(57)【要約】【課題】血栓症の診断／予測方法の提供。【解決手段】本発明は、以下の工程：Ａ−核物質を生物試料から抽出する工程、Ｂ−少なくとも１対の増幅プライマーを使用して核物質の少なくとも１つの標的配列のアンプリコンを得る工程、Ｃ−少なくとも１つの検出プローブを使用して上記アンプリコンの存在を検出する工程：を含み、かつ、工程Ｂにおいて、上記プライマーの対が、配列番号ｌ；３〜８、１５及び１６から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１０個のヌクレオチド単位を含む少なくとも１つの増幅プライマーを含むことを特徴とする、血栓症の診断／予測用のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
Ａ−核物質を生物試料から抽出する工程、
Ｂ−少なくとも１対の増幅プライマーを使用して核物質の少なくとも１つの標的配列のアンプリコンを得る工程、
Ｃ−少なくとも１つの検出プローブを使用して前記アンプリコンの存在を検出する工程：
を含み、かつ、工程Ｂにおいて、前記プライマーの対が、配列番号ｌ；３〜８、１５及び１６から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１０個のヌクレオチド単位を含む少なくとも１つの増幅プライマーを含む
ことを特徴とする、血栓症の診断／予測用のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２】
工程Ｃ）において、前記検出プローブは、配列番号９〜１２；１７及び１８から選択されるヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくとも１０個含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程Ｂにおいて、前記プライマー対は、以下のプライマー対から選択される：
・配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第１増幅プライマーと、配列番号２のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第２増幅プライマー；
・配列番号３のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第１増幅プライマーと、配列番号４のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第２増幅プライマー；
・配列番号５のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第１増幅プライマーと、配列番号６のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第２増幅プライマー；
・配列番号７のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第１増幅プライマーと、配列番号８のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第２増幅プライマー；
・配列番号１５のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第１増幅プライマーと、配列番号１６のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第２増幅プライマー：
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記プライマー対は、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼによる転写の開始を可能にするプロモーターを含む、少なくとも１つの増幅プライマーを含む
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程Ｃにおいて、前記検出プローブはフルオロフォア及びクエンチャーを含む
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
配列番号ｌ；３〜８、１５及び１６から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１０個のヌクレオチド単位を含む増幅プライマー。
【請求項７】
Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼによる転写の開始を可能にするプロモーターを含む
ことを特徴とする請求項６に記載の増幅プライマー。
【請求項８】
以下のプライマー対から選択される増幅プライマー対：
・配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第１増幅プライマーと、配列番号２のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第２増幅プライマー；
・配列番号３のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第１増幅プライマーと、配列番号４のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第２増幅プライマー；
・配列番号５のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第１増幅プライマーと、配列番号６のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第２増幅プライマー；
・配列番号７のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第１増幅プライマーと、配列番号８のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第２増幅プライマー；
・配列番号１５のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第１増幅プライマーと、配列番号１６のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個含む第２増幅プライマー。
【請求項９】
第１プライマーが、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼによる転写の開始を可能にするプロモーターを含む
ことを特徴とする請求項８に記載のプライマー対。
【請求項１０】
ＮＡＳＢＡ増幅反応における、請求項６若しくは７に記載の増幅プライマーの少なくとも１つ、及び／又は、請求項８若しくは９に記載のプライマー対の使用。
【請求項１１】
血栓症の診断／予測用の、請求項６若しくは７に記載のプライマーの少なくとも１つ、及び／又は、請求項８若しくは９に記載のプライマー対の少なくとも１つの使用。
【請求項１２】
請求項６若しくは７に記載のプライマーの少なくとも１つ、及び／又は、請求項８若しくは９に記載のプライマー対の少なくとも１つを含む、血栓症の診断／予測用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血栓症の診断／予測用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関する。本発明はまた、本方法において使用可能な増幅プライマー及びハイブリダイゼーションプローブ、並びに、血栓症の診断／予測用のキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固は必須のホメオスタシス系であり、出血及び血栓症を回避するために正確に調節されなければならない。
【０００３】
この血液凝固は、不活性な循環前駆体（そのタンパク質鎖の一端の損失によって、活性化因子を生じる）の活性化のカスケードに関与している。これらの凝固因子の中でも、具体的には第ＩＩ因子及び第Ｖ因子について言及され得る。プロトロンビンとも呼ばれる第ＩＩ因子は、肝臓によって合成されるプロ酵素である。これは、リン脂質の存在下で活性化される第Ｘ因子及び第Ｖ因子によって活性化され、トロンビン（活性型）となる。活性化されると、フィブリノーゲンからフィブリンへのタンパク質分解を引き起こす。
【０００４】
ホメオスタシスにおいて知られる障害の中でも、具体的には動脈血栓症（心筋梗塞（発作）の形で現れ、末梢動脈障害を経過する）、並びに、罹患率及び死亡率の主要な原因である静脈塞栓症について言及され得る。第ＩＩ因子及び第Ｖ因子をコードする遺伝子における変異は、これらの障害のリスクファクターであると考えられる。従って、１９９６年、静脈血栓症患者を数人含む家族において、第ＩＩ因子をコードする遺伝子のコード領域及び隣接領域を研究することにより、この遺伝子の２０２１０位における変異（以下、２０２１０変異と呼ぶ）の実証が可能となった。この変異は、血漿中のトロンビンの活性を２５％増加させ、静脈血栓症のリスクファクターであると考えられる。
【０００５】
第Ｖ因子ライデン変異（Ｌｅｉｄｅｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）と呼ばれる、第Ｖ因子をコードする遺伝子のヌクレオチド１６９１の変異もまた、リスクファクターである。この変異は、ヘテロ接合体個体において４〜８倍、かつ、ホモ接合体において５０〜１００倍、静脈血栓症のリスクを増加させる。
【０００６】
従って、第ＩＩ因子２０２１０変異及び第Ｖ因子ライデン変異の早期検出は、静脈血栓症のリスクをできるだけ早く予防するために必須である。更に、第ＩＩ因子２０２１０変異及び第Ｖ因子ライデン変異はしばしば共遺伝され、これらの２つの変異の存在が静脈血栓症のリスクの増加を引き起こすことを、多くの研究が示している。従って、これらの２つの変異を同時に研究することも重要である。
【０００７】
特許文献１は、第Ｖ因子ライデン変異の検出に基づいて、血栓症の遺伝的リスクの存在を検出する方法を示す。また、第ＩＩ因子２０２１０変異の検出に基づいて、血栓症の遺伝的リスクの存在を検出する方法を示す、特許文献２も言及され得る。これらの方法は、変異が位置する遺伝子の領域を増幅プライマーを使用して増幅する工程、続いてこの変異に対して特異的な検出プローブを使用して変異を検出する工程を特に含む。
【０００８】
しかし、第Ｖ因子ライデン変異と第ＩＩ因子２０２１０変異は、患者における血栓症のリスクを大幅に増加させるにもかかわらず、これらの方法によって同時に検出することができない。この二重変異の早期検出（これは連続して又は別々に実施可能である）により、患者に警告を与え、かつ、適切な治療を患者に提案することが可能である。更にこれらの方法は、増幅工程で使用する増幅プライマーを選択することにより最適化して、これにより検出工程を改善することができ、増幅工程と検出工程とを同時に実施する場合はなおさらである。
【特許文献１】米国特許第６５５８９１３号
【特許文献２】米国特許第６０４３０３５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
この点で、本発明は、患者の血栓症のリスクを評価する新規の方法を提供することによって、先行技術を改善することを提案する。本方法は特に、増幅工程において、血栓症のリスクを増加させる変異の検出に非常に適した新規増幅プライマーを使用する。上記の新規増幅プライマーは同一の増幅反応に使用することもできることから、その使用により、特に、単一の反応によって第ＩＩ因子２０２１０変異及び第Ｖ因子ライデン変異の存在を決定することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この点で、本発明は、以下の工程：
Ａ−核物質を生物試料から抽出する工程、
Ｂ−少なくとも１対の増幅プライマーを使用して核物質の少なくとも１つの標的配列のアンプリコンを得る工程、
Ｃ−少なくとも１つの検出プローブを使用して上記アンプリコンの存在を検出する工程：
を含み、かつ、工程Ｂにおいて、上記プライマーの対が、配列番号ｌ；３〜８、１５及び１６から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１０個のヌクレオチド単位を含む少なくとも１つの増幅プライマーを含むことを特徴とする、血栓症の診断／予測用のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法に関する。
【００１１】
本発明の目的のために、用語「血栓症の診断／予測」は、血栓形成傾向の遺伝的リスクの概略の確立を意味するものとする。
【００１２】
本発明の目的のために、用語「生物試料」は、以下に規定されるような核物質を含んでいてよい任意の試料を意味するものとする。この生物試料は患者から採取され得、特に、患者由来の組織、血液、血清、唾液又は循環細胞試料であり得る。この生物試料は、当業者に公知の任意の種類の試料採取方法によって得られる。
【００１３】
本発明の目的のために、核物質は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）の配列等の核酸配列を含む。本発明の好ましい実施形態によれば、核物質はデオキシリボ核酸の配列を含む。本発明の好ましい実施形態によれば、核物質は患者から採取された生物試料から抽出される。用語「ヌクレオチド配列」（あるいは核酸配列又はヌクレオチドフラグメント又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド）はリン酸エステル結合によりまとまっている一連のヌクレオチド単位を意味するものとし、これは別の核酸配列にハイブリダイズ可能な天然の核酸の情報配列を特徴とするものであり、上記一連のヌクレオチド単位は、異なる構造のモノマーを含んでいてよく、かつ、天然の核酸分子から及び／又は遺伝子組換えによって及び／又は化学合成によって取得可能である。用語「ヌクレオチド単位」は、連続する構成要素が糖、リン酸基及び窒素性塩基である核酸の天然ヌクレオチドであり得るモノマーの誘導体を意味するものとする；ＤＮＡにおいて、糖は２−デオキシリボースであり、ＲＮＡにおいて、糖はリボースである；ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれの場合であるかによって、窒素性塩基がアデニン、グアニン、ウラシル、シトシン及びチミンから選択される；あるいは、モノマーは、これらの３つの連続する構成要素の少なくとも１つが修飾されたヌクレオチドである；例えば、この修飾は、塩基のレベルで、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジン又はハイブリダイゼーション可能な他の任意の塩基等の修飾塩基によって、又は、糖のレベルで、例えばポリアミンによる少なくとも１つのデオキシリボースの置換によって（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４、１４９７〜１５００（１９９１））、又は、リン酸基のレベルで、例えば具体的には二リン酸エステル、アルキルリン酸エステル、アリールリン酸エステル及びホスホロチオエートから選択されるエステルによるリン酸基の置換のいずれかで生じ得る。この核物質は、少なくとも１つの標的配列を含む。
【００１４】
用語「標的配列」は、一連のヌクレオチド単位が標的遺伝子（例えば、好ましくは第ＩＩ因子をコードする遺伝子又は第Ｖ因子をコードする遺伝子）に対して特異的であるような配列を意味するものとする。本発明の目的のために、標的配列は、血栓症のリスクを増加させる変異（例えば、具体的には第Ｖ因子ライデン変異又は第ＩＩ因子２０２１０変異）を含む。以下の開示において、標的配列は、一本鎖及び二本鎖の両方を指すであろう。
【００１５】
工程Ａにおいて、核物質は、当業者に公知の任意のプロトコルによって生物試料から抽出される。指標として、核酸抽出は、生物試料中に存在する細胞の溶解により、細胞のタンパク質及び／又は脂質エンベロープ（例えば、その後の反応を妨害する細胞片）に含まれる核酸を放出することからなる工程によって実施し得る。例えば、磁気的溶解と機械的溶解との組み合わせに関して特許出願ＷＯ００／０５３３８に記載され、電気的溶解に関して特許出願ＷＯ９９／５３３０４に記載され、そして機械的溶解に関して特許出願ＷＯ９９／１５３２１に記載されるような溶解方法を使用可能である。
【００１６】
当業者は、熱ショック又は浸透圧ショックあるいはグアニジウム塩等のカオトロピック剤を使用した化学溶解（米国特許第５，２３４，８０９号）等の他の周知の溶解方法を使用してもよい。この溶解工程の後に、この溶解工程で遊離された核酸と他の細胞構成成分との分離を可能にする精製工程を続けて実施可能である。この工程は一般的に、核酸の濃縮を可能にし、かつＤＮＡの精製又はＲＮＡの精製に適合され得る。例えば、吸着又は共有原子価によりオリゴヌクレオチドで必要に応じてコーティングされた磁性粒子（この点で、米国特許第４，６７２，０４０号及び米国特許第５，７５０，３３８号を参照のこと）を使用可能であり、従って、この磁性粒子に付着する核酸は洗浄工程によって精製可能である。引き続いて上記核酸を増幅することが望ましい場合、この核酸精製工程は特に有利である。この磁性粒子の特に有利な実施形態は、特許出願ＷＯ９７／４５２０２及びＷＯ９９／３５５００に記載される。核酸を精製する方法の別の有利な例は、カラムの形態での、又は、不活性粒子（Ｂｏｏｍ  Ｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９０、ｎー
２８（３）、ｐ．４９５〜５０３）若しくは磁性粒子（Ｍｅｒｃｋ社：ＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ，Ｐｒｏｍｅｇａ社：ＭａｇｎｅＳｉｌ（商標）常磁性粒子）の形態でのシリカの使用である。これ以外に、カラムにおける、又は、常磁性粒子のギ酸塩（Ｗｈａｔｍａｎ社：ＤＥＡＥ−Ｍａｇａｒｏｓｅ）（Ｌｅｖｉｓｏｎ  ＰＲら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９９８、ｐ．３３７〜３４４）におけるイオン交換樹脂に基づく方法も非常に広範に使用される。本発明に大いに関連している別の方法は、金属酸化物の支持体（Ｘｔｒａｎａ社：Ｘｔｒａ−Ｂｉｎｄ（商標）マトリックス）への吸着であるが、これに限定されない。
【００１７】
生物試料からＤＮＡを特異的に抽出したい場合、具体的にフェノール、クロロホルム及びアルコールを使用して抽出することができ、これによってタンパク質を除去してＤＮＡをアルコールで沈殿させることができる。その後、ＤＮＡを遠心分離によってペレット化し、洗浄して再懸濁することができる。
【００１８】
工程Ｂにおいて、少なくとも１対の増幅プライマーを使用することによって、核物質の少なくとも１つの標的配列のアンプリコンを得ることができる。
【００１９】
本発明の目的のために、用語「増幅プライマー」は、１０〜１００個のヌクレオチド単位、好ましくは１５〜２５個のヌクレオチド単位を含む核配列を意味するものとする。この増幅プライマーは、少なくとも１０個、好ましくは１５個、そして更により好ましくは２０個の、配列番号１；３〜８から選択される配列のヌクレオチド単位を含む。
【００２０】
本発明の目的のために、以下の配列：
・配列番号１；３〜配列番号８；１５及び１６に相同な配列、すなわち、
＊配列番号１；３〜８；１５及び１６に相補的な配列、
＊配列番号１；３〜８；１５及び１６に、又は配列番号１；３〜配列番号８；１５及び１６に相補的な配列にハイブリダイズするのに十分な相同性を示す配列、
・ウラシル塩基がチミン塩基で置換されている、配列番号１；３〜配列番号８；１５及び１６の配列（又は上記に規定されるような配列番号１；３〜配列番号８；１５及び１６に相同な配列）を含む配列：
のヌクレオチド単位を少なくとも１０個、好ましくは１５個、そして更により好ましくは２０個含む増幅プライマーであって、かつ本発明による増幅プライマーと同じ機能を有する（すなわち、ライデン変異を含んでいてよい第Ｖ因子をコードする遺伝子（配列番号１；３〜４）の全部又は一部を増幅するか、あるいは２０２１０変異を含んでいてよい第ＩＩ因子をコードする遺伝子（配列番号５〜８；１５及び１６）の全部又は一部を増幅する）増幅プライマーは、本発明による増幅プライマーに相当するとみなされる。
【００２１】
１対の増幅プライマーにより、酵素的重合（例えば、具体的には酵素的増幅反応）を開始することが可能である。
【００２２】
用語「酵素的増幅反応」は、少なくとも１つの酵素の作用によって核配列の複数のコピー（又はアンプリコン）を生成するプロセスを意味するものとする。本発明の目的のために、用語「アンプリコン」は、酵素的増幅反応の間に得られた標的配列のコピーを意味するものとする。このような増幅反応は当業者に周知であり、米国特許出願第４，６８３，１９５号、米国特許出願第４，６８３，２０２号及び米国特許出願第４，８００，１５９号に記載されるようなＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；例えば欧州特許出願第０２０１１８４号に開示されるＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）；特許出願ＷＯ−Ａ−９０／０１０６９に記載されるＲＣＲ（修復連鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ））；特許出願ＷＯ−Ａ−９０／０６９９５による３ＳＲ（自立配列複製（Ｓｅｌｆ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ））；特許出願ＷＯ−Ａ−９１／０２８１８によるＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））、あるいは、米国特許出願第５，３９９，４９１号によるＴＭＡ（転写介在増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））を具体的に挙げることができる。
【００２３】
一般的に、これらの酵素的増幅反応は、以下の工程：
・標的鎖が二本鎖の場合には、標的配列を変性させて相補的な２つの標的鎖を得る工程、
・少なくとも１つの増幅プライマーを使用して、先の変性工程の間に得られた標的鎖の各々をハイブリダイゼーションさせる工程、
・増幅プライマーがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖を、ポリメラーゼ酵素及びヌクレオシド三リン酸（方法によっては、リボヌクレオシド三リン酸及び／又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸）の存在下で増幅プライマーから形成する工程：
を含む一連のサイクルを使用し、このサイクルを所定の回数繰り返すことにより、標的配列を検出可能な比率で得ることができる。
【００２４】
用語「ハイブリダイゼーション」は、その工程において、適切な条件下で、２つの核配列（例えば、具体的には、増幅プライマー及び標的配列、又は、ハイブリダイゼーションプローブ及び標的配列）が安定かつ特異的な水素結合で互いに結合して二本鎖を形成する工程を意味するものとする。この水素結合は、相補的塩基アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））との間（Ａ−Ｔ結合を指す）あるいは相補的塩基グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）との間（Ｇ−Ｃ結合を指す）の間に生じる。２つの核配列のハイブリダイゼーションは完全であってもよく（従って、相補的配列を指す）、すなわち、このハイブリダイゼーションの間に得られる二本鎖は、Ａ−Ｔ結合及びＣ−Ｇ結合のみを含む。このハイブリダイゼーションは部分的であってもよく（従って、十分に相補的な配列を指す）、すなわち、得られた二本鎖は、二本鎖の形成を可能にするＡ−Ｔ結合及びＣ−Ｇ結合を含むだけでなく、相補的塩基に結合しない塩基をも含む。２つの相補的配列又は十分に相補的な配列の間のハイブリダイゼーションは、使用される作動条件及び特にストリンジェンシーに依存する。ストリンジェンシーは、特に２つの核配列の塩基組成に応じて、かつ、これら２つの核配列間のミスマッチの程度によって規定される。また、ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及び種類、変性剤の性質及び濃度、並びに／又は、ハイブリダイゼーション温度等の、反応パラメータにも依存し得る。これらのデータは全て既知のものであり、当業者であれば適切な条件を決定することができる。
【００２５】
より詳細には、ＮＡＳＢＡは、３つの酵素（ＡＭＶ逆転写酵素、Ｒｎａｓｅ−Ｈ及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）の連合作用に基づく核酸の等温増幅からなる技術である。標的配列に対して特異的な増幅プライマーと組み合わせると、ＲＮＡ標的を９０分に１０億回よりも多く増幅する。増幅反応は４１℃で実施され、最終産物として一本鎖ＲＮＡ分子を生じる。ＮＡＳＢＡは１対のプライマーを必要とし、そのプライマーの少なくとも１つは、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼによる転写の開始のためのプロモーターを含む。
【００２６】
工程Ｃにおいて、少なくとも１つの検出プローブを使用することによって、上記アンプリコンの存在を検出する。好ましくは、この検出プローブにより、上記アンプリコンの存在のみならず、このアンプリコン中に含まれ得る所定の変異の存在を検出することも可能である。
【００２７】
この検出工程は、核酸の検出に関する当業者に公知の任意のプロトコルによって実施することができる。
【００２８】
本発明の目的のために、用語「ハイブリダイゼーションプローブ」は、標的核配列と共にハイブリダイゼーション複合体を形成するための所定の条件下でハイブリダイゼーション特異性を有する核配列を意味するものとする。ハイブリダイゼーションプローブは、その検出のためのマーカーを含んでいてよい。次に、検出プローブについて記載する。用語「検出」は、物理的方法による直接的検出、又は、標識を使用する検出方法による間接的検出のいずれかを意味するものとする。核酸の検出については多くの検出方法がある［例えば、Ｋｒｉｃｋａら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９年、Ｎｏ．４５（４）、ｐ．４５３〜４５８、又は、Ｋｅｌｌｅｒ  Ｇ．Ｈら、ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ、第２版、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ出版、１９９３年、第５節及び第６節、ｐ．１７３〜２４９を参照のこと］。
【００２９】
用語「標識」は、検出可能なシグナルを発生可能なトレーサーを意味するものとする。トレーサーの例としては、例えば比色法、蛍光又はルミネセンスによって検出可能なシグナルを生成する酵素（例えば、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）；蛍光、ルミネセンス又は染料化合物等の発色団；電子顕微鏡法によって又は導電率等のそれらの電気的性質によって、電流測定法又はボルタンメトリー法によって、あるいはインピーダンス測定によって検出可能な、高電子密度の基；回析、表面プラズモン共鳴又は接触角変化等の光学的方法によって、又は、原子間力分光法、トンネル効果等の物理的方法によって検出可能な基；３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
検出プローブは、具体的には、Ｔｙａｇｉ  ＆  Ｋｒａｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈ，１９９６，１４：３０３〜３０８）によって記載されるような「分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）」検出プローブであってよい。この「分子ビーコン」は、ハイブリダイゼーションの間に蛍光になる。分子ビーコンはステムループ構造を有し、フルオロフォア、インヒビター群又は「クエンチャー」を含む。特異的なループ配列とその相補的な標的核酸配列とが結合することにより、適切な波長での励起の間にステムの立体構造の消失及び蛍光シグナルの放出が引き起こされる。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態によれば、検出プローブはフルオロフォア及びクエンチャーを含む。本発明の更に好ましい実施形態によれば、ハイブリダイゼーションプローブはＦＡＭ（６−カルボキシフルオレッセン）又はＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）フルオロフォアをその５’末端に含み、クエンチャー（ダブシル）をその３’末端に含む。以下の開示では、このようなハイブリダイゼーションプローブを「分子ビーコン」と呼ぶ。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態によれば、工程Ｃ）において、ライデン第Ｖ因子変異が存在するか否かが検出される。本発明の好ましい実施形態によれば、工程Ｃ）の間に、第ＩＩ因子２０２１０変異が存在するか否かが検出される。更により好ましい実施形態によれば、第Ｖ因子ライデン変異及び第ＩＩ因子２０２１０変異が存在するか否かが同時に検出される。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態によれば、工程Ｃ）において、上記検出プローブは、配列番号９〜１２；１７及び１８から選択されるヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を、少なくとも１０個、好ましくは１５個、そして更により好ましくは２０個含む。従って、配列番号９を含む検出プローブを使用することによって第Ｖ因子ライデン変異が存在することが診断可能であり、一方、配列番号１０を含む検出プローブを使用することによって第Ｖ因子ライデン変異が存在しないことを診断可能である。
【００３４】
同様に、配列番号１１を含む検出プローブを使用することによって第ＩＩ因子２０２１０変異が存在することが検出可能であり、一方、配列番号１２を含む検出プローブを使用することによって第ＩＩ因子２０２１０変異が存在しないことを診断可能である。更に、配列番号１７を含む検出プローブを使用することによって第ＩＩ因子２０２１０変異が存在することが検出可能であり、一方、配列番号１８を含む検出プローブを使用することによって第ＩＩ因子２０２１０変異が存在しないことを検出可能である。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態によれば、工程Ｂにおいて、上記プライマー対は、以下のプライマー対から選択される：
・配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第１増幅プライマーと、配列番号２のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第２増幅プライマー；指標として、第１プライマーが配列番号１の配列を有し、かつ第２プライマーが配列番号２の配列を有する場合、第Ｖ因子をコードする参照遺伝子（ＮＴ＿００４６６８）の配列上の配列３６５６８〜３６７２６に対応する、第Ｖ因子をコードする遺伝子に特異的なアンプリコン（１５９塩基対のサイズ）が得られる。このアンプリコンは、ライデン変異の原因である変異対立遺伝子又は野生型対立遺伝子（工程Ｃの間に特徴付けられる対立遺伝子）を含んでいてよい：
【００３６】
・配列番号３のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第１増幅プライマーと、配列番号４のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第２増幅プライマー；指標として、第１プライマーが配列番号３の配列を有し、かつ第２プライマーが配列番号４の配列を有する場合、第Ｖ因子をコードする参照遺伝子（ＮＴ＿００４６６８）の配列上の配列３６５６８〜３６９４１に対応する、第Ｖ因子をコードする遺伝子に特異的なアンプリコン（３７４塩基対のサイズ）が得られる。このアンプリコンは、ライデン変異の原因である変異対立遺伝子又は野生型対立遺伝子（工程Ｃの間に特徴付けられる対立遺伝子）を含んでいてよい：
【００３７】
・配列番号５のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第１増幅プライマーと、配列番号６のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第２増幅プライマー；指標として、第１プライマーが配列番号５の配列を有し、かつ第２プライマーが配列番号６の配列を有する場合、第ＩＩ因子をコードする参照遺伝子（ＡＦ４７８６９６）の配列上の配列２１４５５〜２１５９９に対応する、第ＩＩ因子をコードする遺伝子に特異的なアンプリコン（１４５塩基対のサイズ）が得られる。このアンプリコンは、第ＩＩ因子２０２１０変異の原因である変異対立遺伝子又は野生型対立遺伝子（工程Ｃの間に特徴付けられる対立遺伝子）を含んでいてよい：
【００３８】
・配列番号７のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第１増幅プライマーと、配列番号８のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第２増幅プライマー；指標として、第１プライマーが配列番号７の配列を有し、かつ第２プライマーが配列番号８の配列を有する場合、第ＩＩ因子をコードする参照遺伝子（ＡＦ４７８６９６）の配列上の配列２１２１７〜２１６５０に対応する、第ＩＩ因子をコードする遺伝子に特異的なアンプリコン（４３４塩基対のサイズ）が得られる。このアンプリコンは、第ＩＩ因子２０２１０変異の原因である変異対立遺伝子又は野生型対立遺伝子（工程Ｃの間に特徴付けられる対立遺伝子）を含んでいてよい：
【００３９】
・配列番号１５のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第１増幅プライマーと、配列番号１６のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第２増幅プライマー；指標として、第１プライマーが配列番号１５の配列を有し、かつ第２プライマーが配列番号１６の配列を有する場合、第ＩＩ因子をコードする参照遺伝子（ＡＦ４７８６９６）の配列上の配列２１４６５〜２１５７３に対応する、第ＩＩ因子をコードする遺伝子に特異的なアンプリコン（１０８塩基対のサイズ）が得られる。このアンプリコンは、第ＩＩ因子２０２１０変異の原因である変異対立遺伝子又は野生型対立遺伝子（工程Ｃの間に特徴付けられる対立遺伝子）を含んでいてよい。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記プライマー対は、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼによる転写の開始を可能にするプロモーターを含む、少なくとも１つの増幅プライマーを含む。好ましくは、この第１増幅プライマーは、配列番号１３〜１４の配列から選択される配列を含む。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態によれば、工程Ｂ及び工程Ｃは同時に実施される。これは、特にリアルタイム検出を伴うＮＡＳＢＡ増幅反応によって実施することができる。上記に規定されるように、アンプリコンのリアルタイム検出は、Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ  ＥａｓｙＱ（登録商標）読取り装置（ビオメリュー社  ＢＶ、オランダ）及び「分子ビーコン」検出プローブを使用して実施することができる。一般的に、ＮＡＳＢＡによるＤＮＡ増幅は、以下の方法で実施することができる：ＤＮＡを９５℃で変性させることにより、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターを含む「第１プライマー」を結合させる（この段階で単一のプライマーが存在する）。４１℃において逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）を添加し、プライマー伸長を可能とする。その後、「第２プライマー」を添加し、更に変性させる。別の方法としては、同時に２つのプライマーを添加することによって変性工程を一回のみ実施する。この開始期の後、ＮＡＳＢＡは循環期に入る：形成された新しいＲＮＡ分子に「第２プライマー」がハイブリダイズする；ＡＭＶ−ＲＴがこのプライマーを伸長させ；ＲＮａｓｅ  Ｈが、ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを分解する；得られたｃＤＮＡに「第１プライマー」が結合する；ＡＭＶ−ＲＴがこのｃＤＮＡから新しい相補鎖を合成し、次いで、この鎖から「第１プライマー」のＴ７部分を伸長させる；こうして、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡを生成するための２重Ｔ７テイルを含む新しい鋳型を有する。「分子ビーコン」が溶液中にある場合、蛍光体の近くのクエンチャーは、蛍光体の蛍光を阻害する。標的核酸の存在下で、ビーコンはループの配列に相補的な配列に結合するであろう。これによりコンフォーメーションが変化して開き、フルオロフォアがクエンチャーから離れ、従って、蛍光の放出が可能である。増幅される間に多数の分子が合成され、これらは多くの「分子ビーコン」として結合することが可能である。従って、反応中に蛍光が増大する。ＥａｓｙＱ  Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓアナライザー等の適切な装置により、蛍光を経時的に記録することが可能である。
【００４２】
本発明はまた、配列番号１；３〜８；１５及び１６から選択されるヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を、少なくとも１０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む増幅プライマーにも関する。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態によれば、増幅プライマーは、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼによる転写の開始を可能にするプロモーターを含む。好ましくは、このような増幅プライマーは、配列番号１３〜１４の配列から選択される配列を含む。
【００４４】
本発明はまた、以下のプライマー対から選択される１対の増幅プライマーに関する：
・配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第１増幅プライマーと、配列番号２のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第２増幅プライマー；指標として、第１プライマーが配列番号１の配列を有し、かつ第２プライマーが配列番号２の配列を有する場合、第Ｖ因子をコードする参照遺伝子（ＮＴ＿００４６６８）の配列上の配列３６５６８〜３６７２６に対応する、第Ｖ因子をコードする遺伝子に特異的なアンプリコン（１５９塩基対のサイズ）が得られる：
【００４５】
・配列番号３のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第１増幅プライマーと、配列番号４のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第２増幅プライマー；指標として、第１プライマーが配列番号３の配列を有し、かつ第２プライマーが配列番号４の配列を有する場合、第Ｖ因子をコードする参照遺伝子（ＮＴ＿００４６６８）の配列上の配列３６５６８〜３６９４１に対応する、第Ｖ因子をコードする遺伝子に特異的なアンプリコン（３７４塩基対のサイズ）が得られる：
【００４６】
・配列番号５のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第１増幅プライマーと、配列番号６のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第２増幅プライマー；指標として、第１プライマーが配列番号５の配列を有し、かつ第２プライマーが配列番号６の配列を有する場合、第ＩＩ因子をコードする参照遺伝子（ＡＦ４７８６９６）の配列上の配列２１４５５〜２１５９９に対応する、第ＩＩ因子をコードする遺伝子に特異的なアンプリコン（１４５塩基対のサイズ）が得られる：
【００４７】
・配列番号７のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第１増幅プライマーと、配列番号８のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第２増幅プライマー；指標として、第１プライマーが配列番号７の配列を有し、かつ第２プライマーが配列番号８の配列を有する場合、第ＩＩ因子をコードする参照遺伝子（ＡＦ４７８６９６）をコードする配列上の配列２１２１７〜２１６５０に対応する、第ＩＩ因子をコードする遺伝子に特異的なアンプリコン（４３４塩基対のサイズ）が得られる：
【００４８】
・配列番号１５のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第１増幅プライマーと、配列番号１６のヌクレオチド配列のヌクレオチド単位を少なくともｌ０個、好ましくは１５個、そしてより好ましくは２０個含む第２増幅プライマー；指標として、第１プライマーが配列番号１５の配列を有し、かつ第２プライマーが配列番号１６の配列を有する場合、第ＩＩ因子をコードする参照遺伝子（ＡＦ４７８６９６）の配列上の配列２１４６５〜２１５７３に対応する、第ＩＩ因子をコードする遺伝子に特異的なアンプリコン（１０８塩基対のサイズ）が得られる。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記第１プライマーは、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼによる転写の開始を可能にするプロモーターを含む。好ましくは、この第１増幅プライマーは、配列番号１３〜１４の配列から選択される配列を含む。
【００５０】
本発明はまた、ＮＡＳＢＡ増幅反応における、上記に規定されるような少なくとも１つの増幅プライマー、及び／又は、上記に規定されるような１対のプライマーの使用に関する。
【００５１】
本発明はまた、血栓症の診断／予測用の、上記に規定されるような少なくとも１つのプライマー、及び／又は、上記に規定されるような少なくとも１対のプライマーの使用に関する。
【００５２】
最後に、本発明は、上記に規定されるような少なくとも１つのプライマー及び／又は上記に規定されるような少なくとも１対のプライマーを含む、静脈血栓症の診断／予測用のキットに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
以下の図は説明のために記載するものであり、なんら限定するものではない。これらの図により、本発明をより明確に理解可能となるであろう。
【００５４】
図１及び２は、反応混合物中の配列番号１０及び配列番号９の分子ビーコンを同時に存在させることによる、第Ｖ因子変異＋１６９１  Ｇ／Ａについての種々の細胞系の遺伝子型決定を示す。従って、図１ａは、第Ｖ因子の野生型対立遺伝子（＋１６９１−Ｇ）に対してホモ接合性のＧＭ１６０００Ｃ細胞系の遺伝子型決定を示し、図１ｂは、第Ｖ因子の変異対立遺伝子（＋１６９１−Ａ）に対してホモ接合性のＧＭ１４８９９細胞系の遺伝子型決定を示す。白四角は配列番号９の「分子ビーコン」の蛍光の検出を示し、これにより第Ｖ因子の野生型対立遺伝子を明らかにすることが可能であり、一方、黒三角は配列番号１０の「分子ビーコン」の蛍光の検出を示し、これにより変異対立遺伝子（ライデン変異）の検出が可能である。
【００５５】
図２は、第Ｖ因子＋１６９１変異についてヘテロ接合性のＧＭｌ６０２８Ｂ細胞系の遺伝子型決定を示す。白四角は配列番号９の「分子ビーコン」の蛍光の検出を示し、これにより第Ｖ因子の野生型対立遺伝子を明らかにすることが可能であり、一方、黒三角は配列番号１０の「分子ビーコン」の蛍光の検出を示し、これにより変異対立遺伝子（ライデン変異）の検出が可能である。
【００５６】
図３及び４は、反応混合物中の分子ビーコンＯＧＨ  ９１６（配列番号１１、＋２０２１０−Ａ）及びＯＧＨ  １１０４（配列番号１２、＋２０１０−Ｇ）を同時に存在させることによる、第ＩＩ因子変異＋２０２１０  Ｇ／Ａについての種々の細胞系の遺伝子型決定を示す。この点で、図３ａは、第ＩＩ因子の野生型対立遺伝子（＋２０２１０−Ｇ）に対してホモ接合性のＧＭ１４８９９細胞系の遺伝子型決定を示し、一方、図３ｂは、第ＩＩ因子の変異対立遺伝子（＋２０２１０−Ａ）に対してホモ接合性のＧＭ１６０００Ｃ細胞系の遺伝子型決定を示す。十字は配列番号１２の「分子ビーコン」の検出を示し、これにより野生型対立遺伝子を明らかにすることが可能であり、一方、丸は配列番号１１の「分子ビーコン」の検出を示し、これにより第ＩＩ因子２０２１０変異の検出が可能である。
【００５７】
図４は、第ＩＩ因子＋２０２１０変異についてヘテロ接合性のＧＭ１６０２８Ｂ細胞系の遺伝子型決定を示す。変異対立遺伝子（黒丸）及び野生型対立遺伝子（十字を含む曲線）の存在が明確に検出される。十字は配列番号１２の「分子ビーコン」の検出を示し、これにより野生型対立遺伝子を明らかにすることが可能であり、一方、丸は配列番号１１の「分子ビーコン」の検出を示し、これにより第ＩＩ因子２０２１０変異の検出が可能である。
【００５８】
図５及び６は、反応混合物中に配列番号３及び４の分子ビーコンを存在させることによる、第Ｖ因子＋１６９１変異についての種々の細胞系（ＧＭ  １４８９９：Ａ／Ａ；ＧＭ  １６０２８Ｂ：Ａ／Ｇ；ＧＭ  １６０００Ｃ：Ｇ／Ｇ）の遺伝子型決定を示す。
【００５９】
従って、図５は、ＧＭ１４８９９系（Ａ／Ａホモ接合体、変異対立遺伝子；三角）、ＧＭ１６０２８Ｂ系（Ａ／Ｇヘテロ接合体；十字）及びＧＭ１６０００Ｃ系（Ｇ／Ｇホモ接合体、野生型対立遺伝子；丸）由来のＤＮＡを使用した、第Ｖ因子（Ｇ＋１６９１Ａ）のＡ対立遺伝子に特異的なＦＡＭビーコンの検出を示す。
【００６０】
従って、図６は、ＧＭ１４８９９系：Ａ／Ａ（ホモ接合体、変異対立遺伝子；三角）、ＧＭ１６０２８Ｂ系（Ａ／Ｇヘテロ接合体；十字）及びＧＭ１６０００Ｃ系（Ｇ／Ｇホモ接合体、野生型対立遺伝子；丸）由来のＤＮＡを使用した、第Ｖ因子（Ｇ＋１６９１Ａ）のＧ対立遺伝子に特異的なＲＯＸビーコンの検出を示す。
【００６１】
図７及び８は、反応混合物中に配列番号７及び８の分子ビーコンを存在させることによる、第ＩＩ因子＋２０２１０変異についての種々の細胞系（ＧＭ  １４８９９：Ｇ／Ｇ；ＧＭ  １６０２８Ｂ：Ａ／Ｇ；ＧＭ  １６０００Ｃ：Ａ／Ａ）の遺伝子型決定を示す。
【００６２】
従って、図７は、ＧＭ１４８９９系：Ｇ／Ｇ（ホモ接合体、変異対立遺伝子；三角）；ＧＭ１６０２８Ｂ系（Ａ／Ｇヘテロ接合体；十字）及びＧＭ１６０００Ｃ系（Ａ／Ａホモ接合体、野生型対立遺伝子；丸）由来のＤＮＡを使用した、第ＩＩ因子（Ｇ＋２０２ｌ０Ａ）のＧ対立遺伝子に特異的なＦＡＭビーコンの検出を示す。
【００６３】
従って、図８は、ＧＭ１４８９９系：Ｇ／Ｇ（ホモ接合体、変異対立遺伝子；三角）；ＧＭ１６０２８Ｂ系（Ａ／Ｇヘテロ接合体；十字）及びＧＭ１６０００Ｃ系（Ａ／Ａホモ接合体、野生型対立遺伝子；丸）由来のＤＮＡを使用した、第ＩＩ因子（Ｇ＋２０２１０Ａ）のＡ対立遺伝子に特異的なＲＯＸビーコンの検出を示す。
【００６４】
図９は、７２個の第Ｖ因子試料（臨床試料及び細胞系試料）の図解である。これらの試料は、ＦＡＭ（Ａ対立遺伝子特異的）ビーコン及びＲＯＸ（Ｇ対立遺伝子特異的）ビーコンの蛍光強度の比率に従って配置される。
【００６５】
図１０は、１３０個の第ＩＩ因子試料（臨床試料及び細胞系試料）の図解である。これらの試料は、ＦＡＭ（Ｇ対立遺伝子特異的）ビーコン及びＲＯＸ（Ａ対立遺伝子特異的）ビーコンの蛍光強度の比率に従って配置される。
【実施例１】
【００６６】
１／試料及びＤＮＡ抽出
本発明による方法は、細胞系について、及び、患者由来の臨床試料について確認した。
【００６７】
＜細胞系＞第Ｖ因子ライデン変異及び第ＩＩ因子２０２１０変異について公知の遺伝子型の３つのリンパ芽球状細胞系（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）を使用した：
【００６８】
ＧＭ１４８９９系は、第Ｖ因子ライデン変異のみを発現する：この系は、第Ｖ因子ライデン変異についてホモ接合性であり（Ａ／Ａ）、かつ、野生型対立遺伝子について第ＩＩ因子の２０１２０位でホモ接合性である（Ｇ／Ｇ）。ＧＭ１６０００Ｃ系は、第ＩＩ因子２０２１０変異のみを発現する：この系は、第ＩＩ因子２０２１０変異についてホモ接合性であり（Ａ／Ａ）、かつ、野生型対立遺伝子について第Ｖ因子の１６９１位でホモ接合性である（Ｇ／Ｇ）。ＧＭ１６０２８Ｂ系は、これらの２つの変異についてヘテロ接合性である（Ｇ／Ａ）。
【００６９】
これらの細胞系を、ウシ胎仔血清（１５％）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（ペニシリン：２００Ｕ／ｍｌ；ストレプトマイシン：０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。
【００７０】
ＧＭ１６０００Ｃの細胞ペレットから、あるいはＧＭｌ６０２８Ｂの又はＧＭ１４８９９の細胞ペレットから、ＤＮＡ抽出を行った。ペレット化した細胞を低張溶解させ、プロテイナーゼＫによる酵素的消化に供した。タンパク質を除去した後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、乾燥させた後で水に溶解した。ＤＮＡの量及び質は、ＵＶ分光測光法によって決定した。
【００７１】
＜患者由来の試料＞ライデン変異の存在が判明している患者から採取した血液２００μｌを使用した。ゲノムＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎキット（Ｍａｒｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社、Ｈｏｅｒｄｔ、フランス）を使用して抽出し、ＤＮＡｓｅを含まない水２０μｌ中に採取した。ＤＮＡの量及び質は、臭化エチジウムを含むアガロースゲル上でＵＶ分光測光法によって決定した。
【００７２】
＜目的の領域のクローニング＞第Ｖ因子ライデン変異を発現し得る領域のＤＮＡを多量に得るために、第１プライマーについて配列番号３（５’ＡＧＴＧＣＴＴＡＡＣＡＡＧＡＣＣＡＴＡＣＴＡ  ３’）及び第２プライマーについて配列番号４（５’ＡＡＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＡＡＣＴＡＡ  ３’）を含む１対の増幅プライマーを使用して、細胞系又は血液試料から上記で得られたゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲのパラメータは以下のとおりであった：９５℃で２分間；９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル；続いて７２℃で７分間。このようにして得られたアンプリコンを、ベクターＰＣＲ−Ｔｒａｐ（ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ社、米国）中にクローニングし、配列決定によって確認した。ヌクレオチドＧ又はヌクレオチドＡのいずれかを１６９１位に含むプラスミドを、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社；ドイツ）を使用して増幅及び精製した。
【００７３】
第ＩＩ因子２０２１０変異を発現し得る領域のＤＮＡを多量に得るために、第１プライマーについて配列番号７（５’ＴＣＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＧＣＣＴＧＧＣ  ３’）及び第２プライマーについて配列番号８（５’ＣＴＡＣＣＡＧＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧＧＴ  ３’）を含む１対の増幅プライマーを使用して、細胞系から又は血液試料から上記で得られたゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲのパラメータは以下のとおりであった：９５℃で２分間；９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル；続いて７２℃で７分間。このようにして得られたアンプリコンを、ベクターＰＣＲ−Ｔｒａｐ（ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ社、米国）中にクローニングし、配列決定によって確認した。ヌクレオチドＧ又はヌクレオチドＡのいずれかを１６９１位に含むプラスミドを、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社；ドイツ）を使用して増幅及び精製した。
【００７４】
２）ＮＡＳＢＡによる増幅
患者から又は細胞系から採取したＤＮＡ試料の遺伝子型を決定するために、ライデン変異を含み得る領域か又は第ＩＩ因子２０２１０変異を含み得る領域のいずれかを増幅するための増幅プライマー、及び、各変異に対して特異的な検出プローブを含む、増幅反応混合物（Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ４０ｍＭ、ｐＨ８．５；ＭｇＣｌ２  １２ｍＭ；ＫＣｌ  ７０ｍＭ；ジチオスレイトール５ｍＭ；ＤＭＳＯ  １５％ｖ／ｖ；ｄＮＴＰ  １ｍＭ）を調製した。
【００７５】
従って、第Ｖ因子ライデン変異の存在を検出するための反応媒体は、以下を含むものであった：
・配列番号２（５’ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＡＣＴ  Ａ  ３’）の第１増幅プライマー０．２μＭ（最終濃度）、
・Ｔ７ファージポリメラーゼプロモーターを含む、配列番号１（５’ＡＡＡ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＧＡＡ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＧＧ  ３’）の第２増幅プライマー（すなわち、その完全配列が、配列番号１３（５’ａａｔ  ｔｃｔ  ａａｔ  ａｃｇ  ａｃｔ  ｃａｃ  ｔａｔ  ａｇｇ  ｇａｇ  ａＡＡ  ＡＴＴ  ＣＴＣ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＡＧＧ  ３’）に相当する増幅プライマー）０．２μＭ（最終濃度）、
・５’位がＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）フルオロフォアで標識され、かつ３’位が「クエンチャー」（ダブシル）である、配列番号９（５’ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＣＧＡ  ＩＧＡ  Ａ  ３’）の「分子ビーコン」（完全配列：５’ＲＯＸ−ｃｇａｔｃｇ  ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＧＡＩＧＡＡｃｇａｔｃｇ−ダブシル  ３’）０．２μＭ（最終濃度）。この「分子ビーコン」により、ライデン変異が存在しないことを明らかにすることが可能であった、
・５’位がＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）フルオロフォアで標識され、かつ３’位が「クエンチャー」（ダブシル）である、配列番号ｌ０（３’ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＩＧＡ  Ａ  ３’）の「分子ビーコン」（完全配列：５’ＦＡＭ−ｃｇａｔｃｇ  ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＩＧＡＡｃｇａｔｃｇ−ダブシル  ３’）０．１μＭ（最終濃度）。この「分子ビーコン」により、ライデン変異の存在を明らかにすることが可能であった。
【００７６】
第ＩＩ因子については、以下のものを反応媒体に添加した：
・配列番号６（５’ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＡＣＣ  ＡＡ  ３’）の第１増幅プライマー０．２μＭ（最終濃度）
・Ｔ７ファージポリメラーゼプロモーターを含む、配列番号５（５’ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＣ  ３’）の第２増幅プライマー（すなわち、その完全配列が配列番号１４に相当する増幅プライマー）０．２μＭ（最終濃度）
・５’位がＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）フルオロフォアで標識され、かつ３’位が「クエンチャー」（ダブシル）である、配列番号１１（５’ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＣＡＡ  ３’）の「分子ビーコン」（完全配列：５’ＲＯＸ−ｃｇａ  ｔｃｇ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＣＡＡ  ｃｇａ  ｔｃｇ−ダブシル  ３’）０．１μＭ（最終濃度）。この「分子ビーコン」により、第ＩＩ因子２０２１０変異の存在を明らかにすることが可能であった、
・５’位がＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）フルオロフォアで標識され、かつ３’位が「クエンチャー」（ダブシル）である、配列番号１２（５’ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＧＡＧ  ＩＣＴ  ＣＡＡ  ３’）の「分子ビーコン」（完全配列：５’ＦＡＭ−ｃｇｇ  ｔｃｇ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＧＡＧ  ＩＣＴ  ＣＡＡ  ｃｇａ  ｃｃｇ−ダブシル  ３’）０．２μＭ（最終濃度）。この「分子ビーコン」により、第ＩＩ因子２０２１０変異が存在しないことを明らかにすることが可能であった。
【００７７】
図１に示すように、ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）フルオロフォアで標識された配列番号９の「分子ビーコン」は、野生型対立遺伝子に非常に特異的である：実際に、ライデン変異を発現しない細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光はプラトーの出現前に指数関数的であったが（白四角の曲線；図ｌａ）、一方、ライデン変異を発現する細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光はベースラインのままであった（白四角の曲線：図ｌｂ）。
【００７８】
ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）フルオロフォアで標識された配列番号１０の「分子ビーコン」は、変異対立遺伝子に特異的である。実際に、ライデン変異を発現する細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光は指数関数的であったが（三角の曲線；図ｌｂ）、一方、ライデン変異を発現しない細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光はベースラインのままであった（三角の曲線；図ｌａ）。
【００７９】
２つの異なるフルオロフォアを使用することによって、配列番号９の「分子ビーコン」と配列番号１０の「分子ビーコン」とを同時に使用することができ、これにより、一回の反応によって、第Ｖ因子ライデン変異が存在するか否かを非常に迅速に検出することが可能であった。第Ｖ因子ライデン変異についてヘテロ接合性の細胞系から得られた結果を図２に示す。
【００８０】
従って、これらの２つの「分子ビーコン」を配列番号１及び配列番号２の増幅プライマーと同時に使用することによって、２つの対立遺伝子を明確に区別することが可能である。臨床試料を使用した場合にも同様の結果が得られる。
【００８１】
また、得られた結果は、プラトー到達時に放射される蛍光と初期蛍光との比（Ｏ／Ｃ比（開／閉比））に換算して表すこともできる：この比が高いほど、分子ビーコンとアンプリコンとの間のハイブリダイゼーションがより特異的であり、かつ２つの対立遺伝子間がより識別しやすい。
【００８２】
結果を下記表１に示す。
【００８３】
表１：ライデン変異を発現する又は発現しない細胞系及び血液試料について得られたＯ／Ｃ比
【００８４】
【表１】
2007521828.tif 000002
【００８５】
これらの結果は、配列番号１を含む第１プライマーと配列番号２を含む第２プライマーとを含む１対の増幅プライマーを使用したＮＡＳＢＡ増幅と同時に、配列番号９の「分子ビーコン」を使用することによって、ライデン変異が存在しないことを非常に特異的に検出することが可能であったことを示す。配列番号１を含む第１プライマーと配列番号２を含む第２プライマーとを含む１対の増幅プライマーを使用したＮＡＳＢＡ増幅と同時に、配列番号１０の「分子ビーコン」を使用することによって、ライデン変異の存在を非常に特異的に検出することが可能であった。
【００８６】
図３に示すように、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）フルオロフォアで標識された配列番号１２の「分子ビーコン」は、第ＩＩ因子の野生型対立遺伝子に非常に特異的である。実際に、２０２１０変異を発現しない細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光は指数関数的であったが（十字の曲線；図３ａ）、一方、この変異を発現する細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光はベースラインのままであった（十字の曲線；図３ｂ）。
【００８７】
ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）フルオロフォアで標識された配列番号１１の「分子ビーコン」は、変異対立遺伝子に特異的である。２０２１０変異を発現する細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光は指数関数的であったが（丸の曲線；図３ｂ）、一方、この変異を発現しない細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光はベースラインのままであった（丸の曲線；図３ａ）。
【００８８】
２つの異なるフルオロフォアを使用することによって、配列番号１１の「分子ビーコン」と配列番号１２の「分子ビーコン」とを同時に使用することができ、これにより、一回の反応によって、第ＩＩ因子２０２１０変異が存在するか否かを非常に迅速に検出することが可能であった。第ＩＩ因子２０２１０変異についてホモ接合性の細胞系から得られた結果を図４に示す。臨床試料を使用した場合にも同様の結果が得られる。
【００８９】
更に、同様のプロトコルにより、２０３個の臨床のＤＮＡを遺伝子型決定した。得られた結果はすべて、標準技術であるＲＦＬＰによって得られた結果と比較した。この結果、この２つの遺伝子型決定方法間で１００％一致した。
【００９０】
同一チューブ中において種々の第ＩＩ因子及び第Ｖ因子対立遺伝子が存在するか否かを同定する目的で、各対立遺伝子に特異的な４つの「分子ビーコン」の存在下で２つの遺伝子の同時増幅からなるアッセイを行った。遺伝子単独の増幅の場合と同じ「分子ビーコン」及び増幅プライマー対を、同じ濃度で使用した。
【実施例２】
【００９１】
１／試料及びＤＮＡ抽出
本発明による方法は、細胞系について、及び、患者由来の臨床試料について確認した。
【００９２】
＜細胞系＞第Ｖ因子ライデン変異及び第ＩＩ因子２０２１０変異について公知の遺伝子型の３つのリンパ芽球細胞系（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）を使用した：
【００９３】
ＧＭ１４８９９系は、第Ｖ因子ライデン変異のみを発現する：この系は、第Ｖ因子ライデン変異についてホモ接合性であり（Ａ／Ａ）、かつ、野生型対立遺伝子について第ＩＩ因子の２０１２０位でホモ接合性である（Ｇ／Ｇ）。ＧＭ１６０００Ｃ系は、第ＩＩ因子２０２１０変異のみを発現する：この系は、第ＩＩ因子２０２１０変異についてホモ接合性であり（Ａ／Ａ）、かつ、野生型対立遺伝子について第Ｖ因子の１６９１位でホモ接合性である（Ｇ／Ｇ）。ＧＭ１６０２８Ｂ系は、これらの２つの変異についてヘテロ接合性である（Ｇ／Ａ）。
【００９４】
これらの細胞系を、ウシ胎仔血清（１５％）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（ペニシリン：２００Ｕ／ｍｌ；ストレプトマイシン：０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。
【００９５】
ＧＭ１６０００Ｃの細胞ペレットから、あるいはＧＭｌ６０２８Ｂの又はＧＭ１４８９９の細胞ペレットから、ＤＮＡ抽出を行った。ペレット化した細胞を低張溶解させ、プロテイナーゼＫによる酵素的消化に供した。タンパク質を除去した後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、乾燥させた後で水に溶解した。ＤＮＡの量及び質は、ＵＶ分光測光法によって決定した。
【００９６】
＜患者由来の試料＞ＥＴＳ（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  ｓａｎｇ［フランス血液銀行］；リヨン）の正常ドナーから採取した血液１００μｌ（ＦＩＩ／ＦＶの分類は不明であるが、標準ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ法を使用して並行して試験される）。ゲノムＤＮＡは、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ試薬及びＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒキット及びｍｉｎｉＭａｇ機器（Ｗａｓｈ３洗浄（１５秒ではなくｌ０秒）以外はｍｉｎｉＭａｇ公報を参照のこと）を使用して抽出し、ＤＮＡを溶出緩衝液８０μ１中に溶出した（７０℃で１０分＋１４０００ｒｐｍで混合）。
【００９７】
ＤＮＡの量及び質は、ＵＶ分光測光法によって決定した。
【００９８】
＜目的の領域のクローニング＞第Ｖ因子ライデン変異を発現し得る領域のＤＮＡを多量に得るために、第１プライマーについて配列番号３（５’ＡＧＴＧＣＴＴＡＡＣＡＡＧＡＣＣＡＴＡＣＴＡ  ３’）及び第２プライマーについて配列番号４（５’ＡＡＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＡＡＣＴＡＡ  ３’）を含む１対の増幅プライマーを使用して、細胞系から又は血液試料から上記で得られたゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲのパラメータは以下のとおりであった：９５℃で２分間；９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル；続いて７２℃で７分間）。このようにして得られたアンプリコンを、ベクターＰＵＣ１９中にクローニングし、配列決定によって確認した。ヌクレオチドＧ又はヌクレオチドＡのいずれかを１６９１位に含むプラスミドを、ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社；ドイツ）を使用して増幅及び精製した。
【００９９】
第ＩＩ因子２０２１０変異を発現し得る領域のＤＮＡを多量に得るために、第１プライマーについて配列番号７（５’ＴＣＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＧＣＣＴＧＧＣ  ３’）及び第２プライマーについて配列番号８（５’ＣＴＡＣＣＡＧＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧＧＴ  ３’）を含む１対の増幅プライマーを使用して、細胞系から又は血液試料から上記で得られたゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲのパラメータは以下のとおりであった：９５℃で２分間；９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル；続いて７２℃で７分間。このようにして得られたアンプリコンを、ベクターＰＣＲ−Ｔｒａｐ（ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ社、米国）中にクローニングし、配列決定によって確認した。ヌクレオチドＧ又はヌクレオチドＡのいずれかを１６９１位に含むプラスミドを、ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社；ドイツ）を使用して増幅及び精製した。
【０１００】
２）ＮＡＳＢＡによる増幅
患者から又は細胞系から採取したＤＮＡの遺伝子型を決定するために、ＦＶライデン変異を含み得る領域を増幅するための増幅プライマーを含む、第Ｖ因子増幅反応混合物（Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ４０ｍＭ、ｐＨ８．５；ＭｇＣｌ２  １２ｍＭ；ＫＣｌ  １００ｍＭ；ジチオスレイトール  ５ｍＭ；ＤＭＳＯ  １５％ｖ／ｖ；ｄＮＴＰ  １ｍＭ）：
・配列番号２（５’ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＡＣＴ  Ａ  ３’）の第１増幅プライマー０．２μＭ（最終濃度）、
・Ｔ７ファージポリメラーゼプロモーターを含む、配列番号１（５’ＡＡＡ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＧＡＡ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＧＧ  ３’）の第２増幅プライマー（すなわち、その完全配列が、配列番号１３（５’ａａｔ  ｔｃｔ  ａａｔ  ａｃｇ  ａｃｔ  ｃａｃ  ｔａｔ  ａｇｇ  ｇａｇ  ａＡＡ  ＡＴＴ  ＣＴＣ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＡＧＧ  ３’）に相当する増幅プライマー）０．２μＭ（最終濃度）、
・５’位がＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）フルオロフォアで標識され、かつ３’位が「クエンチャー」（ダブシル）である、配列番号９（５’ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＣＧＡ  ＩＧＡ  Ａ  ３’）の「分子ビーコン」（完全配列：５’ＲＯＸ−ｃｇａｔｃｇ  ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＧＡＩＧＡＡｃｇａｔｃｇ−ダブシル  ３’）０．０５μＭ（最終濃度）。この「分子ビーコン」により、ライデン変異が存在しないことを明らかにすることが可能であった、
・５’位がＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）フルオロフォアで標識され、かつ３’位が「クエンチャー」（ダブシル）である、配列番号ｌ０（３’ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＩＧＡ  Ａ  ３’）の「分子ビーコン」（完全配列：５’ＦＡＭ−ｃｇａｔｃｇ  ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＩＧＡＡｃｇａｔｃｇ−ダブシル  ３’）０．０２５μＭ（最終濃度）。この「分子ビーコン」により、ライデン変異の存在を明らかにすることが可能であった。
【０１０１】
患者から又は細胞系から採取したＤＮＡの遺伝子型を決定するために、ＦＩＩ＋２０２１０変異を含み得る領域を増幅するための増幅プライマーを含む、第ＩＩ因子増幅反応混合物（Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ４０ｍＭ、ｐＨ８．５；ＭｇＣｌ２  １２ｍＭ；ＫＣｌ  ７０ｍＭ；ジチオスレイトール  ５ｍＭ；ＤＭＳＯ  １５％ｖ／ｖ；ｄＮＴＰ  １ｍＭ）。
【０１０２】
第ＩＩ因子については、以下のものを反応媒体に添加した：
・配列番号１６（５’ＣＴＧＧＡＡＣＣＡＡＴＣＣＣＧＴＧＡＡＡＧ  ３’）の第１増幅プライマー０．２μＭ（最終濃度）
・Ｔ７ファージポリメラーゼプロモーターをも含む、配列番号１５（５’ＡＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＡＡＴＡＧＣＡＣＴ  ３’）の第２増幅プライマー（すなわち、配列番号１９（ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇＡＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＡＡＴＡＧＣＡＣＴ）に相当する）０．２μＭ（最終濃度）、
・５’位がＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）フルオロフォアで標識され、かつ３’位が「クエンチャー」（ダブシル）である、配列番号１７（５’ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＣＡＡ  ３’）の「分子ビーコン」（完全配列：５’ＲＯＸ−ｃｇａ  ｔｃｇ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＣＡＡ  ｃｇａ  ｔｃｇ−ダブシル  ３’）０．１μＭ（最終濃度）。この「分子ビーコン」により、第ＩＩ因子２０２１０変異の存在を明らかにすることが可能であった、
・５’位がＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）フルオロフォアで標識され、かつ３’位が「クエンチャー」（ダブシル）である、配列番号１８（５’ＴＣＴＣＡＧＣＧＧＧＣＣＴＣＡ  ３’）の「分子ビーコン」（完全配列：５’ＦＡＭ−ｃｇｔｃｇ  ＴＣＴＣＡＧＣＧＧＧＣＣＴＣＡ  ｃｇａｃｇ−ダブシル  ３’）０．１μＭ（最終濃度）。この「分子ビーコン」により、第ＩＩ因子２０２１０変異が存在しないことを明らかにすることが可能であった。
【０１０３】
図５に示すように、ＦＡＭフルオロフォアで標識された配列番号９の「分子ビーコン」は、変異対立遺伝子に非常に特異的である：実際に、ライデン変異を発現する細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光はプラトーの出現前に指数関数的であったが（三角の曲線；及び十字の曲線；図５）、一方、ライデン変異を発現しない細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光はベースラインのままであった（白丸の曲線：図５）。
【０１０４】
ＲＯＸフルオロフォアで標識された配列番号１０の「分子ビーコン」は、野生型対立遺伝子に特異的である。実際に、ライデン野生型遺伝子型を発現する細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光は指数関数的であったが（丸及び十字の曲線；図６）、一方、野生型遺伝子型を発現しない細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光はベースラインのままであった（図６、三角の曲線）。
【０１０５】
２つの異なるフルオロフォアを使用することによって、配列番号１０の「分子ビーコン」と配列番号９の「分子ビーコン」とを同時に使用することができ、これにより、一回の反応によって、２つの第Ｖ因子遺伝子の対立遺伝子についての変異が存在するか否かを非常に迅速に検出することが可能であった。従って、図５及び６の分析によって、試料がＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ又はＡ／Ａ遺伝子型を有するか否かを決定することが可能である。
【０１０６】
従って、これらの２つの「分子ビーコン」を配列番号２及び配列番号１の増幅プライマーと同時に使用することによって、２つの対立遺伝子間を明確に区別することが可能である。
【０１０７】
ｌ’Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  ｄｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｆｒａｎｃａｉｓ（ＥＴＳ）［フランス血液銀行］のドナーから採取した新鮮な血液試料を使用した場合にも、同様の結果が得られる。
【０１０８】
得られた結果はまた、プラトー到達時に放射される蛍光と初期蛍光との比（Ｏ／Ｃ比（開／閉比））に換算して表すこともできる：この比が高いほど、分子ビーコンとアンプリコンとの間のハイブリダイゼーションがより特異的であり、かつ２つの対立遺伝子間がより識別しやすい。
【０１０９】
細胞系によって、陽性検出限界（閾値又はカットオフ）をＦＡＭビーコン及びＲＯＸビーコンについて確立した。
【０１１０】
７２個の細胞系試料の結果を図９に示す。
【０１１１】
「四角」のシンボルは各々、この試料についてのＦＡＭビーコンのＯ／Ｃ比及びＲＯＸビーコンのＯ／Ｃ比の値に従って試料を試験して配置したものを示す。従って、これらの２つのビーコンについての陽性検出限界によって、７２個の試料についての第Ｖ因子ライデンの分類を、グラフを使用して決定することが可能である。
【０１１２】
試料の変異対立遺伝子（Ａ）に特異的なＦＡＭビーコンのＯ／Ｃ比が１．５よりも大きい場合、及び、試料の野生型対立遺伝子（Ｇ）に特異的なＲＯＸビーコンのＯ／Ｃ比が２未満である場合、試料はＡ／Ａに分類される。
【０１１３】
試料の変異対立遺伝子（Ａ）に特異的なＦＡＭビーコンのＯ／Ｃ比が１．５未満である場合、及び、試料の野生型対立遺伝子（Ｇ）に特異的なＲＯＸビーコンのＯ／Ｃ比が２よりも大きい場合、試料はＧ／Ｇに分類される。
【０１１４】
試料の変異対立遺伝子（Ａ）に特異的なＦＡＭビーコンのＯ／Ｃ比が１．５よりも大きい場合、及び、試料の野生型対立遺伝子（Ｇ）に特異的なＲＯＸビーコンのＯ／Ｃ比が２よりも大きい場合、試料はＧ／Ａに分類される。
【０１１５】
これらの結果は、配列番号１を含む第１プライマーと配列番号２を含む第２プライマーとを含む１対の増幅プライマーを使用したＮＡＳＢＡ増幅と同時に、配列番号９の「分子ビーコン」を使用することによって、ライデン変異が存在しないことを非常に特異的に検出することが可能であったことを示す。配列番号１を含む第１プライマーと配列番号２を含む第２プライマーとを含む１対の増幅プライマーを使用したＮＡＳＢＡ増幅と同時に、配列番号１０の「分子ビーコン」を使用することによって、ライデン変異の存在を非常に特異的に検出することが可能であった。
【０１１６】
図７に示すように、ＦＡＭフルオロフォアで標識された配列番号１８の「分子ビーコン」は、野生型対立遺伝子に非常に特異的である：実際に、第ＩＩ因子野生型を発現する細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光はプラトーの出現前に指数関数的であったが（三角の曲線；及び十字の曲線、図７）、一方、第ＩＩ因子野生型多形を発現しない細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光はベースラインのままであった（丸の曲線：図７）。
【０１１７】
ＲＯＸフルオロフォアで標識された配列番号１７の「分子ビーコン」は、変異対立遺伝子に特異的である。実際に、第ＩＩ因子変異を発現する細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光は指数関数的であったが（丸及び十字の曲線；図６）、一方、野生型遺伝子型を発現しない細胞系を使用して反応を行った場合、蛍光はベースラインのままであった（図６、三角の曲線）。
【０１１８】
２つの異なるフルオロフォアを使用することによって、配列番号１７の「分子ビーコン」と配列番号１８の「分子ビーコン」とを同時に使用することができ、これにより、一回の反応によって、第ＩＩ因子遺伝子についての変異が存在するか否かを非常に迅速に検出することが可能であった。従って、図７及び８の分析によって、試料がＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ又はＡ／Ａ遺伝子型を有するか否かを決定することが可能である。
【０１１９】
細胞系（四角）及び新鮮な血液から抽出した試料（三角及び丸）を含む１３０個の試料の結果を図ｌ０に示す。
【０１２０】
各シンボルは、この試料についてのＦＡＭビーコンのＯ／Ｃ比及びＲＯＸビーコンのＯ／Ｃ比の値に従って試料を試験して配置したものを示す。従って、これらの２つのビーコンの陽性検出限界によって、１３０個の試料についての第ＩＩ因子の分類を、グラフを使用して決定することが可能である。
【０１２１】
試料の変異対立遺伝子（Ａ）に特異的なＲＯＸビーコンのＯ／Ｃ比が３．５よりも大きい場合、及び、試料の野生型対立遺伝子（Ｇ）に特異的なＦＡＭビーコンのＯ／Ｃ比が１．８未満である場合、試料はＡ／Ａに分類される。
【０１２２】
試料の変異対立遺伝子（Ａ）に特異的なＲＯＸビーコンのＯ／Ｃ比が３．５未満である場合、及び、試料の野生型対立遺伝子（Ｇ）に特異的なＦＡＭビーコンのＯ／Ｃ比が１．８よりも大きい場合、試料はＧ／Ｇに分類される。
【０１２３】
試料の変異対立遺伝子（Ａ）に特異的なＲＯＸビーコンのＯ／Ｃ比が３．５よりも大きい場合、及び、試料の野生型対立遺伝子（Ｇ）に特異的なＦＡＭビーコンのＯ／Ｃ比が１．８よりも大きい場合、試料はＧ／Ａに分類される。
【０１２４】
更に、同様のプロトコルにより、新鮮な血液の試料を遺伝子型決定した。得られた結果はすべて、標準ＲＴ−ＰＣＲ技術（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ、Ｒｏｃｈｅ）を使用して得られた結果と比較した。この結果、この２つの遺伝子型決定方法間で１００％一致した。
【０１２５】
同一チューブ中において種々の第ＩＩ因子及び第Ｖ因子対立遺伝子が存在するか否かを同定する目的で、各対立遺伝子に特異的な４つの「分子ビーコン」の存在下で２つの遺伝子の同時増幅からなるアッセイを行った。遺伝子単独の増幅の場合と同じ「分子ビーコン」及び増幅プライマー対を、同じ濃度で使用した。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１−ａ】第Ｖ因子の野生型対立遺伝子（＋１６９１−Ｇ）に対してホモ接合性のＧＭ１６０００Ｃ細胞系の遺伝子型決定を示す。
【図１−ｂ】第Ｖ因子の変異対立遺伝子（＋１６９１−Ａ）に対してホモ接合性のＧＭ１４８９９細胞系の遺伝子型決定を示す。
【図２】第Ｖ因子＋１６９１変異についてヘテロ接合性のＧＭｌ６０２８Ｂ細胞系の遺伝子型決定を示す。
【図３−ａ】第ＩＩ因子の野生型対立遺伝子（＋２０２１０−Ｇ）に対してホモ接合性のＧＭ１４８９９細胞系の遺伝子型決定を示す。
【図３−ｂ】第ＩＩ因子の変異対立遺伝子（＋２０２１０−Ａ）に対してホモ接合性のＧＭ１６０００Ｃ細胞系の遺伝子型決定を示す。
【図４】第ＩＩ因子＋２０２１０変異についてヘテロ接合性のＧＭ１６０２８Ｂ細胞系の遺伝子型決定を示す。
【図５】ＧＭ１４８９９系（Ａ／Ａホモ接合体、変異対立遺伝子；三角）、ＧＭ１６０２８Ｂ系（Ａ／Ｇヘテロ接合体；十字）及びＧＭ１６０００Ｃ系（Ｇ／Ｇホモ接合体、野生型対立遺伝子；丸）由来のＤＮＡを使用した、第Ｖ因子（Ｇ＋１６９１Ａ）のＡ対立遺伝子に特異的なＦＡＭビーコンの検出を示す。
【図６】ＧＭ１４８９９系：Ａ／Ａ（ホモ接合体、変異対立遺伝子；三角）、ＧＭ１６０２８Ｂ系（Ａ／Ｇヘテロ接合体；十字）及びＧＭ１６０００Ｃ系（Ｇ／Ｇホモ接合体、野生型対立遺伝子；丸）由来のＤＮＡを使用した、第Ｖ因子（Ｇ＋１６９１Ａ）のＧ対立遺伝子に特異的なＲＯＸビーコンの検出を示す。
【図７】ＧＭ１４８９９系：Ｇ／Ｇ（ホモ接合体、変異対立遺伝子；三角）；ＧＭ１６０２８Ｂ系（Ａ／Ｇヘテロ接合体；十字）及びＧＭ１６０００Ｃ系（Ａ／Ａホモ接合体、野生型対立遺伝子；丸）由来のＤＮＡを使用した、第ＩＩ因子（Ｇ＋２０２ｌ０Ａ）のＧ対立遺伝子に特異的なＦＡＭビーコンの検出を示す。
【図８】ＧＭ１４８９９系：Ｇ／Ｇ（ホモ接合体、変異対立遺伝子；三角）；ＧＭ１６０２８Ｂ系（Ａ／Ｇヘテロ接合体；十字）及びＧＭ１６０００Ｃ系（Ａ／Ａホモ接合体、野生型対立遺伝子；丸）由来のＤＮＡを使用した、第ＩＩ因子（Ｇ＋２０２１０Ａ）のＡ対立遺伝子に特異的なＲＯＸビーコンの検出を示す。
【図９】７２個の第Ｖ因子試料（臨床試料及び細胞系試料）の図解である。
【図１０】１３０個の第ＩＩ因子試料（臨床試料及び細胞系試料）の図解である。
【図１−ａ】
2007521828.tif 000003
【図１−ｂ】
2007521828.tif 000004
【図２】
2007521828.tif 000005
【図３−ａ】
2007521828.tif 000006
【図３−ｂ】
2007521828.tif 000007
【図４】
2007521828.tif 000008
【図５】
2007521828.tif 000009
【図６】
2007521828.tif 000010
【図７】
2007521828.tif 000011
【図８】
2007521828.tif 000012
【図９】
2007521828.tif 000013
【図１０】
2007521828.tif 000014
【配列表】
2007521828000001.app
【国際調査報告】
2007521828.tif 000015
2007521828.tif 000016
2007521828.tif 000017
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