(57)【要約】  ｎｃＲＮＡ分子の新規な検出方法を記載する。開示する方法は、検出ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡに特に有用である。この方法は、試料中に存在するｎｃＲＮＡ分子のプロファイルを作成するのに使用し得る。また、本開示の方法を用いて、所与の疾病又は症状に対するｎｃＲＮＡ固有性を創成し得る。ｎｃＲＮＡ固有性は、診断目的、治療目的及び創薬目的、並びに他の用途に使用し得る。
2007533324.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．  対象から得たＲＮＡ試料であって、複数の標的ｎｃＲＮＡを含有する前記試料を用意する工程と、
ｂ．  前記試料を、検出すべき前記標的ｎｃＲＮＡの各々に特異的な第１オリゴヌクレオチドと、前記第１オリゴヌクレオチドと前記標的ｎｃＲＮＡとの複合体の形成に適切な条件下で接触させる工程であって、前記第１オリゴヌクレオチドの各々が、第１の検出可能なシグナルを発生する第１のシグナル発生体を含み、前記第１オリゴヌクレオチドの各々が、前記標的ｎｃＲＮＡの各々の結合に対する、実質的に同じである第１のＴｍを有する工程と、
ｃ．  前記試料を、検出すべき前記標的ＲＮＡの各々と結合する第２オリゴヌクレオチドと、前記第２オリゴヌクレオチドと前記標的ｎｃＲＮＡとの複合体の形成に適切な条件下で接触させる工程であって、前記第２オリゴヌクレオチドが、第２の検出可能なシグナルを発生する第２のシグナル発生体を含み、前記第２オリゴヌクレオチドの各々が、前記標的ｎｃＲＮＡの各々に結合に対する、実質的に同じである第２のＴｍを有する工程と、
ｄ．  前記第１及び第２の検出可能なシグナルを測定することによって前記試料中の前記複数の標的ｎｃＲＮＡの存在を判定する工程と
を含む、複数の異なる標的ｎｃＲＮＡの同時検出方法。
【請求項２】
前記ｎｃＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の検出可能なシグナルが、前記複数の標的ｎｃＲＮＡ中の異なるｎｃＲＮＡに結合する前記第１オリゴヌクレオチドの各々で異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドが同時に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１及び前記第２オリゴヌクレオチドが逐次的に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のＴｍの各々と前記第２のＴｍの各々が実質的に同じである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方が少なくとも１個の改変ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記改変ヌクレオチドがロックされた核酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のＴｍの各々と前記第２のＴｍの各々が実質的に同じである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１及び第２の検出可能なシグナルが光学的固有性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１及び第２の検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のシグナル発生体がミクロスフェアであり、前記ミクロスフェアが前記第１の検出可能なシグナルを発生する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の検出可能なシグナルが光学的固有性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のオリゴヌクレオチドが８〜１２ヌクレオチド長であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが８〜１２ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、前記試料中に存在する前記標的ｎｃＲＮＡのプロファイルを作成するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料がヒト対象に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＲＮＡ試料が、低分子量ＲＮＡ種の割合を増加させるためにサイズ分画されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ａ．  対象から得たＲＮＡ試料であって、複数の標的ｎｃＲＮＡを含有する前記試料を用意する工程と、
ｂ．  前記試料を、検出すべき前記標的ｎｃＲＮＡの各々に特異的な第１オリゴヌクレオチドと、前記第１オリゴヌクレオチドと前記標的ｎｃＲＮＡとの複合体の形成に適切な条件下で接触させる工程であって、前記第１オリゴヌクレオチドの各々が、第１の検出可能なシグナルを発生する第１のシグナル発生体を含み、前記第１オリゴヌクレオチドの各々が、前記標的ｎｃＲＮＡの各々の結合に対する、実質的に同じである第１のＴｍを有する工程と、
ｃ．  前記試料を、検出すべき前記標的ＲＮＡの各々と結合する第２オリゴヌクレオチドと、前記第２オリゴヌクレオチドと前記標的ｎｃＲＮＡとの複合体の形成に適切な条件下で接触させる工程であって、前記第２オリゴヌクレオチドが、第２の検出可能なシグナルを発生する第２のシグナル発生体を含み、前記第２オリゴヌクレオチドの各々が、前記標的ｎｃＲＮＡの各々の結合に対する、実質的に同じである第２のＴｍを有する工程と、
ｄ．  前記第１及び第２の検出可能なシグナルを測定することによって前記試料中の前記複数の標的ｎｃＲＮＡの存在を判定する工程と
を含む、ＲＮＡ試料中の複数の標的ｎｃＲＮＡ分子のプロファイルを決定する方法。
【請求項２０】
前記ｎｃＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の検出可能なシグナルが、前記複数の標的ｎｃＲＮＡ中の異なるｎｃＲＮＡに結合する前記第１オリゴヌクレオチドの各々で異なる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２オリゴヌクレオチドが同時に添加される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１及び前記第２オリゴヌクレオチドが逐次的に添加される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のＴｍの各々と前記第２のＴｍの各々が実質的に同じである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方が少なくとも１個の改変ヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記改変ヌクレオチドがロックされた核酸である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のＴｍの各々と前記第２のＴｍの各々が実質的に同じである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１及び第２の検出可能なシグナルが光学的固有性を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１及び第２の検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のシグナル発生体がミクロスフェアであり、前記ミクロスフェアが前記第１の検出可能なシグナルを発生する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の検出可能なシグナルが光学的固有性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１オリゴヌクレオチドが８〜１２ヌクレオチド長であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが８〜１２ヌクレオチド長である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法が、前記試料中に存在する前記標的ｎｃＲＮＡのプロファイルを作成するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料がヒト対象に由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＲＮＡ試料が、低分子量ＲＮＡ種の割合を増加させるためにサイズ分画されていない、請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
ａ．  第１プロファイルを作成するために、疾病又は症状を有するとみなされる試料からｎｃＲＮＡプロファイルを得る工程であって、前記プロファイルが請求項１９に記載の方法によって得られる工程と、
ｂ．  第２プロファイルを作成するために、正常とみなされる試料からｎｃＲＮＡプロファイルを得る工程であって、前記プロファイルが請求項１９に記載の方法によって得られる工程と、
ｃ．  前記第１プロファイルを前記第２プロファイルから区別する、前記第１プロファイル中の１個以上のｎｃＲＮＡ分子を特定する工程と
を含む、前記疾病又は症状に対する固有性ｎｃＲＮＡプロファイルを作成する方法。
【請求項３８】
前記ｎｃＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾病が神経膠腫又は乳癌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象がヒトである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
ａ．  請求項１９に従って前記対象から対象ｎｃＲＮＡプロファイルを決定する工程と
ｂ．  前記対象ｎｃＲＮＡプロファイルを疾病又は症状に対する固有性ｎｃＲＮＡプロファイルと比較する工程であって、前記固有性ｎｃＲＮＡプロファイルが請求項３７に記載の方法によって得られる工程と、
ｃ．  前記疾病又は症状を有する対象を、前記対象ｎｃＲＮＡプロファイルと前記疾病又は症状に対する前記固有性ｎｃＲＮＡプロファイルとの比較に基づいて診断する工程と
を含む、前記疾病又は症状を有する対象を診断する方法。
【請求項４２】
前記ｎｃＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾病が神経膠腫又は乳癌である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象がヒトである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
ａ．  疾病又は症状に対する固有性ｎｃＲＮＡプロファイルを得る工程であって、前記固有性ｎｃＲＮＡプロファイルが請求項３７に記載の方法によって得られる工程と、
ｂ．  固有性ｎｃＲＮＡプロファイル中で特定される１個の前記ｎｃＲＮＡが相互作用する分子標的を決定する工程と
を含む、疾病又は症状に関与する遺伝子を特定するためのスクリーニング方法。
【請求項４６】
前記ｎｃＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾病が神経膠腫又は乳癌である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記対象がヒトである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記決定工程がアルゴリズムの補助を得て実施される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
ｍｉｒ−１０７、ｍｉｒ−１５Ｂ及びｍｉｒ−１０３を含む、乳癌に対する固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５１】
ｍｉｒ−１７−５ｐ、ｍｉｒ−１６、ｍｉｒ−１２６、ｍｉｒ−１４１、ｍｉｒ−１９３、ｍｉｒ２９ａ、ｍｉｒ−１９５、ｍｉｒ−２６ａ、ｍｉｒ２０、ｍｉｒ１２８ｂ、ｍｉｒ２１７及びｍｉｒ２１９の少なくとも１個をさらに含む、請求項５０に記載の固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５２】
前記プロファイルが、診断を必要とする乳癌患者を診断するために使用される、請求項５０又は５１に記載の固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５３】
前記プロファイルが薬剤開発のための候補治療標的を特定するために使用される、請求項５０又は５１に記載の固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５４】
ｍｉｒ−１４１、ｍｉｒ−２３ｂ及びｍｉｒ−１７−３ｐを含む、神経膠腫に対する固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５５】
ｍｉｒ−１４３、ｍｉｒ−１５ｂ、ｍｉｒ−２９３及びｍｉｒ−３２０の少なくとも１個をさらに含む、請求項５０に記載の固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５６】
前記プロファイルが、診断を必要とする神経膠腫患者を診断するのに使用される、請求項５４又は５５に記載の固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５７】
前記プロファイルが薬剤開発のための候補治療標的を特定するために使用される、請求項５４又は５５に記載の固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５８】
ａ．  標的ｎｃＲＮＡを含有する、対象から得たＲＮＡ試料を用意する工程と、
ｂ．  前記試料を、前記標的ＲＮＡに特異的な第１オリゴヌクレオチドと、前記第１オリゴヌクレオチドと前記標的ｎｃＲＮＡとの複合体の形成に適切な条件下で接触させる工程であって、前記第１オリゴヌクレオチドが、第１の検出可能なシグナルを発生する第１のシグナル発生体を含む工程と、
ｃ．  前記試料を、前記標的ＲＮＡに特異的な第２オリゴヌクレオチドと、前記第２オリゴヌクレオチドと前記標的ｎｃＲＮＡとの複合体の形成に適切な条件下で接触させる工程であって、前記第２オリゴヌクレオチドが、第２の検出可能なシグナルを発生する第２のシグナル発生体を含む工程と、
ｄ．  前記第１及び第２の検出可能なシグナルを測定することによって前記試料中の前記標的ｎｃＲＮＡの存在を判定する工程と
を含む、標的ｎｃＲＮＡの検出方法。
【請求項５９】
前記第１オリゴヌクレオチドが、前記ｎｃＲＮＡ上の第１の相補配列を結合し、前記第１の相補配列への結合に対する第１のＴｍを有し、前記第２オリゴヌクレオチドが、前記ｎｃＲＮＡ上の第２の相補配列を結合し、第２の相補配列にへの結合に対する第２のＴｍを有し、前記第１のＴｍと前記第２のＴｍが実質的に同じである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２オリゴヌクレオチドが同時に添加される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１及び前記第２オリゴヌクレオチドが逐次的に添加される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方が少なくとも１個の改変ヌクレオチドを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記改変ヌクレオチドがロックされた核酸である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１オリゴヌクレオチドが、前記ｎｃＲＮＡ上の第１の相補配列を結合し、前記第１の相補配列への結合に対する第１のＴｍを有し、前記第２オリゴヌクレオチドが、前記ｎｃＲＮＡ上の第２の相補配列を結合し、第２の相補配列への結合に対する第２のＴｍを有し、前記第１のＴｍと前記第２のＴｍが実質的に同じである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１及び第２の検出可能なシグナルが光学的固有性を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６６】
前記第１及び第２の検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１のシグナル発生体がミクロスフェアであり、前記ミクロスフェアが前記第１の検出可能なシグナルを発生する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６８】
前記第１の検出可能なシグナルが光学的固有性である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１の検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記第１オリゴヌクレオチドが８〜１２ヌクレオチド長であり、前記第２オリゴヌクレオチドが８〜１２ヌクレオチド長である、請求項５８に記載の方法。
【請求項７１】
前記方法が、前記試料中に存在する前記ｎｃＲＮＡ分子のプロファイルを作成するために使用される、請求項５８に記載の方法。
【請求項７２】
前記試料がヒト対象に由来する、請求項５８に記載の方法。
【請求項７３】
前記方法が多重検出反応（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）において使用される、請求項５８に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＲＮＡ試料が、低分子量ＲＮＡ種の割合を増加させるためにサイズ分画されていない、請求項５８に記載の方法。
【請求項７５】
前記ｎｃＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
癌の一般的基本原理は、細胞増殖制御機序の喪失及びそれによって生じる細胞の異常増殖である。従来、発癌の普遍的なパラダイムは、癌遺伝子、癌抑制遺伝子などの細胞遺伝子のコード領域又は調節領域において変異が蓄積することである。これらの変異によって、細胞の増殖及び発生を支配する、正常細胞の情報伝達プロセスが混乱する。しかしながら、最近の研究によって、（機能性ＲＮＡ又はｆＲＮＡとも称される）非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）と称する新しいＲＮＡクラスが明らかになった。ｎｃＲＮＡとしては、ｍｉＲＮＡ（ミクロＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｍＲＮＡ（低分子非ｍＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｎｏｎ−ｍＲＮＡ））、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）及びｓｔＲＮＡ（一過性低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ＲＮＡ））を含めて、但しこれらだけに限定されない様々なＲＮＡ分子が挙げられる。これらのｎｃＲＮＡの機能は多様であり、まだ検討中である。ｎｃＲＮＡ分子の多くは、タンパク質と相互作用して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。
【０００２】
ｍｉＲＮＡは、ｎｃＲＮＡクラスのより興味深いメンバーの１つとして出現した。ｍｉＲＮＡは、細胞の増殖、発生及びホメオスタシスに重要であることが判明し、研究は、癌などの様々な病態にこれらのｍｉＲＮＡが関与することを示している。ｍｉＲＮＡは、より大きなヘアピン前駆体から開裂した短いヌクレオチド転写物である。ある実施形態においては、ｍｉＲＮＡは１９〜２３ヌクレオチド長である。研究によれば、ダイサータンパク質及び関連タンパク質は、ｍｉＲＮＡを形成するＲＮＡヘアピン前駆体の開裂に関与する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：８３４−８３８，２００１；Ｋｅｔｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１５：２６５４−２６５９，２００１）。高度に保存された配列を有することが多い多数のｍｉＲＮＡは、シノラブディス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ、ラット、マウス、ヒトなど、但しこれらだけに限定されない生物のゲノム中に存在する（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８５３−８５８  ２００１；Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２，７３５−７３９，２００２；Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ａｍｂｒｏｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８６２−８６  ２００１；Ｍｏｕｒｅｌａｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１６：７２０−７２８２００２；Ｄｏｓｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  ＲＮＡ  ９：１８０−１８６，２００３）。ｍｉＲＮＡは、数ヌクレオチドのような短い間隔で分離されることもあるクラスターとしてゲノム中に組織化されている場合もある。
【０００３】
ｍｉＲＮＡについて提案されている役割は多様である。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの安定性と翻訳の調節、異質染色質形成、ゲノム再配列及びＤＮＡの切り出しに関与すると推定されている（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：２００２−２００３，２００２）。Ｃ．エレガンスにおいては、ｍｉＲＮＡは、異色性遺伝子（ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍｉｃ  ｇｅｎｅ）の翻訳を整合する（Ｂａｎｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，２４：１１９−１２９，２００２）。２種類のＣ．エレガンスｍｉＲＮＡ、ｌｉｎ−４及びｌｅｔ−７は、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内のエレメントと不完全な塩基対を形成し、それらの翻訳を減衰することによって発生のタイミングを制御する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７５：８４３−８５４，１９９３；Ｗｉｇｈｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．７５（５）：８５５−６２，１９９３）。シロイヌナズナにおける特定のｍｉＲＮＡは、幾つかの推定転写因子をコードする転写物の開裂を指示することが知られている（Ｌｌａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７：２０５３−２０５６，２００２）。ドロソフィラ  バンタム（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｂａｎｔａｍ）遺伝子は、細胞増殖及びアポトーシス促進性遺伝子ｈｉｄを調節するｍｉＲＮＡをコードする（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１３：２５−３６，２００３）。ｍｉＲＮＡが調節性分子の重要なクラスであるという考え方を支持する証拠が増えている。
【０００４】
ｍｉＲＮＡによって調節される基礎的な生物学的プロセスからして、また、これらのプロセスの多くが様々なヒトの症状において変化するという知見からして、ｍｉＲＮＡがこれらの症状に役割を果たすかどうかを明らかにすることは重要である。例えば、ｍｉＲＮＡは、最近、発癌及び多数の細胞タイプの発生と分化に関連づけられた。
【０００５】
Ｍｅｔｚｌｅｒ等（Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ，３９（２）：１６７−９，２００４）は、最近、バーキットリンパ腫に罹患した子供においてｍｉｒ−１５５／ｂｉｃ  ＲＮＡ発現が有意に増加することを報告した。Ｍｉｃｈａｅｌ等による最近の研究（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１（１２），８８２−９１，２００３）によれば、結腸直腸の新形成において特定のｍｉＲＮＡの蓄積が減少する。Ｃａｌｉｎ等（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．，９９（２４）：１５５２４−９，２００２）は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）と、ｍｉＲＮＡのコード領域ｍｉＲ−１５及びｍｉＲ−１６を含む、第１３染色体の一領域における欠失との関連性を見出した。彼らは、これらのｍｉＲＮＡが、ＣＬＬ検体の大多数（約６８％）において欠如しているか、又は下方調整されることを見出した。１３ｑ１４における半接合及び／又は同型接合的損失は、ＣＬＬにおいて最も多い染色体異常を形成する。この領域の欠失は、マントル細胞リンパ腫の約５０％、多発性骨髄腫の１６−４０％及び前立腺癌の６０％においても起こり、この座における１個以上の癌抑制遺伝子の関与を示唆している。幾つかのグループが、広範なヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）分析、変異及び発現試験を含む、詳細な遺伝分析を実施しているが、欠失領域に位置する遺伝子のいずれかの一貫した関与は証明されていない。１３ｑ１４  ｍｉＲＮＡ  Ｒ−１５及びＲ−１６座の損失がＣＬＬ発生の鍵である場合、Ｃａｌｉｎ等によるこれらのデータは、ｍｉＲＮＡが腫瘍抑制因子として作用し得るという考え方と一致する。
【０００６】
癌がｍｉＲＮＡ座への癌遺伝子の転座に起因する可能性もある。そのような可能な一例は、ｍｉＲＮＡ  ｍｉｒ−１４２座へのＭＹＣの転座である。この転座によって、ＭＹＣ発現の強力な上方調整による活動的なＢ細胞白血病が起こる（Ｇａｕｗｅｒｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８６，８８６７−８８７１，１９８９）。ＭＹＣ遺伝子は、ｍｉｒ−１４２  ３’末端のわずか４ヌクレオチド下流に転座し、上流のｍｉＲＮＡプロモーターの制御下にある可能性が高い。ＥＳＴ配列を含むマウスとヒトのｍｉｒ−１４２を整列させると、転座で失われる、ｍｉｒ−１４２ヘアピン下流の約２０ヌクレオチドの保存配列エレメントが示される（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：７３５−７３９，２００２）。推定ｍｉｒ−１４２／ＭＹＣ融合においてこの保存された下流配列エレメントが欠如することによって、適切に処理されるべきｍｉＲＮＡ前駆体として転写物が認識されるのが妨げられ、従って融合転写物の蓄積及びＭＹＣの過剰発現を起こし得ると示唆された。このように、癌などの病態にｍｉＲＮＡが関与する仕方は複数あり、ｍｉＲＮＡを同定することは、病態の根底にある生化学的機序におけるｍｉＲＮＡ機序の協同作用を我々が理解するのに役立つ可能性がある。
【０００７】
Ｓｅｍｐｅｒｅ等（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．５（３）：Ｒ１３．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｆｅｂ  １６，２００４）は、最近、その発現挙動がマウスとヒトの両方の分化ニューロン（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎ）に保存され、脳で発現されるｍｉＲＮＡのサブセットの同定について報告した。このデータは、これらのｍｉＲＮＡが正常な哺乳動物ニューロンの発生及び／又は機能に役割を果たすことを示唆している。また、Ｈｏｕｂａｖｉｙ（Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．５（２）：３５１−８，２００３）は、未分化及び分化型マウス胚性幹細胞中に、ある割合のｍｉＲＮＡが幹細胞のみに特異的に限られている、ｍｉＲＮＡの一グループを確認した。これらの胚性特異的ｍｉＲＮＡの抑制は、胚性幹細胞が分化すると抑制された。これは、多能性細胞状態の維持及び初期の哺乳動物の発達方向におけるｍｉＲＮＡの役割を示唆している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
約２２０個のｍｉＲＮＡがヒトにおいて同定され、同定されたｍｉＲＮＡの多くは重要な生物学的機能と関連があった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）。Ｂａｒｔｅｌ及びＢｕｒｇｅ（２００３）は、バイオインフォマティクス手法によって、ヒトゲノムの最大１％がｍｉＲＮＡをコードし得ると推定した。正常組織の発生及び細胞機能に果たすｍｉＲＮＡの役割は、ちょうど調査し始めたところである。しかしながら、ｎｃＲＮＡ分野における発見は、効率的な分析ツールの欠如により極度に妨げられている。従って、ｍｉＲＮＡなどのｎｃＲＮＡ分子の研究を助ける強力なツールの時宜を得た開発が必要である。本開示は、ｎｃＲＮＡを分析する、そのような分析ツールを提供する。本開示は、ｍｉＲＮＡの検出及び分析を説明する方法を提供する。しかしながら、本開示の方法は、当業者に明らかなように他のｎｃＲＮＡにも適用し得る。
【０００９】
ｎｃＲＮＡ検出のための従来的方法
当該技術は、現在、ｎｃＲＮＡを検出する従来の様々な検出方法に依拠している。現在使用されているアッセイとしては、ノーザンブロットの使用、アレイに基づく方法、ＲＮＡｓｅ保護アッセイなどが挙げられる。ｎｃＲＮＡを検出するのにノーザンブロットを使用するには、一般に全ＲＮＡ  １５−２０μｇが分析のために必要であり、１個の特定のｎｃＲＮＡの試験に主として使用される。全ＲＮＡ（又はサイズ分画によって濃縮されたＲＮＡ）を標準ゲル上で泳動させ、膜に転移させる。検出しようとするＲＮＡ種に相補的な、放射性標識プローブなどの標識プローブを使用して、特異的に検出するために所望のＲＮＡ種とハイブリダイゼーションさせる。この方法は時間がかかり、重労働であり、多量の全ＲＮＡを必要とする。また、１ハイブリダイゼーションによって、特定の１個のｎｃＲＮＡの発現を試験できるにすぎず、又はｍｉＲＮＡの長さが、分離するのに十分に異なるならば、少数のｎｃＲＮＡ発現を試験できるにすぎない。膜は剥がすことができ、他のＲＮＡ種の試験に再使用し得るが、膜を複数回使用すると、得られた結果をアッセイ間で比較することが困難になる。
【００１０】
Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ等（ＲＮＡ，９（１０）：１２７４−８１，２００３；ＲＮＡ，１０（３）：５５１．２００４に正誤表あり）は、ｎｃＲＮＡ、具体的にはｍｉＲＮＡの発現を試験するためのプリント式アレイの使用を報告した。（分析するｍｉＲＮＡに相補的な）５４−７２ヌクレオチド長の３量体オリゴヌクレオチドが、最終濃度７μＭでＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ（ＮＥＮ）膜に付けられた。各実験では、脳組織由来のｍｉＲＮＡ  ５−１０μｇがプローブとして使用された。ｍｉＲＮＡプローブはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによってγ３３Ｐ  ｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で標識された。ハイブリダイゼーション反応は、通常、終夜実施され、特異性を最適にするためには徹底して洗浄する必要がある。プリント式アレイ方法は１回のアッセイで複数のｍｉＲＮＡの発現を分析し得るが、その特異性及び感度は、試料調製、プローブ標識効率、ハイブリダイゼーション及び洗浄によって制限される。多数のｍｉＲＮＡ、特に同じファミリーに属するｍｉＲＮＡは大きな相同保存配列を共有するので、プリント式アレイを用いる検出特異性は著しく制限される。
【００１１】
ＲＮａｓｅ保護アッセイは、ｍｉＲＮＡ分析（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ）などのｎｃＲＮＡ分析のための溶液系ハイブリダイゼーション方法である。この方法では、ｍｉＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって調製された２９ヌクレオチド放射性標識プローブを用いて検出された。このプローブは、ｍｉＲＮＡ配列に相補的でない１０ヌクレオチド配列をその５’末端に有し、ＲＮａｓｅによって開裂し得る。４２℃で１５時間のインキュベーション後、反応物はＲＮａｓｅ  Ａ及びＴ１を用いて３７℃で少なくとも３０分間処理された。保護された断片は沈殿によって回収され、変性ポリアクリルアミドゲル上で分析された。溶液ハイブリダイゼーション方法は感度がノーザンの１０倍であり、ｍｉＲＮＡを全ＲＮＡ  １μｇから検出し得る。しかしながら、溶液ハイブリダイゼーション方法は依然として放射性標識ＩＶＴプローブを調製する必要があり、各ゲルは、サイズの異なるｍｉＲＮＡしか区別できないので、読取り工程では、複数の変性ポリアクリルアミドゲルを泳動させる必要を生じ得る。
【００１２】
一般に使用される上記３つの方法は全て、一揃いの同じ制限を受ける。これらの方法の各々は、プローブの放射性標識、終夜のハイブリダイゼーション、変性ゲル電気泳動、徹底した洗浄工程、ｘ線フィルム露光、定量分析のためのイメージのデジタル化などの重労働で時間のかかる工程を必要とするので労働集約的である。また、プリント式アレイ方法以外の方法は、同時に複数のｍｉＲＮＡを分析する点で制限があり、発現プロファイリング分析には適していない。本明細書に記載のアッセイは、プローブ製造などの労働集約的工程を必要とせず、アッセイ全体を１時間で完了し得る。
【００１３】
また、上記方法は、少量のｎｃＲＮＡを検出する感度に欠ける。通常、所与のｎｃＲＮＡ種を検出するのに全ＲＮＡ  １０−２０μｇを必要とする。この感度では、研究室はＲＮＡ試料の調製にかなりのソースを割り当てなければならない。下記実施例の結果によって実証するように、開示するｎｃＲＮＡ検出方法は、わずか５０ｎｇの全ＲＮＡを使用するだけでＲＮＡ種の発現を検出し得る。
【００１４】
最後に、上記方法及び当分野の現行方法は、相同性の高いｎｃＲＮＡ種を区別するのに必要な特異性を欠いている。ｍｉＲＮＡなど多数のｎｃＲＮＡは、広範な配列相同性を共有し、幾つかのファミリーに分類される。ｎｃＲＮＡファミリーメンバー間で１個のヌクレオチド塩基しか異ならないことも多い。かかる相同性のために、ノーザンブロット又はアレイによる方法によって、高度に保存されたｎｃＲＮＡファミリーメンバーを区別することはきわめて困難である。本明細書に記載の短いＬＡＮスパイク化（ｓｐｉｋｅｄ）オリゴヌクレオチドを使用することによって、検出特異性が有意に増大し、ｎｃＲＮＡ種間の単一ヌクレオチド塩基の差異でも検出し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
ｎｃＲＮＡ検出方法の概要
本開示は、（本明細書では「標的ＲＮＡ」と称し得る）ｎｃＲＮＡ分子の効率的な検出方法を記載する。本明細書ではｎｃＲＮＡは、任意の小ＲＮＡ分子を定義するものとし、具体的にはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡなどが挙げられるが、これらのみに限定されない。一実施形態においては、ｎｃＲＮＡは５〜５００ヌクレオチドの長さを有する。別の実施形態においては、ｎｃＲＮＡは、５〜１００ヌクレオチドの長さを有する。さらに別の実施形態においては、ｎｃＲＮＡは、５〜４０ヌクレオチドの長さを有する。本開示の方法は、既知又は未知のｎｃＲＮＡ分子の検出に使用し得る。一実施形態においては、開示する方法をｍｉＲＮＡ分子の検出に使用する。特許請求の範囲に記載の方法の例示として、開示する方法を、ｍｉＲＮＡ分子の存在を検出するために使用する。しかしながら、本発明の方法は、ｍｉＲＮＡ分子のみの検出に適用は限定されず、任意のｎｃＲＮＡ分子の検出を含むことを理解すべきである。
【００１６】
本明細書に開示する検出方法は、様々な応用例に使用し得る。一実施形態においては、開示する検出方法は、対象から得た試料中に存在する様々なプロファイルｎｃＲＮＡ種を生成するのに使用し得る。特定の実施形態においては、ｎｃＲＮＡはｍｉＲＮＡである。本願に開示する独特で新規なｎｃＲＮＡ検出手法によって、効率的な非過重労働的方法において複数のｎｃＲＮＡ種をプロファイルする分析力が初めて可能になる。
【００１７】
別の実施形態においては、開示する検出方法は、癌などの、但しこれだけに限定されない所与の疾病又は症状に存在する様々なｎｃＲＮＡ種をプロファイルして、病態又は症状に対するｎｃＲＮＡ固有性（ｎｃＲＮＡ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を創成するのに使用し得る。一手法においては、特定の疾病又は症状を有すると特徴づけられる第１の試料を入手してｎｃＲＮＡプロファイルを決定し、特定の病態又は症状がないと特徴づけられる第２の試料を入手してｎｃＲＮＡプロファイルを決定する。複数の第１及び第２の試料を、必要に応じて入手し得る。第１試料と第２試料由来のｎｃＲＮＡプロファイルを比較し、（発現の増加又は減少などの）変異を示すｎｃＲＮＡに注目する。これらのｎｃＲＮＡ種は、疾病又は症状に対するｎｃＲＮＡ固有性を構成する。特定の実施形態においては、ｎｃＲＮＡはｍｉＲＮＡである。第１試料と第２試料は、同じ対象からでも別個の対象からでも入手し得る。一実施形態においては、第１試料と第２試料を同じ対象から入手する。特定の適用例においては、ｎｃＲＮＡ固有性は、所望の特性を示す第１試料及び／又は第２試料を選択することによって疾病又は症状の一特性と相関させることができる。疾病又は症状の特性としては、疾病又は症状の進展／進行状態、特定の薬物療法、治療計画又は治療に対する疾病又は症状の応答性などが挙げられるが、これらだけに限定されない。例えば、疾病又は症状が乳癌であると仮定する。第１試料を薬物Ａに応答性である乳房腫瘍由来の試料とすることができ、第２試料を正常乳房組織とし得る。ｎｃＲＮＡ固有性を判定し得る。第１試料が薬物Ｂに応答性である乳房腫瘍由来である以外は上記プロセスを繰り返すことができる。得られたｎｃＲＮＡプロファイルを比較することによって、薬物応答性と相関するｎｃＲＮＡ固有性を得ることができる。
【００１８】
疾病又は症状に対するｎｃＲＮＡ固有性は、多くの方法で利用し得る。対象から得たｎｃＲＮＡプロファイルを所与の疾病又は症状に対するｎｃＲＮＡ固有性と比較し得る。このようにして、この比較によって、対象を、特定の疾病若しくは症状を有する対象又は特定の病態のリスクを有する対象に分類し得る。また、この比較は、薬物療法、治療計画又は治療に対する潜在的応答性を判定するのに使用し得る。また、この比較は、対象における疾病又は症状の進行状態を判定するのに使用し得る。また、疾病又は症状のｎｃＲＮＡ固有性は、疾病又は症状の進行をモニターするのに使用し得る。また、疾病又は症状に対するｎｃＲＮＡ固有性は、薬物療法、治療計画又は治療の効力をモニターするのに使用し得る。
【００１９】
さらに別の実施形態においては、開示する検出方法は、疾病又は症状の治療に対する薬物標的候補を特定するのに使用し得る。上述したように、特定の疾病又は症状に対するｎｃＲＮＡ固有性を作成し得る。特定の疾病又は症状を特徴づけるｎｃＲＮＡ種の同一性を判定することによって、病態又は症状の原因となる分子経路に関与する分子標的の同一性を特定し得る。これらの分子標的は、疾病又は症状の治療及び／又は予防用の薬剤開発に対する新規な治療学的候補を提供し得る。かかる方法においては、疾病又は症状に対するｎｃＲＮＡ固有性は上述したように得られる。疾病又は症状を特徴づけるｎｃＲＮＡ分子に注目する。ｎｃＲＮＡ分子の同一性を、疾病又は症状の分子経路に関与する分子標的を決定するのに使用する。特定の実施形態においては、ｎｃＲＮＡはｍｉＲＮＡである。
【００２０】
記載した検出方法は、標的ＲＮＡ上にその相補配列を有する捕捉及び検出オリゴヌクレオチドのＴｍを増強するために改変ヌクレオチドを使用し得る。この目的に十分な様々な改変ヌクレオチドが当分野で公知である。一実施形態においては、改変ヌクレオチドはロックされた核酸、すなわちＬＮＡ（商標）である。別の実施形態においては、改変ヌクレオチドはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むことができる。他の改変ヌクレオチドは、当分野で知られているとおりに、又は当分野で開発されたとおりに、使用し得る。下記の捕捉及び検出オリゴヌクレオチドのＴｍを上昇させるための改変ヌクレオチドを使用することによって、標的ＲＮＡ検出の特異性及び感度を増大させることができる。また、（より詳細には以下に記述するように）１個又は改変ヌクレオチドを本開示の捕捉及び検出オリゴヌクレオチドに組み込むことによって、標的ＲＮＡ上のそれらの相補配列に対する捕捉及び検出オリゴヌクレオチドの結合のＴｍをほぼ同じに工作し得る。本明細書ではＬＮＡ塩基又はヌクレオチドとは、リボヌクレオシドが２’−酸素と４’−炭素原子との間でメチレン単位によって連結された二環式核酸を指す。ＬＮＡヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、相補ＤＮＡ及びＲＮＡに対して前例のない熱安定性を示す。平均して、各改変（スパイク化）ＬＮＡヌクレオチドは、ＬＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに関するＴｍを７．３℃上昇させる。ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドの高い結合親和性により、プローブ用途のためのより短いオリゴヌクレオチド配列を使用することができ、ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドはミスマッチ識別用の優れたプローブとなる。
【００２１】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成装置を用いた標準ホスホアミダイト化学反応によって合成し得る。ＬＮＡは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び他の核酸アナログと混合し得る。ＬＮＡは、ビオチン、Ｃｙ色素又は当分野で公知の他の色素を用いて合成し得る。ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドは水溶性であり、例外的に高い熱安定性を備えて、ＤＮＡ及びＲＮＡとの塩基対を形成する（ｂａｓｅｐａｉｒ）。Ｅｘｉｑｏｎ（デンマーク）は、ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドの融解挙動及びＴｍを予測し、ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドの設計を支援するソフトウェアを開発した。また、ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡとＤＮＡの両方の分子とハイブリダイゼーションし得るので、核酸のあらゆるタイプを、本明細書に記載した方法によって検出し得る。二重鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子を検出しようとするときには、本明細書に記載のハイブリダイゼーション工程の前に二重鎖分子を変性する必要がある場合もある。
【００２２】
ｎｃＲＮＡ検出方法の一般的説明
本検出方法は、捕捉オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチドの使用を含む。捕捉オリゴヌクレオチドは、第１の検出可能なシグナルを発生する第１のシグナル発生体を含み、検出オリゴヌクレオチドは、第２の検出可能なシグナルを発生する第２のシグナル発生体を含む。第１及び第２の検出可能なシグナルは、市販装置を用いて検出し得る任意のシグナルとし得る。第１及び第２の検出可能なシグナルは、（光学的固有性を生成する光など、但しこれだけに限定されない）所与の波長の発光、伝導率などの電気的性質の変化又は電磁気若しくは化学的性質の変化であり得る。一実施形態においては、第１及び第２の検出可能なシグナルは光学的固有性である。一実施形態においては、光学的固有性は、発色団、蛍光団、又は光学的固有性を生成し得るあらゆる他の試薬を用いて生成される。様々な光学的固有性は、異なる発色団若しくは蛍光団を混合することによって、又は発色団若しくは蛍光団の異なる濃度（強度）を用いることによって、創成し得る。第１と第２の検出可能なシグナルは、互いの存在下で検出し得る。第１と第２の検出可能なシグナルは、それぞれ捕捉オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドを用いて、直接的又は間接的に関連付けることができる。一実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチド上の第１の検出可能なシグナルは、前記第１の検出可能なシグナルを発生し得るミクロスフェアである。特定の適用例においては、ミクロスフェアは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）によって製造されたミクロスフェアなどの色コード化されたミクロスフェアである。Ｌｕｍｉｎｅｘ技術及びその関連技術は、当分野及び米国特許第６，５２４，４７３号、同６，５１４，２９５号、同６，４４９，５６２号、同６，４１１，９０４号、同６，３６６，３５４号、同６，２６８，２２２号、同６，１３９，８００号、同６，０５７，１０７号、同６，０４６，８０７号及び同５，７３６，３３０号に記載されている。捕捉オリゴヌクレオチドは、共有結合性又は非共有結合性手段によってミクロスフェアにカップリングし得る。捕捉及び検出オリゴヌクレオチドは、（ｍｉＲＮＡなどの）興味ある標的ＲＮＡに特異的であり、捕捉及び検出オリゴヌクレオチドを適切に設計することによって任意の公知の標的ＲＮＡ種を検出し得る。本方法の構成成分の各々をより詳細に以下に説明する。
【００２３】
任意の標的ＲＮＡ種を検出のために標的化し得る。標的ＲＮＡ配列の少なくとも一部がわかることが要件である。以下に示すように、既知の配列が検出及び捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションするのに十分な長さである限り、標的ＲＮＡの配列全体を知る必要はない。一実施形態においては、標的ＲＮＡの配列全体が既知である。
【００２４】
検出のために標的化される各標的ＲＮＡ種に対して、特異的な捕捉オリゴヌクレオチドを設計する。第１のシグナル発生体によって生成される第１の検出可能なシグナルを使用して、本方法を通して捕捉オリゴヌクレオチドを同定し、従って、捕捉オリゴヌクレオチドが結合する標的ＲＮＡの同一性を判定する。一実施形態においては、第１の検出可能なシグナルは光学的固有性を含むことができる。一実施形態においては、第１の検出可能なシグナルが光学的固有性であるときには、光学的固有性をミクロスフェア中に含めることができる。別の実施形態においては、第１の検出可能なシグナルは、プレプリント式アレイなどに捕捉オリゴヌクレオチドを付着させる場合など、所定の位置とし得る。
【００２５】
捕捉オリゴヌクレオチドは、検出しようとする標的ＲＮＡ種の配列の（「捕捉配列」と称する）少なくとも一部に相補的な短い核酸配列を含む。一実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドの長さは６〜１４ヌクレオチドである。さらなる実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドの長さは８〜１２ヌクレオチドである。さらに別の実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドの長さは１２ヌクレオチドである。捕捉配列の長さは捕捉オリゴヌクレオチドの長さに対応する。捕捉オリゴヌクレオチドは、結合特異性及び結合効率を高めるために、ＬＮＡヌクレオチドなどの１個以上の改変ヌクレオチドを含むことができる。一実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチド塩基は改変ヌクレオチドである。別の実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも２〜４個のヌクレオチド塩基は改変ヌクレオチドである。さらに別の実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも５個のヌクレオチド塩基は改変ヌクレオチドである。改変ヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列内で間隔をあけたり、捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列中で連続的にすることができ、又はこれらの組み合わせとし得る。さらに別の実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドは改変ヌクレオチドを含まない。捕捉配列のＧＣ含量が十分高い特定の場合には、上記長さを有する捕捉オリゴヌクレオチドのＴｍは、ハイブリダイゼーションの特異性及び感度を得るのに十分となる。
【００２６】
一実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、検出しようとする標的ＲＮＡ種の捕捉配列のヌクレオチド配列に１００％相補的である。別の実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、検出しようとする標的ＲＮＡ種の捕捉配列のヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１個のミスマッチ塩基を含む。
【００２７】
捕捉オリゴヌクレオチドは、さらに、基質への効率的付着を可能にするスペーサー配列を含むこともできる。スペーサー配列は、捕捉配列に相補的でなく、核酸成分、非核酸成分又は核酸成分と非核酸成分との組み合わせを含むことができる。一実施形態においては、スペーサーは、検出しようとする配列に相補的でない核酸配列である。別の実施形態においては、スペーサーは、長さが炭素６〜１５個の炭素系スペーサーである。捕捉配列は、検出しようとする標的ＲＮＡ分子上の任意の好都合な位置に存在し得る。一実施形態においては、捕捉配列は標的ＲＮＡ分子の５’末端方向に位置する。標的ＲＮＡ分子の５’末端方向の位置は、標的ＲＮＡ分子の５'に最も近いヌクレオチドを捕捉配列が含むように定義することができ、又は標的ＲＮＡ分子の５'に最も近いヌクレオチドの１個以上を捕捉配列が省くように定義し得る。別の実施形態においては、捕捉配列は標的ＲＮＡの３’末端に位置する。標的ＲＮＡ分子の３’末端方向の位置は、標的ＲＮＡ分子の３'に最も近いヌクレオチドを捕捉配列が含むように定義することができ、又は捕捉配列が標的ＲＮＡ分子の３'に最も近いヌクレオチドの１個以上を捕捉配列が省くように定義し得る。捕捉オリゴヌクレオチドの長さは、上述したように、捕捉配列の長さに対応する。さらに別の実施形態においては、捕捉配列は標的ＲＮＡ分子の中間部に位置する。
【００２８】
検出オリゴヌクレオチドは、検出しようとする標的ＲＮＡ種のヌクレオチド配列の（「検出配列」と称する）少なくとも一部に相補的な短いヌクレオチド配列を含む。一実施形態においては、検出オリゴヌクレオチドの長さは６〜１４ヌクレオチドである。さらなる実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドの長さは８〜１２ヌクレオチドである。さらに別の実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドの長さは１０ヌクレオチドである。検出オリゴヌクレオチドは、結合特異性及び結合効率を高めるために、ＬＮＡヌクレオチドなどの１個以上の改変ヌクレオチドを含むことができる。一実施形態においては、検出オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチド塩基は改変ヌクレオチドである。別の実施形態においては、検出オリゴヌクレオチドの少なくとも２〜４個のヌクレオチド塩基は改変ヌクレオチドである。さらに別の実施形態においては、検出オリゴヌクレオチドの少なくとも５個のヌクレオチド塩基は改変ヌクレオチドである。改変ヌクレオチドは、検出オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列内で間隔をあけたり、検出オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列中で連続的にすることができ、又はこれらの組み合わせとし得る。さらに別の実施形態においては、検出オリゴヌクレオチドは改変ヌクレオチドを含まない。検出配列のＧＣ含量が十分高い特定の場合には、上記長さを有する検出オリゴヌクレオチドのＴｍは、ハイブリダイゼーションの特異性及び感度を得るのに十分となる。
【００２９】
検出オリゴヌクレオチドの一端は、第２の検出可能なシグナルを発生する第２のシグナル発生体を含む。第２の検出可能なシグナルは、第１の検出可能なシグナルの存在下で検出可能である。第１と第２の検出可能なシグナルの同時検出は、所与の標的ＲＮＡの陽性同定を得るために必要である。第２の検出可能なシグナルは光学的固有性を含むことができる。第２のシグナル発生体は、検出オリゴヌクレオチドに直接付着し得る。或いは、第２のシグナル発生体は、相補的結合対の使用などによって、検出オリゴヌクレオチドに間接的に付着し得る。相補的結合対とは、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／アビジン、当分野で公知でもよい他のかかる複合体などの結合対を指すものとする。相補的結合対は、化学成分、有機成分又は相補的アミノ酸若しくは核酸配列を含むこともできる。様々な光学的固有性は、異なる発色団若しくは蛍光団を混合することによって、又は発色団若しくは蛍光団の異なる濃度（強度）を用いることによって、生成し得る。
【００３０】
一実施形態においては、検出オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、検出しようとする標的ＲＮＡ種の検出配列に１００％相補的である。別の実施形態においては、検出オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、検出しようとする標的ＲＮＡ種の検出配列のヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１個のミスマッチ塩基を含む。検出配列は、標的ＲＮＡ分子上の任意の好都合な位置に存在し得る。一実施形態においては、検出配列は、標的ＲＮＡ分子の５’末端方向に位置する。標的ＲＮＡ分子の５’末端方向の位置は、標的ＲＮＡ分子の５'に最も近いヌクレオチドを検出配列が含むように定義することができ、又は標的ＲＮＡ分子の５'に最も近いヌクレオチドの１個以上を検出配列が省くように定義し得る。別の実施形態においては、検出配列は標的ＲＮＡの３’末端に位置する。標的ＲＮＡ分子の３’末端方向の位置は、標的ＲＮＡ分子の３'に最も近いヌクレオチドを検出配列が含むように定義することができ、又は標的ＲＮＡ分子の３'に最も近いヌクレオチドの１個以上を検出配列が省くように定義し得る。検出配列の長さは、上述したように、選択した検出オリゴヌクレオチドの長さに対応する。さらに別の実施形態においては、検出配列は標的ＲＮＡ分子の中間部に位置し得る。
【００３１】
一実施形態においては、検出配列を、検出配列と捕捉配列がオーバーラップしないように選択する。従って、一実施形態においては、捕捉配列が標的ＲＮＡ分子の５’末端方向に位置する場合には、検出配列は標的ＲＮＡ分子の３’末端方向に位置する。同様に、別の実施形態においては、捕捉配列が標的ＲＮＡ分子の３’末端方向に位置する場合には、検出配列は標的ＲＮＡ分子の５’末端方向に位置する。
【００３２】
一実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドは、それぞれ捕捉配列及び検出配列との結合に対して実質的に同じＴｍを有する。結合に対して実質的に同じＴｍとは、捕捉オリゴヌクレオチドと捕捉配列の結合と検出オリゴヌクレオチドと検出配列の結合のＴｍが１〜５℃異なることを意味する。一実施形態においては、Ｔｍは１〜３℃異なり、別の実施形態においては、Ｔｍは１〜２℃異なる、さらに別の実施形態においては、Ｔｍは１℃異なる。捕捉オリゴヌクレオチドと捕捉配列及び検出オリゴヌクレオチドと検出配列の結合のＴｍ値が実質的に同じであることによって、検出反応の感度を、検出の特異性を損なわずにかなり増加させることができる。Ｅｘｉｑｏｎ（デンマーク）は、ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドの融解挙動及びＴｍを予測し、ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドの設計を支援するソフトウェアを開発した。一実施形態においては、捕捉及び検出オリゴヌクレオチドの（改変ヌクレオチドを使用する場合には、その組み込みも含む）長さ及び組成物を、捕捉及び検出オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡのそれぞれ捕捉配列及び検出配列とのハイブリダイゼーションに関する類似のＴｍ値を有するように選択する。
【００３３】
ある実施形態においては、関連標的ＲＮＡ種のファミリーを単一反応で検出することが有利である。かかるファミリーメンバーは、標的ＲＮＡのかなりの長さにわたって高い相同性を共有することが多い（関連ｍｉＲＮＡ種の検出例を以下に示す）。関連標的ＲＮＡ種ファミリーの検出が望ましい場合には、捕捉オリゴヌクレオチド又は検出オリゴヌクレオチドは、検出しようとする関連標的ＲＮＡ種の１個以上に対して同じヌクレオチド配列を有し得る（実施例１の表１参照）。検出しようとする標的ＲＮＡ種が相同性を共有しない特定の他の実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチド及び／又は検出オリゴヌクレオチドは、各標的ＲＮＡに対して異なるヌクレオチド配列を有し得る。
【００３４】
本発明の方法は、１個を超える標的ＲＮＡを単一の検出反応で検出できることを意図する。従って、複数の捕捉オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチドを、同じ検出反応で複数の標的ＲＮＡ種のそれぞれ捕捉配列及び検出配列を認識するのに使用し得る。複数の標的ＲＮＡ種を単一の検出反応で検出しようとする場合、捕捉オリゴヌクレオチド及び／又は検出オリゴヌクレオチドの長さは異なっても同じでもよく、捕捉オリゴヌクレオチド及び／又は検出オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に組み込まれる改変ヌクレオチド数は異なっても同じでもよく、検出しようとする標的ＲＮＡ種の捕捉配列及び／又は検出配列の位置は異なっていても同じでもよい。
【００３５】
開示する検出方法においては、試料ＲＮＡを１ソースから入手する。試料ＲＮＡは、分析しようとする少なくとも１個の標的ＲＮＡ種を含む。前記ソースは、ＲＮＡを含む任意のソースとし得る。ソースはヒト、植物、（真核生物及び原核生物を含む）動物又はウイルスとし得る。試料ＲＮＡは、組織、血液、唾液又は他の排出物から採取し得る。ソースはヒト、植物又は動物に由来する細胞系とし得る。一実施形態においては、１個を超える試料をソースから得ることができる。この実施形態においては、１個の試料を、疾病を有すると特徴づけられる組織から採取し得、１個の試料を、疾病を持たないと特徴づけられる組織から採取し得る。ＲＮＡを単離する方法は当分野で公知である。試料ＲＮＡは全ＲＮＡとし得る。或いは、試料ＲＮＡを分画することができ、精製することができ、又はある程度精製し得る。一実施形態においては、試料ＲＮＡを、高分子量ＲＮＡ成分を除去するためにサイズによって分画する。分画は、クロマトグラフィー法など当分野で公知の任意の方法によって実施し得る。別の実施形態においては、細胞溶解物全体を、ＲＮＡの精製を必要とせずに使用し得る。
【００３６】
本検出方法は、様々な実施形態で実施し得る。一実施形態においては、検出しようとする標的ＲＮＡを含む試料ＲＮＡを捕捉オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチドと混合し、インキュベートして、検出しようとする標的ＲＮＡ種上で捕捉オリゴヌクレオチドと捕捉配列及び検出オリゴヌクレオチドと検出配列を同時にハイブリダイゼーションさせる。この反応の生成物は、それぞれ捕捉配列及び検出配列によって標的ＲＮＡ種に結合した捕捉オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチドからなる複合体（「検出複合体」）である。別の実施形態においては、検出しようとする標的ＲＮＡを含む試料ＲＮＡを捕捉オリゴヌクレオチドと混合し、インキュベートして、捕捉オリゴヌクレオチドと検出しようとする標的ＲＮＡ種の捕捉配列とをハイブリダイゼーションさせる。洗浄工程を実施し得る。続いて、検出オリゴヌクレオチドを捕捉オリゴヌクレオチド／標的ＲＮＡ複合体と一緒にインキュベートして、検出オリゴヌクレオチドと検出しようとする標的ＲＮＡ種上の検出配列とをハイブリダイゼーションさせて検出複合体を形成する。
【００３７】
様々なハイブリダイゼーション条件を使用し得る。一実施形態においては、ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション緩衝剤の存在下で溶液中で起こる（捕捉及び検出オリゴヌクレオチド配列並びに標的ＲＮＡが溶液中で遊離していることを意味する）。別の実施形態においては、検出又は捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、チップ、他の固体支持体などの基質に結合している。一実施形態においては、ハイブリダイゼーション条件は、１×ＴＭＡＣ緩衝剤（３Ｍ  ＴＭＡＣ、０．１％サルコシル、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、４ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）中での（５２℃１時間などの）適切な温度で適切な期間のインキュベーションを含む。ＴＭＡＣ緩衝剤は、ハイブリダイゼーション特性が主にオリゴヌクレオチド長によって決定され、塩基組成とは無関係であるという利点をもたらし、その結果、単一の塩基ミスマッチを標準条件セット下で容易に検出し得る。しかしながら、他のハイブリダイゼーション緩衝剤を使用することもできる。別の実施形態においては、ハイブリダイゼーション緩衝剤は、１×ＳＳＣＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１×ＳＳＣ）又はリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．１ｍＬ／１００ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ２０）又は当分野で公知の他のハイブリダイゼーション緩衝剤とし得る。また、ハイブリダイゼーション時間（実施例１の表４参照）及びハイブリダイゼーション温度は、以下で考察するように、また、当分野で公知のとおり、変化し得る。例えば、ハイブリダイゼーション時間を１０分以下に短縮し得る（下記実施例１の表５参照）。１０分間のハイブリダイゼーション時間によって、１時間のハイブリダイゼーション期間中に観察されるシグナルの約７０％のシグナルが発生した。従って、ハイブリダイゼーション時間は、必要な検出反応感度に応じて当業者に自明のとおり変化し得る。
【００３８】
本実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドをミクロスフェア又は（チップ、他の固体支持体などの）基質と複合化する場合には、ミクロスフェア又は基質上の捕捉オリゴヌクレオチドの密度も変えることができる。ミクロスフェア又は基質上の捕捉オリゴヌクレオチドの密度は、捕捉効率に影響を及ぼし得る。捕捉オリゴヌクレオチドの密度は、１０４〜１０９捕捉オリゴヌクレオチド／ミクロスフェア又は基質の範囲とし得る。一実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドの密度は１０６〜１０８の範囲とし得る。ｍｉＲＮＡなど、標的ＲＮＡが短い場合には、捕捉オリゴヌクレオチドの密度は大きい核酸分子であるほど問題とならない。というのは、小さなＲＮＡ分子は、基質と複合化した捕捉オリゴヌクレオチドに容易にアクセスできるからである。同様に、検出オリゴヌクレオチドの濃度も変えることができる。一実施形態においては、ｍｉＲＮＡ標的種よりも過剰の検出オリゴヌクレオチドを使用する。以下の実施例の項に記載する実験においては、検出オリゴヌクレオチドを濃度１０ｐｍｏｌで使用する。しかしながら、当業者に明らかなように、他の濃度を使用することもできる。一般に、検出オリゴヌクレオチドの濃度は、過剰の検出オリゴヌクレオチドに起因するバックグラウンドが最小になるよう選択される。
【００３９】
捕捉及び検出オリゴヌクレオチドの濃度は、検出反応の感度を増大または減少させるために変えることができる。例えば、複数の標的ＲＮＡを検出することが所望されるならば、これらの標的ＲＮＡの１種以上を有意に異なる濃度で存在させることができる。線描範囲で検出されるシグナルを維持するために、適切な捕捉及び検出オリゴヌクレオチドの濃度を低下させることによって、特定の標的ＲＮＡに対して生成されるシグナルを減少させることが望ましい場合もある。同様に、特定の標的ＲＮＡに対するシグナルを増加させることが望ましい場合もある。この場合、適切な標的ＲＮＡに対する捕捉及び検出オリゴヌクレオチドの濃度を増加させることができる。
【００４０】
検出しようとする標的ＲＮＡと捕捉及び検出オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後、生成した検出複合体を遠心分離して検出複合体をペレットにする。このようにして、過剰の検出オリゴヌクレオチド及びＲＮＡ成分を除去し得る。過剰の液体を除去する。周知の洗浄緩衝剤を用いた洗浄工程を必要に応じて実施し得る。しかしながら、下記実施例の項の結果は、洗浄工程なしで実施したものである。次いで、検出複合体を検出に供し得る。第１及び／又は第２の検出可能なシグナルの可視化に必要な試薬を検出反応前に必要に応じて添加し得る。一実施形態においては、（ＰＥなどの）蛍光成分を相補的結合対の（ストレプトアビジンなどの）一方に連結し、検出オリゴヌクレオチド上の相補的結合対の（ビオチンなどの）他方の成分と結合させるために添加する。検出反応は、第１の検出可能なシグナル及び第２の検出可能なシグナルを検出する。従って、捕捉オリゴヌクレオチドの同一性（従って、捕捉オリゴヌクレオチドに結合した標的ＲＮＡ種の同一性）は、検出可能なシグナルによって与えられ、検出複合体中の標的ＲＮＡの存在は、検出オリゴヌクレオチドに付随する第２の検出可能なシグナルによって判定される。第２の検出可能なシグナルは、各検出オリゴヌクレオチドに関して同一にし得る。第１及び第２シグナルタグの検出方法は、当分野で公知のとおり、前記タグの性質に応じて変わる。一実施形態においては、第１及び第２の検出可能なシグナルは蛍光シグナルであり、検出方法は、自動ハイスループット検出プラットフォームを含む。
【００４１】
より具体的な実施形態においては、第１の検出可能なシグナルは、Ｌｕｍｉｎｅｘによって開発されたＸ−Ｍａｐ技術を利用した内部色コード化ミクロスフェアであり、内部色コード化ミクロスフェアは第１の検出可能なシグナルとして働く。第２の検出可能なシグナルは蛍光ストレプトアビジン−ＰＥ標識であり、自動ハイスループット検出プラットフォームは（Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００装置など、但しこれだけに限定されない）Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームである。少なくとも１００個の標的ＲＮＡを単一アッセイで分析し得る。複数アッセイを実施することによって、分析しようとする標的ＲＮＡの数は無限である。
【００４２】
試料中の標的ＲＮＡの存在は、蛍光強度の関数として測定し得る。この実施形態においては、反応混合物をＬｕｍｉｎｅｘプラットフォームに注入する。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームはマイクロ流体を用いてミクロスフェアを単一ファイルに整列させ、レーザーはミクロスフェア内部の色（すなわち、第１の検出可能なシグナル）及び各ミクロスフェア表面の色（すなわち、第２の検出可能なシグナル）を照明する。各色コード化ミクロスフェアに対して、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームは、１００個の別個の読みを記録して、データ報告の平均をとる。統計学的観点から、これは、検出しようとする標的１個につき１００データ点である。高性能オプティクスが色シグナルを捕捉する。最後に、デジタル信号処理によって、各反応のシグナルをリアルタイムで定量データに変換する。
【００４３】
適切な標準を検出方法に追加することもできる。多数のタイプの内部及び外部標準を当分野で知られているように使用し得る。内部標準によって、研究者は、（処理プロトコルの前後など）異なる時点における標的ＲＮＡレベルに関するデータを正規化し、比較することができ、試料取扱いプロセスによって導入された変化を正規化し得る。内部標準は、検出しようとする標的ＲＮＡの特性を模倣するように選択し得る。一実施形態においては、内部標準は５Ｓ又は５．８Ｓ  ｒＲＮＡである。５Ｓと５．８ＳのどちらのｒＲＮＡも偏在性に発現され、小さなＲＮＡ分子である。捕捉及び検出オリゴヌクレオチドを、標的ＲＮＡ分子に対するのと同様に内部標準に対して調製する。また、内部標準に対する発現レベルが高すぎて、検出しようとする標的ＲＮＡと比較できない場合には、内部標準の検出をより低感度にするように（すなわち、内部標準特異的ビーズを反応物にさらに添加することによって、内部標準／基質に特異的な捕捉オリゴヌクレオチドの数を減少させることによって、又は非標識非複合化捕捉オリゴヌクレオチドを反応混合物に添加することによって）系を改変し得る。
【００４４】
外部標準（基準）を含めることもできる。外部標準を使用して、データを正規化し、Ｌｕｍｉｎｅｘ装置及び検出システムによって導入される変化を相殺する。一実施形態においては、４から５個の特異的オリゴヌクレオチドが（異なる色コード化ミクロスフェアなどの）異なる基質分子と結合する。オリゴヌクレオチドは、上述したように、第２シグナルタグを含むか、又は第２シグナルタグと結合し得る。各オリゴヌクレオチドの異なる量を異なる基準に対して添加する。例えば、基準Ａ（ＳｔｄＡ）の場合にはビオチン標識プローブ０．１ｆｍｏｌを使用する。ＳｔｄＢの場合には１ｆｍｏｌ、ＳｔｄＣの場合には１０ｆｍｏｌ、ＳｔｄＤの場合には１００ｆｍｏｌを使用する。各基準の平均蛍光強度は、検出しようとする全標的ＲＮＡ分子と一緒に取得し得る。基準及び標的ＲＮＡの相対濃度を測定し得る。
【００４５】
下記実施例に記載の結果によれば、開示する方法は、小さい標的ＲＮＡ分子の検出にきわめて効率的なツールである。記載する方法は、ハイスループット検出プラットフォームの使用と、改変ヌクレオチドのハイブリダイゼーションの高い特異性及び感度とを組み合わせる。捕捉及び検出オリゴヌクレオチドを適切に設計することによって、複数の標的ＲＮＡ分子を１回の実験で試験し得る。その結果、幾つかの標的ＲＮＡ分子の発現パターン又はプロファイルを試験し得る。既存の方法に比較して、開示する本検出方法は、常法に従って用いたノーザンブロット法の約１００倍の感度がある。全ＲＮＡのわずか５０〜１００ｎｇしか多重分析には必要でない。また、開示する本検出方法は、改変オリゴヌクレオチドと液相ハイブリダイゼーション形式を使用する結果、既存の方法よりも特異的である。開示する本検出方法は、使い易く、オリゴヌクレオチド又は試料ヌクレオチド配列の標識化、標的ＲＮＡ分子の増幅を必要とせず、わずか１時間で完了し得る。
【００４６】
定義
本明細書では「予防」、「予防する」、「予防すること」、「抑制」、「抑制する」及び「抑制すること」という用語は、病態又は症状の臨床症状を予防又は抑制するために、病態又は症状の臨床症状の発生前に開始する（化合物又は薬剤組成物の投与などの）行為経過を指す。かかる予防及び抑制は、絶対的に有用である必要はない。
【００４７】
本明細書では「治療」、「治療する」及び「治療すること」という用語は、病態又は症状の臨床症状を解消又は抑制するために、病態又は症状の臨床症状の発生後に開始する（化合物又は薬剤組成物の投与などの）行為経過を指す。かかる治療は、絶対的に有用である必要はない。
【００４８】
本明細書では「治療を必要とする」という用語は、患者が治療を要する、又は治療の利点があるというケア施行者によってなされた判断を指す。この判断は、ケア施行者の専門知識の域にあるが、本開示の方法若しくは化合物によって治療し得る症状の結果として、患者が病気である、又は病気になるという知識を含む様々な要因に基づいてなされる。
【００４９】
本明細書では診断という用語は、患者が特定の疾病又は症状を有するというケア施行者によってなされる判断を指す。この判断は、ケア施行者の専門知識の域にある様々な要因に基づいてなされ、本明細書に開示する方法の使用を含むことができる。
【００５０】
本明細書では「予防を必要とする」という用語は、患者が予防を要する、又は予防の利点があるというケア施行者によってなされた判断を指す。この判断は、ケア施行者の専門知識の域にあるが、本開示の方法又は化合物によって予防し得る症状の結果として、患者が病気になる、又は病気になる恐れがあるという知識を含む様々な要因に基づいてなされる。
【００５１】
本明細書では「個体」、「対象」又は「患者」という用語は、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、霊長類などの哺乳動物及びヒトを含めたあらゆる動物を指す。この用語は、オス若しくはメス若しくは両方を規定し、又はオス若しくはメスを除外する。
実施例
【実施例１】
【００５２】
合成ｍｉＲＮＡ分子の検出
本開示の方法を使用して、４種類の密接に関連するｎｃＲＮＡ、本実施例ではｍｉＲＮＡ  Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇを分析した（各ｍｉＲＮＡの配列を、関連する配列番号と一緒に表１に示す）。Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇ  ｍｉＲＮＡは保存ｍｉＲＮＡファミリーに属し、各ｍｉＲＮＡの５’末端の１０ヌクレオチドが保存されている。各ｍｉＲＮＡの３’末端にはわずかな配列差がある。
【００５３】
Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇ  ｍｉＲＮＡはＭＷＧ（Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）によって合成され、それらの配列が確認された。Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇに対するＬＮＡスパイク化捕捉オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチドは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）によって調製された。各ｍｉＲＮＡ用の捕捉及び検出オリゴヌクレオチドの配列も、関連する配列番号と一緒に表１に示す。それぞれの配列中の大文字は、ＬＮＡ塩基を示す。捕捉オリゴヌクレオチドに対して示したヌクレオチド配列は、スペーサー基を追加することによって改変できることに留意されたい。前記スペーサー基は、（Ｃ６、Ｃ１２リンカーなど、但しこれらだけに限定されない）炭素系リンカー、（ａａｃｇｃｇｔａｔａ及びｔａｃｇｃｇｔａｔａ、配列番号９４及び９５など、但しこれらだけに限定されない）ヌクレオチド配列又はこれらの組み合わせである。一実施形態においては、Ｃ６及びＣ１２リンカーを、前文に開示したヌクレオチド配列と併用する。捕捉オリゴヌクレオチド／捕捉配列及び検出オリゴヌクレオチド／検出の予測Ｔｍは予測し得る。各複合体のＴｍは、Ｅｘｉｑｏｎ（デンマーク）から入手可能なコンピュータプログラムを用いて、実質的に同等となるように選択した。色コード化ミクロスフェアは、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から購入した。
【００５４】
本実施例においては、捕捉オリゴヌクレオチドを所望の標的ｍｉＲＮＡの３’末端とハイブリダイゼーションするように設計し、検出オリゴヌクレオチドを所望の標的ｍｉＲＮＡの５’末端とハイブリダイゼーションするように設計した。本実施例においては、検出オリゴヌクレオチドの３’末端をビオチンタグで標識して、（ストレプトアビジン基と複合化した）第２の検出可能なシグナルと相互作用できるようにした。また、Ｃ１２リンカー配列を各捕捉オリゴヌクレオチドの５’末端に付加して、検出オリゴヌクレオチドとミクロスフェア第１の検出可能なシグナル）の結合を可能にした。捕捉オリゴヌクレオチドを、以下の「方法」に記載するように製造者の推奨プロトコルによってミクロスフェアに結合させた。
【００５５】
本実施例において使用する検出方法は以下のとおりである。試料ＲＮＡ、本実施例においては合成したＬｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇ  ｍｉＲＮＡを、下表に示すように、１×ＴＭＡＣ緩衝剤（３Ｍ  ＴＭＡＣ、０．１％サルコシル、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、４ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）に様々な濃度で添加する。この反応試験管に、Ｌｕｍｉｎｅｘミクロスフェアに結合した捕捉オリゴヌクレオチドと、表１特性（Ｔａｂｌｅ  １  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に示す、検出しようとする各ｍｉＲＮＡ種に対する検出オリゴヌクレオチドとを添加した。捕捉オリゴヌクレオチドに結合した同等数のミクロスフェア（３０００）を、約１０６〜１０８捕捉オリゴヌクレオチド／ミクロスフェアで添加した（捕捉オリゴヌクレオチドの全濃度は約０．５ｐｍｏｌであった）。検出オリゴヌクレオチドを各々濃度１０ｐｍｏｌで添加した。混合物を１×ＴＭＡＣ緩衝剤中で５２℃で１時間又は下記時間インキュベートして、捕捉オリゴヌクレオチドの配列とそのそれぞれの捕捉配列及び検出オリゴヌクレオチドとそのそれぞれの捕捉配列をハイブリダイゼーションさせた。１時間ハイブリダイゼーション後、混合物を１５，０００ＲＰＭで２分間（室温）遠心分離して検出複合体をペレット化した。過剰の液体を吸引し、希釈ストレプトアビジン−ＰＥ複合体６０μｌを添加した。ストレプトアビジン−ＰＥ複合体を検出複合体と一緒に５２℃で１０分間インキュベートして、ストレプトアビジン−ＰＥ複合体と検出オリゴヌクレオチド上のビオチンタグを結合させた。インキュベーションの最後に、混合物をＬｕｍｉｎｅｘ  １００プラットフォームによって読み取った。記載した検出反応全体は９０分で完了し得る。上述したように、記載した条件は改変し得る。
【００５６】
表２〜５に、開示するｍｉＲＮＡ検出方法の特異性及び感度を示す。（Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇとして示した）表２〜５の各列は、特定の標的ＲＮＡを検出するために反応混合物に添加した特定の捕捉及び検出オリゴヌクレオチドである。表２−５の各行に、反応混合物に添加した特定の標的ＲＮＡ及び標的ＲＮＡの濃度を示す。（各行は個々の検出反応を表す）。各捕捉及び検出オリゴヌクレオチドの配列並びに合成ｍｉＲＮＡの配列を表１に示す。「テンプレートなし」と記載した行は、合成ｍｉＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を反応物に添加せず、負の対照及びバックグラウンドの読みとして働くことを示している。データを正規化するために、特定の標的ｍｉＲＮＡ反応に対して得られる特定シグナルを試料の全シグナルで除算することによって、標的ｍｉＲＮＡに対するシグナルの百分率を計算する（「正規化比」と称する）。全シグナルの３５％を超えるシグナルを強調して表示する。
【００５７】
表２に示す結果では、Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇ合成ｍｉＲＮＡを各１００、８０、６０及び４０ｆｍｏｌで添加した。検出オリゴヌクレオチドを各々濃度１０ｐｍｏｌで添加した。第２〜５行では、Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇ合成ｍｉＲＮＡ  １００ｆｍｏｌを添加した。第６〜９行では、Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇ合成ｍｉＲＮＡ  ８０ｆｍｏｌを添加した。第１０〜１３行では、Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇ合成ｍｉＲＮＡ  ６０ｆｍｏｌを添加した。第１４〜１７行では、Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇ合成ｍｉＲＮＡ  ４０ｆｍｏｌを添加した。表２からわかるとおり、各ｍｉＲＮＡ種の検出はきわめて特異的であり、反応で検出したシグナルの６０％〜９１％が、検出しようとする特定の標的ｍｉＲＮＡ由来であった。負の対照／バックグラウンド反応は、表２の第１行に示すようにきわめて小さかった。
【００５８】
標的ｍｉＲＮＡ種４０ｆｍｏｌ濃度では、高感度で特異的な検出が認められる。Ｌｅｔ−７ａの場合、試料における検出シグナルの８１％が、検出しようとする特定の標的ｍｉＲＮＡ由来であった。Ｌｅｔ−７ｂ及びＬｅｔ−７ｃの場合、試料における検出シグナルの７６％が、検出しようとする特定の標的ｍｉＲＮＡ由来であった。Ｌｅｔ−７ｇの場合、試料における検出シグナルの９１％が、検出しようとする特定の標的ｍｉＲＮＡ由来であった。この高感度特異的検出は、反応において検出したｍｉＲＮＡ種の強い配列相同性にもかかわらず認められる。Ｌｅｔ−７ｂとＬｅｔ−７ｃの配列はわずか１ヌクレオチドしか違わない。Ｌｅｔ−７ｂとＬｅｔ−７ａの配列は２ヌクレオチドだけ異なる。Ｌｅｔ−７ｂとＬｅｔ−７ｇの配列は５ヌクレオチドだけ異なる。
【００５９】
ｍｉＲＮＡ濃度４０ｆｍｏｌのデータは、表２からわかるとおり、他のｍｉＲＮＡ濃度で得られたデータを表示する。表２のデータによれば、ｍｉＲＮＡ標的濃度を減少させることによって、特異性はわずかに増大した。
【００６０】
表３に、ｍｉＲＮＡ標的を濃度１０、１及び０．１ｆｍｏｌで使用する検出アッセイ結果を示す。表３の結果は表２の結果を反映し、検出特異性が０．１ｆｍｏｌと低いｍｉＲＮＡ濃度で維持できることを示している。０．１ｆｍｏｌでは、Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇの場合、各試料において検出したシグナルのそれぞれ７０％、８１％、７７％及び９１％が検出しようとする特定の標的ｍｉＲＮＡ由来であった。
【００６１】
表４に、ミクロスフェアに結合した検出オリゴヌクレオチド及び捕捉オリゴヌクレオチドと検出しようとするｍｉＲＮＡとのハイブリダイゼーション時間を変えた効果を示す。表２及び３の結果では、１時間のハイブリダイゼーション時間を使用した。表４では、１０分間、３０分間及び６０分間のインキュベーション時間を比較した。この実験に使用したＬｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇ標的ｍｉＲＮＡの濃度は５０ｆｍｏｌであった。表４からわかるように、ハイブリダイゼーション時間を１０分間に短縮しても依然として良好な特異性及び感度が得られた。１０分間のハイブリダイゼーション反応によって検出したシグナルは、１時間のハイブリダイゼーション中に得られたシグナルの約７０％であった。
【００６２】
検出方法の反復性を検証するために、試料を３重で上述したように処理し、結果を比較した。この実験では、Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇ標的ｍｉＲＮＡ濃度は５０ｆｍｏｌであり、検出オリゴヌクレオチドを濃度１０ｐｍｏｌで使用し、ハイブリダイゼーション時間を６０分間とした。表５に検出結果を示す。観察されたとおり、検出方法の反復性は優れており、平均ＣＶはわずか１．７％であった。
【実施例２】
【００６３】
ラット脳からの全ＲＮＡのｍｉＲＮＡプロファイリング
本実施例では、天然ＲＮＡソース中に存在する様々なｍｉＲＮＡに対する、開示する検出方法の検出能力を試験した。本実施例では、ＲＮＡソースはラット脳であった。実施例２に記載の実験において使用した検出方法は、試料ＲＮＡが合成ｍｉＲＮＡではなくラット脳から標準方法によって抽出されたＲＮＡである以外は、実施例１において使用した方法と同一であった。捕捉及び検出オリゴヌクレオチドの配列は、表１に示したものである。試料ＲＮＡを、カラム精製して小さなｍＲＮＡの割合を高め、又は精製工程なしで全ＲＮＡとして使用した。上述したとおり、（Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇとして示した）表６〜７の各列は、反応混合物に添加した、所与の標的ＲＮＡに特異的な特定の捕捉及び検出オリゴヌクレオチドである。表６〜７の各行は、反応混合物に添加した試料ＲＮＡ及び試料ＲＮＡを添加した濃度を示す（各行は個々の検出反応である）。検出結果を表６及び７に示す。
【００６４】
表６の結果によれば、開示する検出方法は、（精製として示す）サイズ分画したＲＮＡ及び全ＲＮＡから、ｍｉＲＮＡ分子の存在を検出し得る。第１行は（ＲＮＡを反応物に添加しなかった）負の対照である。第２〜４行に、それぞれ４μｇ、４００ｎｇ及び４０ｎｇで反応混合物に添加した全ＲＮＡを示す。第５〜７行では、小ＲＮＡに濃縮したカラム精製ＲＮＡを、それぞれ４００ｎｇ、４０ｎｇ及び４ｎｇで反応混合物に添加した。第８〜１１行は正の対照であり、そこでは特定の標的合成ｍｉＲＮＡ  ５０ｆｍｏｌを反応混合物に添加した。検出オリゴヌクレオチドを１０ｐｍｏｌで添加した。表６の結果によれば、ｍｉＲＮＡは、小ＲＮＡに濃縮したＲＮＡ調製物及び（小ＲＮＡに濃縮していない）全ＲＮＡにおいて検出し得る。開示する検出方法の感度が高いので、ソースから得られたＲＮＡの濃縮は必要とされない。
【００６５】
ｍｉＲＮＡ検出方法の感度の限界を調べるために、第１〜６行において全ＲＮＡ調製物をそれぞれ１６００、８００、４００、２００、１００及び５０ｎｇの濃度に希釈した。上述したとおり、検出オリゴヌクレオチドを濃度１０ｐｍｏｌで添加した。表７からわかるように、本検出方法の感度は全ＲＮＡ濃度５０ｎｇまで維持される。表６及び７において得られる正規化比率を比較することによってわかるように、反応の特異性も維持された。
【実施例３】
【００６６】
混合合成ｍｉＲＮＡを用いたｍｉＲＮＡプロファイリング
本実施例では、合成ｍｉＲＮＡの混合試料中に存在する様々なｍｉＲＮＡに対する、開示する検出反応の検出能力を試験した。実施例１と同様にｍｉＲＮＡを合成的に産生し、各ｍｉＲＮＡの配列は表１に示したものである。実施例３に記載の実験において使用した検出方法は、実施例１において使用した方法と同一であった。上述したとおり、（Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、Ｌｅｔ−７ｃ及びＬｅｔ−７ｇとして示した）表８の各列は、反応混合物に添加した、所与の標的ＲＮＡに特異的な特定の捕捉及び検出オリゴヌクレオチドを示す。表８の各行は、反応混合物に添加した標的ｍｉＲＮＡ及び各々を添加した濃度を示す（各行は別個の検出反応を示す）。各捕捉及び検出オリゴヌクレオチドの配列並びに合成ｍｉＲＮＡの配列を表１に示す。
【００６７】
表８に、混合合成ｍｉＲＮＡを用いたアッセイの特異性及び感度を示す。第１行は負の対照である。第２〜４行は、（各々１０ｆｍｏｌで添加した）それぞれＬｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ及びＬｅｔ−７ｃである。第５行は、Ｌｅｔ−７ａ  １０ｆｍｏｌとＬｅｔ−７ｂ  １０ｆｍｏｌの混合物である。第６行は、Ｌｅｔ−７ａ  １０ｆｍｏｌとＬｅｔ−７ｂ  ５ｆｍｏｌの混合物である。第７行は、Ｌｅｔ−７ａ  ５ｆｍｏｌとＬｅｔ−７ｂ  １０ｆｍｏｌの混合物である。類似の組み合わせを、Ｌｅｔ−７ａとＬｅｔ−７ｃ（第８−１０行）及びＬｅｔ−７ｂとＬｅｔ−７ｃ（第１１〜１３行）について試験した。表８からわかるように、検出されたシグナルは、反応物中に存在するｍｉＲＮＡ標的の量と相関した。これらの結果は、（特に、配列が１ヌクレオチドしか違わないＬｅｔ−７ｂとＬｅｔ−７ｃなど、相同性の高いｍｉＲＮＡ間の）いくらかの交差ハイブリダイゼーションを確かに示すが、この結果は、様々なｍｉＲＮＡの発現レベルを、開示する方法を用いてモニターできることを示している。
【実施例４】
【００６８】
乳癌のｎｃＲＮＡ固有性の生成
上述したように、本開示の方法は、疾病又は症状に対するｎｃＲＮＡ固有性の生成に使用し得る。本実施例では、ｎｃＲＮＡがｍｉＲＮＡである乳癌に対して生成されるｎｃＲＮＡ固有性の例を説明する。本実施例では、患者のＲＮＡ試料をＡｓｔｅｒａｎｄ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ；ｗｗｗ．ａｓｔｅｒａｎｄ．ｃｏｍ）から購入した。患者のＲＮＡ試料は標的ｍｉＲＮＡを含んでいた。製造者によって記述されたように、患者の組織試料を顕微解剖し、試料から全ＲＮＡを抽出した。２つのケースで、ペアマッチ試料を購入した。すなわち、癌試料に加えて、（同じ対象の）乳房の非癌性ＲＮＡ試料も入手した。非癌性ＲＮＡ試料は、ｍｉＲＮＡ発現のベースラインとして役立った。以下の例に使用するペアマッチ試料を５３８６Ｎ（患者番号５３８６から得られた正常な乳房ＲＮＡ試料）、５３８６Ｔ（患者番号５３８６から得られた乳癌ＲＮＡ試料）、３１８２８Ｎ（患者番号３１８２８から得られた正常な乳房ＲＮＡ試料）、３１８２８Ｔ（患者番号３１８２８から得られた乳癌ＲＮＡ試料）と命名する。ペアマッチ試料に加えて、乳房腫瘍の追加ＲＮＡ試料も購入し、５３８７Ｔ、１７２６０Ｔ、４５９１Ｔ、１１７９３Ｔ、１２５９５Ｔ、１４２９２Ｔ及び１７０５４Ｔと命名した。ｍｉＲＮＡプロファイルを各ＲＮＡ試料について求めた。
【００６９】
初期スクリーニングにおいて、１００個を超えるｍｉＲＮＡ分子を、得られた各ＲＮＡ試料についてスクリーニングし、各試料のｍｉＲＮＡプロファイルを作成した。分析したｍｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１０１ｂ、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０５、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１２８ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３１、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１４７、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５１、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７８、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１８７、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２０１、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０７、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１６、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２９０、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９１−５ｐ、ｍｉＲ−２９２−３ｐ、ｍｉＲ−２９２−５ｐ、ｍｉＲ−２９３、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２９７、ｍｉＲ−２９８、ｍｉＲ−２９９、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３００、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３２１、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−３２３、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３３１、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−３３８、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４１、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４４、ｍｉＲ−３４４、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−３５０、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−７ｂ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−３３６、ｍｉＲ−３４９などが挙げられる。５ｓＲＮＡも試験した。
【００７０】
各ｍｉＲＮＡ分子の検出に特異的な検出オリゴヌクレオチドと捕捉オリゴヌクレオチドの対も合成した。捕捉オリゴヌクレオチドの各々は１０〜１２ヌクレオチド長であり、平均３〜４個のＬＮＡ改変ヌクレオチドを含んでいた。捕捉配列は、標的ｍｉＲＮＡ分子の３’末端に位置した。捕捉オリゴヌクレオチドを合成し、（製造者の指示に従って）色コード化Ｌｕｍｉｎｅｘビーズに共有結合させた。検出オリゴヌクレオチドの各々は８〜１０ヌクレオチド長であり、平均２〜３個のＬＮＡ改変ヌクレオチドを含んでいた。各検出オリゴヌクレオチドは、その３’末端にビオチンタグを含んだ。検出配列は、標的ｍｉＲＮＡ分子の５’末端に位置した。各捕捉オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチド中のＬＮＡ残基の位置及び数は、Ｅｘｉｑｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｌｎａ−ｔｍ．ｃｏｍ／）によって提供されたオンラインソフトウェアツールに基づいて、ハイブリダイゼーションのＴｍが４５℃となるように設計した。
【００７１】
捕捉オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの１１４対を１０個の多重反応物に分けた。各多重反応物は、１０個の異なる標的ｍｉＲＮＡ分子に特異的な捕捉オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの１０セットと、上記患者ＲＮＡ試料の各々から得られた全ＲＮＡ  １μｇとを含んだ。検出しようとする各標的ｍｉＲＮＡについて、（捕捉オリゴヌクレオチド約０．５ｐｍｏｌを含む）約３０００個のビーズ及び検出オリゴヌクレオチド０．５ｐｍｏｌをハイブリダイゼーション緩衝液（１×ＴＭＡＣ緩衝液、Ｓｉｇｍａ）に添加した。捕捉及び検出オリゴヌクレオチドを同時に添加した。反応を４５℃で１時間行った。標的ｍｉＲＮＡ／捕捉オリゴヌクレオチド／検出オリゴヌクレオチド複合体を、遠心分離によって収集し、過剰の液体を除去した。ストレプトアビジン−ＰＥ溶液（Ｐｒｏｚｙｍｅ  ＰＪ／７０Ｓ）を製造者の指示に従って添加し、４５℃で１０分間インキュベートした。試料をＬｕｍｉｎｅｘ−１００検出プラットフォーム（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）ですぐに読み取った。
【００７２】
別個のｍｉＲＮＡプロファイルを、上で考察したＲＮＡ試料の各々から得た。ｍｉＲＮＡプロファイル分析のデータを分析した。標的ｍｉＲＮＡ分子のサブセットをさらに分析するために区別した。さらに分析するために区別したｍｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列並びにこれらのｍｉＲＮＡ分子の各々に対する捕捉及び検出オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を、関連する配列番号と一緒に表１に示す。それぞれの配列中の大文字は、ＬＮＡ塩基を示す。捕捉オリゴヌクレオチドに対して示したヌクレオチド配列は、上記実施例１に記載のスペーサー基を付加することによって改変できることに留意されたい。
【００７３】
これらのｍｉＲＮＡ種の生データを（平均蛍光強度ＭＦＩとして表すデータと一緒に）表９に示す。表９からわかるように、幾つかのｍｉＲＮＡ種は、正常乳房組織試料と乳癌試料で異なる発現を示した。また、幾つかのｍｉＲＮＡ種は、正常試料と乳癌試料で比較的一定した発現を示した。これらのｍｉＲＮＡ種は、データを必要に応じて正規化するための内部参照又は内部標準として使用し得る。表１０にｍｉｒ−１３０ａ  ｍｉＲＮＡに対して正規化したデータを示す。正規化した読み取り値を得るために、検出した各ｍｉＲＮＡのＭＦＩを、対応するｍｉｒ−１３０ａ  ＭＩＦ値で除算した。必要ではないが、内部基準を使用することによって試料間の差を説明し得る。
【００７４】
表９及び１０において、各行は検出したｍｉＲＮＡ標的であり、各列は分析した患者ＲＮＡ試料である。Ｎｅｇは試料ＲＮＡを添加しない負の対照であり、Ｐｏｓは正の対照である（表９）。表９及び１０からわかるように、以下の標的ｍｉＲＮＡ分子は、正常試料と癌試料で発現が異なった：ｍｉｒ−１０７、ｍｉｒ−１５ｂ、ｍｉｒ−１０３、ｍｉｒ−１７−５ｐ、ｍｉｒ−１６、ｍｉｒ−１２６、ｍｉｒ−１４１、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−１４３、ｍｉｒ−１９３、ｍｉｒ−１９９ａ、ｍｉｒ−２９ａ、ｍｉｒ−１９５、ｍｉｒ−２６ａ、ｍｉｒ−２０、ｍｉｒ−１２８ｂ、ｍｉｒ−２１７及びｍｉｒ−２１９。上述したように、ｍｉｒ−１２２ａ、ｍｉｒ２９９、ｍｉｒ−７ｂ及びｍｉｒ１３０ａの発現は、正常試料と癌試料で本質的に一定のままであった。
【００７５】
また、乳癌ｍｉＲＮＡ固有性を含む標的ｍｉＲＮＡ分子は、さらに細分し得る。例えば、図２及び３に示すとおり、ｍｉｒ−１０７、ｍｉｒ−１５ｂ及びｍｉｒ−１０３は、全乳癌試料において正常試料とは異なる（この場合、増加した）発現を示した。しかしながら、ｍｉｒ−１７−５ｐ、ｍｉｒ−１６、ｍｉｒ−１２６、ｍｉｒ−１４１、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−１４３、ｍｉｒ−１９３、ｍｉｒ−１９９ａ、ｍｉｒ−２９ａ、ｍｉｒ−１９５、ｍｉｒ−２６ａ、ｍｉｒ−２０、ｍｉｒ−１２８ｂ、ｍｉｒ−２１７及びｍｉｒ−２１９は、分析した乳癌試料に応じて種々雑多な結果を示した。 ｍｉｒ−１７−５ｐ、ｍｉｒ−１６、ｍｉｒ−１２６、ｍｉｒ−１４１、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−１４３、ｍｉｒ−１９３、ｍｉｒ−１９９ａ、ｍｉｒ−２９ａ、ｍｉｒ−１９５、ｍｉｒ−２６ａ、ｍｉｒ−２０、ｍｉｒ−１２８ｂ、ｍｉｒ−２１７及びｍｉｒ−２１９は、５３８６Ｔ、１２５９５Ｔ、１４２９２Ｔ、１１７９３Ｔ及び１７０５４Ｔ乳癌試料において正常試料に比較して変化した発現を示した。例えば、ｍｉｒ−１４２−３ｐは上記乳癌試料において発現が増加したのに対して、ｍｉｒ−２１９は上記乳癌試料において発現が減少した。これに対して、ｍｉｒ−１７−５ｐ、ｍｉｒ−１６、ｍｉｒ−１２６、ｍｉｒ−１４１、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−１４３、ｍｉｒ−１９３、ｍｉｒ−１９９ａ、ｍｉｒ−２９ａ、ｍｉｒ−１９５、ｍｉｒ−２６ａ、ｍｉｒ−２０、ｍｉｒ−１２８ｂ、ｍｉｒ−２１７及びｍｉｒ−２１９は、５３８７Ｔ、１７２６０Ｔ及び４５９１Ｔ乳癌試料において、正常乳房組織試料のｍｉＲＮＡプロファイルを本質的に反映した。
【００７６】
このデータによれば、乳癌ｍｉＲＮＡ固有性は、少なくともｍｉｒ−１０７、ｍｉｒ−１５ｂ及びｍｉｒ−１０３を含む。他のｍｉＲＮＡ種も、表９及び１０並びに図２及び３に示すように、乳癌ｍｉＲＮＡ固有性に含まれ得る。残りのｍｉＲＮＡ種において観察される差は、試料が採取された乳癌の進行状態の差又は他の分子上の差によると考えられる。ｍｉＲＮＡプロファイルは２つの異なる群に分類されるので、発現パターンの差は、乳癌患者を亜分類するのに有用な診断ツールとなり得る。試料１１７９３Ｔ、１２５９５Ｔ、１４２９２Ｔ及び１７０５４ＴのｍｉＲＮＡプロファイルは５３８６Ｔのそれと類似しており、試料５３８７Ｔ、１７２６０Ｔ及び４５９１ＴのｍｉＲＮＡプロファイルは３１８２８Ｔのそれと類似している。
【００７７】
本実施例によれば、開示するｎｃＲＮＡ検出方法を用いてｎｃＲＮＡプロファイル（この場合ｍｉＲＮＡ）を作成することができ、ｎｃＲＮＡプロファイルは特定の疾病又は症状（この場合は乳癌）に対するｎｃＲＮＡ固有性を創成するのに使用し得る。また、ｎｃＲＮＡ固有性は、図３に示すように、ｎｃＲＮＡ種（この場合はｍｉＲＮＡ）の発現プロファイルに基づいて乳癌試料を亜分類し得る。患者のｎｃＲＮＡプロファイルは、上記のようにして得ることができ、前記患者の疾病若しくは症状、又は前記疾病若しくは症状のリスクを診断するために、疾病のｎｃＲＮＡ固有性と比較し得る。ｎｃＲＮＡ固有性中の各ｎｃＲＮＡは、診断のために患者のｎｃＲＮＡプロファイルに対して調べられる。診断は、患者プロファイルにおけるｎｃＲＮＡレベルをｎｃＲＮＡ固有性におけるｎｃＲＮＡレベルと比較することによって行うことができる。従って、各ｎｃＲＮＡ値が診断を示すかどうか、又はかかるｎｃＲＮＡ値の１個以上が診断を示すかどうかを判定し得る。この判定は、各ｎｃＲＮＡのカットオフ／しきい値を適用する、データの視覚的分析によって、又は（下記実施例６に記載のモデルなど、但しこれだけに限定されない）統計学的モデルを使用することによって行うことができる。
【実施例５】
【００７８】
神経膠腫のｎｃＲＮＡ固有性の生成
本実施例では、ｎｃＲＮＡがｍｉＲＮＡである神経膠腫に対して生成されるｎｃＲＮＡ固有性の例を説明する。本実施例においては、ＲＮＡ試料を一連の神経膠腫細胞系及び正常神経細胞系から得た。ＲＮＡ抽出は標準方法によって達成された。使用した神経膠腫細胞系はＬＮ−２１５、ＬＮ−３４０、Ｕ３４３ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、ＬＮ４０１、ＬＮ４０５、ＬＮ４６４及びＵ８７ＭＧであった。これらの細胞系はＩｓｈｉｉ等（Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．９：４６９−４７９，１９９９）に記載されている。また、ＨＡと称される正常神経細胞系は、ｍｉＲＮＡ発現のベースラインとして役立つ。実施例４に記載したｍｉＲＮＡ検出方法を本実施例では用いた。
【００７９】
ｍｉＲＮＡプロファイルを、先に考察した細胞系の各々に由来するＲＮＡ試料から得た。ｍｉＲＮＡプロファイル分析のデータを分析した。１１４個の標的ｍｉＲＮＡ分子のサブセットをさらに分析するために同定した。これらのｍｉＲＮＡ種の生データを（平均蛍光強度ＭＦＩとして表すデータと一緒に）表１１に示す。表１１からわかるように、幾つかのｍｉＲＮＡ種は、正常神経細胞系と神経膠腫細胞系で異なる発現を示した。また、幾つかのｍｉＲＮＡ種は、正常神経細胞系と神経膠腫細胞系で比較的一定した発現を示した。これらのｍｉＲＮＡ種は、データを必要に応じて正規化するための内部基準又は内部標準として使用し得る。表１２にｍｉｒ−１３０ａ  ｍｉＲＮＡに対して正規化したデータを示す。正規化した読み取り値を得るために、検出した各ｍｉＲＮＡのＭＦＩを、対応するｍｉｒ−１３０ａ  ＭＦＩ値で除算した。必要ではないが、内部基準を使用することによって試料間の差を説明し得る。
【００８０】
表１１及び１２において、各行は検出したｍｉＲＮＡ標的であり、各列は分析したＲＮＡ試料である。Ｎｅｇは試料ＲＮＡを添加しない負の対照であり、Ｐｏｓは正の対照である（表１１）。表１１及び１２からわかるように、以下の標的ｍｉＲＮＡ分子は、正常神経細胞系と神経膠腫細胞系とで変化した発現を示した：ｍｉｒ−１４１、ｍｉｒ−１４３、ｍｉｒ−２３ｂ、ｍｉｒ−１５ｂ、ｍｉｒ−２９３、ｍｉｒ−１７−ｐ３及びｍｉｒ−３２０。ｍｉｒ−１７−５ｐ、ｍｉｒ２１４及びｍｉｒ１３０ａの発現は、正常神経細胞系と神経膠腫細胞系とで本質的に一定のままであった。
【００８１】
図４及び５は、本実施例において試験した細胞系のｍｉＲＮＡプロファイルのグラフ表示である。図４にＭＦＩ（Ｙ軸）の関数としてプロットしたデータを示す。図５は、ｍｉｒ−１３０ａのＭＦＩ値に対して正規化したＭＦＩ値（Ｙ軸）を用いてプロットした同じデータである。両方の図のＸ軸は検出したｍｉＲＮＡ種である。図からわかるように、ｍｉｒ−１４１、ｍｉｒ−１４３、ｍｉｒ−２３ｂ、ｍｉｒ−１５ｂ、ｍｉｒ−２９３、ｍｉｒ−１７−ｐ３及びｍｉｒ−３２０は、神経膠腫細胞系の本質的に全てにおいて正常ニューロン試料と比較して変化した（増加と減少の両方の）発現を示した。
【００８２】
このデータによれば、神経膠腫ｍｉＲＮＡ固有性は、少なくともｍｉｒ−１４１、ｍｉｒ−２３ｂ、ｍｉｒ−２９３、ｍｉｒ−１７−３ｐ及びｍｉｒ−３２０を含む。他のｍｉＲＮＡ種も、表１１及び１２並びに図４及び５に示すように、乳癌ｍｉＲＮＡ固有性に含まれ得る。（ｍｉｒ−１４３、ｍｉｒ−１５ｂなどの）残りのｍｉＲＮＡ種において観察される差は、試料が採取された乳癌の進行状態の差又は他の分子上の差によると考えられる。
【００８３】
本実施例によれば、開示するｎｃＲＮＡ検出方法を用いてｎｃＲＮＡプロファイル（この場合ｍｉＲＮＡ）を作成することができ、ｎｃＲＮＡプロファイルは特定の疾病又は症状（この場合は神経膠腫）に対するｎｃＲＮＡ固有性を創成するのに使用し得る。
【実施例６】
【００８４】
ｎｃＲＮＡ固有性に関する統計学的方法
本明細書に記載したｎｃＲＮＡ固有性の能力を利用するために、統計学的アプローチを生成データに適用し得る。多くの統計学的手法を使用し得る。一実施形態においては、所与の疾病若しくは症状に対するｎｃＲＮＡ固有性を記述するために、及び／又は疾病若しくは症状に罹患した／罹患し易い対象又は罹患していない／罹患し難い対象に分類するために、尤度比（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｒａｔｉｏ）を使用する。この手法では、ｍｉＲＮＡレベルの母集団分布がガウス分布関数に近いと仮定する。尤度比を計算するには、ガウシアン「高さ」を確率の代りに使用する：
【００８５】
【数１】
2007533324.tif 000003
式１において、ｆ（ｘ）は適用パラメータｘ（ｘは、正常集団でも異常集団でもよい）のガウシアン高さであり、μはパラメータｘの母平均であり、δは母集団の標準偏差である。式１は、３つの部分で検討し得る。式の左側の１／（δ√２π）はガウシアンピークの最大高さを制御する。「ｅ」を含む中央部分は、式の第３セクションの出力を正確な形の包絡線に変換する。最終セクションは、母集団分布の中央からの値ｘの距離を定義する標準偏差を計算する。この値は「マハラノビス距離」としても知られる。
【００８６】
各固有性ｍｉＲＮＡに関するガウシアン高さを、「正常」及び「異常」パラメータに対して求める（下記グラフ参照）。μ１及びμ２は、集団固有平均（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅａｎ）であることに留意されたい。μ１値は正常集団に関するｍｉＲＮＡレベルのガウシアン高さを計算するのに使用し、μ２値は異常集団に関するｍｉＲＮＡレベルのガウシアン高さを計算するのに使用する。
【００８７】
【数２】
2007533324.tif 000004
上記グラフに２つのシナリオを示す。ケース１においては、「正常」曲線の高さと「異常」曲線の高さの比（Ｎ１／Ａ１）は約４である。ケース２（Ｎ２／Ａ２）の場合、この比は約０．２５である。換言すると、患者から測定したｍｉＲＮＡレベルが「正常」平均に近い場合、患者は正常である（所与の疾病又は症状に罹患していないと特徴づけられる）可能性が最も高い。しかしながら、ｍｉＲＮＡレベルが「異常」集団の平均に近い場合、対象は異常である（疾病若しくは症状に罹患している、又はそのリスクがあると特徴づけられる）可能性が最も高い。従って、尤度比は、所与の対象が、対象のプロファイル中に同定される或るｎｃＲＮＡ分子のレベルに基づいて、所与の疾病若しくは症状に罹患している、又はそのリスクがある確率を示す。
【００８８】
ガウシアン高さを使用する１つの利点は、対象のプロファイルにおいて得られる複数の独立したｍｉＲＮＡレベルの予測的能力を組み合わせることができることである。対象が疾病若しくは症状に罹患している、又はそのリスクがあるという総合尤度又は確率は、式（２）によって計算し得る。式（２）において、ＬＲｔは異常集団に関する総計ガウシアン高さであり、ＬＲｎは正常集団に関する統計ガウシアン高さである。
【００８９】
確率＝（ＬＲｔ）／（ＬＲｔ＋ＬＲｎ）            ２
［式中、ＬＲｔ＝ＬＲ１ｔ＊ＬＲ２ｔ＊ＬＲ３ｔ．．．ＬＲｎｔ、及びＬＲｎ＝ＬＲ１ｎ＊ＬＲ２ｎ＊ＬＲ３ｎ．．．ＬＲｎｎ］。
この統計学的アプローチを適用できることを実証するために、実施例４に記載のようにｍｉｒ−１３０ａ、ｍｉｒ−１０７、ｍｉｒ−１５ｂ及びｍｉｒ−１０３に対して得られた正規化データ（表１０）を使用する。正規化データから、癌及び正常試料（集団）の平均及び標準偏差の数値を求める。本実施例においては、正常試料の標準偏差を０．２０００とした。ｍｉｒ−１０７、ｍｉｒ−１５ｂ及びｍｉｒ−１０３のガウシアン高さを試料の各々について計算する。まず、正常試料の平均及び標準偏差値を使用して「正常」ガウシアン高さを得る。次いで、乳癌試料の平均及び標準偏差値を使用して「異常」ガウシアン高さを得る。尤度比は、ＧＨ−異常とＧＨ−正常との比として得られる。個々の尤度比を決定したのち、（個体が疾病／症状に罹患している、又はそのリスクがあるかどうかを示す）総合危険因子又は確率因子を、対象のプロファイル中の各ｍｉＲＮＡ種に対して求められた個々の尤度比を乗算することによって求める。上記計算を表１３に示す。
【実施例７】
【００９０】
ｎｃＲＮＡプロファイリングによって特定された候補治療標的の同定
上述したように、開示する検出方法は、疾病又は症状の治療に対する薬物標的候補を同定するのに使用し得る。特定の疾病又は症状に対するｎｃＲＮＡ固有性を作成し得る。特定の疾病又は症状を特徴づけるｎｃＲＮＡ種の同一性を決定することによって、病態又は症状の原因となる分子経路に関与する分子標的の同一性を特定し得る。例えば、ｍｉＲＮＡ分子は、或るタンパク質のｍＲＮＡを分解すること及び／又はタンパク質の転写を妨害することによって、遺伝子発現を調節することが知られている。これらの分子的標的物は、疾病又は症状の治療及び／又は予防用の薬剤開発に対する新規治療学的候補を提供し得る。かかる方法においては、疾病又は症状に対するｎｃＲＮＡ固有性は上述したように得られる。疾病又は症状を特徴づけるｎｃＲＮＡ分子に注目する。ｎｃＲＮＡ分子の同一性を、疾病又は症状の分子経路に関与する分子標的を決定するのに使用する。特定の実施形態においては、ｎｃＲＮＡはｍｉＲＮＡである。
【００９１】
コンピュータプログラムは、ｎｃＲＮＡ分子が結合し得る標的を特定するために、ｎｃＲＮＡ固有性中の１個以上のｎｃＲＮＡ分子の配列を、ゲノム情報を含む市販データベース又は所有権のあるデータベースと比較するのに使用し得る。かかる標的は、薬剤開発の治療学的候補である。比較を実施し得るあらゆるプログラム／ソフトウェアを使用し得る。本実施例においては、公的に利用可能なアルゴリズムを使用して比較した（Ｅｎｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ２（１１）：ｅ３６３）。
【００９２】
この方法を適用できることを実証するために、実施例４に記載したようにｍｉｒ−１０７、ｍｉｒ−１５ｂ及びｍｉｒ−１０３に対して得られた正規化データ（表９及び１０並びに図２及び３）を使用する。実施例４では、ｍｉｒ−１０７、ｍｉｒ−１５ｂ及びｍｉｒ−１０３が乳癌のｍｉＲＮＡ固有性を含むと同定した。これらのｍｉＲＮＡ分子の配列を、同定したｍｉＲＮＡ分子が結合し得る配列を含む標的を同定するために、核酸配列情報を含むゲノムデータベースに照会した。表１４に示す幾つかの標的候補が同定された。表１４は、候補治療標的の部分的リストであることに留意されたい。
【００９３】
表１４からわかるように、（ＴＡＲ  ＤＮＡ−結合タンパク質４３などの）ある種のタンパク質は、ｍｉｒ−１０７、ｍｉｒ−１５ｂ及びｍｉｒ−１０３の各々に対する候補治療標的と同定され、他のタンパク質は、これらのｍｉＲＮＡ分子のサブセットに対する候補治療標的と同定される（例えば、ＭＡＰ−１Ａはｍｉｒ−１０３及びｍｉｒ−１０７によって同定されるが、ｍｉｒ−１５ｂによっては同定されない）。このアプローチを利用して標的を同定することによって、疾病又は症状の分子的機序に関与する標的を洞察することが可能になり、薬剤開発に対する新規候補を提供し得る。
【表１】
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【表２】
2007533324.tif 000006
【表３】
2007533324.tif 000007
【表４】
2007533324.tif 000008
【表５】
2007533324.tif 000009
【表６】
2007533324.tif 000010
【表７】
2007533324.tif 000011
【表８】
2007533324.tif 000012
【表９】
2007533324.tif 000013
【表１０】
2007533324.tif 000014
【表１１】
2007533324.tif 000015
【表１２】
2007533324.tif 000016
【表１３】
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【表１４】
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【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】本開示のｍｉＲＮＡ検出方法の一実施形態の図である。この実施形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドは、（基質として働き、第１シグナルタグを含む）固体の内部色コード化されたミクロスフェアに結合している。
【図２】単一の対象に由来する正常乳房組織と乳癌組織から得られたＲＮＡの２組のペアマッチ試料（５３８６Ｎと５３８６Ｔ；３１８２８Ｎと３１８２８Ｔ）から選択されたｍｉＲＮＡ種のプロファイリングである。図の上半分のＹ軸は、検出した各ｍｉＲＮＡのＭＦＩを示し、図の下半分のＹ軸は、検出した各ｍｉＲＮＡの正規化した読みを示す。Ｘ軸は検出したｍｉＲＮＡ種を示す。
【図３】正常乳房組織と乳癌組織から得られたＲＮＡからの選択したｍｉＲＮＡ種のプロファイリングである。図の上半分のＹ軸は、検出した各ｍｉＲＮＡのＭＦＩを示し、図の下半分のＹ軸は、検出した各ｍｉＲＮＡの正規化したＭＦＩの読みを示す。Ｘ軸は検出したｍｉＲＮＡ種を示す。
【図４】正常神経細胞と選択した神経膠腫細胞系から得られたＲＮＡからの選択したｍｉＲＮＡ種のプロファイリングである。Ｙ軸は検出した各ｍｉＲＮＡのＭＦＩを示し、Ｘ軸は検出したｍｉＲＮＡ種を示す。
【図５】正常神経細胞と選択された神経膠腫細胞系から得られたＲＮＡからの選択したｍｉＲＮＡ種のプロファイリングである。Ｙ軸は検出した各ｍｉＲＮＡの正規化したＭＦＩの読みを示し、Ｘ軸は検出したｍｉＲＮＡ種を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年12月20日(2005.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．  対象から得たＲＮＡ試料であって、複数の標的ｎｃＲＮＡを含有する前記試料を用意する工程と、
ｂ．  前記試料を、検出すべき前記標的ｎｃＲＮＡの各々に関して特異的な第１オリゴヌクレオチドと、前記第１オリゴヌクレオチドと前記標的ｎｃＲＮＡとの複合体を形成するのに適切な条件下で接触させる工程であって、前記第１オリゴヌクレオチドの各々が、第１の検出可能なシグナルを発生する第１シグナル発生体を含み、前記第１オリゴヌクレオチドの各々が、前記標的ｎｃＲＮＡの各々の結合に関して、実質的に同じである第１のＴｍを有する工程と、
ｃ．  前記試料を、検出すべき前記標的ＲＮＡの各々に関して結合する第２オリゴヌクレオチドと、前記第２オリゴヌクレオチドと前記標的ｎｃＲＮＡとの複合体を形成するのに適切な条件下で接触させる工程であって、前記第２オリゴヌクレオチドが、第２の検出可能なシグナルを発生する第２シグナル発生体を含み、前記第２オリゴヌクレオチドの各々が、前記標的ｎｃＲＮＡの各々に結合に関して、実質的に同じである第２のＴｍを有する工程と、
ｄ．  前記第１及び第２の検出可能なシグナルを測定することによって前記試料中の前記複数の標的ｎｃＲＮＡの存在を判定する工程と
を含む、複数の異なる標的ｎｃＲＮＡの同時検出方法。
【請求項２】
前記ｎｃＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の検出可能なシグナルが、前記複数の標的ｎｃＲＮＡ中の異なるｎｃＲＮＡに結合する前記第１オリゴヌクレオチドの各々に関して異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２オリゴヌクレオチドが同時に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１及び前記第２オリゴヌクレオチドが逐次的に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のＴｍの各々と前記第２のＴｍの各々が実質的に同じである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方が少なくとも１個の改変ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記改変ヌクレオチドがロックされた核酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のＴｍの各々と前記第２のＴｍの各々が実質的に同じである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１及び第２の検出可能なシグナルが光学的固有性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１及び第２の検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１シグナル発生体がミクロスフェアであり、前記ミクロスフェアが前記第１の検出可能なシグナルを発生する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の検出可能なシグナルが光学的固有性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１オリゴヌクレオチドが８〜１２ヌクレオチド長であり、前記第２オリゴヌクレオチドが８〜１２ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、前記試料中に存在する前記標的ｎｃＲＮＡのプロファイルを作成するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料がヒト対象に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＲＮＡ試料が、低分子量ＲＮＡ種の割合を増加させるためにサイズ分画されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ａ．  対象から得たＲＮＡ試料であって、複数の標的ｎｃＲＮＡを含有する前記試料を用意する工程と、
ｂ．  前記試料を、検出すべき前記標的ｎｃＲＮＡの各々に特異的な第１オリゴヌクレオチドと、前記第１オリゴヌクレオチドと前記標的ｎｃＲＮＡとの複合体を形成するのに適切な条件下で接触させる工程であって、前記第１オリゴヌクレオチドの各々が、第１の検出可能なシグナルを発生する第１シグナル発生体を含み、前記第１オリゴヌクレオチドの各々が、前記標的ｎｃＲＮＡの各々の結合に関して、実質的に同じである第１のＴｍを有する工程と、
ｃ．  前記試料を、検出すべき前記標的ＲＮＡの各々と結合する第２オリゴヌクレオチドと、前記第２オリゴヌクレオチドと前記標的ｎｃＲＮＡとの複合体を形成するのに適切な条件下で接触させる工程であって、前記第２オリゴヌクレオチドが、第２の検出可能なシグナルを発生する第２シグナル発生体を含み、前記第２オリゴヌクレオチドの各々が、前記標的ｎｃＲＮＡの各々の結合に関して、実質的に同じである第２のＴｍを有する工程と、
ｄ．  前記第１及び第２の検出可能なシグナルを測定することによって前記試料中の前記複数の標的ｎｃＲＮＡの存在を判定する工程と
を含む、ＲＮＡ試料中の複数の標的ｎｃＲＮＡ分子のプロファイルを決定する方法。
【請求項２０】
前記ｎｃＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の検出可能なシグナルが、前記複数の標的ｎｃＲＮＡ中の異なるｎｃＲＮＡに結合する前記第１オリゴヌクレオチドの各々に関して異なる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２オリゴヌクレオチドが同時に添加される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１及び前記第２オリゴヌクレオチドが逐次的に添加される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のＴｍの各々と前記第２のＴｍの各々が実質的に同じである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方が少なくとも１個の改変ヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記改変ヌクレオチドがロックされた核酸である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のＴｍの各々と前記第２のＴｍの各々が実質的に同じである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１及び第２の検出可能なシグナルが光学的固有性を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１及び第２の検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１シグナル発生体がミクロスフェアであり、前記ミクロスフェアが前記第１の検出可能なシグナルを発生する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の検出可能なシグナルが光学的固有性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１オリゴヌクレオチドが８〜１２ヌクレオチド長であり、前記第２オリゴヌクレオチドが８〜１２ヌクレオチド長である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法が、前記試料中に存在する前記標的ｎｃＲＮＡのプロファイルを作成するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料がヒト対象に由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＲＮＡ試料が、低分子量ＲＮＡ種の割合を増加させるためにサイズ分画されていない、請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
ａ．  第１プロファイルを創成するために、疾病又は症状を有すると特徴づけられる試料からｎｃＲＮＡプロファイルを得る工程であって、前記プロファイルが請求項１９に記載の方法によって得られる工程と、
ｂ．  第２プロファイルを創成するために、正常と特徴づけられる試料からｎｃＲＮＡプロファイルを得る工程であって、前記プロファイルが請求項１９に記載の方法によって得られる工程と、
ｃ．  前記第１プロファイルを前記第２プロファイルから区別する、前記第１プロファイル中の１個以上のｎｃＲＮＡ分子を同定する工程と
を含む、疾病又は症状に関する固有性ｎｃＲＮＡプロファイルを創成する方法。
【請求項３８】
前記ｎｃＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾病が神経膠腫又は乳癌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象がヒトである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
ａ．  請求項１９に従って前記対象から対象のｎｃＲＮＡプロファイルを決定する工程と、
ｂ．  前記対象のｎｃＲＮＡプロファイルを疾病又は症状に関するｎｃＲＮＡプロファイルと比較する工程であって、前記疾病又は症状に関する前記ｎｃＲＮＡプロファイルが請求項１９に従って決定される工程と、
ｃ．  前記疾病又は症状を有する対象を、前記対象のｎｃＲＮＡプロファイルと前記疾病又は症状に関する前記ｎｃＲＮＡプロファイルとの比較に基づいて診断する工程と
を含む、疾病又は症状を有する対象を診断する方法。
【請求項４２】
前記ｎｃＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾病が神経膠腫又は乳癌である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象がヒトである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
ａ．  疾病又は症状に関する固有性ｎｃＲＮＡプロファイルを得る工程であって、前記固有性ｎｃＲＮＡプロファイルが請求項３７に記載の方法によって得られる工程と、
ｂ．  固有性ｎｃＲＮＡプロファイル中で同定される１個の前記ｎｃＲＮＡが相互作用する分子標的を決定する工程と
を含む、疾病又は症状に関与する遺伝子を同定するためのスクリーニング方法。
【請求項４６】
前記ｎｃＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾病が神経膠腫又は乳癌である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記対象がヒトである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記決定工程がアルゴリズムを用いて実施される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
ｍｉｒ−１０７、ｍｉｒ−１５Ｂ及びｍｉｒ−１０３を含む、乳癌に関する固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５１】
ｍｉｒ−１７−５ｐ、ｍｉｒ−１６、ｍｉｒ−１２６、ｍｉｒ−１４１、ｍｉｒ−１９３、ｍｉｒ２９ａ、ｍｉｒ−１９５、ｍｉｒ−２６ａ、ｍｉｒ２０、ｍｉｒ１２８ｂ、ｍｉｒ２１７及びｍｉｒ２１９の少なくとも１個をさらに含む、請求項５０に記載の固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５２】
前記プロファイルが、乳癌の診断を必要とする対象を診断するのに使用される、請求項５０又は５１に記載の固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５３】
前記プロファイルが薬剤開発のための治療標的候補を同定するために使用される、請求項５０又は５１に記載の固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５４】
ｍｉｒ−１４１、ｍｉｒ−２３ｂ及びｍｉｒ−１７−３ｐを含む、神経膠腫に関する固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５５】
ｍｉｒ−１４３、ｍｉｒ−１５ｂ、ｍｉｒ−２９３及びｍｉｒ−３２０の少なくとも１個をさらに含む、請求項５０に記載の固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５６】
前記プロファイルが、神経膠腫の診断を必要とする対象を診断するのに使用される、請求項５４又は５５に記載の固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５７】
前記プロファイルが薬剤開発のための候補治療標的を同定するために使用される、請求項５４又は５５に記載の固有性ｍｉＲＮＡプロファイル。
【請求項５８】
ａ．  標的ｎｃＲＮＡを含有する、対象から得たＲＮＡ試料を用意する工程と、
ｂ．  前記試料を、前記標的ＲＮＡに特異的な第１オリゴヌクレオチドと、前記第１オリゴヌクレオチドと前記標的ｎｃＲＮＡとの複合体を形成するのに適切な条件下で接触させる工程であって、前記第１オリゴヌクレオチドが、第１の検出可能なシグナルを発生する第１シグナル発生体を含む工程と、
ｃ．  前記試料を、前記標的ＲＮＡに特異的な第２オリゴヌクレオチドと、前記第２オリゴヌクレオチドと前記標的ｎｃＲＮＡとの複合体を形成するのに適切な条件下で接触させる工程であって、前記第２オリゴヌクレオチドが、第２の検出可能なシグナルを発生する第２シグナル発生体を含む工程と、
ｄ．  前記第１及び第２の検出可能なシグナルを測定することによって前記試料中の前記標的ｎｃＲＮＡの存在を判定する工程と
を含む、標的ｎｃＲＮＡの検出方法。
【請求項５９】
前記第１オリゴヌクレオチドが、前記ｎｃＲＮＡ上の第１の相補配列に結合し、前記第１の相補配列への結合に関する第１のＴｍを有し、前記第２オリゴヌクレオチドが、前記ｎｃＲＮＡ上の第２の相補配列に結合し、第２の相補配列への結合に関する第２のＴｍを有し、前記第１のＴｍと前記第２のＴｍが実質的に同じである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２オリゴヌクレオチドが同時に添加される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１及び前記第２オリゴヌクレオチドが逐次的に添加される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方が少なくとも１個の改変ヌクレオチドを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記改変ヌクレオチドがロックされた核酸である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１オリゴヌクレオチドが、前記ｎｃＲＮＡ上の第１の相補配列に結合し、前記第１の相補配列への結合に関する第１のＴｍを有し、前記第２オリゴヌクレオチドが、前記ｎｃＲＮＡ上の第２の相補配列に結合し、第２の相補配列への結合に関する第２のＴｍを有し、前記第１のＴｍと前記第２のＴｍが実質的に同じである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１及び第２の検出可能なシグナルが光学的固有性を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６６】
前記第１及び第２の検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１シグナル発生体がミクロスフェアであり、前記ミクロスフェアが前記第１の検出可能なシグナルを発生する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６８】
前記第１の検出可能なシグナルが光学的固有性である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１の検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記第１オリゴヌクレオチドが８〜１２ヌクレオチド長であり、前記第２オリゴヌクレオチドが８〜１２ヌクレオチド長である、請求項５８に記載の方法。
【請求項７１】
前記方法が、前記試料中に存在する前記ｎｃＲＮＡ分子のプロファイルを作成するために使用される、請求項５８に記載の方法。
【請求項７２】
前記試料がヒト対象に由来する、請求項５８に記載の方法。
【請求項７３】
前記方法が多重検出反応（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）において使用される、請求項５８に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＲＮＡ試料が、低分子量ＲＮＡ種の割合を増加させるためにサイズ分画されていない、請求項５８に記載の方法。
【請求項７５】
前記ｎｃＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項５８に記載の方法。
【国際調査報告】
2007533324.tif 000041
2007533324.tif 000042