(57)【要約】  ペプチド精製用のタグが開示される。このタグ構造は、タグ分子と、ペプチドへの損傷を最小限にする、実際には好ましくは阻止する条件下でタグ分子が結合しているペプチドと、の間に形成された結合の開裂を容易にする。本発明のタグ分子を使用して、あるペプチドをペプチドおよび／または他の成分との混合物から分離および／または精製することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉで表されるタグ分子であって、
（Ａ）ｎ−Ｃ
式Ｉ
式中、
Ａは捕獲部分であり、
ｎは１以上、例えば、１、２、３または４であり、
Ｃは、式ＩＩ
【化１】
2007537973.tif 000021
または式ＩＩＡで表されるペプチド結合部分であり、
【化２】
2007537973.tif 000022
式中、
Ｃが式ＩＩで表されるペプチド結合部分である場合、Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立に、Ｈ、任意のＣ１〜６アルキル基または電子吸引基であり、Ｒ２は、Ｈまたは任意のＣ１〜６アルキル基であり、Ｒ４およびＲ５の一方は、前記結合部分をＡに連結するリンカー部分Ｂであり、Ｒ４は、リンカー部分Ｂでない場合は、Ｈまたは任意のＣ１〜６アルキル基であり、Ｒ５は、リンカー部分Ｂでない場合は、電子吸引基、Ｈまたは任意のＣ１〜６アルキル基であり、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５のうちの少なくとも一つは電子吸引基であり、
Ｃが式ＩＩＡで表されるペプチド結合部分である場合、Ｒ２およびＲ３の一方は、前記結合部分をＡに連結するリンカー部分Ｂであり、Ｒ２およびＲ３のもう一方、ならびにＲ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、Ｈまたは任意のＣ１〜６アルキル基であるタグ分子。
【請求項２】
Ｃが、式ＩＩで表されるペプチド結合部分である、請求項１に記載のタグ分子。
【請求項３】
一つ（または複数）の前記電子吸引基が、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＮＯ２、ＣＦ３およびＳＯ２Ｍｅからなる群より選択される、請求項２に記載のタグ分子。
【請求項４】
一つ（または複数）の前記電子吸引基がＮＯ２である、請求項３に記載のタグ分子。
【請求項５】
Ｃが、式ＩＩＡで表されるペプチド結合部分である、請求項１に記載のタグ分子。
【請求項６】
Ｂが、アミド、アミン、エーテル、エステル、ヒドラジド、ケトンまたはイミン基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタグ分子。
【請求項７】
前記捕獲部分Ａが疎水性である、前記請求項のいずれか一項に記載のタグ分子。
【請求項８】
前記捕獲部分が、少なくとも１個のフェナントレニル基、アントラセニル基またはナフチル基を含む、請求項７に記載のタグ分子。
【請求項９】
前記捕獲部分が式ＩＩＩで表され、
【化３】
2007537973.tif 000023
前記結合部分が、式ＩＩＩの中央のフェニル環の５位に位置するリンカー部分に連結している、請求項８に記載のタグ分子。
【請求項１０】
式ＩＶで表される、請求項９に記載のタグ分子。
【化４】
2007537973.tif 000024
【請求項１１】
前記捕獲部分が、式ＩＩＩＡで表される環状構造を含む、請求項８に記載のタグ分子。
【化５】
2007537973.tif 000025
【請求項１２】
前記捕獲部分が、式ＩＩＩＢで表される環状構造を含む、請求項８に記載のタグ分子。
【化６】
2007537973.tif 000026
【請求項１３】
前記捕獲部分Ａが金属結合部分である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタグ分子。
【請求項１４】
前記捕獲部分が、少なくとも１個の２−ピリジル基を含む、請求項１３に記載のタグ分子。
【請求項１５】
前記捕獲部分が式Ｖで表される、請求項１４に記載のタグ分子。
【化７】
2007537973.tif 000027
【請求項１６】
式ＶＩで表される、請求項１５に記載のタグ分子。
【化８】
2007537973.tif 000028
【請求項１７】
ペプチド分子に結合した前記請求項のいずれか一項に記載のタグ分子を含む、タグ付きペプチド。
【請求項１８】
前記ペプチドが、カルバメート結合を介して前記タグ分子に結合している、請求項１７に記載のタグ付きペプチド。
【請求項１９】
ペプチド分子にタグを付ける方法であって、
式ＩＩまたは式ＩＩＡのヒドロキシ基が反応性部分で置換されている請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタグ分子を提供するステップと、置換されているタグ分子をペプチド分子と反応させるステップと、を含み、
前記反応性部分が、式ＶＩＩで表される部分であり、
【化９】
2007537973.tif 000029
式中、Ｙはいずれかのハロゲン、好ましくはＣｌであり、
あるいは、前記反応性部分がカルボニルジオキシ部分を含む方法。
【請求項２０】
ペプチドの精製を容易にするためにペプチドを修飾する方法であって、ペプチド鎖の合成中にペプチド鎖の末端に請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタグ分子を結合させるステップを含む方法。
【請求項２１】
アミノ酸に結合した請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタグ分子を含む、タグ付きアミノ酸。
【請求項２２】
前記ペプチドが、カルバメート結合を介して前記タグ分子に結合している、請求項２１に記載のタグ付きアミノ酸。
【請求項２３】
アミノ酸にタグを付ける方法であって、
ａ）式ＩＩまたは式ＩＩＡのヒドロキシ基が反応性部分で置換されている請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタグ分子を提供するステップと、
ｂ）置換されているタグ分子をアミノ酸のＮ末端と反応させるステップと、を含み、
前記反応性部分が、式ＶＩＩで表される部分であり、
【化１０】
2007537973.tif 000030
式中、Ｙはいずれかのハロゲン、好ましくはＣｌであり、
あるいは、前記反応性部分がカルボニルジオキシ部分を含む方法。
【請求項２４】
ｃ）前記アミノ酸を別のアミノ酸またはペプチド分子と結合させるステップ、をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記置換されているタグ分子が、タグ分子を、ホスゲン、炭酸ビス（４−ニトロフェニル）、炭酸ビス（ペンタフルオロフェニル）または炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルと、適切な条件下で反応させることによって形成される、請求項１９、２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
ペプチドの精製を容易にするためにペプチドを修飾する方法であって、
ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタグ分子をアミノ酸のＮ末端に結合させるステップと、
ｂ）ステップ（ａ）で形成されたタグ付きアミノ酸をペプチド分子に結合させるステップと、
を含む方法。
【請求項２７】
ペプチドの精製方法であって、
ａ）請求項１３もしくは１４に記載のタグ付きペプチド、または請求項１９、２０、２４もしくは２６のいずれか一項に記載の方法に従って調製されるタグ付きペプチドを含むサンプルを提供するステップと、
ｂ）前記サンプルを、捕獲部分が親和性を有する捕獲受容体と接触させるステップと、
ｃ）非結合分子を、例えば洗浄によって除去するステップと、
ｄ）場合によっては、結合したタグ付きペプチドを捕獲受容体から取り外すステップと、
ｅ）ペプチドをタグ分子の結合部分から切り離すステップと、
を含む方法。
【請求項２８】
ステップｅ）において、前記ペプチドを、塩基性条件下で前記結合部分から切り離す、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
表面上でペプチドを実質的に均一な方向に空間的に配向させる方法であって、
ａ）請求項１３もしくは１４に記載のタグ付きペプチド、または請求項１９、２０、２４もしくは２６に従って調製されるタグ付きペプチドを提供するステップと、
ｂ）ステップａ）のタグ付き分子を、捕獲部分が親和性を有する捕獲受容体と接触させるステップと、
ｃ）タグ付き分子を、捕獲部分と捕獲受容体との相互作用によって表面に結合させるステップと、
を含む方法。
【請求項３０】
前記表面がマルチウェルプレートの表面である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ペプチドの検出用または精製用の診断キットであって、
ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の分子タグ、または請求項２１もしくは２２に記載のタグ付きアミノ酸と、
ｂ）前記分子タグの捕獲部分と結合できる捕獲受容体と、
を含むキット。
【請求項３２】
実質的に本明細書に記載のタグ分子。
【請求項３３】
実質的に本明細書に記載のタグ付きペプチド。
【請求項３４】
実質的に本明細書に記載のタグ付きアミノ酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製手段、特に合成ペプチドおよびタンパク質の精製で使用するのに適している手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学的に合成されたペプチドおよびタンパク質の特性を高めるのに使用されている化学タグの例はほとんど存在しない。ラメージ（Ｒａｍａｇｅ）ら（Ｒ．ＲａｍａｇｅおよびＧ．Ｒａｐｈｙ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９２、３３、３８５−３８８）は、ペプチドおよびタンパク質を精製するためにＦｍｏｃの疎水性類似化合物としてＴｂｆｍｏｃを使用した。Ｔｂｆｍｏｃは、極端に疎水性であることが分かっており、分離ＨＰＬＣによる精製を助けるために付けられたタグで表されるペプチドおよびタンパク質の溶離に対して十分な効果を有する。多孔性黒鉛化炭素（ＰＧＣ）用の木炭の親和性は、ペプチドおよびタンパク質のクロマトグラフィー精製にも使用されている。しかし、Ｔｂｆｍｏｃ基は、疎水性表面に対する親和性が非常に高いので、しばしば避けることのできない望ましくない表面への結合を生じることが分かった。さらに、Ｔｂｆｍｏｃは、水系においてペプチドおよびタンパク質の溶解性に対して好ましくない影響を与え、精製中にしばしば問題を生じる。
【０００３】
ヒスチジン（Ｈｉｓ）などいくつかのアミノ酸の金属イオンに対する固有の親和性は、いくつかのペプチドおよびタンパク質の精製に利用されてきた。技術の一つは、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ（Ｅ．ＨｅｎｄａｎおよびＪ．Ｐｏｒａｔｈ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９８５、３２３、２５５−２６４）配列を対象となるペプチドまたはタンパク質配列の末端に加え、ニッケルイオンに対する付加物の親和性を使用して所望の生成物を表面に選択的に結合させるものである。これらは効果的ではあるが、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓタグは、折り畳みに影響を及ぼす可能性があり、したがって活性に影響を及ぼす可能性がある、親配列の恒久的な特徴をそのまま残す。さらに、タグを加えるための余分な合成ステップが、材料の全収率を下げる可能性がある。
【０００４】
メチオニン残基が親ペプチド配列とヒスチジン残基との間に挿入されている、開裂可能なｐｏｌｙ−Ｈｉｓタグが、報告されている（セルウィウス（Ｓｅｒｖｉｏｎ）ら、欧州特許第０８２７９６６号明細書）。メチオニン残基での開裂は、臭化シアンでの処理によって選択的に実現される。しかし、臭化シアンは、毒性の高い試薬であり、こうした状況での使用には適していない（ｎｏｔ  ｒｏｂｕｓｔ）。さらに、タンパク質配列中のメチオニン残基は、望ましくない臭化シアン開裂を防ぐために酸化された形で使用される。その後、これらのメチオニン残基を、元の配列を得るために還元しなければならない。
【０００５】
金属中心への連結を可能にするいくつかのアミノ酸の固有の電子供与性は、組換えタンパク質の精製にも使用されてきた（Ｈ．Ｃｈａｏｕｋ、Ｍ．Ｔ．Ｗ．Ｈｅａｒｎ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、１９９９、８５２、１０５−１１５）。
【０００６】
官能化された固体支持体に共有結合するタグは、合成タンパク質および組換えタンパク質の両方を精製するのに使用されてきた（Ｍ．Ｖｉｌｌａｉｎ、Ｊ．ＶｉｚｚａｖｏｎａおよびＫ．Ｒｏｓｅ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００１、８、６７３−６７９；Ｊ  Ｖｉｚｚａｖｏｎａ、Ｍ．ＶｉｌｌａｉｎおよびＫ．Ｒｏｓｅ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２００２、８６９３−８６９６）。当初、この方法は、Ｎ末端システインまたはスレオニンを有するタンパク質にのみ適用可能であったが、全てのＮ末端アミノ酸に適するように調整された（Ｊ  Ｖｉｚｚａｖｏｎａ、Ｍ．ＶｉｌｌａｉｎおよびＫ．Ｒｏｓｅ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２００２、８６９３−８６９６）。しかし、化学タグを得るには、長時間かかる合成が必要であり、ペプチドまたはタンパク質に損傷を与える可能性のある条件（過ヨウ素酸ナトリウム）下で開裂される。
【０００７】
しばしば求められているプロテオミクスの側面は、表面、例えば、ポリスチレンマルチウェルプレート上でペプチドまたはタンパク質のアレイを生成することである。配向ペプチドアレイを実現する方法の一つは、ＵＶ照射後にポリマーに結合するアントラキノンを使用することである（Ｓ．Ｐ．Ｊｅｎｓｅｎ、Ｓ．Ｅ．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ、Ｍ．Ｈ．Ｊａｋｏｂｓｅｎ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＆  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、１９９６、４１９−４２２）。このアントラキノンは、ペプチドのＮ末端基とアミド結合できるように官能化され、したがってこのペプチドはポリスチレン表面と共有結合する。
【０００８】
したがって、ペプチドの精製に使用でき、ペプチド自体への損傷を最小限にしながらペプチドから効率的にかつ容易に開裂できる化学タグが、依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、従来技術のタグに伴う多くの問題を克服するタグを開発した。
【００１０】
本発明の第１の態様によれば、ペプチドの精製用のタグが提供され、前記タグ分子は式Ｉの構造を有し、
（Ａ）ｎ−Ｃ
式Ｉ
式中、Ａは捕獲部分（ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｏｉｅｔｙ）であり、
ｎは１以上、例えば、１、２、３または４であり、
Ｃは、式ＩＩまたは式ＩＩＡで表されるペプチド結合部分であり、
【化１】
2007537973.tif 000002
【化２】
2007537973.tif 000003
式中、Ｃが式ＩＩで表されるペプチド結合部分である場合、Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立に、Ｈ、任意のＣ１〜６アルキル基または電子吸引基であり、Ｒ２は、Ｈまたは任意のＣ１〜６アルキル基であり、Ｒ４およびＲ５の一方は、前記結合部分をＡに連結するリンカー部分Ｂであり、Ｒ４は、リンカー部分Ｂでない場合は、Ｈまたは任意のＣ１〜６アルキル基であり、Ｒ５は、リンカー部分Ｂでない場合は、電子吸引基、Ｈまたは任意のＣ１〜６アルキル基であり、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５のうちの少なくとも一つは電子吸引基であり、
Ｃが式ＩＩＡで表されるペプチド結合部分である場合、Ｒ２およびＲ３の一方、好ましくはＲ２は、前記結合部分をＡに連結するリンカー部分Ｂであり、Ｒ２およびＲ３のもう一方、ならびにＲ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、Ｈまたは任意のＣ１〜６アルキル基である。
【００１１】
あるいは、またはそれに加えて、Ｃが式ＩＩＡで表されるペプチド結合部分である場合、Ｒ１、Ｒ２（リンカー部分Ｂではない場合）、Ｒ３（リンカー部分Ｂではない場合）、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの一つまたは複数は、それぞれ独立に、ペプチドにタグを付けるために使用する場合、タグの安定性に著しい影響を及ぼさない他の置換基とすることも可能である。こうした置換基、例えばアミドまたはアリール基は、弱い電子的効果しか持たないか、または全く持たないことが好ましい。ただし、より著しい電子的効果を有するが、それでもタグがペプチドと結合するのを阻止はしない、置換基を使用することもできる。こうした置換基には、１種（または複数）のハロゲン、ニトロ、エステル、アルコキシまたはアルデヒド基が含まれ得る。Ｃが式ＩＩＡで表されるペプチド結合部分である、好ましい実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のもう一方、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、ならびにＲ２およびＲ３のもう一方は電子的に中性である。
【００１２】
あるいは、またはそれに加えて、Ｃが式ＩＩで表されるペプチド結合部分である場合、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４（リンカー部分Ｂではない場合）およびＲ５（リンカー部分Ｂではない場合）のうちの一つまたは複数は、それぞれ独立に、ペプチドにタグを付けるために使用する場合、タグの安定性に著しい影響を及ぼさない他の置換基とすることも可能である。こうした置換基、例えばアミドまたはアリール基は、弱い電子的効果しか持たないか、または全く持たないことが好ましい。ただし、より著しい電子的効果を有するか、それでもタグがペプチドと結合するのを阻止はしない、置換基を使用することもできる。こうした置換基には、１種（または複数）のハロゲン、ニトロ、エステル、アルコキシまたはアルデヒド基が含まれ得る。
【００１３】
Ｃが式ＩＩで表されるペプチド結合部分である、本発明の好ましい実施形態では、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５のうちの一つだけが電子吸引基である。好ましい実施形態では、Ｒ１は電子吸引基であり、Ｒ３は、Ｈまたは任意のＣ１〜６アルキル基であり、Ｒ５は、リンカー部分Ｂ、Ｈまたは任意のＣ１〜６アルキル基である。
【００１４】
式ＩＩの１種（または複数）の電子吸引基はいかなる電子吸引基でもよく、好ましくは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＳＯ２ＣＨ３、ＣＦ３およびＮＯ２からなる群より選択される電子吸引基である。特に好ましい実施形態では、一つ（または複数）の電子吸引基はＮＯ２である。
【００１５】
こうした構造では、タグ分子とそれが結合しているペプチドとの間に形成される結合を容易に開裂することが容易になる。
【００１６】
この捕獲部分は、タグ分子を他の分子「捕獲受容体（ｃａｐｔｕｒｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」に結合するのに適した任意の基を含むことができ、タグ分子を、捕獲部分を含まない別の分子から分離するのに使用することもできる。
【００１７】
好ましい実施形態では、捕獲分子は疎水性であり、１個または複数の疎水基を含むことができる。好ましい実施形態では、疎水性分子は、フェナントレニル基、アントラセニル基またはナフチル基である。この疎水基は、置換されていても置換されていなくてもよい。適当な置換基としては、アルキル、アルコキシ、アミノまたはハロ基が挙げられるが、それだけには限定されない。好ましい実施形態では、疎水基は置換されていない。一実施形態では、捕獲部分は、式ＩＩＩとして表される環状構造を含み、ここで、前記結合部分は、式ＩＩＩの中央のフェニル基の５位に位置するリンカー部分に連結される。好ましい実施形態では、本発明のタグ分子は式ＩＶで表される。
【化３】
2007537973.tif 000004
【００１８】
捕獲部分が疎水基を含む、特に好ましい実施形態では、この捕獲部分は、式ＩＩＩＡとして以下に示すような環状構造、または式ＩＩＩＢとして以下に示すような環状構造を含む。捕獲部分が式ＩＩＩＡまたは式ＩＩＩＢとして表されるような環状構造を含む実施形態では、本発明のタグ分子は、以下にそれぞれ示すような式ＩＶＡ、またはより好ましくは式ＩＶＢを有する。
【化４】
2007537973.tif 000005
【化５】
2007537973.tif 000006
【化６】
2007537973.tif 000007
【化７】
2007537973.tif 000008
【００１９】
式ＩＩＩで表される捕獲部分と同様に、炭素原子は、それぞれ独立に、置換されていても置換されていなくてもよい。適当な置換基としては、アルキル、アルコキシ、アミノまたはハロ基が挙げられるが、それだけには限定されない。好ましい実施形態では、式ＩＩＩＡまたは式ＩＩＩＢで表される捕獲部分の炭素原子は置換されていない。本発明の特に好ましい実施形態では、捕獲部分は、式ＩＩＩ、式ＩＩＩＡまたは式ＩＩＩＢで表される。
【００２０】
いくつかの別の好ましい実施形態では、捕獲部分Ａは金属結合部分とすることもでき、置換されていても置換されていなくてもよい。置換基が存在する場合は、この部分と金属イオンとの結合の度合いを、置換基を欠く対応する部分による結合の度合いに比べて、下げないまたは著しく下げないような置換基を選択することが好ましい。適当な置換基としては、アルキル、アルコキシ、アミノまたはハロ基が挙げられるが、それだけには限定されない。好ましくは、この部分は置換されていない。
【００２１】
適当な金属結合部分としては、ピリジル基、ヘキサヒスチジン、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトロロ三酢酸（ＮＴＡ）、８−ヒドロキシキノリンおよびＯ−ホスホセリンが挙げられるが、それだけには限定されない（Ｕｅｄａら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、２００３、９８８、１−２３）。好ましい一実施形態では、金属結合部分はヘキサヒスチジンタグである。別の好ましい実施形態では、金属結合部分はピリジル基である。好ましくは、ピリジル基は置換されていない。特に好ましい実施形態では、捕獲部分は式Ｖで表される。
【化８】
2007537973.tif 000009
【００２２】
金属結合捕獲部分を有する、本発明の特に好ましいタグは式ＶＩで表される。
【化９】
2007537973.tif 000010
【００２３】
本発明のタグ分子は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のいずれにもタグを付けるのに使用することができる。本出願では、文脈上別の意味が要求されるのでない限り、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質という用語は互換的に使用される。
【００２４】
ペプチドに結合した本発明によるタグ分子を含むタグ付きペプチドは本発明の第２の態様を構成する。好ましくは、このペプチドは、カルバメート結合を介してタグ分子に結合している。
【００２５】
本発明の第３の態様によれば、ペプチド分子にタグを付ける方法が提供される。前記方法は、式ＩＩのヒドロキシ基が反応性部分と置換されている、本発明の第１の態様によるタグ分子を提供するステップと、この置換されているタグ分子をペプチド分子と適切な反応条件下、好ましくは塩基性条件下で反応させるステップとを含み、前記反応性部分は、式ＶＩＩで表される部分であり、
【化１０】
2007537973.tif 000011
式中、Ｙはいずれかのハロゲン、好ましくはＣｌであり、あるいは、前記反応性部分はカルボニルジオキシ部分を含む。
【００２６】
置換されているタグ分子は、任意の適切な反応を使用して形成することができる。例えば、好ましい実施形態では、置換されているタグ分子は、本発明の第１の態様によるタグ分子を、ホスゲン、炭酸ビス（４−ニトロフェニル）、炭酸ビス（ペンタフルオロフェニル）または炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルと、適切な条件下、例えば塩基性条件下で反応させることによって形成することができる。
【００２７】
本発明のタグ分子を使って、あるペプチドをペプチドおよび／または他の成分との混合物から分離および／または精製することができる。したがって、第４の態様では、本発明は、ペプチドの精製を容易にするためにペプチドを修飾する方法を提供する。この方法は、本発明の第１の態様によるタグ分子をペプチド鎖の合成中にペプチド鎖の末端に結合させるステップを含む。
【００２８】
別の実施形態では、本発明のタグは単一のアミノ酸と結合させることができる。このタグの付いたアミノ酸は、標準的なペプチド合成方法を用いてペプチド配列の残部に結合させることができるＮ末端アミノ酸として使用することができる。こうしたタグの付いたアミノ酸は、例えば、式ＩＩのヒドロキシ基が反応性部分と置換されている、本発明の第１の態様によるタグ分子を提供し、この置換されているタグ分子をアミノ酸（場合により、側鎖またはカルボキシ保護基を有する）と適切な反応条件（好ましくは塩基性条件）下で反応させることによって調製することができ、前記反応性部分は、式ＶＩＩで表される部分であり、
【化１１】
2007537973.tif 000012
式中、Ｙはいずれかのハロゲン、好ましくはＣｌであり、あるいは前記反応性部分は、カルボニルジオキシ部分を含む。
【００２９】
次いで、タグの付いたアミノ酸は、標準的なペプチドカップリング方法を使用してペプチド配列の残部に結合させることができる。
【００３０】
したがって、本発明の第５の態様では、アミノ酸に結合した、本発明の第１の態様によるタグ分子を含むタグ付きアミノ酸が提供される。好ましくは、このアミノ酸は、カルバメート結合を介してタグ分子に結合している。
【００３１】
カルバメート結合の例を、式ＶＩＩＩとして以下に示す。
【化１２】
2007537973.tif 000013
【００３２】
本発明の第６の態様によれば、式ＩＩのヒドロキシ基が反応性部分で置換されている、本発明の第１の態様によるタグ分子を提供するステップと、この置換されているタグ分子をアミノ酸分子と適切な反応条件下、好ましくは塩基性条件下で反応させるステップとを含む、アミノ酸にタグを付ける方法が提供される。この反応性部分は、式ＶＩＩで表される部分であり、
【化１３】
2007537973.tif 000014
式中、Ｙはいずれかのハロゲン、好ましくはＣｌであり、あるいは、この反応性部分はカルボニルジオキシ部分を含む。この方法は、場合によっては、そのアミノ酸を別のアミノ酸またはペプチド分子とカップリングさせる別のステップを含む。
【００３３】
第７の態様では、本発明は、
ａ）本発明の第１の態様によるタグ分子をアミノ酸のＮ末端基に結合させるステップと、
ｂ）ステップ（ａ）で形成されたタグ付きアミノ酸をペプチドとカップリングさせるステップと、
を含む、ペプチドの精製を容易にするためにペプチドを修飾する方法を提供する。
【００３４】
本発明の第８の態様によれば、
ａ）本発明の第２の態様によるタグ付きペプチド、または本発明の第３、第６もしくは第７の態様に従って調製されるタグ付きペプチドを含むサンプルを提供するステップと、
ｂ）前記サンプルを、捕獲部分が親和性を有する捕獲受容体と接触させるステップと、
ｃ）非結合分子を、例えば洗浄によって除去するステップと、
ｄ）場合によって、捕獲受容体から結合したタグ付きペプチドを取り外すステップと、
ｅ）ペプチドをタグ分子の結合部分から開裂するステップと、
を含む、ペプチドの精製方法が提供される。
【００３５】
任意の適切な捕獲受容体を使用することができる。例えば、捕獲受容体を、ＨＰＬＣカラムの一部として提供することができる。
【００３６】
上記のように、本発明のタグ分子は、前記分子でタグを付けたペプチドを、ペプチドへの損傷を最小限にする、実際には好ましくは阻止する条件下で精製した後で、容易にタグ分子から開裂できるので、特に有利である。本発明の第８の態様の方法の特に好ましい実施形態では、ステップｅ）において、前記ペプチドを前記結合部分から塩基性条件下で開裂する。
【００３７】
生物学的検定および診断試験では、一般にマルチウェルプレートのウェル表面などの表面に、ペプチドまたはタンパク質を結合させている。しかし、こうしたペプチドまたはタンパク質を直接に、または従来から使用されているタグ分子を介して結合させると、しばしばペプチドがウェル表面上にランダムに配向し、バックグラウンドノイズが高く再現性が不十分な結果をもたらす。
【００３８】
本発明のタグ分子は、タグ分子を表面にしっかりと固定し、ペプチドまたはタンパク質を均一に配向させ得るのに特に有効であり、したがってペプチドまたはタンパク質の実質的に全てが、基剤との分子結合に使用できるようになると考えられる。こうした均一性は、診断試験の信頼性および再現性を高める。
【００３９】
したがって、本発明の第９の態様によれば、
ａ）本発明の第２の態様によるタグ付きペプチド、または本発明の第３、第６もしくは第７の態様に従って調製されるタグ付きペプチドを提供するステップと、
ｂ）このタグ付きペプチドを、捕獲部分が親和性を有する捕獲受容体と接触させるステップと、
ｃ）このタグ付きペプチドを、捕獲部分と捕獲受容体との相互作用によって表面に結合させることを可能にするステップと、
を含む、表面上でペプチドを実質的に均一な方向に空間的に配向させる方法が提供される。
【００４０】
本発明の別の態様では、ペプチドを検出または精製するための診断キットが提供される。前記キットは、
ａ）本発明の第１の態様による分子タグ、または本発明の第５の態様によるタグ付きアミノ酸と、
ｂ）分子タグの捕獲部分と結合することができる捕獲受容体と、
を含む。
【００４１】
（捕獲部分）
捕獲部分は、対応するリガンド結合分子に結合する任意の適切なリガンドを含むことができる。本出願において、文脈上別の意味が要求されるのでない限り、リガンドには、ハプテン、抗体および親油性分子が含まれ得るが、それだけには限定されない。好ましくは、リガンドおよび対応するリガンド結合分子は互いに結合特異性を有する。こうした結合対のメンバーは、天然物に由来するものでもよく、あるいは完全または部分的に合成による生成物でもよい。１対の分子のメンバーの一方は、その表面上に、突起または空隙となり得る領域を有することができ、具体的には１対の分子のメンバーのもう一方と結合し、したがって１対の分子のうちのもう一方のメンバーの特定の空間および極性構成と相補的である。したがって、対になっているメンバーは、互いに特異的に結合する性質を有し得る。
【００４２】
本出願においては、文脈上別の意味が要求されるのでない限り、リガンドとの言及は、ハプテン、抗体および親油性分子も指すと解することができるが、それだけには限定されない。したがって、捕獲部分は、ハプテン結合分子に結合するハプテン、例えば抗体とすることができる。その特異的抗体が知られているまたは生成させることができる適切などんなハプテンも、捕獲部分として使用することができる。適切なハプテンの一例は、ジゴキシゲニンである（Ｋｅｒｋｈｏｆ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３５９−３６４（１９９２）。
【００４３】
別の実施形態では、抗体を、タグを捕獲するのに用いられる適切なハプテンを有する捕獲部分として使用することができる。一実施形態では、捕獲部分およびそれが結合するハプテンは抗体でよい。例えば、この捕獲部分は抗体でよく、それが結合するハプテンは、抗体、例えば、ある種の抗体に対する抗体、または特定のクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭに対する抗体である。
【００４４】
「抗体」は、天然物であれ、部分的にまたは完全に合成によって生成されたものであれ、免疫グロブリンである。この用語は、抗体結合ドメインであるまたはそれと相同である、結合ドメインを有する、いずれのポリペプチド、タンパク質またはペプチドも含む。これらは、天然物由来のものでもよく、あるいは部分的にまたは完全に合成によって生成したものでもよい。抗体の例には、免疫グロブリンアイソタイプおよびそれらのアイソタイプ下位クラス（ｓｕｂｃｌａｓｓ）；Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメインを含む断片、ならびにダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）がある。こうした抗体および断片を生成する方法は当技術分野でよく知られている。
【００４５】
別の実施形態では、ビオチンを捕獲部分として使用することができ、タグ分子を捕獲するための捕獲受容体としてストレプトアビジンまたはビオチン特異的抗体を使用する。
【００４６】
本発明のさらに別の実施形態では、捕獲部分は親油性分子である。捕獲部分としてこうした分子を使用すると、例えば逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を使用して、混合物または組成物中に混入しているタグの付いていない分子からタグ付きペプチドを分離することが可能になる。本発明のタグ分子または方法において捕獲部分として使用可能な親油性分子の例としては、トコフェリル基、コレステリル基および長鎖アルキル基が挙げられるが、それだけには限定されない。
【００４７】
分子タグが、疎水性表面、例えばポリスチレンと結合するように設計されている場合、捕獲部分は、フェナントレニル基、アントラセニル基またはナフチル基など１個または複数の疎水基を含むことができる。
【００４８】
好ましい一実施形態では、捕獲部分は式ＩＩＩで表され、
【化１４】
2007537973.tif 000015
前記結合部分は、式ＩＩＩで表される構造の中央のフェニル基の５位に位置するリンカー部分に連結される。
【００４９】
別の好ましい実施形態では、捕獲部分は、式ＩＩＩＡとして以下に示すような環状構造、または式ＩＩＩＢとして以下に示すような環状構造を含む。
【化１５】
2007537973.tif 000016
【化１６】
2007537973.tif 000017
【００５０】
タグが、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋またはＮｉ２＋などの金属中心または金属含有表面に結合するように設計されている場合、捕獲部分は、金属結合部分、例えば、１個または複数のピリジル基、ポリヒスチジン、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトロロ三酢酸（ＮＴＡ）、８−ヒドロキシキノリンまたはＯ−ホスホセリン基とすることができる。特に好ましい実施形態では、捕獲部分は、式Ｖで表される。
【化１７】
2007537973.tif 000018
【００５１】
（捕獲受容体）
捕獲部分の選択は、タグ分子が一緒に使用されると想定されている捕獲受容体に基づいて当業者によって決定される。捕獲受容体は、捕獲部分がそれと相互作用でき、タグ付きペプチドをタグの付いていない他のペプチドから分離するのに使用できる、どんな分子、構造または表面も包含する。
【００５２】
捕獲受容体は、タグ付き分子の捕獲を可能にするどんな分子、支持体または表面でもよく、あるいはそれらと連結する、例えば、結合、カップリングまたは固定することができる。こうした分子、支持体または表面は、マルチウェルプレート、ビーズ、膜、瓶、皿、顕微鏡用スライド、繊維、ポリマー、粒子、微粒子などを含むマイクロプレートの形をとることができる。それらには、アクリルアミド、セルロース、コラーゲン、ニトロセルロース、ガラス；ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン、ポリアミノ酸などのポリマー、磁気材料、および／または金属材料を含めて適切などんな材料製のものでもよいが、それだけには限定されない。
【００５３】
捕獲受容体、およびそれを構成する材料あるいはそれを連結またはそれに固定できる材料の性質は、タグ分子および所期の使用法に応じて当業者によって選択される。例えば、いくつかの好ましい実施形態では、非結合分子を容易に洗浄して除去することができ、したがって混合物からタグ付き分子を容易に精製できる固体支持体としてまたは固定支持体上に捕獲受容体を提供する。
【００５４】
例えば、捕獲受容体は、本発明のタグが共有結合で結合する表面でよい。
【００５５】
捕獲受容体は、確立されたカップリング方法を使用して支持体に結合させることができる。捕獲受容体を固体支持体に結合させる際に使用するのに適した結合剤（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｇｅｎｔ）および方法は当技術分野でよく知られており、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ編（Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）およびＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄｓ、Ｃｒａｉｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２）に記載されている。
【００５６】
例えば、捕獲受容体が抗体である場合、抗体の固定化は、標準的な固定化化学反応を使用して、例えば、アミノ化された表面、カルボキシル化された表面またはヒドロキシル化された表面に結合させることによって実施することができる。
【００５７】
さらに、多数のタンパク質および抗体カラムが市販されており、ポリスチレンに基づく逆相ＨＰＬＣカラムも同様である。
【００５８】
（捕獲タグからのペプチドの除去）
本発明のタグ分子の具体的な利点は、タグ分子に結合したペプチドを、ペプチドに損傷を与えずに容易に開裂でき、このペプチドを容易に精製し回収するのが可能なことである。通常、開裂は、水性アセトニトリル中２０％ピペリジン、または水性アセトニトリル中２０％ピペリジンと１％ＤＢＵなどの塩基性条件を使用して実現することができる。
【００５９】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様の各々についても同様に準用される。
【００６０】
次に、本発明を、以下の非限定的な実施例において、添付図面を参照しながらさらに説明する。
【００６１】
（実施例１：金属結合タグの合成）
６−（ジ−（２−ピコリル）アミン）−ヘキサノイル［２−（２−ヒドロキシ−エタンスルホニル）−５−ニトロ−フェニル］−アニリド  ［ＤＰＨＳＡ］の合成を図１に示す。簡潔に述べると、タグＤＰＨＳＡは、６−ブロモヘキサン酸から６ステップで調製され、まずＫＯＨ水溶液で滴定した後にカリウム塩を形成する。次いで、凍結乾燥した塩を塩化チオニルと反応させて酸塩化物２を形成し、これをその場で熱トルエン中２−クロロ−５−ニトロアニリンと反応させてブロモアニリド４を形成した。カルボン酸の活性エステルを経る直接アミド形成（例えば、ＤＩＣ、ＨＯＢｔで処理）はうまくいかないことが分かった。ジ−（２−ピコリル）アミンの４によるアルキル化は、アセトニトリル中ＤＩＥＡと還流することによって実施した。炭酸カリウムや水素化ナトリウムなど他の塩基を使用すると、複雑な副生成物が生じた。５のスルファニル化は、β−メルカプトエタノールと反応させ、過酸化水素水との穏やかな反応によって選択的に酸化させてスルホン７にすることによって実施した。室温条件でＨ２Ｏ２を少量ずつ加え、触媒を注意して選択することにより、ピリジンのＮ酸化物への過酸化を回避した。
【００６２】
（実施例２：ＤＰＨＳＡを使用したペプチドの精製）
ＤＨＰＳＡでタグを付けたペプチドの合成経路を図２Ａに示す。
【００６３】
ＤＰＨＳＡを、塩基性条件下で活性物質、例えば、ホスゲン、炭酸ビス（４−ニトロフェニル）、炭酸ビス（ペンタフルオロフェニル）または炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルと反応させると、例えば、活性物質がホスゲン、ＸがＣｌの場合、反応性部分中間体Ａが形成された。
【００６４】
ペプチドを、従来の保護基を使用して保護したカルボキシル基を用いて、標準的な固相または液相合成法によって調製した。
【００６５】
次いで、この中間体を、アミン塩基（例えば、ジイソプロピルエチルアミン）の存在下でペプチドと反応させた。
【００６６】
別の実施形態では、反応は第２の中間体を含むことができる。例えば、ＸがＣｌである反応性部分中間体Ａは、上述のようにタグ分子をホスゲンと反応させることによって構成することができる。次いで、これを、第２の反応物、例えば、ペンタフルオロフェノール、ｐ−ニトロフェノールまたはジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、第２の中間体を形成することができる。その後、上述のように、第２の中間体を、アミン塩基（例えば、ジイソプロピルエチルアミン）の存在中ペプチドと反応させる。
【００６７】
タグの付いたペプチドを、必要ならば標準的な開裂条件を使用して、樹脂から開裂する。
【００６８】
精製：
凍結乾燥した粗ペプチドを、緩衝液１（８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ  ６．５）に溶解し、捕獲樹脂（ｃａｐｔｕｒｅ  ｒｅｓｉｎ）（ＮＴＡで連結されたＮｉ２＋（またはＺｎ２＋）を含有するアガロース）と一緒に撹拌する。
【００６９】
上澄みを除去し、この樹脂を緩衝液２（８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ  ６．３）で繰り返し洗浄する。
【００７０】
上澄みを除去し、タンパク質を緩衝液３（８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ  ４．９）で溶出する。
【００７１】
生成物溶液を、セファデックスカラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ｃｏｌｕｍｎ）を通すことにより脱塩する。
【００７２】
タグを、塩基性条件下（例えば、水性アセトニトリル中２０％ピペリジン）で処理することによって凍結乾燥した生成物から開裂する。
【００７３】
上記の精製手順を、タグ付きペプチドの精製に使用することができたが、以下の手順を用いて安定性の改善を行った。結合を、すでにＨＰＬＣで精製したタグ付き材料を使用して確認した。
【００７４】
精製した凍結乾燥ペプチドを、緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ６．５）に溶解し、捕獲樹脂（ｃａｐｔｕｒｅ  ｒｅｓｉｎ）（ＮＴＡで連結されたＮｉ２＋を含有するアガロース）と一緒に軽く振盪した。上澄みを除去し、樹脂を緩衝液Ａ中に懸濁し、焼結重力フローカラム（ｓｉｎｔｅｒｅｄ  ｇｒａｖｉｔｙ−ｆｌｏｗ  ｃｏｌｕｍｎ）に移した。この樹脂を、５カラム容量の緩衝液Ａで洗浄し、次いで生成物を１０カラム容量の緩衝液Ｂ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ３．５）または高濃度イミダゾール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）を含む緩衝液で溶出した。その後、ペプチドを、アルカリ性条件下（例えば、水性アセトニトリル中２０％ピペリジン）で処理することによって凍結乾燥した生成物から開裂した。図２Ｂは、精製したタグ付きペプチドのこうした開裂反応のＨＰＬＣトレースを示す。
【００７５】
緩衝液（４０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ  ６．５）にサンプルを投入し、同じ緩衝液で結合していないサンプルを洗浄することによって、Ｎｉ２＋をチャージした予めロード済みのＨｉ−Ｔｒａｐキレートカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、連続フロー式に使用することができる。結合したサンプルを、低ｐＨの緩衝液（４０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ  ３．５）を通すことによってニッケルカラムから除去することができる。このことは、ＨＰＬＣで精製したＤＰＨＳＡ−タグ付きペプチドを使用して実証され、図２Ｃに示す。同図は、Ｎｉ２＋チャージＨｉＴｒａｐキレートカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）への結合を示すＤＰＨＳＡ−タグ付きペプチドを示す。
【００７６】
あるいは、（非結合不純物を洗浄によって除去した後）アルカリ性条件下（例えば、ｐＨ９．０）で樹脂にタグを付け、セファデックスカラムを使用して遊離ペプチドを脱塩しながら、このペプチドを開裂することもできる。
【００７７】
（実施例３：金属結合タグの合成およびペプチドへのタグ付け）
ＤＰＨＳＡを使用してタグ付きアミノ酸を精製するのに使用した、図１および図２Ａに示したのとは別の経路を、図３に示す。
【００７８】
図３から分かるように、この合成経路は、図１に示したスルファニル化された中間体６の場合と同一であった。その後、図１のように選択的に酸化させてスルホン７にした後、図２Ａのように活性物質（例えば、ホスゲン、炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルと反応させて中間体１を形成し、次いでペプチドと反応させる代わりに、スルファニル化中間体６を活性物質（例えば、炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル）と反応させて中間体８（図３）を形成し、次いで、アミノ酸（図３の場合はバリン）と反応させて中間体９を形成し、その後、選択的に酸化して図３の１０に示したスルホン構造とした。
【００７９】
図３に示した方法はバリンへのタグ付けを示しているが、この方法は、他のアミノ酸およびペプチドへのタグ付けにも適用可能である。
【００８０】
（実施例４：ペプチドにタグ付けされる金属結合ヘキサヒスチジンタグの合成）
図４は、例としてグリシンを使用してアミノ酸／ペプチドにタグを付けるのに、ヘキサヒスチジンタグを使用する本発明の態様を示す。Ｆｍｏｃプロトコルを用いた標準的な固相ペプチド合成を使用して、側鎖１６上にトリチル保護基を備える、樹脂に結合したヘキサヒスチジンを形成する。これを、Ｎ末端が修飾されたアミノ酸ｔ−ブチルエステル（例えば、グリシン１５）とカップリングさせる。９５％ＴＦＡでの処理により、タグ付きアミノ酸が樹脂から開裂され、同時に側鎖トリチル基およびｔ−ブチルエステルが開裂されて、１８が形成される（１８は必要に応じてＨＰＬＣによって精製することができる）。弱酸性条件中での酸化により、目的分子１９が得られる。次いで、ヘキサヒスチジングリシンタグを、標準的なアミド結合法（例えば、ＤＩＣ、ＨＯＣｔ、ＤＭＦ）によってペプチドまたはタンパク質のＮ末端に直接結合させる。
【００８１】
修飾ヘキサヒスチジンが金属イオンをチャージしたカラムに結合する原理は、ヒドロキシスルフィド２７の合成から証明された（図５）。この精製した材料（０．２ｍｇ）を、水性緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ６．５）中、ニッケルをチャージしたＨｉ−Ｔｒａｐキレートカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と結合させ、カラムに結合したサンプルを同じ緩衝液で洗浄した。化合物の溶出は、第２緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ３．５）でカラムを洗浄することによって実施した。
【００８２】
（実施例５：疎水性タグの合成）
３，５−（ジフェナントレン−９−イル）−ベンゾイル［２−（２−ヒドロキシ−エタンスルホニル）−５−ニトロ−フェニル］−アニリド  ［ＤＰＢＳＡ］の合成を図６に示す。簡潔に述べると、タグＤＰＢＳＡは、９−ブロモフェナントレン２７から、まず対応するボロン酸２８を形成し、３，５−ジブロモ安息香酸とパラジウムカップリングさせることによって、５ステップで調製される。酸塩化物２９を、２−クロロ−５−ニトロアニリン３と速やかに反応させて、アミド３０を形成する。スルファニル化は、β−メルカプトエタノールと反応させ、過酸化水素水との穏やかな反応によって選択的に酸化させてスルホン３２を形成することによって実施する。
【００８３】
（実施例６：疎水性タグＤＰＢＳＡを使用するペプチドの精製）
ＤＰＢＳＡを、活性物質、例えば、ホスゲン、炭酸ビス（４−ニトロフェニル）、炭酸ビス（ペンタフルオロフェニル）または炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルと塩基性条件下で反応させて、実施例２で述べたものと類似した反応性部分中間体を形成する。
【００８４】
ペプチドを、従来の保護基を使用して保護したカルボキシル基を用いて標準的な固相または液相合成法によって調製する。
【００８５】
次いで、この中間体を、アミン塩基（例えば、ジイソプロピルエチルアミン）の存在下、ペプチドと反応させる。
【００８６】
タグの付いたペプチドを、必要に応じて標準的な開裂条件を使用して、樹脂から開裂する。タグの付いた粗ペプチドを、逆相ＨＰＬＣで精製し、または以下に記述するように固体支持体上に吸収させる。
【００８７】
凍結乾燥した粗ペプチドを、緩衝液１（８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ  ８）に溶解し、固体支持体（例えば、ポリスチレンまたはオクタデシルシランシリカが結合した支持体）と一緒に撹拌する。上澄みを除去し、樹脂を緩衝液２（８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ  ６．３）で洗浄する。
【００８８】
上澄みを除去し、タンパク質を、塩基性条件（例えば、水性アセトニトリル中２０％ピペリジン）で捕獲タグから開裂する。
【００８９】
あるいは、精製方法で、適切な固体支持体を詰めたカラムを使用することができる。
【００９０】
（実施例７：別の疎水性タグの合成およびこのタグを使用する精製）
疎水性捕獲部分、３−（アントラセン−９−イル）−プロピオニル、式ＩＩＩＡ、および３−（アントラセン−９−イル）−２−（アントラセン−９−イルメチル）−プロピオニル、式ＩＩＩＢを、ペプチド用の化学タグとして使用した。捕獲部分の疎水性が、逆相ＨＰＬＣシステムでの物質Ｐの保持時間を増大させることが分かった。それはまた、３６５ｎｍで特有のＵＶ吸収をもたらし、タグ付きペプチド種が簡単に識別できるようになる。
【化１８】
2007537973.tif 000019
【化１９】
2007537973.tif 000020
【００９１】
式ＩＩＩＡで示される捕獲部分は、図７Ａに示す合成経路によって合成した。この捕獲部分を、９−クロロメチルアントラセン２０からマロン酸ジエチルで処理することによって調製し、続いて加水分解および脱炭酸して酸２２を形成する。これを予め形成しておいたシリル化した５−クロロ−２−ニトロアニリン３とカップリングさせ、２−メルカプトエタノールで処理することによってスルファニル化して構造２４を形成した。２４を酸化させて、スルホン２７を形成した。これは、図２Ａで示されるものと類似の方法に従って活性化することができる。
【００９２】
あるいは、２４の遊離ヒドロキシル基を、トリホスゲンで処理し、生じたクロロホルメートを予め調製しておいたビストリメチルシリルバリンと反応させることによって活性化することができる。弱酸性条件下で硫黄を酸化すると、所望のタグ付きアミノ酸２６が得られる。
【００９３】
タグ２６を形成するために疎水性捕獲試薬（例えば、３−アントラセン−９−イル−２−アントラセン−９−イルメチル−プロピオニル）に結合したアミノ酸、例えば、バリンを、標準的なアミドカップリング方法（例えば、ＤＩＣ、ＨＯＣｔ、ＤＭＦ）を使用して樹脂に結合したペプチドまたはタンパク質のＮα末端と直接結合させることができる。次いで、この樹脂を９５％ＴＦＡで処理し、粗ペプチドを分離ＨＰＬＣによって精製し、３６５ｎｍで吸収する材料を採取する。この疎水性捕獲部分を、塩基（例えば、水性アセトニトリル中２０％ピペリジン）で処理することによって精製ペプチドから取り除くことができ、分離ＨＰＬＣで再精製する。
【００９４】
式ＩＩＩＡおよび式ＩＩＩＢとして示される捕獲部分のカルボン酸は、それぞれ独立に、樹脂に結合した物質ＰをＤＩＣ、ＨＯＣｔを使用してカップリングさせた。９５％ＴＦＡを使用して樹脂を開裂すると、付加物を持たないか、または開裂不可能なアミド結合によってＩＩＩＡまたはＩＩＩＢが付加している物質Ｐの粗製サンプルが形成された。図７Ｂに、説明した３個の化合物の混合物のＨＰＬＣトレースを示す。これは、ＩＩＩＢが付加した物質Ｐが最大保持を示している。
【００９５】
（実施例８：ヘキサヒスチジンタグ付きのフルオレニルメタノールタグの合成）
ヘキサヒスチジンタグ付きのフルオレニルメタノールタグの合成を図８に示す。フルオレニルメタノール３３をニトロ化し、アルコールを、例えばシリル基で保護する。ニトロ基を還元してアミン３５を形成し、グルタル酸無水物と反応させて酸３６を形成する。次いで、この酸を、樹脂に結合したヘキサヒスチジン（側鎖上にトリチル保護基を持つ）とカップリングさせ、９５％ＴＦＡで処理し、同時に樹脂と側鎖を開裂することによって最終的なタグ３８を調製する。
【００９６】
本明細書中で参照された文献はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および精神から逸脱しない、本発明のここで説明した実施形態に対する様々な変更形態および改変形態が、当分野の技術者には明らかであろう。本発明を、特定の好ましい実施形態に関して説明してきたが、特許請求の範囲に記載される本発明は、こうした特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当分野の技術者には自明である、ここの記載した本発明を実施するための形態に対する様々な変更は、本発明によって包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本発明の金属結合タグ分子の合成経路を示すスキームである。
【図２Ａ】本発明の金属結合タグをペプチドに結合させる経路を示すスキームである。
【図２Ｂ】精製されたタグ付きペプチドの開裂反応のＨＰＬＣトレースを示すクロマトグラムである。
【図２Ｃ】Ｎｉ２＋チャージＨｉＴｒａｐキレートカラム（Ｎｉ２＋  ｃｈａｒｇｅｄ  ＨｉＴｒａｐ  ｃｈｅｌａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）への結合を示すＤＰＨＳＡ−タグ付きペプチドを示すクロマトグラムである。
【図３】本発明の金属結合タグ分子およびこのタグ分子をペプチドに結合させる別の合成経路を示すスキームである。
【図４】ヘキサヒスチジンタグ付きグリシンの合成経路を示すスキームである。
【図５】ヒスチジンタグの付いたヒドロキシル硫化物の合成を示すスキームである。
【図６】本発明の疎水性タグ分子の合成経路を示すスキームである。
【図７Ａ】本発明の別の疎水性タグ分子の合成経路を示すスキームである。
【図７Ｂ】物質Ｐ（１）、ＩＩＩＡ付加物質Ｐ（２）およびＩＩＩＢ付加物質Ｐ（３）のＨＰＬＣトレースを示すクロマトグラムである。
【図８】本発明のヘキサヒスチジンタグ付きのフルオレニルメタノールタグ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇｇｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ  ｍｅｔｈａｎｏｌ  ｔａｇ）の合成経路を示すスキームである。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【国際調査報告】
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