(57)【要約】  分析物を検出するためのセンサであって、ヒドロゲル、コア中に配置された蛍光試薬、コアを囲む半透性コーティング、ここでこの半透性コーティングは約４ｋＤａから約１８ｋＤａの分子量及び１超の多分散性指数を有する多分散ポリマーを含む、及び半透性コーティングを囲む生体適合性コーティングを含んだコアを含むものが開示されている。
2007510161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物を検出するためのセンサであって：
ヒドロゲルを含んで成るコア；
コア中に配置された蛍光試薬；
コアを囲む半透性コーティング、ここで当該半透性コーティングは約４ｋＤａから約１８ｋＤａの重量平均分子量及び１超の多分散性指数を有する多分散ポリマーを含んで成る；及び
半透性コーティングを囲む生体適合性コーティング、
を含んで成るセンサ。
【請求項２】
前記生体適合性コーティングが約１μｍから約２５μｍの厚さを有している、請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記蛍光試薬がコア中で移動可能である、請求項１に記載のセンサ。
【請求項４】
前記多分散ポリマーがポリリジンを含んで成る、請求項１に記載のセンサ。
【請求項５】
前記センサが１ｍｍ超の直径を有している、請求項１に記載のセンサ。
【請求項６】
前記センサが少なくとも１．２５ｍｍの直径を有している、請求項１に記載のセンサ。
【請求項７】
前記分析物がグルコースを含んで成る、請求項１に記載のセンサ。
【請求項８】
前記センサが非放射性蛍光共鳴エネルギー転移に基づいた分析物の検出が可能である、請求項１に記載のセンサ。
【請求項９】
前記蛍光試薬がカルボシアニン色素、スルホン化アミノクマリン色素、スルホン化ローダミン色素、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１０】
前記蛍光試薬がグルコース結合タンパク質及びグリコシル化基質を含んで成る、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１１】
前記グルコース結合タンパク質がコンカナバリンＡを含んで成り、且つ前記基質がヒト血清アルブミンを含んで成る、請求項１０に記載のセンサ。
【請求項１２】
前記蛍光試薬が、約５８１ｎｍでの励起最大及び約５９６ｎｍでの放射最大を有する第一のカルボシアニン色素、コンカナバリンＡ、約６７５ｎｍでの励起最大及び約６９４ｎｍでの放射最大を有する第二のカルボシアニン色素、及びヒト血清アルブミンを含んで成る、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１３】
前記グルコース結合タンパク質が組み換えコンカナバリンＡを含んで成る、請求項１１に記載のセンサ。
【請求項１４】
前記第一のカルボシアニン色素のコンカナバリンＡに対するモル比率が約０．１から約０．４である、請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１５】
前記第二のカルボシアニン色素のヒト血清アルブミンに対するモル比率が約０．５から約０．９である、請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１６】
前記ヒト血清アルブミンがグリコシル化されている、請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１７】
前記蛍光試薬が、約５７８ｎｍでの励起最大及び約６０３ｎｍでの放射最大を有する第一の色素、コンカナバリンＡ、約６５０ｎｍでの励起最大及び約６６５ｎｍでの放射最大を有する第二の色素、及びヒト血清アルブミンを含んで成る、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１８】
蛍光試薬を含むコアを含んで成るセンサの作製方法であって、
第一の水性アルギン酸組成物の液滴とグループＩＩカチオンを含んで成るイオン溶液とを接触させて、架橋ゲルコアを形成すること、ここで当該第一の水性アルギン酸組成物は水、アルギン酸、及び任意に蛍光試薬を含んで成る、
を含んで成る方法であって、さらに少なくとも、
コアと蛍光試薬とを接触させること、及び
コアと１超の多分散性指数を有する多分散ポリマーを含んで成る組成物とを接触させること、
の１つを含んでなる方法。
【請求項１９】
前記多分散ポリマーがコア上にコーティングを形成し、前記方法が生体適合性組成物で多分散ポリマーコーティングの表面を覆うことをさらに含んで成る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記センサが、ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１５Ｍ 食塩水中において３７℃で２週間保存した場合に、１モル％未満の蛍光試薬の漏出を示す、請求項１に記載のセンサ。
【請求項２１】
分析物を検出するためのセンサであって：
ポリマーマトリクスを含んで成るコア；
コア中に配置された蛍光試薬；
コアを囲む半透性コーティング、ここで当該半透性コーティングは多分散ポリマーを含んで成る；及び
半透性コーティングを囲む生体適合性コーティング、
ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１５Ｍ 食塩水中において３７℃で２週間保存した場合に、１モル％未満の蛍光試薬の漏出を示すセンサ、
を含んで成るセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースなどの分析物を検出するためのセンサを調製することに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病患者を効果的に治療するためには、糖尿病患者個人におけるグルコース濃度の変化をモニタリングする必要がある。現在のところ、糖尿病患者は繰り返し指を刺して評価用の血液サンプルを得ることにより、彼らの状態をモニターしている。グルコースの自己モニタリングは不連続であり、且つ個人のグルコース濃度に関するリアルタイムの情報を提供してくれない。
【０００３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのグルコース濃度の検出が可能な試薬を含む移植型センサを含め、グルコース濃度の連続的なモニタリング用の様々なシステムが提案されてきた。しかし、宿主（ｈｏｓｔ）内で適切に機能するセンサの能力に影響を与える多くの要素により、実用的な移植型センサを得るのは困難であった。宿主の免疫システムが、例えばセンサに対して攻撃をしかける可能性がある。その攻撃は、センサの周りにおける線維鞘の形成を引き起こす可能性がある。その線維鞘は、グルコースがセンサに入るのを邪魔し、そして妨げ、センサを本質的に無能にしてしまうかもしれない。宿主免疫システムの様々な成分は、もしその成分がセンサに入ることができる場合には、センサの試薬を攻撃する可能性もある。センサの透過性が高過ぎると、試薬がセンサから宿主へ漏出する可能性がある。それは宿主に害を及ぼす可能性があり、グルコースの検出に使用可能な試薬の量を激減させてしまう。さらに、センサの透過性が制限され過ぎていたり又はセンサ試薬の反応が宿主グルコース濃度の変化に対して遅すぎる場合には、センサにより与えられる情報は宿主の生理的状態を正確に描写しない。これらの困難を克服し、そして長時間の連続的なグルコースのモニタリングを提供するセンサが得られることが望ましいだろう。
【発明の開示】
【０００４】
概要
１つの側面において、本発明は、分析物を検出するためのセンサ、ヒドロゲルを含むコア（ｃｏｒｅ）を含んだセンサ、コア中に配置された蛍光試薬、コアを囲む半透性コーティング、ここでこの半透性コーティングは約４ｋＤａから約１８ｋＤａの分子量及び１超の多分散性指数を有する多分散ポリマーを含む、及び半透性コーティングを囲む生体適合性コーティングを特徴とする。いくつかの実施態様において、多分散ポリマーは約８ｋＤａから約１２ｋＤａの分子量を有する。他の実施態様において、多分散ポリマーは約９ｋＤａから約１０ｋＤａの分子量を有する。一つの実施態様において、多分散ポリマーは約９．４ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、多分散ポリマーは１超から約１．５までの多分散性指数を有する。他の実施態様において、多分散ポリマーはポリリジンを含む。
【０００５】
一つの実施態様において、センサは１ｍｍ超の直径を有する。他の実施態様において、センサは少なくとも１．２５ｍｍの直径を有する。別の実施態様において、センサは少なくとも１．５ｍｍの直径を有する。いくつかの実施態様において、センサは３ｍｍ以下の直径を有する。他の実施態様において、センサは２．５ｍｍ以下の直径を有する。
【０００６】
いくつかの実施態様において、分析物はグルコースを含む。
【０００７】
一つの実施態様において、センサは非放射性蛍光共鳴エネルギー転移に基づいて分析物を検出することが可能である。いくつかの実施態様において、蛍光試薬はエネルギーアクセプタ及びエネルギードナーを含む。他の実施態様において、蛍光試薬は、カルボシアニン色素、スルホン化アミノクマリン色素、スルホン化ローダミン色素、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。一つの実施態様において、蛍光試薬はグルコース結合タンパク質及びグリコシル化基質を含む。いくつかの実施態様において、グルコース結合タンパク質はコンカナバリンＡを含み、そしてグリコシル化基質はヒト血清アルブミンを含む。別の実施態様において、蛍光試薬は、約５８１ｎｍでの励起最大及び約５９６ｎｍでの放射最大を有する第一のカルボシアニン色素、コンカナバリンＡ、約６７５ｎｍでの励起最大及び約６９４ｎｍでの放射最大を有する第二のカルボシアニン色素、及びヒト血清アルブミンを含む。他の実施態様において、コンカナバリンＡに対する第一のカルボシアニンの比率は約０．１から約０．４である。いくつかの実施態様において、コンカナバリンＡに対する第一のカルボシアニンの比率は０．２である。一つの実施態様において、ヒト血清アルブミンに対する第二のカルボシアニンの比率は約０．５から約０．９である。
【０００８】
いくつかの実施態様において、ヒト血清アルブミンはグリコシル化され、そしてヒト血清アルブミンに対するグルコースのモル比率は約７から約１２である。
【０００９】
別の側面において、本発明は、水性アルギン酸組成物の液滴と少なくとも１００ｍＭのグループIIカチオンを含むイオン溶液とを接触させて架橋ゲルを含むコアを形成することを含む、センサの作製方法を特徴とする（水性アルギン酸組成物は、少なくとも１％重量／体積のアルギン酸を含み且つ約２５℃で少なくとも１７００センチポアズの粘度を有するストック組成物の倍数希釈を含む）。一つの実施態様において、イオンはバリウムイオン、カルシウムイオン又はそれらの組み合わせを含む。
【００１０】
いくつかの実施態様において、そのアルギン酸組成物は約１％重量／体積から約１０％重量／体積のアルギン酸を含む。他の実施態様において、そのアルギン酸組成物は約１％重量／体積から約３％重量／体積のアルギン酸を含む。
【００１１】
一つの実施態様において、ストック組成物は約２５℃で約１７００ｃｐｓから約２０００ｃｐｓの粘度を有する。
【００１２】
他の実施態様において、そのイオン溶液は約１００ｍＭのカチオンから約３００ｍＭのカチオンを含む。
【００１３】
いくつかの実施態様において、その方法はさらに、１超の多分散性指数を有する多分散ポリマーを含む組成物でコアの表面を覆うことを含む。他の実施態様において、その方法はさらに、１超から約１．５までの多分散性指数を有する多分散ポリマーを含む組成物でコアの表面を覆うことを含む。別の実施態様において、その方法はさらに、表面を覆った多分散ポリマーの表面を生体適合性組成物で覆うことを含む。一つの実施態様において、その方法はさらに、蛍光試薬を含む組成物とコアを接触させることを含む。
【００１４】
いくつかの実施態様において、その水性アルギン酸組成物は、蛍光試薬を含む。一つの実施態様において、その蛍光試薬はエネルギードナー及びエネルギーアクセプタを含む。他の実施態様において、その蛍光試薬はグルコース結合タンパク質及びグルコシル化基質を含む。一つの実施態様において、グルコース結合タンパク質はコンカナバリンＡを含み、そしてグリコシル化基質はヒト血清アルブミンを含む。いくつかの実施態様において、蛍光試薬は、カルボシアニン色素、スルホン化アミノクマリン色素、スルホン化ローダミン色素、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。他の実施態様において、蛍光試薬は、カルボシアニン色素、スルホン化アミノクマリン色素、スルホン化ローダミン色素、及びそれらの組み合わせからなる群を含む。別の実施態様において、コンカナバリンＡに対する第一のカルボシアニンの比率は約０．１から約０．４である。他の実施態様において、コンカナバリンＡに対する第一のカルボシアニンの比率は０．２である。いくつかの実施態様において、ヒト血清アルブミンに対する第二のカルボシアニンの比率は約０．５から約０．９である。一つの実施態様において、グルコース結合タンパク質はコンカナバリンＡを含み、そしてグリコシル化基質はヒト血清アルブミンを含む。別の実施態様において、ヒト血清アルブミンはグリコシル化され、そしてヒト血清アルブミンに対するグルコースのモル比率は約７から約１２である。
【００１５】
他の実施態様において、蛍光試薬は、約５７８ｎｍでの励起最大及び約６０３ｎｍでの放射最大を有する第一の色素、コンカナバリンＡ、約６５０ｎｍでの励起最大及び約６６５ｎｍでの放射最大を有する第二の色素、並びにヒト血清アルブミンを含む。
【００１６】
いくつかの実施態様において、そのセンサは、ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１５Ｍ 食塩水中において３７℃で２週間保存した場合、１モル％未満の蛍光試薬の漏出を示す。
【００１７】
別の側面において、本発明は、分析物を検出するためのセンサ、ポリマーマトリクスを含むコアを含んだセンサ、コア中に配置された蛍光試薬、コアを囲む半透性コーティング、ここでこの半透性コーティングは多分散ポリマーから成る、及び半透性コーティングを囲む生体適合性コーティング、を特徴とする。そのセンサは、ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１５Ｍ 食塩水中において３７℃で２週間保存した場合、１モル％未満の蛍光試薬の漏出を示す。
【００１８】
本発明は、グルコースなどの分析物を検出するのに有用な、移植可能、外植可能なセンサを特徴とする。センサは、移植及び外植可能であるために十分硬く、そして通常の一日の中で身体が遭遇する様々な力に破裂せずに直面するために十分変形可能であり、触診可能であるために十分大きい。センサは、宿主がセンサの周りに鞘（ｓｈｅａｔｈ）を形成するのを誘導するために十分大きくもある。ここで形成された鞘は、センサを適所に保持するために十分厚く、且つ生理学的に有用な速度で対象の分析物がセンサに拡散しそしてセンサから出て行くことを可能とするために十分薄い。センサは、生理学的に有用な速度で分析物がセンサに拡散しそしてセンサから出て行くことを可能とするために十分小さい。センサは、少なくとも６ヶ月間、又はさらに少なくとも１２ヶ月間宿主内で安定であるために十分機械的に頑丈であり、且つ少なくとも６ヶ月間、又はさらに少なくとも１２ヶ月間センサの適切な機能にとって有害な線維化反応を引き出さないようにするために十分生体適合可能である。センサは、生理学的に適切な速度で分析物がセンサに拡散しそしてセンサから出て行くことを可能とするために十分透過性があり、且つ試薬がセンサ内に留まるように十分不透過性であり（すなわち、センサは試薬漏出をしないか又は本質的に試薬漏出をしない）、且つＩｇＧはセンサへの到達が妨げられそして本質的に阻止される。
【００１９】
好ましい実施態様についての下記の説明及び特許請求の範囲から、その他の特徴及び利点が明らかになる。
【００２０】
用語の解説
本発明に関して、これらの用語は下記の意味を有する：
【００２１】
ここで使用される「蛍光因子（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）」という用語は、エネルギーを吸収し、そしてその後光を放射する分子を指す。
【００２２】
ここで使用される「分析物−アナログ」という用語は、少なくとも幾つかの結合特性を分析物のそれと共有する物質であり、従って両者に結合するリガンドが存在するものを指す。しかし、分析物−アナログと分析物とは互いに結合しない。分析物−アナログは、分析物の誘導体、例えば、分析物の結合特性の少なくともいくつかに影響を与えることのない官能性化学基を分析物上に導入することにより調製された化合物であってよい。誘導体の別の例は、分析物のより低い分子量の異形であり、それは分析物の結合特性の少なくとも幾つかを維持する。誘導体の別の例は、分析物又は分析物の多重コピー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｐｉｅｓ）のキャリアタンパク質との共有結合体である。
【００２３】
ここで使用される「生体適合性」という用語は、宿主の免疫システムにとって許容できることを指す。すなわち、最小の免疫反応を誘発し且つ宿主に対して無毒であることを指す。
【００２４】
ここで使用される「蛍光」という用語は、特定の波長の放射による励起に応答して放射された放射線を指す。この用語は、短期の(ナノ秒の範囲)及び長期の励起状態寿命の両方を含み、後者はリン光と呼ばれることがある。
【００２５】
ここで使用される「蛍光試薬」という用語は、検出される分析物の存在において蛍光挙動（例えば、強度、放射励起状態の寿命、スペクトル、又は励起スペクトル）が変化する成分を指す。
【００２６】
ここで使用される放射最大又は励起最大への言及は、水中で得られる値に関する。
【００２７】
詳細な説明
センサは、ポリマーマトリクス及びポリマーマトリクス中に配置した試薬を含むコア、コアを囲む多分散ポリマーを含む半透性コーティング、並びに半透性コーティングを囲む生体適合性コーティングを含む。センサは、分析物が関係する生理的状態についての有意義な情報を提供する速度で、分析物がセンサに拡散しそしてセンサから出て行くことを可能とするのと同時に、試薬を保持するように構築されている。センサはｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はそれらの組み合わせでの使用に適するように構築することができ、そして例えば体液（例えば、血液、血漿、血清、皮下液、及び腹水）などを含む様々な液体中で分析物を検出するのに使用することができる。次に、センサの試薬を励起しそしてセンサにより放射される放射線を検出することにより、分析物を検出（及び、任意に定量化）する。
【００２８】
好ましいセンサは、皮下移植した際に触知可能とするために十分大きく（すなわち、その後の外移植の際に容易に位置決定ができるように）、そしてセンサの周りに鞘を形成するように宿主を誘導するために十分大きい。その鞘は宿主において適所にセンサを保持（例えば、固定）するように機能する。好ましくは、鞘は、生理学的に適切な速度で分析物がセンサに拡散しそしてセンサから出て行くことを可能とするために十分薄さである。
【００２９】
生理学的に適切な速度で分析物がセンサに拡散しそしてセンサから出て行くことを可能とするためにセンサは十分小さくもあり、そしてセンサ内の試薬は生理学的に適切な速度で生理学的条件の変化に反応する。任意の形のセンサに対して、分析物がセンサ中に拡散する特性時間は、センサの中心とその表面地点との間の平均距離に関して表すことができる。この距離をｘとし、分析物の拡散係数をＤとした場合、分析物がセンサを通り拡散するための特性時間（ｔ）は、ｔ＝ｘ2／６Ｄとして表すことができる。
【００３０】
好ましいセンサは球体であり、且つ直径は１ｍｍ超、少なくとも１．２５ｍｍ超、少なくとも１．５ｍｍ超、３ｍｍ以下、又はさらに２．５ｍｍ以下である。
【００３１】
有用なセンサ、例えば球形、円筒形、楕円形、卵形、及び円盤形などを含む様々な形を有する。センサは、一般的なポリマーマトリクスに囲まれた、多くのコア、すなわち多くのポリマーマトリクスを含むように構築することができる。
【００３２】
好ましくは、センサは、光散乱特性のない水の屈折率と実質的に同一で且つ水性環境で実質的に透明である屈折率を有する。
【００３３】
好ましくは、センサは、宿主への移植及び宿主からの外移植を可能とするために十分な機械的強度（例えば、硬さ）を有し、そして通常の一日の中で宿主が直面する力を吸収するために十分変形可能である。好ましくは、センサは、破砕することなく又はその完全性が喪失されることなく、例えば少なくとも６ヶ月、又はさらには少なくとも１２ヶ月といった長期間の間、宿主内で移植されたままであることを可能とするために十分な機械的強度を示す。
【００３４】
センサの機械的強度は、ポリマーマトリクス、半透性コーティング、生体適合性コーティング及びそれらの組み合わせによって得ることができる。保護キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）又はケーシング（ｃａｓｉｎｇ）の存在によって、センサに機械的強度を与えることもできる。そのようなケーシングとしては、例えば金属製のメッシュエンベロープ（ｍｅｓｈ ｅｎｖｅｌｏｐｅ）（例えば、チタン、白金、金及びそれらの組み合わせ）が挙げられる。ポリマーマトリクスの形成に使用される架橋可能な成分の濃度及びポリマーマトリクスの架橋の度合いを変えることにより、ポリマーマトリクスの機械的強度を変化させることができる。好ましくは、完全に水和された場合に最終のマトリクスが、少なくとも５０容量％、９０容量％、９２容量％、９５容量％、９８容量％又はさらに９９容量％の水となるように、架橋可能組成物からポリマーマトリクスを調製する。
【００３５】
好ましくは、ポリマーマトリクスはヒドロゲルである。ヒドロゲルはアルギン酸などの架橋可能組成物から形成することができる。有用な架橋可能アルギン酸組成物は、室温（すなわち、約２２℃から約２５℃）で、少なくとも１７００センチポアズ（ｃｐｓ）、又はさらに１７００ｃｐｓから約２０００ｃｐｓの粘度を有するアルギン酸の原液から調製され、それを使用前に１：１に希釈して、水中で少なくとも１％重量／体積（ｗ／ｖ）、約１％ｗ／ｖから約１０％ｗ／ｖ、又はさらに約１％ｗ／ｖから約３ｗ／ｖのアルギン酸を含む架橋可能組成物を形成する。
【００３６】
好ましくは、少なくとも１００ｍＭ（ミリモル）、約１００ｍＭから約３００ｍＭ、又はさらに約１００ｍＭから約１５０ｍＭのイオンを含む濃厚なイオン溶液中にアルギン酸組成物を滴下することにより、アルギン酸を架橋する。有用なイオンとしては、例えばカルシウムイオン、バリウムイオン、マグネシウムイオン、及びそれらの組み合わせを含むグループＩＩカチオンが挙げられる。
【００３７】
好ましいアルギン酸ゲルは、例えば交互ＭＧブロックで、互いに結合した１，４−結合の（Ｄ−マンヌロン酸）（Ｍ）及び（−１−グルコロニック（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｃ）酸）（Ｇ）のブロックを含むアルギン酸から得る。好ましいアルギン酸は高いＧブロック含有量を含み、例えば少なくとも約６０％のＧブロックを含む。アルギン酸組成物中のＧブロックの割合が増加すると、得られるゲルマトリクスの孔（ｐｏｒｅ）の大きさ及び強度が増加する。高いＭブロック含有量を有するアルギン酸ゲルは、高いＧブロック含有量を有するゲルと比較して免疫原性がより高くなるようである。
【００３８】
他の適切なゲルは、センサの所望の形状を維持するのに十分な強度を有するコアの形成が可能な任意のゲルを含む。有用なヒドロゲルの例としては、カラギーナン、ガム（例えば、キサンタンガム）、アガロース、寒天、コラーゲン、ゼラチン、キトサン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、及びそれらの組み合わせが挙げられる。その他の有用なポリマーマトリクスとしては、例えばポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３９】
ポリマーマトリクスを形成するための適切な方法としては、例えば、ゲル形成組成物へ水を加えること、架橋可能組成物を架橋剤にさらすこと、ゲル形成組成物の温度を変化（例えば、加熱）させること、ゲル形成組成物を放射線にさらすこと、及びそれらの組み合わせが挙げられる。センサの構成要素の完全性が保持されるように、ポリマーマトリクスを形成するための条件を選択する。組成物中の架橋可能成分の濃度、架橋剤の濃度、架橋プロセスの環境条件（例えば、温度、ｐＨ、塩度及び放射線）、連鎖移動剤の添加、開始剤の添加、及びそれらの組み合わせを変化させることにより、ポリマーマトリクスの架橋度を変えることができる。
【００４０】
或いは、コアは水溶液を含むことができる。その場合、半透性膜が選択され、センサを移植及び外移植に適合させるためにセンサに対して十分な硬さを提供する。
【００４１】
コアは、例えば球形、偏球形、長球形、円筒形及び円板形などを含む様々な形からなることができる。好ましくは、コアは球形ビーズの形態である。コアを形成するために、微小球形ビーズの任意の適切な作製方法を使用することができ、例えば乳化、エレクトロスプレー、点滴、ローリージェット（Ｒａｌｅｉｇｈ ｊｅｔ）（例えば、空気ジェット）、及び鋳造などが挙げられる。円筒形及び円盤形コアの有用な作製方法としては、例えば、後に切断が続く押し出し（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）、及び鋳造が挙げられる。
【００４２】
ポリマーマトリクスの多孔率（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）は、ポリマーマトリクスを通る成分の移動に影響を与え、そしていくつかの方法で変化させることができる。例えば、ポリマーマトリクスの形成に使用する組成物中の架橋可能成分の濃度を変えること、架橋可能材料の平均分子量を変えること、架橋可能成分の分子量分散度を変えること、架橋可能成分の組成を変えること、他の架橋可能成分で架橋可能成分をドーピング（ｄｏｐｉｎｇ）すること、異なる架橋剤を使用すること、架橋可能成分の水酸化の程度を変えること及びそれらの組み合わせが挙げられる。それから生成されるゲルを変化させるためにアルギン酸に加えることができる成分としては、例えばゼラチン及びコラーゲンが挙げられる。他の適切な架橋剤としては、例えばバリウムイオン、カルシウムイオンと同じバランス（ｖａｌａｎｃｅ）を有する他のイオン、タンパク質架橋剤（例えば、コンカナバリンＡなどのレクチンなど）、光誘起架橋剤、化学架橋剤（例えば、グルタルアルデヒドなど）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。多孔率を変えるため、チャージ（ｃｈａｒｇｅ）を加えることもでき又はゲルマトリクスから差し引くこともできる。アルギン酸の多孔率を変化させるための様々な有用なメカニズムが説明されている。例えば、Ｔｈｕ，Ｂ．Ｊ．の「Ａｌｇｉｎａｔｅ ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ： Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｏｍｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ａｓ ａ ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｐａｎｃｒｅａｓ」（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３５ページ−４６ページ (Ａｕｇｕｓｔ １９９６)）という表題の論文で、アルギン酸中のＧブロックに対するＭブロックの比率を変えることが含まれている。
【００４３】
ヒドロゲルの形成に使用する架橋可能組成物の温度は、得られるゲルマトリクスの孔の大きさに影響を与えることができる。例えば、架橋可能組成物の温度の上昇はヒドロゲルの縮小を生じさせることになり、それによりヒドロゲルの多孔率を減少させることができる。
【００４４】
好ましくは、コアのポリマーマトリクスは水の屈折率と実質的に同じ屈折率を有し、センサの試薬を励起するために使用する波長範囲において蛍光を発せず、そして光散乱特性がない。
【００４５】
好ましくは、センサの外側表面は光散乱を最小にし、そして好ましくは光散乱をなくすために、十分滑らかである。対物レンズの倍率が０．８Ｘから０．５Ｘで、接眼レンズの倍率が１０で、そして合計倍率が８Ｘから５０Ｘで照らされた透過光線リング（ｒｉｎｇ）の下で作動する立体解剖顕微鏡（ｓｔｅｒｅｏ ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）でセンサを見ることにより、センサ表面の滑らかさを判断する。滑らかなセンサを形成する１つの有用な方法は、架橋可能組成物の液滴を高濃縮の架橋剤に加え、そして架橋可能組成物を急速に架橋させてヒドロゲルコアを形成させることにより、滑らかなコアを形成することを含み、好ましくは振動を最小にする条件（例えば、振動絶縁）で行う。架橋アルギン酸に適した有用な濃縮架橋剤組成物としては、上記の架橋可能組成物及びイオン架橋溶液が挙げられ、その記載についてはここに盛り込まれている。
【００４６】
センサのコアは、分析物の存在を検出することができる試薬も含む。好ましくは、その試薬はポリマーマトリクス中で移動可能である。センサの試薬は１成分超を含むことができる。試薬は、例えば体液（例えば、血液及び間質液など）などの液体中での分析物の検出に適している。有用な試薬としては、例えばエネルギー吸収試薬（例えば、光吸収試薬及び音吸収試薬）、ｘ−Ｒａｙ試薬、スピン共鳴試薬、核磁気共鳴試薬、及びそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様において、試薬は十分な結合価を示し、それにより試薬が集まり、結合が起きている間、又はそうでなければ、結合が起きていない間に試薬により放射されるシグナルを増強させる。試薬の凝集は、試薬をセンサ中に保持するのにも役立つ。すなわち、試薬が半透性コーティングを通ってセンサから出て行かない。好ましくは、試薬は多価であり、例えば分析物に結合することのできる少なくとも２つの結合部位を含む。非放射性蛍光エネルギー転移に基づいた試薬の場合、下記でより詳細に論じているように、試薬は分析物−アナログ及び分析物−アナログに結合可能なリガンドを含むことができる。好ましくは、分析物−アナログはリガンドに対する少なくとも２つの結合部位を含む。好ましい試薬は少なくとも２つの結合価、２から１５の結合価、又は更に３から１０の結合価を有する。
【００４７】
検出器とセンサの間に配置される皮膚及び体の他の成分が、試薬により放射されるシグナルを妨害しないように、試薬が選択される。好ましい試薬は皮膚を透過する範囲内の波長の光シグナルを放射し、好ましくは、試薬は６００ｎｍから１１００ｎｍの範囲で放射する。
【００４８】
試薬の有用なクラスとしては蛍光試薬が挙げられる。すなわち、蛍光因子又は蛍光でラベルした化合物を含む試薬である。蛍光試薬は分析物に可逆的に結合することができ、そして試薬の蛍光挙動は分析物結合が起こった時に変化する。
【００４９】
分析物の存在に関連する蛍光の変化は、いくつかの方法で測定することができる。これらの変化は、蛍光因子（又は蛍光因子でラベルした成分）の励起状態寿命の変化、又は蛍光因子（又は蛍光因子でラベルした成分）により放射された蛍光強度の変化を含む。そのような変化には、蛍光因子（又は蛍光因子でラベルした成分）の励起スペクトル又は発光スペクトルの変化も含まれる。励起スペクトル又は発光スペクトルの変化は順々に、（ａ）放射ピークの出現又は消失、（ｂ）２又は複数の放射波長で観察されるシグナルの比率、（ｃ）励起ピークの出現又は消失、（ｄ）２又は複数の励起波長で観察されるシグナルの比率又は（ｅ）蛍光偏光の変化を測定することにより測定できる。
【００５０】
試薬は非放射性蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を示すように選択することができ、それは特異的結合対のメンバーの間における結合の発生及び程度を判断するのに用いることができる。
【００５１】
ＦＲＥＴの基本的要素
ＦＲＥＴは一般に、２つの蛍光因子の間、すなわち一方はエネルギードナー（Ｄ）と他方はエネルギーアクセプタ（Ａ）との間のエネルギーの非放射性転移を伴う。任意の適切に選択されたドナー−アクセプタ対を使用することができるが、但し、ドナーの発光がアクセプタの励起スペクトルとオーバラップし、両メンバーが１つの波長で光エネルギーを吸収し、異なる波長の光エネルギーを放射することができることを条件とする。
【００５２】
或いは、ドナー及びアクセプタは双方とも光エネルギーを吸収することができるが、しかしそれらのうち一方しか光エネルギーを放射しない。例えば、一方の分子（ドナー）は蛍光性であってよく、他方（アクセプタ）は非蛍光性であってよい。（蛍光性）ドナーを励起するのに使用する波長ではアクセプタは通常励起されないドナー−アクセプタ対を使用することも可能であるが、しかし、非放射性ＦＲＥＴはアクセプタ励起を引き起こさない。
【００５３】
励起波長は、それが主にドナー分子のみを励起するように選択することができる。「主に」という用語の使用は、映り込み（ｂｌｅｅｄｔｈｒｏｕｇｈ）現象により若干のアクセプタ励起もあり得ることを表す。従って、ここで用いられているように、ドナー又はアクセプタの「励起」は、ドナー又はアクセプタを主に励起する励起波長を指す。下記の励起、非放射性蛍光共鳴エネルギー転移は、２つの放射波長での蛍光シグナルの比率を測定することにより判断され、その一方はドナー放射によるもので、他方はアクセプタ放射によるものである。励起の場合には、アクセプタ励起がドナー放射シグナルにわずかに寄与し、逆の場合も同様である、蛍光シグナルの「ブリーディング（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）」が若干起こり得る。従って、シグナルがドナー放射又はアクセプタ放射「による」ものとして言及されている場合はいつでも、シグナルが主にドナー放射又はアクセプタ放射によることを意味している。
【００５４】
或いは、励起は、それが１番目の波長でドナーを励起しそして２番目の波長でアクセプタを励起するように、選択されることができる。すなわち、それぞれ異なった波長での２つの別個の励起事象が用いられる。この場合、ドナー励起後のアクセプタによる蛍光シグナルの比率及びアクセプタ励起後のアクセプタによる蛍光シグナルの比率を測定することにより、非放射性蛍光エネルギー転移を判断する。
【００５５】
ドナー寿命の減少、ドナー蛍光強度の消失、又はアクセプタ蛍光強度の増大があるかを評価することによってもＦＲＥＴを測定できる；後者の２つは異なる波長での励起に応答する波長で測定する（上記の比率測定とは対照的であり、それは２つの別個の波長における放射比率の測定又は２つの別個の波長での励起に起因する波長の放射比率の測定のどちらかを伴う）。
【００５６】
ドナー及びアクセプタはここでは「対」として言及されているが、その対の２つの「メンバー」は同じ物質であり得る。一般的に、その２つのメンバーは異なるものとなる（例えば、Ｃｙ３．５及びＣｙ５．５）。1つの分子（例えば、Ｃｙ３．５又はＣｙ５．５）が、ドナーとしてもアクセプタとしても役目を果たすことが可能であり、この場合、エネルギー転移は、蛍光の偏光解消を測定することにより判断される。
【００５７】
ＦＲＥＴを基礎とするグルコースの検出が可能なセンサのための特に有用な試薬としては、タンパク質に対する色素の比率が約０．１から約０．４、又はさらに約０．２でコンカナバリンＡ（例えば、組み換えコンカナバリンＡ）に結合したＣｙ５．５を含むアクセプタ、及びタンパク質に対する色素の比率が約０．５から約０．９で且つタンパク質に対するグルコースの比率が約７から約１２でヒト血清アルブミンに結合したＣｙ３．５を含むドナーが挙げられる。製造業者、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（ウェールズ  カージフ）により報告されている通り、Ｃｙ３．５は５８１ｎｍでの励起最大及び５９６ｎｍでの放射最大を有するカルボシアニン色素である。製造業者、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓにより報告されている通り、Ｃｙ５．５は６７５ｎｍでの励起最大及び６９４ｎｍでの放射最大を有するカルボシアニン色素である。
【００５８】
別の有用な試薬としては、コンカナバリンＡ（例えば、組み換えコンカナバリンＡ）と結合したＡＬＥＸＡ５６８を含むドナー及びヒト血清アルブミンと結合したＡＬＥＸＡ６４７を含むアクセプタが挙げられる。製造業者、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州、ユージーン）により報告されている通り、ＡＬＥＸＡ５６８は約５７８ｎｍでの励起最大及び約６０３ｎｍでの放射最大を有する。製造業者、Molecular Probesにより報告されている通り、ＡＬＥＸＡ６４７は約６５０ｎｍでの励起最大及び約６６５ｎｍでの放射最大を有する。
【００５９】
ドナー／アクセプタ対の他の例としては、ＮＢＤ  Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾル−４−イル）とローダミンとの対、ＮＢＤ又はフルオロセインとエオシン又はエリトロシンとの対、ダンシルとローダミンとの対、及びアクリジン・オレンジとローダミンとの対がある。ここで用いられているように、フルオロセインという用語は、様々な関連化合物及びそれらの誘導体を含む化合物のクラスを指す。同様に、ここで用いられているように、ローダミンという用語は、様々な関連化合物及びそれらの誘導体を含む化合物のクラスを指す。
【００６０】
好ましくは、センサは、４００ｎｍから８００ｎｍ、５３２ｎｍ、６３５ｎｍ、６４５ｎｍ、６５５ｎｍ、６６０ｎｍ、又はさらに６７０ｎｍの波長で励起することができ、且つ６００ｎｍから１１００ｎｍ又は６００ｎｍから７００ｎｍの波長で放射することができる試薬を含む。蛍光因子を含む色素の有用なクラスとしては、例えばカルボシアニン色素、アミノクマリン及びローダミンのスルホン化形態、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。これらの色素のいくつかに関する化学についてはさらに議論されており、例えばＰａｎｃｈｕｋ−Ｖｏｌｏｓｈｉｎａ， Ｎａｔａｌｉｙａ 他の「Ａｌｅｘａ Ｄｙｅｓ， ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｎｅｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅｓ ｔｈａｔ Ｙｉｅｌｄ Ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌｌｙ Ｂｒｉｇｈｔ， Ｐｈｏｔｏｓｔａｂｌｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第４７(９)巻 １１７９−１１８８ (１９９９)）である。商業的に入手可能であり有用な蛍光因子を含有する色素、それらの製造業者、及びそれらの対応するおおよその放射最大については、下記の表１で説明する。
【表１】
2007510161.tif 000003
【００６１】
エネルギードナー及びエネルギーアクセプタの有用な対については、下記の表２で説明する。
【表２】
2007510161.tif 000004
【００６２】
ＦＲＥＴの概念を図１に示す。ドナーの吸光及び発光（それぞれ、Ａ（Ｄ）、及びＥ（Ｄ）で示す）並びに、アクセプタの吸光及び発光（それぞれ、Ａ（Ａ）、及びＥ（Ａ）で示す）を、図１Ａにグラフとして示す。ドナーの発光スペクトルとアクセプタの吸光スペクトルとの間のオーバラップ領域（重なり積分）は重要である。励起が波長Ｉで起こる場合、ドナーによって波長ＩＩで光が放射されることになるが、しかし、アクセプタによって波長ＩＩＩで光が放射されることはない。なぜならば、アクセプタは波長Ｉで光を吸収することはないからである。
【００６３】
発生する非放射性転移プロセスを図１Ｂに示す。Ｄ分子はフォトンを吸収し、そのフォトンの電場ベクトルをＥで示す。Ｄの励起状態は、一方の側に正電荷を、他方の側に負電荷を有する双極子として示されている。アクセプタ分子（Ａ）がＤに十分に近接している（例えば、典型的に１００オングストローム未満)場合、Ａには対向電荷双極子が誘導される（Ａは励起状態にされる）。双極子誘導性のこの双極子間相互作用は、ドナー−アクセプタ分子間距離の６乗に反比例して低下する。
【００６４】
古典的には、部分エネルギー転移が起こり得る。しかし、これはＦＲＥＴにおいては起こらず、それは全か無かの量子力学的事象である。すなわち、ドナーはそのエネルギーの一部をアクセプタに与えることはできない。エネルギーの全てが転移されなければならず、エネルギーレベル（すなわちスペクトル）がオーバラップする場合にだけエネルギー転移が起こり得る。Ａがその励起状態から退くと、放射光は入射光に対して回転又は偏光解消される。その結果、ＦＲＥＴはＩＩにおいて蛍光強度の減少（すなわちドナー発光の減少）として、ＩＩＩにおいて蛍光強度の出現（すなわち増感発光の増加）として、及び入射光に対する蛍光の偏光解消として現れる。
【００６５】
ＦＲＥＴの最終顕在化は、励起状態寿命においてである。蛍光は平衡プロセスと見なすことができる。この平衡プロセスにおいて、分子がその励起状態に留まる時間の長さは、入射光によって分子がこの状態にさせられる速度と、分子をこの状態から追い出す速度の和との間の競合の結果である（蛍光プロセス及び非放射性プロセス）。更なる非放射性プロセスであるＦＲＥＴが加えられると（他の全ては不変のままにする）、減衰が有利となる。これは、ＩＩにおけるドナーの寿命が短くなることを意味する。
【００６６】
励起スペクトルと発光スペクトルとがオーバラップする２つの蛍光因子が十分に近接している場合、ドナー分子の励起状態エネルギーは、共鳴双極子誘導性の双極子間相互作用により、隣接するアクセプタ蛍光因子に転移される。ＦＲＥＴにおいては、ドナーを励起するがアクセプタ分子を直接的に励起しない波長で、試料又は混合物が照射される。次に、試料を２つの波長、すなわちドナー放射の波長及びアクセプタ放射の波長でモニターする。
【００６７】
ドナーとアクセプタとが十分に近接していない場合には、ＦＲＥＴは起こらずドナー波長でのみ放射が起こる。ドナーとアクセプタとが十分に近接している場合には、ＦＲＥＴが起こる。この相互作用の結果、ドナー寿命の減少、ドナー蛍光の消失、アクセプタ蛍光強度の増大、及び蛍光強度の偏光解消が起こる。エネルギー転移の効率Ｅｔは、ドナー分子とアクセプタ分子との間隔Ｒが増大するのに伴って、急激に減少する。分離されたドナー−アクセプタ対の場合、エネルギー転移の効率は以下のように表される：
【数１】
2007510161.tif 000005
上記式中、Ｒはドナーとアクセプタとの間隔であり、Ｒ0は、半転移に対応する距離である。Ｒ0は、ドナー発光スペクトルとアクセプタ励起スペクトルとの重なり積分、屈折率、ドナーの量子収量、並びに、ドナー発光モーメント及びアクセプタ吸光モーメントの配向に依存する値である。Ｆｏｒｓｔｅｒ， Ｔ．， Ｚ Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ ４Ａ， ３２１−３２７(１９４９)； Ｆｏｒｓｔｅｒ， Ｔ．， Ｄｉｓｃ． Ｆａｒａｄａｙ Ｓｏ． ２７．７−１７(１９５９)。
【００６８】
ＦＲＥＴは１／Ｒ6に依存するため、ＦＲＥＴは分子間距離に極度に依存し、「分光学的ルーラー（ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｒｕｌｅｒ）」と呼ばれてきた（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ．，及びＨａｕｇｌａｎｄ， Ｒ．Ｐ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９８：７１９(１９６７)）。例えばこの技術は、タンパク質及び核酸を含む種々のポリマー中の内在的及び外来的な蛍光因子の双方に対して、ドナーとアクセプタとの間隔を測定するのに有用であった。Ｃａｒｄｕｌｌｏ他は、2つのオリゴデオキシヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、ＦＲＥＴを用いてモニターできることを実証した（Ｃａｒｄｕｌｌｏ， Ｒ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８５：８７９０−８７９４ (１９８８)）。
【００６９】
分析物検出のためのＦＲＥＴの使用の概念
一般的に、分析物検出のために２つの方法のうちの一方でＦＲＥＴを用いる。第１の方法は、検出される分析物に対するアナログ並びにアナログ及び分析物双方に結合可能なリガンドが、その一方がドナー蛍光因子で、他方がアクセプタ蛍光因子でラベルされる競合アッセイである。従って、アナログはドナーで、リガンドはアクセプタでラベルすることができ、或いは、アナログはアクセプタで、リガンドはドナーでラベルすることができる。ラベルされた試薬が分析物と接触すると、分析物はリガンドに結合したアナログと置き換わる。リガンド及びアナログはもはやＦＲＥＴが起こるほど十分に互いに近接していないので、ＦＲＥＴによる蛍光シグナルは減少する；この減少は分析物の濃度と相関がある（その相関は、事前の較正段階において確立することができる）。
【００７０】
蛍光試薬の再利用を可能とするために、分析物とリガンドの間の結合は生理学的条件下で可逆的であるべきである。同様に、分析物−リガンド結合及びアナログ−リガンド結合に関連する平衡結合定数は、分析物がアナログに置き換われるほどのものであるべきである。すなわち、アナログ−リガンド結合は分析物がアナログに置き換われないほど強くあるべきではない。
【００７１】
好ましくは、センサはセンサの試薬により引き起こされる内部フィルター効果（ｉｎｎｅｒ ｆｉｌｔｅｒ ｅｆｆｅｃｔ）を受けない。最小の内部フィルター効果の要件は、センサの化学的性質の特性に依存して異なる結果を有する。試薬が蛍光因子を含む場合は、放射光の顕著な再吸収が起こるほど蛍光試薬濃度が十分に高い時に、内部フィルター効果が起こり得る。分析物結合における蛍光の直接的変化により試薬が機能する場合及び分析物の結合定数が所望の測定範囲にある場合は、十分な蛍光シグナルを保持したまま、センサ内の蛍光試薬の濃度を低下させることにより内部フィルター効果の最小化を達成することができる。蛍光性分析物アナログと蛍光性分析物結合物質の間のＦＲＥＴにより試薬が機能する場合、分析物の親和性が所望の濃度範囲で低下するが、分析物と分析物結合試薬の間の相互作用よりかなり高い親和性で互いに相互作用する試薬を選択することによって内部フィルター効果を最小にすることができる。任意の競合蛍光アッセイを用いて同様のアプローチを使用することができる。米国特許第５，３４２，７８９号で説明されているセンサの化学的性質は、例えば試薬間でマイクロモルの親和性を有するが、ミリモラー範囲での親和性でグルコースを検出する。
【００７２】
試薬は多くの方法でコア内に組み入れることができる。１つの方法に従えば、コアを形成する前に架橋可能組成物へ試薬を添加する。別の方法に従えば、試薬を含む組成物中にコアを置き、そして試薬をコアへ浸透させる。
【００７３】
センサの半透性コーティングは、様々なポリマーから調製される多孔性ポリマーコーティングであり、例えばヘテロポリマー、ホモポリマー及びそれらの混合物が含まれる。コーティングの透過性により、分析物の生理学的に適切な変化の測定が可能なセンサに、対象の分析物が流入及び流出し、センサ内の試薬がセンサ内にとどまり（すなわち、宿主が試薬にさらされない）、対象の分析物が試薬と接触することができ、そして所定の分子量の化合物がセンサに入るのを阻害され、好ましくは妨げられる。半透性コーティングを調製するポリマーのタイプ及び分子量、並びにコーティングの厚さは、所望の透過性を与えるように選択される。好ましくは、センサは、３７℃において２週間後に５モル％未満、１モル％未満、０．５モル％未満、又はさらに０．２モル％未満の蛍光試薬の漏出を示す。
【００７４】
好ましくは、半透性コーティングは、約４キロダルトン（ｋＤａ）から約１８ｋＤａ、約８ｋＤａから約１２ｋＤａ、又はさらに約９ｋＤａから約１０ｋＤａの重量平均分子量を有する多分散ポリマーから調製される。好ましい多分散ポリマーは、１超、１．０超から約１．５まで、又はさらに約１．１から１．４の多分散性指数Ｍｎ／Ｍｗ（ｄＩ）を有する。
【００７５】
有用なポリマーの例としては、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン及びポリオルニチン）、ポリヌクレオチド、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好ましいポリマーとしては、例えば１９アミノ酸から６０アミノ酸、３８アミノ酸から約６０アミノ酸、又はさらに約４３アミノ酸から約４８アミノ酸の長さを有するポリアミノ酸が挙げられる。適切な多分散ポリアミノ酸はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（ミズーリ州、セントルイス）から入手可能である。
【００７６】
半透性コーティングは、異なる分子量の単分散ポリマーの混合物を含むことができる。理論により拘束されるものではないが、本発明者は、低分子量ポリマーはコアの表面上のより小さな領域及びより高い分子量ポリマーの間の空間を満たしていると推測する。
【００７７】
半透性コーティングは、それぞれの層が同じポリマー組成物又は異なるポリマー組成物から調製される多層を含むことができる。例えば、半透性コーティングは、多分散ポリマー、単分散ポリマー、及びそれらの組み合わせから成る１又は複数の層を含むことができる。有用な単分散ポリマーは単分散ポリアミノ酸を含み、例えば３３残基、４７残基及び６０残基を有するポリ−Ｌ−リジン単分散ホモポリマーが挙げられる。
【００７８】
いくつかの場合において、多層がセンサに適用されたが、個々の層は個別に識別することはできない。
【００７９】
好ましくは、半透性コーティングはＩｇＧ及び補体（例えば、補体Ｃ１ｑ）を排除する。好ましくは、半透性コーティングは１００ｋＤａ超、６０ｋＤａ超、又はさらに３０ｋＤａ超の分子量を有する分子をセンサに入れさせない。
【００８０】
半透性コーティングの組成物は、コアの体積を減少させるように選択することができる。比較的低い分子量の多分散ポリアミノ酸を含むコーティング組成物（例えば、ポリリジン又はポリオルニチン）は、それを適用するゲルコアの体積を顕著に減少させることができる。多くの場合、体積の減少は少なくとも約５０％、少なくとも６０％、又はさらに少なくとも７０％である。好ましくは、ポリアミノ酸の分子量は、約３０，０００Ｄａ以下、約１５ｋＤａ以下、約１０ｋＤａ以下、約８ｋＤａ以下、約７ｋＤａ以下、約５ｋＤａ以下、約４ｋＤａ以下、約３ｋＤａ以下、又はさらに約１．５ｋＤａ以下である。
【００８１】
３ｋＤａ、７ｋＤａ、９．６ｋＤａ、又はさらに１２ｋＤａの分子量を有する多分散ポリリジンは、コーティングの適用されるコアの直径の顕著な減少（いくつかの場合にといては、およそ３０％）を生じさせることができる。
【００８２】
低分子量のポリアミノ酸も、優れた選択透過性特性を有するコーティングを形成し、そして「削られた（ｐｒｕｎｅｄ）」又は銃眼模様の表面、すなわち比較的複雑又は粗い表面を作り出すことができる。そのような削られた表面は、線維化反応を誘導することができる。削られた表面にアルギン酸を適用することにより、センサの外側に比較的滑らかな表面を提供することができ、それは線維化を阻害しそして光散乱効果を減少させる。図２は、２０Ｘの合計倍率で照らされた透過光線リングの下で作動する立体解剖顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｉｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で観察した、銃眼模様のポリリジンで表面を覆った１４アルギン酸コア１２を囲むアルギン酸コーティング１６を含むセンサ１０を説明する。
【００８３】
センサの外側表面は、生理学的に適切な速度で対象の分析物がセンサに拡散しそしてセンサから出て行くのを弱め又は阻害することとなる宿主の免疫システムによる線維化反応を誘導しないように、十分に生体適合性があり、同時に宿主内でセンサの位置を保持するためのセンサの周りの鞘を宿主に形成させるために、十分に非生体適合性がある。適切な生体適合性コーティング組成物は、コアのポリマーマトリクスに関して上記の（及びここに盛り込まれた）架橋可能組成物を含み、例えばヒドロゲル（例えば、アルギン酸及びアガロース）が挙げられる。
【００８４】
生体適合性コーティングを提供する有用な方法については、例えば米国特許第6,126,936号で説明されている。
【００８５】
好ましくは、センサは、センサを完全に包むような十分厚い生体適合性コーティングの層で覆われる。好ましくは、外側の生体適合性コーティングは、少なくとも１ミクロン（μｍ）、約１μｍから約２５μｍ、又はさらに約５μｍから約２０μｍの厚さを有する。
【００８６】
好ましくは、外側のコーティングは、分析物がセンサに拡散しそしてセンサから出て行くのを妨げ又は防ぐこととなる宿主による線維化反応を誘導させないようにするため、十分滑らかである。線維化反応についての議論は、「ＭＩＣＲＯＲＥＡＣＴＯＲ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＤＥＴＥＲＭＩＮＩＮＧ Ａ ＭＩＣＲＯＲＥＡＣＴＯＲ ＳＵＩＴＡＢＬＥ ＦＯＲ Ａ ＰＲＥＤＥＴＥＲＭＩＮＥＤ ＭＡＭＭＡＬ」という表題の、２００２年３月１１日に出願された米国特許出願第１０／０９５，５０３号において見いだすことができる。
【００８７】
センサは、例えば炭水化物（例えば、グルコース、フルクトース、及びそれらの誘導体）を含む様々な分析物の検出に適合するように構築することができる。ここで使用されているように、「炭水化物」は、糖、でんぷん及びセルロースを含む、炭素、水素、及び酸素から構成される任意の有機化合物の群を指す。他の適切な分析物としては、糖タンパク質（例えば、グリコヘモグロビン、チログロブリン、グリコシル化アルブミン、グリコシル化アルブミン、及びグリコシル化アポリポタンパク質）、グリコペプチド、及び糖脂質（例えば、スフィゴミエリン及びガングリオシド  ＧＭ２）が挙げられる。
【００８８】
適切な分析物の別の群はイオンを含む。これらのイオンは無機イオン又は有機イオンであることができる。例としては、カルシウム、ナトリウム、塩素、マグネシウム、カリウム、重炭酸、リン酸、炭酸、クエン酸、酢酸、コリン及びそれらの組み合わせが挙げられる。センサはタンパク質及びペプチド（後者は前者の低い分子量の異形である）の検出に対しても有用である；多くの生理学的状態は、血液及び他の体液中においてタンパク質の発現レベルを変化させることが知られている。酵素（例えば、ＬＤＨ、ＳＧＯＴ、ＳＧＴＴなどの細胞死に関連する酵素、並びに酸ホファターゼ及びアルカリホファターゼ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンなどの妊娠に関連するホルモン、リポタンパク質（例えば、高密度、低密度、及び極低密度リポタンパク質）、並びに抗体（例えば、ＡＩＤＳなどの自己免疫疾患、重症筋無力症、及び狼瘡（ｌｕｐｕｓ）に対する抗体）はこの群に含まれる。抗体及びハプテンも適切な分析物である。
【００８９】
さらに、センサはステロイド（例えば、コレステロール、エストロゲン、及びそれらの誘導体）などの分析物を検出することができる。センサは、テオフィリン及びクレアチニンなどの物質の検出及びモニタリングに対しても有用である。
【００９０】
センサは、殺虫剤及び薬を検出及びモニターするために使用することもできる。ここで使用されているように、「薬」は、体内に摂取され、吸入され、吸収され又は別の方法で組み入れられた時に生理学的反応を引き起こす材料を指す。アルコール、治療薬剤（例えば、シクロホファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド、シスプラチン、及びカルボプラチンなどの化学療法薬）、麻薬（例えば、コカイン及びヘロイン）及び向精神薬（例えば、ＬＳＤ）は、この群に含まれる。
【００９１】
センサは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）の検出及びモニターに使用することもできる。センサは、例えば細胞溶解の尺度として全長ＤＮＡレベルのアッセイに使用することができる。或いは、センサは特異的配列（例えば、ＨＩＶ  ＲＮＡ）の発現をアッセイするのに使用することができる。
【００９２】
センサは、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ ｓｉｔｕで使用することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの適用の場合、センサは、皮膚の中、皮膚の上、又は皮膚の下、器官の中又は血管（例えば、静脈又は動脈）の中に置くことができる。
【００９３】
センサを励起し（例えば、移植されたセンサを直接的に又は経皮的に励起する）、そしてセンサにより放射された蛍光シグナルを検出する（例えば、移植されたセンサにより放射された蛍光を直接的に又は経皮的に検出する）ことにより、分析物を検出することができる。
【００９４】
下記の実施例により本発明を説明する。
【実施例】
【００９５】
試験手順
本実施例で使用される試験手順には次のようなものがある。
【００９６】
蛍光漏出測定方法
センサを調製し、そして各センサ中に存在する蛍光試薬の量を計算する。センサを、過剰のｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１５Ｍ生理食塩水中に置き、そしてセンサの表面上の残留物を取り除くため３７℃で一晩インキュベートする。センサから上清を取り除き、そして上清の蛍光放射スペクトルをＭｏｄｅｌ  ＱＭ−１  ＰＴＩ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（ニュージャージー州, サウスブラウンズウィック，ＰＴＩ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｓｔｅｒ）を用いて測定する。試薬の蛍光因子の励起最大の付近で上清を励起し、そして蛍光因子の放射最大を含む波長範囲で放射を測定することにより、放射スペクトルを測定する。複数の異なる蛍光因子が蛍光試薬の中に存在する場合は、その前段階をそれぞれの異なる蛍光因子に対して繰り返す。次に、センサを追加の過剰な体積の新たなＨＥＰＥＳ／生理食塩水中に置き、そしてセンサを３７℃で一晩インキュベートして、その後ＨＥＰＥＳ／生理食塩水を取り除いた。
【００９７】
蛍光色素の１００％の漏出が起きた場合に、その結果生じる上清の濃度が１０-10（蛍光因子のモル数／上清のｍＬ）となるような十分な体積のＨＥＰＥＳ／生理食塩水とともに、十分な数（Ｎ）のセンサを試験管中に置く。多くの同様の試験管を用意し、その試験用の十分な数のサンプルを提供する。測定を３回行う、すなわち各時点で３つの異なる試験管からアリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）をとる。
【００９８】
ＨＥＰＥＳ／生理食塩水のサンプルアリコートである１００μＬサンプルを３つの試験管から取り除き、３つの各サンプルに対して蛍光測定を行う。これらのサンプルは時間０を意味する。次に、所望の時間、残りのサンプルを３７℃でインキュベートする。各時点で、サンプルアリコートを３つの試験管から取り除き、各アリコートについて上記のように蛍光測定を行う。蛍光が検出されれば、次にそのサンプルを遊離蛍光色素の濾過及び蛍光試薬の保持が可能なフィルター（１０ ｋＤａ ＭＷ 遮断 Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ フィルター（Ａｍｉｃｏｎ，ＷＲ Ｇｒａｃｅの部門)）を用いて濾過し、そして溶離液の蛍光を測定して遊離色素の量を決定する。
【００９９】
（上清の蛍光強度−溶離液の蛍光強度）／（ＨＥＰＥＳ／生理食塩水の体積ｍＬ当たりのセンサの数（Ｎ）に相当する溶液色素混合液の蛍光強度）を計算することにより、ラベルしたタンパク質の漏出パーセントを決定する。
【０１００】
蛍光試薬を含むマイクロスフェアビーズの調製
ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１５Ｍの生理食塩水中のＣｙ３．５ ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン、分子量６６，４３０ ｇ／ｍｏｌ）及びＣｙ５．５−ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ、分子量１０４，０００ ｇ／ｍｏｌ）のある体積の溶液を、ＨＥＰＥＳ／０．１５Ｍの食塩水中の殺菌した３％アルギン酸の等容積に加える。その溶液を５分間ロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）上で混合する。次に、その混合液を遠心分離機にかけ、そして１４ゲージのカテーテルを備えた注射器に引き入れる。サンプルから気泡を取り除く。１４ゲージのカテーテルを取り除き、２４ゲージのカテーテルと交換する。次に、シリンジのプランジャをゆっくりと押して、２５ｍｌのＨＥＰＥＳ／食塩水及び１．５％（ｗ／ｖ）の無水塩化カルシウムを含む試験管にアルギン酸を滴下する。そのビーズを２０分間浸す。
【０１０１】
次に、ビーズをＨＥＰＥＳ／食塩水及び２ｍＭの塩化カルシウムで４回すすぎ、そしてＨＥＰＥＳ／食塩水中で保存する。
【０１０２】
比較例１
３７℃まで加熱したＨＥＰＥＳ／生理食塩水の緩衝原液中で３３ペプチド残基を有する１％単分散ポリリジンから０．２％単分散ポリリジン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）コーティング溶液（ＨＥＰＥＳ／食塩水中の）を調製する。第一のコーティング溶液の体積は、表面を覆ったマイクロスフェアビーズの体積の１５倍である。２番目のコーティング溶液の体積は、表面を覆ったマイクロスフェアビーズの体積の１０倍である。双方の溶液を滅菌濾過し、そして３７℃で保持する。
【０１０３】
第一の蛍光試薬化合物であるＣｙ３．５ ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン、分子量６６，４３０ ｇ／ｍｏｌ）及び第二の蛍光性化合物であるＣｙ５．５−ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ、分子量１０４，０００ ｇ／ｍｏｌ）を含むマイクロスフェアセンサビーズを、３７℃で５分間ロッカー上で、マイクロスフェアビーズの体積の１５倍の体積のポリリジンコーティング溶液を用いて表面を覆った。ビーズを取り除き、そしてＨＥＰＥＳ／食塩水で３回すすぐ。次に、遮光しながらＨＥＰＥＳ／食塩水中において６０分間室温でビーズをインキュベートする。６０分後、ＨＥＰＥＳ／食塩水をビーズから取り除く。第二の体積のポリリジンコーティング溶液をマイクロスフェアビーズに加える。第二の体積のポリリジンコーティング溶液は、マイクロスフェアビーズの体積の１０倍であり、そしてポリリジンコーティング溶液中で３７℃において５分間ロッカー上でビーズをインキュベートする。次に、ビーズを取り除き、そしてＨＥＰＥＳ／食塩水で３回すすぐ。
【０１０４】
比較例２
ポリリジンで表面を覆ったマイクロスフェアビーズを比較例１の記載の通りに調製するが、比較例２のポリリジンは４７ペプチド残基を有していた。
【０１０５】
比較例３
ポリリジンで表面を覆ったマイクロスフェアビーズを比較例１の記載の通りに調製するが、比較例２のポリリジンは６０ペプチド残基を有していた。
【０１０６】
実施例１
ｐＨ７．４で２ｍＭ塩化カルシウムを有するＨＥＰＥＳ／食塩水の原液中の１％多分散ポリリジンから、０．２％多分散ポリリジン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）コーティング溶液（ＨＥＰＥＳ／食塩水中の）を調製する。０．２％の多分散ポリリジン組成物を３７℃まで加熱する。多分散ポリリジンは、１１，２００ Ｄａの重量平均分子量、９８００ Ｄａの数平均分子量及び１．１４の多分散性指数を有していた。
【０１０７】
Ｃｙ３．５ ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン、分子量６６，４３０ ｇ／ｍｏｌ）及びＣｙ５．５−ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ、分子量１０４，０００ ｇ／ｍｏｌ）を含むアルギン酸マイクロスフェアビーズを、ビーズの体積の１５倍超の体積のポリリジンコーティング溶液中に置き、そしてビーズをポリリジンコーティング溶液中で３７℃において１５分間ロッカー上でインキュベートする。次に、ビーズをポリリジン溶液から取り除き、ＨＥＰＥＳ／食塩水及び２ｍＭ塩化カルシウムで３回すすぐ。
【０１０８】
次に、遮光をしながら、ＨＥＰＥＳ／食塩水中において６０分間室温でビーズをインキュベートする。６０分後、ＨＥＰＥＳ／食塩水をビーズから取り除き、第二の体積のポリリジンコーティング溶液（ビーズの体積の１０倍）をビーズに加え、そしてポリリジン溶液中で３７℃において１５分間ロッカー上でビーズをインキュベートする。
【０１０９】
次に、表面を覆ったビーズを取り除き、ＨＥＰＥＳ／食塩水で３回すすぐ。
【０１１０】
次に、表面を覆ったビーズを滅菌試験管中のＨＥＰＥＳ／食塩水において４℃で一晩保存する。
【０１１１】
次に、表面を覆ったビーズを１．５％ＵＰのアルギン酸溶液でさらに表面を覆い、そしてｐＨ７．２のＨＥＰＥＳ及び１．５％塩化カルシウムの溶液中に１０分間置く。
【０１１２】
実施例１及び比較例のポリリジンで表面を覆ったビーズの各組について、漏出パーセントアッセイを実施する。ビーズを３７℃で３日間保存し、ＨＥＰＥＳ／食塩水で毎日すすぐ。３日間のすすぎ期間の後、上記の蛍光漏出測定方法に従って、ビーズの蛍光成分であるＣｙ５．５及びＣｙ３．５の漏出を５０日間定期的に測定する。特に、実施例１及び比較例のビーズ中に存在する蛍光試薬の量を計算した。多く（１８０）のビーズを３０ｍＬのＨＥＰＥＳ／食塩水中に置き、そして３７℃で一晩インキュベートして、ビーズ表面の残留物を取り除く。ビーズから上清を取り除き、上清の蛍光放射を測定した。次に、ビーズを２０ｍＬの新たなＨＥＰＥＳ／食塩水中に置き、３７℃で一晩インキュベートして、その後ＨＥＰＥＳ／食塩水を取り除く。
【０１１３】
５７０ｎｍで上清を励起し、そして５７５ｎｍから６２５ｎｍの範囲での放射を測定することにより、発光スペクトルを得る。６６０ｎｍで上清を励起し、そして６７０ｎｍから７２５ｎｍの範囲での放射を測定することにより、第二のスペクトルを得る。
【０１１４】
次に、２ｍＬのＨＥＰＥＳ／食塩水を有する１８個の各試験管中にビーズを置く。ＨＥＰＥＳ／食塩水の１００μＬのサンプルアリコートを３つの試験管から取り除き、３つの各サンプルに対して蛍光測定を行う。これらのサンプルは時間０を意味する。残りのサンプルを３７℃で継続してインキュベートした。所望の時点において、サンプルアリコートを３つの試験管から取り除き、そして蛍光測定を行う。蛍光が検出されれば、次にそのサンプルを遊離蛍光色素の濾過及び蛍光試薬の保持が可能な１０ ｋＤａ ＭＷ 遮断 Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ フィルター (Ａｍｉｃｏｎ，ＷＲ Ｇｒａｃｅの部門)を用いて濾過する。溶離液の蛍光を測定し遊離色素の量を決定する。
【０１１５】
結果を図３においてプロットする。ここで、四角はＣｙ３．５の漏出パーセントを表し、丸はＣｙ５．５の漏出パーセントを表す。
【０１１６】
比較例１−３及び実施例１に従って調製したビーズに関して、１４日目におけるＣｙ３．５の漏出量を、図４において棒グラフにより示す。
【０１１７】
他の実施態様は特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】ドナー分子及びアクセプタ分子の吸光スペクトル及び発光スペクトルをグラフで示したものである。
【図１Ａ】非放射性エネルギー転移についての説明である。
【図２】銃眼模様のポリリジンで表面を覆ったアルギン酸コアを囲む、アルギン酸コーティングを含むセンサのカラー写真である。２０Ｘの倍率で、立体解剖顕微鏡の対物レンズを通して撮影した。
【図３】実施例１で得た漏出データのプロットである。
【図４】比較例１−３及び実施例１のビーズに対する、１４日目でのＣｙ３．５の漏出を説明する棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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