(57)【要約】  活性シナプスを可視化する方法であって、前記方法が、（ａ）活性シナプスを形成する細胞を、少なくとも破傷風毒素のＣ断片およびリポータータンパク質を含むバイオマーカーに暴露するステップと、（ｂ）当該バイオマーカーを可視化するステップとを含み、ここで細胞の樹状突起棘へのバイオマーカーの蓄積により活性シナプスの可視化が可能になる方法を提供する。また、シナプス活性をモジュレーションすることが可能な分子をスクリーニングする方法も提供する。神経変性疾患の早期診断に有用なキットは、少なくとも破傷風毒素のＣ断片およびリポータータンパク質を含むバイオマーカーを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性シナプスを可視化する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記活性シナプスを形成している細胞を、破傷風毒素の少なくともＣ断片およびリポータータンパク質を含むバイオマーカーにさらすこと；そして
（ｂ）前記バイオマーカーを可視化すること；
を含み、ここで、前記細胞の樹状突起棘に前記バイオマーカーが蓄積することにより、活性シナプスの可視化が可能となる、前記方法。
【請求項２】
前記細胞は、前記細胞がさらされた前記バイオマーカーを発現することができる、請求項１の方法。
【請求項３】
前記細胞を、ステップ（ａ）で前記細胞がさらされたバイオマーカーを前記細胞において発現できる核酸配列でトランスフェクションする予備ステップをさらに含む、請求項２の方法。
【請求項４】
前記方法は、インビボの方法である、請求項１の方法。
【請求項５】
前記方法は、インビボの方法であり、前記細胞は、非ヒトトランスジェニック動物の細胞である、請求項２の方法。
【請求項６】
前記方法は、神経ネットワークを可視化することを含む、請求項１の方法。
【請求項７】
シナプス活性をモジュレーションできる分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記活性シナプスを形成している細胞を、破傷風毒素の少なくともＣ断片およびリポータータンパク質を含むバイオマーカーにさらすこと；そして
（ｂ）前記バイオマーカーを可視化すること；
を含み、ここで、前記細胞の樹状突起棘に前記バイオマーカーが蓄積することにより、活性シナプスの可視化が可能となり；
ここで、前記細胞をさらに、ステップ（ａ）でスクリーニングすべき前記分子にさらし、前記細胞の樹状突起棘への前記バイオマーカーの含量のモジュレーションが、シナプス活性をモジュレーションできる分子の指標となる、前記方法。
【請求項８】
神経変性疾患の早期診断法であって、前記方法は、
（ａ）前記活性シナプスを形成している細胞を、破傷風毒素の少なくともＣ断片およびリポータータンパク質を含むバイオマーカーにさらすこと；そして
（ｂ）前記バイオマーカーを可視化すること；
を含み、ここで、前記細胞の樹状突起棘に前記バイオマーカーが蓄積することにより、活性シナプスの可視化が可能となり；
ここで、前記細胞は、神経変性疾患の疑われる患者のものである、前記方法。
【請求項９】
神経変性疾患の早期診断のためのキットであって、前記キットは、破傷風毒素の少なくともＣ断片およびリポータータンパク質を含むバイオマーカーを含む、前記キット。
【請求項１０】
ニューロンにおける、破傷風毒素または破傷風毒素のＣ断片を含む融合タンパク質の輸送をモジュレーションする方法であって、前記方法は、前記ニューロンに、破傷風毒素または融合タンパク質のニューロン輸送をモジュレーションするに十分な神経栄養因子を投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、組成物を、ヒトまたは動物の中枢神経系に送達するための、破傷風毒素の一部分の使用に関する。本発明はまた、破傷風毒素のハイブリッド断片、天然破傷風毒素とハイブリダイズするポリヌクレオチド、および活性分子として破傷風毒素断片を含む組成物に関する。さらに、本発明は、プロモーターと、破傷風毒素断片をコードする核酸配列とを含むベクターに関する。さらに、本発明は、破傷風毒素断片の使用法にも関する。
【０００２】
破傷風毒素は、プロテアーゼ感受性ループにより接続された３個の５０ｋＤドメインからなる１５０ｋＤの不活性で一本のポリペプチド鎖として、Clostridium tetaniにより産生される。該毒素は、選択的なタンパク質分解切断時に活性化され、これにより、２個のジスルフィド結合鎖：Ｌ（軽鎖、５０ｋＤ）およびＨ（重鎖、１００ｋＤ）が生じる［Montecucco C.およびSchiavo G.Q.Rev.Biophys.,(1995), 28: 423-472］。
【０００３】
中枢神経系（ＣＮＳ）への破傷風毒素の逆行性軸索輸送の証拠が、Erdmannら、［Naunyn Schmiedebergs Arch Phamacol.,(1975), 290: 357-373］、Priceら［Science,(1975), 188: 945-94］、およびStoeckelら［Brain Res.,(1975), 99: 1-16］により記載されている。これらの各研究において、放射標識された毒素は、膜結合小胞内に見出された。別の特性は、破傷風毒素の経シナプス移動であり、これは、最初に、１２５Ｉ標識破傷風毒素を筋肉中に注射した後、オートラジオグラフィーによりそれが脊髄介在ニューロンに局在することにより実証された［SchwabおよびThoenen, Brain Res.,(1976), 105: 218-227］。
【０００４】
この破傷風毒素の構造は、Heltingら［J.Biol.Chem.,(1977), 252: 187-193］により解明された。パパインにより、破傷風毒素を２個の断片に切断する：
−Ｃ断片とも呼ばれる、４５１アミノ酸の、重鎖のＣ末端部；および
−他の部分は、ジスルフィド結合を介して軽鎖（Ａ断片）に連結したＢ断片と呼ばれる補足的な部分を含んでいた。
【０００５】
欧州特許第ＥＰ００３０４９６Ｂ１号は、ＣＮＳへの断片Ｂ−ＩＩｂの逆行性輸送を示し、眼の筋肉の中央部分に注射した後に一次および二次ニューロンに検出された。この断片は、クロストリジウムによるタンパク質分解により得られる「イソ断片」からなっていてもよい。後に、この断片Ｂ−ＩＩｂは、Eiselら［EMBO J., 1986, 5: 2495-2502］によるパパイン消化により得られるＣ断片と同一であることが実証された。
【０００６】
このＥＰ特許はまた、ジスルフィド結合によりＢ−ＩＩｂに結合したＩｂｃ破傷風毒素断片からなるコンジュゲートが、筋肉内の軸索終末から、運動ニューロン周核体および細胞周囲空間へと逆行性輸送されることを実証した。（Ｉｂｃ断片は、Heltingらにより先に記載されたパパイン消化により得られた他の部分に相当する）。このコンジュゲートが二次ニューロンに見出されたという証拠は全くない。著者らは、ジスルフィド結合により治療薬に結合した断片Ｂ−ＩＩｂからなるコンジュゲートは、ガングリオシドおよびシナプス膜に特異的に固定できることを示した。このようなコンジュゲートの逆行性軸索輸送または経シナプス輸送を示した結果は全くない。
【０００７】
別の欧州特許第ＥＰ００５７１４０Ｂ１号は、同じように、ＣＮＳへの断片ＩＩｃの逆行性輸送を示した。欧州特許第ＥＰ００３０４９６Ｂ１号と同様に、著者らは、断片ＩＩｃと治療薬からなるコンジュゲートは、特異的な固定はできることを示したが、このような主張を例証した結果はなかった。この断片ＩＩｃは、パパイン消化により得られた今回ここでＣ断片と呼ばれているものに相当する。
【０００８】
Francisら［J.Biol.Chem.,(1995), 270(25): 15434-15442］は、遺伝子組換えによるＳＯＤ−１（Cu Znスーパーオキシドジスムターゼ）と組換えＣ破傷風毒素断片の間のハイブリッドのニューロンによる内部移行を示したインビトロでの研究を行なった。この組換えＣ破傷風毒素断片は、Halpernグループから入手した（文献１１参照）。
【０００９】
さらに、Kuypers H.G.J.M.およびUgolini G.［TINS,(1990), 13(2): 71-75］は、経ニューロントレーサーとしてのウイルスの関与するその刊行物において、破傷風毒素断片はニューロン膜上の特異的受容体に結合するという事実にも関わらず、経ニューロン標識は比較的弱く、いくつかのシナプス接続ニューロンでしか検出できないことを示した。
【００１０】
当該技術分野におけるこうした進歩にも関わらず、ヒトまたは動物の中枢神経系に組成物を送達するための方法が依然として必要である。また、当該技術分野において、この結果を達成できる生物学的物質も必要である。
【００１１】
さらに、ニューロン結合性およびシナプス可塑性の活性依存的な改変は、神経系の発達および機能に重要な役割を果たす。近年、新しい光学検出可能な遺伝子的ツールの工学操作により、このような改変を追跡することに多大なる努力が向けられてきた。例えば、ＬａｃＺまたはＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などのリポーター遺伝子と融合させた破傷風毒素の無毒性Ｃ末端断片（またはＴＴＣ断片）は、ハイブリッドタンパク質を直接注入した後（Coenら、1997）、または、マウスで導入遺伝子として発現させた場合に（Maskosら、2002）、限られた神経ネットワーク内で逆行的に経シナプス的に追跡することができる。神経筋接合部（ＮＭＪ）におけるβｇａｌ−ＴＴＣクラスター形成動態は、シナプス前ニューロン活性に強く依存し、おそらく、急速なエンドサイトーシス経路が関与する（Miana-Menaら、2002）。ニューロン活性は、シナプスにおける様々な分子の分泌および／または作用を増強することにより、ＮＭＪにおけるこのクラスター形成および内部移行を誘導する可能性がある。
【００１２】
過去十年間にわたり、様々なデータにより、構造的かつ機能的に関連したタンパク質のファミリーであるニューロトロフィン（例えば、ＮＧＦ（神経成長因子）；ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）；ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）およびニューロトロフィン４（ＮＴ−４）が挙げられる）は、ニューロン生存延長および形態学的分化を促進するだけでなく、中枢シナプスにおけるシナプスの伝達および結合性を強く改変する可能性があり、したがって、ニューロン活性およびシナプス可塑性の間の連関がもたらされる（McAllisterら、1999；Poo, 2001；TaoおよびPoo, 2001）。運動神経と骨格筋細胞の間の神経伝達におけるこれらの因子の役割は、アフリカツメガエル神経筋肉同時培養研究を使用して研究され、ここで、これらの培養液を、外来性ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４で処理すると、神経伝達物質分泌を増強することによりシナプス伝達の増加がもたらされる（Lohofら、1993；StoopおよびPoo, 1996；WangおよびPoo, 1997）。さらに、筋肉でのＮＴ−３およびＮＴ−４の発現（Funakoshiら、1995；Xieら、1997）並びにＮＴ−４分泌（WangおよびPoo, 1997）は、電気活性により調節される。したがって、このファミリーのタンパク質は、電気ニューロン活性とシナプス変化の間の分子的連関を提供する。
【００１３】
ニューロトロフィンの細胞性作用は、次の２種類の受容体により仲介される：ｐ７５ＮＴＲ受容体（主に初期神経発達中に発現される）およびＴｒｋチロシンキナーゼ受容体（Bothwell, 1995）。ニューロトロフィンとＴｒｋ受容体との相互作用は特異的である。ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣは、ＢＤＮＦ／ＮＴ−４およびＮＴ−３によりそれぞれ活性化され、運動ニューロンにより発現される。感覚ニューロンにより発現されるＴｒｋＡは、ＮＧＦにより活性化される。近年、培養運動ニューロンにおけるＴＴＣとニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲの間の共輸送（LalliおよびSchiavo, 2002）、並びに、破傷風毒素およびＴＴＣ断片による、培養皮質ニューロンのＴｒｋ受容体の関与する細胞内経路の活性化（Gilら、2003）の証拠が報告された。
【００１４】
当該技術分野における知見にも関わらず、破傷風毒素または破傷風毒素Ｃ断片を含む融合タンパク質のニューロン輸送をモジュレーションするために、インビボでのＮＭＪにおけるＴＴＣ輸送に対するニューロトロフィンおよび他の神経栄養因子の影響を解明する必要性、そして、これらのニューロトロフィンおよび神経栄養因子並びにそのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用するための方法を開発する必要性が依然としてある。
【００１５】
現在までは、活性シナプスは、パッチニューロンの電気生理的記録を使用して、その電気的特性により特徴づけられることが多かった。したがって、異なる溶液に対する細胞の電気的応答に応じて、活性シナプス、および、シナプス前もしくはシナプス後終末に特異的な膜受容体の活性を間接的に研究することが可能である。しかし、複雑なニューロンネットワーク中の活性シナプスの直接的な可視化は、これらのニューロン構造に特異的に向かうおよび／または蓄積する生物学的マーカーがないことから、現在まで表現しにくかった。
【００１６】
スチリル色素の近年の開発により、活発に発火しているニューロンを同定し、かつ、多種多様の種における活性依存的な小胞のサイクル機序を調べるのに優れた試薬である限り、機能的シナプスを研究し得る方法に革新がもたらされた。したがって、神経伝達物質を活発に放出しているニューロンにおいて、これらの色素は、再利用されるシナプス小胞内に内部移行し、神経終末は明るく染色される（Cochilla, 1999）。それにも関わらず、これらの分子の非タンパク質性およびそれらが与える一過性標識は、長期シナプス活性および再構築を研究しようとした場合には困難な警告を提示する。さらに、脳薄片または無傷動物に提示されるような、より生理的に関連性のあるネットワークをスチリル色素で染色することは、スルホローダミンまたは他の蛍光消光試薬を添加することにより、特異的蛍光シグナルは保持しつつ、非特異的なバックグラウンド蛍光の低減を必要とするために、困難であることが判明した（Pyle, 1999）。
【００１７】
発明の概要
本発明は、当該技術分野におけるこれらの必要性を充足する手助けをする。より特定すると、本発明は、活性シナプスを可視化する方法を提供し、（ａ）該活性シナプスを形成している細胞を、破傷風毒素の少なくともＣ断片およびリポータータンパク質を含むバイオマーカーにさらすこと；および（ｂ）該バイオマーカーを可視化することを含み、ここで、細胞の樹状突起棘へのバイオマーカーの蓄積により、活性シナプスを可視化することが可能となる。好ましくは、該細胞は、該細胞がさらされたバイオマーカーを発現することができる。
【００１８】
本発明の１つの実施形態は、該細胞を、ステップ（ａ）で該細胞がさらされた該バイオマーカーを該細胞において発現できる核酸配列でトランスフェクトする予備ステップを含む。
【００１９】
１つの実施形態において、該バイオマーカーは、破傷風毒素のＣ断片およびリポータータンパク質からなる。別の実施形態において、該バイオマーカーは、融合タンパク質ＧＦＰ−ＴＴＣである。
【００２０】
本発明の方法は、インビボでの方法であってもよい。インビボでの方法において、該細胞は、非ヒトトランスジェニック動物の細胞であってもよい。該方法はまた、インビトロでの実験でも使用できる。
【００２１】
本発明の方法は、ニューロンネットワークを可視化するのに特に適している。
【００２２】
本発明はまた、シナプス活性をモジュレーションできる分子をスクリーニングする方法も提供する。該方法は、（ａ）活性シナプスを形成している細胞を、破傷風毒素の少なくともＣ断片およびリポータータンパク質を含むバイオマーカーにさらすこと；および（ｂ）該バイオマーカーを可視化すること；を含み、ここで、該細胞の樹状突起棘への該バイオマーカーの蓄積により活性シナプスの可視化が可能となり；ここで、該細胞をさらに、ステップ（ａ）でスクリーニングすべき分子にさらし、該細胞の樹状突起棘へのバイオマーカーの含量のモジュレーションは、シナプス活性をモジュレーションできる分子の指標となる。
【００２３】
「モジュレーション」または「モジュレーションしている」なる語句は、特定の反応または活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして化合物が作用できることを意味する。それ故、これらの語句は、「増加」および「減少」なる語句を包含する。例えば、「増加」なる語句は、例えば本発明の方法により可視化された、シナプス活性の増加を意味する。同様に、例えば「減少」なる語句は、例えば、本発明の方法により可視化されたシナプス活性の減少を意味する。
【００２４】
さらに、本発明は、神経変性疾患の早期診断法を提供し、該方法は、（ａ）活性シナプスを形成している細胞を、破傷風毒素の少なくともＣ断片およびリポータータンパク質を含むバイオマーカーにさらすこと；および（ｂ）該バイオマーカーを可視化すること；を含み、ここで、該細胞の樹状突起棘へのバイオマーマーの蓄積により、活性シナプスの可視化が可能となり、ここでの該細胞は、神経変性疾患の疑われる患者の細胞である。
【００２５】
この方法において、健康な患者の樹状突起棘へのバイオマーカーの蓄積と比べて変化した樹状突起棘へのバイオマーカーの蓄積により、神経変性疾患の早期診断が可能となる。したがって、該方法は、場合により、患者の樹状突起棘へのバイオマーカーの蓄積を、健康（対照）個体の樹状突起棘へのバイオマーカーの蓄積と比較するステップ（ｃ）を含む。
【００２６】
本発明は、神経変性疾患の早期診断のためのキットを提供し、ここでの該キットは、破傷風毒素の少なくともＣ断片とリポータータンパク質を含む、バイオマーカーを含む。
【００２７】
さらに、本発明は、バイオマーカーの順行性輸送を検出する方法も提供する。該方法は、バイオマーカーを含む皮質ニューロンを含む解離皮質細胞を提供し、皮質ニューロンからのバイオマーカーの消失によるバイオマーカーの順行性輸送を検出することを含む。この方法を使用して、シナプス後ニューロンからシナプス前ニューロンへのバイオマーカーの輸送を検出することが可能である。
【００２８】
本発明は、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）に所望の組成物をインビボで送達する方法を利用し、ここで、該組成物は、破傷風毒素（ＴＴ）の無毒性タンパク質分解断片を、生物学的機能を有する少なくとも１分子と共に含む。該組成物は、インビボでＣＮＳへの逆行性輸送および経シナプス輸送を行なうことができ、ＣＮＳの様々な領域に送達されることができる。
【００２９】
本発明は、神経筋接合部および少なくとも１箇所のシナプスを通ってタンパク質、ペプチド、またはポリヌクレオチドをインビボで移行させることのできる、Ｃ断片およびＢ断片または少なくとも１１アミノ酸残基のその一部を含む破傷風毒素のハイブリッド断片、あるいは、Ｃ断片およびＢ断片または少なくとも１１アミノ酸残基のその一部およびアミノ酸２２５〜２４５の鎖の中心部に位置する亜鉛結合モチーフを有するタンパク質分解ドメインに相当するその毒性活性の欠失したＡ断片の一部を含むハイブリッド断片を提供する。
【００３０】
生物学的機能を有するタンパク質は、リポータータンパク質であってもよい。さらに、ＴＴＣに連結したリポータータンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）、ＤｓＲｅｄ（および変種）、ＨｃＲｅｄ、ＣＦＰ（および変種）、ＹＦＰ（および変種）、エクオリン−ＧＦＰタンパク質（リンカーを含むまたは含まない）などの、どのような生物発光タンパク質であってもよい。
【００３１】
さらに、本発明は、ニューロンにおいて、破傷風毒素、または、破傷風毒素のＣ断片を含む融合タンパク質の輸送をモジュレーションする方法を提供し、ここで、該方法は、ニューロンに、破傷風毒素または融合タンパク質のニューロン輸送をモジュレーションするのに十分な量の神経栄養因子を投与することを含む。１つの実施形態において、この方法はインビトロで行ない、別の実施形態においてはインビボで行なう。
【００３２】
さらに、本発明は、活性分子を、破傷風毒素（ＴＴ）またはその変種のハイブリッド断片と共に含む、組成物を提供する。該組成物は、ＣＮＳ疾患に罹患した患者または動物の処置に有用であり、これには、本発明の組成物を患者または動物に送達することが含まれる。さらに、本発明の組成物は、ＣＮＳに罹患した患者または動物において免疫応答を誘起するのに有用である可能性があり、これには、本発明の組成物を患者または動物に送達することが含まれる。特定の実施形態において、本発明は、ＣＮＳ疾患に罹患した患者を処置するための薬物の製造における該組成物の使用に関する。
【００３３】
さらに、本発明は、ストリンジェントな条件下で天然破傷風毒素配列とハイブリダイズできるポリヌクレオチド変種断片を提供する。ストリンジェントな条件は、例えば、以下の通りである：６×ＳＳＣ緩衝液、１×デンハート溶液、１％ＳＤＳ、および２５０μｇ／ｍｌのｔＲＮＡの存在下で４２℃で４〜６時間。（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５Ｍクエン酸ナトリウムに相当し、１×デンハート溶液は、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドンおよび０．０２％ウシ血清アルブミンに相当する）。２回の洗浄ステップを室温で０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの存在下で行なう。
【００３４】
ポリヌクレオチド変種断片は、天然破傷風毒素配列に由来し同じ輸送特性を有する、破傷風毒素配列をコードするポリヌクレオチドを意味する。本明細書で使用した「由来」は、例えば、天然破傷風毒素配列と比べて１個または少なくとも１個のヌクレオチド置換を有するポリヌクレオチドを包含し、該ヌクレオチド置換は、保存的、半保存的、または非保存的アミノ酸置換をもたらす。
【００３５】
さらに、本発明は、筋肉細胞において発現できるプロモーターおよび場合によりエンハンサー、本発明の破傷風毒素断片をコードする核酸配列、または、対象のタンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連した本発明のアミノ酸変種断片を含む、ベクターを提供する。本発明の好ましい実施形態において、該プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであってもよく、好ましくは、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、参考番号Ｖ７９０〜２０）に含まれるＣＭＶプロモーター、またはBronson S.V.ら（PNAS, 1996,93: 9067-9072）に記載のプロモーターβアクチンである。
【００３６】
さらに、本発明は、ニューロン細胞または前駆体（例えば、ストラタジーン参照番号２０４１０１のＮＴ２（ｈＮＴ）前駆細胞）において発現できるプロモーターおよび場合によりエンハンサー、本発明の破傷風毒素断片をコードする核酸配列、または、対象のタンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連した本発明のアミノ酸変種断片を含む、ベクターを提供する。本発明の好ましい実施形態において、該プロモーターは、βアクチンであってもよい（先の参照文献を参照）。これらのベクターは、本発明のベクターを、患者または動物に送達することを含む、ＣＮＳ疾患に罹患した患者または動物の処置に有用である。さらに、これらのベクターは、患者または動物において免疫応答を誘起するのに有用である。
【００３７】
破傷風毒素断片（断片Ａ、Ｂ、およびＣ）を含む本発明の１つの利点は、断片Ｃに比べて生物内での該断片のより良好な輸送がなされることである。本発明の組成物の別の利点は、十分に画定されたアミノ酸配列が得られ、多量体組成物ではないことである。したがって、遺伝子療法においてこの組成物を容易に操作することができる。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は、破傷風毒素、または、破傷風毒素の断片Ｃを含む融合タンパク質などの神経毒のニューロンにおける輸送をモジュレーションする方法を提供する。これらの方法は、ＢＤＮＦ、ＮＴ−４およびＧＤＮＦなどの神経栄養因子ならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストを投与して、神経筋接合部における神経毒または本発明のＴＴＣ断片を含む融合タンパク質の内部移行をモジュレーションすることを含む。
【００３９】
１つの実施形態において、これらの方法はさらに、ニューロンに、破傷風毒素または融合タンパク質のニューロン輸送をモジュレーションするに十分な量の、ＴｒｋＢ受容体アゴニストまたはＴｒｋＢ受容体アンタゴニストを投与することを含む。「モジュレーション」なる語句およびその同属体は、特定の反応または活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして化合物が作用できることを意味する。それ故、モジュレーションなる語句は、「増加」および「減少」なる語句を包含する。例えば、「増加」なる語句は、モジュレーション化合物の非存在下でのポリペプチドのニューロン輸送と比べて、該モジュレーション化合物の存在下での該ポリペプチドのニューロン輸送の増加を意味する。同様に、「減少」なる語句は、モジュレーション化合物の非存在下でのポリペプチドのニューロン輸送と比べて、該モジュレーション化合物の存在下での該ポリペプチドのニューロン輸送の減少を意味する。ポリペプチドのニューロン輸送は、当該技術分野において一般的に知られている技術により本明細書に記載した通りに測定することができる。
【００４０】
ＴｒｋＢ受容体アゴニストは、ＴｒｋＢ受容体を活性化する神経栄養因子、例えば、脳由来神経栄養因子またはニューロトロフィン４を含む。ＴｒｋＢ受容体アゴニストはまた、ＴｒｋＢ受容体に結合し、それらを活性化する抗体も含み得る。ＴｒｋＢ受容体アゴニストのこれらの使用法は、破傷風毒素または破傷風毒素融合タンパク質のニューロン輸送を増強するための有用な方法を提供する。
【００４１】
ＴｒｋＢ受容体アンタゴニストは、先に記載したような、ＴｒｋＢ受容体アゴニストに結合し、それによりＴｒｋＢ受容体の活性化を減少させる抗体を含む。例えば、これらの抗体は、脳由来神経栄養因子またはニューロトロフィン４などの、ＴｒｋＢ受容体を活性化させる神経栄養因子に指向させることができる。さらに、ＴｒｋＢ受容体アンタゴニストは、ＴｒｋＢ受容体に結合しそれらを不活性化させる抗体も含む。ＴｒｋＢ受容体アゴニストのこれらの使用法は、破傷風毒素または破傷風毒素融合タンパク質のニューロン輸送を減少または妨げる有用な方法を提供する。
【００４２】
別の実施形態において、これらの方法はさらに、ニューロンに、破傷風毒素または融合タンパク質のニューロン輸送をモジュレーションするに十分な量のＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体アゴニストまたはＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体アンタゴニストを投与することを含む。
【００４３】
ＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体アゴニストは、ＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体を活性化させる神経栄養因子、例えば、グリア細胞由来神経栄養因子を含む。ＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体アゴニストはまた、ＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体に結合しそれらを活性化させる抗体も含むことができる。ＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体アゴニストのこれらの使用法は、破傷風毒素または破傷風毒素融合タンパク質のニューロン輸送を増強する有用な方法を提供する。
【００４４】
ＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体アンタゴニストは、先に記載したものなどの、ＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体アゴニストに結合し、それにより、ＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体の活性化を減少させる抗体を含む。例えば、これらの抗体は、ＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体を活性化する神経栄養因子、例えばグリア細胞由来神経栄養因子に指向することができる。さらに、ＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体アンタゴニストは、ＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体に結合しそれらを不活性化させる抗体を含む。ＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体アゴニストのこれらの使用法は、破傷風毒素または破傷風毒素融合タンパク質のニューロン輸送を減少または妨げる有用な方法を提供する。これらの方法において、該アゴニストまたはアンタゴニストは、破傷風毒素または融合タンパク質をすでに含むニューロン細胞に投与してもよい。または、破傷風毒素または融合タンパク質は、該アゴニストまたはアンタゴニストの投与と同時にまたは投与後に投与してもよい。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明のＴＴＣ含有融合タンパク質は、リポーター遺伝子、例えばｌａｃＺ遺伝子もしくは緑色蛍光タンパク質遺伝子によりコードされる第二タンパク質を含む。このような融合タンパク質は、例えば磁気共鳴画像法により、インビボ（ヒトを含む）でシナプス可塑性のモジュレーションを可視化するのに有用である。例えば、融合タンパク質を使用して、ニューロン輸送に対する化合物（例えば神経栄養因子）の効果をモニタリングおよび検出することができる。これらの方法において、該化合物および融合タンパク質をニューロンに投与し、該融合タンパク質を検出して、ニューロン輸送に対する該化合物の効果を決定する。さらに、該融合タンパク質を使用して、既知の神経変性疾患動物モデルに使用される神経ネットワークなどの、限局された神経ネットワーク内の通行パターンおよび／またはシナプス活性の改変を検出することができる。該融合タンパク質はまた、破傷風毒素のニューロン輸送を減少または妨げる化合物を検出するためのスクリーニング法にも使用できる。このようにして同定された化合物を使用して、破傷風感染を予防または処置することができる。したがって、本発明のスクリーニング法により同定された化合物は、薬物として使用できる。また、ＣＮＳ疾患に罹患した患者を処置するための薬物の製造における該化合物の使用にも関する。
【００４６】
ＴＴＣ断片はまた神経栄養因子に結合させ、これを患者に投与して、様々な因子の産生欠陥に関連したＣＮＳ病態を処置することがでる。ＴＴＣ断片はまた、神経変性疾患に関与するタンパク質との相互作用をモジュレーションするためのベクターとしても使用できる。該ＴＴＣ断片または対応するベクターは、薬物としても使用できる。ＣＮＳ疾患または神経変性疾患に罹患した患者を処置するための薬物の製造における該ＴＴＣ断片または対応するベクターの使用は、本発明の一部を構成する。
【００４７】
本発明はまた、ＴｒｋＢ受容体アゴニスト、または、ＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体アゴニスト、および、第二タンパク質に融合した破傷風毒素の断片Ｃを含む融合タンパク質、を含む組成物を提供する。１つの実施形態において、ＴｒｋＢアゴニストは、神経栄養因子、例えば脳由来神経栄養因子またはニューロトロフィン４である。別の実施形態において、ＧＦＲα／ｃＲＥＴ受容体アゴニストは、神経栄養因子、例えばグリア細胞由来神経栄養因子である。
【００４８】
本発明は、図面を参照して、より完全に説明されるだろう。
【００４９】
詳細な説明
シナプス後ニューロンからシナプス前ニューロンへの逆行性シグナル伝達は、シナプス接続の発達、維持、および活性依存的改変に必須であることが想起される（Chao, 2003）。このシグナル伝達には、ニュートロフィン、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、並びにニュートロフィン３および４（ＮＴ３およびＮＴ４）が関与し、これは、神経細胞生存に対するその古典的な作用の他に、軸索および樹状突起の成長、神経伝達物質放出、長期増強（ＬＴＰ）、およびシナプス可塑性を調節することが示された（McAllisterら、1999； Poo, 2001）。ニューロトロフィンは標的細胞により産生および放出され、シナプス前終末により内部移行され、細胞体に逆行的に輸送され、そこでその作用を奏功する（GintyおよびSegal, 2002； MillerおよびKaplan, 2001）。このシナリオでは、中枢ニューロンにおけるＮＧＦおよびＢＤＮＦの発現および分泌は、神経活性により調節され、これらの過程は、膜脱分極により引き起こされる可能性があることを特筆する価値がある（BlochlおよびThoenen, 1995； GallおよびIsackson, 1989； Goodmanら、1996； Luら、1991； Zafraら、1991）。
【００５０】
破傷風毒素の無毒性断片（ＴＴＣ）の輸送特性を利用することにより、末梢から中枢神経系への逆行性通行の可視化を可能とするＧＦＰでタグをつけたバイオマーカーが開発された。特に、ＧＦＰまたはβ−ｇａｌでタグをつけたこのマーカーは、生存マウスの筋肉にハイブリッドタンパク質を注射した後、神経活性依存的に神経筋接合部（ＮＭＪ）のシナプス前に蓄積することが判明した。その後、該ハイブリッドタンパク質は、シナプスを横断して相互接続高次ニューロンに移行することにより、ＮＭＪから、中枢神経系の標的組織に逆行性に輸送される（Coenら、1997； Miana-Menaら、2002）。さらに、ｌａｃＺリポーター遺伝子と同時発現されるＧＦＰ−ＴＴＣのトランスジェニック発現により、このマーカーが逆方向に移動するという選択性が確認された（Maskosら、2002）。したがって、進化を通じて破傷風毒素は、中枢神経系のより深い層に到達するために、恒常的に逆行性の経路に寄生している可能性がある。興味深いことに、全てのニューロトロフィンおよびその前駆タンパク質を認識する非特異的受容体ｐ７５およびＢＤＮＦ結合受容体ＴｒｋＢは、毒素が細胞表面に結合するのに必要とされる膜ガングリオシドとの相互作用を確立することが示された（ButowtおよびVon Bartheld, 2003）。これらの結果を照らし合わせると、病原性タンパク質は、既存のニューロトロフィン輸送機械を「ハイジャック」し、細胞内に浸潤し、標的組織へと向けて長い距離を移動することが示唆される（ButowtおよびVon Bartheld, 2003）。
【００５１】
細胞レベルで逆行性シグナル伝達経路をより良く理解するために、本発明は、リアルタイムで、解離皮質細胞内でのＧＦＰ−ＴＴＣの結合および内部移行の動態を特徴づけ、ＧＦＰ−ＴＴＣと共に逆行性に同時輸送される天然分子を同定し、シナプス後構造からシナプス前構造へと転位置するために該プローブが使用する構成的経路を解明する。本発明は、光学的画像化を使用して、より複雑で生理的に関連性のある神経ネットワークで機能している脳内の逆行性シグナル伝達の役割を研究するための新しく洗練されたツールとして有用である。
【００５２】
本発明は、ＧＦＰでタグをつけた破傷風毒素の無毒性断片（ＴＴＣ）の内部移行特性および逆行性輸送特性を使用することにより、神経栄養因子ＢＤＮＦが中枢神経系における膜通行をモジュレーションする細胞機序を調べる。ますます多くの証拠により、ＢＤＮＦが細胞を刺激する位置が、活性化されるシグナル伝達経路を決定するのに重要であり、それ故、細胞の生物学的応答を決定するのに重要であることが示される（HeerssenおよびSegal, 2002）。さらに、ＢＤＮＦがその特異的受容体（すなわちＴｒｋＢ；（Barbacid, 1994））に結合する親和性が高いことから、分泌部位より遠くに拡散できず、これにより、自己分泌および／またはパラ分泌因子として作用するようである。これらの特徴により、ＢＤＮＦは、その効果が限局される神経領域に応じて、膜代謝回転において様々な役割を果たすことのできる多機能因子となる。これに一致して、本明細書に提示した結果により、ＧＦＰ−ＴＴＣのシナプス前エンドサイトーシスおよびシナプス後エキソサイトーシスの両方が、解離皮質ニューロンにおけるＢＤＮＦ誘導神経活性に依存した細胞過程であることが示される。
【００５３】
より特定すると、ＣＮＳ中のニューロンに特異的に結合するこのマーカーは、中枢シナプス中のシナプス後分化組織内（すなわち樹状突起棘；図１５Ａ参照）に蓄積することが示された。さらに、本発明は、ＧＦＰ−ＴＴＣの蓄積する棘は、活性シナプス前終末に会合し、シナプス前マーカーとして広く使用されている先に述べたスチリル色素の１つであるＦＭ１−４３（図１５Ｃ参照）に即座に結合する（Betz, 1998）ことを実証する。それ故、これにより、ＧＦＰ−ＴＴＣが、活性シナプス前終末との機能的相互作用を維持するシナプス後棘を明らかにするための優れたマーカーとして作用できることが示される。
【００５４】
さらに、このプローブがリポータープラスミドまたはタンパク質として利用できることにより、研究者は、革新的な方法を使用して、インビトロ並びにトランスジェニック動物、特に非ヒトトランスジェニック動物で簡単な画像技術を用いて脳機能を調べることができる。臨床適用に関して、このプローブは、アルツハイマー病およびパーキンソン病、並びに癲癇などの、ＣＮＳ中の機能的シナプス接続が次第に減少することにより特徴づけられる、神経変性疾患の早期診断に非常に価値がある可能性がある。さらに、ＧＦＰ−ＴＴＣはまた、薬理学的スクリーニング目的にも適用できる。したがって、活性依存的機序によりシナプス後棘からエキソサイトーシスされることができるこのプローブの能力（図１９参照）は、中枢シナプスに対する特定の薬物の効果の指標として役立つ可能性がある。
【００５５】
破傷風毒素は、Clostridium tetaniにより産生される１３１５アミノ酸の強力な神経毒である（１、２）。それは、特定の細胞中毒機序により、脊髄介在ニューロンからの抑制性神経伝達物質の放出を妨げる（レビューについては参考文献３を参照）。この病理発生機序は、破傷風毒素の逆行性軸索およびシナプス経由輸送が関与することが実証された。該毒素は、神経筋接合部で神経終末により取り込まれるが、この部位では作用せず；むしろ、該毒素は、小胞区画に輸送され、その標的に到達するまで運動神経軸索に沿ってかなりの距離を移動する。破傷風毒素のシナプス経由移動は、筋肉に注射した後、脊髄介在ニューロンにおけるオートラジオグラフィーによる位置決定により初めて実証された（４）。しかし、運動ニューロンからの破傷風毒素のシナプス経由通過の以前の研究は、急速な臨床的破傷風の発症および実験動物の死亡により制限された（４、５、６）。
【００５６】
プロテアーゼ消化により得られた破傷風毒素断片であるＣ断片は、天然毒素と同じように臨床的症状を引き起こすことなくニューロンにより輸送されることが示された（７、８、９、１０）。組換えＣ断片は、プロテアーゼによる消化により得られた断片と同じ特性を有することが報告された（１１）。毒性分子の毒性断片は、軸索内を逆行性に移動し、ＣＮＳに蓄積できるという事実により、このような断片は、神経栄養担体として使用できるという推察がなされた（１２）。様々の大きなタンパク質に化学的にコンジュゲートしたＣ断片が、組織培養液中のニューロンにより（１３）および動物モデルの運動ニューロンにより（参考文献１２、１４、および１５）取り込まれた。本発明によれば、破傷風毒素断片は、断片Ｃおよび断片Ｂまたは少なくとも１１アミノ酸残基のその一部を含む破傷風毒素（ＴＴ）の無毒性タンパク質分解断片、あるいは、断片Ｃおよび断片Ｂまたは少なくとも１１アミノ酸残基のその一部およびアミノ酸２２５〜２４５の鎖の中央部分に位置する亜鉛結合モチーフを有するタンパク質分解ドメインに対応するその毒性活性の欠失した断片Ａの一部を含む破傷風毒素（ＴＴ）の無毒性タンパク質分解断片からなる（Montecucco C.およびSchiavo G.Q.Rev.Biophys.(1995), 28: 423-472参照）。したがって、断片Ａの一部は、例えば、アミノ酸配列１〜２２５またはアミノ酸配列２４５〜４５７、あるいは、アミノ酸配列２４５〜４５７に会合したアミノ酸配列１〜２２５を含む。
【００５７】
生物学的機能を有する分子は、例えば、ＣＮＳまたは脊髄の制御下で機能の補足またはモジュレーションのための対象のタンパク質、あるいは、ＣＮＳまたは脊髄へ遺伝子療法発現系により送達されるべき対象のタンパク質からなる群より選択される。対象のタンパク質は、例えば、脊髄筋肉萎縮症に関与するタンパク質ＳＭＮ（Lefebvreら、Cell,(1995), 80: 155-165およびRoyら、Cell,(1995), 80: 167-178）；神経栄養因子、例えばＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）；ＮＴ−３（ニューロトロフィン−３）；ＮＴ−４／５；ＧＤＮＦ（グリア細胞系由来神経栄養因子）；ＩＧＦ（インスリン様成長因子）（Oppenheim、Neuron,(1996), 17: 195-197；Thoenenら、Exp.Neurol.(1933), 124: 47-55およびHendersonら、Adv.Neurol.(1995), 68: 235-240）；またはＰＮＩ（プロテアーゼネキシンＩ）促進神経突起成長（この因子は、アルツハイマー病の処置に使用できる（Houenouら、PNAS,(1995), 92: 895-899））；またはＳＰＩ３セリンプロテアーゼ阻害タンパク質（Safaei、Dev.Brain.Res.(1997), 100: 5-12）；またはアポトーシスを回避するための、アポトーシスに関与するＩＣＥ（インターロイキン−１β変換酵素）因子（Nagata、Cell,(1997), 88: 355-365）；またはプログラム化細胞死の重要な細胞内調節物質であるＢｃｌ−２（Jacobson,M.D.(1997), Current Biology, 7: R277-R281）；またはマーカーとしての緑色蛍光タンパク質（Langら、Neuron,(1997), 18: 857-863）；酵素（例えばβ−Ｇａｌ）；エンドヌクレアーゼ様Ｉ−Ｓｃｅｌ（Choulika A.ら（1995), Molecular and Cellular biology, 15(4): 1968-1973またはＣＲＥ（Gu H.ら、(1994), Science, 265, 103-106）；特異的抗体；側方脊髄筋萎縮などの神経変性疾患に対して特異的に指向される薬物である。いくつかの分子は、ＴＴ断片と会合していてもよい。
【００５８】
会合しては、遺伝子組換えにより得られた会合を意味する。この会合は、ＴＴ断片の上流並びに下流で行なうことができる。好ましい本発明の具現化形態は上流であり、詳述されている；下流での具現も考えられる。（カルボキシル末端アミノ酸は、精製ガングリオシドおよび神経細胞への結合に必要とされるドメインを含むと指摘した、Halpernら、J.Biol.Chem.(1993), 268(15): 11188-11192にも関わらず）。
【００５９】
望ましいＣＮＳ領域は、例えば、舌下運動神経への輸送を指令するために選択された舌；脊髄運動神経への輸送を指令するために選択された腕筋肉を意味する。
【００６０】
ＣＮＳまたは脊髄へのニューロンのこうした移植を実現するためには、Gage,F.H.ら(1987), Neuroscience, 23: 725-807、「脳への遺伝子改変細胞の移植：将来への可能性」を参照されたい。
【００６１】
ポリヌクレオチドを細胞に導入する技術は、米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号に記載され、これを頼りにし、引用例として本明細書に取り込む。例えば、ヌクレオチドは、ＣＮＳまたは脊髄の領域に再移植する前にインビトロでトランスフェクションすることにより導入してもよい。
【００６２】
本発明の特定の実施形態において化学結合が考えられ、ＴＴ断片と、対象の分子をその調節配列（該ポリヌクレオチドを発現できるプロモーターおよびエンハンサー）と共にコードするポリヌクレオチドとの会合を含む。その後、ＴＴ断片により、逆行性軸索輸送および／またはシナプス経由輸送が可能となり、ポリヌクレオチド産物は、直接ニューロンにおいて発現される。この化学結合は、共有結合であってもなくてもよいが、好ましくは、チオール化反応によりまたはGret T.Hermanson（アカデミックプレス, 1996）の「バイオコンジュゲート技術」に記載の任意の他の結合反応により行なわれる共有結合である。
【００６３】
軸索逆行輸送は、筋肉レベルで始まり、ここで対象の組成物は、神経筋接合部で取り込まれ、ＣＮＳまたは脊髄の運動神経（これは一次ニューロンとも呼ばれる）の神経体に移動する。一次ニューロンは、対象の組成物を内部移行させたニューロンを意味し、したがって、この場合、運動神経に相当する。
【００６４】
シナプス経由逆行輸送は、運動ニューロンからのシナプスを介した介在ニューロン伝達に相当し、二次ニューロンおよび高次ニューロンを含む（四次は脳皮質のニューロンに相当する）。
【００６５】
様々なニューロン輸送段階は、神経筋接合部、一次ニューロンとも呼ばれる運動ニューロン、様々な次数のニューロン間の任意の段階のシナプス、二次ニューロンから四次のニューロン（脳皮質に相当する）を通してである。
【００６６】
本発明の１つの実施形態において、β−ｇａｌ−ＴＴＣ（ＴＴ断片Ｃ）ハイブリッドタンパク質は、インビボで、両方のタンパク質の生物活性を保持していることが示されている。それ故、該ハイブリッドタンパク質は、その酵素活性により追跡されるように、相互接続ニューロン鎖を通じて逆行性でニューロン経由の輸送を受けることができる。これらの結果は、化学的にコンジュゲートしたＴＴＣまたは他のタンパク質に融合したＴＴＣを使用した他の研究者の結果と一致している（１２、１３、１４、１５）。これらのインビトロ解析において、コンジュゲートまたはハイブリッドタンパク質の活性は、同様に保持されるか、またはほんの僅かしか消失しなかった。ＴＴＣ融合対の性質に応じて、様々な種類の可能性ある適用を想定できる。例えば、この適用を使用して、治療目的のために、生物学的に活性なタンパク質を、ＣＮＳに送達することができる。このようなハイブリッド遺伝子はまた、ｌａｃＺまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；２９）遺伝子のようなリポーターをＴＴＣに融合させると、シナプス接続したニューロンを解析し位置付けるために使用できる。
【００６７】
ハイブリッドタンパク質の逆行性輸送は、以下のように実証できる。筋肉内に注射された場合、β−ｇａｌ活性は、急速に、筋肉を神経支配する運動神経の細胞体に局在化した。全神経、軸先、細胞体および樹状突起の分枝は、容易に可視化できる。しかし、向神経性ウイルスと比較して、舌下ニューロンからのハイブリッドタンパク質の逆行性ニューロン経由輸送により、二次介在ニューロンを含む大半の領域がβ−ｇａｌ−ＴＴＣマーカーにより同定されているが、相互接続ニューロンのほんの部分集合しか検出されないことが示される。ニューロン経由取り込みは、殆ど二次ニューロンに制限される。このような実験において、少数のニューロントレーサーを筋肉または細胞に注射した場合、シナプスを通して僅か一部しか輸送されず、これによりその検出に対して実験的な制約が課される。現在、輸送程度の点で最も効率的な方法は、向神経性ウイルスに依拠する。例には：αヘルペスウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、仮性狂犬病ウイルス（ＰｒＶ）、およびラブドウイルスが挙げられる（２４、２５）。ウイルス法は、非常に感度の高い方法である。なぜなら、ウイルスが新しい細胞を感染する度に、該ウイルスは複製し、これにより、シグナルを増幅し、鎖中の高次ニューロンの可視化を可能とするからである。しかし、究極的には、トランスジェニック動物などのインビボ状況において神経ネットワークをマッピングすることが望まれる。ここで、ウイルス標識の欠点は、その毒性が存在する可能性である。大半のウイルスは、神経細胞に対して無害であり、その複製は、細胞応答を誘導し、時に細胞変性を誘導する（２４）。さらに、実験条件に応じて、ウイルスの出芽が起こる可能性があり、これにより隣接する細胞および組織に蔓延する。
【００６８】
ニューロン経由移動機序の差異は、β−ｇａｌ−ＴＴＣにより標識されるニューロンの数が限られていることを説明し得る。Matteoliらは、無傷破傷風毒素は、神経終末におけるシナプス小胞再利用の生理的過程に寄生することにより、シナプスを横断するという強い証拠を提供した（２２）。該毒素は、おそらく、細胞内腔が外部媒体にさらされている間、シナプス小胞の内表面に結合する。その後、小胞エンドサイトーシスにより、おそらく、該毒素の内部移行の機序がもたられる。ＴＴＣ断片はインビボでの該毒素の移動を模倣することが知られているので、それ故、類似のシナプス経由経路に沿って融合タンパク質に指向できる。この仮説が確認されれば、β−ｇａｌ−ＴＴＣのニューロン経由輸送にシナプス活性が必要とされることが強く示唆されるだろう。それ故、活性な神経回路のみが、ハイブリッドタンパク質により検出されるだろう。シナプス小胞エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスに対するβ−ｇａｌ−ＴＴＣの依存可能性を、さらに調べることができる。なぜなら、インビトロで神経ネットワークのシナプス活性を記録する技術が現在では入手可能であるからである（３０）。これに対し、向神経性ウイルスのニューロン経由経路は、依然として解明されておらず、シナプス近傍でのウイルス出芽を含めて、基本的に異なる可能性がある。最後に、ハイブリッドタンパク質のニューロン経由輸送は、シナプス特異性に依存する可能性があるが、破傷風毒素は特異性を示すことは知られてない（７、２３）。それ故、ウイルスは、種々のまたは不活性なシナプスを横断するようである。要約すると、無毒性に加えて、ニューロン間輸送の範囲が狭いことにより、β−ｇａｌ−ＴＴＣハイブリッドタンパク質は、神経経路を解析するための新規で強力なツールとなっている。
【００６９】
神経地図作成のための本発明の融合遺伝子の１つの利点は、遺伝子操作および遺伝子工学を受け入れられる単一の遺伝子実体に由来することである。数年前、胚幹細胞での相同的組換えに基づいた技術が開発され、マウスの遺伝子を特異的に置き換えた（３１、３２）。この方法により、置換遺伝子にヌル変異が生じたが、僅かに改変した戦略では、二シストロン性メッセンジャーＲＮＡも産生できる（３３、３４）。リポーター遺伝子、例えばＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺを置換遺伝子として使用すると、この技術は、変異細胞をマークする手段を提供し、よって胚発生中にそれらを追跡することができる。したがって、この技術は、標的遺伝子のヘテロ接合型発現並びにヌル（ホモ接合型）変異動物の表現型の両方の解析を非常に簡単にする。
【００７０】
本発明の別の利点は、融合遺伝子を含む組成物が、抗原をコードしてもよいことである。したがって、該組成物を使用して、その宿主における免疫応答を誘起させ、その後、発現される抗原に対して宿主の防御を付与することができる。これらの免疫化法は、Robinsonら、米国特許第５，４３，５７８号に記載され、これは参考文献として本明細書に取り込まれている。特に、患者または動物宿主を免疫化する方法は、所望の抗原をコードする本発明の融合遺伝子をコードおよび含むＤＮＡ転写単位を導入することを含む。宿主によるＤＮＡ転写単位の取り込みにより、所望の抗原の発現が起こり、その後の体液性および／または細胞性免疫応答の誘起が起こる。
【００７１】
神経細胞は、特異的で複雑な相互接続細胞ネットワークを確立する。所与の神経細胞の遺伝子が変異すると、この変異は、他の相互接続された神経細胞の機能に対して影響を及ぼすことが期待できる。これらの考察を心に留め、活性シナプスを通じて拡散し得る遺伝子マーカーは、変異の効果を解析する際に非常に有用であろう。ヘテロ接合型変異動物では、標的遺伝子が正常に転写される細胞は、神経ネットワークのシナプス接続細胞と同様に同定できる。ホモ接合型動物では、神経ネットワークの確立または活性に対する変異の影響を決定できる。このようなインビボでのアプローチの実行可能性は、融合タンパク質のシナプス移動効率、並びに、その安定性および細胞局在化に非常に依存する。
【００７２】
本発明の別の伸展は、ＣＮＳに適用する遺伝子療法である。本発明は、軸索終末による無毒性の酵素−ベクターコンジュゲートの取り込み、および、脳幹運動神経への逆行性の運搬を提供する。選択的な逆行性のシナプス経由機序は、続いて、ハイブリッドタンパク質を、二次接続ニューロンへと輸送する。血液脳関門を迂回するこのような経路は、巨大分子をＣＮＳに送達することができる。事実、病原性物質、例えば破傷風毒素および向神経性ウイルスは、同じように神経終末により取り込まれ、内部移行し、神経細胞体に逆行性に輸送される。このようなシナリオでは、ｌａｃＺリポーターは、必要または興味深い活性および／または機能を与えるタンパク質をコードする遺伝子により置き換えられる。例えば、ヒトＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼであるＳＯＤ−１およびヒト酵素β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼＡであるＨｅｘＡは、ＴＴＣ断片に融合または化学的に結合し（１３、１６）、インビトロでのニューロンによるその取り込みはかなり増加し、その酵素機能は部分的に保存される。β−ｇａｌ−ＴＴＣを使用したここで記載されたインビボでの実験と合わせて、ＴＴＣハイブリッドタンパク質に基づいた遺伝子療法アプローチは、生物学的機能をＣＮＳに送達するための実行可能な方法であるようである。しかし、小胞に捕獲される可能性が高いＴＴＣハイブリッドタンパク質を、適切な細胞下区画に標的化する方法を見つけなければならない。このような治療戦略は、神経変性疾患および運動神経疾患、例えば筋萎縮側索硬化症（ＡＬＳ、３５）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ、３６、３７）、または神経変性リソソーム蓄積症（３８、３９）を処置するのに特に有用であり得る。選択された筋肉への、さらには子宮への注射は、適切なニューロンを特異的に標的化するのを手助けし得る。さらに、このようなアプローチは、遺伝子を送達する欠陥ウイルスの使用に関連した続発性で毒性の可能性のある作用を回避する（４０、４１）。
【００７３】
ＢＤＮＦ依存的ＧＦＰ−ＴＴＣエンドサイトーシス
【００７４】
以前の研究では、破傷風神経毒は、インビトロで、活性依存的機序により、海馬ニューロンのシナプス終末を通って進入することが実証された（Matteoliら、1996）。さらに、マウスでインビボで行なった近年の研究により、神経筋接合部におけるこの神経毒の無毒性断片の蓄積は、神経活性に依存した過程であり、腓腹筋にハイブリッドタンパク質を注射する前に坐骨神経の軸索を切断することにより、徹底的にＴＴＣの分布に影響を及ぼした（Miana-Menaら、2002）。しかし、現在までにこの神経活性の根底にある細胞機序および分子機序は、依然として解明されていない。
【００７５】
本発明は、初めて、ＴＴＣ−受容体の強化された膜ミクロドメインに会合して見出されることが多い、ＢＤＮＦ受容体の活性化による、ＧＦＰ−ＴＴＣ内部移行におけるＢＤＮＦの直接的な役割を報告する。これらの結果と一致して、近年の研究により、ＴＴＣおよびニュートロフィン受容体ｐ７５（すなわちｐ７５ＮＴＲ）は、解離ラット脊髄運動ニューロンにおいて共通のエンドサイトーシス担体を共有し、これにより、プローブの進入は、ｐ７５ＮＴＲの活性化および内部移行により引き起こされる可能性があることが示される（LalliおよびSchiavo, 2002）。ｐ７５ＮＴＲは、全てのニュートロフィン並びにその前駆タンパク質に非選択的に結合し、ＣＮＳ初期発達段階で高度に発現されている、ＮＧＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである（ChaoおよびBothwell, 2002）。一旦発達が完了すると、ｐ７５ＮＴＲ発現は厳密に調節され、他のニューロトロフィン受容体（すなわちＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、およびＴｒｋＣ）の発現と正確な平衡に到達し、これとｐ７５ＮＴＲは相互作用を確立し、そのリガンドに対する親和性を強化する（Chao, 2003）。このシナリオでは、Butowtおよび同僚（ButowtおよびVon Bartheld, 2003）は、この受容体複合体がまた、ＴＴＣが細胞膜に結合するために必要とされる膜ガングリオシドと相互作用することを見出したが（すなわちＧＴ１ｂ）、この相互作用の生理的関連性は依然として明らかではない。５個までの分子を含むこの多タンパク質複合体（すなわち、ＢＤＮＦ／ＴｒｋＢ／ｐ７５ＮＴＲ／ＧＴ１ｂ／ＴＴＣ）の形成は、ＧＦＰ−ＴＴＣとＢＤＮＦ覆膜ビーズの間の厳密な同場所局在は、形質膜レベルでは見いだされなかったという事実を十分に説明し得る。合わせて考えると、活性帯におけるドッキング小胞の数を増加させ、それによりエキソサイトーシス／エンドサイトーシス代謝回転を増大させる、ＢＤＮＦによるＴｒｋＢ／ｐ７５ＮＴＲ複合体の活性化は（TylerおよびPozzo-Miller, 2001）、ＴＴＣのその受容体への結合を増強し、ＧＦＰ−ＴＴＣ取り込みに有利であるその作用領域におけるエンドサイトーシス速度上昇を誘導する可能性があることを提唱することは妥当である。
【００７６】
ＢＤＮＦおよびＰＳＤ依存的ＧＦＰ−ＴＴＣ細胞内通行は、２つの長い過程である：最初に、プローブがシナプス終末から細胞体へと逆行性輸送を受ける。この輸送は、活性化ニューロトロフィン受容体により使用される逆行性経路に関連しているようである。したがって、本発明において、ＧＦＰ−ＴＴＣ含有小胞は、ＴｒｋＢ／ＢＤＮＦ含有小胞と密接に接触し、両方の担体が、細胞体へと向けて類似しているが独立した逆行性輸送を受けることが判明した。これらの結果を照らし合わせると、ＴＴＣは、過程における分解を回避しながら神経細胞体に到達するために、活性化ＴｒｋＢ受容体（Yanoら、2001）により使用される天然の逆行性運動系を「ハイジャック」するとの仮説が立てられる。この考えを支持して、LalliおよびSchiavoは、近年、培養液中の新生児運動神経内でＴＴＣとＮＧＦ神経栄養因子が実質的に同場所に局在していることを報告した（LalliおよびSchiavo, 2002）。しかし、その研究において、彼らはＮＧＦとは同場所に局在していない形態学的に異なるＧＦＰ−ＴＴＣ含有小胞の亜集団を観察し、このことは、これらの小胞が異なる逆行性経路で輸送されることを示唆する。したがって、異なる比ではあるが、本発明は、解離皮質ニューロンにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ逆行性担体の２つの亜集団を実証する：１つめは、ＢＤＮＦ含有小胞の非常に近くに位置するＧＦＰ−ＴＴＣ含有小胞集団全体のうちの５６％を示し、２つめは、ＢＤＮＦ担体とは相互作用を全く示さない残りの４４％を示す。興味深いことに、近年、ＴＴＣは、Ｔｒｋ受容体リン酸化に共通した細胞内シグナル伝達経路を活性化し、この効果は、タンパク質と細胞膜の相互作用に依存し、ＴＴＣは、破傷風毒素と同じシグナルの活性化を引き起こすことが判明した（Gilら、2003）。したがって、ＢＤＮＦ含有小胞と相互作用を全く示さないＧＦＰ−ＴＴＣ含有小胞の集団は、ＢＤＮＦとは独立的にＴＴＣにより直接活性化されるＴｒｋ受容体画分に相当する可能性がある。
【００７７】
第二に、ＧＦＰ−ＴＴＣは、神経細胞体から、樹状突起棘などのシナプス後構造に輸送され、そこで蓄積する。これらの構造は、神経樹状分枝に全て沿って分布している球状突出であり、順行性および逆行性シグナル伝達過程の細胞内カスケードが始まる（HeringおよびSheng, 2001）。その後、棘は、ＧＦＰ−ＴＴＣがシナプス前細胞へとシナプス経由通過するための構造として作用する可能性がある。この通行段階中に、ＧＦＰ−ＴＴＣは、ＰＳＤタンパク質の局在場所であるこれらのシナプス後構造に向けて特異的に伝達されるように、別の細胞内輸送経路を利用する可能性がある。事実、本発明において、細胞内ＧＦＰ−ＴＴＣクラスターは、ＰＳＤの数多くの成分の１つであるＰＳＤ−Ｚｉｐ４５と同じ場所に局在することが観察された（Katoら、1998；Xiaoら、1998）。ＰＳＤ−Ｚｉｐ４５は、神経活性に応じて、ＰＳＤに急速に再分布することが示された（Okabeら、2001）。したがって、細胞脱分極中にＰＳＤ−Ｚｉｐ４５は、樹状突起棘に迅速で正確に伝達され、シナプス後帯域に到達するようにＧＦＰ−ＴＴＣがこの輸送を手助けする可能性がある。それにも関わらず、ＧＦＰ−ＴＴＣがこの細胞内経路を認識する分子機序、並びに、ハイブリッドタンパク質とＰＳＤタンパク質が示し得る相互作用の可能性を解明するためにさらなる研究が必要とされるであろう。
【００７８】
ＢＤＮＦ依存的ＧＦＰ−ＴＴＣエキソサイトーシス
近年の研究により、マーカータンパク質（すなわちβ−Ｇａｌ）に融合させたＴＴＣをマウスの舌に筋肉内注射すると、中枢神経系へと逆行性輸送を受けることが実証された（Miana-Menaら、2002）。しかし、現在までに、どのようにＴＴＣが異なる神経層を通って逆行的に移動するのかに関する情報は殆ど得られていない。この研究で提示された結果に照らして、本発明者らは、一旦ＧＦＰ−ＴＴＣがシナプス後分化組織に到達すると、シナプス間隙に放出され、ＢＤＮＦ誘導神経活性依存的過程でシナプス前ニューロンにより取り込まれる可能性があると仮説を立てた。この過程は、図１８に示したように起こる可能性がある。シナプス前細胞の脱分極は、神経伝達物質の放出を引き起こし、これによりシグナルはシナプス後ニューロンに伝播される。したがって、シナプス後分化組織の刺激により、シナプス間隙へのＢＤＮＦの分泌が誘導され、これは、シナプス前並びにシナプス後ニューロンのその受容体に結合する。シナプス前ＴｒｋＢ受容体複合体に結合したＢＤＮＦは、大量の神経伝達物質の放出を引き起こし、これによりシナプス前シグナル伝播が強化されるだろう。他方で、シナプス後受容体に結合したＢＤＮＦは、ＧＦＰ−ＴＴＣの放出を引き起こし、これはシナプス前およびシナプス後細胞の両方のＴｒｋＢ受容体複合体に会合した膜ガングリオシドに結合する。シナプス前終末における大量のエキソサイトーシス後、エンドサイトーシスが起こり、シナプス前膜の再利用により、シナプス前細胞内にＧＦＰ−ＴＴＣ／受容体複合体がもたらされる可能性がある。ＧＦＰ−ＴＴＣ取り込みにおけるＢＤＮＦの参加は、ヘビ毒が高レベルのＮＧＦ（毒素がその標的組織に近づき易くすると提唱されている）を含むという事実を考慮すれば驚くべきことではない（KostizaおよびMeier, 1996）。しかし、本研究で見出されたＢＤＮＦ／受容体複合体に会合していないＧＦＰ−ＴＴＣ含有小胞の画分は、カベオラ様の膜再利用経路によるＧＦＰ−ＴＴＣのエンドサイトーシス（すなわちポトサイトーシス）の結果である可能性がある。クラスリン被覆ピットエンドサイトーシス経路とは独立したこの機序は、細胞内にいくつかの分子（病原体および病原体に由来する分子）を内部移行させ、それらをＥＲに送達するのに関与していると考えられている（Anderson, 1998）。別の可能性は、ＧＦＰ−ＴＴＣが、最近示唆されているように、Ｔｒｋ受容体を直接活性化し、ＴＴＣが、Ｔｒｋ受容体リン酸化後に活性化されるものと共通した細胞内シグナル伝達カスケードを刺激するというものである（Gilら、2003）。したがって、この機序は、ニューロトロフィンにより誘導される神経活性の不在下でさえもＧＦＰ−ＴＴＣがシナプス前細胞に侵入する代替的な経路を示す。これは、神経毒および神経変性性ウイルスによる神経侵入の一般的な機序を示す可能性がある。
【００７９】
結論すると、本発明は、中枢シナプスで起こる膜通行に関する新しい情報、および、この過程でニューロトロフィンにより誘導されるシナプス活性が果たす役割を提供する。合わせて考えると、これらの結果により、先に記載した膜通行経路は、シナプス活性をモジュレーションするのに必要な成分を活性シナプス（シナプス前の側並びにシナプス後の側で）の中にまたは外へと追い出すことに関与している。
【００８０】
実施例１：プラスミド作成
【００８１】
（Ａ）ＴＴＣのクローニング：
【００８２】
全長ＴＴＣ  ＤＮＡを、ＰＣＲを使用して、Clostridium Tetani株（パスツール研究所のPopoff博士より贈呈）のゲノムＤＮＡから作成した。３つの重複断片を合成した：
【表１】
2007535316.tif 000002
３つの断片を、pBluescript KS+（ストラタジーン）に連続的に導入し、ｐＢＳ：ＴＴＣプラスミドを得た。上流プライマー１はまた、最適化真核リボソーム結合部位（ＲＢＳ）および翻訳開始シグナルも含んでいた。本発明者らのＴＴＣ断片（４６２アミノ酸）は、破傷風完全毒素のアミノ酸８５４〜１３１５、すなわち、断片Ｃと、断片Ｃのアミノ末端の直前の重鎖の１１アミノ酸とで構成される、重鎖のカルボキシ末端４５１アミノ酸を示した。ｐＢＳ：ＴＴＣにクローニングされたＴＴＣ断片のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を図１に示した。構築物ｐＢＳ：ＴＴＣは図２に示した。
【００８３】
（Ｂ）ｐＧＥＸ：ｌａｃＺ−ＴＴＣ：
【００８４】
ｐＧＥＸ：ｌａｃＺは、ｐＧＮＡベクター（H.Le Mouellic博士より贈呈）のＳｍａＩ／ＸｈｏＩ  ｌａｃＺ断片を、ｐＧＥＸ  ４Ｔ−２（ファルマシア）にクローニングすることにより得た。ＰＣＲを使用して、ｌａｃＺ終止コドンをＮｃｏＩ制限酵素部位に変換した。２つのプライマー
【表２】
2007535316.tif 000003
を使用して、ＮｄｅＩとＸｈｏＩの間の配列を増幅し、ｐＧＥＸ：ｌａｃＺからｐＧＥＸ：ｌａｃＺ（ＮｃｏＩ）を作成した。ｐＧＥＸ：ｌａｃＺ−ＴＴＣを、ＴＴＣ  ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ断片を、ｐＧＥＸ：ｌａｃＺ（ＮｃｏＩ）に挿入し、ｌａｃＺコード領域のすぐ下流に同じリーディングフレームに融合することにより得た。図３は、ｐＧＥＸ：ｌａｃＺ−ＴＴＣ構築物の詳細を示す。
【００８５】
（Ｃ）ｐＧＥＸ：ＴＴＣ−ｌａｃＺ：
【００８６】
ｐＢＳ：ＴＴＣを改変して、ＴＴＣ  ＤＮＡの開始部のＮｃｏＩをＢａｍＨＩ制限酵素部位に変化させ（リンカー５’−ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＧＴ−３’）、ｐＢＳ：ＴＴＣ（ＢａｍＨＩ）プラスミドを得た。ｐＧＥＸ：ＴＴＣは、ｐＢＳ：ＴＴＣ（ＢａｍＨＩ）のＴＴＣ  ＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ断片を、ｐＧＥＸ  ４Ｔ−２（ファルマシア）にクローニングすることにより得た。ＰＣＲを使用して、ＴＴＣ終止コドンを、ＮｈｅＩ制限酵素部位に変換した。２つのプライマー
【表３】
2007535316.tif 000004
を使用して、ＮｓｉＩとＳｍａＩの間の配列を増幅し、ｐＧＥＸ：ＴＴＣからｐＧＥＸ：ＴＴＣ（ＮｈｅＩ）を作成した。プラスミドｐＧＮＡ由来のｌａｃＺ  ｃＤＮＡを、その５’末端で改変し、ＳａｃＩＩをＮｈｅＩ制限酵素部位に変化させた（リンカー５’−ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＣ−３’）。ｐＧＥＸ：ＴＴＣ−ｌａｃＺは、ｌａｃＺ  ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ断片をｐＧＥＸ：ＴＴＣ（ＮｈｅＩ）に挿入し、ｌａｃＺをＴＴＣコード領域のすぐ下流で同じリーディングフレームに融合することにより得た。構築物ｐＧＥＸ：ＴＴＣ−ｌａｃＺの詳細は、図４に示した。
【００８７】
（Ｄ）ｐＣＭＶ：ｌａｃＺ−ＴＴＣ：
【００８８】
ｐＣＭＶベクターは、いくつかの改変後にｐＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック・ラボラトリーズ）から得た：ＧＦＰ配列を、ＢｇｌＩＩ／ＮｈｅＩ消化および再ライゲーションにより欠失させ、ポリリンカー中のＳａｃＩＩは、ＡｓｃＩ制限酵素部位に変換させた（リンカー５’−ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＧＣ−３’および５’−ＴＧＧ  ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＧＣ−３’）。
【００８９】
pBluescript KS+（ストラタジーン）を改変し、ＸｈｏＩをＡｓｃＩ制限酵素部位に変化させ（リンカー５’−ＴＣＧ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＣＡ−３’）、ｐＢＳ（ＡｓｃＩ）プラスミドを得た。ｐＢＳ：ｌａｃＺ−ＴＴＣは、ｐＧＥＸ：ｌａｃＺ−ＴＴＣ由来のＸｍａＩ  ｌａｃＺ−ＴＴＣ断片をｐＢＳ（ＡｓｃＩ）にクローニングすることにより得た。ｐＣＭＶ：ｌａｃＺ−ＴＴＣは、ｌａｃＺ−ＴＴＣ  ＸｍｎＩ／Ａｓｃｌ断片をｐＣＭＶベクターのＸｈｏおよびＡｓｃＩ部位に挿入し（ＸｈｏＩおよびＸｍｎＩはクローニングにより排除された）、ＣＭＶプロモーターの下流に融合物を入れることにより得た。図８は、構築物ｐＣＭＶ：ｌａｃＺ−ＴＴＣの詳細を示す。プラスミドｐｃＭＶ：ｌａｃＺ−ＴＴＣは、１９９７年８月１２日にthe Collection Nationale de Cultures de Microorganism（ＣＮＣＭ）、パスツール研究所, 25、Rue de Docteur Roux、F-75724、Paris Cedex 15、フランスに、アクセッションナンバーＩ−１９１２で寄託された。
【００９０】
実施例２：ハイブリッドタンパク質の精製
【００９１】
ｐＧＥＸ：ｌａｃＺ−ＴＴＣでトランスフェクトされたＥ．ｃｏｌｉ株ＳＲ３３１５（パスツール研究所のA.Pugsley博士より贈呈）をタンパク質の産生のために使用した。一晩経過した細菌培養液を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中に１：１００で希釈し、ＯＤが０．５に達するまで３２℃で数時間増殖させた。Ｐｔａｃプロモーターからの誘導は、１ｍＭのＩＰＴＧおよび１ｍＭのＭｇＣｌ２を加え、さらに２時間インキュベートすることにより行なった。誘導された細菌は、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離にかけ、ＰＢＳで洗浄し、０．１ＭのトリスｐＨ７．８、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ−１００、４ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌのリソソーム、および抗プロテアーゼ混合液（１００μｇ／ｍｌのペファブロック、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのペプスタチン、１ｍＭのベンズアミジン）を含む溶解緩衝液に再懸濁した。フレンチプレスで細胞を破壊した後、全細菌溶解液を３００００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。得られた上清を、ゆっくりと攪拌しながらアフィニティーマトリックスグルタチオンセファロース４Ｂ（ストラタジーン）と共に４℃で一晩インキュベートした。３０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた後、マトリックスを、同じ溶解緩衝液であるが、リソソームとグリセロールは含まないもので３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄した。レジンを、ＰＢＳ中トロンビン（１０Ｕ／ｍｌ；シグマ）と共に一晩かけてインキュベートし、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列に由来するβ−ｇａｌ−ＴＴＣ融合タンパク質を切断し、アフィニティカラムからそれを溶出した。溶出された融合タンパク質の濃縮は、セントリコンＸ−１００チューブで遠心分離することにより行なわれた（アミコン；１００，０００ＭＷカットオフ膜）。
【００９２】
精製ハイブリッドタンパク質を、還元条件下で８％アクリルアミドＳＤＳ／ＰＡＧＥで電気泳動分離にかけ、その後、ニトロセルロース膜（０．２ｍｍの有孔性、バイオラッド製）に電気泳動転写した後、ウェスタンブロットにより解析した。ブロットタンパク質の免疫検出は、Vectastaln ABC−アルカリホスファターゼキット（ベクターラボラトリーズ）およびＤＡＢ発色を用いて行なった。抗体は以下のように使用した：ウサギ抗β−ｇａｌ抗血清（Capel）、希釈度１：１０００；ウサギ抗ＴＴＣ抗血清（Calbiochem）、希釈度１：２００００。β−Ｇａｌ−ＴＴＣハイブリッドタンパク質に相当する１８０ｋＤａの相対分子量を有する主要なバンドを、両方の抗β−Ｇａｌ抗ＴＴＣ抗体で検出した。
【００９３】
実施例３：分化１００９細胞における組換えタンパク質の結合および内部移行
１００９細胞系は、組換えマウス近交系（１２９×Ｂ６）に生じた自然発生精巣奇形癌から得た（１７）。１００９細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させ、亜集密の段階で継代した。レチノイン酸およびｃＡＭＰを用いたインビトロでの分化を記載の通りに行なった（１８）。レチノイン酸処理の８日後、細胞を、ハイブリッドタンパク質またはβ−ｇａｌを用いての内部移行実験のために使用した。
【００９４】
β−Ｇａｌ−ＴＴＣ融合物の結合および内部移行を、改変プロトコルを使用して評価した（１６）。分化１００９細胞を、結合緩衝液（ＰＢＳ中、０．２５％スクロース、２０ｍＭトリスアセテート、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５％ウシ血清アルブミン）に希釈した５μｇ／ｍｌのβ−Ｇａｌ−ＴＴＣまたはβ−Ｇａｌタンパク質と共に３７℃で２時間インキュベートした。次に、細胞を、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのプロナーゼＥ（シグマ製）と共に３７℃で１０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳに希釈したプロテアーゼ阻害剤（１００μｇ／ｍｌのペファブロック、１ｍＭのベンズアミジン）で洗浄した。
【００９５】
細胞を、ＰＢＳ中４％ホルマリンで室温（ＲＴ）で１０分間かけて固定し、その後、ＰＢＳで十分に洗浄した。β−ｇａｌ活性を、Ｘ−Ｇａｌ溶液（ＰＢＳ中、０．８ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ、４ｍＭのフェリシアン化カリウム、４ｍＭのフェロシアン化カリウム、４ｍＭのＭｇＣｌ２）中で３７℃で一晩染色することにより固定細胞で検出した。電子顕微鏡のために、細胞を、さらに、２．５％グルタルアルデヒド中で１８時間かけて固定し、その後、記載のように処理した（１９）。
【００９６】
免疫組織化学的標識のために、細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで室温で固定し、その後、ＰＢＳで十分に洗浄し、その後、ＰＢＳ中２％ＢＳＡ／０．０２％トリトンＸ−１００と共に室温で１時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中２％ＢＳＡ／０．０２％トリトンＸ−１００中に希釈した一次抗体中で室温で２時間共にインキュベートした。使用した抗体は、マウス抗神経フィラメント抗体（ＮＦ２００Ｋｄ、希釈度１：５０；シグマ製）またはウサギ抗ＴＴＣ抗体（希釈度１：１０００）であった。標識は、蛍光二次抗体：Ｃｙ３、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（希釈度１：５００；アマシャム製）またはextravidin-FITCを含む抗マウスＩｇＧ（希釈度１：２００；シグマ製）を使用して可視化した。細胞をモビオールにマウントし、そしてエピ蛍光で可視化した。
【００９７】
実施例４：インビボでの組換えタンパク質注射
１４週令のＢ６Ｄ２Ｆ１マウスを、ＩＦＦＡ−ＣＲＥＤＯから入手した。動物の舌の筋肉に、ハミルトンシリンジを使用して全身麻酔下で３％アバーティン（Avertin）（動物ｇあたり１５μｌ）を注射した（動物１匹あたり２０μｌ）。タンパク質濃度は、ＰＢＳ中０．５〜５μｇ／μｌであり、それ故、マウスは、１回の注射につき約１０〜１００μｇを投与された。動物は注射から１２時間から４８時間生存させ、注射されたタンパク質の移動を可能とし、どの場合においても破傷風の症状は検出されなかった。マウスを、深い麻酔下でＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで心内灌流により屠殺した。脳を収集し、ＰＢＳ中ですすぎ、１５％スクロース中４℃で一晩インキュベートし、その後、クリオスタットを使用して１５μｍの薄片に切片化する前に組織テックにマウントした。
【００９８】
実施例５：組織学、免疫組織学、およびＸ−Ｇａｌ染色
【００９９】
解剖した脳および舌の全体的なＸ−Ｇａｌ染色のために、マウス（１０匹の動物）を屠殺し、先に記載のように固定した。脳をさらに、中央平面に沿ってメスを用いて切断し、Ｘ−Ｇａｌ溶液中で１２時間直接インキュベートした。
【０１００】
免疫組織学のために、切片を、同じ緩衝液で１時間インキュベートすることにより非特異的抗体結合部位を遮断した後、ＰＢＳ中２％ＢＳＡ／０．０２％トリトンＸ−１００中１：５０００希釈度の抗ＴＴＣ抗体中で４℃で一晩インキュベートした。抗体検出は、ＤＡＢ発色を含むベクタスタインＡＢＣ−アルカリホスファターゼキットを使用して行なった。Ｘ−Ｇａｌ染色のために、切片をＸ−Ｇａｌ溶液中でインキュベートし、ＰＢＳ中ヘマトキシリン１１５（ｖ／ｖ）で３０秒間対比染色した。隣接切片における組織学を、ヘマトキシリン／チオニン溶液中での３０秒間のインキュベートを使用して、Ｘ−Ｇａｌ染色の後に行なった。全ての切片は、８回の顕微鏡解析の前にモビオールにマウントした。
【０１０１】
実施例６Ａ：インビトロでのニューロンによるβ−ｇａｌ−ＴＴＣ融合タンパク質の内部移行
【０１０２】
インビトロでのレチノイン酸およびｃＡＭＰを用いた１００９細胞の分化により、神経細胞およびグリア細胞が生じた（１８、２０）。Ｘ−Ｇａｌ染色または免疫標識を、β−ｇａｌ−ＴＴＣ融合タンパク質またはβ−ｇａｌもしくはＴＴＣタンパク質のみのいずれかと共にインキュベートした後に行なった。ハイブリッドタンパク質を分化１００９細胞と共にインキュベートした場合にのみ、強力なＸ−Ｇａｌ染色が、神経表現型を有する細胞に検出された。β−ｇａｌのみを同じ条件下でインキュベートした場合にはシグナルは検出されなかった。類似のＸ−Ｇａｌ染色パターンが、細胞をプロナーゼ処理して表面に結合したタンパク質を除去した後に得られ、このことは、ハイブリッドタンパク質が内部移行したことを示す。ハイブリッドタンパク質の細胞内局在化は、さらに、Ｘ−Ｇａｌ染色細胞の電子顕微鏡解析により確認された。さらに、軸索に観察された酵素活性は、フィラメントに会合した小胞に局在していると見られ、これは、ＴＴＣ断片または天然破傷風毒素に関する以前の研究と一致していた（１４、２１、２２）。抗ＴＴＣおよび抗神経フィラメント抗体を用いた同時標識により、β−ｇａｌ活性は、神経細胞においてＴＴＣ断片と同じ場所に局在していることが判明した。グリア細胞は、抗体では標識されなかった。
【０１０３】
実施例６Ｂ：インビトロでのニューロンによるＴＴＣ−β−ｇａｌ融合タンパク質の内部移行
【０１０４】
内部移行に使用された方法は、先の実施例６に記載したものと同一であった。結果により、先の実施例６のようなハイブリッドの効率的な内部移行が示された。
【０１０５】
実施例７：インビボでのハイブリッドタンパク質の逆行性輸送
【０１０６】
インビボでのβ−ｇａｌ−ＴＴＣタンパク質の挙動を研究するために、ハイブリッドタンパク質を、十分に特徴づけられた神経ネットワークである舌下系で試験した。β−ｇａｌ−ＴＴＣタンパク質をマウスの舌に筋肉内注射した後、ＣＮＳ中のハイブリッドタンパク質の分布を、Ｘ−Ｇａｌ染色により解析した。様々な希釈度のタンパク質を注射し、その後の時点を解析して、舌下運動神経へのタンパク質の輸送を可能とし（ＸＩＩ）、接続された二次ニューロンへのそのさらなるニューロン経由移動も可能とした。
【０１０７】
大きな明白な逆行性に標識されたニューロンの十分に画定されたプロファイルが、注射１２時間後に全体的に解析した舌下構造において明らかに歴然としていた。強い標識もまた、注射したマウスの舌の舌下神経（ＸＩＩｎ）で明らかであった。筋肉線維レベルでは、ハイブリッドタンパク質が神経軸索に内部移行する神経筋接合部の標識を反映する可能性があるボタン構造が観察された。これらのデータにより、β−ｇａｌ−ＴＴＣハイブリッドタンパク質は、舌の神経終末により前以て取り込まれた後、運動神経細胞体まで逆行性軸索輸送により速く移動できることが実証された。この特異的取り込みおよび軸索内輸送は、天然毒素に関して記載された特性と類似している（６、２１、２３）。
【０１０８】
ハイブリッドタンパク質の輸送は、Ｘ−Ｇａｌ染色脳切片を解析することにより、より詳細に調べられた。舌下核の運動神経は急速に標識され、１２時間は調べた最も早い時点である。大半の標識は、神経細胞体に限局され、細胞核は標識されていなかった。標識の強度は、注射されたβ−ｇａｌ−ＴＴＣタンパク質の濃度に依存し：１０μｇのタンパク質を注射した場合には、舌下細胞体のみが検出されたが、２５〜５０μｇを用いた場合には、樹状突起のファジーなネットワークが可視化され；１００μｇのハイブリッドタンパク質ではシナプス経由移動が検出された。脳切片を、抗ＴＴＣ抗体で免疫染色すると、同一の標識分布が観察され、このことは、β−ｇａｌおよびＴＴＣ断片は細胞内の同場所に局在することを実証した。最後に、β−ｇａｌのみの注射では、舌下核は標識されず、それ故、ハイブリッドタンパク質の輸送はＴＴＣ依存性であることが確認された。抗ＴＴＣ抗体での標識は、β−ｇａｌ活性の検出よりも情報が少なく；例えば、脳への神経経路は、抗ＴＴＣ免疫染色により可視化できなかった。注射１８時間後、標識が舌下核に観察され：全ての運動神経体およびその樹状突起の最も近位の部分は非常に濃く染色された。これに対し、ＸＩＩ運動神経またはその軸索に隣接するグリア細胞では検出されなかった。本発明者らの結果は、ＴＴＣ断片のみを注射した後の同一の免疫標識パターンを報告した他の研究者の結果と一致した（９）。ニューロン経由移動は、２４時間後に検出可能であった。さらに２４時間およびそれを超過しても、異なる染色は生じなかった。
【０１０９】
実施例８：ハイブリッドタンパク質のニューロン経由輸送
【０１１０】
舌下運動神経とシナプスを形成している二次介在ニューロン並びに高次ニューロンは、小麦胚凝集素−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体（ＷＧＡ−ＨＲＰ）または向神経性ウイルス、例えばアルファヘルペス（２４）およびラブドウイルス（２５）などの慣用のマーカーを使用して十分に解析された。舌下核にシナプス接続している脳中の領域に関して徹底的に編集されたものも近年記載されている（２５）。本発明において、β−ｇａｌ−ＴＴＣ融合物の分布は、筋肉に注射されたタンパク質の初期濃度に依存し、時間を経過することにより注射後の輸送が可能となった。注射から２４時間後までは、標識は舌下核に制限された。２４時間後、脳の様々な領域における二次ニューロン経由標識細胞の分布は、一貫しており再現性があった。より長い時間が経過した時点でさえも（例えば４８時間）、舌下核の標識は一定のままであった。より高度の拡大率では、二次ニューロンの明確で局在化した染色が観察され、このことは、ハイブリッドタンパク質が、細胞体、シナプスおよび軸索内の小胞に標的化されたことを示唆する。類似の点状の分布は、以前に、破傷風毒素およびＴＴＣ断片のみに関して記載された（１４、２１、２２）。
【０１１１】
強力なニューロン経由標識が、外側網様体（ＬＲＦ）において検出され、ここでは延髄網様体ニューロンが、舌下核に数多くの突出を形成することが報告されている（２６、２７）。β−ｇａｌ活性は、これらの切片の両側に検出された。標識ＬＲＦ突出（projections）は、体軸に沿って外側から始まって舌下核へと連続的な円柱を形成し、いくつかのニューロンが、延髄網様体背側（ＭｄＤ）および延髄網様体腹側（ＭｄＶ）核において優先的に染色されていた。この円柱は延髄を通って吻側に延び、ニューロンは小細胞網様核においてより強力に標識されていた（ＰＣＲｔ、尾側および吻側）。４８時間後、ＭｄＤおよびＰＣＲｔの細胞はより強力に染色された。舌下核に突出している延髄ニューロンの第二の両側分布が、孤束核（Ｓｏｌ）に検出されたが、標識は、網様体よりも強度が低く、おそらくこれは、比較的少ない孤束核細胞が舌下核に突出していたからであろう（２６）。しかし、これもまた舌下核に突出していることが示されている三叉脊髄核（Ｓｐ５）に標識は見出されなかった（２６）。β−ｇａｌ−ＴＴＣタンパク質の経シナプス移行は、尾側橋網様体核（ＰｎＣ）、青斑核（ＬＣ）、前庭神経内側核（ＭＶｅ）、および前庭神経下核（ＩＶ）の少数の細胞にも検出された。これらの細胞群は、舌下核に突出していることが知られているが（２５）、おそらく軸索が比較的長いため、それらの標識は、微弱であった。背側巨細胞傍核（ＤＰＧｉ）、尾側大細胞核（ＲＭｃ）、および尾側縫線核（Ｒ）に少数の標識細胞が認められ、その舌下核との関連も報告されている（２５）。最後に、三叉神経中脳核（Ｍｅ５）の標識ニューロンのような標識ニューロンが中脳突出部の両側に検出され、中脳中央灰白質領域（ＣＧ）で少数のニューロンが染色された。これら後者の核は、舌下核に関係する推定三次細胞群として分類されている（２５）。
【０１１２】
顔面神経核（Ｎ７）におけるニューロン集団とともに、三叉神経運動核（Ｍｏ５）および三叉神経副路（Ａｃｓ５）におけるニューロンも標識された。しかし、これらの核における運動ニューロンが他の筋肉組織部分も神経支配していることが知られているため、この標識の解釈は比較的曖昧であり、ハイブリッドタンパク質の拡散が当該注入点で生じた可能性がある。逆に、Ｎ７におけるニューロンが直接的な舌下神経入力を受けることが報告されているため（２８）、これらの核は、ＸＩＩ神経を介して舌筋肉組織に突出した可能性もある。この後者の解釈は、これらの核の標識が２４時間後になってようやく検出されたという事実と一致している。しかし、この点についてはさらに検討しなかった。
【０１１３】
表１に要約したデータは、総合的に、舌下ニューロンから脳幹の複数の接続領域へのβ−ｇａｌ−ＴＴＣ融合タンパク質の経ニューロン性輸送を明確に確立している。
表１．ＸＩＩ神経からのｌａｃＺ−ＴＴＣ融合物の経ニューロン性輸送：
中枢神経系における異なる細胞型の標識
【０１１４】
【表４】
2007535316.tif 000005
【０１１５】
（＊）は、推定三次ニューロンも有する二次細胞群を表す（本文参照）。−は標識なし；＋から＋＋＋は標識の濃度上昇；＋／−は微弱な標識を表す。注入後１２〜１８時間のデータを得るため動物１６匹を解析し、注入後２４〜４８時間のデータを得るため動物６匹を解析した。
【０１１６】
本発明の別の実施形態において、破傷風毒素のＣ末端断片とＧＦＰリポーター遺伝子を含む融合タンパク質（ＧＦＰ−ＴＴＣ）を構築し、トランスジェニックマウスにおいて逆行性で経シナプス移行的に簡素な神経回路網をマッピングする有効性を示した（Ｍａｓｋｏｓら、２００２）。ＧＦＰ−ＴＴＣ融合タンパク質は、神経筋接合部のシナプス前部レベルにおける膜通過の可視化を可能とし、免疫反応または酵素反応なしに光学的に検出可能である。したがって、ＧＦＰ−ＴＴＣ融合タンパク質により、最小限の生理活性の障害により活性ニューロンを観察することが可能になる。
【０１１７】
神経活性なしにＮＭＪにおけるＴＴＣ融合タンパク質の局在化が損なわれることも以前に示した（Miana-Menaら、2002）。したがって、本発明のこの態様において、ＧＦＰ−ＴＴＣのニューロン局在化および内在化に対する神経栄養因子の影響と、ある種の神経栄養因子がインビボでニューロン輸送に影響を及ぼす機構をインビボで検討した。ＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣの局在化が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、およびグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような神経栄養因子により迅速に誘発されるが、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）には誘発されないことを見出した。
【０１１８】
様々な量のＢＤＮＦとＧＦＰ−ＴＴＣプローブの同時注入により、神経筋接合部（ＮＭＪ）において測定される蛍光の増大が誘発される。注入後５分という早さで検出可能であって、注入後約３０分で最大レベルに達するこの作用により、ＢＤＮＦ処理がニューロンエンドサイトーシスを亢進することが示される。機能ではとりわけ、ＢＤＮＦは、ツメガエルの神経・筋共培養物および海馬ニューロンからの神経伝達物質の分泌を刺激する（Lohofら、1993; TylerおよびPozzo-Miller, 2001）。破傷風毒素は、シナプス小胞エンドサイトーシスによりニューロンに浸入することが知られているため（Matteoliら、1996）、ＢＤＮＦは、シナプス小胞ターンオーバーの増進によりＧＦＰ−ＴＴＣ内在化を増大させる可能性がある。本研究では、ＢＤＮＦ作用は、シナプス小胞のエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスを阻止するＢｏＴｘ／Ａ処理後に持続し、ＢＤＮＦは、別のエンドサイトーシス経路を通じてＮＭＪにおけるＴＴＣ含有融合タンパク質の動態および局在化を増大させることが示される。したがって、ＧＦＰ−ＴＴＣの筋注および輸送機構の可視化により、少なくとも２つの異なるエンドサイトーシス経路、すなわちクラスリン依存性およびクラスリン非依存性経路が明らかになった。ＧＦＰ−ＴＴＣの筋注後、カベオリン３との生化学的共局在およびＣＴ−ｂ結合により同定されるラフトマーカーＧＭ１との共局在を含む、脂質ラフトにおける局在化と一致する特徴を示すことを見出した（OrlandiおよびFishman, 1998; Wolfら、1998）。したがって、ＧＦＰ−ＴＴＣが用いるクラスリン非依存性経路は、脂質マイクロドメインを含むと思われる。共焦顕微鏡による解析により、形態学的に２つの異なる標識が明らかになった。第一に、シナプス小胞ＳＶ２と部分的に重なるがラフトマーカーＣＴ−ｂとも重なり、シナプス小胞と脂質ラフトの混合を示すＧＦＰ−ＴＴＣ拡散染色である。第二に、より拡散的なパターンの前に検出されその後も持続し、シナプス膜の陥入または陥没であるように思われる、高度に蛍光的なドメインである。これらのＧＦＰ−ＴＴＣパッチは、ＣＴ−ｂ標識のみを有した。実際、小胞輸送およびシグナル伝達のような細胞機能の役割を果たす脂質マイクロドメインは（SimonsおよびToomre, 2000）、横方向に移動してより大きなパッチに凝集することができる（Harderら、1998）。また、これらはシナプス前部におけるエキソサイトーシスの特定域であって、標的細胞からの逆行性シグナル伝達に応答して迅速な形態の内部輸送を受ける可能性もある。ニューロン活性に依存したかたちでシナプス小胞のプールを補充する、カエルの運動神経終末における類似の陥没およびシステルナ構造が報告されている（Richardsら、2000）。ＣＨＯ細胞では管状カベオラも報告されている（Mundyら2002）。
【０１１９】
ＮＭＪ局在化に対するプローブの動態に基づき、ＧＦＰ−ＴＴＣとＣＴ−ｂで異なる輸送特性を認めた。細胞への毒素の標的化は、毒素を特定の脂質ラフトマイクロドメインに結合し得る内因性ガングリオシド受容体の構造および機能に依存すると想定されている（Wolfら、1998）。したがって、インビボで内因性または注入されるＢＤＮＦは、ＴＴＣ受容体を有する脂質マイクロドメインの量を増加させ得る。破傷風毒素とコレラ毒素は異なるガングリオシドに結合し、それぞれＧＤ１ｂ／ＧＴ１ｂ、ＧＭ１として知られている。したがって、本発明者らが、シナプス前運動神経終末における補充の力学で認めた相違点は、特定のグリコスフィンゴ脂質およびタンパク組成物を有する、異なる脂質マイクロドメインに関連し得る。ニューロン膜はガングリオシドに富み、細胞表面に異なるマイクロドメインが共存する可能性がある。実際、機能的に異なる２つのＧＰＩタンパク質、Ｔｈｙ−１とＰｒＰプリオンタンパク質が隣接するマイクロドメインに見出される（Madoreら、1999）。同様に、コレステロール依存性マイクロドメインにシンタキシンが集中しており、これはＧＰＩ結合タンパク質を有するラフトとは異なる（Langら、2001）。
【０１２０】
ＢＤＮＦのように、ＮＴ−４もＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣの濃度を上昇させることが見出されたが、ＮＧＦおよびＮＴ−３は効果がなかった。ＴｒｋＢ受容体がＢＤＮＦおよびＮＴ−４により特異的に活性化されるため、ＴｒｋＢ活性は、このニューロン輸送に関わる可能性がある。興味深いことに、高頻度のニューロン活性およびシナプス伝達が、培養海馬ニューロンの表面のＴｒｋＢ受容体の数を増加させることが示され（Duら、2000）、これは明らかに追加のＴｒｋＢ受容体を細胞質膜に補充して行う（Meyer-Frankeら、1998）。さらに、ＴｒｋＢは、神経細胞質膜由来の脂質マイクロドメインに非常に富んでいる（Wuら、1997）。しかし、ＮＭＪにおいてＧＦＰ−ＴＴＣとＴｒｋＢまたはｐ−Ｔｒｋ受容体の間に特異的な共局在は検出されなかった。したがって、ＴｒｋＢは、シナプス前運動神経膜において検出される輸送に間接的に作用し得る。
【０１２１】
ＴＴＣ断片がｐ７５ＮＴＲと同じ小胞で培養運動ニューロンに検出されていることに注目する価値がある（LalliおよびSchiavo, 2002）。この共局在は、主に発達中および病的状態において発現されるｐ７５ＮＴＲのＧＴ１ｂガングリオシドとの緊密な会合により説明し得る（Yamashitaら、2002）。ニューロトロフィンがそのＴｒｋ受容体に結合することにより、複数の細胞内シグナル伝達タンパク質により認識されるチロシン残基のリン酸化が生じる。このような相互作用により、キナーゼカスケードによってＭＡＰキナーゼ、ＰＩ  ３−キナーゼ、およびホスホリパーゼ−Ｃ−γ経路が活性化される（検討するには（HuangおよびReichardt, 2003）を参照されたい）。これらのシグナル伝達カスケードにおける多くの中間体は、脂質ラフトにも存在する（SimonsおよびToomre, 2000; Tsui-Pierchalaら、2002）。活性化ｐ７５ＮＴＲを脂質ラフトに転移させるにはＰＫＡの活性化が必要である（Higuchiら、2003）。同様に、ＧＤＮＦに結合し、したがって、ｃ−ＲＥＴチロシンキナーゼ受容体の活性化を可能にするＧＦＲα１共受容体は、脂質ラフトに局在化する。ＧＦＲα１は、ＧＤＮＦ刺激後にＲＥＴを脂質ラフトに補充し、強力かつ連続的なシグナル伝達を生じる（Paratchaら、2001; Tanseyら、2000）。
【０１２２】
別の神経栄養因子ＧＤＮＦもＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ局在化を誘導した。しかし、ＧＤＮＦは、ＢＤＮＦおよびＮＴ−４と異なる受容体（すなわち、ＧＦＲα／ｃ−ＲＥＴ受容体）を活性化させる。ＢＤＮＦ／ＮＴ−４とＧＤＮＦは、異なる受容体を活性化させるため、それらの活性経路の構成要素が特異的な脂質マイクロドメインにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ受容体の輸送を活性化させ得ると想定した。実際、種々の刺激がカベオラ−脂質ラフトの特殊な形態−の内在化を引き起こし得る。したがって、シミアンウイルス４０は、カベオラにおける内在化を刺激し、カベオソームを通じて輸送する（Pelkmansら、2001）。同様に、アルブミンドッキングタンパク質ｐｇ６０は、カベオリン−１との相互作用および引き続いてのＳｒｃキナーゼシグナル伝達の活性化により、その経内皮輸送を活性化させる（Minshallら、2000）。破傷風毒素がＴＴＣ断片を通じて、Ｔｒｋ受容体、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、およびプロテインキナーゼＣイソ型を含む細胞内経路を活性化し得ることが最近報告された（Gilら、2001; Gilら、2000; Gilら、2003）。したがって、このようにして、破傷風毒素は、リソソーム分解を避けるため、クラスリン依存性経路よりむしろ非被覆経路を通じてそのニューロンエンドサイトーシスを自己活性化し得る。
【０１２３】
最後に、ＧＦＰ−ＴＴＣ輸送が神経栄養因子により調節されることを示した。ＧＦＰ−ＴＴＣ輸送の可視化により、本データでは、おそらくＴｒｋＢの活性化により、ＢＤＮＦがクラスリン被覆および非被覆エンドサイトーシス経路を刺激し得ることが示される。破傷風毒素は、他の病原体または毒素のように細胞における内在化および輸送に構成的機構を用いるため、ＧＦＰ−ＴＴＣにより神経栄養因子への生理学的応答を可視化することができた。
【０１２４】
本発明のこの態様については、次の実施例でさらに考察する。
【０１２５】
実施例９：ＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ局在化
ＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ分布の特徴を判定するため、長耳挙筋（Levator auris longus（ＬＡＬ））の直近においてＧＦＰ−ＴＴＣ融合タンパク質の単回注入を行い、注入後に様々な時点でＬＡＬを除去し、全組織標本として検査した。ＬＡＬは、わずか数層の線維からなる薄い平坦な筋肉であるため、関連神経との神経筋調製の全体は、共焦点解析により検討可能である（図６Ａ）。図６に示すように、ＴＲＩＴＣ共役α−ブンガロトキシン（α−ＢＴＸ）による筋ニコチン性アセチルコリン受容体の染色により同定されるように、ＧＦＰ−ＴＴＣは迅速にＮＭＪに集中する。ＬＡＬ筋肉表面への融合タンパク質の沈着後、約５分後にＧＦＰ−ＴＴＣの斑状クラスター形成が認められた（図６ＤおよびＤ’）。３０分後、ＮＭＪの全面にわたり分布した、より拡散した染色が認められ、これは約２時間持続した（図６ＦおよびＦ’）。トロポニンＴを認識する抗体により実施した免疫染色試験では、ＧＦＰ−ＴＴＣが主にＮＭＪのシナプス前運動神経終末に集中していることが確認された（図６ＣおよびＣ’）。筋内ミエリン化軸索のランビエ絞輪および知覚神経線維において強力なＧＦＰ−ＴＴＣ標識を検出することもできた（図６ＡおよびＢ；それぞれ矢印と矢尻）。注入後２４時間でＮＭＪに持続した蛍光パッチが少数のみであったため、大部分のＧＦＰ−ＴＴＣプローブは、２４時間以内に内在化したと思われる（図６ＧおよびＧ’）。
【０１２６】
実施例１０：運動神経終末におけるＧＦＰ−ＴＴＣ輸送へのＢＤＮＦの影響
外因的に用いられたニューロトロフィンが、運動神経終末におけるＧＦＰ−ＴＴＣ補充に影響を及ぼしたどうかを評価するため、ＬＡＬ筋肉の直近において濃度を高めたＢＤＮＦ（２．５〜２５０ｎｇ）をＧＦＰ−ＴＴＣと同時注入し、一方、対照マウスにはＧＦＰ−ＴＴＣを単独注入した。注入後３０分にマウスを殺処分してＬＡＬ筋肉を採取した。ＴＲＩＴＣ−α−ＢＴＸ標識による同定後、ＮＭＪにおける共焦顕微鏡解析によりＧＦＰ蛍光を定量化した。ＢＤＮＦ注入は、ＮＭＪにおいてＧＦＰ−ＴＴＣ蛍光の統計的に有意な濃度依存性増進を生じ、最大効果は、ＢＤＮＦ５０ｎｇにより得られたが（図７Ｂおよび表２）、高用量（１００および２５０ｎｇ）ではＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ濃度のレベルの上昇は低かった（それぞれ１．７２±０．１２、１．１５±０．２２倍）。これらの高用量で認められた高ＧＦＰ−ＴＴＣ軸索標識（図７Ａ、矢印）は、おそらくプローブの内在化の亢進と相関する。
【０１２７】
ＴｒｋＢ変異マウスにおいて、ＬＡＬ筋肉を神経支配する、顔面神経核における生理学的表現型が報告されている（Kleinら、1993; Silas-Santiagoら、1997）。認められたＢＤＮＦ作用がＬＡＬ特異的である可能性を除外するため、異なる筋肉である腓腹筋も解析した。腓腹筋にＧＦＰ−ＴＴＣ（±ＢＤＮＦ５０ｎｇ）注入後３０分、筋肉を固定し、除去し、連続的に切片とした。各筋肉に対し、材料および方法に記載のように、運動神経終末におけるＧＦＰ−ＴＴＣ蛍光を行うため、異なる連続切片を定量化した。ＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ濃度のＢＤＮＦ依存性の上昇が、ＬＡＬにおいて認められた濃度上昇に近似していることを見出した（それぞれ１．５１±０．１２倍上昇対２．１２±０．１９）。
【０１２８】
実施例１１：運動神経終末におけるＧＦＰ−ＴＴＣ局在化への他の神経栄養因子の影響
ＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ局在化に対する、さらに５つの栄養性因子の作用も検討した。これにはニューロトロフィンＮＴ−３；ＮＴ−４、およびＮＧＦならびにＬＩＦサイトカインファミリーのメンバーであるニューロサイトカインＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）およびＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーであるＧＤＮＦ（グリア由来神経栄養因子）が含まれた（表２）。ニューロンにおける多くのＢＤＮＦ作用は、ＮＴ−４の受容体でもある高親和性受容体チロシンキナーゼＴｒｋＢにより媒介される。ＢＤＮＦのように、ＮＴ−４もＮＭＪにおいてＧＦＰ−ＴＴＣ局在化を誘導した（１．５４±０．２３倍の増大）。ＮＴ−４に類似した誘導レベルがＧＤＮＦでも認められた（表２）。一方、高濃度であっても、ＮＧＦ、ＮＴ−３、またはＣＮＴＦもＧＦＰ−ＴＴＣ局在化に有意な作用を示さなかった。
【０１２９】
【表５】
2007535316.tif 000006
【０１３０】
実施例１２：運動神経終末におけるＴｒｋ受容体の分布とＧＦＰ−ＴＴＣ局在化の比較
成人骨格筋および運動ニューロンにおけるＴｒｋＢ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の検出が、複数の研究で報告されている（Funakoshiら、1993; Gonzalezら、1999; Griesbeckら、1995; Yanら、1997）。本結果ではＧＦＰ−ＴＴＣ局在化へのＢＤＮＦの作用は、ＴｒｋＢ受容体活性に依存することが示されたため、ＧＦＰ−ＴＴＣがＬＡＬ筋肉のＮＭＪにおいてＴｒｋＢと共局在するのかどうかを判定することは興味深かった。過去の研究（Gonzalezら、1999; Sakumaら、2001）と一致し、ＴｒｋＢ免疫染色はＮＭＪに限定された（図８）。シナプス前部側において、ＴｒｋＢ染色はＧＦＰ−ＴＴＣ標識のクラスターに隣接したが、これと共局在はしなかった。活性化Ｔｒｋ受容体（ｐ−Ｔｒｋ、データは示さず）を認識する抗体を用いても同様の結果が得られた。この知見により、ＢＤＮＦが神経終末におけるＧＦＰ−ＴＴＣの濃度に影響を及ぼす機構には、ＴｒｋＢとＧＦＰ−ＴＴＣまたはその受容体の直接的な相互作用は含まれないことが示唆される。
【０１３１】
実施例１３：ＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ濃度に対するＢＤＮＦの作用に関与する機構
ＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣのＢＤＮＦ誘導高濃度化の考えられる説明には、ＮＭＪにおけるプローブの局在化率の上昇および／またはプローブのニューロンエンドサイトーシスの増大が含まれ得る。ＧＦＰ−ＴＴＣ注入（±ＢＤＮＦ５０ｎｇ）後、５，１５，３０，６０および１２０分に行った共焦点解析では、ＢＤＮＦ注入との３０分で最大標識強度を示したが、対照群では最大染色は１時間で生じ、ＢＤＮＦとの混注により得られるレベルより低いレベルに達した。最初の１時間後、同様のレベルのＧＦＰ−ＴＴＣが両方の条件でＮＭＪにおいて記録された（図９Ａ）。これらの結果は、ツメガエルの神経−筋共培養における過去の結果と一致し、ＢＤＮＦの時間限定効果を示す（Lohofら、1993）。
【０１３２】
インビトロでは破傷風神経毒素のニューロンにおける内在化は、被覆および非被覆小胞経路を含むと思われる（Herrerosら、2001; Matteoliら、1996）。エンドサイトーシス流体マーカーＲＨ４１４を用いてインビトロで切除し（データは示さず）、あるいはＳＶ２シナプス小胞タンパク質（図９Ｂ）およびシナプトフィジン（データは示さず）に対して免疫染色したＬＡＬ筋肉で行った試験では、ＧＦＰ−ＴＴＣ標識との一部の重複を示し、これはＧＦＰ−ＴＴＣのエンドサイトーシスが一部は、ニューロンシナプス小胞の再生を通じたものであったことを示す。クラスリン依存性とクラスリン非依存性のエンドサイトーシス経路を差別化するため、運動神経終末において神経伝達物質の放出およびエンドサイトーシスを阻止する（de Paivaら、1999）、ボツリヌス菌神経毒素血清型Ａ（ＢｏＴｘ／Ａ）による処置を用いた。ＧＦＰ−ＴＴＣ注入前４８時間にＢｏＴｘ／Ａを用いた場合、ＮＭＪにおけるプローブレベルは顕著に５０％低下し（図９Ｃ）、クラスリン依存性と非依存性経路の双方が同程度に使用されることが示される。
【０１３３】
外因性ＢＤＮＦ；ＮＴ−３またはＮＴ−４の適用により生じるシナプス伝達の亢進には、神経伝達物質放出の強化が含まれる（Lohofら、1993; StoopおよびPoo, 1996; WangおよびPoo, 1997）。したがって、ＢＤＮＦ注入により誘導されるＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣの量の増加は、部分的にシナプス小胞の再生の増大に起因し得る。この仮説を検証するため、高カリウム培地にてＧＦＰ−ＴＴＣ注入によりシナプス小胞の増大したエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスを誘導した。注入後５分、高Ｋ＋培地またはＢＤＮＦへの暴露により、ＮＭＪにおいて同様のＧＦＰ−ＴＴＣレベルの上昇が誘導された。しかし、３０分後、高Ｋ＋の効果はもはや検出できなかったが、この時間においてＢＮＤＦにより最大の誘導に達した（図９Ｄ）。最後に、神経伝達物質の放出およびシナプス小胞の再生がＢｏＴｘ／Ａにより阻止された後においても、ＢＤＮＦ処置により、非麻痺対照ＮＭＪに記録された振幅に匹敵する振幅を有する（それぞれ２．０５倍の増大対２．１２）、増大したＧＦＰ−ＴＴＣシグナルが誘導された（図９Ｃ）。総合すると、これらの結果は、ＢＤＮＦが非被覆小胞を含むと思われる代替のエンドサイトーシス経路を亢進させることを示す。
【０１３４】
実施例１４：神経筋接合部における界面活性剤不溶性膜でのＧＦＰ−ＴＴＣの関連性の証拠
ＴＴＣの細胞質膜への結合は、ポリシアロガングリオシドＧＤ１ｂおよびＧＴ１ｂならびにＮ−グリコシル化１５ｋＤａタンパク質への会合を含む。これらの３つの構成要素は、ラフトと称される膜マイクロドメインにおいて優先的に区分化する。インビトロではＴＴＣは、ＮＧＦ分化ＰＣ１２細胞および培養脊髄ニューロンにおけるようなマイクロドメインと会合することが示されている（Herrerosら、2001; Vyas, 2001）。ＧＦＰ−ＴＴＣが脂質ラフトに会合するかをインビボで試験するため、ＧＦＰ−ＴＴＣ筋注後に脂質マイクロドメインを単離するため腓腹筋に対して界面活性剤抽出を行った。不連続ショ糖勾配由来の１２フラクションを回収し、ＧＦＰ−ＴＴＣの分布を解析した。
【０１３５】
ニューロンは、カベオリンまたは形態学的に異なるカベオラを有さない（Anderson, 1998）が、界面活性剤不溶性複合体に有意なフラクションのコレステロールとグリコスフィンゴリピドが見出され、これらは界面活性剤不溶性の基準を用いてカベオラに関連するフラクションと区別がつかない（Schnitzerら、1995）。したがって、特異的な筋カベオラマーカーであるカベオリン３（Tangら、1996）を用いて界面活性剤抵抗性フラクションを同定した。免疫ブロット解析により、ＧＦＰ−ＴＴＣがカベオリン３を有するラフトマイクロドメインと共移動することが明らかになった（図１０Ａ）。
【０１３６】
運動神経終末においてインビボで認められるＧＦＰ−ＴＴＣパッチが脂質マイクロドメインに対応するかどうかを検討するため、Ａｌｅｘａ５９４共役コレラ毒素Ｂ断片（ＣＴ−ｂ）との同時染色を行った。ＣＴ−ｂは、ガングリオシドＧＭ１に特異的に結合し、これはコレステロールに富む膜マイクロドメインに富み、膜ラフトおよびカベオラのマーカーとして一般的に用いられている（OrlandiおよびFishman, 1998; Schnitzerら、1995; Wolfら、1998）。ＧＦＰ−ＴＴＣとＡｌｅｘａ５９４共役ＣＴ−ｂ断片を腓腹筋に混注し、１；３；５；９および２４時間後に共焦点解析を行い、ＮＭＪがＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７共役α−ＢＴＸにより同定された（図１０Ｂ）。運動神経終末のＧＦＰ−ＴＴＣ標識は、組織を処理するのに必要な５分間未満で容易に可視化されたが（図６ＤおよびＤ’）、ＣＴ−ｂは、注入後数時間（３〜５時間）でようやくＮＭＪにおいて検出できた。したがって、シナプスを活性化させるＣＴ−ｂとＴＴＣ受容体の輸送の力学は明確に異なる。しかし、５時間後、ＣＴ−ｂで得られた分布はＧＦＰ−ＴＴＣ染色と同様であり、ＧＦＰ−ＴＴＣで得られた染色パターンの広汎な重複を有する拡散染色およびパッチを特徴とし、運動神経終末における脂質マイクロドメインでのＴＴＣプローブの局在化を示す（図１０Ｂ）。腓腹筋注入後２４時間で双方の毒素は内在化されていた。それは、大部分が両方の毒素に対して陽性である、わずかに少数のパッチがＮＭＪにおいて持続したためである（図１０ＢおよびＣ）。この時、ＧＦＰ−ＴＴＣとＣＴ−ｂの染色は、脊髄腹側角における同じ運動ニューロン細胞体において検出されたが、それは異なる小胞領域においてであった（図１１）。総合的に、これらの結果は、ＧＦＰ−ＴＴＣがＣＴ−ｂと異なる、ニューロン結合および／または内在化経路のための脂質マイクロドメインを用いたことを示す。
（材料および方法）
（抗体および試薬）
【０１３７】
Invitrogen社からウサギ抗ＧＦＰポリクローナル抗体を得た（１：５０００希釈）。カベオリン３に対するマウスモノクローナル抗体をTransduction Laboratories社から得た（１：５００）。Sigma社からモノクローナル抗神経フィラメント２００（クローンＮＥ１４）およびウサギポリクローナル抗トロポニンＴを得た。Molecular Probes社からＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４共役コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴ−ｂ）；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７共役α−ブンガロトキシン（α−ＢＴＸ）、およびＲＨ４１４を得た。Ｃｙ３共役ヤギ抗ウサギＩｇＧおよびＣｙ３共役ラット抗マウスＩｇＧをJackson Laboratories社から得た。ＴＲＩＴＣ共役α−ブンガロトキシンをCalbiochem社から得た。ウサギ抗ＴｒｋＢ（７９４）および抗ｐ−Ｔｒｋポリクローナル抗体をSantaCruz社から得た。K.Buckleyが開発したシナプス小胞タンパク質ＳＶ２に対するモノクローナル抗体を、ＮＩＣＨＤの後援で開発され、The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa Cityが維持しているDevelopmental Studies Hybridoma Bankから得た。シナプス小胞シナプトフィジンタンパク質に対するモノクローナル抗体をChemicon社から得た。ホースラディッシュペルオキシダーゼに共役したヤギ抗ウサギおよび抗マウスＩｇＧ抗体を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ検出試薬とともにPierce社から得た。組換え神経栄養因子ラットＣＮＴＦ；ヒトＮＴ３；ヒトＮＴ−４、ヒトＢＤＮＦ、ヒトＧＤＮＦ、および精製マウスＮＧＦ  ７ＳをAlomone labs社から購入した。神経栄養因子は、原液として調製し（１０μｇ／ｍｌ）、−８０℃でアリコートで保管した。
（インビボ筋注）
【０１３８】
フランスおよび欧州共同体の実験動物取扱いの指針に従って試験を行った。６週齢のスイス雌マウスをCharles River Breeding Laboratories社から得た。過去に報告されたように生成したβ−ｇａｌ−ＴＴＣ、ＧＦＰ−ＴＴＣ融合タンパク質（Coenら、1997）、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４共役ＣＴ−ｂを、麻酔マウスに対して腓腹筋に筋注し、あるいは長耳挙筋（Levator auris longus（ＬＡＬ））の直近にて皮下注射した。蛍光定量化のため、２５μｇのＧＦＰ−ＴＴＣ融合タンパク質を最終容量５０μｌのＰＢＳに注入した。免疫検出または生化学的抽出のため、５０μｇのＧＦＰ−ＴＴＣプローブを用いた。神経栄養因子との同時注入を行う際、注入容量は一定に維持した（５０μｌ）。高Ｋ＋での注入のため、６０ｍＭ  ＫＣＬを含有する生理溶液をプローブと同時注入した。
（ボツリヌスＡ型毒素の注入）
【０１３９】
雌スイスマウス（体重２４〜２７ｇ）のＬＡＬ筋肉の直近において、約０．５ｐｇの精製神経毒素を含有する０．０５ｍｌの単回投与として、ボツリヌスＡ型毒素（ＢｏＴｘ／Ａ）を皮下注射した。ＢｏＴｘ／Ａ処置後４８時間、神経伝達物質放出の遮断に起因するＬＡＬにおける筋肉麻痺を誘導するのに十分な時間で（de Paivaら、1999）、ＢＤＮＦ（５０ｎｇ）に関連して、あるいは関連せずに、ＧＦＰ−ＴＴＣ（２５μｇ）をＬＡＬ筋肉の直近に注入した。注入後３０分、ＰＦＡ  ４％の心臓内注射によりマウスを殺処分し、ＬＡＬ筋肉を採取して共焦点解析のために処置した。
（ＧＦＰ−ＴＴＣ局在化および共焦点捕捉のインビトロ解析）
【０１４０】
ＬＡＬ筋肉をその関連神経とともに雌スイスウェブスターマウス（２０〜２５ｇ）から単離し、頚椎脱臼により殺処分した。次の組成物（ｍＭ）の標準的酸化生理溶液により灌流したＲｈｏｄｏｒｓｉｌ（登録商標）裏地の器官槽（２ｍｌ容積）にＬＡＬ筋肉を取り付けた：ＮａＣｌ  １５４；ＫＣｌ  ５；ＣａＣｌ２  ２；ＭｇＣｌ２  １；ＨＥＰＥＳ緩衝液５（ｐＨ＝７．４）、およびグルコース１１。２５μｇ  ＧＦＰ−ＴＴＣおよび３０μＭ  ＲＨ４１４を用いて、筋肉を暗室・室温で４５分装入し、標準溶液またはシナプス小胞再利用のためには高Ｋ＋等張液（６０ｍＭ  ＫＣｌが６０ｍＭ  ＮａＣｌに置換）に溶解した。調製物をＧＦＰ−ＴＴＣおよびＲＨ４１４染料から洗い流し、染料非含有標準溶剤で数回洗浄し、その後、×４０水浸型レンズ（Ｌｅｉｃａ、ＮＡ０．８）を備えたＬｅｉｃａ  ＤＭ−ＲＸＡ２直立顕微鏡に装着したＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２共焦点レーザースキャン顕微鏡装置（Leica Microsystems社、ドイツ）により画像撮影を行った。共焦点システムは、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＮＴワークステーションで作動するＬｅｉｃａ社提供のソフトウェアを通じて制御した。
（界面活性剤抵抗性膜（ＤＲＭ）フラクションの調製およびウェスタンブロット）
【０１４１】
界面活性剤抵抗性膜フラクションの調製は、脂質ラフトを研究するのに最も広範に用いられている方法の１つである。ＧＦＰ−ＴＴＣ注入（５０μｇ）後２時間、マウス腓腹筋組織を採取し、ハサミで切り刻み、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する２ｍｌのＭＥＳ緩衝塩水中で均質化した。均質化は、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織グラインダーを用いて行った。低速で５分間の遠心分離後、上清を４０％ショ糖に調製した。５〜３０％線形ショ糖勾配がホモジネート上に形成され、ＳＷ４１ローターにおいて３９，０００ｒｐｍにて１８時間遠心分離した。次に、勾配上部から１ｍｌの１１〜１２フラクションを回収し、０．０５％デオキシコール酸ナトリウムの存在下、６．５％トリクロロ酢酸により沈降させ、８０％冷アセトンにより洗浄した。引き続いてウェスタンブロットを行う４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ウェスタンブロットにより試料を分析した。まず、膜をポリクローナル抗ＧＦＰおよびモノクローナル抗カベオリン３抗体により精査し、次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼに共役したヤギ抗ウサギＩｇＧおよびヤギ抗マウスＩｇＧ抗体によりインキュベートした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（Pierce社）を用いて反応を可視化した。
（ＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ蛍光強度の定量化）
【０１４２】
心臓内灌流および固定の後、ＬＡＬ筋肉を回収し、ＰＢＳ中にて２０分洗浄し、ＰＢＳ中にて３７℃で４５分、ＴＲＩＴＣ共役ａ−ブンガロトキシン（ＴＲＩＴＣ−ａ−ＢＴＸ）（２μｇ／ｍｌ）で染色し、ＰＢＳ中にて２回洗浄した。ＬＰ５６０およびＢＰ５０５−５５０フィルタを用いて×４０／１．２水浸対物レンズを通じてＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍレーザースキャン共焦点顕微鏡（ＬＳＭ−５１０  Ｚｅｉｓｓ社；バージョン３．２）で画像を得た。ピンホール開口部を１エアリー単位に設定し、画像を８ビットの分解能にてデジタル化して５１２×５１２ピクセル配列にした。異なる試験間のＧＦＰ染色の強度を比較可能にするため、レーザー照射、線形応答に関する光電子増倍ゲイン、および他の捕捉変数を標準化した。ＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ局在化を定量化するため、（ＭＩＰ：最大輝度投影の）一連の「ルックスルー」投影を生成した。各ＮＭＪ由来の画像は同一に処理した。ＮＭＪ表面積（μｍ２）をＴＲＩＴＣ−ａ−ＢＴＸ標識により測定し、次に、ＧＦＰ蛍光の全体的強度（各ピクセル強度の合計）をこの既定の領域においてのみ測定した。ＮＭＪ領域で割ったこの値は平方ミクロンあたりのＧＦＰ蛍光強度を出し、したがって、これは任意の単位として表される蛍光レベルを定義した。各条件に対し、約１５〜２０のシナプスを定量化し、結果を平均±ＳＤと表した。両側ｔ検定を用いて統計的有意性をｐ＜０．０５と定義した。各試験は少なくとも２回または３回繰り返した。
（脊髄の解析）
【０１４３】
β−ｇａｌ−ＴＴＣまたはＧＦＰ−ＴＴＣおよびＣＴ−ｂの腓腹筋への注入（各５０μｇ）後２４時間に、深い麻酔をかけたマウスを４％ＰＦＡにより心臓内灌流した。脊髄を採取し、０．１Ｍ  ＰＢＳ中２５％ショ糖において一晩のインキュベーションの後、ティシュ・テック（Tissue Tek）包埋剤に埋め込んだ。クリオスタット縦断切片（厚さ３０μｍ）を切断し、被覆スライドにマウントした。
（Ｘ−ｇａｌ反応）
【０１４４】
過去に報告されたように（Coenら、1997）、Ｘ−ｇａｌ反応を行った。
【０１４５】
実施例１５：培養の準備
新生（Ｐ０−Ｐ２）スイスマウスから皮質組織を切開する。室温で２分、０．２５％トリプシンで、次に室温で２分、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅにより穏やかに処置して解離皮質ニューロンを得る。次に、細胞懸濁液を１０％ＦＢＳにより補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Life Technologies社、Cergy Pontoise、フランス）で洗浄し、狭小化パスツールピペットにより機械的に分散し、ナイロンフィルター（８０：ｍ細孔径； Millipore社、マサチューセッツ州ベッドフォード）に通す。細胞を２０，０００細胞／ｃｍ２の密度で３５ｍｍガラスボトムプレート（MatTek Co., マサチューセッツ州アシュランド）において平板固定し、試験処置前に１４日間、空気９５％およびＣＯ２５％の水飽和雰囲気にて３７℃で培養する。培地は、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Life Technologies社）およびニューロンの生存率を高め、グリア細胞の増殖を抑制するため（Brunner, 1981）１００：ｇ／ｍｌトランスフェリン（Sigma-Aldrich社、フランス、リヨン）、２０ｎＭセレニウム（Sigma-Aldrich社）、２０ｎＭヒドロコルチゾン（Sigma-Aldrich社）、２０ｎＭプロゲステロン（Sigma-Aldrich社）、ならびに５：ｇ／ｍｌインスリン（Sigma-Aldrich社）からなる。培地は、細胞を平板固定した２４時間後に１回のみ交換する。
【０１４６】
器官型切片を得るため、脳塊全体をMcllwain組織チョッパー（Campden Instruments Ltd., 英国）下で腹側に配置し、皮質から厚さ４００−：ｍの冠状切片を得る。注意深く切片をコラーゲン被覆された孔径３−：ｍの膜（Transwell-Col; Corning B.V.,Schiphol-Rijk、オランダ）に平板固定し、１％ペニシリン／ストレプトマイシンとともにＤＭＥＭ／Ｆ１２においてインキュベートし、解離細胞培養のために前記列挙した同じ化合物を補充する。培地レベルは、培地と気体の混合相を維持するためコラーゲン被覆膜のわずか上に調節し、１週間に２回交換する。切片は、最長１４日まで３７℃で維持する（空気９５％およびＣＯ２  ５％）。
【０１４７】
実施例１６：ＧＦＰ−ＴＴＣの結合および内在化
本発明において用いるハイブリッドタンパク質リポーターは、破傷風毒素（ＴＴＣ）の非毒性Ｃ末端断片に結合したクラゲの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなり、多少改変して他の文献に記載されているように精製した（Coenら、1997）。簡単に述べると、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＲ３３１５をｐＧＥＸ：ＧＦＰ−ＴＴＣプラスミドでトランスフェクションし、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３２℃にて一晩増殖させた。１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドおよび１ｍＭ  ＭｇＣｌ２による２時間のインキュベーションによりタンパク質の発現を誘導した。次に、細菌を遠心分離し（２０分、３，０００ｒｐｍ）、溶解緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、４ｍＭ  １，４−ジチオ−ＤＬ−スレイトール、２０％グリセロ−ル、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、および１００μｇ／ｍｌ抗プロテアーゼ混合物（Roche社））で洗浄し、フレンチプレスで溶解し、３０，０００ｒｐｍで１０分回転させた。上清をグルタチオン−セファロース４Ｂ（Stratagene社）で穏やかに撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。その後、マトリックスを溶解緩衝液（リゾチームおよびグリセロ−ルを含まず）およびＰＢＳで各々３回洗浄した。１０ユニット／ｍｌトロンビン（Sigma-Aldrich社）を用いた一晩のインキュベーションにより、ＧＦＰ−ＴＴＣ−グルタチオントランスフェラーゼを切断した。最後に、ＧＦＰ−ＴＴＣをＹＭ−５０セントリコンチューブ（Amicon社）で５，０００ｒｐｍにて２０分遠心分離することにより、ＧＦＰ−ＴＴＣを濃縮し、タンパク質の収量をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより計算した。
【０１４８】
解離皮質ニューロンの表面へのＧＦＰ−ＴＴＣの結合を検討するため、３７℃で３０分、細胞を１．５μｇ／ｍｌ  ＧＦＰ−ＴＴＣに暴露した。次に、細胞を培養液で洗浄し、マルチトラック動作モードを内蔵したアルゴン−ヘリウム／ネオンレーザーを備えるとともに、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３Ｘ／ＮＡ  １．４および１００Ｘ／ＮＡ  １．４油浸対物レンズを取り付けた共焦点レーザースキャン顕微鏡（Axiovert200M; Carl Zeiss社）の温度制御ステージに載置した。次に、細胞を４８８ｎｍで落射照明し、５００〜５５０ｎｍ帯域通過フィルタを有するＧＦＰ蛍光シグナルを捕捉した。パッケージソフトウェアＬＳＭ５１０（Carl Zeiss社）によりＺスタック画像取得を制御した。
【０１４９】
共局在試験では、先にＧＦＰ−ＴＴＣでインキュベーションした皮質細胞を、キットの説明書に示されるように、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）を被覆した５００−ｎｍまたは１００−ｎｍ径のカルボキシレート修飾赤色蛍光ビーズ（５８０／６０５ｎｍ  ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）；Molecular Probes）に暴露した。
【０１５０】
緑色および赤色蛍光物質をそれぞれ４８８および５４３ｎｍにて励起し、放射された蛍光シグナルをＰｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３Ｘ／ＮＡ  １．４もしくはＰｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  １００Ｘ／ＮＡ  １．４油浸対物レンズを備えたＮｉｐｋｏｗ  Ｄｉｓｋ共焦点顕微鏡（Perkin Elmer社）またはＰｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３Ｘ／ＮＡ  １．４油浸対物レンズを取り付けた共焦点スキャン顕微鏡（Carl Zeiss社）で記録した。
【０１５１】
細胞膜における結合分布およびハイブリッドタンパク質の細胞内動態の画像を、０．５〜１μｍ光学断面で回収し、単一画像にてオフラインで投影した。Ｎｉｐｋｏｗ  Ｄｉｓｋ共焦点を使用した場合、画像取得は、パッケージソフトウェアＵｌｔｒａＶｉｅｗ（ビニング２；Perkin Elmer社）により制御した。皮質ニューロン内のＧＦＰ−ＴＴＣの内在化におけるＢＤＮＦの作用をリアルタイムで検討するようにデザインされた試験では、細胞を１−μｌ液滴の１μｇ／μｌ  ＧＦＰハイブリッドタンパク質（最終濃度１μｇ／ｍｌ；Clontech社）、１μｇ／μｌ  ＧＦＰ−ＴＴＣ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）、または１μｇ／μｌ  ＧＦＰ−ＴＴＣと５０ｎｇ／μｌ  ＢＤＮＦ（最終濃度はそれぞれ１μｇ／ｍｌと５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する混合物に暴露した。続いて、共焦点レーザースキャン顕微鏡（Carl Zeiss社）により１分ごとに蛍光画像を捕捉し、各時間ポイントで細胞内光学密度を計算した。可能な場合、参考目的で各収録の開始および終了時に細胞の明視野画像を捕捉した。
【０１５２】
実施例１７：ＧＦＰ−ＴＴＣの細胞内局在化および輸送
解離皮質ニューロンにおけるＧＦＰ−ＴＴＣの細胞内分布および動態を検討するため、ＧＦＰのコード配列のＴＴＣ下流を発現する構築物（ｐＧＦＰ−ＴＴＣ）で細胞をトランスフェクションした。遺伝子発現は、強力なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの調節下にあった。可視化前に３７℃（空気９５％およびＣＯ２５％）で２４〜４８時間、Lipofectamine 2000（BD Biosciences Clontech社、カリフォルニア州パロアルト）とＧＦＰ−ＴＴＣリポータープラスミド（３：１）の混合物を用いたインキュベーションにより、培養細胞をトランスフェクションした。器官型切片における皮質細胞のトランスフェクションのため、これらを、３７℃（空気９５％およびＣＯ２５％）で５日間、ＧＦＰ−ＴＴＣを発現しているイヌアデノウイルス（ＣＡＶ−２；（５））（Dr.Eric J.Kremer, Molecular Genetic Institute，フランス国モンペリエのご厚意により提供）の５×１０８粒子に暴露した。
【０１５３】
リポーター構築物ＧＦＰ−ＴＴＣを発現している皮質ニューロンの可視化は、マルチトラック動作モードを内蔵したアルゴン−ヘリウム／ネオンレーザーを備えるとともに、Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３Ｘ／ＮＡ  １．４対物レンズ（Carl Zeiss社、Le Pecq、フランス）を取り付けた共焦点顕微鏡の温度制御ステージに培養プレートを載置することにより評価する。５００〜５５０ｎｍ帯域通過フィルターを有するＧＦＰ蛍光シグナルを捕捉するため、４８８ｎｍで落射照明を設定する。器官型切片におけるＧＦＰ−ＴＴＣ発現ニューロンの可視化のため、Mira 900 Modelocked  チタン：Ｓａｐｐｂｉｒｅレーザーシステム（Coherent Inc., 米国カリフォルニア州サンタクララ）および１０ＷでのＶｅｒｄｉダイオード励起固体アルゴンレーザー（Coherent Inc.）からなる多重光子顕微鏡を用いる。画像取得は、Ａｃｈｒｏｐｌａｎ  ２０Ｘ／ＮＡ、０．７５対物レンズ（Carl Zeiss社）を、焦点深度に依存して８８０〜９２０ｎｍ励起波長として用いて評価する。異なる試験設定の画像取得条件を標準化するため、電子ゲインおよびオフセットを最も明るい共焦点面における彩度レベル（saturation level）のすぐ下に設定し、対象領域あたり５０スタック（１０２４×１０２４ビット）を捉える。培養皮質細胞および器官型切片の画像化に使用するソフトウェアパッケージは、ＬＳＭ５１０（Carl Zeiss社）である。
【０１５４】
陽性ニューロンを選択して高拡大率でスキャンし（Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３Ｘ／ＮＡ  １．４）、樹状突起およびシナプス後構造を同定した。画像は、０．１〜０．２μｍごとに取得し、単一画像にて３次元的に再構成した。
【０１５５】
ＧＦＰ−ＴＴＣ蓄積構造と機能的シナプス前終末との関連性は、ＧＥＰ−ＴＴＣに同時に結合するＦＭ１−４３の経時画像の可視化により判定する。シナプス前部位マーカーとしてＦＭ１−４３を用いる理由は、膜ターンオーバーが重要である膜領域にこのスチリル色素が結合することが示されているためである（Cochilla, 1999）。シナプス前終末が神経伝達物質によりエキソサイトーシス／エンドサイトーシスの高ターンオーバーを有する限り、ＦＭ１−４３は、膜の他の領域よりこれらの部位に早く結合する。ＧＦＰ−ＴＴＣ発現培養ニューロンは局在化し、対象領域として樹状突起棘が選択される。次に、細胞を２：Ｍ  ＦＭ１−４３に暴露し、対象領域を３秒ごとに画像化して経時的にＦＭ１−４３の結合を可視化する。
【０１５６】
エンドサイトーシス／エキソサイトーシス活性構造の同定をＦＭ１−４３（Molecular Probes社）画像試験により行った。この親油性蛍光色素は、膜の活性域における小胞の再生を可視化するために広範に使用されている（Cochillaら、1999）。したがって、本発明では、重要な膜ターンオーバーを示すシナプス後構造を標識するためにＦＭ１−４３を用いた。したがって、ＧＥＰ−ＴＴＣを発現している皮質ニューロンを２μＭ  ＦＭ１−４３に暴露し、特定の試料においてオンラインで異なる蛍光色素から発光スペクトルを計算し分離することが可能なスペクトル脱回旋ハードウェアを備えたレーザースキャン共焦点顕微鏡を用いて３分ごとにモニタリングした。
【０１５７】
シナプス後終末に達するのにＧＥＰ−ＴＴＣが用いる細胞内経路を検討するようにデザインされた試験において、皮質ニューロンをｐＧＦＰ−ＴＴＣとｐＤｓＲｅｄ２−ＰＳＤ−Ｚｉｐ４５で同時トランスフェクションした。後者のタンパク質は、Ｈｏｍｅｒ  １ｃおよびＶｅｓｌ−１Ｌとも称され（Katoら、1998; Xiaoら、1998）、興奮性シナプス後部位に局在する係留−足場タンパク質である（Okabeら、2001）。ＥＧＦＰコード領域をｐＥＧＦＰ−Ｃ２−ＰＳＤ−Ｚｉｐ４５（Shigeo Okabe博士；東京医科歯科大学のご厚意により提供）のコード配列から切除し、ＤｓＲｅｄ２のコード配列にインフレームで融合し、Ｎ末端がＤｓＲｅｄ２で標識されたＰＳＤ−Ｚｉｐ４５を生成した。
【０１５８】
皮質ニューロンの同時トランスフェクションは、３μｌリポフェクタミン２０００（Clonetech社）中の各プラスミド構築物１μｇの添加により行った。３７℃で５％ＣＯ２でのインキュベーションの２４〜４８時間後、共焦点顕微鏡（Carl Zeiss社）で陽性ニューロンが画像化された。光学断面画像を０．２〜０．５μｍごとに取得し、単一画像で投影し、両方のタンパク質の共局在の程度をオフラインで計算した。
【０１５９】
実施例１８：ＧＦＰ−ＴＴＣの経ニューロン輸送
皮質ニューロンにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ動態の性質を判定するため、トランスフェクションした細胞を、Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３Ｘ／ＮＡ  １．４油浸対物レンズを備えた高速画像取得Ｎｉｐｋｏｎ  Ｄｉｓｋ共焦点顕微鏡（ビニング２；Perkin Elmer社、マサチューセッツ州ウェルズリー）に配置し、観察下の細胞の樹状突起近傍に置かれた顕微注入ピペット（Eppendorf社、ドイツ、ハンブルク）によりＤＭＥＭ／Ｆ１２（対照条件）または５０ｎｇ／ｍｌ脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）で局所的に処理する。ＢＤＮＦは、この因子がシナプス活性（Kovalchuk, 2002）およびシナプス後部位の再形成（Shimada, 1998）を調整することが示されているため、処理剤として選択した。ＢＤＮＦの作用がＩＴＣ特異的であることを確認するため、ＧＥＰのみを発現している皮質ニューロンに同じプロトコルを適用する。
【０１６０】
ＢＤＮＦによる処理後の細胞内ＧＦＰ−ＴＴＣプールの変化が実際に分泌機構に関係しているかどうかを確認するため、ＧＦＰ−ＴＴＣ発現細胞にＳＮＡＰ−２５に対する中和抗体を微量注入する。このタンパク質が小胞ドッキング複合体の基本構成物である限り（Nehta, 1996）、その遮断は小胞の放出を阻止し、ＧＦＰ−ＴＴＣ放出におけるこの分泌経路の関与の評価が可能になる。細胞を４８８ｎｍレーザー照射に暴露し、５００−５５０ｕｍ帯域通過フィルタを用いて２分間にわたり６秒ごとに２０個の光学断面を回収する。画像取得は、パッケージソフトウェアＵｌｔｒａＶｉｅｗ（Perkin Elmer社）により制御する。
【０１６１】
ハイブリッドタンパク質の経シナプス輸送におけるＢＤＮＦの役割を明らかにするため、解離皮質細胞をＧＦＰ単独またはＧＦＰ−ＴＴＣをコードしている構築物でトランスフェクションし、２４〜４８時間後、Nikon Disk共焦点顕微鏡（ビニング２；Perkin Elmer社）に載置した。ＧＦＰおよびＧＦＰ−ＴＴＣ発現細胞を位置特定し、画像化細胞近傍に置かれた顕微注入ピペット（Eppendorf社）によりＤＭＥＭ／Ｆ１２または５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦで局所的に処理した。ＢＤＮＦを原因とする細胞内蛍光の喪失が、実際にエキソサイトーシスの増大によるものであるのか、あるいはタンパク質の細胞内分解によるものなのかを判定するため、本発明者らは、ＳＮＡＰ−２５マウス（Sternberg Monoclonals Inc.）に対する中和抗体を顕微注することによりＳＮＡＰ−２５プールを免疫低下させ、ＧＦＰ−ＴＴＣの漸進的消失に対するＢＤＮＦの局所適用効果をモニタリングした。この抗体は、ＳＮＡＰ−２５活性を阻害することにより、シナプトソーム調製物（Mehtaら、1996）および視床下部神経細胞（Vazquez-Martinezら、2001a; Vazquez-Martinezら、2001b）における刺激依存性エキソサイトーシスを完全かつ迅速に阻止することが示されている。これらの条件下、ＧＦＰ−ＴＴＣ発現ニューロンの２０個の光学断面を２分間にわたり６秒ごとに回収し、各時間点に対して細胞内蛍光をオフラインで判定した。
【０１６２】
実施例１９：棘内におけるＧＦＰ−ＴＴＣ蓄積の定量化
異なる細胞内領域におけるＧＦＰ−ＴＴＣ蓄積を比較するため、最初に画像をデコンボリューションソフトウェアＨｕｙｇｅｎｓ２．４．４（Scientific Imaging Volume社、Hilverson、オランダ）で処理し、単一画像で投影した。樹状突起幹（dendritic shafts）における無作為の１−：ｍ２対象領域を選択し、その集積光密度（ＩＯＤ）をＩｍａｇｅＪ  Ｉ．２９ｘソフトウェア（ＮＩＨ、メリーランド州ベテスダ）により計算し、樹状突起棘から得たＩＯＤと比較した。すべてのデータは、樹状突起幹内で選択されるすべての領域から計算される平均ＩＯＤに標準化し、次に、統計学的に比較する（Newman Keuls多重比較検定；統計学的有意性は、Ｐ＜０．０５かどうかで考察する）。これらのニューロン領域におけるＩＯＤの差異が特に検討しているＴＴＣに依存するのか、あるいはＧＦＰの予期しない隔離によるものかを判定するため、ｐＧＦＰ−ＴＴＣと同じトランスフェクションプロトコルを用いて、ＧＦＰのみを発現しているプラスミドでトランスフェクションした皮質ニューロンにおいて同じ細胞内蛍光解析を行う。
【０１６３】
実施例２０：ＧＦＰ−ＴＴＣ細胞内動態の解析
ＧＦＰ−ＴＴＣ細胞内動態は、Ｎｉｐｋｏｎ  Ｄｉｓｋ共焦点平面を単一画像で投影し、ImageJ I.29xを用いて全細胞および樹状突起内における無作為に選択した１：ｍ２対象領域から経時的にＩＯＤを計算することにより評価する。ＤＭＥＭ／１２およびＢＤＮＦで処理した細胞からのデータを最初の時間点に標準化し、平均化し、統計学的に比較する（Newman Keuls多重比較検定）。ＧＦＰ−ＴＴＣ発現ニューロンに抗ＳＮＡＰ−２５を顕微注し、ＢＤＮＦで処理したＧＦＰ発現ニューロンに同じ解析手順をあてる。
【０１６４】
次の結果は、実施例１５〜２０で得られた。
【０１６５】
ＧＦＰ−ＴＴＣは、ＢＤＮＦ誘導のニューロン活性を通じて皮質細胞内に内在化した細胞質膜の特定のマイクロドメインに結合する。
【０１６６】
まず、ＧＦＰ−ＴＴＣの分布パターンは、解離皮質細胞の膜に特徴づけられた。３０分のインキュベーション後、ＧＦＰ−ＴＴＣは、細胞全体にわたり断続的に皮質ニューロンの細胞表面に結合することが見出された。図１２Ａには、ＧＦＰ−ＴＴＣのこのような斑状分布を示す皮質ニューロンの２つの代表例を示す。膜におけるＧＦＰ−ＴＴＣの蓄積は、平均面積１．１６±０．１１μｍ２および密度３．５０±０．７１パッチ／１０μｍ２を示した。ＧＦＰ−ＴＴＣは、細胞質膜の特定の領域に蓄積するが、組換えＧＦＰ単独では同じ試験条件でそうではないことから、これらの結果により、皮質ニューロンにおいてＴＴＣに高親和性を示す特異的な膜マイクロドメインの存在が示唆される。さらに、神経細胞の表面上を移動する動的構造であるこれらのマイクロドメインは、活性依存的にＧＦＰ−ＴＴＣのエンドサイトーシス担体として作用することが見出された。したがって、本発明において、全体的な膜脱分極が特定の膜マイクロドメインにおけるＧＦＰ−ＴＴＣの取込みを惹起することが見出された。図１２Ｂに示すように、５０ｍＭ  ＫＣＬの局所投与後、ＧＦＰ−ＴＴＣクラスターを担持した膜マイクロドメインは、膜の異なる領域に移動し、ここで個別のエンドサイトーシスバーストとして内在化が生じ、そしてＴＴＣの内因性受容体が脂質ラフトに位置し、これらが膜の他の領域と異なるコレステロール組成を有する膜マイクロドメインであり、これらの領域に調節かつ対処可能なある種の運動性を付与することが示唆される。
【０１６７】
過去の研究では、ＴｒｋＢおよびｐ７５のようなニューロトロフィン受容体が、毒素結合ガングリオシドを含め、細胞質膜において他の受容体との相互作用を確立し、ニューロトロフィン−受容体リン酸下に関連する細胞内シグナル伝達カスケードを増強することが示されている（Chao, 2003）。したがって、病原体および神経毒素は細胞に侵入し、標的組織に向かって長距離を逆行性に移動するために、ニューロトロフィン受容体の既存のエンドサイトーシス機構を「乗っ取る」可能性が示唆されている（ButowtおよびVon Bartheld, 2003）。
【０１６８】
そして、本発明の次の目的は、ＧＦＰ−ＴＴＣ内在化とニューロトロフィン受容体活性化の関係が示され得るかを検討することであった。脳由来の神経栄養因子（すなわち、ＢＤＮＦ）を被覆した５００−ｎｍ蛍光ミクロスフェアを用いて、細胞質膜におけるＧＦＰ−ＴＴＣの凝集は、蛍光ビーズと緊密に接触することが多く、これにより内在化前にＴＴＣ結合受容体がＢＤＮＦ受容体に隣接する膜マイクロドメインに存在することが示されることが見出された（図１３Ａ）。
【０１６９】
ＢＤＮＦが量的な神経伝達物質の放出、そして結果的にシナプス小胞の回収を亢進することから（Tylerら、2002; TylerおよびPozzo-Miller, 2001）、この神経栄養因子が皮質ニューロン内のＧＦＰ−ＴＴＣ取込みに関与するかどうかが検討された。ＧＦＰ−ＴＴＣ単独に比し、ＧＦＰ−ＴＴＣの存在下で５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦに暴露した細胞は、処理１分以内に細胞内ＧＦＰ蛍光の１０倍の増大を示し、これは試験の間全体にわたり持続した（図１３Ｂ）。これらの結果は、ＢＤＮＦ受容体活性化が皮質ニューロン内のＧＦＰ−ＴＴＣの活性依存性内在化の基本要素であることを示し、これは活性域におけるエンドサイトーシス小胞再生の亢進に起因すると思われる。
【０１７０】
ＧＦＰ−ＴＴＣは、それぞれ活性化ＢＤＮＦ受容体およびシナプス後肥厚タンパク質が用いる経路と同様の経路を用いて、シナプス前出芽から細胞体へ逆行性に移動し、そしてここからシナプス後部位へ移動する。
【０１７１】
次に、ＧＦＰ−ＴＴＣの細胞内輸送をリアルタイムで検討するため、高速共焦点Ｎｉｐｋｏｗスキャン顕微鏡により、活性化ＢＤＮＦ受容体の逆行性輸送と同時に細胞内ＧＦＰ−ＴＴＣの可動性の経時モニタリングを行った。これを行うため、ＧＦＰ−ＴＴＣと組み合わせてＢＤＮＦを被覆した１００ｎｍ蛍光ビーズ（これは５００ｎｍビーズと対照的に細胞に活発に取り込まれるほど小さい）を用いて細胞をインキュベートし、その細胞内輸送を３０分にわたり３０秒ごとに記録した。図１４Ａに示す代表例に示すように、ＢＤＮＦ被覆ビーズは、ＧＦＰ−ＴＴＣ細胞内クラスターの近傍にあることが多かった。ＩｍａｇｅＪ  １．２９ｘ用にテキサス州立大学のJeffrey Kuhnが開発した粒子追跡プラグインにより評価されるように、経時モニタリングによりどちらのタンパク質も細胞体に到達するため同様の細胞内逆行性経路に従うことが明らかになった（図１４Ｂ）。さらに、蛍光クラスターが横断した距離の機能で計算した速度は、ＧＦＰ−ＴＴＣおよびＢＤＮＦ被覆ビーズの双方で同様であり（それぞれ１．７３±０．３７対１．２４±０．１８μｍ／ｍｉｎ）、拡散係数は、細胞内ブラウン運動の場合に予測される拡散係数より２０〜２５倍低かった。したがって、これらの知見により、これらのタンパク質の自由運動は、一般的な細胞内逆行性輸送機構と思われるものにより厳しく制限されることが示される。しかし、細胞内の緑色および赤色蛍光シグナルの完璧な重なりは見出されず、また、ＧＦＰ−ＴＴＣおよびＢＤＮＦ被覆ビーズの輸送が独立していることが多いという事実により、ＧＦＰ−ＴＴＣおよび活性化ＢＤＮＦ受容体が実際には別の輸送小胞内に制約されていることが示唆され、これは異なるエンドサイトーシス経路の結果であり得る。
【０１７２】
次に、ＧＦＰ−ＴＴＣの細胞体からシナプス後部位への輸送を検討した。まず、皮質ニューロンをＴＴＣと並行してＧＦＰをコードしているプラスミド構築物でトランスフェクトし、離れた樹状突起の光学断面をレーザースキャン共焦点顕微鏡法により捉えた。ニューロンにより生成されたＧＦＰ−ＴＴＣが０．９９±０．０６μｍ径の円形で棘状構造に蓄積することが見出された（図１５Ａ）。
【０１７３】
これらのニューロン構造におけるエキソサイトーシス／エンドサイトーシスを評価するため、ＧＦＰ−ＴＴＣ発現皮質ニューロンをスチリル色素ＦＭ１−４３に暴露し、その活性域への結合を経時的にモニタリングした。図１５Ｂに示すのは、３０分のインキュベーション後のＦＭ１−４３蛍光の分布の代表例である。図示するように、色素は、シナプス後棘に形態上類似した神経突起の異なる領域に凝集した（円形突起の直径は、０．９２±０．０４μｍ）。
【０１７４】
さらに、経時的試験によりＧＦＰ−ＴＴＣを蓄積する樹状突起は、ＦＭ１−４３結合の最初の標的となることが明らかになった。図１５Ｃに表すのは、ＧＦＰ−ＴＴＣを蓄積する樹状突起の高拡大率での時間連続画像である。培地に加えたＦＭ１−４３は、細胞質膜の他の領域より優先的に樹状突起のある領域に蓄積し始め、こうしてこれらの部位がエキソサイトーシス／エンドサイトーシスの高ターンオーバーを有する領域を表すことが示される。
【０１７５】
これらの知見に鑑みて、次の疑問は、これらのニューロンにより発現されるプローブがどのようにしてこれらのシナプス後構造に特異的に局在化するかということであった。ＧＦＰ−ＴＴＣは、シナプス後肥厚（ＰＳＤ）に特異的に局在する係留−足場タンパク質により用いられる細胞内輸送経路に寄生し得ると考えられた。このタンパク質ファミリーは、相互作用モチーフを有するＰＳＤタンパク質を含み、これらはＰＳＤにおける特定の受容体の特異的局在化に重要である。これまでに最良に報告されているＰＳＤタンパク質の分子組織は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体相互作用ＰＳＤ−９５のものである（Sheng, 2001）。しかし、本発明では、Ｈｏｍｅｒ／Ｖｅｓｌファミリーの最近になって単離されたメンバーを選択し、ＰＳＤ−Ｚｉｐ４５と称した（Ｈｏｍｅｒ  １ｃおよびＶｅｓｌ−１Ｌとも称される（Katoら、1998; Xiaoら、1998））。これはＧＦＰ−ＴＴＣに類似し、ニューロン活性に依存してシナプス後構造に向かって急速な再分布を受ける。対照的に、ＰＳＤ−９５は、数時間にわたり安定したクラスターを形成する（Okabeら、2001）。シナプス後棘に対するこの構造タンパク質の活性依存性対応は、これらの構造に到達するために両方のタンパク質により用いられる輸送機構の間の関係の存在を示し得る。
【０１７６】
この可能性を検討するため、細胞をｐＧＦＰ−ＴＴＣとｐＤｓＲｅｄ２−ＰＳＤ−Ｚｉｐ４５リポーター構築物で同時トランスフェクションし、両方のタンパク質の細胞内分布をモニタリングした。図１６に示すのは、ＧＦＰ−ＴＴＣとｐＤｓＲｅｄ２−ＰＳＤ−Ｚｉｐ４５タンパク質の両方を発現している皮質細胞の２例である。ＧＦＰ−ＴＴＣ由来の大部分の細胞内蛍光は拡散するが、プローブが蓄積する細胞の領域がある。ＧＦＰのみを発現する構築物でトランスフェクションし、同様のインキュベーション時間後に画像化された皮質細胞が蛍光シグナルのこのような細胞内分布を示さなかったことから、これらの蓄積は、プローブ沈着の結果ではない。さらに、ＧＦＰ−ＴＴＣの細胞内蓄積は、細胞体および樹状突起内のＰＳＤ−Ｚｉｐ４５クラスターと強力に共局在し、これにより両方のタンパク質がシナプス後領域に達するため共通の輸送経路を有することが示される。
【０１７７】
ＧＦＰ−ＴＴＣは、ＢＤＮＦ依存性過程を通じて皮質細胞からエキソサイトーシスされる。
【０１７８】
これまでに、ＢＤＮＦおよび他のニューロトロフィンが逆行性にその作用を及ぼすだけでなく、順行性としても機能することができ、これによりシナプス後細胞にも影響を及ぼすという証拠が集積している（HeerssenおよびSegal, 2002）。後者において、ＢＤＮＦの局所適用により隣接する棘にＣａ２＋過渡が生じ、長時間の増強作用の迅速かつ堅固な誘導を生じさせることが示されている（Kovalchukら、2002）。このことから、次に検討したのは、ＢＤＮＦがシナプス後ニューロンからシナプス前ニューロンへのＧＦＰ−ＴＴＣの経シナプス輸送にも役割を果たす可能性であった。これを行うため、前記の顕微注システムを用いてＧＦＰ−ＴＴＣ発現細胞の近傍に少量の（ピコリットル単位の）ＢＤＮＦを放出し、経時的に細胞内蛍光の変化をモニタリングした（図１７Ａ）。
【０１７９】
この試験的手法を用いて、ＢＤＮＦは、細胞内蛍光の漸進的喪失を誘導することが見出され、これはＢＮＤＦ投与後１２時間以内に有意なレベルに達した（図１７Ｂ）。さらに、細胞が細胞内蛍光レベルの５０％を失うのに必要な計算時間は、ＢＤＮＦの非存在の場合より存在の場合のほうが７倍早かった（それぞれ１０．１±２．２分対６９．６±２９．４；Ｐ＜０．０５、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定）。
【０１８０】
ＧＦＰ−ＴＴＣエキソサイトーシスを誘導するＢＤＮＦの特異性を判定するため、本発明者らは、ＧＦＰのみをコードしている構築物でトランスフェクションした細胞をＢＤＮＦに暴露するように進め、処理後、細胞内蛍光の変動を解析した。これらの条件下、ＢＤＮＦの投与により、ＧＦＰ−ＴＴＣ発現細胞を培地に暴露した場合に認められた（７１．５３±２７．２９分で５０％の細胞内蛍光の喪失）のと同様の細胞内蛍光の緩徐な減衰が生じ、ＢＤＮＦは、細胞から出るためＧＦＰ−ＴＴＣにより用いられるエキソサイトーシス機構を特異的に調整することが示される。しかし、細胞内蛍光の喪失がエキソサイトーシスターンオーバーの増大ではなくタンパク質の急速な分解により生じる可能性を払拭するため、小胞の細胞膜への融合に重要なタンパク質ＳＮＡＰ−２５（Mehta, 1996）を、ＢＤＮＦ投与前にＧＦＰ−ＴＴＣ発現ニューロン内でモノクローナル抗体の顕微注により免疫中和した。この手法を用いることにより、ＳＮＡＲＥ依存性エキソサイトーシスの遮断後、細胞内蛍光の減少に対するＢＤＮＦの作用は、激しく低下したが、完全には阻害されないことが見出された（図１７）。刺激依存性エキソサイトーシスを遮断する点における抗ＳＮＡＰ−２５抗体注入の有効性の可能性が１００％ではないことを除外することはできないが、この抗体はシナプトソーム調製物（Mehtaら、1996）および視床下部神経細胞（Vazquez-Martinezら、2001a; Vazquez-Martinezら、2001b）から迅速かつ正確にエキソサイトーシスを完全に阻止することが複数の研究で報告されている。したがって、ＢＤＮＦがＳＮＡＲＥ依存性およびＳＮＡＲＥ非依存性機構により、解離皮質細胞においてＧＦＰ−ＴＴＣエキソサイトーシスを刺激することが示唆される。
【０１８１】
（機能的シナプス後棘のマーカーとしてのＧＦＰ−ＴＴＣの使用）
図１５は、樹状分枝におけるＧＦＰ−ＴＴＣの細胞内分布を示す。図１５Ａに示すように、ＧＦＰ−ＴＴＣ標識は、解離皮質ニューロンにおける約１：ｍ２領域の円形で棘状の樹状突起において（左パネル）、および厚い器官型切片内の皮質ニューロンにおいて（右パネル）主に蓄積している。さらに、これらの構造体におけるＧＦＰ−ＴＴＣの平均蛍光強度は、樹状突起幹から選択される同様の大きさの領域の場合より約７０％高いが、ＧＦＰの平均蛍光シグナルは、両方のニューロン領域で同様である（図１５Ｄ）。
【０１８２】
これらの結果の集積により、ＧＦＰ−ＴＴＣタンパク質が樹状突起棘において蓄積することが示される。これらのシナプス後構造を求めるＧＦＰ−ＴＴＣの能力は、光学顕微鏡法によりこれらを直接可視化する新規の手法として用い得る。しかし、共焦点顕微鏡写真に示されるように、ＧＦＰ−ＴＴＣ細胞内蛍光は拡散的に分布するが、これは強力なＣＭＶウイルスプロモーターに刺激されるＧＦＰ−ＴＴＣ遺伝子の過剰発現に起因すると思われる。この注意事項により、ＧＦＰ−ＴＴＣの蓄積領域を判定するためオフラインの定量的画像処理が必要になる。しかし、ユーザーが自由に使用可能なＪａｖａベースの画像処理用ソフトウェアパッケージ（すなわち、ＩｍａｇｅＪ  Ｉ．２９ｘ）の画像取得後の数学的処理の簡便性および利便性により、この手法は、試験的および／または病的条件下にある特定の脳領域における樹状突起棘のオフライン定量化の簡便かつ迅速な方法となる。
【０１８３】
ＧＦＰ−ＴＴＣの平均蛍光強度は、所定のＧＦＰ−ＴＴＣ発現ニューロンの樹状突起棘において上昇するが、そのすべてがプローブを蓄積するわけではない。検討した樹状突起棘の約３０％が無作為に選択した幹領域と同様か、あるいはそれより低い蛍光レベルを示す。このことは、シナプス前終末とのシナプス結合を形成しているか否かに依存する、これらの構造の機能状態の結果であると思われる。これを図１５Ｃに示し、ここではＧＦＰ−ＴＴＣ蓄積シナプス後棘に関連するシナプス前部位に結合するＦＭ１−４３の時間経過を示す。これらの結果により、ＧＦＰ−ＴＴＣが、エキソサイトーシス／エンドサイトーシスの高ターンオーバーを示すシナプス前終末に物理的に近接する位置にあるシナプス後棘に特異的に向けられることが確認できる。このＧＦＰ−ＴＴＣの特性により、本発明は、解離ニューロン、器官型切片、またはさらに生物においてネットワーク活性の状態を評価するためのこのプローブの使用を提供する。一例をあげると、多光子共焦点顕微鏡法と組み合わせたＧＦＰ−ＴＴＣ−ＣＡＶ−２アデノウイルストランスダクションを用いることにより、生きた脳の厚い切片における機能的シナプス結合の数を評価するとともに、これを、ある種の神経変性疾患、例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病ならびにシナプスの接触構成の変化を特徴とする他の脳障害の症状を模倣するノックアウトモデル動物から推定される数と比較することが可能であろう。
【０１８４】
（薬理学的スクリーニングのためのＧＦＰ−ＴＴＣの使用）
ＧＦＰ−ＴＴＣが末梢神経から中枢神経系への逆行性輸送を受けることが最近になって示された（Coen.1997, Maskos 2002）。この輸送は、フグ毒による薬理学的処置により遮断されることから、神経筋接合部におけるニューロン活性に依存することが示されている（Miana-Mena, 2002）。このことから、ＧＦＰ−ＴＴＣの移動性および細胞透過が調節された過程であると考えてよい。したがって、ＧＦＰ−ＴＴＣ発現細胞をニューロン活性に影響を及ぼす薬剤で処置すれば、シナプス後ニューロンからのＧＦＰ−ＴＴＣの排出が変化するであろう。これを図１９Ａに示し、ここでＧＦＰ−ＴＴＣ細胞内蛍光の時間経過プロファイルがＢＤＮＦによる局所処置を変化させることを示す。細胞全体を考慮する場合（図１９Ａ  左パネル）、ＢＤＮＦは、処置後２分でビヒクルの６倍以上の細胞内蛍光の減衰を誘導する。しかし、樹状突起の遠位領域では、細胞内ＧＦＰ−ＴＴＣの喪失は細胞全体より明瞭であり、対照条件より２３倍高い蛍光減衰値に達する。図１９Ｂにビヒクル（頂部パネル）およびＢＤＮＦ（底部パネル）で処置した細胞の代表例を示す。この所見により、ＧＦＰ−ＴＴＣの刺激依存性移動は、細胞体の場合より樹状突起の場合のほうが迅速であることが示され、これによりこのプローブが主にシナプス後領域から放出され、シナプスを横断して相互結合した高次のニューロンに達することが支持される。
【０１８５】
活性依存性機構を通じてシナプス後ニューロンから放出されるＧＦＰ−ＴＴＣの特性は、複雑なニューロンネットワークにおけるニューロン活性の内因性モジュレータおよび薬剤の作用をスクリーニングするのに役立ち得る。本発明では、ＢＤＮＦを用いて示したが、特定の脳領域における全体的なシナプス活性を変化させると考えられる他の対象物質に対し、同じプロトコルを容易に改変し、適用することが可能である。
【０１８６】
参考文献
本明細書で引用した次の文献は、信頼性があり、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０１８７】
【表６】
2007535316.tif 000007
2007535316.tif 000008
2007535316.tif 000009
2007535316.tif 000010
2007535316.tif 000011
2007535316.tif 000012
2007535316.tif 000013
2007535316.tif 000014
2007535316.tif 000015
2007535316.tif 000016
2007535316.tif 000017
2007535316.tif 000018
2007535316.tif 000019
2007535316.tif 000020
2007535316.tif 000021
2007535316.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１Ａ】図１Ａは、ｐＢＳ：ＴＴＣにクローニングされたＴＴＣ断片のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｐＢＳ：ＴＴＣにクローニングされたＴＴＣ断片のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、構築物ｐＢＳ：ＴＴＣの詳細を示す。ＴＴＣ  ｃＤＮＡ単離：ＴＴＣ  ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、Clostridium Tetani株から単離した。本発明者らは、３回のＰＣＲを使用して、それぞれ以下
【表７】
2007535316.tif 000023
で示される４６５ｂｐの３個の重複断片を作成し、各断片は、続いて、pBluescript KS+にクローニングし、プラスミドｐＢＳ−ＴＴＣを作成した。上流プライマーは、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）および翻訳開始シグナルを含んでいた。
【図３】図３は、ｐＧＥＸ：ｌａｃＺ−ＴＴＣ構築物を示す。
【図４】図４は、構築物ｐＧＥＸ：ＴＴＣ−ｌａｃＺを示す。
【図５】図５は、構築物ｐＣＭＶ：ｌａｃＺ−ＴＴＣの詳細を示す。
【図６】図６は、成熟マウスＬＡＬ  ＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ膜通行に関する共焦点免疫蛍光解析を示す。（Ａ）ＬＡＬ筋肉の近傍にＧＦＰ−ＴＴＣを皮下注射した２時間後に、プローブ（緑）が、ＮＭＪの運動神経終末において濃縮された。関連した筋肉内運動神経軸索を、ＮＦ２００に対する抗体で免疫染色（赤）した。ＧＦＰ−ＴＴＣ標識はまた、感覚神経線維（矢印（arrow））において、軸索ミエリン鞘のランビエ絞輪（矢印先端（arrowheads））においても検出された。（Ｂ）単一の生きた有髄軸索でのＧＦＲ−ＴＴＣ（緑）（矢印）での強い節点標識。ミエリンは、ＲＨ４１４色素（赤色）で受動的に染色された。（Ｃ）Ａと同様に注射から２時間後、ＬＡＬ筋肉線維を固定し、間接的な免疫蛍光によりトロポニンに関して標識した。（Ｃ’およびＣ’’）挿入図は、ＮＭＪの側面図であり、これにより、ＧＦＰ−ＴＴＣ染色（緑）がシナプス前に局在することが示される。（Ｄ−Ｇ）ＬＡＬを、ＧＦＰ−ＴＴＣ注射後の種々の時点で採集し、ＴＲＩＴＣ−ａ−ＢＴＸ（Ｄ’−Ｇ’）での標識によりＮＭＪが赤色で同定された。Ｄ−Ｄ’：５分間；Ｅ−Ｅ’：３０分間；Ｆ−Ｆ’：２時間およびＧ−Ｇ’：２４時間。尺度棒：Ａ、２０μｍ；Ｂ、８μｍ；Ｃ、２０μｍ；Ｄ、２μｍ；Ｅ−Ｇ、５μｍ。
【図７】図７は、ＢＤＮＦにより、用量依存的にＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ補充が増加することを示す。（Ａ）ＬＡＬ筋肉上のＮＭＪは、様々な量のＢＤＮＦとＧＦＰ−ＴＴＣをインビボで同時注射した３０分後、ＴＲＩＴＣ−ａ−ＢＴＸ標識により同定された。ＧＦＰ蛍光レベルは、これらの領域上で定量された（Ｂ参照）。また、より高いＢＤＮＦ濃度でより顕著な軸索標識（矢印）の増強が検出された。尺度棒：２０μｍ。（Ｂ）ＮＭＪの共焦点区画を解析のために収集し、投影図を作成した。ＴＲＩＴ−ａ−ＢＴＸ標識により、全体的なＧＦＰ蛍光シグナルが測定されたＮＭＪ領域が決定される。各々について（ｎ＝１５〜２０）、ＧＦＰ蛍光をＮＭＪ面積（μｍ２）で割り、蛍光レベルを得た。誤差棒は、Ｓ．Ｄ．を示す。＊＊Ｐ＜０．００５；ｔ検定、ｖｓ対照。
【図８】図８は、ＬＡＬ  ＮＭＪにおけるＴｒｋＢの免疫蛍光可視化を示す。ＬＡＬにＧＦＰ−ＴＴＣを注射した２時間後、共焦点解析を実施した。融合タンパク質が、ＧＦＰ蛍光により直接緑色で同定された。間接的な免疫蛍光（材料および方法を参照）により（赤色で）同定されたＴｒｋＢは、ＮＭＪに局在していた。しかし、２個の投影図を重ねると、ＴｒｋＢとＧＦＰ−ＴＴＣシグナルの間にはオーバーラップは認められなかった。尺度棒：上：５μｍ；下：２μｍ。
【図９】図９は、ＮＭＪへとＧＦＰ−ＴＴＣが補充される機序を解明する実験の結果を示す。（Ａ）ＧＦＰ−ＴＴＣ蛍光定量を、図７に記載した通りに、５０ｎｇのＢＤＮＦと同時注射またはＢＤＮＦと併用せずに注射した後の様々な時点で実施した。（Ｂ）インビトロでＧＦＰ−ＴＴＣを４５分間かけてのせた後、切り出したＬＡＬ筋肉を固定し、間接的な免疫蛍光（赤色）によりＳＶ２タンパク質を検出した。ＳＶ２標識はほぼ拡散し、数箇所のＮＭＪ領域に濃縮していた（矢印）。ＳＶ２とＧＦＰ−ＴＴＣ染色の共局在は、非常に少数の領域にしか観察されなかった。尺度棒：８μｍ。（Ｃ）ボツリヌスＡ型神経毒での処理により、シナプス小胞のエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスは遮断される。ＢｏＴｘ／Ａ注射（材料および方法に記載の通り）から４８時間後、５０ｎｇのＢＤＮＦと併用したまたは併用していないＧＦＰ−ＴＴＣを、ＬＡＬ筋肉に注射し、以前と同様にＧＦＰ蛍光を定量した。＊＊Ｐ＜０．００５；ｔ検定、ｖｓ対照；＊Ｐ＜０．００５；ｔ検定；ｔ検定ｖｓＢｏＴｘ／Ａ処理。（Ｄ）ＮＭＪにおけるＧＦＰ−ＴＴＣ局在に対する、ＫＣｌ誘導脱分極とＢＤＮＦ効果の比較。
【図１０】図１０は、脂質マイクロドメインにおけるＧＦＰ−ＴＴＣプローブの局在を示す。（Ａ）筋肉内注射から２時間後、ＧＦＰ−ＴＴＣが、腓腹筋から単離された界面活性剤に耐性の膜（ＤＲＭ）（レーン４〜６）に見出され、この膜には、ラフトマーカーカベオリン−３も含まれていた。少量のＧＦＰ−ＴＴＣが、可溶性画分にも検出された（レーン１２）。（Ｂ）ＧＦＰ−ＴＴＣは、ラフトマーカーＧＭ１と共にＮＭＪに共局在していた。ＮＭＪは、Alexa６４７−ａ−ＢＴＸ結合（青色）により同定された。ＧＦＰ−ＴＴＣは、ＮＭＪにおいて５分未満で検出されたが、ＣＴ−ｂは３〜５時間要した。この時点で、類似のＧＦＰ−ＴＴＣ標識と同じ場所に局在する散在性の染色が得られたが、ＣＴ−ｂのみを標識するいくつかの斑点も観察された。（Ｃ）ＧＦＰ−ＴＴＣ（緑色）およびAlexa５９４標識ＣＴ−ｂ（赤色）の強度プロファイルを、両方のプローブを腓腹筋内に同時注射した５または２４時間後に行なった。尺度棒：５μｍ。
【図１１】図１１は、運動神経細胞体におけるＧＦＰ−ＴＴＣの局在とＣＴ−ｂの局在の比較を示す。腓腹筋へのβ−ｇａｌ−ＴＴＣ（Ａ）またはＧＦＰ−ＴＴＣおよびＣＴ−ｂ（Ｂ〜Ｅ）の筋肉内注射の２４時間後、マウスの心臓内を灌流させ、その脊髄を取り出した。（Ａ）脊髄横断区画上のＸ−ｇａｌ反応は、運動神経細胞体における標識を示したが、神経突起における標識も示した（挿入図）。（Ｂ）ＧＦＰ−ＴＴＣおよびＣＴ−ｂは、脊髄の縦断面に有意な数の運動神経が検出された。（Ｃ）プローブが、細胞体の高度に濃縮された小胞に検出されたが、神経突起にも検出された。（Ｄ）神経伸張において、ＧＦＰ−ＴＴＣおよびＣＴ−ｂが、異なる小胞様の構造に検出された。その中の僅かしか、両方のプローブに対して陽性でなかったことが特筆される。（Ｅ）１つの光学的断面に示されているように、ＧＦＰ−ＴＴＣもＣＴ−ｂも、核には検出されなかったことが特筆される。尺度棒：Ａ、０．２ｍｍ；挿入図、５０μｍ；Ｂ、２０μｍ；Ｃ、１０μｍ；Ｄ、５μｍ；Ｅ、２μｍ。
【図１２】図１２は、皮質細胞におけるＧＦＰ−ＴＴＣの膜分布およびニューロン活性依存的移動を示す。（Ａ）解離皮質細胞におけるハイブリッドタンパク質膜分布の２つの代表例が示されている。左には、１．５μｇ／ｍｌのＧＦＰ−ＴＴＣタンパク質と共に以前にインキュベートした皮質細胞の２Ｄ投影図が示されている（尺度棒：２０μｍ）。示されているように、ＧＦＰ−ＴＴＣは、原形質膜の特異的なミクロドメインに結合しており、これは、このような領域においてその受容体が蓄積しているためであろう。右には、膜におけるこのマーカーの分布パターンの別の例が示されている。この画像は、唯一の共焦点断面を示す（尺度棒：２０μｍ）。（Ｂ）この図は、５０ｍＭのＫＣｌの存在下で１．５μｇ／ｍｌのＧＦＰ−ＴＴＣにさらされた解離皮質細胞のコマ撮りの連続（分）を示す（尺度棒：５μｍ）。示されているように、ＧＦＰ−ＴＴＣの凝集する膜ミクロドメインは静的ではないが、細胞活性に応じて、細胞膜の特定の領域に移動し、そこで別個のエンドサイトーシス事象で内部移行される。この画像および続く全ての画像は、信号雑音比を増加させるために、Ｈｕｙｇｅｎｓ２．４．４（Scientific Imaging Volume, Hilverson、オランダ）によりオフラインでデコンボリューションされた。
【図１３】図１３は、ＧＦＰ−ＴＴＣの強化された膜ミクロドメインの補充および皮質ニューロン内のその内部移行における、ＢＤＮＦの効果を示す。（Ａ）このパネルは、原形質膜レベルにおける、ＧＦＰ−ＴＴＣ（上）、ＢＤＮＦ受容体（中央）の分布、および合体画像（下）の２つの例を示す。細胞を、５００ｎｍの蛍光ミクロスフェアに共有結合した１．５μｇ／ｍｌのＧＦＰ−ＴＴＣおよび５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦにさらし、Nipkow Disk共焦点顕微鏡を用いて直ちにモニタリングした。示されているように、ＧＦＰ−ＴＴＣがクラスター形成している領域は、ＢＤＮＦ受容体を提示している領域に近い膜ミクロドメインに存在することが多く、このことから、膜レベルでこれらの受容体間の相互作用の存在が確認される。尺度棒；左パネル、１０μｍ；右パネル、２０μｍ。（Ｂ）ＢＤＮＦの非存在下または存在下における解離皮質細胞内へのＧＦＰ−ＴＴＣの内部移行反応速度。ＧＦＰ組換えタンパク質は内部移行しなかったが（■、ｎ＝５）、ＧＦＰ−ＴＴＣは、細胞をハイブリッドタンパク質と共にインキュベートした後に細胞内蛍光レベルを解析することにより評価したところ、基礎条件で遅い内部移行曲線を示した（▲、ｎ＝４）。しかし、ＧＦＰ−ＴＴＣおよび５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦと共に併用してインキュベートしている間、ハイブリッドタンパク質の内部移行反応速度は、最初の１分の処理で１０倍増加し、実験が終わるまで上昇したままであった（●、ｎ＝３）。データは、各処理において示される細胞数の平均±ＳＥＭを示す。
【図１４】図１４は、ＢＤＮＦ／受容体含有小胞およびＧＦＰ−ＴＴＣ含有小胞による細胞内逆行経路を示す。（Ａ）この図は、細胞内に取り込まれるのに十分に小さい、直径１００ｎｍのＧＦＰ−ＴＴＣ（左パネル）およびＢＤＮＦ被覆蛍光ミクロスフェアと共にインキュベートした皮質細胞を示す。１２時間インキュベートした後、ハイブリッドタンパク質は蓄積を形成しながら細胞内に分布し、これにより、ＧＦＰ−ＴＴＣは、皮質細胞内の細胞内輸送小胞に内部移行したことが示唆される。さらに、ＧＦＰ−ＴＴＣクラスターがＢＤＮＦ／受容体担体に会合していること多いことが観察された。（Ｂ）ImageＪのために開発された粒子追跡アルゴリズムによる小胞細胞内運動の解析（Jeffrey Kuhn、テキサス大学）。示されているように、ＧＦＰ−ＴＴＣ含有小胞およびＢＤＮＦ／受容体含有小胞は、神経過程の先端領域から細胞体への類似した逆行通行経路に従う。尺度棒：１０μｍ。
【図１５Ａ】図１５は、以下の細胞内位置を示す。（Ａ）培養液（左パネル）および器官型薄片（右パネル）中のＧＦＰ−ＴＴＣ発現ニューロンの樹状突起棘の共焦点顕微鏡写真。尺度棒は、最初の画像では５μｍ、他の画像では２μｍを示す。
【図１５Ｂ】図１５は、以下の細胞内位置を示す。（Ｂ）この図に示されているのは、解離皮質細胞により示される樹状分枝におけるＦＭ１−４３による染色の一例である。この脂肪親和性色素は、高いエキソサイトーシス／エンドサイトーシスターンオーバーを有する膜領域に優先的に蓄積する。この例において、３０分間インキュベートした後、該色素は、ＧＦＰ−ＴＴＣの蓄積する領域と類似したサイズおよび形態を提示する丸い突起に優先的に位置していた（尺度棒：５０μｍ）。（Ｃ）ＦＭ１−４３結合の時間経過画像化。スチリル色素は、ＧＦＰ−ＴＴＣの蓄積するシナプス後棘の物理的近傍に位置するシナプス前終末膜に優先的に結合する。尺度棒は、２μｍを示す。
【図１５Ｃ】図１５は、以下の細胞内位置を示す。（Ｄ）皮質ニューロン内のＧＦＰまたはＧＦＰ−ＴＴＣハイブリッドタンパク質の分布の定量。データは、４個の異なる細胞から選択された２４個の無作為な樹状突起軸領域から計算したＩＯＤに標準化する。データは、平均＋ＳＥＭとして表現する。ｐ＜０．０５ｖｓ軸領域における平均ＩＯＤ。
【図１６】図１６は、ＧＦＰ−ＴＴＣおよびＰＳＤ−Ｚｉｐ４５の細胞内分布を示す。解離皮質細胞内のＧＦＰ−ＴＴＣ（左パネル）およびＤｓＲｅｄ−ＰＳＤ−Ｚｉｐ４５（中央パネル）の細胞内分布の２個の代表例が示されている。構築物ｐＣＭＶ−ＧＦＰ−ＴＴＣおよびｐＣＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＰＳＤ−Ｚｉｐ４５で同時トランスフェクトした２４〜４８時間後、ニューロンを走査し、両方のタンパク質の細胞内分布を研究した。細胞体レベルでは、ＧＦＰ−ＴＴＣおよびＤｓＲｅｄ−ＰＳＤ−Ｚｉｐ４５は、非常に共局在していることが判明した（合体画像）。程度はより低いが、樹状突起レベルでも、両方のタンパク質が、高い共局在率を示した。尺度棒：上、２０μｍ；下、５μｍ。
【図１７】図１７は、解離皮質細胞からのＧＦＰ−ＴＴＣのエキソサイトーシスに対する、ＢＤＮＦの効果を示す。（Ａ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２または５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦの局所投与に使用した方法の図解。マイクロインジェクションピペットを、ＧＦＰまたはＧＦＰ−ＴＴＣ発現細胞の近くに置き、その内容物を、実験を通じて４０Ｐｓｉの一定圧力で連続的に排出した。各時点での細胞内蛍光をオフラインで計算した。（Ｂ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２（●；ｎ＝５）または５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（■；ｎ＝６）で解離皮質細胞を局所処理した後の細胞内蛍光の測定。示されているように、培養培地は、おそらく光退色作用のために細胞内蛍光のゆっくりとした崩壊を誘導したが（７０分間で５０％の崩壊比と推定）、ＢＤＮＦは、薬物投与の早くも１２秒後に統計学的差異に達する細胞内蛍光の急速な消失を引き起こした（１０分間で５０％の崩壊率と推定）（Ｐ＜０．０５；Newman-Keuls Multiple比較検定）。細胞内ＧＦＰ−ＴＴＣのこの減少が、実際に、エキソサイトーシスターンオーバーの増加により引き起こされ、タンパク質分解により引き起こされるものではないことを確認するために、ＢＤＮＦを局所投与する前に、ＧＦＰ−ＴＴＣ発現細胞に、モノクローナルＳＮＡＰ−２５中和抗体をマイクロインジェクトした（▲；ｎ＝６）。したがって、ＳＮＡＲＥ依存的エキソサイトーシス遮断後、ＧＦＰ−ＴＴＣ細胞内レベルに対するＢＤＮＦ誘導作用は強く低下したが、完全には阻害されなかった。
【図１８】図１８は、中枢シナプスにおける膜通行に対するＢＤＮＦの作用のモデル図である。基礎条件下で、シナプス前ニューロンは、シナプス後構造に向けてシグナルを伝播するのに適切ではない数で、シナプス間隙への僅かな小胞の放出を引き起こす自発活性を提示する。同様に、シナプス後細胞はまた、少量のＧＦＰ−ＴＴＣの放出を誘導する自発的量子的放出を示す。シナプス前細胞の脱分極時に、より重要な神経伝達物質の放出が引き起こされ、これによりシグナルがシナプス後分化組織に伝達される。したがって、シナプス後ニューロンの刺激は、シナプス間隙へのＢＤＮＦの分泌を誘導し、シナプス前並びにシナプス後ニューロンにおけるその受容体に結合する。シナプス前側のその受容体複合体に結合したＢＤＮＦは、シナプス前シグナル伝播を強化する大量の神経伝達物質放出を引き起こす。他方で、そのシナプス後受容体に結合したＢＤＮＦは、神経毒の放出を引き起こし、シナプス前およびシナプス後細胞の両方におけるＢＤＮＦ受容体複合体に会合した膜ガングリオシドに結合する。シナプス前終末における大量のエキソサイトーシス後、エンドサイトーシスが起こり、シナプス前膜並びに遊離細胞外プローブの再利用がＧＦＰ−ＴＴＣ／受容体複合体にもたらされる。
【図１９】図１９は、シナプス後過程からのＧＰＦ−ＴＴＣの放出のモジュレーションを示す。（Ａ）ＧＦＰ、ＧＦＰ−ＴＴＣ、または以前に抗ＳＮＡＰ−２５をマイクロインジェクションされたＧＦＰ−ＴＴＣを発現している培養ニューロンの樹状突起過程近くにＤＭＥＭ／Ｆ１２（対照条件）またはＢＤＮＦを局所投与した後の細胞内蛍光の高速共焦点画像化。データを、最初の時点から計算したＩＯＤに標準化し、全細胞（左パネル）または遠位樹状突起過程の無作為に選択した領域（右パネル）からの細胞内蛍光崩壊を時間をかけて評価した。全てのデータは、１個の実験条件あたり少なくとも５個の異なる細胞の平均ＩＯＤ±ＳＥＭとして示す。（Ｂ）ビヒクル（上パネル）およびＢＤＮＦ（下パネル）にさらしたニューロンにおけるＧＰＦ−ＴＴＣ蛍光低下の代表例。尺度棒は５０μｍを示す。
【図１Ａ】
2007535316.tif 000024
【図１Ｂ】
2007535316.tif 000025
【図２】
2007535316.tif 000026
【図３】
2007535316.tif 000027
【図４】
2007535316.tif 000028
【図５】
2007535316.tif 000029
【図６】
2007535316.tif 000030
【図７】
2007535316.tif 000031
【図８】
2007535316.tif 000032
【図９】
2007535316.tif 000033
【図１０】
2007535316.tif 000034
【図１１】
2007535316.tif 000035
【図１２】
2007535316.tif 000036
【図１４】
2007535316.tif 000037
【図１５Ａ】
2007535316.tif 000038
【図１５Ｃ】
2007535316.tif 000039
【図１６】
2007535316.tif 000040
【図１８】
2007535316.tif 000041
【図１３】
2007535316.tif 000042
【図１５Ｂ】
2007535316.tif 000043
【図１７】
2007535316.tif 000044
【図１９】
2007535316.tif 000045
【配列表】
2007535316000001.app
【国際調査報告】
2007535316.tif 000046
2007535316.tif 000047
2007535316.tif 000048
2007535316.tif 000049
2007535316.tif 000050
2007535316.tif 000051