(57)【要約】  本発明は、特にエナンチオマー富化したＬ−α−アミノ酸、特に一般式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸の製造方法に関する。この関連において、本発明による方法は２−ケトカルボン酸を使用し、前記２−ケトカルボン酸は、アミノ酸デヒドロゲナーゼ及び補因子再生酵素を有するホールセル触媒を使用して所望の生成物へと変換される。
2007529234.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エナンチオマー富化したＬ−α−アミノ酸又はこの塩を製造するための方法であって、相応する２−ケトカルボン酸とアンモニウムイオンドナーとを、補因子依存性のアミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするクローニングした遺伝子と前記補因子を再生する酵素をコードするクローニングした遺伝子とを有するホールセル触媒の存在下で、反応容積につき≧５００ｍＭの全体の基質の導入下で反応させ、その際前記基質の添加は、２−ケトカルボン酸の固定濃度が５００ｍＭよりも少ないように計量供給され、かつ補因子の外部からの添加が全体の基質の導入に対して＜０．０００１当量に相当する、エナンチオマー富化したＬ−α−アミノ酸又はこの塩を製造するための方法。
【請求項２】
補因子を前記反応混合物に添加しないことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
一般式（Ｉ）
【化１】
2007529234.tif 000019
（前記式中、Ｒはアルキル、特に、第三Ｃ原子を示し、かつ５〜１０つのＣ原子を有する空間充填性の分枝したアルキル基、例えばｔｅｒｔ−ブチル、及び置換したアルキルである）のアミノ酸を産生する２−ケトカルボン酸を使用することを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記基質は、流加法に従って計量供給されることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記２−ケトカルボン酸は、４５０ｍＭより少ない、より有利には４００ｍＭより少ない最大固定濃度に維持されることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記ホールセル触媒は、前記基質及び生成物に対する細胞膜の透過性が、この完全系に比較して増加するように、使用前に予備処理されていることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造方法を記載する。特に本発明は、一般式（Ｉ）
【０００２】
【化１】
2007529234.tif 000003
（前記式中、Ｒはアルキル、特に、第三Ｃ原子を示し、かつ５〜１０つのＣ原子を有する空間充填性の分枝したアルキル基、例えばｔｅｒｔ−ブチル、及び置換したアルキルである）の化合物又は前記化合物に由来する塩の製造方法を記載する。
【０００３】
光学活性Ｌ−α−アミノ酸は、数々の有用な化合物の製造のために使用される。例えば、前記化合物は、医薬品の産生における中間体として機能する。Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンは、数々の医薬的活性化合物における構造要素として見出されてよく、結果として、この相応する医薬的活性化合物の合成のための中間体として必要とされるが、この生成物分類のうちの特に有用な代表物である。A. S. Bommarius et al., (J. Mol. Cat. B: Enzymatic 1998, 5, 1−11)は、医薬的活性化合物のための構成ブロックとしてのＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの使用の例を提供する。
【０００４】
補因子をｉｎ  ｓｉｔｕで再生する一方で２−ケトカルボン酸を酵素により還元するために、カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）からのロイシンデヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼを用いることは、光学活性Ｌ−α−アミノ酸を製造するための産業的に確立した方法を構成する。特に、この経路は非タンパク質型アミノ酸Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの製造に適し、前記ロイシンは、この生体触媒法を用いてトンスケールで産生されている。この方法は文献において詳細に説明されている（EP0692538; U. Kragl, D. Vasic-Racki, C. Wandrey, Bioprocess Engineering 1996, 14, 291-297; A. S. Bommarius, M. Schwarm, K. Drauz, J. Mol. Cat. B: Enzymatic 1998, 5, 1−11; G. Krix, A. S.: Bommarius, K. Kottenhahn, M. Schwarm, M.−R. Kula, J. Biotechnol. 1997, 53, 29-39, A. Liese, C. Wandrey, A. Liese, K. Seelbach, C. Wandrey, Industrial Biotransformations, Wiley-VCH, Weinheim, 2000, p. 125〜.及びA. S. Bommarius, K. Drauz, W. Hummel, M. -R. Kula, C. Wandrey, Biocatalysis 1994, 10, 37-47。更に、一般的な総説は、A. S. Bommarius: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (Eds.: K. Drauz及びH. Waldmann),第2巻,第2版, Wiley-VCH, Weinheim, 2003, 15章.3, p. 1047〜に提供されている)。
【０００５】
【表１】
2007529234.tif 000004
図式１．Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの、単離した酵素及び添加した補因子を用いた製造（例として、ＮＡＤ＋依存性アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼを補因子の再生のために使用）。
【０００６】
使用され、そして添加されるべきＮＡＤ＋補因子の一般的な量は、例えばＥＰ０６９２５３８に記載され、０．０００８当量〜０．０２当量の範囲内にある。加えてＧ．Ｋｒｉｘ  ｅｔ  ａｌ．(J. Biotechnol. 1997, 53, 29-39)は、０．００３当量のＮＡＤ＋補因子量を用いた（Ｓ）−ネオペンチルグリシンの産業的なバッチサイズでの製造を記載する。ＥＰ０６９２５３８での一般的な基質濃度は１００〜２５０ｍＭである。Ａ．Ｌｉｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．(Industrial Biotransformations, Wiley-VCH, Weinheim, 2000, p.125〜)は、基質濃度０．５Ｍを使用し、収率７４％でのＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの製造を記載する。Ｇ．  Ｋｒｉｘ  ｅｔ  ａｌ．(J. Biotechnol. 1997, 53, 29-39)はまた、単離したロイシンデヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼ酵素を用いて、基質濃度０．５〜１Ｍでの還元によるアミン化の実施を記載する。
【０００７】
高ターンオーバー及び顕著なエナンチオ選択性（これは＞９９％ｅｅであり、結果として医薬品中間体に課せられた厳密な品質要求を満たすのに役立つ）は、この方法の有利な特徴である。前記方法は高基質濃度で操作することも可能であり、これは、特に産業上の観点から重要な側面である。
【０００８】
しかしながら、これまでの方法の不利な点は、まず第１に、単離した酵素の必要性である。前記酵素は、特に精製した形で使用され、これには生体触媒に起因するコストの割合における増加が伴う。このために生じる触媒の高コストのおかげで、好ましい方法の経済性、特に酵素の低コストを得るために、酵素を複数回リサイクルすることが必要である。前記のリサイクル手法の長い実施時間に加えて、前記手法は有利には連続的に実施されるが、これにより生じるバッチにつき比較的小さい反応容積は不利である。
【０００９】
その他の不利な点は、前記反応に添加される補因子への必要性である。これらの補因子が、およそ０．００１当量の大きさのオーダーで触媒により添加される一方で、これらは、この高い値段のために、触媒量においてですら無視できないほどのコスト要素を示す。
【００１０】
単離した酵素の使用及び補因子の添加の必要性が不要であるか、又は補因子の添加が最小限に維持され、かつ前記合成がそれにも関わらす高ターンオーバー率、高エナンチオ選択性及び高容積生産性で進行する方法は、従って望ましいものである。このようにして、酵素のコストを著しく低下させ、かつ補因子コストを節約し、結果としてこの方法の経済性を増加させることが可能である。
【００１１】
Ｓｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．は、とりわけ、分枝鎖のα−ケトカルボン酸、例えばＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの還元によるアミン化におけるロイシンデヒドロゲナーゼ及び細菌のギ酸デヒドロゲナーゼを有するホールセル触媒（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｃａｔａｌｙｓｔ）の使用を記載する（Appl. Environm. Microbiology 1997, 63, 4651-4656）。この刊行物は明確に、前記還元によるアミン化に必要とされる酵素が、前記酵素を有するホールセル触媒、特に大腸菌の形で、生細胞又は静止細胞として、使用できることを指摘する。しかしながら、ＮＡＤ＋を添加しなくてはならないことを回避する目的のために、大腸菌中のＮＡＤ＋の細胞内プールを利用することが好まれるのであれば、生成物の終濃度は、約０．３Ｍに制限されるであろう。これは、産業適用には十分ではない。
【００１２】
本発明の課題は従って、酵素により動作し、かつ産業スケールにおいて有利に実施されてよいＬ−α−アミノ酸のその他の製造方法を特定することである。この方法は、特に、公知技術の方法に比べて、上述の側面について優れていることが望ましく、かつ方法の経済性の観点（特に空時収率）から所望の生成物を有利に製造することを可能にすることが望ましい。
【００１３】
前記課題及び、詳細には特定されていないが公知技術から明らかに生じるその他の課題は、本願請求項１の特徴を有する方法により達成される。請求項２から９は、本発明の方法の有利な実施態様に関する。
【００１４】
前記課題は、エナンチオマー富化したＬ−α−アミノ酸又はこの塩を製造するための方法であって、相応する２−ケトカルボン酸とアンモニウムイオンドナーとを、補因子依存性のアミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするクローニングした遺伝子と前記補因子を再生する酵素をコードするクローニングした遺伝子とを有するホールセル触媒の存在下で、反応容積につき≧５００ｍＭの全体の基質の導入下で反応させ、その際前記基質の添加は、２−ケトカルボン酸の固定濃度が５００ｍＭよりも少ないように計量供給され、かつ補因子の外部からの添加が全体の基質の導入に対して＜０．０００１当量に相当する、エナンチオマー富化したＬ−α−アミノ酸又はこの塩を製造するための方法において、非常に優雅でありかつ意外ではあるがそれにも関わらず有利である様式で達成される。
【００１５】
意外にも前記方法は、例えばホールセル触媒を使用し、その一方で同時に、前記の高価な補因子のいかなる添加をも不要にするために前記基質を計量供給することにより、又は低い範囲にその濃度を維持するために最小限の外部からの添加（＜０．０００１当量）を行うことで可能であり、これにより方法の導入コストを節約することに役立つ。対照的に、この計量供給技術なしで、そして反応容積につき＞５００ｍＭの基質の量を最初に導入する場合には、前記ホールセル触媒を使用したこの還元によるアミン化は、ＮＡＤ＋補因子の比較的多量を添加した場合にのみ成功する。この非存在下では、前記濃度は不成功に進行するだけである（比較例「合成例１」参照、反応容積につき最初の基質量は９００ｍＭ、終ターンオーバー２５％）。結果として、本方法による方法を使用することによってのみ（合成例２〜５参照）、前記補因子の外部からの添加は、前記合成を反応容積につき比較的高い総ターンオーバー量でもって、そして結果として方法の経済性の観点から意味をなす条件下で実施する場合ですら、ほぼ完全に不要にすることが可能である。
【００１６】
有利な実施態様において、高価な補因子は従って、前記基質に対して、有利には＜０．００００５当量、極めて有利には＜０．００００１当量の濃度が維持される量で添加されるのみである。外部から前記反応混合物に対して補因子を添加しない実施態様が特に有利である。この場合は従って、前記補因子（例えばＮＡＤ（Ｈ））の添加は、全く生じる必要がなく、これは公知技術から明白に導き出すことは可能でない。
【００１７】
考慮される反応の関連において、当業者は、補因子依存性のアミノ酸デヒドロゲナーゼ及び前記補因子を再生する酵素をコードする遺伝子であって、宿主生物である前記ホールセル触媒によって発現されるべき遺伝子を自由に選択することができる。当業者は、公知技術から公知である酵素に頼るものである。
【００１８】
前記アミノ酸デヒドロゲナーゼに関して、適した酵素は特に、ロイシンデヒドロゲナーゼ（例えばＵＳ５８５４０３５）及びフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（例えばＵＳ５４１６０１９）からなるグループから選択される酵素である。適することが証明されたアミノ酸デヒドロゲナーゼ（例えば、A. Bommarius: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (Eds.: K. Drauz及びH. Waldmann), 第III巻, Wiley-VCH, Weinheim, 2002, 15.3章）は、特にロイシンデヒドロゲナーゼであり、前記ロイシンデヒドロゲナーゼに関しては、バシラス種、特にこの場合、特にバシラス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）、バシラス・セレウス（Bacillus cereus）(Seq. ID No. 5)及びバシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）からが特に適する。考慮されてよい補因子再生酵素は、ギ酸デヒドロゲナーゼ（例えばＥＰ1295937）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（例えばPCT/EP/03/08631）、乳酸デヒドロゲナーゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼ（後者は例えば、A. Bommarius: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (eds.: K. Drauz及びH. Waldmann),第III巻,Wiley-VCH, Weinheim, 2002, p. 1473, 993, 994, 1037, 1038, 1054, 1126; Glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis expressed in Escherichia coli. I: Purification, characterization and comparison with glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium, Hilt W; Pfleiderer G; Fortnagel P Biochimica and biophysica acta (1991 Jan 29), 1076(2), 298-304）からなるグループから選択される酵素である。ギ酸含有成分を基質として用いる一方でカンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）又はこれから生じる変異体（例えばＥＰ１２９５９３７; Seq. ID No. 7）からのギ酸デヒドロゲナーゼの使用は、とりわけ非常に有利であることが証明された。
【００１９】
この関連において、ロイシンデヒドロゲナーゼ及びカンジダ・ボイジニ又はこれに由来する変異体からのギ酸デヒドロゲナーゼを有するホールセル触媒は、特に適する。
【００２０】
前記ホールセル触媒によって変換されるこの基質スペクトルは、用いられるアミノ酸デヒドロゲナーゼに依存して相違する。ロイシンデヒドロゲナーゼは、線形及び分枝した脂肪族により置換した２−ケトカルボン酸のためにより適しているが、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼは有利には、芳香族置換した基質のために使用される。ホールセル触媒におけるロイシンデヒドロゲナーゼの使用に関して、脂肪族基Ｒを有する一般式（ＩＩ）
【００２１】
【化２】
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の基質を使用しかつ変換することが有利に可能である。
【００２２】
かさばる脂肪族基をＲとして有する基質は、特に適する。前記Ｒ基は第１に、１−アダマンチル、ネオペンチル、及びｔｅｒｔ−ブチルからなるグループから選択される基である。この理由のために、一般式（Ｉ）
【００２３】
【化３】
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（前記式中、Ｒはアルキル、特に、第三Ｃ原子を示し、かつ５〜１０つのＣ原子を有する空間充填性の分枝したアルキル基、例えばｔｅｒｔ−ブチル、及び置換したアルキルである）のアミノ酸を産生する２−ケトカルボン酸又はこれから生じる塩を使用する方法が有利である。
【００２４】
原則的に、当業者は本発明による方法を実施する様式を自由に選択できる。この関連において、当業者は、公知技術から公知である方法に頼るものである。前記方法は、連続的又は不連続的であってよい。流加法に関連して（例えば、合成例２及び４参照）、又は連続的に前記基質を添加することにより（例えば、それぞれ合成例３及び５）、基質の添加を計量供給することが有利である。両者の方法の変形において、前記基質は、基質の固定濃度が５００ｍＭより少なくなるように添加される。
【００２５】
２−ケトカルボン酸を基質として、４５０ｍＭより小さい、特に有利には４００ｍＭより小さい最大固定濃度で、前記反応の間に使用することが有利であることが明らかになった。
【００２６】
流加法において、前記基質を少量ずつ、所定の時間の単位後、有利には基質溶液として添加する。前記基質の添加される少量の回数は、有利には３〜１５回、特に有利には５〜９回である。添加される基質溶液の濃度は、有利には、できるだけ高い反応容積につき全体とした基質の導入を達成するのに十分高いように設定されることが望ましい。合成例２及び４は、この流加法の変形の例を提供する。連続法の変形の場合には前記基質は、連続的に所定の時間にわたり、有利には一定の計量供給率で、前記基質を有利には基質溶液の形で添加して、添加される。合成例３は、この連続法の変形の例を提供する。
【００２７】
全ての公知の細胞が、アミノ酸デヒドロゲナーゼ及び前記補因子を再生することが可能である酵素を有するホールセル触媒としての使用に適する。この関連において言及されてよい微生物は、生物、例えば酵母、例えばハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピチア種、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、原核生物、例えば大腸菌及びバシラス・サチラス、又は真核生物、例えば哺乳類細胞、昆虫細胞又は植物細胞である。クローニングの方法は当業者に公知である（Sambrook, J.; Fritsch, E. F.及びManiatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。この目的のために大腸菌株が使用されることが有利である。とりわけ特に適する株は以下である：E.coli XL1 Blue、NM 522、JM101、JM109、JM105、RR1、DH5α、TOP 10−、HB101、BL21 codon plus、BL21(DE3) codon plus、BL21、BL21(DE3)、MM294。本発明による核酸を有する遺伝子構築物を宿主生物へとクローニングするために有利に使用されてよいプラスミドは、同様に当業者に公知である（ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７１４８も参照；以下参照）。
【００２８】
適したプラスミド又はベクターは、原則的に、この目的のために当業者に入手可能である全てのバージョンである。これらのプラスミド及びベクターは、例えばＳｔｕｄｉｅｒ及び同僚(Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61-89)又はＮｏｖａｇｅｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社又はＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ社によって提供されているパンフレットに見出されてよい。その他の有利なプラスミド及びベクターは、以下に見出される：Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, 第I巻-第III巻, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R. L.及びDenhardt, D. T. (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3−7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F.及びManiatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York。考慮される核酸配列を含有する遺伝子構築物を、宿主生物中にクローニングするために特に有利に使用されてよいプラスミドは、以下であるか、又は以下に基づく：ｐＵＣ１８／１９(Roche Biochemicals)、ｐＫＫ−１７７−３Ｈ(Roche Biochemicals)、ｐＢＴａｃ２(Roche Biochemicals)、ｐＫＫ２２３−３(Amersham Pharmacia Biotech)、ｐＫＫ−２３３−３、(Stratagene又はｐＥＴ(Novagen)。
【００２９】
本発明による方法のその他の実施態様において、前記ホールセル触媒は有利には、前記基質及び生成物に対する細胞膜の透過性が、この完全系に比較して増加するように、使用前に予備処理されている。この関連において、前記ホールセル触媒が、例えば、凍結及び／又はトルエンでの処理により予備処理されている方法が特に有利である。本発明による方法の本質的な特徴は、図式２に示されている。
【００３０】
前記基質は、本発明の方法を使用する場合に、特別に高濃度で使用されてよく、これはこの個々の酵素を使用する場合の公知技術においても説明されている。本発明の場合、２−ケトカルボン酸を、５００ｍＭよりも高い濃度で使用することが有利である。前記基質を、８００ｍＭよりも高い、有利には９００ｍＭよりも高い、とりわけ１０００ｍＭよりも高い濃度で反応に導入することが有利でもある。しかしながら、この実施態様の場合において、反応混合物に補因子を添加することが、相応するターンオーバー率を達成するために重要である。
【００３１】
しかしながら、高空時収率が要求されているにも関わらず、高価な補因子を外部から添加することを必要としないか、又は０．０００１当量よりも少ない外部からの極めて少量の添加のみを必要とするホールセル細胞を使用することが望まれる場合には、当業者は次いで意外にも、本発明による基質の計量供給によりこれを達成する。
【００３２】
係る反応の場合には、前記手法は有利には、前記ホールセル触媒及びアンモニウムイオンドナーが最初に水中に導入されることが有利である。この目的のために当業者にとって適している任意の化合物を、アンモニウムイオンドナーとして使用してよい。特に、これらのアンモニウムイオンドナーは、典型的なアンモニウム塩からなるグループから選択されている化合物である。とりわけ特に、ギ酸デヒドロゲナーゼが補因子再生系として選択される場合にはギ酸アンモニウム又はこのそれぞれのケト酸のアンモニウム塩の使用が有利である。前記反応は、非常に明確に以下の図式２を用いて描写される。
【００３３】
【表２】
2007529234.tif 000007
図式２．本発明によるホールセル触媒方法における前記反応の原理（ＮＡＤ＋依存性アミノ酸デヒドロゲナーゼ及び補因子の再生のためのギ酸デヒドロゲナーゼを例とする）。
【００３４】
更なる有利な実施態様において、グルコースデヒドロゲナーゼ及びアミノ酸デヒドロゲナーゼを包含するホールセル触媒を、水及びグルコースと混合し、及びこのそれぞれのケト酸のアンモニウム塩を前記反応にかける。前記反応を引き続く図式３に示した。
【００３５】
【表３】
2007529234.tif 000008
図式３．本発明のホールセル触媒の反応、例えばＮＡＤ＋依存性アミノ酸デヒドロゲナーゼ及び補因子の再生のためにグルコースデヒドロゲナーゼによる反応。
【００３６】
その他のデヒドロゲナーゼが、ロイシンデヒドロゲナーゼの代わりに使用される場合には、係る酵素が最適に機能する条件は、公知技術において見出される。読者は、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼの使用に関してＵＳ５４１６０１９及びＧａｌｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．(Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63, 4651)を参照する。
【００３７】
補因子再生酵素及び確立すべき条件に関して、ＥＰ１２９５９３７（ギ酸デヒドロゲナーゼ）、ＰＣＴ／ＥＰ／０３／０８６３１（リンゴ酸デヒドロゲナーゼ）及びEnzyme Catalysis in Organic Synthesis (Eds.: K. Drauz及びH. Waldmann),第III巻, Wiley-VCH, Weinheim, 2002, S. 1473, 993, 994, 1037, 1038, 1054又は1126を参照してよい。更に大腸菌に発現したバシラス・サチラスからのグルコースデヒドロゲナーゼは有利である（I: Purification, characterization and comparison with glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium, Hilt W; Pfleiderer G; Fortnagel P, Biochimica et biophysica acta (1991 Jan 29), 1076(2), 298-304）及びこの引用文献。
【００３８】
前記反応混合物は、当業者に公知の方法を用いて後処理される。前記回分方法において、前記バイオマスは、濾過又は遠心分離により容易にこの生成物から分離されてよい。得られるアミノ酸は次いで、慣例の方法を用いて単離されてよい（イオン交換クロマトグラフィー、晶析）。
【００３９】
しかしながら、本方法は連続的に実施されてもよい。このために、前記反応を、酵素膜反応器と呼称される反応器中で実施し、前記反応器中では、高分子量物質、例えばバイオマスが、超濾過膜の後ろで維持され、低分子量物質、例えば生成されたアミノ酸が、前記膜を通過することが可能である。この性質の方法は既に複数回公知技術において説明されている（Wandrey et al. in year-book 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen [Process technology and chemical engineering], VDI, p. 151ff; Kragl et al., Angew. Chem. 1996, 6, 684）。
【００４０】
アミノ酸、特にかさばったアミノ酸の製造のための本願に提示した方法は、この利点に基づいて、極めて容易に商業規模で確立されてよい。考慮されている反応の場合に必要である、補因子の添加が、本発明の方法において不要になるという意外な事実と同様に、前記ホールセル触媒が取り扱いが容易であるという事実から生じる利点は、公知技術の方法に対して本発明の自明でない優位性を構成する。
【００４１】
更に、ホールセル触媒を使用する場合には、不所望の代謝的／生理学的機能の影響は重要でないことが意外であるとして考慮されてよい。両者側面は、きわめて包括的な様式において、前記Ｌ−α−アミノ酸の製造に伴う方法コストを低下させることに役立つ。
【００４２】
前記細胞壁の透過処理及びこれに伴う、前記細胞中に存在する補因子が逸脱するという可能性にも関わらず、予期される前記反応のネガティブな障害は、例えばターンオーバーが減少する結果である障害は、観察されなかった。
【００４３】
本発明の文脈において、光学的に富化した（エナンチオマー富化した、エナンチオマーが豊富な、エナンチオマー純粋）な化合物は、１つの光学的対掌体の、もう１つと混合した場合の＞５０モル％の存在を意味すると理解される。
【００４４】
前記ホールセル触媒は、有機化学化合物の変体における２つの連続的な工程を少なくとも触媒することが可能である酵素をコードするクローニングした遺伝子を有する微生物を意味すると理解される。この点において、及び一般的な製造方法に関して（酵素発現を、ターンオーバー比に関してマッチさせる）、読者はＥＰ１２１６３０４を参照する。
【００４５】
本発明によれば、アルキルは（Ｃ１〜Ｃ１８）−アルキル基を意味することが理解される。これは、線形及び任意に分枝した、この種類の基を包含する。これは、特にメチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ｎ−ブチル、２−ｎ−ブチル、１−イソブチル又は２−イソブチル、１−ｓｅｃ−ブチル又は２−ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、その他を含む。前記基は、１回又は複数回、（Ｃ１−Ｃ８）−ヘテロアルキル基、又は基、例えばＯＨ、ＳＨ、Ｈａｌ及びＮＨ２により置換されてよい。ヘテロアルキル基は、特に、１〜８つのＣ原子を有し、かつ異種原子、例えばＯ、Ｓ、又はＮをその鎖において有するか、又はこれらの異種原子により考慮される前記分子に結合した、上述したアルキル基を意味することが理解される。
【００４６】
補因子の外部からの添加は、この補因子の量が、前記反応混合物に人工的に添加されることを意味する。この量は、前記ホールセル触媒により反応混合物中に導入される、既に内在している補因子の量に付加的であると理解されたい。
【００４７】
無論、前記反応において使用される２−ケトカルボン酸は前記反応混合物において解離した状態で存在する。この形は、ケトカルボン酸を使用し、かつこのｐＨを相応して調整することにより、又は前記ケトカルボン酸の塩を添加することにより得られてよい。両者の形は、本発明において、同様にかつ本発明と一致して含められる。
【００４８】
全体の基質濃度との用語は、反応容積につき全体の基質の導入を表す。
【００４９】
図：
図１  ｐＡＭ３．２５(Seq. ID No. 9):
ｐＪＯＥ４５８０．２の構築
プラスミドｐＪＯＥ４５８０．２を、公表されたプラスミドｐＪＯＥ３０７５(T. Stumpp, B. Wilms及びJ. Altenbuchner (2000) Biospektrum 1/2000: 33-36)から、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより及びこれを２つのオリゴヌクレオチドで置換することでｍａｌＥ遺伝子を除去することにより形成し、前記オリゴヌクレオチドは再度ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を補完し、そして前記部位に加えてＮｈｅＩ及びＡａｔＩＩ及びＰｓｔＩ切断部位を有した。プラスミドｐＪＯＥ７７３(J. Altenbuchner, P. Viell, I. Pelletier (1992) Positive selection vectors based on palindromic DNA sequences. Methods Enzymol 216: 457-466)からのＳｍａＩ断片を、前記断片は大腸菌ｌａｃＺアルファ遺伝子を有するが、前記ＮｈｅＩ切断部位中にクレノウポリメラーゼ及びｄＮＴＰｓを用いた充填後に挿入した。前記プラスミドを収容する場合には、大腸菌ＪＭ１０９は、Ｘ−Ｇａｌ及びＩＰＴＧを有するＬＢプレート上で青色コロニーを生じる。前記プラスミドはｐＪＯＥ４５８０．２と命名された。ＦＤＨ配列（Seq. ID No. 7）を前記プラスミド中にクローニングした。この生じるプラスミドは、ｐＡＭ３．２５と命名された。
【００５０】
図２  ｐＡＭ５．２２
ｐＪＯＥ４５８０．２の構築
プラスミドｐＪＯＥ４５８０．２を、公表されたプラスミドｐＪＯＥ３０７５(T. Stumpp, B. Wilms及びJ. Altenbuchner (2000) Biospektrum 1/2000: 33-36)から、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより及びこれを２つのオリゴヌクレオチドで置換することでｍａｌＥ遺伝子を除去することにより形成し、前記オリゴヌクレオチドは再度ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を補完し、そして前記部位に加えてＮｈｅＩ及びＡａｔＩＩ及びＰｓｔＩ切断部位を有した。プラスミドｐＪＯＥ７７３(J. Altenbuchner, P. Viell, I. Pelletier (1992) Positive selection vectors based on palindromic DNA sequences. Methods Enzymol 216: 457-466)からのＳｍａＩ断片を、前記断片は大腸菌ｌａｃＺアルファ遺伝子を有するが、前記ＮｈｅＩ切断部位中にクレノウポリメラーゼ及びｄＮＴＰｓを用いた充填後に挿入した。前記プラスミドを収容する場合には、大腸菌ＪＭ１０９は、Ｘ−Ｇａｌ及びＩＰＴＧを有するＬＢプレート上で青色コロニーを生じる。前記プラスミドはｐＪＯＥ４５８０．２と命名された。ＬｅｕＤＨ配列（Seq. ID No. 5）を前記プラスミド中に挿入した。この新規のプラスミドをｐＡＭ５．２２と命名した。
【００５１】
図３  ｐＡＭ８．２１
ｐＨＷＧ６４０．１２(Seq. ID No. 11)の構築
プラスミドｐＨＷＧ６４０．１２は以前には公表されておらず、従ってその構築を以下のように説明する。前記プラスミドｐＨＷＧ６４０．１２を、公表されたプラスミドｐＡＷ２２９から出発して、容易に手直し可能な様式において構築した。プラスミドｐＡＷ２２９は、ラムノースプロモーターを有するｐＡＣＹＣ１８４誘導体である。ｐＡＷ２２９(B. Wilms, A. Wiese, C. Syldatk, R. Mattes, J. Altenbuchner (2001) J. Biotechnol 86: 19-30)から出発して、このｈｙｕＣ遺伝子を前記プラスミドからＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて切り出し、ＰＣＲ断片で置換し、前記断片はこの同一の制限酵素で切断されかつ大腸菌Ｋ１２  ｓｆｃＡ（リンゴ酸酵素）遺伝子を含有する。この生じるプラスミドはｐＨＷＧ６４０．１２と呼ばれる。ＬｅｕＤＨ配列を前記プラスミド中に挿入した。この新規のプラスミドをｐＡＭ８．２１と命名した。
【００５２】
図４  ｐＡＭ１０．１(Seq. ID No. 10)
ｓｃｆＡ遺伝子（Seq. ID No. 11）をプラスミドｐＡＭ８．２１から欠失させた。この新規のプラスミドをｐＡＭ１０．１と命名した。
【００５３】
図５
誘導時間に依存したロイシンデヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）及びギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）の比活性及び光学密度のコース表示による生体触媒；この発酵条件のより詳細な説明に関しては、実験セクションを参照のこと。
【００５４】
実験例
ホールセル触媒の製造
遺伝子増幅及びクローニング
ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ、ｆｄｈ３（カンジダ・ボイジニから）、酸化に対してより低い感受性を有する変異体）及びロイシンデヒドロゲナーゼ（バシラス・セレウスＬｅｕＤＨ）を、トリメチルピルビン酸をｔｅｒｔ−ロイシンへと補因子の再生と共に変換するホールセル触媒のためにクローニングするために、前記二つの酵素のための遺伝子を、最初にＰＣＲにより、上述の株から得られた染色体ＤＮＡから増幅した。使用したオリゴヌクレオチドを表１に列記し、このＰＣＲ混合物の組成を表２に、そしてＰＣＲプログラムを表３に示した。
【００５５】
表１：ＦＤＨ及びＬｅｕＤＨ遺伝子の増幅のためのオリゴヌクレオチド
【００５６】
【表４】
2007529234.tif 000009
【００５７】
前記オリゴヌクレオチドは、前記遺伝子に制限エンドヌクレアーゼのための切断部位を付加するために使用された。これらは、ｓ３７１３の場合にはＢｆｒＩ、ｓ３７１４の場合にはＰｓｔＩ、ｓ３７２３の場合にはＮｄｅＩ、及びｓ３７１６の場合にはＡａｔＩＩである（下線領域を参照のこと）。
【００５８】
表２：Ｂｉｏｍａｓｔｅｒ社に由来するＰＣＲ混合物、ポリメラーゼ、緩衝液及びＭｇＣｌ２；このプラスミドＤＮＡ開始濃度は５０μｇ／ｍｌ。
【００５９】
【表５】
2007529234.tif 000010
【００６０】
表３：ＰＣＲプログラム：工程２〜４を３０回繰り返した
【００６１】
【表６】
2007529234.tif 000011
【００６２】
遺伝子増幅後、ＰＣＲ断片を、「DNA PCR and gel band purification kit」（company GFXにより供給）を用いて精製し、Ｌ−ラムノース誘導性ベクターｐＪＯＥ４５８０．２(ｐＢＲ３２２誘導体；図１)又はｐＨＷＧ６４０．１２（ｐＡＣＹＣ１８４誘導体；図３;Seq. ID No. 11)に以下記載の制限エンドヌクレアーゼを用いて連結した。
【００６３】
一般的に、制限混合物は１０μｌの標準混合物中で約５０μｇのＤＮＡ／ｍｌを用いて調製された。最初の酵素１μｌ、及び１０×濃縮酵素緩衝液１μｌをも添加した。前記混合物を、脱イオンＨ2Ｏを用いて終容積に調節した。挿入すべきＤＮＡを、プラスミドＤＮＡとは別に制限酵素でインキュベーションした。前記最初の酵素での制限後、次いで沈殿工程が引き続き、前記工程においてＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、エタノールで洗浄し、次いで乾燥させＴＥ１０．０１  ８μｌ中に取り込ませた。それぞれの場合において、第２の酵素１μｌ及び第２の１０×酵素緩衝液１μｌを前記混合物に添加し、前記混合物を再度３７℃で１．５時間インキュベーションした。ベクターｐＡＭ１０．１を、ｐＡＭ８．２１から調製し、これにやはりクレノウポリメラーゼによる処置が引き続いた。このＤＮＡを次いで、１％アガロースゲル（臭化エチジウム０．４μｇ／ｍｌを含有するＳｅａｋｅｍアガロース）を用いてこの断片に分離し、この正しいバンドを更なる使用のために小刀で切り出した。前記ＤＮＡを、指示に従って、小さなゲル片から「EASY PURE gel purification kit」（Biozym社）を用いて溶出させ、１５μｌのＴＥ１０．０１中に取り込ませた。
【００６４】
ベクターとインサートとの連結のために、前記混合物を、このインサートＤＮＡが、この標的ベクターのほぼ２倍の濃度で存在するように選択した。この場合にもやはり、前記ＤＮＡ濃度は約５０μｇ／ｍｌであった。この連結混合物の終容積は１０μｌであり、前記混合物はこのベクター／インサート混合物に加えて１μｌのリガーゼ及び１μｌの１０×濃縮リガーゼ緩衝液（両者ともROCHEより）を含有した。このインキュベーションは一晩４℃で行われた。前記連結混合物を、大腸菌Ｋ１２  ＪＭ１０９中に形質転換し、前記細菌を次いで抗生物質（１００μｇのアンピシリン／ｍｌ（ｐＡＭ３．２５[Seq. ID No. 9]、ｐＡＭ５．２２）又は２５μｇのクロラムフェニコール／ｍｌ（ｐＡＭ８．２１、ｐＡＭ１０．１[Seq. ID No. 10]））を含有するＬＢ寒天上で選択し、プラスミドを単離した後、クローンを期待されるプラスミドに関して確認した。
【００６５】
ＬｅｕＤＨ（Seq. ID No. 6）は最初に、リンゴ酸酵素（Seq. ID No. 12）にカップリングすべきものであるから、このＬｅｕＤＨ遺伝子をまず、リンゴ酸酵素のための遺伝子（ｓｆｃＡ）を既に含有するｐＪＯＥ４６２５．１に挿入した（図２）。前記ＬｅｕＤＨ遺伝子を次いで、ｐＨＧＷ６４０．１２（図３）、やはりラムノースプロモーター及びｓｆｃＡ遺伝子を有するｐＡＣＹＣ１８４誘導体中に挿入し、この後者を次いで欠失させた。プラスミドｐＡＭ５．２２（図２）からのＬｅｕＤＨ遺伝子の標的プラスミドｐＡＭ１０．１（図４）へのサブクローニングは、選択のための２つの耐性マーカーを必要とする２つのプラスミド系を構築するために必要であった。
【００６６】
表４：クローニング結果
【００６７】
【表７】
2007529234.tif 000012
【００６８】
ホールセル触媒の発酵
ＨＰＬＣ分析によりＦＤＨ／ＬｅｕＤＨ組み合わせ（大腸菌ＪＭ１０９／ｐＡＭ３．２５／ｐＡＭ１０．１）が、トリメチルピルビン酸をｔｅｒｔ−ロイシンへと変換することにおいて、比較のモデル系（リンゴ酸酵素／ＬｅｕＤＨ、ｐＡＭ５．２２上）よりもより良好な結果を、熱振盪器中でのミニスケール（１ｍｌ）実験において達成することを示したので、プラスミドｐＡＭ３．２５及びｐＡＭ１０．１を大腸菌ＢＷ３１１０中に形質転換した（というのもこの株は発酵により適しているからである）。この意図は、前記モデル系を使用して全ての以下の試験のために十分に大きなバイオマスを調製するために高い細胞密度発酵を使用することである。前記発酵を、いかなる抗生物質もなしで実行し、この予備培養は抗生物質存在下で、３０℃で、８ｌの終容積を有する３０ｌの発酵器中で成長させている。このために、前記細胞を最初に３０℃で、ＯＤ６００＝５０までの回分培養として、そしてグルコースが完全に消費されるまで（およそ２２ｈ）成長させた。遺伝子発現を次いで０．２％の終濃度までのラムノースの添加により誘導し（前記ラムノースは濾過により滅菌されている）、その一方で流加培養を自動的に栄養溶液及び無機質（供給Ｉ及び供給ＩＩ）を添加することで開始させた。ＯＤ及び酵素活性（後者の場合にはそれぞれの活性試験を用いて測定された）を、試料を前記誘導開始後２時間毎に取得した。発酵が終了するまでのこのＯＤ及び活性のコースを、図５において時間に対してプロットした。
【００６９】
この発酵を、ラムノース誘導２２時間後に停止し、というのは細胞密度の増加にもかかわらず、ＦＤＨの活性が停滞し、この原因は推測によれば、プラスミドの損失又はあまりに酸性であった反応媒体である。この後者は、ホールセル反応において明白になり、この湿ったバイオマスを添加した場合に、前記反応において、前もってｐＨ調整した溶液と比較してｐＨは著しく減少した（ΔｐＨｍａｘ＝０．８）。前記２つの酵素の活性は、ＬｅｕＤＨの場合には０．５６５Ｕ／総タンパク質ｍｇに達し、ＦＤＨの場合には０．１２３Ｕ／総タンパク質ｍｇに達した。この容積活性は、発酵媒体に対して、ＬｅｕＤＨに関して３２．７７Ｕ／ｍｌであり、ＦＤＨに関して７．１４Ｕ／ｍｌであった。前記媒体が分離器において除去された後に、この細胞収量は、湿ったバイオマス１．４ｋｇであった。前記細胞をホールセル触媒として使用するまで一時的に−２０℃で貯蔵した。
【００７０】
【表８】
2007529234.tif 000013
【００７１】
【表９】
2007529234.tif 000014
【００７２】
【表１０】
2007529234.tif 000015
【００７３】
【表１１】
2007529234.tif 000016
【００７４】
９００ｍＭで計量供給なしにホールセル触媒を用いたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの調製（比較例＝合成例１）
０．９Ｍのトリメチルピルビン酸溶液５０ｍｌ（ｐＨ７．０に、３２％アンモニアで調整）を、これはまた１ｍＭの塩化マグネシウム及び１％（ｖ／ｖ）のトルエンを含有するが、生物触媒（大腸菌ＪＭ１０５（ｐＡＭ  ３．２５＿１０．１）バイオマス）５．８５ｇ及びギ酸アンモニア７．９５ｇ（２．８モル当量）に添加した。このｐＨを、反応の開始時にｐＨ７．０に調節し、このあとは更には調節せず、この結果この反応の間にｐＨが上昇した。この反応温度は３０℃であった。８ｈの反応時間後、２４．６％の変換が測定され、その際この変換を更なる１５ｈの撹拌後でさえも更に増加させることは可能でなかった。
【００７５】
約０．９Ｍでかつ流加計量供給を使用したホールセル触媒を用いたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの調製（合成例２）
ギ酸アンモニウム２３．８４ｇ（使用した全体の基質量に対して２．８当量に相当）及び生体触媒１７．５５ｇ（大腸菌ＪＭ１０５（ｐＡＭ３．２５＿１０．１）バイオマス）を最初に２５０ｌの三口フラスコ中に量り取り、この後に２８．５０ｍｌの脱イオン水及び１Ｍの塩化マグネシウム溶液１５０μｌ（終容積に対して１ｍＭの濃度に相応）を添加した。３０℃の反応温度に達すると、この反応を１．８Ｍのトリメチルピルビン酸溶液７．５０ｍｌ（ｐＨ７．０、３２％アンモニアで調節）を添加することで開始させた。このｐＨを次いで、７．０に３２％のアンモニアを添加することで調節した。この後、それぞれの場合において１．８Ｍのトリメチルピルビン酸溶液（ｐＨ７．０、３２％アンモニアで調節）７．５０ｍｌを最初に２回計量供給し、その後異なる容積の０．９Ｍのトリメチルピルビン酸（ｐＨ７．０、３２％アンモニアで調節）を５回計量供給し、その際この全ての添加は定義された時間間隔で行われた。この時間間隔及びそれぞれの場合において計量供給された量を、以下の計量供給表に示した。この終容積は１５０ｍｌであり、添加した基質の全体の濃度は０．８６Ｍであり、これは１１２．５ｇ／ｌのメチルピルビン酸の容積の量に相当する。完全な変換（＞９８％、ＨＰＬＣに従って）が、２４ｈの反応時間後観察された。
【００７６】
【表１２】
2007529234.tif 000017
【００７７】
１Ｍでかつ連続的計量供給を使用したホールセル触媒を用いたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの調製（合成例３）
ギ酸アンモニウム２６．４８ｇ（使用した全体の基質量に対して２．８当量に相当）、１Ｍの塩化マグネシウム溶液１５０μｌ（終容積に対して１ｍＭの濃度に相応）及び生体触媒１９．４９ｇ（大腸菌ＪＭ１０５（ｐＡＭ３．２５＿１０．１）バイオマス）を最初に２５０ｌの三口フラスコ中に量り取り、この後に３０ｍｌの脱イオン水を添加した。このｐＨを次いで、７．０に３２％のアンモニアを添加することで調節した。この反応温度が３０℃に達した後、１．２５Ｍのトリメチルピルビン酸溶液全体で１２０ｍｌ（ｐＨ７．０、３２％アンモニアで調節）を連続的に、０．２ｍｌ／分の流速で１０時間にわたって添加した。この終容積は１５０ｍｌであり、使用した基質の全体の濃度は１．０Ｍであり、これは１３０．１ｇ／ｌのトリメチルピルビン酸の容積の量に相当した。９６％の変換（ＨＰＬＣに従って）が、２７ｈの反応時間後観察された。
【００７８】
７００ｍＭでかつ流加計量供給を使用したホールセル触媒を用いたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの調製（合成例４）
ギ酸ナトリウム２．５５ｇ（終容積に対して２．５モル／ｌに相応）を最初に、円錐型の１００ｍｌの反応フラスコ（ＳＴＡＴ  Ｔｉｔｒｉｎｏ  ７１８）に添加し、この後で１ＭのＭｇＣｌ２溶液１５μｌ（１ｍＭの終濃度に相応）及び１ＭのＴＭＰ溶液４．５ｍｌ（ｐＨ７、２５％アンモニアで調節）及び、１．５体積％のトルエン（終容積に対して）をも添加した。この容積を、脱イオンＨ2Ｏで１５ｍｌにまでした。この反応温度３０℃を安定に維持し、閉ループ水回路により制御した。生体触媒の湿ったバイオマス１ｇを、前記基質混合物中で再懸濁し、このｐＨを６．９から７に２５％アンモニアで調節した。
【００７９】
ｐＨ７．５に達した後、１ＭのＴＭＰ溶液４．５ｍｌ（ｐＨ７）を繰り返し添加した。これに関連して、前記ｐＨは約ΔｐＨ＝０．３だけ減少した。ｐＨ７．５に達するとすぐに、１ＭのＴＭＰ溶液４．５ｍｌを再度添加した。前記容積のＴＭＰの添加を、このｐＨがＴＭＰを加えてもそれ以上減少しなくなるまで×１０回繰り返した。加えて、４Ｍのギ酸ナトリウム溶液４ｍｌ（いかなる反応をも考慮することなしに、前記媒体中で９７３ｍＭの濃度に相応する）を、ＴＭＰの８回目の添加に関連して添加した。この終容積は６４ｍｌであり、７７４ｍＭ（１００．６ｇ／ｌ）のトリメチルピルビン酸の容積の終濃度（反応を考慮することなしで）を有した。ギ酸ナトリウムは、終濃度８３６ｍＭの溶液において存在する。ＨＰＬＣは、９２％のトリメチルピルビン酸が、わずか６ｈ後に変換されたことを示した。
【００８０】
異なる添加点での２つの基質の濃度を以下の表５に列記した。
【００８１】
【表１３】
2007529234.tif 000018
【００８２】
バシラス・セレウスのロイシンデヒドロゲナーゼ及びバシラス・サチリスのグルコースデヒドロゲナーゼを含有するホールセル触媒の調製
株の調製
化学処理したコンピテント大腸菌ＤＳＭ１４４５９（特許ＷＯ０３／０４２４１２に説明）細胞を、プラスミドｐＡＭ１０．１（図４、Seq. ID No. 10）（Sambrook et al. 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press）を用いて形質転換した。前記プラスミドは、クロラムフェニコールに対する耐性（ｃａｔ）を有し、かつバシラス・セレウスのロイシンデヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）をコードする（Stoyan, Tanja; Recktenwald, Achim; Kula, Maria-Regina. Cloning, sequencing and overexpression of the leucinee dehydrogenase gene from Bacillus cereus. Journal of Biotechnology (1997), 54(1), 77-80）。前記ｐＡＭ−１０．１形質転換細胞を次いで、化学処理してコンピテントにし（Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press）、プラスミドｐＮＯ４（図６、Seq. ID No. 13）で形質転換した。ｐＮＯ４は、アンピシリンに対する耐性（ｂｌａ）を有し、かつバシラス・サチリスのグルコースデヒドロゲナーゼ（ＢＳ−ＧＬＵＣＯＳＥ  ＤＥＨＹＤＲＯＧＥＮＡＳＥ）（Glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis expressed in Escherichia coli. I: Purification, characterization and comparison with glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium. Hilt W; Pfleiderer G; Fortnagel P, Biochimica and biophysica acta (1991 Jan 29), 1076(2), 298-304）をコードする。前記ロイシンデヒドロゲナーゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼのための遺伝子は、ラムノースプロモーター（ｒｈａＰ）の制御下にあった（Stumpp, Tina; Wilms, Burkhard; Altenbuchner, Josef., A new L-rhamnose-inducible expression system for Escherichia coli. BIOspektrum (2000), 6(1), 33-36）。
【００８３】
活性細胞の調製
大腸菌ＤＳＭ１４４５９（ｐＡＭ１０．１，ｐＮＯ４）の単一コロニーを、３７℃で１８時間、振盪（２５０ｒｐｍ）により、ＬＢ媒体２ｍｌ（１０ｇの酵母エキス／ｌ、５ｇのトリプトン／ｌ、１０ｇのＮａＣｌ／ｌ）中で、添加した抗生物質の存在下で（５０μｇのアンピシリン／ｌ及び２０μｇのクロラムフェニコール／ｍｌ）インキュベーションした。この培養物を、１：１００に、誘導物質としてラムノース（２ｇ／ｌ）、添加した抗生物質（５０μｇのアンピシリン／ｌ及び２０μｇのクロラムフェニコール／ｍｌ）、及び１ｍＭのＺｎＣｌ2を含有する新鮮なＬＢ媒体中で希釈し、３０℃で１８時間振盪（２５０ｒｐｍ）によりインキュベーションした。この細胞を遠心分離し（１００００ｇ、１０分間、４℃）、この後でこの上清を捨て、この細胞ペレットを生体変換実験において直接的に、又は−２０℃で貯蔵した後に使用した。
【００８４】
１Ｍでかつ連続的計量供給を使用したホールセル触媒を用いたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの調製（合成例５）
生体触媒（大腸菌ＤＳＭ  １４４５９（ｐＡＭ  １０．１，ｐＮＯ４）バイオマス）９．９８ｇを、最初に２５０ｌの三口フラスコ中の水３０ｍｌ中に取り込み、その後で３２．７０ｇのＤグルコースを添加した。ｐＨを次いで、水酸化ナトリウム溶液（２５％）の添加により７．０に調整し、この値を反応の間一定に維持した（総消費：１３．１１ｍｌ）。３０℃の反応温度に達した後、１．２５Ｍのトリメチルピルビン酸溶液全体で１２０ｍｌ（ｐＨ７．０、３２％アンモニアで調節）を、０．２ｍｌ／分の流速で１０時間にわたり連続的に添加した。この終容積は約１６５ｍｌであり、使用した基質の全体の濃度は約０．９Ｍであり、これはトリメチルピルビン酸の容積の量１１８ｇ／ｌに相応する。この生成物に対して形成された＞９７％の変換（ＨＰＬＣによれば）及びエナンチオ選択性＞９９％ｅｅは、２４ｈの反応時間後に観察された。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１はｐＡＭ３．２５を示す図である。
【図２】図２はｐＡＭ５．２２を示す図である。
【図３】図３はｐＡＭ８．２１を示す図である。
【図４】図４はｐＡＭ１０．１を示す図である。
【図５】図５は誘導時間に依存したロイシンデヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）及びギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）の比活性及び光学密度を示す図である。
【図６】図６はプラスミドｐＮＯ４を示す図である。
【図１】
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【図２】
2007529234.tif 000021
【図３】
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【図４】
2007529234.tif 000023
【図５】
2007529234.tif 000024
【図６】
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【配列表】
2007529234000001.app
【国際調査報告】
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2007529234.tif 000027
2007529234.tif 000028