(57)【要約】内皮細胞、神経細胞および平滑筋細胞に典型的なものを含む選択した細胞マーカーを検出不可能または低レベルに有する、単離された骨髄幹細胞（MBSC）を開示する。このような細胞を含む移植体である、医薬用生成物も開示する。BMSCを作製する方法も提供する。本発明は、心臓血管疾患の予防および治療での使用を含む、広範囲の有用な応用を有する。
2007519397.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標準的な細胞マーカー検出アッセイ法によって判定した時、次の細胞マーカー：CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct 4、GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCクラスIレセプターおよびMHCクラスIIレセプターのうち、少なくとも一つ、および好ましくはすべてを検出不可能または低レベルに有する、単離骨髄幹細胞。
【請求項２】
視診によって判定した時、本質的に球形であり、直径約25〜35マイクロメートル未満、および好ましくは約15マイクロメートル未満である、請求項1記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項３】
約30〜40キロベース未満の平均テロメア制限フラグメント長（TRF）を有する、請求項1〜2記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項４】
本質的に正倍数体である、請求項1〜3記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項５】
細胞の正倍数体が、細胞培養において少なくとも約10継代、好ましくは約20〜約200継代の間本質的に維持されている、請求項1〜4記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項６】
内皮細胞（EC）促進条件と接触後に、標準的なEC分化アッセイ法によって判定されるECを形成する、請求項1〜5記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項７】
EC促進条件が血管内皮増殖因子（VEGF）との接触を含む、請求項6記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項８】
平滑筋細胞（SMC）促進条件と接触後に標準的なSMC分化アッセイ法によって判定されるSMCを形成する、請求項1〜7記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項９】
SMC促進条件が血小板由来増殖因子（PDGF）との接触を含む、請求項8記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項１０】
神経細胞促進条件と接触後に標準的な神経細胞分化アッセイ法により判定される神経細胞を形成する、請求項1〜9記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項１１】
神経細胞促進条件が肝細胞増殖因子（HGF）との接触を含む、請求項10記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項１２】
神経細胞促進条件が繊維芽細胞増殖因子4（FGF-4）とのさらなる接触を含む、請求項11記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項１３】
神経細胞促進条件がDMSOまたは薬剤学的に許容されるブチレート塩のいずれかとのさらなる接触を含む、請求項12記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項１４】
アクセサリー心筋細胞と接触後に心筋細胞を形成する、請求項1〜12記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項１５】
少なくとも幾つかの形成が細胞とアクセサリー心筋細胞間の細胞融合と関連する、請求項14記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項１６】
アクセサリー心筋細胞が、インビトロ、エクソビボまたはインビボで維持される、請求項1〜15記載の単離骨髄幹細胞。
【請求項１７】
請求項1〜16記載の単離骨幹髄細胞を少なくとも一つ含む移植体。
【請求項１８】
単離骨髄細胞から産生される心筋細胞をさらに含む、請求項17記載の移植体。
【請求項１９】
単離骨髄細胞により産生されるECをさらに含む、請求項17〜18記載の移植体。
【請求項２０】
単離骨髄幹細胞により産生されるSMCをさらに含む、請求項17〜19記載の移植体。
【請求項２１】
移植体がレシピエント由来の細胞をさらに含み、該レシピエント細胞および骨髄幹細胞が哺乳動物細胞である、請求項17〜20記載の移植体。
【請求項２２】
レシピエント細胞および単離骨髄幹細胞が、同種、自己または同系である、請求項21記載の移植体。
【請求項２３】
移植体がインビボまたはインビトロで維持される、請求項17〜22記載の移植体。
【請求項２４】
骨髄細胞から作られた心筋細胞がCMC特異タンパク質（cTnI）を発現する、請求項18記載の移植体。
【請求項２５】
骨髄細胞から作られたECがILB-4を発現する、請求項19記載の移植体。
【請求項２６】
骨髄細胞から作られたSMCがα-SMAを発現する、請求項20記載の移植体。
【請求項２７】
請求項17〜26記載の移植体を含む、細胞培養体、組織または器官。
【請求項２８】
心臓障害を予防、治療または重症度を軽減するための方法であって、処置を必要としている哺乳動物に対し、該哺乳動物において障害の予防、治療または重症度を軽減するのに十分である、請求項1〜16記載の単離骨髄細胞および請求項17〜26記載の移植体の少なくとも一つを投与する段階を含む、方法。
【請求項２９】
細胞または移植体を少なくとも約一週間、哺乳動物においてインキュベーションする段階をさらに含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
哺乳動物内でのインキュベーションが約2〜8週間の間である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
哺乳動物に対し少なくとも一つの血管形成因子を投与する段階をさらに含む、請求項28〜30記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも一つの血管形成因子またはその機能的フラグメントをコードする、少なくとも一つの核酸を投与する段階をさらに含む、請求項28〜31記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物に対し内皮前駆細胞（EPC）を投与する段階をさらに含む、請求項28〜32記載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物からEPCを単離し、該EPCを少なくとも一つの血管形成因子とエクソビボで接触させる段階をさらに含む、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
心臓障害が、鬱血性心不全（CHF）、虚血性心筋症、心筋虚血または梗塞の一つまたは複数である、請求項28〜34記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物において心臓機能をモニタリングする段階をさらに含む、請求項28〜35記載の方法。
【請求項３７】
モニタリングされる心臓機能が、心エコー検査、左室拡張末期径（LVEDD）、左室収縮末期径（LVESD）、短縮率（FS）、壁運動スコア指数（WMSI）および左室収縮期圧（LVSP）の少なくとも一つである、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
心臓障害を、予防、治療または重症度を軽減するための医薬用生成物であって、以下の成分を少なくとも一つ含む生成物：
請求項1〜16記載の単離骨髄細胞および任意で哺乳動物から細胞を単離することに関する指示；請求項17〜26記載の移植体および任意で移植体を調製、維持および／または使用に関する指示；請求項24記載の細胞培養体、組織もしくは器官、および任意でそれを調製する段階に関する指示。
【請求項３９】
血管形成因子またはその機能的フラグメントを少なくとも一つさらに含む、請求項38記載の医薬用生成物。
【請求項４０】
血管形成因子またはその機能的フラグメントを少なくとも一つコードしている核酸を少なくとも一つさらに含む、請求項38〜39記載の医薬用生成物。
【請求項４１】
下記の工程によって得られる単離骨髄細胞の集団：
a)  約100ミクロン未満、好ましくは約50ミクロン未満、より好ましくは約40ミクロン以下のサイズである骨髄細胞を哺乳動物から採集する工程、
b)  接着細胞を選択する条件下で、採集した細胞を培地で培養（拡大）する工程、
c)  接着細胞を選択し、それらの細胞を培地内で準集密になるまで拡大する工程、
d)  拡大細胞のクローン分離株を作製するために、チャンバー１つあたり細胞が約1個未満の密度になるのに十分に希釈で、培養細胞を調整された培地でチャンバーに連続希釈する工程；および
e)  各クローン分離株を培養（拡大）し、拡大した細胞を含むチャンバーを選択して、単離骨髄細胞の集団を作製する工程。
【請求項４２】
工程が次のマーカー：CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct 4、GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCクラスIレセプターおよびMHCクラスIIレセプターの少なくとも一つを検出可能なレベルで発現していない細胞を収集する段階をさらに含む、請求項40記載の単離骨髄細胞の集団。
【請求項４３】
以下を含む、請求項1〜16記載の単離骨髄細胞を作製する方法：
a)  約100ミクロン未満、好ましくは約50ミクロン未満、より好ましくは約40ミクロン以下のサイズである骨髄細胞を哺乳動物から採集する工程、
b)  採集した細胞を接着細胞を選択する条件下に培地で培養（拡大）する工程、
c)  接着細胞を選択し、それらの細胞を培地内で準集密になるまで拡大する工程、
d)  拡大細胞のクローン分離株を作製するために、チャンバー１つあたり細胞が約1個未満の密度になるのに十分に希釈で、培養細胞を調整された培地でチャンバーに連続希釈する工程；および
e)  各クローン分離株を培養（拡大）し、拡大した細胞を含むチャンバーを選択して、単離骨髄細胞の集団を作製する工程。
【請求項４４】
次のマーカー：CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct 4、GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCクラスIレセプターおよびMHCクラスIIレセプターの少なくとも一つを検出可能なレベルで発現していない細胞を収集する段階をさらに含む、請求項43記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的には、選択された細胞マーカーを検出不可能または低レベル有する単離された骨髄幹細胞（BMSC）に関する。重要なことは、細胞は多分化能性であり、様々な望ましい細胞タイプを作るのに用いることができる。本発明は、心臓血管疾患の予防および治療での使用を含め、広い範囲の有用な応用を有する。
【背景技術】
【０００２】
背景
鬱血性心不全（CHF）が増加し、世界中に広がっていることが強く認識されるようになってきた。いくつかの原因、例えば心筋梗塞（MI)による不可逆的損傷などが提出されている。
【０００３】
梗塞の大きさは、CHFの罹病率および死亡率の主要決定因子である。例えば、左心室（LV）の40%以上を侵す大きな梗塞は、難治性心原性ショックまたは急速な鬱血性心不全の発症と一般的に関連している。長年、心筋の自己修復または再生能力は限定的であり、筋肉の不可逆的損失、ならびにそれに伴う心筋瘢痕の収縮および繊維化が連続する事象、即ち虚血を起こしていない心筋の進行性心室リモデリングを引き起こし、これが最終的に進行性のHFを誘発する。
【０００４】
HFをより詳しく理解するための努力が払われている。例えば、心筋細胞（CMC）生存因子の消失がHFに関係すると考えられている。このことは、HF進行中に、生存心筋細胞の維持を補助する治療法の考案の重要性を示唆している。現在、心筋瘢痕を機能的な収縮組織で置換えることに効果を有する、臨床的に使用されている薬物または方法は示されていない。それ故に、MIおよびHFに伴う罹病率および死亡率の高さを考慮し、血管およびCMCの損失といったこれらの状態の原因である重要な病態生理学的欠損に対処するための新たな取り組みが求められている。
【０００５】
組織特異的幹細胞だけが、その起源の組織の細胞に分化できると広く信じられてきた。しかしながら、少なくともある成体組織特異的幹細胞は、起源組織以外の系列に分化できることが認められつつある。このような可塑性は、分化転換と呼ばれている。骨髄細胞は、神経外胚葉細胞、骨格筋原細胞、CMC、内皮、肝臓および胆管上皮組織、ならびに肺、胃および皮膚上皮のような多くの非造血性組織に再増殖する能力を有すると思われる。最近、多能性成体前駆細胞（MAPC）と呼ばれるBM由来の幹細胞のサブセットがMSCと共に同時精製された。MAPCは盛んに増殖し、三つの胚葉すべての細胞に分化すると考えられている。
【０００６】
BM由来幹細胞の治療応用が試みられている。研究からは、虚血心筋内に移植された内皮前駆細胞（EPC）、血管芽細胞またはCD34(+)細胞が、血管新生の増殖巣内に組み込まれ、そしてMI後のLV機能に良好な影響を有することが示されている。別の研究では、より多面的なBM由来造血幹細胞（HSC）の潜在能力が記載されている。
【０００７】
心臓再生の可能性が探究されている別の成体幹細胞供給源は、非造血性間葉性幹細胞（または骨髄間質細胞、MSC）である。MSCは成体BM由来であることが、多系列分化能を有している。培養中、MSCは、未分化の、安定した表現形を多世代にわたって維持できる。MIの動物モデルでは、マウス、ウシおよびヒトのMSCが心筋形成分化できることも記載されている。
【０００８】
BM由来のSCが心筋組織を再生する能力を持つことが報告されているが、このような未熟細胞が臨床的に大きな可能性を有しているかについては明らかではない。
【０００９】
例えば、BMが可塑性を持つ細胞集団を含んでいるという山のような証拠が示される一方、単一細胞レベルから高度に未分化なSCを単離し、拡大できるかについては不確かである。SCクローンの拡大は、治療の信頼性と有効性を高める一つの方法として重要である。よりさらには、MAPCのようないくつかのBM細胞を培養する過去の試みは、大量のサイトカイン処理を必要としたことが、それらを臨床使用にとって魅力のないものにした。より重要なことは、MAPCが示した胚盤胞内注入後の心筋への生着が極めて低いことである。Lin- c-KIT+細胞または血管芽細胞のようなある種のBM細胞は、インビボで、各種心筋組織のかなりの部分を再生することが示されている。しかしながら、これらの細胞は極めて稀少であり、培養法を受け入れない。
【００１０】
BMの使用に関連して、特に治療への応用には別の欠点もある。例えば、心筋傷害モデルにおいて、単一のヒトSCが血管新生と筋形成の両方に関与するか確定していない。ヒトのMSCを用いた研究では、ECの分化は証明されていない。MSCを用いた研究は、免疫組織学的染色によって心筋原性表現形への分化を証明しているが、しかし組み込まれた細胞の数は少数であり、形態学的特徴は成熟したCMCとは一致しなかった。
【００１１】
それゆえに、これら、およびその他の欠点が、心筋梗塞のような心臓障害に伴う症状の予防、治療および重症度軽減に用いることができる細胞供給源としてのBMの使用を制限している。
【００１２】
クローン化単離体として単離および組織培養で維持するのに便利なBM細胞を得ることが望まれている。このようなBM細胞を、多能性クローンとして、特にEC、SMCおよびCMC細胞の少なくとも一つ、好ましくは三つすべての供給源として維持できれば、特に望ましいだろう。このようなBM細胞を疾患または損傷した心臓組織に移植して、付随する症状の予防、治療または軽減を助けることができれば、より望ましいだろう。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
我々は、一またはごく少数の骨髄細胞から培養（拡大）可能な新しいクラスの多能性骨髄幹細胞（BMSC）を発見した。好ましいBMSCは、長期間増殖でき、少なくとも三系統に分化できる。BMSCからのこれら細胞の形成は制御可能であり、移植体を含む分化細胞および組織の、潜在的に無制限な供給源を提供するのに用いることができる。本発明は、このような治療を必要としているレシピエントへのBMSC（またはそこに由来する細胞）の移植を包含する治療を含め、広範囲の重要な応用を有する。
【００１４】
より具体的には、多能性（即ち可塑性）であり、少なくとも約50回の集団倍加（PD）、より一般的には少なくとも約100PD、そして通常は約140PD以上にわたり検出可能な老化をせず、または可塑性を失うことなく、培養によって増殖できる新規幹細胞（SC）集団を我々は骨髄（BM）から単離した。一つの局面では、我々は、ヒト骨髄より得たBMSCをクローン的に拡大し（hBMSCと呼ぶ）、それらが造血性SC、間葉性SC、または内皮前駆細胞（EPC）のような多能性成体前駆細胞のような公知BM由来SC集団には属さないことを見出した。重要なことに、本発明の好ましいBMSCは、適切な手掛かりが与えられれば少なくとも三種類のタイプの細胞、特に内皮細胞（EC）、平滑筋細胞（SMC）および心筋細胞（CMC）に分化できる。この態様では、本発明は、例えば梗塞に関連するものを含めた様々な心臓血管疾患に関係する障害を予防、治療または軽減するのに必要な細胞および組織（移植体を含む）の潜在的に無制限の供給源を提供するのに好適である。
【００１５】
したがって、また一つの局面では、本発明は以下の細胞マーカーの少なくとも一つ、および好ましくはすべてを検出不可能または低（無視できる）レベルで有している、骨髄幹細胞（BMSC）の、単離集団を提供する：標準的な細胞マーカー検出アッセイ法によって判定されるところのCD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct 4、GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCクラスIレセプターおよびMHCクラスIIレセプター。
【００１６】
このようなBMSCには、重要な使用および利点がある。例えば、BMSCは極めて可塑性に富んでおり、これを用いて潜在的に無制限の細胞および組織の供給源を提供して、特に再生治療を必要としている心臓血管障害に対処できる。他のSCを用いて、これらの障害に取り組むことが試みられているが、このような細胞は本明細書記載のBMSCに比べて可塑性が低い。患者は、様々な心臓血管細胞および組織を提供できる治療法がないために苦しんでいる。本発明は、まず一種類または多種類の心臓血管細胞、特にEC、SMCおよびCMCに容易に転換できるBMSCを提供することでこの要求に取り組んでいる。BMSCをヒト患者（hBMSC）のような霊長類から単離する態様では、このような細胞はエクソビボ（例えば一または複数の分裂促進因子を用いて）で維持および／または処理し、患者（または家族のような免疫学的に関係のある個体）に戻し（移植し）、心臓血管疾患を治療することができる。本発明のこの特徴は、例えばウイルスによる予期せぬ感染および移植した細胞の免疫学的拒絶のリスクを下げるのに役立つ。または、もしくはこれに加えて、BMSCを患者から単離してエクソビボで処理し（分裂促進因子を用いて、または用いず）、特定態様において少なくとも患者に対して同種、好ましくは同系である組織を作り出すことができる。このような移植体は、例えば、比較的大量のBMSCまたはそれに由来する細胞を必要としている心臓血管障害への対応に用いることができる。
【００１７】
本発明はさらに、本明細書に記載の単離骨髄細胞（例えばhBMSC）を作製する方法を提供する。一つの態様では、方法は、以下の段階の少なくとも一つ、および好ましくはすべてを含む：
a)  約100ミクロン未満、好ましくは約50ミクロン未満、より好ましくは約40ミクロン以下のサイズである骨髄細胞を哺乳動物から採集する段階、
b)  採集した細胞を接着細胞を選択する条件下で培地培養（拡大）する段階、
c)  接着細胞を選択し、それらの細胞を培地内で準集密になるまで拡大する段階、
d)  拡大細胞のクローン分離株を作製するために、チャンバー１つあたり細胞が約1個未満の密度になるのに十分に希釈で、培養細胞を調整された培地でチャンバーに連続希釈する工程；および
e)  各クローン分離株を培養（拡大）し、拡大した細胞を含むチャンバーを選択して、単離骨髄細胞の集団を作製する段階。
【００１８】
別の局面では、本発明は、hBMSCのような、これに限定されるわけではないが、本明細書記載の単離BMSCを含む組織または移植体を提供する。さらに、移植体を含む、細胞培養体、組織または器官を提供する。
【００１９】
本発明のさらに別の局面では、心臓血管（心臓）障害を予防、治療または重症度を軽減するための方法を提供する。一つの態様では、方法は、そのような処置を必要としている哺乳動物に、本明細書に記載の単離BMSC（例えばhBMSC）の少なくとも一つを投与することを含む。投与は、哺乳動物の障害を予防、治療または重症度軽減するのに十分なものであることが好ましい。あるいは、またはそれに加えて、方法は、心臓障害の増大を抑えることができる条件下で、本発明の移植体の少なくとも一つを哺乳動物に投与することを含む。
【００２０】
本発明はさらに、心臓障害を予防、治療または重症度を軽減するための医薬用生成物も提供する。一つの態様では、生成物は、以下の成分を少なくとも一つ含む：本明細書に記載されている単離BMSC（例えばhBMSC）の集団かつ／または任意で哺乳動物から細胞を単離することに関する指示；本発明の移植体かつ／または任意で移植体を調製、維持および／もしくは使用することに関する指示；本発明の細胞培養体、組織もしくは器官かつ／または任意で、哺乳動物からそれを調製することに関する指示。
【００２１】
本発明はまた、以下の工程段階の少なくとも一つ、および好ましくはすべてによって得られる単離骨髄細胞の集団も提供する：
a)  約100ミクロン未満、好ましくは約50ミクロン未満、より好ましくは約40ミクロン以下のサイズである骨髄細胞を哺乳動物から採集する工程段階、
b)  採集した細胞を接着細胞を選択する条件下で培地培養（拡大）する工程段階、
c)  接着細胞を選択し、それらの細胞を培地内で準集密になるまで拡大する工程段階、
d)  拡大細胞のクローン分離株を作製するために、チャンバー１つあたり細胞が約1個未満の密度になるのに十分に希釈で、培養細胞を調整された培地でチャンバーに連続希釈する工程段階；および
e)  各クローン分離株を培養（拡大）し、拡大した細胞を含むチャンバーを選択して、単離骨髄細胞の集団を作製する工程段階。
【００２２】
本発明のその他特徴、使用および利点を以下に説明する。
【００２３】
発明の詳細な説明
考察したように、本発明は、以下の細胞マーカーの少なくとも一つ、および好ましくはすべてを、検出不可能または低（無視できる）レベルで有している新規の多能生BMSCの単離集団を提供する：CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct 4、GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCクラスIレセプターおよびMHCクラスIIレセプター。これらのマーカーは、本明細書に標準的な細胞マーカー検出アッセイ法として参照するところのものによって容易に判定できる。本発明のBMSCは、心臓血管障害、特に虚血（心筋虚血）、梗塞（心筋梗塞）、鬱血性心不全（CHF）と直接または間接的に関連する冠動脈疾患、および関連する冠動脈適応症に関連する症状の予防、治療または軽減することへの使用を含む、広範囲の重要な用途を有する。
【００２４】
語句「標準的な細胞マーカー検出システム」とは、前記細胞マーカー(即ち、CD90、CD117、CD34他）の一つを検出、および任意で定量するよう定形化された、通常の免疫学または分子的アッセイ法を意味する。このような通常の免疫学的アッセイ法の例としては、ウエスタンブロット、ELISAおよびRIAが挙げられる。このようなアッセイ法での使用に好ましい抗体を以下に示す。一般的には、これらの、およびその他の好適アッセイ法に関連した開示については、Harlow and Lane in Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Publications, N.Y. (1988)を参照。このような使用に特に好適な分子アッセイ法としては、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドプライマー（例えば表1参照）を用いるポリメラーゼチェインリアクション（PCR）型のアッセイ法が挙げられる。組換えPCRおよび関連方法に関する一般的開示に関してはWO 92/07075を参照のこと。細胞マーカーの検出に用いることができることが認められている免疫学的および分子的アッセイ法に関する一般的開示に関しては、SambrookらのMolecular Cloning: A Laboratory Manual（第2版 1989）; および Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989も参照。
【００２５】
BMSCを言及するのに使用する場合、「単離（された）」とは、細胞が、骨髄および本来それに付随しているその他の細胞成分から分離されていることを意味する。好ましくは、本発明のBMSCは少なくとも80%もしくは90%〜95%純粋（w/w）である。多くの薬学、臨床および研究応用にとっては、少なくとも98〜99%の均質度（w/w）を有するBMSC、特にはhBMSCが最も好ましい。ひとたび実質的に純化または単離されると、BMSCは不要な骨髄汚染物を実質的に含まないだろう。ひとたび部分的または実質的に純粋になるまで純化されれば、BMSCは治療または本明細書に記載されているその他の使用に適する。純度は、細胞培養、顕微鏡および遠心分離技術（例えばフィコール勾配）のような各種標準的技術によって決定できる。
【００２６】
内皮細胞（EC）および特に内皮前駆細胞（EPC）を単離する、および操作することに関する具体的開示は、例えば米国特許第5,980,887号およびPCT/US99/05130（国際公開公報第99/45775号）に見出される。
【００２７】
用語「哺乳動物」は、霊長類、家畜化された、または齧歯類またはウサギのようなその他哺乳動物を意味する。好ましい霊長類は、処置を必要としているチンパンジー、サルまたはヒト患者である。好適な家畜としては、スナネズミ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ等が挙げられる。好ましい齧歯類は、ラットまたはマウスである。好ましいBMSCは、霊長類、および特に心臓血管治療を必要としているようなヒト被検者から単離される。
【００２８】
本発明のより具体的なBMSCは、視診（一般的には顕微鏡）によって判定した時に本質的に球形であり、直径約25〜36マイクロメートル未満、好ましくは約15マイクロメートル未満を有する。本発明のその他の具体的な細胞は、平均テロメア制限フラグメント長（TRF）約30〜40キロベース未満、好ましくは約17キロベースのような約20キロベース未満を有するだろう。BMSCの直径を測定するための、およびTRFを決定するための好ましい方法を以下に提供する。
【００２９】
本発明のその他具体的BMSCは、実質的に、正倍数体が細胞培養において少なくとも約10継代、好ましくは約20〜約200継代の間、本質的に維持される正倍数体である。細胞の倍数体を決定するための方法は公知であり、以下に提供する。
【００３０】
本発明のより特異的なBMSCは、例えば、標準的なEC分化アッセイ法によって判定されるようなEC促進条件に接触した後、内皮細胞（EC）を形成できる。このようなEC促進条件の例は、当技術分野公知であり、米国特許第5,980,887号；PCT/US99/05130（国際公開公報第99/45775号）および本明細書に引用されている参考文献に開示されているような、ある種の血管形成因子および細胞分裂促進因子との接触が挙げられる。このような、開示された因子および分裂促進因子としては、酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子（aFGFおよびbFGF）、血管内皮増殖因子（VEGF-1）、VEGF165、上皮増殖因子（EGF）、形質転換増殖因子αおよびβ（TGF-αおよびTGF-β）、血小板由来内皮増殖因子（PD-ECGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、肝細胞増殖因子（HGF）、インスリン様成長因子（IGF）、エリスロポエチン、コロニー刺激因子（CSF）、マクロファージ-CSF（M-CSF）、顆粒球／マクロファージCSF（GM-CSF）、アンギオポエチン-1（Ang1）および酸化窒素合成酵素（NOS）；ならびにその機能的フラグメントが挙げられる。Klagsbrunら、Annu. Rev. Physio., 53: 217-239 (1991); Folkmanら、J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992) および Symesら、Current Opinion in Lipidology, 5:305-312 (1994) を参照。ムテイン、または分裂促進因子のフラグメントは、それらがECの形成を誘導または促進するのであれば使用してもよい。
【００３１】
好ましいEC促進条件としては、VEGF、特にVEGF-1、VEGF165またはその両方への接触が挙げられる。追加の好ましいEC促進条件としては、フィブロネクチンのような特定の細胞マトリックスタンパク質との接触が挙げられる。以下実施例2を参照。
【００３２】
語句「標準的なEC分化アッセイ法」とは、米国特許第5,980,887号および国際公開公報第99/45775号に開示されているような、ECの機能を検出およびモニタリングするのに用いるアッセイ法を意味する。好ましいアッセイ法は、実施例2に報告されているようなEC特異的マーカーの検出を包含する。
【００３３】
また、標準的なSMC分化アッセイ法によって判定されるようなSMC促進条件と接触した後、特に、平滑筋細胞（SMC）を形成できるBMSCも好ましい。一般的なSMC促進条件は公知であり、少なくとも一つの、前述の血管形成因子または細胞分裂促進因子との接触を含む。好ましいSMC促進条件は、ムテリンまたはその活性フラグメントを含む血小板由来増殖因子（PDGF)との接触を包含する。
【００３４】
語句「標準的なSMC分化アッセイ法」とは、以下のSMC特異的マーカーの少なくとも一つ、および好ましくはすべてを検出、および任意で定量化できる免疫学または分子的試験（例えばELISA、ウエスタンブロットまたはPCR）を意味する：αSMA、PDGFβレセプター、SM22αおよびSMI。許容可能なアッセイ法の例を実施例2に示す。
【００３５】
本発明のさらに別のBMSCは、特に、標準的な神経細胞分化アッセイ法により判定されるような神経細胞促進条件と接触した後に、神経細胞を形成できる。様々な神経細胞促進条件が公知であり、一または複数の前記因子および分裂促進因子との接触を含んでいる。肝細胞増殖因子（HGF）単独または、好ましくは、繊維芽細胞増殖因子4（FGF-4）との組合せへの接触を含む条件が好ましい。さらに好ましい神経細胞促進条件は、DMSO、またはブチレートのナトリウムもしくはカリウム塩のような薬剤学的に許容されるブチレート塩とのさらなる接触を包含する。さらに別の神経細胞促進条件は、ポリ-L-オルニチン-ラミニンのような、好適細胞マトリックスタンパク質との接触を含む。
【００３６】
語句「標準的な神経細胞分化」アッセイ法とは、以下の神経特異的マーカーの少なくとも一つ、および好ましくはすべてを検出、および場合により定量化できる免疫学または分子的試験（例えばELISA、ウエスタンブロットまたはPCR）を意味する：GFAP、GalC、NF200、チューブリン、ミエリン塩基性タンパク質、MAP2、GADおよびタウ。実施例2を参照（特に好ましい神経細胞促進条件を開示している）。
【００３７】
加えて、本発明の好ましいBMSCは、アクセサリー心筋細胞との接触後に、心筋細胞を形成できる細胞を含む。用語「アクセサリー心筋細胞」とは、BMSCと接触する前に心筋細胞であった細胞を意味する。このようなアクセサリー心筋細胞の例としては、そのような細胞の樹立培養体ならびに心筋細胞が存在する心臓組織が挙げられる。いくつかの態様では、BMSCによる心筋細胞の形成は、幹細胞とアクセサリー心筋細胞との細胞融合に補助されるだろう。このような心筋細胞（および特にアクセサリー細胞）は、インビトロ、エクソビボ、またはインビボでの維持を包含する方策を含めた、単独または組合せの方策によって維持できる。
【００３８】
考察したように、本発明の目的は、本明細書記載の単離骨髄幹細胞を含む（またはいくつかの態様では単離骨髄幹細胞からなる）移植体を提供することである。「移植体」とは、BMSCおよび、任意で哺乳動物のEC、SMCおよびCMCのような他細胞を含む細胞または組織調製物を意味する。ドナーは、BMSCの供給源として定義され、一方レシピエントは移植体を受ける被験体である。ドナーとレシピエントの間の免疫学的関係は、必要に応じて同種、自己または異種となる。好ましい本発明の態様では、ドナーとレシピエントは遺伝学的に同一であり、また通常は同一個体（同系）である。この場合は、移植体はドナーおよびレシピエントに関して同系である。
【００３９】
「移植体」はまた、レシピエントに投与され、そのレシピエントの一または複数の組織もしくは器官の一部になる、本発明のBMSCも意味する。時に、語「生着」は、BMSCが標的組織または器官内に目的通りに同化したこと（BMSCまたは分化細胞として）を表すのに用いられる。好ましい生着は、静脈、動脈および特に心臓組織のような心臓血管組織を包含する。本発明の移植体はまた、本発明のBMSCが他の細胞または分裂促進因子と組み合わさり、分化および／または細胞複製を促進して目的の移植体を生成する、組織培養調製物の形を取ることもできる。所望であれば、調製物を合成または半合成繊維と組合せ、移植体に構造を付与することもできる。特定の応用では、Dacron、TeflonまたはGore-Texのような繊維が好ましい。
【００４０】
本発明の移植体の具体例は、心筋虚血または梗塞のような心臓血管障害を予防、治療または重症度の軽減をはかるために、ドナーより単離されたhBMSCの調製物である。調製物は、生理食塩水のような薬剤学的に許容されるキャリアを含むことができ、また任意で、目的とする生着結果を支援するために、分裂促進因子、血管形成因子、CMC、EC、EPCおよびSMCの少なくとも一つを含んでもよい。
【００４１】
本発明の具体的なCMCは、CMC特異的タンパク質（cTnI）を発現する。好ましいECはILB-4である。特に対象となるのは、α-SMAおよび関連マーカーを発現するSMCである。
【００４２】
考察したように、本発明はさらに、ヒト患者から得た細胞（hBMSC）を含めた、本明細書記載のBMSCを作製するための方法を提供する。一つの態様では、方法は以下の段階の少なくとも一つ、および好ましくはすべての段階を含む：
a)  約100ミクロン未満、好ましくは約50ミクロン未満、より好ましくは約40ミクロン以下のサイズである骨髄細胞を哺乳動物（好ましくは若年成人）から採集する段階、
b)  採集した細胞を接着細胞を選択する条件下で培地培養（拡大）する段階、
c)  接着細胞を選択し、それらの細胞を培地内で準集密になるまで拡大する段階、
d)  拡大細胞のクローン分離株を作製するために、チャンバー１つあたり細胞が約1個未満の密度になるのに十分に希釈で、培養細胞を調整された培地でチャンバーに連続希釈する段階；および
e)  各クローン分離株を培養（拡大）し、拡大した細胞を含むチャンバーを選択して、単離骨髄細胞の集団を作製する段階。
【００４３】
より具体的、且つヒト細胞が所望される態様では、hBMSCは、若年男性ドナーから新鮮な、未処理の骨髄（BM）細胞を採取することで得ることができる。あるいは、このような細胞は購入することもできる。細胞は、一般的には遠心分離、溶血および関連する基本手順によって血液細胞から分離される。BMは、DPBSのような許容される緩衝液で洗浄し、濾過して約100ミクロン未満、好ましくは約50ミクロン未満、より好ましくは約40ミクロンのサイズである細胞を集める。たとえば、標準ナイロンフィルターを使用してもよい。ひとたび単離したら、BMを、増殖因子およびサイトカインの豊富な供給源を含有する低グルコース完全培地（例えばDMEM）で増殖させる。ウシ胎児血清（FBS）が好ましい。細胞は、約2週間未満、好ましくは4〜6日間のような約1週間以下の期間培養（即ち拡大）する。次にコンディショニング培地を新鮮な培地と交換し、接着細胞を培養皿から取り除き、新鮮培地に再懸濁して拡大できる細胞を選択する。選択した細胞を準集密状態（50%〜90%集密度）まで増殖させ、再度接着細胞の選択を行う。次に、このような細胞を組織培養フラスコ内の完全培地に、1センチメータ当たり約104細胞の密度に再接種する。細胞が準集密状態に達した後、細胞をフラスコ内に、同一または同様の密度で再接種（連続的に）する。培養体は、細胞を拡大するために、1回より多く、典型的には5回未満、および好ましくは約2回継代し、継続的に選択することが好ましい。次に選択した細胞を単一ウエルチャンバー（例えば標準的な96ウエルプレート）に、約1細胞/チャンバー、好ましくは1/2細胞/チャンバー未満の密度に連続希釈する。細胞をコンディショニング培地で培養して、増殖を促進して半集密状態（即ち、50%集密度未満）にすることが好ましい。拡大した細胞クローンの入ったウエルを拡大し、必要に応じて再接種する。
【００４４】
特定の態様では、方法は、以下のマーカーの少なくとも一つを検出可能なレベルで発現している選択細胞クローンをさらに含む：CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct 4、GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCクラスIレセプター、MHCクラスIIレセプターまたは本明細書記載のその他細胞マーカー。選択を実施するための方法は、本明細書に開示した好適アッセイ法を含む。より大量の幹細胞を必要としている態様では、蛍光活性化細胞選別（FACS）のような、より自動化または半自動化された方法が好ましいことが多い。以下に示す実施例を参照のこと。
【００４５】
BMSCを作製するための方法の好ましい例を、以下の実施例1に示す。
【００４６】
本発明はまた、一つの態様において、処置を必要としている哺乳動物に、本明細書に開示した単離BMSC、移植体またはその両方を投与することを含む心臓障害を予防、治療またはその重症度を軽減するための方法も提供する。好ましくは、投与は、哺乳動物における障害を予防、治療またはその重症度の軽減に十分なものであることが好ましい。
【００４７】
一つの態様では、方法は、哺乳動物において細胞または移植体を、少なくとも約1週間、好ましくは約2〜8週間インキュベーションすることをさらに含む。インキュベーションの期間が柔軟であり、具体的な適用に対応するため、または処置を必要としている個体の健康もしくは年齢を考慮して、延長または短縮できることは、当業者にとって明らかであろう。典型的なBMSCの使用量は、処置対象の疾患、必要とされる回復速度を含めたこれら、およびその他の認められているパラメータに依存するだろう。しかしながら、大部分の応用にとっては、約103〜約107BMSCの範囲のそれら細胞で十分であり、一般的には約105である。細胞は、細胞を生理食塩水に懸濁させて、それを針、ステント、カテーテルまたは同様の用具を用いて投与することを含む、許容される経路により投与できる。対処の対象が心筋虚血または梗塞である態様では、投与は障害部位の近く、または直接行う大量瞬時投与注射であろう。
【００４８】
心筋虚血後に心臓組織を再生させるための具体的方法は、実施例3および4に示す。実施例5〜6も参照（心臓組織へのhBMSCの生着を示している）。考察したように、BMSCの移植は、血管形成因子のレベルを増加させること、ならびに毛細血管およびCMC密度を上げることを含む、様々な治療効果を提供する。
【００４９】
別の態様では、方法は、処置を必要としている哺乳動物に、少なくとも一つの血管形成因子または分裂促進因子（もしくは前記因子または分裂促進因子の機能的フラグメント）を投与することをさらに含む。好ましい血管新生因子および分裂促進因子（ならびに使用方法）は、本明細書ならびに米国特許第5,980,887号および国際公開公報第99/45775号に開示されている。あるいは、またはそれに加えて、方法は、少なくとも一つの血管形成因子またはその機能的フラグメントをコードする少なくとも一つの核酸を哺乳動物に投与することを含むことができる。このような核酸を哺乳動物に投与するための方法は、例えば、米国特許第5,980,887号および国際公開公報第99/45775号に開示されている。血管形成因子／分裂促進因子タンパク質またはそれをコードする核酸を用いた処置は、BMSCの使用に先行でき、または必要であれば、そのような処置の間または後に用いることができる。
【００５０】
さらに別の態様では、方法は、哺乳動物に内皮前駆細胞（EPC）を投与することをさらに含む。この本発明の態様は特に、心臓血管障害への取り組みにとって良好な血管増殖が求められる場合に用いられる。EPCの作製および使用の方法は開示されている。例えば、米国特許第5,980,887号を参照。典型的な方法は、EPCを哺乳動物から単離すること、ならびにEPCを少なくとも一つの血管形成因子および／または分裂促進因子とエクソビボに接触させることを含んでもよい。
【００５１】
考察したように、本発明は鬱血性心不全（CHF）、虚血性心筋症、心筋虚血、および梗塞を含む多様な心臓血管障害の予防および治療に応用できる。所望であれば、このような方法は、処置を求める哺乳動物において、例えば心エコー検査、左室拡張末期径（LVEDD）、左室収縮末期径（LVESD）、短縮率（FS）、壁運動スコア指数（WMSI）および左室収縮期圧（LVSP）の少なくとも一つをモニタリングすることで心臓機能をモニタリングすることをさらに含んでもよい。特定の心臓血管障害の予防または治療を包含する好ましい本発明の方法は、これらの検査の一つまたは複数によって例示される良好な心機能を表すだろう。「良好」とは、本発明の組成物を投与されていない（またはプラセボを投与された）コントロールに比べ、少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%または30%の改善を意味する。これら検査を実施するための具体的方法は公知であり、また実施例に記載されている。
【００５２】
本発明はまた、例えば、以下の成分を少なくとも一つ含む、心臓障害を予防する、治療する、またはその重症度を軽減するための医薬用生成物も提供する：BMSC、好ましくはhBMSC、および任意で哺乳動物から細胞を単離することに関する指示；本明細書に開示した移植体、好ましくはhBMSCまたはそれに由来する細胞もしくは組織、および任意で移植体を調製、維持、および／またはもしくは使用することに関する指示；細胞培養体、組織または器官、および任意でそれを調製することに関する指示。一つの態様では、生成物は、少なくとも一つの血管形成因子、分裂促進因子；またはその機能的フラグメントをさらに含む。別の態様では、生成物は、血管形成因子、分裂促進因子またはその機能的フラグメントをコードする核酸を少なくとも一つさらに含む。
【００５３】
これも考察したように、本発明は、本明細書に開示した方法で産生されるhBMSCのような単離BMSCを提供する。このような細胞は、望ましい可塑性および重大な培養問題（例えば不要な倍数体および多能性の消失）を起こすことなく長期間継代できる能力のような利点を有している。一つの態様では、このような細胞は、次のマーカーの少なくとも一つを検出可能なレベルで発現していない細胞を収集することによって、さらに産生される：CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct 4、GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCクラスIレセプター、MHCクラスIIレセプターまたは本明細書に示すその他マーカー。
【００５４】
本開示は、本発明を用いて、単一細胞から、潜在的に無制限の増殖能力を有し、EC、SMCおよびCMCを含む三系列に分化できるBMSCおよび特にhBMSCを単離するのに用いることができることを特に示している。急性梗塞を起こした心筋へのhBMSCの移植は、心筋組織への新規分化および隣接細胞への好ましいパラクリン作用の両方によって、心筋の機能不全を和らげる。
【００５５】
より具体的には、実施例を含めた本開示は、新規の幹細胞（SC）集団（pop）が成人ヒト骨髄内（BM）に特定されたことを示す。さらにまた、これら細胞の単一細胞レベルでの単離、および、明白な老化または多能性を失わない、140集団倍加（PD）を超える増殖も示す。これらクローン拡大されたヒトBM由来多能性SC（hBMSC）のCD90およびCD117の発現は、最小から検出できないものである。それゆえに、我々が単離したhBMSCは、造血性SC、間葉性SCまたは多能性成体前駆細胞のような公知のいかなるBM由来SC popにも属さない。hBMSCは、インビトロで3つの胚葉すべての細胞に分化（Diff）する能力を示す。hBMSCと新生児ラット心筋細胞（CMC）、ラット大動脈内皮細胞（EC）またはラット平滑筋細胞（SMC）との共培養は、真のDiffおよび細胞間融合からなる表現形の変化を示した。我々は、急性不全を起こした心筋（Myoc）を、hBMSCの移植（Xplnt）によって回復できるか試験した。ヌードラットにMIを誘導した直後に、hBMSCを不全周囲域の壁内に移植した。28日後にエコーおよび圧トランスデューサーによって測定されたMyocの機能は、hBMSC移植ラットにおいて、全BM細胞を移植したもの、または生理食塩水注射したコントロールラットに比べて有意に改善されていた。移植細胞の確固たる生着が観察され、移植細胞はCMC、ECおよびSMCへの分化を示した。hBMSCが移植されたMyocでは、複数の血管形成サイトカインおよび必須の心臓転写因子は顕著なアップレギュレーションを受け、ECおよびCMCのより高率な増殖が観察された。結論：ヒトBM内には新規の多能性SC集団が存在しており、局所的に移植されたhBMSCは、新規の血管形成および心筋形成、ならびに宿主心筋組織の増殖および保存の増強によって、急性MIの帰結を改善できる。これは、ヒトBM由来SCが、インビトロおよびインビボの両方において、虚血性心筋の再生に必要なすべての要素に分化できることの初めての証明である。
【００５６】
考察したように、本開示は、公知の成体幹細胞の集団に属さない新規成体ヒト幹細胞集団であるhBMSCが、まず混合状態の全BM細胞培養体から単一細胞レベルで単離されたこと、そして可塑性の消失または複製老化を起こすことなく培養液中で140PDを超えてクローン的に拡大したことを示している。よりさらに、クローン化由来hBMSCは、インビトロで三つの胚葉（内胚葉、中胚葉、神経外胚葉）の細胞に分化した。また、MIの動物モデルへのhBMSCの移植は、MI後の機能および病理的変化を弱める。これに加えて、心機能の改善のメカニズムは、CMC、ECおよびSMCのような必須の心筋組織への分化だけから成るのではなく、移植された幹細胞の顕著なパラクリン作用も関係しており、これが宿主心筋組織の増殖を刺激し、虚血性傷害後危険な状態にある細胞のアポトーシスを防止する。
【００５７】
我々が特定したhBMSCは、CD90およびCD117を発現するhBMSCが1%未満である、ユニークな成体BM由来多能性SCの集団である。HSC、MSCおよびMAPCを画定する一般的なマーカーパネルはいずれもhBMSCのプロフィールに適合しない。hBMSCは、使用する培地がMSC培養に用いる培地と類似しているにもかかわらず、周知のMSCマーカータンパク質であるCD105（SH2）およびCD73（SH3とSH4）を発現しない｛Barry, 1999; Barry, 2001｝。表面分子の発現がない、または最小であることは、多の成体多能性幹細胞に見られるように、hBMSCの可塑性にとって前提条件である［Jiang, 2002］｛Colter, 2001｝。hBMSCのユニークな表面表現形は、初期培養およびクローン単離／選択の手順に全BM細胞集団を使用した結果である。本発明は、幹細胞生物学での一つの重要な問題、即ち多能性幹細胞が単一細胞から培養-拡大できるかという問題に取り組むものである。本明細書において、我々は、hBMSCから中胚葉、内胚葉および神経外胚葉へのインビトロおよびインビボ分化が、単一細胞から作られたクローンより起こることを初めて証明した。MAPCとは異なりhBMSCは、MAPCにとって必須な因子と信じられているOct-4およびRex-1のようなESCの遺伝マーカーを発現しない。我々の研究は、成体SCの未分化状態および無制限の増殖能力の維持に関係する因子は、ESCのものとは異なっていることを示唆している。他の異なるものに、ラットBMSCは、培養拡大について、MAPC培養にとって必須である白血病阻害ペプチドを必要としないという事実がある｛Yoon YS, 2002｝。むしろ、低密度の細胞の維持はhBMSCの多能性および拡張性を維持するのに重要な役割をはたす。
【００５８】
最近の研究は、幹細胞の可塑性に関する細胞融合の重要な役割を立証した。本インビトロデータは、融合と分化転換の両方が、hBMSCからEC、SMCおよびCMCへの表現形の変化を担っていること、そしてその割合が細胞のタイプに依存していることを示している。観察された表現形の変化に対する細胞融合の寄与度を定量化するためのインビボでの決定的な研究はまだ行われていないが、インビトロ研究の結果は、融合と分化転換の両方が役割を果たしているらしいことを暗示している。各成分からの寄与がいかなるものであれ、移植されたhBMSCは、融合幹細胞が代謝性肝疾患にするように、虚血性傷害後の心筋の健全性再生を助けた。この研究からは、細胞融合が、少なくとも成体SCに関しては、必ずしも治療応用にとって重大な障害ではないことが推測される。
【００５９】
他のSCに比し、本発明のhBMSCは心臓疾患の再生治療に関し、優位性を提供する。心臓機能を改善することが示されている幹細胞のうち、新規血管形成をインビボで促進することが示されているのはEPC、CD34(+)細胞、血管芽細胞だけである。MSC、c-kit陽性系列陰性細胞、SP細胞、およびESCのような多能性幹細胞が、虚血性動物モデルで検証されている。ESC細胞だけがCMCに分化する能力が証明されているが、これらはIHDの動物モデルにおいては、ECまたはSMCに分化することは示されていない。さらに、ESCの使用は、臨床応用の前に解決しなければならないある種の倫理問題によって妨げられている。IHDにおいてSP細胞が複数系列に分化転換することは、マウス細胞でのみ実証されているに過ぎず、ヒト細胞では実証されていないので治療効果は不明である。また、ヒトではないが、マウスのLin(-)c-kit(+)細胞は、多能性であり治療効果を示すが、しかし血中またはBM中のこれらSC細胞が稀少であること、そして培養拡大ができないことが、その治療使用を制限している。ヒトMSCは、CMCに分化転換することが示されているが、その形態学的概観は組織化されたCMCのものとは異なっており、またECおよびSMCの分化は実証されていない。これに対し本明細書に記載のhBMSCは、損傷した心筋を再生するためにインビトロおよびインビボで求められる多能性を有しており、培養拡大が可能であり、そして治療応用に関する機能的な能力を開示している。
【００６０】
冠動脈性心疾患は、全心臓血管死亡例の50%、そして心不全の発病率のほぼ40%を占めている。今回の所見は、本発明を用いて、梗塞および／または虚血に関係するものを含めた様々な心臓障害を予防、治療またはその重症度を軽減できることの確固たる証拠を提供している。より具体的には、本発明は、MIの齧歯類モデルにおいて、新規血管-心筋形成を促進し、既存のCMCの血管新生と増殖を増強し、繊維化の進行を遅らせ、心室機能を改善する。我々は、これが、成体ヒト幹細胞が、虚血性組織損傷進行期に、急性MIの治療の成功を高めることの最初の実証であると信じている。本発明はまた、IHDの予防または治療、特にIHDの短期および長期帰結の改善にも応用できる。
【００６１】
以下の実施例は、例示を目的としたものであり、本発明を制限するものではない。本明細書に開示したすべての参照は、参照によって組み入れられる。
【００６２】
実施例1：hBMSCの培養および特徴
以下のとおりhBMSCのクロナリティ、表面エピトープ、倍数体および増殖を評価した。若年男性ドナーからの新鮮未処理ヒトBMを購入した。SC培養のために三つの異なるドナーからの三つの異なる骨髄検体を使用した。17%ウシ胎仔血清（FBS）を含み低（1g）グルコースを有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中でプラスチック皿に入れて総骨髄細胞を系列的に培養した後に、細胞を赤色蛍光色素DiIで標識した。限界希釈（96ウェル平板のウェル1個あたり細胞1〜2個）の後に、蛍光顕微鏡で可視化して細胞1個だけを含むウェルを選択した。細胞1個だけを含むウェル（図1a）のうち、6±4%（範囲2〜13%）は細胞が生存および増殖していることを実証した。細胞が集密度40〜50%まで成長したとき、各ウェル（一つのクローン）からの細胞を6ウェル平板の一つのウェルに再度蒔いた後に細胞4〜8×103個/cm2の密度でそれぞれ25cm2組織培養用フラスコ（T25）、T75およびT175に系列的に再度蒔いた。次に、T175で細胞4〜8×103個/cm2の密度で細胞を培養して、1：20〜40希釈してもう一度平板培養した。3回の繰り返しで再接種を行い、各培養で最も増殖の速いクローンを選択して、系列培養で増大させた。6回目の継代で各骨髄から10個を超えるクローンを得た後で、二つのクローンを連続培養用に選択した。形態的にはMSCに比べてhBMSCの方がより球形の細胞であり、サイズが小さく（直径<15μm）、細胞質に対する核の高い比を示す（図1b）。このように得られたクローン細胞系は140を超える細胞集団倍加数（PD）を経ていた。倍加時間は20から80PDの間で38±9時間であった。多数の表面エピトープを使用したFACS分析は、CD90（図1c）およびCD117（図1S）が最小ないし無発現（0〜1%）であることを実証した。hBMSCは自然発生的に分化せず、培養による増大中に自己の表現型を維持した。対照的に、クローン単離前の培養hBMSCは低レベルのCD105、CD90およびCD117を発現したが、間葉性幹細胞は高レベルのCD29、CD44、CD73、CD105およびCD90を発現した（図1b）。主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI（ABC）およびII（DR）分子ならびに公知の造血幹細胞マーカー（CD34、CD133、FLK-1、Tie2）は発現していなかった（図1S）。RT-PCR分析は、胚性幹細胞およびMAPCの公知のマーカーであるOct4およびRex-1に関して陰性であった。これらの結果は、hBMSCが公知のHSC、MSCおよびMAPCに属さず、免疫学的に不活性であることを示した。5PDの間培養したhBMSCの平均テロメア制限酵素フラグメント（TRF）長は約17キロ塩基（kb）であり、120PD後に再試験しても平均TRFは変化しないままであった（図1d）。プロピジウムヨージドでDNAを染色した後に、FACS分析によりDNAの倍数体（DNAコピー数）を検査した。三つの異なるクローンから20および140PDの間培養したhBMSCは、倍数体の増加の証拠を実証せず、このことは培養による増大中に正倍数体が維持されることを示唆した。
【００６３】
図1A〜Eを次にさらに詳細に論じる：a. 位相差および蛍光像は、ウェル1個あたり細胞一つだけであることを示す。b. 形態的に多くのhBMSCが直径<15μmの細胞サイズである丸い形態を示す。スケールバー=50μm。c. クローン単離したhBMSCを140PDの間培養したものをヒトCD29、CD44、CD73、CD105、CD90または免疫グロブリンアイソタイプコントロールに対するPEまたはFITC複合抗体で標識した。細胞をFACStarフローサイトメータで分析した（B〜D）。青線：コントロール免疫グロブリン、赤線：特異的Ab。クローン単離前の培養hBMSCは低レベルのCD105、CD90を発現した。クローン単離後のhBMSCは、CD90の無発現ないし最小の発現（0〜1%）だけを示した（図1c）。対照的に、購入した間葉性幹細胞は高レベルのCD29、CD44、CD73、CD105およびCD90を発現した。d. 10PD（レーン1、kb）および120PD（レーン2、kb）の間培養したhBMSCの平均テロメア制限酵素フラグメント（TRF）長。これらは平均TRFに差を示さない。e. DNAの倍数体分析。クローン選択前後のhBMSCをプロピジウムヨージドで染色してFACS分析に供した。20（左欄）および140（右欄）PDの間培養したhBMSCは、DNA含量倍数体を超えるものが<1%であることを実証した。>3回の実験の代表例。
【００６４】
実施例2：hBMSCの可塑性：インビトロ分化
成体幹細胞および胚性幹細胞について以前に公表された、主に系列特異的サイトカインを必要とする培養条件を採用および変更することによってhBMSCのインビトロ分化潜在能を試験した。
【００６５】
ECへの分化を誘導するために、2% FBS、10-8デキサメタゾンおよび10ng/ml VEGFを有するDMEMまたはEBM-2(Clonetics)中で0.1%のゼラチンまたはフィブロネクチンのいずれかで被覆したグラスチャンバースライドに入れて細胞5×104個/cm2でhBMSCを再び平板培養した。培養5日後にhBMSCは血管様構造を形成した（図2a、左上欄）。培養14日後にhBMSCはフォンウィルブランド因子（vWF）、Flk1、VE-カドヘリン、CD31、ヒト特異的ECマーカーであるコマツナギ（Ulex europaeus）レクチン1型（UAE-1）のようなEC特異的表現型を表した（図2a）。14日目に63±8%（VE-カドヘリン）から85±12%（UAE-1）のhBMSCがEC表現型であることを免疫細胞化学分析から実証した。EC特異的遺伝子であるVE-カドヘリン、CD34、Flk-1、Tie2およびCD31のRT-PCRもhBMSC（分化前）からEC表現型（分化後）への分化を確認した（図2b）。
【００６６】
SMC系列への分化を誘導するために、PDGF-BB（50ng/ml、R&D）を補充した1〜2% DMEMまたはEBM-2中で、非被覆またはフィブロネクチンで被覆したプラスチック皿に入れて細胞1×105個/cm2でhBMSCを再び平板培養した［Hellstrom, 1999;Yamashita, 2000］。培養14日後に、89±6%および67±12%のhBMSCが、SMC表現型への分化を指示するそれぞれα-平滑筋アクチン（α-SMA）およびカルポニンに関して陽性に染まった（図2c）。RT-PCRから、SMC特異的遺伝子であるαSMA、PDGFβ受容体、SM22α、およびSM1のデノボ発現を確認した（図2d）。
【００６７】
図2A〜Dを以下のとおりさらに詳細に説明する：a. ゼラチン被覆グラスチャンバーに入れてDMEMで5日間培養後のホフマン像（左上）。hBMSCは典型的な血管様構造を形成していた。免疫蛍光撮像は、EC分化培地で14日間hBMSCを培養後にhBMSCがvWF、Flk1、VE-カドヘリン、CD31およびUEA-1のようなEC特異的タンパク質を表出することを実証している。b. EC特異的遺伝子であるVE-カドヘリン、CD34、Flk-1、Tie2およびCD31のプライマーを使用したRT-PCR分析も、hBMSC（分化前）からEC表現型（分化後）への分化を確認した。c. PDGF-BBを含む2% DMEM中で14日間培養したhBMSCは、IF染色によってSMC特異的タンパク質であるα-SMAおよびカルポニンの発現を実証している。d. RT-PCR分析から、SMC特異的遺伝子であるPDGFR-β、α-SMA、SM22αおよびSM1が分化の誘導後にのみ発現することを示す。RT-PCRでのサイズマーカーの太いラダー (bおよびd)=600bp。
【００６８】
神経系列への分化を誘導するために、プラスチック皿またはポリ-L-オルニチン-ラミニンを被覆した皿で100ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、およびB27を補充したDMEM/F12中で4×104/cm2でhBMSCを平板培養した［Palmer, 1999; Mezey, 2000; Brazelton, 2000］。10〜14日後にhBMSCは多様な神経系列細胞の形態および表現型の特徴を示した（図3a）。免疫蛍光細胞化学分析は、星状細胞（グリア線維酸性タンパク質、GFAP）、オリゴデンドロサイト（ガラクトセレブロシド、GalC）、およびニューロンの表現型マーカー（神経フィラメント200であるNF200；β-チューブリンIIIアイソフォームであるβ-チュブリンIII）をそれぞれhBMSCの22±7%、15±6%、57±9%（NF200）が発現していることを明らかにした。RT-PCRから、GFAP、ミエリン塩基性タンパク質（MBP、オリゴデンドロサイト）、MAP2（微小管関連タンパク質2、ニューロン）、GAD（グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ニューロン）、およびタウ（ニューロン）のような多様な神経系列特異的遺伝子のデノボ発現を確認した［Sanchez-Ramos, 2000］。
【００６９】
hBMSCが内胚葉系列に分化できるかどうかを知るために、1%マトリゲル上で、10-8デキサメタゾン、25ng/ml HGF、10ng/ml FGF-4と10mg/ml DMSOもしくは0.5mM酪酸ナトリウムのいずれかとを補充した2% FBS中で、細胞3〜4×104個/cm2でhBMSCを平板培養した［Shen, 2000;Hamazaki, 2001; Oh, 2000; Schwartz, 2002］。培養10〜14日後に、約60%のhBMSCが類上皮形態を獲得した。IF組織化学観察から、培養hBMSC中に内胚葉/肝細胞遺伝子、すなわち10日目にHNF3βおよびαFP、ならびに14日目にHNF1αおよびCK18が発現していることが明らかとなった（図3g〜l）。RT-PCR分析から、内胚葉系列特異的遺伝子であるCK18、CK19、αFPおよびアルブミンがデノボ発現していることが明らかとなった（図3m）。
【００７０】
図3A〜Mを以下のとおりさらに詳細に説明する：神経細胞の典型的な外見を示す神経分化培養でのhBMSCの形態的特徴。スケールバー=50μm。b〜e. 神経分化を誘導した後のhBMSCのIF染色は、多数の神経特異的タンパク質、すなわちGFAP （星状細胞）、GalC（オリゴデンドロサイト）、NF200（ニューロン）、β-チュブリンIIIが発現していることを実証する。f. RT-PCRから、神経への分化の誘導後に神経系列特異的遺伝子であるGFAP、MBP、オリゴデンドロサイト、MAP2（ニューロン）、GAD（ニューロン）、およびタウ（ニューロン）のデノボ発現を確認する。g〜l. hBMSCから内胚葉（類上皮）細胞への分化の表現型のキャラクタリゼーション。マトリゲル上でHGF、FGF-4およびDMSOを含有する培地で培養したhBMSCでの10日目（g〜i）のHNF3β(FITC)およびαFP(Cy3)、ならびに14日目（j〜l)のCK18(FITC)およびHNF1α(Cy3)のIFによる局在測定。m. RT-PCRから、神経分化の誘導後に内胚葉系列特異的遺伝子CK18、CK19、αFPおよびアルブミンがデノボ発現することを確認する。
【００７１】
実施例3：新生ラット心筋細胞（NRCM）と共培養後のBMSCの心筋形成性分化
心筋形成性分化を誘導するためにhBMSCを新生ラット心筋細胞（NRCM）と共培養した。NRCMを細胞1×105個/cm2で平板に入れ10%ウシ胎仔血清（FCS）を含有するDMEM（低グルコース）で培養した。DiIで標識したhBMSCを3日目に1：4比で培養NRCMに加え［Condorelli, 2001］、2週間目まで培養した。固定して心臓特異的マーカーに対する抗体で染色してから、免疫蛍光像を得た。DiI標識hBMSC（図4b、f、j）はDiI標識からの赤色蛍光を表し、心臓トロポニンI（cTnI）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、α-ミオシン重鎖（α-MHC）のようなCMC特異的タンパク質に陽性の細胞は緑色の外見である（図4c、g、k）。マージした画像は、CMC特異的タンパク質についても陽性に染まった部分的なDiI-標識hBMSCを図示し、hBMSCの部分集団が共培養でCMC表現型の特徴を表していることを示している（図4）。心臓転写因子のmRNA発現をRT-PCRで評価した（図4m）。共培養前にGATA-4およびNkx2.5はhBMSC（左側レーン）またはNRCM（中央レーン）の培養物には発現していなかった。hBMSCとNRCMとの共培養（右側レーン）だけがGATA4およびNkx2.5のデノボ発現を誘導した。GATA-4は、ミオシン軽鎖、TnT、TnIおよびα-MHC、およびANPのような数個の心臓遺伝子のプロモーターを活性化することが知られている心臓特異的転写因子である。Nkx2.5は、CMC分化の初期相に限定的な転写因子である［Srivastava, 2000;Bruneau, 2002］。したがって、これらの結果はhBMSCがCMC表現型に向いた分化経路に入ったことを示唆している。注目すべきことには、NRCMからの馴らし培地と共培養したときhBMSCからCMCへの分化は観察されなかった。
【００７２】
図4iにみられるようにNRCMおよびhBMSCは相互に密接に関連し、よって融合の可能性を上記の実験から除外することはできない。さらに、最近の研究はESCおよび骨髄由来幹細胞の表現型の変化が細胞融合の結果として起こりうると報告した｛Ying, 2002｝｛Terada, 2002）。このメカニズムがhBMSCの分化の根底にあるかどうかを決定するために、共培養にCFDA-SE（カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル）標識NRCMおよびDiI標識hBMSCを使用した。それは、これらの化学色素のどちらも隣接細胞に移行しないからである。共培養の7日後に培養細胞を固定して、cTnIの後にAMCA複合二次抗体（青色蛍光）で染色した（図4p）。細胞の重複を避けるために、画像分析に単細胞層の領域を選択した。図4n〜qに示すように、矢印を付けたあるDiI標識hBMSCも緑色（NRCM）および青色（cTnI）蛍光について陽性であった。これは、細胞融合が起こったことを示唆している。本当に分化した細胞を、赤色および青色蛍光が陽性であるが緑色蛍光が陰性であることで図示した（図4o〜q、矢じり印）。これらの結果は、分化および融合の両方が同じ共培養条件で起こることを示している。3回の異なる実験から共培養1回あたり5000個の細胞を計数した後の分化および融合の普及率は、それぞれ2.9±1.1%および3.2±0.9%であった。hBMSCとEC/SMCとの間の融合の発生を決定するためにラット大動脈内皮細胞（RAEC）またはラット血管平滑筋細胞（RVSMC）のいずれかをそれぞれhBMSCと共培養した。RAECおよびRVSMCが集密度50〜60%に達したとき、細胞をCFDA-SE（緑色蛍光）で標識した。その2日後にDiI標識hBMSCをRAECおよびRVSMCの培養平板に1：4の比で加えて7日間培養した。次に、培養細胞を固定してVE-カドヘリンまたはα-SMAの後にAMCA複合二次抗体で染色した。蛍光顕微鏡下で融合および真の分化に関する上記の基準を使用すると、融合の普及率はECでは5.3±1.1%でありSMCでは7.4±0.9%であったが、分化の普及率は3.4±0.7%および3.6±0.5%であった。これらの結果は、hBMSCの表現型の変化は融合と分化との両方から成り、よって分化を明らかにするための系列特異的マーカータンパク質を使用した免疫組織化学分析は、インビボの真の分化普及率を過大評価するおそれがあることを暴いた。インビボの融合および分化の割合はインビトロで記録された割合とは異なるおそれがあると認めねばならない。
【００７３】
図4A〜Mを以下のとおりさらに説明する。a〜m.心筋形成性分化の研究のためのhBMSCとNRCMとの共培養。F344ラットからの初代NRCMを単離してDMEMに入れて培養した。4日目にDiI標識hBMSCを培養NRCMに1：4の比で加えて2週間培養した。IF像は、共培養したDiI標識hBMSC（b、f、j）を赤色で、CMC特異的タンパク質であるcTnI(c)、ANP(g)およびα-MHC(k)に染まったNRCMを緑色で示す。マージした画像（d、h、l）での二重蛍光陽性細胞は、hBMSCの部分集団がCMCの表現型（矢印）を表すことを示す。少数のhBMSCが分化転換しないままであることに注意（b、d、j、l、矢じり印）。DAPIの核対比染色（a、e、i）は核の重複を示さず、これは、このみかけの分化転換がhBMSCおよびNRCMの単なる重複が原因で生じたものではないことを示唆している。心臓転写因子のmRNA発現をRT-PCRにより評価した（m）。共培養前に心臓転写因子であるGATA4およびNkx2.5はhBMSC（レーン1）およびNRCM（レーン2）の培養物で発現していなかった。共培養（レーン3）は、GATA4およびNkx2.5のデノボ発現を誘導した。n〜q. 細胞融合の研究のための予備標識NRCMおよびhBMSCの共培養。両細胞の融合がCMC表現型への変化の根底にあるかどうかを決定するために、我々は緑色蛍光色素であるDFCA-SEで標識したNRCM(n)およびDiI標識hBMSC(o)を共培養した。共培養の7日後にcTnIに続きAMCA複合二次抗体（青色蛍光）で細胞を染色した（p）。IF画像（n〜q）では、三色陽性細胞（矢印）はcTnIタンパク質を発現している融合細胞である。CMC系列に分化転換したhBMSCを、赤色および青色蛍光陽性であるが緑色陰性（矢じり印）であることで図示する。r〜x. hBMSCからEC(r〜u)またはSMC(v〜y)への表現型変化への融合および分化の寄与を決定するために、CDFA-SEで標識したラット大動脈内皮細胞（RAEC）またはラット血管平滑筋細胞（RVSMC）を、DiI標識hBMSCと4：1の比で共培養して7日間培養した。固定後に細胞をVE-カドヘリンまたはα-SMAの後にAMCA複合二次抗体で染色した（青色蛍光）。r〜uでの矢印は、VE-カドヘリンを発現するRAEC（緑色）とhBMSC（赤色）との間で融合したことを表す。r〜uでの矢じり印はhBMSCから分化したECを図示する。v〜xでの矢印はRVSMC（緑色）とhBMSC（赤色）との間で融合したことを表す。
【００７４】
実施例4：急性虚血性心筋に及ぼす再生効果
我々は虚血の危険に置かれた心筋が以下のとおりhBMSCの移植により回復できるかどうかを試験した。
【００７５】
ヌードラットでの冠動脈結紮後すぐに8×105個のhBMSCを梗塞周辺部の壁に移植した。同数のヒト総骨髄細胞（TBMC）および同容積のPBSをコントロールとして使用した。外科手術を受けたラット15匹のうち、4週間の試験期間の間にhBMSCを投与されたラットは14匹が生存したが、TBMC群およびPBS群のラットは12匹が生存した。心機能を評価するために外科手術の前および4週間後に心エコーを行った。ベースラインの左室拡張末期径および左室収縮末期径（LVEDD、LVESD）、短縮率（FS）および壁運動スコア指数（WMSI）は、hBMSC、TBMCまたはPBSを投与されたラットの間で類似していた（データは示さず）。処置の4週間後に行った心エコーは、TBMCまたはPBSで処置したラットに比べてhBMSCを与えたラットではLVEDDとLVESDとの両方が有意に小さく（LVEDD：それぞれTBMCおよびPBSに対してP<0.05、LVESD：それぞれTBMおよびPBSに対してP<0.01）（図5a、b）、よってFSは有意に大きくなった（それぞれTBMCおよびPBSに対してP<0.01）（図5c）。局所壁運動異常の程度を表す壁運動スコア指数（WMSI）は有意に良好であった（それぞれTBMCおよびPBSに対してP<0.01）（図5d）。LVEDD、LVESD、FS、およびWMSIは、TBM処置ラットとPBS処置ラットとの間で異ならなかった。注目すべきことには、hBMSC処置ラット対TBMC処置ラットおよびPBS処置ラットでの運動障害の発生率は14%対58%および67%であった（P<0.05）。侵襲性血液動態測定から、TBMCまたはPBSを注射したラットよりもhBMSC移植ラットの方がLV収縮期圧（LVSP）、+dP/dt（圧上昇の最大速度）および-dP/dt（圧減少の最大速度）がすべて有意に大きいことを実証した（それぞれすべてP<0.01）（図5e、f）。総合すると、これらのデータはhBMSC移植が心筋梗塞後の機能回復の増大と、さらに好都合のリモデリングとをもたらすことを示している。
【００７６】
図5A〜Dを以下のとおりさらに十分に説明する。a〜d. MIおよび細胞移植の4週間後の心エコーパラメータは、TBMC処置ラットおよびPBS処置ラットに比べてhBMSC移植ラットの方が小さいLVEDD、LVESDならびに良好なFSおよびWMSIを示し、これは心機能が改善したことを示している。WMSI：壁運動スコア指数。e、f. ミラーカテーテルを使用したhBMSC移植梗塞周辺部の4週間後の侵襲性血液動態測定。LV収縮期圧（e）ならびに+dP/dtおよび-dP/dtはコントロール群に比べてhBMSC移植ラットの方が有意に増大した。*P < 0.05、** P < p. 01。
【００７７】
実施例5：インビボ移植したhBMSCの生着および多系列への分化転換
移植したhBMSCの生着の程度および大きさを決定するために、凍結サンプルからの4週間目の心筋切片を検査した。蛍光顕微鏡下で梗塞周辺部および梗塞部に多数のDiI標識BMSCの生着を観察した（図6a、b）。対照的に、TBMCを移植した心臓はそれよりも少数の分散したDiI標識細胞を示し、それらの細胞は大部分が梗塞部内に局在している（図5c、d）。免疫表現型のキャラクタリゼーションから、生着したDiI標識hBMSC（赤色）はCMC特異的タンパク質であるcTnIおよびANP（緑色）について陽性に染まり（α-MHCのデータは示さず）、梗塞周辺部および梗塞部に宿主CMCと区別不可能な形態的に成熟した外見のCMCの集団を形成した（図6e〜l）。これはCMCに分化したことを示している。hBMSCからECおよびSMCへの分化も、移植したhBMSCとILB4陽性血管ECおよびα-SMA陽性SMCとの共局在によって確認した。これはECおよびSMC表現型への分化を示唆する（図6m〜t）。CMCへの分化はhBMSC移植ラットだけにみられた。形態類似性およびCMC特異的タンパク質（cTnI）の発現によって定義されるCMCへの分化は、生存しているhBMSC移植ラット14匹中12匹（85%）にみられたことを検出できた。図6hおよび図8cにみられるように正常宿主心筋に類似した再生CMCの編制された集団は、ラット14匹中9匹（64%）に見出され、残りのラットのうち3匹（21%）では分散した細胞が分化していることだけが観察された。しかし、すべてのhBMSC処置ラットでCMC特異的タンパク質の発現が観察された。検査したすべてのラットで、形態およびマーカー陽性により規定したECおよびSMCへの分化が見られた。総合するとこれらの結果は、移植されたhBMSCが梗塞/虚血心筋で強く生着し、長期間生存し、デノボ筋形成および血管新生をもたらすことを示唆した。注目すべきことには、病理研究から、hBMSCを移植した心臓に奇形腫、血管腫症または骨形成がないことが明らかとなった。
【００７８】
図6A〜Dを以下のとおりさらに詳細に説明する。梗塞した心筋へのDiI標識hBMSCおよびTBMCの生着。多数のhBMSC（赤色蛍光）（a）が移植の4週間後に心筋の梗塞部および梗塞周辺部に生着している。対照的に、かなり少数のTBMC（赤色蛍光）は大部分が梗塞部内に見られる（c）。（b）および（d）は、生着した細胞の局在を示す（a）および（c）のホフマン像である。e〜l. CMCに分化したhBMSCの免疫表現型キャラクタリゼーション。4週間目の心筋サンプルをcTnI(g)およびANP(k)（それぞれFITC標識二次Abで検出）について染色した。移植したDiI-hBMSCは両マーカーについて陽性に染色まり、宿主CMCと見分けがつかず、CMC集団の再生を示した。m〜p. 血管ECへのhBMSCの取り込み。ECマーカーであるILB4(o)で染色した心筋切片は、DiI-hBMSCが血管ECと共局在していることを実証した（矢印、p）が、これはECへの分化転換を示唆している。q〜t. 血管SMCへのhBMSCの取り込み。α-SMA(s)で染色した心筋切片は、血管SMCと共局在するDiI-hBMSCを表し（矢印、t）、これはSMC表現型への分化を示す。
【００７９】
実施例6：移植したhBMSCは宿主心筋の増殖および生存を増強する
hBMSC移植の顕著な生理学的効果が、一部のラットでは単にインサイツでの多系列分化の程度で説明できないことから、次に、我々は移植したhBMSCが宿主心筋細胞の増殖および生存に影響するかどうかを解明しようと努めた。宿主心筋細胞の増殖性部分を決定するために、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)を一定に4週間送達するためのミニ浸透圧ポンプを埋込んで細胞周期のS期に入ったすべての細胞を標識した。hBMSCを移植した心臓からの切片では、宿主心筋細胞および移植細胞の両方で多数の増殖中の細胞が観察された（図7a〜d）。対照的に、TBMCまたはPBSを注射した心臓では、それよりもかなり少数のBrdU陽性細胞が観察された（図7e、f）。BrdU指数、すなわち各切片で計数された核の総数に対するBrdU陽性核の百分率は、コントロールよりもhBMSC移植心臓の方が有意に高かった（hBMSC対TBMC、PBS; 25.8±5.2%対11.2±3.1%、9.5±2.8 %、P < 0.001）。BrdUとILB4またはcTnIのいずれかとに対するmAbを使用した二重IF組織化学分析は、CMCおよびECがBrdUについて陽性であることを明らかにした（図7g〜n）。ECおよびCMCのBrdU指数は、今回もhBMSC移植心臓の方が高かった（対TBMC、PBS; EC、8.3±2.7対2.9±1.5、2.4±1.3、P < 0.01; CMC、2.1±1.2対0.2±0.1、0.2±0.1、P < 0.01）。これらの結果は、移植したhBMSCがECおよびCMCを含めた宿主心筋細胞の増殖を増強することを示している。
【００８０】
次に、進行中の心筋変性を担う主なメカニズムの一つと一般にみなされているアポトーシス過程に、移植した細胞が影響できるかどうかを、我々は1週間目の心筋サンプル（n=4）を使用して迅速MI.TUNELアッセイ法にしたがって検討した。各切片で計数した核の総数に対するTUNEL（+）核の百分率であるアポトーシス指数は、hBMSC移植心臓では3分の1であった（アポトーシス指数：対TBMC、PBS、2.1±0.8対6.6±1.2、7.3±1.1、P < 0.01）（図7o-q）。これらの差異は梗塞周辺部内で特に明白であった。サルコメアα-アクチニンまたはILB4とTUNELアッセイ法との同時染色後に得られたCMCおよびECのアポトーシス指数は、hBMSC移植心臓では有意に低下した(対TBMC、PBS; CMC、0.5±0.1対2.1±0.3、1.9±0.3、P < 0.01; EC、0.7±0.1対2.5±0.3、2.0±0.2、P < 0.01）（図7r-u）。このようにこれらの研究は、危険にさらされたCMCおよびECの生存を促してhBMSC移植が心筋機能を保つことができる代替メカニズムを解明する。
【００８１】
図7A〜Uを以下のとおりさらに十分に説明する。a-h. BrdU免疫組織化学分析による増殖性細胞の同定。hBMSC移植心臓切片（a〜d）では、宿主心筋細胞と移植細胞の両方で多数のBrdU陽性細胞（緑色の点）が観察された（c）。対照的に、TBMC(e)またはPBS(f)を注射したラットの心臓では、より少数のBrdU陽性細胞が観察された。g〜j. BrdU(h)およびILB4(i)に対する抗体を用いた同時染色は、hBMSCを移植した心臓の毛細血管ECに、BrdU陽性細胞（矢印）が存在することを実証している。k〜o. BrdU(l)およびcTnI(m)に対する抗体を用いた同時染色は、hBMSCを移植した心臓の成熟CMCに、BrdU陽性細胞（矢印）が存在することを示す（n）。m〜o. アポトーシスを起こした心筋細胞（矢印）を同定するために抗サルコメアα-アクチニンmAbおよびTUNELを用いたhBMSC(m)、TBMC(n)またはPBS(o)で処置された心筋の同時染色。TBMC(p)またはPBS(q)を与えたラットに比べてhBMSC(o)を与えたラットの方が梗塞周辺部でのアポトーシス細胞が少数であることが明らかである。倍率×400。r〜s. サルコメアα-アクチニンに対するmAb（赤色）およびTUNEL（緑色）で染色後に得た代表的画像は、PBSを注射した心臓にCMCのアポトーシス（矢印）を実証している。t〜u. ILB4（赤色）およびTUNEL（緑色）で染色後に得た代表的画像は、PBSを注射した心臓にECのアポトーシス（矢印）を実証している。
【００８２】
実施例7：移植したhBMSCのパラクリン効果：血管新生サイトカインおよび心臓転写因子の上方制御
心筋損傷後のhBMSCの治療効果を担う潜在的パラクリンメカニズムを同定するために、VEGF-A、アンギオポイエチン-1(Ang-1)および2(Ang-2)、肝細胞成長因子（HGF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、血小板由来成長因子-B(PDGF-B)、形質転換成長因子(TGF)-βのような血管新生サイトカインならびにNkx2.5、GATA-4、MEF2cのような心臓転写因子のmRNAの発現を、hBMSCまたはPBSで処置した14および18日後に採取した心臓サンプルを使用して半定量RT-PCRにより評価した。検査したすべての血管新生サイトカインの発現は、PBS群に比べてhBMSC移植心臓では2および4週間の両方で有意に上方制御された（P<0.01）。さらに、すべての血管新生サイトカインの高い発現は、hBMSC移植心臓では4週間目に維持されていた。これらの成果は、移植したhBMSCが血管新生および脈管形成を促進する潜在性を伴って多数の血管新生サイトカインの発現を調整できることを示唆している。GATA-4、Nkx2.5およびMEF2cは、コントロールに比べてhBMSC移植心臓で有意に上方制御されていた（図8b）。これは、移植したhBMSCが宿主CMCの分化を増強し、かつ／または新しいCMCに直接分化することによって筋形成を増大できることを示唆している。総合して、多数の因子の上方制御で、宿主ECおよびCMCに及ぼす移植したhBMSCの増殖効果を部分的に説明できる。
【００８３】
図8A〜Bを以下のとおり説明する。hBMSCまたはPBS処置の2および4週間後に組織サンプルを採取し、mRNAの発現を半定量RT-PCRで検査した。RT-PCR産物の代表的なゲルの写真（n=4）（左欄）およびGAPDHの発現に基づく血管新生サイトカイン（a）および心臓転写因子（b）のmRNAの発現の定量（右欄）。hBMSC移植サンプルでのすべての因子の上方制御が有意であることに注意。少なくとも3回の繰り返しで実験を行った。** P < 0.01、*** < 0.001
【００８４】
実施例8：hBMSCの移植は毛細血管およびCMCの密度を増加させ、心筋線維症を減少させた。
梗塞した心筋の病理的特性に及ぼすhBMSC移植の最終的な影響を決定するためにCD31およびHE染色後に、それぞれ毛細血管密度およびCMC密度を定量して、周縁の線維症の面積百分率を測定した。TBMCおよびPBSを注射したラットよりもhBMSCを移植したラットの方が毛細血管密度は2および2.3倍高かった（P < 0.01）（図9a〜d）。TBMCおよびPBSを注射したラットよりもhBMSCを移植したラットの方がCMC密度も2.4および2.8倍高かった(P < 0.01）（図9d〜g）。マッソン三色染色切片で測定した周縁線維症の面積百分率は、hBMSCを移植した心臓の方が線維症（青色領域）の面積が小さいことを実証した（P < 0.01対TBMC、PBS）。
【００８５】
図9A〜Gを以下のとおりさらに詳細に説明する。a〜d. 細胞移植の4週間後の梗塞心筋でのCD31についての代表的免疫組織化学分析の結果（a〜c）。hBMSCを移植した心臓の方が有意に高い毛細血管密度を示す。** P < 0.01対TBMCおよびPBS。e〜h. HEで染色した梗塞部の代表的な結果（e〜g）は、hBMSC移植心臓での心筋の顕著なサルベージおよび再生を実証している。** P < 0.01対TBMCおよびPBS。i〜l. マッソン三色染色した心臓の代表的な図。hBMSCを移植した心臓の方が線維症の面積百分率が有意に小さいことを示す。** P < 0.01対TBMCおよびPBS。
【００８６】
下記の材料および方法を必要に応じて使用し実施例1〜8として上に示した実験を行った。
【００８７】
1.  BMSCの単離および培養
若年男性ドナーからの新鮮未処理ヒトBMをBiowhitttaker（Cambrex）（Wakersville, MD）から購入した。BMを1300rpmで10分間遠心分離して細胞ペレットを得た。0.5M EDTAを含有するDPBS(DPBS-E) 25mlに細胞ペレットを再懸濁した。1300rpmで7分間遠心分離した後で、溶血を誘導するために細胞をDPBS-E 5mlおよびNH4Cl 20mlに再懸濁した。DPBS-Eで遠心分離および洗浄した後で、40μmのナイロンフィルターで細胞を濾過して、フィブロネクチン（100μg/ml）を被覆した6ウェル平板のウェルに入れて平板培養した。17% FBS（Biowhittaker、骨髄細胞の増大を促進するためにロットを選択）、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび2mMグルタミン酸塩を含有し低（1g）グルコースを有する完全DMEMに入れて37℃および5% CO2で4〜6日間細胞を成長させ、培地を新鮮な完全培地と交換して、接着細胞を集密度60%になるまで成長させた。次に、25cm2組織培養フラスコ（T25）に、完全培地に入れた細胞を1×104個/cm2の密度で再び接種した。細胞が集密度60%になった後で、同密度でT75およびT175フラスコに細胞を系列的に再び接種した。T175フラスコで培養物を少なくとも2回継代した後で、細胞をCellTracker（商標）CM-DiI（Molecular probes）で標識して、限界希釈法により1ウェルあたり細胞1/2個の密度で96ウェル平板のウェルに入れて平板培養して、限界希釈前に採集した馴らし培地と共に培養し、-80℃で保存して0.2μmのフィルターで濾過した。蛍光顕微鏡下で我々は1個を超える細胞を含むウェルを除外した。（図1a）はウェル中の単一細胞の位相差および蛍光像を示す。細胞が集密度40〜50%まで成長したとき、ウェル1個からの細胞を6ウェル平板のウェル1個に系列的に再接種してから、細胞4〜8×103個/cm2の密度でT25、T75およびT175に系列的に接種した。次に細胞をT175で培養して、1：10〜40希釈で再び平板培養して細胞4〜8×103個/cm2まで成長させた。
【００８８】
2.  蛍光標示式細胞分取
培養hBMSCについてhBMSCの蛍光標示式細胞分取（FACS）分析を行った。クローン単離前後の少なくも3つの異なるクローンからの細胞を使用し、クローン系については5PDおよび120PDの2セットの細胞を使用した。FACS染色法は以前に記述されている｛Kalka, 2000 #11｝。簡潔には、10% FBSおよび0.01% NaN3を含有するダルベッコPBS（Cambrex）200μlで総培養細胞2×105個を再懸濁して、PEもしくはFITC複合モノクローナル抗体または非複合抗体と直接、続いてFITC複合ウサギ抗マウスIgG（Jackson Immunoresearch）と共に、4℃で20分間インキュベートした。適当なアイソタイプが同一の免疫グロブリンをコントロールとした（Beckton-Dickinson, Medford, MA, USA）。染色後に、細胞を2%パラホルムアルデヒドで固定した。FACStarフローサイトメーターで定量FACSを行った（B〜D）。FACS分析に使用した抗体は、CD4、CD8、CDllb（Mac-1）、CD13、CD14、CD15、CD29、CD30、CD31、CD34、CD44、CD71、CD73、CD90（Thyl）、CD117（c-kit）、CD146、CD166、HLA-DR、HLA-ABC、Beckton Dickson（BD）からのβ2-ミクログロブリン、Miltenyl Biotech（Auburn, CA, USA）からのCD133（AC133）、およびAncell（Bayport, MN, USA）からのCD105（エンドグリン）に対するFITCまたはフィコエリトリン（PE）複合抗体ならびに、Santa-CruzからのOct4に対する非複合抗体であった。比較のためにヒト間葉性幹細胞（PT-2501）および培地（PT-3001）をCambrex（Poietics）から購入してFACSに使用した。
【００８９】
3.  DNAの倍数体分析
細胞をリボヌクレアーゼ（100μg/ml）で前処理してプロピジウムヨージド（50μg/ml）で染色してからFACS分析することによって細胞1個あたりのDNA含量を決定した。
【００９０】
4.  テロメア長のアッセイ法
異なる三つのクローンからの5PDおよび120PDでのhBMSCのテロメア長を決定するために、我々はTeloTAGGGテロメア長アッセイキット（Roche, Indianapolis, IN）を使用した。簡潔には、ゲノムDNAを単離（1μg）および消化した後に、ゲル電気泳動によってDNAフラグメントを分離してサザンブロットによりナイロン膜に移行させた。移し取ったDNAフラグメントをテロメア制限酵素フラグメント（TRF）に特異的なジゴキシゲニン（DIG）標識プロ−ブとハイブリダイズさせ、アルカリホスファターゼに共有結合したDIG特異的abと共にインキュベートする。最後に、アルカリホスファターゼによって代謝される高感度化学発光基質であるCDP-Starによって固定化テロメアプローブを視覚化する。分子量標準とシグナルを比べることによって平均TRF長を決定した。
【００９１】
5.  hBMSCのインビトロ分化
5および90PDの異なる三つのクローンhBMSCを使用することにより、以下のインビトロ研究のすべてを行った。ECへの分化を誘導するために、0.1%ゼラチンまたはビトロネクチンのいずれかを被覆したグラスチャンバースライドに入れて、2〜5% FBS、10-8デキサメタゾンおよび10ng/ml VEGF（R&D, Minneapolis, MN）を有するDMEMまたはEBM-2(Clonetics)中で細胞5×104個/cm2でhBMSCを再平板培養し、14日間培養した。SMC表現型への分化を誘導するために非被覆またはフィブロネクチンで被覆した培養皿に入れて、PDGF-BB（50ng/ml、R&D）を補充した1〜2%DMEMまたはEBM-2中で細胞1×105個/cm2でhBMSCを再平板培養し［Hellstrom, 1999 #756; Yamashita, 2000 #757］、14日間培養した。神経系列への分化を誘導するために、DMEM/F12に100ng/ml bFGFおよび20ng/ml EGF、B27補充物を有するポリ-L-オルニチン-ラミニンで被覆した皿（B〜D）またはプラスチック皿上で細胞4×104個/cm2でhBMSCを平板培養し［Palmer, 1999 #764;Mezey, 2000 #750;Brazelton, 2000 #749］、14日目まで培養した。内胚葉系列への分化を誘導するために、10-8デキサメタゾン、25ng/ml HGF、10ng/ml FGF-4を補充した2% FBSに入れて1%マトリゲル（BD）上で細胞3〜5×104個/cm2でhBMSCを平板培養し、7日間培養してから、10mg/ml DMSOまたは0.5mM酪酸ナトリウムのいずれかを添加し、さらに7日間培養した［Shen, 2000 #761;Hamazaki, 2001 #762;Oh, 2000 #763;Schwartz, 2002 #747］。hBMSCからCMCへの分化を誘導するために、hBMSCを新鮮単離したNRCMと共に共培養した。F344ラットからの初代NRCMをすでに記述されたように単離して［De Luca, 2000 #759］、細胞2×105個/cm2で平板培養した。10%ウシ胎仔血清（FCS）を含有するDMEMに入れてDiI標識hBMSCをNRCM培養平板に1：4の比で添加し［Condorelli, 2001 #758］、10日目まで培養した。
【００９２】
6.  インビトロ融合の研究
EGM-2 MV Single Quots（Cambrex）を含有するEBM-2中でラット大動脈内皮細胞（RAEC）を培養した。15% FBS、2mM L-グルタミンおよび抗生物質を含有し1g/Lグルコース（Cellgro）を有するDMEM中でラット血管平滑筋細胞（RVSMC）を培養した。NRCMを単離して上記のように培養した。細胞が集密度50〜60%に達したとき（3日以内）に、細胞を25μM Vybrant CFDA SE細胞トレーサーキット（Molecular Probes, Engene, OR）で製造業者の使用説明書にしたがって染色した。CFDA SEで標識した細胞は蛍光顕微鏡下で緑色を示す。2日後にDiI標識hBMSC（赤色蛍光）をRAEC、RVSMCまたはNRCMの培養平板に1：4の比で加え、7日間培養した。培地を2〜4日毎に交換した。融合および分化の普及率を決定するために、異なる3回の実験からの共培養物毎に細胞5000個を計数した。
【００９３】
7.  免疫蛍光細胞化学分析に使用した抗体
免疫細胞化学分析のために、細胞を4%冷パラホルムアルデヒド中で7分間固定し、PBSで2回洗浄した。ECマーカーとして我々は以下に対するabを使用した：vWF（ヤギpAb）（1:400、Sigma, St Louis, MO）、Flk-1（マウスmAb）（1:300、Santa-Cruz, Santa-Cruz, CA）VE-カドヘリン（マウスmAb）（1:100、BD）、CD31（マウスmAb）（1:100、BD）、UEA-1レクチン（1:200、Vector, Burlingame, CA）、イソレクチンB4（1:200、Vector）およびDiIアセチル化 LDL（Biomedical Technologies, Stoughton, MA）。SMCマーカーとして、我々は以下に対するabを使用した：α-平滑筋アクチン（マウスmAb）（1:300）、カルポニン（マウスmAb）（1:250、DAKO, Carpinteria, CA, USA）。神経系列マーカーとして、我々は以下に対するabを使用した：NF-200（マウスmAb）（1:400、Sigma）、β-チューブリンIII（マウスmAb）（1:100、Sigma）、Gal-C（ウサギpAb）（1:100、Sigma）、GFAP（ヤギpAb）（1:200、Santa-Cruz）。内胚葉（肝細胞または他の上皮）系列マーカーとして我々はCK18（マウスmAb；1:300）（Sigma）、α-フェトプロテイン（ヤギpAb、1:200）（Santa-Cruz）、アルブミン（マウスmAb、1:400）（Sigma）、HNF3β（ヤギpAb、1:100）（Santa-Cruz）、HNF1α（ウサギpAb、1:200）（Santa-Cruz）を使用した。CMCマーカーとしてcTnI（マウスmAbおよびウサギpAb（1：100）の2形態）（Chemicon, Temecular, CA）、心室ミオシン重鎖α（α-MHC）（マウスmAb、1:100）（Chemicon）、サルコメアα-アクチニン（クローンEA-53、マウスmAb、1:200）（Sigma）、ANP（ウサギpAb）（Chemicon）に対するabを使用した。コントロールのマウス、ウサギまたはヤギIgGをSigmaから得た。二次抗マウス、ウサギまたはヤギ抗体（AMCA、1:150、FITCまたはCy-2、1:200； Cy-3、1:200）をJackson Immunoresearch（West Grove, PA）から得た。
【００９４】
8.  インビボ実験の実験計画
すべての手順をCaritas St. Elizabethの研究機関の動物管理使用委員会（Caritas St. Elizabeth's Institutional Animal Care and Use Committee）にしたがって実施した。6〜7週齢の雌性ヌードラット（Hsd：RH-rnuラット、Harlan, Indianapolis, IN）に外科手術を行い急性MIを作製して、その直後に8×105個のhBMSCもしくは8×105個のヒト新鮮総BM細胞（TBMC）またはPBSを合計容積200μlで梗塞周辺部の5部位（前方底部、前方中部、側方中部、前方上部、側方上部）に心筋内注射した。各群15匹にラットをランダムに割り付けた。培養前のTBMCの調製はhBMSCの調製と同様であった。以前に記述されたように細胞移植を行う前にhBMSCおよびTBMCをカルボシアニン色素であるDiI（1.5μg/ml、Molecular Probes）で標識した［Kalka, 2000; Kawamoto, 2001］。外科手術の後に1.25mg BrdU/d（Sigma）（ジメチルスルホキシドと0.154M NaClとの1：1（vol/vol）混合物に溶解）を注入するミニ浸透圧ポンプ（model 2ML4, Alzet, Palo Alto, CA）を別々のラット（各群n=4）の背部の皮膚の下に埋め込み、4週間目に屠殺した｛McEwan, 1998｝。TUENLアッセイ法および分子研究のために別のラットを同様に外科手術して、外科手術から1および2週間目に屠殺した（各時点でn=4）。外科手術の後にラットに心エコー検査（エコー）を受けさせて、侵襲性血液動態測定を28日後に行った。次に、大動脈に生理食塩水を潅流することでラットを屠殺した。剖検では心尖から心底にかけて3個の横断切片を得るように心臓をスライスし、4%パラホルムアルデヒド、メタノールで固定するか、またはOCT化合物中で凍結させ、厚さ5μmの切片を作製した。
【００９５】
9.  急性心筋梗塞モデル
我々の研究所で以前に記述したようにMIを誘導した［Kawamoto, 2003; Kawamoto, 2001］。左開胸および人工呼吸器（モデル683、Harvard Apparatus）下での心膜切開の後に、左冠状動脈前下行枝（LAD）をその起始部近くで6-0プロレン縫合糸（Ethicon）で結紮した。
【００９６】
10.  心機能の測定
すでに記述されたようにSONOS 5500（Agilent Technologies, Andover, MA, USA）に接続した6.0〜15.0MHzウルトラバンドリニアトランスデューサを用いて経胸壁心エコー検査を行った｛Kawamoto, 2003｝。LVEDD、LVESD、FSを測定した。すべての測定は少なくとも3回の連続する心サイクルの平均を表す。局所壁運動異常を評価するために、壁運動スコア（WMSI）を使用した｛Oh JK, 1999｝。LV壁運動分析は個別のセグメントの収縮性の等級づけに基づく。このスコアづけシステムでは高いスコアは壁運動異常がより重症であることを示す（1：正常、2：運動低下、3：無運動、4：奇異性収縮、5：心室瘤）。WMSIは視覚化したセグメントの数で壁運動スコアの合計を割ることによって得られる；これは、局所壁運動異常の程度を表す。正常なWMSIは1である。血液動態変数を測定するために、1.4フレンチの高性能圧トランスデューサ（Micro-tip catheter, Millar Instrument, Houston, TX）を右頚動脈を経由して左心室に導入した。血液動態が安定になってからポリグラフ（モデル7P）（Grass Instrument, West Warwick, RI, USA）を使用してLVSP、LVEDP、+dP/dtおよび-dP/dtを記録した［Kawamoto, 2001］。
【００９７】
11.  心組織の免疫蛍光組織化学分析
OCT包埋凍結切片を4%PFAで固定して、以下の免疫組織化学分析に使用した。ECを同定するために一次Abとしてビオチン化イソレクチンB4（1：200、Vector）を、その後にストレプトアビジン-FITC（1：100）を使用した［Kawamoto, 2001］。マウスα-SMC Ab（Sigma、1：200）およびその後のFITC複合ヤギ抗マウスIgGによってSMCを同定した。cTnIおよびANPに対するabならびにその後のFITC複合ヤギ抗ウサギIgGによってCMCを同定した。
【００９８】
12.  BrdU免疫組織化学分析およびTUNELによるアポトーシスの決定
ヒツジ抗BrdU抗体（1：50、Biodesign）およびその後のストレプトアビジン-FITC（1：100、Vector）を用いてBrdUを検出した。DAPIで核の対比染色を行った。瘢痕組織が可視野の20%未満を構成している（倍率×200）梗塞周辺部でBrdU陽性細胞を計数した。
【００９９】
記述されたようにインサイツ細胞検出キット（Roche）を使用してターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）介在性dUTP-ビオチンニック末端標識（TUNEL）法で、フラグメント化したDNAのインサイツ標識を行った（Fujio, 2000）。2週間目の心筋切片をTUNEL染色に使用した（それぞれn=4）。簡潔には、切片をプロテイナーゼK 20μgで処理する。洗浄後に切片をフルオレセインdUTPと混合したTdTの溶液中でインキュベートする。次に、核の局在に関して切片をDAPIで対比染色する。CMCまたはECでアポトーシスを起こした核の比率を決定するためにサルコメアα-アクチンまたはILB4に対するmAbで組織を対比染色した。組織切片を倍率×200で顕微鏡観察し、梗塞/梗塞周辺部での合計8個のランダムな視野を観察した（合計約10,000個の核）。アポトーシス細胞の百分率をアポトーシス指数と名付けた。
【０１００】
13.  RT-PCR分析
以前に記述されたようにRT-PCRを実施した（Yoon, 2003）。製造業者の使用説明書にしたがってRNaqueousキット（Ambion, Austin, Texas, USA）を使用して培養細胞または心臓から総RNAを抽出した。ランダムヘキサマーおよびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Superscript IIキット、Roche）を使用して1マイクログラムの総RNAを逆転写した。Advantage cDNAポリメラーゼミックス（Clontech）またはTaqポリメラーゼ（Roche）を使用してRT産物をPCRに供した。半定量RT-PCRのために、GAPDHの発現に基づき各遺伝子のmRNA発現の定量値を計算した。PCRプライマーおよび使用したアニーリング温度を表1に記述する。100bpのラダー（Life Technologies）用いた1.5%アガロースゲル電気泳動でRT-PCR産物を分析してUV撮像装置Eagle-Eye II（Stratagene）で定量した。
【０１０１】
14.  心臓組織分析および形態測定
以前に記述されたように4週間目のサンプルをCD31に対するmAbおよびH&Eで染色した後で毛細血管密度およびCMC密度を計数した｛Kawamoto, 2003; Kawamoto, 2001｝。計数のために、梗塞/梗塞周辺部で毛細血管およびCMCの横断面がはっきりと見える合計8個の可視野をランダムに選択し、倍率×200で毛細血管またはCMCの数を計数した（各群n=6）。線維症の面積の決定にはマッソン三色染色（Sigma）で染色後のすべての組織切片についてLV面積あたりの線維症面積の平均比率を測定した［Kawamoto, 2001］。
【０１０２】
15.  統計解析。二群を比較するために対応のないStudentのt-検定を、二つを超えた群についてはANOVAに続くScheffeのポストホックで統計解析を行う。P<0.05は統計的有意を意味するものとみなす。
【０１０３】
16.  ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のプライマー。下記の表1は本明細書に開示した実験を実施するために必要に応じて使用したオリゴヌクレオチドプライマーを示す。「産物サイズ」は、増幅産物の（塩基対数で表した）予想サイズに関係する。
表1.  RT-PCRのプライマー配列および産物の予想サイズ
【０１０４】
2007519397.tif 000003
【０１０５】
2007519397.tif 000004
-f：順方向プライマ、r：逆方向プライマー
【０１０６】
追加情報
図10.  多数の表面エピトープを使用したFACS分析は、hBMSCにCD117が無発現ないし最小の発現（<1%）であることを実証した。主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI（ABC）およびII（DR）は陰性であり、公知のHSCマーカー（CD34、CD133、Flk-1、Tie2）は発現していなかった。
【０１０７】
下記の参考文献1〜80は、本開示にわたり参照され、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１０８】
参考文献
2007519397.tif 000005
2007519397.tif 000006
2007519397.tif 000007
2007519397.tif 000008
2007519397.tif 000009
2007519397.tif 000010
【０１０９】
本発明は特定の態様を参照して記述されているが、本発明の変更および変形は、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲から逸脱しないと解釈されうる。すべての参照は参照として本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】本発明のヒト骨髄幹細胞（hBMSC）の特徴を示す。
【図２】hBMSCの内皮細胞（EC）および平滑筋細胞（SMC）系列へのインビトロ分化を示す。
【図３】hBMSCの神経および内皮系列へのインビトロ分化を示す。
【図４】hBMSCの心筋細胞（CMC）、ECおよびSMC細胞へのインビトロ分化転換および融合を示す。
【図５】hBMSC移植が、心筋梗塞（MI）のラットモデルにおける有害な心臓リモデリングを弱めることを示す。
【図６】梗塞心筋に移植されたhBMSCが生着し多系列分化することを示す。
【図７】ヒトBMSCの移植が、心筋細胞の増殖を促進し、心筋のアポトーシスを減じることを示す。
【図８】hBMSCの移植が血管新生サイトカインのmRNA発現および心臓での転写をアップレギューレションすることを示す図。
【図９】ヒトBMSCの移植が毛細血管およびCMCの密度を高め、心筋繊維症を増加することを示す図。
【図１０】複数の表面エピトープを用いたFACS分析の結果を示す図。
【図１−１】
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【図１−２】
2007519397.tif 000012
【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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