(57)【要約】  本発明は、電子移動解離の使用による質量分析計における新規のイオン断片化方法ならびに質量分析によるペプチドおよびタンパク質の配列分析方法に関する。ペプチドの場合、本発明により、ペプチド骨格に沿った断片化が促進され、ＲＦ場デバイスの使用によってサンプル（修飾アミノ酸残基が含まれる）のアミノ酸配列を予想することが可能になる。
2007529014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多価カチオンの解離方法であって、
多価カチオンをＲＦ電場イオン封じ込めデバイスに導入する工程と、
前記イオン封じ込めデバイスに気相電子移動試薬アニオンを導入する工程と、
解離生成物カチオンを得るために、試薬アニオンまたはその誘導体試薬イオンから多価カチオンまたはその誘導体多価カチオンへの電子移動を促進するために、導入された前記試薬アニオンまたはその誘導体試薬イオンおよび多価カチオンまたはその誘導体多価カチオンを混合する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記多価カチオンがポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＦ電場イオン封じ込めデバイスがＲＦイオンガイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＦ電場イオン封じ込めデバイスがＲＦイオントラップである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＦイオントラップがＲＦ線形多重極イオントラップである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＦイオントラップがＲＦ三次元多重極イオントラップである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記混合工程中、導入された前記試薬アニオンまたはその誘導体試薬イオンおよび多価カチオンまたはその誘導体多価カチオンの運動エネルギーが１電子ボルト未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アニオンおよび多価カチオンの運動エネルギーを前記混合工程のための熱レベル付近に減少させるために、バックグラウンドガス分子との衝突を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アニオンをＲＦ線形多重極イオントラップの線形軸に沿って注入する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記気相アニオンが、多環芳香族炭化水素または置換多環芳香族炭化水素から生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記気相アニオンが、アントラセン、９，１０ジフェニルアントラセン、ナフタレン、フルオレン、フェナントレン、ピレン、フルオランテン、クリセン、トリフェニレン、ペリレン、アクリジン、２，２’ジピリジル、２，２’ジキノリン、９−アントラセンカルボニトリル、ジベンゾチオフェン、１，１０’−フェナントロリン、９’アントラセンカルボニトリル、およびアントラキノンからなる群から選択される低電子親和力基質から生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記解離生成物カチオンの質量（ｍ／ｚ）を分析し、前記解離生成物カチオンに由来するイオンを検出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記イオントラップが、セグメント化された線形ＲＦ多重極イオントラップである、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記気相アニオンが、多環芳香族炭化水素化合物または置換多環芳香族炭化水素化合物から生成されたラジカル気相アニオンである、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記多価ポリペプチドおよび気相アニオンが、前記混合工程までイオントラップ内で空間的に分離されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記多価ポリペプチドカチオンおよび気相アニオンが、前記混合工程までイオントラップ内で空間的に分離されている、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
電子移動型解離経路を介した前記非解離電荷減少電子伝達生成物カチオンの解離を促進するために、十分なエネルギーを非解離電荷減少電子移動生成物カチオンに供給して、従来の衝突活性化解離生成物の２０％未満を得る、さらなる活性化工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
電子移動型解離経路を介した前記非解離電荷減少電子伝達生成物カチオンの解離を促進するために、十分なエネルギーを非解離電荷減少電子移動生成物カチオンに供給して、従来の衝突活性化解離生成物の５％未満を得る、さらなる活性化工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記さらなる活性化工程が、アニオンと正電荷の多価ポリペプチドイオンとを混合する工程後に行なわれる、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記活性化エネルギーを、光活性化形態または衝突活性化形態で供給する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
線形イオントラップ内の電子移動生成物カチオンを保持しながらＲＦイオントラップ由来の残存アニオンを放出する工程と、
従来の衝突活性化解離生成物の２０％未満が生成される衝突活性化を起こすために、電子移動生成物イオンを低エネルギーのオフ共鳴運動励起に供する工程と、
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
第２型のアニオンを線形イオントラップに導入する工程と、
前記第２型のアニオンをカチオンと混合して反応させる工程と、
をさらに含み、
前記第２型のアニオンがプロトンを実質的に排他的にカチオンに移動させる、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２のアニオン型が、カルボン酸、フェノール酸、およびアルコキシドを含有する化合物からなる群から選択される化合物に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２のアニオン型が、安息香酸、ＰＤＣＨ、ＳＦ６、およびＰＦＴＢＡからなる群から選択される化合物のアニオンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記電子移動解離生成物イオン、または前記電子移動解離生成物イオンの誘導体イオンの質量（ｍ／ｚ）を分析し検出する工程をさらに含む、請求項１、請求項２、請求項４、請求項２２、または請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドのアミノ酸配列を分析する方法であって、
多価ポリペプチドポリペプチドカチオンをＲＦイオントラップに導入する工程と、
気相アニオンをＲＦイオントラップに導入する工程と、
アニオンから多価ポリペプチドカチオンへの電子移動を促進するために前記気相アニオンと多価ポリペプチドカチオンとを混合し、それにより、電子移動解離生成物イオンの生成を誘導する工程と、
前記電子移動生成物カチオンから残存する気相アニオンを物理的に分離することによって反応を停止させる工程と、
前記トラップ中に残存するカチオンのｍ／ｚ分析を行う工程と、
を含む方法。
【請求項２７】
前記電子移動解離生成物カチオンが、前記ＲＦイオントラップからイオン検出器にｍ／ｚに応じて連続的に排出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記イオントラップが線形ＲＦ多価イオントラップである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記気相アニオンを前記線形イオントラップの線形軸に沿って注入する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ラジカル気相アニオンが、アントラセン、９，１０ジフェニルアントラセン、ナフタレン、フルオレン、フェナントレン、ピレン、フルオランテン、クリセン、トリフェニレン、ペリレン、アクリジン、２，２’ジピリジル、２，２’ジキノリン、９−アントラセンカルボニトリル、ジベンゾチオフェン、１，１０’−フェナントロリン、９’アントラセンカルボニトリル、およびアントラキノンからなる群から選択される低電子親和力基質から生成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
電子移動解離によってポリペプチドを解離する方法であって、
多価ポリペプチドアニオンをＲＦ電場イオン封じ込めデバイスに導入する工程と、
気相カチオンをＲＦ電場イオン封じ込めデバイスに導入する工程と、
アニオンからカチオンへの電子移動を促進するためにラジカル気相イオンとイオン化ポリペプチドとを混合し、それにより、陰電子移動解離生成物イオンの生成を誘導する工程と、
を含む方法。
【請求項３２】
前記カチオンが、不活性ガスカチオンからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記陰電子移動解離生成物イオンまたは前記陰電子移動解離生成物イオン由来のイオンの質量（ｍ／ｚ）を分析し、検出する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、合衆国法典第３５編１１９条（ｅ）項に基づいて、２００４年３月１２日出願の米国特許出願番号６０／５５２，８７６号および２００４年５月２０日出願の６０／５７２，８８４号（その開示が、本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
タンパク質およびペプチドの研究および特徴付けは、現代生物学のまさに重要な部分となっており、これ自体がプロテオミクスという名称を有する。質量分析は、ペプチドおよびタンパク質分析のために使用される最も重要な技術の１つとなっており、この分野で多数の異なる質量分析実験が行われている。本発明は、文献に以前に記載されている「ボトムアップ」または「トップダウン」技術のいずれかを使用したペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列を特徴づけるための質量分析の使用に関する。現在、これらの実験型のうちで最も広範に使用されているものは、「ボトムアップ」プロテオミクス実験である。しかし、本明細書中に記載の発明は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を利用する任意のプロテオミクス質量分析実験と同様に、「トップダウン」型試験の実施を有意に進行させる。
【０００３】
「ボトムアップ」型実験では、通常はいくつかの生体サンプル（細胞溶解物など）に由来し、それにより、数千種類ものタンパク質を桁違いの範囲の相対存在量で含む可能性のあるタンパク質の混合物を分析する。このようなタンパク質サンプルを、タンパク質分解酵素（典型的には、トリプシンまたはトリプシンとエンド−Ｌｙｓとの組み合わせ）で消化して、トリプシンペプチドの複合混合物が得られる（典型的には、消化によって約３０ペプチド／タンパク質が得られる）。消化工程後、一般に、サンプルを質量分析計に導入する前に、サンプルの清浄、分離、断片化、および／または化学的誘導化工程などの種々の工程が存在する。１つの実施形態では、プロセシングしたペプチドサンプルを、クロマトグラフィによって分離し、３つの異なる質量分析計型（ＦｉｎｎｉｇａｎＬＣＱ  ＤｅｃａまたはＬＣＱ  ＸＰ（ＲＦ  ３Ｄ四重極イオントラップ）、ＦｉｎｎｉｇａｎＬＴＱ（放射状排出ＲＦ  ２Ｄ四重極イオントラップ）、またはＦｉｎｎｉｇａｎＬＴＱ／ＦＴ装置（タンデムＲＦ  ２Ｄ四重極イオントラップ／フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計））の１つにおいてエレクトロスプレーイオン源に直接接続されたナノフローＨＰＬＣ（５〜２００ｎＬ／分）を用いて質量分析計に導入する。
【０００４】
エレクトロスプレーイオン源は、ＨＰＬＣカラムから溶離した中性サンプルペプチドを、質量分析計による分析のために気相でイオンに変換する。酸性水溶液では、トリプシンペプチドは、アミノ末端およびＣ末端アミノ酸の側鎖の両方（ＬｙｓまたはＡｒｇ）でプロトン化される。エレクトロスプレー化ペプチドが質量分析計に入るにつれて、水がポンピングにより除去され、正電荷のアミノ基が共に水素結合し、プロトンがペプチド骨格に沿ってアミド基に移動する。その結果、ＨＰＬＣから溶離された各トリプシンペプチド種の凝集体が、ペプチド骨格に沿って異なる部位でプロトン化したイオン化ペプチド分子の集合体に変換される。
【０００５】
１つの手順によれば、異なるペプチド種から生成されたイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルは、以下の一連の工程で得られる（フラグメントイオンのマススペクトル）。
１．ペプチドイオンを導入し、ＲＦ四重極イオントラップ（２Ｄまたは３Ｄ）に捕獲する。
２．選択したペプチド前駆イオン種に関連する質量電荷比（ｍ／ｚ）の狭い範囲外の全イオンを、トラップから排除する。
３．単離された前駆ペプチドイオンを動力学的に励起し、衝突誘起分解（ＣＡＤ）を受ける。
４．保持された生成物イオンを質量分析して、質量（ｍ／ｚ）スペクトルを得る。
【０００６】
工程２の間に、プロトン化ペプチドイオンは、数百回または数千回約１〜５ミリトールの圧力で存在するヘリウム原子と衝突する。このプロセス中に、イオンの内部エネルギーは、分子の骨格中のプロトン化アミド結合を破壊するのに必要な活性化エネルギーを超えるまで、少しずつ増加することによって増加する（このプロセスは、しばしば衝突誘起脱離（ＣＩＤ）ともいわれる）。理想的には、結果は、１つのアミノ酸によって質量が異なるｂ型およびｙ型フラグメントの集合体である。図１は、種々のペプチド骨格切断型を説明する用語を示す。ｂ型イオンは、アミノ末端および１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。ｙ型イオンは、カルボキシル末端および１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。１つのアミノ酸が異なる同型のフラグメントのｍ／ｚ値を引くことによって質量が得られ、それにより、２つのフラグメントの大きい方の余剰残基が同定される。このプロセスの継続により、ターゲティングされたペプチドの後方（ｙイオン）および前方（ｂイオン）のアミノ酸配列を読み取ることが可能である。熟練した分析者は、前駆ペプチドのアミノ酸配列の全部または一部を確認することができる。ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルとタンパク質および核酸のデータベース由来のペプチドの理論上のＭＳ／ＭＳスペクトルを比較して、各ＭＳ／ＭＳスペクトルについての起こり得る前駆ペプチド（およびその構造）のリストが得られるコンピュータプログラムも存在する。
【０００７】
典型的なサンプルは非常に複雑であり、それにより、何十または何百もの異なるペプチドがＬＣカラムから同時に溶離され得る。より大きな比率の同時溶離されたペプチド前駆体のＭＳ／ＭＳスペクトルを記録するための時間を装置に与えるために、ピークパーキングと呼ばれる手順を使用してクロマトグラフィを拡大し、サンプルピーク幅を１０秒から２００秒にすることができる。ピークパーキングの使用は、以前に文献に記載されており、当業者に公知である。一般に、実験を自動化し、この実験は、その後のＭＳ／ＭＳ分析のために前駆体ｍ／ｚピークを選択する（得られたｍ／ｚスペクトルの自動化分析による）第１の全スキャンＭＳ実験を含む配列マススペクトル実験の繰り返しを含む。装置の速度およびクロマトグラフィのピーク幅（各種の溶離の持続時間）に依存して、典型的には、３〜１０ＭＳ／ＭＳスペクトルのどこかに、最初のＭＳのみの実験から決定された前駆体ｍ／ｚ値が得られる。データに依存する前駆体ｍ／ｚ値の選択基準を、冗長なＭＳ／ＭＳスペクトル、公知のバックグラウンドのＭＳ／ＭＳスペクトル、および夾雑物のピークの記録を最小にするようにデザインする。１つのこのようなデータ依存性モードのＬＣ  ＭＳ／ＭＳ実験の持続時間は、３０分から４時間まで様々となる可能性があり、何千ものペプチドイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルが記録され得る。クロマトグラフィ運転の終了後、元の混合物中のタンパク質を、種々のタンパク質および核酸のデータベースに対するペプチド前駆体の記録されたＭＳ／ＭＳスペクトル組の処理によって同定する。データ分析のためのコンピュータプログラムは市販されており、ＳＥＱＵＥＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎから販売されている）およびＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）コンピュータプログラムが含まれる。日常的に、上記テクノロジーを使用した１回に４時間のクロマトグラフィ運転において６０００のトリプシンペプチド配列を得ることができる。複合混合物中に５〜１０ｆｍｏｌレベルで存在するペプチド（カラムにロードした）の同定は容易である。
【０００８】
これらのペプチドの複合混合物の分析のために、より多数の固有のＭＳ／ＭＳスペクトルを記録し、混合物をより完全に特徴づけ、元のタンパク質由来のペプチド部分（配列範囲）をより多くすることにより、より確実に同定される。したがって、１つのＭＳ／ＭＳスペクトルを得るための時間は重要である。約２秒未満でＭＳ／ＭＳスペクトルを得ることができない質量分析計またはＭＳ／ＭＳの実施方法は、「ボトムアップ」型プロテオミクス実験などのクロマトグラフィへの適用に不適切と見なされる。
【０００９】
生成物イオンの生成のためのＣＡＤの使用には欠点があり、以下が含まれる。
ａ）翻訳後修飾された（すなわち、リン酸化およびグリコシル化など）ペプチドは、しばしば、ペプチド骨格の切断によるよりもむしろ修飾の喪失によって断片化する。約（２０％〜３０％）の比較的比率の低いこれらのペプチドイオン前駆体型のみから説明可能な／検索可能な生成物イオンスペクトルを得られる。
ｂ）複数の塩基性アミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ）を含み、それにより２つを超える電荷を有するペプチドも、ペプチド骨格に沿って無作為に断片化することができず、それにより、上記テクノロジーによって分析した場合、不完全な配列情報が得られる。
ｃ）４０個を超えるアミノ酸を含むペプチドもまた、ペプチド骨格に沿って無作為に断片化することができない。これらによっても不完全な配列情報が得られる。
【００１０】
したがって、説明可能な／検索可能な生成物イオンスペクトルの適切なアレイを生成するための改良されたペプチドの断片化方法が必要である。気相でのプロトン化ペプチドおよびタンパク質の別の断片化ストラテジーは、１９９８年にＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ等によって提案された（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，３２６５−３２６６）。この技術は、プロトン化ペプチドと熱電子とが相互作用しながらこれら両方がフーリエ変換質量分析計のＩＣＲセル内に格納される工程を含む。このプロセスを、電子捕獲解離（ＥＣＤ）という。この解離プロセスについての最初に提案された機構は以下である。
【００１１】
多価ペプチド上のプロトン化アミン基（ＲＮＨ３＋）と熱電子との反応は約６ｅＶの発熱反応であり、中性超原子価窒素種（ＲＮＨ３・）を形成する（図２Ａ〜Ｃを参照のこと）。次いで、この化合物は、分子の振動様式を介したエネルギー非局在化と比較して短い時間規模で、ＲＮＨ２と水素ラジカル（Ｈ・）に解離する。水素ラジカルは、ペプチド骨格に結合し、切断反応を誘発して、同系列のａ型、ｃ型、ｙ型、およびｚ型のフラグメントイオンを生成する。ｃ型およびｚ型イオンが一般により豊富である。１つのアミノ酸が異なる所与のイオン系列内のフラグメントのｍ／ｚ値を再度引くことによって質量が得られ、それにより、２つのフラグメントの大きい方の余剰残基が同定される。このプロセスの継続により、ターゲティングされたペプチドの後方（ｙおよびｚイオン）および前方（ａおよびｃイオン）のアミノ酸配列を読み取ることが可能である。この移動性水素ラジカル機構が最初に提案されたので、種々の認められた欠点を説明する別の機構（ＥＣＤが多ナトリウム化された（ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ｓｏｄｉａｔｅｄ）タンパク質イオンおよびペプチドイオン（Ｈ＋よりもむしろＮａ＋の付加によってイオン化された）を等しく断片化する能力などの提案された機構）を提案した。
【００１２】
このアプローチの利点には、以下が含まれる。
１）翻訳後修飾された（リン酸化またはグリコシル化）ペプチドは、主に、ペプチド骨格結合で断片化し、質量分析によって容易に配列決定される。翻訳後修飾および他の側鎖部分を欠く断片化は、小さな副反応のみが認められるか、全く認められない。
２）多塩基性残基（それにより、気相内に２つを超える正電荷を有する）を含むペプチド、程度の差はあるが無作為なペプチド骨格に沿ったフラグメントでさえも容易に配列決定される。
３）ＥＣＤフラグメントは、分析されるペプチドのサイズに制限されない。ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙのグループは、現在、ＥＣＤを使用してインタクトなタンパク質の配列を確認し、インタクトな分子上の翻訳後修飾を位置づけることができるという多数の証拠を示している。
【００１３】
しかし、ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙの技術は、多数の欠点があり、以下が含まれる。
１．ＥＣＤ反応を起こすのに必要な熱運動エネルギー付近で陽イオンおよび電子を同時に閉じ込めることが非常に困難である。これは、つい最近まで、ＦＴ−ＩＣＲ質量分析計の高磁場内に位置づけられたＩＣＲセル中のみで行われていた。これらのＥＣＤ  ＩＣＲ装置は、典型的には、約４．７〜９Ｔｅｓｌａの磁場を得るために超伝導磁石を使用し、それにより、毎回５０〜１５０万ドルかかる。ほとんどのタンパク質配列分析は、現在、ＲＦ四重極イオントラップ、ＲＦ四重極線形トラップ、Ｑ−ＴＯＦ（四重極飛行時間型）、またはＴＯＦ−ＴＯＦ装置で行われている。ＣＡＤ中にイオンを含めるために従来から使用されている不均一なＲＦ場デバイス（ＲＦトラップおよびイオンガイド）が電子を閉じ込めないことが、ＦＴＩＣＲ以外の任意の質量分析計によるＥＣＤの実施を主に困難にしている。これは、電子の質量が非常に小さいことによる。これらのデバイスに注入された電子も、任意の効率でＥＣＤ反応が起こるのに十分な時間間隔で熱エネルギー付近で保持することができない。したがって、いくつかのグループが最近ＲＦイオントラップでのＥＣＤの実施を報告しているにもかかわらず、これらの実験の感度／フラグメントイオン収率は、ＥＴＤを使用して得られた結果よりも実質的に低い。
【００１４】
２．フーリエ変換装置でのＥＣＤは、あまり有効でない。本発明者らが承知している最も進んだ装置由来の最良のデータは、全（統合された）生成物イオンシグナルが前駆体の約２０％であることを示す（前駆体−生成物変換効率が２０％）。比較のために、ＣＡＤを使用する市販のイオントラップ装置は、日常的に、前駆体イオンに依存して、前駆体−生成物変換効率は５０〜１００％の範囲である。ペプチドイオンの前駆体−生成物変換効率は、一般に、この範囲の高い方である。ＲＦ多重極衝突セルを使用するＱ−ＴＯＦなどの装置の前駆体−生成物変換効率はいくらかより低いが、一般に、これらは依然として３０〜９０％の範囲である。
【００１５】
３．最も公開されているＥＣＤスペクトルは、数十の記録されたマススペクトルの平均（または和）である。典型的には、１つのＦＴ／ＩＣＲスペクトルを得るために約１秒かかる。これは、典型的には、妥当なシグナル−ノイズ比を有するＥＣＤ生成物−イオンスペクトルを記録するのに数十秒かかることを意味する。おそらく、検出可能なイオンシグナルを得るために少なくとも３０個のイオンを要する。対照的に、電子増幅ベースの検出器を使用したＲＦ四重極イオントラップおよびＱ−ＴＯＦ型装置は、１つのイオンを容易に検出する。
【００１６】
４．ＥＣＤのさらなる欠点は、前駆体イオンが巨大なペプチドイオンまたはタンパク質イオンである場合、所与の前駆体の生成物イオンは、しばしば、非共有結合（水素結合）によって互いに結合したままになり、ＥＣＤ実験条件下で解離できないことである。第２の解離工程は、これらの水素結合を破壊する必要があり、ＥＣＤ生成物イオン（ｃ型およびｚ型生成物イオン）が認められる。
【００１７】
本発明は、ＲＦ場質量分析計またはＲＦ場イオン封じ込めデバイスにおける正電荷ペプチドの新規の断片化方法および質量分析法によるペプチドおよびタンパク質の配列分析方法を提供する。本発明は、電子を正電荷サンプルイオンに移動させて正電荷サンプルイオンを断片化するための気相アニオンの使用を含む。
【発明の開示】
【００１８】
種々の実施形態の要旨
本開示は、質量分析計におけるイオンの新規の断片化方法および質量分析計によるペプチドおよびタンパク質の配列分析方法に関する。１つの実施形態によれば、ポリペプチドを、電子移動解離事象によってペプチド骨格に沿って無作為に断片化し、ここで標的ポリペプチドがイオン化し、四重極線形イオントラップに注入する。次いで、イオン化ポリペプチドと反対の電荷を有する１価または多価の気相イオンを、四重極線形イオントラップに注入し、気相イオンおよびイオン化ポリペプチドを制御された条件下で混合してアニオンからカチオンへの電子移動を促進し、それにより、電子移動解離生成物イオンの生成を誘導する。
【００１９】
１つの実施形態によれば、多価イオンの解離方法を提供する。この方法は、多価カチオンをＲＦ電場イオン封じ込めデバイスに導入する工程と、前記イオン封じ込めデバイスに気相電子移動試薬アニオンを導入する工程と、試薬アニオンまたはその誘導体試薬イオンから多価カチオンまたはその誘導体多価カチオンへの電子移動を促進するために、導入された前記試薬アニオンまたはその誘導体試薬イオンおよび多価カチオンまたはその誘導体多価カチオンを混合して解離生成物カチオンを得る工程とを含む。この実施形態では、イオンの混合は、電子移動が起こるように２つのイオン雲を重ね合わせる工程を含む。
【００２０】
１つの実施形態によれば、多価ポリペプチドイオンからの電子の移動（引き抜き）を含むイオン−イオン反応を使用して、ＲＦ電場イオン封じ込めデバイス内でポリペプチド分析イオンの陰電子移動解離（ＮＥＴＤ）を行う。ＥＴＤプロセスでは、多価ポリペプチド分析イオンは、カチオン（陽イオン）である。ＮＥＴＤプロセスでは、多価ポリペプチド分析イオンはアニオン（陰イオン）である。ＥＴＤと区別するために、用語「陰電子移動解離（ＮＥＴＤ）」を使用する。ＥＴＤおよびＮＥＴＤは、関与する分析イオンの反対の極性および分析物に対して反対の電子移動方向の両方によって示唆されるように、２つの個別の異なる解離促進イオン−イオン反応型を示す。
【００２１】
１つの実施形態によれば、イオン化ポリペプチドは多価脱プロトン化ペプチドであり、ラジカル気相イオンは、任意の不活性ガスカチオン（例えば、Ｈｅ、Ｎｅ、Ｘｅ、Ａｒ、Ｎ２＋、Ｏ２＋、ＣＯ＋）または任意の他のラジカルカチオン（多価プロトン化多環芳香族炭化水素など）からなる群から選択されるカチオンである。電子移動は、サンプル分子の断片化を引き起こすのに十分に発熱する。別の実施形態では、気相アニオンを使用して、正電荷のサンプルイオンに電子を移動する。このプロセスは、サンプル分子の断片化を引き起こすのに十分に発熱する。１つの実施形態によれば、ラジカル気相アニオンは１価または多価であり、これを２Ｄ多重極トラップの線形軸に沿って注入し、ポリペプチドイオン前駆体を、ラジカル気相アニオンと反対の方向から２Ｄ多重極トラップの線形軸に沿って注入する。
【００２２】
ペプチドの場合、本発明は、ペプチド骨格に沿った断片化を促進し、サンプルのアミノ酸配列を推定することが可能になる。１つの実施形態によれば、ポリペプチドのアミノ酸配列の分析方法を提供する。この方法は、四重極線形イオントラップに多価ポリペプチドを注入する工程と、第１の定義したイオントラップ領域中に多価ポリペプチドを空間的に単離する工程と、１価または多価のラジカル気相アニオンを四重極線形イオントラップに注入する工程と、前記アニオンを第２の定義したイオントラップ領域に空間的に単離する工程と、前記気相アニオンと前記多価ポリペプチドとを混合してラジカルアニオンから多価ポリペプチドへの電子移動を促進し、それにより、電子移動解離生成物イオンの生成を誘導する工程と、電子移動解離イオンから残存するラジカル気相アニオンを分離することによって反応を停止させる工程と、棒電極中のスロットを介してイオン検出器に電子移動解離生成物を連続的に共鳴して排出してイオンの質量分析およびポリペプチドのアミノ酸配列の決定を行う工程とを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
詳細な説明
定義
本明細書中で使用される、用語「ハロゲン」には、臭素、塩素、フッ素、およびヨウ素が含まれる。
【００２４】
本明細書中で使用される、用語「ハロアルキル」は、少なくとも１つのハロゲン置換基を有するアルキルラジカル（例えば、クロロメチル、フルオロメチル、またはトリフルオロメチルなど）をいう。
【００２５】
本明細書中で使用される、用語「Ｃ１〜Ｃｎアルキル（式中、ｎは整数である）」は、１つから規定数の炭素原子を有する分岐または直鎖アルキル基を示す。典型的には、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、およびヘキシルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書中で使用される、用語「アリール」は、１つまたは複数の芳香環を有する単環式または多環式炭素環系をいい、フェニル、ベンジル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニル、およびアントラセニルなどが含まれるが、これらに限定されない。任意選択的に置換されるアリールには、０〜４個の置換基を有するアリール化合物が含まれ、置換アリールには、１〜３つの置換基を有するアリール化合物が含まれ、ここで、置換基には、Ｃ１〜Ｃ４アリール、ハロ、またはアミノ置換基が含まれる。
【００２７】
用語「多環芳香族炭化水素」は、２つまたはそれ以上の芳香環を含む多環式炭素環系をいい、ナフタレン、フルオレン、フェナントレン、ピレン、フルオランテン、クリセン、トリフェニレン、ペリレン、アクリジン、２，２’ジピリジル、２，２’ジキノリン、９−アントラセンカルボニトリル、ジベンゾチオフェン、１，１０’−フェナントロリン、９’アントラセンカルボニトリル、およびアントラキノンが含まれるが、これらに限定されない。置換多環芳香族炭化には、１つまたは３つの置換基を有する置換多環芳香族炭化水素化合物であって、置換基には、アリール、ヘテロアリル、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ハロ、−ＣＮ、またはアミノ置換基が含まれる、置換多環芳香族炭化水素化合物が含まれる。
【００２８】
用語「複素環基」は、１つまたは複数のヘテロ原子を含む単環式または多環式炭素環系であって、ヘテロ原子が、酸素、硫黄、および窒素からなる群から選択される、単環式または多環式炭素環系をいう。
【００２９】
本明細書中で使用される、用語「ヘテロアリール」は、１つまたは複数のヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、およびＳなど）を含む１つまたは複数の芳香環を有する単環式または多環式炭素環系をいい、フリル、チエニル、およびピリジルが含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書中で使用される、用語「高分子」は、単量体単位またはその誘導体のポリマーをいい、天然に存在するポリマーだけでなく合成によって誘導されたポリマーが含まれる。高分子の例には、ポリペプチド、ポリサッカリド、および核酸が含まれる。
【００３１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、および「タンパク質」は、ポリマーの長さと無関係のアミノ酸のポリマーをいい、それにより、交換可能に使用される。この用語はまた、本発明のポリペプチドの化学修飾または発現後修飾を特定も排除もしないが、これらのポリペプチドの化学修飾または発現後修飾には、特定の実施形態として含まれるか排除され得る。ポリペプチドの修飾には、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基、およびユビキチン基などの共有結合が含まれ、用語「ポリペプチド」に明確に含まれる。さらに、これらの修飾を有するポリペプチドを、本発明に含むか排除すべき各種と特定することができる。ポリペプチド（ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシ末端が含まれる）のいずれにもポリペプチドの修飾が起こり得る。所与のポリペプチド中のいくつかの部位に同程度または種々の程度で同一の修飾型が存在し得ると認識される（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ等，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ等，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００３２】
実施形態
本開示は、質量分析システムにおけるポリペプチドイオンを解離するためのイオン−イオン反応の使用に関する。より詳細には、本開示の１つの態様は、ＲＦ電場イオン封じ込めデバイス内での電子の多価ポリペプチド分析物イオンの移動を含み、それにより、ポリペプチドイオンの電子移動解離（ＥＴＤ）が促進されるイオン−イオン反応の利用に関する。
【００３３】
別の実施形態によれば、多価ポリペプチドイオンからの電子の移動（引き抜き）を含むイオン−イオン反応を使用して、ＲＦ電場イオン封じ込めデバイス内でポリペプチド分析イオンの陰電子移動解離（ＮＥＴＤ）を行う。ＥＴＤプロセスでは、多価ポリペプチド分析イオンは、カチオン（陽イオン）である。ＮＥＴＤプロセスでは、多価ポリペプチド分析イオンはアニオン（陰イオン）である。ＥＴＤと区別するために、用語「陰電子移動解離（ＮＥＴＤ）」を使用する。ＥＴＤおよびＮＥＴＤは、関与する分析イオンの反対の極性および分析物に対して反対の電子移動方向の両方によって示唆されるように、２つの個別の異なる解離促進イオン−イオン反応型を示す。以下に説明して示すように、異なるプロセスにより、分析ポリペプチドイオンの骨格に沿って異なる化学結合が解離される。
【００３４】
１つの実施形態によれば、多価ポリペプチドイオンを四重極線形イオントラップに導入し、第１の定義したイオントラップ領域中に閉じ込める。次いで、１価または多価のラジカル気相アニオンを、四重極線形イオントラップの線形軸に沿って四重極線形イオントラップに導入する。次いで、２つのイオンまたは最初に導入された種由来のイオンを線形イオントラップ内で混合して、アニオンからカチオンへの電子移動を促進し、それにより、陰電子移動解離（ＮＥＴＤ）生成物アニオンの生成を誘導する。１つの実施形態によれば、ポリペプチドポリペプチドは、多価脱プロトン化されており、気相イオンはカチオンである。１つの実施形態では、カチオンは、ポリペプチドアニオンから電子を引き抜くポリペプチドアニオンから電子を引き抜く任意の不活性ガスカチオン（例えば、Ｈｅ、Ｎｅ、Ｘｅ、Ａｒ、Ｎ２＋、Ｏ２＋、ＣＯ＋）または任意の他のラジカルカチオン（多価プロトン化多環芳香族炭化水素または置換多環芳香族炭化水素など）である。
【００３５】
１つの実施形態によれば、多価カチオンの解離方法を提供する。カチオンを、広範な材料（核酸、ポリサッカリド、およびポリペプチドなどの高分子、ならびに他の化合物（医薬品および有機化合物の複合混合物が含まれる）が含まれる）から選択することができる。本方法は、多価カチオンをＲＦ電場イオン封じ込めデバイスに導入する工程と、前記イオン封じ込めデバイスに気相電子移動試薬アニオンを導入する工程と、試薬アニオンまたはその誘導体試薬イオンから多価カチオンへの電子移動を促進するために、導入された前記試薬アニオンを混合する工程とを含む。各カチオン／アニオンをＲＦ電場イオン封じ込めデバイスに直接注入し、混合して反応させるか、注入されたカチオンおよび／またはアニオンを、注入後且つ混合前にさらなる操作に供することができることが、本発明の範囲内で見なされる。
【００３６】
１つの実施形態によれば、カチオンをＲＦ電場イオン封じ込めデバイスに注入した後、カチオンを１つまたは複数の以下の操作に供する。この最初のカチオン集団を、ｍ／ｚ単離、プロトン移動電荷減少（イオンパーキングが含まれる）、光解離、衝突活性化、およびイオン−分子反応に供して、最初に注入したカチオン集団の誘導多価カチオンを生成することができる。同様に、最初に注入したカチオンを、アニオンをカチオン（またはカチオン誘導体）と混合する前に種々の操作に供することができる。特に、アニオン集団を１つまたは複数の以下の操作に供して、最初に注入したアニオン集団の１価または多価の誘導体アニオンを生成することができる：ｍ／ｚ単離、光解離、衝突活性化、およびイオン−分子反応。
【００３７】
したがって、１つの実施形態では、多価カチオンをＲＦ電場イオン封じ込めデバイスに注入し、気相電子移動試薬アニオンをイオン封じ込めデバイスに導入し、次いで、注入したアニオンおよびカチオンを任意選択的にさらに操作し、次いで、試薬アニオンまたはその誘導体試薬イオンを導入し、多価カチオンまたはその誘導体多価カチオンへの電子移動を促進するために、多価カチオンまたはその誘導体多価カチオンと混合して解離生成物カチオンを得る。
【００３８】
１つの実施形態によれば、導入された多価カチオンはポリペプチドである。１つの実施形態によれば、導入された前記試薬アニオンまたはその誘導体試薬イオンおよび多価ポリペプチドまたはその誘導体多価ポリペプチドの運動エネルギーは１電子ボルト未満である。１つの実施形態によれば、混合および反応工程中に、バックグラウンドガス分子との衝突を使用してアニオンおよび多価カチオンの運動エネルギーを熱レベル付近に減少させる。
【００３９】
１つの実施形態によれば、ＲＦ電場イオン封じ込めデバイスは、ＲＦイオンガイドである。別の実施形態では、ＲＦ電場イオン封じ込めデバイスは、ＲＦイオントラップである。本発明での使用に適切な１つのこのようなデバイスはＲＦ線形多重極イオントラップであり、１つの実施形態では、ＲＦイオントラップはＲＦ三次元多重極イオントラップである。１つの実施形態では、アニオンを、ＲＦ線形多重極イオントラップの線形軸に沿って注入する。
【００４０】
１つの実施形態によれば、正電荷の多価ポリペプチドの断片化方法を提供する。本方法は、正電荷の多価ポリペプチドをイオントラップに導入する工程と、気相アニオンをイオントラップに導入する工程と、ラジカルアニオンから正電荷の多価ポリペプチドへの電子移動を促進するために、気相アニオンと正電荷の多価ポリペプチドとを混合し、それにより、正電荷の多価ポリペプチドの断片化が誘導されて電子移動解離生成物イオンが生成される工程とを含む。本明細書中で使用される、用語「イオントラップへのイオンの導入」は、イオントラップに直接的に注入されるイオンだけでなく、これらがイオントラップに注入された後に最初に注入されたイオンから生成された誘導体イオンも含まれることが意図される。イオントラップを、当業者に高知の任意のイオン封じ込めデバイスから選択することができる。適切なデバイスには、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）質量分析計、ＲＦ  ３Ｄ多重極イオントラップ（ＱＩＴ）、およびＲＦ線形多重極イオントラップが含まれる。１つの実施形態では、デバイスを、アニオン／カチオンを個別に保存し、その後にこれらを合わせる能力に基づいて選択する。１つの実施形態では、イオントラップはＲＦイオントラップであり、より詳細には、１つの実施形態では、ＲＦイオントラップはセグメント化線形ＲＦ多重極イオントラップである。
【００４１】
多価ポリペプチドとアニオンとの混合中または混合後、電子移動解離生成物イオンを、さらなる活性化エネルギーに供することができる。より詳細には、電子移動解離生成物イオンを、実質的に従来の衝突活性化解離生成物を生成することなく、電子移動型解離経路を誘発するのに十分なエネルギーと共に供給する。１つの実施形態によれば、この手順により、２０％未満のＣＡＤ生成物が生成され、さらなる実施形態では、約１０％未満のＣＡＤ生成物が生成され、さらなる実施形態では、約５％未満のＣＡＤ生成物が生成され、さらなる実施形態では、約１％未満のＣＡＤ生成物が生成される。光活性化または衝突活性化の形態でエネルギーを供給することができる。１つの実施形態では、電子移動解離生成物イオンを、２０％未満の生成物が従来の衝突活性化解離生成物である、低エネルギーオフ共鳴衝突活性化に供する。１つの実施形態によれば、多価ポリペプチドをアニオンと混合した後に、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱ  ＣＡＤ減少条件（ｑ＝０．１５またはそれ未満、２０％またはそれ未満の正規化活性化エネルギーで６０ｍ秒の持続時間）を使用して、電子移動解離生成物イオンをさらに活性化する。１つの実施形態では、活性化減少条件は、０．１３またはそれ未満のｑ値および１７％の正規化活性化エネルギーで６０ｍ秒を含む。
【００４２】
１つの実施形態では、多価ポリペプチドをアニオンと混合して電子移動解離生成物イオンが形成された後、電子移動解離生成物イオンを線形イオントラップ内に保持しながら線形イオントラップ由来の残存イオンを排出する。次いで、残存する電子移動解離生成物イオンを、全イオン生成物（従来の衝突活性化解離生成物）の約２０％もしくはそれ未満または約５％未満を生成するのに十分でない低エネルギーのオフ抵抗衝突活性化に供する。
【００４３】
本発明の方法によって生成された電子移動解離生成物イオンを、質量（ｍ／ｚ）分析に供することができる。１つの実施形態によれば、ポリペプチドのアミノ酸配列の分析方法を提供する。本方法は、多価ポリペプチドカチオンをＲＦイオントラップに導入する工程と、気相アニオンをＲＦイオントラップに導入する工程と、アニオンから多価ポリペプチドカチオンへの電子移動を促進するために、気相アニオンと多価ポリペプチドカチオンとを混合し、それにより、電子移動解離生成物イオンの生成が誘導される工程と、電子移動生成物カチオンから残存する気相アニオンを物理的に分離することによって反応を停止させる工程と、トラップ中に残存するカチオンのｍ／ｚ分析を行う工程とを含む。残存するカチオンには、電子移動解離生成物カチオンまたは電子移動解離生成物カチオンの誘導体カチオンが含まれ得る。本開示によれば、用語「混合」は、ＥＴＤが起こるように２つのイオン雲を重ね合わせるプロセスを含むことを意図する。
【００４４】
電子移動解離生成物イオンの質量（ｍ／ｚ）分析および検出の前に、１つの実施形態では、第１のアニオンをイオントラップから放出させ、第２のアニオン型を線形イオントラップに導入し、ここで、第２のアニオン型がその後排他的にプロトンを実質的に排他的にカチオンに移動させ、第２のアニオン型がカチオンと混合して反応する。１つの実施形態によれば、第２のアニオン型は、カルボン酸、フェノール酸、およびアルコキシドを含有する化合物に由来する。１つの実施形態では、第２のアニオンは、安息香酸、ＰＤＣＨ、ＳＦ６、およびＰＦＴＢＡからなる群から選択される化合物のアニオンである。
【００４５】
１つの実施形態によれば、正電荷の多価ポリペプチドを、四重極線形イオントラップに注入し、イオントラップの第１の定義した領域で単離する。次いで、１価または多価の気相アニオン四重極線形イオントラップに注入し、第２の定義したイオントラップ領域中で単離する。１つの実施形態によれば、アニオンはラジカル気相アニオンであり、ポリペプチドは多価プロトン化ポリペプチドである。次いで、ラジカルアニオンの多価プロトン化ポリペプチドへの電子移動を促進するために気相アニオンと多価ポリペプチドとを混合し、それにより、電子移動解離生成物イオンの生成を誘導する。
【００４６】
電子移動解離（ＥＴＤ）により、ペプチド骨格に沿ってポリペプチドが無作為に断片化され、質量分析法によってポリペプチドの配列が分析される。電子移動解離（ＥＴＤ）は、２つの既存の方法（衝突誘起解離（ＣＩＤ）および電子捕獲解離（ＥＣＤ））の強度を組み合わせる。ＥＣＤは、現在、質量分析器として超伝導磁石においてＰｅｎｎｉｎｇトラップを使用する高価なフーリエ変換装置に制限される。対照的に、ＣＩＤのようなＥＴＤを、Ｑ−ＴＯＦ型装置と同様に、種々のＲＦ四重極イオントラップ質量分析計および最後の質量分析計より前にイオン蓄積のためのＲＦ多重極線形トラップを利用する（または利用するために適合させることができる）他のハイブリッド型装置に適合させることができる。ＥＴＤにより、ＥＣＤと同一のフラグメントイオン型が生成され、それにより、複数の塩基性アミノ酸および翻訳後修飾を含むペプチドの特徴付けに適切である。本明細書中に示すように、ＥＴＤ技術により、クロマトグラフ時間尺度（約２００〜５００ｍ秒／スペクトル）で得られる高品質のスペクトル（前駆体−生成物変換効率が約５〜２０％）が得られる。
【００４７】
１つの実施形態によれば、気相アニオンを使用して、質量分析計のＲＦ多重極線形イオントラップ内で電子を正電荷サンプルに移動させる（図２は、装置の概観を示す）。このプロセスは、サンプル分子の断片化を引き起こすのに十分に発熱する。ペプチドの場合、本発明は、ペプチド骨格に沿った断片化を促進し、サンプルのアミノ酸配列の推定が可能となる。この方法を使用して、例えば、試薬ガスとしてメタンを使用して、化学的イオン（ＣＩ）源中にアニオンが生成される（図３および図４を参照のこと）。７０ｅＶの電子で圧力が１ｔｏｒｒのメタンの電子衝撃により、ＣＨ４＋・、ＣＨ３＋、および熱電子付近集団が得られる。
式１  ＣＨ４＋ｅ７０ｅＶ  →  ＣＨ４・＋  ＋  ｅ−＜７０ｅＶ  ＋  ｅ−Ｔｈｅｒｍａｌ
式２  ＣＨ４＋ｅ７０ｅＶ  →  ＣＨ３＋  ＋  Ｈ・  ＋  ｅ−＜７０ｅＶ＋ｅ−Ｔｈｅｒｍａｌ
ＥＴＤ反応のアニオンを生成するために、分子を化学イオン源に蒸発させ、熱電子集団と反応させる。これは、以前に記載されている周知のテクノロジーである（Ｈｕｎｔ等，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９７６，４８，２０９８およびＨｕｎｔ等，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９７８，５０，１７８１−１７８４）。陽電子親和力（ＥＡ）（発熱反応して安定なまたは一過性に安定なラジカルアニオンを形成する）を有する任意の分子は、電子供与体として機能することができ、それにより、電子移動解離反応における試薬として使用される可能性がある。しかし、非ラジカル（偶数電子）アニオンも電子供与体として機能することができることに留意すべきである。
式３（六フッ化硫黄）ＳＦ６  ＋  ｅ−Ｔｈｅｒｍａｌ  →  ＳＦ６・−
式４（ペルフルオロベンゼン）Ｃ６Ｆ６  ＋  ｅ−Ｔｈｅｒｍａｌ  →  Ｃ６Ｆ６・−  ＋
式５（ペルフルオロベンゼン）Ｃ６Ｆ６  ＋  ｅ−Ｔｈｅｒｍａｌ  →  Ｃ６Ｆ５−  ＋  Ｆ・
式６（アントラセン）Ｃ１４Ｈ１０  ＋  ｅ−Ｔｈｅｒｍａｌ  →  Ｃ１４Ｈ１０・−（アントラセンラジカルアニオン）
【００４８】
非ラジカルアントラセンイオンの式は以下である。
Ｃ１４Ｈ１０・−  →Ｃ１４Ｈ９−  ＋  Ｈ・（単分子分解生成物）
Ｃ１４Ｈ１０・−  ＋  ＣＨ４→Ｃ１４Ｈ１１−  ＋  ＣＨ３・（イオン−分子反応生成物）
【００４９】
本発明の１つの実施形態によれば、質量分析計における正電荷イオンの無作為な解離方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、ＲＦ場装置において電子を気相アニオンから正電荷イオンに移動させる工程を含む。１つの実施形態では、アニオンは１価のアニオンであり、別の実施形態では、ＲＦ場装置はセグメント化２Ｄ多重極トラップであり、１つの実施形態では、本装置はセグメント化２Ｄ四重極トラップである。１つの実施形態では、安定なまたは一過性に安定なアニオンをセグメント化２Ｄ多重極トラップの線形軸に沿って注入して、試薬アニオンからの電子の衝突活性化脱離を防止する。さらなる実施形態では、正電荷イオンを２Ｄ多重極トラップの線形軸に沿って、アニオンを注入したセグメント化２Ｄ多重極トランプの反対側の端に注入する。
【００５０】
１つの実施形態によれば、セグメント化２Ｄ多重極イオントラップの一方の末端から線形軸に沿ったエレクトロスプレーイオン化によって生成されたプロトン化ペプチドの注入および前部セグメントでのこれらの格納によってＥＴＤ実験を行う（図５Ａ〜５Ｃ）。次いで、陰イオンを、同一のセグメント化２Ｄ多重極トラップの線形軸に沿っているが、反対側の末端から注入する（図５Ｄ）。陰イオンを線形イオントラップの中央のセグメントに格納し（図５Ｄおよび５Ｅ）、陽イオンと混合させる（図５Ｆ）。定義された反応期間後、カチオン生成物を質量分析しながらアニオンを軸に沿って排出させる（図５Ｇおよび５Ｈ）。
【００５１】
１つの実施形態によれば、ＥＴＤを、オンラインクロマトグラフィと組み合わせた連続的イオン／イオン反応の使用によるインタクトなタンパク質の直接配列分析に使用することができる。この実施形態では、線形イオントラップ分光計内で多価ポリペプチドを最初に単離し、１価または多価のアニオンと反応させる。１つの実施形態では、アニオンはラジカルアニオンであり、別の実施形態では、アニオンは１価のラジカルアニオンである。比較的短い反応後（約５〜約２０ｍ秒）、残存アニオンをイオントラップから放出させ、ポリペプチドイオン生成物をイオントラップに注入した第２のアニオンと反応させる。トラップに注入される第２のアニオンを、プロトンを移動させる能力に基づいて選択する。ポリペプチドイオン生成物へのプロトンの移動は、１プロトン化フラグメントイオンのみを含み、前駆体タンパク質のＮ末端配列およびＣ末端配列に特徴的な同族列の１価のｃ型およびｚ型フラグメントイオンが生成されるように生成物のスペクトルを簡素化するように作用する。１つの実施形態では、イオントラップに注入された第２のアニオンは安息香酸の偶数電子アニオンであり、反応を約７５〜約１５０ｍ秒行う。
【００５２】
多価（プロトン化）ペプチド（（Ｍ＋ｎＨ）＋ｎ）が奇数電子アニオン（Ａ・−）または偶数電子アニオン（Ａ−）のいずれかに遭遇する場合、種々の反応が起こり得る。ここで、数字ｎは、前駆体イオン上の最初の電荷数を定義する整数である（２またはそれを越えると推測される）。以下に概説するように、電子移動（式７および９）またはプロトン移動（式８および１０）のいずれかを含む反応が出願人によって最初に認められた。電子移動反応（式７および９）により、ＥＣＤ条件下で認められるペプチド骨格断片化を開始させる水素ラジカルが生成される。プロトン移動反応（式８および１０）により、ペプチド上の電荷が減少するが、断片化を促進することはできない。プロトン移動反応において放出されたエネルギーは、新規に形成された共有結合を含む生成物中に保持され、それにより、プロトン化ペプチド中でなく、ＡＨまたはＡＨ・中のいずれかに集中する。
式７  ［Ｍ＋ｎＨ］＋ｎ  ＋  Ａ・−  →  ［Ｍ＋ｎＨ］・（ｎ−１）＋  ＋  Ａ  →  ［Ｍ＋（ｎ−１）Ｈ］（ｎ−１）＋  ＋  Ｈ・  ＋  Ａ
式８  ［Ｍ＋ｎＨ］＋ｎ  ＋  Ａ・−  →  ［Ｍ＋（ｎ−１）Ｈ］（ｎ−１）＋  ＋  ［ＡＨ］
式９  ［Ｍ＋ｎＨ］＋ｎ  ＋  Ａ−  →  ［Ｍ＋（ｎＨ）］・（ｎ−１）＋  ＋  ［Ａ］・  →  ［Ｍ＋（ｎ−１）Ｈ］（ｎ−１）＋  ＋  Ｈ・  ＋  Ａ・
式１０  ［Ｍ＋ｎＨ］＋ｎ  ＋  Ａ−  →  ［Ｍ＋（ｎ−１）Ｈ］（ｎ−１）＋  ＋    ［ＡＨ］
【００５３】
カチオンとアニオンが結合複合体を形成する会合反応も認められ、この反応はその後に解離して種々の生成物イオンを生成することができる。
【００５４】
電子移動は、前駆体カチオンによる試薬アニオンからの電子の引き抜きを含む。これのほぼ直後に、得られたラジカルカチオンが解離する。多価ペプチドカチオンの解離により、主にｃ’型およびｚ型、あまり豊富ではないがａ型およびｙ’型のフラグメント種が得られる。
電子移動
式１１  ［Ｍ＋ｎＨ］ｎ＋  ＋  ［Ａ］−・  →  ［Ｍ＋ｎＨ］・（ｎ−１）＋  ＋  Ａ
水素放射
式１２  ［Ｍ＋ｎＨ］・（ｎ−１）＋  →  ［Ｍ＋（ｎ−１）Ｈ］（ｎ−１）＋  ＋  Ｈ・（水素放射）
再結合および解離
式１３ａ  ［Ｍ＋（ｎ−１）Ｈ］（ｎ−１）＋  ＋  Ｈ・  →  ［Ｃｉ＋（ｍ＋１） ｃ’Ｈ］（ｍ）＋  ＋  ［ＺＮ−ｉ＋（ｎ−１−ｍ）Ｈ］・（ｎ−１−ｍ）＋  ｚ
または
式１３ｂ  ［Ｍ＋（ｎ−１）Ｈ］（ｎ−１）＋  ＋  Ｈ・  →［Ａｉ＋ｍＨ］・（ｍ）＋  ａ＋  ［ＹＮ−ｉ＋（ｎ−ｍ）Ｈ］＋（ｎ−１−ｍ） ｙ’
【００５５】
生成物は、ペプチド上の残存プロトンの位置に依存してイオン化されていてもされていなくてもよい。ここで、標準的な表記法にしたがって、インデックスｉは、アミノ末端を含む生成物についてのペプチド骨格切断の位置を定義する。数字Ｎおよびｍは、それぞれ、ペプチドまたはフラグメント中のアミノ酸数およびｃ型またはａ型フラグメントによって保持されるプロトン数を定義する整数である。ＥＴＤにおける生成物種の生成機構は、ＥＣＤを使用して認められた同一の断片化が得られる機構と同一であると考えられる。
【００５６】
１つの実施形態によれば、質量分析計内の無作為なペプチド断片化方法は、以下の工程を含む。
【００５７】
気相アニオンを、メタン、イソブタン、またはアルゴンなどのバッファーガスを使用して操作されるＴｏｗｎｓｅｎｄ放電源または従来の陰イオン化学的イオン源への無機分子または有機分子の蒸発によって低電子親和力基質から生成する。これらの供給源により、気相有機分子または気相無機分子による捕獲に十分な熱電子が生成される。
【００５８】
次いで、電子脱離によるアニオンの破壊を排除するか最小にする様式で、所望のアニオンをアニオン格納デバイスに注入する。１つの実施形態では、この工程は、デバイスの線形軸に沿ったセグメント化熱電子２Ｄ四重極線形イオントラップ（ＬＴＱ）へのアニオンの注入およびこのデバイスの２つのセグメント中のイオンの格納を含む。ヘリウム浴ガスとのエネルギー衝突を、このプロトコールによって最小にする。したがって、この手順により、広範な電子親和力を有する基質由来のアニオンをＥＴＤのために使用することが可能となる。
【００５９】
多価ペプチドイオンを、エレクトロスプレーイオン化によって生成し、陰イオンとの反応のために格納デバイスに注入する。１つの実施形態では、この工程は、デバイスの線形軸に沿ったセグメント化２Ｄ四重極線形イオントラップへの多価陽イオンの注入およびこのデバイスのセグメント中のイオンの格納を含む。
【００６０】
アニオンから多価陽イオンへの遺伝子移動を促進するために、２つのイオン集団をセグメント２で混合する。ラジカルの正電荷サンプルイオンへの電子移動は、サンプル分子の断片化を引き起こすのに十分に発熱する。ペプチドの場合、本発明は、ペプチド骨格に沿った断片化を促進し、サンプルのアミノ酸配列を推定することが可能になる。
【００６１】
試薬アニオン
上記のように、陽電子親和力（ＥＡ）（発熱反応して安定なまたは一過性に安定なラジカルアニオンを形成する）を有する任意の分子は、電子供与体として機能することができ、それにより、電子移動解離反応における試薬として使用される可能性がある。さらに、本発明者らは、多価ペプチドと反応した場合に電子を移動してＥＴＤを行う偶数電子種を形成するいくつかの化合物も同定した。したがって、ラジカルアニオンの形成は、アニオンが電子移動能力を有するかどうかの決定のための唯一の基準ではない。本発明者らの最初の研究は、以下のいくつかの化合物由来のアニオンを使用した：ＦＣ−４３（ペルフルオロトリブチルアミン、ＰＦＴＢＡ）、サルファヘキサフルオライド（ＳＦ６）、パーフルオロ−１，３−ジメチルシクロヘキサン（ＰＤＣＨ）、ヘキサフルオロベンゼン（Ｃ６Ｆ６）。この研究では、ＥＴＤ型断片化が認められるが、プロトン移動反応が主に起こった。次いで、本発明者らは、選択したペプチドイオンとの反応のための特定のアニオン種を単離する能力を模倣した。その時、本発明者らは、上記の種ではなくバックグラウンドイオンが低レベルＥＴＤ断片化を担うことを発見した。六フッ化硫黄およびＰＤＣＨの両方からのアニオンの単離により、これらのアニオンのみがプロトン移動反応を誘起し、検出可能なＥＴＤは認められないことが証明された。
【００６２】
次いで、Ｃ１４Ｈ１０・−に変換されるアントラセンなどの芳香族種を、試薬として調査した。アニオンへのプロトン移動を最小にするために、９，１０−ジフェニルアントラセンも試薬として使用することができる。電子移動解離の促進のためのアニオンとして使用されるさらなる芳香族化合物には、芳香族炭化水素（多環式アリール）および置換芳香族炭化水素が含まれる。１つの実施形態によれば、一般式：
2007529014.tif 000003
（式中、式中、ｎは１または０であり、
Ｘは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＣＲ５、およびＣＨＲ５からなる群から選択され、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＣＲ６、およびＣＨＲ６からなる群から選択され、
Ｗは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＣＲ７、およびＣＨＲ７からなる群から選択され、
Ｕは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＣＲ８、およびＣＨＲ８からなる群から選択され、
Ｚは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＣＲ３、ＣＨＲ３、および−ＣＨＲ８ＣＨＲ７−からなる群から選択され、
ＴおよびＶは、独立して、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＣＲ４、およびＣＨＲ４からなる群から選択され、
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、独立して、Ｈ、Ｃ５〜Ｃ６アリール、Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール、ハロ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミノ、およびヒドロキシルからなる群から選択されるか、Ｒ１およびＲ８ならびに／あるいはＲ２とＲ７の原子が共に結合してＣ５〜Ｃ６アリール、Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール環を形成するか、Ｒ７およびＲ５ならびに／あるいはＲ６とＲ８との原子が共に結合してＣ５〜Ｃ６アリール、Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール環を形成するか、Ｒ２とＲ３との原子が共に結合してＣ５〜Ｃ６アリール、Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール環を形成する）を有する多環芳香族炭化水素。
【００６３】
１つの実施形態によれば、ｎは１であり、ＸおよびＹは、独立して、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＣＨ、およびＣＨ２からなる群から選択され、ＷはＣＲ７であるか、ＣＨＲ７およびＵはＣＲ８およびＣＨＲ８であり、ここで、Ｒ７およびＲ８は、独立して、Ｈ、Ｃ５〜Ｃ６アリール、Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリールからなる群から選択されるか、Ｒ１とＲ８の原子が共に結合してＣ５〜Ｃ６アリール、Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール環を形成し、Ｒ２とＲ７との原子が共に結合してＣ５〜Ｃ６アリール、Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール環を形成する。別の実施形態では、ＴおよびＶは、独立して、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＣＨ２、およびＣＨからなる群から選択され、Ｚは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＣＨ、およびＣＨ２からなる群から選択され、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、Ｃ５〜Ｃ６アリール、Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール、ハロ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミノ、およびヒドロキシルからなる群から選択される。別の実施形態では、ＴおよびＶは、独立して、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＣＨ２、およびＣＨからなる群から選択され、Ｒ１はＨであり、ＺはＣＨＲ３であり、ここで、Ｒ２とＲ３との原子が共に結合してＣ５〜Ｃ６アリール、Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール環を形成する。別の実施形態では、ＴおよびＶは、独立して、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＣＨ２、およびＣＨからなる群から選択され、Ｚは−ＣＨＲ８ＣＨＲ７−であり、ここで、Ｒ１とＲ８との原子が共に結合してＣ５〜Ｃ６アリール、Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール環を形成し、Ｒ２とＲ７との原子が共に結合してＣ５〜Ｃ６アリール、Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール環を形成する。
【００６４】
試験した全ての芳香族炭化水素は、多価ペプチドと反応した場合に電子移動解離を誘起する能力をいくらか有する。試験したアニオンには、ナフタレン、フルオレン、フェナントレン、ピレン、フルオランテン、クリセン、トリフェニレン、ペリレン、アクリジン、２，２’ジピリジル、２，２’ジキノリン、９−アントラセンカルボニトリル、ジベンゾチオフェン、１，１０’−フェナントロリン、９’アントラセンカルボニトリル、およびアントラキノンが含まれる。これらの全化合物由来のアニオンは、ある程度電子移動解離を誘起した。これらの全芳香族炭化水素は電子移動を促進するが、フルオランテンが特に十分に機能する。そのＥＴＤ誘起能力について試験したいくつかの化合物の化学構造を以下に示す。
2007529014.tif 000004
2007529014.tif 000005
【００６５】
したがって、芳香族炭化水素化合物は、その各アニオンに変換された場合、多価カチオンに電子を移動する化合物の１つの一般的クラスを示す。さらに、硫黄、酸素、または窒素（複素環）を含めるこれらの化合物の修飾により、その電子移動能力が変化すべきではなく、したがって、この群中に電子移動促進化合物が含まれるべきである。したがって、本発明の１つの実施形態では、多環式アリール化合物およびヘテロアリール化合物を、本発明のポリペプチドの電子移動解離促進のためのアニオンとして使用する。表１は、化合物、分子量、およびその対応するアニオンの認められたｍ／ｚを示す。
【００６６】
［表１］
2007529014.tif 000006
【００６７】
装置類
１つの実施形態によれば、これらの実験を行うために使用した装置は、２−Ｄ−多重極イオントラップにおける改良されたペプチド断片化方法のために必要な工程を実施するように改変された市販のシステム（改変ＦｉｎｎｉｇａｎＬＴＱ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．））である。他の代わりの装置の構成を、他の市販または特注の構成要素に組み込んで使用することができる。イオン通路の機構またはＥＳＩ源の間のイオン経路成分からＲＦ  ＱＬＴへの印加電圧を変化させなかった。図２は、装置に合わせた修正の概要を示し、本発明での使用に適切な線形四重極イオントラップのより詳細な説明は、米国特許公開番号＿＿＿で公開された米国特許出願番号＿＿＿に記載されている。
【００６８】
簡単に述べれば、ＦｉｎｎｉｇａｎＬＴＱ  ２−Ｄ−多重極イオントラップを、以下のように修正した。第５の差分ポンプ真空領域を、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ  ４５００イオン源に適合するように装置の後部真空フランジに取り付けた。この領域に２段階ターボ分子ポンプ（ＰｆｅｉｆｆｅｒモデルＴＭＨ２３０−１６０支援のＡｌｃａｔｅｌ  ２００８Ａ−回転翼機械ポンプ）の高真空段階でポンピングする。後八重極番号１および後八重極番号２と記した２つのＲＦ八重極イオンガイドを使用して、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ  ４５００イオン源から放射されたイオンを移動させた。２つのＲＦ八重極イオンガイドを分けるプレートレンズ（後八重極レンズ間）の口径を、付加した真空段階の間（真空領域番号５とＲＦ線形四重極イオントラップ（ＱＬＴ）を含むＬＴＱの真空領域との間）の差分ポンピング伝導限度として機能する。後八重極番号１は、端と端とをくっつけて１つのユニットとして電気的に接続したＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ由来の長さ２インチの八重極電極集合体対（ｒ０＝．１０８インチ）から構成される。後八重極番号２は、単純に、１つのＬＣＱ八重極電極集合体である。ＲＦ  ＱＬＴ集合体を機械的に修正しなかった。しかし、前レンズの電極と後レンズの電極との電気的接続を、標準的エレクトロニクスによって得られるこれらのレンズについて、ＤＣバイアス電圧にＲＦ電圧を重ね合わせることができるように変化させた。
【００６９】
イオン源レンズの電圧をＦｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ４５００  ＰＰＮＩＣＩコントロールモジュールによって供給し、フィラメントパワーおよび放出電流制御を、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ４６００四重極エレクトロニクスモジュール（ＱＥＭ）によって供給する。イオン源ヒータの出力および調節を、ＯｍｅｇａモデルＣＮ９０００Ａ温度調節器および１．５Ａ  ２４ＶＡＣ変圧器に基づいた組み立てユニットによって行う。イオン源較正用ガス電磁弁を、別の組み立て式ユニットによって操作する。イオン源の標準的なプローブ真空ベローズ弁を、ボール弁（Ａ  ａｎｄ  Ｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と交換した。プローブ連動装置ならびにトグル弁およびＡｌｃａｔｅｌモデル２０１２機械ポンプを備えた較正用ガス注入口を大まかに排気する。
【００７０】
後八重極ＲＦおよびＤＣ電圧ならびにＱＬＴ末端レンズのためのＲＦ電圧を、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱおよびＴＳＱ７０００装置の修正回路を使用する組み立て式（ｈｏｍｅ  ｂｕｉｌｄ）電子モジュールから得る。両八重極を、これらが別のＤＣバイアス電圧を有するにもかかわらず、同一のＲＦ電圧を使用して駆動する。同様に、ＱＬＴの末端レンズは、同一の二次ＲＦ電圧を受けるが、異なるＤＣバイアス電圧を有する。２つの周波数合成器（Ｗａｖｅｔｅｋ／Ｒｏｃｋｌａｎｄモデル５１００およびＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓモデル＿ＤＳ３４０）は、それぞれ、八重極および末端レンズのＲＦエレクトロニクスのための基準周波数を提供する。後八重極および末端レンズのＲＦ電圧の両方の振幅を、ＬＴＱエレクトロニクスにけるスペアＤＡＣｓ（デジタル／アナログ変換器）によって制御する。装置の埋め込み式コンピュータ制御システムを、質量分析実験（スキャン機能）の実行中にこれらの電圧を制御できるように再構成した。
【００７１】
化学的負イオン化モードで操作する場合、イオン源レンズ（Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３（Ｌ１はイオン体積に最も近いレンズであり、Ｌ３は最も遠い））は、それぞれ、＋１０Ｖ、＋７０Ｖ、および＋２３ＶのＤＣバイアス電圧を有する。アニオンからＱＬＴへの伝達のために、隣接ロッド間のＲＦ電圧を、典型的には、約２．２ＭＨｚの周波数で約３００ボルトの片側振幅である。ＱＬＴへのアニオンの伝達を遮断する場合、後八重極ＲＦ振幅をゼロにする。
【００７２】
標準的なナノフローＥＳＩ源を装置に使用した。ほとんどの研究のために、標準的なペプチドの混合物を含む４０％アセトニトリル水溶液および０．１％酢酸水溶液を、１００ｎｌ／分で注入する。供給源を修飾することなく使用した。ＬＣ／ＭＳ実験のために、供給源を、本発明者らの研究所で使用している組み込みレーザー引き抜きエレクトロスプレーエミッタを備えた組み立て式パッケージングキャピラリーＨＰＬＣカラムに適切に配置し、電気的に接続するように修正した。
【００７３】
ＥＴＤ  ＭＳ／ＭＳ実験を実施するために質量分析計の制御を支配するコンピュータプログラムを修正した。放射状排出ＲＦ四重極線形トラップの操作は、Ｓｃｈｗａｒｔｚ等（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．２００２，１３，６５９−６６９）に詳細に記載されている。製品がＦｉｎｎｉｇａｎＬＴＱの直接的な旧製品であるという点において装置を記載した。デバイスの基本的な操作工程を、図５Ａ〜５Ｈに示し、以下に詳細に考察する。
【００７４】
操作手順
多価ポリペプチドカチオンを、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によって生成した。１ｐｍｏｌ／μＬのペプチドを含む４０％アセトニトリル水溶液（０．１％酢酸を含む）を、ＳｉｌｉｃａＴｉｐ（商標）融解石英エミッタ（３０μｍチップ、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に注入した。研究ペプチドには、副腎皮質刺激ホルモン断片１−２４（ＡＴＣＨ  ｈｏｒｍｏｎｅ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）および研究所内合成リンペプチドが含まれる。メタンバッファーガス（ＭＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用した化学的陰イオン化を使用して、ＳＦ６（ＭＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）およびＰＤＣＨ（Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）のアニオンを生成した。Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱ線形イオントラップ質量分析計（ＴｈｅｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、デバイスの後ろ側（ファクトリーナノスプレー源の反対側）に置いたＦｉｎｎｉｇａｎ  ４５００化学的イオン源（Ｆｉｎｎｉｇａｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を受け入れるように適合させた。スキャン事象の順序は、以下を含む：以下により詳細に記載するように、前駆体イオンの単離（線形四重極イオントラップ）、イオン／イオン反応ためのアニオンの導入、最後に、生成物イオンの質量分析。
【００７５】
１．衝突安定化されて捕獲されるＱＬＴへのＥＳＩ源によって生成されたカチオンの注入（図５Ａ）
イオントラップへのカチオンの注入を、図５Ａに示す。大気圧インターフェースのスキマー電極を地電位（０ボルト）に維持し、それにより、ＱＬＴに入るカチオンの運動エネルギーが本質的に０ボルトである。したがって、地電位でのＢａｃｋ  Ｌｅｎｓ電極へのバイアス印加によって、バックグラウンドとの少数の散逸的衝突を受けた注入イオンがデバイスの前部への後戻りを反映するようにＤＣ軸ポテンシャルが上昇する。注入イオンは、多数のさらなるヘリウム（約３ｍＴｏｒｒ）原子との運動量減耗衝突を受け、その軸方向の動きが有効に静められ、デバイスの中心部分の低バイアス電位によって十分に得られた軸方向のＤＣ中に捕獲される。これらの衝突もイオンの放射状の動きを静め、その結果、ＲＦ四重極場の放射状の強力な集点効果の影響下で、イオンはデバイスの重心軸付近に広がる。さらなる運動励起に供されない限り、ヘリウムとの衝突により捕獲されたカチオンの運動エネルギーおよび内部エネルギーは約１〜２ｍ秒内に熱レベル付近に減少する。完全に衝突から解放されたイオンは、重心軸の約１．０ｍｍ以内に閉じ込められたままである。
【００７６】
一般に、適切なＱＬＴの性能を妨害する空間電荷効果を回避するために、所望の前駆体ｍ／ｚ範囲内以外の質量電荷比のイオンの蓄積を防止することが望ましい。ＲＦ四重極捕獲電場へ補足的二重極広帯域ＡＣ電場を重ね合わせて前駆体ｍ／ｚ枠内のイオンから逸脱する四重極場（動きがデバイスの軸に矛盾する）において特徴的な動きの周波数を有するイオンを共鳴によって排出することによってこれを行う。前駆体イオンの注入および蓄積に適切なＲＦ四重極場の強度は、前駆体を十分に蓄積させず、約３Ｔｈ（ダルトン／単位電荷）のｍ／ｚ単離バンドが得られる。したがって、「注入波形」単離は、前駆体ｍ／ｚ比の約±２〜１０％の範囲外のｍ／ｚ比を有するイオンの蓄積を、必然的に、大体、典型的に、唯一、妨害する。
【００７７】
２．前駆体ｍ／ｚ単離（図５Ｂ）
カチオン注入の終了および「注入波形」電場の任意の印加の中止後から数ｍ秒以内に、所望のｍ／ｚ分解能および高効率で（前駆体イオンの喪失が最も低い）単離することができるようにＲＦ四重極捕獲電場の強度を増加させることができる。所望の前駆体ｍ／ｚ枠の外側の全ての他の陽イオンがＱＬＴから共鳴によって排出されるようにより高い分解能の「波形」電場を印可する。通常、９０％を超える前駆体が保持される。ｍ／ｚ単離中、デバイスの中心部分内にカチオンを封じ込めるために、ＱＬＴの前部および後部のＤＣバイアス電位を、中心部分より約１２ボルト高く維持する。
【００７８】
３．ＱＬＴの前部への前駆体カチオンの再配置（図５Ｃ）
前駆体ｍ／ｚ単離の完了後、前部のＤＣバイアル電位を中心部より１ボルト低く減少させる。カチオンの軸封じ込めを維持するために、前部ＤＣバイアスを中心部および前部の両方に維持する。数ｍ秒後、中心部中の全前駆体イオンが最初に前部に拡散し、再度、ヘリウム原子との衝突が静められることによって保持さされる。
【００７９】
４．デバイスの中心部で衝突安定化されて捕獲されるＮＩＣＩ源によって生成されたカチオンの注入（図５Ｄ）
一旦前駆体イオンが前部に移動すると、アニオンを注入および捕獲するために、中心部、後部、および後レンズのＤＣバイアス電位は、「地」電位以上に上昇する。ＮＩＣＩ源を０ボルトにバイアスし、それにより、前部を負ＤＣバイアス電圧に保持されて、前駆体カチオンの捕獲が維持され、デバイスの全面に陰イオンのための軸方向の電位壁が作製される。中心部分のＤＣバイアスは、後部よりも正になり、それにより、デバイスのこの部分にアニオンが蓄積する。この工程は、アニオンが定義付けによって負電荷であり、ＤＣバイアス電位が異符号を有するので、アニオンがデバイスの後部から注入されることを除き、工程１におけるカチオンの注入および蓄積に対応する。
【００８０】
アニオン注入中、所望の試薬アニオンに近いｍ／ｚ比および以前に選択した前駆体カチオンに近いｍ／ｚ比のいずれも有さないアニオンを共鳴によって排出するために、「注入波形」を印可することが技術的に可能である。しかし、本発明者らは、ＥＣＤを促進可能性が最も高いアニオン類は、これらが小さなエネルギー衝突に供された場合でさえも電子脱離を容易に受けるではないかと疑った。したがって、イオン注入に関連する運動励起を超える試薬アニオンの任意の過剰な運動励起により、本発明者らがまさに単離を望むアニオンを喪失し得る。したがって、注入中の試薬アニオンの単離は望ましくない可能性がある。アニオン注入の典型的な持続時間は、ＮＩＣＩ源によって得られたアニオンの電流に依存して、１ｍ秒〜１秒の間のいずれか（理想的には、わずか数ｍ秒）である。
【００８１】
５．試薬アニオンｍ／ｚ単離またはｍ／ｚ排除（図５Ｅ）
アニオン注入の終了から数ｍ秒以内に、ＲＦ四重極捕獲電場の強度を、最良の達成可能なｍ／ｚ分解および効率で前駆体を単離することができるように調整することができる。このような試薬アニオンのｍ／ｚ単離を、図５Ｅに示す。上記のように、アニオン単離「波形」により、所望の試薬アニオンに近いｍ／ｚ比および以前に選択した前駆体カチオンに近いｍ／ｚ比のいずれも有さないアニオンを共鳴によって排出しなければならない。したがって、選択した前駆体のｍ／ｚ枠に近いｍ／ｚ比の望ましくないアニオンが排出される。この設定は理想的ではない。しかし、この設定は、この問題を回避するために駆動するＱＬＴおよび／または電圧のデザインを実質的に変化させる必要がある。この実施により、カチオン−アニオン反応の開始前にトラップから最も望ましくないアニオンが確実に排除される。
【００８２】
ＲＦのみの四重極捕獲電場におけるイオンの動きの基本的性質は、任意の特定のＲＦ四重極捕獲電場強度で、イオン捕獲のための対応するｍ／ｚ比の閾値（電場の強度に比例する）が存在することである。このｍ／ｚ比の閾値を超えるｍ／ｚ比を有するイオンのみを捕獲することができる。この閾値未満のｍ／ｚ比を有するイオンが容易に排出される。本発明者らは、しばしば、ＱＬＴ電極に印加したＲＦ電圧の大きさを簡単な操作を使用して、目的の試薬アニオンのｍ／ｚ未満の望ましくない種を排除する。
【００８３】
アニオンがＥＣＤを促進するかどうかの簡単な決定方法は、イオン−イオン反応工程前またはその後に単一周波数の「波形」を使用して、対象とするアニオン種に対応する比較的狭いｍ／ｚ枠を共鳴によって排出することである。このようなアプローチにより、トラップ中に保持されたアニオンの運動活性化がより少なくなり、それにより電子脱離によるアニオン喪失の可能性が減少するはずである。
【００８４】
６．カチオン−アニオン反応およびＥＴＤ生成物イオンの生成のための前駆体カチオンと試薬アニオンとの混合（図５Ｆ）
一旦所望の捕獲された前駆体カチオンおよび試薬アニオン集団が確立されて衝突が静められると、二次電圧を、ＱＬＴの両末端レンズに印加する（本発明者らの命名法にしたがって、放射状封じ込めを行うためにＱＬＴ電極に印加したＲＦ電圧は一次ＲＦ電圧である）。この二次ＲＦ電位の効果は、陽イオンおよび陰イオンの両方を拒絶することである。任意の所与のｍ／ｚのために、この斥力効果を、ｍ／ｚと逆に変化する斥力ポテンシャルとしてモデリングすることができ、文献では、擬ポテンシャルまたは有効ポテンシャルと呼ばれる。ＱＬＴの同一領域中のアニオンおよびカチオンを同時に捕獲し、それにより、カチオン−アニオン反応を起こすために、トラップセグメントおよび末端レンズに印加したＤＣバイアス電圧は等しくなる（通常、０．０００ボルト）。末端レンズに印加された二次ＲＦ電圧によって確立された擬ポテンシャルにより、カチオンおよびアニオンの両方に必要な軸方向の捕獲が得られる。これを、図５Ｆに示す。
【００８５】
本明細書中に記載の全ての研究では、カチオン−アニオン反応の間に１００Ｖの振幅（Ｖ２）（０〜ピーク）および約６００ｋＨｚ周波数（ｆ２）（四重極場の周波数（ｆ１）の１／２）を有する二次ＲＦ電圧を印加する。これにより、１００ｕ未満から２０００ｕを超えるｍ／ｚ比を有する両方の極性のイオンが有効に同時に捕獲される。軸方向の擬ポテンシャルのみによって末端レンズ周辺で有意に作用し、それにより、アニオンおよびカチオンの両方がデバイスの３つ全ての部分にわたって拡散し、自由に反応する。現在、本発明者らのみがＱＬＴの３つの部分に約±．３０ボルトまたはそれ以内にＤＣバイアスを設定することができる。これらのバイアス電圧を制御するＤＡＣの１回の増加は、．０６３ボルトのバイアス電圧の変化に対応する。３００℃でのイオンの平均熱運動エネルギーは約０．０３０ｅＶであるので、バイアス電位のこれらの小さな相違により、捕獲されたアニオンおよびカチオンが軸方向にいくらか分離され得る。しかし、本発明者らは豊富なカチオン−アニオン反応生成物を認めているので、これは多くで起こらないようである。捕獲されたイオン集団は、おそらく、各セグメント中の空間電荷ポテンシャルを補うのに十分高い。イオン自体が分配されて均一な軸ポテンシャルが得られ、それにより、デバイス軸に沿ってイオンが自由に移動する。より低いｍ／ｚイオンが一般に重心軸のより近くに閉じ込められるので、イオンの軸方向の運動性はｍ／ｚ依存性であり得ることが考えられる。これは、おそらく、前駆体ｍ／ｚに対するＥＴＤ生成物イオンの認められた依存性の原因であり得る。したがって、カチオン−アニオン反応期間中に３つのセグメントのＤＣバイアス電位が約±．００１ボルト以内で適合する場合、好ましいであろう。このようなバイアスの相違は、実験温度では無視できるアニオン−カチオン分離が起こるはずである。捕獲されたイオンを常に強制的に軸方向に再分配し、それにより、混合し続けるように、バイアス相違の徴候を繰り返し変化させることによって、カチオン−アニオン分離を回避することが可能である。
【００８６】
試薬アニオン集団が大きいほど、より迅速に前駆体イオンが生成物イオンに変換される。適切な大きさの試薬アニオン集団を使用する場合、典型的には、ほとんどの前駆体カチオンを反応させるのに３０〜１００ｍ秒のイオン−イオン反応期間が適切である。本明細書中に示す結果について、典型的には、約３，０００〜３０，０００個の前駆体イオンが単離された（これにより、前駆体種が３価であり、１０，０００〜１００，０００のＡＧＣ  ＭＳｎ標的値に対応すると予想される）。イオン−イオン反応に利用可能な最初の試薬アニオン数は、おそらく、最初の前駆体イオン集団よりも少なくとも約３〜１０倍であった。前に考察するように、ＥＴＤを促進する試薬アニオン型の最初の数は、おそらくＮＩＣＩイオン源に導入された化合物に依存した大きさによって変化した。
【００８７】
ＥＴＤおよびプロトンイオン生成物イオンは、潜在的に、試薬アニオンとのさらなる反応を受け得る。このような二次反応によって中和され、それにより、任意の１価カチオン生成物が喪失する。これにより、最初の前駆体ペプチドカチオンのＮ末端およびＣ末端のいずれも含まない第２世代の生成物イオンが生成される可能性が高い。このような「内部フラグメント」生成物イオンは、得られた生成物イオンのマススペクトルの解釈を複雑にするので、望ましくない。このような二次反応を阻止するための３Ｄ  ＲＦ四重極イオントラップにおける電荷減少（プロトン移動）イオン−イオン実験方法が開発されている（米国特許出願公開番号ＵＳ２００２／００９２９８０およびＵＳ２００２／０１６６９５８（その開示が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。これらの方法を、２ＤＲＦ四重極イオントラップ中での試薬アニオンとＥＴＤ生成物カチオンとの間の二次反応を阻止するように適合させることができると予想される。
【００８８】
より長い反応時間、より長いイオン蓄積時間、およびおそらくより高い最小サンプルレベルが必要であるという点でおそらく望ましくないが、大きな前駆体カチオン−試薬アニオン比の使用により、二次生成物イオンの生成がより少なくなるであろう。前駆体カチオン集団が常に生成物カチオン集団よりもはるかに大きいので、アニオンは生成物イオンよりも前駆体イオンと反応する可能性がさらにより高い。前駆体イオン−試薬イオン比を前駆体の蓄積率に依存して自動的に調整することができ、それにより、前駆体イオンが豊富に存在する場合に二次生成物イオンの生成が減少すると考えられる。
【００８９】
本発明者らのこの実験では、プロトン移動により、一般に、多数の一次および二次生成物イオンが生成される。例えば、４価前駆体イオン（［Ｍ＋４Ｈ］４＋）により、プロトン移動反応の成功によって、３価の一次生成物イオン（［Ｍ＋３Ｈ］３＋）ならびに２価（［Ｍ＋２Ｈ］２＋）および１価（［Ｍ＋Ｈ］＋）の二次生成物イオンが生成される。二次生成物イオンは、ＥＴＤ生成物イオンと同一のｍ／ｚ比を有し得るので、その所見を妨害し得る。カチオン−アニオン反応中の一次プロトン移動生成物イオンの継続的共鳴排出により、このような二次プロトン移動生成物イオンが阻止される。これはまた、一次および二次プロトン移動生成物からの二次ＥＴＤ生成物イオンの生成および所見を防止する。本明細書中に示すデータの収集のために使用していないが、本発明者らは、この手順を首尾よく証明した。
【００９０】
７．イオン−イオン反応の終結および生成物イオンの質量分析の準備（図５Ｇおよび５Ｈ）
カチオン−アニオン反応を終了させるために、中心部分のＤＣバイアス電圧を、末端部分および末端レンズのＤＣバイアスよりも低くする。２ｍ秒以内に、全カチオンが中心部分に移動し、全アニオンがＱＬＴの末端部分に移動する。次いで、末端レンズプレートに印加した軸方向の捕獲ＲＦ電圧（二次ＲＦ電圧）を止めて、アニオンを放出させる。これを、図５Ｇに示す。診断手順のために、これをしばしば使用して、未反応の試薬アニオンのｍ／ｚスペクトルを得る。上記のように低下させる代わりに中心部分の相対ＤＣバイアスを完全に小さくすることによるカチオン−アニオン反応の終了によって、これを容易に行うことができる。これにより、中心部分にアニオンが保持され、軸に沿ってカチオンが抽出される。これを、図５Ｈに示す。
【００９１】
生成物カチオンの質量分析の前に、共鳴排出によって、特定のｍ／ｚ比を有するカチオンを排除することが望ましいかもしれない。有望な排出候補は、未反応の前駆体イオンおよびプロトン移動生成物イオン（電荷減少生成物イオン）であろう。現在実行可能な約１０〜２０％の前駆体−ＥＴＤ生成物効率を考えると、適切なＥＴＤ生成物イオン数を得るための妥当なストラテジーは、直接的にｍ／ｚ分析をことができ、装置の仕様がｍ／ｚ割り当ての正確さおよび分解能（スペクトル空間電荷制限［２５］）を満たす実質的に過剰量（約５〜１０倍）の前駆体カチオンを単離することである。しかし、カチオン−アニオン反応工程後、保持されたＥＴＤ生成物イオンの総数（より詳細には、保持されたえＴＤ生成物イオンの総電荷）は、スペクトル空間電荷制限の範囲内である。
【００９２】
保持された未反応の前駆体イオンおよび任意の保持されたプロトン移動生成物イオンに関連する過剰な電荷の排除により、良好なｍ／ｚ精度、分解能でＥＴＤ生成物イオンを質量分析することができる。保持されたＥＴＤ生成物イオンの総電荷はスペクトル空間電荷制限付近であるので、装置の最も高い生成物スペクトルのダイナミックレンジを得ることができる。これにより、微量成分であるＥＴＤ生成物イオン（すなわち、小ＥＴＤピーク）の所見が改良される。
【００９３】
８．最終イオン集団の質量分析
従来の様式で、いずれかの選択された極性の最終イオン集団のｍ／ｚスペクトルを得る（Ｂｉｅｒ−Ｓｙｋａ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ等）。イオンを、棒電極中のスロットを介して、連続的に共鳴によってｍ／ｚに応じてイオン検出器に排出する。
【００９４】
上に列挙して考察した実験の８工程のうち、工程１、２、および８は、ＣＡＤを使用した標準的なＱＬＴ  ＭＳ／ＭＳ実験から本質的に荷電されていない。上記手順を、一般に、より大規模な一連の実験の一部として実施すると理解すべきである。カチオン注入時間を、通常、カチオン注入工程（１）でトラップ中の前駆体カチオンの蓄積率および実験で使用すべき総前駆体カチオン電荷の予め決定した目標量を評価する予備実験から決定する。ＲＦ四重極イオントラップ質量分析計中の保存されたイオン電荷（空間電荷）を制御するためのこのアプローチは、当該分野で自動利得制御（ＡＧＣ）として公知である。適切なＡＧＣスキームを使用して、カチオン−アニオン反応のために使用される試薬イオン集団を制御することができると予想される。本明細書中に示したデータでは、標準的なＭＳ／ＭＳ  ＬＴＱ  ＡＧＣプレスキャンを使用して、前駆体単離工程後に前駆体カチオン電荷を制御した。選択した試薬アニオンのための自動化制御スキームは依然として実施されていない。
【００９５】
上記手順の指示した順序付けは、カチオン前駆体のｍ／ｚが試薬アニオンよりも大きいと仮定している。試薬アニオンがｍ／ｚ単離され、特定の前駆体ｍ／ｚ枠よりもはるかに大きなｍ／ｚ比を有する場合、カチオンおよびアニオンの注入および単離の順序を逆にすることが望ましいかもしれない。試薬アニオンの至適な単離のための捕獲条件は、より低いｍ／ｚカチオンの捕獲と矛盾し得る。この場合、アニオンを最初に注入し、中心部分に集まるであろう。試薬アニオンをｍ／ｚ単離し、その後、後部分に再配置するであろう。次いで、カチオンを注入し、中心部分に捕獲し、試薬アニオンを共鳴排出することなく前駆体カチオンがｍ／ｚ単離されるであろう。残りの実験は、上記と同一であろう。
【００９６】
上記考察は、ＲＦ  ＱＬＴ質量分析計におけるＥＴＤの実施に注目している。イオン−イオン型実験のためのＲＦ多重極線形イオントラップにおける電荷徴候に依存しないイオン捕獲を利用する種々の質量分析計システムを、ＥＴＤ  ＭＳ／ＭＳ実験の実施に適応させる。１つの実施形態では、前駆体カチオンおよび試薬アニオン単離の実施およびＥＴＤプロセスのための電荷徴候に依存しない捕獲の実施に適切なＲＦトラップ装置は、６セグメントトラップであろう。このデバイスは、本質的に、途切れずに配置された３つのセグメントトラップ組（ＬＴＱデバイスなど）から構築されたＱＬＴから構成されるであろう。このような「二重の」３セグメントトラップにより、前駆体カチオンおよび試薬アニオンの両方が独立したｍ／ｚ単離を行うであろう。明らかに、この「二重」トラップの半分のうちの１つは、スキャニングｍ／ｚ分析器として機能することもできる。前駆体カチオンおよびアニオンのｍ／ｚ選択をＲＦ四重極線形トラップへのこれらの注入前に行う場合、２または４セグメント（軸方向の捕獲のための二次ＲＦ電圧を末端プレートレンズに印加するか、末端部中の並置するロッドの間二重極電圧として印加するかどうかに依存する）は、非常に満足されるであろう。
【００９７】
多価ペプチドカチオンとの反応のための単一アニオンの単離と組み合わせた本発明の手順の使用は、プロテオミクスへの質量分析の適用に非常に影響を与える。例えば、ＭｃＬｕｃｋｅｙ等によって定義されたプロトン移動実験の全コレクション（例えば、荷電状態の減少、気相集中、イオンパーキングなど）は、現在、タイムスケール許可時間依存操作およびクロマトグラフィを使用した同一の質量分析計においてＥＴＤおよびＣＡＤとタンデムに利用可能である。このような実験の例には、プロトン移動反応を介した選択された荷電状態への多価カチオンの変換が含まれる（イオンパーキング）。シグナルが１つの荷電状態に集中した後、カチオンを電子移動を誘起するアニオンに供して、ＥＴＤ生成物イオンを生成する。選択されたカチオンが多価の場合、プロトン移動アニオンの注入によって、さらなる荷電状態の減少工程を簡単に行うことができる。正味の結果は、種々の多価前駆体の事前の集中に由来する１価または２価のｃ生成物およびｚ生成物（線形イオントラップの分解能の範囲内）を含むマススペクトルである。明らかに、上記のように、最初のイオンパーキング工程を行うことなく、ＥＴＤ生成物イオンの荷電状態の減少が容易に行われる。
【００９８】
いくつかの場合、特にタンパク質または巨大なペプチドを使用して、以下の順序で質量分析計を操作することができる：（１）気相集中（イオンパーキング）、（２）インタクトな前駆体のＥＴＤ、（３）多数の多価フラグメントイオンを生成するためのインタクトな前駆体のＣＩＤ、その後の（４）ＥＴＤへの連続的曝露。得られたＥＴＤスペクトル（工程４から形成されたもの）は、前駆体ｂおよびｙイオン由来の配列情報を示すであろう。このようなストラテジーは、受け入れられつつある「トップダウン」タンパク質配列決定法（工程２）の強度をより従来の「ボトムアップ」アプローチ（工程３および４）の強度と組み合わせるであろう。一定範囲に、工程３（ＣＩＤは一定の切断（例えば、ＰｒｏのＮ末端およびＨｉｓのＣ末端）を好むことが公知である）は、従来の「ボトムアップ」プロテオミクスで使用された酵素消化に類似しているが、少し異なっている。すなわち、各ｂ生成物、ｙ生成物由来のＭＳ３スペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）の獲得により、タンパク質の分子量およびＥＴＤ生成物スペクトルが公知の配列情報が得られる。
【００９９】
［実施例１］
実施例１：ポリペプチドの電子移動解離のためのアニオンの使用
１つの実施形態によれば、ＦＣ−４３（ペルフルオロトリブチルアミン、ＰＦＴＢＡ）、サルファヘキサフルオライド（ＳＦ６）、パーフルオロ−１，３−ジメチルシクロヘキサン（ＰＤＣＨ）ヘキサフルオロベンゼン（Ｃ６Ｆ６）、およびアントラセンをＮＩＣＩ（陰イオン化学的イオン化）源に導入して、実験用アニオンを生成した。全ての場合、供給源で作製されたアニオンを、標準的なペプチド前駆体イオンと反応させた場合に、少なくともいくつかのＥＴＤ生成物を生成した。ＦＣ−４３（電子衝撃イオン源を備えた質量分析計のために使用した標準的なｍ／ｚの較正物）を供給源に導入した場合、非常に低い前駆体−ＥＴＤ生成物変換効率でいくつかのｃイオンおよびｚイオンが生成された。その後の実験では、上記分子を個別にイオン源に導入し、全てにより本発明者らの標準的な前駆体イオン（３価のリンペプチド（ＬＰＩＳＡＳＨｐＳｐＳＫＴＲ）３＋（配列番号１））が広範なｃ型およびｚ型に断片化された。前駆体−ＥＴＤ生成物変換効率は、ＳＦ６およびＰＤＣＨについては約０．１〜１％の範囲であり、（Ｃ６Ｆ６）については約０．５〜５％の範囲であり、アントラセンおよび９，１０ジフェニルアントラセンについては約５〜２０％の範囲であった。
【０１００】
アントラセン由来のアニオンを使用して認められた前駆体−ＥＴＤ生成物変換効率ほど高い前駆体−ＥＴＤ生成物変換効率が得られる他のアニオン供給源は、ＣＩイオン源中の「残存」または「バックグラウンド」ガスであった。この実験の前に、イオン−イオン反応が開始された場合に存在する漸増数の前駆体イオンは、ＥＴＤ生成物数（絶対数）を増加させなかった。イオン−イオン反応期間を通して、存在する前駆体カチオンよりもさらに多くのアニオンがイオントラップ中に存在すると考えられるので、これは興味深い。さらに、これをイオン−イオン反応後に検証し、アニオン集団は枯渇していなかった。これらの条件下では、ＥＴＤ生成物の生成数は、最初の前駆体カチオン数にほぼ比例するはずである（一次速度理論を適用すべきである）。実際、プロトン移動生成物は、最初の前駆体イオン数にほぼ比例して生成されるようであった。ＥＴＤ生成物がアニオン混合物の微量成分との反応によって生成された場合、アニオンの微量成分はイオン−イオン反応期間に枯渇し、所見を説明することができる。
【０１０１】
１つの可能性は、仮定した微量成分アニオンがＥＴＤ生成物イオンの生成を担うイオン源中の残存バックグラウンドガス（汚染）に由来することであった。この実験では、残存量のＦＣ−４３、ＳＦ６、ＰＤＣＨ、およびＣ６Ｆ６ならびにＣＩイオン源における電子捕獲によってイオンが生成される種々の未知のバックグラウンド化合物が存在し、これらを試薬アニオンとして使用した。「バックグラウンド」化合物由来の豊富な試薬アニオン集団を使用した場合、ＥＴＤ生成物イオンの生成数は最初の試薬イオン数に比例するようになった。実験の前駆体−ＥＴＤ生成物効率も実質的に改良した。
【０１０２】
イオントラップ由来の選択された狭いｍ／ｚ範囲のイオンを共鳴によって排出することができるように手順を修正し、それにより、イオン−イオン反応期間中に存在するものから特定の試薬イオン種が含まれるか排除され得る。ＥＴＤ生成物を生成するためのイオン源「バックグラウンド」化合物由来の顕著な試薬アニオンの設備を、この様式で探索した。イオン−イオン反応期間中のｍ／ｚ１８１（モノアイソトピックｍ／ｚ）を有する試薬アニオン種の排除により、実質的に減少しなかったプロトン移動生成物の生成と比較して３〜５という因数によってＥＴＤ生成物の生成が減少した。この種は、ＮＩＣＩイオン源中でのＣ６Ｆ６・−およびメタン（ＣＨ４）との間のイオン分子反応によって形成されたＣ６Ｈ５ＣＨ２−であると考えられる。さらに、アントラセン由来の試薬アニオン（Ｃ１４Ｈ１０・−およびＣＨ４のイオン分子反応に由来する）もＥＴＤを促進する。これらの試薬アニオンを生成するためにアントラセンをＮＩＣＩ源に導入する場合、最初の前駆体カチオン数と比例してＥＴＤ生成物イオンが生成される。イオン−イオン反応期間中に印加したＲＦ電荷の変化を伴うプロトン−ＥＴＤ生成物比の変化も認められた。
【０１０３】
［実施例２］
実施例２：電子移動解離質量分析装置の修正および操作によるポリペプチド配列分析
修正ナノフローエレクトロスプレーイオン源（ＥＳＩ）を備えた市販のＱＬＴ（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を使用して全実験を行った（図２〜４を参照のこと）。ＬＴＱを、装置の後方に配置したＦｉｎｎｉｇａｎ  ４５００ＣＩ源（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）に適合するように修正した。アニオンビームを、八重極イオンガイドに印加したＲＦ電圧のオン／オフ制御によってゲーティングし、ＣＩ源からＱＬＴにアニオンを輸送する。図５Ａ〜５Ｈは、３セグメントデバイスのいずれかの末端に配置したＥＳＩ源およびＣＩ源を備えた線形イオントラップの略図を示す。イオン／イオン反応の生成物を生成および分析するために、装置制御ソフトウェア（ＩＴＣＬコード）を、５Ａ〜５Ｈに図示したスキャン事象を標準的なＱＬＴ  ＭＳｎスキャン機能に組み込むように修正した。
【０１０４】
サンプルの導入
多価（プロトン化）ペプチドを、ＥＳＩによって生成した。１ｐｍｏｌ／μｌのペプチドを含む４０％アセトニトリル水溶液（０．１％酢酸を含む）を、ＳｉｌｉｃａＴｉｐ（商標）融解石英エミッタ（３０μｍチップ、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に注入した。サンプルは、アンギオテンシンＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ；配列番号２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および研究所内合成リンペプチド：ＬＰＩＳＡＳＨｐＳｐＳＫＴＲ（配列番号１）、ＡＰＶＡＰＲＰＡＡｐＴＰＮＬＳＫ（配列番号３）、およびＤＲｐＳＰＩＲＧｐＳＰＲ（配列番号４）を含んでいた。メタンバッファーガス（ＭＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）と共に負ＣＩを使用して、メタン（Ａｌｄｒｉｃｈ）の陰イオンを生成した。アントラセンを、融解石英制限カラムに接続したガスクロマトグラフオーブンおよび加熱トランスファラインアセンブリ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）からなる間に合わせの加熱バッチ注入口を介してＣＩ源に導入した。（図４を参照のこと）
【０１０５】
クロマトグラフィ
Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）１１００シリーズのバイナリＨＰＬＣシステムを、ｎＨＰＬＣ−マイクロ−ＥＳＩ−ＭＳ（ｎＨＰＬＣ−μＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）によるオンラインペプチド分離および分析のためのＱＬＴ質量分析計に接続した。
【０１０６】
合成ペプチド分析
１０の合成ペプチド（１〜１００ｆｍｏｌ）の混合物を、分析カラムにポリテトラフルオロエチレンの管類（長さ０．０６ｉｎ×直径０．０１２ｉｎ（１ｉｎ＝２．５４ｃｍ）、Ｚｅｕｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ，ＳＣ）と端が接続されたポリイミドコーティングした融解石英マイクロキャピラリー「プレカラム」（長さ３６０μｍ×直径７５μｍ、Ｐｏｌｙｍｉ−ｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｈｏｅｎｉｘ）にロードした。このカラム（長さ３６０μｍ×直径５０μｍ）を、５ｃｍの５μｍ  Ｃ１８逆相充填剤（ＹＭＣ、Ｋｙｏｔｏ）で作製されており、組み込みレーザー引き抜きエレクトロスプレーエミッタチップを具備していた（Ｍａｒｔｉｎ等，（２０００）Ａｎａｌ  ｃｈｅｍ．７２：４２６６−４２７４）。ペプチドを以下の勾配を用いて６０ｎｌ／分の流速で溶離した：０〜１００％のＢを１７分、１００〜０％のＢを１８分（Ａ、１００ｍＭ酢酸水溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；Ｂ、１００ｍＭ酢酸の７０：３０アセトニトリル溶液（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ／水））。データ依存性設定下でスペクトルを記録した。全スキャンマススペクトル（３００〜６００ｍ／ｚ）および全スキャンマススペクトル中の最も豊富なイオンに関して記録した３つのＥＴＤ  ＭＳ／ＭＳスペクトルの獲得によって装置をサイクル運転させた（１秒／サイクル）。
【０１０７】
複合混合物の分析
３００μｇアリコートの精製核タンパク質を、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、１：２０、酵素／基質）を含む１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．５）にて３７℃で一晩消化した。溶液を酢酸で酸性化し、乾燥させた。ペプチドを、メチルエステルに変換させた（Ｆｉｃａｒｒｏ等，（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，３０１−３０５）。凍結乾燥によって試薬を除去し、サンプルを、ＭｅＯＨ、ＭｅＣＮ、および０．０１１％酢酸を含む混合物に再構成した。６ｃｍのＰＯＲＯＳ  ２０  ＭＣ金属キレートアフィニティクロマトグラフィ充填剤（Ｐｅｒ−Ｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を充填したＦｅ３＋活性化固定金属アフィニティクロマトグラフィカラム（長さ３６０μｍ×直径１００μｍ）への半分のサンプルのローディングによってリンペプチドを富化した。１５μｌの２５０ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）の使用によってＣ１８マイクロキャピラリープレカラム（上記）にてリンペプチドを溶離した。プレカラムと端を接続し（上記）、リンペプチドを以下の勾配で溶離した：０〜６０％のＢを６０分、６０〜１００％のＢを７０分。全スキャンＭＳ中の５つの最も豊富なイオンをＭＳ／ＭＳのために選択したこと以外は、上記のようにスペクトルを記録した（ＥＴＤ、サイクル時間は１．５秒）。
【０１０８】
結果
図６は、２リン酸化合成ペプチドＬＰＩＳＡＳＨｐＳｐＳＫＴＲ（配列番号１）由来の（Ｍ＋３Ｈ）＋３イオンについて記録した単回スキャンＥＴＤマススペクトルを示す。このスペクトルの総獲得時間は３００ｍ秒であった。考察すべき陽イオンは、１ｐｍｏｌ／μｌレベルでサンプルを含む注入溶液のＥＳＩによってＱＬＴの前部に生成された。得られた全スキャンスペクトルは、（Ｍ＋３Ｈ）＋３イオンと（Ｍ＋２Ｈ）＋２イオンとの混合物をそれぞれｍ／ｚ４８２および７２２で含んでいた。電子移動反応のための試薬アニオンは、ＱＬＴの後部に接続したＣＩ源中に生成された。１  ｔｏｒｒ（１ｔｏｒｒ＝１３３Ｐａ）の圧力での７０ｅＶ電子とのメタンガスの衝撃により、正電荷の試薬イオン（ＣＨ５＋およびＣ２Ｈ５＋）および熱電子または熱電子付近の集団が生成された。アントラセン（Ｃ１４Ｈ１０）がＣＩ源に蒸発された場合、生成された主なアニオンは、それぞれ式Ｃ１４Ｈ９−およびＣ１４Ｈ１１−を有する偶数電子種（ｍ／ｚ１７７および１７９）である。
【０１０９】
Ｃ１４Ｈ９−およびＣ１４Ｈ１１−がＬＰＩＳＡＳＨｐＳｐＳＫＴＲ由来の（Ｍ＋３Ｈ）＋３イオンと反応する場合（約５０ｍ秒間）、これらは塩基および１電子還元薬の両方として機能する。プロトン引き抜きにより、それぞれｍ／ｚ７２２および１４４３で集中したイオンクラスターで認められた（Ｍ＋２Ｈ）＋２および（Ｍ＋Ｈ）＋生成物が生成される。（Ｍ＋３Ｈ）＋２および（Ｍ＋３Ｈ）＋に対応する組成物を有するイオン集団もこれらのクラスター中に存在する。これらのイオンクラスターの単離および衝突活性化により、奇数電子イオン成分由来のｃ型およびｚ型のフラグメントイオンの混合物ならびに偶数電子イオン成分由来のｂ型およびｙ型のフラグメントイオンの混合物が得られる（データ示さず）。等張分配から、本発明者らは、３０〜５０％の電荷移動生成物イオンは依然として解離した前駆体イオンと非共有結合すると評価する。これらは、ＣＡＤによって容易に解離される。
【０１１０】
ｃ型およびｚ型のフラグメントイオンは、電子移動によっても直接生成される。図６では、このサンプル由来の推定されるｃ型およびｚ型の生成物イオンのｍ／ｚ値を、ペプチド配列の上下に示す。認められた値に下線を引き、これは、全生成物イオン電流の３１％である。ｃ型およびｚ型のイオン系列の４つのメンバーのみが失われることに留意のこと。これらのうちの２つは、豊富な（Ｍ＋２Ｈ）＋２種に対応するイオンクラスターと重複するｍ／ｚ値で起こる。他の２つのｃ型およびｚ型のフラグメントイオンは、その形成がＰｒｏの環系におけるＮ−ＣＨ結合の切断を含むので、生成されない。この結合が破壊された場合、新規のフラグメントは、環中の他の原子と結合したままである。したがって、ＰｒｏのＮ末端およびＣ末端をそれぞれ含むｃ型およびｚ型の生成物イオンの形成は、ＥＣＤスペクトルまたはＥＴＤスペクトルのいずれかで認められない。
【０１１１】
クロマトグラフタイムスケールでのＥＴＤスペクトル作成の実現可能性を証明するために、本発明者らは、ｎＨＰＬＣ−μＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって１〜１００ｆｍｏｌレベルで１０種の合成ペプチドを含む混合物を分析した。それぞれＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ（配列番号２；１００ｆｍｏｌ）、ＡＰＶＡＰＲ−ＰＡＡｐＴＰＮＬＳＫ（配列番号３；１０ｆｍｏｌ）、およびＤＲｐＳＰＩＲＧｐＳＰＲ（配列番号４；１ｆｍｏｌ）についてｍ／ｚ４３３、５２４、および４３４で（Ｍ＋３Ｈ）＋３イオンに対応するシグナルを含むイオンクロマトグラムを図７Ａに示す。ピーク幅は、１０〜１４秒の範囲である。データ依存モードで操作する装置を使用して、各サンプルについて複数の単回スキャンＥＴＤスペクトル（この場合、５００〜６００ｍ秒／スペクトル）を記録した。２つのペプチドＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ（配列番号２）およびＤＲｐＳＰＩＲ−ＧｐＳＰＲ（配列番号４）についての単回スキャンＥＴＤスペクトルを、それぞれ図７Ｂおよび７Ｃに示す。アンギオテンシン（ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ、配列番号２）について、１８種の可能なｃ型およびｚ型の生成物イオンのうちの１４種がＥＤＴスペクトル中に存在する（図７Ｂ）。いずれかに存在しないものは、これらがＰｒｏ環系の切断によって形成されるので、非常に低いｍ／ｚ値で起こるか、認められない。１ｆｍｏｌの２リン酸化ペプチド（ＤＲｐＳＰＩＲＧｐＳＰＲ、配列番号４）で記録された単回スキャンＥＴＤスペクトルを、図７Ｃに示す。このサンプルレベルでさえも、スペクトルは、１８種の可能なｃ型およびｚ型のフラグメントイオンのうちの１２種を含む。６種の喪失のうちの４種は、２つのＰｒｏ残基の５員環系の切断に関与する。上記の両ペプチドは、認められたフラグメントイオンから容易に配列決定される。
【０１１２】
２リン酸化ペプチド（ＥＲｐＳＬｐＳＲＥＲ、配列番号５）の（Ｍ＋３Ｈ）＋３イオン（ｍ／ｚ４１２）から作成した従来のＣＡＤおよびＥＴＤ  ＭＳ／ＭＳスペクトルを図８に示す。両スペクトルを、ヒト核タンパク質の典型的な消化において生成されたリンペプチドのｎＨＰＬＣ分析中に得た。全ペプチドを、メチルエステルに変換し、ＭＳによる分析前に固定金属アフィニティクロマトグラフィに供した。低エネルギーＣＡＤスペクトルで認められた断片化（図８Ａ）は、Ｓｅｒ残基の側鎖由来の１つまたは２つのリン酸分子の喪失に対応するイオンが占める。水またはメタンのさらなる喪失によって形成された豊富なイオンも認められる。ペプチド骨格の切断に由来するフラグメントイオンは、０．５％未満の相対イオン存在量で存在しないか存在する。したがって、配列分析は不可能である。
【０１１３】
ＥＴＤスペクトルの情報量（図８Ｂ）は、低エネルギーＣＡＤスペクトルで認められたものと劇的に異なる。リン酸の喪失によって生成されるイオンは存在せず、ペプチド骨格に沿って断片化が支配的に起こる。１４種の可能なｃ型およびｚ型の生成物イオンのうち、１３種がスペクトル中に見出される。これらは、配列ＥＲｐＳＬｐＳＲＥＲ（配列番号５）を定義するのに十分過ぎるほどである。
【０１１４】
考察
図６、７、８に示す断片化の質および範囲、ならびに検出されたサンプルレベル（図７Ｃ）は、今まで何百ものペプチドに関して記録されたスペクトルで認められたもの（ＰＴＭを使用したスペクトルが含まれる）に特有である。これらのスペクトルを手作業で解釈するか（ｄｅ  ｎｏｖｏ）、これらを使用し、ＳＥＱＵＥＳＴなどのアルゴリズムを使用してデータベースを検索し、ペプチド配列を生成することができる（Ｅｎｇ等，（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．５，９７６−９８９）。典型的には、非リン酸化トリプシンペプチドのＣＡＤタンデムマススペクトルにより、２．０〜４．０の相互相関スコアが得られる。ＥＴＤを使用して、ＰＴＭ２を使用するか使用しないトリプシンペプチドのタンデムマススペクトルにより、３．０〜６．５の範囲の相互相関スコアが得られる。一旦ＳＥＱＵＥＳＴをＥＴＤ断片化に典型的な特徴を考慮するように適応させると、これらのスコアがさらに増加する可能性が高い。
【０１１５】
本調査の副産物は、補謝状放出ＱＬＴ質量分析計に基づいたイオン／イオン装置の開発である。従来のＱＬＴデバイスは、軸方法にイオンを封じ込める可能性を使用する。したがって、一極性のイオンのみをトラップの任意の所与の領域またはセグメント内に封じ込めることができ、イオン／イオン実験のために市販のＱＬＴの使用が不可能である。本明細書中に記載の修正ＱＬＴでは、ＲＦ閉じ込め磁場によってカチオンおよびアニオンが完全に同時捕獲される。ＱＬＴの末端レンズへのＲＦ電場の重ね合わせによって課された二次ＲＦ場により、必要な電荷徴候に依存しない軸方向の捕獲が得られた。
【０１１６】
ＱＬＴ装置は、イオン／イオン実験の実施のためのＱＩＴ装置を超えるいくつかの固有の利点を有し、これらには、より高いイオン能力（３０倍）およびより高いイオン注入効率（１０〜３０倍）が含まれる（３９）。図５Ａ〜５Ｈに示すように、ＱＬＴセグメントおよび末端レンズに印加されたｄｃバイアス電位の操作により、アニオンの注射および単離中に前駆体カチオンおよび試薬アニオンが軸方向に分離される。イオン／イオン反応の開始および終了を、これらのｄｃバイアス電位の調整によって制御する。２つの異なるイオン源の使用によってデバイスのいずれかの末端から異なるイオン型を注入することができるので、装置の物理的幾何学も有利である。さらに、アニオンをＲＦ四重極場のヌル軸に沿って注入するので、アニオンは最小の運動励起を受ける。この様式で注入されたアニオンは、ヘリウムバッファーガスとの衝突の安定化の間に電子脱離を受ける可能性が低い。最良のアニオン電子供与体は未熟な電子脱離にも影響を受けやすいと予想されるので、アニオンの「柔らかい」注入は、本研究のためのＱＬＴの選択における重要な検討材料であった。
【０１１７】
本研究のために修正した市販のＱＬＴ装置を、イオン／イオン反応を含む実験のために操作しなかった。本目的のためにデザインしたさらなる線形トラップ装置は、複数のＲＦ、ａｃ、およびｄｃ場の重ね合わせのためのさらなるセグメントおよびコントロールを確実に含む。これらの機構により、前駆体および試薬イオンクラスターの完全に独立した単離を含むさらより広範なイオン／イオン操作を実施可能である。さらに、本発明者らは、ＥＴＤ生成物が、電荷を中和するかさらなるフラグメントが形成されるその後のイオン／イオン反応を受けるのを防止する技術の実施を想定する。
【０１１８】
ＱＬＴにおけるＣＡＤ、ＥＴＤ、およびプロトン移動（電荷減少）を実施するためのタイムスケールが短いので（数十ｍ秒）、複数のイオン反応工程を、各ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ実験に組み込むことができる。「ボトムアップ」プロテオミクス型実験（タンパク質混合物の酵素消化によって生成されたペプチドのデータ依存ＨＰＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析）の文脈では、本発明者らは、ＥＴＤは平均の長さが２０〜２５残基のペプチドを生成するＬｙｓ−ＣまたはＡｓｎ−Ｎなどのタンパク質分解酵素の使用を促進すると予想している。ＥＳＩを使用して、このようなペプチドを、３個〜６個の電荷を有し、それによりＥＴＤの理想的な候補であえる前駆体イオンに変換する。ＥＴＤ後、本発明者らは、質量分析前にｃ型およびｚ型のフラグメントイオンが主に＋１の荷電状態であることを確実にするためのイオン／イオン、プロトン引き抜き反応（電荷減少）の使用を予想する。
【０１１９】
予備段階の結果に基づいて、本発明者らは、ＭＳ３実験を使用したプロトコールは小タンパク質または巨大ペプチドからの配列情報の入手に理想的でありうると考える。典型的なＭＳ３実験は、以下の工程を含み得る：（ｉ）ＥＳＩによってイオン化されたタンパク質で認められる荷電状態の最初の不均一な混合物を単一の荷電状態（前駆体イオンｍ／ｚ）に変換するための気相集中（「イオンパーキング」を使用したプロトン移動による電荷の減少）、（ｉｉ）制限された巨大生成物イオン組を作製するための前駆体イオンのｍ／ｚ単離およびＣＡＤ（Ａｓｐ残基のＣ末端切断によって生成されたｂ型イオンまたはＰｒｏ残基のＮ末端の切断によって形成されたｙ型イオン）、（ｉｉｉ）単一のＣＡＤ生成物イオンのｍ／ｚ単離およびＥＴＤ、および（ｉｖ）第２世代の生成物イオンのｍ／ｚ分析。得られたＥＴＤ  ＭＳ３スペクトルにより、単一のｂ型またはｙ型の中間体生成イオン（ＭＳ２生成物イオン）由来の配列情報が得られるであろう。一連のこのようなＭＳ３実験により、全ての主な中間体タンパク質イオンについての配列情報が得られるであろう。
【０１２０】
上記のプロトコールでは、第１の解離工程（ＣＡＤ）は、従来のボトムアッププロテオミクス分析における酵素消化工程と類似する。ＭＳ３スペクトルは、トリプシンペプチドから得たＭＳ２スペクトルに対応する。しかし、提案されたＭＳ３プロトコールでは、ｂ型またはｙ型の生成物イオンの各ＭＳ３スペクトルにより、分子量が公知のタンパク質の一部についての配列情報が得られる。
【０１２１】
［実施例３］
実施例３：電子移動解離質量分析を使用したホスホプロテオーム分析
リン酸化は、細胞内シグナル伝達ネットワークの基礎をなすが、タンパク質リン酸化は低レベルで起こり、リン酸化ペプチドは従来の衝突活性化解離（ＣＡＤ）ＭＳ／ＭＳを使用して配列決定することが困難であるので、タンパク質リン酸化の大規模分析は依然として困難である。以下を使用するプロトコールを本明細書中に記載する：（１）巨大な（約１５〜３０残基）多価ペプチドの混合物を生成するためのＬｙｓ−Ｃ、（２）リンペプチド富化のための固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）、（３）（リン酸塩を喪失することのない）リンペプチド断片化のための電子移動解離、および（４）データベース検索を容易にするための新規のソフトウェアアルゴリズム（ＯＭＳＳＡ）。全酵母溶解物の分析および２つの異なる細胞系におけるリンタンパク質の差分発現の表示（リンプロファイリング）についてのこのアプローチの有用性を証明する。
【０１２２】
方法
出芽酵母由来のタンパク質をＬｙｓ−Ｃまたはトリプシンで消化し、得られたペプチドを塩酸メタノールでメチルエステルに変換した。差分表示実験のために、２サンプル由来のペプチドを、それぞれｄ０−およびｄ３−メチルエステルに変換し、分析前に混合した。次に、ＩＭＡＣによってリンペプチドを富化し、（イオン／イオン反応のためのさらなるイオン源を受け入れるように適合させた）改変ＦｉｎｎｉｇａｎＬＴＱにおけるｎＲＰ−ＨＰＬＣ−μＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。装置をデータ依存モードで操作して、ＥＴＤスペクトルまたは連続的ＣＡＤ／ＥＴＤスペクトルのいずれかを得た。リンペプチドカチオンの前部から線形イオントラップへの注入およびその後の後ＣＩ源から注入したフルオランテンアニオンとの短時間の反応（約６５ｍ秒）によってＥＴＤスペクトルを得た。
【０１２３】
結果
ＥＴＤによってペプチド骨格の断片化が促進されて、ｃ／ｚイオン対が形成され、翻訳後修飾がインタクトなままである。ＥＴＤスペクトルを使用したデータベース検索を、特にリンペプチドについて、新規の確率ベースのプログラム（オープン質量分析検索アルゴリズム（ＯＭＳＳＡ））の使用によって本発明者らの研究所で至適化する。
【０１２４】
今日まで、酵母ホールセル溶解物に対してＩＭＡＣ富化ストラテジーを使用して、１回の９０分の実験およびその後の１時間のデータベース検索によって高い信頼性で約１，０００個のリンペプチドを同定した。この予備データは、衝突活性化解離後に約１０００個のリンペプチドが認められた酵母に関する初期研究から得た結果（ＣＡＤ  ＭＳの際の特徴的なリン酸塩のニュートラルロス）と十分に一致するが、ＳＥＱＵＥＳＴによって２１６個のペプチドしか同定することができず、そして／または手作業による解釈によって確証することができない。
【０１２５】
［実施例４］
連続的イオン／イオン反応
上記のように、一定のアニオンは、主にＥＴＤ試薬またはＰＴＲ試薬のいずれかとして作用する。いずれかのカテゴリー由来のアニオンへのカチオンの曝露により、これらの別々の反応を、個別且つ首尾よく行うことができる。例えば、多価ペプチド前駆体イオン（例えば、ｚ＞４）を、ＥＴＤ誘起アニオンを使用して解離し、その後これらの試薬を除去し、第２のＰＴＲ誘起アニオン型を導入することができる。生成物種の荷電状態が制御された様式で減少するようにこの第２の反応の持続時間を調整することができる。すなわち、ＥＴＤによって＋１０前駆体ペプチドを解離して、＋１〜−９の範囲の電荷を有するフラグメントを得ることができる。勿論、このような多価生成物の同位体ピークのｍ／ｚ分解能は問題があり得るので、ＥＴＤ生成物が主に＋１荷電状態に変換されるように第２のＰＴＲ反応の持続時間を調整することができる。正味の効果は、種々の荷電状態で最初に精製されたＥＴＤフラグメントをより低い荷電状態に変換し、それにより、スペクトルの解釈を簡潔にすることである。
【０１２６】
明確に、ＥＴＤおよびＰＴＲの他の配列または連続は、単独または他のイオン操作方法（例えば、活性化またはｍ／ｚ選択）と協力して有用である。いくつかの場合、ＥＴＤまたは他のイオン操作技術の前のカチオン前駆体の電荷を検証させることが有利であり得る。
【０１２７】
方法
ＦｉｎｎｉｇａｎＬＴＱ線形イオントラップ質量分析計を、ファクトリーナノスプレー源ペプチドイオン生成に対抗するデバイスの背面に配置した化学イオン化源を受け入れるように適合させた。化学的陰イオン化（メタンバッファー）を使用して、フルオランテン、安息香酸、および六フッ化硫黄のアニオンを生成した。フルオランテンおよび安息香酸を、ガスクロマトグラフオーブンおよび加熱トランスファラインからなるバッチ注入口を介して導入した。六フッ化硫黄を、リーク弁を介して直接供給源（ガスである）に導入した。電荷徴候に無関係の捕獲のために、ＬＴＱエレクトロニクスを、第２のＲＦ捕獲電圧をＱＬＴの末端レンズに重ね合わせるように修正した。
【０１２８】
結果
修正線形イオントラップ質量分析計を使用して、本発明者らは、イオン／イオン反応を使用した多価ペプチドの直接的調査を証明する。ここに、＋７ＡＣＴＨペプチド（ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶＧＫＫＲＲＰＶＲＶＹＰ７+；配列番号７２）（ｍ／ｚ  ４２０）を最初に単離し、フルオランテンのアニオンと約７５ｍ秒反応させた。この反応後に得られたスペクトルを、図９に示す（上のパネル）。ペプチドはほとんど全ての骨格結合で解離するが、多くのフラグメントは、ここで使用した質量分析計の分解能を超えた電荷を有する（挿入図を参照のこと、点で印をつけたｍ／ｚ）。この問題を回避するために、本発明者らは、連続的イオン／イオン反応を実施した。この実験では、ＥＴＤ反応および過剰なフルオランテンアニオンの排除後、得られた多価生成物イオンを偶数の六フッ化硫黄アニオンと反応させる（約２００ｍ秒）。この第２の反応（プロトン移動、ＰＴＲ）は、１プロトン化フラグメントイオンのみを含み、種々のｃ型およびｚ型生成物イオンシグナルを１つの荷電状態に集中させるために生成物スペクトルを簡素化する働きをする。正味の結果は、前駆体ペプチドのＮ末端配列およびＣ末端配列に特有の同族列の１価のｃ型およびｚ型のフラグメントイオンの生成である（線形トラップのｍ／ｚ範囲の限度は２０００である）。上の挿入図中に示す多価フラグメントの排除に留意のこと。
【０１２９】
図１０Ａおよび１０Ｂでは、本発明者らは、この場合のみＰＴＲアニオンとして六フッ化硫黄よりもむしろ安息香酸を使用した同一の実験を行った。本発明者らは最初のＥＴＤ反応の持続時間も減少させたことに留意のこと。さらに、ＥＴＤ実験後に生成された多価フラグメントイオンは、第２のＰＴＲ反応後に電荷が減少し、主に＋１荷電状態に集中する。反応時間が延長される場合、多価フラグメントは、より低い荷電状態に優先的に集中する（１５０ｍ秒の安息香酸との反応の場合、主に１価の生成物）（図１０Ｂ）。明らかに、ＥＴＤ反応後により高い分子量のｃ型およびｚ型のフラグメントイオンが生成され、不運なことに、プロトン移動反応の簡素化によってそのｍ／ｚ値が本発明者らの質量範囲の限度を超えて増加する。装置のｍ／ｚ分解能の上限と適合するほとんどの２価および１価のフラグメントイオンが得られるＰＴＲ反応時間の選択によって範囲を拡大することができる。質量分析器のｍ／ｚ分解能と釣り合った生成物の荷電状態が得られるようにＰＴＲ反応持続時間を調整することができる。あるいは、このイオン／イオンデバイスの他の質量分析器とのハイブリッドも、この質量範囲の限度を拡大する（例えば、ＴＯＦ、ＩＣＲ−ＭＳ、ｏｒｂｉｔｒａｐなど）。
【０１３０】
［実施例５］
実施例５：ＬＴＱ−ＥＴＤ装置の改変、条件、および操作
修正ナノフローエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を具備したＦｉｎｎｉｇａｎＬＴＱ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して全実験を行った（図２を参照のこと）。装置の背面に配置したＦｉｎｎｉｇａｎ４５００ＣＩ源（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）に適応するようにＬＴＱを改変した。八重極イオンガイドに印加したＲＦ電圧のオン／オフ制御によってアニオンビームをゲーティングし、ＣＩ源からＱＬＴにアニオンを輸送する。イオン／イオン反応の生成物を生成および分析するために、所望のスキャン事象を組み込むように装置制御ソフトウェア（ＩＴＣＬ）を改変する。
【０１３１】
合成リンペプチドの調製
リンペプチド標準を、衝突活性化の際に特徴的なリン酸喪失の存在に基づいて以下の種々の現行の研究計画から選択した：ＲＬＰＩＦＮＲＩｐＳＶＳＥ（配列番号６）、ｐＳＲｐＳＦＤＹＮＹＲ（配列番号７）、ＲｐＳｐＳＧＬｐＳＲＨＲ（配列番号８）、ＲＳＭｐＳＬＬＧＹＲ（配列番号９）、ＧｐＳＰＨＹＦＳＰＦＲＰＹ（配列番号１０）、ＤＲｐＳＰＩＲＧｐＳＰＲ（配列番号１１）、ＬＰＩＳＡＳＨｐＳｐＳＫＴＲ（配列番号１）、ＲＲｐＳＰｐＳＰＹＹＳＲ（配列番号１２）、ＳＲＶｐＳＶｐＳＰＧＲ（配列番号１３）、ＡＰＶＡｐＳＰＲＰＡＡｐＴＰＮＬＳＫ（配列番号１４）（「ｐ」をリン酸化部位の前に置く）。標準的なＦｍｏｃ固相化学（ＡＭＳ  ４２２マルチペプチド合成機、Ｇｉｌｓｏｎ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）を使用して合成を行った。
【０１３２】
ヒト核タンパク質の精製および消化
ＨＥＫ細胞をＴ−１５０フラスコ（１５０ｃｍ２）中でコンフルエントまで成長させ、一晩血清を枯渇させた。トリプシン／ＥＤＴＡを使用して細胞をばらばらにし、無血清培地で１回洗浄し、１０ｍＬの２つのアリコートに分けた（２×１０６細胞／ｍＬ）。第１のアリコートを、１０μＭのホルスコリンを含むＤＭＳＯと共に３７℃で５分間インキュベートした。コントロール細胞を、１０μＬのＤＭＳＯ（最終濃度は０．１％）のみを使用すること以外は同様に処理した。再懸濁細胞をペレット化し、以下を含む低張緩衝液中での震盪によって溶解した：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ  ＫＣ１、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、２．１ｍｇ／ｍＬ  ＮａＦ、１ｎＭ  オカダ酸、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、２μｇ／ｍＬロイペプチン、２μｇ／ｍＬペプシンＡ、２μｇ／ｍＬアプロチニン、２０μｇ／ｍＬベンズアミジン。核ペレットを、低速遠心分離によって単離し、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に再懸濁した。ＲＮＡおよびＤＮＡ画分を破棄した。タンパク質ペレットを、塩酸グアニジン／エタノールで洗浄し、１％ＳＤＳ中での超音波処理によって再懸濁した。懸濁液を、３５００ＭＷ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）カセット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中で２Ｌの１％ＳＤＳに対して透析する。ＢＣＡアッセイ（１９、２０）によって決定したところ、タンパク質濃度は約６ｍｇ／ｍＬであった。コントロール由来の約３００μｇの総タンパク質に対応するアリコートを、１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で０．１％ＳＤＳに希釈し、１００℃で１０分間加熱した。タンパク質を、トリプシン（１：２０）にて３７℃で一晩消化した。ペプチドを、酢酸でｐＨ３．５に酸性化した。ホルスコリン処理細胞由来の細胞を分析しなかった。
【０１３３】
ヒト核リンペプチドの分析−ＥＴＤ
反応を２回行うことによってヒト核ペプチドをメチルエステルに変換した。さらに、ペプチドを、同量のアセトニトリル、メタノール、および０．０１％酢酸水溶液中で再構成し、２５０ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用した２時間の逆相分離によってＩＭＡＣ溶離を行った（上記）。フルオランテンを、融解石英制限カラムに接続したガスクロマトグラフオーブン（１２０℃に設定）および加熱トランスファラインアセンブリ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）からなる間に合わせの加熱バッチ注入口を介してＣＩ源に導入した。メタンバッファーガス（ＭＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）を使用して、フルオランテン（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の陰イオンを生成した。ＣＡＤおよびＥＴＤ断片化法の直接比較のためのＩＴＣＬによって得た方法を使用したデータ依存設定下でスペクトルを記録した。装置を全ＭＳスキャンを行うように指示し、その後に５番目までの最も豊富なｍ／ｚ値のＣＡＤおよびＥＴＤを変化させた。自動利得制御標的を、ＣＡＤについては２０，０００、ＥＴＤについては５０，０００に設定した。アニオンを、２５ｍ秒間注入し、ペプチドと５５ｍ秒間反応させ、その後、生成物イオンを排出した。
【０１３４】
自動化ペプチド同定
ＣＡＤのために、ＳＥＱＵＥＳＴ（９）（ｖ．２７，ｒｅｖ．９（ｃ）１９９３）およびＴｕｒｂｏＳＥＱＵＥＳＴ（ｖ．２７，ｒｅｖ．１１（ｃ）１９９９−２００２）を、これらの一連の実験を通して使用した。ＥＴＤデータのために、ｃイオンおよびｚイオンをスコアリングするためにアルゴリズムを修正した（ＴｕｒｂｏＳＥＱＵＥＳＴ  ｖ．２７  ｒｅｖ．１１，（ｃ）１９９９−２００３"Ｓｅｑｕｅｓｔ２７＿ａ＿ｍｏｄ"）。示した配列を、対応するスペクトルの手作業の解釈によって確証した。
【０１３５】
結果
ヒト核リンペプチド分析−ＥＴＤ
ＣＡＤタンデムＭＳによるヒト核抽出物由来のリンペプチドを同定する本発明者らの最初の試みにより、数百種のリン酸化ペプチドが検出されたが、不適切なペプチド骨格の断片化により約１０種のリンペプチド配列のみが解釈された。ヒト核抽出物由来の最も豊富なリンペプチドは、そのＣＡＤスペクトルがリン酸、水、およびメタノールのニュートラルロスによって特徴づけられる２リン酸化ペプチド（ｍ／ｚ４１２．６）であった（図１１Ａ）。別の分析では、本発明者らは、この同一サンプルの分析のためにＥＴＤタンデムＭＳを使用した。この同一ペプチドから得られたＥＴＤスペクトルは、これらのニュートラルロスを含まないが、むしろ、完全なｃ型およびｚ型のイオン系列が明らかとなり、それにより、ヒト核スプライシング因子（アルギニン／セリンリッチ３タンパク質）由来のｅＲｐＳＬｐＳＲｅＲとしてリンペプチドを同定することができる（図１１Ｂ）。小文字の「ｅ」は、グルタミン酸のメチルエステル変換を示し、「ｐ」はリン酸化セリン残基を示す。
【０１３６】
２つの方法（ＣＡＤおよびＥＴＤ）を直接比較するために、本発明者らは、リンペプチドの溶離時に結果的にＣＡＤおよびＥＴＤが変化する第３の実験を行った。これにより、ピーク強度の相違および別のサンプルの間の実験のばらつきを制御するためにＣＡＤスペクトル直後にＥＴＤスペクトルを得ることができた。ｍ／ｚ４１２．６で類似のＣＡＤ断片化パターンが再度認められた（データ示さず）。さらに、図１２Ａは、強いニュートラルロス（不十分な骨格断片化によってこのペプチドの配列分析が妨害された）を有する４価ペプチドのこの実験から記録したＣＡＤスペクトルを示す。対応するＥＴＤスペクトル（その後のスキャン）の解釈により、これが４リン酸化ペプチドであることが明らかとなった（図１２Ｂ）。ｚ３おおびｃ９の例外を有する各生成物イオンが存在した。プロリン環系によりアミド窒素とα炭素との間の切断が全く認められなかったので、これらのイオンは検出されなかった。
【０１３７】
１００のリンペプチドにわたるＥＴＤによるヒト核リンペプチドの再分析後、表２は、ＥＴＤタンデムＭＳおよびその後のＳＥＱＵＥＳＴ（コンピュータスコアリングアルゴリズム）を使用した分析を使用して同定したこれらのリンペプチド配列の一部のリスト（５０の新規の配列にわたる）である。手作業で確証したペプチドにチェックマークを入れる。
【０１３８】
［表２］
表２：ＥＴＤによって検出されたヒト核リンペプチド
分析：Ｌｉｎｄｅｎ＿ＣｏｎＪＢＴＤＣＡＤ０４２６０４
2007529014.tif 000007
2007529014.tif 000008
2007529014.tif 000009
【０１３９】
表２続き
2007529014.tif 000010
【０１４０】
［実施例６］
実施例６：電子移動解離を促進するための芳香族炭化水素アニオンの使用
電子移動解離を促進するアニオンを調査した。多数のこれらのアニオンは、芳香族炭化水素と呼ばれる化合物クラスに属する。本発明者らの結果は、実質的に全ての試験した芳香族炭化水素が多価ペプチドと反応した場合に電子移動解離を誘起する能力を有することを証明する。試験したアニオンには、ナフタレン、フルオレン、フェナントレン、ピレン、フルオランテン、クリセン、トリフェニレン、ペリレン、アクリジン、２，２’ジピリジル、２，２’ジキノリン、９−アントラセンカルボニトリル、ジベンゾチオフェン、１，１０’−フェナントロリン、およびアントラキノンが含まれる。これらの全芳香族炭化水素が電子移動を促進するが、フルオランテンおよび２，２’ジキノリンが特に十分に機能する。
【０１４１】
図１３は、フルオランテンのラジカルアニオン由来のｍ／ｚ２０２とｍ／ｚ４８２（３プロトン化リンペプチド、ＬＰＩＳＡＳＨｐＳｐＳＫＴＲ、配列番号１）との５０ｍ秒の反応に由来する単回スキャンＥＴＤ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。ここにのみ電子移動生成物が認められる。認められた生成物のうち、２／３が直接電子移動解離の生成物にｋ対応する。生成物の約１／３が、解離しない電子移動の結果である。しかし、これらの生成物を衝突活性化してｃ型およびｚ型の生成物イオンを生成することができる（低エネルギー活性化の項を参照のこと）。これは、最初の電子移動事象によってペプチド骨格の解離が誘起されることを示すが、前駆体ペプチドイオンは他の非共有結合性相互作用によってインタクトなままであり得る。他方では、低エネルギー活性化は、ＥＴＤ様断片化経路を実際に誘発することができる。任意の事象では、フルオランテンのラジカルアニオンは、高効率で電子移動を誘起する。
【０１４２】
電子移動解離−反応ｑ（ｑは減少パラメーターであり、特に、イオントラップ中のイオンの動きに影響を与える）のプロットを準備した。このプロットから、電子移動に由来する生成物について約１３００カウント（任意の単位）が得られる（ｑ値は約．３３）。反応なしでは、強度は約３０００カウントである。本発明者が電子伝達効率を１００％と評価する場合、約２０００カウントが得られるであろう（検出器により、＋３と比較した場合、＋２イオンでは約２／３の応答が得られる）。このプロットから、本発明者らは、電子移動効率は６０％と評価する。電子移動を介した直接解離は、この値の２／３を占める（すなわち、約４０％）。
【０１４３】
ここで試験した全ての芳香族炭化水素は、種々の効率で電子移動を誘起した。これらの結果に基づいて、本発明者らは、ここで試験していない他の芳香族炭化水素も同様に挙動することを提案する。したがって、芳香族炭化水素は、一般に、多価カチオンと反応した場合に、好ましい電子移動誘導化合物クラスを示す。さらに、硫黄、酸素、または窒素（複素環）を含めるこれらの化合物の修飾により、その電子移動能力が変化すべきではなく、したがって、この群中に電子移動促進化合物が含まれるべきである。表は、化合物、分子量、およびその対応するアニオンの認められたｍ／ｚを示す。他の試験化合物には、アクリジン、２，２’ジピリジル、２，２’ジキノリン、９−アントラセンカルボニトリル、ジベンゾチオフェン、１，１０’−フェナントロリン、９’アントラセンカルボニトリル、およびアントラキノンが含まれる。これらの全化合物由来のアニオンは、ある程度電子移動解離を誘起した。
【０１４４】
［実施例７］
実施例７：ＥＴＤ質量分析法を使用して同定した不安定な翻訳後修飾
リン酸化に加えて、多数の他のタンパク質の翻訳後修飾はＣＡＤ不安定性を示し、それにより、ＣＡＤタンデムＭＳによって配列決定することは困難である。ここでは、本発明者らは、３つの最も一般的且つ問題の多い修飾（リン酸化、グリコシル化、およびスルホン化）のＥＴＤタンデムＭＳの例を提供する。
【０１４５】
トリプシンで消化した全酵母溶解物由来のリン酸化ペプチドを、ＩＭＡＣによって富化し、実施例５に記載のように、ＣＡＤおよびＥＴＤ解離法を使用して連続的に分析した。典型的なリン酸化ペプチドおよび両方法下でのその断片化挙動の例は、ｍ／ｚ４０７で認められた３プロトン化ペプチドである。このリン酸化ペプチド（ＲＫｐＳＩＬＨＴＩＲ（配列番号６８））は、ＣＡＤタンデムマススペクトルを示し、ペプチド骨格の断片化がほとんど起こらないＨ３ＰＯ４のニュートラルロスに対応するイオンが認められる（図１４Ａ）。ＣＡＤスペクトル中に全イオン電流の５％未満で存在する低レベルのｂイオンおよびｙイオンは、このペプチド配列を定義するのに不十分である。同一ペプチドのＥＴＤスペクトルは、完全なｃ型およびｚ型のイオン系列を生成するための有意なペプチド骨格切断を示し、配列がＲＫｐＳＩＬＨＴＩＲと定義される（図１４Ｂ、ｐＳはホスホセリンを示す）。
【０１４６】
グリコシル化ペプチド（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）、ＫＫＦＥＬＬＰｇＴＰＰＬＳＰＳＲＲ（配列番号６９）、４プロトン化分子（ｍ／ｚ５１８）を、ＣＡＤおよびＥＴＤの両方によっても解離した。ＣＡＤスペクトルは、２つのイオン（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃオキソニウムイオンに対応するｍ／ｚ２０４でのイオンおよびｍ／ｚ６２３で２０３（ＧｌｃＮＡｃ）のニュートラルロスを有する対応する（Ｍ＋３Ｈ）３＋前駆体イオン）によって特徴づけられる（図１５Ａ）。残りのＣＡＤスペクトルは、ほんのわずかなｂ型、ｙ型、およびａ型のイオンから構成される。しかし、ＥＴＤスペクトルは、ペプチドのほとんど完全なｃ型およびｚ型のイオン系列を示す（図１５Ｂ）。認められなかったｃ型およびｚ型のイオンのみが、プロリン環系を含む、禁じられた切断である。
【０１４７】
スルホン化修飾は、ここでＥＴＤおよびＣＡＤタンデムＭＳの両方による第３のＣＡＤ不安定性ＰＴＭ型である。ここで、スルホン化ペプチド（ＧＲＬＧｓＳＲＡＧＲ（配列番号７０））を、ＣＡＤおよびＥＴＤ質量分析法を使用して断片化した。ＣＡＤを使用して、ｍ／ｚ３３７での３プロトン化イオンのスペクトルは、（Ｍ＋３Ｈ）３＋前駆体イオンからのＳＯ３の喪失に対応するｍ／ｚ３１１での１つの主要なイオンを有していた。図１６Ａで認められるように、他のフラグメントイオンは検出できない。このペプチドのＥＴＤタンデムＭＳにより、前駆体イオンからの観察可能なＳＯ３の喪失がない完全なｃ型およびｚ型イオン系列が生成される（図１６Ｂ）。
【０１４８】
リン酸化ペプチドおよびスルホン化ペプチドの両方が、親質量（ＰＯ３およびＳＯ３）に＋８０Ｄａが付加されている。正確に測定しなければ、これら２つのＰＴＭの質量の相違が０．０８４３Ｄａであるので、質量のみによってリン酸化ペプチドからスルホン化ペプチドを同定することは困難であり得る。しかし、ＣＡＤおよびＥＴＤの連続使用により、両配列を容易に決定し（ＥＴＤ）、リン酸化ペプチド対スルホン化ペプチドとしてペプチドを同定することができる（ＣＡＤ）。ＣＡＤを使用して、リン酸化ペプチドの前駆体の質量からの−９８Ｄａの喪失としてリン酸の喪失が検出される一方で、ＳＯ３は前駆体イオンの質量からの−８０Ｄａの喪失を示す。これにより、リン酸化ペプチドまたはスルホン化ペプチドとしてペプチドが同定される。次いで、ＥＴＤスペクトルは、典型的には、ペプチド配列を特徴づけることができる。
【０１４９】
［実施例８］
実施例８：ペプチドアニオンの電子移動解離
本開示の１つの態様は、広範なペプチド骨格断片化、電子移動解離（ＥＴＤ）を誘起するための多価ペプチドカチオンと１価の多核芳香族アニオンとの電子移動反応に関する。しかし、１つの実施形態によれば、修正四重極線形イオントラップ（ＱＬＴ）質量分析計を使用して、多脱プロトン化ペプチドとカチオンとの反応も試験した。３脱プロトン化リンペプチド（ＬＰＩＳＡＳＨｐＳｐＳＫＴＲ（配列番号１））とキセノンのラジカルカチオンとの２００ｍ秒の反応により、電荷減少を伴って広範な断片化が起こる（図１７）。解離生成物のうち、ａ型およびｘ型のフラグメントイオンが最も一般的である。電荷減少前駆体ならびにａ型およびｘ型のフラグメントから二酸化炭素、リン酸、およびこれらの複数の組み合わせの喪失が認められる。
【０１５０】
Ｘｅ＋による電子の引き抜きにより、フリーラジカル化学によって駆動される解離が可能な電荷減少ペプチドを含むラジカルが得られる。証明する目的のために、本発明者らは、次に、３脱プロトン化された３残基の酸性ペプチド（ＥＥＡ）とＸａカチオンとの反応を行う。イオン／イオン反応により、第２の残基のカルボキシル基にラジカル部位を含む電荷減少ペプチドが形成される。骨格アミンのＮからの水素ラジカルの引き抜きによって隣接Ｃ−Ｃ結合の切断が促進されてａ型およびｘ型の生成物イオンが生成される。
【０１５１】
ａ型およびｘ型生成物に加えて、本発明者らはまた、ｘ型フラグメント系列中に含まれる単位よりも４４単位少ない質量電荷比を有する一連のイオンに留意する（図１７）。本発明者らは、Ｘｅ＋に対して少なくとも２個の電子が喪失した多脱プロトン化ペプチドからｘ−４４イオンが生じることを示唆する。１電子の除去はｃ末端で起こる可能性が高く、ここで、フリーラジカル駆動化学によりＣＯ２のニュートラルロスが誘発され、その一方でその他がペプチド骨格切断を誘導して、以前にそのカルボキシル末端が喪失したｘ型フラグメントを生成する（Ｘｎ−−４４、これらのプロセスはいずれかの順序で起こり得ることに留意のこと）。例えば、３脱プロトン化ＥＥＡペプチドのＸ２２−生成物イオンがその後のＸｅ＋との反応によって電子を喪失する場合、ＣＯ２のニュートラルロスが誘発されてＸ２−・−ＣＯ２生成物を生成することができる。２脱プロトン化リンペプチドとＸｅカチオンとの反応後に生成されたタンデムマススペクトルの調査により（ここでは、認められた生成物は、１電子移動事象のみに起因し得る）、ｘｎ−ＣＯ２型生成物イオンの生成の顕著な減少が認められた（２つのｘｎ−ＣＯ２生成物は、その各ｘ型フラグメントに対して約５％の存在量で認められた）。
【０１５２】
本発明者らの結果は、２脱プロトン化セルレインペプチドについてＺｕｂａｒｅｙ  ａｎｄ  ｃｏｗｏｒｋｅｒｓによるＥＤＤを介して達成された結果とある程度適合する。例えば、結果により、前駆体および多数のフラグメントからのＣＯ２のニュートラルロスも留意した。しかし、その実験によってａ型、ｃ型、およびｚ型のフラグメントイオンが生成される一方で、本発明者らのイオン／イオン反応により、ｃ型およびｚ型フラグメント（制限された他のペプチド組に由来する）をほとんどまたは全く含まないａ型およびｘ型のフラグメントが主に生成した。高エネルギーの電子は、ここで使用されるＸｅカチオンよりも電子の引き抜きで選択性が低い可能性があると考えられる。除去された電子の最初の位置の任意の相違により、ＥＤＤは、陰電子移動解離（ＮＥＴＤ）を使用して達成した反応経路とは異なる反応経路にアクセスすることができる。両電子脱離アプローチのさらなる特徴付けには、方法の間のこれらおよび他の可能性のある相違を明らかにする必要がある。
【０１５３】
電子引き抜きのためのＸｅカチオンの使用により、プロトン移動の副反応が阻止される。ペプチドアニオンへのプロトン移動は非常に発熱することに留意のこと。ペプチドアニオンのプロトン移動反応を研究するために、本発明者らは、別のカチオンプロトン化フルオランテンを導入した。プロトン移動反応により、主に、ペプチドの電荷が減少し（式１）、少量の断片化しか起こらなかった。
（１）Ｃ１６Ｈ１１＋［Ｍ−２Ｈ］２−  →  Ｃ１６Ｈ１０＋［Ｍ−Ｈ］１−
ＣＯ２ロス（約５％の相対存在量、データ占めさず）。電荷減少ペプチドアニオンの同位体分布試験より、狭い範囲で以前として起こる電位移動が明らかとなり、移動はおそらくフルオランテンまたは低レベルのバックグラウンドカチオンのいずれかから起こった。いずれかの場合、ニュートラルロス生成物イオンは電荷減少プロトン移動生成物よりも４５単位少なく、本発明者らはＣＯ２の喪失は、電子移動の副反応によって誘発されると結論づけた。
【０１５４】
Ｗｕ  ａｎｄ  ＭｃＬｕｃｋｅｙは、前の経路後に最も一般的な断片化を伴うオリゴヌクレオチドアニオンについての電子移動反応およびプロトン移動反応の両方を記載している（ペプチドアニオンについての本発明者らの所見と一致した結果）。計算により、著者は、反応の発熱性（ラジカル部位の導入ではない）が、イオン／イオン反応後のヌクレオチドアニオンの断片化のための主な原動力であると結論づけた。別の実験では、Ｚｕｂａｒｅｖ等は、ペプチドアニオンをＨ＋カチオンと反応させたところＣＯ２の喪失や骨格の切断が認められず、著者は、ラジカル部位が存在する場合、ポリペプチドアニオンのみが容易に得られると示唆することが促された。少なくともペプチドについて、本発明者らは、ペプチドアニオンからの電子の除去によりフリーラジカル化学によって駆動されたＴＥＡ断片化が誘起されるというＺｕｂａｒｅｖの主張と一致する結果を見出している。簡単に述べれば、多価ペプチドへのフリーラジカル部位の導入により、本来は高価な新規の断片化経路にアクセスすることが可能である（例えば、活性化エネルギーが低くなる）。イオン／イオン化学（すなわち、電子移動反応）により、基数電子多価ペプチドの迅速且つ有効な生成手段が示される。これらの反応を、気相化学の研究およびペプチド配列分析に使用することができる。
【０１５５】
［実施例９］
実施例９：低エネルギーのオフ抵抗共鳴活性化を使用した電子移動解離の誘発
電子移動事象後、以下の２つの結果となる可能性がある：（１）電子授受ペプチド／タンパク質が直接的に切断されて、２つの新規の種（ｃ型およびｚ型生成物対またははるかに可能性が低いがａ型およびｙ型の生成物対）が形成され得ること、または（２）ペプチド／タンパク質イオンが、さらなる電子をさらなるデエＮＣＩを保持することができるが、断片化されないこと。この例を、図１８Ａで見出すことができ、２プロトン化ペプチド（ＲＰＫＰＱＦＦＧＬＭ（配列番号７１）（ｍ／ｚ６７４））がフルオランテンのラジカルアニオンと１００ｍ秒反応した。反応後、いくつかのｃ型イオンが見出され、これらのｃ型フラグメントは、上記の第１のプロセスを示す（直接的なｃ／ｚフラグメントの精製）。図１８Ａでは、認められた電子移動生成物の実質的な部分は、電荷が減少したインタクトな前駆体ラジカル種（（Ｍ＋２Ｈ）＋・）である。
【０１５６】
解離しない直接的断片化と電荷減少との間のこの相対的分配はペプチドごとに異なる。一般に、本発明者らは、以下の傾向を認めた：（１）所与の荷電状態の前駆体イオンについて、ｚ（高ｍ／ｚ比）は非解離ラジカル生成物の収率が増加する傾向があり、（２）所与の前駆体ｍ／ｚについて、より低い前駆体の電荷（ｚ）もまた非解離生成物イオンの生成の増加に相関する傾向があり、より高い荷電状態は非解離生成物の収率の低さに相関する。例えば、＋２および＋３の荷電状態を有するｍ／ｚの前駆体イオンは、インタクトな電荷減少ラジカル生成物を主に生成する可能性が最も高いと思われる。同一のｍ／ｚを有するが荷電状態が＋１０またはそれ以上高い前駆体は主にｃ型、ｚ型、ａ型、およびｙ型の生成物イオンを生成するのに対して、インタクトな電荷減少ラジカル種は全生成物イオン収率の小さい部分である。ｍ／ｚ非または電荷と無関係に、今日まで研究されている全アニオンを有する電子移動事象後にいくつかの電荷が減少しているが解離していない種の生成がほとんど常に認められることに留意のこと。
【０１５７】
電子移動反応後のインタクトなラジカル電荷減少ペプチドイオン生成物の衝突活性化（ＣＡＤ）が三次元イオントラップデバイス中で起こり得ることが最近報告された。この研究では、電荷減少（Ｍ＋２Ｈ）＋・ニューロテンシンペプチドのＣＡＤにより、ｃ／ｚ型生成物（電子移動解離に特徴的なフラグメント）およびｂ／ｙ型生成物（衝突活性化に特徴的なフラグメント）の両方が生成された。電荷減少した電子移動生成物の従来の衝突活性化後に、類似の結果が出願人によって認められた。例えば、図１８Ａは、ペプチドＲＰＫＰＱＦＦＧＬＭ（配列番号７１）の（Ｍ＋２Ｈ）＋・に対応する生成物イオンの実質的収率を示す。典型的なＦｉｎｎｉｇａｎＬＴＱ  ＣＡＤ条件下（ｑ＝０．２５、正規化活性化エネルギーは３５％、３０ｍ秒の持続時間）でのこの電荷減少したインタクトなラジカル種（ｍ／ｚ１３４８）の単離およびその後衝突活性化により、ＥＴＤ（ｃ型およびｚ型のフラグメント）および衝突活性化の両方に特徴的な生成物が生成される（ｍ／ｚ１３３０（ＮＨ３の喪失））。対応する非ラジカルのインタクトな１価のペプチド（（Ｍ＋Ｈ）＋、ｍ／ｚ１３４７）の衝突活性化により、ｍ／ｚ１３３０で同一の生成物イオンが支配的に生成される（図１８Ｃ）。ＭｃＬｕｃｋｅｙ  ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓの所見と一致するこの結果は、電荷減少した電子移動生成物の衝突活性化により、ＥＴＤおよびＣＡＤの両方に特徴的なフラグメントイオンが生成されることを証明する。分析の見地から、２つの異なるプロセスから生成物が生成できることは、いくつかの理由のために望ましくない。第１に、各フラグメントについてｃ、ｚ、ｂ、またはｙを考慮する必要があるので、生成物イオンのスペクトルの解釈がより困難になる。第２に、衝突活性化プロセス（上記）に関連する全ての制限が以前として起こる（不安定なＰＴＭｓ、Ｈ２Ｏ、ＮＨ３などのニュートラルロス）。
【０１５８】
この問題を回避するために、衝突活性化度（解離）を、これらの電荷減少種を活性化および解離するためのオフ共鳴励起スキームの使用によって有意に減少させた。適切に弱い衝突活性化条件下でこのプロセスは依然として衝突活性化を含む一方で、活性化は電子移動型解離経路の誘発に十分であるが、従来の衝突活性化解離生成物の生成を促進するのに十分ではないエネルギーを供給する。弱い衝突活性化条件を、ＥＴＤ反応中のいつでもまたはＥＴＤ反応終了後に適用することができる。１つの実施形態によれば、正電荷の多価ポリペプチドとのアニオンの混合工程後に、電子移動型解離経路の誘発に十分であるが、従来の衝突活性化解離生成物の生成を促進するのに十分ではないエネルギーを反応にさらに供給する。より詳細には、ポリペプチドイオン生成物を、低エネルギーオフ共鳴活性化に供する。１つの実施形態によれば、線形イオントラップ内にペプチドイオン生成物を保持しながらＥＴＤ反応を終了させて残りのアニオンをイオントラップから放出させ、ポリペプチドイオン生成物を低エネルギーオフ共鳴活性化に供する。
【０１５９】
図１８Ｄは、上記ペプチドＲＰＫＰＱＦＦＧＬＭ（配列番号７１）からの低エネルギーオフ共鳴活性化（ＭＳ／ＥＴＤ／ＭＳ／ＣＡＤ／ＭＳ）を示す。ここで、本発明者らは、より低いｑおよびより低い共鳴振幅（ｑ＝０．１３、活性化エネルギーは１７％、６０ｍ秒の持続時間）でインタクトなラジカル生成物を活性化し、この波形を標的ｍ／ｚのオフ共鳴にわずかに適用する。活性化工程中の二重極共鳴によってｍ／ｚ範囲も変化してスイープされるインタクトなラジカル生成物の５ｕの大きさの単離枠の選択によってオフ共鳴活性を行った。より大きな枠によってｍ／ｚ単離工程後のトラップ中にｍ／ｚが保持されたイオンの数または型は変化しなかったが、ＣＡＤを促進するために使用した共鳴励起ＲＦスイープの開始時にイオン共鳴周波数と補助場の周波数との間の偏差が増加する。Ｍａｔｈｉｅｕパラメーターｑは、ＲＦ捕獲場中のイオン特異的周波数にほぼ比例し、達成することができるが場に残存する達成可能な最大運動エネルギーは、イオン周波数の２乗（したがって、ｑ）に比例して変化する。図１８Ｂに示したより高いエネルギー活性化と異なり、この活性化は、全ての電荷減少したインタクトなラジカルイオン集団をｃ型またはｚ型フラグメント（電子移動型解離経路のみに由来し得るフラグメント）に変換する。従来の衝突活性化解離経路に関連する生成物は認められない。さらに、対応する非ラジカルを含む１価のペプチド（（Ｍ＋Ｈ）＋）の（これらの条件下での）活性化により、いかなる型の断片化も誘起されない（図１８Ｅ）。本発明者らは、この低エネルギー活性化後に生成されたいくつかのｃ型フラグメント（ｃ６およびｃ７）が、直接ＥＴ解離後に生成された同一のｃ型イオンと比較して１単位低いｍ／ｚにシフトすることも留意する。本発明者らは、今までのところ、この矛盾を説明できない。この低エネルギーオフ共鳴活性化を、電子移動解離経路に限定される断片化を明らかに誘発することができる緩やかな加熱プロセスと見なすことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】質量分析法によるペプチド分析によって得られた種々のペプチド骨格切断型および切断生成物の関連する命名法の略図である。ａ型、ｂ型、ｃ型のフラグメントイオンは前駆体ペプチドイオンのアミノ末端を含む一方で、ｘ型、ｙ型、ｚ型のフラグメントイオンは前駆体ペプチドイオンのｃ末端を含む。低エネルギーＣＡＤプロセスは主にアミド結合を切断してｂ／ｙ型対を形成し、ＥＣＤおよびＥＴＤはアミド結合を切断して打一分がｃ／ｚ型フラグメントイオンを形成する。
【図２】本明細書中に記載のＥＴＤ実験のための装置のセットアップおよびＦｉｎｎｉｇａｎＬＴＱに付加した成分を示す略図である。斜体で列挙した項目は付加した成分であり、前レンズおよび後レンズ上の星印は、二次ＲＦ電圧を印加する場所を示す。ＮＩＣＩ（陰イオン化学イオン化）イオン源（右側に示す）は、２つの八重極および八重極間レンズの付加によって線形イオントラップと接続している。これらの付加した機構は、アニオン（または所望ならばカチオン）を生成して線形イオントラップに輸送するのに役立つ。
【図３】Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ  ４５００  ＮＩＣＩ源の略図である。
【図４】どのようにしてアントラセンが固体プローブバイアルを使用して導入されるかを示すＦｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ  ４５００  ＮＩＣＩ源の略図である。
【図５Ａ】正および負の注入、同時＋／−格納、およびイオン／イオン反応を達成するための線形イオントラップ操作の略図である。最初に、通常の操作などでカチオンをデバイスの全面から注入し、線形トラップの中心部分に蓄積される。
【図５Ｂ】次に、選択された前駆体イオン種を選択し、選択されたｍ／ｚ枠の外側の全ての他の陽イオンの放射状排出によって単離する。
【図５Ｃ】その後、選択された前駆体型のイオンを前部のＤＣオフセットの調整によって線形イオントラップの前部に移動する。
【図５Ｄ】線形イオントラップの中心部分および後部の両方のＤＣオフセットの上昇による後部供給源からのアニオンの注入手順を示す。この方法では、陽イオンを前部に含む一方で、陰イオンを後部を介して注入し、中心に蓄積させる。
【図５Ｅ】アニオンおよびカチオンを混合して反応させる前のアニオンのｍ／ｚ選択（ｍ／ｚ単離）を示す。
【図５Ｆ】最後に、１５０Ｖｐ、６００ｋＨｚ  ＲＦをレンズに印加して得られる偽ポテンシャルを軸方向への閉じ込めの強制により、組み合わせた捕獲領域でカチオンおよびアニオンが混合されて反応する。中心部分のＤＣオフセットの低下および偽ポテンシャルの除去によってアニオンを軸方向に放出させながら残存する前駆体カチオンおよび生成物カチオンを軸方向へ封じ込めることにより、反応時間を決定した。
【図５Ｇ】次いで、主なＲＦの傾斜および検出器へのイオンのｍ／ｚ連続的放射状排出（偏った共鳴励起）によってこれらのカチオンのｍ／ｚを分析する。
【図５Ｈ】あるいは、残存する試薬アニオンを保持し、ＤＣオフセットを単純に逆にすることによってｍ／ｚを分析することができる。
【図６】ｍ／ｚ４８２での３価リンペプチド（ＬＰＩＳＡＳＨｐＳｐＳＫＴＲ）（配列番号１）のアントラセンアニオンとの５０ｍ秒の反応に起因する単回スキャンＥＴＤ  ＭＳ／ＭＳスペクトル由来のデータを示す図である。ｃ型およびｚ型のフラグメントイオンの推定ｍ／ｚ値を、配列の上下にそれぞれ示す。認められた値に下線を引いている。ｚ５およびｃ７の両方がプロトン引き抜き生成物を含むイオンクラスター（ｍ／ｚ７２２で（Ｍ＋２Ｈ）＋２イオン）と重複するｍ／ｚ値を有することに留意のこと。ｃ型およびｚ型の全ての他の可能なイオンがスペクトル中に出現する。全実験時間は、３００ｍ秒であった。
【図７】ｎＨＰＬＣ−μＥＳＩとＥＴＤ−ＭＳ／ＭＳの組み合わせの使用によるペプチド混合物のデータ依存性分析を示す図である。図７Ａは、総イオンクロマトグラム（ピークは約１０秒幅）を示す。図７Ｂは、１００ｆｍｏｌの３プロトン化ペプチドＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ（配列番号２）について記録された単回スキャン（５００〜６００ｍ秒）のＥＴＤスペクトル由来のデータを示す。図７Ｃは、１ｆｍｏｌの３プロトン化ペプチドＤＲｐＳＰＩＲＧｐＳＰＲについて記録された単回スキャン（５００〜６００ｍ秒）のＥＴＤスペクトル由来のデータを示す。
【図８】ヒト核タンパク質のトリプシン消化で生成されたリンペプチドのデータ依存分析（ｎＨＰＬＣ−μＥＳＩーＭＳ／ＭＳ）の間に記録された単回スキャンした（５００〜６００ｍ秒）ＣＡＤおよびＥＴＤのマススペクトルの比較を示す図である。全ペプチドがメチルエステルに変換され、ＭＳ分析前に固定金属親和性クロマトグラフィに供した。図８Ａは、リン酸およびメタノール部分または水部分のいずれかの喪失に対応するフラグメントイオンが多数を占めるＣＡＤスペクトルを示す。図８Ｂは、１４種の可能なｃ型およびｚ型生成物イオンのうちの１３種を含むＥＴＤスペクトルを示す。スペクトルはリン酸の喪失に対応するフラグメントイオンを欠くことに留意のこと。
【図９】約７５ｍ秒間のフルオランテンのアニオンとの反応（図９、上のパネル）ならびにフルオランテンとの反応後に得られた多価生成物イオンと六フッ化硫黄の偶数アニオンとの２００ｍｓの反応（図９、下のパネル）を行った同一の＋７ＡＣＴＨペプチド（ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶＧＫＫＲＲＰＶＲＶＹＰ７+；配列番号７２）（ｍ／ｚ  ４２０）のＭＳ／ＭＳスペクトルの比較を示す。
【図１０】２０ｍ秒間のフルオランテンのアニオンとの反応（図１０Ａ）ならびにフルオランテンとの反応後に得られた多価生成物イオンと安息香酸の偶数アニオンとの１５０ｍｓの反応（図１０Ｂ）を行った同一の＋７ＡＣＴＨペプチド（ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶＧＫＫＲＲＰＶＲＶＹＰ７+；配列番号７２）（ｍ／ｚ  ４２０）のＭＳ／ＭＳスペクトルの比較を示す。
【図１１】標準的なＣＡＤ手順を使用して得られたｍ／ｚ４１２．６での同一のヒト核リンペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル（図１１Ａ）とＥＴＤを使用して得られた同一のリンペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル（図１１Ｂ）との比較を示す図である。標準的なＣＡＤプロトコール由来のスペクトル（図１１Ａ）により、リンペプチドを同定するために構造的に十分に有益な断片化情報が得られる。ＥＴＤを使用した高コントラストのＭＳ／ＭＳ（図１１Ｂ）により、前駆体の全構造を同定することができるほぼ完全なｃ型およびｚ型のイオン系列が得られる。−ＯＣＨ３はＣ末端のメチルエステルの変換を示し、ｅはグルタミン酸メチルエステルを示し、ＮＬは正規化同一性を意味することに留意のこと。
【図１２】ＣＡＤおよびＥＴＤによって生成された四リン酸化ヒト核ペプチドの断片化パターンの比較を示す図である。図１２Ａは、リン酸の強いニュートラルロスを含む４価ヒト核リンペプチドのＣＡＤ  ＭＳ／ＭＳスペクトルである。図１２Ｂは、ほぼ完全なｃ型およびｚ型のフラグメントイオン系列を有する同一リンペプチドの対応するＥＴＤスペクトルである。ＣＡＤおよびＥＴＤスペクトルは、１回の分析（スキャン２６８１および２６８２）の間に連続して得られた。−ＯＣＨ３はＣ末端のメチルエステルの変換を示すことに留意のこと。
【図１３】フルオランテンのラジカルアニオン由来のｍ／ｚ２０２とｍ／ｚ４８２（３プロトン化リンペプチド、ＬＰＩＳＡＳＨｐＳｐＳＫＴＲ、配列番号１）との５０ｍ秒の反応に由来するＥＴＤ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【図１４Ａ】ＣＡＤおよびＥＴＤ解離によるリン酸化ペプチド（ＲＫｐＳＩＬＨＴＩＲ（配列番号６８））の分析に由来するスペクトルを示す図である。ＣＡＤスペクトル中のシグナルの大部分は、ペプチド骨格が少ししか断片化しないリン酸の喪失に対応する。
【図１４Ｂ】ＣＡＤおよびＥＴＤ解離によるリン酸化ペプチド（ＲＫｐＳＩＬＨＴＩＲ（配列番号６８））の分析に由来するスペクトルを示す図である。同一ペプチドのＥＴＤスペクトルにより、完全なｃイオンおよびｚイオン系列が生成されるペプチド骨格の切断が明らかとなる。
【図１５】ＣＡＤおよびＥＴＤ解離による４プロトン化ペプチドイオン（ＫＫＦＥＬＬＰｇＴＰＰＬＳＰＳＲＲ（配列番号６９））の分析に由来するスペクトルを示す図である。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾ペプチド由来のＣＡＤスペクトルは、ｍ／ｚ２０４でＯ−ＧｌｃＮＡｃに対応するイオンおよびｍ／ｚ６２３で２０３を中性に欠く対応する（Ｍ＋３Ｈ）＋３前駆体イオンを示す（図１５Ａ）。残りのＣＡＤスペクトルは、いくつかのｂ型、ｙ型、およびａ型のイオンから構成される。ＫＫＦＥＬＬＰｇＴＰＰＬＳＰＳＲＲ（配列番号６９）のＥＴＤスペクトルでは、このペプチドについてのほとんど完全なｃイオンおよびｚイオン系列が認められる（図１５Ｂ）。
【図１６】ＣＡＤおよびＥＴＤ解離による３プロトン化ペプチド（ＧＲＬＧｓＳＲＡＧＲ（配列番号７０））の分析に由来するスペクトルを示す図である。ＣＡＤを使用して、ｍ／ｚ３３７での３プロトン化イオンは、（Ｍ＋３Ｈ）＋３前駆体イオンからの（ＳＯ３）の喪失に対応するｍ／ｚ３１１で１つの主要なイオンを有していた。図１６Ａで認められるように、スペクトル中の残りのイオンは検出不可能である。ＧＲＬＧｓＳＲＡＧＲ（配列番号７０）がＥＴＤによって断片化された場合、親イオン由来のＳＯ３の喪失が認められない完全なｃイオンおよびｚイオン系列が認められた（図１６Ｂ）。
【図１７】３脱プロトン化リンペプチド（ＬＰＩＳＡＳＨｐＳｐＳＫＴＲ（配列番号１））とＸｅのラジカルカチオオンとの２００ｍ秒の反応に由来するタンデムマススペクトルを示す図である（１０回の単一スキャンマススペクトルの平均）。
【図１８】ＣＡＤおよびＥＴＤ解離による２プロトン化ペプチド（ＲＰＫＰＱＦＦＧＬＭ（配列番号７１））の分析に由来するタンデムマススペクトルを示す図である。図１８Ａは、フルオランテンのラジカルアニオンの１００ｍ秒の反応に由来するスペクトルを示す。図１８Ｂは、フルオランテンのラジカルアニオンの１００ｍ秒の反応およびその後のｑ２５（３５％の正規化活性化エネルギー）で行ったＣＡＤに由来するスペクトルを示す。図１８Ｃは、ｑ２５（３５％の正規化活性化エネルギー）で行ったＣＡＤ由来のスペクトルを示す。図１８Ｄは、フルオランテンのラジカルアニオンの１００ｍ秒の反応およびその後のｑ１３（１７％の正規化活性化エネルギー）に由来するスペクトルを示す。図１８Ｅは、ｑ１３（１７％の正規化活性化エネルギー）に由来するスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ）】
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【図１０Ｂ）】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年11月13日(2006.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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