(57)【要約】  遅延タンパク質へのカップリングにより遅延される、新規なGLP-1アゴニスト【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式(Ｉ)の化合物：
GLP-1アゴニスト-L-RR-遅延タンパク質   (I)
式中、
GLP-1アゴニストは、ヒトGLP-1受容体のアゴニストであるポリペプチドであり、
Lは、上記GLP-1アゴニストのアミノ酸側鎖、または上記GLP-1アゴニストのC末端アミノ酸残基とRRを結合しているリンカーであり、
RRは、遅延タンパク質のアミノ酸残基と共有結合を形成している反応性残基の残部であり、
遅延タンパク質は、ヒト血漿中において少なくとも24時間の半減期を有する少なくとも5kDの分子量をもつタンパクであり、また該遅延タンパク質は哺乳類生物によって、または合成的に合成されたものである。
【請求項２】
前記遅延タンパク質が組み換えヒト血清アルブミン(配列番号1)である、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
前記遅延タンパク質がヒト血清アルブミン変異体である、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
前記ヒト血清アルブミン変異体の銅およびニッケルに対する結合性が、対応するヒト血清アルブミンの銅およびニッケルに対する結合性に比べて低下している、請求項3に記載の化合物。
【請求項５】
前記遅延タンパク質が、ヒト血清アルブミンのN末端断片、またはその類似物である請求項3，4に記載の化合物。
【請求項６】
前記遅延タンパク質が、Asp-Ala-His-Lys N末端配列の修飾を含んだヒト血清アルブミンの変異体である、請求項3〜5に記載の化合物。
【請求項７】
前記遅延タンパク質が、Asp-Ala-Hisの3つのN末端アミノ酸のうち少なくとも1つの欠損部位を含んでいる、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
前記遅延タンパク質が、Glu-3、Ala-2Glu-1、Phe0-HSA(1-585)またはそのN末端断片のようなN末端伸長部位を含む、請求項6に記載の化合物。
【請求項９】
前記ヒト血清アルブミン（HSA）が、HSA(2-585)、HSA(3-585)、HSA(4-585)、Asp-Ala-HSA(4-585)、Xaa3-HSA(1-585)、およびそれらのN末端断片からなる群より選択され、ここでのXaa3はもともとのHSAの3位にあるヒスチジン残基を置換しているアミノ酸残基である、請求項6〜7のうち何れか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記遅延タンパクが、60〜200アミノ酸残基、例えば100〜150アミノ酸残基の配列を含み、前記アミノ酸配列は配列番号１の断片、または1もしくは2のアミノ酸の置換および／または欠失を伴った配列番号１の断片と同一である、請求項1〜9の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記遅延タンパクが、免疫グロブリン、その類似物または断片のFc部分である、請求項1に記載の化合物。
【請求項１２】
前記GLPアゴニストが、GLP-1(7-37)(配列番号2）またはエキセンディン-4(1-39)(配列番号3)と少なくとも50％のアミノ酸相同性をもつ、前記請求項の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記GLP-アゴニストが、GLP-1(7-37)(配列番号2）またはエキセンディン-4(1-39)(配列番号3)と少なくとも80％のアミノ酸相同性をもつ、請求項12に記載の化合物。
【請求項１４】
前記GLP-1アゴニストが、式(II)のアミノ酸配列を含んでなる、請求項1〜13のの何れか１項に記載の化合物：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46
式(II) (配列番号4)
式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり；
Xaa8は、Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、1-アミノシクロプロピルカルボン酸、1-アミノシクロブチルカルボン酸、1-アミノシクロペンチルカルボン酸、1-アミノシクロヘキシルカルボン酸、1-アミノシクロヘプチルカルボン酸、または1-アミノシクロオクチルカルボン酸であり；
Xaa16 は、Val または Leuであり；
Xaa18 は、Ser、Lys、または Argであり；
Xaa19 は、Tyr または Glnであり；
Xaa20 は、Leu または Metであり；
Xaa22 は、Gly、Glu 、またはAib
Xaa23 は、Gln、Glu、Lys、またはArgであり；
Xaa25 は、Ala または Valであり；
Xaa26 は、Lys、Glu、またはArgであり；
Xaa27 は、Glu または Leuであり；
Xaa30 は、Ala、Glu、またはArgであり；
Xaa33 は、Val または Lysであり；
Xaa34 は、Lys、Glu、Asn、またはArgであり；
Xaa35 は、Gly または Aibであり；
Xaa36 は、Arg、Gly、またはLysであり；
Xaa37 は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、アミドであるか、または存在せず；
Xaa38 は、Lys、Ser、アミドであるか、または存在せず；
Xaa39 は、Ser、Lys、アミドであるか、または存在せず；
Xaa40 は、Gly、アミドであるか、または存在せず；
Xaa41 は、Ala、アミドであるか、または存在せず；
Xaa42 は、Pro、アミドであるか、または存在せず；
Xaa43 は、Pro、アミドであるか、または存在せず；
Xaa44 は、Pro、アミドであるか、または存在せず；
Xaa45 は、Ser、アミドであるか、または存在せず；
Xaa46 は、アミドであるか、または存在しない：
但し、もし Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45、またはXaa46 が存在しなければ、その下流のアミノ酸も存在しない。
【請求項１５】
前記GLP-1アゴニストが、式(III)のアミノ酸配列を含んでなる、請求項14に記載の化合物：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38
式 (III) (配列番号5)
式中、
Xaa7はL-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり；
Xaa8は、Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または1-アミノシクロオクチルカルボン酸であり；
Xaa18 は、Ser、Lys 、またはArgであり；
Xaa22 は、Gly、Glu 、またはAibであり；
Xaa23 は、Gln、Glu、Lys、またはArgであり；
Xaa26 は、Lys、Glu、またはArgであり；
Xaa30 は、Ala、Glu、またはArgであり；
Xaa34 は、Lys、Glu、またはArgであり；
Xaa35 は、Gly または Aibであり；
Xaa36 は、Argまたは Lysであり；
Xaa37 は、Gly、Ala、Glu、またはLysであり；
Xaa38 は、Lys、アミドであるか、または存在しない。
【請求項１６】
前記GLP-1アゴニストが、ジペプチジルアミノペプチダーゼIV保護されている、請求項1から15の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記GLP-1アゴニストが、8位の類似物、即ち、GLP-1(7-37)配列（配列番号2）の8位に対応するアラニン残基が他のアミノ酸残基に置換されたものである、請求項16に記載の化合物。
【請求項１８】
前記GLP-1アゴニストが、GLP-1(7-37)配列(配列番号2)の8位にα-アミノイソ酪酸残基を含む、請求項17に記載の化合物。
【請求項１９】
前記GLP-1ペプチド（N末端）の7位にあるアミノ酸残基が、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、および4-ピリジルアラニンからなる群より選択される、請求項1〜18の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
前記GLP-1アゴニストが、GLP-1(7-37)（配列番号2）またはエキセンディン-4(1-39)(配列番号3)と比較して、置換、付加、または欠失された12以下のアミノ酸残基を含む、請求項1〜19の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２１】
前記GLP-1アゴニストが、GLP-1(7-37)（配列番号2）またはエキセンディン-4(1-39)(配列番号3)と比較して、置換、付加、または欠失された6以下のアミノ酸残基を含む、請求項1〜20の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
前記GLP-1アゴニストが、GLP-1(7-37)（配列番号2）またはエキセンディン-4(1-39)(配列番号3)と比較して、置換、付加、または欠失された4以下のアミノ酸残基を含む、請求項1〜21の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２３】
前記GLP-1アゴニストが、遺伝暗号でコード化されない4以下のアミノ酸残基を含む、請求項1〜22の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２４】
前記GLP-1アゴニストが、GLP-1(7-37)（配列番号2）またはエキセンディン-4(1-39)(配列番号3)と比較すると、置換、付加、または欠失された2以下のアミノ酸残基を含む、請求項1〜22の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２５】
前記GLP-1アゴニストが、[Arg34]GLP-1(7-37)、[Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys、[Lys36Arg26,34]GLP-1(7-36)、[Aib8,22,35]GLP-1(7-37)、[Aib8,35]GLP-1(7-37)、[Aib8,22]GLP-1(7-37)、[Aib8,22,35 Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,35 Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22 Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22,35 Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,35 Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22,35 Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,35 Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22 Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22,35 Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,35 Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22 Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22,35 Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,35 Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22 Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22,35 Lys37]GLP-1(7-37)、
[Aib8,35Lys37]GLP-1(7-37)、[Aib8,22Lys37]GLP-1(7-37)
からなる群から選択される、請求項1〜24の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２６】
前記GLP-1アゴニストが、エキセンディン-4(1-39)（配列番号３）である、請求項1〜13の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２７】
前記GLP-1アゴニストが、ZP-2、即ち、[Ser38Lys39]エキセンディン-4(1-39)LysLysLysLysLys-アミド (配列番号4)である、請求項1〜13の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２８】
前記GLP-1アゴニストが、配列番号2（GLP-1(7−37)）のアミノ酸配列の23,26,34,36,38位におけるアミノ酸残基（配列番号3（エクセンディン-4(1-39)）のアミノ酸配列の17,20,28,30,32位に対応する）の側鎖を介して、-L-RR-遅延タンパク質部分に結合する、請求項1〜27の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２９】
前記GLP-1アゴニストが、C末端アミノ酸残基の側鎖を介して、-L-RR-遅延タンパク質部分に結合する、請求項1〜28の何れか１項に記載の化合物。
【請求項３０】
前記GLP-1アゴニストが、アルギニン、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、セリン、スレオニン、およびチロシンから選択されるアミノ酸残基の側鎖を介して、-L-RR-遅延タンパク質に結合する、請求項1〜29の何れか１項に記載の化合物。
【請求項３１】
前記GLP-1アゴニストが、システイン残基の側鎖を介して、-L-RR-遅延タンパク質部分に結合する、請求項1〜30の何れか１項に記載の化合物。
【請求項３２】
前記リンカーＬが、
アミド類： -C(O)-NR-、ここでのRは水素原子またはC1-6-アルキルである；
アミン： -NR-、ここでのRは水素原子または C1-6-アルキルである；
チオエーテル類：-S-、-S-(CH2)2-SO2- または、
【化１】
2007537142.tif 000014
；
エーテル類： -O-、
ウレタン類： -N(R1)-CO-N(R2)-、ここでのR1およびR2 は水素原子または C1-6-アルキルである；
カルバメート類： -O-CO-N(R)-、ここでのR は水素原子またはC1-6-アルキルである；
ヒドラジン類： 
【化２】
2007537142.tif 000015
ここで、R は水素原子または C1-6-アルキルである；
オキシム類： -O-N=C(-R)-、ここでのR は水素原子または C1-6-アルキルである；
オキサゾリジン類またはチアゾリジン類：
【化３】
2007537142.tif 000016
および
【化４】
2007537142.tif 000017
の二価の連結化学基からなる群より選択される、請求項1〜32の何れか１項に記載の化合物。
【請求項３３】
下記からなる群より選択される、請求項1〜32の何れか１項に記載の化合物：
GLP-1アゴニスト-C(=O)CH2O(CH2)2O(CH2)2-RR-遅延タンパク質、
GLP-1アゴニスト-C(=O)(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-遅延タンパク質、
GLP-1アゴニスト-S(=O)2(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-遅延タンパク質、
GLP-1アゴニスト-CH2(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-遅延タンパク質、
GLP-1アゴニスト-C(=O)O(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-遅延タンパク質
但し、ｎは0〜10の整数であり、ｍは0〜100の整数である。
【請求項３４】
下記からなる群より選択される、請求項1〜33の何れか１項に記載の化合物：
GLP-1アゴニスト-L-NC(=O)CH2 -遅延タンパク質のシステイン残基中の硫黄原子、
GLP-1 アゴニスト-L-S(=O)2(CH2)2 -遅延タンパク質のシステイン残基中の硫黄原子、
GLP-1 アゴニスト-L-NC(=O)CH2 -遅延タンパク質のシステイン残基中の硫黄原子、
【化５】
2007537142.tif 000018
【請求項３５】
下記からなる群より選択される、請求項1〜34の何れか１項に記載の化合物：
S-ガンマ34-(1-{2-[2-(2-([D-Ala8,Lys37]-GLP-1-(7-37)アミド-Nε37-イル)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル)アルバゲン
【化６】
2007537142.tif 000019
S-ガンマ34-(1-{2-[2-(2-([Aib8,22,25,Lys37]-GLP-1-(7-37)アミド-Nε37-イル)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル)アルバゲン
【化７】
2007537142.tif 000020
S-ガンマ34-((1-{2-[2-(2-([Aib8,Arg26,34,Glu22,23,30]-GLP-1-(7-37))Lys アミド-Nε-イル)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル)アルバゲン
【化８】
2007537142.tif 000021
【請求項３６】
下記からなる群より選択される、請求項1〜34の何れか１項に記載の化合物：
S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Lys32]-エキセンディン-(1-39)アミド-N-ε32-yl)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-yl)アルブミン［ここでアルブミンは、ニューセンチュリーファルマ（New Century Pharma）社の組み換えアルバゲン（Albagen）、即ち組み換えHSA(2-585)である］、
S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Lys20]-エキセンディン-(1-39)アミド-N-ε20-yl)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-yl)アルブミン［ここでのアルブミンはニューセンチュリーファルマ社の組み換えアルバゲン、即ち組み換えHSA(2-585)である］、
S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Arg12,Lys27]-エキセンゼィン-(1-39)アミド-N-ε27-yl)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-yl)アルブミン［ここでアルブミンはニューセンチュリーファルマ社の組み換えアルバゲン、即ち組み換えHSA(2-585)である］、
S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Arg12、27,Lys32]-エキセンディン-(1-39)アミド-N-ε32-yl)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-yl)アルブミン［ここでアルブミンはニューセンチュリーファルマ社の組み換えアルバゲン、即ち組み換えHSA(2-585)である］。
【請求項３７】
請求項1〜36の何れか１項に記載の化合物と、薬学的に容認可能な保存剤とを含有してなる医薬組成物。
【請求項３８】
請求項1〜36の何れか１項に記載の化合物と、薬学的に容認される安定化剤とを含有してなる医薬組成物。
【請求項３９】
非経口的投与に適した、請求項37〜38の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
医薬の調製のための、請求項1〜36の何れか１項に記載の化合物の使用。
【請求項４１】
高血糖症、2型糖尿病、グルコース耐性障害、1型糖尿病、肥満症、高血圧、シンドロームX、異脂肪血症、認識障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈性心疾患および他の心臓血管系障害、脳卒中、炎症性腸症候群、機能性消化不良、および胃潰瘍の治療または予防のための医薬の調製のための、請求項1〜36の何れか１項に記載の化合物の使用。
【請求項４２】
2型糖尿病の進行を遅延または予防するための医薬の調製のための、請求項1〜36の何れか１項に記載の化合物の使用。
【請求項４３】
食物摂取量を減らし、β細胞の壊死を減らし、β細胞の機能および量を増大させ、および／またはβ細胞のグルコース感受性を回復させるための医薬の調製のための、請求項1〜36の何れか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規のGLP-1化合物、これらの化合物からなる医薬組成物、糖尿病に関連した疾患の治療のためのこの化合物の利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病はグルコースを代謝する能力が一部、または完全に欠如している代謝疾患である。約5％の人が糖尿病や代謝異常であり、流行の域に近づいている。1920年代のインスリンの導入以来、糖尿病治療を改善する努力が続けられてきた。
【０００３】
糖尿病治療において非常に重要であると考えられるペプチドは、グルカゴン様ペプチド-1（glucagon-like peptide-1(GLP-1)）である。人間のGLP-1は、プログルカゴン前駆物質から生じる37のアミノ酸残基からなるペプチドであり、特に回腸末端部のL細胞、膵臓、脳で合成される。GLP-1はグルコース代謝、また胃腸管系の分泌、代謝において調節機能を有する重要な消化管ホルモンである。GLP-1はグルコースに依存してインスリン分泌を促進し、インスリン合成を促進し、β細胞の働きを助け、グルカゴン分泌、胃内容排出、食物摂取を抑制する。人間のGLP-1は、GLP-1(7−37)およびGLP-1(7−36)-アミドに加水分解されるが、これらはともにインスリン分泌性のペプチドである。それゆえ、例えば[Gly8]GLP-1(7-37)は、形式的には、自然に生成したアミノ酸残基の8位のアラニンをグリシンで置換することによってGLP-1(7-37)から誘導された、GLP-1(7-37)の類似物を意味する。同様に、（Nε34-テトラデカノイル）[Lys34]GLP-1(7-37)は、リジン残基の34位にあるεアミノ基をテトラデカノイル化したGLP-1(7-37)を意味する。PCT公報WO98／08871およびWO99／43706は、親油性の置換基をもつGLP-1類似物質の安定化された誘導体を開示している。これらのGLP-1類似物質の安定な誘導体は、対応するGLP-1類似物質と比較して延長された作用プロファイルを有する。
【０００４】
ここ10年間でアメリカドクトカゲ（Heloderma suspectum と Heloderma horridum）から多数のペプチドが単離された。エキセンディン-4は、Heloderma suspectumの毒から単離された39のアミノ酸残基のペプチドであり、このペプチドは重複領域においてGLP-1(7-37)との52％の相同性を持つ。エキセンディン-4は強力なGLP-1受容体アゴニストであり、犬に注射することでインスリンの遊離を促進し、血液中のグルコースを減少させることが示されている。エキセンディン-4(1-39)、その一定の断片、その類似物、およびその誘導体の一群は、強力なインスリン分泌性物質である。最も重要なのは、エキセンディン-4(1-39)、そのインスリン分泌性断片、インスリン分泌性類似物、インスリン分泌性誘導体である。
【０００５】
エキセンディン化合物を含むある範囲のGLP-1化合物が合成され、また特に血漿半減期と関連付けて研究されてきた。血漿半減期が短いということは、ペプチダーゼ（主にジペプチジルアミノペプチダーゼIV）に対する化学的安定性および腎クリアランスが原因である。しかしながら、これらのインスリン分泌性ペプチドの変異体は、これまで、1日に一度の患者への投与で充分な程度を越えるほどの延長効果は示さなかった。週に一度かそれ未満の頻度で患者に投与できる第二世代のGLP-1化合物が求められている。
【０００６】
US6,329,336は、反応性の高いGLP-1ペプチドの血漿中への注入を開示しており、この場合には血清アルブミンのような血液中の成分との化学反応が生じるであろう。
【０００７】
WO02／46227は、GLP-1ペプチドとヒト血清アルブミンとの融合タンパク質について開示している。
【０００８】
WO2003／103572は、GLP-1類似体と血液成分との抱合体について開示している。
【０００９】
本発明の目的は、ヒト血漿中での半減期が長いタンパク質に結合させたエキセンディンペプチドを含み、それによって週に一度の治療を可能にするGLP-1類似物を提供することである。また、凝集の傾向が少ないGLP-1ペプチドを提供することも本発明の目的である。この凝集は、グルカゴン様ペプチドに付随して起こるよく知られた問題である。より凝集傾向が低いことで製造過程が経済的になることはもちろん、その化合物を医療用の注入ポンプで投与することが可能になる。
【定義】
【００１０】
この明細書において以下の用語は指示された意味を有する。
【００１１】
ここで用いる「ポリペプチド」および「ペプチド」は、少なくとも5つの構成アミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物を意味する。構成アミノ酸は、遺伝暗号によりコード化されたアミノ酸群に由来するものでもよく、コード化されない天然のアミノ酸、並びに合成アミノ酸であってもよい。遺伝暗号によってコード化されていない天然のアミノ酸とは、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン、オルニチン、ホスホセリン、D-アラニン、D-グルタミンである。合成アミノ酸には、化学合成によって製造されたアミノ酸、即ち、D-アラニン、D-ロイシンのような遺伝暗号によってコード化されたアミノ酸のD-異性体、Aib（α-アミノイソ酪酸）、Abu（α-アミノ酪酸）、Tle（tert-ブチルグリシン）、β-アラニン、3-アミノメチル安息香酸、アントラニル酸が含まれる。
【００１２】
ポリペプチドを言うためにここで用いる「類似物」の用語は、ペプチド中の1つまたは複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換され、および／または、1つまたは複数のアミノ酸残基がペプチドから欠失され、および／または、1つまたは複数のアミノ酸残基がペプチドに付加される反応により修飾されたペプチドを意味する。このようなアミノ酸残基の付加または欠失は、ペプチドのN末端および／またはペプチドのC末端で起こりうる。類似物を記述するために、しばしば簡単なシステムが用いられる。例えば[Arg34]GLP-1(7-37)Lysは、本来存在する34位のリジンがアルギニンによって置換され、リジンがアミノ酸残基の末端、即ち37位のグリシンに付加したGLP-1(7-37)類似物を意味する。光学異性体について述べられていない全てのアミノ酸は、L-異性体を意味すると理解すべきである。
【００１３】
ここでペプチドに関して用いられる「誘導体」の用語は、修飾されていないペプチドまたはその誘導体中に少なくとも１つの置換基が存在しない、化学的に修飾されたペプチドまたはその類似物、即ち、共有結合的に修飾されたペプチドを意味する。典型的な修飾はアミド類、糖類、アルキル基、アシル基、エステル類等である。GLP-1(7-37)の誘導体の例は、Nε26-((4s)-4-(ヘキサデカノイルアミノ)-ブタノイル)[Arg34,Lys26]GLP-1(7-37)である。
【００１４】
ここで用いられる「GLP-1アゴニスト」の用語は、ヒトのGLP-1受容体を含む適切な媒質中においてcAMPの生成を刺激するような化合物を意味する。GLP-1アゴニストの能力は、後で述べる用量-反応曲線からEC50の値を計算することによって決定される。
【００１５】
クローン化されたヒGLP-1受容体（BHK-467-12A）を発現させたハムスター幼児腎臓（BHK）細胞を、100IU／mLのペニシリン、100μg／mLのストレプトマイシン、5％のウシ胎児血清および0.5mg／mLのジェネテシンG418（Life Technologies）を加えたDMEM培地中で増殖させた。細胞をリン酸緩衝食塩水で2回洗浄し、バーゼン(Versene)で回収した。原形質膜は、緩衝液１（20mM HEPES-Na、10mM EDTA、pH 7.4）中において、ウルトラターラックス（Ultraturrax）でホモジナイズすることによって細胞から調製された。そのホモジネートを、48,000×g、４℃で15分間遠心分離した。その試料を緩衝液2（20mM HEPES-Na、0.1mM EDTA、pH7.4）中でホモジナイゼーションにより懸濁し、その後、48,000×g、４℃で15分間遠心分離した。洗浄過程をもう一度繰り返した。最終試料は緩衝液2中で懸濁させ、直ちに分析に用いるか、または−80℃で保管した。
【００１６】
機能的な受容体分析は、インスリン分泌性薬剤による刺激反応として、生成するサイクリックAMP（cAMP）を測定することで行われる。cAMP生成量は、AlphaScreen（登録商標） cAMP Kit(Perkin Elmer Life Science)で定量する。培養は半エリア96穴マイクロタイタープレートを用い、50μLの緩衝液3（50mM Tris-塩酸、5mM HEPES、10mM 塩化マグネシウム、pH7.4）に以下のものを加えた中で行った：1mM ATP、1μM GTP、0.5mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）、0.01％ ツイーン-20、0.1％BSA、6μg膜標本、15μg／mL受容体ビーズ、6nMのビオチニルcAMP中でプレインキュベートした20μg／mL供与体ビーズ。アゴニストの活性を調べるための化合物は、緩衝液3中に溶解および希釈した。GTPは各実験ごとに新しく準備した。プレートは暗所において、室温で3時間ゆっくり撹拌しながらインキュベートし、続いて、Fusion（登録商標）機器（Perkin Elmer Life Sciences）でカウントした。濃度-反応曲線は、個々の化合物とPrism v.4.0(GraphPad、Carlsbad、CA)を用いた４つのパラメーターのロジスティックモデルを使って見積もったEC50値についてプロットした。
【００１７】
ここで用いられる「GLP-1ペプチド」の用語は、GLP-1(7-37)(配列番号2)、GLP-1(7-37)類似物、GLP-1(7-37)誘導体、またはGLP-1(7-37)類似物の誘導体を意味する。一つの実施形態において、GLP-1ペプチドはインスリン分泌性物質である。
【００１８】
ここで用いられる「エキセンディン-4ペプチド」の用語は、エキセンディン-4(1-39)(配列番号3)、エキセンディン-4(1-39)類似体、エキセンディン-4(1-39)誘導体、またはエキセンディン-4(1-39)類似体の誘導体を意味する。一つの実施形態において、エキセンディン-4ペプチドはインスリン分泌性物質である。
【００１９】
ポリペプチドについて言うためにここで用いられる「DPP-IV保護された」の用語は、前述の化合物に血漿ペプチダーゼジペプチジルアミノペプチダーゼ４(DPP-IV)に対する耐性を与えるために、化学的に修飾されたポリペプチドを意味する。血漿中のDPP-IV酵素は幾つかのペプチドホルモン、例えばGLP-1、GLP-2、エキセンディン-4などの分解に関わっていることが知られている。それ故、DPP-IVによって分解される割合を減らすために、DPP-IV媒介性加水分解に対して感受性をもったポリペプチドについて、そのような類似体や誘導体を作り出すためにかなりの努力がなされている。一つの実施形態において、DPP-IV保護されたペプチドは、GLP-1(7-37)またはエキセンディン-4(1-39)よりもDPP-IVに対する耐性が強い。
【００２０】
ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによる分解に対するペプチドの耐性は、以下の分解試験によって決定される：
ペプチド（5nmol）の一定分量に、5mUの酵素活性に対応する精製したジペプチジルアミノペプチダーゼIVを1μL加え、100μLの0.1Mトリエチルアミン-塩酸緩衝液（pH7.4）中において10〜180分間37℃で培養した。酵素反応は10％トリフルオロ酢酸を5μL加えることで終結させ、ペプチド分解生成物はHPLCによって分離および定量する。この分析を行う一つの方法は：混合液をVydac C18 (細孔30nm、粒子径5μm)250×4.6mmのカラムに注入し、0.1％トリフルオロ酢酸中にアセトニトリルをSiegel et al., Regul. Pept. 1999; 79:93-102；およびMentlein et al., Eur. J. Biochem. 1993; 214:829-35に従u直線的なステップ状の濃度で加えたものを移動層として、1mL／minの流速で溶出させる（0％アセトニトリルを3分間、0〜24％アセトニトリルを17分間、24〜48％アセトニトリルを1分間）。ペプチドおよびその分解生成物は、220nm（ペプチド結合）および280nm（芳香族アミノ酸）における吸収で確認され、ピーク面積を標準物質と比較することによって定量されるであろう。ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによるペプチドの加水分解速度は、加水分解されるペプチドの割合が10％以下になったインキュベーション時間において評価される。
【００２１】
ここで用いられる「C1-6-アルキル」の用語は、分枝状、直線状または環状の1〜6個の炭素原子を有する飽和炭化水素基を意味する。代表的な例は、限定するものではないが、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、n-ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキサン、その他同種類のものである。
【００２２】
ここで用いられる「薬学的に許容可能な」の用語は、通常の薬学的用途に適していること、即ち、患者に対して有害な影響を及ぼさないこと等を意味する。
【００２３】
ここで用いられる「賦形剤」とは、例えば緩衝液、浸透圧調節剤、保存剤、その他同種のもののような、医薬組成物に通常添加されれ化学物質を意味する。
【００２４】
ここで用いられる「有効な量」とは、患者に投与した場合、投与しない場合に比べて十分な効果がある投与量を意味する。
【００２５】
ここで用いられる「医薬組成物」とは、緩衝液、保存剤、場合によっては張性剤および／または安定剤のような薬学的賦形剤とともに、活性化合物またはその塩を含有するものを意味する。それゆえ、医薬組成物は、当該分野において医薬製剤形態としても知られている。
【００２６】
ここで用いられる「疾患の治療」とは、生じた疾患、状態、障害を管理、およびケアするという意味である。治療の目的は疾患、状態または障害と闘うことである。治療には、疾患、状態または障害に付随する症状や合併症を緩和するばかりでなく、疾患、状態または障害を除去し、制御するために活性物質を投与することが含まれる。
【発明の説明】
【００２７】
一つの実施形態において、本発明は、次式(Ｉ)の構造を持つ化合物に関する。
【００２８】
GLP-1アゴニスト-L-RR-遅延タンパク質      (I)
式中、GLP-1アゴニストは、ヒトGLP-1受容体のアゴニストであるポリペプチドである。Lは、前記GLP-1アゴニストのアミノ酸側鎖または前記GLP-1アゴニストのC末端アミノ酸残基とRRを結合しているリンカーである。RRとは、遅延タンパク質のアミノ酸残基と共有結合を形成する反応性残基の残部である。遅延タンパク質は、少なくとも5kDaの分子量をもつタンパク質で、ヒトの血漿中では少なくとも24時間以上の血漿半減期をもち、そして、前述の遅延タンパク質は哺乳類でない生物により、または合成的に合成されたものである。
【００２９】
式(Ｉ)で表される化合物は以下のような図で示される。
【化９】
2007537142.tif 000002
【００３０】
本発明の一つの実施形態において、遅延タンパク質は組み換え型のヒト血清アルブミンである（配列番号1）。
【００３１】
本発明の一つの実施形態において、遅延タンパク質はヒト血清アルブミンの変異体である。
【００３２】
本発明の一つの実施形態において、ヒト血清アルブミンの変異体は、対応するヒト血清アルブミンに比べて銅とニッケルへの結合性が低下している。
【００３３】
本発明の一つの実施形態において、遅延タンパク質はヒト血清アルブミンのN末端断片またはその類似物である。
【００３４】
本発明の一つの実施形態において、遅延タンパク質はAsp-Ala-His-Lys N末端配列の修飾を含むヒト血清アルブミンの変異体である。
【００３５】
本発明の一つの実施形態において、遅延タンパク質はN末端の3つのアミノ酸残基であるAsp-Ala-Hisのうち少なくとも1つの欠失を含んでいる。
【００３６】
本発明の一つの実施形態において、遅延タンパク質はGlu-3、Ala-2Glu-1、Phe0-HSA(1-585)、またはそのN末端断片のようなN末端伸長部分を含む。
【００３７】
本発明の一つの実施形態において、ヒト血清タンパク（HSA）変異体はHSA(2-585)、HSA(3-585)、HSA(4-585)、Asp-Ala-HSA(4-585)、Xaa3-HSA(1-585) からなる群から選択され、ここでXaa3は、もともとのHSAの3位にあるヒスチジン残基を置換しているアミノ酸残基、およびそのN末端断片である。組み換え型のヒト血清アルブミン変異体はアルバゲン(Albagen)という名でニューセンチュリーファルマ社(New Century Pharma)から商業的に入手可能である。アルバゲンはHSA(2-585)であり、単一のN末端欠失により生じた修飾された金属結合特性に起因してアレルゲン性が低下したものである。
【００３８】
本発明の一つの実施形態において、前記遅延タンパク質は、60〜200のアミノ酸残基、例えば100〜150のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含んでなり、該アミノ酸配列は配列番号１の断片、または1または2のアミノ酸の置換および／または欠失を伴った配列番号1の断片と同じである。
【００３９】
本発明の一つの実施形態において、遅延タンパク質は免疫グロブリン、その類似物または断片のFc部分である。
【００４０】
本発明の一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、GLP-1(7-37)(配列番号2）またはエキセンディン-4(1-39)(配列番号3)と少なくとも50％のアミノ酸相同性をもっている。
【００４１】
本発明の一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、GLP-1(7-37)(配列番号2）またはエキセンディン-4(1-39)(配列番号3)と少なくとも80％のアミノ酸相同性をもっている。
【００４２】
本発明の一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは式(II)のアミノ酸配列を含んでなるものである。
【００４３】
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46
式(II) (配列番号４)
式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa8は、Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、1-アミノシクロプロピルカルボン酸、1-アミノシクロブチルカルボン酸、1-アミノシクロペンチルカルボン酸、1-アミノシクロヘキシルカルボン酸、1-アミノシクロヘプチルカルボン酸、または1-アミノシクロオクチルカルボン酸であり、
Xaa16 は、Val または Leuであり、
Xaa18 は、Ser、Lys、または Argであり、
Xaa19 は、Tyr または Glnであり、
Xaa20 は、Leu または Metであり、
Xaa22 は、Gly、Glu 、またはAibであり、
Xaa23 は、Gln、Glu、Lys、またはArgであり、
Xaa25 は、Ala または Valであり、
Xaa26 は、Lys、Glu、またはArgであり、
Xaa27 は、Glu または Leuであり、
Xaa30 は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa33 は、Val または Lysであり、
Xaa34 は、Lys、Glu、Asn、またはArgであり、
Xaa35 は、Gly または Aibであり、
Xaa36 は、Arg、Gly、またはLysであり、
Xaa37 は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、アミドであるか、または存在せず、
Xaa38 は、Lys、Ser、アミドであるか、または存在せず、
Xaa39 は、Ser、Lys、アミドであるか、または存在せず、
Xaa40 は、Gly、アミドであるか、または存在せず、
Xaa41 は、Ala、アミドであるか、または存在せず、
Xaa42 は、Pro、アミドであるか、または存在せず、
Xaa43 は、Pro、アミドであるか、または存在せず、
Xaa44 は、Pro、アミドであるか、または存在せず、
Xaa45 は、Ser、アミドであるか、または存在せず、
Xaa46 は、アミドであるか、または存在しない：
但し、Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45 、または Xaa46 が存在しなければ、その下流のアミノ酸も存在しない。
【００４４】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは式(III)のアミノ酸配列を含んでなるものである：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38
式 (III) (配列番号5)
式中、Xaa7はL-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンのでああり、
Xaa8は、Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、1-アミノシクロプロピルカルボン酸、1-アミノシクロブチルカルボン酸、1-アミノシクロペンチルカルボン酸、1-アミノシクロヘキシルカルボン酸、1-アミノシクロヘプチルカルボン酸、1-アミノシクロオクチルカルボン酸の何れかであり、
Xaa18 は、Ser、Lys 、またはArgであり、
Xaa22 は、Gly、Glu 、またはAibであり、
Xaa23 は、Gln、Glu、Lys、またはArgであり、
Xaa26 は、Lys、Glu、またはArgであり、
Xaa30 は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa34 は、Lys、Glu、またはArgであり、
Xaa35 は、Gly または Aibであり、
Xaa36 は、Argまたは Lysであり、
Xaa37 は、Gly、Ala、Glu、またはLysであり、
Xaa38 は、Lys、アミドであるか、または存在しない。
【００４５】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、ジペプチジルアミノペプチダーゼIV保護されたる。本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、ここで開示しているDPP-IVによる加水分解試験を用いると、GLP-1(7-37)の加水分解速度よりも低い速度でDPP-IVにより加水分解される。
【００４６】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、8位の類似物、即ち、GLP-1(7-37)配列（配列番号2）の8位に対応するアラニン残基が他のアミノ酸残基に置換されたものである。
【００４７】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、GLP-1(7-37)配列(配列番号2)の8位にα-アミノイソ酪酸残基を含んでいる。
【００４８】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1ペプチド（N末端）の7位にあるアミノ酸残基は、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、および4-ピリジルアラニンからなる群より選択される。
【００４９】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、GLP-1(7-37)（配列番号2）またはエキセンディン-4(1-39)(配列番号3)と比較すると、置換、付加、または欠失がなされた12以下のアミノ酸残基を含んでなるものである。
【００５０】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストはGLP-1(7-37)（配列番号2）やエキセンディン-4(1-39)(配列番号3)と比較すると、置換、付加、または欠失がなされた6以下のアミノ酸残基を含んでなるものである。
【００５１】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、GLP-1(7-37)（配列番号2）やエキセンディン-4(1-39)(配列番号3)と比較すると、置換、付加、または欠失が起こった4以下のアミノ酸残基を含んでなるものである。
【００５２】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、遺伝暗号でコード化されない4以下のアミノ酸残基を含んでなるものである。
【００５３】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、GLP-1(7-37)（配列番号2）やエキセンディン-4(1-39)(配列番号3)と比較すると、置換、付加、または欠失が起こった2以下のアミノ酸残基を含んでなるものである。
【００５４】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、
[Arg34]GLP-1(7-37)、[Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys、[Lys36Arg26,34]GLP-1(7-36)、[Aib8,22,35]GLP-1(7-37)、[Aib8,35]GLP-1(7-37)、[Aib8,22]GLP-1(7-37)、[Aib8,22,35 Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,35 Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22 Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22,35 Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,35 Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22,35 Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,35 Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22 Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22,35 Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,35 Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22 Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22,35 Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,35 Ala37]GLP-1(7-37)Lys、
[Aib8,22 Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8,22,35 Lys37]GLP-1(7-37)、[Aib8,35Lys37]GLP-1(7-37)、 [Aib8,22Lys37]GLP-1(7-37)
かならる群より選択される。
【００５５】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、エキセンディン-4(1-39)(配列番号3)である。
【００５６】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、ZP-2、即ち、[Ser38Lys39]エキセンディン-4(1-39)LysLysLysLysLys-アミド (配列番号4)である。
【００５７】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、配列番号2（GLP-1(7−37)）のアミノ酸配列に関して23、26、34、36、38位［配列番号3（エクセンディン-4(1-39)）のアミノ酸配列に関しては17、20、28、30、32位に対応する］のアミノ酸残基の側鎖を介して、-L-RR-遅延タンパク質部分に結合する。
【００５８】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、C末端アミノ酸残基の側鎖を介して-L-RR-遅延タンパク質部分に結合する。
【００５９】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、アルギニン、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、セリン、スレオニン、およびチロシンから選択されたアミノ酸残基を介して、-L-RR-遅延タンパク質部分に結合する。
【００６０】
本発明のもう一つの実施形態において、GLP-1アゴニストは、システイン残基の側鎖を介して、-L-RR-遅延タンパク質部分に結合する。
【００６１】
本発明のもう一つの実施形態において、リンカーLは、下記の2価の連結化学基からなる群から選択される。
【００６２】
アミド類： -C(O)-NR-、ここでのRは水素原子またはC1-6-アルキルである；
アミン： -NR-、ここでのRは水素原子または C1-6-アルキルである；
チオエーテル類：-S-、-S-(CH2)2-SO2- または、
【化１０】
2007537142.tif 000003
【００６３】
；
エーテル類： -O-、
ウレタン類： -N(R1)-CO-N(R2)-、ここでのR1およびR2 は水素原子または C1-6-アルキルである；
カルバメート類： -O-CO-N(R)-、ここでのR は水素原子またはC1-6-アルキルである；
ヒドラジン類： 
【化１１】
2007537142.tif 000004
【００６４】
ここで、R は水素原子または C1-6-アルキルである；
オキシム類： -O-N=C(-R)-、ここでのR は水素原子または C1-6-アルキルである；
オキサゾリジン類またはチアゾリジン類：
【化１２】
2007537142.tif 000005
【００６５】
および
【化１３】
2007537142.tif 000006
【００６６】
本発明のもう一つの実施形態において、一般式(Ｉ)の化合物は、下記からなる群より選択される：
GLP-1アゴニスト-C(=O)CH2O(CH2)2O(CH2)2-RR-遅延タンパク質、
GLP-1アゴニスト- C(=O)(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-遅延タンパク質、
GLP-1アゴニスト-S(=O)2(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-遅延タンパク質、
GLP-1アゴニスト-CH2(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-遅延タンパク質、
GLP-1アゴニスト-C(=O)O(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-遅延タンパク質：
ここで、ｎは0〜10の整数であり、ｍは0〜100の整数である。
【００６７】
本発明のもう一つの実施形態において、一般式(Ｉ)の化合物は、
GLP-1 アゴニスト-L-NC(=O)CH2 -遅延タンパク質のシステイン残基中の硫黄原子、
GLP-1 アゴニスト-L-S(=O)2(CH2)2 -遅延タンパク質のシステイン残基中の硫黄原子、
GLP-1 アゴニスト-L-NC(=O)CH2 -遅延タンパク質のシステイン残基中の硫黄原子、
【化１４】
2007537142.tif 000007
【００６８】
からなる群より選択される。
【００６９】
本発明のもう一つの実施形態において、一般式(Ｉ)の化合物は、下記からなる群より選択される：
S-ガンマ34-(1-{2-[2-(2-([D-Ala8,Lys37]-GLP-1-(7-37)アミド-Nε37-イル)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル)アルバゲン
【化１５】
2007537142.tif 000008
【００７０】
S-ガンマ34-(1-{2-[2-(2-([Aib8,22,25,Lys37]-GLP-1-(7-37)アミド-Nε37-イル)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル)アルバゲン
【化１６】
2007537142.tif 000009
【００７１】
S-ガンマ34-((1-{2-[2-(2-([Aib8,Arg26,34,Glu22,23,30]-GLP-1-(7-37))Lys アミド-Nε-イル)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル)アルバゲン
【化１７】
2007537142.tif 000010
【００７２】
本発明の化合物は古典的なペプチド合成により合成することができる。即ち、tBocまたはFmoc反応、または他の適切な手法を用いた固相ペプチド合成である。例えば、Green and Wuts、“Protecting Groups in Organic Synthesis”、John Wiley & Sons、1999参照。これらの方法はインスリン分泌性の薬剤が非天然のアミノ酸を含むペプチドであるときに好ましい。
【００７３】
インスリン分泌性薬剤が遺伝暗号によりコード化されたアミノ酸残基のみからなる場合、当該ポリペプチドはまた、ポリペプチドをコード化するDNA配列を含み、ポリペプチドの発現を可能にする条件下に適切な栄養培地中で該ポリペプチドを発現できる宿主細胞を培養するし、その後、結果物としてのペプチドを培地から回収し、式(Ｉ)の化合物へ誘導体化することを含んでなる方法によって調製することができる。
【００７４】
細胞を培養するために使われる培地は、適切な栄養を補った最小培地や複合培地のように、宿主細胞を増殖させるのに適した従来の如何なる培地であってもよい。適切な培地は、商業的供給業者から入手可能であり、或いは、公表されたレシピ(例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)のカタログ)に従って調製されてもよい。次いで、細胞によって製造されたペプチドは、遠心法またはろ過によって培地から宿主細胞を分離する等の通常の手法によって培地から回収してよい。細胞外生成物については、上清のタンパク様成分は、そのタンパク質の性質によって、ろ過、カラムクロマトグラフィー、または沈殿、例えば精密ろ過法、限外ろ過法、等電点沈殿法、さまざまなクロマトグラフィー手法を用いた精製、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって分離される。細胞内、周辺質の生成物については、培地から単離された細胞を分解または浸透化し、抽出して、生成したポリペプチドまたはその前駆物質を回収する。
【００７５】
治療用ポリペプチドをコード化するDNA配列は、適切には、例えば遺伝子ライブラリーまたはcDNAライブラリーの作製、および標準的技術（例えばSambrook、J、Fritsch、EF and Maniatis、T、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989参照）に従って、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、ペプチドの全部または一部をコード化しているDNA配列をスクリーニングすることによって得られるゲノムまたはcDNA起源のものであってよい。また、当該ポリペプチドをコード化するDNA配列は、確立された標準的な手法、例えばBeaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869によるホスホルアミダイト法、またはMatthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805による方法によって化学的に合成されてもよい。DNA配列は、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって調製されてもよい。例えば米国特許第4,683,202号または Saiki et al.、Science 239 (1988)、487-491に記述されている手法である。
【００７６】
DNA配列は、組み換えDNA法に便宜に供され得る何れかのベクターに挿入されるが、そのベクターの選択は、これが導入される宿主細胞に依存することが多い。ベクターは自己複製ベクター、即ち、その複製が染色体複製から独立している染色体外の構成要素として存在するベクター、例えばプラスミドであってよい。或いは、ベクターは宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞遺伝子に組み込まれ、それが組込まれた染色体と共に複製されものであってよい。
【００７７】
ベクターは、好ましくは、ポリペプチドをコード化するDNA配列がプロモーターのようなDNAの転写に必要な付加的な領域と作動可能に連結された発現ベクターである。プロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示す如何なるDNA配列でもよく、宿主細胞に相同性または非相同性のタンパクをコード化する遺伝子から誘導されてよい。種々の宿主細胞において本発明のペプチドをコード化するDNAの転写を指令する適切なプロモーターの例は当該技術において周知である（例えば上記で引用したSambrook et al.参照）。
【００７８】
また、ポリペプチドをコード化するDNA配列は、もし必要であれば、適切なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、および翻訳エンハンサー配列と作動可能に結合されてよい。本発明の組み換えベクターは更に、問題の宿主細胞中でベクターを複製可能にするDNA配列からなるであろう。
【００７９】
該ベクターはまた、選択マーカーを含んでもよい。例えば、その産物が宿主細胞中の欠損を補完する遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ハイグロマイシン、メトトレキサート等の薬物に対する耐性を与える遺伝子である。大規模生産において、好ましくは、選択マーカーは抗生物質耐性ではない。例えば、ベクター中の抗生物質耐性遺伝子は、好ましくは、ベクターを大量生産に用いたときには切除される。ベクターから抗生物質耐性遺伝子を除去する方法は、当該技術において、例えば本明細書の一部として援用する米国特許第6,358,705号において知られている。
【００８０】
本発明の親ペプチドを宿主細胞の分泌経路に導入するために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても知られている）が組み換えベクターに与えられてよい。分泌シグナル配列は、正しいリーディングフレームにおいてペプチドをコード化しているDNA配列に連結される。分泌シグナル配列は、一般的に、ペプチドをコード化しているDNA配列の5’に位置する。分泌シグナル配列は、当該ペプチドに普通にに関連したものであってよく、または他の分泌タンパク質をコード化している遺伝子由来のものであってよい。
【００８１】
このペプチド、プロモーター、並びに任意のターミネーターおよび／または分泌シグナル配列をコードしているDNA配列をそれぞれ結合させるために用いる手法、および、それらを複製に必要な情報を含んだ適切なベクターに挿入するために用いる手法は、例えば上記で引用したSambrook et al..等において当業者に周知である。
【００８２】
DNA配列または組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のペプチドを産生できる如何なる細胞であってもよく、バクテリア、酵母、菌、およびより高度な真核細胞が含まれる。当該分野において周知で且つ使用されている適切な宿主の例は、これに限定するものではないが、大腸菌、酵母、または哺乳類のBHKまたはCHO株化細胞などである。
【００８３】
本発明による化合物を含む医薬組成物は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、1985 or in Remington: The Science and Practice of Pharmacy、19th edition、1995で述べられているような通常の技術で調製されてよい。
【００８４】
本発明の一つの目的は、0.1mg／mL〜25mg／mLの濃度で存在する本発明による化合物含有する医薬製剤を提供することであり、ここでの製剤は2.0〜10.0のpHを有する。この製剤は更に、緩衝剤、保存剤、等張化剤、キレート化剤、安定化剤、および界面活性剤を含有してよい。本発明の一つの実施形態において、この医薬製剤は水溶性、即ち水を含む製剤である。このような製剤は一般的に、溶液または懸濁液である。本発明のもう一つの実施形態において、この薬剤は水溶液である。「水溶性製剤」の用語は、少なくとも50%w／wの水を含む製剤と定義される。同様に「水溶液」の用語は、少なくとも50%w／wの水を含む溶液と定義される。
【００８５】
本発明のもう一つの実施形態において、この医薬製剤は凍結乾燥製剤であり、医師または患者は、使用する前に溶剤および／または希釈液をこれに添加する。
【００８６】
本発明のもう一つの実施形態において、この医薬製剤は、事前に溶解する必要のない乾燥製剤（例えばフリーズドライまたはスプレードライされたもの）である。
【００８７】
更なる側面において、本発明による化合物の水溶液および緩衝液を含有する医薬製剤に関し、ここでの前記化合物は、0.1mg／mL以上の濃度で存在し、また前記製剤のpHは約2.0〜約10.0である。
【００８８】
本発明のもう一つの実施形態において、当該製剤のpHは約7.〜約9.5である。本発明のもう一つの実施形態において、製剤のpHは約3.0〜約7.0である。本発明のもう一つの実施形態において、製剤のpHは約5.0〜約7.5である。本発明のもう一つの実施形態において、製剤のpHは約7.5〜約9.0である。本発明のもう一つの実施形態において、製剤のpHは約7.5〜約8.5である。本発明のもう一つの実施形態において、製剤のpHは約6.0〜約7.5である。本発明のもう一つの実施形態において、製剤のpHは約6.0〜約7.0である。
【００８９】
本発明のもう一つの実施形態において、当該製剤のpHは約3.0〜約9.0であり、上述のpHは本発明の化合物の等電点pHから少なくとも2.0pH単位である。
【００９０】
本発明の更なる実施形態において、前記緩衝液は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびtris(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、またはそれらの混合物からなる群から選択される。これら特定の緩衝液のそれぞれが本発明の別の実施形態を構成する。
【００９１】
本発明のもう一つの実施形態において、この製剤は更に薬学的に許容可能な保存剤を含む。本発明のもう一つの実施形態において、保存剤はフェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、メチルp-ヒドロキシ安息香酸、プロピルp-ヒドロキシ安息香酸、2-フェノキシエタノール、ブチルp-ヒドロキシ安息香酸、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、およびチオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、エチルp-ヒドロキシ安息香酸、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン（3p-クロロフェノキシプロパン-1,2-ジオール）またはこれらの混合物からなる群から選択される。本発明のもう一つの実施形態において、保存剤は0.1mg／mL〜20mg／mLの濃度で存在する。本発明のもう一つの実施形態において、保存剤は0.1mg／mL〜5mg／mLの濃度で存在する。本発明のもう一つの実施形態において、保存剤は5mg／mL〜10mg／mLの濃度で存在する。本発明のもう一つの実施形態において、保存剤は10mg／mL〜20mg／mLの濃度で存在する。これらの特異的な保存剤のそれぞれが本発明の別の実施形態を構成する。医薬品における保存剤の使用は当業者に周知である。便宜上、RemingtonによるThe Science and Practice of Pharmacy、19th edition、1995が参照される。
【００９２】
本発明の更なる実施形態において、この製剤は更に等張化剤を含有する。本発明の更なる実施形態において、前記等張化剤は、塩（例えば塩化ナトリウム）、糖または糖アルコール、アミノ酸（例えばL-グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン）、アルジトール（例えばグリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール（プロピレングリコール）、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール）、ポリエチレングリコール（例えばPEG400）、またはこれらの混合物からなる群から選択される。例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのような糖を含むモノ-、ジ-、またはポリサッカライド類、または水溶性グルカン類を使用してもよい。一つの実施形態において、糖添加物はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一つのヒドロキシル基を有するC4-C8炭化水素として定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラシチトール、ダルシトール、キシリトール、またはアラビトールなどが含まれる。上記の糖または糖アルコールは、個々に使用してもよく、または併用してもよい。糖または糖アルコールが溶液試料に溶解し、また本発明の方法を使用して達成される安定化効果に悪影響を及ぼさない限り、使用量に制限はない。一つの実施形態において、糖または糖アルコールの濃度は1mg／mL〜150mg／mLである。本発明のもう一つの実施形態において、等張化剤は1mg／mL〜50mg／mLの濃度で存在する。本発明のもう一つの実施形態において、等張化剤は1mg／mL〜7mg／mLの濃度で存在する。本発明のもう一つの実施形態において、等張化剤は8mg／mL〜24mg／mLの濃度で存在する。本発明のもう一つの実施形態において、等張化剤は25mg／mL〜50mg／mLの濃度で存在する。これらの特定の等張化剤のそれぞれが本発明の別の実施形態を構成する。医薬組成物中の等張化剤の使用は当業者に周知である。便宜上、RemingtonによるThe Science and Practice of Pharmacy、19th edition、1995が参照される。
【００９３】
本発明の更なる実施形態において、当該製剤は更にキレート化剤を含有する。本発明の更なる実施形態において、キレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、クエン酸、アスパラギン酸、およびその混合物の塩から選択される。本発明の更なる実施形態において、キレート化剤は0.1mg／mL〜5mg／mLの濃度で存在する。本発明の更なる実施形態において、キレート化剤は0.1mg／mL〜2mg／mLの濃度で存在する。本発明の更なる実施形態において、キレート化剤は2mg／mL〜5mg／mLの濃度で存在する。これらの特定のキレート化剤のそれぞれが本発明の別の実施形態を構成する。医薬品中のキレート化剤の使用は当業者に周知である。便宜上、Remingtonによる The Science and Practice of Pharmacy、19th edition、1995が参照される。
【００９４】
本発明の更なる実施形態において、この製剤は更に安定化剤を含有する。医薬組成物に安定化剤を使用することは当業者に周知である。便宜上、Remingtonによる The Science and Practice of Pharmacy、19th edition、1995が参照される。
【００９５】
特に、本発明の組成物は安定化された液状の医薬製剤であり、その治療的活性成分には、液状医薬製剤中に保存されている間に凝集体形成を示す可能性のあるポリペプチドが含まれる。「凝集体形成」の用語は、オリゴマーの形成をもたらすポリペプチド分子間の物理的相互作用を示し、該オリゴマーは可溶性のままであってもよく、または液体から沈殿した大きな可視の凝集体であってもよい。「保存されている間」の用語は、一度調製された液状医薬組成物または製剤が、直ちに患者に投与されないことを意図している。むしろそれは、調製された後に、液体形態で、凍結形態で、または後で患者へ投与するのに適した液体またはその他の形態に再形成するために乾燥形態での保存のために包装される。「乾燥形態」とは、液状医薬組成物または製剤が、凍結乾燥(即ち凍結乾燥法、例えば Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59参照)、噴霧乾燥（Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical、Essez、U.K.)、pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; and Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20を参照)、または空気乾燥(Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; and Roser (1991) Biopharm. 4:47-53)によって乾燥されることを意味する。液状医薬組成物の保存の間のポリペプチドによる凝集体形成は、そのポリペプチドの生物学的活性に悪影響を与え、医薬組成物の治療効果の喪失をもたらす可能性がある。更に、凝集体形成は、ポリペプチドを含む医薬組成物が注入システムを使って投与されるときに、チューブ、膜、ポンプの閉塞ような他の問題を引き起こす可能性がある。  
本発明の医薬組成物は、更に該組成物を保存している間、そのポリペプチドによる凝集体形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含有してもよい。「アミノ酸塩基」の用語は、アミノ酸またはアミノ酸の組み合わせを意味し、ここでは、与えられた何れのアミノ酸もその遊離塩基またはその塩として存在する。アミノ酸の組み合わせが使用される場合、全てのアミノ酸が遊離塩基の形で存在してもよく、全てのアミノ酸が塩の形で存在してもよく、または幾つかのアミノ酸は遊離塩基の形で存在し、その他は塩の形で存在してもよい。一つの実施形態において、本発明の組成物の調製に使用するアミノ酸は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸のような電荷を帯びた側鎖を保有する。特定のアミノ酸（例えば、グリシン、メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン、およびその混合物）の何れかの立体異性体（即ちL、DまたはDL異性体）、またはこれら立体異性体の組み合わせは、その特定のアミノ酸が遊離塩基の形またはその塩の形で存在する限り、本発明の医薬組成物中に存在してよい。一つの実施形態においては、L-立体異性体が使用される。本発明の組成物は、これらのアミノ酸の類似物を用いて処方されてもよい。「アミノ酸類似物」の用語は、本発明の医薬組成物を保存している間のポリペプチドによる凝集体形成を減少させる望ましい効果をもたらすような、天然アミノ酸の誘導体を意味する。適切なアルギニン類似物には、例えば、アミノグアニジン、オルニチン、およびN-モノエチルL-アルギニンが含まれ、適切なメチオニン類似物には、例えばS-エチルホモシステインおよびS-ブチルホモシステインが含まれ、適切なシステイン類似体には、S-メチルL-システインが含まれる。他のアミノ酸に関しても、アミノ酸類似物は、それらの遊離塩基の形または塩の形で当該組成物中に取り込まれる。本発明のもう一つの実施形態において、アミノ酸またはアミノ酸類似物は、タンパクの凝集を防止または遅延させるのに十分な濃度で用いられる。
【００９６】
本発明の更なる実施形態において、治療剤として作用するポリペプチドが酸化反応に対して感受性の高い少なくとも一つのメチオニン残基を含むポリペプチドである場合には、メチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化反応を阻止するためにメチオニン（または他の硫黄含有アミノ酸またはアミノ酸類似体物）を添加してもよい。「阻止する」の用語は、経時的なメチオニンの酸化体の集積を最小化することを意味する。メチオニンの酸化反応を阻止することは、より多くのポリペプチドをその適正な分子形態に維持する結果をもたらす。メチオニンの何れかの立体異性体（L、D、またはDL異性体）またはその組み合わせを使用することができる。加えるべき量は、メチオニンスルホキシドが規制当局に許容可能な量であるように、メチオニン残基の酸化を妨げるために十分な量であるべきである。典型的には、これは、当該成分が約10％〜30％以下のメチオニンスルホキシドを含有することを意味する。一般的に、これは添加されたメチオニンとメチオニン残基との比が約1：1〜約1000：1の範囲、例えば10：1〜100：1になるようにメチオニンを加えることにより達成される。
【００９７】
本発明の更なる実施形態において、当該製剤は、高分子量ポリマーまたは低分子量化合物の群から選択された安定化剤を含む。本発明の更なる実施形態において、該安定化剤はポリエチレングリコール(例えばPEG3350)、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ／ヒドロキシセルロースまたはその誘導体（例えばHPC、HPC-SL、HPC-L、HPMC）、シクロデキストリン類、モノチオグリセロール、チオグリコール酸、および2-メチルチオエタノールのような硫黄含有化合物、およびその他の塩（例えば塩化ナトリウム）からなる群より選択される。これらの特定の安定化剤のそれぞれが本発明の別の実施形態を構成する。
【００９８】
当該医薬組成物はまた、その中の治療的に活性なポリペプチドの安定性を更に増強する追加の安定化剤を含有してもよい。本発明にとって特に興味のある安定化剤には、限定はされないが、メチオニンの酸化反応からポリペプチドを保護するメチオニンおよびEDTA、並びに凍結融解または機械的剪断に付随する凝集からポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００９９】
本発明の更なる実施形態において、この製剤は、更に界面活性剤を含有する。本発明の更なる実施形態において、界面活性剤は以下の中から選択される：即ち、洗剤、エトキシ化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド類、アセチル化モノグリセリド類、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックポリマー類［例えばプルロニック(Pluronic（登録商標）)F68、ポロキサマー(poloxamer) 188 および407、Triton X-100］、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アルキル化およびアルコキシル化誘導体のようなポリオキシエチレンおよびポリエチレンの誘導体（ツイーン類、例えばツイーン-20、ツイーン-40、ツイーン-80、およびBrij-35）、モノグリセリド類またはそのエトキシ化誘導体、ジグリセリド類またはそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール類、グリセロール、レシチン類、およびリン脂質類（例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、およびスフィンゴミエリン）、リン脂質の誘導体（例えばジパルミトイルホスファチジン酸）、およびリゾリン脂質の誘導体（例えばパルミトイルリゾホスファチジル-L-セリンおよびエタノールアミン、コリン、セリン、またはスレオニンの1-アシル-sn-グリセロ-3-リン酸エステル）、リゾホスファチジルコリンおよびホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル(アルキルエステル)、アルコキシ（アルキルエーテル）誘導体、例えばリゾホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、および極性の頭部基（即ち、コリン類、エタノールアミン類、ホスファチジン酸、セリン類、スレオニン類、グリセロール、イノシトール、陽性に帯電したDODAC、DOTMA、DCP、BISHOP）の修飾を受けた誘導体、リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルスレオニン、およびグリセロリン脂質類(例えばセファリン類)、グリセロ糖脂質類 (例えば ガラクトピランソイド)、スフィンゴ糖脂質類 (例えばセラミド類、ガングリオシド類)、ドデシルホスホコリン、雌鶏卵のリゾレシチン、フシジン酸誘導体（例えばタウロ-ジヒドロフシジン酸ナトリウムなど）、C6〜C12の長鎖脂肪酸およびその塩（例えばオレイン酸およびカプリル酸）、アシルカルニチン類およびその誘導体、リジン、アルギニンまたはヒスチジンのNα-アシル化誘導体、またはリジンまたはアルギンニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニン、またはヒスチジンおよび天然または酸化アミノ酸の組み合わせからなるジペプチドのNα-アシル化誘導体、天然アミノ酸および２荷電アミノ酸の幾つかの組み合わせからなるトリペプチドのNα-アシル化誘導体、DSS (ドキュセートナトリウム、CAS登録番号[577-11-7])、ドキュセートカルシウム（CAS登録番号[128-49-4])、ドキュセートカリウム（CAS登録番号[7491-09-0])、SDS (ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム)、カプリル酸ナトリウム、コール酸またはそれらの塩、胆汁酸類およびそれらの塩とグリシンまたはタウリンの抱合体、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アミノ-1-プロパンス���ホン酸塩、アニオン性(アルキル-アリル-スルホン酸塩)の一価の界面活性剤、両性イオン性の界面活性剤(例えばN-アルキル-N,N-ジメチルアミノ-1-プロパンスルホン酸塩、3-クロロアミノ-1-プロピルジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホン酸塩、カチオン性界面活性剤（四級アンモニウム塩基）（例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム）、非イオン性界面活性剤（例えばドデシルβ-D-グルコピラノシド)、ポロクサミン類(例えばテトロン酸類)、これらはプロピレンオキシドおよびエチレンオキシドのエチレンジアミンへの逐次付加により誘導された４官能ブロック共重合体である。また、界面活性剤はイミダゾリン誘導体またはそれらの混合物から選択されるかもしれない。これらの特異的な界面活性剤のそれぞれが、本発明の別の実施形態を構成する。
【０１００】
医薬組成物における界面活性剤の使用は技術者の間で周知である。便宜上、Remingtonによる The Science and Practice of Pharmacy、19th edition、1995が参照される。
【０１０１】
本発明のペプチド医薬製剤中に他の成分が存在することも可能である。このような付加的な成分には湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、充填剤、張性剤、キレート化剤、金属イオン、油性溶媒、タンパク（例えばヒト血清アルブミン、ゼラチン、またはタンパク）、および両性イオン（例えばベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン、およびヒスチジンのようなアミノ酸）が含まれてよい。このような付加的成分はもちろん、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に悪影響を及ぼすべきではない。
【０１０２】
本発明による化合物を含有する医薬組成物は、幾つかの部位において、そのような治療が必要な患者に投与されてよい。例えば局所的部位、例えば皮膚および粘膜部位、吸収をバイパスする部位、例えば動脈、静脈、心臓における投与、および吸収に関与する部位、例えば皮膚、皮下、筋肉、および腹部である。
【０１０３】
本発明による医薬品の投与は幾つかの投与経路でなされてよく、治療が必要な患者に対して、例えば、舌、舌下、頬、口中、経口、胃中および腸中、鼻、肺、例えば、細気管支および肺胞を通して、またはその組み合わせ、表皮、皮膚、経皮、膣、直腸、眼球（例えば結膜）、尿道を通して、および非経口的な方法で投与される。
【０１０４】
一つの側面において、本発明は、式(Ｉ)で表される化合物および薬学的に認容できる賦形剤からなる医薬組成物に関する。
【０１０５】
本発明の一つの実施形態において、この医薬組成物は肺投与に適している。
【０１０６】
もう一つの実施形態において、本発明は肺への医薬の調製のための式(Ｉ)の化合物の使用に関する。
【０１０７】
本発明の組成物は、幾つかの投与量形態で投与されるであろう。例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ミクロエマルジョン、複合エマルジョン、気泡、軟膏、ペースト、硬膏剤、軟膏、錠剤、コーティング錠、リンス、カプセル、例えば硬ゼラチンカプセルおよび軟ゼラチンカプセル、坐剤、直腸カプセル、液滴、ゲル、スプレー、パウダー、エアロゾル、吸入薬、目薬、眼軟膏、眼リンス剤、膣坐薬、膣リング、膣軟膏、注射溶液、インサイチュー形質交換溶液、例えばインサイチューゲル化、インサイチューセッティング、インサイチュー沈降、インサイチュー結晶化、注入溶液、およびインプラントである。
【０１０８】
本発明の組成物は更に、化合物の安定性を更に増大させ、バイオアベイラビリティを増大させ、溶解性を増大させ、有害効果を減少させ、当該分野においてこれらの特殊技術としてよく知られている時間治療を達成し、患者のコンプライアンスを向上させるため、またはこれらの組み合わせを目的として、薬物キャリア、薬物送達システム、および進歩した薬物送達システム中に配合されてよく、或いは、例えば共有結合、疎水的または静電気的相互作用を介してこれらに結合されてよい。キャリア、薬物送達システムおよび進化した薬物送達システムの例は、限定するものではないが、ポリマー類、例えばセルロースおよびその誘導体、ポリサッカライド類、例えばデキストランおよびその誘導体、澱粉およびその誘導体、ポリ（ビニルアルコール）、アセチル化またはメタクリル化されたポリマー、ポリ乳酸およびポリグリコール酸およびそのブロック共重合体、ポリエチレングリコール、輸送タンパク、例えばアルブミン、ゲル、例えば熱ゲル化システム、例えば当業者に周知のブロック共重合体システム、ミセル、リポソーム、ミクロスフェア、ナノ粒子、液晶およびその分散系、脂質-水系における相挙動の当業者に周知のL2相およびその分散系、重合体ミセル、複合エマルジョン、自己乳化、自己ミクロ乳化、シクロデキストリンおよびその誘導体、およびデンドリマーである。
【０１０９】
本発明の組成物は、例えば、全て当業者に周知の用量計測吸入器、ドライパウダー吸入器、およびネブライザーを用いる当該化合物の肺投与のための、固体、半固体、粉末、および液体の製剤において有用である。
【０１１０】
本発明の組成物は、制御放出、持続放出、遅延放出、および緩徐放出の薬物送達システムの製剤において特に有用である。更に詳細に言えば、限定するものではないが、この化合物は当業者に周知の非経口的な制御放出システムおよび持続放出システム（両システムとも投与回数を数分の１に減少させる）の製剤において有用である。更に好ましいのは皮下投与される制御された放出システムおよび持続した放出システムである。本発明の範囲を限定するものではないが、有用な制御放出システムおよび組成物の例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、重合体ミセル、ミクロスフェア、ナノ粒子である。
【０１１１】
本発明の組成物のための有用な制御放出システムを製造する方法には、限定されるものではないが、結晶化、濃縮、共結晶、沈殿、共沈、乳化、分散、高圧均質化、封入、スプレードライ、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、マイクロスフェアを製造するための液体蒸留、押し出し、および超臨界流体加工が含まれる。一般的な参考文献はHandbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise、D.L.、ed. Marcel Dekker、New York、2000) and Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally、E.J.、ed. Marcel Dekker、New York、2000)である。
【０１１２】
非経口投与は、シリンジ、任意にペン型シリンジを用いて、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射により行ってよい。或いは、非経口投与は注入ポンプにより行うことができる。更なる選択肢は、鼻または肺への噴霧の形態での本発明による化合物の投与のための、溶液またはサスペンジョンであってよい組成である。その上更なる選択肢として、本発明の化合物を含む医薬品成分は、例えば無針注射またはパッチ、任意にイオン導入パッチで、または経粘膜（例えば頬）投与により、経皮吸収にも適応し得る。
【０１１３】
「安定化製剤」とは、物理的安定性の増大、化学的安定性の増大、または物理的および化学的安定性が増大された製剤を指称するものである。
【０１１４】
ここで用いられるタンパク質製剤の「物理的安定性」の用語は、タンパク質を熱−機械的なストレス、および／または不安定化する界面および表面（例えば疎水性の界面および表面）との相互作用にさらされた結果物として、タンパク質が生物学的に不活性および／または不溶性のタンパク質凝集体を形成する傾向を意味する。水性タンパク質製剤の物理的安定性は、適切な容器（例えばカートリッジやバイアル）に充填した薬剤を、種々の時間および異なる温度で機械的／物理的ストレス（例えば撹拌）に露出させた後に、視覚的観察および／または混濁度測定をすることにより評価される。製剤の視覚的観察は、暗い背景において焦点が鮮明な光の存在下で行われる。その製剤の混濁度は、例えば0〜3のように混濁度の度合いを格付けする視覚的スコアにより決定される（製剤が混濁性を示さない場合視覚的スコア0に対応し、昼間光で混濁性を示した場合は視覚的スコア3に対応する）。昼間光において視覚的混濁を示した場合、製剤はタンパク質凝集体に関して物理的に不安定であるとして分類される。或いは、その製剤の混濁度は、当業者に周知の単純混濁度測定法によって評価することができる。水性タンパク質製剤の物理的安定性は、当該タンパク質の高次構造状態の分光学的試薬またはプローブを用いることによっても評価することができる。プローブは、好ましくは、タンパク質の非天然の配座異性体に優先的に結合する小さい分子である。タンパク質構造の分光学的小分子プローブの例は、チオフラビンTである。チオフラビンTは、アミロイド原繊維の検出に広く用いられている蛍光色素である。原繊維の存在下、および同様に他のタンパク質立体配置の存在下でも同様に、チオフラビンTは、原繊維タンパク質に結合したときに、新たな最大励起波長を約450nmに生じ、約482nmにおいて増強された発光を生じる。未結合のチオフラビンTは、その波長において基本的に非蛍光性である。
【０１１５】
他の小分子を、天然上位対から非天然状態へのタンパク質構造の変化におけるプローブとして使用することができる。例えば「疎水性パッチ」は、露出されたタンパク質の疎水性パッチに優先的に結合するプローブである。疎水性パッチは、一般的に天然の状態においてはタンパク質の三次構造中に埋もれているが、タンパク質がほどかれ、または変性し始めるに伴って露出されるに至る。これら小分子の分光学的プローブの例は、アントラセン、アクリジン、およびフェナントロリンのような芳香族の疎水性色素である。他の分光化学的プローブは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン等の疎水性アミノ酸のコバルト金属錯体のような、金属-アミノ酸錯体である。
【０１１６】
ここで使われるタンパク質製剤の「化学的安定性」の用語は、天然のタンパク質構造と比較して生物学的効力が低く、および／または免疫原性が増大する可能性のある化学的分解生成物の形成を導く、タンパク質構造における化学的共有結合性の変化を意味する。天然のタンパク質の種類および性質、並びに該タンパク質が置かれている環境に依存して、種々の化学的分解生成物が形成され得る。当業者には周知のように、おそらく、化学的分解を完全に排除することは殆どできないであろうし、タンパク質製剤の保存および使用の際に、化学的分解生成物の量の増大が見られることが多い。殆どのタンパク質は脱アミド化を起こし易く、その過程で、グルタミン残基またはアスパラギン残基中の側鎖アミド基が加水分解されて、遊離カルボン酸を生成する。他の分解経路には、高分子量の変換生成物の形成が含まれ、ここではアミド基転移および／またはジスルフィド相互作用を介して２以上のタンパク質分子が相互に共有結合され、共有結合で結合されたダイマー、オリゴマー、およびポリマー分解生成物の形成を導く(Stability of Protein Pharmaceuticals、Ahern. T.J. & Manning M.C.、Plenum Press、New York 1992)。酸化（例えばメチオニン残基の酸化）は、化学的分解のもう１つの変種と言うことができる。タンパク質製剤の化学的安定性は、異なる環境条件に露出させた後の種々の時点において化学的分解生成物の量を測定することにより評価できる（分解生成物の形成はしばしば、例えば温度上昇によって促進され得る）。それぞれの個々の分解生成物の量は、しばしば、種々のクロマトグラフィー技術（例えばSEC-HPLCおよび／またはRP-HPLC）を用いて、分子のサイズおよび／または電荷に依存した分解性生物の分離によって決定される。
【０１１７】
従って、上記で概説したように、「安定化した製剤」とは、物理学的安定性が増大し、化学的安定性が増大し、または物理学的および化学的安定性が増大した製剤を意味する。一般に、製剤は使用や保管の間（推奨する使用および保管の条件に従う場合）、有効期限に達するまでは安定でなければならない。
【０１１８】
本発明のもう一つの実施形態において、本発明による化合物を含有する医薬品製剤は、使用において6週間以上、保管において3年以上安定である。
【０１１９】
本発明のもう一つの実施形態において、本発明による化合物を含有する、医薬品製剤は使用において4週間以上、保管において3年以上安定である。
【０１２０】
本発明の更なる実施形態において、本発明による化合物を含有する医薬品製剤は、使用において4週間以上、保管において2年以上安定である。
【０１２１】
本発明の更なる実施形態において、当該化合物を含有する医薬品製剤は、使用において2週間以上、保管において2年以上安定である。
【０１２２】
もう一つの側面において、本発明は、医薬の調製のための本発明による化合物の使用に関する。
【０１２３】
一つの実施形態において、本発明による化合物は高血糖症、2型糖尿病、障害性のグルコース耐性、1型糖尿病、肥満症、高血圧、シンドロームX、消化不良、および胃潰瘍の治療または予防のための医薬の調製のために使用される。
【０１２４】
一つの実施形態において、本発明による化合物は、2型糖尿病の進行を遅延または防止するための医薬の調製のために用いられる。
【０１２５】
一つの実施形態において、本発明による化合物は、食物摂取量を低減させ、β細胞のアポトーシスを低下させ、β細胞の機能および量を増大させ、および／またはβ細胞のグルコース感受性を回復させるための医薬の調製のために使用される。
【０１２６】
本発明による化合物を用いた治療は、第二のもしくは更に多くの薬理学的に活性な物質と併用されてよい。これらは、例えば抗糖尿病薬、抗肥満薬、食欲調節薬、降圧剤、糖尿病に由来し、または糖尿病に伴う合併症の治療および／または予防のための薬剤、肥満に由来し、または肥満に伴う合併症および障害の治療および／または予防のための薬剤から選択される。このように薬理学的に活性のある物質の例は、インスリン、スルホニル尿素、ビグアナイド、メグリチナイド、グルコシダーゼ阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト、DPP-IV（ジペプチジルペプチダーゼIV）阻害剤、糖新生および／または糖原分解の刺激作用に含まれる肝酵素の阻害剤、グルコース取り込み調節因子、HMG CoA阻害剤としての抗高脂血症薬（スタチン類）のような脂質代謝を調節する化合物、食物摂取を抑える化合物、RXRアゴニスト、β細胞のATP依存性カリウムチャネルに対する活性剤；コレスチラミン、コレスチポール、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、プロブコール、デキストロチロキシン、ナテグリニド、レパグリニド；アルプレノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、プロプラノロール、メトプロロールのようなβ-遮断薬、 ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、アラトリオプリル、キナプリル、ラミプリルのようなACE（アンギオテンシン変換酵素）阻害薬、ニフェジピン、フェロジピン、ニカルジピン、イスラジピン、ニモジピン、ジルチアゼム、ベラパミルのようなカルシウムチャネル遮断薬、ドキサゾシン、ウラピジル、プラゾシン、テラゾシンのようなα-遮断薬；CART（コカイン、アンフェタミン転写調節）アゴニスト、NPY（ニューロペプチドY）アンタゴニスト、MC4（メラノコルチン4）アゴニスト、オーレキシンアンタゴニスト、TNF（腫瘍壊死因子）アゴニスト、CRF（コルチコトロピン調節因子）アゴニスト、CRF BP（コルチコトロピン調節因子結合タンパク質）アンタゴニスト、ウロコルチンアゴニスト、β3アゴニスト、MSH（メラニン細胞刺激ホルモン）、MCH（メラニン細胞濃縮ホルモン）アンタゴニスト、CCK（コレシストキニン）アゴニスト、セロトニン再取り込み阻害剤、セロトニンおよびノルアドレナリン再取り込み阻害剤、セロトニンおよびノルアドレナリン作動性化合物の混合物、5HT（セロトニン）アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン調節化合物、TRH（甲状腺ホルモン調節ホルモン）アゴニスト、UCP2または3（脱共役タンパク質2または3）修飾因子、レプチンアゴニスト、DAアゴニスト（ブロモクリプチン、ドプレキシン）、リパーゼ／アミラーゼ阻害剤、RXR（レチノイドX受容体）修飾因子、TRβアゴニスト；ヒスタミンH3アンタゴニストである。
【０１２７】
本発明による化合物と１以上の上記の化合物、更に付加的な１以上の薬理学的活性物質との幾つかの適した組み合わせは、本発明の範囲内とみなされることが理解されるべきである。
【０１２８】
本発明を以下の実施例によって更に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。先の説明および以下の実施例で開示した特徴は単独でもまたその幾つかの組み合わせとしても、本発明をさまざまな形態で実現するために重要である。
【０１２９】
もう一つの側面において、本発明は、一般式(Ｉ)による化合物および薬学的に容認される保存剤からなる医薬品成分である。
【０１３０】
本発明の一つの実施形態において、この医薬品成分は、一般式(Ｉ)による化合物および薬学的に容認される安定化剤とからなる医薬品成分である。
【０１３１】
本発明のもう一つの実施形態において、この医薬品成分は、非経口的な投与に適している。
【０１３２】
一つの側面において、本発明は薬物の調製のための一般式(Ｉ)で表される化合物の使用に関連がある。
【実施例】
【０１３３】
一般的製法（Ａ）
一般的合成法
ペプチドはFmocで保護されたRinkアミド樹脂（ノババイオケム(Novabiochem)）またはクロロトリチル樹脂上でFmoc法を用いて、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems )433Aペプチド合成機により0.25mmolの規模で、製造業者により提供されたFastMoc UVプロトコルを使用して合成した。該プロトコルは、N-メチルピロリドン（N-メチルピロリドン）におけるHBTU（ヘキサフルオロリン酸2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3テトラメチルウロニウム）媒介性のカップリング、およびFmoc保護基の脱保護のUVモニタリングを使用する。使用した保護されたアミノ酸誘導体は、Fmoc-Aib-OH (Fmoc-アミノイソブチル酸)のような合成アミノ酸を除き、ABI433A合成機に適した予め秤量されたカートリッジ中に供給された標準Fmocアミノ酸（アナスペック(Anaspec）)であった。
【０１３４】
粗製樹脂に結合された保護されたペプチド上の特定のリジン残基への側鎖およびリンカーの結合は、自動合成の間に、Fmoc-Lys(Dde)-OHの組み込みにより特定の位置において行われた。  
Dde-保護の除去のための手法 
樹脂(0.25mmol)を手動の振盪器／ろ過器具に入れ、N-メチルピロリドン中中の2％ヒドラジンで処理し(20 mL、2x12 min)てDDE基を除去し、N-メチルピロリジン(4x20 mL)で洗浄した。
【０１３５】
リジン残基に側鎖を結合するための手法
アミノ酸（樹脂に対して4モル当量）をN-メチルピロリドン／塩化メチレン(1：1、20mL)に溶解した。ヒソロキシベンゾトリアゾール(HOBt)（樹脂に対して4モル当量）およびジイソプロピルカルボジイミド(樹脂に対して4モル当量)を加え、その溶液を15分間撹拌した。その溶液を樹脂に加え、ジイソプロピルエチルアミン(樹脂に対して4モル当量)を加えた。その樹脂を24時間、室温で振盪した。樹脂をN-メチルピロリドン(2×20mL)、N-メチルピロリドン／塩化メチレン(1：1)(2×20mL)、および塩化メチレン(2×20mL)で洗浄した。
【０１３６】
Dde-保護の除去のための手法：樹脂(0.25mmol)を手動振盪機中の吸引ビンにいれ、N-メチルピロリドン／塩化メチレン(1：1)(2×20mL)およびN-メチルピロリドン(1×20mL)、N-メチルピロリドン中の20％ピペリジン溶液(3×20mL、それぞれ10分間)で処理した。樹脂をN-メチルピロリドン(2×20mL)、N-メチルピロリドン／塩化メチレン(1：1)(2×20mL)、および塩化メチレン(2×20mL)で洗浄した。
【０１３７】
ペプチドを樹脂から切断するための手法：
ペプチドはトリフルオロ酢酸、水、およびトリイソプロピルシラン(95：2.5：2.5)の混合物とともに180分間、室温で撹拌することにより樹脂から切断した。切断混合物はろ過し、ろ液を窒素の流れで油状に濃縮した。未精製のペプチドは45mLのジエチルエーテルを加え、45mLのジエチルエーテルで3回洗浄することでこの油分から沈殿させた。
【０１３８】
精製：未精製のペプチドは、7μ C-18 シリカを充填した20mm×250mmのカラムを用いた半分取用HPLCによって精製した。そのペプチドに依存して、2，1または2の精製系を用いた。
【０１３９】
TFA：乾燥後の未精製のペプチドを5mLの50％酢酸水溶液に溶解し、水で20mLに希釈し、カラムに注入した。その後、0.1%TFA中の40-60％CH3CNの勾配を用いて、40℃で50分間、10mL／minの流速で溶出させた。ペプチドを含む画分を回収した。精製されたペプチドは水で溶出物を希釈した後、凍結乾燥した。
【０１４０】
硫酸アンモニウム：カラムを、濃H2SO4でpH2.5に調節した0.05M硫酸アンモニウム溶液中の40％CH3CNで平衡化した。乾燥後の未精製ペプチドを50％酢酸水溶液5mLに溶解し、水で20mLに希釈し、カラムに注入した。その後、0.05M (NH4)2SO4中の40-60％CH3CNの勾配、pH2.5を用いて、40℃で50分間、10mL／minで溶出させた。画分を含むペプチドを回収し、3倍の水で希釈し、0.1%TFAで平衡化したセプ-パック（Sep-Pak（登録商標））C18カートリッジ(Waters part. #:51910 )を通過させた。その後0.1%TFAを含む70％CH3CNで溶出し、精製ペプチドは水で溶出物を希釈した後、凍結乾燥した。
【０１４１】
得られた最終生成物は分析用RP-HPLC（保持時間）およびLCMSにより特定した。
【０１４２】
RP-HPLC分析では、214nmにおけるUV検出を用い、Vydac 218TP54 4.6mm x 250mm 5m C-18 シリカカラム(セパレーションズグループ(The Separations Group)、ヘスペリア(Hesperia)、USA)を用いて42℃、1mL／minで溶出させた。異なる2つの溶出条件が用いられた。
【０１４３】
A1：濃H2SO4でpH2.5に調整した0.1M (NH4)2SO4からなる緩衝液でカラムの平衡化を行い、50分間、同じ緩衝液中の0％〜60％CH3CNの勾配により溶出；
B1：0.1%TFA／水でカラムの平衡化を行い、0％CH3CN／0.1％TFA／水〜60％CH3CN／0.1％TFA／水で50分間溶出；
B6：0.1％TFA／水でカラムの平衡化を行い、0％CH3CN／0.1％TFA／水〜90％CH3CN／0.1％TFA／水で50分間溶出。
【０１４４】
LCMSは、ヒューレットパッカード（Hewlett Packard）シリーズ 1100 G1312A ビンポンプ（Bin Pump）、ヒューレットパッカードシリーズ 1100 カラムコンパートメント、ヒューレットパッカードシリーズ 1100 G1315A DAD ダイオードアレイ検出器、ヒューレットパッカードシリーズ 1100 MSD 、およびHP ケムステージョンソフトウェア（Chemstation software）により制御されるセデア（Sedere）75 蒸発散乱光検出器により構成される装置により行った。HPLCポンプは以下示す2つの溶出液槽に接続される。
【０１４５】
A：水中の10mM NH4OH
B:90%アセトニトリル中の10mM NH4OH
この分析は、AとBの濃度で溶出されたカラムに適切な量の試料（なるべく20μL）を注入し、23℃で行った。
【０１４６】
使用したHPLC条件、検出器設定、マススペクトロメーター設定は以下に示すとおりである。
【０１４７】
カラム：  Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 μm
勾配：  線形5％〜100％アセトニトリル、6.5分間、1.5mL／min
検出：  210 nm (DADからのアナログ検出)
ELS（ELSからのアナログ検出）：
MSイオン化モードAPI-ES、走査：0.1 amu間隔で100〜1000 amu
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（MALDI-MS）は、窒素レーザーが備えられたボイジャー（Voyager ）RP MALDI-TOF機器 (Perseptive Biosystems Inc.、Framingham、MA)により行った。この機器は抽出遅延を伴う比例モードで操作され、イオン源における加速電圧は25kVであった。試料調製は以下のように行った。1μLの試料溶液(0.5-1.0 mg／mL)を10μLの基質溶液（シナピン酸をアセトニトリル：水：3％TFAを5：4：1で混合したものに溶解）と混合し、1μLを試料プレート上に置き、乾燥させた。使用した直鎖ペプチド標準物質が低分子領域に存在するときには外側の目盛りのみが働くので、血清アルブミンの範囲(＞60kDa)において質量の正確な決定を保証するには不十分である。
【０１４８】
結果として、決定された正確な質量値は0.2％以内の精度にすぎない。
【０１４９】
例1
S-ガンマ34-(1-{2-[2-(2-([D-Ala8,Lys37]-GLP-1-(7-37)アミド-Nε37-イル)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル)アルバゲン
【化１８】
2007537142.tif 000011
【０１５０】
樹脂（Rinkアミド、0.68mmol／g ノババイオケム（Novabiochem） 0.25mmole）は、ABI433A機で製造者ガイドラインに従って一次配列を作るために使用された。37位に使われた残基(FmocLys(ivDde)-OH、ノババイオケム（Novabiochem)）を除き、全ての保護基は酸に対して不安定であり、これにより他の如何なるリジンよりも、このリジンに対する特異的な脱保護を可能にする。
【０１５１】
手順
樹脂(0.25mmol)を手動の振盪／ろ過装置に入れ、N-メチルピロリドン中の2％ヒドラジン(2x12 min. 2x20 mL)で処理して、Dde基を除去した。樹脂を、N-メチルピロリドン(4x20 mL)で洗浄した。Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（ネオシステム（Neosystem）FA03202）(樹脂に対して4モル当量)を、N-メチルピロリドン／塩化メチレン(1:1、20 mL)に溶解した。ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）（樹脂に対して4モル当量）およびジイソプロピルカルボジイミド（樹脂に対して4モル当量）を加え、その溶液を15分間撹拌した。該溶液を樹脂に加え、ジイソプロピルエチルアミン（樹脂に対して4モル当量）を加えた。樹脂を24時間、室温で撹拌した。樹脂をN-メチルピロリドン(4x20 mL)で洗浄した。N-メチルピロリドン中の20％ピペリジン溶液（3×20mL、10分ごと）を振盪中の樹脂に加えた。樹脂をN-メチルピロリドン(4x20 mL)で洗浄した。3-プロピオン酸マレイミド（樹脂に対して4モル当量）を、N-メチルピロリドン／塩化メチレン（1:1、20 mL）に溶解した。ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（HOBt; H2O）（樹脂に対して4モル当量）およびジイソプロピルカルボジイミド（樹脂に対して4モル当量）を加え、その溶液を15分間撹拌した。その溶液を樹脂に加え、ジイソプロピルエチルアミン（樹脂に対して4モル当量）を加えた。樹脂を24時間、室温で撹拌した。樹脂をN-メチルピロリドン(2x20 mL)、N-メチルピロリドン／塩化メチレン(1：1) (2x20mL)、および塩化メチレン(2x20mL)で洗浄した。室温で180分間、トリフルオロ酢酸、水、およびトリイソプロピルシラン（95:2.5:2.5）の混合物とともに撹拌することにより、ペプチドはを樹脂から切断した。その切断混合物をろ過し、ろ液を窒素流により油状物へと濃縮した。未精製のペプチドは、45mLのジエチルエーテルを加え、45mLのジエチルエーテルで3回洗浄することによって、この油状物から沈殿させた。該未精製のペプチドは、7μ C-18 シリカを充填した20mm×250mmのカラムを用いた半分取方HPLCによって精製した。未精製のペプチドを5mLの50％酢酸水溶液に溶解し、水で20mLに希釈し、カラムに注入した。その後、40-60％の勾配（水および0.1%TFA中のアセトニトリル）を用いて40℃で50分間、10mL／minで溶出させた。ペプチドを含有する画分を回収した。精製されたペプチドは、溶出液を水で希釈した後に凍結乾燥し、これによりNε37-(2-(2-(3-(マレイミド)プロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)アセチル)[D-Ala8,Lys37] GLP-1 (7-37)アミドを得た。
【０１５２】
HPLC: (方法 B6): RT=  36.8 min
HPLC: (方法 A1): RT= 35.1 min
LCMS: m／z =  931.4 (M+H)4+、1241.5 (M+H)3+. Calculated (M+H)+ = 3722.1
凍結乾燥されたNε37-(2-(2-(3-(マレイミド)プロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)アセチル)[D-Ala8,Lys37] GLP-1 (7-37)アミドを、10μLの10% 酢酸に溶解し、pH 7.0の無機正リン酸ナトリウム50mM および4％ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン（HP-β-CD）中の800μLの40mg／mL アルバゲン（ニューセンチュリーファルマ (New Century Pharma)）を加え、周囲温度で2時間撹拌した。引き続いて、固体の硫酸アンモニウムを2Mの最終濃縮物にまでゆっくりと加えた。その抱合体を全量1mLのリソース（Resource）（登録商標）HIC ISOで精製した。流速は1mL／minに維持した。緩衝液: 50mM 無機正リン酸ナトリウム pH 7.0 + 4 %ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン (HP-β-CD )。アルバゲンを抱合体から分離するために、20カラム容積以上の2M〜0Mの硫酸アンモニウム濃度勾配を用いた。クロマトグラムは2つの溶出ピークを示した。1つ目のピークはアルバゲンで、2つ目のピークは抱合体を含む。この抱合体を濃縮し、30,000Daの分子量カットオフ値をもつセントリプレプ（centriprep）（登録商標）装置上で、未反応のアナログから分離した。回収率は25-35%であった。抱合の部位はペプチドマッピングによりCys-34であると決定された。
【０１５３】
MALDIにより決定された質量は70023Daである。
【０１５４】
抱合体の理論的な分子量は70046Daである。
【０１５５】
例2
S-ガンマ34-(1-{2-[2-(2-([Aib8,22,25,Lys37]-GLP-1-(7-37)アミド-Nε37-イル)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル)アルバゲン
この化合物は例1のように調製した。
【０１５６】
GLP1前駆物質のデータ
HPLC: (方法 B1): RT= 38.5 min
HPLC: (方法 A1): RT= 36.9 min
LCMS: m／z =   949.0 (M+H)4+、1264.9 (M+H)3+. Calculated (M+H)+ = 3792.2
【化１９】
2007537142.tif 000012
【０１５７】
MALDIにより決定された質量は70102Daである。
【０１５８】
抱合体の理論的な分子量は70116Daである。
【０１５９】
例3
S-ガンマ34-((1-{2-[2-(2-([ Aib8,Arg26,34,Glu22,23,30]-GLP-1-(7-37))Lys アミド-Nε-イル)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル)アルバゲン
この化合物は例1によって調製した。
【０１６０】
GLP1前駆物質のデータ
HPLC: (方法 B1): RT=  36.5 min
HPLC: (方法 A1): RT= 34.9 min
LCMS: m／z =  (M+H)3+ = 1327.8 Calculated (M+H)+ =  3980.3
【化２０】
2007537142.tif 000013
【０１６１】
MALDIにより決定された質量は70208Daである。
【０１６２】
抱合体の理論的な分子量は70304Daである。
【０１６３】
例4
例1で述べた方法に従って合成した他の化合物：
S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Lys32]-エキセンディン-(1-39)アミド-N-ε32-yl)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-yl)アルブミン［ここでアルブミンはニューセンチュリーファルマの組み換えアルバゲン、即ち組み換えHSA(2-585)である］。
【０１６４】
S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Lys20]-エキセンディン-(1-39)アミド-N-ε20-yl)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-yl)アルブミン［ここでアルブミンはニューセンチュリーファルマの組み換えアルバゲン、即ち組み換えHSA(2-585)である］。
【０１６５】
S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Arg12,Lys27]-エキセンゼィン-(1-39)アミド-N-ε27-yl)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-yl)アルブミン［ここでアルブミンはニューセンチュリーファルマの組み換えアルバゲン、即ち組み換えHSA(2-585)である］。
【０１６６】
S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Arg12,27,Lys32]-エキセンディン-(1-39)アミド-N-ε32-yl)アセチルオキシエトキシ)エチルカルバモイル]エチル}-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-yl)アルブミン［ここでアルブミンはニューセンチュリーファルマの組み換えアルバゲン、即ち組み換えHSA(2-585)である］。
【配列表】
2007537142000001.app
【国際調査報告】
2007537142.tif 000022
2007537142.tif 000023
2007537142.tif 000024