(57)【要約】本発明は、哺乳類のＴＣＴＰ遺伝子またはそれから発現される蛋白質を含む抗高血圧剤スクリーニング用組成物、および前記組成物を用いる抗高血圧剤スクリーニング方法に関する。本発明の組成物に含まれるＴＣＴＰは、ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプの細胞質内抑制剤として作用し、高血圧および心臓肥大症を誘発する。したがって、本発明の組成物およびこれを用いたスクリーニング方法は、抗高血圧剤の探索および開発に有用に使用できる。また、本発明のＴＣＴＰを過多発現する形質転換マウスは、高血圧および心臓肥大症を表現型として示し、高血圧または心臓肥大の治療および改善のために開発された試験対象物質を投与して治療および改善程度を観察することにより、試験対象物質スクリーニングの際に有用に使用できる。
2007521001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類のＴＣＴＰ遺伝子を含むことを特徴とする、抗高血圧剤スクリーニング用組成物。
【請求項２】
前記ＴＣＴＰ遺伝子は、配列番号１の塩基配列構造、または配列番号１の塩基配列に一つ以上の崩壊、欠失、挿入、点、置換、ノンセンス、ミスセンス、多形現象、または再配列突然変異が起こったものの中から選ばれた一つであることを特徴とする、請求項１に記載の抗高血圧剤スクリーニング用組成物。
【請求項３】
哺乳類のＴＣＴＰ蛋白質を含むことを特徴とする、抗高血圧剤スクリーニング用組成物。
【請求項４】
前記ＴＣＴＰ蛋白質は、配列番号２のアミノ酸構造を有し、または配列番号１の塩基配列に一つ以上の崩壊、欠失、挿入、点、置換、ノンセンス、ミスセンス、多形現象、または再配列突然変異が起こった塩基配列の中から選ばれた一つから発現でき、ＴＣＴＰと同等な生理的活性を示すポリペプチド断片であることを特徴とする、請求項３に記載の抗高血圧剤スクリーニング用組成物。
【請求項５】
請求項１または２の組成物を標的物質として用いることを特徴とする、抗高血圧剤スクリーニング方法。
【請求項６】
前記組成物と試験対象物質を接触させた後、それらの間の反応を確認して、前記遺伝子の発現を抑制する活性を示すかを決定する段階からなることを特徴とする、請求項５に記載の抗高血圧剤スクリーニング方法。
【請求項７】
請求項３または４の組成物を標的物質として用いることを特徴とする、抗高血圧剤スクリーニング方法。
【請求項８】
前記組成物と試験対象物質を接触させた後、それらの間の反応を確認して、前記遺伝子の発現を抑制する活性を示すかを決定する段階からなることを特徴とする、請求項７に記載の抗高血圧剤スクリーニング方法。
【請求項９】
ＴＣＴＰ遺伝子または蛋白質と試験対象物質とを反応させた後活性を測定する方法、イーストツーハイブリッド法(yeast two-hybrid)、ＴＣＴＰ蛋白質に結合するファージディスプレイペプチドクローン(phage-displayed peptide clone)の検索、天然物および化学物質ライブラリ(chemical library)などを用いたＨＴＳ(high throughput screening)、ドラッグヒットＨＴＳ(drug hit HTS)、細胞系スクリーニング(cell-based screening)、またはＤＮＡアレイ(DNA array)を用いるスクリーニング法であることを特徴とする、請求項８に記載の抗高血圧剤スクリーニング方法。
【請求項１０】
受精卵段階で哺乳類のＴＣＴＰ遺伝子が導入されるので、体細胞と生殖細胞に哺乳類のＴＣＴＰ遺伝子を含み、これからＴＣＴＰ蛋白質が過多発現されて高血圧および心臓肥大症の表現型を示す形質転換マウス。
【請求項１１】
前記ＴＣＴＰ遺伝子は、配列番号１の塩基配列構造、または配列番号１の塩基配列に一つ以上の崩壊、欠失、挿入、点、置換、ノンセンス、ミスセンス、多形現象、または再配列突然変異が起こったものの中から選ばれた一つであることを特徴とする、請求項１０に記載の形質転換マウス。
【請求項１２】
前記ＴＣＴＰ遺伝子は、サイトメガロウィルスエンハンサー（ＣＭＶ−ＩＥ）、ニワトリベータアクチンプロモーター(chicken beta-actin promoter)およびウサギベータグロビンポリＡテール(rabbit beta-globin poly A-tail)を含有するベクターＤＮＡ内に挿入されたものであることを特徴とする、請求項１１に記載の形質転換マウス。
【請求項１３】
前記形質転換マウスの受精卵は、受託番号ＫＣＴＣ１０６４０ＢＰで寄託されたものであることを特徴とする、請求項１２に記載の形質転換マウス。
【請求項１４】
下記の段階からなるＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスの製造方法：
１）哺乳類のＴＣＴＰ遺伝子を形質転換ベクターに挿入させ形質転換用組み換え遺伝子構造物を製造する第１段階、
２）前記第１段階の組み換え遺伝子構造物をマウスの受精卵の雄性前核に微細注入する第２段階、
３）前記微細注入された受精卵を代理母マウスに移植する第３段階、および
４）ＴＣＴＰ遺伝子がゲノムＤＮＡに挿入され、ＴＣＴＰ蛋白質を発現し、高血圧または心臓肥大症の表現型を示すことを確認することにより、前記代理母マウスの子孫の中からＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスを選別する第４段階。
【請求項１５】
前記ＴＣＴＰ遺伝子は、配列番号１の塩基配列構造、または配列番号１の塩基配列に一つ以上の崩壊、欠失、挿入、点、置換、ノンセンス、ミスセンス、多形現象、または再配列突然変異が起こったものの中から選ばれた一つであることを特徴とする、請求項１４に記載のＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスの製造方法。
【請求項１６】
請求項１０〜１３のうちいずれか１項の形質転換マウスに試験対象物質を投与した後、高血圧および心臓肥大症の症状改善の度合いを観察してスクリーニングすることを特徴とする、抗高血圧剤スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗高血圧剤スクリーニング用組成物およびこれを用いる抗高血圧剤スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＣＴＰ蛋白質(translationally controlled tumor protein)は、論文『J Immunol, 123(2);626-32,(1979)』でＴｈｕｅｓｏｎ等によって最初報告されたように、ＨＲＦ(histamine-releasing factor)の機能を有するものと知られている蛋白質である。前記論文によれば、ＨＲＦは、培養されたヒト単核細胞からヒスタミンを遊離させるための活性を有するものである。
【０００３】
ＨＲＦは、活性化された免疫細胞の生成物であって、好塩基球、肥満細胞と相互作用してヒスタミン遊離を誘発する物質と定義され、その結果、２種類に分類された。一つはヒスタミン遊離の際に細胞表面のＩｇＥを必要とし、もう一つはＩｇＥに非依存的に作用する。この中でも、ＩｇＥ依存的ヒスタミン放出因子(IgE-dependent histamine-releasing factor)は、抗原なしに好塩基球からヒスタミン遊離を促進して、後期アレルギー性炎症反応の発生に重要な役割をするものと考えられている。
【０００４】
ＨＲＦ蛋白質は、マウスでは２１ｋＤａポリペプチドの意味でＰ２１と呼ばわれており、ヒトではＰ２３と知られている。ＨＲＦの発現は、１９８８年に血清によって翻訳レベル(translation level)で調節されること、鉛、銅、カドミウムなどによって転写レベル(transcription level)で調節されることが知られることにより、ＴＣＴＰという名称を持つことになった。
【０００５】
Ｐ２１は、２Ｄ−ＰＡＧＥリファレンスマップ(reference map)であり且つ４．９の等電点(isoelectric point)および２４ｋＤａの分子量を有する酸性ペプチドであることが報告された。その後、ＭａｃＤｏｎａｌｄ等（Science, 269:688-690, 1995）によって、アトピー性患者のリンパ球とアレルギー患者の生体液(biological fluids)からＨＲＦが分離、精製され、そのアミノ末端配列確認(amino-terminal sequencing)によって、この蛋白質が、成長調節蛋白質(growth-related protein)と知られてきたＴＣＴＰと同一の蛋白質であるということが証明された。
【０００６】
ＴＣＴＰは、１９８０年代まで、腫瘍に関連した蛋白質(tumor-specific protein)と知られており、この合成は腫瘍の増殖期(proliferative stage)と関連があるものと考えられてきた。ところが、ＴＣＴＰは、腎臓(kidney)と腎細胞癌(renal cell carcinoma)を除いた全ての正常細胞から発見されるだけでなく、ほぼ全ての種において高い相同性(homology)を示すものと報告された。
したがって、ＴＣＴＰは、細胞内で非常に重要な役割を担い、常時一定の水準に発現されるハウスキーピング蛋白(housekeeping protein)であると考えられるが、その明確な機能については知られていない。
【０００７】
本発明者らは、韓国特許出願番号１０−２００１−００２７８９６に記載されているように、ＴＣＴＰと同一の蛋白質であると知られているＨＲＦがナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプ(Na,K-ATPase pump)のサブユニットの３番目の細胞質ループ(cytoplasmic loop)と相互作用することを明らかにした。
【０００８】
ＴＣＴＰは、ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプの３番目の細胞質部分をエサ(bait)としてマウスの骨格筋ライブラリ(rat skeletal muscle library)に対してイーストツーハイブリッド法(Yeast two-hybrid)を行い得た蛋白質である。その相互作用は、イソ型特異的(isoform specific)ではなく、ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプの５個の細胞質部分の中でもただ３番目の部分のみと相互作用をする。これらの相互作用は、バイアコア分析(biacore assay)、共免疫沈澱法(coimmunoprecipitation)、共焦点顕微鏡(confocal microscope)によって再び確認された。この際、ＴＣＴＰは、ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプの細胞質抑制剤(cytoplasmic repressor)として作用するものと示された。
【０００９】
ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプは、細胞膜に存在し、２つのサブユニット、すなわち１１２ｋＤａサブユニットと５５ｋＤａサブユニットからなる膜蛋白質である。ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプの最も重要な作用は、膜を横切るイオン輸送によって細胞内Ｋ＋イオンの濃度を高く維持し、細胞外でのＮａ＋イオンの濃度を高くすることにより、結果的に細胞内Ｎａ＋とＫ＋イオンの濃度調節をすることである。
【００１０】
また、ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプは、蛋白質−蛋白質間の相互作用の際に信号伝達分子としても作用する。ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプのイオン濃度調節機能を阻害する物質は、グリコシド(glycoside)系統のウアバイン(ouabain)、ジゴキシン(digoxin)、ジギトキシン(digitoxin)などがあるが、これらグリコシド類を長期間服用すると、血管が収縮し、血圧が増強される。これは、ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプの機能低下による細胞内Ｎａ＋およびＣａ２＋濃度の増加がその原因であると考えられる。
【００１１】
これに関連して細胞内にナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプの活性を阻害する内因性ウアバイン様因子(endogenous ouabain-like factor)が存在し、これが高血圧(hypertension)と心臓肥大症(heart hypertrophy)の誘発に寄与するという仮説が提起されてきたが、最近では、ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプが阻害されると、ＥＧＦＲとクロストーク(cross talk)をしてＮＦ−ｋＢを活性化することにより、心臓肥大症を誘発することがあるという実験的証拠も提示されたことがある（Haas, M., Askari, A., and Xie, Z., J. Biol. Chem, 275-27832-27837, 2000）。
【００１２】
したがって、ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプの阻害剤は、結果的に高血圧および心臓肥大症を誘発し、このような阻害剤の活性を抑制することが可能な物質の効果的なスクリーニングは、抗高血圧剤の開発において非常に重要であると予想される。
【００１３】
そこで、本発明者らは、ＴＣＴＰがナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプの活性阻害によって高血圧および心臓肥大症を誘発することを見出し、これを用いた抗高血圧剤スクリーニング用組成物およびスクリーニング方法を開発することにより、本発明の完成に至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、哺乳類のＴＣＴＰ遺伝子またはそれから発現される蛋白質を含む抗高血圧剤スクリーニング用組成物、および前記組成物を用いて抗高血圧剤をスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、哺乳類のＴＣＴＰ遺伝子を含む抗高血圧剤スクリーニング用組成物を提供する。
【００１６】
本発明の組成物に含まれるＴＣＴＰ遺伝子は、ほぼ全ての種の哺乳類細胞から発見される遺伝子であって、配列番号１の塩基配列構造、または配列番号１の塩基配列に一つ以上の崩壊(disruption)、欠失(deletion)、挿入(insertion)、点(point)、置換(substitution)、ノンセンス(nonsense)、ミスセンス(missense)、多形現象(polymorphism)、または再配列突然変異が起こったものの中から選ばれた一つであり得る。
【００１７】
本発明は、哺乳類のＴＣＴＰ蛋白質を含むスクリーニング用組成物を提供する。
【００１８】
本発明の組成物に含まれるＴＣＴＰ蛋白質は、ほぼ全ての種の哺乳類細胞で常時一定の水準に発現されるハウスキーピング蛋白であって、配列番号２のアミノ酸構造を有し、または配列番号１の塩基配列に一つ以上の崩壊、欠失、挿入、点、置換、ノンセンス、ミスセンス、多形現象、または再配列突然変異が起こった塩基配列の中から選ばれた一つから発現でき、ＴＣＴＰと同等な生理的活性を示すポリペプチド断片であり得る。
【００１９】
また、本発明は、前記ＴＣＴＰ遺伝子を含む抗高血圧剤スクリーニング用組成物を標的物質として用いる抗高血圧剤スクリーニング方法を提供する。
【００２０】
本発明は、前記ＴＣＴＰ遺伝子を含む抗高血圧剤スクリーニング用組成物と試験対象物質を接触させた後、それらの間の反応を確認して、前記組成物に含まれる遺伝子の発現を抑制する活性を示すかを決定する段階からなる抗高血圧剤スクリーニング方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、前記ＴＣＴＰ蛋白質を含む抗高血圧剤スクリーニング用組成物を標的物質として用いる抗高血圧剤スクリーニング方法を提供する。
本発明は、前記ＴＣＴＰ蛋白質を含む抗高血圧剤スクリーニング用組成物と試験対象物質を接触させた後、それらの間の反応を確認して、前記組成物に含まれる蛋白質の機能を抑制する活性を示すかを決定する段階からなる抗高血圧剤スクリーニング方法を提供する。
【００２２】
ＴＣＴＰは、ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプの大型細胞質ループと結合する蛋白質であって、ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプの細胞質内抑制剤として作用し（図１）、高血圧および心臓肥大症を誘発する。
【００２３】
ＴＣＴＰが高血圧および心臓肥大症を誘発するメカニズムは、ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプ作用が阻害されると、血管平滑筋筋肉および心臓筋肉の反応度と収縮度、並びに脳の神経伝達物質の分泌に影響を及ぼして高血圧を誘発する現象と関連があるものと見られる。
【００２４】
ＴＣＴＰが過多発現されるように形質転換されたマウスは、正常マウスに比べて顕著な高血圧症状（図５）と心臓肥大症の表現型を示す（図６）。
したがって、本発明では、ＴＣＴＰ遺伝子またはそれから発現される蛋白質を含む本発明の組成物を標的物質として用いて抗高血圧剤をスクリーニングする。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法は、前記組成物と試験対象物質とを接触させた後、それらの間の反応を確認して、前記遺伝子の発現を抑制しまたは前記蛋白質の機能を抑制する活性を示すかを決定する段階からなる。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法において、ＴＣＴＰ遺伝子を含む組成物と試験対象物質間の反応確認は、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−蛋白質間の反応有無の確認に用いられる通常の方法を使用することができる。
【００２７】
例えば、生体外で(in vitro)前記遺伝子と試験対象物質間の結合有無を確認するための混成化試験、哺乳類細胞と試験対象物質とを反応させた後、ノーザン分析による前記遺伝子の発現率を測定する方法、または前記遺伝子にレポーター遺伝子を連結させて細胞内に導入した後、試験対象物質と反応させ、レポーター蛋白質の発現率を測定する方法などを使用することができる。
【００２８】
このような場合、本発明の組成物は、ＴＣＴＰ遺伝子の他にも、核酸の構造を安定的に維持させる蒸留水または緩衝液を含むことができる。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法において、ＴＣＴＰ蛋白質を含む組成物と試験対象物質間の反応確認は、蛋白質−蛋白質間の反応有無の確認に用いられる通常の方法を使用することができる。
【００３０】
例えば、ＴＣＴＰ遺伝子または蛋白質と試験対象物質とを反応させた後、活性を測定する方法、イーストツーハイブリッド法(yeast two-hybrid)、ＴＣＴＰ蛋白質に結合するファージディスプレイペプチドクローン(phage-displayed peptide clone)の検索、天然物および化学物質ライブラリ(chemical library)などを用いたＨＴＳ(high throughput screening)、ドラッグヒットＨＴＳ(drug hit HTS)、細胞系スクリーニング(cell-based screening)、またはＤＮＡアレイ(DNA array)を用いるスクリーニング法などを使用することができる。
【００３１】
このような場合、本発明の組成物は、ＴＣＴＰから発現された蛋白質の他にも、蛋白質の構造または生理活性を安定的に維持させる緩衝液または反応液を含むことができる。また、本発明の組成物は、生体内(in vivo)実験のために、前記蛋白質を発現する細胞、または転写率を調節することの可能なプロモーターの下に前記蛋白質を発現するプラスミドを含有する細胞などを含むことができる。
【００３２】
本発明のスクリーニング方法において、試験対象物質は、通常の選定方式によって抗高血圧剤としての可能性を持つものと推定されるかあるいは無作為的に選定された個別的な核酸、蛋白質、その他の抽出物または天然物などであってもよい。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法によって得られた抗高血圧剤候補物質は、以後の抗高血圧剤の開発過程で先導物質(leading compound)として作用し、先導物質に対してＴＣＴＰ遺伝子またはそれから発現される蛋白質の抑制効果を示すことができるようにその構造を変形させて最適化することにより、新しい抗高血圧剤を開発することができる。
【００３４】
こうして得られた物質は、哺乳類のＴＣＴＰ遺伝子またはそれから発現される蛋白質に対して部分的または完全な活性抑制効果を示すので、ＴＣＴＰ遺伝子またはそれから発現される蛋白質による高血圧と心臓肥大症、その他に誘発される疾患を抑制することができる。
【００３５】
したがって、本発明の組成物およびこれを用いるスクリーニング方法は、哺乳類を始めとした病原性細菌に対する抗高血圧剤の探索および開発に有用に使用できる。
【００３６】
また、本発明は、受精卵段階で哺乳類のＴＣＴＰ遺伝子が導入されるので、体細胞と生殖細胞に哺乳類のＴＣＴＰ遺伝子を含み、これからＴＣＴＰ蛋白質が過多発現されて高血圧および心臓肥大症の表現型を示す形質転換マウスを提供する。
【００３７】
本発明の形質転換マウスにおいて、前記ＴＣＴＰ遺伝子は、配列番号１の塩基配列構造、または配列番号１の塩基配列に一つ以上の崩壊、欠失、挿入、点、置換、ノンセンス、ミスセンス、多形現象、または再配列突然変異が起こったもの中から選ばれた一つになり得る。
【００３８】
本発明の形質転換マウスに導入されたＴＣＴＰ遺伝子は、受精卵への注入の際にマウス形質転換ベクターに挿入された状態で注入される。好ましくは、ＴＣＴＰ遺伝子は、サイトメガロウィルスエンハンサー（ＣＭＶ−ＩＥ）、ニワトリベータアクチンプロモーター(chicken beta-actin promoter)およびウサギベータグロビンポリＡテール(rabbit beta-globin poly A-tail)を含有する形質転換ベクターＤＮＡ内に挿入される。
【００３９】
本発明の形質転換マウスを製作するための受精卵は、純血または混血マウスから由来した受精卵を使用することができる。好ましくは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ純血マウスまたはＣ５７ＢＬ／６Ｊ＋ＣＢＡ／Ｎ混血マウスを使用することができる。
【００４０】
本発明のＴＣＴＰを過多発現する形質転換マウスの受精卵は、２００４年５月２１日付けで韓国生命工学研究院の遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ１０６４０ＢＰで寄託された。
【００４１】
また、本発明は、ＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスの製造方法を提供する。
本発明のＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスの製造方法は、１）哺乳類のＴＣＴＰ遺伝子を形質転換ベクターに挿入させて形質転換用組み換え遺伝子構造物を製造する第１段階と、２）前記第１段階の組み換え遺伝子構造物をマウスの受精卵の雄性前核に微細注入する第２段階と、３）前記微細注入された受精卵を代理母マウスに移植する第３段階と、４）ＴＣＴＰ遺伝子がゲノムＤＮＡに挿入され、ＴＣＴＰ蛋白質を発現し、高血圧または心臓肥大症の表現型を示すことを確認することにより、前記代理母マウスの子孫の中からＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスを選別する第４段階とを含んでなる。
【００４２】
前記第１段階において、哺乳類のＴＣＴＰ遺伝子は、配列番号１の塩基配列構造、または配列番号１の塩基配列に一つ以上の崩壊、欠失、挿入、点、置換、ノンセンス、ミスセンス、多形現象、または再配列突然変異が起こったものの中から選ばれた一つを使用することができる。
【００４３】
また、第１段階の形質転換ベクターは、当業界に公知になっているマウスの形質転換用ベクターを使用することができ、ベクター内のプロモーターは、全体組織に発現させるプロモーターまたは組織特異的に発現させるプロモーターを使用することができ、プロモーターを活性化させるエンハンサー(enhancer)、およびターミネーター(terminator)以後のポリＡテールなどを含有する。好ましくは、サイトメガロウィルスエンハンサー（ＣＭＶ−ＩＥ）、ニワトリベータアクチンプロモーター(chicken beta-actin promoter)およびウサギベータグロビンポリＡテール(rabbit beta-globin poly A-tail)を含有するベクターを使用することができる。
【００４４】
哺乳類のＴＣＴＰ遺伝子をマウスの形質転換ベクターに挿入して形質転換用組み換え遺伝子構造物を製作した後、そのＤＮＡ塩基配列を確認し、その後多量生産し、多段階で精製して、微細注入(microinjection)のために適切なＤＮＡ濃度となるように微細注入用溶液に希釈して準備する。
【００４５】
前記第２段階でＴＣＴＰ遺伝子を微細注入する受精卵は、純血または混血マウスから準備する。準備されたマウスの受精卵に極微操作装置(micromanipulator)を用いてマウス受精卵の雄性前核(male pronucleus)に微細注入する。遺伝子が核内に注入されるか否かは、雄性前核の膨張から確認する。このようにＴＣＴＰ遺伝子が微細注入された受精卵は、ＣＯ２培養器で２細胞期まで培養する。
【００４６】
前記第３段階において、前記第２段階の外来遺伝子を微細注入した受精卵を移植するための代理母マウスは、ＩＣＲ系統の雌マウスを精管手術した雄マウスと受精卵採取一日前に交尾させて準備する。その後、前記段階で製造したＴＣＴＰ遺伝子を微細注入した受精卵を代理母の卵管に移植する。
【００４７】
前記第４段階では、受精卵移植の後に代理母マウスから子孫が生まれ、生まれた子孫に挿入されたＴＣＴＰ遺伝子の導入および発現を確認するために、尾からＤＮＡおよび蛋白質を抽出する。ＴＣＴＰ遺伝子がマウスゲノムＤＮＡに挿入され、ＴＣＴＰ蛋白質を発現し、高血圧または心臓肥大症の表現型を示すことを確認することにより、本発明のＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスを選別する。
【００４８】
前記形質転換マウスを製作する方法は、既存公知の様々な方法（Ian Jackson; Catherine M. Abbott; Mouse genetics and transgenics: a practical approach, Oxford; New York: Oxford University Press, 2000）をそのまま適用または変形させて製作することができる。
本発明は、ＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスに試験対象物質を投与した後、高血圧および心臓肥大症の症状改善の度合いを観察してスクリーニングすることを特徴とする、抗高血圧剤スクリーニング方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
以下、実施例で本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲は下記実施例に局限されるものではない。
実施例１：本発明の組成物の抗高血圧剤スクリーニング用途の確認
１）本発明の組成物に含まれるＴＣＴＰ蛋白質のナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプ阻害活性の確認
本発明の組成物に含まれるＴＣＴＰ蛋白質のナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプ阻害活性を確認した。ＴＣＴＰがナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプと相互作用するということは公知になっているので、この相互作用がナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプの活性にどの様な影響を及ぼすかを確認した。
【００５０】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を適正の密度で培養した後、クレブス−リンガー緩衝液(Krebs-Ringer buffer)（ＫＲＰ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４ｍＭ ＣａＣｌ２、２５ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。次いで、細胞を３７℃で１５分間インキュベーションした後、１ｍＭウアバイン(ouabain)を含んだ０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＫＲＰ緩衝液を加えた。
【００５１】
ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプによるＫ＋の移動を測定するために、ウアバインに対して高い感受性を持った８６Ｒｂ＋（０．５Ｃｉ／ｍＬ、ＮＥＮ）をトレーサ(tracer)として用いて５〜１０分間培養し、１０〜２０ｇ／ｍＬのＴＣＴＰを加えた。この際、ＴＣＴＰを加えていない対照群も共に準備して８６Ｒｂ＋移動量、Ｋ＋消費量を測定し、その結果を図１に示した。
【００５２】
図１ａに示すように、ＴＣＴＰは、ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプの活性度を５３．５％まで大幅減少させた。
前記結果を再び確認するために、ナトリウム敏感性染色物質(Na-sensitive dye)を用いてＦＡＣＳ分析を行った。
【００５３】
図１ｂに示すように、ＴＣＴＰは、Ｎａ輸送が円滑に行われる対照群（Ｍｏｃｋ）とは異なり、細胞内Ｎａ＋の濃度を増加させた。
【００５４】
したがって、本発明の組成物に含まれるＴＣＴＰは、ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプのイオン濃度調節活性を抑制し、ナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプに対する細胞質抑制剤であることが分かる。
【００５５】
２）本発明の組成物による高血圧および心臓肥大症誘発の確認
本発明の組成物に含まれるＴＣＴＰを持続的に過多発現する細胞において高血圧と心臓肥大症が誘発することを確認するために、ＴＣＴＰ過多発現形質転換マウス(TCTP transgenic mouse)を製作した。
【００５６】
２−１）ＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスの製作１
本発明のＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ純血(inbred)のマウスで製作された。形質転換マウスの製作過程におけるマウス受精卵の採取、受精卵への遺伝子の微細注入、代理母への受精卵移植などの動物実験は、（株）マクロジェン社に依頼して行った。
【００５７】
ＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスの製作に使用された遺伝子マップは、図２に示した。この遺伝子マップは、ＴＣＴＰが形質転換マウスの全体組織で発現されるように考案された。この時、韓国生命工学研究院の実験動物室で提供したサイトメガロウィルスエンハンサー（ＣＭＶ−ＩＥ）およびニワトリベータアクチンプロモーター(chicken beta-actin promoter)を使用した。
【００５８】
この遺伝子構造物をＣ５７ＢＬ／６Ｎ純血マウスの受精卵に微細注入するために準備する過程は、次のとおりである。
【００５９】
まず、ＴＣＴＰ ｃＤＮＡを、遺伝子組み換え過程によって、サイトメガロウィルスエンハンサーおよびニワトリベータアクチンプロモーターを含有したベクターＤＮＡに入れた後、これをＤＮＡ塩基配列確認方法で最終確認した。
これらのＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ＤＮＡ精製キットを用いて多量回収した後、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩを処理してＤＮＡ断片を作り、これを低融点アガロースゲル(low-melting agarose gel)で電気泳動して、約３Ｋｂｐに相当するエンハンサー、プロモーター、ＴＣＴＰ ｃＤＮＡおよびウサギベータグロビンポリＡテール(rabbit beta-globin poly A-tail)を含有したＤＮＡ断片部分を得た。ＤＮＡ断片を含むゲルを切り出して、高濃度の塩からなる緩衝液（high salt buffer：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で分離した。このように回収したＤＮＡをＥｌｕｔｉｐ−Ｄ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）カラムを用いて最終精製した後、ＤＮＡ濃度を測定して約４〜６ｎｇ／μＬとなるように微細注入用溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で透析して調整した後、ＤＮＡ溶液を５０μＬずつ分注して−２０℃に格納しておいて使用した。
【００６０】
ＴＣＴＰ遺伝子の微細注入は、極微操作装置（micromanipulator: Leitz, Germany）を用いてマウス受精卵の雄性前核に注入して行い、遺伝子が核内に注入されるか否かは、雄性前核の膨張から確認した。
【００６１】
外来遺伝子を微細注入した受精卵を移植するための代理母マウスを準備する過程は、次のとおりである。自然的な状態で発情期を示すＩＣＲ系統の雌性マウスを受精卵採取一日前に交尾をさせるが、この際、使用される雄性マウスは、精管手術を施したマウスであり、少なくとも３日以上交尾をしていない状態の雄性マウスを用いて１：２で交尾させ、翌日の朝、雌性マウスの膣スミア(vaginal smear)を確認して、交尾の行われた(pluged)雌性マウスを代理母として使用した。
【００６２】
ＴＣＴＰ遺伝子が微細注入された受精卵は、ＣＯ２培養器で２細胞期まで培養した後、健康な状態の受精卵を選別して移植した。まず、麻酔剤（Ａｖｅｒｔｉｎ）を代理母に０．５ｍｇ／体重１０ｇの量で腹腔注射して全身麻酔を施した後、仮親マウスの腹壁正中線を約１ｃｍ程度切開し、卵巣、卵管を摘出しそれぞれの卵管に受精卵を移植した後、卵管の膨大部がやや膨れ上がることを確認し、その後腹腔内に再度卵管と卵巣を入れて筋肉層と表皮を縫合した。
代理母から生まれた産子のＴＣＴＰ遺伝子発現有無を確認するために、産子の尾を約０．５ｃｍ程度切り出した後、プロテイナーゼＫ(proteinase K)含有の溶解緩衝液(lysis buffer)を用いてゲノムＤＮＡ(genomic DNA)を抽出し、ＰＣＲを施してＴＣＴＰ遺伝子の生殖系列への伝達(germline transmission)有無を判別した。また、前記マウスの脳、心臓、肝、脾臓、腎臓、肺などの臓器から蛋白質を抽出してウェスタンブロット(Western blotting)を行ってＴＣＴＰ蛋白質の発現も調査した。
【００６３】
その結果、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ純血マウスから、ＴＣＴＰ遺伝子を過多発現することが確認されたＴＣＴＰ形質転換マウスを得、その受精卵を２００４年５月２１日付けで韓国生命工学研究院の遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ１０６４０ＢＰで寄託した。
【００６４】
２−２）ＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスの製作２
本発明のＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ＋ＣＢＡ／Ｎの混血マウスを用いて前記実施例２−１）の方法と同様にして製作した。
混血マウスから製作されたＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスを対象として前記実施例２−１）でのＰＣＲおよびウェスタンブロットを施すことにより、ＴＣＴＰ遺伝子が挿入されたか否かとＴＣＴＰ蛋白質が発現されたか否かを確認した。
【００６５】
その結果、図３の電気泳動写真をみれば、レイン(lane)２は陽性対照群であって、陽性対照群と同じ位置のＰＣＲ産物がレイン６で観察されることにより、レイン６の産子にＴＣＴＰ外来遺伝子が挿入されたことを確認した。
前記マウスの脳、心臓、肝、脾臓、腎臓、肺などの臓器から蛋白質を抽出してウェスタンブロットを行うことにより、形質転換マウスの臓器では全てＴＣＴＰ蛋白質が発現されることを確認した（図４参照）。
【００６６】
２−３）ＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスでの高血圧および心臓肥大症誘発の確認
前記実施例２−２）で製作されたＴＣＴＰ過多発現形質転換混血マウスの雌雄それぞれに対して、テールカフ法による収縮期血圧測定法(SBP measurement by tail-cuff method)およびカテーテルを挿入してマウスの頚動脈収縮期血圧と心臓左心室収縮期血圧を測定する直接法を用いて血圧上昇度を確認し、左心室肥大(left ventricular hypertrophy)の度合いを測定して心臓肥大か否かを確認した。
【００６７】
Ｔ−ＳＢＰ(Tail systolic blood pressure)の測定は、computerized tail-cuff system（BA-98A system, Softron Co）を用いて測定した。１１週齢のマウスから血圧測定を行い 、同じマウスに対して１週間隔で血圧を測定した。この際、週齢別マウスを雌雄の対照群マウスグループと雌雄の形質転換マウスグループよりなる４つのグループに分け、それぞれのグループから少なくとも３匹のマウスを選定して血圧を測定した。
【００６８】
また、生後５〜６週齢の形質転換マウスから９〜１２週齢、１９〜２０週齢のマウス雌雄それぞれで1.4 French high-fidelity micromanometer catheterをマウスの頚動脈に直接挿入して頚動脈での収縮期血圧(carotid systolic blood pressure、Ｃ−ＳＢＰ)を測定し、このカテーテルを心臓左心室まで押し込んで心臓左心室での収縮期血圧(left ventricular systolic pressure、ＬＶＳＰ)を測定した。
【００６９】
左心室肥大(left ventricular hypertrophy)は、生後１９週齢の形質転換マウスの体重（ＢＷ、単位ｇ）に対する左心室重量（ＬＶＷ、単位ｍｇ）の比を測定し、その度合いを確認した。
【００７０】
以上の実験結果は、図５ａ〜図５ｃおよび図６にそれぞれ示した。
【００７１】
図５ａ〜図５ｃはＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスで高血圧症状を確認した図である。ここで、Ｔｇは形質転換マウス、Ｌｍは対照群であって、形質転換されていない同腹子を示し、Ｍは雄、Ｆは雌を意味する。
【００７２】
図５ａ〜図５ｃに示すように、ＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスは、雌雄両方共の尾で測定した収縮期血圧（Ｔ−ＳＢＰ）が対照群に比べて１５ｍｍＨｇ以上上昇して高血圧症状を示した。頚動脈収縮期血圧（Ｃ−ＳＢＰ）および心臓左心室で測定した収縮期血圧（ＬＶＳＰ）もＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスが対照群に比べて１５〜２０ｍｍＨｇ程度上昇した。このような高血圧症状は、生後約６週齢以上のＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスから現われることを確認することができた。
【００７３】
また、図６は本発明の形質転換マウスが生後１９週齢になったとき、左心室肥大を確認した結果図であって、体重（ＢＷ、単位ｇ）に対する左心室重量（ＬＶＷ、単位ｍｇ）の比で表現された。図６において、横軸の１は対照群マウスの雌、２は形質転換マウスの雌、３は対照群マウスの雄、４は形質転換マウスの雄をそれぞれ示す。
【００７４】
図６に示すように、ＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスが対照群に比べて雌雄両方とも心臓肥大症を示すことを確認することができた。
【００７５】
上述したように、本発明の組成物は、高血圧および心臓肥大症を誘発するので、本発明の組成物と反応する物質をスクリーニングすることにより、抗高血圧剤候補物質を開発することができる。
【００７６】
本発明のＴＣＴＰを過多発現する形質転換マウスは、高血圧および心臓肥大症を表現型として示し、高血圧または心臓肥大の治療および改善のために開発された試験対象物質を投与して治療および改善の度合いを観察することにより、試験対象物質スクリーニングの際に有用に使用できる。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の組成物は、高血圧および心臓肥大症を誘発するという効果がある。
したがって、本発明の組成物およびこれを用いたスクリーニング方法は、抗高血圧剤の探索および開発に有用に使用できる。
【００７８】
また、本発明の形質転換マウスは、高血圧および心臓肥大症を表現型として示し、高血圧または心臓肥大の治療および改善のために開発された試験対象物質のスクリーニングの際に有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明のスクリーニング用組成物に含まれるＴＣＴＰのナトリウム／カリウムＡＰＴａｓｅポンプ阻害活性を確認した図である。
【００８０】
【図２】本発明のスクリーニング用組成物に含まれるＴＣＴＰを過多発現する形質転換マウスの製作に必要な遺伝子マップを示す図である。
【００８１】
【図３】ＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスの尾から抽出したゲノムＤＮＡにＴＣＴＰ外来遺伝子が挿入されたことを確認した図である。
【００８２】
【図４】ＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスの臓器でＴＣＴＰ蛋白質の過多発現を確認した図である。
【００８３】
【図５】ＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスで高血圧症状を確認した図であって、図５ａは本発明の形質転換マウスの尾収縮期血圧を測定した図、図５ｂは形質転換マウスの頚動脈収縮期血圧を測定した図、図５ｃは形質転換マウスの左心室収縮期血圧を測定した図である。
【００８４】
【図６】ＴＣＴＰ過多発現形質転換マウスで心臓肥大症の発現を確認した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年2月20日(2006.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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