(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、新規なプロテアーゼ、これらの酵素をコードする新規な遺伝子材料、およびセルロモナス類（Cellulomonas spp.）およびこれより開発された変異タンパク質を含むが、これらに限定されない類を含むミクロコシニアエ類（Micrococcineae spp.）から得られる蛋白分解性タンパク質を提供する。特に、本発明は、セルロモナス類から得られたプロテアーゼ組成物、該プロテアーゼをコードするＤＮＡ、該プロテアーゼをコードするＤＮＡを含むベクター、該ベクターＤＮＡで変異させた宿主細胞、および該宿主細胞で生産された酵素を提供する。また、本発明は、セルロモナス類（Cellulomonas spp.）を含むが、これらに限定されない類を含むミクロコシニアエ類（Micrococcineae spp.）から得られるプロテアーゼを含む、洗浄組成物（例えば、界面活性剤組成物）、動物食餌組成物、および織物および皮革の加工用組成物を提供する。選択的な態様において、本発明は、ここで記載された野生型プロテアーゼに由来するミュータント（すなわち、変異）プロテアーゼを提供する。これらのミュータント・プロテアーゼも多くの応用に用いられる。【選択図】なし
2007515164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミクロコシニアエ（Micrococcineae）の構成種から得られた単離セリンプロテアーゼ。
【請求項２】
前記プロテアーゼがセルロモナディン（cellulomonadin）であることを特徴とする請求項１に記載のセリンプロテアーゼ。
【請求項３】
前記プロテアーゼが、セルロモナス（cellulomonas）、エルスコビア（Oerskovia）、セルロシミクロビウム（cellulosimicrobium）、キシラニバクテリウム（Xylanibacterium）、およびプロミクロモノスポラ（Promicromonospora）からなる群から選択される生物体であることを特徴とする請求項１に記載のセリンプロテアーゼ。
【請求項４】
前記プロテアーゼが、セルロモナス６９Ｂ４であることを特徴とする請求項３に記載のセリンプロテアーゼ。
【請求項５】
前記プロテアーゼが、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４に記載のセリンプロテアーゼ。
【請求項６】
請求項４に記載のセリンプロテアーゼと免疫学的交叉反応性を有する単離セリンプロテアーゼを含む組成物。
【請求項７】
請求項１に記載のセリンプロテアーゼと免疫学的交叉反応性を有する単離セリンプロテアーゼを含む組成物。
【請求項８】
請求項５に記載のセリンプロテアーゼと６０％以上のアミノ酸相同性を含む単離セリンプロテアーゼ。
【請求項９】
前記配列が、２，８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４０、４３、４６、４９、５１、５４、６１、６４、６５、６７、７０、７１、７６、７８、７９、８１、８３、８５、８６、９０、９３、９９、１００、１０５、１０７、１０９、１１２、１１３、１１６、１１８、１１９、１２１、１２３、１２７、１４５、１５５、１５９、１６０、１６３、１６５、１７０、１７４、１７９、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、および１８８位を含む群から選択される少なくとも一つのアミノ酸の位置における置換を含むことを特徴とする請求項４に記載のアミノ酸配列。
【請求項１０】
前記配列が、１、４、２２、２７、２８、３０、３２、４１、４７、４８、５５、５９、６３、６６、６９、７５、７７、８０、８４、８７、８８、８９、９２、９６、１１０、１１１、１１４、１１５、１１７、１２８、１３４、１４４、１４３、１４６、１５１、１５４、１５６、１５８、１６１、１６６、１７６、１７７、１８１、１８２、１８７、および１８９位を含む群から選択される少なくとも一つのアミノ酸の位置における置換を含むことを特徴とする請求項４に記載のアミノ酸配列。
【請求項１１】
配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおける位置と同等の位置におけるアミノ酸の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有するプロテアーゼ変異体。
【請求項１２】
前記置換が、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおける２，８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４０、４３、４６、４９、５１、５４、６１、６４、６５、６７、７０、７１、７６、７８、７９、８１、８３、８５、８６、９０、９３、９９、１００、１０５、１０７、１０９、１１２、１１３、１１６、１１８、１１９、１２１、１２３、１２７、１４５、１５５、１５９、１６０、１６３、１６５、１７０、１７４、１７９、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、および１８８位と同等の位置における置換であることを特徴とする請求項１１に記載の単離プロテアーゼ。
【請求項１３】
前記置換が、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおける１、４、２２、２７、２８、３０、３２、４１、４７、４８、５５、５９、６３、６６、６９、７５、７７、８０、８４、８７、８８、８９、９２、９６、１１０、１１１、１１４、１１５、１１７、１２８、１３４、１４４、１４３、１４６、１５１、１５４、１５６、１５８、１６１、１６６、１７６、１７７、１８１、１８２、１８７、および１８９位と同等の位置における置換であることを特徴とする請求項１１に記載の単離プロテアーゼ。
【請求項１４】
配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む単離プロテアーゼであって、１４、１６、３５、３６、６５、７５、７６、７９、１２３、１２７、１５９、および１７９からなる群から選択される位置における少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていることを特徴とする単離プロテアーゼ。
【請求項１５】
前記プロテアーゼが、Ｒ１４Ｌ、Ｒ１６Ｉ、Ｒ１６Ｌ、Ｒ１６Ｑ、Ｒ３５Ｆ、Ｔ３６Ｓ、Ｇ６５Ｑ、Ｙ７５Ｇ、Ｎ７６Ｌ、Ｎ７６Ｖ、Ｒ７９Ｔ、Ｒ１２３Ｌ、Ｒ１２３Ｑ、Ｒ１２７Ａ、Ｒ１２７Ｋ、Ｒ１２７Ｑ、Ｒ１５９Ｋ、Ｒ１５９Ｑ、およびＲ１７９Ｑからなる群から選択される少なくとも一つの突然変異を含むことを特徴とする請求項１４に記載のプロテアーゼ。
【請求項１６】
前記プロテアーゼが、Ｒ１６Ｑ／Ｒ３５Ｆ／Ｒ１５９Ｑ、Ｒ１６Ｑ／Ｒ１２３Ｌ、Ｒ１４Ｌ／Ｒ１２７Ｑ／Ｒ１５９Ｑ、Ｒ１４Ｌ／Ｒ１７９Ｑ、Ｒ１２３Ｌ／Ｒ１２７Ｑ／Ｒ１７９Ｑ、Ｒ１６Ｑ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ１２７Ｑ、およびＲ１６Ｑ／Ｒ７９Ｔからなる群から選択される多数突然変異を含むことを特徴とする請求項１５に記載のプロテアーゼ。
【請求項１７】
前記プロテアーゼが、以下に示すＲ１２３Ｌ、Ｒ１２７Ｑ、およびＲ１７９Ｑの突然変異を含むことを特徴とする請求項１５に記載のプロテアーゼ。
【請求項１８】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｔ３６Ｉ、Ａ３８Ｒ、Ｎ１７０Ｙ、Ｎ７３Ｔ、Ｇ７７Ｔ、Ｎ２４Ａ、Ｔ３６Ｇ、Ｎ２４Ｅ、Ｌ６９Ｓ、Ｔ３６Ｎ、Ｔ３６Ｓ、Ｅ１１９Ｒ、Ｎ７４Ｇ、Ｔ３６Ｗ、Ｓ７６Ｗ、Ｎ２４Ｔ、Ｎ２４Ｑ、Ｔ３６Ｐ、Ｓ７６Ｙ、Ｔ３６Ｈ、Ｇ５４Ｄ、Ｇ７８Ａ、Ｓ１８７Ｐ、Ｒ１７９Ｖ、Ｎ２４Ｖ、Ｖ９０Ｐ、Ｔ３６Ｄ、Ｌ６９Ｈ、Ｇ６５Ｐ、Ｇ６５Ｒ、Ｎ７Ｌ、Ｗ１０３Ｍ、Ｎ５５Ｆ、Ｇ１８６Ｅ、Ａ７０Ｈ、Ｓ７６Ｖ、Ｇ１８６Ｖ、Ｒ１５９Ｆ、Ｔ３６Ｙ、Ｔ３６Ｖ、Ｇ６５Ｖ、Ｎ２４Ｍ、Ｓ５１Ａ、Ｇ６５Ｙ、Ｑ７１Ｉ、Ｖ６６Ｈ、Ｐ１１８Ａ、Ｔ１１６Ｆ、Ａ３８Ｆ、Ｎ２４Ｈ、Ｖ６６Ｄ、Ｓ７６Ｌ、Ｇ１７７Ｍ、Ｇ１８６Ｉ、Ｈ８５Ｑ、Ｑ７１Ｋ、Ｑ７１Ｇ、Ｇ６５Ｓ、Ａ３８Ｄ、Ｐ１１８Ｆ、Ａ３８Ｓ、Ｇ６５Ｔ、Ｎ６７Ｇ、Ｔ３６Ｒ、Ｐ１１８Ｒ、Ｓ１１４Ｇ、Ｙ７５Ｉ、Ｉ１８１Ｈ、Ｇ６５Ｑ、Ｙ７５Ｇ、Ｔ３６Ｆ、Ａ３８Ｈ、Ｒ１７９Ｍ、Ｔ１８３Ｉ、Ｇ７８Ｓ、Ａ６４Ｗ、Ｙ７５Ｆ、Ｇ７７Ｓ、Ｎ２４Ｌ、Ｗ１０３Ｉ、Ｖ３Ｌ、Ｑ８１Ｖ、Ｒ１７９Ｄ、Ｇ５４Ｒ、Ｔ３６Ｌ、Ｑ７１Ｍ、Ａ７０Ｓ、Ｇ４９Ｆ、Ｇ５４Ｌ、Ｇ５４Ｈ、Ｇ７８Ｈ、Ｒ１７９Ｉ、Ｑ８１Ｋ、Ｖ９０Ｉ、Ａ３８Ｌ、Ｎ６７Ｌ、Ｔ１０９Ｉ、Ｒ１７９Ｎ、Ｖ６６Ｉ、Ｇ７８Ｔ、Ｒ１７９Ｙ、Ｓ１８７Ｔ、Ｎ６７Ｋ、Ｎ７３Ｓ、Ｅ１１９Ｋ、Ｖ３Ｉ、Ｑ７１Ｈ、Ｉ１１Ｑ、Ａ６４Ｈ、Ｒ１４Ｅ、Ｒ１７９Ｔ、Ｌ６９Ｖ、Ｖ１５０Ｌ、Ｑ７１Ａ、Ｇ６５Ｌ、Ｑ７１Ｎ、Ｖ９０Ｓ、Ａ６４Ｎ、Ｉ１１Ａ、Ｎ１４５Ｉ、Ｈ８５Ｔ、Ａ６４Ｙ、Ｎ１４５Ｑ、Ｖ６６Ｌ、Ｓ９２Ｇ、Ｓ１８８Ｍ、Ｇ７８Ｄ、Ｎ６７Ａ、Ｎ７Ｓ、Ｖ８０Ｈ、Ｇ５４Ｋ、Ａ７０Ｄ、Ｐ１１８Ｈ、Ｄ２Ｇ、Ｇ５４Ｍ、Ｑ８１Ｈ、Ｄ２Ｑ、Ｖ６６Ｅ、Ｒ７９Ｐ、Ａ３８Ｎ、Ｎ１４５Ｅ、Ｒ１７９Ｌ、Ｔ１０９Ｈ、Ｒ１７９Ｋ、Ｖ６６Ａ、Ｇ５４Ａ、Ｇ７８Ｎ、Ｔ１０９Ａ、Ｒ１７９Ａ、Ｎ７Ａ、Ｒ１７９Ｅ、Ｈ１０４Ｋ、Ａ６４Ｒ、およびＶ８０Ｌからなる群から選択される少なくとも一つの置換を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項１９】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｈ８５Ｒ、Ｈ８５Ｌ、Ｔ６２Ｉ、Ｎ６７Ｈ、Ｇ５４Ｉ、Ｎ２４Ｆ、Ｔ４０Ｖ、Ｔ８６Ａ、Ｇ６３Ｖ、Ｇ５４Ｑ、Ａ６４Ｆ、Ｇ７７Ｙ、Ｒ３５Ｆ、Ｔ１２９Ｓ、Ｒ６１Ｍ、Ｉ１２６Ｌ、Ｓ７６Ｎ、Ｔ１８２Ｖ、Ｒ７９Ｇ、Ｔ１０９Ｐ、Ｒ１２７Ｆ、Ｒ１２３Ｅ、Ｐ１１８Ｉ、Ｔ１０９Ｒ、１７１Ｓ、Ｔ１８３Ｋ、Ｎ６７Ｔ、Ｐ８９Ｎ、Ｆ１Ｔ、Ａ６４Ｋ、Ｇ７８Ｉ、Ｔ１０９Ｌ、Ｇ７８Ｖ、Ａ６４Ｍ、Ａ６４Ｓ、Ｔ１０Ｇ、Ｇ７７Ｎ、Ａ６４Ｌ、Ｎ６７Ｄ、Ｓ７６Ｔ、Ｎ４２Ｈ、Ｄ１８４Ｆ、Ｄ１８４Ｒ、Ｓ７６Ｉ、Ｓ７８Ｒ、Ａ３８Ｋ、Ｖ７２Ｉ、Ｖ３Ｔ、Ｔ１０７Ｓ、Ａ３８Ｖ、Ｆ４７Ｉ、Ｎ５５Ｑ、Ｓ７６Ｅ、Ｐ１１８Ｑ、Ｔ１０９Ｇ、Ｑ７１Ｄ、Ｐ１１８Ｋ、Ｎ６７Ｓ、Ｑ１６７Ｎ、Ｎ１４５Ｇ、Ｉ２８Ｌ、Ｉ１１Ｔ、Ａ６４Ｉ、Ｇ４９Ｋ、Ｇ４９Ａ、Ｇ６５Ａ、Ｎ１７０Ｄ、Ｈ８５Ｋ、Ｓ１８５Ｉ、Ｉ１８１Ｎ、Ｖ８０Ｆ、Ｌ６９Ｗ、Ｓ７６Ｒ、Ｄ１８４Ｈ、Ｖ１５０Ｍ、Ｔ１８３Ｍ、Ｎ６７Ｑ、Ｓ５１Ｑ、Ａ３８Ｙ、Ｔ１０７Ｖ、Ｎ１４５Ｔ、Ｑ７１Ｆ、Ａ８３Ｎ、Ｓ７６Ａ、Ｎ６７Ｒ、Ｔ１５１Ｌ、Ｔ１６３Ｌ、Ｓ５１Ｆ、Ｑ８１Ｉ、Ｆ４７Ｍ、Ａ４１Ｎ、Ｐ１１８Ｅ、Ｎ６７Ｙ、Ｔ１０７Ｍ、Ｎ７３Ｈ、６７Ｖ、Ｇ６３Ｗ、Ｔ１０Ｋ、Ｉ１８１Ｇ、Ｓ１８７Ｅ、Ｔ１０７Ｈ、Ｄ２Ａ、Ｌ１４２Ｖ、Ａ１４３Ｎ、Ａ８Ｇ、Ｓ１８７Ｌ、Ｖ９０Ａ、Ｇ４９Ｌ、Ｎ１７０Ｌ、Ｇ６５Ｈ、Ｔ３６Ｃ、Ｇ１２Ｗ、Ｓ７６Ｑ、Ａ１４３Ｓ、Ｆ１Ａ、Ｎ７Ｈ、Ｓ１８５Ｖ、Ａ１１０Ｔ、Ｎ５５Ｋ、Ｎ６７Ｆ、Ｎ７Ｉ、Ａ１１０Ｓ、Ｎ１７０Ａ、Ｑ８１Ｄ、Ａ６４Ｑ、Ｑ７１Ｌ、Ａ３８Ｉ、Ｎ１１２Ｉ、Ｖ９０Ｔ、Ｎ１４５Ｌ、Ａ６４Ｔ、Ｉ１１Ｓ、Ａ３０Ｓ、Ｒ１２３Ｉ、Ｄ２Ｈ、Ｖ６６Ｍ、Ｑ７１Ｒ、Ｖ９０Ｌ、Ｌ６８Ｗ、Ｎ２４Ｓ、Ｒ１５９Ｅ、Ｖ６６Ｎ、Ｄ１８４Ｑ、Ｅ１３３Ｑ、Ａ６４Ｖ、Ｄ２Ｎ、Ｇ１３Ｍ、Ｔ４０Ｓ、Ｓ７６Ｋ、Ｇ１７７Ｓ、Ｇ６３Ｑ、Ｓ１５Ｆ、Ａ８Ｋ、Ａ７０Ｇ、およびＡ３８Ｇからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項２０】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｒ３５Ｅ、Ｒ３５Ｄ、Ｒ１４Ｅ、Ｒ１４Ｄ、Ｑ１６７Ｅ、Ｇ４９Ｃ、Ｓ１５Ｒ、Ｓ１５Ｈ、Ｉ１１Ｗ、Ｓ１５Ｃ、Ｇ４９Ｑ、Ｒ３５Ｑ、Ｒ３５Ｖ、Ｇ４９Ｅ、Ｒ１２３Ｄ、Ｒ１２３Ｙ、Ｇ４９Ｈ、Ａ３８Ｄ、Ｒ３５Ｓ、Ｆ４７Ｒ、Ｒ１２３Ｃ、Ｔ１５１Ｌ、Ｒ１４Ｔ、Ｒ３５Ｔ、Ｒ１２３Ｅ、Ｇ４９Ａ、Ｇ４９Ｖ、Ｄ５６Ｌ、Ｒ３５Ｎ、Ｒ３５Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｒ３５Ｃ、Ｒ１２３Ｎ、Ｔ４６Ｖ、Ｒ１２３Ｈ、Ｓ１５５Ｃ、Ｔ１２１Ｅ、Ｒ１２７Ｅ、Ｓ１１３Ｃ、Ｒ１２３Ｔ、Ｒ１６Ｅ、Ｔ４６Ｆ、Ｔ１２１Ｌ、Ａ３８Ｃ、Ｔ４６Ｅ、Ｒ１２３Ｗ、Ｔ４４Ｅ、Ｎ５５Ｇ、Ａ８Ｇ、Ｅ１１９Ｇ、Ｒ３５Ｐ、Ｒ１４Ｇ、Ｆ５９Ｗ、Ｒ１２７Ｓ、Ｒ６１Ｅ、Ｒ１４Ｓ、Ｓ１５５Ｗ、Ｒ１２３Ｆ、Ｒ１２３Ｓ、Ｇ４９Ｎ、Ｒ１２７Ｄ、Ｅ１１９Ｙ、Ａ４８Ｅ、Ｎ１７０Ｄ、Ｒ１５９Ｔ、Ｓ９９Ａ、Ｇ１２Ｑ、Ｐ１１８Ｒ、Ｆ１６５Ｗ、Ｒ１２７Ｑ、Ｒ３５Ｈ、Ｇ１２Ｎ、Ａ２２Ｃ、Ｇ１２Ｖ、Ｒ１６Ｔ、Ｙ５７Ｇ、Ｔ１００Ａ、Ｔ４６Ｙ、Ｒ１５９Ｅ、Ｅ１１９Ｒ、Ｔ１０７Ｒ、Ｔ１５１Ｃ、Ｇ５４Ｃ、Ｅ１１９Ｔ、Ｒ６１Ｖ、Ｉ１１Ｅ、Ｒ１４Ｉ、Ｒ６１Ｍ、Ｓ１５Ｅ、Ａ２２Ｓ、Ｒ１６Ｃ、Ｔ３６Ｃ、Ｒ１６Ｖ、Ｌ１２５Ｑ、Ｍ１８０Ｌ、Ｒ１２３Ｑ、Ｒ１４Ａ、Ｒ１４Ｑ、Ｒ３５Ｍ、Ｒ１２７Ｋ、Ｒ１５９Ｑ、Ｎ１１２Ｐ、Ｇ１２４Ｄ、Ｒ１７９Ｅ、Ｇ４９Ｌ、Ａ４１Ｄ、Ｇ１７７Ｄ、Ｒ１２３Ｖ、Ｅ１１９Ｖ、Ｔ１０Ｌ、Ｔ１０９Ｅ、Ｒ１７９Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｔ１０Ｃ、Ｇ９１Ｑ、Ｓ１５Ｙ、Ｓ１５５Ｙ、Ｒ１４Ｃ、Ｔ１６３Ｄ、Ｔ１２１Ｆ、Ｒ１４Ｎ、Ｆ１６５Ｅ、Ｎ２４Ｅ、Ａ４１Ｃ、Ｒ６１Ｔ、Ｇ１２Ｉ、Ｐ１１８Ｋ、Ｔ４６Ｃ、Ｉ１１Ｔ、Ｒ１５９Ｄ、Ｎ１７０Ｃ、Ｒ１５９Ｖ、Ｓ１５５Ｉ、Ｉ１１Ｑ、Ｄ２Ｐ、Ｔ１００Ｒ、Ｒ１５９Ｓ、Ｓ１１４Ｃ、Ｒ１６Ｄ、およびＰ１３４Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項２１】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｓ９９Ｇ、Ｔ１００Ｋ、Ｒ１２７Ａ、Ｆ１Ｐ、Ｓ１５５Ｖ、Ｔ１２８Ａ、Ｆ１６５Ｈ、Ｇ１７７Ｅ、Ａ７０Ｍ、Ｓ１４０Ｐ、Ａ８７Ｅ、Ｄ２Ｉ、Ｒ１５９Ｋ、Ｔ３６Ｖ、Ｒ１７９Ｃ、Ｅ１１９Ｎ、Ｔ１０Ｙ、Ｉ１７２Ａ、Ａ８Ｔ、Ｆ４７Ｖ、Ｗ１０３Ｌ、Ｒ６１Ｋ、Ｄ２Ｖ、Ｒ１７９Ｖ、Ｄ２Ｔ、Ｒ１５９Ｎ、Ｅ１１９Ａ、Ｇ５４Ｅ、Ｒ１６Ｑ、Ｇ４９Ｓ、Ｒ１６Ｉ、Ｓ５１Ｌ、Ｓ１５５Ｅ、Ｓ１５Ｍ、Ｒ１７９Ｉ、Ｔ１０Ｑ、Ｇ１２Ｈ、Ｒ１５９Ｃ、Ｒ１７９Ｔ、Ｔ１６３Ｃ、Ｒ１５９Ａ、Ａ１３２Ｓ、Ｎ１５７Ｄ、Ｇ１３Ｅ、Ｌ１４１Ｍ、Ａ４１Ｔ、Ｒ１２３Ｍ、Ｒ１４Ｍ、Ａ８Ｒ、Ｑ８１Ｐ、Ｎ２４Ｔ、Ｔ１０Ｄ、Ａ８８Ｆ、Ｒ６１Ｑ、Ｓ９９Ｋ、Ｒ１７９Ｙ、Ｔ１２１Ａ、Ｎ１１２Ｅ、Ｓ１５５Ｔ、Ｔ１５１Ｖ、Ｓ９９Ｑ、Ｔ１０Ｅ、Ｓ９２Ｔ、Ｔ１０９Ｋ、Ｔ４４Ｃ、Ｒ１２３Ａ、Ａ８７Ｃ、Ｓ１５Ｆ、Ｓ１５５Ｆ、Ｄ５６Ｆ、Ｔ１０Ｆ、Ａ８３Ｈ、Ｒ１７９Ｈ、Ｔ１２１Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ｐ１１８Ｃ、Ｇ４９Ｆ、Ｑ１７４Ｃ、Ｓ１１４Ｅ、Ｔ８６Ｅ、Ｆ１Ｎ、Ｔ１１５Ｃ、Ｒ１２７Ｃ、Ｒ１２３Ｋ、Ｖ６６Ｎ、Ｇ１２Ｙ、Ｓ１１３Ａ、Ｓ１５Ｎ、Ａ１７５Ｔ、Ｒ７９Ｔ、Ｒ１２３Ｇ、Ｒ１７９Ｓ、Ｒ１７９Ｎ、Ｒ１２３Ｉ、Ｐ１１８Ａ、Ｓ１８７Ｅ、Ｎ１１２Ｄ、Ａ７０Ｇ、Ｅ１１９Ｌ、Ｅ１１９Ｓ、Ｒ１５９Ｍ、Ｒ１４Ｈ、Ｒ１７９Ｆ、Ａ６４Ｃ、Ａ４１Ｓ、Ｒ１７９Ｗ、Ｎ２４Ｇ、Ｔ１００Ｑ、Ｐ１１８Ｗ、Ｑ８１Ｇ、Ｇ４９Ｋ、Ｒ１４Ｌ、Ｎ５５Ａ、Ｒ３５Ｋ、Ｒ７９Ｖ、Ｄ２Ｍ、Ｔ１６０Ｄ、Ａ８３Ｄ、Ｒ１７９Ｌ、Ｓ５１Ａ、Ｇ１２Ｐ、Ｓ９９Ｈ、Ｎ４２Ｄ、Ｓ１８８Ｅ、Ｔ１０Ｍ、Ｌ１２５Ｍ、Ｔ１１６Ｎ、Ａ７０Ｐ、Ｑ１７４Ｓ、Ｇ６５Ｄ、Ｓ１１３Ｄ、Ｅ１１９Ｑ、Ａ８３Ｅ、Ｎ１７０Ｌ、Ｑ８１Ａ、Ｓ５１Ｃ、Ｐ１１８Ｇ、Ｑ１７４Ｔ、Ｉ２８Ｖ、Ｓ１５Ｇ、およびＴ１１６Ｇからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項２２】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｇ２６Ｉ、Ｇ２６Ｋ、Ｇ２６Ｑ、Ｇ２６Ｖ、Ｇ２６Ｗ、Ｆ２７Ｖ、Ｆ２７Ｗ、Ｉ２８Ｐ、Ｔ２９Ｅ、Ｔ１２９Ｗ、Ｔ４０Ｄ、Ｔ４０Ｑ、Ｒ４３Ｄ、Ｐ４３Ｈ、Ｐ４３Ｋ、Ｐ４３Ｌ、Ａ２２Ｃ、Ｔ４０Ｈ、Ｐ８９Ｗ、Ｇ９１Ｌ、Ｓ１８Ｅ、Ｆ５９Ｋ、Ａ３０Ｍ、Ａ３０Ｎ、Ｇ３１Ｍ、Ｃ３３Ｍ、Ｇ１６１Ｌ、Ｇ１６１Ｖ、Ｐ４３Ｎ、Ｇ２６Ｅ、Ｎ７３Ｐ、Ｇ８４Ｃ、Ｇ８４Ｐ、Ｇ４５Ｖ、Ｃ３３Ｌ、Ｙ９Ｅ、Ｙ９Ｐ、Ａ１４７Ｅ、Ｃ１５８Ｈ、Ｉ２８Ｗ、Ａ４８Ｐ、Ａ２２Ｓ、Ｔ６２Ｒ、Ｓ１３７Ｒ、Ｓ１５５Ｐ、Ｓ１５５Ｒ、Ｇ１５６Ｉ、Ｇ１５６Ｌ、Ｑ８１Ａ、Ｒ９６Ｃ、Ｉ４Ｄ、Ｉ４Ｐ、Ａ７０Ｐ、Ｃ１０５Ｅ、Ｃ１０５Ｇ、Ｃ１０５Ｋ、Ｃ１０５Ｍ、Ｃ１０５Ｎ、Ｃ１０５Ｓ、Ｔ１２８Ａ、Ｔ１２８Ｖ、Ｔ１２８Ｇ、Ｓ１４０Ｐ、Ｇ１２Ｄ、Ｃ３３Ｎ、Ｃ３３Ｅ、Ｔ１６４Ｇ、Ｇ４５Ａ、Ｇ１５６Ｐ、Ｓ９９Ａ、Ｑ１６７Ｌ、Ｓ１５５Ｗ、Ｉ２８Ｔ、Ｒ９６Ｆ、Ａ３０Ｐ、Ｒ１２３Ｗ、Ｔ４０Ｐ、Ｔ３９Ｒ、Ｃ１０５Ｐ、Ｔ１００Ａ、Ｃ１０５Ｗ、Ｓ１５５Ｋ、Ｔ４６Ｙ、Ｒ１２３Ｆ、Ｉ４Ｇ、Ｓ１５５Ｙ、Ｔ４６Ｖ、Ａ９３Ｓ、Ｙ５７Ｎ、Ｑ８１Ｓ、Ｇ１８６Ｓ、Ｇ３１Ｈ、Ｔ１０Ｙ、Ｇ３１Ｖ、Ａ８３Ｈ、Ａ３８Ｄ、Ｒ１２３Ｙ、Ｒ７９Ｔ、Ｃ１５８Ｇ、Ｇ３１Ｙ、Ｑ８１Ｐ、Ｒ９６Ｅ、Ａ３０Ｙ、Ｒ１５９Ｋ、Ａ２２Ｔ、Ｔ４０Ｎ、Ｙ５７Ｍ、Ｇ３１Ｎ、Ｑ８１Ｇ、Ｔ１６４Ｌ、Ｔ１２１Ｅ、Ｔ１０Ｆ、Ｑ１４６Ｐ、Ｒ１２３Ｎ、Ｖ３Ｒ、Ｐ４３Ｇ、Ｑ８１Ｈ、Ｑ８１Ｄ、Ｇ１６１Ｉ、Ｃ１５８Ｍ、Ｎ２４Ｔ、Ｔ１０Ｗ、Ｔ１２８Ｓ、Ｔ１６０Ｉ、Ｙ１７６Ｐ、Ｓ１５５Ｆ、Ｔ１２８Ｃ、Ｌ１２５Ａ、Ｐ１６８Ｙ、Ｔ６２Ｇ、Ｆ１６６Ｓ、Ｓ１８８Ａ、Ｑ８１Ｆ、Ｔ４６Ｗ、Ａ７０Ｇ、およびＡ３８Ｇからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項２３】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｓ１８８Ｅ、Ｓ１８８Ｖ、Ｙ１１７Ｋ、Ｙ１１７Ｑ、Ｙ１１７Ｒ、Ｙ１１７Ｖ、Ｒ１２７Ｋ、Ｒ１２７Ｑ、Ｒ１２３Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｒ１２３Ｉ、Ｑ８１Ｅ、Ｌ１２５Ｍ、Ｈ３２Ａ、Ｓ１８８Ｔ、Ｎ７４Ｆ、Ｃ３３Ｄ、Ｆ２７Ｉ、Ａ８３Ｍ、Ｑ７１Ｙ、Ｒ１２３Ｔ、Ｖ９０Ａ、Ｆ５９Ｗ、Ｌ１４１Ｃ、Ｎ１７０Ｅ、Ｔ４６Ｆ、Ｓ５１Ｖ、Ｇ１６２Ｐ、Ｓ１８５Ｒ、Ａ４１Ｓ、Ｒ７９Ｖ、Ｔ１５１Ｃ、Ｔ１０７Ｓ、Ｔ１２９Ｙ、Ｍ１８０Ｌ、Ｆ１６６Ｃ、Ｃ１０５Ｔ、Ｔ１６０Ｅ、Ｐ８９Ａ、Ｒ１５９Ｔ、Ｔ１８３Ｐ、Ｓ１８８Ｍ、Ｔ１０Ｌ、Ｇ２５Ｓ、Ｎ２４Ｓ、Ｅ１１９Ｌ、Ｔ１０７Ｌ、Ｔ１０７Ｑ、Ｇ１６１Ｋ、Ｇ１５Ｑ、Ｓ１５Ｒ、Ｇ１５３Ｋ、Ｇ１５３Ｖ、Ｓ１８８Ｇ、Ａ８３Ｅ、Ｇ１８６Ｐ、Ｔ１２１Ｄ、Ｇ４９Ａ、Ｓ１５Ｃ、Ｃ１０５Ｙ、Ｃ１０５Ａ、Ｒ１２７Ｆ、Ｑ７１Ａ、Ｔ１０Ｃ、Ｒ１７９Ｋ、Ｔ８６Ｉ、Ｗ１０３Ｎ、Ａ８７Ｓ、Ｆ１６６Ａ、Ａ８３Ｆ、Ｒ１２３Ｑ、Ａ１３２Ｃ、Ａ１４３Ｈ、Ｔ１６３Ｉ、Ｔ３９Ｖ、Ａ９３Ｄ、Ｖ９０Ｍ、Ｒ１２３Ｋ、Ｐ１３４Ｗ、Ｇ１７７Ｎ、Ｖ１１５Ｉ、Ｓ１５５Ｔ、Ｔ１１０Ｄ、Ｇ１０５Ｌ、Ｎ１７０Ｄ、Ｔ１０７Ａ、Ｇ８４Ｖ、Ｇ８４Ｍ、Ｌ１１１Ｋ、Ｐ１６８Ｉ、Ｇ１５４Ｌ、Ｔ１８３Ｉ、Ｓ９９Ｇ、Ｓ１５Ｔ、Ａ８Ｇ、Ｓ１５Ｎ、Ｐ１８９Ｓ、Ｓ１８８Ｃ、Ｔ１００Ｑ、Ａ１１０Ｇ、Ａ１２１Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｒ１５９Ｖ、Ｇ３１Ａ、Ｇ１５４Ｒ、Ｔ１８２Ｌ、Ｖ１１５Ｌ、Ｔ１６０Ｑ、Ｔ１０７Ｆ、Ｒ１５９Ｑ、Ｇ１４４Ａ、Ｓ９２Ｔ、Ｔ１０１Ｓ、Ａ８３Ｒ、Ｇ１２ＨＭ、Ｓ１５Ｈ、Ｔ１１６Ｑ、Ｔ３６Ｖ、Ｇ１５４、Ｑ８１Ｃ、Ｖ１３０Ｔ、Ｔ１８３Ａ、Ｐ１１８Ｔ、Ａ８７Ｅ、Ｔ８６Ｍ、Ｖ１５０Ｎ、およびＮ２４Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項２４】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｔ３６Ｉ、Ｉ１７２Ｔ、Ｎ２４Ｅ、Ｎ１７０Ｙ、Ｇ７７Ｔ、Ｇ１８６Ｎ、Ｉ１８１Ｌ、Ｎ７３Ｔ、Ａ３８Ｒ、Ｎ７４Ｇ、Ｎ２４Ａ、Ｇ５４Ｄ、Ｓ７６Ｄ、Ｒ１２３Ｅ、１５９Ｅ、Ｎ１１２Ｅ、Ｒ３５Ｅ、Ｒ１７９Ｖ、Ｒ１２３Ｄ、Ｎ２４Ｔ、Ｒ１７９Ｔ、Ｒ１４Ｌ、Ａ３８Ｄ、Ｖ９０Ｐ、Ｒ１４Ｑ、Ｒ１２３Ｉ、Ｒ１７９Ｄ、Ｓ７６Ｖ、Ｒ７９Ｇ、Ｒ３５Ｌ、Ｓ７６Ｅ、Ｓ７６Ｙ、Ｒ７９Ｄ、Ｒ７９Ｐ、Ｒ３５Ｑ、Ｒ１７９Ｎ、Ｎ１１２Ｄ、Ｒ１７９Ｅ、Ｇ６５Ｐ、Ｙ７５Ｇ、Ｖ９０Ｓ、Ｒ１７９Ｍ、Ｒ３５Ｆ、Ｒ１２３Ｆ、Ａ６４Ｉ、Ｎ２４Ｑ、Ｒ１４Ｉ、Ｒ１７９Ａ、Ｒ１２７Ａ、Ｒ１７９Ｉ、Ｎ１７０Ｄ、Ｒ３５Ａ、Ｒ１５９Ｆ、Ｔ１０９Ｅ、Ｒ１４Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｇ４９Ａ、Ｎ１１２Ｑ、Ｇ７８Ｄ、Ｔ１２１Ｅ、Ｌ６９Ｓ、Ｔ１１６Ｅ、Ｖ９０Ｉ、Ｔ３６Ｓ、Ｔ３６Ｇ、ｎ１４５Ｅ、Ｔ８６Ｄ、Ｓ５１Ｄ、Ｒ１７９Ｋ、Ｔ１０７Ｅ、Ｔ１２９Ｓ、Ｌ１４２Ｖ、Ｒ７９Ａ、Ｒ７９Ｅ、Ａ３８Ｈ、Ｔ１０７Ｓ、Ｒ１２３Ａ、Ｎ５５Ｅ、Ｒ１２３Ｌ、Ｒ１５９Ｎ、Ｇ６５Ｄ、Ｒ１４Ｎ、Ｇ６５Ｑ、Ｒ１２３Ｑ、Ｎ２４Ｖ、Ｒ１４Ｇ、Ｔ１１６Ｑ、Ａ３８Ｎ、Ｒ１５９Ｑ、Ｒ１７９Ｙ、Ａ８３Ｅ、Ｎ１１２Ｌ、Ｓ９９Ｎ、Ｇ７８Ａ、Ｔ１０Ｎ、Ｈ８５Ｑ、Ｒ３５Ｑ、Ｎ２４Ｌ、Ｎ２４Ｈ、Ｇ４９Ｓ、Ｒ７９Ｌ、Ｓ７６Ｔ、Ｓ７６Ｌ、Ｇ６５Ｓ、Ｎ５５Ｆ、Ｒ７９Ｖ、Ｇ６５Ｔ、Ｒ１２３Ｎ、Ｔ８６Ｅ、Ｙ７５Ｆ、Ｆ１Ｔ、Ｓ７６Ｎ、Ｓ９９Ｖ、Ｒ７９Ｔ、Ｎ１１２Ｖ、Ｒ７９Ｍ、Ｔ１０７Ｖ、Ｒ７９Ｓ、Ｇ５４Ｅ、Ｇ６５Ｖ、Ｒ１２７Ｑ、Ｒ１５９Ｄ、Ｔ１０７Ｈ、Ｈ８５Ｔ、Ｒ３５Ｔ、Ｔ３６Ｎ、Ｑ８１Ｅ、Ｒ１２３Ｈ、Ｓ７６Ｉ、Ａ３８Ｆ、Ｖ９０Ｔ、およびＲ１４Ｔからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項２５】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｇ６５Ｌ、Ｓ９９Ｄ、Ｔ１０７Ｍ、Ｓ１１３Ｔ、Ｓ９９Ｔ、Ｇ７７Ｓ、Ｒ１４Ｍ、Ａ６４Ｎ、Ｒ６１Ｍ、Ａ７０Ｄ、Ｑ７１Ｇ、Ａ９３Ｄ、Ｓ９２Ｇ、Ｎ１１２Ｙ、Ｓ１５Ｗ、Ｒ１５９Ｋ、Ｎ６７Ｇ、Ｔ１０Ｅ、Ｒ１２７Ｈ、Ａ６４Ｙ、Ｒ１５９Ｃ、Ａ３８Ｌ、Ｔ１６０Ｅ、Ｔ１８３Ｅ、Ｒ１２７Ｓ、Ａ８Ｅ、Ｓ５１Ｑ、Ｎ７Ｌ、Ｇ６３Ｄ、Ａ３８Ｓ、Ｒ３５Ｈ、Ｒ１４Ｋ、Ｔ１０７Ｉ、Ｇ１２Ｄ、Ａ６４Ｌ、Ｓ７６Ｗ、Ａ４１Ｎ、Ｒ３５Ｍ、Ａ６４Ｖ、Ａ３８Ｙ、Ｔ１８３Ｉ、Ｗ１０３Ｍ、Ａ４１Ｄ、Ｒ１２７Ｋ、Ｔ３６Ｄ、Ｒ６１Ｔ、Ｇ６５Ｙ、Ｇ１３Ｓ、Ｒ３５Ｙ、Ｒ１２３Ｔ、Ａ６４Ｈ、Ｇ４９Ｈ、Ａ７０Ｈ、Ａ６４Ｆ、Ｒ１２７Ｙ、Ｒ６１Ｅ、Ａ６４Ｐ、Ｔ１２１Ｄ、Ｖ１１５Ａ、Ｒ１２３Ｙ、Ｔ１０１Ｓ、Ｔ１８２Ｖ、Ｈ８５Ｌ、Ｎ２４Ｍ、Ｒ１２７Ｅ、Ｎ１４５Ｄ、Ｑ７１Ｈ、Ｓ７６Ｑ、Ａ６４Ｔ、Ｇ４９Ｆ、Ａ６４Ｑ、Ｔ１０Ｄ、Ｆ１Ｄ、Ａ７０Ｇ、Ｒ３５Ｗ、Ｑ７１Ｄ、Ｎ１２１Ｉ、Ａ６４Ｍ、Ｔ３６Ｈ、Ａ８Ｇ、Ｔ１０７Ｎ、Ｒ３５Ｓ、Ｎ６７Ｔ、Ｓ９２Ａ、Ｎ１７０Ｌ、Ｎ６７Ｅ、Ｓ１１４Ａ、Ｒ１４Ａ、Ｒ１４Ｓ、Ｑ８１Ｄ、Ｓ５１Ｈ、Ｒ１２３Ｓ、Ａ９３Ｓ、Ｒ１２７Ｆ、Ｉ１９Ｖ、Ｔ４０Ｖ、Ｓ１８５Ｎ、Ｒ１２３Ｇ、Ｒ１７９Ｌ、Ｓ５１Ｖ、Ｔ１６３Ｄ、Ｔ１０９Ｉ、Ａ６４Ｓ、Ｖ７２Ｉ、Ｎ６７Ｓ、Ｒ１５９Ｓ、Ｈ８５Ｍ、Ｔ１０９Ｇ、Ｑ７１Ｓ、Ｒ６１Ｈ、Ｔ１０７Ａ、Ｑ８１Ｖ、Ｖ９０Ｎ、Ｔ１０９Ａ、Ａ３８Ｔ、Ｎ１４５Ｔ、Ｒ１５９Ａ、Ａ１１０Ｓ、Ｑ８１Ｈ、Ａ４８Ｅ、Ｓ５１Ｔ、Ａ６４Ｗ、Ｒ１５９Ｌ、Ｎ６７Ｈ、Ａ９３Ｅ、Ｔ１１６Ｆ、Ｒ６１Ｓ、Ｒ１２３Ｖ、Ｖ３Ｌ、およびＲ１５９Ｙからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項２６】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｔ３６Ｉ、Ｐ８９Ｄ、Ａ９３Ｔ、Ａ９３Ｓ、Ｔ３６Ｎ、Ｎ７３Ｔ、Ｔ３６Ｇ、Ｒ１５９Ｆ、Ｔ３６Ｓ、Ａ３８Ｒ、Ｓ９９Ｗ、Ｓ７６Ｗ、Ｔ３６Ｐ、Ｇ７７Ｔ、Ｇ５４Ｄ、Ｒ１２７Ａ、Ｒ１５９Ｅ、Ｈ８５Ｑ、Ｔ３６Ｄ、Ｓ７６Ｌ、Ｓ９９Ｎ、Ｙ７５Ｇ、Ｓ７６Ｙ、Ｒ１２７Ｓ、Ｎ２４Ｅ、Ｒ１２７Ｑ、Ｄ１８４Ｆ、Ｎ１７０Ｙ、Ｎ２４Ａ、Ｓ７６Ｔ、Ｈ８５Ｌ、Ｙ７５Ｆ、Ｓ７６Ｖ、Ｌ６９Ｓ、Ｒ１５９Ｋ、Ｒ１２７Ｋ、Ｇ６５Ｐ、Ｎ７４Ｇ、Ｒ１５９Ｈ、Ｇ６５Ｑ、Ｇ１８６Ｖ、Ａ４８Ｑ、Ｔ３６Ｈ、Ｎ６７Ｌ、Ｒ１４Ｉ、Ｒ１２７Ｌ、Ｔ３６Ｙ、Ｓ７６Ｉ、Ｓ１１４Ｇ、Ｒ１２７Ｈ、Ｓ１８７Ｐ、Ｖ３Ｌ、Ｇ７８Ｄ、Ｒ１２３Ｉ、Ｉ１８１Ｑ、Ｒ３５Ｆ、Ｈ８５Ｒ、Ｒ１２７Ｙ、Ｎ６７Ｓ、Ｑ８１Ｐ、Ｒ１２３Ｆ、Ｒ１５９Ｎ、Ｓ９９Ａ、Ｓ７６Ｄ、Ａ１３２Ｖ、Ｒ１２７Ｆ、Ａ１４３Ｎ、Ｓ９２Ａ、Ｎ２４Ｔ、Ｒ７９Ｐ、Ｓ７６Ｎ、Ｒ１４Ｍ、Ｇ１８６Ｅ、Ｎ２４Ｑ、Ｎ６７Ａ、Ｒ１２７Ｔ、Ｈ８５Ｋ、Ｇ６５Ｔ、Ｇ６５Ｙ、Ｒ１７９Ｖ、Ｙ７５Ｉ、Ｉ１１Ｑ、Ａ３８Ｌ、Ｔ３６Ｌ、Ｒ１５９Ｙ、Ｒ１５９Ｄ、Ｎ２４Ｖ、Ｇ６５Ｓ、Ｎ１５７Ｄ、Ｇ１８６Ｉ、Ｇ５４Ｑ、Ｎ６７Ｙ、Ｒ１２７Ｇ、Ｓ７６Ａ、Ａ３８Ｓ、Ｔ１０９Ｅ、Ｖ６６Ｈ、Ｔ１１６Ｆ、Ｒ１２３Ｌ、Ｇ４９Ａ、Ａ６４Ｈ、Ｔ３６Ｗ、Ｄ１８４Ｈ、Ｓ９９Ｄ、Ｇ１６１Ｋ、Ｐ１３４Ｅ、Ａ６４Ｆ、Ｎ６７Ｇ、Ｓ９９Ｔ、Ｄ２Ｑ、Ｓ７６Ｅ、Ｒ１６Ｑ、Ｇ５４Ｎ、Ｎ６７Ｖ、Ｒ３５Ｌ、Ｑ７１Ｉ、Ｎ７Ｌ、Ｎ１１２Ｅ、Ｌ６９Ｈ、Ｎ２４Ｈ、Ｇ５４Ｉ、Ｒ１６Ｌ、Ｎ２４Ｍ、Ａ６４Ｙ、Ｓ１１３Ａ、Ｈ８５Ｆ、Ｒ７９Ｇ、Ｉ１１Ａ、Ｔ１２１Ｄ、Ｒ６１Ｖ、およびＧ６５Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項２７】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｎ６７Ｑ、Ｓ１８７Ｑ、Ｑ７１Ｈ、Ｔ１６３Ｄ、Ｒ６１Ｋ、Ｒ１５９Ｖ、Ｑ７１Ｆ、Ｖ３１Ｆ、Ｖ９０Ｉ、Ｒ７９Ｄ、Ｔ１６０Ｅ、Ｒ１２３Ｑ、Ａ３８Ｙ、Ｓ１１３Ｇ、Ａ８８Ｆ、Ａ７０Ｇ、Ｉ１１Ｔ、Ｇ７８Ａ、Ｎ２４Ｌ、Ｓ９２Ｇ、Ｒ１４Ｌ、Ｄ１８４Ｒ、Ｇ５４Ｌ、Ｎ１１２Ｌ、Ｈ８５Ｙ、Ｒ１６Ｎ、Ｇ７７Ｓ、Ｒ１７９Ｔ、Ｖ８０Ｌ、Ｇ６５Ｖ、Ｔ１２１Ｅ、Ｑ７１Ｄ、Ｒ１６Ｇ、Ｐ８９Ｎ、Ｎ４２Ｈ、Ｇ４９Ｆ、Ｉ１１Ｓ、Ｒ６１Ｍ、Ｒ１５９Ｃ、Ｇ６５Ｒ、Ｔ１８３Ｉ、Ａ９３Ｄ、Ｌ１１１Ｅ、Ｓ５１Ｑ、Ｇ７８Ｎ、Ｎ６７Ｔ、Ａ３８Ｎ、Ｔ４０Ｖ、Ａ６４Ｗ、Ｒ１５９Ｌ、Ｔ１０Ｅ、Ｒ１７９Ｋ、Ｒ１２３Ｅ、Ｖ９０Ｐ、Ａ６４Ｎ、Ｇ１６１Ｅ、Ｈ８５Ｔ、Ａ８Ｇ、Ｌ１４２Ｖ、Ａ４１Ｎ、Ｓ１８５Ｉ、Ｑ７１Ｌ、Ａ６４Ｔ、Ｒ１６Ｉ、Ａ３８Ｄ、Ｇ５４Ｍ、Ｎ１１２Ｑ、Ｒ１６Ａ、Ｒ１４Ｅ、Ｖ８０Ｈ、Ｎ１７０Ｄ、Ｓ９９Ｇ、Ｒ１７９Ｎ、Ｓ１５Ｅ、Ｇ４９Ｈ、Ａ７０Ｐ、Ａ６４Ｓ、Ｇ５４Ａ、Ｓ１８５Ｗ、Ｒ６１Ｈ、Ｔ１０Ｑ、Ａ３８Ｆ、Ｎ１７０Ｌ、Ｔ１０Ｌ、Ｎ６７Ｆ、Ｇ１２Ｄ、Ｄ１８４Ｔ、Ｒ１４Ｎ、Ｓ１８７Ｅ、Ｒ１４Ｐ、Ｎ１１２Ｄ、Ｓ１４０Ａ、Ｎ１１２Ｇ、Ｇ４９Ｓ、Ｌ１１１Ｄ、Ｎ６７Ｍ、Ｖ１５０Ｌ、Ｇ１２Ｙ、Ｒ１２３Ｋ、Ｐ８９Ｖ、Ｖ６６Ｄ、Ｇ７７Ｎ、Ｓ５１Ｔ、Ａ８Ｄ、Ｉ１８１Ｈ、Ｔ８６Ｎ、Ｒ１７９Ｄ、Ｎ５５Ｆ、Ｎ２４Ｓ、Ｄ１８４Ｌ、Ｒ６１Ｓ、Ｎ６７Ｋ、Ｇ１８６Ｌ、Ｆ１Ｔ、Ｒ１５９Ａ、Ｉ１１Ｌ、Ｒ６１Ｔ、Ｄ１８４Ｑ、Ａ９３Ｅ、Ｑ７１Ｔ、Ｒ１７９Ｅ、Ｌ６９Ｗ、Ｔ１６３Ｉ、Ｓ１８８Ｑ、Ｌ１２５Ｖ、Ａ３８Ｖ、Ｒ３５Ａ、Ｐ１３４Ｇ、Ａ６４Ｖ、Ｎ１４５Ｄ、Ｖ９０Ｔ、およびＡ１４３Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項２８】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｔ３６Ｉ、Ｎ１７０Ｙ、Ａ３８Ｒ、Ｒ７９Ｐ、Ｇ７７Ｔ、Ｌ６９Ｓ、Ｎ７３Ｔ、Ｓ７６Ｖ、Ｓ７６Ｙ、Ｒ１７９Ｖ、Ｔ３６Ｎ、Ｎ５５Ｆ、Ｒ１５９Ｆ、Ｇ５４Ｄ、Ｇ６５Ｐ、Ｌ６９Ｈ、Ｔ３６Ｇ、Ｇ１７７Ｍ、Ｎ２４Ｅ、Ｎ７４Ｇ、Ｒ１５９Ｅ、Ｔ３６Ｓ、Ｙ７５Ｇ、Ｓ７６Ｉ、Ｓ７６Ｄ、Ａ８Ｒ、Ａ２４Ａ、Ｖ９０Ｐ、Ｒ１５９Ｃ、Ｇ６５Ｑ、Ｔ１２１Ｅ、Ａ８Ｖ、Ｓ７６Ｌ、Ｔ１０９Ｅ、Ｒ１７９Ｍ、Ａ８Ｔ、Ｔ１０７Ｎ、Ｇ１８６Ｅ、Ｓ７６Ｗ、Ｒ１２３Ｅ、Ａ３８Ｆ、Ｔ３６Ｐ、Ｎ６７Ｇ、Ｙ７５Ｆ、Ｓ７６Ｎ、Ｒ１７９Ｉ、Ｓ１８７Ｐ、Ｎ６７Ｖ、Ｖ９０Ｓ、Ｒ１２７Ａ、Ｒ１７９Ｙ、Ｒ３５Ｆ、Ｎ１４５Ｓ、Ｇ６５Ｓ、Ｒ６１Ｍ、Ｓ５１Ａ、Ｒ１７９Ｎ、Ｒ１２３Ｄ、Ｎ２４Ｔ、Ｎ５５Ｅ、Ｒ７９Ｃ、Ｇ１８６Ｖ、Ｒ１２３Ｉ、Ｇ１６１Ｅ、Ｇ６５Ｙ、Ａ３８Ｓ、Ｒ１４Ｌ、Ｖ９０Ｉ、Ｒ７９Ｇ、Ｎ１４５Ｅ、Ｎ６７Ｌ、Ｒ１２７Ｓ、Ｒ１５０Ｙ、Ｍ１８０Ｄ、Ｎ６７Ｔ、Ａ９３Ｄ、Ｔ１２１Ｄ、Ｑ８１Ｖ、Ｔ１０９Ｉ、Ａ９３Ｅ、Ｔ１０７Ｓ、Ｒ１７９Ｔ、Ｒ１７９Ｌ、Ｒ１７９Ｋ、Ｒ１５９Ｄ、Ｒ１７９Ａ、Ｒ７９Ｅ、Ｒ１２３Ｆ、Ｒ７９Ｄ、Ｔ３６Ｄ、Ａ６４Ｎ、Ｌ１４２Ｖ、Ｔ１０９Ａ、Ｉ１７２Ｖ、Ａ８３Ｎ、Ｔ８５Ａ、Ｒ１７９Ｄ、Ａ３８Ｌ、Ｉ１２６Ｌ、Ｒ１２７Ｑ、Ｒ１２７Ｌ、Ｌ６９Ｗ、Ｒ１２７Ｋ、Ｇ６５Ｔ、Ｒ１２７Ｈ、Ｐ１３４Ａ、Ｎ６７Ｄ、Ｒ１４Ｍ、Ｎ２４Ｑ、Ａ１４３Ｎ、Ｎ５５Ｓ、Ｎ６７Ｍ、Ｓ５１Ｄ、Ｓ７６Ｅ、Ｔ１６３Ｄ、Ａ３８Ｄ、Ｒ１５９Ｋ、Ｔ１８３Ｉ、Ｇ６３Ｖ、Ａ８Ｓ、Ｔ１０７Ｍ、Ｈ８５Ｑ、Ｎ１１２Ｅ、Ｎ６７Ｆ、Ｎ６７Ｓ、Ａ６４Ｈ、Ｔ８６Ｉ、Ｐ１３４Ｅ、Ｔ１８２Ｖ、Ｎ６７Ｙ、Ａ６４Ｓ、Ｇ７８Ｄ、Ｖ９０Ｔ、Ｒ６１Ｔ、Ｒ１６Ｑ、Ｇ６５Ｒ、Ｔ８６Ｌ、Ｖ９０Ｎ、Ｒ１５９Ｑ、Ｇ５４Ｉ、Ｓ７６Ｃ、Ｒ１７９Ｅ、Ｖ６６Ｄ、Ｌ６９Ｖ、Ｒ１２７Ｙ、Ｒ３５Ｌ、Ｒ１４Ｅ、およびＴ８６Ｆからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項２９】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｇ１８６Ｉ、Ａ６４Ｑ、Ｔ１０９Ｇ、Ｇ６４Ｌ、Ｎ２４Ｌ、Ａ８Ｅ、Ｎ１１２Ｄ、Ａ３８Ｈ、Ｒ１７９Ｗ、Ｓ１１４Ｇ、Ｒ１２３Ｌ、Ａ８Ｌ、Ｔ１２９Ｓ、Ｎ１７０Ｄ、Ｒ１５９Ｎ、Ｎ６７Ｃ、Ｓ９２Ｃ、Ｔ１０７Ａ、Ｇ５４Ｅ、Ｔ１０７Ｅ、Ｔ３６Ｖ、Ｒ１２７Ｔ、Ａ８Ｎ、Ｈ８５Ｌ、Ａ１１０Ｓ、Ｎ１７０Ｃ、Ａ６４Ｒ、Ａ１３２Ｖ、Ｔ３６Ｙ、Ｇ６３Ｄ、Ｗ１０３Ｍ、Ｔ１５１Ｖ、Ｒ１２３Ｐ、Ｗ１０３Ｙ、Ｓ７６Ｔ、Ｓ１８７Ｔ、Ｒ１２７Ｆ、Ｎ６７Ａ、Ｐ１７１Ｍ、Ａ７０Ｓ、Ｒ１５９Ｈ、Ｓ７６Ｑ、Ｌ１２５Ｖ、Ｇ５４Ｑ、Ｇ４９Ｌ、Ｒ１４Ｉ、Ｒ１４Ｑ、Ａ８３Ｉ、Ｖ９０Ｌ、Ｔ１８３Ｅ、Ｒ１５９Ａ、Ｔ１０１Ｓ、Ｇ６５Ｄ、Ｇ５４Ａ、Ｔ１０７Ｑ、Ｑ７１Ｍ、Ｔ８６Ｅ、Ｎ２４Ｍ、Ｎ５５Ｑ、Ｒ６１Ｖ、Ｐ１３４Ｄ、Ｒ９６Ｋ、Ａ８８Ｆ、Ｎ１４５Ｑ、Ａ６４Ｍ、Ａ６４Ｔ、Ｎ２４Ｖ、Ｓ１４０Ａ、Ａ８Ｈ、Ａ６４Ｉ、Ｒ１２３Ｑ、Ｔ１８３Ｑ、Ｎ２４Ｈ、Ａ６４Ｗ、Ｔ６２Ｉ、Ｔ１２９Ｇ、Ｒ３５Ａ、Ｔ４０Ｖ、Ｉ１１Ｔ、Ａ３８Ｎ、Ｎ１４５Ｇ、Ａ１７５Ｔ、Ｇ７７Ｑ、Ｔ１０９Ｈ、Ａ８Ｐ、Ｒ３５Ｅ、Ｔ１０９Ｎ、Ａ１１０Ｔ、Ｎ６７Ｑ、Ｇ６３Ｐ、Ｈ８５Ｒ、Ｓ９２Ｇ、Ａ１７５Ｖ、Ｓ５１Ｑ、Ｇ６３Ｑ、Ｔ１１６Ｆ、Ｇ６５Ａ、Ｒ７９Ｌ、Ｎ１４５Ｐ、Ｌ６９Ｑ、Ｑ１４６Ｄ、Ａ８３Ｄ、Ｆ１６６Ｙ、Ｒ１２３Ａ、Ｔ１２１Ｌ、Ｒ１２３Ｈ、Ａ７０Ｐ、Ｔ１８２Ｗ、Ｓ７６Ａ、Ａ６４Ｆ、Ｔ１０７Ｈ、Ｇ１８６Ｌ、Ｑ８１Ｉ、Ｒ１２３Ｋ、Ａ６４Ｌ、Ｎ６７Ｒ、Ｖ３Ｌ、Ｓ１８７Ｅ、Ｓ１６１Ｋ、Ｔ８６Ｍ、Ｉ４Ｍ、Ｇ７７Ｎ、Ｇ４９Ａ、Ａ４１Ｎ、Ｇ５４Ｍ、Ｔ１０７Ｖ、Ｑ８１Ｅ、Ａ３８Ｉ、Ｔ１０９Ｌ、Ｔ１８３Ｋ、Ａ７０Ｇ、Ｑ７１Ｄ、Ｔ１８３Ｌ、Ｑ８１Ｈ、Ａ６４Ｖ、Ａ９３Ｑ、Ｓ１８８Ｅ、Ｓ５１Ｆ、Ｇ１８６Ｐ、Ｇ１８６Ｔ、Ｒ１５９Ｌ、Ｐ１３４Ｇ、Ｎ１４５Ｔ、Ｎ５５Ｖ、Ｖ６６Ｅ、Ｒ１５９Ｖ、Ｙ１７６Ｌ、およびＲ１６Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３０】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｔ３６Ｉ、Ｎ７３Ｔ、Ｐ１３４Ｒ、Ｇ７７Ｔ、Ｎ２４Ｅ、Ｐ１３４Ｅ、Ｐ１３４Ｌ、Ｎ２４Ｔ、１５９Ｆ、Ｌ６９Ｓ、Ｔ１０Ｇ、Ｇ１８６Ｓ、Ｓ１４０Ａ、Ｔ３６Ｓ、Ｎ１１２Ｓ、Ｎ２４Ｑ、Ｔ３６Ｇ、Ｐ１３４Ｈ、Ｇ３４Ａ、Ｎ２４Ａ、Ａ３８Ｔ、Ｅ１１９Ｒ、Ｇ１８６Ｅ、Ｒ１４Ｍ、Ｓ７６Ｗ、Ｔ１０Ａ、Ａ３８Ｆ、Ｌ１４２Ｖ、Ｎ１７０Ｙ、Ｐ１３４Ｖ、Ａ２２Ｖ、Ｓ７６Ｖ、Ｔ１８２Ｖ、Ｓ７６Ｙ、Ｉ１１Ａ、Ｉ１１Ｓ、Ｓ１１８Ａ、Ｇ１８６Ｖ、Ｌ６９Ｈ、Ｉ１１Ｔ、Ｔ３６Ｎ、Ｇ６５Ｖ、Ｇ４９Ｆ、Ｖ９０Ｉ、Ｒ１７９Ｖ、Ｒ１６Ｋ、Ｔ１６３Ｉ、Ｒ１２７Ｆ、Ｒ１５９Ｋ、Ｎ２４Ｌ、Ｑ７１Ｉ、Ｓ１５Ｇ、Ｓ１５Ｆ、Ｒ１４Ｇ、Ｓ９９Ｎ、Ｔ１０Ｌ、Ｓ１５Ｅ、Ｔ１０７Ｒ、Ｆ１６６Ｙ、Ｇ４９Ａ、Ｖ９０Ｐ、Ｐ１３４Ｄ、Ｑ１６７Ｎ、Ｓ７６Ｄ、Ｓ５１Ａ、Ｖ８０Ａ、Ｖ１５０Ｌ、Ｎ７４Ｇ、Ｔ１０７Ｋ、Ｓ７６Ｌ、Ｎ２４Ｖ、Ｇ１２Ｉ、Ｓ９９Ｖ、およびＲ１６Ｎからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３１】
前記プロテアーゼのアミノ酸が、Ａｒｇ１４、Ｓｅｒ１５、Ａｒｇ１６、Ｃｙｓ１７、Ｈｉｓ３２、Ｃｙｓ３３、Ｐｈｅ５２、Ａｓｐ５６、Ｔｈｒ１００、Ｖａｌ１１５、Ｔｈｒ１１６、Ｔｙｒ１１７、Ｐｒｏ１１８、Ｇｌｕ１１９、Ａｌａ１３２、Ｇｌｕ１３３、Ｐｒｏ１３４、Ｇｌｙ１３５、Ａｓｐ１３６、Ｓｅｒ１３７、Ｔｈｒ１５１、Ｓｅｒ１５２、Ｇｌｙ１５３、Ｇｌｙ１５４、Ｓｅｒ１５５、Ｇｌｙ１５６、Ａｓｎ１５７、Ｔｈｒ１６４、およびＰｈｅ１６５を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３２】
前記プロテアーゼの触媒トリアッドがＨｉｓ３２、Ａｓｐ５６、およびＳｅｒ１３７を含むことを特徴とする請求項３１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３３】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｃｙｓ１３１、Ａｌａ１３２、Ｇｌｕ１３３、Ｐｒｏ１３４、Ｇｌｙ１３５、Ｔｈｒ１５１、Ｓｅｒ１５２、Ｇｌｙ１５３、Ｇｌｙ１５４、Ｓｅｒ１５５、Ｇｌｙ１５６、Ａｓｎ１５７およびＧｌｙ１６２、Ｔｈｒ１６３、およびＴｈｒ１６４を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３４】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｐｈｅ５２、Ｔｙｒ１１７、Ｐｒｏ１１８、およびＧｌｕ１１９を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３５】
前記プロテアーゼのアミノ酸配列が、Ｇｌｙ１５４から基質主鎖への主鎖−主鎖水素結合を有することを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３６】
前記プロテアーゼが、３つのジスルフィド結合を含むことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３７】
前記変異体が、野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べてその基質特性を変化させていることを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３８】
前記変異体が、野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べてｐＩを変化させていることを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３９】
前記変異体が、野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べて安定性を向上させていることを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項４０】
前記変異体が、変化した表面特性を示すことを特徴とする請求項１１に記載のプロテアーゼ。
【請求項４１】
前記変異体が、１、２、４、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２２、２４、２５、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５７、５９、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９５、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３７、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１７０、１７１、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、および１８４からなる群から選択された少なくとも１つの位置における置換変異を含むことを特徴とする請求項４０に記載のプロテアーゼ。
【請求項４２】
前記プロテアーゼが、野生型プロテアーゼと比べて少なくとも１つの向上した特性を有する変異体プロテアーゼであることを特徴とする請求項１に記載のプロテアーゼ。
【請求項４３】
前記少なくとも１つの向上した特性が、酸安定性、熱安定性、カゼイン加水分解、ケラチン加水分解、洗浄性能、およびＬＡＳ安定性からなる群から選択されることを特徴とする請求項４２に記載のプロテアーゼ。
【請求項４４】
請求項１１に記載のプロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４５】
請求項４４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４６】
前記宿主種細胞が、バチルス種（Bacillus sp.）、ストレプトマイセス種（Streptomyces sp.）、アスペルジルス種（Aspergillus sp.）、およびトリコデルマ種（Trichoderma sp.）からなる群から選択される請求項４５に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
請求項４６に記載の宿主細胞により生産されるセリンプロテアーゼ。
【請求項４８】
配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、および７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む変異体プロテアーゼ。
【請求項４９】
前記アミノ酸配列が、配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、および７７からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされることを特徴とする請求項４２に記載の変異体プロテアーゼ。
【請求項５０】
請求項４９に記載のプロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項５１】
請求項５０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５２】
前記宿主細胞が、バチルス種、ストレプトマイセス種、アスペルジルス種、およびトリコデルマ種からなる群から選択されることを特徴とする請求項５１に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
請求項５２に記載の宿主細胞により生産されるセリンプロテアーゼ。
【請求項５４】
前記プロテアーゼが、配列番号１、２、３、および４からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされることを特徴とする請求項１に記載の単離セリンプロテアーゼの少なくとも一部を含む組成物。
【請求項５５】
前記配列が配列番号１の少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項５４に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項５６】
請求項５５に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項５７】
請求項５６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５８】
前記宿主細胞が、バチルス種、ストレプトマイセス種、アスペルジルス種、およびトリコデルマ種からなる群から選択されることを特徴とする請求項５７に記載の宿主細胞。
【請求項５９】
請求項５８に記載の宿主細胞により生産されるセリンプロテアーゼ。
【請求項６０】
配列番号８におけるアミノ酸位置に相当する少なくとも１つの置換を含み、ケラチン加水分解、温度安定性、カゼイン活性、ＬＡＳ安定性、および洗浄能からなる群から選択される少なくとも一つの、野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べて優れた性能を有する変異体プロテアーゼ。
【請求項６１】
（ｉ）配列番号４と７０％以上の相同性を有する、または（ｉｉ）中程度から高度にストリンジェントな条件下で配列番号４で示されるヌクレオチド配列から誘導されるプローブを加水分解により生成することができるか、または（ｉｉｉ）配列番号４で示されるヌクレオチド配列に相補的である、ヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項６２】
請求項６１に記載のポリヌクレオチドをコードする発現ベクター。
【請求項６３】
請求項６２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項６４】
配列番号４に示される配列の少なくとも一部に相補的な配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６５】
プロテアーゼ活性を有する酵素を生産する方法であって、
（ａ）配列番号４と７０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主細胞を変異させる工程、
（ｂ）前記プロテアーゼを生産するために宿主細胞に好適な条件下で形質転換宿主細胞を培養する工程、および
（ｃ）前記プロテアーゼを回収する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６６】
前記宿主細胞が、ストレプトマイセス、アスペルジルス、トリコデルマ、およびバチルス種からなる群から選択されることを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
配列番号４の対応する断片に実質的に同等な４〜１５０のヌクレオチド配列を含むプローブであって、前記プローブは蛋白分解活性を有する酵素をコードする核酸配列を検出するために用いられ、および前記核酸配列はミクロコシニアエの構成種から得られことを特徴とするプローブ。
【請求項６８】
前記ミクロコシニアエがセルロモナス種であることを特徴とする請求項６７に記載のプローブ。
【請求項６９】
前記セルロモナスがセルロモナス株６９Ｂ４であることを特徴とする請求項６８に記載のプローブ。
【請求項７０】
ミクロコシニアエの構成種から得られる少なくとも１つのセリンプロテアーゼを含む洗浄組成物。
【請求項７１】
前記プロテアーゼが、セルロモナス、エルスコビア、セルロシミクロビウム、キシラニバクテリウム、およびプロミクロモノスポラからなる群から選択される生物体から得られるセリンプロテアーゼであることを特徴とする請求項７０に記載の洗浄組成物。
【請求項７２】
前記プロテアーゼがセルロモナス６９Ｂ４から得られることを特徴とする請求項７１に記載の洗浄組成物。
【請求項７３】
前記プロテアーゼが配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項７２に記載の洗浄組成物。
【請求項７４】
前記セリンプロテアーゼが配列番号８で示されるアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸相同性を含むことを特徴とする請求項７３に記載の洗浄組成物。
【請求項７５】
前記セリンプロテアーゼが請求項７０に記載のセリンプロテアーゼと免疫学的交叉反応性を有することを特徴とする洗浄組成物。
【請求項７６】
前記セリンプロテアーゼが請求項７２に記載のセリンプロテアーゼと免疫学的交叉反応性を有することを特徴とする洗浄組成物。
【請求項７７】
前記セリンプロテアーゼが、配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおける位置に均等な位置で生じる少なくとも１つのアミノ酸の置換を含むアミノ酸配列を有する変異体プロテアーゼであることを特徴とする請求項７０に記載の洗浄組成物。
【請求項７８】
前記置換が、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおいて位置２、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４０、４３、４６、４９、５１、５４、６１、６４、６５、６７、７０、７１、７６、７８、７９、８１、８３、８５、８６、９０、９３、９９、１００、１０５、１０７、１０９、１１２、１１３、１１６、１１８、１１９、１２１、１２３、１２７、１４５、１５５、１５９、１６０、１６３、１６５、１７０、１７４、１７９、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、および１８８と同等な位置で起こることを特徴とする請求項７７に記載の洗浄組成物。
【請求項７９】
前記置換は配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおいて位置１、４、２２、２７、２８、３０、３２、４１、４７、４８、５５、５９、６３、６６、６９、７５、７７、８０、８４、８７、８８、８９、９２、９６、１１０、１１１、１１４、１１５、１１７、１２８、１３４、１４４、１４３、１４６、１５１、１５４、１５６、１５８、１６１、１６６、１７６、１７７、１８１、１８２、１８７、および１８９と同等な位置で起こることを特徴とする請求項７７に記載の洗浄組成物。
【請求項８０】
前記プロテアーゼが、配列番号８で示されるものと同等なアミノ酸配列において位置１４、１６、３５、３６、６５、７５、７６、７９、１２３、１２７、１５９、および１７９における少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項７７に記載の洗浄組成物。
【請求項８１】
前記プロテアーゼが、Ｒ１４Ｌ、Ｒ１６Ｉ、Ｒ１６Ｌ、Ｒ１６Ｑ、Ｒ３５Ｆ、Ｔ３６Ｓ、Ｇ６５Ｑ、Ｙ７５Ｇ、Ｎ７６Ｌ、Ｎ７６Ｖ、Ｒ７９Ｔ、Ｒ１２３Ｌ、Ｒ１２３Ｑ、Ｒ１２７Ａ、Ｒ１２７Ｋ、Ｒ１２７Ｑ、Ｒ１５９Ｋ、Ｒ１５９Ｑ、およびＲ１７９Ｑからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含むことを特徴とする請求項８０に記載の洗浄組成物。
【請求項８２】
前記プロテアーゼが、組合せＲ１６Ｑ／Ｒ３５Ｆ／Ｒ１５９Ｑ、Ｒ１６Ｑ／Ｒ１２３Ｌ、Ｒ１４Ｌ／Ｒ１２７Ｑ／Ｒ１５９Ｑ、Ｒ１４Ｌ／Ｒ１７９Ｑ、Ｒ１２３Ｌ／Ｒ１２７Ｑ／Ｒ１７９Ｑ、Ｒ１６Ｑ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ１２７Ｑ、およびＲ１６Ｑ／Ｒ７９Ｔからなる群から選択される突然変異の組合せを含むことを特徴とする請求項８１に記載の洗浄組成物。
【請求項８３】
前記プロテアーゼが以下の突然変異Ｒ１２３Ｌ、Ｒ１２７Ｑ、およびＲ１７９Ｑを含むことを特徴とする請求項８１に記載の洗浄組成物。
【請求項８４】
前記変異体セリンプロテアーゼは配列番号８におけるアミノ酸位置に対応する少なくとも１つの置換を含み、および前記変異体プロテアーゼは野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べて、ケラチン加水分解、熱安定性、カゼイン活性、ＬＡＳ安定性、および洗浄からなる群から選択される少なくとも１つの特性において向上した性能を有することを特徴とする請求項８０に記載の洗浄組成物。
【請求項８５】
前記変異体プロテアーゼが、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、および７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項７０に記載の洗浄組成物。
【請求項８６】
前記変異体プロテアーゼのアミノ酸配列が、配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、および７７からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされることを特徴とする請求項７０に記載の洗浄組成物。
【請求項８７】
洗浄有効量の蛋白分解酵素を含む洗浄組成物であって、前記酵素が配列番号４と７０％以上の配列同等性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする洗浄組成物。
【請求項８８】
プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ（mannanases）、ペクチナーゼ、クチナーゼ（cutinases）、オキシドレダクターゼ、ヘミセルラーゼ、およびセルラーゼからなる群から選択される一つ以上の追加の酵素または酵素誘導体をさらに含むことを特徴とする請求項８７に記載の洗浄組成物。
【請求項８９】
請求項１に記載のセリンプロテアーゼおよび少なくとも１つの安定化剤を含む組成物。
【請求項９０】
前記安定化剤が、ボラックス（borax）、グリセロール、および競合阻害剤からなる群から選択されるむことを特徴とする請求項８９に記載の洗浄組成物。
【請求項９１】
前記競合阻害剤が、前記セリンプロテアーゼをアニオン性界面活性剤に安定化することを特徴とする請求項９０に記載の洗浄組成物。
【請求項９２】
前記セリンプロテアーゼが自己消化に安定な変異体であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９３】
請求項１に記載のセリンプロテアーゼを０．０００１重量％以上含み、任意に添加成分を含む洗浄組成物。
【請求項９４】
前記組成物が添加成分を含むことを特徴とする請求項９３に記載の洗浄組成物。
【請求項９５】
前記組成物が、約３から約５の実質ｐＨの組成物を提供するのに十分量のｐＨ調整剤を含み、ここで前記組成物が約３から約５のｐＨで加水分解する物質を実質的に含まないことを特徴とする請求項９３に記載の洗浄組成物。
【請求項９６】
前記加水分解する物質が界面活性化物質を含むことを特徴とする請求項９５に記載の洗浄組成物。
【請求項９７】
前記洗浄組成物が液体組成物であることを特徴とする請求項９５に記載の洗浄組成物。
【請求項９８】
前記界面活性化物質がエチレンオキサイド部分を含むアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤を含むことを特徴とする請求項９６に記載の洗浄組成物。
【請求項９９】
少なくとも１つの酸安定酵素を含む洗浄組成物であって、約３から約５の実質ｐＨの組成物を提供するのに十分量のｐＨ調整剤を含み、ここで前記組成物が約３から約５のｐＨで加水分解する物質を実質的に含まないことを特徴とする洗浄組成物。
【請求項１００】
前記加水分解する物質が界面活性化物質を含むことを特徴とする請求項９９に記載の洗浄組成物。
【請求項１０１】
前記洗浄組成物が液体組成物であることを特徴とする請求項９９に記載の洗浄組成物。
【請求項１０２】
前記界面活性化物質がエチレンオキサイド部分を含むアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤を含むことを特徴とする請求項９９に記載の洗浄組成物。
【請求項１０３】
前記組成物が好適な添加成分を含むことを特徴とする請求項９５に記載の洗浄組成物。
【請求項１０４】
前記組成物が好適な添加成分を含むことを特徴とする請求項９９に記載の洗浄組成物。
【請求項１０５】
前記組成物が約０．００１から約０．５重量％のＡＳＰを含むことを特徴とする請求項９５に記載の洗浄組成物。
【請求項１０６】
前記組成物が約０．０１から約０．１重量％のＡＳＰを含むことを特徴とする請求項１０５に記載の洗浄組成物。
【請求項１０７】
ａ）布地を含む表面および／または製品を、請求項９４に記載の洗浄組成物、および／または請求項９８に記載の洗浄組成物に接触させる工程、および
ｂ）任意に、前記表面または物質を洗浄および／またはすすぐ工程
を含む洗浄方法。
【請求項１０８】
ａ）布地を含む表面および／または製品を、請求項９９に記載の洗浄組成物、および／または請求項１００に記載の洗浄組成物に接触させる工程、および
ｂ）任意に、前記表面または物質を洗浄および／またはすすぐ工程
を含む洗浄方法。
【請求項１０９】
請求項１に記載のセリンプロテアーゼを含む動物飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００３年９月１９日に出願された審査中の米国仮特許出願第６０／５２３，６０９号について米国特許法第１１９条の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、新規なセリンプロテアーゼ、これらの酵素をコードする新規な遺伝子材料、およびセルロモナス類（Cellulomonas spp.）およびこれより開発された変異タンパク質を含むが、これらに限定されない類を含むミクロコシニアエ類（Micrococcineae spp.）から得られる蛋白分解性タンパク質を提供する。特に、本発明は、セルロモナス類から得られたプロテアーゼ組成物、該プロテアーゼをコードするＤＮＡ、該プロテアーゼをコードするＤＮＡを含むベクター、該ベクターＤＮＡで変異させた宿主細胞、および該宿主細胞で生産された酵素を提供する。また、本発明は、セルロモナス類（Cellulomonas spp.）を含むが、これらに限定されない類を含むミクロコシニアエ類（Micrococcineae spp.）から得られるプロテアーゼを含む、洗浄組成物（例えば、界面活性剤組成物）、動物食餌組成物、および織物および皮革の加工用組成物を提供する。選択的な態様において、本発明は、ここで記載された野生型プロテアーゼに由来するミュータント（すなわち、変異）プロテアーゼを提供する。これらのミュータント・プロテアーゼも多くの応用に用いられる。
【背景技術】
【０００３】
セリンプロテアーゼは、広範囲な特性および生物学的機能を有する多様なクラスの酵素を含むカルボニル・ヒドロラーゼのサブ・グループである（例えば、ストラウド（Stroud）著、Sci. Amer.、１３１巻、７７〜８８頁を参照）。その機能的多様性にも拘わらず、セリンプロテアーゼの触媒機構は少なくとも２つの遺伝的に異なる属の酵素により研究されてきた。これらの酵素は、１）サブチリシン（subtilisins）、２）哺乳類キモトリプシン関連および同属の細菌セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシンおよびグリセウス（griseus）トリプシン）である。これらの２つのセリンプロテアーゼ属は極めて類似の触媒機構を示す（例えば、クラウト（Kraut）著、Ann. Rev. Biochem.、４６巻、３３１〜３５８頁、１９７７年）。さらに、一次構造は関連ないが、これら２つの酵素属の三次構造は、触媒性の保存されたセリン、ヒスチジン、およびアスパラギン酸からなるアミノ酸のトリアッドをともに有する。サブチリシンおよびキモトリプシン関連セリンプロテアーゼはともにアスパラギン酸を含む触媒性トリアッドを有する。サブシチリシン関連プロテア−ゼにおいて、アミノ末端からカルボキシ末端へ読むと相対配列はアスパラギン酸−ヒスチジン−セリンである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、キモトリプシン関連プロテア−ゼにおいて、相対配列はヒスチジン−アスパラギン酸−セリンである。主に洗浄および食餌におけるその有用性のために多くの研究がサブチリシンについて行われてきている。更に、様々な応用においてこれらの酵素機能に逆影響を与えることができる逆環境条件（例えば、酸化剤、キレ−ト剤、温度および／またはｐＨの極値）についての研究が行われてきている。これにも拘らず、従来技術で現在知られているものを超えてこれらの逆環境に耐え、改善された活性を保持または有する酵素系への必要性が課題とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、新規なセリンプロテアーゼ、これらの酵素をコードする新規な遺伝子材料、およびセルロモナス類（Cellulomonas spp.）およびこれより開発された変異タンパク質を含むが、これらに限定されない類を含むミクロコシニアエ類（Micrococcineae spp.）から得られる蛋白分解性タンパク質を提供する。特に、本発明は、セルロモナス類から得られたプロテアーゼ組成物、該プロテアーゼをコードするＤＮＡ、該プロテアーゼをコードするＤＮＡを含むベクター、該ベクターＤＮＡで変異させた宿主細胞、および該宿主細胞で生産された酵素を提供する。また、本発明は、セルロモナス類（Cellulomonas spp.）を含むが、これらに限定されない類を含むミクロコシニアエ類（Micrococcineae spp.）から得られるプロテアーゼを含む、洗浄組成物（例えば、界面活性剤組成物）、動物食餌組成物、および織物および皮革の加工用組成物を提供する。選択的な態様において、本発明は、ここで記載された野生型プロテアーゼに由来するミュータント（すなわち、変異）プロテアーゼを提供する。これらのミュータント・プロテアーゼも多くの応用に用いられる。
【０００６】
本発明は、ミクロコシニアエ類の仲間から得られた単離されたセリンプロテアーゼを提供する。ある態様において、プロテアーゼはセルロモナジン（cellulomonadins）である。ある好ましい態様において、プロテアーゼはセルロモナス（cellulomonas）、オエルスコビア（Oerskovia）、セルロシミクロビウム（cellulosimicrobium）、キシラニバクテリウム（Xylanibacterium）、およびプロミクロモノスポラ（Promicromonospora）で構成される群のなかから選択される微生物から得られる。ある特に好ましい態様において、プロテアーゼはセルロモナス６９Ｂ４から得られる。更なる態様において、プロテアーゼは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む。更なる態様において、本発明は、配列番号８を含むセリンプロテアーゼと少なくとも４５％の同等性を含む単離セリンプロテアーゼを提供する。ある態様において、単離セリンプロテアーゼは、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも６５％、更により好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、更により好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％、更により好ましくは９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の同等性を有する。
【０００７】
また本発明は、ミクロコシニアエ類から得られたセリンプロテアーゼと免疫交叉性を有する単離セリンプロテアーゼを含む組成物を提供する。ある好ましい態様において、前記セリンプロテアーゼはセルロモナス６９Ｂ４から得られたセリンプロテアーゼと免疫交叉性を有する。選択的な態様において、前記セリンプロテアーゼは配列番号８で示されるアミノ酸を含むセリンプロテアーゼと免疫交叉性を有する。更なる態様において、前記セリンプロテアーゼはミクロコシニアエ類、セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼ、および／または配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むセリンプロテアーゼから得られたいずれか任意のセリンプロテアーゼの断片（すなわち、部位）と免疫交叉性を有する。
【０００８】
ある態様において、本発明は配列番号８で示されるアミノ酸配列を提供する。ここで前記配列は、２，８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４０、４３、４６、４９、５１、５４、６１、６４、６５、６７、７０、７１、７６、７８、７９、８１、８３、８５、８６、９０、９３、９９、１００、１０５、１０７、１０９、１１２、１１３、１１６、１１８、１１９、１２１、１２３、１２７、１４５、１５５、１５９、１６０、１６３、１６５、１７０、１７４、１７９、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、および１８８位を含む群から選択される少なくとも一つのアミノ酸の位置における置換を含む。選択的な態様において、前記配列は、１、４、２２、２７、２８、３０、３２、４１、４７、４８、５５、５９、６３、６６、６９、７５、７７、８０、８４、８７、８８、８９、９２、９６、１１０、１１１、１１４、１１５、１１７、１２８、１３４、１４４、１４３、１４６、１５１、１５４、１５６、１５８、１６１、１６６、１７６、１７７、１８１、１８２、１８７、および１８９位を含む群から選択される少なくとも一つのアミノ酸の位置における置換を含む。
【０００９】
ある好ましい態様において、本発明は配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおける位置と同様な位置におけるアミノ酸の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有するプロテアーゼ変異体を提供する。選択的な態様において、本発明は配列番号８の少なくとも一部分を含むセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおける位置と同様な位置におけるアミノ酸の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有するプロテアーゼ変異体を提供する。ある態様において、前記置換は配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおける２，８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４０、４３、４６、４９、５１、５４、６１、６４、６５、６７、７０、７１、７６、７８、７９、８１、８３、８５、８６、９０、９３、９９、１００、１０５、１０７、１０９、１１２、１１３、１１６、１１８、１１９、１２１、１２３、１２７、１４５、１５５、１５９、１６０、１６３、１６５、１７０、１７４、１７９、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、および１８８位と同様な位置における置換である。選択的な態様において、前記置換は配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおける１、４、２２、２７、２８、３０、３２、４１、４７、４８、５５、５９、６３、６６、６９、７５、７７、８０、８４、８７、８８、８９、９２、９６、１１０、１１１、１１４、１１５、１１７、１２８、１３４、１４４、１４３、１４６、１５１、１５４、１５６、１５８、１６１、１６６、１７６、１７７、１８１、１８２、１８７、および１８９位と同様な位置における置換である。ある好ましい態様において、配列番号８を含むアミノ酸配列を含む前記プロテアーゼ変異体は、１４、１６、３５、３６、６５、７５、７６、７９、１２３、１２７、１５９、および１７９からなる群から選択される位置における少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている。ある特に好ましい態様において、前記プロテアーゼはＲ１４Ｌ、Ｒ１６Ｉ、Ｒ１６Ｌ、Ｒ１６Ｑ、Ｒ３５Ｆ、Ｔ３６Ｓ、Ｇ６５Ｑ、Ｙ７５Ｇ、Ｎ７６Ｌ、Ｎ７６Ｖ、Ｒ７９Ｔ、Ｒ１２３Ｌ、Ｒ１２３Ｑ、Ｒ１２７Ａ、Ｒ１２７Ｋ、Ｒ１２７Ｑ、Ｒ１５９Ｋ、Ｒ１５９Ｑ、およびＲ１７９Ｑからなる群から選択される少なくとも一つの変異含む。ある選択的な好ましい態様において、前記プロテアーゼはＲ１６Ｑ／Ｒ３５Ｆ／Ｒ１５９Ｑ、Ｒ１６Ｑ／Ｒ１２３Ｌ、Ｒ１４Ｌ／Ｒ１２７Ｑ／Ｒ１５９Ｑ、Ｒ１４Ｌ／Ｒ１７９Ｑ、Ｒ１２３Ｌ／Ｒ１２７Ｑ／Ｒ１７９Ｑ、Ｒ１６Ｑ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ１２７Ｑ、およびＲ１６Ｑ／Ｒ７９Ｔからなる群から選択される多変異を含む。ある特に好ましい態様において、前記プロテアーゼは以下に示すＲ１２３Ｌ、Ｒ１２７Ｑ、およびＲ１７９Ｑ変異を含む。
【００１０】
また本発明は、Ｔ３６Ｉ、Ａ３８Ｒ、Ｎ１７０Ｙ、Ｎ７３Ｔ、Ｇ７７Ｔ、Ｎ２４Ａ、Ｔ３６Ｇ、Ｎ２４Ｅ、Ｌ６９Ｓ、Ｔ３６Ｎ、Ｔ３６Ｓ、Ｅ１１９Ｒ、Ｎ７４Ｇ、Ｔ３６Ｗ、Ｓ７６Ｗ、Ｎ２４Ｔ、Ｎ２４Ｑ、Ｔ３６Ｐ、Ｓ７６Ｙ、Ｔ３６Ｈ、Ｇ５４Ｄ、Ｇ７８Ａ、Ｓ１８７Ｐ、Ｒ１７９Ｖ、Ｎ２４Ｖ、Ｖ９０Ｐ、Ｔ３６Ｄ、Ｌ６９Ｈ、Ｇ６５Ｐ、Ｇ６５Ｒ、Ｎ７Ｌ、Ｗ１０３Ｍ、Ｎ５５Ｆ、Ｇ１８６Ｅ、Ａ７０Ｈ、Ｓ７６Ｖ、Ｇ１８６Ｖ、Ｒ１５９Ｆ、Ｔ３６Ｙ、Ｔ３６Ｖ、Ｇ６５Ｖ、Ｎ２４Ｍ、Ｓ５１Ａ、Ｇ６５Ｙ、Ｑ７１Ｉ、Ｖ６６Ｈ、Ｐ１１８Ａ、Ｔ１１６Ｆ、Ａ３８Ｆ、Ｎ２４Ｈ、Ｖ６６Ｄ、Ｓ７６Ｌ、Ｇ１７７Ｍ、Ｇ１８６Ｉ、Ｈ８５Ｑ、Ｑ７１Ｋ、Ｑ７１Ｇ、Ｇ６５Ｓ、Ａ３８Ｄ、Ｐ１１８Ｆ、Ａ３８Ｓ、Ｇ６５Ｔ、Ｎ６７Ｇ、Ｔ３６Ｒ、Ｐ１１８Ｒ、Ｓ１１４Ｇ、Ｙ７５Ｉ、Ｉ１８１Ｈ、Ｇ６５Ｑ、Ｙ７５Ｇ、Ｔ３６Ｆ、Ａ３８Ｈ、Ｒ１７９Ｍ、Ｔ１８３Ｉ、Ｇ７８Ｓ、Ａ６４Ｗ、Ｙ７５Ｆ、Ｇ７７Ｓ、Ｎ２４Ｌ、Ｗ１０３Ｉ、Ｖ３Ｌ、Ｑ８１Ｖ、Ｒ１７９Ｄ、Ｇ５４Ｒ、Ｔ３６Ｌ、Ｑ７１Ｍ、Ａ７０Ｓ、Ｇ４９Ｆ、Ｇ５４Ｌ、Ｇ５４Ｈ、Ｇ７８Ｈ、Ｒ１７９Ｉ、Ｑ８１Ｋ、Ｖ９０Ｉ、Ａ３８Ｌ、Ｎ６７Ｌ、Ｔ１０９Ｉ、Ｒ１７９Ｎ、Ｖ６６Ｉ、Ｇ７８Ｔ、Ｒ１７９Ｙ、Ｓ１８７Ｔ、Ｎ６７Ｋ、Ｎ７３Ｓ、Ｅ１１９Ｋ、Ｖ３Ｉ、Ｑ７１Ｈ、Ｉ１１Ｑ、Ａ６４Ｈ、Ｒ１４Ｅ、Ｒ１７９Ｔ、Ｌ６９Ｖ、Ｖ１５０Ｌ、Ｑ７１Ａ、Ｇ６５Ｌ、Ｑ７１Ｎ、Ｖ９０Ｓ、Ａ６４Ｎ、Ｉ１１Ａ、Ｎ１４５Ｉ、Ｈ８５Ｔ、Ａ６４Ｙ、Ｎ１４５Ｑ、Ｖ６６Ｌ、Ｓ９２Ｇ、Ｓ１８８Ｍ、Ｇ７８Ｄ、Ｎ６７Ａ、Ｎ７Ｓ、Ｖ８０Ｈ、Ｇ５４Ｋ、Ａ７０Ｄ、Ｐ１１８Ｈ、Ｄ２Ｇ、Ｇ５４Ｍ、Ｑ８１Ｈ、Ｄ２Ｑ、Ｖ６６Ｅ、Ｒ７９Ｐ、Ａ３８Ｎ、Ｎ１４５Ｅ、Ｒ１７９Ｌ、Ｔ１０９Ｈ、Ｒ１７９Ｋ、Ｖ６６Ａ、Ｇ５４Ａ、Ｇ７８Ｎ、Ｔ１０９Ａ、Ｒ１７９Ａ、Ｎ７Ａ、Ｒ１７９Ｅ、Ｈ１０４Ｋ、Ａ６４Ｒ、およびＶ８０Ｌからなる群から選択される少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を有するプロテアーゼ変異体も提供する。さらなる態様において、前記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、Ｈ８５Ｒ、Ｈ８５Ｌ、Ｔ６２Ｉ、Ｎ６７Ｈ、Ｇ５４Ｉ、Ｎ２４Ｆ、Ｔ４０Ｖ、Ｔ８６Ａ、Ｇ６３Ｖ、Ｇ５４Ｑ、Ａ６４Ｆ、Ｇ７７Ｙ、Ｒ３５Ｆ、Ｔ１２９Ｓ、Ｒ６１Ｍ、Ｉ１２６Ｌ、Ｓ７６Ｎ、Ｔ１８２Ｖ、Ｒ７９Ｇ、Ｔ１０９Ｐ、Ｒ１２７Ｆ、Ｒ１２３Ｅ、Ｐ１１８Ｉ、Ｔ１０９Ｒ、１７１Ｓ、Ｔ１８３Ｋ、Ｎ６７Ｔ、Ｐ８９Ｎ、Ｆ１Ｔ、Ａ６４Ｋ、Ｇ７８Ｉ、Ｔ１０９Ｌ、Ｇ７８Ｖ、Ａ６４Ｍ、Ａ６４Ｓ、Ｔ１０Ｇ、Ｇ７７Ｎ、Ａ６４Ｌ、Ｎ６７Ｄ、Ｓ７６Ｔ、Ｎ４２Ｈ、Ｄ１８４Ｆ、Ｄ１８４Ｒ、Ｓ７６Ｉ、Ｓ７８Ｒ、Ａ３８Ｋ、Ｖ７２Ｉ、Ｖ３Ｔ、Ｔ１０７Ｓ、Ａ３８Ｖ、Ｆ４７Ｉ、Ｎ５５Ｑ、Ｓ７６Ｅ、Ｐ１１８Ｑ、Ｔ１０９Ｇ、Ｑ７１Ｄ、Ｐ１１８Ｋ、Ｎ６７Ｓ、Ｑ１６７Ｎ、Ｎ１４５Ｇ、Ｉ２８Ｌ、Ｉ１１Ｔ、Ａ６４Ｉ、Ｇ４９Ｋ、Ｇ４９Ａ、Ｇ６５Ａ、Ｎ１７０Ｄ、Ｈ８５Ｋ、Ｓ１８５Ｉ、Ｉ１８１Ｎ、Ｖ８０Ｆ、Ｌ６９Ｗ、Ｓ７６Ｒ、Ｄ１８４Ｈ、Ｖ１５０Ｍ、Ｔ１８３Ｍ、Ｎ６７Ｑ、Ｓ５１Ｑ、Ａ３８Ｙ、Ｔ１０７Ｖ、Ｎ１４５Ｔ、Ｑ７１Ｆ、Ａ８３Ｎ、Ｓ７６Ａ、Ｎ６７Ｒ、Ｔ１５１Ｌ、Ｔ１６３Ｌ、Ｓ５１Ｆ、Ｑ８１Ｉ、Ｆ４７Ｍ、Ａ４１Ｎ、Ｐ１１８Ｅ、Ｎ６７Ｙ、Ｔ１０７Ｍ、Ｎ７３Ｈ、６７Ｖ、Ｇ６３Ｗ、Ｔ１０Ｋ、Ｉ１８１Ｇ、Ｓ１８７Ｅ、Ｔ１０７Ｈ、Ｄ２Ａ、Ｌ１４２Ｖ、Ａ１４３Ｎ、Ａ８Ｇ、Ｓ１８７Ｌ、Ｖ９０Ａ、Ｇ４９Ｌ、Ｎ１７０Ｌ、Ｇ６５Ｈ、Ｔ３６Ｃ、Ｇ１２Ｗ、Ｓ７６Ｑ、Ａ１４３Ｓ、Ｆ１Ａ、Ｎ７Ｈ、Ｓ１８５Ｖ、Ａ１１０Ｔ、Ｎ５５Ｋ、Ｎ６７Ｆ、Ｎ７Ｉ、Ａ１１０Ｓ、Ｎ１７０Ａ、Ｑ８１Ｄ、Ａ６４Ｑ、Ｑ７１Ｌ、Ａ３８Ｉ、Ｎ１１２Ｉ、Ｖ９０Ｔ、Ｎ１４５Ｌ、Ａ６４Ｔ、Ｉ１１Ｓ、Ａ３０Ｓ、Ｒ１２３Ｉ、Ｄ２Ｈ、Ｖ６６Ｍ、Ｑ７１Ｒ、Ｖ９０Ｌ、Ｌ６８Ｗ、Ｎ２４Ｓ、Ｒ１５９Ｅ、Ｖ６６Ｎ、Ｄ１８４Ｑ、Ｅ１３３Ｑ、Ａ６４Ｖ、Ｄ２Ｎ、Ｇ１３Ｍ、Ｔ４０Ｓ、Ｓ７６Ｋ、Ｇ１７７Ｓ、Ｇ６３Ｑ、Ｓ１５Ｆ、Ａ８Ｋ、Ａ７０Ｇ、およびＡ３８Ｇからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む。ある好ましい態様において、これらの変異体は野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べてカゼイン加水分解能を向上させている。
【００１１】
また本発明は、Ｒ３５Ｅ、Ｒ３５Ｄ、Ｒ１４Ｅ、Ｒ１４Ｄ、Ｑ１６７Ｅ、Ｇ４９Ｃ、Ｓ１５Ｒ、Ｓ１５Ｈ、Ｉ１１Ｗ、Ｓ１５Ｃ、Ｇ４９Ｑ、Ｒ３５Ｑ、Ｒ３５Ｖ、Ｇ４９Ｅ、Ｒ１２３Ｄ、Ｒ１２３Ｙ、Ｇ４９Ｈ、Ａ３８Ｄ、Ｒ３５Ｓ、Ｆ４７Ｒ、Ｒ１２３Ｃ、Ｔ１５１Ｌ、Ｒ１４Ｔ、Ｒ３５Ｔ、Ｒ１２３Ｅ、Ｇ４９Ａ、Ｇ４９Ｖ、Ｄ５６Ｌ、Ｒ３５Ｎ、Ｒ３５Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｒ３５Ｃ、Ｒ１２３Ｎ、Ｔ４６Ｖ、Ｒ１２３Ｈ、Ｓ１５５Ｃ、Ｔ１２１Ｅ、Ｒ１２７Ｅ、Ｓ１１３Ｃ、Ｒ１２３Ｔ、Ｒ１６Ｅ、Ｔ４６Ｆ、Ｔ１２１Ｌ、Ａ３８Ｃ、Ｔ４６Ｅ、Ｒ１２３Ｗ、Ｔ４４Ｅ、Ｎ５５Ｇ、Ａ８Ｇ、Ｅ１１９Ｇ、Ｒ３５Ｐ、Ｒ１４Ｇ、Ｆ５９Ｗ、Ｒ１２７Ｓ、Ｒ６１Ｅ、Ｒ１４Ｓ、Ｓ１５５Ｗ、Ｒ１２３Ｆ、Ｒ１２３Ｓ、Ｇ４９Ｎ、Ｒ１２７Ｄ、Ｅ１１９Ｙ、Ａ４８Ｅ、Ｎ１７０Ｄ、Ｒ１５９Ｔ、Ｓ９９Ａ、Ｇ１２Ｑ、Ｐ１１８Ｒ、Ｆ１６５Ｗ、Ｒ１２７Ｑ、Ｒ３５Ｈ、Ｇ１２Ｎ、Ａ２２Ｃ、Ｇ１２Ｖ、Ｒ１６Ｔ、Ｙ５７Ｇ、Ｔ１００Ａ、Ｔ４６Ｙ、Ｒ１５９Ｅ、Ｅ１１９Ｒ、Ｔ１０７Ｒ、Ｔ１５１Ｃ、Ｇ５４Ｃ、Ｅ１１９Ｔ、Ｒ６１Ｖ、Ｉ１１Ｅ、Ｒ１４Ｉ、Ｒ６１Ｍ、Ｓ１５Ｅ、Ａ２２Ｓ、Ｒ１６Ｃ、Ｔ３６Ｃ、Ｒ１６Ｖ、Ｌ１２５Ｑ、Ｍ１８０Ｌ、Ｒ１２３Ｑ、Ｒ１４Ａ、Ｒ１４Ｑ、Ｒ３５Ｍ、Ｒ１２７Ｋ、Ｒ１５９Ｑ、Ｎ１１２Ｐ、Ｇ１２４Ｄ、Ｒ１７９Ｅ、Ｇ４９Ｌ、Ａ４１Ｄ、Ｇ１７７Ｄ、Ｒ１２３Ｖ、Ｅ１１９Ｖ、Ｔ１０Ｌ、Ｔ１０９Ｅ、Ｒ１７９Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｔ１０Ｃ、Ｇ９１Ｑ、Ｓ１５Ｙ、Ｓ１５５Ｙ、Ｒ１４Ｃ、Ｔ１６３Ｄ、Ｔ１２１Ｆ、Ｒ１４Ｎ、Ｆ１６５Ｅ、Ｎ２４Ｅ、Ａ４１Ｃ、Ｒ６１Ｔ、Ｇ１２Ｉ、Ｐ１１８Ｋ、Ｔ４６Ｃ、Ｉ１１Ｔ、Ｒ１５９Ｄ、Ｎ１７０Ｃ、Ｒ１５９Ｖ、Ｓ１５５Ｉ、Ｉ１１Ｑ、Ｄ２Ｐ、Ｔ１００Ｒ、Ｒ１５９Ｓ、Ｓ１１４Ｃ、Ｒ１６Ｄ、およびＰ１３４Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有するプロテアーゼ変異体を提供する。選択的な態様において、前記プロテアーゼ変異体は、Ｓ９９Ｇ、Ｔ１００Ｋ、Ｒ１２７Ａ、Ｆ１Ｐ、Ｓ１５５Ｖ、Ｔ１２８Ａ、Ｆ１６５Ｈ、Ｇ１７７Ｅ、Ａ７０Ｍ、Ｓ１４０Ｐ、Ａ８７Ｅ、Ｄ２Ｉ、Ｒ１５９Ｋ、Ｔ３６Ｖ、Ｒ１７９Ｃ、Ｅ１１９Ｎ、Ｔ１０Ｙ、Ｉ１７２Ａ、Ａ８Ｔ、Ｆ４７Ｖ、Ｗ１０３Ｌ、Ｒ６１Ｋ、Ｄ２Ｖ、Ｒ１７９Ｖ、Ｄ２Ｔ、Ｒ１５９Ｎ、Ｅ１１９Ａ、Ｇ５４Ｅ、Ｒ１６Ｑ、Ｇ４９Ｓ、Ｒ１６Ｉ、Ｓ５１Ｌ、Ｓ１５５Ｅ、Ｓ１５Ｍ、Ｒ１７９Ｉ、Ｔ１０Ｑ、Ｇ１２Ｈ、Ｒ１５９Ｃ、Ｒ１７９Ｔ、Ｔ１６３Ｃ、Ｒ１５９Ａ、Ａ１３２Ｓ、Ｎ１５７Ｄ、Ｇ１３Ｅ、Ｌ１４１Ｍ、Ａ４１Ｔ、Ｒ１２３Ｍ、Ｒ１４Ｍ、Ａ８Ｒ、Ｑ８１Ｐ、Ｎ２４Ｔ、Ｔ１０Ｄ、Ａ８８Ｆ、Ｒ６１Ｑ、Ｓ９９Ｋ、Ｒ１７９Ｙ、Ｔ１２１Ａ、Ｎ１１２Ｅ、Ｓ１５５Ｔ、Ｔ１５１Ｖ、Ｓ９９Ｑ、Ｔ１０Ｅ、Ｓ９２Ｔ、Ｔ１０９Ｋ、Ｔ４４Ｃ、Ｒ１２３Ａ、Ａ８７Ｃ、Ｓ１５Ｆ、Ｓ１５５Ｆ、Ｄ５６Ｆ、Ｔ１０Ｆ、Ａ８３Ｈ、Ｒ１７９Ｈ、Ｔ１２１Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ｐ１１８Ｃ、Ｇ４９Ｆ、Ｑ１７４Ｃ、Ｓ１１４Ｅ、Ｔ８６Ｅ、Ｆ１Ｎ、Ｔ１１５Ｃ、Ｒ１２７Ｃ、Ｒ１２３Ｋ、Ｖ６６Ｎ、Ｇ１２Ｙ、Ｓ１１３Ａ、Ｓ１５Ｎ、Ａ１７５Ｔ、Ｒ７９Ｔ、Ｒ１２３Ｇ、Ｒ１７９Ｓ、Ｒ１７９Ｎ、Ｒ１２３Ｉ、Ｐ１１８Ａ、Ｓ１８７Ｅ、Ｎ１１２Ｄ、Ａ７０Ｇ、Ｅ１１９Ｌ、Ｅ１１９Ｓ、Ｒ１５９Ｍ、Ｒ１４Ｈ、Ｒ１７９Ｆ、Ａ６４Ｃ、Ａ４１Ｓ、Ｒ１７９Ｗ、Ｎ２４Ｇ、Ｔ１００Ｑ、Ｐ１１８Ｗ、Ｑ８１Ｇ、Ｇ４９Ｋ、Ｒ１４Ｌ、Ｎ５５Ａ、Ｒ３５Ｋ、Ｒ７９Ｖ、Ｄ２Ｍ、Ｔ１６０Ｄ、Ａ８３Ｄ、Ｒ１７９Ｌ、Ｓ５１Ａ、Ｇ１２Ｐ、Ｓ９９Ｈ、Ｎ４２Ｄ、Ｓ１８８Ｅ、Ｔ１０Ｍ、Ｌ１２５Ｍ、Ｔ１１６Ｎ、Ａ７０Ｐ、Ｑ１７４Ｓ、Ｇ６５Ｄ、Ｓ１１３Ｄ、Ｅ１１９Ｑ、Ａ８３Ｅ、Ｎ１７０Ｌ、Ｑ８１Ａ、Ｓ５１Ｃ、Ｐ１１８Ｇ、Ｑ１７４Ｔ、Ｉ２８Ｖ、Ｓ１５Ｇ、およびＴ１１６Ｇからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む。ある好ましい態様において、これらの変異体は野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べてＬＡＳ安定性を向上させている。
【００１２】
また本発明は、Ｇ２６Ｉ、Ｇ２６Ｋ、Ｇ２６Ｑ、Ｇ２６Ｖ、Ｇ２６Ｗ、Ｆ２７Ｖ、Ｆ２７Ｗ、Ｉ２８Ｐ、Ｔ２９Ｅ、Ｔ１２９Ｗ、Ｔ４０Ｄ、Ｔ４０Ｑ、Ｒ４３Ｄ、Ｐ４３Ｈ、Ｐ４３Ｋ、Ｐ４３Ｌ、Ａ２２Ｃ、Ｔ４０Ｈ、Ｐ８９Ｗ、Ｇ９１Ｌ、Ｓ１８Ｅ、Ｆ５９Ｋ、Ａ３０Ｍ、Ａ３０Ｎ、Ｇ３１Ｍ、Ｃ３３Ｍ、Ｇ１６１Ｌ、Ｇ１６１Ｖ、Ｐ４３Ｎ、Ｇ２６Ｅ、Ｎ７３Ｐ、Ｇ８４Ｃ、Ｇ８４Ｐ、Ｇ４５Ｖ、Ｃ３３Ｌ、Ｙ９Ｅ、Ｙ９Ｐ、Ａ１４７Ｅ、Ｃ１５８Ｈ、Ｉ２８Ｗ、Ａ４８Ｐ、Ａ２２Ｓ、Ｔ６２Ｒ、Ｓ１３７Ｒ、Ｓ１５５Ｐ、Ｓ１５５Ｒ、Ｇ１５６Ｉ、Ｇ１５６Ｌ、Ｑ８１Ａ、Ｒ９６Ｃ、Ｉ４Ｄ、Ｉ４Ｐ、Ａ７０Ｐ、Ｃ１０５Ｅ、Ｃ１０５Ｇ、Ｃ１０５Ｋ、Ｃ１０５Ｍ、Ｃ１０５Ｎ、Ｃ１０５Ｓ、Ｔ１２８Ａ、Ｔ１２８Ｖ、Ｔ１２８Ｇ、Ｓ１４０Ｐ、Ｇ１２Ｄ、Ｃ３３Ｎ、Ｃ３３Ｅ、Ｔ１６４Ｇ、Ｇ４５Ａ、Ｇ１５６Ｐ、Ｓ９９Ａ、Ｑ１６７Ｌ、Ｓ１５５Ｗ、Ｉ２８Ｔ、Ｒ９６Ｆ、Ａ３０Ｐ、Ｒ１２３Ｗ、Ｔ４０Ｐ、Ｔ３９Ｒ、Ｃ１０５Ｐ、Ｔ１００Ａ、Ｃ１０５Ｗ、Ｓ１５５Ｋ、Ｔ４６Ｙ、Ｒ１２３Ｆ、Ｉ４Ｇ、Ｓ１５５Ｙ、Ｔ４６Ｖ、Ａ９３Ｓ、Ｙ５７Ｎ、Ｑ８１Ｓ、Ｇ１８６Ｓ、Ｇ３１Ｈ、Ｔ１０Ｙ、Ｇ３１Ｖ、Ａ８３Ｈ、Ａ３８Ｄ、Ｒ１２３Ｙ、Ｒ７９Ｔ、Ｃ１５８Ｇ、Ｇ３１Ｙ、Ｑ８１Ｐ、Ｒ９６Ｅ、Ａ３０Ｙ、Ｒ１５９Ｋ、Ａ２２Ｔ、Ｔ４０Ｎ、Ｙ５７Ｍ、Ｇ３１Ｎ、Ｑ８１Ｇ、Ｔ１６４Ｌ、Ｔ１２１Ｅ、Ｔ１０Ｆ、Ｑ１４６Ｐ、Ｒ１２３Ｎ、Ｖ３Ｒ、Ｐ４３Ｇ、Ｑ８１Ｈ、Ｑ８１Ｄ、Ｇ１６１Ｉ、Ｃ１５８Ｍ、Ｎ２４Ｔ、Ｔ１０Ｗ、Ｔ１２８Ｓ、Ｔ１６０Ｉ、Ｙ１７６Ｐ、Ｓ１５５Ｆ、Ｔ１２８Ｃ、Ｌ１２５Ａ、Ｐ１６８Ｙ、Ｔ６２Ｇ、Ｆ１６６Ｓ、Ｓ１８８Ａ、Ｑ８１Ｆ、Ｔ４６Ｗ、Ａ７０Ｇ、およびＡ３８Ｇからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有するプロテアーゼ変異体を提供する。選択的な態様において、前記プロテアーゼ変異体は、Ｓ１８８Ｅ、Ｓ１８８Ｖ、Ｙ１１７Ｋ、Ｙ１１７Ｑ、Ｙ１１７Ｒ、Ｙ１１７Ｖ、Ｒ１２７Ｋ、Ｒ１２７Ｑ、Ｒ１２３Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｒ１２３Ｉ、Ｑ８１Ｅ、Ｌ１２５Ｍ、Ｈ３２Ａ、Ｓ１８８Ｔ、Ｎ７４Ｆ、Ｃ３３Ｄ、Ｆ２７Ｉ、Ａ８３Ｍ、Ｑ７１Ｙ、Ｒ１２３Ｔ、Ｖ９０Ａ、Ｆ５９Ｗ、Ｌ１４１Ｃ、Ｎ１７０Ｅ、Ｔ４６Ｆ、Ｓ５１Ｖ、Ｇ１６２Ｐ、Ｓ１８５Ｒ、Ａ４１Ｓ、Ｒ７９Ｖ、Ｔ１５１Ｃ、Ｔ１０７Ｓ、Ｔ１２９Ｙ、Ｍ１８０Ｌ、Ｆ１６６Ｃ、Ｃ１０５Ｔ、Ｔ１６０Ｅ、Ｐ８９Ａ、Ｒ１５９Ｔ、Ｔ１８３Ｐ、Ｓ１８８Ｍ、Ｔ１０Ｌ、Ｇ２５Ｓ、Ｎ２４Ｓ、Ｅ１１９Ｌ、Ｔ１０７Ｌ、Ｔ１０７Ｑ、Ｇ１６１Ｋ、Ｇ１５Ｑ、Ｓ１５Ｒ、Ｇ１５３Ｋ、Ｇ１５３Ｖ、Ｓ１８８Ｇ、Ａ８３Ｅ、Ｇ１８６Ｐ、Ｔ１２１Ｄ、Ｇ４９Ａ、Ｓ１５Ｃ、Ｃ１０５Ｙ、Ｃ１０５Ａ、Ｒ１２７Ｆ、Ｑ７１Ａ、Ｔ１０Ｃ、Ｒ１７９Ｋ、Ｔ８６Ｉ、Ｗ１０３Ｎ、Ａ８７Ｓ、Ｆ１６６Ａ、Ａ８３Ｆ、Ｒ１２３Ｑ、Ａ１３２Ｃ、Ａ１４３Ｈ、Ｔ１６３Ｉ、Ｔ３９Ｖ、Ａ９３Ｄ、Ｖ９０Ｍ、Ｒ１２３Ｋ、Ｐ１３４Ｗ、Ｇ１７７Ｎ、Ｖ１１５Ｉ、Ｓ１５５Ｔ、Ｔ１１０Ｄ、Ｇ１０５Ｌ、Ｎ１７０Ｄ、Ｔ１０７Ａ、Ｇ８４Ｖ、Ｇ８４Ｍ、Ｌ１１１Ｋ、Ｐ１６８Ｉ、Ｇ１５４Ｌ、Ｔ１８３Ｉ、Ｓ９９Ｇ、Ｓ１５Ｔ、Ａ８Ｇ、Ｓ１５Ｎ、Ｐ１８９Ｓ、Ｓ１８８Ｃ、Ｔ１００Ｑ、Ａ１１０Ｇ、Ａ１２１Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｒ１５９Ｖ、Ｇ３１Ａ、Ｇ１５４Ｒ、Ｔ１８２Ｌ、Ｖ１１５Ｌ、Ｔ１６０Ｑ、Ｔ１０７Ｆ、Ｒ１５９Ｑ、Ｇ１４４Ａ、Ｓ９２Ｔ、Ｔ１０１Ｓ、Ａ８３Ｒ、Ｇ１２ＨＭ、Ｓ１５Ｈ、Ｔ１１６Ｑ、Ｔ３６Ｖ、Ｇ１５４、Ｑ８１Ｃ、Ｖ１３０Ｔ、Ｔ１８３Ａ、Ｐ１１８Ｔ、Ａ８７Ｅ、Ｔ８６Ｍ、Ｖ１５０Ｎ、およびＮ２４Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有する。ある好ましい態様において、これらの変異体は野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べて熱安定性を向上させている。
【００１３】
また本発明は、Ｔ３６Ｉ、Ｉ１７２Ｔ、Ｎ２４Ｅ、Ｎ１７０Ｙ、Ｇ７７Ｔ、Ｇ１８６Ｎ、Ｉ１８１Ｌ、Ｎ７３Ｔ、Ａ３８Ｒ、Ｎ７４Ｇ、Ｎ２４Ａ、Ｇ５４Ｄ、Ｓ７６Ｄ、Ｒ１２３Ｅ、１５９Ｅ、Ｎ１１２Ｅ、Ｒ３５Ｅ、Ｒ１７９Ｖ、Ｒ１２３Ｄ、Ｎ２４Ｔ、Ｒ１７９Ｔ、Ｒ１４Ｌ、Ａ３８Ｄ、Ｖ９０Ｐ、Ｒ１４Ｑ、Ｒ１２３Ｉ、Ｒ１７９Ｄ、Ｓ７６Ｖ、Ｒ７９Ｇ、Ｒ３５Ｌ、Ｓ７６Ｅ、Ｓ７６Ｙ、Ｒ７９Ｄ、Ｒ７９Ｐ、Ｒ３５Ｑ、Ｒ１７９Ｎ、Ｎ１１２Ｄ、Ｒ１７９Ｅ、Ｇ６５Ｐ、Ｙ７５Ｇ、Ｖ９０Ｓ、Ｒ１７９Ｍ、Ｒ３５Ｆ、Ｒ１２３Ｆ、Ａ６４Ｉ、Ｎ２４Ｑ、Ｒ１４Ｉ、Ｒ１７９Ａ、Ｒ１２７Ａ、Ｒ１７９Ｉ、Ｎ１７０Ｄ、Ｒ３５Ａ、Ｒ１５９Ｆ、Ｔ１０９Ｅ、Ｒ１４Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｇ４９Ａ、Ｎ１１２Ｑ、Ｇ７８Ｄ、Ｔ１２１Ｅ、Ｌ６９Ｓ、Ｔ１１６Ｅ、Ｖ９０Ｉ、Ｔ３６Ｓ、Ｔ３６Ｇ、ｎ１４５Ｅ、Ｔ８６Ｄ、Ｓ５１Ｄ、Ｒ１７９Ｋ、Ｔ１０７Ｅ、Ｔ１２９Ｓ、Ｌ１４２Ｖ、Ｒ７９Ａ、Ｒ７９Ｅ、Ａ３８Ｈ、Ｔ１０７Ｓ、Ｒ１２３Ａ、Ｎ５５Ｅ、Ｒ１２３Ｌ、Ｒ１５９Ｎ、Ｇ６５Ｄ、Ｒ１４Ｎ、Ｇ６５Ｑ、Ｒ１２３Ｑ、Ｎ２４Ｖ、Ｒ１４Ｇ、Ｔ１１６Ｑ、Ａ３８Ｎ、Ｒ１５９Ｑ、Ｒ１７９Ｙ、Ａ８３Ｅ、Ｎ１１２Ｌ、Ｓ９９Ｎ、Ｇ７８Ａ、Ｔ１０Ｎ、Ｈ８５Ｑ、Ｒ３５Ｑ、Ｎ２４Ｌ、Ｎ２４Ｈ、Ｇ４９Ｓ、Ｒ７９Ｌ、Ｓ７６Ｔ、Ｓ７６Ｌ、Ｇ６５Ｓ、Ｎ５５Ｆ、Ｒ７９Ｖ、Ｇ６５Ｔ、Ｒ１２３Ｎ、Ｔ８６Ｅ、Ｙ７５Ｆ、Ｆ１Ｔ、Ｓ７６Ｎ、Ｓ９９Ｖ、Ｒ７９Ｔ、Ｎ１１２Ｖ、Ｒ７９Ｍ、Ｔ１０７Ｖ、Ｒ７９Ｓ、Ｇ５４Ｅ、Ｇ６５Ｖ、Ｒ１２７Ｑ、Ｒ１５９Ｄ、Ｔ１０７Ｈ、Ｈ８５Ｔ、Ｒ３５Ｔ、Ｔ３６Ｎ、Ｑ８１Ｅ、Ｒ１２３Ｈ、Ｓ７６Ｉ、Ａ３８Ｆ、Ｖ９０Ｔ、およびＲ１４Ｔからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有するプロテアーゼ変異体を提供する。選択的な態様において、前記プロテアーゼ変異体は、Ｇ６５Ｌ、Ｓ９９Ｄ、Ｔ１０７Ｍ、Ｓ１１３Ｔ、Ｓ９９Ｔ、Ｇ７７Ｓ、Ｒ１４Ｍ、Ａ６４Ｎ、Ｒ６１Ｍ、Ａ７０Ｄ、Ｑ７１Ｇ、Ａ９３Ｄ、Ｓ９２Ｇ、Ｎ１１２Ｙ、Ｓ１５Ｗ、Ｒ１５９Ｋ、Ｎ６７Ｇ、Ｔ１０Ｅ、Ｒ１２７Ｈ、Ａ６４Ｙ、Ｒ１５９Ｃ、Ａ３８Ｌ、Ｔ１６０Ｅ、Ｔ１８３Ｅ、Ｒ１２７Ｓ、Ａ８Ｅ、Ｓ５１Ｑ、Ｎ７Ｌ、Ｇ６３Ｄ、Ａ３８Ｓ、Ｒ３５Ｈ、Ｒ１４Ｋ、Ｔ１０７Ｉ、Ｇ１２Ｄ、Ａ６４Ｌ、Ｓ７６Ｗ、Ａ４１Ｎ、Ｒ３５Ｍ、Ａ６４Ｖ、Ａ３８Ｙ、Ｔ１８３Ｉ、Ｗ１０３Ｍ、Ａ４１Ｄ、Ｒ１２７Ｋ、Ｔ３６Ｄ、Ｒ６１Ｔ、Ｇ６５Ｙ、Ｇ１３Ｓ、Ｒ３５Ｙ、Ｒ１２３Ｔ、Ａ６４Ｈ、Ｇ４９Ｈ、Ａ７０Ｈ、Ａ６４Ｆ、Ｒ１２７Ｙ、Ｒ６１Ｅ、Ａ６４Ｐ、Ｔ１２１Ｄ、Ｖ１１５Ａ、Ｒ１２３Ｙ、Ｔ１０１Ｓ、Ｔ１８２Ｖ、Ｈ８５Ｌ、Ｎ２４Ｍ、Ｒ１２７Ｅ、Ｎ１４５Ｄ、Ｑ７１Ｈ、Ｓ７６Ｑ、Ａ６４Ｔ、Ｇ４９Ｆ、Ａ６４Ｑ、Ｔ１０Ｄ、Ｆ１Ｄ、Ａ７０Ｇ、Ｒ３５Ｗ、Ｑ７１Ｄ、Ｎ１２１Ｉ、Ａ６４Ｍ、Ｔ３６Ｈ、Ａ８Ｇ、Ｔ１０７Ｎ、Ｒ３５Ｓ、Ｎ６７Ｔ、Ｓ９２Ａ、Ｎ１７０Ｌ、Ｎ６７Ｅ、Ｓ１１４Ａ、Ｒ１４Ａ、Ｒ１４Ｓ、Ｑ８１Ｄ、Ｓ５１Ｈ、Ｒ１２３Ｓ、Ａ９３Ｓ、Ｒ１２７Ｆ、Ｉ１９Ｖ、Ｔ４０Ｖ、Ｓ１８５Ｎ、Ｒ１２３Ｇ、Ｒ１７９Ｌ、Ｓ５１Ｖ、Ｔ１６３Ｄ、Ｔ１０９Ｉ、Ａ６４Ｓ、Ｖ７２Ｉ、Ｎ６７Ｓ、Ｒ１５９Ｓ、Ｈ８５Ｍ、Ｔ１０９Ｇ、Ｑ７１Ｓ、Ｒ６１Ｈ、Ｔ１０７Ａ、Ｑ８１Ｖ、Ｖ９０Ｎ、Ｔ１０９Ａ、Ａ３８Ｔ、Ｎ１４５Ｔ、Ｒ１５９Ａ、Ａ１１０Ｓ、Ｑ８１Ｈ、Ａ４８Ｅ、Ｓ５１Ｔ、Ａ６４Ｗ、Ｒ１５９Ｌ、Ｎ６７Ｈ、Ａ９３Ｅ、Ｔ１１６Ｆ、Ｒ６１Ｓ、Ｒ１２３Ｖ、Ｖ３Ｌ、およびＲ１５９Ｙからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有する。ある好ましい態様において、これらの変異体は野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べてケラチン加水分解活性を向上させている。
【００１４】
また本発明は、Ｔ３６Ｉ、Ｐ８９Ｄ、Ａ９３Ｔ、Ａ９３Ｓ、Ｔ３６Ｎ、Ｎ７３Ｔ、Ｔ３６Ｇ、Ｒ１５９Ｆ、Ｔ３６Ｓ、Ａ３８Ｒ、Ｓ９９Ｗ、Ｓ７６Ｗ、Ｔ３６Ｐ、Ｇ７７Ｔ、Ｇ５４Ｄ、Ｒ１２７Ａ、Ｒ１５９Ｅ、Ｈ８５Ｑ、Ｔ３６Ｄ、Ｓ７６Ｌ、Ｓ９９Ｎ、Ｙ７５Ｇ、Ｓ７６Ｙ、Ｒ１２７Ｓ、Ｎ２４Ｅ、Ｒ１２７Ｑ、Ｄ１８４Ｆ、Ｎ１７０Ｙ、Ｎ２４Ａ、Ｓ７６Ｔ、Ｈ８５Ｌ、Ｙ７５Ｆ、Ｓ７６Ｖ、Ｌ６９Ｓ、Ｒ１５９Ｋ、Ｒ１２７Ｋ、Ｇ６５Ｐ、Ｎ７４Ｇ、Ｒ１５９Ｈ、Ｇ６５Ｑ、Ｇ１８６Ｖ、Ａ４８Ｑ、Ｔ３６Ｈ、Ｎ６７Ｌ、Ｒ１４Ｉ、Ｒ１２７Ｌ、Ｔ３６Ｙ、Ｓ７６Ｉ、Ｓ１１４Ｇ、Ｒ１２７Ｈ、Ｓ１８７Ｐ、Ｖ３Ｌ、Ｇ７８Ｄ、Ｒ１２３Ｉ、Ｉ１８１Ｑ、Ｒ３５Ｆ、Ｈ８５Ｒ、Ｒ１２７Ｙ、Ｎ６７Ｓ、Ｑ８１Ｐ、Ｒ１２３Ｆ、Ｒ１５９Ｎ、Ｓ９９Ａ、Ｓ７６Ｄ、Ａ１３２Ｖ、Ｒ１２７Ｆ、Ａ１４３Ｎ、Ｓ９２Ａ、Ｎ２４Ｔ、Ｒ７９Ｐ、Ｓ７６Ｎ、Ｒ１４Ｍ、Ｇ１８６Ｅ、Ｎ２４Ｑ、Ｎ６７Ａ、Ｒ１２７Ｔ、Ｈ８５Ｋ、Ｇ６５Ｔ、Ｇ６５Ｙ、Ｒ１７９Ｖ、Ｙ７５Ｉ、Ｉ１１Ｑ、Ａ３８Ｌ、Ｔ３６Ｌ、Ｒ１５９Ｙ、Ｒ１５９Ｄ、Ｎ２４Ｖ、Ｇ６５Ｓ、Ｎ１５７Ｄ、Ｇ１８６Ｉ、Ｇ５４Ｑ、Ｎ６７Ｙ、Ｒ１２７Ｇ、Ｓ７６Ａ、Ａ３８Ｓ、Ｔ１０９Ｅ、Ｖ６６Ｈ、Ｔ１１６Ｆ、Ｒ１２３Ｌ、Ｇ４９Ａ、Ａ６４Ｈ、Ｔ３６Ｗ、Ｄ１８４Ｈ、Ｓ９９Ｄ、Ｇ１６１Ｋ、Ｐ１３４Ｅ、Ａ６４Ｆ、Ｎ６７Ｇ、Ｓ９９Ｔ、Ｄ２Ｑ、Ｓ７６Ｅ、Ｒ１６Ｑ、Ｇ５４Ｎ、Ｎ６７Ｖ、Ｒ３５Ｌ、Ｑ７１Ｉ、Ｎ７Ｌ、Ｎ１１２Ｅ、Ｌ６９Ｈ、Ｎ２４Ｈ、Ｇ５４Ｉ、Ｒ１６Ｌ、Ｎ２４Ｍ、Ａ６４Ｙ、Ｓ１１３Ａ、Ｈ８５Ｆ、Ｒ７９Ｇ、Ｉ１１Ａ、Ｔ１２１Ｄ、Ｒ６１Ｖ、およびＧ６５Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有するプロテアーゼ変異体を提供する。選択的な態様において、前記プロテアーゼ変異体は、Ｎ６７Ｑ、Ｓ１８７Ｑ、Ｑ７１Ｈ、Ｔ１６３Ｄ、Ｒ６１Ｋ、Ｒ１５９Ｖ、Ｑ７１Ｆ、Ｖ３１Ｆ、Ｖ９０Ｉ、Ｒ７９Ｄ、Ｔ１６０Ｅ、Ｒ１２３Ｑ、Ａ３８Ｙ、Ｓ１１３Ｇ、Ａ８８Ｆ、Ａ７０Ｇ、Ｉ１１Ｔ、Ｇ７８Ａ、Ｎ２４Ｌ、Ｓ９２Ｇ、Ｒ１４Ｌ、Ｄ１８４Ｒ、Ｇ５４Ｌ、Ｎ１１２Ｌ、Ｈ８５Ｙ、Ｒ１６Ｎ、Ｇ７７Ｓ、Ｒ１７９Ｔ、Ｖ８０Ｌ、Ｇ６５Ｖ、Ｔ１２１Ｅ、Ｑ７１Ｄ、Ｒ１６Ｇ、Ｐ８９Ｎ、Ｎ４２Ｈ、Ｇ４９Ｆ、Ｉ１１Ｓ、Ｒ６１Ｍ、Ｒ１５９Ｃ、Ｇ６５Ｒ、Ｔ１８３Ｉ、Ａ９３Ｄ、Ｌ１１１Ｅ、Ｓ５１Ｑ、Ｇ７８Ｎ、Ｎ６７Ｔ、Ａ３８Ｎ、Ｔ４０Ｖ、Ａ６４Ｗ、Ｒ１５９Ｌ、Ｔ１０Ｅ、Ｒ１７９Ｋ、Ｒ１２３Ｅ、Ｖ９０Ｐ、Ａ６４Ｎ、Ｇ１６１Ｅ、Ｈ８５Ｔ、Ａ８Ｇ、Ｌ１４２Ｖ、Ａ４１Ｎ、Ｓ１８５Ｉ、Ｑ７１Ｌ、Ａ６４Ｔ、Ｒ１６Ｉ、Ａ３８Ｄ、Ｇ５４Ｍ、Ｎ１１２Ｑ、Ｒ１６Ａ、Ｒ１４Ｅ、Ｖ８０Ｈ、Ｎ１７０Ｄ、Ｓ９９Ｇ、Ｒ１７９Ｎ、Ｓ１５Ｅ、Ｇ４９Ｈ、Ａ７０Ｐ、Ａ６４Ｓ、Ｇ５４Ａ、Ｓ１８５Ｗ、Ｒ６１Ｈ、Ｔ１０Ｑ、Ａ３８Ｆ、Ｎ１７０Ｌ、Ｔ１０Ｌ、Ｎ６７Ｆ、Ｇ１２Ｄ、Ｄ１８４Ｔ、Ｒ１４Ｎ、Ｓ１８７Ｅ、Ｒ１４Ｐ、Ｎ１１２Ｄ、Ｓ１４０Ａ、Ｎ１１２Ｇ、Ｇ４９Ｓ、Ｌ１１１Ｄ、Ｎ６７Ｍ、Ｖ１５０Ｌ、Ｇ１２Ｙ、Ｒ１２３Ｋ、Ｐ８９Ｖ、Ｖ６６Ｄ、Ｇ７７Ｎ、Ｓ５１Ｔ、Ａ８Ｄ、Ｉ１８１Ｈ、Ｔ８６Ｎ、Ｒ１７９Ｄ、Ｎ５５Ｆ、Ｎ２４Ｓ、Ｄ１８４Ｌ、Ｒ６１Ｓ、Ｎ６７Ｋ、Ｇ１８６Ｌ、Ｆ１Ｔ、Ｒ１５９Ａ、Ｉ１１Ｌ、Ｒ６１Ｔ、Ｄ１８４Ｑ、Ａ９３Ｅ、Ｑ７１Ｔ、Ｒ１７９Ｅ、Ｌ６９Ｗ、Ｔ１６３Ｉ、Ｓ１８８Ｑ、Ｌ１２５Ｖ、Ａ３８Ｖ、Ｒ３５Ａ、Ｐ１３４Ｇ、Ａ６４Ｖ、Ｎ１４５Ｄ、Ｖ９０Ｔ、およびＡ１４３Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有する。ある好ましい態様において、これらの変異体は野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べてＢＭＩ能を向上させている。
【００１５】
また本発明は、Ｔ３６Ｉ、Ｎ１７０Ｙ、Ａ３８Ｒ、Ｒ７９Ｐ、Ｇ７７Ｔ、Ｌ６９Ｓ、Ｎ７３Ｔ、Ｓ７６Ｖ、Ｓ７６Ｙ、Ｒ１７９Ｖ、Ｔ３６Ｎ、Ｎ５５Ｆ、Ｒ１５９Ｆ、Ｇ５４Ｄ、Ｇ６５Ｐ、Ｌ６９Ｈ、Ｔ３６Ｇ、Ｇ１７７Ｍ、Ｎ２４Ｅ、Ｎ７４Ｇ、Ｒ１５９Ｅ、Ｔ３６Ｓ、Ｙ７５Ｇ、Ｓ７６Ｉ、Ｓ７６Ｄ、Ａ８Ｒ、Ａ２４Ａ、Ｖ９０Ｐ、Ｒ１５９Ｃ、Ｇ６５Ｑ、Ｔ１２１Ｅ、Ａ８Ｖ、Ｓ７６Ｌ、Ｔ１０９Ｅ、Ｒ１７９Ｍ、Ａ８Ｔ、Ｔ１０７Ｎ、Ｇ１８６Ｅ、Ｓ７６Ｗ、Ｒ１２３Ｅ、Ａ３８Ｆ、Ｔ３６Ｐ、Ｎ６７Ｇ、Ｙ７５Ｆ、Ｓ７６Ｎ、Ｒ１７９Ｉ、Ｓ１８７Ｐ、Ｎ６７Ｖ、Ｖ９０Ｓ、Ｒ１２７Ａ、Ｒ１７９Ｙ、Ｒ３５Ｆ、Ｎ１４５Ｓ、Ｇ６５Ｓ、Ｒ６１Ｍ、Ｓ５１Ａ、Ｒ１７９Ｎ、Ｒ１２３Ｄ、Ｎ２４Ｔ、Ｎ５５Ｅ、Ｒ７９Ｃ、Ｇ１８６Ｖ、Ｒ１２３Ｉ、Ｇ１６１Ｅ、Ｇ６５Ｙ、Ａ３８Ｓ、Ｒ１４Ｌ、Ｖ９０Ｉ、Ｒ７９Ｇ、Ｎ１４５Ｅ、Ｎ６７Ｌ、Ｒ１２７Ｓ、Ｒ１５０Ｙ、Ｍ１８０Ｄ、Ｎ６７Ｔ、Ａ９３Ｄ、Ｔ１２１Ｄ、Ｑ８１Ｖ、Ｔ１０９Ｉ、Ａ９３Ｅ、Ｔ１０７Ｓ、Ｒ１７９Ｔ、Ｒ１７９Ｌ、Ｒ１７９Ｋ、Ｒ１５９Ｄ、Ｒ１７９Ａ、Ｒ７９Ｅ、Ｒ１２３Ｆ、Ｒ７９Ｄ、Ｔ３６Ｄ、Ａ６４Ｎ、Ｌ１４２Ｖ、Ｔ１０９Ａ、Ｉ１７２Ｖ、Ａ８３Ｎ、Ｔ８５Ａ、Ｒ１７９Ｄ、Ａ３８Ｌ、Ｉ１２６Ｌ、Ｒ１２７Ｑ、Ｒ１２７Ｌ、Ｌ６９Ｗ、Ｒ１２７Ｋ、Ｇ６５Ｔ、Ｒ１２７Ｈ、Ｐ１３４Ａ、Ｎ６７Ｄ、Ｒ１４Ｍ、Ｎ２４Ｑ、Ａ１４３Ｎ、Ｎ５５Ｓ、Ｎ６７Ｍ、Ｓ５１Ｄ、Ｓ７６Ｅ、Ｔ１６３Ｄ、Ａ３８Ｄ、Ｒ１５９Ｋ、Ｔ１８３Ｉ、Ｇ６３Ｖ、Ａ８Ｓ、Ｔ１０７Ｍ、Ｈ８５Ｑ、Ｎ１１２Ｅ、Ｎ６７Ｆ、Ｎ６７Ｓ、Ａ６４Ｈ、Ｔ８６Ｉ、Ｐ１３４Ｅ、Ｔ１８２Ｖ、Ｎ６７Ｙ、Ａ６４Ｓ、Ｇ７８Ｄ、Ｖ９０Ｔ、Ｒ６１Ｔ、Ｒ１６Ｑ、Ｇ６５Ｒ、Ｔ８６Ｌ、Ｖ９０Ｎ、Ｒ１５９Ｑ、Ｇ５４Ｉ、Ｓ７６Ｃ、Ｒ１７９Ｅ、Ｖ６６Ｄ、Ｌ６９Ｖ、Ｒ１２７Ｙ、Ｒ３５Ｌ、Ｒ１４Ｅ、およびＴ８６Ｆからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有するプロテアーゼ変異体を提供する。選択的な態様において、前記プロテアーゼ変異体は、Ｇ１８６Ｉ、Ａ６４Ｑ、Ｔ１０９Ｇ、Ｇ６４Ｌ、Ｎ２４Ｌ、Ａ８Ｅ、Ｎ１１２Ｄ、Ａ３８Ｈ、Ｒ１７９Ｗ、Ｓ１１４Ｇ、Ｒ１２３Ｌ、Ａ８Ｌ、Ｔ１２９Ｓ、Ｎ１７０Ｄ、Ｒ１５９Ｎ、Ｎ６７Ｃ、Ｓ９２Ｃ、Ｔ１０７Ａ、Ｇ５４Ｅ、Ｔ１０７Ｅ、Ｔ３６Ｖ、Ｒ１２７Ｔ、Ａ８Ｎ、Ｈ８５Ｌ、Ａ１１０Ｓ、Ｎ１７０Ｃ、Ａ６４Ｒ、Ａ１３２Ｖ、Ｔ３６Ｙ、Ｇ６３Ｄ、Ｗ１０３Ｍ、Ｔ１５１Ｖ、Ｒ１２３Ｐ、Ｗ１０３Ｙ、Ｓ７６Ｔ、Ｓ１８７Ｔ、Ｒ１２７Ｆ、Ｎ６７Ａ、Ｐ１７１Ｍ、Ａ７０Ｓ、Ｒ１５９Ｈ、Ｓ７６Ｑ、Ｌ１２５Ｖ、Ｇ５４Ｑ、Ｇ４９Ｌ、Ｒ１４Ｉ、Ｒ１４Ｑ、Ａ８３Ｉ、Ｖ９０Ｌ、Ｔ１８３Ｅ、Ｒ１５９Ａ、Ｔ１０１Ｓ、Ｇ６５Ｄ、Ｇ５４Ａ、Ｔ１０７Ｑ、Ｑ７１Ｍ、Ｔ８６Ｅ、Ｎ２４Ｍ、Ｎ５５Ｑ、Ｒ６１Ｖ、Ｐ１３４Ｄ、Ｒ９６Ｋ、Ａ８８Ｆ、Ｎ１４５Ｑ、Ａ６４Ｍ、Ａ６４Ｔ、Ｎ２４Ｖ、Ｓ１４０Ａ、Ａ８Ｈ、Ａ６４Ｉ、Ｒ１２３Ｑ、Ｔ１８３Ｑ、Ｎ２４Ｈ、Ａ６４Ｗ、Ｔ６２Ｉ、Ｔ１２９Ｇ、Ｒ３５Ａ、Ｔ４０Ｖ、Ｉ１１Ｔ、Ａ３８Ｎ、Ｎ１４５Ｇ、Ａ１７５Ｔ、Ｇ７７Ｑ、Ｔ１０９Ｈ、Ａ８Ｐ、Ｒ３５Ｅ、Ｔ１０９Ｎ、Ａ１１０Ｔ、Ｎ６７Ｑ、Ｇ６３Ｐ、Ｈ８５Ｒ、Ｓ９２Ｇ、Ａ１７５Ｖ、Ｓ５１Ｑ、Ｇ６３Ｑ、Ｔ１１６Ｆ、Ｇ６５Ａ、Ｒ７９Ｌ、Ｎ１４５Ｐ、Ｌ６９Ｑ、Ｑ１４６Ｄ、Ａ８３Ｄ、Ｆ１６６Ｙ、Ｒ１２３Ａ、Ｔ１２１Ｌ、Ｒ１２３Ｈ、Ａ７０Ｐ、Ｔ１８２Ｗ、Ｓ７６Ａ、Ａ６４Ｆ、Ｔ１０７Ｈ、Ｇ１８６Ｌ、Ｑ８１Ｉ、Ｒ１２３Ｋ、Ａ６４Ｌ、Ｎ６７Ｒ、Ｖ３Ｌ、Ｓ１８７Ｅ、Ｓ１６１Ｋ、Ｔ８６Ｍ、Ｉ４Ｍ、Ｇ７７Ｎ、Ｇ４９Ａ、Ａ４１Ｎ、Ｇ５４Ｍ、Ｔ１０７Ｖ、Ｑ８１Ｅ、Ａ３８Ｉ、Ｔ１０９Ｌ、Ｔ１８３Ｋ、Ａ７０Ｇ、Ｑ７１Ｄ、Ｔ１８３Ｌ、Ｑ８１Ｈ、Ａ６４Ｖ、Ａ９３Ｑ、Ｓ１８８Ｅ、Ｓ５１Ｆ、Ｇ１８６Ｐ、Ｇ１８６Ｔ、Ｒ１５９Ｌ、Ｐ１３４Ｇ、Ｎ１４５Ｔ、Ｎ５５Ｖ、Ｖ６６Ｅ、Ｒ１５９Ｖ、Ｙ１７６Ｌ、およびＲ１６Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有する。ある好ましい態様において、これらの変異体は野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べて、低ｐＨ条件でＢＭＩ能を向上させている。
【００１６】
また本発明は、配列番号８、配列番号６、配列番号７、および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列の部分を少なくとも含むセリンプロテアーゼを提供する。ある態様において、これらのセリンプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある態様において、前記セリンプロテアーゼは配列番号８で示されるものに類似したアミノ酸配列を有する変異体である。ある態様において、前記プロテアーゼはミクロコシニアエの仲間から得られる。ある特別の好ましい態様において、前記プロテアーゼは、セルロモナス、エルスコビア（Oerskovia）、セルロシミクロビウム（Cellulosimicrobium）、キシラニバクテリウム（Xylanibacterium）、およびプロミクロモノスポラ（Promicromonospora）からなる群から選択される生物から得られる。ある特別の好ましい態様において、前記プロテアーゼはセルロモナス６９Ｂ４の変異体から得られる。
【００１７】
また本発明は、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおけるある位置と均等な位置において起こる少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する単離プロテアーゼ変異体を提供する。ここで、前記プロテアーゼのアミノ酸は、Ａｒｇ１４、Ｓｅｒ１５、Ａｒｇ１６、Ｃｙｓ１７、Ｈｉｓ３２、Ｃｙｓ３３、Ｐｈｅ５２、Ａｓｐ５６、Ｔｈｒ１００、Ｖａｌ１１５、Ｔｈｒ１１６、Ｔｙｒ１１７、Ｐｒｏ１１８、Ｇｌｕ１１９、Ａｌａ１３２、Ｇｌｕ１３３、Ｐｒｏ１３４、Ｇｌｙ１３５、Ａｓｐ１３６、Ｓｅｒ１３７、Ｔｈｒ１５１、Ｓｅｒ１５２、Ｇｌｙ１５３、Ｇｌｙ１５４、Ｓｅｒ１５５、Ｇｌｙ１５６、Ａｓｎ１５７、Ｔｈｒ１６４、およびＰｈｅ１６５を含む。ある態様において、前記プロテアーゼの触媒トリアッドはＨｉｓ３２、Ａｓｐ５６、およびＳｅｒ１３７を含む。選択的な態様において、前記プロテアーゼはＣｙｓ１３１、Ａｌａ１３２、Ｇｌｕ１３３、Ｐｒｏ１３４、Ｇｌｙ１３５、Ｔｈｒ１５１、Ｓｅｒ１５２、Ｇｌｙ１５３、Ｇｌｙ１５４、Ｓｅｒ１５５、Ｇｌｙ１５６、Ａｓｎ１５７およびＧｌｙ１６２、Ｔｈｒ１６３、およびＴｈｒ１６４を含む。ある好ましい態様において、前記プロテアーゼのアミノ酸配列はＰｈｅ５２、Ｔｙｒ１１７、Ｐｒｏ１１８、およびＧｌｕ１１９を含む。ある特定の好ましい態様において、前記プロテアーゼのアミノ酸配列は、Ｇｌｙ１５４から基質主鎖への主鎖−主鎖水素結合を有する。
【００１８】
幾つかの態様において、本発明のプロテアーゼは３つのジスルフィド結合を含む。ある好ましい態様において、前記ジスルフィド結合はＣ１７とＣ３８、Ｃ９５とＣ１０５、およびＣ１３１とＣ１５８の間に位置する。ある特定の好ましい態様において、前記ジスルフィド結合は配列番号８のＣ１７とＣ３８、Ｃ９５とＣ１０５、およびＣ１３１とＣ１５８の間に位置する。選択的なプロテアーゼ変異体の態様において、前記ジスルフィド結合は配列番号８におけるジスルフィド結合と均等な位置にある。
【００１９】
また本発明は、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおけるある位置と均等な位置において起こる少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する単離プロテアーゼ変異体を提供する。ここで、前記変異体は野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べてその基質特性を変化させている。ある更に好ましい態様において、前記変異体は野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べてｐＩを変化させている。更に好ましい態様において、前記変異体は野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べて安定性が向上している。更により好ましい態様において、前記変異体は変化した表面特性を示す。ある特定の好ましい態様において、前記変異体は野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べて変化した表面特性を示す。更に特定の好ましい態様において、前記変異体は１、２、４、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２２、２４、２５、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５７、５９、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９５、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３７、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１７０、１７１、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、および１８４からなる群から選択された少なくとも1つの位置における置換変異を含む。
【００２０】
また本発明は、野生型プロテアーゼと比べて少なくとも1つの向上した特性を有するプロテアーゼ変異体を提供する。ある特定の好ましい態様において、前記変異体はミクロコシニアエの仲間から得られるセリンプロテアーゼの変異体である。ある特に好ましい態様において、前記プロテアーゼはセルロモナス、エルスコビア、セルロシミクロビウム、キシラニバクテリウム、およびプロミクロモノスポラからなる群から選択される生物から得られる。ある特に好ましい態様において、前記プロテアーゼはセルロモナス６９Ｂ４の変異体から得られる。ある特に好ましい態様において、少なくとも１つの向上した特性は、酸安定性、温度安定性、カゼイン加水分解、ケラチン加水分解、洗浄能、およびＬＡＳ安定性からなる群から選択される。
【００２１】
また本発明は、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおけるある位置と均等な位置において起こる少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するプロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。更なる態様において、本発明はこれらの発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。ある特に好ましい態様において、前記宿主種細胞はバチルス属（Bacillus sp.）、ストレプトマイセス属（Streptomyces sp.）、アスペルジルス属（Aspergillus sp.）、およびトリコデルマ属（Trichoderma sp.）からなる群から選択される。また本発明は前記宿主細胞により生産されるセリンプロテアーゼを提供する。
【００２２】
また本発明は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、および７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む変異体プロテアーゼを提供する。ある好ましい態様において、前記アミノ酸配列は、配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、および７７からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる。更なる態様において、本発明は少なくとも１つのプロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。更なる態様において、本発明はこれらの発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。ある特に好ましい態様において、前記宿主細胞はバチルス属、ストレプトマイセス属、アスペルジルス属、およびトリコデルマ属からなる群から選択される。また本発明は、前記宿主細胞により生産されるセリンプロテアーゼを提供する。
【００２３】
また本発明は、ミクロコシニアエの仲間から得られる単離セリンプロテアーゼの少なくとも一部を含む組成物を提供する。ここで、前記プロテアーゼは配列番号１、２、３、および４からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる。ある好ましい態様において、前記配列は配列番号１の少なくとも一部を含む。更なる態様において、本発明はこれらの発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。ある特に好ましい態様において、前記宿主細胞はバチルス属、ストレプトマイセス属、アスペルジルス属、およびトリコデルマ属からなる群から選択される。また本発明は、前記宿主細胞により生産されるセリンプロテアーゼを提供する。
【００２４】
また本発明は変異体セリンプロテアーゼを提供する。ここで、前記プロテアーゼは配列番号８におけるアミノ酸位置に相当する少なくとも１つの置換を含み、変異体プロテアーゼは、ケラチン加水分解、温度安定性、カゼイン活性、ＬＡＳ安定性、および洗浄能からなる群から選択される少なくとも一つの、野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べて優れた性能を有する。
【００２５】
また本発明は、（ｉ）配列番号４と７０％以上の相同性を有するか、（ｉｉ）中程度から高度にストリンジェントな条件下で配列番号４で示されるヌクレオチド配列から誘導されるプローブを加水分解により生成することができるか、または（ｉｉｉ）配列番号４で示されるヌクレオチド配列に相補的である、ヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。幾つかの態様において、本発明は少なくとも１つのそのようなポリヌクレオチドをコードする発現ベクターを提供する。更なる態様において、本発明はこれらの発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。ある特に好ましい態様において、前記宿主細胞はバチルス属、ストレプトマイセス属、アスペルジルス属、およびトリコデルマ属からなる群から選択される。また本発明は、前記宿主細胞により生産されるセリンプロテアーゼを提供する。更なる態様において、本発明は配列番号４において示される少なくとも一部分の配列に相補的なポリヌクレオチドを提供する。
【００２６】
また本発明は、プロテアーゼ活性を有する酵素を生産する方法であって、配列番号４と７０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主細胞を変異させる工程と、宿主細胞に好適な条件下で変異宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。ある態様において、前記宿主細胞はストレプトマイセス属、アスペルジルス属、トリコデルマ属、およびバチルス属からなる群から選択される。
【００２７】
また本発明は、配列番号４の対応する断片に実質的に同等な４〜１５０のヌクレオチド配列を含むプローブを提供する。ここで、前記プローブは蛋白分解活性を有する酵素をコードする核酸配列を検出するために用いられ、ここで前記核酸配列はミクロコシニアエのなかまから得られる。ある態様において、このミクロコシニアエはセルロモナス属である。ある好ましい態様において、このセルロモナス属はセルロモナス株６９Ｂ４である。
【００２８】
また本発明は、ミクロコシニアエのなかまから得られる少なくとも１つのセリンプロテアーゼを含む洗浄組成物を提供する。幾つかの態様において、少なくともひとつのプロテアーゼがセルロモナス、エルスコビア、セルロシミクロビウム、キシラニバクテリウム、およびプロミクロモノスポラからなる群から選択される生物から得られる。幾つかの好ましい態様において、前記プロテアーゼはセルロモナス６９Ｂ４から得られる。ある特に好ましい態様において、少なくとも１つのプロテアーゼは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む。幾つかの更なる態様において、本発明は配列番号８を含むセリンプロテアーゼと４５％以上のアミノ酸同等性を含む単離セリンプロテアーゼを提供する。幾つかの態様において、前記単離セリンプロテアーゼは、５０％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、更により好ましくは６５％以上、もっとより好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、更により好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更により好ましくは９０％以上、もっとより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％同等性を含む。
【００２９】
更に本発明は、少なくとも１つのセリンプロテアーゼを含む洗浄組成物であって、少なくとも１つの前記セリンプロテアーゼがミクロコシニアエのなかまから得られるセリンプロテアーゼと免疫交叉反応性を有することを特徴とする洗浄組成物を提供する。幾つかの好ましい態様において、前記セリンプロテアーゼはセルロモナス６９Ｂ４から得られるセリンプロテアーゼと免疫交叉反応性を有する。選択的な態様において、前記セリンプロテアーゼは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むセリンプロテアーゼと免疫交叉反応性を有する。より更なる態様において、前記セリンプロテアーゼは、ミクロコシニアエ、セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼ、および／または配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むセリンプロテアーゼの任意のいずれかの断片（すなわち、部分）と交叉反応性を有する。
【００３０】
更に本発明は、少なくとも１つのセリンプロテアーゼを含む洗浄組成物であって、このプロテアーゼが配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおけるある位置と均等な位置で起こる少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有する変異体プロテアーゼであることを特徴とする洗浄差生物を提供する。幾つかの態様において、前記置換は配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおいて位置２、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４０、４３、４６、４９、５１、５４、６１、６４、６５、６７、７０、７１、７６、７８、７９、８１、８３、８５、８６、９０、９３、９９、１００、１０５、１０７、１０９、１１２、１１３、１１６、１１８、１１９、１２１、１２３、１２７、１４５、１５５、１５９、１６０、１６３、１６５、１７０、１７４、１７９、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、および１８８と同等な位置で起こる。選択的な態様において、前記置換は配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおいて位置１、４、２２、２７、２８、３０、３２、４１、４７、４８、５５、５９、６３、６６、６９、７５、７７、８０、８４、８７、８８、８９、９２、９６、１１０、１１１、１１４、１１５、１１７、１２８、１３４、１４４、１４３、１４６、１５１、１５４、１５６、１５８、１６１、１６６、１７６、１７７、１８１、１８２、１８７、および１８９と同等な位置で起こる。更なる態様において、前記プロテアーゼは配列番号８示されるものと均等なアミノ酸配列において位置１４、１６、３５、３６、６５、７５、７６、７９、１２３、１２７、１５９、および１７９における少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。より更なる態様において、前記プロテアーゼは、Ｒ１４Ｌ、Ｒ１６Ｉ、Ｒ１６Ｌ、Ｒ１６Ｑ、Ｒ３５Ｆ、Ｔ３６Ｓ、Ｇ６５Ｑ、Ｙ７５Ｇ、Ｎ７６Ｌ、Ｎ７６Ｖ、Ｒ７９Ｔ、Ｒ１２３Ｌ、Ｒ１２３Ｑ、Ｒ１２７Ａ、Ｒ１２７Ｋ、Ｒ１２７Ｑ、Ｒ１５９Ｋ、Ｒ１５９Ｑ、およびＲ１７９Ｑからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む。更に追加的な態様において、前記プロテアーゼは、組合せＲ１６Ｑ／Ｒ３５Ｆ／Ｒ１５９Ｑ、Ｒ１６Ｑ／Ｒ１２３Ｌ、Ｒ１４Ｌ／Ｒ１２７Ｑ／Ｒ１５９Ｑ、Ｒ１４Ｌ／Ｒ１７９Ｑ、Ｒ１２３Ｌ／Ｒ１２７Ｑ／Ｒ１７９Ｑ、Ｒ１６Ｑ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ１２７Ｑ、およびＲ１６Ｑ／Ｒ７９Ｔからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む。幾つかの特に好ましい態様において、前記変異セリンプロテアーゼは配列番号８におけるアミノ酸位置に対応する少なくとも１つの置換を含む。ここで、前記変異体プロテアーゼは野生型セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼと比べて、ケラチン加水分解、熱安定性、カゼイン活性、ＬＡＳ安定性、および洗浄からなる群から選択される少なくとも１つの特性において向上した性能を有する。幾つかの態様において、前記変異体プロテアーゼは配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、および７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。選択的な態様において、前記変異体プロテアーゼのアミノ酸配列は配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、および７７からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【００３１】
また本発明は、蛋白分解酵素の洗浄有効量を含む洗浄組成物であって、前記酵素が配列番号４と７０％以上同等なアミノ酸配列を含むことを特徴とする洗浄組成物、および好適な洗浄製剤を提供する。幾つかの好ましい態様において、前記洗浄組成物は、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ（mannanases）、ペクチナーゼ、クチナーゼ（cutinases）、オキシドレダクターゼ、ヘミセルラーゼ、およびセルラーゼからなる群から選択される一つ以上の追加の酵素または酵素誘導体をさらに含む。
【００３２】
また本発明は、ミクロコシニアエのなかまから得られる少なくとも１つのセリンプロテアーゼを含む組成物を提供する。ここで、前記組成物は少なくとも１つの安定化剤をさらに含む。幾つかの態様において、前記安定化剤はボラックス（borax）およびグリセロールからなる群から選択される。幾つかの態様において本発明は、本発明の前記酵素をアニオン性界面活性剤に安定化させるために好適な競合阻害剤を提供する。幾つかの態様において、少なくとも１つのプロテアーゼが、セルロモナス、エルスコビア、セルロシミクロビウム、キシラニバクテリウム、およびプロミクロモノスポラからなる群から選択される生物から得られる。幾つかの好ましい態様において、前記プロテアーゼはセルロモナス６９Ｂ４から得られる。幾つかの特に好ましい態様において、少なくとも１つのプロテアーゼは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３３】
さらに本発明は、ミクロコシニアエのなかまから得られる少なくとも１つのセリンプロテアーゼを含む組成物であって、前記セリンプロテアーゼが自己消化に安定な変異体であることを特徴とする組成物を提供する。幾つかの態様において、少なくとも１つの変異体プロテアーゼは、セルロモナス、エルスコビア、セルロシミクロビウム、キシラニバクテリウム、およびプロミクロモノスポラからなる群から選択される生物から得られる。幾つかの態様において、前記変異体プロテアーゼはセルロモナス６９Ｂ４から得られる。幾つかの特に好ましい態様において、少なくとも１つの変異体プロテアーゼは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３４】
また本発明は、本発明の前記セリンプロテアーゼを０．０００１重量％以上含み、任意に添加成分を含む洗浄組成物を提供する。幾つかの態様において、前記組成物は添加成分を含む。幾つかの好ましい態様において、前記組成物は約３から約５の実質ｐＨの組成物を提供するのに十分量のｐＨ調整剤を含み、ここで前記組成物は約３から約５のｐＨで加水分解する物質を実質的に含まない。追加の態様において、前記洗浄組成物は液体組成物である。更なる態様において、前記表面活性化物質はエチレンオキサイド部分を含むアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤を含む。
【００３５】
追加的に本発明は、少なくとも１つの酸安定酵素を含む洗浄組成物であって、約３から約５の実質ｐＨの組成物を提供するのに十分量のｐＨ調整剤を含み、ここで前記組成物は約３から約５のｐＨで加水分解する物質を実質的に含まないことを特徴とする洗浄組成物を提供する。更なる態様において、前記加水分解する物質は表面活性化物質を含む。幾つかの好ましい態様において、前記洗浄組成物は液体組成物である。さらに追加的な態様においてね前記表面活性化物質はエチレンオキサイド部分を含むアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤を含む。幾つかの態様において、前記組成物は好適な添加成分を含む。幾つかの好ましい態様において、前記組成物は約０．００１から約０．５重量％のＡＳＰを含む。幾つかの選択的な好ましい態様において、前記組成物は約０．０１から約０．１重量％のＡＳＰを含む。
【００３６】
また本発明は、ａ）繊維を含む表面および／または製品を、本発明のセリンプロテアーゼを適当量含む洗浄組成物に接触させる工程、ｂ）任意に、物質の表面を洗浄および／またはすすぐ工程を含む洗浄方法を提供する。選択的な態様において、本発明で提供される任意の好適な組成物はこれらの方法に使用される。
【００３７】
また本発明は、ミクロコシニアエのなかまから得られる少なくとも１つのセリンプロテアーゼを含む動物飼料を提供する。幾つかの態様において、少なくとも１つのプロテアーゼは、セルロモナス、エルスコビア、セルロシミクロビウム、キシラニバクテリウム、およびプロミクロモノスポラからなる群から選択される生物から得られる。幾つかの好ましい態様において、前記プロテアーゼはセルロモナス６９Ｂ４から得られる。幾つかの特に好ましい態様において、少なくとも１つのプロテアーゼは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３８】
本発明は、配列番号８で示されるアミノ酸配列をもつ、蛋白分解活性を有する単離ポリペプチド（例えば、プロテアーゼ）を提供する。幾つかの態様において、本発明は配列番号８で示される配列と約４０％から９８％の同等性を有する単離ポリペプチドを提供する。幾つかの好ましい態様において、本発明は配列番号８で示される配列と約５０％から９５％の同等性を有する単離ポリペプチドを提供する。幾つかの追加的な好ましい態様において、本発明は配列番号８で示される配列と約６０％から９０％の同等性を有する単離ポリペプチドを提供する。さらに追加的な態様において、本発明は配列番号８で示される配列と約６５％から８５％の同等性を有する単離ポリペプチドを提供する。幾つかの特に好ましい態様において、本発明は配列番号８で示される配列と約９０％から９５％の同等性を有する単離ポリペプチドを提供する。
【００３９】
さらに本発明は、ミクロコシニアエ亜目の細菌から得られるプロテアーゼを提供する。幾つかの好ましい態様において、前記プロテアーゼはプロミクロモノスポラシアエ（Promicromonosporaceae）科のなかまから得られる。より更なる態様において、前記プロテアーゼは、キシラニミクロビウム（Xylanimicrobium）、キシラニバクテリウム、キシラニモナス（Xylanimonas）、ミセリゲネランス（Myceligenerans）、およびプロミクロモノスポラ属の任意のなかまから得られる。幾つかの好ましい態様において、前記プロテアーゼはセルロモナダシアエ（Cellulomonadaceae）科のなかまから得られる。幾つかの特に好ましい態様において、前記プロテアーゼはセルロモナスおよびエルスコビア種のなかまから得られる。幾つかの更に好ましい態様において、前記プロテアーゼはセルロモナス種（Cellulomonas spp.）に由来する。幾つかの態様において、セルロモナス種は、セルロモナス・フィミ（fimi）、セルロモナス・ビアゾテア（biazotea）、セルロモナス・セラシア（cellasea）、セルロモナス・ホミニス（hominis）、セルロモナス・フラビゲナ（flavigena）、セルロモナス・ペルシカ（persica）、セルロモナス・イラネンシス（iranensis）、セルロモナス・ゲリダ（gelida）、セルロモナス・フミラタ（humilata）、セルロモナス・トゥルバタ（turbata）、セルロモナス・ウダ（uda）、セルロモナス・フェルメンタンス（fermentans）、セルロモナス・キシラニリティカ（Xylanilytica）、セルロモナス・フミラタ（humilata）およびセルロモナス株６９Ｂ４（ＤＳＭ１６０３５）から選択される。
【００４０】
選択的な態様において、前記プロテアーゼはエルスコビア種に由来する。幾つかの好ましい態様において、前記エルスコビア種は、エルスコビア・ジエネンシス（jenensis）、エルスコビア・パウロメタボラ（paurometabola）、エルスコビア・エンテロフィラ（enterophila）、エルスコビア・トゥルバタ（turbata）、およびエルスコビア・トゥルバタ株ＤＳＭ２０５７７から選択される。
【００４１】
幾つかの態様において、前記プロテアーゼはマトリックス支援レーザ解離／イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分光光度計による測定で約１７ｋＤから２１ｋＤの見かけの分子量を有する。
【００４２】
さらに本発明は、配列番号８と４０％以上同等なアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含むプロテアーゼをコードする単離ポリペプチドを提供する。幾つかの態様において、前記プロテアーゼは配列番号８と５０％以上同等なアミノ酸配列を有する。幾つかの態様において、配列番号８と６０％以上同等なアミノ酸配列を有する。幾つかの態様において、配列番号８と７０％以上同等なアミノ酸配列を有する。幾つかの態様において、配列番号８と８０％以上同等なアミノ酸配列を有する。幾つかの態様において、配列番号８と９０％以上同等なアミノ酸配列を有する。幾つかの態様において、配列番号８と９５％以上同等なアミノ酸配列を有する。また本発明は、上述のように提供される任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００４３】
さらに本発明は、少なくとも１つのプロテアーゼが宿主細胞で発現されるように本発明の発現ベクターで変異した宿主細胞を提供する。幾つかの態様において、前記宿主細胞は細菌であり、他の態様においては真菌である。幾つかの好ましい態様において、細菌宿主細胞は、バチルスおよびストレプトマイセス属からなる群から選択される。幾つかの選択的な好ましい態様において、前記真菌宿主細胞はトリコデルマ属のなかまであり、他の選択的な好ましい態様において、前記真菌宿主細胞はアスペルジルス属のなかまである。
【００４４】
また本発明は、（ｉ）配列番号３または４と７０％以上の同等性、または（ｉｉ）中程度から高度のストリンジェントな条件下で配列番号３または４で開示されたヌクレオチド配列に由来するプローブとハイブリダイズできる、または（ｉｉｉ）配列番号３または４で開示されたヌクレオチド配列と相補的である、ヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。幾つかの態様において、本発明はそのようなポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。更なる態様において、本発明はそのようなベクターで変異した宿主細胞を提供する。
【００４５】
さらに本発明は、プロテアーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素を製造する方法であって、配列番号４と７０％以上同等性を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主細胞を変異させる工程、前記プロテアーゼを生産する宿主細胞に好適な条件下で変異細胞を培養する工程、および前記プロテアーゼを回収する工程を含む方法を提供する。幾つかの好ましい態様において前記宿主細胞はストレプトマイセス種であり、他の態様において前記宿主細胞はバチルス種、トリコデルマ種、および／またはアスペルジルス種である。幾つかの態様において、前記ストレプトマイセス種はストレプトマイセス・リビダンス（lividans）である。選択的な態様において、前記宿主細胞はトリコデルマ・リーセイ（T.reesei）である。更なる態様において、前記アスペルジルス種はアスペルジルス・ニジェ（A.niger）である。
【００４６】
また本発明は、本発明で提供されるプロテアーゼをコードするＤＮＡの断片（すなわち、部分）を提供する。これらの断片は、セルロモナス６９Ｂ４から、または蛋白分解活性を有するそれらのセグメントから本発明で記載される成熟プロテアーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを単離または同定することができる部分長ＤＮＡを得るために用いられる。幾つかの態様において、配列番号１で提供されるＤＮＡの部分は、他種から、特に蛋白分解活性を有するプロテアーゼまたはそれらの部分をコードするミクロコシニアエ種から、ＤＮＡの類似断片を得るのに用いられる。
【００４７】
さらに本発明は、配列番号１、２、３、または４の断片に実質的に同等なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブを提供する。ここで、前記プローブは蛋白分解活性をもつ酵素をコードする核酸配列を検出するために用いられ、前記核酸配列は細菌試料から得られる。幾つかの態様において、前記細菌試料はセルロモナス種である。幾つかの好ましい態様において、前記細菌試料はセルロモナス株６９Ｂ４である。
【００４８】
さらに本発明は、本発明において提供される少なくとも１つのプロテアーゼを含む組成物を提供する。幾つかの好ましい態様において、前記組成物は洗浄組成物である。幾つかの態様において、本発明は、配列番号８と４０％以上の配列同等性、配列番号８と９０％以上の配列同等性を有するアミノ酸配列、および／または配列番号８のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの洗浄有効量のプロテアーゼを含む洗浄組成物を提供する。幾つかの態様において、前記洗浄組成物はさらに少なくと１つの好適な洗浄添加物を含む。幾つかの態様において、前記プロテアーゼはセルロモナス種に由来する。幾つかの好ましい態様において、前記セルロモナス種は、セルロモナス・フィミ、セルロモナス・ビアゾテア、セルロモナス・セラシア、セルロモナス・ホミニス、セルロモナス・フラビゲナ、セルロモナス・ペルシカ、セルロモナス・イラネンシス、セルロモナス・ゲリダ、セルロモナス・フミラタ、セルロモナス・トゥルバタ、セルロモナス・ウダ、およびセルロモナス株６９Ｂ４（ＤＳＭ１６０３５）から選択される。幾つかの特に好ましい態様において、前記セルロモナス種はセルロモナス株６９Ｂ４である。より更なる態様において、前記洗浄組成物は、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、およびセルラーゼからなる群から選択される一つ以上の追加の酵素または酵素誘導体をさらに含む。
【００４９】
また本発明は、配列番号８と４５％以上の配列同等性、配列番号８と６０％以上の配列同等性、配列番号８と７５％以上の配列同等性、配列番号８と９０％以上の配列同等性、配列番号８と９５％以上の配列同等性、および／または配列番号８と配列同等性を有するアミノ酸配列を含む単離天然由来プロテアーゼを提供する。ここで、前記プロテアーゼはセルロモナス種から単離される。幾つかの態様において、前記プロテアーゼはセルロモナス株６９Ｂ４（ＤＳＭ１６０３５）から単離される。
【００５０】
追加的な態様において、本発明は、本発明のセリンプロテアーゼの操作（engineered）変異体を提供する。幾つかの態様において前記操作変異体は組換えＤＮＡ技術を用いて遺伝的に改変されており、他の態様において前記変異体は天然由来である。さらに本発明は類似酵素の操作変異体も含む。幾つかの態様において前記操作変異体類似プロテアーゼは組換えＤＮＡ技術を用いて遺伝的に改変されており、他の態様において前記変異体類似プロテアーゼは天然由来である。
【００５１】
また本発明は、本発明のセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼ（すなわち、ＡＳＰ）と免疫学的に交叉反応を生じるセリンプロテアーゼを提供する。実際に、本発明は動物（ヒトを含むが、これに限定されない）における免疫応答を刺激し、および／または任意のクラスの抗体により認識されるＡＳＰプロテアーゼの断片（例えば、エピトープ）を含むことを意図している。さらに本発明は、ＡＳＰエピトープと交叉反応性をもつプロテアーゼのエピトープを含む。幾つかの態様において、前記ＡＳＰエピトープは抗体により認識されるが、動物（ヒトを含むが、これに限定されない）における免疫応答を刺激しない。一方、他の態様において、前記ＡＳＰエピトープは少なくとも一種の動物（ヒトを含むが、これに限定されない）における免疫応答を刺激し、任意のクラスの抗体により認識される。また本発明は、交叉反応性エピトープを同定および検出する手段および組成物を提供する。
【００５２】
さらに本発明は、（ｉ）配列番号９と７０％以上の配列同等性を有する、または（ｉｉ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で配列番号９をコードするポリペプチド配列由来のプローブとハイブリダイズできる、または（ｉｉｉ）配列番号９で示されるポリペプチド配列に相補的な、シグナルペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを提供する。更なる態様において、本発明は上述のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。より追加的な態様において、前記ベクターにより変異された宿主細胞が提供される。
【００５３】
また本発明は、（ａ）配列番号４と７０％以上の配列同等性を有するポリヌクレオチド、配列番号４と９５％以上の配列同等性を有するポリヌクレオチド、および／または配列番号４のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで宿主細胞を変異させる工程、（ｂ）宿主細胞が前記プロテアーゼを生産するのに好適な条件下で前記変異宿主細胞を培養する工程、（ｃ）前記プロテアーゼを回収する工程を含むプロテアーゼ生産方法を提供する。幾つかの態様において、前記宿主細胞はバチルス種（例えば、バチルス・スブチリス、バチルス・クラウシ（clausii）、またはバチルス・リケニフォルミス（licheniformis））である。選択的な態様において、前記宿主細胞はストレプトマイセス種（例えば、ストレプトマイセス・リビダンス）である。追加的な態様において、前記宿主細胞はトリコデルマ種（例えば、トリコデルマ・リーセイ）である。更なる態様において、前記宿主細胞はアスペルジルス種（例えば、アスペルジルス・ニジェ）である。
【００５４】
いずれ評価されるであろうが、本発明利点はセリンプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする更なるポリヌクレオチドを単離することを可能にするポリヌクレオチドが単離されたことであり、ここでその背景は本発明のセルモナス・プロテアーゼと本質的に同様である。
【００５５】
更なる態様において、本発明は相対的に大量の本発明のセリンプロテアーゼを生産することが可能な宿主細胞を生産する手段を提供する。特に好ましい態様において、本発明は、試料成分、繊維加工、皮革仕上げ、穀物加工、肉加工、洗浄、タンパク質加水分解物調製、消化補助、殺菌剤組成物、静菌剤組成物、静真菌剤組成物、口内ケア、ヘヤケア、および／またはスキンケアを含むパーソナルケア製品と同様に洗浄組成物を含み、ポリペプチドの分解および合成が望まれる様々な商業的応用にプロテアーゼを生産する手段を提供する。
【００５６】
さらに本発明は、現在用いられているスブチリシン（subtilicin）プロテアーゼとくらべて、相当の又は向上した性能を有する酵素組成物を提供する。本発明の他の目的および利点は本発明の詳細な説明より明らかである。
【００５７】
本発明は、配列番号８で示されるアミノ酸配列をもつ、蛋白分解活性を有する単離ポリペプチド（例えば、プロテアーゼ）を提供する。幾つかの態様において、本発明は配列番号８で示される配列と約４０％から９８％の同等性を有する単離ポリペプチドを提供する。幾つかの好ましい態様において、前記ポリペプチドは配列番号８で示される配列と約５０％から９５％の同等性を有する。幾つかの追加的な好ましい態様において、前記ポリペプチドは配列番号８で示される配列と約６０％から９０％の同等性を有する。さらに追加的な態様において、前記ポリペプチドは配列番号８で示される配列と約６５％から８５％の同等性を有する。幾つかの特に好ましい態様において、前記ポリペプチドは配列番号８で示される配列と約９０％から９５％の同等性を有する。
【００５８】
さらに本発明は、ミクロコシニアエ亜目の細菌から得られるプロテアーゼを提供する。幾つかの好ましい態様において、前記プロテアーゼはプロミクロモノスポラシアエ（Promicromonosporaceae）科のなかまから得られる。より更なる態様において、前記プロテアーゼは、キシラニミクロビウム、キシラニバクテリウム、キシラニモナス、ミセリゲネランス、およびプロミクロモノスポラ属の任意のなかまから得られる。幾つかの態様において、前記プロテアーゼはセルロモナダシアエ（Cellulomonadaceae）科のなかまから得られる。幾つかの特に好ましい態様において、前記プロテアーゼはセルロモナスおよびエルスコビア属のなかまから得られる。幾つかのさらに好ましい態様において、前記プロテアーゼはセルロモナス種由来である。幾つかの態様において、前記セルロモナス種は、セルロモナス・フィミ、セルロモナス・ビアゾテア、セルロモナス・セラシア、セルロモナス・ホミニス、セルロモナス・フラビゲナ、セルロモナス・ペルシカ、セルロモナス・イラネンシス、セルロモナス・ゲリダ、セルロモナス・フミラタ、セルロモナス・トゥルバタ、セルロモナス・ウダ、セルロモナス・フェルメンタンス、セルロモナス・キシラニリティカ、セルロモナス・フミラタ、およびセルロモナス株６９Ｂ４（ＤＳＭ１６０３５）から選択される。
【００５９】
選択的な態様において、前記プロテアーゼはエルスコビア種由来である。幾つかの好ましい態様において、前記エルスコビア種は、エルスコビア・ジエネンシス、エルスコビア・パウロメタボラ、エルスコビア・エンテロフィラ、エルスコビア・トゥルバタ、およびエルスコビア・トゥルバタ株ＤＳＭ２０５７７から選択される。
【００６０】
幾つかの態様において、前記プロテアーゼはマトリックス支援レーザ解離／イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分光光度計による測定で約１７ｋＤから２１ｋＤの見かけの分子量を有する。
【００６１】
さらに本発明は、配列番号８と４０％以上のアミノ酸配列同等性を含むアミノ酸配列を含むプロテアーゼをコードする単離ポリペプチドを提供する。幾つかの態様において、前記プロテアーゼは配列番号８と５０％以上のアミノ酸配列同等性を有する。幾つかの態様において、配列番号８と６０％以上のアミノ酸配列同等性を有する。幾つかの態様において、配列番号８と７０％以上のアミノ酸配列同等性を有する。幾つかの態様において、配列番号８と８０％以上のアミノ酸配列同等性を有する。幾つかの態様において、配列番号８と９０％以上のアミノ酸配列同等性を有する。幾つかの態様において、配列番号８と９５％以上のアミノ酸配列同等性を有する。また本発明は、上述のように提供される任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００６２】
さらに本発明は、少なくとも１つのプロテアーゼが宿主細胞で発現されるように本発明の発現ベクターで変異した宿主細胞を提供する。幾つかの態様において、前記宿主細胞は細菌であり、他の態様においては真菌である。幾つかの好ましい態様において、前記細菌宿主細胞は、バチルスおよびストレプトマイセス属からなる群から選択される。幾つかの選択的な好ましい態様において、前記真菌宿主細胞はトリコデルマ属のなかまであり、他の選択的な好ましい態様において、前記真菌宿主細胞はアスペルジルス属のなかまである。
【００６３】
また本発明は、（ｉ）配列番号３または４と７０％以上の同等性、または（ｉｉ）中程度から高度のストリンジェントな条件下で配列番号３または４で開示されたヌクレオチド配列に由来するプローブとハイブリダイズできる、または（ｉｉｉ）配列番号３または４で開示されたヌクレオチド配列と相補的である、ヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。幾つかの態様において、本発明はそのようなポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。更なる態様において、本発明はそのようなベクターで変異した宿主細胞を提供する。
【００６４】
さらに本発明は、プロテアーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素を製造する方法であって、配列番号４と７０％以上の同等性を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主細胞を変異させる工程、前記プロテアーゼを生産する宿主細胞に好適な条件下で変異細胞を培養する工程、および前記プロテアーゼを回収する工程を含む方法を提供する。幾つかの好ましい態様において前記宿主細胞はストレプトマイセス種であり、他の態様において前記宿主細胞はバチルス種、トリコデルマ種、および／またはアスペルジルス種である。幾つかの態様において、前記ストレプトマイセス種はストレプトマイセス・リビダンスである。選択的な態様において、前記宿主細胞はトリコデルマ・リーセイである。更なる態様において、前記アスペルジルス種はアスペルジルス・ニジェである。
【００６５】
さらに本発明は、本発明において提供される少なくとも１つのプロテアーゼを含む組成物を提供する。幾つかの好ましい態様において、前記組成物は洗浄組成物である。幾つかの態様において、本発明は、配列番号８と４０％以上の配列同等性、配列番号８と９０％以上の配列同等性を有するアミノ酸配列、および／または配列番号８のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの洗浄有効量のプロテアーゼを含む洗浄組成物を提供する。幾つかの態様において、前記洗浄組成物はさらに少なくと１つの好適な洗浄添加物を含む。幾つかの態様において、前記プロテアーゼはセルロモナス種に由来する。幾つかの好ましい態様において、前記セルロモナス種は、セルロモナス・フィミ、セルロモナス・ビアゾテア、セルロモナス・セラシア、セルロモナス・ホミニス、セルロモナス・フラビゲナ、セルロモナス・ペルシカ、セルロモナス・イラネンシス、セルロモナス・ゲリダ、セルロモナス・フミラタ、セルロモナス・トゥルバタ、セルロモナス・ウダ、およびセルロモナス株６９Ｂ４（ＤＳＭ１６０３５）から選択される。幾つかの特に好ましい態様において、前記セルロモナス種はセルロモナス株６９Ｂ４である。より更なる態様において、前記洗浄組成物は、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、およびセルラーゼからなる群から選択される一つ以上の追加の酵素または酵素誘導体をさらに含む。
【００６６】
また本発明は、配列番号８と４５％以上の配列同等性、配列番号８と６０％以上の配列同等性、配列番号８と７５％以上の配列同等性、配列番号８と９０％以上の配列同等性、配列番号８と９５％以上の配列同等性、および／または配列番号８と配列同等性を有するアミノ酸配列を含む単離天然由来プロテアーゼを提供する。ここで、前記プロテアーゼはセルロモナス種から単離される。幾つかの態様において、前記プロテアーゼはセルロモナス株６９Ｂ４（ＤＳＭ１６０３５）から単離される。
【００６７】
追加的な態様において、本発明は、本発明のセリンプロテアーゼの操作（engineered）変異体を提供する。幾つかの態様において前記操作変異体は組換えＤＮＡ技術を用いて遺伝的に改変されており、他の態様において前記変異体は天然由来である。さらに本発明は類似酵素の操作変異体も含む。幾つかの態様において前記操作変異体類似プロテアーゼは組換えＤＮＡ技術を用いて遺伝的に改変されており、他の態様において前記変異体類似プロテアーゼは天然由来である。
【００６８】
また本発明は、本発明のＡＳＰプロテアーゼと免疫学的に交叉反応を生じるセリンプロテアーゼを提供する。実際に、本発明は動物（ヒトを含むが、これに限定されない）における免疫応答を刺激し、および／または任意のクラスの抗体により認識されるＡＳＰプロテアーゼの断片（例えば、エピトープ）を含むことを意図している。さらに本発明は、ＡＳＰエピトープと交叉反応性をもつプロテアーゼのエピトープを含む。幾つかの態様において、前記ＡＳＰエピトープは抗体により認識されるが、動物（ヒトを含むが、これに限定されない）における免疫応答を刺激しない。一方、他の態様において、前記ＡＳＰエピトープは少なくとも一種の動物（ヒトを含むが、これに限定されない）における免疫応答を刺激し、任意のクラスの抗体により認識される。また本発明は、交叉反応性エピトープを同定および検出する手段および組成物を提供する。
【００６９】
さらに本発明は、（ｉ）配列番号９と７０％以上の配列同等性を有する、または（ｉｉ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で配列番号９をコードするポリペプチド配列由来のプローブとハイブリダイズできる、または（ｉｉｉ）配列番号９で示されるポリペプチド配列に相補的な、シグナルペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを提供する。更なる態様において、本発明は上述のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。より追加的な態様において、前記ベクターにより変異された宿主細胞が提供される。
【００７０】
また本発明は、（ａ）配列番号４と７０％以上の配列同等性を有するポリヌクレオチド、配列番号４と９５％以上の配列同等性を有するポリヌクレオチド、および／または配列番号４のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで宿主細胞を変異させる工程、（ｂ）宿主細胞が前記プロテアーゼを生産するのに好適な条件下で前記変異宿主細胞を培養する工程、（ｃ）前記プロテアーゼを回収する工程を含むプロテアーゼ生産方法を提供する。幾つかの態様において、前記宿主細胞はバチルス種（例えば、バチルス・スブチリス、バチルス・クラウシ、またはバチルス・リケニフォルミス）である。選択的な態様において、前記宿主細胞はストレプトマイセス種（例えば、ストレプトマイセス・リビダンス）である。追加的な態様において、前記宿主細胞はトリコデルマ種（例えば、トリコデルマ・リーセイ）である。更なる態様において、前記宿主細胞はアスペルジルス種（例えば、アスペルジルス・ニジェ）である。
【００７１】
いずれ評価されるであろうが、本発明利点はセリンプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする更なるポリヌクレオチドを単離することを可能にするポリヌクレオチドが単離されたことであり、ここでその背景は本発明のセルモナス・プロテアーゼと本質的に同様である。
【００７２】
更なる態様において、本発明は相対的に大量の本発明のセリンプロテアーゼを生産することが可能な宿主細胞を生産する手段を提供する。特に好ましい態様において、本発明は、試料成分、繊維加工、皮革仕上げ、穀物加工、肉加工、洗浄、タンパク質加水分解物調製、消化補助、殺菌剤組成物、静菌剤組成物、静真菌剤組成物、口内ケア、ヘヤケア、および／またはスキンケアを含むパーソナルケア製品と同様に洗浄組成物を含み、ポリペプチドの分解および合成が望まれる様々な商業的応用にプロテアーゼを生産する手段を提供する。
【００７３】
さらに本発明は、現在用いられているスブチリシン・プロテアーゼとくらべて、相当の又は向上した性能を有する酵素組成物を提供する。本発明の他の目的および利点は本発明の詳細な説明より明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７４】
以下に、本発明の実施形態について説明する。
図面の簡単な説明
【００７５】
図１は、セルロモナダシアエ科のなかま及びミクロコシニアエ亜目の他の関連する属に対する新規６９Ｂ４株の関係を表す未確立の系統樹を示す図である。
【００７６】
図２は、ＡＳＰプロテアーゼの系統樹を示す図である。
【００７７】
図３は、セルロモナス６９Ｂ４株由来プロテアーゼのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【００７８】
図４は、セルロモナス・フラビゲナ由来のＮ末端が最もトリプティック（tryptic）なペプチドの配列を示す図である。
【００７９】
図５は、ｐＳＥＧＣＴベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００８０】
図６は、ｐＳＥＧＣＴ６９Ｂ４ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００８１】
図７は、ｐＳＥＡ４６９ＢＣＴベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００８２】
図８は、ｐＨＰＬＴ−Ａｓｐ−Ｃ１−１ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００８３】
図９は、ｐＨＰＬＴ−Ａｓｐ−Ｃ１−２ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００８４】
図１０は、ｐＨＰＬＴ−Ａｓｐ−Ｃ２−１ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００８５】
図１１は、ｐＨＰＬＴ−Ａｓｐ−Ｃ２−２ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００８６】
図１２は、ｐＨＰＬＴ−ＡＳＰ−ＩＩＩベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００８７】
図１３は、ｐＨＰＬＴ−ＡＳＰ−ＩＶベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００８８】
図１４は、ｐＨＰＬＴ−ＡＳＰ−ＶＩＩベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００８９】
図１５は、ｐＸＸ−Ｋｐｎｌベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００９０】
図１６は、ｐ２ＪＭ１０３−ＤＮＮＰ１ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００９１】
図１７は、ｐＨＰＬＴベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００９２】
図１８は、開裂ｐＨＰＬＴ−ＡＳＰ−Ｃ１−２用のマップおよびＭＸＬ−ｐｒｏｍ配列を示す図である。
【００９３】
図１９は、ｐＥＮＭｘ３ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００９４】
図２０は、ｐｌＣａｔＨベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００９５】
図２１は、ｐＴＲＥＸ４ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００９６】
図２２は、ｐＳＬＧＡＭｐＲ２ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００９７】
図２３は、ｐＲＡＸｄｅｓ２−ＡＳＰベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００９８】
図２４は、ｐＡＰＤＩベクターのプラスミドマップを示す図である。
【００９９】
図２５は、ＡＳＰ自己消化を示すグラフである。パネルＡは、ＬＡＳを含有しない緩衝液中で観察されるＡＳＰ自己消化ペプチドを示す。パネルＢは、０．１％ＬＡＳ含有する緩衝液中で観察されるＡＳＰ自己消化ペプチドを示す。
【０１００】
図２６は、特定のセリンプロテアーゼの洗浄活性（４０５ｎｍにおける吸光度）−用量（ｐｐｍ）応答曲線を比較したグラフである。（北米洗浄条件下における液体ＴＩＤＥR洗剤中の６９Ｂ４［-×-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-◆-］；ＲＥＬＡＳＥTM［-▲-］；およびＯＰＴＩＭＡＳＥTM［-■-］）
【０１０１】
図２７は、特定のセリンプロテアーゼの洗浄活性（４０５ｎｍにおける吸光度）−用量（ｐｐｍ）応答曲線を比較したグラフである。（日本洗浄条件下における洗剤組成物III粉末洗剤（０．６６ｇ／Ｌ）北米濃度／洗剤製剤中の６９Ｂ４［-×-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-◆-］；ＲＥＬＡＳＥTM［-▲-］；およびＯＰＴＩＭＡＳＥTM［-■-］）
【０１０２】
図２８は、特定のセリンプロテアーゼの洗浄活性（４０５ｎｍにおける吸光度）−用量（ｐｐｍ）応答曲線を比較したグラフである（欧州洗浄条件下におけるＡＲＩＥＬRＲＥＧＵＬＡＲ洗剤粉末中の６９Ｂ４［-×-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-◆-］；ＲＥＬＡＳＥTM［-▲-］；およびＯＰＴＩＭＡＳＥTM［-■-］）。
【０１０３】
図２９は、特定のセリンプロテアーゼの洗浄活性（４０５ｎｍにおける吸光度）−用量（ｐｐｍ）応答曲線を比較したグラフである（日本条件下におけるＰＵＲＥ  ＣＬＥＡＮ洗剤粉末中の６９Ｂ４［-×-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-◆-］；ＲＥＬＡＳＥTM［-▲-］；およびＯＰＴＩＭＡＳＥTM［-■-］）。
【０１０４】
図３０は、特定のセリンプロテアーゼの洗浄活性（４０５ｎｍにおける吸光度）−用量（ｐｐｍ）応答曲線を比較したグラフである（北米条件下における洗剤組成物III粉末（１．００ｇ／Ｌ）中の６９Ｂ４［-×-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-◆-］；ＲＥＬＡＳＥTM［-▲-］；およびＯＰＴＩＭＡＳＥTM［-■-］）。
【０１０５】
図３１は、時間経過（分）による酵素活性パーセントの測定により様々なセリンプロテアーゼ（１００ｐｐｍ）の酸化不活性化を比較したグラフである（ｐＨ９．４５、２５℃において０．１Ｍ過酸化水素存在下の６９Ｂ４［-×-］；ＢＰＮ’変異体１［-◆-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-▲-］；およびＧＧ３６−変異体１［-■-］）。
【０１０６】
図３２は、時間経過（分）による酵素活性パーセントの測定により様々なセリンプロテアーゼ（１００ｐｐｍ）のキレーター不活性化を比較したグラフである（ｐＨ８．２０、４５℃において１０ｍＭＥＤＴＡ存在下の６９Ｂ４［-×-］；ＢＰＮ’変異体１［-◆-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-▲-］；およびＧＧ３６−変異体１［-■-］）。
【０１０７】
図３３は、時間経過（分）による酵素活性パーセントの測定により様々なセリンプロテアーゼ（１００ｐｐｍ）の温度不活性化を比較したグラフである（ｐＨ８．０、４５℃において５０ｍＭＴｒｉｓ存在下の６９Ｂ４［-×-］；ＢＰＮ’変異体１［-◆-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-▲-］；およびＧＧ３６−変異体１［-■-］）。
【０１０８】
図３４は、特定のセリンプロテアーゼの温度不活性化を比較したグラフである（ｐＨ８．６０、５７℃から６２℃への温度グラジエント条件下の６９Ｂ４［-×-］；ＢＰＮ’変異体１［-◆-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-▲-］；およびＧＧ３６−変異体１［-■-］）。
【０１０９】
図３５は、特定のセリンプロテアーゼ（２．５ｐｐｍ）の酵素活性（４０５ｎｍの吸光度で測定したジメチルカゼインの加水分解）を示すグラフである（３７℃、ｐＨ５〜ｐＨ１２条件下の６９Ｂ４［-×-］；ＢＰＮ’変異体１［-◆-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-▲-］；およびＧＧ３６−変異体１［-■-］）。
【０１１０】
図３６は、特定のセリンプロテアーゼ（２．５ｐｐｍ）の％残存活性（４０５ｎｍの吸光度で測定したジメチルカゼインの加水分解）により表される酵素安定性を示す棒グラフである（それぞれ２５℃、３５℃、および４５℃、下記のｐＨ３、４、５、および６条件下の６９Ｂ４、ＢＰＮ’変異体１、ＰＵＲＡＦＥＣＴR、およびＧＧ３６−変異体１）。
【０１１１】
図３７は、それぞれ２５℃、３５℃、および４５℃、ｐＨ３（-◆-）、４（-■-）、５（-▲-）、および６（-×-）条件下のＢＰＮ’変異体１の％残存活性により表される酵素安定性を示すグラフである。
【０１１２】
図３８は、それぞれ２５℃、３５℃、および４５℃、ｐＨ３（-◆-）、４（-■-）、５（-▲-）、および６（-×-）条件下のＰＵＲＡＦＥＣＴRＴＭプロテアーゼの％残存活性により表される酵素安定性を示すグラフである。
【０１１３】
図３９は、それぞれ２５℃、３５℃、および４５℃、ｐＨ３（-◆-）、４（-■-）、５（-▲-）、および６（-×-）条件下の６９Ｂ４プロテアーゼの％残存活性により表される酵素安定性を示すグラフである。
【０１１４】
発明の詳細な説明
本発明は、新規なセリンプロテアーゼ、これらの酵素をコードする新規な遺伝子材料、およびセルロモナス種を含むが、これに限定されないミクロコシニアエ種から得られる蛋白分解性タンパク質、およびそれら由来の変異体タンパク質を提供する。特に本発明は、セルロモナス種から得られたプロテアーゼ組成物、ＤＮＡがコードするプロテアーゼ、該ＤＮＡがコードするプロテアーゼを含むベクター、前記ベクターＤＮＡにより変異した宿主細胞、および該宿主細胞により生産された酵素を提供する。また本発明は、セルロモナス種を含むが、これに限定されないミクロコシニアエ種から得られる洗浄組成物（例えば、洗剤組成物）、動物飼料組成物、並びに繊維および皮革加工組成物を提供する。選択的な態様において、本発明は、本発明で記載される野生型プロテアーゼ由来のミュータント（すなわち、変異体）プロテアーゼを提供する。これらのミュータント・プロテアーゼも多くの応用に用いられる。
【０１１５】
グラム陽性好塩基性細菌が塩基性ソーダ湖の中および周辺から単離されてきた（米国特許５，４０１，６５７号を参照されたい。本文献は参照により本発明に取り込まれる。）。これらの好塩基性細菌は、相互の多くの分類の原則、および既知の細菌のコレクションに基づいて分析され、分類学的に性格付けされた。好塩基性細菌の６つの天然群またはフェノン（phenon）が生じた。分離株のうち同定されたものは６９Ｂ４であった。
【０１１６】
セルロモナス種は、セルロモナダシアエ科、ミクロコシネアエ亜目、アクチノミセタレス（Actinomycetales）目、アクチノバクテリア綱のなかまとして分類されるグラム陽性細菌である。セルロモナスは細く、時々分枝のある棒状にしばしば成長するが、菌糸は形成されない。さらに、空気中で成長せず、胞子は形成されない。遺伝学的レベルでセルロモナスとストレプトマイセスは僅かな関係しかもっていない。セルロモナスとストレプトマイセスとの遺伝学的な（ゲノムの）大きな差異は表現型の特性の大きな違いに反映している。ストレプトマイセスにおけるセリンプロテアーゼはこれまでに検討されてきたが、セルロモナス種により分泌されるセリンプロテアーゼ（分子量約１８，０００から２０，０００）についての報告はないようである。さらに、洗浄および／または飼料産業において用いられるセルロモナス・プロテアーゼについての報告はこれまでにないようである。
【０１１７】
ストレプトマイセスは、ストレプトマイセタシアエ（Streptomycetaceae）科、ストレプトマイシニアエ亜目、アクチノミセタレス目、アクチノバクテリア綱のなかまとして分類されるグラム陽性細菌である。ストレプトマイセスは広範に分枝した主要な又は下層の菌糸として成長し、また成熟すると特徴的な胞子をもつ多数の空気中の菌糸として成長する。ストレプトグリシン（Streptogrisin）は広範で多様なストレプトマイセス種から大量に分泌されるセリンプロテアーゼである。スチレプトマイセス・プロテアーゼのアミノ酸配列は、ストレプトマイセス・グリセウス（griseus）ストレプトグリシンＣ（受託番号：Ｐ５２３２０）、ストレプトマイセス種（受託番号：ＰＣ２０５３）由来アルカリ・セリンプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．−）、ストレプトマイセス種（受託番号：Ｓ３４６７２）由来アルカリ・セリンプロテアーゼＩ、ストレプトマイセス・リビダンス（受託番号：ＣＡＤ４２０８）由来セリンプロテアーゼ、ストレプトマイセス・コエリコロル（coelicolor）Ａ３（２）（受託番号：ＮＰ＿６２５１２９）由来の推定セリンプロテアーゼ、ストレプトマイセス・アベルミティリス（avermitilis）ＭＡ−４６８０（受託番号：ＮＰ＿８２２１７５）由来の推定セリンプロテアーゼ、ストレプトマイセス・リビダンス（受託番号：ＣＡＤ４２８０９）由来セリンプロテアーゼ、ストレプトマイセス・コエリコロルＡ３（２）（受託番号：ＮＰ＿６２８８３０）由来の推定セリンプロテアーゼ前駆体を含む９種以上のストレプトマイセス種から決定されてきた。１９，０００ダルトンの見かけの分子量をもち、ストレプトマイセス・グリセウス・バル・アルカロフィルス（var. alcalophilus）プロテアーゼから分離された単離天然アルカリ・プロテアーゼ、およびそれを含む洗浄組成物が報告されてきている（例えば、米国特許５，６４６，０２８号を参照されたい。本文献は参照により本発明に取り込まれる。）。
【０１１８】
本発明は、これらの生物体により生産されるプロテアーゼを提供する。重要なことに、これらの酵素は良好な安定性と蛋白分解活性を有する。これらの酵素は、洗浄組成物、動物飼料、繊維加工等を含むが、これらに限定されない様々な応用に用いられる。また本発明はこれらの酵素を生産する手段を提供する。幾つかの好ましい態様において、本発明のプロテアーゼは純粋または相当純粋な状態にある。
【０１１９】
また本発明は、遺伝子組換え生物体において本発明のプロテアーゼを生産するのに好適なヌクレオチド配列を提供する。幾つかの態様おいて、遺伝子組換え生産は商業的価値のある品質のプロテアーゼを生産する手段を提供する。
【０１２０】
特記しない限り、本発明の実施には当該分野の技術水準の範囲内にある、分子生物学、微生物学および遺伝子組換えＤＮＡに用いられる共通の従来技術が含まれる。そのような技術は当業者は既知であり、多くの教科書および参考文献に記載されている。（例えば、サムブルック（Sambrook）他著、「分子クローニング：研究室マニュアル」、第二版、コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年；およびオウスベル（Ausubel）他著、「分子生物学における現在のプロトコル」、１９８７年、を参照されたい。）本発明で前述または後述する特許、特許出願、記事および出版物は参照により本発明に明確に取り込まれる。
【０１２１】
特記しない限り、本発明で用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が関連する当業者によって通常理解される意味を有する。例えば、シングルトン及びセインスベリ（Singleton and Sainsbury）著、「微生物学及び分子生物学辞典」、第２版、ジョンウィリー・アンド・サン社、ニューヨーク（１９９４年）；およびヘール及びマーハム（Hale and Marham）著、「ハーパーコリンズ（Harper Collins）・生物学辞典」、ハーバー・ペレニアル社、ニューヨーク（１９９１年）は、本発明で用いられる多くの用語の一般辞書を当業者に提供する。本発明で記述されるものに類似または同等ないかなる方法および物質が本発明の実施に利用されたとしても、好ましい方法および物質は本発明に記載されている。したがって、以下に直に定義される用語は、全体としては詳細な説明を参照してより完全に記載される。また本発明で用いられているように、単数型の表現は明確に特記されない限り複数型も含む。数の範囲は、その範囲を定義する数を含む。特記しない限り、核酸は左から右に５’から３’方向を記載し、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシの方向を記載している。本発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されるものではなく、それらが当業者により用いられる文脈によって変化するものと理解されるべきである。
【０１２２】
特記しない限り、本発明の実施には、当該分野の技術水準の範囲内にあるタンパク質精製、分子生物学、微生物学、遺伝子組換えＤＮＡ、およびタンパク質配列に従来技術が採用される。
【０１２３】
さらに、本発明で示される表題は、全体としては詳細な説明を参照することにより得られる本発明の様々な局面や態様を限定するものではない。したがって、下記に直に記載される用語は、全体としては詳細な説明を参照してより完全に定義される。しかしながら、本発明の理解を容易にするため、多くの用語について以下に定義する。
【０１２４】
１．定義
本発明で用いられるように、「プロテアーゼ」、および「蛋白分解活性」という用語は、ペプチド結合をもつペプチドまたは基質を加水分解する能力を示すタンパク質またはペプチドのことをいう。蛋白分解活性を測定するための多くの周知の操作法が存在している（フリーチャー編「生化学工学／バイオテクノロジーの進歩」（１９８８年）中のカリツ（Kalisz）著「微生物プロテイナーゼ」）。例えば、蛋白分解活性は、市販の基質を加水分解するプロテアーゼのそれぞれの性能を分析する比較アッセイにより確認することができる。プロテアーゼまたは蛋白分解活性のそのような分析に有用な具体的な基質には、ジメチルカゼイン（シグマ社Ｃ−９８０１）、ウシ・コラーゲン（シグマ社Ｃ−９８７９）、ウシ・エラスチン（シグマ社Ｅ−１６２５）、およびウシ・ケラチン（ＩＣＮバイオメディカル社：９０２１１１）が含まれるが、これらに限定されない。これらの基質を利用した比色試験は当該技術分野において周知である。（例えば、ＷＯ９９／３４０１１および米国特許６，３７６，４５０号を参照されたい。本文献は参照により本発明に取り込まれる。）ｐＮＡ試験（例えば、デル・マル他著、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.）９９巻、３１６−３２０頁、１９７９年を参照されたい。）もグラジエント溶出時に回収される分画の活性酵素濃度を測定するために利用される。この試験は、酵素が溶解性合成基質であるスクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解する際にｐ−にとろアニリンが放出される速度を測定する。加水分解反応による黄色の生成速度は分光光度計により４１０ｎｍで測定され、活性酵素濃度に比例する。さらに２８０ｎｍにおける吸光度測定は総蛋白濃度を測定するために用いられる。活性酵素／総蛋白比により酵素純度がわかる。
【０１２５】
本発明で用いられるように、「ＡＳＰプロテアーゼ」、「Ａｓｐプロテアーゼ」、および「Ａｓｐ」という用語は本発明で記載されるセリンプロテアーゼのことをいう。幾つかの好ましい態様において、Ａｓｐプロテアーゼはセルロモナス６９Ｂ４株から得られる６９Ｂ４プロテアーゼとして本発明において設計されたプロテアーゼである。したがって、好ましい態様において、「６９Ｂ４プロテアーゼ」という用語は、配列番号８で示されるアミノ酸配列に実質的に同等なアミノ酸配列を有するセルロモナス６９Ｂ４株由来の天然発生成熟タンパク質のことをいう。選択的な態様において、本発明はＡＳＰプロテアーゼの部分を提供する。
【０１２６】
「セルロモナス・プロテアーゼ・ホモローグ」という用語は、そのような天然発生プロテアーゼをコードするセルロモナス６９Ｂ４株またはポリヌクレオチド配列由来の天然プロテアーゼと実質的に同等なアミノ酸配列を有する天然発生プロテアーゼであり、このプロテアーゼはそのような核酸でコードされるセリンプロテアーゼの機能特性を保持しているもののことをいう。幾つかの態様において、これらのプロテアーゼ・ホモローグは「セルロモナディン」と呼ばれる。
【０１２７】
本発明で用いられるように、「プロテアーゼ変異体」、「ＡＳＰ変異体」、「ＡＳＰプロテアーゼ変異体」、および「６９Ｂプロテアーゼ変異体」は、特にその機能において野生型ＡＳＰと類似であるが、野生型プロテアーゼとは配列で異なるアミノ酸配列における変異を有するプロテアーゼのことをいう。
【０１２８】
本発明で用いられるように、「セルロモナス種」は「セルロモナス」属中の全ての種であり、セルロモナダシアエ科、ミクロコシネアエ亜目、アクチノミセタレス（Actinomycetales）目、アクチノバクテリア綱のなかまとして分類されるグラム陽性細菌のことをいう。セルロモナス属については分類学的再編成が継続しておこなわれているものと考えられる。したがって、この属は再分類されてきた種を含むことを意図している。
【０１２９】
本発明で用いられるように、「ストレプトマイセス種」は「ストレプトマイセス」属中の全ての種であり、ストレプトマイセタシアエ科、ストレプトマイシニアエ亜目、アクチノミセタレス目、アクチノバクテリア綱のなかまとして分類されるグラム陽性細菌のことをいう。ストレプトマイセス属については分類学的再編成が継続しておこなわれているものと考えられる。したがって、この属は再分類されてきた種を含むことを意図している。
【０１３０】
本発明で用いられるように、「バチルス属」は、当業者に知られている「バチルス」属の範囲内の全ての種を含む。これらには、バチルス・スブチリス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス（lentus）、バチルス・ブレビス（brevis）、バチルス・ステアロテルモフィルス（stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシ（clausii）、バチルス・ハロデュランス（halodurans）、バチルス・メガテリウム（megaterium）、バチルス・コアグランス（coagulans）、バチルス・シルクランス（circulans）、バチルス・ラウトゥス（lautus）、およびバチルス・トゥリンギエンシス（thuringiensis）が含まれるが、これらに限定されない。バチルス属については分類学的再編成が継続しておこなわれているものと考えられる。したがって、この属は再分類されてきた種を含むことを意図している。これらには、現在では「ゲオバチルス（geobacillus）・ステアロテルモフィルス」と命名されたバチルス・ステアロテルモフィルスのような生物体が含まれるが、これに限定されない。酸素存在下における抵抗性内生胞子の生産はバチルス属の特徴を決定すると考えられる。もっともこの特徴も最近命名されたアリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、アムフィバチルス（Amphibacillus）、アノイリニバチルス（Aneurinibacillus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、ブレビバチルス（brevibacillus）、フィロバチルス（Filobacillus）、グラシリバチルス（Gracilibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、ペニバチルス（Paenibacillus）、サリバチルス（Salibacillus）、テルモバチルス（Thermobacillus）、ウレイバチルス（Ureibacillus）、およびビルギバチルス（Virgibacillus）に適用する。
【０１３１】
本発明において互換的に用いられる「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー状形態である、リボヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドの両方のことをいう。これらの用語には、一本鎖、二本鎖、または三本鎖ＤＮＡ、遺伝子ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、並びにプリンおよびピリミジン塩基、または他の天然の、化学的、生化学的に修飾された非天然または誘導化塩基が含まれるが、これらに限定されない。以下にポリヌクレオチドの非限定的な具体例を示す。すなわち、遺伝子、遺伝子断片、クロモソーム断片、ＥＳＴ、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボゾーム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の単離ＤＮＡ、任意配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーである。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド・ホモローグのような修飾ヌクレオチド、ウラシル、フルオロリボースおよびチオエート（thioate）のような他の糖および結合基、およびヌクレオチド分枝を含む。選択的な態様において、ヌクレオチド配列は非ヌクレオチド成分により分断されている。
【０１３２】
本発明で用いられるように、「ＤＮＡ構築体（construct）」および「変異（transforming）ＤＮＡ」という用語は、宿主細胞または生物体に配列を導入するために用いられるＤＮＡのことをいう。このＤＮＡは、当業者に既知のin vitro ＰＣＲまたは任意の他の適切な技術によって生成することができる。特に好ましい態様において、前記ＤＮＡ構築体は関心のある配列（例えば、導入配列として）を含む。幾つかの態様において、前記配列は、制御因子（例えば、プロモータ等）のような追加的な因子に人的に結合されている。前記ＤＮＡ構築体はさらに選択可能マーカーを含むことができる。さらにホモロジー・ボックスを脇に備えた導入配列を含むことができる。更なる態様において、前記変異ＤＮＡは、末端に追加した他の非類似の配列（例えば、挿入配列（stuffer sequence）または隣接配列（flanks））を含む。幾つかの態様において、導入配列の末端は、変異ＤＮＡが閉環を形成するように閉じられている。前期変異配列は野生型でも変異体または修飾体でもよい。幾つかの態様において、前記ＤＮＡ構築体は非類似配列を含む。一旦ＤＮＡ構築体がin vitroで組立てられると、これを、１）異種配列を宿主細胞の所望の標的配列に挿入するため、２）宿主細胞クロモソームのある領域に突然変異を誘発させるため（すなわち、内生配列を異種配列で置換するため）、３）標的遺伝子を除去し、および／または宿主細胞に複製プラスミドを導入するために用いることができる。
【０１３３】
本発明で用いられるように、「発現カセット」および「発現ベクター」という用語は、標的細胞中の特定核酸の転写を可能にする一群の特定の核酸を備えた、遺伝子組換え的または合成的に生成させた核酸構築体のことをいう。前記組換体発現カセットは、プラスミド、クロモソーム、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウィルス、または核酸断片に取り込むことができる。具体的には、発現ベクターの組換体発現カセット部分は、他の配列の中に転写されるべき核酸配列およびプロモータを含む。好ましい態様において、発現ベクターは宿主細胞に異種ＤＮＡ断片を取り込み、発現する能力を有する。適当な発現ベクターの選択を当業者はその知識の範囲内で行うことができる。「発現カセット」という用語は、本発明において「ＤＮＡ構築体」と互換的に用いられ、文法的には等価物である。適当な発現ベクターの選択を当業者はその知識の範囲内で行うことができる。
【０１３４】
本発明で用いられるように、「ベクター」という用語は一種以上の細胞型に核酸を導入するために設計されたポリヌクレオチド構築体のことをいう。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、カセット等が含まれる。幾つかの態様において、前記ポリヌクレオチド構築体は、好適な宿主細胞のＤＮＡ発現を奏功することができる好適な前駆配列（例えば、分泌的など）に操作可能に結合されたプロテアーゼ（例えば、前駆体または成熟プロテアーゼ）をコードするＤＮＡ配列を含む。
【０１３５】
本発明で用いられるように、「プラスミド」という用語はクローニングベクターとして用いられる環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築体のことをいい、幾つかの真核生物または原核生物でクロモソーム外の自己複製遺伝子因子を形成し、または宿主クロモソーム内に組み込む。
【０１３６】
本発明で用いられるように、細胞に核酸を導入するという文脈において「導入される」という用語は、細胞に核酸を移転させるのに好適な任意の方法のことをいう。そのような導入のための方法には、プロプラスト融合、形質移入（transfection）、形質転換（transformation）、接合（conjugation）、および誘導（transduction）が含まれるが、これらに限定されない（例えば、ハードウッド他編「バチルス」（プレナム出版）中のフェラーリ他著「遺伝学」、５７−７２頁、１９８９年を参照されたい。）。
【０１３７】
本発明で用いられるように、「形質転換された」および「安定に形質転換された」という用語は、少なくとも二世代の間維持されるゲノム中に、またはエピソームプラスミドとして組み込まれた非内生の（異種の）ポリヌクレオチド配列を有する細胞のことをいう。
【０１３８】
本発明で用いられるように、「選択可能マーカーでコードされたヌクレオチド配列」という用語は、宿主細胞で発現可能で、選択可能マーカーの発現が発現遺伝子を含む細胞に対応する選択的な薬剤の存在下または必須栄養の欠乏下で成長する能力を与えるようなヌクレオチド配列のことをいう。
【０１３９】
本発明で用いられるように、「選択可能マーカー」および「選択マーカー」という用語は、ベクターを有するそのような宿主の選択を容易にするために宿主細胞で発現できる核酸（例えば、遺伝子）のことをいう。そのような選択可能マーカーの具体例には、抗微生物抗体が含まれるが、これに限定されることはない。したがって、「選択可能マーカー」という用語は、宿主細胞が関心のある導入ＤＮＡを取り込む、またはある他の反応が起こることを示す遺伝子のことをいう。具体的には、選択可能マーカーは、形質転換の間にいずれの外部配列をも受容しない細胞から区別される外部ＤＮＡを含むことを細胞が許容するために宿主細胞に微生物に対する抵抗性または代謝上の利点を与える遺伝子のことをいう。「内在（residing）選択可能マーカー」は形質転換される微生物のクロモソームに位置するものである。内在選択可能マーカーは、形質転換用のＤＮＡ構築体上の選択可能マーカーとは異なる遺伝子をコードする。選択マーカーは当業者に周知である。上述のように、好ましくは前記マーカー微生物に対して抵抗性のマーカー（例えば、ａｍｐR、ｐｈｌｅｏR、ｓｐｅｃR、ｋａｎR、ｅｒｙR、ｔｅｔR、ｃｍｐR、およびｎｅｏRである。ゲロ−フルリ（Guerot-Fleury）著、遺伝子、１６７巻、３３５−３３７頁、１９９５年；パルメロ（Palmeros）他著、遺伝子、２４７巻、２５５−２６４頁、２０００年；およびトゥル−キュオ（Trieu-Cuot）他著、遺伝子、２３巻、３３１−３４１頁、１９８３年を参照されたい。）である。本発明にしたがい有用な他のマーカーには、トリプトファンのような栄養要求性マーカー、β−グルコシダーゼのような検出マーカーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
本発明で用いられるように、「プロモータ」という用語は下流遺伝子の転写を命令するために働く核酸配列のことをいう。好ましい態様において、前記プロモータは標的遺伝子が発現される宿主細胞に適している。他の転写および翻訳制御核酸配列（「制御配列（control sequences）とも呼ばれる」）と共に、前記プロモータは特定の遺伝子を発現するために必要である。一般的に前記転写および翻訳制御配列は、プロモータ配列、リボゾーム結合部位、およびエンハンサまたはアクティベイター配列を含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
他の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、核酸は「操作可能に結合される（operably linked）」という。例えば、分泌リーダー（すなわち、シグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与する前駆タンパク質として発現されるなら、そのポリペフチド用のＤＮＡに操作可能に結合される。プロモータまたはエンハンサは、それが配列の転写に奏功するなら、コード配列に操作可能に結合される。また、リボゾーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように位置するなら、コード配列に操作可能に結合される。一般的に「操作可能に結合される」は、結合するＤＮＡ配列は隣接しており、分泌リーダーの場合には隣接し、読取領域に存在する。しかしながら、エンハンサは隣接する必要はない。結合は都合の良い制限部位でリガーゼ結合により行われる。そのような部位がない場合には、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーが従来の実施にしたがって用いられる。
【０１４２】
本発明で用いられるように、「遺伝子」という用語は、個々のコード領域（エクソン）の間の分断配列（イントロン）と同様に、ポリペプチドをコードし、コード領域の前後の領域を含むポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ領域）のことをいう。
【０１４３】
本発明で用いられるように、「ホモログ（homologous）遺伝子」という用語は、互いに対応し、互いに同等か非常に類似している、異なっているが通常関連する種から得られる一対の遺伝子のことをいう。この用語は、遺伝的複製により分離されてきた遺伝子（例えば、パラログ遺伝子）と同様に種形成（すなわち、新種の発生）により分離した遺伝子（オーソログ遺伝子）を含む。
【０１４４】
本発明で用いられるように、「オーソログ」および「オーソログ遺伝子」は、共通の先祖遺伝子（すなわち、ホモログ遺伝子）から種形成により進化してきた異種の遺伝子のことをいう。具体的には、オーソログ遺伝子は進化過程の間に同様の機能を保持した。オーソログ遺伝子の同定は新しくシークエンスされたゲノムにおける遺伝子機能の信頼性のある予測に用いられる。
【０１４５】
本発明で用いられるように、「パラログ」および「パラログ遺伝子」は、ゲノム内の複製により関連する遺伝子のことをいう。オーソログ遺伝子が進化過程を通して同様の保持しているのに対し、幾つかの機能が度々従来の機能と関連しているとしても、パラログ遺伝子は新しい機能を進化させている。パラログ遺伝子の具体的な例には、いずれもセリンプロテイナーゼであり同種内で共に生じる、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、およびスロンビンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
本発明で用いられるように、「ホモロジー」は、同等性が好ましいが、配列類似性または同等性のことをいう。このホモロジーは当該技術分野で既知の標準技術を用いて決定される（例えば、スミスおよびウォーターマン著、アドバンスト・アプライド・マスマティクス（Adv.Appl.Math.）、２巻、４８２頁、１９８１年；ニードルマンおよびウンシュ（Wunsch）著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、４８巻、４４３頁、１９７０年；ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウエア・パッケージ（ジェネティクス・コンピュータ・グループ社、マディソン、ウィスコンシン州）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡのようなプログラム；およびドブリュー（Devereux）他著、ニュクレイック・アシッド・リサーチ（Nucl.Acid.Res.）、１２巻、３８７−３９５頁、１９８４年）。
【０１４７】
本発明で用いられるように、「類似体配列」はセルロモナス６９Ｂ４株プロテアーゼに基づく遺伝子と実質的に同じ遺伝子の機能をもつものをいう。追加的に、類似体遺伝子はセルロモナス６９Ｂ４株プロテアーゼ配列と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同等性を含む。選択的に、類似体配列はセルロモナス６９Ｂ４株プロテアーゼ領域に認められる遺伝子の７０〜１００％の位置同一性（alignment）を有し、および／またはセルロモナス６９Ｂ４株クロモソームにおける遺伝子と一致する領域に認められる少なくとも５〜１０の遺伝子を有する。追加的な態様において、上記特性のうちの１つ以上が前記配列に適用される。類似体配列は配列アラインメント（alignment）の既知の方法により決定される。通常用いられるアラインメント方法はＢＬＡＳＴである。もっとも、前述または後述するように配列アラインメントに用いられる他の方法もある。
【０１４８】
有用なアルゴリズムの１つの具体例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは進歩したペア−ワイズ（pair-wise）・アランイメントを用いて関連配列群から多数の配列を生成する。また、アラインメントを生成するために用いられる集合（clustering）関係を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＴはフェンおよびドゥーリトル（Feng and Doolittle）の進歩したアラインメント方法の簡略化方法を用いる（フェンおよびドゥーリトル著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、３５巻、３５１−３６０頁、１９８７年）。この方法はヒギンスおよびシャープ（Higgins and Sharp）により記述された方法に類似している（ヒギンスおよびシャープ著、ＣＡＢＩＯＳ、５巻、１５１−１５３頁、１９８９年）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは３．００のデフォルト・ギャップ重み（Default gap weight）、０．１０のデフォルト・ギャップ長の重み（Default gap length weight）、および重み付けられた末端ギャップ（weighted gap ends）を含む。
【０１４９】
他の有用なアルゴリズムの具体例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、アルツール（Altschul）他により記述されている（アルツール他著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、２１５巻、４０３−４１０頁、１９９０年；およびカーリン（karlin）他著、プロシーデングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス（Poc.Natl.Acad.Sci.）ＵＳＡ、９０巻、５８７３−５８８７頁、１９９３年）。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（アルツール他著、メソッド・オブ・エンザイモロジー（Meth.Enzymol.）、２６６巻、４６０−４８０頁、１９９６年）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は幾つかの検索パラメータを用い、これらのほとんどはデフォルト値に設定されている。調整可能なパラメータは以下の値に設定される。すなわち、オーバラップ・スパン＝１、オーバラップ・フラクション＝０．１２５、ワード・スレショールド（word threshold）（Ｔ）＝１１である。ＨＳＰ ＳおよびＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的な値であり、配列の特定の構成、および関心のある配列を検索する特定のデータベースの構成に依存してプログラム自体により設定される。しかしながら、これらの値は感度を上げるために調整される。％アミノ酸配列同等性値は、アラインされる領域における一致する同等な残基数を「より長い」配列の残基総数で除することにより決定される（アラインメント・スコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されるギャップは無視される）。
【０１５０】
したがって、「パーセント（％）核酸配列同等性」は出発配列（すなわち、関心のある配列）の核酸残基と同等な候補配列における核酸残基の百分率として定義される。このましい方法は、オーバラップ・スパンおよびオーバラップ・フラクションがそれぞれ１および０．１２５に設定され、デフォルト・パラメータに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
【０１５１】
本発明で用いられるように、「ハイブリダイゼーション」という用語は、当該技術分野で知られているように核酸の一本鎖が塩基対を介して相補鎖と結合する過程のことをいう。
【０１５２】
中程度から高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下において２つの配列が特異的に相互にハイブリダイズするなら、ある核酸配列は対照核酸配列に「選択的にハイブリダイズする」と考えられるハイブリダイゼーション条件は複合体またはプローブに結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいている。例えば、「最大ストリンジェンシー」典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下）で起こり、「高度ストリンジェンシー」はＴｍより約５−１０℃下であり、「中程度ストリンジェンシー」はプローブのＴｍより約１０−２０℃下であり、「低度ストリンジエンシー」はＴｍより約２０−２５℃下である。機能的に最大のストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーション・プローブと厳格な同等性（strict identity）またはほぼ厳格な同等性（near-strict identity）を有する配列の同定のために用いることができ、一方、中程度または程度ストリンジェントのハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列のホモログの検出または同定に用いることができる。
【０１５３】
中程度および高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当該技術分野において周知である。高度にストリンジェンシー条件の具体例には、５０％フォルムアミド中約４２℃、５×ＳＳＣ、５×デンハルツ（Denhardt’s）溶液、室温における０．５％ＳＤＳ、および４２℃の０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中の２つの追加時間が含まれる。中程度にストリンジェントな条件の具体例には、２０％フォルムアミドを含む溶液中３７℃で一晩のインキュベーション、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルツ溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｍｇ／ｍＬ変性分断サケ精液ＤＮＡ、次に約３７−５０℃で１×ＳＳＣ中フィルター洗浄が含まれる。当業者ならプローブ長などのような因子を調節するのに必要な温度、イオン強度などを以下に調整するかを知っている。
【０１５４】
本発明で用いられるように、「遺伝子組換えの」には、異種核酸配列の導入により改変され、その細胞がそのように改変された細胞由来の、細胞またはベクターのことをいうことが含まれる。したがって、例えば、故意の人為的な妨害により発現され、または全く発現されない条件下において、組換え細胞は細胞の自然な（非遺伝子組換えの）状態では同等の形態で認められない遺伝子を発現するか、または他の異常に発現した自然な遺伝子を発現する。「遺伝子組換え」、「遺伝子組換えする」、および「遺伝子組換え」された核酸を生成するということは、一般的に構築がキメラ遺伝子を生じる２以上の核酸断片の構築のことをいう。
【０１５５】
好ましい態様において、突然変異ＤＮＡ配列は１つ以上のコドンにおいて部位飽和突然変異（site saturation mutagenesis）を伴い生じる。他の好ましい態様において、部位飽和突然変異は２以上のコドンに対して起こる。更なる態様において、突然変異ＤＮＡ配列は、５０％より高い、５５％より高い、６０％より高い、６５％より高い、７０％より高い、７５％より高い、８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、９８％より高い、野生型との相同性を有する。選択的な態様において、突然変異ＤＮＡは、例えば放射線、ニトロソグアニジンなどのような任意の既知の突然変異操作を用いてin vivoで発生する。所望のＤＮＡ配列はつぎに単離され、本発明において提供される方法において用いられる。
【０１５６】
本発明で用いられるように、「標的配列」という用語は、宿主細胞ゲノムに挿入される導入配列と望ましい配列をコードする宿主細胞の遺伝子配列のことをいう。幾つかの態様において前記標的配列は機能的な野生型遺伝子またはオペロンをコードし、一方、他の態様において前記標的配列は機能的な突然変異遺伝子またはオペロン、もしくは非機能的な遺伝子またはオペロンをコードする。
【０１５７】
本発明で用いられるように、「フランキング（隣接）配列」とは、配列の上流または下流が議論されている任意の配列のことをいう（例えば、遺伝子Ａ−Ｂ−Ｃの場合、遺伝子ＢはＡおよびＣの遺伝子配列に隣接（flanked）している）。好ましい態様において、前記導入配列は両側にホモロジー・ボックスが隣接している。他の態様において、前記導入配列およびホモロジー・ボックスは両側のスタッファー（詰め込み）配列に隣接する単位を含む。幾つかの態様において隣接配列は一方の側のみに（３’か５’のいずれか）存在するが、好ましい態様においては隣接する配列の両側に存在する。
【０１５８】
本発明で用いられるように、「スタッファー配列」という用語はホモロジー・ボックス（典型的にはベクター配列）に隣接する任意の余剰ＤＮＡのことをいう。いかなる理論にも制限されず、スタッファー配列はＤＮＡ取り込みを開始するため細胞に重要ではない標的を提供する。
【０１５９】
本発明で用いられるように、「増幅」および「遺伝子増幅」という用語は、ゲノム中に初めから存在するよりも増幅されたより多くの複製遺伝子が存在するように、特定のＤＮＡ配列が不均一に複製される過程のことをいう。幾つかの態様において、ある薬剤（例えば、阻害可能な酵素の阻害剤）の存在下で増殖による細胞選択は、薬剤存在下で増殖が求められる遺伝子生産物をコードする内因性遺伝子、または遺伝子配列をコードする外因性（すなわち、挿入）配列の増幅による、またはその両方による増幅をもたらす。
【０１６０】
「増幅」は鋳型（template）特異性を含む核酸複製の特別な場合のことをいう。それは非特異的鋳型複製（すなわち、鋳型依存性ではあるが、特定の鋳型に依存的ではない複製）と対照的である。鋳型特異性は本発明において複製の正確さ（すなわち、適切なポリヌクレオチド配列の合成）およびヌクレオチド（リボ−またはデオキシリボ−）特異性とからは区別される。鋳型特異性はよく「標的」特異性という用語で記述される。標的配列は、他の核酸から選び出すことを追及するという意味において「標的」であ。増幅技術はこの選び出すことを主な目的として設計される。
【０１６１】
本発明で用いられるように、「共増幅」という用語は、他の遺伝子配列（すなわち、発現ベクター内に含んだもののような、１つ以上の非選択可能な遺伝子を含む）と結合した増幅可能なマーカーを単一細胞に導入し、その細胞が増殖可能なマーカーおよび他の非選択可能な遺伝子配列の両方を増幅するように適切な選択的圧力をかけることをいう。前記増幅可能なマーカーは、１つが増幅可能なマーカーを含んで他方が非選択可能なマーカーを含み、同じ細胞に導入することができる、他の遺伝子配列または選択的に２つの別のＤＮＡ断片に物理的に結合することができる。
【０１６２】
本発明で用いられるように、「増幅可能なマーカー」、「増幅可能な遺伝子」および「増幅可能なベクター」という用語は、適切な増殖条件下において、その遺伝子の増幅を可能とする遺伝子をコードする遺伝子またはベクターのことをいう。
【０１６３】
「鋳型特異性」は酵素の選択によりほとんどの増幅技術において達成される。増幅酵素は、それらが用いられる条件下で核酸の不均一な混合物において特定の核酸配列のみを処理する酵素である。例えば、Ｑβレプリカーゼの場合にＭＤＶ−１  ＲＮＡはレプリカーゼの特異的な鋳型である（例えば、カシアン（Kacian）他著、プロシーデングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンスＵＳＡ、６９巻、３０３８頁、１９７２年を参照されたい）。他の核酸はこの増幅酵素により複製されない。同様に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの場合に、この増幅酵素はそれ自身のプロモータにストリンジェントな特異性を有する（チャンバーリン（Chamberlin）他著、ネイチャー、２２８卷、２２７頁、１９７０年を参照されたい）。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの場、この酵素は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質およびリガーゼ結合の鋳型にミスマッチがある場合には２つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのリガーゼ結合をしない（ウおよびウァレス（Wu and Wallace）著、ゲノミクス、４卷、５６０頁、１９８９年を参照されたい）。最後に、ＴａｑおよびＰｆｕポリメラーゼは、高温で機能するそれらの能力のために結合した配列に高い特異性を示し、したがってプライマーにより定義されることがわかっている。この高温のために、標的配列とのプライマー・ハイブリダイゼーションおよび非標的配列とのハイブリダイゼーションに向いている熱動力学的条件をもたらす。
【０１６４】
本発明で用いられるように、「増幅可能核酸」という用語は任意の増幅方法により増幅可能な核酸のことをいう。「増幅可能核酸」は通常「サンプル鋳型」を含むことが考えられる。
【０１６５】
本発明で用いられるように、「サンプル鋳型」という用語は「標的」（以下で定義する）の存在下用に分析されるサンプルから由来する核酸のことをいう。反対に、「バックグラウンド鋳型」はサンプル中に存在し、また存在しない可能性のあるサンプル鋳型の他の核酸について用いられる。バックグラウンド鋳型は最もしばしば不注意なものである。それは飛沫同伴の結果、またはサンプルから精製除去されるべき核酸不純物の存在によるものである。例えば、検出すべきもの以外の生物体からの核酸が試験サンプル中にバックグラウンドとして存在し得る。
【０１６６】
本発明で用いられるように、「プライマー」という用語は、精製された制限消化物に当然に生じ、または合成的に生産したの如何を問わず、核酸一本鎖に相補的なプライマー延長生成物の合成が誘導される条件下に置かれた時に（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＥＮＡポリメラーゼのような誘導剤の存在下で、適当な温度およびｐＨにおいて）合成開始点として働くことができるオリゴヌクレオチドのことをいう。前記プライマーは増幅の最大の効果のために好ましくは一本鎖であるが、選択的に二本鎖であることもできる。二本鎖である場合には、前記プライマーは延長生成物を調製ために用いられる前にその二本鎖を分離するために処理される。前記プライマーは、誘導剤存在下において延長生成物の合成を開始するのに十分な長さを有さなければならない。前記プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、および使用方法を含む多くの要因に依存することになる。
【０１６７】
本発明で用いられるように、「プローブ」という用語は、精製された制限消化物に当然に生じ、または遺伝子組換え的またはＰＣＲ増幅により合成的に生産したの如何を問わず、関心のある他のオリゴヌクレオチドを加水分解することができるオリゴヌクレオチドのことをいう。プローブは一本鎖でも二本鎖でもよい。プローブは検出、同定、および特定遺伝子配列の単離に有用である。本発明で用いられる任意のプローブは、酵素（例えば、酵素に基づく組織化学的アッセイと同様にＥＬＩＳＡ）、蛍光、放射活性、および発光系を含むが、これらに限定されない任意の検出系で検出できるように任意の「レポーター分子」で標識されることになると考えられる。本発明は如何なる特定の検出系または標識にも限定されることを意図していない。
【０１６８】
本発明で用いられるように、「標的」という用語は、ポリメラーゼ鎖反応を言及するために用いられる場合にはポリメラーゼ鎖反応に用いられるプライマーにより結合される核酸領域のことをいう。したがって、「標的」は他の核酸配列から選び出すことが意図されている。「領域（segment）」は前記標的配列内の核酸領域として定義される。
【０１６９】
本発明で用いられるように、「ポリメラーゼ鎖反応（「ＰＣＲ」）」という用語は、米国特許４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号、および４，９６５，１８８号の方法（ここで参照により取り込まれる）であり、クローニングまたは精製を除き、ゲノムＤＮＡ混合物において標的配列の領域の濃度を上昇させるための方法をふくむもののことをいう。標的配列を増幅するためのこの方法は、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に２つのオリゴヌクレオチド・プライマーを導入する工程、つぎにＤＮＡポリメラーゼ存在下における温度サイクルの正確な継続の工程からなる。前記２つのプライマーは二本鎖標的配列のされざれの鎖に相補的である。増幅を奏功するために、前記混合物は変性され、前記プライマーは次に標的分子内の相補的配列にアニール（anneal）される。アニーリング（annealing）に続いて、プライマーは相補鎖の新しい対を形成するようにポリメラーゼで延長される。変性工程、プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼによる延長は所望の標的配列の増幅領域の高濃度を達成するために多数回（すなわち、変性、アニーリング、および延長は１つのサイクルを構成し、多数のサイクルがあり得る）繰り返すことができる。所望の標的配列の増幅領域の長さはプライマー相互の相対的位置により決定することができ、このためこの長さは制御可能なパラメータである。前記工程の繰り返される点から、前記方法は「ポリメラーゼ鎖反応（以下、「ＰＣＲ」という。）」と呼ばれる。所望の標的配列の増幅領域が混合物中の主要な配列（濃度という点から）となるため、それらは「ＰＣＲ増幅された」と言われる。
【０１７０】
本発明で用いられるように、「増幅試薬」という用語は、プライマー、核酸鋳型、および増幅酵素を除いて増幅に必要とされるそれらの試薬（デオキシリボヌクレオチド三燐酸、緩衝液など）のことをいう。具体的には、他の反応成分とともに増幅試薬は反応容器（試験管、マイクロウェルなど）に入れられ、および含まれる。
【０１７１】
ＰＣＲを用いると、ゲノムＤＮＡにおける特定標的配列の１コピーを幾つかの異なる方法により検出可能なレベルまで増幅することができる（例えば、標識プローブによるハイブリダイゼーション、ビオチン化プライマー取り込み後のアビジン−酵素結合物検出、ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰのような32Ｐ標識デオキシヌクレオチド三燐酸の増幅領域への取り込み）。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は適当なプライマー分子セットで増幅することができる。特に、ＰＣＲ法それ自体により生成された増幅領域は、それ自体、引き続くＰＣＲ増幅のための効果的な鋳型である。
【０１７２】
本発明で用いられるように、「ＰＣＲ生成物」、「ＰＣＲ断片」、および「増幅生成物」という用語はＲＮＡ配列の複製および増殖のことをいう。この方法において、米国特許５，３２２，７７０号に記述されるように（本発明に参照により取り込まれる）、温度安定なポリメラーゼが採用される１酵素操作を最もよく用いて、逆転写はＰＣＲと組み合わされている。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、前記ＲＮＡ鋳型はポリメラーゼの逆転写酵素活性のためにｃＤＮＡに変換され、つぎにポリメラーゼの重合活性を用いて増幅される（すなわち、他のＰＣＲ法におけるように）。
【０１７３】
本発明で用いられるように、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は特定核酸配列において、またはその近傍で二本鎖ＤＮＡを切断する微生物酵素のことをいう。
【０１７４】
「制限部位」とは、特定の制限エンドヌクレアーゼにより認識され、開裂されるヌクレオチド配列であり、よくＤＮＡ挿入のための部位とされる。本発明の特定の態様において、制限部位は選択的なマーカーおよびＤＮＡ構築体の５’および３’末端に組み込まれる。
【０１７５】
本発明で用いられるように、「クロモソーム組み込み（integration）」という用語は宿主細胞のクロモソームに外来配列が導入される過程のことをいう。形質転換ＤＮＡの相同性領域はクロモソームの相同性領域と位置合わせを行う。続いて、ホモロジー・ボックスの間の配列が外来配列により二重交差で（すなわち、相同性組換え）置き換えられる。本発明の幾つかの態様において、ＤＮＡ構築体の不活性化するクロモソーム領域の相同性領域は、バチルスのクロモソームの自生クロモソーム領域の隣接相同性領域に位置合わせを行う。続いて、自生クロモソーム領域はＤＮＡ構築物により二重交差（すなわち、相同性組換え）で削除される。
【０１７６】
「相同性組換え」は、同等またはほぼ同等なヌクレオチド配列の部位における、２つのＤＮＡ分子または対のクロモソームの間のＤＮＡ断片の交換のことを意味する。好ましい態様において、クロモソーム組み込みは相同性組換えである。
【０１７７】
「相同性配列」は本発明において、比較のための最適な位置合わせが行われる時に、他の核酸またはポリペプチド配列と、１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８８％、８５％、８０％、７５％、または７０％同等な配列を有する核酸またはポリペプチド配列のことを意味するように用いられる。幾つかの態様において相同性配列は８５％から１００％の配列同等性を有し、一方、他の態様において９０％から１００％の配列同等性が存在する。またより好ましい態様において、９５％から１００％の配列同等性が存在する。
【０１７８】
本発明で用いられるように、「アミノ酸」はペプチドまたはタンパク質またはそれらの部分のことをいう。「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は所望され、および／または測定されるタンパク質／ポリペプチドのことをいう。幾つかの態様において関心のあるタンパク質は細胞内で発現され、一方、他の態様においてされは分泌ポリペプチドである。特に好ましい態様において、これらの酵素は本発明のセリンプロテアーゼを含む。幾つかの態様において、関心のあるタンパク質はシグナルペプチドに融合した分泌ポリペプチド（すなわち、分泌されるタンパク質におけるアミノ末端延長）である。ほとんど全ての分泌タンパク質は、送達および膜を超える前駆タンパク質の以降で重要な役割を果たすアミノ末端タンパク質延長を利用する。この延長は膜移送の間またはその直後にシグナルペプチダーゼにより蛋白分解的に除去される。
【０１７９】
本発明で用いられるように、「異種タンパク質」という用語は、宿主細胞に自然には生成しないタンパク質またはポリペプチドのことをいう。異種タンパク質の具体例には、プロテアーゼを含むヒドロラーゼのような酵素が含まれる。幾つかの態様において、前記タンパク質をコードする遺伝子は自然生成の遺伝子であり、一方、他の態様において突然変異および／または合成遺伝子が用いられる。
【０１８０】
本発明で用いられるように、「ホモローグ・タンパク質」という用語は、未処理または細胞に自然に生成するタンパク質またはポリペプチドのことをいう。好ましい態様において前記細胞はグラム陽性細胞であり、一方、特に好ましい態様において、前記細胞はバチルス宿主細胞である。選択的な態様において前記ホモローグ・タンパク質は他の生物体により生成された未処理のタンパク質であり、Ｅ．コーリ、ストレプトマイセス、トリコデルマ、およびアスペルジルスが含まれるが、これらに限定されない。本発明は組換えＤＮＡ技術を介してホモローグ・タンパク質を生成する宿主細胞を含む。
【０１８１】
本発明で用いられるように、「オペロン領域」とは、共通のプロモータから単一の転写単位として転写され、そのため共制御を受ける一群の接在する遺伝子のことをいう。幾つかの態様において、前記オペロンは制限遺伝子を含む。最も好ましい態様において、ＲＮＡレベルによって測定されるように高度に発現するが、未知の又は不必要な機能を有するオペロンが用いられる。
【０１８２】
本発明で用いられるように、「抗微生物領域」とは抗微生物タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む領域のことをいう。
【０１８３】
ポリヌクレオチドはＲＮＡまたはポリペプチドを「コードする」と言われ、もしその未処理の状態にあり、または当業者に既知の方法により操作されると、前記ＲＮＡ、ポリペプチド、またはそれらの断片を生産するために転写または翻訳され得る。核酸のようなアンチセンス鎖もまた前記配列をコードすると言われる。
【０１８４】
当該技術分野で知られているように、ＤＮＡはＲＮＡポリメラーゼにより転写されてＲＮＡを生成すねが、ＲＮＡは逆転写酵素により逆転写されてＤＮＡを生成する、したがって、ＤＮＡはＲＮＡをコードし、およびその逆も成り立つ。
【０１８５】
「制限領域」または「制限配列」または「発現制御配列」という用語は、コードされたアミノ酸配列の発現を奏功させるポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする、ＤＮＡのポリヌクレオチド配列に操作可能に結合されているＤＮＡのポリヌクレオチド配列のことをいう。制限配列はアミノ酸をコードする操作可能に結合されたポリヌクレオチド配列の発現を阻害、抑制、または促進することができる。
【０１８６】
「宿主株」または「宿主細胞」とは本発明にしたがってＤＮＡを含む発現ベクターに好適な宿主のことをいう。
【０１８７】
もし酵素が対応する野生型細胞で発現するレベルよりも高いレベルで細胞において発現するなら、酵素は宿主細胞において「過剰発現」したという。
【０１８８】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は本発明において互換的に用いられる。生化学命名（ＪＣＢＮ）に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ合同委員会に従って定義されるアミノ酸の３文字コードが本発明の開示を通して用いられる。また、ポリペプチドは遺伝コードの縮重のために１つ以上のヌクレオチド配列によってコードされ得ることも理解されている。
【０１８９】
「前駆配列」とは、プロテアーゼの分泌に必要なシグナル配列と成熟プロテアーゼの間のアミノ酸配列のことである。前駆配列の開裂により成熟活性プロテアーゼが生じることになる。
【０１９０】
「シグナル配列」または「シグナルペプチド」とは、タンパク質の成熟または前駆体形態の分泌に関与するヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の任意の配列のことをいう。シグナルペプチドのこの定義は機能的なものであり、タンパク質の分泌を成し遂げることに関与するタンパク質遺伝子のＮ末端部分をコードする全てのそれらのアミノ酸配列を含むことを意味する。それらは度々、普遍的ではないものの、タンパク質のＮ末端部分または前駆体タンパク質のＮ末端部分に結合している。前記シグナル配列は内因性でも外因性でもよい。前記シグナル配列は通常前記タンパク質（例えば、プロテアーゼ）と会合することができ、または他の分泌タンパク質をコードする遺伝子からも由来し得る。ひとつの具体的な外因性シグナル配列には、バチルス・レントゥス（ＡＴＣＣ２１５３６）由来のスブチリシンのシグナル配列の残渣に融合したバチルス・スブチレス由来のスブチリシンのシグナル配列の最初の７アミノ酸残基が含まれる。
【０１９１】
「ハイブリッド・シグナル配列」とは、発現すべき遺伝子のシグナル配列に融合した発現宿主から配列の一部分が得られるシグナル配列のことをいう。幾つかの態様において、合成配列が用いられる。
【０１９２】
「実質的に同等なシグナル活性」とは、発酵培地への実質的に同等なプロテアーゼ分泌によりしめされるシグナル活性のことをいい、例えば、発酵培地プロテアーゼ濃度が配列番号５および／または９のシグナル配列により提供される発酵培地における分泌タンパク質の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上である。
【０１９３】
タンパク質またはペプチドの「成熟」形態とは、タンパク質またはペプチドの最終的な機能形態のことをいう。例えば、本発明のプロテアーゼの成熟形態は少なくとも配列番号８の残基位置１−１８９に同等なアミノ酸配列を含む。
【０１９４】
タンパク質またはペプチドの「前駆体」という用語は、タンパク質のアミノまたはカルボキシ末端に操作可能に結合した前駆配列を有するタンパク質の成熟形態のことをいう。また前記前駆体は前駆配列のアミノ末端に操作可能に結合した「シグナル」配列を有することもできる。また前記前駆体は翻訳後活性（例えば、タンパク質またはペプチドの成熟形態を除去するためにそれらから開裂されたポリヌクレオチド）に含まれる追加のポリヌクレオチドも有する。
【０１９５】
「自然に生成する酵素」とは、自然状態で認められるものに同等な非改変のアミノ酸配列を有する酵素のことをいう。自然に生成する酵素には、特定の微生物において自然に発現され、認められる未処理酵素が含まれる。
【０１９６】
「に由来する」および「から得られる」という用語は、問題の生物体の株により生産され、生産され得るプロテアーゼばかりではなく、そのような株から単離されたＤＮＡ配列によりコードされ、およびそのようなＤＮＡを含む宿主生物体で生産されるプロテアーゼのこともいう。追加的に前記用語は、合成ＤＮＡ配列および／またはｃＤＮＡ源によりコードされ、問題のプロテアーゼを同定する特徴を有するプロテアーゼのことをいう。例えば、「セルロモナス由来のプロテアーゼ」とは、セルロモナス資源により精製されるが、遺伝子工学技術の使用により前記セリンプロテアーゼをコードする核酸で形質転換された非セルロモナス生物体により精製されるようなセリンプロテアーゼと同様に、セルロモナスにより自然に生成された蛋白分解活性を有するそれらの酵素のことをいう。
【０１９７】
この定義の範囲内にある「誘導体」は一般的に野生型、未処理または親の形態に見られるような特徴的な蛋白分解活性を、前記誘導体が野生型、未処理または親の形態と同様な目的に有用である程度に保持している。セリンプロテアーゼの機能的な誘導体は、本発明のセリンプロテアーゼの一般的な特徴をもつ自然発生、合成的または遺伝子組換え的に生産されたペプチドまたはペプチド断片を含む。
【０１９８】
「機能的な誘導体」という用語は、セリンプロテアーゼをコードする核酸の機能的な特徴を有する核酸誘導体のことをいう。本発明のセリンプロテアーゼをコードする核酸の機能的な誘導体は自然発生、合成的または遺伝子組換え的に生産された核酸または断片を含み、本発明のセリンプロテアーゼの特徴をコードする。本発明にしたがってセリンプロテアーゼをコードする野生型の核酸は自然発生アレル（allele）および当該技術分野で知られている遺伝コードの縮重に基づくホモログを含む。
【０１９９】
２つの核酸またはポリペプチド配列という文脈における「同等」という用語は、以下の配列比較または分析アルゴリズムのいずれかを用いて測定した、最大一致の位置合わせの場合に、同一である２つの配列における残基のことをいう。
【０２００】
「最適アラインメント」という用語は最高のパーセント同等性スコアを与えるアラインメントのことをいう。
【０２０１】
２つのアミノ酸、ポリヌクレオチドおよび／または遺伝子配列（適当な場合に）に関連して、「パーセント配列同等性」、「パーセントアミノ酸配列同等性」、および／または「パーセント核酸／ポリヌクレオチド配列同等性」とは、配列が最適アラインメントされるときに２つの配列における同等な残基のパーセンテージのことをいう。したがって、８０％アミノ酸配列同等性は２つの最適アラインメントされたポリペプチド配列において８０％のアミノ酸が同一であることをいう。
【０２０２】
したがって、２つの核酸またはポリペプチド配列という文脈における「実質的に同等」という用語は、標準パラメータを使用したプログラムまたはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を用いて参照配列と比較するときに、７０％以上の配列、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上、好ましくは９７％以上、好ましくは９８％以上、および好ましくは９９％以上の配列同等を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことをいう。２つのポリペプチドが実質的に同等であることが示されると、第一ポリペプチドは第二ポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるといえる。具体的には、保存的アミノ酸置換により異なるポリペプチドは免疫学的に交差反応性である。したがって、例えば２つのポリペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合には、あるポリペプチドは第二のポリペプチドと実質的に同等である。また、２つの核酸配列が実質的に同等であるということが示されると、その２つの分子はストリンジェントな条件下で（例えば、中程度から高度ストリンジェンシーの範囲内で）、互いにハイブリダイズする。
【０２０３】
この文脈における「等価(equivalent)」という言い方は、中程度から最大のストリンジェンシー条件下で、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドにハイブリダイズすることができるポリペプチドによりコードされるセリンプロテアーゼのことをいう。例えば、等価であるということは等価な成熟セリンプロテアーゼが配列番号８のアミノ酸配列を有する成熟セルロモナス・セリンプロテアーゼに対して、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、および／または９９％以上の配列同同等性を含むことを意味する。
【０２０４】
「単離された」または「精製された」という用語は、その元々の環境(例えば、もし自然に生じるものであるなら、自然環境)から取り除かれた物質のことをいう。例えば、自然に発生して若しくは野生型生物体に若しくは自然発生して又は野生生物体から発現するときに通常存在しない成分と組み合わせて存在する場合よりも、高濃度または低濃度で特定の組成物として存在する時に、前記物質は「精製された」と言われる。例えば、生きている動物に存在する自然発生のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが単離されていないが、自然系にともに存在するある種の又は全ての物質から分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部分であり得るし、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドが生成物の一部分であり得るし、さらにそのようなベクターまたは組成物が自然環境の一部分でないこともあり得る。好ましい態様において、例えば電気泳動ゲルまたはブロットにおいて実質的に１つのバンドを生じるなら、そのような核酸またはタンパク質は精製されているという。
【０２０５】
ＤＮＡ配列の参照として用いられる場合に「単離された」という用語は、自然の遺伝的環境から取り除かれ、したがって他の外来性または不要なコード配列を含まず、遺伝的に操作されたタンパク質生産系内で用いるのに適した形態のＤＮＡ配列のことをいう。そのような単離分子は、その自然環境から分離され、ｃＤＮＡまたはゲノムのクローンを含むものである。本発明の単離ＤＮＡ分子は通常関連する他の遺伝子を含まないが、プロモータまたはターミネータのような自然発生の５’および３’非翻訳領域を含むことができる。関連領域の同定は当業者には明らかであろう(例えば、ディナンおよびティジャン（Dynan and Tijan）、ネイチャー、３１６巻、７７４−７８頁、１９８５年を参照されたい)。「単離されたＤＮＡ配列」という用語は、他には「クローンされたＤＮＡ配列」のことをいう。
【０２０６】
タンパク質に言及して用いられる場合、「単離された」という用語は、タンパク質の未処理の環境以外の条件で認められるタンパク質のことをいう。好ましい形態において、単離されたタンパク質は他のタンパク質、特に他の類似タンパク質を実質的に含まない。単離されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で１０％を超える純度をもち、好ましくは２０％を超える純度、更に好ましくは３０％を超える純度を有する。本発明の更なる態様にはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で高度に精製された形態（すなわち、４０％超の純度、６０％超の純度、８０％超の純度、９０％超の純度、９５％超の純度、９７％超の純度、９９％超の純度）のタンパク質が含まれる。
【０２０７】
本発明で用いられるように、「コンビナトリアル突然変異（combinatorial mutagenesis）」という用語は出発配列の変異体ライブラリが発生する方法のことをいう。これらのライブラリにおいて前記変異体は予め定義された突然変異のセットから選択される一つまたは幾つかの突然変異を含む。さらに前記方法は予め定義された突然変異のセットには含まれないランダム突然変異を導入する手段を提供する。幾つかの態様において、前記方法は米国特許出願０９／６９９，２５０号(２０００年１０月２６日出願)に示される方法を含み、本文献は参照により本発明に取り込まれる。選択的な態様において、コンビナトリアル突然変異法は市販のキット(例えば、クイックチェンジR  マルチサイト、ストラタジーン社、サンジエゴ、カリフォルニア州)を含む。
【０２０８】
本発明で用いられるように、「変異体ライブラリ」という用語は、ほとんどのゲノムの中で同等であるが、ひとつ以上の遺伝子の異なるホモログを含む多数の細胞のことをいう。そのようなライブラリは、例えば改善された特徴をもつ遺伝子またはオペロンを同定するために用いることができる。
【０２０９】
本発明で用いられるように、「出発遺伝子」という用語は本発明を用いて改善および／または改変される関心のあるタンパク質をコードする関心のある遺伝子のことをいう。
【０２１０】
本発明で用いられるように、「多配列アラインメント」（「ＭＳＡ」）という用語はアルゴリズム（例えば、ClustalＷ）を用いて位置あわせされる出発遺伝子の多数のホモログの配列のことをいう。
【０２１１】
本発明で用いられるように、「コンセンサス配列」および「カノニカル配列（canonical）」という用語は、関心のある特定タンパク質または配列の全ての変異体を比較する原型アミノ酸配列のことをいう。また、この用語は関心のあるＤＮＡ配列に最もよく存在するヌクレオチドを示す配列のことをいう。遺伝子の各位置に前記コンセンサス配列はＭＳＡにおけるその位置で最も豊富なアミノ酸を与える。
【０２１２】
本発明で用いられるように、「コンセンサス突然変異」という用語は、出発遺伝子の配列およびコンセンサス配列における相違のことをいう。コンセンサス突然変異は、ＭＳＡから得られる出発遺伝子配列とコンセンサス配列との比較より同定される。また、コンセンサス突然変異は、出発遺伝子のアミノ酸から、出発遺伝子の変化の頻度と比較してその位置でＭＳＡにおいて最も高い頻度が認められるアミノ酸へ変化するアミノ酸変化を含む。したがって、コンセンサス突然変異という用語は、出発遺伝子のアミノ酸がＭＳＡにおけるアミノ酸よりも豊富なアミノ酸により置換される全ての単一アミノ酸変化を含む。
【０２１３】
本発明で用いられるように、「イニシャル・ヒット」という用語はコンビナトリアル・コンセンサス突然変異ライブラリのスクリーニングにより同定される変異体のことをいう。好ましい態様において、イニシャル・ヒットは出発遺伝子と比較して改善された能力特徴を有する。
【０２１４】
本発明で用いられるように、「改善されたヒット」という用語は増強コンビナトリアル・コンセンサス突然変異ライブラリのスクリーニングにより同定される変異体のことをいう。
【０２１５】
本発明で用いられるように、「改善突然変異」および「能力増強突然変異」という用語は、突然変異が出発遺伝子に導入された時に改善された能力をもたらす突然変異のことをいう。幾つかの好ましい態様において、これらの突然変異は前記方法のスクリーニングの間に同定されるヒットのシークエンシングにより同定される。ほとんどの態様において、ヒットで最も頻繁に認められる突然変異は、スクリーニングされていないコンビナトリアル・コンセンサス突然変異ライブラリに比較して改善突然変異の傾向が認められる。
【０２１６】
本発明で用いられるように、「増強コンビナトリアル・コンセンサス突然変異（ＣＣＭ）ライブラリ」という用語は、初期の回のＣＣＭ突然変異およびスクリーニングからのスクリーニングおよび／またはシークエンシング結果に基づいて設計および構築されたＣＣＭライブラリのことをいう。幾つかの態様において、前記増強ＣＣＭライブラリは初期の回のＣＣＭから得られるイニシャル・ヒットの配列に基づいている。更なる態様において、増強ＣＣＭは初期の回の突然変異およびスクリーニングからのイニシャル・ヒットで関さされる頻度の高い突然変異が好ましいように設計されている。幾つかの好ましい態様において、これは能力低下突然変異をコードするプライマーを除くことにより、または初期ＣＣＭライブラリで用いられる他のプライマーと比較して能力増強突然変異をコードするプライマー濃度を増加させることにより達成される。
【０２１７】
本発明で用いられるように、「能力低下突然変異」という用語は、スクリーニングをしていないコンビナトリアル・コンセンサス突然変異ライブラリに比較して、スクリーニングから得られたヒットで認められるあまり多くないコンビナトリアル・コンセンサス突然変異ライブラリにおける突然変異のことをいう。好ましい態様において、前記スクリーニング工程は「能力低下突然変異」を含む多くの変異体を除くか低下させる。
【０２１８】
本発明で用いられるように、「機能アッセイ」という用語はタンパク質活性の指標を提供するアッセイのことをいう。特に好ましい態様において、この用語はタンパク質の通常能力で発揮される能力を分析するアッセイ系のことをいう。例えば、酵素の場合、機能アッセイは反応を触媒する酵素の有効性を決定することを含む。
【０２１９】
本発明で用いられるように、「標的（target）特性」という用語は、変更されるべき出発遺伝子の特性のことをいう。本発明は任意の特定の標的特性に下呈されることを意図していない。しかしながら、いくつかの好ましい態様において標的特性は遺伝子生産物の安定性（例えば、変性、蛋白分解、他の分解性因子に対する抵抗性）であり、他の態様において宿主が変化する生産における生産レベルである。実際、出発遺伝子の任意の特性が本発明において用いられることになると考えられる。
【０２２０】
本発明で用いられるように、核酸という文脈における「特性」という用語またはそれらの文法的な均等物は選択または検出することができる核酸の任意の特徴または属性のことをいう。これらの特性には、ポリペプチドへの結合に影響する特性、特定の核酸を含む細胞に与える特性、遺伝子転写に影響する特性（例えば、プロモータ強度、プロモータ認識、プロモータ制御、エンハンサ機能）、ＲＮＡプロセシングに与える特性（例えば、ＲＮＡスプライシング、ＲＮＡ安定性、ＲＮＡ構造、および転写後修飾）、翻訳に影響する特性（例えば、濃度、制御、リボゾームタンパク質へのｍＲＮＡの結合、翻訳後修飾）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、核酸の転写因子、ポリメラーゼ、制御因子など用の結合部位は望ましい特徴を生み出すため、または望ましくない特徴を同定するために改変することができる。
【０２２１】
本発明で用いられるように、ポリペプチドという文脈における「特性」という用語またはそれらの文法的な均等物は選択または検出することができるポリペプチドの任意の特徴または属性のことをいう。これらの特性には、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、温度安定性、アルカリ安定性、ｐＨ活性プロフィール、蛋白分解への抵抗性、ｋM、ｋcat、ｋcat／ｋM比、タンパク質ホールディング、免疫反応誘導、リガンド結合能力、受容体結合能力、被分泌能力、細胞表面提示能力、オリゴマー化能力、標識能力、細胞増殖刺激能力、細胞増殖阻害能力、アポトーシス誘導能力、リン酸化またはグリコシル化による被修飾能力、疾患治療能力が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２２】
本発明で用いられるように、「スクリーニング」という用語は当該技術分野における通常の意味をもち、一般的に多段階工程である。第一段階において、それらの突然変異核酸または変異体ポリペプチドが提供される。第二段階において、突然変異核酸または変異体ポリペプチドの特性が決定される。第三段階において、決定された特性が突然変異核酸の発生のための対応する前駆体核酸の特性、対応する自然発生ポリペプチドの特性または出発物質の特性と比較される。
【０２２３】
変化した特性を有する核酸またはタンパク質を得るためのスクリーニング操作が、突然変異核酸の発生がその修飾の促進を意図している出発物質の特性に依存することは当業者にとっては明らかであろう。したがって当業者は、本発明が任意の特性に限定されず、以下の特性の記載が具体的な実施例のみを挙げているにすぎないことを理解できる。任意の特性についてのスクリーニング方法は一般的に当該技術分野において記載されている。例えば、その変化が変異を示す結合、ｐＨ、特性等を突然変異の前後において測定することができる。好ましくはスクリーニングは、多数サンプルが同時にスクリーニングされることを含むハイスループット様式で、チップを利用するアッセイ、ファージディスプレイ、および多数基質および／または指標を含むがこれらに限定されずに実施される。
【０２２４】
本発明で用いられるように、幾つかの態様において、スクリーニングは関心のある変異体が変異体の母集団の中で豊富になる選択工程を含む。これらの態様の具体例には、変異体がその結合または触媒特性に基づいて変異体の母集団から捕捉できる場合には、ファージディスプレイまたは他の任意のディスプレイ方法と同様に、宿主生物体に成長優位性を与える変異体の選択が含まれる。好ましい態様において、変異体ライブラリはストレス（熱、プロテアーゼ、変性）に曝され、次にまだ完全な変異体がスクリーニングで同定され、または選択により豊富にされる。前記用語は選択のための任意の適当な手段を含む。実際、本発明は任意の特定のスクリーニング方法に限定されるように意図されていない。
【０２２５】
本発明で用いられるように、「標的ランダム化」という用語は１つ以上の位置がランダム化される複数の配列を生成する過程のことをいう。幾つかの態様において、ランダム化は完全である（すなわち、四つのヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ、およびＣの全てがランダム化位置で生じる）。選択的な態様において、ヌクレオチドのランダム化は四つのヌクレオチドのサブセットに限られている。標的ランダム化は、関心のある１つ以上のタンパク質をコードしている１つ以上の配列のコドンに適用できる。発現の際に、結果として生じるライブラリは、ランダム化されたコドンのランダム化スキームにより決定できる、１つ以上のアミノ酸位置が２０全てのアミノ酸またはアミノ酸サブセットの混合物を含むことができるタンパク質母集団を生成する。幾つかの態様において、標的ランダム化から生じる母集団の個々の構成要素は、標的またはランダム挿入もしくはコドンの削除のためにアミノ酸の構成で異なる。更なる態様において、合成アミノ酸が生成されるタンパク質母集団に含まれる。幾つかの好ましい態様において、標的ランダム化から生じる母集団の大多数の構成要素は出発遺伝子よりもコンセンサス配列に相同な配列が多い。幾つかの態様において、前記配列は１つ以上の関心のあるタンパク質をコードする。選択的な態様において、前記タンパク質は異なる生物学的機能を有する。幾つかの好ましい態様において、前記外来配列は少なくとも１つの選択可能なマーカーを含む。
【０２２６】
「修飾配列」および「修飾遺伝子」という用語は、自然発生の核酸配列の削除、挿入または分断を含む配列と本発明で呼ばれるものに互換的に用いられる。幾つかの好ましい態様において、修飾配列の発現生産物は短縮タンパク質（例えば、もしその修飾か削除または分断ならば）である。幾つかの特に好ましい態様において、前記短縮タンパク質は生物学的活性を保持する。選択的な態様において、修飾配列の発現生産物は延長タンパク質（例えば、核酸配列への挿入を含む修飾）である。幾つかの態様において、挿入により短縮タンパク質（例えば、挿入が停止コドンの生成を生じる場合）が生じる。したがって、挿入により発現生産物として短縮タンパク質または延長タンパク質のいずれかが生じる。
【０２２７】
本発明で用いられるように、「突然変異配列」または「突然変異遺伝子」という用語は互換的に用いられ、宿主細胞の野生型配列において生じる少なくとも１つのコドンにおける変異を有する配列のことをいう。突然変異細胞の発現生産物は野生型と比べて変異したアミノ酸配列を有するタンパク質である。この発現生産物は変異した機能的な能力（例えば、増強した酵素活性）を有することができる。
【０２２８】
「突然変異誘発性（mutagenic）プライマー」または「突然変異誘発性オリゴヌクレオチド」（本発明で互換的に用いられる）は、鋳型配列の一部分に相当し、それらにハイブリダイスすることができるオリゴヌクレオチド組成物のことをいうことを意図している。突然変異誘発性プライマーに関して、このプライマーは鋳型核酸に正確にマッチせず、プライマーにおける一つ以上のミスマッチは核酸ライブラリに所望の突然変異を導入することに用いられる。本発明で用いられるように、「非突然変異誘発性プライマー」または「非突然変異誘発性オリゴヌクレオチド」は、鋳型核酸に性格にマッチするオリゴヌクレオチド組成物のことをいう。本発明の１つの態様において、突然誘発性プライマーのみが用いられる。本発明の他の好ましい態様において、前記プライマーは、突然変異誘発性プライマーが含まれる１つ以上の領域についてオリゴヌクレオチド混合物に非突然誘発性プライマーも含まれるように設計される。少なくとも１つの突然変異誘発性プライマーに相当する突然変異誘発性プライマーおよび非突然変異誘発性プライマーの混合物を加えることにより、様々な組み合わせの突然変異パターンが存在する結果としての核酸ライブラリを生産することが可能である。例えば、突然変異核酸ライブラリのある構成要素がある部位でその前駆体配列を保持する一方で、他の構成要素がそのような部位で突然変異であることが望ましいならば、前記非突然変異誘発性プライマーは一定の残基のための核酸ライブラリの範囲内で特定レベルの非突然変異構成要素を得る能力を提供する。本発明の方法は、一般的に１０−５０塩基長の、より好ましくは１５−４５塩基長の突然変異誘発性および非突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いる。しかしながら、望ましい結果の突然変異を得るために１０塩基長より短いか、５０塩基長よりも長いかいずれかのプライマーを用いることが必要かもしれない。対応する突然変異誘発性および非突然変異誘発性プライマーに関して、対応するオリゴヌクレオチドが同じ長さである必要はなく、加えられる突然変異に相当する領域で重なりがあることのみが必要である。
【０２２９】
本発明に基づいた予め定義されて比でプライマーを加えることができる。例えば、得られるライブラリは、加えるプライマーの量を調整することにより同じまたは異なる部位で有意なレベルのある特定の突然変異およびより少ない量の異なる突然変異を有することが望まれならば、所望のバイアスのかかったライフブラリを生成することが可能である。または、より少ないまたはより多い量の非突然変異誘発性プライマーを添加することにより、突然変異核酸ライブラリにおいて相当する突然変異が発生する頻度を調整することが可能である。
【０２３０】
本発明で用いられるように、「近接突然変異」とい言い回しは同じオリゴヌクレオチドプライマー内に提示された突然変異のことをいう。例えば、近接突然変異は隣接し、または互いに近くに存在し得るが、それらは同じプライマーにより得られる突然変異鋳型核酸に導入されることになる。
【０２３１】
本発明で用いられるように、「非近接突然変異」とい言い回しは離れたオリゴヌクレオチドプライマー内に提示された突然変異のことをいう。例えば、非近接突然変異は別々に調製されたオリゴヌクレオチドプライマーにより得られる突然変異鋳型核酸に導入されることになる。
【０２３２】
「野生型配列」または「野生型遺伝子」という用語は本発明で互換的に用いられ、宿主細胞における未処理または自然発生の配列のことをいう。幾つかの態様において、野生型配列とは蛋白操作プロジェクトの出発点にある関心のある配列のことをいう。野生型配列は同種または異種のいずれのタンパク質もコードすることができる。同種のタンパク質は宿主細胞が干渉なく産生するタンパク質である。他種のタンパク質は宿主細胞が干渉無しには産生しないタンパク質である。
【０２３３】
本発明で用いられるように、「抗体」という用語は免疫グロブリンのことをいう。抗体には、抗体を生産することが望まれる任意の種から直接得られる免疫グロブリンが含まれるが、これに限定されない。さらに、本発明は修飾抗体を含む。また前記用語は、未処理の抗体が結合し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗ＩＤ）抗体を含むエピトープに結合する能力を保持する抗体断片のことをいう。抗体断片には相補性決定領域（CDRs）、単鎖断片可変領域（scFv）、重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）が含まれるが、これらに限定されない。またポリクローナルおよびモノクローナル抗体は本発明に含まれる。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。
【０２３４】
｛酸化安定な｝という用語は、例えば漂白剤または酸化剤に曝され、または接触する間に優勢な条件下で一定時間にわたって特定量の酵素活性を保持する本発明のプロテアーゼのことをいう。幾つかの態様において、前記プロテアーゼは漂白剤または酸化剤に例えば１分、３分、５分、８分、１２分、１６分、２０分など以上の一定時間にわたって曝され、または接触した後に５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の蛋白分解活性を保持する。幾つかの態様において、前記安定性は実施例に記載されるように測定される。
【０２３５】
「キレーター（chelator）安定な」という用語は、本発明の蛋白分解、加水分解、洗浄または他の工程、例えばキレート剤に曝す又は接触させる間の一般的な条件下で一定の時間にわたって特定量の酵素活性を保持する本発明のプロテアーゼのことをいう。幾つかの態様において、前記プロテアーゼは所定の時間、例えば１０分、２０分、４０分、６０分、１００分等以上の時間にわたるキレート剤との接触後、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の蛋白分解活性を保持する。幾つかの態様において、キレート安定性は実施例に記載のように測定される。
【０２３６】
「熱的に安定な（thermally stable）」および「熱安定な（thermostable）」という用語は、本発明の蛋白分解、加水分解、洗浄または他の工程、例えば変化する温度に曝させる間の一般的な条件下で一定の時間にわたって同定された温度に曝した後に特定量の酵素活性を保持する本発明のプロテアーゼのことをいう。変化した温度には上昇または低下した温度が含まれる。前記プロテアーゼは所定の時間、例えば６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分等以上の時間にわたる変化した温度に曝された後、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の蛋白分解活性を保持する。幾つかの態様において、熱安定性は実施例に記載のように測定される。
【０２３７】
酸化、キレート剤、熱および／またはｐＨ安定なプロテアーゼという文脈において「増強した安定性」という用語は、他のセリンプロテアーゼ（例えば、スブチリシン・プロテアーゼ）および／または野生型酵素と比較して、時間経過の間に高く保持された蛋白分解のことをいう。
【０２３８】
酸化、キレート剤、熱および／またはｐＨ安定なプロテアーゼという文脈において「低減した安定性」という用語は、他のセリンプロテアーゼ（例えば、スブチリシン・プロテアーゼ）および／または野生型酵素と比較して、時間経過の間に低く保持された蛋白分解のことをいう。
【０２３９】
本発明で用いられるように、「洗浄組成物」には、特記しない限り、顆粒状または粉状の形態の全目的または「重い役割（heavy-duty）」の洗濯剤、特に洗浄洗剤；ゲルまたはペースト状の形態の全目的の洗濯剤、特にいわゆる重い役割の液体タイプ；液体のきめ細かい織物洗剤；食器手洗い洗剤または軽い役割の食器手洗い洗剤、特に多泡タイプのもの；家庭用の様々な錠剤、顆粒状、液体およびすすぎ用タイプおよび組織用仕様を含む食器機械洗い洗剤；抗菌手洗いタイプ、洗浄棒、口洗い、義歯洗い、車またはカーペットシャンプー、風呂洗剤を含む液体洗浄剤および消毒剤；ヘアシャンプーおよびヘアリンス；シャワーゲル、バスフォームおよび金属洗浄剤が、漂白添加物および「汚れとり（stain-stick）」または前処理タイプと同様に含まれる。
【０２４０】
本発明おいて発明がそれ自体記載またはクレームされていることはそれとして、本発明の実施例に記載された試験方法は本発明のパラメータのそれぞれの価値を決定するために用いられていると理解すべきである。
【０２４１】
特記しない限り、全ての成分または組成物の濃度はその成分または組成物の活性な濃度を言及し、市販で入手できるものには存在し得る、例えば残留溶媒または副生物のような不純物を除いたものである。
【０２４２】
酵素成分重量は総活性蛋白に基づいている。
【０２４３】
全てのパーセンテージおよび比率は、特記しない限り、重量計算による。全てのパーセンテージおよび比率は、特記しない限り、総組成物に基づく。
【０２４４】
本明細書を通して示された全ての最大数限界は、より小さい数限界が本発明で明記されていると見なして、全てのより小さい数限界を含むように理解されるべきである。本明細書を通して示された全ての最小数限界は、より大きい数限界が本発明で明記されていると見なして、全てのより大きい数限界を含むように理解されるべきである。本明細書を通して示された全ての数範囲は、より狭い数範囲が本発明で明記されていると見なして、全てのより狭い数範囲を含むように理解されるべきである。
【０２４５】
「洗浄活性」という用語は、本発明の蛋白分解、加水分解、洗浄または他の工程の一般的な条件下におけるプロテアーゼにより達成される洗浄性能のことをいう。幾つかの態様において、洗浄性能は、例えば染色を標準洗浄条件にした後、様々なクロマトグラフィー法、分光光度法、または他の定量方法により測定される草、血液、ミルク、または卵蛋白のように酵素感度染色に関する様々な洗浄アッセイを適用することにより決定される。具体的なアッセイには、実施例に含まれる方法と同様にＷＯ９９／３４０１１および米国特許６，６０５，４５８号（いずれも参照により本発明に取り込まれる）に記載されたものが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４６】
プロテアーゼの「洗浄有効量」とは、特定の洗浄組成物において望ましい酵素活性レベルを達成する本発明における前述のプロテアーゼ量のことをいう。そのような有効量は実際には当業者によって確定され、使用される特定プロテアーゼ、洗浄応用、洗浄組成物の特定の構成、および液体または乾燥（例えば、顆粒状、棒状）組成物が必要とされるか否かなどの多くの因子に基づく。
【０２４７】
本発明で用いられるように、「洗浄補助（adjunct）物質」は、所望の洗浄組成物特定のタイプおよび生産物の形態（例えば、液体、顆粒、粉体、棒、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル、または泡組成物）として選択される任意の液体、固体または気体物質意味する。ここで、これらの物質も好ましくは組成物で用いられるプロテアーゼ酵素に適合する。幾つかの態様において顆粒組成物は「緻密な（compact）」形態であり、一方他の態様において前記液体組成物は「濃縮された」形態である。
【０２４８】
洗浄活性の文脈における「増強された性能」とは、標準洗浄サイクルおよび／または多回洗浄サイクルの後に通常の評価法により決定される卵、ミルク、草または血液のような特定酵素感度染色の増加した又はより大きな洗浄活性のことをいう。
【０２４９】
洗浄活性の文脈における「低減された性能」とは、標準洗浄サイクルの後に通常の評価法により決定される卵、ミルク、草または血液のような特定酵素感度染色の減少した又はより少ない洗浄活性のことをいう。
【０２５０】
洗浄活性の文脈における「比較性能」とは、ＯＰＴＩＭＡＳＥTMプロテアーゼ（ジェネンコー社）、ＰＵＲＡＦＥＣＴTMプロテアーゼ製品（ジェネンコー社）、ＳＡＶＩＮＡＳＥTMプロテアーゼ（ノボザイム社）、ＢＰＮ’−変異体（例えば、米国特許Ｒｅ３４，６０６号を参照されたい）、ＲＥＬＡＳＥTM、ＤＵＲＡＺＹＭＥTM、ＥＶＥＲＬＡＳＥTM、ＫＡＮＮＡＳＥTMプロテアーゼ（ノボザイム社）、ＭＡＸＡＣＡＬTM、ＭＡＸＡＰＥＭTM、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥTMプロテアーゼ（ジェネンコー社；米国特許Ｒｅ３４，６０６号、５，７００，６７６号、５，９５５，３４０号、６，３１２，９３６号、６，４８２，６２８号も参照されたい）、およびＢ．レンタス変異体プロテアーゼ製品（例えば、ＷＯ９２／２１７６０号、ＷＯ９５／２３２２１号および／またはＷＯ９７／０７７７０号（ヘンケル）で記載されるもの）を含むがこれらに限定されない比較スブチリシン・プロテアーゼ（例えば、市販のプロテアーゼ）の６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上の洗浄活性のことをいう。具体的なスブチリシン・プロテアーゼ変異体には、ＢＰＮ’の位置７６、１０１、１０３、１０４、１２０、１５９、１６７、１７０、１９４、１９５、２１７、２３２、２３５、２３６、２４５、２４８、および／または２５２に相当する残基位置に置換または欠失を有するものが含まれるが、これらに限定されない。洗浄性能は、標準洗浄サイクル条件にした後に通常の分光光度法または分析方法により測定される草、血液、またはミルクのように酵素感度染色に関する様々な洗浄アッセイにおいて、本発明のプロテアーゼをそのようなスブチリシン・プロテアーゼと比較することにより決定できる。
【０２５１】
本発明で用いられるように、「低洗剤濃度」系は洗浄水に約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が存在する洗剤を含む。日本の洗剤は、洗浄水に通常約６６７ｐｐｍの洗剤成分が存在するため、典型的には低洗剤濃度系と見なされる。
【０２５２】
本発明で用いられるように、「中洗剤濃度」系は洗浄水に約８００ｐｐｍおよび約２０００ｐｐｍの間の洗剤成分が存在する洗剤を含む。北米の洗剤は、洗浄水に通常約９７５ｐｐｍの洗剤成分が存在するため、一般的には中洗剤濃度系と見なされる。ブラジルの洗剤は、典型的には洗浄水に約１５００ｐｐｍの洗剤成分を有する。
【０２５３】
本発明で用いられるように、「高洗剤濃度」系は洗浄水に約２０００ｐｐｍより多くの洗剤成分が存在する洗剤を含む。ヨーロッパの洗剤は、洗浄水に約３０００−８０００ｐｐｍの洗剤成分が存在するため、一般的には高洗剤濃度系と見なされる。
【０２５４】
本発明で用いられるように、「織物洗浄組成物」には、洗濯添加組成物および染色織物（例えば、布、リンネル、および他の布地材料）の浸しおよび／または前処理に用いるのに適した組成物を含む、手および機械洗濯洗剤が含まれる。
【０２５５】
本発明で用いられるように、「非織物洗浄組成物」には、食器洗い洗剤組成物、口洗浄組成物、義歯洗浄組成物、およびパーソナル洗浄組成物を含むが、これらに限定されない非織物（non-textile）（例えば、布地）表面洗浄組成物が含まれる。
【０２５６】
本発明の洗浄組成物の「緻密な」形態は濃度に、組成物の用語においては無機充填剤塩に最も影響される。無機充填剤塩は粉状形態の洗剤組成物の従来からの成分である。従来の洗剤組成物においては、前記充填剤塩は組成物の１０％重量を超えない量、またはより好ましくは５％重量存在する。幾つかの態様において、前記無機充填剤塩はアルカリおよびアルカリ土類金属の硫酸および塩酸塩から選択される。好ましい充填剤塩は硫酸ナトリウムである。
【０２５７】
II．セリンプロテアーゼ酵素およびセリンプロテアーゼ酵素をコードする核酸
本発明は、プロテアーゼをコードするアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。幾つかの態様において、これらのポリヌクレオチドは配列番号６−８で示されるアミノ酸配列（例えば、基質のペプチド結合の加水分解を触媒する成熟プロテアーゼを含む、蛋白分解活性を有するポリヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列の少なくとも一部分）に６５％以上のアミノ酸配列同等性、好ましくは７０％以上のアミノ酸配列同等性、より好ましくは７５％以上のアミノ酸配列同等性、さらにより好ましくは８０％以上のアミノ酸配列同等性、より好ましくは８５％以上のアミノ酸配列同等性、さらにより好ましくは９０％以上のアミノ酸配列同等性、より好ましくは９２％以上のアミノ酸配列同等性、もっとより好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同等性、より好ましくは９７％以上のアミノ酸配列同等性、さらにより好ましくは９８％以上のアミノ酸配列同等性、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸配列同等性、および／または同定された洗浄条件下で明示的に同等な又は増強された洗浄性能を含む。
【０２５８】
幾つかの態様において、パーセント相同性（アミノ酸配列、核酸配列、遺伝子配列）は、配列のアライン、アラインされた２つの配列間の一致する正確な数の計数、より短い配列長への分割、およびその結果に１００を乗じることによる、２つの分子間配列情報の直接比較により決定される。これらの分析には、上述のような簡単に利用できるコンピュータプログラムが用いられる。ヌクレオチド配列の相同性を決定するためのプログラムは、ウィスコンシン・アナリシス・パッケージのバージョン８（ジェネティック・コンピュータ・グループ、マディソン、ウィスコンシン州）中で、スミスおよびウォーターマン・アルゴリズムにも依存する、例えばＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＧＡＰプログラムを利用できる。これらのプログラムは製造元により推奨され、上記のウィスコンシン・アナリシス・パッケージにおいて記載されるデフォルト・パラメータとともに容易に利用される。
【０２５９】
配列類似性を決定するの好適なアルゴリズムの具体例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、アルツール（Altschul）他により記述されている（アルツール他著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、２１５巻、４０３−４１０頁、１９９０年）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは国立バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して公的に利用できる。このアルゴリズムは、データベース配列の同じ長さの用語をアラインする時にある陽性値の閾値スコアと一致またはこれを満足するかいずれかの質問配列において長さＷの短い用語を同定することによる高スコア配列ペア（ＨＳＰｓ）の第一同定を含む。これらの初めの隣接用語検索は、これらを含むより長いＨＳＰｓを見つけるための出発地点の役割を果たす。これらの用語検索は、蓄積アラインメント・スコアが増加する限り比較される２つの配列に沿って両方向に拡張される。用語検索の延長は、蓄積アラインメント・スコアが最大到達値から量Ｘだけ減少したとき、蓄積スコアがゼロ以下になったとき、またはいずれかの配列末端に到達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、用語長（Ｗ）の１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア表（ヘニコフ＆ヘニコフ（Henikoff & Henikoff）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンスＵＳＡ、８９巻、１０９１５頁、１９８９年を参照されたい。）アラインメントの５０、期待値（Ｅ）の１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、および両鎖の比較をデフォルトとして用いる。
【０２６０】
つぎにＢＬＡＳＴアルゴリズム２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、カーリンおよびアルツール（karlin and Altschul）著、プロシーデングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス（Poc.Natl.Acad.Sci.）ＵＳＡ、９０巻、５８７３−５８８７頁、１９９３年）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性のひとつの測定値は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸間の一致が偶然に起こる確率を示している。例えば、もしセリンプロテアーゼ核酸に試験核酸を比較した最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは０．００１未満であるなら、核酸は本発明のセリンプロテアーゼ核酸に類似していると見なされる。試験核酸がセリンプロテアーゼをコードする場合には、もし比較によって約０．５未満、より好ましくは約０．２未満の最小合計確率となるなら、特定のセリンプロテアーゼ核酸に類似していると見なされる。
【０２６１】
本発明の幾つかの態様において、配列はＢＬＡＳＴおよび蛋白翻訳配列装置によって分析された。幾つかの態様において、好ましいバージョンはＢＬＡＳＴ（ベーシックＢＬＡＳＴバージョン２．０）である。選択されるプログラムは「ＢｌａｓｔＸ」であり、選択されるデータベースは「ｎｒ」である。標準／デフォルトのパラメータ値が採用された。
【０２６２】
幾つかの好ましい態様において、本発明は配列番号１で示される約１６２１塩基対長のポリヌクレオチドを含む。開始コドン配列番号１において太字で示されている。本発明の他の態様において、これらのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、もし発現すると配列番号９の１−２８アミノ酸をコードするシグナル配列（配列番号５の１−８４ヌクレオチド）、Ｎ末端プロ配列（配列番号６の２９−１９８アミノ酸残基をコードする８４−５９４ヌクレオチド）、成熟プロテアーゼ配列（配列番号８の１−１８９アミノ酸残基をコードする配列番号２の５９５−１１６１ヌクレオチド）、およびＣ末端プロ配列（配列番号６の３８８−４９５アミノ酸残基をコードする１１６２−１４８６ヌクレオチド）をコードすると信じられている１４８５塩基対部分（配列番号２の１−１４８５残基）を含む。選択的には、前記シグナルペプチド、Ｎ末端プロ配列、成熟セリンプロテアーゼ配列、およびＣ末端プロ配列は、１−１８９と番号がつけられた配列番号１の成熟プロテアーゼのアミノ酸残基、すなわち、シグナルペプチド（−１９８〜−１７１残基）、Ｎ末端プロ配列（−１７１〜−１）、成熟セリンプロテアーゼ配列（１〜１８９）、およびＣ末端プロ配列（１９０〜２９８）に関して番号が付けられる。本発明の他の態様において、蛋白分解活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、シグナルペプチドおよび前駆体プロテアーゼをコードする配列番号２の部分の１〜１４８５ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。本発明の他の態様において、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは前駆体セルロモナス・プロテアーゼ（配列番号３）をコードするポリヌクレオチドの１〜１４１２ヌクレオチドの配列を含む。さらに他の態様において、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは成熟セルロモナス・プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの部分の１〜５８７ヌクレオチドの配列を含む。
【０２６３】
当業者によって理解されるように、遺伝子コードの縮重のために様々なポリヌクレオチド配列番号６、７，および／または８のそれぞれにおいて提供されるシグナルペプチド、前駆体プロテアーゼおよび／または成熟プロテアーゼ、または上述の％配列差有働製を有するプロテアーゼをコードすることができる。本発明の他の態様は、シグナルペプチドおよび前駆体プロテアーゼ、前駆体プロテアーゼ、および／または成熟プロテアーゼをそれぞれコードする配列番号２、３、および／または４それぞれのポリヌクレオチド配列に７０％以上の相同性、７５％以上の相同性、８０％以上の相同性、８５％以上の相同性、９０％以上の相同性、９２％以上の相同性、９５％以上の相同性、９７％以上の相同性、９８％以上の相同性、および９９％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０２６４】
追加の態様において、本発明は、コードされた断片が蛋白分解活性を保持する限りプロテアーゼをコードするＤＮＡの断片または部分を提供する。本発明の他の態様は、前駆体プロテアーゼをコードする配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号１の１８５−１６７２残基の２０％以上の配列長、３０％以上の配列長、４０％以上の配列長、５０％以上の配列長、６０％以上の配列長、７０％以上の配列長、７５％以上の配列長、８０％以上の配列長、８５％以上の配列長、９０％以上の配列長、９２％以上の配列長、９５％以上の配列長、９７％以上の配列長、９８％以上の配列長、および９９％以上の配列長を有するポリヌクレオチドを含む。選択的な態様において、これらの配列長の断片または部分は、組換えＤＮＡにおけるＤＮＡ配列（例えば、米国特許６，１３２，９７０号を参照されたい）のシャフリングに有用な配列長の隣接部分である。
【０２６５】
本発明の他の態様は、セルロモナス６９Ｂ４由来の本発明に記載の成熟プロテアーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを単離または同定するために用いることができる部分長ＤＮＡ断片を認められた技術にしたがって得るのに用いられる本発明に記載のＤＮＡ断片を含む。さらに、配列番号１で示されるＤＮＡは他種由来のＤＮＡの相同な断片、および蛋白分解活性を有するそれらのプロテアーゼまたは部分をコードする特にセルロモナス種由来のものを同定するのに用いられる。
【０２６６】
さらに本発明は、ゲノムまたはｃＤＮＡ起源のいずれかの核酸をスクリーニングするためのプローブまたはプライマとして、配列番号１から構築されたプライマまたはプローブ配列、またはそれらの適切な部分または断片（例えば、約５−２０または１０−１５の隣接ヌクレオチド）を用いることを含む。幾つかの態様において、本発明は配列番号１、２、３、または４における配列に基づく所望の長さ（すなわち、概して１００〜１０００塩基長）のＤＮＡプローブを提供する。
【０２６７】
幾つかの態様において、ＤＮＡ断片は電気泳動的に分離され、ゲルから切り出され、ゲルのデンプンマトリックスから回収される。好ましい態様において、このＤＮＡの精製断片は次に標識化され（例えば、製造者の説明にしたがってメガプリム（Megaprime）標識システムを用いて）ＤＮＡ中に32Ｐを取り込む。標識プローブは所定の時間（例えば、５分）９５℃まで加熱することにより変性され、直ちに膜およびハイブリダイゼーション前処理溶液に添加される。ハイブリダイゼーション反応は、穏やかな振とうまたは回転を行い、適切な時間および適切な条件下（例えば、１８時間、３７℃）で進行する。前記膜は浸漬し（例えば、ＳＳＣ／０．３％ＳＤＳ中２回）、次に緩やかに撹拌して適切な洗浄液で洗浄する。望ましいストリンジェンシーは膜（フィルター）が洗浄される条件に依存する。幾つかの態様において「低度ストリンジェンシー」条件は２０℃で１５分間０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することを含み、他の態様において「中程度ストリンジェンシー」条件は３７℃で３０分間０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中でさらに洗浄することを含み、他の態様において「高度ストリンジェンシー」条件は３７℃で４５分間０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中でさらに洗浄することを含み、さらに他の態様において「最大ストリンジェンシー」条件は３７℃で６０分間０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中でさらに洗浄することを含む。したがって、本発明の様々な態様は中程度、高度および／または最大ストリンジェンシー条件下において配列番号１、２、３、４、および／または５で示されるヌクレオチド配列に由来するプローブにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを提供する。
【０２６８】
洗浄後、前記膜は乾燥され、結合プローブが検出される。もし32Ｐまたは他の放射性同位体が標識化剤として用いられるなら、結合プローブはオートラジオグラフィーにより検出される。他のプローブを可視化するための他の技術は当業者に周知である。結合プローブの検出は核酸配列が望ましい相同性を有することを示し、ゆえに配列番号１、２、３、４、および／または５に相同であり、本発明に包含される。したがって、本発明は、配列番号１、２、３、４、および／または５の核酸配列の部分または全部とゲノムまたはｃＤＮＡ起源のいずれかの他の核酸とのハイブリダイゼーションを含む本発明により包含されるプロテアーゼをコードする核酸の検出方法を提供する。
【０２６９】
前述のように他の態様において、ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体の溶融温度（Ｔｍ）に基づき、以下で定義される「ストリンジェンシー」を含む。「最大ストリンジェンシー」は典型的には約Ｔｍ５℃（プローブのＴｍの５℃下）で生じ、「高度ストリンジェンシー」はＴｍより約５℃から１０℃下、「中程度ストリンジェンシー」はＴｍより約１０℃から２０℃下、および「低度ストリンジェンシー」はＴｍより約２０℃から２５℃下で生じる。当業者に知られているように、中程度、高度および／または最大ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチド配列ホモログまたは同等なポリヌクレオチド配列を同定または検出するために条件が最適化されるように選択される。
【０２７０】
さらに追加の態様において、本発明は、本発明のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築体（すなわち、発現ベクター）を提供する。更なる態様において、本発明は１つ以上のこれらのベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。
【０２７１】
更なる態様において、本発明はシグナル配列をさらにコードするポリヌクレオチド配列を提供する。幾つかの態様において、配列番号５と６５％以上の配列相同性、７０％以上の配列相同性、好ましくは７５％以上の配列相同性、より好ましくは８０％以上の配列相同性、より更に好ましくは８５％以上の配列相同性、さらにより好ましくは９０％以上の配列相同性、より好ましくは９５％以上の配列相同性、より好ましくは９７％以上の配列相同性、９８％以上の配列相同性、および最も好ましくは９９％以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル活性を有するポリヌクレオチドを含む。したがって、これらの態様において本発明は、推定シグナル配列、および中程度、高度および／または最大ストリンジェンシー条件下において配列番号５で開示されるヌクレオチド配列由来のプローブにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを提供する。ここで前記シグナル配列は本発明のポリヌクレオチドによりコードされるシグナル配列と実質的に同じシグナル活性を有する。
【０２７２】
幾つかの態様において、前記シグナル活性は出発物質として、発酵培地へのプロテアーゼの分泌と実質的に同じ濃度により示される。例えば、幾つかの態様において、本発明は、配列番号３のシグナル配列により示される発酵培地における分泌プロテアーゼ濃度の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の発酵培地プロテアーゼ濃度を提供する。幾つかの態様において、分泌プロテアーゼ濃度はｐＮＡアッセイ（例えば、以下のデルマル（Del Mar）［１９７９年］を参照されたい）のようなプロテアーゼ活性分析により確認される。グラム陽性宿主細胞における異種または同種タンパク質の分泌濃度を決定し、検出するための追加的な手段には、そのタンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかの抗体を用いることが含まれる。この具体例には、当該技術分野で周知の酵素結合免疫溶解アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が含まれる。
【０２７３】
更なる態様において、本発明は、配列番号９、配列番号２のヌクレオチド残基位置１〜８５、および／または配列番号５に示されたシグナルペプチド（配列番号５の１−８４ヌクレオチド）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに本発明は、低度、中程度、高度および／または最大ストリンジェンシー条件下において配列番号５に示される核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を包含する。しかし、ここで前者配列は後者配列と実質的に同じシグナル活性を有する。本発明は全てのそのようなポリヌクレオチドを包含する。
【０２７４】
更なる態様において、本発明は、本発明で記載されるヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドを提供する。具体的な相補的ヌクレオチド配列は配列番号１−５に示される配列を含む。
【０２７５】
本発明の更なる側面には、配列番号６（すなわち、前記シグナルおよび前駆体プロテアーゼ）、配列番号７（すなわち、前記前駆体プロテアーゼ）、および／または配列番号８（すなわち、成熟プロテアーゼ）のアミノ酸配列に６５％のアミノ酸配列相同性、７０％以上のアミノ酸配列相同性、８０％以上のアミノ酸配列相同性、８５％以上のアミノ酸配列相同性、９０％以上のアミノ酸配列相同性、９５％以上のアミノ酸配列相同性、９７％以上のアミノ酸配列相同性、９８％以上のアミノ酸配列相同性、および９９％以上のアミノ酸配列相同性を含む蛋白分解活性を有するポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドの蛋白分解活性は当該技術分野で既知の方法を用いて測定され、これらの方法には洗剤機能を評価するために用いられる方法が含まれる。更なる態様において、前記ポリペプチドは単離される。本発明の更なる態様において、前記ポリペプチドは配列番号６、７、または８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む。幾つかの更なる態様において、前記ポリペプチドは配列番号６、７、または８の部分と相同である。
【０２７６】
幾つかの態様において、本発明は、配列番号６で示される約４９５アミノ酸長のアミノ酸配列を含み、蛋白分解活性を有する単離されたポリペプチドを提供する。更なる態様において、本発明は、配列番号７で示される約４６７アミノ酸長のアミノ酸配列を含む蛋白分解活性を有するポリペプチドを含む。幾つかの態様において、これらのアミノ酸配列はシグナル配列（配列番号９の１−２８アミノ酸）および前駆体プロテアーゼ（配列番号７の１−４６７アミノ酸）を含む。追加的な態様において、本発明は、Ｎ末端プロ配列（配列番号７の１−１７０アミノ酸）、成熟プロテアーゼ配列（配列番号８の１−１８９アミノ酸）、およびＣ末端プロ配列（配列番号７の３６０−４６７アミノ酸）を含むポリペプチドを含む。より更なる態様において、本発明は、前駆体プロテアーゼ配列（例えば、配列番号７の１−４６７アミノ酸）を含む。さらに他の態様において、本発明は、アミノ酸（例えば、配列番号８の１−１８９）を含む成熟プロテアーゼ配列を含むポリペプチドを提供する。
【０２７７】
更なる態様において、本発明は、アミノ酸配列相同性研究で同定されたミクロコシネアエを含むが、これに限定されない菌種由来の前述の配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび／またはプロテアーゼを提供する。幾つかの態様において、前駆体ミクロコシネアエ・プロテアーゼのアミノ酸残基は、それがセルロモナス６９Ｂ４株（すなわち、同じ又は類似の化学的に結合、反応、および相互作用する機能的な性能を有する）における残基の特定の残基または部分に相同（すなわち、一次または三次構造のいずれかにおいて位置が対応する）または類似のいずれかであるならば、セルロモナス６９Ｂ４株の残基と同等である。
【０２７８】
幾つかの好ましい態様において、一次構造への相同性を構築するために、前駆体のアミノ酸配列は直接的にセルロモナス株６９Ｂ４成熟プロテアーゼのアミノ酸配列および特に配列が既知のセルロモナス様プロテアーゼの全部または大部分において変異していないと認められる一群の保存された残基と比較される。アラインメントを維持するために必要な挿入および欠失を許容する保存された残基のアライン後に、成熟プロテアーゼ（配列番号８）およびセルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼにおける特定のアミノ酸に対応する残基が決定される。保存された残基のアラインメントは、好ましくは１００％のそのような残基を保存すべきである。しかしながら、保存された残基の７５％を超える、または４５％だけのアラインメントも等価な残基を定義するには十分である。しかしながら、触媒的トリアッド（triad）である配列番号８のＨｉｓ３２／Ａｓｐ５６／Ｓｅｒ１３７の保存は維持されるべきである。
【０２７９】
例えば、幾つかの態様において、セルロモナス株６９Ｂ４、および前述の他のミクロコシネアエ種由来のプロテアーゼのアミノ酸配列は、アミノ酸配列間の相同性の最大量を提供するためにアラインされる。これらの配列の比較により各配列に数多くの保存された残基が存在することが示される。問題の前駆体または成熟ミクロコシネアエ・プロテアーゼにおいて同定されるアミノ酸の等価な残基位置を確立するために同定され、用いられる残基が存在する。
【０２８０】
これらの保存された残基はミクロコシネアエ・ホモログ（例えば、セルロモナス・セラシア（ＤＳＭ２０１１８）および／または本発明におけるセルロモナス・ホモログ）における１つ以上のセルロモナス株６９Ｂ４プロテアーゼの対応するアミノ酸残基を確かめるために用いられる。これらの特定のアミノ酸配列は、保存された残基の最大相同性を生成するためにセルロモナス株６９Ｂ４プロテアーゼの配列とアラインされる。このアラインメントによって、セルロモナス種と比較してセルロモナス株６９Ｂ４の配列および特定の残基位置が認められる。したがって、触媒的トリアッド（例えば、セルロモナス株６９Ｂ４プロテアーゼにおける）についての等価なアミノ酸は他のミクロコシネアエ種において同定可能である。本発明の幾つかの態様において、前記プロテアーゼ・ホモログは配列番号８のＨｉｓ３２／Ａｓｐ５６／Ｓｅｒ１３７の等価物を含む。
【０２８１】
２つのポリペプチドが実質的に同じであることは第一ポリペプチドが第二ポリペプチドと免疫学的に交叉反応性を有することでも示される。免疫学的交叉反応性を測定する方法論は当該技術分野において記述されており、また本発明の実施例に記載されている。典型的には、保存されたアミノ酸置換で異なるポリペプチドは免疫学的に交叉反応性である。したがって、例えば２つのペプチドが保存された置換のみで異なる場合には、ポリペプチドは第二ポリペプチドと同じである。
【０２８２】
本発明は様々な起源から得られたプロテアーゼわ包む。幾つかの好ましい態様において前記プロテアーゼは細菌から得られ、一方他の態様において前記プロテアーゼは真菌から得られる。
【０２８３】
幾つかの特に好ましい態様において、細菌源はミクロコシネアエ亜目のなかまから選択される。幾つかの態様において、細菌源はプロミクロモノスポラシアエ科である。幾つかの好ましい態様において、前記プロミクロモノスポラシアエ種は、プロミクロモノスポラ・シトレア（Promicromonospora citrea）（ＤＳＭ４３１１０）、プロミクロモノスポラ・スクモエ（Promicromonospora sukumoe）（ＤＳＭ４４１２１）、プロミクロモノスポラ・アエロラタ（Promicromonospora aerolata）（ＣＣＭ７０４３）、プロミクロモノスポラ・ビンドボネンシス（Promicromonospora vindobonensis）（ＤＳＭ７０４４）、ミセリゲネランス・キシリゴウエンス（Myceligenerans xiligouense）（ＤＳＭ１５７００）、イソプテリコラ・バリアビリス（Isoptericola variabilis）（ＤＳＭ１０１７７、basonym Cellulosimicrobium variabile）、セルロシミクロビウム・セルランス（ＤＳＭ２０４２４、basonym Nocardia cellulans, Cellulomonas cellu;ans）、セルロシミクロビウム・フンケイ（Cellulosimicrobium funkei）、キシラニモナス・セルシリティカ（Xylanimonas cellulosilytica）（ＬＭＧ２０９９０）、キシラニバクテリウム・ウルミ（Xylanibacterium ulmi）（ＬＭＧ２１７２１）、およびキシラニミクロビウム・パクノダエ（Xylanimicrobium pachnodae）（ＤＳＭ１２６５７、basonym Promicromonospora pachnodae）を含み、これらからなる群から選択される。他の特定の好ましい態様において、前記細菌源はセルロモナダシアエ科（Cellulomonadaceae）である。幾つかの好ましい態様において、前記セルロモナダシアエ種は、セルロモナス・フィミ（ＡＴＣＣ４８４、ＤＳＭ２０１１３）、セルロモナス・ビアゾテア（ＡＴＣＣ４８６、ＤＳＭ２０１１２）、セルロモナス・セラシア（ＡＴＣＣ４８７、２１６８１、ＤＳＭ２０１１８）、セルロモナス・デンベレンシス（Cellulomonas denverensis）、セルロモナス・ホミニス（ＤＳＭ９５８１）、セルロモナス・フラビゲナ（ＡＴＣＣ４８２、ＤＳＭ２０１０９）、セルロモナス・ペルシカ（ＡＴＣＣ７００６４２、ＤＳＭ１４７８４）、セルロモナス・イラネンシス（ＡＴＣＣ７００６４３、ＤＳＭ１４７８５）、セルロモナス・フェルメンタンス（ＡＴＣＣ４３２７９、ＤＳＭ３１３３）、セルロモナス・ゲリダ（ＡＴＣＣ４８８、ＤＳＭ２０１１１、ＤＳＭ２０１１０）、セルロモナス・フミラタ（ＡＴＣＣ２５１７４、basonym Actinomyces humiferus）、セルロモナス・ウダ（ＡＴＣＣ４９１、ＤＳＭ２０１０７）、セルロモナス・キシラニリティカ（ＬＭＧ２１７２３）、セルロモナス・セプティカ（Cellulomonas septica）、セルロモナス・パラホミニス（Cellulomonas parahominis）、エルスコビア・トゥルバタ（ＡＴＣＣ２５８３５、ＤＳＭ２０５７７、synonym Cellulomonas turbata）、エルスコビア・ジエネンシス（ＤＳＭ４６０００）、エルスコビア・エンテロフィラ（ＡＴＣＣ３５３０７、ＤＳＭ４３８５２、basonym Promocromonospora enterophila）、エルスコビア・パウロメタボラ（ＤＳＭ１４２８１）、およびセルロモナス株６９Ｂ４（ＤＳＭ１６０３５）を含み、これらからなる群から選択される。更なる態様において、前記細菌源はまた、テルモビフィダ（Thermobifida）種、ラロバクター（Rarobacter）種、および／またはリゾバクター（Lysobacter）種を含み、これからなる群から選択される。さらに追加的な態様において、テ���モビフィダ種はテルモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca、basonym Thermomonospora fusca）（ｔｆｐＡ、ＡＡＣ２３５４５、ラオ（Lao）他著、アプライド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）、６２巻、４２５６−４２５９頁、１９９６年を参照されたい）である。選択的な態様において、ラロバクター種はラロバクター・フェシタビドゥス（Rarobacter faecitabidus）（ＲＰＩ、Ａ４５０５３、例えば、シモア（Shimoi）他著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６７巻、２５１８９−２５１９５頁、１９９２年を参照されたい）である。さらに他の態様において、リゾバクター種はリゾバクター・エンジモゲネス（Lysobacter enzymogenes）である。
【０２８４】
更なる態様において、本発明は真菌源から得られ、および／または単離されたポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを提供する。幾つかの態様において、前記真菌源はメタリジウム（Metarhizium）種を含む。幾つかの好ましい態様において、前記真菌源はメタリジウム・アニソプリアエ（Metarhizium anosopliae）（ＣＨＹ１（ＣＡＢ６０７２９））である。
【０２８５】
他の態様において、本発明は、本発明に参照により取り込まれる米国特許５，４０１，６５７号で記載される分類学的分類のクラスター２から選択されるセルロモナス株由来のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを提供する。米国特許５，４０１，６５７号において、アルカリ性湖の中および周囲から単離された２０株の細菌は、（１）グラム染色反応のドゥソルト（Dussault）修飾（Dussault著、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、７０巻、４８４−４８５頁、１９５５年）、（２）ＫＯＨ感度試験（グレガーセン（Gregersen）著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・アプライド・マイクロバイオロジー＆バイオテクノロジー、５巻、１２３−１２７頁、１９７８年；ハレビアン（Halebian）他著、ジャーナル・オブ・クリニカル・バイオロジー、１３巻、４４４−４４８頁、１９８１年）、（３）アミノペプチダーゼ反応（ツェルニィ（Cerny）著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・アプライド・マイクロバイオロジー、３巻、２２３−２２５頁、１９７６年；Cerny著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・アプライド・マイクロバイオロジー、５巻、１１３−１２２頁、１９７８年）に基づいてグラム陽性細菌として知られているタイプのバクテリアに指定された。さらに、ほとんどの場合、確認もコリンズにより記述された方法（コリンズ著、グッドフェローおよびミニキン編中の「細菌組織における化学的方法」、アカデミックプレス社、ロンドン、１９８５年、２６７−２８８頁）を用いてキノン分析（コリンズおよびジョーンズ、マイクロバイオロジー・レビュー、４５巻、３１６−３５４頁、１９８１年）に基づいてなされた。さらに、株は２００の性質について試験され、結果は数分類（Numerical Taxonomy）の原理を用いて分析された（例えば、スニースおよびソーカル（Sneath and Sokal）著、「数分類」、Ｗ．Ｈ．フリーマン社、サンフランシスコ、カリフォルニア州、１９７３年を参照されたい）。具体的な試験された性質、試験方法、およびコード化方法も米国特許５，４０１，６５７号に記載されている。
【０２８６】
米国特許５，４０１，６５７号に記載されているように、２００単位の性質からなる表現的データは「ｎ×ｔ」マトリクスの形態でスコア付けされ、設定された。ここで、ｔカラムは類似性に基づいてクループ分けされる「ｔ」細菌株を表し、「ｎ」列は単位性質である。細菌株の分類学的類似性は類似係数（スニースおよびソーカル、前述、１１４−１８７頁）によって評価された。多くの異なる係数が生物学的分類に用いられてきたが、細菌学においてはほんの数種のものが正規に用いられているに過ぎない。これらの会合係数（例えば、スニースおよびソーカル、前述、１２９頁）、すなわちゴワ、ジャッカード、およびシンプル（Gower, Jaccard, and Simple）のマッチング係数が適用された。これらはしっかりした分類をもたらすことが示されているため、細菌学的データの分析にたびたび適用されてきており、当業者に広く認められている。
【０２８７】
コード化されたデータは、英国ロチェスター大学のＤＥＣＶＡＸコンピュータで動くＴＡＸＰＡＫプログラムパッケージ（サッキン（Sackin）著、メソッド・オブ・マイクロバイオロジー、１９巻、４５９−４９４頁、１９８７年）を用いて分析した。
【０２８８】
類似マトリクスは、ＴＡＸＰＡＫ中のＲＴＢＮＳＩＭプログラムを用いる、陰性一致（スニースおよびソーカル、前述、１３５−１３６頁）を許容するオプションを含むゴワ係数を用いて全ての株の対について構築した。主要な分析機器および本発明において示される分類データのほとんどが基づくものとして、ゴワ係数は全てのタイプの性質またはデータ、すなわち、２つの状態、多状態（命令され、質的な）、および量的なものに適用できるため、類似マトリクスを生成するための多係数を超えて選択された。
【０２８９】
類似マトリクスのクラスター分析は、ＴＡＸＰＡＫ中のＳＭＡＴＣＬＳＴサブルーチンを動かすことにより、重みのない平均結合操作としても知られる算数平均（ＵＰＧＭＡ）アルゴリズムを有する重みのないペア群方法（Unweighted Pair Group Method）を用いて実施された。
【０２９０】
デンドログラム（樹状図）は細菌株間の類似性のレベルを表している。幾つかの態様において、デンドログラムはＴＡＸＰＡＫ中のＤＥＮＤＧＲプログラムを用いて得られる。表現的データは、ＴＡＸＰＡＫ中のＲＴＢＮＳＩＭプログラムを動かすことにより、ジャッカード係数（Ｓj）（スニースおよびソーカル、前述、１３１頁）およびシンプルマッチング係数（ＳSM）（スニース、Ｐ．Ｈ．Ａおよびソーカル、前述、１３２頁）を用いて再分析された。追加の２つのデンドログラムは、ＴＡＸＰＡＫ中のＵＰＧＭＡオプションおよびＤＥＮＤＧＲサブルーチンを有するＳＭＡＴＣＬＳＴを用いることにより得られた。
【０２９１】
ＳG／ＵＰＧＭＡ法を用いて、６天然クラスターまたはアルカリ性菌のフェノンが７９％類似性レベルで生成された。これらの６クラスターはアルカリ湖から単離された２０アルカリ性菌のうち１５を含んでいた。描写のレベルとして７９％の選択は任意であったが、数分類における現在の実施に調和していた（例えば、オースチン・プリースト（Austin Priest）著、「現代細菌分類」、バン・ノストランド・レインホールド社、ワーキンガム、英国、１９８６年、３７頁）。より低いパーセンテージで描写することは、定義がデータで支持されない明らかに無関係の生物体のグループを混合することになる。７９％レベルで、３クラスターが１３の新しい単離株（潜在的に新しいタクソンを示す）を示す新規なアリカリ性菌を例外的に含んでいた。プロテアーゼ６９Ｂ４はこの方法でクラスター２に分類された。
【０２９２】
このレベルにおけるクラスタリングの意義はＴＥＳＴＤＥＮプログラムの結果により支持された。このプログラムは、平方ユークリッド距離（Squared Euclidean distances）を含むＵＰＧＭＡ生成デンドログラムにおいてクラスターの二分枝ペア（４以上の株を含む）の意義、またはクラスターが超球であること測定および推測としてのそれらの補足物を試験する。臨界重なりは０．２５％に設定された。クラスターの分離は非常に重要である。
【０２９３】
Ｓj係数は、潜在的に主観的で質的なデータ上に置かれる過度の重みによる陰性一致や歪みに基づくＳG係数のフェノンを検出するために用いることができるので、ＳG係数の有用な付加物である。結局、Ｓj係数は、ＳG係数の使用により初めに定義されるクラスターの価値を確認するために有用である。ジャッカード係数は生化学的な非反応性の生物体（オースチンおよびプリースト、前述、３７頁）において特に有用である。さらに、マッチング陰性性質状態（スニースおよびソーカル、前述、１３１頁）の許容性についてのある疑問があり得る。この場合、シンプルのマッチング係数は広く選択的に用いられる。６９Ｂ４株はこの方法によりクラスター２内のものとして分類される。
【０２９４】
主にＳG／ＵＰＧＭＡ法により生成された全てのクラスター（特に新しい細菌のクラスター）はＳj／ＵＰＧＭＡ法（共表現的相関、０．７９５）、およびＳSM／ＵＰＧＭＡ法（共表現的相関、０．８１４）により作成されるデンドログラムにおいて回収される。これらの形質移入の主な効果は、アルカリ性バチルス種および新しいアルカリ性菌と、後者の特異性との間の分離を協調するのにさらに役立つ単一の大きなクラスターにおける全てのバチルス株を集めることであった。これらの方法論に基づいて、６９Ｂ４はクラスター２細菌と見なされる。
【０２９５】
本発明の他の側面において、前記ポリヌクレオチドはセルロモナス６９Ｂ４株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列と７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％以上相同な１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ヌクレオチドを有する細菌に由来する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列は受託番号Ｘ９２１５２でジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に寄託されている。
【０２９６】
図１は、セルロモナダシアエ科（セルロモナス６９Ｂ４株を含む）のなかま及び他のミクロコシネアエ亜目の関連属と新株６９Ｂ４との関係を表すまだ定着していない系統樹を示す。デンドログラムはアラインされた１６ＳｒＤＮＡ配列（１３７４ｎｔ）からＴＲＥＥＣＯＮＷバージョン１．３ｂ（バン・デ・ピア（Van de Peer）およびデ・ウォッチャー（De Watcher）、コンピュータ・アプライド・バイオサイエンス、１０巻、５６９−５７０頁、１９９４年）を用いて構築された。距離評価はジュークスおよびカントーの置換速度カリブレーション（Jukes and Cantor著、「蛋白分子の進化」、ムンロー（Munro）編中、アカデミック・プレス社、ニューヨーク、２１−１３２頁、１９６９年）および近傍参加アルゴリズム（Neighbor-Joining algorithm）（サイトウおよびネイ、モレキュラー・バイオロジー・エボリューション、４巻、４０６−４２５頁、１９８７年）により推論された系統樹トポロジーを用いて計算された。ノードにおける数は１００の再採取データセットからのブートストラップ（bootstrap）値（フェルセンシュタイン（Felsenstein）、進化、３９巻、７８３−７８９頁、１９８５年）および１００ｎｔ中の２ヌクレオチド置換を示すスケールバーのことを言う。
【０２９７】
６９Ｂ４株はセルロモナダシアエ科のセルロモナスおよびエルスコビアのなかまへの緊密な１６ＳｒＤＮＡの関係を示す。この緊密な関係は、６９Ｂ４株１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列に、セルロモナス６９Ｂ４株（例えば、それぞれ９６％および９５％相同性）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が９５％以上の配列相同性を有するＣ．セラシア（ＤＳＭ２０１１８）およびＣ．フィミ（ＤＳＭ２０１１３）と信じられている。
【０２９８】
本発明の幾つかの好ましい態様において、セルロモナス種はセルロモナス６９Ｂ４株（ＤＳＭ１６０３５）である。この株は、１９８８年１０月１０日に収集されたケニア、アカシアキャンプ（Acacia Camp）（緯度０°１２’Ｎ、経度３６°０７’Ｅ）のポゴリア湖の沿岸地域からの沈殿物および水試料から初めて単離された。この水は温度３３℃、ｐＨ１０．５で４４ｍＳ／ｃｍの伝導度を有した。セルロモナス６９Ｂ４株は以下の述べるように表現型の特徴を有することが同定された。新鮮カルチャーはグラム陽性、細く、概してまっすぐ、棒状の細菌であり、約０．５−０．７μｍ×１．８−４μm大であった。他のカルチャーは主に短い棒状および球状の細胞であった。細胞は時折ペアになり、またはＶ字型になったが、主な分枝は認められなかった。内生胞子は検出されなかった。アルカリ性のＧＡＭ寒天上で、この株は３７℃２−３日のインキュベーション後に直径約２ｍｍで、全体の周辺部を有する、不透明な、きらりと光る、薄黄色の、球状および凸状またはドーム状のコロニーを形成する。これらのコロニーは、輪で擦ると凝集する傾向をもつ粘性のぬるぬるしたものである。中性のトリプトン（Trypton）大豆寒天上では、株成長はあまり活発ではなく、半透明の黄色いコロニーで、一般に１ｍｍ未満の直径を有する。このカルチャーは、厳しい嫌気性条件下で成長することができたので、条件的に嫌気性であった。しかしながら、嫌気性条件下の成長は好気性条件下の成長と比べて著しく低下した。またこの株は標準オキシダーゼ、ウレアーゼ、アミノペプチダーゼ、およびＫＯＨ試験で陰性と思われた。さらに、生物体はカタラーゼ陽性でアリカリ条件下でＤＮアーゼが産生されたが、ナイトレートは減少しなかった。成長のための好ましい温度範囲は２０−３７℃であり、最適温度は約３０−３７℃であった。１５℃または４５℃において成長は認められなかった。
【０２９９】
この株は好アルカリ性で少し好塩性であった。また、この株は６．０〜１０．５のｐＨ値で成長すると特徴付けられ、最適なｐＨは約９−１０であった。ｐＨ１１またはｐＨ５．５で成長は認められなかった。ｐＨ７以下の成長は活発ではなく、最適温度で成長したカルチャーよりも高かった。この株は０−８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含む培地で成長することが観察された。さらに、この株はまた、酵母抽出物およびペプトンのような複合基質上で成長し、澱粉、ゼラチン、カゼイン、カルボキシメチルセルロースおよびアモルファス・セルロースを加水分解したので、化学合成有機栄養生物と特徴づけられる。
【０３００】
この株は呼吸および発酵の代謝を有することが観察された。酸は好気的または嫌気的に（ＡＰＩ５０ＣＨ）、すなわち、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、ラムノース（弱い）、セロビオース、マルトース、スクロース、トレハロース、ゲンチオビオース、Ｄ−トゥラノース、Ｄ−リクソース、および５−ケト−グルコン酸から生産された。アミグダリン、アルブチン、サリシン、およびエスクリンも利用される。この株は、リボース、ラクトース、ガラクトース、メリビオース、Ｄ−ラフィノース、グリコゲン、グリセロール、エリスリトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グルコン酸および酪酸を利用できなかった。
【０３０１】
この株は、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、フシジン酸、メチシリン、ノボビオシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、スルファフラゾール、オレアンドマイシン、ポリミキシン、リファンピシン、バンコマイシンおよびバシトラシンに感受性であるが、ゲンタマイシン、ニトロフラントイン、ナリディシン酸（nalidixic acid）、スルファメトキサゾール、トリメトプリム、ペニシリンＧ、ネオマイシンおよびカナマイシンに耐性であると同定された。
【０３０２】
本発明のプロテアーゼとは別に、以下の酵素が生産されることが観察された（ＡｐｉＺｙｍ、ＡＰＩＣｏｒｙｎｅ）。すなわち、Ｃ４−エステラーゼ、Ｃ８−エステラーゼ／リパーゼ、ロイシンアリルアミダーゼ、アルファ−キモトリプシン、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、およびピラジンアミダーゼである。
【０３０３】
この株は以下の化学分類学的特徴を示すことが観察された。主要な脂肪酸（＞全体の１０％）はＣ１６：１（２８．１％）、Ｃ１８：０（３１．１％）、Ｃ１８：１（１３．９％）であった。Ｎ−飽和（７９．１％）およびｎ−不飽和（１９．９％）であった。１１個の炭素を有する脂肪酸は９８％と計測された。主要な極性脂肪成分であるホスファチジルグリセロール（ＰＧ）および３つの未同定のグリコリピド（アルファ−ナフトール陽性）が存在したが、ＤＰＧ、ＰＧＰ、ＰＩおよびＰＥは検出されなかった。メナキノン（Menaquinones）であるＭＫ−４、ＭＫ−６、ＭＫ−７およびＭＫ−９は主要に存在するイソプレノイドであった。細胞壁ペプチドグリカンのタイプは、ペプチド間架橋におけるジアミノ酸であるＬ−オルニチンおよびＤ−アスパラギン酸を含むＡ４βであった。毒性評価に関しては、セルロモナス属の細菌に関連する既知の毒性および病原性の問題はなかった。
【０３０４】
一定種の生物体内に自然に生じる酵素の配列には多様性があり得るが、同種の生物体により生産される特定のタイプの酵素は、一般的に一定の条件下（例えば、温度、ｐＨ、水の硬度、酸化的条件、キレート条件、および濃度等）における基質特異性および／または蛋白分解活性のレベルに関して実質的に同等である。したがって、本発明の目的に関して、セルロモナスの他の株および種も本発明のセルロモナス・プロテアーゼを生産し、よって本発明のプロテアーゼのための有用な源を提供することが考えられる。実際、本発明で示すように、ミクロコシネアエの他のなかまが本発明に利用されることが考えられる。
【０３０５】
幾つかの態様において本発明の蛋白分解性ポリペプチドは物理化学的に特徴付けられ、一方、他の態様においてそれらは多種の特性全てを用いて特徴付けられる。物理化学的な特徴づけは、ＳＤＳ電気泳動、ゲル濾過、アミノ酸組成、マススペクトロメトリー（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＬＣ−ＥＳ−ＭＳ／ＭＳ等）、およびタンパク質の分子量を決定する沈降法、タンパク質のＰＩを決定する等電点電気泳動、タンパク質のアミノ酸配列を決定するアミノ酸シークエンシング、タンパク質の三次構造を決定する結晶学的研究、およびタンパク質に存在する抗原性エピトープを決定する抗体結合のような周知の技術に利点がある。
【０３０６】
幾つかの態様において、機能的な特徴はプロテアーゼ分野の実務家に周知の技術によって決定される。これには、ジメチルカゼイン（「ＤＭＣ」）および／またはＡＡＰＦ−ｐＮＡのような様々な市販の基質が含まれるが、これらに限定されない。この機能的な特徴づけに好ましい技術は本発明の実施例において詳細に記載される。
【０３０７】
本発明の幾つかの態様において、前記プロテアーゼはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる測定で約１７ｋＤ〜約２１ｋＤ、例えば約１８ｋＤ〜１９ｋＤ、例えば１８７００ダルトン〜１８８００ダルトン、例えば約１８７６４ダルトンの分子量を有する。本発明の他の側面において、前記プロテアーゼの測定されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルは図３に示される。
【０３０８】
前記成熟プロテアーゼもＤＭＣのような蛋白分解活性（例えば、ペプチド結合を有する基質に対する加水分解活性）を示す。更なる態様において、本発明のプロテアーゼは同定された条件下で増強された洗浄性能を提供する。本発明は、本発明に記載されたプロテアーゼ６９Ｂ４を含むが、幾つかの態様において本発明のプロテアーゼは６９Ｂ４の蛋白分解活性と比較して５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の蛋白分解活性を示す。幾つかの態様において、前記プロテアーゼは同条件下において、商品名サビナーゼ（SAVINASE：商標）（ノボザイム社）またはプラフェクト（PURAFECT：商標）（ジェネンコー社）で販売されるプロテアーゼの蛋白分解活性と比較して５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の蛋白分解活性を示す。幾つかの態様において、本発明のプロテアーゼは同条件下において、６９Ｂ４と比較して同定された条件下で相当のまたは増強された洗浄性能を示す。幾つかの好ましい態様において、本発明のプロテアーゼは同条件下において、商品名サビナーゼ（SAVINASE：商標）（ノボザイム社）またはプラフェクト（PURAFECT：商標）（ジェネンコー社）で販売されるプロテアーゼと比較して同定された条件下で相当のまたは増強された洗浄性能を示す。
【０３０９】
より更なる態様において、前記プロテアーゼまたは本発明のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドは精製された形態（すなわち、自然発生または野生型の生物体に存在するよりも高いまたは低い濃度の特定の組成で存在する）、または自然発生または野生型の生物体からの発現において通常は存在しない成分と混合して提供される。しかしながら、本発明のプロテアーゼが好適な様々な応用においてプロテアーゼ純度の範囲は利用されるので、本発明は任意の特定純度レベルのプロテアーゼに限定されることを意図していない。
【０３１０】
ＩＩＩ．本発明のミクロコシネアエ（例えばセルロモナス）プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの取得
幾つかの態様において、本発明のプロテアーゼをコードする核酸は当該技術分野で既知の標準的な操作、例えばクローンされたＤＮＡ（ＤＮＡ「ライブラリ」）、化学合成、ｃＤＮＡクローニング、ＰＣＲ、ゲノムＤＮＡまたはその断片または細菌または真菌種のような所望の細胞から精製されたもののクローニングにより得られる（例えば、サムブルック他著、前述、１９８９年；グローバーおよびヘイムズ編「ＤＮＡクローニング：実践的アプローチ」、１巻および２巻、第二版を参照されたい）。ポリヌクレオチド配列の合成は自動化シンセサイザの利用（例えば、ニードハム−バンデバンター（Needham-VanDevanter）他著、核酸研究（Nucl. Acids res.）、１２巻、６１５９−６１６８頁、１９８４年を参照されたい）を含み、当該技術分野（例えば、ビューケージ（Beaucage）およびカルザース（Caruthers）著、テトラヘドロン・レター、２２巻、１８５９−１８６２頁、１９８１年を参照されたい）において周知である。ＤＮＡ配列はまた注文製造し、様々な市販資源から注文することもできる。本発明に詳細に記載されているように、幾つかの態様において、ゲノムＤＮＡ由来の核酸配列はコード領域に加えて制限領域を含む。
【０３１１】
ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングを含む幾つかの態様において、ＤＮＡ断片が生成され、そりらの幾つかは少なくとも所望の遺伝子の部分を含む。幾つかの態様において、前記ＤＮＡは様々な制限酵素を用いて特定部位で開裂される。幾つかの選択的な態様において、ＤＮアーゼ（DNAse）はＤＮＡを断片化するためにマグネシウムの存在下で用いられ、または前記ＤＮＡは物理的に切断される（例えば、音波照射（sonication）により）。生成した直線状ＤＮＡは次にその大きさに従って分離され、アガロースおよびポリアクリルアミド電気泳動、ＰＣＲおよびカラムクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない標準技術により増幅される。
【０３１２】
いったん核酸断片が生成すると、プロテアーゼをコードする特異的なＤＮＡ断片の同定が多くの方法により実行される。例えば、幾つかの態様において、プローブまたはプライマーのような、ａｓｐ遺伝子またはその特定のＲＮＡまたはそれらの断片をコードする蛋白分解酵素が単離され、標識され、および次に生成した遺伝子を検出するために当業者に周知のハイブリダイゼーション・アッセイにおいて用いられる（例えば、ベントンおよびデービス著、サイエンス、１９６巻、１８０頁、１９７７年；およびグルンシュタイン（Grunstein）およびホグネス（Hogness）著、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンシーズ・ＵＳＡ、７２巻、３９６１頁、１９７５年を参照されたい）。好ましい態様において、プローブと実質的な配列類似性を共有するＤＮＡ断片は中程度から硬度ストリンジェンシーにおいてハイブリダイズする。
【０３１３】
幾つかの好ましい態様において、増幅は当該技術分野で知られているようにＰＣＲを用いて実施した。幾つかの好ましい態様において、配列番号１、２、３、および／または４からの約４以上のヌクレオチドおよび約６０までのヌクレオチドの核酸配列（すなわち、断片）、好ましくは約１２〜３０ヌクレオチド、より好ましくは約２５ヌクレオチドがＰＣＲプライマーとして任意の好適な組合せに用いられる。
【０３１４】
幾つかの態様において、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリからの本発明の核酸構築体の単離は、配列番号１−５に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ酸配列に基づいて調製された変性オリゴヌクレオチド・プライマーを用いたＰＣＲを利用する。前期プライマーは、例えば、４以上、５以上、８以上、１５以上、２０以上のヌクレオチド長の任意の部分長であり得る。本願における具体的なプローブは、実施例でより完全に記載されるように、ＴＴＧＷＨＣＧＴおよびＧＤＳＧＧポリヌクレオチド配列を利用した。
【０３１５】
前記に関して、本発明で提供され、配列番号１−５に示されるポリヌクレオチド配列に基づくポリヌクレオチド配列は他種から、特にプロテアーゼ６９Ｂ４により発現されるセリンプロテアーゼ活性を有する酵素をコードする細菌から同等または相同なポリヌクレオチド断片を得るために有用である。
【０３１６】
ＩＶ．本発明のセリンプロテアーゼの発現および回収
本発明のセリンプロテアーゼの発現および回収のための任意の好適な手段は本発明において用いられる。実際、当業者は追加的な酵素（例えば、プロテアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、またはアミラーゼ等のような蛋白分解活性を有する第二ペプチド）と同様に蛋白分解活性を有するセルロモナス由来のポリペプチドをクローニングするために好適な多くの方法を知っている。所望の任意の追加的な配列と結合した、本発明の１つ以上の酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドの１つ以上のコピー（例えば、多数）を、宿主細胞の遺伝子またはゲノムに導入するための多くの方法も当該技術分野において知られている。
【０３１７】
一般的に、遺伝子をクローニングし、前記遺伝子に領域（領域をコードする外因性のものの多数コピーを含む）をコードする外因性プロテアーゼを導入するための標準的な操作は、セルロモナス６９Ｂ４プロテアーゼ誘導体またはそれらのホモログを得るために用いられる。実際、実施例を含む本発明の明細書はそのような示唆を提供している。しかしながら、当該技術分野で既知の追加の方法も好適である（例えば、サムブルック他著、前述、１９８９年；アウスベル（Ausubel）他著、前述、１９９５年、およびハーウッド（Harwood）およびカティング（Cutting）編、「バチルスのための分子生物的方法」、ジョンウィリー・アンド・サン社、１９９０年；およびＷＯ９６／３４９４６を参照されたい）。
【０３１８】
幾つかの好ましい態様において、本発明のポリヌクレオチド配列は、当該技術分野においてよく確率された技術にしたがって、適切な発現ベクターにおいて発現制御配列にそれらを操作可能に結合することにより、また適切な宿主を形質転換する発現ベクターを用いることにより、発現される。幾つかの態様において、本発明のＤＮＡ配列の発現で生成されるポリペプチドは、当該技術分野においてよく確率された技術にしたがって様々な方法で細胞カルチャーの発酵物から単離され、精製される。当業者は最も適切な単離および精製の技術を選択することができる。
【０３１９】
更に、特に本発明は、構築体、本発明に記載されるポリヌクレオチドを含むベクター、そのようなベクターで形質転換された宿主細胞、発現方法、および微生物、特にセルロモナス種を含むがこれに限定されないミクロコシネアエのなかま由来のセリンプロテアーゼ酵素の生成系を提供する。幾つかの態様において、１つ以上のセリンプロテアーゼをコードする一つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のセリンプロテアーゼの発現に好適な組換え宿主細胞を生産するために用いられる。幾つかの好ましい態様において、発現宿主は市販可能な質で１つ以上のプロテアーゼを生産することができる。
【０３２０】
ＩＶ．組換えベクター
上記に示されたように、幾つかの態様において、本発明は前述のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。幾つかの態様において、プロテアーゼをコードする本発明のベクター（すなわち、構築体）はゲノム起源（例えば、ゲノムライブラリの使用および標準技術にしたがって合成オリゴヌクレオチド・プローブを用いたハイブリダイゼーションによりプロテアーゼの全体または部分をコードするＤＮＡ配列のスクレーニングにより調製される）のものである。幾つかの好ましい態様において、プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列は染色体ＤＮＡをセルロモナス株６９Ｂ４から単離し、ＰＣＲ法（実施例を参照されたい）により配列を増幅することにより得られる。
【０３２１】
選択的な態様において、プロテアーゼをコードする本発明の核酸構築体は確立された標準的な方法により合成的に調製される（例えば、ビューケージ（Beaucage）およびカルザース（Caruthers）著、テトラヘドロン・レター、２２巻、１８５９−１８６２頁、１９８１年；マチス（Matthes）他著、エンボ・ジャーナル（EMBO  J.）、３巻、８０１−８０５頁、１９８４年を参照されたい）。ホスホアミダイト法にしたがって、オリゴヌクレオチドは合成され（例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーにおいて）、精製され、アニールされ、結合された適切なベクターにおいてクローンされる。
【０３２２】
追加的な態様において、前記核酸構築体は合成的およびゲノム起源のものの混合物である。幾つかの態様において、前記構築体は標準技術にしたがって、該核酸構築体の様々な部分に対応する合成的またはゲノムＤＮＡ（適切な場合に）の断片を結合して調製される。
【０３２３】
更なる態様において、本発明は、本発明の１つ以上のＤＮＡ構築体を含むベクターを提供する。幾つかの態様において、本発明は組換えベクターを含む。宿主細胞ゲノムに組み込まれた（一時的にまたは安定的に）ベクターと同様に自律的に複製されたベクターも含めて、任意の適切なベクターが本発明に利用されるものと考えられる。実際、広範な種類のベクター、および真菌（鋳型および酵母）、細菌、昆虫および植物細胞におけるクローニング、形質転換および発現に好適な発現カセットは当業者に知られている。具体的には、前記ベクターまたはカセットは、核酸の転写および翻訳を指令する配列、選択可能なマーカー、および自律的な複製または染色体組み込みを許容する配列を含む。幾つかの態様において、好適なベクターは転写開始制御を備える遺伝子の５’領域および転写終止を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含む。これらの制御領域は、選択された制御領域が宿主細胞で機能できる限り、同種または異種遺伝子由来のものでよい。
【０３２４】
前記ベクターは好ましくは、本発明のプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列がＤＮＡ転写に必要とされる追加的な部分に操作可能に結合された発現ベクターである。幾つかの好ましい態様において、前記発現ベクターはプラスミドまたはウィルスＤＮＡに由来し、または選択的な態様において両方の要素を含む。具体的なベクターには、本発明の実施例に記載される全てのベクターのみならず、ｐＳＥＧＣＴ、ｐＳＥＡＣＴ、および／またはｐＳＥＡ４ＣＴが含まれるが、これらに限定されない。そのようにベクターの構築は本発明において記載され、方法は当該技術分野で周知である（例えば、米国特許６，２８７，８３９号、およびＷＯ０２／５０２４５号を参照されたい）。幾つかの好ましい態様において、前記ベクターｐＳＥＧＣＴ（約８３０２塩基、図５を参照されたい）は、本発明で記載されるポリヌクレオチド（例えば、ｐＳＥＧ６９Ｂ４Ｔ、図６を参照されたい）を含むベクター構築に用いられる。選択的な好ましい態様において、前記ベクターｐＳＥＡ４６９Ｂ４ＣＴ（図７を参照されたい）は、本発明で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターの構築に用いられる。実際、本発明で記載される全てのベクターは本発明において用いられることが意図されている。
【０３２５】
幾つかの態様において、転写に必要ちされる追加的な部分には、当該技術分野で知られている制限部分（例えば、プロモータ、分泌部分、インヒビター、全体レギュレーター）が含まれる。１つの具体例には、選択される宿主細胞において転写活性を示し、宿主細胞の同種または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子由来の任意のＤＮＡが含まれる。具体的には、細菌宿主細胞において用いるのに好適なプロモータの例には、バチルス・ステアロテルモフィリスのマルトース源性アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス（ＢＡＮ）アミラーゼ遺伝子、バチルス・スブチリスのアルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・クラウシのアルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・プミリス（pumilis）キシロシダーゼ遺伝子、バチルス・スリンジエンシスｃｒｙＩＩＩＡ、およびバチルス・リケニフォルミスのフルファ−アミラーゼ遺伝子のプロモータが含まれるが、これらに限定されない。追加的なプロモータには、本発明で記載されるようにＡ４プロモータが含まれる。本発明で用いられる他のプロモータには、大腸菌（E. coli）のｌａｃ、ｔｒｐ、またはｔａｃプロモータばかりでなく、ファージラムダＰRまたはＰLプロモータが含まれるが、これらに限定されない。
【０３２６】
幾つかの態様において、前記プロモータは、前記配列と実質的に同等のプロモータ活性を有する前記プロテアーゼまたはその断片をコードする遺伝子由来である。さらに本発明は、中程度、高度、および／または最大ストリンジェンシー条件下において前記プロモータ配列にハイブリダイズするか、またはそのようなプロモータに約９０％以上の相同性、好ましくは約９５％の相同性を有するが実質的に同等のプロモータ活性を有する核酸配列を含む。幾つかの態様において、このプロモータはプロテアーゼおよび／または異種ＤＮＡ配列（例えば、本発明のプロテアーゼに加えて他の酵素）のいずれかの発現を促進するために用いられる。追加的な態様において、前記ベクターはまた、１つ以上の選択可能なマーカーを含む。
【０３２７】
幾つかの態様において、本発明の組換えベクターは宿主細胞においてベクターが複製することを可能にするＤＮＡ配列をさらに含む。細菌宿主を含む幾つかの好ましい態様において、これらの配列はプラスミド複製（例えば、ｏｒｉおよび／またはｒｅｐ配列）を許容するのに必要な全ての配列を含む。
【０３２８】
幾つかの特に好ましい態様において、シグナル配列（例えば、リーダー配列またはプレ配列）もまた、宿主細胞の分泌経路に本発明のポリペプチドを方向づけるために、ベクターに含まれる。幾つかのより好ましい態様において、分泌シグナル配列は正しいリーディング・フレーム（例えば、配列番号１および２を参照されたい）における前駆体プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列に結合される。前記プロテアーゼが細胞内に発現されるか分泌されるかによって、本発明のポリヌクレオチド配列または発現ベクターは、細菌（例えば、バチルス種）、真菌（例えば、トリコデルマ）、他の原核生物または真核生物で機能する天然ポリペプチド・シグナル配列またはシグナル配列を含めて、または含めずに遺伝操作される。幾つかの態様において、発現はシグナル配列を除去するか、部分的に除去するかのいずれかして達成される。
【０３２９】
細菌細胞からの分泌を含む幾つかの態様において、前記シグナルペプチドは自然発生のシグナルペプチドまたはそれらの機能部分であり、一方他の態様においては合成ペプチドである。好適なシグナルペプチドには、バチルス・リケニフォルミスのアルファ−アミラーゼ、バチルス・クラウシのアルカリプロテアーゼ、およびバチルス・アミロリケファシエンスのアミラーゼ由来の配列が含まれるが、これらに限定されない。１つの好ましいシグナル配列は、本発明できさいされるようにセルロモナス株６９Ｂ４由来のシグナルペプチドである。したがって、幾つかの特に好ましい態様において、前記シグナルペプチドは本発明に記載される由来のシグナルペプチドを含む。このシグナルは、６９Ｂ４プロテアーゼおよび／または異種のＤＮＡ配列（例えば、他の野生型プロテアーゼ、ＢＰＮ’変異体プロテアーゼ、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ等のような第二プロテアーゼ）の分泌を容易にするのに用いられる。幾つかの態様において、これらの第二酵素は当該技術分野で知られているＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列（例えば、ＷＯ９８／２２５００号、ＷＯ９２／０５２４９号、ＥＰ０３０５２１６Ｂ１号、およびＷＯ９４／２５５７６号と同様に米国特許６，４６５，２３５号、６，２８７，８３９号、５，９６５，３８４号、および５，７９５，７６４号を参照されたい）によってコードされる。さらに、幾つかの態様において、前記シグナル配列ペプチドはまた、そのような内因性にコードされたプロテアーゼを活性化および分泌するために内因性配列に操作可能に結合される。
【０３３０】
複写に必要な情報を含む好適なベクターに挿入するために、本発明のプロテアーゼ、前記プロモータおよび／または分泌シグナル配列のそれぞれをコードするＤＮＡ配列を結合するために用いられる操作は当業者に周知である。上記で示されるように、幾つかの態様において核酸構築体は特定プライマーを用いるＰＣＲによって調製される。
【０３３１】
Ｖ．宿主細胞
上記に示されるように、幾つかの態様において、本発明はまた、上述のベクターで形質転換される宿主細胞を提供する。幾つかの態様において、宿主細胞に導入される本発明の１つ以上のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドは同種であり、一方他の態様において、前記ポリヌクレオチドは宿主に対して異種である。前記ポリヌクレオチドが宿主細胞に対して同種である（例えば、宿主細胞によって生産される未処理プロテアーゼの追加的なコピー）幾つかの態様において、それは他の同種または異種のプロモータ配列に連結している。選択的な態様において、他の分泌シグナル配列、および／または終止配列は本発明において用いられる。したがって、幾つかの態様において、前記ポリペプチドＤＮＡ配列は、同種ポリペプチド配列の多数のコピー、他の生物体からの異種ポリペプチド配列、または１つ以上の合成ポリペプチド配列を含む。実際、本発明は任意の特定の宿主細胞および／またはベクターに限定されることを意図していない。
【０３３２】
実際、本発明のＤＮＡ構築体が導入される宿主細胞は、細菌、真菌、および高等な原核生物を含むがこれらに限定されない、これらのアルカリプロテアーゼを生産することができる任意の細胞であり得る。
【０３３３】
本発明に用いられる細菌宿主細胞の具体例には、エンテロバクテリアシアエ（例えば、エシェリヒア・コリ）のなかまのようなグラム陰性菌と同様に、バチルス、ストレプトマイセス、およびテルモビフィダ（Thermobifida）のようなグラム陽性菌、例えばＢ．スブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レントゥス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロテルモフィルス、Ｂ．クラウシ、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．シルクランス、Ｂ．ラウトゥス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．スリンジエンシス、Ｓ．グリセウス、Ｓ．リビダンス、Ｓ．コエリコロル、Ｓ．アベルミティリスおよびＴ．フスカ株が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの特に好ましい態様において、前記宿主細胞はＢ．スブチリス、Ｂ．クラウシ、および／またはＢ．リケニフォルミスである。追加の好ましい態様において、前記宿主細胞はＳ．リビダンス（例えば、ＴＫ２３および／またはＴＫ２１）株である。当該技術分野で知られているプロプラスト形質転換、コンピテント（competent）細胞の利用等を含むがこれらに限定されない、細菌の形質転換ために好適な任意の方法が本発明において用いられる。幾つかの態様において、米国特許５，２６４，３６６号で提供される方法は本発明において用いられる。Ｓ．リビダンスについて、形質転換およびタンパク質発現のための１つの好ましい手段はフェルナンデス−アバロス（Fernandez-Abalos）他によって記述されている（フェルナンデス−アバロス他著、マイクロバイオロジー、１４９巻、１６２３−１６３２頁、２００３年を参照されたい；ホップウッド（Hopwood）他著、ストレプトマイセスの遺伝子操作、ラボラトリーマニュアル、イニス、１９８５年も参照されたい；両文献とも参照により本発明に取り込まれる）。もちろん、本発明の実施例に記載される方法は本発明において用いられる。
【０３３４】
本発明において用いられる真菌宿主細胞の具体例には、トリコデルマ種およびアスペルジルス種が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの特に好ましい態様において、前記宿主細胞はトリコデルマ・リヘセルおよび／またはアスペルジルス・ニジェである。幾つかの態様において、アスペルジルスにおける形質転換および発現は米国特許５，３６４，７７０号に記載のように実施され、本文献は参照により本発明に取り込まれる。もちろん、本発明の実施例に記載の方法は本発明において用いられる。
【０３３５】
幾つかの態様において、特定のプロモータおよびシグナル配列は本発明の１つ以上のプロテアーゼの効果的な形質転換および発現を提供するために必要である。したがって、バチルス宿主細胞の利用を含む幾つかの好ましい態様において、前記ａｐｒＥプロモータは既知のバチルス由来シグナルおよび他の制限配列と組み合わせて用いられる。アスペルジルスにおける発現を含む幾つかの好ましい態様において、前記ｇｌａＡプロモータが用いられる。ストレプトマイセス宿主細胞を含む幾つかの態様において、アクチノプラネス・ミスウリエンシス（Actinoplanes missouriensis）のグルコース・イソメラーゼ（ＧＩ）プロモータが用いられ、一方他の態様において前記Ａ４プロモータが用いられる。
【０３３６】
Ｅ．コリのような細菌における発現を含む幾つかの態様において、前記プロテアーゼは細胞質、典型的には不溶性顆粒（すなわち、封入体）として保持される。しかしながら、他の態様において、前記プロテアーゼは細菌分泌配列により細胞質周囲空間（periplasmic space）へと向けられる。前者の場合、細胞が融解し、変性剤を希釈することによりプロテアーゼが再びホールドした後で顆粒が回収され変性される。後者の場合、細胞質周囲空間の中身を放出し、プロテアーゼを回収するために細胞を破砕する（例えば、音波照射またはosmotic衝撃により）ことによりプロテアーゼは細胞質周囲空間から回収される。
【０３３７】
好ましい態様において、本発明の形質転換された宿主細胞はそのプロテアーゼの発現を許容する条件下において好適な栄養培地で培養され、その後生成したプロテアーゼはカルチャーから回収される。細胞を培養するために用いられる培地は、適切な補助剤を含む最小または混合培地のような宿主細胞を成長させるために好適な任意の従来からの培地を含む。好適な培地は、商業的供給者から入手可能であるか、または出版された処方（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ内の）にしたがって調製することができる。幾つかの態様において、細胞により生産されたプロテアーゼは、遠心分離または濾過により培地から宿主細胞を分離し、塩（例えば、アンモニウム塩）により上清または濾液の蛋白性成分を析出させ、クロマトグラフィーにより精製（例えば、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティ等）することを含むが、これらに限定されない従来からの操作により培養培地から回収される。したがって、本発明の1つ以上のプロテアーゼを回収するのに適切な任意の方法を用いることができることになる。実際、本発明は任意の特定の精製方法に限定されることを意図していない。
【０３３８】
ＶＩ．セリンプロテアーゼ酵素の利用
本発明に詳細に記載されるように、本発明のプロテアーゼは一定の利用に非常に適する重要な特徴を有している。例えば、本発明のプロテアーゼは幾つかの現在用いられているプロテアーゼと比較して増強した温度安定性、増強した酸化安定性、および増強したキレート安定性を有している。
【０３３９】
したがって、これらのプロテアーゼは洗浄組成物に利用される。実際、一定の洗浄条件下において、当該プロテアーゼは現在用いられているスブチリシンプロテアーゼと比べて相当のまたは増強した洗浄性能を示す。したがって、本発明の洗浄および／または酵素組成物は様々な洗浄組成物に提供されることになることが考えられる。幾つかの態様において、本発明のプロテアーゼはスブチリシン・プロテアーゼ（すなわち、現在使用されるプロテアーゼ）と同様な方法で利用される。したがって、当該プロテアーゼは、動物飼料利用、皮革加工（例えば、bating）、蛋白加水分解、および織物への利用だけでなく、様々な洗浄組成物に用いられる。同定されたプロテアーゼもパーソナルケアへの利用に用いられる。
【０３４０】
したがって、本発明のプロテアーゼは多くの産業利用において、特に洗浄、非感染、動物飼料、および織物／皮革産業において使用される。いくつかの態様において、本発明の１つ以上のプロテアーゼは洗剤、ビルダー（builder）、漂白剤および他の従来からの成分と組み合わせて、例えば洗濯洗剤（粉体および液体の両方）、洗濯前の浸漬、全ての織物漂白、自動食器洗い洗剤（液体および粉体の両方）、家庭用洗浄剤、特に棒および液体石鹸利用、および配水管開通剤のような洗濯および他の洗浄技術に有用な様々な新規の洗浄組成物を生産する。さらに、前記プロテアーゼはそのような物質を洗浄組成物の水溶液と接触させることにより、他の製品と同様にコンタクトレンズの洗浄に用いられる。さらに、これらの天然生成のプロテアーゼは、例えばペプチド、加水分解汚水処理、織物利用、医療用機器洗浄、生体膜除去に、およびタンパク質生産における溶融−開裂酵素としてなど用いることができる。用いられる設定において一つ以上のプロテアーゼがそれらの機能を維持する限り、これらの製品の組成物は本発明において決定的ではない。いくつかの態様において、前記組成物は、洗浄有効量のプロテアーゼ酵素製剤を含むプロテアーゼまたは酵素組成物をそのような組成物の技術的に認められた量の従来成分と混合することにより容易に調製される。
【０３４１】
Ａ．洗浄組成物
本発明の洗浄組成物は、義歯、歯、髪、および皮膚のような化粧利用と同様に、例えば洗濯利用、硬い表面洗浄、自動食器洗い利用に有利に用いることができる。しかしながら、低温溶液における上昇した有効性および優れた色安全性の側面という特異な利点のために本発明の酵素は、織物の漂白のような洗濯利用に理想的に適している。さらに、本発明の酵素は顆粒状および液体組成物のいずれにも用いることができる。
【０３４２】
本発明の酵素はまた洗浄添加物製品にも用いられる。本発明の酵素を含む洗浄添加物製品は追加の漂白効果が望まれる洗濯過程に含まれることに理想的に適している。そのような例には、低温溶液洗浄利用が含まれ得るが、これに限定されない。前記添加物製品は、その最も単純な形態としてはＡＳＰを含む１つ以上のプロテアーゼである。過酸化物源が用いられ、上昇した漂白効果が望まれる場合には、そのような添加物は洗浄過程に添加するための用量形態で包装することができる。そのような単回用量形態は、丸薬、錠剤、ゲルキャップ（gelcap）、または予め測定した粉体または液体のような他の単回用量単位を含むことができる。充填剤または担体物質はそのような組成物の用量を増加させるために含まれ得る。好適な充填剤または担体には、タルク、粘土等と同様に様々な硫酸、炭酸およびケイ酸の塩が含まれるが、これらに限定されない。液体組成物用の充填剤または担体物質は水またはポリオールまたはジオールを含む低分子量の一級または二級アルコールであり得る。そのようなアルコールには、メタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノールが含まれるが、これらに限定されない。前記組成物はそのような物質を約５％から９０％含むことができる。酸性充填剤はｐＨを低下させるために用いることができる。選択的に、前記洗浄添加物は以下に定義する活性酸素源または以下に完全に定義される補助成分を含むことができる。
【０３４３】
当該洗浄組成物および洗浄添加物は、本発明で提供される有効量のＡＳＰ酵素および／または変異体を必要とする。酵素の必要レベルは本発明の１種以上の酵素を添加することにより達成できる。典型的には、本発明の洗浄組成物は０．０００１重量％以上、約０．０００１〜約１、約０．００１〜約０．５、またはさらに約０．０１〜約０．１重量％の本発明の１つ以上の酵素を含むことになる。
【０３４４】
本発明の洗浄組成物は典型的には、水性洗浄操作における使用で洗濯水が約５．０〜約１１．５、またはさらに約７．５〜１０．５のｐＨをもつように製剤されることになる。液体製品製剤は典型的には、約３．０〜約９．０、またはさらに約３〜約５の実質ｐＨをもつように製剤される。顆粒洗濯製品は典型的には、約９〜約１１のｐＨをもつように製剤される。推奨使用レベルでｐＨを制御するための技術は当業者に周知の緩衝液、アルカリ、酸等の使用を含む。
【０３４５】
好適な低ｐＨ洗浄組成物は典型的に約３〜約５の実質ｐＨを有し、典型的にはそのようなｐＨ環境において加水分解する表面活性剤を含まない。そのような界面活性剤には、１つ以上エチレンオキシド部分またはさらに約１〜１６モルのエチレンオキシドを含むアルキル硫酸ナトリウム表面活性剤が含まれる。そのような洗浄組成物は典型的に、約３〜約５の実質ｐＨをもつそのような洗浄組成物を提供するために、水酸化ナトリウム、モノエタノールアミンまたは塩酸のような十分な量のｐＨ調整剤を含む。そのような組成物は典型的に１つ以上の酸安定な酵素を含む。前記組成物は液体でも固体でもよい。そのような液体組成物のｐＨは実質ｐＨとして測定される。そのような固体組成物のｐＨは、溶媒が蒸留水である場合の前記組成物の１０％固体溶液として測定される。これらの態様において、全てのｐＨ測定は２０℃で行われる。
【０３４６】
１つ以上のセリンプロテアーゼが顆粒組成物または液体に用いられる場合、保存の間に顆粒組成物の他の成分からそのような酵素を保護するために酵素はカプセル化した粒子の形態であるのが望ましい。さらにカプセル化は、洗浄過程中において顆粒組成物の利用性を制御する手段でもあり得、本発明において提供される酵素の性能を増強することができる。この点で、本発明のセリンプロテアーゼは当該技術分野で知られている任意のカプセル化材料でカプセル化できる。
【０３４７】
カプセル化材料は典型的に本発明の酵素の少なくとも触媒部分カプセル化する。具体的には、カプセル化材料は水溶性および／または水拡散性である。前記カプセル化材料は０℃以上のガラス転位温度（Ｔｇ）を有することができる。ガラス転位温度はＷＯ９７／１１１５１、特に６頁２５行〜７頁２行により詳細に記述されている。
【０３４８】
前記カプセル化材料は、炭水化物、天然または合成ゴム、キチンまたはキトサン、セルロースまたはセルロース誘導体、ケイ酸類、燐酸類、ホウ酸類、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、およびこれらの組み合わせからなね群から選択され得る。カプセル化材料が炭水化物の場合、それは典型的には、単糖、オリゴ糖、多糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択できる。具体的には、カプセル化材料は澱粉である。好適な澱粉はＥＰ０９２２４９９号、ＵＳ４，９７７，２５２号、ＵＳ５，３５４，５５９号およびＵＳ５，９３５，８２６号に記述されている。
【０３４９】
カプセル化材料は熱可塑剤、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、およびこれらの組み合わせから作られる微小球状物（ミクロスフィア）であり得る。用いることのできる市販入手可能なミクロスフィアは、エキスパンセル（Expancel：商標）で供給されるエキスパンセル社（Stockvilsverken、スウェーデン）によるもの、商品名ＰＭ６５４５、Ｐｍ６５５０、ＰＭ７２２０、ＰＭ７２２８、エクステンドスフィア（Extendosphere：商標）、ラクスジル（Luxsil：商標）、Ｑ−セル（Q-cel：商標）およびスフェリセル（Sphericel：商標）で供給されるＰＱコープ社（バレー・フォージュ、ペンシルバニア、米国）によるものである。
【０３５０】
本発明で記載されるように、本発明のプロテアーゼは洗濯および食器洗剤を含むがこれらに限定されない洗浄産業で特に用いられる。これらの利用は様々な環境ストレスに酵素を曝す。本発明のプロテアーゼは様々な環境下でのその安定性のために、現在用いられる多くの酵素に亘って有利である。
【０３５１】
実際、洗濯に用いられる酵素が曝される、様々な洗剤製剤、洗濯水量、洗濯水温、および洗濯時間の長さを含む様々な洗濯条件がある。
さらに、異なる地理的な地域で用いられる洗剤製剤は洗濯水に存在する関連成分の異なる濃度を有する。例えば、ヨーロッパの洗剤は典型的に洗濯水中に約４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分を有するが、日本の洗剤は典型的に洗濯水中に約６６７ｐｐｍの洗剤成分を有する。北アメリカ、特に米国では、洗剤は典型的に洗濯水中に存在する約９７５ｐｐｍの洗剤成分を有する。
【０３５２】
低洗剤濃度系は約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が洗濯水中に存在する洗剤を含む。日本の洗剤は、約６６７ｐｐｍの洗濯水中に存在する洗剤成分を有するため、典型的に低洗剤濃度系と見なされる。
【０３５３】
中洗剤濃度系は約８００ｐｐｍおよび約２０００ｐｐｍの間の洗剤成分が洗濯水中に存在する洗剤を含む。北アメリカの洗剤は、約９７５ｐｐｍの洗濯水中に存在する洗剤成分を有するため、一般的に中洗剤濃度系と見なされる。ブラジルでは典型的に約１５００ｐｐｍの洗濯水中の洗剤成分を有する。
【０３５４】
高洗剤濃度系は約２０００ｐｐｍより多くの洗剤成分が洗濯水中に存在する洗剤を含む。ヨーロッパの洗剤は、約４５００〜約５０００ｐｐｍの洗濯水中の洗剤成分を有するため、一般的に高洗剤濃度系と見なされる。
【０３５５】
ラテンアメリカの洗剤は一般的に高燐酸泡ビルダー洗剤であり、ラテンアメリカで用いられる洗剤の範囲は、洗濯水中の洗剤成分が１５００ｐｐｍ〜６０００ｐｐｍに及ぶため、中および高洗剤濃度の両方に該当し得る。上述のように、ブラジルでは典型的に約１５００ｐｐｍの洗濯水中の洗剤成分を有する。しかしながら、他のラテンアメリカ諸国に限定されることなく、他の高燐酸泡ビルダー洗剤の地域は洗濯水中に存在する約６０００ｐｐｍ以上の洗剤成分の高洗剤濃度系を有することができる。
【０３５６】
前述の観点から、世界中の典型的な洗濯溶液中の洗剤成分の濃度は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤組成物（「低洗剤濃度地域」）、例えば日本の約６６７ｐｐｍから、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの間（「中洗剤濃度地域」）、例えば米国の約９７５ｐｐｍおよびブラジルの約１５００ｐｐｍ、約２０００ｐｐｍを超える（「高洗剤濃度地域」）、例えばヨーロッパの約４５００〜約５０００ｐｐｍおよび高燐酸泡ビルダー洗剤地域の約６０００ｐｐｍまで変化する。
【０３５７】
典型的な洗濯溶液の濃度は経験的に決められる。例えば米国では、典型的な洗濯機は約６４．４Ｌの容積の洗濯溶液を擁する。したがって、洗濯溶液内の約９７５ｐｐｍの洗剤の濃度を得るためには、６４．４Ｌの洗濯溶液に約６２．７９ｇの洗剤組成物を加えなければならない。この量は、洗剤に備えられた計量カップを用いて消費者により洗濯水中に量り取られる典型的な量である。
【０３５８】
更なる具体例として、異なる地域では異なる洗濯温度が用いられる。日本の洗濯水の温度は典型的にヨーロッパで用いられるものよりも低い。例えば、北アメリカおよび日本の洗濯水の温度は１０〜３０℃の間であり得、一方ヨーロッパの洗濯水の温度は典型的には３０〜６０℃（例えば、約４０℃）である。
【０３５９】
更なる具体例として、異なる地域は典型的には異なる水の硬度を有する。水の硬度は通常、粒子／ガロン混合Ｃａ2+／Ｍｇ2+という用語で記述される。硬度は水の中のカルシウム（Ｃａ2+）およびマグネシウム（Ｍｇ2+）の量の測定値である。米国のほとんどの水は硬いが、硬度は変動する。中度に硬い（６０−１２０ｐｐｍ）から硬い（１２１−１８１ｐｐｍ）水は６０〜１８１ｐｐｍ（parts per million）（ｐｐｍから粒子／米国ガロンへの変換については、１７．１でｐｐｍ＃を除したものが粒子／ガロンに等しい）の硬度の物質である。
【０３６０】
【表１】
2007515164.tif 000003
【０３６１】
ヨーロッパの水の硬度は典型的には１０．５（例えば、１０．５〜２０．０）粒子／ガロン混合Ｃａ2+／Ｍｇ2+（例えば、約１５粒子／ガロン混合Ｃａ2+／Ｍｇ2+）である。北アメリカの水の硬度は典型的には日本の水の硬度よりも硬いが、ヨーロッパの水の硬度よりも軟らかい。例えば、北アメリカの水の硬度は３〜１０粒子の間、３〜８粒子、または約６粒子であり得る。日本の水の硬度は典型的には北アメリカの水の硬度より軟らかく、通常４未満であり、例えば３粒子／ガロン混合Ｃａ2+／Ｍｇ2+である。
【０３６２】
したがって、幾つかの態様において、本発明は１つ以上の洗濯条件（例えば、水温、水の硬度、および／または洗剤濃度）の組み合わせで驚くべき洗濯性能を示すプロテアーゼを提供する。幾つかの態様において、本発明のプロテアーゼは洗濯性能でスブチリシン・プロテアーゼに匹敵する。幾つかの態様において、本発明のプロテアーゼはスブチリシン・プロテアーゼに比べて増強した洗濯性能を示す。したがって、本発明の幾つかの好ましい態様において、前記プロテアーゼは本発明において増強した酸化安定性、増強した温度安定性、および／または増強したキレート安定性を提供する。
【０３６３】
幾つかの好ましい態様において、本発明はプロテアーゼのホモログおよび変異体ばかりでなく、ＡＳＰプロテアーゼを提供する。これらのプロテアーゼは布地および織物からタンパク質に基づく汚れを洗浄するために望ましい任意の利用に用いられる。
【０３６４】
幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は、食器洗い操作ばかりでなく、洗濯添加物組成物を含む手洗いおよび機械洗い洗剤組成物、および汚れた織物の前処理、織物柔軟化組成物を加えたすすぎにおける使用に適した組成物、および一般的な家庭の硬い表面洗浄操作に使用するのに適した組成物として製剤される。当業者は洗浄組成物として用いることができる異なる製剤に精通している。好ましい態様において、本発明のプロテアーゼは、洗剤組成物の中で（すなわち、他のプロテアーゼと比べて）匹敵する、または増強した性能を含む。幾つかの態様において、洗浄性能は、標準的な方法で卵、草、血液、ミルク等のような酵素感受性の汚れを利用する様々な洗浄アッセイにおいて本発明のプロテアーゼとスブチリシン・プロテアーゼを比較することにより評価される。実際、当業者は標準洗濯サイクル条件下で洗剤性能を評価するために用いられる分光光学的および他の分析的方法に精通している。
【０３６５】
本発明で用いられるアッセイには、ＷＯ９９／３４０１１号、およびＵＳ６，６０５，４５８号（例えば、実施例３を参照されたい）で記載されるものがふくまれるが、これらに限定されない。ＵＳ６，６０５，４５８号の実施例３においては、ｐＨ１０．５で３．０ｇ／Ｌの洗剤用量、１５℃で洗濯時間１５分、水の硬度６°ｄＨ、撹拌棒を備えた１５０ｍＬガラスビーカーに１０ｎＭ酵素濃度、５０ｍＬ中に５つの布地片（ｐｈｉ２．５ｃｍ）、試験材料センター（オランダ）からのＥＭＰＡ１１７試験材料が用いられている。試験材料に関する反応（Reflectance）「Ｒ」の測定はマクベス・カラーアイ７０００分光光度計を用いて４６０ｎｍで行った。追加的な方法は本発明の実施例に示されている。したがって、これらの方法も本発明に用いられる。
【０３６６】
従来の洗浄組成物への本発明のプロテアーゼの追加いは、いかなる特定の使用限定も生じない。言い換えれば、任意の洗剤に好適な温度およびｐＨも、ｐＨが本発明で設定された範囲内である限り本発明の組成物に適し、前記温度は記載されたプロテアーゼの変性温度以下である。さらに、本発明のプロテアーゼは、洗剤、さらにビルダーおよび安定化剤のいずれか一つまたはその組み合わせを含まない洗浄組成物に用いられる。
【０３６７】
洗浄組成物または洗剤に用いられると、酸化安定性はさらに考慮を要する。したがって、幾つかの態様において、様々な使用に望まれるように前記安定性はスブチリシン・プロテアーゼに対して増強され、低減され、または同等にされる。幾つかの好ましい態様において、増強した酸化安定性は望ましい。本発明の幾つかのプロテアーゼはそのような利用の特定の使用に用いられる。
【０３６８】
洗浄組成物または洗剤に用いられると、温度安定性はさらに考慮を要する。したがって、幾つかの態様において、様々な使用に望まれるように前記安定性はスブチリシン・プロテアーゼに対して増強され、低減され、または同等にされる。幾つかの好ましい態様において、増強した温度安定性は望ましい。本発明の幾つかのプロテアーゼはそのような利用の特定の使用に用いられる。
【０３６９】
洗浄組成物または洗剤に用いられると、キレート安定性はさらに考慮を要する。したがって、幾つかの態様において、様々な使用に望まれるように前記安定性はスブチリシン・プロテアーゼに対して増強され、低減され、または同等にされる。幾つかの好ましい態様において、増強したキレート安定性は望ましい。本発明の幾つかのプロテアーゼはそのような利用の特定の使用に用いられる。
【０３７０】
本発明の幾つかの態様において、スブチリシン・プロテアーゼと比べると異なるｐＨで修飾された酵素活性を示す自然発生のプロテアーゼが提供される。ｐＨ−活性プロフィールは酵素活性に対するｐＨのプロットであり、実施例で記載されるようにおよび／または当該技術分野の基地の方法で構築される。幾つかの態様において、広いプロフィールを有する（すなわち、匹敵するスブチリシン・プロテアーゼよりもpＨ範囲でより高い活性を有するもの）自然発生のプロテアーゼを得ることが望ましい。他の態様において、前記酵素はいかなるｐＨでも有意により高い活性を持たない、またはより鋭いプロフィールをもつ自然発生のホモログである（すなわち、一定のｐＨでスブチリシンと比べて増強した活性を有し、かつ他のｐＨでより低い活性を有するもの）。したがって、様々な態様において、本発明のプロテアーゼは異なる至適ｐＨおよび／または範囲を有する。本発明は任意の特定のｐＨまたはｐＨ範囲に限定されることを意図していない。
【０３７１】
本発明の幾つかの態様において、前記洗浄組成物は組成物の重量で０．００００１％〜１０％の本発明の６９Ｂ４および／または他のプロテアーゼのレベルの本発明のプロテアーゼ、および組成物の重量で洗浄補助物質を含むバランス（例えば、９９．９９９％〜９０．０％）を含む。本発明の他の側面において、本発明の洗浄組成物は、組成物の重量で０．０００１％〜１０％、０．００１％〜５％、０．００１％〜２％、０．００５％〜０．５％の本発明の６９Ｂ４または他のプロテアーゼのレベルの６９Ｂ４および／または他のプロテアーゼ、および洗浄補助物質を含む洗浄組成物のバランス（例えば、重量で９９．９９９９％〜９０．０％、９９．９９９％〜９８％、９９．９９５％〜９９．５％）を含む。
【０３７２】
幾つかの態様において、本発明のプロテアーゼに加えて好ましい洗浄組成物は、洗浄性能および／または織物ケアの利点を提供する１つ以上の追加の酵素または酵素誘導体を含む。そのような酵素には、他のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ（例えば、ラッカーゼ（raccases））、および／またはマンナナーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０３７３】
アルカリ溶液での使用に適する任意の他のプロテアーゼは本発明の組成物に用いられる。好適なプロテアーゼには、動物、野菜、または微生物起源のものが含まれる。特に好ましい態様において、微生物プロテアーゼが用いられる。幾つかの態様において、前記プロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼである。アルカリプロテアーゼの具体例にはスブチリシンが含まれ、特にバチルス由来のもの（例えば、スブチリシン、レントゥス、アミロリケファシエンス、スブチリシン・カールスバーク、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７およびスブチリシン１６８）が含まれる。追加的な具体例には、ＵＳＲＥ３４，６０６号、ＵＳ５，９５５，３４０号、５，７００，６７６号、６，３１２，９３６号、および６，４８２，６２８号に記載のものが含まれ、これらは参照により本発明に取り込まれる。追加的なプロテアーゼの具体例には、トリプシン（例えば、ブタまたはウシ由来）、およびＷＯ８９／０６２７０号で記載されるフサリウム（Fusarium）プロテアーゼが含まれるが、これらに限定されない。好ましい市販で入手可能なプロテアーゼ酵素には、マクサターゼ（MAXATASE：登録商標）、マクサカル（MAXACAL：商標）、マクサペム（MAXAPEM：商標）、オプティクレアン（OPTICLEAN：登録商標）、オプティマーゼ（OPTIMASE：登録商標）、プロペラーゼ（PROPERASE：登録商標）、プラフェクト（PURAFECT：登録商標）およびプラフェクトＯＸＰ（PURAFECT：登録商標）（以上、ジェネンコー社製）の商品名で販売されているもの、アルカラーゼ（ALCALASE：登録商標）、サビナーゼ（SAVINASE：登録商標）、プリマーゼ（PRIMASE：登録商標）、デュラジム（DURAZYM：商標）、リラーゼ（RELASE：登録商標）およびエスペラーゼ（ESPERASE：登録商標）（以上、ノボザイム社製）の商品名で販売されているもの、およびＢＬＡＰ（商標）（ヘンケル社製、Kommanditgesellschaft auf Aktien、ジュッセルドルフ、ドイツ）が含まれる。様々なプロテアーゼは、ＷＯ９５／２３２２１号、ＷＯ９２／２１７６０号、およびＵＳ５，８０１，０３９号、５，３４０，７３５号、５，５００，３６４号、５，８５５，６２５号に記載されている。追加のＢＰＮ’変異体（「ＢＰＮ’−ｖａｒ１」および「ＢＰＮ−変異体１」）はＵＳＲＥ３４，６０６号に記載されている。追加のＧＧ−３６変異体（本発明で言及される「Ｇ３６−ｖａ．１」および「ＧＧ３６−変異体１」）はＵＳ５，９５５，３４０号および５，７００，６７６号に記載されている。更なるＧＧ３６−変異体はＵＳ６，３１２，９３６号６，４８２，６２８号に記載されている。本発明の１つの側面において、本発明の洗浄組成物は、組成物中０．００００１％〜１０％の追加プロテアーゼの重量レベルでで追加プロテアーゼ酵素および組成物の重量で９９．９９９％〜９０．０％の洗浄補助物質を含む。本発明の他の態様において、本発明の洗浄組成物はまた、組成物の重量で０．０００１％〜１０％、０．００１％〜５％、０．００１％〜２％、０．００５％〜０．５％の６９Ｂ４プロテアーゼ（またはそのホモログまたは変異体）のレベルのプロテアーゼ、および洗浄補助物質を含む洗浄組成物のバランス（例えば、９９．９��９９％〜９０．０％、９９．９９９％〜９８％、９９．９９５％〜９９．５％）を含む。
【０３７４】
さらに、アルカリ溶液での使用に適した任意のリパーゼは本発明において用いられる。好適なリパーゼには、細菌または真菌起源のものが含まれるが、これらに限定されない。有用なリパーゼの具体例には、フミコラ・ラヌジノサ・リパーゼ（Humicola lanuginose lipase：ＥＰ２５８０６８号およびＥＰ３０５２１６を参照されたい）、リゾムコル・ミエヘイ・リパーゼ（Rhizomucor miehei lipase：ＥＰ２３８０２３号を参照されたい）、Ｃ．アンチクティカ・リパーゼ（例えば、C. Antarctica lipase AまたはB：例えば、ＥＰ２１８２７２号を参照されたい）のようなカンディダ・リパーゼ（Candida lipase）
Ｐ．アルカリジェネス（alcaligenes）およびＰ．シュードアルカリジェネス・リパーゼ(ＥＰ２１８２７２号を参照されたい)のようなシュードモナス・リパーゼ、Ｐ．セパシア（cepacia）・リパーゼ（ＥＰ３３１３７６号）、Ｐ．ストゥツェリ（stutzeri）・リパーゼ（例えば、ＧＢ１，３７２，０３４号を参照されたい）、Ｐ．フルオレセンス・リパーゼ、バチルス・リパーゼ（例えば、B.suftilis lipase、ダトゥア（Daetois）他著、Biochem. Biophys. Acta、１１３１巻、２５３−２６０頁、１９９３年；B.stearothermophilis lipase：例えば、ＪＰ６４／７４４９９２号を参照されたい；およびB. pumilus lipase：例えば、ＷＯ９１／１６４２２号を参照されたい）が含まれる。
【０３７５】
さらに、多くのクローンされたリパーゼが、ペニシリウム・カメンベルティ（camembertii）・リパーゼ（ヤマグチ他著、ジーン、１０３巻、６１−６７頁、１９９１年を参照されたい）、ゲオトゥリクム・カンディドウム（Geotricum candidum）・リパーゼ（シマダ他著、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、１０６巻、３８３−３８８頁、１９８９年を参照されたい）、およびＲ．デレマー（delemar）・リパーゼ（ハス（Hass）他著、ジーン、１０９巻、１１７−１１３頁、１９９１年を参照されたい）、Ｒ．ニベウス（niveus）・リパーゼ（クギミヤ他著、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー、５６巻、７１６−７１９頁、１９９２年を参照されたい）、およびＲ．オリザエ（oryzae）・リパーゼのようなＲ．リゾプス（Rhizopus）・リパーゼを含むが、これらに限定されない本発明の態様に用いられる。
【０３７６】
クチナーゼのような脂肪分解酵素の他のタイプは、シュードモナス・メンドシナ（mendicina：ＷＯ８８／０９３６７号を参照されたい）由来のクチナーゼ、またはフサリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi：ＷＯ９０／０９４４６号を参照されたい）由来のクチナーゼを含むが、これらに限定されない本発明の幾つかの態様に用いられる。
【０３７７】
追加の好適なリパーゼには、Ｍ１ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡＦＡＳＴ（商標）、およびＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（以上、ジェネンコー社製）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）、およびＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（以上、ノボザイム社製）、およびＬＩＰＡＳＥＰ（商標）「アマノ」（天野製薬株式会社製、日本）のような市販で入手できるリパーゼが含まれる。
【０３７８】
本発明の幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は、組成物の重量で０．００００１％〜１０％の追加のリパーゼレベルのリパーゼ、および組成物の重量で洗浄補助物質のバランスを含む。本発明の他の側面において、本発明の洗浄組成物はまた、組成物の重量で０．０００１％〜１０％、０．００１％〜５％、０．００１％〜２％、０．００５％〜０．５％のリパーゼのレベルのリパーゼを含む。
【０３７９】
アルカリ溶液での使用に好適な任意のアミラーゼ（アルファおよび／またはベータ）はまた、本発明の幾つかの態様において用いられる。好適なアミラーゼには細菌または真菌起源のものが含まれるが、これらに限定されない。化学的または遺伝子的に修飾された変異体は幾つかの態様に含まれる。本発明に用いられるアミラーゼには、Ｂ．リケニフォルミス（例えば、ＧＢ１，２９６，８３９号を参照されたい）から得られるα−アミラーゼが含まれるが、これに限定されない。本発明において用いられる市販で入手可能なアミラーゼには、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）およびＢＡＮ（商標）（以上、ノボザイム社製）、およびＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）およびＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（以上、ジェネンコー・インターナショナル社製）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３８０】
本発明の幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は、組成物の重量で０．００００１％〜１０％の追加のアミラーゼのレベルのアミラーゼ、および組成物の重量で洗浄補助物質のバランスを含む。本発明の他の側面において、本発明の洗浄組成物はまた、組成物の重量で０．０００１％〜１０％、０．００１％〜５％、０．００１％〜２％、０．００５％〜０．５％のアミラーゼのレベルのアミラーゼを含む。
【０３８１】
アルカリ溶液での使用に好適な任意のセルラーゼは、本発明の幾つかの態様において用いられる。好適なセルラーゼには細菌または真菌起源のものが含まれるが、これらに限定されない。化学的または遺伝子的に修飾された変異体は幾つかの態様に含まれる。好適なセルラーゼには、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)・セルラーゼ（例えば、ＵＳ４，４３５，３０７号を参照されたい）ゼが含まれるが、これに限定されない。特に好適なセルラーゼは色ケアで利点を有するセルラーゼ（例えば、ＥＰ０４９５２５７号を参照されたい）である。
【０３８２】
本発明において用いられる市販で入手可能なアミラーゼには、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）（ノボザイム社製）、およびＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（株式会社花王製）が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの態様において、セルラーゼは成熟野生型または変異体セルラーゼの部分または断片として取り込まれ、ここでＮ末端の部分は除去される（例えば、ＵＳ５，８７４，２７６号を参照されたい）。
【０３８３】
本発明の幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は、組成物の重量で０．００００１％〜１０％の追加のセルラーゼのレベルのセルラーゼ、および組成物の重量で洗浄補助物質のバランスをさらに含むことができる。本発明の他の側面において、本発明の洗浄組成物はまた、組成物の重量で０．０００１％〜１０％、０．００１％〜５％、０．００１％〜２％、０．００５％〜０．５％のセルラーゼのレベルのセルラーゼを含む。
【０３８４】
洗剤組成物および／またはアルカリ溶液での使用に好適な任意のマンナナーゼは、本発明において用いられる。好適なマンナナーゼには細菌または真菌起源のものが含まれるが、これらに限定されない。化学的または遺伝子的に修飾された変異体は幾つかの態様に含まれる。本発明に用いられる様々なマンナナーゼが知られている（例えば、ＵＳ６，５５６，１１４号、６，６０２，８４２号、および６，４４０，９９１号を参照されたい。これらは参照により本発明に取り込まれる）。
【０３８５】
幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は、組成物の重量で０．００００１％〜１０％の追加のマンナナラーゼのレベルのマンナナーゼ、および組成物の重量で洗浄補助物質のバランスをさらに含むことができる。本発明の他の側面において、本発明の洗浄組成物はまた、組成物の重量で０．０００１％〜１０％、０．００１％〜５％、０．００１％〜２％、０．００５％〜０．５％のマンナーゼのレベルのマンナナーゼを含む。
【０３８６】
幾つかの態様において、ペルオキシダーゼは過酸化水素またはその発生源（例えば、過炭酸、過ホウ酸、または過硫酸）と組み合わせて用いられる。選択的な態様において、オキシダーゼは酸素と組み合わせて用いられる。両タイプの酵素は「溶液漂白」のために用いられ（すなわち、織物が洗濯溶液中でともに洗濯されるときに、染色された織物から他の織物に布地の染料が移動するのを防ぐため）、好ましくは増強剤（例えば、ＷＯ９４／１２６２１号およびＷＯ９５／０１４２６号を参照されたい）とともに用いられる。好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼには細菌または真菌起源のものが含まれるが、これらに限定されない。化学的または遺伝子的に修飾された変異体は幾つかの態様に含まれる。
【０３８７】
幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は、組成物の重量で０．００００１％〜１０％の追加のペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼのレベルのペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼ、および組成物の重量で洗浄補助物質のバランスをさらに含むことができる。本発明の他の側面において、本発明の洗浄組成物はまた、組成物の重量で０．０００１％〜１０％、０．００１％〜５％、０．００１％〜２％、０．００５％〜０．５％のペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼのレベルのペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼを含む。
【０３８８】
上述の酵素の混合物、特に、６９Ｂ４酵素、１種以上の追加の酵素、１つ以上のアミラーゼ、１つ以上のリパーゼ、１つ以上のマンナナーゼ、および／または１つ以上のセルラーゼの混合物は本発明に包含される。実際、これらの酵素の様々な混合物が本発明に用いられることになることが意図されている。
【０３８９】
様々なレベルのプロテアーゼおよび１つ以上の追加の酵素は両方とも独立して１０％まで含まれ、洗浄組成物のバランスは洗浄補助物質となることが意図されている。洗浄補助物質の具体的な選択は、洗浄すべき表面、品目、または織物、および使用の間の洗浄条件（例えば、洗濯洗剤使用を通して）に関して組成物の望ましい形態を考慮することにより容易に行われる。
【０３９０】
好適な洗浄補助物質の具体例には、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化系、キレート化剤、光学的光沢剤、土壌放出ポリマー、染料移動剤、分散剤、泡抑制剤、染料、香料、染色剤、充填剤塩、向水性物質（hydrotrope）、光活性化剤、蛍光剤、織物調整剤、加水分解性界面活性剤、防腐剤、抗酸化剤、抗収縮剤、抗しわ剤、殺菌剤、抗かび剤、色汚れ剤（color speckles）、白髪用剤（silvercare）、抗腐食剤、アルカリ源、可溶化剤、担体、加工助剤、色素、およびｐＨ調整剤（例えば、ＵＳ６，６１０，６４２号、６，６０５，４５８号、５，７０５，４６４号、５，７１０，１１５号、５，６９８，５０４号、５，６９５，６７９号、５，６８６，０１４号、および５，６４６，１０１号を参照されたい。これらは参照により本発明に取り込まれる）が含まれるが、これらに限定されない。具体的な洗浄組成物物質の態様は以下に詳細に例示される。
【０３９１】
もし前記洗浄補助物質が洗浄組成物において本発明のプロテアーゼと適合しないなら、２つの成分の組み合わせが適切になるまで分離された洗浄補助物質および１つ以上のプロテアーゼ（すなわち、互いに接触させない）を保つ適当な方法が用いられる。そのような分離方法には、当該技術分野で既知の任意の適当な方法（例えば、ゲルキャップ、カプセル化、錠剤、物理的分離等）が含まれる。
【０３９２】
好ましくは、本発明で提供される有効量の１つ以上のプロテアーゼはタンパク質様の汚れ除去が必要な様々な表面を洗浄するのに役立つ組成物に含まれる。そのような洗浄組成物は、硬い表面、織物、および食器の洗浄のような利用のための洗浄組成物を含む。実際、幾つかの態様において本発明は織物洗浄組成物を提供し、一方、他の態様において本発明は非織物洗浄組成物を提供する。明らかに、本発明はまた、口内ケア（義歯洗浄組成物ばかりでなく、歯磨き粉（dentifrices）、歯磨き、口洗浄等を含む）、皮膚および髪洗浄組成物を含む、パーソナルケアに好適な洗浄組成物を提供する。本発明は任意の形態（すなわち、液体、顆粒、棒、半固体、ゲル、エマルジョン、錠剤、カプセル等）の洗剤組成物を含むことを意図している。
【０３９３】
実施例により、本発明のプロテアーゼが用いられる数種の洗浄組成物は以下に詳細に記載される。本発明の洗浄組成物が洗濯機械の洗濯方法の使用に好適な組成物として製剤される態様において、本発明の組成物は、好ましくは有機ポリマー性化合物、漂白剤、追加の酵素、泡抑制剤、分散剤、石灰石鹸（lime-soap）分散剤、土壌懸濁液、および抗再沈殿剤および腐食阻害剤から選択される１つ以上の洗浄補助物質と同様に、好ましくは１つ以上の界面活性剤および１つ以上のビルダー化合物を含む。幾つかの態様において、洗濯組成物も柔軟化剤（すなわち、追加的な洗浄補助物質として）を含む。
【０３９４】
本発明の組成物はまた、固体または液体形態の洗剤添加物製品に用いられる。そのような添加物製品は従来の洗剤組成物の性能を補助および／または増強することが目的とされ、洗浄過程の任意の段階で添加することができる。
【０３９５】
手による食器洗い方法で使用される組成物として製剤される態様において、本発明の組成物は好ましくは１つ以上の界面活性剤、および好ましくは有機ポリマー性化合物、泡増強剤、第ＩＩ族金属イオン、溶媒、向水性物質（hydrotrope）および追加の酵素から洗濯される１つ以上の追加の洗浄補助物質を含む。
【０３９６】
幾つかの態様において本発明の洗濯洗剤組成物の密度は４００〜１２００ｇ／Ｌの範囲にあり、一方、他の態様において２０℃で測定される組成物で５００〜９５０ｇ／Ｌの範囲にある。
【０３９７】
幾つかの態様において、ＵＳ６，６０５，４５８号で示されるような様々な洗浄組成物は本発明のプロテアーゼとともに用いられる。したがって、幾つかの態様において本発明の１つ以上のプロテアーゼを含む組成物は緻密な顆粒状の織物洗浄組成物であり、一方、他の態様において前記組成物は染色された織物の洗濯に有用な顆粒状の織物洗浄組成物であり、更なる態様において前記組成物は洗濯性能を通して柔軟化を提供する顆粒状の織物洗浄組成物であり、追加の態様において前記組成物は重責を担う液体織物洗浄組成物である。
【０３９８】
幾つかの態様において、本発明の１つ以上のプロテアーゼを含む組成物はＵＳ６，６１０，６４２号および６，３７６，４５０号で記載されるもののような織物洗浄組成物である。さらに、本発明のプロテアーゼはヨーロッパおよび日本の洗濯条件下で特別の利用性のある顆粒状の洗濯洗剤組成物に用いられる（例えば、ＵＳ６，６１０，６４２号を参照されたい）。
【０３９９】
選択的な態様において、本発明は本発明で提供される１つ以上のプロテアーゼを含む硬い表面洗浄組成物を提供する。したがって、幾つかの態様において、本発明の１つ以上のプロテアーゼを含む組成物はＵＳ６，６１０，６４２号、６，３７６，４５０号、および６，３７６，４５０号に記載されたもののように硬い表面洗浄組成物である。
【０４００】
より更なる態様において、本発明は本発明で提供される１つ以上のプロテアーゼを含む食器洗い組成物を提供する。したがって、幾つかの態様において、本発明の１つ以上のプロテアーゼを含む組成物はＵＳ６，６１０，６４２号、および６，３７６，４５０号に記載されたもののように硬い表面洗浄組成物である。
【０４０１】
なお更なる態様において、本発明は本発明で提供される１つ以上のプロテアーゼを含む食器洗い組成物を提供する。したがって、幾つかの態様において、本発明の１つ以上のプロテアーゼを含む組成物はＵＳ６，６１０，６４２号、および６，３７６，４５０号に記載されたもののように口内ケア組成物である。
【０４０２】
前述のＵＳ６，３７６，４５０号、６，６０５，４５８号、６，６０５，４５８号、および６，６１０，６４２号に含まれる化合物および洗浄補助物質の製剤および記載は、全て参照により本発明に取り込まれる。なお更なる具体例は以下の実施例に示される。
【０４０３】
Ｉ）本発明の洗浄組成物の作製および使用過程
本発明の洗浄組成物は任意の適切な形態に製剤され、ＵＳ５，８７９，５８４号、５，６９１，２９７号、５，５７４，００５号、５，５６９，６４５号、５，５６５，４２２号、５，５１６，４４８号、５，４８９，３９２号、および５，４８６，３０３号に記載される方式の非限定的な例により選択される任意のプロセスにより調製される。ここで、これらは参照により本発明に取り込まれる。低ｐＨの洗浄組成物が望まれる場合には、そのような組成物のｐＨは、モノエタノールアミンのような物質または塩酸のような酸性物質の添加により調整される。
【０４０４】
ＩＩ）本発明のセリンプロテアーゼに添加の補助物質
本発明の目的として本質的ではないものの、以下に説明される補助物の非限定的な一覧は即時の洗浄組成物の使用に好適であり、例えば、洗浄されるべき基質の処理のために洗浄性能を補助または増強するため、または香水、着色剤、染料等の場合に洗浄組成物の麻酔作用を修飾するため、望ましくは本発明の特定の態様に取り込まれ得る。そのような補助物が本発明のセリンプロテアーゼに追加されることは理解される。これらの追加的な成分の正確な性質、およびそれらの取り込みレベルは、組成物の物理的形態および用いられる洗浄操作の性質に依存することになる。好適な補助物質には、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、染料転移阻害剤、析出補助剤、分散剤、追加の酵素、および酵素安定化剤、触媒物質、漂白活性化剤、漂白促進剤、過酸化水素、過酸化水素の発生源、予備形成の過酸、ポリマー性分散剤、粘土汚れ除去剤／再析出防止剤、光沢剤、泡抑制剤、染料、香水、構造弾性剤、織物柔軟剤、担体、向水性物質（hydrotrope）、加工助剤、および／または色素が含まれるが、これらに限定されない。以下の開示に加えて、そのような他の補助物の好適な例および使用のレベルは、ＵＳ５，５７６，２８２号、６，３０６，８１２号、および６，３２６，３４８号に認められ、これらは参照により本発明に取り込まれる。前述の補助成分は本発明の洗浄組成物のバランスを構成することができる。
【０４０５】
界面活性剤
本発明にしたがって前記洗浄組成物は界面活性剤または表面活性剤系を含むことができる。ここで、前記界面活性剤は非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、およびこれらの混合物から選択することができる。約３〜約５の実質ｐＨを有する組成物のような低ｐＨ洗浄組成物の場合、典型的にはエトキシ化硫酸アルキルを含まない組成物が、そのような界面活性剤はそのような組成物の酸性内容によって加水分解されることはないと考えられているため、望ましい。
【０４０６】
前記界面活性剤は典型的には、対象組成物の重量で約０．１％〜約６０％、約１％〜約５０％、またはさらに約５％〜約４０％のレベルで存在する。
【０４０７】
ビルダー
本発明の洗浄組成物は１つ以上の洗剤ビルダーまたはビルダー系を含むことができる。ビルダーが用いられる場合、前記対象洗浄組成物は典型的には、前記対象組成物の重量で約１％以上、約３％〜約６０％、またはさらに約５％〜約４０％のビルダーを含むことになる。
【０４０８】
ビルダーには、メリト酸（mellitic acid）、コハク酸、クエン酸、オキシジクエン酸、ポリマレイン酸、ベンゼン−１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチロキシコハク酸、およびそれらの可溶塩のようなポリカルボキシレートと同様に、アルカリ金属、ポリ燐酸のアンモニウムおよびアルカノールアンモニウム塩、珪酸アルカリ金属、炭酸アルカリ土類金属およびアルカリ金属、アルミニウム珪酸ビルダーポリ炭酸化合物、ヒドロキシポリカルボン酸エーテル、無水マレイン酸とエチレンまたはビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸、およびカルボキシメチロキシコハク酸、様々なアルカリ金属、エチレンジアミン四酢酸およびニトロ三酢酸ようなポリ酢酸のアンモニウムおよび置換アンモニウム塩が含まれるが、これらに限定されない。
【０４０９】
キレート剤
本発明における洗浄組成物はキレート剤を含むことができる。好適なキレート剤には、銅、鉄、および／またはマグネシウムキレート剤、およびこれらの混合物が含まれる。
【０４１０】
キレート剤が用いられる場合、前記洗浄組成物は、対象洗浄組成物の重量で約０．１％〜約１５％、またはさらに約３．０％〜約１０％のキレート剤を含むことができる。
【０４１１】
析出補助剤
本発明の洗浄組成物は析出補助剤を含むことができる。好適な析出補助剤には、ポリエチレングリコール、ポリカルボン酸、ポリテレフタル酸のような防汚ポリマー、カオリナイト、モンモリロナイト、アタパルガイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイトのような粘土、およびこれらの混合物が含まれる。
【０４１２】
染料転移阻害剤
本発明の洗浄組成物はまた、一つ以上の染料転移阻害剤を含むことができる。好適なポリマー性染料転移阻害剤には、ポリビニルピロリドン・ポリマー、ポリアミン−Ｎ−オキシド・ポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンおよびＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾール、またはこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【０４１３】
対象洗浄組成物に存在する場合、前記染料阻害剤は洗浄組成物の重量で約０．０００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、またはさらに約０．１％〜約３％のレベルで存在することができる。
【０４１４】
分散剤
本発明の洗浄組成物はまた、分散剤を含むことができる。好適な水溶性有機物質には、ホモポリマー性またはコポリマー性酸またはそれらの塩が含まれ、これらのポリカルボン酸は、互いに離れているが２炭素原子よりも離れていない二つ以上のカルボキシラジカルを含む。
【０４１５】
酵素
前記洗浄組成物は、洗浄性能および／または織物ケアの利点を提供する１つ以上の洗剤酵素を含むことができる。好適な酵素の具体例には、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ（xylanases）、リパーゼ、ホスホリラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ（pullulanases）、タナーゼ（tannases）、ペントサナーゼ（pentosanases）、マラナーゼ（malanases）、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ（laccase）、およびアミラーゼ、またはこれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。典型的な組合せは、アミラーゼと組み合わせたプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、および／またはセルラーゼのような従来から利用できる酵素のカクテルである。
【０４１６】
酵素安定化剤
洗剤に用いる酵素は様々な技術により安定化することができる。本発明で用いられる酵素は、酵素にイオンを提供する最終組成物中の水溶性のカルシウムおよび／またはマグネシウム源の存在により安定することができる。
【０４１７】
触媒金属錯体
本発明の洗浄組成物は触媒金属錯体を含むことができる。金属含有漂白触媒の１つのタイプは、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、またはマグネシウムカチオン、亜鉛またはアルミニウムのようなほとんど又は全く漂白触媒活性をもたない補助金属カチオン、および触媒および補助金属イオンについて定義された安定定数を有する金属封鎖剤（sequestrate）、特にエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）およびそれらの水溶性塩を含む、定義された漂白触媒活性の繊維金属カチオンを含む触媒系である。そのような触媒はＵＳ４，４３０，２４３号に開示されている。
【０４１８】
所望ならば、本発明の組成物はマグネシウム化合物により触媒されることができる。そのような化合物および使用レベルは当該技術分野において周知であり、例えばＵＳ５，５７６，２８２号で開示されるマグネシウムに基づく触媒を含む。
【０４１９】
本発明で有用なコバルト漂白触媒は既知であり、例えばＵＳ５，５９７，９３６号および５，５９５，９６７号に記述されている。そのようなコバルト触媒は、例えばＵＳ５，５９７，９３６号および５，５９５，９６７号で示唆されるように既知の操作により容易に調製される。
【０４２０】
本発明の組成物はまた、好適には「ＭＲＬ」略されるマクロポリサイクルの強固なリガンドの繊維金属錯体を含む。実践的な事項として限定的ではなく、本発明の組成物および洗浄プロセスは、水溶性媒体における活性ＭＲＬ種の１／１００ｐｐｍ（part per 100 million）オーダーを提供するために調整することができ、好ましくは約０．００５ｐｐｍ〜２５ｐｐｍ、より好ましくは約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、最も好ましくは約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍの洗濯溶液中のＭＲＬである。
【０４２１】
即時の遷移金属漂白触媒における好ましい遷移金属には、マグルシウム、鉄およびクロムが含まれる。本発明において好ましいＭＲＬのそれは、５，１２−ジメチル−１，５，８，１２−テトラアサセヒセシクロ［６．６．２］ヘキサデカンのような交叉架橋した特殊なタイプの超強固なリガンドである。好適な遷移金属ＭＲＬは、例えばＷＯ００／３３２６０１号およびＵＳ６，２２５，４６４号に示唆されているように既知の操作により容易に調製される。
【０４２２】
ＩＩＩ）洗浄組成物の作製および使用方法
本発明の洗浄組成物は任意の適切な形態に製剤され、ＵＳ５，８７９，５８４号、５，６９１，２９７号、５，５７４，００５号、５，５６９，６４５号、５，５１６，４４８号、５，４８９，３９２号、および５，４８６，３０３号に記載される方式の非限定的な例により選択される任意のプロセスにより調製される。ここで、これらは参照により本発明に取り込まれる。
【０４２３】
ＩＶ）使用方法
本発明に開示された洗浄組成物は、場所、特に表面または織物を洗浄するために用いることができる。具体的には、場所の少なくとも一部分が、そのままの形態または洗濯溶液に希釈された状態の本発明の洗浄組成物の態様と接触し、次にその場所が任意に洗浄され、および／または漱がれる。本発明の目的のために、洗浄には擦り洗いおよび機械的な撹拌が含まれるが、これらに限定されない。前記織物には通常の消費者が使用する条件で洗濯することができるほとんどの任意の織物が含まれる。開示された洗浄組成物は典型的には溶液中で約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度が用いられる。洗濯溶液が水の場合、水温は典型的には約５℃〜約９０℃であり、場所が織物の場合、織物に対する水の比は典型的には約１：１〜約３０：１である。
【０４２４】
Ｂ．動物飼料
なおさらに、本発明は、本発明にしたがってプロテアーゼが食品または動物飼料と混合される食品または動物飼料の生産のための組成物および方法を提供する。幾つかの態様において前記プロテアーゼは加工前の乾燥製品として添加され、一方、他の態様においてそれは加工前または後の液体として添加される。乾燥粉体が用いられる幾つかの態様において、前記酵素は製粉された穀物のような担体に液体として希釈される。本発明のプロテアーゼはＵＳ５，６１２，０５５号、５，３１４，６９２号、および５，１４７，６４２号（これらは参照により本発明に取り込まれる）に記載されているもののように動物飼料および／または添加物として用いられる。
【０４２５】
本発明の酵素飼料添加物は、多くの調製法に好適である。例えば、幾つかの態様において、それは酵素混合物を生産するのに適切な活性を有する異なる酵素を混合することにより簡便に調製される。幾つかの態様においてこの酵素混合物は飼料に直接混合され、一方、他の態様において製粉された小麦、トウモロコシまたは大豆の粉のような穀物に基づく担体物質にしみ込まされる。また本発明は、酵素飼料添加物として用いられるため、これらのしみ込んだ担体も包含する。
【０４２６】
幾つかの選択的な態様において、穀物由来の担体（例えば、製粉された小麦またはトウモロコシ）は適当な活性を有する酵素に一時に又は連続的にしみ込まされる。例えば、幾つかの態様において、製粉された小麦担体は初めにキシラナーゼに噴霧され、次にプロテアーゼに、任意にβ−グルコシダーゼに噴霧される。また本発明は、酵素飼料添加物として用いられるため、これらのしみ込んだ担体も包含する。好ましい態様において、これらのしみ込んだ担体は本発明の１つ以上のプロテアーゼを含む。
【０４２７】
幾つかの態様において本発明の飼料添加物は動物飼料に直接混合され、一方他の態様においてそれはビタミン飼料添加物、ミネラル飼料添加物、および／またはアミノ酸飼料添加物のような１つ以上の他の飼料添加物と混合される。数種の異なるタイプの成分を含む最終的な飼料添加物は次に適切な量の飼料と混合される。
【０４２８】
幾つかの好ましい態様において、穀物由来の担体を含む本発明の飼料添加物は通常０．０１〜５０ｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜１０ｇ／ｋｇ、最も好ましくは約１ｇ／ｋｇの量の飼料に混合される。
【０４２９】
選択的な態様において、本発明の酵素飼料添加物は所望の比の量で所望の１つ以上の酵素を生産する遺伝子組換え微生物の構築を含む。幾つかの態様において、本発明の１つ以上のプロテアーゼをコードする遺伝子のコピー数を増加させることにより、および／または１つ以上のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結した適切に強力なプロモータを用いることにより、これは達成される。更なる態様において、前記遺伝子組換え微生物株は、望まれる場合には特定の酵素活性の欠損（例えば、セルラーゼ、エンドクルカナーゼ等）を有する。
【０４３０】
追加的な態様において、本発明で提供される酵素飼料添加物はまた、１つ以上のキシラナーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ、および／またはリパーゼを含むがこれらに限定されない他の酵素を含む。幾つかの態様において、望ましい活性を有する酵素は、穀物由来の担体しみ込ませる前か、選択的にそのような酵素がそのような穀物由来の担体に一時に又は連続的にしみ込まされるかいずれかによりキシラナーゼおよびプロテアーゼと混合される。前記担体は次に最終的な飼料を調製するため穀物由来の飼料と順に混合される。選択的な態様において、前記酵素飼料添加物は個々の酵素活性の溶液として調製され、次にペレットまたはマッシュとして予め形成された飼料物質と混合される。
【０４３１】
より更なる態様において、前記酵素飼料添加物は第二の（すなわち、異なる）飼料または動物の飲み水に取り込まれることにより動物の食餌に含有される。したがって、本発明によって提供される酵素混合物が穀物由来の飼料自体に取り込まれることは、本発明の特定の好ましい態様を形成するものの、本質的なものではない。飼料添加物１ｇあたりのプロテアーゼ活性の単位に対する飼料添加物１ｇあたりのキシラナーゼ活性の単位の比率は、好ましくは１：０．００１〜１，０００であり、より好ましくは１：０．０１〜１００であり、最も好ましくは１：０．１〜１０である。上記に示したように、本発明により提供される酵素混合物は、好ましくは穀物由来の飼料の調製における飼料添加物として用いられる。
【０４３２】
幾つかの態様において、前記穀物由来の飼料は２５重量％以上、またはより好ましくは３５重量％以上の小麦のたはトウモロコシまたはこれらの穀物両方の混合物を含む。さらに前記飼料は、飼料がｋｇあたり１００〜１００，０００単位のプロテアーゼ活性を含むような量で、飼料がプロテアーゼを含むような量で、プロテアーゼ（すなわち、本発明の１つ以上のプロテアーゼ）を含む。
【０４３３】
本発明にしたがって本発明で提供される穀物由来の飼料は、家禽（例えば、七面鳥、ガチョウ、アヒル、鶏等）、家畜（例えば、豚、羊、ウシ、ヤギ等）、および随伴動物（例えば、馬、犬、猫、ウサギ、ねずみ等）を含む様々な非ヒト動物の飼料として用いられる。前記飼料は家禽および豚に特に好適で、中でもブロイラー鶏に好適である。
【０４３４】
Ｃ．布地および皮革の処理
また本発明は、本発明の１つ以上のプロテアーゼを含む布地の処理のための組成物を提供する。幾つかの態様において、本発明の１つ以上のプロテアーゼは絹または羊毛（例えば、ＵＳＲＥ２１６，０３４号、ＥＰ１３４，２６７号、ＵＳ４，５３３，３５９号、およびＥＰ３４４，２５９号を参照されたい）の処理に好適な組成物の成分である。
【０４３５】
さらに、本発明のプロテアーゼはフィチン酸から燐を分離することが望ましい様々な利用で用いられる。したがって、本発明はまた、改善された性質をもつ羊毛または動物毛物質を生産する方法を提供する。幾つかの好ましい態様において、これらの方法はプラズマ処理プロセスおよびデルヘイ（Delhey）プロセスからなる群から洗濯されるプロセスにおいて羊毛、羊毛繊維、または動物毛物質を予備処理し、および予備処理された羊毛または動物毛物質を、性質を改善する有効量での蛋白分解酵素（例えば、本発明の１つ以上のプロテアーゼで）による処理にかける工程を含む。幾つかの態様において前記蛋白分解酵素処理はプラズマ処理の前に発生し、一方、他の態様においてそれはプラズマ処理の後に発生する。幾つかの好ましい態様において、それは分離した工程として実施され、一方他の態様において、それは羊毛または動物毛物質の洗い又は染色と組み合わせて実施される。追加的な態様において、酵素処理工程の間に１つ以上の界面活性剤および／または１つ以上の柔軟剤が含まれ、一方他の態様において、前記羊毛または動物毛物質が柔軟処理にかけられる分離した工程で前記１つ以上の界面活性剤および／または１つ以上の柔軟剤が取り込まれる。
【０４３６】
幾つかの態様において、本発明の組成物は羊毛繊維の収縮防止（例えば、ＪＰ４−３２７２７４号）のための方法に用いられる。幾つかの態様において、前記組成物は前記繊維を低温プラズマ処理に付し、次にブロックウレタン樹脂、ポリアミド−エポクロルヒドリン樹脂、グリオキザル樹脂、エチレン−尿素樹脂またはウレタン樹脂のような収縮防止樹脂で処理し、次に柔軟効果を得るために重量を減少させる蛋白分解酵素で処理する方法に用いられる。幾つかの態様において、前記プラズマ処理工程は低温処理、好ましくはコロナ放電処理またはグロー放電処理である。
【０４３７】
幾つかの態様において、前記低温プラズマ処理は、ガス、好ましくは空気、酸素、窒素、アンモニア、ヘリウム、またはアルゴンからなる群から洗濯されるガスを用いて実施される。慣例的には空気が用いられるが、他の示されたガスのうち任意のものを用いることが有利であり得る。
【０４３８】
好ましくは、約０．１ｔｏｒｒ〜５ｔｏｒｒの間で、低温プラズマ処理は約２秒〜約３００秒間、好ましくは約５秒〜約１００秒間、より好ましくは約５秒〜約３０秒間実施される。
【０４３９】
上記に示されるように、本発明はデルヘイプロセス（例えば、ＤＥ−Ａ−４３ ３２ ６９２を参照されたい）のような方法に関連して用いられる。このプロセスにおいて、羊毛の抗縮充性を改善するために前記羊毛は可溶性タングステン酸塩の存在下てせ過酸化水素水溶液中で処理され、次に任意に合成ポリマーの溶液または分散液で処理される。この方法において前記羊毛は、２〜６０％（ｗ／ｗ）、好ましくは８〜２０％（ｗ／ｗ）の触媒（好ましくはＮａ2ＷＯ4）の存在下、および非イオン性界面活性剤（wetting agent）の存在下で過酸化水素（０．１〜３５％（ｗ／ｗ）、好ましくは２〜１０％（ｗ／ｗ））水溶液中で処理される。好ましくは、前記処理はｐＨ８〜１１、室温で行われる。処理時間は過酸化水素および触媒の濃度に依存するが、好ましくは２分以下である。参加処理の後、前記羊毛は水にすすがれる。残留した過酸化水素の除去のため、および任意に漂白を追加するため、前記羊毛はさらに還元剤（例えば、亜硫酸塩、亜燐酸塩等）の酸性溶液中で処理される。
【０４４０】
幾つかの態様において、前記酵素処理は約１分および約１２０分の間の時間で行われる。この工程は、好ましくは約２０℃および約６０℃の間の温度で、より好ましくは約３０℃および約５０℃の間の温度で行われる。選択的に、前記羊毛は酵素水溶液に浸され又は埋め込まれ、次に慣例的な温度および圧力で、典型的には約３０秒〜約３分蒸気に晒される。幾つかの好ましい態様において、前記蛋白分解酵素処理は緩衝液を含んでもよい酸性または中性またはアルカリ性の溶媒中で行われる。
【０４４１】
選択的な態様において、前記酵素処理工程は1つ以上の慣例的なアニオン性、非イオン性（例えば、ドバノール；ヘンケル社）またはカチオン性界面活性剤の存在下で行われる。更なる態様において、前記羊毛または動物毛物質は蛋白分解酵素による処理の前または同時のいずれかに超音波処理に付される。幾つかの好ましい態様において、前記地様音波処理は約５０℃の温度で約５分行われる。幾つかの好ましい態様において前記酵素処理工程で用いられる蛋白分解酵素の量は羊毛または動物毛物質の重量に基づいて約０．２ｗ／ｗ％および約１０ｗ／ｗ％の間である。幾つかの態様において、処理工程の数にしたがって、前記酵素処理は羊毛または動物毛物質の染色および／または擦り洗いの間に、染色、漱ぎ、および／または擦り洗いバスにプロテアーゼを添加することにより簡単に行われる。幾つかの態様において酵素処理はプラズマ処理の後に行われるが、他の態様においては前記２つの処理工程は反対の順に行われる。
【０４４２】
羊毛に従来から用いられている柔軟剤は、通常カチオン性柔軟剤で、有機カチオン性柔軟剤またはシリコーンに基づく製品であるが、アニオン性または非イオン性柔軟剤も有用である。有用な柔軟剤の具体例には、ポリエチレン柔軟剤およびシリコーン柔軟剤（すなわち、ジメチルポリシロキサン（シリコーンオイル））、Ｈ−ポリシロキサン、シリコーンエラストマ、アミノ官能性ジメチルポリシロキサン、アミノ官能性シリコーンエラストマ、およびエポキシ官能性ポリシロキサン、および有機カチオン性柔軟剤（例えば、アルキル四級アンモニウム誘導体）が含まれるが、これらに限定されない。
【０４４３】
追加的な態様において、本発明は、本発明の１つ以上のプロテアーゼを含む動物皮革の処理のための組成物を提供する。幾つかの態様において、本発明のプロテアーゼはＷＯ０３／００８６５号記載（インセクト・バイオテック社、テジョン市、韓国）のもののような動物皮革の処理のための組成物に用いられる。追加的な態様において、本発明は本発明のプロテアーゼによる皮革または皮膚の酵素的な処理（例えば、ＷＯ９６／１１２８５号を参照されたい）を含む皮革および／または皮膚の皮製品への加工のための方法を提供する。追加的な態様において、本発明は、本発明の１つ以上のプロテアーゼを含む、動物皮膚または皮革の革製品への処理のための組成物を提供する。
【０４４４】
皮革および皮膚は通常、塩漬けまたは乾燥の生皮革または皮膚の形態で皮革工場に納入される。皮革または皮膚の革製品への加工には浸漬、脱毛およびアルカリ液浸漬を含む数種の異なる加工工程が含まれる。これらの工程はウェット加工で構成され、ビームハウス（beamhouse）で行われる。本発明のプロテアーゼを利用する酵素処理は皮加工に含まれる過程の任意の時点で利用できる。しかしながら、プロテアーゼは通常ウェット加工（すなわち、浸漬、脱毛および／またはベイティング（bating：アルカリ液浸漬の過程）の間で用いられる。したがって、幾つかの好ましい態様において、本発明の１つ以上のプロテアーゼを用いる前記酵素処理はウェット加工段階で発生する。
【０４４５】
幾つかの態様において、本発明の浸漬工程は慣例的な浸漬条件（例えば、ｐＨ６．０〜１１の範囲のｐＨで）で行われる。幾つかの好ましい態様において、ｐＨ範囲はｐＨ７．０〜１０．０である。選択的な態様において前記温度は２０〜３０℃の範囲内であり、一方他の態様において好ましくは２４〜２８℃の範囲内である。より更なる態様において前記反応時間は２〜２４時間の範囲内であり、一方好ましい範囲は４〜１６時間である。追加的な態様において、界面活性剤（tensides）および／または防腐剤は所望の場合に用いられる。
【０４４６】
第２相のアルカリ浸漬工程は通常、ベイト（bate）自体の添加により開始される。幾つかの態様において、前記酵素処理はアルカリ浸漬の間に行われる。幾つかの好ましい態様において、前記酵素処理は脱灰後、アルカリ浸漬の間に行われる。幾つかの態様において、本発明のアルカリ浸漬工程は慣例的な条件（例えば、ｐＨ６．０〜９．０の範囲のｐＨで）を用いて行われる。幾つかの好ましい態様において、前記ｐＨ範囲は６．０〜８．５である。更なる態様において前記温度は２０〜３０℃の範囲内であり、一方他の態様において好ましくは２５〜２８℃の範囲内である。幾つかの態様において前記反応時間は２０〜９０分の範囲内であり、一方他の態様においてそれは４０〜８０分の範囲である。皮製品の製造工程は当業者に周知である（例えば、ＷＯ９４／０６９４２９号、ＷＯ９０／１１２１１８９号、ＵＳ３，８４０，４３３号、ＥＰ５０５９２０号、ＧＢ２２３３６６５号、およびＵＳ３，９８６，９２６号を参照されたい。これらは参照により本発明に取り込まれる）。
【０４４７】
更なる態様において、本発明は、本発明のプロテアーゼを含むベイトを提供する。ベイトは、ビームハウス工程、特に革製品製造のためのプロセスのアルカリ浸漬工程で用いられる化学的に活性な成分を含む試剤または酵素含有製剤である。幾つかの態様において、本発明はプロテアーゼおよび好適な賦形剤を含むベイトを提供する。幾つかの態様において、この試剤は、例えば希釈剤、乳化剤、脱灰剤、および担体のような当該技術分野で既知で用いられている試薬を含むが、これらに限定されない。幾つかの態様において、本発明の１つ以上のプロテアーゼを含むベイトは当該技術分野で知られているように製剤される（例えば、ＧＢ−Ａ２２５０２８９号、ＷＯ９６／１１２８５号、およびＥＰ０７８４７０３号を参照されたい）。
【０４４８】
幾つかの態様において、本発明のベイトはベイト１ｇあたり０．００００５〜０．０１ｇの活性プロテアーゼを含むが、他の態様においては、ベイト１ｇあたり０．０００２〜０．００４ｇの活性プロテアーゼを含む。
【０４４９】
したがって、本発明のプロテアーゼは多くの利用および設定において用いられる。
【実施例】
【０４５０】
実験
本発明は以下の実施例においてさらに詳細に記述されるが、以下の実施例は特許請求された発明の範囲を如何なる方法でも限定することを意図していない。添付された図は明細書および発明の詳細な説明を纏めた部分として考慮されるべき意味を有する。引用された全ての文献は、そこに記載される全てについて参照により具体的に本発明に取り込まれる。以下の実施例は本発明を説明するために提供されるが、特許請求された発明を限定しない。
【０４５１】
以下に示す実験的な開示において、以下の省略記号が適用される。すなわち、Pl (proteinase inhibitor), ppm (parts per million); M (molar); mM (millimolar); yM (micromolar); nM (nanomclar); mol (moles); mmol (millimoles); Hmol (micromoles); nmol (nanomoles); gm (grams); mg (milligrams); pg (micrograms); pg (picograms); L (Iiters); ml and mL (milliliters); pl and pL (microliters); cm (centimeters); mm (millimeters); Vm (micrometers); nm (nanometers); U (units); V (volts); MW (molecular weight); sec (seconds); min(s) (minute/minutes); h(s) and hr(s) (hour/hours); ℃ (degrees Centigrade); QS (quantity sufficient); ND (not done); NA (not applicable); rpm (revolutions per minute); H20 (water); dH20 (deionized water); (HCI (hydrochloric acid); aa (amino acid); bp (base pair); kb (kilobase pair); kD (kilodaltons); CDNA (copy or comp[ementary DNA]; DNA (deoxyribonucleic acid); SSDNA (single stranded DNA); dsDNA (double stranded DNA); dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate); RNA (ribonucleic acid); MgC12 (magnesium chloride); NaCl (sodium chloride); w/v (weight to volume); v/v (volume td volume); g (gravity); OD (optical density); Dulbecco's phosphate buffered solution (DPBS); SOC (Bacto-Tryptone, Bacto Yeast Extract, I C mM NaCl; 2.5 mM KCl); Terrific Broth (TB; 12 g/1 Bacto Tryptone, 24 g/1 glycerol, 2.31 g/1 KH2PID4, and 12.54 g/[ K2HP04]; OD80 (optical density at 280 nm); OD600 (optical density at 600 nm); A405 (absorbance at 405 nm); Vmax (the maximum initial ve)ocity of an enzyme catalyzed reaction); PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis); PBS (phosphate buffered saline [150 mM NaCl, 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2]); PBST (PBS+0.25TWEENR 20); pEG (polyethylene glycol); PCR (polymerase chain reaction); RT-PCR (reverse trianscription POR); SDS (sodium dodecyl sulfate); Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane);, HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N-[2-ethanesulfonic acid]); HBS (HEPES buffered saline); SDS (sodium dodecylsulfate); Tris-HCI (tris[Hydroxymethyl]aminomethane-hydrochloride); Tricine (N-[tris-(hydroxymethyl)-methyl]-glycine); CHES (2-(N-cyclo-hexylamino) ethane-sulfonic acid); TAPS (3-{[tris-(hydroxymethyl)-methyl]-amino}-propanesulfonic acid); CAPS (3-(cyclo-hexylamino)-propane-sulfonic acid; DMSO (dimethyl sulfoxide); DTT (1 ,4-dithio-DL-threitol); SA (sinapinic acid (s,5-dimethoxy-4-hydroxy cinnamic acid); TC:A (trichloroacetic acid); Glut and GSH (reduced glutathione); GSSG (oxidized glutathione); TCEP (Tris[2-carboxyethyl] phosphine); Ci (Curies); mCi (milliCuries); VCi (microCuries); HPLC (high pressure liquid chromatography).; RP-HPLC (reverse phase high pressure liquid chromatography); TLC (thin layer chromatography); MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight); Ts (tosyl); Bn (benzyl); Ph (phenyl); Ms (mesyl); Et(ethyl). Me (methyl); Taq (Thermus aquaticus DNA polymerase); Klenow (DNA polymerase I Iarge (Klenow) fragment); rpm (revoiutions per minute); EGTA (ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether) N, N, N'. N'-tetraacetic acid); EDTA (ethylenediaminetetracetic acid); bla (P-Iactamase or ampicillin-resistance gene); HDL (heavy duty liqUid detergent, i.e., Iaundry detergent); ＭＪリサーチ社 (MJ Research, Reno,NV); ベースクリア社 (Baseclear BV, Inc., Leiden, the Netherlands); パーセプティブ社 (PerSeptive Biosystems. Framingham, MA); サーモ・フィネガン社 (ThermoFinnigan, San Jose, CA); アルゴ社 (Argo BioAnalytica, Morris Plains, NJ);サイツＥＫＳ社 (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Germany); ポール社 (Pall Corp., East Hills, NY); スペクトラム社 (Spectrum Laboratories, Dominguez Rancho, CA); モレキュラー・ストラクチャ社 (Molecular Structure Corp., WoodIands, TX); アクセルリス社 (Acceirys, Inc., San Diego. CA); ケミカル・コナンピューティング社 (Chemical Computing Corp., Montreal, Canada); ニュー・ブランズウィック社 (New Brunswick Scientific, Co., Edisan, NJ); ＣＦＴ社 (Center for Test Materials, Vlaardingeng, the Netherlands); ���ロクター＆ギャンブル社 (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH); ＧＥヘルスケア社 (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom); ＤＮＡ２．０社 (DNA2.0, Menlo Park, CA); オキソイド社 (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK); メガザイム社 (Megazyme International lreland Ltd.. Bray Business Park, Bray, Co., Wicklow, Ireland); フィンザイム社 (Finnzymes Oy, Espoo, Finland); ケルコ社 (CP Kelco. Wilmington, DE); コーニング社 (Corning Life Sciences, Corning, NY); ＮＥＮ社 (NEN Life Science Products, Boston, MA); ファーマＡＳ社 (Pharma AS. Oslo, Norway); ディナル社 (Dynal, Oslo, Norway); バイオ・シンセシス社 (Bio-Synthesis, Lewisville, TX); ＡＴＣＣ (American Type Culture Collection, Rockville, MD); Ｂｉｂｃｏ／ＢＲＬ社 (Gibco/BRL, Grand Island , NY); シグマ社 (Sigma Chemical Co.. St. Louis, MO); ファルマシア社 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ); ＮＯＢＩ社 (National Center for Biotechnology Information); アプライド・バイオシステムズ社 (Applied Biosystems, Foster City, CA); ＢＤバイオサイエンス・アンド・クローンテック社 (BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); オペロン・テクノロジーズ社 (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA); ＭＷＧバイオテック社 (MWG Biotech, \High Point, NC); オリゴズＥｔｃ社 (Oligos Etc. Inc. Wilsonville, OR); バケム社 (Bachem Biosdience, Inc., King of Prussia, PA); ディフコ社 (Difco Laboratories, Detroit, MI); メディアテック社 (Mediatec
h, Hbrndon, VA; サンタ・クルツ社 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA); オキソイド社 (Oxoid Inc., Ogdensburg, NY); ワシントン社 (Worthington Biochemical Corp., Freehoid, NJ); ＧｉｂｃｏＢＲＬ社 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg. MD); ミリポア社 (Millipore, Billerica, MA);バイオ・ラッド社 (Bio-Rad, Hercules, CA); インビトロジェン社 (Invitrogen Corp., San Diego. CA); ＮＥＢ社 (New England Biolabs, Beverly, MA); シグマ社 (Sigma Chemical Co., St, Louis, MO); ビアース社 (Pierce Biotechnology, Rockford, iL); 株式会社タカラ (Takara Bio Inc., Otsu. Japan); ロシュ社 (Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland); ＥＭサイエンス社 (EM Science, Gibbs'[own, NJ]; ディアジェン社 (Qiagen, Inc., Valencia, CA); バイオデザイン社 (Biodesign Intl., Saco, Maine); アプタジェン社 (Aptagen, Inc., Herndon, VA); ソーバル社 (Sorvall brand, from Kendro Laboratory Products, Asheville, NC); モレキュラー・デバイシーズ社 (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, CA); Ｒ＆Ｄシステムズ社 (R&D Systems, Minneapolis, MN); ストラタジーン社 (Stratagene Cloning Systems, La Jolia, CA); マーシュ社 (Marsh Biosciences, Rochester, NY); バイオ・テック社 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT); バイオコア社 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ); ペプロテック社 (PeproTech, Rocky Hill, NJ); シンペプ社 (SynPep, Dublin, CA); ニュー・オブシェクティブ社 (New Objective brand; Scientific; Instrument Services, Inc., Ringoes, NJ); ウォーターズ社 (Waters, Inc., Milford, MA); マトリクス・サイエンス社 (Matrix Science. Boston, MA); ディオネックス社 (Dionex, Corp., Sunnyvale. CA); モンサント社Monsanto (MGnsanto Co., St. Louis, MO); ウィンターシャル社 (Wintershall AG, Kassel, Germany); ＢＡＳＦ社 (BASF Co., Florham Park, NJ); ハンツマン社 (Huntsman Petrochemical Corp.,.Salt Lake City, UT); エニケム社 (Enichem iberica, Barcelona, Spain); フルカ・ヘミー社 (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland); ギスト・ブロケイズ社 (Gist-Brocades, NV, Delft, the Netherlands); ダウ・コーニング社 (DOW Corning Corp., Midland. Ml); および マイクロソフト社（Microsoft, Inc., Redmond, WA）
【０４５２】
実施例  １
アッセイ
以下の事例において、たんぱく質測定、適用試験、および安定性試験といった種々のアッセイが用いられた。解釈を容易にするために、以下のアッセイは下記に説明され、個々の実施例において参照される。本発明の発展過程に行われた任意の実験において、以下に提供された任意のプロトコルからの逸脱は実施例において示される。
以下の実施例において使用されたいくつかの洗剤は次の組成物を有した。組成物ｌおよびIIにおいて、バランス（100%まで）は香料／色素および／または水であった。これらの組成物のｐHは、組成物ｌについては約５から約７、および組成物llについては約7.5から約8.5であった。組成物lllにおいて、バランス（100%まで）は水および／または微量の香料、色素、漂白剤／SRPI／カルボキシメチルセルロースナトリウム／光退色／硫酸マグネシウム／PVPVI／泡抑制剤（suds suppressor）／高分子PEG／粘土から成っていた。
【０４５３】
【表２】
2007515164.tif 000004
【０４５４】
【表３】
2007515164.tif 000005
【０４５５】
Ａ．  ９６‐ウエルマイクロタイタープレートにおけるタンパク質含有量決定のためのTCAアッセイ
このアッセイは、230RPMでの振動および加湿エアレーションを伴いながら4日間、33度で培養されたマイクロタイタープレートからろ過された培養上清液を用いて開始された。新鮮な96‐ウエル平底プレートがアッセイに使用された。最初に100μL/wellの0.25 N HCIがウエルに入れられた。次に、50μLのろ過された培養ブロスがウエルに加えられた。ブランクリーディングを提供するために、405nm（プレートリーダーで、５秒のミキシングモードを使用）での光散乱／吸光度が、次に決定された。
【０４５６】
試験用に、100μL/ウエル15%（W/V）TCAがプレートに置かれ、室温で５から30分の間培養された。次に、405nm（プレートリーダーで、５秒のミキシングモードを使用）で光散乱／吸光度が決定された。
【０４５７】
計算はTCAについてのテストリーディングからブランク（すなわち、TCAでない）を差し引くことによって行われた。必要に応じて標準曲線は、既知の換算率を含むクローンのAAPFアッセイを用いたTCAリーディングを較正することによって作られ得る。しかし、TCAの結果は50から500ppmのタンパク濃度に対して直線性を有し、従ってよく機能する変異体を選択するために酵素性能に対して直接にプロットできる。
【０４５８】
Ｂ．96ウエルマイクロタイタープレートにおけるプロテアーゼのsuc−AAPF−pNAアッセイ  
このアッセイ系において使用された試薬液は、
１．0.005% TWEEN(登録商標)‐80を含む、100mM Tris/HCI、pH8.6（トリス緩衝液）。
２．10ｍM CaCl2および0.005%TWEEN(登録商標)‐80を含む、100mMトリス緩衝液（トリス緩衝液）。
３．DMSO内の160mM suc-AAPF-pNA（suc-AAPF-pNA 原液）（シグマ社製：S-7388）
【０４５９】
suc-AAPF-pNA希釈標準溶液を調製するために、1 ml のAAPFが100 mlのTris/Ca緩衝液に加えられ、10秒以上にわたり充分に混合された。
【０４６０】
アッセイは、各ウエルに10μlのプロテアーゼ希釈溶液を追加し、続いて190μl mg/ml AAPF希釈標準溶液の（素早い）追加より行われた。溶液は5秒にわたり混合され、吸収変化は25度においてMTPリーダーで410 nmで解読された。プロテアーゼ活性は、AU ( 活性=δOD-min−1.ml−1)。
【０４６１】
Ｃ．ケラチン加水分解アッセイ
このアッセイ系において使用された化学物質および試薬は、
ケラチン              ＩＣＮ 902111                      
洗剤                  洗剤組成物  ll
1.6ｇの洗剤が1000 mlの水に溶解される（ pH＝8.2 ）。
硬度および緩衝強度がそれぞれ6gpgおよび5mMを与えられた条件の下で、1190 mg HEPESだけでなく更に0.6 mlの10,000 gpg のCaCl2 / MgCl2が加えられる。このpHは、NaOHを用いて8.2まで調整される。
ピクリルスルホン酸（ＴＮＢＳ）
シグマ社製 P-2297 ( 5% 水溶液)
試薬  Ａ              45.4gのNa2B4O7.10 H2O ( メルク社製 6308 )および15mlの4N NaOHが、最終容積1000ml (必要に応じて加熱して) まで一緒に溶解される。
試薬  Ｂ              32.2gのNaH2PO4.1 H2O (メルク社製 6346 )および0.6gのNa2SO3 (メルク社製 6657 )が、最終容積1000ml まで一緒に溶解される。
【０４６２】
方法：
培養に先立って、ケラチンが一回に少しづつ100μmほどふるいにかけられた。次に、10ｇの、100μmより小さいケラチンが8.2までpHを一定間隔で調整されながら、室温で20分以上洗剤液の中で攪拌された。最後に、懸濁液が室温で20分間遠心分離された（Sorvall、GSA roter、13,000 rpm）。次に、この手順が繰り返された。最後に、湿性の沈殿物が総容積200mlまで洗剤において懸濁され、その懸濁液はピペットの間、攪拌され続けた。培養に先立って、マイクロタイタープレート（MTPｓ）は、バイオヒットのマルチチャネルピペットおよび1200μlのチップを用いて、ウエル1つ当たり200μlの基質で満たされた（200μlの6分注し、また、チップ中のケラチンの設定を無効にするように、可能な限り速やかに分注された）。次に、10μlのろ過された培養液がMTPsを含む基質に加えられた。プレートはテープで覆われ、インキュベーターに置かれ、350rpmで3時間にわたり20℃で培養された（ イノバ 4330〔New Brunswick〕）。培養に続いて、プレートは3000 rpmで3分間遠心分離機にかけられた（iSigma 6K 15 centrifuge ）。インキュベーターから第一番目のプレートを除去する前の約15分間に、TNBS試薬は試薬Ａの50mlにつき1mlのTNBS溶液を混合することによって調製された。
【０４６３】
MTPｓは、ウエル1つにつき60μlのTNBS試薬Ａで満たされた。培養されたプレートから10μlが、TNBS試薬Ａを有するMTPsに移された。プレートはテープで覆われ、室温で50rpmでベンチシェーカー（ＢＭＧサーモスター）において20分間振動させた。最後に、200μlの試薬Ｂがウエルに加えられ、シェーカーで1分間混合され、450 nmで吸光度がMTPリーダーを用いて計測された。
【０４６４】
ケラチンの加水分解活性の計算：
得られた吸光値がブランク値（酵素を持たない基質）について修正された。結果として得られた吸光度は加水分解活性のための尺度を提供する。各サンプル（変異体）について性能指数が計算された。性能指数は、同一のタンパク質濃度における変異体の性能（実行値）と標準酵素（理論値）を比較する。さらに理論値は、標準酵素のラングミュア式のパラメータを使って計算できる。性能指数（PI）が1より大きい場合（ PI＞１）は、より良い変異体（ 標準〔例えば、野生型〕と比較した場合）と同定し、他方、PIが１である場合（ PI＝１）は、変異体は標準と同じように機能すると同定し、およびPIが１より小さい場合（ PI＜１）は、変異体は標準よりも低く機能すると同定する。従って、PIは一定の環境の下での使用に関してあまり望ましくない変異体だけでなく成功しそうなものも同定する。
【０４６５】
Ｄ．  プロテナーゼの性能試験のためのマイクロスウォッチアッセイ
これらのアッセイで使用された全ての洗剤は酵素を含んでなかった。
【０４６６】
洗剤の調製：
【０４６７】
１．ヨーロッパの洗剤液：
ミリQ水は15gpgの水の硬度（Ca/Mg=4/1）に調整され、7.6 g/lのアリエル（登録商標）レギュラー洗剤を加え、および、30分以上洗剤液を勢いよく攪拌する。洗剤はアッセイで使用される前に、0.22μmのフィルター（例えば、ナルゲン・トップボトルフィルター）を通してろ過された。
【０４６８】
２．日本の洗剤液
ミリQ水は3gpgの水の硬度（Ca/Mg=3/1）に調整され、0.66g/lの洗剤組成物lllを加え、洗剤液は30分以上勢いよく攪拌された。洗剤はアッセイで使用される前に、0.22μmのフィルター（例えば、ナルゲン・トップボトルフィルター）を通してろ過された。
【０４６９】
３．冷水液体洗剤（米国の条件）：
ミリQ水は6gpgの水の硬度（Ca/Mg=3/1）に調整され、1.60 g/l TIDE（登録商標）LVJ-1洗剤を加え、および洗剤液は15分以上勢いよく攪拌する。5mMのHepes バッファーを加え、pHは6.0に設定する。洗剤はアッセイで使用される前に、0.22μmのフィルター（例えば、ナルゲン・トップボトルフィルター）を通してろ過された。
【０４７０】
4．低ｐHの液体洗剤（米国の条件）：
ミリQ水は6gpgの水の硬度（Ca/Mg=3/1）に調整され、1.60 g/lの洗剤組成物Iが加えられ、および洗剤液は15分以上勢いよく攪拌した。1N NaOH 溶液を用いてpHは6.0に設定された。洗剤はアッセイで使用される前に、0.22μmのフィルター（例えば、ナルゲン・トップボトルフィルター）を通してろ過された。
【０４７１】
マイクロスウォッチ（Microswatches）：
円形直径の1/4のマイクロスウォッチが発注され、CFT Vlaardingenによって供給された。マイクロスウォッチは以下に記述される固定化法を用いて前処理が行われた。シングルマイクロスウォッチが、表面積全体を露出するために96ウエルのマイクロタイタープレートの各ウエルに垂直に置かれた。（すなわち、ウエルの底に広げるのでなく）。
【０４７２】
漂白剤の固化  （“Superfixed”）：
10Lの水を含んだ10Lのステンレス鋼ビーカーにおいて、ヨーロッパ条件（＝Super fixed）で使用されるスウォッチの固化のために、水が60℃に加熱された。日本条件およびその他の条件のために、スウォッチが室温（=3K）で固化された。次に、10mlの30%過酸化水素（１ml/LのH2O2、H2O2の終末濃度は300ppm）が加えられた。次に、100スウォッチ（10スウォッチ/L）が溶液に加えられた。溶液は、時々攪拌および温度を測定しながら30分間放置されておかれた。スウォッチは7-8倍の冷水ですすがれ、乾燥のためにベンチに置かれた。スウォッチの彎曲を防ぐように、タオルがスウォッチの表面に置かれた。３Kのスウォッチについて、この手順が繰り返される（水が加熱されなかったおよび10×量の過酸化水素が加えられたことを除外して）。
【０４７３】
選択的固化  （「３K」スウォッチ固化）：
この特別なスウォッチ固化は室温で行われたが、加えられた30% のH2O2の量は、スーパーフィクススウォッチ固化において10×以上である。気泡形成（泡立ち）は明らかであり、従ってこれを説明するためにより大きなビーカーを使用することが必要である。最初に、8リッターの蒸留水が10L のビーカーに入れられ、80mlの30%過酸化水素が加えられる。水と過酸化物は柄杓を使って充分に混合される。次に、均一な固化を保障するために、40ピースのEMPA 116スウォッチが、溶液に加えられる前に、ファン（fan）に拡げられた。スウォッチは最初の5分は連続的に、残り25分は時々、30分間にわたり溶液中でかき混ぜられた。溶液は廃棄され、スウォッチは毎回およそ6リッターの蒸留水を用いて６回濯がれた。スウォッチは乾燥させるためにペーパータオルの表面に置かれた。空気乾燥されたスウォッチは、エクスパルション・プレス（expulsion press）上の1/４のサーキュラ・ダイ(circular die)を用いて穴をあけられた。シングルマイクロスウォッチが、表面積全体を露出するために96ウエルのマイクロタイタープレートの各ウエルに垂直に置かれた（すなわち、ウエルの底に広げるのでなく）。
【０４７４】
酵素サンプル
酵素サンプルは各配置にとって適切な濃度で試験され、10mのNaCL、0.005%のTWEEN（登録商標）-80溶液において希釈された。
【０４７５】
試験方法
インキュベーターが望ましい温度で設置された。望ましい温度は、液体状の冷水に対しては20℃、低ｐHの液体状に対しては30℃、ヨーロッパ条件に対しては40℃、日本および北米条件に対しては20℃であった。前処理および事前カットされたスウォッチは、上述のように、96ウエル MTPのウエルに入れられた。酵素サンプルは必要に応じて、10 mMのNaCL、0.005% TWEEN（登録商標）-80溶液において、20×望ましい濃度まで希釈された。洗剤液が上述のように調製された。次に、190μlの洗剤液がMTPの各ウエルに加えられた。この混合のために、10μlの酵素溶液が各ウエルに加えられた（総容積200μl/ウエル供給するまで）。MTPはプレートシーラーを用いて密封され、350 rpmで攪拌されながら60分間インキュベータに置かれた。適切な条件下での培養に続いて、各ウエルから100μlの溶液が除去され、新鮮なMTPの中に置かれた。100μlの溶液／ウエルを含む新しいMTPは、MTPリーダーで405 nmで解読された。マイクロスウォッチおよび洗剤を含むが酵素は含まない対照同様、ブランク対照も含まれた。
【０４７６】
【表４】
2007515164.tif 000006
【０４７７】
BMI性能の計算：
得られた吸光度値は、ブランク値（酵素がない場合はマイクロスウォッチの培養後に得られた）について修正された。結果として得られた吸光度は、加水分解活性の尺度であった。各サンプル（変異体）について性能指数が計算された。性能指数は、同一のタンパク質濃度における変異体の性能（実行値）と標準酵素（理論値）を比較する。さらに理論値は、標準酵素のラングミュア式のパラメータを使って計算できる。性能指数（PI）が1より大きい場合（ PI＞１）は、より良い変異体（ 標準〔例えば、野生型〕と比較した場合）と同定し、他方、PIが１である場合（ PI＝１）は、変異体は標準と同じように機能すると同定し、およびPIが１より小さい場合（ PI＜１）は、変異体は標準よりも低く機能すると同定する。従って、PIは一定の環境の下での使用に関してあまり望ましくない変異体だけでなく成功しそうなものも同定する。
【０４７８】
Ｄ．ジメチルカゼイン加水分解アッセイ（96ウエル）
このアッセイ系において、使用された化学製品および洗剤は以下の通り：
ジメチルカゼイン（DMC）：     シグマ社製 C-9801
TWEEN（登録商標） ‐80：   シグマ社製 P-8074
PIESバッファー（遊離酸）：    シグマ社製 P-1851； 15.1gが約960mlの水に溶解される；pHが４N NaOHを有する7.0まで調整される、１ml 5%のTWEEN（登録商標）‐80が加えられ容積は1000 mlになった。PIPESの終末濃度およびTWEEN（登録商標）‐80は、それぞれ50mMおよび0.005%である。
ピクリルスホルン酸（TNBS）  シグマ社製 P-2297（5%水溶液）
洗剤  Ａ                     45.4g  Na2B4O7.10 H2O ( メルク社製 6308 )および15mlの4N NaOHが一緒に終末容積1000mlまで溶解される（ 必要に応じて、加熱することによって）。
洗剤  B                      35.2g NaH2PO4.H2O ( メルク社製 6346 )および0.6gのNa2SO3( メルク社製 6657 )が一緒に終末容積1000mlまで溶解される。
【０４７９】
方法：
基質を調製するために、４ｇのDMCが400 ml PIPESバッファに溶解された。ろ過された培養液の上清がPIPESバッファにおいて希釈された：成長板（growth plate）の対照の終末濃度は、20ppmであった。次に各10μlの希釈された上清がMTPのウエルにおける200μlの基質に加えられた。次にMTPプレートがテープで覆われ、数分間振動させられ、そして攪拌しないで2時間ほど37℃のオーブンに置かれた。
【０４８０】
オーブンから第一プレートを除去する前に約15分間、TNBS試薬が試薬A 50 mlにつきTNBS溶液1mlを混合することによって調製された。MTPｓはウエル1つにつき60μｌのTNBS試薬Aで満たされた。培養プレートは数分間振動させられ、その後10μlがTNBS試薬Aを有するMTPsへ移された。プレートがテープで覆われ、室温で、500 rpmでベンチシェーカー（ BMG サーモスター）において20分間振動させられた。200μlの試薬Ｂがウエルに加えられ、シェーカーで1分間混合され、および、405 nmでの吸光度がMTP リーダーを用いて決定された。
【０４８１】
ジメチルカゼイン加水分解活性の計算：
得られた吸光度値はブランク値（酵素がない場合はマイクロスウォッチの培養後に得られた）に関して修正された。結果として得られた吸光度は、加水分解活性の尺度である。（任意の）サンプルの比活性度は吸光度で除して計算され、タンパク質濃度が決定される。
【０４８２】
Ｅ．  耐熱性アッセイ
このアッセイは、緩衝化培養上清の加熱の前および後の、ジメチルカゼイン加水分解に基づいている。ジメチルカゼイン加水分解アッセイにおいて記述されたものと、同じ化学物質と洗剤液が使用された。
【０４８３】
方法：
ろ過された培養液の上清がPIPESバッファにおいて成長板（growth plate）の対照の終末濃度に基づいて）20ppmに希釈された。次に、各50μlの希釈された上清がMTPの空のウエルに入れられた。MTPプレートは90分間、60℃および400 rpmで、iEMS インキュベータ／シェーカーHT( サーモラボシステム社)において培養された。プレートは氷上で5分間冷却された。次に、１0μlの溶液が200μlのジメチルカゼイン基質／ウエルを含んだ新鮮なMTPに加えられた。このMTPプレートがテープで覆われ、数分間振動させられ、そして攪拌しないで2時間ほど37℃のオーブンに置かれた。DMC加水分解アッセイで使用されたものと同じ検出方法が用いられた。
【０４８４】
耐熱性の計算
サンプルの残存活性は終末吸光度および初期吸光度の比率として説明され、両方ともブランクについて修正された。
【０４８５】
Ｆ．  ＬＡＳ安定性アッセイ
LAS安定性は0.06％ のLAS ( ドデシルベンゼンスホルン酸ナトリウム)の存在下で、試験タンパクの培養後に計測され、および残存活性はAAPFアッセイを使用して測定された。
【０４８６】
試薬：
ドデシルベンゼンスホルン酸、ナトリウム塩（＝LAS）：シグマ社製 D-2525
TWEEN（登録商標）‐80：シグマ社製 Ｐ-8074
トリス・バッファ（遊離酸）：：シグマ社製 Ｔ-1378）；6.35ｇが約960mlの水に溶解される；pHは4H HClを有する8.2に調整される。トリスの終末濃度は52.5mMである。
LAS原液：MQ水で10.5%のLAS溶液を調整する（＝MQ 100 mlにつき10.5ｇ）。
トリス・バッファ−100 mM / pH 8.6 ( 100mM トリス/ 0.005% Tween80 )
トリス−カルシウム・バッファ pH8.6 ( 100mM トリス/ 10mM CaCI2/0.005%  Tween80 )
【０４８７】
ハードウエア
平底MTPｓ：Costar ( #9017)
バイオメック FX
ASYS マルチピペッター
スペクトラマックス MTP Reader
IEMS インキュベーター /シェーカー
イノバ4330 インキュベーター /シェーカー
バイオヒットマルチチャネルピペット
BMG サーモスターシェーカー
【０４８８】
方法：
10μl、0.0063%のLAS溶液がpH8.5、52.5mlのトリス・バッファで調製された。100mg/mlのAAPF原液（ DMSO内の）の1mlをpH8.6、100 ml(100ｍM)のトリス・バッファに加えることにより、AAPFの希釈標準溶液が調製された。上清を希釈するために、平底プレートに希釈バッファが充填され、上清のアリコートが加えられ、十分に混合された。希釈率は成長板（AAPF 活性）においてASP-対照の濃度によって決まった。望ましいタンパク濃度は80 ppmであった。
【０４８９】
希釈された上清の10μlが、190μl、0.063％のLASバッファ／ウエルに加えられた。MTPはテープで密封され、数分間振動させられ、そして200 rpmの攪拌で、60分間、25℃でインキュベータ（イノバ 4230）に置かれた。初期活性（t=10分）は10分間の培養の後、各ウエル内の10μlの混合物を、190μlのAAPF希釈標準溶液を含む新鮮なMTPに導入することにより測定された。これらの溶液は十分に混合され、AAPF活性はMTPリーダー（25℃で、5分間に20リーディング）。
【０４９０】
終末活性（ｔ＝60分）は、60分の培養後に培養プレートから別の10μlの溶液を除去することによって測定された。次に、AAPF活性が上記のとおり測定された。計算は次のとおり行われた：残存活性のパーセンテージは、〔t-60値〕＊10／〔t-10値〕。
【０４９１】
Ｇ．  スクランブルエッグ加水分解アッセイ
プロテアーゼは、96-ウエルマイクロタイタープレートのウエルに入れて焼かれたスクランブルエッグから不溶性粒子を遊離する。スクランブルエッグの除去における酵素性能を決定するために、スクランブルエッグでコートされたウエルは、培養濾液およびADW ( 自動皿洗い洗剤) を含んだプロテアーゼの混合物で処理された。混濁度率が酵素活性の尺度である。
【０４９２】
材料
水槽
空気循環機を備えたオーブン（ Memmert ULE 400 ）
MTPホールダーおよびアルミニウムのカバー、同ボトムを装備し、0.25 cm( マルチトロン)を備えたインキュベーター／シェーカー
バイオメック FX 液体処理方法システム ( ベックマン社製)
マイクロプレートリーダー（モレキュラー・デバイス・スパクトラマックス 340、SOFTmax  Pro ソフトウエア） 
ニチリョー 8800マルチチャネルシリンジディスペンサー＋シリンジ
マイクロタイタープレートテープ
チップを備えたシングルおよびマルチチャネルピペット
グレードAの培養卵
CaCl2.2H2O( メルク社製 102382 ); MgCl2.6H2O( メルク社製 105833 ); Na2CO3( メルク社製 6392 )
ADW 製品：LH-パワー (=ライトハウス)
【０４９３】
操作：
卵3個がガラスビーカー内でフォークで攪拌され、100 mlのミルク( 4℃または室温)を加えられた。ビーカーは85℃の水槽に置かれ、混合物はスプーンで絶えず攪拌された。混合物が濃密になったならば、ビーカーの壁および底から絶えず凝固物質を廃棄するために注意が向けられた。混合物がわずかに液体状になったならば（約25分後）、ビーカーは水槽から除去された。別の40 mlのミルクが混合物に加えられ、ハンドミキサーまたはブレンダーで2分間混合された。混合物は室温まで冷却された（氷槽が使用できる）。次に、基質が追加の5〜10%の量の水（通常7.5%）を用いて攪拌された。
【０４９４】
テスト方法：
最初に、50μlのスクランブルエッグ基質がMTPの各ウエルに分注された。プレートは室温で一晩（約17時間）乾燥され、80℃で2時間オーブンで焼かれ、次に室温で冷却された。
【０４９５】
ADW製品溶液が2.85gのLH-パワーを1Lの水に溶解することにより調製された。約15分の溶解時間だけが必要とされ、溶液の濾過は必要ではなかった。次に、1.16ｍLの人工の硬水溶液が加えられ、2120mgのNa2CO3が溶液に溶解した。
【０４９６】
硬水溶液は188.57ｇのCaCl2.2H2Oおよび86.92gのMgCl2.6H2Oを１Lのデミ(demi)水で混合して調製された（1.28 M Ca + 0.43 M Mgと等しく、全体で10000gpg）。上記ADW、CaCl2および MgCl2の量は、190μl ADW溶液へ10μlの上清を加えるために、すでに比例して上昇した値（200／190×）になっていた。
【０４９７】
ADW溶液（190μl）は基質プレートの各ウエルに加えられた。MTPsが、各ウエルに10μlの上清を加え、テープでプレートをシールすることによって処理された。プレートは、予熱インキュベータ／シェーカーに置かれ、金属カバーおよびクランプで保護された。次に、プレートは700rpmで、適切な温度（米国の場合、50℃）にて、30分間洗浄された。プレートはインキュベータ／シェーカーから除去された。液体の緩やかな上昇および下降の動きを伴いながら、約125μlの温かい上清が空の平底プレートに移された。冷却の後、正確に100μlの分散液（dispersion）が空の平底プレートのウエルに分注された。405nmでの吸光度がマイクロタイタープレートリーダーを用いて測定された。
【０４９８】
スクランブルエッグ加水分解活性の計算：
得られた吸光度がブランク値（酵素を持たない基質）について修正された。結果として得られた吸光度は加水分解活性の尺度である。各サンプル（変異体）について性能指数が計算された。性能指数は、同一のタンパク質濃度における変異体の性能（実行値）と標準酵素（理論値）を比較する。さらに理論値は、標準酵素のラングミュア式のパラメータを使って計算できる。性能指数（PI）が1より大きい場合（ PI＞１）は、より良い変異体（ 標準〔例えば、野生型〕と比較した場合）と同定し、他方PIが１である場合（ PI＝１）は、変異体は標準と同じように機能すると同定し、およびPIが１より小さい場合（ PI＜１）は、変異体は標準よりも低く機能すると同定する。従って、PIは一定の環境の下での使用に関してあまり望ましくない変異体だけでなく成功しそうなものも同定する。
【０４９９】
実施例  ２
グラム陽性好アルカリ性細菌 ６９Ｂ４からの６９Ｂ４プロテアーゼの生産
この実施例は本発明によって提供される新プロテアーゼ69B4を初期に分離するために使われるセルロモナス菌株69B4の説明を提供する。好アルカリ微生物セルロモナス菌株69B4，（DSM 16035）は、含有されるアルカリ性カゼイン培地（ｇL−１）で37℃で分離された（例えば、ダックワース（Duckworth）他、FEMS Microbiol.Ecol.,19:181-191〔１９９６年〕を参照されたい）。
【０５００】
グルコース（メルク社製 1.08342）              10
ペプトン（ディフコ社製 0118）                 5
酵母抽出物（ディフコ社製 0127）               5
K2HPO4                                        １
MgSO4.7H2O                                    0.2
NaCI                                         40
Na2CO3                                        10
カゼイン                                      20
寒天                                          20
【０５０１】
追加的なアルカリ性培養培地（グラント好アルカリ培地）も以下に記述するように、セルロモナス菌株69B4を培養するために使用された。
【０５０２】
グラント好アルカリ培地（“GAM”）溶液Ａ（ｇL−１）
グルコース（メルク社製 1.08342）              10
ペプトン（ディフコ社製 0118）                 5
酵母抽出物（ディフコ社製 0127）               5
K2HPO4                                       １
MgSO4.7H2O                                   0.2
800mlの蒸留水に溶解し、高圧蒸気殺菌法によって無菌化した。
【０５０３】
ＧＡＭ  溶液Ｂ（ｇL−１）
NaCl                            40
Na2CO3                            10
200mlの蒸留水に溶解し、高圧蒸気殺菌法によって無菌化した。
【０５０４】
完全なGAM培地は溶液A( 800ml )と溶液B( 200ml )を混合して調製される。固形培地は寒天の追加（ 2% w/v ）によって調製される。
【０５０５】
増殖条件
解凍されたばかりの培養液（凍結したグリセロールを保存した（20% v/v、貯蔵物は−80℃で保存された））のグリセロールバイアルから微生物が、寒天プレートにおいて上述したグラント好アルカリ培地（GAM）上に接種（inoculation）ループを使用して接種(inoculate)され、2日以上、37℃で増殖させた。次に、１つのコロニーが、pH10で100mlのGAMを含む500mlの振盪フラスコに接種するために使用された。次に、このフラスコは、順調な増殖（目視観測より）が得られるまで１−２日間、２８０rpmでロータリーシェーカーの中で、３７℃でインキュベートされた。次にブロス培養が、５リットルのGAMを含む７Lの発酵槽に接種するために、引き続いて使用された。発酵は、プロテアーゼの最大生産量を得るために、２−３日間、37℃で実施された。約500rpmで回転する羽根車の部分へ、５L/minのペースで空気を吹き込むことを通じて、十分に好気状態が維持された。最初にｐH10に設定されたが、発酵の間に渡って制御されなかった。
【０５０６】
６９Ｂ４粗酵素サンプルの調製
培養液ブロスが発酵槽から集められ、細胞は、10℃、5000×ｇで30分間の遠心分離によって除去された。その結果得られた上清はサイツESK ( サイツシュンクフィルターシステムズ社製 )を通して深層濾過によって浄化された。その結果得られた無菌培養液の上清は、10kDa カットオフ（ポールオメガ 10kDa ミニセット；ポール社製）を備えた限外濾過カセットを使用した限外濾過によって、さらにおよそ10倍に濃縮された。結果として得られた濃縮粗６９Ｂ４サンプルは氷結され、さらなる使用まで−20℃で保存された。
【０５０７】
精製
培養液ブロスから分離された細胞は、８K分子量カットオフ（MWCO）スペクトラ−Por７(スペクトラム)透析チュービングを使用して、pH 5.4、1mM CaCl220mM(2-(4-モルホリノ)-エタンスルフォン酸（「MES」）に対して透析された。透析は一晩またはサンプルの伝導率がMESバッファの伝導率と等しいまたはより小さくなるまで行われた。透析された酵素サンプルは、10×100mm（7.845mL）ポロス高密度スルフォ−プロピル（HS）20 (20ミクロン) 陽イオン交換カラム（パーセプティヴ  バイオシステムズ社製）を備えたバイオキャド・ビジョン（バイオシステムズ社出願）を使用して精製された。5mL/minに予め設定されたカラムへの酵素の充填の後、カラムは25カラム容積において、25mM MES、pH6.2、1mM CaCl2から25mM(N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N’-[2-エタン]硫酸[C8H18N2O4S、CAS # 7365-45-9])(「HEPES」)、pH8.0、1mM CaCl2までのpH勾配で、40mL/minで洗浄された。画分（8mL）は運転の間集められた。５カラムの容積について洗浄工程はPH 8.0が維持され、次に、酵素は勾配（35カラム容積における同じバッファにおいて0-100mM NaCl）を利用して溶出された。画分におけるプロテアーゼ活性はpNAアッセイ（sAAPF - pNA; デルマル他、前述）を使用してモニターされた。40mM NaClに溶出されたプロテアーゼ活性は、20mM MES、pH 5.8、1mM CaCl2まで濃縮され、バッファは交換された（5K MWCO VIVA サイエンス20mL濃縮器を使用して）。この材料は、酵素のさらなる性質決定に使用された。
【０５０８】
実施例  ３
セリンプロテアーゼ遺伝子断片のPCR増幅
この実施例において、セリンプロテアーゼ遺伝子断片のPCR増幅が説明される。
【０５０９】
プライマーデザインの変更
公開されたセリンプロテアーゼアミノ酸配列のアラインメントに基づいて、縮重プライマーが、保存された構造上の触媒的な領域に対して設計された。このような領域は、酵素構造および機能に関して重要性が知られているものだけでなく、セリンプロテアーゼの間で完全に保存されたものを含んでいた。
【０５１０】
本発明の発展の過程で、９つの公開されたセリンプロテアーゼ（ストレプトグリシンＣ相同体）が、下記のようにアラインされた。配列は、ストレプトマイセス・グリセウス・ストレプトグリシンC(受託番号P52320)、サーモビフィダ・フスカからのアルカリセリンプロテアーゼ前駆体（受託番号 AAC23545）、ストレプトマイセス種（受託番号PC2053）からのアルカリプロテイナーゼ（EC 3.4.21.-）、ストレプトマイセス種（受託番号S34672）からのアルカリセリンプロテイナーゼI、ストレプトマイセス・リビダンス（受託番号CAD4208）からのセリンプロテアーゼ、ストレプトマイセス・コエリコロル A3(2)（受託番号NP−625129）からの推定セリンプロテアーゼ、ストレプトマイセス・アベルミティリス MA-4680（受託番号NP−822175）からの推定セリンプロテアーゼ、
ストレプトマイセス・リビダンス（受託番号CAD42809）からのセリンプロテアーゼ、ストレプトマイセス・コエリコロル A3(2)（受託番号NP−628830）からの推定セリンプロテアーゼ前駆体であった。これらの配列の全てはGen Bankから公的に入手可能である。これらのアラインメントは、以下に提供される。このアラインメントにおいて、二つの保存ボックスに下線が引かれ、太字で示される。
【０５１１】
【表５】
2007515164.tif 000007
【０５１２】
【表６】
2007515164.tif 000008
【０５１３】
二つの特別な領域が上記の判定基準に合うように選択され、順方向および逆方向プライマーが、これらのアミノ酸領域に基づいて設計された。プライマーの設計に使われる特異的アミノ酸領域は、上記アラインメントで直接に示された配列において黒で強調されている。コドン使用頻度についての遺伝コードを使って、縮重ヌクレオチドプライマーがMWG-バイオテック社によって合成された。生成された縮重プライマー配列は、
【０５１４】
【表７】
2007515164.tif 000009
【０５１５】
全てのプライマーは５’から３’方向で合成され、混合塩基部位に対して標準IUBコードが使用された（例えば、A/C/T/Gに対して「N」と命名するために）。以下に説明するように、縮重プライマーTTGWXCGT−FWおよびGDSGGX−RVは、PCRによるセルロモナス 種．単離 69B4から177bp領域を成功裡に増幅した。
【０５１６】
セリンプロテアーゼ遺伝子断片のPCR 増幅
セルロモナス 種. 単離 69B4 ゲノムDNAは、上述したプライマーを使用して推定セリンプロテアーゼ遺伝子断片のPCR増幅のための鋳型として使用された。PCRはハイフィデリティプラチナTaqポリメラーゼを使用して実施された（目録番号11304-102；インビトロゲン社）。条件は個々の実験によって決定されたが、典型的には、30サイクルがサーマルサイクラーで行われた（MJリサーチ社）。成功的な増幅は、1%のアガロースでのPCR反応の電気泳動法によって検証された。プライマーTTGWXCGT−FWおよびGDSGGX−RVを用いてセルロモナス種. 69B4から増幅されたPCR生成物は、製造説明書に従ってキアクィックスピンゲル抽出キットを使用したゲル抽出によって精製された（目録番号28704；キアジェン社）。精製されたPCR生成物は、製造説明書に従って市販のｐCR２.1TOPOベクターシステム（インビトロゲン社製）にクローンされ、コンペテントE.コーリTOP10細胞に形質転換された。組み換えプラスミドを含むコロニーは青／白選択を使用して視覚化された。組み換え形質転換体の迅速なスクリーニングのために、プラスミドDNAが、推定陽性（すなわち白）コロニーの培養液から調製された。DNAはキアジェン社プラスミド精製キットを使用して分離され、ベースクリアによって配列決定された。177bpのDNA挿入断片を含むクローンの1つは、種々のストレプトマイセス種のいくつかのストレプトグリシンのようなプロテアーゼと、さらにまた、他の細菌種からのセリンプロテアーゼと幾つかの相同性を示した。この177bp断片の配列をコードするDNAおよびタンパク質は、図１３に示される。
【０５１７】
配列分析
配列は、BLASTおよびその他のタンパク質配列変換ツールによって分析された。ヌクレオチドレベルでのBLAST比較は、公表されたセリンプロテアーゼ配列と、様々なレベルで同一性を示した。当初、ヌクレオチド配列はBLASTに提出（submitted）された（ベーシックBLASTバージョン2.0 ）。選択されたプログラムは「Blast X」、および選択されたデータベースは「nr」であった。標準／初期（デフォルト）パラメータ値が採用された。推定セルロモナス69B4プロテアーゼ遺伝子断片に関する配列データは、本発明の配列をデータベースの既存のものと比較するために、BLASTに提出されたFASTAフォーマットおよびクエリーに入力された。その結果、177bp断片に関して、S.グリセウス、S.リビダンス、S.コエリコロル、S.アルボグリセオルス、S.プラテンシス、S.フラジアエおよびストレプトマイセス種を含む種々のストレプトマイセス種からプロテアーゼ遺伝子について多数のヒットをリターンした。セルロモナス種. 単離 69B4からクローン化された177bp断片の更なる分析が望まれると結論付けられた。
【０５１８】
実施例４
逆方向PCRによってセリンプロテアーゼをコードしているセルロモナス69B4のゲノムからのポリヌクレオチド配列の分離
この実施例において、セルロモナス種. 69B4によって生成されたセリンプロテアーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を分離するために行われる実験が説明される。
【０５１９】
セルロモナス系69B4プロテアーゼをコードしている遺伝子を分離するためのセルロモナス種. 69B4ゲノムDNAの逆方向PCR
逆方向PCRは、セルロモナス種. 69B4から完全長セリンプロテアーゼを分離およびクローン化するために使用される。実施例３において説明されたセルロモナスプロテアーゼ遺伝子の177bp断片のDNA配列に基づいて、新DNAプライマーが設計された。
【０５２０】
【表８】
2007515164.tif 000010
【０５２１】
セルロモナス種. 69B4の染色体DNAは、制限酵素Apal、BamHl、BssHll、Kpnl、Narl、Ncol、Nhel、Pvul、SallまたはSstllを用いて消化され、製造説明書に従って、キアゲン社製PCR精製キットを使用して精製され、およびT4 DNAリガーゼ（インビトロゲン社製）を使用して自己連結された。連結混合物はキアゲン社製PCR精製キットを使用して精製され、およびPCRは69b4int−RV1および69b4int−FW２プライマーを用いて実施された。DNA断片上のPCRはNcolで消化され、次に自己連結され、約1.3kbのPCR生成物となった。DNA配列分析（ベースクリア）は、このDNA配列がセルロモナスからのストレプトグリシン様プロテアーゼ遺伝子の主要な部分を包含することを明らかにした。このプロテアーゼは、「69B4プロテアーゼ」と命名され、および、セルロモナス69B4プロテアーゼをコードする遺伝子は「asp遺伝子」と命名された。asp遺伝子の全体配列は、69B40int−FW2プライマーおよびその他のプライマー：69B4−for4(5’AAC GGC GGG TTC ATC ACC GCC GGC CAC TGC GGC C37( 配列番号 16 ))を用いた追加的な逆方向PCR反応によって得られた。セルロモナス種. 69B4のゲノムDNAの断片を消化し、自己連結するNcol、BssHll、 ApalおよびPvul上のこれらのプライマーを有する逆方向PCRは、asp遺伝子の全体配列の同定をもたらす。
【０５２２】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列
便宜のために種々の配列は以下に含まれる。第一に、下記のasp遺伝子のDNA配列（配列番号１）が、シグナル・ペプチド（配列番号９）およびセルロモナス系69B4（DSM 16035）由来の前駆体セリンプロテアーゼ（配列番号７）をコードする。セルロモナス系69B4プロテアーゼのシグナル・ペプチドをコードする開始ヌクレオチドは太字である（ATG）。
【０５２３】
【表９】
2007515164.tif 000011
【０５２４】
以下のDNA配列（配列番号２）は、セルロモナス系69B4（DSM 16035）由来の前駆体プロテアーゼ（配列番号７）と操作可能に結びついたシグナル・ペプチド（配列番号９）をコードする。セルロモナス系69B4（DSM 16035）プロテアーゼのシグナル・ペプチドをコードする開始ヌクレオチドは太字である（ATG）。アスタリスクは、残基1486から始まる末端コドンを示す。残基85、595、および1162は、N末端プロ配列、成熟配列およびカルボキシル末端プロ配列に、それぞれ関係しており、太字で、下線が引かれている。
【０５２５】
【表１０】
2007515164.tif 000012
【０５２６】
以下のDNA配列（配列番号３）は、セルロモナス系69B4（DSM 16035）由来の前駆体プロテアーゼをコードする。
【０５２７】
【表１１】
2007515164.tif 000013
【０５２８】
以下のDNA配列（配列番号４）は、セルロモナス系69B4（DSM 16035）由来の成熟プロテアーゼをコードする。
【０５２９】
【表１２】
2007515164.tif 000014
【０５３０】
以下のDNA配列（配列番号５）は、セルロモナス系69B4（DSM 16035）由来のシグナル・ペプチドをコードする。
【０５３１】
【表１３】
2007515164.tif 000015
【０５３２】
以下の配列は、セルロモナス系69B4（DSM 16035）由来の前駆体プロテアーゼおよびシグナル配列のアミノ酸配列（配列番号６）であり、次の配列を含む。すなわち、配列番号１、２、３および４に記載のDNA配列によってコードされた、シグナル配列[セグメント 1a-c ]（ 残基1-28 [-198から-171]）、N末端プロ配列 [セグメント 2a-r ]（ 残基29-198 [-170から-1]）、成熟プロテアーゼ [セグメント 3a-t ]（ 残基199-387 [1から-189]）、およびC末端プロ配列 [セグメント 4a-c ]（ 残基388-495 ）である。成熟プロテアーゼアミノ酸配列のN末端配列は太字である。
【０５３３】
【表１４】
2007515164.tif 000016
【０５３４】
以下の配列（配列番号７）は、セルロモナス系69B4（DSM 16035）由来の前駆体プロテアーゼのアミノ酸配列である（配列番号７）。
【０５３５】
【表１５】
2007515164.tif 000017
【０５３６】
以下の配列（配列番号８）は、セルロモナス系69B4（DSM 16035）由来の成熟プロテアーゼのアミノ酸配列である。触媒のトリアッド残基H32、D56およびS132は太字であり、下線が引かれている。
【０５３７】
【表１６】
2007515164.tif 000018
【０５３８】
以下の配列（配列番号９）は、セルロモナス系69B4（DSM 16035）由来のプロテアーゼのシングル・ペプチドのアミノ酸配列である。
【０５３９】
【表１７】
2007515164.tif 000019
【０５４０】
以下の配列（配列番号10）は、セルロモナス系69B4のプロテアーゼの177bp断片を同定するために使用された縮重プライマーである。
【０５４１】
【表１８】
2007515164.tif 000020
【０５４２】
以下の配列（配列番号11）は、セルロモナス系69B4由来のプロテアーゼの177bp断片を同定するために使用された逆方向プライマーである。
【０５４３】
【表１９】
2007515164.tif 000021
【０５４４】
以下のDNA（配列番号13）は、セルロモナス系69B4由来のプロテアーゼ遺伝子の一部をコードする177bp断片のアミノ酸配列（配列番号１２）である。縮重プライマーの配列（配列番号NOS：10および11）は、下線が引かれ、太字である。
【０５４５】
【表２０】
2007515164.tif 000022
【０５４６】
セルロモナス種.69B4プロテアーゼの配列分析
1:1 v/vアセトニトリル（「ACN」）/ 0.1％ギ酸溶液で、飽和シナピン酸（3，5−ジメトキン−４−ヒドロキシ桂皮酸）（「SA」）溶液が調製された。得られた混合物は60秒間ボルテックスされ、次に14,000rpmで20秒間遠心分離機にかけられた。次に、５μlのマトリクスの上清が0.5ｍlのエッペンドルフ管に移され、1μlの10pmole/μlプロテアーゼ69B4 サンプルがSAマトリクス上清に加えられ、そして5分秒間ボルテックスされた。次に1μlの検体／マトリクス溶液がサンプルプレートに移され、完全に乾燥した後に、ボイジャーDE-STR (パーセプティヴ社製)、以下の設定を用いたマトリクス支援レーザー脱離イオン化（MALDI-TOF）質量分析法によって分析された。運転モード：直線、抽出モード：遅延、極性：陽性、加速電圧：25000V、抽出遅延時間：350 nsec、取得質量範囲：4000-20000 Da、レーザー発射数：100/スペクトル、およびレーザー強度：2351。この結果得られたスペクトルは図４に示される。
【０５４７】
典型的なマップが、本発明で説明されたように改変された技術的に既知の方法（クリスチャンソン他、Anal．Biohem．223：119-29[1994年]）を使用して作成された。
10-50μlのプロテアーゼを含むプロテアーゼ溶液は、1.5mlのマイクロチューブ内の冷水を用いて１：１に希釈された。1.0のN HClが0.1 N HClの終末濃度になるまで加えられ、完全に混合され、氷上で10分間培養された。次に、50%のトリクロロ酢酸（「TCA」）が10%TCAの終末濃度まで加えられ、混合された。サンプルは氷上で10分間培養され、2分間遠心分離機にかけられ、上清は廃棄された。次に、1mlの90%冷アセトンが、再懸濁したペレットに加えられた。その結果得られたサンプルは、次に1分間遠心分離機にかけられ、上清は迅速に移され、残った液体は真空吸引によって除去された。乾燥ペレットは0.65mlのアンモニウム重炭酸塩溶液（重炭酸塩の終末濃度：0.5M）内の12μlの8.0M尿素溶液（480mg尿素[ロシュ社製、目録 #1685899 ]）に溶解され、そして37℃で3-5分間培養された。溶液は、48μlのn-オクチル-ベータ‐D-グルコピラノシド溶液（「ｏ-water」）(200mlの水中に200mgのn-オクチル-ベータ‐D-グルコピラノシド[C14H28O6、f.w. 292.4])を用いてゆっくりと希釈された。次に、2.0μlのトリプシン（1mM HCl中に2.5mg/ml）が加えられ、混合物は37℃で15分間培養された。蛋白質分解反応は6μlの10%のトリフルオロ酢酸（「TFA」）を用いて停止された。不溶性物質および気泡が、1分間の遠心分離によってサンプルから除去された。トリプシン消化物が2.1×150mmC-18カラムのRP-HPLC（5μl粒子サイズ、300オングストローム細孔サイズ）によって分離された。溶離グラディエントが、水中の0.1%（v/v）TFAおよび流速0.2ml-minのアセトニトリル中の0.08%（v/v）TFAから形成された。カラム分画は50℃まで加熱された。ペプチド溶離は215nmでモニターされ、データは215nmおよび280nmで集められた。サンプルは次に、サーベイヤーHPLCを備えたLCQアドバンテージ質量分光器（両方ともテルモ・フィニガン社製）によって分析された。LCQ質量分光器は次の設定で操作された：スプレー電圧：4.5kV、毛細管温度：225℃。データ加工は、ターボSEQUESTおよびXcalibur(テルモ・フィニガン社製)を使用して行なわれた。典型的な消化部分の配列は、アルゴ・バイオアナリティカ社によっても部分的に行なわれた。
【０５４８】
完全なasp遺伝子配列の分析は、それが495アミノ酸（配列番号６）のプロ配列プロテアーゼをコードすることを明らかにした。最初の28アミノ酸はシグナル・ペプチドを形成することが予想された。セルロモナス系69B4によって形成された場合、69B4プロテアーゼの成熟鎖の質量は18764の分子重量を有す（MALDI-TOFによって計測された）。成熟鎖のN-末端の配列もMALDI-TOF分析で計測され、FDVIGGNAYTIGGR(配列番号17)の配列で始まる。69B4プロテアーゼは、いくつかの他の酵素を用いて生じることが知られている。NH2-およびCOOH末端プロ配列を備えた独特の前駆体構造を有すると考えられている(例えば、T.アクアチクスアクアリシン l、例えば、リー他、FEMS Microbiol.Lett.、1:69-74[1994年]；坂本（Sakamoto）他、Biosci.Biotechnol.Biochem、59：1438-1443 [1995年]；坂本他、Appl. Microbiol. Biotechnol、45:94-101[1996年]；キム他、Biochem. Biophys. Res. Commun, 231:535-539 [1997年]；およびOledzka他、Protein. Expr. Purific.、29:223-229[2003年]を参照されたい)。配列番号８において示されたように、成熟69B4プロテアーゼの予想粒子重量は18776.42であり、それはセルロモナス種.69B4(すなわち18764)から分離された蛋白質分解活性を有する精製した酵素の粒子重量に明確に一致した。
69B4プロテアーゼにおけるCOOHの末端プロ配列の予測はまた、以下に提供されるT.アクアチクスアクアリシン lを有する69B4プロテアーゼのアラインメントにも基づいていた。このアラインメントにおいてセルロモナス69B4シグナル配列のアミノ酸配列および前駆体プロテアーゼは、シグナル配列およびサーマス・アクアチクス社製の前駆体プロテアーゼアクアリシン lとアラインされる（アクアリシン lのCOOH-末端プロ配列は下線を引かれ、太字である。
【０５４９】
【表２１】
2007515164.tif 000023
【０５５０】
蛋白質分解活性を有するセルロモナス種.69B4からの精製酵素の３つの内部ペプチドの配列は、MALDI-TOF分析によって決定された。3つ全てのペプチドは、正しいプロテアーゼ遺伝子の同定を確認する分離されたaps遺伝子の翻訳生成物においても同定された。
【０５５１】
Aspおよびストレプトグリシン
Asp遺伝子（成熟鎖）の推定ポリペプチド生成物は、実施例３で説明したように設定したBLASTプログラムを用いた他のセリンプロテアーゼとの相同分析に使用された。予備的な分析は約44‐48%からの同一性を示した（以下の表4−1を参照）。翻訳配列分析とともに、これらの結果は、asp遺伝子がストレプトグリシン的なセリンプロテアーゼの成熟鎖と50%以下の配列同一性を有すプロテアーゼをコードすることの証拠を提供した。ストレプトマイセス・グリセウスのストレプトグリシン A、ストレプトグリシン B、ストレプトグリシン C、ストレプトグリシン Dを有するaspのアラインメントは、以下に示される。このアラインメントにおいて、セルロモナス69B4成熟プロテアーゼ（「69B4成熟」）のアミノ酸配列は、ストレプトグリシン C(“Sq‐ストレプトグリシンC‐成熟”）、ストレプトグリシン B(“Sq‐ストレプトグリシンB成熟”)、ストレプトグリシン A(“Sq‐ストレプトグリシンA成熟”)、ストレプトグリシン D(“Sq‐ストレプトグリシンD成熟”)およびコンセンサス残基の成熟プロテアーゼアミノ酸配列とアラインされる。
【０５５２】
【表２２】
2007515164.tif 000024
【０５５３】
【表２３】
2007515164.tif 000025
【０５５４】
追加的なプロテアーゼ配列も調べられた。これらの分析において、ASPの成熟領域のタンパク質配列におけるプロテアーゼ相同性が、BLASTを使用して検索された。同定されたこれらは、次にマルティプル・シークエンス・アラインメント・プログラム、クラスタIWを使用してアラインされた。以下のアラインメントの最初の行の数は、成熟ASPプロテアーゼのアミノ酸配列を参照する。アラインメントの側面の数はアラインメントの下端で記述されているように配列確認番号（identifiers）である。
【０５５５】
【表２４】
2007515164.tif 000026
【０５５６】
【表２５】
2007515164.tif 000027
【０５５７】
上記の収載において、番号は以下のように対応する。
１    ASP  プロテアーゼ
２    ストレプトグリシン A（ストレプトマイセス・グリセウス）
３    グルタミル・エンドペプチダーゼ（ストレプトマイセス・フラディアエ）
４    ストレプトグリシン B（ストレプトマイセス・リビダンス）
５    SAM-P20（ストレプトマイセス・コエリカラー）
６    SAM-P20（ストレプトマイセス・アルボグリセオルス）
７    ストレプトグリシン B（ストレプトマイセス・グリセウス）
８    グルタミル・エンドペプチダーゼll（ストレプトマイセス・グリセウス）  
９    グルタミル・エンドペプチダーゼll（ストレプトマイセス・フラディアエ）
１０  ストレプトグリシン D（ストレプトマイセス・アルボグリセオルス）
１１  ストレプトグリシン D（ストレプトマイセス・コエリカラー）
１２  ストレプトグリシン D（ストレプトマイセス・グリセウス）
１３  サブファミリー S1E 未同定ペプチターゼ（SalOタンパク）（ストレプトマイセス・リビダンス）
１４  サブファミリー S1E 未同定ペプチターゼ（SALOタンパク）（ストレプトマイセス・コエリカラー）
１５  ストレプトグリシン D（ストレプトマイセス・プラテンシス）
１６  サブファミリー S1E 未同定ペプチターゼ（3SC5B7.10タンパク）（ストレプトマイセス・コエリカラー）  
１７  CHY1プロテアーゼ（メタルリジウム・アニソプリアエ）
１８  ストレプトグリシン Ｃ（ストレプトマイセス・グリセウス）  
１９  ストレプトグリシン Ｃ（SCD40A.16cタンパク）（ストレプトマイセス・コエリカラー）
２０  サブファミリー S1E 未同定ペプチターゼ(1)（ストレプトマイセス種）
２１  サブファミリー S1E 未同定ペプチターゼ(ll) （ストレプトマイセス種）
２２  サブファミリー S1E 未同定ペプチターゼ（SCF43A.19タンパク）（ストレプトマイセス・コエリカラー）
２３  サブファミリー S1E 未同定ペプチターゼ（サーモビフィダ・フスカ；バイオニム・サーモモノスポラ・フスカ）
２４  アルファ-溶解エンドペプチダーゼ（リゾバクター・エンジモゲネス）
２５  サブファミリー S1E 未同定ペプチターゼ（SC10G8.13Cタンパク）（ストレプトマイセス・コエリカラー）
２６  イースト-溶解エンドペプチダーゼ（ラロバクター・アシタビドゥス）
２７  サブファミリー S1E 未同定ペプチターゼ（SC10A5.18タンパク）（ストレプトマイセス・コエリカラー）
【０５５８】
実施例５
ＰＣＲによる69B4プロテアーゼの新相同体のスクリーニング
この実施例において、69B4プロテアーゼの新相同体のスクリーニングのために使用された方法が説明される。小球菌亜目の細菌系、具体的には、セルロモナダシアエ科およびプロミクロモノスポラシアエからのものは、ドイツの培養細胞保存機関DSMZ ( Braunschweig) からオーダーされ、凍結乾燥した培養物の形で入手された。追加的な菌株は、ベルギー微生物保存機関、BCCM（商標）／LMG(ゲント大学)から入手された。凍結乾燥したアンプルはDSMZの取扱説明書に従って開封され、材料は1時間かけて無菌生理食塩水（1.5ml）を用いて再水和した。十分に混合された、再水和された細胞懸濁液（300μl）が、続くPCRのために無菌エッペンドルフ管に移された。
【０５５９】
PCR法
i）サンプルの前処理
最水和された微生物細胞懸濁液が、10分間加熱された水槽に入れられた。次に、細胞細片および残った細胞、PCR反応のための鋳型とされた透明な上清部分を除去するために、懸濁液は5分間16000rpmで遠心分離機にかけられた（シグマ社製１-15遠心分離機）。
【０５６０】
ii）PCR試験条件
これらの細菌型（放線菌：actinobacteria）は、特徴として高度にGCリッチ(典型的に＞55 mol％)であり、故に、DMSOの追加は必須である。セルロモナス種株69B4を用いた以前の取り組みに基づく選択された濃度は、4% v/v DMSOであった。
【０５６１】
iii）PCRプライマー（以下の組合せから選択された）
【０５６２】
【表２６】
2007515164.tif 000028
【０５６３】
iv）PCR混合物（全材料はインビトロゲン社から供給された）
鋳型DNA                      ４μl
10×PCRバッファ              ５μl
50mM  MgSO4                  ２μl
10mM  dNTP’s                 １μl
プライマー（10μl soln）         各1μl
白金Taqハイファイポリメラーゼ  0.5μl
DMSO                            ２μl
MilliQ水                        33.5μl
【０５６４】
v）PCRプロトコル
１）94℃        5秒
２）94℃        30秒
３）55℃        30秒
４）68℃        3分
５）繰り返し工程  29サイクルに対して２−４回反復
６）68℃        10分
７）15℃        1分
【０５６５】
増幅したPCR生成物は、アガロースゲル電気泳動法によって検査される。各生体物に対する異なったバンドはゲルから切除され、キアゲンゲル抽出キットを使用して精製され、そして同種のプライマー結合を使用したベースクリアーによって配列決定された。
【０５６６】
vi）配列分析
ヌクレオチド配列データが分析され、およびD69B4‐成熟タンパクの相同体をレビューするために、DNA配列がアミノ酸配列に翻訳された。配列アラインメントは、ベクターNTIスイート9.0.0のコンポーネントであるAlignXを使用して行なわれた。結果は、表5−1にまとめられた。番号を付けは配列番号８で用いられる。
【０５６７】
【表２７】
2007515164.tif 000029
【０５６８】
これらの結果は、69B4プロテアーゼ遺伝子（成熟鎖）、配列番号４のポリヌクレオチド配列に基づくPCRプライマーは、ミクロコシネアエ亜目および特にセルロモナダシアエ科およびプロミクロモノスポラシアエの細菌の菌株における相同遺伝子の検出に成功していることを示す。
【０５６９】
図２はASPプロテアーゼの系統発生系図を示す。このプロテアーゼの系統発生は、タンパク質のキモトリプシンスーパーファミリーの同種の構成種の成熟配列からの多様なアプローチによって検査され、顕著な成熟配列であるASPホモログが推定された。技術的に既知であるタンパク質距離法（例えば、木村、『分子進化の中立説』（The Neutral Theory of Molecular Evolution）、ケンンブリッジ大学出版、ケンブリッジ、UK[1983年]を参照されたい）を使用して、同種の系図が、ギャップを含めてもまたは除外しても得られた。図２の系統発生系図（phylogenetic tree）は、TREECONW v.1.3b(Van de Peer and De Wachter、Comput. Appl. Biosci.、10:569−570[1994年])を使用し、アラインされた配列からネイバージョイングアルゴリズム（Saitou and Nei、Mol.Bio.Evol.、4:406-425[1987年]）によりinferされたtree topologを用いて作成された。この系図(this tree)に示されているように、データは、相同的なプロテアーゼ（「cellulomonadaceae」）のAPS系列はタンパク質の分離したサブファミリーを形成することを示す。図２において、括弧内に示された数字は、本発明で提供された配列に対応する。
【０５７０】
以下は、セルロモナス69B4 ASPプロテアーゼおよび本発明で説明した関連した属の相同的なプロテアーゼとの間のアラインメントである。
【０５７１】
【表２８】
2007515164.tif 000030
【０５７２】
【表２９】
2007515164.tif 000031
【０５７３】
【表３０】
2007515164.tif 000032
【０５７４】
実施例  ６
免疫ブロットによる69B4プロテアーゼの新相同体の検出
この実施例において、69B4の相同体を検出するために用いられた免疫ブロット実験が説明される。以下の生物体がこれらの実験において使用された。
【０５７５】
１．セルロモナス・ビアゾテア DSM 20112
２．セルロモナス・フラビゲナ DSM 20109
３．セルロモナス・フィミ DSM 20113
４．セルロモナス・ラシア DSM 20118
５．セルロモナス・ウダ DSM 20107
６．セルロモナス・ゲリダ DSM 20111
７．セルロモナス・キシラニリティカ DSM 21723
８．セルロモナス・イラネンシス DSM 14785
９．エルスコビア・ジェネシス DSM 46000
10．エルスコビア・トウルバタ DMS 20577
11．セルロシミクロビウム・セルランス DMS 20424
12．キシラニバクテリウム・ウルミ LMG21721
13．イソプラリコラ・バリアビリス DSM 10177
14．キシラニミクロビウム・パクノダエ DMS 12657
15．プロミクロモノスポラ・シトエア DMS 43110
16．プロミクロモノスポラ・スクモエ DMS 44121
17．アグロマイセス・ラモスス DMS 43045
【０５７６】
菌株は、菌株の純度、スキムミルクの除去によるプロテアーゼ反応を確認し、および種菌として機能するために、ハートインフュージョン／スキムミルク寒天板の上で（72時間、30℃）、最初に培養された。細菌菌株は、30℃で5日間にわたり230rpmで、バッフル付の100/500エルレンマイヤーフラスコ内のカゼイン（0.8% w/v）が補充されたブレインハートインフュージョンブロス上で培養された。微生物増殖はマイクロスコープで点検された。30分間、4766×gでの遠心分離によって、上清が細胞から分離された。さらに固形物が9500rpmでの遠心分離によって除去された。上清は、カットオフ10ｋDanoビバスピン20ml濃縮器（ビバサイエンス）を使用し、4000×gでの遠心分離によって濃縮された。濃縮物は−20℃で0.5mLのアリコートにおいて保存された。
【０５７７】
一次抗体
ユーロゲンテック（リージュ・サイエンス・パーク社、Seraing、Belgiuum）によって調製された免疫ブロット法に対する一次抗体（EPO 034323）は、69B4成熟プロテアーゼ（配列番号８）におけるアミノ酸151−164および178−189を含む２つのペプチドに対して産生された。２つのペプチドとはすなわち、以下に示したように、69B4成熟細胞のアミノ酸配列における、TSGGSGNCRTGGTT(エピトープ１、配列番号５１)およびLRMITTDSGSSP(エピトープ２、配列番号５２)である。
【０５７８】
【表３１】
2007515164.tif 000033
【０５７９】
電気泳動法および免疫ブロット法
サンプル調製
１．   濃縮培養液上清（５０μl ）
２．   PMSF (１μL；２０mg/ml )
３．   1M HCl ( ２５μL )
４．   Nu PAGE LDSサンプルバッファ（２５μL ）（インビトロゲン社製、カールスバド、カリフォルニア、米国）
混合され、１０分間、９０℃に加熱された。
【０５８０】
電気泳動法
SDS-PAGEが、５分間にわたり100Vでバッファを作動するMES-SDSを備えたNuPAGE 10% Bis-Tris ゲル（インビトロゲン）を使用し、繰り返して行なわれた。可能であれば、25μLのサンプルが各スロットに装着された。各組みの一つのゲルがクマシーブルーに染色され、その他のゲルは、ベーリンガーマンハイム発色ウエスタンブロットプロトコル（ロシュ社製）を使用した免疫ブロットに使われた。
【０５８１】
免疫ブロット法
使用されたトランスファーバッファは、トランスファー・バッファ：トリス（0.25M）−グリシン（1.92M）−メタノール（20% v/v）である。PVDFメンブランが、メタノール、脱イオン水、および最後にトランスファーバッファにおける連続的な湿潤によって予め湿らされた。
【０５８２】
PAGEゲルは、脱イオン水の中で簡単に洗浄され、トランスファーバッファに浸されたブロッターに移され、予め湿らされたPVDFメンブランおよび予め浸されたブロッターを用いてカバーされた。ブロットは、トランスファーバッファにおいて、2時間半から3時間、400ｍAに一定にされて行なわれた。メンブランは、トリスバッファ生理食塩水（TBS）（0.5Mトリス、0.15M NaCl、pH7.5）の中で簡単に洗浄された（２×）。非特異的抗体結合は、一晩4℃でマレイン酸溶液（100mMのマレイン酸、150ｍM のNaCl、pH7.5）における1% v/vマウス／ラビットブロッキング試薬（ロシュ社製）でメンブランをインキュベートすることによって、防止された。
【０５８３】
これらの反応で使用された一次抗体は、1:1000で希釈されたEP034323であった。反応は、30分間の反応時間で１％のブロッキング溶液に希釈された抗体を用いて行なわれた。メンブランは、TBST (TBS＋0.1% v/v Tween 20)において4×10分ほど洗浄された。
二次抗体は、30分の反応時間を伴う1%ブロッキング溶液20ｍｌにおける抗マウス／抗ラビットlgG（ロシュ社製）73μLから構成された。メンブランはTBSTにおいて、4×15分間洗浄され、基質反応（アルカリ性フォスファターゼ）は、染色が生じるまで、BM発色ウエスタンブロット試薬（ロシュ社製）を用いて行なった。
一次ポリクローナル抗体を用いた交差反応の結果は、表６−１に示される。
【０５８４】
【表３２】
2007515164.tif 000034
【０５８５】
これらの結果に基づいて、これらの実験に用いられた抗体は、69B4プロテアーゼへのアミノ酸配列同一性の極めて高いパーセンテージを有する検出した相同体において顕著に特異的であることが明らかである。さらに、これらの結果は、69B4成熟プロテアーゼ鎖のC末端部分が、特に２‐ペプチドエピトープ領域において、極めて可変的であることを示している。これらの実験において、この領域に二つ以上のアミノ酸の相違がある場合、陰性のウエスタンブロット反応が引き起こされることが解る。
【０５８６】
実施例７
逆方向PCRおよびゲノムウォーキング
この実施例において、APSのポリヌクレオチド配列を明らかにするために行なわれた実験が説明される。これらの実験で利用された微生物は、
１．   セルロモナス・ビアゾテア DSM 20112
２．   セルロモナス・フラビゲナ DSM 20109
３．   セルロモナス・フィミ DSM 20113
４．   セルロモナス・セラシア DSM 20118
５．   セルロモナス・ゲリダ DSM 20111
６．   セルロモナス・イラネンシス DSM 14785
７．   エルスコビア・ジェネシス DSM 46000
８．   エルスコビア・トウルバタ DMS 20577
９．   セルロシミクロビウム・セルランス DMS 20424
１０．プロミクロモノスポラ・シトエア DMS 43110
１１．プロミクロモノスポラ・スクモエ DMS 44121
【０５８７】
これらの細菌の菌株は、2日間、30℃で、230rpmでバッフル付の100/500エルレンマイヤーフラスコにおけるブレインハートインフュージョンブロスまたはトライプトンソーヤブロス上で培養された。細胞は、4766×ｇで30分間の遠心分離によって培養ブロスから分離された。
【０５８８】
染色体DNAは、リゾチーム／EDTA（例えば、サムブルーク他、前述参照されたい）によって消化された細胞から、技術的に既知の標準フェノール／クロロフォルム抽出法によって得られた。染色体DNAは、以下のリストから選択された制限酵素を用いて消化された。すなわち、Apal、BamHl、BssHll、Kpnl、Narl、Ncol、Nhel、Pvul、SallまたはSstllである。
【０５８９】
これらの生物体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下に示される。これらのリストにおいて、成熟プロテアーゼは太字で示されシグナル配列は下線が引かれている。
【０５９０】
【表３３】
2007515164.tif 000035
【０５９１】
【表３４】
2007515164.tif 000036
【０５９２】
【表３５】
2007515164.tif 000037
【０５９３】
【表３６】
2007515164.tif 000038
【０５９４】
【表３７】
2007515164.tif 000039
【０５９５】
【表３８】
2007515164.tif 000040
【０５９６】
【表３９】
2007515164.tif 000041
【０５９７】
【表４０】
2007515164.tif 000042
【０５９８】
【表４１】
2007515164.tif 000043
【０５９９】
【表４２】
2007515164.tif 000044
【０６００】
【表４３】
2007515164.tif 000045
【０６０１】
【表４４】
2007515164.tif 000046
【０６０２】
【表４５】
2007515164.tif 000047
【０６０３】
【表４６】
2007515164.tif 000048
【０６０４】
【表４７】
2007515164.tif 000049
【０６０５】
【表４８】
2007515164.tif 000050
【０６０６】
【表４９】
2007515164.tif 000051
【０６０７】
【表５０】
2007515164.tif 000052
【０６０８】
【表５１】
2007515164.tif 000053
【０６０９】
【表５２】
2007515164.tif 000054
【０６１０】
【表５３】
2007515164.tif 000055
【０６１１】
【表５４】
2007515164.tif 000056
【０６１２】
【表５５】
2007515164.tif 000057
【０６１３】
【表５６】
2007515164.tif 000058
【０６１４】
【表５７】
2007515164.tif 000059
【０６１５】
【表５８】
2007515164.tif 000060
【０６１６】
【表５９】
2007515164.tif 000061
【０６１７】
【表６０】
2007515164.tif 000062
【０６１８】
逆PCR
逆PCRは、PCRにより示されるサブオーダー、ミクロコシネア（Micrococcineae）細菌の菌株の染色体DNAから得られる完全長のセリーンプロテアーゼ遺伝子を決定するため、又は本明細書に記載されている新しいセルロモナス(Cellulomonas)種６９B4の新しい相同体を免疫ブロットするのに用いられた。
【０６１９】
消化されたDNAはPCR精製キット(Qiagen, Catalogue # 28106)を用いて精製され、製造者(Invitrogen)の指示に従いT4 DNAリガーゼにより自己結紮された。結紮のための混合物はPCR精製キット(Qiagen)により精製され、PCRは以下のリストから選択されるプライマにより実行された。
【０６２０】
【表６１】
2007515164.tif 000063
【０６２１】
増幅されたPCR製品はアガロースゲルによる電気泳動（TBE緩衝液(Invitrogen)中0.8％アガロース）により確かめられた。各有機体中明らかに1.3−2.2kbpの範囲帯にあるものはゲルから切除され、Qiagenゲル採取キットを用いて精製され、配列がBaseClearにより分析された。配列分析の結果、これ等のDNA断片はセルロモナス(Cellulomonas)種６９B4プロテアーゼ遺伝子に相同のプロテアーゼ遺伝子の幾つかの追加部分をカバーするものであることが明らかとなった。
【０６２２】
ゲノム末端の急速増幅を用いる遺伝子ウオーキング法
（Genome Walking Using Rapid Amplifiation of Genomic Ends(RAGE)）
その技術分野で知られているゲノムウオーキング法（Genome Walking methology）(RAGE)が、PCRにより示されるサブオーダ、ミクロコシネア（Micrococcineae）細菌の菌株の染色体DNAから得られる完全長のセリーンプロテアーゼ遺伝子の決定、又はセルロモナス(Cellulomonas)種６９B4プロテアーゼの新しい相同物を免疫ブロットするのに用いられた。RAGEは、Universal GenomeWalker (商標) Kit (BD Biosciences Clontech)を用い、製造者の手順に幾らかの変更を加え(BD Biosciences ユーザマニュアル PT3042-1, Version # PR03300)実施した。製造者の手順の変更には、テンプレートDNAのGC容量が高いため全50μL容量中の反応混合物にDMSO(3μL)を加え、そして、PCR反応にAdvantage (商標)−GC Genomic Polymerase Mix (BD Biosciences Clontech)を用いたことを含み、以下の手順により実施した。
【０６２３】
ＰＣＲ１      ＰＣＲ２
９９℃−０．０５秒
９４℃−０．２５秒／７２℃−３．００分      ７サイクル    ４サイクル
９４℃−０．２５秒／６７℃−４．００分    ３９サイクル  ２４サイクル
６７℃−７．００分
１５℃−１．００分
（PCR 1及び PCR 2 の各数値を入れる）
【０６２４】
ＰＣＲは、以下のリストから選択されるプライマー（インビトロジェン社、ペイスリー、英国）を用いて行った（５’から３’の方向にリストした）。
【０６２５】
【表６２】
2007515164.tif 000064
【０６２６】
PCR製品はpCR4-TOPO TA クローンベクター (Invitrogen)にサブクローンされ、大腸菌Top10  ワンショット  電気的に有能な細胞（electrocompetent cell）(Invitrogen) に形質転換された。形質転換細胞は、100μg/mlのアンピシリンを含む２ｘTY培養体中で培養された（37℃、260 rpm, 16 時間）。分離されたプラスミドDNA(Qiagen Qiaprep pDNA分離キットを用いて分離) BaseClearを用いて配列が決められた。
【０６２７】
配列分析
完全長のポリヌクレオチド配列が、実施例４で得られた元のポリヌクレオチド配列をテンプレートとして、及びASP成熟プロテアーゼ、及びアラインメントのためにASP完全長の配列を用いて、CotingExpress 及びVector NTI suite v. 9.0. 0 (Invitrogen)のAlignX を使用してPCT断片配列から組立てられた。ポリヌクレオチド配列の結果は表７−１に示し、翻訳されたアミノ酸配列は表７−２に示す。自然の細菌の菌株のおのおのについて、ポリヌクレオチド配列及び相同プロテアーゼのおのおのの翻訳アミノ酸配列は上に記した通りである。
【０６２８】
表７−１は、ASPプロテアーゼと他の細菌株より得られる他の種々の配列に関する比較情報を提供する。ASP成熟プロテアーゼ相同体に関するアミノ酸配列情報は以下の１３種より得られる。
【０６２９】
セルロモナス ビアゾテア(Cellulomonas biazotea) DSM 20112 
セルロモナス  フラビゲナ(Cellulomonas flavigena) DSM 20109 
セルロモナス  フィミ(Cellulomonas fimi) DSM 20113 
セルロモナス  セラシ (Cellulomonas cellasea) DSM 20118 
セルロモナス  ゲリダ (Cellulomonas gelida) DSM 20111 
セルロモナス  イラネンシス (Cellulomonas iranensis) DSM 14784 
セルロモナス  キラニリチカ (Cellulomonas xylanilytica) LMG 21723 
エルスコビア  ジェネンシス  (Oerskovia jenensis) DSM 46000 
エルスコビア  ツルバタ(Oerskovia turbata) DSM 20577 
エルスコビア  ツルバタ(Oerskovia turbata) DSM 20577 
セルロシミクロビウム  セルランス (Cellulosimicrobium cellulans) DSM 20424 
プロミクロモノスポラ  シトリア (Promicromonospora citrea) DSM 43110 
プロミクロモノスポラ  スクモ (Promicromonospora sukumoe) DSM 44121 
キラニバクテリウム  ウルミ(Xylanibacterium ulmi) LMG21721
【０６３０】
注目すべきことは、48番目のアミノ酸配列のセルロモナス  ゲリダ (Cellulomonas gelida)の配列は有用なコンセンサスアラインメントには短すぎることである。残りの12種のAsp成熟プロテアーゼに対する配列アラインメントは本明細書に記載されている。これまでのところ完全な成熟配列はエルスコビア  ツルバタ(Oerskovia turbata)、セルロモナス  セラシ (Cellulomonas cellasea)、セルロモナス ビアゾテア(Cellulomonas biazotea)及びセルロシミクロビウム  セルランス (Cellulosimicrobium cellulans)について決定されている。しかしながら、いくつかの問題があり、一般に知らされている配列情報の正確性は保証されているわけではなく、セルロモナス  セラシ (Cellulomonas cellasea)プロテアーゼは明らかにAspと相同である（61.4％同一）。
【０６３１】
しかし、C末端領域の10の独立PCR断片の配列は全て184の位置でストップコドンを持ち、これはC末端のプロ配列がないことを示唆している。さらに、セルロシミクロビウム  セルランス (Cellulosimicrobium cellulans)はセルロモナス  (Cellulomonas)に極めて近い関係にあり、明らかにAsp相同プロテアーゼを持っている。しかしながら、配列の同一性は低く47.7％にすぎない。それは43及び44の位置で４アミノ酸が挿入されており、タンパク質のN末端が何処から始まっているか明らかでない。しかし、データから見ると本明細書に記載のAspプロテアーゼに相同の酵素があることを明らかである。したがって、本発明は他の相同プロテアーゼと共にセルロモナス  (Cellulomonas)  株６９B4から分離されたAspプロテアーゼを含むものと考える。
この表では、ヌクレオチド番号は６９B4プロテアーゼ（配列番号２）の完全長遺伝子に基づくものであり、nt 1-84 はシグナルペプチドを、 nt 85-594  はN-末端プロ配列を、 nt 595-1161は成熟６９B4プロテアーゼを、そして nt 1162-1485はC-末端プロ配列をコードするものである。
【０６３２】
【表６３】
2007515164.tif 000065
【０６３３】
以下の表（表７−２）は、完全長ＡＳＰと比較した天然単離株における翻訳アミノ酸配列に関する情報を提供する。
【０６３４】
【表６４】
2007515164.tif 000066
【０６３５】
これ等の結果は明らかに、セルロモナダセア(Cellulomonadaceae)及びプロミクロモノスポラセア(Promicromonosporaceae)のファミリーを含んで、サブオーダ、ミクロコシネア（Micrococcineae）細菌の菌株は69B4(Asp)プロテアーゼと相同の遺伝子を含むことを示している。成熟69Bプロテアーゼの領域に亙り、遺伝子配列は約60−80％同一である。これ等の相同のアミノ酸配列は、成熟69B4プロテアーゼタンパク質と約45−80％同一であることを示す。サブオーダ  ストレプトマイシネア（Streptomycineae）のメンバーに由来するストレプトグリシン(streptogrisin) プロテアーゼの大半と対照的に、サブオーダ、ミクロコシネア（Micrococcineae）由来のこれ等の69B4プロテアーゼ相同体は、６つのシステイン残基を持ち、これ等が成熟69B4プロテアーゼタンパク質において３つのジスルフィド結合を形成している。
【０６３６】
事実、本明細書に記載の配列の不完全性、及びその正確性に関する問題はあるかもしれないが、本発明はAspプロテアーゼグループの必須の要素、並びにストレプトグリシン(streptogrisin)との比較を提供している。Aspは、ストレプトグリシン(streptogrisin)同様に、3つのジスルフィド結合を持つ点でユニークな特徴を持っている。以下の配列において、Aspアミノ酸は太字で表されており、完全保存の残基には下線を付した。活性部位は＃印を付し、二重線を付した。システイン残基には*マークと下線を付した。ジスルフィド結合はC17 とC38, C95 とC105、及びC131とC158の間にある。
【０６３７】
【表６５】
2007515164.tif 000067
【０６３８】
【表６６】
2007515164.tif 000068
【０６３９】
実施例８
ASP相同体の質量分光分析による配列決定
（Mass Spectrometric Sequencing of ASP Homologues）
本実施例では、成熟ASP相同体のN末端及びC末端配列を確認、及び確定のみならず、DNA由来の配列を確認をする実験について記述する。これらの実験で用いられる微小生物は以下の通りである：
【０６４０】
1. セルロモナス ビアゾテア(Cellulomonas biazotea) DSM 20112
2. セルロモナス  フラビゲナ(Cellulomonas flavigena) DSM 20109
3. セルロモナス  フィミ(Cellulomonas fimi) DSM 20113 
4. セルロモナス  セラシ (Cellulomonas cellasea) DSM 20118
7. エルスコビア  ジェネンシス  (Oerskovia jenensis) DSM 46000
8. エルスコビア  ツルバタ(Oerskovia turbata) DSM 20577
9セルロシミクロビウム  セルランス (Cellulosimicrobium cellulans) DSM 20424
【０６４１】
ミクロ精製されたASP相同体は、以下の主要ステップより成る質量分光分析をベースとするタンパク質配列決定手順に付された。すなわち、ミクロ精製、ゲル電気泳動、ゲル内タンパク質分解、毛細管液体クロマトグラフィーエレクトロスプレイ・タンデム質量分析（capillary liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry）(nanoLC-ELI-MS/MS)、質量分光分析データ、及び新たな配列決定である。
【０６４２】
これらのステップの詳細は以下に記す。既に実施例6に記載の様に、濃縮培養サンプル（約200ml）が500ml の1 Ｍ  CaCl2に加えられ、14,000rpmで5分間遠心分離された（モデル 5415C Eppendorf）。上澄みは氷で冷やされ、１規定（N）の塩酸200mlにより酸性化された。5分後、200mlの50％トリクロロ酢酸が加えられ、サンプルは14,000rpmで4分間遠心分離された（モデル 5415C Eppendorf）。上澄みは取り除かれ、ペレットがまず水で、その後90％アセトンで洗浄された。ペレットは、スピード真空乾燥された後2倍のタンパク質生成（Protein Preparation）(Tris-Glycine Sample Buffer; Novex)  緩衝液に溶解され、SDS-PAGEゲルに付される前に等倍（１＋１）の水で希釈された。SDS-PAGEはNuPAGE MES SDS 流体緩衝液が加えられた。SDS-PAGEゲル（1 mm NuPAGE 10% Bis-Tris; Novex）は展開され（developed）その技術分野の標準的手順に従い染色された。SDS-PAGEに従い、ASP相同体に対応するバンドは切除され、その技術分野の標準的手順に従い質量分光分析によるペプチド配列決定のプロセスに付された。
【０６４３】
ペプチドマッピング及び配列決定は毛細管液体クロマトグラフィーエレクトロスプレイ・タンデム質量分析（capillary liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry）(nanoLC-ELI-MS/MS)を用いて行われた。この分析システムは毛細管HPLCシステム（モデルCapLC Waters）及び質量分光分析器（モデルQtof Ultima API ; Waters）よりなる。ペプチドはプレコラム（PrepMap 100 C、18, 5um, 100A 300um IDx1mm ; Dionex）に入れられ、0-100%の勾配で、流量200nL/分（ポンプ流量5uL/分から静的分割（static split）により発生させる）の溶媒Bを 45分掛けて、毛細管コラムでクロマトグラフ分析(BiobasicＣ18 75um x 10cm; New Objectives)を行った。溶媒Aは水に0.1%のギ酸を含み、溶媒Bはアセトニトリルに0.1%のギ酸を含む。質量分光分析は次にパラメータにより実施した：スプレイ電圧3.1kv, デソラヴェイション（desolavation）ゾーン  150℃、質量スペクトル400−1900m/zより取得、解像度  v−モード6000。タンデムMSスペクトルは、2つの最強度ピークを選び、及び質量依存衝突エネルギー（販売者指定の通り）及び2.5X10-5トールの衝突ガス（アルゴン）により断片化されたモードに依存するデータより取得した。
【０６４４】
ペプチドの同一性は、ASP相同のDNA取得配列を含むデータベースを用い、データベース調査プログラム(Mascot, Matrix Science)を用いて決定した。データベース調査は以下のパラメータの下で実施した：酵素の選定は行わず、ペプチド誤差は2.5Da, MS/MSイオン誤差は0.1Da, カルボオキシアミノメチル  システインの可変修飾を行った。マッチしないMS/MSスペクトルに就いては、新たな配列アサインメント手引きを実行した。例えば、図4は、セルロモナス  フラビゲナ(Cellulomonas flavigena)に由来するN末端の最も典型的なペプチドの配列が、このタンデム質量分光分析により決定された事を示す。
【０６４５】
【表６７】
2007515164.tif 000069
【０６４６】
実施例９
ストレプトマイセス  リビダンス（Streptmyces lividans）におけるプロテアーゼ生産
P169
この実施例は、Ｓ．リビダンによるプロテアーゼの生産方法を開発する実験について記載する。このようにしてタンパク質分解活性を持つポリペプチドをコードするポリペプチド含むプラスミドが構築され、プラスミドは、ストレプトマイセス  リビダンス宿主細胞を形質転換するために適したベクターを用いた。この形質転換に用いられる方法は、米国特許番号6,287,839及びＷＯ02/50254により十分に記述されており、これらの文献は引用により本明細書に組み入れられる。
【０６４７】
この実験で開発されたあるプラスミドはpSEG69B4Tと名づけられた。このプラスミドの構築は一つのpSEGCTプラスミドベクター（WO  02/50245を参照）を利用したものである。69B4プロテアーゼをコードする構造遺伝子に動作可能なようにリンクされたグルコースイソメラーゼ（GI）プロモータがプロテアーゼの発現を推進するために用いられた。GIプロモータと69B4シグナル配列、Ｎ末端プロ配列と成熟配列の融合が、融合ＰＣＲ技術によりXbal−BamHI断片として構築された。断片はXbal及びBamHIにより消化されたpSEGCTプラスミドに結紮され、pSEG69B4Tプラスミドとなった(図 6を参照)。本明細書は特定の配列ベクターについて記載するが、本発明においては、異なるプロモータ及び/又はシグナル配列を69B4プロテアーゼの種々のプロ配列と組み合わせて用いる追加ベクターも使用されることを想定している。
【０６４８】
実験において新たに開発されたプラスミドはpSEA469B4CTと呼ばれる（図7を参照）。
pSEG69B4Tプラスミドと同様に、あるpSEGCTプラスミドベクターはこのプラスミドを構築するために用いられた。pSEA469B4CTを作るために、アスペルギラス  ニジェール（Aspergillus niger）(塩基調整配列) ("A4")プロモータが、69B4プロテアーゼをコードする構造遺伝子に動作可能なようにリンクされ、プロテアーゼの発現の推進に用いられた。Ａ４プロモータとCel A（ストレプトマイセス  コエリコーロール（Streptomyces coelicolor）シグナル配列の融合、asp-N末端プロ配列とasp成熟配列との融合は融合、ＰＣＲ技術によりXbal−BamHI断片として構築された。断片はXbal及びBamHIにより消化されたpSEA4 GCTプラスミドに結紮され、pSEA469B4CTプラスミドとなった(図 7を参照)。
A4（アスペルギラス  ニジェール（Aspergillus niger））プロモータ領域の配列は次の通りである：
【０６４９】
【表６８】
2007515164.tif 000070
【０６５０】
これらの実験においては、宿主ストレプトマイセス  リビダンス（Streptmyces lividans）TK23はその技術分野で知られているプロトプラスト法を用いて,  上記のベクターのいずれかにより形質転換された(例えば、Hopwood  et. al., Genetic Manipulation of  A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom (1985)を参照)。
【０６５１】
形質転換された培養体は２つの発酵培養体を提供するために膨張させた。種々の時点で発酵液のサンプルが分析のため取り出された。この実験で、クローンを旨く行うためにスキムミルクの手法が使われた。この方法では、30μlの振動フラスコ上澄みがスキムミルク寒天プレートにあけたパンチ孔に入れられ、３７℃で培養された。培養プレートは、一夜培養の後に視認によりかさ（halos）の存在の有無が確認された。この実験で又、同じサンプルについてプロテアーゼ活性及び分子量(SDS-PAGE)のアッセイがなされた。発酵の最後にSDS-PAGEにより完全長のプロテアーゼが観察された。
【０６５２】
発酵液のサンプルは以下のようにアッセイされた：10μlの希釈上澄みが取られ、190μl AAPF基質液（0.1 M  Tris/005% TWEEN, pH 8.6中、濃度1mg/ml）に加えられた。p-ニトロアニリンの放出による410nmでの吸光度での増加率がモニターされた（25℃）。pSEG69B4Tを用いて得た3クローン（X,  Y、W）及びpSEA469B4Tを用いた2クローン発酵液のアッセイ結果は、Aspは両方の構築体、able XXI,により発現することを示していた。２クローン（pSEA469B4T）の結果を参照。事実、これらの実験の結果では、タンパク質分解活性を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、これらの両方の発現ベクターを用いてストレプトマイセス  リビダンス（Streptmyces lividans）で発現された。二つのベクターはこの実施例に記載されているが、他の構築のみならず、異なるプロモータ及び/又はシグナル配列を、pSEA4CT骨格（ベクター）中の 69B4プロテアーゼ：＋・−N末端及びC末端プロ配列の異なる組合せと組み合わせて用いる追加的な発現ベクターも、本発明において用いることが意図されている。
【０６５３】
実施例10 バシルス  スブティリス（Bacillus Subtillis）におけるプロテアーゼの生成
本実施例は、バシルス スブティリスに置ける69Ｂ4プロテアーゼ（又ASP、Asp、 ASPプロテアーゼ及びAspプロテアーゼとよばれる）について記載する。この実施例では、プラスミドpHPLT-ASP-C1-2(表10−1及び図9を参照)のバシルス スブティリスへの形質転換について記載する。形質転換はその技術分野で知られた方法で行われた（WO 02/14490を参照。この文献は引用により本明細書に組み入れられる）。バシルス スブティリスでのASP 発現を最適化するために、合成DNA配列がDNA2.0により生成され、そしてこれらの発現実験で用いられた。以下に記す、コドンがバシルス スブティリスの使用に適しているDNA配列（合成ASP DNA配列）は野生型ASP前駆体タンパク質をコードする：
【０６５４】
【表６９】
2007515164.tif 000071
【０６５５】
上記の配列では、太字は成熟プロテアーゼをコードし、標準フォントはリーダー配列を示し、下線部分はＮ末端及びＣ末端プロ配列を示す。
【０６５６】
合成ASP遺伝子の発現
Asp発現カセットはpXX-Kpnl (図 15を参照)、又はp2JM103-DNNDPI (図16を参照)ベクターで構築され、そしてバシルス スブティリスでASP発現のためpHPLT（図17を参照）ベクターにクローンされた。pXX-Kpnl は発現を推進するaprEプロモータ（バシルス スブティリス）、キャット遺伝子（cat gene）及びバシルス スブティリスでコピー番号の増幅のための複製aprEプロモータを持つpUCベースのベクターである。Bla遺伝子は大腸菌における選択的成長を許す。リボソーム結合部位に導入されるKpnl、aprEプロモータ領域の下流は、HindIII部位と共にpXX-KpnlでのAsp発現カセットのクローンを可能にする。
【０６５７】
p2JM103-DNNDPIベクターは、酸に不安定なリンカーの枠内（DDNDPI(配列番号132) 、Segalas et. al.,FEBS Lett. , 371: 171-175 [1995]を参照）でBCE103セルラーゼ  コア（義務的好アルカリ性（obligatory alkalophilic）バシルスのエンドセルラーゼ；Shaw et. Al., J. Mol. 320: 303-309 [2002]を参照））の発現を推進するaprEプロモータを含む。ASP発現カセット(BamHI及びHindIII)はBCE103- DDNDPI融合タンパク質に融合された。分泌されたとき、ASPはセルラーゼコアを切り取られ成熟プロテアーゼに変えられる。
pHPLT（図17；及びSolingen et al., Extremophiles 5: 333-341 [2001]を参照）はバシルス リチェノフォルミス（Bacillus lichenoformis）の熱安定なアミラーゼLATプロモータ（PLAT）を含み、それにASP発現構築をクローンするXbal 及び Hpal制限部位が続く。以下の配列はDNNDPI酸に不安定なリンカーを持つBCE103セルラーゼ  コアの配列である。この配列では太字は酸に不安定なリンカーであり、標準フォントはBCE103コアを示す。
【０６５８】
【表７０】
2007515164.tif 000072
【０６５９】
Asp発現カセットは野生型Aspシグナルペプチドにより、又は25Asp C末端シグナルペプチドアミノ酸に融合した５スブティリシンAprE  N末端シグナルペプチドアミノ酸より構築されたハイブリッドシグナルペプチド(MRSKKRTVTRALAVATAAATLLAGGMAAQA（配列番号135）、又は19Asp C末端シグナルペプチドアミノ酸に融合した11スブティリシンAprE  N末端シグナルペプチドアミノ酸より構築されたハイブリッドシグナルペプチド(MRSKKLWISLLLAVATAAATLLAGGMAAQA（配列番号136）をコードするDNAを含むpXX-Kpnlベクターにおいてクローンされた。これ等の発現カセットはまたフレームにあるDNAをコードするasp  C末端プロ配列により構築された。他の発現カセットは、p2JM103-DNNDPIベクターにおいてクローンのために、ASP  N末端のプロ及び成熟配列をコードする。
【０６６０】
pXX-Kpnl 又はp2JM103-DNNDPIベクターでクローンされたAsp発現カセットは大腸菌に形質転換された（Electromax DH10B,Cat. No. 12033-015）。使用されるプライマ及びクローン戦略は表10−１に記載する。その結果、発現カセットはこれらのベクターからクローンされ、バシルス  スブテリス（ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspollE、ΔdegUHy32、ΔamyE(xyIR, pxylA-comK)）株に形質転換される様にpHPLT発現ベクターに導入された。PHPLTでのASP発現カセットクローンのためのプライマ及びクローン戦略は表１０−２に示す。バシルス  スブテリスへの形質転換はWO 02/14490に記載のように実施された。本文献は引用により本明細書に組み入れられる。図１２−２１は本明細書に記載の種々のプラスミドのプラスミドマップを提供する。
【０６６１】
【表７１】
2007515164.tif 000073
【０６６２】
【表７２】
2007515164.tif 000074
【０６６３】
【表７３】
2007515164.tif 000075
【０６６４】
プライマーはMWG 及び Invitrogenから入手した。Invitrogen Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity (Cat. No. 11304-029)が、Invitrogenの指示する手順に従い、PCR増幅(0. 2 μM プライマ, 25以上30サイクルまで)に用いられた。ASP発現カセットと宿主ベクターとの結紮反応はInvitrogen T4 DNA リガーゼ (Cat. No. 15224-025)を用いて、付着端の一般的クローンにおいて推奨されているInvitrogenの手順により完成された。
【０６６５】
p2JM103-ASPベクターを持つバシルス  スブテリス（ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspollE、ΔdegUHy32、ΔamyE (xyIR, pxylA-comK)）形質転換細胞又はｐHPLT-ASPベクターの一つの選択的成熟は25ml のSynthetic Maxatase Medium (SMM)と、0.5g/l CaCl2に代わり、0.97g/l  のCaCl2. 6H20合を含み（米国特許番号  5,324, 653を参照。この文献は引用により本明細書に組み入れられる）、25mg/Lクロラムフェニコール又は20 mg/Lのネオマイシンを含む振動フラスコで行われた。この成長の結果、タンパク質分解活性を持つ分泌性ASPプロテアーゼが生成された。しかしながら、ゲル分析はNuPage Novex 10% Bis- Trisゲル (Invitrogen, Cat. No. NP0301 BOX)を用いて実施された。分析用サンプルの準備のため、2容量の上澄みが1容量  1Ｍ  HCL、1容量４ｘLDSサンプル緩衝液(Invitrogen, Cat. No. NP0007)、及び1％PMSF (20 mg/ml)と混合され、そして70℃で10分過熱された。その後、25μLの各サンプルは、10μL SeeBlueプラス2つの事前に染色されたタンパク質標準と共にゲルに載せられた(Invitrogen, Cat. No. LC5925)。その結果は明らかに、本実施例に記載のaspクローン化戦略は全て、バシルス  スブテリスにより十分な量の活性Aspが生成されることを示している。
【０６６６】
さらに、同じ発酵液のサンプルについて以下のアッセイがなされた：10μlの希釈上澄みが取られ、190μlのAAPF基質溶液に加えられた（濃度は、0.1 M Tris/0.005% TWEENS, pH 8.6中、1mg/ml）。生成されるASPの濃度の測定のため、ｐ-ニトロアニリンの放出による吸光度の増加率を410nmでモニターした。これらの結果によると、全ての構築体は測定可能なASPプロテアーゼを生成することを示していた。
【０６６７】
合成asp遺伝子の影響を、バシルス  スブテリスにおいて、バシルス  スブテリス（ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspollE、ΔdegUHy32、ΔamyE (xyIR, pxylA-comK)）における合成及び自生のaspの pHPLT-ASP-c-1-2構築の発現レベルを比較することにより調査した。自生の遺伝子は、プラチナ pfxポリメラーゼ（Invitrogen）を用い、以下のプライマにより自生asp遺伝子を含むプラスミドから増幅した。
【０６６８】
【表７４】
2007515164.tif 000076
【０６６９】
これらのPCRに対して次の条件が適用された：94℃で２分、続いて94℃で45秒、60℃で30秒、及び68℃で2分、30秒を25サイクル、続いて68℃で5分行う。PCRの生成物はE-gel (Invitrogen) に置かれ、切除され、そしてゲル摘出キット(Qiagen)により精製された。pHPLTベクターを持つ自生ASPを含むこの断片のリガーゼ反応は、T4 DNA Ligase（NEB）を用いて結紮させることにより完成し、そして直接バシルス  スブテリス（ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspollE、ΔdegUHy32、ΔamyE (xyIR, pxylA-comK)）に形質転換された。バシルス  スブテリスへの形質転換はWO 02/14490 A2に記載の通りに実施された。この文献は引用により本明細書に組み入れられる。
【０６７０】
Aspタンパク質は振動フラスコにおいて、以下の成分を含む培養体中において37℃で成長させることにより生成した：0.03 g/L MgSO4, 0.22 g/L K2HPO4, 21.3 g/L NA2HPO4*7H2O, 6.1 g/L NAH2PO4*H2O, 3.6 g/L 尿素, 7 g/L 大豆かす, 70 g/L マルトリン（Maltrin） M150, 及び42 g/L グルコース, 最終pHはpH7.5であった。この実験では、合成遺伝子カセットを持つ宿主の生成レベルは自生遺伝子カセットを持つ宿主よりも3倍高かった。
さらに追加実験において、ASPの発現が、sacBプロモータ及びaprEシグナルペプチドを用いてバシルス  スブテリスにおいて調査された。遺伝子は、TGOポリメラーゼ(Roche)及び以下のプライマーを用いて、合成asp遺伝子を含むプラスミドから増幅された：
【０６７１】
【表７５】
2007515164.tif 000077
【０６７２】
SacBプロモータ（バシルス  スブテリス）、aprEの伝令RNA(+1)の開始、及びaprEシグナルペプチドはTGO ポリメラーゼ(Roche)及び以下のプライマを用いてプラスミドpJHsacBJ2から増幅した：
【０６７３】
【表７６】
2007515164.tif 000078
【０６７４】
これら両方を増幅するためのPCR条件は以下の通りである：
94℃で2分、続いて94℃で30秒、５０℃で1分、そして66℃で1分間を30サイクル行い、続いて72℃で7分。結果のPCR生成物はE-gel(Invitrogen)に置かれ、切除され、そしてゲル摘出キット(Qiagen)により精製された。
さらに、PCR重複延長融合(Ho, Gene, 15: 51-59 [1989] )  が、上記の遺伝子断片を、PFXポリメラーゼ(Invitrogen) 及び以下のプライマを用いて、sacBプロモータaprEシグナルペプチドに融合するために用いられた：
【０６７５】
【表７７】
2007515164.tif 000079
【０６７６】
これらのPCRに対して次の条件が適用された：
94℃で２分、続いて94℃で45秒、60℃で30秒、及び68℃で2分、30秒を25サイクル、そして68℃で5分行う。PCRの結果生成物はE-gel (Invitrogen) に置かれ、切除され、そしてゲル摘出キット(Qiagen)により精製された。
精製された融合物は切断され（EcoRI/HindIII）、結紮されて(T4 DNA Ligase, NEB)、強力な転写終結部分をもつEcoRI/HindIII pJH101 (Ferrari et.al., J. Bacteriol., 152: 809-814 [1983] )ベクターに入れられた。
結紮混合物は有能大腸菌細胞に形質転換され（化学的に有能なトップ10に入る細胞）、プラスミドを回収するためプラスミド準備液が作られた（Qiagen spin-prep）。
【０６７７】
プラスミドpJHsacB-ASP (1-96 sacB プロモータ；97-395 aprE+1 からaprE ssの端まで；及び396-1472 pro+mature asp;  以下の配列を参照)がバシルス  スブテリスに形質転換された。バシルス  スブテリス（ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspollE、ΔdegUHy32、ΔamyE (xyIR, pxylA-comK)）株の形質転換は
WO 02/14490 A2に記載のように実施された。本文献は引用により本明細書に組み入れられる。染色体DNAは一夜培養株（LB培養体において成長）から取り出され、BG 3594 株に形質転換され、「CF 202」と名付づけられた。この株は指示板にはっきりとかさ（halo）を作り出した（LA+1.6%スキムミルク）。
【０６７８】
pJHsacB-ASP配列
【０６７９】
【表７８】
2007515164.tif 000080
【０６８０】
【表７９】
2007515164.tif 000081
【０６８１】
asp遺伝子発現が9つのプロテアーゼを欠失するバシルス  スブテリス宿主において調査された。プラスミドpHPLT-ASP-C1-2（表10−2及び図９を参照）はバシルス  スブテリス（ΔaprE、ΔnprE、Δepr, ΔispA, Δbpr, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfj, ΔnprB）及び（degUHy32、oppA、ΔspollE3501、amyE (xyIRPxylA-comK-ermC)）に形質転換された。形質転換はその技術分野で知られている方法により実施された（WO 02/14490を参照願いたい。本文献は引用により本明細書に組み入れられる）。Aspタンパク質は、MOPベースの合成培地であるMBD培養体で37℃で、振動フラスコにより成長させ生成された。MBD培養体は基本的にその技術分野で知られている（Neidhardt et al., J. Bacteriol., 119: 736-747 [1974] を参照）方法により作られたが、ベース培養体からNH4Cl2, FeSO4, CaCl2が除かれ、3 mM K2HPO4が用いられた。ベース培養体は更に60 mM 尿素、75 g/L グルコース、及び1% ソイトーン（soytone）が追加されたものである。
【０６８２】
また、微小栄養素として1リットル中に100倍原液、即ち400 mg . FeSO4・7H20、100 mg Mn SO4・2H20, 100 mg Zn SO4・7H20,  50 mg CuCl2・2H20, 100 mg CoCl2・6H20, 100 mg NaMoM O4・2H20, 100 mg Na2B4O7・10 H20, 10 ml の１M CaCl2及び 10ml 0.5 M クエン酸ナトリウムを含むものからなっていた。
【０６８３】
これらの実験から得られた発現レベルはかなり高いものであった。
更なる実施形態において、バシルス  スブテリスの増殖型の「シグマAタイプ」（sigma A-type）プロモータの「-10」及び「-35」 領域の確立されたコンセンサス配列に、より完全に適合するプロモータを作り出すために、部位飽和突然変異誘発（site-saturation mutagenesis）により開発された「コンセンサス」プロモータ(Voskuil et al., Mol. Microbiol. 17: 271-279 [1995]を参照 )を本発明において用いることができることを見出した。しかし、バシルス細胞で機能する他のプロモータが本発明において用いられると同様に、本発明は特定のコンセンサスプロモータの使用に限定されるものではない。
【０６８４】
実施例１１
バシルス  クラウシ（Bacillus clausil）におけるプロテアーゼの生成
この実施例ではバシルス  クラウシにおいてプロテアーゼ69B4（また、本明細書では「Asp」とも呼ぶ）の生成実験について記述する。バシルス  クラウシにおいてAspタンパク質を発現させるためには、その調節系がの独特であるためこの好アルカリ性（alkalophilic）微生物中で機能するプロモータを用いる必要があった。
バシルス  クラウシPB92  (MAXACAL (商標) プロテアーゼ) のアルカリ性セリン  プロテアーゼの生成のアウトラインから、このプロテアーゼは、微妙な制限を必要とする、強いプロモータ（ここでは「MXL-prom」と呼ぶ；配列番号173, 174 及び175、図18を参照）を持つ必要のあることが分る。プロモータ領域に加え、シグナル配列（リーダー配列）も又、バシルス  クラウシにおいてタンパク質の分泌ためには非常に重要であることが知られている。したがって、MAXACALプロテアーゼプロモータ領域を持ち、及びMAXACALプロテアーゼリーダー配列、及びN末端Proの前のAspリーダー配列、及びMAXACALプロテアーゼリーダーの３、６、及び２７のアミノ酸を持つ成熟Aspタンパク質を、夫々別々にAspリーダー２５、２６及び０に融合させる３構築を持つ様にデザインされた。
【０６８５】
これらの構築をするために、DNA断片は融合を可能とするよう増幅された。したがって、PCRは、製造者指示に従い、MAXACALプロテアーゼ並びに融合高度再現性を持つポリメラーゼ（Finnzyme）AspテンプレートDNAの両方で
実施された。
【０６８６】
PCR反応はMWG-Biotech AGで合成された以下のプライマを用いて実施された（太字はプライマのMAXACALプロテアーゼ部分）：
【０６８７】
【表８０】
2007515164.tif 000082
【０６８８】
【表８１】
2007515164.tif 000083
【０６８９】
表11-1において、pMAX4はWO 88/06623に記載のテンプレートを指す。本文献は引用により本明細書に組み入れられる。PCR断片3F3R, 6F6R, 27F27Rは
BamHl及びHindIIIの両方により消化された。消化されたPCR断片はT4リガーゼ(Invitrogen)  により結紮されBamHl及びHindIIIにより開かれたプラスミドpHPLT-ASP-C1-2（表１８を参照）となった。結紮された生成物は有能なバシルス  スブテリス細胞（ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspollE、degUHy32、ΔamyE (xyIR, pxylA-comK)）（WO 02/14490を参照。本文献は引用により本明細書に組み入れられる）に形質転換され、ネオマイシン（20 mg/l）上で選定された。ネオマイシンを含むHeart Infusion寒天プレートは抗ネオマイシン群を同定するために用いられた。バシルス  スブテリス形質転換細胞のDNAは、製造者指示に従いQiagenプラスミド分離キットを用いて分離され、同じ試験管中で共にNcol+Hpalにより消化された後に、そのパターンに基づき融合したMAXACALプロテアーゼ−Asp断片の外見がテストされた。この実施例で使用された制限酵素（即ち、BamHl、HindIII、Ncol、及びHpal）は全てNEBから購入し、供給者の指示に従い用いた。バシルス  スブテリス形質転換細胞のDNAは、２つの制限酵素（Ncol+Hpal）により２帯（band）を示したものをプロテアーゼ陰性のバシルス  クラウシ株PBT142プロトプラスト細胞（これ等はPB92に由来する）を形質転換するのに用いた。
【０６９０】
バシルス  クラウシ株PBT142のプロトプラスト形質転換は、特許W088/06623に記載されているバシルス  アルカロフィルス（alkalophilus）のプロトプラスト形質転換の手順に従い実施された。本文献は引用により本明細書に組み入れられる。この手順に関しては、再生プレートについて以下の代替案を用いた点で修飾されている。即ち、1.5%寒天に代えて8.0g/l Gelrite gellam gum（Kelco）を用い、更に1000mg/lのネオマイシンに変えて、Van der Laan et al., (Van der Laan et al., Environ. Microbiol., 57: 901-909 [1991])が記述する様に、20mg/lのネオマイシンを使用したことである。
【０６９１】
バシルス  スブテリスから分離した全ての３つの構築（上記を参照）は、上記と同じ手順を用いてバシルス  クラウシ株PBT142のプロトプラストに形質転換された。バシルス  クラウシ株PBT142の形質転換細胞は20mg/lネオマイシンを含むHeart Infusion寒天プレートにおいてレプリカ平板法により選定された。異なる構築を持つバシルス  クラウシ株は表11−２に示す通りに生成された。
【０６９２】
【表８２】
2007515164.tif 000084
【０６９３】
これらの３つの株は100ml Synthetic Maxatase Medium (SMM) (米国特許番号5,324, 653を参照。本文献は引用により本明細書に組み入れられる)を含む振動フラスコで発酵された。しかし0.97g/l CaC12・6H2Oに代えて,0.5 g/l CaC12が使用された。また、0.5 ml/l  アンチフォーム（antiform）5693に代えて、0.25ml/l  Basildonが用いられた。100 ml SSM 振動フラスコは20 mg/lのネオマイシンを含む10 ml TSB (Tryptone Soya Broth) 中にリーダー構築を含む３つのバシルス  クラウシ株の前培養液0.2 mlで移植された。プロテアーゼ生成値は振動フラスコで3日成長させた後に、AAPFアッセイにより（上記の通り）測定された。その結果、これらの構築はタンパク質分解活性によりプロテアーゼを発現させることができることを示した。
【０６９４】
更なる実験において、リーダー構築が、MAXACALプロテアーゼリーダーの全長に亙り（27アミノ酸）組み込まれているかを調査した。しかし、本発明はこの特定の構造に限定されるものではない。
【０６９５】
バシルス  アルカロフィルス（alcalophilus）（ここでは、バシルス  クラウシである）染色体における異種（heterologous）DNAの安定的な組込みについては幾つかの刊行物に記載されている（WO 88/06623、及び上記Van der Laan et al.,を参照）。
特許WO 88/06623に記載のMAXACALプロテアーゼ遺伝子の一又は二のコピーをバシルス  アルカロフィルス（alcalophilus）（ここでは、バシルス  クラウシである）の染色体中に組み込む手順は、asp遺伝子の少なくとも1つのコピーをバシルス  クラウシPBT142の染色体に組み込むのに用いられた。しかし、pE194-neoの派生物であるpENM#3  (図19を参照)は、（MAXACALプロテアーゼ遺伝子を含むpMAX4を作るため）組み込みベクターpE194-neoに代わって用いられた。組み込みベクターpENM#3において、AspリーダーPCR生成物27F27Rは、MAXACALプロテアーゼ遺伝子の５’及び３’隣接領域の間のユニーク平滑末端部位Hpalにおいてクローンされた。したがって、27F27Rは以下の通り平滑末端とされた：まず最初にHpal（５’末端）により消化され、Qiagen PCR精製キットにより精製され、そしてHindIII（３’末端）により消化された。この処理された断片27F27RはHindIII消化の後再び精製され（同じQiagenキットを用い）そしてＴ4ポリメラーゼ(Invitrogen)  を用いてdNTPにより満たされ、そして再度Qiagenキットにより精製された。Hpalにより開かれたpENM#3及び平滑末端のPCR生成物27F27Rは、T4リガーゼ(Invitrogen)により結紮された。結紮生成物は直接バシルス  クラウシ  PBT142プロトプラストに形質転換され、そして20mg/lのネオマイシンを含むHI寒天プレート上でレプリカ培養の後選別された。組み込みベクターにおけるasp遺伝子の正当な配向が確認をされた2つの形質転換細胞は同定され、特許WO 88/06623に記載の組み込み手順に組み入れられた。選別はMAXACALプロテアーゼ遺伝子座への組み込みのため、2 mg/l 及び 20mg/l ネオマイシンを使い、及び非正統遺伝子座でなされた。これらの結果より、バシルス  クラウシは又Aspプロテアーゼの発現宿主としても適していることが分かる。
【０６９６】
実施例１２  バシルス  リチェニフォルミスでのプロテアーゼの生成
この実施例においては、バシルス  リチェニフォルミスでのプロテアーゼ69B4を生成する実験について記述する。これらの実験においてバシルス  リチェニフォルミスで、プロテアーゼ69B4（またASPプロテアーゼとも呼ぶ）を生成するための種々の発現構築が作られた。構築体は発現プラスミドpHPLT（バシルスで複製される）及び/又は組み込みベクターplCatHにクローンされた。
【０６９７】
プラスミドpHPLT（図17、及び米国特許番号6,562, 612を参照。本文献は引用により本明細書に組み入れられる）はpUB110の派生物であり、選別のために抗ネオマイシンマーカーを持っており、そしてバシルス  リチェニフォルミス  αアミラーゼ（LAT）プロモータ（PLAT）、LATシグナルペプチド（preLAT）をコードする配列を含み、それに続くクローンのためのPstI及び Hpal制限部位、及びLAT転写ターミネータをもっている。plCatHベクター（図20を参照）は温度に敏感な複製起点（ori pE194, バシルスにおける複製のため）、ori pBR322 (大腸菌での増幅のため)、選定のための抗ネオマイシン遺伝子、及び繰り返し行う選定、染色体組み込み及びカセット増幅のための自生のバシルス  リチェニフォルミス  抗クロラムフェニコール遺伝子（cat）をもつ。製造者指示に従い、下記のプライマを用いてASPc1構築体が高度再生プラチナTaqポリメラーゼ（High Fidelity Platinum Taq Polymerase (Invitrogen)）によりＰＣＲ融合によりPstl-Hpal 断片として作られた。
【０６９８】
【表８３】
2007515164.tif 000085
【０６９９】
これらのプライマはMWG Biotechより入手した. PCR反応は通常はアニール温度55℃で、高度再生プラチナTaqポリメラーゼ（High Fidelity Platinum Taq polymerase）(Invitrogen) を用いて熱サイクル器で30サイクル行うことにより実施された。PCR-IはpHPLT上で、プライマpHPLT-Bglll_FW、及び融合C1_RVをテンプレートとして使用することにより実施した。PCR-II はプラスミドpHPLT-ASP-C1-2上でプライマ融合C1_FW及びpHPLT-Hindlll_RVにより実施した。PCR-I 及びPCR-IIの断片はプライマpHPLT-Bglll_FW及びpHPLT-HindLLL_RVにより融合PCRに集められた。最終のPCR断片は、Qiagen PCR精製キットを用い精製され、Bglll及びHindlllにより消化され、そして製作者の指示に従ってT 4DNAに結紮され、Bglll及びHindlllにより消化されたpHPLTに取り入れられた。結紮された混合物はその技術分野で知られているバシルス  スブテリス株OS14に形質転換された（米国特許出願番号20020182734 及び WO 02/14490を参照。本文献は引用により本明細書に組み入れられる）。正しい形質転換細胞はスキムミルクプレートにかさ（halo）を作り出し、その一つがプラスミドpHPLT-ASP-C1を分離するために選択された。このプラスミドは技術分野で知られているプロトプラスト形質転換法によりバシルス  リチェニフォルミス宿主BML780 （BRA7 派生物, cat-, amyL-, spo-, aprL-、endoGluC-）に導入された (Pragai et al., Microbiol., 140: 305-310 [1994] を参照)。  抗ネオマイシン形質転換細胞はスキムミルク上ででかさ（halo）を形成したが、一方pHPLT-ASP-C1を持たない親株は、かさを形成しなかった。これにより、ASPプロテアーゼの発現がLATプロモータにより推進され、それがハイブリッドシグナルペプチド（MRSKKRTVTRALA  VATAAATLLAGGMAAQA:配列番号135）に融合される場合には、バシルス  リチェニフォルミスはASPプロテアーゼの発現および分泌を可能にすることが分る。
【０７００】
構築体ASPc3は融合PCR（合成asp遺伝子において内部Pstlを除去するために必要）により、上記の様に以下のプライマを持つPsfl-Hpal断片として作られた：
【０７０１】
【表８４】
2007515164.tif 000086
【０７０２】
精製の後に、PCR製品はPsfl-Hpalにより消化され、Psfl及びHpal消化のpHPLTに結紮され、そしてバシルス  スブテリス株OS14に形質転換された。プラスミドpHPLT-ASP-C3は、スキムミルクプレートに比較的（他の形質転換細胞と比べ）大きなかさを作っている抗ネオマイシン物質から分離された。プラスミドDNAはQiagen プラスミド精製キットを用い分離され、BaseClearにより配列が決定された。
【０７０３】
配列決定によりASPc3構築は、C最末端（S188D、P189D）に2つのアスパルギン酸残基を持つ成熟ASPをコードするものであった。これらの変異は、ASPのC末端をタンパク質分解からの影響をより受けない様にするために意図的にPCRにより導入されたものであった( WO 02055717を参照)。又、この２つの変異は、PCR法によりN末端のプロ領域のコード領域に導入されたもののようにも思われる。これらの変異はN末端のプロ領域の2つのアミノ酸に変化を起こした：L42I及びQ141Pである。これらの2つのプロ（N）変異を持つ特定のクローンは、これらの変異と持たない他のクローンに比べて幾らか大きなかさ（halo）を作るため、バシルスに於けるASPプロテアーゼの発現及び/又は分泌はN末端のプロ変異により、確実に影響を受けていると考えられる。しかし、本発明では他の変異についても、その使用を考えており、したがって本発明はこれらの特定の変異に限定されるものではない。
【０７０４】
次に、pHPLT-ASPc3は、上記に記すようにBML780に形質転換された。プラスミドを持たない親株と対照的に、BML780 (pHLPT-ASPc3)はスキムミルクプレートでかさを作っており、これは又、このASPc3構築はバシルス  リチェニフォルミスにおけるASPの発現を導くものであることを示している。ASPc3発現カセットを含む組み込み、増幅された株を生成するために、C3構築が以下のプライマを持つpHPLT-ASPc3から増幅された：
【０７０５】
【表８５】
2007515164.tif 000087
【０７０６】
PCR生成物は、上記の通り、Xholにより消化され、Xhol-消化plCatH(図20を参照)に結紮され、そしてバシルス  スブテリス株OS14に形質転換された。ASP発現クローンから得られるプラスミド（スキムミルク上のかさ（halo）の形成により判断した）は分離され、plCatH-ASPc3と命名された。BaseClearによるＤＮＡ配列決定により、plCatH-ASPc3のASPC3カセットでは他の変異株は導入されていないことが確認された。プラスミドは更に、許容される温度（37℃）でBML780に形質転換され、1つの抗ネオマイシン（neoR）及び抗クロラムフェニコール(capR)形質転換細胞が選定され、BML780（plCatH-ASPc3）と名付けられた。BML780（plCatH-ASPc3）中のプラスミドは、クロラムフェニコールを含む培養体において、非許容温度（50℃）で株を成長されることにより、バシルス  リチェニフォルミス  ゲノム上のcat 領域に組み込まれた。
【０７０７】
1つの抗capRクローンが選定され、BML780-plCatH-ASPc3と名付づけられた。BML780-plCatH-ASPc3は、再び、ベクター配列をループ外に置く（loop out）ため抗生物質を使わないで許容温度において数世代育成され、1つのネオマイシンに敏感な（neoS）capRクローンが選定された。
【０７０８】
このクローンでは、染色体上のplCatHのベクター配列は切除され（抗ネオマイシン遺伝子を含む）、ASPc3-catカセットのみが残された。cat遺伝子は自生のバシルス  リチェニフォルミス遺伝子であり、asp遺伝子が宿主に導入された唯一の異種DNAであることに注目すべきである。次に染色体のASPc3-catカセットは、クロラムフェニコールの濃度を上げることにより培養体内/培養体上において株を成長させることにより増幅させた。種々の何度かの増幅により、1つのクローン（75μg/mlのクロラムフェニコールに耐性）が選定され、BML780-ASPc3と命名された。このクローンはスキムミルクプレートで明らかなかさを作っているが、親株BML780は作っておらず、このことよりASPプロテアーゼはBML780-ASPc3により生成され、分泌されることが分る。
【０７０９】
ASPc4の構築はASPc3と類似している、しかしASPc4から発現したASPプロテアーゼは成熟鎖のＣ末端に2つのアスパラギン酸残基を持っていない。ASPc4はplCatH-ASPc3において、以下のHypurプライマ(MWG Biotech (Germany)製)を用いてasp遺伝子を増幅させて作り出した：
【０７１０】
【表８６】
2007515164.tif 000088
【０７１１】
ASPc4 PCR生成物は、ASPc3の場合について上記で述べたと同様、精製され、Xholにより消化され、Xholにより消化されたplCatHに結紮され、バシルス  スブテリスOS14に形質転換された。プラスミドはneoR、 capRクローンから分離され、plCatH-ASPc4と命名された。上記のASPc 3についての記載と同様に、plCatH-ASPc4はBML780に形質転換され、ゲノムに組み入れられ、ベクター配列が切除され、cat- ASPc4カセットが増殖された。ASPc4カセットを持つ株はASPc3カセットを持つ株より、スキムミルクプレート上でより小さなかさを作っていないが、このことは成熟ASPのＣ末端の極性はASPの生成、分泌及び/又はバシルスでの安定に重要な要因となっていないことを示唆する。しかし、本発明はこの特殊な方法に限定されるものではない。
【０７１２】
自生ASPシグナルペプチドがバシルスにおいて移出（export）を促進することが可能かを探るために、ASPc5が構築された。DNA2.0の合成asp遺伝子上でASPendTERMXhol_RV(上記)  及びXhoPlatPREasp_FWプライマを使いPCRを実施した。
【０７１３】
【表８７】
2007515164.tif 000089
【０７１４】
ASPc5は、ASPc3の場合について上記で述べたと同様、精製され、Xholにより消化され、Xholにより消化されたplCatHに結紮され、バシルス  スブテリスOS14に形質転換された。プラスミドはneoR、capRクローンから分離され、plCatH- ASPc５と命名された。DNA配列から、PCRによってはasp遺伝子に望まないいかなる変異も導入されていないことが確認された。plCatH- ASPc5はBML780に形質転換され、ゲノムに組み入れられ、ベクター配列が切除され、そして上で述べたASPc3の構築と同様に、cat-ASPc5カセットが増幅された。ASPc5構築を持つバシルス  スブテリス株は、又スキムミルクプレート上でかさ（halo）を形成することが観察された。これによりASPの自生シグナルペプチドがバシルス種において分泌シグナルとしての機能を持つことが確認された。
【０７１５】
最後に、ASPc6構築が作られた。これはバシルス  リチェニフォルミス  スブティリス（aprL）プロモータ、RBS、及び最適化DNA2.0遺伝子からの成熟ASPをコードするDNA配列に枠組みの中で（in-frame）融合したシグナルペプチド配列を持つ。これは融合PCRにより、ASPendTERMXhol_RV及び以下のプライマを用いて作られた：
【０７１６】
【表８８】
2007515164.tif 000090
【０７１７】
PCR-1はプライマAprLupXhol_FW及びAprLAsp_RVによりBRA7の染色体DNAをテンプレートDNAとして実施された。PCR-IIはAprLAsp_FW及びASPendTERMXhol_RVをDNA2.0の合成asp遺伝子に用いて実施した。PCR-I及びPCR-IIの断片は、プライマはASPendTERMXhol_RV及びAprLupXhol  _FWを使い融合PCRに集められた。この最終PCR断片は、ASPc3の場合について上記で述べたと同様、Qiagen PCR精製キットを用い（製作者の指示に従って）精製され、Xholにより消化され、plCatHに結紮され、そしてバシルス  スブテリス株OS14に形質転換された。プラスミドはneoR、capRクローンから分離され、そしてplCatH- ASPc6と命名された。
【０７１８】
DNA配列から、PCRによってasp遺伝子又はaprL領域に、望まないいかなる変異も導入されていないことが確認された。plCatH- ASPc6はBML780に形質転換され、ゲノムに組み入れられ、ベクター配列が切除され、そして上で述べたASPc3の構築と同様に、ASPc6カセットが増殖された。ASPc6構築を持つバシルス  リチェニフォルミス株は、又スキムミルクプレート上でかさ（halo）を形成することが観察された。これによりaprLプロモータはAprLシグナルペプチドと共に、バシルス  リチェニフォルミス種においてASPプロテアーゼの発現/分泌を推進することが確認された。
【０７１９】
実施例１３  トリコデルマ  リーセイ（Torichoderma reesei）におけるプロテアーゼの生成
この実施例においては、Ｔ．リーセイにおけるプロテアーゼ69B4の生成のための実験について記載する。これらの実験においては、3つの異なる糸状菌構築（cbhl融合を含む糸状菌発現ベクター）が開発された。第一の構築はASP5’プロ領域、成熟した遺伝子及び３’プロ領域を含み、第二はASP5’プロ領域、及び成熟遺伝子、そして第三はASP成熟遺伝子のみを含んでいた。
以下のプライマペアがPCR（10% DMSOの存在下）に使用され、ASP遺伝子を持ち、Spel-Asci部位において断片をクローンし、Spel 及びAsci制限酵素により消化されたpTREX4ベクターに断片の挿入を誘発する、DNA K25.10染色体からの異なる断片をPCR増幅した：
【０７２０】
【表８９】
2007515164.tif 000091
【０７２１】
構築の後、異なるプラスミドは、その技術分野で知られているバイオリスティクローン（biolistic）形質転換法を用いてcbhl, cbh2, egl1、及び egl２遺伝子に断絶のあるトリコデルマ  リーセイ（Torichoderma reesei）株に形質転換された。安定した形質転換細胞が形態に基づいてスクリーンされた。各構築に対して１０の安定した形質転換細胞がスクリーンされ、振動フラスコにとられた。最初に使用された接種物培養体は30g/L α-ラクトース、6.5g/L (NH4)2SO4、 2g/L KH2PO4、0.3g/L Mg SO4・7H20、0.2g/L CaCl2、1ml/L 1000X T. reesei トレース塩（Trace Salts）、 2 mL/L 10% Tween-80, 22.5 g/L Proflo, 及び0.72g/L CaC03,を含み、そこで形質転換細胞を約４８時間成長させた。この培養期間の後に、10％の培養液がその技術分野で知られている最小培養体を含み、発現を誘発するための16g/Lのラクトースを加えたフラスコに移された（Foreman et al., J. Biol. Chem. , 278:31988-31997 [2003]を参照）。フラスコは28℃のシェイカーに置かれた。4日間置いたサンプルが4-12%NuPAGE ゲルに置かれ、Coomassie Blueで着色された。5日後に、プロテアーゼ活性が190μlのAAPF基質液（濃度0.1 M Tris/0. 005% TWEEN, pH 8.6中で1mg/ml）に10μlの上澄み液を加えて測定された。ｐニトロアニリンの放出による吸光率の増加を410nm波長でモニターした(25℃)。
【０７２２】
活性データは、コントロール(すなわち、親株)に対して5倍の高い生成が示され、これはＴリーセイはASPプロテアーゼの発現に適していることを示す。
【０７２３】
実施例１４
アスペルギルス  ニジェールにおけるプロテアーゼの生成
この実施例においては、アスペルギルス  ニジェール  変異体  アワモリにおけるプロテアーゼ69B4の生成を導くための実験について記述する(PCT W090/00192)。この実験では4つの異なる糸状菌構築（glaA融合を含む糸状菌発現ベクター）が開発された。その第一の構築はASPプレ領域（pre-region）、5’プロ領域、成熟した遺伝子及び３’プロ領域を含み、第二はASPプレ領域、ASP5’プロ領域、及び成熟遺伝子、そして第三はASP5’プロ領域、成熟した遺伝子及び３’プロ領域、第4はASP5’プロ領域、及びASP成熟遺伝子を含んでいた。
【０７２４】
下記のプライマペアから選定されたプライマが、asp遺伝子を持ち、Nhe1-BstEll部位に断片をクローンして、Nhe1及びBstEll制限酵素により消化されたpSLGAMpR2ベクター（図22を参照）に断片の挿入を誘発するDNA69B4染色体からの異なる断片をPCR（10% DMSOの存在下）増幅するために用いられた。
【０７２５】
プライマAnforward 01 及び Anforward 02は、プライマの５’末端にattB１ Gatewayクローン配列(Invitrogen)を持ち、プライマAnreversed 01 及び Anreversed 02はプライマの５’末端にattB2 Gatewayクローン配列(Invitrogen)を持っていた。これらのプライマはasp遺伝子を持つDNA69B4染色体からの異なる断片をPCR（10% DMSOの存在下）するのに用いられた。
【０７２６】
異なる構築体は、目的ベクター（destination vector）pRAXdes2（図23、米国特許出願10/804,785, 及びPCT出願  US04/08520を参照。本文献は引用により本明細書に組み入れられる）と適合するアスペルギルス  ニジェールGatewayに移された。
【０７２７】
【表９０】
2007515164.tif 000092
【０７２８】
PCR条件は以下の通り：5μlの１０ｘPCR反応緩衝液(Invitrogen)；20mM MgSO4; 各0.2ｍM のdATP,dTTP, dGTP, dCTP (最終濃度)、1μLの10ng/μLゲノムＤＮＡ，1μlの高度再生Taq ポリメラーゼ（High Fidelity Taq polymerase）(Invitrogen)  １μL当たり1単位、0.2μMの各プライマ(最終濃度)、5μl DMSO及び水50μL。PCR手順は：94℃で5分、続いて94℃で30秒、55℃で30秒、及び68℃で3分を30サイクル行い、続いて68℃で10分、及び15℃で1分である。
【０７２９】
構築の後、異なるプラスミド及びヘルパープラスミド(HM 396 pAPDI)が、その技術分野でよく知られているプロトプラスト形質転換法によりアスペルギルス  ニジェール  変異体  アワモリ(Delta Ap4 株)に形質転換された。安定した形質転換細胞が形態に基づきスクリーニングされた。各10の安定した構築が振動フラスコでスクリーニングされた。この期間の後に、発現を誘引するために、株を含む寒天の一片が、RoboSoy培養体、或いは12g/l Tryptone, 8 g/l Soytone, 15g/l 硫酸アンモニウム、12.1 g/l  NaH2PO4・H20, 2.19 g/l Na2HPO4, 5 ml 20% MgSO4・7H20, 10 ml 10% Tween 80, 500ml 30% Maltose 及び 50 ml 1 M 硫酸塩緩衝液pH 5.8 及び2 ウリジンuridineを含む振動フラスコに移された。フラスコは28℃のシェーカーに置かれた。4日間置いたサンプルがNuPAGE 10% Bis Trisｔタンパク質ゲルに置かれ、Coomassie Blueで着色された。5日後のサンプルは、AAPFを用いてプロテアーゼ活性が測定された。
【０７３０】
ASPの発現量は低く、Coomassie Blue染色ゲルで検知できなかった。しかし、プレート上のコロニーはスキムミルクプレートの寒天では、コントロール株に比べて極めて大きな、明確なかさ（halo）の形成を示していた。このように発現は低いものであったが、この結果は、明らかにアスペルギルス  ニジェールはASPプロテアーゼの発現に適していることを示している。
【０７３１】
実施例１５  Asp部位飽和突然変異（Site-Saturated Nutagenesis; SSM）ライブラリーの生成
この実施例においては、Aspの部位飽和突然変異ライブラリーの開発を導くための実験について記述する。部位飽和Aspライブラリーは夫々、pHPLT-ASP-c１-2発現ベクターを宿す96Ｂバシルス  スブティリス（ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspollE、degUHy32、ΔamyE (xyIR, pxylA-comK)）クローンを持っていた。このベクターは、Aspハイブリッド  シグナル  ペプチド及びAspN末端プロ及び成熟タンパク質をコードする合成DNA配列（実施例10を参照）よりなるAsp発現カセットを含み、以下の示すタンパク質の発現及び成熟Asp プロテアーゼの分泌を可能にするものであることが分った。
【０７３２】
【表９１】
2007515164.tif 000093
【０７３３】
シグナルペプチド及び前駆体プロテアーゼは以下の配列に示す(配列番号214)（この配列においては、太字は成熟プロテアーゼ、下線部分はＮ端末プロ配列、及び標準のフォントはシグナルペプチドを示す）。
【０７３４】
【表９２】
2007515164.tif 000094
【０７３５】
189  asp部位飽和突然変異ライブラリーの構築は、pHPLT-ASP-c１-2発現ベクターをテンプレートとして、及び表15−1にリストされたプライマを用いて完成された。これらの実験で用いた突然変異プライマは、変異を受け、そしてその位置でヌクレオチドのランダム組込みが保証されるAsp成熟配列のコドンに対応する位置において、全て三重DNA配列コードNNS  (N = A, C, T 又は G 及び S = C 又は G)をもっている。各SSMライブラリーの構築は、pHPLT-Bglll_FWプライマ及び特定逆突然変異プライマ、及びpHPLT-Bglll _RV及び特定フォワード突然変異プライマ（突然変異プライマと同等位置）を用いる2つのＰＣＲ増幅により開始された。プラチナTaqDNAポリメラーゼ高度再生（Cat. No. 11304-029 Invitrogen）が、Invitrogenにより提供された手順に従いPCR増幅のために用いられた(0.2 μM プライマ, 20 から 30 サイクル)。簡潔に言えば、両方とも同じコドンを標的とし、両方の特定のPCR混合物の増幅されたDNA断片1μLが、48μlの新しいPCR反応液に、pHPLT-Bglll-FW 及びpHPLT-Bglll-RVと共に加えられた。この融合PCR増幅  (22サイクル)により特定Asp 成熟コドンがランダムに変異し、両端にユニークBglll 制限部位を持った直線pHPLT-ASP-c１-2  DNA断片が得られた。このDNA断片の精製(Qiagen PCR 精製キットCat. No. 28106)、Bglllによる消化、追加の精製ステップの実施、及び結紮反応（Invitrogen T4 DNA Ligase (Cat. No. 15224-025)）により、続いてバシルス  スブテリス（ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspollE、degUHy32、ΔamyE (xyIR, pxylA-comK)）に形質転換される環状で且つ多重結合を持つDNAが生成された。各ライブラリーにおいて、37℃で一夜培養の後、96のシングルコロニーが、20 mg/Lネオマイシンを含むHeart Infusion寒天プレートから取り出され、そして20 mg/Lネオマイシン及び1.25g/Lイースト菌エキス（エキス培地製剤についてはWO 03/062380を参照。本文献は引用により本明細書に組み入れられる）を含むMOPS培養体中で37℃で4日間成長させ、配列分析（BaseClear）、及びスクリーニング目的のためのプロテアーゼ発現がなされた。ライブラリーの数は1から189までに亙り、各数字は、ランダムに変異された成熟aspのコドンの番号である。選定の後、各ライブラリーは最大20のAspプロテアーゼ変異体を含んでいた。
【０７３６】
【表９３】
2007515164.tif 000095
【０７３７】
【表９４】
2007515164.tif 000096
【０７３８】
【表９５】
2007515164.tif 000097
【０７３９】
【表９６】
2007515164.tif 000098
【０７４０】
【表９７】
2007515164.tif 000099
【０７４１】
【表９８】
2007515164.tif 000100
【０７４２】
【表９９】
2007515164.tif 000101
【０７４３】
【表１００】
2007515164.tif 000102
【０７４４】
【表１０１】
2007515164.tif 000103
【０７４５】
【表１０２】
2007515164.tif 000104
【０７４６】
【表１０３】
2007515164.tif 000105
【０７４７】
【表１０４】
2007515164.tif 000106
【０７４８】
【表１０５】
2007515164.tif 000107
【０７４９】
【表１０６】
2007515164.tif 000108
【０７５０】
【表１０７】
2007515164.tif 000109
【０７５１】
【表１０８】
2007515164.tif 000110
【０７５２】
実施例16
アルギニンとシステインの組み合わせ変異体の構築
本実施例では複数のASPのアルギニン及びシステイン変異体の構築を説明する。表面アルギニンとシステインとを組み合わせたライブラリーの使用がタンパク質の発現レベルを高めるかどうかを決定するためにこれらの試験を行った。
【０７５３】
2のライブラリーを構築するためにクイックチェンジ(QuikChange)(登録商標)多重部位直接変異誘発(QCMS)キット(ストラタジェン(Stratagen))を用いた。2のライブラリーを作成するために用いた5’末端をリン酸化したプライマーを表16-1に示す。HPLC、PAGE又は任意の他の方法を用いて精製されたプライマーはプライマー取り込みエラー(primer-containing error)を有意に減らすだけでなく、全長プライマーの取り込みにおいても良い結果を与えることを特記する。
【０７５４】
【表１０９】
2007515164.tif 000111
【０７５５】
pHPLT-ASP-C1-2プラスミド調製及びin vitroにおけるメチル化
QCMSキットを用いてシステイン及びアルギニンライブラリーを構築するために、最初にテンプレートプラスミドpHPLT-ASP-C1-2をin vitroにおいてメチル化した。このプラスミドをメチル化するのは、pHPLT-ASP-C1-2がバチルス系統由来であり、GATC部位のDNAがメチル化されていないためである。この方法を用いたのは、本発明においてはプラスミドpHPLT-ASP-C1-2を大腸菌で成長させることはないので、dam+大腸菌系統から提供されるDNAを含むQUMSプロトコルにおけるメチル化を確実にする一般的方法がここでは、選択肢とはならないからである。
【０７５６】
ミニプレップ(Miniprep)DNAを、プラスミド有するバチルス細胞から調製した。このキットに付属のP1緩衝液250μLを添加した後、100μLの10mg/mlリゾザイムを添加する追加工程を伴い、キアゲンスピンミニプレｐップ(Qiagen spin miniprep)DNAキットをプラスミドDANの調製に用いた。このサンプルを、キアゲンミニプレップ(Qiagen miniprep)キットマニュアルに記載されている残りの工程を行った後に、37℃で15分間、振とうしながらインキュベートした。ミニプレップ(Miniprep)DNAはこのキットに付属のEB緩衝液30μLで溶出した。
【０７５７】
次に、pHPLT-ASP-C1-2プラスミドDANを、NEBより市販されているdam+メチルラーゼキット(NEBカタログ＃MO222S)を用いてin vitroでメチル化した。簡単に説明すると、25μLのミニプレップDNA(約1-2μg)を20μLの10×NBE dam+メチル化緩衝液、0.5μLのS-アデノシルメチオニン(80μM)、4μLのdamメチラーゼ及び150.5μの脱イオン水と共にインキュベートした。反応は37℃で4時間行った。次いで、このDNAをキアゲン(Qiagen)PCR精製キットを用いて精製した。メチル化されたDNAはキットに付属の40μLのEB緩衝液を用いて溶出した。DNAのメチル化を確認するために、2μLのMbol(NEB;この酵素はメチル化されていないGATC部位を切る)、あるいは2μLのDpnl(ロシュ;この酵素はメチル化されたGATC部位を切る)を含む20μLの反溶液中で4μLの精製、メチル化DNAの消化を行った。この反応を37℃で2時間行い、反応物を1.2% Eゲル(インビトロジェン)上で解析した。Dpnlで消化したサンプルでは小さな分子量のDANスメア/ラダーが観察されたが、Mbolで消化したサンプルにおいてはインタクトDNAのみが確認された。このことは、pHPLT-ASP-C1-2プラスミドが確実にメチル化されていることを示す。
【０７５８】
ライブラリー構築
システイン(cys)とアルギニン(arg)との組み合わせライブラリーを、反応溶液中のプライマーの濃度を除いてはストラタジェン(Stratagen) QCMSキットの説明書に従い構築した。具体的には、4μLのメチル化精製pHPLT-ASP-C1-2プラスミド(約25乃至50ng)を15μLの脱イオン水、1.5μLのdNTP、2.5μLの10×緩衝液、1μLの酵素混合物及び1.0μLのアルギニン又はシステイン変異プライマー混合物(すなわち、プライマーの総量が100ngになるように添加)と混合した。プライマー混合物は、9つのアルギニンプライマー(100ng/ml)又は6のシステインプライマー(100ng/ml)の各10μLを用いて調製された。ストラタジェン(Stratagene)マニュアルで推奨されているように、arg及びcysライブラリーの両方の各プライマーの50 ng添加したところ、変異の前段階において変異体を含むクローンが50％未満となった。従って、このプロトコルは各反応において、100 ngの総プライマーを含むように変更された。エムジェーリサーチサーモサイクラー(MJ Research Thermocycler)を用いた、95℃1分間、その後、95℃、1分間、55℃、1分間及び65℃、9分間を30サイクル行う条件下で0.2 mlの薄壁PCRチューブを用いて、反応生成物を得た。37℃で一晩インキュベートすることによってQCMSキットのDpnl 1μLを用いて反応生成物を消化した。更に0.5μLのDpnlを添加し反応生成物を1時間インキュベートした。
【０７５９】
バチルスが形質転換するには二本鎖(多重結合型)(多量)DANが必要であることから、大腸菌を経ずにバチルス細胞の中でDANライブラリーを直接形質転換するために、DNAライブラリー(一本鎖QCMS生成物)をTempliPhiキット(マシャム カタログ＃25-6400)を用いて増幅した。この目的のために、TempliPhiキットのサンプル緩衝液5μLで95℃、3分間加熱することにより1μLのアルギニン又はシステインQCMS反応生成物のDNAを変性させた。この反応物を冷却するために氷上に2分間置き、その後、短時間で遠沈した。次にTempliPhiキットの5μLの反応緩衝液及び0.2μLのphi29ポリメラーゼを添加した。エムジェーリサーチ(MJ Reserch)PCRマシンで30℃、4時間インキュベートすることにより反応を行った。PCRマシンにおいて10分間65℃でインキュベートすることによりphi29酵素を失活させた。
このライブラリーをバチルスの中へ形質転換させるために、0.5μLのTempliPhi増幅反応生成物を100μLのcomKコンピテント細胞と共に、37℃で1時間激しく撹拌することにより混合した。形質転換体を105倍まで連続的に希釈し、各希釈物の50μLを10ppmのネオマイシン及び1.6％スキムミルクを含むLAプレート上で平板培養した。各ライブラリーから24のクローンを配列決定のために選択した。すなわち、コロニーを20μLの滅菌脱イオン水に再懸濁し、その後このうちの2μLを、総容量が25μLになるようにレディータック(Ready Taq)ビーズ(Amersham)と共にPCRに用いた。プライマーASPF1及びASPR4を0.5μLの濃度になるように添加した。PCRサイクルの条件は94℃、4分間の後に、94℃、1分間、56℃、1分間及び72℃、1分間を30サイクル行い、その後に72℃を7分間行った。1.5kbフラグメントが各ケースにおいて得られ、キアゲン(Qiagen)PCR精製キットを用いて生成物を精製した。精製されたPCR生成物をASPF４及びASPF4プライマーを用いて配列決定した。
【０７６０】
全部で48のクローンを配列決定した(各ライブラリーからの24クローン)。変異誘発は良く誘発されており、約15％のコロニーのみがWT(野生型)であった。プレート上にコロニーが密集し、TempliPhi増幅は形質転換のために高濃度のDNAを生産することから、クローンの20％が混合配列を有していた。上で示したように、約12％のクローンが追加的な変異を有していた。残りのコロニーは全て変異体であり、これらのうちの約60乃至80％が独特(ユニーク)な変異を有していた。アルギニンライブラリー及びシステインライブラリーの配列決定の結果を表16-2及び表16-3に示す。
【０７６１】
【表１１０】
2007515164.tif 000112
【０７６２】
【表１１１】
2007515164.tif 000113
【０７６３】
配列決定で同定された変異体のうち、アルギニンライブラリーから以下の変異体が所望の変異体とされた(表16-4参照のこと)。これらの変異体の性質に関する追加的なデータについては、以下の実施例を参照のこと。
【０７６４】
【表１１２】
2007515164.tif 000114
【０７６５】
重要なことは、この活性の結果はシステイン残渣に変異を有する変異体が生産したASPプロテアーゼはとても低いかあるいは、活性がないことを示しており、このことはジスルフィド架橋(disulfide bridges)が分子の安定性に重要な役割を有することを示している。しかしながら、本発明は任意の特定のメカニズムに限定することを意図しない。
【０７６６】
実施例17
ストレプトマイセスリビダンス(S.lividans)における相同エルスコビアタバタ(O.turbata)の発現
この実施例ではストレプトマイセスリビダンス(S.lividans)の69B4プロテアーゼに相同なエルスコビアタバタ(O.turbata)により生産されるプロテアーゼの発現を説明する。従ってこの実施例では、タンパク質分解活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むプラスミド及びストレプトマイセスリビダンス(Streptmyces lividans)宿主細胞を形質転換するために用いるベクターを説明する。ここで用いる形質転換方法は当該技術分野で知られている(米国特許6,287,839及び国際公開公報02/50245参照のこと。これらの文献を参照により本明細書に援用する)。
【０７６７】
エルスコビアタバタ(Oerskovai turbata)  DSM20577から得られた本発明のプロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドを含むベクター(すなわち、プラスミド)をこれらの試験に用いた。このプラスミドをストレプトマイセスリヴィダンス(Streptmyces lividans)の形質転換に用いた。最終プラスミドベクターを、「pSEA4CT-エルスコビアタバタ(O.turbata)」と称した。
【０７６８】
上のベクターを用いて、pSEGCTプラスミドベクターからpSEA4C-O.tubataの構築体を構築した。
【０７６９】
プロテアーゼの発現を提供するために、エルスコビアタバタ(Oerskovai  turbata)プロテアーゼ(Otp)をコードする構造遺伝子に作動可能に結合しているアスペルギウスニガー(Aspergillus niger)(A4)調節配列を用いた。A4調節配列と、エルスコビアタバタ(Oerskovai turbata)シグナル配列、N末端-プロ配列及び成熟プロテアーゼ配列との間の融合体(すなわち、C末端プロ配列のないもの)を、本技術分野の融合PCR技術によりXbal-BamHIフラグメントとして構築した。pSEA4CTの中のエルスコビアタバタ(Oerskovai turbata)プロテアーゼ(Opt)のクローニングのためのポリヌクレオチドプライマーは配列番号67に基づいている。このプライマー配列を以下に示す。
【０７７０】
【表１１３】
2007515164.tif 000115
【０７７１】
このフラグメントをXbal及びBamHIで消化したプラスミドｐSEA4CTへ融合し、プラスミドｐSEA4CT-エルスコビアタバタ(O.turbata)を構築した。
【０７７２】
前記実施例に記載のプロトプラスト法を用いて(すなわち、上記Hoopwood et al.の方法を用いて)プラスミドベクターpSEACT-エルスコビアタバタ(O.turbata)を用いて宿主ストレプトマイセスリビダンス(Streptmyces lividans)TK23を形質転換した。
【０７７３】
TS*培地において2の発酵培養を行うために形質転換された培地を調整した。TS*培地の組成は、トリプトン(ディフコ(Difco))16 g/L、ソイトン(soyton)(ディフコ(Difco))4 g/L、カゼイン加水分解物(メルク)20 g/L、K2HPO4 、10 g/L、グルコース15 g/L、バシルドンアンチフォーム(Basildon antifoam)0.6 g/L、ｐH 7.0である。各時間ポイントで、発酵ブロスのサンプルを採取し、解析した。この試験の目的のために、クローニングを成功させるためにスキムミルク法を用いた。30μLの振とうフラスコ上清をスキムミルクアガーの中に作られた穴の中へピペットで注入し37℃でインキュベートした。
【０７７４】
一晩インキュベートした後、インキュベートプレートにおけるタンパク質分解酵素の発現を示す、円形の透明部分(ハロス(halos))の存在を目視により確認した。この試験の目的のために、プロテアーゼ活性と分子量(SDS-PAGE)に関してもサンプルを解析した。発酵の最終ポイントにおいて、全長プロテアーゼがSDS-APGE上で確認された。
【０７７５】
発酵ブロスの上清は以下のようにアッセイした。10μLの希釈上清を収集し、実施例1で示すようにジメチルカゼイン加水分解アッセイ(Dimethlcasein  Hydrolysis Assay)を用いて解析した。2のコロニーからの発酵ブロスのアッセイ結果は明らかにタンパク質分解活性を有するポリペプチドをコードするエルスコビアタバタ(Oreskovai turbata)由来のポリヌクレオチドがストレプトマイセスリビダンス(Streptomyces lividens)において発現したことを示した。
【０７７６】
実施例18
ストレプトマイセスリビダンス(S.lividans)における相同セルロモナス(Cellulomonas)及びセルロシミクロビウム(Cellulosimicrobium)プロテアーゼの発現
この実施例では、ストレプトマイセスリビダンス(S.lividans)の中のプロテアーゼ694Bに相同なセルロモナスセラセア(Cellulomonas cellasea) DMA20118及びセルロシミクロビウムセルランス(Cellulosimicrobium celulans)DSM204244により生産されるプロテアーゼの発現を説明する。従って、この実施例ではタンパク質分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド及びストレプトマイセスリビダンス(Streptmyces lividans)宿主細胞を形質転換するために用いられるベクターを説明する。この形質転換方法は、当該技術分野で知られている(米国特許6,287,839及び国際公開公報02/50245参照のこと)。これらの文献を参照により本明細書に援用する)。
【０７７７】
最終プラスミドを、pSEA4CT-セルロモナスセラセア(C.cellasea)及びpSEA4CT-セルロシミクロビウムセルランス(Cm.cellulans)と称した。pSEA4CT-セルロモナスセラセア(C.cellasea)及びｐSEA4CT-セルロシミクロビウムセルランス(Cm.cellulans)の構築は、上で述べたpSEGCTプラスミドベクターを用いて行った。
【０７７８】
プロテアーゼの発現を提供するために、セルロモナスセラセア(Cellulomonas cellasea)成熟プロテアーゼ(Ccp)をコードする構造遺伝子又は、代替的に、セルロシミクロビウムセルランス(Cellulosimicrobium  cellulase)成熟プロテアーゼをコードしている構造遺伝子に作動可能に結合しているアスペルギルスニガー(A4)調節配列を用いた。A4-調節配列と、69Bプロテアーゼシグナル配列、69B4プロテアーゼ遺伝子のN末端プロシーケンス及びミクロコシネア(Micrococcineae)(ここではセルロモナスセラセア(Cellulomonas cellusea)又はセルロシミクロビウムセルランス(Cellulosimicrobium cellulans))の系統のゲノムDNAから得られた天然のプロテアーゼ遺伝子との融合体を融合PCR技術によりXbal-BamHIフラグメントとして構築した。
【０７７９】
pSEA4CTにおいてセルロモナスセラセア(Cellulomonas cellasea)プロテアーゼ(Ccp)をクローニングするためのポリヌクレオチドプライマーは配列番号63に基づいており、以下に配列を示す。
【０７８０】
【表１１４】
2007515164.tif 000116
【０７８１】
pSEA4CTにおいてセルロシミクロビウムセルランス(Cellulosimicrobium cellulans)プロテアーゼ(Cmcp)をクローニングするためのポリヌクレオチドプライマーは配列番号71に基づいており以下に示す。
【０７８２】
【表１１５】
2007515164.tif 000117
【０７８３】
宿主ストレプトマイセスリビダンス(Streptmyces lividans)TK23は、pSEA4CTプラスミドベクターを用いて上で説明するプロトプラスト法(すなわち、Hopwood  et  al.,の方法)により形質転換された。TS*培地中で2の発酵培養を行うために形質転換された培地を調製した。TS*培地の組成は、トリプトン(ディフコ(Difco))16 g/L、ソイトン(soyton)(ディフコ(Difco))4 g/L、カゼイン加水分解物(メルク)20 g/L、K2HPO4 10 g/L、グルコース15 g/L、バシルドンアンチフォーム(Basildon antifoam)0.6 g/L、ｐH 7.0である。各種時間ポイントにおいて、発酵ブロスのサンプルを採取し、解析した。この試験の目的のために、クローニングを成功させるためにスキムミルク法を用いた。スキムミルクアガーに作られた穴の中へピペットを用いて30μLの振とうフラスの上清を移し、37℃でインキュベートした。
【０７８４】
一晩インキュベートした後、インキュベートプレートにおけるタンパク質分解酵素の発現を示す、円形の透明部分(halos)の存在を目視により確認した。この試験の目的のために、プロテアーゼ活性と分子量(SDS-PAGE)についてもサンプルを解析した。発酵の終点ポイントにおいて、全長プロテアーゼがSDS-APGEで確認された。
発酵ブロスサンプルを、以下に示すようにアッセイした。10μLの希釈上清を用いて、これに190μLのAAPF基質溶液(濃度は0.1Mトリス/0.005％Tween 80、ｐH 8.6中に1 mg/ml)を添加した。p−ニトロアニリンの放出に依存する吸光度410 nmにおける増加率をモニターした(25℃)。
【０７８５】
上の実施例のように、タンパク質分解活性を有するポリペプチドをコードしている、セルロモナスセラセア(Cellulomonas cellasea)又はセルロシミクロビウムセルランス(Cellulosimicrobium cellulans)の両方由来のポリヌクレオチドがストレプトマイセスリビダンス(Streptmyces lividans)において発現したことがこの試験の結果から明らかとなった。
【０７８６】
実施例19
ASPプロテアーゼの結晶構造の同定
この実施例は、ASPプロテアーゼの結晶構造を決定するのに用いる方法を説明する。実際に、高い品質の単一結晶が精製ASPプロテアーゼから得られた。結晶化条件は、25％のPEG 8000、0.2M硫酸アンモニウム及び15％のグリセロールである。この結晶化条件は低温保護機能があり、サンプルを抗凍結剤へ輸送する必要がない。結晶は液体窒素の中で凍結し、エックスストリーム(Xstream)(モレキュラーストラクチャー(Molecular Structure)を用いたデータ収集間も、凍結されていた。収束ミラーを備えたR-axisIV(モレキュラーストラクチャー)(Molecular Structure)を用いてデータを収集した。X線の反射データは1.9Åの解像度で得られた。空間群はa=35.65Å、b=51.82Å及びc=76.86Åのセル直径を有するP212121である。1分子に1の非対称単位が存在していた。
【０７８７】
結晶構造は分子置換法を用いて解析した。用いたプログラムはX-MR(アクセルリス社)であった。分子置換計算のための出発モデルは、ストレプトグリシン(Streptogrisin)であった。X-MRから得られた電子密度マップから、分子置換解法(molecular replacement solution)が正しいことが明らかである。従ってモデルの98％が正しく構築され、幾つかの内部エラーはマニュアルに従って修正された。1.9Åに対するR-因子のデータは0.23であった。
【０７８８】
この構築体は、βシートから成る大部分と、2の短いα-ヘリックス及びC末端に向かっているより長いヘリックスが見られた。これらの間の接合部分となる2セットのβシートが存在した。活性部位は、この接合部分に形成されている割れ目 (clift)の中に見られた。触媒三つ組み残渣はHis 32、Asp 56、及びSer 137から形成されている。表19-1はASPの同定された原子座標を示す。
【０７８９】
【表１１６】
2007515164.tif 000118
【表１１７】
2007515164.tif 000119
【表１１８】
2007515164.tif 000120
【表１１９】
2007515164.tif 000121
【表１２０】
2007515164.tif 000122
【表１２１】
2007515164.tif 000123
【表１２２】
2007515164.tif 000124
【表１２３】
2007515164.tif 000125
【表１２４】
2007515164.tif 000126
【表１２５】
2007515164.tif 000127
【表１２６】
2007515164.tif 000128
【表１２７】
2007515164.tif 000129
【表１２８】
2007515164.tif 000130
【表１２９】
2007515164.tif 000131
【表１３０】
2007515164.tif 000132
【表１３１】
2007515164.tif 000133
【表１３２】
2007515164.tif 000134
【表１３３】
2007515164.tif 000135
【表１３４】
2007515164.tif 000136
【表１３５】
2007515164.tif 000137
【０７９０】
初期設定のディーエスモデリング(DS Modeling)プログラム(アクセルリス)を用いて、上で提供された結晶座標からASPの表面接触可能残渣を決定した。ASPのトータス表面接触可能性(AS)は8044.777オングストロームであることがわかった。表19-2は、溶媒に接触可能なアミノ酸の総表面のパーセンテージであるトータルSA、側鎖SA、及びパーセントSASを提供する。
【０７９１】
【表１３６】
2007515164.tif 000138
【表１３７】
2007515164.tif 000139
【表１３８】
2007515164.tif 000140
【０７９２】
ASP座標及びそれらの相同体の構造を、MOE(ケミカルコンピューティンググループ(Chemical Computing Group))に読み込ませた。水及びリガンドの座標が除去された。MOE整列を用いて、使用可能な構造的整列及び利用可能なスーパーポーズ鎖(superpose  chains)と共に、実際の二次構造を用いて、構造を整列させた。以下に示す構造アラインメントが得られた。示す数字は成熟ASPプロテアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０７９３】
【表１３９】
2007515164.tif 000141
【０７９４】
上のアラインメントで用いるコードを以下のように示す。
1HPG=ストレプトマイセスグリセウス(Streptomyces griseus)グルタミン酸特異プロテアーゼ
1SGP＝ストレプトマイセスグリセウス(Streptomyces griseus)プロテイナーゼB
1SGT＝ストレプトマイセスグリセウス(Streptomyces griseus)K1系統トリプシン
1TAL=リゾバクターエンザイモゲネス(Lysobacterenzy monogenes)アルファ-リティックプロテアーゼ
2SFA=ストレプトマイセスフラジエス(Streptomyces fradies)セリンプロテイナーゼ
2SGA＝ストレプトマイセスグリセウス(Streptomyces griseus)プロテアーゼA
【０７９５】
実施例20
ASP活性部位の酵素基質モデリング及びマッピング
この実施例では、酵素基質のモデリング及びASP活性部位のマッピング方法を説明する。ASP活性部位の予備検査において、Try, Tyr及びPheの側鎖等の大きな疎水基質に蓄積するのに十分大きいP1結合ポケットが明らかになった。
【０７９６】
オボムコイドインヒビター(pdb code 2SGB)のターキー(turkey)第三ドメイン内のストレプトグリシンAの結晶構造が決定された。ASPの活性部位におけるインヒビターを認識するMOE(ケミカルコンピューティンググループ)を用いて2SGBをASPに整列させた。
【０７９７】
S4からS2’結合部位における結合に対応するASP中のヘキサ-ペプチド結合と定義される結合以外の、全2SGB座標が除去された。プロASPタンパク質は成熟プロテアーゼ酵素を放出するためにプロドメイン-成熟ドメイン結合を自己切断する。プロドメインの最後の4残渣はS1-S4部位で占められ、成熟プロテアーゼの最初の2残渣はS1’及びS2’部位で占められていることが予測された。このことから、in-silicoにおいて、活性部位のヘキサペプチドをPRTMD配列に変更する(配列番号630)。
【０７９８】
初期の基質結合モデルの構造の検討から、Gly135及びAsp136の骨格アミドはオキシ-アニオンホールを形成することが予測される。しかしながら、Gly135のアミドニトロゲンはこれとは違った方向にある。ストレプトグリシンAとの比較によりこのことを確認した。従って、ASPの中の形態変化がオキシ-アミンホールに必要であることが予測された。しかしながら、本発明を特定のメカニズム、又は仮説に限定することは意図しない。134と135残渣の間のペプチド骨格はストレプトグリシンA構造の中の構造的に等しいものへ、同じ長さで置換された。この酵素基質モデルは、その後エネルギーが最小化された。
【０７９９】
モデル基質の6Å内の残基は、プログラムQUANTAの中の近似ツールを用いて決定された。これらの残基はArg14、Ser15、Arg16、Cys17、 His32、Cys33、Phe52、 Asp56、Thr100、Val115、Thr116、Tyr117、Pro118、Glu119、Ala132、Glu133、Pro134、Gly135、Asp136、Ser137、Thr151、Ser152、Gly153、Gly154、Ser155、 Gly156、Asn157、Thr164、Phe165であると同定された。これらのうちのHis32、Asp56及びSer137は触媒三つ組み残渣を形成していた。
【０８００】
P1ポケットはCys131、Ala132、Glu133、Pro134、Gly135、Thr151、Ser152、Gly153、Gly154、Ser155、Gly156、Asn157及びGly162、Thr163、Thr164から形成される。P2ポケットは、Phe52、Tyr117、Pro118及びGlu119と定義される。P3ポケットはGly154から基質主鎖までの主鎖-主鎖水素結合を有している。P1’ポケットはArg16及びHis32により定義される。P2’ポケットは、Thr100及びPro134により定義される。モデル化されたオクタペプチド基質の中のASPの原子座標を以下の表20-1に示す。
【０８０１】
【表１４０】
2007515164.tif 000142
【表１４１】
2007515164.tif 000143
【表１４２】
2007515164.tif 000144
【表１４３】
2007515164.tif 000145
【表１４４】
2007515164.tif 000146
【表１４５】
2007515164.tif 000147
【表１４６】
2007515164.tif 000148
【表１４７】
2007515164.tif 000149
【表１４８】
2007515164.tif 000150
【表１４９】
2007515164.tif 000151
【表１５０】
2007515164.tif 000152
【表１５１】
2007515164.tif 000153
【表１５２】
2007515164.tif 000154
【表１５３】
2007515164.tif 000155
【表１５４】
2007515164.tif 000156
【表１５５】
2007515164.tif 000157
【表１５６】
2007515164.tif 000158
【表１５７】
2007515164.tif 000159
【表１５８】
2007515164.tif 000160
【０８０２】
実施例22
ASPの酸化安定性
この実施例はASPプロテアーゼ及び変異体プロテアーゼの酸化安定性を決定するために行った試験について説明する。セルロモナス(Cellulomoans)69B4プロテアーゼの酸化に対する安定性はBPN'-変異体プロテアーゼ (BPN'-変異体 1; ジネンコー; この酵素についてはRE 34,606 [参照により本明細書に援用する]参照のこと); GG36 変異体プロテアーゼ(GG36-変異体1; ジェネンコー; 例えば、本明細書に援用する米国特許5,955, 340 及び5,700, 676参照のこと)及び ピュアファクト(PURAFECT)プロテアーゼ(ジェネンコー)の酸化に対する安定性と比較した。
【０８０３】
6.0M H2O2と共にプロテアーゼサンプルをインキュベーションすることによりこのアッセイを行った。0.1M H2O2及び100 ppmのプロテアーゼを含む0.1 M ホウ酸緩衝液(45.4 gm NaB407 10H20)、pH9.45の2.0 ml容量を25℃で20分間インキュベートし、酵素活性を測定した。
【０８０４】
酵素活性は以下のように測定した。50μLのインキュベーション混合物を0.1Mトリス緩衝液、pH 8.6の950μLと合わせ、10μLのサンプルを採取し、990μLのAADF基質溶液(0.1 M Tris/0.005%TWEEN(登録商標)中に 1 mg/mlの濃度;pH 8.6)を添加した。p-ニトロアニリンに依存する吸光度410nmにおける増加率をモニターした。これらのプロテアーゼから得られた結果を図31に示す。このグラフが示すように、プロテアーゼC9B4はスブチリシンプロテアーゼに対して酸化条件下での安定性が高くなっていた。
【０８０５】
実施例22
ASPのキレート安定性
この実施例では、ASPのキレート安定性を評価するための試験を説明する。10mMのEDTAを含む 50 mMトリス緩衝液pH 8.2と共に酵素のアリコートをインキュベーションすることにより69B4プロテアーゼのキレートの存在に対する抵抗性を測定する。これらの試験には、実施例21と同じ酵素調製溶液を用いた。
【０８０６】
特に、10 mMのEDTAを含む50 mMトリス緩衝液pH8.2の2.0 ml容量を100 ppmのプロテアーゼと共に45℃で100分間インキュベートし、酵素活性を以下のように測定した。50μLのインキュベーション混合物を0.1 Mトリス緩衝液pH 8.6、950μLに添加し、10μLのサンプルを採取し、990μLのAAPF基質溶液(0.1 M Tris/0.005% TWEEN(登録商標)pH 8.61中、1 mg/mlの濃度)を添加した。
【０８０７】
p-ニトロアニリンの放出に依存して高くなる410 nMの吸光度の割合がモニターされた。これらの4のプロテアーゼの結果を図32に示す。これらの結果が示すように、プロテアーゼ69B4は、BPN'変異体-1、PURAFECT(登録商標)、又はGG36 変異体-1よりもキレートの存在下における安定性が高くなっていた。
【０８０８】
実施例23
ASPの熱安定性
この実施例では、ASPプロテアーゼの熱安定性を決定するために行った試験を説明する。この試験の一のセットにおいて、溶液中の熱失活に対する69B4プロテアーゼの抵抗性を試験した。実施例21及び22のように、BPN’変異体(BPN’変異体-1)、PURAFECT(登録商標)及び GG36 変異体 (GG36-変異体-1)をASPに対する比較として用いた。
【０８０９】
熱失活は、100 ppmのプロテアーゼを含む50 mMトリス緩衝液pH 8.0の2.0 mlを45℃で300分間インキュベーションすることにより行った。酵素活性のアッセイを以下のように行った。50μLのインキュベーション混合物を0.1Mのトリス緩衝液pH8.6の950μLに添加し、10μLのサンプルを採取し、990μLのAAPF基質溶液(0.1 M Tris/0. 005% TWEEN(登録商標)pH 8.6中1 mg/mlの濃度)を添加した。p-ニトロアニリンの放出に依存して高くなる410nMの吸光度の増加率をモニターした。これらの4のプロテアーゼの結果を図33に示す。これらの結果が示すように、プロテアーゼ69B4は、BPN'変異体-1,PURAFECT(登録商標)、又はGG36 変異体-1と比較して摂氏45℃における熱安定性が高くなっていた。
【０８１０】
上に試験に加えて、ASPの熱安定性を決定するための代替的な試験も行った。これらの試験においては、57℃乃至62℃の間の温度を用いた。熱インキュベーション(Thermocycler-MTP plate DNA Engine Tetad; MJ Research、を用いて)を、1 mMのCaCl2及び5 ppmのプロテアーゼを含む100 mMトリス緩衝液を180μL、60分間インキュベーションすることにより行い、酵素活性を以下のように測定した。サンプルを10μL採取し、これに190μLのAAPF基質溶液(0.1 M Tris/0. 005% TWEEN(登録商標)pH 8.6中1 mg/mlの濃度)を添加した。p-ニトロアニリンの放出に依存して高くなる410nMの吸光度の増加率をモニターした(25℃)。4プロテアーゼから得られた結果を図34に示す。
【０８１１】
実施例24
DMC基質上のASPプロテアーゼのpHプロファイル
この実施例では、ASPプロテアーゼのpHプロファイルを決定するために行う試験について説明する。本明細書で述べる方法により単離及び精製された本発明のセルロモナス(Cellulomonas)69B4プロテアーゼ及び実施例21乃至23に記載のスブチリシンプロテアーゼである3の対照プロテアーゼ(PURAFECT(登録商標)、BPN'-変異体1、GG36-変異体-1)のpH 4乃至12の幅において市販の合成基質であるジメチルカゼイン(DMC/シグマC-9801)を分解する能力について解析された。適したDMC緩衝液の組成はpH 4 及び5については40 mM MES 、pH 6 及び7については40 mM HEPES、pH 8 及び9については40 mM TRIS 、 並びに pH 10、11及び12については、40 mMカーボネイトである。
【０８１２】
測定のために、各pHの基質溶液180μLを96ウェルのマイクロプレートに移し、酵素を添加する前に37℃で20分間インキュベーションした。25ppmのプロテアーゼを含む個々の酵素溶液(BPN'-変異体-1、GG36-変異体-1、PURAFECT(登録商標) 及び69B4プロテアーゼ)を調製し、20μLを試験に用いた。これらの酵素溶液をピペットを用いて基質内と混合し、各ウェルにおけるプロテアーゼの最終濃度を2.5ppmになるように調製した。この酵素-基質混合物を含む96ウェルプレートを37℃、及び300rpmで1時間、LSK-(マルチトロンインキュベータ/シェーカー)Multitron incubator/shakerでインキュベーションした。
【０８１３】
DMC基質から放出されたペプチド及びアミノ酸の量を測定するために2,4,6-トリニトロベンゼンスルホネート(TNBS)カラー反応法を用いた。(ペプチド及びアミノ酸の)遊離アミノ基は2,4,6-トリニトロベンゼンスルホネートと反応すると黄色の複合体を生じる。スペクトロマックス(Spectra Max)250 MTP リーダーを用いて405 nMの吸光度を測定した。
【０８１４】
TNBSアッセイを以下のように行った。試薬緩衝液A(2.4g NaOH、45.4g Na2B407・10H20 を加熱して1000mlに溶解)中に1 mg/ml のTNBS(5％、2,4,6-トロニトロベンゼンスルホン酸/シグマ-P2297)を含む溶液を調製した。その後、1ウェル当たり60μLのアリコートを96ウェルプレートに中に移し、10μLの上で述べたインキュベーション混合物を各ウェルに添加し20分間室温で混合した。その後、反応を止めるために200μLの試薬B(2000 ml中 70.4 g NaH2PO4・H20 及び1.2 g Na2SO3)を各ウェルに添加し混合した。スペクトラマックス(Spectra Max) 250 MTPリーダーにおいて、405 nmの吸光度を測定した。吸光度の値はブランク(酵素を含まない溶液)で補正した。表24-1に示すデータは既知の成熟変異体(BPN'変異体-1及びGG36変異体-1)に対する69B4の基質を加水分解する能力の比較を示す。
【０８１５】
図35に示すように、視認されるDMC加水分解活性を比較すると、ｐH  7乃至12の幅広いｐHにおいて、本発明のセリンプロテアーゼによるDMC基質の加水分解が高いことが明らかであった。
【０８１６】
【表１５９】
2007515164.tif 000161
【０８１７】
実施例25
ASPプロテアーゼのｐH安定性
この実施例は、ASPプロテアーゼのpH安定性を決定するために行う試験を説明する。実施例21乃至24に示すように、2の既知のスブチリシンプロテアーゼ(ピュアフェクト(PURAFECT)(登録商標)及びBPN’-変異体-1)が、試験された。
【０８１８】
個々の酵素溶液(すなわち、BPN'-変異体-1, ピュアフェクト(PURAFECT)(登録商標)及び 69B4 プロテアーゼ)は、pH3、4、5、及び6において、0.1Mクエン酸緩衝液中に90ppmのプロテアーゼを含むように調製された。その後、1 mlの緩衝化酵素溶液を含む10 mlのチューブを、25℃、35℃、及び45℃の温度のGFL1083ウォーターバスの中に60分間置いた。AAPF活性については、上で述べたように0乃至60分の時間において各酵素サンプルを測定した。残存酵素活性を計算し、以下の表25-1に示す。(及び図25乃至28に示す)。
【０８１９】
表25-1に示すデータが示すように、ASPプロテアーゼはBPN'変異体-1 及びピュアフェクト(PURAFECT)(登録商標)と比較すると25乃至45℃の温度における、3、4、5及び6のｐHでの安定性が優れていることが示された。
【０８２０】
【表１６０】
2007515164.tif 000162
【０８２１】
実施例26
ASPの安定性及び特異性
この実施例では、異なるASP、ASP変異体及びFNA、の間の安定性及び特異性を決定するために行った試験を説明する。これらの試験はギ酸カルシウム(アニオン界面活性剤滴定剤)、ホウ酸(P1バインダー/インヒビター)及びグリセロール(water ordering)を別個に又はお互いを組み合わせて含む液体TIDE(登録商標)(プロクター＆ギャンブル)を用いた。これらの条件で酵素を試験し、固定温度で長時間に渡り残存酵素活性を測定した。
【０８２２】
試験については以下に詳細を示す。調製されていない液体タイド(TIDE)(登録商標)洗剤(すなわち、酵素安定試薬を添加していないもの)を、11のアリコートに分割した。その後、以下に示す表26-1のように、グリセロール、ホウ砂、ギ酸カルシウムを洗剤のアリコートに添加した。
【０８２３】
【表１６１】
2007515164.tif 000163
【０８２４】
各アリコートを90 OFで予備加熱し、NFA、ASP(野生型)又はASP R18をそれぞれ約1グラム/リットルプロテアーゼで添加した。十分に混合した後、一部を採取し上で説明したように、合成AAPF-pNA基質を用いて活性を測定した。活性を測定した後、個々のアリコートを再び90 OFのオーブン内に置いた。このアッセイ工程を長期間に渡り繰り返した。T0における活性の減少をT0残存活性の％としてプロットした。驚くべきことに、ASPはFNAと同じく、ギ酸カルシウム又はグリセロール依存性を有していなかった。更に、ホウ砂(単独)では、ASPの安定性における影響が最も劇的であった。野生型ASPだけでなく、ASPR18変異体へ安定剤を添加することは、有効であることがわかった。変異部位がホウ砂活性化部位とは関係ないことが示唆された。
【０８２５】
実施例27
ASPのLAS安定性
この実施例では、ASPのアニオン界面活性剤に対する安定性を決定するために行った試験を説明する。アニオン界面活性剤であるLAS(直鎖アルキルスルホン酸)は、酵素を失活させるHDL洗剤の一成分であることが知られている。用いた方法は上で説明されている。
【０８２６】
トリスHCl、pH 8.6の中に溶解したLAS中でインキュベーションされた野生型ASPは失活することが確認された(以下の表27-1参照のこと)。更なる研究は、失活が急速であることを示した(表27-2参照のこと)。LASは不電荷分子であるので、ASPの正電荷のアミノ酸側鎖を伴うLASの静電気引力が、LAS感受性の原因とであるという仮設が導かれる。この仮設を確認するために、(リジン残渣を含まない野生型ASPの)アルギニン残渣を他のアミノ酸で突然変異させた。
【０８２７】
トリスHCl、pH 8.6中に0.05％(v/w)のLASを含む溶液中で、これらの変異体を1時間インキュベーションした場合、全アルギニン置換変異体が野生型ASPよりも安定であることが示された。対照的に非アルギニン置換変異体もLAS安定性についてテストを行ったが、野生型と比較して改善された安定性は見られなかった(表27-3参照のこと)。更に、多重アルギニン置換変異体の酵素は、野生型酵素よりも実質的により安定であり、単一のアルギニン置換変異体よりも安定であることを証明した(表27-4参照のこと)。
【０８２８】
HDL洗剤の中に使われているもう一つのアニオン界面活性剤はAESである。野生型ASPは高濃度のAESの中においては不安定であることがわかった(表27-5参照のこと)。変異体SAP R18はAES中において野生型よりもより安定であることがわかった(表27-5参照のこと)。5 ％ AESによる活性の失活の割合はASPR18変異体よりも野生型の方が高いことがわかった(表27-6参照のこと)。これらの結果は、ASPのアルギニン残渣の置換が通常のアニオン洗剤におけるASPの安定性を改善することを示した。本発明を特定のアニオン洗剤又は変異体に限定することは意図しない。すなわち、洗剤の他に各種アニオン洗剤及び各種ASP変異体を本発明に用いることを意図する。
【０８２９】
【表１６２】
2007515164.tif 000164
【０８３０】
【表１６３】
2007515164.tif 000165
【０８３１】
【表１６４】
2007515164.tif 000166
【０８３２】
【表１６５】
2007515164.tif 000167
この表において、
R-1=R16Q/R35F/R159Q 
R-2=R159Q
R-3=R16Q/R123L 
R-7=R14L/R127Q/R159Q 
R-10B=R14UR179Q 
R-18=R123UR127Q/R179Q. 
R-21=R16Q/R79T/R127Q 
R-23=R16Q/R79T、である。
【０８３３】
【表１６６】
2007515164.tif 000168
【０８３４】
【表１６７】
2007515164.tif 000169
【０８３５】
実施例28
LAS洗剤の存在又は不存在下におけるASP自己分解部位の決定
LASの存在下あるいは不存在下におけるASP自己分解部位を決定するために行った試験を説明する。ASP自己分解はLAS(ドデシルベンゼンスルホン酸)含有及びLAS非含有緩衝液中で評価した。(それぞれMS及びMS/MSデータからの)各ペプチドの分子量及び各ペプチドの配列に基づいて自己分解ペプチドアサインメント(assingment)を決定した。
【０８３６】
(0.35μｇ/μLの濃度における)ASPは、0.1 ％ LAS(ドデシルベンゼンスルホン酸)を含む又は含まない100 mMトリスpH 8.6中でインキュベート(4℃)された。アリコートを0乃至30分間のインキュベーション時間の各ポイントで添加し、最終濃度が1％になるようにTAFを添加して自己分解を停止した。エレクトロスプレイ  タンデム  マス  スペクトロメトリ(LC-ESI-MS/MS)を装備した液体クロマトフィーによりアリコート(10μL)を解析した。HPLCシステム(モデル1100、アライントテクノロジーズ(Agilent  Technologies))、逆送カラム(バイダック(Vydac)C4、0.3mmID×150mm)と5μL/mlの流量で60分間で0乃至100％溶媒Bのグラジエント(250μL/分のポンプ流量からスタティックスプリット(static split)を用いて計算)とを用いてペプチドを解析した。溶媒Aは水の中に0.1％のギ酸を含み、溶媒Bはアセトニトリル中0.1％のギ酸を含む。
【０８３７】
マススペクトルは、イオンチトクロームCラップマススペクトロメータ(モデルLCQクラシック、テルモ)を用いて行った。このマススペクトロメーターは、最適検出域が785のm/Zに調整されており、2.5 kVスプレーボルテージ及び250 ℃のキャピラリー温度で操作された。マススペクトルは500ミリ秒の注入時間及び5ミクロスキャン(microscan)を必要とする。タンデムマススペクトルはデータ依存モードにおいて、35 ％の標準化された衝突エネルギーを用いて、最も強いピークを選択し、分割する。ペプチドの相対的定量化のために、ピークエリアを市販のソフトウェアを用いて決定した。自己分解ペプチドの同定はASP配列を含むデータベース上でデータベースサーチプログラム(TurboSequset、  テルモ)を実行することにより行った。酵素の選択を行わず、10000のスレッシュホールド、dtaファイルパラメータ(2.2のペプチドエラー、0.0のMS/MSエラー、両B.Yイオン)でデータベースの検索を行った。
【０８３８】
サンプル緩衝液中にLASを含まない場合、ASP切断は主に分子末端及び分子中央で見られた(Y9、F47、Y59、F165、Q174、Y176の位置、表28-1参照のこと)。観察されたペプチド及びインタクトASPの相対的な定量化データは試験の経過に従ってプロットした(図25のパネルAを参照のこと)。大部分のASPは無傷で残っており、わずか1％が切断されたペプチドの形態で観察された(タンパク質：ペプチドの比は99：1)。これらのデータはASPの大部分は、インタクトで折りたたまれた状態にあり、更なる自己分解に耐性を有することを示している。
【０８３９】
0.1％ LASを含むサンプル緩衝液中において、ASP切断はタンパク質のあらゆる位置で観察された(Y9、T40、F47、Y57、F59、R61、L69、F165、Q174、Y176の位置)。ASPの大部分は10分後にはペプチドの形態になっていた(図25、パネルB)。60分後、タンパク質：ペプチドの比は、＜1：99であった。このデータは、LAS洗剤の存在下において、ASPは折りたたまれておらず、配列のいたるところに広範な切断が生じていたことを示す。2の条件下で観察された自己切断部位について、以下の表にまとめた。この表において, このピリオド(periods)に先行する及び後に続くアミノ酸は自己分解ペプチドの直前及び直後のアミノ酸である。ピリオド(period)の間の配列は自己分解ペプチドが観察された配列を示している。
【０８４０】
【表１６８】
2007515164.tif 000170
【０８４１】
実施例29
ASPのLAS誘導性分解を減らすための可逆的阻害剤の使用
この実施例では、ASPのLAS誘導性分解を減らすための可逆的阻害剤の使用を説明する。ベンズアミド(BZA)はセリンプロテアーゼの可逆的阻害剤として知られている。前述の標準的なsucc-AAPF-pNAアッセイを用いて、以下の表29-1に示すように1000 mM(1M)において、BZAは約2μg/mlのASPの活性を完全に抑制した。
【０８４２】
【表１６９】
2007515164.tif 000171
【０８４３】
1 M BZA含有又は比含有の、0.1％のLASと約200μg/mlのASPを4日間インキュベートした。10μLのインキュベーションサンプルに990μLのアッセイ溶液を添加し、異なる時間ポイントで、酵素活性を測定した。上の表で参照される10 mMのBZAの濃度までは、酵素活性の減少は抑制されていなかった。それゆえ、活性のロスは、酵素の分解に依存している。以下で示す結果の様に、BZAを含まない0.1％のLASでインキュベーションされた酵素はすべて失活した(すなわち、酵素は分解された)。一方、1M BZA及び0.1％LASと共にインキュベーションした酵素はこの試験のタイムコースの終わりである4日目まで、活性を保持していた。このことは、ASP活性の抑制がLASによる分解を防ぐことを示す。
【０８４４】
【表１７０】
2007515164.tif 000172
【０８４５】
実施例30
変異ASPの試験
上で説明する試験に加えて、各種ASPの変異体に対する試験も行われた。これらの試験には実施例1で示す方法が用いられた。以下の表において、「変異体コード」は野生型アミノ酸配、アミノ酸配列の位置、及び置換アミノ酸を示す(すなわち、「F001A」は特定の変異体において、アミノ酸配列の1の位置に置けるフェニルアラニンがアラニンに置換されていることを示す)。
【０８４６】
ケラチン加水分解
上で説明するケラチンアッセイ(「マイクロタイタープレートにおけるケラチンプロテアーゼアッセイ」)において、この基質の上で活性を示したASP変異体のケラチン加水分解データを以下の表(表30-1)に示す。表の数値は野生型との比較値であり、上記アッセイ法に従い計算した。1以上の値は、WT ASPよりも良い活性を示している。
【０８４７】
【表１７１】
2007515164.tif 000173
【表１７２】
2007515164.tif 000174
【表１７３】
2007515164.tif 000175
【表１７４】
2007515164.tif 000176
【０８４８】
DMSアッセイ
以下に示す表は(表30-2)は、カゼインに対して改善された特異活性を有する変異体を示す。カゼインを基質としたときの全変異体の活性は上で説明するように決定された(「プロテアーゼの予備加熱を伴う又は伴わない、ジメチルカゼインを用いたプロテアーゼアッセイ(96ウェル)及び熱安定性アッセイ」)。表の値は、WT酵素の活性に対する各変異体の相対値である(すなわち、各値は、(変異体の活性)/(野生型の活性)の比である)。すべての変異体は1以上の相対値を有し、WTよりも良いことが示されている。
【０８４９】
【表１７５】
2007515164.tif 000177
【表１７６】
2007515164.tif 000178
【表１７７】
2007515164.tif 000179
【表１７８】
2007515164.tif 000180
【０８５０】
熱安定性アッセイ
以下に示すデータ(表30-3)は、これらの条件下におけるWTASPの熱安定性に対するASP変異体の熱安定性データの相対値である。特定の加温条件において、過熱前後のカゼイン活性を測定することによりこの安定性を決定した(上記「熱安定性アッセイ」参照のこと)。この表は、これらの条件下でのWTと比較した熱安定性を示す。式は(変異体残存活性)/(WT残存活性)である。1以上の値は野生型より高い熱安定性を示す。
【０８５１】
【表１７９】
2007515164.tif 000181
【表１８０】
2007515164.tif 000182
【表１８１】
2007515164.tif 000183
【表１８２】
2007515164.tif 000184
【０８５２】
BMI-LVJ 1パフォーマンスアッセイ
以下の表(表30-4)は、BMI-LVJ 1パフォーマンスアッセイにおいて選択された変異体のデータを示す(「プロテアーゼ性能の試験のためのマイクロスウォッチアッセイ」参照のこと)。この表は、変異体に対して上で説明したように計算したときにWT酵素と比較して改善された性能を示すパフォーマンインデックスを示す。1以上のパフォーマンスインデックスを示す変異体は、改善されたパフォーマンスを有する。
【０８５３】
【表１８３】
2007515164.tif 000185
【表１８４】
2007515164.tif 000186
【表１８５】
2007515164.tif 000187
【表１８６】
2007515164.tif 000188
【０８５４】
BMI-低pHパフォーマンスアッセイ
以下の表(表30-5)は、低pH条件下でミクロスウォッチアッセイ(microswatch assay)の基質に対するタイド(TIDE)(登録商標)を用いて選択された変異体の活性を示す(プロテアーゼパフォーマンス試験に対するミムロスウォッチアッセイ(microswatch assay)を参照のこと)。この表は、上で説明したように計算したときにWT酵素と比較して改善された性能を示す変異体のパフォーマンスインデックスを示す。1以上のパフォーマンスインデックスを示す変異体は、改善されたパフォーマンスを有する。
【０８５５】
【表１８７】
2007515164.tif 000189
【表１８８】
2007515164.tif 000190
【表１８９】
2007515164.tif 000191
【表１９０】
2007515164.tif 000192
【０８５６】
スクランブルエッグアッセイ(AWD)パフォーマンス
以下の表(表30-6)は、洗剤組成物Iを用いたスクランブルエッグパフォーマンスアッセイ(「スクランブルエッグアッセイ」参照のこと)において選択された変異体に対して得られたデータを提供する。この表は上で説明したように計算したときにWT酵素と比較して改善された性能を示す変異体のパフォーマンスインデックスを示す。1以上のパフォーマンスインデックスを示す変異体は、改善されたパフォーマンスを有する。
【０８５７】
【表１９１】
2007515164.tif 000193
【表１９２】
2007515164.tif 000194
【表１９３】
2007515164.tif 000195
【０８５８】
LAS安定性
以下の表(表30-7)は、WT-ASPとの比較において、改善された安定性を有する全ての変異体を示す。上で示すプロトコルに従い全ての変異体について試験し、計算を行った(「LAS安定性アッセイ」参照のこと)。これらの条件において、WTの平均値は10.59％の残存活性であった。これより高い残存活性を有数する全ての変異体はWT分子よりもLAS安定性が改善されていることを示す。
【０８５９】
【表１９４】
2007515164.tif 000196
【表１９５】
2007515164.tif 000197
【表１９６】
2007515164.tif 000198
【表１９７】
2007515164.tif 000199
【０８６０】
実施例31
ASPのクリーニング活性の決定
この実施例において、試験は各洗浄条件におけるASPの性質だけでなく、各種条件におけるASPのクリーニング活性を決定するために行った。
【０８６１】
各種洗剤製剤、洗浄水容量、洗浄水温度、及び洗浄時間の長さを含む幅広い洗浄条件が存在する。従って、プロテアーゼ等の洗浄組成物はこの様に各種条件に耐え、これらの条件において機能的であることが必要とされる。例えば、異なる地域で用いられる洗浄製剤は洗浄水中に存在する関連成分の濃度が異なる。例えばヨーロッパの洗剤は洗浄水の中に、3000-8000 ppmの濃度で洗剤成分が存在する。一方、日本では洗浄水の中の洗浄成分は通常800 ppm未満(例えば、667 ppm)である。北米、特に米国では洗浄水中の洗浄成分は約8000-2000 ppm(例えば、975 ppm)である。
【０８６２】
ラテンアメリカの洗剤は通常、高発泡性リン酸含有洗剤であり、ラテンアメリカにおいて用いられる洗剤は、洗浄水中に1500 ppm乃至6000 ppmの幅で洗剤成分が存在するし、洗剤成分の濃度は中程度から高濃度である。ブラジルの洗剤は、洗浄水中に約1500 ppmの洗剤成分を有する。しかしながら、ラテンアメリカに限定されない他の高発泡性リン酸含有洗剤使用地域は洗浄水に存在する洗浄成分が約6000 ppmまでの洗剤濃度システムを有する。
【０８６３】
世界中の典型的な洗浄溶液中の洗剤組成物の濃度は、例えば日本のように667ppmのような、約800ppm未満の(「低洗剤濃度地域」)から、975ppmの米国及び1500ppmのブラジルのような、約800ppmから約2000ppmの間の濃度(「中洗剤濃度地域」)、並びに約3000ppm乃至約8000ppmのヨーロッパ及び約6000ppmの高発泡性リン酸含有洗剤地域のような2000ppm以上の地域(「高洗剤濃度地域」)までと、様々である。
【０８６４】
典型的な洗浄条件の濃度は、経験的に決定されている。例えば、米国では、通常の洗濯機は約64.4 Lの洗浄溶液を入れることができる。従って、洗浄溶液を約975 ppmの洗剤濃度にするには、約62.79 gの洗剤を64.4 Lの洗浄用液に添加すればよい。この量は洗剤に付いている軽量カップを使用することにより定量的に水の中に投入することができる。
更なる例のように、地域が異なると洗浄温度も異なる。日本の洗浄水温度は、通常ヨーロッパよりも低い。例えば、北米及び日本の洗浄水温度は10℃乃至30℃である(例えば、約20℃)が、ヨーロッパの洗浄水温度は通常30℃乃至50℃(例えば、約40℃)である。
【０８６５】
更なる例において、地域が異なると水硬度も異なる。水硬度は、通常、Ca2+/Mg2+の混合物の1ガロン当たりのグレイン数で表す。硬度は水の中のカルシウム(Ca2+)及びマグネシウム(Mg2+)の量の測定値である。米国の大部分の水は硬水であるが、地域により硬度は変動する。中程度の硬度(60-120 ppm)乃至高い硬度(121-181 ppm)を有する水は60乃至17.1 ppmのミネラル硬度を有する(すなわち、ppmを17.1で除した値がUSガロン当たりのグレイン数への換算値となる)。表31-1に水硬度の幅を示す。
【０８６６】
【表１９８】
2007515164.tif 000200
【０８６７】
ヨーロッパの水硬度は、通常Ca2+/Mg2+混合物が、ガロンあたり10.5(例えば、10.5乃至20.0)グレイン以上である。北米の水硬度は通常日本の水硬度よりも高いが、ヨーロッパの水硬度よりも低い。例えば、北米水硬度は3乃至10グレイン、3乃至8グレイン、又は約6グレインである。日本の水硬度は通常北米よりも低く、通常4未満、例えば、混合Ca2+/Mg2+が1ガロン当たり3グレインである。
【０８６８】
本発明は少なくとも1の洗浄条件のセット及び通常多くの洗浄条件のセットにおいて、改善された洗浄性能を示すプロテアーゼ変異体を提供する。
【０８６９】
本明細書で述べるように、このプロテアーゼ変異体はミクロスウォッチアッセイを用いて、異なる洗剤タイプ及び異なる洗浄条件で性能をテストする(上で開示した、参照により本明細書に援用される米国継続出願09/554,992及び国際公開公報99/34011参照のこと)。プロテアーゼは同様に他の土壌基質に対しても試験された。
【０８７０】
ASPの洗浄活性を決定するために行った試験において、以下の方法を用いた。ヨーロッパ条件については40℃で、日本条件については20℃になるようにインキュベーター(イノーバ(Innova) 4330モデルインキュベーター、ニューブラウンズイック)を予め加温しておいた。スイス連邦材料試験協会(Swiss Federal Laboratories for Material Testing)及びCFTリサーチ(CFT Research)から得られた血液-牛乳-インク汚れ見本(EMPA116)を60℃において30分間0.03％の過酸化水素に曝すことにより前処理しその後乾燥させた。乾燥させた見本を1/4”直径の円形に切断し96マイクロタイタープレートの1ウェル当たりに1つカットした円形切断見本を縦に置いた。
【０８７１】
ASPのプロテアーゼサンプルは、0.005 % Tween(登録商標)-80中10 mMのNaClで希釈し、10 ppm(タンパク質)の濃度とした。「北米洗浄条件」を提供するために、漂白剤を含まないタイド(TIDE)(登録商標)洗濯洗剤(プロクター＆ギャンブル)を脱イオン水1リットルあたり1グラムの濃度で溶解し、カルシウム及びマグネシウムの濃縮ストック溶液を、1ガロンあたり6グレインになるように添加した。「ヨーロッパ洗浄条件」を提供するために、脱イオン水1リットル当たり7.6グラムの漂白剤を含まないアリエール(登録商標)レギュラー洗濯洗剤(プロクター＆ギャンブル)溶液を調整し、カルシウム及びマグネシウムのストック溶液を最終水硬度が1ガロン当たり15グレインになるように添加した。「日本洗浄条件」を提供するために、脱イオン水1リットル当たり0.67グラムの漂白剤を含まないピュアークリーン洗濯洗剤(プロクター＆ギャンブル)を調製し、カルシウム及びマグネシウムの濃縮ストック溶液を1ガロンあたり3グレインの最終水硬度になるように添加した。
【０８７２】
「アメリカの洗剤製剤を用いて日本の洗浄条件」を提供するために、漂白剤を含まない洗剤組成物IIIを0.66グラムを1リットルの脱イオン水を用いて調整し、カルシウム及びマグネシウムの濃縮ストック溶液を最終水硬度を1ガロン当たり3グレインになるように添加した。
【０８７３】
洗剤溶液を15分間混合し、その後、0.2ミクロンのセルロースアセテートフィルターを通した。個々の洗剤溶液190μLをマイクロプレートの適切なウェルに添加した。その後、酵素の最終濃度が0.25乃至3.0 ppm(ミリリットル当たりのマイクログラム数)になるようにフィルター処理した洗剤溶液に10μLの酵素調製溶液を添加した。漏れを起こさないようにマイクロプレートを密閉し、20℃、350/400 RPMにセットしたインキュベーター/シェーカーのホルダー内に置き、1時間振とうした。
【０８７４】
その後プレートをインキュベーター/シェーカーから取り出し、100μLの溶液を各ウェルから採取し、新しいコスター(Costar)マイクロタイタープレート上においた。マイクロタイタープレートリーダー(スペクトロマックス(SpectraMax)340、モレキュラーデバイス(Molecular Device))の上の各アリコートの波長405 nmにおける吸光度を読み、記録した。表31-2にマイクロスウォチアッセイにおける洗剤組成物及びインキュベーション条件を定義する。
【０８７５】
【表１９９】
2007515164.tif 000201
【０８７６】
ピュアフェクト(PURAFECT)(登録商標)(ジェネンコー)、オプティマス(OPTIMASTM )(ジェネンコー)、リラース(RELASETM)(ジェネンコー; GG36-変異体、上記)、 及びASPの各濃度における405nmの吸光度を記載する用量反応曲線を図23-27に提供する。
【０８７７】
図26に記載するように、北米条件下では、液体タイド(TIDE)(登録商標)洗剤において、同じ条件下におけるピユアフェクト(PURAFECT)(登録商標)、リラース(RELASETM)及びオプティマス(OPTIMASETM)プロテアーゼと比較してASPプロテアーゼの洗浄性能が高められていることが示された。日本洗浄条件下で洗浄組成物III粉末(0.66 g/l)を用いた試験では、ASPは、同じ条件においてPURAFECT(登録商標)、リラース(RELASETM)及びオプティマス(OPTIMASETM)プロテアーゼと比較して同じかまたはより高い洗浄能力を示した(図27参照のこと)。ヨーロッパ洗浄条件下において、アリエール(登録商標)レギュラー粉末洗剤を用いた試験において、同じ条件下でPURAFECT(登録商標)、リラース(RELASETM)及びオプティマス(OPTIMASETM)プロテアーゼと比較してASPプロテアーゼは高められた洗浄性能を示した。両テストにおいて、ASP及びオプティマス(OPTIMASETM)は、ピュアフェクト(PURAFECT(登録商標))及びリラース(RELASETM)と比較して2乃至10倍の吸光度でを示した。日本の条件下において、ピュアクリーン(PURE CLEAN)粉末洗剤(図29参照のこと)において、ASPプロテアーゼは同じ条件下でピュアフェクト(PURAFECT(登録商標))、リラース(RELASETM)及びオプティマス(OPTIMASETM)プロテアーゼと比較してかなり高い洗浄性能を示した。
【０８７８】
北米条件において、洗浄組成物III粉末洗剤(図30参照のこと)、ASPプロテアーゼは同じ条件下でピュアフェクト(PURAFECT(登録商標))、リラース(RELASETM)及びオプティマス(OPTIMASETM)ププロテアーゼと比較してかなり高い洗浄性能を示した。
【０８７９】
実施例32
液体布洗浄組成物
この実施例は、本発明と組み合わせて使用することができる液体布洗浄組成物を提供する。これらの組成物は繊細及び/又はデリケートな布の洗浄を含む製品に対してだけでなく、日本における機械洗浄条件で用いることも意図する。表32-1に適切な組成物を適用する。しかしながら、本発明を特定の洗剤製剤に限定することは意図しないので、本発明には多くの他の洗剤製品も用いることができる。
【０８８０】
【表２００】
2007515164.tif 000202
【０８８１】
実施例33
液体食器洗浄組成物
この実施例は、本発明と組み合わせて用いる液体食器洗浄組成物を提供する。これらの組成物は日本の食器洗浄条件下に特に用いることを意図している。表33-1に適した組成物を示す。しかしながら、多くの他の洗剤製剤が本発明に用いることができるので、本発明を特定の洗剤製剤に限定することは意図しない。
【０８８２】
【表２０１】
2007515164.tif 000203
【０８８３】
実施例34
液体布洗浄組成物
本発明のプロテアーゼは洗浄組成物において特定の使用が見出される。例えば、本発明に従って日本における機械洗浄条件において特に有用な液体布洗浄組成物を調製することができる。幾つかの好ましい態様において、これらの組成物は表34-1に示す以下の成分を含んでいる。
【０８８４】
【表２０２】
2007515164.tif 000204
【０８８５】
実施例35
顆粒布洗浄組成物
この実施例では、本発明に使用することができる各種顆粒布洗浄組成物を提供する。以下の表は適切な組成物を示す。しかしながら、これ以外の多くの他の洗剤製剤を本発明に使用することができるので、本発明を特定の製剤に限定するするとは意図しない。
【０８８６】
【表２０３】
2007515164.tif 000205
【０８８７】
【表２０４】
2007515164.tif 000206
【０８８８】
以下で提供する洗濯洗剤組成物はヨーロッパの機械洗浄条件下での使用を特に意図したものである。
【０８８９】
【表２０５】
2007515164.tif 000207
【０８９０】
実施例36
洗剤製剤
この実施例では、ASP及びASP変異体と共に用いることができる各種洗剤製剤を提供する。このセクションで提供されるテスト方法は、本発明の個々のパラメータの値を決定するために用いられなければならない。
【０８９１】
例示された洗剤組成物において、酵素は組成物の総量に対する精製酵素の重量で表し、違った形で定義しない限り、洗剤の原料は、組成物の総重量に対して表す。略記された成分表示の意味を以下に示す。
【０８９２】
表36-1  本実施例で用いられる定義
LAS                ：  長鎖状C11-13アルキルベンゼン硫酸ナトリウム
TAS                ：  タロ-アルキル硫酸ナトリム
CxyAS              ：  C1X-C1Yアルキル硫酸ナトリウム
CxyEz              ：  平均ｚモルのエチレンオキシドで濃縮したC1X-C1Yの主に長鎖状第一アルコール
CxyAEzS            ：         平均ｚモルのエチレンオキシドで濃縮したC1X-C1Yのアルキル硫酸ナトリウム  実施例に分子名を追加した。
非イオン性         ：  混合エトキシ化/プロポキシ化脂肪族アルコール例えば、平均3.8エトキシ化及び4.5プロポキシ化されたアルコールのプラファックLF404
QAS                ：  R2・N+(CH3)2(C2H4OH)ここでR2＝C12-C14
ケイ酸                ：      アモルファスケイ酸ナトリウム(SiO2：Na2O比＝1.6乃至3.2：1)
メタケイ酸         ：  メタケイ酸ナトリウム(SiO2：Na2O比＝1.0)
ゼオライトA        ：  式：Na12(AlO2SiO2)12・27H2Oの水和ケイ酸アルミニウム
SKS-6              ：  式δ-Na2SiO2O5の結晶層状ケイ酸
硫酸               ：  無水硫酸ナトリウム
SIPP               ：  トリポリリン酸ナトリウム
MA/AA              ：  平均分子量約70,000-80,000の4：1アクリル酸/マレイン酸ランダムコポリマー
AA                 ：  平均分子量4,500のポリアクリル酸ナトリウムコポリマー
ポリカルボキシレート   ：      分子量4,500のアクリル酸コポリマーであるBASF社より市販で入手できるソコラン(Sokolan)のような、2,000-80,000の範囲の分子量を有するアクリル酸、マレイン酸、及びメチルアクリル酸のようなカルボキ化したモノマー混合物を含むコポリマー
BB1                ：  3-(3,4-ジヒドロイソキノリニウム)プロパン硫酸
BB2                ：  1-(3,4-ジヒドロイソキノリニウム)デカン-2-硫酸
PB1                ：  過ホウ酸ナトリウム・一水和物
PB4                ：  命名式NaBO3・4H2Oの過ホウ酸ナトリウム・四水和物
過炭酸             ：  命名式2Na2CO3・3H2O2過炭酸ナトリウム
TAED               ：  テトラアセチルエテンジアミン
NOBS               ：  ナトリウム塩の形のノナノイロキシベンゼン硫酸
DTPA               ：  ジエテントリアミン五酢酸
HEDP               ：  1,1-ヒドロキシユタンジリン酸
DETPMP             ：  商品名デケスト(Deguest)2060でモンサント社が販売するジエチルトリアミンペンタ(メチル)リン酸
EDDS               ：  ナトリウム塩の形のエチレンジアミン-N-N’-ジコハク酸(S,S)異性体
ジアミン           ：  ジメチルアミノプロピルアミン、1.6-ヘザンジアミン、1,3-プロパンジアミン、2-メチル-1.5-ヘプタンジアミン、1,3-ペンタンジアミン、1-メチル-ジアミノプロパン
DETBCHD            ：  5,12-ジエチル-1,5,8,12-テトラアザビシクロ[6,6,2]ヘキサデカンジクロライド・Mn(11)塩
PAAC               ：  酢酸ペンタアミン・コバルト(III)塩
パラフィン         ：  ウインターシャル(Wintershall)社の商品名ウィノグクロで販売されるパラフィン油
パラフィン硫酸     ：  幾つかの水素原子が硫酸基で置換されたパラフィン油又はワックス
アルドースオキシダーゼ ：      ノボザイムAS社の商品名アルドースオキシダーゼで販売されるオキシダーゼ酵素
ガラクトースオキシダーゼ       ：      シグマ社のガラクトースオキシダーゼ
プロテアーゼ       ：  ノボノルディクスA/S社の商品名サビナーゼ、アルカラーゼ、エバラーゼで販売される蛋白分解酵素、及びジェネンコー・インターナショナル社の以下のもの。US RE  34,606の図1A、1B及び7及び11欄11-37行目に記載される「プロテアーゼA」、US 5,955,340及びUS 5,700,676の図1A、1B及び5及び表1で記載される「プロテアーゼB」及び、US 6,312,936及びUS 6,482,628の図1-3配列番号3、及び25欄12行で記載される「プロテアーゼC」、WO99/20723で記載される変異体、101G/103A/104I/159D/232V/236H/245R/248D/252K、(BPN’番号)である「プロテアーゼD」
アミラーゼ       ：    ジェネンコーにより販売されるWO 94/18314、WO 96/05295に記載の商品名プラファクト（登録商標）OxAmであるデンプン分解酵素。全てノボザイムA/S社より入手できるナタラーゼ（登録商標）、テルマミル（登録商標）、ファンガミル（登録商標）、及びデゥラミル（登録商標）
リパーゼ         ：    ノボザイムA/S社の商品名リポラーゼ、リポラーゼウルトラ、及びジスト−ブロカデス(Gist-Brocades)社のリポマックスで市販される脂肪分解酵素
セルラーゼ         ：  ノボザイムA/S社の商品名カレザイム、セルザイム、及び/又はエンドゲラーゼで販売されるセルロース分解酵素
ペクチンリアーゼ   ：  ノボザイムA/S社より入手できるペンタウェイ（登録商標）及びペンタウォッシュ（登録商標）
PVP                ：  平均分子量60,000のポリビニルピロリドン
PVNO               ：  平均分子量50,000のポリビニルピリジン-N-オキシド
PVPVI              ：  平均分子量20,000のビニルイミダゾール及びビニルピロリドンのコポリマー
光沢剤 1              ：      4,4’-ビス(2-スルホスチリル)ビフェニル2ナトリウム
シリコン防泡剤     ：  泡調整剤と分散剤の比が10：1から100：1である分散剤としてのシロキサンオキシアルケン・コポリマーを含むポリジメチルシロキサン泡調整剤
泡抑制剤           ：  顆粒状の12％シリコン/シリカ、18％ステアリルアルコール、70％デンプン
SRP1               ：  アニオン性に末端修飾されたポリエステル
PEG X              ：  Xの分子量のポリエチレングリコール
PVP K60（登録商標）    ：      ビニルピロリドン・ホモポリマー(平均分子量160,000)
Jeffamine（登録商標）ED-2001   ：      ハンツマン社のキャップ化ポリエチレングリコール
Isachem（登録商標）AS  ：      エニケム社のアルキル硫酸分岐アルコール
MME PEG(2000)      ：  フルカヘミーAS社のモノメチルエーテルポリエチレングリコール(分子量2000)
DC3225C            ：  ダウ・コーニング社のシリコン泡抑制剤であるシリコン油とシリカの混合剤
TEPAE              ：  テトラエチレンペンタアミン・エトキシレート
BTA                ：  ベンゾトリアゾール
ベタイン           ：  (CH3)3N+CH2COO-
シュガー           ：  工業グレードD-グルコース又は食品グレード砂糖
CFAA               ：  C12-C14アルキルN-メチルグルカミド
TPKFA              ：  C12-C14先端部除去脂肪酸
クレイ             ：  一般式Al2O3SiO2・XH2Oの水和ケイ酸アルミニウム。タイプはカオリナイト、モントモリロナイト、アタパルガイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイト
pH                 ：  20℃の蒸留水の1％溶液として測定した。
【０８９３】
以下の表(表36-2)は、調製された液体洗濯洗剤組成物を提供する。
【０８９４】
【表２０６】
2007515164.tif 000208
【０８９５】
以下の表(表36-3)は、調製された手洗い用食器液体洗剤組成物を提供する。
【０８９６】
【表２０７】
2007515164.tif 000209
【０８９７】
これらの組成物のpHは約8乃至約11である。
【０８９８】
表36-4は、調製された液体自動食器洗浄洗剤組成物を提供する。
【０８９９】
【表２０８】
2007515164.tif 000210
【０９００】
表36-5は、顆粒又は錠剤形態に調製された洗濯用洗浄組成物を提供する。
【０９０１】
【表２０９】
2007515164.tif 000211
【０９０２】
表36-6は、調製された液体洗濯洗剤組成物を提供する。
【０９０３】
【表２１０】
2007515164.tif 000212
【０９０４】
表36-6
*漂白剤/ダイ/SRP1/カルボキシメチルセルロースナトリウム/退色剤/MgS04/PVPVI/消泡剤/高分子PEG/クレイ
【０９０５】
表36-7は、コンパクト濃縮食器洗浄洗剤組成物を提供する。
【０９０６】
【表２１１】
2007515164.tif 000213
*漂白剤/ダイ/SRP1/カルボキシメチルセルロースナトリウム/退色剤/MgS04/PVPVI/消泡剤/高分子PEG/クレイ
上記組成物のpHは約9.6乃至11.3である。
【０９０７】
表36-8は、標準的な12ヘッドロータリープレスを用いて13 KN/cm2の圧力で顆粒食器潜在組成物を圧縮することにより調製された本発明のタブレット洗剤組成物を提供する。
【０９０８】
【表２１２】
2007515164.tif 000214
*漂白剤/ダイ/SRP1/カルボキシメチルセルロースナトリウム/退色剤/MgS04/PVPVI/消泡剤/高分子PEG/クレイ
これらの組成物のpHは約10乃至約11.5である。
これらの組成物のタブレット重量は約20グラム乃至約30グラムである。
【０９０９】
表36-9は、調製された本発明の液体硬質表面洗浄組成物を提供する。
【０９１０】
【表２１３】
2007515164.tif 000215
これらの組成物のpHは約7.4乃至9.5であった。
【０９１１】
実施例37
ASPを含む動物飼料
本発明はASPを含む動物飼料も提供する。この例において、家禽に適した飼料がそのような飼料の1つとして提供される。しかしながら、本発明のプロテアーゼは多くの飼料用製剤に使用することができるので、本発明をこの特定の飼料用製剤に限定することは意図しない。本発明の飼料は家畜(例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ等)だけでなく、愛玩動物(例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ゲッ歯動物等)含むがこれらに限定されない任意の動物への投与に適している。以下の表は、3週齢までのシチメンチョウのヒナに投与するのに適したマッシュ、すなわち、メイズベースのデンプン飼料を示す。
【０９１２】
【表２１４】
2007515164.tif 000216
【０９１３】
いくつかの態様において、本発明のプロテアーゼを各種濃度でこの飼料製剤に補う(例えば、2,000単位/kg、4,000単位/kg、及び6,000単位/kg)。
【０９１４】
本明細書中で言及する全ての特許及び文献は本発明の技術分野における出願時の技術常識を示している。全ての特許及び文献が明確かつ別個に示している内容を参照により本発明の明細書に援用する。しかしながら、引用されるあらゆる刊行物が本発明に対する従来技術であると解釈すべきではない。
ここで説明されている本発明の好ましい態様をもって、開示された態様に対する各種変更がなされ、そのような変更は本発明の範囲内であることは当業者に明らかである。
本発明は課題を実行するために最適化されており、本明細書に内在するものだけでなく、目標及び有利な結果を得るために適していることを当業者は容易に理解する。本明細書で開示されている組成物及び方法は好ましい態様の代表例であり、例示であり、本発明を限定するものではない。当業者が本明細書に開示されている発明の各種置換、及び変更を本発明の範囲及び精神から逸脱することなくなしうることは明らかである。
本明細書で例示する発明は、本明細書で特に開示されていない、構成要素、限定を伴わずに実行することができる。採用された文言及び表現は説明のために用い、限定のために用いるものではない。しかしながら、それらが示す、あるいは、それらの一部の特徴を有するあらゆる等価物を含む文言及び表現の使用を意図するものではない。したがって、本発明は好ましい態様を追加的な特徴により構成されるものであり、そのような変更及び変法は明示の請求項により定義される発明の範囲内である。
この発明は、本明細書に幅広く一般的に記載されている。開示されている属のより狭義の又は亜種グループも本発明の一部を構成する。これは、削除された物質がとくに本発明に引用されたかどうかは別として、この属から除去する旨の規定又は負の限定を伴う本発明の包括的な記載を含む。
【図面の簡単な説明】
【０９１５】
図面の簡単な説明
【０９１６】
【図１】図１は、セルロモナダシアエ科のなかま及びミクロコシニアエ亜目の他の関連する属に対する新規６９Ｂ４株の関係を表す未確立の系統樹を示す図である。
【図２】図２は、ＡＳＰプロテアーゼの系統樹を示す図である。
【図３】図３は、セルロモナス６９Ｂ４株由来プロテアーゼのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図４】図４は、セルロモナス・フラビゲナ由来のＮ末端が最もトリプティック（tryptic）なペプチドの配列を示す図である。
【図５】図５は、ｐＳＥＧＣＴベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図６】図６は、ｐＳＥＧＣＴ６９Ｂ４ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図７】図７は、ｐＳＥＡ４６９ＢＣＴベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図８】図８は、ｐＨＰＬＴ−Ａｓｐ−Ｃ１−１ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図９】図９は、ｐＨＰＬＴ−Ａｓｐ−Ｃ１−２ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図１０】図１０は、ｐＨＰＬＴ−Ａｓｐ−Ｃ２−１ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図１１】図１１は、ｐＨＰＬＴ−Ａｓｐ−Ｃ２−２ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図１２】図１２は、ｐＨＰＬＴ−ＡＳＰ−ＩＩＩベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図１３】図１３は、ｐＨＰＬＴ−ＡＳＰ−ＩＶベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図１４】図１４は、ｐＨＰＬＴ−ＡＳＰ−ＶＩＩベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図１５】図１５は、ｐＸＸ−Ｋｐｎｌベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図１６】図１６は、ｐ２ＪＭ１０３−ＤＮＮＰ１ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図１７】図１７は、ｐＨＰＬＴベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図１８】図１８は、開裂ｐＨＰＬＴ−ＡＳＰ−Ｃ１−２用のマップおよびＭＸＬ−ｐｒｏｍ配列を示す図である。
【図１９】図１９は、ｐＥＮＭｘ３ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図２０】図２０は、ｐｌＣａｔＨベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図２１】図２１は、ｐＴＲＥＸ４ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図２２】図２２は、ｐＳＬＧＡＭｐＲ２ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図２３】図２３は、ｐＲＡＸｄｅｓ２−ＡＳＰベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図２４】図２４は、ｐＡＰＤＩベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図２５】図２５は、ＡＳＰ自己消化を示すグラフである。パネルＡは、ＬＡＳを含有しない緩衝液中で観察されるＡＳＰ自己消化ペプチドを示す。パネルＢは、０．１％ＬＡＳ含有する緩衝液中で観察されるＡＳＰ自己消化ペプチドを示す。
【図２６】図２６は、特定のセリンプロテアーゼの洗浄活性（４０５ｎｍにおける吸光度）−用量（ｐｐｍ）応答曲線を比較したグラフである。（北米洗浄条件下における液体ＴＩＤＥR洗剤中の６９Ｂ４［-×-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-◆-］；ＲＥＬＡＳＥTM［-▲-］；およびＯＰＴＩＭＡＳＥTM［-■-］）
【図２７】図２７は、特定のセリンプロテアーゼの洗浄活性（４０５ｎｍにおける吸光度）−用量（ｐｐｍ）応答曲線を比較したグラフである。（日本洗浄条件下における洗剤組成物III粉末洗剤（０．６６ｇ／Ｌ）北米濃度／洗剤製剤中の６９Ｂ４［-×-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-◆-］；ＲＥＬＡＳＥTM［-▲-］；およびＯＰＴＩＭＡＳＥTM［-■-］）
【図２８】図２８は、特定のセリンプロテアーゼの洗浄活性（４０５ｎｍにおける吸光度）−用量（ｐｐｍ）応答曲線を比較したグラフである（欧州洗浄条件下におけるＡＲＩＥＬRＲＥＧＵＬＡＲ洗剤粉末中の６９Ｂ４［-×-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-◆-］；ＲＥＬＡＳＥTM［-▲-］；およびＯＰＴＩＭＡＳＥTM［-■-］）。
【図２９】図２９は、特定のセリンプロテアーゼの洗浄活性（４０５ｎｍにおける吸光度）−用量（ｐｐｍ）応答曲線を比較したグラフである（日本条件下におけるＰＵＲＥ  ＣＬＥＡＮ洗剤粉末中の６９Ｂ４［-×-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-◆-］；ＲＥＬＡＳＥTM［-▲-］；およびＯＰＴＩＭＡＳＥTM［-■-］）。
【図３０】図３０は、特定のセリンプロテアーゼの洗浄活性（４０５ｎｍにおける吸光度）−用量（ｐｐｍ）応答曲線を比較したグラフである（北米条件下における洗剤組成物III粉末（１．００ｇ／Ｌ）中の６９Ｂ４［-×-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-◆-］；ＲＥＬＡＳＥTM［-▲-］；およびＯＰＴＩＭＡＳＥTM［-■-］）。
【図３１】図３１は、時間経過（分）による酵素活性パーセントの測定により様々なセリンプロテアーゼ（１００ｐｐｍ）の酸化不活性化を比較したグラフである（ｐＨ９．４５、２５℃において０．１Ｍ過酸化水素存在下の６９Ｂ４［-×-］；ＢＰＮ’変異体１［-◆-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-▲-］；およびＧＧ３６−変異体１［-■-］）。
【図３２】図３２は、時間経過（分）による酵素活性パーセントの測定により様々なセリンプロテアーゼ（１００ｐｐｍ）のキレーター不活性化を比較したグラフである（ｐＨ８．２０、４５℃において１０ｍＭＥＤＴＡ存在下の６９Ｂ４［-×-］；ＢＰＮ’変異体１［-◆-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-▲-］；およびＧＧ３６−変異体１［-■-］）。
【図３３】図３３は、時間経過（分）による酵素活性パーセントの測定により様々なセリンプロテアーゼ（１００ｐｐｍ）の温度不活性化を比較したグラフである（ｐＨ８．０、４５℃において５０ｍＭＴｒｉｓ存在下の６９Ｂ４［-×-］；ＢＰＮ’変異体１［-◆-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-▲-］；およびＧＧ３６−変異体１［-■-］）。
【図３４】図３４は、特定のセリンプロテアーゼの温度不活性化を比較したグラフである（ｐＨ８．６０、５７℃から６２℃への温度グラジエント条件下の６９Ｂ４［-×-］；ＢＰＮ’変異体１［-◆-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-▲-］；およびＧＧ３６−変異体１［-■-］）。
【図３５】図３５は、特定のセリンプロテアーゼ（２．５ｐｐｍ）の酵素活性（４０５ｎｍの吸光度で測定したジメチルカゼインの加水分解）を示すグラフである（３７℃、ｐＨ５〜ｐＨ１２条件下の６９Ｂ４［-×-］；ＢＰＮ’変異体１［-◆-］；ＰＵＲＡＦＥＣＴR［-▲-］；およびＧＧ３６−変異体１［-■-］）。
【図３６】図３６は、特定のセリンプロテアーゼ（２．５ｐｐｍ）の％残存活性（４０５ｎｍの吸光度で測定したジメチルカゼインの加水分解）により表される酵素安定性を示す棒グラフである（それぞれ２５℃、３５℃、および４５℃、下記のｐＨ３、４、５、および６条件下の６９Ｂ４、ＢＰＮ’変異体１、ＰＵＲＡＦＥＣＴR、およびＧＧ３６−変異体１）。
【図３７】図３７は、それぞれ２５℃、３５℃、および４５℃、ｐＨ３（-◆-）、４（-■-）、５（-▲-）、および６（-×-）条件下のＢＰＮ’変異体１の％残存活性により表される酵素安定性を示すグラフである。
【図３８】図３８は、それぞれ２５℃、３５℃、および４５℃、ｐＨ３（-◆-）、４（-■-）、５（-▲-）、および６（-×-）条件下のＰＵＲＡＦＥＣＴRＴＭプロテアーゼの％残存活性により表される酵素安定性を示すグラフである。
【図３９】図３９は、それぞれ２５℃、３５℃、および４５℃、ｐＨ３（-◆-）、４（-■-）、５（-▲-）、および６（-×-）条件下の６９Ｂ４プロテアーゼの％残存活性により表される酵素安定性を示すグラフである。
【図１】
2007515164.tif 000217
【図２】
2007515164.tif 000218
【図３】
2007515164.tif 000219
【図４】
2007515164.tif 000220
【図５】
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【図６】
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【図７】
2007515164.tif 000223
【図８】
2007515164.tif 000224
【図９】
2007515164.tif 000225
【図１０】
2007515164.tif 000226
【図１１】
2007515164.tif 000227
【図１２】
2007515164.tif 000228
【図１３】
2007515164.tif 000229
【図１４】
2007515164.tif 000230
【図１５】
2007515164.tif 000231
【図１６】
2007515164.tif 000232
【図１７】
2007515164.tif 000233
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2007515164.tif 000236
【図２１】
2007515164.tif 000237
【図２２】
2007515164.tif 000238
【図２３】
2007515164.tif 000239
【図２４】
2007515164.tif 000240
【図２５】
2007515164.tif 000241
【図２６】
2007515164.tif 000242
【図２７】
2007515164.tif 000243
【図２８】
2007515164.tif 000244
【図２９】
2007515164.tif 000245
【図３０】
2007515164.tif 000246
【図３１】
2007515164.tif 000247
【図３２】
2007515164.tif 000248
【図３３】
2007515164.tif 000249
【図３４】
2007515164.tif 000250
【図３５】
2007515164.tif 000251
【図３６】
2007515164.tif 000252
【図３７】
2007515164.tif 000253
【図３８】
2007515164.tif 000254
【図３９】
2007515164.tif 000255
【国際調査報告】
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