【手続補正書】
【提出日】平成28年2月22日(2016.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体であって、以下：
ａ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のエピトープに選択的に結合する第１のヒトエピトープ結合領域と、第１のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域とを含み、ここで前記第１のＣＨ３領域がプロテインＡに結合する、第１のポリペプチド；ならびに
ｂ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第２のエピトープに選択的に結合する第２のヒトエピトープ結合領域と、第２のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域とを含む、第２のポリペプチド；
を含み、ここで、前記第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの前記第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含む、ヒト二重特異性抗体。
【請求項２】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ１重鎖である、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ２重鎖である、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ４重鎖である、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒもしくは（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒもしくは（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆである、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体を作製するためのインビトロの方法であって、前記方法は、以下:
ａ．第１の核酸配列、第２の核酸配列および第３の核酸配列を哺乳動物細胞に導入する工程であって、ここで；
前記第１の核酸配列が、第１のエピトープを認識する第１の可変ドメインを含む第１のヒト免疫グロブリン重鎖をコードし、ここで、前記コードされる第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される第１の定常ドメインを含み、そしてここで、前記第１のＣＨ３領域はプロテインＡに結合し；
前記第２の核酸配列が、第２のエピトープを認識する第２の可変ドメインを含む第２のヒト免疫グロブリン重鎖をコードし、ここで、前記コードされる第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される第２の定常ドメインを含み、そしてここで前記第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの前記第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含み；
前記第３の核酸配列が、前記第１の免疫グロブリン重鎖および前記第２の免疫グロブリン重鎖と対形成する免疫グロブリン軽鎖をコードする、工程；
ｂ．前記細胞に二重特異性抗体を発現させる工程；ならびに
ｃ．前記二重特異性抗体がプロテインＡに結合する能力に基づいて前記二重特異性抗体を単離する工程
を包含する、方法。
【請求項７】
前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒもしくは（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒもしくは（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記二重特異性抗体が、プロテインＡを備える固体支持体で単離される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記固体支持体が、プロテインＡアフィニティーカラムを含み、前記二重特異性抗体が、ｐＨ勾配を使用して単離される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｐＨ勾配が、ｐＨ３とｐＨ５との間の１またはそれより多いｐＨ段階を含む段階勾配である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体を単離するための方法であって、前記方法は、以下：
破壊された細胞または抗体の混合物から、識別的に改変されたＣＨ３領域を有する、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される重鎖定常領域を含むヒト二重特異性抗体を単離する工程を包含し、ここで、前記識別的に改変されたＣＨ３領域は、プロテインＡに結合する第１のＣＨ３領域およびプロテインＡへの第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含む第２のＣＨ３領域を含み、ここで、前記識別的に改変されたＣＨ３領域は、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でなく、そしてここで、前記二重特異性抗体は、プロテインＡに対するその親和性に基づいて、前記破壊された細胞または前記混合物から単離される、方法。
【請求項１３】
前記重鎖定常領域の一方のモノマーが、ヒトＩｇＧ１であり、前記重鎖定常領域の他方のモノマーが、改変を前記第２のＣＨ３領域に含む改変されたヒトＩｇＧ１であり、前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）Ｈ９５Ｒもしくは（ｂ）Ｈ９５ＲおよびＹ９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）Ｈ４３５Ｒもしくは（ｂ’）Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記破壊された細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体であって、以下：
ａ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のエピトープに選択的に結合する第１のヒトエピトープ結合領域と、第１のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域とを含み、ここで前記第１のＣＨ３領域がプロテインＡに結合する、第１のポリペプチド；ならびに
ｂ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第２のエピトープに選択的に結合する第２のヒトエピトープ結合領域と、第２のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域とを含む、第２のポリペプチド；
を含み、ここで、
前記第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの前記第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含み、
前記抗体は、ヒトにおいて免疫原性でない、ヒト二重特異性抗体。
【請求項１６】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ１重鎖である、請求項１５に記載の二重特異性抗体。
【請求項１７】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ２重鎖である、請求項１５に記載の二重特異性抗体。
【請求項１８】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ４重鎖である、請求項１５に記載の二重特異性抗体。
【請求項１９】
前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒもしくは（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒもしくは（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆである、請求項１５に記載の二重特異性抗体。
【請求項２０】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体を作製するためのインビトロの方法であって、前記方法は、以下：
ａ．第１の核酸配列、第２の核酸配列および第３の核酸配列を哺乳動物細胞に導入する工程であって、ここで；
前記第１の核酸配列が、第１のエピトープを認識する第１の可変ドメインを含む第１のヒト免疫グロブリン重鎖をコードし、ここで、前記コードされる第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される第１の定常ドメインを含み、そしてここで、前記第１のＣＨ３領域はプロテインＡに結合し；
前記第２の核酸配列が、第２のエピトープを認識する第２の可変ドメインを含む第２のヒト免疫グロブリン重鎖をコードし、ここで、前記コードされる第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される第２の定常ドメインを含み、そしてここで前記第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの前記第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含み；
前記第３の核酸配列が、前記第１の免疫グロブリン重鎖および前記第２の免疫グロブリン重鎖と対形成する免疫グロブリン軽鎖をコードする、工程；
ｂ．前記細胞に二重特異性抗体を発現させる工程；ならびに
ｃ．前記二重特異性抗体がプロテインＡに結合する能力に基づいて前記二重特異性抗体を単離する工程
を包含し、
前記抗体は、ヒトにおいて免疫原性でない、方法。
【請求項２１】
前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒもしくは（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒもしくは（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記二重特異性抗体が、プロテインＡを備える固体支持体で単離される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記固体支持体が、プロテインＡアフィニティーカラムを含み、前記二重特異性抗体が、ｐＨ勾配を使用して単離される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｐＨ勾配が、ｐＨ３とｐＨ５との間の１またはそれより多いｐＨ段階を含む段階勾配である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体を単離するための方法であって、前記方法は、以下：
破壊された細胞または抗体の混合物から、識別的に改変されたＣＨ３領域を有する、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される重鎖定常領域を含むヒト二重特異性抗体を単離する工程を包含し、ここで、前記識別的に改変されたＣＨ３領域は、プロテインＡに結合する第１のＣＨ３領域およびプロテインＡへの第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含む第２のＣＨ３領域を含み、ここで、前記識別的に改変されたＣＨ３領域は、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でなく、そしてここで、前記二重特異性抗体は、プロテインＡに対するその親和性に基づいて、前記破壊された細胞または前記混合物から単離され、
前記抗体は、ヒトにおいて免疫原性でない、方法。
【請求項２７】
前記重鎖定常領域の一方のモノマーが、ヒトＩｇＧ１であり、前記重鎖定常領域の他方のモノマーが、改変を前記第２のＣＨ３領域に含む改変されたヒトＩｇＧ１であり、前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）Ｈ９５Ｒもしくは（ｂ）Ｈ９５ＲおよびＹ９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）Ｈ４３５Ｒもしくは（ｂ’）Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記破壊された細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体であって、以下：
ａ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のエピトープに選択的に結合する第１のヒトエピトープ結合領域と、第１のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域とを含み、ここで前記第１のＣＨ３領域がプロテインＡに結合する、第１のポリペプチド；ならびに
ｂ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第２のエピトープに選択的に結合する第２のヒトエピトープ結合領域と、第２のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域とを含む、第２のポリペプチド；
を含み、ここで、前記第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの前記第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含み、ここで、前記改変は、前記抗体の血清半減期を変更しない、ヒト二重特異性抗体。
【請求項３０】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ１重鎖である、請求項２９に記載の二重特異性抗体。
【請求項３１】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ２重鎖である、請求項２９に記載の二重特異性抗体。
【請求項３２】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ４重鎖である、請求項２９に記載の二重特異性抗体。
【請求項３３】
前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒもしくは（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒもしくは（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆである、請求項２９に記載の二重特異性抗体。
【請求項３４】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体を作製するためのインビトロの方法であって、前記方法は、以下：
ａ．第１の核酸配列、第２の核酸配列および第３の核酸配列を哺乳動物細胞に導入する工程であって、ここで；
前記第１の核酸配列が、第１のエピトープを認識する第１の可変ドメインを含む第１のヒト免疫グロブリン重鎖をコードし、ここで、前記コードされる第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される第１の定常ドメインを含み、そしてここで、前記第１のＣＨ３領域はプロテインＡに結合し；
前記第２の核酸配列が、第２のエピトープを認識する第２の可変ドメインを含む第２のヒト免疫グロブリン重鎖をコードし、ここで、前記コードされる第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される第２の定常ドメインを含み、ここで、前記第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの前記第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含み、そしてここで前記改変は、前記抗体の血清半減期を変更せず；
前記第３の核酸配列が、前記第１の免疫グロブリン重鎖および前記第２の免疫グロブリン重鎖と対形成する免疫グロブリン軽鎖をコードする、工程；
ｂ．前記細胞に二重特異性抗体を発現させる工程；ならびに
ｃ．前記二重特異性抗体がプロテインＡに結合する能力に基づいて前記二重特異性抗体を単離する工程
を包含する、方法。
【請求項３５】
前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒもしくは（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒもしくは（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記二重特異性抗体が、プロテインＡを備える固体支持体で単離される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記固体支持体が、プロテインＡアフィニティーカラムを含み、前記二重特異性抗体が、ｐＨ勾配を使用して単離される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｐＨ勾配が、ｐＨ３とｐＨ５との間の１またはそれより多いｐＨ段階を含む段階勾配である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体を単離するための方法であって、前記方法は、以下：
破壊された細胞または抗体の混合物から、識別的に改変されたＣＨ３領域を有する、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される重鎖定常領域を含むヒト二重特異性抗体を単離する工程を包含し、ここで、前記識別的に改変されたＣＨ３領域は、プロテインＡに結合する第１のＣＨ３領域およびプロテインＡへの第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含む第２のＣＨ３領域を含み、ここで、前記改変は、前記抗体の血清半減期を変更せず、ここで、前記識別的に改変されたＣＨ３領域は、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でなく、そしてここで、前記二重特異性抗体は、プロテインＡに対するその親和性に基づいて、前記破壊された細胞または前記混合物から単離される、方法。
【請求項４１】
前記重鎖定常領域の一方のモノマーが、ヒトＩｇＧ１であり、前記重鎖定常領域の他方のモノマーが、改変を前記第２のＣＨ３領域に含む改変されたヒトＩｇＧ１であり、前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）Ｈ９５Ｒもしくは（ｂ）Ｈ９５ＲおよびＹ９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）Ｈ４３５Ｒもしくは（ｂ’）Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記破壊された細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体であって、以下：
ａ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のエピトープに選択的に結合する第１のヒトエピトープ結合領域と、第１のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域とを含み、ここで前記第１のＣＨ３領域がプロテインＡに結合する、第１のポリペプチド；ならびに
ｂ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第２のエピトープに選択的に結合する第２のヒトエピトープ結合領域と、第２のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域とを含む、第２のポリペプチド；
を含み、ここで、前記第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの前記第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含み、ここで、前記改変は、前記抗体の血清半減期を変更せず、
前記抗体は、ヒトにおいて免疫原性でない、ヒト二重特異性抗体。
【請求項４４】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ１重鎖である、請求項４３に記載の二重特異性抗体。
【請求項４５】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ２重鎖である、請求項４３に記載の二重特異性抗体。
【請求項４６】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ４重鎖である、請求項４３に記載の二重特異性抗体。
【請求項４７】
前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒもしくは（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒもしくは（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆである、請求項４３に記載の二重特異性抗体。
【請求項４８】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体を作製するためのインビトロの方法であって、前記方法は、以下：
ａ．第１の核酸配列、第２の核酸配列および第３の核酸配列を哺乳動物細胞に導入する工程であって、ここで；
前記第１の核酸配列が、第１のエピトープを認識する第１の可変ドメインを含む第１のヒト免疫グロブリン重鎖をコードし、ここで、前記コードされる第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される第１の定常ドメインを含み、そしてここで、前記第１のＣＨ３領域はプロテインＡに結合し；
前記第２の核酸配列が、第２のエピトープを認識する第２の可変ドメインを含む第２のヒト免疫グロブリン重鎖をコードし、ここで、前記コードされる第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される第２の定常ドメインを含み、ここで、前記第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの前記第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含み、そしてここで前記改変は、前記抗体の血清半減期を変更せず；
前記第３の核酸配列が、前記第１の免疫グロブリン重鎖および前記第２の免疫グロブリン重鎖と対形成する免疫グロブリン軽鎖をコードする、工程；
ｂ．前記細胞に二重特異性抗体を発現させる工程；ならびに
ｃ．前記二重特異性抗体がプロテインＡに結合する能力に基づいて前記二重特異性抗体を単離する工程
を包含し、
前記抗体は、ヒトにおいて免疫原性でない、方法。
【請求項４９】
前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒもしくは（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒもしくは（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記二重特異性抗体が、プロテインＡを備える固体支持体で単離される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記固体支持体が、プロテインＡアフィニティーカラムを含み、前記二重特異性抗体が、ｐＨ勾配を使用して単離される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ｐＨ勾配が、ｐＨ３とｐＨ５との間の１またはそれより多いｐＨ段階を含む段階勾配である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体を単離するための方法であって、前記方法は、以下：
破壊された細胞または抗体の混合物から、識別的に改変されたＣＨ３領域を有する、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される重鎖定常領域を含むヒト二重特異性抗体を単離する工程を包含し、ここで、前記識別的に改変されたＣＨ３領域は、プロテインＡに結合する第１のＣＨ３領域およびプロテインＡへの第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含む第２のＣＨ３領域を含み、ここで、前記改変は、前記抗体の血清半減期を変更せず、ここで、前記識別的に改変されたＣＨ３領域は、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でなく、そしてここで、前記二重特異性抗体は、プロテインＡに対するその親和性に基づいて、前記破壊された細胞または前記混合物から単離され、
前記抗体は、ヒトにおいて免疫原性でない、方法。
【請求項５５】
前記重鎖定常領域の一方のモノマーが、ヒトＩｇＧ１であり、前記重鎖定常領域の他方のモノマーが、改変を前記第２のＣＨ３領域に含む改変されたヒトＩｇＧ１であり、前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）Ｈ９５Ｒもしくは（ｂ）Ｈ９５ＲおよびＹ９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）Ｈ４３５Ｒもしくは（ｂ’）Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記破壊された細胞がＣＨＯ細胞である、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体であって、以下：
ａ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のエピトープに選択的に結合する第１のヒトエピトープ結合領域と、第１のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域とを含み、ここで前記第１のＣＨ３領域がプロテインＡに結合する、第１のポリペプチド；ならびに
ｂ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第２のエピトープに選択的に結合する第２のヒトエピトープ結合領域と、第２のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域とを含む、第２のポリペプチド；
を含み、ここで、前記第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの前記第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含み、
前記抗体における２つの軽鎖は同一である、ヒト二重特異性抗体。
【請求項５８】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ１重鎖である、請求項５７に記載の二重特異性抗体。
【請求項５９】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ２重鎖である、請求項５７に記載の二重特異性抗体。
【請求項６０】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ４重鎖である、請求項５７に記載の二重特異性抗体。
【請求項６１】
前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒもしくは（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒもしくは（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆである、請求項５７に記載の二重特異性抗体。
【請求項６２】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体を作製するためのインビトロの方法であって、前記方法は、以下：
ａ．第１の核酸配列、第２の核酸配列および第３の核酸配列を哺乳動物細胞に導入する工程であって、ここで；
前記第１の核酸配列が、第１のエピトープを認識する第１の可変ドメインを含む第１のヒト免疫グロブリン重鎖をコードし、ここで、前記コードされる第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される第１の定常ドメインを含み、そしてここで、前記第１のＣＨ３領域はプロテインＡに結合し；
前記第２の核酸配列が、第２のエピトープを認識する第２の可変ドメインを含む第２のヒト免疫グロブリン重鎖をコードし、ここで、前記コードされる第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される第２の定常ドメインを含み、そしてここで前記第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの前記第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含み；
前記第３の核酸配列が、前記第１の免疫グロブリン重鎖および前記第２の免疫グロブリン重鎖と対形成する免疫グロブリン軽鎖をコードする、工程；
ｂ．前記細胞に二重特異性抗体を発現させる工程；ならびに
ｃ．前記二重特異性抗体がプロテインＡに結合する能力に基づいて前記二重特異性抗体を単離する工程
を包含し、
前記抗体における２つの軽鎖は同じである、方法。
【請求項６３】
前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒもしくは（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒもしくは（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記二重特異性抗体が、プロテインＡを備える固体支持体で単離される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記固体支持体が、プロテインＡアフィニティーカラムを含み、前記二重特異性抗体が、ｐＨ勾配を使用して単離される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ｐＨ勾配が、ｐＨ３とｐＨ５との間の１またはそれより多いｐＨ段階を含む段階勾配である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体を単離するための方法であって、前記方法は、以下：
破壊された細胞または抗体の混合物から、識別的に改変されたＣＨ３領域を有する、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される重鎖定常領域を含むヒト二重特異性抗体を単離する工程を包含し、ここで、前記識別的に改変されたＣＨ３領域は、プロテインＡに結合する第１のＣＨ３領域およびプロテインＡへの第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含む第２のＣＨ３領域を含み、ここで、前記識別的に改変されたＣＨ３領域は、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でなく、そしてここで、前記二重特異性抗体は、プロテインＡに対するその親和性に基づいて、前記破壊された細胞または前記混合物から単離され、前記抗体における２つの軽鎖は同じである、方法。
【請求項６９】
前記重鎖定常領域の一方のモノマーが、ヒトＩｇＧ１であり、前記重鎖定常領域の他方のモノマーが、改変を前記第２のＣＨ３領域に含む改変されたヒトＩｇＧ１であり、前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）Ｈ９５Ｒもしくは（ｂ）Ｈ９５ＲおよびＹ９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）Ｈ４３５Ｒもしくは（ｂ’）Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記破壊された細胞がＣＨＯ細胞である、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体であって、以下：
ａ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のエピトープに選択的に結合する第１のヒトエピトープ結合領域と、第１のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域とを含み、ここで前記第１のＣＨ３領域がプロテインＡに結合する、第１のポリペプチド；ならびに
ｂ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第２のエピトープに選択的に結合する第２のヒトエピトープ結合領域と、第２のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域とを含む、第２のポリペプチド；
を含み、ここで、前記第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの前記第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含み、ここで、前記改変は、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒもしくは（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒもしくは（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆである、ヒト二重特異性抗体。
【請求項７２】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ１重鎖である、請求項７１に記載の二重特異性抗体。
【請求項７３】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ２重鎖である、請求項７１に記載の二重特異性抗体。
【請求項７４】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ４重鎖である、請求項７１に記載の二重特異性抗体。
【請求項７５】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体を作製するためのインビトロの方法であって、前記方法は、以下：
ａ．第１の核酸配列、第２の核酸配列および第３の核酸配列を哺乳動物細胞に導入する工程であって、ここで；
前記第１の核酸配列が、第１のエピトープを認識する第１の可変ドメインを含む第１のヒト免疫グロブリン重鎖をコードし、ここで、前記コードされる第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される第１の定常ドメインを含み、そしてここで、前記第１のＣＨ３領域はプロテインＡに結合し；
前記第２の核酸配列が、第２のエピトープを認識する第２の可変ドメインを含む第２のヒト免疫グロブリン重鎖をコードし、ここで、前記コードされる第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＣＨ３領域を含む、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される第２の定常ドメインを含み、ここで、前記第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの前記第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含み、そしてここで前記改変は、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒもしくは（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒもしくは（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆであり；
前記第３の核酸配列が、前記第１の免疫グロブリン重鎖および前記第２の免疫グロブリン重鎖と対形成する免疫グロブリン軽鎖をコードする、工程；
ｂ．前記細胞に二重特異性抗体を発現させる工程；ならびに
ｃ．前記二重特異性抗体がプロテインＡに結合する能力に基づいて前記二重特異性抗体を単離する工程
を包含する、方法。
【請求項７６】
前記二重特異性抗体が、プロテインＡを備える固体支持体で単離される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記固体支持体が、プロテインＡアフィニティーカラムを含み、前記二重特異性抗体が、ｐＨ勾配を使用して単離される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ｐＨ勾配が、ｐＨ３とｐＨ５との間の１またはそれより多いｐＨ段階を含む段階勾配である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項７５〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体であるヒト二重特異性抗体を単離するための方法であって、前記方法は、以下：
破壊された細胞または抗体の混合物から、識別的に改変されたＣＨ３領域を有する、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域から選択される重鎖定常領域を含むヒト二重特異性抗体を単離する工程を包含し、ここで、前記識別的に改変されたＣＨ３領域は、プロテインＡに結合する第１のＣＨ３領域およびプロテインＡへの第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含む第２のＣＨ３領域を含み、ここで、前記改変は、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒもしくは（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒもしくは（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆであり、
前記識別的に改変されたＣＨ３領域は、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でなく、そしてここで、前記二重特異性抗体は、プロテインＡに対するその親和性に基づいて、前記破壊された細胞または前記混合物から単離される、方法。
【請求項８１】
前記重鎖定常領域の一方のモノマーが、ヒトＩｇＧ１であり、前記重鎖定常領域の他方のモノマーが、改変を前記第２のＣＨ３領域に含む改変されたヒトＩｇＧ１であり、前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）Ｈ９５Ｒもしくは（ｂ）Ｈ９５ＲおよびＹ９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）Ｈ４３５Ｒもしくは（ｂ’）Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記破壊された細胞がＣＨＯ細胞である、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項８３】
二重特異性抗原結合タンパク質を単離するための方法であって、前記方法は、以下：
イオン調節物質の存在下で、破壊された細胞または抗原結合タンパク質の混合物と、プロテインＡ親和性支持体とを接触させる工程；および
ｐＨ勾配によって二重特異性抗原結合タンパク質を溶出する工程；
を包含し、ここで、
前記二重特異性抗原結合タンパク質は、各々プロテインＡに対して異なる親和性を有する第１のＩｇＧ  ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体ＩｇＧ  ＣＨ３領域を含む、方法。
【請求項８４】
前記イオン調節物質が、以下：
（ａ）酢酸のベリリウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩もしくはカリウム塩；重炭酸ナトリウムもしくは重炭酸カリウム；炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムもしくは炭酸セシウム；塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化セシウムもしくは塩化マグネシウム；フッ化ナトリウムもしくはフッ化カリウム；硝酸ナトリウム、硝酸カリウムもしくは硝酸カルシウム；リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウム；または硫酸カルシウムもしくは硫酸マグネシウム、
（ｂ）アルカリ金属、アルカリ土類金属、またはハロゲンの塩、
（ｃ）ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２、あるいは
（ｄ）ＮａＣｌ
である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
（ａ）前記イオン調節物質が、約０．１５〜約０．５モル濃度の濃度で存在するか、
（ｂ）前記イオン調節物質が、ＮａＣｌであり、そして少なくとも約１５０ｍＭの濃度で存在するか、または
（ｃ）前記イオン調節物質が、約０．５〜約１．０モル濃度の濃度で存在する、請求項８３または８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ｐＨ勾配が、ｐＨ約３．９〜ｐＨ約４．５、ｐＨ約４．０〜ｐＨ約４．４、またはｐＨ約４．１〜ｐＨ約  ４．３である、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
（ａ）前記ｐＨ勾配が直線勾配であるか、または
（ｂ）前記ｐＨ勾配が段階勾配であり、ここで、前記方法が、ｐＨ約３．９、ｐＨ約４．０、ｐＨ約４．１、ｐＨ約４．２、ｐＨ約４．３またはｐＨ約４．４の段階を、平衡化されたプロテインＡカラムに適用する工程をさらに包含する、請求項８３〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記二重特異性抗原結合タンパク質が、以下：
（ａ）ｐＨ約３．９〜ｐＨ約４．４、ｐＨ約４．０〜ｐＨ約４．３、ｐＨ約４．１〜ｐＨ約４．２、もしくはｐＨ約４．２のｐＨ、または
（ｂ）４、４．１、４．２、４．３、４．４もしくは４．５のｐＨ
で溶出する、請求項８３〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記混合物が培養液である、請求項８３〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記ヘテロ二量体ＩｇＧ  ＣＨ３領域を含む前記二重特異性抗原結合タンパク質が、
プロテインＡに関して同一の親和性を有するＣＨ３ドメインを含むホモ二量体ＩｇＧ  ＣＨ３領域を含む抗体である全タンパク質の約１重量％未満、０．５重量％未満または０．１重量％未満を含む画分に溶出する、請求項８３〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記第２のＩｇＧ  ＣＨ３領域が、プロテインＡへの前記第２のＣＨ３領域の結合を減少させるかまたは排除する改変を含む、請求項８３〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記第１のＩｇＧ  ＣＨ３ドメインおよび前記第２のＩｇＧ  ＣＨ３ドメインが各々、ヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ３ドメイン、ヒトＩｇＧ２重鎖ＣＨ３ドメインおよびヒトＩｇＧ４重鎖ＣＨ３ドメインからなる群から選択されるヒトＩｇＧ重鎖ＣＨ３ドメインである、請求項８３〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒもしくは（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒもしくは（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記第２のＩｇＧ  ＣＨ３ドメインが、以下：
ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインであり、そして、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける１６Ｅ、１８Ｍ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍおよび８２Ｉ、またはＥＵナンバリングシステムにおける３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍおよび４２２Ｉからなる群から選択される１から５つの改変をさらに含むか、
ヒトＩｇＧ２  ＣＨ３ドメインであり、そして、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける４４Ｓ、５２Ｎおよび８２Ｉ、またはＥＵナンバリングシステムにおける３８４Ｓ、３９２Ｎおよび４２２Ｉからなる群から選択される改変をさらに含むか、あるいは ヒトＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインであり、そして、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける１５Ｒ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍ、６９Ｋ、７９Ｑおよび８２Ｉ、またはＥＵナンバリングシステムにおける３５５Ｒ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４０９Ｋ、４１９Ｑおよび４２２Ｉからなる群から選択される改変をさらに含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記第２のＩｇＧ  ＣＨ３ドメインがヒトＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインであり、そして、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける１０５ＰまたはＥＵナンバリングシステムにおけ４４５Ｐの改変をさらに含む、請求項９３または９４に記載の方法。
【請求項９６】
（ａ）前記第１のＩｇＧ  ＣＨ３ドメインおよび前記第２のＩｇＧ  ＣＨ３ドメインが同一のアイソタイプである；
（ｂ）前記二重特異性抗原結合タンパク質の前記ヘテロ二量体ＣＨ３領域が、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でない；
（ｃ）前記二重特異性抗原結合タンパク質が２つの軽鎖を含み、前記２つの軽鎖は同じである；
（ｄ）前記二重特異性抗原結合タンパク質が、ホモ二量体ＩｇＧ  ＣＨ３領域を有する同じ二重特異性抗原結合タンパク質と等価な薬物動態学的プロファイルを示す；あるいは
（ｅ）前記プロテインＡ親和性支持体がプロテインＡカラムである、請求項８３〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
請求項８３〜９６のいずれか一項に記載の方法に従って単離された二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９８】
二重特異性抗体を作製するための方法であって、前記方法は、以下：
破壊された細胞または抗原結合タンパク質の混合物とプロテインＡ親和性支持体とを接触させる工程；および
イオン調節物質の存在下で、ｐＨ勾配によって二重特異性抗原結合タンパク質を溶出する工程；
を包含し、ここで、
前記二重特異性抗体は、各々プロテインＡに対して異なる親和性を有する第１のＩｇＧ  ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体ＩｇＧ  ＣＨ３領域を含む、方法。