(57)【要約】【課題】再生細胞、例えば脂肪由来再生細胞と共に細胞担体部分及び細胞担体封じ込め部分から成る装置を作って用いる方法を提供する。【解決手段】本発明は、再生細胞、例えば幹及び始原細胞を収容する細胞担体部分と、細胞担体封じ込め部分とを含む装置に関する。この装置は、脊椎融合関連疾患及び長骨又は扁平骨関連欠損を含む骨関連疾患の治療に有用である。装置はまた、再生細胞を分離して濃縮するための開示する自動化システム及び方法と共に用いることができる。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ａ．患者から除去された組織を受け取り、再生細胞が該組織から分離されるように該組織の脱凝集を容易にするチャンバアセンブリ、
ｂ．前記チャンバアセンブリに存在する前記脱凝集された組織からの再生細胞を濃縮する、該チャンバアセンブリに接続することができる濃縮装置、及び
ｃ．前記チャンバアセンブリ及び前記濃縮装置と通信してそれを制御することができるプログラム可能処理装置、
を含む、再生細胞を組織から分離して濃縮するための自動化システムを準備する段階と、
（２）ａ．細胞担体部分、及び
ｂ．細胞担体封じ込め部分、
を含む装置を準備する段階と、
（３）前記自動化システムによって分離及び濃縮された前記再生細胞を前記装置の前記細胞担体部分に加える段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記チャンバアセンブリは、前記脱凝集を容易にするための収集チャンバと、該収集チャンバから前記脱凝集された組織を受け取るように接続された処理チャンバとを含み、
前記濃縮装置は、前記処理チャンバに接続することができる遠心分離装置を含み、
前記プログラム可能装置は、前記チャンバアセンブリの前記収集チャンバ及び前記処理チャンバの両方と通信してそれらを制御することができる、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
骨関連疾患を治療するために使用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記骨関連疾患は、脊椎融合欠損であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記骨関連疾患は、脊椎安定化欠損であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記骨関連疾患は、分節欠損であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記骨関連疾患は、身体の非骨伝導性領域にあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記骨関連疾患は、椎骨の疾患であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記骨関連疾患は、椎間板の疾患であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記再生細胞は、幹細胞から成ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記再生細胞は、始原細胞から成ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記再生細胞は、幹細胞及び始原細胞の組合せから成ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記装置の前記細胞担体部分は、成長因子を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記再生細胞は、前記装置に入れる前に細胞培養液中で増殖されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記再生細胞は、骨形成表現型に向う分化を促進する培養条件で増殖されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記再生細胞は、自己細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記装置は、椎体間脊椎融合装置であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記装置の前記細胞担体部分及び前記細胞担体封じ込め部分は、実質的に放物形、実質的に円筒形、実質的に台形、及び実質的に矩形から成る群から選択された形状であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞担体封じ込め部分は、再吸収可能であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞担体封じ込め部分は、ポリ乳酸ポリマー材料から成ることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリ乳酸ポリマーは、７０：３０ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞担体封じ込め部分は、再吸収不能であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞担体封じ込め部分は、複数の穿孔を備えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞担体部分は、多孔性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞担体部分は、ゲル又はヒドロゲルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞担体部分は、再吸収可能であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞担体部分は、再吸収不能であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞担体部分は、アパタイトで被覆されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞担体部分は、擬似体液溶液を用いて被覆されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組織は、脂肪組織であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記分離及び濃縮した再生細胞は、患者内に注入するのに適していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記自動化システムの前記収集チャンバは、更に、該収集チャンバ内のフィルタケージに収容されたフィルタを備え、組織を保持して、遊離脂質、血液、及び洗浄溶液から成る群から選択された非組織成分を濾過して排除することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項３３】
前記自動化システムの前記収集チャンバは、回転可能シャフトを撹拌する時にパドルが前記組織の脱凝集を容易にするように、該パドルから成る該回転可能シャフトの撹拌を通して該組織の脱凝集を容易にすることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項３４】
前記パドルは、前記収集チャンバ内のフィルタケージに取り付けられていることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記回転可能シャフトは、磁気撹拌装置を通じて撹拌されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記収集チャンバは、回転可能シャフトを回転する時にパドルが前記組織の脱凝集を容易にするように、該パドルから成る該回転可能シャフトの回転を通して該組織の脱凝集を容易にすることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項３７】
前記回転可能シャフトは、駆動機構を通じて回転されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
洗浄溶液供給源を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記洗浄溶液は、生理食塩水であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
脱凝集剤供給源を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記脱凝集剤は、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、Ｌｉｂｅｒａｓｅ  Ｈ１、ペプシン、又はその混合物から成る群から選択されることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記処理チャンバは、前記遠心分離装置における前記脱凝集組織の遠心分離中に該処理チャンバに存在する該脱凝集組織を保持する１つ又はそれよりも多くの遠心分離チャンバを備えることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４３】
前記１つ又はそれよりも多くの遠心分離チャンバは、前記遠心分離装置における前記脱凝集組織の遠心分離中に前記濃縮再生細胞を収集する１つ又はそれよりも多くの産出チャンバを更に含むことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記１つ又はそれよりも多くの産出チャンバは、遠心分離中はある一定の異なる角度に傾けられ、前記濃縮再生細胞の収集のために別の角度に傾けられることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記１つ又はそれよりも多くの産出チャンバは、前記濃縮再生細胞の収集のための前記角度に到達するために手動で再位置決めすることができることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記濃縮再生細胞は、シリンジを用いて収集されることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記処理チャンバは、前記脱凝集組織の無菌的な収集を容易にする回転密封部を備えことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４８】
前記回転密封部は、回転シャフト、２つ又はそれよりも多くの軸受、３つ又はそれよりも多くのリップ密封部、外側ハウジング、円形チャンネル、及び円形バネを備えることを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記回転密封部は、回転シャフト、単一のラバーシール、空気ガスケット、１つ又はそれよりも多くのバネ装填密封部、及び２つのセラミック円盤を備えることを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
廃棄物チャンバを更に含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５１】
前記廃棄物チャンバは、患者から除去された前記組織の非再生細胞成分を受け取ることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記廃棄物チャンバに存在する前記非再生細胞成分は、コラーゲン、タンパク質、脂質、脂肪細胞、及び基質成分を含む成分を分離して濃縮するために遠心分離されることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記収集チャンバ及び前記処理チャンバは、管類を通じて接続されていることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５４】
前記管類は、更にセンサを備えることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記収集チャンバ及び前記処理チャンバは、１つ又はそれよりも多くのバルブ、ポンプ、センサ、又はその組合せを更に含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５６】
前記収集チャンバ、前記処理チャンバ、及び前記管類は、使い捨てであることを特徴とする請求項５４に記載のシステム。
【請求項５７】
前記遠心分離装置及び前記処理装置は、再使用可能であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５８】
前記遠心分離装置は、遠心分離モータ、遠心分離モータコントローラ、及び遠心分離ブレーキコントローラを更に含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５９】
前記処理装置は、１つ又はそれよりも多くのポンプの使用を通して組織の流れを誘導することにより、前記収集チャンバ、前記処理チャンバ、及び前記遠心分離チャンバを制御することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポンプは、蠕動ポンプであることを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポンプは、再使用可能であることを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記処理装置は、ユーザがパラメータを前記システムに入力するためのユーザインタフェースを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６３】
前記処理装置は、ユーザがパラメータ入力するのを案内し、予めプログラムされた段階を確認し、エラー警告し、又はその組合せを行う命令を表示する表示スクリーンを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６４】
１つ又はそれよりも多くの添加物が、前記再生細胞を前記装置に加える前に該細胞に添加されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６５】
前記添加物は、成長因子、再懸濁流体、細胞培養試薬、細胞増殖試薬、細胞保存試薬、又は細胞改質試薬、又はその組合せから選択されることを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
１つ又はそれよりも多くの添加物が、前記再生細胞を前記装置に加えた後に該細胞に添加されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６７】
前記添加物は、成長因子、再懸濁流体、細胞培養試薬、細胞増殖試薬、細胞保存試薬、又は細胞改質試薬、又はその組合せから選択されることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
患者における骨又は軟骨形成を促進する方法であって、
ａ）組織除去システムと、細胞担体部分及び該細胞担体部分を少なくとも部分的に収容するように構成された細胞担体封じ込め部分を含む装置とを準備する段階と、
ｂ）前記組織除去システムを用いて患者から脂肪組織を除去する段階と、
ｃ）前記脂肪組織の少なくとも一部を処理して、ある一定の濃度の再生細胞を得る段階と、
ｄ）前記再生細胞を前記装置の前記細胞担体部分に加える段階と、
ｅ）前記装置を前記患者の意図する骨形成領域内に挿入し、それによって該患者の骨及び軟骨形成の少なくとも一方を促進する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６９】
骨及び軟骨形成が、前記患者において促進されることを特徴とする請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記装置を準備する段階は、前記細胞担体部分を挿入するための中心穴を備えた前記細胞担体封じ込め部分を準備する段階を含むことを特徴とする請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記装置を準備する段階は、
放物形を含み、かつ多孔性である前記細胞担体部分を準備する段階と、
放物形を含む前記細胞担体封じ込め部分を準備する段階と、
を含む、
ことを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
患者における骨又は軟骨形成を促進する方法であって、
ａ）組織除去システムと、細胞担体部分及び該細胞担体部分を少なくとも部分的に収容するように構成された細胞担体封じ込め部分を含む装置とを準備する段階と、
ｂ）前記組織除去システムを用いて患者から脂肪組織を除去する段階と、
ｃ）ある一定の濃度の再生細胞を得るために、前記脂肪組織の少なくとも一部を処理する段階と、
ｄ）前記装置を前記患者の意図する骨形成領域内に挿入する段階と、
ｅ）前記患者内に挿入した前記装置の前記細胞担体部分に前記再生細胞を加え、それによって該患者における骨及び軟骨形成の少なくとも一方を促進する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７３】
前記再生細胞を加える前記段階は、前記患者における骨及び軟骨形成を促進することを特徴とする請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記装置を準備する段階は、前記細胞担体部分を挿入するための中心穴を備えた前記細胞担体封じ込め部分を準備する段階を含むことを特徴とする請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記装置を準備する段階は、
放物形を含み、かつ多孔性である前記細胞担体部分を準備する段階と、
放物形を含む前記細胞担体封じ込め部分を準備する段階と、
を含む、
ことを特徴とする請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記脂肪組織の少なくとも一部を処理する前記段階は、該脂肪組織の少なくとも一部を処理して、治療的に有効な用量の再生細胞を得る段階を含み、
前記再生細胞を加える前記段階は、前記患者内に挿入された前記装置の前記細胞担体部分に前記治療的に有効な用量の再生細胞を加え、それによって該患者における骨及び軟骨形成の少なくとも一方を促進する段階を含む、
ことを特徴とする請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記治療的に有効な用量の再生細胞を加える前記段階は、前記患者における骨及び軟骨形成を促進することを特徴とする請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００１年１２月７日出願の米国特許仮出願第６０／３３８，８５６号の恩典を請求する２００２年１２月９日に出願された「処理脂肪吸上げ細胞で患者を治療するためのシステム及び方法」という名称の米国特許出願第１０／３１６，１２７号の一部継続出願である。本出願はまた、「細胞担体及び脂肪由来細胞を封じ込めた細胞担体封じ込め装置」という名称の２００４年３月１９日出願の米国特許仮出願第６０／５５４，４５５号に対する優先権を主張するものである。上述の出願の内容は、この引用により本明細書において明示的に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、骨関連疾患を治療するために、再生細胞、例えば脂肪由来再生細胞と共に細胞担体部分及び細胞担体封じ込め部分を備える装置を作って用いる方法に関する。特に、本明細書に開示した新しい組合せは、骨及び／又は軟骨形成を促進するのに有用である。本発明は、例えば、椎体間脊椎融合手術の形態の治療法が必要な疾患に対して、通常非骨伝導性領域に骨形成を促進するのに特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
６５００万人近くのアメリカ人が、椎間板変性及び脊椎付近の神経に印加される圧力により引き起こされる背痛に罹患している。よく用いられる初期治療の任意選択肢には、ストレッチ体操、鎮痛剤又は背筋へのステロイド注射が含まれる。これらの治療が奏効しない場合には、脊椎融合手術が任意選択肢になる。「米国整形外科学会」によれば、毎年約２５０，０００の脊椎融合手術が主に４５〜６４歳の成人に行われている。
【０００４】
脊椎融合は、脊柱を作り上げる２つ又はそれよりも多くの椎骨が、治癒して単一の中実の骨になる骨移植片及び体内装置（例えば、ロッド）と共に融合される処理である。脊椎融合により、椎骨間の不自然な運動を解消することができ、それによって神経終端に印加される圧力を低減することができる。更に、脊椎融合を用いて、例えば、外傷により引き起こされた脊椎椎骨傷害、椎骨間の緩衝椎間板の突出及び変性（時に脱出椎間板又は椎間板ヘルニアと呼ばれる）、異常湾曲（例えば、脊柱側弯症又は脊柱後弯症）、及び感染又は腫瘍により引き起こされる脆弱又は不安定脊椎を治療することができる。
【０００５】
骨形成を誘発するには、自源骨（患者からの骨）又は同種移植骨（別の個体からの骨）が最も良く用いられる材料である。一般的には、融合する椎骨間の空間に骨小片を入れる。時に大きな骨の中実片を用いて直接的な構造的支持体にする。自源骨は、一般的に、融合の促進に優れると考えられている。しかし、この手順には、骨盤又は腓骨のような患者の体の別の領域から骨を除去するための余分な手術が必要である。従って、患者の約３０パーセントが移植片収集部位に有意な疼痛及び圧痛を訴えたと報告されており、これは長期化する場合もあり、場合によっては、この手順で矯正しようとする背痛よりも長く続く。同様に、同種移植の骨及び他の骨移植片の代替法では、第２の手術の必要性はなくなるが、自源の骨融合に対する費用効率的で有効な代替法であることが未だ証明されていないという欠点がある。
【０００６】
自源の又は同種移植の骨の代替法は、骨形成を促進する成長因子を用いることである。例えば、研究により、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を用いると全体的な融合が良好になり、手術室で過ごす時間が短くなり、更に重要なことには、第２の手術が必要でなくなるために患者の合併症が少なくなることが示されている。しかし、ＢＭＰを用いると、骨成長を促進するのに有効ではあるが、法外に高価である可能性がある。
【０００７】
別の代替法は、自然発生的骨成長因子の遺伝子改変型を用いる方法である。この手法にも限界がある。より詳細には、外科医は、遺伝子改変ＢＭＰが癌細胞の成長の速度を劇的に上げる可能性があること、又は非癌細胞を悪性化する可能性があることを懸念している。別の懸念は、望まない骨の生成である。遺伝子改変ＢＭＰにより発生する骨は、脊椎内の繊細な神経終端を覆って形成されるか、又は更に悪い場合には、体内の他所に形成される可能性がある。
【０００８】
再生細胞、例えば幹細胞（すなわち、身体の未分化万能細胞）が自分自体を無制限に再生し、成熟分化細胞になる機能を利用する再生医療は、従来技術の限界を回避するための手段であると考えられる。幹細胞、すなわち、胚及び成人幹細胞の両方は、全てではなくても、骨を含む身体の２００＋の多くの細胞及び組織型になる新生機能を有することが示されている。近年、脂肪組織は、成人幹細胞の供給源であることが示されている（Ｚｕｋ他、２００１年；Ｚｕｋ他、２００２年）。脂肪組織は（骨髄、皮膚、筋肉、肝臓、及び脳とは異なり）、低罹患率で比較的大量に収集することが比較的容易である（Ｃｏｍｍｏｎｓ他、２００１年；Ｋａｔｚ他、２００１年ｂ）。従って、従来技術の脊椎融合技術に限界があるために、再生細胞、例えば、骨形成を誘発する機能を有する幹細胞を組み込む装置が必要とされている。
【０００９】
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／３３８，８５６号
【特許文献２】米国特許出願第１０／３１６，１２７号
【特許文献３】米国特許仮出願第６０／５５４，４５５号
【特許文献４】米国特許出願第１０／３２５，７２８号
【特許文献５】米国特許第６，００１，６４２号
【特許文献６】米国特許第６，２３８，９０８号
【特許文献７】米国特許公開第２００２０１８２２１１号
【特許文献８】米国特許第６，２６９，７１６号
【特許文献９】米国特許第５，９１９，２３４号
【特許文献１０】米国特許第６，６７３，３６２号
【特許文献１１】米国特許第６，６３５，０６４号
【特許文献１２】米国特許第６，６５３，１４６号
【特許文献１３】米国特許第６，３９１，０５９号
【特許文献１４】米国特許第６，３４３，５３１号
【特許文献１５】米国特許第６，２８０，４７３号
【特許文献１６】米国特許出願第１０／２４２，０９４号
【特許文献１７】米国特許仮出願第６０／３２２，０７０号
【特許文献１８】米国特許第５，７１６，４１６号
【特許文献１９】米国特許第６，１４３，２９３号
【特許文献２０】米国特許第６，４７７，９２３号
【特許文献２１】米国特許第６，５３１，１４６号
【特許文献２２】米国特許第６，０３３，４３８号
【特許文献２３】米国特許第５，０１５，２４７号
【非特許文献１】Ｚｕｋ他、２００１年
【非特許文献２】Ｚｕｋ他、２００２年
【非特許文献３】Ｃｏｍｍｏｎｓ他、２００１年
【非特許文献４】Ｋａｔｚ他、２００１年ｂ
【非特許文献５】Ｂａｒｒｙ他、１９９９年
【非特許文献６】Ｉｎｏｕｅ，Ｃａｒｓｔｅｎ他、１９８１年
【非特許文献７】Ｈａｙｎｅｒ，Ｂｒａｕｎ他、１９８４年
【非特許文献８】Ｎｏｇａ、１９９９年
【非特許文献９】Ｓｅｋｉｙａ他、２００２年
【非特許文献１０】Ｇｅｉｓｅｌｈａｒｔ他、１９９６年
【非特許文献１１】Ｆｏｒｍａｎｅｋ他、１９９８年
【非特許文献１２】Ｇｒａｅｐｌｅｒ他、１９９８年
【非特許文献１３】Ｋｏｂａｒｉ他、２００１年
【非特許文献１４】Ｍｏｈｒ他、２００１年
【非特許文献１５】Ｓｍｉｔｈ、１９９７年
【非特許文献１６】Ｌａｓｃｈ他、２０００年
【非特許文献１７】Ｉｔｏ及びＳｈｉｎｏｍｉｙａ、２００１年
【非特許文献１８】Ｍｏｒｉｚｏｎｏ他、２００３年
【非特許文献１９】Ｍｏｓｃａ他、２０００年
【非特許文献２０】Ｗａｌｔｈｅｒ及びＳｔｅｉｎ、２０００年
【非特許文献２１】Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ他、２０００年
【非特許文献２２】Ｍｕｒａｍａｔｓｕ他、１９９８年
【非特許文献２３】Ｇｉｍｂｌｅ他、１９９５年
【非特許文献２４】Ｌｅｎｎｏｎ他、１９９５年
【非特許文献２５】Ｍａｊｕｍｄａｒ他、１９９８年
【非特許文献２６】Ｃａｐｌａｎ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ、１９９９年
【非特許文献２７】Ｏｈｇｕｓｈｉ及びＣａｐｌａｎ、１９９９年
【非特許文献２８】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他、１９９９年
【非特許文献２９】Ｃａｐｌａｎ及びＢｒｕｄｅｒ、２００１年
【非特許文献３０】Ｆｕｋｕｄａ、２００１年
【非特許文献３１】Ｗｏｒｓｔｅｒ他、２００１年
【非特許文献３２】Ｈ．Ｊ．Ｂｕｃｈｓｂａｕｍ、Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ、Ｓ．Ｌｉｆｓｈｉｔｚ、及びＳ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ著「骨盤底再構成における「Ｖｉｃｒｙｌ」メッシュ」、Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ、第１２０巻（第１２号）：１３８９〜１３９１頁、１９８５年
【非特許文献３３】Ｌ．Ｅ．Ｆｒｅｅｄ、Ｇ．Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ、Ｒ．Ｊ．Ｂｉｒｏｎ、Ｄ．Ｂ．Ｅａｇｌｅｓ、Ｄ．Ｃ．Ｌｅｓｎｏｙ、Ｓ．Ｋ．Ｂａｒｌｏｗ、及びＲ．Ｌａｎｇｅｒ著「組織工学のための生物分解性ポリマー細胞担体」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ  Ｙ）、第１２巻（第７号）：６８９〜６９３頁、１９９４年
【非特許文献３４】Ｗ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ、Ｌ．Ｃｉｍａ、Ｄ．Ｍｏｏｎｅｙ、Ｊ．Ｕｐｔｏｎ、Ｗ．Ｃ．Ｐｕｅｌａｃｈｅｒ、及びＣ．Ａ．Ｖａｃａｎｔｉ著「合成生物分解性ポリマーに細胞移植することを用いて所定の形状に工夫した軟骨」、Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ、第９４巻（第２号）：２３３〜２３７頁、１９９４年
【非特許文献３５】Ａ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ、Ａ．Ｊ．Ｔｈｏｒｓｅｎ、Ｌ．Ａ．Ｃｚｅｒｗｏｎｋａ、Ｂａｏ  Ｙ．、及びＲ．Ｌａｎｇｅｒ著「ポリ（Ｌ−乳酸）発泡体の調整及び特徴付け」、Ｐｏｌｙｍｅｒ、第３５巻（第５号）：１０６８〜１０７７頁、１９９４年
【非特許文献３６】Ｐ．Ｘ．Ｍａ及びＪ．Ｗ．Ｃｈｏｉ．著「明瞭に相互に接続した球状孔網状構造を備えた生物分解性ポリマー細胞担体」、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ、第７巻（第１号）：２３〜３３頁、２００１年
【非特許文献３７】Ｒ．Ｃ．Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｍ．Ｊ．Ｙａｓｚｅｍｓｋｉ、Ｊ．Ｍ．Ｐｏｗｅｒｓ、及びＡ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ著「骨再生のためにポリ（α−ヒドロキシエステル）発泡体で強化されたヒドロキシアパタイト繊維」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１９巻（第２１号）：１９３５〜４３頁、１９９８年
【非特許文献３８】Ｍ．Ｓ．Ｗｉｄｍｅｒ、Ｐ．Ｋ．Ｇｕｐｔａ、Ｌ．Ｌｕ、Ｒ．Ｋ．Ｍｅｓｚｌｅｎｙｉ、Ｇ．Ｒ．Ｅｖａｎｓ、Ｋ．Ｂｒａｎｄｔ、Ｔ．Ｓａｖｅｌ、Ａ．Ｇｕｒｌｅｋ、Ｃ．Ｗ．Ｐａｔｒｉｃｋ，Ｊｒ．、及びＡ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ著「誘導組織再生のための押出し処理による多孔性生物分解性ポリマー導管の製造」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１９巻（第２１号）：１９４５〜１９５５頁、１９９８年
【非特許文献３９】Ｈ．Ｌｏ、Ｐｏｎｔｉｃｉｅｌｌｏ  Ｍ．Ｓ．、及びＫ．Ｗ．Ｌｅｏｎｇ著「相分離による制御放出生物分解性発泡体の製造」、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ、第１巻（第１号）：１５〜２８頁、１９９５年
【非特許文献４０】Ｃ．Ｓｃｈｕｇｅｎｓ、Ｖ．Ｍａｑｕｅｔ、Ｃ．Ｇｒａｎｄｆｉｌｓ、Ｒ．Ｊｅｒｏｍｅ、及びＰ．Ｔｅｙｓｓｉｅ著「細胞移植のためのポリラクチドマクロ孔質生物分解性移植片、第２報、液相−液相分離によるポリラクチド発泡体の調整」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ、第３０巻（第４号）：４４９〜４６１頁、１９９６年
【非特許文献４１】Ｊ．Ｈ．ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ、Ａ．Ｊ．Ｎｉｊｅｎｈｕｉｓ、Ｂｒｕｉｎ  Ｐ．、Ａ．Ｊ．Ｐｅｎｎｉｎｇｓ、Ｒ．Ｐ．Ｈ．Ｖｅｔｈ、Ｊ．Ｋｌｏｍｐｍａｋｅｒ、及びＨ．Ｗ．Ｂ．Ｊａｎｓｅｎ著「半月板再構成における多孔性生物分解性ポリマー移植片の利用、第１報、半月板損傷の再構成のための多孔性生物分解性ポリウレタンの調製」、Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、第２６８巻：１０７３〜１０８１頁、１９９０年
【非特許文献４２】Ｑ．Ｈｏｕ、Ｄ．Ｗ．Ｇｒｉｊｐｍａ、及びＪ．Ｆｅｉｊｅｎ著「複製及び凍結乾燥処理による相互接続した高度多孔性ポリマー構造の調製」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ、第６７Ｂ巻（第２号）：７３２〜７４０頁、２００３年
【非特許文献４３】Ｍ．Ｈ．Ｈｏ、Ｐ．Ｙ．Ｋｕｏ、Ｈ．Ｊ．Ｈｓｉｅｈ、Ｔ．Ｙ．Ｈｓｉｅｎ、Ｌ．Ｔ．Ｈｏｕ、Ｊ．Ｙ．Ｌａｉ、及びＤ．Ｍ．Ｗａｎｇ著「凍結抽出及び凍結ゲル化法を用いることによる多孔性細胞担体の調製」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第２５巻（第１号）：１２９〜１３８頁、２００４年
【非特許文献４４】Ｋ．Ｗｈａｎｇ、Ｃ．Ｈ．Ｔｈｏｍａｓ、及びＫ．Ｅ．Ｈｅａｌｙ著「生体吸収性細胞担体を製造するための新しい方法」、Ｐｏｌｙｍｅｒ、第３６巻（第４号）：８３７〜８４２頁、１９９５年
【非特許文献４５】Ｊ．Ｐ．Ｓｃｈｍｉｔｚ及びＪ．Ｏ．Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ著「生物分解性の環境変容的骨誘導アロ移植片び骨形成潜在機能の予備試験」、Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ．、（第２３７巻）：２４５〜２５５頁、１９８８年
【非特許文献４６】Ａ．Ｇ．Ｃｏｏｍｂｅｓ及びＪ．Ｄ．Ｈｅｃｋｍａｎ著「再吸収可能なポリマーのゲル成形、第１報、処理及び応用」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１３巻（第４号）：２１７〜２２４頁、１９９２年
【非特許文献４７】Ｈ．Ｌｏ、Ｐｏｎｔｉｃｉｅｌｌｏ  Ｍ．Ｓ．、及びＫ．Ｗ．Ｌｅｏｎｇ著「相分離による制御放出生物分解性発泡体の製造」、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ、第１巻（第１号）：１５〜２８頁、１９９５年
【非特許文献４８】Ｙ．Ｓ．Ｎａｍ、Ｊ．Ｊ．Ｙｏｏｎ、及びＴ．Ｇ．Ｐａｒｋ著「ポロゲン添加剤として気体発泡塩を用いるマクロ孔質生物分解性ポリマー細胞担体の新しい製造方法」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ、第５３巻（第１号）：１〜７頁、２０００年
【非特許文献４９】Ｒ．Ａ．Ｇｉｏｒｄａｎｏ、Ｂ．Ｍ．Ｗｕ、Ｓ．Ｗ．Ｂｏｒｌａｎｄ、Ｌ．Ｇ．Ｃｉｍａ、Ｅ．Ｍ．Ｓａｃｈｓ、及びＭ．Ｊ．Ｃｉｍａ著「３次元印刷により製造されている高密度ポリ乳酸構造の機械特性」、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ、Ｐｏｆｙｍ編、第８巻（第１号）：６３〜７５頁、１９９６年
【非特許文献５０】Ｓ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｈ．Ｕｔｓｕｎｏｍｉｙａ、Ｊ．Ａ．Ｋｏｓｋｉ、Ｂ．Ｍ．Ｗｕ、Ｍ．Ｊ．Ｃｉｍａ、Ｊ．Ｓｏｈｎ、Ｋ．Ｍｕｋａｉ、Ｌ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、及びＪ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ著「チャンネルの固有の網状構造を備えた新しい３次元の合成生物分解性ポリマー細胞担体上の肝細胞の生存及び機能」、Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ、第２２８巻（第１号）：８〜１３頁、１９９８年
【非特許文献５１】Ｄ．Ｗ．Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ、Ｔ．Ｓｃｈａｎｔｚ、Ｉ．Ｚｅｉｎ、Ｋ．Ｗ．Ｎｇ、Ｓ．Ｈ．Ｔｅｏｈ、及びＫ．Ｃ．Ｔａｎ著「熱溶解積層法を通じて設計されて製造されたポリカプロラクトン細胞担体の機械特性及び細胞培養反応」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ、第５５巻（第２号）：２０３〜２１６頁、２００１年
【非特許文献５２】Ｗ．Ｊ．Ｌｉ、Ｃ．Ｔ．Ｌａｕｒｅｎｃｉｎ、Ｅ．Ｊ．Ｃａｔｅｒｓｏｎ、Ｒ．Ｓ．Ｔｕａｎ、及びＦ．Ｋ．Ｋｏ．著「エレクトロスパンナノファイバ構造：組織工学のための新しい細胞担体」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ、第６０巻（第４号）：６１３〜６２１頁、２００２年
【非特許文献５３】Ｒ．Ｚｈａｎｇ及びＰ．Ｘ．Ｍａ著「予めデザインしたマクロ孔質構造を備えた合成ナノ原繊維細胞外基質」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ、第５２巻（第２号）：４３０〜４３８頁、２０００年
【非特許文献５４】Ｃｈｏｕ他（２００４年）著「生体模倣アパタイト構造が造骨細胞の活力度、増殖、及び遺伝子発現に及ぼす影響」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（近刊）
【非特許文献５５】Ｏｙａｎｅ他（２００３年）著「修正擬似体液の調製及び評価」、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ、第６５Ａ巻：１８８〜１９５頁
【非特許文献５６】Ｍｕｒｐｈｙ他（１９９９）著「インビトロでの多孔性ポリ（乳酸−コ−グリコリド）骨格内の連続骨状鉱物の成長」、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、第５０巻：５０〜５８ページ
【非特許文献５７】Ｍｉｋｏｓ、Ａ．Ｇ．、Ｂａｏ、Ｙ．、Ｃｉｍａ、Ｌ．Ｇ．、Ｉｎｇｂｅｒ、Ｄ．Ｅ．、Ｖａｃａｎｔｉ、Ｊ．Ｐ．、及びＬａｎｇｅｒ、Ｒ．（１９９３年ａ）著「細胞付着及び移植のためのポリ（グリコール酸）結合繊維構造の調製」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２７巻：１８３〜１８９頁
【非特許文献５８】Ｍｉｋｏｓ、Ａ．Ｇ．、Ｓａｒａｋｉｎｏｓ、Ｇ．、Ｌｅｉｔｅ、Ｓ．Ｍ．、Ｖａｃａｎｔｉ、Ｊ．Ｐ．とＬａｎｇｅｒ、Ｒ．（１９９３年ｂ）
【非特許文献５９】Ｍｉｋｏｓ、Ａ．Ｇ．、Ｔｈｏｒｓｅｎ、Ａ．Ｊ．、Ｃｚｅｒｗｏｎｋａ、Ｌ．Ａ．、Ｂａｏ、Ｙ．、Ｌａｎｇｅｒ、Ｒ．、Ｗｉｎｓｌｏｗ、Ｄ．Ｎ．、及びＶａｃａｎｔｉ、Ｊ．Ｐ．（１９９４年）著「ポリ（Ｌ−乳酸）発泡体の調製及び特徴付け」、Ｐｏｌｙｍｅｒ、第３５巻：１０６８〜１０７７頁
【非特許文献６０】Ｎａｍ、Ｙ．Ｓ．及びＰａｒｋ、Ｔ．Ｇ．（１９９９年ａ）著「修正熱誘導相分離法による生物分解性ポリマー微孔性発泡体」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第２０巻：１７８３〜１７９０頁
【非特許文献６１】Ｎａｍ、Ｙ．Ｓ．、Ｙｏｏｎ、Ｊ．Ｊ．、及びＰａｒｋ、Ｔ．Ｇ．（２０００年）著「気体発泡塩をポロゲン添加物として用いるマクロ孔質生物分解性ポリマー骨格の新しい製造方法」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、第５３巻：１〜７頁
【非特許文献６２】Ｌｏ、Ｈ．、Ｐｏｎｔｉｃｉｅｌｌｏ、Ｍ．Ｓ．、及びＬｅｏｎｇ、Ｋ．Ｗ．（１９９５年）著「相分離による制御放出生物分解性発泡体の製造」、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１巻：１５〜２８頁
【非特許文献６３】Ｗｈａｎｇ、Ｋ．、Ｔｈｏｍａｓ、Ｃ．Ｈ．、Ｈｅａｌｙ、Ｋ．Ｅ．、及びＮｕｂｅｒ、Ｇ．（１９９５年）著「生体吸収性骨格を製造する新しい方法」、Ｐｏｌｙｍｅｒ、第３６巻：８３７〜８４２頁
【非特許文献６４】Ｌｏ、Ｈ．、Ｋａｄｉｙａｌａ、Ｓ．、Ｇｕｇｇｉｎｏ、Ｓ．Ｅ．、及びＬｅｏｎｇ、Ｋ．Ｗ．（１９９６年）著「細胞播種及び制御放出機能を有するポリ（Ｌ−乳酸）発泡体」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第３０巻：４７５〜４８４頁
【非特許文献６５】Ｓｃｈｕｇｅｎｓ、Ｃ、Ｍａｑｕｅｔ、Ｖ．、Ｇｒａｎｄｆｉｌｓ、Ｃ、Ｊｅｒｏｍｅ、Ｒ．、及びＴｅｙｓｓｉｅ、Ｐ．（１９９６年）著「細胞移植のためのポリ乳酸マクロ孔質生物分解性移植片、第２報、液体−液体相分離のためのポリ乳酸発泡体の調製」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第３０巻：４４９〜４６１頁
【非特許文献６６】Ｓ．Ｌ．Ｉｓｈａｕｇ、Ｇ．Ｍ．Ｃｒａｎｅ、Ｍ．Ｊ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ．Ｗ．Ｙａｓｋｏ、Ｍ．Ｊ．Ｙａｓｚｅｍｓｋｉ、及びＡ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ著「生物分解性ポリマー骨格内の３次元間質性造骨細胞の培養による骨形成」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ、第３６巻（第１号）：１７〜２８頁、１９９７年
【非特許文献６７】Ｈ．Ｌ．ＷａＩｄ、Ｇ．Ｓａｒａｋｉｎｏｓ、Ｍ．Ｄ．Ｌｙｍａｎ、Ａ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ、Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ、及びＲ．Ｌａｎｇｅｒ著「多孔性移植装置における細胞播種」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１４巻（第４号）：２７０〜２７８頁、１９９３年
【非特許文献６８】Ｎ．Ｓ．Ｄｕｎｋｅｌｍａｎ、Ｍ．Ｐ．Ｚｉｍｂｅｒ、Ｒ．Ｇ．ＬｅＢａｒｏｎ、Ｒ．Ｐａｖｅｌｅｃ、Ｍ．Ｋｗａｎ、及びＡ．Ｆ．Ｐｕｒｃｈｉｏ著「閉鎖バイオリアクタシステム内のポリグリコール酸骨格上のラビット間接軟骨細胞による軟骨生成」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、第４６巻：２９９〜３０５頁、１９９５年
【非特許文献６９】Ｌ．Ｅ．Ｆｒｅｅｄ、Ａ．Ｐ．Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、Ｉ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｊ．Ｒ．Ｂａｒｒｙ、Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ、及びＧ．Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ著「細胞−ポリマー−バイオリアクタシステムにおける軟骨形成」、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、第２４０巻（第１号）：５８〜６５頁、１９９８年
【非特許文献７０】Ｒ．Ｅ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｎ．Ｓ．Ｄｕｎｋｅｌｍａｎ、Ｇ．Ｎａｕｇｈｔｏｎ、及びＡ．Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ著「生物再吸収可能な骨格上での細胞播種による軟骨の組織工学の方法」、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｄ、第８７５巻：３９８〜４０４頁、１９９９年
【非特許文献７１】Ｇ．Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ他（１９９９年）、ｖａｎ  Ｗａｃｈｅｍ  ＰＢ、ｔｒｏｎｃｋ  ＪＷ、ｏｅｒｓ−Ｚｕｉｄｅｖｅｌｄ  Ｒ、ｉｊｋ  Ｆ、及びｉｌｄｅｖｕｕｒ  ＣＲ著「真空細胞播種：多孔性血管グラフト上に細胞層を均一に分配して迅速に付加するための新しい方法」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１１巻（第８号）：６０２〜６０６頁、１９９０年
【非特許文献７２】Ｌ．Ｅ．Ｆｒｅｅｄ、Ｊ．Ｃ．Ｍａｒｑｕｉｓ、Ｇ．Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ、Ｊ．Ｅｍｍａｎｕａｌ、及びＲ．Ｌａｎｇｅｒ著「細胞−ポリマー軟骨移植片の組成」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、第４３巻：６０５〜６１４頁、１９９４年
【非特許文献７３】Ｊ．Ｌ．ｖａｎ  Ｓｕｓａｎｔｅ、Ｐ．Ｂｕｍａ、Ｇ．Ｊ．ｖａｎ  Ｏｓｃｈ、Ｄ．Ｖｅｒｓｌｅｙｅｎ、Ｐ．Ｍ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒａａｎ、Ｗ．Ｂ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｅｒｇ、及びＧ．Ｎ．Ｈｏｍｍｉｎｇａ著「アルギン酸塩及びコラーゲン担体ゲル中の軟骨細胞の培養物」、Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｓｃａｎｄ、第６６巻（第６号）：５４９〜５６頁、１９９５年
【非特許文献７４】Ｊ．Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ、Ｗ．Ｍｃｌｎｔｏｓｈ、Ｋ．Ａｎｓｅｔｈ、Ｓ．Ｒｉｌｅｙ、Ｐ．Ｒａｇａｎ、及びＲ．Ｌａｎｇｅｒ著「ポリ（エチレンオキシド）ベースの半相互浸入網状構造内への軟骨細胞の光封入」、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、第５１巻：１６４〜１７１頁、２０００年
【非特許文献７５】Ｂａｎｆｉ、２００１年
【非特許文献７６】Ｇａｌｏｔｔｏ、１９９９年
【非特許文献７７】Ｄ’Ｉｐｐｏｌｉｔｏ、１９９９年
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、組み合わせると受益者の骨形成を意図した領域、すなわち、ターゲット領域に骨及び／又は軟骨形成を促進する、細胞担体部分及び細胞担体封じ込め部分、及び治療的に有効な用量の再生細胞を備える装置を作って用いる方法に関する。本発明の装置及び細胞は、通常は非骨伝導性領域に骨形成すると利益がある疾患、例えば、椎体間脊椎融合手術の形態の治療法を必要とする疾患を治療するのに特に有用である。本発明の装置及び細胞はまた、骨伝導によって治癒することができない他の疾患又は欠損、例えば、外傷による長骨の欠損を治療するのにも有用である。好ましい実施形態では、装置の１つ又はそれよりも多くの部分は、再吸収可能である。
【００１１】
本発明は、更に、再生細胞、例えば成人幹及び始原細胞を調製するためのシステム及び方法に関する。本発明は、更に、骨及び／又は軟骨形成を促進する再生細胞、例えば成人幹及び始原細胞の方法及び組成物の発見に基づいている。従って、一実施形態では、本発明は、受益者の骨及び／又は軟骨形成を促進、発生、又は支持するのに必要な添加物と共に装置の細胞担体部分に入れる脂肪組織由来の細胞を用いるための組成物、方法、及びシステムに関する。
【００１２】
一実施形態では、組織抽出から処理を通して装置を受益者の骨及び／又は軟骨形成が意図された部位に配置する全手順は、全て同じ施設内で、実際に、手順を受ける患者と同じ部屋内で行われるであろう。特定的な実施形態では、再生細胞、例えば幹及び始原細胞の有効な用量は、ターゲット領域に挿入する前に装置の細胞担体部分上に配置される。別の実施形態では、再生細胞、例えば幹及び始原細胞の有効な用量は、例えばシリンジを通じて受益者の意図する骨及び／又は軟骨形成部位内への装置の配置に続いて細胞担体上に配置される。更に他の実施形態では、細胞は、他の細胞、組織、組織断片、又は細胞成長及び／又は分化の他の刺激物と共に装置の細胞担体部分内に配置することができる。好ましい実施形態では、細胞は、上述の添加物のいずれかと共に細胞供給者に入れられる（装置を通じて）。好ましい実施形態では、細胞担体部分及び／又は細胞担体封じ込め部分は、再吸収可能である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、患者の骨及び／又は軟骨形成を促進する段階は、ａ）組織除去システムを準備する段階と、ｂ）組織除去システムを用いて患者からある一定の濃度の幹細胞を有する脂肪組織を除去する段階と、ｃ）骨及び／又は軟骨形成を促進するのに有効な用量を構成するのに十分な濃度の幹細胞を得るために、脂肪組織の少なくとも一部を処理する段階と、ｄ）処理する段階で得られた再生細胞、例えば幹及び始原細胞を本発明の装置の細胞担体部分に加える段階と、ｅ）細胞を封じ込めた装置を受益者の意図する骨及び／又は軟骨形成部位に挿入する段階とを含む。好ましい実施形態では、細胞担体部分及び／又は細胞担体封じ込め部分は、再吸収可能である。別の好ましい実施形態では、組織処理システムは自動化されている。
【００１４】
別の実施形態では、患者の骨及び／又は軟骨形成を促進する段階は、ａ）組織除去システムを準備する段階と、ｂ）組織除去システムを用いて患者からある一定の濃度の幹細胞を有する脂肪組織を除去する段階と、ｃ）骨及び／又は軟骨形成を促進するのに有効な用量を構成するのに十分な濃度の幹細胞を得るために、脂肪組織の少なくとも一部を処理する段階と、ｄ）本発明の装置を受益者の意図する骨及び／又は軟骨形成部位に挿入する段階と、ｅ）処理する段階で得られた再生細胞を受益者に挿入された装置の細胞担体部分に加える段階とを含む。好ましい実施形態では、細胞担体部分及び／又は細胞担体封じ込め部分は、再吸収可能である。別の好ましい実施形態では、組織処理システムは自動化されている。
本明細書に説明したあらゆる特徴又は特徴の組合せは、文脈、本明細書、及び当業者の知識から明らかであるように、いずれかのそのような組合せに含められた特徴が互いに矛盾しないという条件で本発明の範囲に含まれる。本発明の付加的な利点及び態様は、以下の詳細説明の中で明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、治療的に有効な用量の再生細胞を用いて骨及び／又は軟骨形成を促進するための侵襲が最小限で費用効率の良い装置を提供する。本発明は、部分的には、本発明の再生細胞が、骨及び軟骨始原細胞、例えば骨芽始原細胞の豊富な供給源であるという発見に基づいている。更に、本発明の再生細胞は、本明細書では、生体内で骨及び軟骨を形成することが示されている。従って、本発明の装置を用いて、例えば、骨及び／又は軟骨形成を促進することによって骨関連疾患を治療することができる。より詳細には、本発明は、１）多孔性細胞担体部分及び細胞担体封じ込め部分を含む装置（以降、本明細書では「装置」という）と、２）骨及び／又は軟骨形成を促進する治療的に有効な用量の脂肪由来再生細胞、例えば成人幹及び始原細胞との新しい組合せを提供する。特定的な実施形態では、本発明の装置及び細胞は、通常非骨伝導性の領域に骨形成が必要な疾患を治療するのに、例えば、椎体間脊椎融合手術等の形態の治療法が必要な疾患を治療するのに有用である。
【００１６】
本発明はまた、以下に限定されるものではないが、脂肪、骨髄、血液、皮膚、筋肉、肝臓、結合組織、筋膜、脳及び他の神経系組織、血管、及び他の軟組織又は液状組織、又は組織成分又は組織混合物（例えば、皮膚、血管、脂肪、及び結合組織を含む組織混合物）を含む様々な組織からの再生細胞、例えば幹細胞及び／又は始原細胞を分離して濃縮するための迅速で信頼できるシステム及び方法にも関する。好ましい実施形態では、システムは、脂肪組織からの再生細胞を分離して濃縮する。別の好ましい実施形態では、システムは、使用者の介入又は専門的知識を最小にして方法全体を行うことができるように自動化される。特定の好ましい実施形態では、本発明のシステム及び方法を用いて得られる再生細胞は、腎疾病又は疾患を受けた組織を抽出した受容者に直接配置するのに適切である。
【００１７】
好ましくは、組織抽出から分離、濃縮を経て再生細胞を受容者内に配置する手順全体は、全て同じ施設で、実際に、場合によっては手順を受けている患者と同じ部屋で行われるであろう。再生細胞は、抽出して濃縮した後、比較的短い時間内に用いることができる。例えば、再生細胞は、患者から組織を収集してから約１時間内に使用する準備をすることができ、ある一定の状況では、組織を収集してから約１０〜４０分以内に使用する準備をすることができる。好ましい実施形態では、再生細胞は、組織を収集してから約２０分以内に使用する準備をすることができる。抽出から分離及び濃縮を経る手順の長さ全体は、患者プロフィール、収集される組織の種類、及び所定の治療用途に必要な再生細胞の量を含むいくつかの因子によって様々とすることができる。細胞はまた、治療的、構造的、又は審美的利益を受容者にもたらすことを意図して単一の作業手順で他の細胞、組織、組織断片、骨格、又は細胞成長及び／又は分化の他の刺激物と共に受容者に入れることができる。システムの分離及び濃縮相を超える再生細胞のいかなる更に別の操作にも、このような操作法に相応の付加的な時間が必要になることは理解される。
【００１８】
本発明を更に容易に理解することができるように、最初にある一定の用語を定める。付加的な定義は、詳細説明を通して示すものとする。
本明細書で用いる場合、「再生細胞」とは、本発明のシステム及び方法を用いて得られ、臓器、組織、又は生理的単位又はシステムの構造又は機能を完全に又は部分的に再生、復元、又は置換することを引き起こすか又はそれに寄与することにより、治療的、構造的、又は審美的利益をもたらすあらゆる異種又は同種細胞を意味する。再生細胞の例には、ＡＳＣ、内皮細胞、内皮前駆細胞、内皮始原細胞、マクロファージ、繊維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、前脂肪細胞、分化又は脱分化脂肪細胞、ケラチノサイト、単分化能及び多分化能始原細胞及び前駆細胞（及びその後代）、及びリンパ球が含まれる。
【００１９】
再生細胞が、治療的、構造的、又は審美的な利益を与えることができる機構の１つは、再生細胞又はその後代を、新しく生成されるか、存在するか、修復された組織又は組織成分に組み込むことによる。例えば、ＡＳＣ及び／又はその後代は、新しく生成された骨、筋肉、又は他の構造的又は機能的な組織に組み込むことができ、それによって治療的、構造的、又は審美的な改善を引き起こすか又はそれに寄与することができる。同様に、内皮細胞又は内皮の前駆又は始原細胞及びその後代は、存在するか、新しく生成されるか、修復されるか、拡張した血管に組み込むことにより、治療的、構造的、又は審美的利益を引き起こすか又はそれに寄与することができる。再生細胞が治療的、構造的、又は審美的利益を与えることができる別の機構は、所定の組織又は組織成分の構造又は機能の作成、維持、復元及び／又は再生を促進する分子、例えば成長因子を発現及び／又は隠蔽することによるものである。
【００２０】
再生細胞は、組織に存在するか又は分離したものを本発明のシステム及び方法を用いて濃縮した「未変性」の形で用いることができ、成長因子又は他の生物反応修飾物質で刺激又は初回刺激することによるか、遺伝子移入（一過性又は安定移入）によるか、得られる母集団を基本又は物理的特性（例えば、大きさ又は密度）、固相材料への差次付着、細胞表面又は細胞内分子の発現、細胞培養又は本明細書に更に説明するような他の生体外又は生体内操作、修飾、又は分画化に関して更に細分画することによって修飾することができる。再生細胞はまた、本明細書に更に説明するような細胞の関連特徴を変更又は促進する因子、薬物、化学物質、又は他の薬剤を送出する合成又は生物学的骨格、材料、又は装置のような他の細胞又は装置と共に用いることができる。
【００２１】
本明細書で用いる場合、「再生細胞組成」とは、一般的に、組織、例えば脂肪組織を洗浄し、少なくとも部分的に脱凝集（解離）した後にある一定容積の液体に存在する細胞の組成を意味する。例えば、本発明の再生細胞組成は、ＡＳＣ、内皮細胞、内皮前駆細胞、内皮始原細胞、マクロファージ、繊維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、前脂肪細胞、分化又は脱分化脂肪細胞、ケラチノサイト、単分化能及び多分化能始原細胞及び前駆細胞（及びその後代）、及びリンパ球を含む複数の異なる種類の再生細胞を含む。再生細胞組成にはまた、組織断片に存在する可能性があるコラーゲン、又は本明細書に説明する組織脱凝集処理から得られる残留コラゲナーゼ、又は他の酵素又は薬剤のような１つ又はそれよりも多くの汚染物も封じ込められる場合がある。
【００２２】
本明細書で用いる場合、「再生医療」とは、再生細胞を直接的又は間接的のいずれかで被検体に入れることによって得られるあらゆる治療的、構造的、又は審美的利益を意味する。本明細書で用いる場合、「骨関連疾患」という語句は、全ての骨関連疾患を含むものとし、例えば、脊椎修復、脊椎安定化、（長骨及び扁平骨でのような）身体の分節欠損の修復、及び通常は非骨伝導性環境での骨成長を必要とする疾患を含むものが骨関連疾患である。特定的な実施形態では、この語句は、脊椎融合手術が必要な疾患を含むものとする。更に、骨関連疾患は、以下に限定されるものではないが、環状裂溝のような椎間板環の分裂、椎間板の慢性炎症、包含突出又は逸脱突出を備えた局所的椎間板ヘルニア、椎間板を囲む椎骨の相対的不安定及び変性椎間板疾病を含む椎骨及び椎間板の疾患を含むものとする。骨関連疾病又は疾患の治療は、再生医療の範囲に含まれる。
【００２３】
本明細書で用いる場合、「幹細胞」とは、１つ又はそれよりも多くの特定の機能を行い、自己複製機能を有する様々な他の細胞型に分化する潜在機能を備えた多分化能再生細胞を意味する。本明細書に開示されている幹細胞の一部は、多分化能であると考えられる。
本明細書で用いる場合、「始原細胞」とは、１つよりも多い細胞型に分化する潜在機能を含み、自己複製機能が限定されているか又はそれを持たない多分化能の再生細胞を意味する。「始原細胞」とは、本明細書で用いる場合、１つ又はそれよりも多くの特定の機能を行い、自己複製機能が限定されているか又はそれを持たない単一の細胞型だけに分化する潜在機能を備えた単分化能細胞も意味する。より詳細には、本明細書で用いる場合、「内皮始原細胞」とは、血管内皮細胞に分化する潜在機能を備えた多分化能又は単分化能細胞を意味する。
【００２４】
本明細書で用いる場合、「前駆細胞」とは、１つの細胞型に分化する潜在機能を備えた単分化能再生細胞を意味する。前駆体細胞及びその後代は、大きな増殖能を維持することができ、例えば、リンパ球及び内皮細胞は、適切な条件下で増殖することができる。
本明細書で用いる場合、「幹細胞数」又は「幹細胞頻度」とは、脂肪由来細胞（ＡＤＣ）を低細胞密度（＜１０，０００細胞／ウェル）で蒔き、ＭＳＣ増殖を支持する増殖培地中（例えば、１０％ウシ胎仔血清、５％ウマ血清、及び抗生物質／抗真菌剤を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地）で増殖するクローン原性アッセイで観察されるコロニーの数を意味する。細胞は、２週間増殖させ、その後、培養物をヘマトキシリンで染色し、５０細胞より多いコロニーをＣＦＵ−Ｆとして数える。幹細胞頻度は、蒔いた１００有核細胞当たりに観察されるＣＦＵ−Ｆの数として計算する（例えば、１，０００の有核再生細胞で開始したプレートに１５コロニー数えられれば、幹細胞頻度は、１．５％である）。細胞数は、幹細胞頻度に得られる有核ＡＤＣ細胞総数を掛けたものとして計算する。再生細胞から増殖した高い割合（〜１００％）のＣＦＵ−Ｆは、細胞表面分子ＣＤ１０５を発現し、これは、骨髄由来幹細胞によっても発現される（Ｂａｒｒｙ他、１９９９年）。ＣＤ１０５はまた、脂肪組織由来幹細胞によっても発現される（Ｚｕｋ他、２００２年）。
【００２５】
本明細書で用いる場合、「脂肪組織」という用語は、脂質を貯蔵する結合組織を含む脂質を意味する。脂肪組織は、ＡＳＣ及び内皮始原細胞及び前駆細胞を含む複数の再生細胞型を封じ込める。
本明細書で用いる場合、「脂肪組織単位」という用語は、脂肪組織の個別又は測定可能な量を意味する。脂肪組織単位は、単位の重量及び／又は容積を判断することによって測定することができる。上に識別されたデータに基づいて、患者から除去される時の処理した脂肪吸上げの単位は、少なくとも０．１％の細胞成分が幹細胞である、すなわち、上述のように求めた幹細胞頻度が少なくとも０．１％である細胞成分を有する。本明細書の開示内容を参照すると、脂肪組織の単位は、患者から除去される脂肪組織の総量をいうことができ、又は患者から除去される脂肪組織の総量よりも少ない量をいうことができる。従って、脂肪組織の単位は、別の脂肪組織単位と共に重量又は容積が個々の単位の合計である脂肪組織の単位を形成することができる。
【００２６】
本明細書で用いる場合、「部分」という用語は、全体よりも少ない材料の量を意味する。少量部分は、５０％未満の量を意味し、多量部分は、５０％を超える量を意味する。従って、患者から除去した脂肪組織の総量よりも少ない脂肪組織の単位は、除去した脂肪組織の一部分である。
本明細書で用いる場合、「処理した脂肪吸い上げ物」という用語は、処理して成熟脂肪細胞及び結合組織から活性細胞成分（例えば、再生性を含む成分）を分離した脂肪組織を意味する。この分画は、本明細書では、「脂肪由来細胞」又は「ＡＤＣ」と呼ばれる。一般的に、ＡＤＣは、脂肪組織由来の細胞を洗浄して分離し、濃縮することによって得られた再生細胞のペレットを意味する。ペレットは、一般的に、細胞が遠心分離チャンバ又は細胞集中装置の底部に凝集するように、細胞の懸濁液を遠心分離することによって得られる。
【００２７】
本明細書で用いる場合、「投与する」、「導入する」、「送出する」、「配置する」、及び「移植する」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、再生細胞が望ましい部位に少なくとも部分的に局在化することになる方法又は経路により、本発明の再生細胞を被検体に配置することを意味する。再生細胞は、細胞又は細胞の成分の少なくとも一部が生存可能である被検体の望ましい部位に送出されることになるあらゆる適切な経路で投与することができる。被検体に投与された後の細胞の生存期間は、数時間、例えば２４時間程の短さから数日、数年程の長さまでとすることができる。
【００２８】
本明細書で用いる場合、「治療する」という用語は、少なくとも１つの有害な作用又は疾病又は疾患の症状を減少又は軽減する段階を含む。
本明細書で用いる場合、「治療的に有効な用量の再生細胞」は、有用又は望ましい臨床作用をもたらすのに十分な量の再生細胞を意味する。この用量は、１回又はそれよりも多くの投与で投与することができる。しかし、有効な用量と考えられることになるものの正確な判断は、以下に限定されるものではないが、患者の年齢、大きさ、疾病の型又は範囲、疾病の段階、再生細胞の投与経路、用いる補足治療法の型又は範囲、進行中の疾病過程、及び望ましい治療の型（例えば、積極的治療対従来の治療）を含む各患者に固有の因子に基づくと考えられる。
本明細書で用いる場合、「被検体」という用語には、温血動物、好ましくはヒトを含む哺乳類が含まれる。好ましい実施形態では、被検体は霊長類である。更に好ましい実施形態では、被検体はヒトである。
【００２９】
ここで、本発明の現在好ましい実施形態を詳細に参照することにするが、その例は、添付の図面に示されている。可能な場合には常に、同じか又は同様の部分を意味するのに図面及び説明では同じか又は同様の参照番号を用いる。図面は、簡略化された形であり、正確な縮尺ではないことに注意すべきである。本明細書の開示内容を参照すると、便宜性及び明瞭性のためだけに、添付の図面に関して上部、底部、左、右、上、下、の上、上方、下方、下の、後部、及び前部のような方向を示す用語が用いられる。このような方向を示す用語は、本発明の範囲を何ら制限するように解釈されるものではない。
【００３０】
本明細書の開示は、ある一定の例示的な実施形態に関するが、これらの実施形態は、一例として示したものであり、制限するために示すものでないことは理解されるものとする。以下の詳細な説明は、例示的な実施形態を説明しているが、その意図は、特許請求の範囲によって規定された本発明の精神及び範囲に含むことができる実施形態の全ての修正、変形、及び均等物を含むと解釈されるものである。本発明は、当業技術で従来用いられている様々な細胞又は組織分離技術に関して実施することができ、本発明を理解するために必要に応じて一般的に実施される処理段階の一部を本明細書に含むものとする。
【００３１】
Ｉ．本発明の方法
１．再生細胞（ＡＤＣ）を得る方法
本明細書で上述のように、再生細胞、例えば幹細胞及び始原細胞は、様々な組織から収集することができる。本発明のシステムは、全てのこのような組織に用いることができる。しかし、脂肪組織は、再生細胞の特に豊富な供給源である。従って、本発明のシステムは、単に例示的であって限定的ではなく、再生細胞の供給源として脂肪組織を用いて本明細書に示すものとする。
脂肪組織は、当業者に公知のあらゆる方法で得ることができる。例えば、脂肪組織は、脂肪吸引（シリンジ又は電力補助）によるか、又は脂肪組織切除、例えば、吸引補助脂肪形成、超音波補助脂肪形成、及び脂肪組織切除術、又はその組合せにより患者から除去することができる。脂肪組織は、除去して収集し、本明細書に説明する本発明のシステムの実施形態のいずれかにより処理することができる。収集される組織の量は、ドナーの肥満度指数及び年齢、収集に利用可能な時間、到達することができる脂肪組織収集部位の利用可能性、併用及び以前から存在する医薬品及び条件（例えば、抗凝固剤治療法）、及び組織を収集する臨床目的を含むいくつかの因子に依存する。例えば、痩せ型の個体から抽出した１００ｍｌの脂肪組織の再生細胞パーセントは、肥満のドナーから抽出したものよりも大きい（表１）。これは、肥満の個体中の脂質含量が大きいことに対する希釈効果を反映していると考えられる。従って、本発明の１つの態様によれば、過体重ドナーからは、痩せ型の患者から引き抜くことになる量に比較して大量の組織を得ることが望ましいと考えられる。また、この知見から、本発明の用途は、大量の脂肪組織を有する個体に限定されないことが示される。
【００３２】
（表１）
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【００３３】
脂肪組織を処理した後、得られる再生細胞は、成熟脂肪細胞及び結合組織を実質的に含まない。従って、本発明のシステムは、研究及び／又は治療目的で用いることができる異種の複数の脂肪由来再生細胞を生成する。好ましい実施形態では、細胞は、受容者の身体内に配置又は再注入するのに適切である。他の実施形態では、細胞は、研究のために用いることができ、例えば、細胞を用いて長期間生存することができる幹又は始原細胞系を確立することができ、更に研究に用いることができる。
【００３４】
今度は図を参照すると、本発明のシステム１０は、一般的に、１つ又はそれよりも多くの組織収集チャンバ２０、処理チャンバ３０、廃棄物チャンバ４０、産出チャンバ５０、及びサンプルチャンバ６０を含む。収集チャンバ２０及び処理チャンバ３０は、集合的に、チャンバアセンブリと呼ぶことができる。様々なチャンバは、閉鎖された無菌流体／組織経路を維持しながら、生物学的材料を包含する流体が１つのチャンバから別のチャンバに通過することができるように１つ又はそれよりも多くの導管１２を通じて共に連結されている。導管は、それぞれ管腔及び管類と互換的に呼ばれる硬質又は可撓性のある本体を含むことができる。いくつかの実施形態では、導管は、従来臨床環境で用いられるポリエチレン管類、シリコーン又は当業技術で公知のあらゆる他の材料のような可撓性のある管類の形である。導管１２の大きさは、流体又は組織が流れることが望ましいか否かに応じて様々とすることができる。更に、導管１２の大きさは、システムを通して循環する組織又は流体の量に応じても様々とすることができる。例えば、流体を通過させるためには、導管の直径は、約０．０６０〜約０．７５０インチの範囲とすることができ、組織を通過させるためには、導管の直径は、０．３１２〜０．７５０インチの範囲とすることができる。一般的に、導管の大きさは、導管が収容することができる容積及び前記導管を通して組織又は流体を運ぶのに必要な時間の均衡をとるように選択される。システムの自動化実施形態では、上述のパラメータ、すなわち、容積及び運ぶ時間は、適切な信号がシステムの処理装置に送信されるように特定すべきである。それにより、装置は、正確な容積の液体及び組織を１つのチャンバから別のチャンバまで移動させることができる。用いる可撓性のある管類は、潰れる可能性を低減するように負の圧力に耐えることができることが必要である。更に、用いる可撓性のある管類は、例えば、システムに用いられることがある容積式ポンプにより生じる正圧にも耐えることができることが必要である。
【００３５】
システムの全てのチャンバは、標準ＩＶ型シリンジ及び吸引管類接合部を受け取る１つ又はそれよりも多くのポート、例えば吐出２２又は吸込み２１ポートを含むことができる。ポートは、ゴム隔膜密封シリンジ針アクセスポート５１のような密封ポートとすることができる。吸込みポートは、導管を通じて１つ又はそれよりも多くのカニューレ（図示せず）に連結することができる。例えば、組織吸込みポート２１は、一体化単回使用脂肪吸引カニューレに連結することができ、導管は、可撓性のある管類とすることができる。導管は、一般的に、システムの１つのチャンバから別のチャンバまでの流体流路を設けるように位置決めされる。この目的で、導管及びポートは、例えば、手動又は自動運転することができる吸引装置（図示せず）に連結することができる。吸引装置は、例えば、シリンジ又は電気ポンプとすることができる。吸引装置は、患者から組織を吸引するのに十分な負の圧力を与えることができることが必要である。一般的に、当業者、例えば外科医に公知のあらゆる適切な吸引装置を用いることができる。
【００３６】
導管１２は、システムの様々な構成要素間の材料の流れを制御するために１つ又はそれよりも多くのクランプ（図示せず）を更に含むことができる。クランプは、システムの異なる領域を有効に密封することにより、システムの無菌性を維持するのに有用である。代替的に、導管１２は、システムを通る材料の流れを制御する１つ又はそれよりも多くのバルブ１４を含むことができる。バルブ１４は、図の白丸として識別されている。好ましい実施形態では、バルブは、電気機械的ピンチバルブとすることができる。別の実施形態では、バルブは、空気圧バルブとすることができる。更に別の実施形態では、バルブは、水圧バルブ又は機械バルブとすることができる。このようなバルブは、レバーに連結することができるシステムを制御することによってアクティブ化されることが好ましい。レバーは、レバーがアクティブ化されるように手動で操作することができる。自動化した実施形態では、制御システムをレバー、並びに処理装置に連結することができ、これが、所定のアクティブ化条件でバルブをアクティブ化することができる。いくつかの自動化した実施形態では、バルブのアクティブ化は、部分的に自動化され、部分的に使用者の選択に委ねられ、処理を最適にすることを可能にする。更に別の実施形態では、ある一定のバルブは、手動でアクティブ化することができ、他のバルブは、処理装置により自動的にアクティブ化することができる。バルブ１４はまた、１つ又はそれよりも多くのポンプ、例えば蠕動ポンプ３４又は容積式ポンプ（図示せず）と共に用いることができる。導管１２及び／又はバルブ１４は、システムを流れる様々な流体成分及び流体レベルを区別することができるセンサ２９、例えば、光センサ、超音波センサ、圧力センサ、又は当業技術で公知の他の形態のモニタを含むことができる。好ましい実施形態では、センサ２９は、光センサとすることができる。
【００３７】
システムはまた、複数のフィルタ３６を含むこともできる。いくつかの実施形態では、フィルタは、システム２８のチャンバ内に含むことができる。システム内の異なるチャンバは、異なるフィルタを含むことができる。フィルタは、再生細胞、例えば幹細胞及び／又は始原細胞を望ましくない細胞及びシステムにより用いられる可能性がある脱凝集剤から分離するのに有効である。一実施形態では、フィルタアセンブリ３６は、中空糸濾過装置を含む。別の実施形態では、フィルタアセンブリ３６は、沈降過程と共に用いられることもそうでないこともある浸出濾過装置を含む。別の実施形態では、フィルタアセンブリ３６は、水簸装置及び処理と共に用いられることもそうでないこともある遠心分離装置を含む。更に別の実施形態では、システムは、これらのフィルタ装置の組合せを含む。本発明のフィルタ機能は、ある一定のフィルタが最終的な濃縮物からコラーゲン、遊離脂質、遊離脂肪細胞、及び残留コラゲナーゼのような物質を除去し、別のフィルタを用いて最終生成物を濃縮する二重式とすることができる。システムのフィルタは、直径及び／又は長さが２０〜８００μｍの範囲の複数の孔を含むことができる。好ましい実施形態では、収集チャンバ２０は、８０〜４００μｍの範囲の複数の孔を備えた前置フィルタ２８を有する。別の好ましい実施形態では、収集チャンバ２０は、複数の２６５μｍ孔を備えた前置フィルタ２８を有する。別の実施形態では、フィルタは、取外し可能及び／又は使い捨て可能にすることができる。
【００３８】
システムはまた、システムの１つ又はそれよりも多くのチャンバに含まれた材料の温度を調節するように位置決めされた１つ又はそれよりも多くの温度制御装置（図示せず）を含むことができる。温度制御装置は、加熱器、冷却器、又は両方、すなわち、加熱器と冷却器の間を切り換えることができるものとすることができる。温度装置は、組織、脱凝集剤、再懸濁液薬剤、すすぎ薬剤、洗浄薬剤、又は添加物を含むシステムを通過するあらゆる材料の温度を調節することができる。例えば、脂肪組織を加熱すると、脱凝集が容易になり、再生細胞排出を冷却すると、生存度を維持するのに望ましいことになる。更に、最適な組織処理をするために予備加熱した試薬の必要に応じて、温度装置の役割は、温度を上昇又は下降させることではなく、所定の温度を維持することになる。
【００３９】
閉鎖した無菌流体／組織経路を維持するために、全てのポート及びバルブは、システムの密封構成を維持する密封装置を含むことができる。密封装置は、流体、空気、及び他の汚染物に不透過性の膜とすることができ、又は当業技術で公知のあらゆる他の適切な密封装置とすることができる。更に、システムの全てのポートは、システムの無菌性を損なうことなくチャンバ内の材料を引き抜くために、シリンジ、針、又は他の装置を収容することができるように設計することができる。
【００４０】
本明細書に説明されているように、組織は、当業技術で認識されているあらゆる方法で患者から抽出することができる。吸引された組織は、処理するためにシステムに入れる前に抽出することができる。吸引した組織は、一般的に、ゴム隔膜密封シリンジ針アクセスポート（収集チャンバには示さず）のような密封入口ポートを介し、導管１２を通して収集チャンバ２０に移送される。代替的に、組織抽出する段階は、システムの一部とすることができる。例えば、収集チャンバ２０は、患者に挿入された標準カニューレを用いて組織除去することを容易にする真空ライン１１を含むことができる。従って、この実施形態では、全システムが患者に取り付けられる。組織は、閉鎖無菌経路の一部である１２のような導管を介し、吸込みポート２１を通して収集チャンバ２０に導入することができる。収集チャンバ２０は、複数の可撓性があるか又は硬質のキャニスタ又はシリンダ又はその組合せを含むことができる。例えば、収集チャンバ２０は、様々な大きさの１つ又はそれよりも多くの硬質キャニスタを含むことができる。収集チャンバ２０はまた、１つ又はそれよりも多くの可撓性のあるバッグを含むことができる。このようなシステムでは、バッグには、バッグを吸引すると潰れることになる可能性を低減する役に立つ内部又は外部フレームのような支持部が設けられることが好ましい。収集チャンバ２０は、処理チャンバ３０で行われる処理である洗浄及び濃縮段階の前に組織を適切に洗浄して脱凝集するのに必要な量の生理食塩水を保持する大きさにされる。好ましくは、収集チャンバ２０に存在する組織又は流体の容積は、裸眼で容易に確認される。例えば、脂肪組織から再生細胞を得るためには、適切な収集チャンバは、８００ｍｌの脂肪吸上げ物及び１２００ｍｌの生理食塩水を保持する収容力を有する。従って、一実施形態では、収集チャンバ２０の収容力は、少なくとも２リットルである。別の実施形態では、血液から赤血球を分離して濃縮するために、収集チャンバ２０の収容力は、少なくとも１．５リットルである。一般的に、収集チャンバ２０の大きさは、患者から収集された組織の種類及び量に応じて変動することになる。収集チャンバ２０は、約５ｍｌ程の少なさから約２リットルまでの組織を保持する大きさにすることができる。少量の組織容積、例えば５ｍｌ〜１００ｍｌに対しては、組織は、収集チャンバ２０に移送する前にシリンジに集めることができる。
【００４１】
収集チャンバ２０は、無菌化することができるあらゆる適切な生体適合性材料を用いて構成することができる。好ましい実施形態では、収集チャンバ２０は、「ＩＳＯ  １０９９３」規格に説明する血管内接触のために要求される生体適合性を満たす使い捨ての材料から成る。例えば、ポリカーボネートアクリル又はＡＢＳを用いることができる。収集チャンバ２０の流路は、発熱物質を含まず、すなわち、疾病伝染の危険なく血液に用いるのに適することが好ましい。一実施形態では、収集チャンバ２０は、使用者がチャンバに存在する組織の大体の容積を視覚的に判断することができる材料から成る。他の実施形態では、収集チャンバ２０内の組織及び／又は流体の容積は、自動センサ２９で判断される。収集チャンバ２０は、自動化された実施形態では、システムが妥当な程度の精度でチャンバ内の組織及び／又は流体の容積を判断することができるように設計されることが好ましい。好ましい実施形態では、システムは、±１５パーセントの精度で収集チャンバ内の容積を検知する。
【００４２】
一例としてのみ挙げた特定的な実施形態では、収集チャンバ２０は、硬質チャンバ、例えば、メッシュサイズ２６５μｍ（図５参照）の医療等級ポリエステルのほぼ円錐形の前置フィルタ２８を含む医療等級ポリカーボネートで構成されたチャンバの形である。硬質組織収集容器の大きさは、ほぼ８インチ高さでほぼ５インチ直径とすることができ、壁厚みは、約０．１２５インチとすることができる。シリンダ内部には、例えば、吸引管類のための１つ又はそれよりも多くのポート、無菌ドッキング技術による接合のための管類を備えた１つ又はそれよりも多くのポート、及び／又はゴム隔膜を通して針穿孔アクセスするための１つ又はそれよりも多くのポートを通してアクセス可能である。収集チャンバ２０の内部の前置フィルタ２８は、例えば、患者から組織が除去される時に脂肪組織を保持し、非脂肪組織を通過させるように構成されることが好ましい。より詳細には、フィルタ２８により、脂肪組織を収集する間又は別の実施形態では収集後に、脂肪組織の断片を維持しながら遊離脂質、血液、及び生理食塩水を通過させることができる。この点で、フィルタ２８は、同じか又は異なる大きさのいずれかであるが、大きさが約２０μｍ〜５ｍｍの範囲である複数の孔を含む。好ましい実施形態では、フィルタ２８は、複数の４００μｍの孔を含む。好ましい実施形態では、フィルタ２８は、ほぼ２００μｍ厚みで孔径がほぼ２６５μｍ、開放面積がほぼ４７％の医療等級ポリエステルメッシュである。この材料は、すすぎの間には組織を保持するが、組織の脱凝集の後には、細胞はメッシュを通過することができる。従って、組織が患者から吸引される時、非脂肪組織は、脂肪組織から分離することができる。異なる材料、メッシュサイズ、及びポートの数及び種類でも、同じ機能を達成することができる。例えば、メッシュ孔径が１００μｍよりも小さいか数千ミクロン程の大きさであれば、脂肪組織凝集物及び断片を保持しながら生理食塩水及び血球を通過させるという同じ目的を達成することになる。同様に、同じ目的は、代替の硬質プラスチック材料を用いることによるか、又は当業者に公知の多くの他の修正により達成することができる。
【００４３】
システム１０はまた、１つ又はそれよりも多くの溶液供給源２２を含むこともできる。溶液供給源は、洗浄溶液供給源２３、及びコラゲナーゼのような組織脱凝集剤供給源２４を含むことができる。収集チャンバ２０は、洗浄及び脱凝集溶液又は薬剤を無菌的に組織に加えることができる閉鎖流体経路を含む。
洗浄溶液２３及び脱凝集剤２４のための容器は、内容物を無菌的に保持することができるあらゆる適切な容器、例えば、臨床環境で用いられるＩＶ型バッグのような折り畳み可能バッグとすることができる。これらの容器は、洗浄溶液及び脱凝集剤を収集チャンバ２０の内部に送出することができるように、収集チャンバ２０に連結された導管１２ｅのような導管１２を有することができる。洗浄溶液及び脱凝集剤は、生理食塩水２３及び／又は脱凝集剤２４のための容器の外側に加えた単純重力圧力又は導管、例えば図４の導管１２ｄに容積式ポンプを配置することを含む当業技術で認識されているあらゆる方法で収集チャンバ２０の内部に送出することができる。自動化した実施形態では、システムの処理装置は、様々なパラメータ、例えば、洗浄に必要な生理食塩水の容積及びサイクルの時間又は回数、並びに使用者が最初に入力した情報（例えば、処理されている組織の容積）に基づいて脱凝集に必要な脱凝集剤の濃度又は量及び時間が計算される。代替的に、量、時間等は、使用者が手動で操作することができる。
【００４４】
収集チャンバ内の組織及び／又は流体は、３０℃〜４０℃の範囲の温度に維持すべきである。好ましい実施形態では、収集チャンバ内部の懸濁液の温度は、３７℃に維持される。いくつかの実施形態では、外科的手順又は治療的適用を遅らせる必要がある場合には、選択した組織は、後に用いるために収集チャンバに保存することができる。組織は、約室温又は約４℃で９６時間まで保存することができる。
【００４５】
洗浄溶液は、生理食塩水又はあらゆる他の緩衝又は非緩衝電解質溶液を含む当業者に公知のあらゆる溶液とすることができる。処理する組織の種類により、用いる洗浄溶液の種類又は組合せが決まることになる。一般的に、生理食塩水のような洗浄溶液は、脂肪組織が患者から除去されて収集チャンバに入れられた後に収集チャンバ２０に入る。しかし、洗浄溶液は、脂肪組織が抽出される前に収集チャンバ２０に送出することもでき、又は脂肪組織と同時に収集チャンバ２０に送出することもできる。収集チャンバ２０では、洗浄溶液及び抽出した脂肪組織を以下に説明する方法を含むあらゆる手段により混合することができる。
【００４６】
例えば、組織は、撹拌により洗浄することができる（それにより、細胞生存度を最大にして放出される遊離脂質の量を最小にする）。一実施形態では、組織は、様々な角度の円弧を通して（例えば、約４５度〜約９０度の円弧を通して）、様々な速度で、例えば約３０回転／分で全収集チャンバ２０を回転させることによって撹拌する。他の実施形態では、組織は、収集チャンバの内面に強固に取り付けられた１つ又はそれよりも多くのパドル又は突起を含む収集チャンバ２０全体を様々な円弧を通して（例えば、約４５度〜約９０度の円弧を通して）様々な速度、例えば約３０回転／分で回転させることによって撹拌する。上述の収集チャンバ２０の回転は、収集チャンバ２０に取り付けられるか又はそれに近接する駆動機構により達成することができる。駆動機構は、単純ベルト又はギア又は当業技術で公知の他の駆動機構とすることができる。回転速度は、例えば３０回転／分とすることができる。一般的に、高速になれば、大量の遊離脂質が生成されることが見出されており、これは最適ではない場合がある。
【００４７】
他の実施形態では、組織は、回転可能なシャフト２５を収集チャンバ２０内に配置することによって撹拌するが、回転可能なシャフトは、シャフトが回転する時に混合物を通過する回転可能なシャフト２５に強固に取り付けられた１つ又はそれよりも多くのパドル２５ａ又は突起を含む。いくつかの実施形態では、強固に取り付けられた２５ａパドルを備えた回転可能なシャフト２５は、収集チャンバ２０の底部に置くことができる。これは、例えば、パドル状装置を回転磁場（例えば、磁気撹拌機）に入れることによって達成することができる。代替的に、組織の撹拌は、当業技術で公知の簡単な撹拌装置、すなわち、回転させずに上下に振動させる装置を用いて達成することができる。更に、組織は、揺動、撹拌、反転などを含む当業技術で認識されているあらゆる他の手段を用いて洗浄することができる。
【００４８】
望ましい量の洗浄サイクルの後、組織脱凝集剤は、収集チャンバ２０に送出され、残りの脂肪組織成分から再生細胞を分離することができる。脱凝集剤は、当業者に公知のあらゆる脱凝集剤とすることができる。用いることができる脱凝集剤には、中性プロテアーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、「Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ」酵素混合物系統に属するもの、例えば「Ｌｉｂｅｒａｓｅ  Ｈｌ」、ペプシン、超音波又は他の物理エネルギ、レーザ、マイクロ波、他の機械的装置、及び／又はその組合せが含まれる。本発明の好ましい脱凝集剤はコラゲナーゼである。脱凝集剤は、他の溶液と共に加えることができる。例えば、上述の生理食塩水供給源２３から送出される生理食塩水のような生理食塩水は、コラゲナーゼと共に、又はコラゲナーゼを加えた直後に脂肪組織に加えることができる。一実施形態では、洗浄した脂肪組織は、コラゲナーゼ含有酵素溶液と３７℃又はその付近の温度で約２０〜６０分間混合する。他の実施形態では、高濃度のコラゲナーゼ又は同様の薬剤を加えて、消化時間を低減することができる。洗浄した脂肪組織及び組織脱凝集剤は、次に、上述の撹拌法と同様の方法で、洗浄した脂肪組織が凝集しなくなるまで撹拌することができる。例えば、洗浄した脂肪組織及び組織脱凝集剤は、ほぼ９０度の円弧を通して収集チャンバ全体を回転させることにより、シャフトが回転する時に溶液を通過する１つ又はそれよりも多くのパドルを含むシャフトを備えることにより、及び／又は収集チャンバの内面にパドル又は突起を含む収集チャンバ全体を回転させることにより撹拌することができる。
【００４９】
脂肪由来細胞を用いる目的に応じて、脂肪組織は、部分的に脱凝集するか、又は完全に脱凝集するかのいずれかとすることができる。例えば、脂肪由来細胞が脂肪組織単位と組み合わされる実施形態では、収集脂肪組織を部分的に脱凝集し、部分的に脱凝集した脂肪組織部分を除去し、その後、収集チャンバに残った脂肪組織の残留部分の脱凝集を続けることが望ましいと考えられる。代替的に、消化を行う前に、洗浄した脂肪組織部分を除去してサンプル容器に取り分けることができる。別の実施形態では、収集した脂肪組織は、患者に再導入して戻す前に部分的に脱凝集し、細胞を濃縮する。一実施形態では、脂肪組織は、一般的に約２０分未満の時間にわたって組織脱凝集剤と混合する。部分的に脱凝集した組織の一部は、次に、収集チャンバから除去し、残りの部分的に脱凝集した組織は、脂肪組織を組織脱凝集剤と更に４０分間混合することによって更に脱凝集することができる。脂肪由来細胞を再生細胞の本質的に純粋な母集団として用いる場合には、脂肪組織は、完全に脱凝集することができる。
【００５０】
消化後、組織及び脱凝集剤溶液は、溶液の浮遊及び非浮遊成分が収集チャンバ内で区別されるようになるのに十分な時間にわたって沈下させる。一般的に、この時間は、約１５秒〜数分の範囲であるが、修正実施形態では、他の時間で実行することもある。浮遊層は、更に洗浄して濃縮する必要がある再生細胞を含む。非浮遊層は、血液、コラーゲン、脂質、及び組織の他の非再生細胞成分を含む。非浮遊層は、廃棄物チャンバから除去すべきである。
【００５１】
従って、収集チャンバ２０は、好ましくは、血液及び組織の他の非浮遊成分が１つ又はそれよりも多くの導管１２を通じて１つ又はそれよりも多くの廃棄物容器４０に排液することができるようにチャンバの最低点に出口ポート２２を含む。収集チャンバ２０は、一般的に、出口ポート２２が収集チャンバの底部に配置されるように、直立位置にされる（又は配置することができる）。排液は、受動性又は能動性とすることができる。例えば、上述の非浮遊成分は、重力を用いて正又は負の圧力を掛けることにより、又はポンプ３４を用いることにより、又は通気口３２を用いることにより排液することができる。自動化した実施形態では、処理装置は、特定のバルブ及び／又はポンプに信号を送り、収集チャンバ２０から非浮遊層を排液することができる。自動化した実施形態はまた、浮遊及び非浮遊液体の間の界面が達成された時を検出することができるセンサ２９を含むことができる。自動化した実施形態はまた、センサ２９、例えば、収集チャンバから送出される導管に流入する溶出物の光反射の変化を検出することができる光センサを含むことができる。光反射の適切な変化があると、出導管に浮遊層が存在する信号を送ることができ、これは、非浮遊層が排液されたことを示している。センサ２９は、次に、処理装置に次の段階に進ませる信号を送ることができる。
【００５２】
しかし、いくつかの実施形態では、組織は、組織の非再生細胞成分を回収するように処理することができる。例えば、ある一定の治療的又は研究用途では、コラーゲン、タンパク質、基質又は間質成分、脂質、脂肪細胞、又は組織の他の成分が望ましい場合がある。このような実施形態では、上述のように廃棄物チャンバに除去する必要があるのは、再生細胞を含む浮遊層である。非浮遊層は、次に、必要に応じて更に処理するためにシステムに保持される。
【００５３】
非浮遊層が除去された状態で、再生細胞を含む浮遊層は、１回又はそれよりも多く洗浄して残留汚染物を除去することができる。従って、収集チャンバ２０は、一般的に、洗浄溶液をチャンバ内部に送出させるための１つ又はそれよりも多くのポート２１と、廃棄物及び他の材料を収集チャンバ２０から導いて出すための１つ又はそれよりも多くのポート２２とを含む。例えば、収集チャンバは、本明細書に説明するように、１つ又はそれよりも多くの密封入口ポートを含むことができる。収集チャンバ２０はまた、洗浄溶液が収集チャンバに送出される間及び／又は廃棄物が運び出される間にシステムが確実に無菌のままであるように、上部キャップ及び底部キャップのような１つ又はそれよりも多くのキャップ（図示せず）を含むことができる。ポート２１は、収集チャンバのキャップ又は収集チャンバの側壁に設けることができる。
【００５４】
新鮮な洗浄溶液で洗浄する処理は、溶液中の非浮遊汚染物の残量含量が所定のレベルに到達するまで繰り返すことができる。言い換えると、収集チャンバ２０に残った材料は、脂肪組織断片を含む上述の混合物の浮遊材料を含み、これを望ましくない材料の量が望ましい所定のレベルに減少するまで１回又はそれよりも多く付加的な回数洗浄することができる。洗浄の終点を判断する１つの方法は、組織溶液中の赤血球の量を測定することである。これは、５４０ｎｍ波長に吸収された光を測定することによって達成することができる。好ましい実施形態では、約０．５４６と約０．８４２の間の範囲が許容可能であると考えられる。
【００５５】
洗浄及び／又は脱凝集中に、結果を改善するために必要に応じて１つ又はそれよりも多くの添加物を様々な容器に加えることができる。添加物の一部の例には、洗浄及び脱凝集を最適にする薬剤、処理の間に活性細胞母集団の生存度を改善する添加物、抗菌薬剤（例えば、抗生物質）、脂肪細胞及び／又は赤血球を溶解させる添加物、又は関連の細胞母集団を富化させる（固相成分に差次付着させるか又は他の方法で細胞母集団の実質的な減少又は富化を促進する）添加物が含まれる。他の可能な添加物には、再生細胞の回収及び生存度を改善するもの（例えば、カスパーゼ阻害剤）又は注入又は布置する時に有害な反応が起こる可能性を低減するもの（例えば、細胞又は結合組織の再凝集阻害剤）が含まれる。
【００５６】
十分な沈下時間を経過させた後、洗浄した脂肪組織断片及び組織脱凝集剤から得られる混合物の非浮遊分画は、再生細胞、例えば幹細胞及び他の脂肪由来始原細胞を含むことになる。本明細書で説明したように、再生細胞を含む非浮遊分画は、処理チャンバ３０に移送され、そこで、脂肪由来幹細胞のような関連の再生細胞は、混合物の非浮遊分画に存在する他の細胞及び材料から分離されることになる。この非浮遊分画は、本明細書では再生細胞組成物と呼ばれ、幹細胞、始原細胞、内皮前駆細胞、脂肪細胞、及び本明細書に説明する他の再生細胞を含む複数の異なる種類の細胞を含む。更に、再生細胞組成物は、脂肪組織断片に存在していたコラーゲン及び他の結合組織タンパク質及びその断片、又は組織脱凝集処理から得られる残留コラゲナーゼのような１つ又はそれよりも多くの汚染物も含むと考えられる。
【００５７】
本発明の処理チャンバ３０は、再生細胞組成物が管類１２、バルブ１４、及びポンプ３４を通じて無菌的に収集チャンバ２０から処理チャンバ３０に移動するようにシステム内に位置決めされることが好ましい。処理チャンバは、１０ｍＬ〜１．２Ｌの範囲の組織／流体混合物を収容する大きさにされる。好ましい実施形態では、処理チャンバは、８００ｍＬを収容する大きさにされる。いくつかの実施形態では、収集チャンバ２０からの再生細胞組成物全体が処理チャンバ３０に導かれる。しかし、他の実施形態では、再生細胞組成の一部が処理チャンバ３０に導かれ、別の一部は、システムの異なる領域、例えばサンプルチャンバ６０に導かれて、後に処理チャンバ３０内で処理される細胞と再び組み合わされる。
【００５８】
処理チャンバ３０は、滅菌することができるあらゆる適切な生体適合性のある材料を用いて構成することができる。好ましい実施形態では、処理チャンバ３０は、「ＩＳＯ  １０９９３」規格に説明するような血管内で接触するために必要とされる生体適合性を満たす使い捨ての材料から成る。例えば、ポリカーボネート、アクリル、ＡＢＳ、エチレンビニルアセテート、又はスチレン−ブタジエンコポリマー（ＳＢＣ）を用いることができる。別の実施形態では、使い捨ての処理チャンバの流路は発熱物質を含まない。処理チャンバは、血液バンクで血液を処理するのに従来用いられるもののようなプラスチックバッグの形とすることができ、他の実施形態では、構造的に剛直とすることができる（図６）。一実施形態では、処理チャンバ３０は、本出願人保有の２００１年１２月７日出願の米国特許出願第１０／３１６，１２７号及び２００２年１２月２０日出願の米国特許出願第１０／３２５，７２８号に開示されている処理チャンバと同様とすることができ、これらの出願の開示内容は、本明細書においてその全内容が引用により組み込まれている。
【００５９】
処理チャンバ３０は、濾過及び遠心分離及び／又はその組合せを含む細胞を分離して濃縮するのに適切なあらゆる方式で構成することができる。いくつかの実施形態では、収集チャンバ２０からの再生細胞組成物は、処理チャンバ３０に導入され、そこで、組成物は濾過され、特定の再生細胞母集団を分離及び／又は濃縮することができる。細胞濾過は、特定の成分及び細胞を他の異なる成分又は細胞の種類から分離する方法である。例えば、本発明の再生細胞組成物は、幹細胞、始原細胞、及び脂肪細胞を含む複数の異なる種類の細胞、並びに脂肪組織断片に含まれていたコラーゲン、又は組織脱凝集から得られる残留コラゲナーゼのような１つ又はそれよりも多くの汚染物を含む。処理チャンバ３０に存在するフィルタ３６により、再生細胞、例えば幹細胞又は内皮始原細胞等の特定の部分母集団を分離して濃縮することができる。
【００６０】
液体から細胞を濾過することに伴ういくつかの変数には、以下に限定されるものではないが、濾材の孔径、孔の幾何学構成（形状）、フィルタの表面積、濾過される溶液の流れる方向、膜間圧力、特定の細胞母集団の希釈、粒子の大きさ及び形状、並びに細胞の大きさ及び細胞生存度が含まれる。本明細書の開示内容によれば、分離されるか又は濾過されることが望ましい特定の細胞は、一般的に脂肪由来幹細胞である。しかし、いくつかの実施形態では、特定の細胞には、内皮前駆細胞のような脂肪由来始原細胞を単独又は幹細胞と共に含むことができる。
【００６１】
再生細胞は、フィルタアセンブリ３６のようなフィルタアセンブリを通して導くことができる。いくつかの実施形態では、フィルタアセンブリ３６は、異なる機能を行い、再生細胞組成物を分離して区別可能な部分又は成分にする構成にされた複数のフィルタを含む。例えば、フィルタの１つは、再生細胞組成物からコラーゲンを分離するように構成することができ、フィルタの１つは、再生細胞組成物から脂肪細胞及び／又は脂質成分を分離するように構成することができ、フィルタの１つは、再生細胞組成から組織脱凝集剤のような残留酵素を分離するように構成することができる。いくつかの実施形態では、フィルタの１つは、コラーゲン及び組織脱凝集剤を組成物から分離することのような２つの機能を実施することができる。複数のフィルタは、一般的に直列に配置されるが、フィルタの少なくとも一部は、並列に配列することができる。フィルタアセンブリ３６のフィルタの直列配置は図２に示している。フィルタアセンブリ３６のフィルタの並列配置は図３に示している。
【００６２】
一実施形態では、フィルタアセンブリ３６は、第１のフィルタ、第２のフィルタ、及び第３のフィルタを含む。第１のフィルタは、再生細胞組成物に存在するコラーゲン粒子を除去するように構成される。これらのコラーゲン粒子は、典型的に直径がほぼ０．１ミクロンであり、長さが２０ミクロンまでとすることができる。コラーゲン粒子は、消化に応じて大きさを変える場合がある。コラーゲン粒子はまた、微小繊維とすることができ、これは、捻れ及び回転を有することを意味する。本明細書に記載のあらゆるフィルタは、ポリエーテルスルホン、ポリエステル、ＰＴＦＥ、ポリプロピレン、ＰＶＤＦ、又は場合によってはセルロースで作ることができる。コラーゲンを濾過するには２つの可能性がある。一方は、最初に大きな粒子を除去し、細胞を通過させることを試みるものであり、これには、例えば、恐らく１０ミクロン程度のフィルタを必要とすることになる。第２の方法は、コラーゲンがよく消化され、細胞を捕捉してコラーゲンを通過させることを意図して４．５ミクロンのような小さいサイズのフィルタを用いるものである。これには、細胞をフィルタから離して再び浮き上がらせる手段を必要とすることになる。更に、コラーゲン繊維を引き付けて保持するフィルタが用いられることもある。
【００６３】
第２のフィルタは、再生細胞組成中では浮遊していない遊離未熟脂肪細胞を除去するように構成される。一実施形態では、第２のフィルタは、ポリエステルで構成することができ、孔径は、約３０と約５０ミクロンとの間とすることができ、好ましい孔径は約４０ミクロンである。第２のフィルタと呼ぶが、このような装置の配置は第２の位置ではなく、第１の位置とし、大きな細胞及び粒子を最初に除去することを容易にすることができる。第３のフィルタは、組成物に存在する未使用又は残留コラゲナーゼ又は他の組織脱凝集剤を除去するように構成される。好ましい実施例では、コラゲナーゼは、長時間にわたって変質する場合がある。一実施形態では、第３のフィルタは、直径又は長さが１μｍ未満の複数の孔を含む。いくつかの実施形態では、孔径は、１μｍよりも小さくすることができる。他の実施形態では、孔径は、１０ｋＤと５ミクロンの間である。いくつかの実施形態では、第３のフィルタは、本明細書で説明したように、再生細胞母集団を少量の生理食塩水又は他の洗浄溶液に濃縮するように構成することができる。現時点で好ましいように、最後のフィルタのみは中空糸ユニットとされる。フィルタのいずれも中空糸型とすることが必要であるわけではない。中空糸単位は、好ましい実施例では、再生細胞に与える悪影響を最小にしてコラゲナーゼを除去するのに最も効率的であるために最終フィルタに用いられる。装置が在庫品を集めたものである実施形態では、３つのフィルタは、別々のハウジングに入っている。中空糸単位が第３のフィルタに用いられている場合には、第１及び第２のフィルタを組み合わせて１つのハウジングに入れることは可能である。最終フィルタが中空糸構成でない場合には、全ての３つのフィルタを１つのハウジングに含むことができる。
【００６４】
フィルタアセンブリ３６のフィルタは、処理チャンバ３０内に配置することができ、又は処理チャンバ３０から分離された構成要素として設けることができる。更に、フィルタアセンブリ３６のフィルタは、複数の処理チャンバ内又はインライン式に設けることができる。いくつかの実施形態では、導管又は管類は、１つ又は複数の処理チャンバとして働くことができる。処理チャンバの大きさは、フィルタに接続される導管の内部容積になるように低減することができる。この種のシステムは、組織溶液の容積が適切な大きさであれば正確に機能することになる。従って、導管は、フィルタを通過する時に細胞と共に流体を含むことによって処理チャンバとして働くことができる。システムを始動して運転する処理で細胞／組織が不必要に失われないように導管の容積を最小にするように配慮することができる。
【００６５】
上述の実施形態を参照すると、洗浄した細胞及び残留コラーゲン、脂肪細胞、及び／又は未消化組織脱凝集剤を含む再生細胞組成物は、第１のフィルタを通して導き、組成物からコラーゲン粒子の少なくとも一部、好ましくは実質的に全てを除去し、濾液にコラーゲン粒子が殆ど、好ましくは全く存在しないようにすることができる。脂肪細胞及び／又は未消化組織脱凝集剤を含む濾過した再生細胞組成物は、次に、第２のフィルタを通して導き、濾過した再生細胞組成物から遊離脂肪細胞の少なくとも一部、好ましくは実質的に全てを除去することができる。その後、未消化組織脱凝集剤を含む２回濾過した再生細胞組成物は、本明細書で説明したように中空糸濾過装置のような第３のフィルタを通して導き、再生細胞組成物から未消化組織脱凝集剤を除去又は低減することができる。
【００６６】
３回濾過した再生細胞組成物（すなわち、第１、第２、及び第３のフィルタを通過させた後に残る組成物）は、次に、複数の吐出口に導くことができ、これは、複数の吐出口を含む処理チャンバ３０の一部を含むことができる。これらの吐出口は、必要な圧力を維持するほか、導管を介し、収集チャンバ２０、産出チャンバ５０、及び／又は廃棄物容器４０を含むことができる他の容器までの接合部を設ける働きをすることができる。
【００６７】
一実施形態では、フィルタアセンブリ３６のフィルタは、中空糸濾過部材を含む。代替的に、言い換えると、フィルタは、濾材で形成された中空管の集合を含む。開示されたシステム１０と共に用いることができる濾材の例には、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、又は混合エステル材料等が含まれる。これらの濾材の中空糸又は中空管は、フィルタアセンブリ３６の円筒形カートリッジに含めることができる。濾材の個々の管又は繊維は、一般的に、内径が約０．１ｍｍ〜約１ｍｍの範囲であり、好ましい値は約０．５ｍｍである。適切な円筒形カートリッジの直径及び長さにより、カートリッジ内に配置することができる濾材の個々の管の数が決まることになる。中空糸フィルタカートリッジの例の１つは、「ＦｉｂｅｒＦｌｏ（登録商標）十字流フィルタ」、カタログ番号Ｍ−Ｃ−０５０−Ｋ（ミネソタ州ミネアポリス所在のＭｉｎｎｔｅｃｈ）である。濾材の孔径は、約１０キロダルトンと約５ミクロンの間の範囲とすることができ、好ましい孔径は、約０．５ミクロンである。
【００６８】
中空糸フィルタでは、各中空管は、第１の端部、第２の端部、及び本体内に配置されて第１の端部と第２の端部の間に延びる管腔を備えた本体を有する。各中空管の本体は、複数の孔を含む。孔は、一般的に、図１２（Ａ）に示すように、再生細胞組成物が本体の管腔を通って流れることによって濾過され、濾過される生成物が接線方向に孔を通過するような本体内の向きに置かれる。言い換えると、液体内の小さな粒子は、本体の管腔を通る流体の流れに対して孔を接線方向に通過する。再生細胞を有する組成物は、組成物が濾過される時に各中空管の管腔を通過する。好ましくは、組成物の流れは、各中空管の本体の孔に対して接線方向である。
【００６９】
流体の接線方向の流れを用いることにより、幹細胞の濾過効率が、他の濾過技術に対して改善すると考えられる。例えば、一部の濾過技術によれば、濾材の孔は、図１２（Ｂ）に示すように、フィルタが流体の流れに垂直に向くように配置され、濾材が濾過される流体の通路を遮断するようになっている。この種類の濾過では、再生細胞組成物、例えば、幹細胞から濾過される粒子は、フィルタの一方の側に蓄積し、孔を通る流体の流れを遮断する傾向がある。この遮断により、フィルタの効率が減少する場合がある。更に、細胞は、流体流れの圧力、並びにフィルタの上流側に蓄積する細胞の重量により常に圧縮される。それにより、幹細胞の溶解が増大することになると考えられる。従って、流体の流れがフィルタの孔の方向に平行であるこのような濾過技術では、大きな細胞及び小さな粒子の両方が、流体が孔を通過する時に濾材に導かれるので望ましくないと考えられる。その結果、細胞のような液体内の大きな生成物は、孔を遮断し、それによって濾過作用を低下させ、細胞破裂又は損傷の発生を増大させる場合がある。
【００７０】
これと対照的に、本発明のシステム１０の中空糸構成では、濾過される流体は、中空管の管腔に流入する。フィルタ本体の孔を通過することができる流体の一部は、本体内の流体の正圧、並びに本体の外側に印加される負の圧力の助けを借りて通過する。この実施形態では、細胞は、一般的に、流体流れの圧力又は他の細胞の重量を受けず、従って、幹細胞に印加されるせん断力が減少する。従って、濾過の効率及び有効性は、目詰まりの速度を低減し、再生細胞の溶解を低減することによって改善することができる。生理食塩水及び望ましくないタンパク質分子の大きさにより、濾過中にこれらの分子及び他の小さな成分は、中空管の本体の孔を通過して中空管の外に出て廃棄物容器４０に導かれる。一実施形態では、濾過は、中空管濾材の外側に真空を発生させることによって促進される。再生細胞、例えば幹細胞又は始原細胞の大きさのために、これらの細胞は、一般的に、本体の孔を通過することができず、従って、中空管フィルタ内部（例えば、管の管腔）に留まり、フィルタと処理チャンバの間の導管を通じて処理チャンバ３０に又は産出チャンバ５０に戻るように導かれる。
【００７１】
１つの特定的な実施形態では、中空糸フィルタの孔径は、約０．０５ミクロンであり、濾材のほぼ５５０ｃｍ2の表面積を含む。個々の濾材管の直径は、一般的に約０．５ｍｍである。１３０ｍｌの再生細胞組成物を処理する際には、ほぼ１２０ｍｌの付加的な生理食塩水を組成物に加えることができる。処理又はフィルタ時間は、ほぼ８分とすることができる。中空糸管本体の両側に印加される圧力（例えば、本体の管腔の内側の圧力、及び本体の外側の圧力）の差は、膜間圧力であると考えられる。膜間圧力は、約１ｍｍＨｇ〜約５００ｍｍＨｇの範囲とすることができ、好ましい圧力は、約２００ｍｍＨｇである。中空糸濾過を用いる平均有核細胞回収度及び生存度は、生存細胞のほぼ８０％とすることができる。
【００７２】
このようなシステムで典型的に除去されるコラゲナーゼの量は、３対数減少に等しい。例えば、収集チャンバから処理チャンバに移送された再生細胞組成物中のコラゲナーゼの初期濃度が０．０７８Ｕ／ｍｌであれば、最終再生細胞組成物のコラゲナーゼ濃度は、０．０００７８Ｕ／ｍｌであることになる。コラゲナーゼは、中空糸フィルタ内に除去され、中空糸フィルタは、上述の第３のフィルタに対応するものである。
【００７３】
上述の１つ又はそれよりも多くの細胞濾過法を示す処理チャンバを図面、特に図１〜図３に示している。図１〜図３を参照すると、処理チャンバ３０とフィルタアセンブリ３６の濾過チャンバとの間にポンプ３４のようなポンプを設けることができる。更に、通気口３２及び圧力センサ３９のような通気口及び圧力センサは、処理チャンバ３０及びフィルタアセンブリ３６に合わせて設けることができる。産出チャンバ５０の継手も設けることができる。これらの任意的な構成要素（例えば、ポンプ３４、通気口３２、圧力センサ３９、及び産出チャンバ５０の継手）は、処理チャンバ３０とフィルタアセンブリ３６の間に設け、処理チャンバ３０に含まれている液体が、フィルタアセンブリ３６を通って流れる前に、これらの任意的な構成要素の１つ又はそれよりも多くに流れることを可能にすることができる。例えば、液体は、フィルタアセンブリ３６に流れる前に、ポンプ３４を通って流れることができる。あるいは、液体は、システム内の前置フィルタ液体圧力を得るために、フィルタアセンブリを通過する前に圧力センサ３９を通過することができる。ある一定の状況では、これらの構成要素の１つ又はそれよりも多くは、図６に示されている通気口３２のように処理チャンバ３０の要素として設けることができる。図示の実施形態では、圧力センサ３９は、フィルタアセンブリ３６が濾過チャンバに入る時にポンプ３４により生じる再生細胞組成物の圧力を判断するためにインラインに設けられる。この構成により、フィルタ膜を超える膜間圧力をモニタするのを容易にすることができる。付加的な生理食塩水又は他の緩衝液及び洗浄溶液を再生細胞組成物に加えて、組成物がフィルタアセンブリ３６を通過して濾過される時に、望ましくないタンパク質を除去するのを助けることができる。このような繰返し洗浄を複数回行い、再生細胞の純度を高めることができる。いくつかの実施形態では、生理食塩水をいずれかの段階で必要と考えられるだけ加え、濾過を改善することができる。
【００７４】
一例として挙げられて限定するものではない１つの特定的な実施形態では、望ましくないタンパク質及び生理食塩水又は他の洗浄溶液は、次のように除去する。再生細胞、並びにコラーゲン及び結合組織粒子又は断片、脂肪細胞、及びコラゲナーゼを含む組成物は、最小容積になるまで一連のフィルタを通して循環させる。最小容積は、システムの総保持容積及び何らかの所定の定数の関数である。保持容積は、全ての処理チャンバが空であれば、管類及び導管に含まれる液体の容積である。一実施形態では、最小容積は、１５ｍｌである。最小容積になると、再生細胞組成物と混合するために、所定の容積の洗浄溶液がシステムに導入される。この洗浄溶液及び再生細胞組成物の混合物は、次に、再び最小容積になるまでフィルタを通して循環させる。このサイクルを複数回繰返し、再生細胞の純度を高めることができ、言い換えると、組成物中の他の材料に対する組成物中の再生細胞の比率を増大させることができる。図１０及び図１１を参照されたい。
【００７５】
再生細胞組成物が、望ましくないタンパク質を浄化され、十分に濃縮されたと判断された後（例示的な実施形態では、約１×１０5〜約１×１０7細胞／ｍｌの範囲内の最小濃度を用いることができ、好ましい実施形態では、最小濃度は、約１×１０7細胞／ｍｌとすることができる）、特定的な実施形態に応じて、産出バッグのような産出チャンバ５０を処理チャンバ３０及び／又はフィルタアセンブリ３６の出口ポートに接続することができる。通気口３２のような通気口を次に開けて、濃縮再生細胞の産出を容易にすることができる。１つの実施例では、いつ最小濃度に達したかの判断は、実験を行って装置の電子制御をプログラムした後に経験的に行われる。この判断は、得ることが望ましいもの、すなわち、幹／始原細胞の望ましい数又は細胞濃度の範囲の処理過程に入力することができる。科学的データに基づいて、好ましい量の脂肪組織を得てシステムに入れ、望ましい結果を達成することが必要である。通気口３２を開け、ポンプ３４のようなポンプを機能させて、濃縮再生細胞を産出バッグに移送することができる。一実施形態では、産出バッグ５０は、一端に継手を備えた管を有する空の血液バッグと同様である。無菌方式では、産出バッグの継手を出口ポートに取り付けることができ、濃縮再生細胞を産出バッグに移送することができる。
【００７６】
図１〜図３に示すように、システム１０に真空ポンプ２６を設け、特に、システム内の圧力を変化させることができる。例えば、真空ポンプ２６は、導管１２ｂのような導管を通じて収集チャンバ２０に連結し、収集チャンバ２０内の圧力を低減することができる。真空ポンプ２６はまた、導管１２ｇのような導管により処理チャンバ３０に連結することができる。ポンプ３４と接続した真空ポンプ２６の運転に関して、２つの別々の真空ポンプ又は供給源を用いることができ、又はこの処理の特定の時点で真空が必要な異なる導管に真空吸引を向けるバルブを用いることにより、単一の真空ポンプ又は供給源を用いることができる。更に、真空ポンプ２６は、導管１２ｆのような導管を通じて廃棄物容器４０に連結することができる。
【００７７】
図１０及び図１１を参照すると、真空ポンプ２６により生じる圧力を用い、再生細胞を含む流体流れを導管１２を通して導くことができる。この圧力は、例えば、自動的又は手動的にシステム１０の１つ又はそれよりも多くのバルブ１４の位置を制御することによって複数の方向に供給することができる。システム１０は、正圧を用いるか、又は負の圧力を用いるか、又はその組合せにより適切に機能するようにすることができる。例えば、再生細胞は、上述の第１及び第２のフィルタを通し、第３のフィルタに接続された側面の柔らかな容器に引き入れることができる。側面の柔らかな容器は、第３のフィルタの前方にインライン（直列）に接続することができる。最後の産出チャンバは、第３のフィルタの他方の側（例えば、下流側）にある側面の柔らかな容器とすることができる。この実施形態では、圧力を用い、フィルタを通して１つの側面の柔らかな容器から第２の側面が柔らかな容器まで再生細胞を移動させる。
【００７８】
システム１０の別の実施形態では、幹細胞及び／又は脂肪由来始原細胞の濾過は、浸出濾過及び沈降分離の組合せを用いて達成することができる。例えば、このようなシステムは、組織再生細胞組成物（例えば、幹細胞及び／又は脂肪由来始原細胞を含む組成物）を通過し、次に、フィルタを通過する生理食塩水を用いる。再生細胞組成物から細胞を浸出濾過することに伴う変数の一部には、以下に限定されるものではないが、濾材の孔径、孔の幾何学構成又は形状、フィルタの表面積、濾過されている再生細胞組成物の流れ方向、注入生理食塩水の流速、膜間圧力、細胞母集団の希釈、細胞の大きさ及び生存度が含まれる。
システム１０の一実施形態では、処理チャンバ３０は、浸出濾過及び沈降分離を用いて再生細胞を分離して濃縮するフィルタアセンブリ３６を用いる。例示的に、限定ではなく、処理チャンバ３０は、図６に示すように、側壁３０ａ、上面３０ｂ、及び底面３０ｃを有するほぼ円筒形本体と定められる。上面３０ｂには無菌通気口３２を設ける。
【００７９】
図６の実施形態では、処理チャンバ３０は、大孔フィルタ３６ａ及び小孔フィルタ３６ｂのような２つのフィルタを含むフィルタアセンブリ３６を含むように示されている。フィルタ３６ａ及び３６ｂの孔径は、一般的に、約０．０５ミクロンと約１０ミクロンの間である。大孔フィルタ３６ａは、直径約５μｍの孔を含むことができ、小孔フィルタ３６ｂは、直径約１〜３μｍの孔を含むことができる。一実施形態では、フィルタの表面積は、約７８５ｍｍ2である。フィルタ３６ａ及び３６ｂは、処理チャンバ３０の内部を分断して第１のチャンバ３７ａ、第２のチャンバ３７ｂ、及び第３のチャンバ３７ｃを含むようにする。図６に示すように、第１のチャンバ３７ａは、第２のチャンバ３７ｂと第３のチャンバ３７ｃの間に配置される。更に、第１のチャンバ３７ａは、吸込みポート３１ａ及び出口ポート３１ｂを有する処理チャンバ３０の領域であるように示されている。図示の処理チャンバ３０は、ポート３１ａ、３１ｂ、及び３１ｃのような処理チャンバ３０の外部から処理チャンバ３０の内部まで連絡通路を設ける複数のポートを含む。ポート３１ａ、３１ｂ、及び３１ｃは、処理チャンバ３０の本体の側壁３０ａに配置されるように示されている。しかし、ポート３１ａ、３１ｂ、及び３１ｃは、他の領域に位置決めすることができる。ポート３１ａは、再生細胞を含む組成物が処理チャンバ３０の内部に通過して入るように導管に連結されて構成されたサンプル吸込みポートとして示されている。ポート３１ｂは、分離されて濃縮された細胞を処理チャンバ３０の内部から除去することができるように導管に連結されて構成された出口ポートとして示されている。ポート３１ｃは、生理食塩水のような新しい洗浄溶液を処理チャンバ３０の内部に送出するために導管に連結されて構成された吸込みポートとして示されている。
【００８０】
使用時には、再生細胞は、吸込みポート３１ａを通じて中央チャンバ３７ａに導入することができる。生理食塩水又は他の緩衝剤は、吸込みポート３１ｃを通して底部チャンバ３７ｂに導入される。生理食塩水は、速度約１０ミリリットル／分でチャンバ３７ａ内の再生細胞組成物を通して導くことができる。生理食塩水の流速は、重力を相殺するようなものである。生理食塩水の流れにより、チャンバ内の細胞は、細胞密度に基づいて分離する機能が与えられる。一般的に、生理食塩水が組成物を通って強制的に上昇する時、組成物中の大きな細胞は、中央チャンバ３７ａの底部に沈下することになり、小さな細胞及びタンパク質は、第２のフィルタ３６ｂを通って上部チャンバ３７ｃ内に運び去られることになる。この濾過は、大きな細胞が所定位置に転がり、それによって小さな粒子が自由になり、生理食塩水と共に運び去られることになるように生理食塩水の流速を調節することによって達成される。処理ユニット内の３つのチャンバ内に正確な圧力勾配が確実に維持されるように、無菌通気口３２がチャンバ３０に含まれる。上側チャンバ３７ｃは、吸収媒体３３を含むことができる。吸収媒体の目的は、望ましくないタンパク質を溶液中に捕捉し、例えば、生理食塩水の流速が減少しても、濾材を超えて処理溶液中に決して戻らないようにすることである。吸収媒体は、吸収性があるか又は濾過して除去される材料又は成分を引き付けるある一定の種類のフィルタ材料とすることができる。上部フィルタの上に流出ポートを加え、廃棄物を出すのを助けることができる。これの別の実施形態では、上部から穏やかな真空を印加して廃棄物を引き出すのを助けることができる。吸収性媒体は、図示の実施形態では、流速が比較的小さい時に用いることができる。次に、過剰な生理食塩水及びタンパク質は、廃棄物容器に運んで除去される。
【００８１】
大きな細胞（例えば、脂肪由来幹細胞及び／又は始原細胞）が、小さな細胞及びタンパク質から十分に分離されると、分離された細胞を含む組成物は、本明細書で説明したように濃縮することができる。組成物は、出口ポート３１ｂを通してチャンバ３７ａから除去された後、又はチャンバ３７ａ内に存在する間に更に濃縮することができる。一実施形態では、組成物中の細胞の濃度は、以下のように増大する。細胞が十分に分離した後、フィルタ３６ａ及び３６ｂのようなフィルタを互いに向って移動させることができる。このように移動させると、２つのフィルタ間の容積（例えば、チャンバ３７ａの容積）を低減することになる。また、処理チャンバ３０に接続して振動部材を設け、組成物中の細胞の濃縮を容易にすることができる。一実施形態では、振動部材は、フィルタ３６ｂ（例えば、小孔フィルタ）に連結することができる。振動により、細胞がフィルタに捕捉される状態になる事例を低減することができる。組成物の容積を低減すると、過剰な生理食塩水は廃棄物として除去することができ、細胞は少量に濃縮することができる。
【００８２】
別の実施形態では、再生細胞の濃度は、以下のように達成される。細胞が十分に分離された後、再生細胞組成物は、重力を用いて過剰な生理食塩水を濾過して除去する別のチャンバ（図示せず）に移送することができる。好ましい実施形態では、浸出と同時に沈降分離も起こすことができる。この沈降分離は、孔径が約１０ｋＤ〜約２ミクロンの範囲であるフィルタ上部に組成物を導入することによって達成することができる。一実施形態では、適切なフィルタの孔径は、約１ミクロンである。重力により、組成物中の細胞がフィルタを通って流れないようにしながら、生理食塩水及び小さな粒子がフィルタを通過することができることになる。細胞が望ましい濃度になり、濾過された小さな粒子がフィルタの下から除去された後、再生細胞組成物を撹拌し、フィルタから細胞を除去し、その後、濃縮された再生細胞を産出バッグに移送することができる。小さな粒子は、吐出口を通して廃棄物として出すことができる。
【００８３】
特定的な実施形態では、収集チャンバ２０からの再生細胞組成物は、処理チャンバ３０に運ばれ、そこで、組成物は遠心分離され、再生細胞を分離、濃縮することができる。遠心分離の原理は、当業技術で公知であり、簡略にするために本明細書では繰り返さないことにする。標準的な当業技術で認識されている遠心分離装置、構成要素、及びパラメータを本明細書では用いる。遠心分離装置の一部として用いるための例示的な処理チャンバが図７及び図８に示されている。一般的に、遠心分離装置は、遠心分離チャンバ（例えば、図７に示すもの）を軸線の周りに回転させ、それによって溶液中の細胞に印加される力を重力よりも増大させる。溶液中の密度が高いか又は重い材料は、一般的に、遠心分離チャンバ、すなわち、図７の産出チャンバ５０の一端に沈下し、再生細胞のペレットを形成する。次に、ペレットを再び懸濁し、望ましい濃度の細胞及び／又は望ましい容積の細胞及び媒体を含む溶液を得ることができる。図７に示す処理チャンバは、遠心力及び重力の両方を用いて細胞を分離、濃縮するように構成される。より詳細には、遠心分離中に遠心力により再生細胞組成物の密度の高い成分、例えば再生細胞は、遠心分離チャンバの最も外側の端部に向って導かれる。遠心分離チャンバの速度が落ちて最終的に停止すると、重力により、再生細胞が遠心分離チャンバの最も外側の端部に留まり、細胞ペレットを形成することが助けられる。従って、再生細胞組成物の望ましくない成分、すなわち、廃棄物は、細胞ペレットを乱すことなく除去することができる。
【００８４】
本発明の更に別の実施形態では、処理チャンバは、回転膜フィルタの形態の細胞集中装置を含むことができる。遠心分離処理の別の実施形態では、遠心水簸も適用することができる。この実施形態では、細胞は、遠心法により与えられる指向性（例えば、外向き）力により細胞及び溶質が異なる速度で沈降するように、個々の細胞沈降分離速度に基づいて分離することができる。水簸では、ターゲット細胞母集団の沈降分離速度は、溶液が遠心力と逆の方向にポンプで汲み出されることによって与えられる逆の（例えば、内向きの）流速により対抗される。溶液中の細胞及び粒子が分離するように対向流を調節する。水簸は、細胞分離の多くの例で用いられており（Ｉｎｏｕｅ，Ｃａｒｓｔｅｎ他、１９８１年、Ｈａｙｎｅｒ，Ｂｒａｕｎ他、１９８４年、Ｎｏｇａ、１９９９年）、当業者は、本開示内容に照らし、流れ及び遠心パラメータを最適にするのに用いられる原理及び実施法を本明細書に用いることができる。
【００８５】
図９は、本発明による水簸の実施に伴う原理を示している。水簸の実施形態は、回転ロータを用いて溶液に力が加えられる限り、遠心法の実施と同様とすることができる。現在具体化されている水簸分離に伴う変数の一部には、以下に限定されるものではないが、回転チャンバの大きさ及び形状、ロータの直径、ロータの速度、対向流管類の直径、対向流の流速、並びに溶液から除去される粒子及び細胞の大きさ及び密度が含まれる。遠心法におけるように、再生細胞は、個々の細胞密度に基づいて分離することができる。
【００８６】
一実施形態では、再生細胞組成物、例えば再生細胞及びコラゲナーゼを含む溶液は、図９（９．１）に示すように回転ロータのチャンバに導入される。溶液がチャンバに加えられた後、付加的な生理食塩水が所定の流速でチャンバに加えられる。生理食塩水の流速は、ロータの速度、細胞直径、及び経験的に確立されたチャンバ定数の関数として予め判断することができる。流速は、例えば、ＩＶ型ポンプと同様の装置で制御されることになる。付加的な生理食塩水の目的は、ロータチャンバ内部に、図９（９．２）に示すように、大きな粒子がチャンバの一端に移動して小さな粒子が他方に移動することになる状態を生じさせることである。流れは、この用途では、図９（９．３）に示すように、小さな粒子がチャンバを出て廃棄物容器に移動することになるように調節される。このように移動することにより、ロータチャンバ内の溶液は、幹細胞のような細胞の実質的に均一な母集団を有することになる。（望ましくないタンパク質及び遊離脂質がチャンバから除去されて）溶液の別の品目から幹細胞が分離されたと判断された後、対向流を停止する。チャンバ内部の細胞は、次に、チャンバの外壁に濃縮ペレットを形成することになる。対向流を反転させ、細胞ペレットを産出バッグに移送する。
【００８７】
本明細書で上述のように、処理チャンバ３０又は産出チャンバ５０は、１つ又はそれよりも多くのポート、例えばポート５１又は５２を含むことができる。これらのポートの１つ又はそれよりも多くは、上述の方法のあらゆる組合せを用いて得られる再生細胞又はその一部を、導管を介して他の外科装置、細胞培養装置、細胞浸漬装置、遺伝子治療装置、又は精製装置に運ぶように設計することができる。これらのポートはまた、導管を通じて、システム内又は上述したものと同様の目的の別のシステムの一部としての付加的なチャンバ又は容器に再生細胞を運ぶように設計することができる。また、ポート及び導管を用いて、１つ又はそれよりも多くの添加物、例えば、成長因子、再懸濁液流体、細胞培養試薬、細胞増殖試薬、細胞保存試薬、又は遺伝子を細胞に導入する薬剤を含む細胞変性試薬を加えることができる。また、ポート及び導管を用いて、再生細胞を移植材料（例えば、骨格又は骨断片）、並びに他の外科的移植片及び装置のような他のターゲットに運ぶことができる。
【００８８】
また、現行のシステムの使い捨ての組の相互接続を再構成し、現行のシステムの処理装置を再プログラムすることにより、現行のシステムに異なるか又は付加的な容器及び／又はチャンバを設けることにより、細胞を１つ又はそれよりも多くの付加的なシステム又は装置に運ぶことにより、及び／又はそのあらゆる組合せにより、細胞の別の処理も開始することができる。例えば、システムは、上述の手段のいずれかにより再構成し、システムを用いて得られた再生細胞が以下の１つ又はそれよりも多くを受けるようにすることができる。すなわち、（１つ又はそれよりも多くの再生細胞型の）細胞増殖及び細胞の維持管理（細胞のシートのすすぎ及び媒体の交換を含む）；２次培養；細胞播種；一過性形質移入（大量供給物から形質移入細胞を播種することを含む）；収集（酵素的収集、非酵素的収集、及び機械的に擦り落とすことによって収集することを含む）；細胞生存度の測定；細胞を蒔くこと（例えば、マイクロタイタープレート上に増殖させるために個々のウェルから細胞を取り、細胞を増殖して新しいウェルに入れる段階を含む）；高速大量処理スクリーニング；細胞治療法的応用；遺伝子治療法的応用；組織工学的応用；治療タンパク質的応用；ウイルスワクチン的応用；バンキング又はスクリーニング、細胞成長の測定、溶解、接種、感染、又は誘導のための再生細胞又は上清の収集；細胞系の生成（ハイブリドーマ細胞を含む）；透過性試験のための細胞の培養物；ＲＮＡｉ及びウイルス耐性試験のための細胞；ノックアウト及び遺伝子導入動物試験のための細胞；親和性精製試験；構造的生物学の応用；アッセイ開発及びタンパク質工学的応用である。
【００８９】
例えば、特定の用途のために再生細胞母集団の増殖が必要な場合、他の母集団は、維持するか（それによって増殖する選択した細胞で希釈されることによって減少する）又は必要な増殖条件がないために失われるようにしながら、母集団を選択的に増殖させる培養状態を用いる手法を用いることができる。Ｓｅｋｉｙａ他は、これに関して、骨髄由来幹細胞に用いることができる条件を説明している（Ｓｅｋｉｙａ他、２００２年）。本方法（組織培養プラスチックに差次付着してもしなくてもよい）は、本発明の別の実施形態に用いることができる。この実施形態では、最終的な再生細胞ペレットが産出チャンバから除去され、細胞培養構成要素とされる第２のシステムに入れられる。これは、従来の実験室用組織培養インキュベータ又はＴｓａｏ他の米国特許第６，００１，６４２号、又はＡｒｍｓｔｒｏｎｇ他の米国特許第６，２３８，９０８号に説明されているようなバイオリアクタ型装置の形とすることができる。別の実施形態では、細胞増殖又は細胞培養構成要素を現行のシステム、例えば産出チャンバに加えて、脂肪由来細胞母集団の短時間の付着及び／又は細胞培養を可能にすることができる。これの別の実施形態では、細胞培養及び／又は細胞増殖構成要素をシステムと一体化することができ、このシステムから細胞を除去して別のシステムに配置する必要がなくなることになる。
【００９０】
処理中に、必要に応じて１つ又はそれよりも多くの添加物を様々なチャンバ又は容器に加えるか又は供給して結果を改善することができる。これらの添加物はまた、現行のシステムに付随するか、又は現行のシステムとは分かれた別のシステムの一部として供給することができる。例えば、いくつかの実施形態では、システムから再生細胞を除去することを必要とすることなく、添加物が加えられるか又は供給される。他の実施形態では、添加物は、添加物を含む新しい容器又はチャンバをシステムの未使用ポートに無菌的に接続することによって加えられるか又は供給される。更に別の実施形態では、添加物は、本発明のシステムに接続されていない第２のシステム又は装置に加えられるか又は供給される。添加物の一部の例には、洗浄及び脱凝集を最適にする薬剤、処理中に活性細胞母集団の生存度を改善する添加物、抗菌薬剤（例えば、抗生物質）、脂肪細胞及び／又は赤血球を溶解させる添加物、又は本明細書に説明するような関連の細胞母集団を富化する添加物（固相成分への差次付着によるか又は他の方法で細胞母集団を実質的に低減するか又は富化させることを促進することによる）が含まれる。
【００９１】
例えば、均一な再生細胞母集団を得るために、例えば幹細胞又は始原細胞、例えば内皮前駆細胞上に存在する抗原を認識して結合する細胞特異的抗体を用いることのような特定の再生細胞型を分離して濃縮するためのあらゆる適切な方法を用いることができる。これらには、積極的な選択（ターゲット細胞を選択）、消極的な選択（望ましくない細胞を選択的に除去）の両方、又はその組合せが含まれる。また、特定の酵素により反応が引き起こされると蛍光を発する分子を用いる選択には、酵素のような細胞内マーカを用いることができる。更に、最終的な細胞ペレット内の再生細胞の特定の母集団を差次付着及び／又は溶出させるように選択された接着性を有する固相材料を、システムの産出チャンバに挿入することができる。
【００９２】
この差次付着法の別の実施形態には、ターゲット再生細胞及び望ましくない細胞上での差次的に表現される表面分子を認識する抗体及び／又は抗体の組合せの使用を含むことになる。特定の細胞表面マーカ（又はその組合せ）の発現に基づく選択は、抗体が（直接的又は間接的に）固相支持構造に取り付けられる別のよく用いられる技術である（Ｇｅｉｓｅｌｈａｒｔ他、１９９６年、Ｆｏｒｍａｎｅｋ他、１９９８年、Ｇｒａｅｐｌｅｒ他、１９９８年、Ｋｏｂａｒｉ他、２００１年、Ｍｏｈｒ他、２００１年）。
【００９３】
別の実施形態では、細胞ペレットは、再懸濁し、流体材料の上（又は下）に重ねた層にして連続又は不連続な密度勾配に形成し、細胞密度に基づいて細胞母集団を分離するために遠心分離機に入れることができる。同様な実施形態では、除去療法（Ｓｍｉｔｈ、１９９７年）、水簸（対向流を用いる場合も用いない場合もある）（Ｌａｓｃｈ他、２０００年）（Ｉｔｏ及びＳｈｉｎｏｍｉｙａ、２００１年）のような連続流法を用いることができる。
【００９４】
添加物の他の例には、本明細書で説明したように、細胞分化因子、成長促進因子、免疫抑制剤、医療装置、又はそのあらゆる組合せのような付加的な生物学的又は構造的成分を含むことができる。例えば、他の細胞、組織、組織断片、ＶＥＧＦ及び他の公知の血管原性又は動脈原性成長因子のような成長因子、生物学的に活性又は不活性化合物、再吸収可能な骨格、又は再生細胞の母集団の送出、有効性、耐用性、又は機能を亢進することが意図された他の添加物を加えることができる。再生細胞母集団はまた、ＤＮＡを挿入することにより、又は細胞培養システム（本明細書で説明するか又は当業技術で公知のようなもの）に入れることにより、構造的又は治療的目的を導くために再生細胞の機能を変化、改善、又は補足するように変質させることができる。例えば、幹細胞のための遺伝子移入技術は、（Ｍｏｒｉｚｏｎｏ他、２００３年、Ｍｏｓｃａ他、２０００年）に開示されているように当業者には公知であり、ウイルス移入技術、より詳細には、（Ｗａｌｔｈｅｒ及びＳｔｅｉｎ、２０００年）及び（Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ他、２０００年）に開示されているようなアデノ関連ウイルス遺伝子移入技術を含むことができる。また、（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ他、１９９８年）に開示されているように非ウイルスベースの技術も行うことができる。また、１つ又はそれよりも多くの細胞の分化因子、例えば成長因子又はサイトカインを符号化する遺伝子を加えることもできると考えられる。様々な細胞分化薬剤の例は、（Ｇｉｍｂｌｅ他、１９９５年、Ｌｅｎｎｏｎ他、１９９５年、Ｍａｊｕｍｄａｒ他、１９９８年、Ｃａｐｌａｎ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ、１９９９年、Ｏｈｇｕｓｈｉ及びＣａｐｌａｎ、１９９９年、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他、１９９９年、Ｃａｐｌａｎ及びＢｒｕｄｅｒ、２００１年、Ｆｕｋｕｄａ、２００１年、Ｗｏｒｓｔｅｒ他、２００１年、Ｚｕｋ他、２００１年）に開示されている。また、抗アポトーシス因子又は薬剤を符号化する遺伝子を加えることもできると考えられる。遺伝子（又は遺伝子の組合せ）は、以下に限定されるものではないが、アデノウイルス形質導入、「遺伝子銃」、リポゾーム媒介形質導入、及びレトロウイルス又はレンチウイルス媒介形質導入、プラスミド、アデノ関連ウイルスを含む当業技術で公知のあらゆる技術で加えることができる。これらの再生細胞は、次に、遺伝子を細胞に長期間放出及び／又は与えることができる担体材料支持遺伝子送出媒体と共に移植し、形質導入が継続するか又は原位置で開始することを可能にすることができる。
【００９５】
細胞及び／又は細胞を含む組織が、細胞及び／又は組織を得た患者以外の患者に投与される場合には、１つ又はそれよりも多くの免疫抑制剤を細胞及び／又は組織を受け取る患者に投与し、移植片の拒絶を低減し、好ましくは防止することができる。本明細書で用いる場合、「免疫抑制薬又は薬剤」という用語は、正常な免疫機能を阻害するか又は損なう医薬品を含むものとする。本明細書に開示されている方法に適する免疫抑制剤の例には、Ｔ細胞／Ｂ細胞同時刺激経路を阻害する薬剤、例えば米国特許公開第２００２０１８２２１１号に開示されているようなＴ細胞及びＢ細胞がＣＴＬＡ４及びＢ７経路を通じて連結することを妨げる薬剤が含まれる。好ましい免疫抑制剤は、シクロスポリンＡである。他の例には、ミオフェニール酸モフェチル、ラパミシン、及び抗胸腺細胞グロブリンが含まれる。一実施形態では、免疫抑制薬は、少なくとも１つの他の治療薬剤と共に投与される。免疫抑制薬は、投与経路に適合する製剤で投与され、望ましい治療効果を達成するのに十分な投薬量で被験者に投与される。別の実施形態では、免疫抑制薬は、本発明の再生細胞の耐性を誘発するのに十分な時間にわたって一過性に投与される。
これらの実施形態では、再生細胞は、本明細書に開示する撹拌装置のような装置及びそれに伴う方法を含む当業技術で認識されるあらゆる方法で添加物に接触させるか、組み合わせるか、混合するか、又は加えることができる。例えば、揺動、反転、圧縮パルス、又は移動ローラを用いることができる。
【００９６】
別の態様では、細胞母集団は、受容者に入れ、「ＭａｃｒｏＰｏｒｅ  Ｂｉｏｓｕｒｇｅｒｙ，Ｉｎｃ．」製のもののような再吸収可能なプラスチック鞘又は他の材料及び関連構成要素で取り囲むことができる（例えば、米国特許第６，２６９，７１６号、第５，９１９，２３４号、第６，６７３，３６２号、第６，６３５，０６４号、第６，６５３，１４６号、第６，３９１，０５９号、第６，３４３，５３１号、第６，２８０，４７３号を参照）。
【００９７】
上述の実施形態の全てにおいて、分離されて濃縮された再生細胞の少なくとも一部は、「非造血組織から得た非胚細胞の保存」という名称の２００２年９月１２日出願の米国特許出願第１０／２４２，０９４号に説明するように低温保存することができ、本出願は、２００１年９月１４日に出願され、本出願人に譲渡された米国特許仮出願第６０／３２２，０７０号の恩典を請求しており、これらの内容は、本明細書においてその全体が引用により明示的に組み込まれている。
【００９８】
処理終了時には、再生細胞は、手動で産出チャンバから回収することができる。細胞は、皮下、筋肉内、又は細胞を患者内のターゲット部位に送出することができる他の技術のいずれかにより受容者に入れるためのシリンジのような送出装置に入れることができる。言い換えると、細胞は、当業者に公知のあらゆる手段で患者に入れることができる。好ましい実施形態には、針又はカテーテルにより、又は直接外科的埋め込みにより配置することが含まれる。他の実施形態では、容器、シリンジ、又はカテーテル等の形態とすることができ、これを用いて細胞を患者に入れることができる産出チャンバに細胞を自動的に運ぶことができる。また、容器を用いて、後に用いるために又は低温保存のために細胞を保存することができる。全ての回収方法は、無菌的に行われる。外科的埋め込みの実施形態では、細胞は、本明細書に説明されているような予備成形された基体又は骨格のような添加物と共に付加することができると考えられる。
【００９９】
本発明の好ましい実施形態（例えば、図４に示すような実施形態）では、システムは自動化される。別の実施形態では、システムは、自動化された構成要素及び手動構成要素の両方を有する。システムは、再利用可能なハードウエア構成要素又はモジュールに接続されるか又は装着された１つ又はそれよりも多くの使い捨ての構成要素を含むことができる。本発明の自動化システムは、システムを適切に作動させるように入力要求する画面表示（図１６参照）を提供する。自動化システムはまた、手順の状況及び／又はシステムの使い捨ての構成要素を適切に設定することに関する段階毎の指示を供給する画面を提供する。画面はまた、もし起こればシステムの問題又は不具合を示し、適切な場合は「トラブルシューティング」手引きを提供することができる。一実施形態では、画面は、ユーザが例えばタッチスクリーンを通じてシステムにパラメータを入力することができるユーザインタフェース画面である。
【０１００】
部分及び完全自動化システムは、処理装置（例えば、マイクロプロセッサ又はパーソナルコンピュータ）、及びユーザ入力に基づく処理の１つ又はそれよりも多くの段階を作動して自動化するシステムのための制御論理を提供する付随するソフトウエアプログラムを含むことができる。いくつかの実施形態では、システムの１つ又はそれよりも多くの態様は、処理装置内にあるソフトウエアを通じてユーザプログラム可能にすることができる。処理装置は、「読取専用メモリ（ＲＯＭ）」に１つ又はそれよりも多くの予めプログラムされたソフトウエアプログラムを有することができる。例えば、処理装置は、血液を処理するように誂えた予めプログラムされたソフトウエア、脂肪組織を処理して少量の再生細胞を得るための別のプログラム、及び脂肪組織を処理して大量の再生細胞を得るための別のプログラムを有することができる。処理装置はまた、必要な再生細胞の量、処理される組織の種類、必要な後処理操作の種類、治療的用途の種類などのようなユーザの関連情報の入力に基づいて、ユーザに適切なパラメータを提供して処理を最適化する予めプログラムされたソフトウエアを有することができる。
【０１０１】
ソフトウエアはまた、システムのポンプ及びバルブを制御することによって特定の管類経路に沿って流体及び組織の移入及び移出を制御する段階、適切な塩基配列及び／又はアクティブ化の方向を制御する段階、圧力センサでの閉塞を検出する段階、混合機構、容積測定機構を用い、特定の通路に沿って移動する組織及び／又は流体の量を測定する段階、熱制御装置を用いて様々な構成要素の温度を維持する段階、及び分離及び濃縮処理をタイミング及びソフトウエア機構と統合する段階のような段階の自動化を可能にすることができる。処理装置はまた、処理される組織の種類及び／又は収集される細胞母集団又は部分母集団、及び行う手順の種類（例えば、再生細胞で増大した脂肪組織を用いて組織を増強する、又は再生細胞で被覆した骨移植片を用いる骨修復用途のために細胞を処理する）に基づいて、遠心速度を制御することができる。処理装置はまた、標準並列又は直列ポート又は他の構成要素又は網状構造と通信する他の手段を含むことができる。従って、処理装置は、独立型ユニットとすることができ、又は本明細書に説明した他の処理方法のために１つ又はそれよりも多くの付加的な装置を付随させることもできる。
【０１０２】
ソフトウエアは、例えば、使い捨ての構成要素のロット番号、温度及び容積測定値、組織容積及び細胞数パラメータ、投与した酵素の用量、培養時間、オペレータＩＤ、日時、患者ＩＤなどを含む「実行データ」を自動収集することができる。装置の好ましい実施形態では、バーコード読取システムのような特徴認識システムが統合され、これらの変数（例えば、使い捨てセットのロット番号及び使用期限、コラゲナーゼのロット番号及び使用期限、患者／サンプルの識別子等）を処理の文書化の一部として処理装置にデータ入力することが可能とされることになる。それにより、データ入力の誤りが起こる機会が減少することになる。このようなバーコード読取システムは、ＵＳＢ又は他のインタフェースポート及び当業技術で公知のシステムを用いて処理装置に容易に組み込むことができる。従って、装置は、処理のデータ入力及び文書化を統合的に制御することになる。これらのパラメータの印刷レポートは、システムのプログラムされた作動のユーザ定義パラメータの一部とされることになる。勿論、これには、プリンタ構成要素（ハードウエア及びドライバ）、すなわち、ソフトウエアのプリンタドライバ、更に、装置のハードウエアのプリンタのためのインタフェース出力コネクタ（例えば、ＵＳＢポート）を統合することを必要とすることになる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、システムは、完全自動化システムである。例えば、ユーザは、最初に処理する組織の量を選択し、システムを患者に取り付けることができ、システムは、ユーザが更に入力することなく連続的に必要な組織を自動的に吸引して再生細胞を分離濃縮することができる。ユーザはまた、必要な再生細胞の量を入力し、システムに必要量の組織を吸引させて組織を処理させることができる。完全自動化システムはまた、ユーザ入力パラメータ、例えば、洗浄サイクルの数、遠心分離速度等の数（例えば、２つ又はそれよりも多い）に基づいて再構成することができるシステムも含む。システムはまた、ユーザが介入しないが、ある一定の処理が起こる可能性がある前にはユーザの介入を必要とするある一定の段階を進む間は半自動モードで運転することができる。他の実施形態では、システムは、ユーザが所定の作動を所定の回数行うことを案内する手引きを表示する単一の統合システムである。例えば、処理装置は、管類、チャンバ、及びシステムの他の構成要素を適切に挿入するのに必要な段階を行うようにユーザに促すことができる。従って、ユーザは、適切な順序の作業が確実に行われるようにすることができる。更に、このようなシステムは、処理の段階が不注意にアクティブ化又は終了されないように、ユーザが各作動可能な段階を確認することを要求することができる。別の実施形態では、システムは、管類、チャンバが正確に挿入され、閉塞がないことなどを確認するために、自動試験を開始することができる。更に別の実施形態では、本発明のシステムは、システムを通る組織流を自動制御することによって複数の分離及び濃縮処理を行うようにプログラムすることができる。この特徴は、例えば、そうでなければ失われることになる組織をシステムに収集し、組織からの再生細胞を分離濃縮して患者に再循環させる手術を患者に行う間に重要であると考えられる。
【０１０４】
上述のように、システムの構成要素は、使い捨て（本明細書では「使い捨てセット」と呼ばれる）とし、１回使用した後にシステムの一部を廃棄することを可能にすることができる。この実施例は、患者の組織と接触するあらゆる表面が使用後に適切に廃棄されることを保証するのを助けることができる。例示的な使い捨てセットが図１３に示されている。好ましい実施形態では、システムの使い捨ての構成要素は、使用及び装填が容易で、多くの管類接合部及び管類接合部の複雑な経路指定が必要でなくなる使用可能な「在庫品」とするために予め滅菌して包装される。このような使い捨ての構成要素は、製造が比較的廉価であり、従って、それを使い捨てとすることによる実質的な費用は生じない。一実施形態では、使い捨てのシステム（本明細書では「使い捨てセット」と互換的に呼ばれる）は、収集チャンバ２０、処理チャンバ３０、廃棄物チャンバ４０、産出チャンバ５０、フィルタアセンブリ３６、サンプルバッグ６０、及び付随する導管１２又は管類を含むか、本質的にそれから成るか、又はそれから成る。システムの使い捨てセットの好ましい実施形態では、収集チャンバ２０及び処理チャンバ３０は、硬いフレームに収容された導管１２により接続される。また、処理チャンバ３０の回転密封網状構造（図７及び図８）も同じ硬いフレームに収容することができる。別の好ましい実施形態では、使い捨てセットの様々なチャンバ及び容器は、ポンプ、バルブ、センサ、及びシステムを自動化する他の装置が、ユーザが介入することなく必要に応じて適切にアクティブ化又は非アクティブ化されるようにシステムの処理装置と通信することができる必要なインタフェースを含む。このインタフェースはまた、システムを設定するのに必要な時間及び専門知識を低減し、システムを適切に設定する方法を示し、誤った設定の場合にはユーザに警告することによって誤りも低減する。
【０１０５】
本発明の使い捨てセットの殆どは、多くの共通要素を有することになる。しかし、当業者は、システムの異なる用途では、使い捨てセットの一部とすることができる付加的な構成要素が必要になる場合があることを認識するであろう。従って、使い捨てセットは、患者から脂肪又は他の組織を得て再生細胞を患者に再循環させるのに適する１つ又はそれよりも多くの針又はシリンジを更に含むことができる。含まれる針及びシリンジの型番及び種類は、処理される組織の種類及び量に依存することになる。使い捨てセットは、洗浄流体及びシステムに用いられる他の処理試薬を保持するための１つ又はそれよりも多くの硬いか又は可撓性のある容器を更に含むことができる。例えば、使い捨てセットは、生理食塩水、酵素、及びこの手順に必要なあらゆる他の処置又は置換流体を保持するための容器を含むことができる。更に、適切な洗浄溶液、再懸濁液流体、添加物、薬剤、又は移植材料は、本発明のシステム及び方法と併せて用いるために使い捨てセットと共に供給することができる。
【０１０６】
本明細書に説明した又はそれ以外の本発明を実施するのに必要なシステム構成要素、機器、又は供給物のあらゆる組合せは、キットの形で供給することができる。例えば、本発明のキットは、例えば、シリンジベースの脂肪吸引に最適な長さ及びゲージの針及び少量の組織を処理することができる好ましい濾材を含む滅菌シリンジを含むことができる。本発明に用いることができ、また本発明のキットに含むこともできる他の例示的な機器及び供給物は、表ＩＩ及び表ＩＩＩに説明している。
以下の表ＩＩは、本発明のシステム及び方法により、脂肪由来再生細胞を得るのに用いることができる供給物の例を特定するものである。
【０１０７】
（表ＩＩ）
2007529515.tif 000003
【０１０８】
以下の表ＩＩＩは、本明細書に開示されているシステム及び方法と用いることができる機器を特定するものである。
【０１０９】
（表ＩＩＩ）
2007529515.tif 000004
【０１１０】
システムの再使用可能構成要素は、収集チャンバ、ポンプ、及びバルブ及びポンプ制御をアクティブ化する様々なセンサのための撹拌機構と、遠心分離モータと、遠心分離モータの回転フレームと、ユーザインタフェース画面及びＵＳＢポートと、使い捨てセットが再使用可能ハードウエア構成要素及び他の関連装置に確実に取り付けられるか又は適合するように使い捨てセットを接続する連動又は結合装置又は構成とを含むか、本質的にそれから成るか、又はそれから成る。例示的な再使用可能な構成要素は、図１４に示されている。好ましい実施形態では、再使用可能な構成要素には、再生細胞を再生細胞組成物から分離して濃縮するための手段、例えば回転遠心分離機が含まれる。この実施形態では、再使用可能な構成要素は、図１５Ａに示すように使い捨てセットの処理チャンバ（遠心分離チャンバを含む）の一部分に結合し、かつそれとインタフェースで接続するように設計される。再使用可能構成要素中の再生細胞を分離して濃縮するための手段は、回転遠心分離機に限定されず、回転膜フィルタを含む本明細書に説明したあらゆる他の構成を含むことができることは理解される。再使用可能な構成要素はまた、いくつかの異なる組織処理手順を実行し、それに応じてシステムの様々なポンプ及びバルブを選択的にアクティブ化するための予めプログラムされたソフトウエアを含む本明細書に説明した処理装置を収容することができる。処理装置はまた、後にダウンロード又は編集するために、ドナー／患者情報、処理又は収集情報、及び他のデータを保存するためのデータ保存機能を含むこともできる。再使用可能な構成要素は、様々な使い捨てセットと用いることができる。使い捨てセットは、再使用可能な構成要素と例えば連動装置又は構成を通して接続し、再使用可能な構成要素上に存在する処理装置が、使い捨てセットの様々な構成要素、並びに再使用可能な構成要素の様々な構成要素及び他の関連装置及びシステムを制御する、すなわち、それへ又はそれからの信号を送受信することができるように、使い捨てセットが再使用可能なハードウエア構成要素に確実に取り付けられ、かつそれとインタフェースで接続するように使い捨てセットを接続する。
【０１１１】
一実施形態では、システムに用いるための使い捨てセットは、約８００ｍＬの組織を収容することができる収集チャンバ２０と、収集チャンバ２０内で洗浄されて消化された約８００ｍＬの組織により生成される再生細胞組成物を処理することができる処理チャンバ３０と、少なくとも０．５ｍＬの再生細胞を収容することができる産出チャンバ５０と、約１０Ｌの廃棄物を収容することができるウエスタ容器４０とを含む。この実施形態では、ハードウエア装置は、２４”Ｌ×１８”Ｗ×３６”Ｈよりも大きくない。使い捨てセット、並びにハードウエア装置の様々な構成要素は、必要に応じて代替的な寸法に構成することができ、これも非限定的に本発明に含まれるものとする。
【０１１２】
システムの使い捨て構成要素は、装置上に容易に配置される。対応する再使用可能な構成要素と共に組み合わせるのに用いられた使い捨てセットの図は、図１５Ａに示されている。システムは、不適切に装填された使い捨て構成要素を検出することができるように設計されることが好ましい。例えば、各使い捨てセットの構成要素は、管類、チャンバなどをシステムの適切な位置に適切に整列させて挿入するように色誘導マークを有することができる。更に別の実施形態では、本明細書に開示されているシステムは、携帯用ユニットである。例えば、携帯用ユニットは、脂肪組織の収集が行われた１つの部位から脂肪組織を収集するための別の部位まで移動することができる。いくつかの実施例では、携帯用ユニットは、患者のベッドサイド近くで脂肪組織を収集して処理するのに適切である。従って、携帯用ユニットは、患者から患者に移動することができるシステムの一部とすることができる。従って、携帯用ユニットは、所定位置に固定する車輪付きとすることができ、従って、手順を通して安定して固定した位置で便利な場所に容易に位置決めして用いることができる。他の実施形態では、携帯用ユニットは、テーブル面のような平坦な表面上に設置して作動させるように設計される。携帯用ユニットはまた、収容ユニットに封入することができる。携帯用ユニットは、ハンガー、フック、ラベル、目盛り、及び手順を助けるための他の装置を更に含むことができる。遠心分離機、処理装置、表示スクリーンのような本明細書に説明したシステムの再使用可能な構成要素の全ては、システムの携帯用ユニットに装着することができる。
再生細胞を得るための代替的な手動実施形態も本発明の範囲内である。例えば、一実施形態では、脂肪組織は、本明細書に説明したシステムの構成要素、機器、及び／又は供給品のあらゆる組合せを用いて処理することができる。
【０１１３】
本発明を具体化するためのシステムの特定の例が図４に示されている。図４は、組織、例えば脂肪組織から再生細胞を分離して濃縮し、患者に再注入するのに適する自動化システム及び方法を示している。図４に示すシステムの適切な実施形態では、システムは、所定の量の組織を患者から吸引するための自動化段階を更に含む。図４に示すシステムは、図１４に示すシステムの再使用可能構成要素に接続されて図１５Ａに示すシステムの自動化実施形態に至る図１３に示す使い捨てセットから成る。使い捨てセットは、例えば連動又は結合装置又は構成を通して再使用可能構成要素に接続され、これは、再使用可能構成要素上の処理装置が、使い捨てセットの様々な構成要素、並びに再使用可能構成要素及び他の関連装置及びシステムの様々な構成要素を制御し、かつそれとインタフェースで接続し、すなわち、それに対して信号の送受信を行うことができるように、使い捨てセットが再使用可能なハードウエア構成要素に確実に取り付けられ、かつそれに関連付けられるように使い捨てセットを再使用可能構成要素に接続する。
【０１１４】
ユーザは、使い捨てセットを再使用可能構成要素に接続し、ユーザインタフェースを用いてある一定のパラメータ、例えば収集される組織の容積を入力し、システムを患者に取り付けることができ、システムは、自動的に予めプログラムした及び／又はユーザが入力したパラメータを用いて、図４に示す段階の全てを連続的に実施する。このような作用順序を図１５Ｂに示している。代替的に、組織は、ユーザが患者から手動で吸引し、再生細胞を処理するために、すなわち、分離して濃縮するためにシステムに輸送することができる。
【０１１５】
より詳細には、図４に示すように、組織、例えば脂肪組織は、導管１２を用いて患者から引き抜き、収集チャンバ２０に導入することができる。図４の収集チャンバの詳細図は、図５に示されている。図５に示すように、収集チャンバ２０は、標準カニューレを用いて組織除去するのを容易にする真空ライン１１を含むことができる。ユーザは、この時点で収集チャンバ２０に導かれる組織の推定容積を入力することができる。組織は、組織、生理食塩水、及び他の薬剤を無菌的に組織に加えることができる閉鎖流体経路の一部である吸込みポート２１を通して収集チャンバ２０に導入される。システムの光センサ、例えばセンサ２９は、組織のユーザ入力容積が収集チャンバ２０に存在する時を検出することができる。いくつかの実施形態では、収集チャンバに存在する組織がユーザ入力よりも少ない場合には、ユーザは、収集チャンバ２０に存在する容積の組織の処理を開始するという任意選択肢を有することになる。いくつかの実施形態では、患者から除去された組織の一部は、ユーザインタフェースを用いたユーザ入力を通じてアクティブ化することができるポンプ、例えば蠕動ポンプを用い、導管を介してサンプルチャンバ６０に導くことができる。
【０１１６】
センサ２９は、再使用可能構成要素に存在する処理装置に信号を送り、組織を洗浄して脱凝集するのに必要な段階をアクティブ化することができる。例えば、処理装置は、自動バルブ及びポンプを用いて収集した組織の容積に基づいて、事前設定した容積の洗浄薬剤を導入することができる。このサイクルは、溶出液体が十分に透明で望ましくない材料を含まないと光センサが判断するまで収集チャンバ内で繰り返すことができる。例えば、収集チャンバ１２ｂ又は１２ｄから導き出された導管に沿った光センサ２９は、望ましくない材料が除去されたことを検出し、必要なバルブを閉じて次の段階を開始するように処理装置に信号を出すことができる。
【０１１７】
次に、処理装置は、収集した組織の容積に基づいて、予めプログラムした量の脱凝集剤を導入することができる。処理装置はまた、収集した組織の初期容積又はユーザ入力に基づいて事前設定した時間にわたって収集チャンバ内の組織の撹拌をアクティブ化することができる。図４に示す実施形態では、脱凝集剤、例えばコラゲナーゼが、コラゲナーゼ供給源２４を通して収集チャンバ２０に加えられると、収集チャンバ２０内のモータは、処理装置を通じてアクティブ化される。モータにより、磁気撹拌装置と、１つ又はそれよりも多くのパドル２５ａが収集チャンバ２８に前置されたフィルタのフィルタケージ２７に強固に取り付けられたパドル状装置とを含む回転可能シャフト２５がアクティブ化される。パドルは、再生細胞が組織から分離されるように脱凝集剤の存在下で撹拌する。
【０１１８】
収集チャンバ２０内の溶液は、事前設定した時間にわたって沈降させる。溶液の浮遊部分は、溶液の上部に上昇することができる。事前設定した時間が過ぎた状態で、必要なバルブ及びポンプは、処理装置によりアクティブ化され、非浮遊部分を除去して廃棄物チャンバ４０に入れる。廃棄物チャンバ４０への移送は、収集チャンバ１２ｂ又は１２ｄから導き出された導管に沿ったセンサ２９が、溶液の浮遊分画が廃棄物チャンバ３０にもうすぐ移送されることを検出することができるまで継続される。例えば、収集チャンバ１２ｂ又は１２ｄから導き出された導管に沿ったセンサ２９は、望ましくない材料が除去されたことを検出し、必要なバルブを閉鎖するように処理装置に信号を送ることができる。
【０１１９】
この時点で、溶液の非浮遊分画、すなわち、再生細胞組成物は、処理チャンバ３０に移動される。これは、必要なバルブ及び蠕動ポンプを用いることによって達成される。いくつかの実施形態では、再生細胞組成物が処理チャンバ３０に移送される前に、収集チャンバ２０に残る溶液の浮遊分画に付加的な容積の生理食塩水を加えることができる。洗浄サイクルは、もう一度繰り返すことができる。このサイクルの後、溶液を沈降させ、非浮遊分画（再生細胞を含む）を処理チャンバ３０に輸送し、浮遊分画を廃棄物チャンバ４０に排液する。洗浄サイクルを更に行い、分離された再生細胞の全てが処理チャンバ３０に最適に移送されるようにする。
【０１２０】
再生細胞組成物が導管１２により処理チャンバ３０に輸送された状態で、組成物は、濃縮段階を開始する前に、１回又はそれよりも多くの付加的な洗浄段階を受ける。それにより、廃棄物及び収集チャンバ２０からの残留汚染物が確実に除去される。同様に、濃縮段階の後、再生細胞組成物には、１回又はそれよりも多くの付加的な洗浄段階を受けさせ、残留汚染物を除去することができる。望ましくない材料は、同様に、すなわち、上述のような処理装置からの信号を通じてバルブ及びポンプを制御し、処理チャンバ３０から除去して廃棄物チャンバ４０に入れることができる。
【０１２１】
図４に示す処理チャンバ３０の様々な実施形態を以下に詳細に説明する。図４に示す処理チャンバ３０は、遠心分離チャンバの形態である。図４の処理チャンバの詳細図は、図７及び図８に示されている。このような処理チャンバ３０は、一般的に、外側ハウジング３０．２、１つ又はそれよりも多くの密封部３０．３、１つ又はそれよりも多くの軸受部３０．４、及び処理チャンバをシステムの再使用可能構成要素内に存在する遠心分離装置に接続するための装着点３０．６を含む回転密封網状構造３０．１と、回転密封部から延びて、フレーム５３内に収容された産出チャンバ５０の形態である各端部が遠心分離チャンバで終端になる導管の形態の１つ又はそれよりも多くの流路３０．５とを含み、フレームは、１つ又はそれよりも多くのポート５２及び手動で産出チャンバ５０を再位置決めする１つ又はそれよりも多くのハンドルを含む。
回転密封網状構造３０．１は、処理チャンバの流体経路を確実に無菌状態に維持することができるように含まれている。更に、処理チャンバの流体経路には、いつでも、たとえ処理チャンバの遠心分離チャンバが回転している時でも、無菌状態で進入することができる（例えば、薬剤又は洗浄溶液を加えるために）。
【０１２２】
図７及び図８に示す回転密封網状構造３０．１には、２つ又はそれよりも多くの軸受部３０．４、３つ又はそれよりも多くのリップ密封部３０．３、及び外側ハウジング３０．２から成る回転シャフトが含まれる。この実施形態では、軸受部３０．４は、本明細書でレースと呼ぶ外側及び内側シャフト（図示せず）を更に含む。これらのレースは、正確に研削した球により分離することができる。軸受部を構成するレース及び球は、好ましくは、体液が接触するのに適する材料で製造されるか、又は体液と接触するのに適する材料で被覆される。好ましい実施形態では、レース及び球は、例えば、窒化シリコーン又はジルコニアを用いて製造されている。更に、この実施形態では、３つのリップ密封部は、円形の「Ｕ字」形のチャンネル（図示せず）、並びに円形バネ（図示せず）を含む。円形「Ｕ字」形チャンネルは、回転密封網状構造３０．１の回転シャフトとの耐漏れ性の接合部を形成するように可撓性のある材料を用いて製造することが好ましい。更に、リップ密封部は、処理チャンバを通って流れる再生細胞組成物からの圧力により、張力が増大して密封部アセンブリの回転シャフトとの接合がきつく締まることになる向きであることが好ましい。密封部は、回転密封網状構造３０．１の外側ハウジング３０．２の溝に係合するのに必要な時に拡張するか及び／又は潰れることができる１つ又はそれよりも多くの円形クリップ（図示せず）により所定位置に固定することができる。回転密封網状構造３０．１により又はその付近に発生する熱は、通路を通って移動する溶液中の細胞が溶解しないように制御すべきである。これは、例えば、回転シャフトを構成するのに硬質の材料を選択し、密封部と接触する回転シャフトの領域を研磨処理し、回転シャフトと密封部の間の接触を最小限にすることによって達成することができる。
【０１２３】
別の実施形態では、回転密封網状構造３０．１は、単一のラバーシール３０．３及び空気ガスケット（図示せず）を含む。この密封部及びガスケットは、システムの無菌性を損なう可能性があるあらゆる生物学的物質のための蛇行性の通路を設けるものである。別の実施形態では、回転密封網状構造３０．１は、複数のバネを装填した密封部３０．３を含み、これは、個々の流路を隔離するものである。密封部３０．３は、滅菌することができるほか、潤滑剤なしに回転シャフトを密封することができる材料で製造されている。別の実施形態では、回転密封網状構造３０．１は、異なる流路を作り出して、システムの回転に耐えて細胞溶解を引き起こさないことが可能な一対のセラミック円盤（図示せず）から成る。別の実施形態では、流体経路は、可撓性があり、処理チャンバに巻き付けることも巻き戻すこともできる。これは、処理チャンバ３０が２回回転する毎に可撓性のある流体経路を１回回転させることによって達成される。それにより、密封部も共に回転させる必要がなくなる。
【０１２４】
再生細胞組成物は、回転密封網状構造３０．１の回転軸を通る流路に沿って収集チャンバ２０からポンプで汲みだされ、次に、各々処理チャンバ３０の中心軸から外向きに広がり、処理チャンバ３０の外側端部近く、すなわち、産出チャンバ５０を収容する遠心分離チャンバ内を終端とする最低２つの流体経路３０．５に分割される（図７及び図８）。従って、好ましい実施形態では、処理チャンバ３０は、図７及び図８に示すように、２つ又はそれよりも多くの産出チャンバ５０を含む。これらの産出チャンバ５０は、処理中には１つの方向３０．７になり、濃縮再生細胞を回収するためには別の方向３０．８になるように位置決めされる。例えば、産出チャンバは、処理中には１つの角度に傾斜し、細胞回収には別の角度に傾斜する。細胞回収角度は、処理角度よりも垂直に近い。産出チャンバ５０の２つの位置は、処理チャンバ３０から突出するハンドル５３を通して手動で操作することができる。再生細胞は、回収方向３０．８の時にシリンジを用いて産出チャンバ５０から手動で回収することができる。別の実施形態では、流路３０．５は、処理チャンバの外部で分割し、それから処理チャンバ３０の外側端部、すなわち、産出チャンバ５０を収容する遠心分離チャンバ（図示せず）内に接続されるように構成される。この実施形態では、大容積の再生細胞組成物及び／又は添加物、溶液などを遠心分離チャンバ及び／又は産出チャンバに直接輸送することができる。
【０１２５】
図４及び図７〜図９を参照すると、収集チャンバ２０と処理チャンバ３０の間には、ポンプ３４及び１つ又はそれよりも多くのバルブ１４を設けることができる。好ましい実施形態では、バルブ１４は、電気機械バルブである。更に、処理チャンバ３０及び収集チャンバ２０と直列に圧力センサ２９のようなセンサを設けることができる。バルブ、ポンプ、及びセンサは、再使用可能構成要素（図１４）に存在する処理装置と協調し、システムの濃縮段階を自動化する。
【０１２６】
センサは、再生細胞組成物が遠心分離チャンバ内に存在することを検出し、システムの処理装置と通信して遠心分離装置をアクティブ化する。次に、再生細胞組成物は、最初に収集された組織量及び／又はユーザ入力に基づいて、予めプログラムされた時間にわたって予めプログラムされた負荷を掛ける。いくつかの実施形態では、この段階は、自動的に又はユーザ入力を通して繰り返すことができる。例えば、組成物には、ほぼ５分間、重力のほぼ４００倍の負荷を掛ける。産出チャンバ５０は、チャンバの外側極限が高密度の粒子及び細胞のための小さなリザーバを形成するように構成される。産出チャンバ５０は、いわゆる「細胞ペレット」内に高密度粒子を保持し、同時に、軽い上清は、流路、例えば回転密封網状構造３０．１の回転軸に沿って、処理チャンバ３０の中心の低い位置から回転密封網状構造３０．１を通して廃棄物容器４０まで進む流路を通して除去することができる。バルブ１４及びポンプ３４は、処理装置に信号を送り、産出チャンバ５０に存在する細胞ペレットを乱すことなく上清を除去して廃棄物容器４０に入れる段階をアクティブ化する。
【０１２７】
図４に示すシステムを用いて得られる細胞ペレットは、本発明の濃縮再生細胞を含む。一部の実施形態では、上清が除去されて廃棄物チャンバ４０に導かれた後、流路３０．５を用いて、付加的な溶液及び／又は他の添加物と共に遠心分離した後に形成された細胞ペレットを再懸濁することができる。このように細胞ペレットを再懸濁することにより、再生細胞を更に洗浄して望ましくないタンパク質及び化学化合物を除去するほか、酸素が細胞に多く流れるようにすることができる。得られる懸濁液には、更にほぼ５分間、再び重力のほぼ４００倍の負荷を掛ける。第２の細胞ペレットが形成され、得られた上清が廃棄物チャンバ４０に除去された後、生理食塩水又は何らかの他の適切な緩衝剤溶液を用い、上述の方法で最後の洗浄を行うことができる。この反復洗浄は、複数回行い、再生細胞溶液の純度を高めることができる。いくつかの実施形態では、生理食塩水は、処理を改善するのに必要と思われるいずれかの段階で加えることができる。図４に示すシステムを用いて得られた再生細胞の濃度は、収集した組織の量、患者の年齢、患者プロフィール等に応じて様々とすることができる。例示的な収量は、表１に示している。
【０１２８】
産出チャンバ５０に存在する最終的なペレットは、次に、産出チャンバ５０が細胞の除去に適切な方向に位置決めされた後、適切なシリンジを用いて無菌的に回収することができる。他の実施形態では、最終的なペレットは、産出チャンバ５０内の容器に自動的に移動することができ、これは、除去して保存することができ、又は必要に応じて用いることができる。この容器は、あらゆる適切な形状又は大きさとすることができる。例えば、容器は、シリンジとすることができる。いくつかの実施形態では、産出容器５０自体をヒートシールして（自動的又は手動的のいずれか）処理チャンバの他の成分から単離し、その後回収して本明細書に説明するように患者への再注入を含む治療的用途に再生細胞を用いることができる。細胞はまた、産出チャンバから回収する前又は第２のシステム又は装置に移送した後のいずれかに本明細書に説明するように更に処理することができる。図１４に示す再使用可能構成要素は、必要に応じて更に処理するために１つ又はそれよりも多くの付加的なシステム又は装置に接続することができるように構成される。
【０１２９】
２．装置の細胞担体部分を製造する方法
本発明の細胞担体部分は、再生細胞の骨形成機能に決定的に重大である。より詳細には、本明細書で更に説明するように、再生細胞が配置される細胞担体は、細胞を３次元に組織化するのに役立つ。従って、基体材料を考慮すると、臨床的に許容可能な生体適合性を示すものを選択することが絶対に必要である。更に、細胞担体の機械的特性は、患者の通常の活動中に細胞担体が潰れないように十分であるべきである。
【０１３０】
様々な細胞担体が公知で当業技術で用いられており、これらは、本発明に含まれるものとする。ヒドロゲルのようなゲルの形態の細胞担体は、本発明に含まれる。また、繊維ベースの細胞担体も本発明に含まれ、これには、織メッシュ、編メッシュ、不織メッシュ（フェルト）、及びポリマー被覆メッシュ（強度改善のため）が含まれる。繊維ベースの細胞担体を製造する方法は、当業技術で公知である。例えば、編メッシュに基づく細胞担体は、Ｈ．Ｊ．Ｂｕｃｈｓｂａｕｍ、Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ、Ｓ．Ｌｉｆｓｈｉｔｚ、及びＳ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ著「骨盤底再構成における「Ｖｉｃｒｙｌ」メッシュ」、Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ、第１２０巻（第１２号）：１３８９〜１３９１頁、１９８５年に説明する方法によって作ることができる。不織メッシュベースの細胞担体は、Ｌ．Ｅ．Ｆｒｅｅｄ、Ｇ．Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ、Ｒ．Ｊ．Ｂｉｒｏｎ、Ｄ．Ｂ．Ｅａｇｌｅｓ、Ｄ．Ｃ．Ｌｅｓｎｏｙ、Ｓ．Ｋ．Ｂａｒｌｏｗ、及びＲ．Ｌａｎｇｅｒ著「組織工学のための生物分解性ポリマー細胞担体」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ  Ｙ）、第１２巻（第７号）：６８９〜６９３頁、１９９４年に説明する方法によって作ることができる。ポリマー被覆されたメッシュ（強度改善のため）は、Ｗ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ、Ｌ．Ｃｉｍａ、Ｄ．Ｍｏｏｎｅｙ、Ｊ．Ｕｐｔｏｎ、Ｗ．Ｃ．Ｐｕｅｌａｃｈｅｒ、及びＣ．Ａ．Ｖａｃａｎｔｉ著「合成生物分解性ポリマーに細胞移植することを用いて所定の形状に工夫した軟骨」、Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ、第９４巻（第２号）：２３３〜２３７頁、１９９４年に説明する方法によって作ることができる。
【０１３１】
好ましい実施形態では、装置の細胞担体部分は、微粒子に予備成形されることになる。これらの微粒子の大きさ及び形状は、直径が１ｍｍ未満〜１０ｍｍまでの範囲、及びそれぞれ抽象的な形状の顆粒から確定した形状までとすることができる。これらの微粒子は、高度多孔性（空隙容積が９５％よりも大きい）又は無孔性のいずれかとすることができる。細胞担体微粒子は、細胞を封じ込め装置の中心又は外側の周りに封じ込めるのに用いることができ、かつ包装して滅菌する前に封じ込め装置内又は上に予め装填することができ、又は封じ込め装置とは別々に包装して滅菌することもできる。
【０１３２】
また、スポンジ又は発泡体ベースの細胞担体も本発明に含まれ、これは、溶液流延微粒子溶脱（ＳＣ−ＰＬ）、溶融成形微粒子溶脱（この場合、溶融成形は、例えば、圧縮成形、射出成形、又は押出しを含むことができる）、押出し微粒子溶脱、乳剤凍結乾燥、微粒子溶脱と組み合わせた凍結乾燥、溶液成形、ゲル成形、噴霧発泡体、相分離、微粒子溶脱と組み合わせた相分離、高圧ＣＯ２、発泡塩のガス発泡、３Ｄ印刷、熱溶解積層法、及びエレクトロスパンナノファイバ又は他のナノファイバを用いる方法のような方法を用いて製造することができる。好ましい実施形態では、本発明の細胞担体部分は、溶媒成形／凍結乾燥法を用いて製造されている。
【０１３３】
本発明のスポンジ又は発泡体ベースの細胞担体を製造する方法は、当業技術で公知である。例えば、溶液流延微粒子溶脱（ＳＣ−ＰＬ）細胞担体は、Ａ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ、Ａ．Ｊ．Ｔｈｏｒｓｅｎ、Ｌ．Ａ．Ｃｚｅｒｗｏｎｋａ、Ｂａｏ  Ｙ．、及びＲ．Ｌａｎｇｅｒ著「ポリ（Ｌ−乳酸）発泡体の調整及び特徴付け」、Ｐｏｌｙｍｅｒ、第３５巻（第５号）：１０６８〜１０７７頁、１９９４年、及びＰ．Ｘ．Ｍａ及びＪ．Ｗ．Ｃｈｏｉ．著「明瞭に相互に接続した球状孔網状構造を備えた生物分解性ポリマー細胞担体」、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ、第７巻（第１号）：２３〜３３頁、２００１年に開示されている方法によって作ることができる。ＳＣ溶融成形細胞担体は、Ｒ．Ｃ．Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｍ．Ｊ．Ｙａｓｚｅｍｓｋｉ、Ｊ．Ｍ．Ｐｏｗｅｒｓ、及びＡ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ著「骨再生のためにポリ（α−ヒドロキシエステル）発泡体で強化されたヒドロキシアパタイト繊維」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１９巻（第２１号）：１９３５〜４３頁、１９９８年によって作ることができる。押出し微粒子溶脱ベースの細胞担体は、Ｍ．Ｓ．Ｗｉｄｍｅｒ、Ｐ．Ｋ．Ｇｕｐｔａ、Ｌ．Ｌｕ、Ｒ．Ｋ．Ｍｅｓｚｌｅｎｙｉ、Ｇ．Ｒ．Ｅｖａｎｓ、Ｋ．Ｂｒａｎｄｔ、Ｔ．Ｓａｖｅｌ、Ａ．Ｇｕｒｌｅｋ、Ｃ．Ｗ．Ｐａｔｒｉｃｋ，Ｊｒ．、及びＡ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ著「誘導組織再生のための押出し処理による多孔性生物分解性ポリマー導管の製造」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１９巻（第２１号）：１９４５〜１９５５頁、１９９８年によって作ることができる。
【０１３４】
凍結乾燥（相分離）ベースの細胞担体は、Ｈ．Ｌｏ、Ｐｏｎｔｉｃｉｅｌｌｏ  Ｍ．Ｓ．、及びＫ．Ｗ．Ｌｅｏｎｇ著「相分離による制御放出生物分解性発泡体の製造」、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ、第１巻（第１号）：１５〜２８頁、１９９５年、及びＣ．Ｓｃｈｕｇｅｎｓ、Ｖ．Ｍａｑｕｅｔ、Ｃ．Ｇｒａｎｄｆｉｌｓ、Ｒ．Ｊｅｒｏｍｅ、及びＰ．Ｔｅｙｓｓｉｅ著「細胞移植のためのポリラクチドマクロ孔質生物分解性移植片、第２報、液相−液相分離によるポリラクチド発泡体の調整」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ、第３０巻（第４号）：４４９〜４６１頁、１９９６年によって作ることができる。微粒子溶脱と組み合わせた凍結乾燥（相分離）を用いて製造された骨格は、Ｊ．Ｈ．ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ、Ａ．Ｊ．Ｎｉｊｅｎｈｕｉｓ、Ｂｒｕｉｎ  Ｐ．、Ａ．Ｊ．Ｐｅｎｎｉｎｇｓ、Ｒ．Ｐ．Ｈ．Ｖｅｔｈ、Ｊ．Ｋｌｏｍｐｍａｋｅｒ、及びＨ．Ｗ．Ｂ．Ｊａｎｓｅｎ著「半月板再構成における多孔性生物分解性ポリマー移植片の利用、第１報、半月板損傷の再構成のための多孔性生物分解性ポリウレタンの調製」、Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、第２６８巻：１０７３〜１０８１頁、１９９０年、及びＱ．Ｈｏｕ、Ｄ．Ｗ．Ｇｒｉｊｐｍａ、及びＪ．Ｆｅｉｊｅｎ著「複製及び凍結乾燥処理による相互接続した高度多孔性ポリマー構造の調製」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ、第６７Ｂ巻（第２号）：７３２〜７４０頁、２００３年によって作ることができる。凍結抽出に基づく細胞担体は、Ｍ．Ｈ．Ｈｏ、Ｐ．Ｙ．Ｋｕｏ、Ｈ．Ｊ．Ｈｓｉｅｈ、Ｔ．Ｙ．Ｈｓｉｅｎ、Ｌ．Ｔ．Ｈｏｕ、Ｊ．Ｙ．Ｌａｉ、及びＤ．Ｍ．Ｗａｎｇ著「凍結抽出及び凍結ゲル化法を用いることによる多孔性細胞担体の調製」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第２５巻（第１号）：１２９〜１３８頁、２００４年によって作ることができる。乳剤凍結乾燥ベースの細胞担体は、Ｋ．Ｗｈａｎｇ、Ｃ．Ｈ．Ｔｈｏｍａｓ、及びＫ．Ｅ．Ｈｅａｌｙ著「生体吸収性細胞担体を製造するための新しい方法」、Ｐｏｌｙｍｅｒ、第３６巻（第４号）：８３７〜８４２頁、１９９５年に開示されている方法を用いて作ることができる。
【０１３５】
ゲル成形又は溶液成形法を用いて製造された骨格は、Ｊ．Ｐ．Ｓｃｈｍｉｔｚ及びＪ．Ｏ．Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ著「生物分解性の環境変容的骨誘導アロ移植片び骨形成潜在機能の予備試験」、Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ．、（第２３７巻）：２４５〜２５５頁、１９８８年、Ａ．Ｇ．Ｃｏｏｍｂｅｓ及びＪ．Ｄ．Ｈｅｃｋｍａｎ著「再吸収可能なポリマーのゲル成形、第１報、処理及び応用」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１３巻（第４号）：２１７〜２２４頁、１９９２年、及び米国特許第５，７１６，４１６号（１９９８年）に開示されている方法を用いて製造することができる。噴霧発泡体を用いて細胞担体を製造する方法は、Ｈ．Ｌｏ、Ｐｏｎｔｉｃｉｅｌｌｏ  Ｍ．Ｓ．、及びＫ．Ｗ．Ｌｅｏｎｇ著「相分離による制御放出生物分解性発泡体の製造」、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ、第１巻（第１号）：１５〜２８頁、１９９５年に見出すことができる。気体発泡微粒子溶脱を用いる方法は、Ｙ．Ｓ．Ｎａｍ、Ｊ．Ｊ．Ｙｏｏｎ、及びＴ．Ｇ．Ｐａｒｋ著「ポロゲン添加剤として気体発泡塩を用いるマクロ孔質生物分解性ポリマー細胞担体の新しい製造方法」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ、第５３巻（第１号）：１〜７頁、２０００年に見出すことができる。
【０１３６】
３Ｄ印刷（「Ｔｈｅｒｉｆｏｒｍ（登録商標）」処理）は、例えば、Ｒ．Ａ．Ｇｉｏｒｄａｎｏ、Ｂ．Ｍ．Ｗｕ、Ｓ．Ｗ．Ｂｏｒｌａｎｄ、Ｌ．Ｇ．Ｃｉｍａ、Ｅ．Ｍ．Ｓａｃｈｓ、及びＭ．Ｊ．Ｃｉｍａ著「３次元印刷により製造されている高密度ポリ乳酸構造の機械特性」、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ、Ｐｏｆｙｍ編、第８巻（第１号）：６３〜７５頁、１９９６年、及びＳ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｈ．Ｕｔｓｕｎｏｍｉｙａ、Ｊ．Ａ．Ｋｏｓｋｉ、Ｂ．Ｍ．Ｗｕ、Ｍ．Ｊ．Ｃｉｍａ、Ｊ．Ｓｏｈｎ、Ｋ．Ｍｕｋａｉ、Ｌ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、及びＪ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ著「チャンネルの固有の網状構造を備えた新しい３次元の合成生物分解性ポリマー細胞担体上の肝細胞の生存及び機能」、Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ、第２２８巻（第１号）：８〜１３頁、１９９８年に説明されている。熱溶解積層法ベースの方法は、Ｄ．Ｗ．Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ、Ｔ．Ｓｃｈａｎｔｚ、Ｉ．Ｚｅｉｎ、Ｋ．Ｗ．Ｎｇ、Ｓ．Ｈ．Ｔｅｏｈ、及びＫ．Ｃ．Ｔａｎ著「熱溶解積層法を通じて設計されて製造されたポリカプロラクトン細胞担体の機械特性及び細胞培養反応」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ、第５５巻（第２号）：２０３〜２１６頁、２００１年に見出すことができる。エレクトロスパンナノファイバを用いる方法は、Ｗ．Ｊ．Ｌｉ、Ｃ．Ｔ．Ｌａｕｒｅｎｃｉｎ、Ｅ．Ｊ．Ｃａｔｅｒｓｏｎ、Ｒ．Ｓ．Ｔｕａｎ、及びＦ．Ｋ．Ｋｏ．著「エレクトロスパンナノファイバ構造：組織工学のための新しい細胞担体」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ、第６０巻（第４号）：６１３〜６２１頁、２００２年に見出すことができる。ポロゲン溶脱と共にナノファイバを用いる方法は、Ｒ．Ｚｈａｎｇ及びＰ．Ｘ．Ｍａ著「予めデザインしたマクロ孔質構造を備えた合成ナノ原繊維細胞外基質」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ、第５２巻（第２号）：４３０〜４３８頁、２０００年に見出すことができる。
【０１３７】
天然（例えば、コラーゲン、エラスチン、ポリ（アミノ酸）；及びヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、カルボキシメチルセルロースのような多糖類；及び多孔性ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、及びキトサンのようなセラミックベースの細胞担体）及び合成材料の両方を用いて、本発明の細胞担体を製造することができる。好ましい実施形態では、細胞担体は、再吸収可能な材料で構成され、細胞担体内に組織成長のための余地を残しながら、細胞担体を除去するための第２の手術の必要性を排除する。本発明の細胞担体を製造するのに用いることができる例示的な合成の再吸収可能ポリマーには、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、及びそのコポリマー、並びにＰＣＬ、ＰＤＯ、及びＰＴＭＣ、及びそのコポリマーが含まれる。これらのポリマーでは、その滅菌性及び相対的生体適合性が文書により確実に立証されているという点で際立った利点がもたらされる。また、その再吸収率は、新しい組織の形成率に適合させる目的に合わせることができる。好ましい実施形態では、細胞担体は、７０：３０ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）から成る。別の実施形態では、細胞担体は、８５：１５ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）から成る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、上述の骨格又は細胞担体部分のいずれも、擬似体液（ＳＢＦ）溶液を用いてアパタイトで被覆することができる。ＳＢＦ溶液は、イオン濃度をヒト血しょうの濃度のほぼ０〜１０倍にして調製することができ、．２２μｍＰＥＳ膜又は同様の膜フィルタを通して無菌濾過することができる。当業技術で認識されたＳＢＦ溶液を作る方法及び本発明で用いるためのその修正は、例えば、Ｃｈｏｕ他（２００４年）著「生体模倣アパタイト構造が造骨細胞の活力度、増殖、及び遺伝子発現に及ぼす影響」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（近刊）、Ｏｙａｎｅ他（２００３年）著「修正擬似体液の調製及び評価」、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ、第６５Ａ巻：１８８〜１９５頁、及びＭｕｒｐｈｙ他（１９９９）著「インビトロでの多孔性ポリ（乳酸−コ−グリコリド）骨格内の連続骨状鉱物の成長」、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、第５０巻：５０〜５８ページに見出すことができる。骨格又は細胞担体は、濡れ性及びＳＢＦイオンに対する親和性を改善するためにＳＢＦ溶液に浸漬する前にグロー放電、アルゴンプラズマエッチングで処置することができる。ＳＢＦ濃度、成分、ｐＨ、及び上述の骨格又は細胞担体を各ＳＢＦ溶液に漬ける時間を制御することにより、骨格又は細胞担体表面上に異なるアパタイト微小環境を生じさせることができる。真空又は流体流れ（有向又は無向）を用いて、ＳＢＦを骨格又は細胞担体部分の孔に強制的に入れることができる。
【０１３９】
細胞担体部分の望ましい再吸収率は、特定の治療用途に基づいて変化させることになることは当業技術で理解されている。厚み０．１ミリメートル〜約５ミリメートルの本発明の細胞担体部分は、実質的に分解するまでに約２週間〜複数月にわたり、好ましくは３〜６ヶ月間を超えてその構造一体性を維持し、骨形成を達成して最適化することを可能にする必要があると考えられている。
細胞担体の再吸収率はまた、選択的に制御することができる。例えば、細胞担体部分は、患者が外科的手順から回復する速度に応じて異なる速度で分解することができるように製造することができる。従って、平均的な患者よりも速く外科的手順から回復する患者には、例えば、細胞担体部分のポリマー材料に選択的で細胞担体部分を更に迅速に分解させる薬剤を投与することができる。あるいは、ポリマー材料が、例えば、感温性であるか又は荷電によって影響を受ける場合には、装置が移植された領域を局所的に加熱又は冷却することができ、そうでなければ、装置が個々の患者に望ましい速度で溶解する荷電に露出させることができる。
【０１４０】
再吸収速度に加えて、細胞担体のある一定の物理的特性も考慮すべきである。一般的に、細胞担体は、細胞を付着させるために大きな表面積を有するべきである。この結果を達成する１つの方法は、高度多孔性ポリマー発泡体を生成することであろう。これらの発泡体では、孔径は、細胞が孔を穿通するほど十分に大きくする必要があり、孔は、相互に接続されてこの構成の深い部分での細胞の栄養の交換を容易にすべきである。これらの特性（空隙率及び孔径）は、細胞担体製造の方法に依存することが多い（Ｍｉｋｏｓ、Ａ．Ｇ．、Ｂａｏ、Ｙ．、Ｃｉｍａ、Ｌ．Ｇ．、Ｉｎｇｂｅｒ、Ｄ．Ｅ．、Ｖａｃａｎｔｉ、Ｊ．Ｐ．、及びＬａｎｇｅｒ、Ｒ．（１９９３年ａ）著「細胞付着及び移植のためのポリ（グリコール酸）結合繊維構造の調製」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２７巻：１８３〜１８９頁、Ｍｉｋｏｓ、Ａ．Ｇ．、Ｓａｒａｋｉｎｏｓ、Ｇ．、Ｌｅｉｔｅ、Ｓ．Ｍ．、Ｖａｃａｎｔｉ、Ｊ．Ｐ．とＬａｎｇｅｒ、Ｒ．（１９９３年ｂ）、Ｍｉｋｏｓ、Ａ．Ｇ．、Ｔｈｏｒｓｅｎ、Ａ．Ｊ．、Ｃｚｅｒｗｏｎｋａ、Ｌ．Ａ．、Ｂａｏ、Ｙ．、Ｌａｎｇｅｒ、Ｒ．、Ｗｉｎｓｌｏｗ、Ｄ．Ｎ．、及びＶａｃａｎｔｉ、Ｊ．Ｐ．（１９９４年）著「ポリ（Ｌ−乳酸）発泡体の調製及び特徴付け」、Ｐｏｌｙｍｅｒ、第３５巻：１０６８〜１０７７頁、Ｎａｍ、Ｙ．Ｓ．及びＰａｒｋ、Ｔ．Ｇ．（１９９９年ａ）著「修正熱誘導相分離法による生物分解性ポリマー微孔性発泡体」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第２０巻：１７８３〜１７９０頁、Ｎａｍ、Ｙ．Ｓ．、Ｙｏｏｎ、Ｊ．Ｊ．、及びＰａｒｋ、Ｔ．Ｇ．（２０００年）著「気体発泡塩をポロゲン添加物として用いるマクロ孔質生物分解性ポリマー骨格の新しい製造方法」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、第５３巻：１〜７頁）。
【０１４１】
骨形成に最適な孔径は、一般的に、４０〜４００ミクロンの範囲である。高度に多孔性の細胞担体を生成するためのいくつかの方法が開発されており、これには、繊維結合（Ｍｉｋｏｓ他、１９９３年、上記）、溶媒成形／微粒子溶脱（Ｍｉｋｏｓ他、１９９３年、上記、Ｍｉｋｏｓ他、１９９４年、上記）、気体発泡（Ｎａｍ他、２０００年、上記）、及び相分離（Ｌｏ、Ｈ．、Ｐｏｎｔｉｃｉｅｌｌｏ、Ｍ．Ｓ．、及びＬｅｏｎｇ、Ｋ．Ｗ．（１９９５年）著「相分離による制御放出生物分解性発泡体の製造」、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１巻：１５〜２８頁、Ｗｈａｎｇ、Ｋ．、Ｔｈｏｍａｓ、Ｃ．Ｈ．、Ｈｅａｌｙ、Ｋ．Ｅ．、及びＮｕｂｅｒ、Ｇ．（１９９５年）著「生体吸収性骨格を製造する新しい方法」、Ｐｏｌｙｍｅｒ、第３６巻：８３７〜８４２頁、Ｌｏ、Ｈ．、Ｋａｄｉｙａｌａ、Ｓ．、Ｇｕｇｇｉｎｏ、Ｓ．Ｅ．、及びＬｅｏｎｇ、Ｋ．Ｗ．（１９９６年）著「細胞播種及び制御放出機能を有するポリ（Ｌ−乳酸）発泡体」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第３０巻：４７５〜４８４頁、Ｓｃｈｕｇｅｎｓ、Ｃ、Ｍａｑｕｅｔ、Ｖ．、Ｇｒａｎｄｆｉｌｓ、Ｃ、Ｊｅｒｏｍｅ、Ｒ．、及びＴｅｙｓｓｉｅ、Ｐ．（１９９６年）著「細胞移植のためのポリ乳酸マクロ孔質生物分解性移植片、第２報、液体−液体相分離のためのポリ乳酸発泡体の調製」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第３０巻：４４９〜４６１頁、Ｎａｍ及びＰａｒｋ、１９９９年、上記）が含まれる。これらの方法のうち、繊維結合、溶媒成形／微粒子溶脱、気体発泡／微粒子溶脱、及び液体−液体相分離は、細胞播種及び移行を容易にする大きな相互接続した孔を生成する。繊維結合、溶媒成形／微粒子溶脱、及び気体発泡／微粒子溶脱法は、臨床的に許容可能な生体適合性を示している。
【０１４２】
本明細書に説明した方法、並びに細胞担体を製造するための当業技術で認識された方法の全ては、細胞が生体内で新しい組織を形成する機能を低減する可能性があると考えられる有機溶媒を除去するように適切に修正すべきである。本発明の細胞担体を製造する方法の一部が例示的に本明細書に説明されているが、限定的なものではない。
例えば、上述のように、３次元の細胞担体を構成するために用いる技術の１つは、細かいＰＬＧＡ粉末及びゼラチン微小球の混合物が「テフロン（登録商標）．ＲＴＭ．」型に入れられ、ポリマーのガラス転移温度よりも高温に加熱される「溶融成形」として公知である。ＰＬＧＡゼラチン複合体を型から除去し、蒸留した脱イオン水に選択的に溶解することによってゼラチン微小球を溶脱する。他の細胞担体製造技術には、ポリマー／セラミック繊維複合体発泡処理、相分離、及び高圧処理が含まれる。
【０１４３】
細胞担体を製造するための別の技術は、「溶媒成形及び微粒子溶脱」として公知である。この技術では、塩化ナトリウム結晶のような篩った塩粒子をＰＬＬＡ／クロロホルム溶液に入れ、次に、これを用いて膜を成形する。溶媒を蒸発させた後、ＰＬＬＡ／塩複合体膜をＰＬＬＡ融点よりも高温に加熱し、その後、制御した速度で冷却することによって急冷又は徐冷し、非晶又は定結晶化度の半晶の形を得る。塩粒子は、選択的に溶解して多孔性ポリマー基質を生成することによって最終的に溶脱する。
【０１４４】
本発明の細胞担体を製造するための更に別の技術は、「繊維結合」として公知であり、望ましい細胞担体の形状の型を準備する段階と、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）のような繊維を型に入れる段階と、ＰＧＡ繊維をポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）／塩化メチレン溶液に包埋する段階とを含む。溶媒を蒸発させ、ＰＬＬＡ−ＰＧＡ複合体を両ポリマーの融点よりも高温に加熱する。ＰＬＬＡは、次に、冷却後に選択的に溶解することによって除去し、表面又は内部を何ら修正することなくその交差点で物理的に接合したＰＧＡ繊維を残し、その初期の直径を維持する。繊維結合は、薄い細胞担体を製造するのに特に有用である。
【０１４５】
別の技術は、固体自由形製造（ＳＦＦ）とすることができ、これは、任意の複雑な形状を迅速かつ自動的に製造するために工業的用途に用いられてきたコンピュータ支援デザイン及びコンピュータ支援製造（ＣＡＤ／カム）方法に関するものである。ＳＦＦ処理では、増分材料堆積及び断面層の融合により形状を構成する。これらの方法では、３次元（３Ｄ）ＣＡＤモデルは、自動処理プランナーを通じて最初に分解又は「薄切り」にされ、一般的に０．００４〜０．０２０インチ厚みの薄い断面層に表示される。物理的形状を構築するために、各層は、次に、自動製造機の以前の層に選択的に付加又は堆積されて融合される。これら及び他の細胞担体製造技術は、米国特許第６，１４３，２９３号に説明されており、この全内容は、本明細書において引用により組み込まれている。
【０１４６】
本発明の別の態様によれば、細胞担体部分は、細胞移行に影響を及ぼす走化性物質、細胞移行に影響を及ぼす阻害物質、細胞増殖に影響を及ぼす分裂促進成長因子、細胞分化に影響を及ぼす成長因子、及び血管形成（新しい血管の形成）を促進する因子のような細胞制御のための物質を含むことができる。細胞制御物質は、細胞担体上の１つ又はそれよりも多くの所定の部位に配置することができる。例えば、細胞の増殖及び／又は分化を一般的に阻害するか又はそうでなければ低減する物質を細胞担体の表面の１つ（例えば、骨形成が意図される領域内の骨成長が望ましくない領域に近接することになる表面）上に配置することができる。同様に、細胞の増殖及び／又は分化を一般的に促進するか又はそうでなければ改善する物質を細胞担体の表面の１つ（例えば、骨形成が意図される領域に近接することになる表面）上に配置することができる。更に、阻害及び促進物質は、所定の部位に細胞担体を通して散在させ、装置の表面にわたる異なる領域で細胞の増殖の速度に影響を及ぼすのを助けるようにすることができる。
【０１４７】
好ましくは、装置の適切な細胞担体部分は、包装及び滅菌する前に製造業者（例えば、「ＭａｃｒｏＰｏｒｅ  Ｂｉｏｓｕｒｇｅｒｙ、Ｉｎｃ．」製）により細胞担体封じ込め部分の形状に一致する特定の形状、構成、及び大きさに予備成形されることになる。しかし、予備成形細胞担体部分は、加熱アイロン、熱風、加熱スポンジ、又は熱水浴法を用いて材料をそのガラス転位温度にすることにより、手術時に付形することができる。いくつかの実施形態では、細胞担体は、切断して封じ込め部分に機械的に圧入し、得られる締り嵌めにより所定位置に保持することができる。別の実施形態では、封じ込め部分は、ガラス転位温度に加熱し、予め判断して予備成形した幾何学形状に復帰させることができ、それにより、細胞担体がクランプ締めされることになり、それによって安定化することになる。更に別の実施形態では、細胞担体は、１つ又はそれよりも多くの適切な大きさの合わせ再吸収可能な又は再吸収不能なネジ、鋲、又はピンを上述の封じ込め部分の１つ又はそれよりも多くの穿孔に挿入することにより、封じ込め部分に固定することができる。再吸収可能なネジ、鋲、又はピンは、「ＭａｃｒｏＰｏｒｅ  Ｂｉｏｓｕｒｇｅｒｙ，Ｉｎｃ．」（カリフォルニア州サンディエゴ）から得ることができる。代替的に、骨形成を意図した領域に挿入された状態で、水のこの領域への流入により、細胞担体が膨張して封じ込め部分が収縮するか、又は細胞担体が収縮して封じ込め部分が膨張することができ、それによって固定することができる。細胞担体及び封じ込め部分はまた、ポリマー溶液、溶媒、又は適切な接着剤を用いて互いに固定することができる。
【０１４８】
ｉ．装置の多孔性細胞担体部分の例示的な実施形態
図５に示すように、本発明の装置の多孔性細胞担体部分２１０は、上面２１１、底面２１２、側面２１３、前端２１４及び後端２１５、及び複数の相互接続孔２１６を有する放物形である。
【０１４９】
３．再生細胞を装置の細胞担体部分に加える方法
細胞担体は、再生細胞を適切に播種し、骨形成を意図した領域での骨形成を最適にすべきである。細胞担体の機能は、骨形成が意図された部位での最適な細胞媒介骨形成に適合するように細胞を送出することである。担体は、その中に細胞を播種する繊維又はスポンジマクロ構造を備えた固体の再吸収可能又は再吸収不能なポリマーベースの骨格とすることができ、又はその中に細胞が封入されるヒドロゲル、例えば、フィブリン、ポリエチレングリコールとすることができる。担体は、化学物質、ペプチド、タンパク質、又遺伝子により、細胞付着支援、例えば、ＲＧＤ、細胞分化支援、例えば、ＣＢＦＡ−１遺伝子、石灰化支援、例えば、リン酸基により改質することができる。細胞は、注射又は処置部位での他の適切な方法により生体内で播種することができ、又は生体外で播種することができる。
【０１５０】
本発明に含まれる固体ベースの骨格のための生体外播種法には、いくつか例を挙げると、静止播種（又は毛管作用）と、注射と、単方向及び双方向潅流、スピナフラスコ、軌道又はランダム振とう機、回転又は転倒型バイオリアクタ播種、及び真空補助播種を含む動的播種と、又は、本方法の混合のような当業技術で認識された方法とが含まれる。本発明に含まれる天然又は合成ゲルベース担体のための播種方法には、ゲルベース担体の液体成分と混合し、物理的相互作用の架橋（例えば、水素、ファンデルワールス力、極性力、イオン結合）又は共有結合性架橋によりゲルを形成する方法のような当業技術で認識された方法が含まれる。ゲルベース担体を用いる播種は、生体内で又は生体外で達成することができる。細胞担体部分が微粒子形であれば、播種方法は、上述のようなものとすることができ、又はそれと異なるものとすることができる。例えば、細胞は、単純に細胞担体部分と混合し、細胞／微粒子混合物を封じ込め装置の中心及び／又は封じ込め装置の周りのような骨形成を意図した領域に入れるか、圧入するか、又は注射することができる。
【０１５１】
担体内に組み込まれる細胞は、担体に付着するか又は細胞の骨形成機能を刺激する細胞の機能を促進することができるあらゆる物質で予め培養又は培養することができる（後者は、骨成長促進タンパク質又は遺伝子（例えば）ＢＭＰ、又は他の骨成長調節性分子（例えば、ＣＢＦＡ−１）による例を含むことができる）。生体外播種方法では、細胞を負荷した細胞担体を次に本発明の細胞担体封じ込め部分で骨形成を意図した領域に入れて骨形成を導く。移植された状態で、ホスト細胞流入及びＡＤＣ増殖、分化、類骨堆積、ミネラル化、並びに再吸収可能な骨格の場合には骨格の同時再吸収が進行する。
【０１５２】
細胞担体を播種するこれら及び他の方法は、例えば、Ｓ．Ｌ．Ｉｓｈａｕｇ、Ｇ．Ｍ．Ｃｒａｎｅ、Ｍ．Ｊ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ．Ｗ．Ｙａｓｋｏ、Ｍ．Ｊ．Ｙａｓｚｅｍｓｋｉ、及びＡ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ著「生物分解性ポリマー骨格内の３次元間質性造骨細胞の培養による骨形成」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ、第３６巻（第１号）：１７〜２８頁、１９９７年、Ｈ．Ｌ．ＷａＩｄ、Ｇ．Ｓａｒａｋｉｎｏｓ、Ｍ．Ｄ．Ｌｙｍａｎ、Ａ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ、Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ、及びＲ．Ｌａｎｇｅｒ著「多孔性移植装置における細胞播種」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１４巻（第４号）：２７０〜２７８頁、１９９３年、Ｎ．Ｓ．Ｄｕｎｋｅｌｍａｎ、Ｍ．Ｐ．Ｚｉｍｂｅｒ、Ｒ．Ｇ．ＬｅＢａｒｏｎ、Ｒ．Ｐａｖｅｌｅｃ、Ｍ．Ｋｗａｎ、及びＡ．Ｆ．Ｐｕｒｃｈｉｏ著「閉鎖バイオリアクタシステム内のポリグリコール酸骨格上のラビット間接軟骨細胞による軟骨生成」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、第４６巻：２９９〜３０５頁、１９９５年、Ｌ．Ｅ．Ｆｒｅｅｄ、Ａ．Ｐ．Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、Ｉ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｊ．Ｒ．Ｂａｒｒｙ、Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ、及びＧ．Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ著「細胞−ポリマー−バイオリアクタシステムにおける軟骨形成」、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、第２４０巻（第１号）：５８〜６５頁、１９９８年、Ｒ．Ｅ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｎ．Ｓ．Ｄｕｎｋｅｌｍａｎ、Ｇ．Ｎａｕｇｈｔｏｎ、及びＡ．Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ著「生物再吸収可能な骨格上での細胞播種による軟骨の組織工学の方法」、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｄ、第８７５巻：３９８〜４０４頁、１９９９年、Ｇ．Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ他（１９９９年）、ｖａｎ  Ｗａｃｈｅｍ  ＰＢ、ｔｒｏｎｃｋ  ＪＷ、ｏｅｒｓ−Ｚｕｉｄｅｖｅｌｄ  Ｒ、ｉｊｋ  Ｆ、及びｉｌｄｅｖｕｕｒ  ＣＲ著「真空細胞播種：多孔性血管グラフト上に細胞層を均一に分配して迅速に付加するための新しい方法」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１１巻（第８号）：６０２〜６０６頁、１９９０年、Ｌ．Ｅ．Ｆｒｅｅｄ、Ｊ．Ｃ．Ｍａｒｑｕｉｓ、Ｇ．Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ、Ｊ．Ｅｍｍａｎｕａｌ、及びＲ．Ｌａｎｇｅｒ著「細胞−ポリマー軟骨移植片の組成」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、第４３巻：６０５〜６１４頁、１９９４年、Ｊ．Ｌ．ｖａｎ  Ｓｕｓａｎｔｅ、Ｐ．Ｂｕｍａ、Ｇ．Ｊ．ｖａｎ  Ｏｓｃｈ、Ｄ．Ｖｅｒｓｌｅｙｅｎ、Ｐ．Ｍ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒａａｎ、Ｗ．Ｂ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｅｒｇ、及びＧ．Ｎ．Ｈｏｍｍｉｎｇａ著「アルギン酸塩及びコラーゲン担体ゲル中の軟骨細胞の培養物」、Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｓｃａｎｄ、第６６巻（第６号）：５４９〜５６頁、１９９５年、Ｊ．Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ、Ｗ．Ｍｃｌｎｔｏｓｈ、Ｋ．Ａｎｓｅｔｈ、Ｓ．Ｒｉｌｅｙ、Ｐ．Ｒａｇａｎ、及びＲ．Ｌａｎｇｅｒ著「ポリ（エチレンオキシド）ベースの半相互浸入網状構造内への軟骨細胞の光封入」、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、第５１巻：１６４〜１７１頁、２０００年に開示されている。
【０１５３】
細胞担体上に播種されると、装置は、受容者の骨形成を意図した領域に装填することができる。代替的に、細胞は、装置（細胞担体部分及び封じ込め部分）を受容者の骨形成を意図した領域に装填した後に細胞担体上に播種することができる。生体内細胞増殖で再吸収可能な細胞担体の場合には、装置が装填された状態で細胞担体の同時再吸収が進行する。
本発明の別の態様では、細胞担体部分は、細胞播種を容易にするための物質（例えば、化学的又は生物学的分子）、例えば、細胞付着を改善するための接着ペプチド又は他の生物学的分子、細胞担体の親水性を変化させる物質、表面電荷、極性分子、又は細胞付着を増大させるか又は流体の細胞担体取り込みを増大させる界面活性剤又は湿潤剤を更に含むことができる。細胞播種を容易にするために用いる物質は、細胞担体孔の表面、細胞担体の外側領域、細胞担体材料内部に散在させて、所定の部位又はその組合せに配置することができる。
【０１５４】
ｉ．再生細胞を播種した細胞担体の例示的な実施形態
図１７に示すように、本発明の装置の多孔性細胞担体部分２１０は、上面２１１、底面２１２、側面２１３、前端２１４及び後端２１５、複数の相互接続する孔２１６を有する放物スリーブの形状であり、幹細胞及び始原細胞２１７のような再生細胞を播種される。
【０１５５】
４．装置の細胞担体封じ込め部分を製造する方法
広範な実施形態では、装置の細胞担体封じ込め部分（「封じ込め部分」）は、本明細書に開示されている方法により用いられる時、骨形成を支配するのに有効なあらゆる材料で構成することができる。好ましくは、封じ込め部分は再吸収可能である。例えば、封じ込め部分は、再吸収可能ポリマーのようなあらゆる生物分解性材料で構成することができる。好ましい実施形態では、封じ込め部分は、有意な抗原性又は免疫原性生物学的応答を誘発しない材料から成る。
【０１５６】
一実施形態によれば、本発明の封じ込め部分を形成するのに用いることができる非制限的ポリマーには、ラクチド（Ｌ、Ｄ、ＤＬ、又はその組合せ）、グリコリド、トリメチレンカーボネート、カプロラクトン、及び／又はその物理的及び化学的組合せのポリマー（例えば、コポリマー）が含まれる。一実施形態では、封じ込め部分は、Ｌ−ラクチド及びＤ，Ｌ−ラクチドのコポリマーとすることができるポリ乳酸から成る。例えば、コポリマーは、約６０〜８０％のＬ−ラクチド及び約２０〜４０％のＤ，Ｌ−ラクチドを含むことができ、好ましい実施形態では、コポリマーは７０：３０ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）を含む。
【０１５７】
一実施形態では、封じ込め部分は、ラクチド（例えば、Ｌ、Ｄ、ＤＬ、又はその組合せ）、ε−カプロラクトン、及びグリコリドのような１つ又はそれよりも多くの環状エステルからのポリマー（例えば、ホモ及び／又はコポリマー）によって形成される。例えば、一実施形態では、封じ込め部分は、約１〜９９％のε−カプロラクトンを含むことができ、別の実施形態では、２０〜４０％のε−カプロラクトンを含むことができる。一例においては、膜は、６５：３５のポリ（Ｌ−ラクチド−コ−εカプロラクトン）を含む。他の実施形態では、ブチロラクトン、バレロラクトン、又はジメチルプロピオラクトンをεカプロラクトンと共に又はその代替物として用いることができる。別の実施形態では、封じ込め部分は、上述のポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）よりも速く体内に再吸収されるラクチド及びグリコリドを含むコポリマーを含むことができる。
【０１５８】
本発明のポリマー（例えば、コポリマー）は、比較的簡単な化学的反応及び剤形を必要とする。本発明の封じ込め部分は、滑らかであり、実質的に無孔性であることが好ましい。好ましくは、封じ込め部分は、包装及び滅菌する前に製造業者（例えば、「ＭａｃｒｏＰｏｒｅ  Ｂｉｏｓｕｒｇｅｒｙ，Ｉｎｃ．」）により特定の形状、構成、及び大きさに形成することができる。しかし、予備形成した封じ込め部分は、加熱アイロン、熱風、加熱スポンジ、又は熱水浴法を用いて材料をガラス転位温度にすることにより、手術時に造形することができる。
【０１５９】
封じ込め部分の厚みは、約０．１ミリメートル〜約５ミリメートルとすることができる。好ましくは、封じ込め部分の厚みは、約２ミリメートル〜約４ミリメートルである。封じ込め部分の材料は、骨の曲率に一致するのに十分な可撓性と、装置がターゲット領域に取り付けられると骨欠損部のマクロ運動を低減し、周囲運動の内部空間への伝達を制限するのに十分な強度とを有することができる。封じ込め部分は、骨形成の間にターゲット領域が隣接する軟組織が、ターゲット部位に脱出しないように保護するようにされ、更に、望ましい骨形成が起こった後には、装置が挿入されることに伴う応力が遮蔽されるために骨の再吸収を防ぐようになっている。
【０１６０】
封じ込め部分は、骨成長を有効に促進することができるあらゆる形状にすることができる。一実施形態では、封じ込め部分は、放物形とすることができ、別の実施形態では、封じ込め部分は、矩形とすることができる。更に別の実施形態では、封じ込め部分は、台形とすることができる。別の実施形態では、封じ込め部分は、円筒形にすることができる。本発明の封じ込め部分は、周囲の解剖学的構造に一致するように十分に可撓性とすることができる。
【０１６１】
一実施形態では、封じ込め部分は、２つの対向する表面を含む。封じ込め部分の一方の側には、骨成長する実質的に滑らかな側又は表面があり、反対側には、骨成長しない実質的に滑らかな側又は表面がある。好ましくは、骨成長する実質的に滑らかな側は、骨形成を意図した領域に面するように位置決めされ、骨成長しない実質的に滑らかな側は、骨形成が望ましくない領域に面するように位置決めされる。
【０１６２】
本明細書で用いる場合、「無孔性」という用語は、ほぼ耐水性であり、好ましい実施形態によれば、流体透過性でない材料を意味する。しかし、本発明の修正実施形態では、微孔（すなわち、流体透過性であるが細胞透過性でない）は、例えば、封じ込め部分の表面の滑らかさを実質的に破壊して組織に瘢痕を引き起こさない限り、本発明の封じ込め部分に存在することができる。限定的な用途のために実質的に変更した実施形態では、細胞透過性であるが血管透過性でない孔を製造して用いることができる。現時点で好ましいように、封じ込め部分は、射出成形手順を用いて製造し、実質的に無孔性封じ込め部分を得ることができる。封じ込め部分はまた、押出し又は圧縮成形手順を用いて製造することができる。封じ込め部分は、半剛性構造にすることができ、ほぼ５５℃に加熱されると完全に制御可能とされる。
【０１６３】
従って、特定的な実施形態では、封じ込め部分の実質的に滑らかな表面は、直径が２０ミクロン〜３０００ミクロンの間の範囲の複数の穿孔を含むことができる。穿孔は、隣接する軟組織が生物学的組織欠損部に脱出しないようにしながら、脈管構造及び結合組織細胞がそれを通って増殖するようになっている。更に、穿孔により、周囲の組織、筋系、及び骨膜からターゲット領域内への血管の極めて重要な寄与が可能になる。装置を通してターゲット領域に侵入する血管により、新しい骨の生成を大幅に促進することができる。周囲組織からの毛細血管が装置を通して増殖する機能により、骨床及び骨膜から移行する細胞がそれらの増大する血液供給を超えないように助けることができる。この血管の増殖により、所定のターゲット領域内での骨形成の潜在機能を増大させることができる。
【０１６４】
封じ込め部分の表面は、直径が１〜５ミリメートルの範囲の複数の大きな穿孔を更に含むことができる。封じ込め部分のこのような大きな穿孔を戦略的に配置し、骨形成を意図した領域内に挿入及び／又は固定装置を固定するために装置が容易に挿入されるようにする。穿孔はまた、融合が遅れるか又は融合しない場合に付加的な再生細胞を穿孔を通して注射する次の外科的手順のために戦略的に配置することができる。封じ込め部分上の大きな穿孔径は、挿入器具及び／又は装置をターゲット領域に固定するのに用いる固定装置の種類に応じて様々とすることができることは当業技術で理解されている。装置を挿入するための当業技術で認識されている器具に加えて、装置は、クランプ、ステープル、ネジ、縫合、鋲、ピン、及び他の従来の手段のような固定装置を用いてターゲット領域に摩擦的に固定することができる。好ましい実施形態では、固定装置は、「ＭａｃｒｏＰｏｒｅ  Ｂｉｏｓｕｒｇｅｒｙ、Ｉｎｃ．」製のもののように再吸収可能である。別の実施形態では、挿入装置又は固定装置の組合せを用いることができる。
【０１６５】
望ましい再吸収率は、特定の治療用途に基づいて変化することになることは当業技術で理解されている。厚みが１ミリメートル〜約５ミリメートル、好ましくは２〜４ミリメートルの本発明の封じ込め部分は、実質的に分解する前にその構造一体性を約１ヶ月、好ましくは約３ヶ月を超えて、より好ましくは約３〜６ヶ月にわたって維持させ、骨形成を達成してそれを最適にすることを可能にする必要があると考えられている。上述の装置の細胞担体部分の再吸収率と同様に、装置の細胞担体封じ込め部分の再吸収率も選択的に制御することができる。
【０１６６】
本発明の全ての態様を製造してそれを用いる例示的な材料及び方法は、例えば、米国特許第５，９１９，２３４号、第６，２８０，４７３号、第６，２６９，７１６号、第６，３４３，５３１号、第６，４７７，９２３号、第６，３９１，０５９号、第６，５３１，１４６号、及び第６，６７３，３６２号に開示されており、その内容は、本明細書において引用により組み込まれている。本発明の装置の再吸収可能な封じ込め部分は、「ＭａｃｒｏＰｏｒｅ  Ｂｉｏｓｕｒｇｅｒｙ、Ｉｎｃ．」（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能である。
【０１６７】
ｉ．装置の細胞担体封じ込め部分の例示的な実施形態
図１８に示すように、一実施形態では、本発明の装置の細胞担体封じ込め部分は、上面２１９、底面２２０、側面２２１、前端２２２、及び後端２２３を有する放物形２１８である。上面及び底面２１９及び２２０の各表面は、装置の封じ込め部分をターゲット領域の周囲の骨に固定するのを助けるリッジ部２２４を有する。リッジ部２２４間の凹みにより、装置の封じ込め部分を所定位置に固定するのを助けると考えられる機械的安定性を改善することができる。細胞担体封じ込め部分２１８は、適切な直径の穿孔２２５を含むことができ、これを用いて、装置を所定位置にネジ留めすることができる。また、穿孔２２５を用いて当業技術で認識された器具を挿入し、装置をターゲット領域に挿入することができる。細胞担体封じ込め部分は、本発明の細胞担体部分を挿入するための大きな中心穴２２６を有する。図１９は、放物形の多孔性細胞担体が放物形の封じ込め部分に挿入された本発明の実施形態を示している。図２０は、本発明の再生細胞が播種された放物形の多孔性細胞担体が放物形の封じ込め部分に挿入された本発明の実施形態を示している。図２０は、当業技術で認識された外科的技術を用いて受容者に挿入するのに適する装置及び細胞の実施形態を示している。
【０１６８】
図２１に示すように、一実施形態では、本発明の装置の細胞担体封じ込め部分は、上面２２８、底面２２９、側面２３０、前端２３１、及び後端２３２を有する台形２２７である。上面及び底面２２８及び２２９の各表面は、装置の封じ込め部分をターゲット領域の周囲の骨に固定するのを助けるリッジ部２３３を有する。リッジ部２３３間の凹みにより、装置の封じ込め部分を所定位置に固定するのを助けると考えられる機械的安定性を改善することができる。細胞担体封じ込め部分２２７は、適切な直径の穿孔２３４を含むことができ、これを用いて、装置を所定位置にネジ留めすることができる。また、穿孔２３４を用いて当業技術で認識された器具を挿入し、装置をターゲット領域に挿入することができる。細胞担体封じ込め部分は、本発明の細胞担体部分を挿入するための大きな中心穴２３５を有する。
【０１６９】
図２２に示すように、一実施形態では、本発明の装置の細胞担体封じ込め部分は、上面２３７、底面２３８、側面２３９、前端２４０、及び後端２４１を有する円筒形２３６である。上面及び底面２３７及び２３８の各表面は、装置の封じ込め部分をターゲット領域の周囲の骨に固定するのを助けるリッジ部２４２を有する。リッジ部２４２間の凹みにより、装置の封じ込め部分を所定位置に固定するのを助けると考えられる機械的安定性を改善することができる。細胞担体封じ込め部分２３６は、適切な直径の穿孔２４３を含むことができ、これを用いて、装置を所定位置にネジ留めすることができる。また、穿孔２４３を用いて当業技術で認識された器具を挿入し、装置をターゲット領域に挿入することができる。細胞担体封じ込め部分は、本発明の細胞担体部分を挿入するための大きな中心穴２４４を有する。
【０１７０】
図２３に示すように、一実施形態では、本発明の装置の細胞担体封じ込め部分は、上面２４６、底面２４７、側面２４８、前端２４９、及び後端２５０を有する矩形２４５である。上面及び底面２４６及び２４７の各表面は、装置の封じ込め部分をターゲット領域の周囲の骨に固定するのを助けるリッジ部２５１を有する。リッジ部２５１間の凹みにより、装置の封じ込め部分を所定位置に固定するのを助けると考えられる機械的安定性を改善することができる。細胞担体封じ込め部分２４５は、適切な直径の穿孔２５２を含むことができ、これを用いて、装置を所定位置にネジ留めすることができる。また、穿孔２５２を用いて当業技術で認識された器具を挿入し、装置をターゲット領域に挿入することができる。細胞担体封じ込め部分は、本発明の細胞担体部分を挿入するための大きな中心穴２５３を有する。
【０１７１】
５．骨及び／又は軟骨形成のための装置を用いる方法
本明細書に例示するように、本発明の脂肪由来再生細胞は、骨又は軟骨前駆体細胞の豊富な供給源であり、これは、生体内で骨及び軟骨を形成することが示されている。従って、本発明の装置を用いて、例えば骨及び／又は軟骨形成を促進することにより骨関連疾患を治療することができる。
従って、本発明の１つの態様では、再生細胞は、ドナーの脂肪組織から抽出され、再吸収可能な細胞担体封じ込め部分に囲まれた多孔性の再吸収可能な細胞担体に加えて、装置及び細胞の組合せを受容者の骨形成を意図した領域に挿入し、それによって骨及び／又は軟骨形成を促進することによって治療的利益を引き出すものである。好ましい実施形態では、細胞はそれを移植することになっているヒトの脂肪組織から抽出され、それによって移植片への抗原性及び／又は免疫原性応答に伴う可能な合併症が減少する。患者は、一般的に、内科医又は他の医療従事者により行われる次の手順の１つ又はそれよりも多くにより骨関連疾患を判断するために評価される。すなわち、以下に限定されるものではないが、患者の病歴、健康診断、及び放射線写真を含む客観的データである。
【０１７２】
一実施形態では、収集手順は、骨関連疾患の処置、例えば脊椎融合手術に関連する血液凝固を低減するように設計された何らかの製品を患者が受ける前に行われる。しかし、いくつかの実施形態では、患者は、収集手順の前に、凝血塊に影響を及ぼすことが公知である薬物（例えば、アスピリン）を受け取ることができる。更に、好ましい１つの方法は、試みる脊椎融合手順のいずれよりも前に脂肪組織を収集する段階を含む。しかし、当業者には理解されるように、収集のタイミングは変動すると考えられ、これは、特に、患者の安定度、患者の凝血プロフィール、供給者の利用可能性、及び優良ケア標準を含むいくつかの因子に依存することになる。最終的には、収集のタイミングは、罹患者に医療を施術することに責任を負う医師により判断されることになる。
【０１７３】
患者から収集される脂肪組織の容積は、約１ｃｃ〜約２０００ｃｃ、一部の実施形態では、約３０００ｃｃまで変動させることができる。除去される脂肪の容積は、患者によって変動することになり、以下に限定されるものではないが、年齢、体形、凝血プロフィール、血行動態安定度、同時罹患率、及び医師の好みを含むいくつかの因子に依存することになる。
細胞は、予め抽出して低温保存様式で保存することができ、又は必要性が確定した時又はほぼその付近で抽出することができる。本明細書に開示されているように、細胞は、細胞を更に精製、改質、刺激、又は他の方法で変化させるために更に処理又は以下の付加的な手順を行うことなく、患者に投与することができ、又は損傷組織に直接又は損傷組織の付近に与えることができる。例えば、患者から得た細胞は、患者に投与する前に細胞を培養することなく、再吸収可能な細胞担体及び再吸収可能な細胞担体封じ込め部分を通じて必要時に患者に投与することができる。一実施形態では、脂肪組織の収集は、患者のベッドサイドで行うことになる。血行動態モニタリングを用いて患者の臨床的状態をモニタすることができる。
【０１７４】
本明細書に開示されている本発明によれば、再生細胞は、脂肪組織を患者から収集して直ぐに患者に送出することができる。例えば、細胞は、脂肪組織を処理して再生細胞組成物を得た後、装置を通じて直ちに投与することができる。最終的に、送出のタイミングは、患者の都合、及び脂肪組織を処理するのに必要な処理時間に依存することになる。別の実施形態では、送出のタイミングは、本明細書で説明するように、患者に再注入することになっている細胞が付加的な改質、精製、刺激、又は他の操作を受ける場合には比較的長くすることができる。患者に投与される細胞数は、例えば、脂肪組織処理後の細胞収量に関連させることができる。細胞の総数の一部は、後に用いるために取って置くことができ、凍結保存することができる。本発明の一実施形態では、患者に送出される細胞、例えば未精製細胞の数は、約５．５×１０4細胞であると考えられる。しかし、この数は、望ましい治療効果を達成するために何桁か調節することができる。
【０１７５】
脂肪組織からの脱凝集後に得られる細胞は、更に、軟骨前駆細胞、骨芽前駆細胞、又はこれらの細胞の１つを除く全ての細胞のいずれかを捕捉するための装置内の又はそれと分離した生物学的ベースの成分の上を流すことによって骨又は軟骨前駆細胞を富化することができる。前者の場合には、装置内又はその外部に含まれる付加的な段階を用いて、生物学的ベースの成分から捕捉された細胞を放出することになる。この軟骨始原細胞又は骨芽前駆体の富化の例は、軟骨前駆細胞又は骨芽前駆細胞（例えば、ＳＨ３細胞）を認識する抗体が付着するクロマトグラフ樹脂とされることになる。放出薬剤の例は、樹脂から抗体／細胞複合体を切断することができるパパイン又はペプシンである。
【０１７６】
細胞はまた、添加物と共に加えて、意図する治療効果を改善、制御、又は他の方法で支配することができる。細胞は、細胞により提供される治療反応を促進すると考えられているか又はそれを意図している遺伝子生成物を発現するように遺伝子操作した後に投与することができる。操作の例には、骨又は軟骨形成を促進する因子の発現と、特定の軟骨又は体細胞系列への分化を促進する遺伝子又は軟骨又は体細胞の成長及び増殖を刺激する遺伝子の発現とを制御（増大又は低減）する操作が含まれる。
【０１７７】
活性細胞母集団は、単独又は他の細胞、組織、組織断片、成長因子（例えば、ＢＭＰ）、又は母集団の送出、有効性、耐用性、又は機能を改善することを意図する他の添加物と共に、本装置の再吸収可能な細胞担体に付加することができる。細胞母集団はまた、構造的又は治療的目的を引き出すために細胞の機能を変更、改善、又は補足するようにＤＮＡをプラスミド又はウイルスベクターに挿入することにより、又は細胞培養物に入れることによって改質することができる。例えば、幹細胞のための遺伝子移入技術は、（Ｍｏｒｉｚｏｎｏ他、２００３年、Ｍｏｓｃａ他、２０００年）に開示されているように当業者には公知であり、（Ｗａｌｔｈｅｒ及びＳｔｅｉｎ、２０００年）及び（Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ他、２０００年）に開示されているようなウイルス移入技術、より詳細には、アデノ関連ウイルス遺伝子移入技術を含むことができる。また、ウイルスを用いない技術は、（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ他、１９９８年）に開示されているように行うことができる。
【０１７８】
別の態様では、細胞は、軟骨又は骨形成の間に細胞をそれ自体の成長因子供給源として働かせることになる前軟骨始原細胞又は前骨形成成長因子を符号化する遺伝子と組み合わせることができる。また、抗アポトーシス因子又は薬剤を符号化する遺伝子を付加することができる。遺伝子（又は、遺伝子の組合せ）の付加は、以下に限定されるものではないが、アデノウイルス形質導入、「遺伝子銃」、リポゾーム媒介形質導入、及びレトロウイルス又はレンチウイルス媒介形質導入、プラスミド、アデノ関連ウイルスを含む当業技術で公知のあらゆる技術によるものとすることができる。細胞は、形質導入を原位置で継続するか又は開始することができるように、長時間にわたって遺伝子を細胞に放出する及び／又は与えることができる担体材料支持遺伝子送出媒介物と共に移植することができる。特に、細胞及び／又は細胞を含む組織が、細胞及び／又は組織を得た患者以外の患者に投与される場合には、細胞及び／又は組織を受け取る患者に１つ又はそれよりも多くの免疫抑制剤を投与して移植片の拒絶を軽減、好ましくは防止することができる。本明細書で用いる場合、「免疫抑制薬又は薬剤」という用語は、正常な免疫機能を阻害するか又は妨害する医薬品を含むものとする。本明細書に開示されている方法に適する免疫抑制剤の例には、米国特許公開第２００２０１８２２１１号に開示されているように、ＣＴＬＡ４及びＢ７経路を通じたＴ細胞及びＢ細胞の連結を妨げる薬剤のようなＴ細胞／Ｂ細胞の同時刺激経路を阻害する薬剤が含まれる。好ましい免疫抑制剤は、シクロスポリンＡである。他の例には、ミオフェニール酸モフェチル、ラパミシン、及び抗胸腺グロブリンが含まれる。一実施形態では、免疫抑制薬は、少なくとも１つの他の治療薬剤と共に投与される。免疫抑制薬は、投与経路に適合する剤形で、望ましい治療効果を達成するのに十分な容積で被験者に投与される。別の実施形態では、免疫抑制薬は、本発明のＡＤＣへの耐性を誘発するのに十分な時間にわたって一過性に投与される。
【０１７９】
本発明のいくつかの実施形態では、細胞は、サイトカイン及び成長因子のような１つ又はそれよりも多くの細胞分化薬剤と共に患者に投与される。様々な細胞分化薬剤の例は、（Ｇｉｍｂｌｅ他、１９９５年、Ｌｅｎｎｏｎ他、１９９５年、Ｍａｊｕｍｄａｒ他、１９９８年、Ｃａｐｌａｎ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ、１９９９年、Ｏｈｇｕｓｈｉ及びＣａｐｌａｎ、１９９９年、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他、１９９９年、Ｃａｐｌａｎ及びＢｒｕｄｅｒ、２００１年、Ｆｕｋｕｄａ、２００１年、Ｗｏｒｓｔｅｒ他、２００１年、Ｚｕｋ他、２００１年）に開示されている。
【０１８０】
ｉ．椎間円板修復又は椎体間脊椎融合手順のための装置を用いる方法
本明細書に説明するように、背痛は、特に老年者では、依然として主な公衆衛生上の問題である。持続的で重篤な背痛により、衰弱及び障害を引き起こすことが多い。この疼痛は、脊椎の椎間円板異常に密接に関連している。背景として、ヒト脊椎は、３３の椎骨を含む可撓性のある構造である。椎間円板は、隣接する椎骨を分離して衝撃を緩和し、脊椎に加わる負荷を最小にする働きをし、椎骨間の運動（屈曲、伸張、回転）を可能にする。椎間円板は、２つの主構成要素、すなわち、髄核及び繊維輪を含む。髄核は、椎間板の中心に配置され、椎間板総断面積の２５〜４０％を占める。髄核の基質は、大部分、水、多糖類、及びタンパク質分子から成る厚いゼラチン状物質から成る。繊維輪は、髄核を囲み、椎間板に加わる捩れ及び屈曲力に抵抗性である。椎骨の終板は、椎間板の両側の椎骨から椎間板を分離する。外側リング層は、構造的に、主に細胞外基質中のＩ型コラーゲンから成る主に繊維軟骨の重なる直交層から成る。この十字パターンで、隣接する椎骨により印加される圧力に対する画期的な構造的回復力が付与される。繊維輪の中央に配置された内側コアは、ヒアルロン酸及びＩＩ型コラーゲンが豊富な基質内に組み込まれた数個の細胞で構成され、生体力学的衝撃吸収材として働く。
【０１８１】
労作、傷害、疾患、事故、又は虐待により、１つ又はそれよりも多くの椎骨及び／又は１つ又はそれよりも多くの椎間板が損傷する場合がある。より詳細には、椎骨及び椎間板の疾患には、以下に限定されるものではないが、１）環状裂溝のような環状椎間板の破壊、２）椎間板の慢性炎症、３）内包性又は逸出突起を伴う局所椎間板ヘルニア、４）椎間板を囲む椎骨の相対的不安定性、及び５）外傷が含まれる。
【０１８２】
繊維輪及び髄核の両方にある椎間円板細胞は、椎間板容積の少量のパーセントしか構成しないが、椎間板の細胞外基質を含むプロテオグリカンが豊富な組織（軟骨に類似する）を合成する機能を有することが示されている。罹患椎間板では、髄核で椎間円板細胞密度が減少し、これに付随して親水性細胞外基質の生成が減少する。従って、椎間円板細胞が減少すれば、椎間円板の空間が徐々に構造的に減少することになり、変性椎間板疾患（ＤＤＤ）の一因になる。従来、軟骨は、ヒアリン、弾性、又は繊維軟骨のいずれかに分類される。髄核のゲル状解剖学的特徴（同様に、固有の脊索胚起源であること）は、軟骨分類のいずれにも当て嵌まらず、古典的には軟骨と見なされない。それにも関わらず、これには、軟骨のものと同様のプロテオグリカンが豊富な細胞外基質が浸透している。本発明の再生細胞が軟骨及び骨を生成することができる機能に基づくと、これらの細胞も、プロテオグリカンが豊富な細胞外基質のように軟骨の形成を刺激することができ、それによって椎間円板を復元することができる。
【０１８３】
背痛を治療するための様々な方法が開発されている。軽い背痛は、薬物治療及び他の非侵襲性の治療法で治療することができる。軽症〜中程度の変性椎間板は、椎間板、髄核、及び繊維輪内の損傷組織を復元することによって治療することができる。従って、本発明の再生細胞を用いて、軟骨発生を刺激することができ、それによって様々な変性段階の椎間円板を復元することができる。例えば、本発明の再生細胞は、椎間板の殆どが依然として全体的に無傷であるが破壊が始まっている軽度変性の場合には、生理的溶液に入れて注射により椎間板髄核に直接送出することができる。椎間板が肉眼的に変性している中程度の椎間板変性の場合には、再生細胞は、髄核に注射されると原位置でゲル化するヒドロゲル液体と混合することができる。ゲル化は、熱的又は熱化学的に影響を及ぼすことができる。
【０１８４】
しかし、損傷及び／又は機能不良背部構成要素の少なくとも一部を除去することが必要なことが多い。例えば、椎間板が破裂した場合には、椎間板切除手術法を行い、破裂椎間板を除去して除去した椎間板の間の２つの椎骨を融合することができる。椎骨を融合する方法を典型的に実施することに関する詳細は、米国特許第６，０３３，４３８号及び第５，０１５，２４７号に開示されており、その内容は、本明細書においてその全内容が引用により組み込まれている。
【０１８５】
脊椎融合は、構造的変形、外傷性不安定性、変性不安定性、及び後切除医原性不安定性のような疾患に対して脊柱を安定させるように示されている。従って、融合又は間接融合は、例えば、隣接する運動セグメント間に骨ブリッジを形成することによって達成することができる。融合は、隣接する椎骨本体の間の前側、又は連続する横突起、ラミナ、又は他の椎骨の後部の態様の間の後側のいずれかに達成することができる。脊椎融合のための外科的技術は、当業技術で公知である。本発明では、自己骨移植片を収集するための第２の手術が必要でなくなるために、当業技術で認識されている技術に優る固有の利点を提供する。更に、一般的に、脊椎融合を促進するために骨移植片材料及び／又は成長因子が必要なことが多い。本発明は、移植片拒絶を恐れることなく骨成長を促進する自己の再生細胞を費用効率的に提供するものである。
【０１８６】
脊椎融合のための外科的方法及び骨関連疾患を治療するための他の外科的技術は、当業者には公知である。全てのこのような当業技術で認識された技術は、本発明に含まれるものとする。
本発明は、更に限定的なものとして決して解釈すべきでない以下の実施例によって更に示される。本出願を通して引用した引用文献、交付済み特許、公開特許出願、及び現在出願中の特許出願を含む全ての引用文献の内容は、本明細書において引用により明示的に組み込まれている。
【実施例】
【０１８７】
以下に説明する実施例を通して用いられるＡＤＣ又は再生細胞は、本開示に説明する方法及び／又は２００１年１２月７日出願の米国特許仮出願出願番号第６０／３３８，８５６号に対する優先権を主張する、２００２年１２月９日出願の「処理した脂肪吸上げ細胞で患者を治療するためのシステム及び方法」という名称の米国特許出願出願番号第１０／３１６，１２７号に説明する方法、並びに２００２年１２月９日出願の「処理した脂肪吸上げ細胞で患者を治療するためのシステム及び方法」という名称の米国特許出願出願番号第１０／３１６，１２７号に対する優先権を主張する、２００４年６月２５日出願の「組織から再生細胞を分離して濃縮するためのシステム及び方法」という名称の米国特許出願第＿＿＿号に説明する方法により得ることができ、これらの全ては、本出願人に譲渡されており、その全ての内容は、本明細書において引用により明示的に組み込まれている。
【０１８８】
実施例１：ヒト脂肪組織は、骨芽前駆細胞の供給源である。
方法及び材料：
脂肪吸引：ヒト脂肪組織は、選択的脂肪形成（脂肪吸引）を受けている個体から得た。一般的に、脂肪吸引手順は、腹部及び／又は大腿部の皮膚に０．５ｃｍ切開を作成し、続いて、腫脹性溶液（リドカイン及びエピネフリンを補足した生理食塩水）で皮下空間を湿潤させる段階を含むものであった。ほぼ１０分後、カニューレ（医師の好みにより３〜５ｍｍ直径）を通して機械補助吸引で皮下脂肪組織を吸引した。脂肪組織、血液、及び腫脹性溶液（脂肪吸い上げ）は、使い捨ての容器に収集し、実験室に運ぶ間４℃で保存した。
【０１８９】
組織消化：脂肪組織は、温（３７℃）生理食塩水で数回洗浄し、過剰な血液及び遊離脂質を除去した。次に、組織をほぼ２容積の生理食塩水に入れた「Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ」コラゲナーゼ（「Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ１」で４５分間又は「Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ  ３」で２０分間：「Ｒｏｃｈｅ」、インディアナ州インディアナポリス）を用いて３７℃で消化した。消化の間中、組織及び媒体を確実に適切に混合するために一定の撹拌を加えた。細胞消化後、非浮遊細胞を除去し、３回洗浄して残留酵素を除去した。生体染色色素（ヨウ化プロピジウム）を用い、血球計数器上で蛍光顕微鏡を用いて細胞を数えた。
【０１９０】
「ＣＦＵ−ＡＰ」アッセイ：６つのマルチウェルプレート（「Ｃｏｒｎｉｎｇ」、ニューヨーク）に２つ組の１，０００、５，０００、２５，０００細胞／ウェルで洗浄細胞を蒔いた。α−ＭＥＭ（「Ｃｅｌｌｇｒｏ」、バージニア州ハーンドン）、１０％ＦＢＳ／５％ウマ血清／１％抗生物質−抗真菌剤溶液（「Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ」、カリフォルニア州ターザナ）に０．１μＭデキサメタゾン（「Ｓｉｇｍａ」、ミズーリ州セントルイス）、１０ｍＭβ−グリセロリン酸（「Ｓｉｇｍａ」、ミズーリ州セントルイス）及び５０μＭのＬ−アスコルビン酸２−リン酸塩（「Ｓｉｇｍａ」、ミズーリ州セントルイス）を補足したものから成る媒体中で細胞を３週間培養することによって骨形成分化を誘発した。１週間誘発した後、培養媒体は、デキサメタゾンを含まない骨形成媒体で毎週変えた。アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）活性を検出するために、培養プレートは、ＰＢＳですすぎ、１％「Ｎａｐｔｈｏｌ  ＡＳ−ＢＩ」ホスフェート（「Ｓｉｇｍａ」、ミズーリ州セントルイス）及び１ｍｇ／ｍｌ「Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  ＴＲ」（「Ｓｉｇｍａ」、ミズーリ州セントルイス）を用いて３７℃で２０分間染色した。染色後、細胞は、ＰＢＳで洗浄し、１０％リン酸緩衝ホルマリン（「Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ」、ペンシルベニア州ピッツバーグ）で１５分間融合した。陽性ＡＰ染色の５０を超える細胞から成るコロニーを「ＣＦＵ−ＡＰ」と定めた。各ウェルの「ＣＦＵ−ＡＰ」の数を数え、２つ組のサンプルから「ＣＦＵ−ＡＰ」の平均数を計算した。
【０１９１】
アルカリフォスファターゼアッセイ：比色アッセイ（「Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」、ミズーリ州セントルイス）を用いて脂肪組織由来細胞の２１日目培養物中の総アルカリフォスファターゼ活性を測定した。簡単に説明すると、２１日目の培養物は、擦り落とすことによって収集し、細胞を生理食塩水に再懸濁し、超音波処理により溶解させた。次に、細胞溶解物をｐ−リン酸ニトロフェニルと共にｐＨ１０．２、３０℃で１５分間培養した。「Ｔｕｒｎｅｒ  ＳＰ−８３０」分光光度計（「Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ」、カリフォルニア州サニーベール）を用いて４０５ｎｍの吸光度を求めた。
【０１９２】
結果：
ドナーの特徴：ドナー母集団の特徴を以下の表Ａに示している。この母集団は、審美的脂肪形成術を受ける母集団を表す。「米国美容形成外科学会」のデータは、３８４、６２６の脂肪吸引処置が２００３年に米国で行われ、男性及び女性の両方に最も良く行われる美容外科処置となったことを示している。女性は、全ての脂肪形成処置の８４％（現在の研究では８１％）を占める。２００３年に脂肪形成を受けた全ての患者のほぼ半数は、年齢３５歳と５０歳の間であり、この試験での年齢の中央値は４６歳であった。
【０１９３】
（表Ａ）
2007529515.tif 000005
【０１９４】
「ＣＦＵ−ＡＰ」アッセイの開発と妥当性確認：組織処理をすると、平均７．３±０．１×１０5の生存可能な非浮遊有核細胞／脂肪組織単位容積（ｍｌ）が得られた。これらの細胞は、次に、この細胞供給源に対するこのアッセイの妥当性を確認するために、「ＣＦＵ−ＡＰ」アッセイに複数の密度で蒔かれる。更に、本発明者は、「ＣＦＵ−ＡＰ」計数が１，０００〜５０，０００細胞／ウェルの範囲にわたって蒔いた細胞数に対して線形性を有することを明らかにしている。検出する頻度の範囲は、標準アッセイに対しては、培養物のコロニー数／ウェルが１０〜６０／ウェルの範囲に確実に含まれるようにするために、２つの異なる細胞濃度の３つ組みで定期的に細胞を蒔くような範囲である。
【０１９５】
骨芽前駆細胞頻度及び収量
本方法を用いて、本発明者は、５４人のドナー（表Ａ）から得られた脂肪組織を試験した。データは、新しい組織（収集して６時間以内に処理した組織）から処理したサンプルの「ＣＦＵ−ＡＰ」頻度が、組織収集の翌日に処理したサンプルの「ＣＦＵ−ＡＰ」頻度よりも有意に高かったことを示している（０．６±０．２「ＣＦＵ−ＡＰ」／１００細胞に対して２．０±０．３「ＣＦＵ−ＡＰ」／１００細胞；ｐ＝０．００１）。「ＣＦＵ−ＡＰ」頻度は、ドナーの年齢又は性別とは相関関係がなかった。
【０１９６】
骨芽前駆細胞の平均収量は、７，２２５±１，７６０「ＣＦＵ−ＡＰ」／ｍｌ脂肪組織（範囲１２０〜６７，５００）であった。「ＣＦＵ−ＡＰ」頻度と異なり、ドナーの年齢が上がるにつれて「ＣＦＵ−ＡＰ」収量／単位容積脂肪組織が減少する傾向があった。しかし、年齢の高い方から四分の１（＞４８歳）を若い方から四分の１（＜３４歳）と比較しても、その差は統計学的有意性には届かなかった（若年ドナーでは９，２００±１，８００であるのに対して、老年ドナーでは４，３００±１，５００細胞／ｍｌ組織；ｐ＝０．０９）。
【０１９７】
アルカリフォスファターゼ活性
この試験では、コロニーは、アルカリフォスファターゼ陽性で少なくとも５０の細胞を含むならばアッセイのためだけに計数した。コロニーの大きさは、相当ばらつきがあり、コロニーによっては数千の細胞から成る。総アルカリフォスファターゼ活性は、造骨細胞の総細胞数（始原細胞増殖の関数）及びこれらの細胞の分化の程度の両方を考慮するので、骨形成活性を測定する優れた方法であると考えられる。従って、アルカリフォスファターゼアッセイは、１５の連続するドナーの複製ウェルに行った。総アルカリフォスファターゼ活性は、蒔いた細胞数と線形関係を示している。次に、アルカリフォスファターゼ活性（蒔いた細胞数に対して正規化したもの）を年齢に対してプロットすると、データは、年齢とアルカリフォスファターゼ活性の間に反比例関係を示す（図２；ｒ2＝０．５７）。
【０１９８】
骨芽前駆細胞収量及び肥満度指数
３８ドナーに対してドナーの身長及び体重が入手可能であった。それによって肥満度指数（ＢＭＩ）を計算し、３つの群に階層化することができる。すなわち、正常ＢＭＩ（１８．５と２４．９の間）に２０ドナー、過体重カテゴリ（２５．０〜２５．９）に１２人、肥満ドナー（＞３０）６人であった。「ＣＦＵ−ＡＰ」／単位容積組織の収量は、過体重群よりも正常ＢＭＩ群で有意に高かった（正常ＢＭＩドナー５，２７９±７８０に対して過体重ドナー１，３７３±１，１５０；ｐ＜０．０２）。肥満ドナーでは、「ＣＦＵ−ＡＰ」収量／単位容積組織に相当のばらつきを示している（８６７〜１８，４６２「ＣＦＵ−ＡＰ」／ｍｌ；図３）。平均は、過体重ドナーよりも高いが、統計学的有意性には届かない（ｐ＝０．０８）。
【０１９９】
要約：
上述の結果から、ヒト脂肪組織は、骨芽前駆細胞の豊富な供給源であると考えられることが示される。より詳細には、この結果は、ヒト脂肪が平均約７，２００骨芽前駆細胞／グラム組織を含むことを示している。この母集団内の「ＣＦＵ−ＡＰ」の頻度は、収集から６時間以内に処理した組織が頻度２．０±０．３「ＣＦＵ−ＡＰ」／１００有核細胞になるように、組織を収集してから組織を処理するまでの時間に依存する。新しく収集されたヒト骨髄を用いる試験では、「ＣＦＵ−ＡＰ」収量が２００〜２，０００「ＣＦＵ−ＡＰ」／ｍｌ骨髄、頻度が５０，０００中でほぼ１であると推定された（Ｂａｎｆｉ、２００１年、Ｇａｌｏｔｔｏ、１９９９年、Ｄ’Ｉｐｐｏｌｉｔｏ、１９９９年）。従って、このデータは、ヒト脂肪組織が、同様の容積の骨髄よりも実質的に多い骨芽前駆細胞を含むことを示している。
【０２００】
上述の試験に用いた脂肪組織は、組織抽出に最適化されているが生存可能細胞の回収には最適化されていない脂肪吸引手順を用いて得たものである。しかし、脂肪吸引のための変更パラメータと共に本発明のシステム及び方法を用いると（すなわち、例えば、加える吸引力の量及び用いるカニューレの様式及び大きさを変更することによって生存可能細胞の回収を目的として）、再生細胞収量が更に大きくなることは疑う余地もない。骨芽前駆細胞収量が大きいことは、本発明の装置では特に重要である。例えば、骨芽前駆細胞の頻度が高ければ、高用量で投与することができ、場合によっては骨形成を促進する臨床的効果を大きくすることができる。
【０２０１】
実施例２：生体内での軟骨及び骨からの脂肪由来再生細胞
方法及び材料：
細胞骨格
ＰＬＡ骨格の製造及び調製：
ほぼ多孔性９０％の多孔性ポリマー骨格は、溶媒−成形／微粒子−溶脱方法（例えば、Ａ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ、Ａ．Ｊ．Ｔｈｏｒｓｅｎ、Ｌ．Ａ．Ｃｚｅｒｗｏｎｋａ、Ｂａｏ  Ｙ．、及びＲ．Ｌａｎｇｅｒ著「ポリ（Ｌ−乳酸）発泡体の調製及び特徴付け」、Ｐｏｌｙｍｅｒ、第３５巻（第５号）：１０６８〜１０７７頁、１９９４年を参照）により製造した。簡単に説明すると、塩化ナトリウムを溶脱可能なポロゲンとして用い、直径が３００〜５００μｍの範囲の粒子に篩い分けた。７０：３０ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−ＤＬ−ラクチド）をクロロホルムと組み合わせることによって３％ポリマー溶液を作った。篩った塩及びポリマー溶液をテフロン（登録商標）のペトリ皿に入れて混合し、塩：ポリマーを９：１重量比にして、フードに２日間入れて溶媒を蒸発させた。塩は、８〜１２時間毎に水を交換して水に３日間浸漬することによって骨格から溶脱させ、残留溶媒は、多孔性ポリマースポンジを低真空下に２日間置くことによって除去した。骨格は、ポリマーシートから直径８ｍｍの移植片を打ち抜くことによって移植用の大きさにした。骨格は、７０％エタノール中に一晩入れ、紫外線に露出し、０．９％注射用生理食塩水で３回すすぐことによって無菌にし、その後、残留生理食塩水は、細胞播種の前に骨格から除去した。
【０２０２】
脱ミネラル骨基質（ＤＢＭ）骨格の調製及び細胞播種：
「Ｇｒａｆｔｏｎ（登録商標）脱ミネラル骨基質パテ」（「Ｏｓｔｅｏｔｅｃｈ」、ニュージャージー州）移植片は、残留生理食塩水を骨格から除去する前に、均等に分断された部分（ほぼ７０ｍｇ／移植片）を０．９％注射用生理食塩水で３回すすぐことによって細胞播種用に調製した。
【０２０３】
脂肪由来再生細胞単離、培養、及び細胞播種：
ＡＤＣは、緑色蛍光タンパク質［Ｃ５７Ｂｌ／６−ＴｇＮ（ＡＣＴｂＥＧＦＰ）１Ｏｓｂ］を発現する遺伝子導入マウスから白い皮下脂肪組織を切除することによって得た。組織に酵素消化を行った。簡単に説明すると、細胞は、１×ＰＢＳで洗浄して０．０７５％コラゲナーゼＩ（「Ｓｉｇｍａ」）に入れて３７℃で４５分間振とうして消化し、その後、「Ｄｕｌｂｅｃｃｏの変法必須培地」（「Ｇｉｂｃｏ」）に入れた１０％ＦＢＳ（「Ｆｉｓｈｅｒ」）で中和し、細胞を濾して除去するフィルタの勾配（１００μｍ、７０μｍ、及び４０μｍ）を通過させ、４００ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットは、骨形成培養培地［０．１μＭのデキサメタゾン（「Ｓｉｇｍａ」、ミズーリ州セントルイス）、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸（「Ｓｉｇｍａ」、ミズーリ州セントルイス）、及び５０μＭのＬ−アスコルビン酸２−リン酸塩（「Ｓｉｇｍａ」、ミズーリ州セントルイス）を補足した「α−ＭＥＭ」（「Ｃｅｌｌｇｒｏ」、バージニア州ヘムドン）、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質−抗真菌剤溶液（「Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ」、カリフォルニア州ターザナ）］中に再懸濁させた。誘導を始めて３日経つと、培養培地は、デキサメタゾンを含まない骨形成培地で毎週交換した。３週間の培養期間に２回継代した。培養ＡＤＣは、次に、組換型ヒト「ＢＭＰ−２」（５μｇ／ｍｌ）を存在させるか又は存在させずに骨形成培地で一晩培養した。次に、細胞は、０．９％注射用生理食塩水（５×１０7細胞／ｍｌ）中に再懸濁させ、「ＰＬＡ」又は「Ｇｒａｆｔｏｎ  ＤＢＭ」骨格上に２．５×１０6細胞／骨格で播種するまで４℃に保持した。
【０２０４】
外科的手順：
無胸腺ラット（ほぼ２００ｇ）をケタミン／キシラジン［それぞれ、１００／１０ｍｇ／ｋｇ（「ＴＷ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｅｒｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｕｐｐｌｙ」）］で麻酔した。ラット腹部は剪毛し、ベタジン及び７０％イソプロパノールを付加した。無菌状態で、臀部域に近い脚の皮膚を通してほぼ１．５ｃｍ長さの全層切開が行われた。張筋を鈍的剥離により露出し、張筋に沿って１．０ｃｍ切開を行い、大腿筋膜を剥離して直筋を露出した。次に、ミクロスパチュラを用いてチャンネルを作り、それに単一の移植片を入れた。次に、５−０絹縫合糸の単一路を用いてチャンネルを閉鎖し、続いて、５−０被覆「Ｖｉｃｒｙｌ（登録商標）」編組縫合糸で張筋切開を縫合し、９ｍｍ創傷クリップで皮膚切開を密封した。手術後、動物を加熱パッド上で麻酔から回復させる。目覚めると、後手術疼痛を緩和するためにブプレノルフィン（０．０２〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、皮下）を投与した。
【０２０５】
分析：
手術後２週間に、ラットは、ＣＯ2に露出させて安楽死させ、移植片を回収した。組織は、０．４％パラホルムアルデヒドに一晩入れて固定し、パラフィンに埋め込み、５ミクロン切片に切断し、その後、「トルイジン・ブルー」又は「フォン・コッサ」で染色して軟骨及びミネラル化組織をそれぞれ可視化した。非染色切片では、緑色蛍光ドナー細胞の存在を評価した。
【０２０６】
結果：
「ＢＭＰ−２」で実験室内で初回刺激を受けたＡＤＣを播種した骨伝導性（ＤＢＭ）又は非骨伝導性（ＰＬＡ）骨格を埋め込んだ組織は、軟骨、類骨、及びミネラル化骨の混合物を含む。軟骨は、トルイジンブルー染色切片では異染性に染色された細胞及び組織が存在することによって識別された。軟骨細胞は、小腔内に存在した。これらは、プロテオグリカンが豊富な基質に囲まれていた。類骨は、骨細胞が組み込まれた滑らかな基質として明らかであった。ミネラル化骨は、「フォン・コッサ」染色された区域として明らかであった。初期造血要素は、骨内に細胞を含む骨髄腔が存在することによって識別した。軟骨はまた、初回刺激を受けた「ＡＤＣ」及び「ＤＢＭ」から成る移植片を有するので組織中で明らかであった。これと対照的に、軟骨又は骨は、「ＡＤＣ」を含まずに移植したいずれの骨格型にも存在しなかった。
【０２０７】
要約：
まとめると、上述の結果は、脂肪由来再生細胞が、骨伝導（ＤＢＭ）又は非骨伝導性（ＰＬＡ）骨格上の骨格筋に送出されると、軟骨及び骨を形成する機能を有することを示している。従って、脂肪由来再生細胞は、軟骨形成を刺激して椎間円板を復元する。更に、上述の試験は、両方とも環境が骨格筋に取り囲まれた椎間本体及び横突起間の脊椎融合の両方の骨形成を刺激するのに脂肪由来再生細胞を利用することを支持している。恐らく、骨格筋は、公知の骨芽始原細胞である随伴細胞を含み、脂肪由来再生細胞と協働して頑丈な骨形成を刺激している。少なくとも、骨格筋は、脂肪由来再生細胞が骨形成を刺激することができる支持環境を与えるものである。
【０２０８】
実施例３：再生細胞が、インビトロで軟骨、骨、及び骨格筋を形成する。
材料及び方法：
再生細胞の調製
ヒト再生細胞は、本明細書に説明されているように酵素的消化により収集した。単離した再生細胞は、次に、免疫磁気ビーズを用いてＣＤ３４（＋）及びＣＤ３４（−）母集団に分離した。細胞の各部分母集団は、複数ウェル培養プレートで複数の密度の完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、５％ウマ血清、及び１％抗生物質、抗真菌剤溶液）で培養した。３週間目に、これらの培養物からＣＤ３４（−）クローンを選択し、次の培養培地、すなわち、完全培地、骨形成培地、又は軟骨形成培地のうちの１つでほぼ２ヶ月植え継ぎ培養した。
【０２０９】
分析：
クローン細胞の軟骨又は骨に向う分化は、アルシアンブルー又はアルカリフォスファターゼでそれぞれ染色することによって求めた。クローン細胞の筋肉に向う分化は、ヒトミオシン重鎖に対する抗体、並びに骨格筋特異的マーカ「ｍｙｆ５」及び「ｍｙｏＤ１」を用いてＣＤ３４（＋）及びＣＤ３４（−）細胞を免疫組織化学染色することによって評価した。ミオシン重鎖の遺伝子発現、「ｍｙｆ５」、及び「ｍｙｏＤ１」を評価するために「ＲＴ−ＰＣＲ」が行われた。
【０２１０】
結果：
ＣＤ３４（−）クローンコロニーからの再生細胞は、用いた培養培地により、軟骨細胞、造骨細胞、及び筋肉細胞に分化した。骨形成培地中で培養された再生細胞は、造骨細胞に分化し、軟骨形成培地中で培養された再生細胞は、軟骨細胞に分化し、これは、アルシアンブルー及びアルカリフォスファターゼをそれぞれ用いて組織化学的染色することによって明らかである。更に、何ら分化培地を含まない完全培地で培養したＣＤ３４（−）クローンコロニーからの再生細胞は、ミオシン重鎖、「Ｍｙｆ５」、及び「ＭｙｏＤ」に対して免疫組織化学的に陽性であり、筋芽細胞表現型に分化することを明らかにするものである。免疫組織化学的データに一致して、これらの筋肉クローンは、ミオシン重鎖、「Ｍｙｆ５」、及び「ＭｙｏＤ」に対する遺伝子を発現した。
【０２１１】
要約：
まとめると、これらのデータは、ヒト培養再生細胞コロニーにより、軟骨細胞、造骨細胞、及び骨格筋芽細胞が生じることを示している。従って、本発明の再生細胞は、失われた組織、例えば、軟骨、腱、又は靭帯の軟組織断裂を復元し、並びに癒着不能長骨骨折のような硬組織破断を修復する際に、軟骨、骨、及び骨格筋形成を刺激する機能を有する。更に、本発明の再生細胞は、例えば、横突起又は椎骨間に骨形成することによる脊椎融合用途では、機械的支持を付与するために新規に組織を生成する機能も有する。
【０２１２】
本明細書に説明したあらゆる特徴又は特徴の組合せは、文脈、本明細書、及び当業者の知識から明らかである時に、このような組合せに含まれる特徴が互いに矛盾しなければ本発明の範囲に含まれるものである。本発明の概要を説明するために、本明細書では、本発明のある一定の態様、利点、及び新しい特徴を説明した。勿論、本発明のあらゆる特定的な実施形態でこのような態様、利点、又は特徴の全てが具体化されることは必ずしも必要でないことは理解されるものとする。本発明の付加的な利点及び態様は、以下の詳細説明及び特許請求の範囲に明らかである。
【０２１３】
上述の実施形態は、一例として挙げたものであり、本発明は、これらの例に限定されない。上述の説明を考慮すれば、当業者には、互いに矛盾しない範囲で開示した実施形態の多くの変形及び修正が想起されるであろう。更に、本明細書の開示を考慮すると、他の組合せ、省略、置換、及び変更も当業者には明らかであろう。従って、本発明は、開示した実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に関連して規定されるものである。
以上において多くの文献及び特許を引用した。引用した文献及び特許の各々は、本明細書においてその全内容が引用により組み込まれている。
【０２１４】
均等物
当業者は、本明細書に説明した本発明の特定的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか又は日常的実験の範囲で確認することができるであろう。このような均等物は、特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１】１つのフィルタアセンブリを含む組織から再生細胞を分離して濃縮するためのシステムの図である。
【図２】直列構成で複数のフィルタアセンブリを有する図１と同様のシステムの図である。
【図３】並列構成で複数のフィルタアセンブリを有する図１と同様のシステムの図である。
【図４】遠心分離チャンバを含む組織から再生細胞を分離して濃縮するためのシステムの図である。
【図５】組織から再生細胞を分離して濃縮するためのシステムに用いられる前置フィルタを含む収集チャンバの断面図である。
【図６】浸出濾過システムを用いる組織から再生細胞を分離して濃縮するためのシステムの処理チャンバの断面図である。
【図７】再生細胞を濃縮するために遠心分離装置を用いる再生細胞を分離して濃縮するためのシステムの処理チャンバの断面図である。
【図８】図７の処理チャンバの別の断面図である。
【図９】９．１、９．２、９．３は、本発明のシステムと共に用いる水簸構成要素を示す図である。
【図１０】真空システムをそのシステムの吐出口に真空ポンプ又は真空供給源を付加ずることによって構成し、流れの方向及びタイミングを制御するためにストップコック、通気口、及びクランプのシステムを用いて所定の速度で組織及び流体を引き抜くように制御することができる、真空圧力を用いてシステムを通して流体を移動する組織から再生細胞を分離して濃縮するためのシステムを示す図である。
【図１１】正圧システムが流れの方向及びタイミングを制御するためにバルブ、ストップコック、通気口、及びクランプを用いて決められた速度でシステムを通して流体及び組織を押し進めるか又は推進するために蠕動ポンプのような機械的手段を用いる、正圧を用いてシステムを通して流体を移動する組織から再生細胞を分離して濃縮するためのシステムを示す図である。
【図１２】（Ａ）流体の供給流がフィルタの孔に対して接線方向に流れる濾過処理を示す図である。（Ｂ）流体の供給流がフィルタの孔に対して垂直に流れる濾過処理を示す図である。
【図１３】本発明のシステムのための例示的な使い捨てセットの図である。
【図１４】本発明のシステムのための例示的な再使用可能構成要素の図である。
【図１５Ａ】図１３の使い捨てセット及び図１４の再使用可能構成要素を用いて組み立てた本発明の例示的な装置を示す図である。
【図１５Ｂ】システムの汎用性を示す２つの代替的な処理パラメータが示されている、本発明のシステムの自動化実施形態を制御するソフトウエアプログラムにより実行される例示的な予めプログラムした段階を示す流れ図である。
【図１６】本発明の装置の例示的な細胞担体部分を示す３次元図である。
【図１７】本発明の再生細胞を播種した図１６の細胞担体を示す図である。
【図１８】本発明の装置の例示的な封じ込め部分を示す３次元図である。
【図１９】本発明の例示的な装置を示す３次元図である。
【図２０】本発明の装置及び脂肪由来細胞の例示的な組合せを示す３次元図である。
【図２１】本発明の装置の別の例示的な封じ込め部分を示す３次元図である。
【図２２】本発明の装置の別の例示的な封じ込め部分を示す３次元図である。
【図２３】本発明の装置の別の例示的な封じ込め部分を示す３次元図である。
【符号の説明】
【０２１６】
１０  本発明のシステム
１２  導管
２６  真空ポンプ
３０  処理チャンバ
３２  通気口
３４  ポンプ
３６  フィルタアセンブリ
３９  圧力センサ
４０  廃棄物チャンバ
５０  産出チャンバ
【図１】
2007529515.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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2007529515.tif 000019
【図１５Ａ】
2007529515.tif 000020
【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2007529515.tif 000026
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月2日(2007.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者に再導入するための再生細胞からなる細胞母集団を処理する方法であって、前記患者は、脊椎融合欠損、脊椎安定化欠損、分節欠損、身体の非骨伝導性領域にある骨関連疾患、椎骨の疾患、椎間板の疾患からなる群から選択された骨関連疾患を有し、
（１）対象から除去した再生細胞を含む組織を、閉じた経路を維持するように構成された自動化細胞処理ユニットに導入する段階を含み、該自動化細胞処理ユニットは、
ａ．前記組織を受け取り、再生細胞が該組織から分離されるように該組織の脱凝集を容易にするチャンバアセンブリ、
ｂ．前記チャンバアセンブリに存在する前記脱凝集された組織からの再生細胞を濃縮する、該チャンバアセンブリに接続することができる濃縮装置、及び
ｃ．前記チャンバアセンブリ及び前記濃縮装置と通信してそれを制御することができるプログラム可能処理装置、を含み、
（２）前記組織を処理して、再生細胞の濃縮した母集団を得る段階と、
（３）前記濃縮した再生細胞を、細胞担体部分と細胞担体封じ込め部分とを含む装置に入れる段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記再生細胞は、幹細胞、始原細胞、又はこれらの組合せから成ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記再生細胞は、自己細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記再生細胞は、前記装置に入れる前に培養されることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
人工器官装置は、椎体間脊椎融合装置であることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞担体封じ込め部分は、再吸収可能であることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞担体封じ込め部分は、再吸収不能であることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞担体部分は、アパタイトで被覆されていることを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞担体部分は、擬似体液溶液を用いて被覆されることを特徴とする請求項１乃至８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記濃縮した再生細胞は、患者内に注入するのに適していることを特徴とする請求項１乃至９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養段階は、再生細胞を骨形成表現型に向う分化を促進する培養条件にさらすことを特徴とする請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織は、脂肪組織であることを特徴とする請求項１乃至１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
１つ又はそれよりも多くの添加物が、前記再生細胞を前記装置に加える前に該細胞に添加されることを特徴とする請求項１乃至１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記添加物は、成長因子、再懸濁流体、細胞培養試薬、細胞増殖試薬、細胞保存試薬、又は細胞改質試薬、又はその組合せから選択されることを特徴とする請求項１乃至１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記脱凝集剤は、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、Ｌｉｂｅｒａｓｅ  Ｈ１、ペプシン、又はそれらの任意の組合わせから成る群から選択されることを特徴とする請求項１乃至１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
１つ又はそれよりも多くの添加物が、前記再生細胞を前記装置に加えた後に該細胞に添加されることを特徴とする請求項１乃至１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記添加物は、成長因子、再懸濁流体、細胞培養試薬、細胞増殖試薬、細胞保存試薬、又は細胞改質試薬、又はその組合せから選択されることを特徴とする請求項１乃至１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
組織除去システムと、細胞担体部分及び細胞担体封じ込め部分とを含む装置であって、
前記細胞担体封じ込め部分は、骨又は軟骨形成を促進する薬剤として使用するため、該細胞担体部分を少なくとも部分的に収容するように構成されたことを特徴とする組織除去システムと装置。
【請求項１９】
前記脂肪組織の少なくとも一部を処理して、ある一定の濃度の再生細胞を得ることを特徴とする請求項１８に記載の組織除去システムと装置。
【請求項２０】
骨及び軟骨形成が、前記患者において促進されることを特徴とする請求項１８に記載の組織除去システムと装置。
【国際調査報告】
2007529515.tif 000030