(57)【要約】  患者の口腔からのサンプルを分析することにより患者の歯周病を診断するためのテストキット。テストキットは、細菌に由来する第一の物質を検出するための少なくとも一の第一の検出アッセイ、および患者の免疫系または炎症系に由来する第二の物質を検出するための少なくとも一の第二の検出アッセイを含む。最も好ましくは、前記第一の物質は、細菌性毒性産物、たとえばPorphyromonas gingivalis由来のarg−ジンジパインであり、前記第二の物質は、ヒトの好中球エラスターゼである。
2007519923.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の口腔からのサンプルを分析することにより患者の歯周病を検出するためのテストキットであって、
細菌に由来する第一の物質を検出するための第一の検出アッセイ、および
患者の免疫系または炎症系に由来する第二の物質を検出するための第二の検出アッセイ
を少なくとも含むテストキット。
【請求項２】
前記第一の検出アッセイが、細菌に由来する前記第一の物質を結合するための結合部位を有する少なくとも一の第一の親和性リガンドを含み、
前記第二の検出アッセイが、患者の免疫系または炎症系に由来する前記第二の物質を結合するための結合部位を有する少なくとも一の第二の親和性リガンドを含む、請求項１に記載のテストキット。
【請求項３】
前記第一の物質が細菌性毒性産物である、請求項１または２に記載のテストキット。
【請求項４】
前記第一の物質が酵素である、請求項３に記載のテストキット。
【請求項５】
前記酵素がプロテアーゼである、請求項４に記載のテストキット。
【請求項６】
前記プロテアーゼが、Porphyromonas gingivalis由来のarg−ジンジパイン（arg-gingipain）およびBacteroides forsythus由来の48 kDaプロテアーゼから成る群より選択される、請求項５に記載のテストキット。
【請求項７】
前記第一の物質が毒素である、請求項３に記載のテストキット。
【請求項８】
前記毒素が、Actinobacillus actinomycetemcomitans由来のロイコトキシンである、請求項７に記載のテストキット。
【請求項９】
前記第二の物質が白血球産物である、先行する請求項の何れかに記載のテストキット。
【請求項１０】
前記白血球産物が天然のセリンプロテアーゼである、請求項９に記載のテストキット。
【請求項１１】
前記天然のセリンプロテアーゼがヒトの好中球エラスターゼである、請求項１０に記載のテストキット。
【請求項１２】
前記第二の物質がサイトカインである、請求項１〜８の何れかに記載のテストキット。
【請求項１３】
前記サイトカインがインターロイキンである、請求項１２に記載のテストキット。
【請求項１４】
前記インターロイキンが、インターロイキン−１β、インターロイキン−６およびインターロイキン−８の中から選択される、請求項１３に記載のテストキット。
【請求項１５】
前記サイトカインが炎症性メディエイターである、請求項１２に記載のテストキット。
【請求項１６】
前記炎症性メディエイターが、腫瘍壊死因子−αおよびプロスタグランジンE2から成る群より選択される、請求項１５に記載のテストキット。
【請求項１７】
前記第一の親和性リガンドが、前記第一の物質の選択的結合を示す第一の抗体であり、前記第二の親和性リガンドが、前記第二の物質の選択的結合を示す第二の抗体である、請求項２〜１６の何れかに記載のテストキット。
【請求項１８】
前記第一および第二の検出アッセイの各々が、免疫クロマトグラフィーアッセイを提供する、請求項１７に記載のテストキット。
【請求項１９】
前記サンプルを受容するためのサンプル貯蔵所を備えた支持体を更に含み、
前記第一および第二の検出アッセイが、前記サンプル貯蔵所と直接接して、または前記サンプル貯蔵所を前記検出アッセイから分離する取り外し可能に配置された分離手段を介して接して、前記支持体上に配置される、
先行する請求項の何れかに記載のテストキット。
【請求項２０】
前記検出アッセイのために前記サンプルを希釈し適合させるための追加のバッファーを更に含む、先行する請求項の何れかに記載のテストキット。
【請求項２１】
前記サンプル貯蔵所とは別にバッファー貯蔵所を更に含む、請求項２０に記載のテストキット。
【請求項２２】
前記サンプルを得るための少なくとも一のサンプリングデバイスを更に含む、先行する請求項の何れかに記載のテストキット。
【請求項２３】
歯周病を検出するための、先行する請求項の何れかに記載のテストキットの使用。
【請求項２４】
歯周病を診断する、および/または前記疾患の進行についてリスクを予測する方法であって、
細菌に由来する少なくとも一の第一の物質の存在、および患者の免疫系または炎症系に由来する第二の物質の存在について、患者の口腔からのサンプルを分析することを含む方法。
【請求項２５】
前記第一の物質が細菌性毒性産物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第一の物質が酵素である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記酵素がプロテアーゼである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プロテアーゼが、Porphyromonas gingivalis由来のarg−ジンジパイン（arg-gingipain）およびBacteroides forsythus由来の48 kDaプロテアーゼから成る群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第一の物質が毒素である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記毒素が、Actinobacillus actinomycetemcomitans由来のロイコトキシンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第二の物質が白血球産物である、請求項２４〜３０の何れかに記載の方法。
【請求項３２】
前記白血球産物が天然のセリンプロテアーゼである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記天然のセリンプロテアーゼがヒトの好中球エラスターゼである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第二の物質がサイトカインである、請求項２４〜３０の何れかに記載の方法。
【請求項３５】
前記サイトカインがインターロイキンである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３６】
前記インターロイキンが、インターロイキン−１β、インターロイキン−６およびインターロイキン−８の中から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記サイトカインが炎症性メディエイターである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記炎症性メディエイターが、腫瘍壊死因子−αおよびプロスタグランジンE2から成る群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記分析が、前記第一の物質の存在を選択的に検出する第一の方法および前記第二の物質の存在を選択的に検出する第二の方法を用いて、前記サンプルを分析することを含む、請求項２４〜３８の何れかに記載の方法。
【請求項４０】
前記第一の方法が、前記第一の物質の選択的結合を示す第一の抗体を使用することを含み、前記第二の方法が、前記第二の物質の選択的結合を示す第二の抗体を使用することを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第一および第二の方法の少なくとも一つが、免疫クロマトグラフィーアッセイを使用することを含む、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病を検出するためのテストキットに関する。更に本発明は、歯周病の診断、および歯周病の進行に関するリスクの予測のための方法に関する。
【技術背景】
【０００２】
歯周炎は、西側世界において成人の約7-15％に影響を及ぼし、これにより我々の最も多発する疾患の一つになっている。歯周病は、多因子疾患であり、歯と歯茎の間のポケットに病原性細菌が存在することが、必要であるが十分ではない診断基準である。宿主の炎症系および免疫系も、当該疾患の発症において重大な役割を果たす。歯周病の進行は、歯肉下の細菌に対する慢性炎症反応の結果、歯の支持組織の破壊につながると考えられる。歯周病は、その挙動が周期性であり、その初期段階には気付かれないままのことがある。
【０００３】
その破壊プロセスは、宿主の防御システムと歯周ポケットにおける特定の細菌種との間の複雑な相互作用の結果であると考えられる。歯周病の出現および進行に関与する病原性細菌には、Porphyromonas gingivalis（以前はBacteroides gingivalis）、Bacteroides forsythus（今日Tannerella forsythensisとも称される）、Actinobacillus actinomycetemcomitans、Triponema denticolaおよびPrevotella intermediaが含まれるが、これらに限定されない。
【０００４】
近年、細菌の毒性産物（主として毒素および酵素）の重要性が広く研究され、その病因に主要な役割を果たすと信じられている（Eley and Cox (2003)）。細菌は、様々な増殖期を経て、これら増殖期の間に歯周ポケットにおいて多かれ少なかれ破壊的であると考えられる。活性な細菌は、毒性産物を産生して、歯周ポケットでの生存および栄養摂取を助ける。この毒性産物は、高い細菌活性の期間に、歯の支持組織の破壊および宿主の防御システムの有効性の低減に寄与する。
【０００５】
今日、歯科医は、歯周ポケットのプロービング深さを測定し、歯槽骨への歯のアタッチメントのＸ線画像を検査し、プロービングによる出血を調べることにより歯周炎を評価する。危険因子には、喫煙習慣、ストレスおよび歯周炎の家族歴が含まれる。この方法は、歯科医の主観的な専門的技術に大きく依存する。プロービング深さは、過去のアタッチメントの減少の測定のみであり、歯周炎の実際の発生や歯周炎の将来的な進行にほとんど有用ではない。プロービングによる出血は、破壊プロセスの代わりに治癒プロセスを示すことができる。
【０００６】
時折、微生物サンプルを採取し、培養またはDNA技術（Socransky (1994)により開発されたチェッカーボードDNA-DNAハイブリダイゼーション技術）の何れかによる分析のためにラボに送る。しかし、その回答は約１週間で得られるが、ある種の細菌の存在を示すのみであり、これは歯周炎を必ずしも示すものではない。
【０００７】
歯周炎を診断するか、または歯周炎の進行を予測することができる化合物、主としてタンパク質、たとえば酵素またはサイトカインを、患者の口腔からの流体中、たとえば歯肉溝滲出液（gingival crevicular fluid (GCF)）中に見出すために、多大な研究がなされている。
【０００８】
今日までに、幾つかのテストおよびアッセイが開発されている（Armitage (2003)）。これらアッセイは、細菌、細菌性毒性産物、または宿主タンパク質の同定を専門としている。
【０００９】
歯周炎の診断または予後の値について調査された宿主由来のタンパク質には、ヒトの炎症系に由来する産物が主に含まれる。これらタンパク質の役割は、炎症および免疫応答を組織化して、組織のリモデリングをすること、または侵入する細菌の殺傷を助けることである。
【００１０】
最も研究された歯周炎診断用の宿主由来タンパク質には、天然のセリンプロテアーゼ（カテプシンＧ、アズロシジン、プロテイナーゼ３、エラスターゼ）、コラゲナーゼ、アミノトランスフェラーゼ（米国特許第4,981,787号、第5,834,226号および第4,801,535号）、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ（米国特許第6,277,587号）、ジペプチジルペジダーゼ、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（米国特許第5,866,432号）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（米国特許第5,736,341号および第6,280,687号）およびサイトカイン、たとえばインターロイキン（特にIL-1β（米国特許第5,328,829号）、IL-6およびIL-8）および炎症性メディエイター、たとえばプロスタグランジンE2および腫瘍壊死因子α（TNF-α）が含まれる。
【００１１】
マトリックスメタロプロテイン（MMP’s）は、歯周病のマーカーとして提案されている。米国特許第5,736,341号は、MMP-8の存在を検出することを開示し、米国特許第5,866,432号は、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンの存在を検出することを開示し、米国特許第6,280,687号は、MMP-13の存在を開示する。これら３つの特許は、歯周炎の診断および進行予測のための、免疫クロマトグラフィー原理に基く迅速なチェアーサイドテストを提案する。しかし、American Association of Periodontology by Oringer (2002) からの情報論文では、歯周病の進行におけるMMP’sの役割を証明するためには更なる研究が必要であることが議論されている。
【００１２】
米国特許第6,406,873号は、二つの炎症性メディエイター（プラスミノゲン活性化因子阻害剤２および組織プラスミノゲン活性化因子）は、単独または組み合わせて、歯周炎を診断可能であると主張する。
【００１３】
米国特許第5,248,595号は、３つまでの異なる歯周病病原体を同時に分析する方法を記載する。
【００１４】
Chapple (1997) は、従来および現在において使用される歯周病診断の方法を概説し、マーカーの検出、たとえば歯肉溝滲出液（gingival crevice fluid）におけるアルカリホスファターゼの存在の検出は、臨床的評価、たとえば組織の色を分析し、ポケットの深さを探針で探り（probe）、歯の易動性を測定することと比較して、感受性および特異性が高いと結論づける。また、Chappleは、かかるマーカーの二つ以上を組合せることにより、進行中または将来の疾患活性を診断するための最も正確な手段が得られるかもしれないと結論づけるが、かかる組合せを示していない。
【００１５】
Jin et al. (1999) は、歯周ポケットにおいてDNAプロービング法を用いることにより、歯周病病原体、すなわち細菌の存在と歯肉溝滲出液（GCF）中のエラスターゼとの間の関係を調査した。
【００１６】
Nisengard et al. (1992) は、P. gingivalis、A. actinomycetemcomitansおよびP. Intermediaの存在に関して、迅速なラテックス凝集テストを記載した。
【００１７】
Lamster et al (1994) は、臨床アタッチメントの減少およびそれとヒト白血球由来のβ−グルクロニダーゼとの関係を調査した。
【００１８】
Eley and Cox (1996) は、P. gingivalis由来のジンジパインに特異的な酵素基質に基くチェアーサイドテストを開発した。
【００１９】
今日までに、歯周病活性を評価するための多くの方法が開発されている。しかし、これらの上記方法はいずれも、歯周病およびその破壊パターンを診断するのに十分特異的で感受性のあるアッセイを提供していない。非特異的な方法の一つの結果として、何人かの患者が、歯周病に実際に罹っていないのに治療されるということがある。深さポケットが進行中の炎症を必ずしも有しておらず、正確な診断を得るためにはラジオグラフィーの評価を詳細な臨床観察と併用しなければならず、歯周ポケットに病原性細菌が単に存在することが疾患活性を正確に反映していないため、プロービング深さなどの臨床観察は、十分に信頼できない。更に、宿主または細菌由来のタンパク質に対する酵素的方法に基くこれまでに開発された診断は、酵素基質が多数の種々の酵素により開裂され得るという事実のために、十分に特異的ではなかった。
【００２０】
また、種々のサイトカインが研究されているが、迅速で特異的なテストは設計されていない。
【００２１】
このため、歯科医は、好ましくは
−迅速で、数分以内に結果が得られる、
−最小限の時間と作業労力を必要とする、
−頑丈で、診療室の環境で手荒に処置可能である、
−容易に解釈される結果を提供する、
−室温または冷蔵庫で長期の貯蔵寿命を有する、
−歯科診療室にそのトレイを備え付け、環境にやさしく、優れた患者の情報材料を提供する、
チェアーサイドテストキットを必要としている。
【発明の概要】
【００２２】
本発明の一つの目的は、従来技術の欠点を解消し、歯科医の現在の要求を満たすテストキットを提供することである。より具体的には、本発明は、特異的で、感受性がよく、使用し易い歯周病を検出するためのキットおよび方法を提供することを目的とする。
【００２３】
本発明の発明者らは、細菌に由来する物質およびヒトの免疫系または炎症系に由来する物質の共存を検出することを含む方法が、本目的のために使用可能であることを見出した。
【００２４】
本発明は、歯科医および歯科衛生士の手助けとなって、更に効果的な歯周病治療を患者に提供するために使用することができる。本発明のテストキットおよび方法は、疑わしい歯をスクリーニングするため、以前の治療を追跡するため、最適な形態の治療を決定するため、正しい種類の抗生物質を選択するため、望ましい毎日の歯科衛生の重要性を患者に伝えるために使用することができる。
【００２５】
第一の側面において、本発明は、患者の口腔からのサンプルを分析することにより患者の歯周病を診断するためのテストキットであって、細菌に由来する第一の物質を検出するための第一の検出アッセイ、および患者の免疫系または炎症系に由来する第二の物質を検出するための第二の検出アッセイを含むテストキットに関する。
【００２６】
好ましくは、本発明は、患者の口腔からのサンプルを分析することにより患者の歯周病を診断するためのテストキットであって、細菌に由来する第一の物質を結合するための結合部位を有する少なくとも一の第一の親和性リガンドを含む第一の検出アッセイ、および患者の免疫系または炎症系に由来する第二の物質を結合するための結合部位を有する少なくとも一の第二の親和性リガンドを含む第二の検出アッセイを少なくとも含むテストキットに関する。
【００２７】
好ましくは、前記患者は哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００２８】
前記第一の検出アッセイからの結果と前記第二の検出アッセイからの結果とを組み合わせて使用して歯周病を検出する。
【００２９】
好ましくは、前記第一の物質は、前記細菌により産生されるタンパク質である。好ましくは、前記タンパク質は、細菌性毒性産物であり、より好ましくは、酵素または毒素である。好ましい酵素は、プロテアーゼであり、たとえば、Porphyromonas gingivalis由来のarg−ジンジパインおよびBacteroides forsythus由来の48 kDaプロテアーゼである。有利な毒素の例は、Actinobacillus actinomycetemcomitans由来のロイコトキシンである。
【００３０】
前記第二の物質は、好ましくは白血球、サイトカイン、またはヒト炎症性メディエイターである。好ましい白血球は、天然のセリンプロテアーゼであり、より好ましくはヒトの好中球エラスターゼである。好ましいサイトカインは、インターロイキン−１β、インターロイキン−６およびインターロイキン−８である。有利な炎症性メディエイターの例は、腫瘍壊死因子−αである。
【００３１】
細菌性由来の第一の物質および上記第二の物質、好ましくはヒトの好中球エラスターゼの共存は、活性な細菌および活性な免疫系または炎症系の両方を示すはずであり、これは歯周破壊を示す。
【００３２】
歯周病が多因子疾患であることが科学界で十分確立されていたとしても、サンプル中の細菌および宿主由来の産物の両方を分析するテストが未だに開発されていないことは明らかである。
【００３３】
テストキットは、上述のとおり細菌または患者の免疫系または炎症系に由来する（好ましくは細菌に由来する）第三の物質を結合するための結合部位を有する少なくとも一の第三の親和性リガンドを含む第三の検出アッセイを含んでいてもよく、幾つかの態様においては、追加の物質の結合のための更なる検出アッセイを更に含んでいてもよい。
【００３４】
好ましくは、第一の親和性リガンドは、前記第一の物質の選択的結合を示す抗体であり、第二の親和性リガンドは、前記第二の物質の選択的結合を示す抗体である。
【００３５】
抗体は、開発され交差反応について試験されると、ターゲットに対して非常に特異的であり、酵素以外の化学物質（たとえば毒素およびサイトカイン）を検出することが可能であるため、抗体の使用は、他の方法（たとえば酵素的方法）より有利である。更に、新規抗原に対して新規抗体を開発する方法は、当業者に周知である。
【００３６】
好ましくは、本発明のテストキットにおける前記検出アッセイは、免疫クロマトグラフィーアッセイを含む。
【００３７】
免疫クロマトグラフィーアッセイ/方法を使用する利点は、これらが容易に作成され使用されること、長期貯蔵寿命を有していること、迅速に回答が得られること、検出目的の物質に対して非常に特異的に設計することができることである。
【００３８】
前記テストキットは、サンプルを受容するためのサンプル貯蔵所を備えた支持体を更に好ましくは含み、前記第一および第二の検出アッセイは、前記サンプル貯蔵所と直接接して、または前記サンプル貯蔵所を前記検出アッセイから分離する取り外し可能に配置された分離手段を介して接して、前記支持体上に配置される。前記キットは、好ましくは前記サンプル貯蔵所とは別にバッファー貯蔵所中に、前記検出アッセイのために前記サンプルを希釈し適合させるための追加のバッファーを含んでいてもよいし、サンプルを得るための少なくとも一のサンプリングデバイスを含んでいてもよい。
【００３９】
本発明のテストキットに具備される個々の検出アッセイは、一緒に提供されてもよいし別々に提供されてもよい。検出アッセイが別々に販売される場合、同時に採取されるGCF等のサンプルは、各アッセイで別々に分析され、その結果は、歯周病の診断のために組合せられる。
【００４０】
本発明のテストキットおよび方法は、歯周病のためのチェアーサイドテストを備え、このテストにおいて歯科医または歯科衛生士は、歯周ポケットからたとえばGCFサンプルを採取する。サンプルは、テストキットで提供されるアッセイにより分析され、これらアッセイから得られる結果は、規定の基準に従って判断され、進行中の歯周病の発症を評価する。
【００４１】
第二の側面において、本発明は、歯周病を診断する、および/または前記疾患の進行についてリスクを予測する方法であって、細菌に由来する少なくとも一の第一の物質の存在および患者の免疫系または炎症系に由来する第二の物質の存在について、患者の口腔からのサンプルを分析することを含む方法に関し、第一および第二の物質は上記規定のとおりである。
【００４２】
更に、本発明の診断方法は、上述の追加の物質の存在を検出する方法を含んでいてもよい。
【００４３】
好ましくは、本発明の方法は、前記第一の物質の選択的結合を示す第一の抗体を使用することを含み、前記第二の方法は、前記第二の物質の選択的結合を示す第二の抗体を使用することを含む。
【００４４】
より好ましくは、前記第一および第二の方法の少なくとも一つは、免疫クロマトグラフィーアッセイを使用することを含む。
【発明の詳細な説明】
【００４５】
本発明は、患者の口腔からのサンプルを分析することにより患者の歯周病を検出するためのテストキットであって、細菌に由来する第一の物質を結合するための結合部位を有する少なくとも一の第一の親和性リガンドを含む第一の検出アッセイ、および患者の免疫系または炎症系に由来する第二の物質を結合するための結合部位を有する少なくとも一の第二の親和性リガンドを含む第二の検出アッセイを少なくとも含むテストキットに関する。
【００４６】
好ましくは、患者の口腔からの前記サンプルは、歯肉溝滲出液、ペリ−インプラント溝液、唾液または口内洗浄サンプルである。
【００４７】
歯肉溝滲出液（GCF）は、歯周ポケットから口腔へ流れる流体である。炎症の起こっている場合、GCFは、炎症細胞、細菌およびそれらの副生成物をそれぞれ含有し、その含有物は、破壊性歯周炎のためのマーカーとして使用され得る。GCFの採取は低侵襲的処置であり、その流体は、生化学的インジケーターの定量的な出所を提供し、これは、患者の応答および細菌の攻撃を反映するものである。
【００４８】
ペリ−インプラント溝液は、歯を歯科インプラントに置換した場合のGCF相当物であり、すなわちインプラントの部位から口腔へ流れる流体である。
【００４９】
第一および第二の物質の部位特異的検出を望む場合、調査される歯の表面それぞれから別々のサンプルを得ることが可能であるため、GCFおよびペリ−インプラント溝液が好ましい。
【００５０】
唾液または口内洗浄サンプルは、部位特異的でない検出または診断を達成するために使用することができる。
【００５１】
ここで使用される「歯周病」および歯周炎の用語は、その最も広い意味で解釈され、歯周炎、インプラント周囲炎（peri-implantatis）（インプラントを支持する組織が崩壊する）、および1999 International workshop for classification of periodontal diseases and conditionsで定義される他の形態の歯周病などの疾患を包含する。
【００５２】
歯周病病原性細菌、たとえばPorphyromonas gingivalis、Bacteroides forsythus、Actinobacillus actinomycetemcomitans、Triponema denticolaおよびPrevotella intermediaは、歯周病の進行に至ることなく、口腔、および歯と健康な歯茎との間のポケットに存在することができる。細菌は、活性になるために、ある増殖条件および栄養の存在を必要とする。活性な細菌は、毒性産物（たとえば上述の毒素および酵素）を産生し、その生存および栄養摂取を助ける。
【００５３】
Porphyromonas gingivalisおよびBacteroides forsythusは、約50 kDaの分子量のトリプシン様セリンプロテアーゼとして公知のタンパク質分解酵素を産生する。P. gingivalis由来のプロテアーゼの一つは、arg-ジンジパインと称され、B. forsythus由来のプロテアーゼの一つは、48 kDaプロテアーゼである。Actinobacillus actinomycetemcomitansは、116 kDaロイコトキシンを産生し、これは、孔形成（pore-forming）ロイコトキシンのリピート−イン−トキシン（repeats-in-toxin）エキソプロテインファミリーのメンバーであり、ヒトの多形核白血球に対して特異的に細胞毒性がある。
【００５４】
好ましい態様において、前記第一の物質は、細菌性毒性産物、好ましくは酵素、たとえばプロテアーゼ、より好ましくはPorphyromonas gingivalis由来のarg−ジンジパイン、およびBacteroides forsythus由来の48 kDaプロテアーゼ、または毒素、より好ましくはActinobacillus actinomycetemcomitans由来のロイコトキシンである。
【００５５】
毒性産物の存在は、宿主の炎症応答および免疫系を誘発し、これにより防御系細胞、たとえば多形核（PMN）白血球を感染部位に集めることができる。
【００５６】
白血球は、感染部位において多量の細菌および細菌性産物を処理することはできず、白血球粒状物由来の酵素が歯周ポケットに放出される。これら酵素は、侵入する細菌を殺傷することを本来の目的とするものであり、周囲の組織に対して非常に破壊的である。ヒトの好中球エラスターゼは、歯の周囲の支持組織の多くを分解することが示されている。エラスターゼは、歯周ポケットにおいてそのプロテアーゼ阻害剤（α-1アンチトリプシン）に結合することがしばしば見出されている。しかし、P. gingivalis由来のプロテアーゼは、ヒト血清においてプロテアーゼインヒビターのα-1アンチトリプシンおよびα-2マクログロブリンを分解して、歯周ポケットまたはペリ−プラントポケットにおいて高い破壊形態でエラスターゼを放出することが示されている。
【００５７】
ここで使用される「免疫系または炎症系に由来する」物質は、免疫系または炎症系に関与する細胞に由来する物質を指す。かかる物質は、前記細胞から分泌されてもよいし、かかる細胞の溶解に由来してもよく、たとえば免疫および炎症応答を組織化するか、または組織のリモデリングもしくは侵入する細菌の殺傷を行う。
【００５８】
第二の物質は、白血球産物、たとえば天然のセリンプロテアーゼ、好ましくはヒトの好中球エラスターゼまたはサイトカイン、たとえばインターロイキン−１β、インターロイキン６およびインターロイキン−８から好ましくは選択されるインターロイキン、または炎症性メディエイター、好ましくは腫瘍壊死因子−αまたはプロスタグランジンE2であり得る。
【００５９】
より好ましくは、前記第二の物質は、ヒトの好中球エラスターゼである。
【００６０】
本発明の検出に適した患者の免疫系または炎症系に由来する他の物質には、コラゲナーゼ、アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、ジペプチジルペジダーゼ、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンおよびマトリックスメタロプロテイナーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
最も好ましくは、前記第一の物質は、細菌性毒性産物であり、前記第二の物質は、ヒトの好中球エラスターゼである。
【００６２】
少なくとも一の細菌由来の第一の物質および上述の第二の物質、好ましくはヒトの好中球エラスターゼの共存は、活性な細菌および活性な免疫系または炎症系の両方を示すはずであり、これは歯周病を示唆する。よって、少なくとも前記第一の物質および前記第二の物質の共存を検出することが有利である。
【００６３】
幾つかの例において、本発明のテストキットは、前記サンプルにおいて追加の物質を検出するための追加の検出アッセイを含み、好ましくは、かかる追加の物質は、上述の細菌由来の物質から選択される。
【００６４】
好ましい態様において、本発明のテストキットでは、前記第一の親和性リガンドは、前記第一の物質への選択的結合を示す第一の抗体を含み、前記第二の親和性リガンドは、前記第二の物質への選択的結合を示す第二の抗体を含む。
【００６５】
ここで使用される「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成で作成される抗体または抗体等価物およびその機能的フラグメントを指す。
【００６６】
本発明にとって特別興味深い抗体は、上述の第一または第二の物質の何れかに特異的に結合する抗体である。ヒトの好中球エラスターゼに対する抗体は、MP Biomedicalsから商業的に入手可能である。A. actinomycetemcomitans由来のロイコトキシンに対する抗体は開発されており（Johansson et al. 2000）、P. gingivalis由来のプロテアーゼに対する抗体も開発されている（Nakagawa et al. 2001）。
【００６７】
ここで使用される「アッセイ」は、サンプル中の一または複数の物質の存在を検出する、および/またはその量を決定するための手段をいう。アッセイでの分析から得られる結果は、検出可能な応答であり、たとえば色、蛍光、吸光度および/または発光の変化、伝導度の変化、放射能の変化等である。
【００６８】
本発明のテストキットでの使用に適した検出アッセイは、幾つかの免疫学的方法のものに基くことができる。かかる方法には、免疫クロマトグラフィー方法、免疫測定方法、免疫凝集方法、蛍光免疫学的方法、免疫発光方法、濁度測定（turbidimetric）免疫学的方法、ELISAおよび比濁分析（nephelometric）方法が含まれるがこれらに限定されない。
【００６９】
本発明のテストキットの好ましい態様において、前記第一および第二の検出アッセイは、免疫クロマトグラフィーアッセイ、好ましくは、ラテラルフローテスト（lateral flow test）として実行されるいわゆる「ストリップテスト（strip-test）」として具体化されるものを提供する。当業者に公知の、免疫クロマトグラフィーアッセイの幾つかの種々の変形例が存在する。それぞれの免疫クロマトグラフィーアッセイは、好ましくは、検出すべき物質の異なるエピトープに特異的な二つの抗体を使用する。
【００７０】
更に、二以上の検出アッセイを単一のストリップテストに適合させ、その結果、二以上の物質の存在を単一のストリップ上で特異的に検出することができる。
【００７１】
更に、免疫クロマトグラフィーアッセイは、当業者に知られているとおり、ポジティブシグナルを得るために、予め規定された閾値量の探索物質をサンプル中に必要とするように設計することができる。
【００７２】
また本発明は、歯周病を診断する、および/または前記疾患の進行についてリスクを予測する方法であって、細菌に由来する少なくとも第一の物質の存在および患者の免疫系または炎症系に由来する第二の物質の存在について、患者の口腔からのサンプルを分析することを含む方法に関する。
【００７３】
本発明の方法において、患者の口腔からのサンプルおよび第一および第二の物質は、上述のとおりである。
【００７４】
また幾つかの例において、本発明の診断方法は、前記サンプル中に上述の追加の物質の存在を検出する工程を更に含む。
【００７５】
本発明の診断方法の好ましい態様において、前記第一の方法は、前記第一の物質の選択的結合を示す第一の抗体を使用することを含み、前記第二の方法は、前記第二の物質の選択的結合を示す第二の抗体を使用することを含み、前記抗体は上述のとおりである。
【００７６】
最も好ましくは、前記第一および第二の方法の少なくとも一つは、免疫クロマトグラフィー方法を使用することを含む。
【００７７】
本発明の方法での使用に適した他の検出方法は、幾つかの免疫学的方法のものに基くことができる。かかる方法には、免疫クロマトグラフィー方法、免疫測定方法、免疫凝集方法、蛍光免疫学的方法、免疫発光方法、濁度測定免疫学的方法、ELISAおよび比濁分析方法が含まれるがこれらに限定されない。
【好ましい態様】
【００７８】
好ましくは、本発明のテストキットは、図１に図示されるとおり、サンプルを受容するためのサンプル貯蔵所４を備えた支持体３上に配置された、二つの免疫クロマトグラフィー検出アッセイ１、２を含む。二つの検出アッセイ１、２は、サンプル貯蔵所４と直接接して、または取り外し可能に配置された分離手段５を介して接して配置される。
【００７９】
サンプル貯蔵所４は、好ましくは支持材料で形成される。支持体３は、幾つかの異なる材料、たとえばプラスチック、紙、カートンまたはその組合せ、たとえばプラスチックとのラミネート紙から作成することができる。検出アッセイ１、２は、各アッセイのサンプル受容領域が、サンプル貯蔵所４と直接接するか、または取り外し可能に配置された分離手段５を介して接するように、支持体３上に固定される。前記分離手段５は、アッセイ上でサンプル受容領域を覆う取り外し可能なフォイル、アッセイから当該貯蔵所を分離するダム等であり得る。
【００８０】
キットは、前記検出アッセイのために前記サンプルを希釈し適合させるための追加のバッファー、および分析すべきサンプルを得るための少なくとも一のサンプリングデバイスを更に含んでいてもよい。使用に適したサンプリングデバイスのタイプは、分析すべきサンプルのタイプに依存し得る。たとえば、歯肉溝滲出液は粘性流体であり、小さなブラシ、デンタルフロス、ペーパーポイントまたは使い捨てピペットにより容易に収集することができる。唾液または口内洗浄サンプルを得るための他のサンプリングデバイスは、当業者に公知である。好ましくは、バッファーは、サンプル貯蔵所とは別に、バッファー貯蔵所に保存され、たとえば別々のフラスコ、支持体上に形成された追加の貯蔵所、またはサンプル貯蔵所に配置した穴開け可能なバッグにバッファーを提供することにより、保存される。
【００８１】
サンプルを得た後、検出アッセイに適したpH、イオン強度および粘度を得るために、サンプルは好ましくはバッファーと混合される。混合した後、サンプルをサンプル貯蔵所に移し、必要に応じて分離手段を移動させることにより、検出アッセイの受容領域と接触させる。
【００８２】
サンプルは、検出アッセイにより分析すべきタンパク質（抗原）の一つのエピトープに特異的な抗体でコーティングした小粒子（たとえばコロイド金またはラテックス）が液体フローによりピックアップされる別の領域に、セルロースストリップに沿って、キャピラリーフローにより移動する。サンプル中に存在する抗原は、抗体結合粒子に結合し、セルロースストリップに沿って更に移動する。キャピラリーフローの流路の更に下流に、抗原の別のエピトープを認識する別の抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）が、不可逆的にストリップに結合する。抗原を捕捉した粒子は、粒子とストリップ結合抗体との間に抗原が挟まれた状態で、第二の抗体が結合したストリップ上の領域に結合する。
【００８３】
充分な粒子が同じ領域に捕捉された場合、目に見えるライン（テストライン）が、ストリップ上に形成される。抗原を捕捉しなかった粒子は、ストリップを下降し続け、幾つかは、ファンクションコントロールラインで捕捉される。粒子は小さいため一つずつではヒトの眼に見えない。充分な粒子が同じ領域に捕捉された場合のみ、目に見えるラインが形成される。
【００８４】
上記方法は、両ストライプでほぼ同時に行い、これにより分析される物質の各々について数分以内に一つの結果が得られる。
【００８５】
本発明の上述の好ましい態様および以下の実験は、説明の目的のみを意図しており、本発明を限定するものと解釈すべきではない。本発明の範囲は、添付のクレームにより規定される。
【実験】
【００８６】
材料と方法
以下の研究のためのサンプルは、スウェーデン、クリシャンスタードの行政歯科サービス（Public dental service）、歯周療法部門（Department of Periodontology）に歯周治療のためにまわされた16人のボランティアから得た。患者の年齢は、28〜54才で、平均40才であった。すべての個人が、プロービング深さが6 mm以上の少なくとも3つの部位を別々の歯に有していた。患者は、ここ6ヶ月の間に、医学的に欠陥があったり、歯周治療および/または抗生物質による治療を受けたりしなかった。
【００８７】
サンプリングおよび臨床検査は、1週間の間隔で2回行った。酵素分析のためのサンプルは、微生物のサンプリングおよび臨床検査の前に集めた。1回目のサンプリングおよび検査は、任意の処置を施す前に行った（ベースライン、測定1）。2回目のサンプリングおよび検査は、1回目の処置の完了から6ヵ月後に行い（測定2）、3回目は、2回目の処置の完了から更に6ヵ月後に行った（測定3）。
【００８８】
ベースライン検査の後、すべての患者は、口腔衛生指導、および全歯列にわたって歯肉縁上および歯肉縁下のデブリドマンを受けた。嫌気性生物の生存総数に対しP. gingivalisが≧0.5％またはP. Intermediaが≧5％を占めるか、あるいは歯肉縁下サンプルにA. actinomycetemcomitansが存在するすべての部位で、2回目の処置期間に、麻酔下で歯周の外科処置または歯石除去（rescaling）を行った。研究のために選択した他の部位はすべて、歯肉縁上の研磨を受けた。
【００８９】
各患者から、最初のプロービング深さが≧6 mmである3〜10部位からサンプルを集めた。サンプリング領域を乾燥させ、コットンロールで隔離し、歯肉縁上では、無菌のキューレットおよび外科用綿撒糸を用いてプラークを注意深く除去した。酵素アッセイのために、3つの媒質ペーパーポイント（Johnson and Johnson, Windsor, NJ）を、歯周溝に約1 mm連続して挿入し、15秒間放置した。各ペーパーポイントの湿った部分を無菌のはさみで切断し、100μl 0.85% NaClを含有するミニソーブ（minisorb）チューブ（Nunc, Rosklide、Denmark）にプールした。サンプルをすぐに-20℃に、6時間以内に-80℃に凍結し、アッセイまで保存した。微生物の分析のために、抵抗性が満たされるまで、3つのペーパーポイントを歯周ポケットに連続して挿入し、15秒間放置した。そのポイントを、直径3 mmの10個のガラスビーズおよび3.3 mmのVMGA III輸送培地を含有するバイアルにプールし、好気的に調製し保存した。サンプルを24時間以内に処理した。細菌は、栄養強化ブルセラ寒天プレートで生育させ、適切な方法により同定した。
【００９０】
診断テストのための適切なカットオフ値を研究するために、ヒト好中球に由来するエラスターゼおよびP. gingivalisに由来するarg-ジンジパインを、選択的基質を用いて研究した。
【００９１】
重複サンプルの第一セットは、酵素アッセイのために使用した。すべてのサンプルは、氷上で解凍し、13,000×gで3分間遠心分離した。
【００９２】
P. gingivalis由来のarg-ジンジパインを測定するための酵素基質は、5% DMSOを含有するアッセイバッファー中で最終濃度1 mMであるN-ベンゾイル-L-アルギニン-p-ニトロアニリン（BAPNA）であった。アッセイバッファーは、50 mMグリシルグリシン（本発明者らによりUS 5,981,164特許で以前に報告されるとおり、gly-glyは、arg-ジンジパインの存在下でBAPNAを選択的に刺激する）および5 mM L-システインとともに5 mM CaClを含有する0.1 M Tris-HCl, pH 7.5であった。50μlの基質を添加する前に、10μlのサンプルを、ウシ血清アルブミンでプレコーティングした96ウェルマイクロタイタープレートのウェルにおいて、140μlのアッセイバッファーと15分間プレインキュベートした。プレートを加湿チャンバーにおいて37℃でインキュベートし、pNAの放出を、12〜36時間の間、数時間ごとに、マイクロタイタープレートリーダーを用いてOD405を読み取ることにより分光光度法で追跡した。1ユニットの活性は、1時間のインキュベーションの間に1 nmolの基質を開裂した酵素の量に等しい。
【００９３】
エラスターゼアッセイは、5μlのCGFを、145μlのアッセイバッファー（0.1 M Tris, 0.5 M NaCl, pH 7.5）を含有する96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに添加することにより行った。15分後、20% DMSOを含有するアッセイバッファー中の2 mMメトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-バリン-pNAの溶液50μlを添加することにより、反応を開始した。プレートを加湿チャンバーにおいて37℃でインキュベートした。pNAを放出する酵素反応を、12〜26時間の間、数時間ごとに、マイクロタイタープレートリーダー（Molecular Devices）を用いてOD405を読み取り、希釈された精製酵素の標準液と比較した。記録された読取り値を、時間に対してプロットし、プロットの直線部分からDA405/60分として酵素活性を計算した。エラスターゼの量は、部位あたりngで表示した。
【００９４】
P. gingivalisの増殖またはgly-gly刺激性BAPNA活性がみられるが、A. actinomycetemcomitansの増殖のみられない患者を、カットオフ研究に含めた。この基準により、8人の異なる患者から35部位が得られた。最初の処置から1年後の測定を、この限られた研究で使用した。圧力平衡状態のプローブを用いて歯周ポケットの底部から歯根セメント縁へと測定したアタッチメントの減少を、歯周病の更なる進行の測定値として使用した。エラスターゼおよびarg-ジンジパインは、それらの能力について分析し、更なるアタッチメントの減少を予測した。個々に、エラスターゼのカットオフレベルを、部位あたり20 ngに設定し、arg-ジンジパインについては、部位あたり0.27ユニットに設定した。
【００９５】
結果
【表１】
2007519923.tif 000003
【００９６】
更なるアタッチメントの減少の予測指標であるエラスターゼでは、50％の感受性および93％の特異性が得られた。フィッシャーの直接確率検定を用いて、0.0264*のp-値が計算された。
【表２】
2007519923.tif 000004
【００９７】
更なるアタッチメントの減少の予測指標であるarg-ジンジパインでは、100％の感受性および55％の特異性が得られた。フィッシャーの直接確率検定を用いて、0.0216*のp-値が計算された。
【００９８】
エラスターゼおよびarg-ジンジパイン単独では、感受性または特異性の何れかが犠牲にされなければならなかった。このため我々は、二つの酵素の組合せを調査することを進めた。我々は二つの酵素について新たなカットオフレベルを調査し、エラスターゼの検出限界は部位あたり2 ngにすべきであり、arg-ジンジパインについては0.30ユニットにすべきであることを見出した。
【表３】
2007519923.tif 000005
【００９９】
更なるアタッチメントの減少の予測指標であるエラスターゼとarg-ジンジパインの組合せでは、83％の感受性および90％の特異性が得られた。フィッシャーの直接確率検定を用いて、0.001***未満のp-値が計算された。歯周病のマーカーとしてエラスターゼとarg-ジンジパインを組合せることにより、何れかの酵素単独よりも統計的に有効なテストが得られることを、この限られたデータは示す。
【参考文献】
【０１００】
2007519923.tif 000006
2007519923.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、サンプル貯蔵所を備えた支持体上に二つの免疫クロマトグラフィーアッセイが配置されたテストキットの一態様を示す。
【図１】
2007519923.tif 000008
【国際調査報告】
2007519923.tif 000009
2007519923.tif 000010
2007519923.tif 000011