(57)【要約】本発明は、一つまたは複数の検体のサンプルにおける、細胞による産生を検出するための方法を提供し、その方法は以下の段階を含む：(a)(i)第一検体に特異的に結合する第一結合タンパク質と(ii)任意で、第二検体に特異的に結合する第二結合タンパク質とを提供し、第一結合タンパク質および任意で第二結合タンパク質が、ウェル内の一つまたは複数の別個の位置にそれぞれ固定される段階；(b)細胞のサンプルをウェルに導入する段階；(c)以下に適した条件下で、細胞のサンプルを培養する段階：(i)前記細胞による検体および任意で第二検体および任意で一つまたは複数のさらなる検体の放出；ならびに(ii)第一検体の第一結合タンパク質への結合および任意で第二検体の第二結合タンパク質への結合；ならびに(d)第一検体が第一結合タンパク質に結合しているかどうか、および第二検体が第二結合タンパク質に結合しているかどうかを判定し、それによって一つまたは複数の検体の細胞のサンプルによる産生を検出する段階。2007535669.tif 000003
2007535669.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つまたは複数の検体のサンプルにおける、細胞による産生を検出するための方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)(i)第一検体に特異的に結合する第一結合タンパク質、および
(ii)任意で、第二検体に特異的に結合する第二結合タンパク質
を提供し、該第一結合タンパク質および任意で該第二結合タンパク質が、ウェル内の一つまたは複数の別個の位置にそれぞれ固定される段階；
(b)細胞のサンプルを該ウェルに導入する段階；
(c)以下に適した条件下で、該細胞のサンプルを培養する段階：
(i)該細胞による該第一検体および任意で該第二検体および任意で該一つまたは複数のさらなる検体の放出；ならびに
(ii)該第一検体の該第一結合タンパク質への結合および任意で該第二検体の該第二結合タンパク質への結合；ならびに
(d)該第一検体が該第一結合タンパク質に結合しているかどうか、および該第二検体が該第二結合タンパク質に結合しているかどうかを判定し、それによって一つまたは複数の検体の細胞のサンプルによる産生を検出する段階。
【請求項２】
段階(a)が、固体表面上の一つまたは複数の別個の位置に固定される一つまたは複数のさらなる検体に特異的に結合する一つまたは複数のさらなる結合タンパク質を提供することをさらに含み；段階(c)において、細胞が、該細胞による該一つまたは複数のさらなる検体の放出、および該一つまたは複数のさらなる検体の該一つまたは複数のさらなる結合タンパク質への結合に適した条件下で培養され；ならびに段階(d)が、該一つまたは複数のさらなる検体が該一つまたは複数のさらなる結合タンパク質に結合しているかどうかを判定することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
別個の位置がスポットである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
スポットがグリッドとして配置される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
第一、第二、およびさらなる結合タンパク質の一つまたは複数が抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
段階(c)において、細胞が、第一検体、第二検体、および/または一つもしくは複数のさらなる検体の産生を誘導するまたは阻害することが可能な第一薬剤の存在下で培養される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
段階(c)において、細胞が、第一、第二、またはさらなる検体の一つまたは複数の検出を高める第二薬剤の存在下で培養される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
第二薬剤が:
(i)第一薬剤に反応した、第一検体、第二検体、および/または一つもしくは複数のさらなる検体の産生を増強する；
(ii)該第一検体、該第二検体、および/または該一つもしくは複数のさらなる検体の産生を抑制するシグナルを阻害する；または
(iii)該第一検体、該第二検体、および/または該一つもしくは複数のさらなる検体の自然な産生を刺激するシグナルを阻害する、
請求項7記載の方法。
【請求項９】
第一薬剤および/または第二薬剤がウェルに固定される、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
第一薬剤および/または第二薬剤が、ウェルの底面上に均一に固定される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
第一薬剤および/または第二薬剤が、ウェル内の一つまたは複数の別個の位置にそれぞれ固定される、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
第一薬剤および/または第二薬剤が溶液中に添加される、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
細胞のサンプルが白血球を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
第一検体、第二検体、および一つもしくは複数のさらなる検体の一つまたは複数がサイトカインである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
細胞のサンプルが、癌細胞、幹細胞、または単離神経細胞を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
細胞のサンプルが、感染物質に曝露されている細胞を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
感染物質がウイルスである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
第一検体、第二検体、および一つもしくは複数のさらなる検体の一つまたは複数が、ウイルス粒子またはタンパク質である、請求項17記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞による一つまたは複数の検体の産生を検出するための方法に関する。本発明は、細胞による一つまたは複数の検体の産生を検出する方法における使用のための新規の製品、その製品を含むキット、その製品およびキットの使用、ならびにその製品を製造するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質レベルで、分泌型サイトカインならびにその他の可溶性物質の検出に対して使用されるアッセイ法には、ELISAおよびELISpotアッセイ法が含まれる。例えば、酵素免疫スポットアッセイ法(enzyme-linked immunospot assay)(ELISpot)は、T細胞特異的反応の検出に対して広く使用される。ELISpotアッセイ法において、特異的サイトカインを分泌するT細胞は、そのサイトカインに対して特異的な抗体が固定されるELISpotアッセイプレートにおいて、T細胞をインキュベートすることによって検出される。次いで、抗体に結合したサイトカインは、標準的な免疫学的試験法を使用して可視化される。サイトカイン産生が生じた、アッセイプレートの領域に局在する結合サイトカインのスポットは、活性化T細胞の存在を示す。各々のスポットは、単一の細胞によるサイトカイン産生を意味する。それ故に、アッセイ法において存在する細胞の数が公知である場合、ELISpotアッセイ法によって、形成されたスポットの数を数えることにより反応細胞の頻度が確定される。
【０００３】
ELISpotアッセイ法は、ウイルス感染細胞の検出、特異的抗体を分泌する細胞の列挙、フィブロネクチンを分泌する細胞の検出、および単球の研究などの、その他の目的に対して使用されてもいる。
【０００４】
ELISpotアッセイ法における陽性細胞の検出を高めるための可溶性共同因子の使用が記載されている。固定化共同因子は、T細胞を刺激するために使用されており、かつ培養培地におけるサイトカインの存在は、ELISAに基づく分析によって検出されている。
【０００５】
ELISpotアッセイ法は、少数の反応または産生細胞を伴う検体に対して理想的である。これの良い例は、典型的には0.1%より少ない反応細胞を伴う、特異的免疫反応の分析である。しかしながら、ELISpotアッセイ法は、細胞の単層のみがアッセイウェルに存在するように、個々のサンプルにおける細胞の数が制限されなければならないという限定を有する(96ウェルプレートにおいて、およそ250,000細胞/ウェル)。
【０００６】
ELISAアッセイ法により、産生されるサイトカインの量を定量することが可能となる。しかしながら、ELISAアッセイ法は、低感度により、ごくわずかな細胞のみが、検出されるタンパク質を産生するような、特異的免疫反応の分析などの検体に対しては有用ではない。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、細胞の同時培養を伴うELISpotの利点と抗体アッセイ法の柔軟性を伴う細胞産物の捕獲とを組み合わせる新規のアッセイ法を提供し、培養細胞によって放出される産物のインビトロ検出のための高感度手法を提供する。本発明のアッセイ法は、一つまたは複数の検体に対する抗体が固体表面上の別個の位置に固定されるアッセイプレートを使用する。本発明の新規アッセイ法は、個々のサンプルにおける培養細胞によって放出される複数のサイトカインの同時検出を可能にする。本発明のアッセイ法は高感度で、特異的免疫反応の分析においてなど、少数の反応または産生細胞を伴う検体に対して使用され得る。ELISpotアッセイ法と異なり、個々のサンプルに存在し得る細胞の数は制限されない。それ故に、本発明のアッセイ法において、ウェルあたり、より多くの数の細胞がアッセイされ得る。従って、新規アッセイ法の感度は、公知のELISpotアッセイ法に比べて高められる。
【０００８】
したがって、本発明のアッセイ法は高感度で、かつ同じ細胞のサンプルを用いた同じアッセイウェルにおける複数のパラメーターの分析を可能にする。本発明のアッセイ法は、陽性または陰性結果のみが要求される診断的適用において、特に有用である。例えば、本アッセイ法は、個体が感染物質にさらされていて、かつ感染物質に反応しうるかどうかを判定するために、またはウイルス感染細胞の検出において、使用され得る。
【０００９】
従って、本発明は、一つまたは複数の検体のサンプルにおける、細胞による産生を検出するための方法を提供し、その方法は以下の段階を含む：
(a)(i)第一検体に特異的に結合する第一結合タンパク質、および
(ii)任意で、第二検体に特異的に結合する第二結合タンパク質
を提供し、第一結合タンパク質および任意で第二結合タンパク質が、ウェル内の一つまたは複数の別個の位置にそれぞれ固定される段階；
(b)細胞のサンプルをウェルに導入する段階；
(c)以下に適した条件下で、前記細胞のサンプルを培養する段階：
(i)前記細胞による第一検体および任意で第二検体および任意で一つまたは複数のさらなる検体の放出；ならびに
(ii)第一検体の第一結合タンパク質への結合および任意で第二検体の第二結合タンパク質への結合；ならびに
(d)第一検体が第一結合タンパク質に結合しているかどうか、および第二検体が第二結合タンパク質に結合しているかどうかを判定し、それによって一つまたは複数の検体の細胞のサンプルによる産生を検出する段階。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞のサンプルによる一つまたは複数の検体の産生を検出するためのインビトロの方法を提供し、その方法は以下の段階を含む：
(a)(i)第一検体に特異的に結合する第一結合タンパク質、および
(ii)任意で、第二検体に特異的に結合する第二結合タンパク質
を提供し、第一結合タンパク質および任意で第二結合タンパク質が、ウェル内の一つまたは複数の別個の位置にそれぞれ固定される段階；
(b)細胞のサンプルをウェルに導入する段階；
(c)以下に適した条件下で、前記細胞サンプルを培養する段階：
(i)前記細胞による第一検体および任意で該第二検体の放出；ならびに
(ii)第一検体の第一結合タンパク質への結合および任意で第二検体の第二結合タンパク質への結合；ならびに
(d)第一検体が第一結合タンパク質に結合しているかどうか、および任意で第二検体が第二結合タンパク質に結合しているかどうかを判定し、それによって一つまたは複数の検体の細胞のサンプルによる産生を検出する段階。
【００１１】
一つまたは複数のさらなる結合タンパク質が、一つまたは複数の別個の位置でウェル内に存在してもよい。各々のさらなる結合タンパク質は、典型的には、ウェル内の異なる別個の位置に存在する。各々のさらなる結合タンパク質は、一つのさらなる検体に特異的に結合する。一つまたは複数のさらなる結合タンパク質が前記固体表面上に存在する場合、段階(c)は、以下に適した条件下で、細胞を培養することを付加的に含み、
(iii)細胞による各々の一つまたは複数のさらなる検体の放出；および
(iv)各々のさらなる検体の、各々の一つまたは複数のさらなる結合タンパク質への結合；
かつ段階(d)は、前記一つまたは複数のさらなる検体の各々が、さらなる結合タンパク質の各々に結合しているかどうかを判定することを付加的に含む。
【００１２】
0〜60の、例えば、2〜50、3〜40、4〜30、5〜20、6〜18、7〜15、8〜12、または9〜10のさらなる結合タンパク質が、ウェル内に存在し得る。
【００１３】
結合タンパク質
第一結合タンパク質は、第一検体に特異的に結合することが可能なタンパク質である。第二結合タンパク質は、第二検体に特異的に結合することが可能なタンパク質である。さらなる結合タンパク質は、さらなる検体に特異的に結合することが可能である。タンパク質は、特異的な検体に対して選択的または高親和性を有して結合する場合に、検体に「特異的に結合する」が、その他の物質には結合しない、実質的には結合しない、または低親和性のみを有して結合する。タンパク質の特異的結合能力は、任意の適した方法によって決定され得る。競合的結合に対する様々なプロトコールが、当技術分野において周知である(例えば、Maddox et al. (1993), J. Exp. Med. 158:1211-1226を参照されたい)。
【００１４】
好ましくは、第一、第二、およびさらなる結合タンパク質の一つまたは複数は、抗体である。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体が好ましい。結合タンパク質は、親和性リガンドまたは抗体フラグメントであってもよく、または含んでもよく、フラグメントは検体に結合することが可能である。そのような抗体フラグメントは、一本鎖抗体と同様に、Fv、F(ab')およびF(ab')2フラグメントを含む。好ましくは、第一、第二、およびさらなる結合タンパク質の各々は、抗体または抗体フラグメントである。
【００１５】
一つの態様において、本発明は、刺激薬剤に反応してサイトカインを分泌するT細胞を検出する方法を提供する。この態様において、本発明の方法における使用に適した抗体は、典型的には、一つまたは複数のサイトカイン、例えば、二つ、三つ、または四つのサイトカインだが好ましくは一つのサイトカインに特異的に結合する。好ましくは、抗体は、IFN-γまたはIL-4に特異的に結合する。サイトカインに対する抗体は、市販されている、または標準的な技術を使用して作成され得る。市販されている抗体は、Mabtech AB、ストックホルム、スウェーデンが提供している、以下のモノクローナル抗体を含む：IL-2に対してIL2-IおよびIL2-II、IL-4に対して82.4および12.1またはIL4-IおよびIL4-II、IL-5に対してTRFK5および5A10、IL-13に対してIL13-IおよびIL13-2、IFN-γに対して1-D1Kおよび7-B6-1、IL-6に対して13A5および39C3、IL-10に対して9D7および12G8、IL-12に対してIL-12-I、IL-12-II、およびIL-12-III、TNF-αに対してTNFα-IおよびTNFα-II、パーフォリンに対してpf-344、ならびにIFNαに対してIFNα-IおよびIFNα-II。
【００１６】
検体
本発明の方法における検出に対する検体は、細胞によって産生される任意の物質であり得る。概して、検体はタンパク質である。検体は、典型的には、細胞から分泌される。検体は、免疫反応性物質、すなわち、抗体に結合する物質であることが好ましい。本発明の方法は、細胞の単一サンプルによって産生される、一つまたは複数の、例えば、2〜100、3〜75、4〜60、5〜50、6〜40、7〜30、8〜20、9〜15、または10〜12の検体を検出するために使用され得る。
【００１７】
細胞がT細胞である好ましい態様において、検体は、典型的にはサイトカインである。サイトカインは、インターロイキン、好ましくはIFN-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、もしくはIL-13、インターフェロン、好ましくはIL-γ、またはTNF-αなどのその他のサイトカインから選択され得る。より好ましくは、サイトカインはIFN-γまたはIL-4である。好ましくは、サイトカインは、T細胞が抗原またはアレルゲンなどの刺激物質に接触させられる際に、放出される。同時検出に対するサイトカインの好ましい組み合わせは、IFN-γと任意の一つまたは複数のIL-2、IL-4、IL-5、およびIL-10を含む。
【００１８】
細胞がウイルス感染細胞である好ましい態様において、検体は、典型的にはウイルス粒子またはウイルスタンパク質である。細胞が癌細胞である場合、検体は、典型的には成長因子または成長調節タンパク質である。細胞が、寄生虫感染血液細胞などの寄生虫感染細胞である場合、検体は、典型的には寄生虫由来タンパク質である。
【００１９】
ウェル
ウェルは、典型的には複数ウェルプレートのウェルである。結合タンパク質は、典型的にはウェルの底面上に固定される。ウェルは、溶液を保持するのに適した任意の構造であり、結合タンパク質が固定され得、かつ表面上に固定された結合タンパク質への検体の結合を検出するのに適した、固体表面を含む。ウェルは、典型的には、平らな水平の底面、および垂直の壁面または複数の壁面を含む。ウェルは、典型的には約25μl〜約250μl、約30μl〜約200μl、約40μl〜約150μl、または約50μl〜100μlの容量を有する。適した培養条件下で、表面が細胞のサンプルに接触させられることが可能であるならば、固体表面がウェルの底面であることは必須ではない。例えば、結合試薬は、細胞培養の間にウェルに置かれるカバースリップまたは類似物などの、固体表面上に固定され得る。
【００２０】
結合タンパク質が固定される固体表面の領域は、典型的には約0.05cm2〜約1cm2、例えば、約0.2cm2〜約0.5cm2、または約0.3 cm2〜約0.4cm2である。
【００２１】
好ましい形式において、ウェルは、複数ウェルプレート、例えば96ウェルプレートの単一ウェルである。適した96ウェルプレートは、ELISAおよびELISpotアッセイ法において一般的に使用される。
【００２２】
本発明のアッセイ法において、細胞によって産生される複数の検体は、複数ウェルプレートの単一ウェルにおいて検出され得る。別々のアッセイ法は、プレートにおける別々のウェルにおいて実施され得る。
【００２３】
好ましくは、結合タンパク質は、ポリビニリデンフルオライド(PVDF)膜またはニトロセルロース膜に固定される。PVDFおよびニトロセルロース膜と同様の高タンパク質結合能力を有するその他の膜が使用されてもよい。典型的には、結合タンパク質が固定される表面は、約60、約70、約80、または約90μg/ウェルなどの、96ウェルプレートのウェルあたり約50〜約100μgのタンパク質結合能力を有する。96ウェルELISpotプレートの表面領域は、約0.32cm2である。従って、固体表面は、180μg/cm2、200μg/cm2、250μg/cm2、または300μg/cm2などの、約150μg/cm2〜350μg/cm2のタンパク質結合能力を有する。
【００２４】
第一結合タンパク質は、ウェル内の一つまたは複数の別個の位置に、またはウェル内に置かれた固体表面上に、固定される。別個の位置は、典型的には、固体表面またはウェルの総表面領域と比べて小さな表面領域を有する、表面またはウェルの領域または範囲である。別個の位置の表面領域は、総表面領域の約1/200〜約1/2、例えば、総表面領域の約1/100〜約1/3、約1/50〜約1/4、約1/20〜約1/8、または約1/15〜約1/10であり得る。
【００２５】
別個の位置は、典型的にはスポットを含む。スポットは、約1nm〜約200μm、例えば、約1μm〜約100μmまたは約10μm〜約50μmの典型的な直径を有する。2〜50、3〜40、4〜30、5〜20、6〜15、7〜12、8、9、または10の固定化結合タンパク質のスポットが、ウェル内に存在し得る。
【００２６】
スポットは、スポットが互いに分離されるならば、表面上の任意の適した配列に配置され得る。スポットは、典型的には、第一、第二、またはさらなる検体が結合したスポットの同定を助けるために、一つまたは複数の直線に配置される。例えば、スポットは、グリッドとして配置され得る。グリッドにおいて、第一結合タンパク質は、一つの行または列に存在し得、かつ第二結合タンパク質は、第二の行または列に存在し得る。一つまたは複数のさらなる結合タンパク質は、グリッドにおいて付加的な行または列を形成し得る、付加的なスポットに存在し得る。または、スポットは、円形配列を形成し得る。
【００２７】
第一、第二、およびさらなる結合タンパク質が、細胞の単一サンプルが固体表面上で結合タンパク質の各々に同時に接触し得るように設置されるならば、第一、第二、およびさらなる結合タンパク質は、ウェル内の代わりに、タンパク質チップまたはその他の固体表面上の別個の位置に設置されてもよい。
【００２８】
細胞
特異的結合タンパク質を使用して検出され得る検体を産生する任意の細胞が、本アッセイ法において使用され得る。一つの好ましい態様において、細胞のサンプルは、T細胞を含む。T細胞は、概して、血液サンプルにおける被験体から採取されるが、T細胞を含むサンプルのその他の型が使用されてもよい。サンプルは、本アッセイ法に直接的に添加され得る、または処理され得る。典型的には、処理は、血液からの細胞の単離および細胞培養培地または緩衝液におけるこれらの懸濁を含み得る。細胞懸濁液は、試験状況に応じて、細胞の異なる濃度を含むように希釈され得る。サンプルにおける細胞の濃度は、血液中の濃度よりも高い可能性がある。
【００２９】
好ましくは、アッセイ法において使用されるT細胞は、未処理または希釈サンプルの形式である。T細胞は、新鮮に単離され得(例えば、新鮮に単離される単核細胞(MNC)または末梢血単核細胞(PBMC))、エクスビボで直接的に使用される、すなわち方法において使用される前に培養されない。または、T細胞は、アッセイ法における使用に先行して、インビトロで培養されていてもよい。
【００３０】
第二の好ましい態様において、細胞は、ウイルス感染細胞であり得る。細胞は、血液細胞、例えば、リンパ球、単球、または顆粒球であり得る。その他の適した細胞は、尿、唾液、精液、または膣分泌物から単離され得る。その他の細胞の型が、ウイルスの親和性に応じて、スクリーニングもされてもよい。本発明の方法によって検出され得るウイルス感染細胞は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、エプスタイン・バー・ウイルス(EBV)、およびサイトメガロ・ウイルス(CMV)に感染された細胞を含む。
【００３１】
癌細胞、神経細胞、および幹細胞を含む、様々なその他の細胞も、本発明のアッセイ法において使用され得る。
【００３２】
概して、約104〜約107細胞が、サンプルに存在する。例えば、約2.5×104、約2.5×106、約5×105、約105〜約3×105、約3×105〜約106細胞が、サンプルに存在し得る。
【００３３】
培養条件
本発明の方法において、細胞のサンプルは、細胞からの第一検体、および任意で第二またはさらなる検体の放出に適した任意の条件下で、ウェルに導入される、または固定化結合タンパク質に接触させられる。条件は、検体が固定化結合タンパク質に結合するのにも適している。概して、細胞は、好ましくは培養培地である溶液中に存在すると思われる。
【００３４】
アッセイ法は、任意の適した量において実施され得る。細胞サンプルの典型的な量は、約10μl〜約1ml、好ましくは、約50μl〜約500μl、より好ましくは、約100μl〜約200μlの範囲である。典型的には、細胞が固体表面でインキュベートされる時間の長さは、約4〜約50時間、例えば、約6〜約48時間、約8〜約45時間、約12〜約36時間、または約16〜約32時間、好ましくは約6〜16時間、例えば、一晩である。
【００３５】
細胞は、任意の適した温度でインキュベートされ得る。適した温度は、細胞が由来するヒトまたは動物の正常な体温と同じ範囲である。典型的には、インキュベーションは、約35℃と約39℃の間の温度、好ましくは約36℃〜約38℃、より好ましくは37℃で実施される。
【００３６】
結合の判定
固定化結合タンパク質と細胞から放出される検体との間で形成される複合体は、任意の適した手法によって検出され得る。抗体が固定される表面は、検出に先行して非結合免疫反応性物質を除去するために、例えばPBS中で、概して洗浄される。
【００３７】
典型的には、結合タンパク質/検体複合体は、複合体に結合すると思われる抗体を使用して検出され得る。結合タンパク質が抗体である場合、二次抗体は、典型的には、結合タンパク質とは異なる抗体である。典型的には、抗体は、結合タンパク質に結合する部位とは異なる部位で、検体に結合する。抗体は、検体と固体基底材上に固定される結合タンパク質との間で形成される複合体に対して、特異的であり得る。
【００３８】
概して、二次抗体は、直接的または間接的に検出され得る標識で標識される。直接的に検出可能な標識は、フルオロセイン、テキサスレッド、ローダミン、またはオレゴングリーンなどの、蛍光標識を含み得る。固定化結合タンパク質/検体複合体への蛍光標識抗体の結合は、顕微鏡検査によって検出され得る。例えば、蛍光または二焦点顕微鏡を使用して、検出され得る。
【００３９】
好ましくは、抗体は、間接的に検出され得る標識に結合している。間接的に検出され得る標識は、実体顕微鏡などの、従来の低倍率、例えば、10倍倍率、20倍倍率、もしくは50倍倍率の顕微鏡下で、または自動ELISpotリーダーを使用して、検出され得る沈殿非蛍光基質に作用する酵素を含み得る。または、スポットを識別するために、拡大鏡が使用されてもよい。自動ELISpotリーダーは、典型的には、スポットの分析に適合したビデオカメラおよび画像解析ソフトウェアに基づく。好ましい酵素は、アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼを含む。
【００４０】
その他の間接的な方法は、二次抗体または結合タンパク質からのシグナルを高めるために使用され得る。例えば、二次抗体または結合タンパク質は、ビオチン化され得、アルカリホスファターゼもしくはホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素に結合したストレプトアビジン、またはFITCもしくはテキサスレッドなどの蛍光プローブに結合したストレプトアビジンを使用する検出を可能にし得る。
【００４１】
すべての検出段階において、二次およびそれに続く薬剤の非特異的結合を最小にするための薬剤を含むことが望ましい。例えば、非特異的結合をブロックするために、ウシ血清アルブミン(BSA)またはウシ胎仔血清(FCS)が使用され得る。
【００４２】
第一薬剤に反応して細胞から放出される検体は、その薬剤の非存在下で、細胞から自然に放出される可能性もある。それ故に、細胞が第一薬剤に反応して検体を放出しているのかどうかを決定するために、一つまたは複数の陰性対照アッセイ法を実施する必要があり得る。例えば、アッセイ法は、刺激薬剤の非存在下で実施され得、かつ第一薬剤の非存在下で検出されるシグナルが、第一薬剤の存在下で検出されるシグナルと比較され得る。
【００４３】
第一薬剤
本発明の方法は、典型的には、特異的刺激シグナルに反応して検体を産生する細胞を検出するために使用される。従って、試験される細胞は、検体の分泌を刺激することが可能な第一薬剤に接触させられ得る。
【００４４】
本発明の方法において、細胞のサンプルは、第一および/または第二検体および/またはさらなる検体の一つもしくは複数の産生を誘導するまたは阻害することが可能な第一薬剤とともに、段階(c)において培養され得る。細胞がT細胞である態様において、分泌を刺激することが可能な第一薬剤が、アッセイウェルに添加される、すなわち、T細胞が第一薬剤の存在下で培養されることが好ましい。
【００４５】
したがって、本発明の方法の段階(b)は、細胞のサンプルを、第一および/または第二検体および/またはさらなる検体の一つもしくは複数の産生を誘導するまたは阻害することが可能な第一薬剤に接触させることをさらに含み得る。
【００４６】
検体の産生または分泌を誘導するまたは刺激することが可能な薬剤は、溶液中に存在し得る、または基底材上に固定され得る。第一薬剤が表面上に固定される場合、それは表面全体にわたって存在し得る。または、第一薬剤は、結合タンパク質が設置されていない基底材の一部上に、好ましくは別個の位置に、設置され得る。
【００４７】
方法が活性化T細胞を検出するためのものである態様において、分泌を刺激することが可能な薬剤は、典型的には抗原である。抗原は、ウイルスまたはバクテリアなどの病原体に由来し得る。抗原は、自己免疫性神経疾患(ミエリン)または糖尿病(グルタミン酸脱炭酸酵素(GAD))などの、自己免疫性疾患に関連し得る。抗原は、腫瘍抗原またはアレルゲンであり得る。分泌を刺激することが可能な薬剤は、単離された粗抗原混合物、または組換え技術によって産生されたタンパク質および/もしくは製造されたペプチドを含み得る。
【００４８】
本発明の方法は、自然にまたは刺激シグナルに反応して、一つまたは複数の検体を産生するまたは分泌する細胞を検出するために使用され得る。本発明の方法は、検体の産生または分泌を阻害する薬剤を同定するために使用されてもよい。そのような薬剤は、検体の自然な分泌を阻害し得る、または特異的刺激に反応した検体の分泌を阻害し得る。
【００４９】
例えば、ウイルス感染細胞を検出することに対する本発明の態様において、方法は、抗ウイルス薬を同定するために使用され得る。薬物スクリーニングのそのような方法において、本発明の方法は、試験される薬剤の存在下および非存在下で実施され得、試験薬剤の存在下におけるウイルスタンパク質または粒子を分泌する細胞の数における任意の減少は、その薬剤が抗ウイルス薬として有用であり得ることを示す。従って、本発明は、試験薬剤が抗ウイルス活性を有するかどうかを判定するための方法を提供し、方法は以下の段階を含む：
(a)(i)第一ウイルスタンパク質に特異的に結合する第一結合タンパク質、および
(ii)任意で、第二ウイルスタンパク質に特異的に結合する第二結合タンパク質
を提供し、第一結合タンパク質および任意で第二結合タンパク質が、固体表面上の一つまたは複数の別個の位置にそれぞれ固定される段階；
(b)固体表面を、ウイルス感染細胞のサンプルおよび試験薬剤に接触させる段階；
(c)以下に適した条件下で、前記細胞サンプルを培養する段階：
(i)前記細胞による第一ウイルスタンパク質および任意で第二ウイルスタンパク質の放出；ならびに
(ii)第一ウイルスタンパク質の第一結合タンパク質への結合および任意で第二ウイルスタンパク質の第二結合タンパク質への結合；ならびに
(d)第一ウイルスタンパク質が第一結合タンパク質に結合しているかどうか、および任意で第二ウイルスタンパク質が第二結合タンパク質に結合しているかどうかを判定し、それによって試験薬剤が抗ウイルス活性を有するかどうかを判定する段階。
【００５０】
T細胞を検出することに対する態様において、本方法は、例えば、抗原特異的システムにおいて、免疫調節性薬剤を同定するために使用され得る。免疫調節性薬剤は、抑制性または増強性であり得る。スクリーニングのそのような方法において、本発明の方法は、試験薬剤の存在下および非存在下で実施され得、試験薬剤の存在下におけるサイトカインを分泌する細胞の数における任意の増加または減少は、その薬剤が免疫調節性活性を有することを示す。したがって、本発明は、試験薬剤が免疫調節性活性を有するかどうかを判定するための方法を提供し、その方法は以下の段階を含む：
(a)(i)第一サイトカインに特異的に結合する第一結合タンパク質、および
(ii)任意で、第二サイトカインに特異的に結合する第二結合タンパク質
を提供し、第一結合タンパク質および任意で第二結合タンパク質が、固体表面上の一つまたは複数の別個の位置にそれぞれ固定される段階；
(b)固体表面を、T細胞のサンプルおよび試験薬剤に接触させる段階；
(c)以下に適した条件下で、細胞のサンプルを培養する段階：
(i)第一サイトカインおよび任意で第二サイトカインの放出；ならびに
(ii)第一サイトカインの第一結合タンパク質への結合および任意で第二サイトカインの第二結合タンパク質への結合；ならびに
(d)第一サイトカインが第一結合タンパク質に結合しているかどうか、および任意で第二サイトカインが第二結合タンパク質に結合しているかどうかを判定し、それによって試験薬剤が免疫調節性活性を有するかどうかを判定する段階。
【００５１】
細胞は、細胞を抗体および検出を高めることが可能な薬剤に接触させることに先行して、試験薬剤とともにインキュベートされ得る。または、試験薬剤は、細胞が抗体および検出を高めることが可能な薬剤に接触させられるのと同時に、細胞に接触させられ得る。
【００５２】
第二薬剤
本発明の方法において、細胞のサンプルは、第一、第二、およびさらなる検体の一つまたは複数の検出を高める第二薬剤に接触させられてもよい。第二薬剤は、段階(b)の間に溶液中に添加され得る、または固体表面上に固定され得る。第二薬剤が表面上に固定される場合、第二薬剤は、第一および任意で第二およびさらなる結合タンパク質が固定される固体表面全体にわたって存在し得る。または、第二薬剤は、結合タンパク質を含まない基底材の一部上に、好ましくは別個の位置に、存在し得る。
【００５３】
第一、第二、および/またはさらなる検体の検出を高めることが可能な第二薬剤は、検体の産生または分泌を高める物質であり得る。
【００５４】
そのような第二薬剤は、陽性対照としても有用である。この点において、マイクロタイタープレートにおける一つもしくは複数だがすべてではないウェルは、第二薬剤を含み得る、または第二薬剤は、アッセイプレートの一つもしくは複数だがすべてではないウェルに溶液中に添加され得る。第二薬剤を含むウェルにおいてシグナルが検出されない場合、次いで、陽性対照は正常に機能しなかったことになり、これはアッセイ条件に関する問題を示唆する。これが生じる場合、第二薬剤を持続するウェルにおいて獲得された陰性結果は、無視され得る。
【００５５】
本発明のこの態様において、細胞の検出を高めることが可能な薬剤は、CD3に対する抗体または植物性赤血球凝集素(PHA)もしくはコンバナバリン(convanavalin)A(ConA)などのレクチンなどのポリクローナル活性化因子であり得る。これらの活性化因子は、活性化T細胞の検出を高めることにおいて有用であり得る。
【００５６】
第一、第二、および/またはさらなる検体の一つまたは複数の検出を高めることが可能な第二薬剤は、第一薬剤に反応した検体の特異的な分泌または産生を増強するように作用し得る。それ故に、第二薬剤は、検体の一つまたは複数の産生または分泌に対する共刺激シグナルを提供する。
【００５７】
活性化T細胞を検出することに対する態様において、第二薬剤は、CD28、誘導性共刺激(ICOS)分子、またはCD40などの共刺激分子に対する抗体または組換えリガンドであり得る。本アッセイ法において提供される正常なインビトロ条件は、最適な抗原提示または細胞間接触の形成を促進しない可能性があり、その両方は、免疫反応に対して重要である。本アッセイ法における共刺激シグナルの提供は、特に第二薬剤が固体表面上に固定される場合、細胞間接触において正常に提供されるシグナルの代わりになり得、したがって、特異的な様式で反応細胞の数を高め得る。例えば、固定化抗CD28抗体の使用は、精製ツベルクリンタンパク質(PPD)および破傷風毒素(TT)という抗原に対するT細胞の特異的反応を有意に高める。
【００５８】
IL-2および/またはIL-15などの成長因子が、第一薬剤に反応した免疫反応性物質の分泌を増強するために使用されてもよい。これらの成長因子は、特異的免疫反応を増強するように作用し、活性化のためのさらなるシグナルを反応T細胞に提供する。適した第二薬剤のその他の例は、IL-4産生細胞の刺激をさらに増強するIL-4、およびインターフェロン-γ(IFN-γ)などのTh-1サイトカインの産生を促進するために使用され得るIL-12である。
【００５９】
または、第二薬剤は、検体の分泌を阻害するシグナルを阻害することによって、第一、第二、および/またはさらなる検体の検出を高め得る。例えば、T細胞の検出に対する態様において、第二薬剤は、IL-10またはTGF-βなどの一般的免疫抑制性分子に対する抗体であり得る。一般的免疫抑制性分子に対する抗体は、免疫抑制性分子を「吸着」し、好ましくはウェル表面上にそれらを固定すると思われ、それによって免疫抑制性分子を潜在的反応T細胞に、より接近しにくいものにすると思われる。
【００６０】
別の代替物において、第二薬剤は、第一、第二、および/またはさらなる検体の自然な分泌を抑制するために、刺激シグナルを阻害するように作用し得る。これは、シグナル対ノイズ比を改善することによって、特異的反応がより容易に明らかにされるのに役立ち得る。例えば、グランザイムBおよびIFN-γは、両方ともT細胞と同様にナチュラルキラー(NK)細胞によって産生される。第二薬剤は、T細胞からのグランザイムBまたはIFN-γの検出を助けるために、NK細胞からのグランザイムBまたはIFN-γの自然な産生を抑制し得る。このような方式で作用する適した第二薬剤は、刺激シグナルを中和するまたはブロックすることが可能な抗体を含む。
【００６１】
フィブロネクチンおよびラミニンなどの細胞外マトリクスタンパク質は、刺激シグナルに反応した物質の分泌を増強することによって、検体の検出を高めることが可能な薬剤のさらなる例である。
【００６２】
細胞外マトリクスタンパク質は、免疫細胞とケモカインなどのマトリクス依存性細胞モジュレータとの適切な相互作用に対して必須である。それ故に、細胞外マトリクスタンパク質の包含は、刺激に対する最適な条件を提供するために要求され得る。
【００６３】
本発明の方法において、検出を高めることが可能な1つ、2つ、3つ、またはそれ以上、例えば、4つまたは5つの第二薬剤が、利用され得る。2つまたはそれ以上のそのような薬剤が使用される場合、薬剤は、同じまたは異なるメカニズムによって作用し得、同じまたは異なる検体の検出を高め得る。例えば、細胞がT細胞である場合、2つの共刺激シグナルが、CD4およびCD8反応細胞の両方を最適に検出するために使用され得る。ここで、検出システムは、好ましくは、T細胞の別々のセットによって通常は産生されるIL-4およびIFN-γなどの、複数のサイトカインに基づく。
【００６４】
ウイルス感染細胞を検出することに対する本発明の態様において、そのような細胞の検出を高めることが可能な第二薬剤は、好ましくは、ウイルス複製を活性化することが可能な薬剤である。例えばHIVなどの場合、ウイルス複製の活性化因子は、抗CD3またはPHAなどのポリクローナル活性化因子であり得、両方ともT細胞におけるウイルス複製を活性化する。
【００６５】
製品
本発明は、一つまたは複数の検体のサンプルにおける、細胞による産生を検出することに適した製品も提供し、製品は、以下を含むウェルを含む：
(i)第一検体に特異的に結合する第一結合タンパク質；
(ii)任意で、第二検体に特異的に結合する第二結合タンパク質；
(iii)第一検体および/または第二検体の産生を誘導するまたは阻害することが可能な第一薬剤；ならびに
(iv)任意で、第一および/または第二検体の検出を高める第二薬剤、
ここで、第一結合タンパク質および任意で第二結合タンパク質が、ウェル内の一つまたは複数の別個の位置に固定され、かつ第一薬剤および任意で第二薬剤が、ウェル内に固定される。
【００６６】
製品は、ウェルの表面上に、第一結合タンパク質または第二結合タンパク質を含む溶液の微液滴(典型的には0.1〜10 nl)を置くことによって作成され得る。例えば+4〜8℃における一晩のインキュベーションによって、結合タンパク質が表面上に固定されるのを可能にした後、過剰な抗体は洗い流され、表面はウシ血清アルブミン(BSA)などのブロッキング試薬によって任意で飽和され得る。
【００６７】
キット
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットも提供し、キットは、本発明に係る製品、ウェルの表面への第一検体ならびに任意で第二およびさらなる検体の結合を検出する手法を含む。
【００６８】
本発明は、以下を含むキットも提供する(a)(i)第一検体に特異的に結合する第一結合タンパク質；および(ii)任意で、第二検体に特異的に結合する第二結合タンパク質を含み、第一結合タンパク質および任意で第二結合タンパク質が、ウェル内の別個の位置に固定され、典型的には、細胞をウェル内に導入することによって、細胞を第一および第二結合タンパク質の両方に接触させるアッセイプレート；および(b)以下の一つまたは複数：細胞培養培地、単核細胞またはT細胞を血液サンプルから分離する手法；第一薬剤および第二薬剤。
【００６９】
検出手法は、典型的には、第一、第二、および/もしくはさらなる検体に、または第一結合タンパク質と第一検体、第二結合タンパク質と第二検体、および/もしくはさらなる結合タンパク質とさらなる検体との間で形成される複合体に、結合することが可能な一つまたは複数の抗体を含む。抗体は、検出のために直接的または間接的に標識され得る。
【００７０】
キットは、細胞のための培地および/または検出段階において使用される洗浄緩衝液を付加的に含み得る。
【００７１】
キットは、陽性または陰性対照などの対照を含んでもよい。キットは、血液サンプルなどの、被験体から細胞を含むサンプルを採取する手法を含んでもよい。キットは、血液サンプルから単核細胞またはT細胞を分離する手法を含み得る。
【００７２】
使用
本発明の方法は、診断的応用と同様に調査状況において使用され得る。本発明の方法は、ELISpotアッセイ法の任意の公知の応用において使用され得る。本発明の方法は、特異的免疫反応を調べるための調査、例えば、ワクチン研究において、特に使用され得る。本発明の方法は、様々な感染症、アレルゲン、腫瘍抗原、または自己免疫標的へのT細胞の反応を検出することを目的とする診断的アッセイ法において使用され得る。
【００７３】
本発明の方法は、薬物スクリーニングにおいて、例えば、抗ウイルス薬および免疫調節性薬剤を同定することにおいて、特別な実用性を有する。
【００７４】
本発明の方法は、様々な単離細胞の反応を検出するために使用されてもよい。例えば、移植のために単離されるインシュリンを産生する島は、インシュリン産生およびストレス反応に対してモニターされ得、免疫治療のために単離される樹枝状細胞は、反応性および成熟マーカーに対してモニターされ得、ならびに脳卒中治療のために単離される神経幹細胞は、ストレスタンパク質および神経化学走化性因子に対してモニターされ得る。
【００７５】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【００７６】
実施例1
アッセイ法の特異性を試験するために、図1に示されるように、試験アッセイプレート(96ウェルELISpot)が製造された。4つの異なる抗サイトカイン捕獲抗体、αIFN-γ、αIL-2、αIL-10、およびαIL-13が、図1に示されるパターンで、PVDFプレート上にスポットされた(4 nl/スポット)。
【００７７】
次いで、システムの特異性は、精製サイトカインの添加によって試験された。100μl/wellのサイトカインを含まない溶液、5 ng/mlのαIFN-γ、αIL-2、αIL-10、およびαIL-13の各々を含む溶液、または5 ng/mlのαIFN-γ、αIL-2、αIL-10、もしくはαIL-13の一つを含む溶液が、様々なウェルに添加された。スポットは、ビオチン化二次抗体(各々のサイトカインに対する1μg/mlの抗体を含む100μl/ウェル)の混合物を添加することによって発色された。非結合抗体を洗い流した後、アルカリホスファターゼに結合したストレプトアビジン(SA-ALP)が添加された。最後に、スポットは、アルカリホスファターゼへの不溶性基質、BCIP/NBT plusの使用によって発色された。
【００７８】
実施例2
PBMC(180000/ウェル)は、実施例1において記載されるように調製されたPVDFプレートにおいて、PPD(マイコバクテリウムに由来する精製タンパク質)、CD8反応性ウイルスペプチドのプール、インフルエンザペプチド(インフルエンザウイルスに由来する単一ペプチド)、または培地単体の存在下で、44時間37℃で培養された。インキュベーション後、細胞は洗い流され、ビオチン結合検出抗体、SA-ALP、および基質が、実施例1において記載されるように添加された。ELISpotは、参照として、並行して行なわれた。
【００７９】
主に単球による、IL-10の高い自然な産生のために、このサイトカインは、対照ウェルにおいても検出される。CD8ペプチドおよびインフルエンザペプチドを伴う培養におけるIL-10の低下した産生は、IL-10分泌を抑制する一つまたは複数の調節分子の同時産生に依存している可能性がある(同じことが、ELISpotにおいてこれまでに観察されている)。
【００８０】
IL-2およびIL-13スポットの欠如は、存在する抗原に伴う、このドナーにおけるこれらのサイトカインの誘導の欠如を反映する(ELISpotにおいても見られる)。
【００８１】
本セットアップにおいて、コーティング抗体の各々は、4つの異なるスポットにおいてコーティングされている。実際の試験状況において、各々の抗体は、1つのスポットとしてのみコーティングされる可能性がより高く、多数のサイトカインの同時分析を可能にすると思われる。1つのスポットのみにおけるサイトカインの蓄積は、アッセイの感度を増大させる可能性もある。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図1は、システムの特異性を試験するための実験の結果を示す。4つの異なる抗サイトカイン捕獲抗体、αIFN-γ、αIL-2、αIL-10、およびαIL-13は、図1に示されるパターンに従って、PVDFプレート上に添加された(4 nl/スポット)。100μl/ウェルのサイトカインを含まない溶液(対照ウェル1)、5ng/mlの精製されたαIFN-γ、αIL-2、αIL-10、およびαIL-13の各々(ウェル2)、または5ng/mlの精製されたαIFN-γ、αIL-2、αIL-10、およびαIL-13の一つ(ウェル3〜6)。
【図２】図2は、本発明の新規アッセイ法(CultiSpot)とELISpotアッセイ法との比較である。上のパネルは、図1について記載されているように調製されたPVDFプレートを使用して、異なる刺激に反応してPBMCによって産生されたサイトカインの検出を示す。下のパネルは、抗IFN-γ捕獲抗体によって均一にコーティングされたPVDFプレートを使用して、異なる刺激に反応してPBMCによって産生されたIFN-γのELISpotによる検出を示す。PBMC(180000/ウェル)は、PPD(マイコバクテリウムに由来する精製タンパク質)、CD8反応性ウイルスペプチドのプール、インフルエンザペプチド(インフルエンザウイルスに由来する単一ペプチド)、または培地単体の存在下で、44時間37℃で培養された。
【図１】
2007535669.tif 000004
【図２】
2007535669.tif 000005
【国際調査報告】
2007535669.tif 000006
2007535669.tif 000007
2007535669.tif 000008