(57)【要約】  記載されているのは、対象における増殖性疾患のｍＴＯＲ阻害剤での処置に対する感受性を決定する方法であって、該対象から得たサンプルにおけるＳ６の発現レベルおよび／またはリン酸化状態を決定する方法、ならびに関連する処置法および使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるｍＴＯＲ阻害剤での処置に対する増殖性疾患の感受性を決定するためのバイオマーカーとしての、Ｓ６の使用。
【請求項２】
ｍＴＯＲ阻害剤での処置のための、増殖性疾患を有する対象を選択するためのバイオマーカーとしての、Ｓ６の使用。
【請求項３】
Ｓ６の発現レベルおよび／またはリン酸化状態の使用を含む、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
リン酸化Ｓ６タンパク質の発現レベルの使用を含む、請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
対象におけるｍＴＯＲ阻害剤での処置に対する増殖性疾患の感受性を決定する方法であって、該対象由来のサンプルにおけるＳ６の発現レベルおよび／またはリン酸化状態を決定することを含む、方法。
【請求項６】
増殖性疾患が癌を含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項７】
ｍＴＯＲ阻害剤がラパマイシンまたはラパマイシン誘導体を含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項８】
ラパマイシン誘導体が４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)ラパマイシンを含む、請求項７記載の方法または使用。
【請求項９】
リン酸化Ｓ６タンパク質の発現レベルの決定を含む、請求項４から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
サンプルが対象の腫瘍由来である、請求項４から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
対照と比較して増加したリン酸化Ｓ６発現レベルが、ｍＴＯＲ阻害剤での処置に対する増殖性疾患の感受性の予測である、請求項４から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ｍＴＯＲ阻害剤のために増殖性疾患を有する対象を選択する方法であって、各対象におけるｍＴＯＲ阻害剤での処置に対する増殖性疾患の感受性を請求項４から１１のいずれかに記載の方法で決定し、そして、ｍＴＯＲ阻害剤での処置のためにリン酸化Ｓ６の発現の増加を示す対象を選択することを含む、方法。
【請求項１３】
処置を必要とする対象における増殖性疾患を処置する方法であって、該対象由来のサンプルにおけるリン酸化Ｓ６の発現レベルを請求項４から１１のいずれかに記載の方法で決定し、そして、リン酸化Ｓ６の発現レベルが上昇しているならば該対象をｍＴＯＲ阻害剤で処置することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、癌のような増殖性疾患の治療剤、特にｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性を決定するためのバイオマーカーに関する。
【０００２】
多くのｍＴＯＲ阻害剤が強力な抗増殖特性を有し、それによりそれらは癌化学療法、特に固形腫瘍、とりわけ進行した固形腫瘍のために有用である。しかしながらｍＴＯＲ阻害剤のさらに的を絞った使用の必要性があり、それはこのような薬剤での処置に応答しそうな患者の同定を必要とする。従って、患者における増殖性疾患、例えば腫瘍のｍＴＯＲ阻害剤での処置に対する応答性を予測できる、例えば臨床試験において有用なバイオマーカーの必要性がある。
【０００３】
驚くべきことに、Ｓ６  ４０Ｓリボソームタンパク質(Ｓ６としても既知)が、増殖性疾患のｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性を予測する有用なバイオマーカーであることが判明した。特に、Ｓ６のリン酸化状態がｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性とよく相関することが、判明した。ｍＴＯＲ阻害剤は、リン酸化Ｓ６の高い発現レベルを示す癌細胞系の処置に使用したとき、著しい抗増殖作用を示す傾向がある。Ｓ６は、ｍＴＯＲタンパク質キナーゼの下流エフェクターであるｐ７０  Ｓ６キナーゼの基質である４０Ｓリボソームサブユニットの構成要素である。Ｓ６の多重リン酸化が、タンパク質合成器官の構成要素をコードするｍＲＮＡの翻訳上方制御に関与しており、そしてそれ自体哺乳類細胞の増殖に重要な役割を有すると考えられている(Volarevic and Thomas, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001, 65:101-27)。ヒトＳ６の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２００２０として入手可能である。
【０００４】
本発明は一つの局面において、ｍＴＯＲ阻害剤での処置に対する増殖性疾患の感受性を決定するためのバイオマーカーとしての、Ｓ６４０Ｓリボソームタンパク質(Ｓ６)、特にリン酸化Ｓ６の使用を提供する。
【０００５】
さらなる局面において、本発明は、対象における増殖性疾患のｍＴＯＲ阻害剤での処置の感受性を決定する方法であって、該対象由来のサンプルにおけるＳ６の発現レベルおよび／またはリン酸化状態を決定することを含む方法を提供する。
【０００６】
他の局面において、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤で処置するための増殖性疾患を有する対象を選択する方法であって、各対象におけるｍＴＯＲ阻害剤での処置に対する増殖性疾患の感受性を上記の方法で決定し、ｍＴＯＲ阻害剤での処置のためにリン酸化Ｓ６の発現の増加を示す対象を選択することを含む、方法を提供する。
【０００７】
本明細書で使用する用語“ｍＴＯＲ阻害剤”は、ラパマイシン(シロリムス)またはその誘導体を含むが、これに限定されない。ラパマイシンは、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)により産生される既知のマクロライド系抗生物質である。ラパマイシンの適当な誘導体は、例えば式Ａ
【化１】
2007519897.tif 000002
〔式中、
Ｒ１ａａはＣＨ３またはＣ３−６アルキニルであり、
Ｒ２ａａはＨまたは−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ、３−ヒドロキシ−２−(ヒドロキシメチル)−２−メチル−プロパノイルまたはテトラゾリルであり、そして
Ｘａａは＝Ｏ、(Ｈ,Ｈ)または(Ｈ,ＯＨ)である。
ただし、Ｘａａが＝Ｏであり、かつＲ１ａａがＣＨ３であるとき、Ｒ２ａａはＨ以外である。〕
の化合物または、Ｒ２ａａが−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨであるとき、そのプロドラッグ、例えば生理学的に加水分解可能なそのエーテル、例えばＲ２ａａが−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−Ａｌｋ(ここで、Ａｌｋは所望により１個または２個の酸素原子で鎖を中断されていてよいＣ１−９アルキルである)である化合物を含む。
【０００８】
式Ａの化合物は、例えばＷＯ９４／０９０１０、ＷＯ９５／１６６９１、ＷＯ９６／４１８０７、ＵＳＰ５,３６２,７１８またはＷＯ９９／１５５３０に記載され、これらは引用により本明細書に包含する。それらはこれらの引用文献に記載の通りまたは記載の方法に準じて製造し得る。
【０００９】
好ましいラパマイシン誘導体は、３２−デオキソラパマイシン、１６−ペント−２−イニルオキシ−３２−デオキソラパマイシン、１６−ペント−２−イニルオキシ−３２(Ｓ)−ジヒドロ−ラパマイシン、１６−ペント−２−イニルオキシ−３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンおよび、より好ましくは、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)ラパマイシンである。ラパマイシン誘導体のさらなる例は、例えばＵＳＰ５,３６２,７１８に記載のＣＣＩ７７９または４０−[３−ヒドロキシ−２−(ヒドロキシメチル)−２−メチルプロパノエート]−ラパマイシンまたは薬学的に許容されるその塩、例えば、ＷＯ９９／１５５３０に記載のＡＢＴ５７８または４０−(テトラゾリル)−ラパマイシン、特に４０−エピ−(テトラゾリル)−ラパマイシンを含む。ラパマイシン誘導体はさらに、例えばＷＯ９８／０２４４１、ＷＯ０１／１４３８７およびＷＯ０３／６４３８３に記載の通りのいわゆるラパログ、例えばＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３６７５またはＡＰ２３８４１も含み得る。ラパマイシン誘導体のさらなる例は、ＴＡＦＡ−９３、バイオリムス−７またはバイオリムス−９の名前で記載されているものである。
【００１０】
特許出願または科学文献の引用が記載されている各場合において、該化合物に関連する対象を引用により本明細書に包含する。同様に包含されるのは、それらの薬学的に許容される塩、対応するラセミ体、ジアステレオ異性体、エナンチオマー、互変異性体ならびに存在するとき、上記化合物の対応する結晶修飾物、例えばその中に記載されている溶媒和物、水和物および多形体である。本発明の組み合わせで活性成分として使用できる化合物は、各々引用文献に記載の通り製造および投与できる。
【００１１】
該増殖性疾患は良性または悪性増殖性疾患、例えば良性前立腺肥大、または新生物疾患、好ましくは悪性増殖性疾患、例えば癌、例えば固形腫瘍、特にＷＯ０２／６６０１９に記載の通りの進行した固形腫瘍である。“固形腫瘍”は、リンパ系癌以外の、腫瘍および／または転移病巣(どこに位置していても)、例えば脳および他の中枢神経系腫瘍(例えば髄膜、脳、脊髄、脳神経および中枢神経系の他の部位の腫瘍、例えば神経膠芽腫または髄質芽細胞腫)；頭頚部癌；乳房腫瘍；循環器系腫瘍(例えば心臓、縦隔および胸膜ならびに他の胸郭内臓器、血管腫瘍および腫瘍が関連する血管組織)；排泄系腫瘍(例えば腎臓、腎盂、尿管、膀胱、他のおよび特定されていない泌尿器臓器)；胃腸管腫瘍(例えば食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、直腸Ｓ状結腸移行部、直腸、肛門および肛門管)、肝臓および肝内胆管、胆嚢、胆管中のその他のおよび非特定部位、膵臓、その他および消化器が関与する腫瘍；頭頚部；口腔(唇、下、歯肉、口腔底、口蓋、および口のその他の部分、耳下腺、および唾液腺のその他の部分、扁桃、中咽頭、鼻咽腔、梨状陥凹、下咽頭、ならびに唇、口腔および咽頭の他の部位)；生殖器系腫瘍(例えば外陰、膣、子宮頚、子宮体、子宮、卵巣、および女性生殖器のその他の部位、胎盤、陰茎、前立腺、精巣、および男性生殖器のその他の部位)；呼吸管腫瘍(例えば鼻腔および中耳、副洞、喉頭、気管、気管支および肺、例えば小細胞肺癌または非小細胞性肺癌)；骨格系腫瘍(例えば肢の骨および関節軟骨、骨関節軟骨およびその他の部位)；皮膚腫瘍(例えば皮膚の悪性黒色腫、非黒色腫皮膚癌、皮膚の基底細胞癌腫、皮膚の扁平上皮細胞癌腫、中皮腫、カポジ肉腫)；および末梢神経および自律神経系、結合および軟部組織、後腹膜および腹膜、眼および付属器、甲状腺、副腎および他の内分泌腺および完全組織を含む他の組織が関与する腫瘍、リンパ節の二次的および特定されていない悪性新生物、呼吸器系および消化器系の二次的悪性新生物ならびにその他の部位の二次的悪性新生物を意味する。前記および後記で、腫瘍、腫瘍疾患、癌腫または癌が記載されているとき、また原発臓器または組織および／またはすべての他の位置における転移病巣が、腫瘍および／または転移病巣の位置がどこであれ、それに変えてまたはそれに加えて包含される。
【００１２】
本発明の方法に従い、このような増殖性疾患を有する対象を、ｍＴＯＲ阻害剤に対する該対象の感受性を予測するためにスクリーニングできる。該方法はインビトロで、例えば該対象由来の生物学的組織サンプル上で行い得る。該サンプルは、例えば組織、細胞系、血漿または血清、細胞または組織溶解物、好ましくは腫瘍組織のような哺乳動物身体から分離された任意の生物学的材料であり得る。該対象は好ましくはヒト対象である。
【００１３】
発現のレベルおよび／またはＳ６のリン酸化状態を、生物学的サンプルにおいて、例えばＲＴ−ＰＣＲの技術を使用した、例えばＲＮＡ発現に基づいた、または例えばイムノアッセイ、免疫沈降および電気泳動アッセイを含むウェスタンブロッティング、免疫組織化学またはＥＬＩＳＡを使用した、例えばタンパク質発現に基づいた技術的手段により、アッセイする。好ましくは該方法は、サンプル中の、(例えばヒト)Ｓ６タンパク質、および特にリン酸化Ｓ６の発現レベルの決定を含む。該方法は、Ｓ６の任意のリン酸化部位のリン酸化の検出を含み得る。例えば、(例えばヒト)Ｓ６のセリン２３５／２３６のリン酸化を決定してよく、より好ましくはＳ６のセリン２４０／２４４のリン酸化を決定する。
【００１４】
例えば、(例えばリン酸化)Ｓ６に特異的な抗体を標準イムノアッセイ形態で使用して、(例えばリン酸化)Ｓ６レベルを測定する。例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着測定法)型のアッセイ、免疫沈降型のアッセイ、慣用のウェスタンブロッティングアッセイおよび免疫組織化学アッセイをまた使用して、バイオマーカータンパク質としてリン酸化Ｓ６のレベルを決定する。
【００１５】
Ｓ６に、例えばＳ６タンパク質にまたはリン酸化Ｓ６に特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体を既知免疫化法に従い産生する。
【００１６】
該リン酸化Ｓ６レベルはまた二次元(２−Ｄ)ゲル電気泳動により測定し得る。２−Ｄゲル電気泳動は当分野で既知であり、典型的に一次元に沿った等電点電気泳動(ＩＥＦ)、続く二次元に沿ったＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を含む。得られた電気泳動図を、例えば、抗体を使用した免疫ブロット分析により分析する。Ｓ６タンパク質またはリン酸化Ｓ６に対する適当な抗体を上記の通り製造できるまたは商業的供給源から得られる(例えばCell Signaling Technology(登録商標)カタログ# 2212;#2215;#2211)。
【００１７】
本発明は、故に、ｍＴＯＲ阻害剤での処置に対する応答性を予測するための、増殖性疾患を有する対象のスクリーニング法であって、上記の方法によりＳ６の発現レベルおよび／またはリン酸化状態を決定することを含む方法を提供する。
【００１８】
さらなる局面において、本発明は処置を必要とする対象における増殖性疾患の処置法であって、対象由来のサンプルにおけるＳ６の発現レベルおよび／またはリン酸化状態を上記の方法により決定し、(例えばリン酸化)Ｓ６の発現レベルが上昇しているならば、該対象をｍＴＯＲ阻害剤で処置することを含む、方法を提供する。
【００１９】
対象の特定組織、例えば腫瘍組織サンプルにおいて見られたレベルを、対照サンプル、例えば該疾患を有しない対照由来の正常組織サンプル、または同じ対象由来の正常(すなわち非腫瘍)サンプルと比較し得る。リン酸化Ｓ６の、例えば対照レベルを超える、上昇したレベルは、ｍＴＯＲ阻害剤の有益な治療効果(すなわち抗増殖効果)の予測である。ｍＴＯＲ阻害剤の使用が指示される上昇したレベルは、当業者により決定してよく、例えばある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤での処置は、サンプルにおけるリン酸化Ｓ６レベルが対照レベルを検出可能に超えるか、または該レベルが対照の少なくとも５０％、１００％、５００％または１０００％高いときに、指示され得る。
【００２０】
さらに、該方法は、各患者について個々に治療を最適化するために、ｍＴＯＲ阻害剤の適切な用量を選択するために使用し得る。例えば、対象由来のサンプルが高いリン−Ｓ６レベルを示すならば低用量のｍＴＯＲ阻害剤を選択でき、またはその逆もあり得る。この内容において考慮すべき因子は、処置している特定の状態、処置している特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、活性化合物の送達部位、活性化合物の特定のタイプ、投与方法、投与の計画、状態の重症度および医師に既知の他の因子を含む。投与すべき活性化合物の有効量はこのような考察により左右され、そして、該疾患の予防、軽減、または処置に必要な最小量である。このような量は、好ましくは宿主に毒性であるか、または宿主に明白な高い感染への感受性を与える用量以下である。ｍＴＯＲ阻害剤の適当な投与量は、例えばＷＯ０２／６６０１９に記載の通りであり、１回用量または分割投与量として、または、間欠的、例えば、１週間に１回の投与で、１日量、例えば約０.１から７０mg、例えば約０.１から２５mg、例えば約０.０５から１０mg活性成分ｐ.ｏ.である。ラパマイシンまたはその誘導体、例えば式Ａの化合物は任意の慣用の経路で、特に経腸的に、例えば経口で、例えば錠剤、カプセル、飲用液の形で、または非経腸的に、例えば注射用溶液または懸濁液の形で投与し得、例えば、約０.１％から約９９.９％、好ましくは約１％から約６０％の活性成分(複数もある)を含む。
【００２１】
実施例１
ヒト腫瘍細胞系、例えば４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)ラパマイシン感受性ＭＣＦ７、ＢＴ５４９またはＬＮＣａｐ系(ｎＭ範囲より下のＩＣ５０)対比較４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)ラパマイシン耐性ＰＣ３Ｍ系(＞１００nM範囲のＩＣ５０)、ならびにＤＵ１４５、ＨＣＣ１９３７およびＭＤＡ−ＭＢ２３１のような適度なラパマイシン感受性(１nM−１００nM範囲のＩＣ５０)の細胞系を９６ウェルプレートに添加し(１００μｌ培地中５００から５０００細胞／ウェル)、２４時間インキュベートする。続いて、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば式Ａの化合物、例えば４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)ラパマイシンの希釈シリーズを別のウェルに作り、該希釈物をウェルに添加する。次いで、細胞を４日間プレインキュベートする。メチレンブルー染色を５日目に行い、結合した色素の量(色素に結合する生存細胞の数に比例)を決定する。その後ＩＣ５０を、Softmax 1.2.0ソフトウェアを使用して決定する。
【００２２】
５０−７０％コンフルエンシーまで培養した上記と同じ腫瘍細胞系を、通常の培養培地(１０％ｖ／ｖ  ＦＣＳ)と共に再供給する。２４時間後、タンパク質溶解物を調製し、２０μｇを電気泳動的に分解し、半乾燥エレクトロブロッティングによりポリビニリデンジフルオリド(ＰＶＤＦ)に移す。ブロットを抗ホスホＳ６または抗Ｓ６タンパク質抗体でプローブし、標識されたタンパク質を増強された化学ルミネッセンスを使用して示す。各細胞系におけるＳ６リン酸化の相対的強度を明らかにし：０(観察されたリン酸化なし)、０.５、１、２、３または４(観察された最大リン酸化)と数字を付ける(numerate)。
【００２３】
同じ細胞系でのリン酸化Ｓ６レベルとｍＴＯＲ阻害剤に対するＩＣ５０測定値の比較は、ｍＴＯＲ阻害剤の増加した抗増殖活性と増加したリン酸化Ｓ６レベルの有意な相関関係を示す(例えばセリン２４０および２４４のＳ６リン酸化[Cell Signaling TechnologyR 抗体カタログ#2215を使用]：Spearman Rank相関分析によりｎ＝７、Ｒ＝−０.７４６、ｐ＝０.００３８４)。同様の相関関係は、リン酸化ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２で同じ分析を行ったとき、観察されなかった(例えばスレオニン２０２およびチロシン２０４のＥＲＫ１／２リン酸化[Cell Signaling TechnologyR 抗体カタログ#9106を使用]；ｎ＝７、Ｒ＝−０.１２３、ｐ＝０.７８１)。
【００２４】
対象における、例えば腫瘍のｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性を予測するために、上記に準じた分析法を、ヒト腫瘍細胞系の代わりに対象由来の腫瘍組織含有サンプルを使用して行い得る。腫瘍組織サンプルから得られたリン酸化Ｓ６レベルを、ｍＴＯＲ阻害剤に対する可能性のある応答性を予測するために、対照組織から得られたもの、またはヒト腫瘍細胞系から得られたデータと比較し得る。
【国際調査報告】
2007519897.tif 000003
2007519897.tif 000004
2007519897.tif 000005
2007519897.tif 000006
2007519897.tif 000007