(57)【要約】本発明は、腫瘍関連抗原をコードするワクチンと腫瘍内皮マーカー８（TEM8）をコードするワクチンとの相乗効果について開示する。それらワクチンの併用によって強力な抗腫瘍免疫が誘導された。このアプローチを用いて、脈管構造によって支持されかつ腫瘍関連抗原が特定されている腫瘍を治療することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）腫瘍関連抗原またはその断片をコードする核酸配列を含むベクター；
（ii）腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列を含むベクター；および
（iii）医薬的に許容されるキャリア；を含有するワクチン組成物。
【請求項２】
前記腫瘍関連抗原が、HER2/neu、チロシナーゼ関連タンパク１（gp75）、チロシナーゼ関連タンパク２（TRP-2）および前立腺特異膜抗原より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列が、マウスまたはヒト由来のものであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項４】
マウス由来の腫瘍内皮マーカー８が、配列番号１の核酸配列を有することを特徴とする請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列が、配列番号２または３の配列を有する腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードすることを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項６】
ヒト由来の腫瘍内皮マーカー８が、配列番号４の核酸配列を有することを特徴とする請求項３記載の組成物。
【請求項７】
前記腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列が、配列番号５または３の配列を有する腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードすることを特徴とする請求項６記載の組成物。
【請求項８】
前記腫瘍内皮マーカー８が、配列番号２、３または５の配列に対して少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３記載の組成物。
【請求項９】
前記腫瘍内皮マーカー８が、配列番号２、３または５の配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３記載の組成物。
【請求項１０】
前記ベクターがプラスミドであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
（i）腫瘍関連抗原またはその断片をコードする核酸配列と腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列とを含むベクター；および
（ii）医薬的に許容されるキャリア；を含有するワクチン組成物。
【請求項１２】
前記腫瘍関連抗原が、HER2/neu、チロシナーゼ関連タンパク１（gp75）、チロシナーゼ関連タンパク２（TRP-2）および前立腺特異膜抗原より成る群から選択されることを特徴とする請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列が、マウスまたはヒト由来のものであることを特徴とする請求項１１記載の組成物。
【請求項１４】
マウス由来の腫瘍内皮マーカー８が、配列番号１の核酸配列を有することを特徴とする請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列が、配列番号２または３の配列を有する腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードすることを特徴とする請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
ヒト由来の腫瘍内皮マーカー８が、配列番号４の核酸配列を有することを特徴とする請求項１３記載の組成物。
【請求項１７】
前記腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列が、配列番号５または３の配列を有する腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードすることを特徴とする請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
前記腫瘍内皮マーカー８が、配列番号２、３または５の配列に対して少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１３記載の組成物。
【請求項１９】
前記腫瘍内皮マーカー８が、配列番号２、３または５の配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１３記載の組成物。
【請求項２０】
前記ベクターがプラスミドであることを特徴とする請求項１１記載の組成物。
【請求項２１】
個体に請求項１記載の組成物を投与する工程を含むことを特徴とする、個体において抗腫瘍免疫応答を誘導する方法。
【請求項２２】
前記組成物が、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、鼻腔内スプレイおよび経口投与より成る群から選択される手段により投与されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物中の２つのベクターが、同時にまたは連続して前記個体に投与されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物中のベクターが、リポソームおよび細菌より成る群から選択される送達手段によって運ばれることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
前記個体が、癌を有するかまたは癌を発生する危険性を有すると診断されたものであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
請求項１記載の組成物および該組成物中のベクターによりコードされるタンパク質より成る群から選択される核酸またはタンパク質を包含する樹状細胞を個体に投与する工程を含むことを特徴とする、個体において抗腫瘍免疫を誘導する方法。
【請求項２７】
前記個体が、癌を有するかまたは癌を発生する危険性を有すると診断されたものであることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項１１記載の組成物を個体に投与する工程を含むことを特徴とする、個体において抗腫瘍免疫を誘導する方法。
【請求項２９】
前記組成物が、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、鼻腔内スプレイおよび経口投与より成る群から選択される手段により投与されることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物中のベクターが、リポソームおよび細菌より成る群から選択される送達手段によって運ばれることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記個体が、癌を有するかまたは癌を発生する危険性を有すると診断されたものであることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
請求項１１記載の組成物および該組成物中のベクターによりコードされるタンパク質より成る群から選択される核酸またはタンパク質でパルスされるかまたはそれらを発現するように誘導された樹状細胞を個体に投与する工程を含むことを特徴とする、個体において抗腫瘍免疫を誘導する方法。
【請求項３３】
前記個体が、癌を有するかまたは癌を発生する危険性を有すると診断されたものであることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）腫瘍関連抗原またはその断片をコードする核酸配列を含むベクター；
（ｂ）腫瘍内皮マーカー８またはその断片を含む組換えタンパク質；および
（ｃ）医薬的に許容されるキャリア；を含有するワクチン組成物。
【請求項３５】
前記腫瘍関連抗原が、HER2/neu、チロシナーゼ関連タンパク１（gp75）、チロシナーゼ関連タンパク２（TRP-2）および前立腺特異膜抗原より成る群から選択されることを特徴とする請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
前記腫瘍内皮マーカー８またはその断片を含む組換えタンパク質が、マウスまたはヒト由来のものであることを特徴とする請求項３４記載の組成物。
【請求項３７】
マウス由来の腫瘍内皮マーカー８またはその断片が、配列番号２または３のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３６記載の組成物。
【請求項３８】
前記アミノ酸配列が、配列番号１の核酸によってコードされることを特徴とする請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
ヒト由来の腫瘍内皮マーカー８またはその断片が、配列番号５または３のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３６記載の組成物。
【請求項４０】
前記アミノ酸配列が、配列番号４の核酸によってコードされることを特徴とする請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
前記腫瘍内皮マーカー８が、配列番号２、３または５の配列に対して少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３６記載の組成物。
【請求項４２】
前記腫瘍内皮マーカー８が、配列番号２、３または５の配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３６記載の組成物。
【請求項４３】
前記ベクターがプラスミドであることを特徴とする請求項３４記載の組成物。
【請求項４４】
個体に請求項３４記載の組成物を投与する工程を含むことを特徴とする、個体において抗腫瘍免疫応答を誘導する方法。
【請求項４５】
前記組成物が、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、鼻腔内スプレイおよび経口投与より成る群から選択される手段により投与されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記組成物中のベクターと組換えタンパク質とが、同時にまたは連続して前記個体に投与されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
前記組成物中のベクターが、リポソームおよび細菌より成る群から選択される送達手段によって運ばれることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
前記個体が、癌を有するかまたは癌を発生する危険性を有すると診断されたものであることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
腫瘍関連抗原またはその断片を含む組換えタンパク質；
腫瘍内皮マーカー８またはその断片を含む組換えタンパク質；および
医薬的に許容されるキャリア；を含有するワクチン組成物。
【請求項５０】
前記腫瘍関連抗原が、HER2/neu、チロシナーゼ関連タンパク１（gp75）、チロシナーゼ関連タンパク２（TRP-2）および前立腺特異膜抗原より成る群から選択されることを特徴とする請求項４９記載の組成物。
【請求項５１】
前記腫瘍内皮マーカー８またはその断片を含む組換えタンパク質が、マウスまたはヒト由来のものであることを特徴とする請求項４９記載の組成物。
【請求項５２】
マウス由来の腫瘍内皮マーカー８またはその断片が、配列番号２または３のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項５１記載の組成物。
【請求項５３】
前記アミノ酸配列が、配列番号１の核酸によってコードされることを特徴とする請求項５２記載の組成物。
【請求項５４】
ヒト由来の腫瘍内皮マーカー８またはその断片が、配列番号５または３のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項５１記載の組成物。
【請求項５５】
前記アミノ酸配列が、配列番号４の核酸によってコードされることを特徴とする請求項５４記載の組成物。
【請求項５６】
前記腫瘍内皮マーカー８が、配列番号２、３または５の配列に対して少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項５１記載の組成物。
【請求項５７】
前記腫瘍内皮マーカー８が、配列番号２、３または５の配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項５１記載の組成物。
【請求項５８】
個体に請求項４９記載の組成物を投与する工程を含むことを特徴とする、個体において抗腫瘍免疫応答を誘導する方法。
【請求項５９】
前記組成物が、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、鼻腔内スプレイおよび経口投与より成る群から選択される手段により投与されることを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記組成物中の組換えタンパク質が、同時にまたは連続して前記個体に投与されることを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６１】
前記個体が、癌を有するかまたは癌を発生する危険性を有すると診断されたものであることを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６２】
腫瘍関連抗原またはその断片を含む組換えタンパク質；
腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列を含むベクター；および
医薬的に許容されるキャリア；を含有するワクチン組成物。
【請求項６３】
前記腫瘍関連抗原が、HER2/neu、チロシナーゼ関連タンパク１（gp75）、チロシナーゼ関連タンパク２（TRP-2）および前立腺特異膜抗原より成る群から選択されることを特徴とする請求項６２記載の組成物。
【請求項６４】
前記腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列が、マウスまたはヒト由来のものであることを特徴とする請求項６２記載の組成物。
【請求項６５】
マウス由来の腫瘍内皮マーカー８が、配列番号１の核酸配列を有することを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項６６】
前記腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列が、配列番号２または３の配列を有する腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードすることを特徴とする請求項６５記載の組成物。
【請求項６７】
ヒト由来の腫瘍内皮マーカー８が、配列番号４の核酸配列を有することを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項６８】
前記腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列が、配列番号５または３の配列を有する腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードすることを特徴とする請求項６７記載の組成物。
【請求項６９】
前記腫瘍内皮マーカー８が、配列番号２、３または５の配列に対して少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項７０】
前記腫瘍内皮マーカー８が、配列番号２、３または５の配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項７１】
前記ベクターがプラスミドであることを特徴とする請求項６２記載の組成物。
【請求項７２】
個体に請求項６２記載の組成物を投与する工程を含むことを特徴とする、個体において抗腫瘍免疫応答を誘導する方法。
【請求項７３】
前記組成物が、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、鼻腔内スプレイおよび経口投与より成る群から選択される手段により投与されることを特徴とする請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
前記組成物中のベクターと組換えタンパク質とが、同時にまたは連続して前記個体に投与されることを特徴とする請求項７２記載の方法。
【請求項７５】
前記組成物中のベクターが、リポソームおよび細菌より成る群から選択される送達手段によって運ばれることを特徴とする請求項７２記載の方法。
【請求項７６】
前記個体が、癌を有するかまたは癌を発生する危険性を有すると診断されたものであることを特徴とする請求項７２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、抗腫瘍免疫の分野に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍関連抗原および腫瘍内皮の両方をターゲティングすることによって抗腫瘍免疫応答を誘導する組成物および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗腫瘍遺伝子療法の試みの多くは実質的に、ワクチンによってもたらされるような永続的な全身免疫応答を確立することを狙った免疫学的アプローチに基づくものである。癌ワクチンへの関心は、ある患者における免疫原性腫瘍関連抗原に対するＢ細胞およびＴ細胞免疫応答の存在によって示されるように、免疫原性腫瘍関連抗原が存在することが明らかになったときに再燃した。
【０００３】
周知の腫瘍関連抗原の１つは、HER2/neu癌遺伝子産物である膜貫通タンパク質p185である。p185タンパク質は、細胞増殖ならびに発癌に関連するチロシンキナーゼ受容体である。例えば、乳癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、前立腺癌および肺癌のような多くのヒト癌において、p185の過剰発現が観察されている。p185の細胞外ドメインをコードするDNA配列がプラスミドに挿入され、最近、臨床免疫療法において用いられている。
【０００４】
それにも関わらず、ほんの僅かな腫瘍抗原のみが免疫療法ターゲットとして選択され、いくつかの重要な試みにも関わらず、遺伝子療法はまだ想定される臨床結果をもたらしていない。成功しないことの理由の１つは、単一の治療ターゲットを使用することにあり、それでは癌の発生を効果的に停止させることができないと思われる。腫瘍細胞は遺伝学的に不安定であることが分かっており、そのことは、高い突然変異率によって腫瘍発生が達成されることを意味する。結果として、ある抗原に対して誘起された免疫応答は、突然変異が生じた場合は最早有効ではなく、免疫系はその抗原の変異体を認識できない。それらの問題を克服するために、多くのエピトープを同じワクチンにおいて組み合わせるかまたは複数のターゲットを標的とする、新しい世代のワクチンが現在開発されている。
【０００５】
微小転移を越えた固形腫瘍の増殖は、独立した血液供給の形成を必要とする。腫瘍脈管構造への宿主内皮の補充が、腫瘍の進行および転移に重要な役割を果たすと考えられている。この理由で、腫瘍脈管構造で発現される分子は、化学療法および免疫療法のターゲットとして開発されている。
【０００６】
生理的および病理的状態に関連する血管新生は、部分的に重複する一連の分子を利用する。例えば、胚形成、黄体および創傷治癒のような生理的新血管形成において、血管新生分子および抗血管新生分子がアクセサリー細胞によって遊離される。それら因子は、内皮細胞の遊走および増殖、それらの形態形成（毛細血管）分化および同時に生じる間質マトリクスのリモデリングを制御する。それら過程は生理的状態においてきちんと調節されているが、永続的な自由な(deregulated)血管新生が癌ならびに他の疾患において観察される。しかしながら、内皮細胞それ自体は変わらず、従って、腫瘍細胞よりも調節しやすい。腫瘍の脈管構造を攻撃することによる腫瘍増殖の阻害は、抗血管新生への介在のための主要なターゲットを提供する。実際、エンドスタチン、アンギオスタチン、VEGFアンタゴニストおよび多くの他の新世代血管新生阻害剤を用いて開発された前臨床動物モデルが、この概念の指針となる原理を十分に実証し、臨床試験を実現した。しかしながら、前臨床試験においてこれら薬剤によって示されたかなりの裏づけにも関わらず、腫瘍細胞を標的とする標準的細胞減少療法と比較したときに、有意な永続的臨床反応は観察されなかった。
【０００７】
異種（ヒト）内皮細胞（HUVEC）から成るワクチンがマウスモデルにおいて抗腫瘍免疫を誘導することが報告された（Wey et al., 2000）。より最近では、乳癌のトランスジェニック(HER-2/neu+)マウスモデルにおいて、ヒト臍帯静脈内皮細胞ワクチンが評価された。異種ヒト臍帯静脈内皮細胞とHER-2/neu+ DNAワクチンとを組合せて、筋肉注射によってHER-2/neu+トランスジェニックマウスを免疫した。これら実験において、個々の免疫学的刺激は、限られた腫瘍防御を示すか(neu DNAワクチン)、または全く示さなかった（ヒト臍帯静脈内皮細胞）が、組合せて投与されたマウスは、攻撃的な乳癌から防御された。このような乳癌発癌の防御は、癌細胞と腫瘍内皮の両方に対する免疫応答を組み合わせることが、腫瘍ワクチンの設計における重要な進歩となるという原理の証拠を示す。
【０００８】
最近、Carson-Walterら(2001)は、腫瘍関連内皮において特異的に上昇する腫瘍内皮マーカー(TEM)と称される少なくとも４６の転写物の存在を開示する。腫瘍内皮マーカーとして、インテグリン、別の増殖因子受容体、ならびに下流シグナリング事象に関連する他の分子が挙げられる。腫瘍内皮マーカーは、ヒトおよびマウスの両方で腫瘍の脈管構造において明らかに検出できる。
【０００９】
TEM8の発現パターンは、その遺伝子が腫瘍血管新生に非常に特異的であり正常な成体の血管新生に必要とされないことを示唆することから、特に興味深い。ヒトおよびマウスのTEM8タンパク質は共に、少なくとも７つの潜在的リン酸化部位を共有する大きな細胞質テイル(large cytoplasmic tail)を有し、TME8が細胞への細胞外シグナルの伝達に関連するという仮説を支持する。
【００１０】
ヒト患者をマウス内皮細胞株で免疫することは理論的には可能であるが、法的理由から、臨床品質のワクチンにおいてヒト臍帯静脈内皮細胞を代用する個々の分子を同定することがより現実的である。異種ヒト臍帯静脈内皮細胞に代わる１つの非常に見込みのある選択は、HER-2/neuのような腫瘍特異的DNAワクチンの抗腫瘍効果を増強するために腫瘍内皮マーカー８（TEM8）抗原を使用することである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
腫瘍関連抗原または腫瘍血管新生に関連する分子をターゲティングすることによって個々に誘導される抗腫瘍免疫を増強するアプローチが必要とされており、先行技術において欠けている。本発明は、同一ワクチンにおいて腫瘍関連抗原とTEM8分子の両方をターゲティングする組成物および方法を提供することによって、当業界におけるこの長年の要求および要望を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、腫瘍内皮マーカー８遺伝子(TEM8)の産物が、免疫原として用いられたときに腫瘍関連抗原に対する免疫応答を高めることができ、それによって効果的でかつ長期間持続する腫瘍発生の免疫防御をもたらすことができるという驚くべき発見を報告する。
【００１３】
腫瘍内皮マーカー８(TEM8)は、腫瘍の新生脈管構造、胎児の肝臓および脳において発現されるが、正常な成体組織では発現されない。炭疽毒素受容体（ATR）は、TEM8のスプライス変異体であり、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインに亘るアミノ酸配列において一致する。
【００１４】
最初の免疫実験は、乳癌のトランスジェニックマウスモデルにおいてTEM8/ATRexおよびHER2/neuの細胞外ドメインを用いて実施した。ラットneu プロト癌遺伝子の遺伝子を導入したマウスを、TEM8/ATRexをコードするDNA 100mgおよびラットneuの細胞外ドメインをコードするDNAで、隔週の間隔で３回筋肉注射によって免疫した。FVB/neuマウス系統に由来する同系腫瘍株をマウスに攻撃接種した。この実験で、TEM8/ATRex単独で免疫したマウスは腫瘍増殖に対して全く防御を示さなかったが、HER2 neuでの免疫は部分的な防御をもたらした。一方、HER2/neu＋TEM8での免疫は、６５日間に亘りほぼ完全な防御をもたらした（図４）。
【００１５】
TEM8ワクチンの効果が広範囲の腫瘍に対する免疫を高めることを示すために、TEM8＋ヒトチロシナーゼ関連タンパク１（hgp75）（メラノーマ分化抗原）でマウスを免疫した。最初の実験では、粒子射撃法により4mg（腹部の各四分区間のそれぞれに1mgずつ）のpINGTEM8 DNAを全てのマウスに週１回ずつ５回注射した。毎週、pINGTEM8 DNA注射の３日後、粒子射撃法により4mg（腹部の各四分区間のそれぞれに1mgずつ）のhgp75 DNAでマウスを免疫した。最後のhgp75 DNA注射の５日後、免疫マウスにB16腫瘍細胞を皮内に攻撃接種した。少なくとも２週間の間、２−３日ごとに腫瘍をキャリパーで計測した。
【００１６】
HER2/neuで免疫しFVB/neu腫瘍を攻撃接種した場合のように、pINGTEM8 ワクチン接種単独ではB16腫瘍増殖に全く影響を及ぼさなかった。図５に示すように、腫瘍の攻撃接種後40日目、hgp75免疫単独では57%の腫瘍防御をもたらしたが、hgp75＋pINGTEM8は、87％腫瘍無し生存(tumor free survival)を示した。従って、その効果は相乗的であり、付加的なものではない。
【００１７】
さらに、本発明者は、hgp75により誘導される免疫がTEM8に依存するか否かも調べた。図６に示すように、TEM8 DNA、PSMA DNAのいずれか単独、またはPSMA DNAとhgp75 DNAの両方のいずれで免疫しても、B16腫瘍に対する免疫をもたらさなかった。しかしながら、TEM8 DNAとhgp75 DNAの両方で免疫すると、B16腫瘍に対して最大の防御をもたらした。このことは、hgp75により誘導される免疫がTEM8に依存することを示した。さらには、図７に示すように、抗腫瘍効果の誘導におけるTEM8とhgp75との相乗的効果は、CD8+Ｔ細胞を欠くマウスでは完全に失われた。このことは、CD8+Ｔ細胞がTEM8により誘導される免疫を媒介することを示す。さらに、図８に示すように、TEM8はB16メラノーマの外科的切除モデルにおいても腫瘍免疫を高めることが観察された。
【００１８】
本発明の目的は、癌の予防的または治療的処置のために同時にまたは別個にまたは連続して用いられる、腫瘍関連抗原およびTEM8遺伝子産物あるいはそれらの免疫原性断片または誘導体をコードする核酸分子を含有する調製物を提供することである。脈管構造によって支持され、さらに例えば分化抗原のような腫瘍関連抗原が特定されている、任意の腫瘍をこのアプローチで処置することができる。
【００１９】
本発明は、ワクチンとして有用な組成物、およびその組成物を用いて抗腫瘍免疫を誘導する方法に関する。本発明の１つの実施形態では、ワクチンとして有用な組成物を提供する。その組成物は、腫瘍関連抗原またはその断片をコードする核酸配列を含むベクター、腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列を含むベクター、および医薬的に許容されるキャリアを含有する。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、ワクチンとして有用な関連組成物を提供する。その組成物は、腫瘍関連抗原またはその断片をコードする核酸と腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列とを含むベクター、および医薬的に許容されるキャリアを含有する。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態では、ワクチンとして有用な別の関連組成物を提供する。その組成物は、腫瘍関連抗原またはその断片をコードする核酸配列を含むベクター、腫瘍内皮マーカー８またはその断片を含む組換えタンパク質、および医薬的に許容されるキャリアを含有する。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態では、ワクチンとして有用な別の関連組成物を提供する。その組成物は、腫瘍関連抗原またはその断片を含む組換えタンパク質、腫瘍内皮マーカー８またはその断片を含む組換えタンパク質、および医薬的に許容されるキャリアを含有する。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態では、ワクチンとして有用な別の関連組成物を提供する。その組成物は、腫瘍関連抗原またはその断片を含む組換えタンパク質、腫瘍内皮マーカー８またはその断片をコードする核酸配列を含むベクター、および医薬的に許容されるキャリアを含む。
【００２４】
さらには、本発明の他の実施形態において、それらワクチン組成物を用いてヒトにおいて抗腫瘍免疫を誘導する方法を提供する。
【００２５】
本発明の他のおよび追加の態様、特徴および利点は、以下の本発明の現在好ましい実施形態の記載から明らかであろう。それら実施形態は、開示目的で記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本明細書で用いられている「抗原」または「免疫原」は、免疫応答を誘起できるかまたは誘起される免疫応答のターゲットとなり得る分子である。
【００２７】
本明細書で用いられている「腫瘍抗原」または「腫瘍関連抗原」は、腫瘍に関連するタンパク質、あるいは癌細胞内またはその表面に発現されるタンパク質であって、MHC分子と関連して抗原提示細胞の表面に提示されるかあるいはその細胞表面上に無傷のタンパク質として提示されたときに免疫応答を誘起できるものである。腫瘍関連タンパク質は、共有抗原(shared antigen)（正常細胞にも存在する抗原）、ウイルス抗原、分化抗原、あるいは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞免疫応答を誘導することができる突然変異抗原であってもよい。抗原は、癌細胞の粗抽出物を調製することによって、組換え技術により抗原を部分的に精製することによって、あるいは公知抗原のde novo合成によって、調製することができる。腫瘍関連抗原として、限定はされないが、ペプチド、ポリペプチド、多糖、複合多糖、脂質および糖脂質などが挙げられる。腫瘍細胞または腫瘍細胞抽出物を腫瘍関連抗原調製物として用いてもよい。
【００２８】
「癌を発生する危険性を有するヒト」は、（i）例えばタバコ、アスベストまたは他の化学毒素、ウイルス、または放射線のような発癌物質への環境曝露に曝されたヒト；（ii）既に癌の治療を受けていてさらに低いまたは検出できない全身腫瘍組織量を有するが、再発を統計的に見積もることができる対象；（iii）その遺伝子的疾病素質、病状または以前の処置、ウイルス感染、あるいは癌を発生する高い可能性との関連性が実証されている遺伝形質に基づき、癌を発生する高い確率を有するヒトである。
【００２９】
「癌を有するヒト」は、検出可能な癌細胞を有するヒトである。癌または腫瘍は、限定はされないが、例えば、胆道癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、上皮内新生物、リンパ腫、肝癌、肺癌（小細胞および非小細胞）、メラノーマ（黒色腫）、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、膀胱癌、甲状腺癌、腎癌、ならびに他の癌および肉腫を含む。
【００３０】
理想的な癌治療薬は、体の複数の部位で全身腫瘍をターゲティングするのに十分な親和性および特異性を有するが、一方で、新生物細胞と非新生物細胞とを識別する必要がある。これに関して、抗原特異的癌免疫療法および腫瘍新生脈管構造の免疫ターゲティングは、癌の予防および治療のための２つの魅力的な戦略を表す。本発明は、それら２つの抗腫瘍免疫誘導の戦略を組み合わせて、結果として予想外の相乗的応答をもたらす新規なアプローチを開示する。
【００３１】
腫瘍内皮マーカー８（TEM8）は、正常および新生物ヒト結腸における内皮細胞の差別的発現スクリーニングによって同定された(Carson-Walter et al., 2001)。TEM8転写物は、腫瘍脈管構造を裏打ちする内皮細胞において差別的におよび豊富に発現される。マウスの対応物は96％同一であり、in situ PCRで示されるように、自然発生マウスメラノーマB16において高発現される。マウス由来のTEM8の核酸配列は配列番号１の配列を有するが、一方、ヒトTEM8の核酸配列は配列番号４の配列を有する。マウスTEM8核酸は、Iドメイン（接着モチーフ）を有する561アミノ酸（配列番号２）のI型膜貫通タンパク質をコードする。一方、ヒトTEM8は、564アミノ酸（配列番号５）のタンパク質をコードする。TEM8の生理的機能は知られていない。TEM8の細胞外ドメインの部分は、インテグリンの細胞外ドメインにおいてよく見られるフォン・ヴィレブランド因子Ａ型ドメインと高い相同性を共有する。
【００３２】
興味深いことに、TEM8遺伝子の他のスプライス産物は、炭疽受容体（ATR）タンパク質を作り出し、それは、完全な細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む最初の364アミノ酸に関してTEM8と一致し、その後、TEM8とは相違する４アミノ酸の後、終結する。炭疽毒素受容体タンパク質は、突然変異誘発物質により炭疽耐性にしたCHO細胞の単離および分析によって炭疽受容体として同定された(Bradley et al., 2001)。
【００３３】
腫瘍脈管構造におけるその発現のために、研究者は、TEM8を、単独でまたは他の腫瘍関連抗原と組み合わせて、腫瘍免疫療法のためのターゲットとして調べた。本発明は、TEM8の細胞外ドメインをコードするDNAワクチンが、腫瘍において発現される分化マーカーをコードするDNAワクチンと組み合わせて用いられたときに、その後の腫瘍攻撃接種からマウスを防御することを示す。従って、腫瘍関連抗原とTEM8遺伝子産物とを１つのワクチンにおいて組み合わせることによって、強力な抗腫瘍免疫を誘導できる。
【００３４】
本発明は、腫瘍関連抗原をコードする核酸配列とTEM8遺伝子産物をコードする核酸配列との組合せを提供する。例えばプラスミドまたは修飾ウイルスのような適切な発現ベクターに核酸配列を挿入することができ、それらベクターは、プロモーター、エンハンサー、シグナルまたはターゲット配列を含んでいてよく、それらの全てが対応ポリペプチドの発現および亜細胞局在化に適したものである。異なる抗原をコードする複数の配列を別個にまたは融合して、同じベクターに挿入してもよい。本発明はまた、腫瘍関連抗原とTEM8組換えタンパク質とをコードする核酸配列を含む組成物を提供する。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、組み合わせた活性成分をワクチンとして用いてもよい。ワクチン調製の原理および方法は、Paul, "Fundamental Immunology", Raven Press, New York (1989)またはCryz, S. J., "Immunotherapy and vaccines", VCH Verlagsgesselshaft (1991)に記載されているように、当業者に公知である。DNAワクチンは通常、CTLまたは抗体誘導エピトープを含む１以上の抗原をコードするプラスミドDNAから構成される（Wolff et al., 1990）。周知技術に従って、プラスミドを調製してワクチンとして用いることができる（Donnelly et al., 1994）。
【００３６】
ワクチン組成物は通常、乳化剤、緩衝剤のような添加剤、および不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバンのようなアジュバントをさらに含む。ワクチン組成物はまた、例えば、免疫応答をさらに高めることができるGM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18またはCD40Lのようなサイトカインを含んでいてよい。
【００３７】
腫瘍抗原およびTEM8遺伝子産物、あるいはそれらの断片または誘導体のいずれか、あるいはそれらをコードする核酸分子、の組合せを含有する製剤を、癌を発生する危険性を有する対象の予防的治療において用いることができる。本発明の１つの実施形態では、製剤は、腫瘍抗原としてHER2プラスミドDNAを含有し、乳癌、子宮癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、頭部癌および頚部癌の予防または治療的処置において用いられる。別の実施形態において、製剤は、腫瘍抗原としてgp75プラスミドDNAまたはTRP-2プラスミドDNAを含有し、悪性黒色腫の治療に用いられる。当業界で周知である他の腫瘍関連抗原を本発明において同様に腫瘍関連抗原として用いてもよい。
【００３８】
腫瘍関連抗原およびTEM8遺伝子産物は、別個のDNA分子によってコードされていてもよい。あるいは、腫瘍関連抗原およびTEM8遺伝子産物は、融合タンパク質またはポリシストロン性のポリペプチドとして構成されてもよい。さらには、TEM8の細胞外ドメインをワクチン組成物に配合できるのみならず、完全長TEM8配列をワクチンとして用いてもよい。
【００３９】
DNAワクチンとして用いるプラスミドは、様々な非経口、粘膜および局所経路によって送達できる。例えば、筋肉内、皮内、皮下(PNAS 83:9551(1986); 国際公開第90/11092号)または他の経路によって、プラスミドDNAを注射できる。鼻腔内スプレイまた点滴剤、直腸用の座薬により、あるいは経口で投与してもよい。遺伝子銃(Johnston, 1992)またはバイオジェクター(Biojector)を用いて、表皮または粘膜表面に投与してもよい。プラスミドは、水溶液中に提供してもよく、金粒子上で乾燥させて提供してもよく、あるいは、限定はされないが、リポソーム、デンドラマー(dendramers)、蝸牛状物(cochleate)およびマイクロカプセル化等の別のDNA送達システムに関連させて提供してもよい。免疫系への送達手段(delivery vehicle)として作用するサルモネラ菌のような、細菌の修飾形態に遺伝子担持プラスミドを導入できることが最近発見された。形質転換された細菌は、経口によりまたは他の当業界で周知の手段により宿主に投与することができる。
【００４０】
例えばmRNAのような核酸を、ワクチンとして用いられる自系樹状細胞に負荷させてもよい。樹状細胞が強力な抗原提示細胞であることは当業界で周知であり、さらに、抗原負荷樹状細胞による免疫応答を誘導する方法およびプロトコルも当業界で周知である。
【００４１】
腫瘍抗原ワクチンおよびTEM8ワクチンは、同時に投与しても別個に投与してもよい。治療は、腫瘍診断の前、疾患が出現したとき、または腫瘍の外科的切除の直後のいずれに開始してもよい。様々な間隔で投与を繰返してもよく、患者の症状が改善する限り、組み合わせた活性成分の用量は当業界で周知であるプロトコルに基づき変化させることができる。
【００４２】
いずれにしても、組み合わせた成分がペプチドであっても核酸であっても、それらは適切な薬剤組成物中に含められるであろう。医薬組成物は、腫瘍抗原およびTEM8抗原の両方の効果量を含有し、その効果量はＢ細胞またはＴ細胞免疫応答を誘起できる量である。
【００４３】
本発明は、ワクチンとして有用な物質の組成物に関する。その組成物は、腫瘍関連抗原(TAA)またはその断片をコードする核酸配列、および腫瘍内皮マーカー８(TEM8)またはその断片をコードする核酸配列を含有する。あるいは、その組成物は、腫瘍関連抗原またはその断片をコードする核酸配列、および腫瘍内皮マーカー８(TEM8)またはその断片を含む組換えタンパク質を含有する。さらには、その組成物は、腫瘍関連抗原またはその断片と腫瘍内皮マーカー８(TEM8)またはその断片とを含む組換えタンパク質を含有する。さらに、その組成物は、腫瘍関連抗原またはその断片を含む組換えタンパク質、および腫瘍内皮マーカー８(TEM8)またはその断片をコードする核酸配列を含有する。腫瘍関連抗原およびTEM8抗原をコードする配列は、異なるベクターに組み込んでも、あるいは単一のベクターに組み込んでもよい。腫瘍関連抗原の代表的例示として、HER2/neu、チロシナーゼ関連タンパク１(gp75)、チロシナーゼ関連タンパク２（TRP-2）、および任意の種由来の前立腺特異膜抗原が挙げられる。１つの実施形態において、TEM8タンパク質またはその断片は、マウスまたはヒト由来のものである。マウス由来TEM8は配列番号１の核酸配列を有し、その配列は、それぞれ配列番号２または３の配列を有するTEM8タンパク質またはその断片をコードする。ヒト由来のTEM8は配列番号４の核酸配列を有し、その配列は、それぞれ配列番号５または３の配列を有するTEM8タンパク質またはその断片をコードする。さらには、当業者は、TEM8アミノ酸配列を操作して、配列番号２、３または５のいずれかに100％同一ではない有用なTEM8を作ることができることを容易に認識するであろう。例えば、当業者は、配列番号２、３または５の配列に80％または90％相同であるタンパク質が有用であることに気づくであろう。
【００４４】
本発明はまた、本発明のワクチン組成物を用いて、例えばヒトのような対象において抗腫瘍免疫を誘導する方法に関する。通常、対象は、癌を有するか、または癌を発生する危険性を有する。ワクチン組成物のベクターは、例えば、リポソームまたは修飾細菌のような送達手段に担持させることができる。ワクチン組成物が別個のベクターを含有する場合、異なるベクターは、同時にまたは連続して対象に投与してよい。好ましくは、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、鼻腔内スプレイまたは経口投与によりワクチンを投与する。あるいは、ワクチンまたはワクチンによってコードされるタンパク質を負荷した樹状細胞を用いて対象を免疫してもよい。
【００４５】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を説明する目的で記載されており、いずれの態様においても本発明を限定することを意図しない。それら実施例は、本明細書に記載されている方法、手順、処置、分子および特定化合物と共に、現在における好ましい実施形態の例示である。当業者は、本明細書に記載の目的、目標および利点、ならびに本来備わっている目的、目標および利点を達成するために、本発明をうまく適合させることを容易に行うであろう。当業者は、請求の範囲によって特定される本発明の精神に包含される変化および他の用途を考え付くであろう。  
【実施例１】
【００４６】
プラスミドDNA構築物
鋳型としてHindIIIで切断したpCDneuNT(Invitrogen)、および以下のプラーマー：センス5'-CGCAAGCTTCATCATGGAGCTGGC-3'（配列番号６）；アンチセンス 5'-GCAGAATTCTTATGTCACCGGGCT-3'（配列番号７）を用いたPCRクローニングによってpVAXXCDneuを調製した。PCR条件は以下の通りである：工程１、94℃で10分；工程２、95℃で１分、58℃で１分、72℃で２分、28サイクル；工程３、72℃で10分。
【００４７】
Concert Qiagen キットによるおよびさらにQiaex  ゲル抽出キット（Qiagen）によるPCR産物の精製の後、HindIIIおよびEcoRI消化；T4 DNAライゲーション（１晩）；エレクトロポレーション（BioRad装置）によるDH5α細胞(Takara)の形質転換；の工程に続いて、HER2の細胞外ドメインに対応する断片をpVAX（Invitrogen、臨床品質)中にクローン化した。得られたクローンをシーケンシングにより確認した(ABI Prism, Perkin-Elmer)。
【００４８】
プラスミドpATRexを構築するため、FVB/neuTトランスジェニックマウスで生じた乳癌から抽出した全RNAから、TEM8 cDNAを調製した。次に、TEM8 cDNAを以下のプライマーを用いてPCR増幅した：センス−GGACTCTGCGTGGCTGCACTCGTGC（配列番号８）；アンチセンス−AGAGCAGCGCCAGGGCCAGCAGCAG（配列番号９）。PCR条件：工程１、95℃で５分；工程２、95℃で１分、64℃で１分、72℃で２分、35サイクル；工程３、72℃で10分。これによって、pGEMへのアミノ酸13-278のクローニングが達成され、この構築物を用いて核酸分析用のリボプローブを作成した。
【００４９】
TEM8のアミノ酸配列27-279（配列番号３）に対応する配列をクローン化するために、このプラスミドからさらに抽出を実施した。以下のプライマーを用いて、新規な配列をPCRクローニングした。FWKpnIm8センス−GGGGGTACCGCAATGGGCCGCCGC GAGGATGGGGGA（配列番号１０）；RVEcoRIm8アンチセンス−GGTGGAATTCCTAGCACAGCAAATAAGTGTCTTC（配列番号１１）。プライマーは、ATG転写開始コドン、終止コドン、および哺乳類細胞で発現させるためにpcDNA3.1中にクローニングするための制限部位を導入するように設計した。PCR条件：工程１、95℃で５分；工程２、95℃で１分、64℃で１分、72℃で２分、35サイクル；工程３、72℃で10分。
【００５０】
増幅後、その断片をKpnIおよびEcoRIで消化し、pcDNA3.1中にクローン化した。続いて、EcoRIおよびKpnI制限酵素を用いてTME8配列を切り出し、臨床品質のベクターpINGのEcoRIおよびKpnI部位に挿入して、pINGTEM8を作成した。pINGTEM8内でのTEM8配列の配向および配列をシーケシングにより確認した。
【００５１】
TEM8組換えタンパク質に用いたプライマーは：attB1bis-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGATGGGCCGCCGCGAGGATGGGGGA（配列番号１２）、attB2bis-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGCACAGCAAATAAGTGTCTTC（配列番号１３）である。
【００５２】
完全長ヒト前立腺特異膜抗原（PSMA）(Isreali et al., 1993)およびマウスPSMA cDNA（Bacich et al. 1998）を臨床品質のベクターpING(Bergman et al., 2003) 中にクローン化した。hgp75 DNAは報告されている(Weber et al., 1998)。DNA免疫の方法は報告されている(Ross et al., 1997; Weber et al., 1998)。
【実施例２】
【００５３】
乳癌に対する免疫および防御
ヒト乳癌のマウスモデルにおいて抗腫瘍免疫に関する本発明の治療的効果を試験した。マウス乳癌ウイルスプロモーター／エンハンサーの転写制御下にラット癌遺伝子neu(neuT)を導入されたメスFVBマウスは、性成熟後に散発性の乳癌を発生した。それら「自然発生」腫瘍由来の細胞を単離およびクローン化して、皮下接種により同じマウスに腫瘍攻撃接種を行うのに用いた。FVB/neuトランスジェニックマウスから単離されVSG A1と称される癌細胞を、neu癌タンパク質(oncoprotein)およびMHCクラスI分子の両方の発現に関するFACS分析に基づき特徴づけした。20％FBSを含有する標準的培地において細胞を拡大させた。スクラッピングにより接着細胞を剥がし、脇腹に皮下注射する直前に生存性を管理した。
【００５４】
100μgのプラスミを含有する100μlの滅菌生理食塩水を大腿四頭筋に注射することにより、DNA免疫を実施した。通常、２週間間隔で３回筋肉注射するスケジュールを用いた。
【００５５】
次に、マウスに攻撃接種し、隔日で触診によって腫瘍の発症を観察した。腫瘍が2mm径に達し成長し続けると、状態を記録した。小さい方の径（mm）の２乗に、２で割った大きい方の径を掛けることによって腫瘍塊の質量（mg）を計算した。急速に成長する腫瘍を切除し、ホルマリンに固定し、組織学的評価および血管免疫染色のために準備した。別の場合として、TEM8 mRNA分析のために、腫瘍を直ぐに液体窒素で凍結させた。腫瘍が進行している（通常約１cmのサイズ）ことが確認されると、マウスを屠殺した。
【００５６】
図４に示すように、pATRex単独で免疫したマウスは腫瘍増殖からの防御を全く示さなかったが、HER2neuで免疫すると部分的な防御をもたらした。一方、HER2/neu＋pATRexで免疫すると、65日間に亘りほぼ完全な防御をもたらした。
【実施例３】
【００５７】
メラノーマに対する免疫および防御
プラスミドDNAをプラスチックチューブに掛けて以前記載したようにマウスの皮膚に注射した（Hawkins et al., 2000）。簡単に説明すると、マウスの腹部の毛を除去し、ヘリウム駆動銃(Accell, PowderJect, Madison, WI)を用いて、腹部四分区画にプラスミドDNAを送達させた（四分区画当たり１μgプラスミドDNA）。これらの実験のために、マウス（15匹／群）に週１回の間隔で５週間pINGTEM8注射を行った。同じスケジュールでhgp75もマウスに注射する場合は、hgp75ワクチンがpINGTEM8ワクチンの３日後に与えられるように時差をつけて行われた。hgp75のみで免疫したマウスは、同じhgp75抗原を受けた他のマウスと同じ日に５週間ワクチンを受けた。
【００５８】
最後のhgp75 DNA免疫の５日後に、3x104のB16メラノーマ細胞をマウスの右脇腹に皮内注射した。pINGTEM8のみを受けたマウスに関しては、最後のpINGTEM8ワクチンの８日後に攻撃接種を行った。その後、隔日で触診により腫瘍の発生に関してマウスを追跡した。腫瘍が2mm径に達し成長し続けると、その状態を記録した。腫瘍が進行している（通常約１cmのサイズ）ことが確認されると、マウスを屠殺した。
【００５９】
図５に示すように、TEM8ワクチン接種単独は、B16腫瘍の増殖に全く影響を及ぼさなかった。しかしながら、腫瘍の攻撃接種の40日後に、hgp75免疫単独は57％腫瘍防御をもたらし、一方でhgp75＋pINGTEM8免疫は87％腫瘍なし生存をもたらした。従って、抗腫瘍効果は相乗的であり、付加的ではない。
【００６０】
さらに、hgp75およびTEM8 DNAワクチンでの免疫により誘導される免疫の改善がTEM8に依存するか否かを調べた。これを達成するために、同じ免疫条件を用いて実験を繰返した。PSMA DNA、またはPSMA DNAおよびhgp75 DNAの両方の何れかでマウスを免疫した、２つの追加のマウス群を含めた。図６に示すように、TEM8免疫単独およびPSMA免疫単独は、腫瘍防御をもたらさなかった。さらには、PSMAおよびhgp75 DNAワクチンの両方での免疫も、腫瘍防御をもたらさなかった。しかしながら、TEM8 DNAおよびhgp DNAの両方での免疫は、最大の腫瘍防御をもたらした。このことは、hgp75により誘導された免疫がTEM8に依存することを示す。
【００６１】
次に、pINGTEM8＋hgp75で免疫したマウスにおいて腫瘍攻撃接種の２日前から４週間CD8+Ｔ細胞を枯渇させた追加の群を含めたことを除いて、同じ免疫条件を用いて実験を繰返した。図６に示すように、pINGTEM8は、hgp75ワクチンとの相乗効果を再び示し、さらにこの相乗効果はCD8+Ｔ細胞を欠くマウスにおいて完全に失われた。このことは、pINGTEM8免疫がCD8+Ｔ細胞エフェクターによって媒介されているという考えを強く支持する。
【実施例４】
【００６２】
B16メラノーマの外科的切除モデルにおける腫瘍免疫
以前記載した外科的切除モデル(Hawkins et al., 2002)を用いて、原発腫瘍の切除後の肺転移に関して免疫を提供する本発明の治療的効果を実証した。簡単に説明すると、マウスの脚部にB16メラノーマ腫瘍細胞を注射した。腫瘍サイズが6-8mmになったとき（21-28日後）、腫瘍を有する脚（後脚）を切除した。マウスを４つの異なる処置群に分けた。１つのマウス群（n=25）は、全く治療を受けなかった（未処置）。第２のマウス群（n=18）は、TRP-2（チロシナーゼ関連タンパク２）DNAワクチンで週１回免疫を受けた。第３のマウス群（n=22）は、TRP-2およびTEM8 DNAワクチンの両方で週１回免疫を受けた。第４のマウス群（n=25）は、TEM8 DNAワクチン単独で週１回免疫を受けた。21-28日目に、肺転移がセンチネルリンパ節に現れる。従って、マウスを21-28日後に屠殺し、表面の肺転移の数を記録した。
【００６３】
図８に示すように、TEM8 DNA単独での免疫は、腫瘍に対する免疫をもたらさなかった。TRP-2 DNA単独で免疫したマウスは表面肺転移の数の減少を示したが、最大免疫はTRP-2 DNAおよびTEM8 DNAの両方で免疫した群で観察された。このことは、TEM8が肺への腫瘍細胞の転移を阻害することによって腫瘍免疫を増強することを示した。
【実施例５】
【００６４】
前立腺癌の脈管構造におけるTEM8発現
ワクチンを用いた任意の臨床試験の設計において重要な検討材料は、所定の腫瘍系においてその抗原を使用することを支持するために、および有害な自己免疫の潜在的部位を強調するのに、抗原の組織分布を特定することである。TEM8 RNAは、いくつかのヒト腫瘍における内皮細胞で検出されているが、前立腺癌またはBPHおよびPIN領域に特徴的ではなかった。TEM8は、ヌードマウスで増殖するPC3細胞の脈管構造において発現されるが、これはヒトでの発現パターンを反映しないであろう。さらには、開示された報告は、ハイブリダイゼーションに用いられるプローブの詳細を提供せず、それらはTEM8とATR転写物とを区別しなかった。
【００６５】
in situ PCRを用いて、ヒトおよびマウス前立腺癌切片においてTEM8およびATR RNA転写物を定量化することができる。TEM8およびATRを別個に評価できるように、２つの転写物に特異的なプライマー対を同定することができる。正常および新生物ヒト組織の追加のin situ PCR分析は、各転写物がどこに発現されているかを特定することを可能にするであろう。臨床標本に加えて、TEM8ワクチンを評価するために前立腺癌のマウスモデルを利用できる。
【実施例６】
【００６６】
TEM8/ATRexに特異的な抗体の作成
in situハイブリダイゼーションまたはPCRは、抗体なしでTEM8転写物の可視化を可能にするが、それはTEM8タンパク質発現のレベルに関する情報を提供しない。さらには、TEM8翻訳後修飾、代謝、および他のタンパク質との相互作用に関するより詳細な説明はいずれも抗体試薬を必要とする。
【００６７】
完全長TEM8から作られたワクチンを特徴付けするために、細胞表面上の天然TEM8に結合する抗体を同定し、完全長hTEM8をクローン化しさらにマウス3T3細胞において安定に発現させることができる。TRM8に対する抗体を誘導する能力に関して、TEM8/ATRex、完全長hTEM8およびTEM8-Flt-3（TEM8と造血サイトカインFlt3リガンドとの融合タンパク質）を含む様々なDNAワクチンを比較することができる。ウェスタンブロットおよび／または免疫組織化学的方法、および完全長TEM8を発現する3T3細胞を用いたフローサイトメトリーによって、血清をアッセイした。このやり方で、様々な有用な特異性を有する抗体を同定できることは間違いないであろう。標準的技術を用いてモノクローナル抗体を作成できる。
【００６８】
以下の参考文献を本明細書において列挙した：
【参考文献】
【００６９】
2007511534.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、pECDrneuのプラスミドマップである。
【図２Ａ】図２Ａは、pcDNA3TEM8のプラスミドマップである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、pINGTEM8のプラスミドマップである。
【図３】図３は、FVB/neuトランスジェニックマウスでの自然発生乳癌におけるTEM8 mRNA発現のノーザンブロット分析を示す。健康な(N)および腫瘍に冒された(T)乳腺を、アンチセンス（T7）またはセンス（SP6）TEM8/ATRプローブ、あるいはアクチンリボプローブを用いて調べた。
【図４】図４は、対照の非免疫マウス、あるいは、HER2/neu DNAワクチン（nex）、pcDNA3TEM8 DNAワクチン（TEM8）またはHER2/neuワクチンとTEM8 DNAワクチンの両方(nex＋TEM8)で免疫したマウスにおける乳癌発生を示す。
【図５】図５は、対照の非免疫マウス、あるいはhgp75 DNAワクチン、pINGTEM8 DNAワクチン、またはhgp75ワクチン＋pINGTEM8 DNAワクチンで免疫したマウスでのメラノーマの発生を示す。
【図６】図６は、hgp75により誘導される免疫を、TEM8は増進させるが、PSMAは増進させないことを示す。マウスを免疫しない（処置なし）か、あるいは、hgp75 DNAワクチン、PSMA（擬似タンパク質）DNAワクチン、PSMA DNAワクチンとhgp75 DNAワクチンの両方、pINGTEM8 DNAワクチン単独またはpINGTRM8 DNAワクチンとhgp75 DNAワクチンの両方で免疫した。
【図７】図７は、hgp75 DNAワクチンおよびpINGTEM8 DNAで誘導された抗腫瘍免疫におけるCD8+Ｔ細胞の役割を示す。CD8+Ｔ細胞を枯渇させたまたは枯渇させていないマウスにおいて、マウスを免疫しない（未処置）か、あるいは、hgp75 DNAワクチン、pINGTEM8 DNAワクチン、またはhgp75 DNAワクチンとpINGTRM8 DNAワクチンの両方で免疫した。
【図８】図８は、B16メラノーマの外科的切除モデルにおいてTEM8が腫瘍免疫を高めることを示す。マウスを免疫しない（未処置）か、あるいは、TRP-2（チロシナーゼ関連タンパク２）、TRP-2とpINGTEM8 DNAワクチンの両方、またはpINGTEM8 DNAワクチン単独で免疫した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2007511534000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月11日(2006.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007511534000001.app
【国際調査報告】
2007511534.tif 000027
2007511534.tif 000028
2007511534.tif 000029