(57)【要約】  本発明は、変形性関節症及び／又は変形性関節症の特定のステージで示差的に発現される新たなバイオマーカーの同定及び選択、並びに新たなバイオマーカーの組み合わせの同定及び選択に関し、同様に新たなバイオマーカーの組み合わせを選択する手段にも関する。本発明のバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせの産物の発現を測定すると、以下のうち１つ又は複数において特定の利点が示される：（ａ）個体を変形性関節症であると診断すること、（ｂ）変形性関節症（ＯＡ）の２つのステージを区別すること、及び（ｃ）個体を変形性関節症（ＯＡ）の特定のステージであると診断すること。理解されているように、本発明のバイオマーカーの産物を測定するために、本発明のバイオマーカーの産物と特異的に及び／又は選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド及びタンパク質もまた、（ａ）個体を変形性関節症であると診断すること、（ｂ）変形性関節症（ＯＡ）の２つのステージを区別すること、及び（ｃ）個体を変形性関節症（ＯＡ）の特定のステージであると診断することに使用する前記ポリヌクレオチド及びタンパク質を含むキットと同様に本発明の範囲に包含される。個体の疾患の進行をモニターし、治療法の効力をモニターするための、本発明のバイオマーカーの産物と特異的に及び／又は選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド及びタンパク質の使用が、さらに本発明に包含される。本発明はまた、変形性関節症の新たな治療標的の同定における本発明のバイオマーカーの産物の使用を提供する。本発明はまた、本発明の遺伝子と結合し及び／又はその活性をモジュレートする化合物の同定における本発明のバイオマーカーの産物の使用を提供する。そのような方法によって同定された化合物は、変形性関節症及び変形性関節症の進行を研究するアッセイの開発に有用である。さらに、そのような方法によって同定された化合物は、変形性関節症又はその症状の予防、治療、管理及び／又は改善のための予防及び治療用の組成物の開発におけるリード化合物として有用である。【選択図】図１
2007511738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのバイオマーカーのタンパク質産物に選択的に結合する２又はそれ以上の単離されたタンパク質の収集物を含む組成物であって、該バイオマーカーが、図１に示される、β−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチンタンパク質リガーゼ、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分 受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセット サブファミリーＡ（ＡＢＣ１） メンバー１（ＡＢＣＡ１）、並びにＡＴＰ結合カセット サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ） メンバー１の遺伝子からなる群より選択される、上記組成物。
【請求項２】
少なくとも２つのバイオマーカーのＲＮＡ産物に選択的に結合する２又はそれ以上の単離されたポリヌクレオチドの収集物を含む組成物であって、該バイオマーカーが、図１に示される、β−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチンタンパク質リガーゼ、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分 受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセット サブファミリーＡ（ＡＢＣ１） メンバー１（ＡＢＣＡ１）、並びにＡＴＰ結合カセット サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ） メンバー１の遺伝子からなる群より選択される、上記組成物。
【請求項３】
少なくとも２つのバイオマーカーのタンパク質産物に選択的に結合する２又はそれ以上の単離されたタンパク質の収集物を含む組成物であって、該バイオマーカーが、図２に示される、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット及びＢ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質の遺伝子からなる群より選択される、上記組成物。
【請求項４】
少なくとも２つのバイオマーカーのＲＮＡ産物に選択的に結合する２又はそれ以上の単離されたポリヌクレオチドの収集物を含む組成物であって、該バイオマーカーが、図２に示される、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット及びＢ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質の遺伝子からなる群より選択される、上記組成物。
【請求項５】
バイオマーカーのタンパク質産物に選択的に結合する単離されたタンパク質の収集物を含む組成物であって、該バイオマーカーが、図３に示される、ジンクフィンガーＲＮＡ結合タンパク質及びＷＤ反復ドメイン９の遺伝子である、上記組成物。
【請求項６】
バイオマーカーのＲＮＡ産物に選択的に結合する単離されたポリヌクレオチドの収集物を含む組成物であって、該バイオマーカーが、図３に示される、ジンクフィンガーＲＮＡ結合タンパク質及びＷＤ反復ドメイン９の遺伝子である、上記組成物。
【請求項７】
少なくとも２つのバイオマーカーのタンパク質産物に選択的に結合する２又はそれ以上の単離されたタンパク質の収集物を含む組成物であって、該バイオマーカーが、図４に示される、Ｐｅｒｉｏｄ１（Drosophila）、ＥＢＮＡ１結合タンパク質２、６番染色体 オープンリーディングフレーム１５１及びラミニンγ１の遺伝子からなる群より選択される、上記組成物。
【請求項８】
少なくとも２つのバイオマーカーのＲＮＡ産物に選択的に結合する２又はそれ以上の単離されたポリヌクレオチドの収集物を含む組成物であって、該バイオマーカーが、図４に示される、Ｐｅｒｉｏｄ１（Drosophila）、ＥＢＮＡ１結合タンパク質２、６番染色体 オープンリーディングフレーム１５１及びラミニンγ１の遺伝子からなる群より選択される、上記組成物。
【請求項９】
単離されたタンパク質がリガンドである、請求項１、３、５又は７記載の組成物。
【請求項１０】
リガンドが抗体である、請求項１、３、５又は７記載の組成物。
【請求項１１】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
単離されたポリヌクレオチドが一本鎖又は二本鎖ＲＮＡである、請求項２、４、６又は８記載の組成物。
【請求項１３】
単離されたポリヌクレオチドが一本鎖又は二本鎖ＤＮＡである、請求項２、４、６又は８記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、３５ＵＳＣ§１１９下で、２００３年８月８日に出願された米国仮出願第６０／４９３，６０７号、及び２００３年１１月３日に出願された米国仮出願第６０／５１６，８２３号の優先権の利益を享受し、それを主張するものであり、各出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、変形性関節症及び／又は変形性関節症の特定のステージで示差的に発現される新たなバイオマーカーの同定及び選択、並びに新たなバイオマーカーの組み合わせの同定及び選択に関し、同様に新たなバイオマーカーの組み合わせを選択する手段にも関する。本発明のバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせの産物の発現を測定すると、以下のうち１つ又は複数において特定の利点が示される：（ａ）個体を変形性関節症であると診断すること、（ｂ）変形性関節症（ＯＡ）の２つのステージを区別すること、及び（ｃ）個体を変形性関節症（ＯＡ）の特定のステージであると診断すること。理解されているように、本発明のバイオマーカーの産物を測定するために、本発明のバイオマーカーの産物と特異的に及び／又は選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド及びタンパク質もまた、（ａ）個体を変形性関節症であると診断すること、（ｂ）変形性関節症（ＯＡ）の２つのステージを区別すること、及び（ｃ）個体を変形性関節症（ＯＡ）の特定のステージであると診断することに使用する前記ポリヌクレオチド及びタンパク質を含むキットと同様に本発明の範囲に包含される。個体の疾患の進行をモニターし、治療法の効力をモニターするための、本発明のバイオマーカーの産物と特異的に及び／又は選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド及びタンパク質の使用が、さらに本発明に包含される。本発明はまた、変形性関節症の新たな治療標的の同定における本発明のバイオマーカーの産物の使用を提供する。本発明はまた、本発明の遺伝子と結合し及び／又はその活性をモジュレートする化合物の同定における本発明のバイオマーカーの産物の使用を提供する。そのような方法によって同定された化合物は、変形性関節症及び変形性関節症の進行を研究するアッセイの開発に有用である。さらに、そのような方法によって同定された化合物は、変形性関節症又はその症状の予防、治療、管理及び／又は改善のための予防及び治療用の組成物の開発におけるリード化合物として有用である。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
変形性関節症（ＯＡ）は、骨の末端にあり、関節の関節形成表面を形成する関節軟骨が、時間が経つにつれて徐々に変性する慢性疾患である。遺伝的感受性、肥満、偶発的な又は運動性の外傷、手術、薬物及び重篤度の身体的な要求を含めて、患者が変形性関節症に罹患しやすくなると考えられる多数の要因が存在する。変形性関節症は、関節の軟骨に対する損傷によって惹起されると考えられる。２つの最も一般的な関節の損傷は、スポーツ関連の損傷及び長期にわたる「反復使用」の関節損傷である。変形性関節症に最も一般的に罹患する関節は、膝、臀部及び手である。ほとんどの場合では、膝及び臀部には必須の体重支持機能があるために、これらの関節における変形性関節症は、手の変形性関節症よりはるかに大きな能力障害を引き起こす。軟骨の変性が進行するにつれて、二次的な変化が、骨、筋、靭帯、半月板及び滑膜を含めて、関節中及びその周囲にある他の組織に生じる。軟骨組織の原発性の不全と他の組織の二次的損傷の最終的な影響は、患者が、罹患した（複数の）関節で疼痛、腫脹、脆弱及び機能的能力の喪失を経験することである。これらの症状は、患者が生産性及び／又は生活の質を喪失する結果となる点で著しい影響を及ぼすステージまで頻繁に進行する。
【０００４】
関節軟骨は、主に軟骨細胞、ＩＩ型コラーゲン、プロテオグリカン及び水からなる。関節軟骨には血液又は神経の供給がなく、軟骨細胞は、この組織中で唯一の型の細胞である。軟骨細胞は、軟骨マトリックスを形成するＩＩ型コラーゲン及びプロテオグリカンを製造する役割を有する。このマトリックスは、水でそのマトリックスの飽和を可能とする物理的化学的特性を有する。この構造的機能的関係の最終的な効果は、関節軟骨が例外的な磨耗の性質を有し、関節を形成する軟骨表面間のほとんど摩擦のない運動を可能にすることである。変形性関節症でない場合、生涯にわたって過酷な身体的条件下でも、疼痛を伴わずに体重を支持し、無制限に関節の運動を行うことが関節軟骨によって可能になることが多い。
【０００５】
生きているすべての組織と同様に、関節軟骨は、更新のプロセスを連続的に行い、「古い」細胞及びマトリックスの構成成分が除去され（異化活性）、「新しい」細胞及び分子が産生される（同化活性）。ほとんどの組織と比べて、関節軟骨での同化／異化の回転率は低い。成熟した軟骨の構造的な完全性の長期にわたる維持は、マトリックスの合成と分解の間の適切な均衡を利用するものである。軟骨細胞は、その周囲環境からの化学的機械的刺激に応答することによってマトリックスの平衡状態を維持する。これらの刺激に対する適当かつ有効な軟骨細胞の応答は、軟骨の恒常性に必須である。不十分な同化活性又は過度の異化活性により恒常性が崩壊すると、軟骨の分解及び変形性関節症が生じる可能性がある（Adams et al., 1995, Nature 377 Suppl:3-174）。損傷を受け、異化活性が増大したほとんどの組織は、組織治癒を可能にする同化反応を増大させることができる。残念ながら、軟骨マトリックスの損傷又は喪失に応答してその同化活性をアップレギュレートし、プロテオグリカン及びＩＩ型コラーゲンの合成を増大させる軟骨細胞の能力は非常に限られたものである。
【０００６】
この軟骨損傷の作用を反転させる治療法は現在知られていない。むしろ変形性関節症の現在の療法はすべて、その症状を処置する方向に向かっている。さらに、変形性関節症が潜行性に発生し徐々に進行するので、変形性関節症の特定は、潜在的な治療がより有効である可能性が高いはずである疾患進行の早期ではなく疾患発症の後期でなされることが多い。その結果、変形性関節症の疾患プロセスの予防、改変又は治療のさらなる進歩は、早期の処置を可能にするような疾患の早期の診断マーカーを同定することに決定的に依存する。
【０００７】
現在「早期の変形性関節症」は、診断することが非常に困難である。医師は、患者の病歴及び理学的検査をまず利用して、軽度の変形性関節症の診断を行う。Ｘ線検査は、関節軟骨における、根底にある早期の変化を示さない。早期の変形性関節症の診断を確認するのに使用する生化学的なマーカーは現在認められていない。一時的な関節痛などの症状は、早期の変形性関節症の一般的な徴候である。関節は、症状出現の間圧痛を感じるようになり、それは数日〜数週間続き自発的に緩和する可能性がある。しかし、これらの症状は、軟骨に対する損傷の病理学的なステージと十分に相関しないことが多い。軟骨損傷の程度を決定することによって、「早期」変形性関節症をより信頼性高く測定することができるが、軟骨の悪化を測定する比較的非侵襲的な方法は現在のところ存在しない。
【０００８】
「後期」変形性関節症の関節の臨床検査から、圧痛、関節の奇形及び可動性の喪失が明らかとなる。検査中の受動的な関節の運動により、関節が動くにつれての捻髪音又は骨と骨のこすり合いが誘発されることがある。Ｘ線検査上の変化はしばしば深在性であり、関節の空間が消失していることがあり、関節のずれが認められる可能性がある。新しい骨の形成（骨棘）が顕著である。やはり、「後期変形性関節症」の診断を正確に確認するのに使用することができる非侵襲的な方法は存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、変形性関節症の種々のステージを検出する単純な非侵襲性の診断試験、及び治療に対する患者の応答を有効にモニターする予後診断試験の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
３．発明の概要
本発明は、変形性関節症及び／又は変形性関節症の特定のステージで示差的に発現される新たなバイオマーカーの同定及び選択、並びに新たなバイオマーカーの組み合わせの同定及び選択に関し、同様に新たなバイオマーカーの組み合わせを選択する手段にも関する。本発明のバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせの産物の発現を測定すると、以下のうち１つ又は複数において特定の利点が示される：（ａ）個体を変形性関節症であると診断すること、（ｂ）変形性関節症（ＯＡ）の２つのステージを区別すること、及び（ｃ）個体を変形性関節症（ＯＡ）の特定のステージであると診断すること。理解されているように、本発明のバイオマーカーの産物を測定するために、本発明のバイオマーカーの産物と特異的に及び／又は選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド及びタンパク質もまた、（ａ）個体を変形性関節症であると診断すること、（ｂ）変形性関節症（ＯＡ）の２つのステージを区別すること、及び（ｃ）個体を変形性関節症（ＯＡ）の特定のステージであると診断することに使用する前記ポリヌクレオチド及びタンパク質を含むキットと同様に本発明の範囲に包含される。個体の疾患の進行をモニターし、治療法の効力をモニターするための、本発明のバイオマーカーの産物と特異的に及び／又は選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド及びタンパク質の使用が、さらに本発明に包含される。本発明はまた、変形性関節症の新たな治療標的の同定において本発明のバイオマーカーの産物を使用する方法の同定をも提供する。本発明はまた、本発明の遺伝子と結合し及び／又はその活性をモジュレートする化合物の同定において本発明のバイオマーカーの産物を使用する方法の同定をも提供する。そのような方法によって同定された化合物は、変形性関節症及び変形性関節症の進行を研究するアッセイの開発に有用である。さらに、そのような方法によって同定された化合物は、変形性関節症又はその症状の予防、治療、管理及び／又は改善のための予防及び治療用の組成物の開発におけるリード化合物として有用である。
【００１１】
他の実施形態では、個体がＯＡであるかどうかを決定する方法は、（ａ）被験者から総細胞タンパク質を単離するステップと、（ｂ）抗体標的として使用する本発明の１又はそれ以上のバイオマーカー、あるいはその一部によってコードされるポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を生成するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の抗体標的をアレイにスポットするステップと、（ｄ）被験者の総細胞タンパク質を前記アレイとインキュベートするステップと、（ｅ）アレイ上の各固有の位置での結合量を測定するステップと、（ｆ）その組み合わせを同定するのに使用された数学的モデルによって定義される診断を決定するために、結合量の測定値を、その数学的モデルによって作成された（複数の）式への入力に使用するステップを含む。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質（Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells kinase complex-associated protein）、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ（Nedd-4-like ubiquitin-protein ligase）、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６（B-cell CLL/lymphoma 6）、補体成分１ｑ副成分受容体１（Complement component 1q subcomponent receptor 1）、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセット サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）（ATP-binding cassette, sub-family A(ABC1), member 1(ABCA1)）、ＡＴＰ結合カセット サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１（ATP-binding cassette, sub-family G(WHITE), member 1）の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、基本的に図１に示す１９遺伝子からなる単離されたバイオマーカーを提供する。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、図２に示す腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、及びＢ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、図３に示すジンクフィンガーＲＮＡ結合タンパク質及びＷＤ反復ドメイン９の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、図４に示すＰｅｒｉｏｄ１（Drosophila）、ＥＢＮＡ１結合タンパク質２、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、及びラミニンγ１の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の５’領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の内部コード領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２０】
他の実施形態では、本発明は、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の５’領域、３’領域又は内部コード領域から増幅される１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２１】
他の実施形態では、本発明は、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の５’領域、３’領域又は内部コード領域のエクスプレスドシークエンスタグ（Expressed Sequence Tag）である１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２２】
他の実施形態では、本発明は、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子によってコードされるポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２３】
他の実施形態では、本発明はさらに、基本的に図１に示す１９遺伝子によってコードされるポリペプチド配列からなる単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２４】
他の実施形態では、本発明はさらに、図２に示す腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、及びＢ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子によってコードされるポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２５】
他の実施形態では、本発明はさらに、図３に示すジンクフィンガーＲＮＡ結合タンパク質及びＷＤ反復ドメイン９の遺伝子によってコードされるポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２６】
他の実施形態では、本発明はさらに、図４に示すＰｅｒｉｏｄ１（Drosophila）、ＥＢＮＡ１結合タンパク質２、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、及びラミニンγ１の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子によってコードされるポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２７】
他の実施形態では、本発明はさらに、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の５’領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ末端ポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２８】
他の実施形態では、本発明はさらに、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列によってコードされるカルボキシ末端ポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２９】
他の実施形態では、本発明はさらに、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の内部コード領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列によってコードされる内部ポリペプチド領域の配列を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００３０】
他の実施形態では、本発明はさらに、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーと特異的にハイブリダイズするプローブを含む組成物を提供する。
【００３１】
他の実施形態では、本発明はさらに、基本的に図１に示す１９遺伝子からなる単離されたバイオマーカーと特異的にハイブリダイズするプローブを含む組成物を提供する。
【００３２】
他の実施形態では、本発明はさらに、図２に示す腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、及びＢ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーと特異的にハイブリダイズするプローブを含む組成物を提供する。
【００３３】
他の実施形態では、本発明はさらに、図３に示すジンクフィンガーＲＮＡ結合タンパク質及びＷＤ反復ドメイン９の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーと特異的にハイブリダイズするプローブを含む組成物を提供する。
【００３４】
他の実施形態では、本発明はさらに、図４に示すＰｅｒｉｏｄ１（Drosophila）、ＥＢＮＡ１結合タンパク質２、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、及びラミニンγ１の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーと特異的にハイブリダイズするプローブを含む組成物を提供する。
【００３５】
他の実施形態では、本発明はさらに、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の５’領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列を含む単離されたバイオマーカーと特異的にハイブリダイズするプローブを含む組成物を提供する。
【００３６】
他の実施形態では、本発明はさらに、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列を含む単離されたバイオマーカーと特異的にハイブリダイズするプローブを含む組成物を提供する。
【００３７】
他の実施形態では、本発明はさらに、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の内部コード領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列を含む単離されたバイオマーカーと特異的にハイブリダイズするプローブを含む組成物を提供する。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ、あるいは一本鎖又は二本鎖ＤＮＡであるプローブを提供する。
【００３９】
一実施形態では、本発明は、補体成分１ｑ副成分受容体１の遺伝子を含む組成物を提供する。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１の遺伝子を含む組成物を提供する。
【００４１】
一実施形態では、本発明は、ＷＤ反復ドメイン９の遺伝子を含む組成物を提供する。
【００４２】
一実施形態では、本発明は、補体成分１ｑ副成分受容体１の遺伝子によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１の遺伝子によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００４４】
一実施形態では、本発明は、ＷＤ反復ドメイン９の遺伝子によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００４５】
一実施形態では、本発明は、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子によってコードされるポリヌクレオチド配列を含む単離されたバイオマーカーの遺伝子によってコードされるポリペプチドと特異的に結合するリガンドを含む組成物を提供する。
【００４６】
一実施形態では、本発明は、基本的に図１に示す１９遺伝子によってコードされるポリペプチド配列からなる単離されたバイオマーカーの遺伝子によってコードされるポリペプチドと特異的に結合するリガンドを含む組成物を提供する。
【００４７】
一実施形態では、本発明は、図２に示す腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、及びＢ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子によってコードされるポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーの遺伝子によってコードされるポリペプチドと特異的に結合するリガンドを含む組成物を提供する。
【００４８】
一実施形態では、本発明は、図３に示すジンクフィンガーＲＮＡ結合タンパク質及びＷＤ反復ドメイン９の遺伝子によってコードされるポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーの遺伝子によってコードされるポリペプチドと特異的に結合するリガンドを含む組成物を提供する。
【００４９】
一実施形態では、本発明は、図４に示すＰｅｒｉｏｄ１（Drosophila）、ＥＢＮＡ１結合タンパク質２、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、及びラミニンγ１の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子によってコードされるポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーの遺伝子によってコードされるポリペプチドと特異的に結合するリガンドを含む組成物を提供する。
【００５０】
一実施形態では、本発明は、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の５’領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ末端ポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーの遺伝子によってコードされるポリペプチドと特異的に結合するリガンドを含む組成物を提供する。
【００５１】
一実施形態では、本発明は、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列によってコードされるカルボキシ末端ポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーの遺伝子によってコードされるポリペプチドと特異的に結合するリガンドを含む組成物を提供する。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の内部コード領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列によってコードされる内部ポリペプチド領域の配列を含む単離されたバイオマーカーの遺伝子によってコードされるポリペプチドと特異的に結合するリガンドを含む組成物を提供する。
【００５３】
他の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体であるリガンドを提供する。
【００５４】
他の実施形態では、本発明は、上述の１又はそれ以上の被験体から単離されたバイオマーカーのうち１個の単離されたバイオマーカー、及びそのパッケージング手段を含むキットを提供する。
【００５５】
他の実施形態では、本発明は、固相支持体に結合した、上述の１又はそれ以上の被験体から単離されたバイオマーカーのうち１個の単離されたバイオマーカーを含むマイクロアレイを提供する。
【００５６】
他の実施形態では、本発明は、支持体に結合したリガンドを含むマイクロアレイを提供し、そのリガンドは、上述の１又はそれ以上の被験体から単離されたバイオマーカーと特異的に結合する。
【００５７】
他の実施形態では、そのリガンドはモノクローナル抗体である。
【００５８】
本発明の他の態様は、個体の変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、対照の同じバイオマーカーの発現レベルと比較して血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００５９】
本発明の他の態様は、個体の変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、基本的に図１に示す１９遺伝子からなる単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、対照の同じバイオマーカーの発現レベルと比較して血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００６０】
本発明の他の態様は、個体の軽度の変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、対照の同じバイオマーカーの発現レベルと比較して血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から軽度の変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００６１】
本発明の他の態様は、個体の軽度の変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、基本的に図１に示す１９遺伝子からなる単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、対照の同じバイオマーカーの発現レベルと比較して血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から軽度の変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００６２】
本発明の他の態様は、個体の中程度の変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、図２に示す腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、及びＢ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、対照の同じバイオマーカーの発現レベルと比較して血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から中程度の変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００６３】
本発明の他の態様は、個体の中程度から顕著な変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、図３に示すジンクフィンガーＲＮＡ結合タンパク質及びＷＤ反復ドメイン９の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、中程度の変形性関節症である個体の血液サンプル中での同じバイオマーカーの発現レベルと比較して、血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から顕著な変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００６４】
本発明の他の態様は、個体の顕著から重篤な変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、図４に示すＰｅｒｉｏｄ１（Drosophila）、ＥＢＮＡ１結合タンパク質２、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、及びラミニンγ１の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、顕著な変形性関節症である個体の血液サンプル中での同じバイオマーカーの発現レベルと比較して、血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から重篤な変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００６５】
本発明の他の態様は、個体の変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子によってコードされるポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、対照の血液サンプル中での同じバイオマーカーの発現レベルと比較して、血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００６６】
本発明の他の態様は、個体の変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、基本的に図１に示す１９遺伝子によってコードされるポリペプチド配列からなる単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、対照の血液サンプル中での同じバイオマーカーの発現レベルと比較して、血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００６７】
本発明の他の態様は、個体の変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、図２に示す腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、及びＢ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子によってコードされるポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、対照の血液サンプル中での同じバイオマーカーの発現レベルと比較して、血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００６８】
本発明の他の態様は、個体の変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、図３に示すジンクフィンガーＲＮＡ結合タンパク質及びＷＤ反復ドメイン９の遺伝子によってコードされるポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、対照の血液サンプル中での同じバイオマーカーの発現レベルと比較して、血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００６９】
本発明の他の態様は、個体の変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、図４に示すＰｅｒｉｏｄ１（Drosophila）、ＥＢＮＡ１結合タンパク質２、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、及びラミニンγ１の遺伝子からなる群から選択される２以上の遺伝子によってコードされるポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、対照の血液サンプル中での同じバイオマーカーの発現レベルと比較して、血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００７０】
本発明の他の態様は、個体の変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の５’領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ末端ポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、対照の血液サンプル中での同じバイオマーカーの発現レベルと比較して、血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００７１】
本発明の他の態様は、個体の変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列によってコードされるカルボキシ末端ポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、対照の血液サンプル中での同じバイオマーカーの発現レベルと比較して、血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００７２】
本発明の他の態様は、個体の変形性関節症を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）個体の血液サンプル中での、図１に示すβ−２−ミクログロブリン、αグルコシダーゼＩＩαサブユニット、インターロイキン１３受容体α１、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのインヒビター キナーゼ複合体関連タンパク質、腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６、ＷＤ反復ドメイン９、Ｎｅｄｄ−４様ユビキチン−タンパク質リガーゼ、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６、補体成分１ｑ副成分受容体１、サイクリンＣ、６番染色体オープンリーディングフレーム１５１、熱ショック９０ｋＤａタンパク質１α、ラミニンγ１、及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質、インターフェロン調節因子１、核内受容体活性化補助因子１、ホモ・サピエンス細胞内塩素チャネル４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の内部コード領域の１又はそれ以上のポリヌクレオチド配列によってコードされる内部ポリペプチド配列を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）に従った、対照の血液サンプル中での同じバイオマーカーの発現レベルと比較して、血液サンプル中でのバイオマーカーの発現レベルの差を検出するステップとを含み、発現レベルの差から変形性関節症が示唆され、又は予測される。
【００７３】
本発明の他の態様は、変形性関節症の進行を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）中程度の変形性関節症である個体の血液サンプル中での、図３に示す単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）のレベルを、顕著な変形性関節症である個体の対応する単離されたバイオマーカーの発現レベルと比較するステップとを含み、そのレベルの差から、中程度の変形性関節症から顕著な変形性関節症への変形性関節症の進行が示唆される。
【００７４】
本発明の他の態様は、変形性関節症の進行を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）顕著な変形性関節症である個体の血液サンプル中での、図４に示す単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）のレベルを、重篤な変形性関節症である個体の対応する単離されたバイオマーカーの発現レベルと比較するステップとを含み、そのレベルの差から、顕著な変形性関節症から重篤な変形性関節症への変形性関節症の進行が示唆される。
【００７５】
本発明の他の態様は、変形性関節症の進行を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）中程度の変形性関節症である個体の血液サンプル中での、図３で開示される遺伝子の１つを含むバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）のレベルを、顕著な変形性関節症である個体の対応する単離されたバイオマーカーの発現レベルと比較するステップとを含み、そのレベルの差から、中程度の変形性関節症から顕著な変形性関節症への変形性関節症の進行が示唆される。
【００７６】
本発明の他の態様は、変形性関節症の進行を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）顕著な変形性関節症である個体の血液サンプル中での、図４で開示される遺伝子の１つを含むバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）のレベルを、重篤な変形性関節症である個体の対応する単離されたバイオマーカーの発現レベルと比較するステップとを含み、そのレベルの差から、顕著な変形性関節症から重篤な変形性関節症への変形性関節症の進行が示唆される。
【００７７】
本発明の他の態様は、変形性関節症の退行を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）顕著な変形性関節症である個体の血液サンプル中での、図３に示す単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）のレベルを、中程度の変形性関節症である個体の対応する単離されたバイオマーカーの発現レベルと比較するステップとを含み、そのレベルの差から、顕著な変形性関節症から中程度の変形性関節症への変形性関節症の退行が示唆される。
【００７８】
本発明の他の態様は、変形性関節症の退行を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）重篤な変形性関節症である個体の血液サンプル中での、図４に示す単離されたバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）のレベルを、顕著な変形性関節症である個体の対応する単離されたバイオマーカーの発現レベルと比較するステップとを含み、そのレベルの差から、重篤な変形性関節症から顕著な変形性関節症への変形性関節症の退行が示唆される。
【００７９】
本発明の他の態様は、変形性関節症の退行を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）顕著な変形性関節症である個体の血液サンプル中での、図３で開示される遺伝子の１つを含むバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）のレベルを、中程度の変形性関節症である個体の対応する単離されたバイオマーカーの発現レベルと比較するステップとを含み、そのレベルの差から、顕著な変形性関節症から中程度の変形性関節症への変形性関節症の退行が示唆される。
【００８０】
本発明の他の態様は、変形性関節症の退行を診断又は予後診断する方法に関し、その方法は、ａ）重篤な変形性関節症である個体の血液サンプル中での、図４で開示される遺伝子の１つを含むバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｂ）ステップａ）のレベルを、顕著な変形性関節症である個体の対応する単離されたバイオマーカーの発現レベルと比較するステップとを含み、そのレベルの差から、重篤な変形性関節症から顕著な変形性関節症への変形性関節症の退行が示唆される。
【００８１】
本発明の他の態様は、患者の変形性関節症を治療する薬物の効力をモニターする方法に関し、その方法は、ａ）治療前に患者から血液サンプルを得、治療後に患者から第２の血液サンプルを得るステップと、ｂ）第１及び第２の血液サンプル中での、図３で開示される単離されたバイオマーカーの発現レベルを検出し、第１のサンプルと第２のサンプルのバイオマーカーの発現レベルを比較するステップとを含み、第２のサンプルと比較した第１のサンプルのバイオマーカーの発現レベルの示差的な発現から、患者の変形性関節症を治療する薬物の効力が示唆される。
【００８２】
本発明の他の態様は、患者の変形性関節症を治療する薬物の効力をモニターする方法に関し、その方法は、治療前に患者から血液サンプルを得、治療後に患者から第２の血液サンプルを得るステップと、第１及び第２の血液サンプル中での、図４で開示される単離されたバイオマーカーの発現レベルを検出するステップと、第１のサンプルと第２のサンプルのバイオマーカーの発現レベルを比較するステップとを含み、第２のサンプルと比較した第１のサンプルのバイオマーカーの発現レベルの示差的な発現から、患者の変形性関節症を治療する薬物の効力が示唆される。
【００８３】
本発明の他の態様は、患者の変形性関節症を治療する薬物の効力をモニターする方法に関し、その方法は、治療前に患者から血液サンプルを得、治療後に患者から第２の血液サンプルを得るステップと、第１及び第２の血液サンプル中での、図３で開示される遺伝子の１つを含むバイオマーカーの発現レベルを検出するステップと、第１のサンプルと第２のサンプルのバイオマーカーの発現レベルを比較するステップとを含み、第２のサンプルと比較した第１のサンプルのバイオマーカーの発現レベルの示差的な発現から、患者の変形性関節症を治療する薬物の効力が示唆される。
【００８４】
本発明の他の態様は、患者の変形性関節症を治療する薬物の効力をモニターする方法に関し、その方法は、治療前に患者から血液サンプルを得、治療後に患者から第２の血液サンプルを得るステップと、第１及び第２の血液サンプル中での、図４で開示される遺伝子の１つを含むバイオマーカーの発現レベルを検出するステップと、第１のサンプルと第２のサンプルのバイオマーカーの発現レベルを比較するステップとを含み、第２のサンプルと比較した第１のサンプルのバイオマーカーの発現レベルの示差的な発現から、患者の変形性関節症を治療する薬物の効力が示唆される。
【００８５】
３．１  定義
以下の定義は、以下の明細書の記載において用いられる特定の用語について提供するものである。
【００８６】
本明細書において用いる用語「３’末端」とは、３’末端ヌクレオチドが（ポリＡテールが存在する場合には）ポリＡテールに隣接するコード領域又は非翻訳領域の末端ヌクレオチドである場合に、ｍＲＮＡの最後の１０００ヌクレオチド又は１／３までのｍＲＮＡの末端部分を意味する。すなわち、ｍＲＮＡの３’末端は、（ポリＡテールが存在する場合には）ポリＡテールを含まない。遺伝子の「３’領域」とは、遺伝子の３’末端内又は３’末端に位置するポリヌクレオチド（二本鎖又は一本鎖）を意味し、それには、限定されるものではないが、３’非翻訳領域（存在する場合）、及び遺伝子の３’タンパク質コード領域が含まれる。３’領域は、８塩基長より短くなく、１０００塩基長より長くはない。３’領域の可能性ある他の長さとしては、限定されるものではないが、１０、２０、２５、５０、１００、２００、４００及び５００ヌクレオチドが挙げられる。
【００８７】
本明細書において用いる用語「５’末端」とは、ｍＲＮＡの最初のヌクレオチドで開始して、（ｍＲＮＡの全長がポリＡテールを含まない場合に）ｍＲＮＡの最初の１０００ヌクレオチド又は１／３までのｍＲＮＡの末端部分を意味する。遺伝子の「５’領域」とは、遺伝子の５’末端内又は５’末端に位置するポリヌクレオチド（二本鎖又は一本鎖）を意味し、それには、限定されるものではないが、５’非翻訳領域（存在する場合）、及び遺伝子の５’タンパク質コード領域が含まれる。５’領域は、８塩基長より短くなく、１０００塩基長より長くはない。５’領域の可能性ある他の長さとしては、限定されるものではないが、１０、２０、２５、５０、１００、２００、４００及び５００ヌクレオチドが挙げられる。
【００８８】
本明細書において用いる用語「増幅された」とは、核酸配列について使用する場合、特定の核酸配列の１又はそれ以上のコピーが鋳型核酸から生成される方法、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応の方法（Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol. 155: 335）を意味する。「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」とは、特異的な核酸鋳型配列を増幅するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を指す。ＰＣＲ反応は反復的な温度サイクル系を含み、典型的には４０〜１００μｌの容量で行われる。反応混合物は、ｄＮＴＰｓ（４種の各デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、プライマー、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ、及び核酸鋳型を含む。ＰＣＲ反応は、ポリヌクレオチドプライマーのセットであって、第１プライマーが核酸鋳型配列の一方の鎖におけるある領域に相補的な配列を含み、第２プライマーが標的核酸配列の第２鎖におけるある領域に相補的な配列を含み、相補ＤＮＡ鎖の合成を開始するようなプライマーセットを添加し、核酸ポリメラーゼを鋳型依存的重合剤として用いて、（ｉ）鋳型配列内に含まれる標的核酸配列に対する増幅に必要なプライマーのアニーリングステップ、（ｉｉ）核酸ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成するプライマーの伸長ステップ、からなるＰＣＲサイクルステップを許容する条件下にて、核酸鋳型配列を増幅することを含む。「ポリヌクレオチドプライマーのセット」又は「ＰＣＲプライマーのセット」は、２、３、４又はそれ以上のプライマーを含みうる。一実施形態においては、ｅｘｏ−Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ反応における核酸鋳型を増幅する。増幅の他の方法としては、限定されるものではないが、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリヌクレオチド特異性に基づく増幅（ＮＳＢＡ）、又は当技術分野で公知の任意の他の方法が挙げられる。
【００８９】
本明細書において用いる用語、ポリペプチドの「アミノ末端」領域とは、遺伝子の５’末端内又は５’末端に位置するポリヌクレオチド配列（二本鎖又は一本鎖）によりコードされるポリペプチド配列を意味し、例えば限定されるものではないが、遺伝子の５’タンパク質コード領域が含まれる。本明細書において用いる用語「アミノ末端」領域とは、ポリペプチドの最初のアミノ酸で開始して、ポリペプチドの最初の３００アミノ酸又は１／３までのポリペプチドのアミノ末端部分を意味する。ポリペプチドの「アミノ末端」領域は、３アミノ酸長より短くなく、３５０アミノ酸長より長くはない。ポリペプチドの「アミノ末端」領域の可能性ある他の長さとしては、限定されるものではないが、５、１０、２０、２５、５０、１００及び２００アミノ酸が挙げられる。
【００９０】
本明細書に使用される、タンパク質性薬剤（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び抗体）に関する用語「類似体」は、第２のタンパク質性薬剤と類似した又は同じ機能を保持する（しかし必ずしも第２のタンパク質性薬剤と類似した又は同じアミノ酸配列を含むのでない）タンパク質性薬剤又は第２のタンパク質性薬剤と類似した又は同じ構造を保持するタンパク質性薬剤を意味する。類似したアミノ酸配列を有するタンパク質性薬剤は、次の３つの条件：（ａ）タンパク質性薬剤が第２のタンパク質性薬剤のアミノ酸配列と、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有すること；（ｂ）タンパク質性薬剤が、第２のタンパク質性薬剤の少なくとも５個の連続アミノ酸残基、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、少なくとも１５個の連続アミノ酸残基、少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、少なくとも２５個の連続アミノ酸残基、少なくとも４０個の連続アミノ酸残基、少なくとも５０個の連続アミノ酸残基、少なくとも６０個の連続アミノ酸残基、少なくとも７０個の連続アミノ酸残基、少なくとも８０個の連続アミノ酸残基、少なくとも９０個の連続アミノ酸残基、少なくとも１００個の連続アミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続アミノ酸残基，又は少なくとも１５０個の連続アミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされること；及び（ｃ）タンパク質性薬剤が第２のタンパク質性薬剤をコードするヌクレオチド配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされることのうち少なくとも１つの条件を満たす第２のタンパク質性薬剤を意味する。第２のタンパク質性薬剤と類似した又は同じ構造を保有するタンパク質性薬剤は、第２のタンパク質性薬剤と類似した二次、三次又は四次構造をもつタンパク質性薬剤を意味する。タンパク質性薬剤の構造は当業者に公知の方法により決定することができ、かかる方法として、限定されるものでないが、ペプチドのアミノ酸配列決定、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴、円偏光二色性、及び結晶学的電子顕微鏡が挙げられる。
【００９１】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するには、最適な比較のために配列同士をアラインメントする（例えば、第２のアミノ酸又は核酸配列との最適なアラインメントのために第１のアミノ酸又は核酸配列の配列中にギャップを導入することができる）。その後、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列のある位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められている場合、それらの分子はその位置で同一となる。２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝重なり合う同一位置の数／位置の総数×１００％）。ある実施形態では、２つの配列が同じ長さである。
【００９２】
２つの配列間の同一性パーセントはまた、数学的アルゴリズムを使っても決定することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好適な非限定的な例は、Karlin及びAltschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2264-2268に記載され、Karlin及びAltschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5877において改変されたアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschulら, 1990, J. Mol. Biol. 215: 403に記載のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメーターセット（例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２）を用いて行うことにより、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメーターセット（例えば、スコア＝５０、ワード長＝３）を用いて行うことにより、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップを挿入したアラインメントを得るためには、Gapped BLASTをAltschulら, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載のように使用する。あるいはまた、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の遠い関係を検出する反復検索を行うこともできる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用してもよい（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照のこと）。配列比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers及びMiller, 1988, CABIOS 4:11-17に記載のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合は、ＰＡＭ１２０加重残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティー１２、及びギャップペナルティー４を使用してもよい。
【００９３】
２つの配列間の同一性パーセントは、上述したものと類似の技法を用いて、ギャップを挿入して又は挿入しないで決定することができる。同一性パーセントを計算するには、典型的には、正確な一致（マッチ）だけを数える。
【００９４】
本明細書中で用いる、非タンパク質性類似体に関する用語「類似体」は、第１の有機若しくは無機分子と類似した又は同じ機能を有し、かつ第１の有機若しくは無機分子と構造上類似している第２の有機若しくは無機分子を意味する。
【００９５】
本明細書において用いる用語「付着」及び「スポッティング（スポット）」とは、核酸アレイを形成するために核酸を固相基板上に配置し、それにより核酸を共有結合、水素結合又はイオン相互作用により安定に固相基板に結合させる方法を意味する。
【００９６】
本明細書において用いる用語「バイオマーカー」とは、ＯＡと非ＯＡとの間で、及び／又はＯＡの１以上のステージとＯＡの１以上の他のステージとの間で、示差的に調節されている遺伝子を意味する。
【００９７】
本明細書において用いる用語「血液核酸サンプル」とは、血液に由来する核酸を意味し、例えば、全血、遠心分離した溶解血液、血清不含全血又は血液画分（末梢血白血球（ＰＢＬ）若しくは本明細書に記載するような他の血液画分）に由来する核酸が挙げられる。全血とは、分画していない血液、例えば、血液の液滴を意味する。遠心分離した溶解血液又は「溶解血液」とは、本明細書（例えば実施例２）に記載のように溶解バッファーと混合し、遠心分離した全血を意味する。血清不含全血とは、本明細書（例えば実施例２）に記載のように血清又は血漿を遠心分離により除去した全血を意味する。好ましくは、血液核酸サンプルは全血又は遠心分離した溶解血液であり、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡであるか、又はｍＲＮＡに対応する核酸、例えば上記血液から単離されたｃＤＮＡである。核酸サンプルとしては、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに由来するＰＣＲ産物も含まれる。
【００９８】
本明細書において用いる用語、ポリヌクレオチドの「カルボキシ末端」領域とは、遺伝子の３’末端内又は３’末端に位置するポリヌクレオチド配列（二本鎖又は一本鎖）によりコードされるポリペプチド配列を意味し、例えば限定されるものではないが、遺伝子の３’タンパク質コード領域が含まれる。本明細書において用いる「カルボキシ末端」領域とは、ポリペプチドの最後のアミノ酸から該ポリペプチドの３００アミノ酸又は１／３までのポリペプチドのカルボキシ末端部分を意味する。「３’末端」は、ポリＡテール（存在する場合）を含まない。ポリペプチドの「カルボキシ末端」領域は、３アミノ酸長より短くなく、３５０アミノ酸長より長くはない。ポリペプチドの「カルボキシ末端」領域の可能性ある他の長さとしては、限定されるものではないが、５、１０、２０、２５、５０、１００及び２００アミノ酸が挙げられる。
【００９９】
本明細書において用いる「軟骨」又は「関節軟骨」とは、哺乳動物（ヒト及び他の種を含む）における、弾力性のある半透明の結合組織を意味する。軟骨は、主に軟骨細胞、ＩＩ型コラーゲン、少量の他の型のコラーゲン、他の非コラーゲンタンパク質、プロテオグリカン及び水から構成され、通常、Ｉ型及びＩＩ型コラーゲン並びに他のプロテオグリカンのマトリックス中の繊維芽細胞で構成される軟骨膜により囲まれている。大部分の軟骨は成熟により骨となるが、軟骨のなかには鼻、耳、膝及び他の関節などの位置で原形を留めるものもある。軟骨は血液又は神経供給がなく、軟骨細胞はこの組織における唯一の細胞型である。
【０１００】
本明細書において用いる用語「軟骨核酸サンプル」とは、軟骨に由来する核酸を意味する。好ましくは、軟骨核酸サンプルは総ＲＮＡ、ｍＲＮＡであるか、又はＲＮＡに対応する核酸、たとえばｃＤＮＡである。軟骨核酸サンプルには、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに由来するＰＣＲ産物も含まれる。
【０１０１】
本明細書において用いる「軟骨細胞」とは、軟骨からの細胞を意味する。
【０１０２】
「コード領域」とは、ＲＮＡとして発現されるＤＮＡの領域を意味する。
【０１０３】
本明細書において用いる用語「化合物」及び「薬物」は、相互互換的に用いられる。
【０１０４】
本明細書において用いる用語「対照」又は「対照サンプル」は、変形性関節症の診断、変形性関節症のステージの決定、又は変形性関節症のステージの識別に関する場合、変形性関節症を有しないと分類される（すなわち「正常」の）個体又は個体群から単離された１以上のサンプルを意味する。対照又は対照サンプルという用語はまた、変形性関節症を有しないと分類された（すなわち「正常」の）１以上の個体のサンプルに由来するデータのまとめを意味する。本明細書において用いる用語「対照」は、予防薬又は治療薬のスクリーニングに関する場合、アッセイ又は方法について他の条件を比較することができる標準又は基準を意味する。
【０１０５】
本明細書中で用いる、タンパク質性薬剤（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び抗体）に関する用語「誘導体」は、アミノ酸残基の置換、欠失及び／又は付加の導入により改変されたアミノ酸配列を含むタンパク質性薬剤を意味する。本明細書中で用いる用語「誘導体」はまた、任意のタイプの分子のタンパク質性薬剤との共有結合により修飾されたタンパク質性薬剤も意味する。例えば、限定されるものでないが、抗体は、グリコシル化、アセチル化、ペグ（ＰＥＧ）化、リン酸化、アミド化、誘導体化（公知の保護基／ブロッキング基による）、タンパク質加水分解による切断、細胞性リガンド又は他のタンパク質との結合などによって修飾することができる。タンパク質性薬剤の誘導体は当業者に公知の技法を用いて化学的修飾により調製することができ、例えば、限定されるものでないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などが含まれる。さらに、タンパク質性薬剤の誘導体は１個以上の非古典的アミノ酸を含んでいてもよい。タンパク質性薬剤の誘導体はそれが誘導された元来のタンパク質性薬剤と類似の又は同一の機能を保持している。
【０１０６】
本明細書中で用いられる、非タンパク質性誘導体に関する用語「誘導体」は、第１の有機又は無機分子の構造に基づいて形成された第２の有機又は無機分子を意味する。有機分子の誘導体には、限定されるものでないが、例えば、ヒドロキシル、メチル、エチル、カルボキシル又はアミノ基の付加又は欠失により修飾された分子が含まれる。有機分子はまた、エステル化、アルキル化及び／又はリン酸化されていてもよい。
【０１０７】
本明細書において用いる「ＯＡの診断」又は「ＯＡ診断」とは、本発明の一態様において、ある個体がＯＡに罹患しているか否かを決定するプロセスを意味する。特定の実施形態において、「ＯＡの診断」又は「ＯＡ診断」とは、個体がＯＡを有しているか又は個体がＯＡを有していないかの２つの状態のいずれかの決定を指す。別の特定の実施形態において、「診断」とは、個体がＯＡを有している、個体がＯＡを有していない、そして個体がＯＡを有しているか又は有していないかを十分な確実性で決定することができないの３つの状態のいずれかの決定を指す。「個体がＯＡの２つのステージの１つを有しているかどうかの診断」又は「ＯＡのステージの識別」とは、個体がＯＡの２つのステージの１つ（例えば、軽度 対 対照（例：非ＯＡ／正常）；中程度 対 軽度；中程度 対 重篤；顕著 対 重篤など）を有しているかどうかを決定するプロセスを意味する。別の特定の実施形態において、「診断」とは、上述のＯＡの２つのステージの１つとして診断、又は個体が言及した２つのステージのいずれを有するかを十分な確実性で決定することができないという３つ目の可能性の３つの状態のいずれかの決定を指す。「ＯＡのステージの診断」又は「ＯＡステージ決定」とは、本発明においては、ＯＡの特定のステージ又は悪性度に罹患しているかどうかの決定に達することを意味する。特定の実施形態において、「ＯＡステージ決定」又は「ＯＡのステージの診断」とは、個体がＯＡのステージの１つを有するか、又は個体がＯＡ若しくは他のＯＡステージのいずれも有していないの２つの状況のいずれかの決定を意味する。別の特定の実施形態において、「ＯＡステージ決定」又は「ＯＡのステージの診断」とは、個体が特定のＯＡのステージを有するか、個体がＯＡを有しておらず、他のＯＡステージのいずれも有していないか、あるいは個体が特定のＯＡのステージを有するか、該特定のＯＡのステージを有しないか否かについて十分な確実性で決定することができないという３つの状態のいずれかの決定を指す。当業者であれば、本明細書において「十分な確実性」が、診断の感度及び特異性の両方についての医学的要求に応じて異なることを理解しうる。より具体的には、十分な確実性には、５０％を超える感度及び／又は特異性、６０％を超える感度及び／又は特異性、７０％を超える感度及び／又は特異性、８０％を超える感度及び／又は特異性、９０％を超える感度及び／又は特異性、１００％の感度及び／又は特異性が含まれる。
【０１０８】
本明細書において用いる用語「示差的発現」とは、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのＲＮＡ及び／又はタンパク質産物の発現レベルの差異であって、１つのサンプル中のバイオマーカーのＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、及び／又は１以上のｍＲＮＡのスプライス変異体の量又はレベルを、第２サンプル中のＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、及び／又は１以上のｍＲＮＡのスプライス変異体の量又はレベルで測定される同じ本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーの発現レベルと比較した場合の差異を意味する。「示差的に発現される」にはまた、本発明のバイオマーカー（１又は複数）のタンパク質発現（１以上のタンパク質変種を含む）の量又はレベルと比較した場合の、サンプル又はサンプル集団中のタンパク質、又は本発明のバイオマーカーによりコードされる１以上のタンパク質変種の測定が含まれる。示差的発現は、本明細書に記載のようにして判定することができ、また当業者であれば理解することができる。「示差的に発現された」又は「発現レベルの変化」という用語は、あるサンプル中のＲＮＡの量及び／又はタンパク質の量で測定される所定のバイオマーカーの測定可能な発現レベルの、第２サンプル中の所定のバイオマーカーの測定可能な発現レベルと比較した場合の増大又は低減を意味する。「示差的に発現された」又は「発現レベルの変化」という用語はまた、あるサンプル集団中の所定のバイオマーカーの測定可能な発現レベルの、第２サンプル集団中のバイオマーカーの測定可能な発現レベルと比較した場合の増大又は低減を意味しうる。本明細書において用いる「示差的に発現された」は、単一サンプルを意味する場合、該サンプル中の所定のバイオマーカーの発現レベルを、対照集団の所定のバイオマーカーの平均発現レベルと比較した場合の比（この比は１．０に等しくない）を意味する。「示差的に発現された」は、発現レベルの比又はｐ値を用いた第２サンプル集団と比較した場合の第１サンプル集団又はサンプル集団に対する単一サンプルの比較に関して用いる。ｐ値を用いる場合、ｈｎＲＮＡ及びｍＲＮＡを含む核酸転写産物は、ｐ値が０．１未満の場合に第１集団と第２集団との間で示差的に発現されたと同定される。より好ましくは、ｐ値は０．０５未満である。よりさらに好ましくは、ｐ値は０．０１未満である。より好ましくは、ｐ値は０．００５未満である。最も好ましくは、ｐ値は０．００１未満である。発現レベルの比に基づいて示差的発現を判定する場合、ＲＮＡ又はタンパク質は、第２サンプルと比較した場合の第１サンプルにおける発現レベルの比が１．０を超える又はそれ未満である、例えば、１．２、１．５、１．７、２、３、４、１０、２０を超える又は１、例えば０．８、０．６、０．４、０．２、０．１未満の場合に、示差的に発現されている。本発明の別の実施形態において、ｈｎＲＮＡ及びｍＲＮＡを含む核酸転写産物は、第２集団の平均発現レベルと比較した場合の第１集団の発現レベルの平均の比が１．０を超える又はそれ未満である、例えば、１．２、１．５、１．７、２、３、４、１０、２０を超える又は１未満、例えば０．８、０．６、０．４、０．２、０．１の場合に、示差的に発現されている。本発明の別の実施形態において、ｈｎＲＮＡ及びｍＲＮＡを含む核酸転写産物は、第２集団の平均と比較した場合の第１サンプルにおけるその発現レベルの比が１．０を超える又はそれ未満である、例えば、１．２、１．５、１．７、２、３、４、１０、２０を超える又は１未満、例えば０．８、０．６、０．４、０．２、０．１の場合に、示差的に発現されている。「示差的に増大した発現」とは、標準、例えば第２集団の発現レベルの平均などに対して、１倍、１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍又はそれ以上であることを意味する。「示差的に低減した発現」とは、標準、例えば第２集団の発現レベルの平均などに対して、１倍、０．８倍、０．６倍、０．４倍、０．２倍、０．１倍又はそれ以下であることを意味する。
【０１０９】
本明細書において用いる用語「薬効（薬物の効力）」とは、薬物の有効性を意味する。「薬効」は、通常は、薬物で処置した又は処置している患者の臨床応答によって測定される。薬物は、それが所望の臨床結果、例えば、本明細書に記載される変形性関節症の症候の低減又は変形性関節症の進行の予防を達成する場合には、効力が高いとみなされる。吸収される薬物の量は、患者の応答を予測するために用いることができる。原則は、薬物の用量が増大すると、所望の最大効果に達するまでは患者においてより大きな効力が観察される。最大点に達した後に薬物を投与すると、通常は副作用が増大する。
【０１１０】
本明細書中で用いる用語「有効量」は、変形性関節症又は１以上のその症候の進行、重篤度及び／又は持続期間を低減する又は改善し、変形性関節症又は１以上のその症候の発達、再発又は発症を防止し、変形性関節症又は１以上のその症候の進行を防止し、あるいは、別の治療の予防又は治療効果を増大又は回線するために十分な化合物の量を意味する。
【０１１１】
本明細書において、「断片（フラグメント）」という用語は、タンパク質性薬剤の場合、別のポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続したアミノ基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基；少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基、又は少なくとも２５０個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質（抗体を含む）を指す。特定の実施形態では、タンパク質又はポリペプチドの断片は、タンパク質又はポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する。別の実施形態において、タンパク質又はポリペプチドの断片は、当該タンパク質又はポリペプチドの少なくとも２、３、４又は５つの機能を保持する。好ましくは抗体のフラグメントは、抗原に免疫特異的に結合する能力を保持する。
【０１１２】
本明細書において、「融合タンパク質」という用語は、第１のタンパク質、ポリペプチド又は機能性フラグメント、これらの類似体又は誘導体のアミノ酸配列と、異種タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのアミノ酸配列（すなわち、第１のタンパク質又はフラグメント、これらの類似体又は誘導体とは異なる第２のタンパク質又はポリペプチド又はフラグメント、これらの類似体又は誘導体）とを含むポリペプチドのことをいう。一実施形態では、融合タンパク質は、異種タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに融合した予防薬又は治療薬を含む。この実施形態によると、これらの異種タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、予防薬又は治療薬と異なる種類であってもよいし、なくてもよい。
【０１１３】
本明細書において用いる用語「遺伝子発現パターン」、「遺伝子発現プロファイル」及び「核酸アレイ発現プロファイル」は、相互互換的に用いられ、対照と比較した場合の、アレイ上の複数の核酸プローブにハイブリダイズした複数の標的核酸配列のハイブリダイゼーションのパターンを含む。
【０１１４】
本明細書において用いる用語「にハイブリダイズする」及び「ハイブリダイゼーション」とは、相補的核酸との配列特異的な非共有結合相互作用、例えば標的核酸配列とアレイ上の核酸メンバーとの相互作用を意味する。
【０１１５】
本明細書において用いる用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる１以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識されているヒト免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、ε、μ定常領域の遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域の遺伝子が含まれる。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄ、すなわち２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端における可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）と、ＣＯＯＨ末端におけるκ又はλ定常領域遺伝子によりコードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄ、すなわち４４６アミノ酸）は、同様に、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）と、上記の定常領域遺伝子以外、例えばγ（約３３０アミノ酸をコードする）の１つによりコードされる。
【０１１６】
本明細書において、「併用（組み合わせ）」という用語は、複数の治療（例えば、複数の予防薬及び／又は治療薬）を使用することをいう。「併用（組み合わせ）」という用語の使用においては、被験体に治療（例えば、予防薬及び／又は治療薬）を投与する順序が限定されない。第１の治療（例えば、第１の予防薬又は治療薬）は、第２の治療（例えば、第２の予防薬又は治療薬）の投与の前（例えば、５分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）に、同時に、後（例えば、５分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に、被験体に投与することができる。
【０１１７】
本明細書において用いる用語「疾患の指標」とは、発現パターンが疾患を有していない患者よりも疾患を有している患者においてより有意に高頻度に見出されるように（最大９５％の信頼水準を設定した慣用の統計方法を用いて決定した場合）、疾患の診断となる発現パターンを意味する。好ましくは、疾患の指標となる発現パターンは、疾患を有する患者の少なくとも６０％において見とめられ、疾患を有していない患者の１０％未満に見とめられる。より好ましくは、疾患の指標となる発現パターンは、疾患を有する患者の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上において見とめられ、疾患を有していない患者の１０％未満、８％未満、５％未満、２．５％未満、１％未満に見とめられる。
【０１１８】
本明細書において用いる用語、遺伝子の「内部コード領域」とは、本明細書において定義する遺伝子の５’領域と３’領域との間に位置するポリヌクレオチド（二本鎖又は一本鎖）を意味する。「内部コード領域」は、８塩基長より短くなく、また１０００塩基長より長くはない。「内部コード領域」の可能性ある他の長さとしては、限定されるものではないが、１０、２０、２５、５０、１００、２００、４００及び５００ヌクレオチドが挙げられる。５’領域、３’領域及び内部領域は、重複しているものではないが、連続している必要はなく、また、対応する遺伝子の全長にまで付加される必要はない。
【０１１９】
本明細書において用いる用語、ポリペプチドの「内部ポリペプチド領域」とは、本明細書において定義するポリペプチドのアミノ末端領域とカルボキシ末端領域の間に位置するポリペプチド配列を意味する。ポリペプチドの「内部ポリペプチド領域」は、３アミノ酸長より短くなく、３５０アミノ酸長より長くはない。ポリペプチドの「内部ポリペプチド領域」の可能性ある他の長さとしては、限定されるものではないが、５、１０、２０、２５、５０、１００及び２００アミノ酸が挙げられる。
【０１２０】
ポリペプチドのアミノ末端領域、カルボキシ末端領域及び内部ポリペプチド領域は、重複しているものではないが、連続している必要はなく、また、対応するポリペプチドの全長にまで付加される必要はない。
【０１２１】
本明細書において用いる「単離された」又は「精製された」とは、核酸について用いる場合、天然の配列がその正常の細胞（例えば染色体）環境から取り出されているか、又は非天然環境において合成された（例えば人工的に合成された）ことを意味する。従って、「単離された」又は「精製された」配列は、無細胞溶液中に存在するか又は異なる細胞環境中に置かれたものでありうる。「精製された」という用語は、配列が存在するヌクレオチドのみであることを意味するものではなく、それが天然に結合している非ヌクレオチド物質を本質的に含まず（約９０〜９５％純粋であり）、従って単離された染色体とは区別されることを意味する。
【０１２２】
本明細書中で用いる用語「単離された」又は「精製された」は、タンパク質性薬剤（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又は抗体）に関する場合、それが由来する細胞又は組織源からの細胞性物質を実質的に含まず、いくつかの実施形態では、異種タンパク質性薬剤（すなわち混入タンパク質）を実質的に含まないか、又は化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質性薬剤を意味する。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、タンパク質性薬剤が細胞から単離されるか又は組換えで生産されたものであって、細胞の細胞成分から分離されているタンパク質性薬剤の調製物を意味する。従って、細胞性物質を実質的に含まないタンパク質性薬剤は、約３０％、２０％、１０％又は５％（乾燥重量基準）未満の量の異種タンパク質性薬剤（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は抗体、本明細書では「混入タンパク質」ともいう）を含有するタンパク質性薬剤の調製物を含む。タンパク質性薬剤が組換えにより生産されたものであるときは、培地をも実質的に含まないことが好ましく、すなわち、培地はタンパク質調製物の体積の約２０％、１０％又は５％未満となるようにする。タンパク質性薬剤が化学合成により調製されたものであるときは、化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まないことが好ましく、すなわちタンパク質性薬剤の合成に伴う化学前駆体又は他の化学物質から分離される。したがって、そのようなタンパク質性薬剤の調製物は、約３０％、２０％、１０％又は５％（乾燥重量基準）未満の化学前駆体又は目的のタンパク質性薬剤以外の化合物を含有する。好ましくは、本明細書において開示されるタンパク質性薬剤は単離されている。
【０１２３】
本明細書において用いる用語「発現レベル」とは、当業者に公知の及び本明細書に記載の方法により測定した場合に、所定の核酸又はタンパク質の測定可能な量を意味する。本発明のバイオマーカーに対応するＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡのスプライス変異体に関して、発現レベルはハイブリダイゼーションによって測定可能であり、又はより定量的な測定方法、例えばリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン、ＴａｑＭａｎ（登録商標）の両方を利用する）、モレキュラービーコン技術を用いることもできる。
【０１２４】
本明細書において用いる「リガンド」とは、本発明のバイオマーカーの遺伝子の１つによりコードされるポリペプチドに特異的に結合する分子である。リガンドは、核酸（ＲＮＡ若しくはＤＮＡ）、ポリペプチド、ペプチド、又は化合物でありうる。本発明のリガンドは、ペプチドリガンド、例えば骨格ペプチド、線状ペプチド、又は環状ペプチドでありうる。好ましい実施形態において、ポリペプチドリガンドは抗体である。抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体でありうる。抗体は、完全な免疫グロブリン例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ又はそれらのサブタイプでありうる。抗体は、機能的部分、例えば、生物学的又は化学的機能を有する化合物（第２の異なるポリペプチドでありうる）、治療薬、細胞傷害剤、検出可能な部分又は固相支持体にコンジュゲートさせてもよい。ポリペプチドリガンド、例えば本発明の抗体は、バイオマーカーの遺伝子の１つによりコードされるポリペプチドと、高いアフィニティ及び特異性で相互作用する。例えば、ポリペプチドリガンドは、バイオマーカーの遺伝子の１つによりコードされるポリペプチドと、少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、又は１０１０Ｍ−１のアフィニティ定数で結合する。
【０１２５】
本明細書において用いる用語「大部分（majority）」とは、組成の総メンバーの５０％を超えることを表す数字（例えば、５１％、６０％若しくは７０％、又は８０％若しくは９０％、又は最大１００％）を意味する。「大部分」という用語は、アレイに関する場合、アレイの固相基板と安定に結合する総核酸メンバーの５０％を超える（例えば、５１％、６０％若しくは７０％、又は８０％若しくは９０％、又は最大１００％）ことを意味する。
【０１２６】
本明細書中で用いる用語「管理する」「管理している」及び「管理」は、被験体に、変形性関節症の治癒をもたらさない治療（例えば、予防薬若しくは治療薬）から引き出す有益な効果を意味する。ある特定の実施形態において、変形性関節症の進行又は悪化を防止するために、変形性関節症を「管理する」ための１種以上の治療を被験体に投与する。
【０１２７】
「ｍＲＮＡ」とは、遺伝子に相補的なＲＮＡを意味し、ｍＲＮＡは、タンパク質コード領域を含み、また５’末端及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含んでもよい。
【０１２８】
本明細書において用いる「ｍＲＮＡの完全性（integrity）」とは、軟骨サンプル又は血液サンプルのいずれかに由来するｍＲＮＡ抽出物の品質を意味する。良好な完全性のｍＲＮＡ抽出物は、当技術分野で周知の方法、例えばＲＮＡアガロースゲル電気泳動（例えば、Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology）によって試験した場合に分解されないと考えられる。好ましくは、ｍＲＮＡサンプルは、それを抽出した軟骨又は血液サンプルの遺伝子発現レベルを真に表すために、良好な完全性を有する（例えば、１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満のｍＲＮＡが分解されている）。
【０１２９】
本明細書中で用いる用語「非応答性」及び「不応性」は、変形性関節症のための現在利用可能な治療（例えば、予防薬若しくは治療薬）であって、臨床上、該変形性関節症に関連する１以上の症候を緩和するのに十分でない上記治療を用いて治療された患者を意味する。典型的には、そのような患者は重症の持続的活動性の変形性関節症を患っており、その変形性関節症に関連する症候を改善するために更なる治療を必要とする。
【０１３０】
本明細書において用いる「正常」とは、ＯＡの症候、例えば関節痛を示さず、軟骨損傷又はＯＡと診断されたことがない個体又は個体群を意味する。好ましくは、正常個体（１若しくは複数）は、ＯＡ罹患の投薬治療を受けておらず、他の任意の疾患と診断されたことがない。より好ましくは、正常個体は、被験サンプルと比較して、類似した性別、年齢及び肥満度指数（ＢＭＩ）を有する。本発明において「正常」とはまた、正常個体から単離されたサンプルを意味し、たとえば正常個体から単離された総ＲＮＡ又はｍＲＮＡを含む。正常個体から採取されたサンプルは、軟骨組織サンプルから単離されたＲＮＡであって、ＯＡと診断されておらず、その組織採取の時点でＯＡのいずれの症候をも示さない個体からの軟骨組織から単離された軟骨の全体又は一片から単離されたＲＮＡである。本発明の一実施形態において、「正常」軟骨サンプルは、死後１４時間に単離され、抽出されたｍＲＮＡサンプルの完全性が確認される。正常個体から採取されたサンプルはまた、血液サンプルから単離されたＲＮＡであって、ＯＡと診断されておらず、その血液採取の時点でＯＡのいずれの症候をも示さない個体からの血液を含む。
【０１３１】
本明細書において用いる「核酸（１若しくは複数）」は、「ポリヌクレオチド（１若しくは複数）」と相互互換的に用いられ、これは一般的には、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチド（ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、あるいはそれらの組み合わせでありうる）を意味する。「核酸（１若しくは複数）」としては、限定されるものではないが、一本鎖若しくは二本鎖核酸が含まれる。本明細書において用いる用語「核酸（１若しくは複数）」はまた、上述のように１以上の修飾塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡを含んでもよい。従って、安定性又は他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも「核酸」である。「核酸」という用語は、本明細書で用いられる場合、核酸の化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞（例えば単一及び複合細胞）に特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学的形態を包含する。「核酸」又は「核酸配列」はまた、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせの領域を含みうる。またこれは、本発明のいくつかの実施形態においてはエクスプレスドシークエンスタグ（ＥＳＴ）を含みうる。ＥＳＴは、遺伝子の発現される配列の一部（すなわち配列の「タグ」）であり、ｍＲＮＡの領域を逆転写してｃＤＮＡを生成することによって作製される。
【０１３２】
本明細書において定義する「核酸アレイ」とは、支持体に付着された複数の固有の核酸（すなわち「核酸メンバー」）であって、各核酸メンバーが、固有の予め選択された領域において支持体に付着されている核酸を意味する。一実施形態において、支持体の表面に付着された核酸プローブはＤＮＡである。好ましい実施形態において、支持体の表面に付着された核酸プローブはｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドである。別の好ましい実施形態において、支持体の表面に付着された核酸プローブは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成されたｃＤＮＡである。本明細書において用いる「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と相互互換性である。別の好ましい実施形態において、「核酸アレイ」とは、サザン及び／又はノーザンブロッティング技法において用いられるニトロセルロース又は他の膜に付着された複数の固有の核酸を意味する。
【０１３３】
本明細書において用いる「核酸プローブ」又は「核酸マーカー」又は「アレイ上の核酸メンバー」又は「アレイ上の核酸プローブ」にはまた、アレイに固定化され、非共有結合する相互作用のセット（相補的な塩基対合の相互作用を含む）により相補配列の核酸メンバーと結合可能な核酸が含まれる。本明細書において用いる核酸プローブは、天然塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ若しくはＴ）又は修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含んでもよい。さらに、核酸プローブ中の塩基は、それらがハイブリダイゼーションを妨害しない（すなわち、核酸プローブが、標準のストリンジェントな又は選択的なハイブリダイゼーション条件下でその相補配列に特異的に結合する）限り、ホスホジエステル結合以外の結合で連結していてもよい。従って、核酸プローブは、その構成塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって連結しているペプチド核酸であってもよい。
【０１３４】
本明細書において用いる「核酸標的」又は「核酸標的マーカー」は、非共有結合する相互作用のセット（相補的な塩基対合の相互作用を含む）により相補配列のアレイに結合した核酸に結合可能な核酸と定義される。核酸標的は、遺伝子若しくはその一部に対応する単離された核酸配列であってもよいし、あるいは核酸標的はサンプルから単離された総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡであってよい。好ましくは、核酸標的又は核酸マーカーは、ヒトの軟骨、血液、又は滑液抽出物に由来する。より好ましくは、核酸標的は、ヒトの軟骨、血液、又は滑液の総ＲＮＡ抽出物、好ましくはｍＲＮＡ抽出物に由来する、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドである。
【０１３５】
一実施形態において、アレイに結合した「標的」の慣用の核酸アレイは、全長ヒトゲノムの典型、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップであってもよいし、図１に記載の１９遺伝子の２又はそれ以上からなる又はそれを含む単離されたバイオマーカー又は遺伝子プローブを慣用のアレイに適用してもよい。
【０１３６】
別の実施形態において、アレイに結合する配列は、本発明のバイオマーカーに対応する単離されたオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ又はＰＣＲ産物であり、総細胞ＲＮＡをアレイに適用する。
【０１３７】
本明細書において用いる用語「オリゴヌクレオチド」とは、２又はそれ以上（好ましくは３を超える）デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドから構成される分子と定義される。その正確なサイズは、多くの要因に依存し、それはまたそのオリゴヌクレオチドの最終的な機能及び用途に依存している。オリゴヌクレオチドは、約８〜約１，０００ヌクレオチド長でありうる。８〜１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが本発明において有用であるが、好ましいオリゴヌクレオチドの範囲は、約８〜約１５塩基長、約８〜約２０塩基長、約８〜約２５塩基長、約８〜約３０塩基長、約８〜約４０塩基長、又は約８〜約５０塩基長である。
【０１３８】
本明細書において用いる「変形性関節症」とは、関節炎の特定の形態、特に、関節の咬合表面を形成する骨の末端にある関節軟骨が経時的に徐々に変性する慢性疾患を意味する。軟骨の変性は、異化活性（「古い」細胞及びマトリックス成分の除去）と同化活性（「新しい」細胞と分子の産生）との不均衡により引き起こされる可能性がある（Westacott et al., 1996, Semin Arthritis Rheum. 25: 254- 72）。
【０１３９】
本明細書において用いる用語「変形性関節症（ＯＡ）のステージ決定」又は「変形性関節症（ＯＡ）のグレード決定」とは、個体におけるＯＡの存在、不在、及び発達（advancement）又は進行（progression）の程度を判定することを意味する。「ＯＡステージ」又は「ＯＡグレード」には、以下に記載するＭａｒｓｈａｌｌのスコア決定系に従って定義される「軽度ＯＡ」、「中程度ＯＡ」、「顕著なＯＡ」及び「重篤なＯＡ」並びに「ＯＡなし」が含まれるが、これらのステージに限定されるものではない。例えば、より小さなカテゴリーが定義されている（例えば「軽度ＯＡ」がＭａｒｓｈａｌｌスコアに基づいて中程度、顕著及び重篤としてカテゴリーに細分されうる）Ｍａｒｓｈａｌｌにより教示されるさらに精密なスコア決定系を用いてもよい。一実施形態において、ＯＡのステージを分類するための伝統的な方法を用いることも可能である。多くのスコア決定系が当技術分野で知られており、例えばＯＡ診断及びステージ決定の別の方法としてＫｅｌｌｇｒｅｎ−Ｌａｗｒｅｎｃｅスコアと共にＸ線写真を用いてもよい。当業者であれば、「軽度ＯＡ」、「中程度ＯＡ」、「顕著なＯＡ」及び「重篤なＯＡ」を他の分類系ではどのように解釈するかを理解することができる。軟骨を異なる疾患ステージに分類するために、好ましくはＭａｒｓｈａｌｌに記載されているスコア決定系を用いる（Marshall W., 1996, The Journal of Rheumatology, 23: 582-584、参照により本明細書に組み入れる）。この方法によると、６種の関節表面（膝蓋、大腿骨滑車、内側大腿顆、内側脛骨プラトー、外側大腿顆及び外側脛骨プラトー）のそれぞれに、その特定の表面上に存在する最も不良な病変に基づいて軟骨のグレードを割り当てる。次いで、スコア決定系を適用し、各関節表面に、その表面の軟骨重症度のグレードを反映する変形性関節症の重症度の数値を与える。例えば、内側大腿顆がその最も重篤な軟骨の損傷としてグレードＩの病変を有する場合、１の値が割り当てられる。次いで、患者の合計スコアは、関節表面６種のスコアの和に由来する。その合計スコアに基づいて、各患者を、変形性関節症の４群のうち１群に入れる：すなわち「軽度」（初期）はＭａｒｓｈａｌｌスコア１〜６を有すると定義され、「中程度」はＭａｒｓｈａｌｌスコア７〜１２を有すると定義され、「顕著」はＭａｒｓｈａｌｌスコア１３〜１８を有すると定義され、「重篤」はＭａｒｓｈａｌｌスコアが１８を超えると定義される。別の実施形態において、本明細書における教示に従って本発明のバイオマーカーの発現を測定して、疾患の存在、不在又は発達若しくは進行の程度を判定することができる。
【０１４０】
本明細書中で使用する表現「薬学的に許容される塩（又は複数の塩）」には、それだけには限定されないが、本発明の方法を用いて同定される化合物中に存在し得る酸性基又は塩基性基の塩が含まれる。塩基性の性質を有する化合物は様々な無機酸及び有機酸と様々な塩を形成することができる。このような塩基性化合物の薬学的に許容される酸付加塩の調製に使用することができる酸は、無毒性の酸付加塩、すなわち、それだけには限定されないが、硫酸（ｓｕｌｆｕｒｉｃ）、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ）、マレイン酸（ｍａｌｅｉｃ）、酢酸（ａｃｅｔｉｃ）、シュウ酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸（ｓｕｌｆａｔｅ）、硫酸水素、リン酸、酸性リン酸、イソニコチン酸、酢酸（ａｃｅｔａｔｅ）、乳酸、サリチル酸、クエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ）、酸性クエン酸、酒石酸、オレイン酸、タンニン酸、パントテン酸、酒石酸水素、アスコルビン酸、コハク酸、マレイン酸（ｍａｌｅａｔｅ）、ゲンチジン酸、フマル酸、グルコン酸、グルカロン酸、サッカリン酸、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸及びパモ酸（すなわち１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸））の塩を含めた薬理学的に許容される陰イオンを含む塩を形成する酸である。アミノ部分を含む化合物は、上述の酸に加えて様々なアミノ酸と薬学的に許容される塩を形成し得る。酸性の性質を有する化合物は様々な薬理学的に許容される陽イオンと塩基塩を形成することができる。このような塩の例には、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩、特にカルシウム、マグネシウム、ナトリウムリチウム、亜鉛、カリウム、及び鉄の塩が含まれる。
【０１４１】
本明細書において用いる「ポリヌクレオチド」は、８塩基長を超える二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖又は一本鎖ＲＮＡを含む。
【０１４２】
本明細書において用いる「によりコードされるポリペプチド配列」とは、本明細書において定義する遺伝子のタンパク質コード領域の翻訳後に得られるアミノ酸配列を意味する。１９遺伝子の各々のｍＲＮＡヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号（図１〜５参照）により特定され、また対応するポリペプチド配列は、タンパク質アクセッション番号（図１〜５参照）により特定される。図１〜５に示すＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号は、１９遺伝子の各々のｍＲＮＡヌクレオチド配列内の５’ＵＴＲ、タンパク質コード領域（ＣＤＳ）及び３’ＵＴＲの位置を提供する。
【０１４３】
タンパク質又はタンパク質の断片を宿主動物の免疫に用いる場合には、タンパク質のいくつかの領域が、該タンパク質の所定の領域又は３次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導しうる。これらの領域又は構造は、エピトープ又は抗原決定基と称する。本明細書において用いる「抗原性断片」とは、１以上のエピトープを含むポリペプチドの部分を意味する。エピトープは、抗原に由来する本質的に線状の配列を含む線状であってもよいし、あるいは、他の配列で遺伝子上では分離されているがポリペプチドリガンドの結合部位で構造的に一緒になる配列を含むコンフォメーションであってもよい。「抗原性断片」は、５０００、１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０又は２５又は２０又は１０又は５アミノ酸長でありうる。
【０１４４】
本明細書において用いる「予め選択された領域」、「予め特定した領域」又は「固有の位置」とは、核酸の付着に使用する、使用された又は使用しようとする基板上の局在化範囲を意味し、本明細書中では「選択領域」又は単に「領域」という。予め選択された領域は、都合の良い任意の形状、例えば、丸形、長方形、楕円形、楔形などでありうる。いくつかの実施形態において、予め選択された領域は、約１ｃｍ２より小さく、より好ましくは１ｃｍ２未満であり、より好ましくは０．５ｃｍ２未満であり、いくつかの実施形態では０．１ｃｍ２未満である。「予め選択された領域」、「予め特定した領域」又は「固有の位置」における核酸メンバーは、その本質（例えば配列）を、その領域又は固有の位置のために決定することができるものである。
【０１４５】
本明細書中で用いる「予防する」「予防している」及び「予防」なる用語は、本発明の方法に従って同定された１以上の化合物の投与、又はかかる化合物と別の治療との組み合わせの投与により結果的に生じる、変形性関節症又はその１以上の症候の発達、再発又は発症の防止を意味する。
【０１４６】
本明細書において用いる用語「プライマー」は、精製された制限消化において天然に存在するか、又は合成により生成されたオリゴヌクレオチドであって、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド、誘導剤（ＤＮＡポリメラーゼなど）及び適当な温度とｐＨの存在下に配置された場合に、合成開始点として機能することができるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、誘導剤の存在下にて所望の伸長産物の合成を開始することができるのに十分な長さである必要がある。プライマーの正確な長さは、多くの要因、例えば温度、プライマーの供与源及び使用する方法などに依存する。例えば、診断用途のためには、標的配列の複雑度に応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５〜２５又はそれ以上のヌクレオチドを含むが、それより少ないヌクレオチドを含んでもよい。プライマーの適当な長さの決定に関与する要因は、当業者であれば用意に理解することができる。
【０１４７】
本明細書において用いる用語「プローブ」とは、オリゴヌクレオチド及びその類似体を意味し、標的配列のヌクレオチド塩基と水素結合により相互作用してポリヌクレオチド標的配列を認識するある範囲の化学種を意味する。標的配列のプローブは、一本鎖若しくは二本鎖ＲＮＡであってもよいし、又は一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ及びＲＮＡ塩基の組み合わせであってもよい。プローブは、少なくとも８塩基長であり、完全な遺伝子の長さより短い。プローブは、標的遺伝子の全長よりも短い限り、１０、２０、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００及び２０００までの塩基長でありうる。プローブは、蛍光、化学発光などにより検出可能なタグを有するように修飾されたオリゴヌクレオチドを含んでもよい。プローブはまた、検出可能なタグ及びクエンチャー分子、例えばＴａｑｍａｎ（登録商標）及びモレキュラービーコン（登録商標）プローブの両方を有するように修飾してもよい。
【０１４８】
オリゴヌクレオチド及びその類似体は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はＲＮＡ若しくはＤＮＡの類似体、一般的にはアンチセンスオリゴマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと称するものであってもよい。そのようなＲＮＡ又はＤＮＡ類似体としては、限定されるものではないが、２−’Ｏ−アルキル糖修飾、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホルムアセタール、３’−チオホルムアセタール、スルホン、スルファメート、及びニトロキシド骨格修飾、並びに、塩基部分が修飾されている類似体が含まれる。さらに、オリゴマーの類似体は、糖部分が別の好適な糖部分で修飾又は置換されて、限定されるものではないが、モルホリノ類似体及びペプチド核酸（ＰＮＡ）類似体（Egholm, et al. Peptide Nucleic Acids (PNA)--Oligonucleotide Analogues with an Achiral Peptide Backbone, (1992)）などのポリマーが得られる、ポリマーであってもよい。
【０１４９】
プローブはまた、オリゴヌクレオチド類似体の任意の種類と共に、あるいはそれと天然ＤＮＡ又はＲＮＡを組み合わせた混合物であってもよい。同時に、オリゴヌクレオチド及びその類似体は、単独で使用してもよいし、あるいは１以上の別のオリゴヌクレオチド又はその類似体と組み合わせて使用してもよい。
【０１５０】
本明細書において用いる「予防薬」及び「予防薬（複数）」という用語は、変形性関節症の予防に用いることができるいかなる化合物のこともいう。ある実施形態では、「予防薬」という用語は、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物を意味する。他のある実施形態では、「予防薬」という用語は、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物以外の薬物であって、変形性関節症又はその１以上の症候の発症、発達及び／又は進行を防止又は妨害するのに有用であると知られているか、かつて使用されたか、又は現在使用されている薬物を意味する。
【０１５１】
本明細書中で用いる「予防上有効な量」とは、変形性関節症又はその１以上の症候の発達、再発又は発症を防止するのに十分な量の治療（例えば予防薬）の量を指す。
【０１５２】
本明細書において用いる用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、ペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸の鎖を意味するために相互互換的に用いられる。特定の実施形態において、タンパク質は、ペプチド結合により互いに連結された、２００未満、１７５未満、１５０未満、１２５未満、１００未満、５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１０未満、又は５未満のアミノ酸から構成される。別の実施形態において、タンパク質は、ペプチド結合により互いに連結された、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、又はそれ以上のアミノ酸から構成される。
【０１５３】
「タンパク質コード領域」とは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの部分を意味する。
【０１５４】
本明細書において用いる用語「本発明のバイオマーカーの産物と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、
本明細書において用いる「複数」又は「セット」とは、２を超える、例えば３又はそれ以上、１０又はそれ以上、１００又はそれ以上、１０００又はそれ以上、あるいは１００００又はそれ以上を意味する。
【０１５５】
本明細書において用いる用語「その一部」及び「ＲＮＡ部分」とは、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物に関する場合、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の少なくとも６、少なくとも９、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２１、少なくとも２４、少なくとも３０、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも９９、又は少なくとも１０８、又はそれ以上のヌクレオチドを含む核酸配列を含むＲＮＡ転写産物を意味する。
【０１５６】
本明細書において用いる用語「本発明のバイオマーカーの産物」とは、本発明のバイオマーカーに対応する遺伝子によって発現されるＲＮＡ及び／又はタンパク質を意味する。「本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物」には、異核ＲＮＡ（「ｈｎＲＮＡ」）、ｍＲＮＡ、及び本明細書に開示される教示に従ってバイオマーカーとして利用することができる発現の測定値を有するｍＲＮＡのスプライス変異体の全部又は一部を含む１以上の産物が含まれる。「本発明のバイオマーカーのタンパク質産物」には、タンパク質、タンパク質変異体及び翻訳後修飾タンパク質を含むバイオマーカーの１以上の産物が含まれる。
【０１５７】
本明細書において用いる用語「選択的に結合する」とは、本発明に関して、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、抗体の任意の２つの相互作用を意味し、ここでその相互作用は、それぞれの分子上の特定の構造の存在に依存している。例えば、２つの分子がタンパク質分子である場合には、第１分子上の構造が、他のタンパク質よりも第２分子上の構造を認識して結合する。本明細書中で用いる用語「選択的結合」は、特異的結合パートナーと、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％及び最も好ましくは１００％の特異性で結合する分子を意味する。
【０１５８】
本明細書において用いる「選択的ハイブリダイゼーション」とは、本発明に関して、本発明に包含されるポリヌクレオチドと、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ又はタンパク質産物との間で生じるハイブリダイゼーションであって、ポリヌクレオチドが、対象のゲノム中の他の遺伝子のＲＮＡ又はタンパク質産物を除いて本発明のバイオマーカーのＲＮＡ又はタンパク質産物（１若しくは複数）に特異的であるハイブリダイゼーションを意味する。好ましい実施形態において、「選択的にハイブリダイズする」ポリヌクレオチドは、７０％を超えて、８０％を超えて、９０％を超えて及び最も好ましくは１００％の特異性でハイブリダイズするものである。当業者には理解されるように、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物と「選択的にハイブリダイズする」ポリヌクレオチドは、長さ及び組成を考慮して決定されうる。
【０１５９】
本明細書において用いる用語「有意な一致」とは、核酸配列に関する場合、当技術分野で周知の比較方法（すなわちAltschul, S.F et al., 1997, Nucl. Acids Res., 25: 3389-3402 ; Schaffer, A. A. et al., 1999, Bioinformatics 15: 1000-1011）を用いて、２つの核酸配列が少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％の同一性を示すことを意味する。本明細書において用いる「有意な一致」は、当技術分野で慣用のアライメント方法を用いて最大にアライメントした場合にその配列が少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％の同一性を示す限り、非連続的な又は散在している同一ヌクレオチドを包含する。
【０１６０】
本明細書において用いる用語「固相基板」及び「固相支持体」とは、硬質又は半硬質表面を有する材料を意味する。「基板」及び「支持体」は、本明細書において用語「固相基板」及び「固相支持体」と相互互換的に用いられる。固相支持体は、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、管、球、ビーズ、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライド、チップなどとして存在する、生物学的なもの、非生物的なもの、有機物、無機物、又はこれらの任意の組み合わせでありうる。基板は、ケイ素又はガラス表面、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）二フッ化ビニリデン、ポリスチレン、ポリカーボネート、荷電した膜（ナイロン６６若しくはニトロセルロースなど）、又はその組み合わせであることが多い。好ましい実施形態において、固相支持体はガラスである。好ましくは、基板の少なくとも１つの表面が実質的に平面である。好ましくは、固相支持体は、反応性基、例えば限定されるものではないが、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、チオールなどを含みうる。一実施形態において、固相支持体は光透過性である。
【０１６１】
固体担体には、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、ポリスチレンビーズ、アルミナゲル、及び多糖類が含まれる。適切な固体担体は、所望の最終用途及び様々な合成プロトコルへの適切性に基づいて選択し得る。たとえば、ペプチドの合成では、固体担体は、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ｐＭＢＨＡ）樹脂（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ケンタッキー州Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ）；クロロメチルポリスチレン、ヒドロキシメチルポリスチレン及びアミノメチルポリスチレンを含めたポリスチレン（たとえばＢａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓなどから得られるＰＡＭ樹脂）；ポリ（ジメチルアクリルアミド）グラフトスチレンコ−ジビニル−ベンゼン（たとえばＡｍｉｎｏｔｅｃｈ、カナダから得られるＰＯＬＹＨＩＰＥ樹脂）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られる）、ポリエチレングリコールグラフトポリスチレン樹脂（たとえばＴＥＮＴＡＧＥＬ若しくはＡＲＧＯＧＥＬ、Ｂａｙｅｒ、ドイツＴｕｂｉｎｇｅｎ）ポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州から得られる）、又はセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）などの樹脂でありうる。
【０１６２】
本明細書において用いる用語「特異的に結合する」とは、２つの分子、例えば、リガンドとタンパク質若しくはペプチド、又は抗体とタンパク質若しくはペプチド、の相互作用を意味し、ここで相互作用は、それぞれの分子上の特定の構造の存在に依存する。例えば、２つの分子がタンパク質分子の場合には、第１分子上の構造は、一般的なタンパク質よりも第２分子上の構造を認識し、結合する。「特異的結合」とは、本明細書で用いる限り、分子は、非特異的分子と結合する場合よりも少なくとも２倍高いアフィニティで、好ましくは少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍高いアフィニティで特異的結合パートナーと結合する。
【０１６３】
本明細書において用いる「特異的にハイブリダイズする」、「特異的ハイブリダイゼーション」とは、２つの核酸配列が実質的に相補的である場合（少なくとも１４〜２５ヌクレオチドの範囲にわたって少なくとも約６５％の相補性、好ましくは少なくとも約７５％の相補性、より好ましくは少なくとも約９０％の相補性）に起こるハイブリダイゼーションを意味する。Kanehisa, M., 1984, Nucleic Acids Res., 12: 203参照（参照により本明細書に組み入れる）。結果として、ある程度のミスマッチは許容される。そのようなミスマッチは、小さい、例えばモノ、ジ又はトリ−ヌクレオチドでありうる。あるいは、ミスマッチの領域は、一連の連続した４又はそれ以上のヌクレオチドにミスマッチが存在する領域として定義されるループを含んでもよい。多くの要因が２つの核酸のハイブリダイゼーション、例えば標的核酸配列へのアレイ上の核酸メンバーのハイブリダイゼーションの効率及び選択性に影響を及ぼす。これらの要因としては、核酸メンバーの長さ、ヌクレオチド配列及び／又は組成、ハイブリダイゼーション温度、バッファー組成、並びに核酸メンバーがハイブリダイズする必要のある領域における立体障害の可能性が含まれる。核酸長と、核酸が標的配列とアニーリングする効率及び精度の両方との間に正の相関がある。特に、配列が長くなると、短いものよりも融解温度（ＴＭ）が高くなり、所定の標的配列内の繰り返しが少なくなると考えられ、それにより無差別のハイブリダイゼーションが最小限となる。ハイブリダイゼーション温度は、核酸メンバーのアニーリング効率と反比例して変化する。同様に、ハイブリダイゼーション混合物中の有機溶媒、例えばホルムアミドの濃度は、アニーリング効率と反比例して変化し、ハイブリダイゼーション混合物中の塩濃度が高くなると、アニーリングを促進する。ストリンジェントなアニーリング条件下では、核酸が長くなると、より許容できる条件下において十分な短いものよりも効率的にハイブリダイズする。
【０１６４】
本明細書において用いる「安定に会合（結合）した」とは、共有結合、水素結合又はイオン相互作用によりアレイを形成するために固相基板に安定に結合している核酸を意味し、核酸が、アレイに安定して会合した他の全ての核酸、又はアレイが典型的に分析される条件下（すなわち、ハイブリダイゼーション、洗浄及び／又は走査などの１以上のステップの過程）で固相基板上の他の全ての予め選択された領域と比較して、その固有の予め選択された位置を保持しているものである。
【０１６５】
本明細書において用いる用語「標準的なストリンジェント条件」とは、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合（ここで同一性の領域は少なくとも１０ヌクレオチドである）にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。一実施形態において、配列は、４２℃にて一晩の配列のインキュベーション後にストリンジェント条件下でハイブリダイズし、その後、ストリンジェントな洗浄（０．２×ＳＳＣ、６５℃）を行う。洗浄のストリンジェンシーの程度は、温度、ｐＨ、イオン強度、二価カチオン濃度、容量及び洗浄時間を変化させることにより異なる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、プローブの融解温度以下の様々な温度にてハイブリダイゼーションを行うことにより異なりうる。プローブの融解温度は、以下の式を用いて計算することができる。
【０１６６】
１４〜７０塩基長のオリゴヌクレオチドプローブに関しては、融解温度（Ｔｍ）（摂氏温度）は、式：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（分数Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの長さである）を用いて計算することができる。
【０１６７】
例えば、ハイブリダイゼーション温度は、約１ＭのＮａ＋濃度を有するハイブリダイゼーションバッファー中で６８℃から４２℃までで５℃ずつ低下しうる。ハイブリダイゼーション後、フィルターをハイブリダイゼーションの温度で２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで洗浄する。これらの条件は、５０℃を超える場合に「中程度ストリンジェンシー」条件、５０℃以下の場合に「低ストリンジェンシー」条件とみなされる。「中程度ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記ハイブリダイゼーションを５５℃にて実施する場合である。「低ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記ハイブリダイゼーションを４５℃にて実施する場合である。
【０１６８】
ハイブリダイゼーションをホルムアミド含有溶液中で実施する場合には、融解温度は、式：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（分数Ｇ＋Ｃ）−（０．６３％ホルムアミド）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはプローブの長さである）を用いて計算することができる。
【０１６９】
例えば、ハイブリダイゼーションは、ホルムアミドを含有するバッファー、例えば６×ＳＳＣ中で、４２℃の温度で実施する。この場合、ハイブリダイゼーションバッファー中のホルムアミド濃度は、プローブに対する相同性のレベルが低下する同一性クローンに対して５０％から０％まで５％ずつ低下しうる。ハイブリダイゼーション後、フィルターを５０℃にて６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで洗浄する。これらの条件は、ホルムアミドが２５％を超える場合に「中程度ストリンジェンシー」条件、ホルムアミドが２５％以下の場合に「低ストリンジェンシー」条件とみなされる。「中程度ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記ハイブリダイゼーションを３０％ホルムアミドにて実施する場合である。「低ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記ハイブリダイゼーションを１０％ホルムアミドにて実施する場合である。
【０１７０】
本明細書において用いる用語「被験体」及び「患者」は、互換性を持って用いられ、動物（例えば哺乳類、魚類、両生類、爬虫類、鳥類及び昆虫）を意味する。特定の実施形態において、被験体は、哺乳動物（たとえば、非ヒト哺乳動物及びヒト）である。別の実施形態において、被験体は、ペット動物（例えばイヌ、ネコ、ハムスター、サル及びトリ）、農業動物（例えばウマ、ウシ、ブタ、ヤギ及びニワトリ）、又は実験動物（例えばマウス及びラット）である。別の実施形態において、被験体は、霊長類（例えば、チンパンジー及びヒト）である。好ましい実施形態において、被験体はヒトである。
【０１７１】
本明細書中で用いる用語「相乗作用」は、複数の治療の相加作用よりも効果的である、本明細書に記載の方法の１つを用いて同定された化合物と別の治療（例えば薬物）との組み合わせを意味する。好ましくは、そのような他の治療は、変形性関節症又はその症候の予防、治療、管理又は改善に用いられていたか又は現在用いられているものである。治療（例えば予防薬若しくは治療薬）の組み合わせの相乗作用により、１以上の治療の投与量を少なくすることができ、並びに／あるいは変形性関節症を有する被験体への上記治療の投与回数を減らすことが可能である。治療（例えば予防薬若しくは治療薬）の投与量を少なくし、かつ／又は上記治療の投与回数を減らすことができるということは、上記薬物の被験体への投与に伴う毒性を減らし、しかも変形性関節症の予防、治療、管理又は改善における上記治療の効力を低下させることがない。その上、相乗作用により、変形性関節症の予防、治療、管理又は改善における治療（例えば薬物）の効力を改善することができる。最後に、治療（例えば、予防薬若しくは治療薬）の組合わせの相乗作用により、いずれかの治療の使用に伴う有害な又は望ましくない副作用を回避し又は軽減することができる。
【０１７２】
本明細書において用いる「滑液」とは、関節の周囲に存在する「滑液嚢」からの分泌液を意味する。滑液は、関節を防護し、関節を滑らかにし、そして関節軟骨へ栄養を供給する。本発明において有用な滑液は、本明細書に記載のように当技術分野で周知の方法に従ってＲＮＡを単離することができる細胞を含む。
【０１７３】
本明細書中で用いる用語「治療薬」及び「治療薬（複数）」とは、変形性関節症又はその１以上の症候の治療、管理又は改善（緩和）に使用することができる化合物を意味する。特定の実施形態において、「治療薬」という用語は、以下の変形性関節症の発達ステージ又は疾患ステージ：（ａ）軽度、（ｂ）中程度、（ｃ）顕著及び（ｄ）重篤のうち任意の２つに由来する軟骨細胞、又は（ｅ）本明細書において定義する正常個体に由来する軟骨細胞において示差的に発現されるポリヌクレオチド配列の発現を増大又は低減する化合物を意味する。本発明に係る治療薬はまた、軟骨細胞の同化活性を増大又は低減する化合物を意味する。本発明は、１）変形性関節症の発症を防止する；２）変形性関節症の症候、例えば疼痛、膨張、脆弱性及び罹患関節における機能的能力の喪失を低減、遅延又は排除する；３）軟骨変性を低減、遅延若しくは排除する、並びに／又は軟骨細胞の代謝活性及び細胞分裂速度を増大する、そして／あるいは４）患者に投与した場合に、患者の１以上の疾患指標核酸の１以上の発現プロファイルを正常個体とより類似したプロファイルに回復させる、「治療薬」を提供する。特定の実施形態において、「治療薬」という用語は、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物を意味する。他の実施形態において、「治療薬」という用語は、変形性関節症又はその１以上の症候を治療、管理又は改善するために、有用であることが知られているか、使用されていたか、あるいは現在使用されている、本明細書に記載のスクリーニングアッセイで同定される化合物以外の薬物を意味する。
【０１７４】
本明細書において用いる用語「治療上有効な量」とは、変形性関節症又はその１以上の症候の改善、変形性関節症の発達の防止、変形性関節症の退行の誘導、あるいは、別の治療（例えば治療薬）の治療効果の増大又は改善に十分な治療（例えば治療薬）の量を意味する。特定の実施形態において、治療上有効な量とは、関節痛又は関節の膨張を低減する治療（例えば治療薬）の量を意味する。好ましくは、治療上有効な量の治療（例えば治療薬）は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）などの対照と比較して、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％において関節の膨張を低減する。
【０１７５】
本明細書中で用いる「治療する」「治療している」及び「治療」とは、本発明の方法によって同定される１以上の化合物の投与、又は本発明の方法によって同定される１以上の化合物と別の治療との組み合わせの投与により生じる、変形性関節症又はその１以上の症候の進行、重篤度、及び／若しくは持続期間の低減又は改善を指す。
【０１７６】
本明細書において用いる用語「アップレギュレートされた」又は「発現レベルが増大した」とは、本発明に関する場合、発現された遺伝子に対応する配列であって、その配列の量の測定値が、正常個体又は変形性関節症のステージ決定により判定される変形性関節症の異なる同定された疾患状態を有する個体から単離された軟骨又は血液における同じ遺伝子と比較して、変形性関節症又は変形性関節症のステージ決定により判定される変形性関節症の同定された疾患状態を有する個体から単離された軟骨若しくは血液においてアレイ分析又は他の分析により測定した場合に遺伝子の発現レベルが増大したことを示すことを意味する。本発明において「発現レベルが増大した」は、本発明の方法に従って、例えばハイブリダイゼーション強度により測定した場合に、少なくとも１０％又はそれ以上、例えば２０％、３０％、４０％、又は５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上、あるいは１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍又はそれ以上を超える増大である。例えば、アップレギュレートされた配列としては、正常個体から単離された軟骨と比較して、軽度、中程度、顕著又は重篤なＯＡを有するという特徴の個体から単離された軟骨又は血液において発現レベルが増大した配列が含まれる。アップレギュレートされた配列にはまた、変形性関節症の１つのステージを有するという特徴の個体から単離された軟骨又は血液において、変形性関節症の別のステージと比較して（例えば、顕著なＯＡ 対 重篤なＯＡ）、発現レベルが増大した配列が含まれる。
【０１７７】
４．図面の簡単な説明
本発明の目的及び特徴は、以下の詳細な説明及び図面を参照してより理解されうる。
【０１７８】
図１は、正常個体集団における同じ遺伝子と比較して、軽度ＯＡ個体の集団において示差的に調節された１９遺伝子のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す図である。
【０１７９】
図２は、正常個体集団と比較して、中程度ＯＡ個体の集団において示差的に調節された４遺伝子のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す図である。
【０１８０】
図３は、顕著なＯＡを患う個体集団と比較して、中程度ＯＡを患う個体集団において示差的に調節された２遺伝子のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す図である。
【０１８１】
図４は、重篤なＯＡを患う個体集団と比較して、顕著なＯＡを患う個体集団において示差的に調節された４遺伝子のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す図である。
【０１８２】
図５は、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた、軽度 対 中程度ＯＡを有する患者由来の血液サンプルにおけるグルコシダーゼＩＩαサブユニット（Ｇ２ＡＮ）の示差的な遺伝子発現を示す。
【０１８３】
図６は、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン、ＱＲＴ−ＰＣＲ及びＴａｑｍＭａｎ（登録商標）分析を用いた、軽度 対 中程度ＯＡを有する患者由来の血液サンプルにおける腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６（ＴＮＦＡＩＰ６）の示差的な遺伝子発現を示す。
【０１８４】
図７は、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた、顕著 対 重篤なＯＡを有する患者由来の血液サンプルにおけるＰｅｒｉｏｄホモログ１（Drosophila）（ＰＥＲ１）の示差的な遺伝子発現を示す。
【０１８５】
図８は、ＴａｑｍＭａｎ（登録商標）、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた、中程度 対 顕著なＯＡを有する患者由来の血液サンプルにおけるジンクフィンガーＲＮＡ結合タンパク質（ＺＦＲ）の示差的な遺伝子発現を示す。
【０１８６】
図９は、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた、軽度 対 顕著なＯＡを有する患者由来の血液サンプルにおけるＡＴＰ結合カセット サブファミリーＡ メンバー１（ＡＢＣＡ）及びＡＴＰ結合カセット サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１（ＡＢＣＧ１）の示差的な遺伝子発現を示す。
【０１８７】
図１０は、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた、軽度 対 顕著なＯＡを有する患者由来の血液サンプルにおけるインターフェロン調節因子１（ＩＲＦ１）の示差的な遺伝子発現を示す。
【０１８８】
図１１は、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた、軽度 対 顕著なＯＡを有する患者由来の血液サンプルにおける核内受容体活性化補助因子１（ＮＲＣＯＡ１）及び細胞内塩素チャネル４（ＣＬＩＣ４）の示差的な遺伝子発現を示す。
【０１８９】
表１は、一実施形態において、本発明の遺伝子を示す、特にそのｌｏｃｕｓ  ｌｉｎｋ  ＩＤに基づいて遺伝子を特定する表である。
【０１９０】
表２は、本発明の遺伝子の特定の実施形態を示し、本発明の遺伝子に対応するｍＲＮＡ産物及びいタンパク質の参照アクセッション番号を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１９１】
５．発明の詳細な説明
本発明の実施は、当分野の技術の範囲内にある分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術の従来技術を一部使用する。そのような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition; Oligonucleotide Synthesis,（M.J. Gait編, 1984）; Nucleic Acid Hybridization（B.D. Harnes & S.J. Higgins編, 1984）; A Practical Guide to Molecular Cloning（B. Perbal, 1984）; 及びMethods in Enzymologyシリーズ（Academic Press, Inc.）; Short Protocols In Molecular Biology,（Ausubel et al. 編, 1995）を参照されたい。上記にも下記にも本明細書で挙げたすべての特許、特許出願、及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９２】
本明細書で開示される本発明は、ＯＡの診断、及び／又はＯＡのステージの診断に有用なバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせを明らかにするものである。これらのバイオマーカーを使用するために、本発明は、ＲＮＡ産物及びタンパク質産物を含めたこれらのバイオマーカーの産物の同定について教示する。本発明はさらに、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物と特異的に及び／又は選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ又は改変ヌクレオチドの天然に存在する他の組み合わせについて開示する。本発明はさらに、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物と特異的に及び／又は選択的にハイブリダイズするタンパク質、ペプチド、抗体、リガンドについて開示する。本発明のバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせのＲＮＡ産物の発現の測定は、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物に特異的及び／又は選択的であるこれらのポリヌクレオチドを用いて、そのＲＮＡ産物の発現を定量することによって行うことができる。本発明の特定の実施形態では、ＲＮＡ産物に特異的及び／又は選択的であるポリヌクレオチドは、プローブ又はプライマーである。一実施形態では、これらのポリヌクレオチドは、製造されたアレイとハイブリダイズすることができる核酸プローブの形である。他の実施形態では、市販のアレイを使用してＲＮＡ産物の発現を測定することができ、本発明は、どの組み合わせの遺伝子を分析すべきかを教示する。他の実施形態では、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物に特異的及び／又は選択的であるポリヌクレオチドは、例えばＳＹＢＲ（登録商標）グリーンを使用する、あるいはＴａｑＭａｎ（登録商標）又はモレキュラー・ビーコン技術を使用する定量リアルタイムＲＴ  ＰＣＲなどの技術においてプライマー及びプローブの形で使用し、この場合で使用するポリヌクレオチドは、フォワードプライマー、リバースプライマー、ＴａｑＭａｎ標識プローブ又はモレキュラー・ビーコン標識プローブの形で使用する。特定の一実施形態では、本発明のＲＮＡ産物の発現レベルの測定から得られた結果を、バイオマーカーの組み合わせの同定に使用する本発明のモデルに入力して、そのモデルによって定義される診断を決定することができる。好ましい実施形態では、同じ方法を使用して、被験者の診断に使用するように、その数学的モデルの作成に使用する発現データを作成することができる。
【０１９３】
本発明はさらに、当業者に知られているように、本明細書で開示されるタンパク質又はポリペプチドを使用して、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物を測定することを意図するものである。次いで、当業者に公知の技術（例えば、ウェスタンブロット法、免疫沈降タンパク質マイクロアレイ分析などの技術）を使用して、本発明のバイオマーカーに対応するタンパク質産物のレベルを測定することができる。当業者に理解されているように、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の発現レベルの測定には、本発明の各バイオマーカーに対応する１又はそれ以上のタンパク質産物と特異的に又は選択的に結合するタンパク質が必要となる。次いで、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の発現レベルを表すデータを、そのモデルによって定義される診断を決定するために、その組み合わせを同定するために作成されたモデルに入力することができる。好ましい実施形態では、同じ方法を使用して、被験者の診断に使用するように、その数学的モデルの作成に使用する発現データを作成することができる。
【０１９４】
５．１  本発明で使用するサンプル
本明細書で特に示さない限り、任意の被験体から得られる任意の組織サンプル（例えば、軟骨、滑液又は血液サンプル）又は細胞サンプル（例えば、軟骨細胞サンプル又は血液細胞サンプル）を、本発明の方法に従って使用することができる。本発明の方法に従ってそのようなサンプルを得、利用することができる被験体の例には、それだけに限らないが、１、２、３、４又はそれ以上の変形性関節症の症状を現している又は示している被験体、変形性関節症であると臨床的に診断された被験体、変形性関節症に罹患しやすい被験体（例えば、変形性関節症の家族歴がある被験体、変形性関節症の遺伝的素因がある被験体、及び変形性関節症に罹患しやすくし、又は変形性関節症に罹患する可能性を高める生活を送る被験体）、変形性関節症であると疑われる被験体、変形性関節症の治療を受けている被験体、変形性関節症と少なくとも１種の他の病態を有する被験体（例えば、２、３、４、５又はそれ以上の病態を有する被験体）、変形性関節症の治療を受けていない被験体、医師（例えば、内科医）によって健康である又は変形性関節症でない（すなわち、正常である）と判定された被験体、変形性関節症が治癒した被験体、変形性関節症をやり過ごしている被験体、及び変形性関節症と診断されていない被験体がある。特定の実施形態では、サンプルを得、利用することができる被験体は、手、足、脊椎、膝、臀部及び／又は手首の変形性関節症である。
【０１９５】
他の実施形態では、サンプルを得、利用することができる被験体は、軽度の、顕著な、中程度の又は重篤な変形性関節症である。さらなる実施形態では、サンプルを得ることができる被験体は、変形性関節症であるかどうかが分からず、及び／又はどのステージの変形性関節症であるかが分からない被験体である。
【０１９６】
疾患状態に従って個体を分類するために、軟骨に基づくスコア決定系を使用することができ、それによって関節鏡検査者による主観的な判定が最小限となる。本明細書に記載する疾患状態を定義するスコア決定系の一例は、Marshall, 1996, The Journal of Rheumatology 23:582-584のものであり、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。この方法によれば、６種の関節表面（膝蓋、大腿骨滑車、内側大腿顆、内側脛骨プラトー、外側大腿顆及び外側脛骨プラトー）のそれぞれに、その特定の表面上に存在する最も不良な病変に基づいて軟骨のグレードを割り当てる。次いで、スコア決定系を適用し、表３に記載するように、各関節表面に、その表面の軟骨重症度のグレードを反映する変形性関節症の重症度の数値を与える。
【０１９７】
2007511738.tif 000003
【０１９８】
例えば、内側大腿顆がその最も重篤な軟骨の損傷としてグレードＩの病変を有する場合、１の値が割り当てられる。次いで、患者の合計スコアは、関節表面６種のスコアの和に由来する。その合計スコアに基づいて、各患者を、変形性関節症の４群：軽度の群（１〜６）、中程度の群（７〜１２）、顕著な群（１３〜１８）、及び重篤な群（＞１８）のうち１群に入れる。
【０１９９】
特定の実施形態では、被験体から得られるサンプルは軟骨サンプル（軟骨由来の細胞のサンプルを含む）である。他の実施形態では、被験体から得られるサンプルは滑液サンプル（滑液由来の細胞のサンプルを含む）である。さらに他の実施形態では、被験体から得られるサンプルは血液サンプル（血液由来の細胞のサンプルを含む）である。
【０２００】
５．１．１  軟骨
一態様では、当技術分野で公知の方法を用いて、胎児から軟骨サンプルを得る。胎児軟骨の軟骨細胞は、健常成人又は任意のステージの（軽度の、中程度の、顕著な、及び重篤な）変形性関節症と診断された個体由来の軟骨の軟骨細胞と比べて高レベルの代謝活性及び細胞分裂速度を有する。
【０２０１】
他の態様では、当技術分野で知られ、下記に記載する方法に従って、生存している健常者から、又は死後１４時間未満の軟骨組織から軟骨サンプルを得る。任意の公知の方法を用いて、ヒト成人の正常な関節軟骨を得る。特定の実施形態では、関節鏡検査又は人工膝関節置換術を受けている個体から軟骨を得、必要になるまでサンプルを液体窒素中に貯蔵する。通常、倫理的な配慮から、生きたドナーから真に正常な軟骨をサンプル採取することは一般にできない。したがって、好ましくは、サンプル採取した関節への灌流が停止した後の死後の時期である１４時間以内に、死亡したドナーから正常な軟骨サンプルを得て、その時期を越えると観察されるＲＮＡの分解を最小限にする。他の実施形態では、死後１３、１２、１１、１０、９、８、６、４、２、１時間など死後１４時間未満に「正常な」組織を得る。好ましくは、死後１２時間未満に正常な軟骨を得る。
【０２０２】
他の態様では、以下の疾患ステージ：軽度の、顕著な、中程度の、又は重篤な変形性関節症の１つと診断された被験体から軟骨を得る。任意の公知の方法を用いて、変形性関節症である個体のヒト軟骨サンプルを得る。好ましくは、関節鏡検査又は人工膝関節置換術を受けている個体から軟骨を得、必要になるまでサンプルを液体窒素中に貯蔵する。特定の実施形態では、軟骨サンプルを最低０．０５ｇ単離して、ｃＤＮＡライブラリー構築用の総ＲＮＡ抽出物２μｇを得る。他の実施形態では、軟骨サンプルを最低０．０２５ｇ単離して、マイクロアレイ用の標的サンプルとして使用する総ＲＮＡ抽出物１μｇを得る。本発明において有用な軟骨サンプルは、本発明に従った１又はそれ以上の核酸配列又はアミノ酸配列の検出に十分な量のものである。
【０２０３】
収集した軟骨は、任意選択であるが好ましくは、本発明の方法に従って使用する前に、４℃などの冷蔵温度で貯蔵する。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って軟骨サンプルの一部を初回に使用し、一方、サンプルの１つ又は複数の残った部分を後の使用のためにしばらくの間貯蔵する。この期間は、１時間以上、１日以上、１週間以上、１カ月以上、１年以上、又は無制限でもよい。長期の貯蔵には、冷凍温度（例えば、−６０℃未満）での貯蔵など当技術分野で周知の貯蔵方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、軟骨の貯蔵に加えて又は軟骨の貯蔵の代わりに、単離した核酸又はタンパク質を、後の使用のためにしばらくの間（例えば、１時間以上、１日以上、１週間以上、１カ月以上、１年以上、又は無制限に）貯蔵する。
【０２０４】
本発明のいくつかの実施形態では、当技術分野で公知の技術を用いて軟骨中に存在する軟骨細胞を分離し、本発明の方法に従ってそれを使用する。以下のいずれの発生ステージ又は疾患ステージの被験体からも軟骨細胞を得ることができる：すなわち、胎児、正常、軽度の変形性関節症、中程度の変形性関節症、顕著な変形性関節症、又は重篤な変形性関節症。本方法で使用する前に、標準的な技術によって軟骨細胞を冷凍することができる。
【０２０５】
５．１．２  滑液
一態様では、当技術分野で周知の方法に従って、被験体から滑液のサンプルを得る。例えば、関節穿刺を行うことができる。関節穿刺の間、滅菌針を使用して滑液を関節から取り出す。膝、肘、手首、指、臀部、脊椎又は他の任意の関節から、関節穿刺を用いて滑液を収集することができる。特定の実施形態では、変形性関節症に罹患した又は罹患したと疑われる関節から滑液を収集する。以下のいずれの発生ステージ又は疾患ステージの被験体からも滑液を得ることができる：胎児、正常、軽度の変形性関節症、中程度の変形性関節症、顕著な変形性関節症、又は重篤な変形性関節症。
【０２０６】
本発明において有用な滑液サンプルは、本発明に係る１又はそれ以上の核酸又はアミノ酸の配列の検出に十分な量のものである。特定の実施形態では、本発明において有用な滑液サンプルは、０．１ｍｌ〜２０ｍｌの、０．１ｍｌ〜１５ｍｌの、０．１ｍｌ〜１０ｍｌの、０．１ｍｌ〜５ｍｌの、０．１ｍｌ〜２ｍｌの、０．５ｍｌ〜２０ｍｌの、０．５ｍｌ〜１５ｍｌの、０．５ｍｌ〜１０ｍｌの、０．５ｍｌ〜５ｍｌの、又は０．５ｍｌ〜２ｍｌの量のものである。他の実施形態では、本発明において有用な滑液サンプルは、０．１ｍｌ以上、０．５ｍｌ以上、１ｍｌ以上、２ｍｌ以上、３ｍｌ以上、４ｍｌ以上、５ｍｌ以上、６ｍｌ以上、７ｍｌ以上、８ｍｌ以上、９ｍｌ以上、１０ｍｌ以上、１１ｍｌ以上、１２ｍｌ以上、１３ｍｌ以上、１４ｍｌ以上、１５ｍｌ以上、１６ｍｌ以上、１７ｍｌ以上、１８ｍｌ以上、１９ｍｌ以上、又は２０ｍｌ以上である。
【０２０７】
収集した滑液は、任意選択であるが好ましくは、本発明の方法に従って使用する前に、４℃などの冷蔵温度で貯蔵する。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って滑液サンプルの一部を初回に使用し、一方、サンプルの１つ又は複数の残った部分を後の使用のためにしばらくの間貯蔵する。この期間は、１時間以上、１日以上、１週間以上、１カ月以上、１年以上、又は無制限でもよい。長期の貯蔵には、冷凍温度（例えば、−６０℃未満）での貯蔵など当技術分野で周知の貯蔵方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、滑液の貯蔵に加えて又は滑液の貯蔵の代わりに、単離した核酸又はタンパク質を、後の使用のためにしばらくの間（例えば、１時間以上、１日以上、１週間以上、１カ月以上、１年以上、又は無制限に）貯蔵する。
【０２０８】
本発明のいくつかの実施形態では、当技術分野で公知の技術を用いて滑液中に存在する細胞を分離し、本発明の方法に従ってそれを使用する。一般に、以下の細胞が滑液中に認められる：リンパ球（Ｂ及びＴリンパ球）、単球、好中球、滑膜細胞及びマクロファージ。変形性関節症など病的状態の患者の滑液中では、以下の細胞も認められる：軟骨細胞、骨芽細胞及び破骨細胞。そのような細胞を単離し、本発明の方法に従って使用することができる。特定の実施形態では、滑液サンプルからリンパ球（Ｂ及びＴリンパ球）を単離し、本発明の方法に従って使用する。他の実施形態では、滑液サンプルから単球又は好中球を単離し、本発明の方法に従って使用する。本方法で使用する前に、標準的な技術によって滑液から単離した細胞を冷凍することができる。
【０２０９】
５．１．３  血液
本発明の一態様では、当技術分野で周知の方法に従って、被験体から血液のサンプルを得る。以下の発生ステージ又は疾患ステージ：胎児、正常、軽度の変形性関節症、中程度の変形性関節症、顕著な変形性関節症、又は重篤な変形性関節症のうちいずれかである被験体から、あるいは変形性関節症であるかどうか、又はあるステージの変形性関節症であるかどうかが分からない被験者から血液のサンプルを得ることができる。いくつかの実施形態では、被験体の皮膚に針で刺した単一の穴から１滴の血液を収集する。そのような実施形態では、針刺し穴から収集したこの１滴の血液が必要なすべてである。当業者に公知の技術、具体的には当技術分野で知られている静脈切開の方法を用いて、身体のどんな部分からも（例えば、指、手、手首、腕、下肢、足、足首、胃、及び首）被験体の血液を採取することができる。特定の実施形態では、被験体から静脈血を得、本発明の方法に従ってそれを使用する。他の実施形態では、動脈血を得、本発明の方法に従ってそれを使用する。静脈血の組成は、それが供給されている身体領域の代謝の必要に従って様々である。その一方で、動脈血の組成は、身体全体を通じて変わらない。日常的な血液の試験では、静脈血を一般に使用する。
【０２１０】
尺側皮静脈、橈側皮静脈、又は正中静脈から静脈血を得ることができる。橈骨動脈、上腕動脈又は大腿動脈から動脈血を得ることができる。真空管、注射器、又は蝶形物を使用して、血液を採取することができる。通常、穿刺部位を清拭し、穿刺部位の約３〜４インチ上に圧迫帯を巻き、針を角度約１５〜４５度で挿入し、真空管を使用する場合、針が静脈壁を貫通するとすぐに持針器にその管を押し込む。血液の収集を終えたとき、針を抜き、穿刺部位上の圧力を維持する。通常、血液が凝固しないように、ヘパリン又は他の型の抗凝固剤が、血液を収集する管又はバイアル中に入っている。動脈血を収集するとき、収集前に麻酔薬を投与することができる。
【０２１１】
収集される血液の量は、収集する部位、本発明の方法に必要な量、及び被験体の快適さに応じて様々となる。しかし、本発明の一実施形態の利点は、本発明の方法の実施に必要な血液の量を少なくすることができるので、サンプルを得るのに侵襲性の高い手順を必要としないことである。例えば、いくつかの実施形態では、１滴の血液が必要とするすべてである。例えば、単一の針刺し穴からこの１滴の血液を得ることができる。いくつかの実施形態では、表１に挙げた１、２、３、４、５、１０又はそれ以上の遺伝子の発現を検出するのに十分な任意の量の血液を収集する。したがって、いくつかの実施形態では、収集される血液の量は、１μｌ以下、０．５μｌ以下、０．１μｌ以下、又は０．０１μｌ以下である。しかし、本発明は、そのような実施形態に限定されない。いくつかの実施形態では、より多くの血液が利用可能であり、いくつかの実施形態では、より多くの血液を使用して、本発明の方法を実施することができる。したがって、種々の特定の実施形態では、０．００１ｍｌ、０．００５ｍｌ、０．０１ｍｌ、０．０５ｍｌ、０．１ｍｌ、０．１５ｍｌ、０．２ｍｌ、０．２５ｍｌ、０．５ｍｌ、０．７５ｍｌ、１ｍｌ、１．５ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌ又はそれ以上の血液を被験体から収集する。他の実施形態では、０．００１ｍｌ〜１５ｍ１、０．０１ｍｌ〜１０ｍｌ、０．１ｍｌ〜１０ｍｌ、０．１ｍｌ〜５ｍｌ、１〜５ｍｌの血液を被験体から収集する。
【０２１２】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｋ３／ＥＤＴＡ管内に血液を貯蔵する。他の実施形態では、米国特許第６，６１７，１７０号（参照により本明細書に組み込まれる）で開示されているものなどの安定化剤を含む血液貯蔵用の管を利用することができる。他の実施形態では、ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ、Ｑｉａｇｅｎ／ＢＤ社から提供されるＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡシステムを使用して血液を収集することができる。さらに他の実施形態では、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから提供されるＴｅｍｐｕｓＴＭ血液ＲＮＡ収集管を使用することができる。ＴｅｍｐｕｓＴＭ収集管は、ＲＮＡ安定化試薬を含有する、密接に真空処理した全血収集用のプラスチック管を提供するものである。
【０２１３】
収集した収集血液は、任意選択であるが好ましくは、本発明の方法に従って使用する前に、４℃などの冷蔵温度で貯蔵する。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って血液サンプルの一部を初回に使用し、一方、血液サンプルの１つ又は複数の残った部分を後の使用のためにしばらくの間貯蔵する。この期間は、１時間以上、１日以上、１週間以上、１カ月以上、１年以上、又は無制限でもよい。長期の貯蔵には、冷凍温度（例えば、−６０℃未満）での貯蔵など当技術分野で周知の貯蔵方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、血液の貯蔵に加えて又は血液の貯蔵の代わりに、単離した核酸又はタンパク質を、後の使用のためにしばらくの間貯蔵する。そのような分子マーカーの貯蔵は、１時間以上、１日以上、１週間以上、１カ月以上、１年以上の期間でもよく、あるいは無期限でもよい。
【０２１４】
一態様では、健常者から、あるいは変形性関節症と診断された又は変形性関節症であると疑われる個体から、当技術分野で周知の静脈切開の方法に従って全血を得る。全血は、直接使用することができる血液を含み、当技術分野で周知の方法に従って（例えば、好ましくは３００〜８００×ｇ、５〜１０分間の穏やかな遠心分離を用いて）、血清又は血漿が除去され、残った血液サンプルからＲＮＡ又はｍＲＮＡが単離されている血液を含む。特定の実施形態では、被験体から得られた全血（すなわち、分離していない血液）を溶解バッファー（例えば、溶解バッファー（１Ｌ）：ＥＤＴＡ  ０．６ｇ、ＫＨＣＯ２  １．０ｇ、ＮＨ４Ｃｌ  ８．２ｇ、ｐＨ７．４に調整（ＮａＯＨを使用））と混合し、そのサンプルを遠心分離し、その細胞ペレットを保持し、当技術分野で公知の方法（「溶解血液」）（例えば、Sambrook et al.を参照）に従ってＲＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する。高価で時間のかかる、血液内の細胞型を分離する必要が回避されるので、全血の使用が好ましい（Kimoto, 1998, Mol. Gen. Genet 258:233-239; Chelly J et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:2617-2621; Chelly J et al., 1988, Nature 333:858-860）。
【０２１５】
本発明のいくつかの実施形態では、被験体から収集した全血を分画する（すなわち構成成分に分離する）。本発明の特定の実施形態では、当技術分野で公知の技術を用いて、被験体から収集した全血から血液細胞を分離する。例えば、被験体から収集した血液を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）密度勾配遠心分離にかけることができる。そのような遠心分離によって、様々な型の有核細胞及び血漿から赤血球（erythrocytes(red blood cells)）が分離される。特に、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離は、本発明の方法に従って使用することができる末梢血白血球（ＰＢＬ）の単離に有用である。
【０２１６】
一例としてであってそれに限定するものではないが、下記のようにマクロファージを得ることができる。注射器で血液を抜き出し、その後Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離にかけることによって、被験体の末梢血から単核細胞を単離する。被験体の血清又はＡＢ＋のヒト血清で組織培養皿を予め被覆し、３７℃で１時間インキュベートする。付着しなかった細胞をピペット操作によって除去する。１ｍＭの冷（４℃）ＥＤＴＡリン酸緩衝食塩水溶液を皿に残った付着細胞に添加し、その皿を室温で１５分間放置する。細胞を収集し、ＲＰＭＩバッファーで洗浄し、ＲＰＭＩバッファーで懸濁する。マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）とともに３７℃でインキュベートすることにより、多数のマクロファージを得ることができる。そのような分子に対するアフィニティ化合物を結合させることにより、Ｍａｃ−１などのマクロファージ特異的な表面マーカーに対する抗体を標識して、マクロファージの検出及び分離を促進することができる。使用することができるアフィニティ化合物には、それだけに限らないが、ビオチン、フォトビオチン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、又は当技術分野で知られている他の化合物がある。次いで、それだけに限らないが、種々の細胞選別法、アフィニティークロマトグラフィーやパニングなど当業者に公知の技術によって、標識抗体を保有する細胞を、そのような抗体と結合しない細胞から分離する。
【０２１７】
蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を用いて、血液細胞を選別することができる。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含めた粒子を分離する既知の方法である。例えば、Kamarch, 1987, Methods Enzymol 151:150-165を参照されたい。個々の粒子における蛍光部分のレーザー励起の結果、小さな電荷が生じ、それによって混合物からの陽性粒子及び陰性粒子の電磁気選別が可能となる。特定の血液細胞の表面上に存在する血液細胞の抗原決定基の検出に使用する抗体又はリガンドを、ＦＩＴＣやフィコエリスリンなどの蛍光色素で標識する。細胞を、蛍光標識した抗体又はリガンドとともに、その標識抗体又はリガンドが細胞と結合するのに十分な時間にわたりインキュベートする。細胞選別器によって細胞を処理し、それによって他の細胞からの対象とする細胞の分離が可能となる。ＦＡＣＳで選別した粒子をマイクロタイタープレートの個々のウエルに直接入れて、分離を促進することができる。
【０２１８】
本発明のいくつかの実施形態では、磁性ビーズを使用して血液細胞を分離することもできる。例えば、磁性ビーズ（直径０．５〜１００ｍ）との粒子の結合能に基づいて粒子を分離する方法である磁性活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技術を用いて、血液細胞を選別することができる。細胞−固相表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合による付加を含めて、その磁性微粒子上に種々の有用な改変を行うことができる。次いで磁場をかけて、選択したビーズを物理的に操作する。特定の実施形態では、血液細胞表面マーカーに対する抗体を磁性ビーズと結合させる。次いで、そのビーズを血液細胞培養物と混合して結合させる。次いで、細胞を磁場に通して、対象とする血液細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。次いでこれらの細胞を単離することができる。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、培養皿の表面を抗体で被覆し、パニングと呼ばれる方法による血液細胞の分離に使用することができる。特定の血液細胞に特異的な抗体で別々の皿を被覆することができる。対象とする血液細胞特異的な抗体で被覆した皿に、最初に細胞を添加することができる。十分にすすいだ後、皿に結合した状態で残った細胞が、対象とする血液細胞マーカーを発現する細胞である。細胞表面の抗原決定基又はマーカーの例には、それだけに限らないが、Ｔリンパ球及びナチュラルキラー細胞に対するＣＤ２、Ｔリンパ球に対するＣＤ３、白血球に対するＣＤ１１ａ、Ｔリンパ球に対するＣＤ２８、Ｂリンパ球に対するＣＤ１９、Ｂリンパ球に対するＣＤ２０、Ｂリンパ球に対するＣＤ２１、Ｂリンパ球に対するＣＤ２２、Ｂリンパ球に対するＣＤ２３、白血球に対するＣＤ２９、単球に対するＣＤ１４、血小板に対するＣＤ４１、血小板に対するＣＤ６１、顆粒球に対するＣＤ６６、顆粒球に対するＣＤ６７、単球及びマクロファージに対するＣＤ６８がある。
【０２２０】
全血を白血球、血小板、赤血球などの細胞型に分離することができ、本発明の方法に従ってそのような細胞型を使用することができる。標準的な技術を用いて白血球を顆粒球と無顆粒球にさらに分離することができ、本発明の方法に従ってそのような細胞を使用することができる。顆粒球は、標準的な技術を用いて好中球、好酸球や好塩基球などの細胞型に分離することができ、本発明の方法に従ってそのような細胞を使用することができる。無顆粒球は、標準的な技術を用いてリンパ球（例えば、Ｔリンパ球及びＢリンパ球）及び単球に分離することができ、本発明の方法に従ってそのような細胞を使用することができる。標準的な技術を用いて、Ｂリンパ球からＴリンパ球を分離し、細胞傷害性Ｔ細胞からヘルパーＴ細胞を分離することができ、本発明の方法に従ってそのような細胞を使用することができる。分離した血液細胞（例えば、白血球）を、本方法で使用する前に標準的な技術を用いて冷凍することができる。
【０２２１】
本発明において有用な血液サンプルは、本発明に係る１又はそれ以上の核酸又はアミノ酸の配列の検出に十分な量のものである。特定の実施形態では、本発明において有用な血液サンプルは、１μｌ〜１００ｍｌ、好ましくは１０μｌ〜５０ｍｌ、より好ましくは１０μｌ〜２５ｍｌ、最も好ましくは１０μｌ〜１ｍｌの量のものである。
【０２２２】
５．１．４  ＲＮＡ調製
本発明の一態様では、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物を測定するために、個体からＲＮＡを単離する。本明細書に記載のように、様々な疾患ステージ又は発生ステージの軟骨サンプルからＲＮＡを単離する。サンプルは、単一の患者のものでもよく、あるいは複数の患者からプールしてもよい。
【０２２３】
他の態様では、本明細書に記載のように、変形性関節症の様々な疾患ステージ又は発生ステージにある個体の滑液からＲＮＡを直接単離する。サンプルは、単一の患者のものでもよく、あるいは複数の患者からプールしてもよい。
【０２２４】
他の態様では、本明細書に記載のように、変形性関節症の様々な疾患ステージ又は発生ステージにある個体の血液サンプルからＲＮＡを直接単離する。サンプルは、単一の患者のものでもよく、あるいは複数の患者からプールしてもよい。
【０２２５】
当技術分野で周知の方法に従って、軟骨サンプルから総ＲＮＡを抽出する。一実施形態では、下記の方法に従って軟骨組織からＲＮＡを精製する。個体又は患者から対象とする組織を取り出した後、液体窒素中で組織を急速冷凍してＲＮＡの分解を防止する。多量の組織グアニジン溶液を加えた後、組織ホモジナイザー（tissuemizer）中で１０秒間の処理を２回又は３回行って組織サンプルを摩砕する。組織グアニジン溶液（１Ｌ）を調製するために、グアニジンイソチオシアネート５９０．８ｇをＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ約４００ｍｌ中に溶解する。２Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５（終濃度０．０５Ｍ）２５ｍｌ、及びＮａ２ＥＤＴＡ（終濃度０．０１Ｍ）２０ｍｌを加え、その溶液を一晩撹拌し、体積を９５０ｍｌに調整し、２−ＭＥ  ５０ｍｌを加える。
【０２２６】
ホモジナイズした組織サンプルを１２℃で１２，０００×ｇ、１０分間の遠心分離にかける。得られた上清を、５．７Ｍ ＣｓＣｌ溶液（ＣｓＣｌ  ０．１ｇ／ｍｌ）９ｍｌ上に重層した０．１倍量の２０％Ｓａｒｋｏｓｙｌの存在下で、６５℃で２分間インキュベートし、２２℃で１１３，０００×ｇ、一晩の遠心分離によって分離する。上清を注意深く除去した後、その管を反転させ排液する。管の底（ＲＮＡペレットを含有）を５０ｍｌプラスチック管中に入れ、組織再懸濁バッファー（５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）Ｓａｒｋｏｓｙｌ、５％（ｖ／ｖ）２−ＭＥ）３ｍｌの存在下で、４℃で一晩（又はそれ以上）インキュベートして、ＲＮＡペレットを完全に再懸濁させる。得られたＲＮＡ溶液を２５：２４：１のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで、その後２４：１のクロロホルム／イソアミルアルコールで順次抽出し、３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２及び２．５倍量の１００％エタノールを加えることによって沈殿させ、ＤＥＰＣ水中に再懸濁させる（Chirgwin et al., 1979, Biochemistry, 18:5294）。
【０２２７】
あるいは、下記の単一ステップのプロトコールに従って、軟骨組織からＲＮＡを単離する。変性溶液（４Ｍチオ硫酸グアニジン、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．１Ｍ  ２−ＭＥ、０．５％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン）を組織１００ｍｇ当たり１ｍｌ入れたガラステフロンホモジナイザー中でホモジナイズすることによって、対象とする組織を調製する。ホモジネートを５ｍｌポリプロピレン管に移した後、２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４  ０．１ｍｌ、水飽和フェノール１ｍｌ、及び４９：１のクロロホルム／イソアミルアルコール０．２ｍｌを順次加える。各構成成分を加えた後にサンプルを混合し、すべての構成成分を加えた後にそれを０〜４℃で１５分間インキュベートした。４℃で１０，０００×ｇ、２０分間の遠心分離によってサンプルを分離し、１００％イソプロパノールを１ｍｌ添加することによってそれを沈殿させ、−２０℃で３０分間インキュベートし、４℃で１０，０００×ｇ、１０分間の遠心分離によってペレットにした。得られたＲＮＡペレットを、変性溶液０．３ｍｌ中に溶解し、微小遠心管に移し、１００％イソプロパノールを０．３ｍｌ加え−２０℃で３０分間置くことによって沈殿させ、４℃で１０，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行った。ＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、ＤＥＰＣ処理水又はＤＥＰＣ処理０．５％ＳＤＳ１００〜２００μｌ中に再懸濁させる（Chomczynski and Sacchi, 1987, Anal. Biochem., 162:156）。
【０２２８】
好ましくは、軟骨サンプルを液体窒素下で細かく粉末化し、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて総ＲＮＡを抽出する。
【０２２９】
あるいは、下記のプロトコールによって血液からＲＮＡを単離する。溶解バッファー３部に対して血液１部の割合で溶解バッファーを血液サンプルに加える（溶解バッファー（１Ｌ）、ＥＤＴＡ  ０．６ｇ、ＫＨＣＯ２  １．０ｇ、ＮＨ４Ｃｌ  ８．２ｇ、ｐＨ７．４に調整（ＮａＯＨを使用））。サンプルを混合し、透明になるまで５〜１０分間氷上に置く。溶解したサンプルを４℃、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を吸引する。ペレットを溶解バッファー５ｍｌ中に再懸濁させ、再度４℃、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて、元の血液サンプル１０ｍｌ毎にＴＲＩｚｏｌ（登録商標）約６ｍｌの割合で、ペレットにした細胞をホモジナイズし、十分にボルテックスをかける。サンプルを室温で５分間放置する。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）１ｍｌ当たりクロロホルム１．２ｍｌを用いてＲＮＡを抽出する。サンプルを４℃、１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上層を収集する。上層に、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）１ｍｌ当たり０．５ｍｌの割合でイソプロパノールを加える。−２０℃で一晩、又は２０℃で１時間サンプルを放置する。既知の方法に従ってＲＮＡをペレットにし、ＲＮＡペレットを空気乾燥させ、ペレットをＤＥＰＣ処理ｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁させる。ＲＮＡサンプルは、サンプルが室温で輸送に安定である７５％エタノール中で貯蔵することもできる。
【０２３０】
あるいは、上記のように、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて、滑液からＲＮＡを単離する。
【０２３１】
２６０／２８０ｎｍでの吸光度、及びアガロースゲル電気泳動後の紫外光下での観察によってＲＮＡの純度及び完全性を評価する。
【０２３２】
５．２  本発明のバイオマーカー
一実施形態では、本発明はバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせを提供し、前記バイオマーカーの産物又は複数産物の発現レベルを測定することによって、変形性関節症の存在が示唆される。他の実施形態では、本発明はバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせを提供し、前記バイオマーカーの産物又は複数産物の発現レベル測定を用いて、個体が変形性関節症の２つのステージのうちどちらであるかを診断することができる。さらに他の実施形態では、本発明はバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせを提供し、前記バイオマーカーの産物又は複数産物の発現レベル測定を用いて、変形性関節症の他の任意のステージと比較して変形性関節症の特定のステージであると個体を診断することができる。
【０２３３】
表１は、本発明のバイオマーカーの遺伝子名、及び関連するｌｏｃｕｓ  ｌｉｎｋ  ＩＤの一覧を示すものであり、そのバイオマーカーの発現レベル測定を、それぞれ独立して又は組み合わせて使用して、個体を変形性関節症であると診断し、変形性関節症の２つのステージのうちどちらかであると診断し、又は変形性関節症の特定のステージであると診断することができる。当業者に理解されているように、ｌｏｃｕｓ  ｌｉｎｋ  ＩＤを使用して、本発明のバイオマーカーに対応するＲＮＡ転写産物すべて及びタンパク質すべての配列を決定することができる。表２は、本発明の一実施形態において、ＲＮＡ転写産物の配列を示すものであり、その配列を用いて、当業者に公知の技術を使用して本発明のバイオマーカーの発現レベルを測定することができる。表２はまた、本発明の一実施形態において、タンパク質の配列を示すものであり、それを用いて本発明のバイオマーカーの発現レベルを測定することができる。したがって、本発明は、上記に概略を述べた各目的でこれらのバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせの発現を測定する、当業者に公知の方法の使用を包含する。
【０２３４】
５．３  バイオマーカーの組み合わせ
一実施形態では、本発明のバイオマーカーの組み合わせは、表１に示すバイオマーカーのうち２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、又はすべての任意の組み合わせを含む。本発明の他の実施形態では、本発明のバイオマーカーの組み合わせは、図１の一覧から選択されるバイオマーカーの任意の組み合わせを含み、その産物の発現測定を用いて、個体が軽度の変形性関節症であるか、又は変形性関節症でないかを診断することができる。本発明の他の実施形態では、本発明のバイオマーカーの組み合わせは、図２の一覧から選択されるバイオマーカーの任意の組み合わせを含み、その産物の発現測定を用いて、個体が中程度の変形性関節症であるか、又は変形性関節症でないかの診断に使用することができる。本発明の他の実施形態では、本発明のバイオマーカーの組み合わせは、図３で選択されるバイオマーカーの任意の組み合わせを含み、その産物の発現測定を用いて、個体が中程度の変形性関節症であるか、又は軽度の変形性関節症であるかの診断に使用することができる。本発明の他の実施形態では、本発明のバイオマーカーの組み合わせは、図４の一覧から選択されるバイオマーカーの任意の組み合わせを含み、その産物の発現測定を用いて、個体が顕著な変形性関節症であるか、又は重篤な変形性関節症であるかを診断することができる。
【０２３５】
例えば、ｎ個の遺伝子の部分集合ｍの考えられる組み合わせの数は、一般式：
ｍ！／（ｎ）！（ｍ−ｎ）！
を用いて、Feller, Intro to Probability Theory, Third Edition, volume 1, 1968, J. Wiley（編）に記載されている。
【０２３６】
一実施形態では、ｎが２であり、ｍが１９である場合、
19!    ＝  19x18x17x16x15x14x13x12x11x10x9x8x7x6x5x4x3x2x1  
2!(19-2)!   (2x1)(19x18x17x16x15x14x13x12x11x10x9x8x7x6x5x4x3x2x1)
＝1.216 1017 ＝171
7,11 1014
通りの一意的な２個の遺伝子の組み合わせが存在する。この２個の遺伝子の各組み合わせの遺伝子発現測定をそれぞれ独立して使用して、患者が変形性関節症であるかどうかを決定することができる。ｍが１９であり、ｎが３である他の特定の実施形態では、１９！／３！（１９−３）！通りの一意的な３個の遺伝子の組み合わせが存在する。この一意的な３個の遺伝子の各組み合わせを、患者が変形性関節症であるかどうかを決定するモデルとして、それぞれ独立して使用することができる。
【０２３７】
５．４  バイオマーカーの特に有用な組み合わせ
本発明のバイオマーカーの組み合わせはすべてＯＡの診断に有用であるが、本発明はさらに、（ａ）個体を変形性関節症であると診断すること、（ｂ）変形性関節症（ＯＡ）の２つのステージを区別すること、及び（ｃ）個体を変形性関節症（ＯＡ）の特定のステージであると診断することのそれぞれについて特に有用なバイオマーカーの組み合わせを選択する手段を提供する。本発明はさらに、上述した有用性のそれぞれについて同定された組み合わせを評価する方法を提供する。
【０２３８】
バイオマーカーの有用な組み合わせを同定するために、本発明の数学的モデルを使用して、２個（例えば、ロジスティック回帰などの二値モデル）又はそれ以上（例えば、ニューラルネットワークなどのモデル）の、そのモデルへの入力に使用する訓練用集団の表現形質を区別する各組み合わせの能力について本発明のバイオマーカーの考えられる各組み合わせを試験する。そのモデルへの入力に使用する訓練用集団の表現形質は、（ａ）ＯＡと診断すること、（ｂ）軽度のＯＡであると診断すること、（ｃ）中程度のＯＡであると診断すること、（ｄ）重篤なＯＡであると診断すること、（ｅ）ＯＡでないと診断することに使用する表現形質である。その数学的モデルへの入力に使用する訓練用集団の表現形質及び使用するモデルによって、ａ）個体を変形性関節症であると診断すること、（ｂ）変形性関節症（ＯＡ）の２つのステージを区別すること、及び（ｃ）個体を変形性関節症（ＯＡ）の特定のステージであると診断することのうち１つの診断法として、そのモデルによって得られる組み合わせの有用性が決定される。その数学的モデルへの入力に使用する訓練用集団の表現形質を選択した結果を下記により詳細に記載する。
【０２３９】
その後、２個（又はそれ以上）の、そのモデルへの入力に使用する訓練用集団の表現形質のうち１個についてそれぞれの個体を正確に呼び出すモデルの能力を決定することによって、発生した数学的モデルを評価することができる。好ましい実施形態では、そのモデルを導き出すのに使用する訓練用集団の個体は、そのモデルの試験に使用する訓練用集団の個体と異なる。当業者に理解されているように、このことによって、表現形の特徴付けが不明である個体を適切に特徴付ける能力について組み合わせの能力を予測することが可能となる。
【０２４０】
数学的モデルに入力するデータは、評価されるバイオマーカーの産物の発現レベルを表すどんなデータでもよい。本発明において有用な数学的モデルは、教師あり学習又は教師なし学習の両方を用いるものを含む。本発明の好ましい実施形態では、選択される数学的モデルは、本発明のバイオマーカーの考えられる各組み合わせを評価する「訓練用集団」と組み合わせて、教師あり学習を使用するものである。本発明の一実施形態では、使用する数学的モデルは、回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、ニューラルネットワーク、クラスタリングモデル、主成分分析、最近傍分類分析、線形識別分析、二次識別分析、サポートベクターマシン、決定木、遺伝的アルゴリズム、バギングによる分類の最適化、ブースティングによる分類の最適化、ランダム部分空間法を用いた分類の最適化、射影追跡、加重投票法から選択される。好ましい実施形態では、ロジスティック回帰モデルを使用する。他の好ましい実施形態では、ニューラルネットワークモデルを使用する。
【０２４１】
得られた数学的モデルを使用して、そのモデルへの入力に使用する表現形質について、未知の個体又は被験個体を診断することができる。好ましい実施形態では、下記の質問：（ａ）個体が変形性関節症であるか、（ｂ）個体が変形性関節症の２つのステージのどちらであるか（変形性関節症でないことはＯＡの一ステージとみなす）、及び（ｃ）個体が変形性関節症の特定のステージであるかの１つに答える、ロジスティック回帰によって得られた式から診断が得られる。本発明のさらに他の実施形態では、上記の任意の質問に対する答えは、決定できない答えでもよい。
【０２４２】
本発明の好ましい一実施形態では、当業者に公知の方法を用いて訓練用集団の各個体を適切に特徴付ける能力について各モデルを評価する。例えば、標準的な統計の方法及び開示されている方法を用いて、交差検証法の１点除外（Leave One out）交差検証法、ｎ重交差検証法、ジャックナイフ分析を使用してモデルを評価することができる。本発明のさらにより好ましい実施形態では、モデルを得るのに使用されなかった訓練用集団の個体を適切に特徴付ける能力について各モデルを評価する。
【０２４３】
一実施形態では、訓練用集団の各個体を適切に特徴付ける能力についてモデルを評価するのに使用する方法は、モデルの感度（ＴＰＦ、真の陽性率）と１−特異度（ＴＮＦ、真の陰性率）を評価する方法である。好ましい実施形態では、モデルを試験するのに使用する方法は、いくつかのパラメータを供給して、得られた式の診断結果の感度と特異度の両方を評価する受信者動作特性（Receiver Operating Characteristic）（「ＲＯＣ」）である。特に好ましい実施形態では、ＲＯＣ面積（曲線下の面積）を使用して式を評価する。好ましい実施形態では、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９を超えるＲＯＣ面積が好ましい。他方では、スコアが１．０の完全なＲＯＣ面積は、感度も１００％であり特異度も１００％であることを示す。
【０２４４】
当業者に理解されているように、数学的モデルによって決定される組み合わせ及び式の有用性は、モデルへの入力用のデータを得るのに使用する集団の表現型に依存する。特定の実施形態の例を、本明細書でより詳細に記載する。
【０２４５】
５．５  数学的モデルへの入力用の集団
いくつかの実施形態では、基準又は訓練用集団は、１０〜３０の被験体を含む。他の実施形態では、訓練用集団は３０〜５０の被験体を含む。さらに他の実施形態では、基準集団は、それぞれ５０〜１００、１００〜５００、５００〜１０００、又は１０００を超える被験体を含む２以上の集団を含む。
【０２４６】
使用する数学的モデルから、基準集団内に何個の表現形質が含まれる可能性があるかも決定される。例えば、いくつかのモデル（二値の数学的モデル）から、２個の表現形質を区別するのに有用なバイオマーカーの組み合わせのみを同定することができる。他のモデルでは、３個以上の表現形質を区別するのに有用なバイオマーカーの組み合わせを使用することができる（例えば、ニューラルネットワーク）。本発明の他の実施形態では、二値モデルを用いて二分決定の組み合わせを使用して、複数の群を区別することができる。
【０２４７】
５．６  二値の数学的モデルに入力する、変形性関節症の診断用のバイオマーカーを同定するための集団
例えば、変形性関節症である、又は変形性関節症でないと個体を診断するのに有用なそれらのバイオマーカーを同定するために、変形性関節症である個体の集団から、表１のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物すべての発現レベルを反映するデータを使用し、変形性関節症でない個体の第２の集団を使用する。変形性関節症である又は変形性関節症でないと集団を特徴付ける目的で、ＯＡを診断する任意の旧来の方法を使用することができる。好ましい実施形態では、本明細書に記載のＭａｒｓｈａｌｌのスコア決定法を使用する。本発明の一実施形態では、変形性関節症であるとみなされる個体の集団は、軽度のＯＡ、中程度のＯＡ、顕著なＯＡ、又は重篤なＯＡであるとスコア決定される任意の個体を含む。同様に、同様の方法に従って、ＯＡでない個体の集団を選択する。好ましい実施形態では、訓練用セットに使用する２集団の表現形質は、ＯＡの有無を除けば類似している。他の好ましい実施形態では、２集団は、少なくとも年齢、性別及びＢＭＩ（肥満度指数）が一致している。
【０２４８】
他の実施形態では、変形性関節症である、又は変形性関節症でないと個体を診断するのに有用なそれらのバイオマーカーを同定するために、変形性関節症である個体の集団、及び変形性関節症でない個体の第２の集団から得られた表１のバイオマーカーの１又はそれ以上のｍＲＮＡ産物の発現レベルを反映するデータを使用する。
【０２４９】
他の実施形態では、変形性関節症である、又は変形性関節症でないと個体を診断するのに有用なそれらのバイオマーカーを同定するために、変形性関節症である個体の集団、及び変形性関節症でない個体の第２の集団から得られた、表２に示される表１のバイオマーカーの１又はそれ以上のｍＲＮＡ産物の発現レベルを反映するデータを使用する。
【０２５０】
他の実施形態では、変形性関節症である、又は変形性関節症でないと個体を診断するのに有用なそれらのバイオマーカーを同定するために、変形性関節症である個体の集団、及び変形性関節症でない個体の第２の集団から得られた血液中で発現する表１のバイオマーカーのＲＮＡ産物すべての発現レベルを反映するデータを使用する。
【０２５１】
５．７  二値の数学的モデルを用いた、変形性関節症のステージを区別するバイオマーカーを同定するための集団
本発明の一実施形態では、軽度の変形性関節症である、又は変形性関節症でないと個体を診断するのに有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定するために、軽度の変形性関節症であるとＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体の集団、及び変形性関節症でない個体の第２の集団から得られた表１のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物すべての発現レベルを反映するデータを使用する。
【０２５２】
本発明の他の実施形態では、軽度の変形性関節症である、又は変形性関節症でないと個体を診断するのに有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定するために、軽度の変形性関節症であるとＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体の集団、及び変形性関節症でない個体の第２の集団に由来する表１のバイオマーカーの１又はそれ以上のｍＲＮＡ産物の発現レベルを反映するデータを使用する。
【０２５３】
本発明の他の実施形態では、軽度の変形性関節症である、又は変形性関節症でないと個体を診断するのに有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定するために、軽度の変形性関節症であるとＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体の集団、及び変形性関節症でない個体の第２の集団に由来する、表２で開示される表１のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物の発現レベルを反映するデータを使用する。
【０２５４】
本発明の他の実施形態では、軽度の変形性関節症である、又は変形性関節症でないと個体を診断するのに有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定するために、軽度の変形性関節症であるとＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体の集団、及び変形性関節症でない個体の第２の集団から得られた血液中で発現する表１のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物の発現レベルを反映するデータを使用する。
【０２５５】
本発明の他の実施形態では、軽度の変形性関節症である、又は変形性関節症でないと個体を診断するのに有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定するために、軽度の変形性関節症であるとＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体の集団、及び変形性関節症でない個体の第２の集団から得られた図１のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物すべての発現レベルを反映するデータを使用する。
【０２５６】
本発明の他の実施形態では、中程度の変形性関節症である、又は変形性関節症でないと個体を診断するのに有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定するために、中程度の変形性関節症であるとＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体の集団、及び変形性関節症でない個体の第２の集団から得られた表１のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物すべての発現レベルを反映するデータを使用する。
【０２５７】
本発明の他の実施形態では、中程度の変形性関節症である、又は変形性関節症でないと個体を診断するのに有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定するために、中程度の変形性関節症であるとＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体の集団、及び変形性関節症でない個体の第２の集団に由来する表１のバイオマーカーの１又はそれ以上のｍＲＮＡ産物の発現レベルを反映するデータを使用する。
【０２５８】
本発明の他の実施形態では、中程度の変形性関節症である、又は変形性関節症でないと個体を診断するのに有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定するために、中程度の変形性関節症であるとＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体の集団、及び変形性関節症でない個体の第２の集団から得られた血液中で発現する表１のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物の発現レベルを反映するデータを使用する。
【０２５９】
本発明の他の実施形態では、中程度の変形性関節症である、又は変形性関節症でないと個体を診断するのに有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定するために、中程度の変形性関節症であるとＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体の集団、及び変形性関節症でない個体の第２の集団から得られた、表２に示される表１のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物の発現レベルを反映するデータを使用する。
【０２６０】
本発明の他の実施形態では、中程度の変形性関節症である、又は変形性関節症でないと個体を診断するのに有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定するために、中程度の変形性関節症であるとＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体の集団、及び変形性関節症でない個体の第２の集団から得られた図２のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物の発現レベルを反映するデータを使用する。
【０２６１】
同様に、顕著なＯＡである個体とＯＡでない個体を、重篤なＯＡである個体とＯＡでない個体を、軽度のＯＡである個体と中程度のＯＡである個体を、軽度のＯＡである個体と顕著なＯＡである個体を、軽度のＯＡである個体と重篤なＯＡである個体を、中程度のＯＡである個体と顕著なＯＡである個体を、中程度のＯＡである個体と重篤なＯＡである個体を、顕著なＯＡである個体と重篤なＯＡである個体を区別するのに有用なバイオマーカーの組み合わせを、上記で概略を述べたものと同様の方法を用いて同定することができる。
【０２６２】
５．８  二値の数学的モデルに入力する、ステージ特異的なＯＡの診断用のバイオマーカーを同定するための集団
本発明の一実施形態では、ＯＡの任意の他のステージと比較して個体が軽度のＯＡであるかどうかを特定する際に有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定する（すなわち、個体のＯＡのステージについて診断するバイオマーカーを同定する）ために、軽度の変形性関節症であるとＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体の集団、並びに中程度のＯＡである個体、顕著なＯＡである個体、重篤なＯＡである個体、及びＯＡでない個体の組み合わせである個体の第２の集団から得られた表１の各バイオマーカーのｍＲＮＡ産物の発現レベルを反映するデータを使用する。好ましくは、両集団の個体は、年齢、性別及びＢＭＩが一致している。
【０２６３】
本発明の他の実施形態では、ＯＡの任意の他のステージと比較して個体が軽度のＯＡであるかどうかを特定する際に有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定する（すなわち、ＯＡの特定のステージにある個体を診断するバイオマーカーを同定する）ために、軽度の変形性関節症であるとＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体の集団、並びに中程度のＯＡである個体、顕著なＯＡである個体、重篤なＯＡである個体、及びＯＡでない個体の組み合わせである個体の第２の集団から得られた表１のバイオマーカーの考えられる各変異体の発現レベルを反映するデータを使用する。好ましくは、両集団の個体は、年齢、性別及びＢＭＩが一致している。
【０２６４】
本発明の他の実施形態では、ＯＡの任意の他のステージと比較して個体が軽度のＯＡであるかどうかを特定する際に有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定する（すなわち、ＯＡの特定のステージにある個体を診断するバイオマーカーを同定する）ために、軽度の変形性関節症であるとＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体の集団、並びに中程度のＯＡである個体、顕著なＯＡである個体、重篤なＯＡである個体、及びＯＡでない個体の組み合わせである個体の第２の集団から得られた表２に示す一覧から選択される表１のバイオマーカーの考えられる各変異体の発現レベルを反映するデータを使用する。好ましくは、両集団の個体は、年齢、性別及びＢＭＩが一致している。
【０２６５】
本発明の他の実施形態では、ＯＡの任意の他のステージと比較して個体が軽度のＯＡであるかどうかを特定する際に有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定する（すなわち、ＯＡの特定のステージにある個体を診断するバイオマーカーを同定する）ために、軽度の変形性関節症であるとＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体の集団、並びに中程度のＯＡである個体、顕著なＯＡである個体、重篤なＯＡである個体、及びＯＡでない個体の組み合わせである個体の第２の集団から得られた血液中で発現する表１のバイオマーカーのこの変異体の発現レベルを反映するデータを使用する。好ましくは、両集団の個体は、年齢、性別及びＢＭＩが一致している。
【０２６６】
同様に、ＯＡの任意の他のステージと比較して中程度のＯＡである個体を、ＯＡの任意の他のステージと比較して顕著なＯＡである個体を、ＯＡの任意の他のステージと比較して重篤なＯＡである個体を区別するのに有用なバイオマーカーの組み合わせを、上記で概略を述べたものと同様の方法を用いて、集団のデータを使用して同定することができる。
【０２６７】
５．９  非二値の数学的モデルに入力する、ステージ特異的なＯＡの診断用のバイオマーカーを同定するための集団
本発明の一実施形態では、ＯＡの任意の他のステージと比較して個体が軽度のＯＡであるかどうかを特定する際に有用なそれらのバイオマーカーの組み合わせを同定するために、（ａ）軽度のＯＡである個体、（ｂ）中程度のＯＡである個体、（ｃ）顕著なＯＡである個体、（ｄ）重篤なＯＡである個体の集団から得られた表１の各バイオマーカーの発現レベルを反映するデータを使用する。その集団は、ＯＡを診断する任意の旧来の方法によって特定された個体から構成されるが、好ましくは、Ｍａｒｓｈａｌｌのスコア決定法（上記）を使用する。好ましくは、その集団の個体は、年齢、性別及びＢＭＩが一致している。
【０２６８】
同様に、ＯＡの任意の他のステージと比較して中程度のＯＡである個体を、ＯＡの任意の他のステージと比較して顕著なＯＡである個体を、ＯＡの任意の他のステージと比較して重篤なＯＡである個体を特徴付けるのに有用なバイオマーカーの組み合わせを、上記で概略を述べたものと同様の方法を用いて同定することができる。
【０２６９】
５．１０  回帰モデル
いくつかの実施形態では、本発明で同定されるバイオマーカーのいくつかの又はすべての考えられる組み合わせの発現データは、回帰モデルで、好ましくはロジスティック回帰モデルで使用する。そのような回帰モデルから、バイオマーカーの考えられる各組み合わせについて１又はそれ以上の式が決定され、各式から、そのモデルによって表される各バイオマーカーの係数が得られる。
【０２７０】
一般に、対象とする多重回帰式は、
Ｙ＝α＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋．．．＋βｋＸｋ＋ε
と書くことができ、従属変数Ｙは、第１のサブグループに関連する生物学的特徴（例えば、変形性関節症の不在／存在／ステージ）の存在（Ｙが正のとき）又は不在（Ｙが負のとき）である。このモデルから、従属変数Ｙが、ｋ個の説明変数（訓練用データセットにおける第１と第２のサブグループの被験体に由来するｋ個の選択遺伝子の特徴的な測定値）と、省略されている様々な不特定の因子を包含する誤差項に依存するといえる。上記に特定したモデルでは、パラメータβ１は、他の説明変数を一定にした状態で、従属変数Ｙに対する第１の説明変数Ｘ１の効果を測るものである。同様に、β２は、残りの説明変数を一定にした状態で、Ｙに対する説明変数Ｘ２の効果を与える。
【０２７１】
ロジスティック回帰モデルは、線形回帰の非線形変換である。ロジスティック回帰モデルは、「ロジット（logit）」モデルと呼ばれ、
ln[p/(1-p)]＝α＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋．．．＋βｋＸｋ＋ε  又は
[p/(1-p)]＝expαexpβ１Ｘ１expβ２Ｘ２×．．．×expβｋＸｋexpε
と表すことができ、式中、
ｌｎは自然対数ｌｏｇｅｘｐであり、ｅｘｐ＝２．７１８２８．．．であり、
ｐは、事象Ｙが起こる確率ｐ（Ｙ＝１）であり、
ｐ／（１−ｐ）は「オッズ比」であり、
ｌｎ［ｐ／（１−ｐ）］は対数オッズ比又は「ロジット」であり、
このモデルの他の成分すべては、上述の一般的な回帰式と同じである。α及びεの項を同じ定数にすることができることが、当業者に理解されるであろう。実際、好ましい実施形態では、単数項を用いてα及びεを表す。「ロジスティック」分布は、Ｓ字形の分布関数である。ロジット分布によって、推定確率（ｐ）は０と１の間にあるように制約される。
【０２７２】
本発明のいくつかの実施形態では、最尤推定（ＭＬＥ）によってロジスティック回帰モデルを適合させる。言い換えれば、係数（例えば、α、β１、β２、．．．）は、最大尤度によって決定される。尤度とは、条件付き確率（例えば、Ｘによって与えられるＹの確率Ｐ（Ｙ｜Ｘ））である。尤度関数（Ｌ）は、サンプルデータセットで生じる特定組の従属変数値（Ｙ１、Ｙ２、．．．、Ｙｎ）が認められる確率を測るものである。それは、従属変数の積の確率：
Ｌ＝Ｐｒｏｂ（Ｙ１＊  Ｙ２＊＊＊  Ｙｎ）
と書ける。尤度関数が高いと、サンプル中でＹｓが認められる確率が高くなる。ＭＬＥは、尤度関数の対数（ＬＬ＜０）をできるだけ大きくし、又は尤度関数の対数の−２倍（−２ＬＬ）をできるだけ小さくする係数（α、β１、β２、．．．）を見出すものである。ＭＬＥでは、パラメータα、β１、β２、．．．について何らかの最初の推定を行う。次いで、このパラメータの推定値によって与えられるデータの尤度を計算する。パラメータの推定値を改善し、データの尤度を再計算する。パラメータの推定値が大して変化しなくなる（例えば、０．０１又は０．００１未満の確率の変化）まで、このプロセスを反復する。ロジスティック回帰及びロジスティックロジスティック回帰モデルの適合の例は、Hastie, The Elements of Statistical Learning, Springer, New York, 2001, pp. 95-100に認められ、この文献はその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７３】
５．１１  ニューラルネットワーク
他の実施形態では、本発明の各バイオマーカーについて測定される発現を用いて、ニューラルネットワークを訓練することができる。ニューラルネットワークとは、２ステージの回帰又は分類モデルである。ニューラルネットワークは層化構造を有し、その構造は、出力単位の層に対する加重の層によってつながった入力単位（及び偏り）の層を含む。回帰では、出力単位の層は、通常出力単位を１個しか含まない。しかし、ニューラルネットワークは、均一な形で複数の量的反応を扱うことができる。したがって、ニューラルネットワークを適用して、２個を超える集団を区別するバイオマーカーを同定することができる。特定の一例では、表１のバイオマーカーの発現データを用いてニューラルネットワークを訓練して、変形性関節症の他の任意のステージと比較して変形性関節症のステージ（例えば軽度の変形性関節症）に特異的なバイオマーカーの組み合わせを同定することができ、この場合変形性関節症でないことを変形性関節症の一ステージとみなすことができる。その結果、訓練したニューラルネットワークを使用して、ステージ特異的バイオマーカーとして有用なバイオマーカーの組み合わせを直接同定することができる。いくつかの実施形態では、ＥａｓｙＮＮ−Ｐｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０ｇソフトウェアパッケージ（Neural Planner Software Inc.）で認められる１０ニューロン（１０個の隠れ単位）からなる単一の隠れ層を含む誤差逆伝搬ニューラルネットワーク（例えば、Abdi, 1994, "A neural network primer", J. Biol System. 2, 247-283を参照）を使用する。
【０２７４】
ニューラルネットワークは、Duda et al., 2001, Pattern Classification, Second Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York; 及びHastie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer-Verlag, New Yorkに記載され、これらの文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７５】
５．１２  他の数学的モデル
上述したパターン分類及び統計技術は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるDuda and Hart, Pattern Classification and Scene Analysis, 1973, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkの211〜256ページに記載されているクラスタリング；主成分分析（参照により本明細書に組み込まれるJolliffe, 1986, Principal Component Analysis, Springer, New Yorkを参照）；最近傍分類分析（例えば、Duda, Pattern Classification, Second Edition, 2001, John Wiley & Sons, Inc; 及びHastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer, New Yorkを参照）；線形識別分析（例えば、Duda, Pattern Classification, Second Edition, 2001, John Wiley & Sons, Inc; 及びHastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer, New York; Venables & Ripley, 1997, Modern Applied Statistics with s-plus, Springer, New Yorkを参照）；サポートベクターマシン（例えば、参照により本明細書に組み込まれるCristianini and Shawe-Taylor, 2000, An Introduction to Support Vector Machines, Cambridge University Press, Cambridge、Boser et al., 1992, Proceedings of the 5th Annual ACM Workshop on Computational Learning Theoryの"A training algorithm for optimal margin classifiers, ACM Press, Pittsburgh, PA, p
p. 142-152; Vapnik, 1998, Statistical Learning Theory, Wiley, New Yorkを参照）などの、ＯＡの分類のモデル構築に使用することができるモデルのタイプの例に過ぎない。
【０２７６】
５．１３  本発明のバイオマーカーの産物
当業者に理解されているように、ＯＡ又はＯＡのステージの間で示差的に発現される１又はそれ以上のバイオマーカーの組み合わせを同定すると、個体におけるバイオマーカー（遺伝子）の産物の発現を測定することによって、ＯＡ及びＯＡのステージの診断が可能となる。
【０２７７】
本発明の各バイオマーカーの産物には、ＲＮＡもタンパク質も含まれる。本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物には、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｍＲＮＡの１又はそれ以上のスプライス変異体の集団が含まれる。本発明を実施するために、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の１又はそれ以上の集団の測定を、診断の目的で使用することができる。より詳細には、ＯＡの間で、又はＯＡのステージの間で示差的に発現されるバイオマーカーのＲＮＡ産物の集団の測定は、診断の目的に有用であり、本明細書に包含される。
【０２７８】
本発明の一実施形態では、測定される本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物は、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｍＲＮＡのすべてのスプライス変異体を含めたＲＮＡ産物の集団である。他の実施形態では、測定される本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物は、ｍＲＮＡの集団である。本発明の他の実施形態では、測定される本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物は、血液中で発現するｍＲＮＡの集団である。本発明のさらに他の実施形態では、測定される本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物は、ｍＲＮＡの１又はそれ以上のスプライス変異体の集団である。本発明のさらに他の実施形態では、測定される本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物は、血液中で発現するｍＲＮＡの１又はそれ以上のスプライス変異体の集団である。本発明のさらに他の実施形態では、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物は、表２に挙げたその産物である。
【０２７９】
本発明のバイオマーカーのタンパク質産物も本発明の範囲に含まれ、それには、本発明のバイオマーカーから生じるタンパク質の集団全体が含まれる。当業者に理解されているように、本発明のバイオマーカーから生じるタンパク質の集団全体には、タンパク質、スプライスｍＲＮＡ変異体から生じるタンパク質変異体、翻訳後修飾タンパク質が含まれる。本発明を実施するために、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の１又はそれ以上の集団の測定を、診断の目的で使用することができる。より詳細には、ＯＡの間で、又はＯＡのステージの間で示差的に発現されるバイオマーカーのタンパク質産物の集団の測定は、診断の目的に有用であり、本明細書に包含される。
【０２８０】
本発明の一実施形態では、測定される本発明のバイオマーカーのタンパク質産物は、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物から翻訳されるタンパク質産物の集団全体である。他の実施形態では、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物は、血液中で発現するそのタンパク質産物である。本発明のさらに他の実施形態では、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物は、１又はそれ以上のｍＲＮＡスプライス変異体から翻訳される１又はそれ以上のタンパク質産物である。本発明のさらに他の実施形態では、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物は、血液中で発現する１又はそれ以上のｍＲＮＡスプライス変異体から翻訳される１又はそれ以上のタンパク質産物である。本発明のさらに他の実施形態では、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物は、表２に挙げたその産物である。
【０２８１】
５．１４  診断のための同定された組み合わせの使用
本発明は、ＯＡを診断し、ＯＡのステージを区別し、ＯＡの特定のステージを診断する目的で、バイオマーカーの有用な組み合わせを同定することができることを教示するものである。本発明のバイオマーカーのＲＮＡ又はタンパク質産物を表すデータを本発明のモデルに入力し、その結果特に有用な組み合わせを同定する。その組み合わせを使用する診断上の目的は、本明細書に記載する入力用集団の表現形質に依存する。同定された組み合わせを、その組み合わせのＲＮＡ及びタンパク質産物の発現レベルを測定する旧来の技術とともに使用して、被験個体と対照集団の１名又は複数名の個体との間に発現パターンがあるかどうか（対照集団は、モデルに入力する集団によって定義される部分表現形質を有する部分集団を含み、対照集団を表すデータを含むことができる）を決定することができる。好ましい実施形態では、個体を診断するために作成されたモデルを使用して、例えば、その組み合わせを同定するために作成したモデルに入力する被験個体における本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の発現レベルを測定することによって、そのモデルによって定義される診断を決定する。好ましい実施形態では、被験個体の診断に使用するものと同じ方法を使用して、数学的モデルの作成に使用する発現データを得る。
【０２８２】
５．１５  ＯＡの進行又は退行をモニターするための同定された組み合わせの使用
本発明は、個体をＯＡの特定のステージであると診断する目的で、バイオマーカーの有用な組み合わせを同定することができることを教示するものである。組み合わせを同定することによって、個体がＯＡの特定のステージと診断される（そのステージは、既知のステージ決定の方法に従ったどんなステージでもよく、Ｍａｒｓｈａｌｌのスコアによってステージが定義されるＭａｒｓｈａｌｌの方法の細分類を含む）。一実施形態では、（ａ）正常な、（ｂ）軽度の、（ｃ）中程度の、（ｄ）顕著な、（ｅ）重篤なステージを含む５ステージが存在する。特定のステージを診断する組み合わせが、例えば治療に応答して、個体のＯＡの重症度について進行したか又は退行したかを決定する際に有用であることが当業者に理解されるであろう。例えば、治療する前に、ＯＡの特定のステージを診断するものとして同定された１又はそれ以上の組み合わせを用いて、個体をＯＡの特定のステージであると診断することができる。治療の後、ＯＡの特定のステージを診断するものとして同定された１又はそれ以上の組み合わせを用いて、個体を再度診断することができる。治療する前にもはや個体についてそのステージを特定できない場合には、このことから、それ自体治療が有効であることが示唆される可能性がある。さらに、治療は、個体がより軽度のＯＡと目下で診断されるようなＯＡのステージの退行を導くこともあり、個体がより重篤なステージのＯＡと目下で診断されるように、治療によって疾患が進行することもある。したがって、ＯＡの進行又は退行をモニターし、あるいは治療に対する応答をモニターするために、ＯＡのステージの診断に特異的なものとして同定された１又はそれ以上の組み合わせは有用である。
【０２８３】
５．１６  本発明のバイオマーカーの産物を測定するのに使用するポリヌクレオチド
当業者に理解されているように、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の発現を測定する手段として、本発明のサンプル中のＲＮＡ発現を測定する１又はそれ以上の方法と組み合わせて、以下のものを１種又は複数種使用することができる：すなわち、本発明のバイオマーカーの１又はそれ以上のＲＮＡ産物と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、又は天然に存在する修飾ヌクレオチドの他の組み合わせ。他の特定の実施形態では、本発明のバイオマーカーの１又はそれ以上のＲＮＡ産物と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、又は天然に存在する修飾ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの他の組み合わせを使用する。好ましい実施形態では、本発明のバイオマーカーの１又はそれ以上のＲＮＡ産物と特異的にも選択的にもハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、又は天然に存在する修飾ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの他の組み合わせを使用する。
【０２８４】
本発明の一実施形態では、本発明のＲＮＡ産物の測定に使用するポリヌクレオチドを、核酸メンバーとして使用することができる。核酸メンバーは、本発明の一態様に従って、アレイを含む固相支持体と安定して結合する。核酸メンバーの長さは、８〜１０００ヌクレオチド長でもよく、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物に特異的となるように選択される。一実施形態では、このメンバーは、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物に選択的である。さらに他の実施形態では、このメンバーは、本発明のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物に選択的である。好ましい実施形態では、このメンバーは、本発明のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物の変異体すべてに選択的である。さらに他の好ましい実施形態では、このメンバーは、本発明のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物の１又はそれ以上の変異体に選択的である。核酸メンバーは、一本鎖又は二本鎖でもよく、かつ／あるいはオリゴヌクレオチド、又はｃＤＮＡから増幅したＰＣＲ断片でもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約２０〜３０ヌクレオチド長である。ＥＳＴは、好ましくは１００〜６００ヌクレオチド長である。本発明のバイオマーカーの発現領域の各部分をアレイ上のプローブとして利用できることが、当業者に理解されるであろう。より詳細には、本発明の遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチド、及び／あるいは本発明の遺伝子に由来するｃＤＮＡ又はＥＳＴが有用である。オリゴヌクレオチドに基づくアレイでは、プローブとして有用な、対象とする遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドの選択は、当技術分野で十分に理解されている。より詳細には、標的核酸とのハイブリダイゼーションを許容する領域を選択することが重要である。オリゴヌクレオチドのＴｍ、％ＧＣ含量、二次構造の程度や核酸の長さなどの要因は重要な要因である。例えば、米国特許第６，５５１，７８４号を参照されたい。
【０２８５】
５．１７  本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物のアレイハイブリダイゼーションを測定する技術
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物と特異的に及び／又は選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、本発明で使用するアレイ上にスポットすることができる。一実施形態では、アレイは、表１で開示される本発明の各バイオマーカーの１又はそれ以上の産物とハイブリダイズすることができる１０〜１０００ヌクレオチド長の配列からなる。
【０２８６】
本発明のアレイとハイブリダイズし、それを用いて分析される標的核酸サンプルは、好ましくはヒトの軟骨、血液又は滑液に由来するものである。この手順の限界は、標的核酸サンプルとして使用する入手可能なＲＮＡの量にある。好ましくは、本発明に従って使用する少なくとも１μｇの総ＲＮＡを得る。ＰＣＲ、及びｍＲＮＡ亜種に対するプライマー（例えばポリＴオリゴヌクレオチド）と組み合わせて、より少量のＲＮＡを使用することができる。
【０２８７】
核酸アレイの構築
対象の方法では、実質的に固体の支持体の表面と安定に結合した核酸メンバーのアレイを、相補的な核酸メンバー／標的の複合体のハイブリダイゼーションパターンが生じるのに十分なハイブリダイゼーション条件下で標的核酸を含むサンプルと接触させ、アレイ上の固有の位置にある１又はそれ以上の相補的な核酸メンバーが標的核酸と特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイズする標的核酸の同一性は、アレイ上の核酸メンバーの位置を参照して決定することができる。
【０２８８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や逆転写（ＲＴ）などの確立されている技術を用いて、核酸メンバーを作製することができる。これらの方法は、当技術分野で現在知られているものと同様である（例えば、PCR Strategies, Michael A. Innis(Editor), et al.(1995)及びPCR: Introduction to Biotechniques Series, C. R. Newton, A. Graham(1997)を参照）。当技術分野で周知の方法（例えば、カラム精製又はアルコール沈殿）によって、増幅した核酸を精製する。核酸は、それが単離され、その結果、プライマー、及び所望の核酸を合成する間に生成する不完全な産物が実質的になくなったときに純粋とみなされる。好ましくは、精製した核酸はまた、その分子の特異的な結合活性を妨げ、又はその他の形でそれをマスキングする可能性がある混入物も実質的に含まない。
【０２８９】
本発明の一態様に従ったアレイは、１ｃｍ２当たり異なる核酸が２０個を超える密度で固相支持体の一表面と結合した複数の核酸を含み、各核酸が、非同一の予め選択された領域中の固相支持体の表面と結合している（例えば、マイクロアレイ）。アレイ上の結合した各サンプルは、下記でより詳細に記載するように、既知の同一性を有する、通常は既知の配列の核酸組成物を含む。考えられる任意の基板を本発明で使用することができる。
【０２９０】
一実施形態では、固相支持体の表面に結合される核酸はＤＮＡである。好ましい実施形態では、固相支持体の表面に結合される核酸は、ｃＤＮＡ又はＲＮＡである。他の好ましい実施形態では、固相支持体の表面に結合される核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡである。好ましくは、本発明に従った、アレイ中の核酸メンバーは、少なくとも１０、２５又は５０ヌクレオチド長である。一実施形態では、核酸メンバーは、少なくとも１５０ヌクレオチド長である。好ましくは、核酸メンバーは、１０００ヌクレオチド長未満である。より好ましくは、核酸メンバーは、５００ヌクレオチド長未満である。
【０２９１】
本発明のアレイでは、核酸組成物は、支持体の表面と安定に結合し、その支持体は、柔軟な固相支持体でもよく、あるいは強固な固相支持体でもよい。「安定に結合している」とは、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、固相支持体に対して各核酸メンバーが固有の位置を維持することを意味する。したがって、サンプルは、非共有結合で又は共有結合で支持体表面と安定に結合している。非共有結合の例には、非特異的な吸着、静電相互作用に基づく結合（例えば、イオン対の相互作用）、疎水性相互作用、水素結合の相互作用、支持体表面と共有結合している特異的な結合対メンバーを介する特異的な結合などがある。共有結合の例には、核酸と、強固な支持体の表面上に存在する官能基（例えば、−ＯＨ）との間に形成された共有結合があり、その官能基は、下記でより詳細に記載するように、天然に存在するものでもよく、あるいは導入した結合基のメンバーとして存在するものでもよい。
【０２９２】
各組成物中に存在する核酸の量は、アレイを使用するアッセイの間に標的核酸配列の十分なハイブリダイゼーション及び検出をもたらすのに十分なものである。一般に、アレイの固相支持体と安定に結合した各核酸メンバーの量は、少なくとも約０．００１ｎｇであり、好ましくは少なくとも約０．０２ｎｇであり、より好ましくは少なくとも約０．０５ｎｇであり、その量は、１０００ｎｇ又はそれより多くてもよいが、通常は約２０ｎｇを超えない。好ましくは、統計的に有意な結果が確実に得られるように、単一遺伝子に対応する複数のサンプルをアレイ上にスポットする。全体的に円形の範囲を占めるスポットとして固相支持体上に核酸メンバーを「スポットする」場合、「スポット」の直径は、通常約１０〜５，０００μｍであり、一般には約２０〜２，０００μｍであり、より一般には約１００〜２００μｍである。
【０２９３】
ゲノムＤＮＡ、ハウスキーピング遺伝子、ベクター配列、植物の核酸配列、陽性及び陰性対照遺伝子などに対応するオリゴヌクレオチド又は核酸を含む核酸メンバーを含めて、対照核酸メンバーがアレイ上に存在してもよい。対照核酸メンバーとは、その機能が、対象とする特定の「鍵となる」遺伝子が発現しているかどうかを伝達するものではないが、発現のバックグラウンドレベル又は基底レベルなど他の有用な情報をもたらすものである校正用又は対照遺伝子である。
【０２９４】
アレイ上に他の対照核酸をスポットし、標的発現対照核酸及びミスマッチ対照ヌクレオチドとして使用して、プローブが対象とする標的以外のサンプル中の核酸との非特異的な結合又は交差ハイブリダイゼーションをモニターする。したがって、ミスマッチプローブは、ハイブリダイゼーションが特異的かそうでないかを示す。例えば、標的が存在する場合、完全に一致するプローブは、ミスマッチプローブより一貫して明るいはずである。さらに、対照のミスマッチがすべて存在する場合、そのミスマッチプローブを使用して突然変異を検出する。
【０２９５】
固相基板
本発明において、アレイは、柔軟な又は強固な基板のどちらかを含む。柔軟な基板は、破損を起こさずに曲げ、折り畳み、又は同様に扱うことができる。本発明に関する柔軟な固相支持体である固体の材料の例には、膜、例えばナイロン膜、及び柔軟なプラスチックフィルムなどがある。「強固な」とは、支持体が固体であり、容易に曲がらない、すなわち支持体が柔軟でないことを意味する。したがって、対象のアレイの強固な基板は、アレイを使用するアッセイ条件下で、特に高処理能で取り扱う条件下で、その上に存在する結合した核酸に対する物理的な支持及び構造をもたらすのに十分である。
【０２９６】
基板は、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、管、球、ビーズ、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライド、チップなどとして存在する、生物学的なもの、非生物的なもの、有機物、無機物、又はこれらの任意の組み合わせでもよい。基板は、円盤状、正方形、球状、円形など、任意の都合のよい形状を有してもよい。基板は、好ましくは水平又は平面であるが、様々な別の表面の構成をとってもよい。基板は、重合ラングミュア・ブロジェットフィルム、官能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳＩＮ４、修飾ケイ素、あるいは（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）二フッ化ビニリデン、ポリスチレン、ポリカーボネートなどの多種多様なゲル若しくはポリマーのいずれか、又はその組み合わせでもよい。他の基板の材料は、この開示を再検討後に当業者には容易に明らかとなるであろう。
【０２９７】
好ましい実施形態では、基板は、水平なガラス又は単結晶ケイ素である。いくつかの実施形態によれば、周知の技術を用いて基板の表面をエッチングし、望ましい表面の特徴をもたらす。例えば、溝、Ｖ字溝、メサ構造などの形成により、合成領域を、衝突光の焦点内により近接させ、蛍光供給源などからの集光を最大にする反射性の「鏡状の」構造をそれにもたらすことができる。
【０２９８】
固相基板上の表面は、常にではないが通常は、基板と同じ材料から構成される。あるいは、表面は、任意の多種多様な材料、例えば、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカ又はシリカを基礎とする材料、炭素、金属、無機ガラス、膜、又は上記に挙げた基板の材料のいずれかから構成されるものでもよい。いくつかの実施形態では、表面は、基板の表面と強く結合したケージド結合メンバーの使用をもたらすことができる。好ましくは、表面は、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基などである反応基を含む。最も好ましくは、表面は、光透過性であり、シリカ表面上で認められるような表面Ｓｉ−ＯＨ官能基を有する。
【０２９９】
基板の表面は、好ましくは、リンカー分子の層を備えるが、リンカー分子が本発明の成分を必要としないことが理解されるであろう。リンカー分子は、好ましくは、基板上にある本発明の核酸を、他の核酸分子とハイブリダイズさせ、その基板にさらした分子と自由に相互作用させるのに十分な長さのものである。
【０３００】
基板は、ケイ素又はガラスの表面、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）二フッ化ビニリデン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ナイロン６６やニトロセルロースなどの荷電膜、又はその組み合わせであることが多い。好ましい実施形態では、固相支持体はガラスである。好ましくは、基板の少なくとも１つの表面は、実質的に水平である。好ましくは、固相支持体の表面は、それだけに限らないが、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基などを含めた反応基を含む。一実施形態では、表面は光透過性である。好ましい実施形態では、基板はポリリジン被覆スライドあるいはγアミノプロピルシラン被覆Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ＧＡＰＳ又はＣＭＴ−ＧＡＰ２被覆スライドである。
【０３０１】
核酸メンバーが結合することができる任意の固相支持体を、本発明で使用することができる。適切な固相支持体の材料の例には、それだけに限らないが、ガラスやシリカゲルなどのケイ酸塩、セルロース及びニトロセルロース紙、ナイロン、ポリスチレン、ポリメタクリレート（polymethacrylate）、ラテックス、ゴム、及びＴＥＦＲＯＮＴＭなどのフッ素樹脂がある。
【０３０２】
固相支持体の材料は、それだけに限らないが、スライド及びビーズを含めて、多種多様な形状で使用することができる。スライドは、いくつかの機能上の利点を提供するものであり、したがって、固相支持体の好ましい形態である。その表面が水平であるために、ガラススライドを使用すると、プローブ及びハイブリダイゼーション試薬は最小限となる。スライドはまた、試薬の標的化も可能にし、一定の温度で維持することが容易であり、洗浄が容易であり、固相支持体上に固定化したＲＮＡ及び／又はＤＮＡの直接の可視化を容易にする。固相支持体上に固定化したＲＮＡ及び／又はＤＮＡの切り離しも、スライドを使用すると容易となる。
【０３０３】
固相支持体として選択した特定の材料は、それが記載の機能をもたらす限り、本発明に必須ではない。通常、本発明を成す又は使用する者は、コスト及び入手し易さの経済性、最終産物の予想される適用の要請、並びに全体の製造プロセスからの要求に基づいて、最も市販されている材料を選択するはずである。
【０３０４】
スポッティング法
一態様では、本発明は、アレイを提供し、そのアレイを含む各核酸メンバーを固相支持体上にスポットする。
【０３０５】
好ましくは、下記のようにスポッティングを実施する。変形性関節症の、胎児の又は正常な軟骨ｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡクローンのＰＣＲ産物（約４０μｌ）を、増幅に使用した同じ９６ウエルチューブの中で、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）４μｌ（１／１０倍量）及びエタノール１００μｌ（２．５倍量）で沈殿させ、−２０℃で一晩貯蔵する。次いでそれを３，３００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心分離する。得られたペレットを氷冷７０％エタノール５０μｌで洗浄し、再度３０分間遠心分離する。次いでそのペレットを空気乾燥させ、３×ＳＳＣ  ２０μｌ中で又は５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で一晩十分に再懸濁する。次いで、ロボット型ＧＭＳ４１７又は４２７アレイ製造装置（arrayer）（Affymetrix, Ca）を用いて、単一で又は二連でスライド上にサンプルをスポットする。
【０３０６】
マイクロアレイ上のスポットの境界に、ダイヤモンド製罫書針で印をつけることができる（スポットが処理後見えなくなるため）。粒子を含まない温かいｄｄＨ２Ｏの皿の上にスライドを約１分間入れることによってアレイを再水和し（スポットはわずかに膨張するが、互いに接することはない）、７０〜８０℃の加熱ブロックに３秒間逆さにして指ではじいて乾燥させる。次いで、核酸をスライドにＵＶ架橋し（Stratagene, Stratalinker、６５ｍＪ、表示を６５０×１００ｕＪである「６５０」に設定）、又はハイブリダイゼーションの前に８０℃で２〜４時間アレイを焼く。アレイをスライドラックに入れる。空のスライドチャンバーを準備し、下記の溶液で満たす：無水コハク酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）３．０ｇを１−メチル−２−ピロリジノン１８９ｍｌに溶解させた（試薬の迅速な添加が極めて重要である）；無水コハク酸の最後の一片が溶解した直後に、０．２Ｍホウ酸ナトリウム２１．０ｍｌをそれに混合し、その溶液をスライドチャンバーに注ぐ。スライドラックを迅速にかつ均等にスライドチャンバーに沈め、数秒間勢いよく上下に振とうし、確実にスライドにその溶液が残らないようにし、次いでオービタルシェーカー（orbital shaker）上で１５〜２０分間混合する。次いでスライドラックを９５℃のｄｄＨ２Ｏ中に２分間穏やかに沈め、その後９５％エタノール中に５回沈める。次いで過剰なエタノールをペーパータオル上に落として、スライドを空気乾燥させる。使用するまでアレイをスライド箱中に室温で貯蔵する。
【０３０７】
基板に対する本発明の核酸メンバーの結合（「スポッティング」と呼ばれるプロセス）に多数の方法を使用することができる。例えば、ポリマー結合の方法を教示する、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８０７，５２２号の技術を用いて、核酸を結合する。
【０３０８】
あるいは、当技術分野で知られている密着焼付けの技術を用いて、スポット化を実施することもできる。
【０３０９】
マイクロアレイの使用
１又はそれ以上の標的核酸配列を含むサンプル中の多数の核酸についてアッセイを行うことができるハイスループット技術において、本発明に係る核酸アレイを使用することができる。本発明のアレイは、遺伝子発現分析、変形性関節症の診断及び変形性関節症の予後診断、治療に対する患者の応答のモニタリング、薬物スクリーニングなどを含めて、様々な用途での使用を見出すものである。
【０３１０】
アレイはまた、本発明の遺伝子の発現パターンに対する特定の活性な作用物質の効果など、薬物の発見及び研究についての幅広い段階の発現スクリーニングにも有用であり、そのような情報を用いて薬物の効力及び毒性、環境モニタリング、疾患の研究などを明らかにする。
【０３１１】
変形性関節症を診断する手段として、又は治療の効果をモニターし、ステージ特異的な変形性関節症を同定する目的で、これらの配列の少なくとも１種を、より好ましくはこれらの配列の組み合わせを用いて、アレイを作製することができる。
【０３１２】
標準サンプルの選択は当業者に十分に理解されており、それには、１名又は複数名の健常者から単離したＲＮＡと相補的なサンプルが含まれ、この場合健常者とは変形性関節症に罹患していない個体である。治療の効果をモニターし、又はステージ特異的な変形性関節症を同定する場合、対照は、様々な程度の変形性関節症に罹患している者、及び／又は治療に応答する者のサンプルを含むことが当業者に理解されるであろう。標準サンプルには、軟骨細胞から、又は血液から、又は滑液から単離したＲＮＡと相補的なサンプルも含まれる。
【０３１３】
標的の調製
本発明において、アレイの標的は、好ましくはヒト軟骨、血液又は滑液に由来するものである。
【０３１４】
標的核酸は、１又はそれ以上の化学結合を介して、通常は相補的な塩基対合により、通常は水素結合の形成により、相補的な配列の核酸プローブ又は核酸メンバーと結合することができる。
【０３１５】
本明細書において、「ｍＲＮＡ転写産物に由来する核酸」又は「ｍＲＮＡに対応する核酸」とは、ｍＲＮＡ転写産物の合成物又はその部分配列が鋳型として最終的に機能した核酸を意味する。したがって、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ、そのｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、その増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどはすべて、ｍＲＮＡ転写産物に由来し又は対応し、そのような由来する又は対応する産物の検出は、サンプル中での元の転写産物の存在及び／又は量を示し、あるいはそれに比例するものである。したがって、適切な標的核酸サンプルには、それだけに限らないが、遺伝子又は遺伝子群のｍＲＮＡ転写産物、そのｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、遺伝子又は遺伝子群から増幅されたＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどがある。本明細書で使用する核酸標的は、好ましくはヒトの軟骨、血液又は滑液に由来する。好ましくは、その標的は、ヒトの軟骨、血液又は滑液の抽出物に由来する核酸である。核酸は、当技術分野で公知の方法、例えば逆転写酵素又はＰＣＲを用いて、ヒトの軟骨、血液又は滑液のｍＲＮＡ抽出物から合成された一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドでもよい。
【０３１６】
最も単純な実施形態では、そのような核酸標的は、軟骨、血液又は滑液サンプルから単離された総ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡに対応する核酸サンプル（例えば、ｃＤＮＡ）を含む。他の実施形態では、例えば、酸性グアニジン−フェノール−クロロホルム抽出法を用いて所与のサンプルから総ｍＲＮＡを単離し、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィーによって、又は（ｄＴ）ｎ磁性ビーズを用いることによってポリＡ＋のｍＲＮＡを単離する（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory,(1989)、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York(1987)を参照）。好ましい実施形態では、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（GIBCO/BRL, Invitrogen Life Technologies, Cat. No. 15596）を用いて総ＲＮＡを抽出する。２６０／２８０ｎｍでの吸光度、及びアガロースゲル電気泳動後の紫外光下での観察によってＲＮＡの純度及び完全性を評価する。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、例えば、滑液を使用するときに、ハイブリダイゼーションの前に標的核酸サンプルを増幅することが望ましい。どんな増幅法を用いても、定量的な結果が所望される場合、増幅した核酸の相対頻度を維持し又は調節する方法を使用することに注意しなければならないことを当業者なら理解するであろう。「定量的な」増幅の方法は、当業者に周知である。例えば、定量ＰＣＲでは、同じプライマーを用いて既知の量の対照配列を同時に増幅する。これは、ＰＣＲ反応の校正に使用することができる内部標準を提供するものである。次いで、高密度アレイは、増幅した核酸の定量用の内部標準に特異的なプローブを含んでもよい。定量ＰＣＲの詳細なプロトコールは、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y.,(1990）で提供されている。
【０３１８】
他の適切な増幅法には、それだけに限らないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Innis, et al., PCR Protocols. A Guide to Methods and Application. Academic Press, Inc. San Diego,(1990)）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Wu and Wallace, 1989, Genomics, 4:560; Landegren, et al., 1988, Science, 241:1077及びBarringer, et al., 1990, Gene, 89:117を参照）、転写増幅（Kwoh, et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173）、及び自律性配列複製（self-sustained sequence replication）（Guatelli, et al., 1990, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874）がある。
【０３１９】
特に好ましい実施形態では、逆転写酵素、並びにオリゴｄＴ及びファージＴ７プロモーターをコードする配列からなるプライマーを用いて標的核酸サンプルのｍＲＮＡを逆転写して、一本鎖のＤＮＡ鋳型を得る。ＤＮＡポリメラーゼを用いて第２のＤＮＡ鎖を重合する。二本鎖ｃＤＮＡの合成後、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを添加し、ｃＤＮＡ鋳型からＲＮＡを転写する。単一の各ｃＤＮＡ鋳型からの連続した転写の過程の結果、ＲＮＡが増幅される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の方法は、当業者に周知であり（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照）、この具体的な方法は、Van Gelder, et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1663-1667に詳細に記載され、その著者らは、この方法に従ったｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅によって種々のＲＮＡ転写産物の相対頻度が保存されることを実証している。さらに、Eberwine et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3010-3014は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写による２回の増幅を使用して元の開始物質の１０６倍を超える増幅を実現し、それによって生物学的サンプルが限られている場合でも発現モニタリングを可能にするプロトコールを提供している。
【０３２０】
標的又は核酸プローブの標識
標的又はプローブのどちらかを標識することができる。
【０３２１】
分子と結合した又はそれに組み込まれた分析上検出可能な任意のマーカーを本発明で使用することができる。分析上検出可能なマーカーとは、分析上検出され定量化される任意の分子、部分又は原子を指す。
【０３２２】
本発明での使用に適した検出可能な標識には、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段によって検出可能な任意の組成物が含まれる。本発明における有用な標識には、標識ストレプトアビジン結合体での染色用のビオチン、磁性ビーズ（例えば、ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びＥＬＩＳＡで通常使用される他の酵素）、金コロイドや、色付きのガラス又はプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズなどの比色標識がある。そのような標識の使用を教示する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、及び第４，３６６，２４１号があり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３２３】
そのような標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、写真フィルム又はシンチレーション計数器を用いて放射標識を検出することができ、放射光を検出する光検出器を用いて蛍光マーカーを検出することができる。酵素に基質を供給し、基質に対する酵素の作用によって生じる反応産物を検出することによって酵素標識を通常検出し、着色した標識を単に可視化することによって比色標識を検出する。
【０３２４】
当業者に周知である任意のいくつかの手段によって標識を組み込むことができる。しかし、好ましい実施形態では、サンプル核酸の調製において増幅ステップの間に標識を同時に組み込む。したがって、例えば、標識プライマー又は標識ヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって標識増幅産物が得られる。好ましい実施形態では、標識ヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識ＵＴＰ及び／又はＣＴＰ）を使用する上述した転写増幅によって、転写された核酸に標識が組み込まれる。
【０３２５】
あるいは、元の核酸サンプル（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡ  ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に又は増幅が終了した後の増幅産物に標識を直接付加することもできる。標識を核酸に結合する手段は当業者に周知であり、それには、例えば、核酸をリン酸化し、その後核酸リンカーを結合（連結）し、サンプル核酸を標識（例えば、蛍光体）と結合することによる（例えば標識ＲＮＡでの）ニックトランスレーション又は末端標識がある。
【０３２６】
好ましい実施形態では、蛍光修飾は、シアニン色素、例えばＣｙ−３／Ｃｙ−５  ｄＵＴＰ、Ｃｙ−３／Ｃｙ−５  ｄＣＴＰ（Amersham Pharmacia）、又はアレクサ色素（Khan,et al., 1998, Cancer Res. 58:5009-5013）によってなされる。
【０３２７】
好ましい実施形態では、比較に使用する２種の標的サンプルを、区別可能な検出シグナルを生じる異なる蛍光色素で標識し、例えば、正常軟骨から調製した標的をＣｙ５で標識し、軽度の変形性関節症の軟骨から調製した標的をＣｙ３で標識する。別々に標識された標的サンプルを、同時に同じマイクロアレイとハイブリダイズする。好ましい実施形態では、標識された標的を、当業者に公知の方法を用いて、例えばエタノール精製又はカラム精製によって精製する。
【０３２８】
好ましい実施形態では、標的はマイクロアレイ上の対照プローブとハイブリダイズして、マイクロアレイから得られるシグナルを正規化する１又はそれ以上の対照分子を含む。好ましくは、標識された正規化の標的は、上述のようにマイクロアレイ上にスポットされた対照オリゴヌクレオチドと完全に相補的な核酸配列である。ハイブリダイゼーション後に正規化の対照から得られたシグナルから、完全なハイブリダイゼーションのシグナルをアレイ間で変動させる可能性があるハイブリダイゼーション条件、標識の強度、「読み取り」の効率及び他の要因における変動についての対照が得られる。好ましい実施形態では、アレイ中の他のプローブすべてから読み取られるシグナル（例えば、蛍光強度）を、対照プローブのシグナル（例えば、蛍光強度）で割り、それによって測定値を正規化する。
【０３２９】
好ましい正規化の標的は、サンプル中に存在する他の標的の平均長を反映するように選択されるが、それは長さの範囲を包含するように選択される。（複数の）正規化の対照は、アレイ中での他のプローブの（平均の）塩基組成を反映するように選択することもできるが、好ましい実施形態では、１個又は少数の正規化プローブしか使用せず、それは、うまくハイブリダイズし（すなわち、二次構造を有さず、自己ハイブリダイズせず）、どんな標的分子とも一致しないように選択される。
【０３３０】
正規化プローブは、ハイブリダイゼーション効率の空間的な変動を調節するため、アレイ全体にわたってアレイ中の任意の位置に又は複数の位置にある。好ましい実施形態では、正規化の対照は、アレイの角又は端、並びにその中央に位置する。
【０３３１】
ハイブリダイゼーションの条件
核酸のハイブリダイゼーションでは、プローブ又は標的核酸メンバー及びその相補的な標的が、相補的な塩基対合により安定なハイブリッド二重鎖を形成することができる条件下で、変性プローブ又は標的核酸メンバー及び標的核酸を供給する。次いで、ハイブリッド二重鎖を形成しない核酸は洗浄によって除去され、通常は、結合している検出可能な標識の検出によって、残っているハイブリダイズした核酸を検出する。核酸が、核酸を含むバッファーの温度の上昇又は塩濃度の低下によって変性することが一般に認められている。低ストリンジェンシー条件（例えば、低温及び／又は高塩）下では、ハイブリッド二重鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、又はＲＮＡ：ＤＮＡ）は、アニールした配列が完全に相補的でない場合でも形成する。したがって、ハイブリダイゼーションの特異性は、低ストリンジェンシー条件で低下する。逆に、高ストリンジェンシー条件（例えば、高温又は低塩）では、ハイブリダイゼーションの成功にはミスマッチがより少ないことが必要である。
【０３３２】
本発明は、Ｄｉｇハイブリダイゼーションミックス（Boehringer）；又は、例えば上記のAusubel et al.、及び上記のSambrook et al.に記載のホルムアミドを基礎とするハイブリダイゼーション溶液を含むハイブリダイゼーション条件を提供する。
【０３３３】
ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は、当業者に周知である（例えば、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y.,(1993)を参照）。
【０３３４】
ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしなかった標識又は非標識核酸を、簡便に洗浄によって支持体表面から除去し、それによって基板表面上でハイブリダイズした標的核酸のパターンが得られる。様々な洗浄液が当業者に知られ、それを使用することができる。ハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチド及び／又は核酸の得られたハイブリダイゼーションのパターンを、試験核酸の特定の標識に基づいて選択される特定の形の検出法で様々に可視化し又は検出することができ、代表的な検出手段には、シンチレーションカウンター、オートラジオグラフィー、蛍光測定、熱量測定、発光測定などがある。
【０３３５】
画像取得及びデータ分析
ハイブリダイゼーション及び（複数の）洗浄ステップ及び／又はその後の処理の後、上述のように、得られたハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションパターンを検出し又は可視化する際に、その標識の強度又はシグナル値を検出するだけでなく定量化し、このことは、ハイブリダイゼーションの各スポットからのシグナルを測定し、既知の数の末端標識核酸が発するシグナルに対応する単位値と比較して、ハイブリダイゼーションパターンにおいて、アレイ上の特定のスポットとハイブリダイズする各末端標識標的の数又はコピー数の絶対値を得ることを意味する。
【０３３６】
アレイへのハイブリダイゼーションから収集したデータを分析する方法は、当技術分野で周知である。例えば、ハイブリダイゼーションの検出で蛍光標識を使用する場合、データ分析は、収集したデータから、基板の位置の関数として蛍光強度を決定し、外れ値、すなわち所定の統計分布から逸脱したデータを除去し、残ったデータの試験核酸の相対的な結合アフィニティを算出するステップを含んでよい。得られたデータは、結合したオリゴヌクレオチド及び／又は核酸と試験核酸の間の結合アフィニティに従って各領域での強度が様々な画像として表示される。
【０３３７】
各サンプルが異なる蛍光色素で標識されている場合、比較する２つの軟骨サンプルの同時分析に下記の検出プロトコールを使用する。
【０３３８】
マイクロアレイの各エレメントを第１の蛍光色で走査する。各アレイのエレメントでの蛍光の強度は、サンプル中のその遺伝子の発現レベルに比例する。
【０３３９】
走査の操作を第２の蛍光標識について反復する。２つの蛍光強度の比から、２つの組織サンプル中の相対遺伝子発現レベルの非常に正確な定量的測定値が得られる。
【０３４０】
好ましい実施形態では、レーザー励起供給源、並びにＣｙ３及びＣｙ５蛍光体に適した干渉フィルターを備えた特注の共焦点顕微鏡で得られた画像から、固定化した標的核酸配列の蛍光強度を決定した。各蛍光体について、１画素当たり解像度２２５μｍ２、６５，５３６階調で別々の走査画像を得た。ハイブリダイゼーションの領域を特定する画像の区分化、２蛍光体の画像間での強度の正規化、各標的での正規化した平均蛍光値の算出は、記載されている通りである（Khan, et al., 1998, Cancer Res. 58:5009-5013、Chen, et al., 1997, Biomed. Optics 2:364-374）。画像間の正規化を使用して、２種の異なる蛍光体で標識し検出する際の異なる効率を調整する。これは、アレイ上にスポットした一連の内部標準遺伝子の一シグナル強度比の値を平衡化することによって実現される。
【０３４１】
他の好ましい実施形態では、Ｃｙ３及びＣｙ５チャネルでアレイを走査し、別々の１６ビットのＴＩＦＦ画像として保存する。アレイ上の各スポットからのハイブリダイゼーション強度データを捕捉するグリッド化のプロセスを含むソフトウェアを用いて画像を取り込み、分析する。各スポットの蛍光強度及びバックグラウンドを差し引いたハイブリダイゼーション強度を収集し、Ｃｙ３に対するＣｙ５の測定された平均強度の比を算出する。線形回帰の手法を正規化に使用し、Ｃｙ３に対するＣｙ５の測定された強度の散布図の傾きが１であると推定する。その比の平均を算出し、それを使用してデータを再設計し、傾きを１に調整する。１と等しくない発現比を、示差的な遺伝子発現を示すものとして使用する。
【０３４２】
特に好ましい実施形態では、サンプル中の１又はそれ以上の核酸配列の転写レベル（及びそれによる発現）を定量することが所望される場合、標的核酸サンプルは、その遺伝子又は遺伝子群の（複数の）ｍＲＮＡ転写産物の濃度、又はその（複数の）ｍＲＮＡ転写産物に由来する核酸の濃度がその遺伝子の転写レベル（及びそれによる発現レベル）に比例するものである。同様に、ハイブリダイゼーションシグナル強度がハイブリダイズした核酸の量に比例することが好ましい。その比例が相対的に厳密である（例えば、転写の割合が倍加すると、サンプルの核酸プール中のｍＲＮＡ転写産物が倍化し、ハイブリダイゼーションシグナルが倍加する）ことが好ましいが、その比例はより緩和したものでもよく、非線形でも依然として意味のある結果が得られることを当業者なら理解するであろう。したがって、例えば、標的ｍＲＮＡの濃度が５倍異なるとハイブリダイゼーション強度が３〜６倍異なるアッセイは、ほとんどの目的で十分である。より正確な定量化を必要とする場合、適当な対照を実行して、本明細書に記載のサンプルの調製及びハイブリダイゼーションで導入された変動を訂正する。さらに、「標準の」標的ｍＲＮＡの連続した希釈系列を使用して、当業者に周知の方法に従って校正曲線を作成する。もちろん、転写産物の有無の単なる検出が所望される場合、綿密な対照又は校正は不要である。
【０３４３】
例えば、アレイ上の核酸メンバーがハイブリダイゼーション後に標識されていない場合、このことから、その核酸メンバーを含む遺伝子がどちらのサンプル中にも発現していないことが示唆される。核酸メンバーが単一色で標識されている場合、標識された遺伝子が片方のサンプルでのみ発現していることが示される。アレイを含む核酸メンバーがどちらの色でも標識されていることから、その遺伝子がどちらのサンプル中にも発現していることが示唆される。１細胞当たり１回発現した遺伝子も検出する（１／１００，０００の感度）。比較する２つのサンプルにおける発現強度の差から、示差的な発現が示唆され、２つのサンプル間での強度の比が１．０と等しくなく、好ましくは０．７未満であり又は１．２を超え、より好ましくは０．５未満であり又は１．５を超える。
【０３４４】
ＲＴ−ＰＣＲ
本発明の態様では、逆転写（ＲＴ）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせて用いて、サンプルからバイオマーカーのＲＮＡ産物を増幅することによって本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の発現レベルを測定することができる。本明細書の一実施形態によれば、当業者に理解されているようにＲＴは定量的である可能性がある。
【０３４５】
サンプルの総ＲＮＡ、又はｍＲＮＡを鋳型として使用し、本発明のバイオマーカーの転写された部分に特異的なプライマーを使用して、逆転写を開始する。ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにする方法は周知であり、上記のSambrook et al., 1989に記載されている。市販されているソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  １．０，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｗａｒｅなど）を利用して、プライマーの設計を行うことができる。逆転写の産物を、引き続いてＰＣＲの鋳型として使用する。
【０３４６】
ＰＣＲは、耐熱性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって媒介される複数サイクルのＤＮＡ複製を用いて、対象とする標的配列を増幅することにより、特定の核酸配列を迅速に増幅する方法を提供するものである。ＰＣＲは、増幅する核酸、増幅する配列に隣接する２種の一本鎖ヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、バッファー及び塩の存在を必要とする。
【０３４７】
ＰＣＲの方法は、当技術分野で周知である。ＰＣＲは、Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155: 335に記載のように行われ、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。鋳型ＤＮＡ（少なくとも１ｆｇ、より一般には１〜１０００ｎｇ）、及び少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行う。典型的な反応混合物は、ＤＮＡ２μｌ、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、１０Ｈ  ＰＣＲバッファー１（Perkin-Elmer,Foster City,CA）２．５μｌ、１．２５μＭ ｄＮＴＰｓ  ０．４μｌ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer,Foster City,CA）０．１５μｌ（又は２．５単位）、及び全量２５μｌにする脱イオン水を含む。ミネラルオイルを重層し、プログラム設定可能なサーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行う。
【０３４８】
ＰＣＲサイクルの各ステップの長さ及び温度、並びにサイクル数を、実際上のストリンジェンシー要件に従って調整する。プライマーが鋳型とアニールすると予想される効率と、許容されるミスマッチの程度の両方によって、アニーリング温度及びタイミングを決定する。プライマーのアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化する能力は、十分に当業者の知識の範囲内である。３０℃〜７２℃の間のアニーリング温度を用いる。鋳型分子の最初の変性は、通常９２℃〜９９℃の間で４分間行い、その後、変性（９４〜９９℃で１５秒〜１分間）、アニーリング（上記で論じたように決定した温度で１〜２分間）、及び伸長（７２℃で１分間）からなる２０〜４０サイクルを行う。一般に最後の伸長ステップを７２℃で４分間実施し、その後に４℃の無制限の（０〜２４時間）ステップを行ってもよい。
【０３４９】
実際上定量的なＱＲＴ−ＰＣＲを行って、遺伝子発現レベルの定量的な測定値を得ることもできる。ＱＲＴ−ＰＣＲでは、２ステップで逆転写及びＰＣＲを行うこともでき、あるいは逆転写をＰＣＲと組み合わせて同時に行うこともできる。Ｔａｑｍａｎ（Perkin Elmer, Foster City, CA）などのキットが市販されているこれらの技術の１つを、転写産物特異的なアンチセンスプローブを用いて実施する。このプローブは、ＰＣＲ産物（例えば、遺伝子に由来する核酸の断片）に特異的であり、クエンチャー及び蛍光レポータープローブをオリゴヌクレオチドの５’末端に複合体化して調製する。異なる蛍光マーカーを異なるレポーターと結合させ、１反応で２種の産物の測定を可能にする。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが活性化したとき、それは、その５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性により、鋳型と結合したプローブの蛍光レポーターを切断する。クエンチャーの不在下では、レポーターはそのとき蛍光を発する。レポーターの色の変化は、それぞれの特異的な産物の量に比例し、蛍光測定器によってそれを測定し、したがって、各色の量を測定しＰＣＲ産物を定量化する。多数の個体に由来するサンプルが同時に処理され測定されるように９６ウエルプレート中でＰＣＲ反応を行う。Ｔａｑｍａｎシステムは、ゲル電気泳動を必要としないというさらなる利点を有し、標準曲線とともに使用したとき定量化が可能となる。
【０３５０】
それ以外でＰＣＲ産物を定量的に検出するのに有用な第２の技術は、市販されているＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ（Qiagen, Valencia California）などの挿入色素を使用することである。ＰＣＲ段階の間にＰＣＲ産物に組み込まれ、ＰＣＲ産物の量に比例して蛍光を発する蛍光標識としてＳＹＢＲグリーンを用いてＲＴ−ＰＣＲを行う。
【０３５１】
ＴａｑｍａｎシステムもＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲシステムも、ＲＮＡの逆転写の後で使用することができる。逆転写は、ＰＣＲのステップと同じ反応混合物中で行うこともでき（１ステッププロトコール）、あるいはＰＣＲを利用する増幅の前に最初に行うこともできる（２ステッププロトコール）。
【０３５２】
さらに、蛍光分子及びクエンチャーを有するプローブを使用するモレキュラー・ビーコン（登録商標）を含めた、ｍＲＮＡ発現産物を定量的に測定する他のシステムが知られ、そのプローブはヘアピン構造を形成することができ、その結果ヘアピン形態中にあるとき蛍光分子が失活し、ハイブリダイズしたとき蛍光が増大し遺伝子発現の定量的な測定値が得られる。
【０３５３】
ＲＮＡ発現を定量的に測定するさらなる技術には、それだけに限らないが、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、Ｑβレプリカーゼ（例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号を参照）、等温増幅法（例えば、Walker et al.(1992)PNAS 89:382-396を参照）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、修復鎖反応（repair chain reaction）、非対称定量ＰＣＲ（例えば、米国公開第ＵＳ２００３３０１３４３０７Ａ１号を参照）、及びFuja et al., 2004, Journal of Biotechnology 108:193-205に記載されているマルチプレックス微粒子ビーズアッセイ（multiplex microsphere bead assay）がある。
【０３５４】
核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）及び３ＳＲを含めた、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）を使用して、サンプルからＲＮＡを増幅することによって遺伝子発現のレベルを測定することができる。例えば、Kwoh et al(1989)PNAS USA 86:1173、国際公開ＷＯ８８／１０３１５号、及び米国特許第６，３２９，１７９号を参照されたい。ＮＡＳＢＡでは、従来のフェノール／クロロホルム抽出、熱変性、ＤＮＡ及びＲＮＡの単離用の溶解バッファー及びミニスピンカラムでの処理、又はＲＮＡの塩化グアニジン抽出を用いて、増幅用の核酸を調製することができる。これらの増幅技術では、標的特異的な配列を有するプライマーをアニールさせる。重合の後、二本鎖ＤＮＡ分子を再度熱変性させる間、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨで消化する。第２の標的特異的なプライマーを添加し、その後重合を行うことによって、どちらの場合でも、一本鎖ＤＮＡを完全に二本鎖にする。次いで、二本鎖ＤＮＡ分子を、Ｔ７やＳＰ６などのポリメラーゼによって多重に転写する。等温サイクル反応では、ＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに逆転写し、Ｔ７やＳＰ６などのポリメラーゼによって一度転写する。得られた産物は、切断されたものであれ完全なものであれ、標的特異的な配列を示す。
【０３５５】
いくつかの技術を使用して、増幅産物を分離することができる。例えば、従来の方法を用いて、アガロース、アガロース−アクリルアミド、又はポリアクリルアミドのゲル電気泳動によって増幅産物を分離することができる。Sambrook et al., 1989を参照されたい。電気泳動を行わずに定量的にＰＣＲ産物を検出するいくつかの技術を、本発明に従って使用することもできる（例えば、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y.,(1990)を参照）。例えば、クロマトグラフィー技術を使用して分離を実施することもできる。本発明で使用することができる多種類のクロマトグラフィー：吸着、分配、イオン交換及び分子篩、ＨＰＬＣ、並びにカラム、紙、薄層及びガスクロマトグラフィーを含めたそれらを使用するための多数の特化した技術がある（Freifelder, Physical Biochemistry Applications to Biochemistry and Molecular Biology, 2nd ed., Wm. Freeman and Co., New York, N.Y., 1982）。
【０３５６】
ＰＣＲ反応で使用するオリゴヌクレオチドプライマーを、種々の型の小分子リガンドで共有結合により標識することによって、他の例の分離方法を行う。そのような分離の１つでは、様々なリガンドが各オリゴヌクレオチド上に存在する。リガンドの１つと特異的に結合する分子、おそらく抗体、又はリガンドがビオチンの場合はアビジンを使用して、９６ウエルＥＬＩＳＡプレートなどのプレートの表面を被覆する。ＰＣＲ反応物をそのような調製プレートの表面に加えると、ＰＣＲ産物がその表面に特異的に結合する。プレートを洗浄して結合しなかった試薬を除去した後、第１のリガンドと結合する第２の分子を含む溶液を添加する。この第２の分子は、いくつかの種類のレポーター系と連結されている。第２の分子は、ＰＣＲ産物が生成している場合プレートとのみ結合し、それによってどちらのオリゴヌクレオチドプライマーも最終ＰＣＲ産物に組み込まれる。次いで、ＥＬＩＳＡ反応を検出し定量するのと同じように、市販のプレートリーダーでＰＣＲ産物の量を検出し定量する。本明細書に記載のものなどのＥＬＩＳＡに類似した系が、Ｃ−Ｔｒａｃｋという商号でＲａｇｇｉｏ  Ｉｔａｌｇｅｎｅ社によって開発されている。
【０３５７】
対象とする核酸配列の増幅であるかどうか確認するために、増幅産物を可視化しなければならない。典型的な可視化の方法の１つでは、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ光下で可視化する。あるいは、増幅産物が放射又は蛍光標識ヌクレオチドで一体的に標識されている場合、分離後に増幅産物をｘ線フィルムに露光し、又は適当な刺激スペクトルの下で可視化することができる。
【０３５８】
一実施形態では、可視化は間接的に行われる。増幅産物の分離後、標識核酸プローブを、対象とする増幅核酸配列と接触させる。プローブは、好ましくは発色団と結合しているが、放射標識することもできる。他の実施形態では、プローブは、抗体やビオチンなどの結合相手と結合し、その結合対の他のメンバーが検出可能な部分を有する。
【０３５９】
他の実施形態では、検出は、サザンブロット法及び標識プローブを用いたハイブリダイゼーションによって行う。サザンブロット法に関する技術は、当業者に周知であり、分子プロトコールに関する多数の標準的な書物に認めることができる。上記のSambrook et al., 1989を参照されたい。簡単に説明すると、増幅産物をゲル電気泳動で分離する。次いで、ゲルをニトロセルロースなどの膜と接触させて、核酸の移動及び非共有結合を行わせる。その後、標的増幅産物とハイブリダイズすることができる発色団結合プローブとともに膜をインキュベートする。検出は、ｘ線フィルムへの膜の露光又はイオン放射検出装置によって行う。
【０３６０】
上記の一例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２７９，７２１号に記載され、この文献は、自動化した電気泳動及び核酸の移動についての装置及び方法を開示している。その装置は、ゲルの外部操作を行わずに電気泳動及びブロットを可能にし、理想的には本発明に従った方法の実施に適している。
【０３６１】
ヌクレアーゼ保護アッセイ
本発明の他の実施形態では、ヌクレアーゼ保護アッセイ（リボヌクレアーゼ保護アッセイとＳ１ヌクレアーゼアッセイの両方を含む）を使用して、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物を検出し定量することができる。ヌクレアーゼ保護アッセイでは、アンチセンスプローブ（例えば、放射標識又は非同位体で標識されている）を、溶液中でＲＮＡサンプルとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、一本鎖である、ハイブリダイズしなかったプローブ及びＲＮＡをヌクレアーゼにより分解する。アクリルアミドゲルを使用して、残っている保護された断片を分離する。通常、溶液でのハイブリダイゼーションは、膜に基づくハイブリダイゼーションより効率がよく、ブロットでのハイブリダイゼーションが最大でサンプルＲＮＡ２０〜３０μｇであるのと比べて、それは最大でサンプルＲＮＡ１００μｇまで適応できる。
【０３６２】
リボヌクレアーゼ保護アッセイは、最も一般的なタイプのヌクレアーゼ保護アッセイであり、ＲＮＡプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチド及び他の一本鎖ＤＮＡプローブのみを、Ｓ１ヌクレアーゼを含むアッセイに使用することができる。一本鎖のアンチセンスプローブは通常、ヌクレアーゼによる、プローブと標的のハイブリッドの切断を防止するために、標的ＲＮＡと完全に相同でなければならない。
【０３６３】
ノーザンブロット
当業者に知られている従来のノーザンハイブリダイゼーション技術に従って、標準的なノーザンブロットアッセイを使用して、ＲＮＡ転写産物のサイズを確認し、選択的スプライシングによるＲＮＡ転写産物、及び本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の相対量を同定することもできる。ノーザンブロットでは、変性条件下のアガロースゲルでの電気泳動により、ＲＮＡサンプルをサイズで最初に分離する。次いで、ＲＮＡを膜に移し、架橋し、標識プローブとハイブリダイズさせる。ランダムプライム法、ニックトランスレーション法又はＰＣＲにより得られるＤＮＡプローブ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡプローブ、及びオリゴヌクレオチドを含めて、非同位体の又は高比活性放射標識プローブを使用することができる。さらに、部分的な相同性しか有さない配列（例えば、異なる種由来のｃＤＮＡ、又はエキソンを含む可能性があるゲノムＤＮＡ断片）をプローブとして使用することができる。標識プローブ、例えば、完全長の一本鎖ＤＮＡ又はそのＤＮＡ配列の断片を含む放射標識ｃＤＮＡは、長さが少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、又は少なくとも１００個の連続したヌクレオチドでもよい。当業者に知られている多数の様々な方法のいずれかによって、プローブを標識することができる。これらの研究で最も一般に使用される標識は、放射性元素、酵素、紫外光にさらしたとき蛍光を発する化学物質他である。いくつかの蛍光物質が知られ、それを標識として利用することができる。これには、それだけに限らないが、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー、及びルシファーイエローがある。特定の検出物質は、ヤギで作製され、イソチオシアネートを介してフルオレセインと結合した抗ウサギ抗体である。放射性元素で又は酵素でタンパク質を標識することもできる。現在利用されている計数の手順のいずれかによって放射活性標識を検出することができる。同位体の非限定的な例には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、及び１８６Ｒｅがある。酵素標識も同様に有用であり、現在利用されている比色定量、分光光度測定、蛍光分光光度測定、電流測定又は気体定量の技術のいずれかによって検出することができる。カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子との反応によって、選択した粒子と酵素を結合する。当業者に知られているどんな酵素も利用することができる。そのような酵素の例には、それだけに限らないが、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、及びアルカリホスファターゼがある。米国特許第３，６５４，０９０号、第３，８５０，７５２号、及び第４，０１６，０４３号は、一例として、代替の標識物質及び方法の開示について言及している。
【０３６４】
５．１８  本発明のバイオマーカーのタンパク質産物を測定する技術
タンパク質産物
標準的な技術を利用して、サンプル中に存在する対象のタンパク質又はタンパク質群の量を決定することもできる。例えばウェスタンブロット、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、免疫細胞化学分析などの例えばイムノアッセイを用いて、例えば標準的な技術を使用してサンプル中に存在する対象のタンパク質又はタンパク質群の量を決定することができる。対象とするタンパク質の検出に好ましい作用物質は、対象とするタンパク質と結合することができる抗体であり、好ましくは、検出可能な標識の付いた抗体である。
【０３６５】
そのような検出の方法では、当業者に周知の技術を用いて、分析するサンプルのタンパク質を容易に単離することができる。タンパク質の単離の方法は、例えば、Harlow及びLane（Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1988)）に記載のものなどでよい。
【０３６６】
対象とするタンパク質又はタンパク質群の検出に好ましい方法では、タンパク質特異的抗体との相互作用を介してそれを検出する。例えば、本明細書に記載のように、対象とするタンパク質に対する抗体を利用することができる。当業者に周知の標準的な技術を利用して、抗体を生成することができる。例えば、本願のセクション５．５．１、及びそのような抗体生成技術についてより詳細に論じている、参照により本明細書に組み込まれる米国公開第２００４００１８２００号のセクション５．２を参照されたい。簡単に説明すると、そのような抗体は、ポリクローナルでもよく、あるいは、より好ましくはモノクローナルでもよい。抗体そのもの、又は抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２）を、例えば使用することができる。好ましくは、抗体はヒト又はヒト化抗体である。
【０３６７】
例えば、対象とするタンパク質に特異的な抗体、又は抗体の断片を使用して、そのタンパク質の存在を定量的に又は定性的に検出することができる。これは、例えば、免疫蛍光技術によって実現することができる。さらに、免疫蛍光法や免疫電子顕微鏡法などで抗体（又はそのフラグメント）を組織に使用して、対象とするタンパク質をｉｎ  ｓｉｔｕで検出することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕでの検出は、患者から組織標本（例えば、生検標本）を取り出し、タンパク質に対する標識抗体をそれに加えることによって実現することができる。好ましくは、生物学的サンプル上に標識抗体（又はフラグメント）を重層することによって抗体（又はフラグメント）を加える。そのような手順の使用により、サンプル内での対象とするタンパク質の存在だけでなく、その分布、細胞（例えば、軟骨細胞及びリンパ球）中でのその存在をも決定することができる。そのようなｉｎ  ｓｉｔｕでの検出を行うために、多種多様な周知の組織学的方法（染色手順など）を利用することができる。
【０３６８】
対象とするタンパク質のイムノアッセイは、生物学的サンプルを、対象とするタンパク質を同定することができる検出可能な標識抗体とともにインキュベートするステップと、当技術分野で周知のいくつかの技術のいずれかにより、結合した抗体を検出するステップとを含む。下記でより詳細に記載するように、「標識された」という用語は、例えば、抗体に対する検出可能な物質の結合（すなわち物理的な連結）による抗体の直接的な標識を指す可能性があり、直接的に標識した他の試薬との反応による抗体の間接的な標識を指す可能性もある。間接的な標識の例には、蛍光標識した二次抗体を使用する一次抗体の検出がある。
【０３６９】
例えば、生物学的サンプルをニトロセルロースなどの固相支持体又は担体、あるいは細胞、細胞粒子又は可溶性タンパク質を固定化することができる他の固相支持体に接触させ、それに固定化することができる。次いで、適切なバッファーでその支持体を洗浄し、その後検出可能な標識の付いたフィンガープリント遺伝子特異的な抗体で処理することができる。次いで、固相支持体をバッファーで２回洗浄して、結合しなかった抗体を除去することができる。次いで、固相支持体上の結合した標識の量を従来の手段によって検出することができる。
【０３７０】
タンパク質性の作用物質において「固相支持体又は担体」は、抗原又は抗体と結合することができる任意の支持体を意図している。周知の支持体又は担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、及び磁鉄鉱がある。担体の性質は、本発明の目的ではある程度可溶性でもよく、あるいは不溶性でもよい。支持体の材料は、結合分子が抗原又は抗体と結合することができる限り、事実上考えられるどんな構造的形態をとることもできる。したがって、支持体の形態は、ビーズのような球状でもよく、あるいは、試験管の内部表面、又は棒の外部表面のような円筒形でもよい。あるいは、表面は、シートや試験ストリップなど水平でもよい。好ましい支持体にはポリスチレンビーズがある。当業者であれば、抗体又は抗原の結合に適した多数の他の担体は周知であり、あるいは日常的な実験を用いることによって同じことを確認することができるであろう。
【０３７１】
検出可能な標識を特定の抗体に付けることができる方法の１つは、酵素に同じものを連結することによるものであり、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）で使用する（Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2:1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD); Voller, A. et al., 1978, J. Clin. Pathol. 31:507-520; Butler, J.E., 1981, Meth. Enzymol. 73:482-523; Maggio, E.(編), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL; Ishikawa, E. et al.,(編), 1981, Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo）。抗体と結合した酵素は、例えば、分光光度測定、蛍光測定又は視覚的な手段によって検出することができる化学的部分が生じるような形で、適当な基質と、好ましくは発色基質と反応する。検出可能な標識を抗体に付けるのに使用することができる酵素には、それだけに限らないが、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼがある。検出は、酵素の発色基質を使用する比色定量の方法によって実現することができる。検出はまた、同様に調製した標準サンプルと比較した、基質の酵素反応の程度の視覚的な比較によって実現することもできる。
【０３７２】
検出はまた、他の様々なイムノアッセイのいずれかを用いて実現することもできる。例えば、抗体又は抗体フラグメントを放射標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用により対象とするタンパク質を検出することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるWeintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照）。γカウンター又はシンチレーションカウンターの使用などの手段、あるいはオートラジオグラフィーによって、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈ）を検出することができる。
【０３７３】
抗体を蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識した抗体を適当な波長の光にさらしたとき、その存在を蛍光により検出することができる。最も一般に使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド（phthaldehyde）及びフルオレスカミンである。
【０３７４】
１５２Ｅｕやランタニド系の他のものなど蛍光放射金属を用いて、検出可能な標識を抗体に付けることもできる。ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート群を用いて、これらの金属を抗体に結合することができる。
【０３７５】
抗体を化学発光化合物と結合することによって、検出可能な標識を抗体に付けることもできる。次いで、化学反応の経過中に生じる発光の存在を検出することによって、化学発光タグの付いた抗体が存在することを決定する。特に有用な化学発光標識化合物は、ルミノール、イソルミノール、セロマチック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジウム塩、及びシュウ酸エステルである。
【０３７６】
同様に、生物発光化合物を使用して、本発明の抗体を標識することができる。生物発光は、生物系でみられる化学発光の一種であり、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める。発光の存在の検出によって、生物発光タンパク質が存在することを決定する。標識の目的で重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。
【０３７７】
タンパク質アレイ
本発明のバイオマーカーのタンパク質産物と特異的に及び／又は選択的に結合するポリペプチドを、タンパク質アレイ上に固定化することができる。タンパク質アレイを診断の道具として使用して、例えば、本発明のバイオマーカーのポリペプチドタンパク質産物が存在するかどうか、医学的なサンプル（単離細胞、血液、滑液、血清、生検材料など）をスクリーニングすることができる。タンパク質アレイはまた、例えば本発明のバイオマーカーによってコードされるポリペプチドと結合する、抗体並びに他のリガンドをも含む可能性がある。
【０３７８】
ポリペプチドアレイを作製する方法は、例えば、De Wildt et al., 2000, Nature Biotech. 18:989-994; Lueking et al., 1999, Anal. Biochem. 270:103-111; Ge, 2000, Nuc. Acids Res. 28:e3 ; MacBeath and Schreiber, 2000, Science 289:1760-1763；国際公開ＷＯ０１／４０８０３及びＷＯ９９／５１７７３Ａ１；並びに米国特許第６，４０６，９２１号に記載されている。例えば、Genetic MicroSystems及びAffymetrix（Santa Clara, California, USA）又はBioRobotics（Cambridge, UK）から市販されているロボット装置を用いて、アレイ用のポリペプチドを高速でスポットすることができる。アレイの基板は、例えば、ニトロセルロース、プラスチック、例えば表面修飾ガラスなどのガラスでもよい。アレイはまた、多孔性基板、例えばアクリルアミド、アガロース、又は他のポリマーを含んでもよい。
【０３７９】
例えば、アレイは、例えば上記のＤｅ  Ｗｉｌｄｔに記載されている抗体のアレイでもよい。ポリペプチドリガンドを産生する細胞を、アレイの形式で、フィルター上で増殖させる。ポリペプチドの産生を誘導し、発現した抗体を細胞の場所でフィルターに固定化する。アレイの各場所での結合の程度についての情報を、例えばコンピュータのデータベース中に蓄積することができる。
【０３８０】
一実施形態では、アレイは、本発明のバイオマーカーの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、全種、又は任意の組み合わせのタンパク質産物のアレイである。一態様では、本発明は、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物と選択的に結合する、アレイと結合した抗体を提供する。
【０３８１】
５．１９  タンパク質作製
標準的な組換え核酸の方法を使用して、本発明のポリペプチド又は抗体（例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物）を発現させることができる。一般に、ポリペプチドをコードする核酸配列を核酸発現ベクター中にクローン化する。もちろん、タンパク質が複数のポリペプチド鎖を含む場合、発現ベクター中に、例えば同じ又は異なる細胞中で発現する同じ又は異なるベクター中に各鎖をクローン化しなければならない。タンパク質が十分に小さい、すなわちタンパク質が５０アミノ酸未満のペプチドである場合、自動化された有機合成の方法を用いてタンパク質を合成することができる。本発明のバイオマーカーの５’領域、３’領域又は内部コード領域を含むポリペプチドを、本発明のバイオマーカーの５’領域、３’領域又は内部コード領域に対応するヌクレオチド配列しか含まない核酸発現ベクターから発現させる。本発明のバイオマーカーのタンパク質産物、あるいは本発明のバイオマーカーの５’領域、３’領域又は内部コード領域によってコードされるポリペプチドに対する抗体を産生する方法を提供する。
【０３８２】
ポリペプチドを発現する発現ベクターは、ポリペプチド又はその断片をコードするセグメントに加えて、例えば、対象とする（複数の）核酸と機能的に連結したプロモーターを含めて、調節配列を含んでよい。多数の適切なベクター及びプロモーターが当業者に知られ、本発明の組換え構築物を生成するのに商業的に入手可能である。一例として、下記のベクターが提供されている。細菌性：ｐＢｓ、ファージスクリプト（ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓ  ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Stratagene, La Jolla, California, USA）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Pharmacia, Uppsala, Sweden）。真核生物性：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＴＩ、ｐＳＧ（Stratagene）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Pharmacia）。好ましい種類の好ましいライブラリーの１つは、下記に記載するディスプレイライブラリーである。
【０３８３】
当業者に周知の方法を使用して、本発明のポリペプチド、及び適当な転写／翻訳制御シグナルを含むベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ  ｖｉｖｏ組換え／遺伝的組換えがある。例えば、Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(2001)、及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.(1989)に記載されている技術を参照されたい。ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター、又は選択マーカーの付いた他のベクターを用いて、任意の所望の遺伝子からプロモーター領域を選択することができる。適当な２つのベクターがｐＫＫ２３２−８及びｐＣＭ７である。特定の名前の付いた細菌性プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰ、及びｔｒｃがある。真核生物性プロモーターには、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来ＬＴＲ、マウスメタロチオネイン−Ｉ、及び当技術分野で知られている様々な組織特異的プロモーターがある。特定の実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。さらに他の実施形態では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。
【０３８４】
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点、宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のアンピシリン耐性遺伝子及び出芽酵母（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＴＲＰｌ遺伝子など）、並びに下流の構造遺伝子の転写を誘導する、高度に発現される遺伝子に由来するプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、特に、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの糖分解酵素、α因子（ａ−ｆａｃｔｏｒ）、酸性ホスファターゼ、又は熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来するものでもよい。翻訳開始及び終結配列を付けて、好ましくは細胞周辺腔又は細胞外媒質への翻訳されたタンパク質の分泌を誘導することができるリーダー配列を付けて、適当な相で本発明のポリヌクレオチドを構築する。場合によっては、本発明の核酸は、例えば、発現した組換え産物の安定化又は精製の単純化など所望の特性を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードする可能性がある。本発明のポリヌクレオチドを適切な翻訳開始及び終結シグナルと一緒に、場合によっては操作可能な読み取り相で機能的なプロモーターとともに挿入することによって、有用な細菌発現ベクターを構築する。ベクターは、１又はそれ以上の表現型選択マーカー、及びベクターを確実に維持し、望ましい場合には宿主内での複製をもたらす複製起点を含む。形質転換に適した原核生物宿主には、大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、並びにシュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、及びスタフィロコッカス（Staphylococcus）属内の様々な種があるが、選択上他のものを使用することもできる。
【０３８５】
代表的であるが非限定的な例として、有用な細菌発現ベクターは、周知のクローン化ベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカー及び細菌性複製起点を含んでよい。そのような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）及びｐＧＥＭ１（Promega, Madison, Wisconsin, USA）がある。
【０３８６】
本発明は、本発明のポリペプチドを含むように遺伝子工学で作製された宿主細胞を提供する。例えば、そのような宿主細胞は、既知の形質転換、トランスフェクション又は感染の方法を用いて宿主細胞に導入された本発明の核酸を含んでよい。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子工学で作製された宿主細胞も提供し、そのようなポリヌクレオチドは、細胞内でポリヌクレオチドの発現を駆動する、宿主と異種の調節配列と機能的に結合している。
【０３８７】
本発明はさらに、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供し、核酸は、既知の形質転換、トランスフェクション又は感染の方法を用いて宿主細胞に導入される。宿主細胞は、哺乳動物細胞や、酵母細胞などの下等真核生物宿主細胞など真核生物宿主細胞でもよく、あるいは、宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞でもよい。例えば、カルシウムリン酸トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、又はエレクトロポレーションによって宿主細胞への組換え構築物の導入を実施することができる（Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology(1986)）。無細胞翻訳系を使用して、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてそのようなタンパク質を生成することもできる。
【０３８８】
任意の宿主／ベクター系を使用して、表２に挙げた１又はそれ以上の遺伝子又はスプライス変異体を発現させることができる。原核生物及び真核生物の宿主に使用するのに適したクローン化及び発現ベクターは、Sambrook et al.により、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, New York(1989)に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。最も好ましい宿主細胞は、特定のポリペプチドを天然に発現せず、あるいはそのポリペプチドを発現する天然のレベルが低いものである。
【０３８９】
特定の実施形態では、誘導性調節エレメントの制御下で本発明のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子を発現するように宿主細胞を工学的に作製し、その場合、内因性遺伝子の調節配列を相同組換えによって置換することができる。本明細書に記載するように、標的遺伝子導入を使用して、遺伝子の有する既存の制御領域を、異なる遺伝子から単離した調節配列、又は遺伝子工学の方法によって合成した新規の調節配列と置換することができる。そのような調節配列は、プロモーター、エンハンサー、骨格結合領域、負の調節エレメント、転写開始部位、制御タンパク質結合部位、又は前記配列の組み合わせからなるものでよい。あるいは、タンパク質の輸送又は分泌特性を促進又は改変するポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡ安定成分、スプライス部位、リーダー配列、あるいはタンパク質又はＲＮＡ分子の機能又は安定性を変化させ又は向上させる他の配列を含めて、生成したＲＮＡ又はタンパク質の構造又は安定性に影響を及ぼす配列を、ターゲティングにより置換し、除去し、付加し、又は他の形で改変することができる。
【０３９０】
本発明の宿主はまた、酵母又は他の菌類でもよい。酵母では、構成的な又は誘導性のプロモーターを含むいくつかのベクターを使用することができる。総説には、Ausubel et al.(eds), Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13(1988); Grant et al., 1987, "Expression and Secretion Vectors for Yeast", Methods Enzymol. 153:516-544; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3(1986); Bitter, 1987, "Heterologous Gene Expression in Yeast", Methods Enzymol. 152:673-684; 及びStrathern et al.(eds), The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II(1982)を参照されたい。
【０３９１】
潜在的に適切な酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）株、カンジダ（Candida）、又は異種タンパク質を発現することができる任意の酵母株がある。潜在的に適切な細菌株には、大腸菌（Escherichia coli）、霊菌（Serratia marescans）などの腸内細菌（enterobacteriaceae）、枯草菌などの桿菌、ネズミチフス菌、シュードモナス、又は異種タンパク質を発現することができる任意の細菌株がある。タンパク質が酵母又は細菌中で生成される場合、機能的なタンパク質を得るために、例えば、適当な部位のリン酸化又は糖鎖付加により、その中で生成したタンパク質を修飾することが必要である可能性がある。既知の化学的又は酵素的方法によって、そのような共有結合を実施することができる。
【０３９２】
様々な哺乳動物細胞培養系を使用して、組換えタンパク質を発現させることもできる。哺乳動物発現系の例には、Gluzman, 1981, Cell 23:175(1981)に記載されているサル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７系統などのサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、正常二倍体細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ初代組織培養物に由来する細胞株、初代移植片、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、Ｃ１２７、３Ｔ３、又はＪｕｒｋａｔ細胞、及び適合性ベクターを発現することができる他の細胞系がある。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター、また任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与及び受容部位、転写終結配列、及び５’フランキング非転写配列を含む。
【０３９３】
タンパク質の発現で使用される微生物細胞は、凍結融解の反復、超音波破砕、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含めて、任意の従来の方法によって破壊することができる。細菌培養物中で生成される組換えポリペプチドは、細胞ペレットから最初に抽出し、その後、１回又は複数回の塩析、水性イオン交換クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーのステップを行うことによって通常単離される。いくつかの実施形態では、鋳型核酸はまた、ポリペプチドタグ、例えばペンタヒスチジン又はヘキサヒスチジンをもコードする。
【０３９４】
当技術分野で周知の技術を用いて組換えタンパク質を単離することができる。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York(1994)）は、組換え（及び非組換え）タンパク質を精製するいくつかの一般的な方法を提供している。その方法には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、選択的沈殿、透析、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーがある。
【０３９５】
本明細書に記載したものの変更、改変及び他の実施が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、当業者なら思い浮かぶであろう。
【０３９６】
本明細書に記載の本発明をより完全に理解することができるように、下記の実施例を示す。本実施例が例示的な目的のみのものであり、どんな形にでも本発明を限定するものと解釈されるべきでないことが理解されるはずである。
【０３９７】
５．２０  変形性関節症又はその症状の予防、治療、管理又は改善に使用する化合物を同定する方法
５．２０．１  バイオマーカーの発現又は活性をモジュレートする化合物を同定する方法
本発明は、本発明のバイオマーカーの産物と結合する化合物を同定する方法を提供する。本発明はまた、本発明のバイオマーカーの産物の発現及び／又は活性をモジュレートする化合物を同定する方法をも提供する。そのような方法によって同定された化合物は、変形性関節症を研究するための１又はそれ以上の動物モデルの開発に有用である。さらに、そのような方法によって同定された化合物は、変形性関節症又はその症状の予防、治療、管理及び／又は改善のための予防及び治療用の組成物の開発におけるリード化合物として有用である。そのような方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの潜在的な予防薬及び治療薬の試験に関する労力及び多大な費用を、本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの方法によって同定された化合物に効率よく集中させる点で特に有用である。
【０３９８】
本発明は、変形性関節症又はその症状を予防、治療、管理又は改善できるかどうかを試験すべき化合物を同定する方法を提供し、前記方法は、（ａ）本発明の１若しくはそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物又はその断片、あるいは本発明の１若しくはそれ以上のバイオマーカーのＲＮＡ産物又はその断片を発現する細胞を試験化合物と接触させるステップと、（ｂ）試験化合物がそのタンパク質産物、タンパク質断片、ＲＮＡ産物、又はＲＮＡ部分と結合できるかどうかを決定し、その結果、化合物がタンパク質産物、タンパク質断片、ＲＮＡ産物、ＲＮＡ部分と結合する場合、変形性関節症又はその症状を予防、治療、管理又は改善できるかどうかを試験すべき化合物が同定されるステップとを含む。例えば、細胞は、酵母細胞でもよく、あるいは哺乳動物由来の細胞でもよい。試験化合物がタンパク質産物、タンパク質断片、ＲＮＡ産物、又はＲＮＡ部分と結合できるかどうかの決定は、例えば、試験化合物がタンパク質産物、タンパク質断片、ＲＮＡ産物、又はＲＮＡ部分と結合したかどうかを複合体中の標識化合物を検出することによって決定することができるように、試験化合物を放射性同位体又は酵素標識と結合することによって実現することができる。例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３Ｈで直接的に又は間接的に試験化合物を標識し、放射線放出の直接計数により、又はシンチレーション計数によりその放射性同位体を検出することができる。あるいは、試験化合物を、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼで酵素標識し、適当な基質の産物への変換を決定することにより酵素標識を検出することができる。特定の実施形態では、そのアッセイは、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物又はその断片、あるいは本発明の１若しくはそれ以上のバイオマーカーのＲＮＡ産物又はその断片を発現する細胞を、そのタンパク質産物、タンパク質断片、ＲＮＡ産物、又はＲＮＡ部分と結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物とするステップと、そのアッセイ混合物を試験化合物と接触させるステップと、試験化合物がそのタンパク質産物、タンパク質断片、ＲＮＡ産物、又はＲＮＡ部分と相互作用できるかどうかを決定するステップとを含み、試験化合物がそのタンパク質産物、タンパク質断片、ＲＮＡ産物、又はＲＮＡ部分と相互作用できるかどうかを決定するステップは、既知の化合物と比べて試験化合物がそのタンパク質産物、タンパク質断片、ＲＮＡ産物、又はＲＮＡ部分と優先的に結合できるかどうかを決定するステップを含む。
【０３９９】
本発明は、変形性関節症又はその症状を予防、治療、管理又は改善できるかどうかを試験すべき化合物を同定する方法を提供し、前記方法は、（ａ）本発明の１若しくはそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物又はその断片、あるいは本発明の１若しくはそれ以上のバイオマーカーのＲＮＡ産物又はその一部分を試験化合物と接触させるステップと、（ｂ）試験化合物がそのタンパク質産物、タンパク質断片、ＲＮＡ産物、又はＲＮＡ部分と結合できるかどうかを決定し、その結果、化合物がタンパク質産物、タンパク質断片、ＲＮＡ産物、ＲＮＡ部分と結合する場合、変形性関節症又はその症状を予防、治療、管理又は改善できるかどうかを試験すべき化合物が同定されるステップとを含む。試験化合物がタンパク質産物又はタンパク質断片と結合するかどうかを、直接的に又は間接的に決定することができる。特定の実施形態では、そのアッセイは、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物又はその断片、あるいは本発明の１若しくはそれ以上のバイオマーカーのＲＮＡ産物又はその一部分を、そのタンパク質産物、タンパク質断片、ＲＮＡ産物、又はＲＮＡ部分と結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物とするステップと、そのアッセイ混合物を試験化合物と接触させるステップと、試験化合物がそのタンパク質産物、タンパク質断片、ＲＮＡ産物、又はＲＮＡ部分と相互作用できるかどうかを決定するステップとを含み、試験化合物がそのタンパク質産物、タンパク質断片、ＲＮＡ産物、又はＲＮＡ部分と相互作用できるかどうかを決定するステップは、既知の化合物と比べて試験化合物がそのタンパク質産物、タンパク質断片、ＲＮＡ産物、又はＲＮＡ部分と優先的に結合できるかどうかを決定するステップを含む。当技術分野で周知の技術を用いて、試験化合物と、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物又はその断片、あるいは本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物又はその一部分との結合を決定することができる。
【０４００】
本発明の上記アッセイ法のいくつかの実施形態では、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物又はその一部分、あるいはその標的分子を固定化して、複合体ではない形態のＲＮＡ産物又はＲＮＡ部分、その標的分子、あるいはその両方からの複合体形態の分離を促進するとともに、アッセイの自動化に適応させることが望ましい可能性がある。本発明の上記アッセイ法の複数の実施形態では、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物又はその断片、あるいはその標的分子を固定化して、複合体ではない形態の一方又は両方のタンパク質からの複合体形態の分離を促進するとともに、アッセイの自動化に適応させることが望ましい可能性がある。本発明のバイオマーカーのタンパク質産物又はその断片との試験化合物の結合は、反応物を入れるのに適した任意の容器中で実現することができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、及び微小遠心管がある。一実施形態では、一方又は両方のタンパク質を基板に結合させることができるドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical; St. Louis, MO）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次いでそれを試験化合物、あるいは試験化合物及び非吸着標的タンパク質又は本発明のバイオマーカーのタンパク質産物若しくはその断片と混合し、複合体形成を促す条件下で（例えば、塩及びｐＨについて生理的な条件で）その混合物をインキュベートする。インキュベーション後、ビーズ、又はマイクロタイタープレートのウエルを洗浄して、結合しなかった構成成分を除去し、例えば、上述のように直接的に又は間接的に複合体形成を測定する。あるいは、複合体を基板から解離させることもでき、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物又はその断片の結合レベルを、標準的な技術を用いて決定することができる。
【０４０１】
本発明のスクリーニングアッセイで、タンパク質を基板上に固定化する他の技術を使用することもできる。例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物又はその断片、あるいは標的分子を、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。本発明のバイオマーカー又は標的分子のビオチン化タンパク質産物を、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から、当技術分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals; Rockford, IL）を用いて調製し、ストレプトアビジン被覆９６ウエルプレート（Pierce Chemical）のウエル中に固定化することができる。あるいは、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物又はその断片と反応する抗体を、プレートのウエルに誘導体化し、抗体の結合によりタンパク質をウエル中で捕捉することもできる。ＧＳＴ固定化複合体について上述したものに加えて、そのような複合体を検出する方法には、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物と反応する抗体を用いた複合体の免疫検出、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物又はその断片、あるいは標的分子に関連する酵素活性の検出を利用する酵素結合アッセイが含まれる。
【０４０２】
試験化合物への本発明のバイオマーカーのタンパク質産物又はその断片の相互作用又は結合は、そのようなタンパク質又はタンパク質の断片を２ハイブリッドアッセイ又は３ハイブリッドアッセイで「ベイト（bait）タンパク質」として用いて決定することもできる（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Zervos et al.(1993)Cell 72:223-232; Madura et al.(1993)J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al.(1993)Bio/Techniques 14:920-924; Iwabuchi et al.(1993)Oncogene 8:1693-1696；及び国際公開ＷＯ９４／１０３００号を参照）。
【０４０３】
本発明は、変形性関節症又はその症状を予防、治療、管理又は改善できるかどうかを試験すべき化合物を同定する方法を提供し、前記方法は、（ａ）本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質又はＲＮＡ産物を発現する細胞を試験化合物と接触させるステップと、（ｂ）（ａ）中に存在するタンパク質又はＲＮＡ産物の量を決定するステップと、（ｃ）（ａ）中の量を、試験化合物と接触させていない対応する対照細胞中に存在する量と比較し、その結果、そのタンパク質又はＲＮＡ産物の量が対照での量と比べて変化した場合、変形性関節症又はその症状を予防、治療、管理又は改善できるかどうかを試験すべき化合物が同定されるステップとを含む。特定の実施形態では、（複数の）発現レベルが、本明細書に記載のアッセイ（例えば、マイクロアレイ又はＲＴ−ＰＣＲ）又は当業者に周知のアッセイを利用することにより測定される対照での発現レベルと比べて５％、１０％、１５％、２５％、３０％、４０％、５０％、５〜２５％，  １０〜３０％、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、１〜１０倍、又は５〜２５倍変化する。別の実施形態では、そのような方法は、細胞中に存在する本発明のバイオマーカーの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、１〜５種、１〜１０種、５〜１０種、５〜２５種、又は１０〜４０種、全種あるいは任意の組み合わせのタンパク質又はＲＮＡ産物の量を決定するステップと、その量を対照中に存在する量と比較するステップとを含む。
【０４０４】
本明細書に記載の、細胞に基づくアッセイで利用する細胞は、当技術分野で公知の技術を利用して、本発明のバイオマーカーを発現するように工学的に作製することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、"Recombinant Expression Vectors and Host Cells"という名称の米国特許第６，２４５，５２７号の第ＩＩＩ節を参照されたい。あるいは、本発明のバイオマーカーを内因的に発現する細胞を使用することもできる。例えば、軟骨細胞を使用することができる。
【０４０５】
特定の実施形態では、「正常な」個体、あるいは軽度の、中程度の、顕著な又は重篤な変形性関節症である個体から軟骨細胞を単離し、試験化合物の存在下又は不在下で、様々な時間（すなわち、３０分、１時間、５時間、２４時間、４８時間及び９６時間）それをインキュベートする。予防又は治療用の作用物質をスクリーニングするとき、本発明のバイオマーカーの完全な配列又はその機能的な一部分のクローンを使用して軟骨細胞にトランスフェクトする。トランスフェクトした軟骨細胞を、試験化合物の存在下又は不在下で、様々な時間（すなわち、１、２、３、５、７、１０、又は１４日間）培養する。インキュベーション後、軟骨細胞から標的核酸サンプルを調製し、正常、軽度の変形性関節症、中程度の変形性関節症、顕著な変形性関節症、及び重篤な変形性関節症のうち少なくともいずれか２種に由来する軟骨細胞中で示差的に発現される核酸配列に対応する核酸プローブとそれをハイブリダイズさせる。核酸プローブは、当技術分野で周知であり本明細書に記載されている方法に従って、例えば放射活性標識で標識する。例えば、上記のAusubel et al.、又は上記のSambrook et al.に記載のように、ノーザンブロットによってハイブリダイゼーションを実施する。本明細書で定義する、軽度の変形性関節症、中程度の変形性関節症、顕著な変形性関節症、及び重篤な変形性関節症のいずれかのＲＮＡと比較した正常のＲＮＡの、アレイ上でのサンプルに対する標的のハイブリダイゼーションの差から、示差的に発現される軟骨細胞特異的な核酸配列に対応するＲＮＡの発現レベルが示唆される。試験化合物の存在下でのインキュベーションステップによる標的配列の発現レベルの変化から、対応する軟骨細胞特異的な核酸配列の発現を増大又は低下させる化合物が示唆される。
【０４０６】
本発明はまた、変形性関節症又はその症状を予防、治療、管理又は改善できるかどうかを試験すべき化合物を同定する方法をも提供し、前記方法は、（ａ）無細胞抽出物（例えば、軟骨細胞抽出物）を、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質又はＲＮＡ産物をコードする核酸配列及び試験化合物と接触させるステップと、（ｂ）（ａ）中に存在するタンパク質又はＲＮＡ産物の量を決定するステップと、（ｃ）（ａ）中の（複数の）量を、試験化合物と接触させていない対応する対照に存在する量と比較し、その結果、そのタンパク質又はＲＮＡ産物の量が対照での量と比べて変化した場合、変形性関節症又はその症状を予防、治療、管理又は改善できるかどうかを試験すべき化合物が同定されるステップとを含む。特定の実施形態では、（複数の）発現レベルが、本明細書に記載のアッセイ（例えば、マイクロアレイ又はＲＴ−ＰＣＲ）又は当業者に周知のアッセイを利用することにより測定される対照サンプルでの発現レベルと比べて５％、１０％、１５％、２５％、３０％、４０％、５０％、５〜２５％、１０〜３０％、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、１〜１０倍、又は５〜２５倍変化する。別の実施形態では、そのような方法は、抽出物中に存在する本発明のバイオマーカーの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、１〜５種、１〜１０種、５〜１０種、５〜２５種、又は１０〜４０種、全種あるいは任意の組み合わせのタンパク質又はＲＮＡ産物の量を決定するステップと、その量を対照中に存在する量と比較するステップとを含む。
【０４０７】
特定の実施形態では、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の量を決定し、他の実施形態では、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の量を決定するが、さらに他の実施形態では、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ及びタンパク質産物の量を決定する。本発明のバイオマーカーのＲＮＡ又はタンパク質産物の量を決定する標準的な方法及び組成物を利用することができる。そのような方法及び組成物は、上記で詳細に記載している。
【０４０８】
特定の実施形態では、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにおいて、キットを利用して本発明のバイオマーカーのタンパク質又はＲＮＡ産物の量を決定する。そのようなキットは、本発明のバイオマーカーの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、全種又は任意の組み合わせの、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種又はそれ以上のタンパク質又はＲＮＡ産物の発現を測定するのに必要とする材料及び試薬を含む。特定の実施形態では、キットはさらに、（１）血液、軟骨細胞又は滑液からＲＮＡを精製するための試薬；（２）試験核酸を生成するためのプライマー；（３）ｄＮＴＰ及び／又はｒＮＴＰ（予め混合したもの又は別々のもの）、場合によっては一意的に標識された１又はそれ以上のｄＮＴＰ及び／又はｒＮＴＰ（例えば、ビオチン化したあるいはＣｙ３又はＣｙ５タグの付いたｄＮＴＰ）を含む；（４）蛍光色素の化学的に活性な誘導体などの合成後標識試薬；（５）逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素；（６）種々のバッファー、例えばハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄バッファー；（７）標識プローブ精製試薬、及びスピンカラムのような構成品など；（８）タンパク質精製試薬；（９）シグナル発生及び検出試薬、例えばストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体、化学蛍光基質又は化学発光基質など、種々の方法で使用する１又はそれ以上のさらなる試薬を含んでよい。特定の実施形態では、キットは、対照として使用する、予め標識され、品質管理されたタンパク質及び／又はＲＮＡ転写産物（好ましくは、ｍＲＮＡ）を含む。
【０４０９】
いくつかの実施形態では、キットはＲＴ−ＰＣＲキットである。他の実施形態では、キットは核酸アレイ及びタンパク質アレイである。本発明に従ったそのようなキットは少なくとも、本発明のタンパク質又は核酸メンバーが結合したアレイと、そのパッケージング手段とを含む。あるいは、本発明のタンパク質又は核酸メンバーをアレイ上に予めパッケージングすることもできる。
【０４１０】
特定の実施形態では、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物を測定するキットは、ＲＮＡ産物の発現を測定するのに必要な材料及び試薬を含む。例えば、マイクロアレイ又はＲＴ−ＰＣＲキットを使用することができ、それは、本発明のバイオマーカーの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、全種又は任意の組み合わせのＲＮＡ産物のレベルを測定するのに必要な試薬及び材料のみを含む。あるいは、いくつかの実施形態では、キットは、本発明のバイオマーカーの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、全種又は任意の組み合わせのＲＮＡ産物のレベルを測定するのに必要なものに限らない材料及び試薬を含んでよい。例えば、マイクロアレイキットは、本発明のバイオマーカー以外の少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種又はそれ以上の遺伝子のＲＮＡ産物のレベルを測定するのに必要なものに限らない材料及び試薬に加えて、本発明のバイオマーカーの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、全種又は任意の組み合わせのＲＮＡ産物のレベルを測定するのに必要な試薬及び材料を含んでよい。特定の実施形態では、マイクロアレイ又はＲＴ−ＰＣＲキットは、本発明のバイオマーカーの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、全種又は任意の組み合わせと、本発明のバイオマーカーでない１種、２種、３種、４種、５種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、５５種、６０種、６５種、７０種、７５種、８０種、８５種、９０種、９５種、１００種、１２５種、１５０種、１７５種、２００種、２２５種、２５０種、３００種、３５０種、４００種、４５０種、又はそれ以上の遺伝子、あるいは本発明のバイオマーカーでない１〜１０種、１〜１００種、１〜１５０種、１〜２００種、１〜３００種、１〜４００種、１〜５００種、１〜１０００種、２５〜１００種、２５〜２００種、２５〜３００種、２５〜４００種、２５〜５００種、２５〜１０００種、１００〜１５０種、１００〜２００種、１００〜３００種、１００〜４００種、１００〜５００種、１００〜１０００種又は５００〜１０００種の遺伝子のＲＮＡ産物のレベルを測定するのに必要な試薬及び材料を含む。
【０４１１】
核酸マイクロアレイキットでは、キットは一般に、固相支持体表面に結合したプローブを含む。検出可能な標識でプローブを標識することができる。特定の実施形態では、プローブは、本発明のバイオマーカーの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、全種又は任意の組み合わせの５’領域、３’領域、内部コード領域、（複数の）エキソン、（複数の）イントロン、（複数の）エキソン結合部、又は（複数の）エキソン−イントロン結合部に特異的である。マイクロアレイキットは、アッセイ、及びアッセイを行った結果得られたデータを解釈し分析する方法を行うための説明書を含むことがある。キットはまたハイブリダイゼーション試薬、及び／又はプローブが標的核酸配列とハイブリダイズするときに発生するシグナルを検出するのに必要な試薬を含むこともある。一般に、マイクロアレイキットの材料及び試薬は１又はそれ以上の容器に入っている。キットの各構成品は一般に、その適切な容器に入っている。
【０４１２】
ＲＴ−ＰＣＲキットでは、キットは一般に、本発明のバイオマーカーの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、全種又は任意の組み合わせの特定のＲＮＡ産物（例えば、（複数の）エキソン、（複数の）イントロン、（複数の）エキソン結合部、及び（複数の）エキソン−イントロン結合部）に特異的な、予め選択したプライマーを含む。ＲＴ−ＰＣＲキットはまた、核酸の逆転写及び／又は増幅に適した酵素（例えば、Ｔａｑなどのポリメラーゼ）、並びに逆転写及び増幅の反応混合物に必要なデオキシヌクレオチド及びバッファーを含んでもよい。ＲＴ−ＰＣＲキットはまた、本発明のバイオマーカーの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、全種又は任意の組み合わせに特異的なプローブを含んでもよい。プローブは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）で標識してもよく、あるいはしなくてもよい。ＲＴ−ＰＣＲキットの各構成品は一般に、その適切な容器に入っている。したがって、これらのキットは一般に、個々の各試薬、酵素、プライマー及びプローブに適した別々の容器を含む。さらに、ＲＴ−ＰＣＲキットは、アッセイ、及びアッセイを行った結果得られたデータを解釈し分析する方法を行うための説明書を含むことがある。
【０４１３】
抗体に基づくキットでは、キットは例えば、（１）対象とするタンパク質（例えば、本発明のバイオマーカーの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、全種又は任意の組み合わせのタンパク質産物）と結合する一次抗体（固相支持体に結合していてもよく、あるいはしていなくてもよい）と、任意選択で（２）タンパク質又は一次抗体と結合し、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、放射性同位体又は酵素）と結合した異なる二次抗体を含んでよい。抗体に基づくキットはまた、免疫沈降を行うためのビーズを含んでもよい。抗体に基づくキットの各構成品は一般に、その適切な容器に入っている。したがって、これらのキットは一般に、各抗体に適した別々の容器を含む。さらに、抗体に基づくキットは、アッセイ、及びアッセイを行った結果得られたデータを解釈し分析する方法を行うための説明書を含むことがある。
【０４１４】
レポーター遺伝子に基づくアッセイを行って、変形性関節症又はその症状を予防、治療、管理又は改善できるかどうかを試験すべき化合物を同定することもできる。特定の実施形態では、本発明は、変形性関節症又はその症状を予防、治療、管理又は改善できるかどうかを試験すべき化合物を同定する方法を提供し、前記方法は、（ａ）化合物を、本発明のバイオマーカーの調節エレメント（例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント）と機能的に連結したレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物を発現する細胞と接触させるステップと、（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現を測定するステップと、（ｃ）（ａ）中の量を、試験化合物と接触させていない対応する対照細胞中に存在する量と比較し、その結果、発現したレポーター遺伝子の量が対照細胞での量と比べて変化した場合、変形性関節症又はその症状を予防、治療、管理又は改善できるかどうかを試験すべき化合物が同定されるステップとを含む。この実施形態によれば、細胞はバイオマーカーを天然に発現するものでもよく、あるいは、バイオマーカーを発現するように工学的に作製してもよい。他の実施形態では、本発明は、変形性関節症又はその症状を予防、治療、管理又は改善できるかどうかを試験すべき化合物を同定する方法を提供し、前記方法は、（ａ）化合物を、無細胞抽出物、及び本発明のバイオマーカーの調節エレメント（例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント）と機能的に連結したレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物と接触させるステップと、（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現を測定するステップと、（ｃ）（ａ）中の量を、試験化合物と接触させていない対応する対照中に存在する量と比較し、その結果、発現したレポーター遺伝子の量が対照での量と比べて変化した場合、変形性関節症又はその症状を予防、治療、管理又は改善できるかどうかを試験すべき化合物が同定されるステップとを含む。
【０４１５】
当業者に周知の任意のレポーター遺伝子を、本発明の方法に従って用いるためのレポーター遺伝子構築体中で使用し得る。レポーター遺伝子とは、その存在（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等）又は活性によって容易に検出可能なＲＮＡ転写物又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列をいう。レポーター遺伝子の非限定的な例は、以下の表４に例示してある。レポーター遺伝子は当業者に周知の任意の方法で得られ、そのエレメントのヌクレオチド配列は当業者に周知の任意の方法によって決定し得る。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列は、たとえば文献又はＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから得ることができる。あるいは、レポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、適切な供与源由来の核酸から作製し得る。特定のレポーター遺伝子をコードする核酸を含むクローンは利用可能でないが、レポーター遺伝子の配列が知られている場合は、レポーター遺伝子をコードしている核酸を化学合成するか、適切な供与源（たとえば、ｃＤＮＡライブラリ、あるいはレポーター遺伝子を発現している任意の組織若しくは細胞から作製したｃＤＮＡライブラリ、又はレポーター遺伝子を発現している任意の組織若しくは細胞から単離した核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、ＰＣＲ増幅によって得てもよい。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列が決定されたあと、レポーター遺伝子のヌクレオチド配列をヌクレオチド配列の操作について当分野で周知の方法、たとえば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなどを用いて操作し（たとえば、Sambrook他、1990、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州Cold Spring Harbor及びAusubel他編、1998、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、ニューヨークに記載の技術を参照。これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）、異なるアミノ酸配列を有するレポーター遺伝子、たとえばアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を作製し得る。
【０４１６】
2007511738.tif 000004
【０４１７】
本発明においては、本発明のバイオマーカーの１つ又はそれ以上、全て又は任意の組み合わせを天然に又は通常発現する細胞を、本明細書に記載の方法において用いることができる。あるいは、当技術分野で周知の技法及び本明細書に記載の方法を用いて、本発明のバイオマーカー又はレポーター遺伝子ーの１つ又はそれ以上、全て又は任意の組み合わせを発現するように細胞を操作してもよい。そのような技術の例としては、限定されるものではないが、リン酸カルシウム沈降（例えば、Graham & Van der Eb, 1978, Virol. 52: 546参照）、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中への核酸の封入、及び核酸の核への直接マイクロインジェクションが挙げられる。 
特定の実施形態において、本明細書に記載の方法において用いる細胞は、軟骨細胞、リンパ球（Ｔ又はＢリンパ球）、単球、好中球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、赤血球又は血小板である。好ましい実施形態において、本明細書に記載の方法において用いる細胞は軟骨細胞である。別の好ましい実施形態において、本明細書に記載の方法において用いる細胞はリンパ球である。別の実施形態において、本明細書に記載の方法において用いる細胞は、供与源、例えば組織から誘導された不死化細胞系である。
【０４１８】
核酸の翻訳、任意により（しかし好ましくは）転写、を可能にする任意の無細胞抽出物を、本明細書に記載の方法において用いることができる。無細胞抽出物は、任意の種の起源の細胞から単離することができる。例えば、無細胞翻訳抽出物は、ヒト細胞、培養マウス細胞、培養ラット細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、アフリカツメガエル卵母細胞、ウサギ網膜細胞、コムギ胚芽、又はライ胚から単離しうる（例えば、Krieg & Melton, 1984, Nature 308: 203及びDignam et al., 1990 Methods Enzymol. 182: 194-203参照）。あるいは、無細胞翻訳抽出物、例えばウサギ網膜細胞溶解物及びコムギ胚芽抽出物は、例えばPromega（Madison, WI）から購入することができる。好ましい実施形態において、無細胞抽出物はヒト細胞から単離された抽出物である。特定の実施形態において、ヒト細胞はＨｅＬａ細胞、リンパ球又は軟骨細胞である。
【０４１９】
本発明のバイオマーカーのＲＮＡ及び／又はタンパク質産物の発現レベルをモジュレートする能力に加えて、少なくともいくつかの場合には、化合物は本発明のバイオマーカーのタンパク質の活性をモジュレートすることが望ましい。したがって、本発明は、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物の活性をモジュレートする化合物を同定する方法を含む、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善する能力について試験対象の化合物を同定する方法を提供する。そのような方法は、（ａ）本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物を発現する細胞と被験化合物を接触させるステップ、（ｂ）タンパク質産物の活性レベルを測定するステップ、（ｃ）その活性レベルを被験化合物と接触させていない対応の対照細胞の活性レベルを比較するステップを含み、ステップ（ａ）の活性レベルが対照細胞における活性レベルと比較して変化している場合には、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善する能力について試験対象の化合物が同定される。特定の実施形態において、活性レベルは、本明細書に記載のアッセイ（例えばマイクロアレイ又はＲＴ−ＰＣＲ）、又は当業者に周知のアッセイを用いて測定した場合に、対照における活性レベルと比較して、５％、１０％、１５％、２５％、３０％、４０％、５０％、５〜２５％、１０〜３０％、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、１〜１０倍、又は５〜２５倍変化する。別の実施形態において、そのような方法は、細胞に存在する本発明のバイオマーカーの、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、１〜５、１〜１０、５〜１０、５〜２５、又は１０〜４０、全て又は任意の組み合わせのタンパク質産物の活性レベルを測定するステップ、及び活性レベルを対照に存在するレベルと比較するステップを含む。
【０４２０】
本発明は、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善する能力について試験対象の化合物を同定する方法であって、（ａ）無細胞抽出物を本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物をコードする核酸及び被験化合物と接触させるステップ、（ｂ）タンパク質産物の活性レベルを測定するステップ、（ｃ）その活性レベルを被験化合物と接触させていない対応の対照における活性レベルと比較するステップを含み、ステップ（ａ）における活性レベルが対照における活性レベルと比較して変化している場合には、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善する能力について試験対象の化合物が同定される。特定の実施形態において、活性レベルは、本明細書に記載のアッセイ（例えばマイクロアレイ又はＲＴ−ＰＣＲ）、又は当業者に周知のアッセイを用いて測定した場合に、対照における活性レベルと比較して、５％、１０％、１５％、２５％、３０％、４０％、５０％、５〜２５％、１０〜３０％、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、１〜１０倍、又は５〜２５倍変化する。別の実施形態において、そのような方法は、サンプル中に存在する本発明のバイオマーカーの、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、１〜５、１〜１０、５〜１０、５〜２５、又は１０〜４０、全て又は任意の組み合わせのタンパク質産物の活性レベルを測定するステップ、及び活性レベルを対照に存在するレベルと比較するステップを含む。
【０４２１】
本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の活性レベルを測定するために、標準的な技術を利用することができる。例えば、当技術分野で周知の技法を用いて測定可能な本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の活性の例については表５を参照のこと。
【０４２２】
2007511738.tif 000005
【０４２３】
５．２０．２  化合物の生物学的活性
変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善する能力について試験対象の化合物（簡便性のため、本明細書中「リード」化合物という）の同定に際しては、化合物をさらに研究してもよい。例えば、本発明の方法により同定される化合物は、炎症、好ましくは関節炎、より好ましくは変形性関節症の認可された動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで試験してもよい。さらに、本方法により同定される化合物は、それらの特異性に関して分析してもよい。特に、化合物は、軟骨細胞によるＩＩ型コラーゲン及びプロテオグリカンの生成に対する影響について試験しうる。そのようなさらなる化合物の研究のための技術は当業者に周知である。
【０４２４】
一実施形態において、リード化合物の効果は、標的細胞の細胞増殖及び生存性を測定することにより評価しうる。そのようなアッセイは、変形性関節症に関与する細胞型の代表的な細胞（例えば軟骨細胞）において実施しうる。あるいは、患者からの培養細胞を用いないで、リード化合物は細胞系の細胞を用いてスクリーニングしてもよい。
【０４２５】
当技術分野で周知の多くのアッセイを用いて、リード化合物への暴露後の患者細胞又は細胞系の生存性及び／又は増殖を評価することができる。例えば、細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込み（例えば、Hoshino et al., 1986, Int. J. Cancer 38, 369; Campana et al., 1988, J. Immunol. Meth. 107: 79参照）又は（３Ｈ）−チミジン取り込み（例えばChen, J., 1996, Oncogene 13: 1395-403 ; Jeoung, J., 1995, J. Biol. Chem. 270: 18367-73参照）を、直接細胞計数により、既知遺伝子（原癌遺伝子、例：ｆｏｓ、ｍｙｃなど）の転写、翻訳若しくは活性の変化を検出することにより、又は細胞周期マーカー（Ｒｂ、ｃｄｃ２、ｃｙｃｌｉｎＡ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｅなど）の変化を検出することにより測定して、アッセイすることができる。そのようなタンパク質及びＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）及び活性のレベルは、当技術分野で周知の任意の方法により測定することができる。例えば、タンパク質は、既知の免疫診断方法、例えば市販の抗体を用いたウエスタンブロッティング又は免疫沈降法により定量しうる。ｍＲＮＡは、当技術分野で周知かつ慣用の方法、例えばノーザン分析、ＲＮａｓｅ保護、逆転写に関するポリメラーゼ連鎖反応を用いて定量しうる。細胞生存性は、トリパンブルー染色又は他の当技術分野で公知の細胞死若しくは生存マーカーを用いて評価しうる。特定の実施形態において、細胞ＡＴＰのレベルを測定して、細胞生存性を判定する。分化、例えば形態の変化に基づいて、可視的に評価しうる。
【０４２６】
軟骨細胞増殖アッセイの一例は以下の通りである。軟骨細胞をヒトの重篤なＯＡの軟骨切片から既に記載されているように回収する（Doherty PJ, Zhang H, Trembley L, Manolopoulos V and Marshall KW., 1998, Osteoartitis and Cartilage 6: 153-160）。次に細胞を洗浄し、計数し、平底９６ウエルプレート（Corning）にＤＭＥＭ＋＋中に１×１０４細胞／ウエルで接種する。細胞がプレートに付着した後、それをＤＭＥＭのみで洗浄し、１０％ＦＣＳを含む又は含まないＤＭＥＭ中で、種々の濃度のリード化合物と共に４８時間インキュベートする。各ウエルにおける細胞数を、１０μｌのＷＳＴ−１（生存細胞におけるミトコンドリアデヒドロゲナーゼにより切断されてホルマザンとなるテトラゾリウム塩）を各ウエルに添加し、１分間十分に混合し、３７℃にて１．５時間インキュベートすることにより判定する。続いて、プレートをマイクロプレートオートリーダー（BIO-TEK Instruments）により４５０ｎｍの吸光度で走査する。生存細胞数は、４５０ｎｍにおける吸光度の測定によって定量される、形成したホルマザンの量に反映される（LangI, Hoffmann C, Olip H, Pabst MA, Hahn T, Dohr G, Desoye G., 2001, Differential mitogenic responses of human macrovascular and microvascular endothelial cells to cytokines underline their phenotypic heterogeneity. Cell Prolif 34: 143-55）。
【０４２７】
リード化合物への暴露が及ぼす軟骨細胞によるＩＩ型コラーゲン及びプロテオグリカンの生成に対する影響は、当技術分野で周知の技法を用いて判定しうる。さらに、特定の変形性関節症の症状の予防、治療、管理又は改善のための治療の効力を評価するための当技術分野で周知の任意のアッセイを、リード化合物を用いて実施してもよい。
【０４２８】
動物モデル
化合物は、ヒトにおける使用の前に、好適な動物モデル系において試験しうる。そのような動物モデル系としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられる。当技術分野で周知の任意の動物系を用いることができる。特定の実施形態において、化合物はマウスモデルにおいて試験する。化合物は、反復投与してもよい。
【０４２９】
認可されている動物モデルを使用して、変形性関節症又はその症候の予防、治療、管理及び又は改善のための、上述した本方法により同定される化合物の効力を判定することができる。そのようなモデルとしては、当技術分野で公知の炎症性関節炎の種々の実験動物モデルが挙げられ、Crofford L. J. and Wilder R. L.,"Arthritis and Autoimmunity in Animals", Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al.(編), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993)に記載されている。当技術分野で公知のかつ広く使用されている関節炎又は炎症性疾患の主な動物モデルとしては、アジュバントにより誘導された関節炎ラットモデル、コラーゲンにより誘導された関節炎ラット及びマウスモデル、及び抗原により誘導された関節炎ラット、ウサギ及びハムスターモデルが挙げられ、これらは全てCrofford L. J. and Wilder R. L.,"Arthritis and Autoimmunity in Animals", in Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al.(編), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993)に記載されている（参照によりその全体を本明細書に組み入れる）。
【０４３０】
一実施形態において、変形性関節症又はその症候の予防、治療、管理及び／又は改善のための化合物の効力は、カラギナン（carrageenan）により誘導された関節炎ラットモデルを使用して判定することができる。カラギナンにより誘導された関節炎は、慢性の関節炎又は炎症の研究において、ウサギ、イヌ及びブタにおいても使用されてきた。定量的組織形態計測評価が治療効力を決定するために使用される。このようなカラギナンにより誘導された関節炎モデルを使用するための方法は、Hansra P.ら、「Carrageenan-Induced Arthritis in the Rat」、Inflammation、24(2):141-155、(2000)中に記載される。当該分野で公知かつ記載されているようなザイモサンにより誘導された炎症動物モデルもまた一般に使用される。
【０４３１】
化合物の抗炎症活性はまた、Winter C.A.ら、「Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs」Proc.Soc.Exp.Biol Med.111、544-547、(1962)中に記載される方法の改変を使用して、ラットにおけるカラギナンにより誘導された脚の浮腫の阻害を測定することによって評価することができる。このアッセイは、ほとんどのＮＳＡＩＤの抗炎症活性についての一次ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングとして使用されており、ヒトでの効力を予測するとみなされている。被験化合物の抗炎症活性は、ビヒクル投与された対照群と比較した、試験群の後脚重量の増大の阻害率（％）として表される。
【０４３２】
別の実施形態において、変形性関節症又はその症候の予防、治療、管理及び／又は改善のための化合物の効力は、コラーゲンにより誘導された関節炎（ＣＩＡ）モデルを用いて判定する。ＣＩＡは、ヒト自己免疫疾患関節リウマチ（ＲＡ）のための動物モデルである（Trenthorn et al., 1977, J. Exp. Med., 146: 857）。この疾患は、多くの種において、異種ＩＩ型コラーゲンの投与によって誘導されうる（Courtenay et al., 1980, Nature 283 : 665 ; Cathcart et at, 1986, Lab. Invest., 54: 26）。関節炎の動物モデルに関しては、さらに例えばHolmdahl, R., 1999, Curr. Biol. 15: R528-530参照。
【０４３３】
別の実施形態において、変形性関節症又はその症候の予防、治療、管理及び／又は改善のための化合物の効力は、骨形成及び／又は骨喪失を決定するアッセイを使用して判定することができる。卵巣摘出術により誘導された骨吸収マウスモデル、ラットモデル及びウサギモデルのような動物モデルが、骨形成についての動的パラメータを得るために当該分野で公知である。Yositakeら又はYamamotoらによって記載されるような方法を使用して、骨体積が、マイクロコンピュータ断層撮影分析及び骨組織形態計測分析によってｉｎ  ｖｉｖｏで測定される。共に本明細書中でその全体が参照により組み入れられる、Yoshitakeら、「Osteopontin-Deficient Mice Are Resistant to Ovariectomy-Induced Bone Resorption」、Proc.Natl.Acad.Sci.96:8156-8160、(1999);Yamamotoら、「The Integrin Ligand Echistatin Prevents Bone Loss in Ovariectomized Mice and Rats」、Endocrinology 139(3):1411-1419、(1998)。
【０４３４】
毒性
本発明によって同定される化合物の毒性及び／又は有効性は、たとえばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物での標準的な薬学的手法によって決定することができる。本発明により同定される化合物の細胞毒性を評価するために用いることができる細胞及び細胞系としては、限定されるものではないが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、Ｃａｃｏ−２細胞、及びＨｕｈ７細胞が挙げられる。毒性と治療効果との用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。本発明によって同定される化合物で、高い治療指数を示すものが好ましい。本発明によって同定される化合物で毒性の副作用を示すものを使用してもよいが、未感染細胞の潜在的な損傷を最小限にし、したがって副作用を低減するために、罹患組織の部位をこのような薬剤の標的とさせる送達系を設計するよう注意すべきである。
【０４３５】
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータを、ヒトで使用するために本発明によって同定される化合物の用量範囲を設定するのに使用することができる。このような薬剤の用量は、毒性をほとんど伴わないか全く伴わないでＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用いる剤形及び利用する投与経路に応じて、用量はこの範囲内で変動し得る。本発明の方法で用いるいかなる薬剤についても、治療上有効な用量は最初に細胞培養アッセイから見積もることができる。動物モデルにおいて、細胞培養物で決定されたＩＣ５０（すなわち症状の最大半値阻害が得られる化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように用量を設定し得る。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、たとえば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０４３６】
同属種又は類似体の設計
所望の生物学的活性を示す化合物は、有用な薬理学的活性を有する同属種又は類似体を開発又は設計するためのリード化合物として使用することができる。たとえば、リード化合物を同定したあと、分子モデリング技術を用いて、より有効であり得る該化合物の変種を設計することができる。分子モデリングシステムの例はＣＨＡＲＭ及びＱＵＡＮＴＡプログラムである（Polygen Corporation、Waltham、MA）。ＣＨＡＲＭは、エネルギー最小化及び分子力学機能を行う。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング及び分析を行う。ＱＵＡＮＴＡにより、分子の互いに対する挙動のインタラクティブな構築、修飾、可視化、及び分析が可能となる。
【０４３７】
いくつかの論文が、特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングを概説しており、そのようなものとしては、Rotivinen他、1988、Acta Pharmaceutical Fennica、97:159-166；Ripka、1998、New Scientist、54-57；McKinaly及びRossmann、1989、Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol.、29:111-122；Perry及びDavies、OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design、189-193ページ(Alan R. Liss, Inc.、1989)；Lewis及びDean、1989、Proc. R. Soc. Lond.、236:125-140及び141-162；Askew他、1989、J. Am. Chem. Soc.、111:1082-1090などがある。化学物質のスクリーニングを行い、グラフィックに示す他のコンピュータプログラムが、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．（Pasadena、California）、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ．（Mississauga、Ontario、Canada）、及びＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．（Cambridge、Ontario）などの会社から市販されている。これらは主に特定のタンパク質に対して特異的な薬物への適用のために設計されているが、任意の同定された領域に対して特異的な薬物を設計するために適合させることができる。類似体及び同属種は、上述した生物学的活性のスクリーニングを用いて、目的のタンパク質（すなわち、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物）への結合について試験することができる。あるいは、スクリーニングによって生物学的活性がほとんどないか全くないと確認されたリード化合物を使用しても、生物学的活性を有する化合物の類似体及び同属種を設計することが可能である。
【０４３８】
５．２０．３  化合物
本明細書に記載の方法により試験し、同定することができる化合物としては、限定されるものではないが、任意の市販供給源、例えばAldrich（1001 West St. Paul Ave., Milwaukee,WI 53233）、Sigma Chemical（P. O. Box 14508, St. Louis, MO 63178）、Fluka Chemie AG（Industriestrasse 25, CH- 9471 Buchs, Switzerland（Fluka Chemical Corp. 980 South 2nd Street, Ronkonkoma, NY 11779））、Eastman Chemical Company, Fine Chemicals（P.O Box 431, Kingsport, TN 37662）、 Boehringer Mannheim GmbH（Sandhofer Strasse 116, D-68298 Mannheim）、Takasago（4 Volvo Drive, Rockleigh, NJ 07647）、SST Corporation（635 Brighton Road, Clifton, NJ 07012）、Ferro（111 West Irene Road, Zachary, LA70791）、Riedel-deHaen Aktiengesellschaft（P. O. Box D-30918, Seelze, Germany）、PPG IndustriesInc., Fine Chemicals（One PPG Place, 34th Floor, Pittsburgh, PA 15272）などから得られる化合物が挙げられる。さらに、本発明の方法を用いて、任意の種の天然産物、例えば微生物、真菌、植物又は動物抽出物などをスクリーニングしてもよい。
【０４３９】
合成又は天然化合物の大きなライブラリに由来する化合物をスクリーニングすることも可能である。現在、糖、ペプチド及び核酸ベースの化合物のランダム合成及び指定合成のための多数の手段を用いることができる。合成化合物ライブラリは、いくつかの会社、例えばMaybridge Chemical Co.（Trevillet, Cornwall, UK）、Comgenex（Princeton, NJ）、Brandon Associates（Merrimack, NH）、及びMicrosource（New Milford, CT）などから市販されている。稀少な化学物質ライブラリは、Aldrich（Milwaukee, WI）から入手可能である。コンビナトリアルライブラリを入手し、作製することも可能である。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリも、例えばPan Laboratories（Bothell, WA）又はMycoSearch （NC）から入手するか、あるいは、当技術分野で周知の方法により容易に作製可能である。さらに、天然及び合成により作製したライブラリ及び化合物は、慣用の化学的、物理的、及び生化学的手段によって容易に修飾することができる。
【０４４０】
さらに、被験化合物（小分子被験化合物を含む）の多様なライブラリを用いることができる。本発明の方法を用いてスクリーニングしたライブラリは様々な化合物種を含むことができる。本発明の方法によってスクリーニングすることができるライブラリの例には、それだけには限定されないが、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドなどのダイバーソマー；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣体；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリ；抗体ライブラリ；炭水化物ライブラリ；並びに小分子ライブラリ（好ましくは有機小分子ライブラリ）が含まれる。一部の実施形態では、スクリーニングするライブラリ中の化合物は核酸又はペプチド分子である。非限定的な例では、ファージディスプレイライブラリ中にペプチド分子が存在することができる。他の実施形態では、化合物の種類には、それだけには限定されないが、天然に存在しないアミノ酸、たとえば、Ｄ−アミノ酸、α−アミノリン酸やα−アミノリン酸などのアミノ酸のリン類似体、又は非ペプチド結合を有するアミノ酸を含むペプチドを含むペプチド類似体、ホスホロチオエートやＰＮＡなどの核酸類似体、ホルモン、抗原、合成若しくは天然に存在する薬物、オピエート、ドーパミン、セロトニン、カテコールアミン、トロンビン、アセチルコリン、プロスタグランジン、有機分子、フェロモン、アデノシン、スクロース、グルコース、ラクトース及びガラクトースが含まれる。ポリペプチド又はタンパク質のライブラリも本発明のアッセイで使用することができる。
【０４４１】
特定の実施形態では、コンビナトリアルライブラリは、それだけには限定されないが、ベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ化合物、及びベンゾジアゼピンを含めた有機小分子ライブラリである。別の実施形態では、コンビナトリアルライブラリはペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ベンゾジアゼピン；ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドなどのダイバーソマー；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣体；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリ；抗体ライブラリ；又は炭水化物ライブラリを含む。コンビナトリアルライブラリはそれ自体が市販されている。例えば、ライブラリは、例えばSpecs and BioSpecs B. V.（Rijswijk, The Netherlands）、Chembridge Corporation（San Diego,CA）、Contract Service Company（Dolgoprudny, Moscow Region, Russia）、Comgenex USA Inc. （Princeton, NJ）、Maybridge Chemicals Ltd.（Cornwall PL34 OHW, United Kingdom）、Asinex（Moscow, Russia）、ComGenex（Princeton, New Jersey）、Ru, Tripos, Inc.（St. Louis, Missouri）、ChemStar, Ltd（Moscow, Russia）、3D Pharmaceuticals（Exton, Pennsylvania）、及びMartek Biosciences（Columbia, Maryland）などから市販品を入手可能である。
【０４４２】
好ましい実施形態では、ライブラリの化合物がより細胞に取り込まれやすくなるようにライブラリを事前に選択する。たとえば、化合物が細胞内に入る可能性を増大する、それだけには限定されないが大きさ、親油性、親水性、及び水素結合などの特定のパラメータに基づいて化合物を選択する。別の実施形態では、化合物を三次元又は四次元のコンピュータ計算プログラムによって解析する。
【０４４３】
本発明の方法によって使用するためのコンビナトリアル化合物のライブラリは合成してもよい。薬理学的活性、生物学的活性又は他の活性についてスクリーニングすることができる有機小化合物の大きなコレクション、すなわちライブラリの作製に向けられた合成方法に大きな関心がもたれている。巨大なコンビナトリアルライブラリを作製するために適用する合成方法は、溶液中又は固相中、すなわち固体担体上で行う。固相合成では、過剰の試薬を加えて各反応ステップ後に洗い流すことが容易に行えるので、複数ステップの反応を実施し、反応を高収率で完了させることが容易になる。固相コンビナトリアル合成はまた、単離、精製及びスクリーニングを改善させる傾向にある。しかし、より慣例の液相化学が固相化学よりも広範な有機反応を支持する。
【０４４４】
本発明のコンビナトリアル化合物のライブラリは、Kilcoin他の米国特許第６，１９０，６１９号（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載の装置を用いて合成し得る。米国特許第６，１９０，６１９号は、複数の別々の化合物の並行合成用又はコンビナトリアル化合物ライブラリ用の複数の反応器を保持できる合成装置を開示している。
【０４４５】
一実施形態では、コンビナトリアル化合物のライブラリを溶液中で合成することができる。Boger他の米国特許第６，１９４，６１２号（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載の方法は、コンビナトリアルライブラリの液相合成の鋳型として有用な化合物を特徴とする。鋳型は、液体／液体抽出又は固体／液体抽出を用いて未反応物質から反応産物を容易に精製することが可能になるよう設計されている。鋳型を用いてコンビナトリアル合成によって産生される化合物は、好ましくは有機小分子である。ライブラリ中の一部の化合物は非ペプチド又はペプチドの効果を模倣し得る。コンビナトリアル化合物のライブラリの固相合成とは対照的に、液相合成では複数ステップの固相合成の個々のステップをモニターするための特殊なプロトコルを使用する必要がない（Egner他、1995、J. Org. Chem.、60:2652；Anderson他、1995、J. Org. Chem.、60:2650；Fitch他、1994、J. Org. Chem.、59:7955；Look他、1994、J. Org. Chem.、49:7588；Metzger他、1993、Angew. Chem., Int. Ed. Engl.、32:894；Youngquist他、1994、Rapid Commun. Mass Spect.、8:77；Chu他、1995、J. Am. Chem. Soc.、117:5419；Brummel他、1994、Science、264:399；及びStevanovic他、1993、Bioorg. Med. Chem. Lett.、3:431）。
【０４４６】
本発明の方法に有用なコンビナトリアル化合物のライブラリは固体担体上で合成することができる。一実施形態では、分割合成（ｓｐｌｉｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）法、すなわち合成中に固体担体を分離及び混合するプロトコルを使用して化合物ライブラリを固体担体上で合成する（たとえば、Lam他、1997、Chem. Rev.、97:41-448；Ohlmeyer他、1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:10922-10926、及びそれ中で引用された参考文献参照）。最終ライブラリ中の各固体担体は、実質上１種の化合物がその表面に結合している。各担体に１種の産物が結合している、コンビナトリアルライブラリを固体担体上で合成する他の方法は当業者には公知でありうる（たとえば、Nefzi他、1997、Chem. Rev.、97:449-472参照）。
【０４４７】
本発明の一部の実施形態では、リンカーによって化合物を固体担体に結合させることができる。リンカーは固体担体の必須構成要素及び一部分であることができ、又は固体担体上で合成される若しくは合成後に固体担体上に結合される必須構成要素でないものであってもよい。リンカーは、固体担体に化合物の結合点を提供することだけでなく、リンカーの性質に応じて様々な条件下で分子の様々な基が固体担体から切断されることを可能にすることでも有用である。たとえば、リンカーは、とりわけ求電子的に切断される、求核的に切断される、光切断可能である、酵素的に切断される、金属によって切断される、還元的条件下で切断される又は酸化的条件下で切断されることができる。好ましい実施形態では、化合物は、化合物のハイスループットスクリーニングの前に固体担体から切断される。
【０４４８】
ライブラリが化合物（各化合物がアドレス又は識別子を有する）のアレイ又はマイクロアレイを含む場合、化合物は、例えば陽性サンプルと個々の試験アッセイにアプライした元の化合物リストとを相互参照することによって、解明することができる。
【０４４９】
ライブラリーがペプチド又は核酸ライブラリの場合には、化合物の配列を、ペプチド又は核酸の直接配列決定によって決定しうる。そのような方法は当業者に周知である。
【０４５０】
いくつかの物理−化学技術を利用して、化合物のｄｅ ｎｏｖｏ特性決定を行いうる。そのような技術の例としては、限定されるものではないが、質量分析法、ＮＭＲ分光法、Ｘ線結晶解析、及び振動分光法が挙げられる。
【０４５１】
５．２１  変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するための同定化合物の使用
本発明は、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善する方法であって、その必要のある被験体に、本発明の方法に従って同定される１以上の化合物を投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、被験体は、軽度、中程度、顕著又は重篤な変形性関節症を有する。好ましい実施形態において、被験体はヒトである。
【０４５２】
一実施形態において、本発明は、変形性関節症又はその症候の予防、治療、管理又は改善方法であって、本発明の方法によって同定される１若しくは複数の化合物の予防上又は治療上有効な量の用量を、それを必要としている被験体に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、本発明によって同定される化合物は、このような化合物が以前に変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善させるために使用されたことがある場合は、変形性関節症又はその症候を予防、治療、又は改善させるために投与しない。別の実施形態において、本発明の方法に従って同定される化合物は、このような化合物を変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善させるために使用することが示唆されている場合は、変形性関節症又はその症候を予防、治療、又は改善させるために投与しない。別の実施形態において、本発明の方法に従って同定される化合物は、本発明のバイオマーカーのほんの１つのタンパク質又はＲＮＡ産物に特異的に結合するか、並びに／あるいはその発現及び／又は活性レベルを改変する。別の実施形態において、本発明の方法に従って同定される化合物は、そのような化合物が、次のバイオマーカー、すなわちＢ２Ｍ、ＴＮＦＡＩＰ６、ＰＤＣＤ５、及びＥＧＲ１の１、２、３つ若しくは全て、又は任意の組み合わせのタンパク質又はＲＮＡ産物に特異的に結合するか、並びに／あるいはその発現及び／又は活性レベルを改変する場合は、変形性関節症又はその症候を予防、治療、又は改善させるために投与しない。また別の実施形態において、本発明の方法に従って同定される化合物は、本発明のバイオマーカーの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、又はそれ以上のタンパク質又はＲＮＡ産物に結合するか、並びに／あるいはその発現及び／又は活性レベルを改変する。
【０４５３】
特定の実施形態において、本発明の方法に従って同定される化合物は、軟骨細胞の同化及び／又は異化活性を増大又は低減する。好ましくは、かかる化合物は、軟骨細胞の同化及び／又は異化活性を、非処置軟骨細胞と比較して１．０倍を超えて、より好ましくは１．５〜５倍、最も好ましくは５〜１００倍、増大又は低減する。別の実施形態において、本発明の方法に従って同定される化合物は、変形性関節症に関連する少なくとも１つの症候及び／又は変化、例えば軟骨変性、又は疼痛、腫れ、脆弱性及び／又は、軟骨変性と関連する罹患関節における機能的能力の喪失を改善する。特定の実施形態において、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために投与される予防薬又は治療は、合成化合物若しくは天然生成物（例えば、植物抽出物又は細胞上清）、又は化合物の混合物である。
【０４５４】
本発明はまた、変形性関節症又はその症候の予防、治療、管理又は改善方法であって、本明細書中に記載のスクリーニング方法を利用して同定される１若しくは複数の化合物と１若しくは複数の他の治療（たとえば予防剤又は治療剤、及び外科手術）とを、それを必要としている被験体に施すことを含む方法を提供する。特定の実施形態において、そのような治療は、変形性関節症又はその症候の予防、治療、管理又は改善に現在使用されている、使用されていた、あるいは有用であることが知られているものである（それだけには限定されないが、以下のセクション５．２１．２に記載の予防剤又は治療剤）。本発明の併用療法の治療（たとえば予防剤又は治療剤）は、順次又は同時に施すことができる。具体的な実施形態では、本発明の併用療法は、本発明により同定された化合物と、前記化合物と同じ作用機構を有する少なくとも１つの他の治療とを含む。別の実施形態では、本発明の併用療法は、本発明の方法により同定された化合物と、前記化合物とは異なる作用機構を有する少なくとも１つの他の治療（たとえば予防剤又は治療剤）とを含む。本発明の併用療法は、相加又は相乗効果を有して化合物と一緒に機能することによって本発明の化合物の予防効果又は治療効果を改善する。本発明の併用療法は、それぞれの治療（たとえばそれぞれの予防剤又は治療剤）に関連する副作用を軽減させる。
【０４５５】
併用療法の予防剤又は治療剤は、同じ医薬組成物中に含めて被験体に投与することができる。あるいは、併用療法の予防剤又は治療剤は、別々の医薬組成物中で被験体に同時に投与することができる。予防剤又は治療剤は、同一又は異なる投与経路によって被験体に投与し得る。
【０４５６】
具体的な実施形態では、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイで同定される１又は複数の化合物を含む医薬組成物を、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために被験体、好ましくはヒトに投与する。本発明によれば、医薬組成物は、１又は複数の予防剤又は治療剤も含み得る。好ましくは、そのような薬剤は、変形性関節症又はその症候の予防、治療、管理又は改善に現在使用されている、使用されていた、あるいは有用であることが知られているものである。
【０４５７】
本発明によって同定される化合物は、変形性関節症の一連の治療の第１、第２、第３、第４又は第５治療として使用し得る。本発明は、このような変形性関節症の従来の治療に対して不応性の被験体において、変形性関節症又はその症候を治療、管理又は改善させる方法であって、本発明の方法によって同定される化合物を、予防上又は治療上有効な量の用量で前記被験体に投与することを含む方法を提供する。
【０４５８】
本発明は、ある変形性関節症の既存の単一薬剤治療に不応性の被験体における変形性関節症又はその症候の治療、管理又は改善方法であって、本発明によって同定される化合物の予防上又は治療上有効な量の用量と、予防上又は治療上有効な量の用量の１又は複数の他の治療（たとえば予防剤又は治療剤）とを前記被験体に投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、変形性関節症又の治療又は管理方法であって、本発明によって同定される化合物を、任意の他の治療（たとえば外科手術）と組み合わせて、他の治療に不応性であると証明されたが既にその治療を受けていない患者に投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、変形性関節症に罹患しており、以前に他の治療を受けたことが原因で免疫抑制状態にある患者の治療又は管理方法を提供する。本発明はまた、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、及び／若しくは生物学的療法／免疫療法では毒性がありすぎると証明されたか、又は証明され得る、すなわち、それらが治療又は管理される被験体にとって容認できないか、又は耐えられない副作用をもたらす場合に、変形性関節症を治療又は管理する別の方法を提供する。
【０４５９】
５．２１．１  変形性関節症又はその症候の予防、治療、管理又は改善に使用するための化合物
本発明の方法に従って、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理及び／又は改善するために用いることができる化合物の代表的な非限定的な例を以下に詳細に記載する。
【０４６０】
最初に、そのような化合物としては、例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質又はＲＮＡ産物の発現又は活性をダウンレギュレートすることができるアンチセンス、リボザイム又はトリプルヘリックス化合物が挙げられる。そのような化合物は、以下のサブセクションで詳細に記載する。
【０４６１】
第２に、そのような化合物としては、例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質若しくはＲＮＡ産物の発現又は本発明のバイオマーカーのタンパク質の活性をモジュレートすることができる抗体組成物が挙げられる。特定の実施形態において、抗体組成物は、本発明のバイオマーカーのタンパク質若しくはＲＮＡ産物の発現又は本発明のバイオマーカーのタンパク質の活性をダウンレギュレートする。そのような化合物は、以下のサブセクションで詳細に記載する。
【０４６２】
第３に、そのような化合物としては、例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物が挙げられる。本発明は、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するための、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物を模倣するように選択されたペプチド又はペプチド模倣物の使用を包含する。さらに、そのような化合物としては、例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質若しくはＲＮＡ産物の発現又は本発明のバイオマーカーのタンパク質の活性をモジュレートする可能性のあるドミナントネガティブポリペプチドが挙げられる。
【０４６３】
本方法はまた、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するための、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の誘導体、類似体及びフラグメントの使用を包含する。特に、本発明は、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するための、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の１以上のドメインを含む、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物のフラグメントの使用を包含する。別の特定の実施形態において、本発明は、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物、又はかかるタンパク質の類似体、誘導体若しくは断片であって、融合又はキメラタンパク質産物として発現されるもの（ペプチド結合を介して異種タンパク質配列に連結されたタンパク質、断片、類似体又は誘導体を含む）の使用を包含する。
【０４６４】
特定の実施形態において、本発明のバイオマーカーの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、又はそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために投与する。他の実施形態において、１又はそれ以上の本発明のバイオマーカーのタンパク質産物、又はその断片、類似体若しくは誘導体を、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために投与する。他の実施形態において、本発明のタンパク質産物に特異的に結合する１又はそれ以上の抗体を、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために投与する。他の実施形態において、１又はそれ以上のドミナントネガティブポリペプチドを、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために投与する。
【０４６５】
アンチセンス、リボザイム、トリプルヘリックス組成物
アンチセンス分子の代表的な非限定的な例には、表６に例示したものが含まれる。
【０４６６】
2007511738.tif 000006
2007511738.tif 000007
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【０４６７】
さらに、標準的な技術を使用して、本明細書に記載の方法の一部として使用するためのアンチセンス、トリプルヘリックス又はリボザイム分子を作製することができる。最初に、アンチセンス核酸分子、すなわち目的のポリペプチドをコードするセンス核酸に相補的な分子、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的な又はｍＲＮＡ配列に対し相補的な分子を作製するために、標準的な技術を使用しうる。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合しうる。アンチセンス核酸は、全長コード鎖又は一部のみ、例えばタンパク質コード領域（すなわちオープンリーディングフレーム）の全体又は一部に対し相補的でありうる。アンチセンス核酸分子は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域の全体又は一部に対してアンチセンスであってもよい。非コード領域（「５’及び３’非翻訳領域」）は、コード領域に隣接する５’及び３’配列であり、これはアミノ酸に翻訳されない。
【０４６８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０個の連続するヌクレオチド又はそれ以上の長さでありうる。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野で公知の方法を用いて、化学合成及び酵素連結反応を用いて構築しうる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチド又は分子の生物学的活性を高める若しくはアンチセンスとセンス核酸との間で形成される二本鎖の物理的安定性を高めるために設計された種々の修飾ヌクレオチドを用いて化学合成することができ、例えばホスホロチオエート誘導体、アクリジン置換ヌクレオチドを使用しうる。アンチセンス核酸を生成するために使用しうる修飾ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及び２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向にサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に作製しうる。（すなわち、挿入核酸から転写されるＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス配向となる）。
【０４６９】
アンチセンス核酸分子は、それが目的のポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡとハイブリダイズ又は結合して、それにより発現が阻害されるように（例えば転写及び／又は翻訳の阻害による）、被験体に投与される又はｉｎ  ｓｉｔｕで生成される。ハイブリダイゼーションは、例えばＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二本鎖の主な溝における特異的相互作用を介して、安定な二本鎖に対する慣用のヌクレオチド相補性によって生じる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織、例えば関節（例：膝、腰、肘、及び指関節）の部位への直接注射がある。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞に標的化されるよう修飾し、その後全身投与してもよい。例えば、全身投与については、アンチセンス核酸を、それらが選択した細胞（例えばＴ細胞又は軟骨細胞）表面上で発現される受容体又は抗原に特異的に結合するように、例えば細胞表面受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体にアンチセンス核酸分子を結合させることにより、修飾しうる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載のベクター、例えば遺伝子治療用ベクターを用いて細胞に送達しうる。十分なアンチセンス分子の細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌＩＩ又はｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に配置したベクター構築物が好ましい。
【０４７０】
目的のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子であってもよい。α−アノマー核酸分子は、通常のα単位（鎖が互いに並行している）とは対照的に相補的なＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641）。アンチセンス核酸分子はまた２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148）又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330）を含んでもよい。
【０４７１】
リボザイムは、相補的な領域を有する一本鎖核酸（ｍＲＮＡなど）を切断可能なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、標準的な技術を用いて生成することができる。したがって、リボザイム（例えばハンマーヘッド型リボザイム（Haselhoff and Gerlach, 1988, Nature 334: 585-591に記載））を用いて、ｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断し、それによりｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の翻訳を阻害しうる。目的のポリペプチドをコードする核酸分子に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示されるｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計しうる。例えば、テトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列が米国特許第４，９８７，０７１号及びCech et al.米国特許第５，１１６，７４２号において切断対象のヌクレオチド配列と相補的であるように構築される。あるいは、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択することができる。例えばBartel and Szostak, 1993, Science 261: 1411-1418参照。
【０４７２】
トリプルへリックス構造もまた、周知技術を用いて生成することができる。例えば、目的のポリペプチドの発現は、該ポリペプチドをコードする遺伝子の調節領域（例えばプロモーター及び／又はエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞において遺伝子の転写を妨害するトリプルへリックス構造を形成させることにより阻害することができる。一般的には、Helene, 1991, Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84 ; Helene, 1992, Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27-36 ; 及びMaher, 1992, Bioassays 14(12):807-15を参照。
【０４７３】
種々の実施形態において、核酸組成物は、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション又は可溶性を改善するために、塩基部分、糖部分又はリン酸骨格に修飾を行ってもよい。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成することができる（Hyrup et al., 1996, Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5-23参照）。本明細書において用いる用語「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」とは、核酸模倣物、例えばデオキシリボースリン酸骨格がプソイドペプチド骨格に置き換えられ、４つの天然核酸塩基のみが維持されているＤＮＡ模倣物を意味する。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡ及びＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを許容することが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyrup et al.,1996前掲 ; Perry-O'Keefe et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-675に記載されているような標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いて行うことができる。
【０４７４】
ＰＮＡは、例えばその安定性若しくは細胞取り込みを増強するために、親油性若しくは他のヘルパー基のＰＮＡへの付着により、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、あるいはリポソーム若しくは他の当技術分野で公知のドラッグデリバリーの技術の使用により、修飾することができる。例えば、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、ＰＮＡとＤＮＡの有利な特性を組み合わせて生成することができる。そのようなキメラにより、ＤＮＡ認識酵素（例えばＲＮＡｓｅＨ及びＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用することができるが、ＰＮＡ部分は高結合アフィニティ及び特異性を提供しうる。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基積層、核酸塩基間のいくつかの結合、及び配向に関して選択された適当な長さのリンカーを用いて連結しうる（Hyrup, 1996前掲）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Hyrup, 1996前掲、及びFinn et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63に記載のように行うことができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホルホロアミダイトカップリング化学及び修飾ヌクレオシド類似体を用いて固相支持体上で合成する。５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイトなどの化合物をＰＮＡとＤＮＡの５’末端との連結に用いることができる（Mag et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17: 5973-88）。ＰＮＡモノマーを段階的に連結して、５’ＰＮＡセグメントと３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（Finn et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24(17): 3357-63）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントと３’ＰＮＡセグメントを有するキメラ分子を合成することができる（Peterser et al., 1975, Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124）。
【０４７５】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、他の付属基、例えばペプチド（例：ｉｎ ｖｉｖｏにおける宿主細胞受容体の標的化のため）、細胞膜（例えば、Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556 ; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652 ; 国際公開第ＷＯ８８／０９８１０号参照）又は脳血管門（例えば国際公開第ＷＯ８９／１０１３４号参照）を横切る輸送を促進する薬物を含んでもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションにより引き起こされる切断薬剤（例えばKrol et al., 1988, Bio/Techniques 6: 958-976参照）又はインターカレート剤（例えばZon, 1988,Pharm. Res. 5: 539-549参照）で修飾してもよい。この目的のため、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションにより引き起こされる架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションにより引き起こされる切断薬剤とコンジュゲートしてもよい。
【０４７６】
抗体組成物
一実施形態において、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物の１又はそれ以上に特異的に結合する抗体は、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために、被験体、好ましくはヒトに投与する。別の実施形態において、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物の１又はそれ以上に特異的に結合する抗体の任意の組み合わせは、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために、被験体、好ましくはヒトに投与する。特定の実施形態において、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物の１又はそれ以上に特異的に結合する１又はそれ以上の抗体は、他の種類の治療（例えばＮＳＡＩＤＳ）と組み合わせて、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために、被験体、好ましくはヒトに投与する。特定の実施形態において、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物の１又はそれ以上と特異的に結合する、当技術分野で公知の抗体は、他の種類の治療（例えばＮＳＡＩＤＳ）と組み合わせて、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために、被験体、好ましくはヒトに投与する。他の実施形態において、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物の１又はそれ以上と特異的に結合する、当技術分野で公知の抗体は、他の種類の治療（例えばＮＳＡＩＤＳ）と組み合わせて、変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために、被験体、好ましくはヒトに投与しない。
【０４７７】
本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物の１又はそれ以上に特異的に結合する１又はそれ以上の抗体は、当業者に公知である種々の送達系を用いて、被験体、好ましくはヒトに投与することができる。例えば、そのような抗体は、リポソーム、微粒子又はマイクロカプセルに封入して投与することができる。例えば、米国特許第５，７６２，９０４号、米国特許第６，００４，５３４号、及び国際公開第ＷＯ９９／５２５６３号を参照のこと。さらに、そのような抗体は、抗体を発現可能な組換え細胞、又は、抗体を発現可能なレトロウイルス、他のウイルスベクター若しくは非ウイルスベクターを用いて投与しうる。
【０４７８】
本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物の１又はそれ以上に特異的に結合する抗体は、任意の公知の供与源から得ることができる。あるいは、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物の１又はそれ以上に特異的に結合する抗体は、抗体の合成のための当技術分野で公知の任意の方法、特に化学合成又は好ましくは組換え発現技術により作製することができる。
【０４７９】
抗体は、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（例えばBird et al. (1988) Science 242: 423-426 ; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883参照）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば本発明の抗Ｉｄ抗体）、並びに上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントを含む。本明細書において用いる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性を有するフラグメント、すなわち抗原結合部位を含む分子を意味する。免疫グロブリン分子は、任意の種（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであってもよい。免疫グロブリン分子の免疫学的活性を有するフラグメントとしては、抗体をペプシン又はパパインなどの酵素で処理することにより生成されうる、Ｆ（ａｂ）フラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント）、及びＦ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド架橋で連結した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）が挙げられる。免疫学的活性を有するフラグメントはまた、限定されるものではないが、Ｆｄフラグメント（ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる）、Ｆｖフラグメント（抗体の１つの腕のＶＬ及びＶＨドメインからなる）、ｄＡｂフラグメント（ＶＨドメインからなる；Ward etal., (1989) Nature 341: 544-546）、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。抗体と特異的に結合する抗体は、抗体の合成のための当技術分野で公知の任意の方法、特に化学合成又は好ましくは組換え発現技術により作製されうる。
【０４８０】
抗原に対して免疫特異的なポリクローナル抗体は、当技術分野で公知の様々な方法により製造することができる。例えば、ヒト抗原を、限定されるものでないが、ウサギ、マウス、ラットその他を含む様々な宿主動物に投与して、ヒト抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導することができる。宿主種に依存して様々なアジュバントを使用して、免疫応答を増加させてもよく、かかるアジュバントとしては、限定されるものでないが、フロイントのアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（bacille Calmette-Guerin)）及びコリネバクテリウム・パルブム（corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。かかるアジュバントもまた当技術分野では公知である。
【０４８１】
「単一特異性抗体」という用語は、単一の結合特異性と特定の標的（例えばエピトープ）に対するアフィニティを示す抗体を意味する。この用語には、モノクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組合せの利用を含む、当技術分野で公知の多種多様な技術を用いて調製することができる。例えば、米国特許ＲＥ３２，０１１号、同第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、同第４，４１１，９９３号及び同第４，１９６，２６５号；Kennett et al（編）Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press (1980)；Harlow and Lane（編）Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)を参照のこと（これらは参照により本明細書に組み入れられる）。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知であって、例えば、Harlowら, 「Antibodies: A Laboratory Manual」（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988)；Hammerlingら, 「Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas」 563-681（Elsevier, N.Y., 1981）（前記参考文献は、参照によりその全文が組み入れられる）に教示される方法をはじめとするハイブリドーマ技術を利用して製造することができる。モノクローナル抗体を構築するために、組換え技術によって抗体を作製することができる他の技法（例えば、techniques described by William D. Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281；L. Sastry et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5728-5732；及びMichelle Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology, 3: 1-9 (1990)に記載の技法。これはStratacyte, La Jolla, Calif.より市販の系を含む）を用いることも可能である。本明細書に用いる用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって製造される抗体に限定されるものではない。用語「モノクローナル抗体」は、それを製造する方法ではなく、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む単一クローンから得られる抗体を意味する。
【０４８２】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を製造しスクリーニングする方法は、当技術分野では日常的に利用されかつ公知である。簡単に説明すると、マウスを、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物を用いて免疫感作することができ、そして免疫応答が一度検出されれば（例えば、そのタンパク質に特異的な抗体がマウス血清中に検出されれば）、マウス脾臓を採取して脾細胞を単離する。次いでその脾細胞を公知の技術により任意の適当な骨髄腫細胞、例えばＡＴＣＣから入手しうる培養細胞株ＳＰ２０由来の細胞と、融合する。ハイブリドーマを選択し、限定希釈によりクローン化する。さらに、ＲＩＭＭＳ（複数部位の反復免疫）技法を用いて動物を免疫してもよい（Kilptrack et al.,1997, Hybridoma 16: 381-9、その全体を参照により組み入れる）。次いで、ハイブリドーマクローンを、当技術分野で公知の方法により、本発明のポリペプチドと結合できる抗体を分泌する細胞についてアッセイする。一般的に高レベルの抗体を含有する腹水液は、マウスを陽性ハイブリドーマクローンを用いて免疫感作することにより生成することができる。
【０４８３】
従って、本発明は、抗体を作製する方法及び本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む方法によって作製される抗体を提供するものであり、好ましくは、上記方法におけるハイブリドーマは、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物を用いて免疫感作したマウスから単離した脾細胞を骨髄腫細胞と融合し、次いで融合から得たハイブリドーマを、そのタンパク質又はタンパク質断片と結合しうる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングすることにより作製されるものである。
【０４８４】
本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、当業者に公知のいかなる技術により作製してもよい。例えば、本発明のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成する）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成する）などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断により生成することができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。さらに、本発明の抗体はまた、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することができる。
【０４８５】
ファージディスプレイ法においては、機能性抗体ドメインが、同ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面に提示される。特に、ＶＨ及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、罹患組織のヒト又はマウスｃＤＮＡライブラリー）から増幅する。ＶＨ及びＶＬドメインをコードするＤＮＡをＰＣＲによりｓｃＦｖリンカーと一緒に組換えて、ファージミドベクター中にクローニングする。そのベクターを大腸菌中にエレクトロポレーションして大腸菌をヘルパーファージに感染させる。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、ｆｄ及びＭ１３を含む繊維状ファージであり、ＶＨ及びＶＬドメインを通常、組換え法によりファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに融合させる。特定の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原により、例えば、標識した抗原又は固体表面若しくはビーズに結合若しくは捕獲された抗原を用いて、選択又は同定することができる。本発明の抗体を作製するために利用しうるファージディスプレイ法の例としては、Brinkmanら, 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50；Amesら, 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186；Kettleboroughら, 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958；Persicら, 1997, Gene 187:9-18；Burtonら, 1994, Advances in Immunology 57:191-280；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；国際公開ＷＯ９０／０２８０９号、ＷＯ９１／１０７３７号、ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９２／１８６１９号、ＷＯ９３／１１２３６号、ＷＯ９５／１５９８２号、ＷＯ９５／２０４０１号、及びＷ０９７／１３８４４号；並びに米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号、第５，９６９，１０８号に開示さ
れた方法が挙げられ、これらはそれぞれ参照によりその全文が本明細書に組み入れられる。
【０４８６】
以上の参考文献に記載の通り、ファージ選択の後、ファージからの抗体コード領域を単離し、さらにそれを使用して、ヒト抗体を含む全抗体、又は任意の他の所望の抗原結合フラグメントを作製し、それらを、例えば以下に記載のようにして、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主にて発現させることができる。組換え法によりＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを製造する技術はまた、国際公報ＷＯ９２／２２３２４号；Mullinaxら, 1992, BioTechniques 12 (6):864-869；Sawaiら, 1995, AJRI 34:26-34；並びにBetterら, 1988, Science 240:1041-1043（上記参考文献は参照によりその全文が組み入れられる）に開示された方法などの当技術分野で公知の方法を用いて、使用することができる。
【０４８７】
全抗体を作製するために、ＶＨ又はＶＬヌクレオチド配列、制限酵素切断部位、及び制限酵素切断部位を保護するフランキング配列を含むＰＣＲプライマーを用いて、ｓｃＦｖクローン中のＶＨ又はＶＬ配列を増幅することができる。当業者に公知のクローニング技術を利用して、ＰＣＲ増幅されたＶＨドメインをＶＨ定常領域、例えば、ヒトγ４定常領域を発現するベクター中にクローニングし、また、ＰＣＲ増幅したＶＬドメインをＶＬ定常領域、例えばヒトκ若しくはλ定常領域を発現するベクター中にクローニングすることができる。好ましくは、ＶＨ又はＶＬドメインを発現するベクターは、ＥＦ−１αプロモーター、分泌シグナル、可変ドメイン、定常ドメイン及びネオマイシンなどの選択マーカーに対するクローニング部位を含む。ＶＨ及びＶＬドメインを、必要な定常領域を発現する１つのベクター中にクローニングすることもできる。次いで、重鎖変換ベクター及び軽鎖変換ベクターを培養細胞株中に共トランスフェクトし、当業者に公知の技術を用いて、全長抗体、例えばＩｇＧを発現する安定した一過性の培養細胞株を作製する。
【０４８８】
ヒトにおける抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ使用、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出アッセイを含む複数の用途について、ヒト抗体又はキメラ抗体を使用することが好ましい場合がある。完全なヒト抗体は、ヒト被験体の治療のためには特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプレイ法を含む、当技術分野で公知の様々な方法により作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号及び第４，７１６，１１１号、；並びに国際公開ＷＯ９８／４６６４５号、ＷＯ９８／５０４３３号、ＷＯ９８／２４８９３号、Ｗ０９８／１６６５４号、ＷＯ９６／３４０９６号、ＷＯ９６／３３７３５号、及びＷＯ９１／１０７４１号も参照のこと；これらはそれぞれ参照によりその全文が本明細書に組み入れられる。
【０４８９】
抗体は、トランスジェニック動物により作製することも可能である。特に、ヒト抗体は、機能性の内因性免疫グロブリンを発現できないがヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて製造することができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、無作為に又は相同組換えによりマウス胚幹細胞中に導入してもよい。あるいは、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、及び多様性領域を、マウス胚性幹細胞中に導入してもよい。相同組換えによりヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入して、マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を別々に又は同時に非機能化してもよい。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失は内因性抗体産生を妨げる。改変した胚幹細胞を増殖させ、胚盤胞中にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作る。次いでキメラマウスを交配し、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を作る。そのトランスジェニックマウスを、通常の方式で、選択した抗原、例えば本発明のポリペプチドの全体若しくは部分を用いて、免疫感作する。その抗原に対するモノクローナル抗体を、免疫感作したトランスジェニックマウスから通常のハイブリドーマ技術を利用して得ることができる。トランスジェニックマウスによって保持されるヒト免疫グロブリントランスジーンはＢ細胞分化の際に再配列し、その後、クラススイッチ及び体細胞突然変異を受ける。従って、かかる技術を利用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体を製造することが可能である。ヒト抗体を製造するためのこの技術の総括については、Lonberg及びHuszar（1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93）を参照のこと。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を製造するためのこの技術並びにかかる抗体を製造するためのプロトコルの詳細な考察については、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み入れられる、国際公開ＷＯ９８／２４８９３号、ＷＯ９６／３４０９６号、及びＷＯ９６／３３７３５号；及び米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、及び第５，９３９，５９８号を参照のこと。さらに、Abgenix, Inc.（Freemont、CA）及びGenpharm（San Jose、CA）などの会社と、選択した抗原に対するヒト抗体を上記と類似の技術を利用して提供する契約を結ぶことができる。
【０４９０】
米国特許第５，８４９，９９２号は、例えば、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において抗体を発現する方法を記載している。乳汁特異的プロモーター及び目的の抗体と分泌のためのシグナル配列をコードする核酸を含むトランスジーンが構築されている。そのようなトランスジェニック哺乳動物の雌により産生される乳汁は、そこに分泌された目的の抗体を含む。該抗体は、乳汁から精製してもよいし、又は用途によっては直接乳汁を使用してもよい。
【０４９１】
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリンに由来する分子である。キメラ抗体を製造する方法は当技術分野で公知である。例えば、Morrison, 1985, Science 229:1202；Oiら, 1986, BioTechniques 4:214；Gilliesら, 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202；並びに米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、第４，８１６，３９７号、及び第６，３３１，４１５号（これらは本明細書に参照によりその全文が組み入れられる）を参照のこと。
【０４９２】
ヒト化抗体は、所定の抗原と結合することができ、そして実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するフレームワーク及び実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗体又はその変異体若しくはそのフラグメントである。ヒト化抗体は、実質的に少なくとも１つの、そして典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）を含み、ここでＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域と対応しかつフレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である。好ましくは、ヒト化抗体はまた、少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部分を含む。通常、抗体は軽鎖並びに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有するであろう。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４域を含んでもよい。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む免疫グロブリンのいずれのクラス、及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むいずれのイソ型から選択してもよい。通常、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞傷害活性を示すことが所望される補体固定定常ドメインであり、かつクラスは典型的にはＩｇＧ１である。かかる細胞傷害活性が所望でない場合、定常ドメインはＩｇＧ２クラスである。ヒト化抗体は１以上のクラス又はイソ型からの配列を含んでもよく、そして所望のエフェクター機能を最適化するための特定の定常ドメインの選択は当技術分野の通常の技術に包含されている。ヒト化抗体のフレームワーク及びＣＤＲ領域は正確に親配列に対応する必要はなく、例えば、ドナーＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークは少なくとも１つの残基の置換、挿入又は欠失により突然変異されていてその部位におけるＣＤＲ又はフレームワーク残基がコンセンサス又はインポート抗体に対応しないようにしてもよい。しかしかかる突然変異は広汎なものではないであろう。通常、親フレームワーク及びＣＤＲ配列の残基と対応しうるヒト化抗体残基は、少なくとも７５％、さらにしばしば９０％、そして最も好ましくは９５％超であろう。ヒト化抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて製造することができ、そのような技術としては、限定されるものでないが、ＣＤＲグラフト（例えば、欧州特許ＥＰ２３９，４００号；国際公開ＷＯ９１／０９９６７号；及び米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号参照）、ベニアリング（veneering）又は再表面形成（resurfacing）（例えば、欧州特許EP 592,106；EP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5):489-498；Studnickaら, 1994, Protein Engineering 7 (6):805-814；及びRoguskaら, 1994, PNAS 91:969-973参照）、及びチェーンシャッフリング（chain shuffling）（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号参照）、並びに、例えば、米国特許第６，４０７，２１３号、第５，７６６，８８６号、国際公開ＷＯ９３／１７１０５号、Tanら, J. Immunol. 169:1119-25 (2002)、Caldasら, タンパク質 Eng. 13(5):353-60 (2000)、Moreaら, Methods 20(3):267-79 (2000)、Bacaら, J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997)、Roguskaら, タンパク質 Eng. 9(10):895-904 (1996)、Coutoら, Cancer Res. 55(23 Supp):5973s-5977s (1995)、Coutoら, Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995)、Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994)、及びPedersenら, J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994)に開示された技術が挙げられる。しばしば、フレームワーク領域のフレームワーク残基を、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基によって置換して、抗原結合を改変し、好ましくは改良する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用をモデル化して抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定し、さらに配列比較により特定位置の異常なフレームワーク残基を同定することによって確認する（例えば、本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Queenら, 米国特許第５，５８５，０８９号；及びRiechmannら, 1988, Nature 332:323を参照）。
【０４９３】
単一ドメイン抗体、例えば軽鎖を欠損する抗体は、当技術分野で公知の方法により作製することができる。Riechmann et al., 1999, J. Immune. 231: 25-38；Nuttall et al., 2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3): 253-263；Muylderman, 2001, J. Biotechnol. 74(4): 277-302；米国特許第６，００５，０７９号；並びに国際公開ＷＯ９４／０４６７８号、ＷＯ９４／２５５９１号及びＷＯ０１／４４３０１号を参照のこと（それぞれ、その全体を参照により本明細書に組み入れる）。
【０４９４】
さらに、今度は、抗原と特異的に結合する抗体を使用し、当業者に公知の技術を用いて、抗原を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を作製することができる（例えば、Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7 (5):437-444；及びNissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8):2429-2438を参照）。そのような抗体は、単独で又は他の治療と組み合わせて、変形性関節症又はその症候の予防、治療、管理又は改善に用いることができる。
【０４９５】
本発明は、抗原と特異的に結合する抗体又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、高いストリンジェンシー、中度の若しくは低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
【０４９６】
ポリヌクレオチドを得て、当技術分野で公知のいずれかの方法によりポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。公知の抗体をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の方法を利用して（すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られるヌクレオチドコドンを、抗体をコードする核酸を生成するように組み立てて）決定することができる。抗体をコードするかかるポリヌクレオチドは、化学合成したオリゴヌクレオチドから組み立てることができ（例えば、Kutmeierら, 1994, BioTechniques 17:242に記載の通り）、これは、簡単に説明すると、抗体、そのフラグメント又は変異体をコードする配列の一部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーション、次いでライゲートしたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を伴う。
【０４９７】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドを、好適な起源由来の核酸から作製することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手できなくても、その抗体分子の配列が既知であれば、その免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成することができるし、あるいは、適当な起源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー若しくはそれから作製したｃＤＮＡライブラリー、それから単離した核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ、本発明の抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞などの、抗体を発現する任意の組織若しくは細胞）からその配列の３’及び５’末端にハイブリダイズする合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅によるか、又は、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて、例えばｃＤＮＡライブラリーから前記抗体をコードするｃＤＮＡクローンを同定してクローニングすることにより、取得することができる。ＰＣＲにより作製された増幅核酸は、次いで、当技術分野で公知の方法を用いて複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることができる。
【０４９８】
抗体のヌクレオチド配列が一度決定されると、抗体のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の遺伝子操作に関する当技術分野で公知の方法、例えば組換えＤＮＡ技術、位置指定突然変異、ＰＣＲなど（例えば、Sambrookら, 1990, 「分子クローニング、研究室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY、及びAusubelら, 編, 1998, 「分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, John Wiley & Sons, NY、に記載の技術を参照、これらの文献は本明細書に参照によりその全文が組み入れられる）を用いて遺伝子操作して、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製し、例えばアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を創出することができる。
【０４９９】
本発明の抗体分子、抗体の重鎖若しくは軽鎖、又はそのフラグメント（好ましくは重鎖若しくは軽鎖可変ドメインを含むが、必ずしも必要ではない）をコードするポリヌクレオチドを得た後、抗体分子の作製用のベクターを、当技術分野で周知の技法を用いて組換えＤＮＡ技術により作製しうる。
【０５００】
１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、哺乳動物において作製する。クローン抗体又はその抗原結合性フラグメントを発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、Urlaub and Chasin （1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220）に記載のＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用するためのｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞、例えばKaufman and Sharp（1982, Mol. Biol. 159: 601-621）に記載のものなど、リンパ球細胞系、例えばＮＳ０ミエローマ細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、並びにトランスジェニック動物（例えばトランスジェニック哺乳動物）に由来する細胞が含まれる。例えば、細胞は乳房上皮細胞である。
【０５０１】
多様な免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、追加的な配列、例えば宿主細胞中でベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）、及び選択マーカー遺伝子などを有してもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号及び同第５，１７９，０１７号参照）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に薬剤（Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキセートなど）に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅によりｄｈｆｒ−宿主細胞に使用するため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。
【０５０２】
本発明の抗体、又はその抗原結合性部分の組換え発現のための系の例において、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによりｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内では、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子はそれぞれ、遺伝子の高レベルの転写を駆動するためにエンハンサー／プロモーター調節エレメントと機能的に連結する（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなど、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメント、又はＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントなどにより駆動される）。組換えはまた、メトトレキセート選択／増幅を利用して、ベクターで形質転換されたＣＨＯ細胞を選択するためのＤＨＦＲ遺伝子を有していてもよい。選択された形質転換宿主細胞を、抗体重鎖及び軽鎖の発現が可能なように培養し、その培養培地から完全な抗体を回収する。組換え、宿主細胞のトランスフェクト、形質転換体の選択、宿主細胞の培養及び培養培地からの抗体の回収のために標準的な分子生物学的手法を用いる。例えば、いくつかの抗体は、プロテインＡ又はプロテインＧを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより単離することができる。
Ｆｃドメインを含む抗体に関しては、抗体作製系、好ましくはＦｃ領域がグリコシル化されている抗体を合成する。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメインのアスパラギン２９７でグリコシル化される。このアスパラギンは、二分岐型オリゴ糖による修飾部位である。このグリコシル化は、Ｆｃγ受容体及び補体Ｃｌｑにより媒介されるエフェクター機能に必要であることが証明されている（Burton and Woof, 1992, Adv. Immunol. 51: 1-84 ; Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163: 59-76）。好ましい実施形態において、Ｆｃドメインは、アスパラギン２９７に対応する残基を適当にグリコシル化する哺乳動物発現系において生成する。Ｆｃドメインはまた、真核生物翻訳後修飾を含んでもよい。
【０５０３】
抗体分子が組換え発現により一旦産生されれば、抗体分子は、免疫グロブリン分子を精製するための当技術分野で公知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、特に、プロテインＡの後の特異的抗原に対する親和性、及びサイズ分離カラムクロマトグラフィ）により、遠心分離、溶解度差（differential solubility）により、又はタンパク質を精製する他の任意の標準技術により、精製することができる。さらに、抗体又はそのフラグメントを、精製を容易にする当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列と融合させてもよい。
【０５０４】
遺伝子治療技術
遺伝子治療とは、発現された又は発現可能な核酸の被験体への投与により実施される治療を意味する。当技術分野で利用可能な遺伝子治療の方法のいずれをも本発明に従って用いることができる。その方法の例を以下に説明する。
【０５０５】
特定の実施形態において、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーに対する１又はそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、遺伝子治療によって変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために投与する。他の実施形態において、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物の１又はそれ以上に特異的に結合する１又はそれ以上の抗体をコードするヌクレオチドを含む１又はそれ以上の核酸分子を、遺伝子治療によって変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために投与する。他の実施形態においては、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物、又はそれらの類似体、誘導体、若しくはフラグメントをコードするヌクレオチドを含む１又はそれ以上の核酸分子を、遺伝子治療によって変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために投与する。また別の実施形態においては、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物の１又はそれ以上のドミナントネガティブポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む１又はそれ以上の核酸分子を、遺伝子治療によって変形性関節症又はその症候を予防、治療、管理又は改善するために投与する。
【０５０６】
遺伝子治療の方法の総説については、Goldspielら、1993, Clinical Pharmacy 12:488-505；WuとWu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, Science 260:926-932 (1993)；及びMorganとAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215を参照されたい。使用可能な組換えDNA技術の分野で一般的に公知の方法は、Ausubelら（編）、Current Protocols in Molecular Biology, ジョンワイリーアンドサンズ（John Wiley & Sons）、ニューヨーク（1993）；及びKriegler, 「遺伝子移動と発現、実験室マニュアル（Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual）」, ストックトンプレス（Stockton Press）、ニューヨーク（1990）に記載されている。
【０５０７】
一態様において、本発明の組成物は、本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーのタンパク質産物の１又はそれ以上に特異的に結合する１又はそれ以上の抗体をコードする核酸配列であって、好適な宿主において１又はそれ以上の抗体を発現する発現ベクターの一部である核酸配列を含む。特に、かかる核酸配列は、該抗体と機能的に連結されたプロモーターであって、誘導性又は構成的（場合によっては組織特異的）プロモーターを有する。
【０５０８】
別の態様において、本発明の組成物は、適当な宿主中で本発明の１又はそれ以上のバイオマーカーの１又はそれ以上のたんぱく質産物のドミナントネガティブポリペプチドを発現する発現ベクターの一部である、該ドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸配列を含む。特にそのような核酸配列は、該ドミナントネガティブポリペプチドと機能的に連結されたプロモーターであって、誘導性又は構成的（場合によっては組織特異的）プロモーターを有する。別の特定の実施形態において、ドミナントネガティブコード配列及び他の所望の配列に隣接して、ゲノム中の所望の部位で相同的組換えを促進する領域が存在する核酸分子が使用され、こうしてドミナントネガティブ核酸の染色体内発現が提供される（KollerとSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；Zijlstraら、1989, Nature 342:435-438）。
【０５０９】
患者への核酸の送達は、被験者が核酸又は核酸運搬ベクターに直接暴露される直接的であってもよいし、あるいは細胞をまず核酸でｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質転換し次に患者に移植される間接的でであってもよい。これらの２つのアプローチは、それぞれｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療として知られている。
【０５１０】
具体的な実施形態において、核酸配列は、発現されてコードされる生成物を産生する場所に直接ｉｎ  ｖｉｖｏで投与される。これは、当該分野で公知の多くの方法の任意のものを使用して、例えば、適切な核酸の一部として発現ベクターを構築し、そして、欠陥若しくは弱毒化レトロウイルス若しくは他のウイルスベクターを使用する感染（米国特許第４，９８０，２８６号）により、又は裸のＤＮＡの直接注入により、又は微粒子衝撃（例えば、遺伝子銃；Biolistic、デュポン（Dupont））の使用により、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクション物質、リポソーム、微粒子、若しくはマイクロカプセル中に封入して被覆することにより、又は核に入ることが知られているペプチドと連結して投与することにより、又はリガンド対象に連結して受容体介在エンドサイトーシスに投与する（例えば、WuとWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432）（これは、受容体を特異的に発現する種類細胞を標的化するために使用することができる）ことなどにより、細胞内になるように投与する。別の実施形態において、リガンドがエンドソームを破壊する膜融合ウイルスペプチドを含む核酸−リガンド複合体を形成することができ、核酸がリソソーム分解を避けることを可能にする。さらに別の実施形態において核酸は、特異的受容体を標的化することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞特異的取り込みと発現に対して標的化することができる（例えば、１９９２年４月１６日付の国際特許公報ＷＯ９２／０６１８０号（Wu et al.）；１９９２年１２月２３日付のＷＯ９２／２２６３５号（Wilson et al.）；１９９２年１１月２６日付のＷＯ９２／２０３１６号（Findeis et al.）；１９９３年７月２２日付のＷＯ９３／１４１８８号（Clarke et al.）；１９９３年１０月１４日付のＷＯ９３／２０２２１号（Yound）を参照）。あるいは核酸は、相同的組換えによる発現のために、細胞内に導入され宿主細胞ＤＮＡ内に取り込むことができる（KollerとSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；及びZijlstraら、1989, Nature 342:435-438）。
【０５１１】
例えばレトロウイルスベクターを使用することができる。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングと、宿主細胞ＤＮＡ内への組み込みに必要ではないレトロウイルス配列を除去するように改変されている。遺伝子治療で使用される目的の抗体、又は目的のタンパク質若しくはその断片をコードする核酸配列は１つ以上のベクター中にクローン化され、これは患者への遺伝子の送達を促進する。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、Boesenら、1994, Biotherapy 6:291-302に記載され、これは、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために造血幹細胞へｍｄｒ１遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示する他の文献には以下がある：Clowesら、1994, J. Clin. Invest. 93:644-651；Kleinら、1994, Blood 83:1467-1473；SalmonsとGunzberg、1993, Hum. Gene Therapy 4:129-141；及びGrossmanとWilson、1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114。
【０５１２】
アデノウイルスは、遺伝子治療で使用できる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、気道上皮に遺伝子を送達するための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは天然には気道上皮に感染し、ここで軽い疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系の他の標的は肝臓、中枢神経系、内皮細胞、及び筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染できるという利点を有する。KozarskyとWilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の総説を提供する。Boutら、1994, Hum. Gene Therapy 5:3-10は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイルスベクターの使用を証明した。遺伝子治療におけるアデノウイルス使用の他の例は、Rosenfeldら、1991, Science 252:431-434；Rosenfeldら、1992, Cell 68:143-155；Mastrangeliら、1993, J. Clin. Invest. 91:225-234；PCT公報WO94/12649；及びWangら、1995, Gene Therapy 2:775-783に記載されている。好適な実施形態においてアデノウイルスベクターが使用される。
【０５１３】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）もまた、遺伝子治療での使用が提唱されている（Walshら、1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300；及びUS Patent No. 5,436,146）。
【０５１４】
遺伝子治療への他のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム介在トランスフェクション、又はウイルス感染のような方法により、組織培養の細胞に遺伝子を移動することを含む。通常、移動の方法は、細胞への適当なマーカーの移動を含む。次に細胞を選択条件に置いて、移動した遺伝子を取り込み発現している細胞を単離する。次にこれらの細胞を被験者に送達する。
【０５１５】
この実施形態において、核酸を細胞に導入後、生じる組換え細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで投与する。そのような導入は、当該分野で公知の任意の方法、特に限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入法、核酸配列を含有するウイルスベクター若しくはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体介在遺伝子移動、マイクロセル介在遺伝子移動、スフェロプラスト融合などにより、行うことができる。細胞への外来遺伝子の導入のために、当該分野で多くの方法（例えば、LoefflerとBehr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618；Cohenら、1993, Meth. Enzymol. 217:618-644；Cline. Pharma. Ther. 29:69-92 (1985)）が知られており、本発明で使用できるが、ただし受容体細胞の必要な成長機能と生理学的機能は破壊されていないものとする。この方法は細胞への核酸の安定な移動を提供するはずであり、その結果核酸は発現可能であり、好ましくはその細胞子孫により遺伝可能かつ発現可能である。
【０５１６】
生じる組換え細胞は、当該分野で公知の種々の方法により患者に送達することができる。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞又は前駆細胞）及び／又は軟骨細胞は、好ましくは静脈内投与される。使用が企図される細胞の量は、限定されるものではないが所望の作用、患者の状態などに依存し、当業者が決定することができる。
【０５１７】
遺伝子治療が目的で核酸が導入される細胞は、任意の所望の利用できる種類の細胞を包含し、特に限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、血液細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球）、特に造血幹細胞若しくは前駆細胞中の種々の幹細胞若しくは前駆細胞（例えば骨髄から得られるようなもの、臍帯血、末梢血、胎児肝など）がある。好適な実施形態において、遺伝子治療で使用される細胞は被験者に対して自己由来である。
【０５１８】
遺伝子治療で組換え細胞が使用される一実施形態において、目的の抗体又は目的のタンパク質若しくはその断片をコードする核酸配列が細胞中に導入され、その結果これらは、細胞若しくはその子孫により発現され、次に組換え細胞は治療作用のためにｉｎ  ｖｉｖｏで投与される。具体的な実施形態において幹細胞又は前駆細胞が使用される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単離でき維持できる任意の幹細胞及び／又は前駆細胞は、本発明のこの実施形態で使用できる可能性がある（例えば、１９９４年４月２８日付の国際公報ＷＯ９４／０８５９８号；StempleとAnderson, 1992, Cell 71:973-985；Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:29；及びPittelkowとScott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771を参照）。
【０５１９】
目的の抗体、目的のタンパク質又はそれらのフラグメントをコードする核酸配列の発現を制御するために用いることができるプロモーターは、構成性、誘導性又は組織特異的のいずれであってもよい。非限定的な例としては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端リピートに含まれるプロモーター（Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42）、原核生物発現ベクター、例えばβラクタマーゼプロモーターなど（Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731）、又はｔａｃプロモーター（DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25、また、”Useful Proteins from recombinant bacteria” Scientific American, 1980, 242: 74-94も参照）；植物発現ベクター、例えばノパリンシンターゼプロモーター領域（Herrera-Estrella et al., Nature 303: 209-213）又はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（Gardner et al.,1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871）、及び光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310: 115-120）；酵母又は他の真菌由来のプロモーターエレメント、例えばＧａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、及び以下の組織と特異性を示し、トランスジェニック動物において用いられている動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性を有するエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646 ; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409 ; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515）、膵臓β細胞において活性を有するインスリン遺伝子制御領域（Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122）、リンパ細胞において活性を有する免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658 ; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538 ; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444）、精巣、乳房、リンパ及び肥満細胞において活性を有するマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495）、肝臓において活性を有するアルブミン遺伝子制御領域（Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276）、肝臓において活性を有するαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648 ; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58）、肝臓において活性を有するα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelsey et al., 1987, Genes and Devel.1: 161-171）、骨髄細胞において活性を有するβグロビン遺伝子制御領域（Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340 ; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94）、脳内の乏突起膠細胞において活性を有するミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712）、骨格筋において活性を有するミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Sani, 1985, Nature 314: 283-286）、並びに視床下部において活性を有する性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378）が挙げられる。
【０５２０】
特定の実施形態において遺伝子治療が目的で導入される核酸は、コード領域に機能できる形で結合した誘導性プロモーターを含み、その結果核酸の発現は、転写の適切なインデューサーの有無を制御することにより調節される。
【０５２１】
５．２１．２  抗炎症治療
抗炎症薬は、変形性関節症の治療、管理及び改善に成功を収め、現在では一般的で、そのような障害の標準的治療となっている。当業者に周知のいかなる抗炎症薬をも本発明の組成物及び方法に用いることができる。抗炎症薬の例には、限定されるものではないが、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド性抗炎症薬、βアゴニスト、抗コリン作動薬及びメチルキサンチンが挙げられる。ＮＳＡＩＤの例には、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸＴＭ）、ジクロフェナク（ＶＯＬＴＡＲＥＮＴＭ）、エトドラク（ＬＯＤＩＮＥＴＭ）、フェノプロン（ＮＡＬＦＯＮＴＭ）、インドメタシン（ＩＮＤＯＣＩＮＴＭ）、ケトロラク（ＴＯＲＡＤＯＬＴＭ）、オキサプロジン（ＤＡＹＰＲＯＴＭ）、ナブメトン（ＲＥＬＡＦＥＮＴＭ）、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬＴＭ）、トルメチン（ＴＯＬＥＣＴＩＮＴＭ）、ロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸＴＭ）、ナプロキセン（ＡＬＥＶＥＴＭ、ＮＡＰＲＯＳＹＮＴＭ）、ケトプロフェン（ＡＣＴＲＯＮＴＭ）、及びナブメトン（ＲＥＬＡＦＥＮＴＭ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのようなＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ酵素（例えば、ＣＯＸ−１及び／又はＣＯＸ−２）を阻害することによって機能する。ステロイド性抗炎症薬の例には、グルココルチコイド、デキサメサゾン（ＤＥＣＡＤＲＯＮＴＭ）、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニソン（ＤＥＬＴＡＳＯＮＥＴＭ）、プレドニソロン、トリアムシノロン、アザルフィジン、及びエイコサノイド（例えば、プロスタグランジン、トロンボキサン、及びロイコトリエンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０５２２】
５．２２  医薬組成物
本発明の方法を用いて同定される、生物学的に活性な化合物又は薬学的に許容されるその塩を、変形性関節症に罹患している患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与することができる。具体的な実施形態では、化合物又は薬学的に許容されるその塩を、患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくは変形性関節症の次のステージ、すなわち軽度、中程度、顕著又は重篤のステージに罹患したヒトに投与する。別の実施形態において、化合物又は薬学的に許容されるその塩は、患者、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトに、変形性関節症に対する予防措置として投与する。これらの実施形態においては、患者は、子供、成人又は高齢者のいずれでもよく、「子供」は２４ヶ月齢から１０歳の年齢の被験者、「成人」は１８歳以上の被験者、そして「高齢者」は６５歳以上の被験者である。
【０５２３】
患者に投与する場合、化合物又は薬学的に許容されるその塩は、場合によっては薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物の構成要素として投与することが好ましい。組成物は、経口的に、又は任意の他の都合のよい経路（たとえば点滴若しくはボーラス注射、上皮若しくは粘膜皮膚の内面（たとえば、口腔粘膜、直腸、及び腸管粘膜など）を介した吸収）によって投与することができ、別の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与し得る。投与は全身性又は局所的であることができる。様々な送達系（たとえばリポソーム、微粒子、ミクロカプセル、カプセルへのカプセル封入など）が公知であり、化合物及び薬学的に許容されるその塩を投与するために使用することができる。
【０５２４】
投与方法としては、それだけには限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸から、吸入によって、又は特に耳、鼻、眼、若しくは皮膚へ局所的な投与が挙げられる。投与方法は専門家の裁量に任される。ほとんどの場合、投与の結果、化合物又は薬学的に許容されるその塩が血流中に放出される。
【０５２５】
具体的な実施形態では、化合物又は薬学的に許容されるその塩を局所的に投与することが望まれ得る。限定しないが、これは、たとえば手術中の局所注入によって、局所適用（たとえば手術後に創傷包帯と組み合わせて）、注射によって、カテーテルによって、坐薬によって、あるいはシラスティック膜などの膜を含めた多孔性、非多孔性、若しくはゼラチン状材料又は線維からなる移植物によって行ってもよい。特定の実施形態において、化合物は、変形性関節症に罹患した関節に局所投与する。
【０５２６】
特定の実施形態では、化合物又は薬学的に許容されるその塩を、脳室内、くも膜下腔内及び硬膜外注射を含めた任意の適切な経路によって中枢神経系内に導入することが望まれ得る。脳室内注射は、たとえばオンマヤリザーバー（Ommaya reserver）などのリザーバーに接続した脳室内カテーテルによって容易になるかもしれない。
【０５２７】
たとえば吸入器又は噴霧器を用い、かつエアロゾル化剤と共に製剤化することによるか、又は炭化フッ素若しくは合成肺サーファクタント中での灌流を介した肺投与を用いることもできる。特定の実施形態では、化合物及び薬学的に許容されるその塩は、慣用の結合剤及びトリグリセリドなどのビヒクルを用いて、坐薬として製剤化することができる。
【０５２８】
別の実施形態では、化合物及び薬学的に許容されるその塩を、小胞、特にリポソーム中で送達することができる（Langer、1990、Science、249:1527-1533；Treat他、Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer、Lopez-Berestein及びFidler (編)、Liss、New York、353-365ページ(1989)；Lopez-Berestein、同書、317-327ページを参照；一般に同書を参照）。
【０５２９】
さらに別の実施形態では、化合物及び薬学的に許容されるその塩を徐放系で送達することができる（たとえばGoodson、Medical Applications of Controlled Release、上記、第2巻、115-138ページ(1984)参照）。Langer、1990、Science、249:1527-1533による総説に記載の他の徐放系を使用してもよい。一実施形態では、ポンプを使用し得る（Langer、上記；Sefton、1987、CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.、14:201；Buchwald他、1980、Surgery、88:507；Saudek他、1989、N. Engl. J. Med.、321:574参照）。別の実施形態では、高分子物質を使用することができる（Medical Applications of Controlled Release、Langer及びWise (編)、CRC Pres.、Boca Raton、Florida (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance、Smolen及びBall (編)、Wiley、New York (1984)；Ranger及びPeppas、1983、J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem.、23:61参照；Levy他、1985、Science、228:190；During他、1989、Ann. Neurol.、25:351；Howard他、1989、J. Neurosurg.、71:105も参照）。さらに別の実施形態では、徐放系を化合物又は薬学的に許容されるその塩の標的ＲＮＡの近傍に配置することができ、これにより全身用量の一部しか必要でなくなる。
【０５３０】
本明細書に記載の化合物は、投与に好適な医薬組成物中に配合しうる。かかる組成物は、典型的に、活性化合物及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書において用いる用語「薬学的に許容される担体」は、医薬投与に適合性の溶媒、分散媒体、被膜、抗細菌剤及び抗菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などのいずれか及び全てを含むことが意図される。薬学的活性を有する物質についての係る媒体及び薬物の使用は当技術分野で周知である。慣用の媒体又は薬物が活性化合物と適合しないことを除いて、組成物中のそれらの使用が意図される。追加の活性化合物もまた組成物中に配合しうる。
【０５３１】
本発明は、目的のポリペプチド又は核酸の発現又は活性を調節するための医薬組成物の製造方法を含む。かかる方法は、薬学的に許容される担体を、目的のポリペプチド又は核酸の発現又は活性を調節する薬物と共に製剤化することを含む。かかる組成物はさらに追加の有効薬剤を含んでもよい。したがって、本発明はさらに、薬学的に許容される担体を、目的のポリペプチド又は核酸の発現又は活性を調節する薬物及び１以上の追加の活性化合物と共に製剤化することを含む、医薬組成物の製造方法を包含する。
【０５３２】
本発明の医薬組成物は、意図する投与経路に適合するように製剤化する。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。静脈内投与が好ましい。非経口、皮内又は皮下投与に用いられる溶液又は懸濁液は、以下の成分を含みうる。すなわち、滅菌希釈剤（注射用液、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒など）、抗細菌剤（ベンジルアルコール又はメチルパラベンなど）、抗酸化剤（アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなど）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸など）、バッファー（酢酸、クエン酸、リン酸など）、等張性の調整のための薬剤（塩化ナトリウム又はデキストロースなど）。ｐＨは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて調節しうる。非経口用調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ又は多用量バイアル（ガラス又はプラスチック製）に入れることができる。
【０５３３】
注射用途に好適な医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）、又は分散液、及び注射可能な滅菌液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与のために、好適な担体としては、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＳＴＳ（BASF ; Parsippany, NJ）、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌である必要があり、シリンジ操作が容易な程度に液体である必要がある。また、製造及び貯蔵条件下で安定であり、微生物（細菌及び真菌など）の混入作用に対して抑制されている必要がある。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロプレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒体でありうる。適当な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒子径の維持、サーファクタントの使用により維持することができる。微生物による作用の抑制は、種々の抗細菌剤及び抗菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成しうる。多くの場合、等張性剤、例えば糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、塩化ナトリウムなどを組成物中に含有されることが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬物、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることにより達成しうる。
【０５３４】
滅菌の注射可能な溶液は、活性化合物（例えばポリペプチド又は抗体）の必要量を、必要であれば上記列挙した成分の１つ又は組み合わせとともに、適当な溶媒中に導入し、滅菌濾過を行うことにより調製することができる。一般的には、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒体と上記列挙した必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに導入することにより調製する。滅菌の注射可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥と凍結乾燥であり、既に滅菌濾過した溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を得る。
【０５３５】
経口用組成物は、一般的には不活性希釈剤又は食用担体を含む。これらは、ゼラチンカプセル中に封入されるか又は圧縮して錠剤にしうる。治療の経口投与の目的で、活性化合物は、賦形剤と共に配合し、錠剤、トローチ剤又はカプセル剤の剤形で使用する。経口用組成物はまた、マウスウォッシュとして使用するための液体担体を用いて調製してもよく、この場合、液体担体中の化合物は経口投与され、局所使用され、喀痰又は嚥下される。
【０５３６】
薬学的に適合性の結合剤及び／又はアジュバント物質が組成物の一部として組み込まれてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか又は類似の性質を有する化合物を含みうる：すなわち、結合剤（微晶質セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンなど）、賦形剤（スターチ又はラクトースなど）、崩壊剤（アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、又はコーンスターチなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、又はＳｔｅｒｏｔｅなど）、流動促進剤（コロイド状二酸化ケイ素）、甘味剤（スクロース又はサッカリンなど）、あるいは着香料（ペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジフレーバーなど）。
【０５３７】
吸入による投与の場合、化合物は、好適な噴射剤（例えば二酸化炭素などの気体）を含む加圧容器若しくはディスペンサー、又は噴霧器からエーロゾルスプレーの形態で送達される。
【０５３８】
経粘膜又は経皮手段による全身投与も可能である。経粘膜又は経皮投与のため、透過させようとする障壁（門）に適当な浸透剤を製剤中で使用する。かかる浸透剤は当技術分野で一般的に知られており、例えば、経粘膜投与に関しては界面活性剤、胆汁塩及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔スプレー又は座剤の使用によって達成することができる。経皮投与のために、活性化合物を、当技術分野で一般的に知られている軟膏（ointment）、軟膏（salve）、ゲル又はクリームに製剤化する。
【０５３９】
化合物はまた、直腸送達のために座剤（例えば慣用の座剤用基剤、ココアバター及び他のグリセリドなどと共に）又は停留浣腸の剤形で調製してもよい。
【０５４０】
一実施形態において、活性化合物は、体内からの迅速な排除に対して化合物を防御しうる担体と共に、制御放出製剤（埋込剤及びマイクロカプセル化送達系を含む)として調製される。生分解性、生体適合性のポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などを用いることも可能である。そのような組成物の調製方法は、当業者には明らかである。材料はまた、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals, Inc.から市販品を入手することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を感染させた細胞に標的化するリポソームを含む）はまた、薬学的に許容される担体として用いることも可能である。これらは、当業者に公知の方法、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載の方法に従って調製することができる。
【０５４１】
投与の簡便性及び投与量の均一性のため、投与単位剤形で経口又は非経口組成物を製剤化することが特に利点がある。本明細書において用いる、投与単位剤形とは、処置対象の被験体について単一の投与量として好適な物理的に別個の単位を意味し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された活性化合物の固有の特性に応じて異なりうる。本発明の投与単位剤形について本明細書は、活性化合物の固有の特徴、達成すべき特定の治療効果、並びに個体の治療のための活性化合物などの配合に関する当技術分野の制限によって決定され、それに直接依存している。
【０５４２】
抗体に関しては、好ましい投与量は、体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜１００ｍｇ（より好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１〜２０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり０．１〜１０ｍｇ、又は体重１ｋｇ当たり０．１〜１．０ｍｇ）である。抗体が脳内で作用する場合には、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの投与量が通常は適当である。一般的には、部分的にヒトの抗体及び完全ヒト抗体は、他の抗体よりもヒト体内での半減期が長い。したがって、より低い投与量及びより少ない投与頻度が可能でありうる。脂質付加などの修飾を用いて、抗体を安定化し、取り込み及び組織透過（例えば脳への）を増強してもよい。抗体の脂質付加の方法は、Cruikshank et al.（1997, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14: 193）により記載されている。
【０５４３】
特定の実施形態において、タンパク質又はポリペプチドの有効量（すなわち有効投与量）は、体重１ｋｇ当たり約０．００１〜３０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．０１〜２５ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．１〜２０ｍｇ、よりさらに好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．１〜１．０ｍｇ、１〜１０ｍｇ、２〜９ｍｇ、３〜８ｍｇ、４〜７ｍｇ、又は５〜６ｍｇの範囲である。
【０５４４】
当業者であれば、被験体を有効に治療するために必要な投与量に影響を及ぼしうる特定の要因、例えば限定されるものではないが、疾患又は障害の重篤度、以前の治療、全身の健康状態及び／又は被験体の年齢、他の存在する疾患などを理解しうる。さらに、治療上有効な量のタンパク質、ポリペプチド、又は抗体による被験体の治療としては、単一治療、又は好ましくは一系列の治療が含まれる。
【０５４５】
上述した化合物に加えて、本発明は、目的の核酸又はポリペプチドの発現又は活性をモジュレートする小分子の使用を包含する。小分子の非限定的な例には、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、１分子当たり分子量約１０，０００ｇ未満の有機又は無機化合物、１分子当たり分子量約５，０００ｇ未満の有機又は無機化合物、１分子当たり分子量約１，０００ｇ未満の有機又は無機化合物、１分子当たり分子量約５００ｇ未満の有機又は無機化合物（すなわち、ヘテロ有機及び有機金属化合物を含む）、並びにかかる化合物の塩、エステル及び他の薬学的に許容される形態が含まれる。
【０５４６】
小分子薬剤の適当な用量は、通常の技法を有する医師、獣医又は研究者の範囲内の多数の要因に応じて異なることが理解される。小分子の用量は、例えば、種類、サイズ及び被験体の状態、処理されるサンプルなどに応じて異なり、さらに、組成物の投与経路（適用可能であれば）、本発明の核酸又はポリペプチドに及ぼすことが望ましい小分子の効果などに応じて異なる。例示的な用量としては、被験体又はサンプル重量の１ｋｇ当たり、ｍｇ又はμｇ単位の小分子の量（例えば、１ｋｇ当たり約１μｇ〜１ｋｇ当たり約５００ｍｇ、１ｋｇ当たり約１００μｇ〜１ｋｇ当たり約５ｍｇ、又は１ｋｇ当たり約１μｇ〜１ｋｇ当たり約５０μｇ）が挙げられる。さらに、小分子の適当な用量は、モジュレートしようとする発現又は活性に関する小分子の効力に応じて異なることが理解される。そのような適当な用量は、本明細書に記載のアッセイを用いて決定しうる。これらの小分子の１又はそれ以上を、本発明のポリペプチド又は核酸の発現又は活性をモジュレートするために被験体（例えばヒト）に投与する場合、医師、獣医又は研究者は、例えば最初は比較的低用量を処方し、その後、適当な応答が得られるまで用量を増大してもよい。さらに、任意の特定の動物被験体についての具体的な用量レベルは、多様な要因、例えば用いる特定の化合物の活性、被験体の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路、排出速度、任意の薬物の組み合わせ、並びにモジュレートしようとする発現又は活性の程度などに応じて異なる。
【０５４７】
医薬組成物は、投与説明書と共に、容器、パック、又はディスペンサーに含まれてもよい。
【０５４８】
５．２３  キット
本発明は、本発明のバイオマーカーの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、全種又は任意の組み合わせのタンパク質及びＲＮＡ産物の発現を測定するキットを提供する。そのようなキットは、そのようなタンパク質及びＲＮＡ産物の発現を測定するのに必要な材料及び試薬を含む。特定の実施形態では、キットはさらに、（１）血液、軟骨細胞又は滑液からＲＮＡを精製するための試薬；（２）試験核酸を生成するためのプライマー；（３）ｄＮＴＰ及び／又はｒＮＴＰ（予め混合したもの又は別々のもの）、場合によっては一意的に標識された１又はそれ以上のｄＮＴＰ及び／又はｒＮＴＰ（例えば、ビオチン化したあるいはＣｙ３又はＣｙ５タグの付いたｄＮＴＰ）；（４）蛍光色素の化学的に活性な誘導体などの合成後標識試薬；（５）逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素；（６）種々のバッファー、例えばハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄バッファー；（７）標識プローブ精製試薬、及びスピンカラムのような構成品など；（８）タンパク質精製試薬；（９）シグナル発生及び検出試薬、例えばストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体、化学蛍光基質又は化学発光基質など、種々の方法で使用する１又はそれ以上のさらなる試薬を含んでよい。特定の実施形態では、キットは、対照として使用する、サンプル（例えば、血液又は軟骨細胞又は滑液）から単離した、予め標識され品質管理されたタンパク質及び／又はＲＮＡを含む。
【０５４９】
いくつかの実施形態では、キットはＲＴ−ＰＣＲキットである。他の実施形態では、キットは核酸アレイ及びタンパク質アレイである。本発明に従ったそのようなキットは、本発明のタンパク質又は核酸メンバーが結合したアレイ、及びそのパッケージング手段を少なくとも含む。あるいは、本発明のタンパク質又は核酸メンバーをアレイ上に予めパッケージングすることもできる。
【０５５０】
いくつかの実施形態では、キットは定量ＲＴ−ＰＣＲキットである。一実施形態では、定量ＲＴ−ＰＣＲキットは、（ａ）本発明のバイオマーカーの各組み合わせの増幅に使用するプライマー、（ｂ）逆転写酵素を含めたバッファー及び酵素、（ｃ）１又はそれ以上の耐熱性ポリメラーゼ、並びに（ｄ）Ｓｙｂｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを含む。好ましい実施形態では、本発明のキットはまた、（ａ）基準対照ＲＮＡ、及び（ｂ）混入対照ＲＮＡをも含む。
【０５５１】
本発明は、（ａ）個体を変形性関節症であると診断すること、（ｂ）変形性関節症（ＯＡ）の２つのステージを区別すること、及び（ｃ）個体を変形性関節症（ＯＡ）の特定のステージであると診断することに有用なキットを提供する。例えば、本発明の特定の実施形態では、キットは、フォワード及びリバースプライマーからなり、そのフォワード及びリバースプライマーは、個体が軽度のＯＡであるか又はＯＡでないかを決定するのに有用な本発明に従って同定された各バイオマーカーに対応するすべての種のｍＲＮＡの発現を定量するように設計する。特定の実施形態では、少なくとも１種のプライマーは、エキソン結合部をまたがるように設計する。
【０５５２】
本発明は、サンプルにおける本発明のバイオマーカーの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、全種又は任意の組み合わせのタンパク質又はＲＮＡ産物の発現に基づく、変形性関節症の検出、診断、モニタリング及び予後診断に有用なキットを提供する。特定の実施形態では、そのようなキットは、従来技術により変形性関節症と関係することが示唆されている本発明のバイオマーカーのタンパク質又はＲＮＡ産物の発現を測定する材料及び試薬を含まない。他の実施形態では、そのようなキットは、従来技術により変形性関節症と関係することが示唆されている本発明のバイオマーカー、及び本発明のバイオマーカー以外の少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種又はそれ以上の遺伝子のタンパク質又はＲＮＡ産物の発現を測定する材料及び試薬を含む。
【０５５３】
本発明は、サンプルにおける本発明のバイオマーカーの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、全種又は任意の組み合わせのタンパク質又はＲＮＡ産物の発現に基づいて、被験体が受けている１又はそれ以上の治療の効力をモニターするのに有用なキットを提供する。特定の実施形態では、そのようなキットは、従来技術により変形性関節症と関係することが示唆されている本発明のバイオマーカーのタンパク質又はＲＮＡ産物の発現を測定する材料及び試薬を含まない。他の実施形態では、そのようなキットは、従来技術により変形性関節症と関係することが示唆されている本発明のバイオマーカー、及び本発明のバイオマーカー以外の少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種又はそれ以上の遺伝子のタンパク質又はＲＮＡ産物の発現を測定する材料及び試薬を含む。
【０５５４】
本発明は、サンプルにおける本発明のバイオマーカーの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、全種又は任意の組み合わせのタンパク質又はＲＮＡ産物の発現に基づく、被験体が治療に応答するかどうかの決定に有用なキットを提供する。特定の実施形態では、そのようなキットは、従来技術により変形性関節症と関係することが示唆されている本発明のバイオマーカーのタンパク質又はＲＮＡ産物の発現を測定する材料及び試薬を含まない。他の実施形態では、そのようなキットは、従来技術により変形性関節症と関係することが示唆されている本発明のバイオマーカー、及び本発明のバイオマーカー以外の少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種又はそれ以上の遺伝子のタンパク質又はＲＮＡ産物の発現を測定する材料及び試薬を含む。
【０５５５】
本発明は、サンプルにおける本発明のバイオマーカーの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、全種又は任意の組み合わせのＲＮＡ産物の発現を測定するキットを提供する。特定の実施形態では、そのようなキットは、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の発現を測定するのに必要な材料及び試薬を含む。例えば、変形性関節症用のマイクロアレイ又はＲＴ−ＰＣＲキットを生産することができ、それは、本発明のバイオマーカーの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、全種又は任意の組み合わせのＲＮＡ産物のレベルを測定するのに必要な試薬及び材料のみを含む。あるいは、いくつかの実施形態では、キットは、本発明のバイオマーカーの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、全種又は任意の組み合わせのＲＮＡ産物のレベルを測定するのに必要なものに限らない材料及び試薬を含んでよい。例えば、マイクロアレイキットは、本発明のバイオマーカーの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、全種又は任意の組み合わせのＲＮＡ産物のレベルを測定するのに必要な材料及び試薬に加えて、必ずしも変形性関節症と関係せず又はそれを示唆しないＲＮＡ産物のレベルを測定するのに必要な試薬及び材料を含んでよい。特定の実施形態では、マイクロアレイ又はＲＴ−ＰＣＲキットは、本発明のバイオマーカーの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、全種又は任意の組み合わせと、本発明のバイオマーカー以外の１種、２種、３種、４種、５種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、５５種、６０種、６５種、７０種、７５種、８０種、８５種、９０種、９５種、１００種、１２５種、１５０種、１７５種、２００種、２２５種、２５０種、３００種、３５０種、４００種、４５０種、又はそれ以上の遺伝子、あるいは本発明のバイオマーカー以外の１〜１０種、１〜１００種、１〜１５０種、１〜２００種、１〜３００種、１〜４００種、１〜５００種、１〜１０００種、２５〜１００種、２５〜２００種、２５〜３００種、２５〜４００種、２５〜５００種、２５〜１０００種、１００〜１５０種、１００〜２００種、１００〜３００種、１００〜４００種、１００〜５００種、１００〜１０００種、５００〜１０００種の遺伝子のＲＮＡ産物のレベルを測定するのに必要な試薬及び材料を含む。
【０５５６】
核酸マイクロアレイキットでは、キットは一般に、固相支持体表面に結合したプローブを含む。検出可能な標識でプローブを標識することができる。特定の実施形態では、プローブは、本発明のバイオマーカーの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、全種又は任意の組み合わせのＲＮＡ産物の（複数の）エキソン、（複数の）イントロン、（複数の）エキソン結合部、又は（複数の）エキソン−イントロン結合部に特異的である。マイクロアレイキットは、アッセイ、及びアッセイを行った結果得られたデータを解釈し分析する方法を行うための説明書を含むことがある。特定の実施形態では、キットは変形性関節症の診断用の説明書を含む。キットはまたハイブリダイゼーション試薬、及び／又はプローブが標的核酸配列とハイブリダイズするときに発生するシグナルを検出するのに必要な試薬を含むこともある。一般に、マイクロアレイキットの材料及び試薬は１又はそれ以上の容器に入っている。キットの各構成品は一般に、その適切な容器に入っている。
【０５５７】
ＲＴ−ＰＣＲキットでは、キットは一般に、本発明のバイオマーカーの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、全種又は任意の組み合わせの特定のＲＮＡ産物（例えば、（複数の）エキソン、（複数の）イントロン、（複数の）エキソン結合部、及び（複数の）エキソン−イントロン結合部）に特異的な、予め選択したプライマーを含む。ＲＴ−ＰＣＲキットはまた、核酸の逆転写及び／又は増幅に適した酵素（例えば、Ｔａｑなどのポリメラーゼ）、並びに逆転写及び増幅の反応混合物に必要なデオキシヌクレオチド及びバッファーを含んでもよい。ＲＴ−ＰＣＲキットはまた、本発明のバイオマーカーの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、全種又は任意の組み合わせのＲＮＡ産物に特異的なプローブを含んでもよい。プローブは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）で標識してもよく、あるいはしなくてもよい。ＲＴ−ＰＣＲキットの各構成品は一般に、その適切な容器に入っている。したがって、これらのキットは一般に、個々の各試薬、酵素、プライマー及びプローブに適した別々の容器を含む。さらに、ＲＴ−ＰＣＲキットは、アッセイ、及びアッセイを行った結果得られたデータを解釈し分析する方法を行うための説明書を含むことがある。特定の実施形態では、キットは変形性関節症の診断用の説明書を含む。
【０５５８】
特定の実施形態では、キットはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲキットである。そのようなキットは、９６ウエルプレート、並びにＳＹＢＲグリーン検出に必要な試薬及び材料を含んでよい。キットは、β−アクチンを用いて結果を正規化できるような試薬及び材料を含んでよい。キットはまた、水、リン酸緩衝食塩水やファージＭＳ２  ＲＮＡなどの対照を含んでもよい。さらに、キットは、アッセイ、及びアッセイを行った結果得られたデータを解釈し分析する方法を行うための説明書を含むことがある。特定の実施形態では、説明書は、本発明のバイオマーカーの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、全種又は任意の組み合わせのＲＮＡ産物のレベルを、例えば５倍〜１０倍異なる２つの濃度で調べるべきであることを示すものである。
【０５５９】
抗体に基づくキットでは、キットは例えば、（１）対象とするタンパク質（例えば、本発明のバイオマーカーの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、全種又は任意の組み合わせのタンパク質産物）と結合する一次抗体（固相支持体に結合していてもよく、あるいはしていなくてもよい）と、任意選択で（２）タンパク質又は一次抗体と結合し、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、放射性同位体又は酵素）と結合した異なる二次抗体を含んでよい。抗体に基づくキットはまた、免疫沈降を行うためのビーズを含んでもよい。抗体に基づくキットの各構成品は一般に、その適切な容器に入っている。したがって、これらのキットは一般に、各抗体に適した別々の容器を含む。さらに、抗体に基づくキットは、アッセイ、及びアッセイを行った結果得られたデータを解釈し分析する方法を行うための説明書を含むことがある。特定の実施形態では、キットは変形性関節症の診断用の説明書を含む。
【０５６０】
以下の実施例は、非限定的であり、本発明の様々な態様及び特徴を単に例示するにすぎない。
【実施例１】
【０５６１】
マイクロアレイ構築
本発明の一態様に係るアレイを以下のように構築した。
【０５６２】
ＯＡ軟骨ｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡクローンのＰＣＲ産物（約４０μｌ）を、増幅に使用した同じ９６ウエルチューブの中で、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）４μｌ（１／１０倍量）及びエタノール１００μｌ（２．５倍量）で沈殿させ、−２０℃で一晩貯蔵する。次いでそれを３，３００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心分離する。得られたペレットを氷冷７０％エタノール５０μｌで洗浄し、再度３０分間遠心分離する。次いでそのペレットを空気乾燥させ、５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で又は３×ＳＳＣ  ２０μｌ中で一晩かけて十分に再懸濁する。次いで、ロボット型ＧＭＳ４１７又は４２７アレイ製造装置（Affymetrix, Ca）を用いて、単一に又は二連でγアミノプロピルシラン（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＣＭＴ−ＧＡＰＳ又はＣＭＴ−ＧＡＰ２，Catalog No. 40003, 40004）又はポリリジン被覆スライド（Sigma Cat. No. P0425）上にサンプルを配置させる。マイクロアレイ上のＤＮＡスポットの境界に、ダイヤモンド製罫書針で印をつけることができる。本発明は、アレイを調製する固相支持体上に１０〜２０，０００個のＰＣＲ産物がスポットされたアレイを提供する。
【０５６３】
粒子を含まない温かいｄｄＨ２Ｏの皿の上に上記のスライドを約１分間入れることによってアレイを再水和し（スポットはわずかに膨張するが、互いに接することはない）、７０〜８０℃の加熱ブロックに３秒間逆さにして指ではじいて乾燥させる。次いで、ＤＮＡをスライドにＵＶ架橋し（Stratagene, Stratalinker、６５ｍＪ、表示を６５０×１００ｕＪである「６５０」に設定）、又は８０℃で２〜４時間アレイを焼く。アレイをスライドラックに入れる。空のスライドチャンバーを準備し、下記の溶液で満たす：無水コハク酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）３．０ｇを１−メチル−２−ピロリジノン１８９ｍｌに溶解させた（試薬の迅速な添加が極めて重要である）；無水コハク酸の最後の一片が溶解した直後に、０．２Ｍホウ酸ナトリウム２１．０ｍｌをそれに混合し、その溶液をスライドチャンバーに注ぐ。スライドラックを迅速にかつ均等にスライドチャンバーに沈め、数秒間勢いよく上下に振とうし、確実にスライドにその溶液が残らないようにし、次いでオービタルシェーカー上で１５〜２０分間混合する。次いでスライドラックを９５℃のｄｄＨ２Ｏ中に２分間穏やかに沈め、その後９５％エタノール中に５回沈める。次いで過剰なエタノールをペーパータオル上に落として、スライドを空気乾燥させる。次いで、使用するまでアレイをスライド箱中に室温で貯蔵する。
【実施例２】
【０５６４】
ＲＮＡの単離
全血から
微小遠心管中で全血１００μｌを得、４℃、２，０００ｒｐｍ（８００ｇ）で５分間遠心し、上清を除去する。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて、元の血液サンプル１０μｌ毎にＴＲＩｚｏｌ（登録商標）約６μｌの割合で、ペレットにした細胞をホモジナイズし、十分にボルテックスをかける。サンプルを室温で５分間放置する。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）１０μｌ当たりクロロホルム１２μｌを用いてＲＮＡを抽出する。サンプルを４℃、１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上層を収集する。上層に、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）１０μｌ当たり５μｌの割合でイソプロパノールを加える。−２０℃で一晩、又は２０℃で１時間サンプルを放置する。既知の方法に従ってＲＮＡをペレットにし、ＲＮＡペレットを空気乾燥させ、ペレットをＤＥＰＣ処理ｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁させる。ＲＮＡサンプルは、サンプルが室温で輸送に安定である７５％エタノール中で貯蔵することもできる。
【０５６５】
遠心分離した溶解血液から
バキュテイナー（Vacutainer）中で全血１０ｍｌを得、４℃、２，０００ｒｐｍ（８００ｇ）で５分間遠心し、血漿層を除去する。溶解バッファー３部に対して血液１部の割合で溶解バッファーを血液サンプルに加える（溶解バッファー（１Ｌ）、ＥＤＴＡ  ０．６ｇ、ＫＨＣＯ２  １．０ｇ、ＮＨ４Ｃｌ  ８．２ｇ、ｐＨ７．４に調整（ＮａＯＨを使用））。サンプルを混合し、透明になるまで５〜１０分間氷上に置く。溶解したサンプルを４℃、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を吸引する。ペレットを溶解バッファー５ｍｌ中に再懸濁させ、再度４℃、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて、元の血液サンプル１０ｍｌ毎にＴＲＩｚｏｌ（登録商標）約６ｍｌの割合で、ペレットにした細胞をホモジナイズし、十分にボルテックスをかける。サンプルを室温で５分間放置する。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）１ｍｌ当たりクロロホルム１．２ｍｌを用いてＲＮＡを抽出する。サンプルを４℃、１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上層を収集する。上層に、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）１ｍｌ当たり０．５ｍｌの割合でイソプロパノールを加える。−２０℃で一晩、又は２０℃で１時間サンプルを放置する。既知の方法に従ってＲＮＡをペレットにし、ＲＮＡペレットを空気乾燥させ、ペレットをＤＥＰＣ処理ｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁させる。ＲＮＡサンプルは、サンプルが室温で輸送に安定である７５％エタノール中で貯蔵することもできる。
【０５６６】
血清不含全血から
バキュテイナー（Vacutainer）中で全血１０ｍｌを得、４℃、２，０００ｒｐｍ（８００ｇ）で５分間遠心し、血漿層を除去する。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて、元の血液サンプル１０ｍｌ毎にＴＲＩｚｏｌ（登録商標）約６ｍｌの割合で、ペレットにした細胞をホモジナイズし、十分にボルテックスをかける。サンプルを室温で５分間放置する。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）１ｍｌ当たりクロロホルム１．２ｍｌを用いてＲＮＡを抽出する。サンプルを４℃、１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上層を収集する。上層に、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）１ｍｌ当たり０．５ｍｌの割合でイソプロパノールを加える。−２０℃で一晩、又は２０℃で１時間サンプルを放置する。既知の方法に従ってＲＮＡをペレットにし、ＲＮＡペレットを空気乾燥させ、ペレットをＤＥＰＣ処理ｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁させる。ＲＮＡサンプルは、サンプルが室温で輸送に安定である７５％エタノール中で貯蔵することもできる。
【実施例３】
【０５６７】
標的核酸の調製及びハイブリダイゼーション
ｍＲＮＡからの蛍光ＤＮＡプローブの調製
本発明のアレイを用いた分析用にＲＮＡの蛍光標識標的核酸サンプルを調製する。
【０５６８】
７０℃で１０分間加熱し、氷上で冷却することによって、オリゴｄＴプライマー１μｇを、変形性関節症と診断された又は変形性関節症であると疑われる患者の血液から単離した総ＲＮＡ１０μｇと総体積１０μｌでアニーリングさせる。終濃度５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＤＴＴ、２５ｍＭ非標識ｄＮＴＰｓ、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（２００Ｕ／μＬ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ）４００単位、及び１５ｍＭ Ｃｙ３又はＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む体積２５μｌで４２℃、４０分間サンプルをインキュベートすることによって、ｍＲＮＡを逆転写する。５５５００ｍＭ ＥＤＴＡ  ２．５μｌ及び１Ｍ ＮａＯＨ  ５μｌを添加し、６５℃で１０分間インキュベートすることによって反応を停止させる。１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．６）１２．５μｌを添加することによって反応混合物を中和する。
【０５６９】
セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−３０微小濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）中で遠心分離することによって、標識した標的核酸サンプルを精製する。２種の異なる標的核酸サンプル（例えば、異なる患者に由来する２種のサンプル）を分析し、同じアレイへのハイブリダイゼーションによって比較する場合、各標的核酸サンプルを異なる蛍光標識（例えば、Ｃｙ３及びＣｙ５）で標識し、別々に濃縮する。別々に濃縮した標的核酸サンプル（Ｃｙ３及びＣｙ５標識）を新たなセントリコン中に混合し、ＴＥ５００μｌで洗浄し、体積７μｌ未満まで再度濃縮する。１０μｇ／μｌポリＡ ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｐ９４０３）１μｌ及び１０μｇ／μｌ ｔＲＮＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，＃１５４０１−０１１）１μｌを添加し、体積を蒸留水で９．５μｌに調整する。最終的な標的核酸調製物に、２０×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、１５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ８．０））２．１μｌ及び１０％ＳＤＳ ０．３５μｌを添加する。
【０５７０】
ハイブリダイゼーション
１００℃で２分間加熱することによって標識核酸を変性させ、３７℃で２０〜３０分間インキュベートした後、核酸アレイ上、２２ｍｍ×２２ｍｍカバーガラスの下に入れる。３×ＳＳＣの小さな貯蔵器により湿度が維持される特注のスライドチャンバー中で、ハイブリダイゼーションを６５℃で１４〜１８時間実施する。０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで２〜５分間、その後１×ＳＳＣ及び０．１×ＳＳＣ中に浸水させ撹拌することによってアレイを洗浄する。最後に、６５０ＲＰＭで２分間、マイクロプラスキャリアー（Microplus carrier）中のＢｅｃｋｍａｎ ＧＳ−６卓上遠心分離機で、スライドラックに入れて２分間遠心分離を行うことによってアレイを乾燥させる。
【実施例４】
【０５７１】
リアルタイムＲＴ  ＰＣＲ
表１及び図１〜４で開示されている遺伝子に対して、Ｑｉａｇｅｎ製のＳＹＢＲ（登録商標）グリーンキット（Product Number 204143）を用いてリアルタイムＲＴ  ＰＣＲを行った。図１〜４で同定された遺伝子の１つに関する実験結果の例を図５に示す。
【０５７２】
１ステップ（逆転写及びＰＣＲを組み合わせた）又は２ステップ（最初に逆転写を、次いでＰＣＲを行う）を使用することができる。２ステップのプロトコールの場合、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（Product number 4322171）を使用し、その中で用いられるプロトコールに従って、逆転写を最初に行った。
【０５７３】
より具体的には、本明細書において前述のように精製したＲＮＡを、逆転写酵素バッファー、ｄＮＴＰｓ、ランダムプライマー及び逆転写酵素とともにインキュベートし、２５℃で１０分間、その後３７℃で２時間インキュベートし、得られた混合物を、定量ＰＣＲの開始産物として使用した。
【０５７４】
逆転写から得られたｃＤＮＡを、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘとともに、提供されている通りにインキュベートし、マグネシウム濃度の調整は行わなかった。ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼは添加しなかった。本発明の遺伝子に特異的な５μＭのフォワードプライマーとリバースプライマーの両方を添加し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００／ＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ５７００／ｉＣｙｃｌｅｒ／ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎを使用する標準的なプロトコールに従って、反応物をインキュベートしモニターした。
【０５７５】
2007511738.tif 000010
2007511738.tif 000011
2007511738.tif 000012
【実施例５】
【０５７６】
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）
Ｑｉａｇｅｎ製のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＴＭＰｒｏｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Product Number 204343）を、目的の遺伝子に対応するＴａｑＭａｎ（登録商標）二重標識プローブ及びプライマーと組み合わせて用いて、定量リアルタイムＲＴ  ＰＣＲも行った。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ及びプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｓａｙｓ−Ｏｎ−ＤｅｍａｎｄＴＭに注文することができる。
【０５７７】
二重標識プローブは、フルオロフォアとクエンチャーの両方を含む。蛍光レポーターとクエンチャーを近接させることによりレポーターが蛍光を発することが防止されるが、ＰＣＲ伸長ステップの間は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によってフルオロフォアが遊離し、それにより蛍光を発することが可能となる。したがって、蛍光の量は、生じるＰＣＲ産物の量に相関する。
【０５７８】
ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンを使用して得られた定量リアルタイムデータを確認するために、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子に対してＴａｑＭａｎ（登録商標）定量ＰＣＲを行った。実験結果の例を図６及び図８に示す。より具体的には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子に特異的なプライマー、及び前述のＲＴ  ＰＣＲから得られたｃＤＮＡとともに、最終体積４５μｌとなるうようにインキュベートし、標準的な条件を用いてＰＣＲ反応を行った。この実験の結果は、図６で見ることができる。本発明の他の遺伝子でも同様の結果を得ることができることが当業者に理解されるはずである。
【実施例６】
【０５７９】
リアルタイムＰＣＲの結果の統計分析
正常と、あるいは軽度のＯＡ、中程度のＯＡ、顕著なＯＡ又は重篤なＯＡと分類された個体から単離した血液サンプルに対するリアルタイムＰＣＲ分析結果を、バイオマーカーとして開示された遺伝子の有用性を確認するために、既知の方法を用いて統計的に分析した。
【０５８０】
好ましくは、年齢及び肥満度指数（ＢＭＩ）が類似した個体を、さらなる分析のために選択した。年齢及びＢＭＩを基礎として比較を行うことができるサンプルの選択を、当業者に理解されている、順位に対する分散のＫＷ一元分析（KW One Way Analysis of Variance on Ranks）を用いて決定した。
【０５８１】
サイズが約２０〜５０の、年齢及びＢＭＩが一致するサンプルのセットに対して、ΔＣＴ値及びＭＷ順位和検定を使用した。前記サンプルのセット間における倍数単位の変化の差を決定するために、サンプルのセットに対して箱ひげ図を作成した。図５、７及び８に、それぞれＧ２ＡＮ、ＰＥＲ１及びＺＦＲについての代表的な分析を示す。当業者には明らかであるように、本明細書で同定された配列のいずれについても同様の分析を行うことができる。
【実施例７】
【０５８２】
図１に記載の単離されたバイオマーカーを使用する、正常な個体の遺伝子発現プロファイルと比較した、軽度の変形性関節症である個体の血液サンプルの遺伝子発現プロファイル分析
本実施例は、特許請求に記載の本発明を使用して、健常な患者から得られた血液サンプルと比較した、ＯＡ患者から得られた血液サンプル中の示差的な遺伝子発現を検出することによって変形性関節症が診断されることを実証するものである。
【０５８３】
本明細書で定義する変形性関節症と臨床的に診断された患者から血液サンプルを得る。次いで、遺伝子発現プロファイルを分析し、ＯＡに罹患していない患者のプロファイルと比較する。各事例で、変形性関節症の診断は、熟練した専門医によって確認される。
【０５８４】
各患者から得られた１滴の血液から、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ）を用いて総ｍＲＮＡを最初に単離し、次いで各血液サンプルについて蛍光標識プローブを作製し、変性させ、図１に記載の１９遺伝子それぞれの全長ｃＤＮＡ配列を含むマイクロアレイとハイブリダイズさせる。次いで、アレイへの特異的なハイブリダイゼーションの検出は、ＧＭＳ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４１８で走査し、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Michael Eisen, Stanford University）、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Silicon Genetics, CA）の分析で実験データを処理することによって測定する。健常な患者と比較した、変形性関節症患者の血液サンプルにおける１９遺伝子の示差的な発現を、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用する統計分析によって決定する（Glantz SA. Primer of Biostatistics. 5th ed. New York, USA: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2002）。図１に記載の１９遺伝子それぞれの示差的な発現は、変形性関節症の診断に有用である。
【実施例８】
【０５８５】
図２に記載の単離されたバイオマーカーを使用する、正常な個体の遺伝子発現プロファイルと比較した、中程度の変形性関節症である個体の血液サンプルの遺伝子発現プロファイル分析
本実施例は、特許請求に記載の本発明を使用して、健常な患者から得られた血液サンプルと比較した、中程度のＯＡ患者から得られた血液サンプル中の示差的な遺伝子発現を検出することによって中程度の変形性関節症が診断されることを実証するものである。
【０５８６】
本明細書で定義する変形性関節症と臨床的に診断された患者から血液サンプルを得る。次いで、遺伝子発現プロファイルを分析し、ＯＡに罹患していない患者のプロファイルと比較する。各事例で、変形性関節症の診断は、熟練した専門医によって確認される。
【０５８７】
各患者から得られた１滴の血液から、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ）を用いて総ｍＲＮＡを最初に単離し、次いで各血液サンプルについて蛍光標識プローブを作製し、変性させ、図２に記載の４遺伝子それぞれの全長ｃＤＮＡ配列を含むマイクロアレイとハイブリダイズさせる。次いで、アレイへの特異的なハイブリダイゼーションの検出は、ＧＭＳ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４１８で走査し、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Michael Eisen, Stanford University）、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Silicon Genetics, CA）の分析で実験データを処理することによって測定する。健常な患者と比較した、中程度の変形性関節症患者の血液サンプルにおける４遺伝子の示差的な発現を、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用する統計分析によって決定する（Glantz SA. Primer of Biostatistics. 5th ed. New York, USA: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2002）。図２に記載の４遺伝子それぞれの示差的な発現は、中程度の変形性関節症の診断に有用である。
【実施例９】
【０５８８】
図３に記載の単離されたバイオマーカーを使用する、中程度の変形性関節症である個体の遺伝子発現プロファイルと比較した、顕著な変形性関節症である個体の血液サンプルの遺伝子発現プロファイル分析
本実施例は、特許請求に記載の本発明を使用して、中程度のＯＡ患者から得られた血液サンプルと比較した、顕著なＯＡ患者から得られた血液サンプル中の示差的な遺伝子発現を検出することによって顕著な変形性関節症が診断されることを実証するものである。
【０５８９】
本明細書で定義する顕著な変形性関節症と臨床的に診断された患者から血液サンプルを得る。次いで、遺伝子発現プロファイルを分析し、中程度のＯＡと臨床的に診断された患者のプロファイルと比較する。各事例で、変形性関節症の診断及びステージ決定は、熟練した専門医によって確認される。
【０５９０】
各患者から得られた１滴の血液から、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ）を用いて総ｍＲＮＡを最初に単離し、次いで各血液サンプルについて蛍光標識プローブを作製し、変性させ、図３に記載の２遺伝子それぞれの全長ｃＤＮＡ配列を含むマイクロアレイとハイブリダイズさせる。次いで、アレイへの特異的なハイブリダイゼーションの検出は、ＧＭＳ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４１８で走査し、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Michael Eisen, Stanford University）、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Silicon Genetics, CA）の分析で実験データを処理することによって測定する。中程度の変形性関節症患者と比較した、顕著な変形性関節症患者の血液サンプルにおける２遺伝子の示差的な発現を、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用する統計分析によって決定する（Glantz SA. Primer of Biostatistics. 5th ed. New York, USA: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2002）。図３に記載の２遺伝子それぞれの示差的な発現は、顕著な変形性関節症の診断に有用である。
【実施例１０】
【０５９１】
図４に記載の単離されたバイオマーカーを使用する、顕著な変形性関節症である個体の遺伝子発現プロファイルと比較した、重篤な変形性関節症である個体の血液サンプルの遺伝子発現プロファイル分析
本実施例は、特許請求に記載の本発明を使用して、顕著なＯＡ患者から得られた血液サンプルと比較した、重篤なＯＡ患者から得られた血液サンプル中の示差的な遺伝子発現を検出することによって重篤な変形性関節症が診断されることを実証するものである。
【０５９２】
本明細書で定義する重篤な変形性関節症と臨床的に診断された患者から血液サンプルを得る。次いで、遺伝子発現プロファイルを分析し、顕著なＯＡと臨床的に診断された患者のプロファイルと比較する。各事例で、変形性関節症の診断及びステージ決定は、熟練した専門医によって確認される。
【０５９３】
各患者から得られた１滴の血液から、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ）を用いて総ｍＲＮＡを最初に単離し、次いで各血液サンプルについて蛍光標識プローブを作製し、変性させ、図４に記載の４遺伝子それぞれの全長ｃＤＮＡ配列を含むマイクロアレイとハイブリダイズさせる。次いで、アレイへの特異的なハイブリダイゼーションの検出は、ＧＭＳ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４１８で走査し、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Michael Eisen, Stanford University）、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Silicon Genetics, CA）の分析で実験データを処理することによって測定する。顕著な変形性関節症患者と比較した、重篤な変形性関節症患者の血液サンプルにおける４遺伝子の示差的な発現を、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用する統計分析によって決定する（Glantz SA. Primer of Biostatistics. 5th ed. New York, USA: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2002）。図４に記載の４遺伝子それぞれの示差的な発現は、重篤な変形性関節症の診断に有用である。
【実施例１１】
【０５９４】
図１に記載の１９遺伝子の５’領域を使用する、健常な個体の遺伝子発現プロファイルと比較した、変形性関節症である個体の血液サンプルの遺伝子発現プロファイル分析
本実施例は、特許請求に記載の本発明を使用して、健常な患者から得られた血液サンプルと比較した、ＯＡ患者から得られた血液サンプル中の示差的な遺伝子発現を検出することによって変形性関節症が診断されることを実証するものである。
【０５９５】
本明細書で定義する変形性関節症と臨床的に診断された患者から血液サンプルを得る。次いで、遺伝子発現プロファイルを分析し、ＯＡに罹患していない患者のプロファイルと比較する。各事例で、変形性関節症の診断は、熟練した専門医によって確認される。
【０５９６】
各患者から得られた１滴の血液から、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ）を用いて総ｍＲＮＡを最初に単離し、次いで各血液サンプルについて蛍光標識プローブを作製し、変性させ、図１に記載の１９遺伝子それぞれの５’領域に対応する２５ヌクレオチド長のＤＮＡ配列を含むマイクロアレイとハイブリダイズさせる。次いで、アレイへの特異的なハイブリダイゼーションの検出は、ＧＭＳ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４１８で走査し、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Michael Eisen, Stanford University）、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Silicon Genetics, CA）の分析で実験データを処理することによって測定する。健常な患者と比較した、変形性関節症患者の血液サンプルにおける１９遺伝子の示差的な発現を、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用する統計分析によって決定する（Glantz SA. Primer of Biostatistics. 5th ed. New York, USA: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2002）。図１に記載の１９遺伝子それぞれの示差的な発現は、変形性関節症の診断に有用である。
【実施例１２】
【０５９７】
図１に記載の１９遺伝子の３’領域を使用する、健常な個体の遺伝子発現プロファイルと比較した、変形性関節症である個体の血液サンプルの遺伝子発現プロファイル分析
本実施例は、特許請求に記載の本発明を使用して、健常な患者から得られた血液サンプルと比較した、ＯＡ患者から得られた血液サンプル中の示差的な遺伝子発現を検出することによって変形性関節症が診断されることを実証するものである。
【０５９８】
本明細書で定義する変形性関節症と臨床的に診断された患者から血液サンプルを得る。次いで、遺伝子発現プロファイルを分析し、ＯＡに罹患していない患者のプロファイルと比較する。各事例で、変形性関節症の診断は、熟練した専門医によって確認される。
【０５９９】
各患者から得られた１滴の血液から、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ）を用いて総ｍＲＮＡを最初に単離し、次いで各血液サンプルについて蛍光標識プローブを作製し、変性させ、図１に記載の１９遺伝子それぞれの３’領域に対応する５０ヌクレオチド長のＤＮＡ配列を含むマイクロアレイとハイブリダイズさせる。次いで、アレイへの特異的なハイブリダイゼーションの検出は、ＧＭＳ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４１８で走査し、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Michael Eisen, Stanford University）、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Silicon Genetics, CA）の分析で実験データを処理することによって測定する。健常な患者と比較した、変形性関節症患者の血液サンプルにおける１９遺伝子の示差的な発現を、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用する統計分析によって決定する（Glantz SA. Primer of Biostatistics. 5th ed. New York, USA: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2002）。図１に記載の１９遺伝子それぞれの示差的な発現は、変形性関節症の診断に有用である。
【実施例１３】
【０６００】
図１に記載の１９遺伝子の内部コード領域を使用する、健常な個体の遺伝子発現プロファイルと比較した、変形性関節症である個体の血液サンプルの遺伝子発現プロファイル分析
本実施例は、特許請求に記載の本発明を使用して、健常な患者から得られた血液サンプルと比較した、ＯＡ患者から得られた血液サンプル中の示差的な遺伝子発現を検出することによって変形性関節症が診断されることを実証するものである。
【０６０１】
本明細書で定義する変形性関節症と臨床的に診断された患者から血液サンプルを得る。次いで、遺伝子発現プロファイルを分析し、ＯＡに罹患していない患者のプロファイルと比較する。各事例で、変形性関節症の診断は、熟練した専門医によって確認される。
【０６０２】
各患者から得られた１滴の血液から、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ）を用いて総ｍＲＮＡを最初に単離し、次いで各血液サンプルについて蛍光標識プローブを作製し、変性させ、図１に記載の１９遺伝子それぞれの内部コード領域に対応する７０ヌクレオチド長のＤＮＡ配列を含むマイクロアレイとハイブリダイズさせる。次いで、アレイへの特異的なハイブリダイゼーションの検出は、ＧＭＳ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４１８で走査し、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Michael Eisen, Stanford University）、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Silicon Genetics, CA）の分析で実験データを処理することによって測定する。次いで、健常な患者と比較した、変形性関節症患者の血液サンプルにおける１９遺伝子の示差的な発現を、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用する統計分析によって決定する（Glantz SA. Primer of Biostatistics. 5th ed. New York, USA: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2002）。図１に記載の１９遺伝子それぞれの示差的な発現は、変形性関節症の診断に有用である。
【実施例１４】
【０６０３】
図１に記載の１９遺伝子によってコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を使用する、健常な個体の血液サンプルと比較した、変形性関節症である個体の血液サンプルの分析
本実施例は、特許請求に記載の本発明を使用して、健常な患者から得られた血液サンプルと比較した、ＯＡ患者から得られた血液サンプル中の示差的な遺伝子発現を検出することによって変形性関節症が診断されることを実証するものである。
【０６０４】
本明細書で定義する変形性関節症と臨床的に診断された患者から血液サンプルを得る。次いで、遺伝子発現プロファイルを分析し、ＯＡに罹患していない患者のプロファイルと比較する。各事例で、変形性関節症の診断は、熟練した専門医によって確認される。
【０６０５】
各患者から得られた血液から、ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈタンパク質抽出及び標識キット（Catalogue #K1848-1又は#631786）を用いて総細胞タンパク質を最初に単離し標識する。簡単に説明すると、抽出プロトコールは、細胞の機械的破壊、細胞の可溶化、及び抽出物の遠心分離の主要な３ステップからなる。そのプロセスは、細胞ペレット又は凍結組織から開始することができ、機械的破壊の任意の方法である、フレンチプレス、超音波破砕、切り刻み（mincing）、又は粉砕（grinding）を使用することができる。破壊した後、抽出／標識バッファーを添加する（１：２０  ｗ／ｖ）ことによりサンプルを可溶化する。そのバッファーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−エステル色素（例えば、Ｃｙ３及びＣｙＳ色素）での標識用に配合されているので、それは、色素との反応について競合する可能性のあるプロテアーゼ阻害剤又は還元剤を含まない。抽出後、サンプルを遠心分離して、染色体ＤＮＡなどの不溶性物質をペレットにする。次いで、可溶性抽出物を、Ｃｙ３及びＣｙ５蛍光色素（単官能ＮＨＳ−エステル）で標識する。次いで、標識タンパク質を、図１に記載の１９遺伝子によってコードされる全長ポリペプチドに対するモノクローナル抗体のアレイとともにインキュベートする。次いで、アレイへの特異的な結合の検出は、ＧＭＳ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４１８で走査し、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Michael Eisen, Stanford University）、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Silicon Genetics, CA）の分析で実験データを処理することによって測定する。健常な患者と比較した、変形性関節症患者の血液サンプルにおける１９遺伝子の示差的な発現を、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用する統計分析によって決定する（Glantz SA. Primer of Biostatistics. 5th ed. New York, USA: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2002）。図１に記載の１９遺伝子それぞれの示差的な発現は、変形性関節症の診断に有用である。
【実施例１５】
【０６０６】
図２に記載の４遺伝子によってコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を使用する、健常な個体の血液サンプルと比較した、中程度の変形性関節症である個体の血液サンプルの分析
本実施例は、特許請求に記載の本発明を使用して、健常な患者から得られた血液サンプルと比較した、ＯＡ患者から得られた血液サンプル中の示差的な遺伝子発現を検出することによって中程度の変形性関節症が診断されることを実証するものである。
【０６０７】
本明細書で定義する中程度の変形性関節症と臨床的に診断された患者から血液サンプルを得る。次いで、遺伝子発現プロファイルを分析し、ＯＡに罹患していない患者のプロファイルと比較する。各事例で、中程度の変形性関節症の診断は、熟練した専門医によって確認される。
【０６０８】
各患者から得られた血液から、ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈタンパク質抽出及び標識キット（Catalogue #K1848-1又は#631786）を用いて総細胞タンパク質を最初に単離し標識する。簡単に説明すると、抽出プロトコールは、細胞の機械的破壊、細胞の可溶化、及び抽出物の遠心分離の主要な３ステップからなる。そのプロセスは、細胞ペレット又は凍結組織から開始することができ、機械的破壊の任意の方法である、フレンチプレス、超音波破砕、切り刻み、又は粉砕を使用することができる。破壊した後、抽出／標識バッファーを添加する（１：２０  ｗ／ｖ）ことによりサンプルを可溶化する。そのバッファーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−エステル色素（例えば、Ｃｙ３及びＣｙＳ色素）での標識用に配合されているので、それは、色素との反応について競合する可能性のあるプロテアーゼ阻害剤又は還元剤を含まない。抽出後、サンプルを遠心分離して、染色体ＤＮＡなどの不溶性物質をペレットにする。次いで、可溶性抽出物を、Ｃｙ３及びＣｙ５蛍光色素（単官能ＮＨＳ−エステル）で標識する。次いで、標識タンパク質を、図２に記載の４遺伝子によってコードされる全長ポリペプチドに対するモノクローナル抗体のアレイとともにインキュベートする。次いで、アレイへの特異的な結合の検出は、ＧＭＳ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４１８で走査し、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Michael Eisen, Stanford University）、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Silicon Genetics, CA）の分析で実験データを処理することによって測定する。健常な患者と比較した、中程度の変形性関節症患者の血液サンプルにおける４遺伝子の示差的な発現を、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用する統計分析によって決定する（Glantz SA. Primer of Biostatistics. 5th ed. New York, USA: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2002）。図２に記載の４遺伝子それぞれの示差的な発現は、中程度の変形性関節症の診断に有用である。
【実施例１６】
【０６０９】
図３に記載の２遺伝子によってコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を使用する、中程度の変形性関節症である個体の血液サンプルと比較した、顕著な変形性関節症である個体の血液サンプルの分析
本実施例は、特許請求に記載の本発明を使用して、中程度のＯＡ患者から得られた血液サンプルと比較した、顕著なＯＡ患者から得られた血液サンプル中の示差的な遺伝子発現を検出することによって顕著な変形性関節症が診断されることを実証するものである。
【０６１０】
本明細書で定義する顕著な変形性関節症と臨床的に診断された患者から血液サンプルを得る。次いで、遺伝子発現プロファイルを分析し、中程度のＯＡ患者のプロファイルと比較する。各事例で、変形性関節症のステージの診断は、熟練した専門医によって確認される。
【０６１１】
各患者から得られた血液から、ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈタンパク質抽出及び標識キット（Catalogue #K1848-1又は#631786）を用いて総細胞タンパク質を最初に単離し標識する。簡単に説明すると、抽出プロトコールは、細胞の機械的破壊、細胞の可溶化、及び抽出物の遠心分離の主要な３ステップからなる。そのプロセスは、細胞ペレット又は凍結組織から開始することができ、機械的破壊の任意の方法である、フレンチプレス、超音波破砕、切り刻み、又は粉砕を使用することができる。破壊した後、抽出／標識バッファーを添加する（１：２０  ｗ／ｖ）ことによりサンプルを可溶化する。そのバッファーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−エステル色素（例えば、Ｃｙ３及びＣｙＳ色素）での標識用に配合されているので、それは、色素との反応について競合する可能性のあるプロテアーゼ阻害剤又は還元剤を含まない。抽出後、サンプルを遠心分離して、染色体ＤＮＡなどの不溶性物質をペレットにする。次いで、可溶性抽出物を、Ｃｙ３及びＣｙ５蛍光色素（単官能ＮＨＳ−エステル）で標識する。次いで、標識タンパク質を、図３に記載の２遺伝子によってコードされる全長ポリペプチドに対するモノクローナル抗体のアレイとともにインキュベートする。次いで、アレイへの特異的な結合の検出は、ＧＭＳ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４１８で走査し、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Michael Eisen, Stanford University）、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Silicon Genetics, CA）の分析で実験データを処理することによって測定する。中程度のＯＡ患者と比較した、顕著な変形性関節症患者の血液サンプルにおける２遺伝子の示差的な発現を、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用する統計分析によって決定する（Glantz SA. Primer of Biostatistics. 5th ed. New York, USA: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2002）。図３に記載の２遺伝子それぞれの示差的な発現は、顕著な変形性関節症の診断に有用である。
【実施例１７】
【０６１２】
図４に記載の４遺伝子によってコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を使用する、顕著な変形性関節症である個体の血液サンプルと比較した、重篤な変形性関節症である個体の血液サンプルの分析
本実施例は、特許請求に記載の本発明を使用して、顕著なＯＡ患者から得られた血液サンプルと比較した、重篤なＯＡ患者から得られた血液サンプル中の示差的な遺伝子発現を検出することによって重篤な変形性関節症が診断されることを実証するものである。
【０６１３】
本明細書で定義する重篤な変形性関節症と臨床的に診断された患者から血液サンプルを得る。次いで、遺伝子発現プロファイルを分析し、顕著なＯＡ患者のプロファイルと比較する。各事例で、変形性関節症のステージの診断は、熟練した専門医によって確認される。
【０６１４】
各患者から得られた血液から、ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈタンパク質抽出及び標識キット（Catalogue #K1848-1又は#631786）を用いて総細胞タンパク質を最初に単離し標識する。簡単に説明すると、抽出プロトコールは、細胞の機械的破壊、細胞の可溶化、及び抽出物の遠心分離の主要な３ステップからなる。そのプロセスは、細胞ペレット又は凍結組織から開始することができ、機械的破壊の任意の方法である、フレンチプレス、超音波破砕、切り刻み、又は粉砕を使用することができる。破壊した後、抽出／標識バッファーを添加する（１：２０  ｗ／ｖ）ことによりサンプルを可溶化する。そのバッファーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−エステル色素（例えば、Ｃｙ３及びＣｙＳ色素）での標識用に配合されているので、それは、色素との反応について競合する可能性のあるプロテアーゼ阻害剤又は還元剤を含まない。抽出後、サンプルを遠心分離して、染色体ＤＮＡなどの不溶性物質をペレットにする。次いで、可溶性抽出物を、Ｃｙ３及びＣｙ５蛍光色素（単官能ＮＨＳ−エステル）で標識する。次いで、標識タンパク質を、図４に記載の４遺伝子によってコードされる全長ポリペプチドに対するモノクローナル抗体のアレイとともにインキュベートする。次いで、アレイへの特異的な結合の検出は、ＧＭＳ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４１８で走査し、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Michael Eisen, Stanford University）、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Silicon Genetics, CA）の分析で実験データを処理することによって測定する。顕著なＯＡ患者と比較した、重篤な変形性関節症患者の血液サンプルにおける４遺伝子の示差的な発現を、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用する統計分析によって決定する（Glantz SA. Primer of Biostatistics. 5th ed. New York, USA: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2002）。図４に記載の４遺伝子それぞれの示差的な発現は、重篤な変形性関節症の診断に有用である。
【実施例１８】
【０６１５】
図１に記載の１９遺伝子の５’領域によってコードされるポリペプチドのアミノ末端領域に対するモノクローナル抗体を使用する、健常な個体の血液サンプルと比較した、変形性関節症である個体の血液サンプルの分析
本実施例は、特許請求に記載の本発明を使用して、健常な患者から得られた血液サンプルと比較した、ＯＡ患者から得られた血液サンプル中の示差的な遺伝子発現を検出することによって変形性関節症が診断されることを実証するものである。
【０６１６】
本明細書で定義する変形性関節症と臨床的に診断された患者から血液サンプルを得る。次いで、遺伝子発現プロファイルを分析し、ＯＡに罹患していない患者のプロファイルと比較する。各事例で、変形性関節症の診断は、熟練した専門医によって確認される。
【０６１７】
各患者から得られた血液から、ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈタンパク質抽出及び標識キット（Catalogue #K1848-1又は#631786）を用いて総細胞タンパク質を最初に単離し標識する。簡単に説明すると、抽出プロトコールは、細胞の機械的破壊、細胞の可溶化、及び抽出物の遠心分離の主要な３ステップからなる。そのプロセスは、細胞ペレット又は凍結組織から開始することができ、機械的破壊の任意の方法である、フレンチプレス、超音波破砕、切り刻み、又は粉砕を使用することができる。破壊した後、抽出／標識バッファーを添加する（１：２０  ｗ／ｖ）ことによりサンプルを可溶化する。そのバッファーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−エステル色素（例えば、Ｃｙ３及びＣｙＳ色素）での標識用に配合されているので、それは、色素との反応について競合する可能性のあるプロテアーゼ阻害剤又は還元剤を含まない。抽出後、サンプルを遠心分離して、染色体ＤＮＡなどの不溶性物質をペレットにする。次いで、可溶性抽出物を、Ｃｙ３及びＣｙ５蛍光色素（単官能ＮＨＳ−エステル）で標識する。次いで、標識タンパク質を、図１に記載の１９遺伝子の５’領域によってコードされるポリペプチドのアミノ末端領域に対するモノクローナル抗体のアレイとともにインキュベートする。次いで、アレイへの特異的な結合の検出は、ＧＭＳ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４１８で走査し、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Michael Eisen, Stanford University）、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Silicon Genetics, CA）の分析で実験データを処理することによって測定する。健常な患者と比較した、変形性関節症患者の血液サンプルにおける１９遺伝子の示差的な発現を、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用する統計分析によって決定する（Glantz SA. Primer of Biostatistics. 5th ed. New York, USA: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2002）。図１に記載の１９遺伝子それぞれの示差的な発現は、変形性関節症の診断に有用である。
【実施例１９】
【０６１８】
図１に記載の１９遺伝子の３’領域によってコードされるポリペプチドのカルボキシ末端領域に対するモノクローナル抗体を使用する、健常な個体の血液サンプルと比較した、変形性関節症である個体の血液サンプルの分析
本実施例は、特許請求に記載の本発明を使用して、健常な患者から得られた血液サンプルと比較した、ＯＡ患者から得られた血液サンプル中の示差的な遺伝子発現を検出することによって変形性関節症が診断されることを実証するものである。
【０６１９】
本明細書で定義する変形性関節症と臨床的に診断された患者から血液サンプルを得る。次いで、遺伝子発現プロファイルを分析し、ＯＡに罹患していない患者のプロファイルと比較する。各事例で、変形性関節症の診断は、熟練した専門医によって確認される。
【０６２０】
各患者から得られた血液から、ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈタンパク質抽出及び標識キット（Catalogue #K1848-1又は#631786）を用いて総細胞タンパク質を最初に単離し標識する。簡単に説明すると、抽出プロトコールは、細胞の機械的破壊、細胞の可溶化、及び抽出物の遠心分離の主要な３ステップからなる。そのプロセスは、細胞ペレット又は凍結組織から開始することができ、機械的破壊の任意の方法である、フレンチプレス、超音波破砕、切り刻み、又は粉砕を使用することができる。破壊した後、抽出／標識バッファーを添加する（１：２０  ｗ／ｖ）ことによりサンプルを可溶化する。そのバッファーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−エステル色素（例えば、Ｃｙ３及びＣｙＳ色素）での標識用に配合されているので、それは、色素との反応について競合する可能性のあるプロテアーゼ阻害剤又は還元剤を含まない。抽出後、サンプルを遠心分離して、染色体ＤＮＡなどの不溶性物質をペレットにする。次いで、可溶性抽出物を、Ｃｙ３及びＣｙ５蛍光色素（単官能ＮＨＳ−エステル）で標識する。次いで、標識タンパク質を、図１に記載の１９遺伝子の３’領域によってコードされるポリペプチドのカルボキシ末端領域に対するモノクローナル抗体のアレイとともにインキュベートする。次いで、アレイへの特異的な結合の検出は、ＧＭＳ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４１８で走査し、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Michael Eisen, Stanford University）、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Silicon Genetics, CA）の分析で実験データを処理することによって測定する。健常な患者と比較した、変形性関節症患者の血液サンプルにおける１９遺伝子の示差的な発現を、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用する統計分析によって決定する（Glantz SA. Primer of Biostatistics. 5th ed. New York, USA: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2002）。図１に記載の１９遺伝子それぞれの示差的な発現は、変形性関節症の診断に有用である。
【実施例２０】
【０６２１】
図１に記載の１９遺伝子の内部コード領域によってコードされるポリペプチドの内部ポリペプチド領域に対する抗体を使用する、健常な個体の血液サンプルと比較した、変形性関節症である個体の血液サンプルの分析
本実施例は、特許請求に記載の本発明を使用して、健常な患者から得られた血液サンプルと比較した、ＯＡ患者から得られた血液サンプル中の示差的な遺伝子発現を検出することによって変形性関節症が診断されることを実証するものである。
【０６２２】
本明細書で定義する変形性関節症と臨床的に診断された患者から血液サンプルを得る。次いで、遺伝子発現プロファイルを分析し、ＯＡに罹患していない患者のプロファイルと比較する。各事例で、変形性関節症の診断は、熟練した専門医によって確認される。
【０６２３】
各患者から得られた血液から、ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈタンパク質抽出及び標識キット（Catalogue #K1848-1又は#631786）を用いて総細胞タンパク質を最初に単離し標識する。簡単に説明すると、抽出プロトコールは、細胞の機械的破壊、細胞の可溶化、及び抽出物の遠心分離の主要な３ステップからなる。そのプロセスは、細胞ペレット又は凍結組織から開始することができ、機械的破壊の任意の方法である、フレンチプレス、超音波破砕、切り刻み、又は粉砕を使用することができる。破壊した後、抽出／標識バッファーを添加する（１：２０  ｗ／ｖ）ことによりサンプルを可溶化する。そのバッファーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−エステル色素（例えば、Ｃｙ３及びＣｙＳ色素）での標識用に配合されているので、それは、色素との反応について競合する可能性のあるプロテアーゼ阻害剤又は還元剤を含まない。抽出後、サンプルを遠心分離して、染色体ＤＮＡなどの不溶性物質をペレットにする。次いで、可溶性抽出物を、Ｃｙ３及びＣｙ５蛍光色素（単官能ＮＨＳ−エステル）で標識する。次いで、標識タンパク質を、図１に記載の１９遺伝子の内部コード領域によってコードされるポリペプチドの内部ポリペプチド領域に対するモノクローナル抗体のアレイとともにインキュベートする。次いで、アレイへの特異的な結合の検出は、ＧＭＳ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４１８で走査し、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Michael Eisen, Stanford University）、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Silicon Genetics, CA）の分析で実験データを処理することによって測定する。健常な患者と比較した、変形性関節症患者の血液サンプルにおける１９遺伝子の示差的な発現を、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用する統計分析によって決定する（Glantz SA. Primer of Biostatistics. 5th ed. New York, USA: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2002）。図１に記載の１９遺伝子それぞれの示差的な発現は、変形性関節症の診断に有用である。
【実施例２１】
【０６２４】
ＯＡのステージと非ＯＡの区別に有用な組み合わせを同定するための、本発明の９種のバイオマーカーからなる部分集合へのロジスティック回帰の適用
Ｍａｒｓｈａｌｌのシステム（上記）を用いて分類された軽度な変形性関節症患者２５９名、及び正常被験者８２名の血液サンプルからＲＮＡを単離した。実施例４の表４で開示されているプライマーを使用して、表２で開示されているＲＮＡ産物の集団の発現レベルに対応するデータを得た。９種のバイオマーカー（ＥＧＲ１、Ｇ２ＡＮ、ＨＳＰＣＡ、ＩＫＢＫＡＰ、ＩＬ１３ＲＡ１、ＬＡＭＣ１、ＭＡＦＢ、ＰＦ４、ＴＮＦＡＩＰ６）のＱＲＴ−ＰＣＲから生じるΔＣｔ値からなる基準のデータセットを、ロジスティック回帰への入力に利用して、この９種の候補バイオマーカーのΔＣｔ値の様々な組み合わせの診断可能性を判定した。２９−１＝５１１通りの考えられるバイオマーカーの組み合わせのうち、２５４通りの組み合わせが、最大尤度のロジスティック回帰でうまく動作し、「対照」に対して「軽度の変形性関節症」が有意に区別された（ＲＯＣ面積＞０．５）。わずか３種のバイオマーカーの組み合わせでも、ＲＯＣ面積＞０．８５となったことは注目に値する。下記の表９に、固定した数の遺伝子で最大のＲＯＣ面積が得られる１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種又は８種のバイオマーカーの組み合わせに関するロジスティック回帰パラメータを示す。
【０６２５】
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【０６２６】
最大の全体ＲＯＣ面積（０．８９〜０．９０）を有する６種のバイオマーカーの組み合わせを図２に示し、それらのロジスティック回帰パラメータの値を表１０に示す。
【０６２７】
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【０６２８】
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【０６２９】
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【０６３０】
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【０６３１】
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【０６３２】
参照文献
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【０６３３】
本出願において引用した全ての参照文献、特許及び特許出願（公開された特許出願を含む）の内容を、参照により本明細書に組み入れる。
【０６３４】
均等物
当業者であれば、本明細書に記載した本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を理解し、通常の実験の範囲内でそれを確認することができる。そのような均等物は、特許請求の範囲により包含されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０６３５】
【図１】図１は、正常個体集団における同じ遺伝子と比較して、軽度ＯＡ個体の集団において示差的に調節された１９遺伝子のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す図である。
【図２】図２は、正常個体集団と比較して、中程度ＯＡ個体の集団において示差的に調節された４遺伝子のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す図である。
【図３】図３は、顕著なＯＡを患う個体集団と比較して、中程度ＯＡを患う個体集団において示差的に調節された２遺伝子のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す図である。
【図４】図４は、重篤なＯＡを患う個体集団と比較して、顕著なＯＡを患う個体集団において示差的に調節された４遺伝子のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す図である。
【図５】図５は、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた、軽度 対 中程度ＯＡを有する患者由来の血液サンプルにおけるグルコシダーゼＩＩαサブユニット（Ｇ２ＡＮ）の示差的な遺伝子発現を示す。
【図６】図６は、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン、ＱＲＴ−ＰＣＲ及びＴａｑｍＭａｎ（登録商標）分析を用いた、軽度 対 中程度ＯＡを有する患者由来の血液サンプルにおける腫瘍壊死因子α誘導型タンパク質６（ＴＮＦＡＩＰ６）の示差的な遺伝子発現を示す。
【図７】図７は、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた、顕著 対 重篤なＯＡを有する患者由来の血液サンプルにおけるＰｅｒｉｏｄホモログ１（Drosophila）（ＰＥＲ１）の示差的な遺伝子発現を示す。
【図８】図８は、ＴａｑｍＭａｎ（登録商標）、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた、中程度 対 顕著なＯＡを有する患者由来の血液サンプルにおけるジンクフィンガーＲＮＡ結合タンパク質（ＺＦＲ）の示差的な遺伝子発現を示す。
【図９】図９は、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた、軽度 対 顕著なＯＡを有する患者由来の血液サンプルにおけるＡＴＰ結合カセット サブファミリーＡ メンバー１（ＡＢＣＡ）及びＡＴＰ結合カセット サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー１（ＡＢＣＧ１）の示差的な遺伝子発現を示す。
【図１０】図１０は、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた、軽度 対 顕著なＯＡを有する患者由来の血液サンプルにおけるインターフェロン調節因子１（ＩＲＦ１）の示差的な遺伝子発現を示す。
【図１１】図１１は、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた、軽度 対 顕著なＯＡを有する患者由来の血液サンプルにおける核内受容体活性化補助因子１（ＮＲＣＯＡ１）及び細胞内塩素チャネル４（ＣＬＩＣ４）の示差的な遺伝子発現を示す。
【図１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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