(57)【要約】  本発明は、サツマイモ由来ＡＤＰ−グルコースリン酸化酵素遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）プロモータに由来した新規の糖誘導性プロモータ配列及び５’非翻訳部位（配列番号１）、前記塩基配列を用いる植物体糖誘導性発現ベクター、並びに前記ベクターを用いる形質転換植物体に関する。本発明に係るプロモータと５’非翻訳部位は、植物体で、特に植物体において澱粉を多量蓄積するために糖を相対的に多量含有する植物体貯蔵根で高効率の糖誘導性発現を誘導することができる。したがって、本発明は、植物体貯蔵根で有用な蛋白質を大量に生産するために形質転換植物体を製造するのに有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の転写開始部位から−１〜−１，９０８部位の塩基配列を含む、分離された植物体糖誘導性プロモータ。
【請求項２】
前記プロモータ配列は、サツマイモＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子ｉｂＡＧＰ１に由来する、請求項１に記載の分離された植物体糖誘導性プロモータ。
【請求項３】
配列番号１の転写開始部位から＋１〜＋６８部位の塩基配列を含む、分離されたサツマイモＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子の５’非翻訳部位。
【請求項４】
請求項１の植物体糖誘導性プロモータ及び請求項３の５’非翻訳部位を含む、植物体糖誘導性形質転換用バイナリベクター。
【請求項５】
請求項１の植物体糖誘導性プロモータ及び請求項３の５’非翻訳部位を含む、植物体糖誘導性一時的発現分析用ベクター。
【請求項６】
請求項４の植物体糖誘導性形質転換用バイナリベクターを含む大腸菌。
【請求項７】
請求項５の植物体糖誘導性一時的発現分析用ベクターを含む大腸菌。
【請求項８】
請求項１の植物体糖誘導性プロモータ及び請求項３の５’非翻訳部位を含む、バイナリベクターによって形質転換された形質転換体植物。
【請求項９】
配列番号１の配列を含むＤＮＡ断片を増幅するための配列番号２及び配列番号３のＰＣＲ用プライマー。
【請求項１０】
配列番号１の配列を含むＤＮＡ断片を増幅するための配列番号４及び配列番号５のＰＣＲ用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、サツマイモに由来する植物体糖誘導性プロモータ塩基配列に関する。さらに詳細には、本発明は、サツマイモに由来するＡＤＰ−グルコースリン酸化酵素遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）プロモータ塩基配列の中でも、植物体で高効率の糖誘導性発現を誘導する塩基配列に関する。また、本発明は、前記プロモータ塩基配列を含む植物体糖誘導性発現ベクター、及び前記プロモータ配列を用いて形質転換体植物を製造する方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
作物分子育種は、全種の遺伝子を材料として使用することができ、既存のゲノム単位のみで可能であった育種技術を遺伝子単位にまで引き下げて無限大の育種効果を微細に調節することができる。したがって、作物分子育種は、次世代農業を先導する核心的な技術の一つであると言える。
【０００３】
このような作物分子育種は、技術の効果を極大化させるためには、１）様々な植物の遺伝子を代表することが可能な多くの遺伝子データの蓄積が先行されるべきであり、２）様々な作物の形質転換システムが構築されるべきであり、３）外部から挿入された遺伝子の発現を調節することができる様々なプロモータの開発が先行されるべきである。
【０００４】
このため、国外では、１９８０年代初めから、植物遺伝子の発現を調節するプロモータに関する研究が行われてきた。カリフラワーモザイクウィルス(Cauliflower mosaic virus)のプロモータが植物の全組織において強い発現を誘導する可能性が提示され(Honh et al., 1982, Curr, Topics Microbiol. Immunol. 96:193-236)、前記プロモータの塩基配列が確認され(Odell et al., 1985, Nature 313:810-812)、植物体内における強い発現が証明された(Sanders et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 1543-58)。その後、ＣａＭＶ ３５Ｓ（特許番号：ＪＰ１９９３１９２１７２−Ａ１）プロモータは、植物で最も広く用いられる普遍的なプロモータになった。
【０００５】
一方、ＣａＭＶ ３５Ｓ以後、植物体内で生理的(biotic)あるいは非生理的な(abiotic)条件の下に活性が増加する誘導性プロモータに関する研究も盛んに行われている。
【０００６】
この中でも、糖処理によってその活性が増加する糖誘導性プロモータに関する研究が盛んに行われているが、このような糖誘導性プロモータは、植物体において糖から合成される澱粉の蓄積量が比較的多い貯蔵器官、特に貯蔵根組織で有用な医療、産業用蛋白質（例えば、インターフェロン、成長ホルモン、ラクトフェリン、フィターゼ等）が大量に生産されることを誘導することができるという利点がある。
【０００７】
このような糖誘導性プロモータに関する研究は、主に、貯蔵器官に蓄積される貯蔵蛋白質遺伝子あるいは澱粉合成に関連する遺伝子を中心として行われてきた。
【０００８】
その例として、ジャガイモ塊茎の貯蔵蛋白質であるパタチンをコードする遺伝子のプロモータの活性が糖によって増大することが確認された(Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J 8, 23-31; Wenzler et al., 1989a, Plant Mol. Biol. 12, 41-50; Wenzler et al., 1989b, Plant Mol. Biol. 13, 347-354)。このプロモータの糖誘導性には−３４４部位の特定の塩基配列（Ｂ配列）が必要であると明らかになっている(Grierson et al., 1994, Plant J, 5, 815-826)。
【０００９】
ところで、２種のジャガイモ糖合成酵素(Sucrose synthase)遺伝子（Ｓｕｓ３とＳｕｓ４）のうちＳｕｓ４が糖によって発現されると確認された(Salanoubat and Belliard, 1989, GENE 84, 181-185)。また、Ｓｕｓ４遺伝子プロモータの−１５００〜−２６７塩基配列、３’非翻訳部位、及び１６１２−ｂｐリーダーイントロン(Leader intron)も糖誘導活性に必須的であると報告された(Fu et al., 1995, Plant Cell 7, 1387-1394)。
【００１０】
澱粉枝付け酵素Ｉ(starch-branching enzymeＩ、ＳＢＥ１)遺伝子のプロモータが糖に反応して活性が増加することが確認された。このような糖誘導性には−３１４〜−１４５部位が必須的であると明らかになった(Kim and Guiltinan, 1999, Plant Physiology 121, 225-236)。
【００１１】
サツマイモβ−アミラーゼ遺伝子のプロモータの活性が糖によって誘導されることが確認された。この糖誘導性の活性には−９０１〜−８２０部位が必須的であり、この中でもＴＧＧＡＣＧＧ塩基配列が調節因子として作用すると明らかになった(Maeo et al., 2001, Plant Mol. Biol. 46, 627-637)。
【００１２】
一方、植物体内の澱粉合成に関連してその含量を調節する決定的酵素であるＡＤＰ−グルコースリン酸化酵素遺伝子プロモータが、トマトとシロイヌナズナにおいて糖誘導性であると報告された(Siedlecka et al., 2003, Planta 217, 184-192; Li et al., 2002, Plant Science 162, 239-244) 。この中でも、シロイヌナズナプロモータは、一般に、蛋白質ホスファターゼＩと２Ａ(phosphatase Ｉ and 2A)の抑制剤(inhibitor)であるオカダ酸(okadaic acid)によってその活性が減少すると報告された。
【００１３】
一方、サツマイモに由来する２種のＡＤＰ−グルコースリン酸化酵素遺伝子（ｉｂＡＧＰ１とｉｂＡＧＰ２）の中でも、ｉｂＡＧＰ１（従前にはｉｂＡＧＰ−ｓＴＬ１と命名される）は糖によってその発現が増加することが確認された(Bae and Liu, 1997, Molecular Genetics and Genomics 154, 179-185) 。また、２種の遺伝子の全長遺伝子塩基配列の比較分析によってそれぞれ遺伝子の転写開始部位が確認されている(Noh et al., in press, GENE)。
【００１４】
ところが、植物体において高効率で糖誘導性を示すプロモータの塩基配列が未だ確認されていない。したがって、より高効率で低廉に植物体内で有用な外来蛋白質を大量に生産することが可能な一つの方法として、糖誘導性発現プロモータに対する要求が続けられてきた。
【００１５】
〔発明の開示〕
〔技術的課題〕
本発明は、かかる問題点及び要求を解決するためのもので、その目的は、サツマイモのＡＤＰ−グルコースリン酸化酵素遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）に由来したターゲット遺伝子を高効率で誘導することが可能な植物体の高効率糖誘導性プロモータ塩基配列を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、糖誘導性プロモータ及び前記ｉｂＡＧＰ１遺伝子の５’非翻訳部位を含む植物体形質転換用高効率糖誘導性発現プラスミドベクターを提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、植物体の貯蔵器官、特に貯蔵根組織で有用な物質を大量に生産することが可能な、前記高効率糖誘導性発現ベクターで形質転換された植物体を提供することにある。
【００１８】
〔技術的解決手段〕
前記目的を達成するために、本発明者らは、サツマイモＡＤＰ−グルコースリン酸化酵素遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の糖誘導性発現プロモータをクローニングし、同一遺伝子の５’非翻訳部位を含ませて植物体形質転換用発現ベクターを製作し、同一ベクターの発現を実験によって確認したところ、糖誘導性に優れることを見い出し、本発明の完成に至った。
【００１９】
したがって、本発明は、配列番号１の塩基配列を含む、分離された糖誘導性プロモータ部位及びサツマイモＡＤＰ−グルコースリン酸化酵素遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の５’非翻訳部位ＤＮＡ塩基配列を提供する。
【００２０】
前記プロモータ塩基配列は、配列番号１のサツマイモＡＤＰ−グルコースリン酸化酵素（ｉｂＡＧＰ１）の転写開始部位からの−１〜−１９０８部位に由来したことを特徴とする（図１参照）。本発明に係る前記プロモータは、植物体内で糖に反応して強い活性が誘導できる。
【００２１】
また、前記非翻訳部位は、配列番号１のサツマイモＡＤＰ−グルコースリン酸化酵素（ｉｂＡＧＰ１）の転写開始部位からの＋１〜＋６８部位に由来したことを特徴とする（図１参照）。本発明に係る非翻訳部位は、別の公知の植物体の５’非翻訳部位のように、植物体内に導入された遺伝子の翻訳効率を高めることにより、目的外来遺伝子の発現を著しく増加させることができる。
【００２２】
前記他の目的を達成するために、本発明は、前記植物体高効率糖誘導性プロモータ及びＡＤＰ−グルコースリン酸化酵素遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の５’非翻訳部位を含む、植物体の形質転換用高効率糖誘導性発現ベクター（ｐＳＰａｇｐ１−１０１）及び一時的発現用ベクター（ｐＳＰａｇｐ１−２２１）を提供する。
【００２３】
前記植物体糖誘導性発現ベクターは、外来遺伝子を導入された植物体内で永久的に発現させることが可能な形質転換用バイナリベクターであり、一時的発現用ベクターは、外来遺伝子を導入された植物体内で一時的に発現させることが可能なベクターである。
【００２４】
前記バイナリベクターは、アグロバクテリウムチュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のＴｉプラスミドの存在の下に植物体を形質転換させることが可能なＴ−ＤＮＡのＲＢ及びＬＢを含むバイナリベクターであり、好ましくはｔｈｅ ｐＢＩ１０１（ｃａｔ＃：６０１８−１、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、ＵＳＡ）、ｐＢＩＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ．Ｕ０９３６５）、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩＮ２０またはＢＩＢＡＣベクターなどの関連分野でよく使用されるバイナリベクターである。
【００２５】
また、前記本発明に係る植物体糖誘導性ベクターおいて、本発明に係るプロモータ及びＡＤＰ−グルコースリン酸化酵素遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の５’非翻訳部位は、ｐＢＩ１０１及びｐＢＩ２２１ベクターに含有された外来遺伝子の前に位置する。本発明では、ＧＵＳレポーター遺伝子が含有されたベクター（ｐＢＩ１０１とｐＢＩ２２１）に本発明に係るプロモータ及び５’非翻訳部位を挿入したｐＳＰａｇｐ１−１０１とｐＳＰａｇｐ１−２２１（図２及び図３参照）を製造したが、前記ＧＵＳレポーター遺伝子は、外来遺伝子の一例であって、他の有用な目的の外来遺伝子で置換することができる。これは、当業者には自明なことである。
【００２６】
本発明は、本発明による植物体糖誘導性高効率バイナリベクターによって形質転換された植物体、及び前記一時的発現用ベクターによって一時的に形質転換された貯蔵根を提供する。
【００２７】
前記植物体糖誘導性バイナリベクターは、アグロバクテリウムを用いる方法(An, G. 1987, Plant Physiology)、あるいは遺伝子銃を用いた方法(Lacorte et al., 1997, Plant Cell Reports)などによって植物体を形質転換させることができる。本発明では、その例としてフローラルディップ(floral dip)方法(Clough and Bent, 1998, Plant J.)を用いてシロイヌナズナに形質転換させた。また、前記植物体糖誘導性一時的発現ベクターは、遺伝子銃を用いて植物体の貯蔵根を一時的に形質転換させることができる。本発明に係る一時的発現ベクターは、貯蔵根作物の種類を問わずに形質転換させることができる。作物の一例としてニンジンなどを挙げることができる。
【００２８】
また、前記外来遺伝子は、植物体内で多量の澱粉を蓄積するために比較的糖含量の高い貯蔵器官で大量発現を希望するいずれの遺伝子であってもよい。本発明の植物体糖誘導性高効率発現ベクターにおいて前記プロモータ及びサツマイモＡＤＰ−グルコースリン酸化酵素遺伝子の５’非翻訳部位の後ろに位置し、必要に応じてレポーター遺伝子と融合して発現されることもある。
【００２９】
ひいては、本発明は、本発明に係る植物体糖誘導性発現プロモータＤＮＡ断片を増幅するための配列番号２〜配列番号５のＰＣＲ用プライマーを提供する。
【００３０】
〔発明の効果〕
本発明は、サツマイモ(Ipomoea batatas)に由来するＡＤＰグルコースリン酸化酵素遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の糖誘導性発現プロモータ部位及びその遺伝子の５’非翻訳部位に関するものである。前記プロモータ部位及び５’非翻訳部位は、植物体内で糖誘導性発現を誘導し、特に多量の澱粉を蓄積するために糖含量が高い貯蔵根では高いレベルの発現を誘導する。
【００３１】
したがって、本発明は、植物の貯蔵根において有用な医療、産業用蛋白質（例えば、インターフェロン(Interferon)、成長ホルモン(growth hormone)、ラクトフェリン(Lactoferrin)、フィターゼ(Phytase) 等）を大量に生産するための形質転換植物体の製造に効果的に利用できる。
【００３２】
〔図面の簡単な説明〕
この発明の前記及び他の目的、特徴及びその他の利点は、添付図面を参照する以降の詳細な説明によってさらに明確に理解されるであろう。
【００３３】
図１は本発明に係る植物体糖誘導性発現プロモータ及びサツマイモ由来ＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の５’非翻訳部位の塩基配列を示す図である。
【００３４】
図２は本発明に係る植物体糖誘導性発現プロモータ及びサツマイモ由来ＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の５’非翻訳部位を含む形質転換用バイナリベクター（以下、「ｐＳＰａｇｐ１−１０１」という）を示す模式図である。
【００３５】
図３は本発明に係る植物体糖誘導性発現プロモータ及びサツマイモ由来ＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子の５’非翻訳部位を含む一時的発現分析用ベクター（以下、「ｐＳＰａｇｐ１−２２１」という）を示す模式図である。
【００３６】
図４は本発明に係るｐＳＰａｇｐ１−１０１ベクターを用いて形質転換させたシロイヌナズナ植物体を組織化学的に染色して観察した各組織のＧＵＳ発現様相を示す図である。
【００３７】
図５は本発明に係るｐＳＰａｇｐ１−１０１ベクターを用いて形質転換させたシロイヌナズナ植物体に糖処理を施した後、ＧＵＳを定量的な方法によって分析して本発明に係るプロモータの糖誘導性を確認した図である。
【００３８】
図６は本発明に係るｐＳＰａｇｐ１−２２１ベクターを用いてニンジン(carrot)の根(taproots)からの一時的発現を分析した結果を示す図である。
【００３９】
〔発明を実施するための最良の形態〕
以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。ところが、これらの実施例は本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の権利範囲が下記実施例に限定されるものではない。
【００４０】
〔実施例１：サツマイモＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の糖誘導性発現プロモータのクローニング〕
サツマイモＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）のプロモータは、サツマイモ(Ipomoea batatas cv Yulmi)ＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）(Noh et al., GENE, 2004, 339, 173-180)の５’領域塩基配列を決定して確認した。
【００４１】
このように確認された１，９０８ｂｐプロモータ塩基配列をＧｅｎb
ａｎｋに登録した（Ａｃｃｅｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＹ６９４１８５）（図１参照）。図１は本発明に係る植物体糖誘導性発現プロモータ及びサツマイモ由来ＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子の５’非翻訳部位の塩基配列を示す図である。図１において、蛋白質合成開始コドン「ＡＴＧ」は、下線の太字であって、転写開始部位である塩基「Ａ」は「＋１」で表示した。
【００４２】
〔実施例２：植物体糖誘導性ベクター及び一時的発現ベクターの製作〕
実施例１でクローニングされたサツマイモＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の糖誘導性発現プロモータと６８ｂｐ５’非翻訳部位（塩基配列１、図１参照）をｐＢＩ１０１とｐＢＩ２２１ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に挿入して植物体糖誘導性ベクター及び一時的発現ベクターをそれぞれ製作した。
【００４３】
まず、植物体糖誘導性ベクターの製作について具体的に考察すると、実施例１でクローニングされたサツマイモＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の糖誘導性プロモータと６８ｂｐ５’非翻訳部位（配列番号１、図１参照）を、表１に示されているプライマーを用いてＰＣＲによって増幅させ、Ｓａ１ＩとＢａｍＨＩで切断した後、ｐＢＩ１０１のＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ位置に挿入してｐＳＰａｇｐ１−１０１と命名した（図２参照）。この際、ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間処理した後、９４℃−１分、５５℃−１分、７２℃−１分３０秒を３０回行った後、７２℃で１０分間処理した。
【００４４】
【表１】
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図２において、ＧＵＳは、ベータ−グルクロニダーゼ(β-glucuronidase)をコードし、カナマイシン(kanamycin)を選択的マーカーとするレポーター遺伝子であり、Ｎｏｓ−ｐｒｏとＮｏｓ−ｔｅｒは、ＮＰＴＩＩのプロモータとターミネータである。そして、ＧＵＳレポーター遺伝子は、挿入されたプロモータとＮｏｓ(Nopalin synthase)ターミネータ（Ｎｏｓ−ｔｅｒ）によって植物体で発現される。
【００４５】
一方、植物体糖誘導性一時的発現ベクターの製作は、実施例１でクローニングされたサツマイモＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の糖誘導性発現プロモータと６８ｂｐ５’非翻訳部位（配列番号１、図１参照）を、表２に示されているプライマーを用いてＰＣＲによって増幅させ、ＳｐｈＩとＢａｍＨＩで切断した後、ｐＢＩ２２１のＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩ位置に挿入してｐＳＰａｇｐ１−２２１と命名した（図３参照）。この際、ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間処理した後、９４℃−１分、５８℃−１分、７２℃−２分を３０回行った後、７２℃で５分間処理した。
【００４６】
【表２】
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〔実施例３：実施例２で製作されたｐＳＰａｇｐ１−１０１ベクターを用いたシロイヌナズナの形質転換〕
実施例２で製作されたｐＳＰａｇｐ１−１０１ベクターをアクロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens C58C1)に冷−解凍(Freeze-thaw)方法(An, G. 1987, Methods in Enzymology)によって導入した。
【００４７】
形質転換されたアグロバクテリア(Agrobacteria)は、２日間２８℃で振とう培養した後、フローラルディップ(floral dip)方法(Clough and Bent, 1998, The Plant Journal)に基づいてシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana cv. Columbia)の開花直前の柱頭に接種してシロイヌナズナ植物体を形質転換させた。
〔実施例４：形質転換されたシロイヌナズナの組織化学的染色及び酵素学的分析〕
実施例３で製造されたシロイヌナズナ形質転換体から種子を収穫した後、カナマイシン（kanamycin, ３０ｍｇ／Ｌ）を含有するＭＳ培地に塗抹して、抵抗能を有する形質転換植物体を選別した。
【００４８】
選別されたシロイヌナズナ形質転換植物体の各組織のＧＵＳ活性を組織化学的染色方法及び酵素学的方法を用いて定量的に調査した。各形質転換植物体の全ての組織を染色するために、植物体の各組織は、１ｍＭ Ｇ−ｇｌｕ(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide)、１００ｍＭ リン酸ナトリウム（sodium phosphate, ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ フェリシアン化カリウム(potassium ferricyanide)、０．５ｍＭ フェロシアン化カリウム(potassium ferrocyanide)及び０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する溶液に浸漬して３７℃で１２時間反応させた後、溶液を除去し、その後１００％エタノールを加えることにより、組織に存在するクロロフィルを除去した。
【００４９】
その結果、図４に示すように、ｐＳＰａｇｐ１−１０１で形質転換されたシロイヌナズナの葉、篩管組織、花茎、根の頂端分裂組織で強いＧＵＳ活性を確認し、花粉では弱いＧＵＳ活性を確認した。
【００５０】
〔実施例５：本発明に係る糖誘導性プロモータ（ｉｂＡＧＰ１プロモータ）の糖誘導性の確認〕
ｉｂＡＧＰ１プロモータの糖誘導性活性を確認するために、糖処理をした形質転換シロイヌナズナを用いてＧＵＳの活性を定量的に調査した。この際、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ等(EMBO J. 6: 3901-3907, 1987)の方法を使用した。
【００５１】
具体的には、形質転換シロイヌナズナの種子を０．５％、３％、６％糖含有のＭＳ培地に播種し、１４日間培養した後、幼い植物体を収去して、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（sodium phosphate,ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ラウロイルサルコシンナトリウム(sodium lauroylsarcosine)、及び１０ｍＭ β−メルカプトエタノール(β−mercaptoethanol)を含有する溶液で摩砕した後、１２，０００×ｇで遠心分離して上澄み液を取った。
【００５２】
得られた上澄み液は、１ｍＭ ＭＵＧ(4-methylumbelliferyl glucuronide)と混ぜて３７℃で反応させた後、０．２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３を入れて反応を終了させた。反応済みの反応液は、蛍光光度計(fluorometer)を用いて３６５ｎｍと４５５ｎｍの波長で値を測定した。その後、測定された値は、ＭＵＧ標準溶液を用いて作った標準曲線と比較することにより、ＧＵＳ活性を計算して図５に示した。
【００５３】
図５に示されているＧＵＳ活性度は、各糖濃度処理別に得られた１２個の形質転換体（Ｔ２ライン植物体）を分析して得られた値である。比較のために、ｐＢＩ１０１ベクターはプロモータのないベクターであり、ＣａＭＶ３５ＳプロモータはｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、ＵＳＡ）ベクターを用いて実験した。その結果、サツマイモｉｂＡＧＰ１遺伝子プロモータは、ＧＵＳ活性が３％糖によって８倍、６％糖によって１１倍程度増加することを確認することができた。しかも、サツマイモｉｂＡＧＰ１遺伝子プロモータのＧＵＳ活性は、普遍的に使われるＣａＭＶ３５Ｓプロモータと比較して１２〜１５倍増加した活性を示した。
【００５４】
〔実施例６：ニンジンの根(taproots)組織における糖誘導性発現プロモータ（ｉｂＡＧＰ１プロモータ）の活性の確認〕
糖誘導性プロモータ（ｉｂＡＧＰ１プロモータ）の活性を植物の貯蔵根組織で確認するために、実施例２で製作されたｐＳＰａｇｐ１−２２１ベクターによってニンジンの根(taproot)における一時的発現分析を行った。
【００５５】
このため、肥大成長中の直径２ｃｍ以下のニンジンの根を採取して洗浄した後、根を横方向に約５ｍｍの厚みに切断し、ペトリ皿内の湿度が十分保たれる状態の３ＭＭ紙上に置き、４℃で４〜５時間放置した。
【００５６】
Ｓａｎｆｏｒｄ等(1993, Meth Enzymol 217:485-509)の方法によって直径１．０μｍの金粒子にＤＮＡを混ぜてコートし、ＤＮＡ濃度を１．０μｇ、ヘリウムガス圧力を１，３５０ＰＳｉ、ニンジンとの距離を６ｃｍにそれぞれ調節してボンバード(bombarding)した。
【００５７】
ボンバードの後、２５℃、癌状態で２４時間放置した後、ＧＵＳ活性を組織化学的染色方法で確認した。ニンジンの切断根組織を染色するために、ＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)に溶解させた１ｍＭ Ｘ−ｇｌｕ(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide)、１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ フェリシアン化カリウム、０．５ｍＭ フェロシアン化カリウム及び０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する溶液に浸漬して３７℃で２４時間反応させた。その次、溶液を除去した後、７０％エタノールに２４時間リンス(rinse)し、１００％エタノールを毎日取り替えながら数日間放置することにより、組織に存在する色素(anthocyanin pigments)を除去した。
【００５８】
その結果、図６に示すように、ｐＳＰａｇｐ１−２２１は、ニンジン根の全組織で強い活性を、特に根の直径が大きくなるほど（植物体内糖含量が高くなるほど）強い活性を確認することができた。
【００５９】
以上の結果をまとめたところ、本発明に係るプロモータは、糖含量の高い植物体内の貯蔵器官組織で非常に強い活性を示すことが分かる。
【００６０】
〔産業上の利用可能性〕
以上説明したように、本発明では、サツマイモＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の糖誘導性プロモータと同一遺伝子の５’非翻訳部位を提供する。
【００６１】
本発明は、前記プロモータと５’非翻訳部位をｐＢＩ１０１とｐＢＩ２２１にそれぞれ挿入させ、バイナリ植物体ベクターと一時的発現による分析用ベクターを提供する。
【００６２】
前記バイナリベクターと一時的発現ベクターを用いて、本発明に係るサツマイモＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の糖誘導性プロモータと同一遺伝子の５’非翻訳部位が糖誘導性発現を誘導することができ、特に植物体で澱粉を多量蓄積するために糖を相対的に多量含有する植物体貯蔵根で高効率発現を誘導することができることが確認された。したがって、本発明は、植物体貯蔵根で有用な蛋白質を多量生産するために形質転換植物体を製造するのに有用である。また、本発明は、形質転換体を用いた貯蔵根組織の代謝調節及び機能性物質生産などの研究に効果的に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は本発明に係る植物体糖誘導性発現プロモータ及びサツマイモ由来ＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の５’非翻訳部位の塩基配列を示す図である。
【図２】図２は本発明に係る植物体糖誘導性発現プロモータ及びサツマイモ由来ＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子（ｉｂＡＧＰ１）の５’非翻訳部位を含む形質転換用バイナリベクター（以下、「ｐＳＰａｇｐ１−１０１」という）を示す模式図である。
【図３】図３は本発明に係る植物体糖誘導性発現プロモータ及びサツマイモ由来ＡＤＰ−グルコースリン酸化遺伝子の５’非翻訳部位を含む一時的発現分析用ベクター（以下、「ｐＳＰａｇｐ１−２２１」という）を示す模式図である。
【図４】図４は本発明に係るｐＳＰａｇｐ１−１０１ベクターを用いて形質転換させたシロイヌナズナ植物体を組織化学的に染色して観察した各組織のＧＵＳ発現様相を示す図である。
【図５】図５は本発明に係るｐＳＰａｇｐ１−１０１ベクターを用いて形質転換させたシロイヌナズナ植物体に糖処理を施した後、ＧＵＳを定量的な方法によって分析して本発明に係るプロモータの糖誘導性を確認した図である。
【図６】図５は本発明に係るｐＳＰａｇｐ１−１０１ベクターを用いて形質転換させたシロイヌズナ植物体に糖処理を施した後、ＧＵＳを定量的な方法によって分析して本発明に係るプロモータの糖誘導性を確認した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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