは、直接視覚分析によるか、または顕微鏡台座に結合させたアナログまたはデジタルカメラ類を用いて得られたデジタル化イメージ分析ソフトウェアを適用することによって、調べることができる。
【００５８】
最初に、サンプル当たり最低でも５００個の精子の研究を薦めるが、下記の基本的基準を採用する（図１および図２を参照）。
１．クロマチン分散ハロを有していない精子（図１）。
２．クロマチン分散ハロを有していない精子で分解。ハロを示さないものは、顆粒に断片化した頭部を有するかまたは非常に弱い染色を示す（図１）。
３．小さいサイズの分散ハロを有する精子。ハロの厚みは、コアの小直径の１／３未満かまたはそれに等しい（図１）。
４．中等度の大きさの分散ハロを有する精子。ハロの厚みは、コアの小直径の１／３より大きく、コアの直径未満である（図１）。
５．大きいサイズの分散ハロを有する精子。ハロがコアの小直径より大きいかそれと等しい精子（図１）。
６．その他。精子に属しない細胞核。それらを識別する形態的特徴のひとつは、尾部がないことである。
【００５９】
断片ＤＮＡを有する精子は、クロマチン分散ハロ１を有していないもの、クロマチン分散ハロを有していないで分解して存在するもの２、および小さいサイズの分散ハロを有するもの３としてみなすことができる。中位の大きさまたは大きいサイズのクロマチン分散ハロとＤＮＡ断片化を有する精子は、ＤＢＤ−ＦＩＳＨ技術（ＤＮＡ断裂検出−蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＤＮＡ  Ｂｒｅａｋａｇｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、フェルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）ら，１９９８、２０００、２００２、フェルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）およびゴンサルベス（Ｇｏｎｓａｌｖｅｚ），２００２）を用いて得られた結果に由来する。この操作により、脱たんぱく質化してＤＮＡの制御変性に供したＤＮＡ断裂細胞核の検出と定量化ができる。この変性により断裂の末端から一重鎖ＤＮＡ部分を産生し、それらは、蛍光色素で標識した総ゲノムＤＮＡプローブを用いてインサイチュハイブリダイゼーションにより検出し、蛍光顕微鏡を用いて可視化する。細胞ＤＮＡ中、断裂レベルが高い時、ハイブリダイズしたプローブの品質が高くなりかつ観察した蛍光が高くなる。本発明に記載の方法により処理したサンプル類は、変性溶液によりＤＮＡ中に存在する断裂の起こり得る末端から産生させた一重鎖ＤＮＡを含んでいる。したがって、総ゲノムＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションの強度は、精子核中に存在する断裂の品質に関連するであろう。このようにして、我々は、ハロを有していないかまたは大きさがはるかに小さくなったハロを有するヌクレオイド類は、ＤＢＤ−ＦＩＳＨにより強い標識を示し、このことは、そのＤＮＡの強い断片化を明らかにしている（図２）ことを示した。ヌクレオイド類の残りは、このプローブにより極めて低いレベルのマーカーしか示さず、それは、クロマチン処理それ自体によるハイブリダイゼーションの深さに対応している。
【００６０】
本発明はまた、動物精子のクロマチン／ＤＮＡの完全性の評価のためのキットに関する。このキットは、ＤＮＡ変性溶液、核たんぱく質類を抽出するための溶解溶液を含み、それは、前記溶解溶液がたんぱく質変性界面活性剤を含まず、必然的に精子の尾部を破壊しないことを特徴としている。好適なＤＮＡ変性溶液類および好適な溶解溶液類は、上記に述べてある。
【００６１】
適宜、前記キットは、また、例えばアガロースによる前処理支持体ならびにサンプルを含むであろう懸濁液に類似の特徴を有する媒体の調製のための溶液を含むことができる。例えば、ミクロゲルを調製することを可能とする低ゲル化点アガロース溶液である。
【００６２】
本発明のバリエーションによるキット使用のための内容物および指示を下記に詳細に示す。
【００６３】
＜キットの内容物の説明＞
前処理スライド類＊
低ゲル化点アガロース試験管（Ａ）を含むエッペンドルフ試験管
３７％ＨＣｌを含む試験管、試験管（Ｂ）
溶解液を含む試験管類、試験管Ｃ＊。組成：２．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．２Ｍ  ＤＴＴ，０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ，１％  トリトンＸ−１００、ｐＨ７．５
変性溶液のためおよび溶解溶液のための処理受け皿
ランセット
エッペンドルフ試験管用フロート類
＊  本明細書で先に述べた調製物
【００６４】
＜必要な材料および装置＞
クリアフィールド顕微鏡または蛍光顕微鏡（浸漬対物レンズ推奨）
４℃の冷蔵庫
３７℃のインキュベーション浴
プラスチック手袋
ガラスカバースリップ（１８×１８ｍｍ、２２×２２ｍｍまたは２４×６０ｍｍ）
マイクロピペット類
インキュベーション用の４個の水平容器
精製水
７０％、９０％、１００％エタノール
【００６５】
＜使用のための指示＞
（スライド用サンプル調製）
１）フラスコＣを取り、常温で溶解溶液を入れる（２２℃）。
２）精液サンプルを培地またはＰＢＳ中で濃度５００万〜１０００万／ミリリットルに希釈する。新鮮または液体窒素中で直接凍結させたサンプルを使用できる。
【００６６】
＜アガロースミクロゲルの調製＞
３）低ゲル化点アガロースを含むエッペンドルフ試験管（試験管Ａ）を静かに垂直方向に軽くたたき、試験管の底部にアガロースを沈殿させる。
４）精製水１４０マイクロリットルを添加し、気泡形成を避け、再度懸濁させる。
５）試験管Ａをフロート中に入れ、それを栓のレベルに保ち、水中９０〜１００℃において５分間浮かせ、アガロースを溶解させる。アガロースの溶融は、これとは別にマイクロウェーブオーブンでも行うことができる。
６）フロートとともに試験管Ａを３７℃の恒温浴に移し、温度に達するまでそのまま５分間保持する。
７）精液サンプル６０マイクロリットルを試験管Ａの内容物に添加し、再度懸濁させる。
８）前処理スライドを４℃の冷表面（例えば、金属またはガラス板）に置く。
９）スライドを冷却した後、試験管Ａの細胞懸濁液を沈殿させ、ガラスカバースリップをおき、気泡形成を避ける。１１、１７および５０マイクロリットルの液滴をそれぞれ、１８×１８ｍｍ、２２×２２ｍｍまたは２４×６０ｍｍのカバースリップに対して置く。
１０）冷蔵庫にスライド付き冷シートを置き、サンプルがゲルとなるまで５分間そのままにしておく。
【００６７】
＜サンプル処理＞
１１）変性溶液を調製する。このため、試験管Ｂの内容物８０マイクロリットルを精製水１０マイクロリットルに添加し、混合し緑色のボックスに入れる。
１２）カバースリップを取り、それらをゆっくりとスライドさせ、すぐにスライドを水平に変性溶液に入れ、常温（２２℃）で７分間、インキュベーションさせる。
１３）ランセットによりスライドを、手袋を使用して持ち上げる。それらを水平に保持し、溶解液１０ｍｌを含む白色受け皿にそれらを水平に入れる（試験管Ｃを温度にする）。２５分間インキュベーションする。
１４）スライドを持ち上げ、それらを多量の精製水を含む容器に水平に入れ、溶解溶液を洗浄除去する。５分間そのままにする。
１５）７０％エタノール（２分間）、次に９０％エタノール（２分間）、最後に１００％エタノール（２分間）を有する容器に前記スライドを水平に入れる。
１６）風乾させる。いったん処理したスライドが乾燥したら、それらを常温（室温）で何ヶ月もファイリングキャビネット中に保存できる。
【００６８】
＜サンプルの染色＞
（クリアフィールド顕微鏡下での観察のための染色）
ライト溶液とリン酸緩衝液を混合（１：１）し、染色層を水平に置き、それは、乾燥ミクロゲルをカバーするであろう。５〜１０分間染色するままにし、時々その上に風を送る。デカントし、水道水で静かに洗浄し、乾燥させる。染色が過剰であるならば、エタノール中で脱色し、乾燥させ再度染色することができる。もし染色が特にハロ内で弱いならば、それを再度、より多くのライト溶液で染色することができる。
【００６９】
別の可能性として、ヘマカラー２溶液（メルク（Ｍｅｒｃｋ）  １．１１９５６）を有するコプリンジャー（Ｃｏｐｌｉｎ  ｊａｒ）中で垂直に５分間インキュベーションし、１０秒間垂直方向で水切りをし、次にヘマカラー３溶液（メルク（Ｍｅｒｃｋ）  １．１１９５７）を有する別のコプリンジャー中で垂直に５分間インキュベーションする。最後に、精製水中でゆっくりと洗浄し、乾燥させる。もし永久調製物を望むならば、これをエンテラン（Ｅｎｔｅｌｌａｎ）に載せることができる。
【００７０】
（蛍光顕微鏡下での観察用染色）
蛍光フィルターの変化に応じて、サンプルをＤＡＰＩタイプのＤＮＡに特異的な蛍光色素類、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）  ３３２５８、エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド等で抗退色媒体（例えば、ベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ），ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ），ｒｅｆ：Ｈ−１０００）中で染色できる。
【００７１】
＜安全性および環境＞
供給溶液類の吸入および接触を避ける。
溶液ＢおよびＣは、塩酸、ジチオスレイトールおよびトリトンＸ−１００を含む。
製造業者による仕様書を参考にする。
使用した製品を環境中に捨ててはいけない。有毒製品の保存および廃棄については、センター（Ｃｅｎｔｒｅ）のガイドラインに従う。
生物サンプルは、潜在的に感染性であるとして取り扱わねばならない。
【００７２】
＜保存および安定性＞
常温（室温）で保存し、ただし、溶液Ｃは４℃に保存すること。有効期限：試薬類および材料類は、最低６ヶ月間安定である。溶液ＢおよびＣは、垂直位置に保持し、密封をよくすることが推奨される。
【００７３】
本発明は、適用関連分野がさまざまある。そのヒト適用における用途は、自明である。例えば、セミノグラムパラメータが正常である不妊のヒト由来サンプルにおいて、流産を繰り返すカップルにおいて、補助生殖のために使用するサンプルにおいて、精巣摘出のため将来的に補助生殖技術で使用するために凍結する（凍結保存）サンプルにおいて、である。また、発癌性疾患のため化学療法および／または放射線療法に供される患者および精管切除術の施行前の患者において、である。
【００７４】
本発明の操作とキットにより実施した研究は、精子ドナー候補の選択基準を向上させ、ならびに、精子バンクにおけるドナー由来サンプルの定期的評価を補足する。また、精液および妊娠の品質に及ぼす高齢の影響を分析できる。その適用は、精子の完全性に影響を及ぼし得る疾患類、発熱，感染，水痘，ストレス，職場またはアクシデントによる遺伝的毒性物質（除草剤、放射線、環境エストロゲン等）に対する暴露，ホルモン処置，または高温に対する反復暴露（ホットオーブン、セラミック、ガラス関連職業または自動車ドライバー）を有する患者の評価を対象とする。これらの患者はまた、定期的に評価することもできる。最後に、本発明は、基本的および臨床研究において有用である。
【００７５】
同様に、本発明は、獣医学研究室においても有用である。例えば、繁殖させるオスのような異なる動物種において、保存サンプルにおいて、疾患プロセスにおいて、絶滅の危機のある種のオスにおいて、よび有毒物質が原因の傷害の評価において、ＤＮＡ断片化のベルを研究することもできる。
【実施例】
【００７６】
本発明を、さらに詳細に先に述べた特徴のいくつかを例示する実施例に基づいて、説明する。
【００７７】
＜実施例１＞
新鮮な精液のサンプルにおいて、記載した方法論を適用して、クロマチン分散ハロを調製する。このため、ＰＢＳ中で濃度１０００万／ミリリットルに希釈したサンプルを、１％液体低ゲル化点アガロースと混合し、最終濃度０．７％の後者を得た。このミクロゲルがスライド上でゲル化した後、サンプルを０．０８Ｍ  ＨＣｌから構成された変性溶液中で８分間、２２℃でインキュベーションし、次に、２．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．２Ｍ  ＤＴＴ，０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ，１％  トリトンＸ−１００、ｐＨ７．５から構成される溶解溶液中２２℃で２５分間、インキュベーションした。スライドを精製水で５分間洗浄し、それらをエタノール浴中で脱水し、風乾した。次に、順次かつ同一細胞について、ＤＢＤ−ＦＩＳＨ（ＤＮＡ断裂検出−蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、フェルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）ら，１９９８、２０００、２００２、フェルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）およびゴンサルベス（Ｇｏｎｓａｌｖｅｚ），２００２）を、総ゲノムＤＮＡプローブを用いて実施した。この操作により、アガロースミクロゲル中に浸漬し、脱たんぱく質化し、かつＤＮＡの制御変性に供した細胞核中においてＤＮＡの断裂を検出しかつ定量化できる。この変性により、断裂の末端から一重鎖ＤＮＡ部分を産生し、それらは、蛍光色素で標識した総ゲノムＤＮＡプローブを用いてインサイチュハイブリダイゼーションにより検出し、それは、赤色の蛍光を発する（Ｃｙ３）。細胞ＤＮＡ中、断裂レベルが高くなると、変性溶液により産生された一重鎖ＤＮＡの品質が高くなり、ハイブリダイズしたプローブの品質が高くなり、かつ観察した赤色の蛍光が高くなる。本発明に記載の方法により処理したサンプル類は変性溶液によりＤＮＡが有する断裂の起こり得る末端から産生させた一重鎖ＤＮＡを含んでいる。したがって、総ゲノムＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションの強度は、精子の核中に存在する断裂の量に関連するであろう。
【００７８】
無作為に得た細胞２５０個を、計数した。クロマチン分散ハロのＤＡＰＩ染色イメージは、２種のフィルターを用いる冷蔵ＣＣＤカメラを用いて捕捉し、分散ハロを見えるようにし、これはブルーに見え、ハイブリダイゼーションシグナルは、同時に赤色に見えた。最終目的は、クロマチン分散ハロの大きさとＤＮＡ断裂マーカーのレベルとの相関を確立することであった。結果は、クロマチン分散ハロの相対的領域とＤＢＤ−ＦＩＳＨを用いたＤＮＡ断裂マーカーの強度との逆相関を明らかにした（表１）。
【００７９】
【表１】
2007521840.tif 000002
【００８０】
ハロの相対的領域が低下するに伴い、ハイブリダイゼーションの総平均密度（ＭＤ）における増加がもたらされることに注意する。
【００８１】
結果として、我々の操作を用いて得られたクロマチン分散ハロの大きさを簡便に決定することで、ヒト精子のクロマチン／ＤＮＡの完全性を簡便にかつ直接的に推定できる。
【００８２】
＜実施例２＞
（補助生殖技術で使用した精子ドナーの評価のための補足的方法）
補助生殖クリニックにおいて、精液ドナーサンプル１０個を得た。通常のスパーモグラムの補足として、ＤＮＡ断片化のレベルをこれらのサンプルで決定した。個人当たり細胞５００個を数えた。この場合、結果は、本発明のクロマチン分散ハロ試験を適用することによって、得た。サンプルは、実施例１に記載のようにアガロースミクロゲル中に含め、酸および溶解溶液中でインキュベーションし、洗浄、脱水し、乾燥させた。この場合、染色は、ＤＡＰＩで行わず、ライト染色で行い、クリアフィールド顕微鏡検査に使用した。このため、ライト溶液をリン酸緩衝液と混合（１：１）し、染色層を水平に置き、乾燥ミクロゲルをカバーした。それを５〜１０分間染色し、ときどき風を吹きかけた。水道水で洗浄後、乾燥させ、ヌクレオイド類を視覚化した。結果を表２に示す。この群での平均断片化レベルは、全ての場合において２０％未満であった（１５．４±３．１）。
【００８３】
【表２】
2007521840.tif 000003
【００８４】
１０名の精液ドナーでハロの大きさ分類の百分率分布が得られた。断片ＤＮＡを有する精子の百分率は、小さいハロ、ハロなしおよびハロなし分解の精子分類の総計から構成されていた。
【００８５】
＜実施例３＞
（不妊患者の臨床評価）
補助生殖クリニックにおいて、サンプル１７個を精子ドナーから採取した。通常のスパーモグラム（精子像）の補足として、ＤＮＡ断片化のレベルをこれらのサンプルで決定した。個人当たり細胞５００個を数えた。先の実施例と同様に、結果は、本発明のクロマチン分散ハロ試験を適用することによって、得た。結果を表３に示す。この群での平均断片化レベルは、全ての場合において２０％を超えていた（４９．９±２０．７）。
【００８６】
【表３】
2007521840.tif 000004
【００８７】
１７名の患者でハロの大きさ分類の百分率分布が得られた。断片ＤＮＡを有する精子の百分率は、小さいハロ、ハロなしおよびハロなし分解の精子分類の総計から構成されていた。
【００８８】
＜実施例４＞
（本発明を用いてヒト精子に影響を及ぼす有毒傷害を評価した。外来性および内因性物質類による傷害）
例示例に示したように、一酸化窒素（ＮＯ）ドナー化学物質により誘発されたＤＮＡ障害を分析した研究を述べる。このため、正常ヒトの総新鮮精液サンプル５０マイクロリットルのアリコットを常温（室温）で１時間、異なる用量のニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）とインキュベーションした。処理サンプルを次に静かに遠心分離し、上清を捨て、ＳＮＰを洗浄した。ＰＢＳ中に再度懸濁した後、サンプルを本発明に記載の方法により処理した。
【００８９】
結果を表４に示した。ＮＯドナー濃度が高くなるに伴い、傷害クロマチン／ＤＮＡを有する精子の百分率が増加した。
【００９０】
【表４】
2007521840.tif 000005
【００９１】
ＤＮＡ中に傷害をもたらす能力のある、異なる濃度の一酸化窒素（ＮＯ）ドナー剤で処理した精液のサンプルでハロの大きさ分類の百分率分布が得られた。断片ＤＮＡを有する精子の百分率は、小さいハロ、ハロなしおよびハロなし分解の精子分類の総計から構成されていた。
【００９２】
＜実施例５＞
（凍結精液サンプルを用いたアッセイの再現性）
サンプルの品質に影響を及ぼす凍結および希釈のような２個の因子を、クロマチンハロ分散の程度の分析による方法論を用いて研究した。このため、異なるドナー由来の４個の新鮮なサンプル類および液体窒素中で凍結させたアリコット類を分析した。サンプルの分析は、２枚の異なるスライド上で異なるタイプのヌクレオイド類の直接視覚カウントにより、サンプル１個当たりかつ実験時点１回当たり最小でも２回行った。
【００９３】
［カウントの再現性］
相関（Ｒ）のクラス内相関係数を、各スライドで行った、異なる測定について計算した。各細胞タイプについての係数および２回のカウントの平均による計算結果は、０．７８と０．９２の間で変動し、Ｒ値が０と１の間で変動すると、それは、高い再現性が得られたことを示している（表５）。
【００９４】
【表５】
2007521840.tif 000006
【００９５】
［凍結］
得られた結果を、２個の因子（保存方法とサンプル）の分散分析を用いて比較する。新鮮処理および液体窒素で凍結したサンプルの断片化のレベルに有意差がない（Ｐ＞０．０５）ことが明らかになった。また、凍結時間も断片化ＤＮＡを有する精子の比率に影響を及ぼさないようであった（表６）。
【００９６】
【表６】
2007521840.tif 000007
【００９７】
結論として、直接視覚化分析後に得られた結果の再現性が明らかになる。
【００９８】
＜実施例６＞
（変性溶液および溶解溶液のインキュベーション順序を変えて用いた、ヒト精子のクロマチン／ＤＮＡの完全性の分析）
この変化では、精子をアガロースミクロゲル中に入れた後、それらを第１段階でキットに記載の溶解溶液中２２℃で、２５分間インキュベーションした。このスライドを次に、０．８８  ＨＣｌで構成された変性溶液中に２２℃で８分間沈める。最後に、精製水で洗浄した後スライドを脱水し、ライト溶液で染色し、クリアフィールド顕微鏡で観察した。
【００９９】
この技術的変化を用いて、断片化ＤＮＡを有する精子は、異なるように挙動する。この場合、それらは、クロマチン／ＤＮＡ断片を分散させ、大きいサイズのハロを生ずるようになる。
【０１００】
＜実施例７＞
（異なる動物の精子サンプルへの本方法論適用の結果）
提案した方法論の全体的特徴を評価する目的で、異なる種のオスを選択し、精子中のＤＮＡ断片化レベルの研究を行い、それらの尾部を平行して明確な細胞要素として視覚化した。精子のサンプルは、下記の種から採取した。マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、オウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、ターボット（ひらめの１種）（Ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ  ｍａｘｉｍｕｓ）およびミミズ（Ｌｏｍｂｒｉｃｕｓ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）である。全種において、本技術を適用することでクロマチン分散ハロが産生し、それらの尾部は、正常ＤＮＡを有するものおよび断片化されたものを含めて認識できた（図４）。精子の形状および産生したハロのタイプは、各種に特徴的である（４ａはオウシに対応、４ｂ，ｃ，ｄはマウスに対応、４ｅはミミズに対応、４ｆはターボットに対応）。断片化ＤＮＡを含んでいるかどうかにかかわらず精子の形態は、種により異なり、したがって、ヒトで見られるものとも異なっている。全例において、クロマチン分散は、平行でヒト精子サンプルの場合に見られるものに匹敵している。すなわち、異なる大きさのクロマチン分散ハロ類が産生され、精子の尾部は視覚化できる。
【０１０１】
異なる種のハロの形態と大きさおよび得られた結果は下記のようであった。
【０１０２】
オウシの場合、独立したサンプルを、５人の異なる観察者により分析した。この場合、各個人による断片化ＤＮＡを有する精子核の百分率に差異が見られたが、各観察者で得られた百分率には全く差異が見られなかった（表７）。
【０１０３】
【表７】
2007521840.tif 000008
【０１０４】
マウスの場合、２種の異なる染色を用い、ひとつは通常の（Ｍ１−３２ＮＮＣ）および別の同属物（Ｍ２−３２ＢＣ）であった。異なるタイプのハロについて得られた百分率は、正常（７．１）および同属（２５．１）染色の間に明確な差異があることを示している（表８）。
【０１０５】
【表８】
2007521840.tif 000009
【０１０６】
ターボットの特定ケースの場合、大きなクロマチン分散ハロと小さなコアを有する精子は、小さい分散ハロと大きなコアを有するそれらに対して識別でき、最終的に、分散ハロを有していない他のものからも識別できた。結果を、表９に示した。
【０１０７】
【表９】
2007521840.tif 000010
【０１０８】
ミミズの場合、先の場合で述べたものに類似のハロのダイナミック産生がもたらされ、この場合、精子の頭部とその尾部は、同様に、完全に識別できる。調べた２名（１名は若く、１名は大人）における断片化ＤＮＡを含む精子の推定百分率は、それぞれ、１５％および２２％であった。この場合、精子頭部は、部分的ハロ形成を有するように見え、その重要性については、現在、研究段階に入っている（図４ｅ参照）。
【０１０９】
＜実施例８＞
（クロマチン分散ハロ、精子尾部および白血球の同一細胞学的調製物の視覚化。精子サンプル中ＤＮＡの完全性に及ぼすロイコサイトスペルミアの効果の評価）
ロイコサイトスペルミアは、精液のサンプルにおける白血球の異常増加（＞５×１０6／ｍｌ）をもたらす望ましくない侵襲性プロセスである。ロイコサイトスペルミアは、不妊男性の１０％〜２０％で検出されている。精液中に存在する好中球およびマクロファージ類はＲＯＳ（反応性酸素種）を産生でき、酸化ストレスをもたらし、その結果、精子中のＤＮＡが傷害されることになる（オミュ（Ｏｍｕ）ら，１９９９、エレンプレイス（Ｅｒｅｎｐｒｅｉｓｓ）ら，２００２、ヘンケス（Ｈｅｎｋｅｓ）ら，２００３）。実際、ロイコサイトスペルミアは、精子の品質分析で用いられてきた従来のパラメータ類の異なる異常に関連している。例えば、異常精子の頻度はロイコサイトスペルミアを有していないヒトサンプルの４７％でしか起こらないが、このロイコサイトスペルミアが存在すると百分率が８８％にまで増加する（ｗｗｗ．ｃｌｅｖｅｌａｎｄｃｌｉｎｉｃ．ｏｒｇ）。
【０１１０】
５例の患者のサンプルにおいて、病因が異なるロイコサイトスペルミア（前立腺炎およびクラミドモナスおよび細菌性物質による感染）の高レベルがあるが、本技術に対する応答を調べて精液サンプル中に存在する白血球の百分率および同一サンプルの精子中におけるＤＮＡ断片化のレベルを明確に識別した。両方の細胞タイプ間の差異は、サンプルを同一処理に供したとき、明確で、断片化ＤＮＡを有する精子およびそれを有していない精子は、それらを特徴付ける尾部を示す。白血球中に尾部が存在しないことで、我々は、それらを残りの細胞タイプから識別できる（図５）。
【０１１１】
このようにして、直接相関をサンプル当たり白血球数と精子中のＤＮＡ断片化のレベルとの間で確立でき、表１０は、病因の異なるロイコサイトスペルミアに罹患した患者５名の精液サンプル中の白血球レベルと正常ＤＮＡ（大きいおよび中位、Ｌ／Ｍ）および断片化（小さいハロおよびハロを有していない、Ｓ／ＷＨ）を有する精子の百分率を示している。
【０１１２】
【表１０】
2007521840.tif 000011
【０１１３】
＜リファレンス＞
エイトケン（Ａｉｔｋｅｎ）  ＲＪ，ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）  Ｅ，ハーキス（Ｈａｒｋｉｓｓ）  Ｄ，「Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  １５  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ」，バイオロジ・オブ・リプロダクション（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．），１９９８年，５９巻，ｐｐ．１０３７−１０４６
デ・ヨンゲ（Ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ）  Ｃ，「Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｓｐｅｒｍ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＤＮＡ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ」，ヒューマン・ファーティリティ（Ｈｕｍ．Ｆｅｒｔｉｌ．），２００２年，５巻，ｐｐ．５１−５３
エレンプレイス（Ｅｒｅｎｐｒｅｉｓｓ）  Ｊ，へレビッカ（Ｈｌｅｖｉｃｋａ）  Ｓ，ザルカルンズ（Ｚａｌｋａｌｎｓ）  Ｊ，およびエレンプレイサ（Ｅｒｅｎｐｒｅｉｓａ）  ＪＪ，「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｏｓｐｅｒｍｉａ  ｏｎ  Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ：Ａ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  Ａｂｎｏｒｍａｌ  Ｓｅｍｅｎ  Ｓａｍｐｌｅｓ」，ジャーナル・オブ・アンドロロジィ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ），２００２年，２３巻，ｐｐ．５
エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）  ＤＰ，ダージンキービックス（Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ）  Ｚ，およびメラメド（Ｍｅｌａｍｅｄ），ＭＲ，「Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｅｒｍ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｔｏ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ」，サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９８０年，２１０巻，ｐｐ．１１３１−１１３３
エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）  ＤＰおよびヨースト（Ｊｏｓｔ）  ＬＫ，「Ｓｐｅｒｍ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｓｓａｙ：ＤＮＡ  ｄｅｎａｔｕｒａｂｉｌｉｔｙ」，Ｉｎ：ダージンキービックス（Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ）  Ｚ，ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）  ＪＰ，クリスマン（Ｃｒｉｓｓｍａｎ）  ＨＡ．著，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２巻，フロウ  サイトメトリィ（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）」，第２版，オーランド（Ｏｒｌａｎｄｏ），フロリダ（Ｆｌａ），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），１９９４年，４２巻，ｐｐ．１５９−１７６
エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）  ＤＰ，ヨースト（Ｊｏｓｔ）  ＬＫ，コルゼット（Ｃｏｒｚｅｔｔ）  Ｍ，バルホーン（Ｂａｌｈｏｒｎ）  Ｒ，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｎ  ｅｐｉｓｏｄｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｆｅｖｅｒ:ａ  ｃａｓｅ  ｓｔｕｄｙ」，ジャーナル・オブ・アンドロロジィ（Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．），２０００年，２１巻，ｐｐ．７３９−７４６
エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）  ＤＰ，ヨースト（Ｊｏｓｔ）  ＬＫ，マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）  Ｄ，ジナマン（Ｚｉｎａｍａｎ）  ＭＪ，クレッグ（Ｃｌｅｇｇ）  Ｅ，パービス（Ｐｕｒｖｉｓ）  Ｋ，デ・アンゲリス（ｄｅ  Ａｎｇｅｌｉｓ）  Ｐ，クラウセン（Ｃｌａｕｓｓｅｎ）  ＯＰ，「Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｅｒｍ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｓｓａｙ  ａｓ  ａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｃｌｉｎｉｃ」，ヒューマン・リプロダクション（Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．），１９９９年，１４巻，ｐｐ．１０３９−１０４９
エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）  ＤＰ，ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）  ＮＪ，ヨースト（Ｊｏｓｔ）  ＬＫ，「Ｓｐｅｒｍ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｓｓａｙ:ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｌｅ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，ジャーナル・オブ・アンドロロジィ（Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ），２００２年，２３巻，ｐｐ．２５−４３
フェルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）  ＪＬ，ゴヤネス（Ｇｏｙａｎｅｓ）  ＶＪ，ラミロ（Ｒａｍｉｒｏ）  Ｊ，ゴサルベス（Ｇｏｓａｌｖｅｚ）  Ｊ，「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＩＳＨ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｒｅａｋａｇｅ」，サイトジェネティックス・アンド・セル・ジェネティックス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．），１９９８年，８２巻，ｐｐ．２５１−２５６
フェルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）  ＪＬ，バスケス−グンディン（Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｇｕｎｄｉｎ）  Ｆ，デルガド（Ｄｅｌｇａｄｏ）  Ａ，ゴヤネス（Ｇｏｙａｎｅｓ）  ＶＪ，ラミロ−ディアス（Ｒａｍｉｒｏ−Ｄｉａｚ）  Ｊ，デ・ラ・トレ（ｄｅ  ｌａ  Ｔｏｒｒｅ）  Ｊ，ゴサルベス（Ｇｏｓａｌｖｅｚ）  Ｊ，「ＤＮＡ  ｂｒｅａｋａｇｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＤＢＤ−ＦＩＳＨ)  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ：ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ」，ミューテイション・リサーチ（Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．），２０００年，４５３巻，ｐｐ．７７−８２
フェルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）  ＪＬ，ゴサルベス（Ｇｏｓａｌｖｅｚ）  Ｊ，「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＩＳＨ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ:ＤＮＡ  ｂｒｅａｋａｇｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ−ＦＩＳＨ（ＤＢＤ−ＦＩＳＨ）」，メソッズ・イン・モレキュラ・バイオロジ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），２００２年，２０３巻，ｐｐ．２０３−２１６
フェルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）  ＪＬ，ゴヤネス（Ｇｏｙａｎｅｓ）  Ｙ，ゴサルベス（Ｇｏｓａｌｖｅｚ）  Ｊ，「ＤＮＡ  Ｂｒｅａｋａｇｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ−ＦＩＳＨ（ＤＢＤ−ＦＩＳＨ）」，Ｉｎ：ラウテンストラウス（Ｒａｕｔｅｎｓｔｒａｕｓｓ）  Ｂ，リーハ（Ｌｉｅｈｒ）  Ｔ．著，「ＦＩＳＨ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｌａｂ  ｍａｎｕａｌ」，ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｂｅｒｇ），スプリンガー−フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），２００２年，ｐｐ．２８２−２９０
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セイラー（Ｓａｉｌｅｒ）  ＢＬ，ヨースト（Ｊｏｓｔ）  ＬＫ，エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ）  ＤＰ，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ａｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ」，ジャーナル・オブ・アンドロロジィ（Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ．），１９９５年，１６巻，ｐｐ．８０−８７
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【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】本発明の方法論による、ヒト精子におけるハロの大きさの定義に用いたパラメータ類。１ａ：精子の広く脱たんぱく質化した核に対応するヌクレオイドで、それは、２つの部分から構成される。中央位置にあるコアと称される精子核のシルエットとクロマチン／ＤＮＡ分散液の周辺ハロ。精子の尾部は、可視化できる。１ｂ：ハロとコアの境界をより視覚化しそれを確定するためのリリーフフィルター。１ｃ：コア（ａ）の小さい直径とハロ（ｂ）の厚さで、本発明の方法論で説明したように異なる大きさのハロを確定するために用いた測定値サンプル。
【図２】本発明の方法論を適用後得られたハロの大きさにより規定した異なるタイプの精子。２ａ：大きいサイズのハロを有する精子。２ｂ：中程度の大きさのハロを有する精子。２ｃ：小さいサイズのハロを有する精子。２ｄ：ハロを有していない精子。２ｅ：ハロを有していない精子で分解されている。２ｆ：先に述べた異なるタイプの精子が観察された全体野。
【図３】ＤＡＰＩ（ａ〜ｅ、フルオロセインブルー）染色後視覚化した、異なるサイズのハロとＤＢＤ−ＦＩＳＨ方法論（ａ’〜ｅ’、フルオレセインレッド）によるＤＮＡ断片化レベルを視覚化するための総ヒトゲノムＤＮＡプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションシグナルとの相関。３ａ：ハロと低ハイブリダイゼーションシグナル（３ａ’）を有する精子。３ｂ：中等度ハロと低ハイブリダイゼーションシグナルを有する精子で、ただし、先の場合（３ｂ’）よりもわずかに高い。３ｃ：小さいハロとハイブリダイゼーションレベルの検出可能な増加（３ｃ’）を有する精子。３ｄ：ハロを有さず高レベルのハイブリダイゼーション（３ｄ’）を有する精子。３ｅ：分解された精子と不規則的ハイブリダイゼーション分布（３ｅ’）を示している。
【図４】本発明の方法を下記種の精子サンプルに適用。マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、オウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、ターボット（ひらめの１種）（Ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ  ｍａｘｉｍｕｓ）およびミミズ（Ｌｏｍｂｒｉｃｕｓ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）。４ａはオウシに対応、４ｂ，ｃ，ｄはマウスに対応、４ｅはミミズに対応、４ｆはターボットに対応。
【図５】高レベルの白血球精子症を有する患者由来のサンプル。白血球に尾部がないことが注目され、それにより、残りの細胞タイプから識別できるようになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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