(57)【要約】  本発明は、42位のスレオニン、50位のイソロイシン、57位のヒスチジン、67位のスレオニン、133位のバリン、143位のスレオニン、145位のプロリン、148位のグリシン、152位のフェニルアラニン、196位のプロリン、240位のアラニン、281位のシステイン、309位のセリンよりなる群から選択される、野生型エキスパンダーゼの位置に対応する1つ以上の残基位置にアミノ酸置換（ただし281位のシステインの残基位置のアミノ酸置換はチロシンではない）を含む変異型ペニシリンエキスパンダーゼに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
42位のスレオニン、50位のイソロイシン、57位のヒスチジン、67位のスレオニン、133位のバリン、143位のスレオニン、145位のプロリン、148位のグリシン、196位のプロリン、240位のアラニン、281位のシステイン、309位のセリンよりなる群から選択される、野生型エキスパンダーゼの位置に対応する1つ以上の残基位置にアミノ酸置換を含み、ただし281位のシステインの残基位置のアミノ酸置換はチロシンではない、変異型ペニシリンエキスパンダーゼ。
【請求項２】
野生型エキスパンダーゼはストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）から得られる、請求項1の変異型ペニシリンエキスパンダーゼ。
【請求項３】
T42A、I50V、H57R、T67A、V133I、T143S、P145L、G148E、P196S、A240T、C281R、およびS309Pよりなる群から選択される1つ以上の残基位置にアミノ酸置換を含む、請求項1の変異型ペニシリンエキスパンダーゼ。
【請求項４】
V133I／P196S；F152L／C281R；T42A／F152L／S309P；V133I／T143S／P196S／S309P、H57R／A240T、H57R／A240T／C281R、T67A／A240T／C281R、I50V／F152L／A240T／C281R、H57R／A240T／I305M、H57R／I305M、H57R／A240T／C281R／I305M、およびT67A／A240T／C281R／I305Mのアミノ酸置換を含む、請求項1の変異型ペニシリンエキスパンダーゼ。
【請求項５】
請求項1のエキスパンダーゼ変異をコードする修飾エキスパンダーゼ遺伝子。
【請求項６】
請求項1に記載の類似の位置に置換を有するアクレモニウム・クリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）の修飾デアセトキシ／デアセチルセファロスポリンCシンターゼ。
【請求項７】
請求項1の変異型ペニシリンエキスパンダーゼを有する宿主株。
【請求項８】
請求項1の変異型ペニシリンエキスパンダーゼを有する発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾エキスパンダーゼ（expandase）酵素、特にペニシリンGのような基質に対する特異性が上昇したペニシリンNエキスパンダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
β−ラクタム抗生物質は、低い毒性、高い特異性、および広範囲の病原性生物に対する臨床的有効性のために、抗感染性セグメントの大きな部分を占める。細菌や真菌の無数の微生物が、古典的なβ−ラクタム抗生物質（例えば、ペニシリン類、セファロスポリン類、セファマイシン類）および非古典的抗生物質（例えばクラブラン酸やチエナマイシン）を産生する。ペニシリウム・クリゾゲナム（Penicillium chrysogenum）やセファロスポリウム・アクレモニウム（Cephalosporium acremonium）（いずれも真菌）は、それぞれペニシリンGとセファロスポリンGを産生する。細菌であるストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）は、古典的な抗生物質セファマイシンと非古典的抗生物質クラブラン酸（これはそのβ−ラクタマーゼ阻害について広く知られている）を産生する。これらの抗生物質の合成に関与する種々の酵素の生合成、遺伝的制御、および生化学的解析については総説（Jensen, S.E.とDemain, A.L. (1993)、「抗生物質の生化学と遺伝学／生合成（Biochemistry and Genetics of Antibiotics/Biosynthesis）」、Vining, L.C.とStuttard, C.編、バターワース−ハイネマン（Butterworth-Heinemann）、ボストン）を参照されたい。
【０００３】
多くの感染性微生物は天然に存在するペニシリン抗生物質に対して耐性になっており、その耐性機構はβ−ラクタマーゼによる分解を介して作用し、従って新規のより強力な抗生物質が必要とされている。セファロスポリン類は、耐性細菌に対する有効性が顕著であり、新規の半合成誘導体を開発するために多くの研究が行われている。セファレキシン、セファドキシルおよびセフラジンのようなセファロスポリン誘導体は、7-アミノデアセトキシセファロスポラン酸（7-ADCA）に適切な側鎖を結合させることにより製造される。現在7-ADCAはフェニルアセチル7-ADCAから製造され、これは高価で汚染の多い化学的方法によりペニシリンGから合成される。それ自体が環境にやさしく化学的方法より安価な方法である生物変換法が必要である。
【０００４】
デスアセトキシセファロスポリンCシンターゼ（DAOCS）としても知られているペニシリンNエキスパンダーゼ（penicillin N expandase）は、ストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）、ストレプトミセス・ラクタムデュランス（Streptomyces lactamdurans）、キサントモナス・ラクタムゲヌス（Xanthomonas lactamgenus）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）種、ストレプトミセス・オルガナネンシス（Streptomyces organanensis）、ストレプトミセス・ラクタムゲンス（Streptomyces lactamgens）、ストレプトミセス・フラジエ（Streptomyces fradiae）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、およびストレプトミセス・オフィバセウス（Streptomyces ofivaceus）のような種に存在する酵素であり、ペニシリンの5員のチアゾリジン環核からセファロスポリン類の6員のジヒドロチアジン核への変換を触媒し、セファロスポリン誘導体の合成のための代替経路の明確な選択肢となっている。
【０００５】
ストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）から分離されたペニシリンNエキスパンダーゼは詳細に解析されており、Kovacevic S.ら、J. Bacteriol. 171(2):754-760, 1989, Dotzlaf, J.E.ら、J. Biol. Chem. 264:10219-10226, 1989、およびValegard, K.ら、Nature 394:805-809, 1998に記載されている。エキスパンダーゼの天然の基質であるペニシリンNは容易に入手はできず、アジポイル側鎖を切断することは非効率的である。一方ペニシリンGは容易に入手でき、フェニルアセチル側鎖基はペニシリンGアミダーゼにより高効率で切断することができる。しかしペニシリンGはペニシリンNエキスパンダーゼの良好な基質ではない。従って商業的投資にはエキスパンダーゼを工学的に作成することが必要であり、かかる修飾エキスパンダーゼおよびその使用はWO01/85951、US6,699,699B2、およびUS20030186354に記載されている。
【０００６】
US公報第20030186354号は、メチオニン73、グリシン79、バリン275、ロイシン277、システイン281、グリシン300、アスパラギン304、イソロイシン305、スレオニン91、アラニン106、システイン155、チロシン184、メチオニン188、およびヒスチジン244（ただし、アスパラギン304の残基位置のアミノ酸置換はN304Lではなく、システイン155の残基位置のアミノ酸置換はC155Yではない）よりなる群から選択される、野生型エキスパンダーゼ中の位置に対応する1つ以上の残基位置のアミノ酸置換を含む変異型ペニシリンエキスパンダーゼを開示する。
【０００７】
本発明の主要な目的は、ペニシリンGまたはペニシリンVのような基質に対して野生型エキスパンダーゼより何倍も高い拡張活性を有する変異型エキスパンダーゼを提供することである。
図１：配列番号1は、ストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）のペニシリンNエキスパンダーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【発明の開示】
【０００８】
従って本発明は、修飾または改良された環拡張活性を有する変異型ペニシリンエキスパンダーゼを提供する。好ましくはエキスパンダーゼはペニシリンNエキスパンダーゼであり、これは改変されて、基質としてのペニシリンGまたはペニシリンVに対する活性を野生型エキスパンダーゼよりも上昇させる。
【０００９】
本発明の別の実施態様において、エキスパンダーゼ変異をコードする修飾エキスパンダーゼ遺伝子が提供される。
本発明の別の実施態様において、修飾されたエキスパンダーゼ活性を有するタンパク質が提供される。
本発明の別の実施態様において、修飾エキスパンダーゼ遺伝子を含む発現ベクターが提供される。
本発明の別の実施態様において、発現ベクターで形質転換された宿主株が提供される。
【００１０】
別の態様において本発明は、42位のスレオニン、50位のイソロイシン、57位のヒスチジン、67位のスレオニン、133位のバリン、143位のスレオニン、145位のプロリン、148位のグリシン、152位のフェニルアラニン、196位のプロリン、240位のアラニン、281位のシステイン、309位のセリンよりなる群から選択される、野生型エキスパンダーゼの位置に対応する1つ以上の残基位置にアミノ酸置換（ただし281位のシステインの残基位置のアミノ酸置換はチロシンではない）を含む変異型ペニシリンエキスパンダーゼを提供する。特に本発明は、T42A、I50V、H57R、T67A、V133I、T143S、P145L、G148E、F152L、P196S、A240T、C281R、S309P、V133I、およびP196S；F152LとC281R；T42A、F152L、およびS309P；V133I、T143S、P196S、およびS309P（ここでアミノ酸置換の残基位置は野生型エキスパンダーゼの位置に対応する）よりなる群から選択される1つ以上の特異的アミノ酸置換を含む変異型ペニシリンエキスパンダーゼを提供する。
【００１１】
別の態様において本発明は、本発明で開示されるものと類似の位置に置換を有する、ストレプトミセス・ラクタムデュランス（Streptomyces lactamdurans）、キサントモナス・ラクタムゲヌス（Xanthomonas lactamgenus）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）種、フラボバクテリウム・チチノボルナ（Flavobacterium chitinovoruna）、ストレプトミセス・オルガナネンシス（Streptomyces organanensis）、ノカルディア・ラクタムデュランス（Nocardia lactamdurans）、ストレプトミセス・リプマニイ（Streptomyces lipmanii）、ストレプトミセス・ジュモンジネンシス（Streptomyces jumonjinensis）、ストレプトミセス・ワダヤメンシ（Streptomyces wadayamensi）、ストレプトミセス・カトレヤ（Streptomyces cattleya）、ストレプトミセス・ラクタムゲンス（Streptomyces lactamgens）、ストレプトミセス・フラジエ（Streptomyces fradiae）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、およびストレプトミセス・オリバセウス（Streptomyces olivaceus）、ストレプトミセス（Streptomyces）種、およびアクレモニウム・クリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）のような微生物中に見られるエキスパンダーゼの天然に存在するかまたは天然に存在しない変種を提供する。
【００１２】
別の態様において本発明は、アクレモニウム・クリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）のような微生物からの大きな拡張活性を有するエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ（デアセトキシ／デアセチルセファロスポリンCシンターゼとしても知られている）のようなエキスパンダーゼの変種を提供する。変種は、変種を配列番号1の配列と整列することにより当業者が同定することができる。例えば配列番号1の304位のアスパラギンと同等のアミノ酸は、変種を配列番号1の配列と整列させて、配列番号1の304位と同等の残基を同定することにより同定される。
【００１３】
修飾エキスパンダーゼ遺伝子を含有する大腸菌（E．coli）DH5αの修飾株は、微生物タイプカルチャーコレクションセンター（Microbial Type Culture Collection center）（チャンディガー（Chandigarh）、インド）にブダペスト条約に従って寄託され、以下の受け入れ番号を付与された：2004年3月23日に寄託されたMTCC5133、MTCC5134、MTCC5135、MTCC5136、MTCC5137、MTCC5138、MTCC5139、MTCC5140、MTCC5141、MTCC5142、MTCC5143、および2004年7月20日に寄託されたMTCC5160、MTCC5161、MTCC5162、MTCC5163、MTCC5164、MTCC5165、およびMTCC5166。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、変異型ペニシリンエキスパンダーゼを提供し、これは、基質として好ましくはペニシリンGまたはペニシリンVに対して、野生型エキスパンダーゼより上昇したまたは修飾された環拡張活性を示す。
【００１５】
本発明の変異型ペニシリンエキスパンダーゼは、ストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）から得られるエキスパンダーゼ、または他の生物から得られるエキスパンダーゼを含む。
【００１６】
ストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）からのペニシリンNエキスパンダーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配列番号1に示す（図1）。
【００１７】
本発明の主要な態様は、ペニシリンGまたはペニシリンVに対する良好な基質特異性を有する変異型ペニシリンエキスパンダーゼを提供し、ここで変異型ペニシリンエキスパンダーゼは、42位のスレオニン、50位のイソロイシン、57位のヒスチジン、67位のスレオニン、133位のバリン、143位のスレオニン、145位のプロリン、148位のグリシン、152位のフェニルアラニン、196位のプロリン、240位のアラニン、281位のシステイン、309位のセリンよりなる群から選択される、野生型エキスパンダーゼの位置に対応する1つ以上の残基位置にアミノ酸置換（ただし281位のシステインの残基位置のアミノ酸置換はチロシンではない）を含む。
【００１８】
配列番号1の配列の変種をここに示す：
50位のイソロイシンはバリンにより置換される；
57位のヒスチジンはアルギニンにより置換される；
67位のスレオニンはアラニンにより置換される；
145位のプロリンはロイシンにより置換される；
148位のグリシンはグルタミン酸により置換される；
152位のフェニルアラニンはロイシンにより置換される；
240位のアラニンはスレオニンにより置換される；
133位のバリンはイソロイシンにより置換される；および196位のプロリンはセリンにより置換される；
【００１９】
152位のフェニルアラニンはロイシンにより置換され、281位のシステインはアルギニン（チロシンではない）により置換される；
42位のスレオニンはアラニンにより置換される；152位のフェニルアラニンはロイシンにより置換され、309位のセリンはプロリンにより置換される；
133位のバリンはイソロイシンにより置換され、143位のスレオニンはセリンにより置換される；196位のプロリンはセリンにより置換され、309位のセリンはプロリンにより置換される；
57位のヒスチジンはアルギニンにより置換され、240位のアラニンはスレオニンにより置換される；
57位のヒスチジンはアルギニンにより置換され、240位のアラニンはスレオニンにより置換され、281位のシステインはアルギニンにより置換される；
67位のスレオニンはアラニンにより置換され、240位のアラニンはスレオニンにより置換され、281位のシステインはアルギニンにより置換される；
50位のイソロイシンはバリンにより置換され、152位のフェニルアラニンはロイシンにより置換され、240位のアラニンはスレオニンにより置換され、281位のシステインはアルギニンにより置換される；
57位のヒスチジンはアルギニンにより置換され、240位のアラニンはスレオニンにより置換され、305位のイソロイシンはメチオニンにより置換される；
57位のヒスチジンはアルギニンにより置換され、305位のイソロイシンはメチオニンにより置換される；
57位のヒスチジンはアルギニンにより置換され、240位のアラニンはスレオニンにより置換され、281位のシステインはアルギニンにより置換され、305位のイソロイシンはメチオニンにより置換される；
67位のスレオニンはアラニンにより置換され、240位のアラニンはスレオニンにより置換され、281位のシステインはアルギニンにより置換され、305位のイソロイシンはメチオニンにより置換される。
【００２０】
本発明の修飾ペプチドは、記載の修飾、例えば50位のイソロイシンの修飾を含んでよい。
【００２１】
上記したように配列番号1のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドは、本発明に従って修飾することができる。本発明で使用される変種は、エキスパンダーゼ活性を有するものである。本発明の修飾変種は、修飾されていない変種配列と比較した時、ペニシリンGまたはペニシリンVのような環基質を拡張させる改良された能力を示すものである。
【００２２】
アミノ酸配列にアミノ酸置換が行うことができる。配列番号1のアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸残基は、代替的または付加的に欠失される。本発明のポリペプチドはまた、上記配列の断片を含む。かかる断片はエキスパンダーゼ活性を保持する。
【００２３】
かかる断片は、他のエキスパンダーゼポリペプチドから得られる酵素の部分を使用してキメラ酵素を産生するのに使用される。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、実質的に単離された形である。ポリペプチドは担体または希釈剤と混合され、これはポリペプチドの目的を妨害せず、まだ実質的に単離されていると見なされることは理解されるであろう。本発明のポリペプチドはまた、実質的に精製された形であり、この場合これは、一般的に調製物中にポリペプチドを含有し、ここで調製物中の90重量％を超えるポリペプチド、例えば95重量％、98重量％、または99重量％のポリペプチドが本発明のポリペプチドである。
【００２５】
本発明のポリペプチドは、組換え発現ベクターからポリペプチドのインサイチュ発現により細胞中に導入される。発現ベクターは場合により、ポリペプチドの発現を制御する誘導性プロモーターを有する。
【００２６】
本発明のポリペプチドが発現されるかかる細胞培養系は、フェニルアセチル7-ADCAの産生に使用される。
【００２７】
本発明は以下の実施例により例示されるが、これらは決して本発明の範囲を限定するものではない。
【００２８】
すべての生化学品、試薬、およびオリゴヌクレオチドは、シグマ−アルドリッチケミカルズピーブイティー社（Sigma-Aldrich Chemicals Pvt. Ltd.）またはUSB（アメリカ合衆国）から得た。制限酵素と菌株は、ニューイングランドバイオラボズ社（New England Biolabs Inc.）（アメリカ合衆国）から購入した。pET24a(+)ベクターおよびバッグバスター（BugBuster）試薬はノバゲン（Novagen）（アメリカ合衆国）から購入した。ストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）とペニシリウム・クリゾゲナム（Penicillium chrysogenum）株は、ATCCから得た。
【００２９】
エキスパンダーゼ遺伝子のクローニング
ストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）（ATCC27064）培養物を、250mlの円錐フラスコ中の50mlのYMG培地（1リットル当たり酵母エキス 4g、麦芽エキス 10g、グルコース 4g、pH7.0）中で、26℃でロータリーシェーカーで180rpmで、600nmのODが3.00に達するまで増殖させた。培養物を13000rpmで20℃で10分間遠心分離して、細胞ペレットを採取した。細胞ペレットを、10mgのリゾチーム（200μlの50mg/mlストック）を含有するTE緩衝液（pH8.0）（培養物容量の1/10）に再懸濁し、混合物を30℃で30分間インキュベートし、次に1mlの10％ SDS、トリス塩酸（pH8.0）を飽和させた5mlのフェノール、および750μlの5M NaClを添加した。混合物を含有する試験管を静かに数回転倒させ、20分間室温に維持した。懸濁物を16,000rpmで20℃で10分間遠心分離して相を分離した。水層を新鮮な遠心分離管に移した後、2容量のイソプロピルアルコールを加え、試験管を静かに数回転倒させ、生じた混合物を室温で10分間放置した。これを再度16,000rpmで20℃で10分間遠心分離し、ペレットをTE緩衝液（pH8.0）に再懸濁した。DNAを溶解後、RNaseAを最終濃度20μg/mlになるように加え、懸濁物を50℃で1時間インキュベートした。プロテイナーゼKを最終濃度200μg/mlになるように加え、次に100mM NaClと0.4％ SDSとを加え、混合物を37℃で1時間インキュベートした。懸濁物を再度等量のフェノールで抽出し、再度16,000rpmで20℃で10分間遠心分離し、水層を新鮮な試験管に移した。混合物を同様にクロロホルムで抽出し、水層をイソプロパノールで処理し、-20℃で1時間放置した。13,000rpmで20℃で10分間遠心分離してDNAを沈殿させ、ペレットを50μlのTE緩衝液（pH8.0）に再懸濁した。
【００３０】
上記したように単離したストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）（ATCC27064）ゲノムDNAから、オリゴヌクレオチド（5'GAGCATATGGACACGACGGTGCCC3'、5'GATTGCTGCTGTGACCATGACGGT3'）を使用して、1×ベント（Vent）DNAポリメラーゼ緩衝液、10％ DMSO、1mM MgSO4、2.5単位のディープベント（Deep Vent）DNAポリメラーゼを含有する100μlの反応容量で50μl重層して、エキスパンダーゼ遺伝子を増幅した。増幅プロセスは、95℃で5分のインキュベーションを1サイクル、変性のための95℃で40秒のインキュベーション、アニーリングのための60℃で30秒のインキュベーション、および伸張のための72℃で5分のインキュベーションを25サイクル、次に72℃で15分伸張の最後のサイクルから構成された。増幅から生じる断片を精製し、SmaI制限切断pUC19ベクターにクローン化した。遺伝子の配列はさらに配列決定により証明した。
【００３１】
変異体の作成
オリゴヌクレオチド5'ATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATT3'、5'CTCACTCATTAGGCACCCCAGGCT3'を使用してヌクレオチド濃度を偏らせることにより、1×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液、10％ DMSO、10ngの鋳型、および3単位のTaq DNAポリメラーゼを含有する100μlの反応容量で、修復ミスの多いポリメラーゼ連鎖反応を使用して突然変異誘発を行った。増幅プロセスは、エキスパンダーゼ遺伝子のクローニングについて記載したように行った。断片をさらに精製し、NdeIとBamHIで消化した。これを、同様に消化したpET24aに3：1のモル比で加え、0.5mM ATP、10×T4 DNAリガーゼ緩衝液、および3単位のT4 DNAリガーゼを使用して、12℃で一晩インキュベーションして連結反応を行った。次に、1μlの連結ミックスを使用して、CaCl2により調製したコンピタントな大腸菌（E．coli）BL21(DE3)を形質転換した。カナマイシン下で組み換え体を選択した。ある場合には変異体鋳型を使用して、追加の変異を生成させた。
【００３２】
部位特異的突然変異誘発：
所望の変異を誘導するためにミスマッチを取り込んだオリゴヌクレオチドを、単独で、またはM13KO7ヘルパーファージの助けで大腸菌（E．coli）CJ236から作成した1本鎖鋳型との複数の組合せで、アニーリングした。1本鎖の未変性のまたは変異体エキスパンダーゼ遺伝子鋳型を、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、第2版、Sambrookら、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、1989に記載のような標準的方法により単離した。次に、200μMの各dNTP、0.2mg/mlのBSA、0.5mMのATP、2単位のT4 DNAリガーゼ、3単位のT4 DNAポリメラーゼ、および10mMのMgCl2の存在下で、42℃で20分間、20μlの反応容量でインビトロ第2鎖合成を行った。EDTAで反応を停止させた後、1μlを大腸菌（E．coli）DH5αの形質転換のために使用した。制限分析と次にDNA配列決定により、変異体を確認した。
【００３３】
エキスパンダーゼ変異体の発現
推定される変異構築体を有する大腸菌（E．coli）BL21(DE3)の単一のコロニーを、抗生物質を補足したLBを含有する96ウェル培養プレートに接種し、37℃で220rpmで増殖させた。光学密度が0.6〜0.8に達した時、IPTGを加えて発現を誘導し、さらに25℃で3時間培養した。次にプレートをマイクロプレート遠心分離機で4000rpmで遠心分離し、ペレットを50mMトリス塩酸（pH7.5）、1mM ジチオスレイトール、0.01mM EDTA、10％ グリセロール、および50mM グルコースを含有する緩衝液に再懸濁し、-80℃で保存した。
【００３４】
エキスパンダーゼ変異体の測定
発現単離体を氷上で融解し、100μlのバッグバスター（BugBuster）試薬で25℃で10分間処理して、細菌の溶解を促進した。30μlの新に調製した10×ミックスと30μlの100mMペニシリンG基質をウェルに加えてエキスパンダーゼアッセイを開始し、混合し、ブレスシール（breathseal）でカバーをして、シェーカー中で25℃で30分間インキュベートした。ミックス中の成分の最終濃度は、50mM 硫酸アンモニウム、1mM α-ケトグルタール酸、50μM アスコルビン酸、2mM ジチオスレイトール、2mM FeSO4、および10mM ペニシリンGであった。150μlのCH3OHと150μlのH2Oとを加えて反応をクエンチさせた。
【００３５】
エキスパンダーゼ変異体の一次スクリーニング
25μlのアッセイミックスをブランクのペーパーディスクにのせ、乾燥させ、大腸菌（E．coli）ESS（カナダのアルバータ（Alberta）大学のS.E. Jensen教授から提供された）を広げたペニシリナーゼを含有するLBプレート上にのせた。プレートを37℃で一晩インキュベートし、未変性のエキスパンダーゼより大きな阻害ゾーンを有するクローンを、さらなる定量と配列決定による確認のための候補リストに入れた。
【００３６】
HPLCを使用するエキスパンダーゼ活性の定量
アッセイ試料を4℃で30分間遠心分離し、その20μlを注入し、メタノールとリン酸緩衝液との混合物を使用してHPLCによりC18カラムで溶出プロフィールを追跡した。ペニシリンGからセファロスポリンGへの変換は、セファロスポリンGを標準物質として使用して定量し、いくつかのエキスパンダーゼ変異体の相対的活性レベルを表1に示す。
【００３７】
【表１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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