(57)【要約】本発明は、再生医学において用いるために胚幹細胞から心筋細胞系列細胞を発生させるための新しい方法を提供する。胚様体形成を経由した分化、または血清中での分化はもはや必要ではない。そのかわりに、幹細胞を固体基質上にプレーティングして、選択因子およびモルフォゲンの存在下で分化させる。適当な表現型を有する細胞の比率を高めた後、細胞は、極めて均一で心疾患の処置に適しているカーディアックボディズ（商標）へとクラスター形成される。2007529227.tif 000007
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を下記の順序で含む、霊長類の多能性幹（pPS）細胞から心筋細胞系列細胞を得る方法：
a）それに対して心筋細胞系列細胞が接着する基質を有する固体表面に、胚様体を形成せずにヒト胚盤胞由来のpPS細胞株からの非分化細胞を直接プレーティングする段階；
b）プレーティングしたpPS細胞を基質上で確立させる段階；
c）血清またはフィーダー細胞の非存在下であるがアクチビンおよび骨形態形成タンパク質の存在下で、確立された細胞を培養する段階；
d）任意で、アクチビンまたは骨形態形成タンパク質のいずれかの非存在下でd）からの細胞を培養する段階；
e）培養物から細胞を回収する段階；および
f）回収した細胞集団をα-心臓ミオシン重鎖（MHC）発現細胞に関して細胞比率を高める段階。
【請求項２】
段階a）におけるpPS細胞が、確立されたヒト胚幹細胞株である、前記請求項記載の方法。
【請求項３】
細胞が、段階b）においてゼラチンまたはフィブロネクチンによってコーティングされた基質上にプレーティングされる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
細胞が、段階c）において、基質上で非分化pPS細胞として4日間またはそれ以上培養することによって確立される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
細胞が、段階d）において、アクチビンAおよびBMP-4と共に4日間またはそれ以上培養される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
細胞が、段階e）において、アクチビンまたは骨形態形成タンパク質のいずれかの非存在下で1週間またはそれ以上培養される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
細胞が、段階d）および段階e）において、BMP-2の非存在下であるが、インスリン、トランスフェリン、およびセレンを含む培地補助物質の存在下で培養される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
段階g）における細胞比率を高める段階が以下の段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法：
回収された細胞をその密度に従って分画する段階；および、
次に内因性の遺伝子からMHCを発現する画分を採取する段階。
【請求項９】
以下の段階をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法：
a）細胞比率が高められた細胞集団において単細胞として存在する細胞を、クラスターとして存在する細胞から分離する段階；
b）クラスターとして存在する細胞を栄養培地において再懸濁する段階；
c）再懸濁した細胞を栄養培地において再培養する段階；および
d）再培養した細胞を採取および洗浄して、それによってクラスターの少なくとも50％が自発的収縮を行う細胞クラスターを作製する段階。
【請求項１０】
ヒト胚盤胞由来のpPS細胞株からの細胞を少なくとも20％のMHC陽性細胞を含む細胞集団に分化させる段階、および分化した細胞を以下の手順に供する段階を含む、pPS細胞から心筋細胞系列細胞を得る方法：
a）単細胞として存在する細胞をクラスターとして存在する細胞から分離する段階；
b）クラスターとして存在する細胞を栄養培地において再懸濁する段階；
c）再懸濁した細胞を栄養培地において再培養する段階；および
d）再培養した細胞を回収および洗浄して、それによってクラスターの少なくとも50％が自発的収縮を行う細胞クラスターを作製する段階。
【請求項１１】
クラスター形成細胞を懸濁液から沈降させ、懸濁液に残っている細胞を除去することによって、単細胞がクラスター形成細胞から分離される、請求項9または10記載の方法。
【請求項１２】
再懸濁した細胞を培養する栄養培地が約20％の血清または血清代用剤を含む、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
細胞を分離、再懸濁、および再培養する段階を3回またはそれ以上含む、請求項9〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
クラスターの少なくとも80％が再培養後自発的収縮を行う、請求項9〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
細胞クラスターがゼラチンまたはMatrigel（登録商標）によってコーティングされた表面にプレーティングされる、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
カーディアックボディズ（cardiac bodies）を、単細胞および／またはより小さい細胞クラスターの懸濁液に分散させる段階をさらに含む、請求項9〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
以下を含む、ヒト胚盤胞細胞由来の心筋細胞系列細胞の産生の際に培養される複数の細胞集団：
a）pPS細胞株からの非分化細胞；および
b）前記請求項のいずれか一項記載の方法に従ってpPS細胞株から分化した心筋細胞系列細胞の集団。
【請求項１８】
カーディアックボディ（cardiac body）が自発的収縮を行う細胞のクラスターとして定義され、心トロポニンI（cTnI）、心トロポニンT（cTnT）、または心房性ナトリウム利尿因子（ANF）、または内因性遺伝子由来のα-心臓ミオシン重鎖（MHC）を発現する多数の細胞を含む、請求項9〜16のいずれか一項に従って得られたカーディアックボディズの組成物。
【請求項１９】
哺乳類対象に対する組成物の投与によって、対象においてカーディアックボディズ由来の細胞の生存および移植が可能となるように、賦形剤で製剤化された請求項17または18記載の心筋細胞系列細胞またはカーディアックボディズ。
【請求項２０】
心疾患の処置における組成物の使用に関する情報と共に包装される、請求項17〜19のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２１】
心疾患を処置するための薬剤の調製における、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法に従って得られた組成物の使用。
【請求項２２】
心臓の筋系またはその周囲に細胞集団を投与するように適合した装置において、請求項1〜16のいずれか一項に従って得られた組成物を含む、心疾患を処置するための産物。
【請求項２３】
請求項1〜16のいずれか一項に従って得られた組成物に組織を接触させる段階を含む、心組織における収縮活性を再構成または補助する方法。
【請求項２４】
請求項1〜16のいずれか一項に従って得られた細胞を、化合物を含む培地と混合する段階、および細胞に及ぼす化合物の影響を決定する段階を含む、心細胞に及ぼす化合物の作用に関して化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２５】
化合物が細胞に対して有毒であるかどうかを決定する段階を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
化合物が細胞の拍動回数を増加または減少させるかどうかを決定する段階を含む、請求項24または25記載の方法。
【請求項２７】
実施例のいずれか一つを参照して実質的に記載される、請求項17〜20のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２８】
実施例のいずれか一つを参照して実質的に記載される、請求項1〜16または21〜26のいずれか一項記載の方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
優先出願
本出願は、2004年3月19日に提出された米国特許出願第10/805,099号（Geron整理番号第099/004号）；2004年3月26日に提出された米国特許出願第60/556,722号（第099/005x号）；および2005年2月3日に提出された米国特許出願第60/650,194号（第099/030x号）の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
背景
再生医学における研究の中心となる課題は、心機能を再構成するために役立ちうる細胞組成物を開発することである。男女5人にほぼ1人が何らかの型の心血管疾患を有すると推定される（米国国立健康栄養研究所調査III、1988〜94、米国疾病管理センターおよび米国心臓協会）。広範な病態には、心血管心疾患（集団の5％）、先天性心血管欠損（0.5％）、およびうっ血性心不全（3％）が含まれる。薬学の技術分野によって、心疾患の結果として起こる損傷を制限するために役立ちうる低分子薬および生物学的化合物が生成されたが、損傷した組織を再生するために役立つ市販の化合物はない。
【０００３】
心臓を再生することができる細胞集団を開発する目的で、いくつかの異なる方向に関して研究が行われている。心筋梗塞後の治療のために自己骨髄由来細胞を用いることを試験するために、いくつかの施設において臨床試験が進行中である（Perin et al., Circulation 107:2294, 2003；Strauer et al., Circulation 106:1913, 2002；Zeiher et al., Circulation 106:3009, 2002；Tse et al., Lancet 361:47, 2003；Stamm et al., Lancet 3661:45, 2003）。細胞は、心組織の血液環流を改善するために洗浄機能を有する可能性があるという仮説が立てられている。同様に心臓治療のために自己骨格筋筋芽細胞の使用を試験するために、臨床試験が行われている（Menasche et al., J. Am. Coll. Cardiol. 41:1078, 2003；Pagani et al., J. Am. Coll. Cardiol. 41:879, 2003；Hagege et al., Lancet 361:491, 2003）。しかし、横紋筋細胞の収縮が心リズムに適切に協調することができるか否かは明確ではない。
【０００４】
より直接的なアプローチは、機能的心筋細胞となるように既に確約されている細胞を用いることであろう。永続的な冠動脈閉鎖に起因する損傷を修復するために、動物モデルにおいて同系の新生児または生後の心細胞が用いられている（Reffelmann et al., J. Mol. Cell Cardiol. 35:607, 2003；Yao et al., J. Molec. Cell Cardiol. 35:607, 2003）。したがって、そのような細胞がヒトの治療に利用できれば、それらは虚血性心疾患の処置にとって非常に有効となりうるであろう。
【０００５】
国際特許出願国際公開公報第99/49015号（Zymogenetics）は、非接着性の多能性心臓由来ヒト幹細胞の単離を提唱している。心細胞を懸濁し、密度勾配遠心を行って培養して、心特異的マーカーに関して試験する。増殖および分化の際に、請求の細胞株は線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞、または軟骨細胞を生じる。しかし、これらの刊行物において例示される任意の細胞調製物を、心機能の再生のための治療組成物として大量生産のために十分量で産生できるか否かは不明である。
【０００６】
心疾患を処置するために可能性がある再生細胞源は、様々な種類の多能性幹細胞、特に胚幹細胞である。いくつかの研究所がマウスES細胞を用いた結果を報告している（Wobus et al., J. Mol. Cell Cardiol. 29:1525, 1997；Kolossov et al., J. Cell Biol. 143:2045, 1998；Narita et al., Development 122:3755, 1996；L. Field, 米国特許第6,015,671号；Klug et al., J. Clin. Invest. 98:216, 1996；Doevendans et al., J. Mol. Cell Cardiol. 32:839, 2000；Muller et al., FASEB J., 14:2540, 2000；Gryschenko et al., Pflugers Arch. 439:798, 2000）。
【０００７】
Thomsonら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995）は、アカゲザルおよびマーモセットをモデルとして用いて、霊長類からの胚幹細胞の培養に初めて成功した。彼らはその後、ヒト胚盤胞からヒト胚幹細胞株（hES）を誘導した（Science 282:114, 1998）。ヒト胚幹細胞はインビトロで分化せずに増殖することができ；それらは正常な核型を保持して、分化して多様な成人細胞タイプを産生する能力を保持している。
【０００８】
しかし、霊長類の多能性幹（pPS）細胞から心筋細胞系列細胞の比率が実質的に高められた集団を得るための模範例の開発途上には、多くの障害が立ちはだかっている。そのいくつかは、霊長類起源の多能性細胞の相対的脆弱性、それらの培養の難しさ、ならびに培養環境に存在する様々な要因に対するその微細な感受性および依存性の結果として起こる。他の障壁は、心臓前駆細胞が最終分化のために臓器胚体内胚葉および原条を必要とするという理解の結果として起こる（Arai et al., Dev. Dynamics 210:344, 1997）。pPS細胞をインビトロで心臓前駆細胞に分化させるために、発達中の胎児におけるそのような細胞の天然の個体発生において起こる全ての事象を模倣または置換することが必要である。
【０００９】
一般的な分化プロトコールによって、拍動する細胞の小さい小片をhES細胞から生成することができ、最近、これらの細胞を心筋細胞の膜内外電位差に対する低分子薬の効果を決定するために用いることが提唱されている（国際公開公報第04/011603号；Thomson, Kamp et al.）。少数の心細胞を含む分化細胞集団は、血清を添加した培地において単に培養する段階、その後拍動する細胞をソーティングする段階によって作製することができると提唱されている（国際公開公報第04/081205号；ES Cell International）。心筋細胞系列細胞の発生率が低い細胞集団をどのように用いて、大量生産された生存した状態で治療的用途のために実質的に純粋な調製物を作製することができるかは不明である。
【００１０】
Geron Corporationは、本質的にフィーダー細胞を含まない環境においてヒト多能性幹細胞の持続的な増殖を可能にする新規組織培養環境を開発した（米国特許第6,800,480号；オーストラリア国特許第AU 751321号、および国際特許公報国際公開公報第03/020920号を参照されたい）。フィーダー細胞を含まないpPS細胞培養を用いて、肝細胞（米国特許第6,458,589号）、神経細胞（米国特許第6,833,269号）、および心筋細胞（国際公開公報第01/88104号）のような異種混入物を含まない分化した細胞集団を作製することができる。
【００１１】
再生医学において用いるためのこれらの技術の商品化は、細胞の均一性および収量を改善するための増殖および分化プロトコールのさらなる改変によって利益を得るであろう。
【発明の開示】
【００１２】
概要
本発明は、インビトロで増殖することができ、そしてインビトロまたはインビボで治療的に有用な表現型へとさらに分化することができる最終段階の心筋細胞または心筋細胞前駆体のいずれかである心筋細胞系列細胞の比率が非常に高められた分化細胞集団へと、ヒト起源の多能性幹細胞を分化させるためのシステムを提供する。
【００１３】
霊長類の多能性幹（pPS）細胞から心筋細胞系列細胞の比率が高められた集団を得るための本発明の新規分化法は、いくつかの局面を有する。一つは、直接分化プロトコールによってプロセスを開始する点である。非分化pPS細胞を、それに対して心筋細胞系列細胞が接着する基質（ゼラチンまたはフィブロネクチンのような）を含む固体表面上に、胚様体を形成することなく、直接プレーティングする。プレーティングした細胞を、高い適合度で細胞を心筋細胞経路へと向かわせる特異的因子の組み合わせと共に一定時間培養する。例は、アクチビンおよび骨形態形成タンパク質、特にレチン酸または血清の非存在下で典型的に用いられるBMP-4である。次に、因子を除去して培養を継続することができる。基質および因子が存在することによって、血清含有成分またはフィーダー細胞（分化を制御するように作用する可能性がある異なる表現型およびゲノムを有する任意の細胞）の使用が不要となりうる。回収した細胞集団を心筋細胞系列細胞および心臓前駆細胞に関して実質的に比率を高めて、心表現型（例えば、α-心臓ミオシン重鎖）を有する細胞の比率を増加させるためにさらに処置することができる。例としての技術には、Percoll（商標）のような密度勾配上での分離または本開示において記載される細胞表面マーカーを用いる免疫学的分離が含まれる。
【００１４】
心細胞の比率は、カーディアックボディズ（cardiac bodies）（商標）の形成によってさらに増加する。これらは、その多くが自発的収縮を行う懸濁液中での心細胞クラスターである。例としての方法において、心筋細胞系列の特徴を発現する細胞の実質的な比率を含むpPS由来細胞集団を、最初に調製する。細胞を培養培地中で懸濁し、単細胞を除去して、クラスターとして存在する細胞を残す。クラスター形成細胞を再懸濁し、新鮮な培地において適した期間再培養する。細胞クラスターの80または100％までが自発的収縮を行う組成物が得られるまで、細胞に分離、再懸濁、および再培養の多数のサイクルを行うことができる。本発明は、pPS細胞および心筋細胞系列細胞の混合集団からカーディアックボディズ（商標）を製造する方法、ならびに任意で培養細胞組成物または哺乳類対象に投与するために適した組成物の形でカーディアックボディズ（商標）組成物そのものを具体化する。
【００１５】
本発明の一つの用途は、心筋細胞に及ぼす作用に関して化合物をスクリーニングすることである。これは、化合物を本発明の細胞集団と混合する段階、およびその後化合物に起因する如何なる調節作用も決定する段階を含む。これには、毒性、代謝の変化、または収縮活性に及ぼす作用に関して細胞を調べることが含まれてもよい。
【００１６】
本発明のもう一つの用途は、ヒトまたは動物の体の処置を意図した医薬品としてのまたは送達装置における心筋細胞系列細胞の製剤である。これによって、医師は、損傷した心組織にまたはその周辺に、血管からまたは筋壁に直接、細胞を投与することができ、それによって心細胞を移植し、損傷を制限し、心筋系の再増殖および心機能の回復に関与することができる。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の記述から明らかとなるであろう。
【００１８】
詳細な説明
本発明は、霊長類の多能性幹細胞から心筋細胞およびその前駆細胞を調製および特徴付けするための改善されたプロトコール、技術、および試薬を提供する。
【００１９】
このシリーズにおけるこれまでの特許出願および刊行物は、霊長類の多能性幹（pPS）細胞を心筋系列の細胞に分化させるための技法を提供する（国際公開公報第03/006950号；Xu et al., Circ. Res. 91:501, 2002）。ミオシン重鎖（MHC）および心トロポニンI（cTnI）のようなマーカーに関して陽性であって、組織培養において自発的で周期的な収縮を行う細胞を含むpPS由来細胞集団が得られた。
【００２０】
以下の説明において提供されるプロトコールは、心筋細胞産生プロセスを改善するいくつかの重要な進歩を取り入れる。とりわけ、心筋細胞が、直接固体表面またはマトリクス上で完全な非分化pPS細部から生成されることが発見されている。これによって、胚様体を作製して、得られた細胞の均一性を改善することによって分化プロセスを開始する必要性がなくなる。直接の分化は、細胞を心筋細胞系列に向ける特定の心指向性因子およびモルフォゲンと共に培養することを含み（実施例5）−この事象は、胚または胚様体における細胞間シグナル伝達によって通常制御される。同様に、因子を除去して一定時間培養を継続することによって、プロセスをさらに強化することができ、これは細胞集団を増殖させるのみならず、初期段階の心筋細胞系列細胞の収率を意外にも改善することが判明した。細胞集団の性質または使用に対する如何なる制限も暗示することなく、初期段階の細胞が存在することは、インビボでの細胞の確立能、適合能、または増殖能を増強するために役立ち、次にこれが心組織の有効な再生能を増強することが提唱されている。
【００２１】
もう一つの重要なプロセスの開発は、pPS細胞から生成された心筋細胞系列細胞が培養においてクラスターを形成することができるという知見に由来する。これらのクラスターは、本開示においてカーディアックボディズ（商標）と呼ばれる。カーディアックボディズを形成させること、それらを分散させること、および次にプロセスを多数のサイクル繰り返すことによって、所望の表現型を有する細胞の比率がかなり増強されることが発見された（実施例6および7）。このプロセスは、商業的大量生産にとって特に十分に適している。さらに、クラスターは保存の際により安定であり、再生医学において用いられるより有効な心筋細胞源を提供する可能性がある。
【００２２】
心筋細胞集団を作製するためのさらなる進歩も同様に以下に記述する。本開示に従って産生された顕著な均一性および機能的特性によって、インビトロで心組織を試験するために、および心疾患の処置において心組織の再生のための新規治療モダリティを開発するために、それらは貴重となる。
【００２３】
定義
本発明の技術および組成物は、pPS由来心筋細胞およびその前駆体に関する。心筋細胞の表現型特徴は、本開示の後の章に提供される。心筋細胞前駆体に関して決定的である特定の特徴はないが、通常の個体発生の過程において、非分化型pPSは最初に中胚葉細胞に分化した後、様々な前駆体段階を通して機能的な（最終段階）心筋細胞へと分化すると認識されている。
【００２４】
したがって、本開示の目的に関して、「心筋細胞前駆体」は、成熟（最終段階）心筋細胞を含む子孫を生じることができる（脱分化または再プログラミングを行わない）細胞であると定義される。心筋前駆細胞はしばしば、GATA-4、Nkx2.5、およびMEF-2転写因子ファミリーから選択される一つまたはそれ以上のマーカーを用いて同定することができる。
【００２５】
「心筋細胞系列細胞」という用語は、一般的に心筋前駆細胞および成熟心筋細胞の双方を指す。本開示における心筋細胞系列細胞、前駆体または心筋細胞という用語は、特に明記していなければ先に定義したように心筋細胞の個体発生の任意の段階での細胞に等しく当てはまると解釈される。下記のように、心筋細胞系列細胞は以下の一覧からの一つまたはそれ以上のマーカー（時に少なくとも3または5個のマーカー）を有してもよい：心トロポニンI（cTnI）、心トロポニンT（cTnT）、サルコメリック（sarcomeric）ミオシン重鎖（MHC）、GATA-4、Nkx2.5、N-カドヘリン、β1-アドレナリン受容体（β1-AR）、ANF、およびMEF-2転写因子ファミリー、クレアチニンキナーゼMB（CK-MB）、ミオグロビン、または心房性ナトリウム利尿因子（ANF）。
【００２６】
本発明の特定の細胞は、自発的で周期的な収縮活性を示す。このことは、適当なCa2+濃度および電解質バランスを有する適した組織培養環境において、細胞を培養すると、細胞は、細胞の一つの軸を超えて周期的に収縮した後、培養培地に如何なるさらなる成分も付加する必要なく、収縮から開放されることが認められうることを意味している。
【００２７】
カーディアックボディ（cardiac body）（商標）（単数形または複数形で用いられる）という名称は、心筋細胞クラスター、より詳しくは、ヒト心筋細胞系列細胞の二つまたはそれ以上の特徴を有する懸濁液でのpPS由来細胞のクラスターに関する名称または商標として、Geron Corporationによって作製されている。クラスターにおける細胞の実質的な割合が、cTnI、cTnT、ANF、または内因性遺伝子からのMHCを発現して、クラスターは通常、Ca++および適当な電解質の存在下で自発的収縮を行う。心筋細胞クラスターは、薬学的調製物または他の任意の有用な組成物における細胞培養物に存在してもよい。本開示によって、ユーザーは、50％を超える細胞が自発的収縮を行うカーディアックボディズ（商標）懸濁液を調製することができる。
【００２８】
原型の「霊長類多能性幹細胞」（pPS細胞）は、任意の種類の胚組織（胎児または胎児前組織）に由来する多能性細胞であり、適当な条件下で、8〜12週齢のSCIDマウスにおける奇形腫形成能、または組織培養における三つ全ての胚芽層の同定可能な細胞の形成能のような、標準的な当技術分野で承認された試験に従って、胚芽層（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の三つ全てに由来する異なる細胞タイプの子孫を生じることができる特徴を有する。
【００２９】
pPS細胞の定義には、Thomsonら（Science 282:1145, 1998）によって記述されるヒト胚幹（hES）細胞；アカゲザル幹細胞（Thomson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995）、マーモセット幹細胞（Thomson, et al., Biol. Reprod. 55:254, 1996）およびヒト胚性（hEG）細胞（Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998）のような他の霊長類由来の胚幹細胞によって例示される、様々なタイプの胚細胞が含まれる。これらの細胞タイプは、確立された細胞株の形で提供されてもよく、またはそれらを一次胚組織から直接得て、分化のために直ちに用いてもよい。他のタイプの多能性細胞も同様にこの用語に含まれる。三つ全ての胚芽層に由来する、子孫を産生することができる霊長類起源の如何なる細胞も、それらが胚組織、胎児組織、または他の起源に由来するか否かによらず、含まれる。pPS細胞は悪性起源には由来しない。細胞は核型が正常であることが望ましい（しかし必ずしも必要ではない）。
【００３０】
pPS細胞培養は、集団における幹細胞およびその誘導体の実質的な部分が非分化細胞の形態学的特徴を示す場合に、「非分化」であると記述される。集団における非分化細胞のコロニーはしばしば、部分的に分化した隣接細胞に取り囲まれるであろうと理解される。
【００３１】
「胚様体」という用語は、pPS細胞を懸濁液培養物または凝集体において非特異的に分化させた場合に出現する、分化または部分的に分化した細胞を含む不均一なクラスターを指す。
【００３２】
「直接分化」は、中間体として胚様体を形成することなく特定の組織タイプの細胞の比率が高められたpPS細胞の子孫への分化のプロセスを指す。特に明記していなければプレーティングは必ずしも必要ではないが、固体基質上に細胞をプレーティングした場合にこれを行ってもよい。直接分化は、懸濁液または容器の壁における培地成分、可溶性因子、不溶性成分の増殖環境、および細胞を所望の組織タイプに向ける目的を達成する他の成分において培養することによって行われる。
【００３３】
「フィーダー細胞」は、それらと同時培養する細胞の増殖を促進および／または分化を制御するように作用する可能性がある、異なる組織タイプで典型的に異なるゲノムの細胞である。非分化pPS細胞は、非分化状態を維持するために役立つフィーダーと共に同時培養することができ、分化途中の細胞は、特定の組織タイプ（例えば、心筋細胞）への分化を指示するフィーダーと同時培養することができる。本開示に記述の技術は、いずれかの種類のフィーダー細胞の非存在下で用いることができる。
【００３４】
「増殖環境」は、その中で対象細胞がインビトロで増殖、分化、または成熟するであろう環境である。環境の特徴には、細胞を培養する培地、存在してもよい任意の増殖因子または分化誘導因子、および存在すれば支持構造（固体表面上の基質のような）が含まれる。
【００３５】
全般的技術
本発明の実践において有用な全般的技術にさらに手を加えるために、実践者は細胞生物学、組織培養、発生学、および心臓生理学における標準的なテキストおよび論評を参照することができる。
【００３６】
細胞培養および胚幹細胞に関して、読者は、「Teratocarcinomas and embryonic stem cells : A practical approach」（E.J. Robertson ed., IRL Press Ltd. 1987）；「Guide to Techniques in Mouse Development」（P.M. Wasserman et al. eds., Academic Press, 1993）；「Embryonic Stem Cell Differentiation In Vitro」（M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993）；「Properties and uses of Embryonic Stem Cells : Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy」（P.D. Rathjen et al., Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998）を参照されたい。心細胞の培養に関して、標準的な参考文献には、「The Heart Cell in Culture」（A. Pinson ed., CRC Press, 1987）、「Isolated Adult Cardiomyocytes」（Vols I & II, Piper & Isenberg eds., CRC Press 1989）、「Heart Development」（Harvey & Rosenthal, Academic Press 1998）、「I Left my Heart in San Francisco」（T. Bennet, Sony Records 1990）；および「Gone with the Wnt」（M. Mitchell, Scribner 1996）が含まれる。分子細胞生化学における一般的な方法は、「Short Protocols in Molecular Biology」, 4th Ed,「Immunology Methods Manual」（I. Lefkovits ed., Academic Press 1997）；および「Cell and Tissue Culture : Laboratory Procedures in Biotechnology」（Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998）のような標準的なテキストに認められうる。
【００３７】
幹細胞源
本発明は、様々なタイプの多能性幹細胞、特に、先に記述したように胚組織に由来して、三つの胚芽層の全ての子孫を産生することができる特徴を有する幹細胞に関して実践することができる。
【００３８】
例は、既存の細胞株として用いられる、またはヒトを含む霊長類種の一次胚組織から確立された胚幹細胞および胚性細胞である。本発明はまた、非分化細胞株を最初に確立する必要なく、一次胚組織から得た多能性細胞を用いて実践することができる。
【００３９】
胚幹細胞
胚幹細胞は、霊長類種の胚盤胞から単離することができる（米国特許第5,843,780号；Thomson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995）。ヒト胚幹（hES）細胞は、Thomsonら（米国特許第6,200,806号；Science 282:1145, 1998；Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998）およびReubinoffら（Nature Biotech. 18:399, 2000）によって記述された技術を用いてヒト胚盤胞細胞から調製することができる。hES細胞と同等の細胞タイプには、国際公開公報第01/51610号（Bresagen）に概要されるように、原始外胚葉様（EPL）細胞のような、その多能性誘導体が含まれる。
【００４０】
hES細胞は、ヒトの着床前胚から得ることができる（Thomson, et al., Science 282:1145, 1998）。または、インビトロ受精（IVF）胚を用いることができる、または一細胞胚を胚盤胞段階まで生育させることができる（Bongso et al., Hum Reprod 4:706, 1989）。胚を胚盤胞段階まで増殖させて、透明帯を除去して、内部細胞塊を単離する（例えば、ウサギ抗ヒト脾細胞抗血清を用いる免疫外科によって）。無傷の内部細胞塊をmEFフィーダー細胞（米国特許第5,843,780号）、ヒトフィーダー細胞（US 2002/0072117A1）上に、または非分化のhES細胞増殖を支持する適した無フィーダー環境（US-2002-0081724-A1；国際公開公報第03/020920号）においてプレーティングする。非分化の形態を有する増殖しつつあるコロニーを凝集塊に解離させて、再びプレーティングする。
【００４１】
非分化状態のpPS細胞の増殖
pPS細胞を、分化を阻害しながら増殖を促進する培養条件を用いて培養において持続的に増殖させることができる。例としての血清含有ES培地は、80％DMEM（ノックアウトDMEM、Gibcoのような）、20％のディファインドウシ胎児血清（FBS, Hyclone）または血清代用剤（US 2002/0076747 A1, Life Technologies Inc.）のいずれか、1％非必須アミノ酸、1 mM L-グルタミンおよび0.1 mMβ-メルカプトエタノールで構成される。
【００４２】
従来、ES細胞は、典型的に胚または胎児組織に由来する線維芽細胞であるフィーダー細胞層上で培養される（Thomson, et al., Science 282:1145, 1998）。Geronの科学者らは、pPS細胞がフィーダー細胞がなくとも非分化状態で維持されうることを発見した。無フィーダー培養の環境には、適した培養基質、特にラミニンまたはMatrigel（登録商標）（エンゲルブレス-ホルム-スウォーム腫瘍細胞によって産生される基底膜でラミニンのような細胞外マトリクス成分を含む）のような細胞外マトリクスが含まれる。pPS細胞を＞15,000個cm-2（任意で90,000 cm-2〜170,000 cm-2）でプレーティングする。典型的に、細胞が完全に分散されるようになる前に酵素消化は停止する（すなわち、コラゲナーゼIVによって〜5分）。細胞〜10〜2,000個の塊を、さらに分散せずに基質上に直接プレーティングする。または、0.5 mM EDTAのPBS溶液において〜5分間インキュベートすることによって、プレートがコンフルエンスに達する前に酵素を用いずに細胞を回収することができる。培養容器を洗浄した後、細胞をさらに分散させずに新しい培養物にプレーティングする。さらなる例として、フィーダーの非存在下で培養したコンフルエントhES細胞を、0.05％（wt/vol）トリプシン（Gibco）および0.053 mM EDTAの溶液と共に37℃で5〜15分間インキュベートすることによって、プレートから採取する。プレートに残っている細胞を除去して細胞を単細胞および小さいクラスターを含む懸濁液に粉砕した後、生存を促進して分化を制限するために細胞を50,000〜200,000個cm-2の密度でプレーティングする。
【００４３】
無フィーダー培養は、分化させることなく細胞の増殖を促進する因子を含む栄養培地によって維持される（米国特許第6,800,480号）。そのような因子は、放射線照射（〜4,000 rad）一次マウス胚線維芽細胞、テロメライズド（telomerized）マウス線維芽細胞、またはpPS細胞に由来する線維芽細胞様細胞（米国特許第6,642,048号）のような、そのような因子を分泌する細胞と共に培地を培養することによって培地に導入してもよい。培地は、20％血清代用剤および4 ng/mL bFGFを添加した、KO DMEMのような無血清培地においてフィーダーをプレーティングすることによって条件を整えることができる。1〜2日間条件を整えた培地にさらにbFGFを添加して、これを用いてpPS細胞培養物を1〜2日間維持する（国際公開公報第01/51616号；Xu et al., Nat. Biotechnol. 19:971, 2001）。
【００４４】
または、非分化型で細胞増殖を促進することができる因子（線維芽細胞増殖因子またはフォースコリンのような）を添加した、新鮮なまたは非条件培地を用いることができる。例は、40〜80 ng/mL bFGFを添加して、任意で幹細胞因子（15 ng/mL）またはFlt3リガンド（75 ng/mL）を含む、X-VIVO（商標）10（Biowhittaker）またはQBSF（商標）-60（Quality Biological Inc.）のような基本培地である。これらの培地処方は、他の系における2〜3倍の速度で細胞増殖を支持するという長所を有する（国際公開公報第03/020920号）。
【００４５】
顕微鏡下で、ES細胞は、高い核／細胞質比、顕著な核小体、および細胞接合部を区別しにくい圧縮されたコロニー形成を有するように思われる。霊長類のES細胞は典型的に段階特異的胚抗原（SSEA）3および4を発現し、Tra-1-60およびTra-1-81と呼ばれる抗体を用いて検出可能なマーカーを発現する。非分化hES細胞はまた、RT-PCRによって検出されるように、典型的に転写因子Oct-3/4、Cripto、ガストリン放出ペプチド（GRP）受容体、ポドカリキシン様タンパク質（PODXL）、およびヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）（US2003/0224411 A1）を発現する。
【００４６】
心筋細胞を調製するための技法
心筋細胞系列細胞は、所望の表現型を有する細胞の比率を高める特殊な増殖環境において培養または分化させることによって、非分化型の幹細胞から得ることができる（所望の細胞の増殖によって、または他の細胞タイプの阻害もしくは死滅によって）。
【００４７】
分化は、胚様体または凝集体を形成することによって、例えば、ドナーpPS細胞培養物の過増殖によって、またはEB形成を許容する低接着特性を有する基質を有する培養容器においてpPS細胞を懸濁液中で培養することによって、開始されうる。pPS細胞は、短いコラゲナーゼ消化によって採取され、クラスターに解離されて、非接着性の細胞培養プレートにプレーティングされる（国際公開公報第01/51616号；米国特許第6,602,711号）。任意で、アルギネートまたは他の適した栄養透過性マトリクスに封入したEBを産生することができ、これは産生された細胞のEB直径の均一性および一貫性を改善するために役立つ可能性がある（国際公開公報第03/004626号、Zandstra et al.）。プロセスがEB形成を含むか否かによらず、血清または血清同等物を含む培地：例えば、RPMIのような適した増殖培地において〜20％ウシ胎児血清またはB27もしくはN2のような血清添加物、を用いることは、心筋細胞系列の収縮細胞の巣状塊を促進する。
【００４８】
心筋細胞表現型を促進するために、細胞を、心筋タイプの細胞の増殖もしくは生存を増強する、または他の細胞タイプの増殖を阻害する因子および因子の組み合わせと共に培養することができる。効果は、細胞自身に対する直接作用によるものであってもよく、またはもう一つの細胞タイプに作用を及ぼして、それによって心筋形成を増強するものであってもよい。例えば、胚盤葉下層または胚盤葉上層と同等の細胞の形成を誘導する因子、またはこれらの細胞に自身の心促進要素を産生させる因子は、全て心指向性因子の説明に含まれる。
【００４９】
pPS細胞を中胚葉層の細胞へと分化誘導する、または心筋系列の細胞へのさらなる分化を促進すると考えられる因子には、以下が含まれる：
・トランスフォーミング増殖因子β関連リガンド（TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、および下記のTGF-βスーパーフェミリーの他のメンバーによって示される）。TGF-β受容体に結合するリガンドは、I型およびII型セリンキナーゼを活性化して、Smadエフェクターの燐酸化を引き起こす。
・モルフォゲン様アクチビンAおよびアクチビンB（TGF-βスーパーファミリーのメンバー）
・インスリン様増殖因子（IGFIおよびIGFIIのような）
・骨形態形成タンパク質（TGF-βスーパーファミリーメンバー、BMP-2およびBMP-4によって示される）
・線維芽細胞増殖因子（bFGF、FGF-4、およびFGF-8によって示される）、細胞質キナーゼraf-1、およびマイトゲン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）を活性化する他のリガンド、ならびに上皮細胞増殖因子（EGF）のような他のマイトゲン
・DNAメチル化および心筋細胞関連遺伝子の発現を変化させるヌクレオチド類似体（例えば、5-アザ-デオキシ-シチジン）
・下垂体ホルモンオキシトシン、または酸化窒素（NO）
・同じ受容体に関するアゴニスト活性を有する特異的抗体または合成化合物。
【００５０】
心指向性因子の特に有効な組み合わせには、任意で一つまたはそれ以上の線維芽細胞増殖因子、骨形態形成タンパク質、および血小板由来増殖因子のようなさらなる心指向性因子を添加した、アクチビンAのようなモルフォゲンと、初期拘束段階の際のTGF-βおよびIGFファミリーに含まれる増殖因子のような複数の増殖因子を用いることが含まれる。
【００５１】
本発明の労作において、インスリン様増殖因子II（IGF II）およびインビトロ分化の最終段階からの関連分子のような省略因子は、実際に心遺伝子発現レベルを増加させることが判明した。無関係な試験において、IGF IIは、線維芽細胞におけるGSK3βレベルを減少させることが判明している（Scalia et al., J. Cell Biochem. 82:610, 2001）。したがって、IGF IIは、培養培地に存在するまたは細胞によって分泌されるWntタンパク質の作用を増強する可能性がある。Wntタンパク質は通常、転写因子TCFの一部を含む細胞質分子βカテニンの核転移を安定化および引き起こす。これは、多数の遺伝子の転写活性を変化させる。Wntの非存在下において、βカテニンは、キナーゼGSK3βによって燐酸化されて、それらはいずれもβカテニンを脱安定化して、それを細胞質に保持する。
【００５２】
IGF IIのようなWnt活性化剤は、心筋細胞の分化を明らかに制限することから、本発明には、pPS細胞の心筋細胞分化の程度または割合を増加させるためにWnt拮抗剤と共に培養することが含まれる。Wntシグナル伝達は、DKK-1またはCrescent（Wntに結合して不活化する分泌型蛋白質）のいずれかをコードする合成mRNAの注射によって（Schneider et al., Genes Dev.15:304, 2001）、またはDKK-1をコードするレトロウイルスによる感染によって（Marvin et al., Genes Dev. 15:316, 2001）阻害されうる。または、Wnt経路は、キナーゼGSK3βの活性を増加させることによって、例えば細胞をIL-6またはグルココルチコイドのような因子と共に培養することによって阻害されうる。
【００５３】
可能性がある心指向性因子の評価を実施例3に示す。当然、明確に必要でなければ、本発明に従う分化の模範例においてそれを用いるために、心指向性因子の作用機序を理解することは必要ではない。心筋細胞産生の比率を高めるために有効であるそのような化合物の組み合わせおよび量は、そのような因子を組み入れる培養環境において非分化または初期分化hES細胞またはその子孫を培養すること、および化合物が下記の表現型マーカーに従って集団において心筋細胞系列細胞の数を増加させるか否かを決定することによって、経験的に決定することができる。
【００５４】
直接分化
既に述べたように、pPS細胞の分化の模範例は従来、異なる細胞タイプ間の相互干渉を可能にする胚様体を形成する段階を含み、胚を暗示するように組織形成を促進すると考えられる。しかし、胚様体を形成する必要がないことがしばしば都合がよく、それによって分化プロセスはより制御され、得られた細胞集団はより均一になる傾向がある（国際公開公報第01/51616号；US 2002/0151053 A1）。本開示は、胚様体を形成することなく、および血清または血清補助物質を用いることなくhES細胞を心筋細胞へと直接分化させるための新規方法を提供する。
【００５５】
直接分化技法の説明を実施例5に提供する。第一に、pPS細胞をそれらを増殖した培養物（任意でフィーダーなし）から回収して、それらを非分化hES細胞に関して接着性があって、心筋細胞の分化に適合性である基質またはマトリクス上にプレーティングする。例は、0.5％ゼラチン、20 μg/mLフィブロネクチン、またはMatrigel（登録商標）である。基質またはマトリクスを培養容器表面にコーティングすることができる；または場合によっては、それらは培養環境を通して存在する微粒子またはメッシュ様支持体の一部となりうる。ゼラチンを用いる場合、細胞の接着は、血清と共にマトリクスをプレインキュベートする段階、その後血清を洗浄して除去してから細胞をプレーティングする段階によって促進することができる。望ましければ、pPS細胞は、例えば、非分化型のpPS細胞を増殖させるために用いられるものと類似の培地によって適した時間（すなわち4〜8日間）培養を継続することによって、基質上で確立させてから分化を開始することができる。これによって、典型的にpPS細胞は、新しい培養環境において単層としてコンフルエンスとなるであろう。
【００５６】
分化プロセスは、本開示における他所で言及した、心筋細胞の分化を促進する因子を含む培地においてプレーティングした細胞を培養することによって開始される。例は、アクチビンおよび／または骨形態形成タンパク質である。TGF-βスーパーファミリータンパク質であるアクチビンAおよびBMP-4の組み合わせは特に有効である（実施例5）。いくつかの状況において、BMP-2のような他のモルフォゲンをBMP-4の代わりに用いてもよい。この段階または後の培養段階で用いる培地は、先に提供した一覧から選択される補助剤を含んでもよい。例は、インスリン増殖因子、特にIGF Iおよび／または腫瘍壊死因子、または他の炎症性サイトカイン、特にTNF-αである。分化因子と共に培養することは、心筋細胞系列に細胞を向かわせるために数日から数週間またはそれ以上要することがありうるが、典型的に4〜7日間である。
【００５７】
本技術の長所の一つは、他の方法にとって典型である血清または血清代用剤が、心筋細胞の分化プロセスを開始または支持するために必要ではない点である。その代わりに、培地を、それが心筋細胞またはニューロンのような分化した細胞を支持する人工的な栄養補助剤を含むように調製することができる。例は、B27補助剤、N2補助剤、およびG5補助剤（Life Technologies/Gibco）である。そのような補助剤はしばしば、ヒトインスリン（500μg/L）、ヒトトランスフェリン（5〜10 mg/mL）、およびセレン（0.5μg/mL）のような栄養および共因子を含み、同様にプトレッシン（1.5 mg/mL）、ビオチン（1μg/L）、ヒドロコルチゾン（0.4μg/L）、またはプロゲステロン（0.6μg/L）、および／またはEGFまたはFGF（1μg/L）のような低レベルのマイトゲンも同様に含んでもよい。大量生産およびヒトの治療の目的に関して、非ヒト動物に由来する成分の消失は特に都合がよい。
【００５８】
同様に、再生医学にとって適した心筋細胞系列細胞の比率は、TGF-βスーパーファミリーのモルフォゲンを除去した後、類似の補助培地において数日から1または2週間またはそれ以上培養を継続することによってしばしば増強されうることが判明している。この段階において、培地は時に、IGFのような増殖因子を含みうるが、BMP-2、他のBMPs、または他のモルフォゲンは、心筋細胞表現型の出現を遅らせて、それによって収率を減少させる可能性がある。
【００５９】
心筋細胞系列細胞（マーカー発現または収縮活性によって同定される）を、最終的に培養物から回収する。回収された集団は、5％または10％Nkx2.5陽性細胞を含んでもよい。
【００６０】
分化した細胞の集団を、機械的分離または表面マーカーに関するソーティングによるような、望ましい特徴を有する細胞の比率を高めるようにさらに処理することができる。例えば、収縮細胞の百分率は、密度分離によって〜20倍まで高めることができる。等密度遠心によって比率が高められた心筋細胞集団の単離を実施例1および4に示す。MHCまたは他の組織特異的マーカーの発現によって同定される心筋細胞系列細胞少なくとも〜5％、〜20％、〜60％を含む、おそらく〜90％以上を含む集団を得ることができる。本開示において言及される研究および治療応用の多くが、心筋細胞の比率を高めることによって利益を得るが、完全な均一性はしばしば必要ではない。
【００６１】
カーディアックボディズ（商標）の形成
pPS由来心筋細胞の調製物は、カーディアックボディズ（商標）と呼ばれるクラスターにおいてそれらを増殖させることによってさらに増殖または比率を高めることができることも同様に発見されている。
【００６２】
第一に、心筋細胞系列細胞の特徴である表現型を有する細胞を含み、任意で密度分離または他の技術によって細胞比率が高められた細胞集団を作製する。次に、細胞にクラスターを形成させて、単細胞懸濁液を除去する。これは、クラスターを沈降させて、単細胞を含む上清をピペットによって除去することによって行うことができる。処置の前に、クラスターを破砕することが時に有用である（例えば、短いトリプシン処理および／または機械的分散によって）。次に、細胞を新鮮な培養培地において低接着プレート（先に述べたように、ウシ胎児血清、血清代用剤、またはCCTを含む培地によって示される）において懸濁液で培養して、「二次」カーディアックボディズ（商標）に再凝集させる。次に、心筋細胞系列細胞のクラスターの大きさが細胞10個〜5000個（典型的に細胞50〜1000個）に留まるように、必要に応じて定期的に栄養を補給しながら培養を継続した。
【００６３】
適した期間（典型的に1〜7日間）の後、培養細胞を特徴付けのために回収する、または薬物のスクリーニングもしくは医薬品の製造のために用いることができる。精製効果は、単細胞を除去してクラスターを再培養するさらなるサイクルを8日間またはそれ以上行うことによって細胞を得た場合に改善する可能性がある。各サイクルは任意で、細胞クラスターを単細胞、またはより小さい細胞クラスターに分散させて、さらに増殖させる段階を組み入れることができる。より大きいクラスターは、懸濁した細胞の凝集によって、クラスター内での増殖によって、またはその双方によって形成される可能性がある。本発明の仮説は、心筋細胞系列細胞が適当な条件でそのようなクラスターを形成する傾向があること、および単細胞の除去は他の細胞タイプの消失に役立ち、均一性を増加させることである。
【００６４】
実施例6および7はプロセスを説明する。心筋細胞を含む混合細胞集団を新鮮な培地に入れて、15または50 mL遠心チューブにおいて沈降させてクラスターを回収する。それらを血清含有培地において栄養を与え、クラスターの分離、プレーティング、および再培養のサイクルを2または3日ごとに行う。約8日後、心筋細胞マーカーcTnIおよびMHCのmRNAレベルでのかなりの発現の増加を認め（図7）、自発的に収縮するクラスターの高い比率を認めた（図8）。
【００６５】
カーディアックボディ（商標）技術を用いて、分化プロセスにおける任意の時期において細胞集団において心筋細胞を増殖および／または比率を高めることができる。下記に例を示すように、技術は、密度分離による前回の比率を高める段階の後に用いることができる。技術の実施は、本発明を作製する前に予想されなかった利益を有する。特に、リアルタイムPCRによって検出されるミオシン重鎖の発現は、細胞を7日間培養した場合に10〜100倍増加する。組成物におけるクラスターの大部分が、自発的収縮活性を示す：これは通常、50％より高いが、記述の方法によって処理した場合には、おそらく約80％〜100％のあいだであろう。
【００６６】
心筋細胞系列細胞の特徴付け
本発明の技術に従って得られる細胞は、多くの表現型基準に従って特徴を調べることができる。pPS細胞株に由来する心筋細胞および前駆細胞は、しばしば他の起源からの心筋細胞の形態学的特徴を有する。それらは紡錘形、丸形、三角形、または多角形の形状となりえて、それらは免疫染色によって検出可能なサルコメリック構造の特徴を有する線条を示すことがある（図1）。それらは平坦なシート状の形をとることがあり、または基質に結合するもしくは懸濁液において浮遊するクラスターの形であってもよく、電子顕微鏡によって調べた場合に典型的なサルコメアおよび心房顆粒を示す。
【００６７】
pPS由来心筋細胞およびその前駆体は典型的に、以下の心筋細胞特異的マーカーの少なくとも一つを有する。
・横紋筋収縮を制御するためのカルシウム感受性分子スイッチを提供するトロポニン複合体のサブユニットである心トロポニンI（cTnI）
・心トロポニンT（cTnT）
・発達中の心臓において持続する初期マウス胚発達の際の心中胚葉において発現される心転写因子であるNkx2.5
【００６８】
細胞は、また典型的に以下のマーカーの少なくとも一つ（しばしば少なくとも3、5個、またはそれ以上）を発現するであろう：
・発達中の心臓および胎児心筋細胞において発現されるが、成人においてダウンレギュレートされているホルモンである心房性ナトリウム利尿因子（ANF）。これは、心細胞において非常に特異的に発現されるが、骨格筋細胞には発現されないことから、心筋細胞の良好なマーカーであると考えられる
・ミオシン重鎖（MHC）、特に心特異的であるβ鎖
・タイチン、トロポミオシン、α-サルコメリックアクチニン、およびデスミン
・心中胚葉において高度に発現されて、発達中の心臓において持続する転写因子であるGATA-4。これは多くの心遺伝子を調節し、心臓発生において役割を有する
・MEF-2A、MEF-2B、MEF-2C、MEF-2D；心中胚葉において発現され、発達中の心臓において持続する転写因子。
・心細胞において接着を媒介するN-カドヘリン。
・心筋細胞間のギャップ接合を形成するコネキシン43。
・β1-アドレナリン受容体（β1-AR）。
・心筋梗塞後に血清中で上昇するクレアチニンキナーゼMB（CK-MB）およびミオグロビン。
・α心アクチン、初期増殖反応-1、およびサイクリンD2。
【００６９】
組織特異的マーカーは、フローイムノサイトメトリー、または細胞表面マーカーのアフィニティ吸着、細胞内または細胞表面マーカーの免疫細胞化学（例えば、固定細胞または組織切片の）、細胞抽出物のウェスタンブロット分析、および細胞抽出物または培地に分泌された産物に関する酵素結合イムノアッセイのような、任意の適した免疫学的技術を用いて検出することができる。cTnIおよびcTnTのような心マーカーを他のイソ型と区別する抗体は、SigmaおよびSpectral Diagnosticsのような供給元から市販されている。細胞による抗原の発現は、任意で細胞の固定後に、および任意で標識二次抗体を用いて、抗体の有意な検出可能な量が標準的な免疫細胞化学またはフローサイトメトリーアッセイにおいて抗原に結合する場合に抗体-検出可能であると言われる。
【００７０】
組織特異的遺伝子産物の発現はまた、ノザンブロット分析によって、ドットブロットハイブリダイゼーション分析によって、または公共に利用できる配列データ（GenBank）を用いて標準的な増幅法において配列特異的プライマーを用いる逆転写酵素開始ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によってmRNAレベルで検出可能である。タンパク質またはmRNAレベルで検出される組織特異的マーカーの発現は、非分化pPS細胞または他の無関係な細胞タイプのような対照細胞より、レベルが少なくとも2倍、好ましくは10倍または50倍より多い場合に陽性であると見なされる。
【００７１】
マーカーが所望の表現型の細胞表面上で同定されれば、それらは、イムノパニングまたは抗体媒介蛍光活性化細胞ソーティングのような技術によって集団の細胞比率をさらに高めるための免疫選択のために用いることができる。
【００７２】
適当な条件において、pPS由来心筋細胞はしばしば、自発的な周期的収縮活性を示す。このことは、それらを適当なCa++濃度および電解質バランスを有する適した組織培養条件で培養した場合に、細胞が、細胞の一つの軸を超えて収縮し、任意のさらなる成分を培養培地に加える必要なく、その後収縮から放出されることが認められうることを意味する。収縮は周期的であり、それらは、通常の緩衝液において、定期的または不規則に〜6〜200回収縮／分の頻度で、しばしば〜20〜90回収縮／分の頻度で反復することを意味する（図2）。個々の細胞は、それ自身、自発的な周期的収縮活性を示してもよく、または組織、細胞凝集物、もしくは培養細胞塊において隣接細胞と共に自発的な周期的収縮活性を示してもよい。
【００７３】
細胞の収縮活性は、収縮の性質および頻度に及ぼす培養条件の影響に従って特徴を調べることができる。利用可能なCa++濃度を減少させるまたはそうでなければCa++の膜を超えての輸送を妨害する化合物はしばしば、収縮活性に影響を及ぼす。例えば、L-型のカルシウムチャンネル阻害剤であるジルチアゼムは、収縮活性を用量依存的に阻害する（図2）。一方、イソプレナリンおよびフェニレフリンのようなアドレナリン受容体アゴニストは、陽性の変時性作用を有する。細胞の機能的特性のさらなる特徴付けは、Na+、K+、およびCa++のチャンネルを特徴付けする段階を含みうる。心筋細胞に関して活動電位のパッチクランプ分析によって電気生理学を調べることができる。Igelmund et al., Pflugers Arch. 437:669, 1999；Wobus et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 27:752, 1995；およびDoevendans et al., J. Mol. Cell Cardiol. 32:839, 2000を参照されたい。
【００７４】
機能的属性は、インビトロで細胞およびその前駆体の特徴を調べる方法を提供するが、本開示において参照される用途のいくつかにとっては必要でない可能性がある。例えば、先に記述したマーカーのいくつかを有するが、機能的または電気生理学的特性を必ずしも全て有するわけではない細胞の比率が高められた混合細胞集団は、それらを損傷した心組織に移植して、心機能を補助するために必要な機能的特性をインビボで獲得することができれば、かなりの治療的利益を有しうるであろう。
【００７５】
確立されたpPS細胞株から誘導する場合、本発明の細胞集団および単離細胞は、それらが由来する細胞株と同じゲノムを有するという特徴を有しうる。このことは、pPS細胞と心細胞とのあいだで染色体DNAが90％より多く同一であることを意味し、これは正常な分裂の過程を通して心細胞が非分化株から得られると推論されうる。心筋系列の細胞が親細胞集団に由来するという特徴は、いくつかの局面において重要である。特に、非分化細胞集団は、ゲノムを共有するさらなる細胞、すなわち心異系移植片の組織適合性タイプに患者を予め認容させることができる集団のような、さらなるバッチの心細胞、または治療において有用となる可能性があるもう一つの細胞タイプ、を産生するために用いることができる（US 2002/0086005 A1；国際公開公報第03/050251号）。
【００７６】
分化した細胞の遺伝子の変化
本発明の細胞は、分化の前後いずれかで細胞を遺伝子操作することによって、一つまたはそれ以上の遺伝子の変化を含むように調製することができる（US2002/0168766 A1）。細胞は、任意の適した人工的な操作手段によってポリヌクレオチドが細胞に移入されている場合、または細胞がポリヌクレオチドを遺伝している当初改変された細胞の子孫である場合、に「遺伝子改変」されていると言われる。例えば、細胞は、それらが発達的に限定された系列の細胞または最終分化細胞へと進行する前または後に、テロメラーゼ逆転写酵素を発現するように細胞を遺伝子改変することによって、その複製能を増加するように処理することができる（US 2003/0022367 A1）。
【００７７】
本発明の細胞はまた、組織再生に関与する能力を増強するため、または投与部位に治療的遺伝子を送達するために遺伝子改変することができる。所望の遺伝子に関して公知のコード配列を用いて、分化した細胞タイプにおいて汎特異的または特異的に活性なプロモーターに機能的に結合したベクターを設計する。FGF、心房性ナトリウム利尿因子のような心指向性因子、クリプト、ならびにGATA-4、Nkx2.5、およびMEF2-Cのような心転写調節因子のような様々なタイプの一つまたはそれ以上の増殖因子を発現するように遺伝子改変された細胞は、特に重要である。投与部位でこれらの因子が産生されれば、機能的表現型の採択を促進する、投与された細胞の有用な作用を増強する、または処置部位に隣接する宿主細胞の増殖もしくは活性を増加させる可能性がある。
【００７８】
心筋細胞およびその前駆体の利用
本発明は、心筋細胞系列細胞を大量に産生する方法を提供する。これらの細胞集団は、多くの重要な研究、開発、および商業的目的のために用いることができる。
【００７９】
薬物のスクリーニング
本発明の心筋細胞は、そのような細胞およびその様々な子孫の特徴に影響を及ぼす因子（溶媒、低分子薬、ペプチド、オリゴヌクレオチドのような）または環境的条件（培養条件または操作のような）をスクリーニングするために商業的に用いることができる。
【００８０】
いくつかの応用において、pPS細胞（非分化または分化）は、後期心筋細胞前駆体もしくは最終分化細胞への成熟を促進する、またはそのような細胞の長期培養における増殖および維持を促進する因子をスクリーニングするために用いられる。例えば、候補成熟因子または増殖因子を、異なるウェルにおける細胞にそれらを加える段階、および細胞のさらなる培養および用途に関する所望の基準に従って、その後それによって起こる任意の表現型の変化を決定する段階によって、試験される。
【００８１】
本発明の他のスクリーニング応用は、心筋組織の維持または修復に及ぼすその効果に関する薬学的化合物の試験に関する。スクリーニングは、化合物が細胞に及ぼす薬理作用を有するように設計されている理由から、または何らかの作用を有するように設計された化合物が、この組織タイプの細胞に及ぼす意図しない副作用を有する可能性があるという理由から、行ってもよい。スクリーニングは、本発明の前駆体細胞または最終分化細胞のいずれかを用いて行うことができる。
【００８２】
読者は一般的に、標準的なテキスト「In Vitro Methods in Pharmaceutical Reserch」, Academic Press, 1997および米国特許第5,030,015号を参照されたい。候補薬学的化合物の活性の評価は、一般的に、本発明の分化細胞を、単独または他の薬剤と併用して候補化合物と混合する段階を含む。試験者は、化合物に帰因しうる（無処置の細胞または不活性化合物を処置した細胞と比較して）細胞の形態、マーカー表現型、または機能的活性における任意の変化を決定して、次に、認められた変化と化合物の作用を相関させる。
【００８３】
細胞障害性は、第一の例において、細胞の生存率、生存、形態、ならびに特定のマーカーおよび受容体の発現に及ぼす作用によって決定することができる。染色体DNAに及ぼす薬物の作用は、DNA合成または修復を測定することによって決定することができる。特に細胞周期における予定されない時期での、または細胞複製に必要なレベルを超えての[3H]-チミジンまたはBrdU取り込みは、薬物の作用と一貫する。望ましくない作用にはまた、分裂中期の染色体の広がりによって決定される、異常な姉妹染色分体交換率が含まれうる。読者は、さらなる詳細に関してA. Vickers（pp 375〜410、「In Vitro Methods in Pharmaceutical Research」, Academic Press, 1997）を参照されたい。
【００８４】
細胞機能の影響は、マーカーの発現、受容体結合、収縮活性、または電気生理学のような心筋細胞の表現型または活性を、細胞培養またはインビボのいずれかにおいて観察するために、任意の標準アッセイを用いて評価することができる。薬学的候補物質はまた、それらが収縮の程度または頻度を増加または減少させるか否かのような、収縮活性に及ぼすその作用に関して試験することができる。作用が認められれば、化合物の濃度を滴定して、有効用量の中央値（ED50）を決定することができる。
【００８５】
動物試験
本発明はまた、代謝機能における生来の欠損、疾患状態の影響、または有意な外傷の結果のような、任意の認められた必要性に関して心筋の組織の維持または修復を増強するために、心筋細胞およびその前駆体を用いることを提供する。
【００８６】
治療的投与のための細胞組成物の適切性を決定するために、最初に細胞を適した動物モデルにおいて試験することができる。一つのレベルにおいて、細胞をインビボでのその生存能およびその表現型の維持能に関して評価する。細胞組成物を免疫欠損動物（ヌードマウス、または化学的もしくは放射線によって免疫欠損にした動物のような）に投与する。再増殖期間後に組織を採取して、pPS由来細胞がなおも存在するか否かに関して評価する。
【００８７】
これは、予め標識されている（例えば、BrdUまたは[3H]チミジンによって）検出可能な標識（緑色蛍光タンパク質、またはβ-ガラクトシダーゼのような）を発現する細胞を投与することによって、または構成的細胞マーカーのその後の検出によって（例えば、ヒト特異的抗体を用いて）行うことができる。投与された細胞の存在および表現型は、ヒト特異的抗体を用いる免疫組織化学もしくはELISAによって、または公表された配列データに従ってヒトポリヌクレオチドに対して増幅を特異的にするプライマーおよびハイブリダイゼーション条件を用いるRT-PCR分析によって評価することができる。
【００８８】
適切性はまた、pPS由来心筋細胞集団による処置によって起こる心回復の程度を評価することによって決定することができる。多くの動物モデルがそのような試験のために利用可能である。例えば、予め冷却したアルミニウム棒を前左心室壁の表面に接触させるように留置することによって、心臓に凍結損傷を与えることができる（Murry et al., J. Clin. Invest. 98:2209, 1996；Reinecke et al., Circulation 100:193, 1999；米国特許第6,099,832号；Reinecke et al., Circ. Res., Epub Mar 2004）。より大きい動物では、凍結損傷は、液体窒素中で冷却した30〜50 mmの銅製の円盤状プローブを、左心室前壁に〜20分間留置することによって行うことができる（Chiu et al., Ann. Thorac. Surg. 60:12, 1995）。梗塞は、左主冠動脈を結紮することによって誘導することができる（Li et al., J. Clin. Invest. 100:1991, 1997）。損傷部位を本発明の細胞調製物によって処置して、損傷領域における細胞の有無に関して、心組織を組織学によって調べる。心機能は、左心室拡張終期圧、発生張力、血圧上昇速度、および圧崩壊速度のようなパラメータを決定することによってモニターすることができる。
【００８９】
ヒトにおける治療的使用
適当な試験の後、本発明の分化細胞を、そのような処置を必要とするヒト患者または他の対象における組織再構成または再生のために用いることができる。意図される組織部位へそれらを移植または遊走させて、機能的に欠損領域を再構成または再生させるように、細胞を投与する。心室、心膜、または心筋内部の所望の位置に直接、心機能を再構成することができる細胞を投与するように適合させた特殊な装置が利用可能である。
【００９０】
望ましければ、pPS由来心筋細胞の同種異系移植片を移植された患者を、移植された細胞の免疫拒絶を減少させるために処置することができる。企図される方法には、シクロスポリンAのような従来の免疫抑制剤（Dunn et al., Drugs 61:1957, 2001）の投与、またはpPS由来細胞のマッチさせた集団を用いる免疫寛容の誘導（国際公開公報第02/44343号；米国特許第6,280,718号；国際公開公報第03/050251号）が含まれる。もう一つのアプローチは、例えばアロプリノールによって対象を処置することによって、対象への移植の際に細胞によって産生される尿酸量を減少させるように心筋細胞集団を適合させることである。またはもしくは共に、アロプリノール、または尿酸オキシダーゼのような尿酸を代謝する酵素を投与することによって患者を準備する（PCT/US04/42917）.
【００９１】
本発明に従う再生医学を行うために適した患者には、冠血管心疾患、心筋症、心内膜炎、先天性心血管欠損、およびうっ血性心不全のような様々な種類の急性および慢性心疾患を有する患者が含まれる。処置の有効性は、瘢痕組織が占める領域の減少または瘢痕組織の血管再建、ならびにアンギナの頻度および重症度；発生圧、収縮期圧、拡張終期圧、△圧／△時間、患者の運動性、およびクオリティオブライフの改善のような臨床的に容認される基準によってモニターすることができる。
【００９２】
本発明の心筋細胞は、ヒトでの投与のために十分な滅菌状態で調製された等張賦形剤を含む、薬学的組成物の形で供給することができる。分化技法が、細胞をカーディアックボディズ（商標）として培養する段階を含む場合、プロテアーゼを用いて、または緩やかな機械的操作によって、単細胞またはより小さいクラスターの懸濁液に細胞を分散することが望ましいかも知れない。移植の際の細胞死のリスクを減少させるために、細胞を投与前に、熱ショックによって処置してもよく、または〜0.5 U/mLエリスロポエチンと共に〜24時間処置してもよい。
【００９３】
医学的製剤における全般的原則に関して、読者は、G. Morstyn & W. Sheridan編の「Cell Therapy : Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy」、Cambridge University Press, 1996；および「Haematopoietic Stem Cell Therapy」, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000を参照されたい。組成物の細胞賦形剤および任意の付随成分の選択は、投与に用いられる経路および装置に従って適合されるであろう。組成物はまた、心筋細胞の移植または機能的動員を促進する一つまたはそれ以上の他の成分を含んでもよく、または伴ってもよい。適した成分には、心筋細胞、相補的細胞タイプ、特に内皮細胞の接着を支持または促進するマトリクスタンパク質が含まれる。
【００９４】
本発明にはまた、製造、流通、または使用の際の任意の時期に存在する細胞の組または組み合わせを含む試薬システムが含まれる。細胞の組は、本開示において記述され、例示されるが分化型pPS-由来細胞（心筋細胞、心筋細胞前駆体、カーディアックボディズ（商標）等）に限定されない二つまたはそれ以上の細胞集団の任意の組み合わせを、しばしば同じゲノムを共有する非分化pPS細胞または他の分化型細胞タイプと組み合わせて含む。組におけるそれぞれの細胞タイプは、共に包装してもよく、同じ施設において異なる容器に、異なる場所で、同じまたは異なる時期に、事業関係を共有する同じ団体もしくは異なる団体の管理下で、包装してもよい。
【００９５】
本発明の薬学的組成物は任意で、疾患状態または心筋の異常を改善するために心筋細胞機能の再構成のような、所望の目的に関する書面での説明書と共に適した容器に包装してもよい。
【００９６】
以下は、本発明の特定の態様のさらなる非制限的な説明として提供される。
【００９７】
実施例
実施例1：hES細胞の心筋細胞への分化
hES細胞株、H1、H7、H9、およびH9.2（H9に由来するクローン株）は、国際公開公報第01/51616号に記述されるように、当初フィーダー細胞上で確立され、その後無フィーダー条件で維持された。分化は、hES細胞懸濁液を培養して胚様体を形成させることによって開始した。懸濁培養において4日後、EBをゼラチンコーティングプレートまたはチャンバースライドガラスに移した。拍動する心筋細胞を、分化15〜29日目にEB増殖物から機械的に単離して、回収して洗浄した。調べたhES細胞株は全て、50代より多い継代回数（集団倍加〜260）維持した後でさえも拍動する心筋細胞の産生能を有したが、いくつかの株（例えば、H7）は他より多く産生した。
【００９８】
図1は、コラゲナーゼBを用いて懸濁し、再プレーティングした後、サルコメリックミオシン重鎖（MHC）、タイチン、トロポミオシン、α-サルコメリックアクチニン、デスミン、cTnI、および心トロポニンT（cTnT）の発現に関して染色した細胞の免疫細胞化学を示す。単細胞およびクラスターはこれらのマーカー全てに関して染色陽性であった。染色された単細胞心筋細胞は紡錘形で、丸く、三角形または多角形形状を有した。サルコメリック構造の横紋特徴も同様に認められ、筋機能にとって必要な収縮装置と一貫する。
【００９９】
心筋細胞の比率を、Percoll（商標）（コロイド状PVP-コーティングシリカを含む密度分離培地）の不連続勾配での密度分離によってさらに高めた。心筋細胞を先のように生成して、ゼラチン上にプレーティング後15日目に回収して、分化培地中で再懸濁した。5分間沈降させた後、細胞懸濁液を、58.5％Percoll（商標）層（〜1.075 g/mL）の上層の40.5％Percoll（商標）（Pharmacia）（〜1.05 g/mL）の層にローディングした。次に、細胞を1500 gで30分間遠心した。遠心後、二つの層の界面の細胞を回収して、洗浄し、分化培地中で再懸濁し、チャンバースライドガラスにプレーティングした。回収した細胞は、サルコメリックミオシン重鎖（MHC）に関して26.8±4.1％の染色を示したが、これは開始細胞集団より少なくとも〜20倍高い。
【０１００】
hES由来心筋細胞の機能を、心活性薬の変時性作用に対して心筋細胞が適切に反応するか否かを決定することによって試験した。
【０１０１】
図2（パネルA）は、拍動数がL-型カルシウム阻害剤であるジルチアゼムによって用量依存的に阻害されたことを示している。細胞を10-5 Mジルチアゼムによって処置すると、拍動領域の100％が収縮を停止した。この知見は、hES由来心筋細胞が機能的L-型カルシウムチャンネルを有することを示している。パネルBおよびCは、イソプレナリン（アドレナリンβ受容体アゴニスト）およびフェニレフリン（アドレナリンα受容体アゴニスト）によって誘導される陽性の変時性作用が存在することを示している。パネルDおよびEは、ホスホジエステラーゼ阻害剤IBMXおよびアドレナリンβ2受容体アゴニストクレンブテロールが類似の作用を有することを示している。このように、hES細胞由来細胞は、心筋系列の細胞に関して適当な方法で心活性薬に反応する。
【０１０２】
実施例2：心筋細胞の分化を促進する因子
H1またはH9細胞株からの胚様体を、DNAメチル化に影響を及ぼすシトシン類似体である5-アザ-デオキシ-シチジンによって分化1〜4、4〜6、または6〜8日目に処置した。細胞を15日目に回収して、心臓MHCに関してリアルタイムRT-PCRによって分析した。1〜10 μM 5-アザ-デオキシ-シチジンを6〜8日目に処置すると、心臓α-MHCの発現が有意に増加して、培養における拍動領域の比率の増加と相関した。
【０１０３】
心筋細胞の分化誘導能に関して調べた他の試薬には、ジメチルスルホキシド（DMSO）、およびオールトランスレチン酸（RA）が含まれた。0.5％DMSOによって0〜4日間処置した胚様体は、無処置培養物より少ない拍動領域を示した。拍動細胞は、0.8％、または1％DMSOによって処置した培養では存在せず、1.5％DMSOは、細胞に対して実際に有毒であった。DMSO処置はまた、無処置培養と比較してα-MHC発現の有意な減少を引き起こした。
【０１０４】
レチン酸を、10-9〜10-5 Mの用量で分化しつつあるhES培養に適用した。0〜4日目、RAは細胞に対して毒性を示したが、4〜8、8〜15、または4〜15日では、無処置培養と比較して拍動細胞に増加を認めなかった。このように、5-アザ-デオキシ-シチジンは、集団における心筋細胞の比率を増加させた。対照的に、DMSOおよびレチン酸は、マウス胚性癌腫または胚幹細胞から心筋細胞を生成するが、これらの化合物は心筋細胞の分化を阻害する（Wobus et al., J. Mol. Cell Cardiol. 29:1525, 1997；McBurney et al., Nature 299:165, 1982）。
【０１０５】
実施例3：心筋細胞分化物質の有効な併用
本実施例は、ヒトES細胞の心筋細胞分化に影響を及ぼす増殖因子添加の併用効果を調べる。
【０１０６】
原理は以下の通りであった。I群の因子は、初回拘束の際に胚盤葉下層の機能を提供することができるとして選択された。II群の因子は、I群の因子と共に、その後の発達の際に内胚葉の機能を提供することができるとして選択された。III群の因子は、持続的な培養における心筋細胞の生存因子として選択された。典型的な作業濃度を、「中」レベルであると定義して、これより4倍低いおよび4倍高いレベルを「低」および「高」レベルとして定義した。濃度を以下に示す。
【０１０７】
（表2）心指向性因子の例
2007529227.tif 000003
【０１０８】
図3（上のパネル）は、これらの因子を用いるためのスキームを示す。継代48回目のH1細胞を用いて、コラゲナーゼ処置後に5 mLピペットによって掻き取って皿から細胞を機械的に剥がすことによって、胚様体を生成した。10 cm2ウェル1個当たりの細胞の内容物を低接着プレートの10 cm2ウェル1個に移して、DMEMプラス20％FBS 4 mLにおいてさらなる因子の存在下または非存在下で4日間培養した。4日目の終了後、胚様体の各懸濁液を二つに分けて、ゼラチンコーティング接着6ウェル組織培養プレート（10 cm2/ウェル）のウェル2個にプレーティングした。接着胚様体およびその増殖物をDMEMプラス20％FBS 4 mlにおいて、さらなる因子の存在下または非存在下で11日間培養した後、各ウェルにおける拍動領域数を光学顕微鏡によって観察して、その後のPCR分析のためにRNAを各ウェルから採取した。
【０１０９】
I群の因子を0日目に加えて（非分化細胞を懸濁培養物に加えて胚様体を作製させる日）、因子は8日まで連続的に存在した（胚様体をゼラチンコーティングウェルにプレーティングした4日後）。II群の因子を4日目（プレーティングした日）に加えて、因子は8日まで連続的に存在した。III群の因子を8日目に加えて、因子は実験終了まで連続的に存在した（15日）。培養物のサブセットを5-アザ-デオキシ-シチジンに48時間（6〜8日）曝露した。培養物に新しい培地プラスまたはマイナス因子を6、8、11および13日目に与えた。
【０１１０】
対照培養（補助因子／5-アザ-デオキシシチジンの非存在下で維持した培養）または5-アザ-デオキシ-シチジンの非存在下で増殖因子を添加して維持した培養には、拍動領域を認めないが、増殖因子プラス5-アザ-デオキシ-シチジンの併用を添加した全てのウェルにおいて拍動領域を認めることが観察された。
【０１１１】
図3（下のパネル）は、正常な心RNAレベルと比較した心遺伝子αミオシン重鎖（αMHC）の発現に関する定量的PCR分析（Taqman（商標））を示す。発現レベルは、増殖因子（GF）プラス5-アザ-デオキシ-シチジンに曝露した細胞では有意に高かった。調べた最低濃度は、対照において認められたレベルより高い（30倍）αMHC発現を得るために十分であった。
【０１１２】
これらの結果を、その後の実験において詳しく調べた。H1細胞（継代回数38回）を、a）前回の実験において用いた因子の最低濃度のみを用いた；およびb）1組の試料において、III群の処置を省略したことを除き、先に記述した通りに培養した。次に、マーカー発現レベルを、リアルタイムPCRアッセイにおいて非分化細胞と比較して決定した。
【０１１３】
図4は、プロトコールからIII群を除去することによって、αMHC mRNA発現量がさらに3倍増加したことを示している。初期心筋細胞関連遺伝子GATA-4の発現の増加も同様に検出された。対照的に、内胚葉関連遺伝子HNF3bはこれらの条件下で特に誘導されない。αMHCおよびGATA-4に及ぼす効果は、如何なる増殖因子併用を用いても増加したが、5-アザ-デオキシ-シチジンを用いた場合には増加しなかった内胚葉関連遺伝子HNF3bと比較して選択的であった。
【０１１４】
これらの結果は、I群およびII群における因子が心筋細胞の特徴的特徴を有する細胞の比率を増強することを証明している。
【０１１５】
実施例4：四相遠心分離法
胚様体を4日間形成させた後、ゼラチンコーティングプレートにおいて17日間増殖させることによって（5-アザ-デオキシ-シチジンおよび増殖因子を用いなかった）、心筋細胞をH7株のhES細胞から生成した。細胞をコラゲナーゼBを用いて解離させて、分化培地中で再懸濁した。細胞懸濁液をPercoll（商標）の不連続勾配にローディングして、1500 gで30分間遠心した。画分4個を得た：I、上部界面；II、40.5％層；III、下界面；IV、58.5％層。細胞を洗浄して、分化培地で再懸濁した。免疫染色のための細胞をチャンバースライドガラスに104個/ウェルでプレーティングして、2または7日間培養した後、固定および染色した。
【０１１６】
結果を表3に示す。MHC陽性細胞の割合を、各画分に関して3個ずつのウェルからの画像30個において細胞を計数することによって決定して、ウェル3個からの細胞の平均値±標準偏差として表した。
【０１１７】
（表3）Percoll（商標）分離
2007529227.tif 000004
拍動細胞を全ての画分に認めたが、画分IIIおよびIVは、最高の割合を含んだ。
【０１１８】
間接的免疫細胞化学によって決定した細胞の表現型を表4に示す。
【０１１９】
（表4）分離した細胞集団の特徴
2007529227.tif 000005
【０１２０】
密度勾配遠心によって分離した心筋細胞集団は、cTnIおよびMHCに関する染色によって区別することが可能であった。ミオゲニン、α-フェトプロテイン、またはβ-チューブリンの染色陰性は、骨格筋、内胚葉細胞タイプ、およびニューロンが存在しないことを示した。SSEA-4およびTra-1-81の染色がないことは、非分化hES細胞が存在しないことを確認する。
【０１２１】
α-平滑筋アクチン（SMA）は、胎児および胚心筋細胞に存在するが、成人心筋細胞には存在しないことが報告されている（Leor et al., Circulation 97:11332, 1996；Etzion et al., Mol. Cell Cardiol. 33:1321, 2001）。心筋細胞分化プロトコールにおいて得られた実質的にほぼ全てのcTnI陽性細胞およびcTnI陰性細胞のサブセットが、SMA陽性であり、このことは、それらが初期段階であって増殖することができる可能性があることを示唆している。
【０１２２】
画分IIIおよびIVの細胞を再度プレーティングして、さらに2日間培養した。MHC陽性細胞の43±4％がBrdUを発現して、それらが細胞周期のS期に存在することを示した。他の実験において、cTnI-陽性細胞のサブセットは、Ki-67を発現することが判明した。これらの結果は、集団における心筋細胞の約20％または40％が活動的増殖を行っていたことを示している。
【０１２３】
実施例5：直接分化プロトコール
本実施例において、H7細胞株のhES細胞を、基質上にプレーティングして、分化因子を含む無血清培地において培養することによって、心筋細胞系列細胞に分化させた。
【０１２４】
0.5％ゼラチンによって一晩コーティングすることによって組織培養表面を調製した後、20％FBSを含む培地と共に2〜4時間インキュベートした後、hES細胞をプレーティングする前に除去した。または、プラスチックをヒトフィブロネクチン（20 μg/mL）または増殖因子減少Matrigel（登録商標）によってコーディングして、血清含有培地によるその後のインキュベーションを行わなかった。
【０１２５】
例としての試験において、TGF-β関連因子を、中胚葉または初期段階心筋細胞の特徴である遺伝子の発現の誘導能に関して試験した。H7株からの非分化hES細胞を24ウェルゼラチンコーティングプレート上にプレーティングした。mEF条件培地において非分化細胞として1週間増殖させた後、培地を、50 ng/mLアクチビンA、50 ng/mL BMP-4または双方の因子を共に含む、または含まないRPMI＋B27補助培地に変更した。4日後、増殖因子を培地交換によって除去して、細胞をRPMI＋B27単独でさらに14日間培養した。比較のために、hES細胞はまた、既に記述したように胚様体プロトコール（20％FBSを含む培地中で懸濁し、4日間培養した後、0.5％ゼラチンコーティング表面上で培養して、培養12〜20日後に回収する）によっても分化させた。
【０１２６】
分化細胞におけるα-ミオシン重鎖の発現を、遺伝子特異的プライマーを用いてリアルタイムPCR分析によって決定した。データを、Applied Biosystemsの18s rRNA特異的アッセイによって多数の反応によって標準化した。
【０１２７】
図5（A）は結果を示す。ゼラチンコーティングプレート上での直接分化法におけるアクチビンAおよびBMP-4の組み合わせは、血清含有培地において胚様体から生成された細胞と比較して、かなり高いレベルのMHCを発現する細胞を生成した。多数の自発的拍動領域が明らかであり、後により平坦な外観を示す球体を形成して、アクチビンAおよびBMP-4を除去後7日目に拍動し始めた。そのような拍動領域は、アクチビンAおよびBMP-4を含まずに培養したウェルでは認められなかった。
【０１２８】
異なる試験において、細胞をマルチウェルチャンバースライドガラスにおいて同じように分化させた。アクチビンAおよびBMP-4を用いて培養したウェルでは、多数の自発的拍動領域がウェルにおいて明らかであり、構築された機能的サルコメアの証拠を示したが、因子の併用の非存在下で培養したウェルでは拍動領域は存在しなかった。スライドガラスを2％パラホルムアルデヒドによって固定して、エタノールによって透過性にした後、マーカー発現に関して染色した。
【０１２９】
図5（B）は結果を示す。細胞は、心転写因子Nkx2.5の強い核局在発現と、α-サルコメリックアクチニンの細胞質発現を示した。双方のマーカーに関して染色された細胞クラスターを認めた。異なる陽性染色細胞は、α-アクチンの整然とした横紋パターンを示し、機能的サルコメアと一致した。類似の結果がhES細胞のH1細胞株を用いて得られた。
【０１３０】
もう一つの実験において、新鮮な培地（非条件）培地において非分化型で既に増殖させたhES細胞のH7株から心筋細胞を作製した。ディファインド培地を、US2005/0037492 A1に記述されるように、市販のXVIVO-10（商標）（BioWhittaker）から調製して、2 mM L-グルタミン、0.1 mM 2-メルカプトエタノール、0.1 mM非必須アミノ酸（Invitrogen）、80 ng/mL bFGF、および0.5 ng/mL TGFβ1を添加した。
【０１３１】
第一段階は、心筋細胞産生にとって適したマトリクス上にhES細胞をプレーティングすることであった。ディファインド培地において維持されたコンフルエントH7 hES細胞を、コラゲナーゼIV（200 U/mL）と共に37℃で5分間インキュベートした後、PBSによって洗浄して、小さいクラスターとして回収し、ゼラチンコーティングチャンバースライドガラスまたは24ウェルプレート（0.5％ゼラチンを一晩コーティングした後、FBS含有培地と共に一晩インキュベートした）にプレーティングした。細胞を新しいマトリクス上で20％FBS、1 mM L-グルタミン、0.1 mM 2-メルカプトエタノール、および0.1 mM非必須アミノ酸を含む培地において2日間培養した後、XVIVO-10（商標）培地で4日間培養した後に、8または80 mg/mL bFGFおよび0.5 ng/mL TGFβ1を含むXVIVO-10（商標）培地において6日間培養した；または添加したXVIVO-10（商標）培地において6日間培養した。
【０１３２】
心筋細胞に分化させるために、プレーティングした細胞をB27、50 ng/mL BMP-4および50 ng/mLアクチビンAを添加したRPMI培地において培養した。培地を4日後に、B27を添加したが増殖因子を欠損するRPMI培地に交換した。
【０１３３】
分化18日目で細胞を免疫細胞化学分析のために回収した。細胞は2％パラホルムアルデヒドを含むPBSにおいて固定して、エタノールによって透過性にし、10％正常ヤギ血清によってブロックした後、Nkx2.5に対する抗体（Santa Cruz Biotech）またはα-サルコメリックアクチニン（Sigma）と共にインキュベートした後、標識二次抗体と共にインキュベートした。
【０１３４】
図6は、結果を示す。心系列細胞は、核におけるNkx2.5と、細胞質におけるα-サルコメリックアクチニンの双方の発現によって同定した。細胞のいくつかは核においてNkx2.5を発現したが、α-アクチニン発現は陰性であり、これは、心筋前駆細胞を表すと考えられる。二重陽性細胞およびNkx2.5陽性／α-アクチニン陰性細胞はいずれも、様々な大きさの細胞クラスターとして存在した。
【０１３５】
直接分化法は、インビトロ試験および移植の双方に適した拍動細胞を多数産生する。このシステムにおける心筋細胞産生の意外な効率および容易さは、心筋前駆細胞の比率が高いことを暗示しており、これは商業的規模での心筋細胞産生、ならびに薬物スクリーニングおよび治療のためにこれらの細胞を用いる特定の局面にとって貴重である。
【０１３６】
実施例6：カーディアックボディズ（商標）を作製することによる収縮細胞の比率の増加
本実施例は、治療的用途および他の目的にとって望ましい特徴を有する細胞の比率を高めるために、心筋細胞クラスターのカーディアックボディズ（商標）としてのその後の培養を説明する。
【０１３７】
H7細胞株の非分化hES細胞の225 cm2フラスコ3個を用いて、既に記述したように胚様体を形成した。各フラスコからのEBを培地75 mL中で再懸濁し、低接着6ウェルプレート（細胞懸濁液4 mL/ウェル）に移して、全体でEB懸濁液のプレート9枚を作製した。1日後、新しく形成されたEBを50 mL遠心管に移して（1プレート／チューブ）、EBを室温で攪拌せずに10〜20分間沈降させた後、培地を除去して新鮮な培地（25 mL/チューブ）に交換することによって、EB懸濁液に栄養を与えた。
【０１３８】
EBをその当初の低接着プレートに戻して、20％FBS含有培地においてさらに3日間懸濁培養で維持した後、ゼラチンコーティング225 cm2組織培養フラスコ3本に移した。ゼラチンコーティングフラスコに移した2日後、培地を除去して、各フラスコに20％FBS含有培地75 mLを加えた。同様の培地交換を、8、11、13、15、および18日目に行った。20日目、分化した培養物をBlendzyme（商標）によって解離して、先に記述したように不連続Percoll（商標）勾配において分画した。画分IV（最高密度画分）を回収して計数し、単細胞および小さいクラスター〜3.7×106個を得た。
【０１３９】
画分IVの細胞を20％FBS含有培地〜6.5 mL中で再懸濁し、15 mL遠心管に移し、室温で攪拌せずに10分間沈降させた。培地（ほとんどが単細胞である細胞2.8×106個を含む）を除去して、新鮮な培地に交換した。細胞懸濁液を低接着6ウェルプレート1枚（細胞懸濁液〜4 mL/ウェル）に移した。CBsを同様に48時間毎に培地交換した（50 mLチューブに移して10分間沈降させ、培地を除去して交換する）。
【０１４０】
図7は、リアルタイムPCR（Taqman（商標））によって測定したサルコメリック遺伝子αMHCおよび心トロポニンIの発現を示す。ゼラチン上での20日培養後の発現と比較して、Percoll（商標）による細胞の分離によって、画分IVの細胞における発現は2〜5倍増加した。単細胞を除去して、クラスターを回収すると、発現は5〜20倍に増加した。細胞をカーディアックボディズ（商標）として培養した8日後、発現は非分離細胞より100〜500倍高かった。
【０１４１】
CBsをゼラチンまたはMatrigel（商標）（ラミニンのような細胞外マトリクス成分を含むエンゲルブレス-ホルム-スウォーム腫瘍細胞によって産生される単離基底膜）において再びプレーティングすると、クラスターは接着し、平坦化して自発収縮細胞の大きい小片を作製する。動物の試験において用いるために、カーディアックボディズ（商標）を直接埋め込んでもよく、または単細胞の懸濁液に分散させてもよい。
【０１４２】
実施例7：培養条件の比較
本実施例において、心筋細胞の分化培養は、Percoll（商標）分離およびカーディアックボディズ（商標）形成の前に異なる期間行った。
【０１４３】
非分化hES細胞の225 cm2フラスコ7個を用いてEBを作製して、全体でEB懸濁液のプレート21枚を得た。先に述べたように、EBを20％ウシ胎児血清において培養して、4日目にゼラチン上にプレーティングして、その後2または3日毎に新鮮な培地を与えた。12日目に、先に記述したように、分化した細胞のフラスコ4個を密度勾配遠心によって分離して、20日目に残りのフラスコ3個を処理した。4つのPercoll（商標）画分のそれぞれにおけるクラスター形成細胞を単細胞懸濁液に分離した。それらを懸濁培養において増殖させてカーディアックボディズ（商標）を形成し、新鮮な培地を2、5、および6日目に与えた。7日目に、それらを回収して、顕微鏡下で観察した。
【０１４４】
図8（A）は、画分IVの細胞から生成したカーディアックボディズ（商標）の領域を示す（バー＝300 μm）。矢印によって記したクラスターは、自発収縮を行った。図8（B）は、それぞれの調製物における収縮クラスターを計数することによって得た定量的データを示す。画分IVは、自発的収縮細胞の最高比率を示し、開始集団を20日間分化させた場合にはさらに高かった。類似のプロトコールを用いて、クラスターのほとんどが拍動する懸濁液を得た。
【０１４５】
カーディアックボディズ（商標）における心細胞の百分率は以下のように増加させることができることが判明した：Percoll（商標）勾配分離および画分IVのクラスターからの単細胞の分離後、クラスターを、トリプシン処理および培養培地（20％FBS含有培地または好ましくは血清代用剤もしくはCCTを含む無血清培地）中で再懸濁することによって単細胞懸濁液に解離させる。懸濁液を低接着6ウェルプレート（4 mL/ウェル）に移して、2〜3日毎に培地を交換することによって培養した。得られた形成された「二次」カーディアックボディズ（商標）は、最初に形成されたクラスター（14.1％）と比較して、より高い割合の心筋細胞（45.9％、cTNT-陽性細胞に関するフローサイトメトリーによって決定する）を示す。
【０１４６】
その後の実験において、カーディアックボディズ（商標）を表現型マーカーに関して分析して、以下の結果を得た。
【０１４７】
（表4）カーディアックボディズ（商標）の特徴
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【０１４８】
直接分化およびカーディアックボディ（商標）形成に関する技術を組み合わせて、心筋細胞系列細胞の純度および収率を最適にすることができる。例は以下の技法である。
【０１４９】
非分化hES細胞を、Matrigel（登録商標）、ヒトフィブロネクチン、または0.5％ゼラチンを前処置して、FBSと共にプレインキュベートした組織培養プレートまたはフラスコにプレーティングする。細胞を、100 ng/ml bFGFおよび0.5 ng/ml TGFβ1を添加したmEF条件培地、またはXVIVO-10（商標）培地のいずれかによって増殖させる。1週間後、培地をRPMIプラスB27、50 ng/mLアクチビンAおよびBMP-4のような補助剤に交換する。4日後、培地をアクチビンまたはBMPを含まないRPMIプラス補助剤に交換する。細胞を回収するまで（典型的に、アクチビンおよびBMP-4の除去後〜14日）、培養物を2または3日毎に同じ培地に交換する。
【０１５０】
細胞をBlendzyme（商標）消化および不連続Percoll（商標）勾配による遠心によって回収および精製する。画分IV細胞を細胞約1〜500万個/mLに対応する濃度で再懸濁し、遠心管に移す。細胞懸濁液を攪拌せずに室温で10分間インキュベートする。浮遊細胞を軽く吸引することによって除去し、残りのクラスターをPBSによって1回洗浄した後、0.025％トリプシン/EDTAによって単細胞に解離する。細胞を、開始画分IV細胞500万個当たり20％FBS含有培地約4 mL中で再懸濁する。細胞懸濁液を低接着組織培養プレートに移して、2〜4日毎に軽く遠心するか、または室温でカーディアックボディズ（商標）を沈降させてから培地を交換することことによって、培地交換する。カーディアックボディズ（商標）は、懸濁培養1〜2週間後に高比率hES由来心筋細胞源として用いることができる、または回収する前にカーディアックボディ（商標）形成のさらなるラウンドに供することができる。
【０１５１】
実施例8：カーディアックボディズ（商標）の無傷の心筋への移植
インビボでのカーディアックボディズの生存能を評価するために、H7-由来細胞を、成体ヌードラットの非損傷心臓に移植した。H7 hES細胞を用いて、20％FBS含有培地において胚様体を形成した。胚様体を懸濁培養において4日間培養した後、ゼラチンコーティングフラスコに接着させ、胚様体をそこでさらに2週間培養した。カーディアックボディズ（商標）を、上記のように調製して、2〜3日毎に培地交換しながら20％FBS含有培地において1週間懸濁培養において維持した。
【０１５２】
移植実験は、シアトル州、ワシントン大学においてGeron Corpとの支援研究合意の下で、Charles MurryおよびMichael Laflamme両博士によって行われた。移植の24時間前、生存を増加させるためにカーディアックボディズ（商標）に43℃の熱ショックを30分間与えた。移植当日、カーディアックボディズ（商標）を、非損傷ヌードラットの左心室心筋に注射した。1週間後、ラットを屠殺して、心臓を固定し、切片にして、心筋におけるヒト細胞の有無に関して調べた。
【０１５３】
図9は結果を示す。ヒト細胞は、ヒト特異的汎セントロメアプローブ（中央のパネル）とのインサイチューハイブリダイゼーションに基づいて、ラット3匹中2匹において同定された。ヒト細胞はさらに、β-ミオシン重鎖に対する抗体であってヒトオルトログに対して特異的である抗体による標識によって心筋細胞であると同定された（下のパネル）。
【０１５４】
これらのデータは、本発明のhES由来心筋細胞系列細胞が、心筋への移植にとって適していること、そこで細胞は生存して宿主組織に組み入れられることを証明している。
【０１５５】
説明において提供された組成物および技法を、当業者は有効に改変することができ、それらも以下の特許請求の範囲において具体化される本発明に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】分離して、トロポミオシン、タイチン、ミオシン重鎖（MHC）、α-アクチニン、デスミン、心トロポニンI（cTnI）、および心トロポニンT（cTnT）に関して染色した単細胞および細胞クラスターを示す。単細胞およびクラスターは、これら全てのマーカーに関して染色陽性であった。筋節構造の特徴である横紋を認めることができ、これは細胞が収縮活性を示すことができる能力と一致する特徴である。
【図２】hES由来心筋細胞の収縮活性に及ぼす薬理活性物質の作用を示す。L-型カルシウムチャンネル阻害剤であるジルチアゼムは、収縮活性を用量依存的に阻害した。アドレナリン受容体拮抗剤であるイソプレナリン、フェニレフリン、およびクレンブテロールは、変時性作用を示した。
【図３】集団における心筋細胞系列細胞の比率増強能に関する、可能性がある心指向性因子の評価を示す。アクチビンおよび特定の増殖因子を胚様体形成の際に導入した（I群）；ゼラチン上にプレーティングした後に、他の増殖因子（II群）および5-アザ-デオキシ-シチジンを導入した；ならびに分化の際にさらなる因子（III群）を後に添加した。組み合わせを三つの濃度レベルで試験した。最も有効であったのは、5-アザ-デオキシ-シチジンと併用した増殖因子の低濃度であった。
【図４】各群の因子を独立して調節することによる、プロトコールのさらなる精製を示す。心筋細胞の特徴であるα-MHCマーカーは、I群およびII群の因子を低レベルで用いてその後5-アザ-デオキシ-シチジンを用いた場合に、最も大量に産生された。分化の際に後に用いられるIII群の因子は心筋細胞の形成を実際に阻害した。初期心筋細胞-関連遺伝子GATA-4の発現も同様に、これらの条件で改善された。α-MHCおよびGATA-4に及ぼす作用は、如何なる増殖因子の組み合わせを用いても増加した内胚葉関連遺伝子HNF3bと比較して、選択的であった。
【図５】図5（A）は、hES細胞の直接分化によって産生された細胞における心筋細胞表現型の発現を示す。非分化hES細胞をFBSをコーティングしたゼラチン基質上でコンフルエンスになるまで増殖させて、無血清培地においてアクチビンAおよびBMP-4を用いて分化誘導した後、分化因子の非存在下で14日間培養した。実質的により高レベルのミオシン重鎖を発現する細胞集団を得て、通常のように血清含有培地における胚様体から生成された細胞と比較した。アクチビンAおよびBMP-4の除去後、7日目で多数の自発的拍動する領域が明白であった。図5（B）は、心筋細胞系列細胞の特徴である転写因子Nkx2.5およびα-サルコメリックアクチニンの転写に関する細胞の染色を示す。
【図６】hES細胞を、直接分化に関して心筋細胞を作製するために用いる前に既定の培地において増殖させる実験の図である。
【図７】Percoll（商標）画分4個のそれぞれから形成されたカーディアックボディズ（商標）において測定されたcTnIの発現を示す。非分化hES細胞を陰性対照として用いた。画分IVの細胞をカーディアックボディズ（商標）として培養すると、αMHCまたはcTnI発現が100〜500倍増加した。
【図８】図8（A）は、画分IVの細胞から形成されたカーディアックボディズ（商標）の領域を示す（バー＝300 μm）。矢印によって示したクラスターは自発的収縮を行っていた。図8（B）は、分化の12または20日後に、Percoll（商標）画分のそれぞれからカーディアックボディズ（商標）を調製した場合の、拍動するクラスターの比率を示す。20日の分化期間、最高密度画分の分離、およびカーディアックボディズ（商標）のその後の7日間培養を組み合わせることによって、自発的収縮を行うクラスターの最高比率が得られた。
【図９】インビボで投与した場合、本発明の心筋細胞系列細胞が心筋において組み入れられて持続することができることを示す。H＆E染色（上のパネル）を、ヒト特異的汎セントロメアプローブ（中央のパネル）、およびヒトβ-ミオシン重鎖に対して特異的な抗体（下のパネル）による染色と比較して、移植領域にhES由来心筋細胞が存在することを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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