(57)【要約】  グルコースを生体内で検出するためのセンサであって、その読み取りが当該センサが体内に埋め込まれたときに外部の光学的手段によって経皮的に照会できる検出可能な光信号であるグルコースのためのアッセイ成分、および分析対象の前記アッセイ成分への接触を許容しつつ前記アッセイ成分を包んでいる生物分解性材料の殻を有しており、前記生物分解性材料が、疎水性ユニットと親水性ユニットとを有するコポリマーを含んでいるセンサ。そのようなセンサを適切に使用してグルコースを検出する方法であって、センサを哺乳類の皮膚へと埋め込むこと、外部の光学的手段を使用して経皮的にグルコースを検出または測定すること、および生物分解性材料を分解することを含んでいる方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースを生体内で検出するためのセンサであって、
・その読み取りが、当該センサが体内に埋め込まれたときに外部の光学的手段によって経皮的に照会できる検出可能な光信号であるグルコースのためのアッセイ成分、および
・分析対象の前記アッセイ成分への接触を許容しつつ、前記アッセイ成分を包んでいる生物分解性材料の殻
を有しており、
前記生物分解性材料が、疎水性ユニットと親水性ユニットとを有するコポリマーを含んでいるセンサ。
【請求項２】
前記コポリマーが、ランダム・コポリマーである請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記コポリマーが、２５０００Ｄａを超えない分子量遮断限界を有している請求項１または２に記載のセンサ。
【請求項４】
前記コポリマーが、１００００Ｄａを超えない分子量遮断限界を有している請求項３に記載のセンサ。
【請求項５】
前記コポリマーが、少なくとも５．０×１０-10ｃｍ2／ｓの透過率を有している請求項１〜３のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項６】
前記疎水性ユニットの重量割合が、前記コポリマーの１０〜９０％である請求項１〜４のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項７】
前記コポリマーの前記親水性ユニットのそれぞれが、ポリエチレングリコールと二価の酸とのエステルを含んでいる請求項１〜５のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項８】
前記親水性ユニットが、二価の酸としてテレフタル酸および／またはコハク酸を含んでいる請求項６に記載のセンサ。
【請求項９】
前記親水性ユニットが、二価の酸としてテレフタル酸のみを含んでいる請求項７に記載のセンサ。
【請求項１０】
前記親水性ユニットにおいて、コハク酸に対するテレフタル酸の比が、１：２〜２：１である請求項７に記載のセンサ。
【請求項１１】
それぞれの親水性ユニットの分子量が、４００〜４０００である請求項６〜９のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項１２】
前記コポリマーの前記親水性ユニットが、ビニルピロリドンおよび／またはビニルアルコールのオリゴマーを含んでいる請求項１〜１０のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項１３】
前記コポリマーの前記疎水性ユニットが、ブタン−１，４−ジオールと二価の酸とのエステルを含んでいる請求項１〜１１のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項１４】
前記疎水性ユニットが、二価の酸としてテレフタル酸および／またはコハク酸を含んでいる請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１５】
前記疎水性ユニットが、二価の酸としてテレフタル酸のみを含んでいる請求項１３に記載のセンサ。
【請求項１６】
コハク酸に対するテレフタル酸の比が、１：２〜２：１である請求項１１に記載のセンサ。
【請求項１７】
前記アッセイが、結合アッセイである請求項１〜１５のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項１８】
前記結合アッセイが、競合結合アッセイであり、その成分が、グルコース結合剤およびグルコース類似物質を含んでいる請求項１６に記載のセンサ。
【請求項１９】
前記グルコース類似物質が、第１の発色団でラベル付けされ、前記グルコース結合剤が、第２の発色団でラベル付けされ、第１の発色団または第２の発色団の放射スペクトルが、それぞれ第２の発色団または第１の発色団の吸収スペクトルと重なり合っている請求項１７に記載のセンサ。
【請求項２０】
前記結合剤が、抗体、Ｆａｂフラグメント、レクチン、ホルモン受容体、薬物受容体、アプタマー、または分子インプリント・ポリマーである請求項１７または１８のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項２１】
前記検出または測定可能な光信号が、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光偏光、蛍光消光、燐光、発光強調、発光消光、回折、またはプラズモン共鳴によって生成される請求項１〜１９のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のセンサの製作方法。
【請求項２３】
コアセルベーション、溶媒の気化および／または抽出、噴霧乾燥、噴霧コーティング、噴霧冷却、回転ディスク・アトマイゼーション、流動床コーティング、共押し出し、ならびに／あるいはパン・コーティングを含んでいる請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のセンサを使用してグルコースを検出する方法であって、該センサを哺乳類の皮膚へと埋め込むこと、外部の光学的手段を使用して経皮的にグルコースを検出または測定すること、および前記生物分解性材料を分解することを含んでいる方法。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のセンサを使用してグルコースを検出する方法であって、哺乳類の皮膚の中または下方に存在する該センサを照射することによって、外部の光学的手段を使用して経皮的にグルコースを検出または測定することを含んでいる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、センサ、当該センサの製作方法、および当該センサの使用方法に関する。このセンサは、光学的技法を使用して、体液内のグルコースの測定または監視に使用することができる。このセンサは、例えば糖尿病の管理において、グルコース測定を繰り返し行なうことによってグルコースのレベルを密に監視しなければならない状況において使用するために、とくに適している。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の管理においては、血中のグルコースの定期的な測定が、正確なインシュリンの投与を保証するために不可欠である。さらに、糖尿尿患者の長期治療において、血糖レベルをより上手く制御することで、糖尿病に関連することがしばしばである網膜症、循環障害、および他の変性疾患の発現を、防止できないまでも遅延させることが可能であることが実証されている。したがって、糖尿病患者自身による血糖レベルの信頼できかつ正確である監視について、ニーズが存在している。
【０００３】
現在のところ、血糖は、糖尿病患者によって、市販の比色分析テスト片または電気化学式バイオセンサ（例えば、酵素電極）を使用して監視されているが、どちらも測定が行なわれるたびに適量の血液を抜き取るために、ランセット型の器具を定期的に使用する必要がある。平均すると、糖尿病患者の大多数は、血糖の測定を行なうために１日に２回、そのような器具を使用していると考えられる。一方で、米国国立衛生研究所(US National Institutes of Health)は、血糖の検査を少なくとも１日に４回行なうべきであると推奨しており、この推奨は、アメリカ糖尿病協会（American Diabetes Association)によって支持されている。この血糖検査の頻度の増加は、糖尿病患者、とくには指先から血液を抜き取るためにランセットを定期的に使用しなければならない長期の糖尿病の患者において、経済的な点ならびに苦痛および不快の点の両者において、かなりの負担を強いることになる。したがって、より良好な長期グルコース監視システムであって、患者からの血液の抜き取りを必要としないシステムについて、ニーズが存在することは明らかである。
【０００４】
患者からの血液の抜き取りを必要としないグルコース測定法について、多くの提案がなされている。酵素電極バイオセンサが血管へと挿入される針またはカテーテルの端部に配置されてなる装置を構築しようとする種々の試みがなされている(Wilkins, E.およびAtanasov, P.、Med. Eng. Phys(1996)18:273〜288)。検出装置そのものは血管内に位置しているものの、針またはカテーテルが、外部の環境への接続を依然として有している。実際には、このような装置は、第１には、針またはカテーテルを血管へと挿入することによって感染の恐れが生じるとともに、患者にとっても不快であって長期の連続使用に適していないため、人間の患者における使用に適していない。第２に、この種の装置は、装置そのものが、針またはカテーテルの端部について、患者の循環系への血栓症の誘発の原因ではないかと示唆されているため、患者における使用について認可を得ていない。これは、患者の健康にきわめて深刻なリスクをもたらすことが明白である。
【０００５】
MansouriおよびSchultz (Biotechnology 1984)、MeadowsおよびSchultz (Anal. Chim. Acta.(1993) 280:p21〜30)、ならびに米国特許第４，３４４，４３８号が、いずれも、光学的な手段によって血液中の低分子量化合物を生体内で監視するための装置を説明している。これらの装置は、血管へと挿入されるように設計され、あるいは皮下に配置されるように設計されているが、外部の光源および外部の検出器へと光ファイバーを接続する必要がある。やはり、血管内にこれらの装置を配置することが、血栓症を促すという付随のリスクを有しており、さらには、一実施の形態においては、外部環境へと光ファイバーの接続を維持する必要性が、長期使用にとって実用的でなく、感染の恐れを有している。
【０００６】
より非侵襲的なグルコース監視技法の探索において、いくらかの注目が、耳たぶや指先などといった比較的「光透過性」であって皮膚の表面近くに血管を位置させている組織の血管内の血糖濃度を直接測定するための赤外分光法の使用に向けられている(Jaremko, J.およびRorstad, O.、Diabetes Care 1998 21:444〜450、ならびにFogt, E.、 J.Clin. Chem.(1990)36:1573〜80)。この手法は、明らかに侵襲が最小であるが、血中グルコースの赤外スペクトルが周囲の組織の赤外スペクトルにきわめて類似しており、実際上２つのスペクトルを分離することがほぼ不可能であるため、実用的価値に乏しいことが明らかになっている。
【０００７】
皮下流体中の分析対象の濃度が、血中の当該分析対象の濃度に相関することが観察されており、したがってグルコース監視装置を皮下の位置に位置させて使用することについて、いくつかの報告がなされている。とくに、Atanasovら(Med. Eng. Phys.(1996)18: p632〜640)が、イヌの皮下流体中のグルコースを監視するための埋め込み可能なグルコース検出装置（寸法５．０×７．０×１．５ｃｍ）の使用について、説明している。この装置は、電流式グルコース・センサ、小型ポテンショスタット、ＦＭ信号送信器、および電源で構成され、外部環境への接続を必要とすることなく、コンピュータベースのデータ取得システムへとリンクされたアンテナおよび受信機を介して、リモート式で照会を行なうことができる。しかしながら、この装置の大きな寸法が、人間の患者におけるこの装置の使用を非現実的なものにしていることは明白である。
【０００８】
Ryan J. RussellらのAnalytical Chemistry、 Vol.71、 Number 15、 3126〜3132が、皮膚への埋め込みのための埋め込み可能なヒドロゲルであって、フルオレセイン・イソチオシアネート・デキストラン（ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ）およびテトラメチルローダミン・イソチオシアネート・コンカバリンＡをヒドロゲル網目構造に化学的に結合させて含んでいるポリエチレングリコール主体のヒドロゲルを説明している。埋め込まれたヒドロゲル球が、経皮的に照会される。
【０００９】
R. BallerstadtらのAnalytica Chemica Acta、 345(1997)、 203〜212が、２つのポリマー（デキストラン）分子がそれぞれ第１および第２の蛍光物質でラベル付けされ、多価のレクチン分子によって一体に結合されて、消光を生じているアッセイ・システムを開示している。グルコースが、レクチンの結合サイトを飽和させ、２つのポリマーの分離を引き起こして、蛍光の増大をもたらす。
【００１０】
Joseph R. LakowiczらのAnalytica Chimica Acta、 271、(1993)、 155〜164が、位相変調蛍光分析の使用を説明している。これは、先に説明した技術において教示されている蛍光強度にもとづく測定を、蛍光の寿命にもとづく測定に置き換えている。
【００１１】
蛍光の寿命は、１〜２００ＭＨｚの強度変調された光を使用して蛍光を励起し、入射光に対する発光の位相のずれおよび変調（復調）を測定することで、位相および変調技法によって測定することが可能である。
【００１２】
国際公開第ＷＯ９１／０９３１２号パンフレットには、グルコースについての親和性アッセイを使用する皮下的な方法および装置が説明されており、光学的な手段によって遠方から照会が行なわれる。国際公開第ＷＯ９７／１９１８８号パンフレットには、埋め込み可能なグルコース・アッセイ・システムのさらなる例が説明されており、遠方において読み取ることができる光信号が生成されている。国際公開第ＷＯ９１／０９３１２号パンフレットおよび国際公開第ＷＯ９７／１９１８８号パンフレットに記載の装置は、アッセイ成分が正しく機能できなくなった後も長きにわたって体内に残り、これは長期にわたる用途においては大きな欠点である。装置の取り出しに、外科的手術が必要である。
【００１３】
国際公開第ＷＯ０３／００６９９２号パンフレットは、ひとたびセンサが使用されたならばマクロファージによって埋め込み部位から取り去られるよう、充分に小さいセンサ粒子内にアッセイを設けることによって、この問題に対処している。国際公開第ＷＯ０２／３０２７５号パンフレットが、センサ粒子を皮膚の上部層へと注入するための装置を提供しており、これらのセンサは、皮膚の成長によってその場所から洗い流される。
【００１４】
国際公開第ＷＯ００／０２０４８号パンフレットは、アッセイ試薬を収容するために生物分解性の材料を使用することで、上記問題に対処している。生物分解性の種々の材料が開示されている。それらには、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（Ｌ−乳酸）のブロックで構成されるJeongら(Nature 388: p.860〜862)の生物分解性ブロック・コポリマーが含まれる。他に開示されている材料は、架橋たんぱく質、ポリサッカライド、ポリ無水物、脂肪酸／コレステロール混合物、および赤血球ゴーストである。
【特許文献１】米国特許第４，３４４，４３８号
【特許文献２】国際公開第ＷＯ９１／０９３１２号
【特許文献３】国際公開第ＷＯ９７／１９１８８号
【特許文献４】国際公開第ＷＯ９１／０９３１２号
【特許文献５】国際公開第ＷＯ０３／００６９９２号
【特許文献６】国際公開第ＷＯ０２／３０２７５号
【特許文献７】国際公開第ＷＯ００／０２０４８号
【非特許文献１】MansouriおよびSchultz (Biotechnology 1984)、MeadowsおよびSchultz (Anal. Chim. Acta.(1993) 280:p21〜30)
【非特許文献２】Jaremko, J.およびRorstad, O.、Diabetes Care 1998 21:444〜450、ならびにFogt, E.、 J.Clin. Chem.(1990)36:1573〜80
【非特許文献３】AtanasovらのMed. Eng. Phys.(1996)18: p632〜640
【非特許文献４】Ryan J. RussellらのAnalytical Chemistry、 Vol.71、 Number 15、 3126〜3132
【非特許文献５】R. BallerstadtらのAnalytica Chemica Acta、 345(1997)、 203〜212
【非特許文献６】Joseph R. LakowiczらのAnalytica Chimica Acta、 271、(1993)、 155〜164
【非特許文献７】JeongらのNature 388: p.860〜862
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、最適な性能のために、生物分解性材料が、生物分解性であることに加え、或るいくつかの要件を満足しなければならないと判断している。
１．  センサの応答時間が短くなるよう、生物分解性材料が、速やかな透過を許さなければならない。これは、生物分解性材料がグルコースに対して高い透過率を有している場合に、達成可能である。
２．  グルコースがアッセイ成分に接触すべく生物分解性材料を通って拡散できるが、アッセイ成分が生物分解性材料を通って拡散して体内を自由に動き回ることがないよう、生物分解性材料が、分子量遮断特性を有していなければならない。
【００１６】
これらの特性は、国際公開第ＷＯ００／０２０４８号パンフレットに開示の材料によっては、必ずしももたらされていない。
【００１７】
明確な分子量遮断特性を呈するポリマーとして、セルロース誘導体(derivatised cellulose)、再生セルロース、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアルコール）、ポリ（カーボネート−コ−エーテル）、ポリアクリロニトリル、およびポリスルホンが挙げられる。しかしながら、これらのポリマーは生物分解性ではない。
【００１８】
生物分解性ポリマーは、通常は、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ−乳酸、ポリ−グリコール酸、およびポリ−カプロラクトンなどの疎水性の材料である。これらの材料は、グルコースの拡散を許さない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
今や、本発明者らは、疎水性のユニットおよび親水性のユニットを有する或る特定のコポリマーが、上述の要件のすべてを満たすことを明らかにした。
【００２０】
したがって、第１の態様において、本発明は、グルコースを生体内で検出するためのセンサであって、
・その読み取りが当該センサが体内に埋め込まれたときに外部の光学的手段によって経皮的に照会できる検出可能な光信号であるグルコースのためのアッセイ成分、および
・分析対象の前記アッセイ成分への接触を許容しつつ、前記アッセイ成分を包んでいる生物分解性材料の殻
を有しており、
前記生物分解性材料が、疎水性ユニットと親水性ユニットとを有するコポリマーを含んでいるセンサを提供する。
【００２１】
生物分解性の材料が殻を形成している点が重要である。このコポリマーの殻は、好ましくは１〜１００μｍ、より好ましくは１〜５０μｍの厚さを有している。
【００２２】
好ましくは、コポリマーが、ランダム・コポリマーである。ブロック・コポリマーの使用は、そのようなポリマーが典型的には適切な分子量遮断特性を有していないため、好ましくない。しかしながら、後述の分子量限界の範囲内のブロックを有するブロック・コポリマーは、本発明における使用に適している。
【００２３】
好ましくは、コポリマーが、少なくとも５．０×１０-10ｃｍ2／ｓの透過率を有している。
【００２４】
用語「透過率」は、水和したコポリマーを通過する分析対象（グルコース）の全体としての透過率を指して使用され、実験的に測定することができる。透過率は、分析対象が、センサを浸している流体と分析対象がアッセイ成分に接触するセンサの内側との間において平衡するために要する時間に、反比例に関係している。したがって、透過率が高いほど、センサの応答時間が高速になる。９５％の平衡に達するまでの遅延が、５分未満であることが望ましい。
【００２５】
好ましくは、ひとたび体内に埋め込まれると、コポリマーは、１週間〜１年間の期間、例えば３０日間をかけて分解する。５μｍというポリマーの標準的な厚さにおいては、これは０．１７μｍ／日の分解速度に相当する。分解速度は、水の透過率（膨潤）およびポリマーの分子量に依存する。膨潤が大きい（親水領域の含有量が多いことに対応する）ほど、分解が速くなり、分子量が大きいほど、分解が遅くなる。
【００２６】
好ましくは、グルコースの移動のため、生物分解性の材料が、２５０００Ｄａ以下の分子量遮断限界を有している。さらに好ましくは、生物分解性の材料が、１００００Ｄａ以下の分子量遮断限界を有している。アッセイ成分は、コポリマーを通って拡散してセンサから失われることがないよう、例えばたんぱく質またはポリマーなど、分子量が大きい。コポリマーの親水性ユニットがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と二価の酸とのエステルを含んでいる好ましい実施の形態においては、分子量遮断限界が、ＰＥＧ鎖の長さ、ポリマーの分子量、および親水性ユニットの重量割合によって左右される。ＰＥＧ鎖が長くなると、分子量遮断限界が高くなり、ポリマーの分子量が大きくなると、分子量遮断限界が低くなり、親水性ユニットの重量割合が少なくなると、分子量遮断限界が低くなる。
【００２７】
好ましくは、疎水性ユニットの重量割合が、コポリマーの１０〜９０％、より好ましくはコポリマーの１０〜５０％である。
【００２８】
好ましくは、それぞれの親水性ユニットの分子量が、２００〜１００００Ｄａ、より好ましくは４００〜４０００Ｄａである。親水性ユニットの分子量が小さすぎると、グルコースの透過率が低くなってしまう。
【００２９】
好ましくは、コポリマーの親水性ユニットのそれぞれが、ポリエチレングリコールと二価の酸とのエステルを含んでいる。ポリエチレングリコールの代案として、エチレングリコールとプロピレングリコールとの混合ポリマーを使用することができ、さらに／あるいはポリエーテル骨格が、疎水および／または親水基で置換されてもよい。ポリエチレングリコールのさらなる代案として、ポリ−テトラヒドロフラン（ポリ−ＴＨＦ）を使用してもよい。
【００３０】
好ましくは、親水性ユニットが、二価の酸としてテレフタル酸および／またはコハク酸を含んでいる。他の適切な二価の酸は、シュウ酸、酒石酸、フタル酸、アスパラギン酸、マロン酸、および例えばポリ（ダイマー酸−セバシン酸）といったオリゴマーまたはポリマーの二価酸である。一つの好ましい実施の形態においては、二価の酸がテレフタル酸のみである。他の好ましい実施の形態においては、コハク酸に対するテレフタル酸のモル比が、１：２〜２：１、適切には１：１である。
【００３１】
代案として、コポリマーの親水性ユニットが、オリゴマーを含んでもよい。適切なオリゴマーは、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ビニルピロリドン、ビニルアルコール、炭水化物、エチレンオキシド、および／または２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸のオリゴマーである。親水性ユニットがＨＥＭＡを含んでいる場合、生物分解性の結合（例えば、テレフタル酸結合などのエステル結合）が、生物分解性を高めるべくポリマー内にもたらされる。
【００３２】
好ましくは、各疎水性ユニットの分子量は、４００〜５０００Ｄａである。疎水性ユニットの分子量が大きすぎると、グルコースの透過率が低くなる。疎水性ユニットの分子量が小さすぎると、ポリマーの物理的な強度が低くなる。
【００３３】
好ましくは、コポリマーの疎水性ユニットが、ブタン−１，４−ジオールと二価の酸とのエステルを含んでいる。ブタン−１，４−ジオールの代案として、ペンタン−１，５−ジオールまたはヘキサン−１，６−ジオールを使用することができる。
【００３４】
好ましくは、疎水性ユニットが、二価の酸としてテレフタル酸および／またはコハク酸を含んでいる。好ましい実施の形態においては、コハク酸に対するテレフタル酸のモル比が、１：２〜２：１、適切には１：１である。あるいは、疎水性ユニットが、二価の酸としてテレフタル酸のみを含んでいる。他の適切な二価の酸は、上述されている。
【００３５】
代案として、コポリマーの疎水性ユニットが、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、ポリウレタン、および／またはアミドのオリゴマー（例えば、ナイロン−６、オリゴ−Ｎ−第三ブチルアクリルアミド、またはオリゴ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を含んでもよい。疎水性ユニットがＭＭＡを含む場合には、生物分解性の結合（例えば、テレフタル酸結合などのエステル結合）が、生物分解性を高めるべくポリマー内にもたらされる。
【００３６】
好ましいポリマーは、ａＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）ｂＰＢ（Ｔ／Ｓ）ｃという一般式を有しており、ここで「ａ」は、ＰＥＧ鎖の分子量を指し、「ｂ」は、得られたポリマーにおけるＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）（ポリエチレングリコール・テレフタル酸塩／コハク酸塩）の重量割合を指し、「ｃ」は、得られたポリマーにおけるＰＢ（Ｔ／Ｓ）（ポリブチレン・テレフタル酸塩／コハク酸塩）の重量割合を指す。そのようなポリマーの例は、６００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、１０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、２０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、４０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、１０００ＰＥＧＴ５０ＰＢＴ５０、および１０００ＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）６０ＰＢ（Ｔ／Ｓ）４０（Ｔ／Ｓ  ５０％）である。これらのポリマーは、生物分解性であり、高いグルコース透過率を有し、２５０００Ｄａの付近に分子量遮断特性を有している。
【００３７】
これらのポリマーのいくつかは、ＵＳ６３８３２２０およびＥＰ１２４７５２２に開示されている。
【００３８】
アッセイ成分は、コポリマーからなる殻によって包まれている。殻の内側に、１つ以上のアッセイ成分用チャンバが存在してもよい。
【００３９】
適切には、アッセイ成分は、殻内の水溶液である。
【００４０】
他の選択肢は、アッセイ成分を他の材料からなるマトリクス中に配置することであり、これがコポリマーからなる殻によって包まれる。
【００４１】
第３の選択肢は、アッセイ成分を他の材料からなる芯とコポリマーからなる外皮との間に配置することである。そのようなセンサについて、３つの種類が、興味深いところである。
【００４２】
第１に、使用において溶解する芯材料を使用することができる。そのような芯材料としては、ラクトース球（例えば、Meggle社のFlowLac（商標））、マンニトール球（例えば、Roquette社のPearlitol（商標））、サッカロース／スターチ球（例えば、Werners社のPharm-a-spheres（商標））、ＰＶＡ、およびＰＶＰが挙げられる。芯材料の性質に応じて、コポリマーの外皮を横切って拡散させて周囲の流体内の芯材料と平衡させてもよく、あるいはセンサ内に捕まえておいてもよい。例えば、マンニトールの芯を、溶解させ外皮を横切って拡散させて、センサ内に数μＭのマンニトール濃度を与えることができる。マンニトールの完全な溶解に要する標準的な時間は、１０〜１５分である。ＰＶＡおよびＰＶＰは、外皮を横切って拡散することはできないであろう。
【００４３】
第２に、使用時に膨潤し、アッセイ成分が拡散して進入できるマトリクスを形成する芯材料を、使用することができる。そのような芯材料としては、アクリルとの架橋ＰＥＧ、ＰＥＧＡポリマー、およびアガロースが挙げられる。
【００４４】
第３に、使用時に溶解せず膨潤もしない芯材料を使用することができる。そのような芯材料としては、ガラスが挙げられる。この場合、アッセイ成分が、芯材料とコポリマーからなる外皮との間の薄い殻状の空間内を移動することができる。
【００４５】
センサは、適切には、１つ以上の繊維またはビーズの形態である。円板も、望ましくはないがセンサに適した形態である。
【００４６】
センサは、好ましくはシリンジを使用して、注射によって皮膚へと導入することができ、あるいは他の方法、とくには国際公開第ＷＯ００／０２０４８号パンフレットに記載のいずれかの方法によって、皮膚へと導入することができる。センサは、好ましくは、患者への不快を最小限にするため、細いゲージの針によって注射するために適した大きさである。好ましくは、センサは、２０μｍ〜１ｍｍの最大寸法を有している。しかしながら、より大きい最大寸法を有する棒状のセンサも、使用可能である。
【００４７】
センサは、真皮の厚さの範囲へと導入することができ、あるいは皮下に導入することができ、あるいは表皮へと導入することも可能である。ただし、後者の場合には、おそらくは生物分解性の材料（そのような材料が存在している場合）が分解されるよりも前に、表皮層の成長によって皮膚から放出される可能性が考えられる。
【００４８】
センサが皮膚内に位置しているため、センサにおいて生成される光信号を、経皮的に（すなわち、皮膚の上層を通して）検出し、センサと外部の環境との間の直接的な接続を不要にすることができる。ひとたびセンサが皮膚内に配置されると、グルコースの測定を、何ら悪影響を生じることなく必要に応じて頻繁に行なうことができる。グルコースの測定がより頻繁に行なわれるならば、血液中のグルコースのレベルについてより密な制御を維持することができ、網膜症、腎症、神経障害、微小血管および大血管の障害全般、および循環不良などといった血糖の管理が不充分であることに関連する症状の発展の恐れを減らすことができるため、これは糖尿病患者の長期治療に関して格別の利点である。
【００４９】
本発明のセンサは、それ自身は、アッセイの読み取りを照会するために必要とされる光学的な構成要素（別個に用意されて体外に配置される）を含んでいないため、センサを、患者にとっての不快を最小限にしつつ注射することができる形態で容易に提供することが可能である。
【００５０】
センサに使用するために適したアッセイとしては、経皮的に観測することができる検出可能な光学的変化、すなわち蛍光の強調または消光につながる加水分解および酸化などの反応が挙げられる。本発明のセンサにおいて使用するために好ましいアッセイは、その読み取りが光学的な手段を使用して経皮的に照会できる検出可能または測定可能な光信号である結合アッセイである。光信号を生成する結合アッセイは、好ましくは、グルコースのレベル変動の連続的な監視を実現できるよう、可逆であるべきである。この可逆性は、アッセイ成分が消費されない結合アッセイ形式の使用に特有の利点である。結合アッセイは、酵素または電気化学反応において生成される可能性がある望ましくない生成物が生成される可能性がないため、安全性の理由においても、本発明のセンサにおける使用のために好ましい。
【００５１】
本発明のセンサにおいて使用するために好ましい結合アッセイの構成としては、その成分がグルコース類似物質と、グルコースおよびグルコース類似物質の両者に可逆に結合できるグルコース結合剤とを含んでいる可逆競合試薬限定結合アッセイが挙げられる。グルコースとグルコース類似物質とが、グルコース結合剤の同じ結合サイトへの結合について競争する。このような競合結合アッセイの構成は、臨床診断の技術分野においてよく知られており、例えばThe Immunoassay Handbook、ed. David Wild、Macmillan Press 1994に説明されている。アッセイにおいて使用するために適した分析対象結合剤としては、グルコース結合サイトを保持している抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）、レクチン（例えば、コンカナバリンＡ）、ホルモン受容体、薬物受容体、アプタマー、および分子インプリント・ポリマーが挙げられる。
【００５２】
本発明によるアッセイの読み出しとして使用することができる適切な光信号としては、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光偏光、蛍光消光、燐光技法、発光強調、発光消光、回折、またはプラズモン共鳴によって生成される光信号など、近接アッセイによって生成することができるあらゆる光信号が挙げられる。
【００５３】
本発明のセンサの最も好ましい実施の形態は、蛍光共鳴エネルギー移動の技法を使用して光学的な読み出しを生成する競合試薬限定結合アッセイを取り入れている。このアッセイ形式においては、グルコース類似物質が、第１の発色団でラベル付けされ、グルコース結合剤が、第２の発色団でラベル付けされている。第１および第２の発色団の一方が、ドナー発色団として機能し、他方が、アクセプタ発色団として機能する。
【００５４】
ドナー発色団およびアクセプタ発色団が結合剤によって密に近接させられているとき、（ドナー発色団によって吸収される波長の入射放射線で照射した後に）ドナー発色団によって発せられて通常であれば蛍光を生み出すエネルギーの或る部分が、蛍光共鳴エネルギー移動として知られるプロセスにて、非発光で隣接するアクセプタ発色団へと伝えられるよう、ドナー発色団の蛍光放射スペクトルが、アクセプタ発色団の吸収スペクトルと重なり合っていなければならない。これは、ドナー発色団によって発せられる蛍光信号の或る部分が消光され、蛍光の寿命が変化し、いくつかの場合にはアクセプタ発色団が蛍光を発するという結果を有している。しかしながら、アクセプタ発色団は、非蛍光の染料であってもよい。
【００５５】
蛍光共鳴エネルギー移動は、グルコース類似物質がグルコース結合剤へと結合することによってドナー発色団とアクセプタ発色団とが密に近接させられている場合にのみ生じる。したがって、グルコース結合剤へと結合すべくグルコース類似物質と競合するグルコースが存在すると、ラベル付けされているグルコース類似物質が、グルコース結合剤との結合から除外されるため、消光の量が少なくなる（ドナー発色団によって発せられる蛍光信号の強度に測定可能な増加が引き起こされ、あるいはアクセプタ発色団によって発せられる信号の強度に測定可能な低下が引き起こされる）。したがって、ドナー発色団から発せられる蛍光信号の強度または寿命が、センサを浸している皮下流体中のグルコースの濃度に相関する。
【００５６】
蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ形式のさらなる好都合な特徴は、アクセプタ発色団の吸収スペクトルの範囲の波長の入射放射線ビームによる励起に続いてアクセプタ発色団によって発せられる蛍光信号が、蛍光共鳴エネルギー移動のプロセスによって影響されないという事実から生じる。したがって、アクセプタ発色団によって発せられる蛍光信号の強度を、例えばセンサの連続的な較正において、あるいはセンサの劣化の程度を監視して新たなセンサの埋め込みまたは注射の必要を知らせるために、内部基準信号として使用することができる。この信号が、認容可能な基準レベルを下回って低下することが、新しいセンサの埋め込みまたは注射の必要を知らせる。
【００５７】
本発明のセンサにおける使用に合わせて構成できる蛍光共鳴エネルギー移動の技法を使用する競合結合アッセイは、この技術分野において知られている。ＵＳ３９９６３４５が、抗体および蛍光剤−消光剤の発色団ペア間の蛍光共鳴エネルギー移動を使用する免疫学的検定を説明している。MeadowsおよびSchultz (Anal. Chim. Acta(1993) 280:p21〜30)は、ラベル付けされたグルコース類似物質（ＦＩＴＣでラベル付けされたデキストラン）とラベル付けされたグルコース結合剤（ローダミンでラベル付けされたコンカナバリンＡ）との間の蛍光共鳴エネルギー移動にもとづくグルコースの測定のためのホモジニアス・アッセイ法を説明している。これらの構成のすべてにおいて、アクセプタおよびドナー発色団／消光剤を、結合剤またはグルコース類似物質のどちらかに結び付けることができる。
【００５８】
本明細書の導入部分において引用した背景技術に記載されている種々のＦＲＥＴ成分を、使用することが可能である。
【００５９】
蛍光の寿命または蛍光の強度の測定を、行なうことができる。Ｌａｋｏｗｉｃｚらに記載されているように、蛍光の寿命を、位相変調技法によって測定することが可能である。
【００６０】
蛍光共鳴エネルギー移動の代案は、蛍光消光技法である。この場合には、蛍光消光能力を有する化合物が、特定のアクセプタ発色団の代わりに使用され、競合結合アッセイにおける光信号が、グルコースの増加とともに強くなる。強力であって非特異的な蛍光消光剤の例が、TyagiらのNature Biotechnology (1998) 18:p49に提示されている。
【００６１】
適切なグルコース類似物質は、デキストランである。適切なグルコース結合剤は、レクチン、例えばコンカナバリンＡである。
【００６２】
蛍光消光または蛍光共鳴エネルギー移動に依存するアッセイにおいては、生物分解性材料からなる殻構造が、互いに結合していない場合の蛍光物質および消光剤分子を、蛍光物質の消光を止めるべく隔てるために充分な空間を提供している。
【００６３】
第２の態様において、本発明は、本明細書に記載のセンサの製作方法に関する。
【００６４】
センサは、コポリマーからなる開いた中空殻を形成し、この殻をアッセイ成分で満たし、この殻を封止してセンサを形成することによって、製作することができる。
【００６５】
押し出し法または成型法を使用することができる。ＰＥＧＴ−ＰＢＴのようなポリマー（Arnitel（商標）（ＤＳＭ）およびHytrel（商標）（ポリテトラメチレングリコール−テレフタレート−ポリアルカン−テレフタレート；Dupont社））が、射出成型、押し出し、およびブロウ成型（フィルム製造）のために広く使用される。
【００６６】
ポリマー・マイクロカプセルの製作のための化学的方法として、相分離（コアセルベーション）、溶媒の気化および／または抽出が挙げられる。
【００６７】
コアセルベーション技法は、ポリマー溶液へと第３の非溶媒成分を添加したときのコーティング・ポリマーの溶解度の低下に依拠している。非溶媒は、ポリマーを溶かさない。第３の成分の添加の際、２つの液相、すなわちポリマーに富んでいるコアセルベートと、上澄み液とが形成される。アッセイ成分が、ポリマー溶液に分散された液滴である場合、それらをコアセルベートによってコートすることができ、水で満たされた芯がポリマー殻を備えて形成される。殻を、ポリマー溶媒の気化または抽出によって硬化させる。コアセルベーション・プロセスにおける重要なパラメータは、第３の成分に対する溶媒の割合、ポリマーの濃度、アッセイ成分に対するポリマーの割合、非溶媒の添加速度、界面活性剤の性質、および界面活性剤の濃度である。溶液での作業の代案として、アッセイ成分を、乾燥微細化粉末として分散させることが可能である。
【００６８】
相分離についての実験から、この方法を使用してＰＥＧＴ−ＰＢＴマイクロカプセルを製作できることが示されている。適切なポリマー溶媒は、ジクロロメタンである。相分離を誘起すべく使用される第３の成分は、例えば少量の界面活性剤（例えば、Ｓｐａｎ  ８５（商標））を含むシリコーン油、ゴマ油、または綿実油であってよい。硬化剤は、適切にはヘプタンである。
【００６９】
溶媒気化技法においては、ポリマーが適切な溶媒（例えば、ジクロロメタン）に溶かされ、ポリマーと混和することができない水性外側相に分散される。水性の相は、粒子の凝集を防止するため、１つ以上の安定剤（例えば、ポリビニルアルコール）を含んでいる。有機溶媒が気化させられて、硬化した粒子がもたらされる。アッセイ成分を、微細化粉末として、あるいは溶液として、有機溶液へと分散させることができる。アッセイ成分が溶液である場合に、密なマイクロ球ではなくマイクロカプセルを得るために、主たる乳濁液（油中水）の組成が、注意深く選択されなければならない。乳濁液は、水溶液中のアッセイ成分および有機溶媒中に溶解したＰＥＧＴ−ＰＢＴポリマーで構成される。
【００７０】
ＰＥＧＴ−ＰＢＴポリマーの溶媒抽出に使用されるべくジクロロメタンよりも高い水混和性を有している適切な溶媒は、酢酸エチル、ＮＭＰ、ＤＭＳＯ、およびジメチルイソソルビドである。ＤＭＦおよびγ−ブチロラクトンも、適切な溶媒である。溶媒の組み合わせも使用可能である。
【００７１】
ポリマー・マイクロカプセルの製作に適した物理的方法としては、噴霧乾燥、噴霧コーティング、噴霧冷却、回転ディスク・アトマイゼーション、流動床コーティング、共押し出し（例えば、静止ノズル共押し出し、遠心ヘッド共押し出し、または浸漬ノズル共押し出し）、およびパン・コーティングが挙げられる。
【００７２】
カプセルのための噴霧乾燥法は、一般的には、芯材料（アッセイ成分と混合されている）および殻材料（溶液）が組み合わせられる二重ノズルを使用する。液滴を、超音波または振動によって形成でき、その後に空気であってよい硬化浴にて乾燥（溶媒の気化）させることによって硬化させる。マイクロカプセルの大きさおよび殻の厚さは、ノズルの寸法、溶液および硬化溶媒の濃度を変えることによって調整できる。この方法において、水を使用できない場合には、適切な芯材料（例えば、アガロース、ＰＶＰ、およびＰＶＡ）を選択しなければならない。
【００７３】
流動床コーティングにおいては、予め形成された芯材料のマイクロ球（アッセイ成分と混合され、あるいは例えば予備的な噴霧コーティングまたは流動床コーティングの工程によって、アッセイ成分でコートされている）が、溶液である殻材料でコートされる。その後の溶媒の気化によって、薄い殻層がもたらされる。流動床コーティングの実行時、好ましくは、上噴霧流動床コーター（Ｃｏｍｂｉ  Ｃｏａｔａ（商標）流動床システムなど）が滑らかな仕上がりを達成するために使用されるが、下噴霧流動床コーターも使用可能である。
【００７４】
噴霧コーティングにおいては、予め形成された芯材料のマイクロ球（アッセイ成分と混合され、あるいは例えば予備的な噴霧コーティングまたは流動床コーティングの工程によって、アッセイ成分でコートされている）が、溶液である殻材料の噴霧によってコートされる。その後の溶媒の気化によって、薄い殻層がもたらされる。
【００７５】
適切なコーティング手順は、例えば、芯をいくつかのコーティング材料のカーテンを通過して送ること（ＵＳ５２４６６３６）、噴霧乾燥およびディスク乾燥からの粒子を集めること（ＵＳ４７６４３１７）、液滴をコートすること（ＵＳ４６７５１４０）である。ＵＳ２００３／００１３７８３  Ａ１は、カプセルの製作のための二重ノズルシステムの使用を記載している。
【００７６】
第３の態様において、本発明は、本明細書に記載のセンサを使用してグルコースを検出する方法であって、このセンサを哺乳類の皮膚へと埋め込むこと、外部の光学的手段を使用して経皮的にグルコースを検出または測定すること、および生物分解性材料を分解することを含んでいる方法に関する。
【００７７】
センサは、光学的な手段を使用して経皮的に照会され、すなわちセンサと光学的手段との間の物理的な接触を必要としない。センサが、蛍光エネルギー移動の技法を使用する競合試薬限定結合アッセイを取り入れている場合、光学的手段は、ドナー発色団の吸収スペクトルの範囲内の波長の第１の入射放射ビームを供給しなければならず、好ましくは、アクセプタ発色団の吸収スペクトルの範囲内の波長の第２の入射放射ビームを供給しなければならない。さらに、光学的手段は、好ましくは、異なる２つの波長でセンサにおいて生成された光信号を測定できなければならない。すなわち、ドナー発色団の放射スペクトルの範囲内の波長１（グルコースの測定に関して生成される信号）、およびアクセプタ発色団の放射スペクトル内の波長２（グルコースの信号であってよく、あるいは内部基準信号または較正用信号であってよい）である。
【００７８】
本発明の装置の遠方からの照会に使用するために適した光学的手段としては、例えば発光ダイオード（青色、緑色、または赤色）などの励起光源と、励起光フィルタ（ダイクロイック・フィルタまたは染料フィルタ）と、蛍光検出器（ＰＩＮダイオード構成）とを有する簡潔な高処理能力の蛍光光度計を挙げることができる。これらの特徴を備える蛍光光度計は、ピコモル〜フェムトモルの蛍光物質濃度の感度を呈することができる。
【００７９】
適切な蛍光光度計の設備構成が、添付の図２に示され、本明細書に含まれている実施例に説明されている。蛍光光度計は、次のパラメータを別個に測定する。
・波長１（ドナー発色団）において
励起光強度  Ｉ（１，０）
周辺光強度  Ｉ（１，１）
蛍光と周辺光との組み合わせの強度  Ｉ（１，２）
・波長２（アクセプタ発色団）において
励起光強度  Ｉ（２，０）
周辺光強度  Ｉ（２，１）
蛍光と周辺光との組み合わせの強度  Ｉ（２，２）
【００８０】
測定は、蛍光光度計を皮膚の近くに、センサと並べて保持することによって行なわれる。センサにおいて生成される蛍光信号を経皮的に測定する際には、皮膚による信号の吸収を考慮する必要があり、人間の皮膚の吸収率は、４００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲で最小になることが実験によって見出されている。もたらされる最終的な出力は、以下の関係（式１）によって定められる２つの蛍光物質からの蛍光強度の間の正規化済みの比である。
（式１）
最終的な出力＝(I(1,2)−I(1,1))★I(2,0)／(I(2,2)−I(2,1) ★I(1,0)
【００８１】
上述の式（１）によって与えられる光学的手段（例えば、蛍光光度計）からの最終的な出力が、好ましくは後述の原理にもとづいて得ることができる較正データを使用するコンピュータによって、分析対象の濃度へと変換される。
【００８２】
生理学的に該当する範囲のグルコース濃度について、グルコース濃度に対する応答を測定することによって、経験的に較正曲線を確立することができる。これは、好ましくは、センサ装置の製造の一部として、体外で行なわれる。較正の手順は、以下のとおり導き出される競合親和センサにおける応答とグルコース濃度との間の数学的関係を使用することによって、顕著に簡単化することができる。
競合親和センサの応答は、分析対象の結合剤（Ｒ）と分析対象（Ｌ）または分析対象類似物（Ｃ）との組み合わせによって形成された複合体ＲＣおよびＲＬの解離を表わす反応
ＲＣ  ←→  Ｒ  ＋  Ｃ
ＲＬ  ←→  Ｒ  ＋  Ｌ
によって支配される。
対応する解離平衡定数は、
【数１】
2007537805.tif 000002
および
【数２】
2007537805.tif 000003
であり、
ここで、Ｃは、センサの体積で除算したセンサ内のそれぞれの種のモル数を指している。この濃度の指標を使用して、不動の種および溶液中の種の両者が同様に取り扱われる。
物質収支の式は、分析対象類似物質の全濃度について、
ＴC＝ＣC＋ＣRC
であり、
分析対象の結合剤の全濃度について、
ＴR＝ＣR＋ＣRC＋ＣRL
である。
上述の式を使用して、応答と分析対象の濃度との間の関係が導かれる。
【数３】
2007537805.tif 000004
この関係を使用することによって、較正に必要なデータの量を、分析対象の結合剤の全濃度および分析対象類似物質の全濃度という２つの鍵となるパラメータへと減らすことができる。したがって、較正曲線が、曲線上の２つの点によって決定される。
【００８３】
本発明を、以下の実施例（本発明がこれらに限られるわけではない）を添付の図面とともに参照することによって、さらに理解できるであろう。
【実施例１】
【００８４】
本発明のセンサに使用するための種々の材料の適切さを判断するため、透過率テストを実行した。ポリマーを、８０重量％の親水性セグメントおよび２０重量％の疎水性セグメントという目標で、S. FakirovおよびT. GogevaのMacromol. Chem. 191 (1990) 603〜614に記載のとおりに製作した。
【００８５】
ドナー・チャンバ１０およびアクセプタ・チャンバ１２を有する透過性セル（図１）にて、テストを実行した。チャンバ１０、１２のそれぞれの容積を、５ｍＬとした（あるいは、変種の透過性セルにおいては３０ｍＬ）。テストしようとする材料の膜１４を、室温で３０分間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で膨潤させた。次いでこの膜を、セルのチャンバ間の密な接続を保証するため、ゴム製Ｏリング（図示されていない）を使用してチャンバ間に取り付けた。膜を、一方のチャンバの上部に配置し、セルの第２の部分を、膜が決して切断されたり損傷したりすることがないよう、きわめて注意深く第１の部分の上に配置した。撹拌棒と膜の間の物理的な接触によって膜に損傷が生じることがあるため、金属メッシュをチャンバへと挿入して使用することによって、膜を撹拌棒から保護した。
【００８６】
５００ｍＭのグルコース（ＰＢＳ中）をドナー・チャンバへと導入し、ＰＢＳをアクセプタ・チャンバに導入した。アクセプタ・チャンバのグルコース濃度を、時間の関数として測定した。測定は、Ｂａｙｅｒ社から市販されているGlucometer Elite（商標）試験片を使用して実行した。試験片を、ＰＢＳバッファ中での使用について較正した。任意のグルコース測定装置を使用することができるが、使用される媒体中での較正は、行われなければならない。
【００８７】
補正後のグルコース値を、拡散係数の計算に使用した。
【００８８】
表１に、実施例１に記載のとおりに製作されたポリマーの拡散結果を示す。
【表１】
2007537805.tif 000005
１）：拡散セルのアクセプタ・チャンバにおいてテスト結合の存在についての特定の印が得られるまでに要する日数
２）：耐久時間は、単位厚さにおいて結合が検出されるまでの時間として計算
【００８９】
表２に、ＰＥＧＴ−ＰＢＴ膜について実行したグルコース拡散についてまとめた結果を示す。
【表２】
2007537805.tif 000006
【００９０】
表３に、デキストラン結合拡散実験の結果を示す。
【表３】
2007537805.tif 000007
１）：拡散セルのアクセプタ・チャンバにおいてテスト結合の存在についての特定の印が得られるまでに要する日数
２）：耐久時間は、単位厚さにおいて結合が検出されるまでの時間として計算
【００９１】
テストを、膜を通ってのアッセイ成分の漏れについて実行した。濃度２μｍ〜１０μＭのＣＦＳＥ−デキストランを、ドナー・チャンバに導入し、アクセプタ・チャンバのＣＦＳＥ−デキストラン濃度を時間の関数として、小量キュベットを使用した定常状態蛍光定量法によって測定した。
【実施例２】
【００９２】
MeadowsおよびSchultz (Talanta、35、145〜150、 1988)によるグルコース・アッセイを、コンカナバリンＡ−ローダミンおよびデキストラン−ＦＩＴＣ（どちらもMolecular Probes Inc.、Oregan、USAから）を使用して作成した。アッセイの原理は、密に近接したときの２つの蛍光物質間の蛍光共鳴エネルギー移動であり、グルコースの存在下においては、共鳴エネルギー移動が妨げられ、ＦＩＴＣ（フルオレセイン）からの蛍光信号が強くなる。すなわち、蛍光の増加がグルコースの増加に相関する。このグルコース・アッセイは、Schultzによって報告されているとおり、２０ｍｇ／ｄＬのグルコースにおいてフルオレセイン蛍光信号の約５０％のリカバリでグルコースに応答することが検出された。蛍光は、シッピング装置を用いた通流測定にあわせて構成されたPerkin Elmer蛍光光度計にて測定した。
【実施例３】
【００９３】
光ファイバー蛍光光度計を、次のとおり組み立てた。
【００９４】
光ファイバー蛍光光度計の光学部分を、マイクロ・ベンチ上の標準的な構成要素から製作した。光源としての赤色ＬＥＤ、レンズ、ダイクロイックなビームスプリッタおよびフィルタ、ならびに検出器ダイオードを有する設備構成を、図２に示すとおりとした。簡単に説明すれば、この蛍光光度計は、励起フィラー（３）を含んでいるコンデンサ（２）を通過してビームスプリッタ（４）に入射する励起光ビームをもたらす発光ダイオード（１）を有している。これにより、励起用ビームの一部が、発射用の光学系（５）へと向けられ、光ファイバ（６）に進入する。蛍光光度計が、励起光のビームがセンサへと入射するよう皮膚のセンサに整列して、皮膚の端部において皮膚に位置したセンサの照会に使用されるとき、励起に続いてセンサから放射される光信号の一部が光ファイバ（６）に進入し、蛍光光度計へと運ばれて、ブロッキング・ダイオード（７）を通過する。さらに蛍光光度計は、ＬＥＤ（１）から発せられた励起光についての基準測定値をもたらす基準検出器ダイオード（９）を含んでいる。直径が０．５ｍｍであって開口数が０．６５である長さ１ｍのEnsign Beckford光ファイバーの両端を、ガラス・ペースト上のダイアモンド・ペーストを使用して鏡面仕上げへと研磨した。このファイバーの一端を、２０×の顕微鏡対物レンズの前面のＸＹＺホルダに取り付けた。ダイオード（ＬＥＤ（１）ならびに検出器ダイオード（７）および（９））は、図３に示すとおり特製のドライバ／増幅器回路へと接続した。この回路は、発信部（１０）、電流増幅器（１１）および（１２）、マルチプレクサ（１３）および（１４）、積分器（１５）および（１６）、ならびにアナログ除算器（１７）を有している。ドライバ回路を、２３８ＨｚでＬＥＤ（１）を駆動するように設定し、検出器ダイオード（７）および（９）からの信号を、駆動信号と同期させて接地と保存コンデンサ（１秒の時定数を有する積分器）との間で切り換えた。２つの積分信号が、バックグラウンドについて補正を済ませた蛍光信号、およびバックグラウンドについて補正を済ませた励起光レベル（ＬＥＤ強度）に相当する。後者による前者の除算が、図３に示すとおりアナログ除算器によってサポートされた。テストの目的のため、ファイバー（６）の遠位端をローダミンの希釈溶液に浸し、光学系をアナログ除算器からの最大信号にあわせて調節した。
【００９５】
この蛍光光度計は、電池で駆動され（典型的な電力消費は９Ｖにおいて１５０ｍＡ）、ペンの形状および寸法に好都合に構成できる。
【実施例４】
【００９６】
アッセイ成分を含んでいるビーズを、以下のやり方で二重乳濁液溶媒気化技法によって製作した。
【００９７】
ＰＢＳ中のＨＭＣＶ１−Ｄｅｘｔｒａｎ  １１０ｋＤａ（３０μＭ）およびＡＦ５９４−ＣｏｎＡ−ｓｕｃｃ（３０μＭ）のアッセイ成分混合物１．０ｍｌを、ジクロロメタン中の１０％ポリマー（１０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０）溶液５ｍｌに、１重量％のＳｐａｎ８５（商標）界面活性剤とともに乳化させ、油中水乳濁液を形成した。次いで、この乳濁液を、１００ｍｌフラスコ内の１０％ポリビニルピロリドン４０ｍｌへと加え、水中油中水乳濁液を形成した。ジクロロメタンを速やかに気化させるため、この乳濁液に真空を加えた。５時間後に、紺青色のマイクロカプセルを濾過によって集め、ＰＢＳバッファ（ｐＨ７．４、５０ｍＭ）で数回洗浄した。得られたビーズを、グルコース応答テストまで冷蔵庫（４℃）に保存した。
【実施例５】
【００９８】
実施例４において製作したビーズを、ＰＢＳバッファ中で３回洗浄し、周波数ドメイン測定の開始前に、沈殿物となるまで前面キュベット中に放置した。これらの測定は、ＫＯＡＬＡ（ISS、Champaign IL、USA）にて実行した。励起正弦波と放射正弦波との間の位相のずれを、蛍光の寿命に変換できるが、生データを、数学的処理の必要なく測定したままで使用した。測定を、ＰＢＳバッファのみ、および２５ｍＭのグルコースを含むＰＢＳバッファについて行なった。溶液を交換するときには、測定しようとする溶液でビーズを充分に洗浄した。
【００９９】
図４は、ＰＢＳバッファ（グルコース０ｍＭ）および２５ｍＭのグルコースを含むＰＢＳバッファにさらしたときのビーズの集まりについての位相測定結果を示している。実験は、２日にわたって行なった。
【実施例６】
【０１００】
実施例４において製作したビーズを、麻酔した豚の皮膚内へと配置した。位相の読み取りを図５に示す。６３０分後における位相の急激な増加は、グルコースの注射によるものである。この増加は、動脈の血液における約１０ｍＭのグルコースの上昇に相当する。
【実施例７】
【０１０１】
実施例４にて用意したビーズを、人間のボランティアの手の甲に、シリンジによって注射する。
【０１０２】
光ファイバー蛍光光度計（実施例４を参照）を皮膚へと向け、ローダミン蛍光寿命信号を得て従来からの血糖の測定と相関付けると、埋め込んだセンサについて経皮的な測定が可能であることを示している。
【実施例８】
【０１０３】
アッセイ成分を含んでいる中空繊維を、以下のやり方で製作した。
【０１０４】
直径が０．４ｍｍであって長さが１０ｃｍである棒状の金属テンプレートを、クロロホルム中の１０％ｗ／ｖの１０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０ポリマー溶液へと、間にそれぞれ３０秒間の乾燥をはさみつつ５回浸漬させて、繊維を製作した。ポリマーを水中で膨潤させることによって、繊維をテンプレートから取り外した。乾燥の後、繊維を所望の長さ（典型的には、約４ｍｍ）に切断し、一端を熱によって閉じた。Alexa Fluor（商標）５９４を結合させたコンカナバリンＡ（ＡＦ５９４−ＣｏｎＡ）およびHexa-Methoxy Crystal Violetを結合させたアミノデキストラン（１５０ｋＤａ）（ＨＭＣＶ１−デキストラン）から調製したアッセイ成分を、細い針を使用して繊維へと導入した。注入後に、繊維の他端を熱によって閉じた。これにより、図６に示したものに類似する繊維がもたらされた（長さ２ｍｍ）。
【０１０５】
これらの繊維を、グルコースをTris−バッファ（生理食塩水）中に２．５ｍＭ、５ｍＭ、２５ｍＭ、および５０ｍＭの間のさまざまな濃度で含んでいるキュベット内に配置した。これらの繊維を、位相蛍光光度計によって連続的に照会した。図７に、実験の第１日目についての位相測定結果を示し、図８に、１５日間のテスト全体についての位相測定結果を示す。
【実施例９】
【０１０６】
実施例８において製作した繊維を、麻酔した豚の皮膚内へと配置し、位相蛍光光度計によって皮膚を通して照会した。位相の読み取りを図９に示す。６．５時間後における急激な増加は、グルコースの注射によるものである。この増加は、血中のグルコースの３５ｍＭへの上昇に相当する。
【実施例１０】
【０１０７】
アッセイ成分を取り込んでなるマンニトール芯をポリマーでコートして含んでいる粒子を、以下のやり方で製作した。
【０１０８】
３１５μｍ〜３５０μｍの粒子サイズへと篩い分けした５０ｇのマンニトール（例えば、Pearlitol（商標）３００  ＳＤ）球を、Combi Coata（商標）上噴霧流動床システム（図１０）において、３５℃の温度で３０ｍＬのＡＦ５９４−ＣｏｎＡ／ＨＭＣＶ１−Dextran水溶液でコートした。この水溶液は、１ｍＬ／分の速度で床／マンニトール球へと加えられた。
【０１０９】
床内の温度を２８℃まで下げ、ポリマー溶液（クロロホルム中の５％ｗ／ｗの１０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０）を１．５ｍＬ／分の速度で加えた。約２０μｍのコーティング厚さを得るため、２０ｇのポリマー、すなわち４００ｇのポリマー溶液を加えなければならず、これには約３時間を要した。乾燥の後、これらの粒子をTris−バッファ生理食塩水に浸漬させた。図１３は、膨潤したポリマー殻、および粒子内部のマンニトール芯の途中までの溶解を示している。マンニトール芯は、１０〜１５分の後に完全に溶解した。
【実施例１１】
【０１１０】
実施例１０にて調製したセンサを、人間のボランティアの手の甲に、シリンジによって注射する。
【０１１１】
光ファイバー蛍光光度計（実施例３を参照）を皮膚へと向け、ローダミン蛍光寿命信号を得て従来からの血糖の測定と相関付けると、埋め込んだセンサについて経皮的な測定が可能であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】実施例１の透過率テストに使用された透過性セルの図である。
【図２】光ファイバー蛍光光度計（実施例３）の光学部分の概略図である。
【図３】光ファイバー蛍光光度計（実施例３）の光学部分に組み合わせて使用されるドライバ／増幅器回路の概略図である。
【図４】実施例５においてテストされたビーズの集まりについて、２日間にわたってＰＢＳバッファ（グルコース０ｍＭ）および２４ｍＭのグルコースを含むＰＢＳバッファにさらしたときの位相測定結果を示している。
【図５】実施例６の皮膚内に配置されたビーズについての位相測定結果を示している。
【図６】実施例８において調製された繊維を示している。
【図７】ＡＦ５９４−ＣｏｎＡおよびＨＭＣＶ１−Ｄｅｘｔｒａｎを含んでいる実施例８においてテストされた繊維の集まりについて、１日間にわたって１０ｍＭのTris−バッファ生理食塩水中の２．５ｍＭ、５ｍＭ、２５ｍＭ、および５０ｍＭのグルコースのグルコース濃度にさらしたときの位相測定結果を示している。
【図８】ＡＦ５９４−ＣｏｎＡおよびＨＭＣＶ１−Ｄｅｘｔｒａｎを含んでいる実施例８においてテストされた繊維の集まりについて、１５日間にわたって１０ｍＭのTris−バッファ生理食塩水中の２．５ｍＭ、５ｍＭ、２５ｍＭ、および５０ｍＭのグルコースのグルコース濃度にさらしたときの位相測定結果を示している。
【図９】実施例９の皮膚内に配置された繊維についての位相測定結果を示している。
【図１０】実施例１０において使用された上噴霧流動床システムを示している。
【図１１】水性蛍光成分およびクロロホルム溶液からのポリマーでコートされたマンニトール芯を示している（実施例１０）。２度コートされた粒子がバッファ中に、マンニトール芯の全体が溶解する前について示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年10月28日(2005.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースを生体内で検出するためのセンサであって、
・その読み取りが当該センサが体内に埋め込まれたときに外部の光学的手段によって経皮的に照会できる検出可能な光信号であるグルコースのためのアッセイ成分、および
・分析対象の前記アッセイ成分への接触を許容しつつ、前記アッセイ成分を包んでいる生物分解性材料の殻
を有しており、
前記生物分解性材料が、疎水性ユニットと親水性ユニットとを有するコポリマーを含んでおり、該親水性ユニットのそれぞれが、ポリエチレングリコールと二価の酸とのエステルを含んでいるセンサ。
【請求項２】
前記コポリマーが、ランダム・コポリマーである請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記コポリマーが、２５０００Ｄａを超えない分子量遮断限界を有している請求項１または２に記載のセンサ。
【請求項４】
前記コポリマーが、１００００Ｄａを超えない分子量遮断限界を有している請求項３に記載のセンサ。
【請求項５】
前記コポリマーが、少なくとも５．０×１０-10ｃｍ2／ｓの透過率を有している請求項１〜４のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項６】
前記疎水性ユニットの重量割合が、前記コポリマーの１０〜９０％である請求項１〜５のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項７】
前記親水性ユニットが、二価の酸としてテレフタル酸および／またはコハク酸を含んでいる請求項１〜６のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項８】
前記親水性ユニットが、二価の酸としてテレフタル酸のみを含んでいる請求項７に記載のセンサ。
【請求項９】
前記親水性ユニットにおいて、コハク酸に対するテレフタル酸の比が、１：２〜２：１である請求項７に記載のセンサ。
【請求項１０】
それぞれの親水性ユニットの分子量が、４００〜４０００である請求項１〜９のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項１１】
前記コポリマーの前記疎水性ユニットが、ブタン−１，４−ジオールと二価の酸とのエステルを含んでいる請求項１〜１０のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項１２】
前記疎水性ユニットが、二価の酸としてテレフタル酸および／またはコハク酸を含んでいる請求項１１に記載のセンサ。
【請求項１３】
前記疎水性ユニットが、二価の酸としてテレフタル酸のみを含んでいる請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１４】
コハク酸に対するテレフタル酸の比が、１：２〜２：１である請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１５】
前記アッセイが、結合アッセイである請求項１〜１４のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項１６】
前記結合アッセイが、競合結合アッセイであり、その成分が、グルコース結合剤およびグルコース類似物質を含んでいる請求項１５に記載のセンサ。
【請求項１７】
前記グルコース類似物質が、第１の発色団でラベル付けされ、前記グルコース結合剤が、第２の発色団でラベル付けされ、第１の発色団または第２の発色団の放射スペクトルが、それぞれ第２の発色団または第１の発色団の吸収スペクトルと重なり合っている請求項１６に記載のセンサ。
【請求項１８】
前記結合剤が、抗体、Ｆａｂフラグメント、レクチン、ホルモン受容体、薬物受容体、アプタマー、または分子インプリント・ポリマーである請求項１６または１７に記載のセンサ。
【請求項１９】
前記検出または測定可能な光信号が、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光偏光、蛍光消光、燐光、発光強調、発光消光、回折、またはプラズモン共鳴によって生成される請求項１〜１８のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のセンサの製作方法。
【請求項２１】
コアセルベーション、溶媒の気化および／または抽出、噴霧乾燥、噴霧コーティング、噴霧冷却、回転ディスク・アトマイゼーション、流動床コーティング、共押し出し、ならびに／あるいはパン・コーティングを含んでいる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のセンサを使用してグルコースを検出する方法であって、該センサを哺乳類の皮膚へと埋め込むこと、外部の光学的手段を使用して経皮的にグルコースを検出または測定すること、および前記生物分解性材料を分解することを含んでいる方法。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のセンサを使用してグルコースを検出する方法であって、哺乳類の皮膚の中または下方に存在する該センサを照射することによって、外部の光学的手段を使用して経皮的にグルコースを検出または測定することを含んでいる方法。
【国際調査報告】
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