(57)【要約】本発明は、活性化合物の送達のための制御放出性微小球を調製するためのエマルションに基づいた方法を提供する。ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマー、生物活性タンパク質、および水を含み、かつ、該生物活性タンパク質の不溶性凝集物を実質的に含まない水性分散相を含むエマルションの調製を、該方法は含む。続いて、該ポリマーは物理的または化学的に架橋されて、ヒドロゲルを形成する。本発明はさらに、該方法によって調製され、かつ活性タンパク質の不溶性凝集物を実質的に含まない、活性タンパク質の充填されたヒドロゲル微小球を提供する。既知のヒドロゲル微小球の放出プロファイルよりもかなり改良されている放出プロファイルによる制御された放出を、該微小球は示す。治療用または診断用タンパク質を注射によって送達するために、該微小球は使用されることができる。【選択図】図５
2007529508.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
制御放出性微小球を調製する方法において、該方法が、
（ａ）  −  ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマー、
−  生物活性タンパク質、および
−  水
を含む水性分散相を含むエマルションを形成すること、
およびその後、
（ｂ）該ポリマーを物理的または化学的に架橋して、ヒドロゲルを形成すること
の段階を含み、該水性分散相が、当該生物活性タンパク質の不溶性凝集物を実質的に含まない、上記の制御放出性微小球を調製する方法。
【請求項２】
制御放出性微小球を調製する方法において、該方法が、
（ａ）ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマー、生物活性タンパク質、および水を含む第一水性相を用意すること、
（ｂ）ヒドロゲルを形成する能力のある当該ポリマーと一緒にされると相分離を起こす能力のある化合物、および水を含む第二水性相を用意すること、
（ｃ）第一水性相を第二水性相中に分散することによってエマルションを形成すること、そしてその後、
（ｄ）ヒドロゲルを形成する能力のある該ポリマーを物理的または化学的に架橋して、ヒドロゲルを形成すること
の段階を含み、ここで、第二水性相の水含有量が、第一水性相の水含有量と少なくとも近似平衡にある、上記の制御放出性微小球を調製する方法。
【請求項３】
制御放出性微小球を調製する方法において、該方法が、
（ａ）温度Ｔ１を持つ水性相を用意すること、但し当該相が、
−  生物活性タンパク質、
−  ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマー、
−  ヒドロゲルを形成する能力のある当該ポリマーと一緒にされると相分離を起こす能力のある化合物、および
−  水
のある量を含み、ここで、該量が、Ｔ１においては水性の単一相系をもたらすが、Ｔ２においては２相系をもたらすように選ばれ、かつ、Ｔ２はＴ１より低い、
（ｂ）  段階（ａ）で得られた水性単一相系をＴ１からＴ２へ冷却し、それによって相分離およびエマルションの形成を誘起させること、そしてその後、
（ｃ）ヒドロゲルを形成する能力のある該ポリマーを、物理的または化学的に架橋して、ヒドロゲルを形成すること
の段階を含む、上記の制御放出性微小球を調製する方法。
【請求項４】
ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーがプレポリマーである、請求項１〜３のいずれか１項に従う方法。
【請求項５】
ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーが、結晶化またはステレオコンプレックス形成によって、物理的に架橋される能力がある、請求項１〜４のいずれか１項に従う方法。
【請求項６】
ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーが、多糖または変性多糖、好ましくは変性デキストランである、請求項１〜５のいずれか１項に従う方法。
【請求項７】
ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーが、デキストランヒドロキシエチルメタクリレート（ｄｅｘＨＥＭＡ）、デキストランヒドロキシプロピルメタクリレート（ｄｅｘＨＰＭＡ）、デキストランヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ｄｅｘＨＰＭＡｍ）、およびデキストランヒドロキシエチルメタクリルアミド（ｄｅｘＨＥＭＡｍ）から選ばれる、請求項６に従う方法。
【請求項８】
生物活性タンパク質が、室温における水中または生理的緩衝溶液中約１０重量％未満の溶解度を持つ、請求項１〜７のいずれか１項に従う方法。
【請求項９】
生物活性タンパク質が、インシュリン、エポエチン−アルファ、エポエチン−ベータ、カルシトニン、ヘパリン、ＩＦＮ（インターフェロン）−アルファ−２ａ、ＩＦＮ−アルファ−２ｂ、ＰＥＧ−ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−アルファコン−１、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ベータ−１ａ、ＩＦＮ−ベータ−１ａ、ＩＦＮ−ベータ−１ｂ、ＩＦＮ−ガンマ−１ｂ、ソマトロピン、フォリトロピン、メノトロピン、ロイプロリド、ゴセレリン、ブセレリン、トリプトレリン、フィルグラスチム（Ｇ−ＣＳＦ）、レノグラスチム（Ｇ−ＣＳＦ）、サルグラルモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ、インターロイキン、血液凝固因子、たとえば第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子、ナドロパリン、ダルテパリン、チンザパリン、セルトパリン、レビパリン、チロフィバン、オクトレオチド、抗原、およびモノクローナル抗体からなる群から選ばれる、請求項１〜８のいずれか１項に従う方法。
【請求項１０】
生物活性タンパク質を含む水性相が、該生物活性タンパク質の凝集を低減する能力のある添加剤をも含む、請求項１〜９のいずれか１項に従う方法。
【請求項１１】
添加剤が、界面活性剤、糖、糖アルコール、カオトロピック剤、酸化防止剤、アミノ酸、および無機塩からなる群から選ばれる、請求項１０に従う方法。
【請求項１２】
ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーを架橋する段階が、エマルションの形成後、約１５分間以内に実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に従う方法。
【請求項１３】
エマルションを形成する段階が、連続方法として実施される、請求項１〜１２のいずれか１項に従う方法。
【請求項１４】
（ａ）微小球を回収すること、
（ｂ）微小球を精製すること、および／または
（ｃ）微小球を乾燥すること
の段階のいずれかをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に従う方法。
【請求項１５】
ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーと一緒にされると相分離を起こす能力のある化合物が、ポリエチレングリコールである、請求項２または３のいずれか１項に従う方法。
【請求項１６】
水性分散相が、ポリマーまたはプレポリマー約５〜６０重量％、および生物活性タンパク質約１〜３０重量％を含む、請求項１に従う方法。
【請求項１７】
エマルションが水性連続相を含み、当該水性連続相が、ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーと一緒にされると相分離を起こす能力のある化合物、および水を含み、当該化合物が、好ましくはポリエチレングリコールである、請求項１に従う方法。
【請求項１８】
エマルションを形成する段階が、
（ａ）固形の、可溶性の形の生物活性タンパク質を用意すること、および
（ｂ）該生物活性タンパク質を、ある量の水と一緒にすること
の下位段階を含む、請求項１に従う方法。
【請求項１９】
水の量が、エマルションの分散相中の生物活性タンパク質の濃度とほぼ同等、またはそれより高い生物活性タンパク質の濃度をもたらすように選ばれる、請求項１８に従う方法。
【請求項２０】
ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーと一緒にされると水性相分離を起こす能力のある化合物の水性溶液または水性分散物の形で、当該量の水が用意される、請求項１８または１９に従う方法。
【請求項２１】
生物活性タンパク質が、凍結乾燥された形で用意される、請求項１８〜２０のいずれか１項に従う方法。
【請求項２２】
生物活性タンパク質が、ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーを含む、凍結乾燥された混合物として用意される、請求項１８〜２１のいずれか１項に従う方法。
【請求項２３】
生物活性タンパク質が、可溶性沈降物として用意される、請求項１８〜２２のいずれか１項に従う方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に従う方法によって得ることができる、微小球。
【請求項２５】
生分解性の、物理的または化学的に架橋されたポリマーと生物活性タンパク質とを含み、当該生物活性タンパク質の不溶性凝集物を実質的に含んでいない、制御放出性微小球。
【請求項２６】
架橋されたポリマーが多糖から、好ましくはデキストラン若しくはデキストラン誘導体から誘導される、請求項２４または２５に従う微小球。
【請求項２７】
生物活性タンパク質約０．１〜６０重量％を含んでいる、請求項２４〜２６のいずれか１項に従う微小球。
【請求項２８】
生物活性タンパク質の少なくとも約９５重量％の部分が、生理的条件下に該微小球から解放可能かつ放出可能であるところの、請求項２４〜２７のいずれか１項に従う微小球。
【請求項２９】
治療用または診断用生物活性タンパク質の担体として、請求項２４〜２８のいずれか１項に従う微小球を使用する方法。
【請求項３０】
請求項２４〜２８のいずれか１項に従う微小球を含んでいる、生物活性タンパク質の制御された放出を行うための薬剤組成物。
【請求項３１】
乾燥した、かつ無菌の形で提供される、請求項３０に従う組成物。
【請求項３２】
非経口注射に適するように調剤され、かつ処理されている、請求項３１に従う組成物。
【請求項３３】
微小球が、レーザー回折によって測定された、約１〜約１００μｍの平均直径を持っている、請求項３２に従う組成物。
【請求項３４】
吸入に適するように調剤され、かつ処理されている、請求項３０に従う組成物。
【請求項３５】
微小球が、レーザー回折によって測定された、約１〜約２０μｍ、より好ましくは約２〜約１０μｍの平均直径を持っている、請求項３５に従う組成物。
【請求項３６】
微小球の少なくとも約８０重量％が、レーザー回折によって測定された、約２〜１０μｍの直径を持つ、請求項３４または３５に従う組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロゲル系、好ましくはヒドロゲル微小球を調製するための水性に基づいた方法、これらの方法によって得られうるまたは得られた微小球、生分解性の、物理的または化学的に架橋されたポリマーと生物活性タンパク質とを含む制御放出性微小球、微小球を含有する薬剤組成物、およびそれらの使用方法に関する。特に、本発明は、この分野で既知の方法にしばしば付随する問題に対処する。
【０００２】
もっと詳細には、本発明は、薬剤の送達または診断の用途に有用な制御された放出性または徐放性の微小球、並びにこのような微小球を含有する薬剤用および診断用組成物に関する。その多くが慣用の微小球中に取り込むことが困難であるところの生物活性タンパク質の送達に、本発明の微小球は特に有用である。他の面では、物理的または化学的に架橋されて、不溶性の粒子を形成することができる、ヒドロゲルを形成するポリマー、たとえば水溶性のポリマーから調製された微小球を、本発明は扱う。さらなる面では、高い有効充填量のタンパク質を微小球に取り込むこと、ゆっくりとした放出速度と、ほとんどまたは全くないバースト（破裂）効果と、再現できる性能とを持つ、望ましい放出プロファイルを達成すること、および／または取り込まれたタンパク質に関する安定性の問題に、本発明は関係している。
【背景技術】
【０００３】
送達系、特に上述のタイプの送達系、たとえば慣用のポリマー状微小球に、多くの生物活性タンパク質は取り込むことが困難である。困難のいくつかは、タンパク質の純度および生物活性の維持に関係している。加えて、高い有効充填量のタンパク質を微小球中に取り込むこと、ゆっくりとした放出速度とほとんどまたは全くないバースト効果と再現できる性能とを持つ、望ましい放出プロファイルを達成すること、および／または取り込まれたタンパク質についての安定性の問題を考慮に入れる系の必要性が存在することが注記される。
【０００４】
高田らは、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ誌（第８８巻（２００３年）、２２９〜２４２ページ）の彼らの論文に、組み換え型ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）の徐放のための生分解性マイクロカプセルを記載している。凍結乾燥されたタンパク質粒子を使用する、水中の油滴中の固体型エマルションの溶媒蒸発手法によって、これらのカプセルは調製される。記載された方法のかぎは、「固体状態のタンパク質は、有機状態中ではその活性を保持する。」ということである。特に、凍結乾燥されたｒｈＧＨ粉体を生分解性コポリ（ＤＬ−乳酸／グリコール酸）（ＰＬＧＡ）のマイクロカプセル中に取り込むことによる、ｒｈＧＨの注射可能な徐放性調合物を、高田らは開示する。形成されたマイクロカプセルから抽出されたｒｈＧＨの比生物活性は、細胞増殖試験における手の加えられていないｒｈＧＨのそれと同じ効力があると述べられている。高い封入率および小さい初期放出の点で、該タンパク質の粒子サイズは、マイクロカプセル封入のために非常に重要であると述べられている。小さい嵩、および取り扱いによって誘導された低い静電気を持つ、凍結乾燥されたｒｈＧＨ粉体を得るために、ある量の酢酸アンモニウムが、揮発性緩衝成分として加えられた。この方法の大きい不利点の一つは、それが有機溶媒の使用を必要とすることである。
【０００５】
国際特許出願公開第０１／５５３６０号および対応する米国特許出願公開第２００１／００４８９４７号は、不溶性の生物活性物質を含有する微粒子を開示しており、該微粒子は溶媒蒸発方法で作られ、その場合に微粒子形成ポリマーが揮発性有機溶媒、たとえば塩化メチレンに溶解される。該活性物質は、可溶性の形で、あるいは微細な粒子へと分散されて、この溶液中に取り込まれる。界面活性剤、たとえばポリ（ビニルアルコール）を含有する水性相中に、この混合物は懸濁される。撹拌が続けられながら、有機溶媒のほとんどが蒸発されて、固形の微小球が残される。代案として、微粒子形成ポリマーを既に含有する揮発性有機溶媒中に、生物活性物質が分散されまたは溶解される。該混合物は油中に懸濁されそして撹拌されて、エマルションを形成する。溶媒が油相中に拡散するに従い、エマルション液滴は硬化して微小球へとなる。さらには、生物活性物質と重合性マクロマーとの均一な混合物が噴霧されて、微細な液滴を形成する方法が記載されている。これらの液滴は、照射されて、微小球を形成する。最後に、重合性マクロマーと活性な成分とを含有する油中水滴型エマルションが形成され、このエマルションが照射されて、ヒドロゲル粒子を形成する。この方法の不利点の中には、有機溶媒の必要性、照射が生成物の生理的耐性へ及ぼす、可能性としてある有害な影響、およびタンパク質の完全無欠状態への、可能性としてある有害な影響がある。
【０００６】
他のタイプの制御放出性微小球は、適当なプレポリマーを架橋することによって調製される化学的ヒドロゲルに基づいている。たとえば、国際特許出願公開第９８／００１７０号は、誘導体化されたデキストランから作られる微小球を開示する。これらのヒドロゲル微小球は、治療用タンパク質と相容性であるだけでなく、いくらかの優れた生理的耐性をも示す。たとえば国際特許出願公開第９８／２２０９３号に記載された方法に従って、有機溶媒の使用なしで、これらは調製されることができる。
【０００７】
しかし、全てのこれらの既知の微小球および慣用のその調製方法は、生物活性タンパク質の取り込みの点になると、重大な問題を伴っている。上述のように、該問題のいくつかは、放出挙動、たとえばバースト放出効果または不完全な薬剤放出に関係しうる。これらの問題の多くの根本的な原因は、生物活性タンパク質の相対的な影響の受け易さでありうる。治療および診断に同様に使用される、小さい分子単一体とは対照的に、タンパク質は、該タンパク質分子の環境に依存する、弱い非共役結合力によって主に決定される動的な三次元構造を持つ。都合の悪い条件下、たとえば有機溶媒が存在すると、タンパク質は、その三次構造（または、該当するならば四次構造）を容易に失う。あいにく、これらの非共役結合構造の変化は、しばしば不可逆であり、したがって、タンパク質変性の初期段階を構成し、しばしば他の段階、たとえば不可逆な沈降がその後に続く。
【０００８】
本発明に想到する前には、比較的穏やかな条件、たとえば国際特許出願公開第９８／２２０９３号の全て水性の方法に記載されたものでさえ、しばしばまたは少なくとも時々、タンパク質の凝集および変性をもたらすことが観察されていた。特に、限られた水中溶解度を持つ生物活性タンパク質は、ヒドロゲル微小球の調製のために典型的に選ばれる条件によって、有害な影響を受ける傾向がある。
【０００９】
したがって、影響を受け易い生物活性タンパク質の取り込みにとりわけ適している制御放出性微小球を調製するための、さらに改良された方法の必要性が存在する。
【特許文献１】国際特許出願公開第０１／５５３６０号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００１／００４８９４７号公報
【特許文献３】国際特許出願公開第９８／００１７０号公報
【特許文献４】国際特許出願公開第９８／２２０９３号
【非特許文献１】高田ら著、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ誌（第８８巻（２００３年）、２２９〜２４２ページ）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
生物活性タンパク質の取り込みに関して、現在知られている方法の限界および不利点を克服しまたは少なくとも低減しまたは最小化する、制御放出性微小球を調製する方法を提供することが、本発明の目的である。特に、微小球の中で、取り込まれたタンパク質が純粋で、生物活性で、かつ放出可能であるところの微小球をもたらす方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１１】
限られた水中溶解度を持つ生物活性タンパク質をヒドロゲル微小球中に取り込む方法を提供することが、もう一つの目的である。
【００１２】
必須成分を溶解するために、水性プロセス媒体が使用されることができる調製方法に基づいた、制御放出系を提供することが、本発明の目的である。水に基づいた系を使用することの利点は、体組織的にまたは環境的に不安全な有機溶媒が使用される必要がなく、かつ放出されるべき生物活性タンパク質の効率に影響を持つ、タンパク質の立体配置変化をもたらしかねない溶媒または相が使用される必要がないことである。
【００１３】
改良された放出挙動を持ち、特に、有意なバースト効果または不完全放出を持たない、活性タンパク質を充填された微小球を提供することが、さらなる目的である。
【００１４】
さらに他の面では、このような改良された微小球を含む、治療用および診断用組成物、並びにその使用方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、以下の記載に照らして明らかになるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
活性化合物を送達するための制御放出性微小球を調製するための、エマルションに基づいた方法を、本発明は提供する。ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマー、生物活性タンパク質、および水を含む水性分散相を含むエマルションを形成し、そしてその後該ポリマーを物理的または化学的に架橋して、ヒドロゲルを形成する段階を、該方法は含む。さらに、水性分散相は、それが生物活性タンパク質の不溶性凝集物を実質的に含まないことを特徴とする。
【００１７】
たとえば、予め平衡化された複数の液相からエマルションを調製することによって、または凍結乾燥された活性タンパク質を水性担体中に溶解することを含む方法により分散相を調製することによって、分散相中に不溶性のタンパク質凝集物が存在しないことは、達成されることができる。他の面では、ポリマーが架橋してヒドロゲル微小球が形成される前に、活性タンパク質が沈降することを防ぎまたは最小化するように選ばれた条件下に、該方法を実施することによって、不溶性のタンパク質凝集物が存在しないことは、達成されることができる。
【発明の効果】
【００１８】
エマルションに基づいた方法によって調製され、かつ活性タンパク質の不溶性凝集物を実質的に含まない、活性タンパク質を充填されたヒドロゲル微小球を、本発明はさらに提供する。既知のヒドロゲル微小球の放出プロファイルよりもかなり改良された放出プロファイルを持つ制御放出を、該微小球は示す。典型的には、本発明の微小球は、それが取り込んだ活性形の薬剤の充填量の少なくとも約９０〜９５％を、所定の放出期間中に放出する。治療用または診断用タンパク質を注射または吸入によって送達するために、該微小球は使用されることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、制御放出性微小球を調製する方法を提供する。（ａ）ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマー、生物活性タンパク質、および水を含む水性分散相を含むエマルションを形成すること、そしてその後（ｂ）該ポリマーを物理的または化学的に架橋して、ヒドロゲルを形成することの段階を、該方法は含む。さらに、水性分散相は、それが生物活性タンパク質の不溶性凝集物を実質的に含まないことを特徴とする。
【００２０】
あるいは、（ａ）ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマー、生物活性タンパク質、および水を含む第一水性相を用意すること、（ｂ）当該ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーと一緒にされると相分離を起こす能力のある化合物、および水を含む第二水性相を用意すること、（ｃ）第一水性相を第二水性相中に分散することによってエマルションを形成すること、そしてその後、（ｄ）該ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーを、物理的または化学的に架橋して、ヒドロゲルを形成すること、の段階を該方法は含む。さらに、第二水性相は、その水含有量が第一水性相の水含有量と少なくとも近似平衡にあることを特徴とする。
【００２１】
他の変法に従うと、（ａ）温度Ｔ１を持つ水性相であって、当該相が、生物活性タンパク質、ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマー、当該ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーと一緒にされると相分離を起こす能力のある化合物、および水、のある量を含み、ここで該量が、Ｔ１においては水性の単一相系をもたらすが、Ｔ２においては２相系をもたらすように選ばれ、かつＴ２はＴ１より低い、温度Ｔ１を持つ水性相を用意すること、（ｂ）  段階（ａ）で得られた水性単一相系をＴ１からＴ２へ冷却し、それによって相分離およびエマルションの形成を誘起させること、そしてその後（ｃ）該ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーを、物理的または化学的に架橋して、ヒドロゲルを形成すること、の段階を、該方法は含む。
【００２２】
さらに、活性タンパク質の制御放出のための微小球、およびこのような微小球を含む薬剤組成物を、本発明は提供する。凝集されていなく、溶解可能、かつ放出可能の状態の、少なくとも１の生物活性タンパク質を、該微小球は含む。少なくとも部分的に凝集され、かつ変性された状態のタンパク質を有する、多くの慣用のタンパク質充填微小球に対して、これは対照的である。慣用のタンパク質充填微小球に付随した問題の多く、たとえば望ましくない放出速度、バースト効果、不完全放出、およびタンパク質の不安定性は、不溶性のタンパク質凝集物の存在と直接的に、または間接的に関連していると、本発明らは推定する。
【００２３】
典型的には、固形または半固形の物質から構成され、かつ生物活性化合物を運び、そして放出する能力のある、ミクロン程度またはミクロン未満程度の粒子として、本明細書で使用される「微小球」は広く定義される。調製方法に応じて、微小球は多かれ少なかれ球状であることができる。内側のコアおよび外側の被覆物を含む構造を持つ粒子、たとえばナノカプセルおよびマイクロカプセルをも、微小球は包含する。これに関連して、「微小球」、「微粒子」、および「マイクロカプセル」の語は、交換して使用されることができる。典型的には、レーザー回折によって測定される重量平均直径として理解される、本発明の微小球の平均直径は、約１００ｎｍ〜約５００μｍの範囲にある。より好ましくは、平均粒子直径は約１μｍ〜約１００μｍである。他の実施態様では、微小球の平均直径は約１０μｍ〜約８０μｍであり、取り込まれた活性物質の徐放を与える非経口デポー製剤として、微小球が使用される場合に、筋肉内、皮下、局所領域内または腫瘍内への注射後の、微小球の局所組織への保持を、たとえば達成するために、この範囲は非常に有用なサイズ範囲である。
【００２４】
微小球が、肺への投与用の薬剤またはワクチンの担体として使用されるならば、好まれる平均直径は、非経口投与用よりも低く、たとえば、および好ましくは約１〜約２０μｍである。他の実施態様では、平均直径は約２〜約１０μｍである。さらに他の実施態様では、肺への投与用の微小球の少なくとも約８０重量％は、約２〜１０μｍの直径を持つ。
【００２５】
本明細書で使用される「制御放出」は、即時放出ではない任意のタイプの放出を意味する。たとえば、修正された、拡張された、持続性の、遅延された、長期化された、または一定の（すなわち、零次の）放出として、制御放出は設計されることができる。理論的には、最も有用な放出プロファイルの１つは、所定の期間にわたって一定の放出である。実際には、このような零次の放出は、めったに達成されない。この発明の文脈では、制御放出は、典型的には徐放を言う。
【００２６】
この文脈では、各微小球は、取り込まれた生物活性タンパク質を非常にゆっくりと放出するので、同じタンパク質の水性溶液の投与と比較して、作用の持続時間が有意に長期化されることを、徐放は意味する。言い換えれば、数分の実効生物学的半減期を持つ短期間作用性タンパク質は、数時間のみにわたる放出がおそらく平坦な、徐放性微小球組成物として調合されることができ、他方、一、二日毎に普通には投与される他のタンパク質は、数週間〜数月の期間にわたって徐放性組成物から放出されることができる。ある場合には、タンパク質を数年にわたって微小球から放出することが望ましいかも知れず、かつ本発明によって達成可能である。本発明に従う、好まれる非経口徐放性組成物は、約１週間〜約１月の放出時間を持ち、また本発明に従う、好まれる経肺徐放性組成物は、約１日〜約１月の放出時間を持つ。投与の他の経路、たとえば経鼻、経眼、経粘膜、または経皮が意図されるならば、該投与の場所における微小球の滞留時間をも考慮に入れて、放出時間は選ばれなければならない。好ましくは、放出時間は、予測される該平均滞留時間よりも長くあってはならない。
【００２７】
エマルションは、少なくとも２の液相を持つ系として定義され、その一方が、他方中に分散されている。分散相は、内相、不連続相、または非凝集相とも言われ、他方、外相は、凝集相または連続相とも言われることがある。エマルションは、２より多い相を含んでもよい。たとえば、エマルションは、３液相（すなわち、三相エマルション）、または２液相と１固相とから構成されてもよい。全てのエマルションに共通なのは、その外相が液体状態にあることである。第三の相、たとえば液相または固相が存在するならば、これは通常、外相中に分散されている分散相の中に分散されている。
【００２８】
本発明の文脈では、ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーは、化学的または物理的に架橋されて、水で膨潤された三次元のポリマー状網状組織を形成することができる親水性ポリマーと定義される。通常、ヒドロゲルは、固体または半固体状態にある。化学的に架橋されることができるポリマーは、プレポリマーを表すことができ、プレポリマーは、モノマーとして作用することができるように、重合性基（たとえば、アクリル基）を持つポリマーと定義される。物理架橋は、架橋が新しい化学結合の形成を含まないことを意味する。たとえば、結晶領域の形成によって、またはその電荷がポリマーの電荷に対して相補的であるところの多価イオンによって、物理架橋は達成されることができる。
【００２９】
本明細書で使用される生物活性タンパク質は、ペプチド結合を通して互いに連結されているアミノ酸から主として構成された比較的大きい分子または化合物であり、これは哺乳類の病気若しくは体調を診断し、予防し若しくは治療するために、または生物の機能を変えるために使用されることができる。タンパク質は、ポリペプチドとも言われることがある。ペプチドがポリペプチドまたはタンパク質であるために持たなければならないアミノ酸の数に、明確な制限はない。普通、ポリペプチドまたはタンパク質の分子量は、少なくとも約１，０００、より典型的には少なくとも約４，０００、すなわち４キロダルトンである。現在使用されている治療用タンパク質のほとんどは、６キロダルトンより大きい分子量を持つ。生物活性タンパク質は、アミノ酸以外の化学構造を含んでもよい。バイオテクノロジーで合成されたタンパク質は、該タンパク質がその中で発現されたところの細胞中で、たとえば翻訳後に変性されることができる。糖鎖形成およびシアル酸化は、翻訳後変性の周知の例である。また、タンパク質は、その特性を変える反応性置換基、連結剤、またはポリマー状の基によってしばしば変性される。ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、すなわち、オリゴマー状またはポリマー状ポリエチレングリコール鎖のタンパク質への付加は、生物活性タンパク質の物理化学的および薬理学的特性を改良するための、最も成功した手法の一つである。したがって、化学的に変性または置換されたタンパク質もまた、本明細書で使用される生物活性タンパク質の定義内に包含される。
【００３０】
本明細書で使用される、生物活性タンパク質の不溶性凝集物は、生理的条件下に再溶解性でない凝集物である。天然に存在する、タンパク質の生物活性凝集物、たとえば生物活性を保持した二量体、三量体または他の多量体を、該凝集物が包含することは意図されない。たとえば、細胞質の「１２０キロダルトンタンパク質」は天然に存在し、単量体、四量体として、さらに八量体としても活性である。そうではなくて、不溶性凝集物は、個々の巨大分子の化学的または物理的相互作用から生じるタンパク質の分解生成物のことを言い、該相互作用においては、関与する巨大分子の三次構造（および、該当するならばその四次構造）が実質的に損なわれており、ここで「実質的に損なわれて」いるとは、所望の効果がもはや達成されないか、または実際の使用がもはや可能でないような低い程度にのみ達成されることを意味する。巨視的には、凝集物は、沈降物として現れるが、必ずしもそうとは限らないし、全てのタンパク質沈降物が不溶性凝集物であると決して結論されてはならない。巨視的であれコロイド規模であれ、生理的条件下に再溶解性でないタンパク質凝集物のみが、本発明の文脈では不溶性凝集物と理解される。このような不溶性凝集物の他の特徴は、それがその生物活性を大部分失っていることである。
【００３１】
好まれる実施態様の１つでは、ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーとして選ばれているプレポリマーを用いて、本発明は実施される。重合性官能基、たとえばラジカル重合を行う能力のある二重結合を含む基を持つ巨大分子を、好適なプレポリマーは包含する。このような基の例は、ビニル基またはアクリル基、たとえばアルキルアクリル基である。好まれる実施態様では、ヒドロゲルを形成する能力のあるプレポリマーは、アルキルアクリレート、アルキルアクリルアミド、ヒドロキシアルキルアクリレート、またはヒドロキシアルキルアクリルアミドの官能基で変性された親水性ポリマーである。現在のところ、最も好まれる重合性基の例は、メタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリルアミド、およびヒドロキシプロピルメタクリルアミド基を含む。本明細書で使用されるこれらの名称は、それからそれぞれの重合性基が誘導されるところの分子種を表す。言うまでもなく、ヒドロキシアルキルアクリレート置換基またはヒドロキシアルキルアクリルアミド置換基は、その水酸基が加水分解性基と反応して、ポリマー骨格に結合してしまえば、その元の水酸基をもはや含まないことはありうる。
【００３２】
ポリマーまたはプレポリマーの骨格は、実質的に親水性でなければならない。さらに、これは微小球の意図された用途から考えて生体適合性でなければならない。これは天然、合成、または半合成のポリマーから誘導されることができる。天然に存在するポリマーの中で、骨格として選ばれるのに適当なのは、タンパク質および多糖である。タンパク質の例は、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、カゼイン、および大豆タンパクを含む。多糖の例は、デンプン、アミロース、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、ヒアルロン酸塩、アルギン酸塩、ペクチン、アカシア、カラゲーニン、グアールガム、ポリデキストロース、キチン、キトサン、トラガカントゴム、およびキサンタンガムを含む。
【００３３】
好まれる実施態様では、ポリマーまたはプレポリマーの骨格は、デキストランから誘導され、これは親水性であり優れた生体適合性を示す。さらに、これは、容易に入手でき、加水分解による生分解の速度のような望ましい特性をもたらす、その置換基および変性内容に関して、目的に合わされることができる。他の好まれる実施態様では、ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーは、デキストランヒドロキシエチルメタクリレート（ｄｅｘＨＥＭＡ）、デキストランヒドロキシプロピルメタクリレート（ｄｅｘＨＰＭＡ）、デキストランヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ｄｅｘＨＰＭＡｍ）、およびデキストランヒドロキシエチルメタクリルアミド（ｄｅｘＨＥＭＡｍ）から選ばれる。さらなる実施態様では、骨格としてのデキストラン、オリゴマー状のスペーサーまたは側鎖から構成されるプレポリマーが選ばれ、該オリゴマー状のスペーサーまたは側鎖は、ラクチドおよび／またはグリコリド単位、並びに該側鎖の末端を占めるヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、またはヒドロキシエチルメタクリルアミドを含む。これらおよび他の好適なプレポリマーは、たとえば国際特許出願公開第９８／００１７０号、米国特許第５，４１０，０１６号および２００４年１２月２８日に出願された、係属中の米国特許出願連続番号第１１／０２５，２９６号に記載されており、好適なプレポリマー（またはマクロマー）、その調製および特性解析の記載として、これらの文書は引用によって本明細書に取り込まれる。
【００３４】
しかし、ヒドロゲル微小球を形成するために物理的架橋を使用する、本発明の方法を実施することが意図されるならば、選ばれるべき最も便利なプレポリマーは、典型的には上記のプレポリマーではない。この場合には、架橋は化学反応、たとえば重合を含まない。たとえば、巨大分子当たり１以上の電荷を持つポリマーと相補的な電荷を持つ多価イオンから選択された架橋剤とを選ぶことによって、非共有結合性架橋が達成されることができる。たとえば、カルシウムイオンと、またはＢタイプゼラチンと、アルギン酸はイオン的に架橋されることができる。
【００３５】
他の実施態様では、結晶性領域または微結晶を形成する能力のあるポリマーが選ばれ、該結晶性領域または微結晶は、物理的な架橋点としての役目をして、三次元のヒドロゲル網状組織を形成する。たとえば、ある種のポリビニルアルコールは、適当な条件下に微結晶を形成する能力があることが知られている。好まれる実施態様の１つでは、結晶化可能なデキストランが、ポリマーとして選ばれる。とりわけ、約２，０００キロダルトン〜約１８，０００キロダルトンの範囲の重量平均分子量を持つデキストラン、特に約６，０００キロダルトンの範囲の平均分子量を持つデキストランが、この実施態様内では適している。このようなデキストランおよびデキストラン誘導体は、国際特許出願公開第０２／１７８８４号に記載されており、これらのデキストランおよびデキストラン誘導体の記載として、この文書は引用によって本明細書に取り込まれる。
【００３６】
さらなる実施態様では、ステレオコンプレックスを形成する能力のある親水性ポリマーから、該ポリマーは選ばれる。ステレオコンプレックスは、反対の対掌性を持つ光学活性の複数のキラルモノマー単位から構成される、ラセミ体の結晶性ドメインまたは領域である。ステレオコンプレックスヒドロゲルは、たとえば反対の対掌性の対掌体濃度の高められた複数のポリマーを混合することによって形成されることができる。あるいは、反対の対掌性の複数の領域を持つ唯一つのポリマー種から、それは形成されることができる。たとえば、乳酸および／またはグリコール酸単位からなる、片方の対掌体濃度の高められた複数の側鎖をグラフトされている、ある種のデキストランから、ステレオコンプレックスヒドロゲルは形成されることができる。ステレオコンプレックスヒドロゲルおよびこのようなヒドロゲルを作るのに便利なポリマーの例は、国際特許出願公開第００／４８５７６号およびこれと同時係属中の欧州特許出願公開第０３０７８８５２．５号に記載されている。これらの文書に含まれた教示は、引用によって本明細書に取り込まれる。
【００３７】
本発明を実施する際に、生物活性タンパク質は、好ましくは治療用タンパク質またはワクチン用抗原の群から選ばれる。典型的には、これらの分子はあまりにも大き過ぎて、非侵襲性投与後の生物学的利用ができないか、あるいはこれらは不安定でありうる。バイオテクノロジーおよび近代の医薬品発見手法は、増大する数多くのこのような新医薬品化合物を製薬産業に提供する。本発明に従う特に好まれる化合物は、インシュリン、エポエチン−アルファ、エポエチン−ベータ、カルシトニン、ヘパリン、ＩＦＮ（インターフェロン）−アルファ−２ａ、ＩＦＮ−アルファ−２ｂ、ＰＥＧ−ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−アルファコン−１、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ベータ−１ａ、ＩＦＮ−ベータ−１ａ、ＩＦＮ−ベータ−１ｂ、ＩＦＮ−ガンマ−１ｂ、インターロイキン、ソマトロピン、フォリトロピン、メノトロピン、ロイプロリド、ゴセレリン、ブセレリン、トリプトレリン、フィルグラスチム（Ｇ−ＣＳＦ）、レノグラスチム（Ｇ−ＣＳＦ）、サルグラルモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ、血液凝固因子、たとえば第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子、ナドロパリン、ダルテパリン、チンザパリン、セルトパリン、レビパリン、チロフィバン、オクトレオチド、抗原、たとえばＢ型肝炎ウイルス表面抗原、モノクローナル抗体、たとえばアブシキマブ、診断用タンパク質、並びにこれらのタンパク質のいずれかの誘導体または官能性類似体である。
【００３８】
ヒドロゲル微小球を作るための、全水性系のエマルションに基づいた方法の群、に適用されたときに本発明の方法は特に有用である。微小球を作るための、本発明以前の方法は、少なくとも１の有機相もまた含むエマルションが関与していた。しかし、有機溶媒は、タンパク質構造に、とりわけその二次および三次構造に、構造的変化をもたらしうる。このような変化は、タンパク質薬剤の変性をもたらしうる。これらの構造的変化は通常、薬理学的活性の消失および有害な副作用の発生をもたらすので、これから明らかになるように、このような変化は望ましくない。その上、有機溶媒の使用は、環境の観点からも望ましくない。さらに、製造された微小球の中またはその上に、微量の有機溶媒が残ることを避けることは、ほとんど不可能である。とりわけ、毒性の溶媒、たとえば広く利用されている溶媒であるクロロホルムおよびジクロロメタンが使用されるときに、これは重大な不利点である。
【００３９】
より最近、微小球を作るための、有機溶媒の使用を完全に避けた、エマルションに基づいた方法が、たとえば国際特許出願公開第９８／２２０９３号および国際特許出願公開第０３／０３５２４４号に記載されており、これらの文書は引用によって本明細書に取り込まれる。手短に言うと、これらの方法は、典型的には水性２相系の形成を含み、この水性２相系では、ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーおよび任意的に活性化合物がその分散相中に存在し、他方、ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーおよび水と一緒になって相分離を引き起こす化合物を、その外相が含む。このようにして形成されたＷ／Ｗ型（水／水型）エマルション内で、該ポリマーは架橋されて、ヒドロゲルの三次元分子網状組織を形成する。
【００４０】
ある種の多糖、たとえばデキストランまたはデキストラン誘導体の存在下に、水性相の相分離を誘起するために使用される好ましい化合物は、ポリエチレングリコールである。この実施態様に従うと、アクリル化されたデキストランプレポリマー（最も好ましくは、デキストランヒドロキシアルキルメタクリレートまたはデキストランヒドロキシアルキルメタクリルアミドであり、ここで、アルキルはエチルまたはプロピルである。）がエマルションの内相中に存在し、多方、外相はポリエチレングリコールを含む。内相および外相の両方が、水および、任意的にさらに添加剤を含む。勿論、水性環境中で互いに組み合わされた時に、同様に相分離およびＷ／Ｗ型エマルションの形成を誘起することができる、ヒドロキシエチルメタクリル化されたデキストランおよびポリエチレングリコール以外の成分を含む水性２相系にも、同じ原理が適用されることができる。どのような化合物の対が、どのような相対濃度において水性相の相分離を誘起することができるかを予測することは困難であるけれども、水性２相系に関する簡単な実験または学術文献に基づいて、そのような化合物対を、当業者は容易に認定することが可能だろう。たとえば、水性２相系の広範なリストが、Ｚａｓｌａｖｓｋｙ（「Ａｑｕｅｏｕｓ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」、Ｂｏｒｉｓ  Ｙ．Ｚａｓｌａｖｓｋｙ著、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社刊、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５年）によって公表されており、好適な水性２相系として、これは引用によって本明細書に取り込まれる。
【００４１】
本発明に従うと、ヒドロゲル微小球中に取り込まれるべき生物活性タンパク質もまた、エマルションの分散相は含有する。エマルションの分散相中に活性化合物を存在させることを、薬剤物質を取り込む代替方法の１つとしてのみ、上に引用された複数の文書は記載しているけれども、多くのタンパク質薬剤について制御放出を達成するために、これは最も有用な方法の1つになりうることが、本発明者らによって発見された。
【００４２】
しかし、微小球調製工程のこの段階において、すなわちエマルションが形成される時に、生物活性タンパク質の不溶性凝集物を実質的に含まないように、分散相が保たれることを確実にする条件を選択することが不可欠である。タンパク質の不溶性凝集物が系内に導入されないこと、および／あるいは該工程の間に不溶性凝集物が生成されないことを確実にする条件が選択されることを、これは本質的に意味する。
【００４３】
慣用のタンパク質充填微小球に付随する多くの問題、たとえば望ましくない放出速度、バースト効果、不完全放出、およびタンパク質の不安定性は、タンパク質凝集物の存在に直接、間接に関連していると、本発明者らは推定する。
【００４４】
事実、生体外で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の、たとえば医薬用タンパク質調合物の調製および貯蔵の間の、タンパク質の最も普通の物理的または物理化学的不活性化機構の１つと、凝集は考えられることができ、また、タンパク質凝集の発生およびその程度の予測は、化学的分解、たとえば脱アミノ化および酸化のそれよりもさらに困難でありうる（Ｊ．Ｌ．Ｃｌｅｌａｎｄら著、「Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．」誌、第１０巻、３０７〜３７７ページ、１９９３年）。
【００４５】
「実質的に含まない」とは、不溶性凝集物が存在するかも知れないが、限られた程度でのみ存在すること、すなわち活性物質のほとんどが凝集されていないで、溶解された、または溶解可能な形で存在しなければならないことを意味する。好ましくは、エマルションの分散相中に存在する活性タンパク質の少なくとも約９０重量％が、生理的条件下に溶解され、または溶解可能であり、かつ該タンパク質の約１０重量％以下が、凝集されおよび／または変性されている。より好まれる実施態様では、エマルションの分散相中に存在する活性タンパク質の約５重量％以下が、不溶性凝集物の形をしている。さらなる実施態様では、不溶性凝集物の含有量は、分散相の全タンパク質含有量のそれぞれ約３、２または１重量％以下である。
【００４６】
タンパク質の状態、すなわちそれが不溶性凝集物の形で存在しているか否かは、ＳＤＳ−ｐａｇｅ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、ＦＴ−ＩＲ、サイズ排除クロマトグラフィー、蛍光法、比濁法、光散乱を使用する粒度分析、および溶解試験から選ばれた種々の方法または方法の組み合わせによって測定されることができる。
【００４７】
本発明の教示を守らないと、上記の相分離方法、たとえば活性タンパク質の存在の下にデキストラン誘導体およびポリエチレングリコールによって誘起される相分離の方法は、典型的には不溶性凝集物の形成をもたらし、そのためタンパク質の相当な程度の変性をもたらすことが、本発明者らによって発見された。この効果を説明する、本発明者らによって現在のところ好まれる仮説に従うと、タンパク質を含有する発生期の分散相から非常に親水性のポリエチレングリコールを含有する発生期の外相へと、水が急速に移動することによって、タンパク質凝集物の形成は、少なくとも部分的に引き起こされ、またはそれに関係しているかも知れない。したがって、ポリエチレングリコールの速い水和は、タンパク質の溶媒和を代償にして起きているかも知れず、該タンパク質は急速に濃縮され、それによってその三次構造が悪害な影響を受けるかも知れない。特に、水への比較的低い溶解度を持つタンパク質は、このような条件下にその三次構造を失い易く、そして不溶性凝集物を形成し易いようである。
【００４８】
これに対して、本発明に従えば、タンパク質の脱水は避けなければならない。好まれる実施態様の１つでは、それらの水含有量に関して予め平衡化されていたところの２の水性相からＷ／Ｗ型エマルションを調製することによって、これは達成される。言い換えると、以下の段階、すなわち、（ａ）ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマー、生物活性タンパク質、および水を含む第一水性相を用意すること、（ｂ）当該ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーと一緒にされると相分離を起こす能力のある化合物、および水を含む第二水性相を用意すること、（ｃ）第一水性相を第二水性相中に分散することによってエマルションを形成すること、そしてその後（ｄ）該ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーを物理的または化学的に架橋して、ヒドロゲルを形成することを、微小球の調製は含み、ここで、第二水性相の水含有量は、第一水性相の水含有量と少なくとも近似平衡にある。
【００４９】
この文脈において、近似平衡にあるとは、第一および第二水性相のそれぞれの水含有量が、両相が一緒にされたときに、一方の相から他方の相への水の正味の移動が起きないか、あるいはほとんど起きない程度にのみ起きるようなものであることを意味する。第一および第二水性相の初期の水含有量が平衡にあるように計算され、選ばれるという意味で、それらは予め平衡化されることができる。
【００５０】
あるいは、ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーと水性環境中で組み合わされた時に相分離を誘起する能力のある化合物、たとえばポリエチレングリコール、を含む第二水性相の水含有量は、第一水性相との平衡が要求するであろう水含有量よりも高くなるように選ばれる。この場合には、２の水性相が一緒にされると、それらの間に水の正味の移動が起きるであろうが、それは第二水性相から第一水性相へと起きることになる。したがって、水移動のこの方向は、第一水性相中に存在する生物活性タンパク質を脱水する危険を伴わないだろう。
【００５１】
複雑な組成を持つ系では、両水性相の平衡水濃度を予め計算することは、困難かも知れない。この場合には、平衡水濃度を経験的に決める方が容易かも知れない。そうするためには、本発明の教示を守らないで水性２相系が調製されることができる。その後、エマルションの２相のそれぞれのサンプルが抜き出され、それらの水含有量が分析される。また、両相のそれぞれの体積が測定される。これらのデータから、２相のそれぞれの組成を計算することは容易である。
【００５２】
他の実施態様では、（ａ）温度Ｔ１を持つ水性相であって、当該相が、生物活性タンパク質、ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマー、当該ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーと一緒にされると相分離を起こす能力のある化合物、および水、のある量を含み、ここで該量が、Ｔ１においては水性の単一相系をもたらすが、Ｔ２においては２相系をもたらすように選ばれ、かつＴ２はＴ１より低い、温度Ｔ１を持つ水性相を用意すること、そして（ｂ）  段階（ａ）で用意された水性単一相系をＴ１からＴ２へ冷却し、それによって相分離を誘起すること、引き続いて（ｃ）ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーを物理的または化学的に架橋して、ヒドロゲルを形成すること、の段階を行うことによって、微小球の調製は実施される。
【００５３】
１の水性相内の相分離は、相分離を誘起する溶解された成分、たとえばデキストランおよびポリエチレングリコールの相対濃度に依存するのみならず、温度および圧力もまた系の状態に影響を与える因子であるという事実を、この実施態様は利用する。したがって、同じ水性組成物が、１の温度においては１相系として存在するが、第二の温度においては２相系として存在することができる。実質的に全ての既知の場合において、２相系が存在する第二の温度は、１相系が存在する第一の温度よりも低い。本発明に従う好まれるポリマー、すなわちポリエチレングリコールと組み合わされるデキストランおよびデキストラン誘導体にも、これは当てはまる。
【００５４】
したがって、本発明の方法によって要求され、かつ請求項１、２および３に記載されたエマルションはたとえば、単一水性相をもたらすために選ばれた高められた温度で、全ての成分を混合することによって、調製されることができる。該高められた温度は、Ｔ２に似ており、好ましくは約３０〜８０℃の範囲、また他の好まれる実施態様では約３５〜６０℃の範囲で選ばれる。したがって、好ましくは室温まで、または約０℃〜室温間の温度まで、該混合物は冷却されて、Ｗ／Ｗ型エマルションを製造する。生物活性タンパク質の急速な脱溶媒和を防ぐために、冷却段階は非常にゆっくりと、かつ注意深く実施されなければならない。多くの生物活性タンパク質が、その三次構造が保持されることを許すのに、かつ不溶性タンパク質凝集物の形成を防ぐのに、ゆっくりとした相分離は十分な程度に穏やかである。
【００５５】
タンパク質の凝集を低減する能力のある添加剤を、少なくとも生物活性タンパク質を含有する水性相中に導入することによっても、エマルション中に生物活性タンパク質の不溶性凝集物がないことは、達成されることができる。２の水性相を一緒にすることによってエマルションが形成されるならば、これらが一緒にされる前に、このような安定化化合物は両相中に取り込まれてもよい。好適な化合物の選択、または２以上の安定化剤の好適な組み合わせは、生物活性タンパク質の性質に依存する。
【００５６】
本明細書で使用される「添加剤」の語は、生理学的に不活性な、またはその生物活性が比較的に低く、それがその使用の所望の効果ではないところの任意の化合物に使用され、微小球の特性、または微小球の調製における任意の中間生成物、たとえばエマルションの特性を調節するために、該化合物は有用である。最終生成物、すなわち微小球中に、添加剤は取り込まれてもよいし、そうでなくてもよい。
【００５７】
各種の生物活性タンパク質の凝集を低減するために有用でありうる添加剤の一群は、界面活性剤のそれである。生物活性タンパク質の物理化学的特性に応じて、イオン性または非イオン性界面活性剤の群から、界面活性剤は選ばれることができる。イオン性界面活性剤は、たとえばリン脂質、たとえばホスファチジルコリンを包含する。潜在的に有用な非イオン性界面活性剤の例は、より親水性の（すなわち、より高いＨＬＢ値を持つ）ポリソルベート（たとえば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）、またはより親油性の（低いＨＬＢの）化学種、たとえばエチレンオキシドとプロピレンオキシドとのブロックコポリマー（たとえば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ６８）を含む。
【００５８】
潜在的に好適な化合物の他の群は、（生物活性タンパク質に応じて、）糖（たとえば、ショ糖）、糖アルコール（たとえば、ソルビトール、マンニトール、およびキシリトール）、並びにオリゴ糖の群である。さらに、アミノ酸は、多くのタンパク質への安定化効果をも持ち、それから微小球が作られるところのエマルション中のタンパク質の凝集を最小化するための有用な添加剤でありうる。好まれるアミノ酸の例はメチオニンである。メチオニンは、その酸化防止特性の故にも有用でありうる。勿論、他の酸化防止剤が必要により使用されることもできる。他の部類からの安定化添加剤の例は、無機塩（たとえば、塩化ナトリウム）および尿素を含み、これらは水性タンパク質溶液中でカオトロピック剤として機能することができる。
【００５９】
本発明のさらなる実施態様では、生物活性タンパク質が可溶性固体として用意されるような様式で、エマルションの調製は実施される。特に、エマルションを形成する段階が、（ａ）固形の、可溶性の形をした生物活性タンパク質を用意すること、および（ｂ）該生物活性タンパク質を水と一緒にすることの下位段階を含む。不溶性タンパク質凝集物とは対照的に、可溶性固体形状のタンパク質は、該巨大分子の三次構造および生物活性を維持する。
【００６０】
注意深く、かつ生物活性を保持して、調製されることができる固体形状の例は、凍結乾燥された粉体または凍結乾燥された単一体、および可溶性沈殿物である。任意的に、該固体は、他の添加剤を含有してもよい。実施態様の１つでは、それからヒドロゲルが架橋によって形成されるところのポリマー、たとえばデキストランまたはデキストラン誘導体をも含有する凍結乾燥物として、生物活性タンパク質は用意される。このような凍結乾燥物は、ポリエチレングリコールの水性溶液中に分散されることができ、そして該ポリマーおよび活性タンパク質が溶解し水和されるに従って、ポリエチレングリコールの外相中に分散されている第二の水性相を、これらは形成することになる。
【００６１】
固形の生物活性タンパク質が一緒にされる水は、単一相であってもよく、または水性エマルションを構成してもよい。事実、ある種の、影響を受け易いタンパク質を取り込むために有用でありうるのは、該生物活性タンパク質以外の、本発明のエマルションの全ての成分を含むエマルション、たとえば主にポリエチレングリコールと水とからなる連続相、および主にデキストラン誘導体（たとえば、デキストランヒドロキシエチルメタクリレート）と水とからなる分散相を持つエマルションを最初に調製し、そして該固形の、可溶性の活性タンパク質をこのエマルションと一緒にすることである。混合すると、典型的にはポリエチレングリコール相よりもデキストラン相にはるかに高い親和性を持つであろう該活性タンパク質は、エマルションの内相中に溶解され、または分散されるだろう。この場合もまた、不溶性タンパク質凝集物の形成は、大方避けられる。
【００６２】
あるいは、ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーおよび水と一緒になると相分離を誘起する化合物、たとえばポリエチレングリコールの水性溶液中に、固形の生物活性タンパク質は分散され、または溶解されてもよい。
【００６３】
好まれる実施態様の１つでは、生物活性タンパク質を分散し、または溶解するために選ばれる水の量は、比較的低いように選ばれる。より特には、エマルションの水性分散相中の濃度と同じであるタンパク質濃度に到達するために要求される量と同等またはそれより低くなるように、該量は選ばれ、それは予め計算され、または経験的に決定されることができる。言い換えれば、エマルションの形成の際に、生物活性タンパク質がさらに濃縮されないような様式で該タンパク質をエマルション中に導入することの目的のために、該タンパク質の比較的高濃度の水性溶液または水性分散物が調製される。
【００６４】
エマルションの形成は、連続方法または非連続方法として実施されることができる。非連続方法は、微小球の小バッチを調製するために、特に有用でありうる。その中で（上記の、選ばれた方法の変種に応じて）１あるいは２の水性相が用意されそして撹拌されることができるところの、攪拌機を備えた容器を、これは必要とする。連続的に供給された（すなわち、移動している、または流れている）基体が処理される方法として定義されうる連続方法に従うと、エマルションは流通式装置内で形成される。好ましくは、該装置はスタティックミキサーを含み、ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーおよび生物活性タンパク質を含む第一水性相を用意し、そして相分離を起こす能力のある化合物を含む、別に用意された第二水性相中に分散させることによって、エマルションは好ましくは形成される。このような連続方法の利点の中に、再現可能な条件下に、かつより短い処理時間で、より大きいバッチを調製する能力がある。
【００６５】
処理時間に関しては、エマルションの形成とヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーの架橋との間の時間の長さを最小化することは、有用でありうることが、本発明者らによって発見された。いくつかのタンパク質については、ポリエチレングリコール存在下の激しい撹拌は凝集をもたらすことがあり、この結果は、短い処理時間を選択することによって避けられ、または低減されることができる。これらのことを確実にするのは、連続方法の設計が選ばれるときは容易であり、また、非連続方法については、特にバッチサイズが大きいと、より困難である。しかし一般に、生物活性タンパク質がポリエチレングリコールおよび／または撹拌に対して敏感であるならば、処理時間は最小化されなければならない。このような生物活性タンパク質については、好ましくは、エマルションの形成からヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーの架橋を開始する時刻までの時間は、約１５分間未満でなければならない。より好ましくは、この時間は約１０分間超であってはならない。約１０ｇ未満の微小球の小バッチが調製されるならば、エマルション化から架橋までの、より好まれる時間は、約５分間以下、特に約１〜２分間以下である。連続方法が使用されるならば、その形成後のエマルションが、ポリマーの架橋が開始されるまでに、約１分間未満、特に約３０秒間以下の移動時間を持つような様式で該方法を実施することは、好まれる実施態様の１つである。
【００６６】
上述のように、生物活性タンパク質は、過酷な条件下に脱水されないことが重要である。凝集、変性、および生物活性の消失と並んで、急速な脱水が、タンパク質の三次構造に有害な影響を持つであろう危険は、水への中程度または低い溶解度を持つタンパク質について最も高いと考えられる。このようなタンパク質は、本発明の文脈内で難溶性と定義される。水中または生理的緩衝溶液中のタンパク質の溶解度が、該タンパク質がその量で微小球中に取り込まれるべきところの投与量に比較して低ければ、該タンパク質は難溶性である。言い換えれば、高投与量で投与される中程度に可溶性のタンパク質にだけでなく、低投与量で投与される非常に難溶性のタンパク質にも特別の利点を持って、この実施態様に従う本発明の教示は、適用されることができる。
【００６７】
しばしば、本発明における有用な治療用タンパク質は、絶対的な意味で難溶性でもあり、室温で約１０重量％未満の、水中または生理的緩衝溶液（たとえば、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４）中の溶解度を持つ。他の実施態様では、該生物活性タンパク質は約５重量％未満の溶解度を持ち、したがって約２重量％未満、またはさらに約１重量％未満の溶解度を持つタンパク質を制御放出性微小球中に取り込むために、本発明は特に有用である。
【００６８】
本発明の微小球を用いて成功裡に送達されることができるタンパク質の例は、アブシキマブ、アガルシダーゼアルファ、アガルシダーゼベータ、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アルテプラーゼ、アミラーゼ、アニストレプラーゼ、アンチトロンビン  III、アプロチニン、アルギプレシン、およびアスパラギナーゼを含む。本発明で好まれる、特に好適なタンパク質は、ヒト成長ホルモン、ソマトロピン、エポエチン−アルファ、エポエチン−ベータ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、および抗原を包含する。
【００６９】
本明細書に述べられたタンパク質のいずれについても、天然型および組み換え型が存在しうる。該両タイプのタンパク質が、本発明に従って選ばれることができる。好まれる実施態様の１つでは、生物活性タンパク質は、組み換えタンパク質、たとえばｒｈＧＨの群から選ばれる。
【００７０】
さらなる実施態様では、本発明のエマルション中の生物活性タンパク質であってもなくてもよい、少なくとも１の追加の活性成分を、本発明は含む。該追加の活性成分も制御放出性微小球中に取り込まれる。あるいは、微小球の調製工程のより後の段階で、これは加えられてもよい。このようにして、制御放出性微小球の懸濁媒体の役割をする水性担体相中に、これは、たとえば取り込まれることができる。追加の活性化合物が微小球中に取り込まれるならば、その放出プロファイルは、（第一の）生物活性タンパク質のそれと実質的に異なっているかも知れないけれども、これも制御された様式で放出されるだろう。
【００７１】
本発明の教示を遵守すること、たとえば微細に分割された形状をした、固形の、しかし再溶解性の生物活性タンパク質を取り込むことによって、本発明のエマルションを調製すること、および不可逆の凝集および変性を引き起こす、好ましくない条件を避けることは、より高い薬剤充填量が微小球中に取り込まれることを許すことができる。実際、ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーも含んでいる、エマルションの内相中に、生物活性タンパク質を約３０重量％まで分散することが、このようにして可能である。選択されたタンパク質の特定の性質に応じて、さらに３０％超が生物活性の消失なしに取り込まれることができる。
【００７２】
好まれる実施態様では、分散相は生物活性タンパク質約１〜３０重量％を含む。他の好まれる実施態様では、分散相は活性タンパク質約５〜２５重量％を含む。
【００７３】
ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーの含有量は、ポリマーと活性成分との適当な比を与えるように選択され、同時に、該ポリマーおよび該ポリマーと一緒になって水性系の相分離を引き起こす化合物の物理化学的性質を、該選択は考慮に入れなければならない。デキストランヒドロキシエチルメタクリレートおよびポリエチレングリコールの場合には、エマルションの分散相は、該プレポリマーを少なくとも約３０重量％含むことが好まれる。他の好まれる実施態様では、分散相は、プレポリマー約５〜６０重量％を含む。
【００７４】
三次元のポリマー状ヒドロゲル網状組織の形成をもたらす、ポリマーの架橋の後、エマルションの内相の分散液滴が固形化する。その後の洗浄および乾燥によって、その中に活性タンパク質が取り込まれているところの微小球が回収されることができる。これらの微小球中では、活性タンパク質の相対量は、エマルションの水性分散相中よりも高い。何故ならば、微小球の水含有量が、より低いからである。典型的には、本発明の微小球は、生物活性タンパク質を約０．１〜６０重量％、たとえば５０重量％含む。より好まれるタンパク質の含有量は、タンパク質の性質およびその治療的または診断的用途に依存する。たとえば、ソマトロピンについては、タンパク質含有量は、より好ましくは約５〜３０重量％、特に約５〜２０重量％である。他方、ＩＦＮ−アルファについては、より好まれる含有量は、約０．５〜５重量％である。ワクチン用抗原の場合には、特に好まれる範囲は約０．１〜約５重量％である。
【００７５】
本発明の教示に従うことは、改良された特性を持つ、特に改良された放出プロファイルを持つ微小球をもたらす。まず第一に、中間生成物、すなわち本発明の方法に使用されるエマルションが不溶性タンパク質凝集物を実質的に含まないような様式で、調製方法を設計することは、そのような凝集物を同様に含有しない微小球を創製するための優れた様式である。言い換えれば、主として純粋な、凝集されていない、変性されていない形の活性タンパク質を含有する微小球を、本発明は提供する。このような形では、生理的条件下に該タンパク質は溶解可能かつ放出可能である。「主として」とは、取り込まれた活性タンパク質の少なくとも約９０重量％が、生理的条件下、すなわち体温および常圧における生来またはシミュレートされた体液中の微小球から溶解可能かつ放出可能であることを意味する。他の好まれる実施態様では、少なくとも約９５重量％が溶解可能かつ放出可能である。より好ましくは、取り込まれたタンパク質の少なくとも約９７重量％が溶解可能かつ放出可能であり、また他の好まれる実施態様では、少なくとも約９８または９９重量％が溶解可能かつ放出可能である。
【００７６】
微小球内のタンパク質の非凝集状態は、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）、マイクロ熱量測定法、またはＦＴ−ＩＲ分光分析法のような方法によって測定されることができる。溶解可能状態は、溶解試験によって測定されることができる。どの方法を選ぶかは、個々のタンパク質および微小球のポリマー組成に大きく依存するだろう。
【００７７】
ヒドロゲルを形成する能力のあるポリマーを化学的または物理的に架橋することによって微小球が形成された後、典型的にはそれは洗われまたは精製され、および／または回収される。たとえば、接線方向流によるろ過を使用するろ過工程として、これは実施されることができる。最終生成物中では不要な何らかの不純物または他の物質から、分散状態の微粒子を分離する目的を、ろ過工程は果たす。不純物は、たとえば、原料物質中に含有されていた不純物として微粒子分散物中に入ってきた何らかの物質、または微粒子の形成段階の際に製造された可溶性分解生成物でありうる。除かれる必要のある他の物質は、いずれかの前の工程段階で必要とされたが、生成物中では不要な物質を包含する。このような物質の例は、架橋剤、開始剤、反応生成物、分解生成物、安定剤、界面活性剤、洗剤、増粘剤、溶媒、共溶媒、ｐＨ、浸透圧、イオン強度、またはゼータ電位を調節するための物質等である。
【００７８】
精製段階の間に達成される必要がありうる他の望ましい効果は、微粒子の整粒であり、この場合、これは所望のサイズより小さい粒子が、ろ過によって除かれることを意味する。好ましくは、約１μｍ〜約１００μｍの平均の重量平均直径を持つ微小球が回収される。他の実施態様では、微小球の平均直径は約１０μｍ〜約８０μｍ、さらにより好ましくは約３０〜８０μｍの範囲にある。
【００７９】
多くの場合に、微粒子分散物内に含有された活性化合物は、商業的に魅力ある貯蔵寿命を許す実用的な期間にわたって、水の存在下に貯蔵されるのに十分なほど安定ではないだろう。これらの場合には、最後の精製段階後直ちに、貯蔵のために分散物が乾燥され、または凍結乾燥されることが好まれる。処理方法の選択肢の詳細な記載は、たとえば国際特許出願公開第０３／０３５２４４号に見出され、この開示は引用によって本明細書に取り込まれる。
【００８０】
真空凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）とも言われる凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）においては、液状の溶液または分散物が急速に凍結される。サンプルがまだ凍結状態にある間に、溶媒が昇華するような程度まで、すなわち、溶媒が固体状態から直接、蒸気状態へ変化し、このようにしてサンプルから除かれるような程度まで、圧力が下げられる。昇華の間に、温度は再び高められることができる。容易かつ迅速に溶解または再分散される、非常に多孔性の固形の発泡体または粉体を、凍結乾燥はもたらす。微粒子分散物の一部を最終容器、たとえばバイアルに充填した後に、凍結乾燥段階は好都合に実施されることができる。該充填および凍結乾燥段階は、好ましくは無菌状態下に実施される。凍結乾燥後、最終容器は密封される。このようにして得られた生成物は、薬剤用または診断用生成物であるので、該生成物がキットとして提供されるように、再構成液体の入った容器をさらに含む二次包装容器内に、これをパッケージ化することが便利でありうる。このようなキットにおいては、凍結乾燥によって得られる微小球を含有する乾燥固体と再構成液体とは、同じ一次容器内に設けられた個々に密封された室内に、たとえば２室注射器内に収容されるか、あるいは別々の容器の一部である密封された室内に保存されることができる。
【００８１】
薬剤用または診断用組成物中の薬剤担体として、微小球は好都合に使用されることができる。１の実施態様では、本発明はこのような組成物を提供する。好ましくは、微小球を含む組成物は、非経口投与、たとえば静脈内、皮下、皮膚内、筋肉内、動脈内、腹膜内、局所領域内、病巣内、または腫瘍内の注射または注入に適した、注射可能な徐放性調合物である。該組成物は、典型的には無菌の水性液体だろうし、安定性の理由から、乾燥組成物、たとえば粉体、凍結乾燥粉体、一体性の凍結乾燥マトリックス、分散性錠剤、または顆粒であってもよく、これはその使用前に無菌の水性担体中に再懸濁されることができる。
【００８２】
このような組成物を調剤するための典型的な添加剤は、薬剤技術者および調剤専門家に知られている。ｐＨを調節する物質、たとえば酸、塩基、緩衝塩；張性を調節する化合物、たとえば塩、糖および糖アルコール、アミノ酸；安定剤および凍結防止剤、たとえば糖アルコール、アミノ酸、および小さいペプチド；酸化防止剤、保存剤、界面活性剤、たとえばリン脂質およびポロクサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）等を、これらの添加剤は包含する。非経口投与に要求されるので、このような組成物は無菌でなければならず、滅菌処理によってか、あるいは製造後の殺菌によって、これは達成される。投与の実際の経路および所望の放出プロファイルに応じて、大きい微小球による望ましくない塞栓効果を防ぐために、または局所蓄積効果が望まれているときの、小さい微小球の局所への保持の不足を防ぐために、粒子サイズはやはり調節されなければならない。
【００８３】
本発明の他の特徴は、タンパク質の放出プロファイルの形状に関連している。多くの場合に、滑らかで比較的一定の放出プロファイルを提供することが望ましい。初期のバースト放出局面、予測不能な投与量の過量放出効果のみならず、放出のより後期の局面における不十分な高さの放出速度は、実験的な微小球調合物に関する文献にしばしば見られる、望ましくない放出特性である。
【００８４】
実質的に凝集されていない状態のタンパク質を含有するように、微小球が設計されるときに、すなわち微小球が不溶性凝集物を実質的に含まないときに、上述のように、滑らかで平らな放出曲線は、はるかにより容易に達成可能である。凝集されていないタンパク質は均一の流体力学的直径を持ち、かつ、ヒドロゲルの好まれるタイプは、その孔サイズに関してタンパク質の放出を制御するように適合化されることができる一方で、より広いサイズ分布を持つ凝集物の存在は、タンパク質のある部分の急速な放出によるはるかに大きい変わり易さをもたらし、また、より大きい凝集物の非常にゆっくりとした放出をもたらすという事実にも、この利点は関係していると、現在のところ考えられている。ヒドロゲルマトリックスがかなりの程度まで分解しない限り、実際、いくらかのタンパク質凝集物は、微小球から全く放出し得ないことがある。
【００８５】
本発明の実施態様の１つでは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で、または適当な生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）モデル内で、３７℃において測定されたときに、取り込まれたタンパク質の２０重量％以下を放出の最初の２４時間に、特許請求された方法によって調製された微小球は放出する。他の実施態様では、取り込まれたタンパク質の約１０重量％以下が、最初の２４時間に放出される。さらに、体内における微小球組成物の所望の治療または診断効果の終了後には、タンパク質の約５〜１０重量％を超える量が微小球内に依然として存在しないように、取り込んだタンパク質を意図された放出期間に完全に（または殆んど完全に）放出する微小球が提供される。
【００８６】
典型的には、注射によって、特に皮下または筋肉内注射によって、微小球組成物は投与される。あるいは、動脈内、静脈内、局所領域内、腹膜内若しくは関節内注射によって、または経鼻、肺内、経眼、経口腔粘膜、膣内投与によって、微小球組成物は投与されることができる。タンパク質が胃腸粘膜から吸収されることができる、あるごく少数の場合には、組成物は経口で投与されることもできる。投与の非注射経路の中では、肺経路が好まれる。
【００８７】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証されるが、これらは本発明の範囲を限定する意図で提示されてはいない。実施例においては、図面が引用される。
【実施例１】
【００８８】
（比較例）高含有量の不溶性凝集物を持つ、ｈＧＨを負わされた微小球の調製
水中水滴型エマルション手法によって、微小球が調製された。詳細には、溶解されたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）６ｍｇを含有するデキストランヒドロキシエチルメタクリレート（ｄｅｘＨＥＭＡ、ＤＳ＝１６、ＭＷｄｅｘ≒４０，０００）の２０重量％水性溶液０．２ｇが、ＰＥＧ２０重量％溶液（ＭＷＰＥＧ≒１０，０００）４．８ｇに加えられた。これら成分は、渦流によって１分間激しく混合された。得られたエマルションは、１０分間放置安定化された。ＫＰＳ溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）１８０μｌおよびＴＥＭＥＤ２０体積％溶液（４モル濃度のＨＣｌで、ｐＨが中和されたもの）１００μｌが加えられて、ＨＥＭＡ基の重合が開始された。この混合物が、撹拌することなく室温で３０分間温置されて、その結果、架橋され、固形化されたヒドロゲル微小球が生成された。該微小球はＰＢＳで３回洗われた。
【００８９】
微小球は、生体外でその薬剤放出特性を試験された。放出実験は、３７℃においてｐＨ７．４のＰＢＳ中で実施された。溶解されたｈＧＨのみを測定するサイズ排除クロマトグラフィーによって、サンプルがｈＧＨを分析された。累積放出プロファイルが、図１に示される。それまでに約６５％の放出が達成されたところの９日後には、さらなる放出は殆んどなく、これは、ｈＧＨの有意の部分が、可溶性の形で放出可能ではないことを示していた。
【実施例２】
【００９０】
凍結乾燥されたｈＧＨを使用する、Ｗ／Ｗ型エマルションの調製
固形の、凍結乾燥されたｈＧＨ３ｍｇが、ｄｅｘＨＥＭＡ（ＤＳ＝１６、ＭＷｄｅｘ≒４０，０００）の５０重量％水性溶液３０ｍｇと混合された。完全に混合した後、ＰＥＧ２７重量％溶液（ＭＷＰＥＧ≒１０，０００）２．９ｇが加えられた。これは、渦流によって１分間激しく混合された。得られたエマルションは、１０分間放置安定化された。不溶性ｈＧＨ凝集物がないことが、サイズ排除クロマトグラフィーによって確認された。
【実施例３】
【００９１】
ｈＧＨとデキストランヒドロキシエチルメタクリレート（ｄｅｘＨＥＭＡ）との凍結乾燥された混合物を使用する、Ｗ／Ｗ型エマルションの調製
ｈＧＨ２．５ｍｇとｄｅｘＨＥＭＡ（ＤＳ＝１６、ＭＷｄｅｘ≒４０，０００）３０ｍｇとの溶液が、バイアル中で凍結乾燥された。凍結乾燥された物質は、水６０ｍｇと均一に混合された。その後、ＰＥＧ２７重量％水性溶液（ＭＷＰＥＧ≒１０，０００）４．９ｇが加えられた。該ブレンドは、渦流によって１分間激しく混合された。得られたエマルションは、１０分間放置安定化された。不溶性ｈＧＨ凝集物がないことが、サイズ排除クロマトグラフィーによって確認された。
【実施例４】
【００９２】
ｈＧＨとデキストランヒドロキシエチルメタクリレート（ｄｅｘＨＥＭＡ）との凍結乾燥された混合物を使用する、Ｗ／Ｗ型エマルションの調製
ｈＧＨ２．５ｍｇとｄｅｘＨＥＭＡ（ＤＳ＝１６、ＭＷｄｅｘ≒４０，０００）３０ｍｇとの溶液が、１のバイアル中で凍結乾燥された。その後、ＰＥＧ２７重量％水性溶液（ＭＷＰＥＧ≒１０，０００）５ｇが加えられた。このブレンドは、渦流によって１分間激しく混合された。得られたエマルションは、１０分間放置安定化された。不溶性ｈＧＨ凝集物がないことが、サイズ排除クロマトグラフィーによって確認された。
【実施例５】
【００９３】
ｈＧＨを負わされた微小球の調製および特性解析
別々の実験において、実施例２、３および４に従って調製されたエマルションが、ｈＧＨを負わされたヒドロゲル微小球を調製するために使用された。ＫＰＳ溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）１８０μｌおよびＴＥＭＥＤ２０体積％溶液（４モル濃度のＨＣｌで、ｐＨが中和されたもの）１００μｌが加えられて、ＨＥＭＡ基の重合が開始された。この混合物が、撹拌することなく室温で３０分間温置されて、その結果、架橋され、固形化されたヒドロゲル微小球が生成された。該微小球はＰＢＳで３回洗われた。
【００９４】
微小球は、その薬剤放出特性を生体外で試験された。放出実験は、３７℃においてｐＨ７．４のＰＢＳ中で実施された。溶解されたｈＧＨのみを測定するサイズ排除クロマトグラフィーによって、サンプルがｈＧＨについて分析された。実施例２、３および４のエマルションから調製された微小球の累積放出プロファイルが、それぞれ図２、３および４に示される。ｈＧＨが溶解可能かつ放出可能の形で取り込まれたことを、これらの放出プロファイルは明白に示す。
【実施例６】
【００９５】
長い処理時間対短い処理時間を使用する、ｈＧＨを負わされた微小球の調製
ｈＧＨを負わされた微小球の２バッチが、比較例１に従って調製された。但し、２バッチのうち１バッチについては、渦流時間がわずか３０秒間であり、かつ、該エマルションには安定化時間が施されなかった。この１のエマルションについては、有意でない量の不溶性ｈＧＨ凝集物だけが、サイズ排除クロマトグラフィーによって見出され、しかるに他方のエマルションは、このような凝集物１０％超を含有していた。その上、得られた微小球のｈＧＨのカプセル封入効率は、２バッチ間で有意に異なっていた。すなわち、より短い処理時間のバッチについては、約７８％のカプセル封入効率が測定され、他方、比較バッチのカプセル封入効率は約５７％のみであった。
【実施例７】
【００９６】
ｈＧＨを負わされた微小球の調製の際の、安定化添加剤がｈＧＨ凝集に及ぼす効果
１の対照バッチを除く各バッチについて、エマルションの形成および安定化の間のｈＧＨ凝集物の形成を低減しまたは防ぐために、添加剤が使用され、かつ、エマルションの調合と架橋段階との間の処理時間が、数バッチの並行処理の故に、幾分、より長かったことを除いて、比較例１に記載されたのと同様な様式で、ｈＧＨを負わされた微小球の数バッチが調製された。各試験バッチについて、エマルションの形成前に、ｄｅｘＨＥＭＡ溶液とポリエチレングリコール溶液との両方に、添加剤が加えられた。試験された添加剤およびその濃度は、ポリソルベート  ８０（０．１％）、尿素（８モル濃度）、塩化ナトリウム（２モル濃度）、ショ糖（２５％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（０．５％）およびメチオニン（１％）であった。
【００９７】
添加剤を含む全てのバッチについて、対照バッチと比較すると、凝集されたｈＧＨの低減された含有量が、エマルション中に存在することが見出された。ショ糖が添加剤として使用されたバッチは、エマルション中に検出可能な凝集物を事実上持っていなかった。
【００９８】
さらに、微小球は、生体外でその薬剤放出特性を試験された。この場合もまた、放出実験は、３７℃においてｐＨ７．４のＰＢＳ中で実施された。溶解されたｈＧＨのみを測定するサイズ排除クロマトグラフィーによって、サンプルがｈＧＨについて分析された。微小球の累積放出プロファイルが、図５に示される。添加剤の存在が、溶解可能かつ放出可能の形をしたｈＧＨの増加された取り込みをもたらしたことを、これらの放出プロファイルは明白に示す。ショ糖の場合には、ｈＧＨの実際上１００％が溶解可能の形で放出された。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】実施例１（比較例）で調製された微小球の放出プロファイルを示す図
【図２】実施例２で調製されたエマルションから得られた微小球の放出プロファイルを示す図
【図３】実施例３で調製されたエマルションから得られた微小球の放出プロファイルを示す図
【図４】実施例４で調製されたエマルションから得られた微小球の放出プロファイルを示す図
【図５】添加剤を含むｈＧＨおよび含まないｈＧＨの生体外での放出を示す図（サイズ排除クロマトグラフィー）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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