(57)【要約】  符号化パタンに基づいて３つ以上の光励起波長から選ばれた組み合わせがサンプルに順次に照射される。その選ばれた組み合わせの光励起波長に応答したサンプルからの複数のスペクトルが検出される。その複数のスペクトルに基づいてサンプルに特有なシフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分とが識別される。
2007537441.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある符号化パタンに基づいて３つ以上の光励起波長から選ばれた組み合わせをサンプルに順次に照射するステップと、
光励起波長の前記選ばれた組み合わせに応答した前記サンプルからの複数のスペクトルを検出するステップと、
前記複数のスペクトルに基づいて前記サンプルに特有なシフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分とを識別するステップと
を含んでなる、ラマン分光法の実行方法。
【請求項２】
前記選ばれた組み合わせは多波長光励起ビームを含むものである請求項１に記載のラマン分光法の実行方法。
【請求項３】
シフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分とを識別するステップは、前記複数のスペクトルを比較して、前記選ばれた組み合わせの波長の変化に応答してシフトしたスペクトル成分またはシフトしなかったスペクトル成分を識別することを含むものである請求項１に記載のラマン分光法の実行方法。
【請求項４】
前記符号化パタンはHadamard符号化パタンの少なくとも一部を含むものである請求項１に記載のラマン分光法の実行方法。
【請求項５】
前記符号化パタンはWalsh符号化パタンの少なくとも一部を含むものである請求項１に記載のラマン分光法の実行方法。
【請求項６】
ある符号化パタンに基づいて３つ以上の光励起波長から選ばれた組み合わせをサンプルに順次に照射するステップは、前記符号化パタンに基づいて放射線源素子のアレイに含まれる放射線源素子を選択的に照射させることを含むものである請求項１に記載のラマン分光法の実行方法。
【請求項７】
符号化パタンに基づいて３つ以上の光励起波長から選ばれた組み合わせをサンプルに順次に照射するステップは、前記放射線源素子のアレイから重複しない放射線源素子の第１の部分集合と第２の部分集合とを識別することを含み、前記選ばれた組み合わせは、前記第１の部分集合の放射線源素子を含む第１の励起ビームと前記第２の部分集合の放射線源素子を含む第２の励起ビームとを含むものである請求項６に記載のラマン分光法の実行方法。
【請求項８】
シフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分とを識別するステップは、前記第１の励起ビームに応答したスペクトルと前記第２の励起ビームに応答したスペクトルとの差分を決定することを含むものである請求項７に記載のラマン分光法の実行方法。
【請求項９】
前記第１の部分集合の放射線源素子と前記第２の部分集合の放射線源素子とは、同数の放射線源素子を含むものである請求項７に記載のラマン分光法の実行方法。
【請求項１０】
Hadamard符号化パタンの少なくとも一部に基づいて前記第１の部分集合の放射線源素子と前記第２の部分集合の放射線源素子を選ぶステップを更に含むものである請求項７に記載のラマン分光法の実行方法。
【請求項１１】
前記第１の部分集合の放射線源素子はHadamard行列の行または列に基づいており、前記第２の部分集合の放射線源素子はHadamard行列の同じ行または列の逆に基づいているものである請求項７に記載のラマン分光方法。
【請求項１２】
シフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分とを識別するステップは、Hadamard符号化パタンを使用して前記複数のスペクトルを解析することを含むものである請求項７に記載のラマン分光法の実行方法。
【請求項１３】
前記シフトしていないスペクトル成分は蛍光放射線を含むものである請求項１に記載のラマン分光法の実行方法。
【請求項１４】
前記放射線源素子はＬＥＤまたはレーザを含むものである請求項６に記載のラマン分光法の実行方法。
【請求項１５】
前記多波長光励起ビームは３つ以上の波長を含むものである請求項２に記載のラマン分光法の実行方法。
【請求項１６】
ある３つ以上の光励起波長から選ばれた組み合わせを順次に照射するステップは、前記選ばれた組み合わせを提供するために広帯域励起線源をフィルタリングすることを含むものである請求項１に記載のラマン分光法の実行方法。
【請求項１７】
符号化パタンに基づいて３つ以上の光励起波長から選ばれた組み合わせをサンプルに順次に照射するよう構成された電磁放射線源と、
光励起波長の前記選ばれた組み合わせのそれぞれの組み合わせに応答した前記サンプルからの複数のスペクトルを検出するよう構成された検出器と、
前記検出器と通信し、前記複数のスペクトルを受け取り、その複数のスペクトルに基づいて前記サンプルに特有なシフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分とを識別するよう構成された信号解析器と
を含んでなる、ラマン分光法の実行システム。
【請求項１８】
前記選ばれた組み合わせは多波長光励起ビームを含むものである請求項１７に記載のラマン分光法の実行システム。
【請求項１９】
前記信号解析器は、前記複数のスペクトルを比較し、前記選ばれた組み合わせの波長の変化に応答してシフトしたスペクトル成分またはシフトしなかったスペクトル成分を識別することによって、シフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分とを識別するよう構成されているものである請求項１７に記載のラマン分光法の実行システム。
【請求項２０】
前記電磁放射線源は、Hadamard符号化パタンの少なくとも一部を含む符号化パタンに基づいて前記選ばれた組み合わせの波長を順次照射するよう構成されているものである請求項１７に記載のラマン分光法の実行システム。
【請求項２１】
前記電磁放射線源は、Walsh符号化パタンの少なくとも一部を含む符号化パタンに基づいて前記選ばれた組み合わせの波長を順次照射するよう構成されているものである請求項１７に記載のラマン分光法の実行システム。
【請求項２２】
前記電磁放射線源は放射線源素子のアレイにより構成されており、前記符号化パタンに基づいて前記放射線源素子のアレイに含まれる放射線源素子を選択的に照射させることによって３つ以上の光励起波長から選ばれた組み合わせを順次に照射するよう構成されているものである請求項１７に記載のラマン分光法の実行システム。
【請求項２３】
前記電磁放射線源は前記放射線源素子のアレイから重複しない放射線源素子の第１の部分集合と第２の部分集合を識別することによって３つ以上の光励起波長から選ばれた組み合わせを選択的に照射するよう構成されており、前記選ばれた組み合わせは前記第１の部分集合の放射線源素子を含む第１の励起ビームと前記第２の部分集合の放射線源素子を含む第２の励起ビームとを含むものである請求項２２に記載のラマン分光法の実行システム。
【請求項２４】
シフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分とを識別することは、前記第１の励起ビームに応答したスペクトルと前記第２の励起ビームに応答したスペクトルとの差分を決定することを含むものである請求項２３に記載のラマン分光法の実行システム。
【請求項２５】
前記第１の部分集合の放射線源素子と前記第２の部分集合の放射線源素子とは、同数の放射線源素子を含むものである請求項２３に記載のラマン分光法の実行システム。
【請求項２６】
前記電磁放射線源はHadamard符号化パタンの少なくとも一部に基づいて前記第１の部分集合の放射線源素子と前記第２の部分集合の放射線源素子を選ぶよう更に構成されているものである請求項２３に記載のラマン分光法の実行システム。
【請求項２７】
前記第１の部分集合の放射線源素子はHadamard行列の行または列に基づいており、前記第２の部分集合の放射線源素子はHadamard行列の同じ行または列の逆に基づいているものである請求項２３に記載のラマン分光法の実行システム。
【請求項２８】
前記信号解析器は、Hadamard符号化パタンを使用して前記複数のスペクトルを解析することによって、シフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分とを識別するよう構成されているものである請求項２３記載のラマン分光法の実行システム。
【請求項２９】
前記シフトしていないスペクトル成分は蛍光放射線を含むものである請求項１７に記載のラマン分光法の実行システム。
【請求項３０】
前記放射線源素子は発光ダイオードまたはレーザを含むものである請求項２２に記載のラマン分光法の実行システム。
【請求項３１】
前記多波長光励起ビームは３つ以上の波長を含むものである請求項１８に記載のラマン分光法の実行システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［米国政府の支援について］
本発明は米国国立アルコール乱用・依存症研究所（National Institutes on Alcoholism and Alcohol Abuse）を通じて提供された米国政府の支援（交付番号1AA23013）のもとに実施された。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、分光法、特にラマン分光法（Raman Spectroscopy）のための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
分子種から非弾性散乱された光の波長は、散乱種の内部振動モードに関連したエネルギーによってシフトする可能性がある。かかる周波数シフトは、分子の調和モードに対応するシャープなスペクトル線の離散的な配列を生じさせることがある。このスペクトルシフトは、一般に、“ストークス（Stokes）”シフトまたは“ラマン（Raman）”効果と称される。ターゲット分子の存在を特定し、分子種の構造および／または密度を解析するために、かつ／または他の目的のために、ラマン分光法が利用されることがある。しかしながら、弾性散乱によって発生する蛍光および／または迷光（stray light）は、スペクトルのラマン部分を曖昧にしてしまう場合がある。
【０００４】
ＳＥＲＤＳ（spectrum-Shifted Excitation Raman Difference Spectroscopy）は、検査サンプルに照射されるレーザ光の周波数をシフトさせることによって蛍光および迷光による干渉を低減するために使用されることがある。ラマン帯域は、一般に励起周波数のシフトに応答してシフトするが、広帯域の背景蛍光および迷光は一般に励起周波数のシフトにはそれほど影響されない。ＳＥＲＤＳは、一般に、２つの異なる（シフトした）励起周波数から得られた２つのスペクトルを引き算することを含む。引き算した結果、背景の蛍光スペクトルが低減されたと考えられる差分スペクトル（derivative spectrum）が得られる。詳細については、文献１）S.E.J.Bell、E.S.O.BourguignonおよびA.Dennis共著「ＳＥＲＤＳを使用した発光性サンプルの分析（Analysis of luminescent samples using subtracted shifted raman spectroscopy）」、アナリスト（Analyst）、第１２３巻、第８号、ｐ．１７２９−１７３４（１９９８）と、文献２）P.Matousek、M.Towrie、およびA.W.Parker共著「複合Kerr-gatedＳＥＲＤ技術を使用したラマン分光法における背景蛍光の抑制法（Fluorescence background suppression in roman spectroscopy using combined kerr gated and shifted excitation raman difference techniques）」、ラマン分光法ジャーナル（Journal of Raman Spectroscopy）、第３３巻、第４号、ｐ．２３８−２４２（２００２）と、文献３）A.P.Shreve、N.J.Cherepy、およびR.A.Mathies共著「ＳＥＲＤ技術を使用したラマン分光法における蛍光性干渉の有効な除去法（Effective rejection of fluorescence interference in raman-spectroscopy using a shifted excitation difference technique）」、応用分光学（Applied Spectrocopy）、第４６巻、第４号、ｐ．７０７−７１１（１９９２）と、文献４）J.Zhao、M.M.Carrabba、およびF.S.Allen共著「ＳＥＲＤ技術を使用した自動蛍光除去法（Automated fluorescence rejection using shifted excitation raman difference spectroscopy）」、応用分光学（Applied Spectroscopy）、第５６巻、第７号、ｐ．９３４−９４５（２００２）とを参照されたい。
【０００５】
しかしながら、ＳＥＲＤＳは全ての環境で蛍光および迷光を十分に低減するわけではない。例えば、ラマン分光法は生体組織などの拡散媒質（diffuse medium）の中では更に難しくなる場合がある。その理由は、ラマン効果は高レベルのインコヒーレント蛍光スペクトルによっておよび／または媒質内に存在し得る多種多様な分子と関連するラマン信号によってはっきりしなくなる場合があるからである。ラマン・スペクトルは散乱信号の空間的なインコヒーレンスのために拡散媒質の中では分離することも難しい場合がある。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の実施態様によれば、符号化パタン（encoding pattern）に基づいて３つ以上の光励起波長から選ばれた組み合わせが検査対象のサンプルに順次照射される。サンプルからのその選ばれた組み合わせの光励起波長に応じた複数のスペクトルが検出される。その複数のスペクトルに基づいて検査対象のサンプルに特有なシフトしているラマン励起スペクトル成分（shifted Raman excitation spectral component）とシフトしていないスペクトル成分（non-shifted spectral component）とが識別される。
【０００７】
一部の態様では、前記選ばれた組み合わせは多波長光励起ビーム（multi-wavelength light excitation beams）である。シフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分を識別するステップは、前記複数のスペクトルを比較して、前記選ばれた組み合わせの波長の変化に応答してシフトしたスペクトル成分またはシフトしなかったスペクトル成分を識別することを含みうる。前記符号化パタンは、Hadamard（アダマール）符号化パタンおよび／またはWalsh符号化パタンの少なくとも一部を含みうる。
【０００８】
特定の態様として、符号化パタンに基づいて３つ以上の光励起波長から選ばれた組み合わせをサンプルに選択的に照射するステップは、前記符号化パタンに基づいて放射線源素子のアレイに含まれる放射線源素子を選択的に照射させることを含みうる。前記放射線源素子のアレイから、重複しない放射線源素子の第１の部分集合と第２の部分集合を識別することができる。前記選ばれた組み合わせは前記第１の部分集合の放射線源素子を含む第１の励起ビームと前記第２の部分集合の放射線源素子を含む第２の励起ビームとを含みうる。シフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分は、前記第１の励起ビームに応答したスペクトルと前記第２の励起ビームに応答したスペクトルの差分（difference）を決定することによって識別することができる。前記第１の部分集合の放射線源素子と前記第２の部分集合の放射線源素子は同数の放射線源素子を含みうる。前記第１の部分集合の放射線源素子と前記第２の部分集合の放射線源素子はHadamard符号化パタンの少なくとも一部に基づいて選ぶことができる。前記第１の部分集合の放射線源素子はHadamard行列の行または列に基づくことが可能であり、前記第２の部分集合の放射線源素子はHadamard行列の同じ行または列の逆に基づくことが可能である。シフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分とは、Hadamard符号化パタンを使用して前記複数のスペクトルを解析することによって識別することができる。
【０００９】
一部の態様では、前記シフトしていないスペクトル成分は蛍光放射線を含む。前記放射線源素子はＬＥＤおよび／またはレーザを含みうる。前記多波長光励起ビームは３つ以上の波長を含みうる。更なる態様では、３つ以上の光励起波長から選ばれた組み合わせは、広帯域励起線源をフィルタリングしてその選ばれた組み合わせを提供することによって、検査対象のサンプルに順次に照射することができる。
【００１０】
本発明の更なる態様として、電磁放射線源と検出器と信号解析器とにより構成されるラマン分光法を実行するためのシステムが提供される。電磁放射線源は、符号化パタンに基づいて３つ以上の光励起波長から選ばれた組み合わせを検査対象のサンプルに順次に照射するよう構成される。検出器は、前記選ばれた組み合わせのそれぞれの組み合わせに応答した検査対象のサンプルからの複数のスペクトルを検出するよう構成される。信号解析器は、前記検出器と通信することができ、前記複数のスペクトルを受け取ってその複数のスペクトルに基づいて検査対象のサンプルに特有なシフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分とを識別するよう構成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、添付図面を参照して、本発明の実施の最良の形態を詳細に説明する。しかしながら本発明は多くの様々な形態で実施することが可能であり、ここに開示された実施形態に限定されるものと解すべきではない。正しくは、これらの実施形態は本明細書が周到に徹底したものとなり、当業者に対して本発明の範囲が十分に明らかなものとなるよう提供される。また図面において、構成要素の相対的大きさはわかりやすくするために誇張して描かれている場合がある。図の中の類似の参照符号は類似の構成要素を示している。
【００１２】
ある構成要素が別の構成要素の“上に”または“隣接して”あるものとして記述されるときは、その構成要素はその別の構成要素の直接上に存在している、または他の構成要素が介在している場合がある。これとは対照的に、ある構成要素が別の構成要素の“直接上に”あるものとして記述されるときには、介在する構成要素は一切存在しない。構成要素または領域の厚みはわかりやすくするために誇張して描かれている場合がある。
【００１３】
図１に示すように、ラマン分光器１０の中にはサンプル２０が置かれている。複数の放射線源素子１６は、分光器１０の中のサンプル２０に励起ビームを照射するよう構成された励起ビームアレイ１４を形成する。放射線源素子１６は分光器１０に少なくとも３つの入力２８によって接続されており、それらはサンプル２０に励起ビームを提供する。励起ビームがサンプル２０に照射されると、その結果の再放射光が検出器アレイ２６の中の複数の検出器１８によって検出される。検出器２６および励起ビームアレイ１４はプロセッサ１２と通信する。プロセッサは信号解析器２２とアレイ制御装置２４とを含む。
【００１４】
アレイ制御装置２４はパタン発生器３０を含んでおり、パタン発生器はある符号化パタン（encoding pattern）に基づいて励起ビームアレイ１４からの３つ以上の光励起波長からある組み合わせを選ぶよう構成することができる。励起ビームは、一般的には多波長光（multi-wavelength light）を含む。例えば、一部または全ての放射線源素子１６の組み合わせを順次に選ぶために様々な符号化パタンが使用できる。アレイ制御装置２４は放射線源素子１６の中の選ばれたものを照射（illuminate）させるために励起ビームアレイ１４に制御信号を配信する。パタン発生器３０は、Hadamard符号化パタンまたはWalsh符号化パタンの少なくとも一部を使って一連の励起ビームを選択することができる。例えば、Hadamard行列またはWalsh行列の１つ以上の行または列が、一連の励起ビームに含まれる励起ビームを選ぶために使用することができる。
【００１５】
サンプル２０から結果的に発生した再放射光は検出器アレイ２６によって励起ビームアレイ１４からの光励起波長の組み合わせに応答したスペクトルとして検出される。プロセッサ１２はそのスペクトルを受信し、信号解析器２２がそれを解析することができる。例えば、信号解析器２２は、検出されたスペクトルに基づいて、サンプル２０に特有なシフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分とを識別することができる。
【００１６】
この構成では、サンプル２０からスペクトルを取得するために多波長光励起ビームが使用できる。励起ビームは３つ以上の光励起波長から選ばれた組み合わせである。例えば、励起ビームが３つの光励起波長から選ばれる場合には、結果の励起ビームは、１つ、２つ、または３つ全ての光励起波長の任意の組み合わせを含みうる。シフトしているラマン励起スペクトル成分とシフトしていないスペクトル成分とは、例えば、検出されたスペクトルを比較し、選ばれた波長の組み合わせの波長の変化に応答してシフトしたスペクトルの成分および／またはシフトしなかったスペクトルの成分を識別することによって、分離することが可能である。このようにして、蛍光および迷光などのスペクトルの非ラマン成分は低減される場合があり、かつ／または信号対ノイズ比は改善可能である。
【００１７】
理論に束縛されることなく、サンプル２０からの散乱光のスペクトルは、一般にラマン成分および非ラマン成分を含む。非ラマン成分は主に蛍光信号である。蛍光信号の周波数はサンプル２０の散乱分子の性質によって決まるという点において、ラマン成分は一般に非ラマン成分とは異なる。他方、ラマン成分の周波数は分子の性質と励起光ビームのスペクトルの両方によって決まる。その結果、ラマン・スペクトル成分は励起光ビームの波長に応じてシフトすることがある。これとは対照的に、非ラマン成分は励起ビームの波長とは無関係に比較的安定している。それゆえに、スペクトルのラマン成分および非ラマン成分はラマン・スペクトル成分において観測される周波数シフトに基づいて分離することが可能である。例えば、励起波長の異なる組み合わせに応答して２つ以上のスペクトルが検出器アレイ２６によって検出可能である。スペクトルの一定成分（例えば、励起波長が変化してもシフトしない非ラマン成分）とスペクトルのシフトしているラマン成分とを分離するためにスペクトルの差分を決定することができる。
【００１８】
一部の実施形態では、放射線源素子１６は、例えば約１／４ナノメータの帯域幅を持つＬＥＤ（発光ダイオード）またはレーザなどの狭帯域光源である。放射線源素子１６を符号化パタン（encoding pattern）に従って選択的に放射線照射（illuminate）させることによって３つ以上の波長から選ばれた波長の組み合わせをサンプル２０に照射することが可能である。特定の実施形態では、符号化パタンはアレイ１４からの重複しない放射源素子１６の部分集合を含みうる。各部分集合に対応する励起ビームがサンプル２０に照射可能である。シフトしているラマン励起スペクトル成分および／またはシフトしていないスペクトル成分を識別するために各部分集合から結果的に発生したスペクトルの違いが決定できる。選ばれた放射線源素子の部分集合は同数の放射線源素子を含むことができ、かつHadamard符号化パタンに従う場合がある。例えば、１つの部分集合の放射線源素子はHadamard行列の行（row）または列（column）に基づくことができ、別の部分集合はHadamard行列の同じ行または列の逆に基づくことができる。
【００１９】
図１には放射線源素子１６のアレイ１４が具体例として示されているが、本発明によれば、波長の符号化された組み合わせを提供するために様々なタイプの励起線源を使用することができることは理解されたい。例えば、図２の分光器１１０が示すように、広帯域励起線源１１４およびフィルタ１１６がサンプル１２０に広帯域線源１１４から選択された波長の光を照射するために使用できる。結果とし発生する再放射光は検出器１２６によって検出される。広帯域線源１１４、フィルタ１１６および検出器１２６は、プロセッサ１１２と通信する。広帯域線源１１４は、高輝度ＬＥＤ（superluminescent light emitting diode）、白色光源、および／またはマルチモードダイオードでありうる。ここで使用される“広帯域”とは、フィルタリングによって１つ以上の狭帯域幅励起ビームを提供することができるのに十分な広さを有する任意の帯域幅を指す。
【００２０】
プロセッサ１１２は、図１に示したプロセッサと同じように、例えば信号解析器１１２などのコンポーネントを含みうる。プロセッサ１１２は、サンプルに選択的に照射される波長の組み合わせを制御するためのフィルタ／線源制御装置１２４も含む。フィルタ／線源制御装置１２４は、例えばHadamard符号化パタンなどの波長の組み合わせパタンを生成するためのパタン発生器１３０を含みうる。例えば、フィルタ／線源制御装置１２４は、励起ビームが所望のフィルタを通過するように例えば広帯域線源１１４の正面で様々なフィルタを動かすことによってあるいは広帯域線源１１４を動かすことによって、広帯域線源１１４を図示されたフィルタ１１６を含む一連のフィルタを通して放射線照射させるための指令を分光器１１０に伝達することができる。一連のフィルタは、パタン発生器１３０によって生成された符号化パタンに基づいて選ばれた組み合わせの波長を提供するよう選ぶことができる。代わりに、ユーザは、手作業で適切なフィルタを選択し、広帯域励起ビームをその選択されたフィルタに通すことができる。パタン発生器１３０は、符号化パタンに基づいてフィルタのリストを提供することができる。
【００２１】
ある特定の実施形態では、検出器２６、１２６は、Hadamard分光器に使用されうる多重検出器配列である。Hadamard分光器は、Hadamard符号化マスクを含む分散分光器の光学部品を使用する多重化分光器（multiplexing spectrometer）である。
【００２２】
図１および図２はそれぞれ、例えば、分光器１０、１１０、プロセッサ１２、１１２、並びに特定構成の検出器２６、１２６および光源、すなわちアレイ１４および広帯域線源１１４に関して示されてきたが、本発明は図１および図２に示された構成に限定されると解すべきではないが、ここで説明した作業を実行することが可能な任意の構成を包含することを意図している。一部の実施形態では、図１および図２に示したコンポーネントは他のコンポーネントに組み込むことが可能である。例えば、図１のアレイ１４および／または検出器２６は分光器１０に組み込むことが可能である。図１のアレイ１４および図２の広帯域線源１１４およびフィルタ１１６は交換可能に使用することができる。図２の広帯域線源１１４、フィルタ１１６および／または検出器１２６は、分光器１１０とは別個のコンポーネントとして提供することができる。加えて、それぞれの信号解析器２２、１２２、パタン発生器３０、１３０、およびプロセッサ１２、１１２は、アレイ制御装置２４および／またはフィルタ線源制御装置１２４とともにそれぞれの分光器１０、１１０などの他のコンポーネントに組み込むことが可能である。
【００２３】
図３に示すように、本発明の実施形態による作業は、ある符号化パタンに基づいて３つ以上の光励起波長から選ばれた組み合わせをサンプルに順次に照射する（ブロック２００）ことを含む。光励起波長は３つ以上の光励起波長から選ぶことができる。多波長励起ビームが使用可能である。図１および図２に関して説明したように、光励起波長は、図１のアレイ１４の励起光源１６などの狭帯域励起光源のアレイによって、および／または図２の広帯域線源１１４およびフィルタ１１６などの広帯域励起線源＆フィルタ構成によって提供することが可能である。光源の波長は光源の中の分子を励起してラマン励起スペクトルを再放射するよう選ぶことができる。選ばれた組み合わせの光励起波長に対する応答であるサンプルからのスペクトルは図１と図２の検出器２６、１４によってそれぞれ検出が可能である（ブロック２０２）。サンプルに特有なシフトしているラマン励起スペクトル成分およびシフトしていないスペクトル成分は、複数のスペクトルに基づいて識別することが可能である（ブロック２０４）。
【００２４】
次に、限定的ではない実施例を通して、本発明の実施形態を説明することにする。
【実施例１】
【００２５】
［ラマン分子応答計算］
非ラマン信号（非ラマン散乱に寄与し得るスペクトル成分）とラマン信号（ラマン散乱に寄与し得るスペクトル成分）とを数学的に区別するためにスペクトル・インパルス応答が使用できる。両方のスペクトル成分は励起波長に関して線形な部分成分と非線形な部分成分を含む。しかしながら、線形成分は一般に非線形成分よりも強い。線形項はインパルス応答によって記述することができる。励起強度の線形変換によって生成される非ラマン・スペクトルＳNRは以下のように表すことができる。
【数１】
2007537441.tif 000003
Ｓe（ν，ｔ）は光出力周波数νとゆっくりとした時間ｔの関数である励起信号（exciting signal）、ｈNRは非ラマン・インパルス応答、ν’は励起周波数（exciting frequency）である。ラマン信号と非ラマン信号の際立った違いは、ラマン・インパルス応答は励起場の中で一般的にシフト不変（shift invariant）であるのに対し、非ラマン・インパルス応答はシフト不変ではない、という点である。“シフト不変”とは、ラマン・インパルス応答が観測周波数（観測された周波数）と励起周波数との差のみの関数、つまりｈR（ν、ν’）＝ｈR（ν−ν’）、であるということを意味する。従ってラマン・スペクトルは次のよう表すことができる。
【数２】
2007537441.tif 000004
線源からの全非弾性散乱スペクトルは非ラマン項とラマン項の和である。
【数３】
2007537441.tif 000005
【実施例２】
【００２６】
［符号化された照射（coded illumination）を使用したラマン信号の区別］
実施例１に示されたラマン・インパルス応答と非ラマン・インパルス応答との間のスペクトル上の違いはそれらの信号を互いに分離するために使用することができる。特に、ラマン・インパルス応答は全スペクトルの測定結果から決定することができる。これを遂行するため、励起信号は時間とスペクトルに関して符号化（encode）され、全スペクトルまたはスペクトルから得られた多重測定値がデジタル処理される。励起ビームは３つ以上の光励起波長からの組み合わせから選ぶことができ、光の２つ以上の波長を含む多波長励起ビーム（multi-wavelength excitation beams）が使用できる。励起スペクトルはＳe（ν，ｔ）が正値関数であるという事実によって拘束され得るが、励起スペクトルの時間変調および適応はバイポーラ符号またはコンプレックス符号を効率的に生成することができる。
【００２７】
変調可能な個別のレーザ線源のアレイが符号化ラマン分光器システムを実現するために使用できる。全てのレーザの線幅は同一（γ（ν））であるが各線源は異なる中心波長（νl）を有すると仮定すると、励起スペクトル（exciting spectrum）は次のように表すことができる。
【数４】
2007537441.tif 000006
この励起によって生み出される全線源スペクトルは以下のように表される。
【数５】
2007537441.tif 000007
【００２８】
励起スペクトルの周波数の比較的小さなシフトに対しては、非ラマン信号は励起波長とは独立であると仮定することができる。この場合には次式が成立する。
【数６】
2007537441.tif 000008
この分光システムはラマン信号から分子密度を推定するために使用されることがある。ラマン・スペクトルは次のように推定することができる。
【数７】
2007537441.tif 000009
【００２９】
実際のシステムでは、スペクトル・時間的測定値は個別的にサンプルされる場合がある。これらのシステムにおいて、ｆl（ｔ）はｎt番目の時間ステップにおけるｌ番目のレーザの出力パワーを指定する離散関数ｆlntである。この場合、式（５）は次のように書くことができる。
【数８】
2007537441.tif 000010
【００３０】
このようにして離散的多重分光法（discrete multiplex spectroscopy）のモデルが構築可能である。しかしながら、この議論は測定システムが全スペクトルを離散的にサンプルすることを仮定している。これとは別に測定システムはＮt個の離散的な時間にＮν個のスペクトル線をサンプルすることが仮定される。各時間ステップごとに、Ｌ個のレーザの符号化された部分集合が検査対象のサンプルに照射する。測定値は成分がｍnνnt＝ＳT（ν0＋ｎνΔν，ｎtΔt）で定義される離散ベクトルｍを含む。既に議論したように、Ｌ個のレーザのプログラムされた集合が各時間ステップごとに照射する。
【数９】
2007537441.tif 000011
式（９）は次のように行列形式で表すことができる。
【数１０】
2007537441.tif 000012
Ｆ1およびＦ2は成分が次式で与えられるＮtＮν×Ｎν行列である。
【数１１】
2007537441.tif 000013
および
【数１２】
2007537441.tif 000014
式（１０）は、ＮtＮν個の線形方程式においてＳNRおよびＳRの２Ｎν個のスペクトル成分を決定する場合がある。システム設計者は、この変換の逆変換でＳNRの推定をできるだけ改善すべく、ｆlntとνlとを選択することがある。一部の実施形態では、設計者はＳNRを全体的に再構成することなく１つ以上の分子密度を推定することができる。
【実施例３】
【００３１】
［照射コード（illumination code）］
全スペクトルは次のように定義されることがある。
【数１３】
2007537441.tif 000015
【００３２】
測定応答行列は次のように定義されることがある。
【数１４】
2007537441.tif 000016
このとき式（１０）は次のように表すことができる。
【数１５】
2007537441.tif 000017
各照射時間ステップごとに唯一のスペクトル成分が使用できる（active）と仮定される場合、Ｆ1,ntはＮν×Ｎνの単位行列、Ｆ2,Ntは非対角成分にノンゼロ１を持つＮν×Ｎν三角行列である。例えば、Ｎν＝３であり、励起信号が２番目の照射が１番目の照射から１周波数瓶だけシフトした２回の照射（Ｎt＝２）から成る場合には、行列Ｆは次の形をとる。
【数１６】
2007537441.tif 000018
【００３３】
式（１５）はＳを推定するために最小二乗推定量を使って逆変換することができる。
【００３４】
符号化照射ラマン分光法（coded illumination Raman spectroscopy）の一例として、石英のキュベット（quartz cuvette、またはセル）中の低密度ブドウ糖溶液からスペクトルが得られた。各スペクトルは単一の励起波長を使用して得られた。本例の照射線波長は以下のものが使用された。
【数１７】
2007537441.tif 000019
【００３５】
図４に示したスペクトルは３５１個のサンプルポイント（標本点）を含む。サンプルポイント数と選ばれた励起波長に基づくと、２番目のラマン線は１番目のラマン線から５サンプルポイントだけシフトされるはずであり、３番目のラマン線は１番目のラマン線から１４サンプルポイントだけシフトされるはずであり、４番目のラマン線は３０サンプルポイントだけシフトされるはずである。この間隔を仮定すると、先述したＦ行列が構築でき、Matlabの最小二乗アルゴリズムを使用して逆変換することができる。推定された非ラマン・スペクトルおよびラマン・スペクトルの結果をそれぞれ図５および図６に示す。
【実施例４】
【００３６】
［ラマン・スペクトルの最小分散推定値（ＭＭＳＥ：Minimum Mean Square Estimate）］
測定ベクトル（あるいは測定値ベクトル）＜ｍ＞は次のように書き表すことができる。
【数１８】
2007537441.tif 000020
ｍは次元ｎ×１を有し、ｓは次元ｐ×１のラマンスペクトルベクトル、Ｎは次元ｎ×１の測定ノイズベクトルである。Ｈは各成分が０≦｜ｈij｜≦１を満たすｎ×ｐの測定行列である。ｎ≧ｐの場合、式（１８）の最小二乗解が存在する。
【００３７】
測定行列Ｈが適切に（例えば列がランクいっぱいに）設計された場合、ラマンスペクトルｓは、次式のような古典的な最小二乗解によって推定することができる。
【数１９】
2007537441.tif 000021
【００３８】
白色ガウスノイズ（ＷＧＮ：White Gaussian Noises）の仮定のもとでは古典的な最小二乗解は線形モデルの最尤推定値（ＭＬＥ：MaximumLikelihood Estimate）に等しくなり得ることにも注意しなければならない。式（１９）の推定値の共分散行列は次のようになる。
【数２０】
2007537441.tif 000022
式（２０）〜（２２）から、平均二乗誤差（ＭＳＥ：mean square error）は以下のように表すことができる。
【数２１】
2007537441.tif 000023
【００３９】
０≦｜ｈij｜≦１の条件で式（２３）のＭＳＥを最小にする測定行列Ｈを見出すことが可能である。自明なケースはＨが単位行列であるときであり、このとき式（２３）のＭＳＥはσ2になる。ＭＳＥがどれだけ小さくなるかについては理論的な限界が存在する場合がある。ＭＳＥは測定行列Ｈを適切に指定することによって最小化することが可能である。導出される最小値はσ2ｎで表すことができる。
【００４０】
Ｈの列は独立であるので、ＨTＨは正定値である。だから、（ＨTＨ）-1も正定値である。行列の正定値性に基づき、（ＨTＨ）-1の対角成分は正値である。
【００４１】
正値系列に対しては、相加平均は相乗平均以上である。このことから、ＭＳＥは次のように表すことができる。
【数２２】
2007537441.tif 000024
【００４２】
Hadamard不等式に基づき、正定値行列に対しては、その対角要素の積はその行列式以上である。この結果を使用すると、式（２４）は次のように表すことが可能である。
【数２３】
2007537441.tif 000025
もう一度、相加平均／相乗平均の不等式を使用すると、式（２５）は以下のように表すことができる。
【数２４】
2007537441.tif 000026
【００４３】
式（２５）および式（２６）を式（２４）に代入すると、ＭＳＥの下限が導出できる。
【数２５】
2007537441.tif 000027
等号はＨが（広義の）直交行列のときに成り立つ。
【００４４】
trace（ＨTＨ）は、Ｈのフロベニウス（Frobenious）ノルムの二乗に等しく、それは基本的に測定行列Ｈの全エネルギーの尺度である。０≦｜ｈij｜≦１の拘束条件のもとでは、trace（ＨTＨ）はｈij＝±１のときに最大になる。
【００４５】
式（２７）における等号は、Ｈが直交行列（ＨTＨが対角行列になるようなもの）であり、ｈij＝±１のときに成立するので、Ｈに対する最適解はHadamard行列（Hadamard matrix）である。
【００４６】
式（２７）における等号はＨが直交行列のときに成り立つ。
【数２６】
2007537441.tif 000028
【００４７】
同形（isomorphic）測定スキーム（ＭＳＥisomorphic＝σ2）と比較すると、Hadamard多重化（multiplexing）のＳＮＲ改善（ＳＮＲimprovement）は次式で与えられる。
【数２７】
2007537441.tif 000029
【００４８】
ＳＮＲの√ｎ改善は、達成可能なベストな理論的改善である。以下のような結果も得られる。
【００４９】
結果１）０≦｜ｈij｜≦１に対しては、ｎ次のHadamard行列は式（２３）を以下のように最小化する。
【数２８】
2007537441.tif 000030
【００５０】
結果２）０≦ｈij≦１に対しては、Ｓ行列（S-matrix）は式（２３）を最小化し、その結果は次式により与えられる。
【数２９】
2007537441.tif 000031
【００５１】
この場合には、Ｓ行列は最適性が証明されていない。しかし、次の結果はＳ行列の次善最適性を保障する。
【００５２】
結果３）０≦ｈij≦１に対しては、ＭＳＥに以下のような理論的下限が存在する。
【数３０】
2007537441.tif 000032
【００５３】
詳細についてはMartin HarwitおよびNeil JA Sloan共著「Hadamard変換光学（Hadamard Transform Optics）」、アカデミックプレス社（Academic Press、１９７９年発行）を参照されたい。
【００５４】
図７に様々な多重化スキームに対するＭＳＥ対ｎのプロットを示す。この図からわかるように、全ての実用上の目的に対しては、Ｓ行列は最適であると見なすことができる。
【実施例５】
【００５５】
［Hadamardスペクトル時間的照射符号化（Hadimard Spectral Temporal illumination coding）］
本発明の実施形態は複数の励起周波数の異なる時間ステップにおけるスペクトル時間的照射スキームを提供し、背景蛍光がなくしかも高いＳＮＲでラマン・スペクトルを再構成する。
【００５６】
Hadamard照射スキームが使用される。次式は８つの異なる励起周波数を使用した一例である。Ｈcode行列は８×８のHadamard行列である。
【数３１】
2007537441.tif 000033
【００５７】
式（３３）の各行は、単一時間ステップに対する符号化スキームを表す。全てのダイオードからのパワーが等しいと（または別にパワー規格化を）仮定すると、各行のプラス（＋）の数とマイナス（−）の数が等しいので蛍光は２つの測定値を引き算することによって削減（低減または削除）できる。各行で表される符号化スキームを遂行するには、その行のプラス（＋）の全てのレーザダイオードが一緒に照射させられ、その後にマイナス−（−）の全てのレーザダイオードが一緒に照射させられる。結果として生じるスペクトルの差分はラマン差分スペクトルを提供するために使用することができる。
【００５８】
レーザダイオードの半数が各時間ステップごとにオンになるので、Hadamard符号化は、集光効率を最大化し、同時にHadamard行列の直交性により測定値の冗長性を最小化する場合がある。さらに、Hadamard行列はその直交性により逆を求める計算効率が高い。
【００５９】
最適な励起周波数シフトは主たるラマンピークの幅と同程度になるよう選ばれることがある。例えば、エタノールのピークは１．２ｎｍの半値全幅（ＦＷＨＭ：full width at half maximum）を有する。分光器の解像度が０．１６ｎｍであれば、実効ピクセルシフトは約１０程度である。以下のシミュレーション全てにおいて、スペクトルチャネルの数は１０００に選ばれる。周波数シフトはレーザダイオードの温度を調整することで正確には制御できないため、励起周波数の間のピクセルシフトは、８〜１２の間において等しい確率でランダムに選ばれる。
【００６０】
平均二乗誤差（ＭＳＥ）は、スペクトル時間的照射システムにおける再構成のメリットを記述するために使用することができる。ノイズ分散測定値がσ2であれば、差分スペクトルにおけるノイズ分散は２σ2である。スペクトルチャネルの数がｎ、Hadamard符号化の測定行列がＨであると仮定すると、再構成のＭＳＥは以下のように表すことができる。
【数３２】
2007537441.tif 000034
【００６１】
実施例７からわかるように、ＭＳＥは励起周波数の数が増えるにしたがって減少する。励起周波数の数は以下の要因によって制限されることがある。
・励起周波数で不変な蛍光が存在する有限な励起窓が存在する。その上、周波数シフトはＦＷＨＭのオーダになければならない。それゆえ、これらの要因は許される励起周波数の最大数を制限することがある。
・より多くの励起周波数は、データを集めるためのより多くの時間、より複雑なエレクトロニクスおよび光学系、そしてより大きな計算負荷を必要とすることがある。
【００６２】
式（３３）における第１行目のHadamard符号化は少し工夫が必要である。そのため、修正されたHadamard符号化が提案されている。４つの励起周波数に対する修正されたHadamard行列は以下のようなものである。
【数３３】
2007537441.tif 000035
次元ｎの修正されたHadamard照射符号化に対するＭＳＥを調べるため、以下のような式を示すことができる。
【数３４】
2007537441.tif 000036
式（３４）を使用することによって、スペクトル再構成のＭＳＥは以下のようになる。
【数３５】
2007537441.tif 000037
式（３７）からわかるように、ＭＳＥは式（３０）に示されたオリジナルのHadamard行列を使用するスペクトル時間的符号化と比べてほぼ２倍になる。
【００６３】
修正されたHadamard符号化の第１行を実施するため、４つ全ての励起周波数のスペクトルが最後の２つの励起周波数のみのスペクトルから引かれる。第２行は同じやり方で使用できる。
【実施例６】
【００６４】
［Hadamard照射符号化からのラマン・スペクトルの再構成］
説明を簡潔にするため、各励起周波数の間のピクセルシフトは１であると仮定する。しかしながら、本例で説明した技法はピクセルシフトが一様でない場合にも拡張することができることは理解されたい。
【００６５】
ＣＣＤ（charge coupled device detector）上にｎ個のピクセルが存在すると仮定すると、元のラマン・スペクトルの４つのシフトバージョンは次のように表すことができる。
【数３６】
2007537441.tif 000038
励起周波数の各組み合わせは式（３８）の１つの行の波長λを励起する。行の様々な組み合わせが符号化パタンに基づいて測定できる。記号Ｘはラマン・スペクトルの期待範囲外にあるスペクトルチャネルを表すが、わずかな関心しかない。ラマン・スペクトルの範囲外にあるスペクトルチャネルは後述する再構成には使用されない。
【００６６】
例えば、式（３５）におけるスペクトル時間的符号化を使用してピクセル数４を議論すると、次の５つの対応する測定値はλ1−λ4を含む。
【数３７】
2007537441.tif 000039
最小二乗法を使用すると、推定スペクトルλ1−λ4が見つけられる。同様に、λ2−λ5はピクセル数５の測定値から再現できる。各逐次代入ごとに、４つのスペクトルチャネルが再構成される。結果を縦に並べた場合、再構成されたラマンシフトの４つのシフトバージョンが以下のように示される。
【数３８】
2007537441.tif 000040
式（４０）における４つの再構成されたスペクトルはラマン・スペクトルの最終的な推定値を与えるために位置合わせして平均化することができる。
【実施例７】
【００６７】
［照射コードのシミュレーション］
図８に励起周波数が全部で８つの一般的な測定値を示す。図８に示すように、ラマン・スペクトルは蛍光および測定ノイズにより曖昧になっている。
【００６８】
図９に８つの励起周波数からの一般的なラマン差分スペクトルを示す。これは２つの測定されたスペクトルを引き算することで得られる。図１０は計算されたラマン・スペクトルである。図１１はＳＥＲＤＳを使用して再構成されたラマン・スペクトルである。
【００６９】
図１２〜図１４はそれぞれ、４個、８個、１６個の励起周波数のHadamardスペクトル時間的符号化を使用して再構成された結果である。図１２〜図１４に示すように、励起周波数の数が増えるにしたがって、再構成のＳＮＲも改善する。
【００７０】
１６個の励起周波数を使用することにより、十分なＳＮＲが得られ、計算およびエンジニアリングの複雑さが低減される。
【００７１】
本発明の実施形態は、ここではHadamard符号化パタンに関して説明されたが、Walsh符号化パタンを含む他の符号化パタンが使用できることは理解されたい。
【００７２】
添付図面および明細書において、本発明の一般的な好ましい実施形態が説明されてきた。上記説明では特定の術語が採用されたが、それらは限定目的ではなく総称的に記述的な意味においてのみ使用されている。さらに、当業者に周知の検出構成および技術が、ここで説明した実施形態の機能および特徴を実現するために使用されることがある。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】励起線源アレイを含む本発明の実施の一形態によるラマン分光システムの概略構成図である。
【図２】広帯域励起線源を含む本発明の実施の更なる一形態によるラマン分光システムの概略構成図である。
【図３】本発明の実施の一形態によるラマン分光方法のフロー図である。
【図４】本発明の実施形態による蛍光およびラマン成分を含むブドウ糖溶液に対する様々な励起波長におけるラマン・スペクトルをグラフで示した図である。
【図５】図４のスペクトルに基づく再構成された蛍光スペクトルをグラフで示した図である。
【図６】図４のスペクトルに基づく再構成されたラマン・スペクトルをグラフで示した図である。
【図７】本発明の実施形態による様々な多重化スキームに対する平均二乗誤差をサイズｎの符号化行列の関数としてグラフで示した図である。
【図８】本発明の実施形態による８つの励起周波数を使用したラマン成分および非ラマン成分を含む一般的なシミュレートされたラマン・スペクトルをグラフで示した図である。
【図９】本発明の実施形態による８つの励起周波数を使用した一般的なラマン差分スペクトルをグラフで示した図である。
【図１０】計算されたラマン・スペクトルを示した図である。
【図１１】従来技術のＳＥＲＤＳを使用して再構成されたスペクトルを示した図である。
【図１２】本発明の実施形態においてスペクトルの非ラマン成分を低減するために４つの励起周波数を使用して再構成したラマン差分スペクトルを示した図である。
【図１３】本発明の実施形態においてスペクトルの非ラマン成分を低減するために８つの励起周波数を使用して再構成したラマン差分スペクトルを示した図である。
【図１４】本発明の実施形態においてスペクトルの非ラマン成分を低減するために１６個の励起周波数を使用して再構成したラマン差分スペクトルを示した図である。
【図１】
2007537441.tif 000041
【図２】
2007537441.tif 000042
【図３】
2007537441.tif 000043
【図４】
2007537441.tif 000044
【図５】
2007537441.tif 000045
【図６】
2007537441.tif 000046
【図７】
2007537441.tif 000047
【図８】
2007537441.tif 000048
【図９】
2007537441.tif 000049
【図１０】
2007537441.tif 000050
【図１１】
2007537441.tif 000051
【図１２】
2007537441.tif 000052
【図１３】
2007537441.tif 000053
【図１４】
2007537441.tif 000054
【国際調査報告】
2007537441.tif 000055