(57)【要約】  免疫原性方法が提供される。該方法は、組換えアデノウイルスベクターおよび組換えアデノ随伴ウイルスベクターの順次投与を含み、そのそれぞれは同一の免疫原性産物、または交差作用性免疫原性産物をコードする異種発現カセットを送達する。本発明の方法内で使用するためのベクターを含む産物も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫応答を誘導する該産物をコードする核酸配列を含んでなる第一の異種発現カセットを含んでなる複製欠陥アデノウイルス、および
（ｂ）産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫応答を誘導する該産物をコードする核酸配列を含んでなる第二の異種発現カセットを含んでなるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
を患者に送達することを含んでなる免疫感作方法。
【請求項２】
複製欠陥アデノウイルスの投与およびアデノ随伴ウイルスの投与を含んでなる免疫感作方法中で有用な薬剤の調製における複製欠陥アデノウイルスおよび／またはアデノ随伴ウイルスの使用であって、
該複製欠陥アデノウイルスが産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫応答を誘導する該産物をコードする核酸配列を含んでなる第一の異種発現カセットを含んでなり、そして
該アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫応答を誘導する該産物をコードする核酸配列を含んでなる第二の異種発現カセットを含んでなる、上記使用。
【請求項３】
ＡＡＶが複製欠陥アデノウイルスの投与の前に投与される、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
複製欠陥アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスの第一のおよび第二の発現カセット内の調節配列が異なる、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用。
【請求項５】
アデノ随伴ウイルスの調節配列が誘導性プロモーターを含んでなる、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用。
【請求項６】
アデノウイルスの投与の後に患者に誘導性作用物質を送達することをさらに含んでなる、請求項５に記載の方法または使用。
【請求項７】
ＡＡＶの投与の後に哺乳動物に誘導性作用物質が投与される、請求項６に記載の方法または使用。
【請求項８】
アデノウイルスの投与の後に哺乳動物に誘導性作用物質が投与される、請求項７に記載の方法または使用。
【請求項９】
アデノウイルスが、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５領域から成るアデノウイルス領域の群から選択される領域内に欠失をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用。
【請求項１０】
アデノウイルスの発現カセットがＥ１領域の部位内に位置する、請求項１に記載の方法または請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
アデノウイルスの第一の発現カセットおよび／またはアデノ随伴ウイルスの第二の発現カセットが、欠失されたＥ３領域内に位置する、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用。
【請求項１２】
アデノウイルスが、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ６８およびＣ１から成る群から選択される血清型である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用。
【請求項１３】
アデノウイルスが経口、鼻内、または筋肉内で投与される、請求項１に記載の方法または請求項２の使用。
【請求項１４】
ＡＡＶがＡＡＶ１およびＡＡＶ８から成る群から選択される血清型である、請求項１に記載の方法または請求項２の使用。
【請求項１５】
ＡＡＶが筋肉内に投与される、請求項１に記載の方法または請求項２の使用。
【請求項１６】
該方法が、ＤＮＡワクチンを投与することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法または請求項２の使用。
【請求項１７】
該ＤＮＡワクチンが、アデノウイルスベクターまたはＡＡＶベクターの前に投与される、請求項１６に記載の方法または使用。
【請求項１８】
タンパク質に基づくワクチンを投与することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法または請求項２の使用。
【請求項１９】
タンパク質に基づく該ワクチンが、アデノウイルスベクターの後に送達される、請求項１８の方法または使用。
【請求項２０】
タンパク質に基づく該ワクチンが、ＡＡＶベクターの後に送達される、請求項１８の方法または使用。
【請求項２１】
タンパク質に基づく該ワクチンが、アデノウイルスベクターおよびＡＡＶベクターの後に送達される、請求項１８の方法または使用。
【請求項２２】
ＡＡＶベクターが、ＡＡＶベクターの抗原性を増強する異種のペプチドまたはポリペプチドを含んでなる改変キャプシドを有する、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法または請求項１〜２１のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
改変キャプシドが、Ｎ−末端に融合したペプチドを有するｖｐ２タンパク質を含んでなる、請求項２２に記載の方法または使用。
【請求項２４】
改変キャプシドが、中に挿入されたペプチドを有する改変ｖｐ１タンパク質を含んでなる、請求項２２に記載の方法または使用。
【請求項２５】
標的に対して動物を免疫感作するための産物であって、
（ａ）産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫応答を誘導する該産物をコードする核酸配列を含んでなる異種発現カセットを含んでなる複製欠陥アデノウイルス、
（ｂ）産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫応答を誘導する該産物をコードする核酸配列を含んでなる異種発現カセットを含んでなるアデノ随伴ウイルス、および
（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）のためのコンテナー
を含んでなる、上記産物。
【請求項２６】
産物が誘導性作用物質をさらに含んでなる、請求項２５に記載の産物。
【請求項２７】
アデノウイルスが筋肉内送達のために配合される、請求項２５に記載の産物。
【請求項２８】
（ｂ）のアデノ随伴ウイルスが筋肉内送達のために配合される、請求項２５に記載の産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
アデノウイルスは、約３６キロベース（ｋｂ）のゲノムサイズを有する二本鎖ＤＮＡウイルスであり、それは各種の標的組織内で高度に効率的な遺伝子移送を達成するその能力および大きい導入遺伝子容量のために、遺伝子移送用途に広く使用されている。都合よく、アデノウイルスのＥ１遺伝子は欠失されそして選択されたプロモーター、関係する遺伝子のｃＤＮＡ配列およびポリＡシグナルから成る導入遺伝子カセットで置換され、複製欠陥組換えウイルスをもたらす。
【０００２】
アデノウイルスは、３種の主要なタンパク質、ヘキソン（ＩＩ）、ペントンベース（ＩＩＩ）および小塊状繊維（ｋｎｏｂｂｅｄ  ｆｉｂｒｅ）（ＩＶ）から成る正二十面体キャプシド、および多数のその他の小さいタンパク質、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＩＩａおよびＩＶａ２を有する特徴的な形態を有する（非特許文献１）。ウイルスゲノムは、５’末端に共有結合した末端タンパク質を有する逆方向末端反復塩基配列（ＩＴＲ）を有する線型、二本鎖ＤＮＡである。ウイルスＤＮＡは高度に塩基性のタンパク質ＶＩＩおよびミューと呼ばれる小さいペプチドと密接に会合している。別のタンパク質Ｖは、このＤＮＡタンパク質複合体と共にパッケージングされてタンパク質ＶＩを介してキャプシドへの構造的連結を提供する。このウイルスは、ウイルスでコードされるプロテアーゼも含み、それは、一部の構造タンパク質をプロセシングして成熟した感染性ウイルスを産生するために必要である。
【０００３】
組換えアデノウイルスは、宿主細胞に分子を送達して免疫応答を誘導すると記載されている。２種のチンパンジーアデノウイルス、Ｃ１およびＣ６８（Ｐａｎ９とも呼ばれる）から誘導されるアデノウイルスベクターを提供する特許文献１、および特許文献２〔Ｐａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７−誘導ベクター〕を参照されたい。
【特許文献１】米国特許第６，０８３，７１６号明細書
【特許文献２】国際特許公開番号ＷＯ０２／３３６４５号明細書
【非特許文献１】Ｗ．Ｃ．Ｒｕｓｓｅｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８１：２５７３−２６０４（２０００年１１月）
【発明の開示】
【０００４】
ワクチン分野で必要とされるのは、強い免疫応答を誘導し同時にワクチン担体（ｃａｒｒｉｅｒ）への最小の反応を有する免疫感作の方法である。
【０００５】
本発明の方法は、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを介して哺乳動物患者に１種もしくはそれ以上の選択された異種遺伝子を連続的に（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ）送達することを含む。それぞれのベクターは、同一の免疫原性もしくは抗原性産物または交差反応性産物を発現する。
【０００６】
本発明の方法は、ウイルスベクターにより担持される産物への免疫応答のブースティングを提供する。
【０００７】
本発明のそれらおよびその他の態様および利益を以下にさらに詳細に記載する。
【０００８】
〈発明の詳細な記述〉
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターおよびアデノウイルス（Ａｄ）ベクターの投与により免疫応答を特異的に誘導する方法を提供する。それぞれのウイルスベク
ターは、産物の発現を指令する調節制御配列の制御下で免疫応答を誘導する該産物をコードする核酸配列を含んでなる異種発現カセットを含む。一つの態様では、コードされる産物は、産物にプライム／ブースト作用をもたらすことについて同一であり、産物が誘導される病原体または交差反応性病原体に産物が免疫応答を誘導する。しかし、調節制御因子およびその他のウイルス因子は、投与されるアデノウイルス内で異なることができる。別の態様では、コードされる産物は異なるが、しかし交差反応性作用を提供する。
【０００９】
意外にも、本発明者らは、著しい抗原特異性体液性反応が、抗原の連続的ｒＡｄ媒介およびｒＡＡＶ媒介投与を含む方法において観察されることを発見した。理論により拘束されることを望まないが、抗原および投与経路に依存して、増強されたＴ細胞反応も観察されると信じられる。
【００１０】
従って、本発明の方法は、本明細書中に記載されるように、異種発現カセットを担持するアデノウイルスベクターおよび異種発現カセットを担持するＡＡＶベクターの連続的投与を含む。本明細書で使用される場合に、連続的投与とは、アデノウイルスベクターの送達に引き続くＡＡＶベクターの送達、すなわち相互に間隔をおいた時点での送達を包含する。連続的投与は、ＡＡＶベクターの送達に引き続くアデノウイルスベクターの送達もさらに包含する。本発明の方法は、アデノウイルスベクターおよびＡＡＶベクターの同時投与、すなわち、一緒にまたは別々に配合されているかにかかわらず、同時または互いに隣接した時点での投与も包含する。一つの態様では、抗原性産物の連続的送達は、ベクターの一方を介する抗原発現の速度、誘導性プロモーターの使用、またはいくつかのその他の活性化可能な発現系のために、異なるベクターの同時投与の場合でも達成できる。
【００１１】
一つの態様では、本発明の免疫感作方法は、本明細書中に記載するＡＡＶベクターの連続的投与と組み合わせた複数のアデノウイルスベクターの投与を提供する、別の態様では、本発明の方法は、複数のＡＡＶベクタ連続的投与と組み合わせたアデノウイルスベクターの投与も提供する。さらに別の態様では、本方法は、複数のＡＡＶベクターと組み合わせた複数のアデノウイルスベクターの連続的投与を提供する。
【００１２】
本発明において、２種以上のアデノウイルスベクターの投与を含む方法は、第一の血清型のキャプシドタンパク質を有する第一のアデノウイルスベクターおよび前のアデノウイルスベクターとは免疫学的に区別されるキャプシドタンパク質を有する少なくとも１種の追加のアデノウイルスベクターの投与を典型的には利用する。
【００１３】
本明細書中に使用される場合に、キャプシドタンパク質は、それが第二のキャプシドタンパク質との感染を防止する免疫応答（例えばクリアリング中和性抗体反応）が存在しない患者へ投与できる場合に、他のキャプシドタンパク質とは免疫学的に区別される。好適には、ブースティングベクターのキャプシドタンパク質は、前に投与した（プライミング）ベクターのキャプシドタンパク質とは血清学的に区別される起源由来である。しかし、別の態様では、キャプシドタンパク質の本来の抗体エピトープがマスク、改変、または別の方法で中和（例えば外因性分子の同時投与）されている場合には、プライミング（そして場合によりブースティング）ベクターノ  キャプシドタンパク質は、血清学的区別を考慮することなく送達できる。
【００１４】
同様に、２種以上のＡＡＶベクターの投与を含む方法は、第一の血清型のキャプシドタンパク質を有する第一のＡＡＶベクターおよび前のＡＡＶベクターとは免疫学的に区別されるキャプシドタンパク質を有する少なくとも１種の追加のＡＡＶベクターの投与を典型的には利用する。
【００１５】
所望の投与経路に従って、当該技術分野の熟練者は、適当な方法を選定できる。例えば
、ピーク免疫応答は、一般にＡｄ媒介送達の約１０〜１４日後に観察される。しかし、このピークに続くブースティングは、第二ののピークを生成してもよい。従って、Ａｄ媒介送達の後約１０〜２１日、または１８〜２８日、または２８日〜６カ月で発現するようにブースティング抗原の発現を時間設定することが望ましいであろう。別の例では、ある種のＡＡＶ血清型は、送達の約３〜４週間後にピーク発現を示す。従って、ＡＡＶ送達後のブースティングは、ＡＡＶ送達の後約３週間〜約４週間、約４週間〜約２カ月、または約２カ月〜６カ月もしくはそれ以上で抗原もしくは交差反応性抗原を発現するように時間設定してもよい。
【００１６】
一つの態様では、本発明に従うウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターを介して送達される異種発現カセットは、誘導性または調節性プロモーターに操作可能に連結された免疫原性産物を含む。本発明に従う方法中に使用される場合に、誘導性または調節性プロモーターは、典型的には、ウイルスベクターの投与の時点で産物の発現が直ちに活性化されるように投与される。その後、発現は、誘導性または調節性作用物質を取り去ると直ちに消失され得る。本発明の方法は、発現の「パルス」状活性化を含むことができる。従って、本発明の方法は、発現を誘導、消失、次いで再び一定時間後に誘導することを可能とする。別の態様では、発現は、投与の時点ではなく、投与の数日または数週間後に誘導される。この態様では、ＡｄおよびＡＡＶの同時送達、次いで誘導性作用物質により起きる遅延に依存して送達の数週間後に誘導（活性化）されることを許容してもよい。例えば、誘導性作用物質が送達されて、その作用が観察されるまで７〜１０日間、またはそれ以上かかるであろう。当該技術分野の熟練者は、誘導性または活性化作用物質の送達とその作用との間の遅延には精通しており、そして選択した方法内に要因として容易に含めることができる。
【００１７】
場合により、本発明の方法は、例えば所望の免疫原性もしくは治療性分子をコードするＤＮＡ分子、またはタンパク質に基づく免疫原もしくは治療剤を含む他の免疫原性もしくは治療性部分の投与と組み合わされることができる。
【００１８】
本発明の方法のそれらおよびその他の局面、および本発明の産物をさらに詳細に説明する。
【００１９】
１．アデノウイルスベクター
「機能的に欠損した」または「機能欠損」の用語は、遺伝子領域が遺伝子発現の機能性産物の産生をもはやできなくなるために十分な遺伝子領域の量が、例えば変異または改変により取去られあるいは損傷されることを意味する。所望の場合には、全遺伝子領域が取り去られてもよい。遺伝子破壊または欠失のために適合するその他の部位は、本出願の別の箇所で言及される。
【００２０】
Ａ．血清型
好適には、本発明のそれらのアデノウイルスベクターは、選択されたアデノウイルスゲノムから誘導される１個もしくはそれ以上のアデノウイルス因子を含む、一つの態様では、該ベクターは一つの選択された血清型からのアデノウイルス逆方向末端反復塩基配列（ＩＴＲ）および同じアデノウイルス血清型からの追加のアデノウイルス配列を含む。別の態様では、ベクターはＩＴＲを提供するものとは異なるアデノウイルス血清型から誘導されるアデノウイルス配列を含む。本明細書で定義する場合には、擬似型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）アデノウイルスとは、アデノウイルスのキャプシドタンパク質がＩＴＲを提供する血清型とは異なる血清型由来であるアデノウイルスを指す。
【００２１】
ＩＴＲの血清型、存在するいずれかのアデノウイルス遺伝子、キャプシドタンパク質、およびベクター内に存在するいずれかの他のアデノウイルス配列の血清型の選択は、本発
明の限定ではない。種々のアデノウイルス株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手できるかまたは各種の商業的および公的機関起源から要求に応じて入手できる。さらに、多数のかかる株の配列は、例えばＰｕｂＭｅｄおよびＧｅｎＢａｎｋを含む各種のデータベースから入手できる。他のサルまたはヒトアデノウイルスから調製されたアデノウイルスベクターは、公開された文献中に記載されている〔例えば米国特許第５，２４０，８４６号明細書参照〕。多数のアデノウイルス型のＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋＴＭデータベースから入手でき、それにはタイプＡｄ５〔ＧｅｎＢａｎｋＴＭアクセッション番号Ｍ７３２６０〕が含まれる。アデノウイルス配列は、いずれかの公知のアデノウイルス血清型、例えば血清型Ｃ、Ｄ、１〜４０、そして殊には２、３、４、５、７、１２および４０から得られてもよく、そしてやがて同定されるであろうヒト型のいずれもさらに含む。同様にヒト以外の動物（例えばサル）を感染するとして知られるアデノウイルスも本発明のベクター構築物内に使用されてもよい。例えば米国特許第６，０８３，７１６号明細書参照。本発明の方法内で有用であろう他のアデノウイルス血清型の例は、例えば血清型３４〔国際特許公開番号ＷＯ２００４／４０９７０１６号明細書〕、血清型２４〔国際特許公開番号ＷＯ２００４／０８３４１８号明細書〕、および血清型３５〔欧州特許第１０５４０６４号明細書〕を含む。本明細書中に記載するベクターの構築に使用されるウイルス配列、ヘルパーウイルス、必要な場合には、組換えウイルス粒子、およびその他のベクター成分および配列は、上記のようにして得ることができる。本発明のサルアデノウイルス配列のＤＮＡ配列は、かかるベクターの調製の際に有用なベクターおよび細胞株を構築するために使用される。
【００２２】
一つの態様では、本発明中に使用される少なくとも１種のアデノウイルスは、ヒト以外の霊長類から誘導されるキャプシドを含む。適合するヒト以外の霊長類の配列の例は、サルアデノウイルス、例えばＰａｎ５（またＣ５）、およびＰａｎ６（またＣ６）、Ｐａｎ７（またＣ７）、ＳＶ１、ＳＶ２５、ＳＶ３９〔国際特許公開番号ＷＯ０２／３３６４５号明細書参照、引用して編入される〕、Ｐａｎ９（またＣ６８）およびＣ１〔米国特許第６，０８３，７１６号明細書、引用により本明細書に編入される〕、およびＳＡ１８〔米国特許出願番号第１０／４６５，３０２号明細書およびその対応国際特許公開番号ＷＯ２００５／００１１０３号明細書、引用により本明細書に編入される〕を含む。
【００２３】
本発明はさらに擬似型アデノウイルス、キメラおよびハイブリッドアデノウイルスベクターを包含する。例えば米国特許出願番号第１０／４６５．３０２号明細書およびその対応国際特許公開番号ＷＯ２００５／００１１０３号明細書（引用することにより本明細書に編入される）参照。しかし、本発明はキャプシド血清型の選択またはウイルスベクター内に存在する他のアデノウイルス因子の起源には限定されない。
【００２４】
Ｂ．アデノウイルス因子
本発明において使用されるアデノウイルス粒子またはベクターは、宿主内に発現されるべき産物を担持する発現カセットおよび感染された宿主細胞への発現カセットの送達を許容するために十分なウイルス因子をその中にパッケージングされたアデノウイルスキャプシドから成る。それらのアデノウイルスベクターは、複製欠陥性であり、それにより宿主細胞内での複製を回避する。
【００２５】
一つの態様では、本発明で使用されるアデノウイルス粒子は、５’アデノウイルスシス因子および３’アデノウイルスシス因子をアデノウイルスのそれぞれ５’最末端および３’最末端に含む。アデノウイルスゲノムの５’末端はパッケージングおよび複製のために必要な５’シス因子を含む；すなわち、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（複製起点として機能する）および５’パッケージングエンハンサードメイン（Ｅ１プロモーターのための線型Ａｄゲノムおよびエンハンサー因子をパッケージングするために必要な配列を含む）を含む。アデノウイルスゲノムの３’末端は、パッケージングおよびキャプシド化のために必要な３’シス因子（ＩＴＲを含む）を含む。
【００２６】
アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムに本来的な機能性アデノウイルス遺伝子を含むことができるか、または本来のアデノウイルスゲノムに対して複数の欠失を含むことができる。一つの態様では、アデノウイルスは、Ｅ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子産物を含み、その領域の機能性欠損および遺伝子産物を発現不能とするＥ１領域内の機能性欠損を有する。
【００２７】
さらに、本発明において使用されるアデノウイルスベクターは、１個もしくはそれ以上の他のアデノウイルス初期遺伝子領域内で機能的に欠失していてもよい。例えば、本発明で使用されるアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域内で機能欠損および、場合により、１個もしくは双方のアデノウイルスＥ２領域、アデノウイルスＥ３領域、またはアデノウイルスＥ４領域内に機能欠損を含むことができる。Ｅ２領域内の機能欠損は、１個もしくはそれ以上のＥ２産物、Ｅ２ａおよびＥ２ｂを機能的に発現する能力の破壊を含んでもよい。同様に、Ｅ４領域内の機能欠損は、機能性ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７遺伝子産物を発現する能力の破壊を含んでもよい。
【００２８】
Ｅ３の排除は、その領域内への発現カセットの挿入を許容する。しかし、Ｅ３はアデノウイルスへの宿主免疫応答の調節に関与すると信じられており、従って、別の態様では保持される。この態様では、Ｅ３遺伝子産物は、Ｅ１発現を要する本来のＥ３プロモーターの下降制御を回避するために、異種プロモーターの制御下で発現される。
【００２９】
Ｅ４欠失を含む本発明に使用されるアデノウイルスは、Ｅ４の１個もしくはそれ以上のオープンリーディングフレーム（例えばＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６およびＯＲＦ７）を機能欠損されている。一つの態様では、構築物は、Ｅ４ＯＲＦのそれぞれの機能欠損を含む。別の態様では、すべてのＥ４  ＯＲＦがＥ４  ＯＲＦ６を除いて欠失されている。さらに別の態様では、１個もしくはそれ以上のそれらのＥ４  ＯＲＦの他の組合せが、本発明の方法で使用されるアデノウイルス構築物中で機能欠失されている。
【００３０】
本発明で使用される一つのアデノウイルスベクターは、１個もしくはそれ以上のアデノウイルス遺伝子領域、例えば１個もしくはそれ以上のアデノウイルス中間遺伝子、遺伝子ＩＸおよびＩＶａ２またはアデノウイルス後期遺伝子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）中で機能的に欠失されていてもよい。
【００３１】
さらに別の態様では、その他の欠失が他の構造的または非構造的アデノウイルス遺伝子内で作られてもよい。それらの欠失は個別に使用でき、すなわち本発明中で使用されるアデノウイルス配列は単一領域内でのみ欠失を含んでもよい。
【００３２】
アデノウイルスキャプシド内へのパッケージングのために必要なタンパク質を発現するベクターの能力を排除する機能欠損を含むアデノウイルスベクターを生成する方法は、当該技術分野の熟練者には公知でありそして本発明の限定ではない。
【００３３】
Ｃ．ベクター因子
抗原および免疫原標的（すなわち産物）およびそれらをコードする配列の選択のために使用される方法、「異種発現カセット」のクローニングおよび構築、およびウイルスベクター内へのその挿入は、本明細書で提供される教示を与えられた当該技術分野の技術の範囲内である。本発明に従って、異種発現カセットは、本来のアデノウイルスゲノムにおいてどのアデノウイルス領域の部位内にでも位置でき、それは５’および３’アデノウイル
スＩＴＲの間に位置される。一つの態様では、異種発現カセットはアデノウイルスベクターの本来のＥ１領域内に位置される。別の態様では、異種発現カセットは本来のＥ３領域内に位置される。別の態様では、遺伝子産物は、アデノウイルスベクターの本来のＥ２領域から、またはアデノウイルスベクターの本来のＥ４領域から発現され、そして遺伝子産物をコードする配列と隣接していない調節制御因子に操作可能に連結されている。本発明は発現カセットの方向により限定はされず、それは発現カセットの挿入部位に隣接（ｆｌａｎｋ）するアデノウイルスゲノムの方向に関して５’−３’、または３’−５’であってもよい。
【００３４】
さらに別の態様では、アデノウイルスベクターは２個以上の異種発現カセットを担持し、それらはアデノウイルスゲノム内の複数の欠失部位内に挿入できる。本態様では、異種発現カセットはアデノウイルスゲノム内の複数の位置から同一または異なる産物を発現できる。
【００３５】
１．核酸配列
発現カセットは配列に隣接するベクター配列とは異種の核酸配列を含み、それは関係するポリペプチド、タンパク質、またはその他の産物をコードする。好適には、この産物は免疫原または抗原である。配列をコードする核酸は、宿主細胞内で産物の転写、翻訳、および／または発現を許容する様式で調節成分に操作可能に連結される。適合する核酸配列および産物は、当該技術分野の熟練者により容易に選択されるであろう。それらの因子の選択は本発明の限定ではない。
【００３６】
２．調節因子
発現カセットのために上記に同定された主要因子に加えて、ベクターは、本発明中に使用されるウイルスで感染された細胞内の産物の転写、翻訳、および／または発現を許容する様式で産物をコードする配列に操作可能に連結されている通常の制御因子も含む。本明細書中に使用される場合に、「操作可能に連結」された配列は、関係する産物（例えば遺伝子）と隣接している発現制御配列および関係する遺伝子を制御するためにトランス（ｔｒａｎｓ）またはある距離をもって作用する発現制御配列の双方を含む。
【００３７】
発現制御配列は、適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；効果的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増進する配列（すなわちコザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列）；タンパク質安定性を増進する配列；および所望の場合には、コードする産物の分泌を増進する配列を含む。本来的、構成性、誘導性および／または組織特異性であるプロモーターを含む、多数の発現制御配列が当該技術分野では公知でありそして利用してもよい。
【００３８】
構成性プロモーターの例は、限定ではないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーおよび／またはＣＭＶイントロン領域を伴う）〔例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）参照〕、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーターおよびその変種、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター〔Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ〕を含む。抗原が重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス抗原である一つの態様では、βアクチンプロモーターが、ＣＭＶからのエンハンサーおよびイントロン領域と組み合わせて使用される。
【００３９】
別の態様では、遺伝子の本来のプロモーターが使用される。本来のプロモーターは、産
物の発現が本来の発現を擬似することを望まれる場合に好ましいであろう。本来のプロモーターは、産物の発現が一時的もしくは発生的に、組織特異性の様式、または特異性転写刺激因子への応答として調節されなければならない場合に使用されてもよい。さらなる態様では、その他の本来の発現制御因子、例えばエンハンサー因子、ポリアデニル化部位またはコザック・コンセンサス配列も本来の発現を擬似するために使用されてもよい。
【００４０】
発現カセットの別の態様は、組織特異性プロモーターに操作可能に連結された産物をコードする核酸配列を含む。例えば、骨格筋内の発現が望まれる場合には、筋肉内で活性なプロモーターを使用しなければならない。それらには、骨格性βアクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチン・キナーゼ、ならびに天然に存在するプロモーターおよび高い活性を有する合成筋肉プロモーターをコードする遺伝子からのプロモーターを含む（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，１７：２４１−２４５（１９９９）参照）。組織特異性のプロモーターの一つの例は、なかでも、肝臓〔アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９（１９９６）；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：５０３−１４（１９９６）〕、骨オステオカルシン〔Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６（１９９７）〕；骨唾液タンパク質〔Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４（１９９６）〕、リンパ球〔ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体鎖〕、ニューロン性、例えば神経細胞特異性エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５（１９９３））、神経フィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５（１９９１））、およびニューロン特異性ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４（１９９５））に対して知られている。
【００４１】
場合により、免疫原性産物をコードする配列を担持するベクターは選択可能なマーカーを含んでもよいかまたはレポーター遺伝子はなかでもジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｅ）、ハイグロマイシンもしくはピューロマイシン耐性をコードする配列を含んでもよい。かかる選択可能なレポーターまたはマーカー遺伝子（好ましくは、ウイルス粒子中にパッケージングされるウイルスゲノムの外側に位置される）は、細菌細胞内のプラスミドの存在を知らせるために使用でき、例えばアンピシリン耐性である。ベクターのその他の成分は、複製の起点を含んでもよい。それらおよびその他のプロモーターおよびベクター因子の選択は、当該技術分野の熟練者には通常のことでありそして多数のかかる配列は入手できる〔例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ、およびその中の引用文献参照〕。
【００４２】
それらのベクターは、当該技術分野の熟練者に公知の技術と同時に、本明細書中に提供される技術および配列を用いて生成される。かかる技術には、従来のｃＤＮＡのクローニング技術、例えば教科書〔Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ〕に記載のもの、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列をもたらすいずれかの適当な方法の使用を含む。
【００４３】
上記のように、一つの態様では本発明の免疫感作方法は異なるウイルスベクターを介する同じ免疫原生産物の連続的送達を含むけれども、いずれかの与えられた方法内のベクター内に使用される異種発現カセットも同一である必要はない。実際に、それぞれの異種発現カセットは、方法内に使用される他の発現カセット内の調節配列およびベクター因子とは異なる免疫原性産物および／またはベクター因子に対する調節配列を含むことができる。従って、それらの調節およびベクター因子の選択は、選択された対照者に対する免疫感作方法の範囲内ではあっても本発明の制限ではない。
【００４４】
ＩＩ．アデノウイルス粒子
ＡＤＥ粒子の各種の産生方法は、当該技術分野の熟練者には公知である。適切な産生方法の選択は、本発明の制限ではない。例えば、米国特許第６，０８３，７１６号明細書、国際特許公開番号ＷＯ０２／３３６４５号明細書；および米国特許出願番号第１０／４６５，３０２号明細書（それらは引用することにより編入される）参照。要約すると、１種もしくはそれ以上の必須のいずれかのアデノウイルス遺伝子産物（例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４  ＯＲＦ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）を発現する能力を欠損するアデノウイルスベクターの産生は、アデノウイルス粒子のウイルス感染性および繁殖性のために要求される欠損アデノウイルス遺伝子産物の存在下で培養できる。それらのヘルパー機能は、１種もしくはそれ以上のヘルパー構築物（例えばプラスミドもしくはウイルス）またはパッケージング宿主細胞の存在下でアデノウイルスを培養して提供されてもよい。例えば、１９９６年５月９日付で公開された国際特許公開番号ＷＯ９６／１３５９７号明細書（引用することにより編入される）中の「最小」ヒトＡｄベクターの調製に関して記載された技術参照。
【００４５】
アデノウイルスベクターが、最小のＡｄ配列のみ、またはＥ１、Ｅ３および／またはＥ４領域内で機能欠損のみを有する全Ａｄゲノムを含むかどうかに関係なく、一つの態様では、組換えウイルスは単一アデノウイルスから誘導されたキャプシドを含む。あるいは、別の態様では、組換え擬似型アデノウイルスもしくはハイブリッドアデノウイルスが本発明の方法に使用されてもよい。それらのアデノウイルスベクターの産生の方法は、記載されている。
【００４６】
Ａ．ヘルパーウイルス
従って、発現カセットを担持するために使用されるウイルスベクターのアデノウイルス遺伝子含有量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非反復ウイルスフラグメントが、発現カセットを含む感染性組換えウイルス粒子を産生するために必要な十分なアデノウイルス遺伝子配列をもたらすために必要であろう。有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクター構築物中に存在しないおよび／またはベクターがその中でトランスフェクションされるパッケージング細胞株により発現しない選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含む。一つの態様では、ヘルパーウイルスは複製欠陥性でありそして上記の配列に加えて種々のアデノウイルス遺伝子を含む。かかるヘルパーウイルスは、Ｅ１発現細胞株と組み合わせて使用されることが望ましい。
【００４７】
ヘルパーウイルスは、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６４：１６９８５−１６９８７（１９８９）；Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９９：４９（１９９４年４月１日）に記載のようなポリカチオン接合体内に形成されてもよい。ヘルパーウイルスは、場合により第二ののレポーター発現カセットを含んでもよい。多数のかかるレポーター遺伝子が当該技術分野では公知である。アデノウイルスベクター上の遺伝子産物とは異なるヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在は、Ａｄベクターおよびヘルパーウイルスの両者を独立して監視することを可能とする。この第二ののリポーターは精製による組換えウイルスとヘルパーウイルスの間の分離を可能とするために使用される。
【００４８】
Ｂ．相補性細胞株
上記のいずれかの遺伝子を欠失された組換えアデノウイルス（Ａｄ）を生成するために
、ウイルスの複製および感染性に必須の場合には、欠失された遺伝子領域の機能は、ヘルパーウイルスまたは細胞株、すなわち相補性またはパッケージング細胞株により組換えウイルスへ供給されなければならない。多くの場合に、ヒトアデノウイルスＥ１を発現する細胞株は、チンパンジーＡｄベクターをトランスコンプリメント（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）するために使用できる。これは、本発明のチンパンジーＡｄ配列と現在利用できるパッケージング細胞内に見られるヒトＡｄＥ１配列との間の差異に起因し、現在のヒトＥ１含有細胞の使用が複製および産生プロセスの間の複製適格アデノウイルスの生成を防止するために、特に有利である。しかし、ある場合には、Ｅ１欠失サルアデノウイルスの産生のためにＥ１遺伝子産物を発現する細胞株が使用できることが望ましいであろう。かかる細胞株は記載されている。例えば米国特許第６，０８３，７１６号明細書参照。
【００４９】
選択された親細胞株内での発現のためのプロモーターの転写的制御下で少なくともアデノウイルスＥ１遺伝子を発現するパッケージング細胞または細胞株を生成するために本明細書中で提供される配列を使用してもよい。誘導性または構成性プロモーターがこの目的のために使用されてもよい。かかるプロモーターの例は、本明細書の別の箇所に詳細に記載されている。いずれかの所望のＡｄ遺伝子を発現する新規の細胞株の生成のために親細胞が選択される。限定ではなく、かかる親細胞株は、なかでもＨｅＬａ〔ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ２〕、Ａ５４９〔ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ１８５〕、ＨＥＫ２９３、ＫＢ〔ＣＣＬ１７〕、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）〔例えばデトロイト５１０、ＣＣＬ７２〕およびＷＩ−３８〔ＣＣＬ７５〕細胞であってもよい。それらの細胞株は、すべてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９）から入手できる。その他の適合する親細胞株は他の起源から入手されてもよい。その他の適合する親細胞株は他の供給元から入手されてもよい。
【００５０】
かかるＥ１発現細胞株は、組換えアデノウイルスＥ１欠失ベクターの生成に有用である。追加的、または改変的に、本発明は、１種もしくはそれ以上のサルアデノウイルス遺伝子産物、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、および／またはＥ４  ＯＲＦ６を発現する細胞株を提供し、それらは組換えサルウイルスベクターの生成に使用されるものと本質的に同様の手順を用いて構築できる。かかる細胞株は、それらの産物をコードする必須遺伝子中で欠失されたトランスコンプリメントアデノウイルスベクターに利用できる。本発明による宿主細胞の調製は、選択されたＤＮＡ配列のアセンブリーのような技術を含む。このアセンブリーは直接クローニング技術を用いて達成されてもよい。かかる技術は記載されている〔Ｇ．Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００３年１０月；１０（２２）：１９２６−１９３０；２００３年５月１５日付公開の米国特許出願公開番号２００３−００９２１６１−Ａ号明細書、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１２４０５号明細書〕。あるいは、周知でありそして上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．中に記載のｃＤＮＡおよびゲノムクローニングのような技術、ポリメラーゼ連鎖反応、合成方法、および所定のヌクレオチド配列をもたらすいずれかのその他の適合する方法と組合せたアデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用を含む。
【００５１】
さらに別の代替方法では、必須アデノウイルス遺伝子産物は、アデノウイルスベクターおよび／またはヘルパーウイルスによりトランス的にもたらされる。かかる場合に、適合する宿主細胞は、原核（例えば細菌）細胞および昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を含む真核細胞を含むいずれかの生物学的生物体から選択できる。宿主細胞はいずれかの哺乳動物種から選択され、それには、限定ではないが、細胞、例えばＡ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＨＥＫ２９３細胞またはＰＥＲＣ６（これら双方は機能性アデノウイルスＥ１を発現する）〔Ｆａｌｌａｕｘ  ＦＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，９：１９０９−１９１７〕、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０，ＨｅｐＧ２およびヒト、サル、マウス、ラット、ラビット、およびハムスターを含む哺乳動物から誘導した初期繊維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞が含まれる。細胞を提供する哺乳動物種の選択も、哺乳動物細胞の型、すなわち繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞なども本発明を限定はしない。
【００５２】
Ｃ．ウイルス粒子のアセンブリーおよび細胞株のトランスフェクション
一般に、トランスフェクションにより発現カセットを含んでなるベクターを送達する場合に、ベクターは、約１ｘ１０４  細胞〜約１ｘ１０１３細胞、もしくは約１０５細胞に対して約５μｇ〜約１００μｇＤＮＡ、約１０〜約５０μｇＤＮＡの量で送達される。しかし、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択されたベクター、送達方法および選択された宿主細胞などの要因を考慮に入れて調整されてもよい。
【００５３】
ベクターは、裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、ウイルスなどを含み、当該技術分野で公知または上記に開示のいずれのベクターでもよい。ベクターの宿主細胞内への導入は、トランスフェクションおよび感染を含み、当該技術分野で公知または上記に開示のいずれかの手段により達成されてもよい。１個もしくはそれ以上のアデノウイルス遺伝子は、宿主細胞のゲノム内に安定に組み込まれるか、エピソームとして安定に発現されるか、または一時的に発現されてもよい。遺伝子産物は、一時的、エピソーム上もしくは安定に組込まれてすべて発現されてもよいか、または一部の遺伝子産物が安定に発現され他のものが一時的に発現されてもよい。
【００５４】
さらに、それぞれのアデノウイルス遺伝子のプロモーターが、構成性プロモーター、誘導性プロモーターまたは本来のアデノウイルスプロモーターから独立して選択されてもよい。プロモーターは、例えば生物体または細胞の特定の生理学的状態により（すなわち分化状態により、または複製もしくは静止細胞中で）または外因的に付加された因子により調節されてもよい。宿主細胞内への分子（例えば、プラスミドまたはウイルス）の導入は、熟練者に公知の技術を用いそして本明細書中で考察したようにして達成されてもよい。好ましい態様では、標準トランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ４トランスフェクションまたは電気穿孔法が使用される。
【００５５】
各種中間体プラスミド内へのアデノウイルスの（ならびに導入遺伝子およびその他のベクター要素選択されたＤＮＡ配列のアセンブリー、および組換えウイルス粒子を産生するプラスミドおよびベクターの使用は、従来の技術を用いてすべて達成される。かかる技術は、例えば教科書〔Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ、上記に引用〕に記載のような従来のｃＤＮＡのクローニング技術、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の利用、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列をもたらすいずれかの適合する方法を含む。標準トランスフェクションおよび同時トランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ４  沈降技術が利用される。使用されるその他の従来の方法には、ウイルスゲノムの相同組換え、アガーオーバーレイ内のウイルスのプラーク形成、シグナル生成を測定する方法などが含まれる。
【００５６】
例えば、所望の発現カセットを含むウイルスベクターの構築およびアセンブリーに続いて、ベクターをヘルパーウイルスの存在下でパッケージング細胞株中へ実験室内でトランスフェクションする。相同組換えがヘルパーとベクター配列との間で起き、それはベクター内でのアデノウイルス導入遺伝子配列の複製およびビリオンキャプシド内へのパッケージングを許容して組換えウイルスベクター粒子をもたらす。かかるウイルス粒子を産生する現在の方法は、トランスフェクションに基づくものである。しかし、本発明はかかる方法に限定はされない。
【００５７】
得られた組換えウイルスは、選択された細胞への選択された導入遺伝子の導入のために
有用である。
【００５８】
ＩＩＩ．ＡＡＶベクター
一つの態様では、本発明に有用なＡＡＶベクターは、最低でも、その中に異種発現カセットがパッケージングされているＡＡＶキャプシドをコードする配列を含む。カセットは、ＡＡＶ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ３’ＩＴＲに隣接されている。ＡＡＶ  ＩＴＲは、キャプシドとして同一の起源由来、または異なる起源由来（すなわち擬似型ＡＡＶベクター）であってもよい。
【００５９】
一つの態様では、本発明は組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生成する方法を提供する。かかる方法は、本明細書中で定義されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質をコードする核酸配列、またはそのフラグメント；機能性ｒｅｐ遺伝子；最低でも、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接された発現カセット；およびＡＡＶキャプシド内へ発現カセットのパッケージングを許容するために十分なヘルパー機能を含む宿主細胞の培養を含む。
【００６０】
ＡＡＶキャプシド内でＡＡＶ  ＩＴＲに隣接された発現カセットをパッケージする宿主細胞内で培養されるために必要な成分は、トランスで宿主細胞にもたらされてもよい。あるいは、所要の成分のいずれかの１種もしくはそれ以上（例えば発現カセット、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）は、当該技術分野の熟練者には公知の方法を用いて１種もしくはそれ以上の所要の成分を含むように操作された安定な宿主細胞によりもたらされてもよい。最も適切には、かかる安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下で所要の成分（１個もしくはそれ以上）を含む。しかし、所要の成分（１個もしくはそれ以上）は、構成性プロモーターの制御下にあってもよい。適合する誘導性および構成性プロモーターの例は、産物をコードする配列と一緒に使用するために適する調節因子の考察中で、本明細書中に提供される。さらに別の態様では、選択された安定な宿主細胞は、構成性プロモーターの制御下で選択された成分および１種もしくはそれ以上の誘導性プロモーターの制御下のその他の選択された成分を含んでもよい。例えば、２９３細胞（それは構成性プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含む）から誘導される安定な宿主細胞を生成してもよいが、しかしそれは誘導性プロモーターの制御下でｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含む。さらに他の安定宿主細胞は、当該技術分野の熟練者いより生成されるであろう。
【００６１】
本発明のｒＡＡＶを産生するために必要な発現カセット、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、それに担持されている配列を移送するいずれかの遺伝因子の形態で宿主細胞をパッケージングするために送達されてもよい。選択される遺伝因子は、本明細書中に記載のものを含み、いずれかの適切な方法により送達されてもよい。本発明のいずれかの態様を構築するために使用される方法は、核酸操作の熟練者には公知でありそして遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ参照。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は、周知でありそして適切な方法の選択は本発明の限定とはならない。例えばＫ．Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号明細書参照。
【００６２】
別に特定しない限り、本明細書中に記載するＡＡＶ  ＩＴＲ、ＡＡＶキャプシド、およびその他の選択されたＡＡＶ成分は、いずれのＡＡＶ血清型中からでも容易に選択でき、それには、限定ではなく、ＡＡＶ１〔国際特許公開番号ＷＯ００／２８０６１号明細書〕、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９および国際特許公開番号ＷＯ２００３／０４２３９７号明細書、米国特許出願番号６０／５０８，２２６号明細書およびその対応国際特許ＰＣＴ／ＵＳ０４／０２８８１７号明細書、および「ＡＡＶベクターの機能を上昇する方法」の名称を有し２００５年４月７日付け出願の米国特許出願番号第６０／６６９，０８３号明細書（これらは引用することにより本明細書に編入される）中に記載のその他のＡＡＶの一種が含まれる。それらのＩＴＲおよびその他のＡＡＶ成分は、ＡＡＶ血清型から当該技術分野の熟練者により利用できる技術を用いて容易に単離されてもよい。かかるＡＡＶは、学問的、商業的または公的起源（例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離または入手できる。あるいは、ＡＡＶ配列は、公開起源、例えば文献中、または例えばＧｅｎＢａｎｋＴＭデータベース、ＰｕｂＭｅｄＴＭデータベースなどのデータベース中で入手できる公開された配列を参照して合成またはその他の適切な手段を介して入手されてもよい。
【００６３】
本発明中で有用なＡＡＶベクターは、すべてのＡＡＶ配列およびキャプシドタンパク質（例えば繊維、ペントン、ヘキソン）が単一起源から誘導されるベクターを含む。あるいは、本発明中に使用されるＡＡＶベクターは、トランス包膜化されたものを含む（すなわち、ＡＡＶ  ＩＴＲとは異なる起源のＡＡＶキャプシドおよび／またはキャプシド内のその他のＡＡＶ因子を含む）。かかるトランス包膜化されたベクターは、従来の技術を使用して擬似型化されたもの、または合成、人工および／またはキメラキャプシドを含むものを含む。例えば、国際特許公開番号ＷＯ２００３／０４２３９７号明細書、米国特許出願番号第６０／５０８，２２６号明細書およびその対応国際特許ＰＣＴ／ＵＳ０４／０２８８１７号明細書および米国特許第６，４９１，９０７号明細書参照。
【００６４】
一つの態様では、本発明は、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、またはその他の標的細胞もしくは組織細胞によるベクター取り込みおよびそれらの活性化の増加により、ＡＡＶの抗原性を増強するために、１個もしくはそれ以上のｖｐ１、ｖｐ２および／またはｖｐ３タンパク質（これらはＡＡＶキャプシドを形成するようにアセンブルしている）が改変されるＡＡＶウイルスベクターを利用する。改変されたｖｐ１、ｖｐ２またはｖｐ３タンパク質は、キャプシドの外面上に暴露した挿入ペプチドまたはタンパク質を有するＡＡＶキャプシド内にアセンブルする。それらの改変は、ジローら〔Ａ．Ｇｉｒｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｍｅｄ，５（９）：１０５２−１０５６（１９９９）〕またはウオリントンら〔ＫＨ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｊｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（１２）：６５９５−６６０９（２００４）〕の方法を用いて作製されてもよい。ジローの方法に従うと、選択されたＡＡＶのｖｐ３コードドメイン中の一つの部位が、ＡＡＶ２のアミノ酸位置５８７に相当するコード領域で核酸配列を挿入して〔そして従来のプログラムおよび方法を用いるアラインメントで決定されるように、他のＡＡＶの相当する配列中で〕改変できる。かかるアミノ酸挿入は、長さ約１〜３４アミノ酸であってもよくそして所望のペプチド、例えばペプチド特異性受容体、抗原、またはその他の所望の配列を伴う改変ＡＡＶｖｐ２タンパク質を含むアセンブルされたＡＡＶキャプシドをもたらしてもよい。適合するフラグメントの例は、例えばＴ．Ｊ．Ｃｕｒｉｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２（１２０）：７４２５−３１（２００４）中に記載のＤＣ３、ＤＣ１２、およびＤＣ１８のような樹状細胞へ標的とされたペプチドを含む。
【００６５】
ウオリントンの方法に従うと、ｖｐ２キャプシドのＮ−末端（すなわちＡＡＶ２の位置１３８そして他のＡＡＶ配列の相当する位置）は、ペプチドの挿入を含むように改変でき、改変キャプシドタンパク質を含むアセンブルされたＡＡＶキャプシド中で有用な融合タンパク質をもたらす。一つの態様では、それらの融合タンパク質は追加の標的配列を与える。別の態様では、融合タンパク質は追加の抗原性配列をもたらしてもよい。一つの態様では、２５０アミノ酸以下、さらに望ましくは１５０アミノ酸、または５〜１５０アミノ酸長さの挿入が選択される。ペプチドの適切な起源の例は、例えばフラジェリン、熱ショックタンパク質、および補体タンパク質から選ばれたフラグメント（例えば補体成分３、フラグメントｄ）を含む。
【００６６】
キャプシドの起源および／またはＡＡＶ  ＩＴＲおよびその他のＡＡＶ因子の供給源として限定ではなく本発明中に使用するためにさらに他のＡＡＶベクターが選択されてもよいことが理解されるであろう。
【００６７】
Ａ．パッケージング発現カセット
本発明において有用なアデノウイルスベクターと関連して上記に定義した異種発現カセットは、その５’末端において、５’ＡＡＶ逆方向末端反復塩基配列（ＩＴＲ）および、その３’末端において、３’ＡＡＶ  ＩＴＲの間に位置する。その他のＡＡＶまたはベクター因子は、発現カセットと５’ＡＡＶ  ＩＴＲまたは３’ＡＡＶ  ＩＴＲのいずれかの間に位置してもよい。キャプシドタンパク質内にパッケージングされ本発明のＡＡＶベクターをもたらすのはこの構築物である。
【００６８】
産物、ベクター因子などをコードする核酸配列を含み、異種発現カセットの因子は、アデノウイルスベクターの上記のものの中から容易に選択される。
【００６９】
一つの態様では、本発明に従ってｒＡＡＶを介して送達される異種発現カセットは、誘導性または調節性プロモーターに操作可能に連結された免疫原性産物を含む。本発明に従う方法内で使用される場合に、誘導性または調節性作用物質は、典型的には、ｒＡＡＶの投与の直後に産物の発現が活性化されるように投与される。従って、発現は、誘導性または調節性作用物質の除去により消失できる。本発明の方法は、発現の「パルス」状活性化を含むことができる。換言すると、発現は、誘導、消失次いで一定期間後に再び誘導できる。
【００７０】
誘導性および調節性プロモーターは遺伝子発現の調節を許容しそして外因的に供給された化合物、環境因子、例えば温度、または特定の生理学的状態、例えば急性相、細胞の特定の分化状態、もしくは複製の存在により調節され得る。調節性プロモーターおよびシステムは、限定ではないがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを含む各種の商業的供給源から入手できる。多数のその他のシステムが記載されそして当該技術分野の熟練者により容易に選択できる。例えば、誘導性プロモーターは、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーターおよびデキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターを含む。その他の誘導性システムは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム〔ＷＯ９８／１００８８〕；エクダイソン昆虫プロモーター〔Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１（１９９６）〕、テトラサイクリン抑制性システム〔Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）、およびテトラサイクリン誘導性システム〔Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８  １７６６−１７６９（１９９５）、またＨａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２−５１８（１９９８）も参照〕を含む。その他のシステムは、ＦＫ５０６ダイマー、カストラジオールを用いるＶＰ１６またはｐ６５、ジフェノール・ムリスレロン（ｍｕｒｉｓｌｅｒｏｎｅ）、ＲＵ４８６誘導性システム〔Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１（１９９７）〕およびラパマイシン誘導性システム〔Ｍａｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２（１９９７）〕を含む。ある種の誘導性プロモーターの有効性は、時間経過と共に上昇する。かかる場合に、縦列に複数のレプレッサー、例えばＩＲＥＳによりＴｅｔＲに連結されたＴｅｔＲを挿入してかかるシステムの有効性を増強できる。あるいは、少なくとも３日間待った後所望の機能についてスクリーニングできる。このシステムの有効性を増強する公知の手段により所望のタンパク質の発現を増強できる。例えば、ウッドチャック・肝炎ウイルス転写後調節因子（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＷＰＲＥ））を用いる。調節可能因子の選択は、本発明の限定ではない。
【００７１】
さらに、本発明の方法はかかるプロモーターの使用に限定はされず、そして本発明の方法によりｒＡＡＶにより担持される異種発現カセットは、構成性、本来、もしくは組織特異性プロモーターを含むことができる。プロモーターの選択は、本発明の限定ではない。
【００７２】
Ｂ．ｒｅｐおよびｃａｐ配列
ミニ遺伝子に加えて、宿主細胞は宿主細胞中に本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質（またはそのフラグメントを含んでなるキャプシドタンパク質）の発現を推進する配列およびミニ遺伝子内に見いだされるＡＡＶ  ＩＴＲの血清型と同一の血清型のｒｅｐ配列、または交差補完性血清型を含む。ＡＡＶ  ｃａｐおよびｒｅｐ配列は、上記のようにしてＡＡＶ源から独立して得られてもよくそして上記のようにして当該技術分野の熟練者には公知のいずれかの様式で宿主細胞内に導入されてもよい。さらに、（例えばＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシド）内のＡＡＶベクターを型擬似（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）した場合に、それぞれの必須のｒｅｐタンパク質をコードする配列は、異なるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、または本明細書中で同定したいずれかの血清型）により供給されてもよい。例えば、ｒｅｐ７８／６８配列はＡＡＶ２由来であってもよく、一方ｒｅｐ５２／４０配列はＡＡＶ８由来であってもよい。
【００７３】
一つの態様では、宿主細胞は、適合するプロモーター、例えば上記のものの制御下でキャプシドタンパク質を安定に含む。一つの態様では、キャプシドタンパク質は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の態様では、キャプシドタンパク質は、トランスで宿主細胞に供給される。トランスで宿主細胞に送達される場合には、キャプシドタンパク質は、宿主細胞内で選択されたキャプシドタンパク質の発現を指令するために必要な配列を含むプラスミドを介して送達されてもよい。トランスで宿主細胞に送達される場合には、キャプシドタンパク質を担持するプラスミドは、ｒＡＡＶをパッケージングするために必要な他の配列、例えばｒｅｐ配列も担持してもよい。
【００７４】
別の態様では、宿主細胞は、適合するプロモーター、例えば上記のものの制御下でｒｅｐ配列を含む。最も望ましくは、本態様において、必須ｒｅｐタンパク質は誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の態様では、ｒｅｐタンパク質はトランスで宿主細胞に供給される。トランスで宿主細胞に送達される場合に、ｒｅｐタンパク質は、宿主細胞内で選択されたｒｅｐタンパク質の発現を指令するために必要な配列を含むプラスミドを介して送達されてもよい。最も望ましくは、トランスで宿主細胞に送達される場合に、キャプシドタンパク質を担持するプラスミドは、ｒＡＡＶ、例えばｒｅｐおよびｃａｐ配列をパッケージングするために必要な他の配列も担持する。
【００７５】
従って、一つの態様では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は単一の核酸分子上で宿主細胞内にトランスフェクションされそしてエピソームとして細胞内に安定に存在してもよい。別の態様では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は細胞の染色体内に安定に組み込まれる。別の態様は、宿主細胞内で一時的に発現されたｒｅｐおよびｃａｐ配列を有する。例えば、かかるトランスフェクションに有用な核酸分子は、５’から３’に向けて、プロモーター、プロモーターとｒｅｐおよびｃａｐ配列の開始部位との間に挟まれた任意のスペーサー、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子配列、およびＡＡＶｃａｐ遺伝子配列を含んでなる。
【００７６】
場合により、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、宿主細胞内に導入されるべき他のＤ
ＮＡ配列を含むベクター上に供給されてもよい。例えば、ベクターはミニ遺伝子を含んでなるｒＡＡＶ構築物を含んでもよい。ベクターはヘルパー機能をコードする１個もしくはそれ以上の遺伝子、例えばアデノウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ２ａ、およびＥ４ＰＲＦ６、およびＶＡＩ  ＲＮＡのための遺伝子を含んでなってもよい。
【００７７】
この構築物中に使用されるプロモーターは、当該技術分野の熟練者には公知であるかまたは上記に考察したような構成性、誘導性または本来のプロモーターのいずれであってもよい。一つの態様では、ＡＡＶ  Ｐ５プロモーター配列が使用される。いずれかのそれらの配列を提供するＡＡＶの選択は、本発明を限定はしない。
【００７８】
他の態様では、ｒｅｐのためのプロモーターは、誘導性プロモーター、例えば導入遺伝子調節因子と関連して上記で考察したものである。ｒｅｐ発現のための一つの好ましいプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターおよびｃａｐ遺伝子により調節されるｒｅｐ遺伝子を含んでなるベクターは、Ｔ７ポリメラーゼを構成性または誘導可能に発現する細胞内にトランスフェクションまたは形質導入される。１９９８年３月１２日付けで公開された国際特許公開番号ＷＯ９８／１００８８号明細書参照。
【００７９】
スペサーは、ベクターの設計における任意因子である。スペーサーは、プロモーターとｒｅｐ遺伝子ＡＴＧ開始部位との間に挟まれたＤＮＡ配列である。スペーサーは、いずれかの所望の設計を有してもよい。すなわち、それはヌクレオチドの無作為配列であっもよく、またはその代わりに、それはマーカー遺伝子のような遺伝子産物をコードしてもよい。スペーサーは、典型的には開始／終止およびポリＡ部位を組み込む遺伝子を含んでもよい。スペーサーは、原核または真核生物からの非コードＤＮＡ配列、反復非コード配列、転写制御がないコード配列もしくは転写制御を有するコード配列であってもよい。２種の例示的なスペーサー配列の例は、λファージラダー配列または酵母ラダー配列であり、それらは例えばなかでもＧｉｂｃｏまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから商業的に入手できる。スペーサーは、ｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８遺伝子産物の発現を低下し、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０およびｃａｐ遺伝子産物を正常レベルで発現させるために十分ないずれかの大きさであってもよい。従って、スペーサーの長さは、約１０ｂｐ〜約１０．０ｋｂｐの範囲、好ましくは約１００ｂｐ〜約８．０ｋｂｐの範囲内であってもよい。再結合の可能性を低下するために、スペーサーは、好ましくは長さ２ｋｂｐ未満である。しかし本発明はそのように限定はされない。
【００８０】
ｒｅｐおよびｃａｐをもたらす分子は一時的に宿主細胞内に存在するであろうが（すなわちトランスフェクションを介して）、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の一方または双方およびそれらの発現を制御するプロモーターは宿主細胞内で、例えばエピソームとしてもしくは宿主細胞の染色体内への組込みにより安定に発現されることが望ましい。本発明の態様を構築するために使用される方法は、従来の遺伝子工学または組換操作技術、例えば上記の引用文献中に記載のものである。本明細書は、本明細書内で提供される情報を用いて特定の構築物の例示的な例を提供するが、当該技術分野の熟練者は、スペーサー、Ｐ５プロモーターおよび少なくとも１種の翻訳開始および停止シグナル、およびポリアデニル化部位の任意付加を含むその他の因子の選択を用いて、その他の適合する構築物を選択および設計するであろう。
【００８１】
本発明のその他の態様において、ｒｅｐまたはｃａｐタンパク質は、宿主細胞により安定して供給されるであろう。
【００８２】
Ｃ．ヘルパー機能
本発明のｒＡＡＶをパッケージするために、パッケージング宿主細胞はヘルパー機能も要求する。場合により、それらの機能はヘルペスウイルスにより供給される。必要なヘル
パー機能は、上記および／またはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳ）を含む種々の供給源から入手できるもののような、ヒトまたは非ヒト霊長類アデノウイルス起源からそれぞれ提供されてもよい。さらに別の態様では、宿主細胞は、Ｅ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物、および／またはＥ４  ＯＲＦ６遺伝子産物を備えているかおよび／または含む。宿主細胞は、他のアデノウイルス遺伝子、例えばＶＡＩ  ＲＮＡを含んでもよいが、しかしそれらの遺伝子は必要ではない。さらに別の態様では、宿主細胞内に他のアデノウイルス遺伝子または遺伝子機能は存在しない。
【００８３】
「Ｅ１ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡ」とは、Ｅ１ａをコードするいずれかのアデノウイルス配列またはいずれかの機能性Ｅ１ａ部分を意味する。Ｅ２ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡおよびＥ４  ＯＲＦ６遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡも同様に定義される。アデノウイルス遺伝子の対立遺伝子もしくはその他の改変またはそれらの機能性部分も含まれる。かかる改変は、ある様式によりアデノウイルス機能を増強するために、従来の遺伝子工学もしくは変異誘発技術の手段により計画的に導入されるか、ならびにそれらの天然に存在する対立遺伝子変種であってもよい。それらのアデノウイルス遺伝子機能を達成するためにＤＮＡを操作するかかる改変および方法は、当該技術分野の熟練者には公知である。
【００８４】
アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、および／またはＥ４  ＯＲＦ６遺伝子産物、ならびにいずれかのその他の所望のヘルパー機能は、細胞内にそれらの発現させるどの手段を用いてでももたらすことができる。それらの産物をコードするそれぞれの配列は、別のベクター上にあってもよく、または１個もしくはそれ以上の遺伝子が同一ベクター上にあってもよい。ベクターは、当該技術分野では公知もしくは上記に開示されたどのベクターでもよく、それにはプラスミド、コスミドおよびウイルスが含まれる。ベクターの宿主細胞内への導入は、当該技術分野で公知または上記に開示されたいずれの手段で達成されてもよく、それには、トランスフェクション、感染、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト誘導がなかでも含まれる。１個もしくはそれ以上のアデノウイルス遺伝子は、宿主細胞のゲノム内に安定に組み込まれるか、エピソームとして安定に発現されるか、または一時的に発現でされてもよい。遺伝子産物は、エピソーム上にすべて発現されるかもしくは安定に組み込まれてもよく、または一部の遺伝子産物は安定に発現され、その他は一時的に発現されてもよい。さらに、それぞれのアデノウイルス遺伝子のプロモーターは、構成性プロモーター、誘導性プロモーターまたは本来のアデノウイルスプロモーターから独立して選択されてもよい。プロモーターは、生物体または細胞の特定の生理学的状態により（すなわち分化状態によりまたは複製または静止細胞内で）または例えば外因的付加因子により調節されてもよい。
【００８５】
Ｄ．宿主細胞およびパッケージング細胞株
宿主細胞自体は原核ウイルス（例えば細菌）細胞、および昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を含む真核細胞を含むいずれの生物学的生物体から選択されてもよい。一つの態様では、宿主細胞は、限定ではなく、例えばＡ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ  ７、ＢＳＣ  １、ＢＳＣ  ４０、ＢＭＴ
１０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、２９３細胞（これらは機能性アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２およびヒト、サル、マウス、ラット、ラビット、およびハムスターを含む哺乳動物から誘導された初期繊維芽細胞、肝細胞および筋肉芽細胞を含むいずれかの哺乳動物種から選択される。細胞を提供する哺乳動物種の選択、あるいは哺乳動物細胞の型、すなわち繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などは本発明の限定ではない。使用される細胞への要求は、それがＥ１、Ｅ２ａおよび／またはＥ４  ＯＲＦ６以外のいかなるアデノウイルス遺伝子も含まないこと；それがｒＡＡＶの産生の間に混入ウイルスの相同組換えをもたらす可能性があるいずれの他のウイルス遺伝子も含まないこと；およびそれがＤＮＡの感染もしくはトランスフェクションおよびトランスフェクションされたＤＮＡの発現が可能であることである。一つの態様では、宿主細胞は、細胞内に安定にトランスフェクションされたｒｅｐおよびｃａｐを有するものである。
【００８６】
本発明中で有用な一つの宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする配列を用いて安定に形質転換され、そしてアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４  ＯＲＦ６ＤＮＡおよび上記のようなミニ遺伝子を担持する構築物を用いてトランスフェクションされた宿主細胞である。安定なｒｅｐおよび／またはｃａｐ発現細胞株、例えばＢ−５０（ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９４６３）、または米国特許第５，６５８，７８５号明細書中に記載のものも、同様に使用されてもよい。その他の宿主細胞は、Ｅ４  ＯＲＦ６を発現するために十分な最低のアデノウイルスＤＮＡを含む。さらに別の細胞株は、本発明の新規のＡＡＶ９ｃａｐ配列を用いて構築できる。
【００８７】
本発明による宿主細胞の調製は、選択されたＤＮＡ配列のアセンブリーなどの技術を含む。このアセンブリーは、従来の技術を利用して達成されてもよい。かかる技術は、周知でありそして上記に引用したＳａｍｂｒｏｏｋら中に記載されているｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、合成法、および所望のヌクレオチド配列をもたらすいずれかのその他の適合する方法と組み合わせたアデノウイルスおよびＡＡＶゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用を含む。
【００８８】
宿主細胞内への分子（プラスミドまたはウイルスとして）の導入は、当該技術分野の熟練者には公知でありそして本明細書中で考察されている技術を用いて達成されてもよい。好ましい態様では、標準トランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ４  トランスフェクションまたは電気穿孔、および／またはハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターの細胞株、例えばヒト胚腎細胞株ＨＥＫ２９３（トランス作用性Ｅ１タンパク質を提供する機能性アデノウイルスＥ１遺伝子を含むヒト腎細胞株）による細胞株内への感染が使用される。
【００８９】
従って、本発明は、本明細書中に記載のワクチン／免疫感作方法内に有用なベクターをさらに提供する。それら、またはその他のＡＡＶベクター構築物は、Ａｄベクターの連続的投与を含む方法内の免疫原の送達のための方法内に使用されてもよい。
【００９０】
ＩＶ．免疫感作方法
本発明に従って、組換えベクターは、生体外または生体内投与の後にヒトもしくはサル以外の獣医学的患者内に免疫応答を誘導するための本発明の免疫感作方法に使用される。一つの態様では、誘導される免疫応答はウイルスベクターにより発現される産物に対する体液性（すなわち抗体）反応である。発現される抗原産物に応じて、かかる抗体反応は、抗原が誘導されまたはその他の関連する病原体と交差反応する病原体に対して特異性であり得る。別の態様では、免疫応答は細胞性（例えばＣＴＬ）反応であることができる。発現される免疫原性産物に応じて、かかるＣＴＬ反応は、免疫原が誘導されるかまたは他の関連する病原体と交差反応する抗原に特異性であり得る。さらに別の態様では、抗体およびＣＴＬ反応の双方が誘導されてもよい。しかし、本発明の方法は、それが、ウイルスベクターそして特にはアデノウイルスベクターへの免疫応答を最小化、そして一部の場合には排除するという利点を有する。
【００９１】
従って、本発明の免疫感作方法は、予防的もしくは治療的の双方のワクチンに適用できる。かかるワクチン性（またはその他の免疫原性）組成物は、上記のような適合する送達ベヒクル内に配合される。一般に、免疫原性組成物の投与量は、治療用組成物に対して上
記に定義した範囲内である。選択された遺伝子の免疫性のレベルは、もし使用する場合にはブースターの必要性を決定するために測定できる。血清中の抗体力価の評価の後に、最適ブースター免疫感作が望まれるであろう。
【００９２】
場合により、本発明の組成物は、本明細書中に記載のウイルスベクターならびに例えばアジュバント、安定剤、ｐＨ調整剤、保存剤などを含む別の成分を含んで配合されてもよい。適合する例示的な保存剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールを含む。
【００９３】
適合する化学安定化剤は、ゼラチンおよびアルブミンを含む、適合する例示的なアジュバントは、なかでも免疫刺激性複合物（ＩＳＯＣＯＭＳ）、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）を含むＬＰＳ類似体、鉱油および水、水酸化アルミニウム、アンフィゲン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）、アビルジン（Ａｖｉｒｄｉｎｅ）、Ｌ１２１／スクアレン、ムラミルペプチド類、およびサポニン、例えばクイル（Ｑｕｉｌ）Ａ、およびいずれかの生物学的活性因子、例えばサイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、リガンド、およびそれらの最適な組合せを含む。それらの生物学的に活性な因子の一部は、生体内、例えばプラスミドまたはウイルスベクターを介して発現できる。例えば、かかるアジュバントは、プライミングアデノウイルスベクターと一緒に投与できる。
【００９４】
本発明中に使用されるウイルスベクターは、「免疫原性量」、すなわち、所望の細胞をトランスフェクションするための投与経路で効果的でありそして免疫応答を誘導するために十分なレベルの選択された遺伝子の発現もたらすウイルスの量で投与される。防御的免疫がもたらされる場合に、ウイルスは、疾患および／または再発感染を防止するために有用なワクチン組成物であると考えられる。
【００９５】
あるいはまたは追加として、本発明に使用されるベクターは選択された免疫原に対して免疫応答を誘導する製品（例えばペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質）をコードする核酸配列を含んでもよい。本明細書で提供される免疫原性方法は、ベクターにより発現される挿入異種抗原タンパク質に対する細胞溶解性Ｔ細胞および抗体を誘導することに高度に有効と期待される。
【００９６】
免疫原は各種のウイルスファミリーから選択されてもよい。それに対して免疫応答が望ましいウイルスファミリーの例は、通常の風邪の原因の約５０％を占めるライノウイルス属、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、およびヒト腸内ウイルス例えばＡ型肝炎ウイルスを含むエンテロウイルス属、主としてヒト以外の動物における足および口疾患の原因となるアフトウイルス属を含むピコルナウイルス科を含む。ウイルスのピコルナウイルス科内で、標的抗原はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、およびＶＰＧを含む。その他のウイルスファミリーは、流行性胃腸炎の重要な原因であるウイルスのノーウオークグループを包含するカルシウイルス科を含む。ヒトおよびヒト以外の動物内で免疫応答を誘導する標的抗原での使用が望ましいさらに別のウイルスファミリーは、シンドビスウイルス、ロスリバー（ＲｏｓｓＲｉｖｅｒ）ウイルス、およびベネズエラ、イースタン＆ウエスタンウマ脳炎を含むアルファウイルス属および風疹ウイルスを含むルビウイルス属を含むトガウイルス科である。フラビウイルス科は、デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）脳炎およびダニ媒介脳炎ウイルスを含む。
【００９７】
その他の標的抗原は、Ｃ型肝炎〔例えば米国特許公開番号ＵＳ２００３／１９０６０６号明細書（２００３年１０月９日）；ＵＳ２００２／０８１５６８号明細書（２００２年６月２７日）または多数の非ヒトウイルス、例えば感染性喘息ウイルス（家禽類）、ブタ
伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）、および通常の風邪および／またはＡ、ＢおよびＣ型以外の肝炎を起こすヒト呼吸器コロナウイルスから成るコロナウイルス科から生成されてもよい。コロナウイルス科の範囲内で、標的抗原はＥ１（Ｍまたはマトリックスタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ２（Ｓまたはスパイクタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥまたはヘマグルチン−エルテロース（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ−ｅｌｔｅｒｏｓｅ）とも呼ばれる）糖タンパク質（すべてのコロナウイルス内には存在しない）、またはＮ（ヌクレオキャプシド）を含む。コロナウイルス科は、突然急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の推定原因作用物質を含む。さらに別の抗原は、ベシクロウイルス属（例えばインディアナ型水疱性口内炎ウイルス）およびリッサウイルス属（例えば狂犬病）を含むラブドウイルス科に対して標的とされてもよい。ラブドウイルス科内で、適切な抗原はＧタンパク質またはＮタンパク質から誘導されてもよい。出血熱ウイルス、例えばマールブルグおよびエボラウイルスを含むフィロウイルス科も抗原の適切な起源であろう。パラミクソウイルス科は、１型パラインフルエンザウイルス、３型パラインフルエンザウイルス、３型ウシパラインフルエンザウイルス、ルブラウイルス（おたふくかぜウイルス）、２型パラインフルエンザウイルス、４型パラインフルエンザウイルス、ニューキャッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹およびネコジステンパーを含む麻疹ウイルス、および呼吸器合胞体ウイルス（例えば糖（Ｇ）タンパク質および融合（Ｆ）タンパク質、それらの配列はＧｅｎＢａｎｋから入手できる）を含むニューモウイルスを含む。
【００９８】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科内に分類されそして抗原（例えばＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）の適合する起源である。ブニヤウイルス科は、ブニヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、クロス）、フレボウイルス属（リフトヴァレー熱）、ハンタウイルス属（プレマラ（ｐｕｒｅｍａｌａ）はヘマハジン（ｈｅｍａｈａｇｉｎ）熱ウイルスである）、ナイロウイルス属（ナイロビヒツジ病）および種々の帰属されていないブンガ（ｂｕｎｇａ）ウイルスを含む。アレナウイルス科は、ＬＣＭおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原の起源を提供する。レオウイルス科は、レオウイルス属、ロタウイルス属（これは小児に急性胃腸炎を起こす）、オルビウイルス属、およびクルチ（ｃｕｌｔｉ）ウイルス属（コロラドダニ熱ウイルス、レボンボ（Ｌｅｂｏｍｂｏ）（ヒト）、ウマ脳炎、ブルータング）を含む。
【００９９】
レトロウイルス科は、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩのようなヒトおよび獣医的疾患を包含するオンコリ（ｏｎｃｏｒｉ）ウイルス亜科、レンチウイルス亜科（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ感染性貧血症ウイルス、およびスプーマウイルスを含む）を含む。レンチウイルスの中で、多数の適合する抗原が記載されそして容易に選択できる。適合するＨＩＶおよびＳＩＶ抗原の例は、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、およびＲｅｖタンパク質、ならびにそれらの種々のフラグメントを限定ではなく含む。例えばＥｎｖタンパク質の適合するフラグメントは、その他のサブユニット、例えばｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ４１、またはそれらのより小さいフラグメント、例えば少なくともアミノ酸約８個の長さのもののようないずれかのそのサブユニットを含んでもよい。同様に、ｔａｔタンパク質のフラグメントが選択されてもよい〔米国特許第５，８９１，９９４号明細書および米国特許第６，１９３，９８１号明細書参照〕。また、Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（５）：２４６２−２４６７（２００１年３月）、およびＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９−７４（２００１年４月６日）に記載のＨＩＶおよびＳＩＶタンパク質も参照のこと。別の例では、ＨＩＶおよび／またはＳＩＶ免疫原性タンパク質またはペプチドは、融合タンパク質またはその他の免疫原性分子を形成するために使用されてもよい。例えば、国際特許公開番号ＷＯ０１／５４７１９号明細書、２００１年８月２日公開、および国際特許公開番号ＷＯ９９／１６８８４号明細書、１９９９年４月８日公開中に記載のＨＩＶ−１  Ｔａｔおよび／またはＮｅｆ融合タンパク質および免疫感作方法を参照のこと。本発明は、本明細書中に記載のＨＩＶおよび／またはＳＩＶ免疫原性タンパク質またはペプチドに限定はされない。さらに、それらのタンパク質に対する種々の修飾が記載されるかまたは当該技術分野の熟練者により容易に作製できる。例えば、米国特許第５，９７２，５９６号明細書に記載の改変ｇａｇタンパク質を参照のこと。さらに、いずれかの所望のＨＩＶおよび／またはＳＩＶ免疫原は、単独または組合せて送達されてもよい。かかる組合せは、単一ベクターからまたは複数ベクターからの発現を含んでもよい。場合により、別の組合せは、タンパク質形態での１個もしくはそれ以上の免疫原の送達を伴う１種もしくはそれ以上の発現された免疫原の送達を含んでもよい。標的抗原および免疫原の追加の起源は以下にさらに詳細に考察される。
【０１００】
パポーバウイルス科は、ポリオーマウイルス亞科（ＢＫＵおよびＪＣＵウイルス）およびパピローマウイルス亞科（乳頭腫のガンまたは悪性進行に関連する）を含む。免疫原性産物として有用なパピローマウイルスタンパク質の例は、Ｅ１〜Ｅ７、Ｌ１およびＬ２と呼ばれるパピローマウイルス「初期」および「後期」遺伝子から誘導されたものを含む。例えば米国特許出願公開番号２００２／０１３７７２０号明細書〔Ｅｒｔｌ〕参照。その他のパピローマウイルス抗原およびそれらの組合せが記載されている。例えば米国特許出願公開番号２００３／１２９１９９号明細書（２００３年７月１０日）、米国特許出願公開番号２００２／１８２２１号明細書（２００２年１２月１５日）、米国特許第６，３４２，２２４号明細書参照。
【０１０１】
アデノウイルス科は呼吸器疾患および／または腸炎を起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を含む。パルボウイルス科は、ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス、およびブタパルボウイルスを含む。ヘルペスウイルス科は、シンプレックスウイルス属（ヒトＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、ワリセロ（ｖａｒｉｃｅｌｌｏ）ウイルス属（仮狂犬病、水胞性帯状疱疹ウイルス）を包含するアルファヘルペスウイルス亞科およびサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス）を含むベータヘルペスウイルス亞科、およびリンホクリプトウイルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ種）、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルス、およびラジノウイルス（ｒｈａｄｉｎｏｖｉｒｕｓ）を含むガンマヘルベスウイルス亞科を含む。ポックスウイルス科は、オルトポックスウイルス属（痘瘡（天然痘）およびワクチニア（牛痘））、パラポックスウイルス属、アビポックスウイルス属、カプリポックスウイルス属、レポリポックスウイルス属、スイポックスウイルス属を包含するチョルドポックスウイルス亞科、およびエントモポックスウイルス亞科を含む。ヘパドナウイルス科は、Ｂ型肝炎ウイルスを含む。抗原の起源として適合するであろう一つの分類されていないウイルスは、デルタ型肝炎ウイルスである。さらに他のウイルス起源は、トリ感染性嚢性疾患ウイルスおよびブタ呼吸器および生殖器症候群ウイルスを含んでもよい。アルファウイルス科は、ウマ関節炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルスを含む。
【０１０２】
本発明は、ヒトまたはヒト以外の動物を、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物に感染する細菌、真菌、寄生微生物もしくは多細胞寄生体、またはガン細胞もしくは腫瘍細胞由来を含む他の病原に対して免疫感作するために有用な産物を利用する方法も包含する。細菌性病原の例は、肺炎双球菌、ブドウ球菌および連鎖球菌を含む病原性グラム陽性球菌を含む。病原性グラム陰性球菌は、髄膜炎菌、淋菌を含む。病原性腸内グラム陰性桿菌は、腸内菌科；シュードモナス、アシネト菌およびエイケネラ菌（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）；類鼻疽菌；サルモネラ菌；赤痢菌；ヘモフィルス菌（インフルエンザ菌、ハエモフィルス  ソムヌス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ））；モラクセラ菌；軟性下疳菌（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を起こす）；ブルセラ菌；フラニセラ  ツラレンシス（Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（ツラレミア病を起こす）；エルシニア菌（パスチュレラ（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ））；モニリホルム連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）およびスピリルム菌を含む。グラム陽性桿菌は、リステリア菌（ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；豚丹毒菌（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ菌；炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）；ドノヴァノシス（ｄｏｎｏｖａｎｏｓｉｓ）（鼠蹊肉芽腫）；およびバルトネラ症菌を含む。病原性嫌気細菌により起きる疾患は、破傷風、ボツリヌス中毒、その他のクロストリジウム属細菌、結核、癩病、およびその他のマイコバクテリウム属の細菌を含む。
【０１０３】
特定の細菌種の例は、限定ではなく、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、モラクセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ブタコレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、セキリ菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アヴィウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム細胞内複合体（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ボレリア・ブルガドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇａｄｏｒｆｅｒｉ）、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチノバチルス・プルロニュモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマイコプラズマ・ガリセプチクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）である。
【０１０４】
病原性スピロヘータ疾患は、梅毒；トレポネーマ症；イチゴ腫、ピンタおよびその他の地方流行性梅毒；およびレプトスピラ症を含む。その他の高次病原性細菌および病原性真菌により起きる感染症は、アクチノミセス症、ノカルジア症、クリプトコックス症（クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））、ブラストミセス症（ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ））、ヒストプラズマ症（ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ））およびコクシヂオイデス症（コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ））；カンジダ症（カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ））；アスペルギルス症（アスペルギリス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ））、およびムコール症；スポロトリウム症；パラコクシジオイデス症；ペトリエリジオシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）；トルロプシス症、ミセトーマ（ｍｙｃｅｔｏｍａ）およびクロモミコシス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｏｓｉｓ）；および皮膚糸状菌症を含む。リッケチア感染症は、発疹チフス、ロッキー山紅斑熱、Ｑ熱、およびリッケチア痘を含む。マイコプラズマおよびクラミジア感染症の例は、マイコプラズマ肺炎、リンパ肉芽腫、オウム病、及び周生期クラミジア感染症を含む。病原性真核生物は、病原性原生生物および蠕虫を包含しそしてそれらにより起きる感染症は、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア症（例えばリーシュマニア  マジョール（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）により起きるもの）、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症（例えばトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）により起きるもの）、カリニ肺炎、トリカンズ（Ｔｒｉｃｈａｎｓ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、バベシア病、ランブル鞭毛虫症（例えばジアルディア（Ｇｉａｒｄｉａ）により起きるもの）、旋毛虫症（トリコモナス（Ｔｒｏｃｈｏｍｏｎａｓ）により起きるもの）、フィラリア症、住血吸虫症（例えば住血吸虫により起きるもの）、線虫類、吸虫類またはフルーク、および条虫（サナダムシ）感染症を含む。その他の寄生生物感染症は、なかでも回虫、鞭虫、クリプトスポリジウム、およびニューモシスチス  カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉ）より起きるであろう。
【０１０５】
多数のそれらの生物体および／またはそれらにより産生される毒素は、生物攻撃に使用される可能性がある薬剤として、疾病管理センター〔（ＣＤＣ）、米国保健および社会福祉省〕により同定されている。例えば、それらの生物学的薬剤の一部の例には下記が含まれる：炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびその毒素（ボツリヌス症）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）、大痘瘡（痘瘡）、フランシセラ  ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（ツラレミ菌）、およびウイルス性出血熱〔フィロウイルス（例えばエボラ、マーブルグ）〕、およびアレナウイルス〔例えばラサ、マチュポ〕、これらのすべは現在カテゴリーＡ薬剤に分類されている；コクシエラ  ブルネチ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ）（Ｑ熱）；ブルセラ種（ブルセラ症）、ブルコルデリア  マレイ（Ｂｒｕｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）（鼻疽）、ブルコルデリア  シュドマレイ（Ｂｒｕｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（メロイドーシス（ｍｅｌｏｉｄｏｓｉｓ））、ヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびその毒素（リシン毒素）、ウエルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびその毒素（イプシロン毒素）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種およびそれらの毒素（腸毒素Ｂ）、オウム病クラミジア（Ｃｌａｍｉｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（オウム病）、水の安全への脅威（例えばコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クリトスポルジウム  パルブム（Ｃｒｙｔｏｓｐｒｏｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、チフス熱（リッケチア  ポワゼキ（Ｒｉｃｈｅｔｔｓｉａ  ｐｏｗａｚｅｋｉｉ））、およびウイルス性脳炎（アルファウイルス、例えばベネズエラウマ脳炎、イースタンウマ脳炎、ウエスタンウマ脳炎）；それらのすべては現在カテゴリーＢ薬剤に分類されている；およびナイパン（Ｎｉｐａｎ）ウイルスおよびハンタウイルス、それらは現在カテゴリーＣ薬剤に分類されている。さらに、そのように分類されているかまたは異なって分類されているその他の生物体は、将来同定されるかおよび／またはかかる目的に使用されるであろう。本明細書中に記載のウイルスベクターおよびその他の構築物は、それらの生物体、ウイルス、それらの毒素またはその他の副産物からの抗原を送達するために有用であり、それらはそれらの生物学的薬剤を用いる感染またはその他の不利益な反応を防止および／または処置するであろうと容易に理解される。
【０１０６】
Ｔ細胞の可変領域に対する免疫原を送達するための本発明によるベクターの投与は、ＣＴＬを含む免疫応答を誘発してそれらのＴ細胞を排除する。リウマチ性関節炎（ＲＡ）の場合に、疾患に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の数個の特定の可変領域が検討された。それらのＴＣＲはには、Ｖ−３、Ｖ−１４、Ｖ−１７およびＶα−１７が含まれる。従って、それらのポリペプチドの少なくとも１個をコードする核酸配列の送達は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘発する。多発性硬化症（ＭＳ）では、疾患に関与するＴＣＲの数個の特定の可変領域が検討された。それらのＴＣＲはＶ−７およびＶα−１０を含む。従って、それらのポリペプチドの少なくとも１個をコードする核酸配列の送達は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘発する。強皮症では、疾患に関与するＴＣＲの数個の特定の可変領域が検討された。それらのＴＣＲは、Ｖ−６、Ｖ−８、Ｖ−１４およびＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７，Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８およびＶα−１２を含む。従って、それらのポリペプチドの少なくとも１個をコードする組換えサルアデノウイルスの送達は、強皮症に関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘導する。
【０１０７】
さらに、望ましい免疫原は脊椎動物宿主、例えば、限定ではないが、前立腺特異性抗原、ガン胎児性抗原、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５およびＭＡＧＥ−３を含み、それらに限定はされないガン抗原または腫瘍関連抗原を用いる産物の内に治療的または予防的抗ガン効果を誘導するように指令するものを含む。
【０１０８】
好適には、アデノウイルスベクターおよびＡＡＶベクターは、アデノウイルスベクターおよびＡＡＶベクターの連続的投与、または同時投与を含む複合方法で送達される。それらの方法は、１種もしくはそれ以上の追加のアデノウイルスベクター、例えば機能性Ｅ１欠損、機能性Ｅ４欠損アデノウイルス、１種もしくはそれ以上の追加のＡＡＶベクター、またはその他の治療および／またはワクチン作用物質を用いる連続的もしくは同時投与をさらに含むことができる。
【０１０９】
一つの態様では、本免疫感作方法は、例えば遺伝子ガン（ｇｕｎ）またはプラスミドを介するＤＮＡワクチンの投与をさらに含む。かかるＤＮＡワクチンはプライミング段階として使用されてもよく、それは本発明によるアデノウイルス媒介および／またはＡＡＶ媒介送達より前に行われる。あるいは、かかるＤＮＡワクチンは、本発明の１回もしくはそれ以上のアデノウイルス媒介および／またはＡＡＶ媒介送達の後にブーストとして使用されてもよい。
【０１１０】
別の態様では、本方法はタンパク質に基づくワクチンの連続的または同時投与をさらに含む。かかるワクチンは、本発明によるアデノウイルス媒介および／またはＡＡＶ媒介送達の後にブーストとして使用できる。あるいは、かかるタンパク質に基づくワクチンは、プライムとして、または本発明の方法内の１回もしくはそれ以上のアデノウイルス媒介および／もしくはＡＡＶ媒介免疫感作の間に使用されてもよい。
【０１１１】
一つの例では、本発明の免疫感作方法は抗原が誘導されるウイルス、細菌もしくはその他の生物体、または交差反応性ウイルス、細菌もしくはその他の起源に対する防御性免疫応答を提供する、別の例では、本明細書中に記載の免疫感作方法は、多タンパク質方法を含むことができる。例えば、ＨＩＶおよびＳＩＶに対して免疫応答を生成するために有用なタンパク質サブユニットの発現のための多タンパク質方法を記載したＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９−７４（２００１年４月６日）を参照されたい。
【０１１２】
別の望ましい態様では、本方法は治療的免疫作用を提供する。場合により、それらの作用は、抗原特異性抗体、Ｔ細胞または治療が施される状態の存在の検出のためのアッセイを用いて測定できる。
【０１１３】
本発明の免疫感作方法に使用されるベクターは、投与量依存の様式で身体内の種々の部位に投与でき、それは所望の免疫応答が標的とされる産物に依存する。本発明は注入の量もしくは部位にもまたは製薬学的担体にも限定されない。より正しくは、本方法はプライミングおよびブースティング段階を含んでもよく、それぞれの段階は、単回投与量または時間毎、日毎、週毎または月毎または年毎に投与される投与を含んでもよい。送達の量または部位は、望ましくは哺乳動物の実体および状態に基づいて選定される。
【０１１４】
哺乳動物への抗原の送達のために適するベクターの投与単位は、本細書中に記載されている。ベクターは、かかる投与の熟練者には明らかな製薬学的または生理学的に許容できる担体、例えば等張性食塩水、等張性塩溶液、またその他の配合中に懸濁もしくは溶解されて投与するように調製される。適切な担体は、当該技術分野の熟練者には明らかでありそして投与の経路に大きく依存する。本発明に使用される組成物は、上記の経路に従い、生分解性の生体適合性ポリマーを用いる徐放配合、またはミセル、ゲルおよびリポソームを用いる部位送達により哺乳動物に投与される。場合により、本発明のプライミング段階は、本明細書中に規定したように、プライミング組成物、アジュバントの適量と共に投与することも含む。
【０１１５】
ウイルスベクターの投与は、患者の処置される状態、年齢、体重および健康のような要因に主として依存し、そして（ヒトを含む）哺乳動物患者毎に変動するであろう。有利には、本発明の組換えサル（例えばチンパンジー）アデノウイルスの予期しない効力は、所望の免疫原性効果を誘導（例えば抗体および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のあらかじめ決定されたレベルを誘導）するために有効な量を提供する組換えチンパンジーアデノウイルスの著しく低い量の使用を可能とする。
【０１１６】
例えば、小型動物に対して、アデノウイルスベクターの有効投与量は、アデノウイルスの１０５粒子／動物〜１０１１粒子／動物により提供される。例えば約８０ｋｇの大型動物に対しては、患者あたりに１０７〜１０１３粒子が有用であろう。しかし、例えば選択された送達経路に依存して、さらに多い投与量も容易に選定できる。例えば、アデノウイルスベクターは担体溶液約１００μＬ〜約１００ｍｌ、そしてさらに好ましくは約１ｍＬ〜約１０ｍＬの範囲の量で送達されてもよい。
【０１１７】
一つの態様では、ＡＡＶベクターの有効な投与は、一般に約１ｘ１０９〜１ｘ１０１６ゲノムウイルスベクターの濃度を含む溶液の約０．１ｍｌ〜約１００ｍｌの範囲内である。大型器官（例えば肝臓、筋肉、心臓および肺臓）への送達のために好ましいヒト投与は、約１〜１００ｍＬの体積で１ｋｇあたりに約５ｘ１０１０〜５ｘ１０１３ＡＡＶゲノムであってもよい。眼への送達のために好ましい投与は、約０．１〜１ｍＬの体積で約５ｘ１０９〜５ｘ１０１２ゲノムコピーである。
【０１１８】
投与の所望の経路に依存して、当該技術分野の熟練者は、適切な方法を選択できる。一般に、二回目、すなわち後続の免疫感作の組成物は、哺乳動物患者に対して、前回の免疫感作組成物の投与の約２〜約２７週後に投与できる。後続の組成物の投与は、前回の組成物により投与されたと同じ抗原を含むかまたは送達できる組成物の有効量を用いて達成できる。望ましくは、ブースティング組成物の産物は、プライミング組成物によりコードされたものと同一、または交差反応性である。
【０１１９】
本発明による連続的投与の間の期間は、Ａｄ媒介送達、ＡＡＶ媒介送達、およびいずれの任意の追加のプライミングまたはブースティング組成物（例えばＤＮＡに基づくかまたはタンパク質に基づくワクチン）の順序に従って調節できる。例えば、ピーク免疫応答は、一般にＡｄ媒介送達の約１０〜１４日後に観察される。しかし、このピークの後のブースティングが第二ののピークを生成してもよい。従って、Ａｄ媒介送達の後、約１０〜２１日、または１８〜２８日、または２８日〜２７週間に発現するようにブースティング抗原の発現を時間設定することが望ましいでだろう。別の例では、一部のＡＡＶ血清型は送達の３〜４週間後にピーク発現が示された。従って、ＡＡＶ送達の後のブースティングは、ＡＡＶ送達の約３週間〜約４週間、約４週間〜約２カ月、または約２カ月〜２７週間、またはさらに長期間の後に抗原または交差反応性抗原が発現するように時間設定してもよい。
【０１２０】
一つの態様では、本発明によるウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターを介して送達される異種発現カセットは、誘導性または調節性プロモーターに操作可能に連結された免疫原性産物を含む。本発明に従う方法に使用される場合に、誘導性または調節性作用物質は、典型的には、産物の発現がウイルスベクターの投与時に直ちに活性化されるように投与される。その後、誘導性または調節性作用物質を取り去ると発現を消失できる。本発明の方法は、発現の「パルス」状活性化を含むことができる。従って、本発明の方法は、発現を誘導し、消失し、次いで一定期間後に再び誘導することを許容する。別の態様では、発現は投与の際ではなく、投与の数日〜数週間後に誘導される。この態様は、誘導作用物質により起きる遅延に依存して送達の数週間後の誘導（活性化）が後に続くＡｄおよびＡＡＶの同時発現を許容してもよい。例えば、一旦誘導作用物質が送達されると、効果が確認されるまで７〜１０日を要する。当該技術分野の熟練者は、誘導性または活性化作用物質の送達とその効果との間の遅延は熟知しておりそして選択された方法内にこれを容易に要因として含めることができるであろう。
【０１２１】
選択された遺伝子の免疫性の治療レベルまたは複数のレベルは、利用できる場合にブースターの必要性を決定するために測定できる。血清中のＣＤ８＋Ｔ細胞反応、または、抗体力価の評価の後に、任意の追加ブースター免疫感作が望ましいであろう。
【０１２２】
別の局面では、本発明は、本明細書中に記載の免疫感作方法を実施するために有用な産物を提供する。
【０１２３】
かかる産物は、適合するコンテナー内にある本明細書中に記載のアデノウイルスベクターの１個もしくはそれ以上を含むことができる。典型的には、かかる産物はアデノウイルスベクターの投与のための指図をさらに含むであろう。
【０１２４】
さらに、産物は、送達の選択された経路のため、例えば１種もしくはそれ以上のアデノウイルスベクター、シリンジ、バイアルなどの希釈および／または再構成のために適する生理学的に許容できる担体を含んでもよい。
【０１２５】
実施例
下記の実施例は本発明を例示説明するために提供されそしてその範囲を限定はしない。当該技術分野の熟練者は、下記の実施例中に特定の試薬および条件が記載されているけれども、本発明の精神および範囲により包含されると意図される変更が可能であることを認めるであろう。
【０１２６】
最近、同一抗原を発現する異種ワクチン担体を用いる連続的免疫感作を含む戦略が、特異的免疫の無類のレベルの生成をもたらし、そして、ある場合には、感染性作用物質に対する保護を与えた。
【０１２７】
ヒト血清型５（Ｈ５）に基づく複製欠陥アデノウイルスベクターは、遺伝子産物に対して強力な細胞性および体液性免疫応答を誘導できる。さらに、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、抗原特異性免疫応答を誘発することも示された。
【実施例１】
【０１２８】
実施例２に記載する研究のために、エボラ・ザイール（Ｅｂｏｌａ  Ｚａｉｒｅ）ウイルスエンベロープ糖タンパク質（Ｅｂｏ  ＧＰ）が、Ｈ５ＣＭＶＧＰおよびＡＡＶ−１ＣＭＶＧＰワクチンベクターを創成するためのモデル抗原として使用された。筋肉に形質導入するために高度に有効なので、ＡＡＶ血清型１を選択した。
【０１２９】
それらの研究に使用したベクターは、下記のように従来の方法を用いて生成した。
【０１３０】
Ａ．アデノウイルスベクターの生成
１．ＥｂｏＺ発現アデノウイルスベクターの分子クローンの創成
アデノウイルスの種々の種および株から誘導されそしてＥｂｏＺＧＰを発現する組換えアデノウイルスゲノムを、直接結合および緑／白色選択システムを介して創成した。緑／白色選択システムは別の箇所に記載されている（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００３）およびＲｏｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１５（５）：５１９−５３０（２００４年５月））。要約すると、ＥｂｏＺＧＰ
ｃＤＮＡを、アデノウイルスバックボーンの種々の分子クローン内にＥｂｏＺＧＰを導入するために使用されたＣＭＶプロモーターとウシ成長ホルモンポリＡとの間の汎用ｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドベクター内にサブクローニングした。
【０１３１】
アデノウイルスバックボーンの分子クローンは、Ｅ１およびＥ３欠失を有するヒト血清型５（Ｈ５．０４０）、Ｅ１欠失のみ（Ｃ７．０００）、Ｅ１およびＥ３欠失（Ｃ７．０１０）およびＥ１およびＥ４欠失（Ｃ７．００１）のチンパンジー血清型７を含む。それらの分子クローンを創成するクローニングプロセスは、他の箇所〔Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、上記に引用、２００３およびＲｏｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１５（５）：５１９−５３０（２００４年５月）〕に記載されている。すべてのこれらの分子クローンは、細菌ｌａｃプロモーターから原核ＧＦＰを発現しそして２個のレア（ｒａｒｅ）制限部位、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＣｅｕＩに隣接されているカセットを含む。これは、汎用ｐＳｕｔｔｌｅ構築物からのＥｂｏＺ発現カセットに、慣用で効率的な緑／白色選択媒介クローニングプロセスを介してアデノウイルス分子クローン内へスワップされることを許容した（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００３）。
【０１３２】
２．ＡｄＥｂｏＺベクターのレスキュー、拡大および精製
分子クローンからの組換えウイルスをレスキューするために、プラスミドＤＮＡを適合する制限酵素により線型化してプラスミドバックボーンからベクターゲノムを放出させそして適切な細胞株内にトランスフェクションした。Ｅ１／Ｅ４欠失ベクターに対して、１０−３細胞、すなわち亜鉛誘導下で発現されるＥ４ＯＲＦ６  を有する２９４細胞に基づくＥ１／Ｅ４補足細胞株を使用した。その他のすべての構築物に対しては、２９３細胞を使用した。
【０１３３】
完全な細胞改変効果（ＣＰＥ）、ウイルスレスキューの徴候および複製が観察されると、粗ウイルス溶解物を適切な細胞株内での大規模感染に徐々に拡大するために採取した。ウイルスを標準ＣｓＣｌ勾配沈降法により精製した。組換えウイルスの複合体ゲノム構造は、制限酵素分析で確認した。Ｅ１／Ｅ４欠失ベクターを除くすべてのベクターに対して、ウイルスの感染性を２９３細胞上のプラークアッセイにより決定した。しかし、免疫感作実験に使用したベクターはＵＶ分光分析計を用いるＯＤ２６０の読みにより測定されたウイルスの物理的粒子数に基づいて投与された。
【０１３４】
Ｂ．ＡＡＶ２／１ＣＭＶＥｂｏＺＧＰベクターの創成および産生
ＥｂｏＺ糖タンパク質を発現する組換えＡＡＶ２ゲノムを創成するために、ｐＡＡＶ２ＣＭＶＥＧＦＰプラスミド中のＥＧＦＰ挿入物〔Ｅ．Ｍ．Ｓｕｒａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７（１４）：７９５７−７９６３（２００３年７月）〕をＥｂｏＺＧＰ  ｃＤＮＡを用いて置換した。
【０１３５】
組換えＡＡＶ２／１ＣＭＶＥｂｏＺＧＰウイルスは、ＡＡＶ１キャプシドを用いるＡＡＶ２ＣＭＶＥｂｏＺＧＰをトランス包膜化するために２９３細胞内での三重トランスフェクションにより産生された。ベクターはＣｓＣｌ沈降法により精製された。ベクターのゲ
ノムコピー力価は実時間ＰＣＲにより決定され、一方その感染力価は、感染中心アッセイにより分析された。ワクチン接種のためのベクター投与量はゲノム力価に基づいた。
【実施例２】
【０１３６】
本発明の免疫感作方法は抗原に対する免疫応答をブーストする
Ｂ１０ＢＲマウス（６〜８週齢）をＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＡ）から購入しそしてＴｈｅ  Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）の動物施設で飼育した。下記により規定された１００μｌ  ＰＳＢ中で希釈した組換えアデノウイルスベクターまたは組換えアデノ随伴ウイルスベクターで筋肉内注入を用いてマウスを免疫感作した。さらに具体的には、プライミングは、Ｈ５ＧＰベクターの５ｘ１０１０、５ｘ１０９、もしくは５ｘ１０８粒子／マウスの組換えアデノウイルスベクターを用いた。ブースティングは、ＡＡＶ２／１ＧＰベクターの５ｘ１０１０ゲノムコピー／マウスを用いた。図中に示すように注入後４２日目（ブースティング前）、またはブーストの１週間後、またはブーストの２週間後のいずれかで各群中のマウス３匹からの血清を採取しそしてプールした。ＧＰに対する全ＩｇＧ反応をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１３７】
Ａ．抗原特異性免疫応答
Ｂ１９ＢＲマウス中に誘発されたＧＰ特異性Ｔ細胞およびＢ細胞反応は、Ｈ５ＣＭＶＧＰまたはＡＡＶ−１ＣＭＶＧＰベクター単独のいずれかを用いるＩＭ注入による接種の後に分析された。
【０１３８】
Ｈ−２ｋハプロタイプのマウスに対するＥｂｏＺ  ＧＰの免疫優性ＭＨＣクラスＩエピトープを担持するＴＥＬＲＴＦＳＩペプチド〔配列番号１〕がＭｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｉｒａ）により合成された。ペプチドをＤＭＳＯ中で５ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈しそして−８０℃で保存した。ペプチドは２μｇ／ｍｌで使用されそしてＤＭＳＯ濃度はすべての最終アッセイ混合物中で０．１％（ｖ／ｖ）以下に保持された。
【０１３９】
免疫感作されたマウスからの脾細胞を、１μｌ／ｍｌブレフェルジン（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）Ａ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ，ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下で３７℃および１０％ＣＯ２で５時間、Ｈ−２Ｋ制限ＥｂｏＺ  ＧＰ特異性ペプチド（配列番号１）を用いて刺激した。対照細胞をペプチドを含まないでインキュベーションした。洗浄した後、ＦＩＴＣ標識  抗マウスＣＤ８抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて細胞を染色した。次いで、細胞を洗浄しそしてサイトフィックス／サイトパーム（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｒｙｔｏｐｅｒｍ、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）中で２０分間、氷上で透過性を上げた。次いで、細胞を再度洗浄しそしてＰＥ標識抗マウスＩＦＮ−γ抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて染色した。十分に洗浄した後、細胞を二色フローサイトメトリーにより検査しそしてデータをＷｉｎＭＤＩＴＭソフトウエアにより解析した。ＧＰへのペプチドを用いないでインキュベーションした脾細胞は、０．５％以下のＣＤ８＋Ｔ細胞産生ＩＦＮ−ガンマを示した。
【０１４０】
マウスあたりに５ｘ１０１０ゲノムコピーの投与量でのＡＡＶ−１ＣＭＶＧＰベクターは、刺激因子としてＨ−２Ｋ制限ＧＰ特異性ペプチドを用いて染色した細胞内サイトカインにより非常に低い頻度のＣＤ８＋Ｔ細胞産生ＩＦＮ−γ、およびマウスあたりに５ｘ１０８粒子の投与量のＨ５ＣＭＶＧＰよりも低いＥＬＩＳＡで測定したＧＰに対する全ＩｇＧ反応を誘導した。
【０１４１】
Ｂ．抗原に対する増強された免疫応答
Ｂ１０ＢＲマウス中で誘発された免疫応答は、Ｈ５ＣＭＶＧＰ（５ｘ１０８粒子／マウス）を用いるプライミングおよびＡＡＶ−１ＣＭＶＧＰ（５ｘ１０９ゲノムコピー／マウス）を用いるブースティングの後に検査した。
【０１４２】
免疫感作後の種々の時点で眼窩後穿刺によるかまたは終結時に心臓穿刺によるかのいずれかでマウスから採血した。血清を調製しそしてＰＢＳ中で希釈したＥｂｏＺ  ＶＬＰを用いて被覆した９６ウエルプレート上でＥｂｏＺ  ＧＰに対する全ＩｇＧ反応を試験した。プレートを一晩４℃で被覆しそして３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＡを用いて室温で２時間ブロックした。洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で希釈した血清をウエル上に２時間、室温で加えた。洗浄の後、ホースラディシュペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の１：１０．０００希釈液をウエルに１時間、室温で加えた。洗浄の後、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を１０〜２０分間で加えそして引き続き停止試薬（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を加えて反応を停止した。光学密度を４５０ｎｍで読み取った。陽性試料に対するカット・オフ値は、１：１００希釈における本来の血清に対する４５０ｎｍでの平均デルタＯＤに標準偏差の３倍を加えて算出した。次いで、試験した各試料の終点抗体力価は、カット・オフ値上で、線型回帰分析に従って内挿された４５０ｎｍでのデルタＯＤを用いて血清の最高希釈の逆数として定義された。
【０１４３】
ＧＰに対する全ＩｇＧ反応の著しい増加が、ブーストの１０日後ですでに観察された。さらに重要なことは、このプライム／ブースト戦略により達成されたＧＰに対する全ＩｇＧ反応は、マウスあたりに５ｘ１０１０粒子の投与量であってもＨ５ＣＭＶＧＰ単独で生成したもよのり少なくとも２〜４倍高かった。図１参照
【実施例３】
【０１４４】
ＡＡＶ８のキャプシド改変バージョンおよびアデノウイルス発現エボラエンベロープ糖タンパク質を用いるエボラに対する免疫感作
Ａ．挿入カセットを有するＡＡＶ８の生成
ＡＡＶ８のアミノ酸残基位置５８７に挿入を有する改変ｖｐ１タンパク質は、公知のＤＣ結合モチーフの組込みにより樹状細胞（ＤＣ）形質導入を増加するように設計されたペプチドの第一のクラスを用いて生成される。それらのペプチドは記載されている〔Ｔ．Ｊ．Ｃｕｒｉｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２（１２）：７４２３−３１（２００４）〕。
【０１４５】
ワクチン担体としてＡＡＶをさらに魅力的とするために、我々は、生来の免疫を活性化するキャプシドの能力を増強することを試みる。細胞免疫応答を増強すると記載されており、その一部は公知のＴＬＲ依存様式である選択された細胞のパネルをＡＡＶキャプシドに融合する。この原理で、キャプシドは、ＡＰＣの補充および活性化のための適切な炎症状況を生成する。操作されたキャプシドは危険信号として作用するので、導入遺伝子発現は適合免疫系をプライムするように作用する。
【０１４６】
クラス    タンパク質／      ＃ＡＡ        標的細胞
ペプチド                                
Ｉ          ＤＣ３          １２            ＤＣ
Ｉ          ＤＣ１２        １２            ＤＣ
Ｉ          ＤＣ１８        １２            ＤＣ
【０１４７】
位置５８７への挿入は、重複延長（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）によるスプライシングを使用する挿入型変異誘起により達成される〔Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１０）：６１−６８〕。５８７挿入部位に隣接する２個のフラグメントを立ち上げる２組のプライマーを設計する。挿入物自体は内部プラ
イマーの５’尾部上にコードされ、スプライシング段階のアニーリングために十分な重複があることを確実にする。外部の２プライマーはパッケージングプラスミドｐ５Ｅ１８（ＡＡＶ２）、ｐＡＡＶ２／１およびｐＡＡＶ２／８内の保存されたＢｓｉＷＩおよびＥｃｏＲＶ部位をコードする。第二のＰＣＲ反応において、それらの２個のフラグメントは、２個の外部プライマーおよび２個のフラグメントの存在下で一緒にスプライスされる。次いで、スプライスされたフラグメントは、ＢｓｉＷＩおよびＥｃｏＲＶを用いて消化されそして引き続いて同様に消化された親パッケージングベクターに結合されてトランス  プラスミドｐＡＡＶ２／８（改変）を生成する。
【０１４８】
次いで、改変されたキャプシドを有するＡＡＶ２／８ベクターが、公知の方法を用いて生成される。実施例１参照。
【０１４９】
Ｂ．ｖｐ２融合タンパク質を用いるＡＡＶ８の生成
クラスＩ分子ＤＣ３、ＤＣ１２およびＤＣ１８を用いる融合タンパク質が、本明細書中に記載の方法を用いて生成される。
【０１５０】
さらに、ｖｐ２融合タンパク質は、公知の受容体−リガンド相互作用を介して生来の免疫系の利用を、目的とする分子の第二のクラスを用いて生成される。このプロセスは、生産的な適応免疫応答に必須の前炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）環境を生むと期待される。強い前炎症性反応は遺伝子治療には望ましくないが、それはワクチンの目的には有利と考えられる。
【０１５１】
タンパク質／  通称                生物体            ＃ＡＡ  リガンド  標的細胞
ペプチド
ＦｌａＡ    フラジェリン          単球症リステリア  ２８７  ＴＬＲ５  モノＤＣ
(L.monocytogenes)
Ｈｓｐ６０  熱ショックタンパク質  ヒト              ５７３  ＴＬＲ４  モノＤＣ
Ｃ３ｄ      補体成分３            ヒト／マウス      ２９４  ＣＤ２１  Ｂ細胞
フラグメントｄ                                  （ＣＲ２）ｆＤＣｓ
＃ＡＡ：アミノ酸の数
ＲＧＤモチーフ：３ペプチドモチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−分化
（ｆ）ＤＣ：（小胞状）樹状細胞
モノ：単球Ａｓｐはインテグリン分子のサブセット結合を介する細胞付着を支持する
ＴＬＲ：トール様受容体
ＣＤ：分化のクラスター
【０１５２】
ＦｌａＡタンパク質は記載されている〔Ｈａｙａｓｈｉ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１．４１０（６８３２）：１０９９−１０３ページ〕。Ｈｓｐ６０タンパク質は記載されている〔Ｏｈａｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００．１６４（２）：５５８−６１ページ〕；Ｃ３ｄタンパク質は記載されている〔Ｄ’Ｓｏｕｚａ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．１９９１．１６（７）：２４６−５０ページ；Ｍ．Ｃ．Ｃａｒｒｏｌｌ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８．１６：５４５−６８ページ〕。
【０１５３】
ＶＰ２  Ｎ−末端融合のために、上記に引用したウオリントンらにより記載されたパッケージングプラスミドの同様の組がＡＡＶ８に対して作製される。ＶＰ１，３のみを発現するベクターおよび変異した強開始（ｓｔｒｏｎｇ  ｓｔａｒｔ）ＡＴＧからのプラスミド発現性ＶＰ２が著者らによる記載のようにして構築される。要約すると、ＶＰ１，３発現プラスミドに対して、ＶＰ２開始コドンは部位指定変異誘発によりアラニンをコードするＧＣＧ内で変異される。ＶＰ２強開始プラスミド（ＶＰ２Ａ）は、引き続いてＶＰ１お
よびＶＰ３  ＡＴＧのＣＴＧへの変異、次いでＶＰ２開始としてＡＴＧの導入により得られる。
【０１５４】
位置１３８内への挿入のための順応性があるシステムを得るために、ＶＰ２Ａパッケージングプラスミド内にリンカーが導入された。ＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅＴＭ変異誘起キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、我々はＡＡ位置１３８でＶＰ２の開始コドンの直後に独特のＮｈｅＩおよびＣｌａＩ部位を挿入する。次いで、ＮｈｅＩ（５’）およびＣｌａＩ（３’）部位をコードする隣接プライマーを使用してｃＤＮＡからＰＣＲによりすべてのペプチドを挿入できる。この方法で、ペプチドは均等な様式で異なるＶＰ２Ａパッケージングプラスミド内に導入できる。
【０１５５】
次いで、それらのトランスプラスミドおよび公知の方法を使用して、改変されたキャプシドを有するＡＡＶ２／８ベクターが生成される。実施例１参照。
【０１５６】
Ｃ．（Ａ）を用いる免疫感作方法
アデノウイルスベクター、例えばＡｄＨ５ＥｂｏＺＧＰを種々の投与量で動物を筋肉内プライムする。６週間後に、ＥｂｏＺＧＰを担持する改変ＡＡＶ８（ｖｐ１挿入カセットを有し、Ａに記載のようにして調製される）を動物あたりに５ｘ１０１０ゲノムコピーの投与量で動物をブーストする。ＧＰ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞反応および全ＩｇＧ力価をブーストの前およびその後に測定できる。
【０１５７】
ＧＰ特異性細胞免疫応答および／または改善された体液性免疫応答が著しく増加する。
【０１５８】
Ｄ．（Ｂ）を用いる免疫感作方法
アデノウイルスベクター、例えばＡｄＨ５ＥｂｏＧＰを種々の投与量で動物を筋肉内でプライムする。６週間後に、同一の抗原（ＥｂｏＺＧＰ）を担持する改変ＡＡＶ８（ｖｐ２融合タンパク質を有し、段階Ａに記載のようにして調製される）を動物あたりに５ｘ１０１０ゲノムコピーの投与量で動物をブーストする。ＧＰ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞反応および全ＩｇＧ力価をブーストの前およびその後の双方で測定できる。
【０１５９】
ブースト後にＥＬＩＳＡによりＧＰ特異性ＩｇＧ力価に著しい増加が期待される。
【０１６０】
ＦｌａＡ含有改変ＡＡＶ８キャプシドに対して、改善されたＤＣ活性化および抗原提示細胞内に導入された改善されたＡｇ発現導入遺伝子ガ期待される。
【０１６１】
ｈｓｐ６０およびＣ３ｄ含有改変ＡＡＶ８キャプシドに対して、生来の免疫性の活性化が期待される。
【０１６２】
本明細書中に引用されたすべての出版物、および配列表は、引用することにより本明細書に編入される。本発明は特定の態様を採用して記載されているが、本発明の精神より離れるとなく変更が可能なことが認められる。かかる変更は、添付の請求範囲の範囲内に入ることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】異種プライムおよびブーストの後のＥｂｏＺ  ＧＰに対する全ＩｇＧ反応を図示する。Ｈ５ＧＰベクターの５ｘ１０１０、５ｘ１０９、または５ｘ１０８粒子／マウスを用いてＢ１０ＢｒマウスをＩＭ免疫感作した。６週間後に、ＡＡＶ２／１ＧＰベクターの５ｘ１０１０ゲノムコピー／マウスを用いて、マウスをＩＭブーストした。図示したように注入の４２日後（ブースト前）、ブーストの１週間後またはブーストの２週間後のそれぞれで、それぞれの群内のマウス３匹から血清を採取しそしてプールした。ＧＰに対する全ＩｇＧ反応をＥＬＩＳＡにより測定した。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007535550.tif 000005
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