(57)【要約】  本発明は、個体におけるアルツハイマー病の診断または予後のための方法に関する。本方法は、少なくとも１つの、遺伝子ＡＢＣＡ２の多型ｒｓ９０８８３２のマイナーアレルの存在または非存在を検出する工程を含む。遺伝子ＡＢＣＡ２の多型ｒｓ９０８８３２のマイナーアレルの存在は、その個体は、アルツハイマー病に罹っているか、または、目下アルツハイマー病を進行させる危険が高い可能性があることを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの、ＡＢＣＡ２遺伝子の多型の存在を検出する工程を含む、個体におけるアルツハイマー病の診断または予後のための方法。
【請求項２】
少なくとも１つの、遺伝学的にアルツハイマー病と関連するＡＢＣＡ２遺伝子の多型のマイナーアレルの存在の検出工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルの存在の検出工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
検出工程は、生物学的サンプルを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生物学的サンプルは、有核細胞を含むサンプルである、請求項４に記載の個体におけるアルツハイマー病の診断または予後のための方法。
【請求項６】
生物学的サンプルは、血液サンプル、精液サンプル、または、毛髪サンプルである、請求項４または５に記載の個体におけるアルツハイマー病の診断または予後のための方法。
【請求項７】
多型を有するＤＮＡの存在または非存在の検出工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ハイブリダイゼーション、メンブレンへのサザンブロッティング、ヌクレアーゼでの消化、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）もしくは直接の配列解析の技術、または、それらの組み合わせによって行われる、請求項１に記載の個体におけるアルツハイマー病の診断または予後のための方法。
【請求項８】
ａ．個体のＤＮＡを抽出すること、
ｂ．単離された上記ＤＮＡを、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型に対応する配列を増幅することができるプライマーを用いて増幅すること、
ｃ．増幅されたＤＮＡにおける、少なくとも１種のＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のアレルの存在を決定すること、
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
増幅工程ｂ）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＴａｑＭａｎ）の５’ヌクレアーゼ活性を用いた技術によって、増幅されたｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを有するＤＮＡと、増幅されたこのアレルを有さないＤＮＡとを区別する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析によって、増幅されたｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを有するＤＮＡと、増幅されたこの多型を有さないＤＮＡとを区別する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
制限断片は、アガロースゲルでの移動、メンブレンへのサザンブロッティング、および、ハイブリダイゼーションの前に、増幅されたＤＮＡを制限酵素で消化することによって得られたものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＢＣＡ２タンパク質をコードする転写物の２１８５位のヌクレオチドの決定を含む、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型を検出する方法。
【請求項１４】
個体から採取された生物学的サンプルの解析方法であって、
ａ．ＡＢＣＡ２遺伝子に関する遺伝子型を決定する、および、
ｂ．得られたデータを、上記個体がアルツハイマー病を進行させる危険に関する予後、および、この病気に関して想定できる治療的処置の有効性を得るために変換する、
上記の方法。
【請求項１５】
ｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを増幅するためのプライマー。
【請求項１６】
配列番号３の配列の約１５〜３０個の連続したヌクレオチドを有する、請求項１５に記載のプライマー。
【請求項１７】
配列番号６の配列を有する、請求項１６に記載のプライマー。
【請求項１８】
配列番号３に相補的な配列の約１５〜３０個の連続したヌクレオチドを有する、請求項１５に記載のプライマー。
【請求項１９】
配列番号７の配列を有する、請求項１８に記載のプライマー。
【請求項２０】
配列番号３に相補的な配列の約１２〜１７個の連続したヌクレオチドを有するプローブ。
【請求項２１】
配列番号８の配列を有する、請求項２０に記載のプローブ。
【請求項２２】
配列番号４に相補的な配列の約１２〜１７個の連続したヌクレオチドを有するプローブ。
【請求項２３】
配列番号９の配列を有する、請求項２２に記載のプローブ。
【請求項２４】
請求項１６〜２３のいずれか一項に記載のプライマーおよびプローブに相補的なプライマーおよびプローブ。
【請求項２５】
ｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを有するＤＮＡの存在または非存在の検出を行うのに必要な様々な要素を含む、アルツハイマー病の診断または予後のためのセットまたはキット。
【請求項２６】
請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のプライマー対を含む、請求項２５に記載のセット。
【請求項２７】
ゲノムに、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを有する外因性ゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１種が挿入されたトランスジェニック動物、幹細胞系、および、この幹細胞系から分化した細胞系。
【請求項２８】
ヒト以外の哺乳動物から選択される、請求項２７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２９】
請求項２７または２８に記載のトランスジェニック動物、幹細胞系、および、これらの幹細胞系から分化した細胞系を得る方法であって、ヒトＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを含むトランスジェニック動物、幹細胞系、および、これらの幹細胞系から分化した細胞系を作製することを含む、上記の方法。
【請求項３０】
アルツハイマー病を予防および／または治療することを目的とする物質または方法の活性を試験するための、請求項２７または２８に記載のトランスジェニック動物、幹細胞系、および、これらの幹細胞系から分化した細胞系の使用。
【請求項３１】
請求項２７または２８に記載のトランスジェニック動物から抽出された細胞。
【請求項３２】
アルツハイマー病の治療を目的とする化合物を実証するための、請求項３１に記載の細胞の使用。
【請求項３３】
アルツハイマー病に罹った個体を治療するための医薬品を製造するための、アルツハイマー病に対するそれらの活性を有することがわかっている化合物または化合物の混合物の使用であって、上記個体は、治療の前にＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルの存在がすでに検出されている、上記の使用。
【請求項３４】
病気は、早期のアルツハイマー病である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルに関連する病気を示す個体に投与することを目的とする化合物を選択する方法であって：
ａ．上記個体由来の生物学的サンプルにおいて、少なくとも１つの、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルの存在を決定する工程、および、
ｂ．上記アレルが存在する場合、適切な化合物を選択する工程、
を含む、上記の方法。
【請求項３６】
ｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルに関連する病気は、アルツハイマー病である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
アルツハイマー病を示す個体に投与することを目的とする化合物を選択する方法であって：
ａ．上記個体由来の生物学的サンプルにおいて、少なくとも１つの、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルの存在を決定する工程；および、
ｂ．上記アレルが存在する場合、適切な化合物を選択する工程、
を含む、上記の方法。
【請求項３８】
アルツハイマー病の治療方法であって、
- 少なくとも１つの、個体においてｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルの存在を検出する工程、および、
- アルツハイマー病に対する活性を有することがわかっている化合物または化合物の混合物を、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを示す個体に投与すること、
を含む、上記の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の診断または予後のための方法に関する。本発明はまた、アルツハイマー病の診断または予後のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、高齢の個体群の大部分に影響を与える神経変性疾患である。臨床的な観点でいえば、この病気は、認知機能の損失を特徴とし、神経病理学的な観点でいえば、脳内における細胞内の神経原線維の沈着、および、アミロイドプラークを形成する細胞外のβ−アミロイド（Ａβ）ペプチドの沈着の存在を特徴とする。アミロイドプラークは主として、β−アミロイドペプチド前駆タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解プロセスによって生成する４０または４２個のアミノ酸を含むＡβペプチドで構成される。細胞外のＡβ沈着は、アルツハイマー病に特異的である。それらは、アルツハイマー病の全てのタイプ（家族性のタイプなど）の、早期で不変の特徴を示す。
【０００３】
この病気の家族性のタイプは、比較的早期（４０〜６０歳）に観察される。これは、少なくとも部分的には、ＡＰＰ遺伝子ならびにプレセニリン−１（ＰＳ１）およびプレセニリン−２（ＰＳ２）遺伝子における突然変異が原因のようである。これら３種の遺伝子における突然変異により、ＡＰＰのタンパク質分解における変化が誘発され、Ａβの過剰生産と、アルツハイマー病の散発性のタイプの病理および症状と類似した病理および症状の早期の出現が引き起こされる。
【０００４】
また、疫学的な研究、ならびに、近年の生化学および細胞生物学的な研究の結果から、コレステロールとアルツハイマー病との関連も確立されている（総論として、Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｔ．（２００１年）ＴＩＮＳ  ２４：Ｓ４５〜４８を参照）。成年層における高いコレステロールレベル、さらに動脈性の高血圧もまた、アルツハイマー病の危険を著しく増加させる（Ｋｉｖｉｐｅｌｔｏ等，２００１年  Ｂｒ  Ｍｅｄ  Ｊ．３２２：１４４７）。
【０００５】
一方で、スタチン系のコレステロール降下剤で治療した個体群においては、危険が極めて減少されたことが記録されている（Ｗｏｌｏｚｉｎ等（２０００年）Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．５７：１４３９；Ｊｉｃｋ等（２０００年）Ｌａｎｃｅｔ  ３５６：１６２７）。
【０００６】
近年、分子的な関連が確立されているようである。インビトロおよびインビボでの、高いコレステロールレベルによって、Ａβペプチドの生産が増加し、アミロイドプラーク出現が促進されるが（Ｓｐａｒｋｓ等（１９９４年）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２６：８８〜９４；Ｒｅｆｏｌｏ等（２０００年）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．７：３２１〜３３１；Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ等（２００１年）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：９０５；Ｓｈｉｅ等（２００２年）．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  １３：４５５）、それに対して、コレステロール合成経路の阻害剤によってそれらは減少する（Ｓｉｍｏｎｓ等（１９９８年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：６４６０〜６４６４；Ｆａｓｓｂｅｎｄｅｒ等（２００１年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９８：５８５６，Ｒｅｆｏｌｏ等，（２００１年）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．８：８９０〜８９９）。
【０００７】
相当な前進にもかかわらず、医学界はなお、アルツハイマー病に対して実際に有効な分子の欠如に直面している。このような分子が欠如している理由の一つとして、この病気に対して治療的作用を発揮できる分子の有効なスクリーニングのための標的を発見することが難しいということがある。
【０００８】
その上、患者に対する高度の身体障害が進行して現れ始める初期症状前に治療を提供するためには、この病気の早期発見が決定要因と思われる。
【０００９】
加えて、この病気の様々な型によって、まず第一に、治療しようとする個体、第二に、治療に用いることができる分子に応じた治療を目標とすることが必要のようである。このような薬理ゲノム学的または遺伝薬理学的なアプローチは、ますます重要になりつつある。
【００１０】
ＡＢＣＡ２タンパク質は、ＡＢＣ（ＡＴＰ−結合カセット）型のコレステロール輸送体の大規模なファミリーに属するタンパク質である。この輸送体は、脳で特異的に発現される。
【００１１】
Ｚｈａｏ等（２０００年）により、ＡＢＣＡ２遺伝子のクローニングが説明されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ.，３５０，８６５〜８７２）。また、その配列は、アクティブパ・ファーマシューティカルズ社（ＡＣＴＩＶＥＰＡＳＳ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ）により出願されたＰＣＴ出願ＷＯ０１／１４４１４の主題である。上記出願において、ＡＢＣＡ２の役割に関する様々な仮説が提唱されているが、それらを支持する結果はまったくない。
【００１２】
様々なＡＢＣＡ２遺伝子の多型は、すでに同定されている。それらの配列は特に、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰデータベースで得ることができる。このデータベースに列挙された様々な多型のなかで、多型ｒｓ９０８８３２が説明されている。
【００１３】
この多型は、白色人種の個体群におけるメジャーアレル（配列番号２の配列の３４８位に位置するグアニン）、および、白色人種の個体群におけるマイナーアレル（配列番号１の配列の３４８位に位置するアデニン）を特徴とする。
【００１４】
あるいは、この一塩基多型は、配列番号３および配列番号４の配列（これらはそれぞれ、部分的に配列番号１と配列番号２に相補的である）で示される。従ってこの多型は、白色人種の個体群におけるメジャーアレル（配列番号４の配列の２０１位に位置するシトシン）、および、白色人種の個体群におけるマイナーアレル（配列番号３の配列の２０１位に位置するチミジン）を特徴とする。
【００１５】
この多型は同義であり、すなわち、翻訳されたタンパク質配列を改変しない。この多型の２つのアレルは、アスパラギン酸をコードするコドンの一部である。これをコードする多型は、配列番号５の配列を示す転写物の２１８５位でエキソン１４上に位置する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
驚くべきことに、本出願人は、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを示す個体は、アルツハイマー病を早期発症させる危険が増加していることを示した。
【００１７】
この発見によって、出願人の知る限り初めて、ＡＢＣＡ２タンパク質、特にこのタンパク質をコードする遺伝子の多型と、アルツハイマー病のような病理学的な状態との関連の証明が与えられたため、これは特に重要である。
【００１８】
すでにアルツハイマー病と診断された患者の病気の重症度、さらに、想定される可能な治療有効性に関する予後を確認する、および／または、伝えること、または、アルツハイマー病の症状を示さない個体（例えば、診断が確認されている患者と血縁関係である個体）における病気を発症させる危険に関する予後を伝えることを可能にする。
【００１９】
また、アルツハイマー病の生理病理学におけるＡＢＣＡ２に関する主要な機能的役割を確認することで、アルツハイマー病に対する治療適用の目的で、ＡＢＣＡ２の活性に対する刺激または阻害作用を発揮できる分子をスクリーニングするための試験の使用の根拠を示すことも可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
従って、本発明の第一の主題は、個体におけるアルツハイマー病の診断または予後のための方法である。前記方法は、少なくとも１つの、ＡＢＣＡ２遺伝子の多型のアレルの検出工程を含む。有利には、このような多型は、アルツハイマー病に関与する多型である。好ましくはｒｓ９０８８３２多型だが、ｒｓ９０８８３２多型との遺伝子の連鎖不平衡におけるその他のあらゆる多型も可能である。
【００２１】
適切な個体としては、例えば：
- アルツハイマー病の症状を示さない個体、
- アルツハイマー病を進行させる危険がすでに検出されているが、病気の症状をまだ示していない個体、および、
- これまでにアルツハイマー病に罹患していると診断されており、診断の確認が望ましい個体、
が挙げられる。
【００２２】
ｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルの存在または非存在を検出する１または複数の工程（同時でもよいし、同時でなくてもよい）は、生物学的サンプルを用いて、あらゆる適切な手段によって直接的または間接的に行われる。
【００２３】
それゆえに、本発明はまた、アルツハイマー病を進行させる傾向が高い個体を検出するための、個体（特にアルツハイマー病の症状を示さない個体）から採取された生物学的サンプルをスクリーニングする方法にも関する。このようなスクリーニングは、前記生物学的サンプル中で、ｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルの存在を検索すること（場合によっては同時に）を含む。
【００２４】
同定しようとするＤＮＡまたはタンパク質を含む前記サンプルとしては、様々な起源のものが可能である。このようなサンプルとしては、例えば、血液サンプル、精液サンプル、または、毛髪サンプル（毛根を含む）、または、その他のあらゆる有核細胞を含むサンプルが挙げられる。好ましくは、解析される生物学的サンプルは、血液サンプルである。この場合、同定しようとするＤＮＡは、白血球から採取される。
【００２５】
本発明の目的において、用語「生物学的サンプル」は、診断または予後を要する個体から直接的に得られたサンプル（その他のいかなる変換も含まない）、または、検出工程に利用される分画のみを保存するために、１またはそれ以上の調製工程で処理されたサンプル（例えば粗細胞抽出物）を意味することとする。
【００２６】
ｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを有するＤＮＡの存在または非存在を検出または同定する技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、ヌクレアーゼでの消化、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）および／またはＰＣＲ産物の直接の配列解析の技術組み合わせが可能である。これらの技術はいずれも当業者既知である。
【００２７】
一般的に、本発明に関して用いることができるｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを有するＤＮＡを同定するための技術はいずれも、同定しようとするＤＮＡを含む生物学的サンプルを回収する事前の工程、および、当業者周知の標準的な技術に従って、例えばＳｍｉｔｈ等の方法（Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，１９９２年，３３９，１３７５〜７頁）に従って、ゲノムＤＮＡを抽出する工程を含む。
【００２８】
このような同定方法は：
ａ）前記個体のＤＮＡを抽出すること、
ｂ）単離された前記ＤＮＡを、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のアレルそれぞれに対応する配列を増幅することができるプライマーを用いて増幅すること、および、  ｃ）増幅されたＤＮＡにおいて、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のアレルの少なくとも１種を決定すること、
を含んでもよい。
【００２９】
有利な実施形態によれば、ＰＣＲ技術が用いられる。従って、有利には、工程ｂ）は、ポリメラーゼ連鎖反応の工程を含む。この技術は、まず第一に、増幅しようとするＤＮＡセグメントの境界を定める領域の配列に相補的なオリゴヌクレオチド（プライマー）を合成することからなる。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとして役立つ。次に、２つのＤＮＡ鎖を解離させるための熱変性の工程（９２〜９５℃）、２種の特異的プライマーを用いた温度を低くすることによるハイブリダイゼーション工程（５０〜５５℃）、および、ＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマーの伸長工程（７０〜７２℃）が行われる。
【００３０】
このような、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のアレル、特にマイナーアレルそれぞれを増幅するためのプライマー、さらに、それらに相補的な配列も、本願のその他の主題を構成する。有利には、それらはそれぞれ、ＤＮＡ分子におけるそれらそれぞれのハイブリダイゼーションポイント間の塩基数が２５〜２５００塩基対、好ましくは１００〜５００塩基対になるような配列を有する。
【００３１】
有利には、このようなプライマーは、配列番号３の配列の、または、配列番号４の配列の約１５〜３０個の連続したヌクレオチドを有する。好ましくは、このようなプライマーは、配列番号６および配列番号７の配列を有するプライマー対である。
【００３２】
有利な実施形態によれば、本願の主題は、増幅されたｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを有するＤＮＡと、増幅されたこのアレルを有さないＤＮＡとを、２種のプローブ（これらはそれぞれ、多型の２つのタイプの一方に特異的である）の特異的なハイブリダイゼーションによって区別する方法である。これらのプローブ、さらにそれらに相補的な配列も、本願のその他の主題を構成する。
【００３３】
有利には、これらのプローブはそれぞれ、配列番号３または配列番号４の配列の約１２〜１７個の連続したヌクレオチドからなる。好ましくは、これらのプローブはそれぞれ、配列番号８および配列番号９の配列を有する。
【００３４】
また、増幅されたｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを有するＤＮＡと、増幅されたこのアレルを有さないＤＮＡとを、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＴａｑＭａｎ）の５’ヌクレアーゼ活性を用いた技術によって区別することもできる。
【００３５】
有利な実施形態によれば、本願の主題は、増幅されたｒｓ９０８８３２多型を有するＤＮＡと、増幅されたこの多型を有さないＤＮＡとを、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析によって区別する方法である。有利には、上記制限断片は、アガロースゲルでの移動、メンブレンへのサザンブロッティング、および、ハイブリダイゼーションの前に、増幅されたＤＮＡを制限酵素で消化することによってより得られたものである。
【００３６】
より大きい感度とより優れた特異性の両方を得るために、２回の連続した２種の異なるプライマー対を用いたＰＣＲ（「ネステッドＰＣＲ」）を行うことも可能である：第一の外側のプライマー対は、慣用のＰＣＲと同様に増幅されたＤＮＡ断片を得ることが可能であり、第二の内側のプライマー対は、第一のＰＣＲから得られたＤＮＡ断片を増幅するためである。
【００３７】
また、望ましい領域の遺伝学的なフットプリントを決定するために、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片を、電気泳動によりそれらの大きさに従って分離し、ＥＴＢ（エチジウムブロマイド）と紫外線で可視化することもできる。
【００３８】
この場合において特に有利な可能性は、３’末端に突然変異したヌクレオチド配列を有する第一のプライマーと、３’末端に野生型のヌクレオチド配列を有する第二のプライマーとを用いたＰＣＲを行うことで構成される。これらの２つのケースにおける変性温度の差、その結果としての増幅効率における差によって、突然変異体ＤＮＡと、野生型ＤＮＡとを区別することが可能になる。
【００３９】
その他の代替法によれば、増幅されたＤＮＡ断片は、ドットブロット技術によって直接的に同定され、この技術は、ＰＣＲで生産されたＤＮＡ断片のサンプルをナイロンフィルター上に沈着させること、ＤＮＡ断片を変性させること、それらと放射性の特異的プローブとをハイブリダイズすること、および、付着しなかった過量の放射活性物質を除去するために洗浄すること、次に、オートラジオグラムを行うことで構成される。放射標識以外の標識（例えば色素または蛍光標識）を含む特異的プローブを用いたその他の手段によって、確認を行うこともできる。
【００４０】
その他の代替法によれば、増幅されたＤＮＡ断片の全部または一部を直接配列解析することによって、ｒｓ９０８８３２多型を含むＤＮＡにおける突然変異の存在または非存在を検出することも可能である。このような方法は、ｒｓ９０８８３２多型のヌクレオチド配列を決定することで構成される。上記配列解析は、当業者既知のあらゆる方法（例えばサンガー法またはマクサム‐ギルバート法）によって行うことができる。
【００４１】
その他の代替法によれば、ｒｓ９０８８３２多型を有するＤＮＡの存在または非存在の検出は、サザンブロッティング技術を用いて行うことができ、この技術は、１またはそれ以上の制限酵素の処理の後に得られたＤＮＡ断片の電気泳動を行うことで構成される。次に、このゲルを変性させ、ナイロンメンブレン上にブロッティングする。このメンブレンは、特異的プローブとハイブリダイズさせることを目的とする。洗浄して付着しなかった過量の放射活性物質を除去した後、このフィルムをメンブレンにアプライする。このようにして、プローブによって認識されたＤＮＡ断片に相当する１またはそれ以上のバンドを検出することができる。
【００４２】
また、ｒｓ９０８８３２多型の存在または非存在を検出するために、サザンブロッティングおよび／またはＰＣＲ技術と併用したＲＦＬＰ技術を用いることも可能である。ＲＦＬＰは、様々な個体のＤＮＡを比較すること、および、点突然変異を発生させる制限部位の出現または非出現が起こっているかどうかを調査することを可能にする。制限酵素で処理された同一な配列の２種のＤＮＡは、同一な断片を発生させると予想され、従って、これらの断片を用いて得られたサザンブロットは、同一になると予想される。一方で、突然変異後に、制限部位が出現していない場合、またあるいは、出現している場合、その断片は、同一の大きさを有さなくなるため、それらをオートラジオグラムで可視的に観察できる。突然変異後に新規の制限部位が出現した場合も同じことが言える。
【００４３】
また、ＡＢＣＡ２タンパク質をコードする転写物の２１８５位のヌクレオチドを決定することによって、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型を検出することも可能である。
【００４４】
上述の技術は全て当業者周知である。既知であり、さらにｒｓ９０８８３２多型の存在または非存在を検出するのにも適したその他のあらゆる技術を用いることができる。これに関して、例えば、リガーゼ連鎖反応技術、鎖置換による増幅、転写に基づく増幅などが挙げられる。有利には、前記検出工程は、文献で説明されている方法に従って、ＰＣＲ、ＲＦＬＰ、サザンブロッティングおよび／またはこれらの技術の組み合わせによって行われる（例えば、以下を参照：Ｇｏｕｇｈ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０年，３４７，７７３頁；Ｋａｇｉｍｏｔｏ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.，１９９０年，２６５，１７２０９頁；Ｗｏｌｆ等，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，１９９０年，３３６，１４５２頁；Ｈａｙａｓｈｉ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.，１９９１年，１９，４７９７頁；Ｄａｌｙ等，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９１年，１，３３頁；Ｓｐｕｒｒ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ.，１９９１年，２０６，１４９頁；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ等，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，１９９２年，３３９，１０１７頁；Ｋｕｒｔｈ等，Ａｍ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ.，１９９３年，４８，１６６頁；ＭｃＣａｎｎ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ.，１９９７年，１５３，５０頁；Ｓｔｒｏｏｍｂｅｒｇｅｎ等，Ｈｕｍ．＆  Ｅｘｐｅｒ．Ｔｏｘｉｃｏｌ.，１９９９年，１８，１４１頁）。
【００４５】
これら検出方法は全て、個体が、アルツハイマー病に罹っているかどうか、または、アルツハイマー病を進行させる危険の増加を示すかどうかを決定するための基準を構成するため、特に有用である。
【００４６】
従って、本発明のその他の主題は、個体から採取された生物学的サンプルの解析方法に関し、本方法は：
ａ）前記個体のＡＢＣＡ２遺伝子に関する遺伝子型を決定すること、および、
ｂ）ａ）で得られたデータを変換して、前記個体がアルツハイマー病を進行させる危険に関する予後、および、この病気に関して想定できる治療的処置の有効性を得ること、
で構成される。
【００４７】
その他の側面によれば、本発明はまた、個体におけるアルツハイマー病の診断または予後のためのセットまたはキットに関する。
【００４８】
このようなキットは、例えばバイアルまたはチューブのような様々な容器が区別できるようにパッケージ化された形態が可能である。これらの容器はそれぞれ、ｒｓ９０８８３２多型を有するＤＮＡの存在または非存在の検出を行うのに必要な様々な要素を含む。
【００４９】
検出反応を行うための前記要素は、上述の要素から選択される。これら要素は、例えば：
- ＡＢＣＡ２遺伝子の定義された領域とハイブリダイズするプライマー対、および、場合により増幅反応を行うのに必要な手段、または、
- 検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチドプローブ（場合により支持体に固定されている）、および、場合により、ハイブリダイゼーション反応を行うのに必要な試薬、
が可能である。
【００５０】
本発明のその他の主題は、アルツハイマー病の治療方法であり、本方法は：
- 少なくとも１つの、個体においてｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルの存在を検出する工程、および、
- アルツハイマー病に対する活性を有することががわかっている化合物または化合物の混合物を、ｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを示す個体に投与する工程、
を含む。好ましくは、前記病気は、早期のアルツハイマー病である。
【００５１】
本発明のその他の主題は、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルに関連する病気を示す個体に投与することを目的とする化合物を選択する方法であり、本方法は：
ａ．前記個体由来の生物学的サンプルにおいて、少なくとも１つの、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルの存在を決定する工程、および、
ｂ．前記アレルが存在する場合、適切な化合物を選択する工程、
を含む。
【００５２】
本発明のその他の主題は、アルツハイマー病を示す個体に投与することを目的とする化合物を選択する方法であり、本方法は：
ａ．前記個体由来の生物学的サンプルにおいて、少なくとも１つの、ＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルの存在を決定する工程；および、
ｂ．前記アレルが存在する場合、適切な化合物を選択する工程、
を含む。
【００５３】
本願はまた、アルツハイマー病に罹った個体を治療するための医薬品を製造するための、アルツハイマー病に対する活性を有することががわかっている化合物または化合物の混合物の使用（前記個体は、治療の前にｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルの存在が検出されている）に関する。
【００５４】
アルツハイマー病に対する活性がわかっている前記化合物としては、例えば、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（ＡｃｈＥＩ、例えばドネペジル（アリセプト）、ガランタミン（レミニル）、または、エクセロン（リバスチグミン））、ＮＭＤＡ受容体チャンネルアンタゴニスト（例えばメマンティン（エビクサ））、アミロイドペプチド生産阻害剤、例えばＢＭＳ２９９８９７、または、さらに、ＡＢＣＡ２活性モジュレーターが挙げられる。
【００５５】
組み合わせた化合物は、経口的に、非経口的に、経皮に、もしくは直腸に、同時に、もしくは別々に、または、時間が経つにつれて拡散する様式のいずれかで投与することができる。
【００５６】
本化合物は、製薬上許容できるビヒクルを用いて、上記で定義されたような１種またはそれ以上の化合物の組み合わせを含む医薬組成物の形態に製剤化される。
【００５７】
経口投与のための固形組成物として、錠剤、丸剤、散剤（ゼラチンカプセル剤、カシェ剤）、または、顆粒剤の使用が可能である。これらの組成物において、活性主成分は、１種またはそれ以上の不活性な希釈剤（例えばスターチ、セルロース、スクロース、ラクトースまたはシリカ）と、アルゴン流下で混合される。また、これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えば１種またはそれ以上の潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはタルク、色素、コーティング（糖衣錠）、または、ワニスを含んでもよい。
【００５８】
経口投与のための液状組成物として、不活性な希釈剤（例えば水、エタノール、グリセロール、植物油またはパラフィンオイル）を含む、製薬上許容できる液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤およびエリキシル剤の使用が可能である。これらの組成物は、希釈剤に加えて、例えば潤滑剤、甘味剤、増粘剤、矯味矯臭剤または安定化剤のような物質を含んでいてもよい。
【００５９】
非経口投与のための滅菌組成物は、好ましくは、水性液剤または非水性液剤、懸濁剤または乳剤が可能である。溶媒またはビヒクルとして、水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、特にオリーブ油、注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチル、または、その他の適切な有機溶媒の使用が可能である。また、これらの組成物は、アジュバント、特に湿潤剤、等張剤、乳化剤、分散剤および安定化剤を含んでいてもよい。滅菌は、数種の方法で行うことができ、例えば無菌ろ過、滅菌剤を組成物に含ませること、照射、または、加熱によって行われる。このような滅菌組成物はまた、使用時に、滅菌水またはその他のあらゆる注射用滅菌媒体に溶解させることができる滅菌固形組成物の形態に製造することもできる。
【００６０】
直腸内投与のための組成物は、坐剤または直腸用のカプセルであり、これらは、活性物質に加えて、カカオバター、半合成グリセリドまたはポリエチレングリコールのような賦形剤を含む。
【００６１】
一般的に、上記で定義されたような組み合わせを含む医薬組成物は、化合物を０.１〜５００ｍｇ含む。
【００６２】
用量は、望ましい作用、治療期間、および、用いられる投与経路に依存する；用量は、一般的に、成人の場合、経口で化合物０.１〜５００ｍｇ／日である。
【００６３】
一般的に、適切な用量は、年齢と体重、さらに治療しようとする個体に特異的なその他全ての要因に応じて医師が決定する。
【００６４】
本発明また、ＡＢＣＡ２遺伝子の機能が改変されるように、ゲノムにｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを有する外因性ＤＮＡ配列の少なくとも１つが挿入されたトランスジェニック動物に関する。
【００６５】
用語「トランスジェニック動物」は、ゲノムの人工的な改変を示す、ヒト以外のあらゆる動物を意味することとする。ゲノムの改変は、「ノックイン」または「ノックアウト」による変更または改変による１種またはそれ以上の遺伝子の結果（相同組換えによる遺伝子の不活性化／改変）、または、マウス中での、ニューロン細胞型（例えばＴｈｙＩ、ＰＤＧＦまたはプリオン）またはグリア細胞型（例えばＧＦＡＰ）に特異的なプロモーターの制御下でのヒト遺伝子の過剰発現であり得る。この改変は、慣用の改変作用または突然変異誘発物質によるものでもよいし、または、ハイブリッド遺伝子を発現させる発現カセットを安定して挿入することによって実現することができる。特に、例えば、出願ＷＯ０１／０２５５２、または、ＷＯ０１／１３１７６で説明されている方法と同一な、または類似した方法に従った手法を行うことができる。
【００６６】
また、ゲノムの改変は、その野生型または突然変異型における、遺伝子の挿入の結果、または、遺伝子の置換の結果であってもよい。
【００６７】
有利には、改変は、生殖幹細胞に行われる。
【００６８】
現時点で、「ノックイン」および「ノックアウト」技術を用いたゲノムの改変は、マウスの胚から誘導された生殖細胞系に定着する能力を有する幹細胞（「ＥＳ」細胞という）しか利用できないために、モデルとしてはマウスに限定される。ＥＳ細胞系がその他の種に利用可能である場合、当業者にとって、ＫＯおよび／またはＫＩモデルを作製するために、これらのテクノロジーを、これらのその他の種に容易に適用することが可能であると予想される。加えて、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッド）の使用に基づくアプローチを、単独で、または、ＤＮＡ／ＲＮＡを改変する酵素と併用して用いて、ゲノムの所定の遺伝子座に定義された改変／突然変異を導入することができる。さらに、ゲノム中でランダムな改変を誘発する放射線照射または化学的突然変異誘発物質も、有効な一連の生物学的なマーカー（表現型）、および、ハイスループットポジショナルクローニング法と併用される場合に用いることができる。
【００６９】
しかしながら、実験動物（マウス、ラット、雌牛、ブタ、ヒツジなど）のゲノムを改変するための直接的なアプローチのほとんどが、直線状にしたＤＮＡをマイクロインジェクションすることによる、単細胞の段階（２細胞段階またはそれ以上の段階での注入を用いてもよいが、好ましくはキメラ動物の発生を防ぐためである）で受精させた卵母細胞の１または２つの前核へのランダムなトランスジーン組込みである。一般的な法則として、トランスジーンは、２つの部分で構成されており、それは、上記ＤＮＡによってコードされたＲＮＡを時空的に発現制御する調節因子と、それに並置された前記ＤＮＡ（ｃＤＮＡまたはゲノム断片）である。これらの２つの要素（調節要素と、望ましいタンパク質をコードするＤＮＡ）は、標的ゲノムと相同でもよいし、または異種でもよい。関連するトランスジェニック動物は、一般的に、ヒト以外の哺乳動物から選択される。このような動物としては、例えば、ネズミ科の動物、すなわちマウス、ラットおよびモルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジまたはウシが挙げられる。このような動物として好ましくは、慣用の遺伝子導入技術に従って得られたネズミ科の動物、ラットまたはウサギである。本発明のその他の主題は、ｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを有する外因性ゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１種がゲノムに挿入された幹細胞系、および、これらの幹細胞系から分化した細胞系である。
【００７０】
簡単に言えば、本発明に係る幹細胞系および分化細胞系のトランスジェニック動物の生産は、ＡＢＣＡ２タンパク質をコードする外因性ゲノムＤＮＡの挿入、それに対応する動物の遺伝子への相同組換え（トランスジーンが正しい発現の特徴を示し、動物の内因性遺伝子の発現が妨害されるすなわちノックアウトように、トランスジーンの挿入は動物の遺伝子のプロモーターの直後を標的とする：ノックアウトされた）、または、本発明で説明した、ヒトＡＢＣＡ２遺伝子のアイソフォームに相当する特異的な突然変異の、動物の内因性遺伝子への挿入（改変は幹細胞での相同組換えによって行われる：ノックインされた）、または、ｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを有するＡＢＣＡ２遺伝子の過剰発現によるトランスジェニック動物の作製を用いた方法からなる。
【００７１】
マウスの場合、これらの動物は、アルツハイマー型の突然変異を含むヒトＡＰＰ遺伝子を有し、アミロイドプラークを発生させるトランスジェニックマウスと有利に交雑することもできる。このようにして得られたダブルトランスジェニック動物において、アルツハイマー病に罹った、または、その危険を有する患者で観察された遺伝子型が複製される。このようにして得られた新生動物のｒｓ９０８８３２多型の遺伝子型は、上述の技術を用いて、特に増幅反応（ＰＣＲ）および／またはサザンブロッティングを用いて制御可能である。
【００７２】
このようなトランスジェニック動物は、アルツハイマー病の特徴を極めて正確に再現しており、アルツハイマー病を理解するのに有利なモデルを提供することができるので、特に有用である。既知のモデルと比較することによって、このモデルは特に、アルツハイマー病の治療に特に適した化合物を実証すること、特に、ヒトにおいて説明されているような実証を可能にする。これらの化合物としては、化学的な分子、ペプチドまたはタンパク質分子、抗体、キメラ分子、さらにアンチセンスＤＮＡまたはリボザイムが挙げられる。
【００７３】
従って、実証された化合物は、単独で、または、医薬組成物を形成するためには製薬上許容できるビヒクルと組み合わせて、医薬品として用いることができる。このようなビヒクルとしては、特に、滅菌水、等張水、食塩水（リン酸一ナトリウムまたはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなど、または、このような塩の混合物）、または、乾燥した組成物、特に凍結乾燥した組成物が挙げられ、このような乾燥した組成物は、組成物に滅菌水または生理食塩水を適宜添加すると、注射用の溶質となり得る。注射は定位的（stereotaxically）、局所的、経口的、非経口的、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼球内、経皮的等に行うことができる。
【００７４】
上述の化合物の実証は、本発明の動物モデルと、作用を有すると思われる化合物または化合物の混合物とを、特に投与（例えば注射）によって接触させること、次に、その化合物の、（特にモデルの脳内における）様々な生化学および／または組織学的な変化に関する作用を測定することに基づく。
【００７５】
アルツハイマー病を予防、緩和または治すための治療的化合物をインビボで試験することに加えて、これらのトランスジェニック動物はまた、アルツハイマー病用の動物モデルを提供することを可能にし、このような動物モデルは、病因を誘発または促進する環境要因をスクリーニングするため、または、病気が進行している際の挙動を研究するため、および、例えば新しい医薬品を研究する目的、または医薬品の有効量と毒性を決定する目的で関与する様々な生物学的なメカニズムを研究するために使用できる。従って、本発明のその他の主題は、アルツハイマー病を予防および／または治療することを目的とする化合物または方法の活性を試験するための、上記で定義されたような幹細胞系または分化細胞系のトランスジェニック動物の使用に関する。本発明のその他の主題は、上述のようなトランスジェニック動物から抽出された細胞、さらに、アルツハイマー病の治療を目的とする化合物を実証するためのそれらの使用に関する。
【００７６】
上述の化合物の実証は、本発明の動物モデルから抽出された細胞と、作用を有すると思われる化合物または化合物の混合物を接触させること、次に、細胞のホモジネート中で、細胞全体に対する化合物の作用、または、細胞成分分画に対する化合物の作用、例えば細胞死のような様々なパラメーターに対する化合物の作用を測定することに基づく。
【００７７】
上記の構成に加えて、本発明はまた、以下に記載の実施例および図より生じると考えられるその他の特徴および利点を含み、これらは、本発明の範囲を限定することなく本発明を説明するものと考慮されるべきである。
【実施例】
【００７８】
実施例１：患者サンプルにおけるＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型の遺伝子型の研究
アルツハイマー病に罹った白色人種系の患者とコントロール個体から得られたＤＮＡのコレクションを、それに関して患者側の同意を受けた後に用いた。
【００７９】
コリエル研究所（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，米国）によって販売されているパネルの４７個体のサンプルを遺伝子型解析することによって多型の頻度を決定した。
【００８０】
アルツハイマー病に罹った患者とコントロールにおいて遺伝子型解析するために、１０の多型（ｒｓ９０８８３２多型を含む）を、それらの遺伝子中での位置と頻度に基づき選択した。
【００８１】
その遺伝子型を、５’ヌクレアーゼ分析方法（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），フォスターシティー，米国のアレルを識別する技術）によって調製し、次に、これらのマーカーそれぞれと、アルツハイマー病との関連を試験することによって、χ2統計的分析を行った（異質性検定）。解析のために、病気が早期に（６５歳より前、または６５歳で）、または、後期に（６５歳より後に））発症した年齢と、その起源（散発性（最初に認識された症例）、または、家族性（同じ家族における、すでに認識されている別の症例））に従ってグループを区別した。
【００８２】
ｒｓ９０８８３２多型に関して得られた結果は以下の通り：
- 患者（４４０の遺伝子型）におけるマイナーアレルの頻度（Ｔ）：７.４、
- コントロール（５１９の遺伝子型）におけるマイナーアレルの頻度（Ｔ）：３.４。
【００８３】
ハーディ−ワインベルグ平衡を患者とコントロールにおいて確認したところ、有意な偏差は観察されず、従って遺伝子型解析のエラーがないことが確認された。
【００８４】
病気の早期の症状を示す患者（６５歳より前、または６５歳前）で行われた試験の結果：
- １３６人の散発性の症例対２７２人のコントロール：
- 異質性検定：χ2（１ｄｄｌ）＝２２.６９ｐ＝２(１０-6、
- アレルの試験（頻度（Ｔ）対頻度（Ｃ））：χ2（１ｄｄｌ）＝２１.２７ｐ＝４(１０-6、
- １０４人の家族性の症例対２７２人のコントロール：
- 異質性検定：χ2（２ｄｄｌ）＝７.８０ｐ＝０.０２、
- アレルの試験（頻度（Ｔ）対頻度（Ｃ））：χ2（１ｄｄｌ）＝７.２７ｐ＝７(１０-3。
【００８５】
早期の症状を示す２４０人の患者においてロジスティック回帰によりオッズ比を推測した（性別とＡＰＯＥ−ε４の状況に応じて調整）。その結果も有意であった：ＯＲ＝３.９７、ＩＣ＝［２.２３−７.０９］。
【００８６】
得られた値は、複数の試験をボンフェローニの方法によって補正した後でも有意性を保持していた（閾値は０.０５に固定された）。
【００８７】
これらの結果から、ＡＢＣＡ２遺伝子は、アルツハイマー病の原因論において重要重要な遺伝子であることが示される。危険に関して、この結果は、これまで最も一般的に知られているアルツハイマー病の危険因子であるアポリポタンパク質Ｅ４によって生じる危険と同じオーダーであることを示す。
【００８８】
実施例２：トランスジェニックマウスの作製
１．ヒトＡＢＣＡ２タンパク質を発現するトランスジェニックマウスの作製
ヒトＡＢＣＡ２タンパク質の変異誘発は、スカルプター（Ｓｃｕｌｐｔｏｒ）TM（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ），フランス）のようなインビトロでの変異誘発システムを用いて行われる。ＡＢＣＡ２のコード領域を、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔタイプ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のクローニングベクターにクローニングし、製造元によって提供されるプロトコールに従って、望ましい突然変異を含むオリゴヌクレオチドを用いて突然変異を導入した。突然変異した配列は、配列解析で確認することができる。
【００８９】
２．ＡＢＣＡ２トランスジェニックマウスの作製および同定
トランスジーンを構築するために、ＡＢＣＡ２をコードし、ヒトｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを示すゲノムＤＮＡを、所定の組織／細胞型に特異的なトランスジェニック発現用のベクター［例えば、ニューロン型にはＴＨＹＩ（Ｌｕｅｔｈｉ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１７，４６８８〜９９頁）、ＰＤＧＦまたはプリオン、または、星状細胞型にはＧＦＡＰ］のポリリンカーにクローニングした。プラスミド調製キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて、スーパーコイルＤＮＡを製造する。マイクロインジェクションのために、ベクター配列を所定の制限酵素での消化によって除去し、無傷のトランスジーン全体を残し、それをクローニングベクターの不要な配列から分離する必要がある。次に、発現カセットを含む断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。
【００９０】
浮動性のフィルター（ミリポア；メンブレンタイプ：ＶＳ；０.０２５μｍ）で、マイクロインジェクションを目的とするアリコートをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７.４；０.１ｍＭのＥＤＴＡ）に対して透析し、次に、ろ過した（Ｓｐｉｎ−Ｘ；コースター（Ｃｏｓｔａｒ）；ポリアセテートメンブレン；０.２２μｍ）。マイクロインジェクションのために、ＤＮＡを最終濃度１〜２ｎｇ／μｌに希釈した。精製した断片を、受精させたマウス卵母細胞の２つの前核のうち一方に注入した。生存した胚を、（「偽妊娠の」）養母の輸卵管に即座移植した。新生児におけるトランスジーンの存在は、ＰＣＲまたはサザン解析のいずれかによって、特異的プローブ／配列を用いて決定された。これら全ての解析に基づいて、親とそれらの子孫におけるトランスジーンのあらゆる主要な転位または欠失を排除することが可能である。
【００９１】
３．ゲノムにヒトＡＢＣＡ２タンパク質を含むトランスジェニック動物の作製
幹細胞における相同組換え技術を用いて、ヒトｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを示すＡＢＣＡ２遺伝子をマウス遺伝子の望ましい所定の位置に導入した。対応するマウス遺伝子を単離し、クローニングするために、本発明で説明されているプライマーおよびサンプルを用いて、同質遺伝子型のマウスのゲノムライブラリー（ラムダ、ＢＡＣ、ＹＡＣなどのライブラリー）を容易にスクリーニングすることができる。前記マウス遺伝子は、ヒトＤＮＡが挿入されたと予想される正確な部位を定義するために、当業者既知の標準的な技術（制限部位  マッピング、配列解析、生物学的な分析ツール）を用いてそのゲノム構成および配列に関して特徴付けられ、ヒトＤＮＡに関する望ましい発現の特徴を得ることができ、それと同時に、最終的にマウス遺伝子の発現を妨害することができる。正確な位置が同定されたら、幹細胞用の標準的なターゲティングベクター（すなわち望ましい事象を選択するためのマーカーを有するベクターであり、前記マーカーはいずれも当分野に特化した当業者に周知である）を構築した。迅速に、選択カセット（抗生物質耐性遺伝子）を、選択された挿入部位の直後に位置するマウスのＡＢＣＡ２遺伝子配列の３’および５’伸長部と同一なマウスのゲノムＤＮＡ断片（２〜６ｋｂ）の３’および５’末端の境界に置いた。
【００９２】
ハイスループットスクリーニングの手順を最適化し、有効にするために、マウス遺伝子知見に基づき組換え幹細胞をスクリーニングするためのポジティブコントロールベクターを作製した（組込みがうまく起これば、ベクターは、マウス遺伝子の遺伝子座を再現する）。
【００９３】
ターゲティング実験のために、標準的な手法に従ってＤＮＡを精製した。標準化されたエレクトロポレーション技術を用いてターゲティングベクターを幹細胞に導入し、その後、望ましい組換えを有する幹細胞のクローニングが促進されるように、幹細胞クローンを連続的なスクリーニング手順（抗生物質）で処理した。一般的に、スクリーニングは、約２週間かかる。耐性幹細胞クローンを、ＰＣＲおよび／またはサザンによってスクリーニングした。
【００９４】
望ましい組換えを有し、かつゲノム中にその他の検出可能な改変をまったく含まない幹細胞のクローンを、十分な細胞が得られるように発達させた。次に、前記細胞を、自然に排卵したメスから得られた３日半の胚に注入した。生存した胚細胞（上記幹細胞を含む）を、レシピエントのメスに移植し、このメスは、胚細胞を発達させ、宿主胚細胞および幹細胞クローン由来の細胞で構成された新生の若いマウスを産むと予想される。この種の動物は「キメラ動物」と称される。
【００９５】
これらのキメラ（幹細胞系のほとんどはオスマウスから得られるため、好ましくはオス）は、野生型マウスと適合しており、改変に関してヘテロ接合型の動物を得ることができる。ヘテロ接合型の動物を互いに繁殖させることによって、ホモ接合型の動物を作製することができる。
【００９６】
４．対応する遺伝子にヒトＡＢＣＡ２遺伝子のｒｓ９０８８３２多型のマイナーアレルを含むトランスジェニック動物の作製
マウス遺伝子を、上記と同様にして単離し、特徴付けた。このタイプの改変に関して、ヒトで見出される突然変異点がマウス遺伝子に導入されているはずの正確な位置を同定するために、ヒト遺伝子とマウス遺伝子とを比較することが必須である。この段階で、生物学的な分析が必須である。最終的に、上記と同様にしてターゲティングベクターを開発し構築した。相同組換えが成功した後、望ましい突然変異点がマウス遺伝子のコード配列において変化していただけであった。いくつかの選択マーカーがイントロンに残存したままであったが、一般的には上記遺伝子の発現に影響はない。必要に応じて、これらは、第二のリコンビナーゼ認識要素を含むターゲティングベクター作製を用いて除去できる。コンストラクトが構築されたら、工程は、上述の手順の工程と同一である。
【００９７】
一般的に、これらのＡＢＣＡ２トランスジェニックマウスは、アミロイドプラークの沈着を促進するために、家族性のタイプのアルツハイマー病の突然変異を含むＡＰＰ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスと都合よく交雑されると予想される。
【００９８】
５．神経組織病理学
脳組織の調製
マウスを強く麻酔し（ペントバルビタール：腹腔内に６０ｍｇ／ｍｌ／ｋｇ、ケタミン：腹腔内に４０ｍｇ／ｍｌ／ｋｇ）、次に、生理食塩水、次にパラホルムアルデヒド（４％ＰＢＳ溶液）で経心臓的に潅流した。続いて脳を除去し、次に、同じ固定溶液で、４℃で２４時間、後固定した。固定後に、脳を右半分と左半分の脳に分離し、次に、パラフィン埋め込みの標準的なプロトコールで処理した。
【００９９】
トランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウスのパラフィンに埋め込んだ左半分の脳、さらにアルツハイマー病に罹った個体と、コントロール個体からの、死後のヒトの脳組織（前頭皮質）のブロックを、マイクロトーム（ＬＥＩＣＡ  ＲＭ２１５５，フランス）を用いて厚さ６μｍに切り出した（連続切片）。トランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウスの右半分の脳に相当する組織ブロックを、厚さ２５μｍに切り出した。
【０１００】
Ａβアミロイドペプチドに関する免疫反応性は、当業者により一般的に説明されているようにして検出される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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