(57)【要約】本発明は、合成遺伝子の作製、このような遺伝子のライブラリーの作製、ならびにそれらの遺伝子および対応するコードされたポリマーペプチドの操作および特徴づけのための、ストラテジー、方法、ベクター、試薬およびシステムを提供する。１つの局面において、本発明のこれら合成遺伝子は、ポリケチドシンターゼポリペプチドをコードし得、そして治療上重要であるかまたは商業上重要である、ポリケチド化合物の産生を容易にし得る。
2007533308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のＤＮＡセグメントをライゲーションしてライゲーション生成物を得るための方法であって、該ライゲーション生成物は、該ＤＮＡセグメントの各々由来の配列を所定の順序で含み、該方法は：
ａ）少なくとも３つのＤＮＡ分子を提供する工程であって、該少なくとも３つのＤＮＡ分子の各々は該ＤＮＡセグメントを含み、各セグメントは、該ライゲーション生成物中の１つまたは２つの他のセグメントに隣接し、各セグメントは、第１の隣接するＤＮＡセグメントとの配列同一性を有する第１の領域、および存在する場合、第２の隣接するＤＮＡセグメントとの配列同一性を有する第２の領域を含む、工程；
ｂ）１つまたは２つのライゲーション可能な末端を有するＤＮＡセグメントを生成するために、各ＤＮＡ分子を切断する工程であって、各ライゲーション可能な末端は、隣接するＤＮＡセグメントとの配列同一性を有する少なくとも一部の領域を含み；少なくとも１つのセグメントは、切断後に２つのライゲーション可能な末端を含む、工程；
ｃ）該隣接するセグメントに各セグメントを同時にライゲーションする、工程；および
ｄ）該ＤＮＡセグメントの各々由来の配列を所定の順序で含むライゲーション生成物を選択する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
複数のＤＮＡセグメントをライゲーションしてライゲーション生成物を得るための方法であって、該ライゲーション生成物は、該ＤＮＡセグメントの各々からの配列を所定の順序で含み、該方法は：
ａ）最終ライゲーション生成物中の１つまたは２つの他のセグメントに隣接するＤＮＡセグメントを各々が含む、１型ＤＮＡ分子、２型ＤＮＡ分子および少なくとも１つの３型ＤＮＡ分子を提供する工程であって、ここで：
ｉ）該１型ＤＮＡ分子は、第１のＤＮＡセグメント、第１の選択可能なマーカー、第１の対抗選択可能なマーカー、第１の切断部位、および第２の切断部位を含み、該第２の切断部位の切断は、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出を該第１のＤＮＡセグメント中に生成し；
ｉｉ）該２型ＤＮＡ分子は、第２のＤＮＡセグメント、第２の選択可能なマーカー、第２の対抗選択可能なマーカー、第３の切断部位、および第４の切断部位を含み、該第４の切断部位の切断は、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出を該第２のＤＮＡセグメント中に生成し；
ｉｉｉ）各該３型ＤＮＡ分子は、ＤＮＡセグメント、第３の対抗選択マーカー、５’切断部位および３’切断部位を含み、該５’切断部位は、切断の際に、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出を該セグメント中に生成し、そして該３’切断部位は、切断の際に、異なる隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出を該セグメント中に生成し；
該第１の選択可能なマーカーおよび該第２の選択可能なマーカーは、異なり；
該第１の対抗選択可能なマーカー、該第２の対抗選択可能なマーカーおよび該第３の対抗選択可能なマーカーは、独立して選択され、そして同じであるか、または異なり；
該第１の切断部位および該第３の切断部位は、同じであるか、または適合性であり；
該第２の切断部位および該第４の切断部位は、独立して選択され、そして同じであるか、または異なり；そして
各該５’切断部位および各該３’切断部位は、各該３型ＤＮＡ分子において独立して選択され、そして同じであるか、または異なる、
工程；
ｂ）各ＤＮＡ分子を、該第１の切断部位、該第２の切断部位、該第３の切断部位、および該第４の切断部位、該５’切断部位（単数または複数）および該３’切断部位（単数または複数）にて切断する、工程；ならびに
ｃ）得られたフラグメントを互いにライゲーションし、それによって該ＤＮＡセグメントの各々からの配列を所定の順序で含むライゲーション生成物を生成する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、以下：
ｄ）工程（ｃ）において生成されたライゲーション生成物によって細胞を形質転換する、工程；および
ｅ）前記第１の選択可能なマーカーおよび前記第２の選択可能なマーカーを発現し、そして前記第１の対抗選択可能なマーカー、前記第２の対抗選択可能なマーカー、または前記第３の対抗選択可能なマーカーを発現しない形質転換体を選択する、工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、以下：
ｆ）前記ＤＮＡセグメントの各々からの配列を所定の順序で含む前記ライゲーション生成物を、前記形質転換体またはこれらの子孫から単離する、工程
をさらに包含する、方法。
【請求項５】
前記第１の選択可能なマーカーおよび前記第２の選択可能なマーカーは、薬剤耐性を付与する遺伝子である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の対抗選択可能なマーカー、前記第２の対抗選択可能なマーカーおよび前記第３の対抗選択可能なマーカーは、ｃｃｄＢ（抗ＤＮＡジャイレースタンパク質）、ｓａｃＢ（スクロース感受性）、ａｒａＢ（リブロース感受性）、ｔｅｔＡＲ（テトラサイクリン耐性／フザリン酸過感受性）からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
請求項２に記載の方法であって、以下：
ａ）前記第１の切断部位および前記第３の切断部位は、同じであり；
ｂ）前記第２の切断部位および前記第４の切断部位は、同じであり；
ｃ）少なくとも１つの３型ＤＮＡ分子の前記５’切断部位は、同じ３型ＤＮＡ分子の前記３’切断部位と同じであり；そして／または
ｄ）少なくとも１つの３型ＤＮＡ分子の前記５’切断部位は、異なる３型ＤＮＡ分子の前記５’切断部位と同じである、
方法。
【請求項８】
請求項２に記載の方法であって、以下：
ａ）前記第１の切断部位および前記第３の切断部位は、ＩＩＳ型制限酵素によって切断される部位であり；
ｂ）前記第２の切断部位および前記第４の切断部位は、ＩＩＳ型制限酵素によって切断される部位であり；そして／または
ｃ）少なくとも１つの３型ＤＮＡ分子の前記５’切断部位および前記３’切断部位は、ＩＩＳ型制限酵素によって切断される部位である、
方法。
【請求項９】
前記第１の切断部位、前記第２の切断部位、前記第３の切断部位、前記第４の切断部位、前記５’切断部位および前記３’切断部位は、ＩＩＳ型制限酵素によって切断される部位である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の切断部位、前記第２の切断部位、前記第３の切断部位、前記第４の切断部位、前記５’切断部位および前記３’切断部位は、同じＩＩＳ型制限酵素によって切断される部位である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記１型ＤＮＡ分子、前記２型ＤＮＡ分子および前記３型ＤＮＡ分子の前記ＤＮＡセグメントは、ポリケチドシンターゼのポリペプチドセグメントをコードする配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記１型ＤＮＡ分子、前記２型ＤＮＡ分子および前記３型ＤＮＡ分子の前記ＤＮＡセグメントは、ポリケチドシンターゼドメインをコードする配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）において切断される前記ＤＮＡ分子は、同じ容器中で切断される、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
組成物であって、以下：
ｉ）第１のＤＮＡセグメント、第１の選択可能なマーカー、第１の対抗選択可能なマーカー、第１の切断部位、および第２の切断部位を含む１型ＤＮＡ分子であって；該第２の切断部位の切断は、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出を該第１のセグメント中に生成する、１型ＤＮＡ分子；
ｉｉ）第２のＤＮＡセグメント、第２の選択可能なマーカー、第２の対抗選択可能なマーカー、第３の切断部位、および第４の切断部位を含む２型ＤＮＡ分子であって、該第４の切断部位の切断は、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出を該第１のセグメント中に生成する、２型ＤＮＡ分子；
ｉｉｉ）ＤＮＡセグメント、第３の対抗選択可能なマーカー、５’切断部位および３’切断部位を含む少なくとも１つの３型ＤＮＡ分子であって、該５’切断部位および該３’切断部位は、切断の際に、２つの隣接するセグメントの各々の一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出を該セグメント中に生成する、３型ＤＮＡ分子；
を含有し、ここで：
該第１の選択可能なマーカーおよび該第２の選択可能なマーカーは、異なり；
該第１の対抗選択可能なマーカー、該第２の対抗選択可能なマーカーおよび該第３の対抗選択可能なマーカーは、独立して選択され、そして同じであるか、または異なり；
該第１の切断部位および該第３の切断部位は、同じであるか、または適合性であり；
該第２の切断部位および該第４の切断部位は、独立して選択され、そして同じであるか、または異なり；そして
各該５’切断部位および各該３’切断部位は、独立して選択される、
組成物。
【請求項１５】
少なくとも２つの前記３型ＤＮＡ分子を含有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１の切断部位、前記第２の切断部位、前記第３の切断部位、もしくは前記第４の切断部位または１つ以上の５’切断部位もしくは３’切断部位にて切断するエンドヌクレアーゼを含有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記エンドヌクレアーゼは、前記第１の切断部位、前記第２の切断部位、前記第３の切断部位、および前記第４の切断部位ならびに１つ以上の５’切断部位または３’切断部位にて切断する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
５’切断部位または３’切断部位を含む少なくとも２つの３型ＤＮＡ分子を含み、そして前記エンドヌクレアーゼは、前記第３の切断部位および前記第４の切断部位、ならびに該３型ＤＮＡ分子の前記５’切断部位および３’切断部位にて切断する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１４に記載の前記１型ＤＮＡ、前記２型ＤＮＡおよび前記３型ＤＮＡの、前記第１の切断部位、前記第２の切断部位、前記第３の切断部位、前記第４の切断部位、前記５’切断部位および前記３’切断部位における切断から得られる生成物を含有する組成物。
【請求項２０】
ＤＮＡリガーゼをさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
クローニングベクターであって、以下、
ａ）ＳＩＳ−ＣＳＭ−Ｒ−ＵＳＭもしくはＳＩＳ−ＵＳＭ−Ｒ−ＣＳＭ；または
ｂ）ＳＩＳ−ＣＳＭ−ＳＭ、
を示される順序で含み、ここで：
ＳＩＳは、シントン挿入部位であり、ＣＳＭは、対抗選択可能なマーカーであり；ＳＭおよびＵＳＭは、選択可能なマーカーであり、そしてＲは、エンドヌクレアーゼ切断部位である、
クローニングベクター。
【請求項２２】
前記ＳＩＳは、−Ｎ１−Ｒ２−Ｎ２−を含み、Ｎ１およびＮ２は、ニック形成酵素のための認識部位であり、そして同じであっても異なっていてもよく、そしてＲ２は、エンドヌクレアーゼのための認識部位である、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２３】
ＳＭおよびＵＳＭは、薬剤耐性を付与する遺伝子である、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２４】
ベクターであって、以下：
ａ）Ｒ１−Ｓｙ−２Ｓ１−ＣＳＭ−Ｒ２−ＵＳＭ；
ｂ）２Ｓ２−Ｓｙ−Ｒ３−ＵＳＭ−Ｒ４−ＣＳＭ；または
ｃ）２Ｓ３−Ｓｙ−２Ｓ４−ＣＳＭ−ＳＭ、
を示された順序で含み、ここで：
２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３および２Ｓ４は、ＩＩＳ型制限酵素のための認識部位であり、該ＩＩＳ型制限酵素は、同じであってもまたは異なっていてもよく；
Ｓｙは、シントンコード領域であり；
Ｒ１およびＲ３は、エンドヌクレアーゼ切断部位であり；
Ｒ２およびＲ４は、切断の際に適合性の末端を生じるエンドヌクレアーゼ切断部位であり；
ＣＳＭは、対抗選択可能なマーカーであり；そして
ＵＳＭおよびＳＭは、選択可能なマーカーである、
ベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクター、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３、または２Ｓ４のうちの１つ以上にて切断するエンドヌクレアーゼを含有する組成物。
【請求項２６】
組成物であって、以下：
ａ）式Ｒ１−Ｓｙ−２Ｓ１−ＣＳＭ−Ｒ２−ＵＳＭのベクター
ｂ）式２Ｓ２−Ｓｙ−Ｒ３−ＵＳＭ−Ｒ４−ＣＳＭのベクター；および
ｃ）式２Ｓ３−Ｓｙ−２Ｓ４−ＣＳＭ−ＳＭのベクター、
のうちの各々を含み、ここで：
２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３および２Ｓ４は、ＩＩＳ型制限酵素のための認識部位であり、該ＩＩＳ型制限酵素は、同じであっても異なっていてもよく；
各Ｓｙは、異なるシントンコード領域であり；
Ｒ１およびＲ３は、エンドヌクレアーゼ切断部位であり、そして同じであるか、または異なっており；
Ｒ２およびＲ４は、切断の際に適合性の末端を生じるエンドヌクレアーゼ切断部位であり；
２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３、および２Ｓ４は、エンドヌクレアーゼ切断部位であり、そして同じであるか、または異なっており；
ＣＳＭは、対抗選択可能なマーカーであり；そして
ＵＳＭおよびＳＭは、選択可能なマーカーである、
組成物。
【請求項２７】
式２Ｓ３−Ｓｙ−２Ｓ４−ＣＳＭ−ＳＭのベクターを２個か、３個か、４個か、５個か、または６個含有し、該ベクターは、それぞれ異なるＳｙを有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｒｌ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３、および２Ｓ４のうちの１つ以上にて切断するエンドヌクレアーゼをさらに含有する、請求項２６の組成物。
【請求項２９】
天然に存在する遺伝子によってコードされるポリケチドシンターゼのドメインに対応するポリケチドシンターゼのドメインをコードする合成遺伝子であって、該合成遺伝子の該ドメインコード配列は、該天然に存在する遺伝子の該ドメインコード配列と異なり、以下：
ａ）該合成遺伝子の該ドメインコード配列は、該天然に存在する遺伝子の該ドメインコード配列に対して約８０％未満同一であり；そして／または
ｂ）該合成遺伝子の該ドメインコード配列は、該天然に存在する遺伝子の該ドメインコード配列中に存在しないか、または該天然に存在する遺伝子の該ドメインコード配列において固有でない少なくとも１つの固有の制限識部位を含み；そして／または
ｃ）該合成遺伝子の該ドメインコード配列は、該天然に存在する遺伝子の該ドメインコード配列に存在する少なくとも１つの制限部位を含まず；そして／または
ｄ）該ドメインコード配列におけるコドン使用頻度の内訳は、該天然に存在する遺伝子のコドン使用頻度の内訳と実質的に異なる、
合成遺伝子。
【請求項３０】
ポリペプチドセグメントをコードする遺伝子の合成のための方法であって、以下：
ａ）該ポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子を設計する、工程；
ｂ）該遺伝子の合成のために成分オリゴヌクレオチドを設計する、工程；
ｃ）該成分オリゴヌクレオチドからシントンを産生し、そして２つ以上の該シントンを１つにステッチングすることによって該遺伝子を合成する、工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府援助に関する声明）
本出願に開示される主題は、国立標準技術研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ＡＴＰ助成金番号７０ＮＡＮＢ２Ｈ３０１４の下の政府援助を用いて一部分が実行された。従って、米国政府は本発明において特定の恩恵を有し得る。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、合成遺伝子生成のためのストラテジー、方法、ベクター、試薬およびシステム、このような遺伝子のライブラリーの生成、ならびに遺伝子および対応するコードポリペプチドの操作および特徴付けを提供する。１つの局面において、この合成遺伝子は、ポリケチドシンターゼポリペプチドをコードし得、そして治療的または商業的に重要なポリケチド化合物の生成を容易にし得る。本発明は、ヒト医学および獣医学、薬理学、農業、および分子生物学の分野において適用が見出される。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ポリケチドは、真菌、菌糸細菌および他の生物によって生成される化合物の大きなファミリーを示す。多くのポリケチドは、治療に適切な活性および／または商業的に価値のある活性を有する。有用なポリケチドの例としては、エリスロマイシン、ＦＫ−５０６、ＦＫ−５２０、メガロマイシン（ｍｅｇａｌｏｍｙｃｉｎ）、ナルボマイシン（ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ）、オレアンドマイシン、ピクロマイシン（ｐｉｃｒｏｍｙｃｉｎ）、ラパマイシン、スピノシン（ｓｐｉｎｏｃｙｎ）およびチロシンが挙げられる。
【０００４】
ポリケチドは、一連の濃縮およびポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）によるその後の改変によって２−炭素単位から天然では合成される。ポリケチドシンターゼは、複数の大きなポリペプチドから構成される多機能酵素複合体である。この複合体のポリペプチド成分の各々は、別個のオープンリーディングフレームによってコードされる。このオープンリーディングフレームは、典型的には、染色体上に一緒に集められている特定のＰＫＳに対応している。ＰＫＳの構造およびポリケチド合成の機構は、非特許文献１に総説されている。
【０００５】
ＰＫＳポリペプチドは、多くの酵素ドメインおよびキャリアドメインを含み、これらとしては、ローディング工程および濃縮工程に関与するアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）活性、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）活性、およびβ−ケトアセチルシンターゼ（ＫＳ）活性；成長鎖のβ−炭素位置での改変に関与するケトレダクターゼ（ＫＲ）活性、脱水酵素（ＤＨ）活性およびエノイルレダクターゼ（ＥＲ）活性；ならびにＰＫＳからのポリケチドの放出に関与するチオエステラーゼ（ＴＥ）活性が挙げられる。これらのドメインの多様な組み合せは、「モジュール」と呼ばれる単位で組織される。例えば、エリスロマイシンの生成に関与する６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ（６−ｄｅｏｘｙｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ  Ｂ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）（「ＤＥＢＳ」）は、３つの別個のポリペプチド上に６つのモジュール（１ポリペプチドあたり２つのモジュール）を含む。ＰＫＳモジュールの数、配列およびドメインの内容は、ＰＫＳのポリケチド生成物の構造を決定する。ポリケチドシンターゼドメインの特性は、周知である（例えば、非特許文献２を参照のこと）。
【０００６】
ポリケチドの重要性、伝統的な化学的方法によるポリケチド化合物の生成の困難性および野生型細胞での典型的に低いポリケチドの生成を考えると、ポリケチド化合物を生成するための改善された手段または代替的な手段を発見することには相当な関心が存在している。この関心は、ＰＫＳ酵素をコードする遺伝子の組換えＤＮＡ技術によってクローニング、分析および操作をもたらした。得られた技術は、公知のＰＫＳ遺伝子クラスターを操作して、天然に存在するよりも、または、そうでなければポリケチドを生成しない宿主よりも、高いレベルでＰＫＳによって合成されたポリケチドを生成することを可能にする。この技術はまた、ＰＫＳのドメインを不活性化することによっておよび／またはＰＫＳ遺伝子の操作ではＰＫＳにおいて通常見いだされないドメインを付加することによって、公知のＰＫＳ遺伝子クラスターから生成されるポリケチドに構造的に関連するがそれとは異なる分子を生成することを可能にする。
【０００７】
ＰＫＳ酵素が機能する機序およびＰＫＳ遺伝子を操作するための方法の開発の詳細な理解は、新規のポリケチドの作製を容易にしたが、現在、遺伝子操作による新規ポリケチドの作製には限界がある。このような限界の１つは、ＰＫＳ遺伝子の利用可能性である。多くのポリケチドが公知であるが、対応するＰＫＳ遺伝子の比較的わずかな部分のみがクローニングされており、操作に利用され得る。さらに、多くの場合において、目的のポリケチドを生成する生物は、多大な困難性および高い費用を伴ってのみ入手可能であり、実験室でこの生物を増殖させる技術およびこの生物が生成するポリケチドの生成のための技術は、未知であるか、または実施困難であるか、もしくは実施に多くの時間を費やす。また、たとえ所望のポリケチドについてのＰＫＳ遺伝子がクローニングされたとしても、それらの遺伝子は、特定の宿主細胞において所望される生成レベルをもたらすようには働かないかも知れない。
【非特許文献１】Ｃａｎｅら、「Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ：ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ，ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３−８
【非特許文献２】ＤｏｎａｄｉｏおよびＫａｔｚ、「Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ．」１９９２，Ｇｅｎｅ  １１１：５１−６０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ポリケチドを生成するＰＫＳをコードする遺伝子にアクセスする必要なく、所望のポリケチドを生成する方法が存在すれば、これらの困難性の多くは、改善されるか、または完全に回避され得る。本発明は、この必要性および他の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の簡単な概要）
１つの局面において、本発明は、天然に存在する遺伝子によってコードされる参照ポリペプチドセグメントに対応するポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子を提供する。この合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、天然に存在す遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列とは異なる。１つの局面において、その合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、その天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列と約９０％未満同一であり、他の実施形態では、約８５％未満同一または約８０％同一である。１つの局面において、この合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、少なくとも１つ（いくつかの実施形態においては、１を超える、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの）特有（独特）の制限部位を含み、これらは、天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列に存在しないかまたは特有（独特）のものではない。１つの局面において、その合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列に存在する少なくとも１つの制限部位を含まない。本発明の実施形態において、その合成遺伝子によってコードされるポリペプチドセグメントは、天然に存在する遺伝子によってコードされる少なくとも５０連続したアミノ残基に対応する。
【００１０】
１つの実施形態において、そのポリペプチドセグメントは、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）に由来し、ＰＫＳドメイン（例えば、ＡＴ、ＡＣＰ、ＫＳ、ＫＲ、ＤＨ、ＥＲ、およびＴＥを含む）または１以上のＰＫＳモジュールであり得るかまたはこれらを含み得る。いくつかの実施形態において、その合成ＰＫＳ遺伝子は、モジュールコード配列あたり、高々１コピーの制限酵素認識部位を有し、この認識部位は、Ｓｐｅ  Ｉ認識部位、Ｍｆｅ  Ｉ認識部位、Ａｆｉ  ＩＩ認識部位、Ｂｓｉ  ＷＩ認識部位、Ｓａｃ  ＩＩ認識部位、Ｎｇｏ  ＭＩＶ認識部位、Ｎｈｅ  Ｉ認識部位、Ｋｐｎ  Ｉ認識部位、Ｍｓｃ  Ｉ認識部位、Ｂｇｌ  ＩＩ認識部位、Ｂｓｓ  ＨＩＩ認識部位、Ｓａｃ  ＩＩ認識部位、Ａｇｅ  Ｉ認識部位、Ｐｓｔ  Ｉ認識部位、Ｋａｓ  Ｉ認識部位、Ｍｌｕ  Ｉ認識部位、Ｘｂａ  Ｉ認識部位、Ｓｐｈ  Ｉ認識部位、Ｂｓｐ  Ｅ認識部位、およびＮｇｏ  ＭＩＶ認識部位からなる群より選択される。１つの実施形態において、その合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列中に存在する少なくとも１つのＩＩＳ型酵素またはＩＩＳ型様酵素（例えば、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、Ｂｓｒ  Ｄｉ、ＢｔｓＩ、ＥｃｉＩ、ＥａｒＩ、ＳａｐＩ、Ｂｓｍ  ＢＩ、Ｂｓｐ  ＭＩ、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＢｆｕＡＩ、Ｆｏｋ  ＩおよびＡｌｗＩ）の制限部位を含まない。
【００１１】
関連する実施形態において、本発明は、天然に存在するＰＫＳ遺伝子によってコードされる参照ポリペプチドセグメントに対応するポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子を提供し、ここで、その合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列とは異なり、ａ）上記モジュールのアミノ末端をコードする配列の近位のＳｐｅ  Ｉ部位；ｂ）ＫＳドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｆｅ  Ｉ部位；ｃ）ＫＳドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＫｐｎ  Ｉ部位；ｄ）ＡＴドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｓｃ  Ｉ部位；ｅ）ＡＴドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＰｓｔ  Ｉ部位；ｆ）ＥＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＢｓｒ  ＢＩ部位；ｇ）ＫＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＡｇｅ  Ｉ部位；ｈ）ＡＣＰドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＸｂａ  Ｉ部位のうち少なくとも２つを含む。
【００１２】
関連する局面において、本発明は、本発明の合成遺伝子を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）を提供する。１つの実施形態において、そのベクターは、第１のＰＫＳモジュールをコードするオープンリーディングフレームを含み、そして、（ａ）ＰＫＳ伸長モジュール、（ｂ）ＰＫＳローディングモジュール、（ｃ）放出ドメイン（例えば、チオエステラーゼドメイン）およびｄ）ポリペプチド間リンカーを含む。
【００１３】
本発明の遺伝子またはベクターを含みそして必要に応じて発現する細胞、ならびにそれらのベクターによってコードされたポリペプチドを含む細胞が提供される。また、そのベクターによってコードされるポリペプチドを含む機能的ポリケチドシンターゼを発現する細胞も提供される。１つの局面において、非天然アミノ酸配列を有するＰＫＳポリペプチドが、提供される。これらのポリペプチドは、例えば、そのドメインのカルボキシ末端でジペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎを含むＫＳドメイン；および／またはそのドメインのカルボキシ末端にジペプチドＳｅｒ−Ｓｅｒを含むＡＣＰドメインによって特徴付けられる、ポリペプチドである。ポリケチドを作製するための方法が提供され、この方法は、ポリケチドが産生される条件のもとで本発明の合成ＤＮＡを含む細胞を培養する工程を包含し、そのポリケチドは、そのベクターの非存在下でのその細胞によっては産生されない。
【００１４】
１つの局面において、本発明は、異なるポリペプチドをコードする配列を含む複数の異なるＤＮＡ単位のハイスループット合成のための方法を提供し、この方法は、各ＤＮＡについて、複数の重複しているオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施して、ポリペプチドセグメントをコードするＤＮＡ単位を生成して、ＰＣＲ増幅によってＵＤＧ含有リンカーをそのＤＮＡ単位の５’末端および３’末端に加え、それによって、連結されたＤＮＡ単位を生成する工程を包含し、ここで、その同じＵＤＧ含有リンカーが、その異なるＤＮＡ単位に加えられる。実施形態において、その複数性は、５０を超える異なるＤＮＡ単位、１００を超える異なるＤＮＡ単位または５００を超える異なるＤＮＡ単位（シントン）を含む。関連する局面において、本発明は、ポリペプチドコード配列を含むベクターを産生するための方法を提供し、この方法は、ライゲーション非依存性クローニング法を使用して連結されたＤＮＡ単位をベクターにクローニングする工程を包含する。
【００１５】
本発明は、遺伝子ライブラリーを提供する。１つの実施形態において、複数の異なるＰＫＳモジュールコード遺伝子を含むライブラリーが提供される。ここで、このライブラリー中のモジュールコード遺伝子は、共通する少なくとも１つ（または、１を超える（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４、少なくとも５つ、または少なくとも６つ））の制限部位を有しており、この制限部位は、各モジュールにおいて高々１回見出され、そして、そのライブラリーにコードされたモジュールは、５以上の異なるポリケチドシンターゼタンパク質からのモジュールに対応する。種々の実施形態において、制限部位は、ＳｐｅＩ認識部位、ＭｆｅＩ認識部位、ＡｆｉＩＩ認識部位、ＢｓｉＷＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、ＮｇｏＭＩＶ認識部位、ＮｈｅＩ認識部位、ＫｐｎＩ認識部位、ＭｓｃＩ認識部位、ＢｇｌＩＩ認識部位、ＢｓｓＨＩＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、ＡｇｅＩ認識部位、ＰｓｔＩ認識部位、ＢｓｒＢＩ認識部位、ＫａｓＩ認識部位、ＭｌｕＩ認識部位、ＸｂａＩ認識部位、ＳｐｈＩ認識部位、ＢｓｐＥ認識部位、およびＮｇｏＭＩＶ認識部位から選択される。１実施形態において、共通の制限部位は、分子のアミノ末端をコードする配列付近のＳｐｅＩ部位であり、ＫＳドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＭｆｅＩ部位であり、ＫＳドメインのカルボキシ末端をコードする配列付近のＫｐｎＩ部位であり、ＡＴドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＭｓｃＩ部位であり、ＡＴドメインのカルボキシ末端をコードする配列付近のＰｓｔＩ部位であり、ＥＲドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＢｓｒＢＩ部位であり、ＫＲドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＡｇｅＩ部位であり、そして／またはＡＣＰドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＸｂａＩ部位である。遺伝子ライブラリーのためのベクターとしては、クローニングベクターおよび発現ベクターが挙げられる。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、伸長モジュールを含み、かつ、第２のＰＫＳ伸長モジュール、ＰＫＳローディングモジュール、チオエステラーゼドメイン、およびポリペプチド間リンカーのうちの少なくとも１つを含む、オープンリーディングフレームを含む。
【００１６】
関連する局面において、本発明は、上述のように複数の異なるＰＫＳモジュールコード遺伝子を作製し、そして、各遺伝子を発現ベクターにクローニングすることによってＰＫＳモジュールコード遺伝子の発現ライブラリーの合成のための方法を提供する。このライブラリーは、例えば、少なくとも約５０または少なくとも約１００の異なるモジュールコード遺伝子を含む。
【００１７】
本発明は、編成（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）について有用な種々のクローニングベクターを提供し、このベクターは、例えば、示された順序で、ＳＭ４−ＳＩＳ−ＳＭ２−Ｒ１またはＬ−ＳＩＳ−ＳＭ２−Ｒ１を含み、ここで、ＳＩＳは、シントン挿入部位であり、ＳＭ２は、第１の選択マーカーをコードする配列であり、ＳＭ４は、第１の選択マーカーとは異なる第２の選択マーカーをコードする配列であり、Ｒ１は、エンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）のための認識部位であり、そして、Ｌは、様々なエンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）のための認識部位である。本発明は、シントン配列を含むベクターをさらに提供し、このベクターは、例えば、示された順序で、ＳＭ４−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−ＲｌまたはＬ−２Ｓ１−Ｓｙ２−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒｌを含み、ここで、２Ｓ１は、第１のＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様制限酵素であって、ここで、２Ｓ２は、異なるＩＩＳ制限酵素またはＩＩＳ型様制限酵素のための認識部位であり、そして、Ｓｙは、シントンコード領域である。ベクターおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）もしくはＩＩＳ型様エンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）またはそのベクター上の部位を認識する他のエンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）の組成物、ベクター、キットなどの同族（ｃｏｇｎａｔｅ）対を含む組成物もまた、提供される。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明は、ベクターを提供し、このベクターは、第１の選択マーカー、第１のエンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）によって認識されるエンドヌクレアーゼ部位（例えば、制限部位）（Ｒ１）、第１のＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様制限酵素によって認識される制限酵素によって認識される部位と第２のＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様制限酵素によって認識される制限部位とに挟まれたシントンコード領域を含み、ここで、Ｒ１を認識するエンドヌクレアーゼおよびその第１のＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様制限酵素を用いるベクターの消化によって、その第１の選択マーカーおよびそのシントンコード領域を含むフラグメントが産生され、そのＲ１を認識するエンドヌクレアーゼおよびその第２のＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様制限酵素を用いるそのベクターの消化によって、上記シントンコード領域を含み上記選択マーカーを含まないフラグメントを産生する。１つの実施形態において、そのベクターは、第２の選択マーカーを含み、ここで、そのベクターを第１のエンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）および第１のＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様制限酵素で消化することによって、上記第１の選択マーカーおよび上記シントンコード領域を含むが第２の選択マーカーを含まないフラグメントを生成し、そのベクターを上記第１のエンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）および上記第２のＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様制限酵素で消化することによって、上記第２の選択マーカーおよび上記シントンコード領域を含むが上記第１の選択マーカーを含まないフラグメントを生成する。
【００１９】
本発明は、隣接ＤＮＡ単位（シントン）を編成して、より大きな単位を合成する方法を提供する。例えば、本発明は、アセンブリＰＣＲによって複数の（すなわち、少なくとも３つの）ＤＮＡ単位を生成すること（各ＤＮＡ単位が、ＰＫＳモジュールの一部分をコードする）および所定の配列においてこの複数のＤＮ単位を組み合わせて、ＰＫＳモジュールコード遺伝子を生成することによって、ＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子を製作するための方法を提供する。１つの実施例において、本方法は、ＰＫＳ伸長モジュール、ＰＫＳローディングモジュール、チオエステラーゼドメイン、またはＰＫＳポリペプチド間リンカーをコードするヌクレオチド配列とフレームを一致させて上記モジュールコード遺伝子を組み合わせて、ＰＫＳオープンリーディングフレームを産生する工程を包含する。
【００２０】
関連する実施形態において、本発明は、ベクター対を使用して一連のＤＮＡ単位を連結するための方法を提供し、この方法は、（ａ）第１のセットのＤＮＡ単位を、各々、第１の型の選択ベクター中にある状態で提供し（上記第１の選択ベクターは、第１の選択マーカーを含む）、そして、第２のセットのＤＮＡ単位を、各々第２の型の選択ベクター中にある状態で提供する（上記第２の選択ベクターは、上記第１の選択マーカーとは異なる第２の選択マーカーを含む）工程であって、ここで、上記第１の型の選択ベクターおよび第２の型の選択ベクターは、それらの異なる選択マーカーに基づき選択され得る、工程、（ｂ）上記第１のセットからのＤＮＡ単位を上記第２のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第３のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択マーカーを生成して、そして、上記第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；（ｃ）上記第３のＤＮＡ単位を上記第２のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成し、そして、上記第１の選択マーカーについて選択することにより望ましいクローンを得る工程、または上記第３のＤＮＡ単位を上記第２のセットからの隣接するＤＮＡと組換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成し、そして上記第２の選択マーカーについて選択することによって、所望のクローンを得る工程による。１つの実施形態において、上記の工程（ｃ）は、上記第３のＤＮＡ単位を、上記の第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結することによって、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成し、そして、上記第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを取得する工程を包含する。上記方法は、上記第４のＤＮＡ単位を第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第５のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成して、そして、上記第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；または上記第３のＤＮＡ単位を、第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成して、そして、上記第２の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；をさらに包含する。１つの実施形態において、工程（ｃ）は、上記第３のＤＮＡ単位を、上記第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結することによって、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成し、そして、上記第２の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを取得する工程を包含する。上記方法は、上記第４のＤＮＡ単位を、上記第１のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第５のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成して、そして、上記第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；または上記第３のＤＮＡ単位を、上記第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成して、そして、上記第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；をさらに包含する。
【００２１】
関連する局面において、本発明は、一連のＤＮＡ単位を連結して、ＤＮＡ構築物を生成するための方法を提供して、この方法は、（ａ）第１の複数のベクターを提供する工程であって、これらのベクターの各々は、ＤＮＡ単位および第１の選択マーカーを含む工程；（ｂ）第２の複数のベクターを提供する工程であって、これらのベクターの各々は、ＤＮＡ単位および第２の選択マーカーを含む工程；（ｃ）（ａ）からのベクターを消化して、ＤＮＡ単位を含む第１のフラグメントと、そのＤＮＡ単位を含まない少なくとも１つのさらなるフラグメントとを生成する工程；（ｄ）（ｂ）からのＤＮＡを消化して、ＤＮＡ単位を含む第２のフラグメントと、そのＤＮＡ単位を含まない少なくとも１つのさらなるフラグメントを生成し（ここで、上記第１のフラグメントおよび上記第２のフラグメントのうちの１つだけが複製起点を含む）、それらのフラグメントを連結して、（ｄ）からのＤＮＡ単位に連結された（ｃ）からのＤＮＡ単位を含む生成物ベクターを生成して、上記の第１の選択マーカーまたは第２の選択マーカーのいずれかについて選択することによってその生成物ベクターを選択する、工程；（ｅ）上記の生成物ベクターを消化して、ＤＮＡ単位を含む第３のフラグメントと、そのＤＮＡ単位を含まない少なくとも１つのさらなるフラグメントとを生成する工程；（ｄ）（ａ）または（ｂ）からのＤＮＡを消化して、ＤＮＡ単位を含む第４のフラグメントと、そのＤＮＡ単位を含まない更なるフラグメントとを生成する工程であって、ここで、上記第３のフラグメントおよび上記第４のフラグメントうちの１つだけが、複製起点を含む工程；（ｆ）上記第３のフラグメントおよび第４のフラグメントを連結して、（ｄ）からのＤＮＡ単位と連結した（ｅ）からのＤＮＡ単位を含む生成物ベクターを生成して、そして、上記第１の選択マーカーまたは上記第２の選択マーカーのいずれかについて選択することによってその生成物ベクターを選択する工程による。
【００２２】
別の局面において、オープンリーディングフレームベクターが提供され、このベクターは、内部型：４−［７−＊］−［＊−８］−３；左端型：４−［７−１］−［＊−８］−３；および右端型：４−［７−＊］−［６−８］−３；の構造を含み、ここで、７および８は、適合性突出部「＊」を生じるように切断するＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様制限酵素のための認識部位であり；１および６は、必要に応じて存在するＩＩ型制限酵素部位であり；そして、３および４は、レアカッター（ｒａｒｅ  ｃｕｔｔｅｒ：例えば、８塩基対以上の認識部位を有する）であるエンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）のための認識部位である。種々の実施形態において、１は、Ｎｄｅ  Ｉであり、かつ／または６は、Ｅｃｏ  ＲＩであり、かつ／または４は、Ｎｏｔ  Ｉであり、かつ／または３は、Ｐａｃ  Ｉである。
【００２３】
別の局面において、合成遺伝子の設計に有用なエンドヌクレアーゼ酵素（例えば、制限酵素）認識部位を同定するための方法が提供される。その方法は、以下の工程：複数の機能的関連のあるポリペプチドセグメントのためのアミノ酸配列を得る工程；上記アミノ酸配列を逆翻訳して、各ポリペプチドセグメントについて複数のポリペプチドセグメントコード核酸配列を生成する工程；上記ポリペプチドセグメントの少なくとも約５０％で、少なくとも１つのポリペプチドセグメントコード核酸配列において見出されるエンドヌクレアーゼ酵素（例えば、制限酵素）認識部位を同定する工程を包含する。特定の実施形態において、上記機能的に関連のあるペプチドセグメントは、ポリケチドシンターゼモジュールまたはポリケチドシンターゼドメイン（例えば、ＰＫＳモジュールまたはＰＫＳドメインにおける高相同性領域）である。
【００２４】
本発明に従って合成遺伝子を設計するための方法において、参照アミノ酸配列が提供され、その参照アミノ酸配列が、宿主生物のコドン優先度について必要に応じて最適化された無作為なコドン選択を使用して、そのアミノ酸配列をコードする無作為化ヌクレオチド配列へと逆翻訳される。その合成遺伝子の配列におけるエンドヌクレアーゼ部位（例えば、制限部位）の位置について１以上のパラメータが提供され、その無作為化ヌクレオチド配列から、１以上の選択されたエンドヌクレアーゼ部位（例えば、制限部位）の存在が取り除かれる。選択された位置において、１以上の選択されたエンドヌクレアーゼ部位（例えば、制限部位）が、その無作為化したヌクレオチド配列に挿入され、その合成遺伝子の配列が生成される。
【００２５】
本発明の１つの局面において、その合成遺伝子の配列を一緒に含む重複オリゴヌクレオチド配列のセットが生成される。
【００２６】
本発明の別の局面において、その合成遺伝子の配列上の制限部位の位置についての１以上のパラメーターが、選択された位置における１以上の予め選択された制限部位を含む。
【００２７】
本発明の別の局面において、その予め選択された制限部位の選択された位置が、シントン端、ドメイン端、およびモジュール端からなる群より選択される位置に対応する。
【００２８】
本発明の別の局面において、上記合成遺伝子の配列上の制限部位の位置についての１以上のパラメーターを提供する工程の後に、上記の無作為化したヌクレオチド配列において挿入され得る全ての可能な制限部位を予測して、必要に応じて、１以上の特有の制限部位を同定する工程が続く。
【００２９】
本発明の別の局面において、上記の合成遺伝子は、選択した長さの一連のシントンに分割され、ついで、各々のシントンの配列を含む重複したオリゴヌクレオチド配列のセットが生成される。
【００３０】
本発明の別の局面において、上記の重複オリゴヌクレオチド配列のセットが、（ａ）上記の合成遺伝子に対応するシントンコード領域を一緒に含むオリゴヌクレオチド配列および（ｂ）１以上のシントン隣接配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
本発明の別の局面において、１以上の特性試験が、上記の重複オリゴヌクレオチド配列のセットについて実施され、それらの試験は、翻訳エラー、無効な制限位置、制限部位の正しくない位置、および異常プライミングからなる群より選択される。
【００３２】
本発明の別の局面において、各オリゴヌクレオチド配列は、選択された長さであり、上記の合成遺伝子の配列を一緒に含むオリゴヌクレオチドのセットの隣接するオリゴヌクレオチドとの、予め決定された長さの重複を含む。
【００３３】
本発明の別の局面において、オリゴヌクレオチドの各々は、長さにして約４０ヌクレオチドであり、隣接するオリゴヌクレオチドに対して約１７ヌクレオチドと約２３ヌクレオチドとの間の重複を含む。
【００３４】
本発明の別の局面において、重複オリゴヌクレオチド配列のセットが、選択され、各オリゴヌクレオチドは、選択された温度範囲においてその隣接するオリゴヌクレオチドとアニールする。
【００３５】
本発明の別の局面において、重複オリゴヌクレオチド配列のセットを生成する工程は、配列特異性についてのアライメントカットオフ値を提供すること、その合成遺伝子の配列とオリゴヌクレオチド配列の各々とをアライメントすること、およびそのアライメント値を決定すること、およびそのアライメントカットオフ値よりも小さいアライメント値を備えるオリゴヌクレオチドを同定して退けることを包含する。
【００３６】
本発明の別の局面において、退けられたオリゴヌクレオチドにおけるエラー領域が、同定され、必要に応じて、そのエラー領域における１以上のヌクレオチドが、置換されて、その退けられたオリゴヌクレオチドのアライメント値が、そのアライメントカットオフ値よりも増加するようにされる。
【００３７】
本発明の別の局面において、合成遺伝子またはシントンを含むオリゴヌクレオチドの順序リスト（ｏｒｄｅｒ  ｌｉｓｔ）が生成される。
【００３８】
本発明の別の局面において、制限部位を取り除く工程は、その無作為化されたヌクレオチド配列における予め選択された部位の位置を同定すること、その制限部位のヌクレオチド配列における置換を受容するためにその制限部位のヌクレオチド配列を含む1以上のコドンの能力を同定すること（ここで、このような置換は、（ａ）その制限部位を取り除き、そして、（ｂ）配列が変化したコドンと同一のアミノ酸をコードするコドンを生成する）、および、その同定されたコドンにおける制限部位の配列を変化させることを、包含する。
【００３９】
本発明の別の局面において、制限部位（または等価に、他のエンドヌクレアーゼ認識部位）を挿入する工程は、その無作為化したヌクレオチド配列における選択した制限部位の挿入のための選択した位置を同定すること、その選択した位置におけるヌクレオチド配列において置換を実施して、その選択した制限部位配列がその選択した位置において作製されるようにすること、その置換された配列をアミノ酸配列に翻訳すること、その選択した位置においてその翻訳したアミノ酸配列がその参照アミノ酸配列と同一である置換を受容すること、そして、その選択した位置においてその翻訳したアミノ酸配列がその参照アミノ酸配列と異なる置換を退けること、を包含する。
【００４０】
本発明の別の局面において、その参照アミノ酸配列と同一である翻訳されたアミノ酸配列は、その選択された位置において、類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含む。
【００４１】
本発明の別の局面において、その合成遺伝子は、ＰＫＳモジュールをコードする。
【００４２】
本発明の別の局面において、その参照アミノ酸配列は、天然に存在するポリペプチドセグメント由来である。
【００４３】
本発明の別の局面において、この方法の1以上の工程は、プログラムされたコンピュータによって実施され得る。
【００４４】
本発明の別の局面において、コンピュータ読み取り可能記憶媒体は、本発明の方法を実行するためのコンピュータ実行可能コードを含む。
【００４５】
本発明に従うシントンのヌクレオチド配列を分析する方法において、合成遺伝子の配列が、提供され、この合成遺伝子は、複数のシントンに分割される。複数のシントンサンプルの配列がまた、提供され、その複数のシントンの各々シントンは、ベクターにクローニングされる。そして、挿入物を含まないそのベクターの配列が、提供される。そのクローニングされたシントンの配列からのベクター配列は取り除かれ、そして、それらの複数のシントンの配列コンティグマップが構築される。この配列のコンティグマップは、その合成遺伝子の配列とアライメントされ、そして、その複数のシントンの各々についてのアライメントの程度が同定される。
【００４６】
本発明の別の局面において、1以上のシントン配列におけるエラーが同定され；そして、1以上の情報が報告され、それらの情報は、アライメントの程度によるシントンサンプルの順位付け、シントンサンプルの配列におけるエラー、修復され得るシントンの同一性からなる群より選択される。
【００４７】
本発明の別の局面において、複数のアライメントエラーについての統計学的レポートが準備される。
【００４８】
本発明に従った合成遺伝子のハイスループット合成のためのシステムは、アセンブリＰＣＲのためのオリゴヌクレオチド含む少なくとも１つの供給源マイクロウェルプレート；ポリメラーゼとアセンブリＰＣＲのために有用な緩衝液とを含む、増幅混合物のための第１の供給源；ＬＩＣ伸長プライマー混合物のための第２の供給源；オリゴヌクレオチド増幅のためのＰＣＲマイクロウェルプレートを備える。液体操作デバイスが、複数の予め決定されたセットのオリゴヌクレオチドを上記の供給源マイクロウェルプレートから取り出し、その予め決定されたセットと、上記のＰＣＲマイクロウェルプレートのウェル中の増幅混合物とを組み合わせ、ＬＩＣ伸長プライマー混合物を取り出し、そのＬＩＣ伸長プライマー混合物と、上記のＰＣＲマイクロウェルプレートのウェル中にあるアンプリコンとを組み合わせる。上記システムはまた、少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレートを受容するように構成された、ＰＣＲ増幅用熱源を備える。
【００４９】
１つの局面において、本発明は、以下の工程によって複数のＤＮＡセグメントをライゲーションしてライゲーション生成物を得るための方法であって、このライゲーション生成物は、このＤＮＡセグメントの各々からの配列を所定の順序で含む、方法を提供する：（ａ）ＤＮＡセグメントを各々が含む少なくとも３つのＤＮＡ分子を提供する工程であって、各セグメントは、このライゲーション生成物中の１つまたは２つの他のセグメントに隣接し、各セグメントは、第１の隣接するＤＮＡセグメントとの配列同一性を有する第１の領域、および存在する場合、第２の隣接するＤＮＡセグメントとの配列同一性を有する第２の領域を含む、工程；（ｂ）１つまたは２つのライゲーション可能な末端を有するＤＮＡセグメントを生成するために、各ＤＮＡ分子を切断する工程であって、各ライゲーション可能な末端は、隣接するＤＮＡセグメントとの配列同一性を有する少なくとも一部の領域を含み；少なくとも１つのセグメントは、切断後に２つのライゲーション可能な末端を含む、工程；（ｃ）この隣接するセグメントに各セグメントを同時にライゲーションする工程；および（ｄ）このＤＮＡセグメントの各々からの配列を所定の順序で含むライゲーション生成物を選択する工程。
【００５０】
関連する局面において、本発明は、以下の工程によって、複数のＤＮＡセグメントをライゲーションしてライゲーション生成物を得るための方法であって、このライゲーション生成物は、このＤＮＡセグメントの各々からの配列を所定の順序で含む、方法を提供する：（ａ）最終ライゲーション生成物中の１つまたは２つの他のセグメントに隣接するＤＮＡセグメントを各々が含む、１型ＤＮＡ分子、２型ＤＮＡ分子および少なくとも１つの３型ＤＮＡ分子を提供する工程であって、ここで（ｉ）この１型ＤＮＡ分子は、第１のＤＮＡセグメントと、第１の選択可能なマーカー、第１の対抗選択可能なマーカー、第１の切断部位および第２の切断部位を含むベクター配列とを含み、この第２の切断部位の切断は、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出をこの第１のＤＮＡセグメント中に生成し；（ｉｉ）この２型ＤＮＡ分子は、第２のＤＮＡセグメントと、第２の選択可能なマーカー、第２の対抗選択可能なマーカー、第３の切断部位および第４の切断部位を含むベクター配列とを含み、この第４の切断部位の切断は、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出をこの第２のＤＮＡセグメント中に生成し；（ｉｉｉ）各３型ＤＮＡ分子は、ＤＮＡセグメントと、第３の対抗選択マーカー、５’切断部位および３’切断部位を含むベクター配列とを含み、この５’切断部位は、切断の際に、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出をこのセグメント中に生成し、そしてこの３’切断部位は、切断の際に、異なる隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出をこのセグメント中に生成し；この第１の選択可能なマーカーおよびこの第２の選択可能なマーカーは、異なり；この第１の対抗選択可能なマーカー、この第２の対抗選択可能なマーカーおよびこの第３の対抗選択可能なマーカーは、独立して選択され、そして同じであるか、または異なり；この第１の切断部位およびこの第３の切断部位は、同じであるか、または適合性であり；この第２の切断部位およびこの第４の切断部位は、独立して選択され、そして同じであるか、または異なり；そして各５’切断部位および３’切断部位は、各３型ＤＮＡ分子において独立して選択され、そして同じであるか、または異なる、工程；（ｂ）各ＤＮＡ分子を、この第１の切断部位、この第２の切断部位、この第３の切断部位、およびこの第４の切断部位、５’切断部位（単数または複数）およびこの３’切断部位（単数または複数）にて切断する工程；ｃ）得られたフラグメントを互いにライゲーションし、それによってこのＤＮＡセグメントの各々からの配列を所定の順序で含むライゲーション生成物を生成する工程。本方法のバリエーションは、以下の工程を包含する：工程（ｃ）において生成されたライゲーション生成物によって細胞を形質転換する工程；および（ｅ）この第１の選択可能なマーカーおよびこの第２の選択可能なマーカーを発現し、そしてこの第１の対抗選択可能なマーカーも、この第２の対抗選択可能なマーカーも、この第３の対抗選択可能なマーカーも発現しない形質転換体を選択する工程。本方法の別のバリエーションは、以下の工程を包含する：（ｆ）このＤＮＡセグメントからの配列を所定の順序で含む前記ライゲーション生成物を、この形質転換体またはこれらの子孫から単離する工程。実施形態において、工程（ｂ）において切断されたＤＮＡ分子は、同じ容器中で切断される。
【００５１】
種々の実施形態において、この第１の選択可能なマーカーおよびこの第２の選択可能なマーカーは、薬剤耐性を付与する遺伝子であり、そして／またはこの第１の対抗選択可能なマーカー、この第２の対抗選択可能なマーカーおよびこの第３の対抗選択可能なマーカーは、ｃｃｄＢ（抗ＤＮＡジャイレースタンパク質）、ｓａｃＢ（スクロース感受性）、ａｒａＢ（リブロース感受性）、ｔｅｔＡＲ（テトラサイクリン耐性／フザリン酸過感受性）からなる群より選択される。別の実施形態において、第１の切断部位および第３の切断部位は同じであり；第２の切断部位および第４の切断部位は同じであり；そして／またはこの少なくとも１つの３型ＤＮＡ分子の５’切断部位は、同じ３型ＤＮＡ分子の５’切断部位と同じである。
【００５２】
種々の実施形態において、この第１の切断部位およびこの第３の切断部位は、ＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様制限酵素によって切断される部位であり、そして／またはこの第２の切断部位およびこの第４の切断部位は、ＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様制限酵素によって切断される部位であり、そして／または少なくとも１つの３型ＤＮＡ分子のこの５’切断部位およびこの３’切断部位は、ＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様の制限酵素によって切断される部位である。１実施形態において、この第１の切断部位、この第２の切断部位、この第３の切断部位、この第４の切断部位、この５’切断部位およびこの３’切断部位は、ＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様制限酵素によって切断される部位である。１実施形態において、この第１の切断部位、この第２の切断部位、この第３の切断部位、この第４の切断部位、この５’切断部位およびこの３’切断部位は、同じＩＩＳ型制限酵素または同じＩＩＳ型様制限酵素によって切断される部位である。実施形態において、この１型ＤＮＡ分子、この２型ＤＮＡ分子およびこの３型ＤＮＡ分子のこのＤＮＡセグメントは、ポリケチドシンターゼのポリペプチドセグメントのコード配列を含む。１実施形態において、この１型ＤＮＡ分子、この２型ＤＮＡ分子およびこの３型ＤＮＡ分子のＤＮＡセグメントは、ポリケチドシンターゼをコードするコード配列を含む。
【００５３】
別の局面において、本発明は、以下の組成物を提供する：（ｉ）第１のＤＮＡセグメント、第１の選択可能なマーカー、第１の対抗選択可能なマーカー、第１の切断部位、および第２の切断部位を含む１型ＤＮＡ分子であって；この第２の切断部位の切断は、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能であるこの第１のセグメント中に一本鎖突出を生成する、１型ＤＮＡ分子；（ｉｉ）第２のＤＮＡセグメント、第２の選択可能なマーカー、第２の対抗選択可能なマーカー、第３の切断部位、および第４の切断部位を含む２型ＤＮＡ分子であって、この第４の切断部位の切断は、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能であるこの第１のセグメント中に一本鎖突出を生成する、２型ＤＮＡ分子；（ｉｉｉ）ＤＮＡセグメント、第３の対抗選択可能なマーカー、５’切断部位および３’切断部位を含む少なくとも１つの３型ＤＮＡ分子であって、この５’切断部位およびこの３’切断部位は、切断の際に、２つの隣接する各セグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出をこのセグメント中に生成し；この第１の選択可能なマーカーおよびこの第２の選択可能なマーカーは、異なり；この第１の対抗選択可能なマーカー、この第２の対抗選択可能なマーカーおよびこの第３の対抗選択可能なマーカーは、独立して選択され、そして同じであるか、または異なり；この第１の切断部位およびこの第３の切断部位は、同じであるか、または適合性であり；この第２の切断部位およびこの第４の切断部位は、独立して選択され、そして同じであるか、または異なり；そして各５’切断部位および各３’切断部位は、独立して選択される、３型ＤＮＡ分子。１つの実施形態において、この組成物は、少なくとも２つの３型ＤＮＡ分子を含む。１つの実施形態において、この組成物は、この第１の切断部位、この第２の切断部位、この第３の切断部位もしくはこの第４の切断部位、または１つ以上の５’切断部位もしくは３’切断部位にて切断するエンドヌクレアーゼを含むか、あるいはこの第１の切断部位、この第２の切断部位、この第３の切断部位およびこの第４の切断部位、ならびに１つ以上の５’切断部位および３’切断部位にて切断するエンドヌクレアーゼを含む。１つの実施形態において、この組成物は、５’切断部位または３’切断部位を含む少なくとも２つの３型ＤＮＡ分子を含み、そしてこのエンドヌクレアーゼは、この３型ＤＮＡ分子のこの第３の切断部位およびこの第４の切断部位ならびにこの５’切断部位および３’切断部位にて切断する。
【００５４】
関連する実施形態において、本発明は、請求項１４に記載のこの１型ＤＮＡ、この２型ＤＮＡおよびこの３型ＤＮＡの、この第１の切断部位、この第２の切断部位、この第３の切断部位、この第４の切断部位、この５’切断部位およびこの３’切断部位における切断から得られる生成物を含む組成物を提供する。１実施形態において、請求項１９に記載の組成物は、ＤＮＡリガーゼをさらに含む。
【００５５】
１つの局面において、本発明は、クローニングベクターであって、（ａ）ＳＩＳ−ＣＳＭ−Ｒ−ＵＳＭもしくはＳＩＳ−ＵＳＭ−Ｒ−ＣＳＭ；または（ｂ）ＳＩＳ−ＣＳＭ−ＳＭを示された順序で有し、ＳＩＳは、シントン挿入部位であり、ＣＳＭは、対抗選択可能なマーカーであり；ＳＭおよびＵＳＭは、選択可能なマーカーであり、そしてＲは、エンドヌクレアーゼ切断部位である、クローニングベクターを提供する。１実施形態において、このＳＩＳは、−Ｎ１−Ｒ２−Ｎ２−を含み、Ｎ１およびＮ２は、ニック形成酵素のための認識部位であり、そして同じであっても異なっていてもよく、そしてＲ２は、エンドヌクレアーゼのための認識部位である。１実施形態において、ＳＭおよびＵＳＭは、薬剤耐性を付与する遺伝子である。
【００５６】
１つの局面において、本発明は、クローニングベクターであって、（ａ）Ｒ１−Ｓｙ−２Ｓ１−ＣＳＭ−Ｒ２−ＵＳＭ；（ｂ）２Ｓ２−Ｓｙ−Ｒ３−ＵＳＭ−Ｒ４−ＣＳＭ；または（ｃ）２Ｓ３−Ｓｙ−２Ｓ４−ＣＳＭ−ＳＭを示された順序で有し、２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３および２Ｓ４は、ＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様制限酵素のための認識部位であり、このＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様の制限酵素は、同じであっても異なっていてもよく、Ｓｙは、シントンコード領域であり、Ｒ１およびＲ３は、エンドヌクレアーゼ切断部位であり、Ｒ２およびＲ４は、切断の際に適合性の末端を生じるエンドヌクレアーゼ切断部位であり、ＣＳＭは、対抗選択可能なマーカーであり；そして、ＵＳＭおよびＳＭは、選択可能なマーカーである、クローニングベクターを提供する。関連する局面において、本発明は、このベクター、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３、または２Ｓ４の１つ以上にて切断するエンドヌクレアーゼを含有する組成物を提供する。
【００５７】
ある局面において、本発明は、（ａ）式Ｒ１−Ｓｙ−２Ｓ１−ＣＳＭ−Ｒ２−ＵＳＭのベクター；（ｂ）式２Ｓ２−Ｓｙ−Ｒ３−ＵＳＭ−Ｒ４−ＣＳＭのベクター；および（ｃ）式２Ｓ３−Ｓｙ−２Ｓ４−ＣＳＭ−ＳＭのベクターの各々を含有する組成物であって、２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３および２Ｓ４は、ＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様制限酵素のための認識部位であり、このＩＩＳ型制限酵素またはＩＩＳ型様の制限酵素は、同じであっても異なっていてもよく、各Ｓｙは、異なるシントンコード領域であり、Ｒ１およびＲ３は、エンドヌクレアーゼ切断部位であり、そして同じであるか、または異なっており、Ｒ２およびＲ４は、切断の際に適合性の末端を生じるエンドヌクレアーゼ切断部位であり、２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３、および２Ｓ４は、エンドヌクレアーゼ切断部位であり、そして同じであるか、または異なっており、ＣＳＭは、対抗選択可能なマーカーであり；そしてＵＳＭおよびＳＭは、選択可能なマーカーである、組成物を提供する。実施形態において、Ｒ１およびＲ３は、異なる。実施形態において、この組成物はまた、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３、および２Ｓ４の１つ以上にて切断するエンドヌクレアーゼを含む。実施形態において、この組成物は、式２Ｓ３−Ｓｙ−２Ｓ４−ＣＳＭ−ＳＭのベクターを２個、３個、４個、５個または６個含有し、このベクターは、それぞれ異なるＳｙを有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
（詳細な説明）
以下の概説は、読み手を補助するために提供される。以下の開示の構成は、便宜のためであり、特定の節における本発明の１つの局面の開示は、その局面が他の異なって表示された節における開示に関連しないことを意味しない。
【００５９】
（１．定義）
本明細書で使用される場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーであるが、通常、少なくとも約５０残基を含む。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチドセグメント」は、目的のポリペプチド配列を指すために使用され得る。ポリペプチドセグメントは、天然に存在するポリペプチド（例えば、ＤＥＢＳ  ＯＲＦ１遺伝子の生成物）、天然に存在するポリペプチドのフラグメントまたは領域（例えば、ＤＥＢＳモジュール１、ＤＥＢＳモジュール１のＫＳドメイン、リンカー、機能的に規定された領域、および任意の特定の機能にも構造にも一致していない任意に規定された領域）、あるいは天然に存在するポリペプチドにも天然に存在する領域にも必ずしも一致しない合成ポリペプチドに対応し得る。「ポリペプチドセグメントコード配列」は、ポリペプチドセグメントをコードするヌクレオチド配列の一部（より大きなヌクレオチド配列から単離されるかまたはその中に含まれるかのいずれか）（例えば、ＤＥＢＳ１  ＫＳドメインをコードするヌクレオチド配列）であり得；このポリペプチドセグメントは、より大きなポリペプチドまたは完全ポリペプチドに含まれ得る。一般に、用語「ポリペプチドセグメントコード配列」は、本発明の方法を使用して作製され得る、任意のポリペプチドコードヌクレオチド配列を含むことが意図される。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「シントン（ｓｙｎｔｈｏｎ）」および「ＤＮＡ単位」は、より大きな高分子（例えば、ＰＫＳモジュールコードポリヌクレオチド）を生成する他の２本鎖ポリヌクレオチドと組み合せた２本鎖ポリヌクレオチドをいう。シントンは、何らかの特定の方法（例えば、アセンブリＰＣＲ）によって合成されるポリヌクレオチドに限定されず、全ての型の合成ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、クローン化ＤＮＡおよび天然に存在するＤＮＡを含む。いくつかの場合において、シントンの３つの異なる領域（１つのコード領域および２つの隣接領域）が、区別され得る。シントン編成の最終ＤＮＡ生成物（例えば、モジュール遺伝子）に組み込まれるシントンの一部分は、「シントンコード領域」と称され得る。シントンコード領域に隣接し、かつ上記の生成物ＤＮＡの一部にはならないシントンの領域は、「シントン隣接領域」と称され得る。以下に記載されるように、シントン隣接領域は、エンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を用いる切断により、編成の間、シントンコード領域から物理的に分離される。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「マルチシントン（ｍｕｌｔｉｓｙｎｔｈｏｎ）」は、２つ以上のシントン（通常、４つ以上のシントン）の組み合わせ（例えば、ライゲーション）により形成されるポリヌクレオチドをいう。「マルチシントン」はまた、「シントン」（前述の定義を参照のこと）と称され得る。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「モジュール」は、ポリペプチドの機能単位である。本明細書で使用される場合、「ＰＫＳモジュール」は、天然に存在するＰＫＳ伸長モジュール、合成ＰＫＳ伸長モジュールまたはハイブリッドＰＫＳ伸長モジュールをいう。ＰＫＳ伸長モジュールは、ＫＳドメインおよびＡＣＰドメイン（通常、１分子あたり１つのＫＳおよび１つのＡＣＰ）を含み、時々ＡＴドメイン（通常、１つのＡＴドメインおよび時折２つのＡＴドメイン）（ここでそのＡＴ活性は、トランスで提供されず、隣接モジュールからも提供されない）を含み、そして時々、ＫＲドメイン、ＤＨドメイン、ＥＲドメイン、ＭＴ（メチルトランスフェラーゼ）ドメイン、Ａ（アデニル化）ドメイン、もしくは他のドメインの１つ以上を含む。ポリペプチドのアミノ末端以外で天然に存在するＰＫＳ伸長モジュールの記載において、用語「モジュール」は、ドメインと、あるＡＣＰドメインのカルボキシ末端から次のＡＣＰドメインのカルボキシ末端にほぼ延びるドメイン間連結領域（例えば、そのモジュールを連結する配列（図６に示されるモジュールのＳｐｅ  Ｉ−Ｍｆｅ  Ｉ領域に一致する）を含む）リンカーとのセットを称し得るか、あるいは、上記リンカー配列（例えば、図６に示されるモジュールのＭｆｅ  Ｉ−Ｘｂａ  Ｉ領域におおまかに一致する）を含まないセットを称し得る。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「モジュール」は、２つの意味において「ＰＫＳモジュール」よりも包括的である。第一に、「モジュール」は、ＰＫＳに由来しない単位を含む任意の型の機能的単位であり得る。第二に、ＰＫＳに由来する場合、「モジュール」は、「ＰＫＳモジュール」とはこのＰＫＳの分野では通常呼ばない、ＰＫＳポリペプチドの機能的単位（例えば、リンカー、ドメイン（チオエステラーゼまたは他の放出ドメインを含む）を包含し得る。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「マルチモジュール」は、２つ以上のモジュールを含む単一ポリペプチドをいう。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「ＰＫＳ補助単位」（または「補助単位」）は、伸長モジュール以外または伸長モジュールドメイン以外のＰＫＳポリペプチド（またはポリケチド合成において機能する）領域もしくはドメインをいう。ＰＫＳ補助単位の例としては、ローディングモジュール、ポリペプチド間リンカー、および放出ドメインが挙げられる。ＰＫＳ補助単位は、当該分野で公知である。ＰＫＳローディングドメインについての配列は、公に利用可能である（表１２を参照のこと）。一般に、ローディングモジュールは、ポリケチドを合成するために使用される第１の構築ブロックを接続し、第一の伸長モジュールにそれを移す役割を担う。例示的なローディングモジュールは、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインおよびアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメイン（例えば、ＤＥＢＳのドメイン）；ＫＳＱドメイン、ＡＴドメイン、およびＡＣＰドメイン（例えば、チロシンシンターゼまたはオレアンドライドシンターゼのドメイン）；ＣｏＡリガーゼ活性ドメイン（アべルメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）シンターゼ、ラパマイシンまたはＦＫ−５２０  ＰＫＳ）またはＮＲＰＳ様モジュール（例えば、エポチロンシンターゼ）からなる。リンカー（天然に存在するリンカーおよび合成リンカーの両方）もまた、公知である。天然に存在するＰＫＳポリペプチドは、一般に、以下の２つの型のリンカーを含むと解釈される：「ポリペプチド間リンカー」および「ポリペプチド内リンカー」。例えば、Ｂｒｏａｄｈｕｒｓｔら、２００３，「Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ」Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１０：７２３−３１；Ｗｕら、２００２，「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｏｎｏｒ  ａｃｙｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｋｅｔｏｓｙｎｔｈａｓｅｓ，ａｎｄ  ｌｉｎｋｅｒ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｔｏｉｎｔｅｒｍｏｄｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：５０５６−６６；Ｗｕら、２００１，「Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｅ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｍｏｄｕｌｅｓ」Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１２３：６４６５−７４；およびＧｏｋｈａｌｅら、２０００，「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌｉｎｋｅｒｓ  ｉｎ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｕｌｅｓ」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．４：２２−７を参照のこと。便宜上、特定のポリペプチド内配列連結伸長モジュール（例えば、図６に示されるモジュールのＳｐｅ  Ｉ−Ｍｆｅ  Ｉ領域に対応する）は、「ＡＣＰ−ＫＳ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｒｅｇｉｏｎ」またはＡＫＬと称される。チオエステラーゼドメイン（ＴＥ）は、たいていの天然に存在するＰＫＳ分子（例えば、ＤＥＢＳ、チロシンシンターゼ、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）シンターゼ、ピクロマイシン（ｐｉｋｒｏｍｙｃｉｎ）シンターゼおよびソラフェン（ｓｏｒａｐｈｅｎ）シンターゼ）において見出され得る。他の鎖放出活性はまた、補助単位、例えば、ラパマイシンクラスター由来のｒａｐＰ遺伝子およびＦＫ５０６、ＦＫ５２０などに由来するそのホモログによってコードされるようなアミノ酸取り込み活性；リファマイシン（ｒｉｆａｍｙｃｉｎ）およびゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）ＰＫＳにおいて見出されるアミド形成活性；ならびに加水分解酵素または直鎖状エステル形成酵素（ｌｉｎｅａｒ  ｅｓｔｅｒ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ）である。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「遺伝子」は、ポリペプチドまたはポリペプチドセグメントをコードするＤＮＡ配列である。遺伝子はまた、さらなる配列（例えば、転写調節エレメント、イントロン、３’非翻訳領域など）を含み得る。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「合成遺伝子」は、天然において見出されないポリペプチドセグメントコード配列を含む遺伝子であり、ここでそのポリペプチドセグメントコード配列は、少なくとも約３０アミノ酸残基長、通常は少なくとも約４０アミノ酸残基長そしてしばしば少なくとも約５０アミノ酸残基長のポリペプチドまたはフラグメントまたはドメインをコードする。
【００６９】
本明細書において使用される場合、「モジュール遺伝子」または「モジュールコード遺伝子」は、モジュールをコードする遺伝子をいい；「ＰＫＳモジュール遺伝子」は、ＰＫＳモジュールをコードする遺伝子をいう。
【００７０】
本明細書において使用される場合、「マルチモジュール遺伝子」は、マルチモジュールをコードする遺伝子をいう。
【００７１】
「天然に存在する」ＰＫＳ、「天然に存在する」ＰＫＳモジュール、「天然に存在する」ＰＫＳドメインなどは、天然に見出されるアミノ酸配列を有する、ＰＫＳ、モジュール、もしくはドメインである。
【００７２】
「天然に存在する」ＰＫＳ遺伝子、「天然に存在する」ＰＫＳモジュール遺伝子または「天然に存在する」ＰＫＳドメイン遺伝子は、天然に見出されるＰＫＳ遺伝子のヌクレオチド配列を有する遺伝子である。例示的な天然に存在するＰＫＳ遺伝子の配列は、公知である（例えば、表１２を参照のこと）。
【００７３】
「遺伝子ライブラリー」は、目的の個々にアクセス可能なポリヌクレオチドの収集物を意味する。そのポリヌクレオチドは、ベクター（例えば、プラスミドまたはファージ）、細胞（例えば、細菌細胞）中にか、精製ＤＮＡとしてか、または他の形態として、維持され得る。ライブラリーメンバー（クローン、構築物、ポリヌクレオチドなどと多様に称される）は、回収および使用のための多様な様式（例えば、マルチウェル培養プレートまたはマイクロタイタープレート中、バイアル中、適切な細胞環境（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）中）においてか、適切な保存培地（例えば、ｔｈｅ  Ｓｔｏｒａｇｅ  ＩｓｏＣｏｄｅ（登録商標）ＩＤＴＭ  ＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｃａｒｄ；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）上で精製ＤＮＡ組成物としてか、あるいは当該分野で公知な他の多様なライブラリー形態において、保存され得る。典型的には、ライブラリーは、少なくとも約１０メンバー、しばしば少なくとも約１００メンバー、好ましくは約５００メンバー、そしてなおより好ましくは少なくとも約１０００メンバーを有する。「個々にアクセス可能である」とは、選択されたライブラリーメンバーの位置が既知であり、そのメンバーがそのライブラリーから回収され得るようになっていることを意味する。
【００７４】
本明細書で使用される場合、用語「一致（対応）する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ）」または「一致（対応）している（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」は、ポリペプチド間の関係を記載する。合成遺伝子によってコードされるポリペプチド（例えば、ＰＫＳモジュールまたはＰＫＳドメイン）は、同じアミノ酸配列を実質的に有する場合、天然に存在するポリペプチドに対応する。例えば、合成遺伝子によってコードされるＫＳドメインは、合成遺伝子によってコードされるＫＳドメインがＤＥＢＳのモジュール１のＫＳドメインと実質的に同じアミノ酸配列を有する場合、ＤＥＢＳのモジュール１のＫＳドメインと対応する。
【００７５】
本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチドの組換え操作を記載する場合、「〜に接続（結合）（連結）した（ｊｏｉｎｅｄ  ｔｏ）、「〜に組み合わせた（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ）」および各々の文法的に等価な表現は、２つのＤＮＡ分子（または同一のＤＮＡ分子の２つの末端）のライゲーション（すなわち、５’−３’核酸共有結合の形成）をいう。
【００７６】
本明細書において使用される場合、隣接（する）ＤＮＡ（例えば、隣接（する）シントン）を言う場合、「隣接（する）」は、天然に存在する遺伝子または合成遺伝子において連続して（または重なって）いる配列をいう。「隣接（する）シントン」の場合において、そのシントンコード領域の配列は、そのシントンにコードされる合成遺伝子において連続しているかまたは重なっている。
【００７７】
本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドセグメントの状況において「端（ｅｄｇｅ）」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドセグメントの末端の領域（すなわち、物理的な端）あるいはそのポリペプチドの領域（例えば、ドメイン）またはポリヌクレオチドの領域（例えば、ドメインコード配列）の範囲を定める境界付近の領域をいう。
【００７８】
用語「接続末端（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｅｄｇｅ）」は、隣接シントンに（例えば、各シントンにおける適合性の連結可能末端の形成によって）接続されたシントンの領域を記載するために使用される。従って、シントンの「接続末端における連結可能な末端」という言及は、その隣接したシントンの適合性の連結可能連結可能末端に連結されている（または連結され得る）末端を意味する。５つ以上のシントンを含む構築物において、たいていのシントンは、２つの接続末端を有することが理解される。言及されている接続末端は、文脈から明らかである。配列モチーフまたはエンドヌクレアーゼ部位（例えば、制限酵素部位）は、あるモジュール内のＰＫＳドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端をコードするヌクレオチド配列に対して、そのモチーフまたは部位が、そのモジュール内の他のどのドメインの末端（境界）に対してよりも特定の末端（境界）に対して近い場合、上記ヌクレオチド配列の「付近」にある。配列モチーフまたはエンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）の認識部位もしくは切断部位は、ＰＫＳモジュールのアミノ末端またはカルボキシ末端をコードするヌクレオチド配列に対して、そのモチーフまたは部位が、そのモジュール内のどのドメインの末端に対してよりも特定の末端（境界）に近い場合、上記ヌクレオチドの「付近」にある。ＰＫＳドメインの境界は、当該分野で公知の方法によって、対象のドメインの配列を、類似の型（例えば、ＫＳ、ＥＲなど）の他のＰＫＳドメインの配列と整列させること、そして比較的高い配列同一性領域と比較的低い配列同一性領域との間の境界を確認することによって、決定され得る。ＤｏｎａｄｉｏおよびＫａｔｚ，１９９２，「Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ」Ｇｅｎｅ  １１１：５１−６０を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、ＣＬＵＳＴＡＬＷのようなプログラムおよびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｉ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｐｋｓｄｂ．ｈｔｍｌで利用可能なプログラムが、整列のために使用され得る。いくつかの実施形態において、境界付近にあるモチーフまたはエンドヌクレアーゼ部位（例えば、制限酵素部位）は、その境界から約２０アミノ酸残基以下にある。
【００７９】
本明細書において使用される場合、「突出部」は、二本鎖ポリヌクレオチドを言及する場合、その通常の意味を有し、そして二本鎖ポリヌクレオチドの末端での、対をなさない一本鎖伸長部をいう。
【００８０】
「配列特異的ニック形成エンドヌクレアーゼ」または「配列特異的ニック形成酵素」は、二本鎖ＤＮＡ配列を認識して１本のＤＮＡ鎖のみを切断する、酵素である。例示的なニック形成エンドヌクレアーゼは、米国特許出願２００３０１０００９４  Ａ１の「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｔｒａｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ＤＮＡ−ｎｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ」に記載される。例示的なニック形成酵素としては、Ｎ．ＢｂｖＣ  ＩＡ、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  ＩおよびＮ．Ａｌｗ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）が挙げられる。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、用語「エンドヌクレアーゼ」は、ニック形成エンドヌクレアーゼを参照する場合またはそれ以外に文脈から明らかである場合を除き、配列特異的な様式で二本鎖ＤＮＡを切断する酵素をいう。エンドヌクレアーゼに対する認識配列は、「エンドヌクレアーゼ認識部位」といわれる。エンドヌクレアーゼの切断部位は、「エンドヌクレアーゼ切断部位」といわれ、そしてエンドヌクレアーゼ認識部位内または認識部位外に存在し得る。配列特異的エンドヌクレアーゼの１例は、制限エンドヌクレアーゼである。制限エンドヌクレアーゼは、それらの特性を記載することおよび／または標準的命名法を使用することによって、言及され得る。一般に、「ＩＩ型」制限エンドヌクレアーゼは、特定のＤＮＡ配列を認識し、そしてその配列における一定の位置またはその配列付近の一定の位置において切断して、５’−リン酸および３’−ヒドロキシルを生成する。パリンドローム配列を認識する「ＩＩ型」制限エンドヌクレアーゼは、時々、本明細書中で「従来の制限エンドヌクレアーゼ」といわれる。「ＩＩＡ型」制限エンドヌクレアーゼは、その認識部位が非対称である、ＩＩ型のサブセットである。配列特異的様式で二本鎖ＤＮＡを切断してライゲーション可能な末端を生成する、他の制限エンドヌクレアーゼ様エンドヌクレアーゼが、公知である。このようなエンドヌクレアーゼの例は、いわゆるホーミング型（自動追尾型）エンドヌクレアーゼであり、エンドヌクレアーゼのＩ−ＣｅｕＩ  Ｒ０６９９、Ｉ−ＳｃｅＩ  Ｒ０６９４、ＰＩ−Ｐｓｐ  Ｉ  Ｒ０６９５、ＰＩ−ＳｃｅＩ  Ｒ０６９６および他のものが、現在利用可能である（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（一般的に、Ｂｅｌｆｏｒｔら、１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−８８；Ｄｕｊｏｎら、１９８９，Ｇｅｎｅ  ８２：１１５-１１８；Ｐｅｒｌｅｒら、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：１１２５−２７；Ｊａｓｉｎ、１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔら，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５-３５３；Ａｓｓｅｌｂｅｒｇｓら、１９９６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０：５５８−５６２を参照のこと；また、米国特許第５，４２０，０３２号（Ｍａｒｓｈａｌｌら）および同第５，４７４，８９６号（Ｄｕｊｏｎら）も参照のこと）。本発明のいくつかの実施形態において、使用されるエンドヌクレアーゼは、ホーミング型エンドヌクレアーゼであり、そして／または認識部位（例えば、ベクター中の部位）は、ホーミング型エンドヌクレアーゼによって認識される配列である。制限エンドヌクレアーゼ以外の配列特異的エンドヌクレアーゼが使用される事例において、このエンドヌクレアーゼは、関連の制限酵素について本明細書中に記載される特性（例えば、エンドヌクレアーゼ認識部位の内側または外側での切断；二本鎖ＤＮＡの両方の鎖の切断、など）を有することが、理解される。従って、ベクター中に含まれる「制限部位」は、いくつかの実施形態において、同等に、任意の配列特異的エンドヌク��アーゼ（例えば、ホーミング型エンドヌクレアーゼ）認識部位であり得る；「制限部位」における切断を含むプロセスは、同等に、任意の配列特異的エンドヌクレアーゼによる切断を含み得る；そして「制限酵素」の使用は、同等に、任意の配列特異的エンドヌクレアーゼの使用を含み得る。
【００８２】
注記したように、エンドヌクレアーゼ切断部位は、エンドヌクレアーゼ認識部位の内側または外側であり得る。認識部位の外側に切断部位を有するエンドヌクレアーゼの１例は、「ＩＩＳ型」制限エンドヌクレアーゼである。一般的に、本明細書中で用いられる場合、「制限エンドヌクレアーゼ」または「制限酵素」は、当該分野におけるその通常の意味を有する。一般に、「ＩＩＳ型」制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの切断部位がその認識部位の外側にある、ＩＩＡ型のサブセットである。本明細書中で用いられる場合、「ＩＩＳ型」制限酵素に対する言及は、特にそうでないと示されない限り、両方のＤＮＡ鎖がその認識部位の外側およびその制限部位の同じ側で切断される、ＩＩＳ型酵素を言及する。本発明の１つの実施形態では、２〜４塩基の突出部を生成するＩＩＳ型酵素が選択される。認識部位の外側を切断する他のエンドヌクレアーゼとしては、ときとしてＩＶ型制限酵素といわれるものが挙げられる。ＩＶ型酵素は大きく、制限酵素と修飾酵素との組合せである。これらの酵素は、それらの認識配列の外側で切断する；連続した配列を認識するもの（例えば、Ｅｃｏ５７Ｉ：ＣＴＧＡＡＧ）は、一方の側のみを切断し、不連続配列（例えば、ＢｃｇＩ：［５’．．．＾１０（Ｎ）ＣＧＡ（Ｎ）６ＴＧＣ（Ｎ）１２＾．．．３’／３’．．．＾１２（Ｎ）ＧＣＴ（Ｎ）６ＡＣＧ（Ｎ）１０＾．．．５］を認識し、そして認識配列を含む小フラグメントを解放する両方の側で切断する。認識配列の外側で切断する別の型の酵素は、市販されていないものの、いわゆるＩＩＩ型酵素である。これらの酵素は、切断を達成するために、同じＤＮＡ分子内で反対方向の２つの配列を必要とする。ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼおよび認識部位の外側で切断する他のもの（ＩＶ型エンドヌクレアーゼ）は、「ＩＩＳ型様」エンドヌクレアーゼともいわれ得る。単純化のため、本特許出願は、時々、ＩＩＳ型制限酵素に言及する。しかしながら、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼ、ＩＩＳ型制限部位、ＩＩＳ型切断部位などの使用に対する本明細書中のいずれの参照においても、文脈で他に示されない限り、本発明の少なくともいくつかの実施形態において、他のＩＩＳ型様エンドヌクレアーゼが同等な目的を達成し得る限り、これら他のＩＩＳ型様エンドヌクレアーゼの使用も包含し、そしてこれを使用することをいうことが意図される。同等の文脈において、便宜上、時々、「制限部位」または「制限酵素」に対する参照が成されるが、配列特異的な様式でＤＮＡを切断して所望の位置でライゲーション可能な末端を生成する任意のＤＮＡ切断因子（好ましくはエンドヌクレアーゼ）は、このような参照に包含されることを意図されることが、読者によって理解されるべきである。例示的な制限エンドヌクレアーゼとしては、非限定的に、以下が挙げられる：
【００８３】
【数１Ａ】
2007533308.tif 000003
【００８４】
本明細書中で用いられる場合、用語「連結可能（な）末端」とは、連結され得る、２つのＤＮＡフラグメントの末端（または同じ分子の末端）をいう。「連結可能（な）末端」とは、平滑末端および（一本鎖突出部を有する）「粘着末端」を包含する。２つの粘着末端は、これらがアニーリングして連結され得る場合（例えば、各突出部が、３’−ヒドロキシル端を有する場合；各々が、同じ長さ（例えば、４ヌクレオチド単位）の突出部である場合、および２つの突出部が、互いの逆相補体である場合）、「適合性」である。
【００８５】
本明細書中で用いられる場合、特に示されるかまたは文脈から明らかでない限り、「制限部位」またはエンドヌクレアーゼ部位とは、少なくとも５塩基対、通常は少なくとも６塩基対の長さの認識部位をいう。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ部位は、「稀なカッター（ｒａｒｅ  ｃｕｔｔｅｒ）」によって認識され、そして少なくとも長さ７塩基対、少なくとも長さ８塩基対、少なくとも長さ９塩基対または少なくとも長さ１０塩基対の認識部位を有する。エンドヌクレアーゼ切断部位は、認識部位中に位置付けられてもよいし、位置付けられなくてもよい。
【００８６】
本明細書中で用いられる場合、「特有（独特）（ｕｎｉｑｕｅ）のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、「特有（独特）の制限部位」）とは、特定のポリヌクレオチド（例えば、ベクター）または特定のポリヌクレオチド領域（例えば、モジュールをコードする部分、特定のベクター領域など）中に１回のみ存在する制限部位をいう。
【００８７】
本明細書中で用いられる場合、「有用なエンドヌクレアーゼ部位（例えば、有用な制限部位」とは、特定のポリヌクレオチドまたは特定のポリヌクレオチド領域中で、特有（独特）であるか、もし特有（独特）でないにしてもあるパターンおよび数で存在し、その結果、特定のポリヌクレオチド（例えば、ベクター）または特定のポリヌクレオチド領域（例えば、モジュール遺伝子）中におけるその部位の全てでの消化が、あたかもその部位が特有（独特）であるのと本質的に同じ結果を達成する、制限部位をいう。
【００８８】
本明細書中で用いられる場合、「ベクター」とは、発現または複製のいずれかのために細胞中に組換え核酸を導入するために用いられ、かつ複製起点ならびに適切な転写制御配列および／または翻訳制御配列（例えば、エンハンサーおよびプロモーター）ならびにベクター維持のための他のエレメントを有する、ポリヌクレオチドエレメントをいう。１つの実施形態では、ベクターは、自己複製性の環状の染色体外ＤＮＡである。このようなビヒクルの選択および使用は、当該分野で慣用的である。「発現ベクター」は、そのベクター中に挿入されたＤＮＡ（例えば、調節配列（例えば、プロモーター領域）と作動可能に連結されたＤＮＡ配列）を発現し得るベクターを包含する。従って、発現ベクターとは、適切な宿主細胞中に導入された際に、クローニングされたＤＮＡの発現をもたらす、組換えＤＮＡ構築物または組換えＲＮＡ構築物（例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクター）をいう。
【００８９】
本明細書中で使用される場合、「選択可能なマーカー」および「対抗選択可能なマーカー」とは、この遺伝子の発現が、この遺伝子を含むベクターで形質転換されているかまたはこの遺伝子を含むベクターをトランスフェクトされている細胞の選択を可能にする遺伝子をいう。「選択可能なマーカー」は、その遺伝子を発現しない同様の細胞に対して致死性であるかまたは増殖阻害的である特定の選択条件下で、増殖される細胞中で発現する場合、その細胞がマーカーを発現して生存および増殖するのを可能にする遺伝子である。従って、選択可能なマーカーは、通常は生物体を殺傷する物質に対する耐性をコードし得る。広範な種々の選択可能なマーカーおよび選択方法が当該分野で公知であり、そして選択のために使用され得る。代表的に、マーカーは、ｃａｒｂ（カルベニシリン耐性（例えば、ｂｌａ））、ｔｅｔ（テトラサイクリン耐性）、ｋａｎ（カナマイシン耐性（例えば、ａｐｈ（３’）−ＩＩ））、ｓｔｒｅｐ（ストレプトマイシン耐性）、またはｃｍ（クロラムフェニコール耐性（例えば、ｃａｔ））のような、薬物耐性のための遺伝子である。「対抗選択可能なマーカー」は、特定の選択条件下で増殖される細胞中で発現される場合、細胞死（これによって、この遺伝子を含む細胞のいずれに対しても選択する）を生じる遺伝子である。。広範な種々の対抗選択可能なマーカーおよびその選択方法は、当該分野で公知であり、そして選択のために使用され得る。例として、ｃｃｄＢ（抗ＤＮＡジャイレースタンパク質）、ｓａｃＢ（スクロース感受性）、ａｒａＢ（リブロース感受性）、およびｔｅｔＡＲ（テトラサイクリン耐性／フザリン酸過敏性）が挙げられる。
【００９０】
本明細書中で用いられる場合、特定のアミノ酸は、あるタンパク質における参照アミノ酸に対して、その参照アミノ酸をその特定のアミノ酸で置換してもそのタンパク質の機能（例えば、生物学的活性）を実質的に改変しない場合、その参照アミノ酸に「類似」する。類似するアミノ酸はしばしば、互いにとって保存的置換である。以下の６群は、互いにとって保存的置換であるアミノ酸を含む：［アラニン；セリン；トレオニン］；［アスパラギン酸、グルタミン酸］、［アスパラギン、グルタミン］、［アルギニン、リジン］、［イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン］、および［フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン］。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８４，ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙもまた参照のこと。
【００９１】
非リボソームペプチドシンターゼ、すなわち「ＮＲＰＳ」は、リボソーム非依存性プロセスによって個々のアミノ酸を接続することによってペプチド産物を生成する酵素である。ＮＲＰＳの例としては、グラミシジンシンテターゼ、シクロスポリンシンテターゼ、サーファクチンシンテターゼなどが挙げられる。概説については、ＷｅｂｅｒおよびＭａｒａｈｉｅｌ，２００１，「Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ」，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ）．９：Ｒ３−９；Ｍｏｏｔｚら，２００２，「Ｗａｙｓ  ｏｆ  ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｎ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ」，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．３：４９０−５０４を参照のこと。
【００９２】
（規定）
用語「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」、「など」、「例示的な」、「例としては、以下が挙げられる」、「例えば（ｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａ（ｅ．ｇ．））」、「代表的に」などの使用は、本発明の局面を例示することを意図するが、記載される特定の例に本発明を限定することを意図しない。従って、このような語句の各例は、あたかも、語句「しかし限定のためではない」（例えば、「例えば、以下であるがこれらに限定されない…」）が存在するかのように読み替えられ得る。
【００９３】
用語「モジュール」および「ドメイン」は一般に、ポリペプチドまたはポリペプチド領域を言及するが、用語「モジュール遺伝子」および「ドメイン遺伝子」または文法的等価物は、そのタンパク質をコードするＤＮＡをいう。この約束事に対する不注意での逸脱はいずれも、文脈から明らかである。例えば、「モジュール端部での制限部位」とは、そのモジュール遺伝子のうちの、モジュールポリペプチド配列の端部をコードする領域における制限部位をいうことが明らかである。
【００９４】
（２．緒言）
本発明は、遺伝子の合成、このような遺伝子のライブラリーの生成、ならびにその遺伝子および対応するコードされたポリペプチドの操作および特徴付けのための、ストラテジー、方法、ベクター、試薬およびシステムに関する。特に、本発明は、大きなポリペプチドをコードする遺伝子の合成のための、新たな方法およびツールを提供する。合成され得る遺伝子の例としては、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）のドメイン、モジュールもしくはポリペプチドをコードする遺伝子；非リボソームペプチドシンターゼ（ＮＲＰＳ）のドメイン、モジュールもしくはポリペプチドをコードする遺伝子；ＰＫＳおよびＮＲＰＳの両方のエレメントを含むハイブリッド；ウイルスゲノムなどが挙げられる。ポリケチドシンターゼ分子をコードする遺伝子は特に興味深いものであり、そして便宜のために、本開示全体を通して、ＰＫＳのモジュール、ドメインおよびポリペプチドをコードする遺伝子の設計および合成に対する言及がしばしばなされる。しかし、言及するかさもなければ文脈から明らかでない限り、本発明の局面は、いかなる１つのクラスの遺伝子にもポリペプチドにも限定されない。本発明の方法が、多様なポリヌクレオチドの設計および合成のために有用であることが読者によって理解される。
【００９５】
目的のポリペプチドをコードする合成遺伝子を生成するための本発明の方法は、以下の工程を包含し得る：
ａ）目的のポリペプチドセグメントをコードする遺伝子を設計する工程；
ｂ）この遺伝子の合成のために成分オリゴヌクレオチドを設計する工程；
ｃ）以下によってポリペプチドセグメントをコードする遺伝子を合成する工程：
ｉ）遺伝子の部分をコードするシントンを作製する工程；および
ｉｉ）シントンを一緒に「編成」して、目的のポリペプチドセグメントをコードするマルチシントン（すなわち、より大きなＤＮＡ単位）を生成する工程。目的のポリペプチドが、発現され得、組換えによって操作され得るなどのことが読者には明らかである。
【００９６】
本明細書中に開示される方法およびツールは、ポリケチドシンターゼ遺伝子の合成についての特定の適用を有し、そしてポリケチドの合成についての種々の新たな利点を提供する。上記で考察されるように、ポリケチドシンターゼにおけるモジュールの順序、数およびドメインの内容は、そのポリケチド生成物の構造を決定する。本明細書中に開示される方法を用いて、ＰＫＳモジュール（これら自体が、ドメインの種々の組み合わせを含む）の本質的に任意の組み合わせを含むポリペプチドをコードする遺伝子が、合成され得、クローニングされ得、そして評価され得、そして機能的ポリケチドシンターゼの産生に用いられ得る。このようなポリケチドシンターゼは、対応する遺伝子クラスターをクローニングすることも配列決定することもない、天然に存在するポリケチドの産生（培養不可能な生物または希少生物からの場合など、ＰＫＳ遺伝子が入手可能でない場合に有用である）；産生されない（または何らかの任意の天然に存在するＰＫＳによって産生されることが公知ではない）新規ポリケチドの産生；公知のポリケチドのアナログの、より効率的な産生；遺伝子ライブラリーの産生、および他の用途に用いられ得る。
【００９７】
関連の局面では、本発明は、有用な制限部位が、機能的に規定されたコード領域（例えば、モジュール、ドメイン、リンカー領域またはこれらの組み合わせをコードする、配列）に隣接した、ＰＫＳモジュール（または他のポリペプチド）をコードする遺伝子の汎用的設計に関する。この設計は、多数の異なるモジュールが、共通のベクターセットにクローニングされること、または多様なマルチモジュールタンパク質の（例えば、ドメインの置換による）操作および／もしくは発現を可能にする。
【００９８】
関連の局面では、本発明は、ＰＫＳモジュールがコードする遺伝子の大きなライブラリーを提供する。
【００９９】
関連の局面では、本発明は、遺伝子合成に有用なベクターおよび方法を提供する。
【０１００】
関連の局面では、本発明は、合成遺伝子の設計に有用なアルゴリズムを提供する。
【０１０１】
関連の局面では、本発明は、遺伝子合成に有用な自動化システムを提供する。
【０１０２】
本発明は、アセンブリＰＣＲまたは他の方法（ここで、各ＤＮＡ単位は、ＰＫＳモジュールの一部をコードする）による複数のＤＮＡ単位を生成し、そしてこれらのＤＮＡ単位を所定の順序で組み合わせてＰＫＳモジュールコード遺伝子を生成することによって、ＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子を作製するための方法を提供する。１つの実施形態では、この方法は、上記モジュールコード配列を、ＰＫＳ伸長モジュール、ＰＫＳローディングモジュール、チオエステラーゼドメイン、またはＰＫＳポリペプチド間リンカーをコードするヌクレオチド配列とインフレームで組み合わせ、それによりＰＫＳオープンリーディングフレームを生成する工程を包含する。
【０１０３】
ＰＫＳモジュールをコードする遺伝子の合成のための本発明の方法は、任意の1つ以上の以下の工程を包含し得る：
ａ）（例えば、特定のポリケチドの生産のため、またはモジュールのライブラリー中に含めるために）ＰＫＳモジュールを設計する工程
ｂ）所望のＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子を設計する工程；
ｃ）上記遺伝子の合成のための成分オリゴヌクレオチドを設計する工程；
ｄ）上記モジュール遺伝子を、以下によって合成する工程：
ｉ）上記モジュール遺伝子の一部をコードするシントンを作製する工程；および
ｉｉ）複数のシントンを一緒に「編成する」工程；
ｅ）モジュール遺伝子を改変する工程；
モジュール遺伝子および／または補助単位遺伝子を含むオープンリーディングフレームを、作製する工程；および／もしくは
モジュールコード遺伝子のライブラリーを産生する工程；ならびに／または
ｆ）必要に応じて、他のポリペプチドと組み合わせて、宿主細胞において、（ｄ）または（ｅ）由来のモジュール遺伝子を発現する工程。
これらの工程の各々を、以下の節で詳細に記載する。
【０１０４】
（３．合成遺伝子の設計）
本発明の合成遺伝子のヌクレオチド配列は、その遺伝子の性質および意図される用途に依存して変動する。一般に、これらの遺伝子の設計は、その遺伝子によってコードされるべきポリペプチドまたはフラグメント（例えば、ＰＫＳモジュールまたはＰＫＳドメイン）のアミノ酸配列、および以下のうちの全てまたはいくつかを反映する：
ａ）意図される発現宿主のコドン優先度、
ｂ）その合成遺伝子の特定の位置における有用な制限部位の存在（導入）、
ｃ）その遺伝子またはその遺伝子の特定の領域における所望されない制限部位の非存在（除去）、
ｄ）本明細書中に開示される合成方法（特に、ハイスループット法）との適合性。
【０１０５】
本発明の方法によって合成されるべき遺伝子を選択することに関して、種々の基準が実施者にとって利用可能である。主な考慮事項は、通常、その遺伝子によってコードされるタンパク質である。例えば、タンパク質をコードする遺伝子が、合成され得、そのタンパク質の少なくとも一部は、天然に存在するドメイン、モジュール、リンカーもしくは他のポリペプチド単位または上記の組み合わせと同じ配列またはそれらと実質的に同じ配列を有する。
【０１０６】
目的のポリペプチドを選択したら、そのタンパク質をコードする多数の核酸配列が、そのアミノ酸配列の逆翻訳によって決定され得る。逆翻訳のための方法は周知である。以下に記載のとおり、本発明によれば、逆翻訳は、コドン使用頻度を無作為化し、そして必要に応じて、選択されたコドン優先度またはコドンの偏りを反映する様式で、実施され得る。本発明の合成遺伝子は、種々の宿主において発現され得るので、意図される発現宿主のコドン優先度の考慮は、発現の効率についての利益を有し得る。
【０１０７】
コドン優先度を考慮する際に、優先度の表が、公に入手可能な供給源から入手されてもよく、または実施者によって作成されてもよい。コドン優先度は、ある生物についての全ての報告された配列または推定された配列、あるいは配列のサブセット（例えば、ハウスキーピング遺伝子）に基づいて作成され得る。広範な種々の種についてのコドン優先度の表は、公に入手可能である。多くの生物についての表は、かずさＤＮＡ研究所において維持されるサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）からのリンクから入手可能である。Ｅ．ｃｏｌｉについての例示的なコドン優先度を表１に示す。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについてのコドン表は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｏｄｏｎｕｓａｇｅ．ｓｈｔｍｌにおいて見出され得る。コドン表が特定の宿主について入手可能でない場合、大部分の近縁生物について入手可能な表が用いられ得る。
【０１０８】
【表１】
2007533308.tif 000004
【０１０９】
＊フィールド［トリプレット］［１０００当たりの頻度］［数］
特定の宿主（発現）生物のコドン優先度について考慮することに加えて、上記合成遺伝子のヌクレオチド核酸配列は、隣接する稀なコドンのクラスターまたは配列の重複領域を回避するように設計され得る。
【０１１０】
適切な発現宿主は、コードされるタンパク質に依存する。ＰＫＳタンパク質については、適切な宿主としては、モジュール型ポリケチドを元々生成する細胞またはモジュール型ポリケチドを生成し得るように操作された細胞が挙げられる。宿主としては、放線菌類（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）、真正細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、粘液細菌（例えば、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ）、および酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｋｅａｌｅｙら，１９９８，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎ  ｎｏｎｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｈｏｓｔｓ」，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：５０５−９；Ｄａｙｅｍら，２００２，「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ  ｍｕｔａｓｅ−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：５１９３−２０１を参照のこと。また、米国特許第６，４１０，３０１号；同第５，８４３，７１８号および同第５，８３０，７５０号、ならびに特許公開のＷＯ０１／３１０３５、ＷＯ０１／２７３０６、ＷＯ０２／０６８６１３、ＷＯ９７／１３８４５、ＷＯ９８／２７２０３、ＵＳ２００２００００８７４５１およびＵＳ２００２００４５２２０（これらは、ＰＫＳ遺伝子の異種性発現のための方法、ならびにこれら遺伝子の発現およびポリケチドの生成に適した宿主細胞を記載する）を参照のこと。
【０１１１】
コドンの最適化は、その遺伝子全体を通して、あるいは特定の領域（例えば、そのコードされるポリペプチドの最初のいくつかのコドン）においてのみ、用いられ得る。異なる実施形態では、特定の宿主についてのコドン最適化は、その遺伝子の設計においては考慮されないが、コドン無作為化が用いられる。
【０１１２】
代替の実施形態では、このタンパク質をコードする天然に存在する遺伝子のＤＮＡ配列は、上記合成遺伝子を設計するために用いられる。この実施形態では、その天然に存在するＤＮＡ配列は、（例えば、制限部位を除去および導入するために）以下に記載のとおりに改変されて、上記合成遺伝子の配列が提供される。
【０１１３】
本発明の合成遺伝子の設計はまた、その遺伝子中の特定の位置に所望のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、制限部位）を含めること、および／またはその遺伝子中またはその遺伝子の特定の領域中にある所望されないエンドヌクレアーゼ部位（例えば、制限部位）を除去すること、ならびにその遺伝子を作製するために用いられる合成方法との適合性を包含し得る。しばしば、「所望されない」制限部位（例えば、Ｅｃｏ  ＲＩ部位）は、ある位置から除去されて、その同じ部位がその遺伝子、シントン、ベクターなどの別の位置において（例えば）独特（特有）であることを確実にされる。これらの考慮事項は、本発明の合成遺伝子の合成および使用において用いられる方法およびツールの説明に従って、より容易に記載され、そして理解される。これらの方法およびツールは、以下の第４節において、部分的に記載され、遺伝子設計のさらなる局面は、第５節において考察される。
【０１１４】
（４．遺伝子の合成）
本節は、合成遺伝子の産生のための方法を記載する。上記のとおり、本発明の１つの局面において、合成遺伝子の産生は、２以上の二本鎖ポリヌクレオチド（本明細書では、「シントン」と呼ばれる）を組み合わせ（「編成」し）て、より大きなＤＮＡ単位（すなわち、マルチシントン）を生成する工程を包含する。そのより大きなＤＮＡ単位は、組換えベクター中にクローニング可能な実質的に任意の長さであり得る。例えば、この長さは、約５００塩基対、約１０００塩基対、約２０００塩基対、約３０００塩基対、約５０００塩基対、約８０００塩基対、または約１００００塩基対という下限と、約５０００塩基対、約１００００塩基対、約２００００塩基対または約５００００塩基対という独立して選択される上限とによって束縛された範囲内であり得る（ここで、この上限は、この下限よりも大きい）。例示の目的のために、以下の考察は一般に、上記のより大きなＤＮＡ単位がＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子の産生を言及する。しかし、本明細書中に記載される方法および材料が、任意の数のポリペプチドセグメントコードヌクレオチド配列（ＮＲＰＳモジュールをコードする配列および合成改変体をコードする配列、他のモジュール型タンパク質のポリペプチドセグメントをコードする配列、他のタンパク質ファミリーからのポリペプチドセグメントをコードする配列、または関心がある任意の機能的ＤＮＡ単位もしくは構造的ＤＮＡ単位が挙げられる）の合成に用いられ得ることが企図される。
【０１１５】
本発明によれば、代表的に、合成ＰＫＳモジュール遺伝子は、約３００ｂｐ〜約７００ｂｐ（より頻繁には約４００ｂｐ〜約６００ｂｐ、通常は約５００ｂｐ）の長さの範囲のシントンを組み合わせることによって産生される。ＰＫＳモジュールの場合、天然に存在するＰＫＳモジュール遺伝子（および対応する合成遺伝子）は、約５０００ｂｐ隣にある。隣接する複数のシントンの間の配列の何らかの重複を可能にすることにより、１０〜１２個の５００ｂｐのシントンが代表的に組み合わされて、天然に存在するモジュールまたはその改変体をコードする５０００ｂｐのモジュール遺伝子が産生される。本発明の種々の局面では、一緒に「編成される」シントンの数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、もしくは少なくとも１０であり得るか、または２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０から選択される第１の整数と５、１０、２０、３０または５０から選択される第２の整数とによって決定される範囲であり得る（ここで、この第２の整数は、この第１の整数よりも大きい）。
【０１１６】
次の節は、シントン産生を記載する。以下の節４．２は、シントンを編成することによるモジュール遺伝子の合成、ならびに編成に有用なベクターを記載する。
【０１１７】
（４．１  シントン（ｓｙｎｔｈｏｎ）の合成）
シントンは、種々の方法において産生され得る。モジュール遺伝子がいくつかのシントンを組み合わせることによって産生されるのとちょうど同じように、シントンは一般に、いくつかのより短いポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチド）を組み合わせることによって産生される。一般に、シントンは、アセンブリＰＣＲ法を用いて産生される。有用なアセンブリＰＣＲストラテジーが公知であり、そして重複する一本鎖ポリヌクレオチドのセットをＰＣＲ増幅して、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを産生することを包含する（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒら，１９９５，「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｅｎｔｉｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｒｏｍ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」，Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３；Ｗｉｔｈｅｒｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら，１９９９，「ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ＋Ｔ−ｒｉｃｈ  ｍａｌａｒｉａ  ｇｅｎｏｍｅ」，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２：１１１３−２０；ならびにＨｏｏｖｅｒおよびＬｕｂｋｏｗｓｋｉ，２００２，「ＤＮＡ  Ｗｏｒｋｓ：Ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４３）。あるいは、シントンは、他の方法（例えば、リガーゼベースの方法（例えば、ＣｈａｌｍｅｒおよびＣｕｒｎｏｗ，２００１，「Ｓｃａｌｉｎｇ  Ｕｐ  ｔｈｅ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０：２４９−２５２））によって調製され得る。
【０１１８】
シントンのオリゴヌクレオチド成分の配列が、そのシントンの配列を決定し、最終的にはそのシントンを用いて作製される合成遺伝子を決定することが、読者には明らかである。したがって、そのオリゴヌクレオチド成分の配列は、以下である：（１）所望のアミノ酸配列をコードする、（２）通常、発現宿主についてのコドン優先度を反映する、（３）その合成遺伝子の合成の間用いられるかまたは所望される、エンドヌクレアーゼ部位（例えば、制限部位）を含む、（４）所望されないエンドヌクレアーゼ部位（例えば、制限部位）がその合成遺伝子から除去されるように設計される、（５）合成法（例えば、アセンブリＰＣＲ）と調和したアニーリング特徴、プライミング特徴および他の特徴を有する、ならびに（６）本明細書中に記載される他の設計考慮事項を反映する。
【０１１９】
長さが約５００ｂｐのシントンは、約２５個の４０塩基オリゴヌクレオチド（「４０マー」）のアセンブリ増幅によって便利に調製される。本発明のいくつかの実施形態では、ウラシル含有オリゴヌクレオチドが、シントンの末端（すなわち、シントン隣接領域）に付加されて、ライゲーション非依存性クローニングを促進する（例えば、実施例１を参照のこと）。そのオリゴヌクレオチド自体は、本明細書中に記載される原理に従って設計され、従来の方法（例えば、ホスホロアミダイト合成）を用いて調製され得、そして／または多数の商業的供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｏｐｅｒｏｎ）から入手され得る。精製されたオリゴヌクレオチドは、シントンアセンブリのために用いられ得るが、ハイスループット法のためには、そのオリゴヌクレオチド調製物は通常、脱塩されるが、ゲル精製されない（例えば、実施例１を参照のこと）。アセンブリおよび増幅の条件は、変異の導入（配列エラー）を最小にするように選択される。
【０１２０】
（４．２  モジュール遺伝子の合成（編成（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）））
シントンを組み合わせてモジュール遺伝子を生成するプロセスは、「編成（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」と呼ばれる。通常、少なくとも３つのシントンが組み合わされ、より頻繁には少なくとも５つのシントンが組み合わされ、そして最も頻繁には少なくとも８つのシントンが組み合わされる。本発明の編成方法は、ハイスループットシステムのために適切であり、シントンフラグメントの精製の必要性を回避し、そして他の利点を有する。上記の通り、編成は、ＰＫＳ遺伝子モジュール（約５０００ｂｐ）の合成の文脈において記載されるが、これは、任意の大きな遺伝子の合成のために用いられ得る。例えば、編成は、２以上のＰＫＳモジュール遺伝子を組み合わせて、マルチモジュール遺伝子を調製するために、またはポリヌクレオチド（例えば、プロモーター配列およびＲＮＡコード配列）の種々の他の組み合わせのいずれかを組み合わせるために、用いられ得る。
【０１２１】
編成は、第１のベクター中にある第１のＤＮＡ単位（例えば、第１のシントンまたは第１のマルチシントン）が、その第１のベクターとは異なるように選択可能である第２のベクター中にある隣接するＤＮＡ単位（例えば、隣接シントンまたは隣接マルチシントン）と組み合わされるプロセスによって、隣接するＤＮＡ単位（例えば、シントン）を連結することを包含する。その２つのベクターの各々は、複製起点を含む（本明細書中で用いられる場合、「ベクター」に対する言及は、複製起点の存在を示す）。隣接するＤＮＡ単位（本明細書中では今後、「シントン」）を含む２つのベクターは、時々、「同族（ｃｏｇｎａｔｅ）対」または「ドナー」ベクターおよび「アクセプター」ベクターと呼ばれる。この編成プロセスでは、その２つのベクターの各々は、そのシントン配列において適合性（通常、付着性）の連結可能な末端を有する（それらのシントンが連結によって接続されるのを可能にする）フラグメントを作製するために、そして適合性（通常、付着性）の連結可能末端をそれらのシントン配列の外側に作製するために、制限酵素を用いて消化され、その結果、その２つのシントンを含有するベクターフラグメントが連結されて、連結されたシントン配列（マルチシントン）を含む新たな選択可能ベクターが作製され得るようになる。以下に詳細に記載される通り、本発明は、合成の間のフラグメント精製工程の必要のない、大きな遺伝子の迅速なクローング法を提供する。編成方法は以下に記載され、そして図３、図５および図７に例示される。
【０１２２】
本発明の１つの局面において、いくつかのＤＮＡ単位を順々に連結するための方法が提供され、この方法は、
ａ）アクセプターベクターフラグメント（第１のシントンＳＡ０、シントンＳＡ０と隣接するシントンＳＤ０との接続末端にある連結可能末端ＬＡ０、および別の連結可能末端ｌａ０を含む）と、ドナーベクターフラグメント（第２のシントンＳＤ０、シントンＳＤ０とシントンＳＡ０との接続末端にある別の連結可能末端ＬＤ０（ここで、ＬＤ０およびＬＡ０は、適合性である）、別の連結可能末端ｌｄ０（ここで、ｌｄ０およびｌａ０は適合性である）、および、選択マーカーを含む）とを連結する工程を包含する、第１ラウンドの編成を実行する工程であって、ここで、ＬＡ０およびＬＤ０が連結され、ｌａ０およびｌｄ０が連結され、それによって、上記第１のシントンと上記第２のシントンとを連結し、それによって、シントンをコードする配列Ｓ１を含む第１のベクターを作製する、工程；
ｂ）（ａ）において上記選択マーカーについて選択することによって上記第１のベクターを選択する工程；ならびに
ｃ）さらにｎラウンドの編成を実行する工程であって、ここで、ｎは、１〜２０の整数であり、Ｓｎは、前のラウンドの編成において複数のシントンを連結することにより作製されたシントンコード配列であり、そして、ｎラウンドの編成各々は、以下：
１）アクセプターベクターＡｎまたはドナーベクターＤｎのいずれかとして、上記第１のベクターまたは次のベクターを設計すること；
２）（例えば、制限酵素で）アクセプターベクターＡｎを消化してアクセプターベクターフラグメント（シントンコード配列Ｓｎ、シントンＳｎと隣接するシントンＳＤｎ＋１００との接続末端における連結可能末端ＬＡｎ、および別の連結可能末端ｌａｎを含む）を生成すること；ならびに、上記アクセプターベクターフラグメントを、ドナーベクターフラグメント（シントンＳＤｎ＋１００、シントンＳＤｎ＋１００とシントンＳｎとの接続末端における連結可能末端ＬＤｎ＋１００（ここで、ＬＡｎおよびＬＤｎ＋１００は適合性である）、別の連結可能末端ｌｄｎ＋１００（ここでｌａｎおよびｌｄｎ＋１００は適合性である）、および選択マーカーを含む）に連結することであって、ここで、ＬＡｎおよびＬＤｎ＋１００が連結され、ｌａおよびＩｄｎ＋１００が連結され、これによって、次のベクターを作製することか；あるいは、
（例えば、制限酵素で）ドナーベクターＤｎを消化して、ドナーベクターフラグメント（シントンコード配列Ｓｎ、シントンＳｎと隣接するシントンＳＡｎ＋１００との接続末端にある連結可能末端ＬＤｎ、別の連結可能末端ｌｄｎ、および選択マーカーを含む）を生成すること；ならびに、
上記ドナーベクターフラグメントを、アクセプターベクターフラグメント（シントンＳＡｎ＋１００、シントンＳＡｎ＋１００とシントンＳｎの接続末端にある連結可能末端ＬＡｎ＋１００、および別の連結可能末端ｌａｎ＋１００を含む）に連結することであって、ここで、ＬＡｎ＋１００およびＬＤｎは適合性でありかつ連結され、ｌａｎ＋１００およびｌｄｎは適合性でありかつ連結され、それによって、次のベクターを作製する、こと；
ｄ）工程（ｃ）のドナーベクターフラグメントの選択マーカーを選択することによって、次のベクターを選択する工程
ｅ）工程（ｃ）および（ｄ）をｎ−１回繰り返し、それによって、マルチシントンを生成する工程
による。
【０１２３】
種々の実施形態において、工程（ｄ）の選択マーカーは、以前の編成工程の選択マーカーと同じでなく、そして／または、次の編成工程の選択マーカーとも同じではない；ｌａ０、ｌｄ０、ｌａｎ、ｌｄｎは、同じであり、そして／またはＬａ０、Ｌｄ０、ＬａｎおよびＬｄｎは、ＩＩＳ型制限酵素により作製され；シントンＳＡ０、ＳＤ０、ＳＡｎ＋１００およびＳＤｎ＋１００は、合成ＤＮＡであり；シントンＳＡ０、ＳＤ０、ＳＡｎ＋１００またはＳＤｎ＋１００の任意の１つ以上は、マルチシントンであり；ならびに／あるいは、工程（ｅ）のマルチシントン生成物は、ＰＫＳドメインを含むポリペプチドをコードする。
【０１２４】
編成のための３つのアプローチが、本発明者らによって使用され、そのアプローチの各々が、（１）アセンブリベクターにシントンをクローニングする工程、（２）隣接するシントンを連結する工程、および（３）所望の構築物を選択する工程を含む。第１の編成アプローチは、「方法Ｓ」と呼ばれるが、ＩＩＳ型制限酵素についての認識部位の使用により促進される（または等価な活性（例えば、エンドヌクレアーゼ認識部位の外側の規定される距離において切断すること）を有する任意のエンドヌクレアーゼ）。第２の編成アプローチは、「方法Ｒ」と呼ばれるが、認識部位内で切断するエンドヌクレアーゼ（例えば、従来のＩＩ型制限酵素）についての認識部位によって促進される。第３の編成アプローチは、「方法Ｍ」として参照され、ライゲーション産物を途中で精製する必要なしに、複数のＤＮＡフラグメントをライゲーションするのに特に有用である。
【０１２５】
本明細書中に記載されるこれらの編成アプローチは、連結工程に違いがあるが、アセンブリベクターへのクローニングおよび選択のために同じ方法を使用する。これらの工程の各々は、以下に議論される。
【０１２６】
（４．２．１  アセンブリベクターにおけるシントンのクローニング）
用語「アセンブリベクター」は、遺伝子合成の編成工程のために使用されるベクターを呼ぶために使用される。本発明の１つの局面において、アセンブリベクターは、シントンがクローニングされ得る（挿入され得る）「シントン挿入部位」すなわち「ＳＩＳ」を有する。そのＳＩＳの構造は、使用されるクローニング法に依存する。シントン配列を含むアセンブリベクターは、「占拠された（ｏｃｃｕｐｉｅｄ）」アセンブリベクターと呼ばれ得る。シントン配列がクローニングされていないアセンブリベクターは、「空の」アセンブリベクターと呼ばれ得る。
【０１２７】
上記シントンをクローニングする任意の方法が、上記ベクターのＳＩＳへの上記シントンの導入のために使用され得るが、自動化されたハイスループットクローニングについては、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）法が好ましい。ＬＩＣについてのいくつかの方法が知られており、これには；一本鎖伸長ベースの方法およびトポイソメラーゼベースの方法が挙げられる（例えば、Ｃｈｅｎら、２００２，「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ−Ｆｒｅｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒｓ」ＢｉｏＴｅｃｈ  ３２：５１６−２０；Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎら、１９９２，「Ｕｒａｃｉｌ  ＤＮＡ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ」Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０６：９１−９７；およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．によるＴＯＰＯ−ｃｌｏｎｉｎｇを参照のこと）。あるＬＩＣ法は、（ａ）上記シントンおよび（ｂ）上記ベクター上で、互いにアニーリングするために十分長い（しばしば１２塩基〜２０塩基）、一本鎖の相補的な突出部を作製する工程を包含する。上記シントンおよび上記ベクターがアニーリングし、宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換されると、閉じた環状プラスミドが高効率で生成される。
【０１２８】
１つの実施形態において、３’突出部または「ＬＩＣ伸長部」が、ＰＣＲを使用して上記シントンに導入され、このＰＣＲプライマーは後に部分的に破壊される。この破壊は、ウラシル（Ｕ）残基をＰＣＲプライマーに（チミジンの代わりに）組み込むこと、そのプライマーを上記のアセンブリＰＣＲの生成物の３’末端上に連結すること、そして、ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ（ＵＤＧ）で消化することによって、達成され得る。ＵＤＧは、糖骨格からウラシル残基を切断し、他の鎖の塩基を、そのベクター上の相補鎖と自由に相互作用させる（例えば、Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎら、１９９２を参照のこと）。代替的な方法は、穏やかな塩基またはＲＮＡｓｅで切断されるリボヌクレオチドを含有するプライマーを組み込む工程を包含する。
【０１２９】
シントンの端にある配列が、実施者によって制御され得るので、単一のＵＤＧプライマー対が、多数の異なるシントンのＬＩＣのために使用され得、シントンの自動化されかつハイスループットなＬＩＣクローニングを可能にする。
【０１３０】
上記ベクター上に３’突出部を作製するためのいくつかのオプションがまた存在する。上記のように。Ｔの代わりにＵを含有するプライマーを使用して、プラスミド全体を複製し、その後、ＵＤＧで処理することによって、その３’突出部が生成され得る。あるいは、一方の鎖に複数のＵ’を含有する二本鎖フラグメントが、上記ベクターに連結され、その後、ＵＤＧで処理され得る。ＬＩＣ伸長部を生成するための特に有用な方法は、二本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）、および、配列特異的ニック形成エンドヌクレアーゼを用いて、適切に設計されたＳＩＳを消化することによる。図１は、例として、ベクターｐＫＯＳ２９３−８８−１からのＵＤＧ−ＬＩＣシントン挿入部位を使用するこの技術を例示する。また、実施例２も参照のこと。ニックが形成された直鎖状のＤＮＡが、エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理されて、小さなオリゴヌクレオチドが除去される（エキソヌクレアーゼＩＩＩは、３’→５’で切断し、３’突出部がないことを提供する）。代替的な方法において、上記ベクター上の３’突出部は、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩの作用によって生成される（実施例２を参照のこと）。「中央」制限部位は、制限エンドヌクレアーゼ、ニック形成エンドヌクレアーゼによる切断、その後の、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる消化が、相補的な３’突出部を有するフラグメントへのアニーリングのために適している複数の３’突出部を生じるように、位置づけられる。通常、その中央制限部位は、上記ベクター中の単一の独特（特有）の部位である。しかし、読者は、制限部位の対または組合せを使用して、同じ結果を達成し得ることを直ぐに理解する。
【０１３１】
代替的な実施形態において、上記ＳＩＳは、両方の鎖を切断する１つ以上の制限酵素についての他の認識部位（例えば、従来の「ポリリンカー」）を有し得、そして、シントンが、リガーゼ媒介性のクローニングによって挿入され得る。
【０１３２】
（４．２．２  シントンの確認）
大きな遺伝子のライブラリーのハイスループット合成は、多くの合成工程（例えば、オリゴヌクレオチドの合成から開始する工程）を必要とする。首尾よい結果（すなわち、所望の配列を有する遺伝子）の頻度を最大にするために、本発明は、その合成プロセス全体にわたって、最適な確認工程を提供する。（例えば、オリゴヌクレオチド合成、アセンブリＰＣＲおよびＬＩＣの後に）予測された配列を有するシントンを含むクローンを同定するために、アセンブリベクターＤＮＡが、通常、いくつか（代表的には５以上）のクローンから単離され、配列決定される。実施例３を参照のこと。シントンサンプルは、所望の配列を有するクローンが見出されるまで、配列決定され得る。あるいは、少数のエラー（例えば、わずか１つまたは２つの点変異）を有するクローンが、部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）を使用して修正され得る。ＳＤＭのための１つの方法は、元の遺伝子合成において使用した４０マーのオリゴヌクレオチドを使用する、ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発である。
【０１３３】
（４．２．３  方法Ｓ：接続ストラテジー、アセンブリベクターおよび選択スキーム）
上記のように、３つの異なる編成法「方法Ｓ」、「方法Ｍ」および「方法Ｒ」が、本発明者らによって使用されている。この節は、方法Ｓを記載する。
【０１３４】
（４．２．３．１  接続ストラテジー）
方法Ｓは、通常はシントンのコード配列の外側に位置付けられる（例えば、シントン隣接領域中に位置付けられる）ＩＩＳ型制限酵素の認識部位（上記の通り）の使用を必要とする。方法Ｓにおいて、ＩＩＳ型制限酵素についての認識部位が、（例えば、アセンブリＰＣＲの間に）シントン隣接領域内に導入され得る。この部位は、対応する制限酵素の付加が、そのシントンコード領域における切断と、連結可能末端の生成を生じるように位置付けられる。例示のためであり、制限はされないが、これは、以下に図解される（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、ＩＩＳ型制限酵素についての認識部位であり、Ｒ２およびＲ３での消化により、適合性の付着末端（例えば、同じ長さおよび方向の突出部）を生じ、ｖｖｖｖｖｖｖはアセンブリベクター領域であり、ｓｓｓｓｓｓｓｓは、シントンコード領域であり、ｓは、２つのシントンにおいて同じ配列であり、ｏｏｏは、シントン隣接領域である）。
【０１３５】
【化１】
2007533308.tif 000005
【０１３６】
この方法の１つの実施形態において、Ｒ１とＲ３が同じであり、Ｒ２とＲ４が同じである。このアプローチは、使用されるベクターの設計および編成プロセスを単純化する。別の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は同じである。代替の実施形態において、ＩＩＳ型認識部位は、上記隣接領域にではなく上記シントンコード領域内に存在し得、但し、それらの部位は、コード領域のコドン要件と調和して導入され得る。この方法は、認識配列に対して規定される位置における、認識部位の外側で切断して、ライゲーション可能な末端を生成する他の型のエンドヌクレアーゼを使用して、実行され得ることが理解される。
【０１３７】
上記の２つのシントンにおいて同じ配列（「ｓ」）は通常、少なくとも３塩基対を含み、しばしば、少なくとも４塩基対を含む。１つの実施形態において、上記配列は、５’−ＧＡＴＣ−３’である。表２は、例示的なＩＩＳ型制限酵素および認識部位を示す。図２は、酵素としてＢｂｓ  ＩおよびＢｓａ  Ｉを使用する方法Ｓ接続方法を例示する。
【０１３８】
【表２】
2007533308.tif 000006
【０１３９】
（４．２．３．２  アセンブリベクター）
図３は、上記の接続方法が、選択ストラテジーとどのようにして組み合わされて、効率的に一連の隣接するシントンを連結するかを例示する。１つの実施形態において、隣接するシントン（または隣接するマルチシントン）の対が、同族ベクター対のＳＩＳ部位にクローニングされ、ここで、これらの同族対の２つのメンバーが、差次的に検出可能である。これらの選択ストラテジーは、次の節（４．３．２．３）により詳細に議論される。この節においては、編成において使用され得る例示的な同族ベクター対、ならびに、編成プロセスの間に作製される特定の中間体（占拠された（ｏｃｃｕｐｉｅｄ）アセンブリベクター）を記載する。上に注記されるように、以下の考察はしばしば制限部位（例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ、Ｌ’）をいうが、等価な特性を有する他のエンドヌクレアーゼ（例えば、ホーミング型エンドヌクレアーゼ）もまた使用され得ることが理解される。
【０１４０】
（ベクター対Ｉ）
１つの実施形態において、編成ベクターは、ｉ）シントン挿入部位（ＳＩＳ）；ｉｉ）両方のベクターに共通するか、あるいは、各ベクターにおいて異なるが適合性末端を生じる、「右」制限部位（Ｒ１）；ｉｉｉ）各ベクターにおいて異なる第１の選択マーカー（ＳＭ２またはＳＭ３）；ｉｖ）各ベクターにおいて異なる第２の選択マーカー（ＳＭ４またはＳＭ５）；およびｖ）必要に応じて、両方のベクターに共通する第３の選択マーカー（ＳＭ１）を有する。本明細書で使用される規則は、ＳＭ２とＳＭ４が上記対の第１のベクター上にあり、ＳＭ３とＳＭ５が上記対の第２のベクター上にあり、ＳＭ２〜５は、全て異なることである。
【０１４１】
これらのエレメントの空間的配置は、以下であり得る：
（ＳＭ２またはＳＭ３）−ＳＩＳ−（ＳＭ４またはＳＭ５）−Ｒ１  ［Ｉ］
ベクターＩにおいて、上記の右制限部位は、通常、そのベクター中の独特（特有）の部位である。１つよりも多くの部位が存在する場合、さらなる部位は、さらなるコピーが、以下に記載されかつ図３Ａに例示されるストラテジーを妨害しないように位置付けられる。［例えば、アクセプターベクターにおいて、Ｒ１部位は、独特（特有）であり得、または、独特（特有）でない場合には、そのベクターのＳＩＳ（またはシントン）およびＳＭ２／ＳＭ３部位を含有する部分には存在せず、ＳＩＳ（または、シントンの接続末端）およびＲ１部位（すなわち、連結可能末端を生じるように切断されるＲ１）により境界を定められ得る。ドナーベクターにおいて、Ｒ１部位は、独特（特有）であり得、または、独特（特有）でない場合には、ＳＩＳ（またはシントン）およびＳＭ４／ＳＭ５部位を含有するベクターの部分には存在せず、ＳＩＳ（またはシントンの接続末端）およびＲ１部位（例えば、連結可能末端を生じるように切断されるＲ１）によって境界を定められ得る。
【０１４２】
Ｒ１部位は、連結可能末端（例えば、通常は付着末端）を形成する、任意のＩＩ型制限酵素についての認識部位であり得る。通常、その認識配列は、少なくとも５ｂｐであり、しばしば、少なくとも６ｂｐである。１つの実施形態において、その右制限部位は、ＳＩＳの約１ｋｂ下流である。本発明の１つの実施形態において、ドナーベクターのＲ１部位およびアクセプターベクターのＲ１部位は、同じではないが、各々が、制限酵素によって切断されると、適合性の付着末端を簡単に生じる。
【０１４３】
本発明の１つの実施形態において、ＳＩＳは、部位特異的なニック形成エンドヌクレアーゼによって認識される１対のニック形成部位（通常は、同じエンドヌクレアーゼは両方のニック形成部位を認識する）を有し、かつニック形成部位の間に位置付けられる、制限ヌクレアーゼによって認識される（ニックが形成されたＳＩＳを直鎖化し、これは上記のＬＩＣストラテジーに一致する）制限部位を有する、ＬＩＣに適切な部位である。１つの実施形態において、ニック形成エンドヌクレアーゼは、Ｎ．ＢｂｖＣ  ＩＡであり、これは、以下の配列を認識する
【０１４４】
【化２】
2007533308.tif 000007
従って、１つの実施形態において、ベクター対Ｉのベクターは、以下の構造を有し、ここで、Ｎ１およびＮ２は、複数のニック形成酵素（通常は同じ酵素）についての認識部位であり、Ｒ２は、上記のようなＳＩＳ制限部位であり、そして、Ｒ１およびＳＭ１〜５は、上記の通りである。例えば、
（ＳＭ２またはＳＭ３）−Ｎ１−Ｒ２−Ｎ２−（ＳＭ４またはＳＭ５）−Ｒ１    ［ＩＩ］
本発明の１つの実施形態において、ベクター対Ｉのベクターは、シントンにより「占拠され」ており、以下の構造を有し、ここで、２Ｓ１および２Ｓ２は、ＩＩＳ型制限酵素についての認識部位であり、Ｓｙは、シントンコード領域であり、そして、Ｒ１およびＳＭ１〜５は、上記の通りである。例えば、
（ＳＭ２またはＳＭ３）−２Ｓ１−Ｓｙ−２Ｓ２−（ＳＭ４またはＳＭ５）−Ｒ１    ［ＩＩＩ］
これは、編成のための有用な中間体構築物である。
【０１４５】
（ベクター対ＩＩ）
ベクター対ＩＩは、その対において各ベクター上に１つのみの独特（特有）の選択マーカーしか必要としない（すなわち、ＳＭは、一方のベクター上で見出されるが、他方では見出されない）が、さらなる選択マーカーが必要に応じて含められ得る。１つの実施形態において、その編成ベクターは、以下を有する：
ｉ）シントン挿入部位（ＳＩＳ）；
ｉｉ）ベクターＩについて上記したような「右」制限部位（Ｒ１）（通常は、両方のベクターに共通する）；
ｉｉｉ）同じであっても異なっていてもよい、各ベクター上にある「左」制限部位（ＬまたはＬ’）；
ｉｖ）各ベクターで異なる、第１の選択マーカー（ＳＭ２またはＳＭ３）
ｖｉ）各ベクターで異なる、必要に応じた第２の選択マーカー（ＳＭ４またはＳＭ５）；ならびに
ｖｉ）両方のベクターに共通する、必要に応じた第３の選択マーカー（ＳＭ１）。
【０１４６】
これらのエレメントの空間的配置は、
（ＳＭ４またはＳＭ５）−（ＬまたはＬ’）−ＳＩＳ−（ＳＭ２またはＳＭ３）−Ｒ１  ［ＩＶ］
であり得る。
【０１４７】
この実施形態において、上記の右制限部位（Ｒ１）および左制限部位（ＬまたはＬ’）は、通常、そのベクターにおける独特（特有）の部位である。これらが独特（特有）でない場合、以下に記載されかつ図３Ｂにおいて例示されるストラテジーを妨害しないように、さらなる部位が位置付けられる。任意のＩＩ型制限酵素についての認識部位が使用され得るが、代表的には、この認識配列は、少なくとも５ｂｐであり、しばしば、６ｂｐである。１つの実施形態において、上記の右制限部位は、ＳＩＳの約１ｋｂ下流である。
【０１４８】
上記のベクターはまた、宿主細胞におけるベクター機能に必要とされるかまたはベクターの維持に有用な、従来のエレメントを含む（例えば、上記のベクターは、１つ以上の複製起点、転写制御配列および／または翻訳制御配列（例えば、エンハンサーおよびプロモーター）ならびに他のエレメントを含み得る）。
【０１４９】
本発明の１つの実施形態において、ＳＩＳは、ベクター対Ｉの説明において上記されたような、部位特異的ニック形成エンドヌクレアーゼにより認識される１対のニック形成部位を備える配列を有する、ＬＩＣのために適切な部位である。従って、１つの実施形態において、ベクター対ＩＩのベクターは、以下の構造を有し、ここで、Ｎ１およびＮ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ、Ｌ’ならびにＳＭ２およびＳＭ３およびＳＭ１〜ＳＭ５は、上記の通りである。例えば、
（ＬまたはＬ’）−Ｎ１−Ｒ２−Ｎ２−（ＳＭ２またはＳＭ３）−Ｒ１  ［Ｖ］。
【０１５０】
本発明の１つの実施形態において、ベクター対ＩＩのベクターは、ＳＩＳ部位においてクローニングされたシントンを含み、以下の構造を有し、ここで、２Ｓ１および２Ｓ２、Ｓｙ、Ｒ１、Ｌ、Ｌ’、ＳＭ２および３は、上記の通りである。例えば、
（ＬまたはＬ’）−２Ｓ１−Ｓｙ−２Ｓ２−（ＳＭ２またはＳＭ３）−Ｒ１  ［ＶＩ］
図４は、例示的な編成ベクターｐＫｏｓ２９３−１７２−２およびｐＫｏｓ２９３−１７２−Ａ７６の模式図である。
【０１５１】
（４．２．３．３  選択スキーム）
（２選択マーカースキーム）
示されるように、図３は、上に示される接続方法が、いかにして選択ストラテジーと組み合わされて、一連の隣接するシントン（または他のＤＮＡ単位）を効率的に連結し得るかを例示する。ベクター対Ｉを使用して（図３Ａ）、隣接するシントンがクローニングされているこの対のベクターは、Ｒ１（例えばＸｈｏ  Ｉ）および２Ｓ１または２Ｓ２（接続末端に最も近い部位）のいずれかで消化され、それらの生成物が連結される。こうして、第１のシントンを含有するベクター（アクセプターベクター）が、３’−シントン端およびその３’シントン端の下流にあるＲ１にて制限酵素処理される。第２の３’隣接シントンを含有するベクター（ドナーベクター）は、５’シントン端およびＲ１にて制限酵素処理される。得られた生成物を連結して、２つのシントンを含有するベクターを再構築し、抗生物質耐性マーカーであるＳＭ２およびＳＭ５によって選択する。上記のドナープラスミドおよびアクセプタープラスミドの両方に由来する独特（特有）の選択マーカーを有する陽性クローンについて選択することによって、所望のライゲーション産物を有するクローンが選択される。
【０１５２】
組換えクローンの発現および選択のための細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞）の形質転換は周知であり、そして本発明のライゲーション産物は、慣用的な技術を使用して操作され得る。本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学の従来の技術（組換え技術を含む）、微細胞生物学の従来の技術、細胞生物学の従来の技術、生化学の従来の技術、核酸化学の従来の技術、および免疫学の従来の技術を使用し、これら技術は当業者の範囲内であることが、当業者によって理解され得る。このような技術は、文献に完全に説明される（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７（２００１年までの補遺を含む）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ，２００１））。
【０１５３】
並行反応を実行することによって、４つの２シントンベクターを同時に調製して、４つの２シントンベクターを調製する。続いて、同じアプローチを用いて、４つの２シントンフラグメントを編成して、２つの４シントンフラグメントを作製し、次いで、その２つの４シントンフラグメントを一緒に編成して、１つの８シントン生成物を作製する。例示のために、各々が２つの独特（特有）のＳＭ（ＳＭ２、ＳＭ４およびＳＭ３、ＳＭ５）を有するベクター対を考慮する。配列Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３−Ｓ４−Ｓ５−Ｓ６−Ｓ７−Ｓ８（Ｓ１〜Ｓ８はシントンである）という仮想８シントンモジュールを作製するために、表３にまとめるように、シントン１、シントン４、シントン６およびシントン７がＳＭ２マーカー＋ＳＭ４マーカーを有するベクター中にクローニングされ、シントン２、シントン３、シントン５およびシントン８がＳＭ３マーカー＋ＳＭ５マーカーを有するベクター中にクローニングされ得る。
【０１５４】
【表３】
2007533308.tif 000008
【０１５５】
１は、シントンがクローンにングされたベクターの特有（独特）のマーカーを示す。
２は、シントンが組み合わされた後に選択されるマーカーを示す。
【０１５６】
同じ手順が、シントン３を含有するベクター（ＳＭ３、ＳＭ５）およびシントン４を含有するベクター（ＳＭ２、ＳＭ４）の２つのベクターに適用される。これは、ＳＭ３およびＳＭ４を含有する２シントンベクターを生じ、これらのマーカーについて選択可能である。続いて、シントン３およびシントン４を含有する２シントンインサートを、第１の２シントンベクター（シントン１およびシントン２を含有する）中にクローニングして、ＳＭ２＋ＳＭ４ベクター内に４シントン生成物（１−２−３−４）を生じる。これは、シントン５、シントン６、シントン７およびシントン８を用いて繰り返され得、ＳＭ３＋ＳＭ５ベクター中に４シントンインサート（５−６−７−８）を生じる。この２つが、次いで、上記のように合わせられて、ＳＭ３ベクター内に８シントンモジュールを生じる。
【０１５７】
複数のモジュールが、２ｎ個のシントンを含むように設計することによって、そして、シントン編成反応を並行処理することによって、完全なモジュールが、ｎ回の操作で構築され得ることが理解され得る。
【０１５８】
１対を組み合せる工程は、連結工程を最小限にし、従って、特に効率的にするが、方法Ｒについて図７に例示されるような他の組合せストラテジーが使用され得る。
【０１５９】
（１マーカースキーム）
代替的な選択ストラテジーは、ベクター対ＩＩを使用する。このストラテジーに従って、各ラウンドにおいて、その２つのベクターが等量で混合され、制限酵素Ｒ１、制限酵素Ｌ（またはＬ’）、および接続されるべき２つのシントン端における制限部位に対応するＩＩＳ型酵素を用いて、同時に完全に消化され、その後連結される。図３Ｂにおいて、シントン１＋ＳＭ２を含有するベクターは、そのシントンの右端およびＲで切断され、シントン２＋ＳＭ３を含有するベクターは、そのシントンの左端およびＲ１およびＬ’で切断される。Ｌ’における切断は、このフラグメントの再連結を防止することが意図される。フラグメントの混合物が、連結され、形質転換され、そして、抗生物質上で細胞を増殖して、ＳＭ１およびＳＭ３について選択される。これらの選択条件下で、優勢なクローンが、所望の２シントン生成物である。
【０１６０】
表４は、ベクター対ＩＩを使用して、配列１−２−３−４−５−６−７−８の仮想８シントンモジュールを編成するための選択スキームを示す。表４にまとめるように、シントン１、シントン４、シントン６およびシントン７が、ＳＭ２マーカーを有するベクター中にクローニングされ得、シントン２、シントン３、シントン５およびシントン８が、ＳＭ３マーカーを有するベクター中にクローングされ得る。
【０１６１】
【表４】
2007533308.tif 000009
【０１６２】
（４．２．４  方法Ｍ：アセンブリベクター、接続ストラテジーおよび選択スキーム）
関連する局面において、選択可能なマーカーと対抗選択可能なマーカー（すなわち、対抗選択可能なマーカー）との組み合わせは、複数のＤＮＡセグメントまたはＤＮＡ単位（例えば、シントンコード領域）の迅速なライゲーションを容易にするために使用される。本方法の利点は、数種のＤＮＡフラグメントが、同時に一緒にライゲーションされ得ることである。本明細書中で使用される場合、複数のポリヌクレオチドフラグメントの「同時の」ライゲーションとは、中間の切断または中間のライゲーション生成物の精製を介在する必要をほぼ伴わない、単一工程における（すなわち、同じ容器中での）複数のフラグメントのライゲーションをいう。
【０１６３】
この迅速なライゲーション方法は、種々の型のＤＮＡセグメント（例えば、合成ＤＮＡ、天然に存在するＤＮＡ、およびキメラＤＮＡが挙げられる）を接続するために有用である。同時にライゲーションされるセグメントの数は、ときとして、少なくとも３つであり、多くの場合、少なくとも４つであり、そしてより多くの場合、少なくとも５つである。いくつかの実施形態において、同時にライゲーションされるセグメントの数は、３、４、５、および６から選択されるより低い値、および４、５、６、７、８、９および１０から独立して選択されるより高い値（ここで、より高い値はより低い値より大きい）によって定義される範囲である。幅広い範囲の大きさのセグメント（例えば、３０ｂｐ長から１ｋｂ長を上回る範囲のフラグメント）が、本方法によってライゲーションされ得る。本発明の１つの実施形態において、ライゲーションされるべきセグメントは、約３００ｂｐ長〜約７００ｂｐ長（例えば、約４００ｂｐ長〜約６００ｂｐ長）の範囲の合成シントンである。
【０１６４】
（用語法）
３つ以上のＤＮＡセグメントの任意の所定のライゲーションにおいて、このセグメントのうちの２つは、得られるライゲーション生成物の末端に位置すると考えられ得、そしてその他のセグメントは、これらの末端の間に位置する。これらの位置に基づいて、このＤＮＡフラグメントは、「末端セグメント」または「内部セグメント」と言われ得る。「末端セグメント」は、一般的ではないが、遊離の終端を有し得る（例えば、これらの終端は、隣接するベクター配列と連続していても、一緒にライゲーションされて環状生成物を形成してもよい）ことが理解される。これら２つの末端セグメントはさらに、「上流」末端セグメントおよび「下流」末端セグメントと命名され得る。この文脈において、一方の末端セグメントを「上流」とし、そして第２の末端セグメントを「下流」とする命名は、任意であり得るが、このセグメントがコード配列を含む場合、「上流」とは、通常、一般的慣例に合わせてコーディング鎖の５’方向をいうことが明らかである。参照を容易にするために、最も遠い上流ＤＮＡフラグメントは、「セグメント１」と称され、そして残りのＤＮＡセグメントは、ライゲーションから得られるポリヌクレオチド中に見出される順序に従って一連に番号を付けられる。したがって、４つのセグメントのライゲーションにおいて、これらのセグメントは、１、２、３および４と番号を付けられ、この４は、下流末端セグメントである。同様に、６つのセグメントのライゲーションにおいて、これらのＤＮＡセグメントは、１、２、３、４、５および６と番号を付けられ、この６は、下流末端セグメントである。
【０１６５】
本発明に従って、上記末端セグメントおよび上記内部セグメントは、アセンブリベクター（以下に記載される）中にクローニングされる。１つの実施形態において、「シントンコード領域」および「シントン側方領域」を含むシントンは、本明細書中で他所に記載される通りに調製される（例えば、必要に応じてリンカーの付加を伴う、アセンブリＰＣＲ、完全合成、またはクローニングされたＤＮＡの消化によって）、そして上記アセンブリベクター中にクローニングされる。この場合において、このシントンの「シントンコード領域」は、「末端セグメント」および「内部セグメント」に対応する。
【０１６６】
（アセンブリベクター）
方法Ｍにおいて、ライゲーションされるセグメント（本明細書中で、以下「シントンコード領域」と称される）を含むポリヌクレオチド（本明細書中で、以下「シントン」と称される）は、アセンブリベクターの３つの型のうちの１つにクローニングされ、このことは、このシントンが、「上流」末端セグメント（１型ベクター中にクローニングされる）、「下流」末端セグメント（２型ベクター中にクローニングされる）または「内部」セグメント（３型ベクター中にクローニングされる）を含むか否かに依存する。これらのベクターの型の各々は、以下に記載され、そして図２０に示される。
【０１６７】
１型ベクター、２型ベクターおよび３型ベクターは、シントン挿入部位および対抗選択可能なマーカーを含む。１型ベクターおよび２型ベクターは、「固有の選択可能なマーカー」を、さらに含む。３型ベクターは、「増殖選択可能なマーカー」を、さらに含む。好ましい実施形態において、１型ベクターおよび２型ベクターもまた、「増殖選択可能なマーカー」を含む。
【０１６８】
（ａ）シントン挿入部位（「ＳＩＳ」）は、上記され（例えば、節４．２．１）、そしてライゲーション非依存性のクローニングおよび慣習的なクローニング方法に適した部位を含む。１つの実施形態において、このＳＩＳは、稀な切断エンドヌクレアーゼ（例えば、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ  Ｒ０６９９、Ｉ−ＳｃｅＩ  Ｒ０６９４など；図２０を参照のこと）のための認識部位に隣接される。この稀な切断部位は、ライゲーション生成物の大きさの確認およびライゲーション生成物の他の操作のために有用である。シントンがクローニングされている１型ベクター（例えば、「占有されたアセンブリベクター」）は、「１型ＤＮＡ分子」と称され得る。同様に、シントンがクローニングされている２型ベクターは、「２型ＤＮＡ分子」と称され得、そしてシントンがクローニングされている３型ベクターは、「３型ＤＮＡ分子」と称される。したがって、これらの１型ＤＮＡ分子、２型ＤＮＡ分子、および３型ＤＮＡ分子は、シントン配列およびベクター配列の両方を含む。
【０１６９】
（ｂ）「増殖選択可能なマーカー」（「ＳＭ」）は、ベクター中へのシントンの最初のクローニング、形質転換体についてのスクリーニング、および他の使用のために有用である選択可能なマーカー（例えば、薬剤耐性を付与する遺伝子）である。好ましい実施形態において、このＳＭは、１型ベクターおよび２型ベクターおよび３型ベクター上に見出される。ベクターの型の各々において共通のＳＭを使用することは、異なるベクターの簡便な同時選択を同時に可能にし、そして他の利点を有し；したがって、１つの実施形態において、このＳＭは、３つのベクター全てに関して同じである。しかし、代替的な実施形態において、これらの１型ベクターおよび２型ベクターの「固有の選択可能なマーカー」は、日常的なクローニング工程の間の選択のために使用され、したがってこれらのベクター上のＳＭを置換する。
【０１７０】
（ｃ）対抗選択可能なマーカー（「ＣＳＭ」）は、特定の選択条件下での細胞増殖において発現される場合に、細胞死を引き起こす（これによって、この遺伝子を含む任意の細胞に対して選択する）遺伝子である。対抗選択可能なマーカーは、当該分野において周知である。対抗選択可能なマーカーの例としては、ｃｃｄＢ（抗ＤＮＡジャイレースタンパク質）、ｓａｃＢ（スクロース感受性）、ａｒａＢ（リブロース感受性）、ｔｅｔＡＲ（テトラサイクリン耐性／フザリン酸過感受性）およびその他のマーカーが挙げられる。
【０１７１】
（ｄ）上記１型ベクターおよび上記２型ベクターは、それぞれ「固有の選択可能なマーカー」（Ｕ−ＳＭ）を含む。この文脈において、「固有の」は、このマーカーが、ライゲーション反応に使用される異なる型のベクター上に見出されないことを意味する。したがって、この１型ベクターのＵ−ＳＭは、上記２型ベクターのＵ−ＳＭと異なり、そして両方は、増殖選択可能なマーカーと異なる。図２０において、１型ベクター上の固有の選択可能なマーカーは、「Ｕ−ＳＭ２」または「Ｕ−ＳＭ４」と名付けられ、そして２型ベクター上の固有の選択可能なマーカーは、「Ｕ−ＳＭ３」または「Ｕ−ＳＭ５」と称される。
【０１７２】
（ｅ）上記１型ベクターおよび上記２型ベクターはまた、対抗選択可能なマーカー（ＣＳＭ）と上記固有の選択可能なマーカー（Ｕ−ＳＭ）との間に位置決めされる切断部位（「Ｒ」）を含む。代表的に、この切断部位は、切断の際にライゲーション可能な末端を生じるエンドヌクレアーゼ切断部位である。上記１型ベクターおよび上記２型ベクターのＲ部位は、好ましくは同じであるか、または異なる（しかし、エンドヌクレアーゼ消化の際に適合性の（ライゲーション可能な）突出を生成する）。１つの実施形態において、「Ｒ」は、固有のエンドヌクレアーゼ切断部位である（すなわち、上記ＳＩＳに挿入されるフラグメントを含むベクター中の他所に見出されない）。１つの実施形態において、このＲ部位は、Ｘｈｏ  Ｉ部位である。１つの実施形態において、この１型ベクターおよびこの２型ベクターは、数種のエンドヌクレアーゼ認識部位のクラスター（例えば、マルチクローニングサイトカセット）を含み、このベクターまたはＳＩＳ部位に挿入されるシントン中の他所に見出されず、したがってこのＲ部位としての使用するのに適切である１つ以上の部位の選択を実行者に提供する。１つの実施形態において、このＲ部位は、ホーミング型エンドヌクレアーゼの切断部位である。
【０１７３】
１つの実施形態において、上記Ｒ部位は、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位である。このＲ部位がＩＩＳ型切断部位である場合、これは、ときとして、酵素認識部位が最終ライゲーション生成物中に保持されるようにこの認識部位を位置決めするのに有用である。１つの実施形態において、以下にさらに詳細に記載されるように、このＲ部位は、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位であり、このエンドヌクレアーゼはまた、シントンコード領域もしくは隣接するシントンコード配列に対してライゲーションされるライゲーション可能な末端を生じる領域の端で切断する。
【０１７４】
（ｆ）必要に応じて、上記１型ベクター、上記２型ベクターおよび／または上記３型ベクターは、ＳＩＳ（またはシントン）に隣接する一対のエンドヌクレアーゼ切断部位を有し得る。これらの部位は、ライゲーション生成物の操作のために有用である。図２０Ａにおいて、Ｎｏｔ  Ｉ部位およびＰａｃ  Ｉ部位が、示される（例示のためであり、かつ限定ではない）。（これらの部位は、図２０Ｂ、図２０Ｃまたは図２０Ｄに示されないが、必要に応じて存在する）。好ましい実施形態において、フランキング（側方）エンドヌクレアーゼ部位は、「稀なカッター（ｃｕｔｔｅｒ）」エンドヌクレアーゼによって認識される。
【０１７５】
（ベクターの編成）
図２０Ａ〜図２０Ｄに示されるように、上記対抗選択可能なマーカーＣＳＭの相対的な位置、上記固有の選択可能なマーカーＵ−ＳＭ、上記切断部位Ｒ、および上記ＳＩＳに挿入されるシントンは、上記１型ベクターおよび上記２型ベクターにおいて異なる：１つのベクターにおいて、この順序は、５’−シントン−３’→ＣＳＭ→Ｒ→Ｕ−ＳＭであるが、第２のベクターにおいて、この順序は、このシントンの５’−３’方向が、得られるマルチシントン（ｍｕｌｔｉｓｙｎｔｈｏｎ）中のこれらの方向と一致する（そして通常、このコーディング鎖の５’→３’方向性に対応する）場合に５’−シントン−３’→Ｕ−ＳＭ→Ｒ→ＣＳＭである。
【０１７６】
（シントン配列のエンドヌクレアーゼ部位）
シントンは、（例えば、アセンブリＰＣＲによって）調製され、そして上記されるようなベクターのＳＩＳ中にクローニングされる。上記においても議論されるように、このシントンは、切断の際に隣接するシントンコード領域の接続部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）にライゲーション可能な末端を生成する、エンドヌクレアーゼ切断部位を含む。各シントン側方領域は、適切なエンドヌクレアーゼによる消化が隣接するシントンに対して特異的であるライゲーション可能な末端（シントンコード領域の端に配置される）の生成を生じるように設計される。
【０１７７】
１つの実施形態において、上記エンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型制限酵素（または切断部位がこのエンドヌクレアーゼ認識部位の外側にある他のエンドヌクレアーゼ）である。このようなエンドヌクレアーゼが使用される場合、ライゲーション可能な末端は、図３に示される原理に従い、重複するコード領域を有するシントンを提供し、そして隣接するシントンの共通配列中に適合性の突出を生成するエンドヌクレアーゼを使用することによって形成され得る。エンドヌクレアーゼを選択し、そして消化が、隣接するシントンに対して適合性の付着末端を生成するように位置決めされるエンドヌクレアーゼ認識部位を設計することは、この開示によって導かれる当業者の能力の範囲内である。
【０１７８】
異なる実施形態において、上記ライゲーション可能な末端は、シントンコード領域の端において部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ）による切断によって生成され、そして一般的には節４．２．５．１の図に示されるように、隣接するシントンの末端において、類似の（または適合性の）部位に対してライゲーション可能な終端を生じる。隣接するシントンの端における適合性の（例えば、同一の）制限酵素部位は、切断され、そして一緒にライゲーションされる。
【０１７９】
任意の所定のライゲーションに関して、得られる突出（ライゲーション可能な末端）がこのライゲーション反応における特定のセグメントに対して固有であるように、切断部位を選択することが望ましいことは、本特許の教示によって導かれる読み手によって理解される。例えば、４つのセグメントのライゲーションにおいて、セグメント２とセグメント３との間の突出は、固有であり、そしてセグメント３とセグメント４との間の突出とは適合しない。このことは、これらのセグメントの正しい順序付けを確実にする。本開示によって導かれる当業者は、エンドヌクレアーゼ選択し、そして消化が隣接するシントンに対して適合性の付着末端を生成するように位置決めされる、エンドヌクレアーゼ認識部位を設計する。
【０１８０】
各シントンまたは各シントンコード領域は、２つの末端または２つの端を有する。上流末端セグメントおよび下流末端セグメントの各々に関して、一方の末端におけるエンドヌクレアーゼ切断部位は、ライゲーションの任意の特定のラウンドにおける最終ライゲーション生成物中の隣接するシントンにライゲーションされる付着末端を生じる（エンドヌクレアーゼによる処理の際に）。その内部セグメントは、それぞれの末端にエンドヌクレアーゼ切断部位を含み、この切断部位の各々は、２つの隣接するシントンにライゲーションされる付着末端を生じる（エンドヌクレアーゼによる処理の際に）。内部セグメント中のこれら２つ部位は、５’切断部位および３’切断部位と称される。
【０１８１】
（複数のフラグメントの形成およびライゲーションならびに生成物の選択）
アセンブリベクター中へのシントンの挿入後、このベクターは、以下に記載される通りに消化されて、規定されたフラグメントを生成し、次いでこのフラグメントはライゲーションされて、より大きいポリヌクレオチド（例えば、マルチシントン）を生成し得る。その後の工程において、複数のシントンは結合されて、さらに大きい分子を生成し得る。
【０１８２】
本発明の１つの実施形態において、上流末端セグメントを含む１型アセンブリベクターは、（ｉ）上記Ｒ部位および（ｉｉ）シントンコード配列の一方の端にて切断する１種以上の酵素によって消化されて、ライゲーション可能な末端を生成する。切断されるシントンコード配列の端は、次いで隣接するセグメントに接続される端であり、そして代表的に、このシントンコード配列の３’末端である。このＲ部位におけるライゲーション可能な末端は、上記２型アセンブリベクターのＲ部位における消化の際にこの２型アセンブリベクター中に生成される末端に、ライゲーション可能である。このシントンコード配列の端におけるライゲーション可能な末端は、隣接する（例えば、下流の）、内部シントン中に生成される末端にライゲーション可能である。
【０１８３】
単数または複数の内部セグメントを含む、単数または複数の３型アセンブリベクターは、切断する１種以上の酵素によって消化され、シントンコード領域の両端にライゲーション可能な末端を生成する。
【０１８４】
下流末端セグメントを含む２型アセンブリベクターは、（ｉ）上記Ｒ部位および（ｉｉ）シントンコード配列の一方の端にて切断する１種以上の酵素によって消化されて、ライゲーション可能な末端を生成する。上記１型ベクターに類似して、切断はシントンコード配列の端に存在し（この端は次いで隣接するセグメントに接続される）、そして代表的にはこの２型ベクターについてのシントンコード配列の５’末端である。このＲ部位におけるライゲーション可能な末端は、１型アセンブリベクターのＲ部位にて消化される際にこの１型アセンブリベクター中に生成される末端に、ライゲーション可能である。このシントンコード配列の端におけるライゲーション可能な末端は、隣接する（例えば、上流の）内部シントン中に生成される末端にライゲーション可能である。
【０１８５】
それぞれ個々のベクターのエンドヌクレアーゼ消化は、別個に（例えば、別々のチューブ、チャンバー、またはウェルにおいて）行われ得、次いで切断生成物は、ライゲーションのために組み合わされる。あるいは、複数のベクター（例えば、ライゲーションのためのセグメントを含む上記１型ベクターおよび上記２型ベクターおよび全ての上記３型ベクター）は、同じチューブ中で同時に消化され得る（但し、使用されるエンドヌクレアーゼは、適合可能な条件（例えば、温度、ｐＨ、イオン濃度など）下において活性である）。１つの実施形態において、切断が上記されるシントンの端の全てにおける切断部位、ならびにこの１型ベクターおよびこの２型ベクターのＲ部位に関する切断部位は、同じ酵素（例えば、同じＩＩＳ型制限酵素）のための切断部位である。このような設計は、切断工程に必要とされるエンドヌクレアーゼ、緩衝液などの数および量の低減が可能である限り有利である。あるいは、複数の異なる酵素は、必要な場合に緩衝液の調整、酵素の不活化などを伴って、同じチューブにおいて同時に使用されても連続して使用されてもよい。
【０１８６】
図２０Ｂは、マルチシントンを作製するためのシントン１、シントン２、シントン３およびシントン４の４つのセグメントのライゲーションを示す。図において、１．１、１．２およびＡ〜Ｆは、エンドヌクレアーゼ認識部位である。この１型ＤＮＡ分子、この２型ＤＮＡ分子およびこの３型ＤＮＡ分子（占有されたアセンブリベクター）は、部位Ａ〜ＦおよびＲを認識するエンドヌクレアーゼによって消化される。１実施形態において、Ａ〜ＦおよびＲは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位であり、そして必要に応じて同じ酵素である。得られたフラグメントは、付着末端のアニ−リングおよびライゲーションによって接続され、細胞は、このライゲーション生成物によって形質転換され、そしてＵ−ＳＭ２およびＵＳＭ３を発現するがＣＳＭ１を発現しない形質転換体が、選択される。このライゲーションの生成物および選択は、図２０Ｂに示される。エンドヌクレアーゼ認識部位１．１および１．２が、図２０Ｃに示されるような、ライゲーションのその後のラウンドに使用され得ることに注目すること。図２０Ｃにおいて、第１のマルチシントン（シントン１→シントン４）は、まさに上記の通りに調製される。第２のマルチシントン（シントン５→シントン８）は、ライゲーションの第１ラウンドにおいて使用される１型ベクターおよび２型ベクターが、固有の選択可能なマーカーの異なるセットを含み（図２０Ａに示されるベクターの第１の対と第２の対とを比較する）、そしてこの上流セグメントおよび下流末端セグメント（シントン５およびシントン８）が、（例えば、このシントンコード領域における）エンドヌクレアーゼ認識部位２．１および２．２によって遠位に結合されることを除いて、まさに上記される通りに調製される。図２０Ｃに示される通り、１．２部位および２．１部位を認識し、そして互いにライゲーション可能な末端を形成するエンドヌクレアーゼによる消化、ならびにＲ部位を認識して、互いにライゲーション可能な末端を形成するエンドヌクレアーゼによる消化の際に、フラグメントは、ライゲーションの際にマルチシントン１→８をもたらすように生成される。これらのライゲーションフラグメントは、付着末端のアニーリングおよびライゲーションによって接続され、細胞は、このライゲーション生成物によって形質転換され、そしてＵ−ＳＭ２およびＵＳＭ５を発現する形質転換体が、選択される。１実施形態において、１．２および２．１を認識するエンドヌクレアーゼは、同じであり、そして必要に応じてＲを認識するエンドヌクレアーゼと同じものである。図２０Ｄは、示されるように、上記ＳＭがｃａｒｂ（カルベニシリン耐性）であり、上記Ｕ−ＳＭがｔｅｔ（テトラサイクリン耐性）およびｋａｎ（カナマイシン耐性）であり、上記ＣＳＭは、ａｒａＢ（リブロース感受性）であり、上記Ｒ部位が、ＢｓａＩによって両方とも認識され、そして上記他のエンドヌクレアーゼ認識部位が、ＢｓａＩ、ＥｃｏＲＩおよびＢｂｓＩである１型ベクター、２型ベクターおよび３型ベクターを使用する４つのシントンのライゲーションを示す。
【０１８７】
別個のチューブにおいて実行されるか、またはプールされるかにかかわらず、本方法の利点は、ライゲーション前に、セグメントを単離するか、または精製する必要がない点である。非生産的なライゲーション生成物が形成されることが推定されるが、本発明の選択システムは、所望の生成物に関する迅速かつ効率的（すなわち、正確な構築物  対  不正確な構築物の高い比率）な単離を可能にする。必要に応じて、さらなる工程は、望ましくないライゲーション生成物を減少させるか、または排除するために採用され得、これらの工程としては、例えば、（ｉ）ベクターに複数回切り込みをいれる酵素を使用する、ベクター配列（例えば、ライゲーション生成物の一部でないと意図される配列）の消化；（ｉｉ）ライゲーションされていないと意図される配列（例えば、ベクター配列）に特異的にハイブリダイズする固定化プライマーの使用しての、望まれないベクター配列の除去が挙げられる。例えば、ビオチン化プライマーは、不要なベクター配列にハイブリダイズし得、得られた複合体は、ストレプトアビジンビーズを使用して除去される。関連する実施形態において、このプライマーは、磁性ビーズに対して標識化される。
【０１８８】
（ライゲーションおよび選択）
ライゲーション可能な末端の生成後、セグメントは、アセンブリベクターの各々の消化から得たアリコートを合わせ、（別々に消化された場合）そして適切な緩衝液中でリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）を添加するか、またはこのアセンブリベクターが消化のためにプールされる場合には、このプールされた反応混合物またはこのプールされた反応混合物のアリコートにリガーゼを添加することによって１つにライゲーションされる。一般的に、リガーゼの添加前に、上記エンドヌクレアーゼは、不活性化される（例えば、６５℃〜８０℃で２０分間か、または２５℃で１５時間のインキュベーション）。
【０１８９】
細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）は、慣習的な方法によりライゲーション混合物を使用して形質転換され、そして所望のライゲーション生成物を有するベクターを含む細胞は、固有の選択可能なマーカー（Ｕ−ＳＭ）を有するプラスミドを含み、かつ対抗選択可能なマーカーを保有するプラスミドを含まない細胞のみが生き残る選択条件下において増殖される。例えば、このＵ−ＳＭは、ｋａｎマーカーおよびｃａｒｂマーカーであり、そしてこのＣＳＭは、ｓａｃＢであり、細胞は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、および５％のスクロースを使用して選択され得る。
【０１９０】
（さらなるライゲーション）
図２１に示されるように、上記のようにそれぞれ調製されるマルチシントン（しかし、異なるＵ−ＳＭを有する１型ベクターおよび２型ベクターを使用する）が合わせられて、より大きいポリヌクレオチドを生成し得る。１実施形態において、マルチセグメント（ｍｕｌｔｉｓｅｇｍｅｎｔ）のライゲーションの第１ラウンドから得られる２つの構造物は、それぞれ、これら２つのマルチシントンの間の接続を定義する切断部位、および「Ｒ」部位において切断される。この得られる生成物は、一緒にライゲーションされ、細胞は、このライゲーション生成物によって形質転換され、そして２種の固有の選択可能なマーカーを使用して選択される。
【０１９１】
（４．２．５  方法Ｒ：ベクターアセンブリ、接続ストラテジー、および選択スキーム）
（４．２．５．１  接続ストラテジー）
方法Ｒは、シントンのコード配列の端にあるＩＩ型制限酵素（または同等に、等価な特性を有する他の配列特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ホーミング型エンドヌクレアーゼ）についての認識部位の使用を必要とする。隣接するシントンの端にある適合性（例えば、同一）の制限部位が切断され、そして生じた末端が一緒に連結される。例示のためであり限定する意図はないが、これが、以下に模式化される（Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は異なるＩＩ型制限酵素についての認識部位であり、ｖｖｖｖｖｖｖは、アセンブリベクター領域であり、ｓｓｓｓｓｓｓｓはシントンコード領域であり、ｏｏｏは、シントン隣接領域である）。
【０１９２】
【化２Ａ】
2007533308.tif 000010
【０１９３】
ＳＭ２またはＳＭ３と特定のシントン（モジュール内のそれらの位置に依存する）との関連およびそれらのシントンにおける制限部位の選択の両方が重要である。上記のように、シントンは、そのシントンの左右の端の両方において有用な制限部位を有するように設計され、これらの部位は、隣接するシントンの端が共通（または適合性）の制限部位を共有するように選択される。例えば、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、配列６、配列７および配列８を含むシントンの編成によって、配列１−２−３−４−５−６−７−８を有するモジュールを調製するために、隣接するシントンの端は、以下のように共通の部位Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨを共有し得る：Ａ−１−Ｂ、Ｂ−２−Ｃ、Ｃ−３−Ｄ、Ｄ−４−Ｅ、Ｅ−５−Ｆ、Ｆ−６−Ｇ、Ｇ−７−Ｈ、Ｈ−８−Ｘ。例示のため、図５を参照のこと。図５において、ベクターはＬ’において消化により切断されて、所望されないライゲーション産物の形成を低減させる。得られた２シントン産物は、ドナーベクターとして次の工程において使用される場合、Ｌにおいて消化によって切断されることは、明らかである。
【０１９４】
この方法についての基本は、シントンの端に独特（特有）の制限部位を含むシントン（および成分オリゴヌクレオチド）の設計である。このことは、（そのシントンの端における）有用な制限部位の存在（挿入）およびそのシントンの内側におけるこれらの部位の不在（除去）の両方を必要とする。実施例４は、モジュールアミノ酸配列における破壊的な変化を生じることなく、シントンおよびモジュールにおいて操作され得る有用な制限部位を同定するためのストラテジーを記載し、１４０ＰＫＳモジュールの分析から得られる例示的な結果を提供する（図６および表８〜１２を参照のこと）。以下の５節は、所望のパターンの制限部位を有するシントンを生成するために使用され得るオリゴヌクレオチドの設計のための、コンピュータ実行可能なアルゴリズムを記載する。
【０１９５】
（４．２．５．２  アセンブリベクター）
方法Ｒは、方法Ｓのために有用なものと同じベクター対を使用して実行され得る。方法Ｒを使用して、ベクター対Ｉのベクターは、ＳＩＳ部位にクローニングされたシントンを含み、以下の構造を有し得る（ここで、Ｒ３およびＲ４は、シントンの端にある制限部位またはエンドヌクレアーゼ部位であり、他の略語は、以前に記載された通りである）：
−（ＳＭ４またはＳＭ５）−Ｒ３−Ｓｙ−Ｒ４−（ＳＭ２またはＳＭ３）−Ｒ１  ［ＶＩＩ］。
これは、編成のために有用な中間体構築物である。
【０１９６】
（４．２．５．３  選択スキーム）
方法Ｓについて記載された選択スキームが、方法Ｒについて使用され得る。シントンの端にある制限部位は、ベクターのエンドヌクレアーゼ部位（例えば、制限部位）ＬおよびＬ’における消化と適合性であるように設計されなければならないことが、理解される。
【０１９７】
（５．遺伝子設計およびＧｅＭＳ（遺伝子変形システム（ｇｅｎｅ  ｍｏｒｐｈｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ））アルゴリズム）
本発明の合成遺伝子の設計、ならびに、遺伝子合成のために使用され得るオリゴヌクレオチドの設計は、多数の因子を同時に考慮することを必要とする。例えば、本発明の合成モジュール遺伝子は、所望のアミノ酸配列および／または活性を有するポリペプチドをコードし、代表的には、
・特定の発現宿主のコドン優先度（ｃｏｄｏｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を使用し、
・編成方法と矛盾する制限部位を含まず（例えば、編成法Ｓにおいて使用されるＩＩＳ型部位）、そして／または、編成方法と矛盾する制限部位を含まないシントンから構成され（例えば、編成方法Ｒにおいて使用されるＩＩ型部位）、そして／または、（以下に記載されるように）オープンリーディングフレームおよび遺伝子ライブラリーの構築と矛盾する制限部位を含まず、
・特定の位置（例えば、ドメインコード領域の端、シントン端、モジュール境界およびシントン内）において、有用な（例えば、特有（独特）の）制限部位または配列モチーフを含む。限定はされないが、シントン内の制限部位は、遺伝子合成または大きな遺伝子の他の改変におけるエラーを修正するために使用される；シントン端にある制限部位および／または配列モチーフは、ＬＩＣクローニング（例えば、ＵＤＧ−リンカーの付加）、編成のために使用される；ドメインの端にある制限部位は、ドメイン「交換」のために使用され、モジュール端にある制限部位は、モジュール遺伝子をベクター内にクローニングし、マルチモジュール遺伝子を合成するために使用される。これらの部位を多数の異なるＰＫＳモジュールコード遺伝子に組み込むことによって、その「モジュール」は、共通ベクターセット内に容易にクローニングされ得、ドメイン（またはドメインの組合せ）がモジュール間に容易に移動され得、そして、他の遺伝子改変がなされ得る。
【０１９８】
大きな遺伝子の合成設計の間に遭遇する問題としては、宿主生物についての効率的なコドン最適化、タンパク質配列に影響を及ぼさない制限部位の挿入および排除、ならびに、合成のための高品質なオリゴヌクレオチド成分の設計が挙げられる。
【０１９９】
合成遺伝子（ならびに成分シントンおよびオリゴヌクレオチド）の設計のためのコンピュータ実行可能なアルゴリズムは、この節に記載される。遺伝子変形システム（Ｇｅｎｅ  Ｍｏｒｐｈｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（「ＧｅＭＳ」）は、上記の遺伝子設計プロセスを単純化することを目的とする。
【０２００】
上に注記されるように、以下の考察はしばしば制限酵素または制限部位について言及するが、いくつかの実施形態において、等価な特性を有する他のエンドヌクレアーゼ（例えば、ホーミング型エンドヌクレアーゼ）に対する切断部位もまた包含され得ることが理解される。
【０２０１】
（５．１  ＧｅＭＳ−概要）
ＧｅＭＳプロセスは、最初にＰＫＳ遺伝子を設計するために開発され、以下に記載される。このプロセスは、任意の遺伝子の設計のための成分を含む。簡便にするために、ＧｅＭＳプロセスは、特定のポリペプチドセグメントをコードする遺伝子を参照して記載される。上記ポリペプチドセグメントは、完全なタンパク質、構造的または機能的に規定されたフラグメント（例えば、モジュールまたはドメイン）、特定のシントンのシントンコード領域によってコードされるセグメント、または、目的のポリペプチドの任意の他の有用なセグメントであり得る。
【０２０２】
任意の遺伝子の設計のために包括的に適用可能なＧｅＭＳプロセスは、一般的に、以下の特徴のうちのいくつかを有する：（ｉ）制限部位予測アルゴリズム；（ｉｉ）宿主生物ベースのコドン最適化；（ｉｉｉ）制限部位の自動割当て；（ｉｖ）入力としてＤＮＡまたはタンパク質配列を受容する能力；（ｖ）オリゴヌクレオチド設計および試験アルゴリズム；（ｖｉ）ロボットシステムのための入力生成；および（ｖｉｉ）オリゴヌクレオチドのスプレッドシートの作成。
【０２０３】
ＧｅＭＳは、いくつかの工程を実行し、合成遺伝子を構築し、インビトロアセンブリのためのオリゴヌクレオチドを生成する。これらの工程の各々は、全体のプログラム実行パイプラインに密接に関連している。このことは、遺伝子設計が図８に示されるようなハイスループットなプロセスで行われることを可能にする。
【０２０４】
簡単に述べると、ＧｅＭＳプロセスは、（ｉ）参照ポリペプチドのアミノ酸配列、および（ｉｉ）制限部位または所望の配列モチーフの位置決めおよび同定のためのパラメータ、に関する入力８００で開始する。１つの実施形態において、参照ポリペプチドのＤＮＡ配列が入力され、そして対応するアミノ酸配列に翻訳される。そのアミノ酸／ＤＮＡ配列は、公に利用可能なデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）から入力されるが、１つの実施形態において、その配列は、ＧｅＭＳプロセスへの入力の前に、正確性について（独立した配列決定によって）確認される。図８の実施例において、本発明に従うＧｅＭＳプロセスは、第１の一連の工程８１０を包含し、ここで、上記アミノ酸配列は、対応するヌクレオチド配列を生成するための参照として使用され、このヌクレオチド配列は、上記参照ポリペプチドをコードする（「逆翻訳される」）。この第１の一連の工程におけるさらなるプロセスは、コドン無作為化を包含し、ここで、追加のヌクレオチド（これらは同一の（または類似の）アミノ酸をコードする）が、その配列のある位置での各アミノ酸についての縮重コドンの無作為選択を使用して、上記参照ポリペプチドとして生成される。このプロセスは、必要に応じて、コドン使用頻度についての宿主発現生物の公知の偏向に基づく、コドン使用頻度の最適化を包含する。このソフトウェアによって生成されたコドン無作為化ＤＮＡ配列は、特定の位置での制限部位の導入のため、そしてその後の工程における部位の望ましくない発生を除去するために、さらに処理される。
【０２０５】
一連の工程８２０および８３０は、制限部位の選択および配列におけるそれらの位置の同定に応じた、制限部位の除去および挿入を包含する。１つの実施形態において、このプロセスは、ＧｅＭＳ制限部位予測アルゴリズムを使用して、その配列におけるすべての可能な制限部位を予測する。（「全ての可能性ある」制限部位は、参照セットの部位から選択される全ての部位をいうことが明らかであり、それらセットとしては、例えば、ＩＩ型酵素によって認識される、少なくとも６塩基対の認識部位を有する全ての公知な部位が挙げられる得るが、これに限定されない）。所定のパラメータと、ユーザーの入力と、内部決定との組み合わせに基づいて、上記アルゴリズムは、最適に位置決めされた（または空間をあけられた）制限部位を示唆し、この制限部位は、核酸配列中に導入され得る。これらの部位は、（遺伝子全体、またはその遺伝子の部分内で）特有（独特）であり得るか、または位置および間隔に基づいて有用であり得る（例えば、方法Ｒを使用するシントン編成のために有用な部位（これは特有（独特）である必要はない））。別の実施形態において、ユーザーは、その配列における好ましい制限部位の位置を入力する。
【０２０６】
一連の工程８２０において、ＧｅＭＳソフトウェアは、制限部位の発生を望まれない位置から除去する。このプロセスは、その配列における特定の制限部位の特有（独特）の位置を維持する。除去の後、第３の一連の工程８３０が、その配列における特定の位置で、選択された制限部位を挿入する。次いで、そのヌクレオチド配列は、一連の重複オリゴヌクレオチドに分けられ、この重複オリゴヌクレオチドは、一連のシントンへのインビトロアセンブリのために合成され、これらのシントンは、次いで、一緒に編成されて最終的な合成遺伝子を含むようにされる。工程８４０およびシントンにおけるオリゴヌクレオチドの設計は、以下でより詳細に議論される多数の基準によって導かれる。設計の後、上記オリゴヌクレオチド配列は、工程８４０において、上記基準を満たす能力について試験される。オリゴまたはシントンがＧｅＭＳのストリンジェントな品質試験を通過できない場合において、その遺伝子配列全体が、再び最適化されて、特有（独特）の新しい配列を生成し、この配列が種々の設計段階に供される。
【０２０７】
成功した設計は、工程８５０において、参照ポリペプチドのアミノ酸配列、制限部位のエラーおよびサイレント変異に対する配列整合性を確認することによって確認される。このソフトウェアはまた、上記オリゴヌクレオチドのスプレッドシートを生成し、このオリゴヌクレオチドは、商業的な注文および自動システムへの入力として使用され得る形式である。
【０２０８】
ＧｅＭＳソフトウェアによるシントン設計のための全体のスキームは、図９のフロー図に示される。ＧｅＭＳソフトウェアに対する入力９１０としては、参照ポリペプチドセグメントのアミノ酸配列（またはポリペプチドセグメントをコードするＤＮＡ配列（通常は、天然に存在する遺伝子の配列））を含むファイル（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ派生情報）が挙げられる。ＤＮＡ配列が、ＧｅＭＳへ入力される場合、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から対応するアミノ酸配列への翻訳が実行される。上記の入力は、必要に応じて、上記合成遺伝子の発現のための適切な宿主生物の同定、およびそのコドン使用頻度についての優先度を含む。上記入力は、必要に応じて、（例えば、モジュール／ドメイン／シントン端で）上記遺伝子のヌクレオチド配列中に組み込まれることが望まれる注釈付きの制限部位または他の配列モチーフ、および上記遺伝子から除去されるかまたは排除されるべき注釈付きの制限部位（例えば、編成で使用されるＩＩＳ型酵素用の制限部位）に関する、１つ以上のリストを含み得る。ユーザーは、シントンサイズの利用可能範囲（代表的には、約３００塩基対〜約７００塩基対）、シントンの数（例えば、２ｎ、ここで、ｎ＝２〜５）、およびシントン隣接配列（例えば、ライゲーション非依存性のクローニング（例えば、「ユニバーサル」ＵＤＧプライマーのアニーリング）のために有用な配列）を入力し得る。
【０２０９】
工程９２０において、上記参照ポリペプチドセグメントのアミノ酸配列は、無作為に選択されたコドンを使用して、ＤＮＡ配列へと変換（逆翻訳）され、その結果、その第２のＤＮＡ配列が、実質的に同一のタンパク質についてコードする（すなわち、対応する位置で同一のアミノ酸または類似のアミノ酸についてコードする）ようにされる。１つの実施形態において、コドンの無作為選択は、選択された宿主生物のコドン優先度を反映する。１つの実施形態において、コドン最適化およびコドン無作為化は省略され、そしてデータベースに由来するＤＮＡ配列が、その後の工程で直接処理される。そのコドンの無作為化および最適化プロセスは、図１０Ａおよび１０Ｂ、ならびに付随する本文により詳細に記載される。
【０２１０】
１つの実施形態において、予め選択された制限部位およびそれらの位置が、工程９３０に入力される。次いで、工程９３２において、ＧｅＭＳプログラムが、指定された部位の挿入についての位置を同定し、そして特定の制限部位の望まれない存在が除去されるべき位置を同定する。別の実施形態のその後の工程において、制限部位の位置についての１以上のパラメータおよびその部位の指定された特性が、工程９３４に入力される。ＧｅＭＳは、工程９３６において、その配列内で可能性のあるすべての制限部位を同定する。上記プログラムはまた、工程９３６において、予め決められたパラメータ（例えば、空間、制限部位、型など）に従う独特（特有）の制限部位セットを示唆する。１つの実施形態において、示唆された範囲は、シントンフラグメント境界内またはシントンフラグメント境界に隣接するそれらの存在について選択される。（上記の設計原則に基づく）モジュール、ドメイン末端、シントン接続部およびそれらの位置についての一般的な独特（特有）の制限部位または関連する規定配列が、工程９３６において上記プログラムによって同定される。ユーザーは、工程９３８において、示唆された制限部位および位置を受容するかまたは拒絶する。１つの実施形態において、ユーザーは、提案された制限部位を手動で入力し得る。
【０２１１】
工程９４０において、特定の位置（例えば、端）での制限部位の独特さ（特有さ）が、その配列におけるこれらの部位の望ましくないすべての存在を除去することによって維持される。特定の位置における選択されたコドンは、同一の（または類似の）アミノ酸を指定する代替のコドンで置換されて、望ましくない制限部位が除去される。
【０２１２】
この工程の後には、特定の位置での選択されたコドンの挿入が続き、工程９５０において制限部位が作製される。１つの実施形態において、ユーザーは、上記ＤＮＡ配列中にさらなる部位を含む選択肢および／または上記ＤＮＡ配列から特定の部位を削除する選択肢を保持する。
【０２１３】
制限部位の除去および挿入後に生成されたＤＮＡ配列は、次いで、工程９６０において、予め決められたサイズおよび数を有するシントンコード領域のフラグメントに分割される。シントン隣接配列が、ＬＩＣプライマー、制限部位または他のモチーフの追加のための配列モチーフに関する各々のシントン配列追加の決定に対して追加される。
【０２１４】
１つの実施形態において、特定のシントン内部位が、工程９５０において上記ＤＮＡ配列中に導入され、これはそのシントン内で独特（特有）である。これらは、シントン内で修復のために使用され得るかまたは将来の変異誘発のために使用され得る。各々のシントン配列は、工程９７０において、その２つの隣接オリゴヌクレオチドと特定の量の重複を有する、特定の長さの重複オリゴヌクレオチドとして生成される。いくつかの因子が、そのオリゴヌクレオチドの長さおよびその重複の長さの決定に入力される（例えば、合成効率、アニーリング条件、異常なプライミングなど）。そのオリゴヌクレオチドの長さは、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、または約１００ヌクレオチドであり得る。その重複の長さは、約５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３５ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、または約５０ヌクレオチドであり得る。その重複の長さは、正確ではないかもしれず、そして隣接するシントンを含むいくつかのオリゴヌクレオチド間で１、２、３、４または５の変動が受容可能である。１つの実施形態において、各々のシントンは、隣接するオリゴヌクレオチド間で約２０塩基の重複を有する、重複４０マーのオリゴヌクレオチドとして設計される。この重複は、一セットのオリゴヌクレオチド全体にわたって、１７ヌクレオチドと２３ヌクレオチドとの間で変化し得る。同一のアニーリング温度に基づいてこれらのオリゴヌクレオチドを設計するための選択肢もまた、利用可能である。
【０２１５】
以下で詳細に議論さるように、シントン（シントンコード領域およびシントン隣接配列）の合成のために使用される各々のオリゴヌクレオチドセットは、工程９８０において１以上の品質試験に供され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、プライマー特異性に関する１以上の基準（増幅を妨げることが予測される二次構造のないこと、および上記参照配列に関する忠実性が挙げられる）の下で試験される。以下で議論されるように、確認はまた、アセンブルされた遺伝子についても行われる。
【０２１６】
あらゆる失敗が、工程９８２において、ユーザーが選択する２つの方針の選択を引き起こす：１）無作為コドン生成プロトコル９８４の繰り返しならびにコドン除去９４０およびコドン挿入９５０からのプロセスの継続；および／または２）工程９８４において、問題のある領域中の予め決められたパラメータにより良く適合させるための、配列の手動調節。このプロセスは、上記試験を通過していない特定のシントンについて（コドン最適化および無作為化工程９２０で始まて）繰り返されても、ポリペプチドセグメント配列全体について新規に行われてもよい。このプロセスによって生成される候補オリゴヌクレオチド配列は、再度、順に試験される。１０〜１２のシントン配列についてのオリゴヌクレオチドセット全体が、首尾良く生成される場合、候補モジュール配列全体が、個々のシントンの再設計を誘発する可能性と共に、望まれる任意の方法（繰り返しなど）で検査され得る。必要に応じて、重複領域が除去されるが、無作為選択手順は、実質的な繰り返しの発生が生じる可能性がないようにする。必要に応じて、このソフトウェアはまた、その配列を編集して、希少なコドンのクラスター化された位置決めを除去する。各々の再設計が、無作為なコドンセットを使用するので、シントンフラグメントは、比較的少ない反復でこれらの試験を通過する。
【０２１７】
一旦、すべてのフラグメントが上記の試験を通過すると、ＧｅＭＳは、それらのフラグメントを予め決められた順序で再アセンブルし、そして元々の入力配列との比較によって制限部位およびＤＮＡ配列を確認する。この完全性検査は、標的配列が意図された設計と一致し、そして望まれない部位が最終的なＤＮＡ配列に存在しないことを保証する。図９の方法の実施は、各々のフラグメントについてのオリゴヌクレオチドが、各々のシントンを表す別個のファイルに保存されるか、または合成遺伝子を表す完全なセットとして保存されることを可能にする。このソフトウェアはまた、工程９８６においてそれらのオリゴヌクレオチドのスプレッドシートを生成し得、これは、商業的注文のため、および自動システムのロボットに対する入力として、使用され得る形式である。自動システムに対して入力されるスプレッドシートは、以下を含み得る：（ａ）オリゴヌクレオチド位置（例えば、９６ウェルプレートのバーコード番号およびそのプレート上のウェル位置などの、身元（ｉｄｅｎｔｉｔｙ））；（ｂ）オリゴヌクレオチドの名前または称号；（ｃ）オリゴヌクレオチドを用いて合成されたモジュールの名前または称号；（ｄ）オリゴヌクレオチドを用いて合成されたシントンの身元（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）（ＰＣＲアセンブリ用にプールされるべきオリゴヌクレオチドの識別）；（ｅ）モジュール内のシントンの数；（ｆ）シントン内のオリゴヌクレオチドの数；（ｇ）オリゴヌクレオチドの長さ；（ｈ）オリゴヌクレオチドの配列。ユーザーの相互作用を伴う遺伝子設計プロセス全体は、数分間で達成され得る。ＧｅＭＳは、ハイスループットなパイプライン構造を使用して、末端間統合を達成する。１つの実施形態において、ＧｅＭＳは、ウェブブラウザプログラムを通して実施され、グラフィックインタフェースを備える。
【０２１８】
上記の設計プロセスを誘導するための少なくとも１セットの規則が、上記システムのメモリーに入力され保存される。上記設計ソフトウェアは、一連の別個かつ独立に作動可能なルーチンによって作動し、このルーチンの各々は、その設計システムにおける別個の工程を処理し、かつ１以上のサブルーチンから構成される。
【０２１９】
これらの機能は、以下により詳細に記載される。首尾良い設計は、配列完全性、制限部位のエラーおよびサイレント変異について再検査される。
【０２２０】
（５．２  ＧｅＭＳアルゴリズム）
本発明に従う方法は、以下のサブルーチンのうち１以上を実行し得るアルゴリズムを包含する。
【０２２１】
（１．コドン無作為の化および最適化）  ＧｅＭＳは、コドンの無作為化および最適化サブルーチンを使用し、これらのサブルーチンの概略例が、図１０Ａおよび１０Ｂに示される。１つの実施形態において、上記の最適化−無作為化プログラムは、コドンの手動選択または天然のヌクレオチド配列の受容によって回避され得る。
【０２２２】
図１０Ａの概略図に示されるコドン最適化プロセスは、選択された宿主生物のコドン優先度データベース１０１２からの様々なアミノ酸に関する宿主コドン頻度（Ｆａａ＝頻度／１０００コドン）の入力１０１０で開始する。次いで、各々のコドンについてのコドン優先度（Ｎ）が、工程１０１４において算出される。１つの公知のコドン最適化ルーチン（ＣＯＤＯＰ）において、コドン優先度Ｎが、以下のように算出される：Ｎ＝Ｆａａ１×ｎ／（Ｆａａ１＋Ｆａａ２＋Ｆａａ３．．．＋Ｆａａｎ）（ここで、ｎは同義コドン（同一のアミノ酸についてのコドン）の数であり、Ｆａａ１〜Ｆａａｎは、各々の同義コドンに関する１０００コドン当たりの割合である）。（Ｗｉｔｈｅｒｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら、１９９２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １２（１１１３−２０）を参照のこと。）コドン最適化についてのカットオフ値は、工程１０２０においてユーザーによって選択される。１つの実施形態において、その値は０．６である。そのカットオフ値は、宿主発現系のＧＣリッチの度合いに基づいて変化し得るか、または代謝特性および生化学的特性に基づいて各々のアミノ酸について異なり得る。理論的根拠は、ほとんどの希少なコドンを排除するカットオフ値を選択することである。１つの実施形態において、これは、改変されたコドン表の視覚検査、および好ましいコドンに影響を及ぼすことなくほとんどの希少なコドンを排除するカットオフ値を選択することによって、行われる。各々のコドンは、工程１０２２において、そのカットオフ値よりも大きなコドン優先度について試験される。ユーザーが規定したカットオフ値よりも小さいＮを有するすべてのコドンは、工程１０２４において拒絶される。各々のアミノ酸について、そのカットオフ値よりも大きなＮ値を有するコドンがプールされ、そして工程１０３０においてそのＮ値の合計が１になるようにＮ値が正規化される。合成遺伝子についてのコドン優先度表が、工程１０４０において生成される。
【０２２３】
無作為化されかつ最適化された合成遺伝子配列を生成することにおける上記の最適化されたコドンの使用が、図１０Ｂの概略図に示されている。入力アミノ酸配列１０５２について、各々のアミノ酸についてのコドンの数が、工程１０５０において、合成コドン優先度表１０５４に基づいて算出される。その配列中の各々のアミノ酸１０５２について、コドンは、工程１０６０において、そのアミノ酸について最適化されたコドンの選択から無作為に選別される。その無作為に選択されたコドンは、工程１０７０において、新しい合成遺伝子配列を生成するために使用される。コドンがその合成遺伝子配列で使用されるたびに、工程１０６２において、上記の合成遺伝子優先度表１０５４中のそのアミノ酸について最適化されたコドンの選択から、そのコドンが排除される。その合成遺伝子配列は、工程１０８０において、その翻訳されたアミノ酸配列と入力アミノ酸配列との比較によって確認される。それらの配列が同一である場合（１０８２）、その無作為化され最適化された合成遺伝子配列が、工程１０９０において報告される。それらの配列が同一でない場合、その合成遺伝子配列中のエラーが、工程１０８４において報告される。１つの実施形態において、ユーザーは、類似のアミノ酸の置換を受容する選択肢を有する。別の実施形態において、上記のエラーは、その後の無作為化ルーチンの補正を実行することについて分析される。
【０２２４】
（２．制限部位予測）  １つの実施形態において、制限酵素予測ルーチンが、この段階で実行される。この制限部位予測ルーチンは、対応するアミノ酸配列に関して可能性のあるすべての有効なコドン組み合わせについて、ヌクレオチド配列におけるすべての制限部位を予測する。このプログラムは、ユーザーが特定した位置または間隔で、ＤＮＡ配列に沿って独特（特有）の制限部位を自動的に同定する。このルーチンは、モジュールおよび／またはシントンの初期設計において、および必要に応じて、予測された配列におけるエラーを検査することにおいて、使用される。
【０２２５】
これらのルーチンの実行の後、ユーザーは、１つの実施形態に従う出力の受容を示す。生成された制限部位の一覧がユーザーによって受容される場合、上記のプロセスは、ＧｅＭＳコドン最適化ルーチンに移される。その結果がユーザーにとって受容可能でない場合、そのユーザーが手動でパラメータを修正することを許容しつつ、サブルーチンが繰り返される。このプロセスは、受容を示すシグナルがそのユーザーから得られるまで繰り返される。そのユーザーが制限部位を受容した後、その配列がＧｅＭＳモジュールにおける次のルーチンに移されて、その後の手順が実行される。
【０２２６】
（３．制限部位の除去）  ＧｅＭＳプログラムの工程９３２または９３８（図９を参照のこと）で選択された制限部位は、図１１に概略的に示されるように、コドン最適化遺伝子配列から除去される。
【０２２７】
本発明のプロセスのサブルーチンは、選択された制限部位を除去し、この制限部位は、特定され、そして上記の無作為化され最適化された遺伝子配列と共に入力される（１１００）。このサブルーチンは、工程１１００において、コドン最適化遺伝子配列における予め選択された制限部位を同定し、そしてそれらの位置を同定する。工程１１２０において、各々の所定の位置で、上記の制限部位を含むオープンリーディングフレームが、その制限部位で影響を受けるコドンによってコードされるアミノ酸を変えることなくその配列を変化させて制限部位を除去する能力について試験される。そのリーディングフレームがオープンである場合、その認識部位の第１のコドンが、その制限部位配列を除去する様式で、同一または類似のアミノ酸をコードするコドンで置換される。しかし、その第１のコドンが置換のために不適切である場合、そのサブルーチンは、次の利用可能なコドンに移り、その制限部位が除去されるまで継続される。制限部位は６ヌクレオチドまで含み得るので、部位の除去は、３つまでのアミノ酸コドンの分析を含み得る。制限部位の除去は、工程１１３０において、コードされるアミノ酸の身元（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を維持する様式で実行される。このサブルーチンは、選択された制限部位がそのアミノ酸配列を変えることなく除去された、無作為化され最適化された遺伝子配列を生成する（１１４０）。
【０２２８】
（４．制限部位の挿入）  このプロセスによって実施されるその次のサブルーチンは、制限部位を導入する。この工程は、図１２の概略図で示されるように、選択された位置でヌクレオチド塩基を置換し、そのアミノ酸配列を変えることなく、選択された制限酵素の制限部位を生成する。このサブルーチンにおいて、選択された制限部位が除去された無作為化され最適化された遺伝子配列が、工程１２１０において、配列への挿入について選択された制限部位およびその位置と共に入力される。その選択された挿入位置が、その配列中で同定され、そしてヌクレオチドは置換されて、工程１２２０において、その選択された位置で選択された制限部位を生成する。１つの実施形態において、制限部位によって作製された突出部の配列のみが、制限部位の代わりに挿入される。このような配列がシントン中に存在する場合、その配列はＩＩＳ型制限酵素によって遠くで切断され得るので、そのようにして生成された突出部が、ＩＩ型制限酵素で切断されて相補的突出部を生成したＤＮＡフラグメントとの連結のために利用可能である。その置換された配列が翻訳され、得られたアミノ酸配列が、工程１２３０において参照アミノ酸の配列（図１０Ｂの１０５２を参照のこと）と比較される。その置換された配列が翻訳され、得られたアミノ酸配列が、工程１２３０において参照アミノ酸の配列（図１０Ｂの１０５２を参照のこと）と比較される。これは、それらのアミノ酸配列の身元（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）について比較する。工程１２４０において、その置換配列と重複するコドンのアミノ酸特異性が変化したことが見出される場合、工程１２４０Ａにおいて、上記のコドン表が、そのアミノ酸配列および置換配列の両方と適合性でありかつ望ましい制限部位および他のモチーフのパターンまたは他のパターンとの適合性であるコドンについて、再試験され得る。任意の適合性コドンが見出される場合、（例えば、コドン表における相対的確率の使用によって）ユーザーの優先度に従ってそのようなコドンの一覧から１つが選択され、そして望ましくないコドンの代わりとして挿入される；プログラムは１２４０に戻る。そのアミノ酸配列が変えられ、そして工程１２４０Ａに記載される手順によって修復不可能な場合、プログラムは工程１２４２に進む。工程１２４２において、ユーザーは、工程１２４４における出力を拒絶し、かつ選択された位置でヌクレオチド置換のプロセスを繰り返すという、選択肢を有する。１つの実施形態において、ユーザーは、工程１２４６において、アミノ酸を類似のアミノ酸で置換し、そしてその出力を手動で受容する。次いで、その制限部位の導入後に生成された配列は、工程１２５０において、翻訳エラーについて検査される。選択された制限部位が除去されかつ他の選択された制限部位が挿入された、無作為化され最適化された合成遺伝子配列が、工程１２６０において提供される。上記のように、制限部位以外の配列モチーフが「挿入」されるかまたは「除去」され得る（すなわち、オリゴヌクレオチド、シントンおよび遺伝子が、その配列モチーフを含むように、または特定の位置からその配列モチーフを除去するように、設計され得る）。例えば、配列同一性の領域は、マルチシントン���構築のために有用であり（例えば、以下の節６．４．３における例示的構築方法２を参照のこと）、合成遺伝子の特定の位置で含まれ得る。
【０２２９】
（５．合成遺伝子またはシントンを含むためのオリゴヌクレオチドの生成）  ＧｅＭＳへの入力は、ドメイン端またはシントン端のいずれかとしてそれらの位置に沿ってタグ化された、制限部位各々を有する。これらの基準に基づいて、上記のプログラムパイプラインのこの工程１３２０（図１３を参照のこと）は、１つの実施形態において、遺伝子配列全体を多数のシントンへと分割する。別の実施形態において、好ましいシントンサイズが入力される。重複オリゴヌクレオチド配列が、工程１３２０において、シントンコード領域ならびにシントン隣接配列を含むように生成される。
【０２３０】
合成遺伝子についてのオリゴヌクレオチドの生成は、図１３の概略図に示されている。合成遺伝子配列１３１２は、工程１３１０において、オリゴヌクレオチドの長さおよび隣接オリゴヌクレオチド間の重複の程度を特定するパラメータとともに入力される。その合成遺伝子配列は、工程１３２０において、重複を有する特定の長さの複数のオリゴヌクレオチド配列に分割されて、選択された数の塩基が隣接鎖と対合することを可能にする。各々のオリゴヌクレオチドは、合成遺伝子配列１３１２と共に整列され、そしてその整列の程度が、工程１３３０で決定される。整列の程度（一致スコア）は、工程１３３２において、受容可能な整列の程度について、予め決められた配列特異性カットオフ値と比較される。決定が、工程１３４０におけるこれらの配列の一致に基づいてなされる。この一致スコアが特異性カットオフ値未満である場合、無効なオリゴヌクレオチドが同定され、そのエラーが工程１３４２で同定される。その出力は、手動で破棄され得るかまたは調整され得る。１つの実施形態において、そのオリゴヌクレオチドの長さは、そのオリゴヌクレオチドの全体的整列の程度を調整するために増大されるかまたは減少される。その一致スコアが特異性カットオフ値を超える場合、確認されたオリゴヌクレオチドの一覧が生成される。
【０２３１】
１つの実施形態において、その合成遺伝子はシントンである。シントンを含むオリゴヌクレオチドは、そのシントンコード領域ならびにシントン隣接配列に特異的な、オリゴヌクレオチドを含む。各々のシントンは、１セットのオリゴヌクレオチドとして設計されたオリゴヌクレオチドから構成され、この１セットのオリゴヌクレオチドの各々は、相補配列と、両側にあるその２つの隣接オリゴヌクレオチドとの重複部を有する。オリゴヌクレオチドの長さの選択は、いくつかの因子（特定の長さのオリゴヌクレオチド合成の効率および正確性、アセンブリＰＣＲ中のプライミングの効率、アニーリング温度および翻訳効率が挙げられる）を考慮する。好ましい実施形態において、サイズが４０マーの各オリゴヌクレオチドが、隣接オリゴヌクレオチドと約２０ヌクレオチドの重複部を有するように選択される。各々のオリゴヌクレオチドは、２つのおよそ等しい半体（この場合、２つの２０マー部分）として設計され、ここで、各々の半体は、その２つの隣接オリゴヌクレオチドとの相互作用（例えば、アニーリング、プライミング）についての基準を満たしていなければならず、これらの２つの隣接オリゴヌクレオチドは、いずれかの半体と重複し、４０マー配列の選択は、その長さのオリゴヌクレオチドの化学合成の精度にさらに反映する。
【０２３２】
本発明は、ＰＣＲ反応による上記の重複オリゴヌクレオチドのアセンブリに関するが、それらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡリガーゼ酵素とＤＮＡポリメラーゼ酵素との組み合わせによって酵素的にアセンブルされ得ることが企図される。このような実施形態において、より長いオリゴヌクレオチドが、より短い重複部と共に使用され得る。その重複部は、その２つの隣接オリゴヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドの領域間において、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチドまたはそれ以上のギャップを残し得ることが企図される。このようなギャップは、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって修復され得、次いで、それらのオリゴヌクレオチドによって含まれるシントンが、ＤＮＡリガーゼ媒介反応によってアセンブルされ得る。
【０２３３】
（６．オリゴヌクレオチド設計基準）  適切なオリゴヌクレオチドセットの設計は、多数の基準に基づく。この設計で使用される２つの基準は、アニーリング温度およびプライマー特異性である。
【０２３４】
（６Ａ．最適アニーリング温度）：アニーリング温度（好ましくは６０〜６５℃）およびオリゴヌクレオチド重複部の長さについてユーザーが規定した範囲が、入力される。温度を増大するために、オリゴヌクレオチド重複部の長さのサイズが増大され、逆の場合も同様である。ＧｅＭＳプログラムは、特定のアニーリング温度境界内でこれらのオリゴヌクレオチドを設計する。その基準は、単一のＰＣＲ反応によってアセンブルされるべきオリゴヌクレオチドのセット全体について一定の（好ましくは、狭い範囲の）アニーリング温度である。アニーリング温度は、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ（Ｂｒｅｓｌａｕｌｅｒら、１９８６「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｄｕｐｌｅｘ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｂａｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８３：３７４６−３７５０）およびＢａｌｄｉｎｏ（Ｂａｌｄｉｎｏ、１９８９、「Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（Ｐ．Ｍ．Ｃｏｎｎ編）、１６８：７６１−７７７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）によって記載された最近接モデルを使用して測定される。自動的にオリゴヌクレオチド成分に塩基を加えるかまたは塩基を削除することよる、設計されたオリゴヌクレオチド二重鎖の融解温度範囲を狭くするためのさらなる方法もまた、実行される。
【０２３５】
（６Ｂ．プライマー特異性）：各々のシントン（またはシントン遺伝子）について生成される重複オリゴヌクレオチド配列の各々は、シントン全体に対するプライマー特異性試験に供される。最適なプライミングを保証するために、シントン中の各々のオリゴヌクレオチド配列が、シントン配列全体に対するアライメントによって試験される。アライメントは、そのオリゴヌクレオチド配列とそのシントンの配列との間で一致数と不一致数とを比較することによって決定される。予め決められた値よりも高いアライメントの程度で整列するオリゴヌクレオチドが、合成のために選択される。１つの実施形態において、これは、位置１で開始して、そのオリゴヌクレオチド配列をそのシントン配列の長さにわたって一度に１塩基スライドして、そのシントン配列に対してそのオリゴヌクレオチド配列を整列することによって実行される。
【０２３６】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、以下の一連の工程に従って使用のために不適切であることが決定される。
【０２３７】
工程１：両方のオリゴヌクレオチド配列およびシントン参照配列の両方の最後の３塩基を、それらが同一であるように整列させる；
工程２：整列された配列における一致の数および不一致の数を数え、一致とは、同じ位置で両方の配列において同一の塩基である。
【０２３８】
工程３：重複およびアライメントを形成する塩基の総数に対する一致の割合を算出する。
【０２３９】
その割合が、ユーザーが規定した閾値０．７（または７０％）よりも大きい場合、そのオリゴヌクレオチドは合成のために適切である。１つの実施形態において、閾値がそのユーザーの規定した値よりも低いオリゴヌクレオチドは、その配列の手動改変に供されて、アライメントの程度が増大され得、そして閾値の要件を満たし得る。
【０２４０】
（７．オリゴヌクレオチド品質試験）：上記のソフトウェアは、各シントンのオリゴヌクレオチド間の、あらゆる望ましくない程度の異常なプライミングをチェックする。存在する場合、このソフトウェアはシントンを繰り返し再設計する。この再設計は、その設計が改善されるまで起こる。困難な場合、このソフトウェアは、結果を報告し、ユーザーが手動でエラーを修正するよう促す。
【０２４１】
（８．入力確認ルーチン）：一つ以上のユーザー入力確認ルーチンが、シントン設計ルートンと並行して独立して実行するように遂行され得る。これらは、ユーザーにより入力された指示に対して確認チェックを行う。これらのルーチンは、ＧｅＭＳプロセスの一工程の間にユーザーによって代表的には入力された指示を確認し、そしてこのルーチンは、部位予測アルゴリズム、フレームシフトおよびシントン境界に基づく制限部位の位置の確認を含む。この入力段階でのエラーの同定は、ユーザーが、誤った設計をもたらすあらゆる入力を与えることを防止する。
【０２４２】
（９．出力確認ルーチン）−−プログラム出力確認ルーチンは、設計されたシントンを確認するための時間を減少させるために使用され得る。これは、末端間設計プロセスが、ハイスループット様式で働くようにさせる。このプログラムは、その設計されたシントンを再アセンブルする一方でその正確な順序を維持し、シントン遺伝子を再生成する。次いで、新しい合成遺伝子が、そのアミノ酸配列に翻訳されて、起こり得るエラーについて、元々の入力されたタンパク質配列と比較される。そのアセンブルされた配列に関する制限部位パターンが、所望されたパターンであると確認される。各設計されたシントン（シントン特異的プライマーを含む）についての制限部位パターンもまた、確認される。他の品質試験（望ましくないｍＲＮＡ二次構造および望ましくないリボソーム開始部位についての試験を含む）が行われ得る。
【０２４３】
（１０．ユーザーインターフェース）  任意のウェブベースのソフトウェアの実行は、設計を完了するのに必要とされる工程数を最小化する、グラフィカルインターフェースを提供する。適用可能な場合、ユーザーは、設計プロセスに役立つ遺伝子配列、遺伝子機能、制限部位などについてのウェブサイトおよび／もしくはデータベースへのスクリーン上でのリンクを提供される。
【０２４４】
これらは、パイプラインを決定し、そして合成遺伝子の各シントンに対して適切なオリゴヌクレオチドの一覧を出力する。
【０２４５】
（５．３  ソフトウェアの実行）
一つの実施形態において、ＧｅＭＳソフトウェアは、ウェブブラウザのアプリケーションの範囲内で行われ、これによって、ＧｅＭＳソフトウェアはプラットフォームに中立なシステムになる。その設計は、クライアント−サーバーモデルに基づき、コモンゲートウェイインターフェース（ＣＧＩ）標準を使用して実行される。
【０２４６】
ＧｅＭＳに関する全てのＣＧＩスクリプトおよびアプリケーションプログラムインターフェース（ＡＰＩ）は、Ｐｙｔｈｏｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２で実行された。このアプリケーションの開発、テストおよびホスティングは、ＲｅｄＨａｔ  Ｌｉｎｕｘ  ｖｅｒｓｉｏｎ７．３を実行する１．０ＧＨｚ  Ｉｎｔｅｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）  ＩＩＩベースのプロセッササーバー上で行った。このウェブインターフェースは、Ａｐａｃｈｅ  ＨＴＴＰ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ２．０上で実行する。
【０２４７】
ＧｅＭＳ  ＡＰＩにおけるアニーリング温度モジュールは、ＥＭＢＯＳＳソフトウェア分析パッケージ（Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．およびＢｌｅａｓｂｙ，Ａ．，２０００，「ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ」Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：２７６−７７）を利用して、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３７４６−５０）およびＢａｌｄｉｎｏ  （Ｂａｌｄｉｎｏ  Ｊｒ．，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １６８：７６１−７７）によって記載された最近接モデル（ｔｈｅ  ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｏｄｅｌ）を実行する。
【０２４８】
公共で利用可能なソフトウェア（例えば、ＤＮＡ  Ｂｕｉｌｄｅｒ（Ｂｕら、「ＤＮＡ  Ｂｕｉｌｄｅｒ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＰＣＲ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｎｔｉｏｎｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ＤＮＡ  Ｗｏｒｋｓ（Ｄａｖｉｄ  Ｍ．ＨｏｏｖｅｒおよびＪａｃｅｋ  Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ，２００２「ＤＮＡ  Ｗｏｒｋｓ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０，Ｎｏ．１０，ｅ４３）、およびＣＯＤＯＰ（Ｗｉｔｈｅｒｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら、１９９９「ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ＋Ｔ−ｒｉｃｈ  ｍａｌａｒｉａ  ｇｅｎｏｍｅ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １２：１１１３−２０））が、当業者によって構築されて、ポリケチドモジュールの自動設計のためにＧｅＭＳによって使用される、いくつか（全てではない）のタスクを達成し得る。
【０２４９】
一つの局面において、本発明は、本明細書中で記載されるような合成遺伝子の設計のために有用な工程もしくは方法を行うための、コンピュータが実行可能な指令を有する、コンピュータ読出し可能媒体を提供する。
【０２５０】
（６．マルチモジュール構築物およびライブラリー）
（６．１  緒言）
本明細書中で開示された方法に従って設計および／もしくは生成された合成遺伝子は、（例えば、プロモーターおよび／もしくは他の調節エレメントに連結された後）発現され得る。本発明の一つの局面において、合成遺伝子は、別の合成遺伝子と、単一のオープンリーディングフレーム中にて連結されて、「融合ポリペプチド」をコードするようにされる。この融合ポリペプチドをコードするＤＮＡは、それ自体が（より小さな遺伝子の連結から生成される）合成遺伝子であることが、認識される。関連する局面において、複数の異なるオープンリーディングフレームは同時発現されて（またはそれらのタンパク質産物がインビトロで組み合わせられて）、多タンパク質複合体を形成し得る。これは、天然に存在するポリケチドシンターゼと類似している。この天然に存在するポリケチドシンターゼは、いくつかのポリペプチドの複合体であり、そのポリペプチドの各々は、二つ以上のモジュールおよび／もしくは補助単位を含む。
【０２５１】
したがって、ポリケチドの生成に関して、本発明は、以下を企図する：（Ａ）ＰＫＳモジュールおよび／もしくは補助単位の組合せを含むポリペプチドをコードする合成遺伝子を生成する工程；（Ｂ）互いに会合して多ポリペプチド複合体を形成する、二つ以上の異なる（Ａ）のポリペプチドを発現する工程。
【０２５２】
ＰＫＳモジュールおよび／もしくは補助単位の組合せを含むポリペプチドをコードする合成遺伝子を生成するための方法は、上記（例えば、第４節）で議論された方法を用いて、この組合せをコードする遺伝子をともにコードするシントンを設計して一緒に編成する工程を含む。あるいは、上記の単一のポリペプチドの異なる部分をコードし得る二つ以上の合成遺伝子が、従来の組み換え技術（ライゲーション非依存的方法およびリンカー媒介法、ならびに他の方法を含む）によって、遺伝子配列中の特定の位置（例えば、モジュールの末端をコードする領域、ドメインの末端をコードする領域、補助単位の末端をコードする領域など）に位置する（例えばそこで操作される）部位および配列モチーフを使用して、接続され得る。本発明の設計および合成方法の一つの重要な新しい利点は、遺伝子配列を制御して、モジュール、ドメインなどのクローニングを容易にする能力である。これらの方法の特に有用な派生効果は、構造的もしくは機能的に類似する単位（例えば、モジュール、補助単位、リンカー、他の機能的ポリペプチド配列）をコードする遺伝子の、複数の大きなライブラリーを作製する能力である。このライブラリーにおいて、この制限酵素認識部位もしくは他の配列モチーフは、このライブラリーの全てのメンバーの類似した位置に配置される。例えば、ＰＫＳモジュール遺伝子は、その末端に独特（特有）の制限酵素認識部位を有して合成され得（例えば、Ｘｂａ  Ｉ部位およびＳｐｅ  Ｉ部位）、ベクター中の同じ部位へのクローニングを容易にする。
【０２５３】
関連する局面において、本発明は、ポリペプチド（このライブラリのメンバーによってかもしくは他のライブラリのメンバーによってコードされる他のポリペプチドに、このポリペプチドを会合させるようにする領域（リンカー）を含む）をコードする遺伝子の、複数の大きなライブラリーを提供する。
【０２５４】
関連する局面において、本発明は、例えば、多くの異なるポリペプチドセグメントをコードする遺伝子の操作、発現、および分析のために使用され得るベクターおよびベクターセットを提供する。例えば、本発明は、マルチモジュール構築物をコードする遺伝子のライブラリーの調製を容易にする有用なベクター（ＯＲＦベクターと呼ばれる）を提供する。
【０２５５】
以下の節は、ＰＫＳモジュールおよび補助単位をコードするＯＲＦを含む、ベクターおよびベクターライブラリーの製造ならびに使用についての例示的な方法を記載する。以下の節６．２は、どのようにライブラリーが使用されてモジュールと他のポリペプチド単位との間の相互作用が分析され得るのかを記載する。この節は、どのようにライブラリーが構築され得そして使用され得るかを例示することを意図される。節６．３は、モジュールおよびリンカーの組み合わせを議論する。節６．４は、特定のＯＲＦベクターおよびこれらを構築するための方法を記載する。
【０２５６】
（６．２．ＯＲＦベクターライブラリーの例示的な使用）
一つの局面において、本発明は、天然においては見出されない組み合わせにおけるＰＫＳモジュールコード遺伝子の発現のための方法を提供する。このような新規モジュールの構築は、新規ポリケチドの産生、公知ポリケチドのより効率的な産生を可能とし、そしてさらにＰＫＳモジュール、ドメインおよびリンカーの相互作用を支配する「ルール」を理解することを可能とする。「異種」モジュール（すなわち、天然では相互作用しないモジュール）の組み合わせは、生産的でも効率的でもないかもしれない。例えば、異種モジュールの境界面において、第一モジュールの生成物は、第二または続くモジュールについての天然の基質ではないかもしれず、そしてこの受容するモジュールは、外来の基質を効率的に受容しないかもしれない。さらに、ポリケチド鎖の（一つのモジュールのＡＣＰチオールエステルからその次のＫＳチオールエステルまで）の転移は、効率的に生じないかもしれない。米国特許出願第２００３００６８６７６Ａ１号：「ポリケチドシンターゼモジュールの有効性を媒介するための方法」を参照のこと。本発明は、ベクターに対する方法、ライブラリー、ならびにモジュール、ドメイン、リンカーおよび他のポリペプチドセグメントが生産的に機能する能力を評価するための方法を提供する。
【０２５７】
本発明の一つの局面において、ベクターのライブラリーが調製され、ここでこのライブラリーの異なるメンバーは、異なる伸長モジュールを含む。本発明の一つの局面において、ベクターのライブラリーが調製され、ここでこのライブラリーのメンバーは、同一の伸長モジュールを含むが、異なる補助単位（例えば、異なるローディングモジュールおよび／または異なるリンカードメインおよび／または異なるチオエステラーゼドメイン）を含む。従って、本発明は、ＰＫＳモジュールをコードする遺伝子の発現ライブラリーを合成するための方法を提供し、この方法は、複数の異なる合成ＰＫＳモジュールをコードする遺伝子（例えば、本明細書中に記載されるような）の作製および各遺伝子を発現ベクターへクローニングすることによる。一つの実施形態において、このライブラリーは、少なくとも約５０個または少なくとも約１００個の異なるモジュールをコードする遺伝子を含む。本発明の一つの局面において、このようなライブラリーは、対で使用され、ＰＫＳモジュールの対または組み合わせの間の生産的な相互作用が同定される。
【０２５８】
説明のために、本発明の技術のライブラリーの１つの適用は、（多くの可能なもののうちの）２つのＯＲＦベクターライブラリーを記載することによって説明され得る。この開示によってガイドされる当業者は、作製および使用され得る種々の匹敵するライブラリーまたは類似のライブラリーを認識する。第１のＯＲＦライブラリーは、ローディングドメイン（ＬＤ）、ＰＫＳモジュール（Ｍｏｄ）、および左リンカー（ＬＬ）をコードするオープンリーディングフレームを含むベクターを含む。１実施形態において、そのライブラリーの異なるメンバーは、同じＬＤおよびＬＬをコードするが、異なるモジュールをコードする。すなわち：
［ＬＤ−Ｍｏｄ−ＬＬ］ｎ      ［例示のライブラリーＩ］
ここで、ｎは、通常、＞２０である。第２のＯＲＦライブラリーは、右リンカー（ＲＬ）、モジュール（Ｍｏｄ）、およびチオエステラーゼドメイン（ＴＥ）をコードするオープンリーディングフレームを含むベクターを含み、ここで、そのライブラリーの異なるメンバーは、異なるモジュールをコードする。すなわち：
［ＲＬ−Ｍｏｄ−ＴＥ］ｎ      ［例示のライブラリーＩＩ］。
ここで、ｎは、通常、＞２０である。
【０２５９】
用語「右リンカー」（ＲＬ）および「左リンカー」（ＬＬ）とは、２つのポリペプチドを会合させ得るポリペプチド間リンカーをいう。１つより多くのポリペプチドを含むポリケチドシンターゼの構築のために、転移のために適切なリンカーが、供与モジュールの適切なＣ末端アミノ酸配列を、受容モジュールのポリペプチド間リンカーの適切なＮ末端アミノ酸配列と適合させることによって達成され得る。これは、例えば、ネイティブのＰＫＳにおいて存在するような対を選択することによってなされ得る。例えば、２つの任意の選択されたモジュールが、ＤＥＢＳのモジュール４のＣ末端部分およびＤＥＢＳのモジュール５のための連結配列のＮ末端部分を使用して、連結され得る。あるいは、リンカーの新規な組み合わせまたは人工リンカーが、評価され得そして使用され得る。
【０２６０】
１つの実施形態において、説明のために、示される２つのライブラリーのそれぞれが、４つのメンバーを含み、各メンバーが、異なるモジュール（すなわち、モジュールＡ、モジュールＢ、モジュールＣまたはモジュールＤ（「ＭｏｄＡ」、「ＭｏｄＢ」、「ＭｏｄＣ」、「ＭｏｄＤ」）をコードする遺伝子を含む。以下に示される８つの例示的なベクターのライブラリーを使用して、モジュールＡ、モジュールＢ、モジュールＣまたはモジュールＤ（「ＭｏｄＡ」、「ＭｏｄＢ」、「ＭｏｄＣ」、「ＭｏｄＤ」）の全ての可能な組み合わせが、適切な発現ベクターへの転移後に機能について試験され得る。
【０２６１】
ＬＤ−ＭｏｄＡ−ＬＬ    ＲＬ−ＭｏｄＡ−ＴＥ
ＬＤ−ＭｏｄＢ−ＬＬ    ＲＬ−ＭｏｄＢ−ＴＥ
ＬＤ−ＭｏｄＣ−ＬＬ    ＲＬ−ＭｏｄＣ−ＴＥ
ＬＤ−ＭｏｄＤ−ＬＬ    ＲＬ−ＭｏｄＤ−ＴＥ
ライブラリーＩおよびライブラリーＩＩからのモジュールの組み合わせ（例えば、対の組み合わせ）の機能について調べるために、適切な宿主（例えば、ＰＫＳ翻訳後修飾および基質Ｃｏ−Ａチオエステル産生を支持するように操作されたＥ．ｃｏｌｉ）中に同時トランスフェクトし得、そして産物トリケチドが、適切な方法（例えば、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳ、または生物学的活性）によって分析され得る。あるいは、このライブラリーのメンバーは、個々に発現され得、ライブラリーＩ−ライブラリーＩＩの組み合わせが、インビトロでなされ得る。アフィニティータグおよび／または標識タグが、タンパク質単離、ならびにモジュールの組み合わせの活性および物理的相互作用についての試験を容易にするために、モジュール構築物の一方の末端または両方の末端に付着され得る。
【０２６２】
生産性の組み合わせが同定された場合、生産性の対が組み合わされ得、新たな対の組み合わせで試験され得る。例えば、ＬＤ−ＭｏｄＡ−ＬＬ＋ＲＬ−ＭｏｄＡ−ＴＥが生産性である場合、構築物ＬＤ−ＭｏｄＡ−ＭｏｄＤ−ＬＬが合成され得、ライブラリーＩＩのメンバーと組み合わせて試験され得る。同様に、第３のライブラリー（［ＬＬ−Ｍｏｄ−ＲＬ］ｎ構築物を含む）が使用され得る。本発明の方法によって利用可能にされる多くの他の有用なライブラリーが、本開示によってガイドされる当業者に明らかである。
【０２６３】
相補的なストラテジーにおいて、補助単位とモジュールとの相互作用は、そのモジュール遺伝子を一定に保ちながら、その補助単位を変える（例えば、異なるメンバーが同じ伸長モジュールをコードするが、異なるローディングモジュールまたはリンカーをコードするライブラリーを使用する）ことによって評価され得る。
【０２６４】
生産性タンパク質−タンパク質相互作用の同定以外の使用のために、遺伝子ライブラリーが使用され得ることが明らかである。例えば、本明細書中に記載されるＯＲＦライブラリーのメンバーは、生物合成プロセスにおいて、他のライブラリー構築のための中間体として、および他の使用のために、使用され得る。
【０２６５】
（６．３  モジュールおよびリンカーの組み合わせ）
この節は、モジュール遺伝子が、ネイティブなリンカー配列または異種のリンカー配列とともにどのように発現され得るかを詳細に記載する。以下に記載されるように、本発明の有用な融合タンパク質は、多くのエレメントを含み得る。例えば、以下が挙げられる：
構築物番号            構造
１．        ＬＤ−Ｍｏｄ１−ＬＬ
２．        ＬＤ−Ｍｏｄ２−ＬＬＨ
３．        ＲＬ−Ｍｏｄ３−ＴＥ
４．        ＲＬＨ−Ｍｏｄ４−ＴＥ
５．        ＲＬ−Ｍｏｄ５−Ｍｏｄ６−ＬＬ
６．        ＬＤ−Ｍｏｄ７−＊−ＬＬ
ここで、「ＬＤ」は、ＰＫＳローディングモジュールを示し、「ＴＥ」は、チオエステラーゼドメインを示し、「ＲＬ」および「ＬＬ」は、ＰＫＳポリペプチド間リンカーを示し、下付き文字「Ｈ」Ｈは、「異種」リンカーを示し、「＊」は、異種ＡＫＬ（ＡＣＰ−ＫＳリンカー）（定義の節１を参照のこと）が存在することを示し、そして「Ｍｏｄ」は、種々のＰＫＳモジュールを示す。これらのモジュールは、配列およびドメインの内容に関してだけではなく、ポリペプチド間リンカーおよびモジュール間リンカーの性質に関しても異なり得る。ＰＫＳリンカーについての一般的な考察は、上記の節１およびそこに引用される参考文献に提供される。簡単に述べると、異なるポリペプチド中のＰＫＳ伸長モジュールが、見出される（または配置される）「ポリペプチド間リンカー」リンカー（すなわち、ＲＬおよびＬＬ）によって連結され得、そして同じポリペプチド中の複数のＰＫＳ伸長モジュールが、ＡＫＬによって連結され得る。
【０２６６】
上記の構築物において使用される伸長モジュールは、天然に存在するポリペプチドのアミノ末端に位置するかまたはそのアミノ末端以外に位置する、天然に存在するモジュールに対応し得、そして合成遺伝子（例えば、Ｍｏｐ３）によってコードされるポリペプチドのアミノ末端に配置され得るか、またはそのアミノ末端以外に配置され得る（例えば、Ｍｏｄ６）。
【０２６７】
モジュールをコードする合成遺伝子を含むＯＲＦにおいて、そのモジュールは、種々の異なるリンカーに接続され得ることが当業者に明らかである。例えば、天然に存在するモジュールに対応するモジュールは、その天然に存在するモジュールと関連するポリペプチド間リンカー配列または他のモジュール間リンカー配列をコードする配列と会合され得るか、またはその天然に存在するモジュールと関連しないポリペプチド間リンカー配列または他のモジュール間リンカー配列（例えば、異種リンカー配列、人工リンカー配列、またはハイブリッドリンカー配列）をコードする配列と会合され得る。所望される最終の構築物に依存して、合成モジュールは、その対応する天然に存在するモジュールのＡＫＬを含んでもよいし含まなくてもよいことが明らかである。簡便には、本発明の合成モジュールコード遺伝子または遺伝子ライブラリー中に必要に応じて配置されるＳｐｅ  Ｉ部位およびＭｆｅ  Ｉ部位が使用されて、異なるＡＫＬでの置換のためにＡＫＬを追加、除去または交換し得る。
【０２６８】
（６．４  例示的なＯＲＦベクター構築物）
上記のように、モジュールが、複合ポリペプチドの構築のために、「ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）ベクター」内にクローニングされ得る。多くの選択的ストラテジーが明らかであるが、専門化したベクターに合成遺伝子の合成および発現において種々の役割を果たさせることが、一般的に簡便である。例えば、本発明の１つの実施形態において、シントン編成（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）が、１つのベクターセット（例えば、アセンブリベクター）で行われ、モジュールおよび／または補助単位をコードする遺伝子が、異なるセットのベクター（例えば、ＯＲＦベクター）において組み合わされ、ポリペプチドが、第３のセットのベクター（発現ベクター）において発現される。しかし、他のストラテジーが、この開示によってガイドされる読者に明らかである。例えば、本発明のＯＲＦベクターは、発現ベクターとしても役立つように構成され得る。
【０２６９】
アセンブリベクターからＯＲＦベクターへとクローニングする場合、アセンブリベクター（そのアセンブリベクターのマルチシントンに隣接する有用な制限部位を含む）を使用することが、しばしば簡便である。従って、有用なアセンブリベクターは、ＳＩＳのいずれかの側（従って、占拠された（ｏｃｃｕｐｉｅｄ）アセンブリベクターに含まれるモジュールのいずれかの側）に位置する節４に記載される制限部位に加えて、制限部位を含み得る。これらの隣接制限部位（「ＦＲＳ」）は通常、合成モジュール遺伝子の配列中に無い（すなわち、遺伝子設計の間に「除去される」）ので、まれな部位（例えば、８ｂｐ認識部位）を使用することが一般的に有利である。
【０２７０】
以下に記載される方法の説明において、以下の略語は、説明のみのために使用される：１＝Ｎｄｅ  Ｉ部位、２＝Ｘｂａ  Ｉ部位、３＝Ｐａｃ  Ｉ部位、４＝Ｎｏｔ  Ｉ部位、５＝Ｓｐｅ  Ｉ部位、６＝Ｅｃｏ  ＲＩ部位、７＝Ｂｂｓ  Ｉ部位、８＝Ｂｓａ  Ｉ部位、＊＝共通配列モチーフ。以下の説明を考慮する場合、有用なベクターは、示される特定の制限部位を有するベクターに制限されないことを留意することが重要である。例えば、示される部位のうちのいずれかが、異なる部位（同じ様式で機能し得る）を使用することによって置換され得る。例えば、ＩＩＳ型酵素によって認識される大多数の部位のいずれかが、部位７および部位８のために使用され得；種々の部位のいずれかが、部位３および部位４のために使用され得るが、まれな部位（例えば、７塩基対認識配列または８塩基対認識配列を有する）が好ましい。同様に、多くの部位が、Ｘｂａ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉの代わりに使用され得る。ただし、適合性の付着末端が、それらの部位の消化によって作製される（好ましくは、いずれの部位も、それらの付着末端の連結の際に再生しない）。さらに、これらの部位の全てが有用ではあるが、全てが本発明の方法のために必要とされるわけではなく、これは、当業者に明らかである。多くの実施形態において、それらの部位のうちの１つ以上が省略される。以下の考察において、アセンブリベクターからＯＲＦベクターへ転移されるマルチシントンが、時々、単純に「モジュール」と呼ばれる。
【０２７１】
（６．４．１  アミノ末端補助単位およびカルボキシ末端補助単位または他のポリペプチド配列を含む、ＯＲＦベクター）
マルチモジュール遺伝子構築物を合成するために、以下の構造を有するＯＲＦベクターが、操作のために使用され得る：
【０２７２】
【化３】
2007533308.tif 000011
【０２７３】
ここで、
【０２７４】
【化３Ａ】
2007533308.tif 000012
【０２７５】
は、非ＰＫＳポリペプチドセグメント（例えば、ＮＲＰＳモジュール）またはＰＫＳ補助単位のような構造的ポリペプチドセグメントまたは機能的ポリペプチドセグメントをコードするヌクレオチド配列を示す。例えば、
【０２７６】
【化３Ｂ】
2007533308.tif 000013
【０２７７】
は、ローディングモジュールまたはポリペプチド間リンカーをコードする遺伝子配列であり得、そして
【０２７８】
【化３Ｃ】
2007533308.tif 000014
【０２７９】
は、チオエステラーゼドメイン、他の放出ドメイン、ポリペプチド間リンカーなどをコードする遺伝子配列であり得る。例えば、ＯＲＦベクター（上記の１−２フラグメントがメチオニン開始コドンと、ＤＥＢＳローディングドメインをコードする合成遺伝子配列とを含み、その中心領域が、ＤＥＢＳモジュール２およびＤＥＢＳモジュール３をコードする合成遺伝子配列を含み、そしてそのＣ末端領域が、ＤＥＢＳ  ＴＥドメインをコードする合成遺伝子配列を含む）は、ＤＥＢＳ  Ｎ−ＬＭ−ＤＥＢＳ２−ＤＥＢＳ３−ＴＥ−Ｃを含むポリペプチドをコードする（本明細書中に記載される全ての連続した合成ポリペプチドコード遺伝子が、互いにインフレームにある）。
【０２８０】
補助単位のコード配列は、公知であり（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）、そして合成補助単位遺伝子は、シントン編成および本明細書中に記載される他の方法によって作製され得る。このようなＮ末端領域およびＣ末端領域を有するＯＲＦベクターの構築のための例示的方法が、以下に記載される。
【０２８１】
（６．４．２  ＯＲＦベクター合成）
この節は、交換可能なエレメントの遺伝子ライブラリーの構築のために有用な「ＯＲＦ２」型ベクターを記載する。これらの一般的な型のベクターは、以下を含む：
内部型      ４−［７−＊］−［＊−８］−３
左端型      ４−［７−１］−［＊−８］−３
右端型      ４−［７−＊］−［６−８］−３
上記の括弧は、一旦７が選択されると、７から＊までの必要とされる距離が固定されるという事実を示すために使用される；同様に、一旦８が選択されると、＊から８までの必要とされる距離が固定される；そして残りの括弧の対［７−１］および［６−８］は、必要に応じて、以下に記載されるように、互いに対して有用に近位であるように選択され得る。上記の３つのベクターを使用するために、認識部位が７および８である酵素は、［７−＊］または［＊−８］と印された全ての位置で相互に適合性の突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）産物を有し、好ましくは、これは、ａ）等しい突出部の長さ（０であり得る）を有することによって；ｂ）それらの位置において同一の突出部（もしあれば）を作り出す切断（ｃｕｔ）部位（すなわち、切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）部位）を有することによって［その突出部（もしあれば）におけるモジュールまたは補助遺伝子内の同一の配列が＊で標識される］；およびｃ）その切断部位は、同様に、上記のオープンリーディングフレームと適合性であることが必要とされる［その結果、２つの＊の存在（もしあれば）が、そのフレームに関して同じ位置にて始まる；あるいは認識部位が７および８である酵素が平滑末端化切断酵素（ｂｌｕｎｔ  ｃｕｔｔｅｒ）である場合、その切断部位は、そのフレームに関して等しく配置されなければならない］ことによって達成される。
【０２８２】
１と標識された部位は、上記の構築物の左端になり、その部位内で切断する酵素（例えば、Ｎｄｅ  Ｉ）のための制限認識部位（または、他のエンドヌクレアーゼ認識部位）であるように選択され得る。同様に、６と標識された部位は、上記の構築物の右端になり、そしてその部位内で切断する酵素（例えば、Ｅｃｏ  ＲＩ）のための制限認識部位であるように選択され得る。この部位の対は、所望されるように、最終の構築物を種々の発現ベクター内に移動させるために簡便な対であるように有用に選択される。この構築方法自体は、１または６のいずれかが制限酵素認識部位であることを必要としないが、単純に、以下の条件で切断部が作製され得る場所を必要とする（ライブラリ中のモジュール含有アセンブリベクターは、「アセンブリベクター（すなわち「占有されたアセンブリベクター」）または「ライブラリベクター」」と呼ばれ得る）：
ａ）上記のアセンブリ（ライブラリー）ベクターの１における切断部は、ＯＲＦ構築物作製の間にＯＲＦ構築ベクターファミリー中の部位１において作製され得る切断部と適合性である；
ｂ）上記のアセンブリ（ライブラリー）ベクターの６における切断部は、ＯＲＦ構築作製の間にＯＲＦ構築ベクターファミリー中の部位６において作製され得る切断部と適合性である；
ｃ）各場合において、ＯＲＦ構築ベクターへのライブラリーＯＲＦエレメントの転移の後に、部位７および部位８について選択されたＩＩＳ型酵素についての認識部位は、そのベクター産物において独特（特有）である（存在する場合）。
【０２８３】
例えば、７についてのＩＩＳ型酵素を使用して、部位１を切断し得、転移のために使用され得る１における突出部を作製する。
【０２８４】
（規定された初期Ｎ末端領域を有するＯＲＦベクターの構築）
左端型のライブラリーベクター（部位パターン４−［７−１］−［＊−８］−３を有する）を、１および３で切断し、そしてフラグメント１−［＊−８］−３が保存される；ＯＲＦベクター（最初に、部位パターン１−３−４−６を有する）を１および３で切断し、そしてフラグメント３−４−６−１がドナーフラグメント１−［＊８］−３に接続されて、パターン１−［＊−８］−３−４−６を有するフラグメントが作製される。
【０２８５】
（規定された初期Ｃ末端領域を有するＯＲＦベクターの構築）
右端型のライブラリーベクター（部位パターン４−［７−＊］−［６−８］−３を有する）を、４および６で切断し、そしてフラグメント４−［７−＊］−６が保存される；ＯＲＦベクター（最初に、部位パターン１−３−４−６を有する）を４および６で切断し、そしてフラグメント６−１−３−４がドナーフラグメント４−［７−＊］−６に接続されて、パターン１−３−４−［７−＊］−６を有するフラグメントが作製される。
【０２８６】
同じ方法による左端の構築を、先に構築された右端の存在下で行い得る。この場合、ドナーは、再び、左端型のライブラリーベクターである（部位パターン４−［７−１］−［＊−８］−３を有する）；アクセプターは、ここで、部位パターン１−３−４−［７−＊］−６を有するＯＲＦベクターである；再び、ドナーフラグメント１−［＊−８］−３は、アクセプターフラグメント１−３を置換する。
【０２８７】
同様に、同じ方法による右端の構築を、先に構築された左端の存在下で行い得る。この場合、ドナーは、再び、右端型のライブラリーベクターである（部位パターン４−［７−＊］−［６−８］−３を有する）；アクセプターは、ここで、部位パターン１−［＊−８］−３−４−６を有するＯＲＦベクターである；再び、ドナーフラグメント４−［７−＊］−６は、アクセプターフラグメント４−６を置換する。
【０２８８】
一旦、左端または右端のいずれかが加えられると、その端は、もう一方の端での伸長についての可能性を妨害することなく、標準的な内部伸長手順によって任意の回数、伸長され得る。左端および右端が加えられた後の任意のときに、内部型のライブラリー遺伝子フラグメントによるその左および／または右での任意の回数の伸長とともに、この手順は、［＊−８］および［７−＊］にて上記のＯＲＦ構築ベクターを切断し、その２つの＊部位において作製される突出部（または、平滑末端型ＩＩＳの場合、平滑末端）を接続することによって、終結され得る。
【０２８９】
内部型構築物、左端型構築物、および右端型構築物がまた、次の節で記載される「ＯＲＦ１」型ベクターにおいて、ＯＲＦ１ベクターおよびＯＲＦ２ベクター中の制限部位における差異を考慮する上記方法の改変形を使用して作製され得ることが、上記から明らかである。
【０２９０】
（６．４．３  例示的なＯＲＦベクター構築方法）
この節は、マルチモジュール遺伝子を構築するための３つの例示的な方法を記載した。与えられる例は、上記のようなＯＲＦベクター中での構築を示すが、各アプローチの多くの改変形が可能であること、そして示されるクローニングストラテジーが他の状況で使用され得ることが、当業者に明らかである。簡潔さのために、以下の方法は、節６．４．３においては、上で考察されるアミノ末端領域およびカルボキシ末端領域（例えば、補助単位）をコードする配列の存在無しで示される。しかし、このような領域を含む可能性があることは、読者に明らかである。
【０２９１】
（例示的構築方法１）
この例示的な方法において、独特（特有）のＮｏｔ  Ｉ部位（４）および独特（特有）のＥｃｏ  Ｒ１部位（６）がシントン挿入部位に隣接するアセンブリベクターを使用する。従って、モジュール遺伝子は、各々が、（ａ）そのモジュール遺伝子がＮｏｔ  Ｉ部位もＥｃｏ  ＲＩ部位も含まないように設計される。さらに、ライブラリー中の各モジュール遺伝子が、そのモジュールの５’／アミノ末端における独特（特有）のＳｐｅ  Ｉ（５）部位およびそのモジュールの３’／カルボキシ末端における独特（特有）のＸｂａ  Ｉ部位（２）を有して設計されることが、この例において想定される（図６を参照のこと）。このモジュール含有アセンブリベクターの構造は、以下のように記載され得る：
【０２９２】
【化４】
2007533308.tif 000015
【０２９３】
ここで、「モジュール」は、モジュール遺伝子をいい、囲まれた領域は、そのモジュールの境界を示す（すなわち、この例において、部位５および部位２は、このモジュール遺伝子内にある）。このようなモジュール含有アセンブリベクター（種々のモジュールＡ、モジュールＢ、モジュールＣ、．．．を含む）のライブラリーは、以下のように記載され得る：
【０２９４】
【化５】
2007533308.tif 000016
ライブラリー中のモジュール含有アセンブリベクターは、「アセンブリベクター」（または「占拠されたアセンブリベクター」）または「ライブラリーベクター」と呼ばれ得る。
【０２９５】
マルチモジュール遺伝子構築物を合成するために、ＯＲＦ（「オープンリーディングフレーム」）ベクターが、操作のために使用される。この例において、そのＯＲＦベクターは、以下の構造を有し得る：
１−２−３−４−５−６−      ［ＯＲＦ１］
Ｎｄｅ  Ｉ部位（１）（メチオニン開始コドンを含む）が、都合が良い。なぜなら、理解されるように、このＮｄｅ  Ｉ部位は、このオープンリーディングフレームのアミノ末端の範囲を定めるために使用され得るからである；しかし、このＮｄｅ  Ｉ部位は、全ての実施形態において必要とされるわけではない（例えば、メチオニン開始コドンは、このＯＲＦベクターによって提供されるよりもむしろ、モジュール内に設計され得る）。この構築物中のＰａｃ  Ｉ部位（３）は、制限分析のために有用であるが、これもまた必要というわけではない（最終のＯＲＦ構築物中にＰａｃ  Ｉ部位が無いことは、３−４によって定められた領域が、上記の生成プロセスの間に首尾良く除去されたことを示す；以下を参照のこと）。
【０２９６】
このＯＲＦベクター内へと第１のモジュール遺伝子（例えば、モジュールＡ遺伝子）を挿入するために、このＯＲＦベクターは、Ｎｏｔ  Ｉ（４）およびＳｐｅ  Ｉ（５）を用いて消化され、このライブラリーベクターは、Ｎｏｔ  Ｉ（４）およびＸｂａ  Ｉ（２）を用いて消化され、そしてこのライブラリーベクターの４−２フラグメントが、このＯＲＦベクター内にクローニングされ、以下が生成される：
【０２９７】
【化７】
2007533308.tif 000017
。
【０２９８】
制限部位２および制限部位５は、連結された場合に両方の部位（２／５）を破壊する適合性の付着末端を有する。第２のモジュールを挿入するために、このプロセスが繰り返される；モジュールＡを含むＯＲＦベクターが、Ｎｏｔ  Ｉ（４）およびＳｐｅ  Ｉ（５）で消化され、そして第２のライブラリーベクターの４−２フラグメントが、このＯＲＦベクター内にクローニングされ、以下が生成される：
【０２９９】
【化８】
2007533308.tif 000018
。
さらなるモジュール、補助単位、または他の配列を類似の様式で加え得る。
【０３００】
（例示的な構築方法２）
第２の例示的な方法において、ＩＩＳ型制限酵素を使用する（節４において上記される）。この場合、そのライブラリー中のモジュール遺伝子含有アセンブリベクターの構造は、以下のように記載され得る：
【０３０１】
【化９】
2007533308.tif 000019
ここで、７および８は、付着性かつ適合性の末端（例えば、同じ長さおよび方向の突出部を有する）を形成し得るＩＩＳ型酵素についての認識部位であり、＊は、以下に記載されるように、共通の配列モチーフである。明瞭さのために、以下の考察において、７は、Ｂｂｓ  Ｉであり、８は、Ｂｓａ  Ｉである。この場合、モジュールは、（ａ）そのモジュール遺伝子がＢｂａ  Ｉ（７）部位もＢｓａ  Ｉ（８）も含まず、Ｎｏｔ  Ｉ（４）部位を含まないように設計される。
【０３０２】
ＩＩＳ酵素７およびＩＩＳ酵素８の作用による付着性かつ適合性の末端の作製は、共通の配列モチーフが、モジュールの各末端に存在しそしてＩＩＳ型認識部位が、その共通の配列モチーフの配列を有する突出部を生成するように位置することを、必要とする。１つの実施形態において、そのモジュールの異なる末端に位置する（例えば、図６におけるような）Ｘｂａ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉについての制限部位が、簡便さのために使用される。この実施形態において、その共通の配列モチーフは、５’−ＣＴＡＧ−３’であり、これは、Ｘｂａ  Ｉ（５’−Ｔ∧ＣＴＡＧＡ−３’／３’−ＡＧＡＴＣ∧Ｔ−５’）およびＳｐｅ  Ｉ部位（５’−Ａ∧ＣＴＡＧＴ−３’／３’−ＴＧＡＴＣ∧Ａ−５’）の両方の中心領域である。Ｂｂｓ  ＩおよびＢｓａ  Ｉによる切断は、適合性の付着末端（５’−ＮＮＮＮＣＴＡＧ−３’）を生成する。重要なことには、この共通の配列モチーフは、制限部位（または何らかの特定の制限部位）を必要とせず、任意の数のモチーフが使用され得ることが、認識される。そのモジュール配列内へのこの共通の配列モチーフの導入が、そのライブラリーによってコードされるポリペプチドの機能（例えば、生物学的活性）を破壊することもまた、認識される。本明細書中の他の箇所で考察されるように、上記のＳｐｅ  Ｉ部位およびＸｂａ  Ｉ部位の導入は、この要件を満たすことが予期される；代替法は、例えば、Ａｌａ−Ａｌａを（周りの遺伝子配列と組み合わせて）コードするモチーフである。
【０３０３】
マルチモジュール構築物を合成するために、以下の構造を有するＯＲＦベクターが使用され得る：
−１−＊−８−３−４−７−＊−６−      ［ＯＲＦ２］。
【０３０４】
第１のモジュール（例えば、モジュールＡ）を上記のＯＲＦベクター内に挿入するために、このＯＲＦベクターは、Ｎｏｔ  Ｉ（４）およびＢｂｓ  Ｉ（７）を用いて消化され、上記ライブラリーベクターが、Ｎｏｔ  Ｉ（４）およびＢｓａ  Ｉ（８）を用いて消化される。そのモジュール含有フラグメント（Ｎｏｔ  Ｉ付着末端と、Ｓｐｅ  Ｉと適合性の第２の付着末端とを備える）が、このＯＲＦベクター内にクローニングされ、以下が生成される：
【０３０５】
【化１０】
2007533308.tif 000020
。
【０３０６】
第２のモジュールを挿入するために、このアセンブリベクターは、上記の第１のモジュールについてのように消化され（例えば、
【０３０７】
【化１０Ａ】
2007533308.tif 000021
を生じ）、そしてモジュールＡを含むＯＲＦベクターが、Ｎｏｔ  Ｉ（４）およびＢｂｓ  Ｉ（７）を用いて消化されて以下が生成される：
【０３０８】
【化１１】
2007533308.tif 000022
この構築物が、Ｂｂｓ  Ｉ（７）およびＢｓａ  Ｉ（８）の両方を用いて切断されて、以下が生成され得る：
【０３０９】
【化１２】
2007533308.tif 000023
。
【０３１０】
（例示的な構築方法３）
この例示的な方法において、独特（特有）のＮｏｔ  Ｉ部位（４）および独特（特有）のＰａｃ  Ｉ部位（３）が、シントン挿入部位に隣接するアセンブリベクターが使用されて、ＰＫＳモジュール遺伝子のライブラリーが作製される。このＰＫＳモジュール遺伝子の各々は、（ａ）そのモジュール遺伝子がＮｏｔ  Ｉ部位もＰａｃ  Ｉ部位も含まないように設計される。さらに、このモジュール遺伝子は、そのモジュール遺伝子の５’末端における独特（特有）のＳｐｅ  Ｉ（５）部位、およびそのモジュールの３’末端におけるＸｂａ  Ｉ部位（２）を有する。
【０３１１】
そのライブラリー中のモジュール遺伝子含有アセンブリベクターの構造は、以下のように記載され得る：
【０３１２】
【化１３】
2007533308.tif 000024
このようなアセンブリベクターのライブラリーは、以下のように記載され得る：
【０３１３】
【化１４】
2007533308.tif 000025
【０３１４】
例示的な方法３を使用して、モジュール遺伝子は、ベクターにおいて二方向でアセンブルされ得る。例えば、モジュールＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅについての遺伝子を含むベクターを作製するために、それらのモジュール遺伝子は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ；Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｂ、Ａ；Ｃ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ａ；などの順序でそのベクターに個々に加えられ得る。
【０３１５】
以下の部位
１−２−３−４−５−６−      ［ＯＲＦ１］
を有するＯＲＦベクターを使用して、第１のモジュール遺伝子（Ａ）が、そのモジュールにおいてＮｏｔ  Ｉ（４）およびＸｂａ  Ｉ（２）を用いて切断すること、およびＮｏｔ  Ｉ（４）およびＳｐｅ  Ｉ（５）を用いてそのＯＲＦベクターを消化して
【０３１６】
【化１５】
2007533308.tif 000026
を生じることによってか、あるいはそのアセンブリベクターにおけるＳｐｅ  Ｉ（５）およびＰａｃ  Ｉ（３）ならびにそのＯＲＦベクター中のＸｂａ  Ｉ（２）およびＰａｃ  Ｉ（３）を用いて切断して、生じる構築物：
【０３１７】
【化１６】
2007533308.tif 000027
を得ることによって、導入され得る。第２のモジュール遺伝子（モジュールＢ遺伝子）を構築物ＩＩＩ中のモジュールＡの左に加えるために、モジュールＢを含むアセンブリベクターが、Ｓｐｅ  Ｉ（５）およびＰａｃ  Ｉ（３）を用いて消化され、そして上記のモジュールＡ遺伝子を含むＯＲＦベクターが、Ｘｂａ  Ｉ（２）およびＰａｃ  Ｉ（３）を用いて消化されて以下が得られる：
【０３１８】
【化１７】
2007533308.tif 000028
【０３１９】
次いで、さらなるモジュールが、上記のモジュールＢ遺伝子の隣またはモジュールＡ遺伝子の隣のいずれかに、構築物（Ｖ）に加えられ得る。例えば、構築物：
【０３２０】
【化１８】
2007533308.tif 000029
が作製され得る。構築物（Ｖ）〜構築物（ＶＩＩＩ）は、Ｓｐｅ  Ｉ（５）およびＸｂａ  Ｉ（２）を用いて消化されて２−５フラグメントが除去され得、単一のオープンリーディングフレーム中に連続モジュールを含むポリペプチドをコードする遺伝子が作製される。
【０３２１】
これらの方法を使用して作製されたモジュール含有オープンリーディングフレームは、上記のＯＲＦベクターから切り出され得、そして発現ベクター内に挿入される。例えば、上に示される例において、そのオープンリーディングフレームは、Ｎｄｅ  Ｉ（１）部位およびＥｃｏ  ＲＩ（６）部位を使用して切り出され得る。
【０３２２】
上に示される例は、マルチモジュール遺伝子構築物の作製のためにアセンブリモジュールのライブラリーを使用するための能力を説明するためだけのものであることが理解される。制限部位、酵素、共通配列モチーフおよび切断部位の種々の他の組み合わせが、先の段落に示される結果を達成するために使用され得ることが認識される。例えば、ライブラリー（またはツールボックス）は、４つのモジュールおよび補助単位（例えば、上記［ＶＩ］および[ＶＩＩ］のような構築物）の種々の組み合わせを含む不完全なＯＲＦを含み得る。
【０３２３】
【化１９】
2007533308.tif 000030
【０３２４】
このようなライブラリーは、例えば、生産的であることが既知であるかまたは生産的である可能性があると考えられるモジュールの組み合わせを含み得る。このようなライブラリーを使用して、ＰＫＳモジュールまたはＮＲＰＳモジュールあるいは他のポリペプチドセグメントの活性が、種々の環境で試験され得る。多くの有用なライブラリーが、本明細書中に開示される方法によって可能になることが、上記考察から明らかである。
【０３２５】
（７．天然に存在する組み合わせに基づくマルチモジュール設計）
ポリケチドシンターゼをコードする合成遺伝子の設計のための代替的ストラテジーまたは補完的ストラテジーは、Ｋｈｏｓｌａら、ＷＯ０１／９２９９１（「Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｇｅｎｅｓ」に記載されるものに基づき、ここで、その開始点は、所望されるポリケチド（例えば、天然に存在するポリケチドまたは天然に存在するポリケチドの新規なアナログ）である。１つのストラテジーにおいて、所望されるポリケチドの構造は、そのポリケチドを「鋸歯」形式に変換すること（すなわち、そのポリケチドは線状化され、あらゆる合成後改変が除去される）、そしてそのポリケチドを記載するストリング（ｓｔｒｉｎｇ）を作製するために、ポリケチドにおいて見出される可能な２炭素ケチド単位のそれぞれに対応する一文字コードを割り当てることによって、ポリケチドコード（ストリング）を割り当てられる。所望されるポリケチドのケチド単位は、そのポリケチドを生成し得る、可能なモジュールを決定することによって、モジュールコードに変換される。次いで、そのモジュールコードは、公知のポリケチドシンターゼに対応するモジュールコードと（好ましくは、このような構造のデータベースのコンピュータ実行走査により）整列されて、天然において機能するモジュールの組み合わせが同定される。
【０３２６】
本発明の一つの実施形態において、モジュール配列の潜在的供給源は、公知のＰＫＳモジュールを有する所望されるポリケチドを生成し得る概念的モジュールのアライメントに基づいて選択される。アライメントは、例えば、非ネイティブのモジュール間境界面および／もしくは非ネイティブのタンパク質間境界面を最小化することによって、順位付けされ得る。例えば、構造ＬＤ−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆを有する遺伝子（ここで、ＬＤは、ローディングドメインであり、そしてＡ〜Ｅは、ＰＫＳモジュールである）を合成するために、そのアライメントは、表６に示された結果をもたらし得る。
【０３２７】
【表６】
2007533308.tif 000031
【０３２８】
この例では、いくつかの供給源が、以下のモジュール配列：ＬＤ  Ａ、Ｂ−Ｃ、Ｄ−Ｅ−Ｆ、の各々について同定される。接続部Ａ−Ｂおよび接続部Ｃ−Ｄは、接続されて、機能的ＰＫＳを形成する。いくつかのモジュール配列は、他よりもよくこの目的にかない得る。例えば、配列＃２および配列＃３は、両方ともＢ−Ｃの供給源として役立ち得る；しかし、配列＃２では、Ｂの天然の基質は、Ａの産物であり、したがって、より生産性が高い可能性があり得る。
【０３２９】
（８．ドメインの置換）
いくつかの実施形態において、本発明は、機能的ドメインの境界において有用な制限酵素認識部位を含む合成モジュール遺伝子のライブラリーを提供する（例えば、図４を参照のこと）。これらの部位はライブラリー全体に共通するので、「ドメイン交換」が容易に達成され得る。例えば、ＫＳドメインのＣ末端に独特（特有）のＰｓｔ  Ｉ部位を有し、かつＡＴドメインのＣ末端に独特（特有）のＫｐｎ  Ｉ部位を有するモジュール遺伝子（例えば、図４を参照のこと）において、これらのモジュールのＡＴドメインは除去され得、交換され得るこれらの部位によって境界を決定された異なるＡＴドメインをコードする遺伝子によって置換され得る。
【０３３０】
例えば、本発明の方法を用いて、１５０個の合成モジュール遺伝子（各々は、異なる天然に存在するモジュール遺伝子に対応する）のライブラリーが合成され得る。ここで、各合成遺伝子は、その遺伝子の５’末端に独特（特有）のＳｐｅ  Ｉ制限酵素認識部位を、その遺伝子の３’末端にＸｂａ  Ｉ制限酵素認識部位を、各ＫＳドメインコード領域の３’境界にＫｐｎ  Ｉ制限酵素認識部位を、そして各ＡＴドメインコード領域の３’境界にＰｓｔ  Ｉ制限酵素認識部位を有する。次いで、この１５０個のモジュールのいずれかが、分析、操作および発現のため、一般的なベクターまたはベクターのセット中にクローン化され得、さらに、共通の制限酵素認識部位の存在が、ドメインもしくはドメインの組み合わせの交換もしくは置換を可能にする。例えば、上記の例では、Ｋｐｎ  Ｉ部位およびＰｓｔ  Ｉ部位が、ＫＳドメインに続いてＡＴドメインを有する任意のモジュールにおいて、ドメインを交換するために使用され得る。
【０３３１】
（９．例示的な生成物）
（９．１  合成ＰＫＳモジュール遺伝子）
一局面において、本発明は、参照ポリペプチドセグメントに対応するポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子を提供する（ここで、この合成遺伝子のコード配列は、上記参照ポリペプチドセグメントをコードする天然に存在する遺伝子の配列とは異なる）。例えば、一つの実施形態において、本発明は、天然に存在するＰＫＳのドメインに対応するＰＫＳドメインをコードする合成遺伝子を提供する（ここで、この合成遺伝子のコード配列は、上記の天然に存在するＰＫＳをコードする遺伝子の配列とは異なる）。例示的ドメインとしては、ＡＴ、ＡＣＰ、ＫＳ、ＫＲ、ＤＨ、ＥＲ、ＭＴ、およびＴＥが挙げられる。関連する実施形態において、本発明は、天然に存在するＰＫＳのＰＫＳモジュールの一部に対応するＰＫＳモジュールの少なくとも一部をコードする合成遺伝子を提供する（ここで、この合成遺伝子のコード配列は、上記の天然に存在するＰＫＳをコードする遺伝子の配列とは異なり、そしてこのＰＫＳモジュールの一部は、少なくとも二つ、時には少なくとも三つ、そして時には少なくとも四つのＰＫＳドメインを含む）。関連する実施形態において、本発明は、天然に存在するＰＫＳのＰＫＳモジュールに対応するＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子を提供する（ここで、この合成遺伝子にコードされる配列は、上記の天然に存在するＰＫＳをコードする遺伝子の配列とは異なる）。一つの実施形態において、上記の合成遺伝子をコードするポリペプチドセグメントは、上記の天然に存在する遺伝子によりコードされる、少なくとも約２０個、少なくとも約３０個、少なくとも約５０個、もしくは少なくとも約１００個連続するアミノ酸残基に対応する。
【０３３２】
上記の合成コード配列と天然に存在するコード配列との間の差は、以下を包含し得る：（ａ）上記の合成遺伝子のヌクレオチド配列が、上記の天然に存在する遺伝子のヌクレオチド配列と約９０％未満同一であり、時には約８５％未満同一であり、そして時には約８０％未満同一であり；時には約７８％未満同一であり；時には約７７％未満同一である；および／または（ｂ）上記の合成遺伝子のヌクレオチド配列が、少なくとも一つの独特（特有）の制限酵素認識部位（上記の天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列中には存在しないか、もしくは独特（特有）ではない）を含む；および／または（ｃ）上記の合成遺伝子におけるコドン使用頻度分布が、上記の天然に存在する遺伝子のコドン使用頻度分布と実質的に異なる（例えば、上記の合成遺伝子および天然に存在する遺伝子によってコードされるポリペプチド中で同一である各アミノ酸について、同じコドンが、その場合の約９０％未満、時には約８０％未満、時には約７０％未満、使用される）；および／または（ｄ）上記の合成遺伝子のＧＣ含有量が、上記の天然に存在する遺伝子のＧＣ含有量と実質的に異なる（例えば、ＧＣが、約５％より大きく異なり、通常は約１０％より大きく異なる）。
【０３３３】
上記のアプローチにおいて、個々のドメイン、リンカー、ドメインの組み合わせ、およびモジュール全体のアミノ酸配列は、公知の（例えば、天然に存在する）ドメイン、ドメインの組み合わせ、およびモジュールの配列に基づき（すなわち、対応し）得る。本明細書中で使用される場合、第一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも一つ、少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、少なくとも五つ、もしくは少なくとも六つのＰＫＳドメイン（ＡＴ、ＡＣＰ、ＫＳ、ＫＲ、ＤＨ、およびＥＲから選択される）をコードする配列）は、第二のアミノ酸配列に対して、それらの配列が実質的に同じである場合に対応する。本発明の種々の実施形態において、上記の天然に存在するドメイン、リンカー、ドメインの組み合わせ、およびモジュールは、エリスロマイシンＰＫＳ、メガロマイシン（ｍｅｇａｌｏｍｉｃｉｎ）ＰＫＳ、オレアンドマイシンＰＫＳ、ピクロマイシンＰＫＳ、ニダマイシン（ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）ＰＫＳ、スピラマイシンＰＫＳ、タイロシンＰＫＳ、ゲルダナマイシンＰＫＳ、ピマリシンＰＫＳ、ｐｔｅＰＫＳ、アベルメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）ＰＫＳ、オリゴマイシンＰＳＫ、ナイスタチンＰＫＳ、またはアンホテリシンＰＫＳのうちの一つに由来する。
【０３３４】
この状況において、二つのアミノ酸配列は、それらが、少なくとも約９０％同一である場合、好ましくは、少なくとも約９５％同一である場合、さらにより好ましくは、少なくとも約９７％同一である場合、そして時には少なくとも９８％同一である場合、または少なくとも９９％同一である場合、実質的に同じである。二つのアミノ酸配列間の配列同一性は、必要な場合にはギャップを導入することにより、残基の一致を最適化することによって、決定され得る。いくつかの有用な比較アルゴリズムの一つは、ＢＬＡＳＴである；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，「Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ」．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈら、１９９３，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｂｙ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｅａｒｃｈ」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ａｌｔｓｃｈｕｌｒａら、９９７，「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、を参照のこと。Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４，「ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−８０もまた参照のこと。（ＢＬＡＳＴおよびＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ、または他のプログラムを用いる場合、初期設定パラメータが使用される。）
一局面において、本発明は、一つ以上のＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子（例えば、ＡＴ活性、ＡＣＰ活性、およびＫＳ活性をコードし、そして必要に応じて一つ以上のＫＲ活性、ＤＨ活性、およびＥＲ活性をコードする配列）を提供する。いくつかの実施形態において、この合成遺伝子は、モジュールをコードする配列一つあたり、多くとも一コピーの制限酵素認識部位（例えば、Ｓｐｅ  Ｉ認識部位、Ｍｆｅ  Ｉ認識部位、Ａｆｉ  ＩＩ認識部位、Ｂｓｉ  ＷＩ認識部位、Ｓａｃ  ＩＩ認識部位、Ｎｇｏ  ＭＩＶ認識部位、Ｎｈｅ  Ｉ認識部位、Ｋｐｎ  Ｉ認識部位、Ｍｓｃ  Ｉ認識部位、Ｂｇｌ  ＩＩ認識部位、Ｂｓｓ  ＨＩＩ認識部位、Ｓａｃ  ＩＩ認識部位、Ａｇｅ  Ｉ認識部位、Ｐｓｔ  Ｉ認識部位、Ｋａｓ  Ｉ認識部位、Ｍｌｕ  Ｉ認識部位、Ｘｂａ  Ｉ認識部位、Ｓｐｈ  Ｉ認識部位、Ｂｓｐ  Ｅ認識部位、およびＮｇｏ  ＭＩＶ認識部位）を有する。一つの実施形態において、本発明は、以下：ＰＫＳモジュールをコードする配列のアミノ末端をコードする配列の近くに、Ｓｐｅ  Ｉ部位を有し；および／またはｂ）ＫＳドメインのアミノ末端をコードする配列の近くに、Ｍｆｅ  Ｉ部位を有し；および／またはｃ）ＫＳドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近くに、Ｋｐｎ  Ｉ部位を有し；および／またはｄ）ＡＴドメインのアミノ末端をコードする配列の近くに、Ｍｓｃ  Ｉ部位を有し；および／またはｅ）ＡＴドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近くに、Ｐｓｔ  Ｉ部位を有し；および／またはｆ）ＥＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近くに、ＢｓｒＢ  Ｉ部位を有し；および／またはｇ）ＫＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近くに、Ａｇｅ  Ｉ部位を有し；および／またはｈ）ＡＣＰドメインのアミノ末端をコードする配列の近くに、Ｘｂａ  Ｉ部位を有する、ＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子を提供する。本発明の合成遺伝子は、上記（ａ）〜（ｈ）のうちの少なくとも一つ、少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、少なくとも五つ、少なくとも六つ、少なくとも七つ、もしくは少なくとも八つを含み得る。
【０３３５】
関連する局面において、本発明は、本発明の合成遺伝子を含むベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。一つの実施形態において、本発明は、第一のＰＫＳモジュールと、以下：（ａ）ＰＫＳ伸長モジュール；（ｂ）ＰＫＳローディングモジュール；（ｃ）チオエステラーゼドメイン；および（ｄ）ポリペプチド間リンカー、のうちの一つ以上とをコードする配列を含むベクターを提供する。例示的なベクターは、上記の節７に記載される。
【０３３６】
一局面において、本発明は、本発明の合成遺伝子もしくはベクターを含むか、またはこのようなベクターによってコードされるポリペプチドを含む、細胞を提供する。関連する局面において、本発明は、機能的ポリケチドシンターゼ（少なくともその一部は、この合成遺伝子によってコードされる）を含む細胞を提供する。このような細胞は、例えば、培養もしくは発酵によってポリケチドを生成するために使用され得る。例示的な有用な発現系（例えば、細菌細胞および真菌細胞）は、上記の節３に記載される。
【０３３７】
（９．２  ベクター）
本発明は、本発明の方法（例えば、節４に記載された編成法、および節７に記載されたようなマルチモジュール構築物を用いた分析が挙げられる）に有用な多種多様なベクターを提供する。
【０３３８】
したがって、一局面において、本発明は、（ａ）ＳＭ４−ＳＩＳ−ＳＭ２−Ｒ１または（ｂ）Ｌ−ＳＩＳ−ＳＭ２−Ｒ１を、示された順番で含むクローニングベクターを提供する（ここで、ＳＩＳは、シントン挿入部位であり、ＳＭ２は、第一選択マーカーをコードする配列であり、ＳＭ４は、第一と異なる第二選択マーカーをコードする配列であり、Ｒ１は、制限酵素認識部位であり、そしてＬは、異なる制限酵素の認識部位である）。１つの実施形態において、選択可能なマーカーは、薬物耐性を付与する遺伝子である。一つの実施形態において、このＳＩＳは、−Ｎ１−Ｒ２−Ｎ２−を含む（ここで、Ｎ１およびＮ２は、ニック形成酵素の認識部位であり、これは、同じであってももしくは異なっていてもよく、そしてＲ２は、Ｒ１ともＬとも異なる制限酵素の認識部位である）。本発明はまた、このようなベクターと、Ｒ１を認識する制限酵素および／もしくはニック形成酵素（例えば、Ｎ．ＢｂｖＣ  ＩＡ）とを含む、組成物を提供する。既に注記したように、考察は時々、制限部位（例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ、Ｌ’）を参照するが、等価な特性を有する他のエンドヌクレアーゼ（例えば、ホーミング型エンドヌクレアーゼ）もまた使用され得ることが理解される。
【０３３９】
一局面において、本発明は、ＳＭ４−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒ１を含むベクターを提供する（ここで、２Ｓ１は、第一のＩＩＳ型制限酵素の認識部位であり、２Ｓ２は、異なるＩＩＳ型制限酵素の認識部位であり、そしてＳｙは、シントンをコードする領域である）。一局面において、本発明は、Ｌ−２Ｓ１−Ｓｙ２−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒ１を含むベクターを提供する。一つの実施形態において、Ｓｙは、ポリケチドシンターゼのポリペプチドセグメントをコードする。一つの実施形態において、Ｂｂｓ  Ｉおよび／もしくはＢｓａ  Ｉが、ＩＩＳ型制限酵素として使用される。一つの実施形態において、本発明は、このようなベクターと、２Ｓ１もしくは２Ｓ２のいずれかを認識するＩＩＳ型制限酵素とを含む、組成物を提供する。
【０３４０】
関連する局面において、本発明は、ベクターと、２Ｓ１もしくは２Ｓ２を認識するＩＩＳ型制限酵素（または、２Ｓ１を認識する第一のＩＩＳ型制限酵素および２Ｓ２を認識する第二のＩＩＳ型制限酵素）とを含む、キットを提供する。
【０３４１】
一実施形態において、本発明は、同族ベクター対を含む組成物を提供する。本明細書中で使用される場合、「同族対」とは、本発明の編成（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）方法を実施するために組み合わせて使用され得る、一対のベクターを意味する。一実施形態において、上記組成物は、２Ｓ２を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されたＳＭ４−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒ１を含むベクターと、２Ｓ１を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されたＳＭ５−２Ｓ３−Ｓｙ２−２Ｓ４−ＳＭ３−Ｒ１を含むベクターとを含む。別の実施形態において、上記組成物は、２Ｓ２を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されたＬ−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒ１を含むベクターと、２Ｓ１を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されたＬ’−２Ｓ１−Ｓｙ２−２Ｓ２−ＳＭ３−Ｒ１を含むベクターとを含む。（ＳＭ１、ＳＭ２、ＳＭ３、ＳＭ４は、異なる選択マーカーをコードする配列であり、Ｒ１は、制限酵素の認識部位であり、ＬおよびＬ’は、２つの異なる制限酵素の認識部位であり、このＬおよびＬ’の各々は、Ｒ１と異なり、２Ｓ１および２Ｓ２は、２つの異なるＩＩＳ型制限酵素の認識部位であり、Ｓｙ１およびＳｙ２は、隣接するシントンであり、いくつかの実施形態において、これらのシントンは、ポリケチドシンターゼのポリペプチドセグメントをコードし得る。）
関連する実施形態において、本発明は、第１選択マーカーと、第１制限酵素により認識される制限部位（Ｒ１）と、シントンコード領域（第１のＩＩＳ型制限酵素により認識される制限部位と、第２のＩＩＳ型制限酵素により認識される制限部位とに挟まれる）とを含む、ベクターを提供し、上記第１制限酵素と第１のＩＩＳ型制限酵素とで上記ベクターを消化すると、上記第１選択マーカーと上記シントンコード領域とを含むフラグメントが生じ、上記第１制限酵素と上記第２のＩＩＳ型制限酵素とで上記ベクターを消化すると、上記シントンコード領域を含むが上記第１選択マーカーは含まない、フラグメントを生じる。一実施形態において、上記ベクターは、第２選択マーカーを含み、上記第１制限酵素と上記第１のＩＩＳ型制限酵素とでこのベクターを消化すると、上記第１選択マーカーと上記シントンコード領域を含むが上記第２選択マーカーは含まない、フラグメントを生じる。上記第１制限控訴と上記第２のＩＩＳ型制限酵素とで上記ベクターを消化すると、上記第２選択マーカーと上記シントンコード領域とを含むが上記第１選択マーカーは含まない、フラグメントを生じる。別の実施形態において、上記ベクターは、第３選択マーカーを含む。
【０３４２】
関連する局面において、本発明は、本明細書中に開示される方法のために有用な、ベクター、ベクター対、プライマー、および／または酵素を、キット形態で提供する。一実施形態において、上記キットは、編成方法において使用するための、上記のベクター対と、必要に応じて制限酵素（たとえば、ＩＩＳ型酵素）とを備える。
【０３４３】
（９．３．ライブラリー）
一局面において、本発明は、本明細書中に記載される合成遺伝子の有用なライブラリー（「遺伝子ライブラリー」）を提供する。一例において、ライブラリーは、天然に存在するＰＫＳのモジュールに対応するモジュールをコードする、複数の遺伝子（たとえば、少なくとも１０個、よりしばしば少なくとも約１００個、好ましくは少なくとも約５００個、なおより好ましくは少なくとも約１０００個）を含み、上記モジュールは、１つより多くの天然に存在するＰＫＳを、通常は３個以上、しばしば１０個以上、時には１５個以上の天然に存在するＰＫＳを含む。一例において、ライブラリーは、１つより多くのポリケチドシンターゼタンパク質、通常は３個以上、しばしば１０個以上、時には１５個以上のポリケチドシンターゼタンパク質に由来するドメインに対応するドメインをコードする遺伝子を含む。一例において、ライブラリーは、１つより多くのポリケチドシンターゼモジュール、通常は５０個以上、時には１００個以上のポリケチドシンターゼモジュールに由来するドメインに対応するドメインをコードする遺伝子を含む。
【０３４４】
本発明のいくつかの局面において、上記ライブラリーのメンバーは、共有される特徴（例えば、共有される構造的特徴または機能的特徴）を有する。一実施形態において、上記共有される構造的特徴は、共有される制限部位（例えば、遺伝子中または遺伝子の指定された機能的ドメイン中で稀であるかまたは独特（特有）である、共有される制限部位）である。例えば、一実施形態において、本発明のライブラリーは、遺伝子を含み、その遺伝子の各々は、ＰＫＳモジュールをコードし、上記遺伝子のモジュールコード領域は、少なくとも３つの独特（特有）な制限部位（例えば、Ｓｐｅ  Ｉ認識部位、Ｍｆｅ  Ｉ認識部位、Ａｆｉ  ＩＩ認識部位、Ｂｓｉ  ＷＩ認識部位、Ｓａｃ  ＩＩ認識部位、Ｎｇｏ  ＭＩＶ認識部位、Ｎｈｅ  Ｉ認識部位、Ｋｐｎ  Ｉ認識部位、Ｍｓｃ  Ｉ認識部位、Ｂｇｌ  ＩＩ認識部位、Ｂｓｓ  ＨＩＩ認識部位、Ｓａｃ  ＩＩ認識部位、Ａｇｅ  Ｉ認識部位、Ｐｓｔ  Ｉ認識部位、Ｂｓｔ  ＢＩ認識部位、Ｋａｓ  Ｉ認識部位、Ｍｌｕ  Ｉ認識部位、Ｘｂａ  Ｉ認識部位、Ｓｐｈ  Ｉ認識部位、Ｂｓｐ  Ｅ認識部位、およびＮｇｏ  ＭＩＶ認識部位）を共有する。一実施形態において、本発明のライブラリーは、１つより多くのＰＫＳモジュール各々をコードする遺伝子を含み、各モジュールコード領域は、少なくとも３つの独特（特有）な制限部位を共有する。いくつかの実施形態において、共有される制限部位の数は、４より多いか、５つより多いか、または６つより多い。共有される制限部位の例示的部位および位置としては、ａ）上記モジュールコード配列のアミノ末端をコードする配列付近のＳｐｅ  Ｉ部位；および／またはｂ）ＫＳドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＭｆｅ  Ｉ部位；および／またはｃ）ＫＳドメインのカルボキシ末端をコードする配列付近のＫｐｎ  Ｉ部位；および／またはｄ）ＡＴドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＭｓｃ  Ｉ部位；および／またはｅ）ＡＴドメインのカルボキシ末端をコードする配列付近のＰｓｔ  Ｉ部位；および／またはｆ）ＥＲドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＢｓｒＢ  Ｉ部位；および／またはｇ）ＫＲドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＡｇｅ  Ｉ部位；および／またはｈ）ＡＣＰドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＸｂａ  Ｉ部位が挙げられる。
【０３４５】
一局面において、上記ライブラリーの遺伝子は、クローニングベクターまたは発現ベクター中に含まれる。一局面において、ライブラリー中のＰＫＳモジュールコード遺伝子はまた、さらなる機能的ドメイン（例えば、１つ以上のＰＫＳ伸長モジュール、ＰＫＳローディングモジュール、チオエステラーゼドメイン、またはポリペプチド間リンカー）のインフレームコード配列を有する。
【０３４６】
（９．４．データベース）
一局面において、本発明は、配列情報を記憶しているコンピュータ読出し可能媒体を提供する。上記コンピュータ読出し可能媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ハードドライブ、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ＣＤ−ＲＯＭ、磁気テープなどが挙げられる。さらに、搬送波中（例えば、Ｉｎｔｅｒｎｅｔを含むネットワーク中）で具体化されるデータシグナルは、コンピュータ読出し可能記憶媒体であり得る。記憶された配列情報は、例えば、（ａ）本発明の合成遺伝子のＤＮＡ配列またはコードされるポリヌクレオチド、（ｂ）本発明のポリヌクレオチドのアセンブリのために有用なオリゴヌクレオチドの配列、（ｃ）本発明の合成遺伝子の制限地図であり得る。一実施形態において、上記合成遺伝子は、ＰＫＳドメインまたはＰＫＳモジュールをコードする。
【０３４７】
（１０．ハイスループットなシントン合成およびシントン分析）
（１０．１合成の自動化）
本明細書中に記載される遺伝子合成方法は、例えば、ハイスループットな遺伝子合成および遺伝子分析のためのコンピュータ指向性ロボットシステムを使用して、自動化され得る。自動化され得る工程としては、シントン合成、シントンクローニング、形質転換、クローン採取（ｐｉｃｋｉｎｇ）、および配列決定が挙げられる。特定の実施形態についての以下の説明は、例示のためであって、本発明を限定することは意図しない。
【０３４８】
図１９に示されるように、本発明は、液体ハンドラー（ｈａｎｄｌｅｒ）１２（例えば、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ液体ハンドラー；Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）と、この液体ハンドラー１２に接続されたランダムアクセスホテル１４（例えば、ＣｙｔｏｍａｔＴＭ  Ｈｏｔｅｌ；Ｋｅｎｄｒｏ）とを備える、自動システム１０を提供する。液体ハンドラー１２は、システム１０中で使用されるマイクロプレートおよび他の容器を受容し得る複数の位置Ｐ１〜Ｐ１９を備える。下記に考察されそして図１９に示されるように、上記の位置のうちの多数が、さらなる機能を備える。ランダムアクセスホテル１４は、各々がオリゴヌクレオチド溶液を保有する１つ以上の供給源マイクロプレート１６、シントンアセンブリウェルを含む１つ以上のＰＣＲプレート１８、およびＬＩＣ伸長プライマー（例えば、ウラシル含有オリゴヌクレオチド）の１つ以上の（必要に応じた）供給源２０を格納可能であり、そして、プレートおよびピペット先端を液体ハンドラー１２へと送達可能である。いくつかの実施形態において、上記ホテルは、＞５個、１０＞個、または＞２０個のマイクロプレート（例えば、＞５０個、＞１００個、または＞２００個の異なるオリゴヌクレオチド溶液）を含む。図１９の例において、供給源２０は、微量遠心管を備える。供給源２０はまた、バイアルまたは他の適切な任意の容器であり得る。ランダムアクセスホテル１４は、プライマー混合、ＰＣＲ関連手順、配列決定、および他の手順のために使用される。一実施形態において、液体ハンドラー１２は、位置Ｐ４にある加熱エレメント２２と、位置Ｐ１２にある冷却エレメント２３とを備える、デッキ２１を備える。デッキ２１はまた、図１９の例において位置Ｐ７に位置する、自動読み取りデバイス２４（例えば、バーコードリーダー）を備え得る。システム１０はまた、サーマルサイクラー２６、プレートリーダー２８、プレートシーラー３１、およびプレートピアス装置３０を備える。上記読み取りデバイス２４は、データを追跡可能であり、上記第６節において考察されるような、ライブラリーの圧縮および拡大のためのヒット採取（ｐｉｃｋｉｎｇ）を可能にする。ヒット採取（ｐｉｃｋｉｎｇ）は、例えば、ユーザーの入力に従ってライブラリーからクローンを再配置するために有用であり得る。
【０３４９】
ランダムアクセスホテル３２は、ハイスループットプライマー（オリゴヌクレオチド）混合のために必要なプレート格納を提供し、プラスミド調製および配列決定の間のユーザーの介入を減少させる。プレートリーダー２８は、サンプルのＤＮＡ濃度を測定するための分光光度計を備える。プレートリーダー２８から得られるデータは、配列決定の前にＤＮＡ濃度を正規化するために使用される。サーマルサイクラー２６は、遺伝子合成のために必要なＰＣＲ工程のための可変式温度インキュベーターとして役立つ。上記読み取りデバイス２４は、サンプル追跡のために組み込まれる。システム１０はまた、システム１０の中の異なるエレメントの間（例えば、液体ハンドラー１２と、ランダムアクセスホテル１４との間）を、サンプルおよびプレートを輸送するためのロボットアーム４０を備える。
【０３５０】
例示的のためであって如何なる限定としてでもないが、合成は、以下の様式で自動化され得る。
【０３５１】
（プライマー混合）  ロボットアーム４０が、液体ハンドラー１２に接続され、ランダムアクセスホテル１４から液体ハンドラー１２へと、１つ以上の供給源マイクロプレートおよびＰＣＲプレートを輸送する。液体ハンドラー１２は、適切な量の約２５種のオリゴヌクレオチド各々を、供給源マイクロプレート１６から、ＰＣＲプレート１８の「シントンアセンブリ」ウェルへと供給して、各ウェルがシントンを生成するために必要な等モル量のプライマーを含むようにする。各プライマー混合物は、上記のような、異なるプライマー（オリゴヌクレオチド）を含むので、どのプライマーがどのシントンアセンブリウェルに対応するかを決定するために、そのプライマーを同定して液体ハンドラー１２に必要なデータを自動的に抽出するために、スプレッドシードプログラムが必要に応じて利用される。一実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーの位置および目的地を同定するＧＥＭＳ出力からのデータが、液体ハンドラー１２について対応する転移データを生成するために使用される。位置および目的地のデータからそのような転移データを作成することは、当該分野で十分に理解されている。一実施形態において、ホテル１４は、マイクロウェル型プレートの異なるウェル中に、少なくとも約５０種、少なくとも約１００種、少なくとも約１５０種、少なくとも約２００種、または少なくとも約１０００種のオリゴヌクレオチド混合物を保有する。
【０３５２】
（ＰＣＲによるシントン合成）  一旦ＰＣＲプレート１８にプライマー混合物が充填されると、液体ハンドラー１２は、アセンブリＰＣＲ増幅混合物（ポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ、および「シントンアセンブリ」のために必要な他の成分を含む）を、各ウェルに送達し、ＰＣＲが、その中で実施される。ロボットアーム４０は、ＰＣＲプレート１８を、プレートシーラー３１へと移動して、ＰＣＲプレート１８をシールする。シールした後、ＰＣＲプレート１８は、ロボットアーム４０によって、サーマルサイクラー２６へと移動される。
【０３５３】
ウラシルを含むＬＩＣ伸長物が、第２ＰＣＲ工程によって、液体ハンドラー１２によってＰＣＲ産物（アンプリコン）へと、添加される。この第２ＰＣＲ工程において、ＬＩＣ伸長物を含むプライマーが、各ウェルに添加され（ＬＩＣ伸長混合物）、「連結されたシントン」が調製される。
【０３５４】
シントンクローニング混合物は、上記の連結されたシントンと、シントンアセンブリベクターとを、液体ハンドラー１２において合わせることによって、調製される。その後、各シントンクローニング混合物は、形質転換用のコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を含む姉妹プレートへと移される。この姉妹プレートは、冷却エレメント１２に位置する。形質転換後、各ウェル中の細胞は、ペトリ皿上に広げられ、これがインキュベートされて、単離クローンが形成される。
【０３５５】
細菌細胞培養物のインキュベーションの後、上記プレートは、インキュベーター５４から自動コロニーピッカー（ｐｉｃｋｅｒ）５０（例えば、Ｍａｎｔｉｓ；Ｇｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ）へとロボットアーム４０によって移される。自動コロニーピッカー５０は、プレート上の５〜１０個の単離コロニーを同定し、それらを採取し、そしてそれらを、液体増殖培地を含む深ウェルタイタープレート５２の個々のウェルに配置する。
【０３５６】
液体増殖培地が、例えば、上記のように、配列決定用のＤＮＡを調製するために使用される。その後、液体ハンドラー１２は、両方の方向でプライマーを使用する配列決定反応を設定する。配列決定は、自動配列決定機（例えば、ＡＢＩ  ３７３０  ＤＮＡ配列決定機）を使用して実行される。
【０３５７】
その配列は、下記のように分析される。
【０３５８】
（１０．２．クロマトグラムの迅速な分析（Ｒａｃｏｏｎ））
遺伝子合成における障害は、シントンからのＤＮＡ配列決定データの分析であり得る。例えば、単一のシントンの配列分析には、両方の方向で５つのクローンを配列決定することが必要であり得る。一実施形態において、代表的ＰＫＳ遺伝子は、各々５つの順方向配列および５つの逆方向配列を用いる、１００個のシントンの分析（合計１０００個の配列）を含み得る。
【０３５９】
大きな遺伝子の合成における精度を確保するために、それらの結果の迅速な分析が、図１４の模式図に示されるようなＲＡＣＯＯＮプログラムによって実施される。合成遺伝子の配列（この合成遺伝子は、複数のシントンへと分割される）、上記複数のシントンの各シントンがベクター中にクローン化されているシントンクローンの配列、インサートを含まない上記ベクターの配列が、プログラム１９１２に入力される。さらに、各シントン配列を特定のクローンまで追跡するＤＮＡ配列決定機追跡データもまた、提供される（１９１２）。すべての読み取りについて、ヌクレオチド配列は、各クローン化サンプルについて（塩基呼び出しにより）分析され（１９１０）、サンプル配列中に存在するベクター配列が、除去される（１９２０）。ハイスループット配列決定におけるデータ処理ソフトウェアの精度を改善するためおよびその精度の信頼可能な測定において、塩基呼び出しプログラム（例えば、ＰＨＲＥＤ）が、各塩基呼び出しについての誤りの確率を、上記の追跡データからコンピュータにより得た特定のパラメータの関数として評価するために、使用される。完全な合成遺伝子セグメントを示す重複するシントンクローンの連結ライブラリーの相対次数を示す地図が、構築され（「コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）マップ」）（１９３０）、そのコンティグ配列は、合成遺伝子の参照配列に対して整列される（１９４０）。上記プログラムは、各サンプルについての誤りおよび整列スコアを同定し（１９５０）、サンプルの順位付け、置換−挿入−欠失の誤り、選択または修復のために最も可能性がある候補を示す、包括的報告を作成する（１９６０）。
【０３６０】
単一シントンの調製は、両方の方向で５つのクローンを配列決定することを包含し得る。これらの配列が呼び出され、ベクター配列が、ＰＨＲＥＤ／ＣＲＯＳＳ＿ＭＡＴＣＨにより除去される。次に、これらの配列は、整列のためにＰＨＲＡＰへと送られ、ユーザーは、データを分析する：正確な（存在する場合は）配列が、望ましい配列との比較により選択され、他の配列中にあるエラーが、捕捉され、そして将来の統計的比較のために分析される。
【０３６１】
このＲａｃｏｏｎアルゴリズムは、このプロセスの冗漫な手動部分を自動化するために開発された。ＰＨＲＥＤは、ＤＮＡ配列決定機追跡データを読出し、塩基を呼び出し、それらの塩基に品質値を割り当て、それらの塩基呼び出しおよび品質値を記載してファイルを出力する。ＰＨＲＥＤは、ＳＣＦファイルおよびＡＢＩモデル３７３およびＡＢＩモデル３７７のＤＮＡ配列決定機ファイルから追跡データを読出し得、ファイル形式を自動検出する。塩基を呼び出した後、ＰＨＲＥＤは、ＦＡＳＴＡ形式、ＸＢＡＰに適切な形式、ＰＨＤ形式、またはＳＣＦ形式のいずれかにて、それらの配列をファイルへと書き出す。上記塩基についての品質値は、ＦＡＳＴＡ形式ファイルまたはＰＨＤファイルへと書き出され、これらのファイルは、アセンブルされた配列の精度を増加するためにＰＨＲＡＰ配列アセンブリプログラムにより使用され得る。ＰＨＲＥＤにより配列を処理した後、Ｒａｃｃｏｎは、各クローンの順方向配列および逆方向配列を統合し、その複合体を、同じシントン由来の他のものと整列するために、ＰＨＲＡＰへと送る。このソフトウェアは、その正確な配列を呼び出し、すべてのクローン中の誤りの位置、型（挿入、欠失、置換）および数を同定して集計する。これはまた、サイレント変異、アミノ酸変化、望ましくない制限部位、およびそのサンプルを不適格にし得る他のパラメータも検出する。その後、ユーザーは、どのようにそのデータ（エラー分析、統計など）を使用するかを決定する。
【０３６２】
Ｒａｃｏｏｎの特徴としては、（ｉ）複数のデータ形式（ＳＣＦ、ＡＢＩ、ＥＳＤ）を読み取ること；（ｉｉ）塩基呼び出し、アライメント、ベクター配列除去およびアセンブリを実施すること；（ｉｉｉ）複数の９６ウェルプレートサンプルを分析することについてのハイスループット能力；（ｉｖ）１サンプル１つ当たりの挿入、欠失、および置換、ならびにサイレント変異を検出すること；（ｖ）サイレント変異により生じる望ましくない制限部位を検出すること；（ｖｉ）さらなる分析用のデータベースに結果がダウンロードまたは記憶され得る、サンプルセットについての統計学的報告を作成することが挙げられる。
【０３６３】
このＲａｃｏｏｎシステムは、以下のソフトウェア成分を使用して実施される：Ｐｈｒｅｄ，Ｐｈｒａｐ，Ｃｒｏｓｓ＿Ｍａｔｃｈ（Ｅｗｉｎｇ  Ｂ，Ｈｉｌｌｉｅｒ  Ｌ，Ｗｅｎｄ  Ｍ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐ：Ｂａｓｅ  ｃａｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｔｒａｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｒｅｄ．Ｉ．Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ  ８，１７５〜１８５（１９９８）；Ｅｗｉｎｇ  Ｂ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐ：Ｂａｓｅｃａｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｔｒａｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｒｅｄ．ＩＩ．  Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８，１８６〜１９４（１９９８）；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．，Ｃ．ＤｅｓｍａｒａｉｓおよびＰ．Ｇｒｅｅｎ  ２００１．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ａｕｔｏｆｉｎｉｓｈ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ．１１（４）：６１４〜６２５）；Ｐｙｔｈｏｎ  ２．２  ａｓ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｃｒｉｐｔｉｎｇ  ｌａｎｇｕａｇｅ（Ｐｙｔｈｏｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｍ．Ｂｅａｚｌｅｙ）；ＧｅＭＳ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（Ｋｏｓａｎ私有ソフトウェア）；Ａｐａｃｈｅ  Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．４４（ｈｔｔｐ：／／ｈｔｔｐｄ．ａｐａｃｈｅ．ｏｒｇ）；およびＲｅｄ  Ｈａｔ  Ｌｉｎｕｘ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｄｈａｔ．ｃｏｍ）。
【０３６４】
（Ｒａｃｏｏｎアルゴリズム）
（工程Ｉ：データ集団）  ユーザーは、Ｒａｃｏｏｎプログラムに、生の配列決定データ、ベクター配列、およびサンプルを特定のシントンへとマッピングするルックアップ表を入力する。このプログラムは、各サンプルの実行フォルダを作成し、配列決定ファイル（順方向および逆方向）を望ましいシントン配列とともに正確にそのフォルダ中に配置する。このプログラムは、合成遺伝子設計データを含むデータベースから関連シントン配列を見出すために、上記ルックアップ表を使用する。
【０３６５】
（工程ＩＩ：塩基呼出し、ベクター配列決定および配列アセンブリ）  複数の読み取り値が、塩基呼出しソフトウェア（例えば、ＰＨＲＥＤおよびＰＨＲＡＰ（例えば、ＥｗｉｎｇおよびＧｒｅｅｎ（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：１７５〜１８５；ＥｗｉｎｇおよびＧｒｅｅｎ（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：１８６〜１９４；ならびにＧｏｒｄｏｎら（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：１９５〜２０２））を使用して分析されて、配列決定された各ヌクレオチドについての確実性値が得られ得る。ｐｙｔｈｏｎスクリプトが、特定のシントンのクロマトグラムファイルを含む各サンプルフォルダに対して実行される。このスクリプトは、次いで、以下のプログラムを連続して実行する。
【０３６６】
（ＰＨＲＥＤ）  配列追跡における多色ピークに基づいてヌクレオチド配列を決定するための塩基呼出しソフトウェア。ＰＨＲＥＤは、ＤＮＡ配列決定追跡データを読み取り、塩基を呼び出し、品質値をその塩基に割り当て、そしてその塩基呼出しおよび品質値を書き出してファイルを出力する（例えば、ＥｗｉｎｇおよびＧｒｅｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ  ８：１８６〜１９４（１９９８）参照）。塩基を呼び出した後、ＰＨＲＥＤは、その配列を、ＦＡＳＴＡ形式、ＸＢＡＰに適切な形式、ＰＨＤ形式、またはＳＣＦ形式のいずれかでファイルへと書き出す。当業者は、特定の配列決定機器の出力に適合するヌクレオチド配列特徴付けプログラムを選択可能であり、種々の塩基呼出しプログラムを用いる分析のために配列決定機器の出力を適合可能である。
【０３６７】
（ＣＲＯＳＳ＿ＭＡＴＣＨ）  Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ配列整列アルゴリズムの実施。これは、各サンプルからベクター配列を除去するためにこの工程において使用される。
【０３６８】
（ＰＨＲＡＰ）  ショットガンＤＮＡ配列決定データをアセンブルするためのプログラムパッケージ。これは、読出し値の最高品質部分のモザイクとしてコンティグ配列を構築するために使用される。生じるアセンブリファイルは、比較および分析のための候補である。
【０３６９】
（工程ＩＩＩ：エラーの検出、サンプルの順位付け）  ｐｙｔｈｏｎスクリプトは、もとのシントン配列と、生じるアセンブリファイルとの間での各サンプルについての変動を決定する目的で、ＣＲＯＳＳ＿ＭＡＴＣＨを戻す。
【０３７０】
各シントンフォルダは、サンプルフォルダの集合物と、ＰＨＲＥＤ、ＰＨＲＡＰ、およびＣＲＯＳＳ＿ＭＡＴＣＨにより作成される関連ファイルとを有する。ｐｙｔｈｏｎプログラムは、関連サンプルの各々を検出し、それらを、シントンと関連付ける。このプログラムは、出力ファイルから必要な情報を探索し、上記サンプルを順位付けする。このプログラムは、サイレント変異を探索し、新たに導入された制限部位を点検し、そしてさらなる分析のために使用され得る報告を作成する。
【０３７１】
Ｒａｃｏｏｎは、大きなデータセットを迅速に処理することが可能である。約２００個のサンプルが、２分間未満で分析され得る。このことは、塩基呼出し、ベクタースクリーニング、エラーの検出、報告の作成を含んだ。これらの結果は、ＨＴＭＬファイルとして保存され得るか、または個々のサンプルの実行が、さらなる分析のためにデスクトップにダウンロードされ得る。
【実施例】
【０３７２】
（１１．実施例）
（実施例１）
（遺伝子アセンブリプロトコルおよび遺伝子増幅プロトコル）
本実施例は、遺伝子のアセンブリおよび増幅のためのプロトコルを記載する。
【０３７３】
（アセンブリ）
合成ＤＮＡフラグメントのアセンブリを、以前に開発された手順（Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ  １６４：４９〜５３；ＨｏｏｖｅｒおよびＬｕｂｋｏｗｓｋｉ  ２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４３）から適合させる。この遺伝子合成方法は、フラグメント全体の両方の鎖について、互いに２０ヌクレオチド重複する４０マーオリゴヌクレオチドを使用する。
【０３７４】
あるシントンについての等容量の重複オリゴヌクレオチドを、一緒に添加し、水で希釈して、最終濃度２５μＭ（合計）にする。上記オリゴ混合物を、ＰＣＲによりアセンブルする。アセンブリ用のＰＣＲ混合物は、０．５μｌのＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５単位／μＬ、Ｒｏｃｈｅ）、１．０μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５．０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、３．０μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．０μｌの２５μＭ  Ｏｌｉｇｏ混合物、３８．５μｌの水である。アセンブリ用のＰＣＲ条件は、９５℃にて５分間の変性工程で始まり、その後、９５℃で３０秒間の変性、５０℃もしくは５８℃で３０秒間のアニーリング、および伸長温度７２℃で９０秒間を２０〜２５サイクル行う。
【０３７５】
（増幅）
上記アセンブリ反応のアリコートを採取し、それを増幅ＰＣＲ用のテンプレートとして使用する。増幅ＰＣＲにおいて、使用するプライマーの領域は、ＬＩＣ−ＵＤＧクローニングにおいて使用するために、ウラシル残基を含む。上記プライマーは、３１６−４−Ｆｏｒ＿Ｍｏｒｐｈ＿ｄＵ：
【０３７６】
【化２０】
2007533308.tif 000032
【０３７７】
である。ウラシル含有領域に、下線を付している。留意されるように、共通リンカー対を、シントンの縁に共通配列を設計することによって、多くの異なるシントンについて使用し得る。
【０３７８】
増幅ＰＣＲ用の反応混合物は、０．５μｌのＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１．０μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５．０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、３．０μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（１．５ｍＭ）、１．０μｌの５０μＭ順方向Ｏｌｉｇｏストック、１．０μｌの５０μＭ逆方向Ｏｌｉｇｏストック、１．２５μｌのアセンブリラウンドＰＣＲサンプル（テンプレート）および３７．２５μｌの水である。増幅用プログラムは、９５℃にて５分間の初期変性工程を含む。９５℃で３０秒間の変性、６２℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で６０秒間の伸長を２５サイクル、そして最終伸長が１０分間である。
【０３７９】
サンプルの増幅を、ゲル電気泳動により確認する。望ましいサイズが生成された場合は、そのサンプルを、ＵＤＧクローニングベクター中にクローン化する。増幅が機能しない場合、第２ラウンドのアセンブリを、実施する。これには、アセンブリ用ＰＣＲ混合物を使用する。このＰＣＲ混合物は、１６μＬの第１ラウンドアセンブリ、０．５μＬ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１．０μＬ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、３．３μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２．０μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．０μｌのオリゴ混合物、および３５．２μＬの水である。第２ラウンドアセンブリ用のＰＣＲ条件は、上記第１アセンブリと同じである。第２アセンブリの後、増幅ＰＣＲを実施する。
【０３８０】
（実施例２）
（ライゲーション非依存性クローニング）
編成ベクター中にシントンをクローニングするためのプロトコルが、ベクターｐＫｏｓ２９３−１７２−２またはベクターｐＫｏｓ２９３−１７２−Ａ７６を参照して下記に記載される。当該分野の知識を持つ読者は、異なる制限部位、異なるシントン挿入部位、または異なる選択マーカーを有するベクターを供給するために使用される変化を容易に同定する。
【０３８１】
（エキソヌクレアーゼＩＩＩ方法）
（ベクター調製）  ＵＤＧ−ＬＩＣ用のベクターを調製するために、１０μＬのベクター（１μｇ〜２μｇ）を、１μＬのＳａｃ  Ｉ（２０単位／μＬ）を用いて３７℃にて２時間消化する。１μＬのニック形成エンドヌクレアーゼＮ．ＢｂｖＣ  ＩＡ（１０単位／μｌ）を添加し、そのサンプルを、３７℃にてさらに２時間インキュベートする。その酵素を、６５℃にて２０分間インキュベートすることによって熱不活化し、その後、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、その消化緩衝液を水で交換する。そのサンプルを、２００単位のＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）を用いて３０℃にて１０分間処理し、Ｑｉａｇｅｎ  ｑｕｉｋカラムにて精製し、最終容量３０μＬになるまで溶出する。サンプルを、ゲル電気泳動により分解について検査し、そして試験ＵＤＧクローニング反応のために使用して、クローニング効率を決定する。
【０３８２】
（フラグメントのＵＤＧクローニング）  上記合成遺伝子フラグメントをクローン化するために、それらのフラグメントを、ＬＩＣベクターの存在下にてＵＤＧで処理する。２μＬのＰＣＲ生成物（１０ｎｇ）を、最終反応容量１０μＬにて，４μＬの事前処理済みｄＵベクター（５０ｎｇ）の存在下で、１μＬ（２単位）のＵＤＧ（ＮＥＢ）を用いて３７℃にて３０分間処理する。
【０３８３】
生じた混合物を、氷上に２分間配置し、反応容量全体（１０μＬ）を、ＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン（すなわち、ＳＭ１）を含むＬＢプレート上で選択する。それらのプラスミドを、特徴付けとその後のクローニング工程のために精製する。  
【０３８４】
（エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ方法）
（ベクター調製）  上記ベクターを、ＳａｃＩを用いる消化により線状化する。ニック形成エンドヌクレアーゼ（１００単位のＮ．ＢｂｖＣ  ＩＡ）を添加し、その混合物を、３７℃にて２時間インキュベートする。ＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出とその後のエタノール沈殿により反応混合物から単離する。
【０３８５】
（ＵＤＧクローニング）  ２０ｎｇの線状化ベクター、１０ｎｇのＰＣＲ生成物、および１単位のＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからキットとして入手可能である、エンドヌクレアーゼＶＩＩとＵＤＧとの混合物）を、合わせ、３７℃にて１５分間インキュベートし、室温にて１５分間インキュベートし、そして氷上で２分間インキュベートし、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換するために使用する。エンドヌクレアーゼＶＩＩＩは、Ｍｅｌａｍｅｄｅら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１２５５〜６４において記載される。
【０３８６】
（実施例３）
（クローン化したシントンの特徴付けおよび修正）
（クローンの同定）  正確なＰＣＲ生成物（例えば、配列エラーを有さない）を含むクローンを同定するために、プラスミドＤＮＡを、いくつかの（代表的には、５個以上の）クローンから単離して配列決定する。任意の適切な配列決定法を使用し得る。一実施形態において、φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｍｐｌｉｃａｓｅ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって得られるＤＮＡを使用して、配列決定を実施する。Ｎｅｌｓｏｎら、２００２、「ＴｅｍｐｌｉＰＨｉ，ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂａｓｅｄ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｍｐｌａｔｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｕｐｐｌ：４４−７参照。一実施形態において、配列決定されるべきプラスミドを含む各コロニーを、１．４ｍＬのＬＢ培地中に懸濁し、１μｌを、増幅／配列決定反応において使用する。
【０３８７】
（配列分析）  配列決定後、結果を、意図される配列と整列して比較し得る。好ましくは、このプロセスを、ＲＡＣＯＯＮプログラム（下記）を使用して自動化して、各シントンに対応する配列を整列した後に正確な配列を同定する。
【０３８８】
（クローンの保存）  目的とするクローンを、回収および使用のための種々の様式（Ｓｔｏｒａｇｅ  ＩｓｏＣｏｄｅ（登録商標）ＩＤＴＭ  ＤＮＡライブラリーカード（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を含む）にて保存し得る。
【０３８９】
（配列エラーを修正するための部位特異的変異誘発：）
シントンサンプルを、所望の配列を有するクローンが見出されるまで配列決定し得る。あるいは、１つまたは２つのみの点変異を有するクローンが、部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）を用いて修正され得る。ＳＤＭの１つの方法は、元の遺伝子合成において使用された、４０マーのオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲベースの部位特異的変異誘発である。例えば、所望の標的配列由来の１つのみの点変異を有するサンプルは、以下のように修正される：シントンのアセンブリからの重複オリゴヌクレオチド（これは、シントンのその部分に対応する）を同定し、そしてそのシントンの修正のために用いた。エラーを含むサンプルＤＮＡを、Ｐｆｕに基づくＰＣＲ方法を使用して、その変異の領域を網羅する重複オリゴヌクレオチド（番号１および番号２）を用いて、増幅した（ＦｉｓｃｈｅｒおよびＰｅｉ，１９９７，「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：５７０−７４）。反応混合物は、以下を含んだ：ＤＮＡテンプレート［５ｎｇ〜２０ｎｇ］、５．０μＬ；１０×Ｐｆｕ緩衝液、０．５μＬ；オリゴ番号１［２５μＭ］、０．５μＬ；オリゴ番号２［２５μＭ］、１．０μＬ；１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．０μＬ；Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、および５０μＬまでの水。ＰＣＲ条件は、以下のようであった：９５℃  ３０秒（熱感受性リガンドとともにＰｆｕを用いる場合は、２分間）、１２サイクル〜１８サイクルの「９５℃  ３０秒間、５５℃  １分間、６８℃  ２分間／ｋｂプラスミド長（Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏの場合、１分間／ｋｂ）。次に、メチル化（親）ＤＮＡを、ＰＣＲ反応物に１μＬ  ＤｐｎＩ（１０単位）を添加し、そして１時間３７℃でインキュベートすることによって、分解した。得られたサンプルを、コンピテントＤＨ５α細胞内に形質転換した。４つのクローン由来のプラスミドＤＮＡを、単離し、そして配列決定して、所望のクローンを同定した。
【０３９０】
（実施例４）
（ＰＫＳモジュールにおける有用な制限部位の同定）
ＰＫＳモジュールにおける有用な制限部位を同定するため、ＰＫＳ遺伝子からの１４０モジュールのアミノ酸配列を、分析した。理論上の制限部位を同定するための戦略が開発されている。この理論上の制限部位は、すなわち、モジュール配列中に破壊的変化を生じない、そのモジュールをコードする遺伝子中に位置し得、以下の診断基準のいくつかまたは全てを満たす：
１．部位は、その遺伝子において約５００ｂｐ離れているか、そして／またはドメイン端またはモジュール端に存在し、
２．シントンからのモジュールのハイスループットアセンブリと適合可能であり（これは、しばしばモジュール内で独特（特有）であることに起因する）、
３．異なったモジュールの間に同様に配置され、そして
４．ＰＫＳの機能（活性）を破壊しない。
【０３９１】
２つの型の制限部位を、同定した。第１のセットの部位は、ドメインの端に位置する部位である（モジュールの端にあるＸｂａ  Ｉ部位およびＳｐｅ  Ｉ部位を含む）。第２のセットは、シントンの端に位置し得るが、一般にドメインの端では見出されなかった。
【０３９２】
この実施例において記載される制限部位は、例示に過ぎないものであること、さらなる異なった部位が、本明細書中に開示される方法によって同定され得、本発明の合成方法において使用され得る。
【０３９３】
ある１４個のＰＫＳ遺伝子クラスターから取った１４０個のモジュールの選択された領域のアミノ酸配列を、整列した（図９参照）。次いで、ドメインの端に近く相同性の高い領域（可能性のあるすべてのＤＮＡ配列に逆翻訳した場合、６塩基以上の制限部位が明らかになった）を、同定した。特定の場合、制限部位を配置するためのアミノ酸の保存的変化を、許容した。但し、そのＰＫＳモジュールのうちの多くに変化が見出された。稀に、制限部位を、推定ドメイン間配列に配置した。これには、アミノ酸の変化が必要であった。このような場合、改変アミノ酸配列は、あるＰＫＳにおいて機能を邪魔しないという、実験的証拠が存在した。
【０３９４】
ＰＫＳモジュールの４つの共通の改変体（［ＫＳ＋ＡＴ＋ＡＣＰ］；［ＫＳ＋ＡＴ＋ＡＣＰ＋ＫＳ］；［ＫＳ＋ＡＴ＋ＡＣＰ＋ＫＳ＋ＤＨ］；［ＫＳ＋ＡＴ＋ＡＣＰ＋ＫＳ＋ＤＨ＋ＥＲ］）についての遺伝子設計の結果を、図４および表７〜表１１に示す。制限部位の位置は、可能な場合にはドメイン内の相同アミノ酸標的部位に当てはまり、そして６−ＤＲＢＳ遺伝子または６−ＤＲＢＳタンパク質のモジュール４（６つすべての共通ドメインを含む）に当てはまる。後者について、参照として使用されるアミノ酸およびヌクレオチドの配列の番号付けは、ＫＳドメインのＮ末端で見出されるＥＰＩＡＩＶの最初の残基で始まる；相同なモチーフは、サンプル中の１４０個すべてのＫＳドメインのＮ末端で見出される。
【０３９５】
【表７】
2007533308.tif 000033
【０３９６】
＊各モジュールの番号付けは、エリスロマイシンのモジュール４のＥ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｉ−Ｖのグルタミン酸（Ｅ）の部位と相同な部位のアミノ酸になる、ＫＳドメインのＮ末端で開始する。
【０３９７】
Ｍｆｅ  Ｉ部位を、ＫＳをコードする配列の左端近くに、ＫＳの最初のモチーフのＰＩＶと相同なトリペプチドをコードする９塩基の塩基２〜７を使用して、組み込み得る。上記の１４０個のＫＳのうちの７０％は、アミノ酸における変化を必要としない；残りの３０％は、保存的変化のみを必要とする［８１％  Ｖ→Ｉ、１７％  Ｌ→Ｉおよび２％  Ｍ→Ｉ］。１４０個のＫＳドメインのうちの１００％の右端に、保存されたＧＴ（ヌクレオチド１２６７〜１２７２）が存在し、これは、Ｋｐｎ  Ｉ制限部位についての配列によってコードされ得る。
【０３９８】
Ｍｓｃ  Ｉ部位を、ＡＴコード配列の左端近く（ヌクレオチド１５９０〜１５９５）に、サンプルにしたＡＴのうちの１００％において見出されるＧＱジペプチドの部位で組み込み得る。ＰｓｔＩ部位を、ＡＴの右側（ヌクレオチド２６１１〜２６１７）に、Ｐｓｔ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉが以前配置されていた位置に、ドメイン交換の後に機能を喪失することなく配置する。この可変配列領域は、多くのモジュールにおいて、Ｙ−ｘ−Ｆ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−ｘ−Ｗモチーフによって同定され、ここで、「ｘ」は、任意のアミノ酸である；別の場合は、アライメントによって、よく規定された等価な位置が常に生成される。このモチーフのすぐ右側の２つのアミノ酸（ＷのＣ末端側）を、ＰｓｔＩ部位を導入するために改変する。
【０３９９】
ＫＲを含むモジュールについて、Ａｇｅ  Ｉ部位を、ＴＧジペプチド（ヌクレオチド４８９４〜５５４２）（試験配列中の１３６個のＫＲのうちの１００％において見出される）に配置し得る。ＥＲドメインがこのモジュール内に存在する場合、Ｂｓｒ  ＢＩ部位を、その左端（これは、その試験配列中の１７個のＥＲの１つを除き全てにおいて見出される（残りのＥＲは、そのサンプル中で活性を有さない唯一のＥＲドメインである）保存的ＰＬジペプチド（ヌクレオチド４０７２〜４９２９）をコードする）に配置し得る。ＥＲドメインおよびＫＳドメインは、わずか４アミノ酸〜６アミノ酸で分離されているに過ぎないので、そのＫＲのＡｇｅ  Ｉ部位は、このＥＲのもう一方の切除部位として作用する。
【０４００】
上記のモジュールのカルボキシ末端において、ＸｂａＩ部位を、そのモジュールのＡＣＰのカルボキシ末端に隣接する、よく規定された位置に配置し得る。全てのＡＣＰの活性部位のセリン（Ｓ）の右側の３６位および４０位に２つのロイシン（Ｌ）が存在する。４０位のロイシンの後の２つのアミノ酸（通常、上記の活性部位のセリンの後の４１位および４２位）のコドンを、ＸｂａＩの認識配列に変化させる（Ｃ末端）。
【０４０１】
天然では別のモジュールの後に続くモジュールにおいて、ＳｐｅＩクローニング部位を、アミノ末端部位として組み込み得る。この部位は、ＸｂａＩについて上述した部位（通常、上記の活性部位のセリンの後の４１位および４２位）と類似し、この後に、そのＫＳ中のＭｆｅ  Ｉ部位へのモジュール間リンカーが続く。タンパク質のＮ末端に存在するモジュール（すなわち、その左側にＡＣＰは存在しない）において、Ｓｐｅ  Ｉ−Ｍｆｅ  Ｉリンカー配列は必要なく、合成されたモジュールのセグメントは、Ｍｆｅ  Ｉ−Ｘｂａ  Ｉ本体部のみからなる。
【０４０２】
本発明が、特に、合成遺伝子の設計のために有用な制限酵素認識部位を、以下によって同定するための方法を提供することが、理解される：（ｉ）複数の機能的に関連するポリペプチドセグメントについてのアミノ酸配列を得る工程；（ｉｉ）このアミノ酸を逆翻訳し、各ポリペプチドセグメントについて複数のポリペプチドセグメントコード核酸配列を生成する工程；上記のポリペプチドセグメントのうちの少なくとも約５０％の、少なくとも１つのポリペプチドセグメントコード核酸配列において見出される制限酵素認識部位を同定する工程。好ましい制限酵素認識部位は、上記のポリペプチドセグメントのうちの少なくとも約７５％の、さらにより好ましくは少なくとも約８０％の、さらにより好ましくは少なくとも約８５％の、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の、そして時々約１００％の、少なくとも１つのポリペプチドセグメントコード核酸配列において見出される。機能的に関連するポリペプチドセグメントの例としては、ポリケチドシンターゼおよびＮＲＰＳモジュール、ドメインおよびリンカーが挙げられる。１つの実施形態において、上記の機能的に関連したポリペプチドセグメントは、ＰＫＳモジュールまたはドメインにおいて、（すなわち、モジュールまたはドメインの範囲全体ではなく）相同性の高い領域である。
【０４０３】
本発明はまた、以下によってポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子を作製する方法を提供する：（ｉ）上記のような１つ、２つ、または３つ、または３つよりも多い制限部位を同定する工程、および（ｉｉ）そのポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝しを生成する工程であって、その合成遺伝しは、その制限部位の存在によって、天然に存在する遺伝子と異なり、かつ（ｉｉｉ）必要に応じて、そのポリペプチドセグメントコード配列の他の領域からの上記の制限部位の除去によって、その天然に存在する遺伝子と異なる、工程。
【０４０４】
【表８】
2007533308.tif 000034
【０４０５】
【表９】
2007533308.tif 000035
【０４０６】
１つの実施形態において、各部位＃１を、第２モジュールの部位＃１１（または別の上流単位からの等価なＸｂａ  Ｉ）と接続し得；そして各＃１１をＳｐｅＩへ接続し得る。従って、最終構築物中の＃１／＃１１は、ジペプチドＳｅｒＳｅｒをコードするただ１つの位置（この位置は、ネイティブのアミノ酸が相同なジペプチドＴｈｒＳｅｒで置換された場合において、以前に首尾よく利用されている）である。＃ｌａ、＃７および＃１／＃１１以外の部位において、アミノ酸の変更は必要ない。これらの３つの部位の各々において、上述の首尾よい変換の履歴を使用し得る。
【０４０７】
部位＃７において、任意のネイティブのジペプチドを、ＬｅｕＧｌｎで置換する。報告された配列において、この部位は、第１のアミノ酸がしばしば大型の疎水型である（Ｌｅｕのように）ことを除き、十分には保存されていない。［Ｌ→Ｉ、Ｖ→Ｉ、Ｍ→Ｉ］
１つの局面において、本発明は、非天然アミノ酸配列を有するＰＫＳポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、そのドメインのカルボキシ末端にジペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎを含むＫＳドメインを含み；かつ／またはそのドメインのカルボキシ末端にジペプチドＳｅｒ−Ｓｅｒを含むＡＣＰドメインを含む。
【０４０８】
シントン端（ドメイン端ではない）のために使用される制限部位は、その制限部位がモジュール間で適合性であることを必要としない。表１０における特定の部位において、制限部位のリストが提供され、それにより、そのリストのうちの１つの各部位（表９参照）についての場合の記載されている数が、そのアミノ酸配列と適合するようになる。
【０４０９】
【表１０】
2007533308.tif 000036
【０４１０】
【表１１】
2007533308.tif 000037
【０４１１】
特定の場合（部位＃６および部位＃ＥＲ２を参照）において、上記構築物を、５’シントンについての１つの制限部位、および３’シントンの突出部に適合する第２の制限部位を使用して設計する。これは、最終産物において所望されないシントンについての特定の制限部位の使用を可能にする（例えば、部位＃ＥＲ２におけるＸｂａ  Ｉは、遺伝子構築のための＃１１における３’Ｘｂａ  Ｉ部位の使用を妨げる）。
【０４１２】
【表１２】
2007533308.tif 000038
【０４１３】
ＰＫＳのドメイン、モジュールおよびＯＲＦ、ならびにＰＫＳ様ポリペプチドの他の配列は、公開されたデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）から入手し得、それらの配列としては、以下の登録番号が例として挙げられるが限定はされない。
【０４１４】
【数１−１】
2007533308.tif 000039
【０４１５】
【数１−２】
2007533308.tif 000040
【０４１６】
【数１−３】
2007533308.tif 000041
【０４１７】
【数１−４】
2007533308.tif 000042
【０４１８】
２００３年９月１日の時点での、前述の受託番号の各々と関連するヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列は、全ての目的のため、本明細書により参考として援用される。また、以下のポリケチドシンターゼについての説明もまた参照のこと。アバメクチン（米国特許第５，２５２，４７４号、ＭａｃＮｅｉｌら、１９９３、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂａｌｔｓ，ＨｅｇｅｍａｎおよびＳｋａｔｒｕｄ編（ＡＳＭ）、ｐ２４５〜２５６；ＭａｃＮｅｉｌら、１９９２、Ｇｅｎｅ  １１５：１１９−２５）；Ｃａｎｄｉｃｉｄｉｎ（ＦＲＯ００８）（Ｈｕら，１９９４，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：１６３−７２）；エポチロン（Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）（米国特許第６，３０３，３４２号）；エリスロマイシン（ＷＯ９３／１３６６３；米国特許第５，８２４，５１３号；Ｄｏｎａｄｉｏら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：６７５−７９；Ｃｏｒｔｅｓら，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：１７６−８）；ＦＫ−５０６（Ｍｏｔａｍｅｄｉら，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６：５２８−３４；Ｍｏｔａｍｅｄｉら，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４：７４−８０）；ＦＫ−５２０（米国特許第６，５０３，７３７号；また、Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：５７８９−９６を参照のこと）；ロバスタチン（米国特許第５，７４４，３５０号）；ネマデクチン（ＭａｃＮｅｉｌら，１９９３，前述）；ニダマイシン（Ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）（Ｋａｋａｖａｓら，１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：７５１５−２２）；オレアンドマイシン（Ｓｗａｎら，１９９４，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４２：３５８−６２；米国特許第６，３８８，０９９号；Ｏｌａｎｏら，１９９８，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５９：２９９−３０８）；プラテノリド（Ｐｌａｔｅｎｏｌｉｄｅ）（欧州特許出願第７９１，６５６号）；ラパマイシン（Ｓｃｈｗｅｃｋｅら，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８３９−４３）；Ａｐａｒｉｃｉｏら，１９９６，Ｇｅｎｅ  １６９：９−１６）；リファマイシン（Ａｕｇｕｓｔら，１９９８，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：６９−７９）；ソラフェン（Ｓｏｒａｐｈｅｎ）（米国特許第５，７１６，８４９号；Ｓｃｈｕｐｐら，１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７：３６７３−７９）；スピラマイシン（米国特許第５，０９８，８３７号）；タイロシン（Ｔｙｌｏｓｉｎ）（欧州特許第０  ７９１，６５５号；Ｋｕｈｓｔｏｓｓら，１９９６，Ｇｅｎｅ  １８３：２３１−３６；米国特許第５，８７６，９９１号）；ゲルダナマイシン（ＷＯ０３１０６６５３Ａ３）；ハービマイシン（ＷＯ０３１０６６５３Ａ３）；カルコマイシンＣｈａｌｃｏｍｙｃｉｎ（ＷＯ０４０１８７０３Ａ２）；ナルボノリド（Ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）（ＷＯ０２０９７０６２Ａ２）、これらの全ては本明細書中で援用される）。
【０４１９】
データベース由来の配列の正確性は、必要に応じて、合成置換が成されるべき遺伝子または遺伝子フラグメントについて再配列決定することによって確実にされ得る。さらに、合成遺伝子の配列は、一旦調製されると、発現および／または酵素活性を改善するために改変され得る。１実施形態において、改変は、天然に存在するタンパク質中の位置では見出されないアミノ酸をコードする合成遺伝子中のコドンを、天然に存在するタンパク質中の位置において見出されるアミノ酸をコードするコドンで置き換える工程を包含する。多くの方法による改変が存在し得、合成遺伝子の点突然変異による改変、および遺伝子の部分の再合成（例えば、オリゴマー、シントン、および初期合成の間に調製される多重シントンを使用する）による改変が挙げられる。
【０４２０】
（実施例５）
（ＤＥＢＳモジュール２の合成）
ＤＥＢＳモジュール２は、４３４４ｂｐのモジュールである。このモジュールを、種々の長さ（３５０ｂｐ〜７００ｂｐの範囲）の１０個のシントンを生じるように設計した。それらのシントンの各々を調製した。その合成結果を表１３に示す。ＤＥＢＳモジュール２のこの１０個のシントンを、従来の方法（例えば、３元連結反応）によって、単一のモジュールになるようにアセンブルさせ、所望の配列の存在を確認するために、二次配列決定を行なった。最初の試みで正確な配列を入手しなかったシントンを、最適化およびエラーの決定のために使用した。表１３における括弧内の数は、２セット目の結果を示す。
【０４２１】
【表１３】
2007533308.tif 000043
【０４２２】
ａシントン００１−０４のアセンブリーにおいて使用したオリゴを、ＨＰＬＣによって部分的に精製した。このシントンのアセンブリーのために、異なるポリメラーゼもまた、使用した。
【０４２３】
ｂシントン００１−０５および００１−０８に関する正確なアミノ酸配列を、受容可能なコドン使用頻度を有するサイレント変異のみを含むサンプルを使用して得た。
【０４２４】
（実施例６）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおける合成ＤＥＢＳ  ＭＯＤ２の発現）
高い１５−Ｍｅ−６ｄＥＢ産生を有するＥ．ｃｏｌｉ株におけるＤＥＢＳ  Ｍｏｄ２遺伝子を、合成版（実施例５）で置換し、タンパク質発現およびポリケチド力価を比較した。使用した株は、安定なＲＳＦ１０１０ベースのベクター由来のＤＥＢＳ  Ｍｏｄ２誘導体（ＫＳ５  Ｎ末端リンカー付き）および単一のｐＥＴベクター由来のＤＥＢＳ２およびＤＥＢＳ３を発現する。バックグラウンド株（Ｋ２０７−３）は、染色体上に組み込んだパンテテイン化およびＣｏＡチオエステル合成のために必要な遺伝子を有する。Ｔ７プロモーターは、Ｍｏｄ２発現ならびにＤＥＢ２発現およびＤＥＢ３発現を制御する。誘導された培養物に、１５−Ｍｅ−６ｄＥＢを産生するために、プロピルジケチド（ｐｒｏｐｙｌ  ｄｉｋｅｔｉｄｅ）を供給する。
【０４２５】
合成（２）および天然（１）の配列Ｍｏｄ２を発現する株は、発現の２５時間後（８ｍｇ／Ｌ）および４２時間後（２５ｍｇ／Ｌ）に、識別不能なレベルの１５−Ｍｅ−６ｄＥＢを生成した。その可溶性タンパク質画分の定量的なＰＡＧＥ分析は、合成Ｍｏｄ２遺伝子から、その天然の配列遺伝子と比較してかなり高いタンパク質発現を示した（図１５）。約３．２倍多いＭｏｄタンパク質が、２２℃での４２時間の発現後に、上記合成遺伝子から観察された。より高い発現レベルにも関わらず等価である力価は、以前の研究（非公開）から予期されるように、Ｍｏｄ２が、使用された株では生成を制限するものではないことを示唆する。
【０４２６】
（方法：発現株構築物）  合成ＤＥＢＳ  Ｍｏｄ２に対するＯＲＦを、以下の方法でアセンブルした。ＭＰＧ０１１（ＬＬＫ１）のＳｐｅ  Ｉ−Ｅｃｏ  ＲＩフラグメントを、ＯＲＦアセンブリーベクター内にライゲーションした（ｐＫＯＳ３３７−１５９−１）。次いで、ＭＰＧ００１のＮｏｔＩ−ＸｂａＩフラグメント（ＤＥＢＳ  Ｍｏｄ２）を、このベクターのＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ部位にライゲーションした。生じたプラスミドのＡａｔＩＩ−ＭｆｅＩフラグメントを、ＭＰＧ００９由来のＡａｔＩＩ−ＭｆｅＩフラグメント（ＤＥＢＳ  Ｍｏｄ５）で置換し、ＫＳ５  Ｎ末端リンカー配列に付加した。Ｍｏｄ２  ＯＲＦを含むこのプラスミド（ｐＫＯＳ３７８−０１４）のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＲＳＦ１０１０バックボーン中に挿入し、発現ベクターｐＫＯＳ３７８−０３０を作製した。使用したＥ．ｃｏｌｉ宿主株は、Ｋ２０７−３であった。これは、その染色体上に組み込まれた、パンテテイン化およびＣｏＡチオエステル合成のためのｓｆｐ遺伝子、ｐｒｐＥ遺伝子、ｐｃｃＢ遺伝子およびａｃｃＡ１遺伝子を有する。合成（２）および野生型（１）のＭｏｄ２株をそれぞれ作製するために、Ｔ７プロモーター制御の下でＤＥＢＳ２およびＤＥＢＳ３に関する遺伝子を発現するｐＥＴベクターｐＢＰ１３０（Ｐｈｅｉｆｅｒら、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：１７９０−９２）を保有するＫ２０７−３を、ｐＫＯＳ３７８−０３０およびｐＫＯＳ２０７−１４２ａ（ｐＲＳＦ１０１０中に野生型Ｍｏｄ２がある；Ｊ．Ｋｅｎｎｅｄｙから得た）で形質転換した。合成Ｍｏｄ２構築物および野生型Ｍｏｄ２構築物のタンパク質配列は、その合成遺伝子における４つの置換（Ｌ９１４Ｑ、Ｇ１４６７Ｓ、Ｔ１４６８ＳおよびＰ１５５１Ｇ）が制限部位の操作のために必要とされること以外は、同じである。
【０４２７】
（ＰＫＳ発現およびポリケチド分析）  Ｍｏｄ２＋ＤＥＢＳ２遺伝子およびＤＥＢＳ３遺伝子の発現のために、株を、３７℃で、対数増殖期中期まで増殖させた。０．５ｍＭまでのＩＰＴＧの添加により発現を誘導し、５００ｍｇ／Ｌの２−メチル−３−ヒドロキシヘキサノイル−Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル（プロピルジケチド）、５ｍＭのプロピオン酸塩、５０ｍＭのコハク酸塩および５０ｍＭのグルタミン酸塩の添加により発現を供給した。誘導された培養物を、示した時間、２２℃でインキュベートした。各サンプリング時に、培養上清を酢酸エチルで抽出し、１５−Ｍｅ−６ｄＥＢ力価をＬＣ／ＭＳにより定量した（参照）。細胞を採集し、ＢＰＥＲＩＩ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶解し、可溶性タンパク質を定量し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ；Ｐｉｅｒｃｅ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ゲルを、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で定量的に画像化した。
【０４２８】
（実施例７）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおける合成ＤＥＢＳ遺伝子発現）
全長３０，８５２ｂｐのＤＥＢＳ  ＰＫＳ遺伝子クラスター（ローディングジドメイン、６つの伸長モジュールおよびチオエステラーゼ放出ドメイン）を首尾よく合成した。この研究室で開発したＧｅＭＳソフトウェアを使用して、各モジュールおよびＴＥに関する成分オリゴヌクレオチドを設計して調製した；全部で、約１６００個の４０マーのオリゴヌクレオチドを設計し、調製した。その設計は、高Ｅ．ｃｏｌｉ発現のために最適なコドンを使用し、アセンブリーおよびモジュール交換を容易にするために、制限部位を組み込んだ。２３８ｂｐ〜７５４ｂｐの範囲の６７個のシントンを調製し、上記のようにしてクローン化した。本発明者らは、ＵＤＧクローニングにおける９０より高い成功率を観察した。遺伝子アセンブリーのエラーの割合は１０００分の３であった。配列決定したクローンのうちの平均２２％が正確であった。シントンを、上記編成縫合方法（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ  ｓｅｗｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いてアセンブルしてモジュールにした。クローンの約７５％が、所望のベクターを含む。モジュール００１（ＤＥＢＳモジュール２）を遺伝子合成の最初の試験に使用したので、そのエラーの割合（平均約６．５のエラー／ｋｂ）は、これらのシントンについては、より高かった。
【０４２９】
モジュール２を、実施例５に記載されるように調製した。次いで、残りのモジュールのマルチシントン成分を、一緒に編成縫合（ｓｔｉｔｃｈ）し、図１６および図１７に示されるストラテジーに従って選択した。
【０４３０】
ＤＥＢＳ遺伝子を用いる１０個のライゲーションの実験セットの例において、七個は、８個中７個または８個中８個の正しいライゲーション生成物を生じ、一個は、８個中６個の正しいライゲーション生成物を生じ、二つは、８個中３個および８個中１個の正しいライゲーション生成物を生じ；それらの誤ったサンプルは全て、切断されずに残っていなければならないドナーベクターのサンプルであった。
【０４３１】
全てのＤＥＢＳサブユニット遺伝子を、完全に合成しアセンブルして完全にＯＲＦした。これらの遺伝子を、活性および発現の試験のためにＥ．ｃｏｌｉ宿主株中に形質転換する。合成および天然のＤＥＢＳ成分を、個々のサブユニットの活性に対する遺伝子合成コドン使用頻度の効果およびアミノ酸置換の効果を決定するために種々の組合せで同時発現させる（図４−２）。合成ＤＥＢＳ１を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で活性な形態で首尾よく発現させた。合成コドン最適化サブユニットの総ＤＥＢＳ１発現は、天然配列サブユニットの３倍よりも高い。天然のＤＥＢＳ２サブユニットおよびＤＥＢＳ３サブユニットと同時発現した合成ＤＥＢＳ１は、天然のＤＥＢＳ１構築物と類似したレベルの６−ｄＥＢ生成物を支持する。
【０４３２】
合成遺伝子の三個のＤＥＢＳオープンリーディングフレームの配列は、以下の表１４Ｂに示される（ＤＥＢＳ１およびＤＥＢＳ２は、タグの付加を容易にするために含まれた３’ＥｃｏＲＩ部位を導入する、さらなるＧＧＧＡＡＴＴＣＴ配列を有する）。表１４Ａは、合成配列、ならびにＤＥＢＳ１、ＤＥＢＳ２およびＤＥＢＳ３の注記されたとおりにＧｅｎＢａｎｋの配列に対して補正を導入した配列に関する、全体的な配列類似性を示す。
【０４３３】
【表１４Ａ】
2007533308.tif 000044
１．天然に存在するＤＥＢＳ１を部分的に再配列決定し、Ｍ６３６７６に対する以下の変化を、合成ＤＥＢＳ１遺伝子（ＤＥＢＳ１として以下に示される配列）の設計に使用した：
ａ．最初のフレームシフトは、ＡＡＡ２６４９３の最初の１８アミノ酸を、代わりの７１アミノ酸Ｎ末端配列で置換する効果を有する；
ｂ．相補性フレームシフトを含む約１００ｂｐの領域に変化が存在し、それは、報告された配列の３２アミノ酸を異なる３３アミノ酸断片で置換する効果を有する。
続いて、天然に存在するＤＥＢＳ１の完全なＯＲＦを再配列決定し、そしてＭ６３６７６に対するさらなる以下の変化を、合成ＤＥＢＳ１＊遺伝子（ＤＥＢＳ１＊として以下に示される配列）の設計に使用した：
ｃ．ＧｅｎＢａｎｋの配列からのさらなる６個の矛盾は、Ｍ６３６７６に対して、４個のアミノ酸の置換を生じた；
ｄ．ＧｅｎＢａｎｋの配列に対する３塩基の挿入は、Ｍ６３６７６に対して、さらなるアミノ酸の挿入を生じた。
合成ＤＥＢＳ１＊を調製するため、最初の１３９２塩基対を再設計したシントンから合成した；標準的な分子生物学的方法を使用して、残りの９２４９塩基中の８位に変化を導入した。
２．ＤＥＢＳ２を再配列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋの配列が５つの誤ったヌクレオチド塩基（点のエラー）を有することを決定した；ヌクレオチド配列の補正は、３つのアミノ酸の置換を生じた。
３．ＤＥＢＳ３を再配列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋの配列が７つの誤った塩基（点のエラー）を有すること、および配列のエラーが２塩基対を５塩基対で置き換えることを生じることを、決定した；結果は、３つのアミノ酸位置における補正、および４番目のアミノ酸を１対の新規残基で置き換えることを追加した。
４．ＤＥＢＳ１合成遺伝子は、Ｍ６３６７６配列（上の注記１ａおよび１ｂにおいて補正されたとおり）から９つの位置において異なっていた。これらの変化は、部位モジュール中に、１つのＳｐｅＩ部位、１つのＸｂａＩ部位（ＳｅｒＳｅｒをコードするＳｐｅＩ／ＸｂａＩを生じる）；１つのＰｓｔＩ部位（ＰｒｏＧｌｕを生じる）；１つのＭｆｅＩ部位（Ｌ、Ｖ、Ｍ→Ｉ）のうちの１つ以上を導入する。タグの付加を容易にするための３’配列ＧＧＧＡＡＴＴＣＴ（ＧｌｙＡｓｎＳｅｒを生じる）の付加は、計算には含められない。
５．ＤＥＢＳ２の２つのバージョンを作製した。１つは７残基の変化を含み（ＤＥＢＳ２として以下に示される）、そして１つは９残基の変化を含んだ。後者のバーションのこれらのさらなる変更は、モジュール４においてＰｓｔＩ部位を追加する。
【０４３４】
【表１４Ｂ−１】
2007533308.tif 000045
【０４３５】
【表１４Ｂ−２】
2007533308.tif 000046
【０４３６】
【表１４Ｂ−３】
2007533308.tif 000047
【０４３７】
【表１４Ｂ−４】
2007533308.tif 000048
【０４３８】
【表１４Ｂ−５】
2007533308.tif 000049
【０４３９】
【表１４Ｂ−６】
2007533308.tif 000050
【０４４０】
【表１４Ｂ−７】
2007533308.tif 000051
【０４４１】
【表１４Ｂ−８】
2007533308.tif 000052
【０４４２】
【表１４Ｂ−９】
2007533308.tif 000053
【０４４３】
【表１４Ｂ−１０】
2007533308.tif 000054
【０４４４】
【表１４Ｂ−１１】
2007533308.tif 000055
【０４４５】
【表１４Ｂ−１２】
2007533308.tif 000056
（実施例８）
（２つのタンパク質の相対量の定量的測定方法）
同じ細胞で発現された二つ以上のＰＫＳタンパク質の相対量を定量的に測定するために、二重ｍＡｂ技術を開発した。この方法に従って、各ＰＫＳタンパク質に対して異なるエピトープタグを用いて、二つの異なる標識をした抗体（例えば、ＣＹ３で標識した抗体およびＣＹ５で標識した抗体）の混合物を用いるウェスタンブロットにより、それらを同時に定量する。色素の比率は、発現した二つのタンパク質の相対的な化学量論の評価を提供する。
【０４４６】
この技術を開発するためのモデルシステムとして、本発明者らは、いずれかの末端を二つの異なるエピトープタグで標識したタンパク質（ｃｍｙｃ−Ａ〜Ｃ−ＦＬＳＧ−ＢＲＳ−Ｈｉｓ）を使用した（５５ｋＤａのＡ〜Ｃ）。
【０４４７】
本発明者らの最初の実験では、本発明者らは、特に、μｇ未満の量で、ウェスタンブロット後の上記タンパク質に結合した二つのＭａｂの再現可能な比率を得ることが困難であった。従って、本発明者らは、ｃｍｙｃ−Ａ〜Ｃ−ＦＬＡＧのドットブロットの使用を必要とする分析方法を開発することに努力した。以下に示すデータにおいて、二つの蛍光標識した抗体（ｃｍｙｃ−ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８およびＦＬＡＧ−Ｃｙ５）を同時に使用して、上に述べたＡ〜Ｃ構築物のドットブロットを定量した。そのブロットを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４１０  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅｒを使用して走査し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて分析を行なった。結果を表１５に示す。
【０４４８】
【表１５】
2007533308.tif 000057
【０４４９】
ｃｍｙｃ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗体は、５０ｎｇ〜１０００ｎｇの範囲において、非常に正確な範囲の定量を提供する。ＦＬＡＧ−Ｃｙ５抗体は、５０ｎｇ〜１０００ｎｇの範囲にわたって正確であり、１０００ｎｇレベルで明らかにシグナル飽和する。ピーク面積の比率もまた、１０ｎｇ〜５００ｎｇの範囲にわたって安定であり、Ｎ末端の分解またはＣ末端の分解の検出を可能にし、かつ、タンパク質レベルの化学量論的な分析を可能にする。
【０４５０】
エピトープタグ化したＤＥＢＳタンパク質を、定量的ウエスタン分析のためのエピトープ標識した標準物質として使用するために、発現させ、精製した。
【０４５１】
【表１６】
2007533308.tif 000058
【０４５２】
合成ＤＥＢＳモジュール２タンパク質（ｍｏｄ２）を、融合タンパク質（ｃ−ｍｙｃ−ｍｏｄ２−ｆｌａｇ−ｂｒｓ−ｈｉｓ）として、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ２０７−３で発現させた。モジュール２遺伝子を、タグ配列をコードする遺伝子とインフレームの状態で発現ベクター内へクローニングすることを、その合成遺伝子へのＥｃｏＲＩ部位の導入によって容易にした。Ｎ末端エピトープタグおよびＣ末端エピトープタグを有するＤＥＢＳモジュール２を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｋ−２０７−３内で、ＤＥＢ２およびＤＥＢ３と同時発現させた。２０時間目および４０時間目に、生成培養物からのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（各株の二つのコロニーを試験した）。ゲルを、サイプロ（ｓｙｐｒｏ）レッドを用いて染色するか、またはエピトープタグであるｃ−ｍｙｃ、フラッグおよびビオチンに対する蛍光標識抗体を使用するウェスタンブロットに供した。モノクローナル抗体を、二つの蛍光シグナルが同時にモニタリングできるように、蛍光色素（ａｌｅｘａ４８８およびａｌｅｘａ６４７）で標識した。
【０４５３】
（実施例９）
（エポチロンＰＫＳ遺伝子の合成）
全長５４，４８９ｂｐのエポチロン合成遺伝子（ローディングジドメイン、９つの伸長モジュール、およびＤＥＢＳ遺伝子のチオエステラーゼ）を合成し、アセンブルした。エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）ポリケチドシンターゼのモジュラー構造（ドメイン構成）は、周知であり、そして例えば、Ｊｕｌｉｅｎら，２０００，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ」Ｇｅｎｅ  ２４９：１５３−６０に記載される。エポチロンＰＫＳのＤＮＡ配列は公知であり、そして例えば、米国特許第６，３０３，３４２号およびＧｅｎＢａｎｋに記載される。
【０４５４】
この遺伝子を、開発したあるバージョンのＧｅＭＳソフトウェアを用いて設計した。モジュールを、方法ＲおよびＩＩ型ベクターを使用して合成した。約５５ｋｂのＤＮＡを合成するために、その遺伝子クラスターを、１５６ｂｐ〜７８１ｂｐの範囲の大きさの１１８個のシントンフラグメントに分解した。３０００個のオリゴヌクレオチドを、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸを用いてオリゴヌクレオチド混合物にプールし、そして、実施例１に記載される条件を使用して、アセンブリおよび増幅を行なった。それらを、ＵＤＧ−ＬＩＣベクター中にクローニングし（方法ＲおよびＩＩ型ベクターを使用した）、ＵＤＧクローニングは、９０より高い成功率であった。各シントンに対して８個のコロニーを、１．５ｍＬ  ＬＢ／ｃａｒｂ（カルベニシリン）中に選別し、アリコートを、配列決定のためのサンプルを提供するためのＲＣＡ反応のテンプレートとして使用するために、採取した。Ｅｐｏ遺伝子クラスターを構成する１１８個のシントン全てに関する正確な配列を含むクローンを得た。その１１８個のシントンに関する平均のエラーの割合は、２．４／１０００であり、配列決定したサンプルのうちの平均３２％は正確であった。これは、１ｋｂあたり３個のエラーがあり２２％のみが正しいというＤＥＢＳ遺伝子クラスターからの改善であった。１１８個中１０４個（８８％）の正確なサンプルを、８個のサンプルのこの第１ラウンドの配列決定から得た；残りの１２個のシントンに関しては、さらなるクローンの配列決定後に正しい配列を見出した。配列決定を介して正しいクローンを同定した後、保存した培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。そのシントンをモジュールになるようにアセンブルすることを、前述の編成縫合ストラテジーを用いて行なった。
【０４５５】
エポチロンシンターゼポリペプチドＥｐｏＡ−Ｆる合成ＯＲＦの配列を、以下の表１７Ｂに示す（それらの配列の各々は、タグの付加を容易にするために含まれる３’ＥｃｏＲＩ部位を含む。タグの付加を容易にするための３’配列ＧＧＧＡＡＴＴＣの付加は、計算に含まれない）。表１７Ａは、合成遺伝子のＤＮＡ配列と報告されたエポチロンシンターゼ配列との間の全体的配列同一性を示す。
【０４５６】
【表１７Ａ】
2007533308.tif 000059
１．示されるＧｅｎＢａｎｋ登録番号で報告されるとおり。
【０４５７】
【表１７Ｂ−１】
2007533308.tif 000060
【０４５８】
【表１７Ｂ−２】
2007533308.tif 000061
【０４５９】
【表１７Ｂ−３】
2007533308.tif 000062
【０４６０】
【表１７Ｂ−４】
2007533308.tif 000063
【０４６１】
【表１７Ｂ−５】
2007533308.tif 000064
【０４６２】
【表１７Ｂ−６】
2007533308.tif 000065
【０４６３】
【表１７Ｂ−７】
2007533308.tif 000066
【０４６４】
【表１７Ｂ−８】
2007533308.tif 000067
【０４６５】
【表１７Ｂ−９】
2007533308.tif 000068
【０４６６】
【表１７Ｂ−１０】
2007533308.tif 000069
【０４６７】
【表１７Ｂ−１１】
2007533308.tif 000070
【０４６８】
【表１７Ｂ−１２】
2007533308.tif 000071
【０４６９】
【表１７Ｂ−１３】
2007533308.tif 000072
【０４７０】
【表１７Ｂ−１４】
2007533308.tif 000073
【０４７１】
【表１７Ｂ−１５】
2007533308.tif 000074
【０４７２】
【表１７Ｂ−１６】
2007533308.tif 000075
（実施例１０）
ゲルダナマイシンポリケチドシンターゼのモジュール０、モジュール１およびモジュール２に対応する合成遺伝子を設計し、そして上記のように（方法Ｓの編成を使用して）合成した。合成遺伝子の配列を、以下に示す。対応する天然に存在する遺伝子の配列は、公知である（例えば、Ｒａｓｃｈｅｒら，２００３，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｆｏｒ  ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ＮＲＲＬ  ３６０２．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１８：２２３−３０およびＰＣＴ公開ＷＯ０３１０６６５３Ａ２を参照のこと）。
【０４７３】
【表１８−１】
2007533308.tif 000076
【０４７４】
【表１８−２】
2007533308.tif 000077
【０４７５】
【表１８−３】
2007533308.tif 000078
【０４７６】
【表１８−４】
2007533308.tif 000079
【０４７７】
【表１８−５】
2007533308.tif 000080
【０４７８】
【表１８−６】
2007533308.tif 000081
（実施例１１）
オレアンドマイシンポリケチドシンターゼの搭載ドメイン（Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ）に対応する合成遺伝子を設計し、そして上記のように（方法Ｓの編成）を使用して合成した。合成遺伝子の配列を以下に示す。対応する天然に存在する遺伝子の配列は公知である（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２２０９５１を参照のこと、また、Ｓｈａｈら，２０００，「Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｎｄ  Ｐ−４５０  ｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ」Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．５３：５０２−５０８を参照のこと）。
【０４７９】
【表１９−１】
2007533308.tif 000082
【０４８０】
【表１９−２】
2007533308.tif 000083
（実施例１２）
ピクロマイシンポリケチドシンターゼのモジュール２およびモジュール６ならびにチオエステラーゼ（ＴＥ）に対応する合成遺伝子を設計し、そして上記のように（方法Ｓの編成を使用して）合成した。合成遺伝子の配列を以下に示す。対応する天然に存在する遺伝子の配列は、公知である（米国特許第６，３０３，７６７号および同第６，１１７６５９号を参照のこと）。
【０４８１】
【表２０−１】
2007533308.tif 000084
【０４８２】
【表２０−２】
2007533308.tif 000085
【０４８３】
【表２０−３】
2007533308.tif 000086
【０４８４】
【表２０−４】
2007533308.tif 000087
（実施例１３）
ＨＳＰ９０遺伝子に対応する合成遺伝子を設計し、そして上記のように（方法Ｓの編成を使用して）合成した。合成遺伝子の配列を以下に示す。対応する天然に存在する遺伝子の配列は、公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５３４８を参照のこと；また、Ｙａｍａｚａｋら、１９８９，「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  ｆｏｒ  ９０  ｋＤａ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７１０８；Ｙａｍａｚａｋｉら，１９９０，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｈｏｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １２  Ｅ１Ａ  ｉｎ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ」Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４：３１６３−７０；Ｈｉｃｋｅｙら，１９８９，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｈｕｍａｎ  ８９−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２６１５−２６を参照のこと）。Ｐ０７９００（受託番号Ｐ０７９００）に対応するＨＳＰ９０のアミノ酸配列もまた公知である。
【０４８５】
【表２１−１】
2007533308.tif 000088
【０４８６】
【表２１−２】
2007533308.tif 000089
（実施例１４）
ＣＲＭ１遺伝子に対応する合成遺伝子を設計し、そして上記のように（方法Ｓの編成を使用して）合成した。合成遺伝子の配列を以下に示す。対応する天然に存在する遺伝子の配列は、公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ０８６１４を参照のこと；また、Ｆｏｒｎｅｒｏｄら，１９９７，「Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ＣＲＭ１  ｉｓ  ｉｎ  ａ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｓｕｂｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ＣＡＮ／Ｎｕｐ２１４  ａｎｄ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｒｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｎｕｐ８８」ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：８０７−８１６を参照のこと）。ＣＲＭ１のアミノ酸配列もまた公知である。
【０４８７】
【表２２−１】
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【０４８８】
【表２２−２】
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本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、特許出願および受託番号（出願日および／または優先権出願の出願日の時点での、ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方、ならびに対応する注釈を含む）は、このようなそれぞれの刊行物または文献が具体的かつ個別に本明細書中で参考として援用されることが示されたかのように、本明細書中で参考として援用される。
【０４８９】
同時係属中の共有に係る米国特許出願第１０／６７２，３９６号（２００３年９月２６日に出願された）の開示全体は、あらゆる目的のために、本明細書によってその全体が参考として援用される。
【０４９０】
本発明は、特定の実施形態に関して詳細に記載されるが、当業者は、改変および改良が本発明の範囲および精神の範囲内にあることを認識する。刊行物および特許文献の引用は、いずれかのこのような文献が関連する先行技術であることを承認するものであることを意図せず、その引用が、それらの刊行物および特許文献の内容または日付についてなんらかの承認を構成することも意図しない。本発明は、ここに、記載された説明によって記載されているが、当業者は、本発明が種々の実施形態で実施され得ること、および上記説明が例示の目的のためであり、限定的ではないことを理解する。
【図面の簡単な説明】
【０４９１】
【図１】図１は、ＤＵＧ−クローニングカセット（「クローニングリンカー」）と、ニック形成エンドヌクレアーゼＮ．ＢｂｖＣ  ＩＡを用いるライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）のためのベクター調製のスキームとを示す。図１Ａ。ＵＤＰ−クローニングカセット。ベクター調製に使用されるＳａｃ  Ｉ酵素部位およびニック酵素部位が標識されている。図１Ｂ。ニック形成エンドヌクレアーゼＮ．ＢｂｖＣ  ＩＡ（配列番号１２）を用いるＬＩＣのためのベクター調製物のスキーム。
【図２】図２は、ＩＩＳ型制限酵素としてＢｂｓ  ＩおよびＢｓａ  Ｉ（配列番号１３、１４、および１５）を用いる方法Ｓ接続方法を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ベクター対Ｉを用いる方法Ｓ接続方法を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ベクター対ＩＩを用いる方法Ｓ接続を示す。２Ｓ１−４は、ＩＩＳ型制限酵素についての認識部位であり、Ａ、Ｂ、ＢおよびＣ、それぞれは、それらの酵素についての切断部位である。
【図４Ａ】図４は、編成のために有用なベクター対を示す。図４Ａ：ベクターｐＫｏｓ２９３−１７２−２。
【図４Ｂ】図４は、編成のために有用なベクター対を示す。図４Ｂ：ベクターｐＫｏｓ２９３−１７２−Ａ７６。両方のベクターは、Ｎ．Ｂｂｖ  ＣＩＡ認識部位を含むＵＤＧクローニングカセット、両方のベクターに共通の「右制限部位」（Ｘｈｏ  Ｉ部位）、各ベクターにより異なる「左制限部位」（例えば、Ｅｃｏ  ＲＶ部位またはＳｔｕ  Ｉ部位）、両方のベクターに共通の第１選択マーカー（カルベニシリン耐性マーカー）および各ベクターにより異なる第２の選択マーカー（クロラムフェニコール耐性マーカーまたはカナマイシン耐性マーカー）を含む。
【図５】図５は、ベクター対ＩＩを用いる方法Ｒ接続を示す。
【図６】図６Ａは、ｅｒｙモジュール４において見られるように、６つのＰＫＳドメインの完全相補体を有する複合制限マップを示す。大まかなサイズは、ＫＳ＝１．２、ＫＳ／ＡＴリンカー＝０．３、ＡＴ＝１．０、ＡＴ／ＤＨリンカー＝０．０３、ＤＨ＝０．６、ＤＨ／ＥＲリンカー＝０．８、ＥＲ＝０．８、ＥＲ／ＫＲリンカー＝０．０２、ＫＲ＝０．８、ＫＲ／ＡＣＰリンカー＝０．２、ＡＣＰ＝０．２である。１Ｕｎｉｔ＝１ｋｂである。；図６Ｂは、ＤＥＢＳ２を参照してシントンの端についての例示的な制限部位を示す。
【図７】図７は、モジュール１−２−３−４−５−６−７−８−９を作製するためのシントン１−９の編成についての非対合選択ストラテジーを示す。括弧は、シントンまたは所望のマルチシントンがクローニングされるベクターについての、選択マーカー（Ｋ＝カナマイシン耐性、Ｃｍ＝クロラムフェニコール耐性）ならびに左制限部位ＬおよびＬ’（Ｓ＝Ｓｔｕ  Ｉ制限部位、Ｅ＝Ｅｃｏ  ＲＶ制限部位）を示す。シントンは、以下の付着末端で接続される：１−２  ＮｇｏＭ  ＩＶ；２−３  Ｎｈｅ  Ｉ；３−４  Ｋｐｎ  Ｉ；４−５  Ｂｇｌ  ＩＩ；５−６  Ａｇｅ  Ｉ／Ｎｇｏ  ＭＩＶ；６−７  Ｐｓｔ  Ｉ；７−８  Ａｇｅ  Ｉ；８−９  Ｂｇｌ  ＩＩ。
【図８】図８は、ＧｅＭＳプロセスを示すフローチャートである。
【図９Ａ】図９は、ＧｅＭＳアルゴリズムを示すフローチャートである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａの続きである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、合成遺伝子についてのコドン優先度表の作成を示すフローチャートである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、無作為化されかつコドンを最適化された遺伝子配列を生成するためのアルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、制限部位除去アルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１２】図１２は、制限部位挿入アルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１３】図１３は、オリゴヌクレオチド設計についてのアルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１４】図１４は、シントンＤＮＡ配列の迅速な分析のためのアルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１５】図１５は、ＤＥＢＳのＰＡＧＥ分析を示す。合成配列（ｓＭｏｄ２）および天然配列（ｎＭｏｄ２）からの可溶性タンパク質抽出物。Ｍｏｄ２株を、誘導４２時間後にサンプル採集し、３〜８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＭＷスタンダードの位置を右に示す。このゲルをＳｙｐｒｏ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。
【図１６Ａ】図１６は、合成ＤＥＢＳ遺伝子の構築において使用される制限部位およびシントンを示す。１６Ａ  ＤＥＢＳ１  ＯＲＦ；１６Ｂ，ＤＥＢＳ２  ＯＲＦ，１６Ｃ  ＤＥＢＳ３  ＯＲＦ。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、図１６Ａの続きである。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、図１６Ｂの続きである。
【図１７Ａ】図１７は、合成ＤＥＢＳ遺伝子の構築のための編成および選択ストラテジーを示す。Ａ＝シントンクローニングベクター２９３−１７２−Ａ７６；Ｂ＝シントンクローニングベクター２９３−１７２−２。（Ａ）Ｍｏｄ００６（ＤＥＢＳ  ｍｏｄｌ）；（Ｂ）Ｍｏｄ００７（ＤＥＢＳ  ｍｏｄ３）；（Ｃ）Ｍｏｄ００８（ＤＥＢＳ  ｍｏｄ４）；（Ｄ）Ｍｏｄ００９（ＤＥＢＳ  ｍｏｄ５）；（Ｅ）Ｍｏｄ０１０（ＤＥＢＳ  ｍｏｄ６）。
【図１７Ｂ】図１７Ａの続き。
【図１７Ｃ】図１７Ｂの続き。
【図１７Ｄ】図１７Ｃの続き。
【図１７Ｅ】図１７Ｄの続き。
【図１８Ａ】図１８は、合成エポチロン（Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）ＰＫＳ遺伝子の構築において使用される制限部位およびシントンを示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、図１８Ａのつづきである。
【図１９】図１９は、ハイスループット遺伝子合成および分析のための自動化システムを示す。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜Ｄは、「方法Ｍ」を使用した編成を例示する。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜Ｄは、「方法Ｍ」を使用した編成を例示する。
【図２０Ｃ】図２０Ａ〜Ｄは、「方法Ｍ」を使用した編成を例示する。
【図２０Ｄ】図２０Ａ〜Ｄは、「方法Ｍ」を使用した編成を例示する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年12月22日(2006.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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