(57)【要約】  本発明は、診断ツール、たとえば個体の体液試料におけるバイオマーカーとしてのケモカインＣＣＬ１８、および様々な方法におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の体液試料におけるバイオマーカーとして使用するための、ケモカインＣＣＬ１８。
【請求項２】
アレルギー性疾患およびＴｈ２介在性障害からなる群から選択される障害または疾患のための、個体の体液試料におけるバイオマーカーとして使用するための、請求項１に記載のケモカイン。
【請求項３】
障害または疾患がアトピー性皮膚炎と関係する、請求項１または２に記載のケモカイン。
【請求項４】
個体におけるアレルギー性疾患およびＴｈ２介在性障害からなる群から選択される障害または疾患のスクリーニングおよび／またはインビトロ診断方法であって、
ａ）個体の体液試料を得ること、
ｂ）工程ａ）で得た試料におけるＣＣＬ１８のレベルを測定すること、
ｃ）工程ｂ）で測定したＣＣＬ１８のレベルを、健常対照個体の体液試料に由来する参照レベルと比較すること、そして
ｄ）工程ｂ）で測定したＣＣＬ１８のレベルが参照レベルと有意に異なるか否かを決定して、アレルギー性疾患およびＴｈ２介在性障害からなる群から選択される障害または疾患をスクリーニングおよび／またはインビトロ診断すること
を含んでなる方法。
【請求項５】
ＣＣＬ１８のレベルをＣＣＬ１８特異的抗体を使用して測定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アレルギー性疾患およびＴｈ２介在性障害からなる群から選択される障害または疾患を軽減または治癒する効果を有することが予期される物質での個体の処置の治療効果をモニターする方法であって、当該個体の体液試料におけるＣＣＬ１８のレベルを測定し、そしてそれを当該物質を投与する前のＣＣＬ１８のレベルと比較することを含んでなる、方法。
【請求項７】
個体の体液試料におけるアレルギー性疾患およびＴｈ２介在性障害からなる群から選択される障害または疾患のスクリーニングおよび／またはインビトロ診断のためのキットであって、
ａ）ＣＣＬ１８タンパク質またはその一部を認識する、所望により標識形態の分子、
ｂ）使用のための指示書、
ｃ）所望により検出手段、
ｄ）所望により固相
を含んでなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は診断ツール、たとえばバイオマーカーとして使用するためのケモカインＣＣＬ１８、および様々な方法におけるその使用に関する。
【０００２】
恒常性応答および病理学的応答での白血球移動の制御は、大部分がケモカインによって達成される。ケモカインは、細胞表面７重らせんＧタンパク質共役受容体と相互作用することによってそれらの生物学的効果を示す、同種タンパク質の巨大グループを含む。ＤＣ−ＣＫ１、ＰＡＲＣ、ＡＭＡＣ−１およびＭＩＰ−４とも示されるＣＣＬ１８は、ＣＣＬ３と構造的に関連したヒトケモカインである。これまでのところ、ＣＣＬ１８はマウス相同物を有さず、そのレセプターは知られていなかった。ＣＣＬ１８は、胚中心および扁桃腺において、樹状細胞（ＤＣ）によって構成的に発現され、そして主に無傷なＴ細胞、ＣＤ３８−マントル領域Ｂリンパ球およびＤＣを引きつけることが示された。抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＣＣＬ１８の生産は、ＩＬ−４、ＩＬ−１３のようなＴｈ２サイトカインによって亢進され、そしてＩＦＮ−γによって抑制される。
【０００３】
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、湿疹性皮膚病変によって特徴付けられるＴヘルパー２（Ｔｈ２）介在性、慢性炎症性皮膚疾患であり、これはたとえば表皮細胞間浮腫と関連する激しい掻痒性紅斑性丘疹によって特徴付けられる。病理組織学的には、ＡＤの皮膚病変は、マクロファージ、増加した数のＩｇＥ生産ランゲルハンス細胞（ＬＣ）、炎症性樹状表皮細胞、好酸球およびＣＤ４＋Ｔｈ細胞から成る、単核細胞浸潤を示す（たとえば、Leung DY., J. Allergy Clin.Immunol. 2000, 105:860-76参照）。急性病変において、これらのＴｈ細胞は主にＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３のようなＴｈ２サイトカインを生産する一方、慢性ＡＤにおいて、ＩＦＮ−γ分泌Ｔｈ細胞も存在する。Ｔｈ細胞のＡＤ皮膚への帰巣を介在することが提唱されているケモカインには、ＣＣＲ４リガンドＣＣＬ１７、ならびにＣＣＬ２２およびＣＣＲ１０リガンドＣＣＬ２７が含まれる。しかし、さらなる走化性シグナルが、特殊化したＴ細胞亜集団の特異的動員のためには必要であり得る。
【０００４】
今まで、ＡＤに対する信頼できる実験マーカーは存在しなかったが、ＡＤ患者はしばしば上昇したＩｇＥレベル、食物に対する、そして花粉、かびおよび昆虫のような他の一般的なアレルゲンに対するアレルギー性反応を有する。アレルゲンの種類に関係なく、ＡＤ患者の病態を理解するために、そして疾患に対する処置レジメンを決定するために有用な診断指標が、当該技術分野において大いに必要とされている。患者に対する害が少ないのみならず、診断に必要な情報をすぐに得ることのできるアレルギー性疾患に対するマーカーが大変有用である。
【０００５】
我々は、体液における、たとえば血液におけるＣＣＬ１８のレベルならびにＣＣＬ１８分泌細胞、たとえばＡＰＣ（単球を含む）およびＤＣが、健常対照と比較して、たとえばＡＤ患者において有意に増加することを見出した。この発見、そして他の発見が、ＣＣＬ１８のバイオマーカーとしての有用性を明らかにする。
【０００６】
１つの局面において本発明は、個体の体液試料におけるバイオマーカーとして使用するための、ケモカインＣＣＬ１８を提供する。
【０００７】
本発明において使用されるバイオマーカーは、個体の体液試料におけるＣＣＬ１８の測定（＝検出および／または定量）が障害それ自体の、および／または障害の状態をモニターするための指標であることを意味する。
【０００８】
本発明の体液試料は、血液、たとえば単離された単核細胞に、または血液分画、たとえば血漿または血清、たとえば血清に由来し得る。
【０００９】
他の局面において、本発明は血液試料、たとえば血清におけるバイオマーカーとしてのＣＣＬ１８の使用を提供する。
【００１０】
本明細書において使用するとき、ＣＣＬ１８は全長ＣＣＬ１８タンパク質、ＣＣＬ１８タンパク質フラグメント、変異ＣＣＬ１８タンパク質、ＣＣＬ１８誘導体、ならびにＣＣＬ１８分泌（生産）細胞、たとえば単球および樹状細胞（ＤＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む。ＣＣＬ１８のフラグメント、変異体および誘導体は、ＣＣＬ１８のバイオマーカー特性が保持されているものである。
【００１１】
本発明のバイオマーカーとしてのＣＣＬ１８の使用は、ＣＣＬ１８を個体の当該試料において、たとえば、イムノアッセイ、たとえば酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；蛍光を利用したアッセイ、たとえば時間分解蛍光免疫アッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）または放射性アッセイのようなアッセイの分野において常套のものを含む検出方法で、測定することを意味する。本発明の検出方法には、たとえば特異的にＣＣＬ１８を認識する分子、たとえば直接または間接的に検出可能な分子が含まれる。本発明の検出方法は、好ましくは抗体（抗体の誘導体またはそのフラグメントを含む）、たとえばＣＣＬ１８を認識する抗体、たとえば標識を有するＣＣＬ１８認識抗体を含む。
【００１２】
他の局面において、ＣＣＬ１８のレベルはＣＣＬ１８特異的抗体を使用して測定される。
【００１３】
標識は、常套のもの、たとえばビオチンあるいはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）もしくはペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）のような酵素、または蛍光分子、たとえば蛍光染料たとえば蛍光イソチオシアネートであり得る。好ましくは標識はビオチンである。標識を有する分子、たとえば標識を有する抗体は、常套の方法、たとえば蛍光測定または酵素検出方法により、検出することができる。
【００１４】
好ましい局面において、ＣＣＬ１８認識抗体は、たとえば蛍光標識化のような標識化形態で、検出手段として使用される。
【００１５】
個体の体液の試料、たとえば血液におけるＣＣＬ１８分泌細胞を、たとえば下記のような常套の方法を使用して測定することができる。
細胞を、試料、たとえば血液から精製、たとえば密度勾配により分離することができ、そして得られる精製された細胞を染色する。抗ＣＣＬ１８抗体、たとえば蛍光標識抗ＣＣＬ１８抗体を、染色された細胞調製物へと、所望により、たとえばインターロイキン４で、細胞を刺激した後に加え、そしてＣＣＬ１８分泌細胞のレベルを測定する。
【００１６】
所望により、試料に含まれるＣＣＬ１８または検出手段に含まれるＣＣＬ１８認識、たとえば検出可能な分子を、固相に固定する。適当な固相には、たとえば常套のもの、たとえばポリスチレンまたはポリビニルプレートのようなプラスチックプレート、とりわけマイクロタイタープレートが含まれる。また、マイクロビーズ、たとえば被覆マイクロビーズを固相として使用することができる。固相を、たとえば検出手段に含まれる標識に依存した性質のコーティング物質で被覆することができる。コーティング物質は標識と結合できなければならず、たとえば標識はビオチンであり、そしてコーティング物質には、たとえば固相と共有結合するストレプトアビジンが含まれる。
【００１７】
他の局面において本発明は、アレルギー性疾患およびＴｈ２介在性障害からなる群から選択される障害または疾患に対する、個体の体液試料におけるバイオマーカーとして使用するためのケモカインＣＣＬ１８を提供する。
【００１８】
他の局面において本発明は、アトピー性皮膚炎に関連する障害または疾患に対する、個体の体液試料におけるバイオマーカーとして使用するためのケモカインＣＣＬ１８を提供する。
【００１９】
本発明において使用される障害および疾患には、アレルギー性疾患およびＴｈ２介在性障害からなる群から選択される様々な種類および重症度の障害または疾患が含まれる。アレルギー性疾患およびＴｈ２介在性障害には、たとえば過敏性肺炎、春期カタル、接触過敏症および、様々な炎症性皮膚疾患、たとえばアトピー性皮膚炎を含む、アトピー性皮膚炎に関連する障害または疾患が含まれる。
【００２０】
他の局面において本発明は、個体におけるアレルギー性疾患およびＴｈ２介在性障害からなる群から選択される障害または疾患のスクリーニングおよび／またはインビトロ診断方法であって、
ａ）個体の体液試料を得ること、
ｂ）工程ａ）で得た試料におけるＣＣＬ１８のレベルを測定すること、
ｃ）工程ｂ）で測定したＣＣＬ１８のレベルを、健常対照個体の体液試料に由来する参照レベルと比較すること、そして
ｄ）工程ｂ）で測定したＣＣＬ１８のレベルが参照レベルと有意に異なるか否かを決定して、アレルギー性疾患およびＴｈ２介在性障害からなる群から選択される障害または疾患をスクリーニングおよび／またはインビトロ診断すること
を含んでなる方法を提供する。
【００２１】
ＣＣＬ１８の測定を上記のとおり、たとえばバイオマーカーを特異的に認識する分子、たとえば抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、たとえば抗ＣＣＬ１８抗体、たとえば商業的に入手可能なＣＣＬ１８特異的抗体を使用して、たとえば免疫診断アッセイ法により、行う。
【００２２】
他の局面において本発明は、アレルギー性疾患およびＴｈ２介在性障害からなる群から選択される障害または疾患を軽減または治癒する効果を有することが予期される物質での個体の処置の治療効果をモニターする方法であって、当該個体の体液試料におけるＣＣＬ１８のレベルを測定し、そしてそれを当該物質を投与する前のＣＣＬ１８のレベルと比較することを含んでなる方法を提供する。
【００２３】
他の局面において本発明は、個体の体液試料におけるアレルギー性疾患およびＴｈ２介在性障害からなる群から選択される障害または疾患のスクリーニングおよび／またはインビトロ診断のためのキットであって、
ａ）ＣＣＬ１８タンパク質またはその一部を認識する、所望により標識形態の分子、
ｂ）使用のための指示書、
ｃ）所望により検出手段、
ｄ）所望により固相
を含んでなるキットを提供する。
【００２４】
本発明により提供される当該キットは、さらに、試験される試料の適当な環境を含む実質的な要素およびたとえば試験される試料のＣＣＬ１８を測定する適当な手段を含み得る。
【００２５】
図の説明
図１：ＡＤにおけるＣＣＬ１８発現。ＡＤ、乾癬または健常皮膚由来の病変生検の凍結切片をＣＣＬ１８について染色する。
図２：ＡＤにおけるＣＣＬ１８発現。示した抗体で．２重免疫蛍光染色をＡＤ皮膚生検の凍結切片について行った。元の倍率２００×（図１）および４００×（図２）。
図３：ＣＣＬ１８の血清レベル。ＡＤ患者（ｎ＝８）および対照（ｎ＝１３）由来のＰＢＭＣをＩＬ−４で刺激する。ＰＢＭＣにおけるＣＣＬ１８生産単球およびＣＣＬ１８分泌ＣＤ１１ｃ＋血液ＤＣの割合をボックスプロットとして示す。分析はＡＤと対照のＤＣ間で（それぞれ平均７．１％および１．３％、ｐ＜０．００３）、そしてＡＤと対照のＤＣ間で（それぞれ平均５．６％および１．９％、ｐ＜０．００１）有意な差を示す。
【００２６】
図４：ＣＣＬ１８の血清レベル。ＡＤ患者由来の血清におけるＣＣＬ１８レベル（ｎ＝３６）は、健常対照（ｎ＝２８）対象のものより有意に高い（それぞれ平均３４．９ｎｇ／ｍｌおよび１０．７ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０００３）。
図５：ＣＣＬ１８の血清レベル。異なる重症度疾患スコア（ＩＧＡ）でのＡＤ患者におけるＣＣＬ１８の血清レベルのグラフ分布。
図６：ＣＣＬ１８の血清レベル。ＡＤ患者におけるＣＣＬ１８とＣＣＬ２２血清レベル間の相関関係。黒丸は極めて軽度から重症の患者を含む（ｒ＝０．６、ｐ＜０．００３）。極めて重症のスコアを有する患者は、白丸で表し、相関関係分析から除外する。
図７：ＡＤ由来記憶Ｔ細胞のＣＣＬ１８結合。ＡＤ皮膚におけるＣＣＬ１８結合（赤）およびＣＤ３発現（暗青）の免疫組織化学分析。ＨＥで対比染色（元の倍率１０００×）。
図８：ＡＤ由来記憶Ｔ細胞のＣＣＬ１８結合。静止期ＡＤ由来Ｔ細胞株およびクローンにおける、蛍光（Ｆ）標識ケモカインを使用したＣＣＬ１８またはＣＣＬ２２結合細胞。ＣＤ４＋、ＣＣＬ１８結合Ｔ細胞の割合を、右上象限に示す。
図９：ＡＤ由来記憶Ｔ細胞のＣＣＬ１８結合。ＣＣＲ３についてのＣＣＬ１８結合Ｔ細胞株ＮＩＴのＦＡＣＳ染色。
【００２７】
図１０：ＡＤ由来記憶Ｔ細胞のＣＣＬ１８結合。Ｔ細胞株ＮＩＴにおけるＣＣＬ１８−ＦおよびＣＣＬ２２−Ｆ結合のＦＡＣＳ。全ＦＡＣＳ染色は５〜１０複製を代表し、そして異なるＴ細胞株およびクローンにわたって一致した。
図１１：ＣＣＬ１８にインビトロおよびインビボで応答するＡＤ由来記憶Ｔ細胞遊走。ＡＤ皮膚由来のＴ細胞は、走化性チャンバーアッセイにおいて、増加した濃度のＣＣＬ１８（黒丸）およびＣＣＬ２２（白四角）と有意に反応する（ｐ＜０．０５）。高い濃度を特異的中和ｍＡｂと共にインキュベーションしてブロックする。各点を、４組で評価し、１５実験中２つの平均±ＳＥで示す。
図１２：ＣＣＬ１８にインビトロおよびインビボで応答するＡＤ由来記憶Ｔ細胞遊走。ヒト記憶Ｔ細胞の、ＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚マウスにおけるヒト皮膚移植片に対する遊走。ＣＣＬ１８（ｎ＝８）、ＣＣＬ２２（ｎ＝８）またはＰＢＳ（ｎ＝９）をヒト皮膚移植片へと注射し、そしてＴ細胞の皮膚帰巣をＦＡＣＳ分析により評価する。ＣＣＬ１８はＴ細胞株ＮＩＴおよびＴ細胞クローン98016T.02の有意な遊走を誘導した（ｐ＜０．０５）。４つの独立した実験のうち２つを示す。
【００２８】
下記実施例において、温度は摂氏度（℃）であり、そして補正はしていない。
下記略語を使用する：
【表１】
2007529759.tif 000002
【実施例】
【００２９】
方法：
患者
血液試料をＡＤを有する３６名の患者から、そして２８名のアトピーのない健常対象から得る。臨床的重症度をＥＡＳＩおよびＩＧＡにより記録する（たとえばHanifin, J.M., et al, Exp.Dermatol. 2001, 10:11-18参照）。ＩＧＡスコアによる患者群の構成：ほぼ無傷：ｎ＝３、軽度の疾患：ｎ＝０、中程度の疾患：ｎ＝１５、重度の疾患：ｎ＝１０、極めて重度の疾患：ｎ＝４。患者は免疫抑制剤でのあらゆる全身または局所処置を、血液試料および皮膚生検の採取前少なくとも４週間は、受けなかった。
【００３０】
細胞の精製および培養
ヒト血液由来のＰＢＭＣを、Ficoll-Paque（商標）Plus（Amersham Biosciences）での密度勾配分離によって製造する。皮膚リンパ球抗原（ＣＬＡ）、ＣＣＲ４を発現し、そして活性化後にＴｈ２／Ｔｈ０サイトカイン分泌パターンを示す、ＡＤ由来Ｔ細胞株（ＮＩＴ、ＳＶＴ、ＤＫ２−ＪＯＴ）およびクローン（98016T.02、98016T.24）を病変パンチ生検から、たとえば
-Carballido, J.M., et al, J.Immunol. 1997, 159:4316-4321、
-Biedermann, T., et al,. Eur.J.Immunol. 2002, 32:3171-3180
に記載のとおりに製造する。
Ｔ細胞を組み換えヒトＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を補ったＸ−Ｖｉｖｏ１５培地（BioWitthaker）中で培養する。
【００３１】
フローサイトメトリー
細胞を３０分間、ＦＡＣＳ緩衝液を使用した氷上で染色する。下記ｍＡｂおよび対応するアイソタイプを使用する：ＣＤ３−Ｐｅ、ＣＤ３−Ｐｅｒｃｐ、ＣＤ４−Ｐｅ、ＣＤ４−Ｐｅｒｃｐ、ＣＤ８−Ｐｅｒｃｐ、ＣＤ１４−ＦＩＴＣ、ＣＤ１９−ＦＩＴＣ、ＣＤ２０−ＦＩＴＣ、ＣＤ６２−Ｐｅ、ＣＤ５６−ＦＩＴＣ、ＨＬＡＤＲ−Ｃｙｃｈｒｏｍｅ、ＣＣＲ４−Ｐｅ（BD Pharmingen）、ＣＤ３−ＡＰＣ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＤ１１ａ−Ｐｅ、ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ、ＣＤ１９−ＡＰＣ、（Caltag）、ＣＣＲ３−Ｐｅ、ＣＣＲ５−Ｐｅ、ＣＣＲ７−Ｐｅ、ＣＸＣＲ３−Ｐｅ、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６−Ｐｅ（Ｒ＆Ｄ Systems）。ＣＣＬ２２−Ａｌｅｘａ６４７をDictageneから得る。ＣＣＬ１８（Peprotech）をＦＩＴＣまたはビオチン（Molecular Probes）で、製造業者の指示に従って、標識化する。分析をFACSCalibur（商標）（BD）で、BD CELL（商標）Quest Softwareを使用して行う。
【００３２】
ＩＬ−４刺激後の単球および樹状細胞中の、細胞内ＣＣＬ１８の検出
ＡＤ患者（ｎ＝８）および対照（ｎ＝１３）由来のＰＢＭＣを、１０ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−４あり、またはなしで、４８時間刺激し（５×１０５細胞／ｍｌ）、そしてBrefeldin-A（１０μｇ／ｍｌ、Sigma）で少なくとも３時間処理する。単球はＣＤ１４染色により認識され、そして脊髄ＤＣをＨＬＡ−ＤＲ＋のＣＤ１１ｃ＋分画、ｌｉｎ（ＣＤ３，１４，１９，２０，５６）− ＰＢＭＣとして同定する。ＣＣＬ１８の細胞内染色のために、表面染色細胞を４％パラホムルアルデヒド（Sigma）で固定し、０．５％サポニン（saponin）（Sigma）で透過させ、そしてヤギ抗ヒトＣＣＬ１８ｍＡｂで、その後ロバ抗ヤギ−Ｐｅ（DPC Biermann）染色する。ヤギ血清（Sigma）をアイソタイプ対照として使用する。
【００３３】
ＥＬＩＳＡ
血清ＣＣＬ１８およびＣＣＬ２２レベルをＤｕｏｓｅｔ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定する。
【００３４】
走化性アッセイ
ケモカインまたは対照培地（０．５％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０）を３０μｌ、９６ウェル走化性チャンバー（Neuro Probe）の下側のウェルへと加える。Calcein-AM（１μＭ、Molecular Probes）標識化細胞を上側のチャンバーに３×１０６細胞／ｍｌで播種し、そして下側のチャンバーのウェルを選択して１００％遊走値を得る。２個のチャンバー区画を孔径３μｍのポリカーボネートフィルター（Neuro Probe）で分離させる。３７℃にて２．５時間インキュベート後、フィルターを取り外し、プレートを遠心分離して、上清を廃棄する。２０μｌの０．４％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Sigma）を各ウェルに加える。遊走の程度を、Victor II（Wallac）マルチウェルプレートリーダーを使用して蛍光を測定し、定量化する。
【００３５】
ＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚マウスにおけるインビボ遊走アッセイ
ＳＣＩＤ（C.B-17/GbmsTac-Prkdcscid Lystbg）マウス（Taconic Ｍ＆Ｂ）を、Carballido, J.M., et al, J.Immunol.Methods 2003, 273:125-135に記載のとおりに、ＷＨＲＴＢ、Petz Aladar County Hospital Gyoer, Hungary由来のヒト皮膚片で、施設および国の倫理ガイドラインにしたがって、移植する。ヒトＴ細胞のケモカイン誘導性皮膚帰巣を、Biedermann, T., et al,. Eur.J.Immunol. 2002, 2:3171-3180に記載の方法の変法を使用して行う。ＡＤ皮膚誘導性Ｔ細胞をＣＦＳＥ（Molecular Probes、ＰＢＳ中１μＭ、５分間ＲＴにて）で標識化し、そして５×１０７細胞／マウスをヒト皮膚を移植されたＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚マウス）へと静脈注射する。その直後に、ＣＣＬ１８またはＣＣＬ２２（３０μｌのＰＢＳ中３００ｎｇ、Ｒ＆Ｄ）またはＰＢＳのみを、ヒト皮膚移植片へと経皮的に注射する。２４時間後、皮膚移植片を外植し、一種類の細胞懸濁液へと処理し、染色し、そしてＦＡＣＳ中で、ＣＤ３＋、ＣＦＳＥ＋細胞の割合を定量することによって、分析する。
【００３６】
免疫組織学
健常対照（ｎ＝３）の通常皮膚の、およびＡＤ（ｎ＝１０）または乾癬（ｎ＝３）を有する患者由来の病変皮膚の、アセトン固定化５μｍ凍結切片をヤギ抗ＣＣＬ１８ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ）、またはヤギ血清およびビオチニル化ウマ抗ヤギＩｇＧ（Vector）で、その後アビジン接合アルカリホスファターゼ（ＡＰ）およびナフトールＡＳホスファターゼ／Fast Red TR 物質（Sigma）で染色する。ＡＤ試料中のＣＣＬ１８結合細胞を、ＣＣＬ１８ビオチン、その後アビジンＡＰおよびFast Redを使用して検出する。試料を抗ＣＤ３ｍＡｂ（BD）、次いで抗マウスビオチン（Vector）、アビジンＡＰおよびFast Blue（Sigma）で共に染色し、ヘマトキシリンエオシン（ＨＥ、Merck）で対比染色する。免疫蛍光分析のために、凍結切片をヤギ抗ＣＣＬ１８およびマウス抗ＨＬＡ−ＤＲまたは抗ＣＤ３（BD）、抗ＣＤ１ａ（Caltag）、抗ＣＤ２０７（Baxter）で、次いでウサギ抗ヤギＴｘＲｄおよびウマ抗マウスＦＩＴＣ（Vector）で、それぞれ染色する。スライドをＤＡＰＩ含有マウント培地（Vector）と共にカバーガラスで覆う。
【００３７】
統計分析
データを平均±ＳＥまたはボックスプロット（平均、中央値、２５％〜７５％の百分率およびＳＤを示す）として示す。統計上の有意性を、対応なしスチューデントｔ検定を使用して決定する。臨床データを単純な相関関係について、ピアソンの相関係数を測定することにより、および未補正可能性値について、試験する。Ｐ＜０．０５を有意とする。
【００３８】
実施例１：
ＡＤは、アレルゲンに対する皮膚過敏性および高いＩＬ−４生産に関連した炎症性皮膚疾患である。したがって、ＡＤはＣＣＬ１８上方制御に好適な環境を提供することができる。このことを証明するため、ＡＤ患者（ｎ＝１０）の皮膚試料を、正常（ｎ＝３）および乾癬（ｎ＝３）皮膚と比較して、ＣＣＬ１８発現の免疫組織化学評価を行う。ＣＣＬ１８発現は全てのＡＤ皮膚で検出されるが、健常または乾癬個体由来の皮膚では検出されない（たとえば図１参照）。ＡＤ皮膚において、ＣＣＬ１８は上皮膚血管叢において、単核細胞浸潤と密接に関連して、強く発現される。免疫蛍光染色は、ＣＣＬ１８発現がＨＬＡ−ＤＲ＋ＡＰＣに限定されることを示す（たとえば図２参照）。とりわけ、表皮における全ＣＣＬ１８発現細胞はＣＤ１ａ＋である。ＣＤ２０７での続く染色は、ＣＣＬ１８発現細胞のほとんどがＬＣであるが、残りの集団が炎症性樹状上皮細胞からなることを示す。ＬＣによるＣＣＬ１８の生産は、正常または乾癬皮膚がこのケモカインを生産しないため、ＡＤと関連したＴｈ２サイトカイン環境の結果であると思われる。ケラチン生成細胞、繊維芽細胞およびＣＤ３陽性Ｔ細胞はＣＣＬ１８を発現しない（たとえば図２参照）。
【００３９】
実施例２：
さらなる研究により、ＣＣＬ１８およびＣＣＬ１８分泌ＡＰＣがＡＤ患者の血液中で増加することが示される。ＡＤ患者および健常対照のＡＰＣによるＣＣＬ１８発現を、細胞内免疫蛍光染色とその後のＩＬ−４刺激により評価する。我々は、ＡＤ患者の血液中のＣＣＬ１８分泌単球（ＣＤ１４＋）の割合が健常個体において観察されるものよりも有意に高い（＞５倍、ｐ＜０．００３）ことを発見した（たとえば図３参照）。同様に、ＣＣＬ１８生産ＤＣにおけるＣＤ１１ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋の割合も、ＡＤ患者の血液において増加する（３倍、ｐ＜０．００１）（たとえば図３参照）。両方の群において、ＣＣＬ１８発現細胞はＩＬ−４刺激後にのみ検出される。ＣＣＬ１８生産は、刺激なしまたはＩＬ−４刺激したＰＢＭＣのＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ１９＋Ｂ細胞分画において検出することができない。ＡＤ患者の循環中に存在する多数のＣＣＬ１８分泌細胞がＣＣＬ１８の上昇した血清レベルと相関する（たとえば図４参照）。ＣＣＬ１８の血清値は、ＡＤ患者において（平均３４．９ｎｇ／ｍｌ±５．３ＳＥ）、健常、非アレルギー、年齢および性別の合致した対照よりも（平均１０．７ｎｇ／ｍｌ±０．９ＳＥ）３倍高い（ｐ＜０．０００３）。中程度および重度のＡＤ段階におけるＣＣＬ１８の発現レベル（臨床スコアＩＧＡおよびＥＡＳＩによって評価する）は、軽度の疾患徴候におけるよりも高い（たとえば図５参照）。しかし、ＣＣＬ１８の血清レベルは極めて重度の疾患スコアを有する患者において減少する（たとえば図５参照）。多くのＩＦＮ−γ生産Ｔｈ細胞がこれらの皮膚病変において検出されるため、ＡＤの極めて重度／慢性徴候は、ＩＬ−４生産のみを含まない（たとえばGrewe,M., et al, Immunol.Today 19:359-361, 1998参照）。重度／慢性状況において、環境がＩＬ−４について豊富でないとき、少量のＣＣＬ１８が生産されることが予期される。これは最高の臨床性疾患スコアを有する患者の血清において観察されるＣＣＬ１８発現の減少のためであり得る。我々の患者集団において、我々はまた、ＥＡＳＩおよび血清ＣＣＬ２２レベルの間の相関関係を見出した（ｒ＝０．４、ｐ＜０．０５、図示せず）。さらに、我々は軽度〜重度の疾患を有する患者においてＣＣＬ１８とＣＣＬ２２発現の間に強い相関関係を見出した（ｒ＝０．６、ｐ＜０．００３、図６黒丸）。しかし、最高のＣＣＬ２２血清レベルを有し、最高の疾患スコアも有する患者は中程度のＣＣＬ１８発現しか示さなかった（たとえば図６参照、白丸）。したがって、ＡＤ発症中のＣＣＬ１８発現の選択的増加および最高の臨床疾患スコアを有する患者におけるその後の減少は、ＣＣＬ１８制御の特徴的なパターンを示唆している。
【００４０】
実施例３：
我々はまた、ＣＣＬ１８がＡＤにおける記憶Ｔｈ細胞と結合することを見出した。ＣＣＬ１８によって標的化される細胞集団の検出は、ＣＣＬ１８レセプターが未知であるという事実により妨げられる。この問題を解決するために、我々はＦＩＴＣおよびビオチン標識化ＣＣＬ１８を、それらの生物学的特性を変化させることなく生産した。ＣＣＬ１８はＡＤ患者の生検におけるＣＤ３＋皮膚浸潤Ｔ細胞の分画と結合する（たとえば図７参照）。加えて、ＣＣＬ１８はリンパ管と結合し、これはこのケモカインがこれらの管を通るリンパ球移動に関連し得ることを示唆する（たとえば図７参照）。ＣＣＬ１８はまた、記憶Ｔ細胞株およびＡＤ皮膚由来のクローンの５％までと結合する（たとえば図８参照）。Ｔ細胞株において、ＣＣＬ１８発現はＣＤ４＋分画において優勢に観察される（たとえば図８参照）。ＣＣＬ１８がＰＢＭＣにおけるヒトＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７ｈｉｇｈ、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＤ２５−、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的な集団と結合し、これはＣＣＬ１８の無傷なＴ細胞に対する報告された効果と一致するため、当該結合は特異的である（たとえばAdema, G.J., et al,  Nature 387:713-717 （1997）参照）。また、ＣＣＬ１８結合は標識なしのＣＣＬ１８と競合し得るが、ＣＣＬ１１を含む他のケモカインとはなく、このレセプター（ＣＣＲ３）はＣＣＬ１８のアンタゴニスト作用を媒介することが記載されている（たとえばNibbs, R.J., et al, J.Immunol. 2000, 164:1488-1497参照）。さらに、特異的ｍＡｂを使用して、ＣＣＬ１８結合Ｔ細胞集団におけるＣＣＲ３発現を排除する（たとえば図９参照）。異なるＴ細胞株およびクローンにおけるＣＣＬ２２結合細胞の割合は、ＣＣＬ１８結合細胞の割合よりも高い（たとえば図３Ｂ参照）。一方、全ＣＣＬ１８結合細胞もＣＣＬ２２と結合し（たとえば図１０参照）、それらがＣＣＲ４＋Ｔｈ細胞の亜集団を示し得ることを示唆する。
【００４１】
実施例４：
記憶Ｔｈ細胞とのＣＣＬ１８結合の機能的関連性を、機能的インビトロおよびインビボ遊走アッセイにおいて評価する。インビトロで、試験した全てのＡＤ由来Ｔ細胞株およびクローンは、顕著に、そしてＣＣＬ１８に応答した用量依存方法において移動する。ＣＣＬ１８誘導性遊走の程度はＣＣＬ２２により誘導されたものと比較可能である（図１１参照）。ＣＣＬ１８およびＣＣＬ２２誘導性遊走の両方を、特異的中和ｍＡｂを使用してブロックすることができ、これは応答の特異性を示す（たとえば図１１参照）。インビボでのＣＣＬ１８の役割を、既出のＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚マウスモデル（Biederman T. et al, Eur.J.Immunol. 2002, 32, 3171-3180）の変法を使用して調査する。ＡＤ由来の記憶Ｔ細胞株およびクローンはＳＣＩＤマウスに移植されたヒト皮膚移植片へと、ＣＣＬ１８に応答して顕著に移動する（たとえば図１２参照）。ＣＣＬ１８誘導性皮膚帰巣はＣＣＬ２２により媒介される遊走の程度と同等である（たとえば図１２参照）。
【００４２】
結論として、全てのこれらの結果は、ＣＣＬ１８タンパク質発現がＡＤと関連するという証拠、そして記憶Ｔｈ細胞集団をヒト皮膚へとインビボで動員するというＣＣＬ１８の新規な能力についての説明を提供する。患者の試料、たとえば血液試料において決定することができるＣＣＬレベルの調節、たとえば上昇は、したがって、ＡＤの指標として使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＡＤにおけるＣＣＬ１８発現。ＡＤ、乾癬または健常皮膚由来の病変生検の凍結切片をＣＣＬ１８発現について染色する。
【図２】ＡＤにおけるＣＣＬ１８発現。示した抗体で、２重免疫蛍光染色をＡＤ皮膚生検の凍結切片について行った。元の倍率２００×（図１）および４００×（図２）。
【図３】ＣＣＬ１８の血清レベル。ＡＤ患者（ｎ＝８）および対照（ｎ＝１３）由来のＰＢＭＣをＩＬ−４で刺激する。ＰＢＭＣにおけるＣＣＬ１８生産単球およびＣＣＬ１８分泌ＣＤ１１ｃ＋血液ＤＣの割合をボックスプロットとして示す。分析はＡＤと対照のＤＣ間で（それぞれ平均７．１％および１．３％、ｐ＜０．００３）、そしてＡＤと対照のＤＣ間で（それぞれ平均５．６％および１．９％、ｐ＜０．００１）有意な差を示す。
【図４】ＣＣＬ１８の血清レベル。ＡＤ患者由来の血清におけるＣＣＬ１８レベル（ｎ＝３６）は、健常対照（ｎ＝２８）対象のものより有意に高い（それぞれ平均３４．９ｎｇ／ｍｌおよび１０．７ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０００３）。
【図５】ＣＣＬ１８の血清レベル。ことなる重症度疾患スコアでのＡＤ患者におけるＣＣＬ１８の血清レベルのグラフ分布（ＩＧＡ）。
【図６】ＣＣＬ１８の血清レベル。ＡＤ患者におけるＣＣＬ１８とＣＣＬ２２血清レベル間の相関関係。黒丸は極めて軽度から重症の患者を含む（ｒ＝０．６、ｐ＜０．００３）。極めて重症のスコアを有する患者は、白丸で表し、相関関係分析から除外する。
【図７】ＡＤ由来記憶Ｔ細胞のＣＣＬ１８結合。ＡＤ皮膚におけるＣＣＬ１８結合（赤）およびＣＤ３発現（暗青）の免疫組織化学分析。ＨＥで対比染色（元の倍率１０００×）。
【図８】ＡＤ由来記憶Ｔ細胞のＣＣＬ１８結合。静止期ＡＤ由来Ｔ細胞株およびクローンにおける、蛍光（Ｆ）標識ケモカインを使用したＣＣＬ１８またはＣＣＬ２２結合細胞。ＣＤ４＋、ＣＣＬ１８結合Ｔ細胞の割合を、右上象限に示す。
【図９】ＡＤ由来記憶Ｔ細胞のＣＣＬ１８結合。ＣＣＲ３についてのＣＣＬ１８結合Ｔ細胞株ＮＩＴのＦＡＣＳ染色。
【図１０】ＡＤ由来記憶Ｔ細胞のＣＣＬ１８結合。Ｔ細胞株ＮＩＴにおけるＣＣＬ１８−ＦおよびＣＣＬ２２−Ｆ結合のＦＡＣＳ。全ＦＡＣＳ染色は５〜１０複製を代表し、そして異なるＴ細胞株およびクローンにわたって一致した。
【図１１】ＣＣＬ１８にインビトロおよびインビボで応答するＡＤ由来記憶Ｔ細胞遊走。ＡＤ皮膚由来のＴ細胞は、走化性チャンバーアッセイにおいて、増加した濃度のＣＣＬ１８（黒丸）およびＣＣＬ２２（白四角）と有意に反応する（ｐ＜０．０５）。高い濃度を特異的中和ｍＡｂと共にインキュベーションしてブロックする。各点を、４組で評価し、１５実験中２つの平均±ＳＥを示す。
【図１２】ＣＣＬ１８にインビトロおよびインビボで応答するＡＤ由来記憶Ｔ細胞遊走。ヒト記憶Ｔ細胞の、ＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚マウスにおけるヒト皮膚移植片に対する遊走。ＣＣＬ１８（ｎ＝８）、ＣＣＬ２２（ｎ＝８）またはＰＢＳ（ｎ＝９）をヒト皮膚移植片へと注射し、そしてＴ細胞の皮膚帰巣をＦＡＣＳ分析により評価する。ＣＣＬ１８はＴ細胞株ＮＩＴおよびＴ細胞クローン98016T.02の有意な遊走を誘導した（ｐ＜０．０５）。４つの独立した実験のうち２つを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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