(57)【要約】  本発明は、サンプル液体中の生体分子又はアナライトを、標識を用いずに検出するための方法及びデバイスを提供する。方法は、少なくとも２つの導電表面のうちの１つにアナライトが結合することを可能にするステップを含む。交番電界が、少なくとも２つの導電表面間に印加される。少なくとも２つの導電表面間を流れる交流電流の振幅及び位相が、基準信号の振幅及び位相と比較される。双方の電流間の差から、アナライトが導電表面に存在するかどうかを決定することが可能である。
2007507689.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル液体中のアナライトを、標識を使わずに検出するためのデバイスであって、
少なくとも一方の導電表面が、固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブを有する、少なくとも２つの導電表面と、
前記２つの導電表面間に、１０−２乃至１０６Ｈｚの周波数を有する電界を与えるための手段と、
を有するデバイス。
【請求項２】
前記固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブを有する第１の導電表面と第２の導電表面との間を流れる第１の交流電流の振幅及び位相を測定するための測定手段を更に有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記第１の交流電流の振幅及び位相を、基準信号の振幅及び位相と比較するための比較器を更に有する、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
第１及び第２の導電表面を有し、前記第１の導電表面が、少なくとも一方の側に前記固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブを有する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項５】
第１の導電表面及び第２の導電表面が、実質的に互いに平行に配置されており、前記ターゲット特有のプローブによって固定化されている側が、前記第２の導電表面と向かい合っている、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記第１の導電表面の少なくとも一部が、前記第２の導電表面の少なくとも一部と互いにかみ合う、請求項４又は請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
前記アナライトが、ペプチド、タンパク質、抗体及びそのフラグメント、酵素、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、代謝物質、補助因子、ホルモン、サイトカイン、細胞、微生物、ウィルス、薬剤、農薬、除草剤、殺菌剤、毒素、ビタミン、任意の他の小さい分子、及び１又は複数の炭水化物基を含むペプチド又は結合された補助因子を有する酵素のような前述したものの組み合わせ、からなるグループから選択される、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項８】
前記サンプル液体が、分析溶液、血液のような体液、血漿、血清、尿、唾液、肺水又は髄液、細胞抽出液、排水、産業処理における任意の流体、乳、飲料水、地表水、並びに任意の他の食品及びその溶液、からなるグループから選択される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記ターゲット特有のアフィニティプローブが、ペプチド、タンパク質、抗体及びそのフラグメント、酵素、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アプタマ、炭水化物、オリゴサッカライド、脂質、代謝物質、補助因子、ホルモン、サイトカイン、細胞、微生物、ウィルス、薬剤、農薬、除草剤、殺菌剤、毒素、ビタミン、任意の他の小さい分子、及び１又は複数の炭水化物基を含むペプチド、結合された補助因子を有する酵素又は多重結合のタンパク質のような前述したものの組み合わせ、からなるグループから選択される、請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１０】
サンプル液体中のアナライトを、標識を使わずに検出するための方法であって、
前記サンプル液体中の前記アナライトと、少なくとも１つのターゲット特有のアフィニティプローブとの間の関連を可能にするために、導電表面上に固定化された少なくとも１つのターゲット特有のアフィニティプローブを有する少なくとも１つの導電表面を、前記サンプル液体に露呈するステップと、
関連されるアナライトの存在について、前記少なくとも１つの導電表面をアッセイするアッセイステップと、
を含み、前記アッセイステップが、
少なくとも１つの導電表面の第１の導電表面と、第２の導電表面との間に、１０−２乃至１０６Ｈｚの周波数を有する交番電界を印加して、前記第１及び前記第２の導電表面間に第１の交流電流を生じさせるステップと、
前記第１の交流電流の電気的特性を測定するステップと、
前記ステップのいずれかの間に逐次的に又は同時に、前記第１の交流電流の前記測定された電気的特性を、基準信号の電気的特性と比較して、比較結果を生成する比較ステップと、
前記アナライトが前記ターゲット特有のアフィニティプローブの少なくとも１つと関連したかどうかを、前記比較結果から決定するステップと、
を含む方法。
【請求項１１】
前記比較ステップが、前記第１の交流電流の振幅及び位相を、前記基準信号の振幅及び位相と比較することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記電界が、１０−２乃至１０２Ｈｚの周波数を有する、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の導電表面が、前記第１の導電表面と同じターゲット特有のアフィニティプローブを含む、請求項１０乃至請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記基準信号が、前記アナライトのインキュベーションなしに、前記少なくとも１つの導電表面と同様の導電表面を使用して、独立して得られる較正信号である、請求項１０乃至請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、前記サンプル液体に露呈される前に、前記少なくとも１つのターゲット特有のアフィニティプローブが固定化されている前記少なくとも１つの導電表面をアッセイし、それによって第２の交流電流が生じることを含む、請求項１０乃至請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記基準信号が、前記第２の交流電流である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプル液体を除去することを更に含む、請求項１０乃至請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブに非特異的に結合される材料を除去するために、洗浄溶液によって前記導電表面をリンスすることを更に含む、請求項１０乃至請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプル液体又は洗浄溶液を測定溶液と置き換えるために、前記導電表面をリンスすることを更に含む、請求項１０乃至請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブを有する前記第１の導電表面と前記第２の導電表面との間に前記交番電界を印加するステップ及び前記第１の交流電流の振幅及び位相を測定するステップが、誘電スペクトルを得るために前記交番電界の周波数を変化させながら、繰り返される、請求項１０乃至請求項１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
洗浄溶液又は測定溶液の温度及び／又は組成を変化させることを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記基準信号が、測定又は周波数スペクトルの組である、請求項１０乃至請求項２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子が表面と関連するときの該表面における誘電特性の変化を利用して、生体分子又は他のアナライトを標識を用いずに検出するための方法及びデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子の検出は、医学的診断並びに環境及び食品の安全の監視のような多くのアプリケーションにおいて必要である。一般に、バイオセンサは、ターゲット特有の認識分子が固定化される表面を有する。この表面は、関心のある１又は複数のアナライトを含むサンプルと接触させられ、アナライトは、結合され、従って更に固定化されることができる。これらの結合イベントは、測定可能な信号に変えられなければならない。感度が良く且つ特異的な態様で生体分子を検出することができるようにするために、発展（development）ステップ及び標識が、通常、適用される。発展ステップの例は、２次、３次又は更に高次の抗体の使用であり、それらの抗体のうち１次抗体は、固定化されたターゲットと結合し、最後の抗体は、標識をもつ。ＤＮＡマイクロアレイのような他のアッセイの場合、ターゲットは、それらが認識層と結合することができるようになる前に、まず標識化されることが多い。ここで、最も多く使用される標識は、発光団であるが、標識の他の例は、光学的に又は電気的に検出されることができる製品に基板を変えることができる放射性同位元素及び酵素である。
【０００３】
米国特許第５，１１４，６７４号明細書には、容量性アフィニティセンサが、記述されている。第１の実施例において、図１に示されるセンサ１０は、２つの電極１２、１４を有する。電極１２、１４は、反対の極性を有し、ベースレイヤ１６上に配置され、不動態化（passivating）層２０によって絶縁される。レセプタ２２は、不動態化層２０から延び、生化学的活性層を形成する。この層のそれぞれのレセプタ２２は、特定のアナライト２４の分子のための潜在的な結合部位である。大きい分子２６は、大きい分子鎖を形成するためにアナライト２４に結合し、大きい分子鎖は、電極１２、１４間の電界３０中で加えられるアレイとしてレセプタ２２に結合する。これらの大きい分子鎖は、低い比誘電率（dielectric constants）を有し、電界３０から、高い比誘電率の溶媒２８の多くの量を移動させる。大きい分子鎖は、容量アフィニティセンサ１０の誘電材料の厚さを大きく増やすアレイとして結合し、そのセンサ１０の誘電特性を大きく変える。
【０００４】
米国特許第５，１１４，６７４号明細書の発明の第２の実施例には、直接的な結合を使用する容量性アフィニティセンサが記述されている。この第２の実施例によるセンサは、図２に示されている。センサ表面３４は、図１の第１の実施例に記載されるような、ベースレイヤ１６及び不動態化層２０を有する。第１の実施例のレセプタ分子２２の一例であるウィルスフラグメント３６が、センサ表面３４から、生化学的活性層に延びている。溶媒２８中のアナライトは、人間の抗ウィルス抗体３８である。この人間の抗ウィルス抗体３８は、ウィルスのフラグメント３６に結合するためにそのウィルスのフラグメント３６に対して生体特異性をもつ。抗ヒト抗体４０及び結合されたタンパク質分子４６が、溶媒２８に加えられる。両方が溶媒２８に加えられる前に、結合されたタンパク質分子４６は、抗ヒト抗体４０に結合される。複数の抗ヒト抗体４０が、それぞれの人間の抗ウィルス抗体３８に結合し、大きい分子鎖のアレイを形成する。分子鎖は、非常に大きく、低い比誘電率を有し、従って、高い比誘電率を有する溶媒２８の多くの量を移動させる。センサの誘電特性は、溶媒２８中の抗ウィルス抗体３８の濃度によって大きく変化する。
【０００５】
双方の実施例において、低い比誘電率のアナライト分子の移動は、２つの電極間の生化学的活性層から、より高い比誘電率の溶媒分子を移動させ、これによって２つの電極間のキャパシタンスを低減させる。２つの電極間のキャパシタンスは、米国特許第５，１１４，６７４号の発明によるセンサによって測定されるアナライトの濃度に反比例する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記発明のデバイスの不利益は、溶媒中のアナライトが標識化（ラベリング）及びゆえに複数の発展ステップを必要とすることである。発展ステップ及び標識の使用は、より長くより複雑なアッセイ、高価な生体分子及び標識の増加する使用、及びより複雑且つ高価なアッセイデバイスをもたらす。高速且つ費用対効果的な測定のために、理想的なアッセイは、標識フリーである（標識を使用しない）。しかしながら、標識を使用しないアッセイはほとんど存在しない。その理由は、通常、標識を使用しないアッセイが、必要な感度及び特異性を欠くからである。
【０００７】
更に、認識表面との相互作用の前にターゲットを標識化することは、ターゲット分子に変化を生じさせることがあり、これは、ターゲット分子の有効性に影響を与えることがあり、それらの濃度を変化させることがあり、及び／又は例えば標識化が分子ごとに又は測定ごとに変わるとき、ターゲット分子の正確な検出を妨げることがある。
【０００８】
更に、複数のアナライトが、１つのボリュームにおいて検出されるとき、複数の発展及び標識化ステップに起因する一層高いアッセイの複雑さは、すぐに、増加する交差反応及び他の背景問題をまねく。標識を用いないアッセイの利用は、それらが多重化される検出のために引き起こす不利益及び発展ステップの必要を回避する。
【０００９】
本発明の目的は、標識の適用を必要としない、１又は複数の生体分子、分子複合体又は他のアナライトを検出するための方法及びデバイスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述の目的は、本発明による方法及びデバイスによって達成される。
【００１１】
方法は、サンプル液体中のアナライトを標識を用いずに検出するためのデバイスを提供する。デバイスは、その間に電界が印加されうる少なくとも２つの導電表面を有し、導電表面の少なくとも１つは、固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブを有する。電界は、それ自体を固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブに付着させる分子によって影響を及ぼされるように生じさせられる。更に、デバイスは、２つの導電表面の間に、１０−２乃至１０６Ｈｚの周波数を有する電界を与えるための手段を有する。検出のために使用される周波数は、表面における又は表面に形成される誘電インタフェースにおける相互作用を検出するように選択される。表面感度を向上させるために、好適には、１０−２乃至１０２Ｈｚの周波数が使用されることができる。
【００１２】
更に、デバイスは、固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブを有する第１の導電表面と、第１の導電表面と同じターゲット特有のアフィニティプローブを含みうる又は含まなくてもよい第２の導電表面と、の間を流れる第１の交流電流の振幅及び／又は位相を測定するための測定手段を有することができる。代替例として、インピーダンス測定が行われることができる。
【００１３】
本発明のデバイスは、更に、第１の交流電流の振幅及び位相を、基準信号の振幅及び位相と比較するための比較器を有することができる。
【００１４】
本発明の特定の実施例において、デバイスは、第１及び第２の導電表面を有することができる。第１の導電表面は、少なくとも１つの側の上に又は１つの側に、固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブを含むことができる。第１及び第２の導電表面は、互いにほぼ平行に配置されることができ、ターゲット特有のプローブを有する固定化された側は、第２の導電表面と向かい合う。
【００１５】
更に別の見地において、少なくとも１つの導電表面の少なくとも一部は、少なくとも１つの他の導電表面の少なくとも一部と互いにかみ合う（interdigitate）ことができる。
【００１６】
本発明の方法及びデバイスを使用して決定されることができるアナライトは、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体又はそのフラグメント、酵素、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、代謝物質、補助因子、ホルモン、サイトカイン、細胞、微生物、ウィルス、バクテリア、藻類、原生動物、薬剤、農薬、除草剤、殺菌剤、毒素、ビタミン、ポリサッカライド（polysacchraide）、グリコシレートされたサイト、任意の他の小さい分子、又は例えば１又は複数の炭水化物基を含むペプチド又は結合された補助因子を有する酵素のような前述の組み合わせである。
【００１７】
本発明において使用されることができるサンプル液体は、例えば解析溶液、血液のような体液、血漿、血清、尿、唾液、肺水（lung fluid）、髄液、細胞抽出液、汚水、産業処理における任意の流体、乳、飲料水、地表水、任意の他の食品又はその溶液である。
【００１８】
本発明において使用されることができるターゲット特有のアフィニティプローブは、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体又はそのフラグメント、酵素、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アプタマ、炭水化物、オリゴサッカライド、脂質、代謝物質、補助因子、ホルモン、サイトカイン、細胞、微生物、ウィルス、薬剤、農薬、除草剤、殺菌剤、毒素、ビタミン、任意の他の小さい分子、特定の結合特性を有するポリマー、又は例えば１又は複数の炭水化物基を含むペプチド、結合された補助因子を有する酵素若しくは多重結合のタンパク質のような前述の組み合わせ、である。
【００１９】
更に、本発明は、サンプル液体中のアナライトを標識を使わずに検出するための方法を提供する。方法は、サンプル液体中のアナライトと、少なくとも１つの導電表面上の又は導電表面における少なくとも１つのターゲット特有のアフィニティプローブと、の間の関連を可能にするように、少なくとも１つの導電表面をサンプル液体に露呈することを含む。前の任意のステップの間に少なくとも１つの導電表面をアッセイする次のステップにおいて、電界が、少なくとも１つの固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブを有する第１の導電表面と、同じ固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブを含みうる又は含まなくてもよい第２の導電表面と、の間に印加され、続いて、結果として生じる第１の交流電流の例えば振幅及び位相のような電気的特性が測定される。印加される電界の周波数は、１０−２乃至１０６Ｈｚである。好適には、印加される電界の周波数は、１０−２乃至１０２Ｈｚでありうる。次のステップにおいて、第１の交流電流の振幅及び位相のような電気的特性が、基準信号の振幅及び位相のような電気的特性と比較され、それによって比較結果が生成される。比較結果から、アナライトが、ターゲット特有のアフィニティプローブの少なくとも１つに関連したかどうかが決定される。
【００２０】
本発明の一実施例において、基準信号は、アナライトのインキュベーションなしに、固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブを含む少なくとも１つの導電表面と同様の導電基板において独立して得られる較正信号でありえる。
【００２１】
別の実施例において、方法は、液体サンプルへの露呈の前に、少なくとも１つのターゲット特有のアフィニティプローブが固定化されている少なくとも１つの導電表面をアッセイし、その結果第２の交流電流をもたらすアッセイステップを含むことができる。このアッセイステップは、液体サンプルに露呈した後のアッセイステップと同じステップを含むことができる。この実施例において、第２の交流電流が、基準信号でありうる。
【００２２】
更に別の実施例において、基準信号は、測定又は周波数スペクトルの組でありうる。
【００２３】
本発明の方法は、更に、サンプル液体を除去することを含むことができる。
【００２４】
方法は、更に、固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブに非特異的に結合される材料を除去するために、導電表面を洗浄溶液によりリンスすることを含むことができる。
【００２５】
別の実施例において、方法は、更に、サンプル液体又は洗浄溶液を測定溶液と置き換えるために、導電表面をリンスするステップを含むことができる。
【００２６】
本発明の一実施例において、少なくとも１つの固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブを有する導電表面と、同じ固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブを含むことができ又は含まなくてもよい第２の導電表面と、の間に電界を印加するステップと、第１の交流電流の振幅及び位相を測定するステップと、が、誘電スペクトルを得るために交番電界の周波数を変化させながら、繰り返される。
【００２７】
方法は、更に、洗浄又は測定溶液の温度及び／又は組成を変えるステップを含むことができる。
【００２８】
本発明のこれら及び他の特性、特徴及び利点は、本発明の原理を例示によって説明する添付の図面とともに以下の詳細な説明から明らかになる。この説明は、例示のためだけに与えられており、本発明の範囲を制限しない。以下で引用される参照図は、添付の図面を参照する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
さまざまな異なる図において、同じ参照図は、同じ又は類似の構成要素を指す。
【００３０】
本発明は、特定の実施例に関して及び特定の図面を参照して記述されるが、本発明は、それらに限定されず、請求項のみによって制限される。記述される図面は、概略的なものにすぎず、非制限的である。図面において、構成要素のいくつかの大きさは、説明の目的で、誇張されていることがあり、一定の縮尺で描かれていないことがある。「有する、含む」なる語が、本説明及び請求項において使用されているが、他の構成要素又はステップを除外しない。例えば「a」、「an」、「the」のような不定冠詞又は定冠詞が、単数名詞に言及するときに使用されているが、これは、特記されていない限り、名詞の複数形を含む。
【００３１】
更に、この説明及び請求項において第１、第２、第３なる語が、同様の構成要素を区別するために使用されているが、必ずしも連続した順序又は時間順を説明するために使用されているのではない。このように使用される語は、適当な環境下において入れ替え可能であり、ここに記述される本発明の実施例は、ここに記述され又は説明されるもの以外のシーケンスでの動作が可能であることが理解されるべきである。
【００３２】
本発明は、生体分子又はアナライトが導電表面又は導電表面上の絶縁層と関連するときの導電表面における誘電特性の変化を利用して、溶媒中の生体分子又は他のアナライトを、標識を使わずに検出するための方法及びセンサデバイスを提供する。
【００３３】
本発明のデバイス５０は、少なくとも２つの導電表面５１ａ及び５１ｂであって、該導電表面５１ａ及び５１ｂの少なくとも一方が、それに付着され又は少なくとも１つの表面上の絶縁層に付着される固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブ５２を有し、該導電表面間に電界が印加されることができる、少なくとも２つの導電表面５１ａ及び５１ｂと、本発明のセンサデバイス５０から離れており又は本発明のセンサデバイス５０に組み込まれており、電界の印加をもたらし、結果として生じる電流の振幅及び／又は位相を測定する別のデバイス５４への接続を可能にする導電コネクタ５３ａ、５３ｂと、を有する。
【００３４】
図３に、本発明の一実施例によるデバイス５０が示されている。デバイスは、２つの導電表面５１ａ、５１ｂを有することができる。導電表面５１ａは、５１ｂ、例えば、金属（例えば銅、金、銀、プラチナ）、導電金属酸化物（例えばインジウムスズ酸化物、インジウム亜鉛酸化物）、又は導電ポリマー（例えばポリアニリン、ポリピロール又はポリ（エチレンジオキソチオフェン）（poly(ethylenedioxothiophene)）／ポリスチレンスルホン酸混合物）を含むことができる。導電表面５１ａ、５１ｂは、１つの導電材料からなる塊状であってもよく、又は基板上の層であってもよい。好適には、基板は、絶縁体である。導電表面５１ａ、５１ｂが、異なる材料の基板上の導電層で構成されるとき、導電層の表面は、基板の表面と同じ高さであってもよく、又は代替例として、基板の表面と比較して高められ又は引っ込められることができる。導電表面５１ａ、５１ｂは、いかなる有用な形状及び／又は大きさを有することもでき、いかなる有用な構造に構成されることもできる。形状は、例えば円、多角形、三角形、矩形、及びストリップのようないかなる適切な形状であってもよい。ストリップは、直線状であり、又は曲がり部、角部、若しくは互いにリンクされるこれらの形状の２又はそれ以上を含むことができ、例えばかみ合い（interdigitated）構造の形状であってもよい。導電表面５１ａ、５１ｂの大きさは、直径、長さ又は幅が２ｃｍ乃至１ｎｍのいかなる大きさでもよい。導電表面は、平坦であってもよく、又は引っ込められた若しくは高められた領域を含むこともできる。
【００３５】
導電表面５１ａ、５１ｂの少なくとも一方は、固定化されたターゲット特有のアフィニティプローブ５２を有することができる。本発明のこの実施例において、導体表面５１ａのみが、ターゲット特有のアフィニティプローブ５２によって固定化される。この実施例の更なる説明において、ターゲット特有のアフィニティプローブ５２によって固定化された導電表面は、導電表面５１ａと示され、他方の導電表面は、導電表面５１ｂと示される。好適には、ターゲット特有のアフィニティプローブ５２は、いかなる適切なプローブであってもよく、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体又はそのフラグメント、酵素、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アプタマ、炭水化物、オリゴサッカライド、脂質、代謝物質、補助因子、ホルモン、サイトカイン、細胞、微生物、ウィルス、薬剤、農薬、除草剤、殺菌剤、毒素、ビタミン、任意の他の小さい分子、又は１又は複数の炭水化物基を含むペプチド、結合された補助因子を有する酵素、若しくは多重結合のタンパク質のような前述したものの組み合わせである。最も好適には、ターゲット特有のアフィニティプローブ５２は、抗体又はそのフラグメント、アプタマ、オリゴサッカライド、又はオリゴヌクレオチドでありうる。
【００３６】
ターゲット特有のアフィニティプローブ５２は、例えばフロー、ドロッピング、スポッティング、接触によって、又は他の任意の適切な堆積技法によって、導電表面５１ａ上に堆積されることができる。
【００３７】
導電表面５１ａへのターゲット特有のアフィニティプローブ５２の固定化は、さまざまな異なるやり方で達成されることができる。
【００３８】
一実施例において、導電表面５１ａは、ターゲット特有のアフィニティプローブ５２の固定化の前に、修飾される（modified、変えられる）ことができる。可能な修飾は、導電表面５１ａに、例えばカルボキシル基、アミン基その他のような活性基を与えること、及び／又は例えばスクシンイミジルエステルの形成のようなこれらの基の活性化、を含みうる。多くの目的のために、導電表面５１ａは、アルキル鎖又はその改変によって修飾されることができる。アルキル鎖は、他のアルキル鎖の結合又はその改変の結合のために、アフィニティプローブ５２の結合のために、又はアフィニティプローブ５２の固定化のために使用されうる分子又は分子複合体の結合のために、活性化され、使用されることができる活性基を含むことができる。導電表面は、自己組織化単分子層すなわちＳＡＭによりコーティングされることができる。
【００３９】
別の実施例において、ターゲット特有のアフィニティプローブ５２は、例えばこれに限定されないが、カルボキシル酸基、アミン基、ヒドロキシル基、エポキシ基、イソシアナート、（メタ）アクリレート、チオール、スルフィド、ビオチン、アフィニティペプチド、オリゴサッカライド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド及びスクシンイミジルエステルのような活性化されたエステルのような、それらの固定化のために使用されることができる１又は複数の活性基を含むように修飾されることができる。
【００４０】
ターゲット特有のアフィニティプローブ５２は、導電表面５１ａに直接吸着し又は結合することができ、結合の例は、チオール基を含むアフィニティプローブ５２の金、銀又はプラチナ表面との関連である。
【００４１】
代替例として、アフィニティプローブ５２は、導電表面５１ａに与えられた活性基又は活性化された基に結合することができる。活性基又は活性化された基は、化学結合を介して導電表面５１ａと連結される。化学結合の数は、１乃至１０万でありえ、これらの間のいかなる数であってもよい。２以上の化学結合が、導電表面５１ａと、アフィニティプローブ５２の固定化のために使用される活性基又は活性化された基との間に存在するとき、リンカについて言及することができる。リンカ分子は、いかなる組成も有することができる。多くの場合に使われる分子は、アルキル鎖及びその改変、エチレングリコール鎖並びにヒドロゲルでありうる。
【００４２】
アフィニティプローブ５２の固定化の別のモードは、導電表面５１ａにすでに固定化されているアフィニティプローブ５２に特異的に結合する１又は複数の分子又は分子複合体との関連を介する。非制限的な例は、ビオチニル化されたペプチドの、表面固定化されたストレプタビジン（streptavidin）との関連、抗体の、抗免疫グロブリンである固定化された別の抗体との関連、第１のオリゴヌクレオチドの一部が第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的である場合の、オリゴヌクレオチドの、固定化された第２のオリゴヌクレオチドとの関連、である。
【００４３】
２つの導電表面５１ａ、５１ｂの構造は、実質的に平行でありえ、固定化されたアフィニティプローブ５２を有する側５１ａは、他の導電表面５１ｂと向かい合っている。代替例として、２つの表面５１ａ、５１ｂは、互いに完全に平行でなくてもよく、０乃至１８０度のいかなる角度をなすようにも配置されることができる。一方の導電表面５１ａ、５１ｂの一部は、他方の導電表面５１ａ、５１ｂの一部と互いにかみ合うことができる。２つの導電表面５１ａ、５１ｂ間の間隔は、１ナノメートルから１センチメートルの間で多様である。
【００４４】
ターゲット特有のアフィニティプローブ５２を導電表面５１ａ上に固定化した後、デバイス５０が、分析されなければならないアナライト５６を含むサンプル液体５５に露呈される前に、導電表面５１ａをアッセイする任意のステップが、実施されることができる。導電表面５１ａ、５１ｂは、存在する可能性のあるアナライト５６と、アフィニティプローブ５２（図４を参照）との間の関連を可能にするために、サンプル液体５５に露呈される。
【００４５】
好適には、サンプル液体５５は、分析溶液、血液のような体液、血漿、血清、尿、唾液、肺水、髄液、細胞抽出液、汚水、産業処理における流体、乳、飲料水、地表水、任意の他の食品又はその溶液でありうる。
【００４６】
好適には、アナライト５６は、ペプチド、タンパク質、抗体又はそのフラグメント、酵素、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、代謝物質、補助因子、ホルモン、サイトカイン、細胞、細胞のオルガネラ、細胞溶解物、細胞膜、微生物、ウィルス、バクテリア、原生動物、藻類、薬剤、農薬、除草剤、殺菌剤、毒素、ビタミン、任意の他の小さい分子、又は例えば１又は複数の炭水化物基を含むペプチド又は結合された補助因子を有する酵素のような前述したものの組み合わせ、でありうる。より好適には、アナライト５６は、タンパク質又はポリヌクレオチドでありうる。
【００４７】
次のステップにおいて、サンプル液体５５は、任意に除去されることができ、そののち、非特異的に結合された材料を除去するために、洗浄溶液によって表面５１ａを任意にリンスするステップが続く。洗浄溶液は、例えば、さまざまな異なる濃度のさまざまな異なる塩、糖、例えばＴｗｅｅｎ又は非特異的な結合を除去するためのもののような洗浄剤、を含みうる。測定中に使用される場合、洗浄溶液は、更に、測定中に信号を強めることができる付加の成分又は最適化された濃度を含むことができ、及び／又は容易に誘電スペクトルにおいて（好適にはより高い周波数で）見られることができ、洗浄ステップの程度を特徴付けるために使用されることができる化合物を含むことができる。例えば電界又は磁界の印加、温度の上昇等の、非特異的に結合された材料を除去する他の方法が、使用されることもできる。
【００４８】
次の任意のステップにおいて、表面５１ａは、サンプル液体５５又は洗浄溶液を測定溶液と置き換えるために、再びリンスされることができる。測定溶液は、特定の塩のタイプ及び濃度、大きい両性イオンのような特定のバッファ塩、糖、洗浄剤、その他を含むことができる。
【００４９】
アナライト５６の存在について表面５１ａをアッセイするステップは、前の任意のステップのいずれかの間に、逐次的に又は同時に実施されることができる。
【００５０】
サンプル液体５５への露呈前及び／又は露呈後に導電表面５１ａをアッセイするステップは、以下のステップによって実施されることができる。第１のステップにおいて、固定化されたアフィニティプローブ５２を有する導電表面５１ａと導電表面５１ｂとの間に電圧を印加することによって、交番電界が印加される。
【００５１】
印加される交番電界の周波数は、１０−３乃至１０１２Ｈｚでありえるが、表面感度を向上させるために、好適には１０−３乃至１０７Ｈｚであり、より好適には１０−２乃至１０６Ｈｚであり、最も好適には１０−２乃至１０２Ｈｚである。印加される交番電界の振幅は、好適には０乃至１０Ｖでありえ、より好適には０．００１乃至１Ｖでありえ、最も好適には０．０１乃至０．２Ｖでありうる。
【００５２】
結果として生じる交流電流の振幅及び位相が測定される。前記交流電流の振幅及び位相から、例えば分析下の材料の比誘電率又はインピーダンスのような誘電特性に関する情報が、得られることができる。電圧と同相の電流の成分から、比誘電率の導電部が導き出されることができ、電界と位相がずれた電流の成分から、比誘電率の容量部が得られることができる。電流信号から、例えばキャパシタンス及びインピーダンスのような多くの他の量が得られることができる。
【００５３】
任意には、電界を印加し、結果として生じる電流の振幅及び位相を測定するステップが、誘電スペクトルを得るために周波数を変化させながら、繰り返されることができ、それによって、得られることができる情報量が、増加されうる。
【００５４】
次の任意のステップにおいて、前述のステップは、例えば洗浄又は測定溶液の温度又は組成のような１又は複数のパラメータを変化させながら、繰り返されることができる。
【００５５】
次に、アナライト５６に対する導電表面５１ａの露呈後、前述のステップのいずれかの間に逐次的に又は同時に、交流電流の振幅及び位相又はそれらから計算される量又は値を、基準信号の振幅及び位相と比較するステップが行われる。比較のために、単一の測定が使用されてもよいが、測定及び完全な周波数スペクトルの組が使用されることもできる。
【００５６】
基準信号は、さまざまな異なるやり方で決定されることができる。一実施例において、基準信号は、較正信号でありえ、かかる較正信号は、センサデバイス５０による測定の実施の前に且つ測定から独立して、導電表面５１ａと同様の導電基板において得られることができる。
【００５７】
別の実施例において、基準信号は、センサデバイス５０をサンプル液体５５に露呈する前に、センサデバイス５０の導電表面５１ａにおいて得られる。
【００５８】
他の実施例において、比較のため、アナライト５６をアフィニティプローブ５２に関連させる前に同じ導電表面５１ａの評価を使用する代わりに、アナライト５６に露呈されなかった他の導電表面５１ｂの評価が、使用されることもできる。
【００５９】
アナライト５６のターゲット特有のアフィニティプローブ５２との関連後、交流電流の振幅及び位相又はそこから導き出される任意の値の変化から、アナライト５６の存在が導き出されることができる。更に、アナライト５６の量は、定性的に決定されることができ、又はアナライト５６の数は、定量的に決定されることができる。
【００６０】
結合前、結合中及び結合後のスペクトルの正確な比較のために、洗浄ステップを必要とする同じ測定溶液において得られるデータを使用することが重要である。測定溶液の塩濃度は、他の（好適にはより高い）周波数の誘電スペクトルを使用してチェックされることができ、洗浄ステップの程度及びゆえにアナライト５６の濃度決定の精度の制御として使用されることができる。
【００６１】
加えて又は代替例として、発展プロシージャにおいて洗い流されない残余の塩についての補正は、アナライト５６の検出のために使用されるもの以外の誘電スペクトルの周波数における測定を適用することによって、達成されることができる。
【００６２】
本発明の別の一実施例において、本発明の方法は、複数のターゲットを検出するために使用されることができる。これは、各導電表面上にそれぞれ異なるターゲット特有のアフィニティプローブ５２が固定化される複数の導電表面５１ａ、５１ｂを、特定の距離をおいて配置し、同時にそれらをサンプル液体５５の１つの同じボリュームに露呈することによって達成されることができる。導電表面は、サンプル液体５５への露呈の前後に、並行に又は逐次的に評価されることができる。そのようにして、本発明のデバイス５０を使用する１つの測定によって、さまざまなアナライト５６を含むサンプル液体５５を解析することが可能である。
【００６３】
特定の例において、本発明のデバイス５０は、１０ｍＭのリン酸塩バッファ中のアナライト５６として、血液凝固物質であるフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）の１ピコモル（ｐＭ）濃度を含むサンプル液体５５を調べるために適用される。導電表面（５１ａ、５１ｂ）は、互いにかみ合わせられる金電極であり、金電極上には、それぞれ異なる自己組織化単分子層（ＳＡＭ）が形成され、単分子層上には、抗ｖＷＦ抗体が固定化される。
【００６４】
まず、図５には、比誘電率の実数部又は容量部が、ＭｉｌｌｉＱ（脱イオン水）及び１０ｍｍのリン酸塩バッファに関して周波数の関数としてプロットされており、それにより１０マイクロメータの間隔をもつ互いにかみ合わせられた金電極の表面のより近いところで又はバルク中で測定したときの周波数の変化が示されている。低い周波数のところでは、より多くのイオンが、サンプル液体バルク中にある。それゆえ、電気的二重層はより薄くなり、容量はより高くなる。図５において、より低い周波数では、比誘電率の容量部が、より高い周波数においてよりも高いことが分かる。ＭｉｌｌｉＱ溶液中には、より少ないイオンが存在するので、比誘電率の容量部は、リン酸塩バッファ溶液中の同じ周波数の場合よりも高い。図６は、比誘電率の虚数部又は導電部を示す。
【００６５】
図７において、１０ｍｍのリン酸塩バッファに１ｐＭ濃度のｖＷＦを複数回注入した後の、センサのＣｏｌｅ−Ｃｏｌｅプロットが示されている。それぞれの異なる注入は、２０分の時間期間内に実施される。それぞれの注入と注入の間に、センサは、洗浄溶液により処理される。図７は、比誘電率の導電部を容量部の関数として示している。
【００６６】
図８乃至図１１は、本発明のデバイス及び方法を適用することによって、サンプル液体中のアナライトを検出することが可能であることを示している。図８及び図９において、互いにかみ合わせられる金電極は、アセチルシステインのＳＡＭにより被覆される。測定は、０．１Ｈｚの周波数で実施される。図１０及び図１１は、メルカプトヘキサデカン酸のＳＡＭにより被覆されている互いにかみ合わせられた金電極において得られた結果を示している。ここでも、測定は、０．１Ｈｚの周波数で実施される。
【００６７】
図１２及び図１３は、それぞれ、抗ｖＷＦ（上側の曲線）によって又は抗ＩＦＮｇａｍｍａ（下側の曲線）によって固定化されている互いにかみ合わせられた金電極において測定された総インキュベーション時間の関数として、比誘電率の容量部及び導電部を示している。抗ＩＦＮｇａｍｍａは、ｖＷＦに対して非特異的である。これらの結果から、図８乃至図１１の結果が、抗インターフェロンγ抗体が固定化されるＳＡＭ上での１ｐＭ濃度のｖＷＦの非特異的結合の検出と比較される場合、信号の少なくとも一部が特異的であることが明らかになる。図１２及び図１３の上下の曲線間の差は、信号の特異的な部分を表す。
【００６８】
本発明の方法及びデバイス５０によれば、決定されなければならないアナライト５６は、従来技術のように標識化される必要がない。このために、検出のために使用される周波数は、表面５１ａにおける又は表面５１ａに形成される誘電インタフェースにおける、相互作用を検出するように選択される。サンプル液体５５中の成分の影響は、結果的に強く減じられ、（干渉するバックグラウンド信号の低減によって）検出方法の感度の大幅な改善及び特定性の大幅な改善をもたらす。アナライト５６の濃度の定量的な測定の信頼性を増加させるために、冗長性が、同じアナライト５６について２以上のセンサデバイス５０を使用することによって組み込まれてもよい。
【００６９】
本発明の方法及びデバイス５０は、水溶液中の生体分子又は分子複合体の測定のために使用されることができるだけでなく、他のいかなる種類の溶液中の他のいかなる分子又は分子複合体の検出のためにも適用されることができることに注意することが重要である。
【００７０】
好適な実施例、特定の構造及び構成、並びに材料が、本発明によるデバイスに関して本願明細書に記述されたが、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、形態及び詳細のさまざまな変更又は変形が行われることができることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】従来技術による容量アフィニティセンサを示す図。
【図２】従来技術による容量アフィニティセンサを示す図。
【図３】本発明の一実施例によるセンサデバイスを示す図。
【図４】本発明の一実施例によるセンサデバイスを示す図。
【図５】本発明の特定の例による測定曲線を示す図。
【図６】本発明の特定の例による測定曲線を示す図。
【図７】本発明の特定の例による測定曲線を示す図。
【図８】本発明の特定の例による測定曲線を示す図。
【図９】本発明の特定の例による測定曲線を示す図。
【図１０】本発明の特定の例による測定曲線を示す図。
【図１１】本発明の特定の例による測定曲線を示す図。
【図１２】本発明の特定の例による測定曲線を示す図。
【図１３】本発明の特定の例による測定曲線を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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