(57)【要約】  本発明は、イヌプレプロＧＨＲＨポリペプチド、イヌ成熟ＧＨＲＨペプチド、イヌプレプロＧＨＲＨ又はイヌ成熟ＧＨＲＨをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、プレプロＧＨＲＨ又はＧＨＲＨをコードし発現するベクターも包含し、それを使用して、脊椎動物において、具体的にはイヌにおいて遺伝子治療により疾患及び成長ホルモン欠乏を治療することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロペプチドＮ末端を欠失させたイヌプロＧＨＲＨをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、ポリヌクレオチドが、配列番号３の９１ヌクレオチド位〜３２１ヌクレオチド位のヌクレオチド塩基配列と融合したペプチドシグナル配列を含む発現ベクター。
【請求項２】
イヌ成熟ＧＨＲＨをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、ポリヌクレオチドが、配列番号４のヌクレオチド塩基配列と融合したペプチドシグナル配列を含む発現ベクター。
【請求項３】
ヌクレオチド塩基配列と融合したペプチドシグナル配列が、エンハンサー及び／若しくはプロモーターと作動的に連結し、又はペプチドシグナル配列がウマＩＧＦ−１シグナルペプチドであり、或いはヌクレオチド塩基配列と融合したペプチドシグナル配列が、エンハンサー及び／若しくはプロモーターと作動的に連結し、且つペプチドシグナル配列がウマＩＧＦ−１シグナルペプチドである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
ヌクレオチド塩基配列と融合したペプチドシグナル配列が、エンハンサー及び／若しくはプロモーターと作動的に連結し、又はペプチドシグナル配列がウマＩＧＦ−１シグナルペプチドであり、或いはヌクレオチド塩基配列と融合したペプチドシグナル配列が、エンハンサー及び／若しくはプロモーターと作動的に連結し、且つペプチドシグナル配列がウマＩＧＦ−１シグナルペプチドである、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項５】
プロペプチドＮ末端を欠失させたイヌプロＧＨＲＨの細胞中への送達及び細胞中での発現のための製剤であって、請求項１に記載のベクター、及び薬学上又は獣医学上許容される担体、媒体又は賦形剤を含む製剤。
【請求項６】
イヌ成熟ＧＨＲＨの細胞中への送達及び細胞中での発現のための製剤であって、請求項２に記載のベクター、及び薬学上又は獣医学上許容される担体、媒体又は賦形剤を含む製剤。
【請求項７】
担体、媒体又は賦形剤がトランスフェクションを促進し、且つ／或いはベクター又はタンパク質の保存性を高める、請求項５に記載の製剤。
【請求項８】
担体、媒体又は賦形剤がトランスフェクションを促進し、且つ／或いはベクター又はタンパク質の保存性を高める、請求項６に記載の製剤。
【請求項９】
ＧＨＲＨを脊椎動物へと送達する方法であって、請求項５に記載の製剤を脊椎動物に注射するステップを含む方法。
【請求項１０】
ＧＨＲＨを脊椎動物へと送達する方法であって、請求項６に記載の製剤を脊椎動物に注射するステップを含む方法。
【請求項１１】
脊椎動物がイヌである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
脊椎動物がイヌである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
脊椎動物において貧血、骨折治癒、悪液質、肥満、骨粗鬆症又は創傷治癒を治療する方法であって、脊椎動物の細胞に請求項５に記載の製剤を有効量投与するステップと、細胞中でＧＨＲＨを発現させるステップとを含む方法。
【請求項１４】
脊椎動物において貧血、骨折治癒、悪液質、肥満、骨粗鬆症又は創傷治癒を治療する方法であって、脊椎動物の細胞に請求項６に記載の製剤を有効量投与するステップと、細胞中でＧＨＲＨを発現させるステップとを含む方法。
【請求項１５】
脊椎動物がイヌである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
脊椎動物がイヌである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
脊椎動物において免疫応答を刺激する方法であって、脊椎動物の細胞に請求項５に記載の製剤を有効量投与するステップと、細胞中でＧＨＲＨを発現させるステップとを含む方法。
【請求項１８】
脊椎動物において免疫応答を刺激する方法であって、脊椎動物の細胞に請求項６に記載の製剤を有効量投与するステップと、細胞中でＧＨＲＨを発現させるステップとを含む方法。
【請求項１９】
脊椎動物がイヌである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
脊椎動物がイヌである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
プロペプチドＮ末端を欠失させたプロＧＨＲＨをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、ポリヌクレオチドが、エンハンサー及び／又はプロモーターと作動的に連結したウマＩＧＦ−１シグナルペプチドを含む発現ベクター。
【請求項２２】
成熟ＧＨＲＨをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、ポリヌクレオチドが、エンハンサー及び／又はプロモーターと作動的に連結したウマＩＧＦ−１シグナルペプチドを含む発現ベクター。
【請求項２３】
プロＧＨＲＨがＣ末端にグリシンを付加した、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
ＧＨＲＨが、連結した血清アルブミンを含み、或いはＧＨＲＨが、リンカーテトラペプチドを介して連結した血清アルブミンを含む、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
プロペプチドＮ末端を欠失させたイヌプロＧＨＲＨの細胞中への送達及び細胞中での発現のための製剤であって、請求項２１に記載のベクター、及び薬学上又は獣医学上許容される担体、媒体又は賦形剤を含む製剤。
【請求項２６】
イヌ成熟ＧＨＲＨの細胞中への送達及び細胞中での発現のための製剤であって、請求項２２に記載のベクター、及び薬学上又は獣医学上許容される担体、媒体又は賦形剤を含む製剤。
【請求項２７】
担体、媒体又は賦形剤がトランスフェクションを促進し、且つ／或いはベクター又はタンパク質の保存性を高める、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２８】
担体、媒体又は賦形剤がトランスフェクションを促進し、且つ／或いはベクター又はタンパク質の保存性を高める、請求項２６に記載の製剤。
【請求項２９】
ＧＨＲＨを脊椎動物へと送達する方法であって、請求項２５に記載の製剤を脊椎動物に注射するステップを含む方法。
【請求項３０】
ＧＨＲＨを脊椎動物へと送達する方法であって、請求項２６に記載の製剤を脊椎動物に注射するステップを含む方法。
【請求項３１】
脊椎動物がウシ、イヌ又はブタである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
脊椎動物がウシ、イヌ又はブタである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
脊椎動物において貧血、骨折治癒、悪液質、肥満、骨粗鬆症又は創傷治癒を治療する方法であって、脊椎動物の細胞に請求項２５に記載の製剤を有効量投与するステップと、細胞中でＧＨＲＨを発現させるステップとを含む方法。
【請求項３４】
脊椎動物において貧血、骨折治癒、悪液質、肥満、骨粗鬆症又は創傷治癒を治療する方法であって、脊椎動物の細胞に請求項２６に記載の製剤を有効量投与するステップと、細胞中でＧＨＲＨを発現させるステップとを含む方法。
【請求項３５】
脊椎動物がウシ、イヌ又はブタである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
脊椎動物がウシ、イヌ又はブタである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
脊椎動物において免疫応答を刺激する方法であって、脊椎動物の細胞に請求項２５に記載の製剤を有効量投与するステップと、細胞中でＧＨＲＨを発現させるステップとを含む方法。
【請求項３８】
脊椎動物において免疫応答を刺激する方法であって、脊椎動物の細胞に請求項２６に記載の製剤を有効量投与するステップと、細胞中でＧＨＲＨを発現させるステップとを含む方法。
【請求項３９】
脊椎動物がウシ、イヌ又はブタである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
脊椎動物がウシ、イヌ又はブタである、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年５月１日に出願した米国仮出願第６０／４６７，４０５号の優先権を主張する、２００４年５月３日に出願した米国出願第１０／８３８，１２２号の優先権を主張する、２００４年１２月１７日に出願した米国出願第１１／０１５，４６１号の優先権を主張するものである。上記の出願、及びその中で又はその実行の間に引用されたすべての文献（「出願引用文献」）、及び出願引用文献で引用又は参照されたすべての文献、及び本明細書で引用又は参照されたすべての文献（「本明細書引用文献」）、及び本明細書引用文献で引用又は参照されたすべての文献は、本明細書で又は参照により本明細書に組み込まれている任意の文献で言及された任意の製品用の、任意の製造業者の取扱説明書、説明書、製品仕様書、及び製品シートとともに、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において使用することができる。
【０００２】
本発明は、イヌプレプロＧＨＲＨポリペプチド、イヌ成熟ＧＨＲＨペプチド、イヌプレプロＧＨＲＨ又はイヌ成熟ＧＨＲＨをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
【０００３】
一実施形態では、本発明は、プレプロＧＨＲＨ又はＧＨＲＨをコードし発現するベクターに関する。そのようなベクターを使用して、脊椎動物において、具体的にはイヌにおいて遺伝子治療により疾患及び成長ホルモン欠乏を治療することができる。
【０００４】
他の実施形態では、本発明は、インビボでイヌプレプロＧＨＲＨ又はイヌＧＨＲＨを発現するベクターを動物宿主に注射するステップを含む、ペプチドＧＨＲＨを脊椎動物へと、具体的にはイヌへと送達する方法に関する。
【０００５】
本発明はまた、脊椎動物において、具体的にはイヌにおいて、貧血、悪液質、創傷治癒、骨折治癒、骨粗鬆症、肥満を治療する方法にも関する。
【背景技術】
【０００６】
成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）は、下垂体前葉による成長ホルモン（ＧＨ）の合成及び分泌の調節に重要な役割を果たす視床下部のペプチドである。ヒトＧＨＲＨは、４４アミノ酸からなるＣ末端アミド化ペプチドである。その一方で、ラットＧＨＲＨは、長さが４３アミノ酸である非アミド化ペプチドであり、ヒトＧＨＲＨとの相同性が６７％しかない。ＧＨＲＨが前駆体（プレプロＧＨＲＨ）に由来し、それがシグナルペプチドの除去及びＣ末端領域でのタンパク質分解性切断により成熟ＧＨＲＨにプロセシングされることが明らかとなっている。前駆体のアミノ酸配列は、２つの考えられるスプライス受容部位の使用の違いに応じて、１０７残基又は１０８残基を含む。
【０００７】
ヒト及びラットのＧＨＲＨ遺伝子は、イントロン４個によって分離された小さなエキソン５個を含み、ゲノムＤＮＡ上に１０キロ塩基にまたがっているが、イントロンの位置及びサイズに違いがある。
【０００８】
特許出願ＥＰ１０５２２８６は、ゲノムライブラリーからイヌＧＨＲＨ遺伝子をクローン化する非特異的な方法を例示するが、その記載からは、遺伝子のヌクレオチド配列が開示されず、又はイントロンを除去しエキソン配列を集合させて完全なコード配列を得る方法の指針が得られない。
【０００９】
家畜では、ＧＨＲＨは、乳汁の組成を変化させずに乳汁産生を促進し、飼料から乳汁への転換を増大させ、主として除脂肪体重の増大により成長を維持する。ＧＨ分泌の刺激によって、ＧＨＲＨは、動物の免疫機能を亢進させる。ＧＨＲＨは、成長ホルモン産生異常に起因する、ガンなどの慢性疾患での悪液質の治療（Bartlett et al Cancer 1994, 73, 1499-1504及びSurgery 1995, 117, 260-267）、創傷治癒、骨折治癒、加齢過程の遅延、骨粗鬆症、及び貧血（Sohmiya et al J. Endocrinol. Invest. 2000, 23, 31-36及びClin. Endocrinl. 2001, 55, 749-754）に大きな治療有用性がある。
【００１０】
比較的少量のＧＨＲＨが、ＧＨの産生及び分泌の刺激に必要であることが研究から示されている。しかし、異なる動物種に由来する異種ＧＨＲＨを使用すると、ＧＨ放出の強力な刺激が生じない可能性がある。異種ＧＨＲＨペプチドを治療として投与すると、宿主中の抗体反応が誘導される可能性もある。イヌＧＨＲＨをコードするＤＮＡは、本発明まで不明であり、イヌ又は他の動物種の治療に十分な量のイヌＧＨＲＨを入手可能にする必要があった。
【００１１】
本出願における任意の文献の引用又は特定は、そのような文献が本発明に対する従来技術として利用可能であることを認めるものではない。
【特許文献１】米国仮出願第６０／４６７，４０５号
【特許文献２】米国出願第１０／８３８，１２２号
【特許文献３】米国出願第１１／０１５，４６１号
【特許文献４】特許出願ＥＰ１０５２２８６
【非特許文献１】Bartlett et al Cancer 1994, 73, 1499-1504
【非特許文献２】Bartlett et al Surgery 1995, 117, 260-267
【非特許文献３】Sohmiya et al J. Endocrinol. Invest. 2000, 23, 31-36
【非特許文献４】Sohmiya et al Clin. Endocrinl. 2001, 55, 749-754
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、一部には、出願人による新規なイヌプレプロＧＨＲＨ及びイヌ成熟ＧＨＲＨのポリヌクレオチド及びポリペプチドの配列の同定に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、イヌプレプロＧＨＲＨポリペプチド、イヌ成熟ＧＨＲＨペプチド、及びイヌプレプロＧＨＲＨ又はイヌ成熟ＧＨＲＨをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。有利な実施形態では、イヌプレプロＧＨＲＨポリペプチドは、本質的に配列番号１のアミノ酸残基からなる。他の有利な実施形態では、イヌ成熟ＧＨＲＨペプチドは、本質的に配列番号２のアミノ酸残基からなる。
【００１４】
本発明はまた、本質的に配列番号３の配列を有するイヌプレプロＧＨＲＨからなる単離ポリヌクレオチド、又はそれと完全に相補的であるアンチセンス鎖、及び本質的に配列番号４の配列を有するイヌ成熟ＧＨＲＨからなる単離ポリヌクレオチド、又はそれと完全に相補的であるアンチセンス鎖をも包含する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子でもよく、或いはＲＮＡ分子でもよい。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、イヌプレプロＧＨＲＨ又はイヌＧＨＲＨをコードし発現するベクターに関する。そのようなベクターを使用して、脊椎動物において、遺伝子治療により疾患及び成長ホルモン欠乏を治療することができる。有利な実施形態では、発現ベクターは、イヌプレプロＧＨＲＨをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド塩基配列を含む。他の有利な実施形態では、発現ベクターは、イヌ成熟ＧＨＲＨをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、配列番号４のヌクレオチド塩基配列を含む。有利な実施形態では、ヌクレオチド塩基配列は、プロモーター、及び場合によってはエンハンサーと作動的に連結している。
【００１６】
特に有利な実施形態では、本発明は、イヌプロＧＨＲＨ、プロペプチドＮ末端（３１〜１０６ＡＡに対応）を欠失させたイヌプロＧＨＲＨ、又はイヌＧＨＲＨをコードし発現するベクターに関し、ペプチドシグナル配列が、イヌプロＧＨＲＨ、プロペプチドＮ末端（３１〜１０６ＡＡに対応）を欠失させたイヌプロＧＨＲＨ、又はイヌＧＨＲＨと融合している。有利には、ペプチドシグナル配列はインスリン様成長因子（ＩＧＦ）ペプチドシグナル配列である。特に有利な実施形態では、ペプチドシグナル配列はＩＧＦ−１ペプチドシグナル配列であり、より有利には、ウマＩＧＦ−１ペプチドシグナル配列である。
【００１７】
他の有利な実施形態では、本発明は、ペプチドシグナル配列、有利にはＩＧＦ−１ペプチドシグナル配列、及びプロペプチドＮ末端を欠失させたプロＧＨＲＨを含み、場合によってはＣ末端にグリシンの付加を含むＧＨＲＨをコードし発現するベクターを包含する。さらに他の有利な実施形態では、本発明は、ペプチドシグナル配列、有利には、場合によってはリンカーテトラペプチドを介して連結した成熟ＧＨＲＨ及び血清アルブミンと融合したＩＧＦ−１シグナル配列を含むベクター骨格を提供する。ＧＨＲＨは、ブタ又はウシ並びにイヌに由来するものでもよい。
【００１８】
上記のベクターのいずれかを使用して、脊椎動物において、遺伝子治療により疾患及び成長ホルモン欠乏を治療することができる。有利な実施形態では、発現ベクターは、イヌプレプロＧＨＲＨをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド塩基配列を含む。他の有利な実施形態では、発現ベクターは、イヌ成熟ＧＨＲＨをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、配列番号４のヌクレオチド塩基配列を含む。有利な実施形態では、ヌクレオチド塩基配列は、プロモーター、及び場合によってはエンハンサーと作動的に連結している。
【００１９】
他の実施形態では、本発明は、インビボでイヌプレプロＧＨＲＨ又はイヌＧＨＲＨを発現するベクターを動物宿主に注射するステップを含む、ペプチドＧＨＲＨを脊椎動物へと、具体的にはイヌへと送達する方法に関する。有利な実施形態では、動物宿主はイヌである。有利な実施形態では、製剤は、イヌＧＨＲＨ又はイヌプレプロＧＨＲＨを発現するベクター、並びにイヌＧＨＲＨ又はイヌプレプロＧＨＲＨの細胞中への送達及び細胞中での発現を促進し、又はベクターの安定性を向上させる薬学上又は獣医学上許容される担体又は媒体又は賦形剤を含む。有利には、送達はインビボで動物に対して、有利には脊椎動物に対して、より有利にはイヌに対して行う。より有利な実施形態では、製剤中のベクターは、本質的に配列番号３からなるイヌプレプロＧＨＲＨ配列、又は本質的に配列番号４からなるイヌ成熟ＧＨＲＨ配列を含む。
【００２０】
本発明はまた、ＧＨＲＨ製剤を動物に注射するステップを含む、動物、有利には脊椎動物、より有利にはイヌにＧＨＲＨを送達する方法をも提供する。有利な実施形態では、製剤は、イヌＧＨＲＨを発現するベクター、及び薬学上又は獣医学上許容される担体又は媒体又は賦形剤を含む。
【００２１】
本発明はまた、脊椎動物において、貧血、悪液質、創傷治癒、骨折治癒、骨粗鬆症及び肥満を治療する方法にも関する。本発明はまた、脊椎動物の免疫応答を刺激する方法にも関する。
【００２２】
本開示において、特に請求項及び／又は段落において、「含む（comprises）」、「含まれる（comprised）」、「含んでいる（comprising）」などの用語は、米国特許法においてそれぞれに付与されている意味を有し得る；例えば、それらは「含む（includes）」、「含まれる（included）」、「含んでいる（including）」などを意味し得、「本質的に〜からなっている（consisting essentially of）」や「本質的に〜からなる（consists essentially of）」などの用語は、米国特許法においてそれぞれに付与されている意味を有し、例えば、それらでははっきりと列挙されていない要素を考慮するが、従来技術中で認められ、或いは本発明の基本的な又は新規な特徴に影響を及ぼす要素を除外することに留意されたい。本明細書において、「一貫して本質的に〜からなる（consistently essentially of）」とは、非イヌＧＨＲＨ配列をはっきりと除外する意味を有する。
【００２３】
これら及び他の実施形態は、下記の詳細な説明から開示され又は明らかとなり、それによって包含される。
【００２４】
例として示すが、記載した特定の実施形態に本発明を単に限定するものではない下記の詳細な説明は、添付した図面と併せると最もよく理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、一部には、出願人による新規なイヌプレプロＧＨＲＨ及びイヌ成熟ＧＨＲＨのポリヌクレオチド及びポリペプチドの配列の同定に基づいている。本発明の前は、マウス、ラット、ブタやウシなど、様々な動物種由来のＧＨＲＨペプチド及びコード配列が入手可能であった。イヌにおいて異種ＧＨＲＨを使用すると、ＧＨ放出の強力な刺激が生じない可能性があり、反復投与後に宿主中の抗体反応が誘導される可能性がある。イヌＧＨＲＨをコードするＤＮＡは、本発明まで不明であり、イヌの治療に十分な量のイヌＧＨＲＨを入手可能にする必要があった。
【００２６】
本発明は、下記のアミノ酸配列：H-MPLWVFFLVILTLSSGSHSSPPSLPIRIPRYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNREQGAKVRLGRQVDSLWASQKQMALENILASLLQKRRNSQG-OH（配列番号１）を有するイヌプレプロＧＨＲＨポリペプチドに関する。ペプチドシグナル（プレペプチド）配列は、Ｍｅｔ（１）からＳｅｒ（２０）にまたがっている。シグナルペプチドの切断は、Ｓｅｒ（１９）の後で起こる可能性もある。括弧の間の数は、プレプロＧＨＲＨ配列中でのアミノ酸の位置を意味する。Ｈ−Ｍ及びＧ−ＯＨは、プレプロペプチドのＮ末端のＭｅｔアミノ酸及びカルボキシ末端のＧｌｙアミノ酸が修飾されていないことを意味する。プレＧＨＲＨペプチドの切断後、プロＧＨＲＨペプチドがＡｒｇ（３０）の後及びＬｅｕ（７４）の後で切断されて、成熟ＧＨＲＨペプチドが生じる。
【００２７】
イヌプレプロＧＨＲＨポリペプチドの変異体は、アミノ酸Ｌｅｕによる２位のアミノ酸Ｐｒｏの置換を有する。
【００２８】
本発明はまた、下記のアミノ酸配列：R1-YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNREQGAKVRL-R2（配列番号２）を有するイヌ成熟ＧＨＲＨペプチドにも関し、式中、Ｒ１は水素又はＨ−Ｍｅｔであり、Ｒ２はＯＨ又はＮＨ２である。Ｎ末端のＨ−Ｍｅｔ又はＨ−Ｙは、メチオニン又はチロシンが修飾されていないことを意味する。成熟ペプチドのカルボキシ末端のＬ−ＯＨ又はＬ−ＮＨ２は、ロイシンアミノ酸が修飾されていない、又はアミド化されていることを意味する。
【００２９】
他の実施形態では、本発明は、安定性が向上したイヌ成熟ＧＨＲＨ類似体を含む。この類似体は、Ｔｙｒ（１）からＨｉｓ（１）、Ａｌａ（２）からＶａｌ（２）、Ｇｌｙ（１５）からＡｌａ（１５）、Ｍｅｔ（２７）からＬｅｕ（２７）又はＳｅｒ（２８）からＡｓｎ（２８）からなる群間で選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。括弧の間の数は、成熟ＧＨＲＨ配列中でのアミノ酸の位置を意味する。これらのアミノ酸置換をイヌプレプロＧＨＲＨポリペプチド中で導入することができる。そのような特異的アミノ酸置換を行うことは、当業者にとって日常的な実験である。例えば、限定されるものではないが、イヌ成熟ＧＨＲＨポリヌクレオチドの部位特異的突然変異生成を行って、上記に列挙した１つ又は複数のアミノ酸置換を有する突然変異イヌ成熟ＧＨＲＨペプチドを得ることができる。当技術分野で知られている方法を使用して、遺伝子を化学的に合成することもできる。
【００３０】
「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「ポリペプチド断片」という用語は、任意の長さのアミノ酸残基からなるポリマーを指すのに本明細書において相互に使用される。ポリマーは、直鎖又は分枝状でもよく、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を含んでもよく、アミノ酸以外の化学的部分によって中断されていてもよい。その用語はまた、天然に、或いは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、糖鎖付加、脂質付加、アセチル化、リン酸化、又は標識や生物活性構成成分との結合など他の任意の操作若しくは改変によって修飾されているアミノ酸ポリマーをも包含する。
【００３１】
本発明は、配列及び断片：5'-ATGCCACTCTGGGTGTTCTTCCTGGTGATCCTCACCCTCAGCAGTGGCTCCCACTCTTCCCCGCCATCCCTGCCCATCAGAATCCCTCGGTATGCAGACGCCATCTTCACCAACAGCTACCGGAAGGTGCTGGGCCAGCTGTCCGCCCGCAAGCTCCTGCAGGACATCATGAGCCGGCAGCAGGGAGAGAGAAACCGGGAGCAAGGAGCAAAGGTACGACTCGGCCGTCAGGTGGACAGTCTGTGGGCAAGCCAAAAGCAGATGGCATTGGAGAACATCCTGGCATCCCTGTTACAGAAACGCAGGAACTCCCAAGGATGA-3'（配列番号３）を有するイヌプレプロＧＨＲＨをコードする単離ポリヌクレオチドを包含する。
【００３２】
本発明はまた、それぞれヌクレオチドＴ及びＧによる５位及び６位のＣ及びＡの置換を有するイヌプレプロＧＨＲＨをコードするポリヌクレオチドの変異体をも提供する。
【００３３】
本発明はまた、配列：5'-TATGCAGACGCCATCTTCACCAACAGCTACCGGAAGGTGCTGGGCCAGCTGTCCGCCCGCAAGCTCCTGCAGGACATCATGAGCCGGCAGCAGGGAGAGAGAAACCGGGAGCAAGGAGCAAAGGTACGACTC-3'（配列番号４）を有するイヌ成熟ＧＨＲＨをコードする単離ポリヌクレオチドをも含む。
【００３４】
「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さのポリマー型ヌクレオチドであり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び類似体を任意の組合せで含む。ポリヌクレオチドは、三次元構造を有することができ、既知又は未知の任意の機能を果たすことができる。「ポリヌクレオチド」という用語には、二本鎖、一本鎖、及び三重らせんの分子が含まれる。別段に指定又は要求しない限り、本明細書に記載する、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖の形態と、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はハイブリッド分子の二本鎖形態を形成することが知られ又は予測される２つの相補的な形態それぞれをどちらも包含する。
【００３５】
以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体、ウラシル、フルオロリボースやチオレートなどの他の糖及び結合基や、ヌクレオチド分枝など、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドの配列は、重合後に、結合などによって、標識構成成分でさらに修飾することができる。この定義において、他の型の修飾には、キャップ、１個又は複数個の天然に存在するヌクレオチドの類似体との置換、ポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識構成成分、他のポリヌクレオチド又は固体支持体と結合させる手段の導入がある。
【００３６】
「単離」ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは、その生来の環境で付随する物質を実質的に含まないものである。実質的に含まないとは、これらの物質を少なくとも５０％、有利には少なくとも７０％、より有利には少なくとも８０％、さらに有利には少なくとも９０％含まないことを意味する。
【００３７】
本発明は、ＧＨＲＨポリヌクレオチドに相補的な鎖をさらに含む。
【００３８】
相補的な鎖は、任意の長さのポリマーでもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び類似体を任意の組合せで含むことができる。
【００３９】
ハイブリダイゼーション反応は、様々な「厳密性」の条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応の厳密性を増大させる条件は周知である。例えば、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition （Sambrook et al. 1989)を参照されたい。適切な条件の例には、（厳密性が高くなる順に）以下のものがある：インキュベーション温度２５℃、３７℃、５０℃、及び６８℃；緩衝液濃度１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ（ＳＳＣとは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び１５ｍＭクエン酸の緩衝液である）、及び他の緩衝液系を使用するその同等物；ホルムアミド濃度０％、２５％、５０％、及び７５％；インキュベーション時間５分〜２４時間；洗浄ステップ１回、２回又はそれ以上；洗浄インキュベーション時間１、２、又は１５分；並びに洗浄溶液６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、又は脱イオン水。
【００４０】
本発明はさらに、それによってコードされるポリペプチドの特性を亢進し、低下させ又はそれに有意な影響を及ぼさない可能性がある、イヌＧＨＲＨポリペプチドの機能的に同等な変異体及び誘導体並びに機能的に同等なその断片をコードするポリヌクレオチドを包含する。これらの機能的に同等な変異体、誘導体、及び断片は、イヌＧＨＲＨ活性を保持する能力を示す。例えば、コードされたアミノ酸配列を変化させないＤＮＡ配列の変化、並びにアミノ酸残基の保存的置換が生じる変化、１つ又は少数のアミノ酸の欠失又は付加、及びアミノ酸類似体によるアミノ酸残基の置換は、コードされたポリペプチドの特性に有意な影響を及ぼさないものである。保存的アミノ酸置換は、グリシン／アラニン、バリン／イソロイシン／ロイシン、アスパラギン／グルタミン、アスパラギン酸／グルタミン酸、セリン／スレオニン／メチオニン、リシン／アルギニン、及びフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。
【００４１】
他の実施形態では、本発明は、配列番号１と少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性又は同一性を有するイヌプレプロＧＨＲＨポリペプチド変異体を含む。
【００４２】
他の実施形態では、本発明は、配列番号２と少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％又は少なくとも９９％の相同性又は同一性を有するイヌ成熟ＧＨＲＨポリペプチド変異体を含む。
【００４３】
他の実施形態では、本発明は、配列番号３と少なくとも８６．５％、少なくとも８７％、少なくとも８７．５％、少なくとも８８％、少なくとも８８．５％、少なくとも８９％、少なくとも８９．５％、少なくとも９０％、少なくとも９０．５％、少なくとも９１％、少なくとも９１．５％、少なくとも９２％、少なくとも９２．５％、少なくとも９３％、少なくとも９３．５％、少なくとも９４％、少なくとも９４．５％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の相同性又は同一性を有するイヌプレプロＧＨＲＨをコードするポリヌクレオチドの変異体を含む。本発明は、イヌプレプロＧＨＲＨ類似体をコードするポリヌクレオチドをも包含する。有利な実施形態では、イヌプレプロＧＨＲＨ類似体は、配列番号１と少なくとも８６．５％、少なくとも８７％、少なくとも８７．５％、少なくとも８８％、少なくとも８８．５％、少なくとも８９％、少なくとも８９．５％、少なくとも９０％、少なくとも９０．５％、少なくとも９１％、少なくとも９１．５％、少なくとも９２％、少なくとも９２．５％、少なくとも９３％、少なくとも９３．５％、少なくとも９４％、少なくとも９４．５％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の相同性又は同一性を有する。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、配列番号４と９０．５％、少なくとも９１％、少なくとも９１．５％、少なくとも９２％、少なくとも９２．５％、少なくとも９３％、少なくとも９３．５％、少なくとも９４％、少なくとも９４．５％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の相同性又は同一性を有するイヌ成熟ＧＨＲＨをコードするポリヌクレオチドの変異体を含む。本発明は、イヌ成熟ＧＨＲＨ類似体をコードするポリヌクレオチドをも包含する。有利な実施形態では、イヌ成熟ＧＨＲＨ類似体は、配列番号２と９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の相同性又は同一性を有する。
【００４５】
本発明の目的で、重複及び同一性が最大となるが配列ギャップが最小となるように整列したときに配列を比較することによって配列の同一性又は相同性を決定することができる。具体的には、配列同一性は、いくつかの数学的アルゴリズムのいずれかを使用して決定することができる。２つの配列の比較に使用する数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: 5873-5877などで改変された、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 2264-2268のアルゴリズムである。
【００４６】
配列の比較に使用する数学的アルゴリズムの他の例は、Myers & Miller, CABIOS 1988; 4: 11-17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（第２．０版）中に組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを利用するとき、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティー、及び４のギャップペナルティーを使用することができる。局所的な配列の類似性及びアラインメントの領域を同定するさらに他の有用なアルゴリズムは、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 2444-2448に記載のＦＡＳＴＡアルゴリズムである。
【００４７】
ＷＵ−ＢＬＡＳＴ（Washington University BLAST）第２．０版ソフトウェアが本発明に従った使用に有利である。複数のＵＮＩＸプラットフォーム用のＷＵ−ＢＬＡＳＴ第２．０版実行可能プログラムをftp://blast.wustl.edu/blast/executablesからダウンロードすることができる。このプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ第１．４版を基礎とし、そのプログラムは、パブリックドメインのＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ第１．４版を基礎とする（Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480；Altschul et al., Journal of Molecular Biology 1990; 215: 403-410；Gish & States, 1993；Nature Genetics 3: 266-272；Karlin & Altschul, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877；これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれている）。
【００４８】
一般に、アミノ酸配列の比較は、既知の構造を有するポリペプチドのアミノ酸配列を、未知の構造を有するポリペプチドのアミノ酸配列と整列することによって行う。次いで、配列中のアミノ酸を比較し、相同性があるアミノ酸の集団を一群にする。この方法によって、ポリペプチドの保存された領域が検出され、アミノ酸の挿入及び欠失が明らかとなる。アミノ酸配列間の相同性は、市販のアルゴリズムを使用することによって決定することができる（上記の相同性の記載も参照されたい）。本明細書においてその他の形で言及したものに加えて、米国バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）によって提供されるプログラムＢＬＡＳＴ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴにも言及する。これらのプログラムは、この目的で当技術分野において広く使用され、２つのアミノ酸配列の相同性がある領域を整列することができる。
【００４９】
そのセット中のすべての検索プログラムにおいて、ギャップアラインメントルーチンは、データベース検索自体に不可欠である。ギャップ形成は、望ましい場合には停止することができる。長さのギャップ１つについての初期設定のペナルティー（Ｑ）は、タンパク質及びＢＬＡＳＴＰではＱ＝９であり、ＢＬＡＳＴＮではＱ＝１０であるが、任意の整数に変更してもよい。ギャップを伸長する、初期設定の残基当たりのペナルティー（Ｒ）は、タンパク質及びＢＬＡＳＴＰではＲ＝２であり、ＢＬＡＳＴＮではＲ＝１０であるが、任意の整数に変更してもよい。重複及び同一性が最大となるが配列ギャップが最小となるように配列を整列するために、Ｑ値及びＲ値の任意の組合せを使用することができる。初期設定のアミノ酸比較行列はＢＬＯＳＵＭ６２であるが、ＰＡＭなどの他のアミノ酸比較行列を利用することができる。
【００５０】
或いは又はさらには、「相同性」又は「同一性」という用語は、例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸の配列に関して、２つの配列間にある類似性の定量的尺度を示すことができる。％配列類似性は、（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）＊１００／Ｎｒｅｆとして算出することができ、式中、Ｎｄｉｆは、整列したときに２つの配列で同一でない残基の合計数であり、Ｎｒｅｆは、配列の１つの残基数である。したがって、ＤＮＡ配列AGTCAGTCは、配列AATCAATCとの配列同一性が７５％である（Ｎｒｅｆ＝８；Ｎｄｉｆ＝２）。
【００５１】
或いは又はさらには、配列に関して「相同性」又は「同一性」という用語は、２つの配列の短い方でのヌクレオチド又はアミノ酸の数で割った、同一のヌクレオチド又はアミノ酸の位置の数を指すこともでき、２つの配列のアラインメントは、例えば、２０ヌクレオチドのウィンドウサイズ、４ヌクレオチドの語長、及び４のギャップペナルティーを使用して、Wilbur及びLipmanのアルゴリズムに従って決定することができ（参照により本明細書に組み込まれているWilbur & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80: 726）、アラインメントを含めた配列データのコンピュータ支援型の分析及び解釈は、好都合なことに、市販されているプログラム（例えば、Intelligenetics（商標）Suite、Intelligenetics社製、カリフォルニア州）を使用して行うことができる。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と類似する、又はある程度の配列の同一性又は相同性を有するというとき、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）は、ＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と同じであるとみなす。したがって、ＲＮＡ配列は、本発明の範囲内にあり、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）をＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と同じであるとみなすことにより、ＤＮＡ配列に由来し得る。
【００５２】
また、過度の実験を行わずに、当業者は、％相同性を決定するための他の多数のプログラム又は参照文献を参考にすることができる。
【００５３】
本発明はさらに、ベクター分子又は発現ベクター中に含まれ、プロモーターエレメント、及び場合によってはエンハンサーと作動的に連結しているイヌＧＨＲＨポリヌクレオチドを包含する。
【００５４】
本発明はさらに、ベクター分子又は発現ベクター中に含まれるイヌＧＨＲＨポリヌクレオチドを包含し、ペプチドシグナル配列が、イヌプロＧＨＲＨ、プロペプチドＮ末端（３１〜１０６ＡＡに対応）を欠失させたイヌプロＧＨＲＨ、又はイヌＧＨＲＨと融合している。有利には、ペプチドシグナル配列はインスリン様成長因子（ＩＧＦ）ペプチドシグナル配列である。特に有利な実施形態では、ペプチドシグナル配列はＩＧＦ−１ペプチドシグナル配列であり、より有利には、ウマＩＧＦ−１ペプチドシグナル配列である。当業者なら、潜在性のスプライス部位を除去することによって、例えば、開始コドンの前にKozak共通配列を導入して発現を高めることによりコドンの使用を適合させることによって、ペプチドシグナル配列と融合したイヌプロＧＨＲＨ、プロペプチドＮ末端（３１〜１０６ＡＡに対応）を欠失させたイヌプロＧＨＲＨ、又はイヌＧＨＲＨのヌクレオチド配列の発現を最適化することができる。
【００５５】
有利な実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前早期遺伝子のプロモーターである。他の有利な実施形態では、プロモーター及び／又はエンハンサーエレメントは酸素誘導性である。本発明の方法で使用することができる酸素誘導性のプロモーター及び／又はエンハンサーには、それだけに限らないが、早期増殖反応−１（early growth response-1）（Ｅｇｒ１）のプロモーター（例えば、Park et al., J Clin Invest. 2002 Aug; 110（3): 403-1を参照）、低酸素誘導性因子（hypoxia-inducible factor）（ＨＩＦ）の誘導性エンハンサー（例えば、Cuevas et al., Cancer Res. 2003 Oct 15; 63（20): 6877-84を参照）、及びＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（Ｍｎ−ＳＯＤ）のプロモーター（例えば、Gao et al., Gene. 1996 Oct 17; 176（1-2): 269-70を参照）がある。
【００５６】
他の実施形態では、エンハンサー及び／又はプロモーターには、様々な細胞又は組織に特異的なプロモーター（例えば、筋、内皮細胞、肝、体細胞又は幹細胞）、様々なウイルスのプロモーター及びエンハンサー並びに同質遺伝子として各動物種に特異的である様々なＧＨＲＨのＤＮＡ配列がある。例えば、イヌＧＨＲＨがイヌ筋細胞中で発現している場合、エンハンサー及び／又はプロモーターは、イヌＧＨＲＨの発現を最適化するために、イヌ筋細胞に特異的である可能性がある。筋特異的なプロモーター及びエンハンサーの例は記載されており、当業者に知られている（例えば、Li et al., Gene Ther. 1999 Dec; 6（12): 2005-11；Li et al., Nat Biotechnol. 1999 Mar; 17（3): 241-5及びLoirat et al., Virology. 1999 Jul 20; 260（1): 74-83を参照；これらの開示は、その全体が参照により組み込まれている）。
【００５７】
本発明で使用することができるプロモーター及びエンハンサーには、それだけに限らないが、Rous肉腫ウイルスのＬＴＲ、ＨＳＶ−１のＴＫ、ＳＶ４０の早期又は後期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ、メタロチオネイン、α−１アンチトリプシン、アルブミン、コラゲナーゼ、エラスターゼＩ、β−アクチン、β−グロビン、γ−グロビン、α−フェトプロテイン、筋クレアチンキナーゼがある。
【００５８】
「ベクター」とは、インビトロ又はインビボで標的細胞へと送達される異種ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ又はＲＮＡのプラスミド又はウイルスを指す。異種ポリヌクレオチドは、治療の目的で対象とする配列を含んでもよく、場合によっては、発現カセットの形態でもよい。本明細書においては、ベクターは、最終的な標的の細胞又は対象の中で複製可能である必要がない。その用語はクローン化用ベクターを含み、ウイルスベクターもそれに含まれる。
【００５９】
「組換えの」という用語は、ポリヌクレオチドの半合成的又は合成的な由来を意味し、それは天然には存在せず、又は天然には認められない配置で他のポリヌクレオチドと連結している。
【００６０】
「異種の」とは、比較する残りの存在物と遺伝的に異なる存在物に由来することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、遺伝子工学技術により、異なる供給源に由来するプラスミド又はベクター中に入れることができ、それは異種のポリヌクレオチドである。その生来のコード配列から除去し、生来の配列以外のコード配列と作動的に連結したプロモーターは、異種のプロモーターである。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドは、同じ転写単位内にあるさらなるコード配列、プロモーターなどの調節エレメント、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、同じ又は異なるプロモーターの調節下にあるさらなる転写単位、クローン化、発現、相同組換え、及び宿主細胞の形質転換を可能にする配列や、本発明の実施形態の提供に望ましい可能性がある任意の構築物などのさらなる配列を含んでもよい。
【００６２】
本発明は、プレプロＧＨＲＨ、成熟ＧＨＲＨ、プロＧＨＲＨ或いは変異体又は類似体又は断片を発現するベクターを包含する。成熟ＧＨＲＨ又はプロＧＨＲＨでは、ペプチドをコードするヌクレオチド配列の直前にインフレーム（in frame）でペプチドシグナルをコードするヌクレオチド配列を置いて、ＧＨＲＨを細胞外媒質中に分泌させることが好ましい。シグナル配列は、プレプロＧＨＲＨ由来の天然の配列でもよく、或いは分泌タンパク質のペプチドシグナル、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質（ｔＰＡ）、特にヒトｔＰＡ（S. Friezner Degen et al J. Biol. Chem. 1996, 261, 6972-6985；R. Rickles et al J. Biol. Chem. 1988, 263, 1563-1569；D. Berg. et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 179, 1289-1296）由来のシグナルペプチド、又はインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、特にウマＩＧＦ１（K. Otte et al. Gen. Comp. Endocrinol. 1996, 102（1), 11-15）、イヌＩＧＦ１（P. Delafontaine et al. Gene 1993, 130, 305-306）、ネコＩＧＦ１（ＷＯ−Ａ−０３／０２２８８６）、ウシＩＧＦ１（S. Lien et al. Mamm. Genome 2000, 11（10), 877-882）、ブタＩＧＦ１（M. Muller et al. Nucleic Acids Res. 1990, 18（2), 364）、ニワトリＩＧＦ１（Y. Kajimoto et al. Mol. Endocrinol. 1989, 3（12), 1907-1913）、シチメンチョウＩＧＦ１（GenBankアクセッション番号ＡＦ０７４９８０）由来のシグナルペプチドでもよい。ＩＧＦ１由来のシグナルペプチドは、天然のものでもよく、或いは最適化する、具体的には潜在性のスプライス部位を除去し且つ／又はコドンの使用を適合させることによって最適化することもできる。成熟ＧＨＲＨでは、コードポリヌクレオチド配列において、アミド化するためにＧｌｙ及びＡｒｇをペプチドのＣ末端に付加することができる。
【００６３】
イヌＧＨＲＨの発現用エレメントが本発明のベクター中に存在すると有利である。最小限の形では、これは、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン及びプロモーター、並びにまた場合によってはプラスミドなどの特定のベクター、及び特定のウイルスベクター、例えばポックスウイルス以外のウイルスベクター用のポリアデニル化配列を含み、本質的にそれらからなり、又はそれらからなる。ポリヌクレオチドがポリタンパク質断片、例えばイヌＧＨＲＨをコードするとき、ベクター中で、ＡＴＧを読み枠の５’に置き、終止コドンを３’に置くと有利である。エンハンサー配列、イントロンなどの安定化配列や、タンパク質の分泌を可能にするシグナル配列など、発現調節用の他のエレメントが存在してもよい。
【００６４】
インビボ又はインビトロで本発明の遺伝子の遺伝子産物を発現させるベクター又は組換え体又はプラスミドを作製し且つ／又は投与する方法は、任意の望ましい方法、例えば、米国特許第４，６０３，１１２号；第４，７６９，３３０号；第４，３９４，４４８号；第４，７２２，８４８号；第４，７４５，０５１号；第４，７６９，３３１号；第４，９４５，０５０号；第５，４９４，８０７号；第５，５１４，３７５号；第５，７４４，１４０号；第５，７４４，１４１号；第５，７５６，１０３号；第５，７６２，９３８号；第５，７６６，５９９号；第５，９９０，０９１号；第５，１７４，９９３号；第５，５０５，９４１号；第５，３３８，６８３号；第５，４９４，８０７号；第５，５９１，６３９号；第５，５８９，４６６号；第５，６７７，１７８号；第５，５９１，４３９号；第５，５５２，１４３号；第５，５８０，８５９号；第６，１３０，０６６号；第６，００４，７７７号；第６，１３０，０６６号；第６，４９７，８８３号；第６，４６４，９８４号；第６，４５１，７７０号；第６，３９１，３１４号；第６，３８７，３７６号；第６，３７６，４７３号；第６，３６８，６０３号；第６，３４８，１９６号；第６，３０６，４００号；第６，２２８，８４６号；第６，２２１，３６２号；第６，２１７，８８３号；第６，２０７，１６６号；第６，２０７，１６５号；第６，１５９，４７７号；第６，１５３，１９９号；第６，０９０，３９３号；第６，０７４，６４９号；第６，０４５，８０３号；第６，０３３，６７０号；第６，４８５，７２９号；第６，１０３，５２６号；第６，２２４，８８２号；第６，３１２，６８２号；第６，３４８，４５０号；及び第６，３１２，６８３号；１９８６年１０月１６日に出願された米国特許出願第９２０，１９７号；ＷＯ９０／０１５４３；ＷＯ９１／１１５２５；ＷＯ９４／１６７１６；ＷＯ９６／３９４９１；ＷＯ９８／３３５１０；ＥＰ２６５７８５；ＥＰ０  ３７０  ５７３；Andreansky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11313-11318；Ballay et al., EMBO J. 1993; 4: 3861-65；Felgner et al., J. Biol. Chem. 1994; 269: 2550-2561；Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11371-11377；Graham, Tibtech 1990; 8: 85-87；Grunhaus et al., Sem. Virol. 1992; 3: 237-52；Ju et al., Diabetologia 1998; 41: 736-739；Kitson et al., J. Virol. 1991; 65: 3068-3075；McClements et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11414-11420；Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11341-11348；Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11349-11353；Pennock et al., Mol. Cell. Biol. 1984; 4: 399-406；Richardson （Ed), Methods in Molecular Biology 1995; 39, "Baculovirus Expression Protocols," Humana Press Inc.；Smith et al. （1983) Mol. Cell. Biol. 1983; 3: 2156-2165；Robertson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11334-11340；Robinson et al., Sem. Immunol. 1997; 9: 271；並びにRoizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11307-11312による、又はそれらの中で開示されている方法に類似する、又はそれらの中で引用された文献中に開示されている方法でもよい。したがって、本発明のベクターは、（参照により本明細書に組み込まれている文献中にある）ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、アライグマポックス（raccoonpox）ウイルス、豚痘ウイルスなど）、アデノウイルス（例え��、ヒトアデノウイルス、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルス（例えば、イヌヘルペスウイルス）、バキュロウイルス、レトロウイルスなど、任意の適切な組換えウイルス又はウイルスベクターでもよく、或いは、ベクターはプラスミドでもよい。本明細書で引用され、参照により本明細書に組み込まれている文献は、本発明の実施に有用なベクターの例を提供するのに加えて、本発明の組成物中の１つ又は複数のベクターによって発現させ、或いはその組成物中に含まれる非イヌＧＨＲＨペプチド又はその断片、例えば、非イヌ成熟ＧＨＲＨペプチド、非イヌプレプロＧＨＲＨペプチド、非イヌプレＧＨＲＨペプチド、非イヌプロＧＨＲＨペプチド又はその断片、サイトカインなどの供給源を提供することもできる。
【００６５】
本発明はまた、発現ベクターなどのベクターを含む製剤、例えば治療用組成物にも関する。製剤は、１つ又は複数のＧＨＲＨポリヌクレオチドを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる（且つ有利にはそれを発現する）１つ又は複数のベクター、例えばインビボ発現ベクターなどの発現ベクターを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得る。有利には、ベクターは、薬学上又は獣医学上許容される担体、賦形剤又は媒体中で、イヌＧＨＲＨをコードするコード領域を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなるポリヌクレオチドを含み、発現する。したがって、本発明の実施形態によれば、製剤中の他の１つ又は複数のベクターは、イヌＧＨＲＨの１つ又は複数の他のタンパク質、或いはその断片をコードし、ポリヌクレオチドを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり、適当な状況下では、ベクターは、そのタンパク質又はその断片を発現する。
【００６６】
他の実施形態によれば、製剤中の１つ又は複数のベクターは、イヌＧＨＲＨの１つ又は複数のタンパク質或いは（複数の）その断片をコードする（複数の）ポリヌクレオチドを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり、１つ又は複数のベクターは、（複数の）ポリヌクレオチドの発現を有する。本発明の製剤は、有利には、同じタンパク質及び／又は異なるタンパク質をコードするが、有利には同じタンパク質をコードする異なるイヌＧＨＲＨ単離物由来のポリヌクレオチドを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり、また有利には適当な条件又は適切な条件の下で、或いは適切な宿主細胞中で、インビボで有利にはそれを発現する少なくとも２つのベクターを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。１つ又は複数のベクターを含む製剤は、イヌＧＨＲＨペプチド、融合タンパク質又はそのエピトープをコードし、有利にはインビボで有利には発現するポリヌクレオチドを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。本発明はまた、異なるＧＨＲＨ、例えば、それだけに限らないが、イヌに加えて、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラットやヒツジなどの異なる種由来のＧＨＲＨを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり、それをコードし発現するベクターの混合物をも対象とする。
【００６７】
本発明の一実施形態によれば、発現ベクターはウイルスベクターであり、具体的にはインビボ発現ベクターである。有利な実施形態では、発現ベクターはアデノウイルスベクターである。有利には、アデノウイルスはヒトＡｄ５ベクター、Ｅ１欠失及び／又はＥ３欠失アデノウイルスである。
【００６８】
特定の一実施形態では、ウイルスベクターは、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス又は弱毒化ワクシニアウイルス（例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞上でのアンカラワクチン株の５７０回を超える継代の後に得られたＭＶＡという改変型アンカラ株；Stickl & Hochstein-Mintzel, Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153；Sutter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 10847-10851を参照；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５０８として入手可能；又はＮＹＶＡＣ、ＮＹＶＡＣの構築、並びにコペンハーゲン株のワクシニアウイルスゲノムから欠失したさらなるＯＲＦも有し、異種コード核酸分子のこの組換え体の部位への挿入も有するＮＹＶＡＣの変異、また適合するプロモーターの使用について論じる米国特許第５，４９４，８０７号を参照、例えば米国特許第５，４９４，８０７号の実施例１〜６及び以下参照；ＷＯ９６／４０２４１も参照されたい）、アビポックスウイルス又は弱毒化アビポックスウイルス（例えば、カナリア痘、鶏痘、ハトポックス、鳩痘、ウズラポックス、ＡＬＶＡＣ又はＴＲＯＶＡＣ；例えば、米国特許第５，５０５，９４１号、第５，４９４，８０７号を参照）、豚痘、アライグマポックス、ラクダ痘、或いは粘液腫症ウイルスである。
【００６９】
本発明の他の実施形態によれば、ポックスウイルスベクターは、カナリア痘ウイルス又は鶏痘ウイルスベクターであり、有利には、弱毒化カナリア痘ウイルス又は鶏痘ウイルスである。これに関して、カナリア痘ウイルスは、アクセス番号ＶＲ−１１１でＡＴＣＣから入手可能である。弱毒化カナリア痘ウイルスは、米国特許第５，７５６，１０３号（ＡＬＶＡＣ）及びＷＯ０１／０５９３４中に記載されている。多数の鶏痘ウイルス予防接種株、例えばMERIAL社によって売り出されているＤＩＦＴＯＳＥＣ  ＣＴ株、及びINTERVET社によって売り出されているＮＯＢＩＬＩＳ  ＶＡＲＩＯＬＥワクチンも入手可能である；弱毒化鶏痘ウイルス株ＴＲＯＶＡＣに関する米国特許第５，７６６，５９９号も参照されたい。
【００７０】
その組換え体を生成する方法及びその組換え体をどのように投与するかに関する情報について、当業者は、本明細書で引用した文献及びＷＯ９０／１２８８２を参照することができ、例えば、ワクシニアウイルスに関しては、とりわけ米国特許第４，７６９，３３０号、第４，７２２，８４８号、第４，６０３，１１２号、第５，１１０，５８７号、第５，４９４，８０７号及び第５，７６２，９３８号に言及がなされ、鶏痘ウイルスに関しては、とりわけ米国特許第５，１７４，９９３号、第５，５０５，９４１号及び第５，７６６，５９９号に言及がなされ、カナリア痘ウイルスに関しては、とりわけ米国特許第５，７５６，１０３号に言及がなされ、豚痘ウイルスに関しては、とりわけ米国特許第５，３８２，４２５号に言及がなされ、アライグマポックスウイルスに関しては、とりわけＷＯ００／０３０３０に言及がなされている。
【００７１】
発現ベクターがワクシニアウイルスである場合、発現させる１つ又は複数のポリヌクレオチドの１つ又は複数の挿入部位は、有利には、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子又は挿入部位、血球凝集素（ＨＡ）遺伝子又は挿入部位、Ａ型封入体（ＡＴＩ）をコードする領域である；本明細書で引用した文献、特にワクシニアウイルスに関するものも参照されたい。カナリア痘ウイルスの場合では、有利には、１つ又は複数の挿入部位は、（複数の）ＯＲＦのＣ３、Ｃ５及び／又はＣ６である；本明細書で引用した文献、特にカナリア痘ウイルスに関するものも参照されたい。鶏痘ウイルスの場合では、有利には、１つ又は複数の挿入部位は、ＯＲＦのＦ７及び／又はＦ８である；本明細書で引用した文献、特に鶏痘ウイルスに関するものも参照されたい。ＭＶＡウイルスの１つ又は複数の挿入部位は、有利には、Carroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15 （4), 387-394；Stittelaar K. J. et al., J. Virol., 2000, 74 （9), 4236-4243；Sutter G. et al., 1994, Vaccine, 12 （11), 1032-1040を含めた様々な刊行物中にあるものと同様であり、これに関しては、完全なＭＶＡゲノムがAntoine G., Virology, 1998, 244, 365-396に記載されており、それから当業者は他の挿入部位又は他のプロモーターを使用することができることにも留意されたい。
【００７２】
有利には、発現させるポリヌクレオチドを、特定のポックスウイルスプロモーター、例えば、とりわけワクシニアプロモーター７．５ｋＤａ（Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35）、ワクシニアプロモーターＩ３Ｌ（Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434）、ワクシニアプロモーターＨＡ（Shida, Virology, 1986, 150, 451-457）、牛痘プロモーターＡＴＩ（Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47）、ワクシニアプロモーターＨ６（Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508；Guo P. et al. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198；Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836）の調節下に挿入する。
【００７３】
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス（ＨＡＶ）やイヌアデノウイルス（ＣＡＶ）などのアデノウイルスである。
【００７４】
一実施形態では、ウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス、具体的には、ウイルスゲノムのＥ１領域における欠失、具体的にはGenbankにおいてアクセッション番号Ｍ７３２６０で且つ参照刊行物J. Chroboczek et al Virol. 1992, 186, 280-285で開示されているｈＡｄ５の配列を基準として約４５９ヌクレオチド位〜約３５１０ヌクレオチド位の欠失により複製できなくした血清型５型のアデノウイルスである。欠失させたアデノウイルスは、Ｅ１を発現する２９３細胞（F. Graham et al J. Gen. Virol. 1977, 36, 59-72）又はＰＥＲ細胞、具体的にはＰＥＲ．Ｃ６（F. Falloux et al Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917）中で増殖する。Ｅ３領域において、具体的には約２８５９２ヌクレオチド位〜約３０４７０ヌクレオチド位でヒトアデノウイルスを欠失させることができる。Ｅ１領域における欠失は、Ｅ３領域における欠失と組み合わせて行うことができる（例えば、J. Shriver et al. Nature, 2002, 415, 331-335；F. Graham et al Methods in Molecular Biology Vol .7: Gene Transfer and Expression Protocols Edited by E. Murray, The Human Press Inc, 1991, p 109-128；Y. Ilan et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 2587-2592；米国特許第６，１３３，０２８号；米国特許第６，６９２，９５６号；S. Tripathy et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91, 11557-11561；B. Tapnell Adv. Drug Deliv. Rev.1993, 12, 185-199；X. Danthinne et al Gene Thrapy 2000, 7, 1707-1714；K. Berkner Bio Techniques 1988, 6, 616-629；K. Berkner et al Nucl. Acid Res. 1983, 11, 6003-6020；C. Chavier et al J. Virol. 1996, 70, 4805-4810を参照）。挿入部位は、事実上Ｅ１及び／又はＥ３領域の部分的な又は完全な欠失の後のＥ１及び／又はＥ３座位（領域）でもよい。有利には、発現ベクターがアデノウイルスであるとき、発現させるポリヌクレオチドは、強力なプロモーターなど真核細胞中で機能するプロモーター、好ましくはサイトメガロウイルス前早期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）、具体的にはM. Boshart et al Cell 1985, 41, 521-530における約−７３４ヌクレオチド位〜＋７ヌクレオチド位のエンハンサー／プロモーター領域、又はPromega社製のpCIベクターのエンハンサー／プロモーター領域の調節下に挿入する。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、有利にはネズミ又はヒト由来である。伸長因子１αのプロモーターを使用することもできる。特定の一実施形態では、低酸素状態によって制御されるプロモーター、例えば、K. Boast et al Human Gene Therapy 1999, 13, 2197-2208に記載されているプロモーターＨＲＥを使用することができる。筋特異的プロモーターを使用することもできる（X. Li et al Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245）。プラスミドベクターに関して、強力なプロモーターについても本明細書で論じる。一実施形態では、スプライシング配列をエンハンサー／プロモーター領域の下流に置くことができる。例えば、ＣＭＶ−ＩＥ遺伝子から単離されたイントロン１（R. Stenberg et al J. Virol. 1984, 49, 190）、ウサギ又はヒトのβ−グロビン遺伝子から単離されたイントロン、具体的にはｂ−グロビン遺伝子のイントロン２、イムノグロブリン遺伝子から単離されたイントロン、ＳＶ４０早期遺伝子由来のスプライシング配列、又はマウスイムノグロブリン受容配列と融合したヒトβ−グロビン供与配列を含むPromega社製のpCIベクターから単離されたキメライントロン配列（Genbankアクセッション番号ＣＶＵ４７１２０における約８９０ヌクレオチ��位〜約１０２２ヌクレオチド位）。発現させるポリヌクレオチド、例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子、具体的にはGenbankアクセッション番号ＢＯＶＧＨＲＨにおける約２３３９ヌクレオチド位〜約２５５０ヌクレオチド位、ウサギβ−グロビン遺伝子又はＳＶ４０後期遺伝子ポリアデニル化シグナルの下流にポリ（Ａ）配列及び終結配列を挿入することができる。
【００７５】
他の実施形態では、ウイルスベクターは、イヌアデノウイルス、具体的にはＣＡＶ−２である（例えば、L. Fischer et al. Vaccine, 2002, 20, 3485-3497；米国特許第５，５２９，７８０号；米国特許第５，６８８，９２０号；ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１４１０２を参照）。ＣＡＶでは、挿入部位は、Ｅ３領域中、且つ／又はＥ４領域と右ＩＴＲ領域の間に位置する領域中でもよい（米国特許第６，０９０，３９３号；米国特許第６，１５６，５６７号を参照）。一実施形態では、挿入物は、サイトメガロウイルス前早期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）や、ヒトアデノウイルスベクターについてすでに記載したプロモーターなどのプロモーターの調節下にある。発現させるポリヌクレオチド、例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子、又はウサギβ−グロビン遺伝子のポリアデニル化シグナルの下流にポリ（Ａ）配列及び終結配列を挿入することができる。
【００７６】
他の特定の実施形態では、ウイルスベクターは、イヌヘルペスウイルス（ＣＨＶ）やネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）などのヘルペスウイルスである。ＣＨＶでは、挿入部位は、具体的にはチミジンキナーゼ遺伝子中、ＯＲＦ３中、又はＵＬ４３ＯＲＦ中でもよい（米国特許第６，１５９，４７７号を参照）。一実施形態では、発現させるポリヌクレオチドを、真核細胞中で機能するプロモーター、有利にはＣＭＶ−ＩＥプロモーター（ネズミ又はヒト）の調節下に挿入する。特定の一実施形態では、低酸素状態によって制御されるプロモーター、例えば、K. Boast et al Human Gene Therapy 1999, 13, 2197-2208に記載されているプロモーターＨＲＥを使用することができる。発現させるポリヌクレオチド、例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子、又はウサギβ−グロビン遺伝子のポリアデニル化シグナルの下流にポリ（Ａ）配列及び終結配列を挿入することができる。
【００７７】
本発明のさらなる実施形態によれば、発現ベクターは、プラスミドベクター又はＤＮＡプラスミドベクター、具体的にはインビボ発現ベクターである。特定の非限定的な例では、pVR1020又は1012プラスミド（VICAL社製；Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97；Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217；例えば米国特許第５，８４６，９４６号及び第６，４５１，７６９号を参照）を、ポリヌクレオチド配列挿入用ベクターとして利用することができる。pVR1020プラスミドは、pVR1012に由来し、ヒトｔＰＡシグナル配列を含む。一実施形態では、ヒトｔＰＡシグナルは、Genbankアクセッション番号ＨＵＭＴＰＡ１４におけるアミノ酸Ｍ（１）〜アミノ酸Ｓ（２３）を含む。他の特定の非限定的な例では、ポリヌクレオチド配列挿入用ベクターとして利用されるプラスミドは、Genbankアクセッション番号Ｕ２８０７０におけるアミノ酸Ｍ（２４）〜アミノ酸Ａ（４８）のウマＩＧＦ１のシグナルペプチド配列を含むことができる。実施の際に参考にし又は使用することができるＤＮＡプラスミドに関するさらなる情報は、例えば、米国特許第６，８５２，７０５号；第６，８１８，６２８号；第６，５８６，４１２号；第６，５７６，２４３号；第６，５５８，６７４号；第６，４６４，９８４号；第６，４５１，７７０号；第６，３７６，４７３号及び第６，２２１，３６２号の中に認められる。
【００７８】
プラスミドという用語は、本発明に従ったポリヌクレオチド、及び望ましい宿主又は標的の１つ又は複数の細胞中でのそのインビボ発現に必要なエレメントを含む任意のＤＮＡ転写単位を包含する；また、これに関して、超らせん型又は非超らせん型の環状プラスミド、並びに直鎖の形態が本発明の範囲内にあるものとされることに留意されたい。
【００７９】
各プラスミドは、イヌ成熟ＧＨＲＨ、イヌプレプロＧＨＲＨ、異種ペプチド配列と融合したイヌプロＧＨＲＨ、プロペプチドＮ末端（３１〜１０６ＡＡに対応）を欠失させたプロペプチドＧＨＲＨをコードするポリヌクレオチドに加えて、プロモーターと作動的に連結した、又はプロモーターの調節下にある、又はプロモーターに依存する変異体、類似体又は断片を含み又は含有し又は本質的にそれからなる。一般に、真核細胞中で機能する強力なプロモーターを使用すると有利である。好ましい強力なプロモーターは、ヒト又はネズミ由来の前早期サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、或いは、場合によってはラットやモルモットなど他に由来するものである。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、事実上のプロモーター部を含むことができ、それはエンハンサー部と結合していてもよく、或いは結合していなくてもよい。ＥＰ−Ａ−２６０  １４８、ＥＰ−Ａ−３２３  ５９７、米国特許第５，１６８，０６２号、第５，３８５，８３９号、及び第４，９６８，６１５号、並びにＰＣＴ出願ＷＯ８７／０３９０５を参照することができる。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、有利にはヒトＣＭＶ−ＩＥ（Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530）又はネズミＣＭＶ−ＩＥである。
【００８０】
より一般的な用語において、プロモーターはウイルス又は細胞に由来する。本発明の実施で通常使用することができるＣＭＶ−ＩＥ以外の強力なウイルスプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの早期／後期プロモーター、又はラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターである。本発明の実施で通常使用することができる強力な細胞プロモーターは、例えば、デスミンプロモーター（Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344）や、アクチンプロモーター（Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-277）など、細胞骨格の遺伝子のプロモーターである。
【００８１】
これらのプロモーターの機能的な細断片、即ち、十分なプロモーター活性を維持するこれらのプロモーターの一部分は本発明内に含まれ、例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９８／００１６６又は米国特許第６，１５６，５６７号に従った切断型ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、本発明の実施で使用することができる。その結果、本発明の実施におけるプロモーターは、十分なプロモーター活性を維持し、したがってプロモーターとして機能し、好ましくは、その誘導体又は細断片が由来する実際の又は完全長のプロモーターのものと実質的に類似した、例えば、米国特許第６，１５６，５６７号の切断型ＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性又は完全長ＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性と同種のプロモーター活性を維持する完全長プロモーターの誘導体及び細断片を含む。したがって、本発明の実施におけるＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、完全長プロモーターのプロモーターの一部分及び／又は完全長プロモーターのエンハンサーの一部分、並びに誘導体及び細断片を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得る。
【００８２】
好ましくは、プラスミドは、他の発現調節エレメントを含み、又は本質的にそれからなる。（複数の）安定化配列、例えば（複数の）イントロン配列、好ましくは、ｈＣＭＶ−ＩＥの第１イントロン（ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０１０３６）、ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンII（van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344）を組み込むと特に有利である。
【００８３】
ポックスウイルス以外のプラスミド及びウイルスベクター用のポリアデニル化シグナル（ポリＡ）に関しては、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子のポリ（Ａ）シグナル（米国特許第５，１２２，４５８号）、又はウサギβ−グロビン遺伝子のポリ（Ａ）シグナル又はＳＶ４０ウイルスのポリ（Ａ）シグナルをより多く使用することができる。
【００８４】
本発明の有利な実施形態によれば、発現ベクターは、ＩＧＦ１のシグナルペプチド、及びプロペプチドＮ末端（３１〜１０６ＡＡに対応）を欠失させたプロペプチドＧＨＲＨをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明の他の有利な実施形態によれば、発現ベクターは、ＩＧＦ１のシグナルペプチド及び成熟ＧＨＲＨ（３１〜７４ＡＡに対応）をコードするポリヌクレオチドを含む。他の有利な実施形態では、本発明は、ペプチドシグナル配列、有利にはＩＧＦ−１ペプチドシグナル配列、及びプロペプチドＮ末端を欠失させたプロＧＨＲＨ、及び場合によってはＣ末端でのグリシンの付加を含むＧＨＲＨをコードし発現するベクターを包含する。さらに他の有利な実施形態では、本発明は、ペプチドシグナル配列、有利にはリンカーテトラペプチドを介して作動的に連結した成熟ＧＨＲＨ及び血清アルブミンと融合したＩＧＦ−１シグナル配列を含むベクター骨格を提供する。ＧＨＲＨは、ブタ又はウシ並びにイヌに由来するものでもよい。
【００８５】
本発明の他の実施形態によれば、発現ベクターは、適当な細胞系においてタンパク質のインビトロ発現に使用する発現ベクターである。分泌後に、又は分泌後でなくても（細胞溶解の分泌が通常起こらず又は行われない場合）、培養上清中で、又は培養上清から、発現したタンパク質を回収し、場合によっては、限外濾過などの濃縮方法により濃縮し、且つ／或いはアフィニティー、イオン交換やゲル濾過型のクロマトグラフィー法などの精製手段により精製することができる。
【００８６】
本発明で使用することができる宿主細胞には、それだけに限らないが、筋細胞、ケラチン生成細胞、筋原細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ベロ細胞、ＢＨＫ２１、ｓｆ９細胞などがある。宿主細胞を培養する条件が、特定の遺伝子に従って様々であり、宿主細胞に応じて、イヌＧＨＲＨを培養する最適な条件を決定するのに、日常的な実験が時に必要となることが、当業者に理解されている。例えば、イヌＧＨＲＨをコードするベクターで、（治療の必要がある動物由来の筋組織から得ることができる）筋原細胞を形質転換することができ、形質転換した筋原細胞を動物に移植することができる。その結果、組換えイヌＧＨＲＨを発現するように遺伝子工学により作製された筋原細胞は、動物の血液中にホルモンを分泌することができる。他の例では、ＧＨＲＨをコードするベクターでケラチン生成細胞を形質転換し、それを動物に移植し、その結果、イヌＧＨＲＨを循環中に分泌させることもできる。
【００８７】
「宿主細胞」とは、遺伝子改変した、又は組換えプラスミドやベクターなどの外因性ポリヌクレオチドの投与によって遺伝子改変することができる原核細胞又は真核細胞を意味する。遺伝子改変細胞を指すとき、その用語は、最初に改変された細胞とその子孫細胞をどちらも指す。
【００８８】
望ましい配列を含むポリヌクレオチドは、適切なクローン化用又は発現ベクター中に挿入することができ、そのベクターは、複製及び増幅に適した宿主細胞中に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている任意の手段によって宿主細胞に導入することができる。対象とするポリヌクレオチドを含むベクターは、直接的な取り込み；エンドサイトーシス；トランスフェクション；ｆ−交配；エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、又は他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（ベクターが感染性である、例えばレトロウイルスベクターである場合）を含めたいくつかの適当な手段のいずれかによって宿主細胞中に導入することができる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特長によってしばしば決まる。
【００８９】
有利な実施形態では、本発明は、治療有効量の、イヌＧＨＲＨの送達及び標的細胞中での発現用の製剤の投与を提供する。治療有効量の決定は、当業者にとって日常的な実験である。一実施形態では、製剤は、イヌＧＨＲＨを発現するポリヌクレオチド、及び薬学上又は獣医学上許容される担体、媒体又は賦形剤を含む発現ベクターを含む。有利な実施形態では、薬学上又は獣医学上許容される担体、媒体又は賦形剤は、トランスフェクションを促進し、且つ／或いはベクター又はタンパク質の保存性を高める。
【００９０】
薬学上又は獣医学上許容される担体又は媒体又は賦形剤は、当業者に周知である。例えば、薬学上又は獣医学上許容される担体又は媒体又は賦形剤は、０．９％ＮａＣｌ溶液（例えば、食塩水）又はリン酸緩衝液でもよい。本発明の方法に使用することができる他の薬学上又は獣医学上許容される担体又は媒体又は賦形剤には、それだけに限らないが、ポリ−（Ｌ−グルタミン酸）又はポリビニルピロリドンがある。薬学上又は獣医学上許容される担体又は媒体又は賦形剤は、ベクター（又はインビトロで本発明のベクターから発現したタンパク質）の投与を促進する任意の化合物又は化合物の組合せでもよい；有利には、担体、媒体又は賦形剤は、トランスフェクションを促進し、且つ／或いはベクター（又はタンパク質）の保存性を高める。投与量及び投与体積は、本明細書において全体的な記載の中で論じるが、過度の実験を行わずに、当技術分野の知識と併せて読み取られた本開示から当業者が決定することもできる。
【００９１】
プラスミドに独占的にではないが有利に適した四級アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質は、有利には下記の式を有するものである：
【化１】
2007535936.tif 000002
（式中、Ｒ１は、１２〜１８個の炭素原子を有する飽和又は不飽和の直鎖脂肪族ラジカルであり、Ｒ２は、２又は３個の炭素原子を含む他の脂肪族ラジカルであり、Ｘは、アミン又はヒドロキシル基、例えばＤＭＲＩＥである）。他の実施形態では、陽イオン性脂質は、中性脂質、例えばＤＯＰＥと結合している。
【００９２】
これらの陽イオン性脂質の中で、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアンモニウム；ＷＯ９６／３４１０９）、有利には、中性脂質と、有利にはＤＯＰＥ（ジオレオイル−ホスファチジル−エタノールアミン；Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389）と結合して、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを形成するものが好ましい。
【００９３】
有利には、アジュバントとのプラスミド混合物は、製剤を投与して、又は製剤投与のすぐ前に即時的に形成され、有利にはそれと同時に形成される；例えば、投与のすぐ前又は先に、プラスミド−アジュバントの混合物が形成され、有利には、その結果、投与以前に混合物が複合体を形成する十分な時間、例えば、投与前の約３０分など、投与前の約１０〜約６０分が得られる。
【００９４】
ＤＯＰＥが存在する場合、ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥのモル比は、有利には約９５：約５〜約５：約９５であり、より有利には約１：約１、例えば１：１である。
【００９５】
ＤＭＲＩＥ又はＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥのアジュバント：プラスミドの重量比は、約５０：約１〜約１：約５などの約５０：約１〜約１：約１０、有利には約１：約１及び約１：約２、例えば１：１及び１：２でもよい。
【００９６】
特定の実施形態では、薬剤組成物をインビボで直接投与し、そのコード産物を宿主中でベクターによって発現させる。ＧＨＲＨをコードするベクターのインビボ送達の方法（例えば、米国特許第６，４２３，６９３号；特許公開ＥＰ１０５２２８６、ＥＰ１２０５５５１、米国特許公開２００４００５７９４１、ＷＯ９９０５３００及びDraghia-Akli et al., Mol Ther. 2002 Dec; 6（6): 830-6を参照；これらの開示は、その全体が参照により組み込まれている）を改変して、本発明のイヌＧＨＲＨをイヌに送達することができる。本明細書に記載のイヌＧＨＲＨをコードするベクターのインビボ送達は、上記に挙げた参照文献の教示を得た当業者によって実現することができる。
【００９７】
有利には、本発明に従った薬剤及び／又は治療用の組成物及び／又は製剤は、治療応答の誘発に有効な量の、本明細書で論じた１つ又は複数の発現ベクター及び／又はポリペプチドを含み、又は本質的にそれからなり、又はそれからなる；また、有効量は、過度の実験を行わずに、本明細書に組み込まれている文献、及び当技術分野の知識を含めた本開示から決定することができる。
【００９８】
プラスミドベクターに基づく治療用及び／又は薬剤組成物の場合では、投与量は、一般的にいえば、約１μｇ〜約２０００μｇ、有利には約５０μｇ〜約１０００μｇ、より有利には約１００μｇ〜約８００μｇの、ＧＨＲＨを発現するプラスミドである。プラスミドベクターに基づく治療用及び／又は薬剤組成物をエレクトロポレーションで投与する場合、プラスミドの投与量は、一般に約０．１μｇ〜１ｍｇ、有利には約１μｇ〜１００μｇ、有利には約２μｇ〜５０μｇである。投与体積は、約０．１〜約２ｍｌ、有利には約０．２〜約１ｍｌでもよい。これらの投与量及び投与体積は、イヌ、及びウマやネコなど他の哺乳動物標的種の治療に適している。
【００９９】
治療用及び／又は薬剤組成物は、投与１回当たりに、ＧＨＲＨを発現する組換えアデノウイルスのウイルス粒子約１０４個〜約１０１１個、有利には約１０５個〜約１０１０個、より有利には約１０６個〜約１０９個を含む。ポックスウイルスに基づく治療用及び／又は薬剤組成物の場合では、投与量は、約１０２ｐｆｕ〜約１０９ｐｆｕでもよい。薬剤組成物は、投与１回当たりに、ＧＨＲＨを発現するポックスウイルス又はヘルペスウイルスの組換え体約１０５〜約１０９、有利には約１０６〜約１０８ｐｆｕを含む。
【０１００】
哺乳動物である標的種用の組成物の投与体積、例えば、ウイルスベクターに基づくイヌ用組成物、例えばポックスウイルスでないウイルスベクターに基づく組成物の投与体積は、一般に約０．１〜約２．０ｍｌであり、好ましくは約０．１〜約１．０ｍｌであり、より好ましくは約０．５ｍｌ〜約１．０ｍｌである。
【０１０１】
本明細書における開示が一例として提供するものであり、本発明がそれだけに限定されないことが、当業者には理解されるはずである。本明細書における開示及び当技術分野の知識から、当業者なら、過度の実験を行わずに、各注射プロトコールについて使用する投与の回数、投与経路、及び投与量を決定することができる。
【０１０２】
本発明は、本発明に従って作製された有効量の治療用組成物を少なくとも１回動物に投与することを意図するものである。動物は、雄、雌、妊娠した雌及び新生仔でもよい。この投与は、様々な経路を介するものでもよく、その経路には、それだけに限らないが、筋内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、又は皮下（ＳＣ）注射、或いは鼻内を介する又は経口の投与がある。針を含まない器具によって（例えば、Pigjet、Biojector又はVitajet器具（Bioject社製、米国オレゴン州）で）本発明に従った治療用組成物を投与することもできる。プラスミド組成物を投与する他の手法は、エレクトロポレーションを使用することである（例えば、S. Tollefsen et al. Vaccine, 2002, 20, 3370-3378；S. Tollefsen et al. Scand. J. Immunol., 2003, 57, 229-238；S. Babiuk et al., Vaccine, 2002, 20, 3399-3408；ＰＣＴ出願ＷＯ９９／０１１５８を参照）。他の実施形態では、遺伝子銃又は金粒子銃によって、プラスミドを動物に送達する。有利な実施形態では、動物は脊椎動物である。より有利な実施形態では、脊椎動物はイヌである。
【０１０３】
本発明は、疾患状態の治療用薬剤組成物を作製するための、イヌＧＨＲＨ、イヌ成熟ＧＨＲＨ、イヌプレプロＧＨＲＨ、イヌプロＧＨＲＨ、変異体、類似体又は断片をコードし発現させるウイルスベクターの使用に関する。例えば、本発明に従ったＧＨＲＨの投与によって刺激されたＧＨの分泌は、貧血の動物中の赤血球系細胞に対する直接刺激効果を有する可能性がある。しかし、ＧＨＲＨ組成物の投与から利益を得る可能性がある他の疾患状態には、それだけに限らないが、脊椎動物における悪液質、特にガンから生じる悪液質、創傷治癒、骨折治癒、骨粗鬆症、肥満などがある。本発明のイヌＧＨＲＨを発現するベクターは、成長ホルモン産生異常に起因する、ガンなどの慢性疾患での悪液質の治療（Bartlett et al Cancer 1994, 73, 1499-1504及びSurgery 1995, 117, 260-267）、創傷治癒、骨折治癒、加齢過程の遅延、骨粗鬆症、及び貧血（Sohmiya et al J. Endocrinol. Invest. 2000, 23, 31-36及びClin. Endocrinl. 2001, 55, 749-754）に治療有用性がある。
【０１０４】
ブタＧＨＲＨをコードするプラスミドの筋内送達により、イヌにおいて成長ホルモン及びＩＧＦ−Ｉ放出が刺激されて、貧血及び悪液質が治療されることが示されている（例えば、Draghia-Akli et al., Mol Ther. 2002 Dec; 6（6): 830-6）。ＧＨＲＨの長期投与により、イヌにおいて骨折治癒が促進されることが示されている（例えば、Dubreuil et al., Can J Vet Res. 1996 Jan; 60（1): 7-13を参照）。動物中の骨の成長を促進するDubreuil et al.のポリエチレン製杆状外科的移植物（Can J Vet Res. 1996 Jan; 60（1): 7-13）の代わりに本発明の治療用イヌＧＨＲＨベクターを投与すると有利となるはずである。同様に、ＧＨＲＨの長期投与により、ラットにおいて創傷治癒が促進されることが示されている（例えば、Garrel et al., Surg Res. 1991 Oct; 51（4): 297-302を参照）。また、動物中の創傷治癒を促進するGarrel et al.の徐放性ペレット状移植物（Surg Res. 1991 Oct; 51（4): 297-302）の代わりに本発明の治療用イヌＧＨＲＨベクターを投与すると有利となるはずである。
【０１０５】
本発明はまた、脊椎動物の免疫応答を刺激する方法にも関する。一実施形態では、脊椎動物は、トリ、ネコ、ウシ、イヌ、魚、ヤギ、ウマ、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット又はヒツジである。より有利な実施形態では、脊椎動物はイヌである。
【０１０６】
リンパ球はＧＨ−ＩＧＦ−Ｉ、ＧＨＲＨ及びそのそれぞれの受容体を発現するので、ＧＨＲＨの投与によって、免疫細胞機能が亢進されると仮説が立てられている（例えば、Khorram et al., J Clin Endocrinol Metab. 1997 Nov; 82(11): 3590-6を参照）。ヒトでは、健常な老齢のヒトにＧＨＲＨ類似体を投与した結果、大きな免疫亢進効果が得られ、それによって、免疫機能不全の状態に治療的利益がもたらされる可能性がある（例えば、Khorram et al., J Clin Endocrinol Metab. 1997 Nov; 82(11): 3590-6を参照）。トランスジェニックマウスにおけるＧＨＲＨの過剰発現によって、免疫機能のいくつかのパラメーターの有意な刺激が生じた（例えば、Dialynas et al., J Clin Endocrinol Metab. 1997 Nov; 82(11): 3590-6を参照）。他のマウスの研究では、ＧＨＲＨは、実験的自己免疫性脳脊髄炎の発症に重要な役割を果たし、それによって、自己免疫疾患からの防御の治療的手法についての基礎がもたらされる可能性がある（例えば、Ikushima et al., J Immunol. 2003 Sep 15; 171(6): 2769-72を参照）。上記に挙げた研究から、ＧＨＲＨが免疫細胞機能を亢進することが示唆されるので、本発明の治療用イヌＧＨＲＨベクターの投与は、脊椎動物における免疫応答の刺激に有利となるはずである。
【０１０７】
次に、下記の非限定的な実施例によって、本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【０１０８】
視床下部をイヌから採取し、それを液体窒素中で直ちに凍結した。QIAGEN社製のキット（Rneasy Mini Protocol for Isolation of Total RNA、カタログ参照番号７４１０４）を使用して、組織から全ＲＮＡを抽出した。そのキットの変性溶液６００μｌ中で、Potter Dounceを用いて視床下部の細胞を解離させた。この溶液は、グアニジンチオシアネート及びβ−メルカプトエタノールを含んでいた。組織ホモジネートを、１４０００ＲＰＭ（１分当たりの回転数）で５分間遠心分離して、砕片を除去した。７０％エタノール溶液６００μｌを添加し、その混合物をRneasyカラム上に充填し、１００００ＲＰＭで１５秒間遠心分離した。キットに付いているＲＷ１緩衝液でカラムを２回洗浄した。１４０００ＲＰＭで１分間の遠心分離後、ＲＮアーゼを含まない緩衝液５０μｌを用いてＲＮＡを溶出させた。
【０１０９】
５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ８．３、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、ＲＮアーゼ阻害剤２０単位、Moloneyネズミ白血病ウイルス逆転写酵素５０単位、２．５μＭのランダムヘキサヌクレオチドプライマー、及び全視床下部ＲＮＡ２μｌを含む反応混合物２０μｌ中でｃＤＮＡを合成した。下記のサイクルで逆転写のステップを行った：２３℃で５分間、４２℃で２０分間、９９℃で５分間及び１０℃で５分間。
【０１１０】
下記の反応用オリゴヌクレオチドを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｃＤＮＡプールを増幅した：
【０１１１】
ＮＢ１５１（１８ｍｅｒ）5'-ATGCYRCTCTGGGTGYTC-3'（配列番号５）
【０１１２】
ＮＢ１５２（１７ｍｅｒ）5'-TCATCCYTGGGAGTTCC-3'（配列番号６）
【０１１３】
ＮＢ１５３（２１ｍｅｒ）5'-GCTACCGGAAGGTKCTGGGCC-3'（配列番号７）
【０１１４】
ＮＢ１５４（２１ｍｅｒ）5'-GGCCCAGMACCTTCCGGTAGC-3'（配列番号８）
【０１１５】
式中、ＹはＣ又はＴであり、ＲはＡ又はＧであり、ＫはＧ又はＴであり、ＭはＡ又はＣである。
【０１１６】
オリゴヌクレオチドＮＢ１５１及びＮＢ１５４を使用して、ＧＨＲＨ遺伝子の５’末端に対応する１３６塩基対（ｂｐ）の断片を増幅した。ＮＢ１５２及びＮＢ１５３のオリゴヌクレオチドを使用して、ＧＨＲＨ遺伝子の３’末端に対応する、重複する２０６ｂｐの断片を増幅した。
【０１１７】
反応混合物１００μｌは、ｃＤＮＡ混合物２０μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位（J. Cline et al. Nucl. Acid Res.1996, 24, 3546-3551 and H. Hogrefe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2002, 99, 596-601）、５０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ８．２、各オリゴヌクレオチド０．５μｇ（ＮＢ１５１／ＮＢ１５４又はＮＢ１５２／ＮＢ１５３）を含んでいた。増幅は、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の３５サイクルで行い、その後最後に７２℃で１０分の伸長を行った。
【０１１８】
ＧＨＲＨｍＲＮＡの５’及び３’末端のヌクレオチド配列を得るために、ＲＡＣＥプロトコールに従って、ｃＤＮＡの５’及び３’末端を増幅した。５’末端では、全視床下部ＲＮＡ３μｌ、２μＭのプライマーオリゴｄＴ５’−ＣＤＳ、２μＭのＳｍｔオリゴヌクレオチドを含む混合物５μｌを７０℃で加熱し、氷上で冷やして変性させた。オリゴヌクレオチドとともに変性させたＲＮＡ５μｌ、５０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、逆転写酵素１００単位を含む混合物反応液１０μｌを４２℃で９０分間インキュベートし、次いで、１０ｍＭのトリシン−ＫＯＨ  ｐＨ８．５、１ｍＭのＥＤＴＡの緩衝液中に１：１０で希釈した。アリコート２．５μｌを、０．０４μＭのユニバーサルプライマー、０．２μＭのＮＢ１５４オリゴヌクレオチド、４０ｍＭのトリシン−ＫＯＨ  ｐＨ８．７、１５ｍＭのＫＯＡｃ、３．５ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、３．７５μｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．００５％のTween 20（登録商標）、０．００５％のNonidet-P40、０．２μＭの各ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５単位も含む反応混合物５０μｌ中での増幅に使用した。３分を５サイクル、９４℃で３０秒、６５℃で３分、７２℃で３分を３０サイクル行って、増幅を実施した。２３９ｂｐの断片が得られた。
【０１１９】
Ｓｍｔ（３０ｍｅｒ）5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'（配列番号９）
【０１２０】
オリゴｄＴ５’−ＣＤＳ  5'-(T)25N-1N-3'、式中、Ｎ−１はＡ、Ｃ又はＧであり、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである。
【０１２１】
ユニバーサルプライマー5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'（配列番号１０）
【０１２２】
３’末端では、全視床下部ＲＮＡ３μｌ、２μＭのSMART（Clontech Laboratories社製、カリフォルニア州Palo Alto）オリゴヌクレオチドだけを含む混合物５μｌ、希釈したｃＤＮＡのアリコート２．５μｌ、０．０４μＭのユニバーサルプライマーミックス、０．２μＭのＮＢ１５３オリゴヌクレオチド、５０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのＭｇＣｌ２、３．７５μｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．００５％のTween 20（登録商標）、０．００５％のNonidet-P40、０．２μＭの各ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５単位を含むＰＣＲ用の反応混合物５０μｌ以外は、手順は上記に記載のものと同じである。３８６ｂｐの断片が得られた。
【０１２３】
SMART（５７ｍｅｒ）5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3'（配列番号１１）、式中、Ｎ−１はＡ、Ｃ又はＧであり、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである。
【０１２４】
ＰＣＲ増幅断片を適当なプラスミド中に直接クローン化した。コロニーリフトハイブリダイゼーションによって、大腸菌（E. coli）コロニーをスクリーニングした。アルカリホスファターゼで標識したＮＢ１５５プローブを使用して、プラスミドpCRII NB151/154及びpCRII NB152/153に対応する、ＧＨＲＨｃＤＮＡを有するプラスミドを同定した。
【０１２５】
ＮＢ１５５（５０ｍｅｒ）5'-GCCATCTTCACYAACARCTACCGGAAGGTBCTGGGCCAGCTVTCYGCCCG-3'（配列番号１２）、式中、ＹはＣ又はＴであり、ＲはＡ又はＧであり、ＢはＣ又はＧ又はＴであり、ＶはＡ又はＣ又はＧである。
【０１２６】
クローンを配列決定した。３２１ｂｐを含むイヌプレプロＧＨＲＨをコードするヌクレオチド配列は以下のものである：5'-ATGCCACTCT GGGTGTTCTT CCTGGTGATC CTCACCCTCA GCAGTGGCTC CCACTCTTCC CCGCCATCCC TGCCCATCAG AATCCCTCGG TATGCAGACG CCATCTTCAC CAACAGCTAC CGGAAGGTGC TGGGCCAGCT GTCCGCCCGC AAGCTCCTGC AGGACATCAT GAGCCGGCAG CAGGGAGAGA GAAACCGGGA GCAAGGAGCA AAGGTACGAC TCGGCCGTCA GGTGGACAGT CTGTGGGCAA GCCAAAAGCA GATGGCATTG GAGAACATCC TGGCATCCCT GTTACAGAAA CGCAGGAACT CCCAAGGATG A-3'（配列番号３）。
【０１２７】
対応するアミノ酸配列は以下のものである：H-MPLWVFFLVI LTLSSGSHSS PPSLPIRIPR YADAIFTNSY RKVLGQLSAR KLLQDIMSRQ QGERNREQGA KVRLGRQVDS LWASQKQMAL ENILASLLQK RRNSQG-OH（配列番号１）。シグナルペプチドは、アミノ酸１〜アミノ酸２０にまたがり、成熟ＧＨＲＨはアミノ酸３１〜アミノ酸７４にまたがる。
【実施例２】
【０１２８】
イヌＧＨＲＨをコードするポリヌクレオチドは、ＮＢ１８４及びＮＢ１８５のオリゴヌクレオチド並びにＤＮＡポリメラーゼ（J. Cline et al.1996及びH. Hogrefe et al. 2002）を使用する、全視床下部ＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲによって得られる。
【０１２９】
ＮＢ１８４（３３ｍｅｒ）：5'-TTTCGCGGATCCTATGCAGACGCCATCTTCACC-3'（配列番号１３）（その５’末端上にBamH I部位を含む）
【０１３０】
ＮＢ１８５（３５ｍｅｒ）：5'-AAAGCTCTAGATCAACGGCCGAGTCGTACCTTTGC-3'（配列番号１４）（その５’末端上にXbaI部位を含む）
【０１３１】
４２℃で１５分、９５℃で５分、４℃で５分の逆転写ステップを１サイクル、９５℃で４５秒、５５℃で４５秒、７２℃で１分のＰＣＲステップを３０サイクル行って増幅を実施する。
【０１３２】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ産物（１６４ｐｂ）を精製し、その後それをBamH I及びXbaIで消化して、１４７ｂｐのBamH I／XbaI（断片Ａ）を生じさせる。
【０１３３】
プラスミドのBamH I／Bgl II消化後にＰＢ３２６及びＰＢ３２９のオリゴヌクレオチドに対応するポリリンカー（BamH I、Not I、EcoR I、EcoR V、XbaI、Pml I、Pst I、Bgl II）の挿入によって、プラスミドpAB110をpVR1020プラスミド（Vical社製）から誘導する。
【０１３４】
ＰＢ３２６（４０ｍｅｒ）：5'-GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC-3'（配列番号１５）
【０１３５】
ＰＢ３２９（４０ｍｅｒ）：5'-GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT-3'（配列番号１６）
【０１３６】
BamH I／XbaI消化によってプラスミドpAB110を直鎖化して、断片Ｂ（５０５５ｂｐ）を生じさせる。
【０１３７】
その後、断片Ａ及びＢを精製し、連結してプラスミドpNB179（５２０２ｂｐ）（図１）を生じさせる。
【実施例３】
【０１３８】
プラスミドpCRII NB151/154を最初にEcoR Iで消化する。EcoR I断片（１６７ｂｐ）を精製し、最後にBsaWIで消化して、EcoR I−BsaWI断片（１４３ｂｐ）を生じさせる。プラスミドpCRII NB152/153を最初にEcoR Iで消化する。EcoR I断片（２３５ｂｐ）を精製し、最後にBsaWIで消化して、BsaWI−EcoR I断片（２２０ｂｐ）を生じさせる。
【０１３９】
その後、これら２つの断片を精製し、EcoR Iで直鎖化したプラスミドpCRII NB151/154中にクローン化して、最終的なプラスミドpCRII NB151/152（４２９５ｂｐ）を生じさせする。
【実施例４】
【０１４０】
pNB209の構築は、イヌＧＨＲＨ前駆体（１０６アミノ酸のポリペプチド）をコードするpVR1012プラスミド（Vical社製）に基づいている。
【０１４１】
５’及び３’末端にそれぞれSalI及びXbaI部位を有する、ｃＧＨＲＨ遺伝子に対応するＤＮＡ断片を、プライマーＮＢ３６１及びＮＢ３６０、鋳型であるプラスミドpCRIINB151/152、並びにＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって増幅する。
【０１４２】
ＮＢ３６０（３０ｍｅｒ）：5'-AAAGCTCTAGATCATCCTTGGGAGTTCCTG-3'（配列番号１７）（その５’末端上にXbaI部位を含む）
【０１４３】
ＮＢ３６１（３１ｍｅｒ）：5'-TTTACGCGTCGACATGCTGCTCTGGGTGTTC-3'（配列番号１８）（その５’末端上にSalI部位を含む）
【０１４４】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ産物（３４５ｂｐ）を精製し、その後それをSalI及びXbaIで消化して、断片Ａ（３２７ｂｐ）を生じさせる。
【０１４５】
SalI／XbaI消化によってプラスミドpVR1012を直鎖化して、断片Ｂ（４８８０ｂｐ）を生じさせる。
【０１４６】
その後、断片Ａ及びＢを精製し、連結してプラスミドpNB209（５２０７ｂｐ）を生じさせる。図２にpNB209のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【実施例５】
【０１４７】
プラスミドpNB210／pNB211／pNB212／pNB213：ＧＨＲＨプロペプチドと融合した真核生物ｔＰＡリーダーペプチドを含むハイブリッドタンパク質をコードする改変ＧＨＲＨ遺伝子を含むpAB110由来プラスミドの構築。
【０１４８】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるSalI及びEco47III部位を有する、ｔＰＡ（１〜２３ＡＡ）と対応するＤＮＡ断片は、プライマーＮＢ３５５及びＮＢ３５６、鋳型であるプラスミドpAB110、並びにＤＮＡポリメラーゼ（J. Cline et al.1996及びH. Hogrefe et al. 2002）を使用するＰＣＲによって得られる。
【０１４９】
ＮＢ３５５（２０ｍｅｒ）：5'-CCGTCGTCGACAGAGCTGAG-3'（配列番号１９）（その５’末端上にSalI部位を含む）
【０１５０】
ＮＢ３５６（２４ｍｅｒ）：5'-AAAAGCGCTGGGCGAAACGAAGAC-3'（配列番号２０）（その５’末端上にEco47III部位を含む）
【０１５１】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（１８４ｂｐ）を精製し、その後それをSalI及びEco47IIIで消化して、断片Ａ（１７２ｂｐ）を生じさせる。
【０１５２】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるSalI及びNaeI部位を有する、ｔＰＡ（１〜２８ＡＡ）と対応するＤＮＡ断片は、プライマーＮＢ３５５及びＮＢ３５７、鋳型であるプラスミドpAB110、並びにＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって得られる。
【０１５３】
ＮＢ３５５（２０ｍｅｒ）：5'-CCGTCGTCGACAGAGCTGAG-3'（配列番号１９）（その５’末端上にSalI部位を含む）
【０１５４】
ＮＢ３５７（４２ｍｅｒ）：5'-AAAGCCGGCATGGATTTCCTGGCTGGGCGAAACGAAGAC TGC-3'（配列番号２１）（その５’末端上にｔＰＡリーダーペプチドの５ＡＡ付加配列及びNaeI部位を含む）
【０１５５】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（１９９ｂｐ）を精製し、その後それをSalI及びNaeIで消化して、断片Ｂ（１８７ｂｐ）を生じさせる。
【０１５６】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるNlaIV及びXbaI部位を有する、欠失（１〜１９ＡＡ）ＧＨＲＨと対応するＤＮＡ断片は、プライマーＮＢ３５８及びＮＢ３６０、鋳型であるプラスミドpCRII NB151/152、並びにＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって得られる。
【０１５７】
ＮＢ３５８（２１ｍｅｒ）：5'-TTTGGTTCCCCGCCATCCCTG-3'（配列番号２２）（その５’末端上にNlaIV部位を含む）
【０１５８】
ＮＢ３６０（３０ｍｅｒ）：5'-AAAGCTCTAGATCATCCTTGGGAGTTCCTG-3'（配列番号１７）（その５’末端上にXbaI部位を含む）
【０１５９】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（２８１ｂｐ）を精製し、その後それをNlaIV及びXbaIで消化して、断片Ｃ（２６５ｂｐ）を生じさせる。
【０１６０】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるStuI及びXbaII部位を有する、欠失（１〜２０ＡＡ）ＧＨＲＨと対応するＤＮＡ断片は、プライマーＮＢ３５９及びＮＢ３６０、鋳型であるプラスミドpCRII NB151/152、並びにＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって得られる。
【０１６１】
ＮＢ３５９（２４ｍｅｒ）：5'-TTTAGGCCTCCATCCCTGCCCATC-3'（配列番号２３）（その５’末端上にStuI部位を含む）
【０１６２】
ＮＢ３６０（３０ｍｅｒ）：5'-AAAGCTCTAGATCATCCTTGGGAGTTCCTG-3'（配列番号１７）（その５’末端上にXbaI部位を含む）
【０１６３】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（２７８ｂｐ）を精製し、その後それをStuI及びXbaIで消化して、断片Ｄ（２６２ｂｐ）を生じさせる。
【０１６４】
SalI／XbaI消化によってプラスミドpVR1012を直鎖化して、断片Ｅ（４８８０ｂｐ）を生じさせる。
【０１６５】
その後、断片Ｅ、Ａ及びＣを精製し、連結してプラスミドpNB210（５３１３ｂｐ）を生じさせる。図３にpNB210のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０１６６】
その後、断片Ｅ、Ａ及びＤを精製し、連結してプラスミドpNB211（５３１０ｂｐ）を生じさせる。図４にpNB211のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０１６７】
その後、断片Ｅ、Ｂ及びＣを精製し、連結してプラスミドpNB212（５３３１ｂｐ）を生じさせる。図５にpNB212のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０１６８】
その後、４断片Ｅ、Ｂ及びＤを精製し、連結してプラスミドpNB213（５３２８ｂｐ）を生じさせる。図６にpNB213のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【実施例６】
【０１６９】
プラスミドpNB214／pNB215の構築
プラスミドpNB214／pNB215：イヌＧＨＲＨ成熟ペプチドと融合したヒトｔＰＡを含むハイブリッドタンパク質をコードする改変ＧＨＲＨ遺伝子を含むpAB110由来プラスミドの構築。
【０１７０】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるBst1107I及びXbaII部位を有する、ペプチド（３１〜７４ＡＡ）ＧＨＲＨと対応するＤＮＡ断片は、プライマーＮＢ３６２及びＮＢ３６３、鋳型であるプラスミドpCRII NB151/152、並びにＤＮＡポリメラーゼ（J. Cline et al.1996及びH. Hogrefe et al. 2002）を使用するＰＣＲによって得られる。
【０１７１】
ＮＢ３６２（２７ｍｅｒ）：5'-TTTGTATACGCAGACGCCATCTTCACC-3'（配列番号２４）（その５’末端上にBst1107I部位を含む）
【０１７２】
ＮＢ３６３（３２ｍｅｒ）：5'-AAAGCTCTAGATCAGAGTCGTACCTTTGCTCC-3'（配列番号２５）（その５’末端上にXbaI部位を含む）
【０１７３】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（１５２ｂｐ）を精製し、その後それをBst1107II及びXbaIで消化して、断片Ｆ（１３６ｂｐ）を生じさせる。
【０１７４】
その後、断片Ｅ、Ａ及びＦを精製し、連結してプラスミドpNB214（５１８４ｂｐ）を生じさせる。図７にpNB214のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０１７５】
その後、断片Ｅ、Ｂ及びＦを精製し、連結してプラスミドpNB215（５２０２ｂｐ）を生じさせる。図８にpNB215のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０１７６】
断片Ｅ、Ａ及びＢは、実施例５に記載されている。
【実施例７】
【０１７７】
潜在性のスプライス部位を除去し、カニスファミリアリス（Canis familiaris）の１つにコドンの使用を適合させ、発現を高めるためにKozak共通配列を導入することによって、イヌプレプロＧＨＲＨヌクレオチド配列を最適化する。そのような改変遺伝子は、合成によって得られる：配列番号４０。
【０１７８】
pNB216の構築は、イヌＧＨＲＨ最適化前駆体（１０６アミノ酸のポリペプチド）配列番号４０をコードするpVR1012プラスミド（Vical社製）に基づいている。
【０１７９】
最適化イヌプレプロＧＨＲＨ遺伝子を挿入したプラスミドpCR-Script Amp-GHRH（Stratagene社製、米国カリフォルニア州Lajolla）をSalI及びXbaIで消化して、SalI−XbaI断片（３３６ｂｐ）を生じさせ、SalI／XbaI消化によってプラスミドpVR1012を直鎖化して断片Ｅ（４８８０ｂｐ）を生じさせる。その後、これら２つの断片を精製し、連結して、最終的なプラスミドpNB216（５２１６ｂｐ）を生じさせる。
【実施例８】
【０１８０】
プラスミドpNB217／pNB218：最適化したＧＨＲＨプロペプチドと融合した真核生物ｔＰＡリーダーペプチドを含むハイブリッドタンパク質をコードする改変ＧＨＲＨ遺伝子を含むpAB110由来プラスミドの構築。
【０１８１】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるNlaIV及びXbaI部位を有する、最適化した欠失（１〜２０ＡＡ）ＧＨＲＨと対応するＤＮＡ断片は、プライマーＮＢ３６４及びＮＢ３６５、鋳型であるプラスミドpCR-Script Amp-GHRH、並びにＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって得られる。
【０１８２】
ＮＢ３６４（２４ｍｅｒ）：5'-TTTGGCCCCCCCAGCCTGCCCATC-3'（配列番号４５）（その５’末端上にNlaIV部位を含む）
【０１８３】
ＮＢ３６５（３３ｍｅｒ）：5'-AAAGCTCTAGATTATCAGCCCTGGCTGTTCCGC-3'（配列番号４６）（その５’末端上にXbaI部位を含む）
【０１８４】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（２８１ｂｐ）を精製し、その後それをNlaIV及びXbaIで消化して、断片Ｇ（２６５ｂｐ）を生じさせる。
【０１８５】
SalI／XbaI消化によってプラスミドpVR1012を直鎖化して、断片Ｅ（４８８０ｂｐ）を生じさせる。
【０１８６】
その後、断片Ｅ、Ａ及びＧを精製し、連結してプラスミドpNB217（５３１３ｂｐ）を生じさせる。図１０にpNB217のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０１８７】
その後、断片Ｅ、Ｂ及びＧを精製し、連結してプラスミドpNB218（５３２８ｂｐ）を生じさせる。図１１にpNB218のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０１８８】
断片Ａ及びＢは、実施例５に記載されている。
【実施例９】
【０１８９】
プラスミドpNB219／pNB220：最適化したイヌＧＨＲＨ成熟ペプチドと融合したヒトｔＰＡを含むハイブリッドタンパク質をコードする改変ＧＨＲＨ遺伝子を含むpAB110由来プラスミドの構築。
【０１９０】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるBst1107I及びXbaI部位を有する、最適化したペプチド（３１〜７４ＡＡ）ＧＨＲＨと対応するＤＮＡ断片は、プライマーＮＢ３６６及びＮＢ３６７、鋳型であるプラスミドpCRII NB151/152、並びにＤＮＡポリメラーゼ（J. Cline et al.1996及びH. Hogrefe et al. 2002）を使用するＰＣＲによって得られる。
【０１９１】
ＮＢ３６６（２７ｍｅｒ）：5'-TTTGTATACGCCGACGCCATCTTCACC-3'（配列番号４７）（その５’末端上にBst1107I部位を含む）
【０１９２】
ＮＢ３６７（３２ｍｅｒ）：5'-AAAGCTCTAGATCACAGCCGCACTTTGGCGCC-3'（配列番号４８）（その５’末端上にXbaI部位を含む）
【０１９３】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（１５２ｂｐ）を精製し、その後それをBst1107I及びXbaIで消化して、断片Ｈ（１３６ｂｐ）を生じさせる。
【０１９４】
その後、断片Ｅ、Ａ及びＨを精製し、連結してプラスミドpNB219（５１８４ｂｐ）を生じさせる。図１２にpNB219のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０１９５】
その後、断片Ｅ、Ｂ及びＨを精製し、連結してプラスミドpNB220（５１９９ｂｐ）を生じさせる。図１３にpNB220のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０１９６】
断片Ａ及びＢは、実施例５に記載されている。
【実施例１０】
【０１９７】
米国特許公開第２００４００５７９４１号の実施例２から、動物におけるＤＮＡ取り込み及び発現のための低電圧エレクトロポレーションの方法を適合させることができ、その開示は、その全体が参照により組み込まれている。過度の実験を行わずに、本明細書に記載の方法を改変して、本発明のプラスミドを送達することができる。
【０１９８】
直接筋内にプラスミドＤＮＡを注射し、その後エレクトロポレーションを行うことは、骨格筋中にプラスミドＤＮＡを局所的且つ制御された送達を行う方法である。受動的な送達様式で通常使用される多いプラスミド量ではなく、少ないプラスミド量（わずか０．１ｍｇ）を使用することは利点を有する。特定の理論に拘泥するものではないが、エレクトロポレーションによるプラスミド取り込みの増大の機構は、おそらく、タンパク質能動輸送を起こす又は起こさない、新たに形成された膜孔を介して生じる。特定の理論に拘泥するものではないが、筋細胞の透過性の程度は、電界強度、パルスの長さ、電極の形状及び型（Bureau et al., Biochim Biophys Acta. 2000 May 1; 1474（3): 353-9及びGilbert et al., Biochim Biophys Acta. 1997 Feb 11; 1334（1): 9-14.）、並びに細胞サイズ（Somiari et al., Mol Ther. 2000 Sep; 2（3): 178-87）に依存的である。古典的な電極の構成である、４ｍｍ離して配置した板又は１対のワイヤー電極は、げっ歯類で有効であることが示されているが、ブタ又はヒトのような大きな哺乳動物では、皮膚の抵抗の増大、皮下脂肪組織の厚さ、及び電界の強度が比例的に増大する場合の組織損傷の懸念から、これらの型の電極は実用的でない。ブタ又はイヌの筋線維は非常に大きく、その結果、げっ歯類の筋より電気的透過に適している。この報告では、大きな哺乳動物において様々な投与量のＧＨＲＨ又は類似体の核酸配列を単回注射し、その後筋内アプリケーターでエレクトロポレーションを行うことが、貧血を治療し、消耗を反転させ、対象の体重を増加させ、慢性的な疾患を有する対象の平均寿命を延長することができる、生物学的に有意な効果を伴う治療的な血漿ホルモンレベルを生じさせるのに十分であることを示す。
【０１９９】
インビボエレクトロポレーションを介して、pSP-HV-GHRH系（ブタＧＨＲＨを発現するベクター）を健常なイヌの左前脛骨筋に送達した。イヌ４匹（雄２匹及び雌２匹）からなる１群を対照として使用し、イヌ８匹（雄４匹及び雌４匹）からなる３群にpSP-HV-GHRH系を注射した。イヌに媒体のみ（対照）、或いは２００ｍｃｇ、又は６００ｍｃｇ又は１０００ｍｃｇのpSP-HV-GHRHを注射し、その後針エレクトロポレーションを行った。ＧＨＲＨ及びＧＨの全身レベルの増大を示す指標は、血清ＩＧＦ−Ｉ濃度の増大である。したがって、注射してから２８日後、媒体のみ（対照）、或いは２００ｍｃｇ、又は６００ｍｃｇ又は１０００ｍｃｇのpSP-HV-GHRHを注射したイヌから血清を収集し、ＩＧＦ−Ｉレベルを決定した。６００ｍｃｇを注射したイヌのＩＧＦ−Ｉレベルは、対照（媒体のみ）処置動物より３倍高かった（図２）。ＩＧＦ−Ｉレベルの増大は統計上有意であった（ｐ＜０．０４６）。２００ｍｃｇ及び１０００ｍｃｇのプラスミドを注射した動物は対照より高いＩＧＦ−Ｉレベルを示したが、ＩＧＦ−Ｉレベルは、６００ｍｃｇを注射した動物より低かった。ＧＨＲＨレベルの増大に対応するＩＧＦ−Ｉレベルの増大は、イヌにおいて組換えブタＧＨ（「ｐＧＨ」）を利用した他の研究と一致する。例えば、ｐＧＨで処置したイヌにおいて、血清ＧＨレベルの上昇と相関する投与量関連性の血清ＩＧＦ−Ｉレベルの増大（約２〜１０倍）が認められた。
【０２００】
特定の理論に拘泥するものではないが、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）は、下垂体前葉からの成長ホルモン（ＧＨ）の産生及び放出を刺激し、その成長ホルモンは、肝及び他の標的臓器からのＩＧＦ−Ｉの産生を刺激する。したがって、ＧＨＲＨ及びＧＨの全身レベルの増大を示す指標は、血清ＩＧＦ−Ｉ濃度の増大である。２００、６００及び１０００ｍｃｇのpSP-HV-GHRHを注射した健常なイヌの血清ＩＧＦ−Ｉのレベルは、注射前の値と比較したとき、注射してから２８日後ですべて高かった。６００ｍｃｇのpSP-HV-GHRHを注射したイヌは、ＩＧＦ−Ｉレベルの最も統計上有意な増大（例えば、９０％より大きい、ｐ＜０．０４６）を示し、このことから、６００ｍｃｇが健常なイヌの最適な濃度である可能性があることが示唆される。
【実施例１１】
【０２０１】
プラスミドpNB240、pNB239及びpNB244の構築
pNB240の構築は、プロペプチドＣ末端を欠失させ、ｃ−ｍｙｃエピトープタグと融合したプレプロＧＨＲＨを含むハイブリッドタンパク質をコードする改変ＧＨＲＨ遺伝子を含むpVR1012プラスミド（Vical社製）に基づいている。
【０２０２】
pNB239及びpNB244の構築は、改変ＧＨＲＨと融合し、ｃ−ｍｙｃエピトープタグと融合したウマＩＧＦ１（インスリン様成長因子１）ペプチドシグナル配列（ＳＳＩＧＦ１、GenBankアクセッション番号Ｕ２８０７０（２４〜４８ＡＡ）及びＵ８５２７２で開示されている）を含むハイブリッドタンパク質をコードする改変ＧＨＲＨ遺伝子を含むpVR1012プラスミド（Vical社製）に基づいている。
【０２０３】
３’末端にさらなるXbaI部位を有する、プロペプチドＣ末端（１〜７４ＡＡに対応）を欠失させ、ｃ−ｍｙｃエピトープタグと融合したプレプロＧＨＲＨをコードするＤＮＡ断片を、プライマーＰＢ０９１及びＮＢ４１２、鋳型であるプラスミドpNB209（実施例４を参照）、並びにＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって増幅する。
【０２０４】
ＰＢ０９１（２２ｍｅｒ）：5'-CCAGACATAATAGCTGACAGAC-3'（配列番号５１）
【０２０５】
ＮＢ４１２（６８ｍｅｒ）：5'-AAAGCTCTAGATTAGAGATCCTCTTCTGAGATAAGCTTTTGTTCGAGTCGTACCTTTGCTCCTTGCTC-3'（その３’末端上にｃ−ｍｙｃエピトープタグ及びXbaI部位を含む）（配列番号５２）
【０２０６】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（３３８ｂｐ）を精製し、その後それをSalI及びXbaIで消化して、断片Ａ（２６１ｂｐ）を生じさせる。
【０２０７】
潜在性のスプライス部位を除去し、コドンの使用を適合させ、発現を高めるために開始コドンの前にKozak共通配列を導入することによって、ウマプレプロＩＧＦ１ヌクレオチド配列を最適化する。そのような改変遺伝子は、合成によって得られる：配列番号６５。
【０２０８】
最適化ウマＩＧＦ１遺伝子を含むプラスミドpCR-Script Amp-eIGF1（Stratagene社製、米国カリフォルニア州Lajolla）をＰＣＲの鋳型として、プライマーＮＢ３９３及びＮＢ３９４、並びにＤＮＡポリメラーゼとともに使用した。
【０２０９】
ＮＢ３９３（３８ｍｅｒ）：5'-TTTGCGTCGACGCCACCATGCACATCATGAGCAGCAGC-3'（その５’末端上にSalI部位を含む）（配列番号６６）
【０２１０】
ＮＢ３９４（３８ｍｅｒ）：5'-AAAGCTCTAGATTATCACATCCGGTAGTTCTTGTTGCC-3'（その５’末端上にXbaI部位を含む）（配列番号６７）
【０２１１】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（４２４ｂｐ）を精製し、その後それをSalI及びXbaIで消化して、断片Ｆ（４０８ｂｐ）を生じさせる。
【０２１２】
SalI／XbaI消化によってプラスミドpVR1012を直鎖化して、断片Ｅ（４８８０ｂｐ）を生じさせる。
【０２１３】
その後、断片Ｅ及びＦを精製し、連結してプラスミドpNB231（５２８８ｂｐ）を生じさせる。
【０２１４】
３’末端にさらなるNaeI部位を有するウマＳＳＩＦＧ１（図１５〜１８の１〜２５ＡＡ）に対応するＤＮＡ断片は、プライマーＰＢ０９１及びＮＢ３９８、鋳型であるプラスミドpNB231、並びにＤＮＡポリメラーゼ（J. Cline et al.1996及びH. Hogrefe et al. 2002）を使用するＰＣＲによって得られる。
【０２１５】
ＰＢ０９１（２２ｍｅｒ）（配列番号５１）
【０２１６】
ＮＢ３９８（２５ｍｅｒ）：5'-AAAGCCGGCGGTGGCGCTGCTGGTG-3'（その３’末端上にNaeI部位を含む）（配列番号５３）
【０２１７】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（１５９ｂｐ）を精製し、その後それをSalI及びNaeIで消化して、断片Ｂ（８６ｂｐ）を生じさせる。
【０２１８】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるBst1107I及びXbaI部位を有する、ｃ−ｍｙｃエピトープタグと融合したＧＨＲＨ成熟ペプチド（３１〜７４ＡＡ）に対応するＤＮＡ断片は、プライマーＮＢ３６２及びＮＢ４１２、鋳型であるプラスミドpNB209、並びにＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって得られる。
【０２１９】
ＮＢ３６２（２７ｍｅｒ）（配列番号２４）
【０２２０】
ＮＢ４１２（６８ｍｅｒ）（配列番号５２）
【０２２１】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（１８２ｂｐ）を精製し、その後それをBst1107I及びXbaIで消化して、断片Ｃ（１６６ｂｐ）を生じさせる。
【０２２２】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるNlaIV及びXbaI部位を有する、プロペプチドＣ末端（２０〜７４ＡＡ）を欠失させ、ｃ−ｍｙｃエピトープタグと融合したＧＨＲＨプロペプチドに対応するＤＮＡ断片は、プライマーＮＢ３５８及びＮＢ４１２、鋳型であるプラスミドpNB209、並びにＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって得られる。
【０２２３】
ＮＢ３５８（２１ｍｅｒ）（配列番号２２）
【０２２４】
ＮＢ４１２（６８ｍｅｒ）（配列番号５２）
【０２２５】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（２１５ｂｐ）を精製し、その後それをBst1107I及びXbaIで消化して、断片Ｄ（１９９ｂｐ）を生じさせる。
【０２２６】
SalI／XbaI消化によってプラスミドpVR1012を直鎖化して、断片Ｅ（４８８０ｂｐ）を生じさせる。
【０２２７】
その後、断片Ｅ及びＡを精製し、連結してプラスミドpNB240（５１４１ｂｐ）を生じさせる。図１４にpNB240のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０２２８】
その後、断片Ｅ、Ｂ及びＣを精製し、連結してプラスミドpNB239（５１３２ｂｐ）を生じさせる。図１５にpNB239のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０２２９】
その後、断片Ｅ、Ｂ及びＤを精製し、連結してプラスミドpNB244（５１６５ｂｐ）を生じさせる。図１６にpNB244のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０２３０】
Lipofectamin 2000を使用してＣＨＯ−Ｋ１細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞、カタログ番号ＣＣｌ−６１で米国基準菌株保存機構（American Tissue Culture Collection）ＡＴＣＣから入手可能）の一過性トランスフェクションを行った後、pNB239、pNB240及びpNB244によってコードされる融合タンパク質のインビトロ発現について検討した。直径６ｃｍのプレート中で９０％コンフルエントな状態であるＣＨＯ−Ｋ１細胞に、製造業者の説明書に従って、プラスミド５μｇ及びリポフェクタミン１０μｌをそれぞれトランスフェクトした。トランスフェクション後、１％ＦＣＶ（ウシ胎児血清）を含むMEM-glutamax培地中で細胞を２４時間培養した。培養上清を回収し、タンパク質のトリコロ酢酸（trichoroacetic acid）沈殿によって４０倍に濃縮した。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で洗浄し、掻爬によって回収し、LaemmliＳＤＳ−ＰＡＧＥ添加緩衝液を使用して溶解した。全細胞抽出物及び濃縮（４０倍）培養上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体（Euromedex社製、フランス）を使用するウェスタンブロット法にかけることにより、組換えタンパク質の産生及び分泌を分析した。
【０２３１】
プラスミドpNB240は、プレプロＧＨＲＨのアミノ酸１〜７４を含み、ｃ−ｍｙｃエピトープタグと融合したハイブリッドタンパク質をコードする。
【０２３２】
プラスミドpNB239は、ＧＨＲＨ成熟ペプチド（３１〜７４ＡＡ）及びｃ−ｍｙｃエピトープタグと融合したウマＩＧＦ１ペプチドシグナル配列（ＳＳＩＧＦ１）を含むハイブリッドタンパク質をコードする。
【０２３３】
プラスミドpNB244は、ＧＨＲＨプロペプチド（２０〜７４ＡＡ）及びｃ−ｍｙｃエピトープタグと融合したウマＩＧＦ１ペプチドシグナル配列（ＳＳＩＧＦ１）を含むハイブリッドタンパク質をコードする。
【０２３４】
発現結果の概要を表１に示す。その３つの構築物から、培養上清中で６．３ｋＤａの発現産物が生じ、このことは、組換えホルモンが正確に成熟したことを示すものである。
【０２３５】
【表１】
2007535936.tif 000003
【実施例１２】
【０２３６】
プラスミドpNB232及びpNB245の構築
pNB232及びpNB245の構築は、改変ＧＨＲＨと融合したウマＩＧＦ１ペプチドシグナル配列（ＳＳＩＧＦ１、GenBankアクセッション番号Ｕ２８０７０（２４〜４８ＡＡ）及びＵ８５２７２で開示されている）を含むハイブリッドタンパク質をコードする改変ＧＨＲＨ遺伝子を含むpVR1012プラスミド（Vical社製）に基づいている。
【０２３７】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるBst1107I及びXbaI部位を有する、プロペプチドＮ末端（３１〜１０６ＡＡに対応）を欠失させたプロペプチドＧＨＲＨに対応するＤＮＡ断片は、プライマーＮＢ３６２及びＮＢ４２１、鋳型であるプラスミドpNB209（実施例４を参照）、並びにＤＮＡポリメラーゼ（J. Cline et al.1996及びH. Hogrefe et al. 2002）を使用するＰＣＲによって得られる。
【０２３８】
ＮＢ３６２（２７ｍｅｒ）（配列番号２４）
【０２３９】
ＮＢ４２１（３６ｍｅｒ）：5'-AAAGCTCTAGATTATCCTTGGGAGTTCCTGCGTTTC-3'（その５’末端上にXbaI部位を含む）（配列番号５４）
【０２４０】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（２４８ｂｐ）を精製し、その後それをBst1107I及びXbaIで消化して、断片Ｇ（２３２ｂｐ）を生じさせる。
【０２４１】
SalI／XbaI消化によってプラスミドpVR1012を直鎖化して、断片Ｈ（４８８０ｂｐ）を生じさせる。
【０２４２】
その後、断片Ｈ、Ｂ及びＦを精製し、連結してプラスミドpNB232（５１０２ｂｐ）を生じさせる。図１７にpNB232のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０２４３】
その後、断片Ｈ、Ｂ及びＧを精製し、連結してプラスミドpNB245（５１９８ｂｐ）を生じさせる。図１８にpNB245のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０２４４】
断片Ｂは実施例１１に記載されている。断片Ｆは実施例６に記載されている。
【実施例１３】
【０２４５】
プラスミドpNB228、pNB297及びpNB298の構築
pNB228プラスミドは、カルボキシ末端プロペプチドを欠失させたプレプロＧＨＲＨペプチドをコードする核酸断片を含むpVR1012プラスミド（Vical社製）骨格に対応する。
【０２４６】
pNB297プラスミドは、プレプロＧＨＲＨのアミノ酸１〜７４及びそのカルボキシ末端のグリシンをコードする核酸断片を含むpVR1012プラスミド（Vical社製）骨格に対応する。カルボキシ末端のグリシンは、アミド化酵素によって容易にアミド化されるはずである。
【０２４７】
pNB298プラスミドは、成熟ＧＨＲＨ（３１〜７４ＡＡ）及びそのカルボキシ末端のグリシンと融合したウマＩＧＦ１シグナル配列（ＳＳＩＧＦ１）をコードする核酸断片を含むpVR1012プラスミド（Vical社製）骨格に対応する。
【０２４８】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるSalI及びXbaI部位を有する、カルボキシ末端プロペプチドを欠失させたプレプロＧＨＲＨに対応するＤＮＡ断片を、プライマーＮＢ３６１及びＮＢ３６３、鋳型であるプラスミドpNB209、並びにＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって増幅する。
【０２４９】
ＮＢ３６１（３１ｍｅｒ）：5'-TTTACGCGTCGACATGCTGCTCTGGGTGTTC-3'（配列番号１７）（その５’末端上にSalI部位を含む）
【０２５０】
ＮＢ３６３（３２ｍｅｒ）：5'-AAAGCTCTAGATCAGAGTCGTACCTTTGCTCC-3'（配列番号２４）（その５’末端上にXbaI部位を含む）
【０２５１】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（２４９ｂｐ）を精製し、その後それをSalI及びXbaIで消化して、断片Ａ（２３１ｂｐ）を生じさせる。
【０２５２】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるSalI及びXbaI部位を有する、プレプロＧＨＲＨ（１〜７４ＡＡ）及びそのカルボキシ末端のグリシンに対応するＤＮＡ断片を、プライマーＮＢ３６１及びＮＢ４７６、鋳型であるプラスミドpNB209、並びにＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって増幅する。
【０２５３】
ＮＢ３６１（３１ｍｅｒ）：5'-TTTACGCGTCGACATGCTGCTCTGGGTGTTC-3'（配列番号１７）（その５’末端上にSalI部位を含む）
【０２５４】
ＮＢ４７６（３２ｍｅｒ）：5'-AAAGCTCTAGATTAGCCGAGTCGTACCTTTGC-3'（配列番号６８）（その５’末端上にXbaI部位を含む）
【０２５５】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（２５２ｂｐ）を精製し、その後それをSalI及びXbaIで消化して、断片Ｂ（２３４ｂｐ）を生じさせる。
【０２５６】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるSalI及びXbaI部位を有する、成熟ＧＨＲＨ（３１〜７４ＡＡ）及びそのカルボキシ末端のグリシンと融合したウマＩＧＦ１シグナル配列（ＳＳＩＧＦ１）に対応するＤＮＡ断片は、プライマーＮＢ３９３及びＮＢ４７６、鋳型であるプラスミドpNB232、並びにＤＮＡポリメラーゼ（J. Cline et al.1996及びH. Hogrefe et al. 2002）を使用するＰＣＲによって得られる。
【０２５７】
ＮＢ３９３（３８ｍｅｒ）：5'-TTTGCGTCGACGCCACCATGCACATCATGAGCAGCAGC-3'（配列番号６６）（その５’末端上にSalI部位を含む）
【０２５８】
ＮＢ４７６（３２ｍｅｒ）：5'-AAAGCTCTAGATTAGCCGAGTCGTACCTTTGC-3'（配列番号６８）（その５’末端上にXbaI部位を含む）
【０２５９】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（２４１ｂｐ）を精製し、その後それをSalI及びXbaIで消化して、断片Ｃ（２２５ｂｐ）を生じさせる。
【０２６０】
SalI／XbaI消化によってプラスミドpVR1012を直鎖化して、断片Ｅ（４８８０ｂｐ）を生じさせる。
【０２６１】
その後、断片Ｅ及びＡを精製し、連結してプラスミドpNB228（５１１１ｂｐ）を生じさせる。図１９にpNB228のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０２６２】
その後、断片Ｅ及びＢを精製し、連結してプラスミドpNB297（５１１４ｂｐ）を生じさせる。図２０にpNB297のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０２６３】
その後、断片Ｅ及びＣを精製し、連結してプラスミドpNB298（５１０５ｂｐ）を生じさせる。図２１にpNB298のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０２６４】
実施例１３及び実施例６、１１、１２に記載の方法に従って、下記のプライマーを使用して、イヌＧＨＲＨ配列の代わりにブタＧＨＲＨ（配列番号８２）を含むプラスミドpNB297及びpNB298に類似したプラスミドを構築する：
【０２６５】
プライマーＮＢ３６１に対応するＮＢ４６４（３７ｍｅｒ）5'-TTTACGCGTCGACATGCTGCTGTGGGTGTTCTTCCTG-3'（配列番号８３）、及び
【０２６６】
プライマーＮＢ４７６に対応するＮＢ４６５（３９ｍｅｒ）5'-TTTTGCTCTAGATTAGCCCAGCCTCACCCTGGCGCCCTG-3'（配列番号８４）
【０２６７】
プライマーＮＢ３６２に対応するＮＢ４１６（２７ｍｅｒ）5'-TTTGTATACGCCGACGCCATCTTCACC-3'（配列番号８５）、及び
【０２６８】
プライマーＮＢ３６３に対応するＮＢ４１８（３８ｍｅｒ）5'-AAAGCTCTAGATTACAGCCTCACCCTGGCGCCCTGCTC-3'（配列番号８６）
【０２６９】
プライマーＮＢ４７６に対応するＮＢ４６５（３９ｍｅｒ）（配列番号８４）。
【０２７０】
ブタＧＨＲＨ（２３１ｍｅｒ）（配列番号８２）：5'-ATGCTGCTGTGGGTGTTCTTCCTGGTGACCCTGACCCTGAGCAGCGGCAG CCTGAGCAGCCTGCCCAGCCAGCCCCTGAGGATGCCCAGGTACGCCGACG CCATCTTCACCAACAGCTACAGGAAGGTGCTGGGCCAGCTGAGCGCCAGG AAGCTGCTGCAGGACATCATGAGCAGGCAGCAGGGCGAGAGGAACCAGGA GCAGGGCGCCAGGGTGAGGCTGGGCAGGCAGGTGGACAGCATGTGGGCCG ACCAGAAGCAGATGGCCCTGGAGAGCATCCTGGCCACCCTGCTGCAGGAG CACAGGAACAGCCAGGGCTGA-3'。
【実施例１４】
【０２７１】
プラスミドpNB299及びpNB300の構築
pNB299プラスミドは、成熟ＧＨＲＨ（３１〜７４ＡＡ）と融合したウマＩＧＦ１シグナル配列（ＳＳＩＧＦ１）をコードする核酸断片を含むpVR1012プラスミド（Vical社製）骨格に対応する。
【０２７２】
pNB300プラスミドは、リンカーテトラペプチド（ＧＳＧＳ）を介して成熟ＧＨＲＨ（前駆体のアミノ酸３１〜７４）及びイヌ血清アルブミン（前駆体のアミノ酸２５〜６０８）と融合したウマＩＧＦ１シグナル配列（ＳＳＩＧＦ１）をコードする核酸断片を含むpVR1012プラスミド（Vical社製）骨格に対応する。
【０２７３】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるSalI及びPshAI部位を有する、成熟ＧＨＲＨ（３１〜７４ＡＡ）と融合したウマＩＧＦ１シグナル配列（ＳＳＩＧＦ１）に対応するＤＮＡ断片は、プライマーＮＢ３９３及びＮＢ４７７、鋳型であるプラスミドpNB232、並びにＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって得られる。
【０２７４】
ＮＢ３９３（３８ｍｅｒ）：5'-TTTGCGTCGACGCCACCATGCACATCATGAGCAGCAGC-3'（配列番号１７）（その５’末端上にSalI部位を含む）
【０２７５】
ＮＢ４７７（５０ｍｅｒ）：5'-AAATCTAGAGCCGGTTTAAAAGACCGTAGTCGTACCTTTGCTCCTTGCTC-3'（配列番号７５）（その５’末端上にXbaI及びPshAI部位を含む）
【０２７６】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（２５０ｂｐ）を精製し、その後それをSalI及びXbaIで消化して、断片Ａ（２３６ｂｐ）を生じさせる。
【０２７７】
SalI／XbaI消化によってプラスミドpVR1012を直鎖化して、断片Ｅ（４８８０ｂｐ）を生じさせる。
【０２７８】
その後、断片Ｅ及びＡを精製し、連結してプラスミドpNB299（５１１６ｂｐ）を生じさせる。図２２にpNB299のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０２７９】
５’及び３’末端にそれぞれさらなるNaeI及びXbaI部位を有する、イヌ血清アルブミン（アミノ酸２５〜６０８）と融合したリンカーＧＳＧＳに対応するＤＮＡ断片は、ＲＴ−ＰＣＲによって得られる。
【０２８０】
肝をイヌから収集し、それを液体窒素中で直ちに凍結する。QIAGEN社製のキット（Rneasy Mini Protocol for Isolation of Total RNA、カタログ参照番号７４１０４）を使用して、組織から全ＲＮＡを抽出する。そのキットの変性溶液６００μｌ中で、Potter Dounceを用いて肝の細胞を解離させる。この溶液は、グアニジンイソチオシアネート及びβ−メルカプトエタノールを含む。組織ホモジネートを、１４０００ＲＰＭ（１分当たりの回転数）で５分間遠心分離して、砕片を除去する。７０％エタノール溶液６００μｌを添加し、その混合物をRneasyカラム上に充填し、１００００ＲＰＭで１５秒間遠心分離する。キットに付いているＲＷ１緩衝液でカラムを２回洗浄する。１４０００ＲＰＭで１分間の遠心分離後、ＲＮアーゼを含まない緩衝液５０μｌを用いてＲＮＡを溶出させる。５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ８．３、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、ＲＮアーゼ阻害剤２０単位、Moloneyネズミ白血病ウイルス逆転写酵素５０単位、２．５μＭのランダムヘキサヌクレオチドプライマー、及び肝の全ＲＮＡ２μｌを含む反応混合物２０μｌ中でｃＤＮＡを合成する。下記のサイクルで逆転写のステップを行う：２３℃で５分間、４２℃で２０分間、９９℃で５分間及び１０℃で５分間。ＤＮＡポリメラーゼ及び下記の反応用オリゴヌクレオチドを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｃＤＮＡ貯留物を増幅する：
【０２８１】
ＮＢ４７８（４３ｍｅｒ）：5'-TTTGCCGGCTCAGGATCCGAAGCATATAAGAGTGAGATTGCTC-3'（配列番号７８）（その５’末端上にNaeI部位及びリンカーＧＳＧＳを含む）
【０２８２】
ＮＢ４７９（３５ｍｅｒ）：5'-AAAGCTCTAGATTAGACTAAGGCAGCTTGAGCAGC-3'（配列番号７９）（その５’末端上にXbaI部位を含む）
【０２８３】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（１７８４ｂｐ）を精製し、その後それをNaeI及びXbaIで消化して、断片Ｂ（１７６８ｂｐ）を生じさせる。
【０２８４】
PshAI／XbaI消化によってプラスミドpNB299を直鎖化して、断片Ｃ（５０９８ｂｐ）を生じさせる。
【０２８５】
その後、断片Ｃ及びＢを精製し、連結してプラスミドpNB300（６８６６ｂｐ）を生じさせる。図２３にpNB300のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを示す。
【０２８６】
本実施例１４に記載の方法に従って、下記のプライマーを使用して、イヌＧＨＲＨ配列の代わりにブタＧＨＲＨ（配列番号８２）を含むプラスミドpNB299及びpNB300に類似したプラスミドを構築する：
【０２８７】
プライマーＮＢ４７７に対応するＮＢ４５９（５３ｍｅｒ）5'-AAATCTAGAGCCGGTTTAAAAGACCGTAGTCTCACCCTGGCGCCCTGCTCCTG-3'（配列番号８７）
【０２８８】
プライマーＮＢ４７８に対応するＮＢ４５７（４０ｍｅｒ）5'-TTTGCCGGCTCAGGATCCGATACATACAAGAGTGAAATTG-3'（配列番号８８）、及び
【０２８９】
プライマーＮＢ４７９に対応するＮＢ４５８（２９ｍｅｒ）5'-AAAGCTCTAGATTAGGCTAAGATCCCTCG-3'（配列番号８９）。
【０２９０】
本発明の有利な実施形態をこうして詳細に説明してきたが、本発明の趣旨又は範囲から逸脱せずに、その多数の明らかな変更形態が考えられるので、上記の段落によって定義された本発明が、上記の記載に示した特定の細部に限られないことが理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０２９１】
【図１】pNB179のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号４９であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号５０である。
【図２】pNB209のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号２６であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号２７である。
【図３】pNB210のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号２８であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号２９である。
【図４】pNB211のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号３０であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３１である。
【図５】pNB212のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号３２であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３３である。
【図６】pNB213のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号３４であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３５である。
【図７】pNB214のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号３６であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３７である。
【図８】pNB215のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号３８であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３９である。
【図９】pNB216のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号４０であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号２７である。
【図１０】pNB217のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号４１であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３１である。
【図１１】pNB218のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号４２であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３５である。
【図１２】pNB219のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号４３であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３７である。
【図１３】pNB220のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号４４であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３９である。図１３は、pNB220のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。
【図１４】pNB240のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号５５であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号５６である。
【図１５】pNB239のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号５７であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号５８である。
【図１６】pNB244のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号５９であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号６０である。
【図１７】pNB232のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号６１であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号６２である。
【図１８】pNB245のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号６３であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号６４である。
【図１９】pNB228のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号６９であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号７０である。
【図２０】pNB297のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号７１であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号７２である。
【図２１】pNB298のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号７３であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号７４である。
【図２２】pNB299のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号７６であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号７７である。
【図２３】pNB300のプラスミド地図及びそのコードされたＯＲＦを描く図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号８０であり、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号８１である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図１】
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【配列表】
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