(57)【要約】誘導性の自然発生癌モデルとして有用なキメラ非ヒト哺乳動物が、開示される。上記非ヒト哺乳動物は、１個以上の遺伝子改変された胚性幹（ＥＳ）細胞を初期段階の胚の中へ導入し、そして次に、その操作された胚を代理母の中へ移植することにより、得られる。上記ＥＳ細胞は、組換えオンコジーンを含む。このＥＳ細胞はまた腫瘍サプレッサ遺伝子を欠失または不活性化する遺伝子変異もまた含み得る。種々の型の癌のモデルが、上記初期段階の胚の中へ導入される上記ＥＳ細胞の中へ種々の組み合わせの遺伝子変異を導入することにより、作製される。
2007503814.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ非ヒト哺乳動物であって、該キメラ非ヒト哺乳動物の一部の細胞は組換えオンコジーンを含むゲノムを含むが、該キメラ非ヒト哺乳動物の細胞すべてが組換えオンコジーンを含むゲノムを含むわけではない、キメラ非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
請求項１に記載の哺乳動物であって、前記オンコジーンは、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、哺乳動物。
【請求項３】
請求項１に記載の哺乳動物であって、前記オンコジーンは、活性化されたオンコジーンである、哺乳動物。
【請求項４】
請求項１に記載の哺乳動物であって、遺伝子変異をさらに含み、該遺伝子変異は、該哺乳動物に、該遺伝子変異を含まない哺乳動物よりも強く、癌に対する感受性を持たせる、哺乳動物。
【請求項５】
請求項１に記載の哺乳動物であって、該哺乳動物は、マウスである、哺乳動物。
【請求項６】
請求項１に記載の哺乳動物であって、前記組換えオンコジーンは、Ｋ−ＲＡＳ、Ｈ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ−ＣＡ、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲンレセプター遺伝子、プロゲステロンレセプター遺伝子、Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＴＧＦα、ＴＧＦ−β、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２  ＰｙＶ  ＭＴ、およびＳＶ４０  ＬＴからなる群より選択される、哺乳動物。
【請求項７】
請求項１に記載の哺乳動物であって、前記遺伝子変異は、腫瘍サプレッサ遺伝子を欠失または不活性化する変異である、哺乳動物。
【請求項８】
請求項７に記載の哺乳動物であって、前記腫瘍サプレッサ遺伝子は、Ｒｂ、Ｐ５３、ＩＮＫ４ａ、ＰＴＥＮ、ＬＡＴＳ、Ａｐａｆ１、Ｃａｓｐａｓｅ  ８、ＡＰＣ、ＤＰＣ４、ＫＬＦ６、ＧＳＴＰ１、ＥＬＡＣ２／ＨＰＣ２またはＮＫＸ３．１、ＡＴＭ、ＣＨＫ２、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡ／ＰＫ、ＸＲＣＣ４またはＭＬＨ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＡＰＣ、ＷＴ、Ｐａｔｃｈｅｄ、およびＦＨＩＴからなる群より選択される、哺乳動物。
【請求項９】
請求項２に記載の哺乳動物であって、前記誘導性プロモーターは、応答エレメントを含み、該応答エレメントの活性は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結されているトランスアクチベーター遺伝子によりコードされるトランスアクチベーターに依存する、哺乳動物。
【請求項１０】
請求項９に記載の哺乳動物であって、前記誘導性プロモーターは、ＴｅｔＯプロモーターである、哺乳動物。
【請求項１１】
非ヒト哺乳動物胚性幹細胞であって、該非ヒト胚性幹細胞はゲノムを含み、該ゲノムは、
（ａ）誘導性プロモーターに作動可能に連結されている組換えオンコジーン；および
（ｂ）遺伝子変異であって、該哺乳動物に、該遺伝子変異を含まない哺乳動物よりも強く、癌に対する感受性を持たせる遺伝子変異
を含む、胚性幹細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の胚性幹細胞であって、該細胞は、マウス胚性幹細胞である、胚性幹細胞。
【請求項１３】
請求項１１に記載の胚性幹細胞であって、前記組換えオンコジーンは、ＨＥＲ２、Ｋ−ＲＡＳ、およびＥＧＦＲからなる群より選択される、胚性幹細胞。
【請求項１４】
請求項１１に記載の胚性幹細胞であって、前記オンコジーンは、活性化されたオンコジーンである、胚性幹細胞。
【請求項１５】
請求項１１に記載の胚性幹細胞であって、前記遺伝子変異は、腫瘍サプレッサ遺伝子を欠失または不活性化する変異である、胚性幹細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の胚性幹細胞であって、前記腫瘍サプレッサ遺伝子は、Ｉｎｋ４ａ、Ｐ５３およびＰＴＥＮからなる群より選択される、胚性幹細胞。
【請求項１７】
請求項１１に記載の胚性幹細胞であって、前記誘導性プロモーターは、応答エレメントを含み、該応答エレメントの活性は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結されているトランスアクチベーター遺伝子によりコードされるトランスアクチベーターに依存する、胚性幹細胞。
【請求項１８】
請求項１７に記載の胚性幹細胞であって、前記誘導性プロモーターは、ＴｅｔＯプロモーターである、胚性幹細胞。
【請求項１９】
請求項１１に記載の胚性幹細胞に由来する、分化した細胞。
【請求項２０】
請求項１１に記載の胚性幹細胞に由来する、癌細胞。
【請求項２１】
請求項１に記載のキメラ非ヒト哺乳動物を得るための方法であって、
（ａ）組換えオンコジーンを含む胚性幹細胞を提供する工程、
（ｂ）該胚性幹細胞を宿主非ヒト哺乳動物の胚の中へ導入することにより、操作された胚を作製する工程、および、
（ｃ）該操作された胚を代理母の中へ移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記胚性幹細胞は、前記胚の中へ注入により導入される、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
トランスジェニック技術およびノックアウト技術は、実験動物（例えば、マウス）におけるヒト遺伝子変異のシミュレーションを可能にした。しかしながら、複数の遺伝子変異を含む複雑な疾患モデルを作製することは、１匹の動物において望ましい対立遺伝子の組み合わせを得るために種々の動物系を交配する必要性に起因して、時間のかかるプロセスである。それらの細胞の相当な数において複数の遺伝子変異を保有し、かつ疾患（例えば、癌）の傾向のあるような動物を、迅速に産生する必要性がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
（発明の要旨）
非ヒト哺乳動物胚性幹（ＥＳ）細胞において、上記ＥＳ細胞の多分化能を維持しながら２個よりも多くの遺伝子改変を作製することが可能であることが、発見された。加えて、組換えオンコジーンを含む胚性幹細胞が初期段階の胚の中へ注入された場合、結果として生じるキメラ哺乳動物は、有用なインビボ癌モデルであることが、発見された。本発明のこのようなキメラ動物は、上記キメラ動物の遺伝子改変された細胞に存在する遺伝子改変と同じ遺伝子改変を含む、従来のトランスジェニック動物を超える特定の利点を提供する。
【０００３】
これらの発見に部分的に基づき、本発明は、キメラ非ヒト哺乳動物を提供する。そのキメラ非ヒト哺乳動物の細胞の一部は組換えオンコジーンを含むが、このキメラ非ヒト哺乳動物の細胞すべてが組換えオンコジーンを含むわけではない。本発明のいくつかの実施形態において、上記組換えオンコジーン（例えば、活性化されたオンコジーン）は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。本発明のいくつかの実施形態において、組換えオンコジーンを含む上記細胞はまた、上記哺乳動物に、上記遺伝子変異を含まない哺乳動物よりも強い、癌に対する感受性を持たせる遺伝子変異を含む。本発明の好ましい実施形態においては、上記非ヒト哺乳動物は、マウスである。
【０００４】
本発明の哺乳動物において有用な組換えオンコジーンの例としては、ＨＥＲ２、Ｋ−ＲＡＳ、およびＥＧＦＲが挙げられる。上記哺乳動物に、癌に対する増大した感受性を持たせるために有用な遺伝子変異の例は、腫瘍サプレッサ遺伝子を欠失または不活性化する変異である。本発明の哺乳動物において欠失または不活性化され得る腫瘍サプレッサ遺伝子の例は、Ｉｎｋ４ａ、Ｐ５３およびＰＴＥＮである。本発明のいくつかの実施形態においては、上記誘導性プロモーターは、組織特異的プロモーターに作動可能に連結されているトランスアクチベーター遺伝子によりコードされているトランスアクチベーターに活性が依存する、応答エレメントを含む。このような誘導性プロモーターの例は、ＴｅｔＯ（テトラサイクリンオペレーター）プロモーターである。
【０００５】
本発明は、非ヒト哺乳動物ＥＳ細胞を提供する。この非ヒト哺乳動物ＥＳ細胞は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている組換えオンコジーンと；上記ＥＳ細胞由来の細胞を含む哺乳動物に、上記ＥＳ細胞由来の細胞を含まない哺乳動物よりも強い、癌に対する感受性を持たせる遺伝子変異とを含む、ゲノムを含む。本発明の好ましい実施形態においては、上記ＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞である。
【０００６】
本発明はまた、本発明のＥＳ細胞由来の分化した細胞、および本発明のＥＳ細胞由来の癌細胞を、提供する。
【０００７】
本発明は、キメラ非ヒト哺乳動物を得るための方法を提供する。このキメラ非ヒト哺乳動物の細胞の一部は（ａ）組換えオンコジーンと（ｂ）遺伝子変異とを含むゲノムを含むが、このキメラ非ヒト哺乳動物の細胞すべてが上記ゲノムを含むわけではない。（ａ）上記組換えオンコジーンは、誘導性プロモーターに作動可能に連結している；（ｂ）上記遺伝子変異は、その遺伝子変異を含む哺乳動物に、その遺伝子変異を含まない哺乳動物よりも強く、癌に対する感受性を持たせる。その方法は、
（ａ）非ヒト哺乳動物ＥＳ細胞を提供する工程であって、その非ヒト哺乳動物ＥＳ細胞は、誘導性プロモーターに作動可能に連結された組換えオンコジーンと；上記ＥＳ細胞由来の細胞を含む哺乳動物に、上記ＥＳ細胞由来の細胞を含まない哺乳動物よりも強い、癌に対する感受性を持たせる遺伝子変異とを含む、ゲノムを含む、工程；
（ｂ）上記ＥＳ細胞を宿主非ヒト哺乳動物の胚の中へ（例えば、注入により）導入し、それにより、操作された胚を作製する工程、および
（ｃ）上記操作された胚を代理母の中へ移植する工程、
を包含する。
【０００８】
他のように定義しない限り、本明細書において使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野において一般に理解されているものと同じ意味を有する。代表的な方法および材料が以下に記載されるが、本明細書中に記載される方法および材料と同様または同等な方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用され得る。本明細書で言及されるすべての刊行物および他の参考文献は、本明細書中に参考としてそれらの全体が援用される。矛盾がある場合、定義を含めた本明細書が、支配する。材料、方法、および実施例は、例示であるに過ぎず、限定することを意図しない。本明細書および特許請求の範囲全体を通して、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはその変化形（例えば、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）は、記載された整数または整数の群を含むことを意味するが、他のどんな整数も整数の群も排除することは意味しないことが、理解される。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明において記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（発明の詳細の説明）
本発明は、疾患の発症（例えば、腫瘍の発生）における所定のタンパク質の役割、遺伝子変異の状況依存性発癌能、器官の発達（生存を含む）における所定のタンパク質の毒性を研究する方法を特徴とする。本発明はまた、これらの方法において有用である細胞（例えば、ゲノム中に２つよりも多くの（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つの）組換え型（すなわち、自然に起こらない）遺伝子改変を有する、ＥＳ細胞）を特徴とする。本発明はまた、キメラ非ヒト哺乳動物を特徴とし、そのキメラ非ヒト哺乳動物の細胞の一部は、その哺乳動物における他の細胞とは遺伝的に異なり、そしてそのようなＥＳ細胞に由来する。この動物は、上記ＥＳ細胞が注入された、多細胞の初期段階の胚（例えば、胚盤胞）より産生される。好ましい実施形態において、上記キメラ動物は、疾患易発性（ｄｉｓｅａｓｅ−ｐｒｏｎｅ）であり、そして疾患（例えば、癌）を発症する。上記ＥＳ細胞およびそのＥＳ細胞が中に注入される胚盤胞が同じ動物系に由来する場合、そのキメラ哺乳動物はまた、モザイク動物とも呼ばれる。上記のＥＳ細胞注入方法に加え、モザイク動物はまた、望まれる遺伝子要素を含むウイルス構築物に感染している胚からも発生し得る。
【００１０】
生殖細胞系列のトランスジェニックモデルと同じ遺伝子設計を保存するが、本発明のキメラモデルは、複数の遺伝子が関与する疾患を研究するための新たな利点を提供する。上記キメラモデルは、疾患モデルの開発の速度および柔軟性を有意に改善した。例えば、Ｃｈｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４００：４６８−４７２（１９９９）に記載されるトランスジェニック黒色腫モデルを作製するためには、４つの別個の遺伝子改変−ホモ接合性ＩＮＫ４ａヌル変異（すなわち、両方のＩＮＫ４ａ対立遺伝子におけるヌル変異）、Ｔｙｒ−ｒｔＴＡ導入遺伝子、およびｔｅｔＯ−Ｈ−ｒａｓ導入遺伝子−を有する３つの動物系統を交配して、４つの遺伝子改変全てを有するトランスジェニック動物を得なくてはならない。これは、多くの時間を必要とする。対照的に、本発明のキメラ黒色腫モデルは、交配を必要としない。４つの遺伝子改変全てを有するＥＳ細胞を樹立し、そしてそれらのＥＳ細胞を胚盤胞の中へ注入することのみ、必要とされる。この胚盤胞は、代理母の子宮の中へ移植されると、インタクトな動物へと発生する。節約される平均時間は、１年間もの長さであり得る。種々の疾患のための動物モデルを樹立するためには、ＥＳ細胞の中へ、遺伝子変異の種々のセットまたは組み合わせを導入することのみが必要とされる。
【００１１】
本発明のキメラモデルは、初期発生において重要な遺伝子の研究をさらに可能にする。なぜなら、上記キメラモデルは、キメラ現象の程度と動物の生存度との間の定性的な相関関係を提供するからである。上記キメラモデルはまた、抗癌治療の試験のための媒介手段を提供する。
【００１２】
本発明は、ＥＳ細胞技術における主要な障害を克服した。本発明の前は、組換えＤＮＡ技術を通じて２つよりも多い遺伝子改変に供されたＥＳ細胞は、分化する傾向があり、そして多分化能を喪失する傾向があると、広く信じられていた。
【００１３】
（Ｉ．遺伝子改変ＥＳ細胞）
本発明のＥＳ細胞系統は、そのゲノム中に２つよりも多くの組換え型遺伝子改変を含む。上記ＥＳ細胞系統は、２つよりも多くの核酸構築物をＥＳ細胞中に同時または順に導入することにより樹立され得、各々の構築物は、宿主ゲノムの遺伝子改変を引き起こす１つ以上の遺伝子エレメントを含み得る。これらの遺伝子エレメントはまた、１つの単一ベクター（例えば、ＢＡＣベクター、ＰＡＣベクター、ＹＡＣベクターまたはＭＡＣベクター）の中に挿入され得る。
【００１４】
代表的な遺伝子エレメントとしては、オンコジーン、ＲＮＡ干渉構築物、選択マーカー遺伝子（例えば、薬物選択マーカー遺伝子および蛍光タンパク質をコードする遺伝子または発光タンパク質をコードする遺伝子）、および内因性の疾患抑制遺伝子（例えば、腫瘍サプレッサ遺伝子）を標的とするノックアウト構築物が挙げられる。望ましい遺伝子エレメントは、上記ゲノムの中に無作為に、または標的化された位置に、組み込まれ得る。
【００１５】
標的化された遺伝子改変は、遺伝子疾患に関与する内因性遺伝子（例えば、神経変性疾患に関与する内因性遺伝子（例えば、アルツハイマー病におけるＡＰＰ遺伝子、およびルー・ゲーリグ病におけるＳＯＤ−１遺伝子）、心臓病に関与する内因性遺伝子（例えば、心臓病および口蓋心顔面症候群におけるＴＢＸ−１遺伝子またはＴＢＸ−５遺伝子）、糖尿病に関与する内因性遺伝子（例えば、ＩＩ型糖尿病におけるＡＫＴ遺伝子）、および自己免疫疾患）における特定の位置に、望ましい変化を導入し得る。上記変化の例としては、腫瘍サプレッサ遺伝子に対するヌル（ノックアウト）変異、または細胞オンコジーンに対する活性化変異（ノックイン）が挙げられる。例えば、腫瘍サプレッサ遺伝子のコード領域または調節領域を、一対のＬｏｘＰ部位により挟まれた選択マーカー遺伝子で置換しえ得るか；または腫瘍サプレッサ遺伝子中にドミナントネガティブな変異を挿入し得るか；または細胞オンコジーンの天然のプロモーターを構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターで置換し得るか；または細胞オンコジーン中に活性化変異を挿入し得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：１１１１−６（２００１）を参照のこと）。このような遺伝子改変は、相同組換えにより達成され得る。相同組換えのために使用される核酸構築物において、宿主ゲノムの中に導入される上記遺伝子改変は、上記標的ゲノム領域に相同な配列により挟まれる。
【００１６】
本発明のキメラ疾患モデルの樹立において有用であるオンコジーンとしては、Ｋ−ＲＡＳをコードするオンコジーン、Ｈ−ＲＡＳをコードするオンコジーン、Ｎ−ＲＡＳをコードするオンコジーン、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）をコードするオンコジーン、ＭＤＭ２をコードするオンコジーン、ＴＧＦ−βをコードするオンコジーン、ＲｈｏＣをコードするオンコジーン、ＡＫＴファミリーのメンバーをコードするオンコジーン、ｍｙｃ（例えば、ｃ−ｍｙｃ）をコードするオンコジーン、β−カテニンをコードするオンコジーン、ＰＤＧＦをコードするオンコジーン、Ｃ−ＭＥＴをコードするオンコジーン、ＰＩ３Ｋ−ＣＡをコードするオンコジーン、ＣＤＫ４をコードするオンコジーン、サイクリンＢ１をコードするオンコジーン、サイクリンＤ１をコードするオンコジーン、エストロゲンレセプター遺伝子をコードするオンコジーン、プロゲステロンレセプター遺伝子をコードするオンコジーン、Ｈｅｒ２（ｎｅｕまたはＥｒｂＢ２としても公知）をコードするオンコジーン、他のＥｒｂＢ遺伝子（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４が挙げられる）をコードするオンコジーン、ＭＡＰＫシグナル伝達経路における遺伝子をコードするオンコジーンおよびＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路における遺伝子をコードするオンコジーン、ＴＧＦαをコードするオンコジーン、ｒａｓ−ＧＡＰをコードするオンコジーン、Ｓｈｃをコードするオンコジーン、Ｎｃｋをコードするオンコジーン、Ｓｒｃをコードするオンコジーン、Ｙｅｓをコードするオンコジーン、Ｆｙｎをコードするオンコジーン、Ｗｎｔをコードするオンコジーン、およびＢｃｌ２抗アポトーシスファミリーのメンバー（例えば、Ｂｃｌ２）をコードするオンコジーンならびにそれらの活性化された形態をコードするオンコジーン、およびウイルスタンパク質（例えば、Ｐｙｖ  ＭＴ抗原およびＳＶ４０  Ｔ抗原）をコードするオンコジーンが挙げられるが、これらに限定されない。これらのオンコジーンの活性化変異（例えば、Ｈｅｒ２Ｖ６６４Ｅ、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ、およびβ−カテニンΔ１３１）もまた、使用され得る。
【００１７】
上記キメラ疾患モデルの樹立において腫瘍サプレッサ遺伝子の不活性化が有用である腫瘍サプレッサ遺伝子としては、Ｒｂ、Ｐ５３、ＩＮＫ４ａ、ＰＴＥＮ、ＬＡＴＳ、Ａｐａｆ１、Ｃａｓｐａｓｅ  ８、ＡＰＣ、ＤＰＣ４、ＫＬＦ６、ＧＳＴＰ１、ＥＬＡＣ２／ＨＰＣ２またはＮＫＸ３．１が挙げられる。腫瘍サプレッサ遺伝子の他の例としては、ＤＮＡ損傷修復に関与する遺伝子（例えば、ＡＴＭ、ＣＨＫ２、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡ／ＰＫ、ＸＲＣＣ４、またはＭＬＨ１）、および細胞シグナル伝達ならびに細胞分化に関与する遺伝子（例えば、１型神経線維腫症、２型神経線維腫症、大腸腺腫性ポリポーシス、ウィルムス腫瘍サプレッサタンパク質、ＰａｔｃｈｅｄまたはＦＨＩＴ）が挙げられる。標的化された変異に加えて、腫瘍サプレッサ遺伝子（または他の任意の疾患抑制遺伝子）は、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、または宿主のゲノムの中に安定に組み込まれた構築物より発現されるリボザイム物質により、不活性化され得る。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態において、上記キメラ疾患モデルは、導入された活性オンコジーンならびに１つ以上の不活性化された内因性の腫瘍サプレッサ遺伝子を含む、ＥＳ細胞より発生する。例えば、上記ＥＳ細胞は、減少したｐ１６ＩＮＫ４ａまたはｐ１９ＡＲＦの発現との組み合わせで活性化された形態のＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ＊と呼ぶ）の発現が結果として生じる遺伝子改変（例えば、ＥＧＦＲ＊＋遺伝子型およびＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ−／−遺伝子型を産生する遺伝子改変）；減少したｐ５３の発現との組み合わせでＰＤＧＦの発現が結果として生じる遺伝子改変（例えば、ＰＤＧＦ＋遺伝子型およびｐ５３−／−遺伝子型を産生する遺伝子改変）；減少したｐ５３の発現との組み合わせでＴＧＦαの発現が結果として生じる遺伝子改変（例えば、ＴＦＧα＋遺伝子型およびｐ５３−／−遺伝子型を産生する遺伝子改変）；ならびに減少したＰＴＥＮ発現および減少したｐ１６ＩＮＫ４ａまたはｐ１９ＡＲＦの発現が結果として生じる遺伝子改変（例えば、ＰＴＥＮ−／−遺伝子型およびＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ−／−遺伝子型を産生する遺伝子改変）を含み得る。
【００１９】
肺癌モデルの産生のための遺伝子改変の適切なセットの例は、ＴｅｔＯ−ＥＧＦＲ＊、ＣＣＳＰ−ｒｔＴＡ、ｐ５３−／−、ＴｅｔＯ−ルシフェラーゼおよびＰＧＫ−プロマイシン（選択的抗生物質耐性マーカー）である。結腸癌モデルの産生のための遺伝子改変の適切なセットの例は、ＴｅｔＯ−Ｋ−ＲＡＳ、ビリン−ｒｔＴＡ、ＡＰＣ−／−、ＴｅｔＯ−ルシフェラーゼおよびＰＧＫ−プロマイシンである。グリア芽細胞腫癌モデルの産生のための遺伝子改変の適切なセットの例は、ＴｅｔＯ−ＥＧＦＲ＊、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）−ｒｔＴＡ、ｐ５３−／−、ＴｅｔＯ−ルシフェラーゼおよびＰＧＫ−プロマイシンである。前立腺癌モデルの産生のための遺伝子改変の適切なセットの例は、ＴｅｔＯ−ＡＫＴ１、プロバシン（ｐｒｏｂａｓｉｎ）−ｒｔＴＡ、Ｒｂ−／−、ＴｅｔＯ−ルシフェラーゼおよびＰＧＫ−プロマイシンである。肝臓癌モデルの産生のための遺伝子改変の適切なセットの例は、ＴｅｔＯ−βカテニン、ＡｐｏＥ−ｒｔＴＡ、ＮＦ１−／−、ＴｅｔＯ−ルシフェラーゼおよびＰＧＫ−プロマイシンである。
【００２０】
種々のベクターが、本発明のための核酸構築物を作製するために使用され得る。これらのベクターは、プラスミドまたはウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、およびレンチウイルス）を基礎とし得る。上記ベクターは、種々の方法を介してＥＳ細胞の中へ導入され得る。この種々の方法としては、細胞融合（例えば、スフェロプラスト融合）、リポソーム融合（トランスポゾーム（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ））、従来の核酸トランスフェクション法（例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション）、およびウイルスベクターによる感染が挙げられるが、これらに限定されない。種々の方法が、上記の望ましい遺伝子改変が安定に組み込まれたＥＳ細胞をスクリーニングするために使用され得る。このような方法としては、薬物選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子、またはハイグロマイシン耐性遺伝子）が共導入されている場合は、薬物耐性の検出；蛍光／生物発光マーカー遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、黄色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、青色蛍光タンパク質をコードする遺伝子または赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、およびルシフェラーゼ遺伝子）が共導入されている場合は、蛍光／生物発光の放出の検出；ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）；およびサザンブロット分析が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
上記ＥＳ細胞は、誘導性様式にて調節される核酸配列を含むように遺伝子改変され得る。例えば、導入されたオンコジーンまたはＲＮＡ干渉配列は、誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンにより調節されるプロモーター系（例えば、ＷＯ  ０１／０９３０８に記載される））の制御下に配置され得る。この場合は、食物または飲料水を介して、少なくとも一部の細胞がこれらの遺伝子改変されたＥＳ細胞に由来するキメラ動物へと誘発剤（例えば、テトラサイクリンまたはドキシサイクリン）を投与すると、結果として上記オンコジーンまたはＲＮＡｉ産物を発現させ得る。他の誘導性プロモーターとしては、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、ＩＰＴＧ／ｌａｃＩプロモーター系、エクジソンプロモーター系、および翻訳または転写についての阻害配列を不可逆的に欠失させるための「ｌｏｘ  ｓｔｏｐ  ｌｏｘ」系が挙げられるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターに代わる、疾患を誘発する遺伝子の発現はまた、上記遺伝子のポリペプチド産物を、例えば、エストロゲンレセプターポリペプチド配列に融合することにより誘導的にスイッチをオンまたはオフにされ得、この場合、エストロゲンまたはエストロゲンアナログ（例えば、ヒドロキシタモキシフェン）の投与によって、上記ポリペプチドを正しく折りたたみ機能性タンパク質にすることを可能にする。
【００２２】
上記の導入されたポリペプチドコード配列または干渉ＲＮＡコード配列はまた、一般的な、構成的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１α、レトロウイルスＬＴＲ、およびＳＶ４０初期領域）の下流に配置され得る。あるいは、上記コード配列は、組織特異的プロモーター（例えば、黒色腫細胞またはメラニン細胞の場合は、チロシナーゼプロモーターまたはＴＲＰ２プロモーター；乳房細胞および／または乳癌の場合は、ＭＭＴＶプロモーターまたはＷＡＰプロモーター；腸細胞および／または腸癌の場合は、ビリンプロモーターまたはＦＡＢＰプロモーター；膵細胞の場合は、ＰＤＸプロモーター；膵ベータ細胞の場合は、ＲＩＰプロモーター；ケラチノサイトの場合は、ケラチンプロモーター；前立腺上皮の場合は、プロバシンプロモーター；中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞および／または中枢神経系の癌の場合は、ネスチンプロモーターまたはＧＦＡＰプロモーター；ニューロンの場合は、チロシンヒドロキシラーゼ、Ｓ１００プロモーターまたは神経フィラメントプロモーター；Ｅｄｌｕｎｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６（１９８５）に記載される、膵臓特異的プロモーター；肺癌の場合は、クラーラ細胞分泌タンパク質プロモーター；および、心細胞の場合は、αミオシンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【００２３】
発生的に調節されるプロモーターもまた、選択され得る。それらとしては、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９（１９９０））およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６（１９８９））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
適切なキメラ現象を提供する任意のＥＳ細胞系統が、本発明において使用され得る。上記細胞系統としては、Ｅ１４．１、ＷＷ６、ＣＣＥ、Ｊ１、およびＡＢ１が挙げられるが、これらに限定されない。Ａｌｅｘ  Ｊｏｙｎｅｒ編、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章（Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、（２０００）もまた、参照のこと。いくつかの実施形態においては、上記ＥＳ細胞系統は、１０％以上のキメラ現象を提供する。いくつかの実施形態においては、上記ＥＳ細胞系統は、９０％以上のキメラ現象を提供する。
【００２５】
（ＩＩ．キメラ非ヒト動物）
本明細書で使用される場合、「キメラ（キメラの）」とは、個体発生に関するキメラを意味する。したがって、キメラ非ヒト哺乳動物は、少なくとも１つの遺伝子改変ＥＳ細胞が注入または凝集した多細胞胚から、直接的に成長した（すなわち、発生した）動物である。本発明のキメラ非ヒト哺乳動物は、異種移植片（例えば、別の動物からの器官移植片、組織移植片、または腫瘍移植片）を受けた、形態学的に発生した動物と区別されるべきである。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「非ヒト哺乳動物」とは、ヒト以外の任意の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ハムスターまたはモルモット）を意味する。
【００２７】
本発明のキメラ非ヒト哺乳動物は、ＥＳ細胞を宿主の胚の中に導入することにより、産生され得る。これは、例えば、胚盤胞注入または早期段階の着床前の胚（例えば、８細胞胚）との凝集によりなされ得る。上記胚は、引き続いて、妊娠のために代理母の中へ移される。その生まれた動物におけるキメラ現象は、表現型（例えば、上記宿主の胚および上記ＥＳ細胞が異なる毛色の動物系由来である場合は、毛色）、ＰＣＲ、サザンブロット分析、または多型遺伝子（例えば、グルコースリン酸イソメラーゼ）の生化学的分析もしくは分子的分析により、決定され得る。望ましい遺伝子改変を有するキメラ動物の同定を容易にするために、検出可能なレポーター遺伝子と上記望ましい遺伝子改変とを、上記ＥＳ細胞の中に共注入させ得る。代表的なレポーター遺伝子としては、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質）をコードする遺伝子または発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼもしくはβ−ガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２８】
特定の組織への導入されたＥＳ細胞の寄与を増大させるために、その組織を発生させることを欠く宿主の胚を使用し得る。これは、任意の適切な方法により達成され得、その任意の適切な方法としては、特定の細胞型における毒素遺伝子（例えば、ジフテリア毒素）の誘導発現、またはこの細胞型の発生のために必要な遺伝子の組織特異的な欠失が挙げられる。このような相補系において、上記望ましい細胞型または組織のすべての細胞またはほとんどの細胞は、上記導入されたＥＳ細胞由来となる。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態において、上記非ヒト哺乳動物は、免疫無防備状態または免疫不全である。このような動物において、疾患はより早くおよび／または急速に発症し得る。このような動物を発達させるために、例えば、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ動物、またはＲＡＧ１−／−動物もしくはＲＡＧ２−／−動物由来の胚盤胞が使用され得る。
【００３０】
本発明のキメラ動物は、導入されたＥＳ細胞に由来する疾患を発症させるために効率的なモデルを提供する。本発明の誘導可能な癌モデルにおいて、上記動物は、オンコジーン発現の誘導の数ヶ月以内に癌を発症し得る。上記動物はまた、このプロセスを促進させるために発癌物質（例えば、９，１０−ジメチル−１，２−ベンズアントラセンまたはＥＮＵ）で処理され得る。
【００３１】
本発明のキメラ動物モデルは、種々の疾患モデルを開発する際における柔軟性を提供する。例えば、腫瘍サプレッサ遺伝子（例えば、ｐ５３）をノックアウトすること、およびレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）、組織特異的リバーステトラサイクリントランスアクチベーター遺伝子（すなわち、ＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ）、ならびに選択したオンコジーン（例えば、Ａｋｔ、Ｈｅｒ２Ｖ６６４Ｅ、Ｈｅｒ２、Ｂｃｌ２、Ｋ−ＲａｓおよびサイクリンＤ１）を、リバーステトラサイクリントランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）により調節されるプロモーターの制御下に導入することにより、種々の癌モデルのためにＥＳ細胞系統が樹立され得る。これらの癌モデルは、種々の病因の癌の比較研究、および癌の発症における種々のオンコジーンの比較研究を可能にする。
【００３２】
（ＩＩＩ．代表的な使用）
本発明のキメラ動物およびその動物由来の疾患細胞は、特定の疾患（例えば、癌）のイニシエーション、進行、維持、退縮、最小残存疾患、再発、または他の任意の発生段階を描写するために使用され得る。それらはまた、薬物標的の同定、標的の確認、および薬物開発の間の効力試験のために使用され得る。
【００３３】
（Ａ．新規な癌関連遺伝子の同定）
本発明のキメラ癌モデルは、任意の遺伝子の発癌能を検査するため、および新規な癌関連遺伝子を同定するために、使用され得る。例えば、候補オンコジーンおよび内因性の腫瘍サプレッサ遺伝子（または上記腫瘍サプレッサ遺伝子を標的とするＲＮＡｉ構築物）のヌル変異が、ＥＳ細胞の中に共導入され得る。上記ヌル変異のみを含むＥＳ細胞由来の対照動物における癌と比較して、結果としてキメラ動物における上記ＥＳ細胞由来の癌の高い発生率または短い潜伏期間は、上記候補遺伝子がオンコジーンであることを示す。
【００３４】
加えて、ＥＳ細胞を介して導入されたオンコジーンの発現が原因である癌を有するキメラ動物について遺伝子発現プロフィールが、確立され得る。次に、癌の発達の種々の段階における遺伝子発現プロフィールの比較が、発現パターンが変化する遺伝子を同定するために実施され得る。遺伝子発現プロフィールを確立させるために使用される技術としては、（細胞培養における）抑制サブトラクションの使用、ディファレンシャルディスプレイ、プロテオミック分析、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）および比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）が挙げられる。ハイスループットプロファイリングを可能にするために、ｃＤＮＡマイクロアレイおよび／またはオリゴヌクレオチドマイクロアレイが、使用され得る。
【００３５】
別々の動物モデルを同じ型の癌になりやすくする異なる遺伝子改変を含む、別々の動物モデルにおける遺伝子発現プロフィールが、腫瘍関連遺伝子を同定するために比較され得る。以下に述べられるように、代理バイオマーカー（例えば、Ａｋｔ、Ｈｅｒ２、Ｂｃｌ−２、Ｋ−ｒａｓおよびサイクリンＤ１の任意の１つの過剰発現、またはこれらの遺伝子の任意の活性化変異（例えば、Ｈｅｒ２Ｖ６６４Ｅ））が、乳癌を引き起こし得る。これらの遺伝子のうちの１つに変異を各々が含む、異なるキメラ動物より単離された乳癌組織における遺伝子発現プロフィールの比較により、乳癌の発達（イニシエーション、維持および再発を含む）に関与する異なる経路についての情報を取得し得る。この情報は、異なる遺伝子の損傷により引き起こされた乳癌のための治療用のレジメンの決定において、価値あるものとなる。
【００３６】
（Ｂ．代理バイオマーカーの同定）
本発明のキメラ動物はまた、診断のための代理バイオマーカーを同定するため、または非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、または非ヒト霊長類）における疾患の進行を追跡するために、使用され得る。上記バイオマーカーは、疾患を発症したキメラ動物の発現プロフィールと、上記疾患を発症していないキメラ動物の発現プロフィールとの間の差に基づいて同定され得る。上記動物からの血液、尿または他の体液は、上記疾患の発生、維持、進行または退縮の間に上記疾患組織から循環の中にどのバイオマーカーが放出されるかを決定するために、ＥＬＩＳＡまたは他のアッセイを用いて試験され得る。このような診断は、上記バイオマーカーの発現レベルまたは活性レベルの検出を含み得、対照と比較して異常に高いレベル（例えば、すくなくとも約５０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、または３００％高い）は、異常な状態を示している。これらのバイオマーカーは、疾患治療後の疾患退縮の後において、特に臨床的に有用である。これらのバイオマーカーはまた、任意の疾患治療の毒性を評価するために、臨床的に使用され得る。
【００３７】
（Ｃ．治療剤の同定）
本発明のキメラ動物は、疾患を処置するための治療剤をスクリーニングするために使用され得る。このような方法の１つは、癌を発症した動物へ候補化合物を投与する工程を包含する。次に、その癌に対する上記化合物の効果が、少しでもある場合は、観察され得る。例えば、腫瘍の大きさ、転移、または新脈管形成が測定され得る。あるいは、上記癌のためのバイオマーカーの発現レベルまたは活性レベルに対する上記化合物の効果が、観察され得る。
【００３８】
（Ｄ．器官の生存または機能のために重要な遺伝子の同定）
器官の生存または機能のために重要な遺伝子を同定するために、候補遺伝子において遺伝子改変を有する細胞を含む器官における再生を評価し得る。候補遺伝子の遺伝子改変が、誘導可能な機構を介して上記候補遺伝子の発現が阻害または刺激されるようにＥＳ細胞系統の中へ導入され得る。結果生じるキメラ動物において、そのキメラ細胞における上記候補遺伝子の発現は、誘導物質分子により誘導され得るか、またはＲＮＡ干渉により阻害され得る。誘導または阻害の際に、キメラ現象の程度は器官において変わり得る。例えば、候補遺伝子の発現の誘導の後に、肝臓においてキメラ細胞の割合は変化し得る。上記候補遺伝子産物の欠失または過剰発現が肝細胞の生存に対して有害である場合、キメラ細胞は誘導によって死に、そして肝臓におけるキメラ現象は減少する。
【００３９】
（Ｅ．ＥＳ細胞の分化能の研究）
いくつかの実施形態において、腫瘍形成に関して、このようなＥＳ細胞の分化能がインビボにおいて研究され得る。特定の遺伝子改変を含むＥＳ細胞由来の細胞を有するキメラ動物は、特定の組織において腫瘍を発生させるより強い傾向があり得る。従って、上記キメラ動物の種々の組織における腫瘍の発生を比較することによって、どの遺伝子改変がどの組織において優先的に腫瘍を引き起こすかについての洞察を提供する。
【００４０】
（Ｆ．腫瘍形成における細胞／細胞相互作用の研究）
本発明のキメラ動物は、腫瘍形成に対する細胞／細胞相互作用の寄与を研究するために使用され得る。上記細胞／細胞相互作用は、種々の遺伝子改変を有するＥＳ細胞由来の、または２つの異なる源由来の細胞（例えば、上記導入されたＥＳ細胞および上記宿主胚盤胞細胞）からの、種々の遺伝的バックグラウンドを有する細胞を含み得る。
【００４１】
例としては、ＥＳ細胞注入のための上記宿主胚盤胞は、腫瘍の発生に対する間質の寄与の研究を可能にするために遺伝子改変される。上記宿主胚盤胞は、例えば、特定の組織において成長因子またはサイトカインのレベル上昇を生じるトランスジェニック動物より誘導され得、したがって、その組織において上記導入されたＥＳ細胞の細胞子孫より生じる腫瘍の発生に対する、この成長因子またはサイトカインの効果を研究し得る。上記宿主胚盤胞はまた、例えば、特定の組織における特定の細胞生成物（例えば、接着分子、新脈管形成因子、レセプター、またはシグナル伝達分子）を欠くトランスジェニック動物より誘導され得、したがって、その組織における腫瘍発生のための間質の支持の提供における細胞生成物の役割を研究し得る。
【００４２】
別の例においては、異なる遺伝子改変を有する２つのＥＳ細胞系統由来のＥＳ細胞が、胚盤胞の中に共導入され、結果として生じるキメラ動物は、両方のＥＳ細胞系統由来の腫瘍を発生させ得る。このようなキメラ動物における腫瘍形成は、上記２つのＥＳ細胞系統のうちのただ１つに由来する腫瘍細胞を含むキメラ動物と、比較され得る。このような比較は、腫瘍形成に対する、上記異なる遺伝子改変を有する細胞の間の相互作用の効果についての洞察を提供する。
【００４３】
（Ｇ．遺伝子エレメントの毒性の研究）
本発明のキメラ動物は、遺伝子エレメント（例えば、細胞の中に導入された遺伝子（例えば、誘導性オンコジーン）、過剰発現された内因性の遺伝子、内因性の遺伝子（例えば、腫瘍サプレッサ遺伝子）に対するＲＮＡｉ構築物、内因性の遺伝子をノックアウトする構築物など）の毒性を定量的に測定するために使用され得る。これを実施するために、その試験遺伝子エレメントを含むＥＳ細胞が注入されている宿主胚盤胞からキメラ動物が産生され得、ここで、上記宿主胚盤胞自体はこの試験遺伝子エレメントを含まない。次に、上記動物のキメラ現象を、対照動物（例えば、上記遺伝子エレメントを含まない対照ＥＳ細胞を含んで発達したキメラ動物、または同じＥＳ細胞を含んで発達したが、それらの細胞またはそれらの子孫における上記試験遺伝子エレメントは発現（例えば、誘導）されないキメラ動物）と比較し得る。より低いキメラ現象の程度は、上記試験遺伝子エレメントが発生に対して負に影響することを示す。より高いキメラ現象の程度は、その逆を示す。
【００４４】
キメラ現象の程度を決定するために、種々の方法が使用され得る。例えば、器官の生検が獲得され得、そして生化学的方法により分析される。あるいは、上記宿主胚およびＥＳ細胞は、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、およびＹＦＰのうちの１つ）を発現するように操作され、そしてキメラ現象を示す２つの蛍光シグナルの比率が、インビボ画像法により分析される。
【００４５】
（Ｈ．哺乳動物セカンドサイトサプレッサー（ＭａＳＳ）スクリーニング）
本発明のキメラ動物は、癌関連遺伝子を同定するためにＭａＳＳスクリーニングにおいて使用され得る。通常、ＭａＳＳスクリーニングは：
（ａ）腫瘍形成能が誘導性オンコジーンの発現に依存する細胞を、上記オンコジーンの発現が誘導されない条件下で維持する工程；
（ｂ）上記細胞の中に、その細胞のゲノム中に組み込む核酸分子（例えば、レトロウイルス）を導入することにより、その核酸分子が組み込んだ位置をタグ化する工程；
（ｃ）上記核酸分子の組み込みにより、腫瘍形成能が誘導されている細胞を同定する工程；および
（ｄ）上記組み込まれた核酸分子によりタグ化されている遺伝子を同定する工程
を包含する。ＭａＳＳスクリーニングの実施のための方法と材料は、ＷＯ  ０２／０７９４１９に記載される。
【実施例】
【００４６】
（ＩＶ．実施例）
本発明は、以下の実施例により、さらに例示される。この実施例は、例示的な目的のみのために提供され、そしてこの実施例は、決して本発明の範囲または内容を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４７】
（実施例１：ＨＥＲ２肺癌モデル）
肺癌におけるＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現の頻度は、ほとんどの場合は、非小細胞肺癌において研究された。そしてその報告されたＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現の頻度は、５％〜５９％の範囲である。ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍を有する患者の生存期間は、有意に短い。ＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現はまた、肺の腫瘍細胞系統における腫瘍形成能に対して寄与することが示しされた。例えば、Ｈｉｒｓｃｈら、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ３６：２６３−４（２００２）；およびＧａｔｚｅｍｅｉｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １５：１９−２７（２００４）を参照のこと。しかしながら、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（トラスツズマブまたはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））は、ヒトにおけるＨＥＲ２陽性の非小細胞肺癌の処置において、有効ではないようである。上記のＧａｔｚｅｍｅｉｅｒらを参照のこと。
【００４８】
肺においてＨＥＲ２／ｎｅｕを誘導可能に過剰発現を誘導し、そして誘導のすぐ後に肺癌を発症するキメラマウスを、産生した。これらのマウスを、ＨＥＲ２／ｎｅｕと肺癌との間の因果関係を示すために、使用した。ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕコード配列を、上記マウスの作製において使用したので、上記マウスは、とりわけ、ヒトの患者におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを標的とする肺癌治療剤を開発するため、および公知のＨＥＲ２／ｎｅｕ薬物の抗肺癌効力の試験のために、有用である。上記マウスを、以下のようにして作製した。
【００４９】
ＩＮＫ４ａ−／−ＥＳ細胞系統を、２つの発現構築物で最初に共トランスフェクトした。第１の構築物（ＣＣＳＰ−ｒｔＴＡ）は、クラーラ細胞分泌タンパク質（ＣＣＳＰ）プロモーターに作動可能に連結したリバーステトラサイクリントランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）コード配列を含んだ（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １５：３２４９−６２（２００１））。第２の構築物（ＴｅｔＯ−ｌｕｃ）は、テトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含む最小ｆｏｓプロモーターに作動可能に連結したルシフェラーゼ（ｌｕｃ）コード配列を含んだ。ＣＣＳＰ−ｒｔＴＡおよびＴｅｔＯ−ｌｕｃの両方を含むＥＳ細胞系統を、これら２つの構築物をＰＧＫ−プロマイシンと一緒に共トランスフェクションすることによって樹立した。プロマイシン耐性細胞をクローン化して単離し、そしてＣＣＳＰ−ｒｔＴＡおよびＴｅｔＯＬｕｃの両方の存在に関して、ＰＣＲおよびサザンブロットにより遺伝子型決定した。これらの結果として得た細胞系統のうちの１５細胞系統を、胚盤胞の中に注入してキメラマウスを産生し、上記細胞系統の相対的性能を評価した。肺における上記ルシフェラーゼレポーター遺伝子の誘導能を、ドキシサイクリンに曝露したキメラまたは曝露しなかったキメラより切り出した肺サンプルの発光のシグナルの比較により、インビトロにおいて調査した。
【００５０】
上記誘導能の分析を通過した上記細胞系統のうちの２細胞系統を、ＴｅｔＯに作動可能に連結したヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕコード配列を含む第３の構築物で、さらにトランスフェクトした。上記ＨＥＲ２／ｎｅｕポリペプチド産物は、ハイグロマイシン．６５９とともにＶ６６４Ｅ／Ｎｅｕ変異（すなわち、６６４位におけるバリン→グルタミン酸置換）を含んだ。したがって、これらの操作されたＥＳ細胞由来の細胞を含むキメラマウスにおいて、ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の発現は、上記ｒｔＴＡおよびテトラサイクリンまたはテトラサイクリンアナログ（例えば、ドキシサイクリン）の制御下にあった。そして上記ｒｔＴＡは肺特異的ＣＣＳＰプロモーターの制御下にあったので、そのＨＥＲ／ｎｅｕオンコジーンは、肺においてのみ発現可能に誘導した。
【００５１】
次に、これらのＥＳ細胞系統のうちの１２細胞系統を、Ｃ５７／ＢＬ６メス由来のマウス胚盤胞の中に注入した。注入された胚盤胞を、妊娠のために代理母に移入した。（毛色により）定性的に評価したところ、生じた動物の体の約５％〜９０％よりも多くかつ、上記操作されたＥＳ細胞からモザイク様式において発生した。次に上記マウスに、ドキシサイクリンを含む飲用水（２ｍｇ／ｍｌ）を４週間目に与えた。上記キメラマウス由来の肺組織を、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学によって分析した。上記処理を開始した後７週間以内に、肺腺腫を観察した。２ヶ月〜５ヶ月以内に、肺において浸潤腺癌が発症した。したがって、これらのデータは、ＨＥＲ２／ｎｅｕは肺癌を開始し得ることを示した。
【００５２】
上記キメラＨＥＲ２／ｎｅｕマウスは、同じ遺伝子改変を含む従来のトランスジェニック肺癌モデルより優れた、種々の利点を提供した。肺においてＨＥＲ２／ｎｅｕを誘導的に発現させたトランスジェニックマウスにおいては、２週間〜３週間の誘導の内に、肺のいたるところに重篤な過形成を発症した。その肺は機能しなくなり、いずれかの腫瘍が発生する機会を有する前に、死亡する結果となった。同様に、肺においてＫ−ｒａｓを誘導的に発現させたトランスジェニックマウス（上記のＦｉｓｈｅｒらを参照のこと）においても、その腫瘍負荷量が高いため、上記腫瘍が浸潤する機会を得る前に、上記動物は死亡した。上記キメラＨＥＲ２／ｎｅｕマウスにおいては、対照的に、過形成発症後の生存を支えるのに十分に健常である肺組織が残存した。結果として、形質転換された肺細胞は、より悪性である、浸潤性腫瘍にまで進行する時間を有した。したがって、上記キメラマウスは、腫瘍発生のより詳細な研究を可能にした。
【００５３】
（実施例２：ＨＥＲ２乳癌モデル）
Ｉｎｋ４ａホモ接合性ヌルＥＳ細胞を、別々のフラグメントとした、以下の４つの構築物で共トランスフェクトした：ＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ、ＴｅｔＯ−Ｈｅｒ２Ｖ６６４Ｅｎｅｕ、ＴｅｔＯ−ルシフェラーゼおよびＰＧＫ−プロマイシン。プロマイシン耐性細胞を、ＰＣＲおよびサザンブロットにより遺伝子型決定した。ＥＳ細胞における上記オンコジーンの誘導能を、ノーザンブロットにより分析した。上記トランスフェクトされたＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６胚盤胞の中に注入し、それを妊娠のために偽妊娠させたメスのマウスの中に移植し、上記キメラマウスの出生をもたらした。
【００５４】
マウス乳腺癌ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ）を、リバーステトラサイクリントランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）の乳房特異的発現を誘導するために使用する。ドキシサイクリンが上記マウスに与えられた（例えば、マウスらの飲料水中に入れて与えられた）場合、上記ｒｔＴＡは、上記ＨＥＲ２活性化されたオンコジーンの乳房特異的な発現を
提供する。
【００５５】
上記ＨＥＲ２オンコジーンおよびルシフェラーゼの誘導能を、上記マウス由来の培養細胞を使用し、（それぞれ）ＲＴ−ＰＣＲおよびルシフェラーゼアッセイにより確認した。キメラマウスより乳腺を取り出し、そしてコラゲナーゼで消化した。収集した小器官の半分をドキシサイクリンの存在下で培養し、そしてもう一方の半分はドキシサイクリンの非存在下で培養した。５日間の培養の後、その細胞をトリプシン処理し、そしてその細胞の１０分の１をルシフェラーゼアッセイに使用し、そしてその残りはＲＮＡ抽出のために使用した。
【００５６】
ＨＥＲ２乳癌モデルマウスより収集された腫瘍の組織学的分析は、浸潤性腺癌を示した。２つの主要な型を、識別した。それらは、中実なシート状の増殖パターン、および壊死中心を含む入れ子状の増殖パターンであった。
【００５７】
ＨＥＲ２乳癌モデルマウス由来の乳腺癌の免疫組織化学分析は、その腫瘍内には２つの細胞型があることを明らかにした。その第１の細胞型は、上皮起源（サイトケラチン陽性）であり、そしてＨＥＲ２の発現および強い増殖を示した。その第２の細胞型は、線維芽細胞様の外見で間様起源であった。これら第２の細胞型の細胞は、コラーゲン陽性であった。これら第２の細胞型の細胞は強い増殖を示さず、そしてそれらは間質性の機能を示した。アポトーシスが、上記腫瘍の上皮部分の壊死中心において見られた。
【００５８】
腫瘍退縮の研究を、上記ＨＥＲ２乳癌モデルマウスを使用して実施した。それぞれ、２つより多くのドキシサイクリン誘導性腫瘍を保有する、２匹のマウスを選択した。２つの腫瘍それぞれの腫瘍サイズを、ドキシサイクリンを上記飲用水より取り除く前および後に、カリパスを使用して測定した。ドキシサイクリンを、６日目に取り除いた。腫瘍サイズを、毎日測定した。上記腫瘍サイズの測定を、上記腫瘍の体積を計算するために使用した。結果をプロットし、そして上記腫瘍の退縮を確定した。全ての腫瘍は退縮し、ドキシサイクリン依存性を表した（図１および図２）。腫瘍退縮の免疫組織化学分析は、ドキシサイクリン依存的なＨＥＲ２発現を確証した。このようにして、上記腫瘍の増殖および維持が、ＨＥＲ２発現に依存することを示した。
【００５９】
（実施例３：Ｋ−ＲＡＳ乳癌モデル）
Ｉｎｋ４ａホモ接合性ヌルＥＳ細胞を、別々のフラグメントとした、以下の４つの構築物で共トランスフェクトした：ＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ、ＴｅｔＯ−Ｋ−ＲＡＳＧ１２Ｖ、ＴｅｔＯ−ルシフェラーゼおよびＰＧＫ−プロマイシン。プロマイシン耐性細胞を、ＰＣＲおよびサザンブロットにより遺伝子型決定した。ＥＳ細胞における上記オンコジーンの誘導能を、ノーザンブロットにより分析した。上記トランスフェクトされたＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞の中に注入し、それを妊娠のために、偽妊娠させたメスのマウスの中に移植して、上記キメラマウスの出生をもたらした。
【００６０】
上記Ｋ−ＲＡＳオンコジーンおよびルシフェラーゼの誘導能を、上記マウス由来の培養細胞を使用し、（それぞれ）ＲＴ−ＰＣＲおよびルシフェラーゼアッセイにより確認した。キメラマウスより乳腺を取り出し、そしてコラゲナーゼで消化した。収集したオルガノイドの半分をドキシサイクリンの存在下で培養し、そしてもう一方の半分はドキシサイクリンの非存在下で培養した。５日間の培養の後、その細胞をトリプシン処理し、そしてその細胞の１０分の１をルシフェラーゼアッセイに使用し、そしてその残りはＲＮＡ抽出のために使用した。
【００６１】
Ｋ−ＲＡＳ乳癌モデルマウスより収集された腫瘍の組織学的分析は、ドキシサイクリン存在下で２ヶ月後の乳腺の上皮管において過形成を示した。この過形成は、その観察の期間（ドキシサイクリン存在下で６ヶ月間）の終了時まで観察された。
【００６２】
（実施例４：Ｋ−ＲＡＳ肺癌モデル）
Ｉｎｋ４ａホモ接合性ヌルＥＳ細胞を、別々のフラグメントとした、以下の４つの構築物で共トランスフェクトした：ＣＣＳＰ−ｒｔＴＡ、ＴｅｔＯ−Ｋ−ＲＡＳＧ１２Ｖ、ＴｅｔＯ−ルシフェラーゼおよびＰＧＫ−プロマイシン。プロマイシン耐性細胞を、ＰＣＲおよびサザンブロットにより遺伝子型決定した。ＥＳ細胞における上記オンコジーンの誘導能を、ノーザンブロットにより分析した。上記トランスフェクトされたＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６胚盤胞の中に注入し、それを妊娠のために、偽妊娠させたメスのマウスの中に移植し、上記キメラマウスの出生をもたらした。
【００６３】
上記Ｋ−ＲＡＳオンコジーンおよびルシフェラーゼの誘導能を、上記マウスの肺由来の組織を使用し、（それぞれ）ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットおよびルシフェラーゼアッセイにより確認した。キメラマウスより肺を取り出し、そしてホモジナイズした。ドキシサイクリンの存在下および非存在下のマウス由来のホモジナイズした材料を、ルシフェラーゼアッセイおよびＲＮＡ発現分析により比較した。
【００６４】
ドキシサイクリン存在下のマウス由来の肺の組織学的分析は、その肺における複数の腺癌を明らかにした。上記腺癌は、ドキシサイクリン存在下で３ヶ月程度の速さで見受けられ得る。ＥＳ細胞の割合の低いキメラは、全体的に減少した腫瘍負荷で、より長い腫瘍発症のための潜伏期を示した。ＳＰＣ抗原に対する抗体およびＣＣ１０抗原に対する抗体を使用した免疫組織化学により分析すると、上記腫瘍はＩＩ型肺胞細胞由来である。
【００６５】
他の実施形態は、特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、飲用水からドキシサイクリンを取り除いた後の、乳房Ｈｅｒ２モデルマウス（マウス番号２５９）からの２つの腫瘍の退縮を示すデータのグラフである。四角は、左第四乳腺において生じた腫瘍を表す。丸は、右第四乳腺において生じた腫瘍を表す。上記マウスは、６週間にわたってドキシサイクリン存在下におかれた。第１日目は、上記腫瘍の最初の測定を表す。その腫瘍サイズの測定後、ドキシサイクリンを、飲用水から取り除いた。腫瘍を、２週間にわたって毎日測定した。ドキシサイクリンの除去は、結果として上記腫瘍の完全退縮をもたらした。
【図２】図２は、飲用水からドキシサイクリンを取り除いた後の、乳房Ｈｅｒ２モデルマウス（マウス番号３３１）からの２つの腫瘍の退縮を示すデータのグラフである。四角は、右第四乳腺において生じた腫瘍を表す。丸は、左第四乳腺において生じた腫瘍を表す。上記マウスは、７週間のあいだドキシサイクリン存在下におかれた。第１日目は、上記腫瘍の最初の測定を表す。第７日目に、腫瘍サイズの測定後、ドキシサイクリンを水から取り除いた。腫瘍を、２３日間にわたって毎日測定した。ドキシサイクリンの除去は、研究期間のあいだに、結果として一方の腫瘍の完全退縮を、もう一方の腫瘍の完全に近い退縮をもたらした。
【図１】
2007503814.tif 000003
【図２】
2007503814.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月10日(2006.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラマウスであって、該キメラマウスの一部の細胞は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている組換えオンコジーンと、内因性腫瘍サプレッサ遺伝子を欠失または不活性化する変異とを含むが、該キメラマウスの細胞すべてが、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている組換えオンコジーンと、内因性腫瘍サプレッサ遺伝子を欠失または不活性化する変異とを含むわけではない、キメラマウス。
【請求項２】
請求項１に記載のマウスであって、前記オンコジーンは、活性化されたオンコジーンである、マウス。
【請求項３】
請求項１に記載のマウスであって、前記組換えオンコジーンは、Ｋ−ＲＡＳ、Ｈ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ−ＣＡ、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲンレセプター遺伝子、プロゲステロンレセプター遺伝子、Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＴＧＦα、ＴＧＦ−β、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２  ＰｙＶ  ＭＴ、およびＳＶ４０  ＬＴからなる群より選択される、マウス。
【請求項４】
請求項１に記載のマウスであって、前記腫瘍サプレッサ遺伝子は、Ｒｂ、Ｐ５３、ＩＮＫ４ａ、ＰＴＥＮ、ＬＡＴＳ、Ａｐａｆ１、Ｃａｓｐａｓｅ  ８、ＡＰＣ、ＤＰＣ４、ＫＬＦ６、ＧＳＴＰ１、ＥＬＡＣ２／ＨＰＣ２またはＮＫＸ３．１、ＡＴＭ、ＣＨＫ２、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡ／ＰＫ、ＸＲＣＣ４、ＭＬＨ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＡＰＣ、ＷＴ、Ｐａｔｃｈｅｄ、およびＦＨＩＴからなる群より選択される、マウス。
【請求項５】
請求項１に記載のマウスであって、前記誘導性プロモーターは、応答エレメントを含み、該応答エレメントの活性は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結されているトランスアクチベーター遺伝子によりコードされるトランスアクチベーターに依存する、マウス。
【請求項６】
請求項１に記載のマウスであって、前記誘導性プロモーターは、ＴｅｔＯプロモーターである、マウス。
【請求項７】
マウス胚性幹細胞であって、該マウス幹細胞は、
（ａ）誘導性プロモーターに作動可能に連結されている組換えオンコジーン；および
（ｂ）内因性腫瘍サプレッサ遺伝子を欠失または不活性化する変異；
を含む、胚性幹細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の胚性幹細胞であって、前記組換えオンコジーンは、ＨＥＲ２、Ｋ−ＲＡＳ、およびＥＧＦＲからなる群より選択される、胚性幹細胞。
【請求項９】
請求項７に記載の胚性幹細胞であって、前記オンコジーンは、活性化されたオンコジーンである、胚性幹細胞。
【請求項１０】
請求項７に記載の胚性幹細胞であって、前記腫瘍サプレッサ遺伝子は、Ｉｎｋ４ａ、Ｐ５３およびＰＴＥＮからなる群より選択される、胚性幹細胞。
【請求項１１】
請求項７に記載の胚性幹細胞であって、前記誘導性プロモーターは、応答エレメントを含み、該応答エレメントの活性は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結されているトランスアクチベーター遺伝子によりコードされるトランスアクチベーターに依存する、胚性幹細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の胚性幹細胞であって、前記誘導性プロモーターは、ＴｅｔＯプロモーターである、胚性幹細胞。
【請求項１３】
請求項１に記載のキメラマウスを得るための方法であって、
（ａ）誘導性プロモーターに作動可能に連結されている組換えオンコジーンと、内因性腫瘍サプレッサ遺伝子を欠失または不活性化する変異とを含む、マウス胚性幹細胞を提供する工程、
（ｂ）該胚性幹細胞を宿主マウスの胚の中へ導入することにより、操作された胚を作製する工程、および、
（ｃ）該操作された胚を代理母の中へ移植する工程、
を包含する、方法。
【国際調査報告】
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