(57)【要約】  有核赤血球の測定のための有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物の使用方法が開示される。当該有核赤血球成分は、特定の測定により測定される場合、血液溶解条件においてヒト有核赤血球のインピーダンス及び光学特性をシミュレートするインピーダンス及び光学特性を有する、安定化され又は処理された有核赤血球から作製される。当該方法は、リファレンスコントロール組成物を溶解剤と混合すること、及び当該コントロールサンプル混合物をフローサイトメトリー機器において、インピーダンス、及びインピーダンスと光学測定、又はＤＣインピーダンスと光散乱、高周波、及び第二ＤＣインピーダンスの多次元測定により分析すること；及びリファレンスコントロール中のシミュレートされた有核赤血球をレポートすることを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）リファレンスコントロール組成物を、インピーダンス測定により有核赤血球の測定が可能なフローサイトメトリー機器に供する工程であって、当該リファレンスコントロール組成物が、安定化動物有核赤血球から作製された有核赤血球成分を含んで成り；ここで当該安定化動物有核赤血球が、当該インピーダンス測定により測定される場合、血液溶解条件においてヒト有核赤血球のインピーダンス特性をシミュレートするインピーダンス特性を有する工程；
（ｂ）コントロールサンプル混合物を形成するために、上記リファレンスコントロール組成物を溶解試薬と混合する工程であって；ここで当該溶解試薬への暴露において、上記安定化動物有核赤血球が実質的に溶解され、そしてその細胞容積が実質的に核容積まで減少する工程；
（ｃ）工程（ｂ）由来の実質的に溶解された動物有核赤血球を測定するために、上記インピーダンス測定により上記コントロールサンプル混合物を分析する工程；及び、
（ｄ）上記リファレンスコントロール組成物中のシミュレートされたヒト有核赤血球の数をレポートする工程、
を含んで成る、有核赤血球の測定のためのリファレンスコントロール組成物の使用方法。
【請求項２】
前記インピーダンス組成物が、直流（ＤＣ）インピーダンス測定である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インピーダンス測定が、高周波（ＲＦ）インピーダンス測定である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記安定化動物有核赤血球が、約３８０ｆｌ〜約４６０ｆｌの平均細胞容積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記安定化動物有核赤血球が、爬虫類赤血球、及び魚類赤血球から成る群から選択される１つである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記安定化動物有核赤血球が、ワニ赤血球である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記リファレンスコントロール組成物が、更に、前記懸濁培地中に白血球成分を含んで成り、そして前記方法が、更に、白血球を測定及びレポートする工程を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リファレンスコントロール組成物が、更に、前記懸濁培地中で分散される赤血球成分、及び血小板成分を含んで成り、そして前記方法が、更に、赤血球及び血小板を測定及びレポートする工程を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）リファレンスコントロール組成物を、インピーダンス及び光学測定により有核赤血球の測定が可能なフローサイトメトリー機器に供する工程であって、当該リファレンスコントロール組成物が、安定化動物有核赤血球から作製された有核赤血球成分を含んで成り；ここで当該安定化動物有核赤血球が、当該インピーダンス及び光学測定により測定される場合、血液溶解条件においてヒト有核赤血球のインピーダンス及び光学特性をシミュレートするインピーダンス及び光学特性を有する工程；
（ｂ）コントロールサンプル混合物を形成するために、上記リファレンスコントロール組成物を溶解試薬と混合する工程であって；ここで当該溶解試薬への暴露において、上記安定化動物有核赤血球が実質的に溶解され、そしてその細胞容積が実質的に核容積まで減少する工程；
（ｃ）工程（ｂ）由来の実質的に溶解された上記動物有核赤血球を測定するために、上記インピーダンス及び光学測定により上記コントロールサンプル混合物を分析する工程；及び、
（ｄ）上記リファレンスコントロール組成物中のシミュレートされたヒト有核赤血球の数をレポートする工程。
【請求項１０】
前記インピーダンス測定が、直流（ＤＣ）インピーダンス測定である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記インピーダンス測定が、高周波（ＲＦ）インピーダンス測定である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記光学測定が、光散乱測定である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記光学測定が、軸上光損失測定である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記安定化動物有核赤血球が、約３８０ｆｌ〜約４６０ｆｌの平均細胞容積を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記安定化動物有核赤血球が、爬虫類赤血球、及び魚類赤血球から成る群から選択される１つである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記安定化動物有核赤血球が、ワニ赤血球である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記リファレンスコントロール組成物が、更に、前記懸濁培地中に白血球成分を含んで成り、そして前記方法が、更に、白血球を測定及びレポートする工程を含んで成る、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記リファレンスコントロール組成物が、更に、前記懸濁培地中で分散される赤血球成分、及び血小板成分を含んで成り、そして前記方法が、更に、赤血球及び血小板を測定及びレポートする工程を含んで成る、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）安定化動物有核赤血球から作製された有核赤血球成分を含んで成る、リファレンスコントロール組成物を供する工程であって；ここで当該安定化動物有核赤血球が、ＤＣインピーダンス、高周波、及び光散乱測定により測定される場合、血液溶解条件下においてヒト有核赤血球のＤＣインピーダンス、高周波、及び光散乱特性をシミュレートするＤＣインピーダンス、高周波、及び光散乱特性を有する工程；
（ｂ）赤血球を溶解し、そして第一コントロールサンプル混合物を形成するために、上記リファレンスコントロール組成物の第一アリコットを第一溶解試薬系に暴露する工程；
（ｃ）赤血球を溶解し、そして第二コントロールサンプル混合物を形成するために、上記リファレンスコントロール組成物の第二アリコットを第二溶解試薬系に暴露する工程であって；ここで上記第一及び第二溶解試薬への暴露において、上記安定化動物有核赤血球が実質的に溶解され、そしてその細胞容積が実質的に核容積に減少される工程；
（ｄ）第一直流インピーダンス測定（ＤＣ１）、高周波インピーダンス測定（ＲＦ）、及びメジアン角光散乱測定（ＬＳ）を含んで成る検出により、上記第一コントロールサンプル混合物を測定する工程；
（ｅ）第二直流インピーダンス測定（ＤＣ２）により、上記第二コントロール試料混合物の血液細胞分布を測定する工程；
（ｆ）工程（ｄ）及び（ｅ）の測定値を分析する工程；及び、
（ｇ）上記リファレンスコントロール組成物中のシミュレートされた有核赤血球をレポートする工程、
を含んで成る、有核赤血球の測定のためのリファレンスコントロール組成物の使用方法。
【請求項２０】
前記安定化動物有核赤血球が、約３８０ｆｌ〜約４６０ｆｌの平均細胞容積を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記安定化動物有核赤血球が、爬虫類赤血球、及び魚類赤血球から成る群から選択される１つである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記安定化動物有核赤血球が、ワニ赤血球である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２３】
前記リファレンスコントロール組成物が、更に、前記懸濁培地中に白血球成分を含んで成り、そして前記方法が、更に、白血球を測定及びレポートする工程を含んで成る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記リファレンスコントロール組成物が、更に、前記懸濁培地中で分散される赤血球成分、及び血小板成分を含んで成り、そして前記方法が、更に、赤血球及び血小板を測定及びレポートする工程を含んで成る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
懸濁培地中で懸濁された安定化動物有核赤血球を含んで成る予定された容量の類似体懸濁液、及び予定された容量のヒト全血を含んで成るリファレンスコントロール組成物であって、ここで当該組成物中の当該ヒト全血の血液細胞がフローサイトメトリー機器の分析において当該類似体懸濁液と混合する前のヒト全血の血液細胞と実質的に同じように振舞うように、当該懸濁培地がヒト全血と適合するリファレンスコントロール組成物。
【請求項２６】
前記安定化有核赤血球が、動物有核赤血球赤血球である、請求項２５に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項２７】
前記動物有核赤血球が、爬虫類及び魚類赤血球から成る群から選択される１つである、請求項２５に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項２８】
細胞懸濁培地中に懸濁される、約４．０μｍ〜約４．７μｍの範囲における核サイズを有する小型哺乳類リンパ球から作製された有核赤血球成分を含んで成る、リファレンスコントロール組成物。
【請求項２９】
前記小型哺乳類リンパ球の細胞質が、実質的に除去され、そして残存する細胞の実体が固定される、請求項２８に記載のリファレンスコントロール組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フローサイトメトリー機器における血液サンプルの有核赤血球の測定のためのリファレンスコントロール組成物の製造及び使用方法に関する。より具体的には、当該リファレンスコントロール組成物は、インピーダンス及び光学測定、並びにこれらの組み合わせによる、血液サンプル中の他の細胞種から有核赤血球を判別する方法に適当である。
【０００２】
本願は、その全体における参考文献として本明細書に組み入れられている、２００３年１０月１２日に出願された仮特許出願第６０／５１０，７２８号の３５  ＵＳＣ  １１９（ｅ）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
クオリティーコントロールは、臨床的な血液学において、長い間必要とされ、そして慣習的な手順であった。多様な種類の血液細胞の計数における精度は、部分的に、適当なコントロール製品の使用、及び当該コントロール製品の使用方法に依存する。機器の誤動作の可能性が存在することから、現在入手可能な多くの種類の粒子計数用の機器におけるコントロール製品の使用のために、コントロール製品の使用によるクオリティーコントロールが必要とされる。自動粒子計数計のクオリティーコントロールプログラムを維持する伝統的な方法は、全血スタンダードとして新鮮なヒトの血液を供することから成っている。しかしながら、当該新鮮な血液は１日しか使用可能ではなく、このため製品のより長い有効期間を有する、多様な製造されたコントロール製品が開発されてきた。
【０００４】
コントロール製品において一般的に使用される粒子は、分析を行うことが意図される粒子又は細胞の種類をシミュレートし、又は近似する。結果的に、これらの粒子は類似粒子として、しばしば適用されてきた。これらの類似粒子は、機器において分析されるこれらの粒子又は細胞に類似する特定の特性を有するように選択又は作製されるべきである。代表的な特性及びパラメーターは、大きさ、容積、表面特性、粒度特性、光散乱特性、及び蛍光特性における類似性を含む。
【０００５】
現在、ヒト血液細胞の類似体として、多様な、処理又は固定されたヒト又は動物血球を使用する多様な商業的リファレンスコントロール製品が入手可能である。米国特許第５，５１２４８５号（Young, et al)は、処理及び固定された動物赤血球から作製された、いくつかの白血球類似体を含んで成る血液学的なコントロールを教示する。米国特許第６，１８７，５９０号及び第５，８５８，７９０号（Kim, et al)は、溶解及び固定されたトリ又は魚類赤血球から作製された有核赤血球（ＮＲＢＣ）類似体を含んで成る、血液コントロールを教示する。米国特許第６，４０６，９１５号、第６，４０３，３７７号、第６，３９９，３８８号、第６，２２１，６６８号、及び６，２００，５００号（Ryan, et al)は、トリ血球由来のＮＲＢＣ類似体を含んで成る、血液コントロールを教示する。米国特許第６，４４８，０８５号（Wang, et al)は、ニワトリ血液及び有核赤血球を伴う固定ヒト血液由来の有核赤血球（ＮＲＢＣ）類似体を含んで成る、血液コントロールを教示する。これらの先行技術は、有核赤血球のステージングの測定を促進するためのコントロール物質の細胞サイズ、及び蛍光強度の測定を教示する。米国特許第６，６５３，１３７号、及び第６，７２３，５６３号（Ryan)は、爬虫類又は魚類血液細胞から細胞質を溶解させ、そして除去することにより作製される有核赤血球成分を含む、血液リファレンスコントロールの製造及び使用方法を教示する。
【０００６】
更に、血液学的な機器における血液サンプル中の有核赤血球の測定のためのいくつかの検出方法が報告されている。米国特許第５，８７４，３１０号及び第５，９１７，５８４号(Li, et al)は、蛍光分析の使用の必要なく、溶解条件下において血液サンプルの光散乱シグナルの２つの角度を測定することによる有核赤血球を判別する方法を教示する。米国特許第５，８７４，３１０号及び第５，９１７，５８４号は更に、散乱光及びＤＣインピーダンスシグナルを測定することによる有核赤血球を判別する方法を教示する。米国特許第６，４１０，３３０号（Li et al) 及び同時継続中の米国特許出願第１０／２２６８００号（Li et al) はＤＣインピーダンス測定を使用することによるＮＲＢＣの測定方法を供する。
【０００７】
米国特許第６，４７２，２１５号（Huo et al) は、血液サンプルの第一アリコット及び第二アリコットを別々に第一溶解試薬系、及び第二溶解試薬系で溶解させること；フローセル中の第一サンプル混合物をＤＣインピーダンス、高周波、及び光散乱測定により測定すること；第二サンプル中の残存している血液細胞の細胞分布及び計数をフォーカスされていないフローアパーチャーにおけるＤＣインピーダンス測定により測定すること；第一サンプル混合物の測定、及び第二サンプル混合物からそれぞれ得られた血液細胞分布パターンを分析すること；そして更に、ＮＲＢＣを他の細胞種と判別するため、そして当該血液サンプル中のＮＲＢＣの数を測定するための併用分析を行うこと、により有核赤血球を判別する方法を教示する。
【０００８】
機器のクオリティーコントロールのための上述の各測定方法のための有核赤血球成分を含むリファレンスコントロールを供することが所望される。
【０００９】
また、リファレンスコントロール中の有核赤血球に基づく細胞を使用することが所望され、ここで当該類似体に基づく細胞は、特定の反応条件及び検出条件下において有核赤血球の個体群の特性をシミュレートする。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
ある態様において、本発明は、有核赤血球の測定のための有核赤血球成分を含むリファレンスコントロールを使用する方法に関する。当該方法は、以下の工程を含んで成る：（ａ）リファレンスコントロール組成物を、インピーダンス測定により有核赤血球の測定が可能なフローサイトメトリー機器に供する工程であって、当該リファレンスコントロール組成物が、安定化動物有核赤血球から作製された有核赤血球成分を含んで成り；ここで当該安定化動物有核赤血球が、インピーダンス測定により測定される場合、血液溶解条件においてヒト有核赤血球のインピーダンス特性をシミュレートするインピーダンス特性を有する工程；（ｂ）コントロールサンプル混合物を形成するために、リファレンスコントロール組成物を溶解試薬と混合する工程であって；ここで当該溶解試薬への暴露において、上記安定化動物有核赤血球が実質的に溶解され、そしてその細胞容積が実質的に核容積まで減少する工程；（ｃ）工程（ｂ）由来の実質的に溶解された動物有核赤血球を測定するために、インピーダンス測定により上記コントロールサンプル混合物を分析する工程；及び（ｄ）リファレンスコントロール組成物中のシミュレートされたヒト有核赤血球の数をレポートする工程。
【００１１】
本明細書における、インピーダンス測定は、直流（ＤＣ）及び高周波（ＲＦ）インピーダンス測定を含む。
【００１２】
上記安定化動物有核赤血球は、約３８０ｆｌ〜約４６０ｆｌの平均細胞容積を有し、好ましくは、爬虫類赤血球又は魚類赤血球、より好ましくはワニ赤血球である。
【００１３】
上記リファレンスコントロール組成物は、更に、白血球、赤血球、及び血小板成分を含んで成ってよく、そして上記方法は、更に、白血球、赤血球、及び血小板を測定及びレポートすることを含んで成ってよい。
【００１４】
更なる態様において、上記方法は以下の工程を含んで成る：（ａ）リファレンスコントロール組成物を、インピーダンス及び光学測定により有核赤血球の測定が可能なフローサイトメトリー機器に供する工程であって、当該リファレンスコントロール組成物が、安定化動物有核赤血球から作製された有核赤血球成分を含んで成り；ここで当該安定化動物有核赤血球が、インピーダンス及び光学測定により測定される場合、血液溶解条件においてヒト有核赤血球のインピーダンス及び光学特性をシミュレートするインピーダンス及び光学特性を有する工程；（ｂ）コントロールサンプル混合物を形成するために、リファレンスコントロール組成物を溶解試薬と混合する工程であって；ここで当該溶解試薬への暴露において、上記安定化動物有核赤血球が実質的に溶解され、そしてその細胞容積が実質的に核容積まで減少する工程；（ｃ）工程（ｂ）由来の実質的に溶解された動物有核赤血球を測定するために、インピーダンス及び光学測定により上記コントロールサンプル混合物を分析する工程；及び（ｄ）リファレンスコントロール組成物中のシミュレートされたヒト有核赤血球の数をレポートする工程。
【００１５】
本明細書において、インピーダンス測定は、直流（ＤＣ）及び高周波（ＲＦ）インピーダンス測定を含み、そして光学測定は、光散乱測定、及び軸上光損失測定（axial light loss measurement)を含む。
【００１６】
他の態様において、上記方法は以下の工程を含んで成る：（ａ）安定化動物有核赤血球から作製された有核赤血球成分を含んで成るリファレンスコントロール組成物を、供する工程であって；ここで当該安定化動物有核赤血球が、ＤＣインピーダンス、高周波、及び光散乱測定により測定される場合、血液溶解条件下においてヒト有核赤血球のＤＣインピーダンス、高周波、及び光散乱特性をシミュレートするＤＣインピーダンス、高周波、及び光散乱特性を有する工程；（ｂ）赤血球を溶解し、そして第一コントロールサンプル混合物を形成するために、上記リファレンスコントロール組成物の第一アリコットを第一溶解試薬系に暴露する工程；（ｃ）赤血球を溶解し、そして第二コントロールサンプル混合物を形成するために、上記リファレンスコントロール組成物の第二アリコットを第二溶解試薬系に暴露する工程であって；ここで第一及び第二溶解試薬への暴露において、上記安定化動物有核赤血球が実質的に溶解され、そしてその細胞容積が実質的に核容積に減少される工程；（ｄ）第一直流インピーダンス測定（ＤＣ１）、高周波インピーダンス測定（ＲＦ）、及びメジアン角光散乱測定（ＬＳ）を含んで成る検出により、上記第一コントロールサンプル混合物を測定する工程；（ｅ）第二直流インピーダンス測定（ＤＣ２）により第二コントロール試料混合物の血液細胞分布を測定する工程；（ｆ）工程（ｄ）及び（ｅ）の測定値を分析する工程；及び（ｇ）上記リファレンスコントロール組成物中のシミュレートされた有核赤血球をレポートする工程。
【００１７】
更なる観点において、本発明は、有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物に関する。ある態様において、上記リファレンスコントロール組成物は、懸濁培地中で懸濁された安定化動物有核赤血球を含んで成る予定された容量の類似体懸濁液、及び予定された容量のヒト全血を含んで成り、ここで上記懸濁培地は、組成物中のヒト全血の血液細胞が、フローサイトメトリー機器の分析における類似体懸濁液と混合する前のヒト全血の血液細胞と実質的に同じように振舞うように、ヒト全血と適合する。上記安定化有核赤血球は、動物有核赤血球、好ましくは、爬虫類及び魚類赤血球である。
【００１８】
他の態様において、上記リファレンスコントロール組成物は、細胞懸濁培地中に懸濁される約４．０μｍ〜約４．７μｍの範囲における核サイズを有する、小型哺乳類リンパ球から作製された有核赤血球成分を含んで成り、ここで当該小型哺乳類リンパ球の細胞質は、実質的に除去され、そして残存する細胞の実体（cellular entity)が固定される。
【００１９】
本発明の詳細な説明
１．有核赤血球を含むリファレンスコントロール組成物及び製造方法
ある態様において、本発明は、有核赤血球（ＮＲＢＣ）成分を含むリファレンスコントロール組成物の製造方法を供する。当該方法は、以下の工程を含んで成る：特定の測定、又は特定の測定の組み合わせにより測定される場合、溶解条件下においてヒト有核赤血球をシミュレートするのに適当な有核血液細胞を供する工程；上記有核血液細胞を安定化させる工程；それからリファレンスコントロール組成物を有核赤血球の分析のためのフローサイトメトリー分析計に送達するのに適当な懸濁培地中に上記安定化有核血液細胞を混合する工程。本発明の目的のために、上記有核赤血球成分、並びに他の細胞種成分もまた、類似体、例えば、ＮＲＢＣ類似体として称される。
【００２０】
ヒト有核赤血球をシミュレートするために適当な有核血液細胞の適当な例は、多様な有核動物赤血球、及び小型哺乳類リンパ球を含む。好ましい爬虫類及び魚類赤血球、例えば、ワニ、サメ、及びサケ赤血球が使用される。異なる動物種からの有核赤血球は、異なる細胞及び核容積又はサイズを有する。例えば、ニワトリ赤血球は、実質的にワニ及びサメ赤血球よりも小さい。溶解及び固定されたニワトリ赤血球は、蛍光的な測定のためのＮＲＢＣ類似体として使用されてきたが、測定方法がサイジングに基づく場合、これらの細胞は、ヒト有核赤血球をシミュレートするには小さすぎる。例えば、インピーダンス又は光散乱測定のみが使用される場合、これらの類似体は、ヒト血液分析のために供される測定のダイナミックレンジ外となりうる。
【００２１】
ワニ及びサメ赤血球は、大きな核容積を有する。サンプル調製に使用される溶解試薬に暴露する場合、これらは実質的に溶解され、そして当該細胞容積は、同じ反応条件下において、実施的に、ヒト有核に近似するこれらの核容積にまで減少する。更に、これらの実質的に溶解されたワニ又はサメ赤血球もまた、同じ反応条件下において、ヒト有核赤血球の特定の光学特性、例えば、光散乱特性、及び軸上光損失特性をシミュレートする。好ましい態様において、ワニ赤血球は、ワニ全血の入手可能性のために、有核赤血球成分の製造に使用される。
【００２２】
更に、ワニ赤血球の細胞及び核容積は、ワニの年齢及び彼らの食物摂取に依存して異なる可能性があることが知られている。例えば、新鮮な肉を摂食したワニは、加工されたドライフードを摂食したものよりも比較的大きな赤血球を有する。本発明の目的のために、約３８０ｆｌ〜４６０ｆｌの平均細胞容積を有するワニ赤血球が、下記のインピーダンス及び光学測定により測定される場合、ヒト有核赤血球をシミュレートするために適当であることが発見された。
【００２３】
有核赤血球成分を調製するために、先ず、ワニ全血量中のワニ赤血球を、遠心分離により、白血球、血小板、血漿を含む他の血液成分から分離する。当該ワニ赤血球をそれから、等張性洗浄溶液により洗浄する。当該洗浄されたワニ赤血球を、保管及びフローサイトメトリー機器における使用のために、安定性懸濁培地中に懸濁させる。適当な洗浄溶液の１つは、リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）である。当該安定性懸濁培地の適当な例は、リン酸緩衝生理食塩溶液、及び血漿物質の水溶液を含む。本明細書から明らかなように、血漿物質の水溶液は、血清物質の水溶液、血漿タンパク質との組み合わせにおける血清物質、及びこれらの組み合わせを含んで成る。当該血清物質は、血清脂質の水溶液を含んで成る。本明細書から明らかなように、血清脂質は、コレステロール、コレステロールエステル、及び血清、血漿、及びこれらの混合物中で見つかる１又は複数の他の化合物と組み合わされたコレステロールを含んで成る。好ましくはこのような他の化合物は、更に、リポタンパク質、及びリン脂質、並びにこれらの混合物を含んで成る。当業者に認識されているように、典型的には、コレステロールは、約３０％のエステルを含む。好ましくは前処理における上記血清物質は、コレステロール、コレステロールエステル、リポタンパク質コレステロール、リポタンパク質コレステロールエステル、リン脂質と組み合わされたコレステロール、及びこれらの混合物から成る群から選択される。リン脂質との組み合わせにおけるコレステロールの適当な商業的に入手可能な例は、Miles, Inc,. の Pentex（登録商標）Cholesterol Super-Trate であり、これは、リン脂質との組み合わせにおける、高密度リポタンパク質コレステロール及びリポタンパク質コレステロールエステルである。本明細書から更に明らかなように、血漿タンパク質は、血漿中の１又は複数のタンパク質を含んで成る。好ましくは、このような血漿タンパク質は、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン、フィブリノーゲン、及びこれらの混合物を含む。上記安定懸濁培地は、長期の安定性を与えるために、当業者に既知な他の成分を含んでよい。適当な培地の他の例は、米国特許第４，２１３，８７６号、第４，２９９，７２６号、第４，３５８，３９４号、第３，８７３，４６７号、第４，７０４，３６４号、第５，３２０，９６４号、第５，５１２，４８５号、及び６，５６９，６８２号により完全に記載されており、これらの全体における参考例により本明細書に組み入れられている。
【００２４】
以下の具体例は、米国特許第４，２９９，７２６号に開示されている：
【表１】
2007515623.tif 000003
更に、以下の培地は、米国特許第６，５６９，６８２号に開示され、リファレンスコントロール組成物の持続的安定性を供する。
【表２】
2007515623.tif 000004
【００２５】
上に挙げられる多くの化学薬品は、いくつかの名称により商業的に知られているため、与えられた名称は、Merck and Co., Inc., New Jersey により出版されている Merck Index に挙げられる一般名称である。
【００２６】
実施例１は、代表的な、ワニ赤血球を使用する有核赤血球成分の調製プロセスを説明する。調製された有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物は、実施例５〜７に説明されるように、多様な測定方法を使用する有核赤血球測定のために利用された。
【００２７】
他の態様において、全血由来の、又は適当な細胞株により試験管内で産出された小型哺乳類リンパ球は、有核赤血球成分を作製するために使用することができる。有核赤血球成分を作製するために適当な小型哺乳類リンパ球は、約４．０μｍ〜約４．７μｍの範囲の核サイズを有する。当該核サイズは、溶解条件下でリンパ球を他の細胞種と判別することができる血液計において測定することができる。小型哺乳類リンパ球が使用される場合、細胞容積を実質的にこれらの核容積にまで減少させるために、細胞質を実質的に除去するために当該リンパ球を処理し、それから残存する細胞の実体を固定することが好ましい。「残存する細胞の実体」の語は、部分的に細胞膜を維持できる、細胞質の実質的な除去における小型哺乳類リンパ球を意味する。当該処理は、小型哺乳類リンパ球を溶解試薬に一定時間暴露することに関する。当該溶解試薬は、細胞膜を透過し、細胞質の除去をもたらす。当該処理された小型哺乳類リンパ球は、下記のようなインピーダンス及び光学測定により測定される場合、溶解条件下において、ヒト有核赤血球のサイズ及び光学特性をシミュレートする。
【００２８】
血液細胞の溶解のための当業界に既知な多様な溶解試薬は、小型哺乳類リンパ球を処理するために使用することができる。１つの適当な例は、以下の分子構造により表される四級アンモニウム界面活性剤を含む溶解試薬である：
【化１】
2007515623.tif 000005
式中、Ｒ1は、１２〜１６個の炭素原子を有する、アルキル、アルケニル、又はアルキニル基であり、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4は、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、そしてＸ-は、塩素又は臭素陰イオンである。他の例は、サポニンを含む溶解試薬である。実質的な細胞質の除去における残存する細胞の実体は、固定液で固定することができる。固定液の適当な例は、制限することなく、アルデヒド固定液、例えば、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドを含む。
【００２９】
更なる態様において、上記リファレンスコントロール組成物は、更に、特定の検出条件下において、白血球（ＷＢＣ）をシミュレートする白血球成分を含んで成る。白血球成分の存在下において、ＮＲＢＣ成分と赤血球成分の割合は、１００個のＷＢＣあたりのＮＲＢＣの数をレポートするために使用することができ、これは臨床実験室における血液サンプル中の有核赤血球をレポートするために使用される単位と同じである。好ましくは、白血球成分又は類似体は、主な白血球亜集団の１つ、例えば、顆粒球、又はリンパ球と類似する特性を有する。
【００３０】
更に、上記白血球成分は、白血球の示差分析のため、複数の白血球亜集団をシミュレートするために、１つ以上の白血球亜集団、例えば、２、３、４、又は５種の白血球亜集団、又は類似体を含んでよい。白血球類似体の適当な例は、当業界で知られるような、安定化及び固定された哺乳類白血球、及び処理及び／又は固定されたヒト及び動物赤血球を含む。ある態様において、当該白血球亜集団は、米国特許第５，３２０，９６４号、及び第５，５１２，４８５号に教示され、その全体の参考例により本明細書にくみいれられている、インピーダンス及び光散乱測定の組み合わせを使用する、示差分析（differential analysis)のために処理されたガチョウ及びワニ赤血球から作製できる。他の態様において、白血球小成分は、米国特許第４，７０４，３６４号に教示され、その全体の参考例により本明細書にくみいれられている、インピーダンス測定を使用する示差分析のために、加工されたトリ及びヒト赤血球から作製することができる。更なる態様において、当該白血球小成分は、固定された哺乳類白血球から作製することができる。当該哺乳類白血球は、白血球小成分の調製の間、全血中の赤血球を溶解する前に固定される。
【００３１】
任意的に、上記哺乳類白血球、並びにヒト及び動物赤血球は、更に、上記白血球小成分の調製プロセスの間、リポタンパク質と接触させることにより処理することができる。米国特許第５，３２０，９６４号、第５，５１２，４８５号、第６，４０６，９１５号、第６，４０３，３７７号、第６，３９９，３８８号、第６，２２１，６８８号、及び第６，２００，５００号に教示され、これらの全体の参考例により本明細書に組み入れられているように、リポタンパク質との接触は、白血球又は赤血球の固定化の前に行うことができ、又は固定化及び懸濁培地中における保管の間に行うことができる。
【００３２】
他の態様において、本発明は、懸濁培地中の上述の有核赤血球成分、白血球成分、及び追加的な赤血球成分及び血小板成分を含んで成る、リファレンスコントロール組成物を供する。
【００３３】
上記赤血球成分は、安定化ヒト又は動物赤血球、好ましくは安定化ヒト赤血球であってよい。赤血球成分の製造方法は、米国特許第４，２９９，７２６号、及び第４，３５８，３９４号に記載されており、これらの全体における参考例により組み入れられている。上記血小板成分は、安定化ヒト又は動物血小板、又は他の細胞種から作製された血小板類似体であってよい。ある適当な例は、血小板類似体として、処理されたヤギ赤血球を使用することであり、米国特許第４，２６４，４７０号、第４，３８９，４９０号、及び第４，４０５，７１９号に開示されている。
【００３４】
血液サンプルの赤血球、又はリファレンスコントロール組成物中の安定化ヒト赤血球は、有核赤血球及び白血球の測定のための血液サンプルの調製のために通常使用される溶解条件下で溶解され、そして分析計が適切に作動する場合には、測定において検出されるべきではない。溶解条件下において血液サンプルの血小板は、サイズが減少し、そしてこれらは有核赤血球の測定の検出限界以下であるか、又は有核赤血球から分離される。上述の血小板類似体は、溶解条件下における血液サンプルの血小板の応答をシミュレートする。このため、リファレンスコントロール組成物中の赤血球成分及び血小板成分は、更に、溶解試薬に対するコントロール組成物の応答、並びに機器における反応条件に影響する。このため、赤血球及び血小板成分を含むリファレンスコントロール組成物は、機器の作動状態に関する更なる情報を供することができる。
【００３５】
更に、赤血球及び血小板を含んで成るリファレンスコントロール組成物はまた、赤血球及び血小板の測定のために使用することができ、自動血液分析計において、白血球及び有核赤血球の測定と一緒に通常行われる。
【００３６】
実施例２は、有核赤血球成分、白血球成分、赤血球成分、及び血小板成分を含むリファレンスコントロール組成物の調製を示す。当該リファレンスコントロール組成物は、実施例５に示されるとおり、ＤＣインピーダンス測定を使用する有核赤血球の計数のために利用された。
【００３７】
実施例３は、有核赤血球成分、複数の白血球類似体、並びに赤血球成分及び血小板成分を含むリファレンスコントロール組成物を説明する。当該リファレンスコントロール組成物は、有核赤血球の測定、及び白血球の示差分析のために利用された。
【００３８】
更なる態様において、本発明は、有核赤血球成分を含む一連のリファレンスコントロール組成物を含んで成る、血液コントロールシステムを供する。当該系列中、各組成物は、上昇濃度の有核赤血球類似体を有するが、一定濃度の白血球成分を有する。当該コントロールシステムは、フローサイトメトリー機器における有核赤血球計数法の直線応答の測定のために使用され、これにより直線コントロールとしても適用される。
【００３９】
実施例４は、有核赤血球成分、白血球成分、赤血球成分、及び血小板成分を含む直線コントロールの例を説明する。説明されるとおり、有核赤血球成分は、安定化ワニ赤血球から作製され、そして白血球成分は、固定化ガチョウ赤血球から作製された。実施例４においては、単一の白血球成分が使用された。しかしながら、実施例３に記載された複数の白血球小成分もまた、有核赤血球成分のための直線コントロールの作成のために使用することができる。
【００４０】
他の態様において、有核赤血球類似体を新鮮なヒト全血サンプルと混合することにより、リファレンスコントロール組成物もまた供することができる。当該コントロール組成物はフローサイトメトリー機器の操作前に調製することができる。直線コントロールは、変化量における一連の有核赤血球類似体を、一連の一定の予定量の新鮮なヒト全血に添加することにより作製することができる。当該方法を使用して、フローサイトメトリー機器において測定される場合、全血の血液細胞が、これらの特性を維持するために、有核赤血球類似体の懸濁培地は全血に適合することが必要とされる。米国特許第４，２９９，７２６号、第４，７０４，３６４号、第５，３２０，９６４号、及び第５，５１２，４８５号に開示される懸濁培地が全血での使用に適当であることが判明した。
【００４１】
実施例６は、有核赤血球及び白血球の測定のための全血中の有核赤血球類似体を含むリファレンスコントロール組成物の使用を説明する。また、当該リファレンスコントロール組成物は、蛍光測定を使用する有核赤血球及び白血球の測定のためのフローサイトメーターにおいて使用できることが発見された。
【００４２】
２．有核赤血球の測定のためのリファレンスコントロール組成物の使用方法
他の観点において、本発明は、多様な測定方法を使用する有核赤血球の測定のための有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物の使用方法を供する。
【００４３】
ある態様にいて、本発明は、インピーダンス測定を使用する有核赤血球の測定のための有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物の使用方法を供する。当該インピーダンス測定は、直流（ＤＣ）インピーダンス及び高周波（ＲＦ）インピーダンス測定を含む。ＤＣインピーダンス測定に使用される方法及び機器は、米国特許第６，４１０，３３０号に記載されており、その全体における参考例として本明細書中に組み入れられている。当該ＤＣインピーダンス測定は、フォーカスされていないフローアパーチャー、又はフォーカスされたフローセルを使用して行うことができる。ＲＦインピーダンス測定は、フォーカスされたフローセルを使用して行われることが好ましい。
【００４４】
実施例５は、ＤＣインピーダンス測定を使用する有核赤血球の測定のための実施例２のリファレンスコントロール組成物を使用する例を説明する。図１は、１００個のＷＢＣあたり約２２個のＮＲＢＣを含む臨床的な全血サンプルの得られたヒストグラムを示す。示されるとおり、有核赤血球は、ヒストグラムの左において明確なピークとして現われ、そして白血球は有核赤血球の右側に現れている。図２は、安定化ワニ赤血球から作製された有核赤血球成分、及び固定化ガチョウ赤血球から作製された白血球成分を含む、実施例２のリファレンスコントロール組成物の得られたヒストグラムを示す。示されるとおり、安定化ワニ赤血球は、ヒト有核赤血球に近似しており、これらは、ＷＢＣ類似体から明らかに分離していた。当該得られたヒストグラムは後で分析し、そしてＮＲＢＣ類似体とＷＢＣ類似体の割合は、１００個のＷＢＣあたりのＮＲＢＣの数としてレポートした。
【００４５】
実施例４の直線コントロールは、実施例５に記載されるとおり、改変ＬＨ７５０血液分析計において測定した。上記ヒストグラムから得られた１００個あたりのＮＲＢＣの数を、ＮＲＢＣ類似体及びＷＢＣ類似体の濃度から得られた理論値に対してプロットした。図３に示されるとおり、リファレンスコントロールの測定されたＮＲＢＣ濃度は、測定された濃度範囲中において理論値と優れた直線的な相関性を有した。
【００４６】
他の態様において、本発明は、光散乱測定を使用する有核赤血球の測定のための有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物を使用する方法を供する。当該測定方法及び当該測定に使用される機器は、米国特許第５，８７４，３１０号、及び第５，９１７，５８４号に詳細に記載されており、これらの全体における参考例により本明細書中に組み入れられている。
【００４７】
有核赤血球の示差分析は、光散乱測定を使用してフォーカスされたフローセル中において行われる。粒子、例えば、血液細胞がフローセルのアパーチャーを通過すると、それは全方向においてレーザー光線からの入射光を散乱する。当該光散乱シグナルは、０°〜１８０°の入射光に関する多様な角度において光検出器により検出することができる。各細胞群は、有意な又は微量な、異なる光散乱特性を有し、異なる細胞群の判別のために利用することができる。入射光から１０°以下において検出される光散乱シグナルは、通常低角度光散乱と称される。入射光から約１０°〜約７０°で検出される光散乱シグナルは、中角度光散乱と称され、そして入射光から約約９０°で検出される光散乱シグナルは、右角度光散乱又は側方散乱と称される。光散乱シグナルの特性は、細胞のサイズ、細胞の含有量、及び細胞の表面特性により影響される。
【００４８】
好ましくは、光散乱シグナルの２つの角度は、他の細胞種からの有核赤血球の判別に使用される。より好ましくは、１つの光散乱は、１０°以下である低角度光散乱シグナルである。低角度光散乱シグナルの好ましい範囲は、約０°〜約４°である。２つめの光散乱角度は、低、中、又は右−角度光散乱シグナルである。
【００４９】
ある態様において、実験的フローサイトメトリー機器は複数の角度の光散乱検出器を装備した。当該検出器は、いくつかの角度範囲、即ち、約１°〜約３°（ＬＳ１）、約４°〜約６°（ＬＳ２）、約２４°〜約３５°（ＬＳ３）、及びより高角度において、フォーカスされたフローセルを通過する細胞由来の光散乱シグナルを検出する。また、当該機器は、フローセルを通過する細胞の光散乱及びインピーダンスシグナルを測定するために、光散乱検出器と一緒に使用することができるＤＣインピーダンス検出器を装備した。しかしながら、また、当該ＤＣインピーダンス検出器は光散乱測定のみが必要とされる場合には、電源を切ることができる。等張性血液希釈剤はシース試薬として使用し、そして赤血球を溶解するために実施例６に示した溶解試薬を使用した。
【００５０】
実施例６は、光散乱測定を使用する有核赤血球の測定のためのリファレンスコントロール組成物を使用する例を説明する。図４は、１００個のＷＢＣあたり約１００個のＮＲＢＣを含む臨床的な全血サンプルのＬＳ１対ＬＳ２のスキャッタグラムを示す。示されるとおり、有核赤血球は明らかなクラスターとして現れ、残骸（スキャッタグラムの下部において示されるクラスター）、及び白血球（上方、但し当該スキャッタグラムの範囲外）から分離した。
【００５１】
図５は、実施例１の予定量の安定化ワニ赤血球を新鮮なヒト全血と混合することにより調製されたリファレンスコントロール組成物のＬＳ１対ＬＳ２のスキャッタグラムを示す。示されるとおり、当該ＮＲＢＣ類似体は、ヒト有核赤血球の同じ領域において異なるクラスターを形成した。更に、図６は、同じリファレンスコントロール組成物のＬＳ１対ＬＳ３のスキャッタグラムを示す。
【００５２】
図７は、図４及び図５に示されるものよりも極めて大きなダイナミックレンジを伴うログ（log)スケールにおける、他のＬＳ１対ＬＳ２のスキャッタグラムを示す。示されるとおり、ＮＲＢＣ類似体は、ヒト全血の白血球と明確に分離した。このため、安定化ワニ赤血球を含むリファレンスコントロール組成物は、低角度光散乱測定を使用することにより、又は低角度及び中角度光散乱測定の組み合わせを使用することにより他の細胞種から有核赤血球を判別するためのリファレンスコントロールとして使用することができる。
【００５３】
更なる態様において、本発明は、ＤＣインピーダンス及び光散乱測定を使用する有核赤血球の測定のための有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物を使用する方法を供する。また、当該測定方法及び当該測定方法に使用される機器は、米国特許第５，８７４，３１０号、及び第５，９１４，５８４号に開示されており、これらの全体における参考例により本明細書中に組み入れられている。
【００５４】
上述の実施例６は、更に、ＤＣインピーダンス及び光散乱測定を使用する有核赤血球の測定のためのリファレンスコントロール組成物の使用を説明する。図８は、図５に示された同じリファレンスコントロール組成物から得られたＤＣ対ＬＳ３のスキャッタグラムを示す。示されるとおり、ＤＣインピーダンス及び中角度光散乱シグナル（約２４°〜約３５°）の測定を使用して、有核赤血球の判別に追加して、更に白血球が２つの亜集団、即ち骨髄系及びリンパ系群に判別される。
【００５５】
従って、安定化ワニ赤血球と新鮮なヒト全血を混合することにより作製されたリファレンスコントロール組成物は、血液サンプルの複数のパラメーター分析のためのリファレンスコントロールとして使用することができる。他の適当な測定方法とともに、当該リファレンスコントロール組成物は、他の細胞種からＮＲＢＣを判別するため、並びに白血球を３つ又は５つの亜集団に判別するために使用することができる。
【００５６】
より更なる態様において、上記測定は、軸上光損失（axial light loss)測定を更に含んでよい。軸上光損失（ＡＬＬ、前方吸光としても知られる）は、一般的に、レーザー光線の前を通過する粒子又は細胞により光エネルギーが減少することであり、光ダイオードにより検出される。当該光損失は、一般的に吸収及び散乱が原因であり、光ビームを通して（一般的に、ＡＬＬは、約０°〜約１°の角度において検出される）粒子又は細胞の通過により光ビームの進路における検出器に達する光エネルギーの損失として定義される。入射光から０°において測定された光散乱シグナルからの相違は、散乱による光の増加であり、軸上光損失は、入射光から０°における光の減少である。光学センサーは、これらの２つの測定と同じであってよいが、電気回路は、２つの異なる測定間で異なる。好ましい態様において、ＡＬＬシグナルは、入射光軸から約０．５°未満のサーキュラーエリアにおいて得られる。ＡＬＬは粒子サイズに強く影響される。当該軸上光損失測定は、インピーダンス又は光散乱測定との組み合わせにおいて使用することができる。
【００５７】
他の態様において、本発明は、ＤＣインピーダンスとＶＣＳ測定法の組み合わせを使用する、有核赤血球の測定のための有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物を使用する方法を供する。当該測定方法及び当該測定方法のために使用される機器は、米国特許第６，４７２，２１５号に開示されており、その全体における参考例により本明細書に組み入れられている。ＶＣＳ測定の語は、米国特許第５，１２５，７３７号に記載され、その全体における参考例により本明細書に組み入れているように、ＤＣインピーダンス、高周波、及び中角度光散乱シグナルの複数のパラメーター測定を意味する。
【００５８】
実施例７は、ＤＣインピーダンスとＶＣＳ測定法の組み合わせを使用する、有核赤血球の測定のためのリファレンスコントロール組成物を使用する例を説明する。フローサイトメトリー機器は、白血球数、白血球亜集団、及び有核赤血球を測定するための、フォーカスされていないフローアパーチャー及びＤＣインピーダンス検出器；及び白血球及び有核赤血球の示差分析のためのＶＣＳ検出器を伴うフォーカスされたフローセルを装備したコールターＬＨ７５０血液分析計（Beckman Coulter, Inc.)とした。血液サンプル、又はリファレンスコントロールは、血液分析計により吸引され、そしてサンプルの第一アリコットは、実施例７に記載される試薬により溶解、及び安定化され、そして白血球を５つの亜集団に判別する分析のためにフォーカスされたフローセルに送達された。第二アリコットサンプルは、ＤＣインピーダンス検出器により、フォーカスされていないフローアパーチャーを通過すると、溶解され、そして測定された。第一アリコット及び第二アリコットサンプルから獲得されたシグナルは、先ず、別々に分析し、それから有核赤血球の数を供するために組み合わせた。
【００５９】
実施例３のリファレンスコントロール組成物は、ＬＨ７５０血液分析計において分析した。有核赤血球のレポートされた数は、リファレンスコントロール組成物の理論値と一致した。
【００６０】
以下の実施例は、本発明の例示であり、如何なる場合においても特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を制限するものとしては解釈されない。
【実施例】
【００６１】
実施例１
ワニ赤血球から作製された有核赤血球成分
以下は有核赤血球成分又はＮＲＢＣ類似体を得るためにワニ赤血球を処理するための好ましい試薬及び推奨される具体的な工程手順の具体例である。
【００６２】
【表３】
2007515623.tif 000006
【００６３】
【表４】
2007515623.tif 000007
【００６４】
【表５】
2007515623.tif 000008
【００６５】
手順：
１．約３８０〜４６０ｆＬの範囲の平均細胞容積を有するワニ赤血球を選択する。当該ワニ全血を遠心分離し、そして上層（白血球、血小板、及び血漿を含む）を除去する。
２．リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）で、通常３回、充填されたワニ赤血球を洗浄する。
３．上述の安定な懸濁培地の１つにおいて、上記洗浄したワニ赤血球を再懸濁する。当該安定化ワニ赤血球は、４５日強の期間、約４℃で保管することができる。
【００６６】
実施例２
有核赤血球成分、白血球成分、及び赤血球及び血小板成分を含むリファレンスコントロール組成物
【００６７】
手順；
１．実施例１に記載された、予定された容積の第一懸濁培地を供する。
２．上記培地中に予定量の安定化ヒト赤血球を添加する。当該安定化ヒト赤血球は米国特許第４，２９９，７２６号、及び第４，３５８，３９４号に記載された手順に従い処理された。
３．安定化ヒト赤血球を含む懸濁培地中に予定量の血小板類似体を添加する。当該血小板類似体は、米国特許第４，２６４，４７０号、及び第４，４０５，７１９号に記載されている手順に従い、固定化ヤギ赤血球から作製された。
４．白血球成分としての予定量の固定化ガチョウ赤血球を、安定化ヒト赤血球及び血小板類似体を含む懸濁培地中に添加する。
５．実施例１の予定量の安定化ワニ赤血球を、安定化ヒト赤血球、血小板類似体、及び白血球成分を含む懸濁培地中に添加する。
６．工程５において形成されたリファレンスコントロール組成物を混合する。赤血球、白血球、及び血小板成分の細胞濃度は、ヒト全血サンプルの対応する細胞濃度をシミュレートするように調製した。有核赤血球成分の細胞濃度は、好ましくは１００個のＷＢＣあたり１〜５０個のＮＲＢＣの範囲において、一定レベルの有核赤血球含む臨床サンプルをシミュレートするように調製した。当該リファレンスコントロール組成物は、４５日強の期間、約４℃で保管することができる。
【００６８】
実施例３
有核赤血球成分、及び複数の白血球小成分を含む血液リファレンスコントロール組成物
当該リファレンスコントロールを作製するための手順は、工程４において、予定量の複数の白血球小成分を、安定化ヒト赤血球及び血小板類似体を含む懸濁培地中に添加することを除き、実施例２において上述した手順と本質的に同じとした。当該リファレンスコントロール組成物は、４５日強の期間、約４℃で保管することができる。
【００６９】
上記複数の白血球小成分は、米国特許第４，７０４，３６４号、第５，３２０，９６４号及び第５，５１２，４８５号に記載されている手順に従い調製された。米国特許第４，７０４，３６４号に記載された手順に従い調製された複数の白血球類似体を使用して、当該リファレンスコントロール組成物は、有核赤血球の測定、及び白血球を３つの亜集団に判別するために使用することができる。米国特許第第５，３２０，９６４号及び第５，５１２，４８５号に記載されている手順に従い調製された複数の白血球類似体を使用して、当該リファレンスコントロール組成物は、有核赤血球の測定、及び白血球を５つの亜集団に判別するために使用することができる。
【００７０】
実施例４
有核赤血球成分を含む直線コントロール
実施例２の手順は、直線コントロールを調製するために使用した。工程５において、安定化ヒト赤血球、血小板類似体、及び白血球成分を含む一定の予定容量の懸濁液を、一連の容器に分注し、それから実施例１において調製された、一連の予定量の安定化ワニ赤血球を、これらの容器に添加する。白血球成分の濃度は、約１０×１０3／μＬにおいて一定に保ち、そしてＮＲＢＣ類似体濃度は、１００個のＷＢＣあたり０〜約４５個のＮＲＢＣの間におけるＷＢＣ類似体に対するＮＲＢＣ類似体の割合を生じる範囲において変化させた。当該リファレンスコントロール組成物は、約４．７×１０6／μＬの安定化ヒト赤血球、及び約２．２×１０5／μＬの血小板類似体を含んだ。
【００７１】
実施例５
ＤＣインピーダンス測定を使用する、有核赤血球の測定のためのフローサイトメトリー機器におけるリファレンスコントロール組成物の使用
赤血球を溶解し、そして有核赤血球を分析するための活性成分を含む水溶液である、実験的な溶解試薬を調製した：２５．０ｇ／Ｌのテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、１５．０ｇ／ＬのＩｇｅｐａｌ  ＳＳ−８３７(エトキシル化フェノール、Rhone-Poulenc, Cranbury, New Jersey)、及び４．０ｇ／ＬのＰｌｕｒｏｆａｃ  Ａ３８  Ｐｒｉｌｌ  界面活性剤（エトキシル化アルコール、BASF Corp., Mount Olive, New Jersey)。
【００７２】
全血サンプル又はリファレンスコントロール組成物のアリコットを、白血球数、白血球亜集団、及び有核赤血球を測定するための、フォーカスされていないフローアパーチャー及びＤＣインピーダンス検出器を装備した、改変コールターＬＨ７５０血液分析計（Beckman Coulter, Inc. Miami, Florida)により吸引した。吸引されたサンプルは、等張性血液希釈剤であるＬＨ７００シリーズ希釈剤（Beckman Coulter, Inc.の製品）で希釈し、それから上述の溶解試薬組成物と混合させた。当該サンプル混合物は、真空源により、３つのアパーチャーセットを通して引いた。当該アパーチャーを通過すると、ＤＣインピーダンス検出器により、各血液細胞が測定された。当該測定は、約１８℃〜約２８℃の範囲における温度において行った。
【００７３】
図１は、１００個のＷＢＣあたり約２２個のＮＲＢＣを含む、臨床的な全血サンプルの得られたヒストグラムである。示されるとおり、有核赤血球は、ヒストグラムの左側において明確なピークとして現われ、そして白血球は当該有核赤血球の右側において現れた。
【００７４】
図２は、実施例２のリファレンスコントロール組成物の得られたヒストグラムである。示されるとおり、安定化ワニ赤血球は、ヒト有核赤血球に近似し、そしてこれらはＷＢＣ類似体から明確に分離した。当該得られたヒストグラムはポスト分析され、そしてＮＲＢＣ類似体とＷＢＣ類似体間の割合は、１００個のＷＢＣあたりのＮＲＢＣの数としてレポートした。
【００７５】
実施例４の直線コントロールは、上述の手順に従い、改変ＬＨ７５０血液分析計において測定した。１００個のＷＢＣあたり０〜４５個のＮＲＢＣを含む各６つのコントロール組成物を吸引し、そして分析計により分析した。当該ヒストグラムから得られた１００個のＷＢＣあたりのＮＲＢＣの数は、ＮＲＢＣ類似体及びＷＢＣ類似体濃度から得られた理論値に対してプロットされた。図３は、得られた相関曲線である。示されるとおり、リファレンスコントロール組成物の測定されたＮＲＢＣ濃度は、測定された濃度範囲において、理論値と良好な直線的な相関性を有した。
【００７６】
実施例６
光散乱測定、及び光散乱とＤＣインピーダンス測定を使用する、有核赤血球の測定のためのフローサイトメトリー機器におけるリファレンスコントロール組成物の使用
１４ｇ／ＬのＮａ2ＳＯ4、２ｇ／ＬのＮａＣｌ、２ｇ／Ｌのトリアゾール、９ｇ／Ｌのドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（AKZO, Chicago, lllinois)、０．５ｇ／Ｌのテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含み、そしてｐＨ７を有する、等張性水溶液である、実験的溶解試薬を調製した。
【００７７】
全血サンプル又はリファレンスコントロール組成物のアリコットを、上述の溶解試薬と、３０：１の希釈比において混合した。溶解試薬の添加から２０秒後、当該サンプル混合物を、実験的な血液計において、シース液、ＩＳＯＴＯＮ（登録商標）III 希釈剤（Beckman Coulter, Inc. 製品）とともにフローセルに送達した。当該実験的な血液計器は、約１°〜約３°（ＬＳ１）、約４°〜約６°（ＬＳ２）、約２４°〜約３５°（ＬＳ３）、及びより高角度の多様な角度において光散乱シグナルの検出を可能にする光学検出器、並びにＤＣインピーダンス検出器を装備した。当該検出器により、フォーカスされたフローセルを通過した各血液細胞を測定した。ＤＣインピーダンス検出器は、光散乱検出器と一緒に使用することができ、そしてまた、光散乱分析のみが必要な場合には、電源を切ることができる。当該測定は、約１８℃〜約２８℃の範囲における温度において行った。
【００７８】
図４は、１００個のＷＢＣあたり約１００個のＮＲＢＣを含む、臨床的な全血サンプルの得られたＬＳ１対ＬＳ２のスキャッタグラムである。示されるとおり、当該有核赤血球は、デブリ、及び白血球（上、スキャッタグラムの範囲外である）から分離し、明確なクラスターとして現われた。
【００７９】
図５は、実施例１の安定化ワニ赤血球と新鮮なヒト全血を添加し、そして混合することにより調製されたリファレンスコントロール組成物の得られたＬＳ１対ＬＳ２のスキャッタグラムである。示されるとおり、ＮＲＢＣ類似体は、ヒト有核赤血球と同じ領域において明確なクラスターを形成した。図６は、リファレンスコントロール組成物の得られたＬＳ１対ＬＳ３のスキャッタグラムである。
【００８０】
図７は、図４及び図５において示されるよりも大きなダイナミックレンジを伴うログスケールおける他のＬＳ１対ＬＳ２である。示されるとおり、ＮＲＢＣ類似体は、ヒト全血の白血球から明らかに分離した。
【００８１】
図８は、図５に示された同じリファレンスコントロール組成物の、得られたＤＣ対ＬＳ３のスキャッタグラムである。示されるとおり、ＤＣ及びＬＳ３の測定を使用して、有核赤血球の判別に追加して、更に、白血球を２つの亜集団、すなわち骨髄系及びリンパ系群に判別した。
【００８２】
実施例７
ＤＣインピーダンス及びＶＣＳ測定を使用する、有核赤血球の測定のためのフローサイトメトリー機器におけるリファレンスコントロール組成物の使用
フローサイトメトリー機器は、白血球数、白血球亜集団、及び有核赤血球を測定するための、フォーカスされていないフローアパーチャー及びＤＣインピーダンス検出器、及びＶＣＳ検出器を伴うフォーカスされたフローセルを装備したコールターＬＨ７５０血液分析計（Beckman Coulter, Inc.)とした。当該ＶＣＳ検出システムは、フローセルを通過する細胞のＤＣインピーダンス、高周波、及び中角度光散乱シグナルを測定する。
【００８３】
血液サンプル又はリファレンスコントロール組成物は、血液分析計により吸引され、そしてサンプルの第一アリコットを、赤血球を溶解するために第一溶解試薬、Ｅｒｙｔｈｒｏｌｙｓｅ（登録商標）IIと混合し、そして続いて安定化剤、Ｓｔａｂｉｌｙｓｅ（ともにBeckman Coulter, Inc.の製品である)と混合した。第一サンプル混合物は、白血球の５つの亜集団への示差分析、及び有核赤血球の分析のために、フォーカスされたフローセルに送達された。サンプルの第二アリコットを等張性血液希釈剤、ＬＨ７００シリーズ希釈剤で希釈し、それから、第二溶解試薬、Ｌｙｓｅ  Ｓ（登録商標）III （ともにBeckman Coulter, Inc.の製品である)と混合させた。当該サンプル混合物を、真空源により、３つのアパーチャーセットを通して引いた。ＤＣインピーダンス検出器によりアパーチャーを通過する各血液細胞を測定した。当該測定は、約１８℃〜約２８℃の範囲における温度において行った。第一アリコット及び第二アリコットサンプルから獲得されたシグナルは、先ず別々に分析され、それから有核赤血球の数を供するために組み合わせた。
【００８４】
実施例３のリファレンスコントロール組成物は、ＬＨ７５０血液分析計により分析された。有核赤血球のレポートされた数は、リファレンスコントロール組成物の理論値と一致した。
【００８５】
本発明は、付随する図において詳細に且つ写真的に示されるが、これらは、本発明の範囲を制限するものとして考慮すべきではなく、好ましい態様の例証として考慮すべきである。しかしながら、上述の明細書に記載され、並びに付属の特許請求の範囲及びこれらの合法的な相当物において規定されるように、本発明の精神及び範囲において、多様な修正及び変更を行うことができることは明らかである。本明細書に引用される全ての特許及び他の文献は、参考文献として明示的に組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ＤＣインピーダンス測定を使用して得られた臨床的な全血サンプルのヒストグラムを示す。
【図２】安定化ワニ赤血球から作製された有核赤血球成分、及び固定化ガチョウ赤血球から作製された白血球成分を含む、実施例２のリファレンスコントロールのヒストグラムを示す。
【図３】実施例４のリファレンスコントロール組成物のＮＲＢＣ濃度の理論値と、ＤＣインピーダンス測定により得られた結果の相関を示す。
【図４】光散乱測定により得られた臨床的な全血サンプルのＬＳ１対ＬＳ２のスキャッタグラムを示す。
【図５】実施例１の安定化ワニ赤血球と新鮮なヒト全血を混合することにより作製されたリファレンスコントロールのＬＳ１対ＬＳ２のスキャッタグラムを示す。
【図６】図５において示されたリファレンスコントロールのＬＳ１対ＬＳ３のスキャッタグラムを示す。
【図７】より大きなダイナミックレンジを伴うログスケールにおける図５において示されたリファレンスコントロールのＬＳ１対ＬＳ２のスキャッタグラムを示す。
【図８】図５において示された同じリファレンスコントロールのＤＣ対ＬＳ３のスキャッタグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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