(57)【要約】  タンパク質又は粒子として発現させる組換えタンパク質の新規な精製  方法をここに記載する。この精製方法では、タンパク質を疎水性相互作用により精製する。このタンパク質の相互作用では、回収率及び純度を１５％から８０％に増大させた。さらに精製されたタンパク質はワクチンや医薬品に適用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス抗原タンパク質や他の治療用組換えタンパク質などを調製及び精製する方法であって、本明細書記載のＨＩＭＡＸと名付けられた新規技術により精製を行い、前記タンパク質を回収することを特徴とする方法。
【請求項２】
大腸菌、酵母などの原核細胞又は真核細胞などのベクターでタンパク質を発現させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
調製及び精製が以下のステップを含むことを特徴とする請求項１又は２記載の方法：
（ａ）界面活性剤の非存在下において、ベクター細胞を溶解して細胞ライセートを得ること、
（ｂ）ステップ(ａ)の細胞ライセートを１，０００〜１０，０００ｇで遠心分離にかけること、
（ｃ）デカンテーションによりステップ（ｂ）からタンパク質を含む固形物を得ること、
（ｄ）前記固形物をｐＨ６〜７．５の緩衝液中で懸濁し、微小な不純物が存在する場合には、本明細書記載の界面活性剤で至適に処理して微小な不純物を可溶化すること、
（ｅ）ＨＩＭＡＸ技術の一部分として、前記タンパク質を、リン酸塩、塩化物及び／又は酢酸塩溶液のいずれかの対イオンを有する濃度０．２〜１０％の二価のイオン性塩を添加することによって捕獲し、不溶性のマトリックスを形成すること、
（ｆ）前記不溶性のマトリックスを遠心分離し、至適にペレットを形成すること、
（ｇ）頻回の脱着プロセスを行い、ｐＨ８．０〜８．５のトリス緩衝液又はＥＤＴＡを含むｐＨ７．０〜８．０のトリス緩衝液のいずれかを使用して、不溶性のマトリックス／ペレットから結合抗原を遊離すること、
（ｈ）最終的に、限外濾過、コロイド状シリカのクロマトグラフィー、疎水性及び／若しくは親和性のクロマトグラフィー、イオン交換、ダイアフィルトレーション、除菌、又はそれらの組合せを介して前記タンパク質を回収すること。
【請求項４】
タンパク質がウイルス抗原であることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
（クロマトグラフィーによる）脱着前に、ウイルス抗原の不活性化が周知の方法によって行なわれることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
タンパク質がウイルス抗原以外であることを特徴とする請求項１〜３記載の方法。
【請求項７】
不活性化のステップが脱着前に回避されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
所望のタンパク質を含むクロマトグラフ上で精製された画分が、ダイアフィルトレーション及び／又は除菌のためにプールされていることを特徴とする請求項１〜７記載の方法。
【請求項９】
二価カチオンが、好ましくは、Ｚｎ、Ｃａ、Ｍｇ又それらの組合せであることを特徴とする請求項１〜８記載の方法。
【請求項１０】
界面活性剤が非イオン性の界面活性剤であることを特徴とする請求項３のステップ（ｄ）記載の方法。
【請求項１１】
界面活性剤が使用されないことを特徴とする請求項３のステップ（ｄ）記載の方法。
【請求項１２】
限外濾過が、分画分子量１００〜３００Ｋの膜フィルターを使用して行なわれることを特徴とする請求項３のステップ（ｈ）記載の方法。
【請求項１３】
イオン交換マトリックスが、硫酸セルロース／ＤＥＡＥマトリックスなどのアニオン交換樹脂から選択されたことを特徴とする請求項３のステップ（ｈ）記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質が、生物活性を損失することなく高度に精製されたことを特徴とする請求項１〜１３記載の方法。
【請求項１５】
核酸フラグメントなどの夾雑物が、タンパク質の調製及び精製の方法に干渉／影響しないことを特徴とする請求項１〜１４記載の方法。
【請求項１６】
ウイルス抗原、組換えタンパク質、バイオ療法タンパク質などが、同時に調製及び精製されることを特徴とする請求項１〜１５いずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原核細胞系又は真核細胞系のいずれかで製造されるウイルス抗原タンパク質及び他の治療用組換えタンパク質の新規な製造並びに精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
原核細胞系及び真核細胞系を使用して多様な治療用タンパク質分子を製造することは、現在のバイオテクノロジーにおいて一般的な方法となっている。このプロセスでは、目的とするタンパク質を、細胞の増殖中に適切に誘導された場合に、発現系の分子遺伝学を適切に用いてプラスミドを組み込み所望のタンパク質の生産を促進させることにより、前記細胞系で発現させる。
【０００３】
また同様に、ウイルスの増殖のために多様な細胞基質を使用してウイルス抗原を製造することは、一般的な実施方法である。このプロセスでは、細胞は増殖して大量となり、そして要求されるウイルスが「感染」してウイルスの増殖を促進する。交互に、トランスフェクト細胞もまた増殖する。ウイルスは、培養上清から又は細胞溶解により回収される。上記両方の場合では、目的のタンパク質を濃縮し、精製し、さらに適切に処理して (不活化若しくは切断)、医薬用製剤又はワクチンを場合によって調製する。
【０００４】
上記プロセスのいずれにおいても、主な課題は以下のとおりである。
ａ）最も経済的な方法での、目的タンパク質又は抗原の回収。
ｂ）製造プロセスで使用した宿主細胞タンパク質、培地成分、他の物質などの混入した物質を取り除くための、目的タンパク質の精製。
ｃ）さらなるプロセスを可能にするための精製したタンパク質の濃縮。
ｄ）精製の様々な段階におけるタンパク質の機能的構造及び活性、並びに回収効率の維持。
ｅ）基準製品の性能と比較して、同等又はより良い性能を示す最終プロセスでの医薬用製品の調製。
【０００５】
上記の目標を達成するために多様なプロセスが適用される。組換え分子は、出芽酵母（Sacharomyces cerevisiae）、ビキア酵母（Pichia pastoris）などの酵母又は大腸菌（E. coli）及び他の生物体において異種タンパク質として、発現させることが可能である。多くのバイオ医薬品、及び、Ｂ型肝炎、インスリン、ストレプトキナーゼ、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモンなどの他のポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術を利用して製造される。製品を得るため、発現したタンパク質は発現宿主の培養物から精製される。同様に、いくつかのウイルスワクチンもまた、異なるタイプの初代又は継代細胞株の培養によって製造される。このようにして増殖したウイルスは、適切に精製され、濃縮され、不活化されるか、又はワクチンの調製用などに使用される。
【０００６】
精製のいくつかのステップでは、清澄、遠心分離、濾過及び限外濾過、硫酸アンモニウム沈澱、シリカビーズの使用、連続遠心分離、レートゾーン（rate zonal）勾配遠心分離、並びに、ゲル浸透、サイズ排除、アフィニティー及びイオン交換のようなクロマトグラフィーの様々な方法などが、一般的に適用される。上記の精製プロセスは、多くのステップ、製品損失、高額の設備や消耗品、及び塩化セシウムなどの時々使用する化学物質の有害性など、いくつかの欠点を有している。さらに、そのいくつかのプロセスでは、「川下加工」のコスト高により生き残れない製品が作られる。
［発明の簡単な説明］
【０００７】
本明細書記載の発明により、大腸菌、酵母、真核細胞などのベクターで組換えタンパク質を発現させ、抽出し、ＨＩＭＡＸテクノロジーを利用して精製する。「ＨＩＭＡＸ」という単語は、本発明者によって造られ、以下に説明するように、この発明のために開発されたテクノロジーにのみ言及する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
１）本発明の第１番目の課題は、ＨＩＭＡＸテクノロジーを利用して、ベクターから組換えタンパク質を調製及び精製する方法を提供することにある。
２）本発明の第２番目の課題は、生物活性を失うことなく高度に精製された組換えタンパク質を調製することにある。
３）本発明の第３番目の課題は、組換えタンパク質の調製中に核酸又は他の夾雑物が存在する場合、その核酸又は他の夾雑物の干渉を無視できるほどの僅少にすることにある。 
４）本発明の第４番目の課題は、多様な組換えタンパク質、ウイルス抗原及びバイオ療法分子の同時濃縮並びに精製の方法を提供することにある。
５）本発明の第５番目の課題は、多大な時間を必要とせずに費用効率の良いタンパク質を精製する方法を提供することにある。
６）本発明の別の実施態様は、細胞ライセート及び細胞液から生存し且つ不活性化されたウイルス抗原を精製する方法を提供することにある。
７）本発明の第７番目の課題は、酢酸塩、リン酸塩及び塩化物などのアニオンと組み合わせて、亜鉛、カルシウム、マグネシウムなどの二価カチオンを使用して組換えタンパク質を精製することにある。
【０００９】
したがって、本発明は、ウイルス抗原タンパク質や他の治療用組換えタンパク質などを製造及び精製する方法であって、本明細書記載のＨＩＭＡＸと名付けられた新規技術により精製を行い、前記タンパク質を回収することを特徴とする方法に関する。
【００１０】
本発明は、さらに以下のステップを含む調製及び精製に関する。
（ａ）界面活性剤の非存在下において、ベクター細胞を溶解して細胞ライセートを得ること、
（ｂ）ステップ(ａ)の前記細胞ライセートを１，０００〜１０，０００ｇで遠心分離にかけること、
（ｃ）デカンテーションによりステップ（ｂ）からタンパク質を含む固形物を得ること、
（ｄ）前記固形物をｐＨ６〜７．５の緩衝液中で懸濁し、微小な不純物が存在する場合には、本明細書記載の界面活性剤で至適に処理して微小な不純物を可溶化すること、
（ｅ）ＨＩＭＡＸテクノロジーの一部分として、前記タンパク質を、リン酸塩、塩化物及び／又は酢酸塩溶液のいずれかの対イオン（counter ions）を有する濃度０．２〜１０％の二価のイオン性塩を添加することによって捕獲し、不溶性のマトリックスを形成すること、
（ｆ）前記不溶性のマトリックスを遠心分離し、至適にペレットを形成すること、
（ｇ）頻回の脱着プロセスを行い、ｐＨ８．０〜８．５のトリス緩衝液又はＥＤＴＡを含むｐＨ７．０〜８．０のトリス緩衝液のいずれかを使用して、不溶性のマトリックス／ペレットから結合抗原を遊離すること、
（ｈ）最終的に、限外濾過、コロイド状シリカのクロマトグラフィー、疎水性及び／若しくは親和性のクロマトグラフィー、イオン交換、ダイアフィルトレーション（diafiltration）、除菌、又はそれらの組合せを介して前記タンパク質を回収すること。
【００１１】
本発明は、さらにジフテリアや破傷風などのトキソイドの調製及び精製に関する。
［発明の詳細な説明］
【００１２】
本発明の詳細を以下に述べる。
ａ）組換え発現方法により又は適当な組織培養における培養物から得られる所望のタンパク質を、細胞溶解、壊死組織片の除去、清澄化などの様々なステップ後に回収する。
ｂ）タンパク質又は抗原の一次捕獲（primary capture）はＨＩＭＡＸメソッドを用いて行なわれる。簡潔に言えば、そのメソッドは、リン酸塩、塩化物又は酢酸塩水溶液のいずれかの対イオンを有する０．２〜１０％の二価のイオン性塩を添加して不溶性マトリックスを形成することに関する。このようにして得られた不溶性マトリックスを、穏やかに遠心分離をかけて結合抗原を分離する。次に、得られたペレットを、ｐＨ８．０〜８．５のトリス緩衝液又はＥＤＴＡを含むｐＨ７．０〜８．０のトリス緩衝液のいずれかで、繰返し脱着する。
ｃ）所望の抗原を含む脱着をさらに行なう。ウイルス抗原の場合は、そのプロセスはクロマトグラフィー（イオン交換）による不活性化である。他の抗原の場合は、高純度のタンパク質を得るための脱着は直接にクロマトグラフィー精製で行なわれる。
ｄ）最終バルク製品を、所望のタンパク質を含んだ、クロマトグラフ上で精製した画分をプールした後に得て、
続いてダイアフィルトレーション（diafiltration）を行うか、
ｅ）又は、除菌を行う。
【００１３】
発明の上記のステップは、組換え及び細胞培養タンパク質に対する以下の実施例においてさらに明瞭に記載した。本明細書に記載された実施例は、単に本発明を詳しく説明するためであり、本発明の範囲を限定することにはならない。本発明の範囲内にあり、明細書の記載に網羅されてはいないが、当業者に可能な様々な選択肢は本発明に包含される。
実施例Ｉ
【００１４】
組換え経路からのＢ型肝炎抗原の製造
発酵後の細胞ライセートを遠心分離し、不溶性画分は界面活性剤で処理する。遠心分離後の上清は、アエロジル（Aerosil）吸着及び脱着（伝統的技術）（表１）を行なうか、又はリン酸塩、塩化物若しくは酢酸塩の存在下、カルシウム、マグネシウム及び亜鉛などの二価カチオンの塩を、０．２〜１０％（Ｗ／Ｖ）で添加して白色の不溶性マトリックスを形成するバッチ操作によるHbsAgの一次捕獲を行なう。マトリックスのin situ形成はさらに抗原と相互作用し、タンパク質捕獲のプロセスはＨＩＭＡＸテクノロジーとして言及される（表２０）。このマトリックスを、７，０００〜１０，０００ｇの遠心分離によって分離し、結合抗原をｐＨ８．５の緩衝液で繰返し脱着した。この脱着を、アニオン交換マトリックスすなわちＤＥＡＥを使用してさらに精製した。
【００１５】
全中間ステップのHbsAg活性を表Ｉ及び表IIに記載する。別のストラテジーでは、細胞ライセートは、リン酸塩、塩化物若しくは酢酸塩の存在下、０．２〜１０％カチオンによって、直接に抗原の一次捕獲が行なわれる。その後のすべてのステップは、前記の方法と同様である。全中間ステップのHbsAg活性を表IIIに記載する。
【００１６】
2007535911.tif 000002
【００１７】
2007535911.tif 000003
【００１８】
2007535911.tif 000004
【００１９】
2007535911.tif 000005
【００２０】
表２と表３の大きな相違は界面活性剤の使用である。表２では、不溶性画分は界面活性剤で処理され、さらに吸着及び脱着により処理が行なわれる。一方、表３に記載した実験では、細胞ライセートは、ＨＩＭＡＸテクノロジーにより直接に吸着及び脱着が行なわれる。
実施例II
【００２１】
細胞培養経路からの狂犬病抗原の製造（図２）
ウイルスの大量培養により、培養上清における狂犬病ウイルスの獲得は促進される。伝統的に、このようにして収穫したウイルスは限外濾過によって濃縮され、次に連続式又はバッチ式のゾーン遠心分離におけるスクロースの勾配超遠心を利用して精製される。本発明では、ＨＩＭＡＸにより培養上清をまず精製し、カルシウム、マグネシウムや亜鉛などの二価カチオンの塩が添加されて最終濃度が８〜１０倍（W/V）となり、白色の不溶性マトリックスを形成するバッチ操作による狂犬病抗原の一次捕獲を行ない、さらに相互作用させる。マトリックスのin situ形成は、さらに抗原と相互作用し、このタンパク質捕獲のプロセスはＨＩＭＡＸテクノロジーとして言及される。このマトリックスは、７，０００〜１０，０００ｇの遠心分離によって分離され、結合抗原をｐＨ７．２のＥＤＴＡ緩衝液で繰返し脱着した。
【００２２】
次に、得られた濃縮抗原を、通常の方法によって不活化し、アニオン交換マトリックス用いてさらに精製して、狂犬病の精製抗原を獲得する。次に、抗原はダイアフィルター（diafiltered）を行ない、ワクチンとして混合する。狂犬病抗原を製造するＨＩＭＡＸ精製の全中間ステップを、表IVに記載する。
【００２３】
2007535911.tif 000006
【００２４】
2007535911.tif 000007
実施例III
【００２５】
細胞培養経路からのＡ型肝炎抗原の製造
ウイルスの大量培養により、細胞結合ウイルスとして培養中のＡ型肝炎ウイルスの獲得は促進される。伝統的に、ウイルスは、清澄し、不活化し、次に連続式又はバッチ式のゾーン遠心分離におけるスクロースの勾配超遠心を利用して精製した細胞ライセートとして収穫される。本発明では、ＨＩＭＡＸにより培養ライセートをまず精製し、カルシウム、マグネシウムや亜鉛などの二価カチオンの塩が添加されて最終濃度が８〜１０倍（W/V）となり、白色の不溶性マトリックスを形成するバッチ操作によるＡ型肝炎抗原の一次捕獲を行ない、さらに相互作用させる。マトリックスのin situ形成は、さらに抗原と相互に作用し、タンパク質捕獲のプロセスはＨＩＭＡＸテクノロジーとして言及される。このマトリックスは、７，０００〜１０，０００ｇの遠心分離によって分離され、結合抗原をｐＨ７．２のＥＤＴＡ緩衝液で繰返し脱着した。
【００２６】
次に、得られた濃縮抗原を、通常の方法によって不活化し、アニオン交換マトリックスを使用してさらに精製して、Ａ型肝炎の精製抗原を獲得する。次に、抗原はダイアフィルター（diafiltered）を行ない、ワクチンとして混合する。Ａ型肝炎抗原を製造するＨＩＭＡＸ精製の全中間ステップを、表Ｖに記載する。
【００２７】
2007535911.tif 000008
【００２８】
2007535911.tif 000009
実施例IV
【００２９】
ジフテリア毒素は、ジフテリア菌培養から得られる精製タンパク質である。
細胞の収穫では、遠心分離又は濾過を行ない、その上清の毒素を、０．６０％ホルマリン添加によりトキソイドに変換する。毒素は、３３℃で６週間インキュベートされ、トキソイドに変換される。解毒は、動物実験によって確認される。伝統的な方法では、トキソイドを濃縮し、硫酸アンモニウムで分画し、透析し、除菌する。活性を凝集試験により測定する。トキソイドの回収率を表VIに記載する。ＨＩＭＡＸテクノロジーによる精製では、トキソイドは、リン酸塩、塩化物若しくは酢酸塩の存在下、亜鉛、カルシウム、マグネシウムなどの二価カチオンの塩を、０．２〜１０％（Ｗ／Ｖ）で添加して白色の不溶性マトリックスを形成するバッチ操作により捕獲される。このマトリックスは、７，０００〜１０，０００ｇの遠心分離によって溶液から分離され、結合抗原を１０〜２００ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ６．８〜７．２のリン酸緩衝液中で可溶化する。精製されたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法により検査する。溶液は限外濾過され、大部分は０．２２ミクロンで除菌される。結果を表VIIに記載する。
【００３０】
2007535911.tif 000010
【００３１】
2007535911.tif 000011
【００３２】
2007535911.tif 000012
実施例Ｖ
【００３３】
破傷風トキソイドは、破傷風菌培養から得られる精製タンパク質である。細胞の収穫では、遠心分離又は濾過を行ない、その上清の毒素を、０．４０％ホルマリン添加によりトキソイドに変換する。毒素は、３５〜３６℃で４週間インキュベートされ、トキソイドに変換される。解毒は、動物実験によって確認される。従来の方法では、トキソイドを濃縮し、硫酸アンモニウムで分画し、透析し、除菌する。活性を凝集試験により測定する。トキソイドの回収率を表VIIIに記載する。ＨＩＭＡＸテクノロジーによる精製では、トキソイドは、リン酸塩、塩化物若しくは酢酸塩の存在下、亜鉛、カルシウム、マグネシウムなどの二価カチオンの塩を、０．２〜１０％（Ｗ／Ｖ）で添加して白色の不溶性マトリックスを形成するバッチ操作により捕獲される。このマトリックスは、７，０００〜１０，０００ｇの遠心分離によって溶液から分離され、結合抗原を１０〜２００ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ６．８〜７．２のリン酸緩衝液中で可溶化する。精製物をＳＤＳ電気泳動法により検査する。溶液は限外濾過され、大部分は０．２２ミクロンで除菌される。結果を表IXに記載する。
【００３４】
2007535911.tif 000013
【００３５】
2007535911.tif 000014
【国際調査報告】
2007535911.tif 000015
2007535911.tif 000016
2007535911.tif 000017
2007535911.tif 000018