(57)【要約】  本発明はメラノーマ、乳癌、および肝細胞癌において発現されるＳＭ５−１抗原に特異的な抗体、および抗体をコードしているポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、悪性腫瘍の診断および治療における、かかる抗体および／またはポリヌクレオチドの用途に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の、ＳＭ５−１ターゲット抗原に対する免疫特異的結合を競合的に阻害する抗体であって、前記ヒトＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の重鎖の可変領域が、配列番号９に示されたアミノ酸配列を含んでおり、前記ヒトＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列を含んでいる抗体。
【請求項２】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ′フラグメント、Ｆ（ａｂ′）2フラグメント、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体、単鎖抗体、および抗体フラグメントから形成された多特異性抗体からなる群より選ばれる、請求項１の抗体。
【請求項３】
前記抗体の重鎖の可変領域が、配列番号９に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり、前記抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含んでいる、請求項１の抗体。
【請求項４】
前記抗体の重鎖の可変領域が、配列番号９に示されたアミノ酸配列を含んでいる、請求項３の抗体。
【請求項５】
前記抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列を含んでいる、請求項３の抗体。
【請求項６】
ヒトＳＭ５−１特異モノクローナル抗体であって、前記ヒトＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の重鎖の可変領域が、配列番号９に示されたアミノ酸配列を含んでおり、前記ヒトＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列を含んでいる抗体。
【請求項７】
ＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の、ＳＭ５−１ターゲット抗原に対する免疫特異的結合を競合的に阻害する抗体であって、前記ＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の重鎖の可変領域が、配列番号１に示されたアミノ酸配列を含んでおり、前記ＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号２に示されたアミノ酸配列を含んでいる抗体。
【請求項８】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ′フラグメント、Ｆ（ａｂ′）2フラグメント、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体、単鎖抗体、および抗体フラグメントから形成された多特異性抗体からなる群より選ばれる、請求項７の抗体。
【請求項９】
前記抗体の重鎖の可変領域が、配列番号１に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり、前記抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号２に示されたアミノ酸配列２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含んでいる、請求項７の抗体。
【請求項１０】
ヒト化された抗体である、請求項９の抗体。
【請求項１１】
前記抗体の重鎖の可変領域が、配列番号３に示されたアミノ酸配列を含んでおり、前記抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号４に示されたアミノ酸配列を含んでいる、請求項７の抗体。
【請求項１２】
ヒト化ＳＭ５−１特異モノクローナル抗体であって、前記ヒト化抗体の重鎖の可変領域が、配列番号１に示されたアミノ酸配列を含んでおり、前記ヒト化抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号２に示されたアミノ酸配列を含んでいる抗体。
【請求項１３】
請求項３の抗体の、重鎖および／または軽鎖か、またはそのフラグメントをコードしているヌクレオチド配列を含んでいる、単離された核酸。
【請求項１４】
請求項６のヒトＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の、重鎖および／または軽鎖か、またはそのフラグメントをコードしているヌクレオチド配列を含んでいる、単離された核酸。
【請求項１５】
配列番号１１および／または配列番号１２に示されたヌクレオチド配列を含んでいる、請求項１４の核酸。
【請求項１６】
請求項１３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでいる，単離された核酸。
【請求項１７】
請求項１３の核酸を含有しているベクター。
【請求項１８】
前記抗体の、重鎖および／または軽鎖か、またはそのフラグメントをコードしている核酸に、作動可能に結合された発現調節配列をさらに含んでいる、請求項１７のベクター。
【請求項１９】
請求項１３の核酸を含んでいる組換え細胞。
【請求項２０】
真核細胞である、請求項１９の組換え細胞。
【請求項２１】
ＣＨＯ細胞である、請求項１９の組換え細胞。
【請求項２２】
請求項９の抗体の、重鎖および／または軽鎖か、またはそのフラグメントをコードしているヌクレオチド配列を含んでいる、単離された核酸。
【請求項２３】
請求項１２のヒト化抗体の、重鎖および／または軽鎖か、またはそのフラグメントをコードしているヌクレオチド配列を含んでいる、単離された核酸。
【請求項２４】
配列番号５および／または配列番号６に示されたヌクレオチド配列を含んでいる、請求項２３の核酸。
【請求項２５】
請求項２２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでいる、単離された核酸。
【請求項２６】
請求項２２の核酸を含んでいるベクター。
【請求項２７】
前記抗体の、重鎖および／または軽鎖か、またはそのフラグメントをコードしている核酸に、作動可能に結合された発現調節配列をさらに含んでいる、請求項２６のベクター。
【請求項２８】
請求項２２の核酸を含んでいる組換え細胞。
【請求項２９】
真核細胞である、請求項２８の組換え細胞。
【請求項３０】
ＣＨＯ細胞である、請求項２８の組換え細胞。
【請求項３１】
抗体、またはそのフラグメントを産生する方法であって、請求項１３の核酸を含有している組換え細胞によって、コードされた抗体またはそのフラグメントが発現されるように前記細胞を成長させ、前記抗体はヒト抗体であり；かつ発現された抗体またはそのフラグメントを回収することを含む方法。
【請求項３２】
前記回収された抗体またはそのフラグメントを、単離および／または精製することをさらに含む、請求項３１の方法。
【請求項３３】
抗体、またはそのフラグメントを産生する方法であって、請求項２２の核酸を含有している組換え細胞によって、コードされた抗体またはそのフラグメントが発現されるように前記細胞を成長させ、前記抗体はヒト化抗体であり；かつ発現された抗体またはそのフラグメントを回収することを含む方法。
【請求項３４】
前記回収された抗体またはそのフラグメントを、単離および／または精製することをさらに含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
有効量の請求項３の抗体と、薬学上許容されるキャリアまたは賦形剤とを含んでいる薬剤組成物であって、前記抗体がヒト抗体である組成物。
【請求項３６】
有効量のヒト化ＳＭ５−１特異モノクローナル抗体と、薬学上許容されるキャリアまたは賦形剤とを含んでいる薬剤組成物であって、前記ヒト化ＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の重鎖の可変領域が、配列番号１に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり、前記ＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号２に示されたアミノ酸配列２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含んでいる組成物。
【請求項３７】
有効量の請求項３の抗体と、前記抗体の投与のための指示手段とを含んでいるキットであって、前記抗体がヒト抗体であるキット。
【請求項３８】
ヒト化ＳＭ５−１特異モノクローナル抗体と、前記抗体の投与のための指示手段とを含んでいるキットであって、前記ヒト化ＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の重鎖の可変領域が、配列番号１に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり、前記ヒト化ＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号２に示されたアミノ酸配列２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含んでいるキット。
【請求項３９】
哺乳類における新生物を治療するための方法であって、かかる治療が必要かまたは望ましい哺乳類へ、有効量の請求項１の抗体を投与することを含む方法。
【請求項４０】
前記哺乳類がヒトである、請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記新生物がメラノーマ、乳癌、または肝細胞癌である、請求項３９の方法。
【請求項４２】
前記抗体がヒトＳＭ５−１特異モノクローナル抗体である、請求項３９の方法。
【請求項４３】
前記抗体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）により、その抗新生物効果を及ぼす、請求項３９の方法。
【請求項４４】
哺乳類における新生物を治療するための方法であって、かかる治療が必要かまたは望ましい哺乳類へ、有効量の請求項７の抗体を投与することを含む方法。
【請求項４５】
前記抗体がヒト化抗体であって、前記ヒト化抗体の重鎖の可変領域が、配列番号１に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり、前記ヒト化抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号２に示されたアミノ酸配列２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含んでいる、請求項４４の方法。
【請求項４６】
前記哺乳類がヒトである、請求項４５の方法。
【請求項４７】
前記新生物がメラノーマ、乳癌、または肝細胞癌である、請求項４５の方法。
【請求項４８】
前記ヒト化抗体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）により、その抗新生物効果を及ぼす、請求項４５の方法。
【請求項４９】
ａ）有効量の、請求項１の抗体；および
ｂ）有効量の抗新生物薬、
を含んでいる組合せ剤。
【請求項５０】
前記抗新生物薬が、メラノーマ、乳癌、または肝細胞癌を治療する薬剤である、請求項４９の組合せ剤。
【請求項５１】
哺乳類における新生物を治療するための方法であって、かかる治療が必要かまたは望ましい哺乳類へ、有効量の請求項４９の組合せ剤を投与することを含む方法。
【請求項５２】
ａ）有効量の、請求項７の抗体；および
ｂ）有効量の抗新生物薬、
を含んでいる組合せ剤。
【請求項５３】
前記抗体がヒト化抗体であって、前記ヒト化抗体の重鎖の可変領域が、配列番号１に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり、前記ヒト化抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号２に示されたアミノ酸配列２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含んでいる、請求項５２の組合せ剤。
【請求項５４】
前記抗新生物薬が、メラノーマ、乳癌、または肝細胞癌を治療する薬剤である、請求項５２の組合せ剤。
【請求項５５】
哺乳類における新生物を治療するための方法であって、かかる治療が必要かまたは望ましい哺乳類へ、有効量の請求項５２の組合せ剤を投与することを含む方法。
【請求項５６】
細胞においてカスパーゼ−１０介在性のアポトーシスを誘導する方法であって、かかる誘導が必要かまたは望ましい細胞へ、有効量の請求項１の抗体を投与することを含む方法。
【請求項５７】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項５６の方法。
【請求項５８】
前記細胞が哺乳類の中に含まれる、請求項５６の方法。
【請求項５９】
細胞においてカスパーゼ−１０介在性のアポトーシスを誘導する方法であって、かかる誘導が必要かまたは望ましい細胞へ、有効量の請求項７の抗体を投与することを含む方法。
【請求項６０】
前記抗体がヒト化抗体であって、前記ヒト化抗体の重鎖の可変領域が、配列番号１に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり、前記ヒト化抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号２に示されたアミノ酸配列２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含んでいる、請求項５９の方法。
【請求項６１】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項５９の方法。
【請求項６２】
前記細胞が哺乳類の中に含まれる、請求項５９の方法。
【請求項６３】
毒素および／または放射性同位元素へコンジュゲートされた、請求項１の抗体を含んでいるコンジュゲート。
【請求項６４】
前記抗体がヒト抗体であって、前記抗体の重鎖の可変領域が、配列番号９に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり、前記抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含んでいる、請求項６３のコンジュゲート。
【請求項６５】
毒素および／または放射性同位元素へコンジュゲートされた、請求項７の抗体を含んでいるコンジュゲート。
【請求項６６】
前記抗体がヒト化抗体であって、前記ヒト化抗体の重鎖の可変領域が、配列番号１に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり、前記ヒト化抗体の軽鎖の可変領域が、配列番号２に示されたアミノ酸配列２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含んでいる、請求項６５のコンジュゲート。
【請求項６７】
試料中のヒトＳＭ５−１ターゲット抗原をアッセイするための方法であって：
ａ）検査されるべき患者から試料を取得すること；
ｂ）前記試料を請求項１の抗体と、好適な条件下に接触させ、もし前記試料中に存在すれば、前記ヒトＳＭ５−１ターゲット抗原と、前記抗体との間の結合を可能にすること；および
ｃ）もし前記試料中に存在すれば、前記ヒトＳＭ５−１ターゲット抗原と、前記抗体との間の結合を査定して、前記試料中の前記ヒトＳＭ５−１ターゲット抗原の存在、不在、および／または、量を決定すること、を含む方法。
【請求項６８】
新生物の予後または診断において使用される、請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記新生物がメラノーマ、乳癌、または肝細胞癌である、請求項６８の方法。
【請求項７０】
試料中のヒトＳＭ５−１ターゲット抗原をアッセイするための方法であって：
ａ）検査されるべき患者から試料を取得すること；
ｂ）前記試料を請求項７の抗体と、好適な条件下に接触させ、もし前記試料中に存在すれば、前記ヒトＳＭ５−１ターゲット抗原と、前記抗体との間の結合を可能にすること；および
ｃ）もし前記試料中に存在すれば、前記ヒトＳＭ５−１ターゲット抗原と、前記抗体との間の結合を査定して、前記試料中の前記ヒトＳＭ５−１ターゲット抗原の存在、不在、および／または、量を決定すること、を含む方法。
【請求項７１】
新生物の予後または診断において使用される、請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記新生物がメラノーマ、乳癌、または肝細胞癌である、請求項７１の方法。
【請求項７３】
試料中のヒトＳＭ５−１ターゲット抗原をアッセイするためのキットであって：
ａ）請求項１の抗体；および
ｂ）もし前記試料中に存在すれば、前記ヒトＳＭ５−１ターゲット抗原と、前記抗体との間の結合を査定して、前記試料中の前記ヒトＳＭ５−１ターゲット抗原の存在、不在、および／または、量を決定するための手段とを含むキット。
【請求項７４】
試料中のヒトＳＭ５−１ターゲット抗原をアッセイするためのキットであって：
ａ）請求項７の抗体；および
ｂ）もし前記試料中に存在すれば、前記ヒトＳＭ５−１ターゲット抗原と、前記抗体との間の結合を査定して、前記試料中の前記ヒトＳＭ５−１ターゲット抗原の存在、不在、および／または、量を決定するための手段とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願へのクロス・リファレンス）
本出願は、２００３年６月６日出願の中国特許出願第０３１２９１２３．６号、および２００３年１１月２５日出願の第２００３１０１１９９２６４号；米国特許出願、２００３年１１月２６日出願の米国特許出願第１０／７２２，８４９号；および、２００３年１１月２８日出願の台湾特許出願第０９２１３３５７１号の恩典をクレームするものであり、そのすべてが参考として本明細書に含まれるものとする。
【０００２】
本発明は、全般的には癌生物学および免疫療法の分野に関する。さらに具体的には、本発明はメラノーマ、乳癌、および肝細胞癌において特異的に発現される腫瘍抗原、腫瘍抗原に対して向けられた抗体、および抗原に関連した癌の診断および／または治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
悪性腫瘍は、人類の生命を脅かす重大な疾患の一つである。メラノーマ、乳癌および肝細胞癌は、最も一般的な悪性腫瘍の一部である。
【０００４】
メラノーマは、悪性度の高いタイプの癌である。メラノーマの症例の約２０％が頸部および頭部に発生し、大部分は皮膚および腔ならびに洞の粘膜上である。一般に、ヒトのメラノーマは色素母斑に由来し、それは照射により刺激されると有害な転移性メラノーマ細胞になる。メラノーマはかなり体中に広がりやすく、管理しにくい。化学療法および放射線療法は、メラノーマには有効ではない。
【０００５】
メラノーマの免疫組織化学的診断に最も一般的に使用される抗体は、ＨＭＢ−４５、抗Ｓ−１００、およびＮＫＩ／Ｃ３である（スモーラー（Smaller BR）ら著、Pathology : state of the art reviews、１９９４年、第２巻、ｐ．３７１−３８３）。これらの抗体は不利な点を有する。ＨＭＢ−４５の感度は充分に高くなく（６７％〜９３％の間の感度）、いくつかのメラノーマの症例を診断未確定のまま残すことがある（ウィック（Wick M R）ら著、J. Cutan Pathol、１９８８年、第１５巻、ｐ．２０１−２０７；オルドネツ（Ordonez N G）ら著、Am J. Clin. Pathol.１９８８年、第９０巻、ｐ．３８５−３９０）。抗Ｓ−１００抗体は、ＨＭＢ−４５に比べてより感受性ではあるが（ナカジマ（Nakajima T）ら著、Cancer、１９８２年、第５０巻、ｐ．９１２−９１８；キンドブロム（Kingdblom L G）ら著、Acta. Pathol. Microbial. Immunol. Scand、１９８４年、第９２巻、ｐ．２１９−２３０）、それは非常に特異的というわけではない。ＮＫＩ／Ｃ３は、多くの良性および悪性腫瘍に結合し、この非特異性がＭＫＬ／Ｃ３のメラノーマ診断における適用を大きく制限している。
【０００６】
乳癌は女性には最もよく起こる悪性腫瘍の一つである。世界中で、毎年約１２０万人の女性がこの病気に冒されており、毎年約５０万人がこの病気で死亡している。北アメリカ、西および北ヨーロッパの先進国は、この病気の発症率が最も高く、アフリカ諸国での発症率は最も低い。乳癌の新たな症例は世界中で有意に増加しつつあり、発生率の高い地域および発生率の低い地域の双方において、５〜２０％の割合で増加している。
【０００７】
肝細胞癌は、中国で最も多い悪性腫瘍の一つであり、その発症は肝炎と関係している。最もよく研究されている肝臓癌抗原は、ＰＨＣ、Ｆ０６２、２５Ｔ、およびＨａｂ１８その他（リアン・ユン・ヤン（Lian-Jun Yang）、ウェン・リャン・ワン（Wen-Liang Wang）、World J. Gastroenterol.、２００２年、第８巻、第５号、ｐ．８０８−８１４）を含む。ＡＦＰは肝臓癌患者の血液中に発現されるばかりでなく、卵巣および精巣の癌細胞においても発現されることが見出されている。ヘパトーム特異モノクローナル抗体Ｈａｂ１８も研究されているが、へパトーム療法に有効なターゲットとはなり得ていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
悪性腫瘍の免疫療法用に多くのモノクローナル抗体が開発されてきたが、このようなモノクローナル抗体の特異性および中和能は完璧ではない。悪性腫瘍に対し高い特異性および高い中和能をもつモノクローナル抗体（ヒト化抗体を含めて）を開発することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本文において開示される本発明は、メラノーマ、乳癌、および肝細胞癌において発現される抗原ＳＭ５−１に特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体などの）およびポリペプチドに関する。この抗原の分子量は２３０ｋＤおよび１８０ｋＤである。この抗原は、メラノーマ、乳癌、および／または肝細胞癌から、本発明の抗体を用いて単離されることが可能である。
【００１０】
一つの観点において、本発明はヒトＳＭ５−１特異モノクローナル抗体（ｈｕＳＭ５−１）を提供する。ヒトＳＭ５−１特異モノクローナル抗体（ｈｕＳＭ５−１）の重鎖および軽鎖の可変領域は、表１に示されている。抗体ｈｕＳＭ５−１は、アクセシング番号 を有する宿主細胞またはその子孫により産生される。
【００１１】
いくつかの態様においては、本発明は、抗体ｈｕＳＭ５−１のフラグメントまたは領域を含んでいる抗体またはポリペプチドである。一つの態様においては、フラグメントは表１に示された抗体ｈｕＳＭ５−１の重鎖である。もう一つの態様においては、フラグメントは表１に示された抗体ｈｕＳＭ５−１の軽鎖である。さらにもう一つの態様においては、フラグメントは、配列番号９および配列番号１０に示された、抗体ｈｕＳＭ５−１の重鎖および／または軽鎖からの、一以上の可変領域を含む。さらに別の態様においては、フラグメントは、表１に示された抗体ｈｕＳＭ５−１の重鎖および／または軽鎖からの、一以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００１２】
もう一つの観点においては、本発明は、抗体ｈｕＳＭ５−１の、ＳＭ５−１ターゲット抗原への免疫特異的結合を競合的に阻害する抗体を提供する。いくつかの態様においては、抗体の重鎖の可変領域は、配列番号９に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり、抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号１０に示されたアミノ酸配列２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含んでいる。別の態様においては、抗体の重鎖の可変領域は、配列番号９に示されたアミノ酸配列を含む。さらに別の態様においては、抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号１０に示されたアミノ酸配列を含む。さらに他の態様においては、抗体の重鎖の可変領域は、配列番号９に示されたアミノ酸配列を含んでおり、抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号１０に示されたアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの態様においては、抗体はヒト抗体である。
【００１３】
もう一つの観点においては、本発明はマウスＳＭ５−１特異抗体（ｍＳＭ５−１）（重鎖および軽鎖の可変領域が、表２に示されている）を提供する。抗体ｍＳＭ５−１の重鎖の可変領域は、配列番号３に示されたアミノ酸配列を含んでおり、抗体ｍＳＭ５−１の軽鎖の可変領域は、配列番号４に示されたアミノ酸配列を含んでいる。
【００１４】
いくつかの態様においては、本発明は、抗体ｍＳＭ５−１のフラグメントまたは領域を含んでいる抗体またはポリペプチドである。いくつかの態様においては、フラグメントは、配列番号３および配列番号４に示された、抗体ｍＳＭ５−１の重鎖および／または軽鎖からの、一以上の可変領域を含む。さらに別の態様においては、フラグメントは、配列番号３および配列番号４に示された、抗体ｍＳＭ５−１の重鎖および／または軽鎖からの、一以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００１５】
もう一つの観点においては、本発明は、抗体ｍＳＭ５−１の、ＳＭ５−１ターゲット抗原への免疫特異的結合を競合的に阻害する抗体を提供する。いくつかの態様においては、抗体の重鎖の可変領域は、配列番号３に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり、抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号４に示されたアミノ酸配列２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含んでいる。いくつかの態様においては、抗体はヒト化抗体である。
【００１６】
さらにもう一つの観点においては、ＳＭ５−１ターゲット抗原に免疫特異的な抗体はキメラ抗体であって、該抗体の重鎖の可変領域は配列番号３に示されたアミノ酸配列を含んでおり、該抗体の軽鎖の可変領域は配列番号４に示されたアミノ酸配列を含んでいる。
【００１７】
さらにもう一つの観点においては、本発明の抗体はヒト化抗体であって、ヒト化抗体の重鎖の可変領域は配列番号１に示されたアミノ酸配列を含んでおり、および／またはヒト化抗体の軽鎖の可変領域は配列番号２に示されたアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの態様においては、ヒト化抗体はアクセッション番号 を有する宿主細胞またはその子孫により産生される。いくつかの態様においては、本発明は、ヒト化抗体のフラグメントまたは領域を含んでいる抗体またはポリペプチドである。いくつかの態様においては、フラグメントは、配列番号１および配列番号２に示された、ヒト化抗体の重鎖および／または軽鎖からの、一以上の可変領域を含む。いくつかの態様においては、フラグメントは、配列番号１および配列番号２に示された、ヒト化抗体の重鎖および／または軽鎖からの、一以上のＣＤＲを含む。本発明はまた、ＳＭ５−１ターゲット抗原に対するヒト化抗体の免疫特異的結合を、競合的に阻害する抗体を提供する。
【００１８】
本文に記述された、いくつかの態様においては、本発明の抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ′フラグメント、Ｆ（ａｂ′）2フラグメント、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体、単鎖抗体、または本文に記述された抗体フラグメントから形成された多特異性抗体である。
【００１９】
もう一つの態様においては、本発明はまた、本文に記述された任意の抗体の、重鎖および／または軽鎖、またはそれらのフラグメントをコードしているヌクレオチド配列を含んでいる、単離された核酸も提供する。いくつかの態様においては、核酸は、配列番号９および／または配列番号１０に示されたアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様においては、核酸は、配列番号１１および／または配列番号１２に示されたヌクレオチド配列を含む。別の態様においては、核酸は、配列番号３および／または配列番号４に示されたアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含む。別の態様においては、核酸は、配列番号７および／または配列番号８に示されたヌクレオチド配列を含む。別の態様においては、核酸は、配列番号１および／または配列番号２に示されたアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含む。別の態様においては、核酸は、配列番号５および／または配列番号６に示されたヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
もう一つの観点において、本発明は、本文に記述された任意のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでいる、単離された核酸を提供する。
【００２１】
もう一つの観点においては、本発明は、本文に記述された任意の核酸を含有しているベクターを提供する。ベクターはさらに、本文に記述された任意の抗体をコードしている核酸に作動可能に結合された、発現調節配列をさらに含んでよい。
【００２２】
もう一つの観点においては、本発明はまた、本文に記述された任意の核酸を含有している組換え細胞も提供する。いくつかの態様においては、組換え細胞は真核細胞である。別の態様においては、組換え細胞はＣＨＯ細胞である。いくつかの態様においては、細胞は
アクセッション番号 を有する。もう一つの態様においては、細胞はアクセッション番号 を有する。
【００２３】
もう一つの観点においては、本発明は本文に記述された任意の抗体、またはそのフラグメントを産生する方法であって、核酸を含有している組換え細胞によって、コードされた抗体またはそのフラグメントが発現されるように細胞を成長させ；および、発現された抗体またはそのフラグメントを回収することを含む方法である。いくつかの態様においては、方法はさらに、回収された抗体またはそのフラグメントを、単離および／または精製することを含む。
【００２４】
もう一つの観点においては、本発明は、本文に記述された有効量の任意の抗体と、薬学上許容されるキャリアまたは賦形剤とを含む薬剤組成物を提供する。いくつかの態様においては、薬剤組成物は有効量のヒトＳＭ５−１特異モノクローナル抗体と、薬学上許容されるキャリアまたは賦形剤とを含んでおり、ヒトＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の重鎖の可変領域は、配列番号９に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり、ヒトＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号１０に示されたアミノ酸配列２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含んでいる。別の態様においては、薬剤組成物は有効量のヒト化ＳＭ５−１特異モノクローナル抗体と、薬学上許容されるキャリアまたは賦形剤とを含んでおり、ヒト化ＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の重鎖の可変領域は、配列番号１に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり、ヒト化ＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号２に示されたアミノ酸配列２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含んでいる。
【００２５】
本発明はまた、有効量の、本文に記述された任意の抗体と、抗体の投与のための指示手段とを含んでいるキットも提供する。
【００２６】
もう一つの観点においては、本発明は哺乳類における新生物を治療するための方法であって、かかる治療が必要かまたは望ましい哺乳類へ、有効量の、本文に記述された任意の抗体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様においては、哺乳類はヒトである。いくつかの態様においては、新生物はメラノーマ、乳癌、または肝細胞癌である。いくつかの態様においては、抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）により、その抗新生物効果を及ぼす。いくつかの態様においては、抗体はヒト抗体である。別の態様においては、抗体はヒト化抗体である。
【００２７】
もう一つの観点においては、本発明は、ａ）有効量の、本文に記述された抗体；およびｂ）有効量の抗新生物薬を含んでいる、組合せ剤を提供する。いくつかの態様においては、抗新生物薬はメラノーマ、乳癌、または肝細胞癌を治療する薬剤である。
【００２８】
本発明はまた、哺乳類における新生物を治療するための方法であって、かかる治療が必要かまたは望ましい哺乳類へ、有効量の、本文に記述された組合せ剤を投与することを含む方法を提供する。
【００２９】
もう一つの観点においては、本発明は細胞においてカスパーゼ−１０介在性のアポトーシスを誘導する方法であって、かかる誘導が必要かまたは望ましい細胞へ、有効量の、本文に記述された任意の抗体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様においては、細胞は哺乳類細胞である。いくつかの態様においては、細胞は哺乳類の中に含まれる。
【００３０】
もう一つの観点においては、本発明はまた、毒素および／または放射性同位元素へコンジュゲートされた、本文に記述された任意の抗体を含むコンジュゲートも提供する。
【００３１】
もう一つの観点においては、本発明は、試料中のＳＭ５−１ターゲット抗原（たとえば、ヒトＳＭ５−１ターゲット抗原）をアッセイするための方法であって：ａ）検査されるべき患者から試料を取得すること；ｂ）前記試料を本文に記述された任意の抗体と、好適な条件下に接触させ、もし前記試料中に存在すれば、前記ＳＭ５−１ターゲット抗原と、前記抗体との間の結合を可能にすること；およびｃ）もし前記試料中に存在すれば、前記ＳＭ５−１ターゲット抗原と、前記抗体との間の結合を査定して、前記試料中の前記ＳＭ５−１ターゲット抗原の存在、不在、および／または、量を決定すること、を含む方法を提供する。いくつかの態様においては、方法は新生物の予後または診断において使用される。いくつかの態様においては、新生物はメラノーマ、乳癌、または肝細胞癌である。
【００３２】
本発明はまた、試料中のＳＭ５−１ターゲット抗原（たとえば、ヒトＳＭ５−１ターゲット抗原）をアッセイするためのキットであって；ａ）本文に記述された任意の抗体；およびｂ）もし前記試料中に存在すれば、前記ＳＭ５−１ターゲット抗原と、前記抗体との間の結合を査定して、前記試料中の前記ＳＭ５−１ターゲット抗原の存在、不在、および／または、量を決定するための手段とを含む、キットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明は、メラノーマ、乳癌、および肝細胞癌において過剰発現される新規な抗原、ＳＭ５−１抗原の発見に基づいている。該抗原は、グリコシル化および非グリコシル化された形状で存在する。ウェスタンブロットでは、本発明の抗体は、２３０ｋＤ（Ａ２３０と呼ばれる）および１８０ｋＤ（Ａ１８０と呼ばれる）の分子量を有する二つのタンパク質に対し特異的に結合する。
【００３４】
本発明はまた、ヒト抗体（ｈｕＳＭ５−１、その可変領域が表１に示される）、ヒト化抗体（ＲｅＳＭ５−１、可変領域は表３に示される）、およびキメラ抗体（ｃｈＳＭ５−１、可変領域は表２に示される）のような、ＳＭ５−１抗原に特異的な抗体も提供する。これらの抗体は、メラノーマ、乳癌、および肝細胞癌に存在する抗原に結合することができる。これらの抗体はまた、これらの癌細胞において、成長および／または増殖を阻害し、カスパーゼ１０介在性のアポトーシスを誘導する。したがって、ＳＭ５−１抗原はこれらの悪性腫瘍を治療するためのターゲットを提供する。
【００３５】
開示の明確さのためであって、制限としてではなく、本発明の詳細な説明が以下の項に分けられている。
【００３６】
Ａ．全般的な技術
本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含めて）、微生物学、細胞生物学、生化学、免疫学の通常の技術を用いており、それらは当業者の技術の範囲内にある。かかる技術は、サンブルック（Sambrook）ら著、「Molecular Cloning : A Laboratory Manual（分子クローニング：実験室マニュアル）」第２版、１９８９年、コールドスプリングハーバー出版（Cold Spring Harbor Press）；ガイト（M. J. Gait）編、「Oligonucleotide Synthesis（オリゴヌクレオチド合成）」、１９８４年；「Methods in Molecular Biology（分子生物学の方法）」、フマナ出版（Humana Press）；セリス（J. E. Cellis）編、「Cell Biology : A Laboratory Notebook（細胞生物学：実験室ノート）」、１９８８年、アカデミックプレス（Academic Press）；フレッシュニー（R. I. Freshney）編、「Animal Cell Culture（動物細胞培養）」１９８７年；ドイル（A. Doyle）、グリフィス（J. B. Griffiths）、およびニューウェル（D. G. Newell）編、「Cell and Tissue Culture : Laboratory Procedure（細胞および組織培養：実験室手順）」、１９９３〜１９９８年、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（J. Wiley and Sons）；「Methods in Enzymology（酵素学の方法）、アカデミックプレス・インク（Academic Press Inc）；ウェア（D. M. Weir）およびブラックウェル（C. C. Blackwell）編、「Handbook of Experimental Immunology（実験免疫学ハンドブック）」；ミラー（J. M. Miller）およびカロス（M. P. Calos）編、「Gene Transfer Vector for Mammalian Cells（哺乳類細胞のための遺伝子伝達ベクター）」、１９８７年；アズベル（F. M. Ausubel）ら編、「Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学における最新のプロトコール）」、１９８７年；ミュリス（Mullis）ら著、「ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction（PCR：ポリメラーゼ連鎖反応）」、１９９４年；コリガン（J. E. Coligan）ら編「Current Protocols in Immunology（免疫学の最新プロトコール）」、１９９１年；「Short Protocols in Molecular Biology（分子生物学におけるショートプロトコール）」、１９９９年、ウィリー・アンド・サンズ（Wiley and Sons）；ジェーンウェイ（C. A. Janeway）およびトラバーズ（P. Travers）著、「Immunobioligy（免疫生物学）」、１９９７年；フィンチ（P. Finch）著、「Antibodies（抗体）」、１９９７年；キャティ（D. Catty）編、「Antibodies : a practical approach（抗体：実用的アプローチ）」、１９８８〜１９８９年、ＩＲＬ出版；シェファード（P. Shepherd）およびディーン（C. Dean）編、「Monoclonal antibodies : a practical approach（モノクローナル抗体：実用的アプローチ）」、２０００年、オックスフォード大学出版（Oxford University Press）；ハーロウ（E. Harlow）およびレーン（D. Lane）著、「Using antibodies : a loboratory manual（抗体の使用：実験室マニュアル）」、１９９９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）：ザネッティ（M. Zanetti）およびカプラ（J. D. Capra）編、「The Antibodies（抗体）」、１９９５年、ハーウッド・アカデミック・パブリッシャーズ（Harwood Academic Publishers）；および、デビータ（V. T. DeVita）ら編、「Cancer : Princeples and Practice of Oncology（癌：腫瘍学の原理と実際）」、１９９３年、ジェイ・ビー・ リッピンコット・カンパニー（J. B. Lippincott Company）、のような文献において充分に説明されている。
【００３７】
Ｂ．定義
他に定義されない限り、本文において使用されたすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術の当業者によって共通して理解されているものと同様の意味を有する。本文において参照されたすべての特許、出願、公表された出願、および他の刊行物は、そのすべてが参考として本明細書に含まれる。もし本節において示された定義が、参考として本文に含まれている特許、出願、公表された出願、および他の刊行物に示された定義に反するか、さもなければ矛盾する場合には、本節において示された定義が、参考として本文に含まれている定義に勝る。
【００３８】
本文において使用されるように、「一つの（ａまたはａｎ）」は、「少なくとも一つの」または「一以上」を意味する。
【００３９】
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくも一つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどといったターゲットへ特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本文において用いられるように、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体のみならず、それらのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）2、Ｆｖのような）、単鎖（ＳｃＦｖ）、二重特異性抗体、抗体フラグメントから形成された多特異性抗体、それらの突然変異体、抗体部分を含んでいる融合タンパク質、および必要とされる特異性の抗原認識部位を含んでいる任意の他の修飾された構造の免疫グロブリン分子も含む。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそれらのサブクラス）のような任意のクラスの抗体、および、必ずしも特定のクラスのものではない抗体を含む。抗体の重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列により、免疫グロブリンは異なるクラスに割当てることができる。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、各々アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。サブユニット構造および、異なるクラスの免疫グロブリンの三次元構造は周知である。
【００４０】
「モノクローナル抗体」は、均一な抗体集団を指し、モノクローナル抗体は、抗原の選択的な結合に関与するアミノ酸（天然および非天然の）を含んでいる。モノクローナル抗体は高度に特異的であって、単一の抗原性部位へ向けられている。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体および完全長のモノクローナル抗体ばかりでなく、それらのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）2、Ｆｖなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの突然変異体、抗体部分を含んでいる融合タンパク質、必要とされる特異性および抗原への結合能力の抗原認識部位を含んでいる、任意の他の修飾された構造の免疫グロブリン分子を含む。抗体の供給源またはそれが作製された方法（たとえば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物など）に関して、制限されることは意図されていない。
【００４１】
抗体の「可変領域」は、単独または組合せでの、抗体軽鎖の可変領域か、または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域は各々、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結された、４つの枠組み構造領域（ＦＲ）からなる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより、近接して一緒に保持されており、他鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するための、少なくとも二つの技術：（１）交差種間配列の可変性に基づくアプローチ（カバット（Kabat）ら著、「Sequences of Proteins of Immunological Interest（免疫学的に関心のあるタンパク質の配列）第５版、１９９１年、国立衛生研究所（National Institute of Health）、メリーランド州、ベセスダ」；および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（チョシア（Chothia）ら著、「Nature」、１９８９年、第３４２巻、ｐ．８７７；アル・ラジカニ（Al-lazikani）ら著、J. Molec. Biol. １９９７年、第２７３巻、ｐ．９２７−９４８）、がある。本文において用いられるように、ＣＤＲはいずれかのアプローチによるか、または双方のアプローチの組合せによって定義されるＣＤＲを指してよい。
【００４２】
抗体の「定常領域」は、単独または組合せでの、抗体軽鎖の定常領域か、または抗体重鎖の定常領域をさす。
【００４３】
「ヒト化」抗体は、実質的に非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位と、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく残りの免疫グロブリン構造分子とを有する分子を指す。抗原結合部位は、定常領域へ融合された完全な可変ドメインか、または可変ドメイン中の適当な枠組み構造領域へグラフトされた相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含んでもよい。抗原結合部位は、野生型か、または一以上のアミノ酸置換によって修飾されてもよい；たとえば、ヒト免疫グロブリンにさらに類似するべく修飾される。いくつかのタイプのヒト化抗体は、すべてのＣＤＲ配列を保持している（たとえば、マウス抗体からの全６個のＣＤＲを含有するヒト化マウス抗体）。他のタイプのヒト化抗体は、もとの抗体に対して変えられた一以上（１、２、３、４、５、６）のＣＤＲを有しており、それらもまた、もとの抗体の一以上のＣＤＲに「由来する」一以上のＣＤＲと呼ばれる。
【００４４】
「キメラ抗体」は、重鎖および軽鎖の各アミノ酸配列の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定のクラスに属している抗体の、対応する配列に対し相同である一方で、鎖の残りのセグメントは、別の対応する配列に対して相同である抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体においては、軽鎖および重鎖双方の可変領域は、哺乳類の一つの種に由来する抗体の可変領域を模倣しており、一方、定常部分は別のものに由来する抗体の配列に対して相同である。かかるキメラ形状の一つの明らかな利点は、たとえば、容易に入手可能なハイブリドーマまたは非ヒト宿主生物からのＢ細胞を用いることにより、可変領域が、たとえば、ヒト細胞標品に由来する定常領域との組合せにおいて、現在既知の供給源から便利に誘導することができることである。可変領域が調製の容易さという利点を有しており、かつ特異性がその供給源によって影響されないのに対し、ヒトの定常領域は、抗体が注射されるとき、非ヒト供給源からの定常領域よりも、ヒト患者から免疫応答を誘発しにくい。この定義はしかしながら、この特定の例に限定されない。
【００４５】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すべく、本文において互換的に使用される。ポリマーは直鎖または分枝鎖でよく、修飾されたアミノ酸を含んでよく、また非アミノ酸によって割込まれてもよい。この用語はまた、天然に、または介入による、たとえば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または、標識成分とのコンジュゲーションのような任意の他の操作または修飾によって修飾された、アミノ酸ポリマーも含む。この定義の範囲内には、たとえば、アミノ酸の一以上の類似体（たとえば、非天然アミノ酸などを含めて）、ならびにこの技術において既知の他の修飾を含んでいるポリペプチドもまた含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づいていることから、ポリペプチドが単鎖または結合鎖として生じることが可能であることが理解される。
【００４６】
本文において用いられるように、「核酸」は、特に単鎖、二重鎖、三重鎖、直鎖および環状鎖の形状を含めた、任意の形状のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。それはまた、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸のキメラ、およびそれらの類似体も含む。本文に記述され核酸は、塩基アデノシン、シトシン、グアニン、チミジン、およびウリジンからなる、周知のデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドで構成されることが可能であるか、またはこれらの塩基の類似体または誘導体で構成されてもよい。さらに、ホスホトリエステエル、ポリヌクレオペプチド（ＰＮＡ）、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ポリヌクレオチドプライマー、ロックされた核酸（ＬＮＡ）などといった、非通常のホスホジエステル骨格をもつ種々の他のオリゴヌクレオチド誘導体もまた本文に含まれる。
【００４７】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチドインサートの取込みのためのベクターのレシピエントとなり得るか、またはなっている、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含んでおり、子孫は天然の、偶発的な、または計画的な突然変異のため、もとの親細胞とかならずしも（形態的にまたはゲノムＤＮＡ補体として）完全に同一でなくてもよい。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを用いてインビボでトランスフェクトされた細胞を含む。
【００４８】
本文において用いられる、「治療」または「治療すること」は、好ましくは臨床結果を含む、有益または所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のための、有益または所望の臨床結果は、これに制限されないが、以下の一以上：癌性細胞の増殖を低減すること（または破壊すること）、癌に見られる癌性細胞の転移を低減すること、腫瘍のサイズを縮小させること、疾病からの結果として生じる症状を減少させること、これらの疾病を患っている者の生活の質を向上すること、疾病を治療するために必要な他の薬物治療の用量を低減すること、疾病の進行を遅延すること、および／または個体の生存を延長すること、を含む。
【００４９】
「有効量」の抗体、薬物、または薬剤組成物は、腫瘍サイズの萎縮（癌という状況、たとえば、乳癌または肝臓癌、における）、癌性細胞増殖の遅延、疾病からの結果として生じる一以上の症状の減少、疾病を患っている者の生活の質の向上、疾病の治療に必要な他の薬物治療の用量を低減すること、ターゲティングによるなどの他の薬物治療の効果を高めること、疾病の進行を遅延すること、および／または個体の生存を延長することといった臨床結果を含めた、有益かつ所望の結果をもたらすべく充分な量である。有効量は、一回以上の投与で投与されることが可能である。本発明の目的のための、有効量の薬物、化合物、薬剤組成物は、癌性細胞の増殖を低減し（または破壊し）、かつ癌性細胞転移の発生または成長を、直接または間接的に低減および／または遅延するべく充分な量である。癌の臨床状況において理解されているように、有効量の薬物、化合物、薬剤組成物は、別の薬物、化合物、薬剤組成物と一緒に達成されてよく、されなくてもよい。したがって、「有効量」は、一以上の治療用薬物を投与する状況において考慮されてもよく、単一の薬剤は、所望の結果が一以上の他の薬剤と一緒に達成されてよいかまたは達成される場合、有効量が与えられるものとみなされてよい。
【００５０】
「生物学的試料」は、個体から得られた多様なタイプの試料を包含しており、診断またはモニタリングアッセイにおいて使用されることが可能である。この定義は、血液および生物学的起源の他の液体試料、生検材料のような固形組織試料、または、組織培養物またはそれに由来する細胞、およびそれらの子孫を含む。この定義はまた、その獲得の後に、試薬による処理、可溶化、または、タンパク質またはポリヌクレオチドのようなある成分の濃縮か、または切片法のため、半固形または固形マトリックス中に包埋することによるなどの任意の方法で操作された試料も含む。用語「生物学的試料」は、臨床試料を含んでおり、また培養物にある細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的液体、および組織試料も含む。
【００５１】
Ｃ．組成物および組成物の作製法
一つの観点において、本発明は、ＳＭ５−１抗原に対し特異的に結合する抗体またはポリペプチドを提供する。いくつかの態様においては、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様においては、抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。
【００５２】
いくつかの態様においては、本発明は、ＳＭ５−１抗原に対し特異的に結合する抗体またはポリペプチドであって、抗体の重鎖の可変領域は、配列番号９に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり、および／または、抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号１０に示されたアミノ酸配列２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含んでいる。いくつかの態様においては、抗体の重鎖可変領域は、配列番号９に示されたアミノ酸配列を含む。別の態様においては、抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１０に示されたアミノ酸配列を含む。他の態様では、抗体の重鎖可変領域は配列番号９に示されたアミノ酸配列を含んでおり、抗体の軽鎖可変領域は配列番号１０に示されたアミノ酸配列を含む。いくつかの態様においては、抗体は表１に示されたｈｕＳＭ５−１である。
【００５３】
いくつかの態様においては、本発明は抗体（たとえば、モノクローナル抗体）か、またはポリペプチドであって、抗体の重鎖可変領域は配列番号３に示されたアミノ酸配列３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０８を含んでおり，および／または抗体の軽鎖可変領域は配列番号４に示されたアミノ酸配列の２４〜４０、５６〜６２、および９５〜１０２を含む。いくつかの態様においては、抗体の重鎖可変領域は、配列番号３に示されたアミノ酸配列を含む。別の態様においては、抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４に示されたアミノ酸配列を含む。いくつかの態様においては、抗体の重鎖可変領域は配列番号３に示されたアミノ酸配列を含んでおり、抗体の軽鎖可変領域は配列番号４に示されたアミノ酸配列を含む。いくつかの態様においては、抗体はヒト化抗体である。いくつかの態様においては、ヒト化抗体の重鎖可変領域は配列番号１に示されたアミノ酸配列を含んでおり、ヒト化抗体の軽鎖可変領域は配列番号２に示されたアミノ酸配列を含む。
【００５４】
いくつかの態様においては、抗体はキメラ抗体であり、前記キメラ抗体の重鎖の可変領域は、配列番号３に示されたアミノ酸配列を含む。別の態様においては、抗体はキメラ抗体であり、前記キメラ抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号４に示されたアミノ酸配列を含む。別の態様においては、抗体はキメラ抗体であって、前記キメラ抗体の重鎖の可変領域は配列番号３に示されたアミノ酸配列を含んでおり、前記キメラ抗体の軽鎖の可変領域は配列番号４に示されたアミノ酸配列を含む。
【００５５】
本発明はまた、本文に記述された任意のＳＭ５−１特異モノクローナル抗体の、ＳＭ５−１ターゲット抗原に対する免疫特異的結合を競合的に阻害する抗体（たとえば、モノクローナル抗体）およびポリペプチドも提供する。競合アッセイは、二つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識することにより、同じエピトープに結合するかどうかを決定するべく使用されることが可能である。競合アッセイは、この技術において既知である。典型的には、抗原はマルチウェルプレート上に固定され、標識された抗体の結合を阻止する未標識抗体の能力が測定される。かかる競合アッセイに一般的な標識は、放射性標識または酵素標識である。
【００５６】
本発明はまた、上記の抗体および、同等の抗体またはポリペプチドフラグメント(たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）2、Ｆｖ、Ｆｃ等)、単鎖（ＳｃＦｖ）、二重特異性抗体、抗体フラグメントから形成された多特異性抗体、それらの突然変異体、抗体部分を含んでいる融合タンパク質、および必要な特異性であるＳＭ５−１抗原認識部位を含んでいる任意の他の修飾された構造の抗体の種々の処方も含む。
【００５７】
表１に示された可変領域の配列を有するヒト抗体（ｈｕＳＭ５−１）を産生する宿主細胞は、 に、 において、アクセッション番号 で寄託されている。表３に示された可変領域の配列を有するヒト化抗体（ＲｅＳＭ５−１）を産生する宿主細胞は、 に、 において、アクセッション番号 で寄託されている。この寄託は、特許手続き上の目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の条項、およびその規定の下に行なわれた。したがって、本発明は抗体、抗体フラグメント、および、本文に記述された宿主細胞によって産生された抗体に由来するポリペプチドを提供する。
【００５８】
本発明はまた、任意の以下もの、または任意の以下のものを含む組成物（薬剤組成物を含めて）も提供する：（ａ）抗体ｈｕＳＭ５−１（可変領域が表１に示されているか、またはアクセッション番号 を有する宿主細胞か、またはその子孫により産生された）；（ｂ）抗体ｈｕＳＭ５−１のフラグメントまたは領域；（ｃ）抗体ｈｕＳＭ５−１の重鎖；（ｄ）抗体ｈｕＳＭ５−１の軽鎖；（ｅ）抗体ｈｕＳＭ５−１の軽鎖および／または重鎖からの一以上の可変領域；（ｆ）抗体ｈｕＳＭ５−１の一以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲ）；（ｇ）抗体ｈｕＳＭ５−１の軽鎖からの３つのＣＤＲ；（ｈ）抗体ｈｕＳＭ５−１の重鎖からの３つのＣＤＲ；（ｉ）抗体ｈｕＳＭ５−１の軽鎖からの３つのＣＤＲおよび重鎖からの３つのＣＤＲ；および（ｊ）（ｂ）から（ｉ）までの任意の一つを含んでいる抗体。
【００５９】
本発明はまた、任意の以下のもの、または任意の以下のものを含む組成物（薬剤組成物を含めて）も提供する：（ａ）抗体ｍＳＭ５−１（可変領域が表２に示されているか、またはＡＴＣＣ指定番号ＨＢ−１２５８８を有する宿主細胞か、またはその子孫により産生された）；（ｂ）抗体ｍＳＭ５−１のフラグメントまたは領域；（ｃ）抗体ｍＳＭ５−１の軽鎖および／または重鎖からの一以上の可変領域；（ｄ）抗体ｍＳＭ５−１の一以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲ）；（ｅ）抗体ｍＳＭ５−１の軽鎖からの３つのＣＤＲ；（ｆ）抗体ｍＳＭ５−１の重鎖からの３つのＣＤＲ；（ｇ）抗体ｍＳＭ５−１の軽鎖からの３つのＣＤＲおよび重鎖からの３つのＣＤＲ；および（ｈ）（ｂ）から（ｇ）までの任意の一つを含んでいる抗体。
【００６０】
本発明はまた、任意の以下のもの、または任意の以下のものを含む組成物（薬剤組成物を含めて）も提供する：（ａ）抗体ＲｅＳＭ５−１（可変領域が表３に示されているか、またはアクセッション番号 を有する宿主細胞か、またはその子孫により産生された）；（ｂ）抗体ＲｅＳＭ５−１のフラグメントまたは領域；（ｃ）抗体ＲｅＳＭ５−１の軽鎖および／または重鎖からの一以上の可変領域；（ｄ）抗体ＲｅＳＭ５−１の一以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲ）；（ｅ）抗体ＲｅＳＭ５−１の軽鎖からの３つのＣＤＲ；（ｆ）抗体ＲｅＳＭ５−１の重鎖からの３つのＣＤＲ；（ｇ）抗体ＲｅＳＭ５−１の軽鎖からの３つのＣＤＲおよび重鎖からの３つのＣＤＲ；および（ｈ）（ｂ）から（ｇ）までの任意の一つを含んでいる抗体。
【００６１】
いくつかの態様においては、ＣＤＲはＫａｂａｔＣＤＲまたはＣｈｏｔｈｉａＣＤＲか、またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａＣＤＲの組合せであることが可能であることが理解される。ＣＤＲ領域の決定は、充分に当業者の技術の範囲内にある。
【００６２】
いくつかの態様においては、本発明は、ｈｕＳＭ５−１、ｍＳＭ５−１、またはＲｅＳＭ５−１の少なくとも一つのＣＤＲ、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つのＣＤＲと実質的に相同な（または、いくつかの態様においては、ｈｕＳＭ５−１、ｍＳＭ５−１、若しくはＲｅＳＭ５−１の、またはｈｕＳＭ５−１、ｍＳＭ５−１、若しくはＲｅＳＭ５−１に由来する、６つのＣＤＲすべてと実質的に相同である）、少なくとも一つのＣＤＲを含む抗体を提供する。別の態様は、ｈｕＳＭ５−１、ｍＳＭ５−１、若しくはＲｅＳＭ５−１の、またはｈｕＳＭ５−１、ｍＳＭ５−１、若しくはＲｅＳＭ５−１に由来する、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲに実質的に相同である、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲを有する抗体を含む。本発明の目的のためには、結合特性および／または全体的な活性（癌（たとえば、メラノーマ、乳癌、および肝細胞癌）を治療するという面においてであってよい）は一般に保持されるが、活性の程度はｈｕＳＭ５−１、ｍＳＭ５−１、またはＲｅＳＭ５−１に比較して変わってよい（より大きいかまたはより小さくてよい）ことが理解される。
【００６３】
本発明はまた、任意の以下のものを有するアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体であってもよく、なくてもよい）も提供する：本明細書において記述された抗体（ｈｕＳＭ５−１、ｍＳＭ５−１、およびＲｅＳＭ５−１のような）の可変配列の、少なくとも５つの隣接したアミノ酸、少なくとも８つの隣接したアミノ酸、少なくとも約１０の隣接したアミノ酸、少なくとも約１５の隣接したアミノ酸、少なくとも約２０の隣接したアミノ酸、少なくとも約２５の隣接したアミノ酸、少なくとも約３０の隣接したアミノ酸。
【００６４】
本発明はまた、任意のこれらの抗体またはポリペプチドの作製法も提供する。本発明の抗体は、この技術において既知の手法によって作製されることが可能であり、そのいくつかが実施例に例示されている。いくつかの態様においては、この方法は、本文に記述された任意の抗体またはそのフラグメントをコードしている核酸（表１に示されたｈｕＳＭ５−１および表３に示されたＲｅＳＭ５−１をコードしている核酸のような）を含有している組換え細胞を、コードされた抗体またはそのフラグメントが発現されるように成長させること、および発現された抗体またはそのフラグメントを回収することを含む。いくつかの態様においては、この方法はさらに、回収された抗体またはそのフラグメントを単離および／または精製することを含む。
【００６５】
ポリペプチドは、抗体の蛋白質分解または他の分解によるか、上記の組換え法（すなわち、単鎖または融合ポリペプチド）によるか、または化学合成によって産生されることが可能である。抗体のポリペプチド、特に約５０アミノ酸までのより短いポリペプチドは、化学合成によって便利に作製される。化学合成の方法はこの技術において既知であり、市販されている。
【００６６】
モノクローナル抗体は、コーラー（Kohler）およびミルステイン（Milstein）、Nature、１９７５年、第２５６巻、ｐ．４９５によって記述されたもののような、ハイブリドーマ法を用いて調製されてよい。ハイブリドーマ法においては、マウス、ハムスター、また他の適当な宿主動物は、典型的には、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することが可能なリンパ球を誘発するための免疫化剤で免疫化される。別法として、リンパ球はインビトロで免疫化される。
【００６７】
本発明の抗体またはフラグメントはまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記述されたもののような、組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい。抗体またはフラグメントをコードしているＤＮＡは、抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することの可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによるなどの、通常の手法を用いて単離および配列決定される。ひとたび単離されれば、ＤＮＡ（たとえば、配列番号５および配列番号６）は発現ベクター内へおかれてよく、それらは次に、通常では免疫グロブリンタンパク質を産生することのない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞などの宿主細胞へトランスフェクトされ、組換え宿主細胞における抗体の合成を得る。ベクター（発現ベクターを含めて）および宿主細胞は、本文においてさらに記述される。
【００６８】
本発明は、その特性には有意に影響しない機能的に同等な抗体および、増大または低減された活性を有する変異体を含め、本文に記述された抗体に対する修飾を含む。ポリペプチドの修飾は、この技術において日常的な方法であり、本文において詳細に記述される必要はない。修飾されたポリペプチドの実例は、アミノ酸残基の保存的置換、機能活性を有意に有害に変化させることのないアミノ酸の一以上の欠失または付加、または化学的類似物の使用のあるポリペプチドを含む。相互に保存的に置換されることが可能なアミノ酸残基は：グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニン；リジン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシンを含むが、これに制限されない。これらのポリペプチドはまた、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、ならびに、たとえば、別々の糖によるグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化といった、他の翻訳後修飾をもつポリペプチドも含む。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であって、すなわち、置換されたアミノ酸はもとのアミノ酸のものと類似した化学的特性を有するものである。かかる保存的な置換はこの技術において既知であり、実例は上記に表示されている。アミノ酸修飾は、一以上のアミノ酸の変換または修飾から、可変領域のような、領域の完全な再設計まで変動することが可能である。可変領域における変換は、結合親和性および／または特異性を変えることが可能である。他の修飾法は、これに制限されないが、酵素的手段、酸化的置換、およびキレート化を含め、この技術において既知のカップリング技術の使用を含む。修飾は、たとえば、イムノアッセイ用の標識の付着のために使用されることが可能である。
【００６９】
本発明はまた、本発明の抗体からの一以上のフラグメントまたは領域を含む融合タンパク質も包含する。一つの態様においては、融合ポリペプチドは配列番号２および／または配列番号１に示された軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の態様においては、融合ポリペプチドは配列番号１０および／または配列番号９に示された軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。本発明の目的のためには、融合タンパク質は、一以上の抗体および、天然の分子においてはそれへ付着されることのないもう一つのアミノ酸配列、たとえば、別の領域からの異種配列または同種配列を含む。代表的な異種配列は、これに制限されないが、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグのような「タグ」を含む。タグはこの技術において周知である。本文において開示された抗体またはそのフラグメントは、そのすべてが参考として本文に含まれる、２００３年１１月２６日出願の米国同時係属出願第 号（弁護士ドケット番号（Attorney Docket No.）５４９０６−２０００２００；名称：抗腫瘍二機能性融合タンパク質の調製および適用（Preparation and application of anti-tumor bifunctional fusion protein））に記述されたキメラタンパク質のような、抗腫瘍二機能性融合タンパク質を作製するべく使用されてよい。
【００７０】
融合ポリペプチドはこの技術において既知の方法、たとえば合成により、または組換えにより創製されることが可能である。典型的には、本発明の融合タンパク質は、それらをコードしているポリヌクレオチドの発現を、本文において記述された組換え法を使用して調製することによって作製されるが、それらはまたこの技術において既知の他の方法、たとえば化学合成によっても調製されてよい。
【００７１】
もう一つの態様においては、本発明のキメラ抗体は、重鎖および／または軽鎖が融合タンパク質であるものが提供される。いくつかの態様においては、鎖の定常ドメインは一つの特定の種および／またはクラスからであり、可変ドメインは別の種および／またはクラスからである。たとえば、キメラ抗体（いくつかの態様において）は、定常領域がヒトに由来し、可変領域は同種またはマウスの抗体（たとえば、配列番号３および配列番号４）から由来したものである。また本発明において具体化されるものは、ヒト化可変領域をもつ抗体であって、（いくつかの態様において）ＣＤＲ領域はマウスのアミノ酸配列を含んでおり、一方枠組み構造領域は、ヒトの配列に由来する。ヒト化抗体の他の形状はこの技術において既知であり、本文に記述されている。またキメラの機能性フラグメントも具体化される。一つの実例はヒト化Ｆａｂフラグメントであり、ヒトのヒンジ領域、ヒトの第一定常領域、ヒトカッパ軽または重鎖定常領域、およびマウス抗体（たとえば、配列番号３および配列番号４）からの軽鎖および／または重鎖の可変領域を含む。ヒト化Ｆａｂフラグメントは，次いでＦａｂダイマーへ形成されることが可能である。典型的には、本発明の融合タンパク質およびキメラは、それらをコードしているポリヌクレオチドの発現を、本文に記載の組換え法を用いて調製することにより作製されるが、それらはまた、たとえば、化学合成を含め，この技術において既知の他の手段によっても調製されてよい。たとえば、米国特許第５，８０７，７１５；４，８１６，５６７；および６，３３１，４１５号を参照。
【００７２】
本発明はまた、ヒト化抗体も包含する。抗体のポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号７および配列番号８）か、または他の同等の抗体は、「ヒト化」抗体を生成するべく、または抗体の親和性または他の性質を改善するべく遺伝子操作に使用されてよい。抗体のヒト化における一般的な原理は、抗体の抗原結合部位の基本的な配列を保持することとともに、ヒト抗体配列内の抗体の残りの非ヒト部分を交換することを含む。モノクローナル抗体をヒト化するための４つの一般的な段階がある。それらは：（１）出発抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列を決定すること、（２）ヒト化抗体を設計すること、すなわち、どの抗体の枠組み構造領域を、ヒト化プロセスを通じて使用するかを決定すること、（３）実際のヒト化方法論／技術、および（４）トランスフェクションおよびヒト化抗体の発現、である。たとえば、定常領域は、もし抗体がヒトにおける臨床試験および治療において使用される場合には、免疫反応を避けるべく、ヒト定常領域にさらに似るよう設計されてよい。たとえば、米国特許第５，９９７，８６７および５，８６６，６９２号参照。
【００７３】
ヒトの定常ドメインへ融合された、げっ歯類の、または修飾されたげっ歯類のＶ領域および、それに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを有するキメラ抗体を含め、非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含んでいる多くの「ヒト化」抗体分子が記述されている。たとえば、ウィンター（Winter）ら著、Nature、１９９１年、第３４９巻、ｐ．２９３−２９９；ロブグリオ（Lobuglio）ら著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、１９８９年、第８６巻、ｐ．４２２０−４２２４；ショウ（Shaw）ら著、J. Immnol.、１９８７年、第１３８巻、ｐ．４５３４−４５３８、およびブラウン（Brown）ら著、Cancer Res.、１９８７年、第４７巻、ｐ．３５７７−３５８３を参照のこと。他の参考文献は、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合に先立ち、ヒトの保持性の枠組み構造領域（ＦＲ）へグラフトされた、げっ歯類ＣＤＲを記述している。たとえば、ライヒマン（Reichmann）ら著、Nature、１９８８年、第３３２巻、ｐ．３２３−３２７、ベルホイエン（Verhoeyen）ら著、Science、１９８８年、第２３９巻、ｐ．１５３４−１５３６、およびジョーンズ（Jones）ら著、Nature、１９８６年、第３２１巻、ｐ．５２２−５２５を参照のこと。もう一つの参考文献は、組換え的に張合わされたげっ歯類枠組み構造領域によって保持された、げっ歯類のＣＤＲを記述している。たとえば、欧州特許公報第５１９，５９６号を参照のこと。これらの「ヒト化」分子は、ヒト患者におけるこれらの部位の治療的適用の持続時間および有効性を制限するげっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫応答を、最小化するべく設計される。利用されてもよい抗体をヒト化する他の方法は、ドーハーティ（Daugherty）ら、Nucl. Acids Res.、１９９１年、第１９巻、ｐ．２４７１−２４７６、により、また米国特許第６，１８０，３７７；６，０５４，２９７；５，９９７，８６７；５，８６６，６９２；６，２１０，６７１；６，３５０，８６１号、およびＰＣＴ  ＷＯ  ０１／２７１６０において開示されている。
【００７４】
もう一つの別法においては、抗体はファージディスプレイ技術により組換え的に作製されてよい。たとえば、米国特許第５，５６５，３３２；５，５８０，７１７；５，７３３，７４３および６，２６５，１５０号、およびウィンター（Winter）ら著、Annu. Rev. Immunol.、１９９４年、第１２巻、ｐ．４３３−４５５、および実施例２を参照のこと。別法として、ファージディスプレイ技術（マッカファティ（McCafferty）ら著、Nature、１９９０年、第３４８巻、ｐ．５５２−５５３）を使用して、免疫化されていないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロにおいて産生できる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄといった、糸状バクテリオファージのメインまたはマイナーのいずれかのコートタンパク質遺伝子へ、インフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能性の抗体フラグメントとしてディスプレイされる。糸状の粒子はファージゲノムの単鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能特性に基づく選択はまた、結果としてこれらの特性を示している抗体をコードしている遺伝子の選択を生じる。したがって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは、種々の方式で実行されることが可能である；総説には、たとえば、ジョンソン（Johnsn, Kevin S.）およびチズウェル（Chiswell, David J.）著、Current Opinion in Structural Biology、１９９３年、第３巻、ｐ．５６４−５７１参照。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源が、ファージディスプレイに使用されることが可能である。クラックソン（Clackson）ら、Nature、１９９１年、第３５２巻、ｐ．６２４−６２８は、免疫化されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の、小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫化されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーが構築されることが可能であり、抗原（自己抗原を含めて）の多様なアレイに対する抗体が、基本的には、マーク（Mark）ら、J. Mol. Biol.、１９９１年、第２２２巻、ｐ．５８１−５９７、またはグリフィス（Griffith）ら、EMBO J. 、１９９３年、第１２巻、ｐ．７２５−７３４、によって記述された技術に従って単離されることが可能である。天然の免疫応答においては、抗体遺伝子は高率で突然変異を蓄積する（体細胞超突然変異）。導入された変異のいくつかはより高い親和性を与え、高親和性の表面免疫グロブリンをディスプレイしているＢ細胞は、優先的に複製され、その後の抗原攻撃の間に分化される。この天然のプロセスは、「チェイン・シャフリング（chain shuffling）」として知られる技術を用いることにより、模倣されることが可能である。マークス（Marks）ら著、Bio/Technol.、１９９２年、第１０巻、ｐ．７７９−７８３。この方法においては、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性は、免疫化されていないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に生じる変異体のレパートリー（レパートリー）を用いて、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を連続的に置換することによって改良されることが可能である。この技術は、ｐＭ〜ｎＭの範囲の親和性をもつ抗体および���体フラグメントの産生を可能にする。ファージ抗体の非常に大きいレパートリーを作製するための戦略（「ザ・マザー・オブ・オール・ライブラリーズ（the mother-of-all libraries）」としても知られる）は、ウォーターハウス（Waterhouse）ら、Nucl. Acids Res.、１９９３年、第２１巻、２２６５−２２６６、によって記述されている。ヒト抗体が出発のげっ歯類抗体に類似した親和性および特異性を有する場合には、遺伝子シャフリングもまた、げっ歯類抗体からヒト抗体を派生させるべく使用されることが可能である。「エピトープ・インプリンティング」とも呼ばれるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術によって得られたげっ歯類抗体の、重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換され、げっ歯類−ヒトのキメラを創製する。抗原についての選択は、結果として機能性の抗原結合部位を修復することが可能なヒト可変領域の単離を生じることとなり、すなわちエピトープがパートナーの選択を支配（インプリント）している。残りのげっ歯類Ｖドメインを置換するためプロセスが反復されると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公表されたＰＣＴ特許出願、ＰＣＴ  ＷＯ  ９３０６２１３参照）。ＣＤＲグラフティングによるげっ歯類抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術は、げっ歯類起源の枠組み構造またはＣＤＲ残基をもたない完全なヒト抗体を提供する。上記の議論はヒト化抗体に該当するが、議論された一般原理が、たとえばイヌ、ネコ、霊長類、ウマ、およびウシにおける使用に向けて抗体をカスタマイズするべく適用できることは、明白である。
【００７５】
本発明はまた、放射性部位、毒素（たとえば、カリケアミシン）、または化学療法用分子、プロドラッグを活性のある抗癌剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素といった、治療薬に対して、または、化学療法用化合物（またはこれらの抗体またはポリペプチドを含んでいる組成物）を含有しているリポソームかまたは他のベシクルに対してコンジュゲートされた（たとえば、結合された）、本明細書に記述された抗体またはポリペプチドも提供する。組成物は、個体へ投与される場合、抗体またはポリペプチドによって認識されるＳＭ５−１抗原を発現している癌細胞へこれらの薬剤をターゲットすることが可能であり、したがって、たとえば、癌性細胞を除去し（またはその数を減少させ）、および／または、癌性細胞の増殖および／または成長を抑制することが可能である。これらのコンジュゲーションは、一般に本文に記述されたこれらの成分を結合することを指す。結合（一般にはこれらの成分を少なくとも投与のため近接結合して固定すること）は、以下に記述されたような多数の方法で達成されることが可能である。
【００７６】
本発明の放射性部位または分子は、癌性細胞の破壊において有効な任意の放射性同位元素を含む。例としては、これに制限されないが、コバルト６０、131Ｉ、およびＸ線を含む。加えて、ウラニウム、ラジウム、および、典型的には放射性同位元素の混合物を意味しているトリウムのような、天然に生じる放射性元素は、放射性分子の好適な例である。
【００７７】
本発明の毒素は、これに制限されないが、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または同族体を含む。
【００７８】
本発明の抗体またはポリペプチドは、放射性部位または分子、毒素、または他の治療薬、プロドラッグを活性のある抗癌剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素に対して、または、治療薬を含有しているリポソームかまたは他のベシクルに対して、共有結合的または非共有結合的に、直接あるいは間接的に、コンジュゲート（結合）されることが可能である。抗体は、放射性分子、毒素、治療用分子、またはプロドラッグ活性化酵素に対し、抗体がそのターゲット抗原へ結合することが可能である限り、抗体に沿った任意の位置において結合されてよい。
【００７９】
毒素または治療薬は、適当なモノクローナル抗体に対し、直接または間接的に（たとえば、リンカー基によるか、または別法として、米国特許第５，５５２，３９１号に記述されたプラットフォーム分子のような、適当な付着部位をもつ結合分子によって）結合され（たとえば、共有結合的に結合され）てもよい。本発明の毒素および治療薬は、この技術において既知の方法を用いて、特定のターゲティングタンパク質に対し、直接的に結合されることが可能である。たとえば、薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が、他と反応することが可能な置換基を有する場合に可能である。たとえば、一方におけるアミノまたはスルフヒドリル基のような求核基は、他方の無水物または酸ハロゲン化物のようなカルボニル含有基と、または良好な脱離基（たとえば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と、反応することが可能であってもよい。
【００８０】
本発明の抗体またはポリペプチドコンジュゲートは、毒物または治療薬へ結合することが可能な基、および抗体へ結合することが可能な基の、双方を含んでいる二機能性のリンカーを含有してもよい。リンカーは、結合能力の妨害を避けるため、薬剤から抗体を離すためのスペーサーとして機能することが可能である。リンカーは切断可能であるか、または切断可能でなくてもよい。リンカーはまた、薬剤または抗体上の置換基の化学反応性の増大に寄与することが可能であり、したがって結合能力を増大させる。化学反応性の増大はまた、さもなければ可能ではなかった薬剤または薬剤上の官能基の使用を促進してもよい。二機能性のリンカーは、この技術において既知の手段により抗体へ結合されることが可能である。たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような活性エステル部位を含有しているリンカーは、アミド結合による抗体中のリジン残基への結合に使用されることが可能である。もう一つの例においては、求核性アミンまたはヒドラジン残基を含有しているリンカーは、抗体の炭水化物残基の解糖の酸化によって産生されるアルデヒド基へ結合されることが可能である。このような結合の直接法に加えて、リンカーは、アミノデキストランのような中間のキャリアにより、間接的に抗体へ結合されることが可能である。このような態様においては、修飾された結合は、リジン、炭水化物、または中間のキャリアのいずれかによる。一つの態様においては、リンカーは部位選択的に、タンパク質中の遊離のチオール残基へ結合される。タンパク質上のチオール基への選択的な結合に適した部位は、この技術において周知である。例としては、ジスルフィド化合物、α−ハロカルボニルおよびα−ハロカルボキシル化合物、およびマレイミドを含む。求核性アミン官能基が、α−ハロカルボニルまたはカルボキシル基として同一分子中に存在する場合には、アミンの分子内アルキル化によって環化が起こる可能性が存在する。この問題を避けるための方法は、当業者には周知であり、たとえば、アミンおよびα−ハロ官能基が、アリール基またはトランスアルケンのような、望ましくない環化を立体化学的に不都合にする曲げられない基によって分離されている分子の調製による。たとえば、ジスルフィド部位によるメイタンシノイドおよび抗体のコンジュゲートの調製には、米国特許第６，４４１，１６３号を参照のこと。
【００８１】
本発明の抗体（またはポリペプチド）は、この技術において既知の任意の方法により、放射性部位または分子へコンジュゲート（結合）されてよい。抗体を放射能標識するための方法についての議論は、ゴールデンバーグ（D. M. Goldenberg）編、「Cancer Therapy with Monoclonal Antibodies T（モノクローナル抗体Ｔによる癌療法）」、１９９５年、ＣＲＣプレス、ボカレイトン（CRC Press, Boca Raton）、を参照のこと。
【００８２】
本発明の抗体（またはポリペプチド）は、プロドラッグを活性のある抗癌剤へ変換する薬剤（プロドラッグ活性化酵素を含めて）へ結合されてもよい。たとえば、本発明の抗体（またはポリペプチド）は、プロドラッグ（たとえば、ペプチジル化学療法薬、ＷＯ８１／０１１４５参照）を活性のある抗癌剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素と抗体をコンジュゲート（結合）することにより、抗体依存酵素介在性プロドラッグ療法（Antibody Dependent Enzyme Mediaed Prodrug Therapy（ＡＤＥＰＴ））において使用されてもよい。たとえば、ＷＯ  ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号参照。
【００８３】
本発明の抗体（またはポリペプチド）は、蛍光性分子、放射性分子、またはこの技術において既知の他の標識のような、標識剤（あるいは「ラベル」と呼ばれる）へ結合されてもよい。標識は、この技術において既知であり、一般に（直接または間接的に）シグナルを提供する。
【００８４】
本発明は、ＳＭ５−１抗原に結合する有効量の抗体（抗体コンジュゲートを含めて）およびポリペプチドと、本明細書に記述された抗体、ポリペプチドをコードしている配列を含んでいるポリヌクレオチドとを含んでいる、薬剤組成物を含めた組成物を包含する。本文において使用されるように、組成物は、ＳＭ５−１抗原へ結合する一以上の抗体、および／または、ＳＭ５−１へ結合する一以上の抗体をコードしている配列を含んでいる一以上のポリヌクレオチドを含んでなる。これらの組成物はさらに、緩衝液を含めた薬学上許容される賦形剤のような、この技術において周知の適当な賦形剤を含んでもよい。
【００８５】
本発明はまた、本文に記述された有効量の任意の抗体と、有効量の抗新生物薬とを含む組合せ剤も包含する。抗新生物薬は、メラノーマ、乳癌、または肝細胞癌を治療する薬剤であることが可能である。
【００８６】
本発明はまた、本文に記述された抗体へ特異的に結合するタンパク質を含む、単離されたＳＭ５−１ターゲット抗原も提供する。いくつかの態様においては、単離されたＳＭ５−１抗原はヒト抗原である。いくつかの態様においては、単離されたＳＭ５−１抗原はグリコシル化されたタンパク質である。他の態様においては、単離されたＳＭ５−１抗原はグリコシル化されていないタンパク質である。いくつかの態様においては、単離されたＳＭ５−１抗原は、本文に記述されたＡ２３０またはＡ１８０のフラグメントである。いくつかの態様においては、単離されたＳＭ５−１抗原は、メラノーマ、乳癌、および／または肝細胞癌の細胞から単離される。
【００８７】
Ｄ．ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本発明はまた、本発明の抗体（たとえば、配列番号２および配列番号１に示された軽鎖および重鎖可変領域のポリペプチド配列を含んでいる抗体、および、配列番号１０および配列番号９に示された軽鎖および重鎖可変領域のポリペプチド配列を含んでいる抗体）をコードしている単離されたポリヌクレオチド、およびベクター、および該ポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞も提供する。
【００８８】
もう一つの観点においては、本発明は、本文に記述された任意のポリペプチド（抗体フラグメントを含めて）をコードしているポリヌクレオチドを提供する。
【００８９】
もう一つの観点においては、本発明は、本発明の任意のポリヌクレオチドを含んでいる組成物（薬剤組成物のような）を提供する。いくつかの態様においては、ポリヌクレオチドは、配列番号１１または配列番号１２に示されたヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様においては、ポリヌクレオチドは、配列番号５または配列番号６に示されたヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様においては、組成物は、本文に記述された抗体をコードしているポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターを含む。さらに別の態様においては、組成物は、本文に記述されたポリヌクレオチドのいずれか，または双方を含む。発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与は、本文においてさらに記述される。
【００９０】
もう一つの観点においては、本発明は、本文に記述された任意のポリヌクレオチド作製法を提供する。
【００９１】
任意のかかる配列に相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは単鎖（コーディングまたはアンチセンス）または二重鎖でよく、ＤＮＡ（ゲノムの、ｃＤＮＡ、または合成の）またはＲＮＡ分子でもよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含みかつＤＮＡ分子と一対一に対応するＨｎＲＮＡ分子と、イントロンを含まないｍＲＮＡ分子とを含む。付加的なコーティングまたは非コーティング配列が、必ずではないが、本発明のポリヌクレオチド内に存在してよく、ポリヌクレオチドは、必ずではないが、他の分子および／または支持物質へ結合されている。
【００９２】
ポリヌクレオチドは、天然の配列（すなわち、抗体またはその部分をコードする内在性配列）を含んでよく、あるいはかかる配列の変異体を含んでもよい。ポリヌクレオチド変異体は、コードされたポリペプチドの免疫反応性が、天然の免疫反応性分子に比較して減衰されないようにする一以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含む。コードされたポリペプチドの免疫反応性に対する影響は、一般に、本文に記述されたように査定される。変異体は、天然の抗体またはその部分をコードするポリヌクレオチド配列に対し、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約８０％の同一性、および、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
【００９３】
二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、以下に記述されるように対応が最大となるようにアラインされたとき、二つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じであれば、「同一」であると言われる。二つの配列間の比較は、典型的には、局所領域の配列類似性を同定および比較するための、比較ウィンドウについて、配列を比較することによって実行される。本文において使用される「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０の近接位の、通常は３０〜約７５、４０〜約５０のセグメントを指し、それにおいて配列は、二つの配列が最適にアラインされた後に、同じ番号の隣接位の基準配列に対し比較されてよい。
【００９４】
比較のための配列の最適アラインメントは、デフォルトパラメータを用いた、バイオインフォマティクス・ソフトウェアのレーザージーン・スーツ（Lasergene suite）（ＤＮＡスター・インク（DNASTAR, Inc.）、ウィスコンシン州、マジソン）のメガライン（Megalign）プログラムを用いて行なわれてよい。このプログラムは、以下の参考文献に記述された、いくつかのアラインメントスキームを具体化する：デイホフ（Dayhoff, M. O.）著、「A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships（タンパク質における進化的変化のモデル−距離関係を検出するための基盤）」、デイホフ（Dayhoff, M. O.）編、「Atlas of Protein Sequence and Structure（タンパク質配列および構造のアトラス）」、１９７８年、第５巻、増刊第３号、ｐ．３４５−３５８、国立バイオメディカル研究財団（National Biomedical Research Foundation）、ワシントン；ハイン（Hein J.）著、「Unified Approach to Alignment and Phylogenes（アラインメントおよび系統発生への統一されたアプローチ）」、Methods in Enzymology、１９９０年、第１８３巻、ｐ．６２６−６４５、アカデミック・プレス・インク（Academic Press, Inc.）、カリフォルニア州、サンディエゴ；ヒギンス（Higgins, D. G.）およびシャープ（Sharp, P. M.）著、ＣＡＢＩＯＳ、１９８９年、第５巻、ｐ．１５１−１５３；マイヤーズ（Meyrs, E. W.）およびミュラー（Muller W.）著、CABIOS、１９８８年、第４巻、ｐ．１１−１７；ロビンソン（Robinson, E. D.）著、Comb. Theor.、１９７１年、第１１巻、ｐ．１０５；サントウ（Santou, N.）、ネス（Nes, M.）著、Mol. Biol. Evol. 、１９８７年、第４巻、ｐ．４０６−４２５；スニース（Sneath, P. H. A.）およびソカル（Sokal, R. R.）著、「Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy（数値分類学  数値分類学の原理および実践）」、１９７３年、フリーマン・プレス（Freeman Press）、カリフォルニア州、サンフランシスコ；ウィルバー（Wilbur, W. J.）およびリップマン（Lipman, D. J.）著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、１９８３年、第８０巻、ｐ．７２６−７３０。
【００９５】
好ましくは、「配列同一性のパーセント」は、少なくとも２０個の位置の比較用ウィンドウについて、二つの最適にアラインされた配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、二つの配列の最適なアラインメントについて、基準配列（付加または欠失を含まない）に比較して、２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセントは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が双方の配列中に生じている位置の数を測定して、適合した位置の数をもたらすことと、適合した位置の数を、基準配列（すなわち、ウィンドウサイズ）中の位置の全数で割ること、および、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセントを生じること、によって計算される。
【００９６】
変異体はまた、あるいは別法として、天然の遺伝子または、その一部分または相補体に対し、実質的に相同であってもよい。かかるポリヌクレオチド変異体は、天然の抗体をコードしている天然に生じるＤＮＡ配列（または相補配列）に対し、中程度のストリンジェントな条件下にハイブリダイズすることが可能である。
【００９７】
適当な「中程度のストリンジェントな条件」は、５Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で予洗浄すること；５０℃〜６５℃、５Ｘ  ＳＳＣにおいて一晩ハイブリダイズすること；その後６５℃において、０．１％ＳＤＳを含有する各々２Ｘ、０．５Ｘ、および０．２ＸのＳＳＣで２０分間、２回洗浄すること、を含む。
【００９８】
本文において使用されるように、「高度にストリンジェントな条件」または「高度の緊縮条件」は：（１）洗浄用に、低いイオン強度および高い温度、たとえば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で使用するか；（２）ハイブリダイゼーションを通じて、ホルムアミドのような変性剤を、たとえば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール（Ficoll）／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液とともに、ｐＨ６．５において、７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムとともに４２℃において使用するか；または（３）５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート（Denhardt）液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μg／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、および５５℃における５０％ホルムアミドによる洗浄、およびそれに続く、５５℃におけるＥＤＴＡを含有する０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮洗浄とともに４２℃で使用すること、である。当業者は、必要に応じて温度、イオン強度などを、プローブの長さなどといった因子に対応させていかに調整するかを認識するであろう。
【００９９】
当業者には、遺伝コードの縮重の結果、本文に記述されたポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることが認識されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然の遺伝子のヌクレオチド配列と最少の相同性をもつ。それにもかかわらず、コドン使用の差異によって変異するポリヌクレオチドは、本発明によって特に企図されている。さらに、本文に記述されたポリヌクレオチド配列を含んでいる遺伝子のアレルは、本発明の範囲内にある。アレルは、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換といった、一以上の突然変異の結果として変異された内在性遺伝子である。結果として生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、必ずしもそうではないが、変異した構造または機能を有する。アレルは，標準的な技術（ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列比較のような）を用いて同定されてよい。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを用いて取得されることが可能である。化学的なポリヌクレオチド合成の方法は、この技術において周知であり、本文において詳細に記述される必要はない。当業者は、本文において提供された配列および、市販のＤＮＡ合成装置を用いて、所望のＤＮＡ配列を製造することが可能である。
【０１０１】
組換え法を用いてポリヌクレオチドを調製するためには、本文においてさらに議論されるように、所望の配列を含んでいるポリヌクレオチドは、適当なベクター内へ挿入されることが可能であり、ベクターは次に、複製および増幅のため、適当な宿主細胞へ導入されることが可能である。ポリヌクレオチドは、この技術において既知の任意の手段によって宿主細胞へ挿入されてよい。細胞は、直接的な取込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−交配、または電気穿孔により、外来性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。ひとたび導入されれば、外来性ポリヌクレオチドは、組込まれないベクター（プラスミドのような）として、あるいは宿主細胞ゲノムへ組込まれて、細胞内に維持されることが可能である。そのように増幅されたポリヌクレオチドは、この技術において周知の方法により、宿主細胞から単離されることが可能である。たとえば、サンブルック（Sambrook）ら、１９８９年、を参照のこと。
【０１０２】
別法として、ＰＣＲはＤＮＡ配列の再生を可能にする。ＰＣＲ技術はこの技術において周知であり、米国特許第４，６８３，１９５、４，８００，１５９、４，７５４，０６５、および４，６８３，２０２号、ならびに、ミュリス（Mullis）ら編、「PCR : The Polymerase Chain Reaction（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応）」、１９９４年、バーコースワー・プレス（Birkauswer Press）、ボストン、に記述されている。
【０１０３】
ＲＮＡは、適当なベクター中の単離されたＤＮＡを用いること、およびそれを適当な宿主細胞へ挿入することにより、取得されることが可能である。細胞が複製し、かつＤＮＡがＲＮＡへ転写されれば、ＲＮＡは次に、たとえば、サンブルック（Sambrook）ら（１９８９年）において示されたような、当業者に周知の方法を用いて単離されることが可能である。
【０１０４】
適当なクローニングベクターは、標準的な技術にしたがって構築されてよく、あるいはこの技術において利用可能な多数のクローニングベクターから選ばれてもよい。選ばれたクローニングベクターは、使用されるべき宿主細胞によって変化しうるが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力をもち、特定の制限エンドヌレアーゼのための単一のターゲットをもってよく、および／または、ベクターを含有しているクローンの選択において使用可能なマーカーの遺伝子を保持してもよい。好適な例は、プラスミドおよび細菌ウイルス、たとえば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ５７、ｐＭＧ１８−３Ｋ、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（たとえば、ｐＢＳ  ＳＫ＋、ｐＢＳ  ＳＫ−）、およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、およびｐＳＡ３およびｐＡＴ２８のようなシャトルベクターを含む。これらの、および多くの他のクローニングベクターは、バイオラッド（BioRad）、ストラタジーン（Stratagene）、およびインビトロジェン（Invitrogen）のような民間の供給業者から入手可能である。
【０１０５】
発現ベクターは、一般に、本発明のポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、宿主細胞内で、エピソームとして、あるいは染色体ＤＮＡの不可欠な一部として、複製可能でなければならない。適当な発現ベクターは、これに制限されないが、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、およびコスミドを含め、プラスミド、ウイルスベクターを含む。ベクター成分は一般に、これに制限されないが、一以上の以下のものを含んでよい：シグナル配列；複製の起点；一以上のマーカー遺伝子；適当な転写調節要素（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターのような）。発現（すなわち、翻訳）には、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンといった、一以上の翻訳調節要素もまた通常は必要である。
【０１０６】
目的のポリヌクレオチドを含有しているベクターは、電気穿孔、塩化カルシウムか、塩化ルビジウムか、リン酸カルシウムか、ＤＥＡＥデキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント；リポフェクション；および感染（たとえば、ベクターがワクシニアウイルスのような感染性因子である場合）を含めた、任意の多くの適当な手段により、宿主細胞内へ導入されることが可能である。導入ベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、宿主細胞の性質にしばしば依存するであろう。
【０１０７】
本発明はまた、本文に記述された任意のポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞は、目的の抗体、ポリペプチド、またはタンパク質をコードしている遺伝子を単離するという目的のために使用されることが可能である。哺乳類の宿主細胞の限定しない例は、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞を含むが、これに制限されない。好適な非哺乳類宿主細胞は、原核生物（大腸菌または枯草菌のような）および酵母（Ｓ．セレビシエ（cerevsisae）、Ｓ．ポンベ（pombe）、またはＫ．ラクティス（lactis）のような）を含む。好ましくは、宿主細胞はｃＤＮＡを、もし宿主細胞に存在する場合には、対応する内在性の目的の抗体またはタンパク質のものよりも、約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、さらに好ましくは２０倍高いレベルで発現する。ＳＭ５−１ターゲット抗原に結合する特異抗体についての宿主細胞のスクリーニングは、イムノアッセイまたはＦＡＣＳによって行なわれる。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現している一つの細胞が、同定されることが可能である。
【０１０８】
Ｅ．ＳＭ５−１抗原に特異的に結合する抗体を用いた癌診断法
一つの観点においては、本発明は、試料中のヒトＳＭ５−１ターゲット抗原をアッセイするための方法であって：ａ）検査されるべき患者から試料を取得することと；ｂ）前記試料を、ＳＭ５−１ターゲット抗原に特異的な抗体と接触させること；およびｃ）もし前記中に存在すれば、前記ヒトＳＭ５−１ターゲット抗原と、前記抗体との間の結合を査定して、前記試料中の前記ヒトＳＭ５−１ターゲット抗原の存在、不在、および／または、量を決定すること、を含む方法を提供する。
【０１０９】
本文に記述されたＳＭ５−１ターゲット抗原に特異的な抗体は、診断を目的として、これに制限されないが、メラノーマ、乳癌、および肝細胞癌を含めた、癌性細胞の存在または不在を同定するべく使用されてよい。検出は一般に、細胞を、本文に記述されたＳＭ５−１ターゲット抗原に特異的な、該抗原に結合する抗体と接触させること、および該抗原と該抗体との間の複合体の形成を含む。かかる複合体の形成は、インビトロまたはインビボであることが可能である。
【０１１０】
もう一つの観点においては、本発明は、本文に記述された任意の抗体またはポリペプチドを用いて、癌の診断を支援する方法を提供する。本文において使用されるように、「診断を支援する」ための方法は、これらの方法が癌の分類または性質に関する臨床決定を行なう上で助けとなること、および最終的な診断に関しては決定的であってもなくてもよいことを意味する。したがって、癌の診断を支援する方法は、個体からの生物学的試料中のＳＭ５−１ターゲット抗原のレベルを検出すること、および／または、試料中のＳＭ５−１ターゲット抗原の発現レベルを測定すること、の段階を含むことが可能である。
【０１１１】
診断のために抗体を用いる一つの方法は、抗体を標識化部位（たとえば、蛍光剤、放射性または放射線不透剤）へ結合すること、該抗体を個体へ投与すること、およびＸ線または他のイメージング機器を用いて、抗原を発現している癌細胞の表面における標識された抗体の局在性を可視化することによる、インビボの腫瘍イメージングである。抗体は、生理学的条件において結合を促進する濃度で投与される。標識化部位は、この技術において既知である。
【０１１２】
別の方法においては、癌性細胞は除去され、組織は、この技術において周知の方法（たとえば、凍結化合物中に包埋すること、固定するかまたは固定せずに、凍結および切片化すること；種々の抗原検索および対比染色法を用いるかまたは用いずに、固定およびパラフィン包埋すること）により、免疫組織化学用に調製される。抗体はまた、発症の異なる段階において癌性細胞を同定するべく使用されてもよい。抗体はまた、どの個体の腫瘍が、あらかじめ決められたレベルでその表面に抗原を発現するか、およびしたがって、どの個体の腫瘍が前記抗原に向けられた抗体を用いた免疫療法のための候補であるか、を決定するべく使用されてもよい。
【０１１３】
抗原を認識する抗体（またはポリペプチド）はまた、これに制限されないが、血液、唾液、尿、肺液、または腹水を含めた体液中の、生きているかまたは死んでいる癌細胞から放出または分泌された抗体の検出のための、診断用イムノアッセイを創製するべく使用されてもよい。診断目的のための本発明の抗体の使用法は、任意の抗癌治療、たとえば、化学療法または放射線療法の、前および後の双方に有用であって、どの腫瘍が所与の治療に対して最も反応しそうであるか、癌を持つ個体の予後、腫瘍のサブタイプまたは転移性疾患の起源、および、疾病の進行または治療に対する応答を測定する。
【０１１４】
Ｆ．治療目的のためのＳＭ５−１抗原に特異的な抗体の使用法
本発明はまた、哺乳類における新生物を治療するための方法であって、かかる治療が必要かまたは望ましい哺乳類に対し、本文に記述されたＳＭ５−１抗原に特異的な有効量の抗体（たとえば、ｈｕＳＭ５−１およびＲｅＳＭ５−１）を投与することを含む方法を提供する。本発明において記述された抗体は、メラノーマ、乳癌、および肝細胞癌を含むがこれに制限されない、多様な組織中に癌を持つ個体における治療目的のために使用されてよい。いくつかの態様においては、抗体はがん患者の受動免疫のために使用される。いくつかの態様においては、投与された抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）により、その抗新生物作用を及ぼす。いくつかの態様においては、抗体はヒトにおける新生物の治療に使用される。
【０１１５】
本発明はまた、哺乳類における新生物の治療法であって、かかる治療が必要かまたは望ましい哺乳類に対し、本文に記述されたＳＭ５−１に特異的な有効量の抗体と、有効量の抗新生物薬とを含んでいる有効量の組合せ剤を投与することを含む方法も提供する。いくつかの態様においては、抗新生物薬は、メラノーマ、乳癌、または肝細胞癌を治療する薬剤である。
【０１１６】
本発明はまた、カスパーゼ１０介在性のアポトーシスを細胞に誘導する方法であって、かかる誘導が必要かまたは望ましい細胞に対し、本文に記述されたＳＭ５−１に特異的な有効量の抗体を投与することを含む方法も提供する。いくつかの態様においては、細胞は哺乳類細胞である。いくつかの態様においては，細胞は哺乳類中に含まれる。
【０１１７】
本文に記述された抗ＳＭ５−１抗体の、および、キメラ抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの突然変異体、抗体部分を含んでいる融合タンパク質、ヒト化抗体、毒素または放射性同位元素へコンジュゲートされた抗体、および必要なその特異性を含んでいる任意の他の修飾された構造物といった同等の抗体またはフラグメント（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）2、Ｆｖ、Ｆｃなど）の、種々の処方が投与に使用されてよい。いくつかの態様においては、抗体またはその種々の処方は、そのまま投与されてよい。別の態様においては、抗体またはその種々の処方（本文に記述された任意の組成物の態様を含めて）、および薬学上許容される賦形剤が投与され、種々の処方によるものであってよい。薬学上許容される賦形剤はこの技術において既知であり、薬理学的に有効な物質の投与を促進する比較的不活性な物質である。たとえば、賦形剤は形状または硬度を与え、あるいは希釈剤として作用することが可能である。適当な賦形剤は、これに制限されないが、安定化剤、湿潤および乳化剤、重量オスモル濃度を変えるための塩、封入剤、緩衝液、および皮膚浸透促進剤を含む。賦形剤ならびに非経口および経口薬物デリバリー用の処方は、レミントン（Remington）の「The Science and Practice of Pharmacy（調剤の科学および実践）」第２０版、２０００年、マック出版（Mack Publishing）に示されている。
【０１１８】
一般に、これらの薬剤は、注射（たとえば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）による投与用に処方されるが、他の投与の形状（たとえば、経口、粘膜など）もまた使用可能である。したがって、抗体およびその同等物は、好ましくは、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液などといった、薬学上許容される賦形剤と組合される。特定の用量レジメン、すなわち薬用量、タイミング、および反復は、特定の個体しかも個体の医学的病歴に依存するであろう。一般に、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重の薬用量が投与される。たとえば、１日あたり１〜２００ｍｇの薬用量が投与されてよい。抗体は、インサイトゥにおいて腫瘍内へ注入されてよく（イリエ（Irie）ら著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、１９８６年、第８３巻、ｐ．８６９４−８６９８）、あるいは全身へ投与されてもよい（特に転移用に）。
【０１１９】
半減期のような、経験的な考慮が、一般に用量の決定に寄与するであろう。ヒト化抗体または完全なヒト抗体のような、ヒトの免疫系に適合する抗体は、抗体の半減期を延長させるべく、また抗体が宿主の免疫系によって攻撃されるのを防止するべく使用されてよい。投与の頻度は、治療の経過にわたって決定および調整されてよく、癌性細胞の数の減少、癌性細胞の減少の維持、癌性細胞の増殖の減少、または転移の発生の遅延に基づいている。癌性細胞の存在は、当業者に既知の、または本文において議論された、多数の方法（たとえば、生検材料または生物学的試料についての免疫組織化学またはフローサイトメトリによる検出）によって同定されてよい。別法として、抗体の持続放出処方が適当であってもよい。徐放を達成するための種々の処方および装置は、この技術において既知である。
【０１２０】
一つの態様においては、抗体の用量は、一以上の投与を与えられてきた個体において、経験的に決定されてよい。個体は、用量の増加して行く抗体が与えられる。抗体の有効性を査定するため、特異な癌病状のマーカーが追跡されることが可能である。これらは、触診または目視観測による腫瘍サイズの直接的な測定、Ｘ線または他のイメージング技術による腫瘍サイズの間接的な測定；直接的な腫瘍生検および腫瘍試料の顕微鏡検査により査定されるような改善；間接的な腫瘍マーカーである、疼痛または麻痺の減少の測定；改善された、言語、視力、呼吸、または他の腫瘍に関連した障害；食欲増進；または、公認された検査により測定されるような生活の質の向上、または生存の延長を含む。当業者には、個体、癌のタイプ、癌の段階、癌が個体の他の場所へ転移し始めているかどうか、および用いられている過去および現在の治療法、に依存して用量が変わることが明らかであろう。
【０１２１】
他の製剤は、これに制限されないが、リポソームのようなキャリアを含め、この技術において既知の適当なデリバリー形状を含む。たとえば、マハト（Mahato）ら著、Pharm. Res.、１９９７年、第１４巻、ｐ．８５３−８５９参照。リポソーム剤は、これに制限されないが、サイトフェクチン、マルチラメラベシクル、ユニラメラベシクルを含む。
【０１２２】
いくつかの態様においては、一より多い抗体または他の薬剤が存在してもよい。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることが可能である。かかる組成物は、癌腫、腺癌、肉腫、または腺肉腫に対して反応性である少なくとも一つの、少なくとも二つの、少なくとも三つの、少なくとも四つの、少なくとも五つの異なる抗体を含有してよい。この技術においてしばしば示されるような抗体混合物は、より広範囲の個体の集団の治療において特に有用であってよい。
【０１２３】
Ｇ．本発明の抗体を含んでいるキット
本発明はまた、検出および／または療法における使用のための、抗体を含んでいるキットも提供する。いくつかの態様においては、キットは本文に記述された任意の抗体を含む。本発明のキットは、適当にパッケージングされており、任意に、緩衝液のような付加的な成分、および本文に記述された任意の方法で抗体を使用するための説明書といった付加的な成分を提供してもよい。
【０１２４】
一つの観点においては、キットは本文に記述された任意の方法で使用されてよく、たとえば、新生物をもつ個体を治療することを含む。いくつかの態様においては、キットは、本文に記述された有効量の抗体と、前記抗体を投与するための指示手段とを含む。
【０１２５】
もう一つの態様においては、本発明は、試料中のヒトＳＭ５−１ターゲット抗原をアッセイするためのキットであって、本文に記述された抗体と、もし試料中に存在すればヒトＳＭ５−１ターゲット抗原と該抗体との間の結合を査定して、試料中のターゲット抗原の存在、不在、および／または、量を決定するための手段とを含むキットを提供する。いくつかの態様においては、キットはさらに、アッセイを実行するための指示手段を含む。
Ｈ．実施例
【実施例１】
【０１２６】
ヒトＳＭ５−１抗原のスクリーニングおよび同定
１．肝細胞癌細胞系ＱＹＣのｃＤＮＡライブラリの構築
全ＲＮＡは、肝細胞癌細胞系ＱＹＣからトリゾール（Trizol）試薬を用いて抽出された。次いでｍＲＮＡが単離され、ｃＤＮＡが記述（マーケン（Marken JS.）、PNAS、１９９２年、第８９巻、ｐ．３５０３−３５０７）のように合成された。ｃＤＮＡは、非自己相補的ＢｓｔＸＩアダプタの結合の後、哺乳類一時的発現ベクターｐＣＤＭ８（インビトロジェンより）へ挿入され、電気穿孔により大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３（インビトロジェンより）へ形質転換されてｃＤＮＡライブラリを構築した。
【０１２７】
２．ｃＤＮＡライブラリの発現およびスクリーニング
ＣＯＳ−７（インビトロジェン）細胞は、上述のように獲得されたｃＤＮＡライブラリにより、リポフェクション（Lipofection）法を用いてトランスフェクトされた。１２時間後、細胞は消化され、新たなフラスコへ播種された。トランスフェクションの７２時間後、細胞は収穫され、ＳＭ５−１抗原（ｍＳＭ５−１と呼ばれる、この抗体を産生するハイブリドーマは、１９９８年１０月１０日、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に特許受託記号ＨＢ−１２５８８で寄託された）に特異的なマウスモノクローナル抗体を含有しているＰＢＳ／０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ／５％ＦＢＳ中に再懸濁された。氷浴中で１時間後、細胞は再び収穫され、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／０．５％ＦＢＳ中に再懸濁され、ヤギ抗マウスＩｇ二次抗体でプレコートされた１０個のペトリ皿上に再播種された。室温で２時間後、細胞は次にＰＢＳ／ＥＤＴＡ／５％ＦＢＳで注意深く洗浄され、未結合の細胞を除去した。プラスミドＤＮＡはハート（Hirt）法（ハート（Hirt B.）著、J. Mol. Biol.、１９６７年、第２６巻、ｐ．３６５−３６９）により、接着細胞から回収された。回収されたプラスミドＤＮＡは、大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３細胞へ形質転換され、形質転換された大腸菌は二次ｃＤＮＡライブラリを調製するべく用いられた。
【０１２８】
上述のトランスフェクション、発現、スクリーニング、およびプラスミド収穫の４周後、ハート法によって得られた最終的な収穫されたプラスミドは、大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３へ形質転換された。次いで，多くのクローニングが無作為に選択された。これらのクローンからプラスミドが抽出され、リポフェクション法により、ＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトするべく用いられた。トランスフェクションの１２時間後、細胞はトリプシンで消化され、新たなプラスチック皿へ播種された。トランスフェクションの７２時間後、ｍＳＭ５−１が皿へ添加され、ＦＩＴＣ標識されたヤギ抗マウスＩｇ二次抗体で染色された。陽性クローンは、蛍光顕微鏡下に同定された。最後に、プラスミドｃＤＮＡが、単一の陽性クローンから単離された。次いで、ＳＭ５−１抗原をコードしているｃＤＮＡクローンが配列決定され、分析された。ＳＭ５−１抗原の細胞外領域は、哺乳類発現ベクター内へクローン化され、構築されたベクターは発現のためＣＨＯ細胞へトランスフェクトされた。ＳＭ５−１抗原の細胞外領域は、無血清培養上清からのアフィニティクロマトグラフィー（セファロース（Sepharose）−４Ｂ上に固定されたマウスＳＭ５−１抗体）により精製された。
【実施例２】
【０１２９】
ヒト抗体ライブラリからのヒト抗ヒトＳＭ５−１抗体の可変領域遺伝子のスクリーニング
ヒト抗体ライブラリは、マークス（Marks）ら（J. Mol. Biol.、第２２２巻、ｐ．５８１−５９７）、フーゲンブーム（Hoogenboom）およびウィンター（Winter）（J. Mol. Biol.、第２２７巻、ｐ．３８１−３８８）、ハイダイス（Haidais CG）ら（J. Immunol. Methods、２００１年１１月１日、第２５７巻、第１−２号、ｐ．１８５−２０２）、グリフィス（Griffith, A. D.）ら（EMBO J.、１９９４年、第１３巻、ｐ．３２４５−３２６０）；ニッシム（Nissim, A.）ら（EMBO J.、１９９４年、第１３巻、ｐ．６９２−６９８）によって記述された方法にしたがって構築された。
【０１３０】
回収された抗体ライブラリは、１４ｍｌの新鮮なＬＢ培地へ添加され、５０ｍｌのトライアングルボトル中で１６時間３７℃で培養された。
【０１３１】
細菌は、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。上清は、無菌の５０ｍｌ遠心管へ移され、その後の使用のために保存され、タイターは２ｘ１０11より高くされた。細胞培養フラスコは、実施例１で得られた精製された抗ＳＭ５−１でコートされた。３ｘ１０10ものファージ粒子がフラスコに添加され、３７℃で１時間インキュベートされた。フラスコは、１％ツイーン（Tween）−２０を含有する１０ｍｌＰＢＳで１０回洗浄された。接着性の粒子は溶出緩衝液で溶出され、対数増殖期にある１ｍｌのＴＧ１細胞へ添加された。細胞は、振盪機において、３７℃で１６時間培養された。
【０１３２】
前の段落に記述された段階が、さらに３回繰り返された。
【０１３３】
上記のようにして得られた細胞は、１０5／ｍｌに希釈され、次いで０．１％Ａｍｐ、１．５％寒天プレート上で培養され、単一クローンを得た。クローンは、９６穴ディープウエルプレート上で、１クローンに１ウエルで培養され、合計９６０クローン（１０プレート）が得られた。プレートは５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離され、上清は無菌のディープウエルプレートへ移され、カバーされ、４℃で保存された。
【０１３４】
１０個の９６穴プレートにおいて、ウエルおよび複数のウエルの各々は、１０μｌのＳＭ５−１抗原（１０μｇ／ｍｌ）でコートされた。上記の上清（１０μｌ）が各ウエルに添加され、プレートは３７℃で１時間インキュベートされた。ウエルは１％ツイーン−２０を含有するＰＢＳで２０回洗浄された。次いで、１μｌのＨＲＰ標識されたヤギ抗Ｍ１３ｍＡｂが各ウエルへ添加され、プレートは３７℃で３０分間インキュベートされた。ウエルは１％ツイーン−２０を含有するＰＢＳで１０回洗浄された。
【０１３５】
洗浄の後、１００μｌのＴＭＢ基質溶液がウエルへ添加され、プレートは室温で、光なしで５〜２０分間インキュベートされ、発色された。さらに５０μｌの停止溶液が各ウエルへ添加された。プレートは４５０ｎｍで読取られた。
【０１３６】
このプロセスを通して、４１５の陽性クローンが選択された。ＯＤ450がより高いウエルは、より高い親和性をもつ抗体の可変領域を含有しているクローンに対応する。光学吸収により、５つのクローンが選択された。これら５つのクローンは、１００ｍｌのＬＢ培地中へ播種され、２６０ｒｐｍの浸盪機で３７℃において９時間培養された。次いで、ＩＰＴＧが最終濃度１ｍＭで培養物に加えられ、培養物は１０時間の誘導のためインキュベートされた。次いで、ヒトＳＭ５−１抗原に対するヒト抗体である、抗ＳＭ５−１タンパク質が単離および精製された。このヒト抗体（ｈｕＳＭ５−１）は、アフィニティ測定用に精製され、最高の親和性をもつ陽性クローンがさらなる研究に向けて選択された。この抗体の重鎖可変領域（配列番号９および１１）、および軽鎖可変領域（配列番号１０および１２）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、以下の表１に示されている。
【０１３７】
【表１】
2007535905.tif 000002
【実施例３】
【０１３８】
ヒトＳＭ５−１抗原に対するヒト抗体の発現
１．発現ベクターの構築
ＰＣＲ法を用いて、ＸｂａＩ部位およびｍＡｂ  ＯＫＴ３のシグナルペプチドが、ｈｕＳＭ５−１の重鎖可変領域遺伝子（ＶＨ）の５′末端へ、ＮｈｅＩ部位が３′末端へ添加された。ｍＡｂ  ＯＫＴ３シグナルペプチジドのアミノ酸配列は、ＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＩＳＲＧ（配列番号１３）であり、ｍＡｂ  ＯＫＴ３シグナルペプチジルのヌクレオチド配列は、ＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴ
ＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＧ（配列番号１４）である。ＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔベクターへクローン化され、その配列が検証された。ＶＨはＸｂａＩおよびＮｈｅＩ消化により切除され、次に図１に示された発現ベクターｐＭＧ１８−３Ｋ（ｉｎｃｐ−９プラスミド配列に基づく環境モニタリング用ツールの開発から。グレイティッド（A. Greated）、クラソウィアク（R. Krasowiak）、ティトク（M. Titok）バーミンガム大学、トーマス生物科学校（C.M. Thomas school of biological sciense）、英国、バーミンガムＢ１５  ２ＴＴ、エジバストン（Edgbaston）、およびベラルーシ州立大学生物学部微生物学科、ベラルーシ、ミンスク（Minsk）２２００８０、スコリナ通り（Scorina Av.）４）のＸｂａＩ／ＮｈｅＩ部位へ挿入された。
【０１３９】
ＰＣＲ法を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびｍＡｂ  ＯＫＴ３のシグナルペプチドは、ｈｕＳＭ５−１の軽鎖可変領域遺伝子（ＶＬ）の５′末端へ、ＢｓｉＷＩ部位が３′末端へ添加された。ＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔベクターへクローン化され、その配列が検証された。ＶＬは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｉＷＩ消化によって切除され、次いで発現ベクターｐＭＧ１８−３ＫのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｉＷＩ部位に挿入された。
【０１４０】
ヒトＳＭ５−１抗原に対するヒト抗体のための発現ベクターが構築された。
【０１４１】
トランスフェクションに先立ち、ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞は、グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジン（ＧＨＴ）を含有する完全ＤＭＥＭ培地中に維持された。上記の発現ベクターは、リポフェクタミン（Lipofectamine）２０００試薬（インビトロジェン、カリフォルニア州、カールスバッド）を用いて製造業者の指示に従ってＣＨＯｄｈｆｒ−細胞へトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は次に、１．０Ｍまで段階的にレベルが増加するＭＴＸを含有するＧＨＴフリーＤＭＥＭ培地中で選択された。薬剤耐性クローンは摘取られ、さらなる分析に向けて拡張された。細胞クローンからの培養上清は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ）を捕獲抗体として、ヤギ抗ヒトカッパＨＲＰ（ＫＰＬ）を検出抗体として用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、抗体産生について分析された。精製されたヒトＩｇＧ１／カッパ（シグマ（Sigma））が、ＥＬＩＳＡアッセイにおける標準として使用された。最も高い抗体量を産生しているクローンが選択され、無血清培地中で成長された。組換え抗体は、無血清培養上清からプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製された。
【実施例４】
【０１４２】
マウス抗ＳＭ５−１抗体（ｍＳＭ５−１）のヒト化およびキメラ抗体の構築
１．マウス抗ＳＭ５−１抗体重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のクローニング
ＲＮＡは、ＳＭ５−１（ＩｇＧ１、κ）ハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ記号番号ＨＢ−１２５８８）から、トリゾル試薬（TRIzol Reagent）（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド（Gland Island））を用いて単離された。ｍＳＭ５−１の重鎖および軽鎖可変領域ｃＤＮＡは、ハイブリドーマ細胞から、５′ＲＡＣＥシステム（ギブコＢＲＬ、メリーランド州、ガイザースバーグ（Gaithersburg））を用いて、製造業者の指示に従ってクローン化された。最終的なＰＣＲ産物は、配列決定のため、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ（Promega）、ウィスコンシン州、マジソン）へクローン化された。ヌクレオチド配列、および重鎖（ｍＳＭ５−１  ＶＨ）および軽鎖（ｍＳＭ５−１  ＶＬ）の可変領域の推測されるアミノ酸配列は、以下の表２に示されている。
【０１４３】
【表２】
2007535905.tif 000003
【０１４４】
２．キメラ抗体の構築および発現
上記に示されたｍＳＭ５−１の重鎖および軽鎖の可変領域が、マウス−ヒトキメラ抗体を構築するべく使用された。キメラ抗体発現ベクターは、実施例３に記述されたｈｕＳＭ５−１と同一の方式で構築された。
【０１４５】
トランスフェクションに先立ち、ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞は、グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジン（ＧＨＴ）を含有する完全ＤＭＥＭ培地中に維持された。ｃｈＳＭ５−１の重鎖および軽鎖を含有している発現ベクターｐＭＧ１８−３Ｋは、リポフェクタミン（Lipofectamine）２０００試薬（インビトロジェン、カリフォルニア州、カールスバッド）を用いて、製造業者の指示に従ってＣＨＯｄｈｆｒ−細胞へトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は次に、１．０Ｍまで段階的にレベルが増加するＭＴＸを含有するＧＨＴフリーＤＭＥＭ培地中で選択された。薬剤耐性クローンは摘取られ、さらなる分析に向けて拡張された。細胞クローンからの培養上清は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ）を捕獲抗体として、ヤギ抗ヒトカッパＨＲＰ（ＫＰＬ）を検出抗体として用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、抗体産生について分析された。精製されたヒトＩｇＧ１／カッパ（シグマ（Sigma））が、ＥＬＩＳＡアッセイにおける標準として使用された。最も高い抗体量を産生しているクローンが選択され、無血清培地中で成長された。組換え抗体は、無血清培養上清からプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製された。
【０１４６】
３．ヒト化抗体の構築および発現
ヒト抗体ＫＯＬのＶHが、ヒト化重鎖用の枠組み構造として選ばれ、ヒトベンズ・ジョーンズタンパク質ＲＥＩのＶLが、ヒト化軽鎖用に選ばれた。ｍＳＭ５−１軽鎖または重鎖からの３つのＣＤＲは、ヒト抗体軽鎖または重鎖枠組み構造領域内へ直接的にグラフトされ、ヒト化抗体遺伝子を生成した。ヒト化抗体の軽鎖および重鎖可変領域遺伝子は、ＰＣＲ法を重複することにより合成された。ヒト化抗体のための発現ベクターは、上記のキメラ抗体と同一の方式で構築された。
【０１４７】
図２に示されたように、ｍＳＭ５−１軽鎖または重鎖からの３つのＣＤＲは、ヒト抗体軽鎖または重鎖の枠組み構造領域内へ直接的にグラフトされ、ヒト化抗体遺伝子を生成した。ヒト化ＶLおよびＶHは、ｐＭＧ１８−３Ｋ発現ベクターへクローン化され、ＣＯＳ細胞内で一過性に発現され、ヒト化された変形物を生じた。ＣＯＳ細胞培養上清中のヒト化抗体は、ＥＬＩＳＡにより定量され、肝臓癌細胞系ＱＹＣに対するこの変形物の結合は、ＦＣＭにより測定された。抗原結合活性のアッセイは、この抗体がヒトメラノーマ細胞へ充分には結合しないことを示した。このことは、完全な結合活性を再度組立てるためには、いくつかのヒトＦＲ残基が変えられねばならないことを示唆した。結合活性に対し影響があってもよい重要なＦＲ残基が分析され、復帰突然変異アッセイが行なわれた。最終的には、ｃｈＳＭ５−１と同様の抗原結合活性を示すヒト化抗体が得られた。ヒト化変形物は、ＲｅＳＭ５−１と呼ばれ、その重鎖および軽鎖の双方のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、下記の表３に示されている。競合結合アッセイにおいて、ＲｅＳＭ５−１はマウスＳＭ５−１またはキメラＳＭ５−１抗体と同等な活性を示した。
【０１４８】
【表３】
2007535905.tif 000004
【０１４９】
４．ヒト化抗体の精製
トランスフェクションに先立ち、ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞はグリシン、ヒポキサンチン、およびチミジン（ＧＨＴ）を含有する完全ＤＭＥＭ培地中に維持された。適当な発現ベクターは、リポフェクタミン（Lipofectamine）２０００試薬（インビトロジェン、カリフォルニア州、カールスバッド）を用いて製造業者の指示に従ってＣＨＯｄｈｆｒ−細胞へトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は次に、１．０Ｍまで段階的にレベルが増加するＭＴＸを含有するＧＨＴフリーＤＭＥＭ培地中で選択された。薬剤耐性クローンは摘取られ、さらなる分析に向けて拡張された。細胞クローンからの培養上清は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ）を捕獲抗体として、ヤギ抗ヒトカッパＨＲＰ（ＫＰＬ）を検出抗体として用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、抗体産生について分析された。精製されたヒトＩｇＧ１／カッパ（シグマ（Sigma））が、ＥＬＩＳＡアッセイにおける標準として使用された。最も高い抗体量を産生しているクローンが選択され、無血清培地中で成長された。組換え抗体（ＲｅＳＭ５−１）は、無血清培養上清からプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製された。
【実施例５】
【０１５０】
モノクローナル抗体ｈｕＳＭ５−１の生物学的活性
１．メラノーマ細胞に対するｈｕＳＭ５−１の影響
メラノーマ細胞系Ａ２０５８は、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で１０6／ｍｌまで増やされた。細胞懸濁液（２０μｌ）および異なる量のｈｕＳＭ５−１（０，１，５，１０，２０，５０，１００μｌ）が９６穴プレートの各ウエルへ添加された。抗体ｈｕＳＭ５−１は１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中に希釈され、ウエルへ添加される前には１μｇ／μｌの最終濃度に達した。１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地が各ウエルへ添加され、各ウエル内の最終体積を５００μｌとした。各々の条件は、三重に行なわれた。細胞は、加湿されたインキュベーター中で、５％ＣＯ2下に３７℃で２４時間インキュベートされた。インキュベーションの最後で、細胞は懸濁され、生細胞は顕微鏡下に検査され、またはＭＴＴを用いて検査された。
【０１５１】
（１）生細胞数
各ウエルからの０．２ｍｌの細胞懸濁液中の生細胞が計数された。結果は、表４に示されている。生細胞は、ｈｕＳＭ５−１を添加しないウエルに比較した生細胞のパーセントが表されている。表４に示されたように、抗体ｈｕＳＭ５−１は、２４時間のインキュベーションの後、生きたＡ２０５８細胞の数を用量依存的に有意に減少させた。
【０１５２】
【表４】
2007535905.tif 000005
【０１５３】
（２）ＭＴＴ
ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）は、上記の０．２ｍｌの細胞懸濁液へ、１：１０希釈で添加された。細胞は次に３７℃で３０分間インキュベートされ、各々の試料について５７０ｎｍの光学吸収が読取られた。表５に示されたように、抗体ｈｕＳＭ５−１で処理された細胞は、対照に比較して５７０ｎｍにおける光学吸収が有意に低く、抗体ｈｕＳＭ５−１による処理の後、生細胞が有意に減少したことを示している。
【０１５４】
【表５】
2007535905.tif 000006
【０１５５】
上記の結果は、ｈｕＳＭ５−１抗体がヒトメラノーマ細胞の増殖をインビトロにおいて有効に防止することができ、メラノーマの治療に使用されてもよいことを示した。
【０１５６】
２．ｈｕＳＭ５−１抗原発現のフローサイトメトリ分析
癌細胞の表面のヒトｈｕＳＭ５−１抗原の発現は、ｈｕＳＭ５−１抗体を用いたフローサイトメトリを用いて行なわれた。研究に使用された癌細胞は、乳癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢＴ−２０−Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、およびＭＣＦ−７；メラノーマ細胞系ＣＲＬ−１８７２およびＵ１０；肝細胞癌細胞系ＱＹＣ、ＬＹＸ、およびＸＪＣがあった。
【０１５７】
上記の研究に加えて、本発明者らは獲得された細胞系について以下の研究も行い、ＳＭ５−１抗原がメラノーマ細胞によって特徴的に発現されるばかりでなく、乳癌および肝細胞癌細胞によっても過剰発現されることを見出した。
【０１５８】
検査されるべき癌細胞は、適当に希釈されたｈｕＳＭ５−１と１時間インキュベートされ、次いでＰＢＳで５回洗浄された。細胞はＦＩＴＣ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（２ｍｇ／ｍｌ、ジャクソン免疫研究所（Jackson Immunoreseach Laboratories）（ペンシルバニア州、ウェストグローブ（West Grove））とインキュベートされ、次いで１％ホルマリンを含有しているＰＢＳ中で固定された。これらの細胞における抗原の発現は、次にフローサイトメトリを用いて分析された。
【０１５９】
図３に示されたように、ＳＭ５−１抗原は、乳癌細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、およびＭＣＦ−７）、メラノーマ細胞系（ＣＲＬ−１８７２）、および肝細胞癌細胞系（ＱＹＣおよびＬＹＸ）において、高度に、または中程度に発現された。しかし、肝細胞癌細胞系ＸＪＣ、乳癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３およびＢＴ−２０−Ｔ、メラノーマ細胞系Ｕ１０においては、抗原の発現は低レベルであった。これらのデータは、ヒトＳＭ５−１抗原がメラノーマ、乳癌、および肝細胞癌の細胞系において発現されたことを示している。
【０１６０】
ｈｕＳＭ５−１抗体のための抗原決定基を同定するため、肝細胞癌細胞系ＱＹＣからタンパク質が抽出され、ｈｕＳＭ５−１抗体を用いて免疫沈降された。マウス抗ヒトＣＤ４抗体もまた、陰性対照として免疫沈降に使用された。免疫沈降は、ウエスタンブロットにより分析された。ブロットは、ｈｕＳＭ５−１抗体を用いてプローブされた。図４に示されたように、タンパク質がｈｕＳＭ５−１抗体と免疫沈降された場合にのみ、分子量２３０ｋＤおよび１８０ｋＤの二つのタンパク質が見出された；陰性対照抗体および二次抗体の場所には、何ら特異的なバンドが観察されなかった。
【０１６１】
３．ｈｕＳＭ５−１抗体はカスパーゼ１０関連アポトーシスを誘導する
ｈｕＳＭ５−１抗体誘導性のアポトーシスにカスパーゼが関与するかどうかを決定するため、種々のカスパーゼ阻害剤が検査され、アポトーシスの阻害率が観察された。検査されたカスパーゼ阻害剤は、共通のカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−１阻害剤（Ｚ−ＷＥＨＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−２阻害剤（Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−３阻害剤（Ｚ−ＤＥＶＥＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−４阻害剤（Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−６阻害剤（Ｚ−ＶＥＩＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−８阻害剤（Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−９阻害剤（Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−１０阻害剤（Ｚ−ＡＶＥＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−１３阻害剤（Ｚ−ＬＥＥＤ−ＦＭＫ）を含む。ＱＹＣ細胞は、５０ｍｏｌ／ｌのカスパーゼ阻害剤とともに２時間インキュベートされた。次いでＱＹＣ細胞は、５０ｎｇ／ｍｌのｈｕＳＭ５−１抗体で処理された。これらの阻害剤の阻害率は：全カスパーゼ阻害剤で７２％、カスパーゼ１０阻害剤で５２％、カスパーゼ６阻害剤で２８％、カスパーゼ１阻害剤で２７％、カスパーゼ８阻害剤で１７％、カスパーゼ１３阻害剤で１５％、カスパーゼ４阻害剤で１４％、カスパーゼ９阻害剤で５％、カスパーゼ２阻害剤で１％、カスパーゼ３阻害剤で１％であった。上記の結果を基盤とすれば、全カスパーゼ阻害剤がｈｕＳＭ５−１誘導性のアポトーシスに対して最も高い阻害作用を有しており、カスパーゼ１０阻害剤もまたｈｕＳＭ５−１誘導性のアポトーシスを有意に阻害しており、ｈｕＳＭ５−１誘導性のアポトーシスがカスパーゼ介在性の経路に関係していること、およびカスパーゼ１０がｈｕＳＭ５−１誘導性のアポトーシスに最も影響を及ぼすカスパーゼの一つであったことを示している。
【０１６２】
ｈｕＳＭ５−１誘導性のアポトーシスがカスパーゼ１０関連性であることをさらに確認するべく、カスパーゼ１０カラー比較分析キットが使用され、ＱＹＣ細胞およびＸＩＣ細胞におけるカスパーゼ１０の生物活性の増加が調べられた。カスパーゼ１０活性は、カスパーゼ１０分析キット（Ｒ＆Ｄ、米国）を用いて製造業者の指示に従って調べられた。細胞は、５０ｎｇ／ｍｌのｈｕＳＭ５−１抗体とともに一定時間インキュベートされた。細胞は次いで遠心分離され、氷上の溶解緩衝液中（２５μｌ／１０6細胞）で１０分間溶解された。溶解物は遠心分離され、上清は新たな管へ移され、氷上に保持された。カスパーゼの酵素活性は、９６穴マイクロタイタープレート上で検査された。各反応は、５０μｌの細胞溶解物上清、５０μｌの２ｘ反応緩衝液、１０μｌの新鮮なＤＴＴ貯蔵溶液を含んでいた。加えて、５μｌのカスパーゼ１０カラー比較基質（ＡＥＶＤ−ｐＮＡ）が反応物に加えられた。プレートは３７℃で１〜２時間インキュベートされ、４０５ｎｍにおける吸収が測定された。カスパーゼ１０関連活性の増加は、以下の式に従って計算された：
カスパーゼ１０活性（％）＝（Ｂ−Ｃ）／（Ａ−Ｃ）ｘ１００％
【０１６３】
「Ａ」はｈｕＳＭ５−１抗体処理なしの細胞溶解物からの上清のＯＤ値を表し；
「Ｂ」はｈｕＳＭ５−１抗体で処理された細胞溶解物からの上清のＯＤ値を表し；「Ｃ」は陰性対照のＯＤ値を表す。各検査は三重に行なわれた。
【０１６４】
図５は、ｈｕＳＭ５−１処理されたＱＹＣ細胞ではカスパーゼ１０活性が１３％（４８時間）から５１％（９６時間）まで増加したこと、およびｈｕＳＭ５−１処理されたＸＪＣ細胞では１７％（４８時間）から３８％（７２時間）まで増加したことを示している。しかしながら、ＸＪＣ細胞ではカスパーゼ１０活性は９６時間で２８％まで減少した。これらのデータは、ｈｕＳＭ５−１誘導性アポトーシスがカスパーゼ１０関連性であることを示している。
【０１６５】
４．細胞分化および成長に対するｈｕＳＭ５−１の影響
ｈｕＳＭ５−１抗体による細胞成長阻害は、ＭＴＴアッセイを用いて検査された。ＭＴＴアッセイは、生細胞が黄色のＭＴＴを青紫色の結晶へ還元することができるという原理に基づいている。目的の細胞（１ｘ１０3）は、種々の濃度の抗体とインキュベートされた。一定時間の後、２０μｌのＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌ）が細胞培地へ添加され、２時間インキュベートされた。インキュベーションの後、培地は除去され、１５０μｌのＤＭＳＯが添加されてＭＴＴ沈殿が溶解された。還元されたＭＴＴは、４９０ｎｍにおける吸収を、ベンチマーク（Benchmark）光学吸収読取り機（バイオラッド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories））を用いて測定することにより検査された。細胞成長阻害は、以下の式に従って計算された：
阻害（％）＝（Ｂ−Ｃ）／（Ａ−Ｃ）ｘ１００
【０１６６】
「Ａ」はｈｕＳＭ５−１処理なしの細胞のＯＤ値を表し；
「Ｂ」はｈｕＳＭ５−１処理細胞のＯＤ値を表し；「Ｃ」は陰性対照のＯＤ値を表す。各条件は三重に行なわれた。
【０１６７】
ｈｕＳＭ５−１による成長阻害は、４つの腫瘍細胞系（肝細胞癌細胞ＱＹＣおよびＸＪＣ、乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびメラノーマ細胞系ＣＲＬ−１８７２）において、ＭＴＴアッセイを用いて検査された。細胞は、異なる量のｈｕＳＭ５−１（５０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）を用いて、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間にわたり処理された。最大の阻害は、抗体の濃度が５０ｎｇ／ｍｌでありかつ処理の７２時間後の場合に生じた。たとえば、５０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、および１ｎｇ／ｍｌにおいては、肝細胞癌細胞系ＱＹＣの成長阻害は、ｈｕＳＭ５−１による処理の２４時間後では、各々２９％、１１％、および７％であり；処理の４８時間後では成長阻害は各々約２８％、１７％、および５％であり；７２時間後では、阻害は４３％、１９％、および１０％であり；かつ９６時間後では、阻害は３６％、１１％、および２．５％であった。同様の結果が他の三つの細胞系で観察された。陰性対照用に使用された抗体は、非関連のヒトＩｇＧ１であり、細胞成長には何ら影響を示さなかった。上記の結果は、ｈｕＳＭ５−１抗体が腫瘍細胞の成長を、用量および時間依存性の様式で有意に阻害することができたことを示した。
【０１６８】
上記に示されたように、ｈｕＳＭ５−１抗体の成長阻害は、カスパーゼ１０介在性の経路を通したアポトーシス誘導に関連づけられており、アポトーシスプロセスはＤＮＡの断片化を包含してもよい。
【実施例６】
【０１６９】
腫瘍細胞に対する抗ヒトＳＭ５−１キメラ抗体（ｃｈＳＭ５−１）およびヒト化抗体（ＲｅＳＭ５−１）のインビトロにおける効果
生存率試験において使用された細胞系はＱＹＣ細胞であり、それらは上海国際合同癌研究所（Shanghai International Joint Cancer Institute）から入手された。ＱＹＣ細胞は２５ｃｍ2のフラスコ内で、１０％ＦＢＳ（ギブコ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０／ＤＭＥＭ（Ｖ：Ｖ＝１：１、ギブコ）を用いて培養された。
【０１７０】
上記の細胞は、０．０５％トリプシンにより０．０２％ＥＤＴＡ中で消化され、細胞数が数えられ、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０／ＤＭＥＭ培地中で、６ｘ１０4／ｍｌに調整された。
【０１７１】
アッセイは９６穴プレートにおいて行なわれた。上記の抗ヒトＳＭ５−１ヒト化およびキメラ抗体は、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０／ＤＭＥＭで希釈された。検査されるべき抗体（２０ｍｇ／ｍｌ）は、各々が１０倍を超えない希釈により、８μｇ／ｍｌまで連続希釈された。抗体はさらに、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０／ＤＭＥＭを用いて、９６穴プレート内の１４の連続した濃度用に、１：２に連続的に希釈され、１００μｌ／ウエルとした。細胞（１００μｌ）は、２００μｌの種々の濃度の抗体か、または対照として２００μｌの１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０／ＤＭＥＭを含有している各ウエルに添加された。プレートのエッジ効果を防止するため、プレートの端にあるウエルはアッセイに使用されず、２００μｌのＰＢＳが添加された。プレートは、３７℃において、７％ＣＯ2を用いて７日間インキュベートされた。
【０１７２】
発色剤ＰＭＳ：ＭＴＳ（１：２０）（２０μｌ）が、９６穴プレートの各ウエルへ添加された。次いでプレートは蓋なしで３時間インキュベートされた。
【０１７３】
９６穴プレートはＯＤ４９０ｎｍで読取られた。結果は、以下の４つのパラメータの式で表された：
Ｙ＝（Ａ−Ｂ）／［１＋（Ｘ／Ｃ）D］＋Ｂ
【０１７４】
該式によれば、Ｘ＝＋∞、Ｙ＝Ｂのとき、上限；Ｘ＝０、Ｙ＝Ａのとき、下限；Ｘ＝Ｃ、Ｙ＝（Ａ＋Ｂ）／２のとき、最大値の半分。それゆえ、Ｃは半有効量（ＥＤ５０）である。図６は、ヒト化された、ならびにキメラの、抗ヒトＳＭ５−１抗体による、腫瘍細胞系（ＱＹＣ）の成長阻害を示している。
【０１７５】
この検査は、キメラおよびヒト化抗ＳＭ５−１抗体が、インビトロのＱＹＣ細胞の増殖を有意に阻害したことを示している。
【実施例７】
【０１７６】
ＲｅＳＭ５−１／キメラＳＭ５−１による抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
１．末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の単離
静脈血は、健康なドナーから無菌的に採取され、２０Ｕ／ｍｌのヘパリンを含有している無菌の１５ｍｌ遠心管に入れられた。溶液は注意深く混合され、同体積の無菌のＰＢＳが添加され，血液を希釈した。
【０１７７】
１５ｍｌの遠心管内において、室温にあらかじめ加温された６ｍｌの１００％リンパ球単離液（ＣＡＣＳより入手、細胞生物学研究所（Cellular Biology Institute））が添加された。傾斜された管の管壁に沿って、６ｍｌの希釈された抗凝固末梢血が、界面を損なうことなく徐々に管内へ添加された。
【０１７８】
管は２０℃において、８００ｇで３０分間ブレーキをオフにして遠心分離された。遠心分離の後、３つの層が形成された。３つの層（上から下へ）は、血漿層、細胞分離液層、赤血球および顆粒球層であった。血漿層と細胞分離液層との間の白色の曇りガラス様の層は、リンパ球および単核細胞を含有する層であった。この白色層はピペットを用いて採取され、別の１５ｍｌの無菌の遠心管へ入れられた。ＰＢＳが遠心管へ添加されてＰＢＬ懸濁液が希釈され、次いで２００ｇで５分間遠心分離された。ペレットはＰＢＳで２回洗浄された。
【０１７９】
細胞濃度は、フェノールレッド非含有ＲＰＭＩ−１６４０／ＤＭＥＭ（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））を用いて６ｘ１０6／ｍｌに調整された。１５ｍｌの遠心管中に懸濁された細胞は、さらなる研究のため、３７℃において７％ＣＯ2を用いてインキュベートされた。
【０１８０】
２．ターゲットＱＹＣ細胞の調製
対数増殖期のＱＹＣ細胞が、インキュベータから採取された。細胞はＰＢＳで２回洗浄された。０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡを含有する０．５ｍｌの消化液が細胞へ添加された。細胞の形態学は、顕微鏡下に観察された。細胞が丸くなり始めたとき、消化液は除去された。細胞はフェノールレッド非含有ＲＰＭＩ−１６４０／ＤＭＥＭ中に再懸濁された。細胞は計数され、濃度は３ｘ１０5／ｍｌに調整された。
【０１８１】
３．細胞に対するＳＭ５−１抗体の役割
抗ＳＭ５−１抗体は４０μｇ／ｍｌに希釈され、次いで１．５ｍｌの遠心管において、フェノールレッド非含有ＲＰＭＩ−１６４０／ＤＭＥＭを用いて、連続的に１：２希釈され、合計１４の濃度および３００μｌ／管とした。ＱＹＣ細胞（３００μｌ）が、各管へ添加された。細胞は４℃において３０分間インキュベートされた。細胞は次いで、２００ｇで５分間遠心分離された。細胞ペレットはＰＢＳで２回洗浄された。細胞は次に、３００μｌのフェノールレッド非含有ＲＰＭＩ−１６４０／ＤＭＥＭ中に懸濁された。抗ＳＭ５−１抗体と反応した細胞は、９６穴プレートのウエルへ１００μｌ／ウエルで添加された。１００μｌ／ウエルのエフェクター細胞が、２０：１のエフェクター：ターゲット比で、９６穴プレートの各ウエルへ添加された。プレートは３７℃において、７％ＣＯ2を用いて７時間インキュベートされた。
【０１８２】
４．発色およびＯＤ490
ロシュズ・コーポレーション（Roche's Corporation）による細胞毒性検出キット（Cytotoxicity Detection Kit）が使用された。触媒は１ｍｌのｄｄＨ2Ｏ中に溶解された。触媒は、１：４５の割合で色素溶液と混合された。インキュベータから取出された９６穴プレートは、２００ｇで５分間遠心分離され、上清５０μｌが各ウエルから採取され、別の９６穴プレートへ添加された。混合された発色液５０μｌ／ウエルが９６穴プレートへ添加され、プレートは室温で（光を避けて）３０分間インキュベートされた。ＯＤは４９０ｎｍにおいて読取られた。図７の結果は、キメラおよびヒト化ＳＭ５−１ｍＡｂｓがアポトーシスを誘導し、ＡＤＣＣ経路を通して腫瘍細胞の成長を阻害することを示した。
【実施例８】
【０１８３】
補体依存性細胞毒性活性（ＣＤＣ）
抗ＳＭ５−１により認識される抗原は、ヒト肝細胞癌細胞系ＱＹＣの表面に高度に発現される。培養液中のヒト補体を用いて、キメラ抗体と結合したターゲット細胞は、いわゆる補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）により溶解されるであろう。一定の範囲内で、過剰な量の補体（新鮮な正常ヒト血清により供給された）がある場合には、溶解の程度は抗体の濃度に関係づけられる。溶解の程度は、溶解された細胞により放出される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を検出することによって測定されることが可能である。
【０１８４】
生物活性測定用の細胞系は、何ら病原体のないＱＹＣである。細胞は、２５〜７５ｃｍ2フラスコ内で、１０％ＮＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０／ＤＭＥＭ（１：１）を用いて培養された。以下の培地が調製され、４℃に貯蔵された：Ａ、１０％ＮＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０／ＤＭＥＭ（１：１）；Ｂ、無血清フェノールレッド非含有ＲＰＭＩ−１６４０；Ｃ、５％正常ヒト血清を含む培養液Ｂ。血清は、健康なドナーから新たに単離され、−８０℃に貯蔵された。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ2、および飽和湿度であった。
【０１８５】
対数増殖期のＱＹＣ細胞が採取され、計数された。生物活性測定には、２ｘ１０6細胞が各９６穴プレートに使用された。細胞は遠心分離され、上清は除去された。培地Ｂがペレットに添加されて細胞を再懸濁し、細胞濃度は２ｘ１０5／ｍｌに調整された。再懸濁された細胞は、０．１ｍｌ／ウエルで９６穴プレートへ添加された。エッジ付近のウエルは使用されず、これらのウエルにはエッジ効果をさけるべく滅菌水が添加された。
【０１８６】
標準試料および検査されるべきタンパク質は、各希釈が１０倍を超えないように、４０μｇ／ｍｌまで連続希釈された。標準および検査されるべきタンパク質はさらに、１４の１．５ｍｌ無菌遠心管において、０．４ｍｌの最終希釈体積で１：２希釈された（注意：９６穴プレートへ添加された最高濃度は２μｇ／ｍｌであった）。
【０１８７】
培地Ｃは陰性対照として使用された。ＱＹＣ細胞が播種された培養プレートにおいて、０．１ｍｌの希釈された標準タンパク質か、または上記の検査されるべきタンパク質か、または陰性対照が、各ウエルへ添加された。各々の条件は二重に行なわれた。プレートは、３７℃、５％ＣＯ2において、３〜４時間インキュベートされた。
【０１８８】
５０μｌの上清が、各ウエルから、第二の９６穴プレートの対応するウエルへ移され、５０μｌの充分に撹拌されたＬＤＨ検査キット試薬が第二のプレートのウエルへ添加された。第二のプレートは、室温において、光なしで０．５時間インキュベートされた。発色は、５０μｌの中和液（酢酸１ｍｏｌ／Ｌ）を添加することによって停止された。ＯＤは、検出波長として４９０ｎｍを、参照波長として６３０ｎｍを用いて測定された。図８は結果を示している。
【０１８９】
結果は、特別の分析用ソフトウエアＳｅｌｅｃｔ２．２を用いて分析され、自動分析を行い、標準曲線を計算した：横軸は標準産物および試料の濃度を意味しており、縦軸は光学吸収を意味しており、４つのパラメータの式としての回収式は、結果として「Ｓ字」曲線を生じる。標準産物および試料の半有効量（ＥＤ５０）が計算された。試料の生物活性は、以下のように示された。
【０１９０】
生物活性パーセント（％）＝標準産物の半有効量（ＥＤ５０）／試料の半有効量（ＥＤ５０）ｘ１００％
【０１９１】
注意：ソフトウエアは以下の４つのパラメータの式を与えた：
Ｙ＝（Ａ−Ｂ）／［１＋（Ｘ／Ｃ）D］＋Ｂ
【０１９２】
該式によれば、Ｘ＝＋∞、Ｙ＝Ｂのとき、上限；Ｘ＝０、Ｙ＝Ａのとき、下限；Ｘ＝Ｃ、Ｙ＝（Ａ＋Ｂ）／２のとき、最大値の半分。それゆえ、Ｃは半有効量（ＥＤ５０）である。
【０１９３】
図８に示されたように、キメラおよびヒト化された抗ヒトＳＭ５−１抗体の双方は、アポトーシスを誘導し、ＣＤＣ経路を通して腫瘍細胞の成長を阻害した。
【実施例９】
【０１９４】
ＱＹＣをもつヌードマウスに関する抗ＳＭ５−１モノクローナル抗体の治療効果
キメラおよびヒト化抗ＳＭ５−１モノクローナル抗体、並びにヒト化およびキメラ抗ＣＤ３抗体は、それらの治療効果について、ＱＹＣをもつヌードマウスにおいて検査された。
【０１９５】
４０匹のメスのヌードマウスは、ＱＹＣを皮下接種された。７週間後、腫瘍塊は直径０．５ｃｍに達した。これらのマウスは無作為に５群に分けられた：ＰＢＳ群用の８匹のマウス；無関係の抗体、キメラ抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ、４ｍｇ／ｋｇ用の８マウス；ヒト化抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ、４ｍｇ／ｋｇ用の８匹のマウス；抗ヒトＳＭ５−１キメラｍＡｂ、４ｍｇ／ｋｇ用の８匹のマウス；抗ヒトＳＭ５−１ヒト化ｍＡｂ、４ｍｇ／ｋｇ用の８匹のマウス。
【０１９６】
４つのｍＡｂは、ＰＢＳで最終濃度０．４ｍｇ／ｍｌまで希釈された。マウスは、尾静脈を通して４ｍｇ／ｋｇ／週で尾静脈注射され、対照は同体積のＰＢＳを注射された。ヌードマウスの体重に従って、注入体積は各ヌードマウスについて約２５０μｌであった。
【０１９７】
６週間後、腫瘍塊のサイズが各マウスにおいて測定され、統計学的に分析された。その結果を図９に示す。図９は、キメラおよびヒト化された抗ヒトＳＭ５−１モノクローナル抗体の双方が、ヒト肝細胞癌細胞系ＱＹＣにより形成された腫瘍塊のサイズの制御において有効であったことを示している。これらの抗体は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを通して機能しうる。
【実施例１０】
【０１９８】
ヌードマウスへの尾静脈注射後の125Ｉ標識された抗ヒトＳＭ５−１キメラ抗体およびヒト化ｍＡｂの組織分布
平均して直径０．７ｃｍの腫瘍をもつ８匹のヌードマウスは、無作為に２群に分けられた。文献および臨床用量によれば、４ｍｇ／ｋｇはヌードマウスにおいて腫瘍の成長を阻害するには充分であった。したがって、インビボの分布を調べるため、単回の用量が用いられた。
【０１９９】
標識効率は、抗ヒトＳＭ５−１キメラ抗体では６８２８２３ｃｐｍ／μｌ（０．５２μｇ／μｌ）であり、抗ヒトＳＭ５−１ヒト化ｍＡｂでは６８１０１２ｃｐｍ／μｌ（０．５２μｇ／μｌ）であった。
【０２００】
ヌードマウスは秤量され、125Ｉ標識されたヒト化およびキメラ抗ヒトＳＭ５−１ｍＡｂが、各マウスにつき約１８０μｌで、尾静脈を通して注射された。文献にしたがって、分布測定は一般に２４〜７２時間以内に行なわれた。この実験では、測定時間として４８時間が採用された。
【０２０１】
まず、血液は眼球から眼科用の鉗子を用いて採取され、次に以下の２１種類の組織（血液、甲状腺、肺、心臓、皮膚、胆嚢、脾臓、脂肪、副腎、腎臓、肝臓、胃、腸、腸管内容物、腸間膜リンパ節、膀胱、精巣、筋肉、骨、脳、および腫瘍）が連続して採取された。腫瘍組織は最後に採取された。プロセスを通して、交差汚染は避けられるべきである。
【０２０２】
各組織は試験管内に置かれ、秤量された。ｃｐｍは、γ−カウンタを用いて読取られた。各組織について、ｍｇ／ｃｐｍが計算された。図１０は、その結果を示している．図１０に示されたように、キメラおよびヒト化双方の抗ヒトＳＭ５−１ｍＡｂは、選択的に腫瘍塊において濃縮された。したがって、キメラおよびヒト化抗ヒトＳＭ５−１ｍＡｂ由来の薬剤は、腫瘍の放射線療法用に適用されてよい。
【実施例１１】
【０２０３】
動物モデルにおける131Ｉ標識された抗ＳＭ５−１抗体の治療効果
ヨードジェン（Iodogen）による抗体の標識化は穏やかであり、行ないやすく、傷害はほとんどなく、標識化の効率が高い。
【０２０４】
１．反応管のコーティング
０．０２％のヨードジェンを含有する５０μｌのジクロロメタンまたはクロロホルムは、反応管の底へ添加された。管は窒素を用いて、または空気の減圧により乾燥され、乾燥状態で低温中に保存された。管は検査に先立ち、少量の０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳで数回洗浄されて、接着できなかった試薬を除去した。
【０２０５】
２．抗体の標識化
以下の物質が反応管へ添加された：ヨードジェン（０．０２％）、５０μｌ；０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳ、５０μｌ；Ｎａ131Ｉ溶液、１１ｍＣｉ／１０μｌ；抗体、５〜１０μｇ／μｌ。溶液は、室温で５〜１５分間、反応を可能にするまで混合された。反応は、２００μｌの０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳを添加することにより停止された。
【０２０６】
３．標識された抗体の精製
反応混合物は、ゲル濾過精製のため、セファデックスＧ−５０ゲルカラム上に負荷され
た。検査の後、標識された抗体の放射能は１２６ＭＢｑ／ｍｇであり、放射免疫療法には充分であった。
【０２０７】
４．放射線標識された抗体による、腫瘍細胞をもつマウスの治療
上記の方法は、５ｍｇの精製されたｃｈＳＭ５−１およびＲｅＳＭ５−１抗体を標識するべく用いられた。３２匹の腫瘍をもつヌードマウス（ＱＹＣ細胞をもつ）は、無作為に、各群あたりマウス８匹の４群に分けられた（腫瘍塊は直径約０．７ｃｍ）。治療群には、標識された抗体が、５ＧＢｑ／ｋｇの用量で尾静脈へ注射された。８週間後、腫瘍体積（もし動物が実験の終わる前に死亡した場合、測定は死亡の時点で行なわれた）、および生存状態が、以下の表６に示されたように記録された。
【０２０８】
【表６】
2007535905.tif 000007
【０２０９】
上記の結果は、131Ｉ標識されたキメラおよびヒト化抗ヒトＳＭ５−１モノクローナル抗体が、腫瘍（肝細胞癌細胞）をもつマウスに有効であったことを示している。これらの131Ｉ標識された抗体は、腫瘍塊を有意に縮小させ、腫瘍をもつマウスの生存率を改善した。
【実施例１２】
【０２１０】
キメラおよびヒト化抗ＳＭ５−１モノクローナル抗体間の親和性の比較
二つの抗体のＫｄ（Ｋオン／Ｋオフ）は、ファルマシア（Pharmacia）からのＢＩＡｃｏｒｅを用いて、カールソンらにより提供されたアプローチ（カールソン（Karlsson, R.）、ミカエルソン（Michaelsson, A.）、およびマットソン（Mattsson, L.）著、「Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system（新規なバイオセンサーに基づく分析システムによる、モノクローナル抗体−抗原相互作用の動態解析）」J. Immunol. Methods、１９９１年、第１４５巻、ｐ．２２９−２４０）に基づき測定された。二つの抗体のＫｄは、ヒト化抗体では９．３１ｘ１０-9Ｍであり、キメラ抗体では３．７８ｘ１０-9Ｍで、非常に類似していた。
【０２１１】
上記の結果は、ヒト化された抗ＳＭ５−１モノクローナル抗体用の調整が、親和性の減少がほとんどなく、かつヒト化抗体の親和性が治療用モノクローナル抗体の親和性要求に合致されており、成功であったことを示した。
【０２１２】
上記の実施例は例示のみを目的として含まれたものであり、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。上述のものに対し、多くの変形が可能である。当業者には、上述の実施例に対する修飾および変形が明白であることから、本発明は添付された特許請求の範囲によってのみ制限されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】発現ベクターｐＭＧ１８−３Ｋを例示している。異なる機能をコードしているベクターの領域が示されている。ＨＣＭＶ  ｐｒｏ、ヒトサイトメガロウイルス主要前初期プロモーター；Ｃκ、ヒトκ鎖定常領域遺伝子；ＣＨ、ヒトγ１鎖定常領域遺伝子；ｐＡ、ポリアデニル化シグナル；ＤＨＦＲ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子；ｐＵＣｏｒｉｇｉｎ、プラスミドの複製起点；Ａｍｐはβ−ラクタマーゼ遺伝子を示す。
【図２】ヒト化抗ＳＭ５−１抗体（ＲｅＳＭ５−１）の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を例示している。ヒト抗体ＫＯＬのＶHは、ヒト化重鎖用の枠組み構造として選ばれ、ヒトベンスジョーンズタンパク質ＲＥＩのＶLは、ヒト化軽鎖用に選ばれた。ダッシュはアミノ酸が、ヒト抗体ＫＯＬまたはＲＥＩ中の対応する残基と同じであることを表す。ＣＤＲは括弧で囲まれている。アミノ酸（一文字表記の）は、カバット（カバット（Kabat）ら著、「Sequence of Proteins of Immunological Interest（免疫学的に関心のあるタンパク質の配列）第５版、１９９１年、米国保健社会福祉省（US Department of Health and Human Services）、国立衛生研究所（National Institute of Health），ベセスダ（Bethesda）」に従って番号づけされている。
【図３】乳癌細胞系およびメラノーマ細胞系へのヒト抗ＳＭ５−１抗体（ｈｕＳＭ５−１）の結合を示すＦＡＣＳグラフを例示している。
【図４】ヒトＳＭ５−１抗原を用いた免疫フットプリンティングを例示している。
【図５】ヒト抗ＳＭ５−１抗体（ｈｕＳＭ５−１）処理されたＱＹＣおよびＸＪＣ細胞におけるカスパーゼ１０活性の変化を例示している。
【図６】ヒト化およびキメラ抗ＳＭ５−１抗体で処理されたＱＹＣ細胞についての、増殖／成長曲線の阻害を例示している。Ａ：ｃｈＳＭ５−１処理細胞についての成長阻害曲線；Ｂ：ＲｅＳＭ５−１処理細胞についての成長阻害曲線。
【図７】ｃｈＳＭ５−１抗体およびヒト化抗ＳＭ５−１抗体（ＲｅＳＭ５−１）による、ＱＹＣ細胞に対する、ＡＤＣＣを通した抗新生物作用を例示している。
【図８】ｃｈＳＭ５−１抗体（Ａ）およびヒト化抗ＳＭ５−１抗体（ＲｅＳＭ５−１）（Ｂ）による、ＱＹＣ細胞に対する、ＣＤＣを通した抗新生物作用を例示している。
【図９】ｃｈＳＭ５−１およびＲｅＳＭ５−１の、ＱＹＣをもつヌードマウスについての治療効果を例示している。
【図１０】125Ｉ標識されたＲｅＳＭ５−１およびｃｈＳＭ５−１の分布を例示している。
【図１】
2007535905.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2007535905.tif 000015
【図９】
2007535905.tif 000016
【図１０】
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【国際調査報告】
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