(57)【要約】  本発明は、体液試料内の循環グリコホリンを定量するためのアッセイを提供する。このアッセイによって測定される循環グリコホリンは、鬱血性心不全（ＣＨＦ）の診断に用いられる短縮グリコホリンである。【選択図】  図１
2007510915.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体の鬱血性心不全（ＣＨＦ）を診断するための方法であって、
（Ａ）前記被検体に存在するグリコホリン抗原と前記グリコホリン抗原に特異的なモノクローナル抗体との間で抗体抗原結合複合体が形成される条件下で、前記モノクローナル抗体と前記被検体から得た体液とを接触させるステップと、  
（Ｂ）前記抗体抗原結合複合体を検出するステップとを含み、
前記抗体抗原結合複合体の存在によって鬱血性心不全（ＣＨＦ）が診断される、被検体の鬱血性心不全（ＣＨＦ）を診断するための方法。
【請求項２】
前記体液が、血液、血液産物、尿、唾液、脳脊髄液、およびリンパ液からなる群から選択される請求項１記載の方法。  
【請求項３】
前記モノクローナル抗体が３Ｆ４であり、配列番号２および配列番号４のアミノ酸残基５〜２５を認識する請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体が６Ｇ４であり、配列番号２のアミノ酸残基３９〜４５を認識する請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が５Ｆ４であり、配列番号２のアミノ酸残基１０７〜１１９を認識する請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記グリコホリン抗原が短縮グリコホリンである請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記検出が、（Ａ）前記グリコホリン抗原と前記グリコホリン抗原に対応するポリクローナル抗体との間で複合体が形成される条件下で、前記抗体抗原結合複合体と前記ポリクローナル抗体とを接触させるステップと、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）の前記ポリクローナル抗体に対応するポリクローナル抗体に標識を付けるステップと、
（Ｃ）前記標識されたポリクローナル抗体と前記ステップ（Ａ）の前記ポリクローナル抗体との間で複合体が形成される条件下で、前記ステップ（Ａ）で形成された前記複合体と前記ステップ（Ｂ）で形成された前記標識されたポリクローナル抗体とを接触させるステップと、
（Ｃ）前記標識されたポリクローナル抗体上の前記標識を検出するステップとを含む請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記標識されたポリクローナル抗体上の前記標識がシグナル生成物質を含む請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記シグナル生成物質がペルオキシダーゼである請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に免疫学の分野、詳しくは異常状態または疾病状態を診断するための免疫学的アッセイの使用、より詳しくは鬱血性心不全（ＣＨＦ）の診断に用いられる体液中を循環する短縮グリコホリンの定量のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
既知の疾患の診断は、病気の患者の主治医により通常行われる標準的同意所見（standard agreed-upon observation）を必要とする。いくつかの疾患については、正確な診断を下すのに十分な程度のほぼ確定的な結果を与える単回試験（例えば、糖尿病に関するブドウ糖負荷試験）が利用可能である。しかし、ほとんどの疾患は、かなり確かな診断に達するまでいくつかの高度な試験を必要とする。今のところ、治療的介入は、疾患の後期でしばしば開始されることから、多くの場合、この疾患に冒された患者の生活の質および寿命がわずかに改善されるにすぎない。疾患予防は、疾患治療よりも容易で、より効果的である。早期診断は、疾患関連死亡率を減少させ、患者の生活の質を高め、かつ寿命を延ばすことで、健康管理の全体的コストを下げる。したがって、早期診断で疾患を正しく診断することができる診断試験を開発することが、生物医学研究者の目的である。
鬱血性心不全（ＣＨＦ）の早期診断は、進行性疾患により生ずる心臓再建が初期の治療的介入により遅くなるか、もしくは予防可能であることから、特に有益である。しかし、早期診断は、心臓がすでに構造的変化を生じるに至るまで一般に症状が現れないことから、早期診断が実現困難であることが明らかである。
ＣＨＦは、約５００万人ものアメリカ人がかかっている高死亡率の重態である（ＣＨＦの議論に関しては、特許文献１を参照せよ）。現在のところ、ＣＨＦが本質的に異なった疾病経過ではなく、むしろ多発奇形の効果を表すと考えられており、多発奇形が相互作用することで、最終的に循環ポンプとして機能する心臓の能力の進行的消失が生ずる。ＣＨＦで生ずる主な病態生理学的異常は、視床下部−脳下垂体−副腎系、全身性内皮細胞機能不全、および心筋再構築の活性化である。ＣＨＦの進行は、心筋が損傷したり、あるいは高血圧および／または心筋梗塞から生じる心臓奇形等の現象によって開始される。近年では、インスリン抵抗性およびＩＩ型糖尿病等の特定の症状を有する患者は、ひとたびＣＨＦを発症すると、心不全および予後不良について特に高いリスクを持つことが発見された（非特許文献１）。
疾病経過（例えば、糖尿病およびＣＨＦで起こる疾病経過）は、しばしば細胞および／または組織障害をもたらし、その結果として細胞および／または組織特異的生体高分子マーカーが個人の体液に放出される。これらの生体高分子標識は、疾患および／または疾患進行の前兆である。そのような生体高分子マーカーと異常および／または疾病状態とが関連し合うことで、新たな診断への道（diagnostic avenues）が提供される。診断への道は、疾患の初期段階にある患者または発症の危険性がある患者を識別することを可能とすると思われる。ＣＨＦの診断に用いられる生体高分子マーカーの同定は、ＣＨＦに関連する革新的な病態生理学を考えれば、特に有益である。当該技術分野で不足していることは、ＣＨＦに罹った個人を特定することが可能な診断方法を効率的かつ容易におこなうことである。
【０００３】
【特許文献１】米国特許第６，５７２，８９５号公報。
【非特許文献１】ソラング（Solang）他、欧州心臓学会誌（European Heart Journal）第２０巻、７８１〜７９５頁、１９９９年。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、ＣＨＦを罹患した個人を特定するための、効率的かつ容易に実施可能な診断方法を提供する。この方法は、体液中の増加グリコホリンを定量するためにマウス・モノクローナル抗体（抗グリコホリン）を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを含む。グリコホリンは、哺乳類赤血球細胞（ＲＢＣ）の膜内在性タンパク質であり、高度にグリコシル化している。グリコホリンのグリコシル化は、ＲＢＣ細胞表面の全体的な負電荷に関与しており、赤血球細胞間の正常な静電反発をもたらす。糖尿病およびＣＨＦの疾病過程では、グリコホリン等の赤血球細胞（ＲＢＣ）膜タンパク質が異常に減少して細胞表面の全体的な負電荷を少なくし、赤血球細胞間の正常な静電反発の低下をもたらす。その結果、糖尿病およびＣＨＦの発症で赤血球の凝集が生ずる。本発明のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いることで、本発明者は、ＣＨＦ患者の血漿中に含まれる異常な循環グリコホリンを同定した。このグリコホリンは、正常グリコホリンの分子量よりも低い分子量を持っていたことから、疾病過程でＲＢＣ膜から切断された短縮フラグメントであると予測される。
３種類のマウス・モノクローナル抗体（３Ｆ４、６Ｇ４、および５Ｆ４）が本発明のＥＬＩＳＡアッセイで用いられる。モノクローナル抗体３Ｆ４は、配列番号２および配列番号４のアミノ酸残基５〜２５（グリコホリンＡおよびＢ）を認識する。モノクローナル抗体６Ｇ４は、配列番号２のアミノ酸残基３９〜４５（グリコホリンＡ）を認識する。モノクローナル抗体５Ｆ４は、配列番号２のアミノ酸残基１０７〜１１９（グリコホリンＡ）を認識する。
したがって、本発明の目的は、体液中を循環する異常な短縮グリコホリンを定量するための、マウス抗グリコホリン・モノクローナル抗体３Ｆ４、６Ｇ４、および５Ｆ４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、鬱血性心不全（ＣＨＦ）の診断に用いられる短縮された循環グリコホリンを同定することである。
この発明の他の目的および利点は、添付した図と関連される以下の説明から明らかになるもので、この発明の特定の実施形態が説明および例示のために示される。図は、この明細書の一部を構成するもので、本発明の典型的な実施例を含み、本発明の種々の目的および特徴を説明する。
【０００５】
（図面の簡単な説明）
図１は、モノクローナル抗体３Ｆ４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡから得られたデータを示す。
図２は、モノクローナル抗体６Ｇ４、５Ｆ４、および３Ｆ４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡから得られるデータを示す図である。
図３は、グリコホリンに対する自己抗体の存在を評価する直接ＥＬＩＳＡから得られるデータを示す図である。
図４は、ＣＨＦ患者の血漿から得たグリコホリンの免疫沈降の結果を示す図である。
図５Ａないし図５Ｃは、クロマトグラムを示す。図５Ａは、ＣＨＦ患者から得た捕獲グリコホリンを示し、図５Ｂは健康な患者から得た捕獲グリコホリンを示し、さらに図５Ｃは精製された捕獲グリコホリンを示す。
図６は、脱グリコシル化後のクロマトグムを示す図であって、上段のクロマトグラムは精製グリコホリン、中段のクロマトグラムはＣＨＦ患者由来の捕獲グリコホリン、および下段のクロマトグラムはグリコホリン試料無しで流した対照である。
【０００６】
定義
以下のリストは、本明細書全体にわたって使用される用語、慣用句、および略語を定義する。単数形で用語、慣用句、および略語が表されていても、定義はすべての文法的形態を包含することを意図している。
本明細書で用いられるように、略語「ＣＨＦ」は鬱血性心不全のことをいう。
本明細書で用いられるように、略語「ＧＰ」はグリコホリンのことをいう。
本明細書で用いられるように、略語「ＧＰＡ」はグリコホリンＡのことをいう。
本明細書で用いられるように、略語「ＧＰＢ」はグリコホリンＢのことをいう。
本明細書で用いられるように、略語「ＧＰＡｘ２」はグリコホリンＡの二量体化した形態のことをいう。
本明細書で用いられるように、略語「ＧＰＢｘ２」はグリコホリンＢの二量体化した形態のことをいう。
本明細書で用いられるように、略語「ＥＬＩＳＡ」は酵素結合免疫吸着アッセイのことをいう。
本明細書で用いられるように、略語「ＲＢＣ」は赤血球細胞のことをいう。
本明細書で用いられるように、略語「ＭｏＡｂ」はモノクローナル抗体のことをいう。
本明細書で用いられるように、略語「ＭＳ」は質量分析法のことをいう。
本明細書で用いられるように、略語「ＳＥＬＤＩ」は質量分析技術である表面活性化レーザー脱着イオン化のことをいう。
本明細書で用いられるように、略語「ＰＢＳ」は燐酸緩衝生理食塩水のことをいう。
「ＲＥＣ」、「赤血球細胞（red
blood cell）」、および「赤血球（erythrocyte）」という用語は、本明細書では同義的に用いられる。
本明細書で用いられるように、用語「グリコホリン」は哺乳類赤血球の主要な膜内在性糖タンパク質のことをいう。グリコホリンは、高度にグリコシル化しており、ＡおよびＢのイソ型で生ずる（コンサイス・エンサイクロペディア（Concise Encyclopedia）：生化学および分子生物学（Biochemistry and Molecular Biology）、トーマス・Ａ、スコット（Thomas A. Scott）およびＥ．アイアン・マーサー（E. Ian Mercer）によって改訂および増補、ワルター・デグライター（Walter deGruyter）、ベルリン−ニューヨーク（Berlin-New York）１９９７年、２０１〜２０２頁、ならびにインスタント・ノート（Instant Notes）：生化学（BioChemistry）、第２版、Ｂ．Ｄ．ハムズ（B.D. Hames）およびＮ．Ｍ．フーパー（N.M. Hooper）、シュプリンガー出版（Springer-Verlag）、ニューヨーク（New York）、２０００年、１２５、１２６、および１３０頁（ＲＢＣ膜およびグリコホリンについての概論に関して）を参照せよ）。
本明細書で用いられるように、用語「循環する短縮グリコホリン（circulating, truncated glycophorin）」は、本発明のアッセイによってＣＨＦ患者の血清中に同定された異常グリコホリン・フラグメントのことをいう。グリコホリンＡおよびＢの細胞外部分を認識する３Ｆ４マウス抗グリコホリン・モノクローナル抗体は、この循環する短縮グリコホリンに結合する。この循環する短縮グリコホリンは、正常な可溶性グリコホリンとは構造的に異なり、疾病過程でＲＢＣ表面から切断されたフラグメントであると理論上想定される。
本明細書で用いられるように、用語「体液（biological fluid）」は任意の身体的液体をいう。非限定的な具体例として、血液、血液産物、尿、唾液、脳脊髄液、およびリンパ液が挙げられる。
本明細書で用いられるように、用語「被検体（subject）」は任意の哺乳類生物のことをいう。特に好ましい被検体はヒトである。
本明細書で用いられるように、用語「対応する（corresponding）」は、一般に抗体抗原結合複合体に関して使用され、例えば、ある抗原に対応する抗体が、生理学的条件下でその抗原に結合する。結合した抗体−抗原は、抗体抗原結合複合体と呼ばれる。
本明細書で用いられるように、用語「シグナル生成物質（signal generating substance）」は、測定可能な反応をおこなう任意の材料のことをいう。非限定的な具体例は、フルオロフォア、酵素、および放射性同位体である。特に好ましいシグナル生成物質は、ペルオキシダーゼがあり、その用途は本明細書の実施例で説明される。
本明細書で用いられるように、用語「鬱血性心不全（congestive heart failure）」は、心臓が循環ポンプとして機能する能力を失う進行性の消耗状態のことをいう。
本明細書で用いられるように、用語「抗体（antibody）」は、生理学的条件下で特異的分子に結合することが可能なＢリンパ球によって分泌されるタンパク質のことをいう。
本明細書で用いられるように、用語「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）は、単一エピトープ特異性を持つ抗体のことをいう。
本明細書で用いられるように、用語「ポリクローナル抗体（polyclonal antibody）は、多数のエピトープに結合可能な抗体のことをいう。
本明細書で用いられるように、用語「抗原（antigen）」は、概して免疫反応を誘導する任意の物質のことをいい、より詳しくは用語「抗原」は抗体の対応結合パートナーのことをいう。
本明細書で用いられるように、用語「自己抗体（auto-antibody）」は、自己抗原を認識する抗体のことをいい、例えば生物によって産生され、かつ該生物自体が持つタンパク質に結合する抗体は自己抗体として呼ばれる。
【０００７】
特異的抗体を用いて、生体試料中の対応する抗原の量を定量することができる。本明細書で用いられるように、用語「ＥＬＩＳＡ」は、酵素結合免疫吸着アッセイのことをいい、該アッセイは生体試料中の微量（ナノグラム未満）の抗原を検出および定量することができる。試験抗体を、不活性の高分子支持体（例えば、成形されたウエルを有するプラスチック・トレイ）に結合させ、続いて生体試料にさらす。未結合のタンパク質を洗い流し、試験抗体が反応する場合とは異なるエピトープで抗原と反応する二次抗体を加える。この二次抗体は、該二次抗体に結合した酵素を有し、この酵素は無色または非蛍光の基質を発色または蛍光産物に変換する。結合した二次抗体の量、したがって元の生体試料に存在するタンパク質抗原の量は、生じた色または蛍光の強度を定量することで、決定される。このＥＬＩＳＡアッセイもまた、「間接ＥＬＩＳＡ」または「サンドイッチＥＬＩＳＡ」と呼ばれる（ＥＬＩＳＡアッセイアッセイの一般原理については、インスタント・ノート（Instant Notes）：生化学（Biochemistry）、第２版、Ｂ．Ｄ．ハムズ（B.D. Hames）およびＮ．Ｍ．フーパー（N.M. Hooper）、シュプリンガー出版（Springer-Verlag）、ニューヨーク（New York）、２０００年、１１２〜１１４頁を参照せよ）。「直接（direct）」と呼ばれるＥＬＩＳＡアッセイの形態も存在し、ここでは抗体を不活性ポリマー支持体に結合させ、対応の抗体を含む生体試料にさらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
疾病過程の結果として、身体の細胞および組織に対する損傷は、細胞および亜細胞レベルで生ずる。当初は、これらのプロセスによって細胞の外膜が損傷を受け、細胞外マトリックスの部分が剥がれ落ちるだけであると考えられ、このようなプロセスは可逆的損傷として広く定義されている。病状の延時間および／または重症度が増加するにつれて、外膜が壊れ始めることで、膜の破裂が生じて細胞内成分が放出される。このようなプロセスは、不可逆的損傷として広く定義されている。そのような損傷が生ずると（可逆的または不可逆的）、生体高分子マーカーが体液循環（circulation）中に放出され、免疫系の活性化が生ずる。なぜなら、通常、該生体高分子マーカーは体液中に存在しないからである。免疫系は、無力化させるべき脅威を持つ侵入病原体または異物として、これらの生体高分子マーカーを見る。この察知された脅威に耐える目的で、自己抗体がこれらの生体高分子マーカーに対して形成される。これらの自己抗体を、生体に損傷を与える最初の侵襲があったことを示す続発症として特徴づけることができる。自己抗体の存在は、細胞損傷が自己抗体産生カスケードに至る免疫応答のイニシエーターとして作用するという理論を実証するものであり、この自己抗体産生カスケードは最終的にはそれ自体が特徴的であってしばしば予測可能な疾病状態として現れる。これらの生体高分子マーカーおよびそれらに関連した自己抗体の出現は、疾患および／または疾患進行の前兆であり、診断目的にとって有用である。
赤血球膜に対する損傷が疾病仮定（例えば、糖尿病およびＣＨＦ）で生ずることが知られている。これらの疾患では、酵素産生および／または活性化（好中球プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、シアリダーゼ、およびエンドペプチダーゼ）の増大があり、該増大は直接的および／または間接的に赤血球細胞膜タンパク質の異常な分解を導く（ガクジスカ（Gaczyiska）他。サイトバイオス（Cytobios）７５：７〜１１、１９９３；  ベネランド（Venerando）他。血液（Blood）  ９９（３）：１０６４〜１０７０、２００２；  ウェグナー（Wegner）他。心臓血管研究（Cardiovascular Research）３１：８９１〜８９８、１９９６；  ピオワー（Piwowar）他。臨床化学実験医学（Clinical Chemistry Lab Medicine）  ３８（１２）：１２５７〜１２６１、２００；  およびサントス・シルバ（Santoes-Silva）他。クリニカ・キミカ・アクタ（Clinica Chimica Acta）  ３２０：２９〜３５、２００２）。
さらに、赤血球（ＲＢＣ）凝集性が糖尿病および脈管アテローム性動脈硬化症で増加することが詳しく記載されている（カイミ（Caimi）他。血栓症および止血（Thromb Haemost）８３：５１６〜５１７、２０００；デミログル（Demiroglu）他。実験臨床内分泌性糖尿病（Experimental Clinical Endocrinol
Diabetes）１０７（１）：３５〜３９、１９９９；  マルチンズ（Martinez）他。臨床血液流動学および微小循環（Clinical Hemorheology and Microcirculation）１８：２５３〜２５８、１９９８；  およびジエグラー（Ziegler）他。代謝（Metabolism）  ４３（９）：１１８２〜１１８６、１９９４）。ＲＢＣ膜リン脂質の変化は、ＲＢＣ凝集性と関連している（マルチンズ（Martinez）他。臨床血液流動学および微小循環（Clinical Hemorheology and
Microcirculation）１８：２５３〜２５８、１９９８）。スフィンゴミリエンは、外膜の主要なリン脂質であり、非糖尿病患者に比べて糖尿病患者に含まれる飽和脂肪酸の割合が高いことが示されている。この飽和の増加は、赤血球間での静電反発を減少させると考えられており、そのことは赤血球の凝集性を高めることになる。
グリコホリンの損失は、赤血球細胞の静電反発をさらに減少させる。グリコホリンは、主要なＲＢＣ膜内在性糖タンパク質である。グリコホリンの高シアル酸付加は、赤血球細胞間での正常な静電反発をもたらす負の表面電荷に関与する（アイラー（Eylar）他。生物化学雑誌（The Journal of Biological
Chemistry）２３７（６）：１９９２〜２０００  １９６２）。疾病過程（例えば、糖尿病）での酵素産生および／または酵素活性化の増加は、ＲＢＣ膜からのグリコホリン類の損失をもたらす。これらのグリコホリン・フラグメントは体液中に放出されて自己抗体の産生を刺激する。次に、グリコホリンの減少は、ＲＢＣ膜の正常な負電荷の減少をもたらし、血液細胞間での全体的な静電反発を減少させる。赤血球間での静電反発の損失は、糖尿病で見られる赤血球細胞の凝集を生ずる。 
いかなる特定の理論にも束縛されることなく、本発明者は、本明細書に説明されたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いてＣＨＦ患者の血漿中に同定された循環短縮グリコホリンが、疾病過程中にＲＢＣ膜から切断される細胞外グリコホリン・フラグメントであると考える。この循環短縮グリコホリンは、グリコホリンの正常な可溶性形態とは構造的に異なる。配列番号２および配列番号４（グリコホリンＡおよびＢ）のアミノ酸残基５〜２５を認識するマウス抗グリコホリン３Ｆ４モノクローナル抗体は、循環グリコホリンも認識する。本発明者はまた、ＣＨＦ患者が抗グリコホリン自己抗体の増加を示すことを直接ＥＬＩＳＡアッセイによって示した。したがって、この循環短縮グリコホリンをＣＨＦ診断の新規生体高分子マーカーとして使用することができると結論する。
【０００９】
実験手順
配列
ホモ・サピエンス（ヒト）グリコホリンＡ核酸配列は、配列番号１として開示され、アミノ酸配列番号２として開示されたグリコホリンＡタンパク質に翻訳される。ホモ・サピエンス（ヒト）グリコホリンＢ核酸配列は、配列番号３として開示され、アミノ酸配列番号４として開示されたグリコホリンＢタンパク質に翻訳される。
【００１０】
抗体
以下の実験で用いたマウス抗グリコホリン・モノクローナル抗体は、バイオアトランティック（BioAtlantic）から購入した。モノクローナル抗体６Ｇ４は、配列番号２（グリコホリンＡ）のアミノ酸残基３９〜４５を認識する。モノクローナル抗体５Ｆ４は、配列番号２のアミノ酸残基１０７〜１１９を含むグリコホリンＡの細胞内部分を認識する。モノクローナル抗体３Ｆ４は、配列番号２および配列番号４のアミノ酸残基５〜２５であるグリコホリンＡおよびＢの細胞外部分を認識する。３Ｆ４抗体とそのエピトープとの結合は糖依存的であり、一方６Ｇ４抗体の結合は糖依存的ではない。これらのモノクローナルは、ラサモエリソロ（Rasamoelisolo）他、ボックス・サングイニス（Vox Sanguinis）７２：１８５〜１９１、１９９７に、詳細に記載されている。
マウス抗グリコホリン３Ｆ４モノクローナル抗体を、寄託番号ＰＴＡ−５１５４のハイブリドーマＮａＭ２６−３Ｆ４Ｄ１１Ａ２として、２０００年４月２３日に米国菌培養収集所（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）に寄託した。米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）の所在地は、２０１１０−２２０９バージニア州マナッサス大学通り１０８０１である。
【００１１】
サンドイッチＥＬＩＳＡによるグリコホリンの定量
１μｌの各ＭｏＡｂを含有する５０ｍＭ炭酸塩（ｐＨ９．４）１００μｌをＥＬＩＳＡプレート（ヌク（Ｎｕｃ）、デンマーク）に塗布し、一晩＋４℃に設定した。次に、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）（シグマ（Sigma）から購入）に０．０５％トゥイーン（Tween）２０を含有させた溶液（ＰＢＳＴ）で、プレートを３回洗った。次に、プレートを、０．５％ＢＳＡ（シグマ）含有ＰＢＳＴ２００μｌで、３７℃で３０分間にわたり、ブロックした。１００μｌのＣＨＦ患者血漿（ＰＲＡＩＳＥＩ２試験）および健常対照血漿（インタージェン（Intergen））をＰＢＳＴで１／１０に希釈したものをウエル毎に添加し（繰り返して同一試料を２つ用意）、それらを室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１００μｌのウサギ・ポリクローナル抗グリコホリンＡ＋Ｂ（バイオアトランティック（BioAtlantic）を添加して室温で１時間インキュベートした後、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで１／５０，０００に希釈したペルオキシダーゼ標識ロバ・ポリクローナル抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）１００μｌを添加した。捕捉グリコホリンの存在は、１００μｌのＴＭＢ（モス（moss, Inc.））を添加することで検出される。５０μｌの１ＮＨ２ＳＯ４を添加することで反応を停止させた。次に、プレートをバイオラド（BioRad）のマイクロプレート・リーダー上、４５０ｎｍで読み取った。
【００１２】
図１は、３Ｆ４モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す。４５０ｎｍの吸光度をＹ軸上に示す。ＣＨＦ患者の血漿から捕捉されたグリコホリンを左側に、正常血漿（対照、ｎ＝３６）から捕捉されたグリコホリンを右側に示す。シグナルは、独立ｔ検定によって計算された対照よりもＣＨＦ血漿のほうが有意に高いこと（ｐ＜０．００１）から、ＣＨＦ血漿試料中に高濃度のグリコホリンがあることが示される。３Ｆ４ＭｏＡｂは、グリコホリンＡおよびＢの両方に共通の配列（配列番号２および配列番号４のアミノ酸残基５〜２５）を認識する。この結合は、このグリコホリン・フラグメントが高度にグリコシル化していることから、糖依存型である。
アッセイがグリコホリンの細胞外ポリペプチドまたはオリゴ糖鎖に特異的であるかどうかを確かめるために、ＭｏＡｂ６Ｇ４（配列番号２のアミノ酸残基３９〜４５を認識）および５Ｆ４（配列番号２のアミノ酸残基１１２〜１２９を認識）を用いた。両方とも、糖鎖とは関係なくグリコホリンＡに結合する。
【００１３】
グリコホリン量が最も高い８つのＣＨＦ試料と、グリコホリン量が最も低い８つの正常血漿試料とを分析し、その結果を図２に示す。図２は、ＣＨＦ患者由来の血漿に捕獲されたグリコホリンと対照である正常血漿に捕獲されたグリコホリンを含むサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイから得た結果を示す（ｎ＝８）。上段の図は、６Ｇ４ＭｏＡｂを用いた結果を示す（ｐ＝０．００１）。中段の図は、５Ｆ４ＭｏＡｂ（ｐ＝０．３６）を用いた結果を示す。下段の図は、３Ｆ４ＭｏＡｂ（ｐ＝０．００３）を用いた図を示す。Ｙ軸は、４５０ｎｍで読み取った吸光度を示す。これら３つの図では、ＣＨＦ患者の血漿から捕獲したグリコホリンを左側に示し、正常血漿から捕獲したグリコホリンを右側に示す。結果は、６Ｇ４がＣＨＦ試料中のグリコホリン量の増加を検出する一方で、５Ｆ４がＣＨＦとヒト正常血漿との間に有意の差がないことを示すことを表している。この結果は、抗体によって認識されたフラグメントが細胞外フラグメントであることから、ＣＨＦの進行中に赤血球細胞膜からグリコホリンが切断されることを示唆している。しかし、留意すべき点は、グリコホリンの可溶形がＣＨＦ患者血漿と同様に正常血漿にも存在し、それがグリコホリンの５Ｆ４モノクローナル抗細胞内ドメインによって検出されることである。
【００１４】
直接ＥＬＩＳＡによる自己抗体の検出
０．５μｇの血液型ＭＭ由来の精製グリコホリンまたは血液型ＭＮ由来のアシアログリコホリン類（シグマ（Sigma））を含有する５０ｍＭ炭酸塩緩衝液ｐＨ９．４を、＋４℃で一晩かけてＥＬＩＳＡプレート上に吸着させた。１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ）（シグマ（Sigma）から購入）に０．０５％トゥイーン（Tween）２０を含有させた溶液（ＰＢＳＴ）で、プレートを３回洗浄した。次に、プレートを、０．５％ＢＳＡ（シグマ（Sigma））含有ＰＢＳＴ２００μｌで、３７℃で３０分間にわたり、ブロックした。１００μｌのＣＨＦ血漿（ＰＲＡＩＳＥ２試験）および対照正常血漿（インタージェン（Intergen））をＰＢＳＴで１／１００に希釈したものをウエル毎に添加し（繰り返して同一試料を２つ用意）、それらを室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＰＢＳＴで１／１０，０００に希釈したペルオキシダーゼ標識ロバ・ポリクローナル抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）１００μｌを添加した。自己抗体抗グリコホリンの存在は、ＴＭＢ（モス社（Moss, Inc.））１００μｌを添加することで検出し、５０μｌの１ＮＨ２ＳＯ４によって反応を停止させた。次に、プレートをバイオラド（BioRad）のマイクロプレート・リーダー上、４５０ｎｍで読み取った。
グリコホリンは、高量の糖鎖が存在することによって免疫原性が高いことが知られている。ひとたび血漿中に見いだされると、それによって抗グリコホリン自己抗体を産生する免疫応答が誘導されると考えられる。
【００１５】
グリコホリンに対するＣＨＦ誘導自己抗体の存在を示すために、血液型ＭＮ由来のグリコホリンおよび血液型ＭＮ由来のアシアログリコホリンをＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、健康なドナー由来の血漿またはＣＨＦ患者由来の血漿を添加した。図３は、正常およびＣＨＦ患者の血漿中でのＣＨＦ誘導自己抗体の存在を評価する直接ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す（ｎ＝３６）。上段の図では、血液型ＭＮ由来のグリコホリンをプレートにコーティングした（ｐ＝０．０１）。下段の図では、血液型ＭＮ由来の脱シアリル化されたグリコホリンをプレート上にコーティングした（ｐ＝０．０３）。Ｙ軸は、４５０ｎｍで読み取った吸光度を表す。図３は、グリコホリン上の重シアル酸および血液型（ＭまたはＮ）とは無関係にＣＨＦでの自己抗体の存在を示す。
【００１６】
免疫沈降によるＣＨＦ血漿中グリコホリンの同定および免疫ブロット法による検出
ＰＲＩＡＳＥＩＩ試験から得たプールＣＨＦ血漿１．２ｍｌを０．５％トリトン（Triton）Ｘ−１００含有ＰＢＳでｖ／ｖ希釈した。次に、２μｌの３Ｆ４ＭｏＡｂ（１．７ｍｇ／ｍｌ）を添加した。＋４℃で一晩インキュベートした後、セファロース（SEPHAROSE）−４Ｂビーズ（ザイメド（Zymed））に結合した２５μｌのヤギＩｇＧ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を添加した。混合物を＋４℃で５時間インキュベートした後、ビーズを０．０５％トゥイーン（Tween）２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。捕獲（糖）タンパク質を１００μｌの０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）で溶出させ、１Ｍトリス（Tris）緩衝液（ｐＨ１１）で中和させた。溶出液をセントリバプ・コンセントレーター（CentriVap Consentrator）（ラブコンコ（Labconco））で濃縮し、５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料検証液中に懸濁し、１００℃で５分間沸騰させた後、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。電気泳動終了後、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、３Ｆ４ＭｏＡｂ抗−ＧＰＡ＋Ｂで染色した後、ＰＢＳＴで１／５０，０００に希釈されたペルオキシダーゼ標識ヤギ・ポリクローナル抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）で染色した。次に、免疫ブロットをＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア（Amersham Pharmacia））を用いて可視化させた。カラムから溶出した３Ｆ４に対する二次抗体の交差反応性を制御するために、ブロットを二次抗体単独でインキュベートした。
【００１７】
３Ｆ４カラムによって捕獲された分子を溶出させて１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードし、同一ＭｏＡｂに対する免疫ブロット法で評価した。図４に示すように、ＣＨＦ血漿に見られるグリコホリンの分子量は、７５、４５、および４０ｋＤａ（レーン２、３Ｆ４でインキュベートしたブロット）である。一般にグリコホリンは、正常赤血球細胞膜から精製された正常グリコホリンをロードしたレーン１に示されるように、ＧＰＡの二量体形、二量体ＧＰＡ／ＧＰＢ、ＧＰＢの二量体形、ＧＰＡの単量体形、およびＧＰＢの単量体形として、それぞれが８０−７０−４０−３７、および２０ｋＤａに泳動する。したがって、ＣＨＦ患者の血漿に見いだされるグリコホリンは、ＲＢＣ膜から精製された正常グリコホリンと比較して、異なる分子量を有する。免疫ブロットを二次抗体単独（対照）とインキュベート、または３Ｆ４抗体とインキュベートした後に二次抗体とインキュベートした。レーン１（両方のブロットで）は、ＲＢＣ膜から精製したグリコホリンを示し、レーン２（両方のブロット）はＣＨＦ患者血漿由来のグリコホリンを示す。２５ないし２００ｋダルトンのタンパク質マーカーを左端に示す。
対照ブロットおよび３Ｆ４ブロットで同定されたＩｇＧは、免疫沈降に用いられ、かつカラムから分離したマウス・モノクローナル３Ｆ４である。２００ｋＤａを上回る（＞２００ｋＤａ）高分子量（ＭＷ）のバンドも検出される。本発明者は、このバンドの性質については確信がもてない。このバンドは、ＩｇＭまたはＩｇＧ自己抗体とグリコホリンとの複合形態と考えられる。
【００１８】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによるＣＨＦ患者試料でのグリコホリンの同定
本発明の方法は、質量分析の技術を用いておこなうことができる。ＰＳ２０チップ（サイファージェン（Cyphergen））を純アセトニトリル（Acetonitrile）-１９０（ＡＣＮ）（カレドン（Caledon））で洗浄して空気乾燥させた。５０μｇのプロテイン（Protein）Ｇ（ピアース（Pierce）を５０μｌの超純水に溶解し、１μｌをＡＣＮ（１μｌ）含有の各スポットにロードした。この混合物を湿度チェンバーで１時間インキュベートした後、スポットを１０μｌの０．５Ｍトリス（Tris）−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）（カレドン（Caledon）で１５分間にわたりブロックした。次に、このチップを超純水で洗浄して空気乾燥した。モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）抗ＧＰＡ＋ＧＰＢ、１．７ｍｇ／ｍｌの３Ｆ４（バイオアトランティック（BioAtlantic）を０．１％トリトン（TRITON）Ｘ（シグマ（Sigma））含有ＰＢＳで１／３に希釈し、１スポットあたり３μｌのＭｏＡｂ溶液をロードし、湿度チェンバーで１時間インキュベートした。未結合のＭｏＡｂを、ＰＢＳによる洗浄でチップから洗い流した。
精製されたグリコホリン（シグマ（Sigma））、ＰＲＡＩＳＥ２試験から得たＣＨＦ血漿、または正常血漿（インタージェン（Intergen））を、以下のようにして、３Ｆ４被覆チップに添加した。
１ｍｇ／ｍｌのグリコホリンをＰＢＳで１／５に希釈し、ＣＨＦおよび正常血漿試料を０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０含有ＰＢＳで１／５に希釈し、さらに各々の２μｌを１スポット毎にロードした。次に、チップを湿度チェンバーで１時間インキュベートし、超純水で２回洗浄した。
次に、捕獲グリコホリンをエンドプロテアーゼＧｌｕＣ（ロッシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics）で処理した。Ｇｌｕｃ粉末を５０μｌの超純水に溶解し、５０ｍＭ炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）（ＢＤＨラボラトリー・サプライズ（BDH Laboratory Supplies）による１／１０希釈物を調製した。１μｌのＧｌｕＣ溶液を各スポットに添加し、湿度チェンバーで２時間インキュベートした。次に、スポットを乾燥させて、飽和シナピン酸（シグマ（Sigma））含有０．５％ＴＥＡ５０％ＡＣＮを１μｌ添加した後に、ＳＥＬＤＩ上での直接分析またはカルバイオケム（Calbiochem）脱グリコシル化キットを用いる処理のいずれかをおこなった。次に、感度＝１０、強度＝１８０〜１９０、および０〜５，０００Ｄａの範囲（０〜５，０００Ｄａに対して最適化）で、チップをＳＥＬＤＩ（サイファージェン（Ciphergen））上で読み取った。
【００１９】
３Ｆ４チップ上に捕獲された（糖）タンパク質をＧｌｕＣで処理した。図５Ａは、ＣＨＦ由来の捕獲グリコホリンのオン・チップ処理から得られた結果を示す。図５Ｂは、正常血漿試料のオン・チップ処理から得られた結果を示す。図５Ｃは、精製グリコホリンのオン・チップ処理から得られた結果を示す。図５Ａないし図５Ｃに示すように、ｍ／ｚが２３６１＋Ｈである（糖）ペプチドが、ＣＨＦおよびグリコホリンの両方で見られたことから、ＣＨＦから捕獲された（糖）タンパク質は、グリコホリンとおそらく一致する。留意すべきことは、精製グリコホリンから得たクロマトグラム（図５Ａないし図５Ｃ）およびＣＨＦ血漿から得たクロマトグラムは、重なり合うことはなかった。このことは、ＣＨＦに含まれるグリコホリンの構造がわずかに修飾を受けていると思われる。
【００２０】
捕獲（糖）タンパク質がグリコホリンと関連があることをさらに証明するために、捕獲（糖）タンパク質をチップ上で脱グリコシル化した。図６は、ＰＳ２０チップ上にコーティングした３Ｆ４モノクローナル抗体を用いて、精製グリコホリンまたはＣＨＦ血漿のいずれかから捕獲した糖タンパク質のオン・チップ脱グリコシル化処理を示す。図６に示すように、少なくとも８つの主ピークが標準グリコホリンから生じたピークと今や一致した。また、ここで注目すべきことは、より多くのピークが検出され、それらはペプチドのみならず脱グリコシル化処理後に放出された糖鎖にも一致していることである。
【００２１】
結論として、本発明は、ＣＨＦの診断に用いられる、体液を循環する短縮グリコホリンを定量するためのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを提供する。グリコホリンが鬱血性心不全（ＣＨＦ）のマーカーとして既に認識されていることに留意することが重要である。本発明者は、ＣＨＦのマーカーとしてグリコホリンを最初に記述したものであり、本明細書中に記載されたアッセイが、ＣＨＦを罹患した個人を識別することが可能な効率的かつ容易に実施可能な診断方法を提供する。
【００２２】
この明細書に述べた全ての特許および刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示すものである。全ての特許および刊行物は、個々の特許および刊行物が具体的かつ個別的に参照によって取り込まれることを示している場合に、同程度に参照することによって、本明細書に取り込まれる。
本発明の特定の形態が例示される一方で本明細書に記載し、かつ示した特定の形態または構成要素の組み合わせに限定されるものではないことは、理解される。本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更が可能であり、また本発明が明細書に示し、かつ記載したものに限られて考慮されるものではないことは、当業者にとって明らかである。
当業者は、本明細書中に内在するものと同様に、目的を実行し、かつ言及された結果および利点を得ることに本発明が十分適していることを容易に理解する。本明細書中に記載したオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した化合物、方法、手順、および技術は、現在のところ好ましい実施形態を示し、例示的であることを意図しており、範囲を限定するものとして意図したものではない。その中での変更および他の用途は、当業者に想到され、それらは本発明の精神の範囲内に包含される。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連させて説明したけれども、特許請求の範囲に記載したとおりに本発明はそのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないと理解しなければならない。実際、当業者に周知である本発明を実行するための記載された態様の種々の修飾は、特許請求の範囲内であることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】モノクローナル抗体３Ｆ４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡから得られたデータを示す。
【図２】モノクローナル抗体６Ｇ４、５Ｆ４、および３Ｆ４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡから得られるデータを示す図である。
【図３】グリコホリンに対する自己抗体の存在を評価する直接ＥＬＩＳＡから得られるデータを示す図である。
【図４】ＣＨＦ患者の血漿から得たグリコホリンの免疫沈降の結果を示す図である。
【図５Ａ】ＣＨＦ患者から得た捕獲グリコホリンのクロマトグラムを示す図である。
【図５Ｂ】健康な患者から得た捕獲グリコホリンのクロマトグラムを示す図である。
【図５Ｃ】精製された捕獲グリコホリンのクロマトグラムを示す図である。
【図６】脱グリコシル化後のクロマトグムを示す図であって、上段のクロマトグラムは精製グリコホリン、中段のクロマトグラムはＣＨＦ患者由来の捕獲グリコホリン、および下段のクロマトグラムはグリコホリン試料無しで流した対照である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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