(57)【要約】Y1レセプター及びY2レセプターよりY4レセプターに関して選択性のY4レセプターアゴニストが、Y4レセプターの活性化に応答性の症状の治療に有用である。Y4選択性アゴニストは、（ａ）明細書中で特定されたＣ末端配列及びＮ末端配列の特徴を有するPP折り畳みペプチド又はPP折り畳みペプチド模擬体であるか、又は（ｂ）共有結合性分子内連結を有するか、又は（ｃ）各々がタイプ（ａ）アゴニストのＣ末端レセプター認識配列の最後の４残基を含んでなる共有結合的に連結された２つのＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列を含んでなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2（式中、R1及びR1は、独立して、水素又はC1-C6アルキルであり、ＸはVal、Ile、Leu又はAlaであり、X3はGln以外の残基である）又はThrがHis又はAsnで置換され、及び/又はTyrがTrp又はPheで置換され、及び/又はArgがLysで置換されているその保存的置換変形体で表されるＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列、及び
（ii）H2N-X1-Pro-X2-(Glu又はAsp)-（式中、X1は存在しないか又は任意のアミノ酸残基であり、X2はLeu、Ile又はSerである）又はその保存的置換体により表されるＮ末端Ｙレセプター認識アミノ酸配列
を有するPP折り畳みペプチド又はPP折り畳みペプチド模擬体であるか、又は
（ｂ）上記（ｉ）で規定されたＣ末端Y4レセプター認識配列、及び任意に、上記（ii）で規定されたY4レセプター認識アミノ酸配列で始まるＮ末端配列を含んでなり、
前記Ｃ末端Y4レセプター認識配列は、前記ヘキサペプチド配列のＮ末端に隣接する少なくとも１つのαヘリックスターンを含んでなる両親媒性アミノ酸配列ドメインに融合し、
前記ターンは共有結合性分子内連結によりヘリックス形状に拘束されているか、又は
（ｃ）各々が上記（ｉ）で規定された配列の最後の４つの残基を含んでなる共有結合的に連結された２つのＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列を含んでなる
Y1レセプター及びY2レセプターよりY4レセプターに対して選択性であるPP以外のY4レセプターアゴニストのY4レセプターの活性化に応答性の症状の治療用組成物の製造における使用。
【請求項２】
前記アゴニストの前記Ｃ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列において、R1及びR2が各々水素である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記Ｃ末端Y4レセプター認識配列において、残基X3がAsnでない請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記Ｃ末端Y4レセプター認識配列において、残基X3がLysでも、Argでも、AspでもGluでもない請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】
前記Ｃ末端Y4レセプター認識配列において、残基X3がProである請求項１又は２に記載の使用。
【請求項６】
前記Ｃ末端Y4レセプター認識配列において、残基X3がHisである請求項１又は２に記載の使用。
【請求項７】
前記Ｃ末端Y4レセプター認識配列において、X3が、4-ヒドロキシプロリン、アゼチジン-2-カルボン酸、アゼチジン-3-カルボン酸、アザプロリン、及び1-アミノシクロブタンカルボン酸から選択される非天然Proアナログである請求項１又は２に記載の使用。
【請求項８】
前記アゴニストの前記Ｃ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列において、残基ＸがLeuである請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記アゴニストが-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2（式中、残基XAは非塩基性且つ非酸性であり、配列-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2は上記と同義である）により表されるＣ末端ヘプタペプチドを含んでなる請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記アゴニストの前記Ｃ末端ヘプタペプチド配列において、前記非塩基性且つ非酸性のアミノ酸残基XAがLeu又はMetである請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記アゴニストが-XC-Tyr-XB-Asn-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2（式中、配列-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2は請求項９又は１０に定義したとおりであり、XCはArg又はLysであり、XBはIle、Leu又はValである）により表されるＣ末端ウンデカペプチドを含んでなる請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
前記アゴニストがＣ末端ウンデカペプチド配列-Arg-Tyr-Ile-Asn-(Leu又はMet)-Leu-Thr-Arg-(Pro又はHis)-Arg-Tyr-C(=O)NH2を含んでなる請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
前記アゴニストが-XC-Tyr-XB-Asn-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2（式中、配列-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2は請求項９又は１０に定義したとおりであり、XCはHis、Asn又はGlnであり、XBはIle、Leu又はValである）により表されるＣ末端ウンデカペプチド配列を含んでなる請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
前記アゴニストがＣ末端ウンデカペプチド配列-His-Tyr-(Ile又はLeu)-Asn-Leu-(Val/Ile)-Thr-Arg-(Pro又はHis)-Arg-Tyr-C(=O)NH2を含んでなる請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
前記アゴニストの前記Ｎ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列において、残基X1が存在する場合にはAlaであり、又は存在しない請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記アゴニストのＮ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列において、残基X2が存在する場合にはLeu、Ile又はSerである請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
Ｎ末端配列H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-又はH2N-Pro-Leu-Glu-を有する請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記アゴニストがＮ末端Y4レセプター認識配列を有するタイプ（ｂ）であり、PP折り畳み構造を有し、該構造において、前記ヘリックスターン拘束性分子内連結が、前記両親媒性ドメイン中のアミノ酸残基から、該両親媒性ドメインに逆平行に伸びるPP折り畳みペプチドのポリプロリンドメインに対応する該アゴニストのＮ末端部分の連結点まで伸びている請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記アゴニストにおいて、前記ヘリックスターン拘束性分子内連結がジスルフィド連結又はラクタム連結である請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記アゴニストにおいて、該アゴニスト中の前記共有結合性分子内連結が、前記αヘリックス中のL-Cys残基又はD-Cys残基と、前記両親媒性ドメインに逆平行に伸びるPP折り畳みペプチドのポリプロリンドメインに対応する該アゴニストのＮ末端部分に位置するCys残基との間に形成されたジスルフィド連結である請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記アゴニストがタイプ（ｂ）であり、該アゴニストにおいて、前記ヘリックスターン拘束性分子内連結が前記ヘリックスターン中のLys残基とGlu残基との間に形成されたか、又は該ヘリックスターン中のLys残基又はGlu残基と前記Ｃ末端Y4レセプター認識配列中のGlu残基又はLys残基との間に形成されたラクタム連結である請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記アゴニストがタイプ（ａ）又は（ｂ）であり、請求項１又は請求項２〜１４のいずれか１項で規定されたＣ末端ヘキサペプチドY4レセプター認識配列と、請求項１又は請求項１５〜１７のいずれか１項で規定されたＮ末端Y4レセプター認識配列との両方を有し、該Ｃ末端ヘキサペプチド配列が、Ｎ末端で、該ヘキサペプチド配列のＮ末端に隣接する少なくとも１つのαヘリックスターンを含んでなる両親媒性アミノ酸配列ドメインに融合し、該Ｃ末端アミノ酸配列及び該Ｎ末端アミノ酸配列がペプチド結合により式NH2(CH2)nCO2H（式中、ｎは２〜12である）のアミノ酸のカルボキシル基及びアミノ基にそれぞれ結合している請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
前記アゴニストにおいて、ｎが６、７、８、９又は10である請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記アゴニストがタイプ（ｃ）であり、前記２つの配列が該２つの配列の各々のＣ末端から少なくとも４つの残基に位置する少なくとも一対の残基間の架橋により連結されている請求項１に記載の使用。
【請求項２５】
前記アゴニストがタイプ（ｃ）であり、前記２つの配列が該２つの配列の各々のＣ末端から少なくとも４つの残基に位置する二対の残基間の一対の架橋により連結されている請求項１に記載の使用。
【請求項２６】
前記架橋が、システイン残基間のジスルフィド橋架けによるか、又は一方の配列中の2,3-プロピオン酸残基の3-アミノ基と他方の配列中の残基の側鎖のカルボキシル基との間のアミド結合によるか、又は両端部がそれぞれの配列の各々で残基を形成しているビス-アミノ酸HOOCCH(NH2)(CH2)1-6CH(NH2)COOHにより形成された-(CH2)1-6-橋架けにより構成されている請求項２４又は２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記２つの共有結合的に連結されたＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列が同一でない請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記２つの共有結合的に連結された配列が、請求項１〜１４のいずれか１項で規定されるＣ末端配列の最後の５残基又は最後の６残基を含んでなる請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記アゴニストが及びその保存的置換アナログから選択される請求項１に記載の使用。
【請求項３０】
前記アゴニストが
[Cys2,DCys27]-PP（配列番号：４）
[Lys28,Glu32]PP25-36（配列番号：５）
[Glu28,Lys32]PP25-36（配列番号：６）
[Cys2,Aoc5-24,Dcys27]-PP（配列番号：９）
PP2-36（配列番号：10）
[His34]-PP（配列番号：11）
[Ala1,Pro34]-PYY（配列番号：12）
[Ala2,Pro34]-PYY（配列番号：13）
[Glu4,Pro34]-PYY（配列番号：14）
[Arg26,Pro34]-PYY（配列番号：15）
[Ile28,Pro34]-PYY（配列番号：16）
[Met30,Pro34]-PYY（配列番号：17）
[Ala1,Glu4,Pro34]-PYY（配列番号：25）
[Nle17]PP（配列番号：32）
[Nle30]PP（配列番号：33）
[Nle17,Nle30]PP（配列番号：34）
[Nle17]PP2-36（配列番号：37）
[Nle30]PP2-36（配列番号：38）
[Nle17,His34]-PP（配列番号：41）
[Nle30,His34]-PP（配列番号：42）
[Nle17,Nle30,His34]-PP（配列番号：43）
[Ala30,Pro34]-PYY（配列番号：46）
[Leu34]-PP（配列番号：51）
[Ile34]-PP（配列番号：52）
[Phe34]-PP（配列番号：53）
[Lys13]PP2-36（配列番号：54）
【化１】
2007529463.tif 000020
及びこれらの保存的置換アナログ
から選択される請求項１に記載の使用。
【請求項３１】
前記アゴニストがPP2-36（配列番号：10）、[His34]-PP（配列番号：11）、若しくは[Cys2,DCys27]-PP（配列番号：４）、又はこれらの保存的置換アナログである請求項１に記載の使用。
【請求項３２】
Y4レセプターの活性化に応答性の症状の治療用組成物の製造におけるＮ末端にてアシル化されたPPの使用。
【請求項３３】
前記アゴニストがアミノペプチダーゼ活性に対する耐性を付与するためにＮ末端にてアシル化されている請求項１〜２３、２９、又は３１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３４】
前記アゴニストがＮ末端にて２〜２４の炭素原子を有する炭素鎖でアシル化されている請求項３２又は３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記アゴニストがＮ末端にてアセチル化されている、例えばN-アセチル-PP（配列番号：30）である請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
Y4レセプターの活性化に応答性の症状の治療用組成物の製造における、血清アルブミン結合モチーフ若しくはグリコサミノグリカン（GAG）結合モチーフ若しくはヘリックス誘導モチーフを含んでなるように改変したPP又はPEG化PPの使用。
【請求項３７】
前記アゴニストが請求項１〜３６のいずれか１項に規定されたとおりであり、且つ血清アルブミン結合モチーフ若しくはグリコサミノグリカン（GAG）結合モチーフ若しくはヘリックス誘導モチーフを含んでなるか又はPEG化されている請求項１〜３６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３８】
前記アゴニストにおいて、前記血清アルブミン結合モチーフが親油性基である請求項３６又は３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記アゴニストにおいて、前記親油性基が、任意に置換されていてもよい飽和又は不飽和の直鎖又は分枝鎖の１０〜２４炭素原子の炭化水素基を含んでなる請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記アゴニストにおいて、前記親油性基が該アゴニストの主鎖に対して側鎖であるか又は側鎖の一部である請求項３８又は３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記アゴニストにおいて、前記親油性基含有側鎖がエーテル結合、チオエーテル結合、アミノ結合、エステル結合又はアミド結合を介して前記主鎖中の残基に接続している請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記アゴニストにおいて、前記親油性基含有側鎖が
CH3(CH2)nCH(COOH)NH-CO(CH2)2CONH-（式中、ｎは９〜15の整数である）、
CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CONH-（式中、ｒは９〜15の整数である）、
CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CONH-（式中、ｓは９〜15の整数である）、
CH3(CH2)mCONH-（式中、ｍは８〜18の整数である）、
-NHCOCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3（式中、ｐは10〜16の整数である）、
-NHCO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3（式中、ｑは10〜16の整数である）、
CH3(CH2)nCH(COOH)NHCO-（式中、ｎは９〜15の整数である）、
CH3(CH2)pNHCO-（式中、ｐは10〜18の整数である）、
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3（式中、ｍは８〜18の整数である）、
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3（式中、ｐは10〜16の整数である）、
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3（式中、ｑは10〜16の整数である）、及び
部分的又は完全に水素化されたシクロペンタノフェナントレン骨格
からなる群より選択される請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記アゴニストにおいて、前記親油性基含有側鎖が、該アゴニストの主鎖の残基の側鎖に存在するアミノ基をアシル化するC12、C14、C16又はC18のアシル基である請求項４０に記載の使用。
【請求項４４】
前記アゴニストにおいて、前記親油性基含有側鎖が、該アゴニストの主鎖の残基の側鎖に存在するアミノ基をアシル化するテトラデカノイル基である、例えば
N-(N'-ヘキサデカノイル)-γグルタモイル-PP（配列番号：31）
[N-(N'-ヘキサデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,Nle30]PP（配列番号：35）
[N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13]PP2-36（配列番号：39）
[N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,His34]-PP（配列番号：44）
[N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,Ala30,Pro34]-PYY（配列番号：47）
[Cys2,N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,DCys27]-PP（配列番号：48）
[N-(8-(8-γグルタモイルアミノ-オクタノイルアミノ)-オクタノイル)-[Lys13]PP2-36（配列番号：55）若しくは
【化２】
2007529463.tif 000021
又はこれらの保存的置換アナログの請求項４０に記載の使用。
【請求項４５】
前記アゴニストが[テトラデカノイル-Ala1]-PP（配列番号：20）若しくは[テトラデカノイル-Ala1,His34]-PP（配列番号：21）又はそれらの保存的置換アナログである請求項３８に記載の使用。
【請求項４６】
前記アゴニストにおいて、前記GAG結合モチーフが該アゴニストの主鎖に対して側鎖であるか又は側鎖の一部であるアミノ酸配列である請求項３６又は３７に記載の使用。
【請求項４７】
前記アゴニストにおいて、前記GAG結合モチーフがアミノ酸配列XBBXBX及び/又はXBBBXXBX（式中、Ｂは塩基性アミノ酸残基であり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含んでなる請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
前記アゴニストにおいて、前記GAG結合モチーフがコンカテマー又はデンドリマーである請求項４６又は４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記GAG結合モチーフが、コンカテマーGAG結合モチーフのＣ末端と[Lys18,His34]-PP（配列番号：22）又は[Lys18]PP（配列番号：23）のεアミノ基との間に形成されるアミド結合によりカップリングしたAla-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Alaである請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５０】
前記GAG結合モチーフが、コンカテマーGAG結合モチーフのＣ末端と[Lys18,His34]-PP（配列番号：22）又は[Lys18]PP（配列番号：23）のεアミノ基との間に形成されるアミド結合によりカップリングしたAla-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Alaである請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５１】
前記アゴニストにおいて、前記GAG結合モチーフが該アゴニストのＣ末端又はＮ末端に直接にか又はリンカー基を介してかのいずれかで共有結合的に連結している請求項３６又は３７に記載の使用。
【請求項５２】
前記アゴニストにおいて、前記GAG結合モチーフが該アゴニストのＮ末端に直接にか又はリンカー基を介してかのいずれかで共有結合的に連結している請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前記アゴニストにおいて、前記GAG結合モチーフがアミノ酸配列XBBXBX及び/又はXBBBXXBX（式中、Ｂは塩基性アミノ酸残基であり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含んでなる請求項５１又は５２に記載の使用。
【請求項５４】
前記アゴニストにおいて、前記GAG結合モチーフがアミノ酸配列[XBBBXXBX]n（式中、ｎは１〜５であり、Ｂは塩基性アミノ酸残基であり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含んでなる請求項５１又は５２に記載の使用。
【請求項５５】
前記ペプチドが、
Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-PP（配列番号：24）
[N-[(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3]-Lys13]PP（配列番号：36）
[N-[(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3]-Lys13]PP2-36（配列番号：40）又は
[N-[(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3]-Lys13,His34]PP（配列番号：45）
である請求項３６に記載の使用。
【請求項５６】
前記アゴニストにおいて、前記PEGが最大で約20kDaの分子量を有するポリエチレングリコール又はポリエチレンオキシドである請求項３６又は３７に記載の使用。
【請求項５７】
前記アゴニストがPP又は[His34]PP（配列番号：11）である請求項３６又は３７に記載の使用。
【請求項５８】
前記アゴニストにおいて、前記ヘリックス誘導ペプチドが該アゴニストのＣ末端又はＮ末端に直接にか又はリンカー基を介してかのいずれかで共有結合的に連結している請求項３６又は３７に記載の使用。
【請求項５９】
前記アゴニストにおいて、前記ヘリックス誘導ペプチドが該アゴニストのＮ末端に直接にか又はリンカー基を介してかのいずれかで共有結合的に連結している請求項３６又は３７に記載の使用。
【請求項６０】
前記ヘリックス誘導ペプチドがAla、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met、Orn、及び式-NH-C(R1)(R2)-CO-（式中、R1は水素であり、R2は任意に置換していてもよいC1-C6アルキル、フェニル又はフェニルメチルであるか、或いはR1及びR2はこれらが付着しているＣ原子と一緒になってシクロペンチル、シクロヘキシル又はシクロヘプチル環を形成する）のアミノ酸残基からなる群より選択される４〜20アミノ酸残基を有する請求項５８又は５９に記載の使用。
【請求項６１】
前記ヘリックス誘導ペプチドが４、５又は６つのLys残基を含んでなる請求項５８又は５９に記載の使用。
【請求項６２】
前記アゴニストがLys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PP（配列番号：27）又はLys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-[His34]PP（配列番号：28）である請求項５９に記載の使用。
【請求項６３】
前記アゴニストにおいて、前記血清アルブミン結合モチーフ又はGAG結合モチーフ又はPEG基が、PYY若しくはPPの以下：１位、３位、６位、７位、10位、11位、12位、13位、15位、16位、17位、18位、19位、21位、22位、23位、25位、26位、28位、29位、30位及び32位のいずれかに相当する主鎖炭素、又はNPYの以下：１位、３位、６位、７位、10位、11位、12位、14位、15位、16位、17位、18位、19位、21位、22位、23位、25位、26位、28位、29位、30位及び32位のいずれかに相当する主鎖炭素の側鎖であるか又は側鎖の一部を形成している請求項３８〜４４、４６〜４８、又は５６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６４】
請求項１〜６３のいずれか１項に規定されている、Y1レセプター及びY2レセプターよりY4レセプターに対して選択性であるＹレセプターアゴニスト。
【請求項６５】
[Cys2,DCys27]-PP（配列番号：４）
[Lys28,Glu32]PP25-36（配列番号：５）
[Glu28,Lys32]PP25-36（配列番号：６）
[Cys2,Aoc5-24,Dcys27]-PP（配列番号：９）
PP2-36（配列番号：10）
[His34]-PP（配列番号：11）
[Ala1,Pro34]-PYY（配列番号：12）
[Ala2,Pro34]-PYY（配列番号：13）
[Glu4,Pro34]-PYY（配列番号：14）
[Arg26,Pro34]-PYY（配列番号：15）
[Ile28,Pro34]-PYY（配列番号：16）
[Met30,Pro34]-PYY（配列番号：17）
[Ala1,Glu4,Pro34]-PYY（配列番号：25）
[Nle17]PP（配列番号：32）
[Nle30]PP（配列番号：33）
[Nle17,Nle30]PP（配列番号：34）
[Nle17]PP2-36（配列番号：37）
[Nle30]PP2-36（配列番号：38）
[Nle17,His34]-PP（配列番号：41）
[Nle30,His34]-PP（配列番号：42）
[Nle17,Nle30,His34]-PP（配列番号：43）
[Ala30,Pro34]-PYY（配列番号：46）
[Leu34]-PP（配列番号：51）
[Ile34]-PP（配列番号：52）
[Phe34]-PP（配列番号：53）
[Lys13]PP2-36（配列番号：54）
【化３】
2007529463.tif 000022
N-アセチル-PP（配列番号：30）
N-(N'-ヘキサデカノイル)-γグルタモイル-PP（配列番号：31）
[N-(N'-ヘキサデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,Nle30]PP（配列番号：35）
[N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13]PP2-36（配列番号：39）
[N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,His34]-PP（配列番号：44）
[N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,Ala30,Pro34]-PYY（配列番号：47）
[Cys2,N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,DCys27]-PP（配列番号：48）
[N-(8-(8-γグルタモイルアミノ-オクタノイルアミノ)-オクタノイル)-[Lys13]PP2-36（配列番号：55）
【化４】
2007529463.tif 000023
[N-[(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3]-Lys13]PP（配列番号：36）
[N-[(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3]-Lys13]PP2-36（配列番号：40）
[N-[(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3]-Lys13,His34]PP（配列番号：45）
及びこれらの保存的置換アナログから選択される、Y1レセプター及びY2レセプターよりY4レセプターに選択性であるＹレセプターアゴニスト。
【請求項６６】
PP2-36（配列番号：10）、[His34]-PP（配列番号：11）、若しくは[Cys2,DCys27]-PP（配列番号：４）及びそれらの保存的置換アナログから選択されるY1レセプター及びY2レセプターよりY4レセプターに選択性であるＹレセプターアゴニスト。
【請求項６７】
その必要がある患者に有効量の請求項１〜６６のいずれか１項に記載のY4選択性レセプターアゴニストを投与することを含んでなるY4レセプターの活性化に応答性の症状を治療する方法。
【請求項６８】
前記治療される症状がエネルギー摂取若しくはエネルギー代謝の調節、腸分泌の制御、胃腸管運動性の減少、又は胃排出の速度の減少が指示される症状である請求項１〜６３のいずれか１項に記載の使用又は請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記治療される症状が肥満若しくは過体重、又は肥満若しくは過体重が主因であるとされる症状である請求項６８に記載の使用又は方法。
【請求項７０】
前記治療される症状が炎症性腸疾患、過食症、神経性大食症、Ｘ症候群（メタボリック症候群）、糖尿病、２型糖尿病若しくはインスリン非依存性糖尿病（NIDDM）、高血糖、インスリン抵抗性、グルコース寛容減損、心血管疾患、高血圧、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、心筋梗塞、末梢血管疾患、卒中、血栓塞栓性疾患、高コレステロール血症、高脂血症、胆嚢疾患、変形性関節症、睡眠時無呼吸、生殖障害、例えば多嚢胞性卵巣症候群、又は胸部、前立腺若しくは結腸のガンである請求項６９に記載の使用又は方法。
【請求項７１】
前記アゴニストが絶食状態の患者に投与される請求項６７又は６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記治療される症状が下痢又は腸瘻からの過剰分泌である請求項１〜６３のいずれか１項に記載の使用又は請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
前記治療される症状が悪心又は嘔吐である請求項１〜６３のいずれか１項に記載の使用又は請求項６６に記載の方法。
【請求項７４】
悪心又は嘔吐の治療用組成物の製造におけるPPの使用。
【請求項７５】
前記治療される悪心又は嘔吐の症状が別の薬剤での治療から生じるものであるか又は該治療から生じると予期されるものである請求項７３又は７４に記載の使用又は方法。
【請求項７６】
前記Y4選択性レセプターアゴニストがGAG結合モチーフを含んでなる請求項６８〜７５のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項７７】
前記Y4選択性レセプターアゴニストが血清結合モチーフを含んでなる請求項６８〜７５のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項７８】
前記Y4選択性レセプターアゴニストがPEG化されている請求項６８〜７５のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項７９】
前記アゴニストが皮下、筋肉内、静脈内、鼻、経皮又は口腔粘膜投与を含む非経口経路を介して患者に投与される請求項６７〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Y1レセプター及びY2レセプターよりY4レセプターの選択性アゴニストとして作用するペプチド又はペプチド性化合物に関し、また、Y4レセプターの活性化に応答性の症状の治療、例えば肥満及び過体重、並びにこれらが一因とされる症状の治療、下痢及び腸分泌過多のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
PP折り畳みファミリーのペプチド  −  NPY（ニューロペプチドＹ）（ヒト配列−配列番号：１）、PYY（ペプチドYY）（ヒト配列−配列番号：２）、及びPP（膵ポリペプチド）（ヒト配列−配列番号：３）は、天然に分泌される、相同な36アミノ酸の、Ｃ末端がアミド化されたペプチドであり、これらは共通の三次元構造−PP折り畳み（PP-fold）（これは驚くべきことに希水溶液中でさえも安定であり、当該ペプチドのレセプター認識に重要である）−により特徴付けられる。
【０００３】
初期に、トリのPPのＸ線構造は、0.98Åまでの小さい分解能のＸ線結晶学的分析及び独特な構造（その名がこのペプチドから命名された）により非常に詳細に特徴付けられた（Blundellら、1981 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78: 4175-79；Gloverら、1984, Eur.J.Biochem. 142: 379-85）。続いて、このファミリーの他のメンバーのPP折り畳み構造が、特にNMR分光光学的分析により分析された。Ｘ線分析及びNMR分析は両方とも、明らかに、非常に濃縮された条件又は固相条件で実施される；しかし、詳細な円偏光二色性分析は、NPY及びPPが水溶液中でさえPP折り畳み構造をとることを示唆している。このことは、このような小さなペプチドに関しては通常ではない（Fuhlendorffら、1990 J.Biol.Chem. 265: 11706-12）。重要なことに、これらペプチド並びにそれらのフラグメント及びアナログのタンパク質分解的安定性の分析は、例えば完全長PP1-36が希水溶液でさえ折り畳まれた形状（この形状が、僅かな置換のためにPP折り畳み構造をとることができないアナログを容易且つ迅速に分解する或る種の酵素による分解から保護する）に保持されることを強く示している（Schwartzら、1990 Annals NY Acad.Sci. 611: 35-47）。
【０００４】
NPY、PYY、及びPPに共通するPP折り畳み構造は、１）Ｎ末端ポリプロリン様ヘリックス（Pro2、Pro5、及びPro8を有する残基１〜８に相当）、続いて２）タイプＩ βターン領域（残基９〜12に相当）、続いて３）両螺旋軸間に約152度の角度を有してポリプロリンヘリックスに対し逆平行に位置する両親媒性αヘリックス（残基13〜30）、及び４）Ｃ末端ヘキサペプチド（残基31〜36）からなる。折り畳まれた構造は、両親媒性αヘリックスの側鎖と、これらと互いに密接に嵌合する両親媒性αヘリックスの側鎖との間の疎水性相互作用により安定化されている（Schwartzら、1990）。レセプター認識Ｃ末端ヘキサペプチド中の鍵となる残基の他に、PP折り畳みペプチドのファミリー間で保存されているのは、PP折り畳み構造を安定化するコア疎水性残基である。図1AはNPY配列を示し、NPY、PYY、及びPP間で保存されている残基が、黒の背景に白抜き文字で表されている。図1Aはまた、上記のPP折り畳み構造の要素を説明する。Ｃ末端ヘキサペプチド（これはレセプター認識に重要である）は構造化されていないが、PP折り畳みは安定な足場を提供し、この足場がＣ末端ヘキサペプチドをレセプターに提示する（これは種々の程度で当該ペプチドのＮ末端の部分にも依存し、又は依存しないこともある）（図1Bに図示）。NMR分光光学分析により、例えばNPYの極Ｃ末端部分及びＮ末端部分はかなり可動性であることが証明されている。このことは、PP折り畳みが、常時、その自由端から「開かれる（unzipped）」の危険があることを意味している。
【０００５】
NPYは、ヒトにおいて多くの異なるレセプターサブタイプ（Y1、Y2、Y4、及びY5）を通じて作用する中枢神経系及び末梢神経系の両方の種々の部分で複数の作用を有する非常に広範に散在するニューロペプチドである。主要なNPYレセプターは、概してNPYニューロンの「作用」を伝えるシナプス後レセプターであるY1レセプター、及び概してシナプス前の抑制性レセプターであるY2レセプターである。これは、NPYニューロン−これはまたメラノコルチンレセプターアンタゴニスト/逆アゴニストAgRP（アグーチ関連ペプチド）も発現する−が弓状核の刺激性分枝における一次「感覚」ニューロンとして作用する視床下部でも事実である。したがって、食欲及びエネルギー消費を制御するこの「センサー核（sensor nucleus）」では、NPY/AgRPニューロンが、抑制性POMC/CARTニューロンと共に、身体のホルモン及び栄養の状態を監視している。なぜなら、これらのニューロンは、レプチン及びインスリンのような長期レギュレーター、並びにグレリン及びPYYのような短期レギュレーターの両方の標的であるからである（下記参照）。刺激性NPY/AgRPニューロンは、例えば室傍核−これもまた視床下部である−に投射する。そこでは、シナプス後の標的レセプターはY1レセプター及びY5レセプターであると考えられている。NPYの脳室内（ICV）注射に際してげっ歯類は文字通り破裂するまで食べるので、NPYは食物摂取の増大に関して公知の最も強力な化合物である。NPY/AgRPニューロンからのAgRPは、主としてメラノコルチンレセプタータイプ４（MC-4）に対してアンタゴニストとして作用し、このレセプターに対するPOMC由来ペプチド−主にaMSH−の作用を遮断する。MC4レセプターシグナルは食物摂取のインヒビターとして作用するので、AgRPの作用は、−ちょうどNPY作用のように−食物摂取のための刺激性シグナル（すなわち、抑制の抑制）である。NPY/AGRPニューロン上に、抑制性−シナプス前−Y2レセプターが見出されている。このレセプターは、局所的に放出されるNPY及び腸ホルモンPYY−別のPP折り畳みペプチド−の両方の標的である。
【０００６】
PYYは、食事の間に−食事のカロリー含量に比例して−遠位小腸及び結腸の腸内分泌細胞から放出され、末梢ではGI管機能に対して作用し、中枢では満腹シグナルとして作用する。末梢では、PYYは、例えば上部GI管の自動運動性、胃酸、及び膵外分泌性分泌に対してインヒビター−「回腸遮断（ileal break）」−として機能すると考えられる。中枢では、PYYは、主として、弓状核（血液からアクセスされると考えられている）のNPY/AgRPニューロン上のシナプス前抑制性Y2レセプターに対して作用すると考えられる（Batterhamら、2002 Nature 418: 650-4）。このペプチドはPYY1-36として放出されるが、或る割合−約50％−は、ジペプチジルペプチダーゼ-IV（３つの全てのPP折り畳みペプチド−PP、PYY、及びNPY−と同様にPro又はAlaが２位に見出されれば、ペプチドのＮ末端からジペプチドを取り除く酵素）による分解産物であるPYY3-36として循環する（Eberleinら、1989 Peptides 10: 797-803）。したがって、循環中のPYYは、PYY1-36（これはY1レセプター及びY2レセプターの両方に対して作用し、Y4及びY5にも種々の親和性で作用する）とPYY3-36（これは親和性Y2レセプターに関する親和性より低い親和性をY1レセプター、Y4レセプター及びY5レセプターに関して有する）の混合物である。
【０００７】
PPは、特に食物摂取により誘発される迷走神経のコリン作動性刺激によってほぼ独占的に支配される膵島の内分泌細胞から放出されるホルモンである（Schwartz 1983 Gastroenterology 85:1411-25）。PPは胃腸管に対して種々の効果を有するが、これらのいずれも単離した細胞及び器官では観察されず、全てが無傷の迷走神経供給に依存しているようである（Schwartz 1983 Gastroenterology 85:1411-25）。このことと一致して、PPレセプター（Y4レセプターと呼ばれる）は脳幹に位置し、迷走運動ニューロン−この活性化はPPの末梢効果を生じる−及び孤束核（NTS）−この活性化は満腹ホルモンとしてのPPの効果を生じる−で強力に発現する（Whitecombら、1990 Am.J.Physiol. 259: G687-91；Larsen & Kristensen 1997 Brain Res.Mol.Brain Res 48: 1-6）。血液脳関門は末梢からの種々のホルモンが感知されるこの領域で「漏れやすい（leaky）」ので、血液からのPPは脳のこの領域に自由に出入りできることに留意すべきである。最近、食物摂取に対するPPの効果の一部は、弓状核のニューロン−特にPOMC/CARTニューロン−に対する作用を通じて媒介されていると主張されている（Batterhamら、2004 Abstract 3.3 International NPY Symposium in Coimbra, Portugal）。PPはY4レセプターを通じて作用し、このレセプターに対してナノモルの親和性を有するPYY及びNPYとは対照的にPPはナノモル未満の親和性を有する（Michelら、1998 Pharmacol. Rev. 50: 143-150）。PPはまた、Y5レセプター対して相当の親和性を有するが、このことは、このレセプターが特に発現しているCNSの細胞へのアクセスを欠いているため、及びPPに関する比較的低い親和性のために、循環PPに関しては生理学的に重要である可能性は低い。
【０００８】
PP折り畳みペプチドレセプター
ヒトには、４つの十分に確立されたタイプのPP折り畳みペプチドレセプター：Y1、Y2、Y4、及びY5が存在し、これらは全て類似する親和性でNPY1-36及びPYY1-36を認識する。かつては、PYYよりNPYを好むとされたY3レセプタータイプが示唆されたが、今日ではこれは真のレセプターサブタイプとして受け入れられていない（Michelら、1998 Pharmacol. Rev. 50: 143-150）。Y6レセプターサブタイプがクローニングされており、これは、ヒトで、TM-VII並びにレセプターテイルを欠く切断形態で発現され、その結果少なくともそのままでは機能的レセプター分子を形成しないようである。
【０００９】
Y1レセプター  −  親和性研究により、Y1はNPY及びPYYと等しく親密に結合し、基本的にはPPに結合しないことが示唆されている。Y1に対する親和性は、PP折り畳み分子（NPY/PYY）の両末端配列の同一性−例えば残基Tyr1及びPro2が必須である−に依存し、そしてこれはペプチド端が全く正しい様式で提示されていることに依存する。Ｃ末端部（その残基の幾つかのものの側鎖が必須である）では、Y1レセプターは、−Y5レセプター及びY4レセプターと同様であるが、Y2レセプターとは異なり−34位（通常はGln）での或る種の置換（例えばPro）に寛容である（Fuhlendorffら、1990 J.Biol.Chem. 265: 11706-12；Schwartzら、1990 Annals NY Acad.Sci. 61: 35-47）。Y1レセプター及びY2レセプターの要件に関する構造-機能研究も幾つか報告されている（Beck-Sickingerら、1994 Eur.J.Biochem. 225: 947-58；Beck-Sickinger及びJung 1995 Biopolymers 37: 123-42；Sollら、2001 Eur.J.Biochem. 268: 2828-37）。
【００１０】
Y2レセプター  −  親和性研究により、Y2はNPY及びPYYと等しく親密に結合し、基本的にはPPに結合しないことが示唆されている。このレセプターは、特にPP折り畳みペプチド（NPY/PYY）のＣ末端部を必要とする。したがって、長いＣ末端フラグメント−例えばNPY13-36（αヘリックス全体＋Ｃ末端ヘキサペプチド）程度までの−は、比較的高い親和性で、すなわち全長ペプチドの親和性の１/10〜10倍（within ten-fold）で認識される（Sheikhら、1989 FEBS Lett. 245: 209-14；Sheikhら、1989 J.Biol.Chem. 264: 6648-54）。したがって、種々のＮ末端欠失（これはY1レセプターへの結合を消失する）は、依然としてY2レセプターへの或る程度の結合を保存する。しかし、Ｃ末端フラグメントの親和性は、比較的長いフラグメントに関してさえ、NPY/PYYと比較して約１/10倍（10 folds）に低下する。NPY及びPYYの34位のGln残基は、Y2レセプターのリガンド認識にとって高度に重要である（Schwartzら、1990 Annals NY Acad.Sci. 611: 35-47）。
【００１１】
Y4レセプター  −  親和性研究により、Y4はPPに血漿中で見出される濃度に相当するナノモル未満の親和性で結合する一方、NPY及びPYYはよりずっと低い親和性で認識されることが示唆されている。このような研究により、Y4レセプターはPP折り畳みペプチドのＣ末端部に高度に依存すること、及び比較的短いＮ末端欠失はこのリガンドの親和性を損なうことが示唆されている。Y4レセプターに関する構造活性研究が幾つか報告されている（Gehlertら、1996 Mol.Pharmacol. 50: 112-18；Walkerら、1997 Peptides 18: 609-12）。
【００１２】
Y5レセプター  −  親和性研究により、Y5はNPY及びPYYに等しく親密に結合し、PPにもより低い（が、このホルモンの通常の循環レベルを下回る）親和性で結合する。PYY3-36もまた、Y5レセプターによって十分に認識されるが、このレセプターは、このペプチドが末梢に投与されたときに容易に該レセプターにアクセスできないCNSにおいてかなりの程度で発現される。
【００１３】
PP折り畳みペプチド及びこれらのアナログは、動物モデル及びヒトでこれらペプチドの或る種のものの証明された効果、並びに、肥満のヒトがPP及びPYYの低い基礎レベル及びこれらペプチドのより低い食事応答を有している事実に基づいて、肥満及び付随する疾患（例えばプラーダー‐ヴィリ症候群を含む）の治療における使用について示唆されている（Holst JJら、1983 Int.J.Obes. 7: 529-38；Batterhamら、1990 Nature）。1970年代半ばから、PPがげっ歯類において食物摂取に影響し得ることは知られていた。1993年に、PPの注入は、プラーダー‐ヴィリ症候群を有する中程度に肥満の患者において、食物摂取を減少させることが報告された（Berntsonら、1993 Peptides 14: 497-503）。最近、PPのこの効果は健常なヒト対象におけるPPの注入によって確認されており、この患者では、24時間にわたって食欲の長期持続性抑制及び減少した食物摂取が観察された（Batterhamら、2003, Clin.Endocrinol.Metab. 88: 3989-92）。
【００１４】
しかし、天然型PP折り畳みペプチドは、バイオ医薬品としての使用に最適ではなく、例えば、種々のプロテアーゼ、例えばDPP-IVによる分解を受け易い。したがって、天然ペプチドは、タンパク質安定性について最適化されていない。なぜならば、天然ペプチドは、通常、比較的短時間、ニューロペプチド又はホルモンとして作用するように作られているからである。
【００１５】
したがって、Y4レセプター調整に応答性の症状、例えば肥満及び腸分泌過多の治療のためには、アゴニストとして作用し且つ標的として意図されるY4レセプターに特異的であり且つレセプター結合に重要なPP折り畳み構造の要素が安定的に保存されるPP折り畳みペプチド又はPP折り畳みペプチド模擬体を使用することが望ましい。特に、Y1レセプター及びY2レセプターよりY4レセプターに対して選択性である薬剤を使用することが極めて望ましい。このことは、Y1レセプターの活性化が望まない心血管及び腎の副作用、例えば血管収縮及びナトリウム排泄増加を引き起こす可能性が大きいと予測されるので、特に重要である。更に、Y2レセプターの活性化もまた、副作用を引き起こし得る。真に効率的な脈管形成性Ｙレセプタープロフィールは何であるが依然として不明であるが、Y2アゴニスト、例えばNPY3-36は、見かけ上、例えば虚血後肢モデルにおいて、すなわち、例えば非手術ペレット（inoperated pellet）から放出されるような定常曝露で高用量で投与したときに、血行再建を誘導することができる（Zukowska Zら、Trends Cardiovasc Med. 2003 ,13 :86-92）。NPYに対する脈管形成応答はY2レセプターノックアウト動物で減少する；しかし、この広範囲ＹレセプターアゴニストNPYに対する応答は、実際には、消失せず、Y2レセプター及びY5レセプターは共に、虚血血管でアップレギュレートされる（Leeら、J.Clin.Invest. 2003, 111: 1853-62）。いずれにせよ、PP折り畳みペプチド又はPP折り畳みペプチド模擬体は、Y2レセプターの活性化を通じて、例えば糖尿病患者で網膜症を悪化するというような副作用を引き起こし得、或るガンの増殖に関連する新生血管形成を助ける可能性があり得る。したがって、効果的でY1レセプター及びY2レセプターよりY4レセプターに選択性であるアゴニストの使用は、Y4レセプター活性化を受け易い疾患及び症状で特に有用である。
【００１６】
本明細書で使用する幾つかの共通する用語
親和性：特定のレセプターに対するペプチドの親和性は、例えばIC50値又はKi若しくはKd値として与えられる。親和性は、具体的ではあるが限定的でない例において、アッセイ、例えば競合結合アッセイで決定される。IC50値は、該当する所定のレセプターに関しての、Kdより遥かに少ない量で使用する放射性リガンドと50％置換するペプチドの濃度に相当する。
【００１７】
食欲：食物に対する自然な欲望又は切望。食欲の増加は、一般に、摂食行動の増加に至る。
食欲抑制剤：食物に対する欲望を減少させる化合物。
【００１８】
結合：２つの分子が相互作用するような当該２つの分子間の特異的相互作用。レセプターへの結合は特異的且つ選択的であることができ、その結果、或る分子は別の分子と比較して優先的に結合される。特異的結合は解離定数（Kd）によって同定されてもよい。この値は、試験される化合物の選択性に依存する。例えば、10nM未満のKdを有する化合物は、一般に、優れた薬物候補であると考えられる。しかし、より低い親和性を有するが特定のレセプターに対して選択性である化合物もまた、良好な薬物候補であり得る。
【００１９】
ボディ・マス・インデックス（BMI）：ボディマスを測定するための数式であり、時にケトレー指数（Quetelet's Index）とも呼ばれる。BMIは体重（kg）を身長2（メートル）で除して算出する。男性及び女性の両方について「正常」と認められている現行の標準は、約20kg/m2のBMIである。１つの実施形態では、25kg/m2より大きなBMIは、肥満対象を同定するために使用することができる。グレードＩの肥満は25kg/m2のBMIに相当する。グレードIIの肥満は30〜40kg/m2のBMIに相当し；グレードIIIの肥満は40kg/m2より大きなBMIに相当する（Jequier 1987 Ain. J Clin. Nutr. 45:1035-47）。理想的な体重は、身長、体格、骨構造、及び性別に基づいて種間及び個体間で変わる。
【００２０】
カロリー摂取又は熱量摂取：個体により消費されるカロリー数（エネルギー）。本発明に関しては、この用語は用語「エネルギー摂取」と同一である。
【００２１】
美容処置：この用語は、医学目的でないが、例えば対象の外観に関して、対象の満足な状態（well-being）を改善するための処置を指称すると意図される。この用語には、必ずしも過体重でも肥満でもない体重を減少させることを望む対象の処置が含まれる。
【００２２】
食物摂取：個体によって消費される食物の量。食物摂取は体積又は重量で測定することができる。この意味には、ｉ）個体により消費された食物の総量としての食物摂取、及びii）個体のタンパク質、脂肪、炭水化物、コレステロール、ビタミン、ミネラル、又は他の任意の食物成分の量である食物摂取が含まれる。したがって、本発明に関して使用される用語「食物摂取」は、用語「エネルギー摂取」と同様である。
【００２３】
正常な日々の食餌：所定の種の個体についての平均的な食物摂取。正常な日々の食餌は、カロリー摂取、タンパク質摂取、炭水化物摂取、及び/又は脂肪摂取に関して表すことができる。ヒトにおける正常な日々の食餌は、一般に、以下を含んでなる：約2,000、約2,400、又は約2,800カロリー〜それより相当高いカロリー。加えて、ヒトにおける正常な日々の食餌は、一般に、約12ｇ〜約45ｇのタンパク質、約120ｇ〜約610ｇの炭水化物、及び約11ｇ〜約90ｇの脂肪を含む。低カロリー食餌は、ヒト個体の正常なカロリー摂取の約85％以下、好ましくは約70％以下である。動物では、カロリー及び栄養の要件は、動物の種及びサイズに依存して変わる。例えば、ネコでは、１kg当たりの総カロリー摂取並びにタンパク質、炭水化物及び脂肪の構成比は、ネコの年齢及び繁殖状態で変わる。
【００２４】
肥満：過剰の体脂肪がヒトを健康上の危険に曝しているかもしれない症状（Barlow及びDietz, Pediatrics 102:E29, 1998；National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), Obes. Res. 6 (suppl. 2):51 S209S, 1998を参照）。過剰の体脂肪は、エネルギー摂取及びエネルギー消費の不均衡の結果である。１つの実施形態では、ボディ・マス・インデックス（BMI）が肥満を評価するために使用される。１つの実施形態では、約22kg/m2（すなわち正常値を約10％上回る）から約30kg/m2まで、特に約25.0kg/m2から30kg/m2までのBMIが過体重とみなされる一方、30kg/m2以上のBMIは肥満である。
【００２５】
過体重：理想的な体重より体重が重い個体。過体重の個体は肥満であり得るが、必ずしも肥満ではない。１つの実施形態では、過体重の個体は、体重を減少させたいと願っている任意の個体である。別の実施形態では、過体重の個体は、約22kg/m2（すなわち正常値を約10％上回る）から約30kg/m2までのBMIを有する個体である。約22kg/m2（すなわち正常値を約10％上回る）から約30kg/m2まで、特に約25.0kg/m2から30kg/m2までのBMIが過体重とみなされる。正常値よりほんの僅かに高いBMI（例えば約22〜約25kg/m2）を有する対象は、体重の減少を願うことが非常に頻繁であるが、これは美容的理由のみからであり得ることに留意すべきである。
【００２６】
効力：化合物のインビトロ効力は、該当する所定のレセプターに関してのシグナル伝達アッセイで決定されるEC50値に関して、すなわち達成可能な最大限の効果の50％を導く濃度に関して定義される。
【００２７】
対象：対象は、ヒト対象及び獣医学上の哺乳動物対象の両方を含む任意の対象であり得る。したがって、対象はヒトであり得、又は非ヒト霊長類、家畜動物（例えばブタ、ウシ、ヒツジ及び家禽）、スポーツに用いる動物若しくはペット（例えばイヌ、ネコ、ウマ、ハムスター及びげっ歯類）であり得る。
【００２８】
治療有効量：特定の症状又は疾患を予防、治療又は寛解し、及び/又は、特定の症状又は疾患の特定の徴候又は症状を緩和するために十分な用量。この用語は、障害の進行を予防し又は退行を引き起こすに十分な用量、又は障害の徴候若しくは症状を軽減できる用量、又は所望の結果を達成することができる用量を含む。美容処置又は過体重若しくは肥満の治療に関連する実施形態では、レセプターアゴニストの治療上の効果は、体重増加を阻害又は停止するに十分な量、又は食欲を減少させるに十分な量、又はエネルギー若しくは食物の摂取を減少させるか又はエネルギー消費を増加させるに十分な量である。用語「美容上の有効量」は、処置される対象が所望の効果を達成するために十分な用量を指称すると意図される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２９】
発明の詳細な説明
最も広い観点では、本発明は、Y4レセプターの活性化に応答性の症状の治療用組成物の製造における、Y1レセプター及びY2レセプターよりY4レセプターに対して選択性であるPP以外のY4レセプターアゴニストの使用を提供する。
ここで、
【００３０】
（ａ）前記アゴニストは、
（ｉ）-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2（式中、R1及びR1は、独立して、水素又はC1-C6アルキルであり、ＸはVal、Ile、Leu又はAlaであり、X3はGln以外の残基である）又はThrがHis又はAsnで置換され、及び/又はTyrがTrp又はPheで置換され、及び/又はArgがLysで置換されているその保存的置換変形体で表されるＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列、及び
（ii）H2N-X1-Pro-X2-(Glu又はAsp)-（式中、X1は存在しないか又は任意のアミノ酸残基であり、X2はLeu、Ile又はSerである）又はその保存的置換体により表されるＮ末端Ｙレセプター認識アミノ酸配列
を有するPP折り畳みペプチド又はPP折り畳みペプチド模擬体であるか、又は
【００３１】
（ｂ）前記アゴニストは、上記（ｉ）で規定されたＣ末端Y4レセプター認識配列、及び任意に、上記（ii）で規定されたY4レセプター認識アミノ酸配列で始まるＮ末端配列を含んでなり、
前記Ｃ末端Y4レセプター認識配列は、前記ヘキサペプチド配列のＮ末端に隣接する少なくとも１つのαヘリックスターンを含んでなる両親媒性アミノ酸配列ドメインに融合し、
前記ターンは共有結合性分子内連結によりヘリックス形状に拘束されているか、又は
【００３２】
（ｃ）前記アゴニストは、各々が上記（ｉ）で規定された配列の最後の４つの残基を含んでなる共有結合的に連結された２つのＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列を含んでなる。
【００３３】
本発明に関連する具体的用語法
本発明に係るアゴニストは、Y1レセプター及びY2レセプターよりY4レセプターに対して選択性である。本発明に関しては、この条件は、当該アゴニストが、本明細書中に記載の親和性アッセイで測定したとき、Y4レセプターに対して、Y1レセプター及びY2レセプターに対してより少なくとも10倍（10-fold）低いIC50値を有すれば充足される。一般に、効力に関して、本発明のアゴニストはまた、本明細書中に記載の効力アッセイで測定したとき、Y4レセプターに対し、Y1レセプター及びY2レセプターに対してより少なくとも10倍（10-fold）低いEC50値を有している。多くの本発明の好ましいアゴニストは、Y4レセプターに対し、Y1レセプター及びY2レセプターに対してより少なくとも100倍（100-fold）高い親和性及び効力を有する。本発明の好ましいアゴニストの幾つかは、Y4レセプターに対し、Y1レセプター及びY2レセプターに対してより少なくとも1000倍（1000-fold）高い親和性及び効力を有している。
【００３４】
本明細書の目的のためには、PP折り畳みペプチドは、Ｘ線結晶学により決定した（Blundellら、1981 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78: 4175-79；Gloverら、1984, Eur.J.Biochem. 142: 379-85）トリPPの本来の3-D構造に対してマッピングしたとき、NPY、PYY及び/又はPPのＮ末端ポリプロリン様ヘリックス、タイプＩβターン領域、両親媒性αヘリックス及びＣ末端ヘキサペプチドドメイン（図１）に対応し、実質的にこれらと同様に整列されるドメインを有する3-D構造を有する分子である。したがって、本明細書で使用するPP折り畳みペプチドの種々のドメインの記載は、トリPPの本来のＸ線構造（Blundellら、1981 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78: 4175-79；Gloverら、1984, Eur.J.Biochem. 142: 379-85；Schwartzら、1990）を参照している。
【００３５】
本明細書の目的のためには、PP折り畳みペプチド模擬体は、トリPPの本来の3-D構造に対してマッピングしたとき、PPの両親媒性αヘリックスの最後のターン及びＣ末端ヘキサペプチドドメインに対応し、実質的にこれらと同様に整列されるドメインを少なくとも有する3-D構造を有する分子である。PP折り畳みペプチド模擬体はまた、上記のようにマッピングしたとき、両親媒性αヘリックスの残りのターン、Ｎ末端ポリプロリン様ヘリックス及びタイプＩβターン領域のうちの１又はそれ以上に対応するドメインを有していてもよい。ペプチド模擬体は、全体が古典的なペプチド結合によって連結されたαアミノ酸の配列からなっている必要はない。そのような配列中の１又はそれ以上の結合は、当該ペプチド模擬体が擬ペプチド配列とみなされ得るように、ペプチド模擬結合（例えば逆アミド（reverse amide）、及び還元されたペプチド結合）によって置換されていてもよい。このような結合置換は、エンドペプチダーゼ分解に対する耐性を付与し、当該分子の薬力学特性を改善することができる。
【００３６】
「PP折り畳みペプチド」及び「PP折り畳みペプチド模擬体」の上記定義で言及した3-D構造の比較は、例えばＸ線回折法により決定される原子座標に基づいて分子比較モデルを構築することにより、又は構造式から予測される分子の3-D構造の視覚化用に市販されているコンピュータプログラム、例えば：Schrodinger Inc.（1500 S.W. First Avenue, Suite 1180 Portland, OR 97201）の「Maestro Modelling Environment」；Accelrys Inc.（San Diego）の「Insight II Modeling Environment」 Release 4.0；及びTripos Inc.（1699 South Hanley Rd., St. Louis, Missouri, 63144, USA）の「SYBYL（登録商標）7.0」の１又はそれ以上を使用することにより行ってもよい。本発明に従うPP折り畳みペプチド又はPP折り畳みペプチド模擬体の3-D構造は、天然のNPY、PYY、又はPPの3-D構造と正確な対応関係を有する必要はなく、一般にはそのような正確な対応関係を有していないことに留意すべきである。PP折り畳みペプチド又はPP折り畳みペプチド模擬体の見かけの3-D構造は、これを研究するために使用される実験条件に依存して変わり、特により小さなペプチドについては、或る種の条件下ではより多く折り畳みが解かれているようにも見えるし、より少なく折り畳みが解かれているようにも見え得る。しかし、PP折り畳みペプチド又はPP折り畳みペプチド模擬体は、上記で特定したPP折り畳みドメインに対応するドメインを有するべきであること、及びそれが天然型ペプチドに類似する全体形状（Ｃ末端配列及び存在すればＮ末端配列が正常に配向している）をとるための構造的要素を有することで十分である。
【００３７】
本発明に係るアゴニストはＣ末端Y4レセプター認識配列を有する。これは、該アゴニストのＣ末端に位置する、通常約５〜７残基長の配列、特にヘキサペプチド配列であり、PP折り畳みペプチド又はPP折り畳みペプチド模擬体中に存在する場合、Y4レセプターに結合し、結合相互作用単独により又はその結合作用と該アゴニストに存在するＮ末端Y4レセプター配列のY4レセプターへの結合との結果として該レセプターを活性化する配列である。Ｎ末端Y4レセプター認識配列は、該アゴニストのＮ末端に位置する、通常約３〜５残基長の配列、特に４残基配列であり、PP折り畳みペプチド又はPP折り畳みペプチド模擬体中に存在する場合、Y4レセプターに結合し、その結合作用と該アゴニストに存在するＣ末端Y4レセプター配列のY4レセプターへの結合との組合せにより該レセプターを活性化する配列である。古典的なＣ末端Y4レセプター認識配列及びＮ末端Y4レセプター認識配列は、天然のPPペプチド中に見出されるものであるが、本明細書中で明らかになるように、これら古典的配列はY4認識を維持するがY1及びY2認識を減少するように改変されてもよい。任意の特定のアゴニスト中に存在するＣ末端配列又はＮ末端配列は、その配列が存在するときには問題のPP折り畳みペプチド又はPP折り畳みペプチド模擬体が本明細書に記載の親和性及び/又は効力アッセイでY4レセプターと相互作用し、当該配列を欠失しているときには相互作用しない（又は有意でない程度で相互作用する）場合、Y4レセプター認識配列である。
【００３８】
本明細書中で、「NPYのSer3に相当する残基」のような用語は、アゴニストの3-D構造をNPYの3-D構造にマッピングすると、NPYのSer3に最も近接してマッピングされる当該アゴニストのアミノ酸残基をいう。同様に、「PPのPro34に対応する位置に」のような用語は、アゴニストの3-D構造をPPの3-D構造にマッピングすると、PPのPro34に最も近接してマッピングされるアミノ酸残基の当該アゴニスト中での位置をいう。特定のペプチド中の特定の残基の実際の番号付けは、天然ペプチドに関して例えば欠失が生じていることに起因して、これとは変わり得る。
【００３９】
一般に、本発明に係るPP折り畳みアゴニスト又はPP折り畳み模擬体アゴニストは、通常、ペプチド性主鎖又は部分的にペプチド性である主鎖（少なくともＣ末端アミノ酸配列に、しばしばＮ末端アミノ酸配列にも）を有するが、主鎖の残りは、非ペプチド性リンカー基、例えば直鎖又は分枝鎖のアルキレン鎖であってもよい。アゴニストのペプチド性部分に存在するアミノ酸は、通常、特にY4レセプターと相互作用するＣ末端及びＮ末端の配列では、天然に存在するアミノ酸であるが、PP折り畳みを保存し且つY4レセプター結合を妨げない非天然αアミノ酸もまた存在してもよい。
【００４０】
本発明に係るアゴニストがＣ末端アミノ酸配列又はＮ末端アミノ酸配列を有する場合、Ｃ末端がアミド化され、及び/又はＮ末端がアシル化されて、カルボキシペプチダーゼ及び/又はアミノペプチダーゼに対する耐性を付与されてもよい。事実、天然型NPY、PYY、及びPPペプチドのＣ末端はアミド化されているので、本発明のアゴニストのＣ末端アミノ酸もアミド化され得る。
【００４１】
本明細書中で、アミノ酸に対する言及は、一般的な名称又は略称、例えばバリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、アスパラギン（Asn）、グルタミン酸（Glu）、グルタミン（Gln）、ヒスチジン（His）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、アスパラギン酸（Asp）、グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）、システイン（Cys）、及びプロリン（Pro）により行われる。立体異性体型を特定せずに一般的な名称又は略称で言及する場合、問題のアミノ酸は、Ｌ体として理解されるべきである。Ｄ体を意図する場合、アミノ酸は、そのように特定して言及される。時には、文脈によりそうすることが望ましい場合には、Ｌ体は推論されるよりむしろ特定される。
【００４２】
本明細書中で使用される用語「保存的置換」は、１又はそれ以上のアミノ酸が生物学的に類似する別の残基により置換されることを指称する。例としては、類似する特徴を有するアミノ酸残基（例えば小さいアミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸、及び芳香族アミノ酸）の置換が挙げられる。本発明における使用に適切な保存的アミノ酸置換の限定的でない例としては、下記の表に記載のもの、及び元の残基に類似する特徴を有する非天然αアミノ酸による同類置換（analogous substitution）が挙げられる。例えば、本発明の好ましい実施形態において、Met残基は、Metの生物学的等価物であるが−Metとは対照的に−容易には酸化されないノルロイシン（Nle）で置換される。内因性の哺乳動物ペプチド及びタンパク質では通常は見出されない残基での保存的置換の別の例は、Arg又はLysの、例えばオルニチン、カナバニン、アミノエチルシステイン、又はその他の塩基性アミノ酸での保存的置換である。ペプチド及びタンパク質における表現型的にサイレントな置換に関する更なる情報については、例えばBowieら、Science 247, 1306-1310, 1990を参照。
【００４３】
【表１】
2007529463.tif 000002
【００４４】
出現する文脈中で特に断りのない限り、本明細書において任意の部分（moiety）に適用される用語「置換（された）」は、４つまでの適合性の置換基で置換されていることを意味する。この置換基の各々は、独立して、例えば、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C1-C6)アルキル、メルカプト、メルカプト(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、ハロ（フルオロ、ブロモ、及びクロロを含む）、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ニトロ、ニトリル（-CN）、オキソ、フェニル、-COOH、-COORA、-CORA、-SO2RA、-CONH2、-SO2NH2、-CONHRA、-SO2NHRA、-CONRARB、-SO2NRARB、-NH2、-NHRA、-NRARB、-OCONH2、-OCONHRA、-OCONRARB、-NHCORA、-NHCOORA、-NRBCOORA、-NHSO2ORA、-NRBSO2OH、-NRBSO2ORA、-NHCONH2、-NRACONH2、-NHCONHRB、-NRACONHRB、-NHCONRARB、又は-NRACONRARB（式中、RA及びRBは独立して(C1-C6)アルキル基である）であり得る。「任意の置換基」は上記の置換基のうちの１つであり得る。
【００４５】
文脈が他を示していない限り、本明細書中でのNPY、PYY、及びPPペプチド並びにそれらの配列への言及は、ヒト形態のこれらペプチド及び配列に関する。しかし、他の哺乳動物のNPY、PYY、及びPPペプチドは、それらの用語が本明細書中で使用されているように、ヒトNPY、PYY、及びPPのPP折り畳みペプチド模擬体又は保存的置換したヒトNPY、PYY、又はPPを構成する。
【００４６】
本発明に係るアゴニストは、Ｃ末端Y4レセプター認識配列中のPPのPro34に対応する位置にGln以外の残基、好ましくはAsn以外の残基を有する。これらの残基を回避することは、Y2レセプターに対する減少した親和性を確実にすることの助けとなる。
【００４７】
更に、Ｎ末端Ｙレセプター認識アミノ酸配列は、本発明に係るアゴニスト中に存在する場合、H2N-X1-Pro-X2-(Glu又はAsp)-（式中、X1は存在しないか、又は任意のアミノ酸残基であり、X2はLeu、Ile又はSerである）、又はその保存的置換体により表される。これら要件は、Ｎ末端Y4認識配列の親和性を確実にし、Y1レセプター及びY2レセプターに対する選択性を獲得するための助けとなる。
【００４８】
本発明に従う使用のためのタイプ（ａ）アゴニスト
一般に、タイプ（ａ）アゴニストは、Y4レセプター効力を保持又は付与するがY1レセプター及びY2レセプターに対する効力を実質的に減少させる改変を有する、PP、NPY若しくはPYYのPP折り畳みアナログ又はPP、NPY若しくはPYYのPP折り畳み模擬体である。このようなPP折り畳みアナログ及び模擬体としては、PP折り畳みの特徴（Ｎ末端ポリプロリン様ヘリックス、βターン、両親媒性αヘリックス及びＣ末端ヘキサペプチド）を全て備えたペプチド、主鎖の一部（例えばβターン残基及び隣接残基）が非ペプチド性スペーサー鎖により置換されているペプチドアナログ、並びにＣ末端ヘキサペプチド及び両親媒性αヘリックスの最後のターンを保有するが、ポリプロリン様ヘリックス及び/又はβターンの全て又は一部を欠いている切断型ペプチドが挙げられる。
【００４９】
本発明に従う使用のためのタイプ（ｂ）アゴニスト
一般に、タイプ（ｂ）アゴニストは、その最小PP折り畳み構造的特徴（Ｃ末端ヘキサペプチド及びαヘリックスの最後のターン）が指定された分子内共有結合性連結により安定化されているタイプ（ａ）のPP折り畳みペプチドアナログ又はPP折り畳み模擬体とみなすことができる。
【００５０】
このタイプのアゴニストは、天然型NPY、PYY若しくはPPペプチドに等価物を有しない分子内連結か又は共有結合性連結に相当するか若しくは非共有結合性相互作用がそのような共有結合性連結で置換されている分子内連結により特徴付けられる。例えば、[Cys2,D-Cys27]PP（配列番号：４）中のCys2とD-Cys27との間の共有結合性ジスルフィド橋架けは、トリPPのＸ線構造で観察されるようなPro2及びTyr27の側鎖間の非共有結合性疎水性相互作用を模擬する。上記のように、このような連結は、PP折り畳み構造の必須要素（特に可動性Ｃ末端Y4認識配列及びαヘリックスの最後のターン）及び/又はＮ末端の提示を安定化するために働くことができる。完全長ペプチド又は完全長に近いペプチドでは、このような連結は、天然型PP折り畳み構造自体を安定化することができる。このことは２通りで有益である。第１には、そのような連結は、両親媒性αヘリックスのＣ末端部分を安定化し、そのことにより、最適な様式でのＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列の提示を安定化し、その結果、Y4レセプターに対する高い効力を生じる；第２には、PP折り畳み自体の全体を安定化することにより、ペプチドがタンパク質分解性分解に対してより感受性でなくなる。なぜならば、酵素は、標的配列がむしろ折り畳みを解かれている様式で見出されることを要求することが多いからである（Schwartzら、1990）。分子内連結はまた、天然型ペプチドの構造に関して激しく（heavily）改変されているY4選択性アゴニスト、例えば天然型ペプチド中に見出される１又はそれ以上のドメイン、又はドメインの部分を欠くアゴニストを可能にすることができる。
【００５１】
このタイプ（ｂ）のアゴニストの１つのセットは、PP折り畳み構造を有し、該構造において、ヘリックスターン拘束性分子内連結が、両親媒性ドメイン中のアミノ酸残基から、該両親媒性ドメインに逆平行に伸びPP折り畳みペプチドのポリプロリンドメインに対応する該アゴニストのＮ末端部分の連結点まで伸びている。ヘリックスターンを拘束する分子内連結、例えばジスルフィド連結又はラクタム連結は、両親媒性ドメイン中のアミノ酸残基から、４つのＮ末端残基の１つまで伸びていてもよい。
【００５２】
このタイプのアゴニストの特に好ましいサブセットは、両親媒性ドメイン中のアミノ酸残基から、ポリプロリンドメインのＮ末端部分中の連結点まで伸びるヘリックスターン拘束性分子内連結を有するPP折り畳みペプチドからなる。このような連結は、５位と20位の残基間又は８位と16位の残基間、特には２位と27位の残基間であり得、例えば27位のD-Cysと２位のCysとの間のジスルフィド連結であり得る。27位ではＤ体のCysが好ましい。なぜならば、これは、分子全体がPP折り畳み構造をとり、これを模擬するために、２位に導入された「正常な」Ｌ体のCysとジスルフィド橋架けを形成するように最適にチオール側鎖を配向するからである。タイプ（ｂ）の別のセットのアゴニストでは、ヘリックスターン拘束性分子内連結は、αヘリックスドメインの最後のヘリックスターンの残基間に伸びるか（例えば該ヘリックスターンのLys残基とGlu残基との間に形成されるラクタム連結）、又はＣ末端Y4認識アミノ酸配列中の残基とαヘリックスドメインの最後のヘリックスターン中の残基との間に伸びる（例えば[Lys28,Glu32]PYY25-36（配列番号：５）又は[Glu28,Lys32]PP25-36（配列番号：６）中のLysとGluとの間のラクタム橋架け）。
【００５３】
本発明に従う使用のためのタイプ（ｃ）アゴニスト
本発明に係るタイプ（ｃ）アゴニストは、タイプ（ａ）及び（ｂ）アゴニストに存在するＣ末端Y4レセプター認識配列の少なくとも最後の４残基の二量体、例えば末端ヘキサペプチド配列又は最後の５残基若しくは４残基の二量体とみなし得る。したがって、Ｃ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列自体は、−例えばヘキサペプチド形態では−Y4レセプターに対してむしろ低い親和性を有し、タイプ（ａ）及び（ｂ）アゴニスト中で、他の構造的要素を有して高い親和性及び効力のリガンドになるが、２つのＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列は二量体に結合することにより有用な高い親和性及び効力を得ることができる。結果的に、このような構築物の驚くべきほどの高い親和性の理由は、Y4レセプターが、ファミリーＡタイプの他の全てではないにしろ多くの7TMレセプターと同様に、細胞膜で二量体として見出され機能することである（Bouvier, 2001, Nat Rev Neurosci. 2: 274-86）。したがって、単一のＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列の親和性は、Y4レセプターそのものに対してはむしろ低いが、二量体形態のこの配列の１つのプロトマーの結合は、他のＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列の「非常に高い局所濃度」を生じ、このことが二量体レセプターに対する二量体リガンドの高親和性を生じる。文献では、NPYのＣ末端部分のアナログの二量体構築物は、Y1レセプターのアンタゴニストとして作製された（Danielsら、1995 Proc Natl Acad Sci U S A. 92:9067-71）。驚くべきことに、この構築物は、その後、Y4レセプターのアゴニストであることが示された（Parkerら、1998 Eur J Pharmacol. 349:97-105）。
【００５４】
タイプ（ｃ）アゴニストのこの２つの配列は、例えば当該２つの配列の各々のＣ末端からの少なくとも４残基に位置する少なくとも一対の残基間の架橋により、連結され得る。例えば、２つの共有結合的に連結された配列は、上記で規定され議論されたＣ末端配列の最後の５残基又は最後の６残基を含んでなり得る。１つの実施形態では、架橋は、２つの配列の各々のＣ末端からの少なくとも４残基（例えば５残基又は６残基）に位置する二対の残基間の一対の架橋を介する。架橋法としては、システイン残基間のジスルフィド橋架け、一方の配列中の2,3-プロピオン酸残基の3-アミノ基と他方の配列中の残基の側鎖のカルボキシル基との間のアミド結合によるか、又はビス-アミノ酸HOOCCH(NH2)(CH2)1-6CH(NH2)COOH（これの両端部がそれぞれの配列の各々で残基を形成している）により形成された-(CH2)1-6-橋架けによるものが挙げられる。
【００５５】
単一ジスルフィド橋架けにより架橋したタイプ（ｃ）アゴニストの例は：
【化１】
2007529463.tif 000003
である。
【００５６】
しかし、この二量体の２つのＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列は、同一である必要はない。したがって、単一ジスルフィド橋架けにより架橋したタイプ（ｃ）アゴニストの別の例は：
【化２】
2007529463.tif 000004
である。
【００５７】
タイプ（ｃ）Y4アゴニストへテロ二量体の別の例は：
【化３】
2007529463.tif 000005
である。
【００５８】
このペプチドでは、Lys残基が、−この場合には−血清アルブミン結合モチーフ用の付着部位としてペプチド単位の一方の「31」位に導入されている。
【００５９】
Ｃ末端Y4レセプター認識配列（タイプ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）アゴニスト）
Y4選択性であるために、本発明に係る３つの全てのタイプのアゴニストは、本明細書に記載される親和性アッセイ及び効力アッセイにより確証することができるＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列を有する。本発明のタイプ（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）アゴニストに存在する好ましいＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列の１つのセットは、-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2（式中、Ｘ及びX3は上記と同義であり、R1及びR2は各々水素である）により表される。また、好ましくは、残基X3はAsnであってはならず、Lys、Arg、Asp又はGluは好ましくはX3残基としては回避される。現時点では、X3はProであることが好ましいが、X3はまたHis、又は4-ヒドロキシプロリン、アゼチジン-2-カルボン酸、アゼチジン-3-カルボン酸、アザプロリン、及び1-アミノシクロブタンカルボン酸から選択される非天然Proアナログであり得る。本アゴニストのＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列では、１つの好ましい残基XはLeuである。
【００６０】
本発明に係るアゴニストでは、上記に規定し議論したような６残基のＣ末端Y4認識配列は、-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2（式中、残基XAは非塩基性且つ非酸性であり、配列-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2は上記で規定し議論したとおりである）により表されるＣ末端ヘプタペプチドの最後の残基であり得る。このような場合、非塩基性且つ非酸性アミノ酸残基XAは、例えばLeu又はMetであり得る。
【００６１】
更に、前段のＣ末端ヘプタペプチド配列は、それ自体、-XC-Tyr-XB-Asn-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2（式中、配列-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2は前段で議論したとおりであり、XCはArg又はLysであり、XBはIle、Leu又はValである）により表されるＣ末端ウンデカペプチドの最後の残基であり得る。このようなウンデカペプチド配列の例としては、-Arg-Tyr-Ile-Asn-(Leu又はMet)-Leu-Thr-Arg-(Pro又はHis)-Arg-Tyr-C(=O)NH2が挙げられる。
【００６２】
本発明に係るアゴニストに存在し得るＣ末端ウンデカペプチド配列の別の例は、-XC-Tyr-XB-Asn-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2（式中、配列-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2は２つ前の段落で議論したとおりであり、XCはHis、Asn又はGlnであり、XBはIle、Leu又はValである）により表される。このような配列の例は、-His-Tyr-(Ile又はLeu)-Asn-Leu-(Val/Ile)-Thr-Arg-(Pro又はHis)-Arg-Tyr-C(=O)NH2である。
【００６３】
本発明に係るタイプ（ａ）又は（ｂ）のPP折り畳み模擬体アゴニストの１つのセットにおいて、Y4レセプター認識アミノ酸配列を含んでなるＣ末端配列は、そのＮ末端で、該エピトープのＮ末端に隣接する少なくとも１つのαヘリックスターンを含んでなる両親媒性アミノ酸配列ドメインと融合していてもよく、及び少なくとも２つのアミノ酸のＮ末端アミノ配列。該Ｃ末端及びＮ末端のアミノ酸配列はリンカー基にペプチド結合により結合している。該リンカー基は、任意に１又はそれ以上の二重結合又は三重結合を含有していてもよい、直鎖又は分岐鎖のアルキレン基であり得る。例えば、該リンカー基のペプチド結合は、式NH2(CH2)nCO2H（式中、ｎは２〜12であり、特には６、７、８、９又は10である）のアミノ酸のカルボキシル基及びアミノ基とそれぞれ形成していてもよい。したがって、このアゴニストは、上記のようなCys-Cys橋架けを有するが、天然型ペプチドの５〜24に相当するアミノ酸残基が６-アミノヘキサン酸（ε-アミノカプロン酸）、７-アミノヘプタン酸、８-アミノオクタン酸、９-アミノノナン酸、及びアミノデカン酸からなる群より選択される６〜10炭素原子の炭素鎖を有するアミノカルボン酸で置換されているNPY、PPY又はPPのアナログであってもよい。具体的な実施形態において、８-アミノオクタン酸（本明細書中で時に「Aoc」と略される）が好ましい。このようなアゴニストの例は、[Cys2,Aoc5-24,D-Cys27]-PP（配列番号：９）である。
【００６４】
Ｎ末端Y4レセプター認識配列（タイプ（ａ）及び（ｂ）アゴニスト）
本発明のタイプ（ａ）及び（ｂ）アゴニストのＮ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列では、残基X1はAlaであるか又は存在しないのが現時点で好ましい。更に、本アゴニストのＮ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列では、残基X2はLeu、Ile又はSerであることが現時点で好ましい。
【００６５】
このようなＮ末端配列の具体例は、H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-、及びH2N-Pro-Leu-Glu-である。
【００６６】
本発明に係るタイプ（ａ）及び（ｂ）Y4選択性アゴニストは、アミノペプチダーゼ活性に対する耐性を付与するためにＮ末端にてアシル化されてもよい。例えば、アシル化は、２〜24炭素原子を有する炭素鎖を用いるものであってもよく、Ｎ末端アセチル化は特定の例である。
【００６７】
本発明に従う使用のための具体的アゴニスト
本発明に従う使用のためのアゴニストの具体例は以下である：
[Cys2,DCys27]-PP（配列番号：４）
[Lys28,Glu32]PP25-36（配列番号：５）
[Glu28,Lys32]PP25-36（配列番号：６）
[Cys2,Aoc5-24,Dcys27]-PP（配列番号：９）
PP2-36（配列番号：10）
[His34]-PP（配列番号：11）
[Ala1,Pro34]-PYY（配列番号：12）
[Ala2,Pro34]-PYY（配列番号：13）
[Glu4,Pro34]-PYY（配列番号：14）
[Arg26,Pro34]-PYY（配列番号：15）
[Ile28,Pro34]-PYY（配列番号：16）
[Met30,Pro34]-PYY（配列番号：17）
[Ala1,Glu4,Pro34]-PYY（配列番号：25）
[Nle17]PP（配列番号：32）
[Nle30]PP（配列番号：33）
[Nle17,Nle30]PP（配列番号：34）
[Nle17]PP2-36（配列番号：37）
[Nle30]PP2-36（配列番号：38）
[Nle17,His34]-PP（配列番号：41）
[Nle30,His34]-PP（配列番号：42）
[Nle17,Nle30,His34]-PP（配列番号：43）
[Ala30,Pro34]-PYY（配列番号：46）
[Leu34]-PP（配列番号：51）
[Ile34]-PP（配列番号：52）
[Phe34]-PP（配列番号：53）
[Lys13]PP2-36（配列番号：54）
【化４】
2007529463.tif 000006
N-アセチル-PP（配列番号：30）
N-(N'-ヘキサデカノイル)-γグルタモイル-PP（配列番号：31）
[N-(N'-ヘキサデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,Nle30]PP（配列番号：35）
[N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13]PP2-36（配列番号：39）
[N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,His34]-PP（配列番号：44）
[N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,Ala30,Pro34]-PYY（配列番号：47）
[Cys2,N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,DCys27]-PP（配列番号：48）
[N-(8-(8-γグルタモイルアミノ-オクタノイルアミノ)-オクタノイル)-[Lys13]PP2-36（配列番号：55）
【化５】
2007529463.tif 000007
[N-｛(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3｝-Lys13]PP（配列番号：36）
[N-｛(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3｝-Lys13]PP2-36（配列番号：40）
[N-｛(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3｝-Lys13,His34]PP（配列番号：45）
及びそれらの保存的置換アナログ。
【００６８】
本発明に従う使用に特に好ましいY4選択性アゴニストは、PP2-36、[His34]-PP（配列番号：10）又は[Cys2,DCys27]-PP（配列番号：４）及びこれらの保存的置換アナログである。
【００６９】
本発明に従う使用のための適合化されたアゴニスト
ここまで、本発明に従う使用のための基本的なY4選択性アゴニストを一般的に記載し、そのようなアゴニストの具体的例を提供してきた。しかし、薬物動態学、薬力学、及び代謝特性の改善を目的として、種々の改変がこのようなアゴニスト（具体的に特定されたアゴニストを含む）に対してなされ得る。このような改変としては、アゴニストを、それ自体はペプチド又はタンパク質の製薬分野で公知の機能集団（functional groupings）（モチーフとしても知られる）に連結することが含まれ得る。本発明に係るアゴニストの場合に特に有益な３つの特定の改変は、タイプ（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれであるかにかかわらす、血清アルブミン結合モチーフ又はグリコサミノグリカン（GAG）結合モチーフとの連結、又はPEG化である。
また、PPは本発明に従う使用からは排除されるが、このような改変を有するPPの使用は排除されない。
【００７０】
血清アルブミン結合モチーフ
血清アルブミン結合モチーフは、代表的には、投与の際に体内で延長された滞留を可能にするため又は他の理由で組み込まれる親油性基であり、これは、種々の公知の方法で、ペプチド性又はタンパク質性の分子に、例えばｉ）共有結合性連結を介して、例えば側鎖アミノ酸残基上に存在する官能基に、ii）当該ペプチド又は適切な誘導体化ペプチド中に挿入された官能基を介して、iii）当該ペプチドの統合部分（integrated part）として、カップリングされ得る。例えば、WO 96/29344（Novo Nordisk A/S）及びP. Kurtzhalsら、1995 Biochemical J. 312: 725-31は、本発明に係るアゴニストの場合に用いることができる多くの適切な親油性改変を記載している。
【００７１】
適切な親油性基には、任意に置換されていてもよい、飽和又は不飽和の、直鎖又は分枝鎖の10〜24炭素原子の炭化水素基が挙げられる。このような基は、例えばアゴニストの主鎖中のアミノ酸残基の側鎖への又はPP折り畳み模擬体アゴニストの主鎖中の非ペプチド性リンカー基の主鎖炭素若しくは主鎖炭素からの分枝へのエーテル結合、チオエーテル結合、アミノ結合、エステル結合又はアミド結合により、アゴニストの主鎖に対して側鎖を形成していてもよいし、該側鎖の一部を形成していてもよい。親油性基の付着のための化学ストラテジーは、重要でないが、親油性基を含む以下の側鎖が、アゴニストの主鎖炭素又はそれからの適切な分枝に連結され得る例である：
CH3(CH2)nCH(COOH)NH-CO(CH2)2CONH-（式中、ｎは９〜15の整数である）、
CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CONH-（式中、ｒは９〜15の整数である）、
CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CONH-（式中、ｓは９〜15の整数である）、
CH3(CH2)mCONH-（式中、ｍは８〜18の整数である）、
-NHCOCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3（式中、ｐは10〜16の整数である）、
-NHCO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3（式中、ｑは10〜16の整数である）、
CH3(CH2)nCH(COOH)NHCO-（式中、ｎは９〜15の整数である）、
CH3(CH2)pNHCO-（式中、ｐは10〜18の整数である）、
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3（式中、ｍは８〜18の整数である）、
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3（式中、ｐは10〜16の整数である）、
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3（式中、ｑは10〜16の整数である）、及び
部分的又は完全に水素化されたシクロペンタノフェナントレン骨格。
【００７２】
１つの化学合成ストラテジーにおいて、親油性基含有側鎖は、アゴニストの主鎖の残基の側鎖に存在するアミノ基をアシル化するC12、C14、C16又はC18のアシル基、例えばテトラデカノイル基である。
【００７３】
記載のように、改善された血清結合性特徴を提供するために使用されるアゴニストの改変は、一般に（特には上記に列挙した具体的アゴニストの場合に）適用され得るストラテジーである。したがって、適切な改変アゴニストとしては、[テトラデカノイル-Ala1]-PP（配列番号：20）若しくは[テトラデカノイル-Ala1,His34]-PP（配列番号：21）又はこれらの保存的置換アナログであるアゴニストが挙げられる。
【００７４】
GAG結合
上記の親油性血清結合モチーフの場合と同様に、本発明に係るアゴニストは、アゴニストの主鎖に対して側鎖として又は側鎖の一部としてGAG結合モチーフを組み込むことによって改変されていてもよい。この方法での組込みのための公知のGAG結合モチーフとしては、アミノ酸配列XBBXBX及び/又はXBBBXXBX（式中、Ｂは塩基性アミノ酸残基であり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）が挙げられる。複数、例えば３つのこのような配列が、コンカテマー（直鎖）又はデンドリマー（分枝鎖）の様式で組み込まれていてもよい。具体的コンカテマーGAGモチーフとしては、Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala及びAla-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Alaが挙げられる（この両方が、例えばコンカテマーGAG結合モチーフのＣ末端とアゴニストの主鎖アミノ酸の側鎖中のアミノ酸、例えば[Lys18,His34]PP（配列番号22）又は[Lys18]PP（配列番号：23）のεアミノ基との間に形成されるアミド結合を通じてカップリングされ得る）。
【００７５】
主鎖残基に対する側鎖として又は側鎖の一部としてアゴニストに付着する代わりに、GAGモチーフは、アゴニストのＣ末端又は（好ましくは）Ｎ末端に、直接にか又はリンカー基を介してかのいずれかで共有結合的に連結していてもよい。ここでまた、GAG結合モチーフは、アミノ酸配列XBBXBX及び/又はXBBBXXBX（式中、Ｂは塩基性アミノ酸残基であり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）、例えば配列[XBBBXXBX]n（式中、ｎは１〜５であり、Ｂは塩基性アミノ酸残基であり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含んでなってもよい。このようなコンカテマー反復は、GAGと結合する場合、αヘリックスを形成する傾向にあり、その結果Ｃ末端ヘキサペプチド/最後のαヘリックスターンと融合する場合、当該ターンを安定化することができ、そのことによりY4レセプター認識に最適な方法でこの組合せ構造を提示することができる。このタイプのアゴニストの具体例は、[XBBBXXBX-XBBBXXBX]PP又は[XBBBXXBX-XBBBXXBX-XBBBXXBX]PP（式中、Ｂは塩基性アミノ酸残基であり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）、特には、Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-]PP（配列番号：24）である。
【００７６】
本発明に係るY4選択性アゴニストは、とりわけ、延長した曝露が望ましい適応症において有用である。このような適応症のためには、具体的には、アゴニストは、好ましくは、上記のようなグリコサミノグリカン（GAG）結合モチーフを含んでなる。このようなモチーフにより、確実に、アゴニストは細胞外マトリクス中のGAGに結合し、そのことにより、その組織中のY4レセプターの延長された局所的曝露を確実にする。成長因子、ケモカインなどがパッチ状の塩基性アミノ酸（これがGAGの酸性糖鎖と相互作用する）を介してGAGに結合する。成長因子上のこれらの正に荷電したエピトープは、通常、塩基性残基の側鎖から構成されている。塩基性残基の側鎖は、必ずしも配列中で連続して位置していないが、二次構造要素（例えばαヘリックス又はターン）により、又は当該タンパク質の三次元構造全体により近接して提示されることが多い。上記のような或る種のGAG結合性直線配列、例えばXBBXBX及びXBBBXXBX（式中、Ｂは塩基性残基を表す）が記載されている（Hilemanら、Bioassays 1998, 20: 156-67）。これらセグメントは、GAGへの結合に際してαヘリックスを形成することが円偏光二色性により示されている。このような配列が、例えばコンカテマー又はデンドリマーの構築物（ここでは、例えば３つのこのような配列、例えば各々ARRRAARA配列が提示されている）で配置されている場合、得られる24マーペプチド、例えば、ARRRAARA-ARRRAARA-ARRRAARAにより、確実に、高分子量ポリリジンに類似する細胞外マトリクス中で保持される。すなわち、これは、４時間の灌流期間の間に洗い流されない（Sakharovら、FEBS Lett 2003, 27: 6-10）。
【００７７】
したがって、成長因子及びケモカインは、天然には、２つのタイプの結合モチーフを有して構築される：１つは、それを介してシグナル伝達が達成されるレセプター用の結合モチーフであり、１つは、それを介して付着及び長期持続局所活性が達成されるGAG用の結合モチーフである。PYY及びNPYのようなペプチドはニューロペプチド及びホルモンであり、これらは組織からかなり迅速に洗い流され、長期持続局所活性に最適化されていない。GAG結合モチーフを本発明に従うY4選択性アゴニスト又は古典的な公知ペプチドアゴニストPYY3-36に付着させることにより、成長因子及びケモカインに類似する二機能性分子が、PP折り畳みペプチド部分のレセプター結合エピトープ及びGAG結合モチーフの両方を有して構築される。
【００７８】
既に上記で論じたように、本発明の好ましい実施形態において、GAG結合モチーフ、例えば上記のようなコンカテマーの24マー配列は、Y4選択性アゴニストのＮ末端伸長として配置される。この配置は、Ｎ末端が切断されたPP折り畳み模擬体アゴニストに関して特に興味深い。本明細書に記載のものはY4選択性であるが、Y4レセプターに関し、天然型のPPと比較して幾分減少した親和性又は効力を示し得る。このような切断型PP折り畳み模擬体アゴニストにとって、コンカテマーのGAG結合モチーフで伸長することは有利であり得る。なぜならば、これは、GAGへの結合に際して、ヘリックス部分の安定化を助け、そのことにより極Ｃ末端のセグメントを正確な様式で提示することを助けることができるαヘリックスを形成するからである。
【００７９】
PP折り畳みペプチドのGAG結合モチーフ−例えば塩基性コンカテマー又はデンドリマー構築物−の導入のための別の適切な位置は、NPYペプチド及びそのアナログのためには14位であり、PYY及びPPペプチド並びにそれらのアナログのためには13位である。しかし、上記のように、GAG結合モチーフを含んでなる残基は、この導入が、タイプ（ａ）及び（ｂ）の本発明に係るアゴニスト中で必要とされるPP折り畳み構造及び必要なＣ末端Y2認識配列の保持と矛盾しないという条件で、当該アゴニスト中の任意の位置で導入することができる。したがって、GAG結合モチーフは、PP折り畳みの部分が非ペプチドスペーサーにより置換されているアナログ中のスペーサー構築物の一部として配置され得る。
【００８０】
PEG化
PEG化において、ポリアルキレンオキシド基は、投与後の身体内での効果半減期を改善するために、ペプチド性又はタンパク質性の薬物に共有結合的にカップリングされる。この用語は、このようなプロセスで使用される好ましいポリアルキレンオキシドに由来する。すなわち、この用語は、エチレングリコール−ポリエチレングリコール、又は「PEG」に由来する。
【００８１】
適切なPEG基は、任意の簡便な化学により、アゴニストに、例えば当該アゴニストの主鎖アミノ酸残基を介して、付着してもよい。例えば、例えばPEGのような分子に関しては、頻繁に使用される付着基は、リジンのε-アミノ基又はＮ末端アミノ基である。その他の付着基としては、遊離カルボン酸基（例えば、Ｃ末端アミノ酸残基又はアスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のもの）、適切に活性化されたカルボニル基、メルカプト基（例えば、システイン残基のもの）、芳香族酸残基（例えば、Phe、Tyr、Trp）、ヒドロキシ基（例えば、Ser、Thr又はOH-Lysのもの）、グアニジン（例えばArg）、イミダゾール（例えばHis）、及び酸化した炭水化物部分が挙げられる。
【００８２】
アゴニストがPEG化されている場合、それは、通常、１〜５のポリエチレングリコール（PEG）分子、例えば、１、２又は３のPEG分子を含んでなる。各PEG分子は、約５kDa（キロダルトン）〜約100kDaの分子量、例えば約10kDa〜約40kDaの分子量、例えば約12kDaの分子量、好ましくは上限約20kDaの分子量を有していてもよい。
【００８３】
適切なPEG分子は、Shearwater Polymers, Inc.及びEnzon, Incから入手可能であり、SS-PEG、NPC-PEG、アルデヒド-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC、SC-PEG、トレシル化mPEG（米国特許第5,880,255号）、又はオキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシイミド-PEG（米国特許第5,122,614号）から選択してもよい。
【００８４】
血清アルブミン、GAG、及びPEG
アゴニストに対する改変が血清結合、GAG結合、又はPEG化を介する改善された安定性を促進するための基の付着である場合、血清アルブミン結合モチーフ又はGAG結合モチーフ、又はPEG基は、PYY又はPPの以下の位置：１位、３位、４位、６位、７位、10位、11位、12位、13位、15位、16位、17位、18位、19位、21位、22位、23位、25位、26位、28位、29位、30位及び32位のいずれかに相当するか又はNPYの以下の位置：１位、３位、４位、６位、７位、10位、11位、12位、14位、15位、16位、17位、18位、19位、21位、22位、23位、25位、26位、28位、29位、30位及び32位のいずれかに相当するアゴニストの主鎖炭素の側鎖であってもよいし、又はその一部を形成していてもよい。
【００８５】
特にアゴニストが（ｂ）タイプである場合、血清アルブミン結合モチーフ又はGAG結合モチーフ、又はPEG基はまた、PYY、NPY又はPPの以下の位置：２位、５位、８位、９位、13位、14位、20位及び24位のいずれかに相当する主鎖炭素の側鎖であってもよいし、又はその一部を形成していてもよい。
【００８６】
より大きな生体分子との接合
上記のように、或るモチーフをPP折り畳みペプチド又はPP折り畳みペプチド模擬体中の種々の位置で、それらの高いＹレセプター親和性を損なうことなく連結することが可能である（実施例参照）。類似する様式で、Y4選択性レセプターアゴニストは、それが例えばアルブミン若しくは別のタンパク質又は有益な薬力学的特性若しくは他の型の特性（例えば、減少した腎排泄のような特性）を提供するキャリア分子と連結されている融合タンパク質として使用し得る。使用することができる多数のタンパク質又はキャリアが存在するように、当該分野で公知の共有結合性付着に使用できる多数の化学的改変及びリンカーが存在する。特に、Y4選択性ペプチドアゴニストのアルブミンへの共有結合性付着は、好ましく、種々のモチーフを伴う改変に関して本明細書中の他で指摘したPP折り畳み構造中の位置の１つである。このような融合タンパク質は、ペプチドを本明細書中に記載のようなペプチド合成により作り、組換え技術により生体分子を作ってもよい種々の半合成技法により製造することができる。融合タンパク質はまた、全体が、例えばGly-Lys-Arg配列（これは、真核細胞で分泌性タンパク質として発現する場合、生合成酵素により切断され、GlyはＣ末端Y4レセプター認識配列のＣ末端Tyr残基上のカルボキシアミドに転換される）により伸長された前駆体分子として発現された組換え分子として作られてもよい。
【００８７】
安定化
本明細書中の種々の箇所で記載したように、本発明のY4選択性アゴニストの多くが、種々の方法、例えばＮ末端アシル化により、又はアゴニスト主鎖の一部を非ペプチド性リンカーで置換することにより、又はPP折り畳み構造を安定化する架橋を内部環化することにより、安定化されている。この安定化は、ほとんどの場合で、２つの目的に働く。一方は、PP折り畳みを保存することによりレセプター認識エピトープをY4レセプターに最適な様式で提示することであり；他方は、分解（すなわち、特にはタンパク質分解性分解）に対してペプチドを安定化することである。これは、Y4選択性アゴニストがまた、上記のような種々のモチーフの付着により、延長された半減期、持続性放出、及び/又は長期持続性組織曝露を得るために改変されている場合に、特に重要である。通常、このペプチドアゴニストは、主に腎臓を通じて、比較的迅速に排泄され、タンパク質安定性自体は重要な問題ではないかもしれない；しかし、種々の体液中のペプチドの存在が、１又はそれ以上の方法で、何時間も延長される場合には、ペプチドの生物学的活性もまた無傷で維持されること、すなわち、一般的に及びY4選択性アゴニストペプチドの具体例に関連して記載されているように、タンパク質分解性攻撃に対して耐性である形態（例えばPP折り畳み安定化環状[Cys2,D-Cys27]PP及びこの種々のアナログ）で安定化されていることが特に重要である。したがって、本発明の好ましい実施形態において、Y4選択性アゴニストは共に、−構造的変化（その幾つかが下記の実施例で具体的に示される）により−構造的に安定化され、これらは、延長されたレセプター曝露が得られるように、種々のモチーフで修飾され、及び/又は生体分子に融合され、及び/又は持続性放出などが得られる医薬様式で調製される。
【００８８】
ヘリックス誘導性ペプチド
本発明に係るアゴニストのＮ末端のアシル化は、アミノペプチダーゼの作用に対してアゴニストを安定化する手段として言及されている。別の安定化する改変として、４〜20アミノ酸残基の安定化性ペプチド配列をＮ末端及び/又はＣ末端、好ましくはＮ末端で共有結合性に付着することが挙げられる。このようなペプチド中のアミノ酸残基は、Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Metなどからなる群より選択される。興味深い実施形態において、Ｎ末端ペプチド付着は、4、５又は６のLys残基、例えばLys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PP又はLys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-[His34]PPを含んでなる。これらは、PP折り畳みペプチドアゴニストのＮ末端で連結することができ、又はこれらは、Ｎ末端が切断されたPP折り畳み模擬体アゴニスト又はＮ末端が短縮化されたPP折り畳み模擬体アゴニストのＮ末端に配置されてもよい（ここで、スペーサペプチドが新たなＮ末端と安定化性ペプチドとの間に導入されている）。このような改変は特に興味深い。なぜならば、Lys残基の連続＜string＞は、上記のように本発明のY2選択性アゴニストペプチドの最後のヘリックスターン及びＣ末端Y2レセプター認識アミノ酸配列のレセプター提示に対して有益であるαへリックス構造を形成し、これを後続の残基に誘導する傾向を有するからである。このような安定化性ペプチド伸長の一般的な記載は、WO 99/46283（Zealand Pharmaceuticals）（本明細書中に参考として援用する）に与えられる。
【００８９】
本発明に係るレセプターアゴニストは、周知の方法、例えば合成法、半合成法及び/又は組換え法のような方法により製造されてもよい。このような方法としては、標準的なペプチド調製技法、例えば、溶液合成、及び固相合成のようなペプチド調製技法が挙げられる。当該分野の教科書及び一般的知識に基づいて、当業者は、本アゴニスト及びその誘導体又は改変体を取得するための手順を理解する。
【００９０】
以下で、本発明に従う具体的アゴニストを、分子薬理学的特性並びにペプチド化学特性及び安定性特性に関して記載する。
【００９１】
N-アセチル-PP（配列番号：30）、N-(N'-ヘキサデカノイル)-γグルタモイル-PP（配列番号：31）、[Nle17]PP（配列番号：32）、[Nle30]PP（配列番号：33）、[Nle17,Nle30]PP（配列番号：34）、[N-(N'-ヘキサデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,Nle30]PP（配列番号：35）、[N-[(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3]-Lys13]PP（配列番号：36）
これらペプチドは、内因性Y4アゴニストPPの有用な変形体又はアナログを例示する。N-アセチル-PP及びN-(N'-ヘキサデカノイル)-γグルタモイル-PPは、アミノペプチダーゼによるタンパク質分解性分解に対する保護を提供するようにαアミノ基で改変されているPPのアナログである。N-(N'-ヘキサデカノイル)-γグルタモイル-PPの場合、N'-ヘキサデカノイル)-γグルタモイルモチーフは、同時に、延長した有効T1/2を確実にする血清アルブミン結合モチーフを構成する。[Nle17]PP、[Nle30]PP、[Nle17,Nle30]PPは、PP2-36中のMet残基が非酸化可能残基（この場合には非天然残基ノルロイシン（Nle））で置換されているアナログを代表する。MetとNleとの間の高い構造的類似性に起因して、この置換は、高いY4レセプター親和性及び選択性を変化させない。[N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13]-PP及び[N-[(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3]-Lys13]PPは、血清アルブミンなどへの結合を得るためにモチーフが付着され、そのことにより延長された有効T1/2及びGAGへの結合が得られ、そのことにより注射部位からの緩慢な放出及び/又は組織における延長した存在に起因して長期持続性の局所Y4レセプター曝露が得られるPPのアナログの代表である。−両方の場合で、当該モチーフは17位に導入したLys残基に付着している。Lys残基−及びこれにより種々のモチーフもまた−が構造において、その部分で該ペプチドがＹレセプターにより認識される該部分から遠く離れて導入されるという事実に起因して、これら改変は、基本ペプチドの高いY4親和性及び選択性に影響しない。本明細書の他の箇所に示したように、別の有用な置換は例えばPEG化であり得る。PPのこれらアナログは、本発明に記載したY1及びY2よりY4に高度に選択性のアゴニストの多くの異なる群の中の１つの群−この場合、基本的なPP構造が（この場合には、種々のモチーフ用の付着部位が導入されていることを除いて）保存されている−のメンバーである。この群から、Y4アゴニストに応答性の疾患（例えば肥満、分泌性下痢、過敏性腸疾患など）の治療について化合物を選択することができる。これらは全て新規化合物である。
【００９２】
PP2-36（配列番号：10）
このペプチドは、残基１がないＮ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列を有するPPアナログを代表するタイプ（ａ）である。PP2-36は、PP1-36と比較して向上した安定性を有する高度Y4選択性レセプターアゴニストである。PPは、２位にProを有するので、通常、DPP-IV分解の基質である。したがって、PPから最初の残基を除去することにより、PP折り畳み構造が損なわれていないペプチドが作り出される。なぜならば、残基１（Ala1）は逆平行ヘリックス（これはPro2により担当される）と相互作用をなさず、PP2-36は、もはや野生型ペプチドのようなDPP-IVの基質ではないからである。重要なことに、Y1レセプターが１位の残基の存在に依存するのに対し、Y4レセプターは１位の残基の存在に依存しない。したがって、PP2-36は、より安定なペプチドでもあり、Y1レセプターに対して向上した選択性窓を有するY4選択性レセプターアゴニストでもある。
【００９３】
レセプター認識プロフィール  −  PP2-36は、Y4レセプターに、PPの親和性（IC50 = 0.41）と類似する親和性（IC50 = 0.64nM）で結合する。Y1レセプター及びY2レセプターに対するPP2-36の親和性は、1000nMより大きい（表１）。PP2-36は、Y4レセプターに対して0.64nMの効力（EC50）でアゴニストとして作用する。この効力もまた、実験の項で記載したトランスフェクトCOS-7細胞で実施したイノシトールリン酸代謝回転アッセイにおいて測定して、PPの効力（EC50 = 0.85nM）に非常に類似している（表２）。PP2-36及びPPは共に、Y2レセプターに関して低効力（すなわちEC50値＞1000nMの）リガンドである。しかし、Y1レセプターに対しては、PP2-36はPPのものより３〜４倍（3-4 fold）低い効力を有する（EC50値は297nM対83nMである）（表２）。したがって、PP2-36は、機能的なインビトロアッセイで決定して、Y1レセプター及びY2レセプターの両方に対し300倍（300 fold）より大きい窓を有する高度Y4選択性アゴニストである。
【００９４】
タンパク質安定性  −  PP2-36は、PP1-36と比較して、より安定で、したがってより良好なバイオ医薬薬剤であるという利点を有する。なぜならば、PP2-36はDPP-IVの基質ではなく−PPは２位でのPro残基の存在に起因して基質である−、PP2-36における新規なＮ末端Pro残基がほとんどの他のアミノペプチダーゼによる分解を防ぐからである。これら安定性特性は、体液中での当該ペプチドの延長された存在が種々の手段（例えばペプチド自体のモチーフ改変）又は種々の形態の薬学的方法（例えば持続性放出製剤）により得られるということに関連して、特に有用である。
【００９５】
急性食物摂取に対するインビボ効果  −  生理食塩水又はPP2-36のいずれかを、８匹のマウスの群に、動物当たり１若しくは10μgの用量で16時間の絶食後に単回皮下注射により投与した。図２に８時間のマウスの累積の食物摂取量を示す。Y4選択性レセプターアゴニストであるPP2-36は、食事の開始後最初の20分間の間、生理食塩水を投与された動物の群により摂取されたものの約50％まで食物摂取を阻害した。食物摂取に対するこの50％抑制効果は、食物摂取が最初の１時間（the first full hour）の間で測定された場合にも、観察された。１μg及び10μgのPP2-36の効果はかなり類似していた。PP2-36の抑制性効果は、単回皮下注射後の８時間の全期間で持続した（図２）。したがって、Y2レセプター及びY1レセプターよりY4レセプターに対して高度に選択性であるPP2-36は、PPについて以前に証明されたように、マウスにおいて食物摂取の効率的な抑制剤である（Asakawaら、1999 Peptides 20: 1445-48；Asakawa 2003 Gastroenterology 124: 1325-36）。PPのこの効果は健常ヒト対象（Batterhamら、2003 Clin.Endocrinol.Metab. 88: 3989-92）でも、中程度に肥満の患者（Berntsonら、1993 Peptides 14: 497-503）においても観察されることが以前に証明されている。
【００９６】
[Nle17]PP2-36（配列番号：37）、[Nle30]PP2-36（配列番号：38）、[N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13]PP2-36（配列番号：39）、[N-[(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3]-Lys13]PP2-36（配列番号：40）
これらペプチドは、タイプ（ａ）PP2-36の高度Y4選択性レセプターアゴニストの有用な変形体又はアナログの例示である。[Nle17]PP2-36及び[Nle30]PP2-36は、PP2-36中のMet残基が非酸化可能残基（この場合、非天然残基ノルロイシン（Nle））で置換されているアナログの代表である。MetとNleとの間の高い構造的類似性に起因して、この置換は、高いY4レセプター親和性及び選択性を変化させない。[N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13]-PP2-36及び[N-[(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3]-Lys13]PP2-36は、血清アルブミンなどへの結合を得るためにモチーフが付着され、そのことにより延長された有効T1/2及びGAGへの結合が得られ、そのことにより注射部位からの緩慢な放出及び/又は組織における延長した存在に起因して長期持続性の局所Y4レセプター曝露が得られるPP2-36のアナログの代表である。−両方の場合で、当該モチーフは17位に導入したLys残基に付着している。Lys残基−及びこれにより種々のモチーフもまた−が構造において、その部分で該ペプチドがＹレセプターにより認識される該部分から遠く離れて導入されるという事実に起因して、これら改変は、基本ペプチドの高いY4親和性及び選択性に影響しない。本明細書の他の箇所に示したように、別の有用な置換は例えばPEG化であり得る。PP2-36のこれらアナログは、本発明に記載したY1及びY2よりY4に高度に選択性のアゴニストの多くの異なる群の中の１つの群のメンバーである。この群から、Y4アゴニストに応答性の疾患（例えば肥満、分泌性下痢、過敏性腸疾患など）の治療について化合物を選択することができる。これらは全て新規化合物である。
【００９７】
[His34]-PP（配列番号：11）、[Leu34]-PP（配列番号：51）、[Ile34]-PP（配列番号：52）、[Phe34]-PP（配列番号：53）
これらペプチドは、Ｃ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列中に置換（これらの好ましい場合は34位（通常はPro残基である）での単一置換）を有するPPアナログである、一群のタイプ（ａ）高度Y4選択性レセプターアゴニストの代表である。この34位置換PPアナログは、本発明に記載したY1及びY2よりY4に高度に選択性のアゴニストの多くの種々の群の１つを構成する。この群から、Y4アゴニストに応答性の疾患（例えば肥満、分泌性下痢、過敏性腸疾患など）の治療について化合物を選択することができる。これらは全て新規化合物である。
【００９８】
レセプター認識プロフィール  −  表１に示したように、[His34]PPで例示される天然Pro34の別の残基での置換は、[His34]PPがY4レセプターに対してPPの親和性（IC50 = 0.41nM）と類似する高親和性（IC50 = 0.48nM）で結合するので、Y4レセプターに対する親和性を損なわない。重要なことに、[His34]PPの親和性は、Y1レセプター及びY2レセプターに対して測定可能でない（IC50 ＞ 1000nM）。したがって、これは、Y1レセプター及びY2レセプターではなく、Y4レセプターに関して高度に選択性であるリガンドである。[His34]-PPはY4レセプターに対して1.2nMの効力（EC50）でアゴニストとして作用する。この効力は、イノシトールリン酸代謝回転アッセイにおいて測定して、PPの効力（EC50 = 0.64nM）に非常に類似している（表２）。PPと同様、[His34]-PPは、Y2レセプターに関して低効力（すなわちEC50値＞1000nM）を示す。しかし、Y1レセプターに対しては、[His34]-PPはPPのものより遥かに低い効力を有する（EC50値は[His34]-PPについて＞1000nMに対しPPについて83nMである）（表２）。したがって、[His34]-PPは、機能的なインビトロで決定して、Y1レセプター及びY2レセプターの両方に対し1000倍（1000 fold）より大きい窓を有する高度Y4選択性アゴニストである。
タンパク質安定性  −  [His34]-PPはPPのものと類似するタンパク質安定性を有する。
【００９９】
[Nle17,His34]-PP（配列番号：41）、[Nle30,His34]-PP（配列番号：42）、
[Nle17,Nle30,His34]-PP（配列番号：43）、[N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,His34]-PP（配列番号：44）、[N-[(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3]-Lys13,His34]PP（配列番号：45）
これらペプチドは、Ｃ末端Y4認識アミノ酸配列中の置換（この場合、34位での）により特徴付けられるタイプ（ａ）の高度Y4選択性レセプターアゴニスト（この特定の場合では[His34]PP）の有用な変形体又はアナログの例示である。[Nle17,His34]-PP、[Nle30,His34]-PP及び[Nle17,Nle30,His34]-PPは、[His34]PP中のMet残基の一方又は両方が非酸化可能残基（この場合、非天然残基ノルロイシン（Nle））で置換されているアナログの代表である。MetとNleとの間の高い構造的類似性に起因して、この置換は、高いY4レセプター親和性及び選択性を変化させない。[N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,His34]-PP及び[N-[(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3]-Lys13,His34]PPは、血清アルブミンなどへの結合を得るためにモチーフが付着され、そのことにより延長された有効T1/2及びGAGへの結合が得られ、そのことにより注射部位からの緩慢な放出及び/又は組織における延長した存在に起因して長期持続性の局所Y4レセプター曝露が得られる[His34]PPのアナログの代表である。−両方の場合で、当該モチーフは17位に導入したLys残基に付着している。Lys残基−及びこれにより種々のモチーフもまた−が構造において、その部分で該ペプチドがＹレセプターにより認識される該部分から遠く離れて導入されるという事実に起因して、これら改変は、基本ペプチドの高いY4親和性及び選択性に影響しない。本明細書の他の箇所に示したように、別の有用な置換は例えばPEG化であり得る。[His34]PPのこれらアナログは、本発明に記載したY1及びY2よりY4に高度に選択性のアゴニストの多くの異なる群の中の１つの群のメンバーである。この群から、Y4アゴニストに応答性の疾患（例えば肥満、分泌性下痢、過敏性腸疾患など）の治療について化合物を選択することができる。これらは全て新規化合物である。
【０１００】
[Ala1,Pro34]-PYY（配列番号：12）、[Ala2,Pro34]-PYY（配列番号：13）、[Glu4,Pro34]-PYY（配列番号：14）、[Ala1,Glu4,Pro34]-PYY（配列番号：25）
これらペプチドは、タイプ（ａ）のY4選択性レセプターアゴニストであり、Ｃ末端Y4レセプターアミノ酸配列がPYYのＣ末端部分におけるPro34置換により導入され、Y1レセプターに対向する選択性がＮ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列における置換により増大されている（すなわちTyrからAla1への置換、ProからAla2への置換又はLysからGlu4への置換のいずれか）PYYアナログの代表である。[Ala1,Glu4,Pro34]-PYYでは、２つの置換がＮ末端セグメントになされている。[DesTyr1,Pro34]-PYYは、Y1レセプターに対向するペプチドの選択性がまた増大されている別のペプチドである。[Pro34]PYYのこれらアナログは、本発明に記載したY1及びY2よりY4に高度に選択性のアゴニストの多くの異なる群の中の１つの群のメンバーである。この群から、Y4アゴニストに応答性の疾患（例えば肥満、分泌性下痢、過敏性腸疾患など）の治療について化合物を選択することができる。これらは全て新規化合物である。
【０１０１】
レセプター認識プロフィール  −  例として、[Ala1,Pro34]-PYYは、Y2レセプター（IC50 ＞ 1000nM）及びY1レセプター（IC50 = 176nM）とは対照的に、Y4レセプターと高い親和性（IC50 = 4.4nM）で結合する（表１）。したがって、PYYにおけるAla1及びPro34置換は、Y4レセプターに対する親和性を30nMから4.4nMへ増大させ、Y1レセプターに対する親和性を16nMから176nMへ、Y2レセプターに対する親和性を0.22nMから＞1000nMへ減少させた。例えば[Glu4,Pro34]-PYYに関するレセプター認識プロフィールはかなり類似して、Y4レセプターに対する親和性が2.4nMであり、Y1に対する親和性は99nMである（表１）。
【０１０２】
[Arg26,Pro34]-PYY（配列番号：15）、[Ile28,Pro34]-PYY（配列番号：16）、[Met30,Pro34]-PYY（配列番号：17）
これらペプチドはまた、タイプ（ａ）のY4選択性レセプターアゴニストであり、Ｃ末端Y4レセプターアミノ酸配列がPYYのＣ末端部分におけるPro34置換により導入され、Y1レセプターに対向する選択性がPYY配列のＣ末端セグメントにおける単一置換により増大されている（すなわちHisからArg26への置換、LeuからIle28への置換又はLeuからMet30への置換のいずれか）PYYアナログの代表である。[Pro34]PYYのこれらアナログは、本発明に記載したY1及びY2よりY4に高度に選択性のアゴニストの多くの異なる群の中の１つの群のメンバーである。この群から、Y4アゴニストに応答性の疾患（例えば肥満、分泌性下痢、過敏性腸疾患など）の治療について化合物を選択することができる。これらは全て新規化合物である。
【０１０３】
レセプター認識プロフィール  −  例として、[Arg26,Pro34]-PYYは、Y2レセプター（IC50 = 177nM）及びY1レセプター（IC50 = 15nM）とは対照的に、Y4レセプターと高い親和性（IC50 = 0.43nM）で結合する（表１）。例えば[Ala30,Pro34]-PYYに関するレセプター認識プロフィールはかなり類似するが、Y4レセプターに対する親和性が0.99nMであり、Y1レセプターに対しては173nMであり、Y2レセプターに対して＞1000nMであるので、Y1レセプターに対する尚更により大きな選択性窓を有している。３番目の例[Met30,Pro34]PYYに対応するデータは表１に示す。
【０１０４】
[Cys2,D-Cys27]PP（配列番号：４）
このペプチドは、レセプター選択性及び高安定性の両方について設計されたタイプ（ｂ）高度Y4選択性アゴニストの代表である。[Cys2,D-Cys27]PPは、PP折り畳み構造を安定化するために完全長PP分子においてリンカー（この場合には、分子内ジスルフィド橋架け）がこの特定の場合には２位でProから置換されたCysと27位でTyrから置換されたD-Cysとの間に導入されている一群のY4選択性アゴニストの代表である。[Cys2,D-Cys27]PPはまた、もはや２位にProを有さないので、DPP-IVによる分解に対して保護されている。このペプチドは、Ｎ末端でアセチル化されても活性である（アミノペプチダーゼによるペプチドの分解を更に予防するような改変）。遊離のペプチド及び例えばアセチル化体は共に新規化合物である。
【０１０５】
レセプター認識プロフィール  −  [Cys2,D-Cys27]PPは、Y4レセプターに１桁ナノモルの親和性（IC50 = 8.2nM）で結合する。[Cys2,D-Cys27]PPのY1レセプター及びY2レセプターに対する結合親和性は＞1000nMである（表１）ので、これはY4レセプターに関して高度に選択性である。[Cys2,D-Cys27]PPは、Y4レセプターに対し、トランスフェクトCOS-7細胞で実施したイノシトールリン酸代謝回転アッセイにおいて測定して、PPの効力（EC50 = 0.64nM）より僅かに７倍（7-fold）低い4.6nM（EC50）の効力を有するアゴニストとして作用する（表２）。[Cys2,D-Cys27]PPはY2レセプターに関して低効力（すなわち、EC50値 ＞ 1000nM）のリガンドである。重要なことには、PPとは対照的に、[Cys2,D-Cys27]PPの効力はY1レセプターに対して非常に低い。すなわち、PPに対するEC50値は83nMであり、[Cys2,D-Cys27]PPに対するEC50値は測定不可能に低い（表２）。したがって、[Cys2,D-Cys27]PPは、Y1レセプター及びY2レセプターの両方に対して向上した選択性窓を有する高度Y4選択性アゴニストである。
【０１０６】
タンパク質安定性  −  [Cys2,D-Cys27]PPは、PPと比較して、より安定で、したがってより良好なバイオ医薬薬剤であるという利点を有する。なぜならば、[Cys2,D-Cys27]PPはDPP-IVの基質ではなく、そのPP折り畳みは分子内ジスルフィド橋架けにより安定化されているからである。これら安定性特性は、体液中での当該ペプチドの延長された存在が種々の手段（例えばペプチド自体のモチーフ改変）又は種々の形態の薬学的方法（例えば持続性放出製剤）により得られるということに関連して、特に有用である。
【０１０７】
[Cys2,N-(N'-テトラデカノイル)-γグルタモイル-Lys13,DCys27]-PP（配列番号：48）
このペプチドは、一群のタイプ（ｂ）高度Y4選択性アゴニストの代表であり、上記のようにレセプター選択性及び分子内リンカーによる高い安定性の両方について設計され、結合モチーフ（この場合、[Cys2,D-Cys27]PP中の導入されたLys13残基に付着した血清アルブミン結合モチーフが例示される）の付着により改変されている。このペプチドは、付着部位の位置に起因して、[Cys2,D-Cys27]PPのものと類似するＹレセプター結合特性を有する。
【０１０８】
[Cys2,Aoc5-24,DCys27]-PP（配列番号：９）
[Cys2,Aoc5-24,D-Cys27]PPは、タイプ（ｂ）のY4選択性アゴニストであり、中央部が切断されたジスルフィド安定化PP模擬体の代表である。これはY4レセプターについて選択性であり、PPに対し、非常により小さく−36残基と比較して僅かに16残基−、安定であるという利点を有する。[Cys2,Aoc5-24,DCys27]-PPは新規化合物である。
レセプター認識プロフィール  −  [Cys2,Aoc5-24,D-Cys27]PPは、Y4レセプターに286nMの親和性で結合し、Y1レセプター及びY2レセプターには測定不可能な親和性を有する（表１）。
【０１０９】
[Lys28,Glu32]PP25-36（配列番号：５）及び[Glu28,Lys32]PP25-36（配列番号：６）
これらは、タイプ（ｂ）のY4選択性レセプターアゴニストであり、分子内ラクタム橋架けにより安定化された環状PPアナログの代表である。これらの場合、PPのIle28（実際のドデカペプチドでは４位）はLys残基又はGlu残基で置換され、Thr32（実際のドデカペプチドでは８位）はGlu残基又はLys残基で置換され、28位及び32位でこれら残基の側鎖中のアミノ基及びカルボキシル基がラクタム化により結合している。これらペプチドは新規化合物である。
【０１１０】
【化６】
2007529463.tif 000008
【０１１１】
これらは、タイプ（ｃ）のY4選択性レセプターアゴニストであり、２つのＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列がこの場合には２つのCys残基間のジスルフィド橋架けにより結合している二量体構築物の代表である。これらは、小さいが高い効力のY4選択性レセプターリガンドであるという利点を有する。これらは新規化合物である。
【０１１２】
レセプター認識プロフィール  −  例として、[CTRPRY-アミド]×２ ホモ二量体（配列番号：18）は、Y4レセプターに29nMの親和性で結合し、Y1レセプター及びY2レセプターには測定不可能な親和性を有する（表１）。一方、より長い[CLTRPRY-アミド]×２ ホモ二量体（配列番号：26）は、Y4レセプターに尚より高い親和性（IC50 = 1.3nM）で結合し、Y1レセプター及びY2レセプターにはこれもまた測定不可能な親和性を有する（表１）。したがって、このタイプ（ｃ）化合物は、高い親和性でのY4結合と低い親和性でのY1レセプター及びY2レセプター結合との間で大きな選択性窓（すなわち、ここに提示された[CLTRPRY-アミド]×２ ホモ二量体の例については1000倍（1000 fold）を超える差）を有する。
【０１１３】
【化７】
2007529463.tif 000009
このペプチドは、２つのＣ末端Y4レセプター認識アミノ酸配列がこの場合には２つのCys残基間のジスルフィド橋架けにより結合しており、「31」位でLeuから置換されたLysに付着した結合モチーフ−この場合、血清アルブミン結合モチーフにより修飾されている二量体構築物である一群のタイプ（ｃ）Y4選択性レセプター化合物の代表である。したがって、基本ペプチドの小さなサイズにもかかわらず、このタイプのY4選択性化合物は腎臓において迅速に除去されず、その結果延長されたT1/2を有する。結合モチーフのための付着部位は、ジスルフィドリンカーに近接して配置されている。この位置で、付着部位は、この「31」位の残基がない上記のより短い[CTRPRY-アミド]×２の高親和性結合で例示されるように、Y4レセプター認識に対して最小の効果を有する。
【０１１４】
臨床適応症
本発明に係るY4特異的アゴニストは、Y4レセプターの活性化に応答性の症状の治療に価値がある。このような症状としては、そのためにエネルギー摂取又はエネルギー代謝の調節が指示される症状が挙げられる。そのような使用のためには、アゴニストは、ペプチダーゼに対する安定性、血清タンパク質結合特性を付与する改変又はモチーフ、血清及び/又は組織の半減期を延長するためのPEG化又はGAG結合モチーフを含んでなるアゴニストであり得る。
【０１１５】
エネルギー摂取又はエネルギー代謝の調節が指示される疾患又は症状としては、肥満及び過体重、並びに肥満及び過体重が主因として考えられる症状、例えば過食症、神経性大食症、Ｘ症候群（Syndrome X）（メタボリック症候群）、糖尿病、２型糖尿病又はインスリン非依存性糖尿病（NIDDM）、高血糖、インスリン抵抗性、グルコース寛容減損、心血管疾患、高血圧、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、心筋梗塞、末梢血管疾患、卒中、血栓塞栓性疾患、高コレステロール血症、高脂血症、胆嚢疾患、変形性関節症、睡眠時無呼吸、生殖障害、例えば多嚢胞性卵巣症候群、或いは胸部、前立腺又は結腸のガンが挙げられる。
【０１１６】
Y4選択性アゴニストはまた、下痢又は腸瘻（intestinal stomia）からの過剰分泌の治療に、及び悪心又は嘔吐の治療に、又は制吐剤若しくは鎮吐剤として、又は悪心及び/又は嘔吐を引き起こし易い薬物との同時治療に価値を有する。
【０１１７】
１．肥満及び過体重
PPが食物摂取の制御に関与し得ることは1970年代に既に示唆されている。最近、PPが、事実、末梢に投与されたときに強力で効率的な摂食抑制性ペプチドであることを非常に明らかに示す多くのげっ歯類研究の証拠が蓄積されている（Asakawaら、Peptides 1999, 20; 1445-8；Katsuuraら、Peptides 2002, 23: 323-9；Asakawaら、Gastroenterology 2003, 124: 1325-36）。PPは、Y4ノックアウト動物において食欲、食物摂取などに対して効果を有しないので、PPがY4レセプターを通じて作用して食欲及び食物摂取を減少させる可能性が非常に高い（Batterhamら、2004 Coimbra（ポルトガル）におけるInternational NPY symposiumの要旨集S3.3）。PPはまた、食餌により誘導された肥満動物において、食物摂取に対する効果を有している。PPレセプターは、特には脳幹において、最後野中及び迷走運動ニューロンで見出されている。ここは、血液脳関門が効率的でない領域であり、PPのような循環しているホルモンがニューロンに接近することが可能である。したがって、脳幹のNTS中のY4レセプターが主要な標的であり、これを通じてPPが食欲及び食物摂取を抑制するように作用する可能性が非常に高い。しかし、最近の証拠は、PPがまた弓状核においてＹレセプターを通じておそらくPOMCニューロンに及び多分NPY/AgRPニューロン上にも作用し得る可能性も指摘している（Batterhamら、Coimbra NPY meeting abstract S3.3）。低レベルのPPが肥満対象、特にプラーダー‐ヴィリ症候群で見出されている（Zipfら、J.C.E.M.1981, 52: 1264-6；Holstら、1983, Int.J.Obes. 7: 529-38；Glaserら、Horm.Metab. 1988, 20: 288-92）。高PPレベルは神経性食欲不振の患者で見出される。重要なことには、ヒトにおけるPPの注入は、24時間までの間、食欲及び食物摂取を減少させる（Batterhamら、JCEM 2003, 88: 3989-92）。したがって、食物摂取に対するPPの効果は、循環中のPPレベルが正常レベルに回復した後に観察された。食欲などに対するこのような長期持続性効果は、他の化合物から、例えばAgRPのICV注射からも周知である。重要なことに、PPの注入は、中程度に肥満したプラーダー‐ヴィリ症候群の患者において食物摂取を減少させることが示されている（Berntsonら、1993 Peptides 14: 497-503）。
【０１１８】
故に、本発明に係るY4選択性アゴニストは、エネルギー摂取を調節するために、対象における、例えばヒトを含む哺乳動物における使用に適切である。したがって、本発明は、エネルギー摂取、食物摂取、食欲、及びエネルギー消費を変化させるための方法に関する。対象に美容上又は治療上の有効量の本アゴニストを投与することによりエネルギー摂取又は食物摂取を減少させる方法が本明細書中に開示される。１つの実施形態では、本レセプターアゴニストの投与は、食物の量、総重量若しくは総体積のいずれか、又はカロリー含量の減少を生じる。別の実施形態では、本レセプターアゴニストの投与は、食物成分の摂取の減少、例えば脂質、炭水化物、コレステロール、又はタンパク質の摂食の減少を生じてもよい。本明細書中に開示されるいずれの方法においても、本明細書中で詳細に議論されている好ましい化合物が投与され得る。更なる実施形態では、治療有効量の本アゴニストを投与することにより食欲を減退させる方法が本明細書に開示される。食欲は当業者に公知の任意の手段により測定することが可能である。
【０１１９】
例えば、減少した食欲は、精神学的評価により評価することができる。このような実施形態では、本レセプターアゴニストの投与は、知覚される空腹、満腹、及び/又は充足の変化を生じる。空腹は、当業者に公知の任意の手段により評価することができる。１つの実施形態では、空腹は、精神学的アッセイを用いて、例えば質問表を使用する空腹感及び感覚認知の評価のようなアッセイにより評価される。
【０１２０】
更なる実施形態では、上部GI間の運動性を減少させるため、例えば胃排出を減少させるための方法が本明細書に開示される。PP（原型のY4アゴニスト）は胃排出を減少させることが知られている。この方法は、治療有効量のY4選択性アゴニストを対象に投与し、そのことによりGI管の運動性を減少させることを含む。胃排出を減少させる化合物は、対象がより充足感又は満足感を感じるので、食物摂取の減少にも有益な効果を有することは周知のことである。
【０１２１】
更なる実施形態では、対象においてエネルギー代謝を変化させる方法が本明細書に開示される。この方法は、治療有効量の本アゴニストを対象に投与し、そのことによりエネルギー消費を変化させることを含む。エネルギーは、全ての生理学的プロセスにおいて燃焼する。身体は、直接、又はそのプロセスの効率を改変することにより、又は起こっているプロセスの数及び性質を変えることにより、エネルギー消費の速度（rate）を変更することができる。例えば、消化の間、身体はエネルギーを消費して食物を腸を通って移動させ、食物を消化し、細胞内では、より多くの又はより少ない熱を生み出すために細胞代謝の効率を変更することができる。更なる実施形態では、食物摂取を変更し、協調的に及び相互的にエネルギー消費を変更する本出願に記載される弓状回路の任意及び全ての操作の方法が本明細書に開示される。エネルギー消費は、細胞代謝、タンパク質合成、代謝率、及びカロリー利用の結果である。したがって、この実施形態では、末梢投与は、増大したエネルギー消費、及びカロリー利用の減少した効率を生じる。１つの実施形態では、治療有効量の本発明に従うレセプターアゴニストが対象に投与され、そのことによりエネルギー消費を増大させる。
【０１２２】
治療的使用及び美容的使用の両方に関連する幾つかの実施形態では、体重制御、及び肥満の処置、減少又は予防のために、詳細には以下：体重増加を予防し及び減少させること；体重損失を誘導し及び促進すること；及びボディ・マス・インデックスにより測定される肥満を減少させることの任意の１つ又はそれ以上のために、Y4選択性アゴニストを使用することが可能である。上記のように、本発明はまた、食欲、満腹及び空腹の任意の１つ又はそれ以上を制御するため、詳細には以下：食欲を減退させ、抑制し、及び阻害すること；満腹及び満腹の感覚を誘導し、増大させ、増強し、及び促進すること；並びに空腹及び空腹の感覚を減少させ、阻害し、及び抑制することの任意の１つ又はそれ以上のための、Y4選択性アゴニストの使用に関する。本開示は更に、所望する体重、所望するボディ・マス・インデックス、所望する外観及び良好な健康状態の任意の１つ又はそれ以上を維持することにおけるY4選択性アゴニストの使用に関する。
【０１２３】
更なる又は代替の観点では、本発明は、減少したエネルギー代謝、摂食障害、食欲障害、過体重、肥満、過食症、神経性大食症、Ｘ症候群（メタボリック症候群）、又はそれらに関連する合併症若しくは危険（糖尿病、２型糖尿病又はインスリン非依存性糖尿病（NIDDM）、高血糖、インスリン抵抗性、グルコース寛容減損、心血管疾患、高血圧、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、卒中、心筋梗塞、血栓塞栓性疾患、高コレステロール血症、高脂血症、胆嚢疾患、変形性関節症、睡眠時無呼吸、生殖障害、例えば多嚢胞性卵巣症候群、胸部、前立腺及び結腸のガンを含む）の治療及び/又は予防のための方法に関し、この方法は、対象、例えばヒトを含む哺乳動物に、有効用量の１又はそれ以上の本明細書中に記載のようなY4選択性アゴニストを投与することを含んでなる。
【０１２４】
２．腸分泌過多
PPは、小腸及び大腸の両方に対して強力な抗分泌性効果を有することが知られており、これは、上皮細胞に位置するY4レセプターにより媒介されているようである（Cox & Tough 2001 Br.J.Pharmacol. 135: 1505-12）。PYY−Y1レセプター及びY2レセプターを活性化する別のPP折り畳みペプチド−の末梢投与が、回腸フィステル形成術を受けたヒト対象において、血管作用性腸ペプチドにより誘導される腸分泌の長期持続性減少を引き起こし得ることがインビボで示されている（Playfordら、1990 Lancet 335: 1555-57）。PYYは下痢に対する治療薬であり得ると結論付けられた。しかし、例えばY1及びY2組合せアゴニスト、NPY及びPYYペプチドのナトリウム排泄増加効果及び高血圧効果はこれを予防した。このような副作用は、本発明のY4選択性レセプターアゴニストには該当しない。したがって、本発明のY4選択性アゴニストは、分泌過多により直接引き起こされるか否かにかかわらず、種々の形態の下痢を含むGI管の分泌過多に対する治療又は保護に特に有用である。なぜならば、胃分泌の抑制は、下痢の原因を除去するか又はその症状を除去するかのいずれかするからである。１つの特に興味深い適応症は、回腸フィステル形成術をうけた患者（この患者はしばしば大量の体液を失いつつある）で観察される分泌過多である。本発明のY4選択性アゴニストは、小腸の回腸造瘻術に関連する過剰分泌に対する治療又は保護に特に有用である。
【０１２５】
３．嘔吐及び悪心
食欲を制御するための薬剤として示唆されている（例えばPYY及びCB1アンタゴニストのような）多くのペプチド及び他のタイプの化合物は、催吐性であることが知られている。例えば、事実、PYYは、イヌに嘔吐を引き起こす腸抽出物における生物学的に活性な物体として1989年に「再」発見された（Harding及びMcDonald、1989 Peptides 10: 21-24）。PYYは同定された最も強力な循環性の催吐性ペプチドであり、この効果は漏れ易い血液脳関門を有すると知られている最後野により媒介されていると結論付けられた。PYY3-36がヒト対象の末梢に投与されたとき嘔吐を引き起こし得ることもまた報告された（2004年６月29日のNastech報道発表）。興味深いことに、類似用量で与えられたPPは、これらのイヌで嘔吐を引き起こさなかった（Harding及びMcDonald 1989）ことが注目された。したがって、脳幹の最後野にも位置するY4レセプターを通じて作用するPPは、嘔吐を引き起こさない。重要なことには、大用量のY2-Y4組合せアゴニストペプチド−これはY2レセプターに関してPYYと類似するインビトロ効力を有する−は、動物、例えばカニクイザル（cyno monkey）に、該動物の嘔吐もGI管副作用の証拠も観察されずに12〜13.000nMの非常に高い血漿レベルに達するように投与することが可能である。この嘔吐の欠如は驚くべきことである。なぜならば、Y2レセプターに対する類似の効力を有するPYY3-36は、確かに、よりずっと低い用量で投与される場合、ヒト及びおそらく動物において嘔吐を引き起こすからである。したがって、驚くべきことに、Y2-Y4組合せ選択性アゴニストは、Y2選択性アゴニストのPYY3-36化合物が引き起こす同じ程度には、嘔吐を引き起こさない。明らかなことは、Y4レセプター活性化−おそらくは最後野における−は、Y2活性化の催吐効果（この場合、Y2レセプターに対して作用する当該化合物によって引き起こされる効果）を防ぐ。したがって、本発明のY4選択性化合物は、嘔吐及び悪心の治療又は保護に特に有用である。これは、別の食欲抑制剤、例えばY2アゴニストタイプ、CB1アンタゴニスト/逆アゴニストタイプの又は嘔吐及び悪心をしばしば引き起こす他のタイプの食欲抑制剤の治療と関連する嘔吐及び悪心である。Y4選択性化合物の食欲抑制効果は、同時に相加的であるか又は相乗的でさえもある可能性が非常に高いことに留意すべきである。したがって、本発明のY4選択性アゴニストを別の食欲抑制剤又は他のタイプの抗肥満薬と同時に投与することにより、２つのゴールが達成される：１）完全に又は部分的に相加的な抗肥満効果が得られるという有益な効果、２）Y4選択性化合物は当該他の抗肥満薬の催吐効果を消失させるか又は減少させるという有益な効果。
【０１２６】
本発明のY4選択性化合物及びPP自体はまた、妊娠に関連する嘔吐及び悪心の治療又は保護に特に有用である。この特別な適応症のためには、Y4選択性化合物が天然のPP折り畳みペプチドに近いアナログであり、一般に無視し得る副作用を有すると期待されることが重要である。特に、これらペプチドが胎盤で母体の循環から胎児の循環中に横断しないという事実が重要である。なぜならば、このことにより胎児は最小限にしか曝露されず、よって発育上の副作用を引き起こす危険が非常に低くなるからである。
本発明のY4選択性化合物及びPP自体はまた、アルコール不耐症に関連する嘔吐及び悪心の治療又は保護に有用である。
【０１２７】
４．過敏性腸疾患
Y4レセプターの天然リガンドであるPPの分泌及び機能は、自律神経系の活性に高い相関を有する（Schwartz 1983, Gastroenterology 85:1411-25）。したがって、例えばPPの血漿レベルの変動は、GI管の運動性及び分泌の変動、並びにホルモン/神経伝達物質モチリンの分泌に密接に相関する。PPは副交感神経系の活性化を通じて、及び中枢神経系の迷走制御中枢（例えば脳幹の迷走運動神経）を通じて働き、それによってGI管への遠心性迷走線維における活性を制御することが知られている。過敏性腸疾患は特に疼痛などを導くGI管の運動性及び機能における機能不全、及び自律神経系を通じてのこの制御における機能不全に関連すると考えられているので、過敏性腸疾患の治療におけるY4選択性アゴニストの使用は、本発明の好ましい実施形態である。
【０１２８】
肥満及び関連疾患の治療又は予防のためのY4アゴニストの投与に関する追加コメント
食事の間、大量のレパートリーの胃腸ホルモン及び神経伝達物質系が、注意深く協調し、逐次的な、重複した様式で活性化される。更に、食物成分は、GIホルモンの分泌及び種々の求心性ニューロン経路の活性のみに影響するわけでなく、これら食物成分は、それらが吸収された後に、種々のホルモン及びCNSの中枢に直接影響もする。したがって、食物摂取及びエネルギー消費の調節は、高度に複雑で多面的なプロセスである。この観点で、或るホルモン、例えばPPが、例えば食事の間に達成される血漿レベルの僅か３〜４倍を生じる様式で投与されたときに、事実、実質的に前記系に影響し得ることは驚くべきことである。
【０１２９】
明白なことに、本化合物−Y4選択性アゴニスト−の投与は、主に、該化合物が絶食状態において記載されるような有効用量で与えられた場合に意図する効果を有する。種々のホルモン及びニューロン系がGI管での食物成分の存在又は食事の期待に起因して活性である状況でY4アゴニストが与えられる場合、効果が見られないか又はより小さな効果が観察される。したがって、本発明の好ましい実施形態では、Y4選択性アゴニストは、絶食状態において、有効用量で皮下、鼻又は本明細書の他の箇所に記載のその他の手段のいずれかにより投与される。本発明に関しては、用語「絶食状態」とは、対象がY2レセプターアゴニストの投与前少なくとも２時間以内、例えば投薬の少なくとも３時間以内、少なくとも４時間以内、少なくとも５時間以内、少なくとも６時間以内、少なくとも７時間以内、少なくとも８時間以内、少なくとも９時間以内、少なくとも10時間以内、少なくとも11時間以内、少なくとも12時間以内に食物も飲料も摂取していないことを意味する。
【０１３０】
人口の或る亜群では、Y4アゴニストは、Y4レセプター遺伝子における遺伝的多様性、例えば多形性に起因して、意図する作用を有しないことがある。これらレセプターにおける機能損失変異は、肥満に関連している可能性が高い。したがって、本発明の好ましい実施形態において、これら遺伝子における多形性/変異について及びそのような多形性の同定について探索するために、処置すべき対象のY4遺伝子の分析が行われる。この様な分析に基づいて、対象の最適な治療をなすことができる。例えば、正常な遺伝子型又はY4アゴニストの機能に影響しない多形性を有する対象のみを、本アゴニストで治療すべきである。別の可能性は、薬物の最適な効果を確実にするために、損傷したレセプターを発現する対象でY4アゴニストの用量を増加させることである。対象の肥満がY4レセプターの機能の損傷により引き起こされている場合、−例えば大用量の−Y4アゴニストでの治療は、例えば異型接合体の患者において、−該当するレセプター機能の少なくとも幾つかが依然として残っているという条件で−代償療法の形態であると主張され得る。
【０１３１】
本発明の１つの実施形態では、慢性治療を開始する前に、Y4アゴニストがこれら化合物が処置すべき対象において意図する効果を有することを確実にするように投与される急性試験を実施してもよい。これら手段により、Y4アゴニストでの治療に感受性である対象のみがこれら化合物で治療されることが確実にされる。
【０１３２】
Y2選択性アゴニスト及び他の薬剤との組合せでのY4選択性アゴニストの使用
出願人の同時係属中の同日出願の国際特許出願は、Y2選択性アゴニスト及び治療におけるその使用を開示している。本願の付録に、その出願に従うY2アゴニストに必要とされる構造的特徴が簡潔にまとめ、Y2選択性アゴニストの具体例を挙げる。下記に簡潔に議論するように、本発明のY4アゴニストは、Y2特異的アゴニストと共に、治療に使用してもよい。
【０１３３】
２つの化合物、それぞれY4選択性アゴニスト及びY2選択性アゴニストでの組合せ治療により、最大の有益な効果を得るために、これら化合物の各々を、自由に、すなわち互いに独立して、投薬することが可能である。換言すれば、例えば、最小限の副作用のみが例えば末梢心血管Y2レセプター又は嘔吐の発生により得られることを高い確率で確実にするために最大用量未満のY2選択性化合物を投与する一方で、同時にY4レセプター経路（より広い治療窓を有する）を通じて全ての対象において非常に強い効果を確実にするために、最大用量の又は最大を超える用量でさえのY4アゴニストを投与することが可能である。Y2レセプター経路のこの同時の−部分的−刺激は、Y4アゴニスト刺激単独より効率的な食欲調節及びエネルギー消費に対する効果を確実にする。例えば、Y2アゴニストは、Y4アゴニストより顕著な胃内容排出に対する効果を有し得る。そして、Y4レセプターの同時刺激は、より低く安全な用量のY2アゴニスト（単独では効率的ではない）の使用を可能にする。
【０１３４】
２つの個々の化合物がY4レセプター及びY2レセプターの組合せ刺激を得るために使用される場合、投与レジメンは、上記のように合わせることができる。したがって、本発明の具体的な実施形態において、Y2アゴニストとY4アゴニストとの組合せは、Y2の用量とY4の用量との比が約0.1:10〜約10:0.1、例えば約0.1:１〜約１:0.1、約0.2:１〜約１:０、約0.3:１〜約１:0.3、約0.4:１〜約１:0.4、又は約0.5:１〜約１:0.5、例えば１:１、１:２、１:３、１:４、１:５、１:６などであるように投与する。上記のように、興味深い実施形態は、最大効果が最小の副作用（あれば）を伴って達成されるようにY2の量とY4の量との間のバランスが調整されている、Y2アゴニストとY4アゴニストとの組合せである。したがって、そのような組合せでのY2アゴニストの濃度は、Y4アゴニストの濃度より小さいと考えられる。このために、上記のような濃度及び比は、それぞれモル濃度及びモル比に関する。
【０１３５】
したがって、本発明の好ましい実施形態において、Y4選択性アゴニストは、肥満の治療のためにY2選択性アゴニストと併せて投与される。
【０１３６】
これら化合物は、同じ投与経路により、又は異なる投与経路により投与することが可能である。投与経路は、原理的には、任意の経路、例えば本明細書に記載のような経路であり得、非経口経路及び局所経路が最も興味深い。したがって、本発明の１つの実施形態において、Y4アゴニスト及びY2アゴニストは共に、例えば局所経路、例えば鼻投与により又は皮下注射により投与され、別の実施形態では、Y4アゴニストは鼻投与により投与され、Y2アゴニストは皮下注射により投与されるか、又はその逆である。投与経路の他の適切な組合せも本発明の範囲内である。
【０１３７】
組合せの治療で使用するY4アゴニスト及びY2アゴニストは、同じ医薬組成物に（例えば、医薬組成物中で混合物で）含有されてもよく、特別の使用指示書を伴って、同時の、逐次の、又は個別化された投与のために別々の医薬組成物で提供されてもよい。したがって、このような組成物は、随意に使用指示書を伴い、Y4アゴニスト及びY2アゴニストが同じ容器又は個別の容器に含まれてなるキットの形態で提供されてもよい。
【０１３８】
本発明のY4特異的アゴニストは、肥満、糖尿病及び関連する疾患の治療において、食欲及びエネルギー消費を標的する種々の他の薬物の使用と組合せてもよい。このような薬物としては、GI管リパーゼインヒビター、神経伝達物質再取込みインヒビター、カンナビノイドレセプターアンタゴニスト及び逆アゴニスト、並びに他のタイプの神経伝達物質−5HTレセプターを含むがこれに限定されない−及び/又はホルモン−GLP-1、MC4、MC3を含むがこれらに限定されない−のレセプターアゴニスト又はアンタゴニストのような薬物が挙げられるが、これらに限定されない。Y4選択性アゴニストは、GI管とCNSとの間の連絡における恒常性調節機構−すなわち、通常、膵臓からの満腹媒介ホルモンPPにより標的されているY4レセプター−を標的しているという事実に起因して、Y4選択性アゴニストでの治療を、食欲及びエネルギー消費の調節における中枢の快楽機構、例えば報酬系の一部である、例えばCB1レセプターを標的する薬物での治療と組み合せることは特に有益である。したがって、肥満及び関連する疾患の治療における、CB1アンタゴニストとの組合せでのY4選択性アゴニストの使用は、本発明の好ましい実施形態である。
【０１３９】
投薬
本発明に従うY4レセプターアゴニストの治療有効量は、用いる具体的アゴニスト、治療すべき対象の年齢、体重及び状態、治療すべき症状又は疾患の重篤度及びタイプ、投与の方式、並びに適用する組成物の強度に依存する。
【０１４０】
例えば、Y4レセプターアゴニストの治療有効量は、約0.01μg/キログラム（kg）体重から約１ｇ/kg体重まで、例えば約１μgから約５mg/kg体重まで、又は約５μgから約１mg/kg体重まで変えることができる。別の実施形態では、本レセプターアゴニストは、対象に0.5〜135ピコモル（pmol）/kg体重、又は約72pmol/kg体重で投与する。
【０１４１】
１つの具体的な、限定的でない例では、約５〜約50nmolが皮下注射として投与され、例えば約２〜約20nmol、又は約1.0nmolが皮下注射として投与される。正確な用量は、使用する具体的化合物（例えば本レセプターアゴニスト）の効力、対象の年齢、体重、性別及び生理学的状態に基づいて、当業者により容易に決定される。アゴニストの用量は、PYY3-36の治療有効用量とモル等価であり得る。
【０１４２】
量は、日々の、１日おきの、週ごとの、１週間おきの、毎月の、又は他の任意の適切な頻度の投与のために、１つの用量又は幾つかの用量に分割することができる。通常、投与は１日に１回又は２回である。
【０１４３】
投与方法
本発明に従うY4レセプターアゴニスト並びに美容組成物又は医薬組成物は、任意の経路（経腸投与（例えば経口投与）又は非経口経路を含む）により投与することができる。具体的実施形態では、非経口経路が好ましく、これには、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、胸骨内の注射及び注入、並びに舌下、経皮、局所、経粘膜（鼻経路を含む）による投与、又は吸入による投与（例えば肺吸入）が挙げられる。具体的な実施形態において、皮下及び/又は鼻の投与経路が好ましい。
【０１４４】
中枢に投与される場合、天然のY4選択性ペプチドPPは、ICV投与されたNPY及びPYYと同様に、摂食行動を引き起こし得る（おそらく、循環しているホルモン又は末梢投与されたペプチド化合物によっては通常到達されない中枢のレセプターの活性化に起因している）。したがって、増大した摂食行動を回避すべき場合には、本発明のY4選択性アゴニストは末梢に投与することが好ましい。
【０１４５】
本レセプターアゴニストは、適切なビヒクル中に分散されたそのもので投与することができ、或いは、適切な医薬組成物又は美容組成物の形態で投与することができる。このような組成物もまた本発明の範囲内である。以下で、適切な医薬組成物を記載する。当業者は、そのような組成物が美容的使用にも適切であり得ることを理解している。或いは、当業者は、適切な美容上許容される賦形剤の使用により医薬組成物を美容組成物に調整する方法を理解している。
【０１４６】
医薬組成物
本発明に従うレセプターアゴニスト（「化合物」とも称する）は、医薬品又は化粧品における使用のためには、通常、具体的化合物又はその誘導体を１又はそれ以上の生理学的又は医薬的に許容される賦形剤と共に含んでなる医薬組成物の形態で提供される。
【０１４７】
本化合物は、哺乳動物、例えば人を含む動物に、任意の簡便な投与経路、例えば経口経路、口腔粘膜経路、鼻経路、眼経路、肺経路、局所経路、経皮経路、膣経路、直腸経路、眼経路、非経口経路（とりわけ、皮下経路、筋肉内経路、及び静脈内経路を含む、上記参照）のような投与経路により、個々の目的に効果的である用量で投与してもよい。当業者は、適切な投与経路を選択する方法を理解している。上記のように、非経口投与経路が好ましい。特定の実施形態では、本レセプターアゴニストは、皮下に及び/又は鼻に投与される。皮下注射が容易に自己投与できることは当該分野で周知である。
【０１４８】
特定の投与経路に適切な組成物は、医療実務者により各患者個人個人について容易に決定される。種々の医薬的に許容されるキャリア及びそれらの製剤は、標準的な製剤専門書、例えばE. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。
【０１４９】
本発明に従う化合物を含んでなる医薬組成物は、固体、半固体、又は流体の組成物の形態であり得る。非経口使用のためには、本組成物は、通常、流体組成物の形態であり、移植のためには半固体の形態か又は固体形態である。
【０１５０】
滅菌溶液又は分散液である流体組成物は、例えば静脈内、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内又は皮下の注射又は注入により利用することができる。本化合物はまた、投与の前又は投与時に、例えば滅菌水、生理食塩水又は他の適切な滅菌注射可能媒体を用いて溶解又は分散され得る滅菌固体組成物として製造されてもよい。
【０１５１】
流体形態の組成物は、溶液、エマルジョン（ナノエマルジョンを含む）、懸濁液、分散液、リポソーム組成物、混合液、スプレー、又はエアロゾルであり得る（最後の２つのタイプは鼻投与に特に該当する）。
【０１５２】
溶液又は分散液用の適切な媒体は、通常、水又は医薬的に許容される溶媒、例えば油（例えばごま油又はピーナッツ油）のような溶媒又は例えばプロパノール又はイソプロパノールのような有機溶媒をベースにする。本発明に従う組成物は、医薬的に許容される賦形剤、例えばpH調整剤、例えば組成物の等張性を生理学的に許容されるレベルに合わせるための浸透圧的に活性な薬剤、粘性調整剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤、抗酸化剤などを更に含んでなり得る。好ましい媒体は水である。
【０１５３】
鼻投与用の組成物はまた、適切な非刺激性ビヒクル、例えばポリエチレングリコール、グリコフロール（glycofurol）などのようなビヒクル、並びに当業者に周知の吸収増強剤（例えば、Remington's Pharmaceutical Scienceを参照）を含有してもよい。
【０１５４】
非経口投与のためには、１つの実施形態において、本レセプターアゴニストは、一般には、注射可能な単位剤形（溶液、懸濁液、又はエマルジョン）の所望の純度の当該レセプターアゴニストを、医薬的に許容される賦形剤又はキャリア（すなわち、用いる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、組成物の他の成分と適合性であるもの）と混合することにより製剤することができる。
【０１５５】
一般に、製剤は、本レセプターアゴニストを均一に及び親密に液体キャリア又は微細に分割した固体キャリア又はその両者と接触させることにより製造する。次いで、必要であれば、生成物を所望の製剤に成形する。キャリアは、好ましくは非経口キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張性の溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液が挙げられる。非水性ビヒクル、例えば不揮発性油及びエチルオレエート、並びにリポソームもまた本明細書中において有用である。本明細書に記載のペプチドの両親媒性に起因して、適切な形態としては、ミセル状製剤、リポソーム、及び１又はそれ以上の適切な脂質、例えばリン脂質などを含んでなる他のタイプの製剤なども挙げられる。
【０１５６】
好ましくは、これらは、水性キャリア中、例えば、約3.0〜約8.0のpH、好ましくは約3.5〜約7.4のpH、3.5〜6.0のpH、又は3.5〜約５のpHの等張性緩衝溶液中に懸濁する。有用な緩衝液物質としては、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、カルボン酸塩、例えばクエン酸ナトリウム-クエン酸及びリン酸ナトリウム-リン酸、及び酢酸ナトリウム/酢酸緩衝液などが挙げられる。
【０１５７】
本組成物は、より少ない頻度の投与レジメンを得るために、投与後の本レセプターアゴニストが制御又は延長された送達をされるように設計されてもよい。通常、１〜２の日々の投与を含む投薬レジメンが適切であると考えられるが、他の投薬レジメン、例えばより頻繁な投薬レジメン及びより頻度の少ない投薬レジメンもまた本発明の範囲に含まれる。本レセプターアゴニストの延長された送達を達成するためには、投与部位でデポー（これから本レセプターアゴニストが循環系中にゆっくりと放出される）を形成するために例えば脂質又は油を含む適切なビヒクルを用いてもよいし、又はインプラントを使用してもよい。この点に関して適切な組成物としては、その中に本レセプターアゴニストが組み込まれているリポソーム及び生物分解性粒子が挙げられる。
【０１５８】
固体組成物が必要とされる状況では、固体組成物は、錠剤、例えば従来型の錠剤、沸とう錠、コーティング錠、融解錠（melt tablet）又は舌下錠、ペレット、散剤、顆粒剤（granules、granulates）、粒子状物質（particulate material）、固体分散剤又は固溶体の形態であってもよい。
【０１５９】
半固体形態の組成物は、チューインガム、軟膏、クリーム、リニメント剤、パスタ剤、ゲル又はヒドロゲルであり得る。
本発明に従う医薬組成物の他の適切な剤形は、膣坐剤（vagitory）、坐剤、プラスター剤、パッチ剤、錠剤、カプセル剤、薬袋剤（sachet）、トローチ剤、デバイスなどであり得る。
剤形は、本化合物を自由に又は制御された様式（例えば錠剤に関しては適切なコーティングによる）で放出するように設計されてもよい。
【０１６０】
本医薬組成物は、治療有効量の本発明に従う化合物を含んでなり得る。
本発明の医薬組成物中の本発明の化合物の含有量は、例えば、医薬組成物の約0.1〜約100％ w/wである。
本医薬組成物は、医薬製剤の当業者に周知の任意の方法により製造され得る。
【０１６１】
医薬組成物において、本化合物は、通常、医薬賦形剤、すなわち治療上不活性な物質又はキャリアと組み合わされる。
キャリアは、所望の剤形及び投与経路に依存して、幅広い種々の形態をとり得る。
医薬的に許容される賦形剤は、例えば、充填剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、流動促進剤（glidant）、溶媒、乳化剤、懸濁剤、安定化剤、増強剤、香料、着色料、pH調整剤、緩染剤、湿潤剤、表面活性剤、防腐剤、抗酸化剤などであり得る。詳細は、薬学ハンドブック、例えばRemington's Pharmaceutical Science又はPharmaceutical Excipient Handbookに見出すことができる。
【実施例】
【０１６２】
以下の実施例は、本発明の幾つかの具体的アゴニストの製造及び活性を記載する。
合成
本発明のペプチド性アゴニストは、自動化ペプチド合成機又は伝統的なベンチ合成のいずれかを用いて、固相ペプチド合成により合成されてもよい。固相支持体は、例えば、クロロトリチル（Cl）樹脂又はWang（OH）樹脂であり得る。これらは共に商業的に容易に入手可能である。これら樹脂の活性基は、N-Fmocアミノ酸のカルボキシル基と容易に反応し、そのことによってポリマーに共有結合的に結合する。樹脂に結合したアミンは、ピペリジンへの曝露により脱保護され得る。次いで、第２のＮ保護アミノ酸が、その樹脂-アミノ酸にカップリングされ得る。所望の配列が得られるまでこれらの工程を繰り返す。合成の最後に、樹脂結合保護ペプチドを脱保護し、トリフルオロ酢酸（TFA）で樹脂から切断し得る。樹脂結合アミノ酸鎖への新たなアミノ酸のカップリングを容易にする試薬の例は：テトラ-メチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HATU）、O-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、O-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TBTU）、1H-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）である。
【０１６３】
固相化学よりむしろ溶液化学によるペプチド合成もまた実現可能である。
例えば上記のようなGAG結合モチーフ又は他のモチーフを導入するための、ペプチド鎖中のアミノ酸の側鎖アミノ基又はカルボキシル基の改変は、反応に関与しない他の反応性側鎖基の選択的な保護及び脱保護という単純なことにすぎない。
【０１６４】
本明細書中で言及したペプチドは、固相合成により、PAL Peg-PS樹脂（アミド樹脂（amide resin Applied Bioscience、Warrington、UK GEN913401）上で、５×試薬過剰でのFmoc化学を使用して製造する。カップリングは、溶媒DMF、HCTUスルーアウト（throughout）により実行した。Fmoc除去は、DMF中の20％ピペリジンで10〜15分間実施した。しかし、これらペプチドは、好都合なことに、種々の他の標準的なペプチド合成法、例えばtBOC化学及び固相状態に代わる溶液化学などにより合成され得る。合成は以下の記載により説明されるが、本発明に係る他のペプチドも同様な方法により製造された：
【０１６５】
[Cys2,D-Cys27]PPの合成
一般に、側基保護は、以下を除いて標準的なFmocであった：
Arg                      = Fmoc Arg(Pbf)-OH
Asn、Gln                 = Fmoc Asn(Trt)-OH
Thr、Ser、Asp、Glu、Tyr  = tButyl
Ala-Ser 22-23            = Fmoc AlaSer 偽プロリン
【０１６６】
[Cys2,D-Cys27]PPの場合、選択的脱保護を得るために以下の特別な保護基を使用した：  Cys 27                   = Fmoc DLys(Trt)-OH
【０１６７】
このペプチドは、固相合成により、PAL Peg-PS樹脂（切断に際して生物学的に重要なカルボキシアミド基を生じる樹脂）上で、５倍モルの試薬過剰でのFmoc化学を使用して合成した。カップリングは、DMFを溶媒として使用するHCTUスルーアウトにより実施した。各カップリング工程後のFmoc除去は、DMF中20％ピペリジンで10〜15分間実施した。カップリングは、定量的ニンヒドリンアッセイにより各工程後に確認した。或る場合には、二重カップリングを実施し得る。
続いて、樹脂を異なるバッチに分割してペプチドを作製した。
【０１６８】
本発明に係るY4選択性アゴニストの製造に使用し得る合成法の更なる説明として、以下のプロトコルを例としてのみ示す：
【０１６９】
[Lys13]PP2-36（配列番号：54）及びそのアナログの合成
以下に、Y4選択性ペプチド[Lys13]PP2-36の合成及びGAG結合モチーフ、血清タンパク質結合モチーフ又はポリエチレングリコール部分のいずれかがLys13のεアミノ基に付着しているアナログの合成を記載する。
【０１７０】
一般に、側基保護は、以下を除いて標準的なFmocである：
Arg                      = Fmoc Arg(Pbf)-OH
Asn、Gln                 = Fmoc Asn(Trt)-OH
Thr、Ser、Asp、Glu、Tyr  = tButyl
Ala-Ser 22-23            = Fmoc AlaSer 偽プロリン
【０１７１】
[Lys13]PP2-36の場合、選択的な脱保護を得るために、以下の特別な保護基を使用した：
Lys 13       = Fmoc Lys(Dde)-OH
【０１７２】
このペプチドは、固相合成により、PAL Peg-PS樹脂（切断に際して生物学的に重要なカルボキシアミド基を生じる樹脂）上で、５倍モルの試薬過剰でのFmoc化学を使用して合成する。カップリングは、DMFを溶媒として使用するHCTUスルーアウトにより実施する。各カップリング工程後のFmoc除去は、DMF中20％ピペリジンで10〜15分間実施する。カップリングは、定量的ニンヒドリンアッセイにより各工程後に確認する。或る場合には、二重カップリングを実施し得る。
【０１７３】
完全長ペプチドの合成後、ペプチドを依然として樹脂に付着させたままで、Lys13のεアミノ基上の保護基を、DMF中２％ヒドラジンでの15〜20分間の処理により選択的に除去する。
続いて、樹脂を異なるバッチに分割して、非誘導体化ペプチド及び３つの異なるモチーフ改変ペプチドを作製する。
【０１７４】
１．[Lys13]PP2-36−「マザーペプチド」−を樹脂から切断し、95％トリフルオロ酢酸：2.5％水：2.5％トリプロピルシランでの２〜３時間の処理により脱保護する。
ペプチドを、逆相HPLC：Vydac 300Åカラム、250mm×10mmカラムにより精製し、20分間にわたって（２ml/分）、30〜80％の緩衝液Ｂの勾配中、（緩衝液Ａ = 水中0.05％TFA；緩衝液Ｂ = 60％MeCN：40％水：0.05％TFA）で溶出させる。OD 215nMを測定し、特定ペプチドを含有する溶出液を集めて凍結乾燥する。
ペプチドの構造を質量分析、アミノ酸分析により、そして望ましい場合にはアミノ酸配列分析によっても確認する。
【０１７５】
２．[N-(8-(8-γグルタモイルアミノ-オクタノイルアミノ)-オクタノイル)-[Lys13]PP2-36（配列番号：55）  −  血清アルブミン結合モチーフを付着するために、ペプチドを依然として樹脂に付着させたままで、保護されたアミノオクタン酸を２回使用し、続いて保護されたγグルタミン酸を使用するペプチド合成によって、保護性Dde基の除去後のLys13の遊離εアミノ基に8-(8-γグルタモイルアミノ-オクタノイルアミノ)-オクタノイル基を連結する。
「マザーペプチド」について上に記載したように、このモチーフ改変ペプチドを樹脂から切断し、脱保護し、そして精製する。
【０１７６】
３．フルオレセイン-[N-[(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3]-[Lys13]PP2-36（配列番号：39）  −  GAG結合モチーフを付着するために、上記で一般的に記載したような標準的なFmoc化学を用いて、Dde基の除去後に、依然として樹脂に付着したペプチド上のLys13の遊離εアミノ基を使用するペプチド合成により段階的にこのモチーフを構築する：このように付着したGAG結合配列はAla-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Alaである。フルオレセインタグ基を付加した。インビトロ及びインビボでの分析目的に、フルオレセインタグ基を5,6異性体として−NHSエステル、10倍過剰を72時間にわたって−最後のGAG結合配列のＮ末端に付加する。
【０１７７】
「マザーペプチド」に関して上で記載したように、GAG結合モチーフ改変ペプチドを樹脂から切断し、脱保護し、そして精製する。
【０１７８】
４．[N-[N'-(21-アミノ-4,7,10,13,16,19-ヘキサオキサヘンエイコサノイル)]-γグルタモイル-[Lys13]PP2-36（配列番号：40）
−  Y4選択性ペプチドにポリエチレングリコール部分を付着するために、樹脂に依然として付着しているペプチドに対して、Dde基の除去後にLys13の遊離εアミノ基を使用するペプチド合成により、保護された21-アミノ-4,7,10,13,16,19-ヘキサオキサヘンエイコサン酸を、続いて保護されたγ-グルタミン酸を結合する。
「マザーペプチド」について上で記載したように、PEG化ペプチドを樹脂から切断し、脱保護し、精製する。
【０１７９】
【表２】
2007529463.tif 000010
【０１８０】
分析HPLC法Ａ
カラム      = Vydac C18 ペプチド-タンパク質カラム、250×4.6mm
緩衝液Ａ    = 0.05％ TFA（水中）
緩衝液Ｂ    = 0.05％ TFA（100％ MeCN中）
勾配        = 20分間で０％Ｂ〜60％Ｂ
流量        = 1.00mL/分
波長        = 215nm
質量分析    = MALDI-TOF（マトリクスとしてゲンチシン酸又は□シアノヒドロキシ桂皮酸）
【０１８１】
分析HPLC法Ｂ
カラム      = Hypersil ODS-2、250×4.6mm
緩衝液Ａ    = 0.1％ TFA（100％ MeCN中）
緩衝液Ｂ    = 0.1％ TFA（100％水中）
勾配        = 25分間で24％Ａ〜35％Ａ
流量        = 1.00mL/分
波長        = 220nm
質量分析  = ESI [ネブライザーガスフロー：1.5L/分；CDL -20.0v；CDL temp：250℃；Block temp：200℃；プローブバイアス：+4.5kv；検出器：1.5kv；T. フロー：0.2mL/分；B. conc：50％ H20/50％ CAN.]
【０１８２】
分析HPLC法Ｃ
カラム      = Vydac C18 218TP54、250×4.6mm
緩衝液Ａ    = 20mLのMeCN及び２mLのTFA（水中）（総容量2000mL）
緩衝液Ｂ    = ２mLのTFA（水中）（総容量2000mL）
勾配        = 27分にわたって25％Ｂ〜75％Ｂ
流量        = 1.00mL/分
波長        = 215nm
注入容量    = 10μL
【０１８３】
生物学的アッセイ及び結果
Ｉ．ペプチド親和性及び効力を決定するためのインビトロアッセイ
ヒトY2レセプター親和性アッセイ
ヒトY2レセプターに対する試験化合物の親和性は、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法を用いてヒトY2レセプターで一過性にトランスフェクトしたCOS-7細胞において、125I-PYY結合を使用する競合結合アッセイで決定する。
トランスフェクションの１日後に、放射性リガンドの５〜８％の結合を目的として、トランスフェクトしたCOS-7細胞を培養プレートにウェル当たり40×103細胞の密度で移す。トランスフェクションの２日後、25pMの125I-PYY（Amersham、Little Chalfont、UK）を用いて競合結合実験を３時間４℃にて行う。結合アッセイは、１mM CaCl2、５mM MgCl2、及び0.1％（w/v）ウシ血清アルブミン並びに100μg/mlバシトラシンを補充した0.5mlの50mM Hepes緩衝液（pH7.4）中で行う。非特異的結合は、１μMの未標識PYYの存在下での結合として決定する。細胞を0.5mlの氷冷緩衝液中で２回洗浄し、0.5〜１mlの溶解緩衝液（３Ｍ酢酸中８Ｍ尿素、２％ NP40）を加え、結合した放射能をガンマカウンターでカウントする。測定は２連（in duplicate）で行う。定常状態の結合は、これら条件下での放射性リガンドで達成される。
標準的な薬理学的データを扱うソフトウェアPrism 3.0（graphPad Sofware、San Diego、USA）を用いてEC50値を算出した。
【０１８４】
ヒトY4レセプター親和性アッセイ
ヒトY4形質転換COS-7細胞を使用し、競合アッセイに125I-PPを使用し、PPを非特異的結合の決定に使用する以外はY2親和性アッセイについてと同様なプロトコル。
【０１８５】
ヒトY1レセプター親和性アッセイ
ヒトY1形質転換COS-7細胞を使用し、ウェルあたり1.5×106細胞の密度で培養プレートに移し、競合アッセイに125I-NPYを使用し、NPYを非特異的結合の決定に使用する以外はY2親和性アッセイについてと同様なプロトコル。
【０１８６】
ヒトY5レセプター親和性アッセイ
ヒトY5形質転換COS-7細胞を使用し、ウェルあたり５×105細胞の密度で培養プレートに移し、競合アッセイに125I-NPYを使用し、NPYを非特異的結合の決定に使用する以外はY2親和性アッセイについてと同様なプロトコル。
【０１８７】
上記親和性アッセイにおいて、NPY、PYY、PYY3-36、PP及び本発明の３つのアゴニストを試験した結果を表１に示す：
【表３】
2007529463.tif 000011
【０１８８】
ヒトY2レセプター効力アッセイ
ヒトY2レセプターに対する試験化合物の効力を、ヒトY2レセプター及び無差別Ｇタンパク質、Y2レセプターがGq経路を通じて共役してイノシトールリン酸代謝回転の増加を導くことを確実にするGqi5で一過性にトランスフェクトしたCOS-7細胞において用量-応答実験を実施することにより決定する。
【０１８９】
ホスファチジルイノシトール代謝回転  −  トランスフェクションの１日後、COS-7細胞を、10％胎仔ウシ血清、２mMグルタミン及び0.01mg/mlゲンタマイシンを補充したウェルあたり１mlの培地中で５μCiの[3H]-myo-inositol（Amersham、PT6-271）と24時間インキュベートする。細胞を、140mM NaCl、５mM KCl、１mM MgSO4、１mM CaCl2、10mMグルコース、0.05％（w/v）ウシ血清を補充した緩衝液（20mM HEPES、pH7.4）中で２回洗浄し；10mM LiClを補充した37℃の0.5ml緩衝液中で30分間インキュベートする。種々の濃度のペプチドで45分間37℃にての刺激後、細胞を10％氷冷過塩素酸で抽出し、続いて氷上で30分間インキュベートする。得られる上清をHEPES緩衝液中のKOHで中和し、生成された[3H]-イノシトールリン酸をBio-Rad AG 1-X8アニオン交換樹脂上で精製し、ベータカウンターでカウントする。測定は２連で行う。EC50値を、標準的な薬理学的データを扱うソフトウェアPrism 3.0（graphPad Sofware、San Diego、USA）を用いて算出した。
【０１９０】
ヒトY4レセプター効力アッセイ
ヒトY4形質転換COS-7細胞を使用する以外はY2効力アッセイと同様なプロトコル。
【０１９１】
ヒトY1レセプター効力アッセイ
ヒトY1形質転換COS-7細胞を使用する以外はY2効力アッセイと同様なプロトコル。
【０１９２】
ヒトY5レセプター効力アッセイ
ヒトY5形質転換COS-7細胞を使用する以外はY2効力アッセイと同様なプロトコル。
【０１９３】
上記効力アッセイにおいて、NPY、PYY、PYY3-36、PP及び本発明の４つのアゴニストを試験した結果を表２に示す：
【表４】
2007529463.tif 000012
【０１９４】
II．タンパク質安定性を決定するためのインビトロアッセイ
多くの本発明のペプチドについての重要な尺度は、タンパク質安定性、特に、例えばPYY3-36と比較して増加した安定性又は完全長PYY及びPPと比較してさえ増加した安定性を有するように設計されているペプチドとして酵素による分解に対する安定性に関するタンパク質安定性である。
【０１９５】
PP折り畳みの安定性  −  これは、例えば記載（O'Hare, M. & Schwartz, T.W. 1990 In Degradation of Bioactive Substances: Physiology and Pathophysiology. J.Henriksen編, CRC Press, Boca Raton, Fl.）されているように比較的可橈性であるループ領域で切断する、エンドペプチダーゼによる分解に対するペプチドの安定性として決定する。モデル酵素として、エンドプロテイナーゼAsp-N（Pierce）を使用する。この酵素はAsp残基のＮ末端で、例えばPP中の残基９と残基10（Asp）との間で切断する。ペプチドを、室温の0.01Ｍ Tris/HCl緩衝液（pH7.5）中で、製造業者により指示されるような有効な用量のエンドペプチダーゼAsp-Nとインキュベートし、24時間にわたって種々の期間後にサンプルを取り出す。サンプルをHPLCにより分析し、ペプチドの徐々の分解を時間とともに追跡する。ペプチドを、安定性について、PYY、PYY13-36及びPPと比較する。
【０１９６】
アミノペプチダーゼに対する安定性  −  これは、エンドペプチダーゼについて上記と同様ではあるが、代わりにアミノペプチダーゼＮ及びジペプチジルペプチダーゼIVを使用して決定する。これらアミノペプチダーゼに対して耐性であるように幾つかのペプチド、例えばPYY2-36、Ｎ末端がアセチル化されたそのペプチド誘導体、及びＮ末端にアルブミン結合部分を有してアルキル化されたそのペプチド誘導体を特別に設計する。ペプチドを、安定性に関して、PYY、PYY3-36及びPPと比較する。
【０１９７】
III．グルコサミノグリカン（GAG）への結合を決定するためのインビトロアッセイ
HiTrapヘパリン-セファロースカラム（Amersham Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden）又はヘパリンHPLCカラム（これらは２mM DTT及び１mM MgEDTAを含有する50mMリン酸ナトリウム（pH7.3）中の０〜0.5Ｍ NaClの50分間の線形勾配で１ml/分の流量にて溶出される）のいずれかを使用して、固定化したヘパリン、すなわち、親和性マトリクスとしてのヘパリンアガロースを使用するインビトロアッセイで、GAGに結合する試験化合物の能力をモニターする。再生のために、カラムを緩衝液Ａ中１Ｍ NaClで51〜55分洗浄した。
【０１９８】
IV．食欲、食物摂取及び体重に対するペプチドの効果を決定するためのインビボ研究
マウスにおける急性食物摂取に対するY4選択性アゴニストの効果
ddy系統のマウス（34〜37ｇ及び８〜９週齢）（Japan SLC、Shizuuoka、Japan）を使用した。マウスを調節された環境（22℃、55％湿度）下、AM７時に点灯する12時間の明暗サイクルで個別に飼育した。食餌及び水は、実験直前以外は自由摂取とした（下記参照）。実験開始の１週間前の間に皮下注射に対してマウスを慣れさせた。実験では各マウスを１回使用した。投与直前に、ペプチドを生理学的食塩水に希釈し、100μL容量で皮下投与した。結果は平均±SEとして表す。分散分析の後にBonferroni検定を使用して群間の差を評価した。
【０１９９】
マウスを、実際の試験の前16時間、水は自由に摂取させるが絶食させ、翌日のAM10時に実験を開始した。標準的な食餌を使用し（CLEA Japan, Inc.、Tokyo、Japan）、投与後、最初に予め測定した食物から食べ残された食物を減算し、こぼれた食物を確認することにより食物摂取を測定した。各群８匹の動物に、生理食塩水、１μgのPP2-36、又は10μgのPP2-36試験化合物のいずれかを投与した。
試験化合物としてPP2-36（配列番号：10）についての結果を図２に示す。
【０２００】
【表５−１】
2007529463.tif 000013
【０２０１】
【表５−２】
2007529463.tif 000014
【０２０２】
【表５−３】
2007529463.tif 000015
【０２０３】
【表５−４】
2007529463.tif 000016
【０２０４】
【表５−５】
2007529463.tif 000017
【０２０５】
【表５−６】
2007529463.tif 000018
【０２０６】
【表５−７】
2007529463.tif 000019
【０２０７】
＜  付録  ＞
本出願人の同時係属中の国際特許出願「治療的介入のためのY2選択性レセプターアゴニスト（Y2 Selective receptor agonists for Therapeutic Interventions）」は、種々の治療処置及び美容処置、例えば肥満及び過体重並びにこれらが主因と考えられる症状の治療のためのY2選択性アゴニストの使用を記載している。
【０２０８】
その出願によるY2レセプターアゴニストは、
（ａ）Ｃ末端Y2レセプター認識アミノ酸配列を有し、及び
NPYのTyr1に相当するチロシン残基を有さず、及び/又は
NPYのPro2に相当するプロリ残基を有さず、及び/又は
NPYのSer3に相当するセリン残基も、アスパラギン残基も、グルタミン残基も、スレオニン残基も、ロイシン残基も、イソロイシン残基も、バリン残基も、メチオニン残基も、トリプトファン残基も、チロシン残基も、フェニルアラニン残基も有さず、
NPYのLys4に相当するリジン残基もアルギニン残基も有さず、及び/又は
NPYのLeu24に対応する位置にロイシン以外の残基を有し、及び/又は
NPYのArg25に対応する位置にアルギニン以外の残基を有し、及び/又は
NPYのHis26に対応する位置にヒスチジン以外の残基を有し、及び/又は
NPYのIle28に対応する位置にイソロイシン以外の残基を有し、及び/又は
NPYのAsn29に対応する位置にアスパラギン以外の残基を有し、及び/又は
NPYのLeu30に対応する位置にロイシン又はメチオニン以外の残基を有する
PYY、NPY、PYY模擬体及びNPY模擬体から選択されるPP折り畳みペプチド又はPP折り畳みペプチド模擬体であるか、又は
【０２０９】
（ｂ）Ｃ末端Y2レセプター認識アミノ酸配列を有し、及び
PPのPro2に対応する位置にプロリンを有さず、及び/又は
PPのILe3に対応する位置にイソロイシンを有さず、及び/又は
PPのGlu4に対応する位置にグルタミン酸を有さない
PP及びPP模擬体から選択されるPP折り畳みペプチド又はPP折り畳みペプチド模擬体であるか、又は
【０２１０】
（ｃ）（ｉ）Ｎ末端で両親媒性アミノ酸配列ドメインに融合したＣ末端Y2レセプター認識アミノ酸配列を含んでなり、該両親媒性アミノ酸配列ドメインは該Y2レセプター認識配列のＮ末端に隣接する少なくとも１つのαヘリックスターンを含んでなり、該ターンは共有結合性分子内連結によりヘリックス形状中に拘束され、（ii）前記アゴニストがNPY又はPYYと類似するＮ末端構造を有する場合には上記（ａ）で挙げた改変の１以上を有し、前記アゴニストがPPと類似するＮ末端構造を有する場合には上記（ｂ）で挙げた改変の１以上を有する。
【０２１１】
一般に、その出願のタイプ（ａ）アゴニストは、Y1レセプターに対する効力を実質的に減少させる改変を有する、NPY若しくはPYYのPP折り畳みアナログ又はNPY若しくはPYYのPP折り畳み模擬体であり、NPYのTyr1に対応する位置にTyr、Trp又はPhe以外の残基を、及び/又はNPYのPro2に対応する位置にPro以外の残基を、及び/又はNPYのSer3に対応する位置にIle、Leu、Val、Phe、Trp、Tyr、Ser、Thr、及びAsn以外の残基を、及び/又はNPYのLys4に対応する位置にリジン又はアルギニン以外の残基を有するものを包含する。このようなアゴニストは、１位にTyr、Trp又はPhe以外の残基が、及び/又は２位にPro以外の残基が、及び/又は３位にIle、Leu、Val、Phe、Trp、Tyr、Ser、Thr、及びAsn以外の残基が、及び/又は４位にリジン又はアルギニン以外の残基が存在することを除いてヒトNPYの配列と同一の配列を有するペプチドを包含する。
【０２１２】
一般に、その出願のタイプ（ｂ）アゴニストは、Y4レセプターに対する効力を実質的に減少させY2レセプターに対する効力を増大させる改変を有する、PPのPP折り畳みアナログ又はPPのPP折り畳み模擬体である。これらは、34位にGln又は構造的に類似する残基を有し、PPのPro2に対応する位置にPro、Tyr、Phe、及びTrp以外の残基を、及び/又はPPのIle3に対応する位置にIle、Leu、Met、及びVal以外の残基を、及び/又はPPのGlu4に対応する位置にGlu又はAsp以外の残基を有するアゴニストを包含する。このタイプの１つのサブセットのアゴニストは、34位にGln残基が、及び/又は２位にPro、Tyr、Phe、及びTrp以外の残基が、及び/又は３位にIle、Leu、Met、及びVal以外の残基が、及び/又は４位にGlu又はAsp以外の残基が存在することを除いてヒトPPの配列と同一の配列を有するペプチドからなる。
【０２１３】
その出願のタイプ（ｃ）アゴニストは、天然型のNPY、PYY、又はPPペプチドに等価物がないか、又は非共有結合性相互作用に相当するか若しくは非共有結合性相互作用を共有結合性連結で置換されたかのいずれかの分子内連結により特徴付けられる。このアゴニストは、ヘリックスターンを拘束する分子内連結が両親媒性ドメイン中のアミノ酸残基からポリプロリンドメインのＮ末端部分の連結点まで伸びることを除いてヒトPYYの配列と同一の配列を有するものを包含する。このような連結は、５位と20位の残基間又は８位と16位の残基間、特に２位と27位の残基間にあり得、例えば27位のD-Cysと２位のCysとの間のジスルフィド連結であり得る。タイプ（ｃ）の別のセットのアゴニストでは、ヘリックスターン拘束性分子内連結は、αヘリックスドメインの最後のヘリックスターンの残基間に伸びる（例えばヘリックスターンのLys残基とGlu残基との間に形成されるラクタム連結）か、又はＣ末端Y2認識アミノ酸配列中の残基とαヘリックスドメインの最後のヘリックスターン中の残基との間に伸びる。
【０２１４】
Y2選択性であるために、その出願に係る３つの全てのタイプのアゴニストは、Ｃ末端Y2レセプター認識アミノ酸配列を有する。その出願のアゴニストに存在するＣ末端Y2レセプター認識アミノ酸配列の１つのセットは、-X-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(=O)NR1R2（式中、Xは塩基性残基でも酸性残基でもなく、R1及びR2は独立して水素又はC1-C6アルキルである）又はThrがHis又はAsnに置換され、及び/又はTyrがTrp又はPheに置換され；及び/又はArgがLysに置換されたその保存的置換変形体により表される。R1及びR2の両方が水素であり得る。１つの特定のＣ末端Y2レセプター認識アミノ酸配列は-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(=O)NH2であり、別のものは-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(=O)NH2である。
【０２１５】
３つ全てのタイプ（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）では、Y2レセプター認識アミノ酸配列を含んでなるＣ末端の配列は、そのＮ末端で、該エピトープのＮ末端に隣接する少なくとも１つのαヘリックスターンを含んでなる両親媒性アミノ酸配列ドメインと融合していてもよく、及び少なくとも２つのアミノ酸のＮ末端アミノ配列。該Ｃ末端及びＮ末端のアミノ酸配列はリンカー基にペプチド結合により結合している。該リンカー基は、任意に１又はそれ以上の二重結合又は三重結合を含有していてもよい、直鎖又は分岐鎖のアルキレン基であり得る。例えば、[Cys2,Aoc5-24,D-Cys27]PYY。
【０２１６】
その出願で言及されるY2選択性アゴニストの具体例は以下である：
PYY2-36
NPY2-36
[D-Ala1]PYY
[D-Ala2]PYY
[Ala28]PYY
[Ala30]PYY
[Ala31]PYY
[Lys4,Gln34]PP
[Cys2,D-Cys27]PYY
[Cys2,D-Cys27]NPY
[Cys2,Ile3,D-Cys27,Val31]NPY
[Cys2,Aoc5-24,D-Cys27]NPY 
[Cys2,Ile3,Aoc5-24,D-Cys27,Val31]NPY
[Lys28,Glu32]PYY25-36
[Glu28,Lys32]PYY25-36
[D-Ala2]PYY2-36
[Lys4,Leu17,Gln34]PP
[Lys4,Leu17,Leu30,Gln34]PP
[Lys4,Nle17,Nle30,Gln34]PP
[Cys2,Ile3,D-Cys27,Leu28,Val31]NPY
[Cys2,Ile3,Nle17,D-Cys27,Nle28,Val31]NPY
[Cys2,Ile3,Aoc5-24,D-Cys27,Val31]NPY
[Cys2,Lys13,D-Cys27]PYY
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】
2007529463.tif 000024
【図２】
2007529463.tif 000025
【国際調査報告】
2007529463.tif 000026
2007529463.tif 000027
2007529463.tif 000028
2007529463.tif 000029
2007529463.tif 000030
2007529463.tif 000031
2007529463.tif 000032