(57)【要約】本発明は、新たな細胞死誘導ペプチドに関し、より詳細には、アポトーシスを誘発するＢｃｌ−２ファミリーの中、“BH3-only”メンバーであるＮｏｘａのＣ-末端部位の特定のペプチドが、癌細胞を殺す活性を持つことを見出して開発した、新たな細胞死誘導ペプチドと、これを含む細胞死誘導融合蛋白質に関する。  本発明によれば、細胞死誘導ペプチドが、従来のＴＲＡＩＬなどの細胞死誘導蛋白質に比べて、遥かに強力な細胞死滅活性を示すので、死滅を要する各種細胞の治療、特に、癌細胞の治療に効果的に用いることができる。
2007535916.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
序列番号１のアミノ酸序列、または、これと７０％以上の相同性を持つアミノ酸序列を含む、細胞死誘導ペプチド。
【請求項２】
前記７０％以上の相同性を持つアミノ酸序列は、２、３、５及び９番目のアミノ酸序列がロイシンであることを特徴とする請求項１に記載の細胞死誘導ペプチド。
【請求項３】
序列番号７の１２乃至２１番目のアミノ酸序列を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞死誘導ペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞死誘導ペプチドのアミノ酸序列を暗号化する塩基序列を含む、DNA又はRNAオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載の細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ)と蛋白質運搬ドメイン(ＰＴＤ)とを融合して含む、細胞死誘導融合蛋白質。
【請求項６】
蛋白質運搬ドメイン(ＰＴＤ)は、HIV-1 Tat蛋白質、ショウジョウバエ・アンテナペディア(Drosophila Antennapedia)のホメオドメイン(homeodomain)、HSV VP22の転写調節断白質、vFGFから誘導されたMTSペプチド、Penetratin、Transportan、または、Pep-１ペプチドに由来したことを特徴とする請求項５に記載の細胞死誘導融合蛋白質。
【請求項７】
蛋白質運搬ドメイン(ＰＴＤ)は、序列番号３のアミノ酸序列を含むことを特徴とする請求項５に記載の細胞死誘導融合蛋白質。
【請求項８】
請求項１に記載の細胞死誘導ペプチドと癌細胞標的ドメイン(ＣＴＤ)とを融合して含む、細胞死誘導融合蛋白質。
【請求項９】
癌細胞標的ドメインは、癌細胞特異レセプターを標的とするリガンド、癌細胞特異抗原を標的とする単クローン抗体、リポソーム、及びポリマーから構成された群から選ばれたことを特徴とする請求項８に記載の細胞死誘導融合蛋白質。
【請求項１０】
請求項４から９のいずれか１項に記載の融合蛋白質を有効成分として含む、細胞死誘導用の医薬的組成物。
【請求項１１】
癌細胞の治療に使用されることを特徴とする請求項１０に記載の医薬的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな細胞死誘導ペプチドに関し、より詳細には、アポトーシス(apoptosis)を誘発するＢｃｌ−２ファミリーの中、“ＢＨ３-only”メンバーであるＮｏｘａのＣ-末端部位の特定のペプチドが、癌細胞を殺す活性を持つことを見出して開発した、新たな細胞死誘導ペプチドと、これを含む細胞死誘導融合蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、多細胞生物においてプログラムされた細胞の死(programmed cell death)を称する用語であり、正常細胞の成長、細胞の恒常性の維持、癌のような疾病から防御、ウイルスやバクテリアの感染から自身を防御することに、その重要な生理学的意味を有している。
【０００３】
このようなアポトーシスを促進させるＢｃｌ−２ファミリー(family)蛋白質の例として、Ｂａｘ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂｉｄ、Ｎｏｘａなどが知られている。これらの蛋白質は、細胞死滅を決定する役割を果たすＢｃｌ−２相同性部位(homology domain)であるＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３及びＢＨ４などを持っている。この中で、Ｎｏｘａは、Ｂｃｌ−２ファミリーの“ＢＨ３-only”メンバーであり、x-rayに露出されたマウス細胞で初めて見出されており、ｐ５３-誘導されたアポトーシスの媒介者として知られている(Oda E et. al., 2000, Science, 288(5468), 1053-8)。ＢＨ３ドメインは、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質でよく知られているドメインにアポトーシスを誘導するにあたって決定的な役割を果たすものとして知られている。特に、Ｂｉｄ蛋白質に由来したＢＨ３ドメインペプチドは、その自体としてアポトーシスを誘導できる機能を有していると報告されている(Letai et. al., 2002, Cancer cell, 2, 183-192)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
human Noxaは、ミトコンドリアの機能を調節して、アポトーシスを起こすと知られている。本発明者は、human Noxaにおいてアポトーシスの誘導に重要な役割を果たすＢＨ３ドメインの他、Ｃ-末端部位でミトコンドリア標的化ドメイン(ＭＴＤ: mitochondria targeting domain)を見出した(Seo et. al., 2003, JBC, 278, 48292-48299)。Human Noxaは、ミトコンドリアに作用してシトクロムｃの排出を誘発することで、カスパーゼ(caspase)活性を促進させて細胞死に至るようにする。ＭＴＤドメインは、Ｎｏｘａ蛋白質がミトコンドリアへ移動するのに必要なドメインであり、このドメインを除去したり、切断すれば、ＢＨ３ドメインを持っているＮｏｘａ蛋白質であっても、細胞を殺す機能を喪失してしまう。したがって、ＭＴＤドメインは、Ｎｏｘａ蛋白質が細胞死を起こすのに非常に重要な役割を果たすドメインとされる。しかし、ＢＨ３ドメイン無しで、ＭＴＤドメインだけでは、アポトーシスを起こせないと知られてきている。
【０００５】
本発明者等は、従来のＮｏｘａ蛋白質のＣ-末端部位に存在し、ＢＨ３ドメインを補助して、単にミトコンドリアの標的化の役割を果たすと知られたＭＴＤドメインが、蛋白質の運搬ドメイン(ＰＴＤ)であるＲ８と組み合わせられた際に、強力に癌細胞株(例えば、ＨｅＬａ、HCT116)の細胞死を起こせるということを見出して、新たな細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ:cell-killing peptide)である本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明の主な目的は、Ｎｏｘａ蛋白質のＣ-末端部位に由来した新たな細胞死誘導ペプチドを提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記ペプチドを融合して作った新たな細胞死誘導融合蛋白質を提供することにある。
【０００８】
本発明の更に他の目的は、前記融合蛋白質を含む細胞死誘導用薬学的組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明の目的を達成するために、本発明は、序列番号１のアミノ酸序列、又は、これと７０％以上の相同性を持つアミノ酸序列を含む細胞死誘導ペプチドを提供する。
【００１０】
本発明では、従来のアポトーシスを誘発するＮｏｘａにおいて、ミトコンドリア標的ドメインとして知られたペプチドが、癌細胞を効果的に殺す活性を持つことを初めて見出して、前記ペプチドを細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ:cell killing peptide)と命名した。前記Ｎｏｘａに由来した細胞死誘導ペプチドは、序列番号１のKLLNLISKLF(Lys-Leu-Leu-Asn-Leu-Ile-Ser-Lys-Leu-Phe)のアミノ酸序列を有する。
【００１１】
本発明の細胞死誘導ペプチドは、従来のペプチド合成法、例えば、Fmocケミストリー(chemistry)を用いた固状(solid)ペプチドの合成法によって化学的に合成することができる。また、前記ペプチドをコーディングするオリゴヌクレオチドを自動合成器で合成したり、Ｎｏｘａ遺伝子の塩基序列(NCBI GenBank number:NM_021127)からＭＴＤドメイン(41-50)をコーディングする塩基序列を選択的にＰＣＲ(polymerase chain reaction)増幅して適宜なベクトルに組み込んだ後、インビボ(in vivo)において転写(transcription)及び翻訳(translation)を経て発現、精製して製造することもできる。
【００１２】
本発明の細胞死誘導ペプチドは、序列番号１のアミノ酸序列と少なくとも７０％以上の相同性を持っていると、本発明の細胞死誘導活性を示すことができる。本発明の細胞死誘導ペプチドの天然序列と変移体序列との間の相同性の程度(比率)は、例えば、この目的のために通常的に使用されるコンピュータプログラムを用いて、２つの序列を比較することにより測定することができる。一つの適切なプログラムは、デベロー(Devereux)などの文献[Nucl.Acids Res.12:387, 1984]に記載されたように、バージョン６.０のＧＡＰコンピュータプログラムであり、ウィスコンシン大学の遺伝学コンピュータグループ(UWGCG)から購入可能である。ＧＡＰプログラムは、スミス(Smith)及びウォーターマン(Waterman)により改正されたように[Adv.Appl.Math2:482, 1981]、ニードルマン(Needleman)及びブンシュ(Wunsch)の整列方法[J.Mol.Biol. 48:443, 1970]を用いる。したがって、本発明のペプチドの変形体は、序列番号１の細胞死誘導ペプチドと実質的に同質的なペプチドや、１つ乃至３つのアミノ酸の結実、挿入、または、置換により、部分的に異なるたアミノ酸序列を有することができる。例えば、全体的なペプチドの２次構造と生化学的な性質とに影響を与えることなく、非極性残基ら(例:Ile、Leu、Phe、または、Trp)間、あるいは、極性残基ら(例:Gly、Lys、Arg、Glu、Asp、Gln、Asn)間で置換することが可能である。本発明のペプチドの変形体に対する実験は、実施例４及び図６により裏付けられる。
【００１３】
本発明の細胞死誘導ペプチドにおいて、望ましくは、前記７０％以上の相同性を持つアミノ酸序列は、２、３、５及び９番目のアミノ酸序列がロイシン(Leucine)であることを特徴とする。前記序列番号の１の細胞死誘導ペプチドは、２、３、５及び９番目の序列にロイシンが繰り返し現れており、これらの序列が、細胞死の能力に重要な役割を果たすということを、実施例４及び図６において実験で証明した。
【００１４】
本発明の細胞死誘導ペプチドは、細胞内に導入されることで細胞を死滅させる効果を達成する。細胞に導入する手段としては、従来に知られたエレクトロポレーション及びマイクロ・インジェクションのような機械的方法(Wong, T.K.&Neumann, E.(1982) Biochem.Biophys.Res.Commun.107, 584-587)、ビヒクル及びリポソームとの融合のような融合方法(Celi, J. E., ed.(1998) in Cell Biology:a laboratory handbook, 2nd. ed., Vol.4.(Acad Press, San Diego, Calif.));ATP、または、ＥＤＴＡ使用のような化学的方法(Rozengurt, E., et al.(1975) Biochem.Biophys.Res.Commun.67, 1581-1588)、または、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のα-トキシンのようなポア(pore)-形成トキシンとの混合方法(Grant、N.J., Aunis D.&Bader, M.F.(1987) Neuroscience 23, 1143-1155)などを用いることができる。
【００１５】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記本発明の細胞死誘導ペプチドのアミノ酸序列を暗号化する塩基序列を含むＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドの例として、human Noxa遺伝子の３'末端部位に由来した序列番号２の塩基序列が挙げられる。
【００１６】
本発明の更に他の目的を達成するために、本発明は、前記本発明の細胞死誘導ペプチドと蛋白質運搬ドメイン(ＰＴＤ:protein transduction domain)とを融合して含む細胞死誘導融合蛋白質を提供する。
【００１７】
本発明の細胞死誘導ペプチドを細胞内に導入(permeable peptide transduction)するために、蛋白質運搬ドメイン(ＰＴＤ:protein transduction domain)を前記ペプチドと融合して融合蛋白質を生成した。前記蛋白質運搬ドメイン(ＰＴＤ)は、リシン(lysine)/アルギニン(arginine)などの塩基性(basic)アミノ酸残基らを主に含んでおり、これと融合した蛋白質を、細胞膜を透過して細胞内に浸透させる役割を果たす。前記蛋白質運搬ドメイン(ＰＴＤ)は、望ましくは、HIV-1 Tatの蛋白質、ショウジョウバエ・アンテナペディア(Drosophila Antennapedia)のホメオドメイン(homeodomain)、HSV VP22の転写調節蛋白質、vFGFから誘導されたMTSペプチド、Penetratin、Transportan、または、Pep-1ペプチドに由来したことを特徴とし、より望ましくは、８つのArgアミノ酸を人為的に合成した序列番号３のアミノ酸序列を含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明の細胞死誘導ＰＴＤ-融合蛋白質は、アミノ酸残基の個数が少ないために、従来のペプチド合成法、例えば、Ｆｍｏｃケミストリー(chemistry)を用いた固状ペプチド合成法によって化学的に合成することができる。また、前記ＰＴＤと蛋白質とを接合させて発現させることのできるｐＴＡＴベクトル(vector)のような公知の発現ベクトル(ジェニファー・エンベリー(Jennifer Embury)など、Diabetes, August, 2001参照)に、前記ＣＫＰを暗号化する塩基序列を挿入した再組合せベクトルを作製した後、インビボにおいてＰＴＤ-ＣＫＰ融合蛋白質を発現、精製して製造することができる。
【００１９】
具体的に、本発明のＣＫＰペプチドを細胞内に伝達させるために、ＰＴＤドメインＲ８ＧをＣＫＰペプチドのＮ末端に付けて、細胞死活性を有する融合蛋白質をペプチド合成法にて直接生成した。前記融合蛋白質は、RRRRRRRRG(RQ)KLLNLISKLF(序列番号４)のアミノ酸序列を有しており、Ｒ８は、８つのArgアミノ酸を意味し、(RQ)は、リンカー序列を意味する。
【００２０】
本発明の更に他の目的を達成するために、本発明は、前記本発明の細胞死誘導ペプチドと癌細胞標的ドメイン(ＣＴＤ:cancer targeting domain)とを融合して含む細胞死誘導融合蛋白質を提供する。
【００２１】
本発明の細胞死誘導ペプチドを、癌細胞を標的として選択的に導入させるために、癌細胞標的ドメイン(cancer targeting domain)を前記ペプチドと融合して融合蛋白質を生成した。前記癌細胞標的ドメインは、癌細胞の表面に特異的に発現するレセプター、または、抗原などを認識できるリガンド、または、単クローン/多クローン抗体だけではなく、癌組織の血管を通過できるポリマー、細胞膜を透過できるリポソームなどを含む。前記抗体という用語は、抗原の結合部位を有するある抗体-類似分子を意味し、Fab'、Fab、F(ab').sub.2、シングル・ドメイン・抗体(single domain antibodies)(DABs)、Fv、scFv(シングル・チェーン(single chain) Fv)、リニアー抗体(linear antibodies)、ディアボディス(diabodies)などのような抗体断片を含む。前記融合という用語は、接合(conjugation)及びカプセル化(encapsulation)の意味を含み、蛋白質は、アミノ酸の以外の化学物質を含むことができる。前記癌細胞標的ドメインは、望ましくは、乳癌抗原を標的からするボンベシン(bombesin)及び短いテトラペプチド(ＥＰＰＴ)、前立腺特異抗原(ＰＳＡ)を標的とする単鎖抗体断片(scFv)、上皮細胞癌特異抗原ＣＥＡを標的とする抗-CEA単クローン抗体、癌細胞のＥＧＦレセプターを標的とする抗-ＥＧＦ-Ｒ単クローン抗体、癌細胞のＨＥＲ２を標的とする抗-ＨＥＲ２ ＳＬ、その他、単クローン抗体(例、mAb CD20、mAb HER2、mAb CD33、mAb 105等)、血管標的媒介者(vascular-targeting agents)(ZD6126、AVE8062、Oxi4503等)、リポソーム(liposome)、ＰＥＧ(polyethylene glycol)、ＨＰＭＡ(N-(２-Hydroxypropyl)methacrylamide)copolymer等から選ばれたことを特徴とする。
【００２２】
本発明の細胞死誘導ＣＴＤ-融合蛋白質は、アミノ酸残基の個数が少ない場合は、従来のペプチド合成法、例えば、Fmocケミストリー(chemistry)を用いた固状ペプチド合成法によって化学的に合成できる。また、融合蛋白質のアミノ酸残基の個数が多い場合は、前記単クローン抗体をコーディングする遺伝子をＰＣＲ(polymerase chain reaction)増幅し、前記ＣＫＰペプチドをコーディングするオリゴヌクレオチドを自動合成器で合成したり、ＰＣＲ増幅して、両者をフレームに合わせて(in frame)融合した後、融合遺伝子を適宜なベクトルに挿入し、その後、インビボで転写(transcription)及び翻訳(translation)を繰り返し発現、精製して製造することもできる(Zhao Jなど, J Biol Chem. 2004 Mar 5参照)。また、本発明のＣＫＰペプチドがＰＥＧコーディングされた(coated)リポソーム(liposome)にカプセル化(encapsulation)されて融合蛋白質を製造することもできる(Sharpe Mなど、Drugs. 2002;62(14):2089-126参照)。また、本発明のＣＫＰ及び単クローン抗体の融合体がＨＰＭＡコポリマー(copolymer)のオリゴペプチド測鎖に接合(conjugated)されて融合蛋白質を製造することもできる(Kovar Mなど, J Control Release. 2003 Oct 30;92(3):315-30参照)。
【００２３】
本発明の融合蛋白質において、細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ)と蛋白質運搬ドメイン(ＰＴＤ)、または、癌細胞標的ドメイン(ＣＴＤ)との間には、ＣＫＰの細胞死誘導活性に邪魔にならない程度の長さのアミノ酸序列、または、細胞内で分解可能な化学的連鎖(intra cellular degradable chemical linkages)のようなリンカーを含むことができる。
【００２４】
本発明の更に他の目的を達成するために、本発明は、前記本発明の融合蛋白質を有効成分として含む細胞死誘導用の医薬的組成物を提供する。
【００２５】
望ましくは、本発明の医薬的組成物は、癌細胞の治療に使用されることを特徴とする。
【００２６】
本発明の医薬的組成物は、薬理学的分野において公知の方法により製造することができ、融合蛋白質そのもの、または、薬学的に許容される担体、賦形剤、稀釈剤などと混合して、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、または、注射剤などの剤型で製造されて使用することができる。また、これらは、経口、または、非経口で投与することができる。
【００２７】
本発明の医薬的組成物を投与する投与量は、患者の年齢、性別、状態、疾病の症状によって適切に選択することができ、望ましくは、成人の癌患者を基準として、１日５０-１００mg(有効成分)の量が投与される。
【００２８】
本発明では、細胞死誘導ペプチドが、ＰＴＤドメイン、または、ＣＴＤドメインと組み合わせられた際に、強力に癌細胞株(例えば、ＨｅＬａ)の細胞死を起こせるということを証明した。このような細胞死がどの経路を通じてなされるかについては、まだ知られていないが、通常のアポトーシスよりも強力な細胞死滅の効果を奏する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、従来アポトーシスを誘発するＢｃｌ−２ファミリーの中、“ＢＨ３-only”のメンバーとして知られたＮｏｘａ蛋白質のＣ-末端部位に存在する特定のペプチドである細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ)を、蛋白質運搬ドメイン(ＰＴＤ)、または、癌細胞標的ドメイン(ＣＴＤ)と組み合わせた際に、強力に癌細胞株(例えば、ＨｅＬａ、HCT116)の細胞死を起こすことができる。したがって、本発明の細胞死誘導ペプチドが、従来のＴＲＡＩＬ(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)などの細胞死誘導蛋白質に比べて、遥かに強力な細胞死滅活性を示すので、死滅を要する各種細胞の治療、特に、癌細胞の治療に効果的に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、実施例に基づき、本発明をより詳細に説明することにする。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであるので、本発明の範囲が、これらの実施例により制限されるものと解析されるべきではない。
【００３１】
＜実施例１:ペプチド合成＞
ペプチド合成は、０.２５mmolを単位とする受動Fmoc合成方法を基本的に用いた。具体的に記述すれば、レジンをＤＭＦ(4x)で清潔に洗った後、１０mlの２０％ピペリジン(piperidine)/ＤＭＦ溶液をレジンに入れた。１分間よく混ぜた後、上記の溶液を除去し、再び１０mlの２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液をレジンに入れた。３０分間振った後、再びレジンをＤＭＦ(4x)で洗って、ピペリジンが残っていないことをニンヒドリン試験(ninhydrin test)をして確認した(レジンが青色にならなければならない)。カップリング段階を進行するために、下記の溶液を準備した:１mmol Fmoc-アミノ酸(amino acid)、２.１ml ０.４５M HBTU/HOBT(１mmol)、３４８μL DIEA(２mmol)。上記の溶液をレジンに入れて、３０分間振った。溶液をレジンから注ぎ出した後、ＤＭＦ(4x)を入れてレジンを洗浄した。次いで、アミノ酸をカップリングさせるために、上記の溶液を入れた後、上記のカップリング段階を繰り返し、ＰＴＤと結合された形態の本発明のＣＫＰペプチド(序列番号４:RRRRRRRRGRQKLLNLISKLF)を合成した。このような方法にて合成されたペプチドは、ＨＰＬＣ(機器:Waters ２６９０ セパレイション・モジュール(separations module)、流速(Flow rate):１.０ml/min、勾配(Gradient):０％-２０％ Ｂ ５分;２０％-５０％ Ｂ ２０分;５０％-８０％ Ｂ ５分、Ａ;０.１％ ＴＦＡ水(water)、Ｂ;０.１％ ＴＦＡアセトニトリル(acetonitrile)、カラム(column):水(Waters) Ｃ１８、５ミクロン、検出(Detection):２２０nm、純度(purity):９５％)、そして、質量分析(機器:ＨＰ１１００series ＬＣ/ＭＳＤ)をした。合成されたペプチドは、水に１mM濃度で溶かし、-８０℃で保管して使用した。
【００３２】
＜実施例２:ＣＫＰペプチドの細胞死誘導実験＞
実施例１で製造されたＣＫＰペプチドの細胞死誘導活性を試験するために、子宮頸癌の細胞株であるＨｅＬａ細胞を培養した後、培養液を、ＣＫＰペプチドを０、１、５、１０、１５、２０、３０、４０μMを持っている培養液に交替した後、２４時間更に培養した。底に付いている生きている細胞を染色するために、１００μｌ ０.５％ クリスタル・バイオレット溶液で１０分間染色した。培養液に浮んでいる、死んだ細胞を除去することと同時に、クリスタル・バイオレット溶液の脱染色のために、蒸溜水、または、水道水で清潔に洗い流した。培養容器を蛍光灯ボックスに置いて、カメラで写真を撮った結果を、図３に示した。クリスタル・バイオレットで染色された青色は、底に付いている生きている細胞を表すものである。図３から分かるように、本発明のＣＫＰペプチドは、１０μMから顕著な細胞死誘導活性を示した。
【００３３】
＜実施例３:ＣＫＰペプチドとＰＴＤドメインとの細胞死誘導の比較実験＞
本発明のＣＫＰペプチドの細胞死誘導効果が、なるほど、ＰＴＤではなく、ＣＫＰによる効果であるかを確認するために、ＣＫＰ部位のないＰＴＤドメインだけを実施例１の方法にて合成して、本発明のＣＫＰペプチドと細胞死誘導の比較実験をした。実験方法は、実施例２で説明した方法と同様の方法にて実験した。図４から分かるように、ＣＫＰ部位のないＰＴＤドメインだけの場合には、細胞死誘導活性が現れないが、本発明のＣＫＰペプチドの場合には、顕著な細胞死誘導活性を示した。また、細胞の模様を正確に観察するために、図４で得られた培養容器を、光学顕微鏡(Nikon、Model:Optiphot-２、Japan)で１００倍拡大して写真を撮って、図５に示した。コントロール(control)は、ペプチド(peptide)を処理していないＨｅＬａ細胞であり、ＣＫＰは、ＣＫＰペプチドを処理したＨｅＬａ細胞であり、ＰＴＤは、ＣＫＰ部位のないＰＴＤドメインである。
【００３４】
＜実施例４:ＣＫＰペプチドの変移体による細胞死誘導実験＞
本発明のＣＫＰペプチドの一部のアミノ酸を置換した変移体も、細胞死誘導活性を示すかを調べるために、１乃至３つのアミノ酸残基が置換されたＣＫＰペプチドの変移体ＣＫＰ２(１つ置換)、ＣＫＰ３(２つ置換)、ＣＫＰ４(２つ置換)、ＣＫＰ５(３つ置換)を、実施例１の方法によって合成した。これらは、各々、RRRRRRRRGRQKALNLISKLF(序列番号５)、RRRRRRRRGRQKLAALISKLF(序列番号６)、RRRRRRRRGRQKLLNLIAALF(序列番号７)、RRRRRRRRGRQKALNLIAALF(序列番号８)のアミノ酸序列を有している。また、ＣＫＰから繰り返し現れる序列である、ロイシンの置換についての影響を調べるために、ＣＫＰペプチドの変移体ＣＫＰ６(２、３番目のLをAに置換)、ＣＫＰ７(５番目のLをAに置換)、ＣＫＰ８(９番目のLをAに置換)を、実施例１の方法によって合成した。これらは、各々、RRRRRRRRGRQKAANLISKLF(序列番号９)、RRRRRRRRGRQKLLNAISKLF(序列番号１０)、RRRRRRRRGRQKLLNLISKAF(序列番号１１)のアミノ酸序列を有している。これらの変移体がＨｅＬａ細胞に対する細胞死の能力をどのように表すのかを観察するために、実施例２で説明した方法にて実験したし、図６の結果を得た。ＣＫＰ２、ＣＫＰ３、ＣＫＰ５ペプチドは、ＣＫＰペプチドに比べて細胞死誘導能力がやや減少したが、ＣＫＰ４ペプチドは、ＣＫＰペプチドよりもむしろ優れた細胞死能力を表した。また、ロイシンが置換されたＣＫＰ６、ＣＫＰ７、ＣＫＰ８ペプチドは、ＣＫＰペプチドに比べて細胞死誘導能力が多く減少し、これらのロイシン序列が、ＣＫＰの細胞死能力に重要な役割を果たす領域であることが分かった。
【００３５】
＜実施例５:ＣＫＰペプチドと他のＢＨ３ドメインとの融合体による細胞死誘導実験＞
本発明のＣＫＰペプチドがＮｏｘａではなく、他のＢＨ３ドメインと融合した時も、細胞死誘導活性を示すかを調べるために、自然状態でＣＫＰ序列を有していないＢｉｄＢＨ３とＣＫＰとの融合体であるＢｉｄＢＨ３ＣＫＰ(序列番号１２)を合成した。前記融合体が、ＨｅＬａ細胞に対する細胞死能力をどのように表すかを観察するために、実施例２のような方法にて実験した。その結果、図１０から分かるように、ＢｉｄＢＨ３も細胞死能力があるが、ＢｉｄＢＨ３ＣＫＰの融合体が２倍以上強い細胞死能力を現すことが分かった。
【００３６】
また、前記ＢｉｄＢＨ３ＣＫＰの融合体による細胞死滅が、カスパーゼに依存的であるのかを調べるために、汎カスパーゼ阻害剤(pan-caspase inhibitor)であるz-VAD-fmk(Calbiochem、USA)を添加したものと、添加していないものとの細胞死の能力を、実施例２の方法にて実験して比較した。その結果、図１１から明らかなように、z-VAD-fmkを添加したものと、添加していないものとの細胞死の能力に大きな差がないことから、ＢｉｄＢＨ３ＣＫＰの融合体による細胞死滅は、カスパーゼに非依存的であることがわかった。
【００３７】
また、前記ＢｉｄＢＨ３ＣＫＰの融合体による細胞死滅が、ＢｉｄＢＨ３またはＣＫＰによるものであるのかを調べるために、ＢＨ３ドメインの活性をなくした突然変異ＢｉｄＢＨ３とＣＫＰとの融合体であるＢｉｄ(mt)ＢＨ３ＣＫＰ(序列番号１３)を合成した。前記突然変異融合体がＨｅＬａ細胞に対する細胞死能力を表すかを観察するために、実施例２のような方法にて実験した。その結果、図１２から分かるように、Ｂｉｄ(mt)ＢＨ３ＣＫＰも細胞死能力を表すので、ＣＫＰにより細胞死滅活性を示すことが分かった。
【００３８】
＜実施例６:ＣＫＰペプチド、ＴＲＡＩＬ、シスプラチン(Cisplatin)による細胞死誘導の比較実験＞
本発明のＣＫＰペプチドによる細胞死類型を調べるために、既存に知られている細胞死誘導物質による細胞死と比較した。ＨｅＬａ細胞株に、ＣＫＰペプチド(１０μM)、ＴＲＡＩＬ(４００ng/ml)、シスプラチン(１００μg/ml)を処理し、ＣＫＰペプチドの場合２０秒、ＴＲＡＩＬの場合４０秒、シスプラチンの場合３分の間隔で、各々１時間４０分、３時間３０分、８時間、４８時間の間、微速度撮影・ビデオ・キャプチャー(time-lapse video capture)顕微鏡(Leica、Model:DMIRBE、ドイツ)とＦＷ４０００ソフトウェアとを用いて写真(４０倍)を撮影した。図７は、得られた写真を、各々表示された時間に従って連続的に示す。ＴＲＡＩＬによる細胞死は、ＴＲＡＩＬを処理した後、１時間３０分程度で始まり、約８時間程度でＨｅＬａ細胞の細胞死が最高レベルに至ることが観察できた。しかし、ＣＫＰペプチドを処理した後、約１０分程度経過すれば、ＨｅＬａ細胞が死に始めることが観察でき、２３分２０秒程度経過すれば、既に殆どのＨｅＬａ細胞が死んでいることが確認できる。図８から分かるように、ＣＫＰペプチドを処理した後、２３分２０秒が経過した写真を拡大して観察すれば、バルーンのような細胞膜が複数個見られた。このような細胞死の形態は、既存に知られているＴＲＡＩＬまたはシスプラチンなどによって誘導されるアポトーシスとは異なる形態の細胞死である。しかし、ＴＲＡＩＬを処理した後、５時間３０分が経過した写真を拡大して観察すれば、ＣＫＰペプチドで観察されたバルーンのような細胞膜が見られなく、細胞が死んでいくことが見られた。
【００３９】
＜実施例７:ＣＫＰペプチド、ＴＲＡＩＬ、シスプラチンによる細胞死誘導の比較実験II＞
本発明のＣＫＰペプチドによる細胞死の強度を調べるために、既存に知られている細胞死誘導物質による細胞死と比較した。子宮頸癌の細胞株であるＨｅＬａ細胞を培養した後、ＣＫＰペプチド、ＴＲＡＩＬ、シスプラチンを、３０μM、１００ng/ml、１００μg/mlずつ各々１時間処理した。実施例５で説明した方法にて２０秒間隔で、各々１時間の間、 微速度撮影・ビデオ・キャプチャー顕微鏡(Leica、Model:DMIRBE、ドイツ)を用いて写真(４０倍)を撮影した。撮影した写真を用いて、生きている細胞の数と死んでいる細胞の数とを数えて(count)、相対的な生存率をグラフに示した。図９から分かるように、１時間でＣＫＰによる細胞の生存率が０-１０％程度に落ちるのに対して、ＴＲＡＩＬまたはシスプラチンによる細胞の生存率は、９５-１００％を維持しており、本発明のＣＫＰが、ＴＲＡＩＬまたはシスプラチンに比べて約９倍以上強力な細胞死活性を示すことが分かる。
【００４０】
＜実施例８:ＣＫＰペプチドと癌標的ドメインとの融合実験＞
癌組織の血管を通過できる水溶性ポリマーであるＨＰＭＡコポリマーのテトラペプチド(tetrapeptidic)測鎖(Gly-Phe-Leu-Gly)にＣＫＰペプチドを付けた接合体(conjugate)を合成した。合成されたＨＰＭＡ-ＣＫＰを、ＨＰＬＣ(機器:水(Waters) ２６９０ 分離モジュール(separations module)、流速:１.０ml/min、勾配(Gradient):０％-２０％ Ｂ ５分;２０％-５０％ Ｂ ２０分;５０％-８０％ Ｂ ５分、Ａ;０.１％ ＴＦＡ水(water)、Ｂ;０.１％ ＴＦＡアセトニトリル、カラム:水(Waters) Ｃ１８、５ミクロン、検出(Detection):２２０nm、純度(purity):９５％)を用いて精製した。精製されたＨＰＭＡ-ＣＫＰ薬物は、使用する時まで-８０℃で保管した。人の乳癌に由来した癌細胞株であるＭＣＦ-７を、ヌード・マウス(Nude mouse)に注射して癌組織を誘発させ、これらのマウスに、ＨＰＭＡ-ＣＫＰを、血中濃度が１０μMになるように注射した。２日に１回ずつ、７日間注射した後、癌組織の大きさを確認した。また、正常組織が損傷しているか否かを、肝、腎臓、血管組織などから観察した。ＨＰＭＡ-ＣＫＰを注射した実験群において、癌組織の大きさが大きく減っているのに対して、対照群においては、癌組織の大きさが増加し続けて、ついに、死んでしまった。
【００４１】
以上で説明したように、本発明によれば、従来のアポトーシスを誘発するＢｃｌ−２ファミリーの中、“BH3-only”メンバーとして知られた、Ｎｏｘａ蛋白質のＣ-末端部位に存在する特定のペプチドである細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ)を、蛋白質運搬ドメイン(ＰＴＤ)または癌細胞標的ドメイン(ＣＴＤ)と組み合わせた際に、強力に癌細胞株(例えば、ＨｅＬａ、HCT116)の細胞死を起こすことができる。したがって、本発明の細胞死誘導ペプチドが、従来のＴＲＡＩＬなどの細胞死誘導蛋白質に比べて、遥かに強力な細胞死滅活性を示すので、死滅を要する各種細胞の治療、特に、癌細胞の治療に効果的に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ)と蛋白質運搬ドメイン(ＰＴＤ:protein transduction domain)とを融合した本発明の融合蛋白質の概略図である。
【図２】細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ)と癌細胞標的ドメイン(ＣＴＤ:cancer targeting domain)とを融合した本発明の融合蛋白質の概略図である。
【図３】ＨｅＬａ細胞に本発明の細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ)を濃度別に処理した後、生きている細胞をクリスタル・バイオレット(crystal violet)で染色した写真である。
【図４】ＨｅＬａ細胞に本発明の細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ)とＣＫＰペプチドとを有さないＰＴＤを処理した後、生きている細胞をクリスタル・バイオレットで染色した写真である。
【図５】ＨｅＬａ細胞に本発明の細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ)とＣＫＰペプチドを有さないＰＴＤを処理した後、生きている細胞を光学顕微鏡で撮影した写真である。
【図６】ＨｅＬａ細胞に本発明の細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ)の各種変移体を処理し、生きている細胞をクリスタル・バイオレットで染色した写真である。
【図７】ＨｅＬａ細胞に対する本発明の細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ)とＴＲＡＩＬとシスプラチン(Cisplatin)とによる細胞死を、時間別に写真撮影した比較実験結果である。
【図８】ＨｅＬａ細胞に対する本発明の細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ)とＴＲＡＩＬとによる細胞死の形態を拡大して撮影した比較実験結果である。
【図９】ＨｅＬａ細胞に本発明の細胞死誘導ペプチド(ＣＫＰ)とＴＲＡＩＬとシスプラチンとを濃度別に処理した後、生きている細胞数を数えて、相対的な生存率を示したグラフである。
【図１０】ＨｅＬａ細胞に本発明のＣＫＰとＢｉｄＢＨ３との融合体(ＢｉｄＢＨ３ＣＫＰ)を濃度別に処理した後、生きている細胞数を数えて、相対的な生存率を示したグラフである。
【図１１】ＨｅＬａ細胞にカスパーゼ阻害剤(caspase inhibitor)であるz-VAD-fmkを処理した培地で、本発明のＣＫＰとＢｉｄＢＨ３との融合体(ＢｉｄＢＨ３ＣＫＰ)を処理した後、生きている細胞をクリスタル・バイオレットで染色した写真である。
【図１２】ＨｅＬａ細胞に本発明のＣＫＰと突然変異ＢｉｄＢＨ３との融合体(Ｂｉｄ(mt)ＢＨ３ＣＫＰ)を濃度別に処理した後、生きている細胞をクリスタル・バイオレットで染色した写真である。
【図１】
2007535916.tif 000003
【図２】
2007535916.tif 000004
【図３】
2007535916.tif 000005
【図４】
2007535916.tif 000006
【図５】
2007535916.tif 000007
【図６】
2007535916.tif 000008
【図７】
2007535916.tif 000009
【図８】
2007535916.tif 000010
【図９】
2007535916.tif 000011
【図１０】
2007535916.tif 000012
【図１１】
2007535916.tif 000013
【図１２】
2007535916.tif 000014
【配列表】
2007535916000001.app
【国際調査報告】
2007535916.tif 000015
2007535916.tif 000016
2007535916.tif 000017