(57)【要約】  本発明は、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体、ポリペプチド、およびこれらをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、ニューロパシー、例えばタキソール誘導性感覚性ニューロパシー、シスプラチン誘導性感覚性ニューロパシー、およびピリドキシン誘導性感覚性ニューロパシーを含む感覚性ニューロパシーの治療および／または予防における、こうした抗体、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体であって：
（ａ）式ＧＹＴＦＴＳＹＸａａＸａａＨ（配列番号１６）のＣＤＲ１、式中、８位のＸａａはＲまたはＷであり、そして９位のＸａａはＩ、Ｌ、Ｒ、またはＭである；
（ｂ）式ＥＩＹＰＳＮＸａａＲＴＮＹＮＥＫＦＸａａＳ（配列番号１７）のＣＤＲ２、式中、７位のＸａａはＡ、Ｔ、ＳまたはＧであり；そして１６位のＸａａはＫまたはＥである；および
（ｃ）式ＫＹＹＹＧＮＸａａＸａａＲＳＷＹＦＤＶ（配列番号１８）のＣＤＲ３、式中、７位のＸａａはＴまたはＳであり；８位のＸａａはＲ、Ｑ、Ｋ、Ｓ、またはＹである
を含む重鎖ＣＤＲを含み；
配列番号２２のＣＤＲ１領域、配列番号２３のＣＤＲ２領域、および配列番号２４のＣＤＲ３領域を含む重鎖ＣＤＲを含む抗体ではない
前記アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項２】
軽鎖可変領域をさらに含む、請求項１のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項３】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体であって：
（ａ）式ＲＡＳＥＳＸａａＤＸａａＹＧＩＳＦＸａａＸａａ（配列番号１９）のＣＤＲ１、式中、６位のＸａａはＩまたはＶであり；８位のＸａａはＮまたはＳであり；１４位のＸａａはＬまたはＭであり；１５位のＸａａはＡ、ＴまたはＮである；
（ｂ）式ＡＡＳＮＸａａＧＳ（配列番号２０）のＣＤＲ２、式中、５位のＸａａはＲ、Ｌ、またはＱである；および
（ｃ）式ＱＱＳＫＸａａＶＰＲＴ（配列番号２１）のＣＤＲ３、式中、５位のＸａａはＴ、Ａ、Ｓ、またはＥである
を含む軽鎖ＣＤＲを含み；
配列番号２５のＣＤＲ１領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、および配列番号２７のＣＤＲ３領域を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗体ではない
前記アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項４】
重鎖可変領域をさらに含む、請求項１のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項５】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体であって：
（ａ）重鎖ＣＤＲであって：
（ｉ）式ＧＹＴＦＴＳＹＸａａＸａａＨ（配列番号１６）のＣＤＲ１、式中、８位のＸａａはＲまたはＷであり、そして９位のＸａａはＩ、Ｌ、Ｒ、またはＭである；
（ｉｉ）式ＥＩＹＰＳＮＸａａＲＴＮＹＮＥＫＦＸａａＳ（配列番号１７）のＣＤＲ２、式中、７位のＸａａはＡ、Ｔ、ＳまたはＧであり；そして１６位のＸａａはＫまたはＥである；および
（ｉｉｉ）式ＫＹＹＹＧＮＸａａＸａａＲＳＷＹＦＤＶ（配列番号１８）のＣＤＲ３、式中、７位のＸａａはＴまたはＳであり；８位のＸａａはＲ、Ｑ、Ｋ、Ｓ、またはＹである
を含む前記重鎖ＣＤＲ；並びに
（ｂ）軽鎖ＣＤＲであって：
（ｉ）式ＲＡＳＥＳＸａａＤＸａａＹＧＩＳＦＸａａＸａａ（配列番号１９）のＣＤＲ１、式中、６位のＸａａはＩまたはＶであり；８位のＸａａはＮまたはＳであり；１４位のＸａａはＬまたはＭであり；１５位のＸａａはＡ、ＴまたはＮである；
（ｉｉ）式ＡＡＳＮＸａａＧＳ（配列番号２０）のＣＤＲ２、式中、５位のＸａａはＲ、Ｌ、またはＱである；および
（ｉｉｉ）式ＱＱＳＫＸａａＶＰＲＴ（配列番号２１）のＣＤＲ３、式中、５位のＸａａはＴ、Ａ、Ｓ、またはＥである
を含む前記軽鎖ＣＤＲ
を含み；
（ａ）配列番号２２のＣＤＲ１領域、配列番号２３のＣＤＲ２領域、および配列番号２４のＣＤＲ３領域を含む重鎖ＣＤＲ；並びに（ｂ）配列番号２５のＣＤＲ１領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、および配列番号２７のＣＤＲ３領域を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗体ではない
前記アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項６】
ヒトｔｒｋＣに結合する、請求項１〜５のいずれかのアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項７】
約５ｎＭ未満のＫＤでヒトｔｒｋＣに結合する、請求項６のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項８】
げっ歯類ｔｒｋＣにさらに結合する、請求項６のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれかのアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項１０】
ヒト化抗体である、請求項１〜５のいずれかのアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項１１】
（ａ）配列番号４のＣＤＲ１領域；
（ｂ）配列番号５のＣＤＲ２領域；および
（ｃ）配列番号６のＣＤＲ３領域
を含む重鎖可変領域を含む、請求項１〜５のいずれかのアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項１２】
重鎖可変領域が配列番号１の配列からなる、請求項１１のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項１３】
（ａ）配列番号７のＣＤＲ１領域；
（ｂ）配列番号８のＣＤＲ２領域；および
（ｃ）配列番号９のＣＤＲ３領域
を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜５のいずれかのアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項１４】
軽鎖可変領域が配列番号２の配列からなる、請求項１３のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれかのアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体であって
（ａ）重鎖可変領域であって：
（ｉ）配列番号４のＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）配列番号５のＣＤＲ２領域；および
（ｉｉｉ）配列番号６のＣＤＲ３領域
を含む前記重鎖可変領域；並びに
（ｂ）軽鎖可変領域であって：
（ｉ）配列番号７のＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）配列番号８のＣＤＲ２領域；および
（ｉｉｉ）配列番号９のＣＤＲ３領域
を含む前記軽鎖可変領域
を含む、前記アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項１６】
重鎖可変領域が配列番号１からなり、そして軽鎖可変領域が配列番号２の配列からなる、請求項１５のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項１７】
重鎖が配列番号２８の配列からなり、そして軽鎖可変領域が配列番号２９の配列からなる、請求項１５のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかのアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体をコードする核酸。
【請求項１９】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の重鎖可変領域をコードする配列番号１２の配列、およびアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の軽鎖可変領域をコードする配列番号１０の配列を含む、請求項１８の核酸。
【請求項２０】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の重鎖をコードする配列番号１３の配列、およびアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の軽鎖可変領域をコードする配列番号１１の配列を含む、請求項１９の核酸。
【請求項２１】
請求項１８の核酸を含むベクター。
【請求項２２】
請求項１８の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２３】
（ａ）請求項１〜１７のいずれかのアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の有効量および（ｂ）薬学的に許容しうる賦形剤を含む、薬剤組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１７のいずれかのアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を含むキット。
【請求項２５】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を作成する方法であって、請求項１〜１７のいずれかのアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体をコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞において発現させることを含む、前記方法。
【請求項２６】
ｔｒｋＣに結合するポリペプチドであって：
（ａ）式ＧＹＴＦＴＳＹＸａａＸａａＨ（配列番号１６）のＣＤＲ１、式中、８位のＸａａはＲまたはＷであり、そして９位のＸａａはＩ、Ｌ、Ｒ、またはＭである；
（ｂ）式ＥＩＹＰＳＮＸａａＲＴＮＹＮＥＫＦＸａａＳ（配列番号１７）のＣＤＲ２、式中、７位のＸａａはＡ、Ｔ、ＳまたはＧであり；そして１６位のＸａａはＫまたはＥである；および
（ｃ）式ＫＹＹＹＧＮＸａａＸａａＲＳＷＹＦＤＶ（配列番号１８）のＣＤＲ３、式中、７位のＸａａはＴまたはＳであり；８位のＸａａはＲ、Ｑ、Ｋ、Ｓ、またはＹである
を含み；
配列番号２２のＣＤＲ１領域、配列番号２３のＣＤＲ２領域、および配列番号２４のＣＤＲ３領域を含むＣＤＲを含むポリペプチドではない
前記ポリペプチド。
【請求項２７】
ｔｒｋＣに結合するポリペプチドであって：
（ａ）式ＲＡＳＥＳＸａａＤＸａａＹＧＩＳＦＸａａＸａａ（配列番号１９）のＣＤＲ１、式中、６位のＸａａはＩまたはＶであり；８位のＸａａはＮまたはＳであり；１４位のＸａａはＬまたはＭであり；１５位のＸａａはＡ、ＴまたはＮである；
（ｂ）式ＡＡＳＮＸａａＧＳ（配列番号２０）のＣＤＲ２、式中、５位のＸａａはＲ、Ｌ、またはＱである；および
（ｃ）式ＱＱＳＫＸａａＶＰＲＴ（配列番号２１）のＣＤＲ３、式中、５位のＸａａはＴ、Ａ、Ｓ、またはＥである
を含み；
配列番号２５のＣＤＲ１領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、および配列番号２７のＣＤＲ３領域を含むＣＤＲを含むポリペプチドではない
前記ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロス・リファレンス
本出願は、仮出願米国第６０／５３２，５９２号、２００３年１２月２３日出願に優先権を請求し、該出願は完全に本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体およびポリペプチドに関する。本発明は、感覚性ニューロパシーなどの疾患の治療および／または予防における、こうした抗体およびポリペプチドの使用にさらに関する。
【０００３】
連邦政府が資金援助した研究または開発に関する説明
該当なし。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ニューロトロフィンは、小型ホモ二量体タンパク質のファミリーであり、神経系の発生および維持に重大な役割を果たす。ニューロトロフィン・ファミリーのメンバーには、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、ニューロトロフィン−６（ＮＴ−６）、およびニューロトロフィン−７（ＮＴ−７）が含まれる。ニューロトロフィンは、他のポリペプチド増殖因子と同様、細胞表面受容体との相互作用を通じて、ターゲット細胞に影響を及ぼす。現在の知識によると、２種類の膜貫通糖タンパク質がニューロトロフィン類の受容体として働く。ニューロトロフィン応答性ニューロンは、ｐ７５ＮＴＲまたはｐ７５とも称され、２ｘ１０−９ＭのＫＤでＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４／５に結合する、共通の低分子量（６５〜８０ｋＤａ）低親和性受容体（ＬＮＧＦＲ）；並びに高分子量（１３０〜１５０ｋＤａ）高親和性（１０−１１Ｍ範囲のＫＤ）受容体を所持し、これらは受容体チロシンキナーゼのｔｒｋファミリーのメンバーである。ｔｒｋ受容体ファミリーの同定されたメンバーは、ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、およびｔｒｋＣである。
【０００５】
ＴｒｋＣは中枢神経系で、そして末梢神経系のニューロンのサブセット上で広く発現される。ＴｒｋＣはまた、いくつかの副交感腸ニューロン、およびいくつかの非神経組織上でも発現される。ＴｒｋＣは、交感ニューロン、およびＤＲＧ一次感覚ニューロンのサブセットであるＤＲＧの大径線維（ｌａｒｇｅ  ｆｉｂｅｒ）感覚ニューロン上で発現される。大径線維感覚ニューロンは、末梢へと伸びる巨大な有髄軸索を有し、該軸索を通じて、自己受容、並びに繊細な触角および振動の感覚に関する情報を運ぶ。
【０００６】
全長天然ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ受容体の細胞外ドメインは、５つの構造ドメインを有し、これらのドメインは、多様な他のタンパク質において同定された相同な構造またはそうでなければ類似の構造に関連して定義されてきている。これらのドメインは、成熟ｔｒｋ受容体のアミノ酸配列のＮ末端から始まって、１）第一のシステインリッチドメイン；２）ロイシンリッチドメイン；３）第二のシステインリッチドメイン；４）第一の免疫グロブリン様ドメイン；および５）第二の免疫グロブリン様ドメインと称されている。例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ０１９８３６１号；Ｕｒｆｅｒら  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：５８２９−５８４０（１９９８）を参照されたい。
【０００７】
ニューロトロフィン類は、多様な神経変性疾患および神経学的疾患の潜在的な療法剤として重要である。ＮＧＦおよびＮＴ−３などのニューロトロフィンは、ピリドキシン治療またはシスプラチン治療と関連する感覚性ニューロパシーを治療するため、動物モデルにおいて試験された。米国特許第５，６０４，２０２号；ＰＣＴ公報第ＷＯ  ０１９８３６１号。神経変性疾患および神経学的疾患の治療におけるニューロトロフィンの使用には、いくつかの欠点があった。１つの重大な欠点は、特異性が欠如していることである。大部分のニューロトロフィンは、１より多い受容体と交差反応する。例えば、ＮＴ−３は、ｔｒｋＣ受容体チロシンキナーゼの好ましいリガンドであるが、ｔｒｋＡおよびｔｒｋＢにもまた結合し、そしてこれらも活性化する（Ｂａｒｂａｃｉｄ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ２５：１３８６−１４０３，  １９９４；Ｂａｒｂａｒｃｉｄ，  Ａｎｎ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃｅｄ．  Ｓｃｉ．  ７６６：４４２−４５８，  １９９５；ＲｙｄｅｎおよびＩｂａｎｅｚ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ，  Ｃｈｅｍ．  ２７１：５６２３−５６２７，  １９９６，  Ｂｅｌｌｉｖｅａｕら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３６：３７５−３８８，  １９９７；Ｆａｒｉｎａｓら，  Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：３２５−３３４，  １９９８）。その結果、ニューロンの特定の集団をターゲットとする療法を考案するのが困難である。ニューロトロフィン療法の別の制限は、ＮＴ−３を含むニューロトロフィンが、痛覚過敏を引き起こすことが知られることである（Ｃｈａｕｄｈｒｙら，  Ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  Ｎｅｒｖｅ  ２３：１８９−１９２，  ２０００）。さらに、ＮＴ−３などのいくつかのニューロトロフィンは、げっ歯類において、劣った薬物動態学的特性および生物学的利用能特性を有することから、ヒトの臨床適用に関して深刻な疑問が生じる（Ｈａａｓｅら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃｉ．  １６０：Ｓ９７−Ｓ１０５，  １９９８、Ｈｅｌｇｒｅｎら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １７（１）：３７２−８２，  １９９７で用いられる投薬量）。したがって、ニューロトロフィンの既知の欠点を回避する、神経変性障害および神経学的疾患を治療するための新規療法剤の開発が必要である。
【０００８】
げっ歯類アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体が報告されてきている。ＰＣＴ公報第ＷＯ  ０１／９８３６１号を参照されたい。しかし、げっ歯類抗体がヒトにおいて療法的に用いられる場合、治療される個体のかなりの数で、ヒト抗ネズミ抗体反応が発展する。さらに、マウス抗体のエフェクター機能は、ヒトの状況においては、より効率的でないことが立証されている。したがって、ヒト化アゴニスト抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体を含む、改善されたアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体に関する重大な必要性がある。
【０００９】
本明細書に開示するすべての参考文献、刊行物および特許出願は、完全に本明細書に援用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の簡単な概要
本明細書に開示する発明は、ｔｒｋＣ受容体に対するアゴニスト抗体に関する。したがって、１つの側面において、本発明は、ヒトおよびげっ歯類のｔｒｋＣ受容体（「ｔｒｋＣ」）に特異的に結合する、ヒト化し、そして親和性成熟させた抗体、Ａ５である。Ａ５の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ、図１Ａ（配列番号１）および図１Ｂ（配列番号２）に示す。抗体Ａ５の相補性決定領域（ＣＤＲ）部分（ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔのＣＤＲを含む）を、図１Ａおよび図１Ｂに図式的に示す。Ａ５重鎖および軽鎖のアミノ酸配列、並びに個々の拡張（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ＣＤＲのアミノ酸配列もまた、以下に示す（以下の「抗体配列」を参照されたい）。
【００１１】
本発明はまた、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体（いくつかの態様において、ポリペプチド）であって：（ａ）式ＧＹＴＦＴＳＹＸａａＸａａＨ（配列番号１６）のＣＤＲ１、式中、８位のＸａａはＲまたはＷであり、そして９位のＸａａはＩ、Ｌ、Ｒ、またはＭである；（ｂ）式ＥＩＹＰＳＮＸａａＲＴＮＹＮＥＫＦＸａａＳ（配列番号１７）のＣＤＲ２、式中、７位のＸａａはＡ、Ｔ、ＳまたはＧであり；そして１６位のＸａａはＫまたはＥである；および（ｃ）式ＫＹＹＹＧＮＸａａＸａａＲＳＷＹＦＤＶ（配列番号１８）のＣＤＲ３、式中、７位のＸａａはＴまたはＳであり；８位のＸａａはＲ、Ｑ、Ｋ、Ｓ、またはＹである、を含む重鎖ＣＤＲを含み；配列番号２２のＣＤＲ１領域、配列番号２３のＣＤＲ２領域、および配列番号２４のＣＤＲ３領域を含む重鎖ＣＤＲを含む抗体ではない、前記アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体も提供する。いくつかの態様において、ＣＤＲ１は、式ＧＹＴＦＴＳＹＸａａＸａａＨ（配列番号１６）、式中、８位のＸａａはＲであり、そして９位のＸａａはＩ、Ｌ、またはＲである、を有する。いくつかの態様において、ＣＤＲ２は、式ＥＩＹＰＳＮＸａａＲＴＮＹＮＥＫＦＸａａＳ（配列番号１７）、式中、７位のＸａａはＡ、Ｔ、またはＳであり；そして１６位のＸａａはＫまたはＥである、を有する。いくつかの態様において、ＣＤＲ３は、式ＫＹＹＹＧＮＸａａＸａａＲＳＷＹＦＤＶ（配列番号１８）、式中、７位のＸａａはＴであり；８位のＸａａはＲ、Ｑ、Ｋ、またはＳである、を有する。いくつかの態様において、抗体は軽鎖可変領域を含む。
【００１２】
本発明はまた、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体（いくつかの態様において、ポリペプチド）であって：（ａ）式ＲＡＳＥＳＸａａＤＸａａＹＧＩＳＦＸａａＸａａ（配列番号１９）のＣＤＲ１、式中、６位のＸａａはＩまたはＶであり；８位のＸａａはＮまたはＳであり；１４位のＸａａはＬまたはＭであり；１５位のＸａａはＡ、ＴまたはＮである；（ｂ）式ＡＡＳＮＸａａＧＳ（配列番号２０）のＣＤＲ２、式中、５位のＸａａはＲ、Ｌ、またはＱである；および（ｃ）式ＱＱＳＫＸａａＶＰＲＴ（配列番号２１）のＣＤＲ３、式中、５位のＸａａはＴ、Ａ、Ｓ、またはＥである、を含む軽鎖ＣＤＲを含み；配列番号２５のＣＤＲ１領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、および配列番号２７のＣＤＲ３領域を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗体ではない、前記アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体も提供する。いくつかの態様において、ＣＤＲ１は、式ＲＡＳＥＳＸａａＤＸａａＹＧＩＳＦＸａａＸａａ（配列番号１９）の配列、式中、６位のＸａａはＩであり；８位のＸａａはＮまたはＳであり；１４位のＸａａはＬであり；１５位のＸａａはＡまたはＴである、を有する。いくつかの態様において、ＣＤＲ２は、式ＡＡＳＮＸａａＧＳ（配列番号２０）の配列、式中、５位のＸａａはＲまたはＬである、を有する。いくつかの態様において、ＣＤＲ３は、ＱＱＳＫＸａａＶＰＲＴ（配列番号２１）の配列、式中、５位のＸａａはＴ、Ａ、またはＳである、を有する。いくつかの態様において、抗体は、重鎖可変領域を含む。
【００１３】
本発明はまた、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体（いくつかの態様において、ポリペプチド）であって：（ａ）重鎖ＣＤＲであって：（ｉ）式ＧＹＴＦＴＳＹＸａａＸａａＨ（配列番号１６）のＣＤＲ１、式中、８位のＸａａはＲまたはＷであり、そして９位のＸａａはＩ、Ｌ、Ｒ、またはＭである；（ｉｉ）式ＥＩＹＰＳＮＸａａＲＴＮＹＮＥＫＦＸａａＳ（配列番号１７）のＣＤＲ２、式中、７位のＸａａはＡ、Ｔ、ＳまたはＧであり；そして１６位のＸａａはＫまたはＥである；および（ｉｉｉ）式ＫＹＹＹＧＮＸａａＸａａＲＳＷＹＦＤＶ（配列番号１８）のＣＤＲ３、式中、７位のＸａａはＴまたはＳであり；８位のＸａａはＲ、Ｑ、Ｋ、Ｓ、またはＹである、を含む前記重鎖ＣＤＲ；並びに（ｂ）軽鎖ＣＤＲであって：（ｉ）式ＲＡＳＥＳＸａａＤＸａａＹＧＩＳＦＸａａＸａａ（配列番号１９）のＣＤＲ１、式中、６位のＸａａはＩまたはＶであり；８位のＸａａはＮまたはＳであり；１４位のＸａａはＬまたはＭであり；１５位のＸａａはＡ、ＴまたはＮである；（ｉｉ）式ＡＡＳＮＸａａＧＳ（配列番号２０）のＣＤＲ２、式中、５位のＸａａはＲ、Ｌ、またはＱである；および（ｉｉｉ）式ＱＱＳＫＸａａＶＰＲＴ（配列番号２１）のＣＤＲ３、式中、５位のＸａａはＴ、Ａ、Ｓ、またはＥである、を含む前記軽鎖ＣＤＲを含み；（ａ）配列番号２２のＣＤＲ１領域、配列番号２３のＣＤＲ２領域、および配列番号２４のＣＤＲ３領域を含む重鎖ＣＤＲ；並びに（ｂ）配列番号２５のＣＤＲ１領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、および配列番号２７のＣＤＲ３領域を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗体ではない、前記アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体も提供する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、抗体Ａ５（本明細書において、交換可能に「Ａ５」とも称される）の断片または領域を含む抗体である。１つの態様において、断片は、配列番号２９に示すような抗体Ａ５の軽鎖である。別の態様において、断片は、配列番号２８に示すような抗体Ａ５の重鎖である。さらに別の態様において、断片は、抗体Ａ５の軽鎖および／または重鎖由来の１以上の可変領域を含有する。さらに別の態様において、断片は、図１Ａおよび図１Ｂに示すような抗体Ａ５の軽鎖および／または重鎖由来の１以上のＣＤＲを含有する。
【００１５】
別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を持つ宿主細胞に産生されるポリヌクレオチドにコードされる軽鎖を含む抗体である。別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を持つ宿主細胞に産生されるポリヌクレオチドにコードされる重鎖を含む抗体である。別の側面において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を持つ宿主細胞に産生されるポリヌクレオチドにコードされる軽鎖；および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を持つ宿主細胞に産生されるポリヌクレオチドにコードされる重鎖を含む抗体である（本明細書において、便宜上、寄託された宿主細胞に産生されるポリヌクレオチド（単数または複数）は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号およびＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を有すると称される）。別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を持つ宿主細胞に産生されるポリヌクレオチドにコードされる軽鎖可変領域を含む抗体である。別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を持つ宿主細胞に産生されるポリヌクレオチドにコードされる重鎖可変領域を含む抗体である。別の側面において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を持つ宿主細胞に産生されるポリヌクレオチドにコードされる重鎖可変領域；および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を持つ宿主細胞に産生されるポリヌクレオチドにコードされる軽鎖可変領域を含む抗体である。さらに別の側面において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を持つ宿主細胞に産生されるポリヌクレオチドにコードされる１以上のＣＤＲ（単数または複数）；および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を持つ宿主細胞に産生されるポリヌクレオチドにコードされる重鎖を含む抗体である。
【００１６】
いくつかの態様において、抗体は、免疫学的に不活性な定常領域、例えば補体仲介性溶解を誘発せず、また抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない定常領域などの、修飾定常領域を含む。他の態様において、定常領域は、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号；および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載されるように修飾される。さらに他の態様において、抗体は、以下の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（アミノ酸番号付けは野生型ＩｇＧ２ａ配列に準拠している）を含む、ヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域を含む。Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４。
【００１７】
別の側面において、本発明は、以下のいずれか１以上：ａ）図１Ａおよび図１Ｂに示す抗体Ａ５の１以上のＣＤＲ（単数または複数）；ｂ）図１Ａに示す抗体Ａ５の重鎖由来のＣＤＲ  Ｈ３；ｃ）図１Ｂに示す抗体Ａ５の軽鎖由来のＣＤＲ  Ｌ３；ｄ）図１Ｂに示す抗体Ａ５の軽鎖由来の３つのＣＤＲ；ｅ）図１Ａに示す抗体Ａ５の重鎖由来の３つのＣＤＲ；並びにｆ）図１Ａおよび図１Ｂに示す抗体Ａ５の軽鎖由来の３つのＣＤＲおよび重鎖由来の３つのＣＤＲを含むポリペプチド（抗体であることもまた抗体でないことも可能である）を提供する。本発明は、以下のいずれか１以上：ａ）図１Ａおよび図１Ｂに示す抗体Ａ５由来の１以上（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）のＣＤＲ（単数または複数）；ｂ）図１Ａに示す抗体Ａ５の重鎖由来のＣＤＲ  Ｈ３由来のＣＤＲ；および／またはｃ）図１Ｂに示す抗体Ａ５の軽鎖由来のＣＤＲ  Ｌ３由来のＣＤＲを含むポリペプチド（抗体であることもまた抗体でないことも可能である）をさらに提供する。
【００１８】
本発明はまた、以下のいずれか１以上：（ａ）式ＧＹＴＦＴＳＹＸａａＸａａＨ（配列番号１６）の配列、式中、８位のＸａａはＲまたはＷであり；そして９位のＸａａはＩ、Ｌ、Ｒ、またはＭである、であって、ＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号２２）の配列でない、前記配列；（ｂ）式ＧＹＴＦＴＳＹＸａａＸａａＨ（配列番号１６）の配列、式中、８位のＸａａはＲであり；そして９位のＸａａはＩ、Ｌ、またはＲである；（ｃ）式ＥＩＹＰＳＮＸａａＲＴＮＹＮＥＫＦＸａａＳ（配列番号１７）の配列、式中、７位のＸａａはＡ、Ｔ、ＳまたはＧであり；そして１６位のＸａａはＫまたはＥである、であって；ＥＩＹＰＳＮＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号２３）でない、前記配列；（ｄ）式ＥＩＹＰＳＮＸａａＲＴＮＹＮＥＫＦＸａａＳ（配列番号１７）の配列、式中、７位のＸａａはＡ、Ｔ、またはＳであり；そして１６位のＸａａはＫまたはＥである；（ｅ）式ＫＹＹＹＧＮＸａａＸａａＲＳＷＹＦＤＶ（配列番号１８）の配列、式中、７位のＸａａはＴまたはＳであり；８位のＸａａはＲ、Ｑ、Ｋ、Ｓ、またはＹである、であって；ＫＹＹＹＧＮＳＹＲＳＷＹＦＤＶ（配列番号２４）でない、前記配列；（ｆ）式ＫＹＹＹＧＮＸａａＸａａＲＳＷＹＦＤＶ（配列番号１８）の配列、式中、７位のＸａａはＴであり；８位のＸａａはＲ、Ｑ、Ｋ、またはＳである；（ｇ）式ＲＡＳＥＳＸａａＤＸａａＹＧＩＳＦＸａａＸａａ（配列番号１９）の配列、式中、６位のＸａａはＩまたはＶであり；８位のＸａａはＮまたはＳであり；１４位のＸａａはＬまたはＭであり；１５位のＸａａはＡ、ＴまたはＮである、であって；ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮ（配列番号２５）でない、前記配列；（ｈ）式ＲＡＳＥＳＸａａＤＸａａＹＧＩＳＦＸａａＸａａ（配列番号１９）の配列、式中、６位のＸａａはＩであり；８位のＸａａはＮまたはＳであり；１４位のＸａａはＬであり；１５位のＸａａはＡまたはＴである；（ｉ）式ＡＡＳＮＸａａＧＳ（配列番号２０）の配列、式中、５位のＸａａはＲまたはＬである；（ｊ）式ＱＱＳＫＸａａＶＰＲＴ（配列番号２１）の配列、式中、５位のＸａａはＴ、Ａ、またはＳである、を含むポリペプチド（抗体であることもまた抗体でないことも可能である）も提供する。
【００１９】
いくつかの態様において、本発明は、上述の抗体のいずれかであって、さらにヒト抗体である抗体を提供する。他の態様において、本発明は、上述の抗体のいずれかであって、さらにヒト化抗体である抗体を提供する。いくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体はヒトｔｒｋＣに結合する。いくつかの態様において、抗体は、ヒトｔｒｋＣに優先的に結合する。いくつかの態様において、抗体は、約５ｎＭ未満のＫＤでヒトｔｒｋＣに結合する。いくつかの態様において、抗体はげっ歯類ｔｒｋＣにさらに結合する。
【００２０】
マウス・モノクローナル抗体、２２５６の配列に同一の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）からなる態様（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）は、特に排除されることが理解される。２２５６可変領域（ＣＤＲ領域を含む）のアミノ酸配列を図２Ａおよび図２Ｂに示す。
【００２１】
別の側面において、本発明は、抗体Ａ５（本明細書において、交換可能に「Ａ５」とも称される）の断片または領域をコードするポリヌクレオチドを含む、単離ポリヌクレオチドを提供する。１つの態様において、断片は、図１Ｂに示すような抗体Ａ５の軽鎖である。別の態様において、断片は、図１Ａに示すような抗体Ａ５の重鎖である。さらに別の態様において、断片は、抗体Ａ５の軽鎖および／または重鎖由来の１以上の可変領域を含有する。さらに別の態様において、断片は、図１Ａおよび図１Ｂに示すような抗体Ａ５の軽鎖および／または重鎖由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。
【００２２】
別の側面において、本発明は、抗体Ａ５をコードするポリヌクレオチドを含む、単離ポリヌクレオチドである。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１および配列番号１３に示すポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。別の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１０および配列番号１２に示すポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。
【００２３】
別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を持つＡ５軽鎖をコードする、単離ポリヌクレオチドである。別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を持つＡ５重鎖をコードする、単離ポリヌクレオチドである。さらに別の側面において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を持つポリヌクレオチドにコードされる可変領域、および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を持つポリヌクレオチドにコードされる可変領域を含む、単離ポリヌクレオチドである。別の側面において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を持つポリヌクレオチドにコードされる１以上のＣＤＲ；および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を持つポリヌクレオチドにコードされる１以上のＣＤＲを含む、単離ポリヌクレオチドである。
【００２４】
別の側面において、本発明は、本明細書に記載する抗体（抗体断片を含む）またはポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の側面において、本発明は、本明細書に開示するポリヌクレオチドのいずれかを含むベクター（発現ベクターおよびクローニングベクターを含む）および宿主細胞を提供する。
【００２５】
別の側面において、本発明は、Ａ５軽鎖をコードするポリヌクレオチドおよびＡ５重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、Ａ５軽鎖をコードするポリヌクレオチド（単数または複数）がＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を有し、そしてＡ５重鎖をコードするポリヌクレオチドがＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を有する、前記宿主細胞である（本明細書において、便宜上、寄託された宿主細胞に産生されるポリヌクレオチド（単数または複数）は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号およびＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を有すると称される）。いくつかの態様において、宿主細胞は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を持つポリヌクレオチドにコードされる可変領域、および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を持つポリヌクレオチドにコードされる可変領域を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、宿主細胞は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を持つポリヌクレオチドにコードされる１以上のＣＤＲ；および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を持つポリヌクレオチドにコードされる１以上のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。
【００２６】
別の側面において、本発明は、寄託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５６８３号としてＡＴＣＣに寄託されるポリヌクレオチドを提供する。別の側面において、本発明は、寄託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５６８２号としてＡＴＣＣに寄託されるポリヌクレオチドを提供する。
【００２７】
別の側面において、本発明は、抗体Ａ５が結合しているｔｒｋＣの複合体である。いくつかの側面において、複合体は単離されている。いくつかの態様において、ｔｒｋＣはヒトｔｒｋＣである。
【００２８】
別の側面において、本発明は、本明細書記載の抗体またはポリペプチドのいずれかが結合しているｔｒｋＣの複合体である。いくつかの側面において、複合体は単離されている。
【００２９】
別の側面において、本発明は、本明細書記載のポリペプチド（抗体Ａ５などの抗体を含む）またはポリヌクレオチドのいずれかを含む薬剤組成物、例えば抗体Ａ５または抗体Ａ５の断片を含む抗体、および薬学的に許容しうる賦形剤を含む、薬剤組成物である。
【００３０】
別の側面において、本発明は、抗体Ａ５を生成する方法であって、抗体Ａ５をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を調製し；抗体Ａ５の産生を可能にする条件下で、宿主細胞またはその子孫を培養し；そして抗体Ａ５を精製することを含む、前記方法である。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１および配列番号１３に示すポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。別の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１０および配列番号１２に示すポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。
【００３１】
別の側面において、本発明は、抗体Ａ５を生成する方法であって、Ａ５軽鎖をコードするポリヌクレオチドおよびＡ５重鎖をコードするポリヌクレオチドを、適切な細胞において発現させ、ここでＡ５軽鎖をコードするポリヌクレオチドはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を有し、そしてＡ５重鎖をコードするポリヌクレオチドはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を有する；一般的に、その後、抗体を回収し、そして／または単離することを含む、前記方法である。
【００３２】
別の側面において、本発明は、抗体をコードする１以上のポリヌクレオチドを適切な細胞において発現させ（単一軽鎖または単一重鎖として別個に発現させることも可能であるし、あるいは１つのベクターから軽鎖および重鎖の両方を発現させる）、一般的に、その後、目的の抗体またはポリペプチドを回収し、そして／または単離することによって、本明細書記載の抗体のいずれかを生成する方法を提供する。
【００３３】
別の側面において、本発明は、本明細書開示のポリペプチド（抗体Ａ５などの抗体を含む）のいずれかを用いて、ヒトｔｒｋＣまたは他の哺乳動物ｔｒｋＣの生物学的活性を活性化する方法である。１つの態様において、該方法は、ヒトｔｒｋＣを本明細書記載のポリペプチド（抗体Ａ５を含む）のいずれかと接触させ、それによってヒトｔｒｋＣ活性を活性化することを含む。
【００３４】
別の側面において、本発明は、本明細書記載のポリペプチド（抗体Ａ５などの抗体を含む）のいずれかを用いて、ｔｒｋＣを検出する方法である。ｔｒｋＣの存在は、ｔｒｋＣおよび本明細書記載のポリペプチド（抗体Ａ５など）のいずれかの間の複合体を検出することによって、検出される。用語「検出」は、本明細書において、対照と比較した、または比較しない、定性的および／または定量的検出（レベルを測定する）を含む。
【００３５】
別の側面において、本発明は、本明細書記載の抗体Ａ５またはポリペプチド（抗体を含む）いずれかあるいはポリヌクレオチド態様を含む、有効量の組成物を投与することによって、大径線維感覚性ニューロパシーなどの感覚性ニューロパシーを治療する方法である。いくつかの態様において、感覚性ニューロパシーは、タキソール誘導性感覚性ニューロパシーである。いくつかの態様において、感覚性ニューロパシーは、シスプラチン誘導性感覚性ニューロパシーである。いくつかの態様において、感覚性ニューロパシーは、ピリドキシン誘導性感覚性ニューロパシーである。
【００３６】
別の側面において、本発明は、本明細書記載の１以上の組成物いずれかを含むキットおよび組成物を提供する。これらのキットは、一般的に適切なパッケージングがなされ、そして適切な使用説明書とともに提供され、本明細書記載の方法のいずれかに有用である。
【００３７】
本発明はまた、（例えば）薬剤および／または薬剤の製造としての使用の状況においてであってもなくても、本明細書記載の使用のいずれかのための、本明細書記載の組成物いずれか（抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチドなど）も提供する。
【００３８】
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドまたは抗体は、本明細書記載の除外を含まない。本明細書の式を参照した際、当業者には明らかであるように、各アミノ酸置換基は、独立に選択可能である。本発明はまた、１以上のアミノ酸置換基が除去された式も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
発明の詳細な説明
本明細書開示の本発明は、ｔｒｋＣに結合する抗体およびポリペプチド（Ａ５など）、およびこれらの抗体を作成し、そして用いる方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ｔｒｋＣ受容体（「ｔｒｋＣ」）に結合するヒト化抗体、Ａ５、およびこの抗体を作成し、そして用いる方法を提供する。本発明はまた、ｔｒｋＣに結合するＡ５ポリペプチド（抗体を含む）、並びにＡ５抗体および／またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。
【００４０】
本明細書に開示する本発明はまた、療法的有効量のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与によって、個体における感覚性ニューロパシー（タキソール誘導性感覚性ニューロパシーなど）を予防し、そして／または治療する方法も提供する。
【００４１】
一般的な技術
本発明の実施は、別に示さない限り、当該技術分野の技術内にある、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用的技術を使用するであろう。こうした技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ監修、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．  Ｃｅｌｌｉｓ監修，  １９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ監修、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．  ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．  Ｄｏｙｌｅ，  Ｊ．Ｂ．  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．  Ｎｅｗｅｌｌ監修，  １９９３−１９９８）Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ監修）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．  ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．  Ｃａｌｏｓ監修，  １９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  １９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら監修，  １９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  １９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  １９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．  ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．  Ｔｒａｖｅｒｓ，  １９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．  Ｆｉｎｃｈ，  １９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．  Ｃａｔｔｙ監修，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．  ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．  Ｄｅａｎ監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．  ＨａｒｌｏｗおよびＤ．  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．  ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．  Ｃａｐｒａ監修，  Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  １９９５）���どの文献に、完全に説明されている。
【００４２】
定義
「抗体」は、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等のターゲットに特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子であり、該免疫グロブリン分子の可変領域に位置する、少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、ターゲットに結合する。本明細書において、該用語は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のいずれかの修飾立体配置も含む。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などのいかなるクラスの抗体も含まれ、そして抗体は特定のクラスのものである必要はない。重鎖定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることも可能である。免疫グロブリンには、５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、そしてこれらのいくつかをサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることも可能である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置が周知である。
【００４３】
本明細書において、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体集団から得た抗体を指し、すなわち集団を構成する個々の抗体は、少量で存在することも可能な、ありうる天然存在突然変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的で、単一の抗原性部位に向けられる。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特性を示し、そして特定の方法いずれかによる抗体の産生を必要とするとは見なされないものとする。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるものなどの組換えＤＮＡ法によって作成可能である。モノクローナル抗体はまた、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，  １９９０，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４８：５５２−５５４に記載される技術を用いて生成されるファージライブラリーからも単離可能である。
【００４４】
本明細書において、「ヒト抗体」は、ヒトに産生される抗体のものに対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味し、そして／または当該技術分野に知られるかまたは本明細書に開示するヒト抗体作成技術のいずれかを用いて作成されている。ヒト抗体のこの定義には、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。１つのこうした例は、ネズミ軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。当該技術分野に知られる多様な技術を用いて、ヒト抗体を産生することも可能である。１つの態様において、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら，  １９９６，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １４：３０９−３１４；Ｓｈｅｅｔｓら，  １９９８，  ＰＮＡＳ，  （ＵＳＡ）  ９５：６１５７−６１６２；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，  １９９１，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら，  １９９１，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１）。ヒト抗体はまた、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えばマウスに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによっても作成可能である。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号に記載されている。あるいは、ターゲット抗原に対して向けられる抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することによって、ヒト抗体を調製可能である（こうしたＢリンパ球を個体から回収することも可能であるし、またｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫しておくことも可能である）。例えば、Ｃｏｌｅら，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら，  １９９１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４７（１）：８６−９５；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。
【００４５】
本明細書において、用語「Ａ５」および「抗体Ａ５」は交換可能に用いられ、図１Ａおよび図１Ｂに示す重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む抗体を指す。抗体Ａ５のＣＤＲ部分（ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔのＣＤＲを含む）を図１Ａおよび図１Ｂに図式的に示す。配列番号１１および配列番号１３は、それぞれ、Ａ５の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドを示す。Ａ５の性質決定を実施例に記載する。限定されるわけではないが、ｔｒｋＣ受容体に結合し、そして該受容体を活性化し、そして／またはｔｒｋＣシグナル伝達機能によって仲介される下流経路を活性化する能力を含む、異なる生物学的機能がＡ５と関連付けられる。いくつかの態様において、用語「Ａ５」は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を有するＡ５軽鎖をコードするポリヌクレオチド、および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を有するＡ５重鎖をコードするポリヌクレオチドにコードされる免疫グロブリンを指す。
【００４６】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書において交換可能に用いられ、いずれかの長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖であることもまたは分枝していることも可能であり、修飾アミノ酸を含むことも可能であり、そして非アミノ酸によって中断されることも可能である。該用語はまた、天然にまたは介入によって；例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは他の操作または修飾いずれか、例えば標識構成要素とのコンジュゲート化で修飾されているアミノ酸ポリマーも含む。この定義内にやはり含まれるのは、例えば、１以上のアミノ酸類似体（例えば非天然アミノ酸などを含む）、並びに当該技術分野に知られる他の修飾を含有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、抗体に基づくため、ポリペプチドは、一本鎖または会合鎖として存在することも可能であることが理解される。
【００４７】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書において交換可能に用いられ、いずれかの長さのヌクレオチドのポリマーを指し、そしてＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／またはその類似体、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに取り込まれることも可能な基質いずれかであることも可能である。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびその類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことも可能である。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立て前または組み立て後に行うことも可能である。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断可能である。重合後、標識構成要素とのコンジュゲート化によるなどで、ポリヌクレオチドをさらに修飾することも可能である。他の種類の修飾には、例えば、「キャップ」、１以上の天然存在ヌクレオチドの類似体での置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結を持つもの（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カバメート（ｃａｂａｍａｔｅ）など）および荷電連結を持つもの（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジンなど）を含有するもの、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）（例えばアクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾連結を持つもの（例えばアルファ・アノマー核酸など）、並びにポリヌクレオチド（単数または複数）の非修飾型での修飾が含まれる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかが、例えばホスホネート基、ホスフェート基によって置換されるか、標準的保護基によって保護されるか、またはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結に備えるため活性化されていることも可能であるし、あるいは固体支持体にコンジュゲート化されていることも可能である。５’末端および３’末端のＯＨをリン酸化するか、あるいは１〜２０炭素原子のアミンまたは有機キャッピング基部分で置換することも可能である。他のヒドロキシルを誘導体化して、標準的保護基にすることもまた可能である。ポリヌクレオチドはまた、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環類似体および無塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドを含む、当該技術分野に一般的に知られるリボース糖またはデオキシリボース糖の類似の型を含有することもまた可能である。別の連結基によって、１以上のホスホジエステル連結を置換することも可能である。これらの代替連結基には、限定されるわけではないが、ホスフェートが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルム���セチル」）、式中、各ＲまたはＲ’は、独立にＨ、あるいは所望によってエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジルを含有する、置換または非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である、に置換されている態様が含まれる。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。先行する説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で言及するすべてのポリヌクレオチドに適用される。
【００４８】
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を、単独でまたは組み合わせて指す。重鎖および軽鎖の可変領域は、各々、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に連結される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲによって近接して一緒に保持され、そして他の鎖由来のＣＤＲと一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するには、少なくとも２つの技術：（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（すなわちＫａｂａｔら  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版，  １９９１，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  メリーランド州ベセスダ））；および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３：９２７−９４８））がある。本明細書において、ＣＤＲは、いずれかのアプローチによって、または両方のアプローチの組み合わせによって定義されるＣＤＲを指すことも可能である。
【００４９】
抗体の「定常領域」は、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を、単独でまたは組み合わせて指す。
本明細書において、「ｔｒｋＣ」は、チロシンキナーゼ・スーパーファミリーのメンバーである、ｔｒｋＣ受容体ポリペプチドを指す。ｔｒｋＣは、限定されるわけではないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、霊長類、およびげっ歯類（マウスおよびラットを含む）を含む哺乳動物種いずれかの天然ｔｒｋＣ受容体を含む。全長天然ｔｒｋＣの細胞外ドメインは、多様な他のタンパク質において同定された相同な構造またはそうでなければ類似の構造に関連して定義されてきている。これらのドメインは、成熟ｔｒｋＣ受容体のＮ末端から始まって：１）アミノ酸１〜アミノ酸４８に渡る第一のシステインリッチドメイン；２）アミノ酸４９〜アミノ酸１２０に渡るロイシンリッチドメイン；３）アミノ酸１２１〜アミノ酸１７７に渡る第二のシステインリッチドメイン；４）およそアミノ酸１９６〜アミノ酸２５７に渡る第一の免疫グロブリン様ドメイン；および５）およそアミノ酸２８８〜アミノ酸３５１に渡る第二の免疫グロブリン様ドメインと称されている。例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ０１９８３６１号を参照されたい。ｔｒｋＣ受容体の細胞外ドメインのドメイン構造もまた、結晶構造を参照することによって、以下のように称されてきている：アミノ酸１〜アミノ酸４７のドメイン１；アミノ酸４８〜アミノ酸１３０のドメイン２；アミノ酸１３１〜アミノ酸１７７のドメイン３；アミノ酸１７８〜アミノ酸１６５のドメイン４；およびアミノ酸１６６〜アミノ酸３８１のドメイン５。例えば、ＰＣＴ  ＷＯ  ０１／９８３６１；Ｕｒｆｅｒら  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：５８２９−５８４０（１９９８）を参照されたい。やはり含まれるのは、ｔｒｋＣの変異体であり、この例には、限定されるわけではないが、キナーゼドメインを欠く変異体（Ｓｈｅｌｔｏｎら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １５（１）：４７７−４９１，  １９９５）、および修飾キナーゼドメインを含む変異体（Ｓｈｅｌｔｏｎら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １５（１）：４７７−４９１，  １９９５）が含まれる。
【００５０】
「アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体」（「抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体」または「抗ｔｒｋＣ抗体」と交換可能に称される）は、ｔｒｋＣ受容体に結合し、そして該受容体を活性化し、そして／またはｔｒｋＣシグナル伝達機能によって仲介される下流経路（単数または複数）を活性化することが可能な抗体を指す。例えば、アゴニスト抗体は、ｔｒｋＣ受容体の細胞外ドメインに結合し、そしてそれによって受容体の二量体化を引き起こし、細胞内触媒性キナーゼドメインの活性化を生じることも可能である。その結果、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで受容体を発現する細胞の増殖および／または分化の刺激を生じることも可能である。いくつかの態様において、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、ｔｒｋＣに結合し、そしてｔｒｋＣ生物学的活性を活性化する。いくつかの態様において、本発明の方法で有用なアゴニスト抗体は、ｔｒｋＣのドメインＶおよび／またはドメインＩＶを認識する。Ｕｒｆｅｒら  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：５８２９−５８４０（１９９８）を参照されたい。アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の例を本明細書に提供する。
【００５１】
「生物学的活性」は、本発明のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体と組み合わせて用いた場合、一般的に、ｔｒｋＣ受容体に結合し、そして該受容体チロシンキナーゼを活性化し、そして／またはｔｒｋＣシグナル伝達機能によって仲介される下流経路を活性化する能力を有することを指す。本明細書において、「生物学的活性」は、ｔｒｋＣの天然リガンドであるＮＴ−３の作用によって誘導されるものと共通の、ｔｒｋＣ発現細胞に対する、１以上のエフェクター機能を含む。ｔｒｋＣの「生物学的活性」はまた、ＮＴ−３の作用によって誘導されるものとは異なる下流シグナル伝達経路（単数または複数）またはエフェクター機能も含むことも可能である。限定なしに、生物学的活性には、１以上の以下が含まれる：ｔｒｋＣに結合し、そしてこれを活性化する能力；ｔｒｋＣ受容体二量体化を促進し、そしてｔｒｋＣを活性化する能力；細胞（損傷を受けた細胞を含む）、特に末梢（交感、感覚、および腸）ニューロン、および中枢（脳および脊髄）ニューロンを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのニューロン、並びに非ニューロン細胞、例えば末梢血白血球の発生、生存、機能、維持および／または再生を促進する能力。本開示によって、当業者に明らかであるように、これらの原理は、ポリペプチド態様に適用される。
【００５２】
抗体またはポリペプチドに「優先的に結合する」かまたは「特異的に結合する」（本明細書において交換可能に用いられる）エピトープは、当該技術分野においてよく理解されている用語であり、そしてこうした特異的結合または優先的結合を測定する方法もまた、当該技術分野によく理解されている。分子は、別の細胞または物質とよりも、特定の細胞または物質と、より頻繁に、より迅速に、より長い期間そして／またはより強い親和性で反応するかまたは会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。抗体は、他の物質に結合するよりも、より強い親和性、アビディティーで、より容易に、そして／またはより長い期間ターゲットに結合する場合、ターゲットに「特異的に結合する」かまたは「優先的に結合する」。例えば、ｔｒｋＣエピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体は、他のｔｒｋＣエピトープまたは非ｔｒｋＣエピトープに結合するよりも、より高い親和性、アビディティーで、より容易に、そして／またはより長い期間、このｔｒｋＣエピトープに結合する抗体である。この定義を読むと、例えば、第一のターゲットに特異的にまたは優先的に結合する抗体（あるいは部分またはエピトープ）は、第二のターゲットに特異的にまたは優先的に結合することもまたしないことも可能であることもまた理解される。こうしたものとして、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも排他的な結合を必要としない（が含むことも可能である）。必ずしもではないが、一般的に、結合への言及は優先的な結合を意味する。
【００５３】
本明細書において、抗体の「免疫特異的」結合は、抗体の抗原結合部位およびその抗体に認識される特異的抗原の間に起こる、抗原特異的結合相互作用を指す（すなわち、抗体はＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイにおいて、該タンパク質と反応し、そして関連しないタンパク質とは検出可能に反応しない）。
【００５４】
本明細書において、「実質的に純粋な」は、少なくとも５０％純粋（すなわち混入物質を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは少なくとも９８％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋である物質を指す。
【００５５】
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチド挿入物を取り込むベクター（単数または複数）のレシピエントであることが可能であるか、またはレシピエントである、個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれ、そして子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異のため、必ずしも、元来の親細胞と（形態においてまたはゲノムＤＮＡ相補体において）完全に同一でないことも可能である。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチド（単数または複数）でｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクションされた細胞が含まれる。
【００５６】
本明細書において、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明する。好ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、そしてＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体のアレル変異体および選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれ、これらは、細胞質ドメインが主に異なる、類似のアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，  １９９１，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ９：４５７−９２；Ｃａｐｅｌら，  １９９４，  Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，  ４：２５−３４；およびｄｅ  Ｈａａｓら，  １９９５，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．，  １２６：３３０−４１に概説される。「ＦｃＲ」にはまた、新生受容体、ＦｃＲｎが含まれ、該受容体は、胎児への母性ＩｇＧの輸送に関与する（Ｇｕｙｅｒら，  １９７６，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １１７：５８７；およびＫｉｍら，  １９９４，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２４：２４９）。
【００５７】
「補体依存性細胞傷害」および「ＣＤＣ」は、補体の存在下でのターゲットの溶解を指す。同族（ｃｏｇｎａｔｅ）抗原と複合体化した分子（例えば抗体）への補体系（Ｃ１ｑ）の第一の構成要素の結合によって、補体活性化経路が開始される。補体活性化を評価するため、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２０２：１６３（１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイを行うことも可能である。
【００５８】
「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を所持する。典型的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが含まれる。こうしたエフェクター機能は、一般的に、Ｆｃ領域が結合性ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と組み合わされることを必要とし、そしてこうした抗体エフェクター機能を評価するために当該技術分野に知られる多様なアッセイを用いて、こうした機能を評価することも可能である。
【００５９】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾のため、天然配列Ｆｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含むが、なお天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持する。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域に、または親ポリペプチドのＦｃ領域に比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば天然配列Ｆｃ領域中または親ポリペプチドのＦｃ領域中に、約１〜約１０のアミノ酸置換、そして好ましくは約１〜約５のアミノ酸置換を有する。本明細書の変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域と、そして／または親ポリペプチドのＦｃ領域と、少なくとも約８０％の配列同一性を、そして最も好ましくはこれらと少なくとも約９０％の配列同一性を、より好ましくはこれらと少なくとも約９５％の配列同一性を所持するであろう。
【００６０】
本明細書において、「抗体依存性細胞仲介性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ類）を発現する非特異性細胞傷害細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、ターゲット細胞上に結合した抗体を認識し、そして続いて、ターゲット細胞の溶解を引き起こす、細胞仲介性反応を指す。米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されるものなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを用いて、目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価することも可能である。こうしたアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、Ｃｌｙｎｅｓら，  １９９８，  ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），  ９５：６５２−６５６に開示されるものなどの動物モデルにおいて、目的の分子のＡＤＣＣ活性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価することも可能である。
【００６１】
本明細書において、「治療」は、有益なまたは望ましい臨床的結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のため、有益なまたは望ましい臨床的結果には、限定されるわけではないが、検出可能であってもまたは検出不能であっても、症状の軽減、疾患の度合いの縮小、疾患の安定化された（すなわち悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または完全いずれであっても）が含まれる。「治療」はまた、治療を受けていなかった場合に予期される生存に比較した際、生存を延長することを意味することも可能である。「治療」は、障害の病状の発展を予防するかまたは病状を改変することを意図して行われる介入である。したがって、「治療」は、療法的治療および予防的または防止的手段の両方を指す。治療の必要なものには、すでに障害を持つもの、並びに障害が予防されるべきであるものが含まれる。具体的には、治療は、損傷の細胞性変性の病状、例えば神経細胞の病状を予防するか、遅延させるかまたは別の方式で減少させることも可能であるし、あるいは細胞、例えばニューロンを、他の療法剤による治療により感受性にすることも可能である。
【００６２】
「タキソール誘導性感覚性ニューロパシー」は、化学療法剤タキソールまたは他のタキサン類での治療から生じる神経学的障害である。本明細書において、「タキソール誘導性感覚性ニューロパシー」は、この神経学的障害と関連する１以上の症状のいずれかを指し、そしてこれらを含む。タキソール誘導性感覚性ニューロパシーは、多様な種類の一次感覚ニューロン、交感ニューロンを含む自律ニューロン、並びに特殊化された感覚、例えば味覚、嗅覚、聴覚、および前庭のニューロンに影響を及ぼすことも可能である。本明細書において、「タキソール誘導性感覚性ニューロパシー」は、剤、タキソールまたは関連タキサン類の投与中または投与後に、個体において関連するかまたは個体に存在する感覚ニューロンに影響を及ぼす神経学的障害を指す。いくつかの態様において、「タキソール誘導性感覚性ニューロパシー」は、末梢感覚ニューロン（大径線維感覚ニューロンを含む）の変性によって特徴付けられる。いくつかの態様において、「タキソール誘導性感覚性ニューロパシー」は、以下のいずれかによって特徴付けられる：遠位対称性感覚異常、振動覚減退、関節位置感覚の欠失、疼痛性異常感覚、レールミット徴候、疼痛、進行性遠位および／または近位不全麻痺、筋痛症、麻痺性イレウス、起立性血圧降下症、および不整脈；並びに末梢感覚ニューロン（大径線維感覚ニューロンを含む）の変性。標準的神経学的検査、患者インタビュー、またはより特殊化された定量的試験によって、これらを決定することも可能である。これらのより特殊化された定量的試験には、限定されるわけではないが、例えば微小神経記録法または他の電気生理学的試験の使用による、影響を受けたニューロンの伝導速度の測定；限定されるわけではないが、熱、軽い接触、振動、または２点識別を含む皮膚刺激を感じる能力の定量的および／または定量的測定；聴覚試験；平衡の特殊化試験；自己受容または運動感覚の特殊化試験；限定されるわけではないが、血圧コントロールの試験を含む自律機能試験；並びに多様な生理学的刺激および薬理学的刺激に対する心拍反応試験が含まれる。これらの試験はまた、運動技能の試験を含むことも可能である。
【００６３】
本明細書において、「タキソール」は、パクリタキセル（タキソール（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ニュージャージー州プリンストン）、ドセタキセル（タキソテール（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、フランス・アントニー）、および他のタキサンを指す。タキソール（他のタキサンを含む）を単独で、または他の薬剤と併用して投与することも可能である。タキソールは、カポジ肉腫、並びに乳房、卵巣、および肺の肉腫を含む、多様な悪性腫瘍を治療するのに認可され、そして一般的に用いられている。タキソールはまた、前立腺、頭部および首部の他の悪性腫瘍、並びに多様な血液学的悪性腫瘍を治療するのにも用いられる。タキソールはまた、骨髄移植中にも投与される。
【００６４】
「有効量」（例えばタキソール誘導性感覚性ニューパシーの状況において）は、臨床的結果または疾患開始の遅延を含む、有益なまたは望ましい臨床的結果を達成するのに十分な量である。１以上の投与で、有効量を投与することも可能である。本発明の目的のため、本明細書記載のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の有効量は、感覚性ニューロパシー、例えば大径線維感覚性ニューロパシー、例えばタキソール誘導性感覚性ニューロパシーを改善し、安定化し、逆転させ、その進行を減速させ、そして／または遅延させるのに十分な量である。有効量のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体はまた、本明細書に記載するように、癌のタキソール治療（療法的効果）を増進するのに十分な量のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体も含む（これは次に、タキソール投薬量を増加させ、そして／またはタキソール治療の副作用の減少など、何らかの他の有益な効果が観察されることを意味することも可能である）。当該技術分野に理解されるように、有効量のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、とりわけ、患者病歴、並びに、用いるアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の種類（および／または投薬量）などの他の要因に応じて、多様であることも可能である。本開示により、当業者には明らかであるように、これらの原理は、ポリペプチド態様に適用される。
【００６５】
本明細書において、「組み合わせ」投与には、同時投与および／または異なる時点での投与が含まれる。組み合わせ投与はまた、共配合物（例えば同一組成物中に、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体およびタキソールが存在する）としての投与、または別個の組成物としての投与も含む。本明細書において、組み合わせ投与は、同時におよび／または別個に起こることも可能な、個体にアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体およびタキソールを投与するいかなる状況も含むと意味される。本明細書にさらに論じるように、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体およびタキソールを異なる投薬頻度または間隔で投与することも可能であることが理解される。例えば、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を毎週投与し、一方、タキソールをより頻繁でなく投与することも可能であることが理解される。同じ投与経路または異なる投与経路を用いて、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体およびタキソールを投与することも可能であることが理解される。
【００６６】
「生物学的試料」は、個体から得られる多様な試料種を含み、そして診断アッセイまたは監視アッセイで使用可能である。該定義は、血液および生物学的起源の他の液体試料、固形組織試料、例えば生検標本または組織培養物またはそこから得られる細胞、およびその子孫を含む。該定義はまた、入手後、試薬での処理、可溶化、または特定の構成要素、例えばタンパク質またはポリヌクレオチドの濃縮、あるいは切片作成目的のための半固体マトリックスまたは固体マトリックス中での包埋によるなどのいずれかの方式で操作されている試料も含む。用語「生物学的試料」は、臨床試料を含み、そして培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的液体および組織試料もまた含む。
【００６７】
「個体」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、限定されるわけではないが、農場動物（ウシなど）、スポーツ用動物、ペット（ネコ、イヌ、およびウマなど）、霊長類、マウスおよびラットが含まれる。
【００６８】
本明細書において、「ベクター」は、目的の１以上の遺伝子（単数または複数）または配列（単数または複数）を搬送し、そして好ましくは宿主細胞において発現することが可能な構築物を意味する。ベクターの例には、限定されるわけではないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン凝縮剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に被包されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および生成細胞などの特定の真核生物細胞が含まれる。
【００６９】
本明細書において、「発現調節配列」は、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現調節配列は、プロモーター、恒常性または誘導性プロモーター、あるいはエンハンサーであることも可能である。発現調節配列は、転写される核酸配列に機能可能であるように連結される。
【００７０】
本明細書において、「薬学的に許容しうるキャリアー」には、活性成分と組み合わせた際、該成分が生物学的活性を保持することを可能にし、そして搬送された際、被験者の免疫系と非反応性であり、そして被験者に対して非毒性である、いかなる物質も含まれる。例には、限定されるわけではないが、標準的薬学的キャリアー、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、および多様な種類の湿潤剤が含まれる。エアロゾルまたは非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水または通常の（０．９％）生理食塩水である。
【００７１】
周知の慣用的方法によって、こうしたキャリアーを含む組成物を配合する（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１８版，  Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ監修，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  ペンシルバニア州イーストン，  １９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ２０００を参照されたい）。
【００７２】
用語「ｋｏｆｆ」は、本明細書において、抗体／抗原複合体からの抗体の解離の解離速度定数を指すよう意図される。
用語「ＫＤ」は、本明細書において、抗体−抗原相互作用の解離定数を指すよう意図される。
【００７３】
組成物および組成物を作成する方法
本発明は、薬剤組成物を含む組成物であって、本明細書記載の抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体（Ａ５抗体など）またはポリペプチド；並びに該抗体（Ａ５抗体など）またはポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む。本明細書において、組成物は、ｔｒｋＣに結合する１以上の抗体またはポリペプチド（抗体であることもまたないことも可能である）、および／またはｔｒｋＣに結合する１以上の抗体またはポリペプチドをコードする配列を含む１以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当該技術分野に周知の、緩衝剤を含む薬学的に許容しうる賦形剤などの適切な賦形剤をさらに含むことも可能である。
【００７４】
本発明はまた、単離抗体、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド態様も含む。本発明はまた、実質的に純粋な抗体、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド態様も含む。
本発明の抗体およびポリペプチドは、以下の特性のいずれか（１以上）によって特徴付けられる：（ａ）ｔｒｋＣ受容体に結合する；（ｂ）ｔｒｋＣ受容体の１以上のエピトープに結合する；（ｃ）ｔｒｋＣ受容体に結合してｔｒｋＣ受容体を活性化し、そして／またはｔｒｋＣシグナル伝達機能によって仲介される１以上の下流経路を活性化する；（ｄ）ｔｒｋＣ受容体に結合して、ｔｒｋＣ受容体を活性化し、そして感覚性ニューロパシー（タキソール誘導性感覚性ニューロパシーなど）の１以上の症状を治療するか、予防するか、逆転させるか、または改善する；（ｅ）ｔｒｋＢまたはｔｒｋＡに結合せず、そして／またはこれらを活性化しない；（ｆ）好ましい薬物動態学的特性および生物学的利用能特性を示す。
【００７５】
ネズミ抗ｔｒｋＣ抗体２２５６（「Ｍａｂ  ２２５６」）に比較して、高い親和性および緩慢な解離速度でヒトｔｒｋＣに結合する、抗体Ａ５の結合特性を以下に要約する。Ａ５重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を図１に示す。Ｍａｂ  ２２５６重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を図２に示す。
【００７６】
【表１】
2007519401.tif 000002
【００７７】
表中の「ｍｅｎ」は：ｍｘ１０ｎを意味する。
Ａ５抗体および関連抗体（本明細書記載）はまた、Ｓａｄｉｃｋら，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．（１９９７）２３４：３５４−３６１に記載されるようなキナーゼ受容体活性化アッセイ（ＫＩＲＡ）によって評価した際、ヒトｔｒｋＣを活性化し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏニューロン生存アッセイによって評価した際、ラットｔｒｋＣを活性化する強い能力も示す。図３および図４に示すように、Ａ５は、ヒトおよびげっ歯類両方のｔｒｋＣの強力なアゴニストである。
【００７８】
したがって、いくつかの態様において、本発明の抗体およびポリペプチドは、以下によってさらに同定され、そして性質決定される：（ｇ）緩慢な解離反応速度でのヒトｔｒｋＣへの高親和性結合（いくつかの態様において、約１０ｎＭ未満のＫＤおよび／または約０．０１ｓ−１より遅いｋｏｆｆ）および／または（ｈ）約１００ｐＭ以下のＥＣ５０でラットＥ１２三叉神経のｔｒｋＣ依存性生存を活性化する能力。
【００７９】
いくつかの態様において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を持つ宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチドにコードされる軽鎖を含む抗体である。別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を持つ宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチドにコードされる重鎖を含む抗体である。本発明はまた、Ａ５および同等の抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および必要な特異性の抗原（ｔｒｋＣ）認識部位を含むＡ５の他のいずれかの修飾立体配置の多様な配合物も含む。Ａ５の抗体およびポリペプチド断片（抗体であることもまたないことも可能である）、並びにＡ５のポリペプチド断片を含むポリペプチドを含む、Ａ５の同等抗体が、上述の基準のいずれか（１以上）によって同定され、そして性質決定されている。
【００８０】
したがって、本発明は、以下のいずれか、または以下のいずれかを含む組成物（薬剤組成物を含む）を提供する：（ａ）抗体Ａ５；（ｂ）抗体Ａ５の断片または領域；（ｃ）配列番号２９に示すような抗体Ａ５の軽鎖；（ｃ）配列番号２８に示すような抗体Ａ５の重鎖；（ｄ）抗体Ａ５の軽鎖および／または重鎖由来の１以上の可変領域（単数または複数）；（ｅ）図１Ａおよび図１Ｂに示す抗体Ａ５の１以上のＣＤＲ（単数または複数）（１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲ）；（ｆ）図１Ａに示す抗体Ａ５の重鎖由来のＣＤＲ  Ｈ３；（ｇ）図１Ｂに示す抗体Ａ５の軽鎖由来のＣＤＲ  Ｌ３；（ｈ）図１Ｂに示す抗体Ａ５の軽鎖由来の３つのＣＤＲ；（ｉ）図１Ａに示す抗体Ａ５の重鎖由来の３つのＣＤＲ；（ｊ）図１Ａおよび図１Ｂに示す抗体Ａ５の軽鎖由来の３つのＣＤＲおよび重鎖由来の３つのＣＤＲ；並びに（ｋ）（ｂ）〜（ｊ）のいずれか１つを含む抗体。本発明はまた、（ａ）〜（ｊ）のいずれか１以上のポリペプチドも提供する。いくつかの態様において、抗体Ａ５は、以下の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（アミノ酸番号付けは野生型ＩｇＧ２ａ配列に準拠している；Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４を参照されたい）を含有する、ヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域；およびヒト軽鎖カッパ定常領域をさらに含む。
【００８１】
抗体Ａ５のＣＤＲ部分（ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔのＣＤＲを含む）を図１Ａおよび図１Ｂに図式的に示す。ＣＤＲ領域の決定は、十分に当該技術分野の技術の範囲内である。いくつかの態様において、ＣＤＲはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの組み合わせであることも可能である（「組み合わせＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも称される）ことが理解される。いくつかの態様において、ＣＤＲはＫａｂａｔ  ＣＤＲである。他の態様において、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲである。
【００８２】
いくつかの態様において、本発明は、Ａ５の少なくとも１つのＣＤＲ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つのＣＤＲに実質的に相同な（またはいくつかの態様において、Ａ５の６つのＣＤＲすべてに実質的に相同な、あるいはＡ５由来の）、少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体を提供する。他の態様には、Ａ５の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲに実質的に相同な、あるいはＡ５由来の、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ（単数または複数）を有する抗体が含まれる。本発明の目的のため、結合特異性および／または全体の活性（感覚性ニューロパシー（例えば大径線維感覚性ニューロパシー、例えばタキソール誘導性感覚性ニューロパシー）を治療し、そして／または予防する、あるいはＥ１２ラット三叉ニューロンのｔｒｋＣ依存性生存を活性化する観点であることも可能である）は、一般的に保持されるが、活性の度合いはＡ５に比較して多様であることも可能である（より大きいかまたはより小さいことも可能である）ことが理解される。いくつかの態様において、Ａ５の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つのＣＤＲに実質的に相同な１以上のＣＤＲは、Ａ５の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つのＣＤＲに、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、同一である。
【００８３】
本発明はまた、以下のいずれかを有するＡ５のアミノ酸配列（図１Ａおよび図１Ｂに示す）を含むポリペプチド（抗体であることもまたないことも可能である）も提供する：Ａ５の配列の少なくとも５つの隣接アミノ酸、少なくとも８つの隣接アミノ酸、少なくとも約１０の隣接アミノ酸、少なくとも約１５の隣接アミノ酸、少なくとも約２０の隣接アミノ酸、少なくとも約２５の隣接アミノ酸、少なくとも約３０の隣接アミノ酸であって、アミノ酸の少なくとも３つはＡ５の可変領域由来であり、マウス・モノクローナル抗体、２２５６のアミノ酸配列に同一のアミノ酸配列からなる態様は、特に排除されることを理解するものとする。２２５６可変領域（ＣＤＲ領域を含む）のアミノ酸配列を図２Ａおよび図２Ｂに示す。１つの態様において、可変領域は、Ａ５の軽鎖由来である。別の態様において、可変領域は、Ａ５の重鎖由来である。別の態様において、５（以上）の隣接アミノ酸が、図１Ａおよび図１Ｂに示すＡ５の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来である。
【００８４】
別の態様において、本発明は、以下のいずれかを有する、Ａ５のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する：Ａ５の配列の少なくとも５つの隣接アミノ酸、少なくとも８つの隣接アミノ酸、少なくとも約１０の隣接アミノ酸、少なくとも約１５の隣接アミノ酸、少なくとも約２０の隣接アミノ酸、少なくとも約２５の隣接アミノ酸、少なくとも約３０の隣接アミノ酸であって、Ａ５配列が、以下のいずれか１以上を含む：ＣＤＲ  Ｈ１のアミノ酸残基Ｒ３３および／またはＩ３４；ＣＤＲ  Ｈ２のＡ５６；ＣＤＲ  Ｈ３のＴ１０５および／またはＲ１０６；ＣＤＲ  Ｌ１のＩ２９、Ｌ３７および／またはＡ３８；ＣＤＲ  Ｌ２のＲ５８；並びに／あるいはＣＤＲ  Ｌ３のＴ９７。
【００８５】
ｔｒｋＣ（ｈｔｒｋＣなど）への抗ｔｒｋＣ抗体の結合親和性は、約０．１０〜約０．８０ｎＭ、約０．１５〜約０．７５ｎＭおよび約０．１８〜約０．７２ｎＭであることも可能である。いくつかの態様において、結合親和性は、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭであるか、または約４０ｐＭを超える。１つの態様において、結合親和性は約２ｐＭ〜２２ｐＭの間である。他の態様において、結合親和性は、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭ未満である。いくつかの態様において、結合親和性は約１０ｎＭである。他の態様において、結合親和性は約１０ｎＭ未満である。他の態様において、結合親和性は、約０．１ｎＭまたは約０．０７ｎＭである。他の態様において、結合親和性は、約０．１ｎＭ未満または約０．０７ｎＭ未満である。他の態様において、結合親和性は、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭのいずれかから、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、または約４０ｐＭのいずれかまでである。いくつかの態様において、結合親和性は、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭのいずれかである。さらに他の態様において、結合親和性は、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭであるか、または約４０ｐＭを超える。
【００８６】
当該技術分野に周知の方法を用いて、ｔｒｋＣへの抗体の結合親和性を決定することも可能である。ｔｒｋＣへの抗体の結合親和性を決定する１つの方法は、実施例に記載するように、抗体の単一官能性Ｆａｂ断片の親和性を測定することによる。単一官能性Ｆａｂ断片を得るため、抗体（例えばＩｇＧ）をパパインで切断するかまたは組換え的に発現することも可能である。実施例に記載するように、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００ＴＭ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）系、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって、抗体の抗ｔｒｋＣ  Ｆａｂ断片の親和性を決定することも可能である。このプロトコルは、ヒトｔｒｋＣ、別の脊椎動物（いくつかの態様において、哺乳動物）のｔｒｋＣ（マウスｔｒｋＣ、ラットｔｒｋＣ、または霊長類ｔｒｋＣなど）を含む、いかなる種のｔｒｋＣへの抗体の結合親和性を決定する際の使用にも適している。
【００８７】
本発明の他のポリペプチドおよび抗体態様を、発明の概要を含めて、本明細書に提供する。本発明のポリペプチドを合成中間体として使用することもまた可能である。
本発明はまた、これらの抗体またはポリペプチドのいずれかを作成する方法も提供する。当該技術分野に知られる方法によって、本発明の抗体を作成することも可能である。抗体のタンパク質分解的分解または他の分解によって、上述のように組換え法によって（すなわち単一または融合ポリペプチド）、あるいは化学合成によって、ポリペプチドを産生することも可能である。抗体のポリペプチド、特に約５０アミノ酸までのより短いポリペプチドは、化学合成によって、好都合に作成される。化学合成法は、当該技術分野に知られ、そして商業的に利用可能である。例えば、固相法を使用する自動化ポリペプチド合成装置によって、Ａ５抗体を産生することも可能である。米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第６，３３１，４１５号も参照されたい。
【００８８】
別の代替法において、当該技術分野に周知の方法を用いて、抗体を組換え的に作成することも可能である。１つの態様において、抗体Ａ５の可変領域および軽鎖領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０および配列番号１２）を、発現または増殖のため、ベクターにクローニングする。別の態様において、配列番号１１および配列番号１３に示すポリヌクレオチド配列を、発現または増殖のため、１以上のベクターにクローニングする。宿主細胞中のベクターにおいて、目的の抗体をコードする配列を維持することも可能であり、そして次いで、宿主細胞を増殖させ、そして将来の使用のために凍結することも可能である。ベクター（発現ベクターを含む）および宿主細胞は、本明細書にさらに記載される。
【００８９】
本発明は、ヒト化抗体を含み、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有する、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合性下位配列）である、非ヒト（例えばネズミ）抗体の型を指す。大部分、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、この中で、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基と交換されている、前記ヒト免疫グロブリンである。いくつかの場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基と交換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体、または取り込まれたＣＤＲもしくはフレームワーク配列のいずれにも見られないが、抗体の性能をさらに精緻化し、そして最適化するために含まれる残基を含むことも可能である。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、この中で、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そしてすべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン・コンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適にはまた、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むであろう。好ましいのは、ＷＯ  ９９／５８５７２に記載されるように修飾されたＦｃ領域を有する抗体である。ヒト化抗体の他の型は、元来の抗体に対して改変された、１以上（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）のＣＤＲを有し、これらもまた、元来の抗体由来の１以上のＣＤＲに「由来する」１以上のＣＤＲと称される。
【００９０】
本発明はまた、本発明の抗体、例えばＡ５の一本鎖可変領域断片（「ｓｃＦｖ」）も含む。短い連結ペプチドを用いることにより軽鎖および／または重鎖の可変領域を連結することによって、一本鎖可変領域断片を作成する。Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６。連結ペプチドの例は、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３）であり、該ペプチドは、一方の可変領域のカルボキシ末端およびもう一方の可変領域のアミノ末端の間をおよそ３．５ｎｍで架橋する。他の配列のリンカーが設計され、そして用いられてきている。Ｂｉｒｄら（１９８８）。さらなる機能、例えば薬剤の付着または固体支持体への付着などのため、リンカーを続いて修飾することも可能である。一本鎖変異体を組換え的または合成的に産生することも可能である。ｓｃＦｖの合成産生のため、自動化合成装置を使用することも可能である。ｓｃＦｖの組換え産生のため、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドを、酵母、植物、昆虫または哺乳動物細胞などの真核細胞、あるいは大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）などの原核細胞のいずれかの、適切な宿主細胞に導入することも可能である。ポリヌクレオチドの連結などの日常的な操作によって、目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを作成することも可能である。当該技術分野に知られる標準的タンパク質精製技術を用いて、生じたｓｃＦｖを単離することも可能である。
【００９１】
一本鎖抗体の他の型、例えばディアボディもまた、含まれる。ディアボディは、二価の二重特異性抗体であり、単一ポリペプチド鎖上にＶＨドメインおよびＶＬドメインが発現されるが、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするにはあまりに短いリンカーを用いるため、ドメインが別の鎖の相補ドメインと対形成することを余儀なくされ、そして２つの抗原結合部位が生成されるものである（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，  Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。
【００９２】
例えば、本明細書開示の抗体を用いて、二重特異性抗体、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体を調製することも可能である。二重特異性抗体を作成する方法が当該技術分野に知られる（例えばＳｕｒｅｓｈら，  １９８６，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０）。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、異なる特異性を有する２つの重鎖を用いた、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいた（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，  １９８３，  Ｎａｔｕｒｅ  ３０５，  ５３７−５３９）。
【００９３】
二重特異性抗体を作成するための１つのアプローチにしたがって、望ましい結合特異性を持つ抗体可変ドメイン（抗体−抗原組み合わせ部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。融合は、好ましくは、ヒンジの少なくとも一部、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行う。軽鎖結合に必要な部位を含有する、第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合物の少なくとも一方に存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および望ましい場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクターに挿入し、そして適切な宿主生物に同時トランスフェクションする。これは、構築に用いられる３つのポリペプチド鎖が等しくない比である場合に、最適収量が得られる態様において、３つのポリペプチド断片の相互比率を調節する際に非常に柔軟性を与える。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が等しい比であることが高収量を生じるか、または比が特に有意性を持たない場合、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を、１つの発現ベクターに挿入することも可能である。
【００９４】
１つのアプローチにおいて、二重特異性抗体は、一方のアームにおける、第一の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにおける、ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）で構成される。二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在する、この非対称構造によって、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせから望ましい二重特異性化合物を分離することが容易になる。このアプローチは、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９４／０４６９０号、１９９４年３月３日公開に記載される。
【００９５】
２つの共有結合された抗体を含む、ヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内である。こうした抗体は、望ましくない細胞に免疫系細胞をターゲティングするのに用いられ（米国特許第４，６７６，９８０号）、そしてＨＩＶ感染の治療に用いられてきている（ＰＣＴ出願公報第ＷＯ  ９１／００３６０号および第ＷＯ  ９２／２００３７３号；およびＥＰ  ０３０８９）。好適な架橋法いずれかを用いて、ヘテロコンジュゲート抗体を作成することも可能である。適切な架橋剤および技術が当該技術分野に周知であり、そして米国特許第４，６７６，９８０号に記載される。
【００９６】
架橋剤を伴うものを含む、合成タンパク質化学反応の既知の方法を用いて、キメラ抗体またはハイブリッド抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することもまた可能である。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構築することも可能である。この目的に適した試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが含まれる。
【００９７】
当該技術分野に知られるいかなる方法を用いて、抗体Ａ５の１以上のＣＤＲまたは抗体Ａ５由来の１以上のＣＤＲを含むヒト化抗体を作成することも可能である。例えば、４つの一般的な工程を用いて、モノクローナル抗体をヒト化することも可能である。これらは：（１）出発抗体軽鎖および重鎖の可変ドメインのヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列を決定し、（２）ヒト化抗体を設計し、すなわちヒト化プロセス中にどの抗体フレームワーク領域を用いるかを決定し、（３）実際のヒト化方法論／技術を決定し、そして（４）ヒト化抗体をトランスフェクションし、そして発現することである。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；第５，８０７，７１５号；第５，８６６，６９２号；第６，３３１，４１５号；第５，５３０，１０１号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，５８５，０８９号；第６，１８０，３７０号；第５，２２５，５３９号；第６，５４８，６４０号を参照されたい。
【００９８】
組換えヒト化抗体において、Ｆｃ部分を修飾して、Ｆｃγ受容体および補体免疫系の相互作用を回避することも可能である。この種の修飾は、ケンブリッジ大学病理学部のＭｉｋｅ  Ｃｌａｒｋ博士によって設計され、そしてこうした抗体を調製する技術は、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９９／５８５７２号、１９９９年１１月１８日公開に記載されている。
【００９９】
例えば、抗体がヒトにおいて臨床試験および治療に用いられる場合、ヒト定常領域により似るように定常領域を操作して、免疫応答を回避することも可能である。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号および第５，８６６，６９２号を参照されたい。
【０１００】
本発明は、本明細書記載の抗体（抗体Ａ５など）またはポリペプチドに対する修飾を含み、特性に有意な影響を及ぼさない機能的に同等の抗体、および増進した活性または減少した活性を有する変異体を含む。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において日常的な実務であり、そして本明細書に詳細に記載する必要はない。ポリペプチドの修飾を実施例に例示する。修飾ポリペプチドの例には、アミノ酸残基の保存的置換、機能活性を有意に有害に変化させない１以上のアミノ酸の欠失または付加、あるいは化学的類似体の使用を伴うポリペプチドが含まれる。
【０１０１】
アミノ酸配列挿入または付加には、長さ１残基から、１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシ末端融合、並びに単一または多数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を伴う抗体またはエピトープタグに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させる、抗体のＮ末端またはＣ末端への酵素またはポリペプチドの融合が含まれる。
【０１０２】
置換変異体は、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、そしてその代わりに異なる残基が挿入されている変異体である。置換突然変異誘発に最も重要な部位には、超可変領域が含まれるが、ＦＲ改変もまた意図される。保存的置換を表１の「保存的置換」の頭書き以下に示す。こうした置換が生物学的活性の変化を生じるならば、表１に「典型的な置換」と称する、またはアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載するような、より実質的な変化を導入して、そして産物をスクリーニングすることも可能である。
【０１０３】
表１：アミノ酸置換
【０１０４】
【表２】
2007519401.tif 000003
【０１０５】
（ａ）置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造、例えばシートまたはらせんコンホメーションとしての構造、（ｂ）ターゲット部位での分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖のかさを維持することに対する影響が有意に異なる置換を選択することによって、抗体の生物学的特性における実質的な修飾が達成される。天然存在残基は、共通の側鎖特性に基づいて、群に分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１０６】
これらのクラスの１つのメンバーと別のクラスのメンバーを交換することによって、非保存的置換を行う。
抗体の適切なコンホメーションの維持に関与していないシステイン残基のいずれかを、一般的にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し、そして異常な架橋を防止することもまた可能である。逆に、システイン結合（単数または複数）を抗体に付加して、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合に、安定性を改善することも可能である。
【０１０７】
アミノ酸修飾は、１以上のアミノ酸の変化または修飾から、領域、例えば可変領域の完全な再設計までの範囲にあることも可能である。可変領域中の変化は、結合親和性および／または特異性を改変することも可能である。いくつかの態様において、ＣＤＲドメイン内で、１〜５の保存的アミノ酸置換を超えない置換を作成する。他の態様において、ＣＤＲ３ドメイン内で、１〜３の保存的アミノ酸置換を超えない置換を作成する。さらに他の態様において、ＣＤＲドメインは、ＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲ  Ｌ３である。
【０１０８】
修飾にはまた、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、並びに例えば異なる糖を用いたグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの、他の翻訳後修飾を持つポリペプチドも含まれる。抗体は、定常領域の保存される位でグリコシル化される（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ，  １９９７，  Ｃｈｅｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６５：１１１−１２８；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ，  １９９７，  ＴｉｂＴＥＣＨ  １５：２６−３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら，  １９９６，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３２：１３１１−１３１８；ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ，  １９９０，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２９：４１７５−４１８０）、および糖タンパク質の部分間の分子内相互作用に影響を及ぼし、こうした分子内相互作用への影響は、糖タンパク質のコンホメーションおよび提示される三次元表面に影響を及ぼしうる（ＨｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記；ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ，  １９９６，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ７：４０９−４１６）。オリゴ糖はまた、特異的認識構造に基づいて、既定の糖タンパク質を特定の分子にターゲティングするようにも働くことも可能である。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすことも報告されてきている。特に、二分ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリンが制御する発現を伴うＣＨＯ細胞が、改善されたＡＤＣＣ活性を有することが報告された（Ｕｍａｎａら，  １９９９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １７：１７６−１８０）。
【０１０９】
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ連結またはＯ連結のいずれかである。Ｎ連結は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システイン、式中、Ｘはプロリン以外のアミノ酸いずれかである、は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着の認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在によって、潜在的なグリコシル化部位が生成される。Ｏ連結グリコシル化は、糖、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つがヒドロキシアミノ酸に付着することを指し、該ヒドロキシアミノ酸は、最も一般的にはセリンまたはスレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンを用いることもまた可能である。
【０１１０】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、１以上の上述のトリペプチド配列（Ｎ連結グリコシル化部位の場合）を含有するように、アミノ酸配列を改変することによって、好都合に達成される。改変はまた、元来の抗体の配列に、１以上のセリン残基またはスレオニン残基を付加するか、あるいは元来の抗体配列をこれらで置換することによっても作成可能である（Ｏ連結グリコシル化部位の場合）。
【０１１１】
根底にあるヌクレオチド配列を改変することなく、抗体のグリコシル化パターンを改変することもまた可能である。グリコシル化は、大部分、抗体を発現するのに用いる宿主細胞に依存する。潜在的な療法剤としての組換え糖タンパク質、例えば抗体の発現に用いる細胞種が天然細胞であることは稀であるため、抗体のグリコシル化パターンの変動を予期することも可能である（例えばＨｓｅら，  １９９７，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：９０６２−９０７０を参照されたい）。
【０１１２】
宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生中のグリコシル化に影響を及ぼす要因には、増殖様式、培地配合、培養密度、酸素添加、ｐＨ、精製スキーム等が含まれる。特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを改変する、多様な方法が提唱されてきており、こうした方法には、オリゴ糖産生に関与する特定の酵素を導入するかまたは過剰発現させることが含まれる（米国特許第５，０４７，３３５号；第５，５１０，２６１号および第５，２７８，２９９号）。グリコシル化、または特定の種類のグリコシル化は、例えばエンドグリコシダーゼＨ（エンドＨ）を用いて、糖タンパク質から酵素的に除去可能である。さらに、組換え宿主細胞を遺伝子操作して、特定の種類の多糖のプロセシングを不全にすることも可能である。これらの技術および類似の技術が当該技術分野に周知である。
【０１１３】
修飾の他の方法には、当該技術分野に知られるカップリング技術の使用が含まれ、限定されるわけではないが、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化が含まれる。例えばイムノアッセイ用の標識を付着するため、修飾を用いることも可能である。当該技術分野で確立された方法を用いて、修飾ポリペプチド（Ａ５など）を作成し、そして当該技術分野に知られる標準アッセイを用いてスクリーニングすることも可能であり、こうした方法のいくつかを以下に、そして実施例に記載する。
【０１１４】
他の抗体修飾には、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９９／５８５７２号、１９９９年１１月１８日公開に記載されるように修飾された抗体が含まれる。これらの抗体は、ターゲット分子に向けられる結合性ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインのすべてまたは一部に実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、有意な補体依存性溶解、または細胞仲介性のターゲット破壊を誘発せずに、ターゲット分子に結合することが可能である。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＩＩｂに特異的に結合可能である。これらは、典型的には、２以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメイン由来のキメラドメインに基づく。この方式で修飾される抗体は、慣用的抗体療法に対する炎症反応および他の不都合な反応を回避するため、長期抗体療法における使用に特に適している。
【０１１５】
本発明には、親和性成熟態様が含まれる。例えば、当該技術分野に知られる方法によって、親和性成熟抗体を産生することも可能である（Ｍａｒｋｓら，  １９９２，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０：７７９−７８３；Ｂａｒｂａｓら，  １９９４，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３；Ｓｃｈｉｅｒら，  １９９５，  Ｇｅｎｅ，  １６９：１４７−１５５；Ｙｅｌｔｏｎら，  １９９５，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５５：１９９４−２００４；Ｊａｃｋｓｏｎら，  １９９５，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５４（７）：３３１０−９；Ｈａｗｋｉｎｓら，  １９９２，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２６：８８９−８９６；およびＷ０２００４／０５８１８４）。
【０１１６】
抗体の親和性を調整し、そしてＣＤＲを性質決定するため、以下の方法を用いることも可能である。抗体のＣＤＲを性質決定し、そして／またはポリペプチド、例えば抗体の結合親和性を改変する（例えば改善する）１つの方法は、「ライブラリー・スキャニング突然変異誘発」と称される。一般的に、ライブラリー・スキャニング突然変異誘発は、以下のように働く。当該技術分野に認識される方法を用いて、ＣＤＲ中の１以上のアミノ酸位を、２以上（例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）のアミノ酸と交換する。これによって、各々が２以上のメンバー（すべての位が２以上のアミノ酸で置換される場合）の複雑性を持つ、クローンの小さいライブラリー（いくつかの態様において、解析するアミノ酸位１つにつき１つ）が生成される。一般的に、ライブラリーはまた、天然（非置換）アミノ酸を含むクローンも含む。ターゲットポリペプチド（または他の結合性ターゲット）に対する結合親和性に関して、各ライブラリー由来の少数のクローン、例えば約２０〜８０クローン（ライブラリーの複雑性に応じる）をスクリーニングし、そして結合が増加したか、同一か、減少したか、またはまったくない候補を同定する。結合親和性を決定する方法は、当該技術分野に周知である。約２倍以上の結合親和性の相違を検出する、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴解析を用いて、結合親和性を決定することも可能である。ＢＩＡｃｏｒｅは、出発抗体がすでに比較的高い親和性、例えば約１０ｎＭ以下のＫＤで結合する場合、特に有用である。ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴を用いたスクリーニングを、本明細書の実施例に記載する。
【０１１７】
Ｋｉｎｅｘａバイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮイムノアッセイ（ＩＧＥＮ）、蛍光消光、蛍光移動、および／または酵母ディスプレイを用いて、結合親和性を決定することも可能である。適切なバイオアッセイを用いて、結合親和性をスクリーニングすることもまた可能である。
【０１１８】
いくつかの態様において、当該技術分野で認められている突然変異誘発法（このうちいくつかを本明細書に記載する）を用いて、２０の天然アミノ酸すべてで、ＣＤＲ中のすべてのアミノ酸位を置換する（いくつかの態様において、一度に１つずつ）。これによって、各々が２０のメンバー（すべての位が２０のアミノ酸で置換される場合）の複雑性を持つ、クローンの小さいライブラリー（いくつかの態様において、解析するアミノ酸位１つにつき１つ）が生成される。
【０１１９】
いくつかの態様において、スクリーニングされるライブラリーは、同一ＣＤＲ中または２以上のＣＤＲ中であることも可能な、２以上の位で置換を含む。したがって、ライブラリーは、１つのＣＤＲ中の２以上の位で置換を含むことも可能である。ライブラリーは、２以上のＣＤＲ中の２以上の位で置換を含むことも可能である。ライブラリーは、２、３、４、５または６のＣＤＲ中に見られる、３、４、５、またはそれより多い位で置換を含むことも可能である。重複性が低いコドンを用いて、置換を調製することも可能である。例えば、Ｂａｌｉｎｔら（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７（１）：１０９−１８の表２を参照されたい。
【０１２０】
ＣＤＲは、ＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲＬ３であることも可能である。ＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、および／またはＣＤＲＨ３の１以上であることも可能である。ＣＤＲはＫａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ、または拡張ＣＤＲであることも可能である。
【０１２１】
結合が改善された候補を配列決定し、それによって親和性改善を生じるＣＤＲ置換突然変異体（「改善置換」とも称される）を同定することも可能である。結合する候補を配列決定し、それによって結合を保持するＣＤＲ置換を同定することもまた可能である。どの抗体が結合を消滅させるかを知るため、非結合性変異体の配列を配列決定することもまた可能である。
【０１２２】
多数の周期のスクリーニングを行うことも可能である。例えば、結合が改善された候補（各々、１以上のＣＤＲの１以上の位でアミノ酸置換を含む）はまた、改善されたＣＤＲ位（すなわち、置換突然変異体が結合改善を示す、ＣＤＲ中のアミノ酸位）の各々で、少なくとも元来のアミノ酸および置換されたアミノ酸を含有する、第二のライブラリーを設計するのにも有用である。このライブラリーの調製、およびスクリーニングまたは選択を以下にさらに論じる。
【０１２３】
ライブラリー・スキャニング突然変異誘発はまた、結合が改善されたか、同一であるか、減少したか、またはまったくないクローンの頻度もまた、抗体−抗原複合体の安定性に対する、各アミノ酸位の重要性に関する情報を提供するという範囲で、ＣＤＲを性質決定する手段も提供する。例えば、ＣＤＲの位を２０のアミノ酸すべてに変化させた際に、結合が保持されるならば、この位は抗原結合に必要である可能性が低い位と同定される。逆に、ＣＤＲの位を置換した際、低い割合でしか結合が保持されないのであれば、この位はＣＤＲ機能に重要な位と同定される。したがって、ライブラリー・スキャニング突然変異誘発法は、多くの異なるアミノ酸（２０のアミノ酸すべてを含む）に変化させることも可能なＣＤＲ中の位、および変化させることが不能であるか、またはいくつかのアミノ酸にしか変化させることが可能でない、ＣＤＲ中の位に関する情報を生じる。
【０１２４】
改善されたアミノ酸、その位の元来のアミノ酸を含み、そして望ましいスクリーニング法または選択法を用いた際に望ましいか、または許容される、ライブラリーの複雑性に応じて、その位でさらなる置換をさらに含むことも可能な、第二のライブラリー中で、親和性が改善された候補を組み合わせることも可能である。さらに、望ましい場合、隣接するアミノ酸位を少なくとも２以上のアミノ酸にランダム化することも可能である。隣接するアミノ酸のランダム化は、突然変異ＣＤＲ中のさらなるコンホメーション柔軟性を許容することも可能であり、これが次に、多数の改善された突然変異の導入を許容するかまたは促進することも可能である。ライブラリーはまた、第一周期のスクリーニングにおいて、親和性改善を示さなかった位での置換を含むことも可能である。
【０１２５】
改善されたおよび／または改変された結合親和性を持つライブラリー・メンバーに関して、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴解析を用いたスクリーニング、並びにファージ・ディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソーム・ディスプレイを含む当該技術分野で知られる選択法いずれかを用いた選択を含む、当該技術分野に知られる方法いずれかを用いて、第二のライブラリーをスクリーニングするかまたは選択する。
【０１２６】
本発明はまた、本発明の抗体（Ａ５など）またはポリペプチド由来の１以上の断片または領域を含む融合タンパク質も含む。１つの態様において、図１Ｂに示す軽鎖可変領域の少なくとも１０の隣接アミノ酸および／または図１Ａに示す重鎖可変領域の少なくとも１０のアミノ酸を含む、融合ポリペプチドを提供する。別の態様において、融合ポリペプチドは、図１Ａおよび図１Ｂに示すような、Ａ５の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の態様において、融合ポリペプチドは、Ａ５の１以上のＣＤＲ（単数または複数）を含む。さらに他の態様において、融合ポリペプチドは、抗体Ａ５のＣＤＲ  Ｈ３および／またはＣＤＲ  Ｌ３を含む。別の態様において、融合ポリペプチドは、以下のいずれか１以上を含む：ＣＤＲ  Ｈ１のアミノ酸残基Ｒ３３および／またはＩ３４；ＣＤＲ  Ｈ２のＡ５６；ＣＤＲ  Ｈ３のＴ１０５および／またはＲ１０６；ＣＤＲ  Ｌ１のＩ２９、Ｌ３７および／またはＡ３８；ＣＤＲ  Ｌ２のＲ５８；並びに／あるいはＣＤＲ  Ｌ３のＴ９７。本発明の目的のため、Ａ５融合タンパク質は、１以上のＡ５抗体、および天然分子では付着していない別のアミノ酸配列、例えば異種配列または別の領域由来の相同配列を含有する。典型的な異種配列には、限定されるわけではないが、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグなどの「タグ」が含まれる。タグは当該技術分野に周知である。
【０１２７】
当該技術分野に知られる方法によって、例えば合成的または組換え的に、融合ポリペプチドを生成することも可能である。典型的には、本明細書記載の組換え法を用いて、本発明のＡ５融合タンパク質をコードする発現ポリヌクレオチドを調製することによって、該融合タンパク質を作成するが、これらはまた、例えば化学合成を含む、当該技術分野に知られる他の手段によって、調製することも可能である。
【０１２８】
本発明はまた、固体支持体へのカップリングを促進する剤（例えばビオチンまたはアビジン）にコンジュゲート化された（例えば連結された）、抗体（Ａ５など）またはポリペプチドを含む組成物も提供する。簡単にするため、一般的に、Ａ５または抗体への言及を行い、これらの方法が、本明細書記載のｔｒｋＣ結合態様のいずれにも適用されることを理解するものとする。コンジュゲート化は、一般的に、本明細書に記載するようなこれらの構成要素の連結を指す。いくつかの方法のいずれかによって、連結（一般的に、これらの構成要素を、少なくとも投与のため、近接した関係に固定する）を達成することも可能である。例えば、互いに反応することが可能な置換基を各々が所持する場合、剤および抗体の間の直接反応が可能である。例えば、一方の上にアミノ基またはスルフィドリル基などの求核基があると、他方の上に、無水物または酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基、あるいは優れた脱離基（例えばハロゲン化物）を含有するアルキル基があった場合、反応することも可能である。
【０１２９】
本発明の抗体またはポリペプチドを、標識剤（あるいは「標識」と称する）、例えば蛍光分子、放射性分子または当該技術分野に知られる他の標識いずれかに連結することも可能である。標識は、一般的に（直接または間接的いずれかで）シグナルを提供することが知られる。したがって、本発明には、標識抗体およびポリペプチドが含まれる。
【０１３０】
当該技術分野に知られる方法を用いて、本発明の抗体およびポリペプチドの能力、例えばｔｒｋＣに結合し、ｔｒｋＣ生物学的活性を活性化し；そして／またはＥ１２ラット三叉ニューロンのｔｒｋＣ誘導性生存を増進する能力を試験することも可能であり、このうちいくつかを実施例に記載する。
【０１３１】
本発明はまた、抗体Ａ５、および本開示が明らかにするように、本明細書記載の抗体および／またはポリペプチドのいずれかまたはすべてを含む、組成物（薬剤組成物を含む）およびキットも提供する。
【０１３２】
ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明の抗体およびポリペプチド（図１Ａおよび図１Ｂに示す軽鎖および重鎖の可変領域のポリペプチド配列を含む抗体を含む）をコードする単離ポリヌクレオチド、並びに該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供する。
【０１３３】
したがって、本発明は、以下のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド（または薬剤組成物を含む組成物）を提供する：（ａ）抗体Ａ５；（ｂ）抗体Ａ５の断片または領域；（ｃ）図１Ｂに示すような抗体Ａ５の軽鎖；（ｄ）図１Ａに示すような抗体Ａ５の重鎖；（ｅ）抗体Ａ５の軽鎖および／または重鎖由来の１以上の可変領域（単数または複数）；（ｆ）図１Ａおよび図１Ｂに示す抗体Ａ５の１以上のＣＤＲ（単数または複数）（１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲ）；（ｇ）図１Ａに示す抗体Ａ５の重鎖由来のＣＤＲ  Ｈ３；（ｈ）図１Ｂに示す抗体Ａ５の軽鎖由来のＣＤＲ  Ｌ３；（ｉ）図１Ｂに示す抗体Ａ５の軽鎖由来の３つのＣＤＲ；（ｊ）図１Ａに示す抗体Ａ５の重鎖由来の３つのＣＤＲ；（ｋ）図１Ａおよび図１Ｂに示す抗体Ａ５の軽鎖由来の３つのＣＤＲおよび重鎖由来の３つのＣＤＲ；あるいは（ｌ）（ｂ）〜（ｋ）のいずれかを含む抗体。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１０および配列番号１２に示すポリヌクレオチド（単数または複数）のいずれかまたは両方を含む。他の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１および配列番号１３に示すポリヌクレオチド（単数または複数）のいずれかまたは両方を含む。他の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１０および配列番号１３に示すポリヌクレオチド（単数または複数）のいずれかまたは両方を含む。他の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１および配列番号１２に示すポリヌクレオチド（単数または複数）のいずれかまたは両方を含む。
【０１３４】
別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を持つＡ５軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドである。別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を持つＡ５重鎖をコードする単離ポリヌクレオチドである。さらに別の側面において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を持つポリヌクレオチドにコードされる可変領域、および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を持つポリヌクレオチドにコードされる可変領域を含む、単離ポリヌクレオチドである。別の側面において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８２号の寄託番号を持つポリヌクレオチドにコードされる１以上のＣＤＲ；および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６８３号の寄託番号を持つポリヌクレオチドにコードされる１以上のＣＤＲを含む、単離ポリヌクレオチドである。
【０１３５】
別の側面において、本発明は、本明細書記載の抗体（抗体断片を含む）およびポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当該技術分野に知られる方法によって作成可能である。
【０１３６】
別の側面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物（薬剤組成物など）を提供する。いくつかの態様において、組成物は、本明細書記載のＡ５抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の態様において、組成物は、本明細書記載の抗体またはポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。さらに他の態様において、組成物は、配列番号１０および配列番号１２に示すポリヌクレオチド（単数または複数）のいずれかまたは両方を含む。他の態様において、組成物は、配列番号１１および配列番号１３に示すポリヌクレオチド（単数または複数）のいずれかまたは両方を含む。他の態様において、組成物は、配列番号１０および配列番号１３に示すポリヌクレオチド（単数または複数）のいずれかまたは両方を含む。他の態様において、組成物は、配列番号１１および配列番号１２に示すポリヌクレオチド（単数または複数）のいずれかまたは両方を含む。発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与を、本明細書にさらに記載する。
【０１３７】
別の側面において、本発明は、本明細書記載のポリヌクレオチドのいずれかを作成する方法を提供する。
こうした配列いずれかに相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）または二本鎖であることも可能であるし、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成分子）またはＲＮＡ分子であることも可能である。ＲＮＡ分子には、イントロンを含有し、そして一対一様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が含まれる。さらなるコード配列または非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在することも可能であるが、存在する必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質に結合することも可能であるが、結合する必要はない。
【０１３８】
ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち抗体またはその一部をコードする内因性配列）を含むことも可能であるし、またはこうした配列の変異体を含むことも可能である。ポリヌクレオチド変異体は、天然免疫反応性分子に比較して、コードされるポリペプチドの免疫反応性または有効性が減少しないように、１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する影響は、本明細書に記載するように、一般的に評価可能である。変異体は、好ましくは、天然抗体またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約８０％の同一性、そして最も好ましくは、少なくとも約９０％の同一性を示す。
【０１３９】
２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、これらの２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載するように最大に一致させて並列した際に、同じである場合、「同一」であるという。２つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウに渡って配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定し、そして比較することによって、行われる。「比較ウィンドウ」は、本明細書において、少なくとも約２０の隣接部分、通常３０〜約７５、４０〜約５０の隣接位のセグメントであって、２つの配列を最適に並列させた後、このウィンドウ中の配列を参照配列の同数の隣接位と比較することも可能な、前記セグメントを指す。
【０１４０】
バイオインフォマティクス・ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，  Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソン）の一連のＬａｓｅｒｇｅｎｅ中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムをデフォルトパラメーターで用いて、比較のため、配列の最適並列を行うことも可能である。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかの並列スキームを具現化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．  Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．（監修）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ中，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  ワシントンＤＣ  Ｖｏｌ．  ５，  Ｓｕｐｐｌ．  ３，  ｐｐ．  ３４５−３５８；Ｈｅｉｎ  Ｊ．，  １９９０，  Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．  ６２６−６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．  １８３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  カリフォルニア州サンディエゴ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，  Ｐ．Ｍ．，  １９８９，  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，  Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．，  １９８８，  ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｅ．Ｄ．，  １９７１，  Ｃｏｍｂ．  Ｔｈｅｏｒ．  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，  Ｎ．，  Ｎｅｓ，  Ｍ．，  １９８７，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，  Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，  Ｒ．Ｒ．，  １９７３，  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  カリフォルニア州サンフランシスコ；Ｗｉｌｂｕｒ，  Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．，  １９８３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【０１４１】
好ましくは、少なくとも２０の位の比較ウィンドウに渡って、最適に並列された２つの配列を比較することによって、「配列同一性パーセント」を決定し、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列中の部分は、２つの配列の最適並列の参照配列（付加または欠失を含まない）に比較した際、２０パーセント以下、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことも可能である。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも存在する位の数を決定して、マッチした位の数を得て、マッチした位の数を、参照配列中の位の総数（すなわちウィンドウサイズ）で割り、そして結果に１００を乗じて、配列同一性パーセントを得ることによって、パーセントを計算する。
【０１４２】
変異体はまた、またはあるいは、天然遺伝子、あるいはその一部または相補体に実質的に相同であることも可能である。こうしたポリヌクレオチド変異体は、中程度のストリンジェント条件下で、天然抗体をコードする天然存在ＤＮＡ配列（または相補配列）にハイブリダイズすることが可能である。
【０１４３】
適切な「中程度のストリンジェント条件」には、５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中の前洗浄；５０℃〜６５℃、５ｘＳＳＣ、一晩のハイブリダイズ；その後、０．１％ＳＤＳを含有する２ｘＳＳＣ、０．５ｘＳＳＣ、および０．２ｘＳＳＣ各々での６５℃または４２℃で２０分間、２回の洗浄が含まれる。
【０１４４】
本明細書において、「非常にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は：（１）洗浄に低いイオン強度および高い温度、例えば５０℃で、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用する；（２）ハイブリダイゼーション中、４２℃で、変性剤、例えばホルムアミド、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ６．５と７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを使用する；または（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を使用し、０．２ｘＳＳＣ中４２℃で、そして５５℃、５０％ホルムアミドで洗浄し、その後、５５℃または６８℃で、ＥＤＴＡを含有する０．１ｘＳＳＣからなる高ストリンジェンシーで洗浄する。当業者は、プローブの長さなどの要因に適応するのに必要とされるように、温度、イオン強度等を調節する方法を認識するであろう。
【０１４５】
一般の当業者は、遺伝暗号の縮重の結果、本明細書記載のポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることを認識するであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、天然遺伝子いずれかのヌクレオチド配列に最小限の相同性を所持する。にもかかわらず、コドン使用法の相違のために異なるポリヌクレオチドが、本発明に特に意図される。さらに、本明細書に提供するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のアレルは、本発明の範囲内である。アレルは、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの１以上の突然変異の結果、改変されている内因性遺伝子である。生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、改変された構造または機能を有することも可能であるが、そうである必要はない。標準的技術（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を用いて、アレルを同定することも可能である。
【０１４６】
化学合成、組換え法、またはＰＣＲを用いて、本発明のポリヌクレオチドを得ることも可能である。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は当該技術分野に周知であり、そして本明細書に詳細に記載する必要はない。当業者は、本明細書に提供する配列および商業的ＤＮＡ合成装置を用いて、望ましいＤＮＡ配列を産生することも可能である。
【０１４７】
本明細書にさらに論じるように、組換え法を用いてポリヌクレオチドを調製するため、望ましい配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入し、そして次に該ベクターを、複製および増幅のため、適切な宿主細胞内に導入することも可能である。当該技術分野に知られる手段いずれかによって、ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することも可能である。直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ交配またはエレクトロポレーションにより、外因性ポリヌクレオチドを導入することによって、細胞を形質転換する。ひとたび導入されたら、外因性ポリヌクレオチドは非組込みベクター（プラスミドなど）として細胞内に維持されることも、また宿主細胞ゲノム内に組み込まれることも可能である。当該技術分野に周知の方法によって、こうして増幅されたポリヌクレオチドを宿主細胞から単離することも可能である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照されたい。
【０１４８】
あるいは、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の再生を可能にする。ＰＣＲ技術は、当該技術分野に周知であり、そして米国特許４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，７５４，０６５号、および第４，６８３，２０２号、並びにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，  Ｍｕｌｌｉｓら監修，  Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ボストン（１９９４）に記載される。
【０１４９】
適切なベクター中の単離ＤＮＡを用い、そして適切な宿主細胞に挿入することによって、ＲＮＡを得ることも可能である。細胞が複製し、そしてＤＮＡがＲＮＡに転写されると、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に示されるような、当業者に周知の方法を用いて、ＲＮＡを単離することも可能である。
【０１５０】
標準的技術にしたがって、適切なクローニングベクターを構築することも可能であるし、または当該技術分野で入手可能な多数のクローニングベクターから選択することも可能である。選択されるクローニングベクターは、用いようと意図される宿主細胞にしたがって多様であることも可能であるが、有用なクローニングベクターは、一般的に、自己複製能を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一のターゲットを所持することも可能であり、そして／またはベクターを含有するクローンを選択する際に使用可能なマーカーの遺伝子を所持することも可能である。適切な例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えばｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその派生物、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、並びにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターが含まれる。これらのベクターおよび多くの他のクローニングベクターが、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの商業的業者から入手可能である。
【０１５１】
発現ベクターは、一般的に、本発明にしたがったポリヌクレオチドを含有する、複製可能ポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターが、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの組み込まれた部分としてのいずれかで、宿主細胞中で複製可能でなければならないことが意味される。適切な発現ベクターには、限定されるわけではないが、プラスミドや、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公報第ＷＯ  ８７／０４４６２号に開示される発現ベクター（単数または複数）が含まれる。ベクター構成要素には、一般的に、限定されるわけではないが、１以上の以下が含まれることも可能である：シグナル配列；複製起点；１以上のマーカー遺伝子；適切な転写調節要素（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなど）。発現（すなわち翻訳）のため、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンなどの１以上の翻訳調節要素もまた、通常、必要である。
【０１５２】
いくつかの適切な手段のいずれによって、目的のポリヌクレオチドを含有するベクターを宿主細胞に導入することも可能であり、こうした手段には、エレクトロポレーションや、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えばベクターがワクシニアウイルスなどの感染性病原体である場合）が含まれる。導入ベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、しばしば、宿主細胞の特徴に依存する。
【０１５３】
本発明はまた、本明細書に記載するポリヌクレオチド、あるいはポリペプチドまたは抗体のいずれかを含む宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを発現する（過剰発現を含む）ことが可能な宿主細胞のいずれを、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的に用いることも可能である。哺乳動物宿主細胞の限定されない例には、限定されるわけではないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が含まれる。ＰＣＴ公報第ＷＯ  ８７／０４４６２号もまた参照されたい。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（大腸菌または枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）など）および酵母（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．  ｐｏｍｂｅ）；またはＫ．ラクティス（Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ）など）が含まれる。好ましくは、宿主細胞に、対応する抗体またはタンパク質が内因性に存在する場合、宿主細胞は、対応する内因性のものより、約５倍高いレベル、より好ましくは１０倍高いレベル、さらにより好ましくは２０倍高いレベルで、該ｃＤＮＡを発現する。ｔｒｋＣに特異的に結合するポリペプチドを産生する宿主細胞のスクリーニングは、イムノアッセイまたはＦＡＣＳによって達成される。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することも可能である。
【０１５４】
抗体またはポリペプチドを用いる方法
ｔｒｋＣに結合する抗体Ａ５を用いて、ｔｒｋＣまたはｔｒｋＣ断片の存在または非存在を同定するかまたは検出することも可能である。簡単にするため、一般的に、Ａ５または抗体への言及を行い、これらの方法が、本明細書記載のｔｒｋＣ結合態様（ポリペプチドなど）のいずれにも適用されることを理解するものとする。検出は、一般的に、ｔｒｋＣに結合する本明細書記載の抗体と、生物学的試料を接触させ、そしてｔｒｋＣおよびｔｒｋＣに特異的に結合する抗体（例えばＡ５）の間で複合体を形成させることを伴う。こうした複合体の形成は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであることもまたはｉｎ  ｖｉｖｏであることも可能である。用語「検出」は、本明細書において、対照と比較した、または比較しない、定性的および／または定量的検出（レベルを測定する）を含む。
【０１５５】
限定されるわけではないが、ポリペプチドに結合する抗体を用いたイムノアッセイ、例えば酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）など；およびコードされるポリペプチドに関する機能アッセイ、例えば結合活性または酵素アッセイを含む、多様な既知の方法のいずれを用いることも可能である。いくつかの態様において、抗体を検出可能に標識する。他の態様が当該技術分野に知られ、そして本明細書に記載される。
【０１５６】
抗体の診断使用
本発明の抗体およびポリペプチドを、改変されたかまたは異常なｔｒｋＣ発現（いくつかの態様において、（正常試料に比較して）増加したかまたは減少したｔｒｋＣ発現、並びに／あるいは不適切な発現、例えば、通常はｔｒｋＣ発現を欠く組織（単数または複数）および／または細胞（単数または複数）における発現の存在、または通常ｔｒｋＣ発現を所持する組織（単数または複数）または細胞（単数または複数）におけるｔｒｋＣ発現の非存在）と関連する疾患、状態、または障害の検出、診断および監視に使用可能である。例えば、ｔｒｋＣ発現腫瘍が当該技術分野に知られ、そしてこれには、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、ユーイング肉腫細胞、膵臓癌および甲状腺髄様癌が含まれる。本発明の抗体およびポリペプチドはさらに、例えば、ｔｒｋＣに対する、改変されたかまたは異常な感受性または反応性に関連する疾患における、ｔｒｋＣ発現の検出にも有用である。したがって、いくつかの態様において、本発明は、改変されたかまたは異常なｔｒｋＣ発現を有すると推測される個体の標本（試料）を、本発明の抗体またはポリペプチドと接触させ、そしてｔｒｋＣレベルが、対照または比較標本のものと異なるかどうかを決定することを含む。
【０１５７】
他の態様において、本発明は、個体の標本（試料）を接触させ、そしてｔｒｋＣ発現レベルを決定することを含む。いくつかの態様において、個体は、ｔｒｋＣ発現に対する、改変されたかまたは異常な感受性または反応性を特徴とするかまたはこれに関連する疾患、障害を有すると推測される。
【０１５８】
診断適用のため、限定されるわけではないが、放射性同位体、蛍光標識、および多様な酵素−基質標識を含む、検出可能部分で、抗体を標識することも可能である。抗体に標識をコンジュゲート化する方法が当該技術分野に知られる。本発明の他の態様において、本発明の抗体を標識する必要はなく、そして本発明の抗体に結合する標識抗体を用いて、本発明の抗体の存在を検出することも可能である。
【０１５９】
競合的結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法いずれかにおいて、本発明の抗体を使用することも可能である。Ｚｏｌａ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ｐｐ．  １４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８７）。
【０１６０】
抗体をｉｎ  ｖｉｖｏ画像化などのｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイに用いることもまた可能である。一般的に、免疫シンチグラフィーを用いて、目的の細胞または組織を位置決定することが可能であるように、抗体を放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、または３Ｈなど）で標識する。
【０１６１】
当該技術分野に周知の技術にしたがって、病理学における染色試薬として抗体を用いることもまた、可能である。
療法目的のため、抗体またはポリペプチド（Ａ５など）を用いる方法
抗体Ａ５は、ｔｒｋＣの生物学的活性を活性化するのに有用である。このアゴニスト活性は、感覚性ニューロパシーまたは神経変性疾患と関連する病理学的状態の治療に、あるいは損傷を受けた神経細胞の修復に有用であると考えられる。ニューロパシーは、例えば、限定なしに大径線維感覚性ニューロパシーを含む、末梢ニューロパシーであることも可能である。いくつかの態様において、感覚性ニューロパシー、例えば大径線維感覚性ニューロパシー、例えばタキソール誘導性感覚性ニューロパシー、シスプラチン誘導性感覚性ニューロパシー、またはピリドキシン誘導性ニューロパシーを患う個体に、本明細書記載のＡ５または他の抗体あるいはポリペプチドでの治療を施す。一般的に、これらの態様において、有効量を個体に投与する。
【０１６２】
簡単にするため、一般的に、Ａ５または抗体への言及を行い、これらの方法が、本明細書記載のｔｒｋＣ結合態様のいずれにも適用されることを理解するものとする。
Ａ５またはＡ５断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、例えば一本鎖（ＳｃＦｖ）、これらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および必要な特異性の抗原ｔｒｋＣ認識部位を含むＡ５の他の修飾立体配置いずれかの多様な配合物を投与に用いることも可能である。いくつかの態様において、Ａ５抗体またはＡ５の多様な配合物をそのまま（ｎｅａｔ）投与することも可能である。他の態様において、Ａ５またはＡ５の多様な配合物（本明細書記載の組成物態様いずれかを含む）および薬学的に許容しうる賦形剤が投与され、そしてこれらは多様な配合にあることも可能である。薬学的に許容しうる賦形剤は、当該技術分野に知られ、そして薬理学的有効物質の投与を容易にする、比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形またはコンシステンシーを与えるか、あるいは希釈剤として作用することも可能である。適切な賦形剤には、限定されるわけではないが、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変化させる塩、被包剤、緩衝剤、および皮膚浸透増進剤が含まれる。非経口および経口薬剤搬送のための賦形剤、並びに配合物が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に示される。
【０１６３】
いくつかの態様において、注射（例えば腹腔内、クモ膜下内、静脈内、皮下、筋内など）による投与のために、これらの剤を配合するが、他の型の投与（例えば経口、粘膜、吸入を介するもの、舌下など）もまた、使用可能である。好ましくは、Ａ５抗体およびその同等物を生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液等の薬学的に許容しうるビヒクルと組み合わせる。特定の投薬措置、すなわち用量、時期および反復は、特定の個体および個体の病歴に応じるであろう。一般的に、約１μｇ／ｋｇ体重未満、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約２μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇ体重、またはそれより多く（例えば約５０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇまたは約５００ｍｇ／ｋｇ）の用量を投与する。数日以上に渡る反復投与には、状態に応じて、疾患症状の望ましい抑制が起こるまで、治療を持続する。典型的な投薬措置は、抗ｔｒｋＣ抗体の約２ｍｇ／ｋｇの最初の用量、その後、約１ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量、または１週おきの約１ｍｇ／ｋｇの維持用量の投与を含む。しかし、医師が達成を望む薬物動態学的減衰パターンに応じて、他の投薬措置が有用である可能性もある。半減期などの実験的考慮は、一般的に、投薬量の決定に寄与するであろう。この療法の進行は、慣用的技術およびアッセイによって、容易に監視される。
【０１６４】
ある個体においては、１回より多い用量が必要とされる可能性もある。療法経過に渡って、投与頻度を決定し、そして調節することも可能である。例えば、治療しようとする症状の種類および重症度、剤が予防目的でまたは療法目的で投与されるか、以前の療法、患者の病歴および剤に対する反応性、並びに主治医の判断に基づいて、投与頻度を決定するかまたは調節することも可能である。典型的には、医師は、投薬量が、望ましい結果を達成するに至るまで、アゴニスト抗ＴｒｋＣ抗体（Ａ５など）を投与するであろう。ある場合には、Ａ５抗体の持続性連続放出配合物が適切である可能性もある。持続性放出を達成する多様な配合物および装置が、当該技術分野に知られる。
【０１６５】
１つの態様において、１以上の投与（単数または複数）を与えられた個体において、Ａ５抗体（またはポリペプチド）の投薬量を実験的に決定することも可能である。個体に、増加性でＡ５投薬を行う。Ａ５または他の同等抗体の有効性を評価するため、疾患症状のマーカー（疼痛など）を監視することも可能である。
【０１６６】
本発明の方法にしたがった抗体（Ａ５など）またはポリペプチドの投与は、例えばレシピエントの生理学的状態、投与目的が療法的であるかまた予防的であるか、および医師に知られる他の要因に応じて、連続性であることもまたは断続性であることも可能である。抗体の投与は、あらかじめ選択された期間に渡って、本質的に連続性であることも可能であるし、あるいは例えば症状を発展させる前、間、または後のいずれか、症状を発展させる前、間、前および後、間および後、または前、間および後など、間を空けた一連の用量であることも可能である。投与は、創傷、切開、外傷、手術、および症状を生じさせる可能性がある他の事象（例えば感覚性ニューロパシー、例えばタキソール誘導性感覚性ニューロパシー）いずれかの、前、間および／または後であることも可能である。
【０１６７】
他の配合物には、当該技術分野に知られる適切な搬送型が含まれ、これには限定されるわけではないが、リポソームなどのキャリアーが含まれる。例えば、Ｍａｈａｔｏら（１９９７）Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １４：８５３−８５９を参照されたい。リポソーム調製物には、限定されるわけではないが、サイトフェクチン、多層小胞および単層小胞が含まれる。
【０１６８】
いくつかの態様において、１より多い抗体またはポリペプチドが存在することも可能である。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることも可能である。こうした組成物は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの異なる抗体を含有することも可能である。抗体混合物は、当該技術分野にしばしば示されるように、集団または個体のより広い範囲を治療するのに、特に有用であることも可能である。
【０１６９】
本発明の抗体またはポリペプチド（抗体Ａ５など）のいずれかをコードするポリヌクレオチドを、本発明の抗体またはポリペプチド（抗体Ａ５など）のいずれかの搬送および望ましい細胞における発現に用いることも可能である。発現ベクターを用いて、Ａ５抗体またはポリペプチドの発現を指示することも可能であることが明らかである。発現ベクターを、当該技術分野に知られる手段いずれかによって、投与することも可能であり、投与には例えば、腹腔内、静脈内、筋内、皮下、クモ膜下内、心室内、経口、経腸、非経口、鼻内、皮膚、舌下、または吸入によるものがある。例えば、発現ベクターの投与には、局所投与または全身性投与が含まれ、注射、経口投与、微粒子銃またはカテーテル投与、および局所的投与が含まれる。当業者は、ｉｎ  ｖｉｖｏの外因性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与に精通している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号；第６，４１３，９４２号；および第６，３７６，４７１号を参照されたい。
【０１７０】
本発明の抗体またはポリペプチド（抗体Ａ５など）のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む療法組成物のターゲティング化搬送を用いることもまた、可能である。受容体仲介性ＤＮＡ搬送技術が、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．  Ｗｏｌｆｆ監修）（１９９４）；Ｗｕら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９９０）８７：３６５５；Ｗｕら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８に記載されている。遺伝子治療プロトコルでは、局所投与のため、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で、ポリヌクレオチドを含有する療法組成物を投与する。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲もまた、遺伝子治療プロトコルで使用可能である。遺伝子搬送ビヒクルを用いて、本発明の療法ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを搬送することも可能である。遺伝子搬送ビヒクルは、ウイルス起源であることもまた非ウイルス起源であることも可能である（一般的には、Ｊｏｌｌｙ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１；Ｋｉｍｕｒａ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８を参照されたい）。内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを用いて、こうしたコード配列の発現を誘導することも可能である。コード配列の発現は、恒常性であることもまた制御されていることも可能である。
【０１７１】
望ましいポリヌクレオチドを搬送し、そして望ましい細胞において発現させるためのウイルスに基づくベクターが当該技術分野に周知である。ウイルスに基づく典型的なビヒクルには、限定されるわけではないが、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９０／０７９３６号；第ＷＯ  ９４／０３６２２号；第ＷＯ  ９３／２５６９８号；第ＷＯ  ９３／２５２３４号；第ＷＯ  ９３／１１２３０号；第ＷＯ  ９３／１０２１８号；第ＷＯ  ９１／０２８０５号；米国特許第５，２１９，７４０号；第４，７７７，１２７号；ＧＢ特許第２，２００，６５１号；およびＥＰ特許第０  ３４５  ２４２号）、アルファウイルスに基づくベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えばＰＣＴ公報第ＷＯ  ９４／１２６４９号、第ＷＯ  ９３／０３７６９号；第ＷＯ９３／１９１９１号；第ＷＯ  ９４／２８９３８号；第ＷＯ  ９５／１１９８４号および第ＷＯ  ９５／００６５５号を参照されたい）が含まれる。Ｃｕｒｉｅｌ，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７に記載されるように、殺したアデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与もまた、使用可能である。
【０１７２】
非ウイルス搬送ビヒクルおよび方法もまた使用可能であり、これらには、限定されるわけではないが、殺したアデノウイルスのみに連結されたまたは連結されないポリカチオン性凝縮ＤＮＡ（例えばＣｕｒｉｅｌ，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７を参照されたい）；リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５）；真核細胞搬送ビヒクル細胞（例えば米国特許第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９５／０７９９４号；第ＷＯ  ９６／１７０７２号；第ＷＯ  ９５／３０７６３号；および第ＷＯ  ９７／４２３３８号）および核酸電荷中和または細胞膜との融合が含まれる。裸のＤＮＡもまた使用可能である。裸のＤＮＡの典型的な導入法は、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。遺伝子搬送ビヒクルとして作用可能なリポソームが、米国特許第５，４２２，１２０号；ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９５／１３７９６号；第ＷＯ  ９４／２３６９７号；第ＷＯ  ９１／１４４４５号；およびＥＰ特許第０  ５２４  ９６８号に記載される。さらなるアプローチが、Ｐｈｉｌｉｐ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１に記載される。
【０１７３】
本明細書記載のすべての方法に関して、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体（またはポリペプチド）への言及はまた、１以上のこれらの剤を含む組成物もまた含む。これらの組成物は、適切な賦形剤、例えば緩衝剤を含む薬学的に許容しうる賦形剤をさらに含むことも可能であり、こうした賦形剤は当該技術分野に周知である。本発明を単独で、または他の慣用的治療法と組み合わせて用いることも可能である。
【０１７４】
適切な経路いずれかを介して、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体（またはポリペプチド）を個体に投与することも可能である。異なる投与経路の例を本明細書に記載する。
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与
適切な経路いずれかを介して、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体（またはポリペプチド）を個体に投与することも可能である。本明細書記載の実施例は、限定することを意図せず、利用可能な技術の例示を意図することが、当業者には明らかであるはずである。簡単にするため、一般的に、Ａ５または抗体への言及を行い、これらの方法が、ｔｒｋＣ結合態様のいずれにも適用されることを理解するものとする。したがって、いくつかの態様において、静脈内投与などの既知の方法にしたがって、例えばボーラス（ｂｏｌｕｓ）として、または一定期間に渡る連続注入によって、筋内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、舌下、滑膜内、吹送を介した、クモ膜下内、経口、吸入または局所的経路によって、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を個体に投与する。投与は全身性、例えば静脈内投与であることも、または局所性であることも可能である。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含む、液体配合物用の商業的に入手可能な噴霧器は、投与に有用である。液体配合物は直接噴霧可能であり、そして凍結乾燥粉末は、再構成後、噴霧可能である。あるいは、フルオロカーボン配合物および定量吸入器を用いて、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体をエアロゾル化することも可能であるし、また凍結乾燥し、そして粉砕した粉末として吸入することも可能である。
【０１７５】
１つの態様において、部位特異的またはターゲット化局所搬送技術を介して、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を投与する。部位特異的またはターゲット化局所搬送技術の例には、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の多様な移植可能デポ供給源、あるいは局所搬送カテーテル、例えば注入カテーテル、留置カテーテル、または針カテーテル、合成移植片、外膜ラップ、シャントおよびステントまたは他の移植可能装置、部位特異的キャリアー、直接注入、または直接適用が含まれる。例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ００／５３２１１号および米国特許第５，９８１，５６８号を参照されたい。
【０１７６】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の多様な配合物を投与に用いることも可能である。いくつかの態様において、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体をそのまま投与することも可能である。いくつかの態様において、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体および薬学的に許容しうる賦形剤は多様な配合にあることも可能である。薬学的に許容しうる賦形剤は、当該技術分野に知られ、そして薬理学的有効物質の投与を容易にする、比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形またはコンシステンシーを与えるか、あるいは希釈剤として作用することも可能である。適切な賦形剤には、限定されるわけではないが、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変化させる塩、被包剤、緩衝剤、および皮膚浸透増進剤が含まれる。非経口および経口薬剤搬送のための賦形剤、並びに配合物が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に示される。
【０１７７】
いくつかの態様において、注射（例えば腹腔内、クモ膜下内、静脈内、皮下、筋内など）による投与のために、これらの剤を配合する。したがって、これらの剤を生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液等の薬学的に許容しうるビヒクルと組み合わせることも可能である。特定の投薬措置、すなわち用量、時期および反復は、特定の個体および個体の病歴に応じるであろう。
【０１７８】
注射（例えば腹腔内、クモ膜下内、静脈内、皮下、筋内など）によるものを含む、適切な方法いずれかを用いて、抗ｔｒｋＣ抗体を投与することも可能である。抗ｔｒｋＣ抗体を、本明細書に記載するような吸入を介して投与することもまた可能である。一般的に、約１μｇ／ｋｇ体重未満、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約２μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇ体重、またはそれより多く（例えば約５０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇまたは約５００ｍｇ／ｋｇ）の用量を投与する。数日以上に渡る反復投与には、状態に応じて、症状の望ましい抑制が起こるまで、または症状、例えばニューロパシーを減少させるのに十分な療法レベルが達成されるまで、治療を持続する。典型的な投薬措置は、抗ｔｒｋＣ抗体の約２ｍｇ／ｋｇの最初の用量、その後、約１ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量、または１週おきの約１ｍｇ／ｋｇの維持用量の投与を含む。しかし、医師が達成を望む薬物動態学的減衰パターンに応じて、他の投薬措置が有用である可能性もある。例えば、いくつかの態様において、週１〜４回の投薬が意図される。この療法の進行は、慣用的技術およびアッセイによって、容易に監視される。投薬措置（用いるｔｒｋＣアゴニスト（単数または複数）を含む）は、時間に渡って多様であることも可能である。
【０１７９】
本発明の目的のため、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の適切な投薬量は、使用するアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体（またはその組成物）、治療しようとする症状の種類および重症度、剤が予防目的でまたは療法目的で投与されるか、以前の療法、患者の病歴および剤に対する反応性、並びに主治医の判断に応じるであろう。典型的には、医師は、投薬量が、望ましい結果を達成するに至るまで、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を投与するであろう。用量および／または頻度は、治療の経過に渡って多様であることも可能である。
【０１８０】
半減期などの実験的考慮は、一般的に、投薬量の決定に寄与するであろう。例えば、ヒト免疫系に適合する抗体、例えばヒト化抗体または完全ヒト抗体を用いて、抗体の半減期を延長し、そして宿主免疫系に抗体が攻撃されるのを防止することも可能である。療法経過に渡って、投与頻度を決定し、そして調節することも可能であり、そして一般的に、投与頻度は、症状（例えばニューロパシー）の治療および／または抑制および／または改善および／または遅延に基づく。あるいは、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の持続性連続放出配合物が適切である可能性もある。持続性放出を達成する多様な配合物および装置が、当該技術分野に知られる。
【０１８１】
１つの態様において、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の１以上の投与（単数または複数）を与えられた個体において、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投薬量を実験的に決定することも可能である。個体に、増加性でアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体投薬を行う。アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の有効性を評価するため、ニューロパシー（タキソール誘導性感覚性ニューロパシーを含む、感覚性ニューロパシーなど）の指標を追跡することも可能である。
【０１８２】
本発明の方法にしたがったアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与は、例えばレシピエントの生理学的状態、投与目的が療法的または予防的であるか、および医師に知られる他の要因に応じて、連続性であることもまたは断続性であることも可能である。アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与は、あらかじめ選択された期間に渡って、本質的に連続性であることも可能であるし、あるいは間を空けた一連の用量、例えば感覚性ニューロパシーを発展させる前、間、または後のいずれか；感覚性ニューロパシーを発展させる前；間；前および後；間および後；前および間；または前、間および後であることも可能である。
【０１８３】
いくつかの態様において、１より多いアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体が存在することも可能である。少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたはそれより多くの異なるアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体が存在することも可能である。一般的に、これらのアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、互いに不都合に影響を及ぼさない、相補的活性を有する。アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を、剤の有効性を増進し、そして／または補うように作用する、他の剤と組み合わせて用いることもまた可能である。
【０１８４】
凍結乾燥配合物または水性溶液の形で、望ましい度合いの純度を有する抗体と、所望による薬学的に許容しうるキャリアー、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００））を混合することによって、本発明にしたがって用いられるアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の療法配合物を貯蔵用に調製する。許容しうるキャリアー、賦形剤、または安定化剤は、使用する投薬量および濃度で、レシピエントに非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリン類を含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むことも可能である。
【０１８５】
Ｅｐｓｔｅｉｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）；並びに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載されるものなど、当該技術分野に知られる方法によって、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を含有するリポソームを調製する。循環時間が増進したリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって、特に有用なリポソームを生成することも可能である。定義される孔サイズのフィルターを通じてリポソームを押し出して、望ましい直径のリポソームを生じる。
【０１８６】
それぞれコロイド薬剤搬送系（例えば、リポソーム、アルブミン微小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにおいて、例えばコアセルベーション技術によって、または界面重合によって、調製された微小カプセル、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン微小カプセルおよびポリ−（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））微小カプセルに、活性成分を被包することもまた可能である。こうした技術が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に開示される。
【０１８７】
持続性放出調製物を調製することも可能である。持続性放出調製物の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成型された物品の形、例えばフィルム、または微小カプセルである。持続性放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸および７エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、分解不能エチレン−酢酸ビニル、分解可能乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射可能微小球体）、スクロース・アセテート・イソブチレート、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０１８８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に用いようとする配合物は、無菌でなければならない。これは、例えば無菌ろ過膜を通じたろ過によって容易に達成される。一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアル、またはあらかじめ充填したシリンジに療法アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体組成物を入れる。
【０１８９】
本発明にしたがった組成物は、経口、非経口または直腸投与、あるいは吸入または吹送による投与のため、錠剤、ピル、カプセル、粉末、顆粒、溶液または懸濁物、あるいは座薬などの単位投薬型であることも可能である。
【０１９０】
錠剤などの固体組成物を調製するため、主な活性成分を薬学的キャリアー、例えば慣用的な錠剤化成分、例えばコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはゴム質、および他の薬学的希釈物、例えば水と混合して、本発明の化合物または非毒性の薬学的に許容しうるその塩の均質な混合物を含有する、あらかじめ配合された固体組成物を形成することも可能である。これらのあらかじめ配合された組成物を均質と称する際、組成物が、錠剤、ピルおよびカプセルなどの、同等に有効な単位投薬型に容易に細分可能であるように、組成物全体に均一に活性成分が分散していることを意味する。次いで、本発明の活性成分０．１〜約５００ｍｇを含有する、上述の種類の単位投薬型に、このあらかじめ配合された固体組成物を細分する。新規組成物の錠剤またはピルをコーティングするかまたは別の方式で混合して、作用を延長する利点を提供する投薬型を提供することも可能である。例えば、錠剤またはピルは、内部投薬構成要素および外部投薬構成要素を含有することも可能であり、後者が前者のエンベロープの形であることも可能である。胃での分解に耐性であり、そして内部構成要素が損なわれずに、十二指腸へと通過するか、または放出が遅延されるのを可能にする、溶腸層によって、２つの構成要素を分離することも可能である。こうした溶腸層またはコーティングに、いくつかのポリマー酸、並びにポリマー酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの物質の混合物を含む、多様な成分を用いることも可能である。
【０１９１】
適切な表面活性剤には、特に、非イオン性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタン（例えばＴｗｅｅｎＴＭ２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例えばＳｐａｎＴＭ２０、４０、６０、８０または８５）が含まれる。表面活性剤を含む組成物は、都合よくは、０．０１〜５％の表面活性剤を含むであろうし、そして０．１〜２．５％の間であることも可能である。他の成分、例えばマンニトールまたは必要であれば他の薬学的に許容しうるビヒクルを添加可能であることも認識されるであろう。
【０１９２】
商業的に入手可能な脂肪エマルジョン、例えばＩｎｔｒａｌｉｐｉｄＴＭ、ＬｉｐｏｓｙｎＴＭ、ＩｎｆｏｎｕｔｒｏｌＴＭ、ＬｉｐｏｆｕｎｄｉｎＴＭおよびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎＴＭを用いて、適切なエマルジョンを調製することも可能である。活性成分を、あらかじめ混合したエマルジョン組成物に溶解することも可能であるし、あるいは油（例えば大豆油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、コーン油またはアーモンド油）に溶解し、そしてリン脂質（例えば卵リン脂質、大豆リン脂質または大豆レシチン）および水と混合してエマルジョンを形成させることも可能である。他の成分、例えばグリセロールまたはグルコースを添加して、エマルジョンの強直性を調節することも可能であることが認識されるであろう。適切なエマルジョンは、典型的には、２０％までの油、例えば５〜２０％の油を含有するであろう。脂肪エマルジョンは、０．１〜１．０μｍ、特に０．１〜０．５μｍの間の脂肪小滴を含み、そして５．５〜８．０の範囲のｐＨを有することも可能である。
【０１９３】
エマルジョン組成物は、ｔｒｋＣアゴニスト抗体とＩｎｔｒａｌｉｐｉｄＴＭまたはその構成要素（大豆油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）を混合することによって調製したものであることも可能である。
【０１９４】
吸入または吹送のための組成物には、薬学的に許容しうる水性溶媒または有機溶媒中の溶液および懸濁物、あるいはその混合物、並びに粉末が含まれる。液体または固体組成物は、上述のような適切な薬学的に許容しうる賦形剤を含有することも可能である。いくつかの態様において、局所効果または全身効果のため、経口経路または鼻呼吸経路によって、組成物を投与する。好ましくは無菌の薬学的に許容しうる溶媒中の組成物を、ガスの使用によって噴霧することも可能である。噴霧化溶液を噴霧装置から直接呼吸することも可能であるし、または噴霧装置をフェイスマスク、テントまたは間欠的陽圧呼吸装置に取り付けることも可能である。適切な方式で配合物を搬送する装置から、好ましくは経口投与または鼻投与で、溶液、懸濁物または粉末組成物を投与することも可能である。
【０１９５】
当該技術分野に周知の方法によって、治療有効性を評価することも可能である。
本発明の抗体、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドを含むキット
本発明はまた、検出および／または療法で使用するための抗体またはポリペプチドを含むキットも提供する。したがって、いくつかの態様において、キットは抗体Ａ５を含む。いくつかの態様において、キットは、本明細書記載の抗体またはポリペプチドいずれかを含む。
【０１９６】
他の側面において、例えばタキソール誘導性感覚性ニューロパシー、ピリドキシン誘導性ニューロパシー、シスプラチン誘導性ニューロパシーなどの感覚性ニューロパシー（いくつかの態様において、大径線維感覚性ニューロパシー）の個体を治療する方法を含む、本明細書記載の方法いずれかのために、キットを用いることも可能である。本発明のキットは、適切なパッケージング中にあり、そして所望によって、本明細書記載の方法いずれかにおいて抗体を使用するための、緩衝液などのさらなる構成要素、および使用説明書を提供することも可能である。いくつかの態様において、キットは、個体において、感覚性ニューロパシー（タキソール誘導性感覚性ニューロパシー、ピリドキシン誘導性ニューロパシー、またはシスプラチン誘導性ニューロパシーなど）を治療し、そして／または予防するための、本明細書記載のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体および使用説明書を含む。いくつかの態様において、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、抗体Ａ５である。
【０１９７】
別の側面において、本発明は、本明細書記載のＡ５ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含むキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、本明細書記載の方法いずれかにおいて、ポリヌクレオチドを使用するための使用説明書をさらに含む。
【０１９８】
本発明を例示するために以下の実施例を提供するが、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１９９】
実施例
（実施例１）
マウス・モノクローナル抗体２２５６のヒト化および親和性成熟
Ａ．一般的な方法
本実施例では以下の一般的な方法を用いた。
【０２００】
クローン性質決定に用いた発現ベクター
抗体の発現は、Ｂａｒｂａｓ（２００１）Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２．１０．ページ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＣｏｍｂ３Ｘ）に記載されるものと類似のＩＰＴＧ誘導性ｌａｃＺプロモーターの調節下にあったが、以下のさらなるドメイン：ヒト・カッパ軽鎖定常ドメインおよびＩｇＧ２ａヒト免疫グロブリンのＣＨ１定常ドメインの付加および発現を含むように修飾した。Ｉｇガンマ−２鎖Ｃ領域、タンパク質寄託番号Ｐ０１８５９；免疫グロブリン・カッパ軽鎖（ホモサピエンス（ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ））、タンパク質寄託番号ＣＡＡ０９１８１。
【０２０１】
小規模Ｆａｂ調製
９６ウェルプレート中のＦａｂの小規模発現を以下のように行った。Ｆａｂライブラリーを形質転換した大腸菌から出発して、コロニーを摘み取って、マスタープレート（寒天ＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％グルコース）および作業プレート（２ｍｌ／ウェル、１．５ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％グルコースを含有する９６ウェル／プレート）の両方に接種した。両方のプレートを３０℃で８〜１２時間増殖させた。マスタープレートを４℃で保存し、そして作業プレート由来の細胞を５０００ｒｐｍでペレットにし、そして１ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋１ｍＭ  ＩＰＴＧに再懸濁してＦａｂの発現を誘導した。３０℃で５時間の発現時間後に遠心分離によって細胞を採取し、次いで、５００μｌの緩衝液ＨＢＳ−Ｐ（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｐ２０）に再懸濁した。１周期の凍結（−８０℃）、次いで３７℃の融解によって、ＨＢＳ−Ｐ再懸濁細胞の溶解を達成した。細胞溶解物を５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、Ｆａｂを含有する上清から細胞破片を分離した。次いで、上清をＢＩＡｃｏｒｅプラズモン共鳴装置に注入して、各Ｆａｂの親和性情報を得た。Ｆａｂを発現するクローンをマスタープレートからレスキューして、ＤＮＡを配列決定し、そして以下に記載するように、大規模Ｆａｂ産生および詳細な性質決定を行った。
【０２０２】
大規模Ｆａｂ調製
詳細な動力学パラメーターを得るため、Ｆａｂを発現させ、そして大規模培養物から精製した。２００ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％グルコースを含有する三角フラスコに、選択したＦａｂ発現大腸菌クローンからの一晩培養物５ｍｌを接種した。１．０のＯＤ５５０ｎｍが達成されるまでクローンを３０℃でインキュベーションし、そして次いで２００ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋１ｍＭ  ＩＰＴＧの培地に交換することによって誘導した。３０℃で５時間発現させた後、遠心分離によって細胞をペレットにし、次いで、１０ｍｌ  ＰＢＳ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。２周期の凍結／融解（それぞれ−８０℃および３７℃）によって、細胞の溶解を達成した。細胞溶解物の上清を、ＰＢＳ、ｐＨ８で平衡化したＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー・セファロース（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）カラム上に装填し、次いで５カラム体積のＰＢＳ、ｐＨ８で洗浄した。個々のＦａｂが、ＰＢＳ（ｐＨ８）＋３００ｍＭイミダゾールを用いて、異なる分画に溶出された。Ｆａｂを含有する分画をプールし、そしてＰＢＳ中で透析し、次いで、親和性性質決定前に、ＥＬＩＳＡによって定量化した。
【０２０３】
全長抗体調製
全長抗体を発現するため、重鎖および軽鎖の可変領域を哺乳動物発現ベクターにクローニングし、そしてリポフェクタミンを用い、一過性発現のため、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。標準法を用い、プロテインＡを用いて抗体を精製した。
【０２０４】
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ
ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００ＴＭ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）系（ＢＩＡｃｏｒｅ，  ＩＮＣ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、抗ｔｒｋＣ  Ｆａｂおよびモノクローナル抗体の親和性を決定した。供給者の指示にしたがって、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いてＣＭ５チップを活性化した。ヒトまたはラットのｔｒｋＣ−Ｆｃ融合タンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０に希釈し、そして０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度で活性化チップ上に注入した。個々のチップチャネルを渡る多様なフロー時間を用いて、２つの範囲の抗原密度：詳細な動力学研究用の２００〜４００応答単位（ＲＵ）およびスクリーニングアッセイ用の５００〜１０００ＲＵを達成した。チップをエタノールアミンでブロッキングした。再生研究によって、Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液（製品番号２１００４、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、イリノイ州ロックフォード）および４Ｍ  ＮａＣｌ（２：１）の混合物は、結合したＦａｂを有効に除去しながら、２００回の注入に渡って、チップ上のｈｔｒｋＣ活性を維持することが示された。すべてのＢＩＡｃｏｒｅアッセイに関して、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）をランニング緩衝液として用いた。精製Ｆａｂ試料の連続希釈（０．１〜１０ｘ概算ＫＤ）を１００μｌ／分で１分間注入し、そして２時間までの解離時間を許容する。既知の濃度のＦａｂ（アミノ酸解析によって決定）を標準として用いて、ＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、Ｆａｂタンパク質の濃度を決定する。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いて、データを１：１ラングミュア結合モデルに適合させることによって（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，  Ｒ．  Ｒｏｏｓ，  Ｈ．  Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，  Ｌ．  Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，  Ｂ．（１９９４）．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６．９９−１１０）、動力学会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を同時に得る。ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして、平衡解離定数（ＫＤ）値を計算する。
【０２０５】
スクリーニングアッセイ
スクリーニングＢＩＡｃｏｒｅアッセイを最適化して、ライブラリー由来のＦａｂクローンの親和性を決定した。小規模培養溶解物の上清を、５０μｌ／分で２分間注入した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、単一指数関数解離速度（ｋｏｆｆ）の決定に、５分間の解離時間を用いた。確認のため試料を注入し、そしてよりよいｋｏｆｆ値を得るため、４５分間までの解離時間を許容した。改善された（より遅い）ｋｏｆｆ値を示すクローンを大規模に発現させ、そして精製したタンパク質に対して、完全動力学パラメーター、ｋｏｎおよびｋｏｆｆを決定した。該アッセイは、およそ２倍以上の親和性の相違を検出可能であった。
【０２０６】
Ｂ．マウス・モノクローナル抗体２２５６のヒト化および親和性成熟
ヒト化および親和性成熟のため、マウス・モノクローナルｔｒｋＣアゴニスト抗体２２５６を選択した。ＰＴＣ／ＵＳ０１／２０１５３（ＷＯ  ０１／９８３６１  Ａ２）を参照されたい。Ｍａｂ２２５６は、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴を用いて決定した際、およそ６２ｎＭのヒトｔｒｋＣに対する結合親和性を有する。Ｍａｂ２２５６は、ヒトｔｒｋＣを用いたＫＩＲＡアッセイを用いてアッセイした際、およそ４０ｎＭのＥＣ５０を有し、そして本明細書に記載するようなラット三叉ニューロン生存アッセイを用いてアッセイした際、およそ５ｎＭのＥＣ５０を有する。
【０２０７】
マウス・モノクローナルアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体２２５６（「Ｍａｂ  ２２５６」または「２２５６」とも称される）の拡張ＣＤＲを図２に示す（ＣＤＲ  Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａに対応し、これらはこれらのＣＤＲでは１００％一致する。Ｈ１はＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｉａの間の妥協であり、そして両方の定義由来のすべての残基を含む）。図２もまた、ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔのＣＤＲを示す。
【０２０８】
抗体２２５６のヒト化および親和性成熟には、以下のヒト生殖系列アクセプター配列を用いた：ヒト軽鎖アクセプター生殖系列配列Ｏ８（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ６４８５５号）；およびヒト重鎖アクセプター生殖系列配列ＶＨ１−４６（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ０１９４３８号）。ＶＨ１−４６およびＯ８のフレームワーク領域の配列を図１に示す（抗体Ａ５アミノ酸配列の関連において）。アミノ酸番号付けは連続している。以下のヒトＪ配列が、ヒト化抗体に含まれる：（ａ）重鎖：ヒトＪＨ４（ＷＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１４））；および（ｂ）軽鎖：ＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５）。
【０２０９】
本発明者らは、表１に示すＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域置換突然変異を所持する抗体クローンを調製し、そして本明細書に記載するように、ＢＩＡｃｏｒｅ解析を用いてＫＤおよび他の動力学パラメーターを決定した。表１に示す置換突然変異は、以下のように示される：（ａ）フレームワーク領域に関しては：置換突然変異（単数または複数）を軽鎖アクセプター生殖系列配列Ｏ８、またはヒト重鎖アクセプター生殖系列配列ＶＨ１−４６に比較して記載し；そして（ｂ）ＣＤＲ領域に関しては：置換突然変異（単数または複数）をＭａｂ２２５６の対応するＣＤＲ配列に比較して記載する。表２では、突然変異体ＦａｂのヒトｔｒｋＣに対する結合親和性（ＫＤを含む）を決定した。
【０２１０】
表３は、ＢＩＡｃｏｒｅ解析を用いて決定されるような、ラットおよびヒトのｔｒｋＣに対する、Ｆａｂ  Ａ５、Ｆａｂ  ２２５６（親）、および選択される突然変異体の他のクローンの動力学解析の結果を要約する。
【０２１１】
さらなる性質決定のため、抗体Ａ５（クローン１２９（Ｔ８）（Ｈ８ｘＥ１０）（１０Ｂ）（Ａ５）とも称される）を選択した。Ａ５重鎖および軽鎖の可変領域の配列を、配列番号１および配列番号２に示す。ヒトｔｒｋＣに対するＡ５の親和性は、（親抗体２２５６の親和性に対して）２００倍改善され、そしてラットＴｒｋＣに対するＡ５の親和性は１９ｎＭに増加し、この値は、（親抗体２２５６のμＭ範囲の親和性に比較して）動物研究に適している。
【０２１２】
表２．抗体２２５６突然変異体のアミノ酸配列および動力学データ。ＢＩＡｃｏｒｅ解析を用いて、ヒトｔｒｋＣへの結合を試験した。
【０２１３】
【表３】
2007519401.tif 000004
【０２１４】
１＝ＢＩＡｃｏｒｅで決定したｋｏｆｆを用いて、そして２２５６ｋｏｎ＝５Ｅ５  １／Ｍｓを用いて、ＫＤを計算した。
２＝ヒト軽鎖アクセプター生殖系列配列Ｏ８のフレームワーク配列に比較して、置換突然変異体を示す。
【０２１５】
Ｏ８のフレームワーク領域の配列を図１に示す。アミノ酸番号付けは連続している。
３＝ヒト重鎖アクセプター生殖系列配列ＶＨ１−４６のフレームワーク配列に比較して、置換突然変異体を示す。
【０２１６】
ＶＨ１−４６のフレームワーク領域の配列を図１に示す。アミノ酸番号付けは連続している。
表中の「ｍｅｎ」は：ｍｘ１０ｎを意味する。
【０２１７】
表３．抗体２２５６突然変異体の動力学データ。ラットｔｒｋＣに対する結合親和性を試験した。
【０２１８】
【表４】
2007519401.tif 000005
【０２１９】
表中の「ｍＥｎ」は：ｍｘ１０ｎを意味する。
Ｃ．ヒト化し、そして親和性成熟させた抗体Ａ５の性質決定
抗体Ａ５を全長ＩｇＧとして発現させ、そしてＳａｄｉｃｋら，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．（１９９７）２３４：３５４−３６１に記載されるようなＫＩＲＡによって、ヒトＴｒｋＣに対するアゴニスト活性を測定し、そして以下のプロトコルに記載するように行うニューロン生存アッセイによって、ラットＴｒｋＣに対するアゴニスト活性を測定した。図３および図４は、抗体Ａ５がヒトおよびげっ歯類のＴｒｋＣに対して強力なアゴニストであったことを示す。ニューロン生存における、げっ歯類ＴｒｋＣに対してのＡ５に関するＥＣ５０は０．００１ｎＭであり、一方、２２５６に関しては５ｎＭであり、これらの抗体間の親和性の相違とよく一致した。
【０２２０】
別の実験において、ｔｒｋＣ結合親和性に関して本質的に上に記載するようなＢＩＡｃｏｒｅアッセイを用いて、ヒトおよびラットのｔｒｋＡおよびｔｒｋＢに対するＡ５抗体の結合親和性を決定することによって、ｔｒｋＣに対する抗体Ａ５の特異性を試験した。陽性対照（ヒトｔｒｋＡに関しては、抗ヒトｔｒｋＡ抗体を用い；ラットｔｒｋＡに関してはヒトＮＧＦを用い；ヒトｔｒｋＢに関しては抗ヒトｔｒｋＢ抗体を用い；ラットｔｒｋＢに関しては、ヒトＮＴ−４／５を用いた）とは対照的に、ヒトｔｒｋＡ、ラットｒｔｋＡ、ヒトｔｒｋＢ、またはラットｔｒｋＢに対するＡ５の結合は検出されなかった。
【０２２１】
Ｅ１２三叉ラットニューロン生存アッセイ
三叉神経節は、顔領域に神経を分布させる皮膚感覚ニューロンで構成される。これらのニューロンは、神経節形成の初期段階では、ＢＤＮＦおよびＮＴ３に補助され、そしてより後期の段階では、ＮＧＦに補助される。Ｅ１２胚から得た三叉神経節ニューロンは、ＮＴ３に補助され、したがって該神経栄養因子を飽和濃度にしておくと、培養４８時間まで、生存は１００％近い。ＮＴ３の非存在下では、４８時間までに５％未満のニューロンしか生存しない。したがって、Ｅ１２三叉ニューロンの生存は、ＴｒｋＣアゴニスト抗体のアゴニスト活性を評価する感受性アッセイである。
【０２２２】
適切な時期に交尾させた妊娠スプレーグ・ドーリーのメスラットをＣＯ２吸入によって安楽死させた。子宮角を除去し、そして胚段階Ｅ１２の胚を摘出し、そして頭部を除去した。電解によって鋭くしたタングステン針を用いて、三叉神経節を切開した。次いで、神経節をトリプシン処理し、機械的に解離させ、そしてポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンでコーティングした９６ウェルプレート中、定義された血清不含培地中で、ウェルあたり２００〜３００細胞の密度でプレーティングした。用量−反応方式、３つ組で、抗ＴｒｋＣ抗体のアゴニスト活性を評価した。培養４８時間後、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ液体取り扱いワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で行う自動化免疫細胞化学プロトコルに、細胞を供した。プロトコルには、固定（４％ホルムアルデヒド、５％スクロース、ＰＢＳ）、透過化（ＰＢＳ中の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、非特異的結合部位のブロッキング（５％正常ヤギ血清、０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ）、並びにニューロンを検出するための一次抗体および二次抗体との連続インキュベーションが含まれた。確立されたニューロン表現型マーカーであるタンパク質遺伝子産物９．５（ＰＧＰ９．５、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対するウサギ・ポリクローナル抗体を、一次抗体として用いた。培養中に存在する細胞すべての核を標識する核色素Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と一緒に、二次試薬としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いた。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−１／ＧｅｎＩＩ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上で、画像獲得および画像解析を行った。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２の２波長で画像を自動的に獲得し、この際、核がすべてのウェルに存在することから、Ｉｍａｇｅｒの画像に基づくオートフォーカス系のため、参照点として核染色を用いた。適切な対物レンズおよびウェルあたりに画像化する部位数を選択して、各ウェルの全表面をカバーした。抗ＰＧＰ９．５抗体での特異的染色に基づいて、培養４８時間後、各ウェルに存在するニューロンの数を計数するように、自動化画像解析を設定した。画像を注意深く閾値設定し、そして形態、および蛍光強度に基づく選択性フィルターを適用して、ウェルあたりの正確なニューロン数を得た。
【０２２３】
（実施例２）
ピリドキシン誘導性ニューロパシーに対する抗体Ａ５の影響
治療プロトコル。実験開始時に１５０〜２００ｇの体重であった、成体オス・スプレーグ・ドーリーラットに対して、そして認可された研究室動物飼育および使用プロトコルにしたがって、この実験を行った。各治療群に６〜８匹の動物を用いた。注射直前に再蒸留水中１００ｍｇ／ｍｌにしたピリドキシン（ＰＤＸ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を注射することによってニューロパシーを誘導し、そして１日２回８日間、腹腔内注射によって、４００ｍｇ／ｋｇで投与を行った。Ａ５治療動物には、ＰＤＸ治療開始３日前、腹腔内注射によってＡ５（５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、そしてＡ５の最初の用量の１週間後、再び投与した。ベクター治療動物には、中毒開始３日前に、両後肢の足底表面に、ベクターＱＬ２ＨＮＴ３（１ｘ１０９ｐｆｕ／ｍｌ）２５μｌを単回皮下接種した。ベクターＱＬ２ＨＮＴ３は、ＮＴ−３のコード配列を含有する、複製不適合の単純疱疹ウイルスゲノムに基づくベクターであり、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでラット後根神経節の感覚ニューロンに形質導入することが可能であり、そしてこれらのニューロンにおいてＮＴ−３を発現させることが可能である。Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙら，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ５１：１９−２７（２００２）。対照には、未治療動物（対照）および他の治療はまったく受けずにＰＤＸに中毒させた動物（ＰＤＸ）が含まれた。
【０２２４】
電気生理学的測定値。ピリドキシンの最初の用量の１５日後に、標準的臨床筋電図装置（Ｖｉｋｉｎｇ  ＩＩ、Ｎｉｃｏｌｅｔ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ウィスコンシン州マディソン）およびガラス針電極を用いて、すべての記録を行った。抱水クロラール（４００ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）を用いてラットを麻酔し、体の長軸に対して後肢を３０〜４５度の角度に固定し、皮下温度を３６〜３７℃に維持し、そして接地電極を尾に挿入した。記録電極を腓腹筋に挿入して、坐骨神経の運動神経伝導速度および振幅を決定した。坐骨切痕またはひざ近位に刺激電極対を置き、そして参照−記録電極対を後肢の第五指に皮下挿入した。潜伏期および振幅の両方を決定し、そして伝導速度を計算した。坐骨切痕を刺激し、そして第五指近位に置いたクリップ電極から記録した後、Ｈ波を記録した。少なくとも８つの反応を得て、そして最大Ｈ波振幅を決定した。感覚神経記録のため、坐骨切痕に置いた電極を記録電極として用い；刺激電極をかかとに置き、そして参照電極を第一指に置いた。行った多数の事後解析にボンフェローニの補正を行い、分散分析（ＡＮＯＶＡ）（Ｓｙｓｔａｔ  ９）によって、群間の相違の統計的有意性を決定した。
【０２２５】
ニューロパシーの行動評価。自己受容機能を評価するため、長さ１８５ｃｍの３ｃｍ直径の細い棒を渡るように、中毒前にラットを訓練しておいた。棒の全長に渡って、幅０．６ｃｍの黒い線１対を、中央から１．０５ｃｍ側面に、各側に描いた。ＰＤＸ中毒完了の８日後、各ラットに横材（ｂｅａｍ）を渡らせる試験を５回行った。記録したビデオテープを低速で再生して、スコア線に比較した足（中足指節関節）の配置、および棒からスリップした回数を数えた。行った多数の事後解析にボンフェローニの補正を行い、ＡＮＯＶＡ（Ｓｙｓｔａｔ  ９）によって、群間の相違の統計的有意性を決定した。
【０２２６】
電気生理学によって測定した、抗体Ａ５によるニューロパシーに対する保護。図５Ａおよび図５Ｂに示すように、誘発された感覚神経活動電位の測定によって、対照と比較して、ＰＤＸに中毒させたラットでは、振幅に顕著な減少が生じ、そして足の感覚神経伝導速度の遅延が生じることが明らかになった。感覚神経振幅は、対照動物の１６．２±１μＶからＰＤＸ中毒動物の６．８±０．６μＶに減少し（Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）、そして伝導速度は２３．６ｍ／秒から１９．３ｍ／秒に減少した（Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）。ＰＤＸに中毒させる３日前に、ＱＬ２ＨＮＴ３を形質導入した動物では、感覚神経振幅は、１６．１±２．４μＶであった（ＰＤＸのみに比較してＰ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）。Ａ５で治療した動物は、ＰＤＸ群に比較して、感覚神経振幅の有意な保持を示した（１１．９±３μＶ、Ｐ＜０．００５、ＡＮＯＶＡ）。同様に、ＰＤＸに中毒させたＱＬ２ＨＮＴ３治療動物は、対照と同一の感覚神経伝導速度（２３ｍ／秒）を有した（ＰＤＸのみに比較してＰ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）。Ａ５で治療したＰＤＸ中毒動物は、ＰＤＸ治療群と有意には異ならない感覚神経伝導速度（２１．１ｍ／秒）を有した。図５Ｃに示すように、Ｈ反射は、対照に比較して、ＰＤＸを投与したラットでひどく減弱した一方、先に報告されたように、直接Ｍ反応は減弱しなかった。ＰＤＸに中毒させた動物は、検出可能なＨ反射を本質的に示さなかった。ＰＤＸに中毒させ、そしてＱＬ２ＨＮＴ３で治療した動物は、Ｈ波の実質的だが不完全な保持を示す（１．８４±０．８ｍＶ、Ｐ＜０．００１  ＰＤＸのみに比較してＰＤＸ＋ＱＬ２ＨＮＴ３、ＡＮＯＶＡ）。ＰＤＸに中毒させＡ５で治療した動物は、Ｈ波のある程度の保持を示した（０．６±０．５ｍＶ）が、相違はＰＤＸ中毒群に比較して有意ではなかった。
【０２２７】
行動能力によって測定した、抗体Ａ５による、ニューロパシーに対する保護。自己受容感覚機能を試験するため、３．０ｃｍ直径の横材上を歩くように、ＰＤＸ中毒前にラットを訓練しておき、そしてＰＤＸ治療完了７日後（治療開始１５日後であり、そしてベクターまたは最初の抗体接種の１８日後）、同じ横材上で試験した。図５Ｄに示すとおり、対照動物は、スコア線より下にスリップすることがなかったことに示されるように、横材を渡る際に困難はまったくなかった。ＰＤＸに中毒させた動物は、かなりの困難を示し、試験期間中、平均１６回、横材からスリップした。ＰＤＸ中毒３日前にＱＬ２ＨＮＴ３を形質導入したラットは、定性的および定量的両方で、ＰＤＸのみの動物より、実質的に優れた能力を示した。ＱＬ２ＨＮＴ３で治療した動物は、平均３回のスリップ（ＰＤＸのみに比較してＰ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）を記録した。Ａ５を投与した動物は、試験期間中、棒から平均６．５回スリップし、この相違は統計的に有意であったが、ベクター治療ＰＤＸ中毒動物より度合いが小さかった（ＰＤＸのみに比較してＰ＜０．００１）。
【０２２８】
（実施例３）
シスプラチン誘導性ニューロパシーに対する抗体Ａ５の影響
治療プロトコル。実験開始時体重１８０〜２００ｇのメス・ウィスターラット（Ｈａｒｌａｎ、イタリア・コッレッツァーナ）に対して実験を行った。コンピュータが生成するランダム選択によって、動物を異なる群に分け、そして各治療群に対して８匹の動物を用いた。週２回４週間の２ｍｇ／ｋｇシスプラチン（ＣＤＤＰ）（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒ  Ｓｑｕｉｂｂｓ、無菌生理食塩水中０．５ｍｇ／ｍｌ）腹腔内（ｉｐ）注射によって、ニューロパシーを誘導した。第１群の動物（対照）は未治療であった。第２群の動物には、週２回４週間２ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰをｉｐ注射した。第３群の動物には、週２回４週間２ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰをｉｐ注射し、そして７日ごとに２ｍｇ／ｋｇの抗体２２５６を皮下（ｓｃ）注射した。第４群の動物には、週２回４週間２ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰをｉｐ注射し、そして７日ごとに１０ｍｇ／ｋｇの抗体２２５６を皮下注射した。第５群の動物には、週２回４週間２ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰをｉｐ注射し、そして７日ごとに２ｍｇ／ｋｇの抗体Ａ５を皮下注射した。第６群の動物には、週２回４週間２ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰをｉｐ注射し、そして７日ごとに１０ｍｇ／ｋｇの抗体Ａ５を皮下注射した。
【０２２９】
神経生理学的測定。実験開始前および治療期間（４週間）終了時に、各動物に、尾の感覚神経伝導速度の測定を行った。これらの方法は、Ｐｉｓａｎｏら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９：５７５６−６７（２００３）；およびＴｒｅｄｉｃｉら，  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １５９：５５１−８（１９９９）に記載される。簡潔には、尾の遠位に記録環電極を置き、一方、刺激環電極を記録点に対して５ｃｍおよび１０ｃｍ近位に置くことによって、尾部神経の逆行性神経伝導速度を評価した。神経刺激後、２部位で記録される電位の潜伏期間を測定し（ピークからピーク）、そしてそれによって神経伝導速度を計算した。動物飼育室に隣接した温度管理室において、標準的条件下で、すべての神経生理学的決定を行った。分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキー・クレーマー事後検定を用いて、実験期間中、異なる群で得た神経伝導速度の相違を統計的に評価した（有意レベルをｐ＜０．０５に設定）。
【０２３０】
病状決定。治療期間（４週間）終了時、各群の４匹のラットから、研究部位の坐骨神経および後根神経節標本を得て、そしてＴｒｅｄｉｃｉら，  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １５９：５５１−８（１９９９）に記載されるように病理検査を行った。
【０２３１】
シスプラチン誘導性ニューロパシーに対するＡ５の影響。図６および以下の表４に示すように、ＣＤＤＰ注射は、対照群に比較した際、約３０％、尾部神経伝導速度を有意に（Ｐ＜０．００１）減少させた。２ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの両方で、抗体Ａ５は、尾部神経伝導速度を有意に改善した。ＣＤＤＰ投与によって、先に記載されるように、対照群に比較して、ＤＲＧニューロンの体細胞サイズ、核サイズおよび核小体面積に関して、有意な形態学的変化が誘導された。Ｐｉｓａｎｏら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９：５７５６−６７（２００３）；およびＴｒｅｄｉｃｉら，  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １５９：５５１−８（１９９９）。しかし、ＤＲＧニューロンの体細胞サイズ、核サイズ、または核小体面積に関して、ＣＤＤＰ注射ラットに比較して、２２５６またはＡ５で治療したＣＤＤＰ注射ラットでは、有意な変化は観察されなかった。
【０２３２】
表４．異なる治療群における尾部神経伝導速度の要約
【０２３３】
【表５】
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【０２３４】
統計分析には、一方向ＡＮＯＶＡ（テューキー事後検定）を用いた。
生物学的物質の寄託
以下の物質をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ，  ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した：
【０２３５】
【表６】
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【０２３６】
ベクターＥｂ．ｐｕｒ．２２５６．Ａ５は、Ａ５軽鎖可変領域およびヒト軽鎖カッパ定常領域をコードするポリヌクレオチドであり；そしてベクターＤｂ．２２５６．Ａ５は、Ａ５重鎖可変領域、および以下の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（アミノ酸番号付けは野生型ＩｇＧ２ａ配列に準拠している；Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４を参照されたい）を含有する、ヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域をコードするポリヌクレオチドである。
【０２３７】
特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびそれに従う規制（ブダペスト条約）の条件下で、この寄託を行った。これによって、生存培養物の寄託日から３０年間の寄託の維持が保証される。ブダペスト条約の条件下で、ＡＴＣＣによって寄託物が入手可能になり、そして寄託がＲｉｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．およびＡＴＣＣの間の合意下にあり、これによって、関連する米国特許の発行、あるいは米国または外国の特許出願いずれかの公共公開の、いずれが先であっても、これに際して、寄託培養物子孫が、永続的に、そして制限されずに公共に入手可能であることが保証され、そして３５ＵＳＣ  １２２条およびそれに準拠する長官規則（８８６  ＯＧ  ６３８に特に関連して、３７ＣＦＲ  １．１４条を含む）にしたがって、米国特許庁長官によって資格があると決定された者に、子孫が入手可能になることが保証される。
【０２３８】
本出願の譲受人は、寄託される物質の培養物が、適切な条件下で培養されている際に死ぬか、または失われるか、または破壊された場合、告示に際してこれを別の同じものとすみやかに交換することに合意している。寄託物質が入手可能であることは、いずれかの政府の権威の下に特許法にしたがって授与される権利に違反して、本発明を実施するライセンスと見なされるものではない。
【０２３９】
抗体配列
【０２４０】
【化１−１】
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【０２４１】
【化１−２】
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【０２４２】
【化１−３】
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【０２４３】
【化１−４】
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【０２４４】
本明細書記載の実施例および態様は、例示目的のみのためであり、そしてその観点から、多様な修飾または変化が当業者に示唆され、そしてこれらは本出願の精神および範囲内に含まれると理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】図１Ａ：Ａ５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（Ａ５−Ｈと標示）。拡張ＣＤＲを囲み、そしてＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲおよびＫａｂａｔ  ＣＤＲを、それぞれ斜字および太字で示す。可変領域アミノ酸残基を連続して番号付けする。図１Ｂ：Ａ５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（Ａ５−Ｌと標示）。拡張ＣＤＲを囲み、そしてＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲおよびＫａｂａｔ  ＣＤＲを、それぞれ斜字および太字で示す。可変領域アミノ酸残基を連続して番号付けする。
【図２】図２Ａ：マウス・モノクローナルアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体２２５６の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（２２５６Ｈと標示）。拡張ＣＤＲを囲み、そしてＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲおよびＫａｂａｔ  ＣＤＲを、それぞれ斜字および太字で示す。可変領域アミノ酸残基を連続して番号付けする。図２Ｂ：マウス・モノクローナルアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体２２５６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（２２５６Ｌと標示）。拡張ＣＤＲを囲み、そしてＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲおよびＫａｂａｔ  ＣＤＲを、それぞれ斜字および太字で示す。可変領域アミノ酸残基を連続して番号付けする。
【図３】図３：ラットＥ２０三叉神経ニューロン生存アッセイにおける、マウス・モノクローナルアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体２２５６および抗体Ａ５のアゴニスト活性を示すグラフである。
【図４】図４：ＫＩＲＡを用いてアッセイした際の、マウス・モノクローナルアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体２２５６および抗体Ａ５の活性を比較するグラフである。
【図５Ａ】図５Ａ：対照、ＰＤＸ、ＰＤＸ＋ＱＬ２ＨＮＴ３、およびＰＤＸ＋Ａ５治療動物で測定した感覚神経振幅を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂ：対照、ＰＤＸ、ＰＤＸ＋ＱＬ２ＨＮＴ３、およびＰＤＸ＋Ａ５治療動物で測定した感覚神経伝導速度を示すグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃ：対照、ＰＤＸ、ＰＤＸ＋ＱＬ２ＨＮＴ３、およびＰＤＸ＋Ａ５治療動物で測定したＨ波を示すグラフである。
【図５Ｄ】図５Ｄ：対照、ＰＤＸ、ＰＤＸ＋ＱＬ２ＨＮＴ３、およびＰＤＸ＋Ａ５治療動物で測定したスリップ数を示すグラフである。
【図６】図６：対照、ＣＤＤＰ、ＣＤＤＰ＋２２５６（２ｍｇ／ｋｇ）、ＣＤＤＰ＋２２５６（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＤＤＰ＋Ａ５（２ｍｇ／ｋｇ）、およびＣＤＤＰ＋Ａ５（１０ｍｇ／ｋｇ）治療動物で測定した尾部神経伝導速度を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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