(57)【要約】  本発明は、線状または環状ペプチド、ならびに医薬および特に、炎症性軟骨破壊に関連する疾患、例えば、炎症性関節疾患など、例えば、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、感染性関節炎および若年性特発性関節炎など、関節構造に関与する他の疾患、例えば、骨関節炎、半月板損傷、痛風など、筋骨格系の構造エレメントに影響を及ぼす疾患、例えば、腱損傷、靭帯損傷など、ならびに骨疾患、例えば、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化を含む腫瘍動脈に影響を及ぼす疾患の処置および／または予防のための医薬品の製造における前記ペプチドの使用に関する。本発明による線状または環状ペプチドの最小コア配列は、例えば、ＷＬＥＡＫ、ＬＲＲＷＬＥＡＫ、ＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫ、ＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＡＳ、ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＡＳＲＰＤＡＴＣ、ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＣ、ＣＷＬＥＡＫＣ、ＫＲＳＫＫ、ＣＫＲＳＫＫＣ、ＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨおよびＣＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨのようなペプチドを含んでなる［ＷＫＹ］−［ＬＲ］−［ＥＳ］−［ＡＫＤＥ］−Ｋである。
2007535517.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式１
Ｐ１−ｘ１−ｘ２−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−ｘ７−ｘ８−ｘａ−ｘｂ−ｘｃ−ｘｄ−Ｋ−ｙ１−ｙ２−ｙ３−ｙ４−ｙ５−ｙ６−ｙ７−ｙ８−Ｐ２、
（式中、ｘａは、Ｗ、ＫまたはＹから選択され、
ｘｂは、ＬまたはＲから選択され、
ｘｃは、ＥまたはＳから選択され、
ｘｄは、Ａ、Ｋ、ＤまたはＥから選択され、
ｘ１は、Ｃまたは存在しないから選択され、
ｘ２は、Ｑまたは存在しないから選択され、
ｘ３は、Ｌまたは存在しないから選択され、
ｘ４は、Ｒ、Ｃまたは存在しないから選択され、
ｘ５は、Ｇ、Ｋまたは存在しないから選択され、
ｘ６は、Ｌ、Ｆまたは存在しないから選択され、
ｘ７は、Ｒ、Ｐまたは存在しないから選択され、
ｘ８は、Ｒ、Ｃ、Ｔまたは存在しないから選択され、
ｙ１は、Ａ、Ｃまたは存在しないから選択され、
ｙ２は、Ｓ、Ｇまたは存在しないから選択され、
ｙ３は、Ｒまたは存在しないから選択され、
ｙ４は、Ｐ、Ｈまたは存在しないから選択され、
ｙ５は、Ｄまたは存在しないから選択され、
ｙ６は、Ａまたは存在しないから選択され、
ｙ７は、Ｔまたは存在しないから選択され、
ｙ８は、Ｃまたは存在しないから選択され、
そして、Ｐ１およびＰ２は存在しないかまたは保護基である）で表される線状または環状ペプチドの使用であって、
炎症性軟骨破壊に関連する疾患、例えば、炎症性関節疾患など、例えば、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、感染性関節炎および若年性特発性関節炎など、関節構造に関与する他の疾患、例えば、骨関節炎、半月板損傷、痛風など、筋骨格系の構造エレメントに影響を及ぼす疾患、例えば、腱損傷、靭帯損傷など、ならびに骨疾患、例えば、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化を含む腫瘍動脈に影響を及ぼす疾患の処置および／または予防のための医薬品の製造における使用。
【請求項２】
Ｐ１はアセチルであるかまたは存在せず、Ｐ２はアミドであるかまたは存在しない請求項１に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項３】
ｘ２−ｘ３は、Ｑ−Ｌまたは存在しないから選択され、ｙ５−ｙ６−ｙ７は、Ｄ−Ａ−Ｔであるかまたは存在しない請求項１または２に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項４】
ｘ４−ｘ５−ｘ６−ｘ７は、Ｒ−Ｇ−Ｌ−Ｒ、Ｃ−Ｋ−Ｆ−Ｐまたは存在しないから選択され、ｙ２−ｙ３−ｙ４は、Ｓ−Ｒ−Ｐ、Ｇ−Ｒ−Ｈまたは存在しないから選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項５】
式１は、ＫＲＳＫＫ（配列番号４）である請求項１〜３のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項６】
式１は、ＣＫＲＳＫＫＣ（配列番号１６）である請求項１〜３のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項７】
式１は、ＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ（配列番号６）である請求項１〜３のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項８】
式１は、ＣＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ（配列番号７）またはその保護された形態（配列番号１５）である請求項１〜３のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項９】
ｘａは、ＷまたはＴから選択され、ｘｂはＬであり、ｘｃはＥであり、ｘｄは、ＡまたはＥから選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項１０】
ｘａはＷであり、ｘｂはＬであり、ｘｃはＥであり、ｘｄはＡである請求項９に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項１１】
式１は、ＷＬＥＡＫ（配列番号１）である請求項１０に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項１２】
式１は、ＬＲＲＷＬＥＡＫ（配列番号２）である請求項１０に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項１３】
式１は、ＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫ（配列番号３）である請求項１０に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項１４】
式１は、ＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＡＳ（配列番号１１）である請求項１０に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項１５】
式１は、ＣＷＬＥＡＫＣ（配列番号１３）である請求項１０に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項１６】
式１は、ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＡＳＲＰＤＡＴＣ（配列番号９）またはその保護された形態（配列番号１２）である請求項１０に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項１７】
式１は、ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＣ（配列番号１４）である請求項１０に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項１８】
前記ペプチドは環状である請求項３〜１７のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチドの使用。
【請求項１９】
以下の式１
Ｐｌ−ｘｌ−ｘ２−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−ｘ７−ｘ８−ｘａ−ｘｂ−ｘｃ−ｘｄ−Ｋ−ｙｌ−ｙ２−ｙ３−ｙ４−ｙ５−ｙ６−ｙ７−ｙ８−Ｐ２、
（式中、ｘａは、Ｗ、ＫまたはＹから選択され、
ｘｂは、ＬまたはＲから選択され、
ｘｃは、ＥまたはＳから選択され、
ｘｄは、Ａ、Ｋ、ＤまたはＥから選択され、
ｘ１は、Ｃまたは存在しないから選択され、
ｘ２は、Ｑまたは存在しないから選択され、
ｘ３は、Ｌまたは存在しないから選択され、
ｘ４は、Ｒ、Ｃまたは存在しないから選択され、
ｘ５は、Ｇ、Ｋまたは存在しないから選択され、
ｘ６は、Ｌ、Ｆまたは存在しないから選択され、
ｘ７は、Ｒ、Ｐまたは存在しないから選択され、
ｘ８は、Ｒ、Ｃ、Ｔまたは存在しないから選択され、
ｙ１は、Ａ、Ｃまたは存在しないから選択され、
ｙ２は、Ｓ、Ｇまたは存在しないから選択され、
ｙ３は、Ｒまたは存在しないから選択され、
ｙ４は、Ｐ、Ｈまたは存在しないから選択され、
ｙ５は、Ｄまたは存在しないから選択され、
ｙ６は、Ａまたは存在しないから選択され、
ｙ７は、Ｔまたは存在しないから選択され、
ｙ８は、Ｃまたは存在しないから選択され、
そして、Ｐ１およびＰ２は存在しないかまたは保護基である）で表される線状または環状ペプチド。
【請求項２０】
Ｐ１はアセチルであるかまたは存在せず、Ｐ２はアミドであるかまたは存在しない請求項１９に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項２１】
ｘ２−ｘ３は、Ｑ−Ｌまたは存在しないから選択され、ｙ５−ｙ６−ｙ７は、Ｄ−Ａ−Ｔであるかまたは存在しない請求項１９または２０に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項２２】
ｘ４−ｘ５−ｘ６−ｘ７は、Ｒ−Ｇ−Ｌ−Ｒ、Ｃ−Ｋ−Ｆ−Ｐまたは存在しないから選択され、ｙ２−ｙ３−ｙ４は、Ｓ−Ｒ−Ｐ、Ｇ−Ｒ−Ｈまたは存在しないから選択される請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項２３】
式１は、ＫＲＳＫＫ（配列番号４）である請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項２４】
式１は、ＣＫＲＳＫＫＣ（配列番号１６）である請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項２５】
式１は、ＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ（配列番号６）である請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項２６】
式１は、ＣＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ（配列番号７）またはその保護された形態（配列番号１５）である請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項２７】
ｘａは、ＷまたはＴから選択され、ｘｂはＬであり、ｘｃはＥであり、ｘｄは、ＡまたはＥから選択される請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項２８】
ｘａはＷであり、ｘｂはＬであり、ｘｃはＥであり、ｘｄはＡである請求項２７に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項２９】
式１は、ＷＬＥＡＫ（配列番号１）である請求項２８に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項３０】
式１は、ＬＲＲＷＬＥＡＫ（配列番号２）である請求項２８に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項３１】
式１は、ＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫ（配列番号３）である請求項２８に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項３２】
式１は、ＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＡＳ（配列番号１１）である請求項２８に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項３３】
式１は、ＣＷＬＥＡＫＣ（配列番号１３）である請求項２８に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項３４】
式１は、ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＡＳＲＰＤＡＴＣ（配列番号９）またはその保護された形態（配列番号１２）である請求項２８に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項３５】
式１は、ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＣ（配列番号１４）である請求項２８に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項３６】
前記ペプチドは環状である請求項２１〜３５のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項３７】
医薬における使用のための請求項１９〜３６のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチド。
【請求項３８】
請求項１９〜３６のいずれか一項に記載の線状または環状ペプチドを１つもしくはそれ以上のアジュバント（ａｄｊｕｔａｎｔ）、キャリアまたは賦形剤と共に含んでなる薬学的組成物。
【請求項３９】
被験体の炎症性軟骨破壊、例えば、炎症性関節疾患など、例えば、関節リウマチ、乾癬性関節炎、骨関節炎のインビボでの処置および／または予防のための方法であって、それを必要とする被験体に、請求項１９〜３６のいずれか一項に記載の化合物または請求項３８に記載の組成物の有効量を投与すること含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織変化に関連する疾患、例えば、炎症性関節疾患など、例えば、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、感染性関節炎および若年性特発性関節炎など、関節構造に関与する他の疾患、例えば、骨関節炎、半月板損傷、痛風など、筋骨格系の構造エレメントに影響を及ぼす疾患、例えば、腱損傷、靭帯損傷など、ならびに骨疾患、例えば、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化を含む主要動脈に影響を及ぼす疾患、血管炎および損傷をもたらす外傷、喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む肺疾患の処置および／または予防のための方法に関する。本発明はまた、そのような方法および組成物における使用のための新規化合物に関し、好適な態様において、本発明は、コアペプチド配列ＷＬＥＡＫ(配列番号１)を伴う新規ペプチド化合物に関する。
【０００２】
ここでは、主な対象の組織変化のタイプは、炎症性軟骨破壊（ｉｎｆｌａｍａｔｏｒｙ
ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）
に関与する変化である。
【０００３】
さらなる態様において、本発明は、例えば、インテグリン受容体および／またはポリアニオン構造などの受容体と相互作用する化合物、例えば、ヘパリン／ヘパラン硫酸などに関する。
【背景技術】
【０００４】
組織の破壊は多くの器官タイプに影響を及ぼす疾患の特徴であり、高齢化が特に重要視される集団に増加している問題である。これらの疾患の多くは慢性炎症の要素を有する。そのような疾患の例には、関節リウマチ、骨関節炎、骨粗鬆症、動脈硬化（ａｒｔｈｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、慢性肺疾患、腱炎、腰痛および椎間板ヘルニアを伴う脊椎の問題がある。これらの疾患は、社会的にもおよび個人にかかる負担においても、主要な疾患カテゴリーの中で、他を大きく引き離して最も大きな出費をもたらす。
【０００５】
関節炎は、種々の炎症性関節疾患の一般名である。関節疾患は、集団において極めて一般的である。関節リウマチの罹患者は約１％である一方、骨関節炎は、少なくとも約１０％の発症率で、さらにかなり一般的である。２つの疾患の実体の主な特徴は、関節構造の進行的破壊ならびに疼痛および障害を引き起こす炎症である。
【０００６】
現在、例えば、関節リウマチの徴候は、いくつかの患者については、医学的処置、例えば、副腎皮質ステロイドを含む抗炎症剤、物理療法または手術によって、緩和することができる。サイトカインのインヒビター、特に、ＴＮＦ−αの最近の使用により、重度の関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｔｈｒｉｔｉｓ）を伴う患者の３分の２の状況が改善されている。
【０００７】
しかし、多くの患者は、上記の処置に効果的には応答しないか、または処置は、多くの所望されない副作用をもたらす（例えば、非特許文献１を参照のこと）。
【０００８】
さらなる化合物に共役されたコンドロアドヘリン（ＣＨＡＤ）が、組織変化に対する効果を有すること（特許文献１）は当該分野において公知であり、また、コンドロアドヘリンと組み合わされたコラーゲンＩＩ（特許文献２）は、椎間板を処置するために使用され得ることも示されている。本発明は、驚くべきことに、コンドロアドヘリンおよび純粋な化合物としてのそのフラグメントは、組織損傷性疾患に関連するパラメータを除去および
／または阻害するのに所望の効果を有することを示す。
【０００９】
特に、処置の効率および副作用の減少の観点から、組織変化に関連する疾患の処置に関する新規のアプローチの必要性が存在する。
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０１３７８６１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３０４９６６９号パンフレット
【非特許文献１】スモレン（Ｓｍｏｌｅｎ）およびシュタイナー（Ｓｔｅｉｎｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、第２巻、（２００３年）、４７３−４８８
【発明の開示】
【００１１】
従って、本発明は、組織変化に関連する疾患、例えば、炎症性関節疾患など、例えば、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、感染性関節炎および若年性特発性関節炎など、関節構造に関与する他の疾患、例えば、骨関節炎、半月板損傷、痛風など、脊椎の椎間板に関与する疾患、例えば、腰痛、筋骨格系の構造エレメントに影響を及ぼす疾患、例えば、腱損傷、靭帯損傷など、ならびに骨疾患、例えば、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化を含む主要動脈に影響を及ぼす疾患、血管炎および損傷をもたらす外傷、喘息およびＣＯＰＤを含む肺疾患の処置および／または予防のための方法を提供する。それを必要とする被験体に、以下の少なくとも１つが可能な処置および／または予防量の化合物を投与することを含んでなる方法：
ａ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の表現型の変化を調節すること、
ｂ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞によって、細胞外マトリックス分子の産生を調節すること、
ｃ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の異化作用因子、例えば、ＮＯ、サイトカインおよび／またはプロテイナーゼの正常な産生ならびに活性を阻害すること、
ｄ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の分裂を調節すること、
ｅ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞移動を調節すること、
ｆ）増殖因子の産生を調節すること、ならびに／あるいは、
ｇ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の外部刺激に対する応答を調節すること。
【００１２】
本発明による方法の一般的な目的は、細胞に、特定の作用を実施するように指向させることであり、該特定の作用のすべてが組織変化に関連する疾患に対してポジティブな効果を有する。
【００１３】
ここでは、主な対象の組織変化のタイプは、炎症性軟骨破壊に関与する変化である。組織変化に関連する疾患に関与する細胞のタイプは、問題の疾患および罹患した組織に依存する。上記の疾患に関与する細胞の例には、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、線維芽細胞、腱細胞、平滑筋細胞、マクロファージならびに滑膜線維芽細胞および樹状細胞のような前炎症性細胞がある。
【００１４】
特定の実施形態において、疾患に関与する細胞は軟骨細胞である。上記の方法の以下の説明は、一般に、組織変化に関連する疾患に関与する細胞のすべてのタイプを対象にするが、特定の細胞、例えば、軟骨細胞および平滑筋細胞を参考にして、軟骨細胞に関連する組織変化を処置または防止するために、これらの細胞の挙動をどのようにして調節すべきかについて記載する。
【００１５】
特定の態様において、本発明の方法は、それを必要とする被験体に、組織変化に関連する疾患に関与する細胞の表現型の変化を調節することが可能な治療および／または予防量の化合物を投与することを含んでなる。本明細書における用語「表現型」の特定の規定は単純ではなく、当業者であれば、該用語が細胞の特徴に関連し、多くのレベルで規定され
得ることを理解するであろう。最も単純かつ伝統的に使用されるパラメータは、細胞形状である。表現型を同定する他の方法は、例えば、個別のパターンのマトリックスタンパク質、プロテイナーゼおよび増殖因子の産生のような分子の細胞産生、細胞の定常、移動、異化および／または同化状態の同定、ならびに細胞が分裂または非分裂であるかどうかの同定によってである。従って、本発明による使用のための化合物は、単独で、細胞の表現型に影響を及ぼすことができる。しかし、本発明の特定の実施形態において、他の少なくとも１つの因子は、（主作用として）細胞の表現型に対する効果を有することなく、本発明による化合物の使用の影響を受け得る。例として、例えば、増殖因子の産生を調節することによるものが挙げられる。
【００１６】
いずれの特定の理論にも限定されることなく、本発明者らは、特定の実験において、特に、円形の軟骨細胞が細胞挙動に関連することを見出した。
【００１７】
本発明による方法における項目ｂについて、組織破壊のような組織変化をもたらすプロセスの１つは、組織損傷を修復することができない。組織は、しばしば、いくつかのマトリックス構成要素の産生の増加によって応答するが、組織構造の適切な集成に必要なすべての成分の調和した産生が欠如することが次第に明らかにされている。結果は、阻害された集成であるようであり、活性が不十分な修復プロセスよりもさらに不良である。従って、細胞外マトリックス成分の産生を調節することによって、組織構造の適切な集成を得ることができる。
【００１８】
本発明の方法の項目ｃ：組織変化をもたらすもう１つのプロセスは、組織の衰弱および破壊をもたらす組織構造分子の崩壊の増加である。これは、例えば、組織細胞自体によって産生されるプロテイナーゼによって、達成され得る。組織破壊の成分を伴うすべての組織において、プロテイナーゼ産生の増加が認められる。細胞を刺激して、プロテイナーゼの産生を減少させることによって、組織構造分子の崩壊を防止することができる。以下においてさらに詳細に説明するように、例えば、軟骨細胞上のインテグリン受容体のような受容体への特定のリガンドの結合は、プロテイナーゼの産生の減少をもたらす。
【００１９】
本発明の方法の項目ｄ：細胞が増殖している場合、細胞によるマトリックス成分の産生は最小であり、即ち、細胞は、組織の修復に寄与していない。従って、細胞分裂を防止することによって、細胞をマトリックス成分の産生および組織修復に集中するようにシフトさせることができる。細胞分裂は、インテグリン受容体の活性に依存すると考えられ、即ち、受容体を刺激するかまたは阻害するリガンドを添加することにより、インテグリン受容体の活性を調節することによって、細胞分裂を調節することができる。
【００２０】
本発明による項目ｅ：組織変化によって関連付けられる疾患を処置する方法は、そのような疾患に関与する細胞移動を阻害することである。例えば、動脈硬化（ａｔｈｒｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）では、平滑筋細胞の動脈内膜への移動が認められ得る。これらの細胞は蓄積し、それらのうちの多くは分裂する。同時に、脂肪がこれらの細胞内およびそれらの周辺で増し、それらはまた、結合組織を形成する。従って、動脈の最内層は、これらの蓄積する細胞および周囲の材料によって、顕著に厚化する。壁が十分に厚化する場合、動脈の内腔が減少し、血流が減少し、従って、酸素供給を減少する。細胞移動は、インテグリン受容体の活性に依存すると考えられ、即ち、受容体と相互作用するリガンドを添加することにより、インテグリン受容体の活性を調節することによって、細胞移動を阻害することができる。
【００２１】
本発明者らは、特定の状況における軟骨細胞の細胞移動の阻害は、組織変化に関連する疾患の改善に有利であることを見出した。
【００２２】
本発明の方法の項目ｆ：組織変化に関連する疾患の処置のための別の開始ポイントは、増殖因子の産生の調節である。増殖因子は、例えば、細胞分裂、組織増殖およびマトリックス構成要素の産生の調節に重要な役割を果たす遺伝子産物である。各増殖因子は特定の細胞表面受容体を有し、増殖因子のその受容体への結合は、細胞分裂を開始するか、または場合により阻止し得る。極めて高いレベルの特定の増殖因子、ｔｇｆ−βは、骨関節炎において認められる変化を誘導することが示されており、ｔｇｆ−βレベルもまた、過度のコラーゲン産生をもたらす肺線維症において高い。
【００２３】
より具体的には、本発明による方法における使用のための化合物は、細胞の細胞表面上の構造と相互作用することによって、上記の疾患に関連する細胞に対するそれらの作用を仲介する。そのような構造の例には、受容体および／またはポリアニオン構造、特に、ヘパリンおよび硫酸ヘパランを含むヘパリン類似物質がある。従って、本発明は、１つもしくはそれ以上の化合物が以下について可能である方法に関する：
ａ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の表面で発現される受容体と相互作用すること、
ｂ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の表面において発現されるかまたは該表面上に存在するヘパラン硫酸（但し、これに限定されない）などのポリアニオン構造と相互作用すること、ならびに／あるいは
ｃ）１つもしくはそれ以上の受容体および／または１つもしくはそれ以上のポリアニオン構造との組み合わされた相互作用。
【００２４】
本方法において、化合物は、受容体およびポリアニオン構造の両方か、あるいは２つもしくはそれ以上の受容体および／または２つもしくはそれ以上のポリアニオン構造と相互作用することが可能である。受容体は、しばしば、至適活性のためにポリマー化する必要があり、即ち、２つもしくはそれ以上の受容体またはポリアニオン構造を架橋することが可能な１つの化合物を提供することによって、二量体化またはポリマー化が確実にされ、至適活性がもたらされる。さらに、２つもしくはそれ以上の結合点が関与する場合、結合がより緊密になるため、化合物の受容体および／またはポリアニオン構造への結合が増加する。例えば、コンドロアドヘリンは、２つの特定の結合ドメイン（一方は受容体インテグリンに対するものおよび他方はヘパリン類似物質結合に対するもの）を有すると考えられる。従って、そのような物質は、１つもしくはそれ以上の機能性を有し得る。
【００２５】
軟骨細胞は軟骨における細胞の唯一のタイプであり、軟骨ホメオスタシスにおいて重要な機能を有する。軟骨細胞の役割は、マトリックス分子の正常なターンオーバーおよび分子の機能性マトリックスへの沈着を含む。
【００２６】
本発明者らによる研究は、軟骨細胞が、細胞の調節に関連するいくらかの細胞表面構造を発現することを示している。
【００２７】
関連細胞表面構造は、インテグリン受容体を含む。インテグリン受容体は、異なる１８種のα鎖および異なる８種のβ鎖から選択され得る１つのαおよび１つのβ鎖の複合体である。多様なインテグリン受容体は、異なるリガンドを有し、異なる応答を発揮し得る。
【００２８】
細胞の調節に関連する軟骨細胞上の細胞表面構造のもう１つの例は、ポリアニオン構造、例えば、ヘパリン／ヘパラン硫酸などのようなヘパリン類似物質、コンドロイチン／デルマタン硫酸鎖、または硫酸化ガングリオシドもしくはリン脂質のクラスターである。
【００２９】
ヘパリン類似物質、ヘパラン硫酸は細胞表面に偏在し、ここで、それは、膜貫通シンデカンファミリーまたはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型グリピカンファミリーのいずれかのプロテオグリカン上において主に見出され得る。
【００３０】
本明細書を通して、ヘパリン類似物質という用語はまた、ヘパリン類似物質模倣物を含む。
【００３１】
本発明者らは、コンドロアドヘリンが軟骨細胞上のインテグリンα２β１受容体への細胞の結合を阻害することを見出したが、これは、コンドロアドヘリンが、インテグリンα２β１受容体を介して、軟骨細胞に結合することを強く示唆する。コンドロアドヘリンは、ロイシンリッチの軟骨マトリックスタンパク質である。コンドロアドヘリンの結合は、円形を維持し、同化作用形態に留めるように細胞を誘導し、ＥＣＭ分子の産生に対して細胞を刺激するようであり、細胞の拡散および／または移動ならびに細胞分裂を防止する。研究はまた、例えば、コラーゲンＩＩなどの他のほとんどの天然のインテグリンリガンドが細胞に対してほぼ逆の効果を有することも示している。
【００３２】
本明細書において示されるように、ヒト軟骨細胞は、生来のコンドロアドヘリンに対するのと同等に、ホールディングされていないコンドロアドヘリンにも接着することから、線状のペプチド配列が接着を仲介していることが示される。また、コンドロアドヘリンの消化により、コンドロアドヘリンの小さい方のフラグメントが上記の効果を仲介することが可能であることが示されている。
【００３３】
従って、本発明の１つの特定の実施形態において、受容体ａ）はインテグリン受容体であり、１つもしくはそれ以上の化合物は、１つもしくはそれ以上のコンドロアドヘリンフラグメントまたはそのアナログを含んでなり得るペプチドである。
【００３４】
本発明者らは、コンドロアドヘリンの特定のフラグメント（ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫ−配列番号３）を同定したが、これは、例えば、インテグリンα２β１受容体のようなインテグリン受容体を介して軟骨細胞に結合させる時に、上記のような軟骨細胞に対する効果を有するように考慮され、即ち、細胞の拡散および移動を防止し、同時に細胞は、円形の表現型を維持する傾向がある。さらなる研究により、ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫに類似のサブフラグメントＬＲＲＷＬＥＡＫ（配列番号２）が細胞拡散および移動を防止し、細胞の円形を維持することが示されている。インテグリン結合性のための活性は、ＷＬＥＡＫ配列（配列番号１）に関与する配列のＣ末端残基に局在する。本発明者らは、リジンを、塩基性側鎖を伴う別のアミノ酸、つまりアルギニンと交換する場合、配列のインテグリン結合特性が失われることから、即ち、ＷＬＥＡＫ（配列番号１）配列中のリジンが活性に必要であることを見出した。
【００３５】
しかし、リジンが別のアミノ酸と交換される配列がその活性を維持する可能性は否定できない。
【００３６】
本発明者らはまた、トリプトファンの芳香族側鎖を伴う別のアミノ酸、つまりチロシンへの交換およびグルタミン酸の別のアミノ酸、つまりアスパラギン酸への交換は、配列のインテグリン結合活性に何ら影響を及ぼさないことを見出した。
【００３７】
従って、本発明は、コンドロアドヘリンフラグメントの少なくとも１つが、配列番号１（ＷＬＥＡＫ）のアミノ酸配列に対し、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一性を有する方法に関する。
【００３８】
配列番号１に対し少なくとも６０％同一性を有する配列の例には、以下の配列Ｘａａ−Ｌ−Ｙａａ−Ａ−Ｋ、
（式中、Ｘａａは、トリプトファンおよびチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎ）から選択され得、
Ｙａａは、グルタミン酸およびアスパラギン酸から選択され得る）がある。
【００３９】
本発明はまた、コンドロアドヘリンフラグメントの少なくとも１つが、配列番号２（ＬＲＲＷＬＥＡＫ）のアミノ酸配列に対し、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一性を有する方法に関する。
【００４０】
さらに、本発明は、コンドロアドヘリンフラグメントの少なくとも１つが、配列番号３（ＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫ）のアミノ酸配列に対し、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一性を有する方法に関する。
【００４１】
本発明者らはまた、細胞表面上のシンデカンへのコンドロアドヘリンの結合が細胞分裂を防止し、接着の増加をもたらすことを見出した。
【００４２】
シンデカンは、接着およびシグナル伝達に能動的に参加する重要な細胞表面接着共同受容体として認識される４つの膜貫通ヘパラン硫酸プロテオグリカンのファミリーである。
【００４３】
コンドロアドヘリンは、ヘパリン／ヘパラン硫酸鎖を介してシンデカンに結合する。本発明者らは、ヘパリン／ヘパラン硫酸と相互作用するコンドロアドヘリンの特定のフラグメントを同定した。
【００４４】
従って、本発明は、コンドロアドヘリンフラグメントの少なくとも１つが、配列番号４（ＫＲＳＫＫ）のアミノ酸配列に対し、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一性を有する方法に関する。
【００４５】
本発明はまた、コンドロアドヘリンフラグメントの少なくとも１つが、配列番号５（ＫＫＡＧＲＨ）のアミノ酸配列に対し、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一性を有する方法に関する。
【００４６】
さらに、本発明はまた、コンドロアドヘリンフラグメントの少なくとも１つが、配列番号６（ＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ）のアミノ酸配列に対し、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一性を有する方法に関する。
【００４７】
さらに、本発明は、コンドロアドヘリンフラグメントの少なくとも１つが、配列番号７（ＣＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ）のアミノ酸配列に対し、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一性を有する方法に関する。
【００４８】
別の実施形態では、本発明によるペプチドは、シグナル伝達を調節するために、インテグリン受容体に結合可能な少なくとも１つのコンドロアドヘリンフラグメント、およびヘパリン／ヘパラン硫酸に結合可能な少なくとも１つのコンドロアドヘリンフラグメントを含んでなり、ここで、ヘパリン／ヘパラン硫酸は、シンデカンおよびグリピカンの細胞外ドメイン上に見出すことができる。
【００４９】
特定の実施例において、ペプチドは、
ｉ）配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列の１つ、および
ｉｉ）配列番号４、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列の１つ
に対し少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％もしくは少なくとも約９５％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【００５０】
アミノ酸配列に関して、「配列同一性」は、例えば、可変ｐａｍ因子（ｐａｍｆａｃｔｏｒ）を伴うＦＡＳＴＡ  ｐｅｐ−ｃｍｐ、ならびに１２．０に設定されたギャップ作製ペナルティ（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）および４．０に設定されたギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）、ならびに２アミノ酸のウインドウを使用するＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データバンクを使用して評価される場合、上記の値を有する配列を指す。特定の残基における配列同一性には、単に誘導化されているだけの同一の残基も含まれることが意図される。
【００５１】
上記のように、研究により、コンドロアドヘリンの線状フラグメントは、それらの細胞表面構造と強度に相互作用することが示されている。他のペプチドおよび細胞表面構造については、ペプチドが非線状である場合、相互作用はより良好であり得る。
【００５２】
環状ペプチドはエキソペプチダーゼに対してより耐性であるため、より安定なペプチドを作製する目的で、環状となるようにペプチドを設計してもよい。さらに、保護基、例えば、アセチル、アミドまたはメチル、当該分野において周知のツールは、分解および代謝分解に対してペプチドを安定化するのにさらに役立つ合成修飾物である。
【００５３】
本発明は、特に、一般式（Ｉ）
式Ｉ
Ｐ１−ｘ１−ｘ２−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−ｘ７−ｘ８−ｘａ−ｘｂ−ｘｃ−ｘｄ−Ｋ−ｙ１−ｙ２−ｙ３−ｙ４−ｙ５−ｙ６−ｙ７−ｙ８−Ｐ２
（式中、ｘａは、Ｗ、ＫまたはＹから選択され、
式中、ｘｂは、ＬまたはＲから選択され、
式中、ｘｃは、ＥまたはＳから選択され、
式中、ｘｄは、Ａ、Ｋ、ＤまたはＥから選択され、
式中、ｘ１は、Ｃまたは存在しないから選択され、
式中、ｘ２は、Ｑまたは存在しないから選択され、
式中、ｘ３は、Ｌまたは存在しないから選択され、
式中、ｘ４は、Ｒ、Ｃまたは存在しないから選択され、
式中、ｘ５は、Ｇ、Ｋまたは存在しないから選択され、
式中、ｘ６は、Ｌ、Ｆまたは存在しないから選択され、
式中、ｘ７は、Ｒ、Ｐまたは存在しないから選択され、
式中、ｘ８は、Ｒ、Ｃ、Ｔまたは存在しないから選択され、
式中、ｙ１は、Ａ、Ｃまたは存在しないから選択され、
式中、ｙ２は、Ｓ、Ｇまたは存在しないから選択され、
式中、ｙ３は、Ｒまたは存在しないから選択され、
式中、ｙ４は、Ｐ、Ｈまたは存在しないから選択され、
式中、ｙ５は、Ｄまたは存在しないから選択され、
式中、ｙ６は、Ａまたは存在しないから選択され、
式中、ｙ７は、Ｔまたは存在しないから選択され、
式中、ｙ８は、Ｃまたは存在しないから選択され、
式中、Ｐ１およびＰ２は存在しないかまたは保護基である）の新規の線状または環状ペプチド、ならびにそれらの使用、または薬学的に活性なその塩の、炎症性軟骨破壊に関連する組織変化に関する疾患、障害の処置および／または診断のための医薬品の製造における使用を提供する。
【００５４】
別の実施形態では、本発明は、参考とする添付の特許請求の範囲においてさらに例示されるような新規ペプチドに関する。上記のような類似の考察もまた、これらのペプチドに関連する。
【００５５】
薬学的組成物
本発明はまた、以下が可能な化合物を含んでなる薬学的組成物であって：
ａ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の表現型の変化を調節すること、
ｂ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞によって、細胞外マトリックス分子の産生を調節すること、
ｃ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の異化作用因子、例えば、ＮＯ、サイトカインおよび／またはプロテイナーゼの正常な産生ならびに活性を阻害すること、
ｄ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の分裂を調節すること、
ｅ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞移動を調節すること、
ｆ）増殖因子の産生を調節すること、ならびに／あるいは、
ｇ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の外部刺激に対する応答を調節すること、
１つもしくはそれ以上の薬学的賦形剤を伴う上記薬学的組成物に関する。
【００５６】
さらに、本発明は、以下が可能な化合物を含んでなる薬学的組成物であって：
ａ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の表面で発現される受容体と相互作用すること、
ｂ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の表面において発現されるかまたは該表面上に存在するポリアニオン構造と相互作用すること、ならびに／あるいは
ｃ）１つもしくはそれ以上の受容体および／または１つもしくはそれ以上のポリアニオン構造との組み合わされた相互作用。
１つもしくはそれ以上の薬学的賦形剤を伴う上記薬学的組成物に関する。
【００５７】
１つの実施形態では、受容体はインテグリン受容体である。
【００５８】
本発明による薬学的組成物は、通常、１つもしくはそれ以上の生理学的に許容可能な賦形剤、即ち、治療的に不活な物質またはキャリアを伴う特定の化合物を含んでなる。
【００５９】
キャリアは、所望の剤形および投与経路に依存して広範な形態をとることができる。
【００６０】
薬学的に許容可能な賦形剤は、例えば、充填剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、流動化剤、溶媒、乳化剤、懸濁剤、安定剤、増強剤、風味剤、着色剤、ｐＨ調整剤、遅延剤、湿潤剤、表面活性剤、保存剤、抗酸化剤などであり得る。詳細については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅまたはＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋのような製剤ハンドブックにおいて見出すことができる。薬学的組成物が放出制御を目的とするような場合では、それはまた、放出制御型薬剤、例えば、マトリックス錠の処方で通常使用されるような材料（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのようなセルロース誘導体）を含んでなり得る。あるいは、組成物を、腸溶コーティングまたはフィルムコーティングのような放射制御型コーティングで被覆してもよい。適切なコーティングは、実質的に水不溶性であるが、水透過性コーティングであり得る。
【００６１】
化合物は、個々の目的に有効である用量で、例えば、経口、口内、鼻、眼、肺、局所、経皮、膣、直腸、眼、非経口（とりわけ、皮下、筋肉内、関節内（ｉｎｔｒａａｒｉｃｕｌａｒ）および静脈内を含む）経路のような任意の適切な経路によって、投与することができる。当業者であれば、適切な投与経路の選択の仕方を知っているであろう。
【００６２】
本発明による化合物を含んでなる薬学的組成物は、固体、半固体または液体組成物の形態であってもよい。
【００６３】
固体組成物は、例えば、従来の錠剤、発泡錠、コーティング錠、溶解錠もしくは舌下錠のような錠剤、ペレット、散剤、細粒剤、顆粒剤（ｇｒａｎｕｌａｔｅ）、粒状物質、固体分散体または固溶体の形態であってもよい。
【００６４】
半固形形態の組成物は、ペースト、クリーム、軟膏、ゲルまたはハイドロゲルであってもよい。
【００６５】
液体形態の組成物は、溶液、ナノエマルジョンを含むエマルジョン、懸濁剤、分散剤、リポソーム組成物、噴霧剤、混合物、シロップ剤またはエリキシル剤であってもよい。
【００６６】
本発明による薬学的組成物の他の適切な剤形は、膣剤（ｖａｇｉｔｏｒｉｅｓ）、坐剤、硬膏、パッチ剤、錠剤、カプセル、サシェ、トローチ、デバイスなどであってもよい。
【００６７】
薬学的組成物は、薬学的処方において当業者に周知の方法のいずれかによって調製することができる。
【００６８】
本発明はまた、以下が可能な化合物の使用に関する：
組織変化に関連する疾患の処置および／または予防のための薬学的組成物の調製のために、
ａ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の表現型の変化を調節すること、
ｂ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞によって、細胞外マトリックス分子の産生を調節すること、
ｃ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の異化作用因子、例えば、ＮＯ、サイトカインおよび／またはプロテイナーゼの正常な産生ならびに活性を阻害すること、
ｄ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の分裂を調節すること、
ｅ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞移動を調節すること、
ｆ）増殖因子の産生を調節すること、ならびに／あるいは、
ｇ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の外部刺激に対する応答を調節すること。
【００６９】
本発明は、以下が可能な化合物の使用にさらに関する：
ａ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の表面で発現される受容体と相互作用すること、
ｂ）組織変化に関連する疾患に関与する細胞の表面において発現されるかまたは該表面上に存在するポリアニオン構造と相互作用すること、ならびに／あるいは
ｃ）１つもしくはそれ以上の受容体および／または１つもしくはそれ以上のポリアニオン構造との組み合わされた相互作用。
【００７０】
受容体はインテグリン受容体である。
【００７１】
化合物とインテグリン受容体との間の相互作用は、任意の適切な方法によって検出することができる。適切な方法の１つの例は、細胞形状の任意の変更を測定するための細胞の顕微鏡分析である。もう１つの検出方法は、細胞挙動の変更の検出を伴った。
【００７２】
化合物とインテグリン受容体との間の結合の検出のためのもう１つの方法は、インテグリン受容体を発現する細胞およびインテグリン受容体に対する固定化された天然のリガンドを含んでなるアッセイへの問題の化合物の添加、ならびに化合物が、細胞の天然のリガンドへの結合を阻害するかどうかの評価を含む。
【００７３】
結合は、標的化されたペプチドのＦＡＣＳ分析、およびプラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって、測定することができる。
【００７４】
化合物とポリアニオン構造との間の相互作用は、任意の適切な方法によって検出することができる。適切な方法の１つの例は、細胞形状の任意の変更を測定するための細胞の顕微鏡分析である。もう１つの検出方法は、例えば、細胞移動のような細胞挙動における変更の検出を伴った。
【００７５】
化合物とポリアニオン性細胞表面構造との間の結合の検出のためのもう１つの方法は、ポリアニオン構造を発現する細胞およびポリアニオン構造に対する固定化された天然のリガンドを含んでなるアッセイへの問題の化合物の添加、ならびに化合物が、細胞の天然のリガンドへの結合を阻害するかどうかの評価を含む。
【００７６】
結合は、標的化されたペプチドのＦＡＣＳ分析、および等温滴定熱量計（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｃｏｌｏｍｅｔｒｙ）（ＩＴＣ）によって、測定することができる。
【００７７】
本発明はまた、細胞外マトリックス構成要素の産生に関する化合物または２つもしくはそれ以上の化合物の組み合わせの活性を試験するためのインビトロ方法に関し、該方法は、以下を含んでなる：
ａ）試験しようとする１つもしくはそれ以上の化合物の存在下で細胞を培養すること、
ｂ）培養された組織エクスプラント由来のマトリックス成分の放出をモニターすること、ｃ）例えば、ＩＬ−１およびフィブロネクチンフラグメントのような異化作用因子によって刺激される組織エクスプラントの培養物由来のマトリックス成分の修飾された放出をモニターすること、
ｄ）増殖因子の存在下で培養された組織エクスプラント由来のマトリックス成分の修飾された放出をモニターすること、
ｅ）動物におけるモデル疾患、例えば、コラーゲン関節炎、ブレオマイシン肺線維症および骨関節炎の発達の進行の変調をモニターすること。
【実施例】
【００７８】
以下の実施例は、本発明を例示することを目的とするものであって、それを制限するものではない。
【００７９】
コンドロアドヘリン誘導性ペプチドが組織変化に関連する疾患に関与する細胞の表現型の変化を調節するという証拠を得るために、本発明者らは、そのような細胞（軟骨細胞、滑膜細胞）により、軟骨エクスプラントおよび関節炎動物モデルにおいて、実験を実施した。
【００８０】
材料および方法
組換えタンパク質の発現および精製
ヒトコンドロアドヘリンｃＤＮＡをｐＱＥ８ベクター（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．  Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州）に連結し、Ｍ１５大腸菌（Ｅ−ｃｏｌｉ）において発現させた。定常期の細菌の１晩培養物（８ｍｌ）を使用して、４００ｍｌ  ＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）に播種し、細胞を２．５時間、３７℃で増殖させた（０．７〜０．９のＯＤ６００）。２ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−ｐ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＣＯ．、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）の添加によってタンパク質発現を誘導し、培養を、さらに４．５時間、増殖させた。次いで、細菌を遠心分離によって回収し、凍結し、５ｍＭ  ＮＥＭ（Ｓｉｇｍａ）を含有する
溶解緩衝液（６Ｍ  ＧｕＨＣＩ、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４および０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。懸濁液を２１ゲージ針（２１Ｇ、０．８×５０）に１０回通過させ、細胞を溶解した。不溶性の破砕物を、遠心分離によって取り出した。本質的に、製造者由来の指示書に従って、Ｈｉｓタグ化組換えタンパク質を、Ｈｉ−Ｔｒａｐ  Ｎｉ−キレートカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、瑞国）を使用して精製した。溶解物をＮｉ２＋チャージカラムに適用し、１０容積の溶解緩衝液で洗浄し、結合タンパク質を、８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４および０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．３で溶出させた。１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０の添加によって、画分を直ちに中和した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって測定されるような所望のタンパク質を含有する画分（データ示さず）をプールし、水に対して透析し、凍結乾燥した。ＥＢＮＡ細胞により発現されるコンドロアドヘリンを、他に記載（８）のように、産生させた。
【００８１】
コンドロアドヘリンペプチドの作製
無傷（Ｉｎｔａｃｔ）な組換えタンパク質（１ｍｇ、ＥＢＮＡ細胞より発現（８））を、製造者の指示に従い、１：５０の酵素対基質比で、Ｌｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）でタンパク質消化した。ＳＭＡＲＴ−Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、０〜７０％アセトニトリルの勾配、０．１％ＴＦＡ（０．１ｍｌ／分、５０分間）により、Ｓｅｐｈａｓｉｌ  Ｃ８カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、瑞国）上での逆相クロマトグラフィーによって、作製されたペプチドを分離した。溶出物を、２８０ｎｍでの吸収でモニターした。画分をプールし、凍結乾燥し、ＰＢＳに再懸濁し、次いで、細胞接着実験に使用して、無傷（ｉｎｔａｃｔ）なコンドロアドヘリンへの接着を阻止した。
【００８２】
質量分析
Ｂｒｕｋｅｒ  Ｓｃｏｕｔ  ３８４Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＩＩマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析器を使用して、質量分析を実施した。計器は、遅延引き出しを伴う陽イオンモードおよび２６ｋＶの加速電圧で使用した。ペプチドサンプルを、主に、リフレクター型検出器を使用して分析し、５０〜１５０のシングルショットのスペクトルを、信号対ノイズ比の改善のために蓄積させた。得られるペプチドの質量を同定するために使用されるソフトウェアは、本明細書において記載のようなＰｒｏＦｏｕｎｄであった。
【００８３】
合成ペプチド
ポリペプチドは、化学合成または組換えＤＮＡ技術を含む合成の任意の従来の形態によって、調製することができる。化学合成は、末端アミノ酸の官能基の選択的脱保護および選択的に保護されたアミノ酸のカップリング、続いて、すべての官能基の完全な脱保護の反応のサイクルの組を包含する当該分野において周知の方法によって、実施することができる。合成は、溶液中で実施してもよく、または当該分野において既知の適切な固相を使用して、固相支持体上で実施してもよい。好ましくは、ポリペプチドは、実質的に精製された、例えば、パイロジェンフリーで、例えば、７０％を超える、特により好ましくは、９０％を超える純度である（例えば、ペプチドの場合、ペプチドマッピング、配列決定またはクロマトグラフィーのような適切な技術によって評価される）。精製は、例えば、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、サイズ除外、イオン交換、アフィニティー、疎水相互作用、逆相）またはキャピラリー電気泳動によって実施することができる。
【００８４】
ヘパリン結合
ＰＢＳ中に希釈された無傷（Ｉｎｔａｃｔ）な組換えタンパク質（１００ｅｌ  １０μｇ、ＥＢＮＡ細胞より発現）を、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（１ｍｌ）上に通過させ、２０容積のＰＢＳで洗浄し、２Ｍ  ＮａＣｌ（６×１ｍｌ）で溶出させた。溶出された材料をエタノールで沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）で分離し、ウエスタンブロットによって可視化した。（ＣＨＡＤ  ａｂ  α−８０、ラルッソン（Ｌａｒｓｓｏｎ）ら）。ペプチドＣＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ（配列番号７）をＰＢＳ中に希釈し、ヘパリンセファロース（１００μｌ）に通過させ、カラムを２０容積のＰＢＳで洗浄し、結合した材料を、０．５、１、および２Ｍ  ＮａＣｌ（それぞれ３カラム容積）で溶出させた。
【００８５】
細胞および細胞培養
ヒト軟骨肉腫由来のヒト細胞（Ｋ９）は、スヴェン  イナーロット（Ｓｖｅｎ  Ｉｎｅｒｏｔ）およびアンダーズ  リンダル（Ａｎｄｅｒｓ  Ｌｉｎｄａｈｌ）博士、Ｔｈｅ  Ｓａｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ、瑞国から贈呈されたものである。
Ｋ９細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地：１０％ウシ胎児血清、２５μｇ／ｍｌアスコルビン酸、５０ＩＵのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を補充したＧＬＵＴＡＭＡＸ  Ｉを伴うＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２  １：１）中で培養した。ヒト軟骨肉腫由来の異なるヒト細胞系統（Ｋ１０５）は、スヴェン  イナーロット（Ｓｖｅｎ  Ｉｎｅｒｏｔ）博士、Ｔｈｅ  Ｓａｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ、瑞国から贈呈されたものである。Ｋ１０５細胞を、１００ｎＭヒドロコルチゾン、１００ｎｇ／ｍｌインスリン、１０％ウシ胎児血清、２５μｇ／ｍｌアスコルビン酸、５０ＩＵのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を補充した４０％ダルベッコ改変イーグル培地、４０％最小必須培地（ＭＥＭ）αＭｅｄｉｕｍ、１０％Ｎｕｔｒｉｅｎｔ
Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１の混合物中で培養した。細胞を回収するために、培養ディシュを、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳで３回濯ぎ、細胞を、０．５％トリプシンおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡと共に、５分間、インキュベートした。剥離された細胞を、１ｍｇ／ｍｌトリプシンインヒビター（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中に懸濁し、次いで、ＰＢＳ中で洗浄した。膜結合性コラーゲンを取り出すために、細胞を、ＰＢＳ中コラゲナーゼ１００Ｕ／ｍｌ（ＣＬＳＰＡ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｌａｎｃｅｗｏｏｄ、ニュージャージー州）で、３０分間、３７℃で処置し、次いで、ＰＢＳ中で洗浄した。
【００８６】
（１０）に記載のように、ウシ軟骨細胞を、４〜６箇月齢のウシ由来の関節軟骨のコラゲナーゼ（ＣＬＳ１；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，
Ｌａｃｅｗｏｏｄ、ニュージャージー州）消化によって、単離した。簡単に説明すると、軟骨スライスを、１６時間、ＥＢＳＳ（Ｅａｒｌｅの緩衝塩類溶液、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｇａｉｔｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）中コラゲナーゼで消化した。細胞を、１００μｍナイロンフィルターを介してろ過し、０．２％ＢＳＡ（ＳＥＲＶＡ）を含有するＰＢＳ中で３回洗浄した。
【００８７】
細胞接着
組織培養４８ウェルディシュ（Ｎｕｎｃｌｏｎ，Ｎｕｎｃ、丁国）を、１晩、４Ｍグアニジン−ＨＣＩ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．８中５μｇ／ｍｌコンドロアドヘリンで、または生来のタンパク質についてはＰＢＳ中で、被覆した。あるいは、コーティングは、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ  ＩＩ型コラーゲンで処理し、続いて、コーティング後は、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡで３時間、処理した。ＩＩ型コラーゲンを、ペプシン消化によって、ウシ鼻軟骨から単離した（１１）。細菌で発現されるコンドロアドヘリンを、上記のように単離した。ＥＢＮＡ細胞において発現される組換えコンドロアドヘリンをクローニングし、他において記載（８）のように精製した。
【００８８】
細胞結合性を試験するために、軟骨肉腫細胞あるいはウシ軟骨細胞を、０．１％ＢＳＡ、２５Ｕ／ｍｌコラゲナーゼを含有するＰＢＳに懸濁し、多様なペプチドプールまたは合成ペプチド（２００、１００、５０、２５、１２．５μｇ／ｍｌ）の非存在もしくは存在下で、ウェル（５０，０００／ウェル）に添加した。非接着細胞を、１時間後に取り出し、リソソームＮ−アセチルグルコサミニダーゼを計測することによって、接着を測定した（１２）。接着および拡散を、光学顕微鏡によって可視化した。時間研究では、ｋ１０５細胞を３０分間接着させ、非結合細胞を取り出し、血清を伴わない、ペプチド（２５０μｇ／ｍｌ）、β１インテグリン抗体（クローンＰ４Ｃ１０、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）を補充したまたは補充していない培地を添加した。１、３および２０時間後に、細胞形態を光学顕微鏡により可視化した。
【００８９】
コンドロアドヘリンのアガロースへの結合
組換えコンドロアドヘリン（アガロース１ｍｌあたりＥＢＮＡ細胞において発現される２．５ｍｇ）を、製造者の指示に従って、Ｍｉｎｉ−Ｌｅａｋアガロース（Ｋｅｍ  Ｅｎ
Ｔｅｃ，Ａ／Ｓ、丁国）に結合させた。コントロールアガロースを、同じ様式で、但し、タンパク質の添加を伴わずに、処置した。
【００９０】
表面標識および膜の調製
ＰＢＳに懸濁されたヒト軟骨肉腫細胞（ｋ１０５）を、ＥＺ連結スルホＮＨＳ−ＬＣビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）と共に、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で、１時間、室温でインキュベートした。細胞を、１０分間、ＰＢＳ中０．１Ｍグリシン中で、インキュベートして、遊離のビオチンを阻止し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、次いで、１０ｍＭ  ＫＣＩ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（１ｍｌ／１０６細胞）中に再懸濁し、均質化した。１，５００ｇで５分間の遠心分離によって、核を取り出し、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを上清に添加して、５０，０００ｇ、３０分間の遠心分離によって、膜画分を回収した。ペレットを、ＣＯＭＰＬＥＴ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充したＴＢＳ  ｐＨ７．４中２ｍｌの８Ｍ尿素、２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１０００に懸濁した。溶解物を、１４，０００ｇ、２０分間の遠心分離によって澄明にした。
【００９１】
コンドロアドヘリン結合性タンパク質のアフィニティ精製
コンドロアドヘリン−およびコントロールアガロース（１ｍｌ）をミニカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）に充填し、２０容積のランニング緩衝液（ＣＯＭＰＬＥＴ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充したＴＢＳｐＨ７．４中６Ｍ尿素、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）で平衡化する。ビオチン標識した細胞の溶解物を、コントロール−カラムに２回通過させ、コンドロアドヘリン−アガロースと共に、４℃での連続的な水平軸型回転の混合で、１晩、インキュベートした。コンドロアドヘリン−およびコントロールアガロースを、２０容積のランニング緩衝液で洗浄し、ＣＯＭＰＬＥＴを補充したＴＢＳ  ｐＨ７．４中０．５Ｍ  ＮａＣｌ、６Ｍ尿素で溶出させた（１ｍｌの画分）。溶出したタンパク質をエタノールで沈殿させ、再懸濁し、材料の部分を、ヘパリチナーゼおよびコンドロイチナーゼＡＢＣにより、３７℃で、１晩消化した。非消化および消化された材料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ４〜１２％により分離し、エレクトロトランスファーによりＰＶＤＦ−膜（ｐａｌｌ）に移し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび２％Ｔｗｅｅｎ（ブロッキング緩衝液）中２％ＢＳＡでブロックした。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ブロッキング緩衝液中１：５０００）とのインキュベーション後、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用する化学発光検出によって、ビオチン標識タンパク質を可視化した。
【００９２】
免疫沈降（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｉｏｎ）
ビオチン標識細胞表面材料を、固定化コンドロアドヘリン上でアフィニティー精製し、０．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出させ、脱塩カラム（ＰＤ−１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通過させ、平衡化し、ＣＯＭＰＬＥＴプロテアーゼ阻害剤を補充したＴＢＳ中０．１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で溶出させた。溶出した材料を、１晩、シンデカン−ｐａｎ−抗体（５μｇ／ｍｌ、Ｒａｐｒａｅｇｅｒ）と共にインキュベートし、ｐｒｏｔ−Ａ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用して、免疫複合体を回収した。セファロースを、ヘパリチナーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で３回洗浄し、同じ緩衝液中に再懸濁し、ヘパリチナーゼにより３７℃で消化した。免疫沈降したタンパク質および細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ１０％により分離し、ＰＶＤＦ−膜（ｐａｌｌ）にエレクトロトランスファーした。膜を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび２％Ｔｗｅｅｎ（ブロッキング緩衝液）中２％ＢＳＡでブロックした。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ブロッキング緩衝液中１：５０００）とのインキュベーション後、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用する化学発光検出によって、免疫沈降したタンパク質を可視化した。ｋ１０５細胞によって発現されるシンデカンを、シンデカン−ｐａｎ−抗体（１μｇ／ｍｌ、Ｒａｐｒａｅｇｅｒ）、抗ウサギＨＲＰ（ＤＡＫＯ）抗体およびＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ＥＣＬを使用する化学発光により検出した。
【００９３】
細胞接着、例ＩＩ
以下の実験は、細胞接着を阻害する能力を測定するために行われる。
研究デザイン：組織培養ディッシュ（４８ウェル）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現される５μｇ／ｍｌコンドロアドヘリンで被覆し、ＢＳＡで非特異的結合についてブロックした。Ｋ１０５細胞を、０．１％ＢＳＡ、２５Ｕ／ｍｌコラゲナーゼを含有するＰＢＳ中に懸濁し、試験しようとする合成ペプチドの存在下でウェル（５０，０００／ウェル）に添加し、１時間、３７℃で接着させた。洗浄によって、非接着細胞を取り出し、リソソームヘキソサミニダーゼを分析することによって、接着を測定した。
【００９４】
軟骨エクスプラント
以下の実験は、ＩＬ−１で刺激された軟骨におけるＮＯ放出に対するペプチドの効果を測定する。
研究デザイン：（１８〜２４箇月齢由来の）皮を剥いだウシの鼻部は、ヘービー（Ｈｏｒｂｙ）解体処理所（Ｔｅａｍ  Ｕｇｇｌａｒｐ、瑞国）で回収した。鼻内部の中隔を切り出し、軟骨を、ＰＥＳＴ（１００ＩＵペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）および２．５ｕｇ／ｍｌファンギゾン（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ由来、瑞国）を伴うＰＢＳ中に、２時間、室温（ｒｔ）で配置する前に、粘膜および軟骨膜を取り出した。
【００９５】
軟骨から２ｍｍ片をパンチアウトした。各片を、１ｍｌの細胞培養培地、１０ｐｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２５ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸（両方ともＳｉｇｍａ由来、瑞国）、ＰＥＳＴ（１００ＩＵペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）および２．５ｕｇ／ｍｌファンギゾンを補充したＨＡＭｓ  Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、瑞国）を含有する２４ウェル細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ、瑞国）に配置した。２４時間後、培地を変え、軟骨片を、ヒト組換えＩＬ−１ａ、１０ｎｇ／ｍｌ（Ｒｏｃｈｅ、瑞国）で刺激した。２０および４００μＭで、３重に試験したペプチド。軟骨組織をさらに６日間、インキュベートし、３日ごとに培地を交換した。毎回、ＮＯの測定（グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応）のために培地を回収した。
【００９６】
滑膜線維芽細胞
以下の実験では、ＩＬ−１で刺激した滑膜細胞におけるＩＬ−６放出を測定する。研究デザイン：抗原誘導性関節炎を伴うラットを対象として、疾患発症４日目に膝の炎症部分から過形成性滑膜、パンヌスを採取した。コラゲナーゼ（４００Ｕ／ｍｌ、ワシントン、
米国）中、３時間、３７℃、５％ＣＯ２におけるインキュベーション前に、ＰＥＳＴ（１００ＩＵペニシリン、１００ｐｇ／ｍｌストレプトマイシン）およびファンギゾン（２．５ｐｇ／ｍｌ）（すべてＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ由来、瑞国）を伴うＰＢＳにおいて、パンヌス組織を小片に切断した。細胞を、遠心分離（８分間、室温（ｒｔ）、１１００ｒｐｍ）し、１０％ＦＣＳ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、瑞国）、ＰＥＳＴおよびファンギゾンを補充したＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、２５ｃｍ２フラスコに、３７℃、５％ＣＯ２において播種した。翌日、細胞を培地で１回濯ぎ、さらにインキュベートした。コンフルエントに達したら、細胞を１分間、トリプシン処理（ＥＤＴＡを伴う０．２５％トリプシン、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、瑞国）し、計数し、９６ウェルプレートに１００００細胞／ウェル／２００μｌで播種した。
【００９７】
２４時間後、培地を交換し、細胞を、ヒト組換えＩＬ−１ａ、５０ｎｇ／ｍｌ（Ｒｏｃｈｅ、瑞国）で刺激した。調べようとするペプチドを、濃度間隔５０〜４００ｐＭ、３重に試験した。３７℃、５％Ｃ０２で７２時間のインキュベーション後、ＮＯの測定（グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応）のために培地を回収し、製造者（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）の指示に従って、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−６を分析した。
【００９８】
インビボ抗原誘導性関節炎
以下のモデル実験では、抗原誘導性関節炎を使用して、膝関節腫脹に対する調査化合物の効果を測定する。
【００９９】
ラットのｍ−ＢＳＡ抗原誘導性単関節炎における関節炎の発達に対する４００ｍＭで連日２回局所投与した試験化合物の効果を評価した。
【０１００】
食塩水またはメトトレキサート（臨床関連用量で）で処置した動物をコントロールとして使用した。
研究デザイン：体重約１５０ｇの雌性ダーク−アグーチ（Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ）系ラット（Ｂ＆Ｋ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｃｅｎｔｅｒ、丁国）を使用した。動物を、５０ｍｇ食塩水に溶解し、５０ｍｌフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ｆ  ５８８１）に乳化した１ｍｇ  ｍＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−１００９）で、尾根部において皮内より感作した。１０日後、ラットを剃毛（左膝）し、５０ｍｌ食塩水に溶解した５０ｍｇ  ｍＢＳＡの関節内（ｉ．ａ）注入でチャレンジした。試験化合物を、チャレンジ４時間前およびその後連日２回、５０ｍｌ食塩水において、関節内（左膝）に投与した。関節炎の発達（膝直径）は、移動距離（ｏｄｉｍｅｔｅｒ）／キャリパー（ｃａｌｌｉｐｅｒ）で登録した。手順は、短時間のエンフルラン麻酔下で行った。動物は、チャレンジ／第１の処置の４日目に屠殺した。
【０１０１】
結果
合成ペプチド
候補ペプチドを合成し、Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｎ、丁国による逆相クロマトグラフィーにより精製した。最も好適なペプチド配列を表１に列挙するが、ここで、環化は括弧［および］によって示され、Ｈ−はＮ末端、そして−ＯＨはＣ末端、即ち、非保護アミノ酸末端を示す。
【０１０２】
【表１】
2007535517.tif 000003
【０１０３】
図１．Ｋ９細胞の選択されたマトリックス構成要素への接着
４８ウェル組織培養ディッシュを、５μｇ／ｍｌＩＩ型コラーゲン、組織抽出されたウシコンドロアドヘリン、ＥＢＮＡ細胞において発現されるヒトコンドロアドヘリンおよび大腸菌（Ｅ−ｃｏｌｉ）において発現されるヒトコンドロアドヘリンで被覆し、ＢＳＡによる非特異的結合に対してブロックした。細胞を、１時間、３７℃で接着させた。洗浄によって、非接着細胞を取り出し、リソソームＮ−アセチルグルコサミニダーゼを分析することによって、接着を測定した。付着は細胞の数で表され、５００００細胞／ウェルが播種された。
【０１０４】
図１に認められるように、細胞は、多様な基質に同等に良好に接着する。特に、コーティングは、４Ｍグアニジン−ＨＣＩの変性条件下で行われ、システイン残基がＮ−エチルマレイミドによってブロックされたようなジスルフィド結合が存在しないため、ＥＢＮＡ細胞によって発現される生来のコンドロアドヘリンは、細菌から発現されるおそらくホールディングしていないと思われるようなタンパク質の結合と実質的に同一な結合を示した。従って、結合は、おそらく線状配列によって仲介される。
【０１０５】
図２．コンドロアドヘリンフラグメントの単離およびペプチドプールによる細胞結合性の阻害
ＥＢＮＡ細胞において発現される組換えコンドロアドヘリン（１ｍｇ）を、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃで消化し、ＳＭＡＲＴ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、Ｓｅｐｈａｓｉｌ  Ｃ８カラム上で画分した。溶出物を２８０ｎｍでモニターし、図２Ａ（Ｐ１〜Ｐ１１）に示されるように、画分をプールした。ペプチドプールを凍結乾燥し、ＰＢＳに溶解し、阻害実験に使用した。４８ウェル組織培養ディッシュを、大腸菌（Ｅ−ｃｏｌｉ）において発現される５μｇ／ｍｌコンドロアドヘリンで被覆し、ＢＳＡで非特異的結合についてブロックした。ペプチドプールＰ１〜Ｐ１１の存在下、１時間、３７°で、細胞（５００００細胞／ウェル）を接着させた（図２Ｂを参照のこと）。
洗浄によって、非接着細胞を取り出し、リソソームＮ−アセチルグルコサミニダーゼを分析することによって、接着を測定した。ＩＩ型コラーゲンに対する接着をポジティブコントロールとして使用し、ＢＳＡ被覆ウェルに対する接着をネガティブコントロールとして使用した。ペプチドプールの阻害効果を測定し、Ｐ７がコンドロアドヘリンへの細胞接着を阻害するのに最も強力であることが見出された。
【０１０６】
Ｐ７におけるタンパク質フラグメントの同定
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを使用して、Ｐ７におけるコンドロアドヘリンフラグメントを同定し、その分子量を測定した。同定されたペプチドを、以下の表Ｉに列挙する。
【０１０７】
【表２】
2007535517.tif 000004
【０１０８】
Ｇｌｕ−Ｃ消化組み換えコンドロアドヘリンの画分において、どのペプチドが存在したかを比較することによって（データ示さず）、ペプチド１９４７．０１を、細胞結合性に至適な候補として選択した。
【０１０９】
図３．Ｋ１０５細胞のコンドロアドヘリンへの接着、ペプチドＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫによる阻害
質量分析によって同定される候補配列を表す１２マーのペプチド（１９４７．０１）＋Ｎ末端システイン（ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫ）を合成し、細胞接着を阻害するその能力を測定した。組織培養ディッシュを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現される５μｇ／ｍｌコンドロアドヘリンで被覆し、ＢＳＡで非特異的結合についてブロックした。細胞を、０．１％ＢＳＡ、２５Ｕ／ｍｌコラゲナーゼを含有するＰＢＳ中に懸濁し、合成ペプチド（２００、１００、５０、２５、１２．５μｇ／ｍｌ）の存在下でウェル（５０，０００／ウェル）に添加し、１時間、３７℃で接着させた。洗浄によって、非接着細胞を取り出し、リソソームヘキソサミニダーゼを分析することによって、接着を測定した。
【０１１０】
接着は細胞の数として表現され、ここで、データは２つのウェルの平均を表す。独立した別の実験でも類似の結果を示した。図３は、ｋ１０５細胞のコンドロアドヘリンへの付着が１２マーのペプチドの増加量の存在下において用量依存的様式で減少したことを示す。従って、このペプチドは細胞結合性配列を含有する。
【０１１１】
図４．コンドロアドヘリンヘパリン結合性およびヘパリン結合性ペプチドの同定
ＥＢＮＡ細胞において発現される組換えコンドロアドヘリン（１０または１００μｇ）
を、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通過させた。カラムを洗浄し、ＰＢＳ中２Ｍ  ＮａＣｌで溶出させた。溶出した材料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）上で分離し、コンドロアドヘリン抗体を使用するウエスタンブロットによって検出した（図４を参照のこと）。３６ｋＤａのバンドはコンドロアドヘリンを表し、７２ｋＤａのバンドはコンドロアドヘリンの二量体を表す。コンドロアドヘリンは、実際に、ヘパリンセファロースに結合することが見出された。
【０１１２】
候補ペプチドＣＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ（配列番号７）を合成した。ヘパリンに結合するペプチドの能力をヘパリン−セファロース上確認したが、ここで、０．５、１および２Ｍ  ＮａＣｌで溶出される材料は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって同定された（データ示さず）。
【０１１３】
図５．異なる表面構造と相互作用する２種の細胞結合性ペプチドの添加を伴うまたは伴わないＫ１０５細胞のヒトコンドロアドヘリンへの接着。
組織培養ディッシュを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現される５μｇ／ｍｌコンドロアドヘリンまたはＩＩ型コラーゲンで被覆し、ＢＳＡで非特異的結合についてブロックした。細胞（５００００／ウェル）を、０．１％ＢＳＡ、２５Ｕ／ｍｌコラゲナーゼを含有するＰＢＳ中に懸濁し、合成ペプチド（２５０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下でウェルに添加し、１時間、３７℃で接着させた。非接着細胞を、洗浄により取り出した。光学顕微鏡によって拡散を可視化し、リソソームヘキソサミニダーゼを分析することによって接着を測定した。接着は細胞の数として表現され、ここで、データは２つのウェルの平均を表す。独立した別の実験でも類似の結果を示した。図５に示されるように、コンドロアドヘリンへの細胞（ｋ１０５）接着は、２５０μｇ／ｍｌの１２マーのペプチド（ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫ）の存在下で減少する一方、２５０μｇ／ｍｌの１３マーのヘパリン結合性ペプチド（ＣＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ、配列番号７）の存在下では、接着および拡散が増加した。ＩＩ型コラーゲンへの接着は、２つのペプチドのいずれによっても有意には影響を受けなかった。データは、コンドロアドヘリンにおける２つの特異的な細胞結合性ドメインを明らかに実証する。１つは、ヘパリン結合性ペプチドによって表され、１つは、インテグリン結合性ペプチドと思われるものによって表される。
【０１１４】
図６．細胞結合性ペプチドの添加を伴うまたは伴わないウシ軟骨細胞のヒトコンドロアドヘリンへの接着。
組織培養ディッシュを、大腸菌（Ｅ−ｃｏｌｉ）において発現される５μｇ／ｍｌコンドロアドヘリンまたはＩＩ型コラーゲンで被覆し、ＢＳＡで非特異的結合についてブロックした。ウシ軟骨細胞（１００，０００／ウェル）を、０．１％ＢＳＡ、２５Ｕ／ｍｌコラゲナーゼを含有するＰＢＳ中に懸濁し、合成ペプチド（２５０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下でウェルに添加し、１時間、３７℃で接着させた。非接着細胞を、洗浄により取り出した。リソソームヘキソサミニダーゼを分析することによって、接着を測定した。付着は細胞の数として表現され、１００，０００細胞／ウェルが播種された。図６が示すように、コンドロアドヘリンへのウシ軟骨細胞接着は、１２マーのペプチド（ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫ）の存在下で減少する一方、接着は、１３マーのヘパリン結合性ペプチド（ＣＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ、配列番号７）の存在下で増加する。このペプチドのその細胞表面分子への結合は、細胞表面受容体の活性を増加するシグナルを誘導する。
【０１１５】
図７．Ｋ１０５細胞のコンドロアドヘリンへの接着、接着細胞に対する細胞結合性ペプチドの効果。
組織培養ディッシュを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現される５μｇ／ｍｌコンドロアドヘリンで被覆し、ＢＳＡで非特異的結合についてブロックした。ｋ１０５細胞を、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳに懸濁し、ウェル（５０，０００／ウェル）に添加した。３０分後、洗浄によって非接着細胞を取り出し、血清を伴わない、ペプチド（２５０
μｇ／ｍｌ）を伴うかまたは伴わないプレーン（ｐｌａｉｎ）な培地を添加し、１、３および２０時間後に結合型細胞を光学顕微鏡によって可視化した。図７は、１２マーのペプチド（ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫ）が細胞を刺激して、凝集体を形成させる一方、拡散および移動は、１３マーのヘパリン結合性ペプチド（ＣＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ、配列番号７）の存在下で増加することを示す。
【０１１６】
図８．Ｋ１０５細胞の細胞結合性ペプチドへの接着
組織培養ディッシュを、３３μｇ／ｍｌ（２０μＭ）ペプチド溶液で被覆した。細胞（５０，０００／ウェル）を、０．１％ＢＳＡ、２５Ｕ／ｍｌコラゲナーゼを含有するＰＢＳ中に懸濁し、合成ペプチド（２５０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下でウェルに添加し、１時間、３７℃で接着させた。非接着細胞を、洗浄により取り出した。拡散を、光学顕微鏡によって可視化した。
【０１１７】
図８は、ペプチドＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫに対してプレート化された細胞が粘着し、円形を保持し、接着は溶液中の同じペプチドの存在下で阻害されることを示した。ペプチドＣＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ、配列番号７に対してプレーと化される細胞は接着し、拡散するが、このペプチドは、試験した濃度では、接着を阻害することができなかった。従って、ヘパラン硫酸結合性ペプチドへの結合はかなりより緊密であるか、または細胞挙動がこのペプチドへの結合時に変化するようである。
【０１１８】
図９．Ｋ１０５細胞のコンドロアドヘリンへの接着、阻害ペプチドにおける不可欠アミノ酸のより短い配列の測定
組織培養ディッシュを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現される５μｇ／ｍｌコンドロアドヘリンで被覆し、ＢＳＡで非特異的結合についてブロックした。細胞を、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳに懸濁し、ウェル（５０，０００／ウェル）に添加した。３０分後、洗浄によって非接着細胞を取り出し、血清を伴わない、ペプチド（２５０μｇ／ｍｌ）を伴うかまたは伴わないプレーン（ｐｌａｉｎ）な培地を添加し、１、３および２０時間後に結合型細胞を光学顕微鏡によって可視化した。図９に認められるように、ペプチドＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫ（配列番号３）およびＬＲＲＷＬＥＡＫ（配列番号２）は、同様に、拡散を防止し、凝集体を形成するように細胞を誘導する一方、ペプチドＱＬＲＧＬＲＲＷは、細胞拡散および移動に対して効果を及ぼさない。インテグリン結合性のための活性は、ＷＬＥＡＫ（配列番号１）配列に関与する配列のＣ末端の８残基に局在する。
【０１１９】
図１０．Ｋ１０５細胞のコンドロアドヘリンへの接着、接着細胞に対するβ１インテグリン抗体およびＥＤＴＡの効果
組織培養ディッシュを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現される５μｇ／ｍｌコンドロアドヘリンで被覆し、ＢＳＡで非特異的結合についてブロックした。ｋ１０５細胞を、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳに懸濁し、ウェル（５０，０００／ウェル）に添加した。３０分後、洗浄によって非接着細胞を取り出し、ペプチド、抗β１抗体、５ｍＭ  ＥＤＴＡまたは血清を伴わないプレーン（ｐｌａｉｎ）な培地を添加し、１および３時間後、結合型細胞を、光学顕微鏡によって可視化した。図１０は、ペプチドＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫおよび抗β１抗体が拡散を防止し、細胞が凝集体を形成する一方、ＥＤＴＡの添加により細胞分離が生じることを示す。
【０１２０】
図１１．ｋ１０５細胞上のコンドロアドヘリン結合性膜プロテオグリカン
ヒト軟骨肉腫細胞（Ｋ１０５）上の細胞表面タンパク質を、ビオチン標識し、尿素中コンドロアドヘリン−アガロース上でアフィニティー精製した。結合型材料を０．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％）上で分離し、ヘパリチナーゼおよびコンドロイチナーゼＡＢＣ処置の前後にウエスタンブロットによって検出した。個別の実験においても、ヘパリチナーゼのみによる消化によって、類似の結果が得られた（図１１を
参照のこと）。酵素消化後の約５０〜６０ｋＤａに対応する位置に移動する成分は、酵素処置を伴わない２５０ｋＤａマーカーより上で見出されるヘパラン硫酸プロテオグリカンに対応する。
【０１２１】
図１２．ｐａｎ−シンデカン抗体によるコンドロアドヘリン結合性タンパク質の免疫沈降
ヒト軟骨肉腫細胞（Ｋ１０５）はビオチンで標識された表面であり、膜は、界面活性剤で抽出され、固定化されたコンドロアドヘリン上でアフィニティー精製された。結合した材料を０．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出させ、シンデカン−ｐａｎ−抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）によって分離し、ストレプトアビジンＨＲＰおよびＥＣＬシステムを使用するウエスタンブロットによって検出した。図１２Ａが示すように、抗体は、コンドロアドヘリン−カラムの溶出された材料由来の約５０ｋＤａのタンパク質（ヘパリチナーゼ後）を免疫沈降する一方、コントロール−カラムからは何ら異なるタンパク質は検出されなかった（図１２Ｂを参照のこと）。
【０１２２】
シンデカン−ｐａｎ−抗体を使用して、Ｋ１０５細胞によって発現されるシンデカンを検出した（ヘパリチナーゼ後）（図１２Ｂを参照のこと）。膜タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）によって分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、ｐａｎ−抗体と共にインキュベートし、抗ウサギＨＲＰ抗体およびＥＣＬシステムを使用して検出した。Ｋ１０５細胞は、シンデカン１、２、３および４を発現することが示された。コンドロアドヘリンに結合した成分はシンデカン３を表す。
【０１２３】
図１３．細胞接着の阻害試験、例ＩＩ。
図は、環状ペプチド、Ｈ−［ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＡＳＲＰＤＡＴＣ］−ＯＨ、配列番号９）、および対応する保護されたペプチドＡｃ−［ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＡＳＲＰＤＡＴＣ］−ＮＨ２（配列番号１２）が細胞接着に対する阻害効果を示すことを示す。
【０１２４】
図１４．軟骨外植試験。
配列番号９は、ＩＬ−１により刺激された軟骨エクスプラントからのＮＯ放出を減少することが可能な濃度４００μＭにあった。
【０１２５】
図１５．滑膜線維芽細胞およびＩＬ−６放出。
配列番号９は、ＩＬ−１により刺激された滑膜細胞からのＩＬ−６放出を、用量依存的様式で減少することが可能である。
【０１２６】
図１６．インビボ抗原誘導性関節炎。
局所投与されたペプチド、配列番号９は、食塩水処置された動物と比較して、膝関節腫脹を減少した。疾患緩和効果は、メトトレキサート処置と同じ大きさであった。
【０１２７】
考察
コンドロアドヘリン由来のインテグリン結合性フラグメント
用量依存的様式で無傷なタンパク質への細胞接着を阻害することが可能なコンドロアドヘリンペプチド（ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫ）が同定される。コンドロアドヘリンへの細胞接着は、インテグリンα２β１を介して仲介され、ここで、接着は、そのＩ−ドメインを介して仲介されるようである（９）。
【０１２８】
結合が線状配列を介して仲介され得るかどうかを同定することを目的とするパイロット実験において、ヒト軟骨肉腫細胞（Ｋ９）がホールディングされていないコンドロアドヘリンに対するのと同等に良好に生来のコンドロアドヘリンに接着することが見出された。これは、線状ペプチド配列が結合を仲介し、構造に対する検索を可能にすることの強力な
証拠を提供する。置換基を欠く、微生物により発現されるコンドロアドヘリンの使用は、結合が、翻訳後修飾を必要としないペプチド配列を介して仲介されるという見解に対するさらなる支持を提供する。線状ペプチド配列が結合に関与するという知識により、少なくとも１つの場合において、活性な構造を保持するために、異なる２種のプロテイナーゼを使用して、ＥＢＮＡ細胞より発現されるタンパク質のタンパク質分解的切断に基づいたストラテジーが案出された。作製されるペプチドを分画し、細胞の無傷なタンパク質への結合を阻害するために使用した。ＭＡＬＤＩＴＯＦ質量分析を使用して、活性なペプチドを同定した。
【０１２９】
このプロトコルを使用して、細胞（ｋ１０５）結合性を、用量依存的様式で阻害することが示されたペプチドＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＫを同定した。ペプチドＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫに接着する細胞は、無傷なタンパク質への接着時に観察されるように、円形を保持する。この１３残基長のペプチドは、受容体への結合がなお可能なより短いストレッチのアミノ酸を含有すべきである。この問題に取り組むために、２つの重複するペプチド、ＣＱＬＲＧＬＲＲおよびＬＲＲＷＬＥＡＫ（配列番号２）を合成した。ペプチドを、固定化されたコンドロアドヘリンに対してプレート化された細胞に添加し、ＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫに類似のＬＲＲＷＬＥＡＫ（配列番号２）が拡散を防止し、凝集体を形成するように細胞を誘導することが見出された。これらの結果は、細胞結合性のための活性は、ＷＬＥＡＫ（配列番号１）配列に関与する配列のＣ末端の８残基に局在することを示す。
【０１３０】
いくつかの報告が、１つのマトリックスタンパク質と特定のインテグリンとの間の接着を阻止する特定の活性を伴う短いペプチドの所見について記載している。多くのペプチドが、クサリヘビノカーペットバイパー（Ｅ．ｃａｒｉｎａｔｕｓ）の毒から精製される（いくらかのディスインテグリンにおける）ディスインテグリンのループ構造、例えば、ＭＬＤ（ＥＣ３ＢおよびＥＣ６Ａ）、ＶＧＤ（ＥＣ３Ａ）（１３）ならびにＲＧＤにおいて見出される。α９およびα４サブユニットは構造的に類似であり、両方ともリガンドとしてＶＣＡＭ−１を認識する。ディスインテグリンＥＣ３およびＥＣ６において見出されるＭＬＤＧのモチーフは、ＶＣＡＭ−１へのα９β１およびα４β１接着を阻害したが、α９がトランスフェクトされた細胞のＶＣＡＭ−１への接着を廃止した濃度は、他のα９β１リガンド、オステオポンティンおよびテネイシン−Ｃへの接着をほとんどまたは全く示さなかった（１３）。一方、オステオポンティンおよびテネイシン−Ｃへの結合を阻害することが予め示されているペプチド、ＳＳＶＹＧＬＲおよびＡＥＩＤＧＩＥＬ（１４）は、ＶＣＡＭ−１へのα９β１接着に対して効果を及ぼさなかった。別のペプチド、ＲＲＥＴＡＷＡは、ＲＧＤ含有フィブロネクチンフラグメントのα５β１結合と直接競合する（１５）。ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ−ペプチドは、ＩＣＡＭ−１およびまたフォンウィルブラント因子へのβ２接着を阻害する（１６）。プラスチック支持体上に固定化される場合、β２インテグリン白血球接着であり、β１またはβ３インテグリン仲介細胞接着ではない。脈管損傷の部位のＩＣＡＭ−１およびフォンウィルブラント因子に対して暴露されるＬＬＧ配列は、白血球に結合する役割を果たすことが示唆されており、おそらく、炎症反応における治療アプローチにおいて使用され得る。
【０１３１】
細胞性α２β１とのＣＨＡＤの相互作用は、むしろ、マトリックスタンパク質合成の調節を伴う細胞表現型ならびに明らかな阻止された細胞分裂および移動に特定の効果を及ぼす（データ示さず）。コラーゲンＩＩ結合性によって誘導されるものとは異なるこの表現型は、成体軟骨における軟骨細胞の役割を維持するのに中核的であるべきである。これは、主に、効率的に処理する必要がある荷重に継続的に暴露される細胞外マトリックスの修復および適応を必要とし得る。さらに、おそらく、Ｔリンパ球の研究により示されるように、α２β１インテグリンの活性化は、細胞死を防止する役割を果たすようである（ゲンデロン，Ｓ．（Ｇｅｎｄｒｏｎ，Ｓ．）、クチュール，Ｊ．（Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ｊ．）、
アウディト，Ｆ．（Ａｏｕｄｊｉｔ，Ｆ．）；Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ２  ｂｅｔａ１  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２Ａ−ｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＡＰＫ／ＥＲＫ  ｐａｔｈｗａｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２００３年、９月１７日）。
【０１３２】
コンドロアドヘリンのヘパリン結合フラグメント
配列解析は、ヘパリン結合特徴を示すコンドロアドヘリンの極めてＣ末端部における塩基性アミノ酸のクラスターを同定した。これにより、コンドロアドヘリンがヘパリンに結合し得るかどうかの調査がもたらされる。組換えコンドロアドヘリンはヘパリンに結合することが見出され、候補ペプチド（ａａ３４６）ＣＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ（ａａ３５９）、配列番号７を合成し、ヘパリンに結合することが示された。結合を担う受容体は、シンデカン３であることが同定された。
【０１３３】
インテグリンは、接着性受容体ファミリーであることが最も良好に特徴付けられるが、今回、シンデカンは、接着およびシグナル伝達に能動的に参加することができる重要な細胞表面付着共同受容体として認識される（１，２）。ペプチド（ａａ３４６）ＣＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ（ａａ３５９）、配列番号７は、細胞接着、拡散および移動に対しインビトロで重要な刺激効果を及ぼす。（ＰＭＡ）処置後の細胞接着に対する類似の効果が示されている（３、９、４、５）。ＰＭＡは、タンパク質キナーゼＣのシグナル伝達を活性化し、従って、シンデカン４ならびにインテグリンを必要とするプロセスにおける接着および拡散を刺激することが公知である（３）。
【０１３４】
間葉細胞は、シンデカンを使用して、ＡＤＡＭ１２およびβ１インテグリンに接着し、拡散を誘導する（６）。
【０１３５】
コンドロアドヘリンは、未知の機能的差異を伴う組織において、２つの形態として存在し、ここで、１つの形態は、最後の９アミノ酸を欠く（ニーム  ＰＪ（Ｎｅａｍｅ  ＰＪ）、ソマリン  Ｙ（Ｓｏｍｍａｒｉｎ  Ｙ）、ボイントン  ＲＥ（Ｂｏｙｎｔｏｎ  ＲＥ）、ハイネガード  Ｄ．（Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ  Ｄ．）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４年８月２６日；２６９（３４）：２１５４７−５４．）。  合成したヘパリン結合性ペプチド、ＣＫＦＰＴＫＲＳＫＫＡＧＲＨ、配列番号７は、コンドロアドヘリンのこの部分に対応する。
【０１３６】
参考文献のリスト
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８．マンソン，Ｂ．（Ｍａｎｓｓｏｎ，Ｂ．）、ウェングレン，Ｃ．（Ｗｅｎｇｌｅｎ，Ｃ．）、モルゲリン，Ｍ．（Ｍｏｒｇｅｌｉｎ，Ｍ．）、サクスネ，Ｔ．（Ｓａｘｎｅ，Ｔ．）、およびハイネガード，Ｄ．（Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ，Ｄ．）（２００１年）．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，３２８８３−３２８８８
９．カンペル，Ｌ（Ｃａｍｐｅｒ，Ｌ．）、ハイネガード，Ｄ（Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ，Ｄ．）、およびルンドグレン−エイカールンド，Ｅ．（Ｌｕｎｄｇｒｅｎ−Ａｋｅｒｌｕｎｄ，Ｅ．）（１９９７年）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ１３８，１１５９−１１６７
１０．サマリン，Ｙ．（Ｓｏｍｍａｒｉｎ，Ｙ．）およびハイネガード，Ｄ（Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ，Ｄ．）（１９８３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１４，７７７−７８４
１１．ミラー，Ｅ．Ｊ．（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｊ．）（１９７２年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１１，４９０３−４９０９
１２．ランダーグレン，Ｕ．（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．）（１９８４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ６７，３７９−３８８
１３．サマリン，Ｙ．（Ｓｏｍｍａｒｉｎ，Ｙ．）、ラルッソン，Ｔ．（Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｔ．）、およびハイネガード，Ｄ（Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ，Ｄ．）（１９８９年）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１８４，１８１−１９２
１４．バリー，Ｓ．Ｔ．（Ｂａｒｒｙ，Ｓ．Ｔ．）、ルドブルック，Ｓ．Ｂ．（Ｌｕｄｂｒｏｏｋ，Ｓ．Ｂ．）、ムッリソン，Ｅ．（Ｍｕｒｒｉｓｏｎ，Ｅ．）、およびホーガン，Ｃ．Ｍ．（Ｈｏｒｇａｎ，Ｃ．Ｍ．）（２０００年）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５８，３４２−３５１
１５．モールド，Ａ．Ｐ．（Ｍｏｕｌｄ，Ａ．Ｐ．）、バーロース，Ｌ．（Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｌ．）、およびハンフリーズ，Ｍ．Ｊ．（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｍ．Ｊ．）（１９９８年）Ｊ．ＢｉｏＬＣｈｅｍ．２７３，２５６６４−２５６７２
１６．コイヴネン，Ｅ．（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，Ｅ．）、ランタ，Ｔ．Ｍ．（Ｒａｎｔａ，Ｔ．Ｍ．）、アニラ，Ａ．（Ａｎｎｉｌａ，Ａ．）、タウブ，Ｓ．（Ｔａｕｂｅ，Ｓ．）、アパラ，Ａ．（Ｕｐｐａｌａ，Ａ．）、ジョキネン，Ｍ．（Ｊｏｋｉｎｅｎ，Ｍ．）、バン・ウィルゲン，Ｇ．（ｖａｎ  Ｗｉｌｌｉｇｅｎ，Ｇ．）、イハヌス，Ｅ．（Ｉｈａｎｕｓ，Ｅ．）、およびゲイムベルグ，Ｃ．Ｇ．（Ｇａｈｍｂｅｒｇ，Ｃ．Ｇ．）（２００１年）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５３，９０５−９１６
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】Ｋ９細胞の選択されたマトリックス構成要素への接着を表す。
【図２】コンドロアドヘリンフラグメントの単離およびペプチドプールによる細胞結合性の阻害を表す。
【図３】Ｋ１０５細胞のコンドロアドヘリンへの接着、ペプチドＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫによる阻害を表す。
【図４】コンドロアドヘリンヘパリン結合性およびヘアピン結合性ペプチドの同定を表す。
【図５】異なる表面構造と相互作用する２種の細胞結合性ペプチドの添加を伴うまたは伴わないＫ１０５細胞のヒトコンドロアドヘリンへの接着を表す。
【図６】細胞結合性ペプチドの添加を伴うまたは伴わないウシ軟骨細胞のヒトコンドロアドヘリンへの接着を表す。
【図７】Ｋ１０５細胞のコンドロアドヘリンへの接着、接着細胞に対する細胞結合性ペプチドの効果を表す。
【図８】Ｋ１０５細胞の細胞結合性ペプチドへの接着を表す。
【図９】Ｋ１０５細胞のコンドロアドヘリンへの接着、阻害ペプチドにおける不可欠アミノ酸のより短い配列の決定を表す。
【図１０】Ｋ１０５細胞のコンドロアドヘリンへの接着、接着細胞に対するβ１インテグリン抗体およびＥＤＴＡの効果を表す。
【図１１】ｋ１０５細胞上のコンドロアドヘリン結合性膜プロテオグリカンを表す。
【図１２】ｐａｎ−シンデカン抗体によるコンドロアドヘリン結合性タンパク質の免疫沈降を表す。
【図１３】細胞接着の阻害試験、例ＩＩを表す。
【図１４】軟骨外植試験を表す。
【図１５】滑膜線維芽細胞およびＩＬ−６放出を表す。
【図１６】インビボ抗原誘導性関節炎を表す。
【図１】
2007535517.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図１３】
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【図１４】
2007535517.tif 000011
【図１５】
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【図１６】
2007535517.tif 000013
【図５】
2007535517.tif 000014
【図７】
2007535517.tif 000015
【図８】
2007535517.tif 000016
【図９】
2007535517.tif 000017
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年3月27日(2007.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性関節疾患、関節構造に関与する他の疾患、筋骨格系の構造エレメントに影響を及ぼす疾患、骨疾患および大動脈に影響を及ぼす疾患からなる群より選ばれる炎症性軟骨破壊に関連する疾患の処置および／または予防のための医薬品の製造におけるＷＬＥＡＫ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む線状または環状ペプチドの使用。
【請求項２】
請求項１記載の使用であって、炎症性関節疾患が関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、感染性関節炎および若年性特発性関節炎からなる群より選ばれ、関節構造に関与する他の疾患が骨関節炎、半月板損傷および痛風からなる群より選ばれ、筋骨格系の構造エレメントに影響を及ぼす疾患が腱損傷および靭帯損傷からなる群より選ばれ、骨疾患が骨粗鬆症であり、そして大動脈に影響を及ぼす疾患がアテローム性動脈硬化症である、上記使用。
【請求項３】
請求項１または２記載の使用であって、該線状または環状ペプチドがＬＲＲＷＬＥＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の使用であって、該線状または環状ペプチドがＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の使用であって、該線状または環状ペプチドがＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＡＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項６】
請求項１または２記載の使用であって、該線状または環状ペプチドがＣＷＬＥＡＫＣ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の使用であって、該線状または環状ペプチドがＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＡＳＲＰＤＡＴＣ（配列番号９）のアミノ酸配列またはその保護された形態（配列番号１２）を含むことを特徴とする使用。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の使用であって、該線状または環状ペプチドがＣＱＬＲＧＬＲＲＷＬＥＡＫＣ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項９】
請求項１および３−８のいずれかで特定されている線状または環状ペプチド。
【請求項１０】
請求項１および３−８のいずれかで特定されている線状または環状ペプチドを１つもしくはそれ以上のアジュバント（ａｄｊｕｔａｎｔ）、キャリアまたは賦形剤と共に含んでなる薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項１および３−８のいずれかで特定されている線状または環状ペプチドを有効成分として含んでなる炎症性軟骨破壊に関連する疾患の処置および／または予防のための医薬製剤。
【請求項１２】
請求項１１記載の医薬製剤であって、炎症性軟骨破壊に関連する疾患が炎症性関節疾患、関節構造に関与する他の疾患、筋骨格系の構造エレメントに影響を及ぼす疾患、骨疾患および大動脈に影響を及ぼす疾患からなる群より選ばれることを特徴とする上記医薬製剤。
【国際調査報告】
2007535517.tif 000028
2007535517.tif 000029
2007535517.tif 000030
2007535517.tif 000031
2007535517.tif 000032