(57)【要約】  本発明は、互いに類似しており、ＤＮＡが土壌サンプルから得られる２つの新規アルカリプロテアーゼ（配列番号：４および７）に関し、Ｃ末端が削除され同様のタンパク質分解活性を示すそのフラグメント（配列番号：５および８）、配列番号：４と少なくとも９０％までまたは配列番号：７と少なくとも８７．５％まで類似している全てのアルカリプロテアーゼ、および配列番号：４および配列番号：７から得られるコンセンサス配列（配列番号９）としてまとめられ得るものに関する。さらに、関連核酸（配列番号：３および６）と少なくとも８５％同一の相同性を持つ全ての核酸または該関連フラグメントに関する。さらに、これらのプロテアーゼに対する使用の技術的可能性を定義し、特に洗浄剤および清浄剤におけるそれらの使用を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が、配列番号：４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるか、または配列番号：７に記載のアミノ酸配列と少なくとも８７．５％同一である、アルカリプロテアーゼ。
【請求項２】
アミノ酸配列が、配列番号：４に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順で好ましく、特に好ましくは１００％同一であるか、配列番号：７に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順で好ましく、特に好ましくは１００％同一である、請求項１に記載のアルカリプロテアーゼ。
【請求項３】
各ケースにおける相同性値が、配列番号：４におけるアミノ酸位置３３〜５８１または配列番号：７におけるアミノ酸位置３９〜５８６に対応する領域に適用される、請求項１または２に記載のアルカリプロテアーゼ。
【請求項４】
各ケースにおける少なくとも９０％の同一性からの相同性値が、配列番号：５におけるアミノ酸位置３３〜４７０、または配列番号：８におけるアミノ酸位置３３〜４７０に対応する領域に適用される、請求項１〜３のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼ。
【請求項５】
配列番号：９のコンセンサス配列として、好ましくはアミノ酸位置３９〜５８７、特に好ましくはアミノ酸位置３９〜４７６の範囲におけるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼ。
【請求項６】
配列番号：３に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも８５％、そして少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％同一であるヌクレオチド配列、特に配列番号：３に記載のヌクレオチド位置９７〜１７４６に対応する領域、より特別には配列番号：３に記載のヌクレオチド位置９７〜１４１０に対応する領域によってコードされているか、または配列番号：６に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも８５％、そして少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％同一であるヌクレオチド配列、特に配列番号：６に記載のヌクレオチド位置１１５〜１７６１に対応する領域、より特別には配列番号：６に記載のヌクレオチド位置１１５〜１４２８に対応する領域によってコードされている、請求項１〜５のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼ。
【請求項７】
天然環境から単離し得るか、または天然環境から単離し得る核酸から得られる、請求項１〜６のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼ。
【請求項８】
関連核酸が天然環境から単離し得る生物を起源とする、請求項１〜７のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼ。
【請求項９】
生物が、微生物、好ましくは真菌または細菌、これらの中の好ましいものはグラム陽性細菌、特に好ましくはバシラス属のものである、請求項８に記載のアルカリプロテアーゼ。
【請求項１０】
出発分子において既に結合された、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、２００個、２５０個の順に好ましく、特に好ましくは少なくとも３００個のアミノ酸を有する断片化または欠失突然変異誘発によって、請求項１〜９のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼから得られるアルカリプロテアーゼまたはタンパク質。
【請求項１１】
挿入突然変異誘発による、置換突然変異誘発および／または他のタンパク質の少なくとも一つとの融合による、請求項１〜１０のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼまたはタンパク質から得られる、請求項１〜１０のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼまたはタンパク質。
【請求項１２】
図１におけるアラインメントによって割当てられた、バシラス・レンタス由来のアルカリプロテアーゼの番号付けした位置３、４、３６、４２、４７、５６、６１、６９、８７、９６、９９、１０１、１０２、１０４、１１４、１１８、１２０、１３０、１３９、１４１、１４２、１５４、１５７、１８８、１９３、１９９、２０５、２１１、２２４、２２９、２３６、２３７、２４２、２４３、２５５および２６８において、１以上のアミノ酸置換を有する、請求項１１記載のアルカリプロテアーゼまたはタンパク質。
【請求項１３】
さらに安定されている、請求項１〜１２いずれかに記載のアルカリプロテアーゼまたはタンパク質。
【請求項１４】
さらに誘導体化されている、請求項１〜１３いずれかに記載のアルカリプロテアーゼまたはタンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜１４に示したアルカリプロテアーゼまたはタンパク質の１つと共通する少なくとも１つの抗原決定基、特に図１におけるアラインメントによって割当てられた位置３、４、３６、４２、４７、５６、６１、６９、８７、９６、９９、１０１、１０２、１０４、１１４、１１８、１２０、１３０、１３９、１４１、１４２、１５４、１５７、１８８、１９３、１９９、２０５、２１１、２２４、２２９、２３６、２３７、２４２、２４３、２５５および２６８が、バシラス・レンタス由来のアルカリプロテアーゼの番号付けに位置する少なくとも１以上のエピトープ領域を有する、アルカリプロテアーゼまたはタンパク質。
【請求項１６】
配列番号：３に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも８５％または配列番号：６に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一である、ヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項１７】
配列が、記載されたヌクレオチド配列の一つと、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％と順に好ましく、特に好ましくは１００％同一である、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
各ケースで相同性値が、配列番号：３に記載のヌクレオチド位置９７〜１７４６と対応するか、または配列番号：６に記載のヌクレオチド位置１１５〜１７６１と対応する領域に適用される、請求項１６または１７に記載の核酸。
【請求項１９】
各ケースで相同性値が、配列番号：３に記載のヌクレオチド位置９７〜１４１０に対応するか、または配列番号：６に記載のヌクレオチド位置１１５〜１４２８に対応する領域に適用される、請求項１６〜１８のいずれかに記載の核酸。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼまたはタンパク質をコードしている、請求項１６〜１９のいずれかに記載の核酸。
【請求項２１】
１または好ましくは２以上のコドンが同義コドンによって置換されている、請求項１６〜２０のいずれかに記載の核酸。
【請求項２２】
請求項１６〜２１のいずれかに記載の核酸を天然に含む、生物の細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれかに記載のプロテアーゼまたはタンパク質を天然に発現し、好ましくは分泌する、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
細胞が、微生物、好ましくは真菌または細菌であり、それらのなかで好ましくはグラム陽性細菌、特に好ましくはバシラス属のグラム陽性細菌またはザントモナス属のグラム陰性細菌である、請求項２２または２３いずれかに記載の細胞。
【請求項２５】
天然に定着した生存環境由来の核酸単離物を基にした、請求項１〜１５のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼの同定方法。
【請求項２６】
ＰＣＲプライマーとして働くことができ、２つの配列の配列番号：３または６の一つから得られ得る、互いに対応している、１つ好ましくは２つのオリゴヌクレオチドを用いる請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
単離核酸がクローニングされ、好ましくは発現され、特に好ましくは発現産物のプロテアーゼ活性によってプロテアーゼとして同定される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１６〜２１に示した核酸領域を含む、ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載のクローニングベクター。 
【請求項３０】
請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項３１】
組換えＤＮＡ修飾後に請求項１６〜２１のいずれかに記載の核酸領域を含む、細胞。
【請求項３２】
核酸領域がベクター、特に請求項２８〜３０のいずれかに記載のベクターに位置する、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
請求項１〜１５のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼまたはタンパク質の一つを発現し、好ましくは分泌する、請求項３１または３２に記載の細胞。
【請求項３４】
細菌である、請求項３１〜３３のいずれかに記載の細胞。
【請求項３５】
グラム陰性細菌、特にエシュリキア・コリ属、クレブシエラ属、シュードモナス属またはザントモナス属、特にエシュリキア・コリ K12 株、エシュリキア・コリB 株または クレブシエラ・プランチコラ株、より具体的にはエシュリキア・コリ BL21 (DE3)株、エシュリキア・コリ RV308株、エシュリキア・コリ DH5α株、エシュリキア・コリ JM109株、エシュリキア・コリ XL-1 株またはクレブシエラ・プランチコラ(Rf)株からの誘導体である、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
グラム陽性細菌、特にバチラス属、スタフィロコッカス属またはコリネバクテリウム属、より具体的にはバシラス・レンタス種、バシラス・リケニフォルミス種、バシラス・アミロリケファシエンス種、バシラス・サブチリス種、バシラス・グロビギー種またはバシラス・アルカロフィラス種、スタフィロコッカス・カルノサス種またはコリネバクテリウム・グルタミカム種の一つである、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３７】
真核生物細胞、好ましくはサッカロマイセス属のうちの一つである、請求項３１〜３３のいずれかに記載の細胞。
【請求項３８】
請求項１〜１５のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼまたはタンパク質の製造方法。
【請求項３９】
請求項１６〜２１の一つに記載した核酸を用いる、好ましくは請求項２８〜３０のいずれかに記載の一つに記載したベクターを用いる、特に好ましくは請求項３１〜３７のいずれかに記載の細胞を用いる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ヌクレオチド配列が、１または好ましくは２以上のコドンにおいて宿主株のコドン頻度に適応されている、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜１５のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼを含む組成物。
【請求項４２】
清浄剤または洗浄剤である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
組成物の１ｇあたり、２μg〜２０mg、好ましくは５μg〜１７．５mg、特に好ましくは２０μg〜１５mg、非常に特に好ましくは５０μg〜１０mgの量のアルカリプロテアーゼを含有する、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
さらに酵素、特に他のプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、オキシドレダクターゼおよび／またはリパーゼを含む、請求項４２または４３に記載の組成物。
【請求項４５】
織物原料の処理用組成物または織物手入用組成物である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４６】
天然構成成分を含有する繊維または織物、特にウールまたはシルクを含有する繊維または織物の処理用の、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４７】
少なくとも一つの方法工程において、請求項１〜１５のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼが活性となる、織物または硬表面の機械洗浄方法。
【請求項４８】
アルカリプロテアーゼが、適用あたり、４０μg〜４ｇ、好ましくは５０μg〜３ｇ、特に好ましくは１００μg〜２g、特に好ましくは２００μg〜１gの量で用いられる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも１つの方法工程において、請求項１〜１５のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼが活性となる、織物原料の処理または織物手入の処理のための方法。
【請求項５０】
天然構成成分を含有する織物原料、繊維または織物、特にウールまたはシルクを含有する織物原料、繊維または織物のための、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
織物または硬表面の洗浄のための、請求項１〜１５のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼの使用。
【請求項５２】
アルカリプロテアーゼが、適用あたり、４０μg〜４g、好ましくは５０μg〜３g、特に好ましくは１００μg〜２g、特に好ましくは２００μg〜１gの量で用いられる、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
化粧品である、請求項４１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡが土壌サンプルから得られる互いに類似している２つの新規アルカリプロテアーゼに関し、Ｃ末端が削除され、タンパク質分解活性なそのフラグメントと全ての十分類似性のあるアルカリプロテアーゼおよび核酸に関し、これらのプロテアーゼについての工業的用途の可能性、特に洗浄剤および清浄剤における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、全ての酵素の中で最も産業的に重要なものの一つである。それらの中で、スブチリシン型のプロテアーゼ(スブチラーゼ、スブチロペプチダーゼ、ＥＣ３.４.２１.６２)は特に重要であり、これらは触媒活性なアミノ酸であるために、セリンプロテアーゼに分類されるべきである。それらは、非特異的なエンドペプチダーゼとして作用する、即ちそれらは、ペプチドまたはタンパク質の内部にある任意の所望の酸アミド結合を加水分解する。通常、それらの至適ｐＨは明らかにアルカリ性の範囲にある。このファミリーの概説は、例えば標題"スブチラーゼ：スブチリシン様プロテアーゼ"として、"スブチリシン酵素"（R. Bott and C. Betzel, New York, 1996編）のp.75-95にR. Siezenによって提供する。スブチラーゼは微生物から天然に形成され、特にバチラス（Bacillus）種によって形成され、分泌されるスブチリシンは、スブチラーゼにおいて特に最も有意な群と記載され得る。
【０００３】
他の酵素と共に、プロテアーゼは、洗浄剤および清浄剤の確立された活性成分である。それらは、洗浄されるべき物品上のタンパク質を含有する汚れを分解する。理想的には、相互効果が、関連のある組成物の酵素と他成分との間で生じる。洗浄剤および清浄剤のプロテアーゼのなかで、それらの有利な酵素的特性、例えば安定性または至適ｐＨから、スブチラーゼは優れた位置を占める。さらに、それらは、その他非常に多くの工業的用途の可能性、例えば化粧品成分として、または有機化学合成の構成成分として好適である。
【０００４】
新規酵素を得るための従来方法は、微生物含有サンプルを天然環境から採取し、適当な、例えばアルカリ性培地においてそれらを培養する方法である。こうして、ある見込みを持って、関連のある条件下で活性である酵素、特にアルカリプロテアーゼを含有する富化微生物培養物を得る。これらから、能力が最も高い酵素を持つ微生物が、例えばタンパク質含有寒天プレート上に播種し、形成した分解孔を測定することによって、選択され、精製されるか、または関連のある遺伝子がクローニングされる。かかる方法は、例えば「アルカリ好適微生物。新規の微生物の世界」：K. Horikoshi および T. Akiba 編(1982)［Japan Scientific Societies Press, Springer-Verlag, New York, Heidelberg, Berlin, ISBN 0-387-10924-2, Chapter 2, pp. 9-26］に記載されている。
【０００５】
このように、天然に、好ましくは微生物的に形成されたアルカリプロテアーゼは、洗浄剤および清浄剤にすでに使用されている。例えば、国際特許出願公開 ＷＯ９３/０７２７６ Ａ１によれば、バチラス 種１６４−Ａ１から得られ得るプロテアーゼ１６４-Ａ１(Chemgen Corp., Gaithersburg, MD, USA, and Vista Chemical Company, Austin, TX, USA）は、洗浄剤および清浄剤に使用するのに適切である。他の例は、バシラス種ＰＤ１３８由来のアルカリプロテアーゼであるＮＣＩＭＢ ４０３３８（Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark, (ＷＯ 93/18140 A1)）、バシラス種 ferm. ＢＰ-３３７６(US Patent 5,344,770)由来のプロテイナーゼＫ-1６(Kao Corp., Tokyo, Japan)、およびＷＯ９６/２５４８９ Ａ１によれば好冷生物 Flavobacterium balustinum由来のプロテアーゼ(Procter & Gamble, Cincinnati, OH, USA)、である。
【０００６】
天然のプロテアーゼは、自体既知である突然変異誘発方法によって、例えば洗浄剤および清浄剤における使用のために至適化される。これらは、点突然変異誘発、欠失、挿入または他のタンパク質またはタンパク質の一部分との融合による、またはその他の修飾法による方法を包含する。例えばスブチリシンの洗浄能を改善するために、既知分子に計画的な点突然変異を導入するためのストラテジーは、「合理的タンパク質設計」とも言われる。同様の性能改善に対するストラテジーは、表面電荷および／または分子等電点を修飾すること、そしてそれによって、基質とそれらの相互作用を修飾することからなる。例えば、点突然変異を用いると、スブチリシンの正味電荷は基質結合に影響するために、特に洗浄剤および清浄剤における使用のために修飾され得る。さらに、特に補足的ストラテジーは、関連のあるプロテアーゼの安定性の増加、すなわちそれらの効果の増加からなる。ポリマーとの結合による安定化は、化粧品用のプロテアーゼについて、例えば米国特許５２３０８９１に記載されている；それは良好な皮膚適合性に関連する。特に、洗浄剤および清浄剤については、点突然変異法による安定化はよく知られている。
【０００７】
酵素開発における現在の目的は、統計学的方法を用いて既知の相互に関係するタンパク質からの要素を組合せて従来では達成されていない特性を有する新規酵素を得ることである。このような方法は、一般的用語「定方向進化」としてまとめられている。これらは、例えば次の方法を包含する：ＳtＥＰ方法(Zhao et al. (1998), Nat. Biotechnol., Vol. 16, pp. 258-261)；ランダムプライミング組換え法 (Shao et al., (1998), Nudleic acids Res., Vol. 26, pp. 681-683)；ＤＮＡシャッフリング(Stemmer, W.P.C. (1994), Nature, Vol. 370, pp. 389-391)；またはＲＡＣＨＩＴＴ(Coco, W.M. et al. (2001), Nat. Biotechnol., Vol. 19, pp. 354-359)。さらに「組換え化ライゲーション反応」(ＲＬＲ)の名称を示すシャッフリング方法は、ＷＯ ００/０９６７９ Ａ１に記載されている。
【０００８】
スブチリシン型の工業的に最も重要なアルカリプロテアーゼの概説は、下記に示される。バシラス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）または バシラス・サブチリス（B. subtilis）から得られるスブチリシン ＢＰＮ’は、Vasanthaら [J. Bacteriol., Volume 159, pp. 811-819 (1984)]およびJ. A. Wellsら [nucleic acids Research, Volume 11, pp. 7911-7925 (1983)]の研究において開示されている。スブチリシンＢＰＮ’は、特に位置番号付与に関して、スブチリシンの参照酵素として使用される。
【０００９】
例えば、全てのスブチリシンに関連のある欧州特許出願  ＥＰ ２５１４４６ Ａ１の点突然変異は、ＢＰＮ’の番号付与において示され、同出願の対象は、Procter & Gamble Corp., Cincinnati, Ohio, USAによって「プロテアーゼＢ」と呼ばれる。欧州特許出願 ＥＰ １９９４０４ Ａ１のＢＰＮ’変異体は、Procter & Gamble Corp.によって「プロテアーゼＡ」と呼ばれる。「プロテアーゼ Ｃ」は、ＢＰＮ’の別の点突然変異によって国際出願公開 ＷＯ９１/０６６３７に従って区別される。ＷＯ ９５/１０５９１ Ａ１によれば、「プロテアーゼ Ｄ」はBacillus lentus由来のプロテアーゼの変異体である。
【００１０】
プロテアーゼスブチリシンカールスバーグは、E.L.Smithら(1968)[J.Biol.Chem., 第243巻, 第2184-2191頁]およびJacobsら(1985)[Nucl.Acids Res., 第13巻, 第8913-8926頁]による文献に記載される。それは、Bacillus licheniformisから天然に形成され、Maxatase（登録商標）(Genencor International Inc., Rochester, New York, USA)の商品名で、Alcalase（登録商標）(Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)の商品名で入手可能である。
【００１１】
プロテアーゼ ＰＢ９２は、好アルカリ性細菌Bacillus nov. spec. 92から天然に産生され、Maxacal（登録商標）(the Gist-Brocades company, Delft, Netherlands)の商品名で入手できる。その原型配列において、欧州特許出願 ＥＰ ２８３０７５ Ａ２に記載している。
【００１２】
スブチリシン１４７および３０９は、NovozymesによってEsperase（登録商標）およびSavinase（登録商標）の商品名の下で市販される。それらは、英国特許出願ＧＢ １２４３７８４ Ａに開示されているBacillus 株から元来由来される。
【００１３】
スブチリシンＤＹは、初めてNedkov ら(1985)[Biol. Chem Hoppe-Seyler, Volume 366, pp. 421-430]により記載された。
【００１４】
B.lentus由来のアルカリプロテアーゼは、国際出願公開 ＷＯ９１/０２７９２ Ａ１に記載のBacillus 種由来のアルカリプロテアーゼである。プロテアーゼそれ自身が、酸化に関する比較的高い安定性および洗浄作用をすでに持っている。国際出願公開 ＷＯ９１/０２７９２ Ａ１または欧州特許出願 ＥＰ ４９３３９８ Ｂ１および米国特許ＵＳ ５３５２６０４では、宿主 B.licheniformis ＡＴＣＣ ５３９２６におけるその異種発現を記載している。前記米国特許の請求項では、B.lentus アルカリプロテアーゼの特性的な位置として位置２０８、２１０、２１２、２１３および２６８が指定される；それらは、成熟タンパク質の番号付与において、位置９７、９９、１０１、１０２および１５７に対応し、この点でこの酵素は成熟スブチリシン３０９(Savinase（登録商標））とは異なる。この酵素の３次元構造は、Goddette(1992)らの文献［J. Mol. Biol., Volume 228, pp. 580-595："The Crystal structure of the Bacillus lentus Alkaline protease, Subtilisin BL, at 1.4Å resolution."］に記載されている。点突然変異によって安定され、洗浄剤および清浄剤における使用のために特に適当であるこの酵素の工業的に重要な変異体は、特に国際出願公開 ＷＯ９２／２１７６０ Ａ１、ＷＯ ９５／２３２２１ Ａ１、ＷＯ ０２／０８８３４０ Ａ２およびＷＯ ０３／０３８０８２ Ａ２に開示されている。
【００１５】
Thermoactinomyces vulgarisによって天然に形成された酵素サーミターゼ（thermitase）は、Melounら (FEBS Lett. 1983, pp. 195-200) によって初めて記載された。これは、他のスブチリシンと比較して、相当な配列不一致を示す分子である。すなわち、成熟タンパク質のサーミターゼとB.lentus ＤＳＭ ５４８３(下記を参照されたい)由来のアルカリプロテアーゼとの間の相同性は、４５％の同一性(類似アミノ酸の６２％)である。
【００１６】
プロテイナーゼＫは、B.lentus由来のアルカリプロテアーゼに対して相当に低い相同性を示すプロテアーゼである：成熟タンパク質レベルでわずか３３％のみの同一性（４６％アミノ酸類似性)である。プロテイナーゼＫは、微生物の Tritirachium album Limberから得られた初めてのものであり、K.D. Jany および B. Mayer (1985)[Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Vol. 366, pp. 485-492]によって記載されている。
【００１７】
ＷＯ ８８／０７５８１ Ａ１は、とりわけ洗浄および浄化製品において使用するための、極めて類似したプロテアーゼＴＷ３およびＴＷ７を開示している。
【００１８】
アミノ酸レベルで、Bacillus subtilis 由来のバシロペプチダーゼ（Bacillopeptidase）Ｆは、B.lentus アルカリプロテアーゼと３０％同一の類似性しか持たなかった。この酵素は、上記研究においてSiezen らにより挙げられているが、洗浄剤および清浄剤における使用については、いまだ記載されておらず、また請求もされていない。
【００１９】
卵の汚れに関して良好な性能を有する新規スブチリシンは、国際出願公開 ＷＯ０１／６８８２１ Ａ２から明らかとなる。
【００２０】
天然環境から単離され得る微生物から形成される別のアルカリプロテアーゼは、例えば国際出願公開 ＷＯ０３／０５４１８５Ａ１(Bacillus gibsonii由来(ＤＳＭ １４３９１))、ＷＯ ０３／０５６０１７ Ａ２(Bacillus sp.由来(ＤＳＭ １４３９０))、ＷＯ ０３／０５５９７４ Ａ２(Bacillus sp.由来(ＤＳＭ １４３９２))およびＷＯ ０３／０５４１８４ Ａ１(Bacillus gibsonii由来(ＤＳＭ １４３９３))から明らかである。全てのこれら出願は、これらの新規アルカリプロテアーゼを含有する等価な洗浄剤および清浄剤を開示する。
【００２１】
工業的に重要なプロテアーゼのさらなる群はメタロプロテアーゼであり、これはコファクターとして金属カチオンを必要とするプロテアーゼである。これらの代表的なものは、スブチラーゼファミリーに分類され得る。ＵＳ ２００３／０１１３８９５ Ａ１は、例えば、グラム陽性微生物、例えばバシラス・サブチリス由来、またS.cerevisiae、S.pombe、E.coliおよびH.influenzae由来のメタロプロテアーゼを記載する。例えば国際出願公開 ＷＯ ００／６００４２ Ａ１およびＷＯ ０２／３６７２７ Ａ１は、メタロプロテアーゼを含有する洗浄剤および清浄剤を開示している。以前は未公開であったＤＥ１０３６０８０５．２は、その関連ＤＮＡが土壌サンプルから単離され得るアルカリメタロプロテアーゼ、および洗浄剤と清浄剤におけるそれらの使用を開示している。
【００２２】
基本的に全ての確立された適用範囲のための多くの新規プロテアーゼは、国際特許出願番号ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２から明らかになる。さらなる既知のプロテアーゼは、Stenotrophomonas maltophilia 由来のＳtmＰr２であり、これはGenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)において、エントリー番号AY253983として寄託され、公開されている。
【００２３】
さらに、既知のプロテアーゼは、Novozymesから、商品名 Durazym(登録商標）、Relase（登録商標）、Everlase（登録商標）、Nafizym、Natalase（登録商標）およびKannase（登録商標）として、Genenncorから、商品名 Maxapem（登録商標）、Purafect（登録商標）、Purafect OxP（登録商標）およびProperase（登録商標）として、BioChemicals Ltd. Thane（インド）から、商品名 Protosol（登録商標）として、およびWuxi Snyder Bioproducts Ltd.（中国）から、商品名Wuxi（登録商標）として入手可能な酵素である。
【００２４】
長い時間をかけて為されてきたあらゆるこれらの研究によって確認されるように、ある場合においては極端に、他の場合においては少数の部分でのみ、以前から知られているプロテアーゼとは異なる工業的に使用し得るプロテアーゼについての多大な需要が存在する。それらは、特に洗浄剤および清浄剤において、それらの使用に特に適応する広範囲にわたる性能の相違をカバーすべきであり、このためにそれらの一部は広範な適用領域を示す。洗浄剤または清浄剤のための適当なプロテアーゼは、対応する条件(例えば、本来的な変性界面活性剤、漂白、高温など)に対する特定の非感受性によって、および適切な基質、例えば食品残留物に存在するタンパク質などの良好な性能によって区別されるのが好ましい。
【００２５】
また明らかなように、それ自体で即時使用でき、様々な突然変異誘発の可能性によってさらに特異的に至適化できる新規アルカリプロテアーゼについての要望がいまだ存在する。このような新規のプロテアーゼは、最近確立されたシャッフリング技術のために、特に興味深い。現在まで知られていなかったヌクレオチド配列は、関連する酵素それ自身が比較的穏やかな性能を提供するとしても、新規のシャッフリング方法（例えば、既知配列を用いるかまたは完全に新規の人為的酵素に代えて）に対して変化の余地を広げる。
【発明の開示】
【００２６】
そのため、本発明は、新規のアルカリプロテアーゼを見出す目的にもとづく。特に、すでに天然で洗浄剤または清浄剤の性能における改善をもたらすアルカリプロテアーゼを見出すことであった。
【００２７】
このようなプロテアーゼを単離するための適当な方法を確立する別の目的は、本明細書と関連する。さらなる副題は、プロテアーゼの獲得およびさらなる開発に使用され得、所望によりシャッフリングに導入し得る、組換えＤＮＡおよび微生物エレメントを得るために、かかるプロテアーゼをコードする核酸を利用できようにすることを含む。さらに、適切な組成物（特に、洗浄剤および清浄剤）、適当な洗浄および清浄方法、およびこのようなプロテアーゼについての適切な方法および使用の可能性が利用できるように為されるべきである。最終的には、発見されたプロテアーゼに対する工業的な利用可能性を明確にすべきである。
【００２８】
目的を達成するために、ほとんど現在までにはとられなかった方法が利用された。例えば、好アルカリ性微生物のための従来の集積培養は用いないが、この遠回りをせずに、アルカリプロテアーゼをコードする核酸が土壌サンプルから単離された。もともと関連する核酸は、関連のある特定の株、即ち特定ゲノムに割り当てることができないので、これは「メタゲノムＤＮＡ」である。
【００２９】
驚くべきことに、この方法に従って、互いに高い類似性を有し、完全な成熟酵素またはＣ末端欠失突然変異体として洗浄剤および清浄剤に上手く用い得る２つの新規プロテアーゼが見出された。
【００３０】
即ち上記目的は、アミノ酸配列が、配列番号：４に示したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるかまたは配列番号：７に示したアミノ酸配列と少なくとも８７．５％同一であるアルカリプロテアーゼによって達成される。
【００３１】
本発明に関連した本発明の別の目的としては、関連のある核酸、対応する天然細胞、それらを同定するための適当な方法、特に分子生物学的方法、核酸を合成する方法原理、組成物、洗浄剤および清浄剤を合成する方法、洗浄および清浄方法、関連のあるプロテアーゼによって特徴づけられる使用可能性である。
【００３２】
具体的な例から確かめられるように、配列番号：４および７に示した酵素または関連のある成熟酵素は、洗浄および清浄するために使用し得るタンパク質分解活性をすでに有する。ＤＮＡが利用できるようになったので、これらの酵素のさらなる至適化が、例えば点突然変異誘発によって可能となる。さらに、これらのＤＮＡは、シャフリングに導入され、完全に新規なプロテアーゼの産生に利用され得る。
【００３３】
本発明における「タンパク質」とは、天然のアミノ酸からなるポリマーであって、実質的に線状構造を有し、通常は３次元構造を採ってその機能を発揮するポリマーを意味する。本願においては、タンパク質を生成する１９個の天然Ｌ-アミノ酸を、国際的に使用されている１文字コードおよび３文字コードによって示される。名称と数字によるこれらの記号表示の組合せは、それぞれのタンパク質について、アミノ酸基がそれぞれの位置に保持するアミノ酸残基を示す。同様の記号表示が点突然変異に対して確立されている。特別に記載されていなければ、位置表示は、各場合において関連したタンパク質の成熟形態、即ちシグナルペプチドを含まない形態に関する(後記参照)。
【００３４】
本発明における酵素とは、特定の生化学機能を発揮するタンパク質として解されるべきである。例えば、タンパク質分解酵素またはタンパク質分解機能を有する酵素とは、タンパク質の酸アミド結合を加水分解するものとして一般的に解されるべきである。
【００３５】
多くのタンパク質は、「プレタンパク質」として、すなわち「シグナルペプチド」とともに産生される。これは、タンパク質のＮ末端部分として理解され、その機能は、通常、産生細胞から産生されたタンパク質をペリプラズムまたは周囲培地への放出および／またはその正確な折り畳みを確実にすることである。このシグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼによって天然の条件下でシグナルペプチド以外のタンパク質から除去され、その結果このタンパク質は、最初に存在していたＮ末端アミノ酸なしに、実際の触媒活性を発揮する。
【００３６】
その酵素活性のゆえに、技術的応用のためには、プレタンパク質よりも「成熟タンパク質」、即ちその調製後にプロセシングされた酵素が好ましい。
【００３７】
「プロタンパク質」は、タンパク質の不活性前駆体である。シグナル配列を有するその前駆体は、「プレプロタンパク質」と呼ばれる。
【００３８】
本発明において「核酸」とは、天然にヌクレオチドから合成される情報担体として働き、タンパク質または酵素の線状アミノ酸配列をコードしている分子を意味する。それらは、一本鎖として、該一本鎖に相補的な一本鎖として、または二本鎖として存在することができる。分子生物学の研究のためには、天然でより耐久性の高い情報担体として、核酸ＤＮＡが好ましい。対照的に、ＲＮＡは、天然環境において、例えば発現細胞において本発明を実施するために産生されてＲＮＡが形成されるので、本発明に重要なこのＲＮＡ分子は同様に本発明の実施態様である。それらから（ｃ)-ＤＮＡ分子を、例えば逆転写によって導くことができる。
【００３９】
タンパク質に対応する核酸の情報単位も、本発明において「遺伝子」としてみなされる。ＤＮＡの場合、両方の相補鎖の配列は、各々の場合において３つの全ての可能な読み取り枠を考慮されるべきである。さらに、異なるコドントリプレットが、同じアミノ酸をコードすることができるので、そのために特定のアミノ酸配列が、恐らく低い同一性しか有さない複数の異なるヌクレオチド配列から得られるという事実も考慮しなければならない（遺伝子コードの縮重）。さらに、種々の生物は、これらコドンの使用の点で異なる。これらの理由から、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の両方が、発明の保護範囲に含まれなければならず、示したヌクレオチド配列の各々は、例示のために特定のアミノ酸配列をコードしているにすぎないとみなされるべきである。
【００４０】
当業者は、現在一般的に知られている方法、例えば化学合成またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを、分子生物学および／またはタンパク質化学などの標準的方法と組み合わせて、既知のＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列に基づいて完全な遺伝子を調製することが可能である。このような方法は、例えば「Lexikon der Biochemie（生化学百科事典）」、Spektrum Akademischer Verlag、Berlin、1999、第1巻、267〜271頁、および第2巻、227〜229頁から既知である。これは、特に、株収集において寄託された株を使用する場合に利用できる。該株から、例えば、既知配列に基づいて合成し得るＰＣＲプライマーを用いて、および／または単離したｍＲＮＡ分子を用いて、該菌株から当該遺伝子を、合成、クローン化、および所望によりさらに処理、例えば突然変異誘発することができる。
【００４１】
例えば分子生物学的な自体既知の方法を用いてもたらされ得るヌクレオチド配列に対する変更は、「突然変異」と呼ぶ。変更の性質によって、欠失突然変異、挿入突然変異、置換突然変異、または種々の遺伝子もしくは遺伝子の一部が、互いに融合された突然変異(シャッフリング)が知られている；これらは遺伝子突然変異である。対応する生物を突然変異体という。突然変異した核酸由来のタンパク質は、「改変体」と呼ぶ。例えば、欠失、挿入、または置換変異または融合は、欠失-、挿入-、置換変異導入または融合遺伝子をもたらし、タンパク質レベルでは、各々対応する欠失突然変異体、挿入突然変異体、置換突然変異体また融合タンパク質をもたらす。
【００４２】
正確に１つのアミノ酸位置(アミノ酸置換)を参照する点突然変異の記載について、次の慣例が用いられる：まず、天然に存在するアミノ酸を国際的に認められた１文字コードの形式で表し、次いで関連する配列位置、最後に挿入されたアミノ酸を明記する。同じポリペプチド鎖内での複数交換は、各々スラッシュによって各々区別される。
【００４３】
本発明においてベクターとは、核酸からなるエレメントであって、かつ特徴的な核酸領域として目的の遺伝子を含むエレメントと解される。それらは、数世代または細胞分裂にわたって、種または細胞系で残りのゲノムとは独立して複製する安定な遺伝的エレメントとして、目的の遺伝子を確立することができる。ベクターとは、特に細菌において用いられる場合、特別なプラスミド、即ち環状の遺伝子エレメントである。遺伝子操作において、一方では、貯蔵のために使用され、ある程度までは遺伝子操作の研究のために使用されるベクターである「クローニングベクター」と、他方では、宿主細胞における目的の遺伝子を産生する機能、即ち関連タンパク質の発現を可能にする機能を発揮するベクターとの間を、遺伝子工学的に区別する。これらのベクターは発現ベクターと呼ばれる。
【００４４】
上記ベクターを含有する細菌細胞および真核細胞の両方の細胞は、一般的に、それらの相違に関係なく、細胞という。ベクター、特に発現ベクターを含有し、そしてトランスジーンを発現するために刺激され得る細胞は、それらが関連のある遺伝子系を保持しているため、宿主細胞と呼ばれる。
【００４５】
相同性決定（Homologation）は、既知遺伝子またはタンパク質の配列と、核酸またはアミノ酸配列の比較である。それは、例えばアラインメント（整列）によって行われる。相同性の尺度は、同一性のパーセンテージ（％）であり、例えば、D. J. Lipman および W. R. Pearson(1985)[Science 227, pp. 1435-1441]によって記載された方法に従って測定され得る。これは、現在、市販入手し得るコンピュータープログラムによって使用されるアルゴリズムを介して為されるのが好ましい。これらは、例えば、ベクターＮＴＩ（登録商標）Suite 7.0（InforMax, Inc., Bethesda, USAから入手し得る）と呼ばれるプログラムを包含し、好ましくは予め定義されたデフォルト(即ち、標準的)パラメーターを用いる。相同性表示とは、完全タンパク質または分配された個々の領域を示す。より広い相同性の概念である用語である「類似性」とは、保存された変異、即ち同様の化学活性を有するアミノ酸をも考慮に含む。これは、通常はこれらがタンパク質内で同様の化学活性を発揮するためである。核酸の場合には、同一性の割合(％)だけが知られる。
【００４６】
相同性決定により、アミノ酸またはヌクレオチド配列から、考慮下の完全酵素の酵素活性および個々の配列領域の「機能」を推論することができる。異なるタンパク質の相同領域とは、同等の機能を有する領域であり、一次アミノ酸配列における同一性または保存された交換によって認識することができる。それらは、個々のアミノ酸から、数個のアミノ酸鎖長である非常に小さな領域、いわゆるボックスから、一次アミノ酸配列における長い領域までを含む。即ち、相同領域の機能は、完全タンパク質によって発揮される機能の極めて副次的な部分的機能、例えば基質または遷移錯体の複合化に対する個々の水素結合の形成を含むと理解すべきである。実際の酵素反応に関与しないタンパク質の他の領域は、それらを定性的または定量的に修飾することができる。これは、例えば酵素安定性、活性、反応条件または基質特異性に関する。
【００４７】
従って、タンパク質分解酵素またはプロテアーゼなる用語は、触媒活性中心の少数のアミノ酸残基の機能だけでなく、実際の触媒活性領域上のタンパク質全体または残りのタンパク質の一部または多数の部分の作用から生じるあらゆる機能を意味する。さらに、他のプロテアーゼの活性が、例えば本発明のタンパク質の１以上の部分によって定性的または定量的に修飾されることも可能である。他のファクターに対するこのような影響も、同様にタンパク質分解活性と見なされる。タンパク質分解活性な酵素は、それらのプロテアーゼである。また、タンパク質分解活性な酵素とは、その活性が所定の時点で、例えば阻害剤によって遮断されるようなプロテアーゼである。対応するタンパク質分解反応に対するそれらの主適合性は重要である。
【００４８】
フラグメントとは、天然のタンパク質または完全に翻訳された遺伝子に相当するタンパク質よりも小さく、例えば合成によっても得ることができる全てのタンパク質またはペプチドを意味する。そのアミノ酸配列のゆえに、これらは、対応する完全なタンパク質に関連付けることができる。これらは、例えば、同一の構造をとることもでき、またタンパク質分解活性または部分活性を発揮することもできる。出発タンパク質のフラグメントおよび欠失改変体は、基本的には類似しているが、フラグメントは比較的小さい小片を示すが、欠失変異体は、短い領域を欠いているだけであり、そのため個々の部分的機能を欠いているにすぎない。
【００４９】
本発明において、キメラまたはハイブリッドタンパク質とは、同じ生物由来または異なる生物由来の異なるポリペプチド鎖に天然に由来するエレメントから構成されるタンパク質であると解される。この方法はまた、シャッフリングまたは融合突然変異誘発とも呼ばれる。このような融合の目的とは、例えば本発明の融合されたタンパク質部分の助けを借りて特定の酵素機能をもたらすか、または修飾することである。
【００５０】
挿入突然変異によって得られたタンパク質とは、出発配列にタンパク質フラグメントまたは核酸フラグメントを挿入することによって、それ自体既知の方法により得られたタンパク質改変体であると解される。原則的に、それらの類似性の故に、それらはキメラタンパク質に分類されるべきである。これらは、単に、完全なタンパク質のサイズに対する未変更タンパク質部分のサイズの点で、後者とは異なる。このような挿入突然変異されたタンパク質における外来タンパク質の割合は、キメラタンパク質における割合よりも低い。
【００５１】
反転突然変異誘発、すなわち、配列の部分的反転は、欠失および挿入の両方の特別な例とみなすことができる。同じことが、元のアミノ酸配列とは異なる種々の分子部分の新規分類に当てはまる。それは、元のタンパク質の欠失変異体、挿入変異体およびシャッフリング変異体としてもみなすことができる。
【００５２】
本発明において、誘導体とは、純粋なアミノ酸鎖が、化学的に修飾されているタンパク質を意味する。このような誘導体化は、例えば、宿主生物によるタンパク質生合成と関連して生物学的に行い得る。このために、分子生物学の方法、例えば対応する修飾を提供する遺伝子を用いる同時形質転換を使用することができる。しかし、誘導体化を、化学的に、例えばアミノ酸側鎖の化学的転換によって、あるいはタンパク質と別の化合物との共有結合によって行うこともできる。このような化合物は、例えば本発明のタンパク質に、例えば二官能性化合物を介して結合される他のタンパク質であってもよい。このような修飾は、例えば、基質特異性または基質に対する結合強度に影響を与えるか、または結合する物質が阻害剤である場合には酵素活性の一時的な遮断をもたらし得る。これは、例えば、貯蔵期間にとって有用である。同様に、誘導体化とは、巨大分子支持体に対する共有結合とも解されるべきである。
【００５３】
本発明において、全ての酵素、タンパク質、フラグメント、融合タンパク質および誘導体は、それらがそうであると明確に言及される必要がなければ、一般的用語のタンパク質に含まれる。
【００５４】
酵素の性能とは、考慮される技術領域におけるその効力、好ましくは対応して指向される製品の範囲内でのその効力と解する。これは、実際の酵素活性に基づくが、さらに、特定のプロセスに関連するさらなる要因に依存する。これらの要因には、例えば、安定性、基質結合、基質を担持する物質との相互作用、または他の成分との相互作用、特に相乗作用が包含される。
【００５５】
洗浄剤または清浄剤の洗浄性能または清浄性能とは、本発明においては、汚れた物品（例えば、織物または硬表面を有する物品）に対して考慮される組成物が発揮する効果として解される。かかる組成物の個々の成分、例えば個々の酵素が、全洗浄剤または清浄剤の洗浄または清浄性能に対する該酵素の寄与という点について評価される。その理由は、酵素の酵素特性から、製品の洗浄性能に対する該酵素の寄与を推定することが、容易にはできないためである。ここで、ある役割を果たす他の要因の例は、安定性、基質結合、浄化されるべき物質への結合、および該洗浄剤または清浄剤の他の成分との相互作用、特に汚れ除去における相乗作用である。
【００５６】
配列番号：４および７に示されるアミノ酸配列は、本発明の実施例において記載したように、土壌サンプルから単離した核酸から得られる。それらの配列は、配列番号：３または６として示される。得られたタンパク質は、本発明に従ってプロテアーゼ ＨＰ７０（配列番号：３および４）またはＨＰ５３（配列番号：６および７）と呼ぶ。アラインメントの助けによって、例えば図４によって理解されうるように、それらは互いに９３．９％のアミノ酸レベルで相同性を有する。
【００５７】
本発明の実施例に従って見出され、特徴付けられたこれらの２つのプロテアーゼに記載されている最も近縁の類似した酵素は、GenBank (National Center for Biotechnology Information, NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)においてアクセス番号ＮＰ＿636242を持つ、Xanthomonas campestris pv. campestris (ATCC 33913)由来の細胞外セリンプロテアーゼであると決定された。InforMax, Inc., Bethesda,USA から得たコンピュータープログラムベクターＮＴＩ（登録商標）Suite 7.0によって、特定のデフォルト・パラメーターを用いて、後の全ての相同性値と同様に、決定したこの酵素の相同性は、アミノ酸レベルでＨＰ７０に対して７５％の同一性であり、ＨＰ５３に対しては７５．４％同一性であった。
【００５８】
最も近縁で類似している決定された酵素は、表の形式で実施例４および５にまとめた：それらは、各々Xanthomonas campestris および X axonopodis 由来の細胞外プロテアーゼである。アルカリプロテアーゼＨＰ７０の完全長にわたり、確立されたB.lentus アルカリプロテアーゼ(ＷＯ ９７/２１７６０ Ａ１)と、アミノ酸レベルで２６．２％同一の相同性および核酸レベルで３３．６％同一の相同性が生じる。ＨＰ５３は、B.lentus アルカリプロテアーゼと２５．９％および３３．５％同一の相同性値を持つ。
【００５９】
実施例にまとめられたこれらのデータは、次のとおりに更新され得る：St. maltophilia(GenBank：AY253983)由来のプロテアーゼＳtmＰr２は、本発明のプロテアーゼＨＰ７０（配列番号：４）に対して８４．７％の配列相同性およびＨＰ５３（配列番号：７）に対して８２．５％の同一性を有する。ＷＯ２００４/０３３６６８Ａ２において配列番号：６６として開示されたプロテアーゼはＨＰ７０と８３．１％同一であり、ＨＰ５３と８１．１％同一である。ＷＯ２００４/０３３６６８Ａ２において配列番号：７０として開示されたプロテアーゼと比較すると、ＨＰ７０に対して８５．０％同一およびＨＰ５３に対して８２．３％同一の相同性値を与える。
【００６０】
本発明の保護範囲において、アミノ酸配列が、配列番号：４と少なくとも９０％まで同一であるかまたは配列番号：７と少なくとも８７．５％まで同一である全てのアルカリプロテアーゼが包含され得る。
【００６１】
それらの中で、機能的アルカリプロテアーゼが好ましい、即ち欠失していないか、または単なる推定上の酵素ではない、むしろ酵素活性のために工業的用途に実際に利用し得る機能的アルカリプロテアーゼが好ましい。
【００６２】
順に好ましいアルカリプロテアーゼには、アミノ酸配列が、配列番号：４に示したアミノ酸配列と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％同一であるか、または配列番号：７に示したアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に１００％同一である、このタイプのあらゆるアルカリプロテアーゼが包含され、この各ケースにおいてあらゆる整数または分数の中間値も含まれる。
【００６３】
１００％同一のタンパク質をコードし、図３に示したベクターから得られる、実施例に記載した対応するベクターは、ＨＰ７０に対しては表記名７０-pＵＣ(ＡＷＢ４０３)およびＨＰ５３に対しては表記名５３-pＵＣ(ＡＷＢ４０３)が与えられる。それらは、２００３年１０月２日に、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124, Braunschweig (http://www.dsmz.de)でこの名称でもって受託され、各々受託番号ＤＳＭ １５９７７およびＤＳＭ １５９７６を持つ。各生存性は、２００３年１０月１７日にＤＳＭＺによって確認された。これらのベクターにコードされ、本発明の実施例において試験され、そうして最も好ましいプロテアーゼを各々ＨＰ７０およびＨＰ５３と表示する。
【００６４】
これらの本発明のアルカリプロテアーゼの中で、各ケースにおいて相同性値が、配列番号：４においてアミノ酸位置３２〜５８１または配列番号：７においてアミノ酸位置３９〜５８６に対応する領域にあてはまるものがさらに好ましい。
【００６５】
これにより、実際に活性な成熟タンパク質を意味する。それは工業的に適切な機能を発揮するためである。現時点では、各ケースにおいてどのアミノ酸が成熟タンパク質のＮ末端を示すかを明確にはまだ説明できない。現在のところ、位置３３または３９における開始が、もっとも妥当であると思われる。他のアミノ酸がＮ末端を示すと後になって見出されたなら、発明の保護範囲はそれを基にするだろうし、その場合、各ケースにおいて記載した位置は各ケースにおいて成熟タンパク質の最初のアミノ酸を表す。
【００６６】
先行技術から最も近縁の類似した酵素と、実施例４に示したように行ったこれら成熟酵素との配列比較から、次の結果を得た：（仮定的）成熟プロテアーゼＨＰ７０（配列番号：４、位置３３〜５８１）は、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２からの配列番号：６６の相同領域と８４．２％同一であり、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２からの配列番号：７０の相同領域と８６．２％同一であり、そしてプロテアーゼＳＴmＰr２の相同領域と８５．８％同一である。この（仮定的）成熟プロテアーゼＨＰ５３（配列番号：７、位置３９〜５８６）は、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２からの配列番号：６６の相同領域と８３．８％同一であり、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２からの配列番号：７０の相同領域と８５．０％同一であり、そしてプロテアーゼＳＴmＰr２の相同領域と８５．２％同一である。
【００６７】
同じことがＣ末端にもあてはまる。現在のところ、配列番号：４および７における位置５８１および５８６は、各ケースにおいて、配列番号：３においてヌクレオチド位置１７４４〜１７４６および配列番号：６においてヌクレオチド位置１７５９〜１７６１がストップコドンを示すために、本明細書中では妥当であると思われる。しかし、プロセシングの結果として、別のアミノ酸が成熟で活性なタンパク質のＣ末端を示すことが後になって見出されたなら、発明の保護範囲はそれに関連するし、その場合、各ケースにおいて記載した番号は成熟な活性タンパク質の最後のアミノ酸を表す。基本的に、タンパク質の成熟時に内部フラグメントがおそらく切り取られる場合に同じことがあてはまる。
【００６８】
各ケースにおいて少なくとも９０％同一性から相同性値が、配列番号：５においてアミノ酸位置３３〜４７０または配列番号：８においてアミノ酸位置３３〜４７０に対応する領域にあてはまる、これまでに記載されたあらゆるアルカリプロテアーゼが、さらに好ましい。
【００６９】
実施例において記載したように、実施例に記載され、それによって好ましい保護範囲から除外されたＣ末端領域がＨＰ７０およびＨＰ５３の両方から削除されるが、その欠失改変体は、それらのプロテアーゼ活性、特に洗浄および清浄過程中に必要とされるタンパク質活性を失わない。この強烈な削除における利点は、関連のあるタンパク質の生物工学的調製における出費および費用の節約を含む。このようにして短時間で、本発明のより有用な、特に洗浄剤および清浄剤における使用のための有用なより多くの酵素を得られ、これは、例えば、産生微生物の発酵に必要な培地構成成分のより良好な利用を伴う。
【００７０】
実施例４で行った先行技術による最も近縁の類似した酵素と、これらの成熟かつＣ末端が削除された酵素との配列比較から、次の結果を得た：（仮定的）成熟およびＣ末端削除プロテアーゼＨＰ７０（配列番号：５、位置３３〜４７０）は、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２からの配列番号：６６の相同領域と８５．２％同一であり、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２からの配列番号：７０の相同領域と８８．１％同一であり、プロテアーゼＳＴmＰr２の相同領域と８７．７％同一である。この（仮定的）成熟およびＣ末端削除プロテアーゼＨＰ５３（配列番号：８、位置３３〜４７０）は、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２からの配列番号：６６の相同領域と８５．４％同一であり、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２からの配列番号：７０からの相同領域と８７．０％同一であり、そしてプロテアーゼＳＴmＰr２様の相同領域と８７．０％同一である。
【００７１】
配列番号：９のコンセンサス配列、好ましくはアミノ酸位置３９〜５８７のアミノ酸の範囲において、特に好ましくはアミノ酸位置３９〜４７６の範囲にあるようなアミノ酸配列を有するこれまでに記載された任意のアルカリプロテアーゼがさらに好ましい。
【００７２】
配列番号：９は、例えば図４のアラインメントによって確立され得るように、２つのアミノ酸配列の配列番号：４および７から得られたコンセンサス配列を示す。それらの位置の各々におけるアミノ酸配列が、配列番号：４および７のいずれかと判明し得るプロテアーゼを含む。このように、これらの２つの配列は、互いに関連するか類似したスブチリシンプロテアーゼに対して配列スペースを広げる。それらは配列番号９に記載の一般配列を有し、この場合各ケースにおける下記の３５の位置において２つの異なるアミノ酸が存在し得るか、または特定のアミノ酸（３文字コードで表示する）または（−）アミノ酸が存在しない；正確に言うと、以下の可能性（各ケースにおける配列プロトコールでは「改変体」として定義される）：位置２：−またはＩｌｅ、位置３：ＳｅｒまたはＴｈｒ、位置４：ＨｉｓまたはＡｓｎ、位置５：ＡｓｐまたはＳｅｒ、位置７：−またはＳｅｒ、位置８：−またはＶａｌ、位置９：−またはＰｒｏ、位置１０：−またはＧｌｙ、位置１１：−またはＡｓｐ、位置１２：ＧｌｎまたはＰｒｏ、位置１３：ＰｒｏまたはＧｌｎ、位置２５：ＡｌａまたはＧｌｙ、位置４８：ＳｅｒまたはＡｌａ、位置６５：ＡｓｎまたはＴｈｒ、位置６６：ＬｅｕまたはＡｓｐ、位置８２：ＳｅｒまたはＧｌｎ、位置１４９：ＡｌａまたはＳｅｒ、位置２３４：ＳｅｒまたはＡｌａ、位置２３６：ＩｌｅまたはＴｙｒ、位置２５９：ＳｅｒまたはＴｈｒ、位置２６７：ＰｈｅまたはＴｙｒ、位置３２１：ＴｈｒまたはＳｅｒ、位置３８６：ＩｌｅまたはＶａｌ、位置４０６：ＴｈｒまたはＡｌａ、位置４３８：ＴｈｒまたはＳｅｒ、位置４８７：Ｔｈｒまたは−、位置４８８：ＶａｌまたはＴｈｒ、位置５０１：ＡｌａまたはＳｅｒ、位置５０７：ＳｅｒまたはＡｌａ、位置５１１：ＶａｌまたはＡｌａ、位置５２２：ＳｅｒまたはＴｈｒ、位置５２７：ＳｅｒまたはＴｈｒ、位置５４６：ＡｓｎまたはＴｈｒ、位置５６２：ＳｅｒまたはＡｌａおよび最後に位置５７４：ＧｌｙまたはＡｌａである。
【００７３】
本実施例によって文書化された研究において２つの酵素ＨＰ７０およびＨＰ５３は、本発明に関する利点を持ち、さらに９３．９％と一致するので、このプロテアーゼのサブファミリーに属する各々別の酵素は比較的好ましい特性を有すると考えられる。
【００７４】
これは、上記したことが、特に各ケースにおいて、活性である成熟酵素、かつＣ末端の大部分がタンパク質分解活性を失わずに除去される欠失変異体にあてはまる。
【００７５】
これまでに記載した各アルカリプロテアーゼは、配列番号：３に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の順に好ましく、特に好ましいのは１００％同一であるヌクレオチド配列、特に配列番号：３に記載のヌクレオチド位置９７〜１７４６に対応する領域、より具体的には配列番号：３に記載のヌクレオチド位置９７〜１４１０に対応する領域によってコードされているか、または配列番号：６に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の順に好ましく、特に好ましいのは１００％同一であるヌクレオチド配列、特に配列番号：６に記載のヌクレオチド位置１１５〜１７６１に対応する領域、より具体的には配列番号：６に記載のヌクレオチド位置１１５〜１４２８に対応する領域によってコードされているものがさらに好ましい。
【００７６】
上記してきたことから、そして具体的には実施例から判るように、特に好ましいプロテアーゼは、それ自体または対応する微生物を介して検出されてはいないが、本発明に関連して発見された核酸によってコードされている。
【００７７】
実施例３および４において説明されるように、ヌクレオチドレベルでＨＰ７０およびＨＰ５３に最も近縁の類似した酵素である、Xanthomonas campestris pv. campestris (ATCC 33913; NP_636242)由来の細胞外セリンプロテアーゼ（E.C.3.4.21.-）は、特定のデフォルトパラメーターを用いて、InforMax, Inc., Bethesda, U.S.A.から得られるコンピュータープログラムVector NTI（登録商標）Suite 7.0によって測定され得るように、ヌクレオチドレベルで７４．４％または７５．０％同一の相同性を有する。従って、より著しく類似した核酸によってコードされる全てのアルカリプロテアーゼおよびタンパク質は、保護範囲内に包含される。
【００７８】
実施例に含まれるこれらのデータは、次のようにアップデートされ得る：St. maltophilia(GenBank: AY253983)由来のプロテアーゼ ＳｔｍＰｒ２は、相同性決定領域において本発明のプロテアーゼＨＰ７０（配列番号：３）に対してＤＮＡレベルで８０．８％の配列相同性、およびＨＰ５３（配列番号：６）のＤＮＡ配列に対して８１．２％同一の配列相同性を有する。ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２において配列番号：６５として開示されるプロテアーゼＤＮＡ配列は、ＨＰ７０のものと７９．６％同一であり、ＨＰ５３のものと７９．９％同一である。ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２において配列番号：６９として開示されたプロテアーゼをコードしているＤＮＡ配列と比較すると、ＨＰ７０ＤＮＡと８１．３％同一およびＨＰ５３ＤＮＡと８１．１％の同一の相同性値が得られる。
【００７９】
これまでの説明は、特に成熟タンパク質および特にＣ末端が削除されたタンパク質分解活性のあるそれらの改変体をコードする核酸配列にあてはまる。これらは、タンパク質分解活性、特に本発明の実施例において保護される対応する製剤の洗浄および清浄性能に寄与する酵素である。
【００８０】
先行技術からの最も近縁の類似したものと、実施例４で行った成熟酵素をコードするこれらのＤＮＡ断片の配列比較から、次の結果を得た：（仮定）成熟プロテアーゼＨＰ７０（配列番号：３、位置９７〜１７４６）についての遺伝子は、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２の配列番号：６５の相同領域と８０．０％、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２の配列番号：６９の相同領域と８１．８％およびプロテアーゼＳｔｍＰｒ２の相同領域と８１．３％同一である。（仮定）成熟プロテアーゼＨＰ５３（配列番号：６、位置１１５〜１７６１）についての遺伝子は、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２の配列番号：６５の相同領域と８１．０％、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２の配列番号：６９の相同領域と８２．２％およびプロテアーゼＳｔｍＰｒ２の相同領域と８２．９％同一である。
【００８１】
このことから得られるアルカリプロテアーゼは好ましい。
【００８２】
先行技術からの最も近縁の類似したものと、実施例４で行ったこれらの成熟かつＣ末端で削除された酵素をコードしているＤＮＡ断片のさらなる配列比較から、次の結果を得た：（仮定）成熟かつＣ末端で削除されたプロテアーゼＨＰ７０（配列番号：３、位置９７〜１４１０）についての遺伝子は、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２からの配列番号：６５の相同領域と８１．４％、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２からの配列番号：６９の相同領域と８３．７％およびプロテアーゼＳｔｍＰｒ２の相同領域と８３．２％同一である。（仮定）成熟およびＣ末端削除プロテアーゼＨＰ５３（配列番号：６、位置１１５〜１４２８）をコードしている核酸は、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２の配列番号：６５の相同領域と８２．１％、ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２の配列番号：６９の相同領域と８３．６％およびプロテアーゼＳｔｍＰｒ２の相同領域と８３．９％同一である。
【００８３】
これらのＤＮＡから得たアルカリプロテアーゼは、特に好ましい。
【００８４】
さらに、天然環境から単離されるか、天然環境から単離され得る核酸から得られるこれまでに記載した本発明の各アルカリプロテアーゼは好ましい。
【００８５】
実施例に記載した方法を用いて単離されたＤＮＡは、天然の生物から形成され、また機能タンパク質をイン・ビボでコードすると考えられるべきである。それ故に、類似した方法によって、特に、もしそれらが偽遺伝子でなく実際に形成されたタンパク質であるなら、関連酵素それら自身を見出すことも可能である。一方、核酸の単離によって、分子生物学的特性を導入し、そして産生され得る遺伝子が直ちに導かれる。さらに、関連する遺伝子が全ての条件下で発現されることは、必ずしも予測できないが、翻訳されていない遺伝子もまた核酸単離方法によって直ぐに利用できる。
【００８６】
さらに、天然環境から単離し得る生物由来のプロテーゼそのものか、またはその関連核酸であるこれまでに記載された本発明の各アルカリプロテアーゼが好ましい。
【００８７】
この実施態様は、関連生物それ自身が培養され得るので特に有利である。有利には、本発明のプロテアーゼは、その細胞抽出物または培養上清から単離され、調製され得る。
【００８８】
これらの中のアルカリプロテアーゼには、微生物が関与しており、好ましくは真菌類または細菌、これらのなかで好ましくはグラム陽性細菌、特に好ましくはBacillus属のものである。
【００８９】
特にこれらの生物について、培養方法は、先行技術において知られており、確立されている。これは、工業的酵素産生において特に卓越した機能を果たすBacilliにあてはまる。Xanthomonas 種 から得られるアルカリプロテアーゼおよびタンパク質は、さらなる態様である。これらのグラム陰性種の一つから、最も近縁の類似したもの（上記参照）として決定された既知酵素を生じる：Xanthomonasの生物工学的発酵においては既に経験がある。
【００９０】
断片化または欠失変異誘発によってこれまでに記載された本発明のアルカリプロテアーゼの一つから得られたアルカリプロテアーゼ、または開始分子にすでに連結された少なくとも１００、少なくとも１５０、２００、２５０の順に好ましく、特に好ましくは少なくとも３００個のアミノ酸を有するタンパク質、がさらに好ましい。
【００９１】
例えば、結果としてタンパク質分解活性を失わずに、酵素の末端でまたはループ中の個々のアミノ酸を削除することも可能である。このような変異は、例えばＷＯ ９９/４９０５７ Ａ１に記載されている。ＷＯ ０１/０７５７５ Ａ２は、このような欠失方法によって、プロテアーゼのアレルギー誘発性が低下され、それらの全体的な利用性が改善されたことを教示している。このフラグメント化は、後に説明されるが、挿入または置換突然変異誘発および／または他の酵素と後に行われる融合に有利にはたらく。これらの酵素の目的とする使用に関して、それらがフラグメント化または欠失突然変異誘発後であってもタンパク質分解活性を持つ場合が好ましい；酵素がこの結果からさらに増強された活性を持つ場合に特に好ましい。
【００９２】
挿入突然変異誘発によって、置換突然変異誘発によっておよび／または少なくとも他のタンパク質との融合によって、以前に本発明に従って記載されており、これまでに記載されたようなアルカリプロテアーゼまたはタンパク質の一つから得られるようなアルカリプロテアーゼまたはタンパク質がより好ましい。
【００９３】
先行技術からの多くの文書によって、上記ＷＯ ９９/４９０５７ Ａ１ および ＷＯ ０１/０７５７５ Ａ２も、酵素における挿入および置換に関する有利な効果が開示されている。基本的に、これらは、アミノ酸の個々の置換を包含するが、多数の結合したアミノ酸も、別のものに置換され得る。また、これらのものには、より大きな酵素セクション、即ち前記フラグメントと、他の機能を持つ他のプロテアーゼまたはタンパク質との新規の組合せが含まれる。例えば、ＷＯ ９９/５７２５４ Ａ１に従って、本発明のタンパク質またはそれらの一部分を、ペプチドリンカーを介して、または他のタンパク質からの結合ドメイン、例えばセルロース結合ドメインとの融合タンパク質として直接的に提供することもでき、結果として基質の加水分解をより効果的に提供することも可能である。同様に、本発明のタンパク質を、例えば、二つの機能を発揮させるために、アミラーゼまたはセルラーゼと結合させることもできる。
【００９４】
これらの中で、Bacillus lentus由来のアルカリプロテアーゼの番号付けにおいて、位置３、４、３６、４２、４７、５６、６１、６９、８７、９６、９９、１０１、１０２、１０４、１１４、１１８、１２０、１３０、１３９、１４１、１４２、１５４、１５７、１８８、１９３、１９９、２０５、２１１、２２４、２２９、２３６、２３７、２４２、２４３、２５５、および２６８で、１以上のアミノ酸置換を有するアルカリプロテアーゼまたはタンパク質が好ましい；これらの位置は、図１におけるアラインメントによって割り当てられるべきである。
【００９５】
ここで、下記アミノ酸残基はB. lentusアルカリプロテアーゼの野生型分子にある：Ｓ３、Ｖ４、Ｓ３６、Ｎ４２、Ａ４７、Ｔ５６、Ｇ６１、Ｔ６９、Ｅ８７、Ａ９６、Ｒ９９、Ａ１０１、Ｉ１０２、Ｓ１０４、Ｎ１１４、Ｈ１１８、Ａ１２０、Ｓ１３０、Ｓ１３９、Ｔ１４１、Ｓ１４２、Ｓ１５４、Ｓ１５７、Ａ１８８、Ｖ１９３、Ｖ１９９、Ｇ２０５、Ｌ２１１、Ａ２２４、Ｋ２２９、Ｓ２３６、Ｎ２３７、Ｎ２４２、Ｈ２４３、Ｎ２５５およびＴ２６８。
【００９６】
Bacillus licheniformis 由来のアルカリプロテアーゼに加えて、先行技術におけるB.lentus アルカリプロテアーゼは、新規プロテアーゼおよび点突然変異の説明に重要な参照分子であり、該新規プロテアーゼが明細中で記述され、その配列はこれまでは知られていなかったので、点突然変異の割り当てにおいてこの番号付与を参照することは有利であると思われる。一方、番号付与は一般的に成熟タンパク質に左右され、上記したように、成熟タンパク質を開始させるアミノ酸位置は、現時点ではまだ特定されていない。配列番号：４（ＨＰ７０）の番号付けにおいて、これらの位置は、図１により理解され得るように、次の位置番号に対応し得る：Ｐ１４０、Ｎ１４１、Ｔ１８２、Ｎ１８８、Ｙ１９５、Ａ２０４、Ｇ２０９、Ｔ２４５、Ｋ２６４、Ｋ２７３、（−）、Ｙ２７７、Ｔ２７８、Ｄ２８０、Ｖ２９６、Ｅ３０４、Ｉ３０６、Ｓ３１７、Ｇ３２６、Ｖ３２８、Ｓ３２９、Ｓ３４１、Ｖ３４５、Ａ３７６、Ｓ３８１、Ｓ３９３、Ｇ３９９、Ｙ４０６、Ｖ４１９、Ｑ４２４、Ｔ４３２、Ｐ４３３、Ｔ４３８、Ｌ４３９、Ｇ４５３およびＶ４６６。
【００９７】
配列番号：７、即ちＨＰ５３の番号付与においては、これらは次の位置である：Ｐ１４６、Ｎ１４７、Ｔ１８８、Ｎ１９４、Ｙ２０１、Ａ２１０、Ｇ２１５、Ｔ２５１、Ｋ２７０、Ｋ２７９、（−）、Ｙ２８３、Ｔ２８４、Ｄ２８６、Ｖ３０２、Ｅ３１０、Ｉ３１２、Ｓ３２３、Ｇ３３２、Ｖ３３４、Ｓ３３５、Ｓ３４７、Ｖ３５１、Ａ３８２、Ｓ３８７、Ｓ３９９、Ｇ４０５、Ｙ４１２、Ｖ４２５、Ｑ４３０、Ｓ４３８、Ｐ４３９、Ｔ４４４、Ｌ４４５、Ｇ４５９およびＶ４７２。
【００９８】
このように、ＷＯ ９２/２１７６０ Ａ１には、Bacillus lentus DSM 5483由来のスブチリシンの次の位置における１つおよび複数の改変体が開示されている：３、４、３６、４２、４７、５６、６９、８７、９６、１０１、１０２、１０４、１１４、１１８、１２０、１３０、１３９、１４１、１４２、１５７、１８８、１９３、１９９、２０５、２２４、２２９、２３６、２３７、２４２、２４３、２５５、および２６８。国際特許出願公開ＷＯ９５/２３２２１ Ａ１は、位置９９、１５４および２１１において、特にＲ９９Ｇ、Ｒ９９Ａ、Ｒ９９Ｓ、Ｓ１５４Ｄ、Ｓ１５４Ｅ、Ｌ２１１Ｄ、およびＬ２１１Ｅにおいてこの分子における置換をさらに開示する。ＷＯ ９５/０７７７０ Ａ１によれば、このような改変体は、化粧品における使用に特に適当である。他の置換に加え、置換Ｌ２１１Ｇは、ＷＯ ０２/０８８３４０ Ａ２に記載されており、国際特許出願公開ＷＯ ０３/０３８０８２ Ａ２では置換Ｇ６１Ａが記載されている。
【００９９】
これらの中のもので、さらなるアミノ酸置換は、１以上の位置３、４、６１、１８８、１９３、１９９および２１１に存在する。ＨＰ７０においては、位置Ｐ１４０、Ｎ１４１、Ｇ２０９、Ａ３７６、Ｓ３８１、Ｓ３９３およびＹ４０６がこれに対応し、ＨＰ５３では、位置Ｐ１４６、Ｎ１４７、Ｇ２１５、Ａ３８２、Ｓ３８７、Ｓ３９９およびＹ４１２３に対応する。
【０１００】
上記してきたことに対応するこれらの中のもので、対応する相同位置が、これら好ましいアミノ酸の一つによってすでに天然に獲得されていないものを与える、１以上のさらなるアミノ酸置換３Ｔ、４Ｉ、６１Ａ、１８８Ｐ、１９３Ｍ、１９９Ｉおよび２１１Ｄまたは２１１Ｇであるものが好ましい。
【０１０１】
置換体Ｓ３ＴおよびＶ４Ｉは、特にＷＯ ０２/０８８３４０ Ａ２に記載されたとおりに、おそらく分子に対する安定化効果によって、洗浄剤または清浄剤の洗浄性能に対するその寄与に関する改善をもたらす。置換体Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１９９Ｉ、およびＬ２１１Ｄは、先行技術において確立された高性能比較酵素として、本発明の実施例７および８で用いているＷＯ ９５/２３２２１ Ａ１のＦ４９として表されたプロテアーゼとみなす。一方で、プロテアーゼ ＨＰ７０およびＨＰ５３は未修飾の野生型分子であり、この活性、特に洗浄性能に対するそれらの寄与において、これらの同一置換によって改善される。
【０１０２】
先に記載した本発明のアルカリプロテアーゼまたはさらに安定化されたかかるタンパク質が、さらに好ましい。
【０１０３】
貯蔵中および／または使用中、例えば洗浄過程における安定性の増加は、その活性を長く継続させ、即ち効果を増強させる。安定化の可能性として、記載されている全ての方法および先行技術における手段は適切である、例えばＵＳ ５２３０８９１に従えばポリマーとの共有結合である。
【０１０４】
好ましいのは、分子それ自体の点突然変異誘発により起こりうる安定化である。これは、タンパク質の回収後に、さらなる処理工程を必要としないからである。これに適するいくつかの点突然変異が、先行技術から自体既知である。即ち、ＵＳ６０８７３１５およびＵＳ６１１０８８４によれば、特定のチロシン残基を他の残基で置換することによって、プロテアーゼを安定化することができる。
【０１０５】
さらなる可能性は、例えば：
−金属イオンの結合を修飾すること、特にカルシウム結合部位、例えば国際特許出願公開 ＷＯ ８８/０８０２８ Ａ１およびＷＯ ８８/０８０３３ Ａ１の教示に従う；これら最初の明細書によると、カルシウム結合において関与する１以上のアミノ酸残基は、負電荷アミノ酸に置換されるべきである；国際特許出願公開 ＷＯ ８８/０８０３３の教示によると、カルシウム結合による安定化のために、点突然変異が２つの基アルギニン／グリシンの配列の少なくとも一つの配列に同時に導入されるべきである；
−米国特許ＵＳ５４５３３７２によれば、タンパク質は、表面上の特異的変異によって、界面活性剤などの変性剤の影響から保護され得る。
【０１０６】
高温および界面活性剤の作用に関する安定化のための別の可能性は、ＷＯ ９２/２１７６０ Ａ１、ＷＯ ０２/０８８３４０ Ａ２およびＷＯ ０３/０３８０８２ Ａ２の教示において、Ｎ末端付近に位置するアミノ酸を、おそらく非共有結合的相互作用によって分子の残りと接触させ、こうして球状構造の維持に寄与する別のアミノ酸に置換することによる安定化であろう。これは、特にB.lentus として元々得られてきたアルカリプロテアーゼについて望ましいものである。配列番号：１２および１６にある改変体を有する適当な変異体は、本発明の実施例に記載されている。
【０１０７】
好ましい実施態様は、分子が複数の方法で安定化されるものである。例えば、ＷＯ ８９/０９８１９ Ａ１によれば、複数の安定化突然変異は付加的に作用することが考えられ得るからである。
【０１０８】
前記した本発明のアルカリプロテアーゼまたは付加的に誘導体化されるかかるタンパク質が、より好ましい。
【０１０９】
「誘導体」とは、産生されたタンパク質のさらなる修飾によって得られるタンパク質を意味すると解される。このような修飾は、例えば安定性、基質特異性または基質への結合強度、または酵素活性に影響し得る。また、このような修飾は、アレルギー誘発性および／またはそのタンパク質の免疫原性を低下させ、このようにして、例えばそれらの皮膚適合性を増強させ得る。
【０１１０】
このような誘導体化は、産生宿主生物によって、例えば生物学的に、タンパク質生合成などと関連して実施され得る。低分子量化合物、例えば脂質またはオリゴサッカライドのカップリングは、特に強調されるべきである。
【０１１１】
しかし、誘導体化は、化学的に、例えば側鎖の化学的変換によって、またはタンパク質への、別の化合物、例えば巨大分子の共有結合によって行うこともできる。化学修飾は、例えばドイツ特許出願 ＤＥ ４０１３１４２ Ａ１に記載されている。例えば、等電点を変更するために酵素のカルボキシル基にアミンを結合させることは、ＷＯ ９５/２６３９８ Ａ１に従う。例えば、タンパク質などの巨大分子は、二官能化合物によって、本発明のタンパク質と結合され得る。例えば、ＷＯ ９９/５７１５４ Ａ１の教示を用いて、非タンパク質リンカーによって特異的結合ドメインを持つ本発明のタンパク質を提供することも可能である。このような誘導体は、特に洗浄剤または清浄剤に使用するために適当である。ＷＯ ００/０１８３１ Ａ２と同様に、プロテアーゼ阻害剤は、リンカー（特にアミノ酸リンカー）を介して、本発明のタンパク質と結合することもできる。他の巨大分子化合物（例えばポリエチレングリコール）とのカップリングは、さらなる特性、例えば、安定性または皮膚適合性に関して分子を改良する；これはすでに説明されている。
【０１１２】
本発明のタンパク質の誘導体は、最も広い意味で、これら酵素の調製物であると解される。取得、ワークアップ、調製によっては、タンパク質は、例えば産生微生物の培養物から得られる様々な他の物質と結合され得る。タンパク質は、例えばその貯蔵安定性を増強するために、ある種の他の物質と特別に処理され得る。それ故に、本発明のタンパク質の全ての調製物は、本発明に関するものである。またこれは、特定の調製物においてこの酵素活性が実際に示されるか否かとは無関係である。貯蔵中にはごくわずかの活性しか持たないかまたは全く活性を持たず、使用時にのみタンパク質分解機能を示すのが望ましい。これは、例えば、適当な付随物質によって制御することができる。プロテアーゼ阻害剤とプロテアーゼとをあわせた調製は有利であり、先行技術から知られている(ＷＯ ００/０１８２６ Ａ２)。
【０１１３】
前記した本発明のアルカリプロテアーゼまたはタンパク質の一つと共通する少なくとも一つの抗原決定基、特に図１のアラインメントによって割り当てられたBacillus lentus由来のアルカリプロテアーゼの番号付与にある位置３、４、３６、４２、４７、５６、６１、６９、８７、９６、９９、１０１、１０２、１０４、１１４、１１８、１２０、１３０、１３９、１４１、１４２、１５４、１５７、１８８、１９３、１９９、２０５、２１１、２２４、２２９、２３６、２３７、２４２、２４３、２５５および２６８において少なくとも一以上のエピトープ領域を持つ、前記した本発明のアルカリプロテアーゼまたはかかるタンパク質が更に好ましい。
【０１１４】
一方でその変異体はそれ自体が好ましく、もう一方では、変異体は、野生型分子と一致する位置におけるプロテアーゼからの領域に対して特異的に形成される抗体によって、区別されるので、これは特に上記したこれらの位置における変異体にあてはまる。
【０１１５】
補助的目的の達成、即ち本発明の独立した目的の達成は、配列番号：３に示されたヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるか、または配列番号：６に示されたヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸である。
【０１１６】
一方で、実施例に記載したプロテアーゼの検出は、関連のあるＤＮＡの単離を基にしているためである。一方で、この核酸は、直接クローニングされて、目的の酵素の組み換えＤＮＡ産物に導入され得る。
【０１１７】
それらの中では、提示されたヌクレオチド配列に対して、少なくとも８７．５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％同一であり、そこでは各ケースにおいて全ての整数または分数の中間値も包含される。
【０１１８】
上述に対応して、実施例に記載したように、７４．４％および７５．０％同一性を有するヌクレオチド配列のみが、配列番号：３および配列番号：６と最も近縁の類似したヌクレオチド配列として、先行技術において見出され得る。
【０１１９】
ＷＯ２００４／０３３６６８Ａ２およびGenBankエントリー番号AY253983から得られるさらなるＤＮＡ配列は、すでに上記で議論されており、本明細書に記載された本発明のヌクレオチド配列とは大きく異なる。
【０１２０】
また、相同性値が、各々のケースにおいて配列番号：３のヌクレオチド位置９７から１７４６または配列番号：６のヌクレオチド位置１１５から１７６１に対応する領域にあてはまる核酸がさらに好ましい。
【０１２１】
上記したものと対応して、該領域は、各ケースにおいて成熟(即ち活性な)タンパク質をコードする領域である。ストップコドンの存在によって、より大きなもはや機能的ではない、望ましくない融合タンパク質が形成されなくなるため、ストップコドンもまた包含されている。即ち、クローニングの際に、タンパク質融合がＣ末端によって特に生じないならは、この位置にストップコドンが存在することに注目すべきである。成熟タンパク質が、この配列の他の部分から形成されることが後に見出されれば、本発明の保護範囲は、その部分にも相応じてあてはまる。
【０１２２】
本発明のこれらの核酸は、各ケースにおいて相同性値が、配列番号：３に示されたヌクレオチド位置９７〜１４１０に対応する領域に、または配列番号：６に示したヌクレオチド位置１１５〜１４２８に対応する領域にあてはまるものがより好ましい。
【０１２３】
実施例に記載したように、タンパク質ＨＰ７０およびＨＰ５３の場合において、全タンパク質のＮ末端部分を使用すれば十分である；両方のケースにおいて十分なＣ末端削除により、洗浄剤および清浄剤中の酵素のタンパク質分解活性を導き、これにより関連する組成物の全清浄性能に対応する寄与を提供するものである。そのために、このような改変体をコードする核酸は、関連のある蛋白質のコスト効率的な生物工学的調製が可能となるために、好ましい実施態様である。
【０１２４】
さらに、以前の記載に対応して、本発明の核酸は、本発明の第一の目的のアルカリプロテアーゼまたはタンパク質をコードする核酸が好ましい。
【０１２５】
同タンパク質は、本発明によって利用できるように為されるべきである、これは不活性タンパク質についてのみコードする核酸は、本発明の解決とはならないからである。成熟タンパク質をコードするそれらの核酸、より具体的にはさらなる活性な改変体をコードする核酸が好ましい。
【０１２６】
本発明の該核酸のもののうち、１つまたは好ましくは複数のコドンが同義コドンに置換されている核酸が、さらに好ましい。
【０１２７】
この態様は、特に、関連のあるプロテアーゼの異種発現に関する。このように、各生物、特に各産生株は、特定のコドン頻度を持つ。宿主細胞中のトランスジェニック核酸に位置するコドンが、比較的少数の担持ｔＲＮＡに対して逆である場合に、タンパク質生合成において障害が生じ得る。同義コドンは、一方で、同じアミノ酸をコードし、宿主によって良好に翻訳され得る。所望により必要な転写は、発現系の選択に依存する。特に、未知生物由来のサンプルを用いると培養できない場合もあり得るので、対応する調整が必要とされ得る。
【０１２８】
上記見解に対応して、本発明の核酸を天然に含有している生物細胞は、さらに保護範囲に包含され、本発明の個々の対象である。
【０１２９】
その培養によって、所望の酵素が直接利用できる。
【０１３０】
特に、それらの中の好ましいものは、本発明の第一の目的であるプロテアーゼまたはタンパク質を、天然に発現し、好ましくは分泌するそれらの細胞である。
【０１３１】
本発明のプロテアーゼは、それらの目的とする適用領域に関して直ちに試験でき、この生物の即時培養によって比較的大量に得ることができる。
【０１３２】
それらの中の好ましい細胞は、微生物、好ましくは真菌または細菌、それらの中で好ましくはグラム陽性細菌、特にBacillus属のものか、またはXanthomonas属のグラム陰性細菌である。
【０１３３】
微生物を用いて、分子生物学的技術および産生に関して、先行技術で非常に多くの実験が行われてきた。これは、特にグラム陽性バクテリを用いており、その中でBacillus属のものが最もよく知られた産生株に属する。しかし、あまり好ましくないものは、Xanthomonas属のグラム陰性細菌であり、これは現在までに細胞外ポリサッカリドのキサンタンを産生するのに使用されてきた。相同性比較についてはすでに議論され、実施例において記載されており、この属の株がさらに本発明のＨＰ７０およびＨＰ５３の好ましいプロテアーゼを天然に産生することが可能であることが明らかになった。少なくとも、密接に関連される株におけるそれらの産生は、例えば、特にそれらのコドン頻度に関係のある限り特に有利であることが判る。
【０１３４】
さらに本発明の独立した対象は、本発明の第一の対象のアルカリプロテアーゼを同定するための方法であり、この方法は、天然に密集した生育環境からの核酸の単離を基にしている。
【０１３５】
本発明によって確認されるように、新規プロテアーゼを同定するために、天然から関連のあるプロテアーゼおよび微生物を、天然から単離されることをかならずしも必要とするものではない。特にショットガンクローニング操作によって、または既知配列モチーフに対するＰＣＲプライマーによって、直接関連のある核酸を発見することができる。かかる方法は、本発明の実施例１〜３に示されている。従って、例えば、土壌サンプルの微生物叢を培養し、その培養物からＤＮＡを単離し、発現ベクターにおけるクローニングによって、プロテアーゼ発現を試験することができる。
【０１３６】
該方法のうちで、１つ、または好ましくは２つの互いに対応しているオリゴヌクレオチドを用いるのが好ましく、これらはＰＣＲプライマーとして機能でき、２つの配列の配列番号：３または６の一つから得られる。
【０１３７】
適当なプライマーを用いるＰＣＲに基づく比較可能なアプローチは、例えば、国際特許出願公開 ＷＯ０３/００２７１１ Ａ２からのα-アミラーゼの例に従う。このように、微生物を培養して、それらからＤＮＡを調製する代わりに、土壌サンプル中に含まれる核酸を直接増幅することが可能である。このためには、ＰＣＲを基にしたアプローチが適当である。この場合において、配列番号：３および６として示したヌクレオチド配列は、対応するＰＣＲプライマー設計のためのプロトタイプとして機能し得る。明細書では、独占的または特にＮ末端が、成熟タンパク質と大差ないものを含む、プライマーを自体既知の方法に従って設計することは有利である；さらに、ｄｃ変異体（実施例６）で得られた知識は、ＰＣＲによって対応する削除された後のタンパク質をコードする核酸のみがＰＣＲによって増幅されるという効果に利用される。
【０１３８】
さらに、単離核酸がクローニングされ、好ましくは発現され、特に好ましくは発現産物のプロテアーゼ活性によりプロテアーゼとして同定される方法が好ましい。
【０１３９】
通常、クローニングは、ＰＣＲが事前に行われていなくても、関連酵素の獲得によっても重要な分子生物学的ステップが開始される。発現は、核酸から得られたタンパク質の生物学的に特徴分析に役立つ。特に、プロテアーゼ活性、例えばタンパク質基質の分解による試験（比較例）が上手くいった場合、プロテアーゼを見出したことを確信でき、続く試験においてその産業的利用性に関して調べることができる。
【０１４０】
本発明のさらなる独立した対象は、前記に示した本発明の核酸領域を含有するベクターである。
【０１４１】
本発明に適切な核酸を扱うために、特に本発明のタンパク質の産生を調製するために、核酸がベクターへ適切に連結される。このようなベクターおよび関連する操作方法は、先行技術において詳細に記載されている。ベクターは、クローニングおよび発現の両方のために、非常に多くの、かつ広範囲において市販購入し得る。これらには、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージまたはウイルスから得られるベクター、または主に合成ベクターが包含される。ベクターは、例えば、グラム陰性またはグラム陽性細菌のための、酵母のための、または高等真核生物のためのベクターとして確立され得る細胞型によって識別される。それらは、例えば分子生物学的および生物化学的研究のための、関連のある遺伝子または関連するタンパク質を発現するための適当なスターティング・ポイントを構成する。
【０１４２】
実施態様において、本発明のベクターはクローニングベクターである。
【０１４３】
クローニングベクターは、貯蔵、生物学的増幅または目的とする遺伝子の選択に加えて、その分子生物学的特性分析に適当である。同時に、それらは、本願核酸の輸送可能かつ貯蔵可能な形態であり、細胞にしばられない分子生物工学技術、例えばＰＣＲまたはイン・ビトロ突然変異誘発方法についてのスターティング・ポイントでもある。
【０１４４】
本発明のベクターは、好ましくは発現ベクターである。
【０１４５】
このような発現ベクターが、対応する核酸を生物学的産生系において対応する核酸、それに加えて関連タンパク質を産生するための基礎である。本発明のこの対象の好ましい実施態様は、発現に必要な遺伝子エレメント、例えば本来その遺伝子の上流に位置する天然プロモーターまたは異なる生物由来のプロモーターを担持する発現ベクターである。これらのエレメントは、例えば「発現カセット」の形態で配置され得る。あるいは、個々のまたは全ての調節エレメントが、各宿主細胞によって利用できるように為される。特に好ましくは、発現ベクターは、さらなる特性、例えば至適複製数に関して、選択される発現系、特に宿主細胞(下記を参照されたい)と適合される。
【０１４６】
本発明の独立した対象は、組換えＤＮＡ修飾後に、前記した本発明の核酸領域の一つを含有する細胞である。
【０１４７】
これらの細胞が、本発明のタンパク質の合成のための遺伝子情報を含有する。それらの中で、上記したような天然の産生体とは異なり、自体既知の方法に従って、本発明の核酸を提供するか、またはこのような細胞から得られるような細胞である。このために、比較的容易に培養され得るおよび／または高い産生率を提供し得る宿主細胞を選択することは適切である。
【０１４８】
それらは、例えば、対応する遺伝子の増幅、突然変異誘発または転写および翻訳、そして最終的に、適切なタンパク質の生物工学的製造を可能にする。この遺伝子情報は、別々の遺伝子エレメント(即ち、細菌の場合には、プラスミド局在性)として染色体外に存在し得るか、染色体に導入され得るかいずれかである。適当な系の選択は、例えば遺伝子または生物の型および貯蔵耐性、または突然変異誘発または選択の型などの問題に依存する。例えば、バクテリオファージおよびそれらの特異的宿主細胞を基にした突然変異誘発および洗浄製品の酵素の改良のための選択方法は、従来技術において説明されている(ＷＯ ９７/０９４４６ Ａ１)。
【０１４９】
ヒトの胚幹細胞がかかる出願対象から除外することが要求される国内法を適用する各国では、本発明は対応する制限対象についてのみ請求するものである。
【０１５０】
好ましくは、上記核酸領域は、上記に示した本発明のベクター、特にクローニングまたは発現ベクターの一つに位置する。
【０１５１】
それらは、これにより本発明の実現に関連がある。
【０１５２】
さらに、それらの細胞は、本発明の第一の対象のアルカリプロテアーゼまたはタンパク質を発現する、好ましくは分泌する細胞である。
【０１５３】
タンパク質形成宿主細胞は、生物工学的製造を可能にする。タンパク質発現のための適当な宿主細胞は、基本的に全ての生物、即ち原核生物、真核生物、または藍色植物門（Cyanophyta）である。これらの宿主細胞は、遺伝子的に取扱いが容易であるのが好ましく、発現ベクターによる形質転換、その安定性確立および発現調節に関連するものであり、例えば単細胞性の真菌または細菌である。好ましい宿主細胞は、さらに、良好な微生物学的および生物工学的操作性によって区別される。これは、例えば培養容易性、高増殖速度、発酵培地に対する低要求性、および外来タンパク質に対する良好な産生および分泌速度を示す。好ましくは、発現を重視する研究室株が選択される。かかる株は、商業的に得られるか、または一般的に入手し得る株寄託機関から得られる。この方法で本発明の各タンパク質は、多くの宿主生物から理論的に得られ得る。先行技術に従って利用し得る多数の様々な系から、個々の場合に対して至適発現系が実験的に決定され得る。
【０１５４】
宿主自身がプロテアーゼに陰性である、即ち形成されたタンパク質を分解しない宿主細胞が、特に有利である。
【０１５５】
好ましい実施態様は、適当な遺伝子エレメントのゆえに、例えば化学物質の制御された添加によって、培養条件の修飾によって、または特定の細胞密度の関数として、活性を調節することができる宿主細胞である。この制御可能な発現は、目的とするタンパク質の極めて経済的な製造を可能にした；それは、例えば関係のあるベクターに対する適切なエレメントによって実現され得る。適切には、遺伝子、発現ベクターおよび宿主細胞は、例えば発現に必要な遺伝子的エレメント(リボゾーム結合部位、プロモーター、ターミネーター)またはコドン頻度に関する限り、互いに一致している。
【０１５６】
宿主細胞が細菌であることを特徴とする宿主細胞が好ましい。
【０１５７】
細菌は、短い世代時間および培養条件に対する低い要求性によって区別される。結果として安価な方法が確立できる。さらに、発酵技術における細菌を用いる実験の豊富な経験が利用できる。グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌が、個々の場合に実験的に決定すべき様々な理由、例えば栄養供給源、生成物の形成速度、所要時間などのために、特定の製造に適当であり得る。
【０１５８】
好ましい実施態様において、これらは、グラム陰性細菌、特にエシュリキア・コリ（Escherichia coli）、クレブシエラ（Klebsiella）、シュードモナス（Pseudomonas）またはザントモナス（Xanthomonas）属の細菌、より具体的にはE. coli K12、E. coli B またはKlebsiella planticola 株、および特にEscherichia coli BL21 (DE3)、E. coli RV308、E. coli DH5α、E.coli JM109、E. coli XL-1またはKlebsiella planticola (Rf) 株の誘導体である。
【０１５９】
グラム陰性細菌（例えば大腸菌など）において、多数のタンパク質はペリプラズマ空間に分泌される。これは、特定の用途にとって有利であり得る。国際出願公開 ＷＯ０１/８１５９７ Ａ１において、グラム陰性細菌が発現タンパク質を外部に放出することを達成したという方法が開示されている。好ましいこのような系は、本発明のタンパク質産生にとっても適当である。好ましいものとして、列挙したグラム陰性細菌は、一般的に容易に入手でき、市販または公的な株寄託機関によって、多数の入手し得るような他成分、例えばベクターとの相互作用における特異的な産生条件を至適化し得るものである。
【０１６０】
上記のように、ザントモナスだけではなく、シュードモナスもまたイン・ビボでＨＰ７０および／またはＨＰ５３を産生する株と予測される関係のために、有望な宿主細胞である；おそらく類似したコドン頻度を理由とするものではない。
【０１６１】
あるいは、同様に好ましい実施態様において、これらは、グラム陽性細菌である、特にバシラス、スタフィロコッカスまたはコリネバクテリウム属の一つ、具体的にはBacillus lentus、B. licheniformis、B. amyloliquefaciens、B. subtilis、B. globigii または B. alcalophilus、Staphylococcus carnosus、または Corynebacterium glutamicumである。
【０１６２】
グラム陽性細菌は、グラム陰性細菌と比較して、分泌されたタンパク質を細胞周辺の栄養培地に迅速に放出し、所望により本発明の発現タンパク質を栄養培地から直接精製され得る。さらに、それらは、工業的に重要なスブチリシンに対する最も起源的な生物と関連するかまたは同一であり、通常それらは類似のコドン頻度を有しそれ自体が同等のスブチリシンを形成するので、それらのタンパク質合成系は天然に適応している。さらなる利点は、この方法を用いて、本発明のタンパク質と、宿主細胞から内生的に形成されたスブチリシンとの混合物を得ることができるという事実であり得る。このような共発現は、国際特許出願公開 ＷＯ ９１/０２７９２から理解される。それが所望ではないときには、宿主細胞中に天然に存在するプロテアーゼ遺伝子は永久または一時的に不活性化されるべきである。
【０１６３】
宿主細胞は、真核細胞、好ましくはSaccharomyces属であるのが好ましい。
【０１６４】
これらの例は、真菌、例えば放線菌または酵母、例えばSaccharomycesまたはKluyveromycesである。好熱性真菌の発現系は、例えばＷＯ ９６/０２６５３ Ａ１に示されている。これらは、特に、温度耐性変異体の発現に適当である。真核性の系が、特にタンパク質合成に関連して行う修飾には、例えば低分子量化合物（例えば、膜アンカーまたはオリゴサッカライドなど）の結合が包含される。このタイプのオリゴサッカリド修飾は、例えばアレルギー誘発性を低下させることが望ましい。この型の細胞から天然に形成される酵素、例えばセルラーゼとの共発現も有利であり得る。
【０１６５】
本発明の独立した目的は、本発明の第一目的のアルカリプロテアーゼまたはタンパク質の産生方法である。
【０１６６】
これらには、上記した本発明のタンパク質の産生のためのあらゆる方法、例えば化学合成方法を包含する。
【０１６７】
しかし、一方で、先行技術において確立され、すでに個々の態様において上記に挙げられた全ての分子生物学的、微生物学的または生物工学的製造方法は好ましい。
【０１６８】
これらは、上記した本発明の核酸を用いて行われる方法、好ましくは上記に示したベクターを用いて実施した方法であり、特に好ましくは上記した細胞を用いて行われる方法である。
【０１６９】
上記核酸、特に配列番号：３または６として配列プロトコールに示した核酸によって、対応する好ましい遺伝子情報は、微生物学的に利用し得る形態で、即ち組換えＤＮＡ産生方法を用い得る。宿主細胞またはかかる細胞自身により特に上手く利用し得るベクターのための条件は一層好ましい。関連のある産生方法は、当業者には自体既知である。
【０１７０】
関連のある核酸配列に基づいて、イン・ビトロでタンパク質生合成を行う細胞不含の発現系も、本発明の態様であると解される。上記において既に議論されてきた全てのエレメントは、本発明のタンパク質を産生するために、新規方法と組合わされ得る。この場合、それぞれの本発明のタンパク質について、多数の方法行程の可能な組合せが考えられるので、実際の個々の場合に対する至適方法は、実験的に決定されるべきである。
【０１７１】
細胞関連方法のもとに上記してきたことに対応して、上記方法のなかで、該ヌクレオチド配列が、１つのコドン、好ましくは複数コドンにおいて、宿主株のコドン頻度に適合されているような方法が好ましい。
【０１７２】
本発明の独立した対象は、上記した本発明のアルカリプロテアーゼを含有する組成物である。
【０１７３】
それによって、上記した本発明のタンパク質の添加によって利用性が改良される組成物の全ての型、特に混合物、調製物、溶液などが、本発明の保護範囲内に包含される。これらは、例えば適用分野によって、固体混合物、例えば、凍結乾燥タンパク質またはカプセル化されたタンパク質を含む粉末、またはゲル化または液体組成物であり得る。好ましい調製物は、例えば緩衝物質、安定剤、反応パートナーおよび／またはプロテアーゼのコファクターおよび／またはプロテアーゼと相乗効果を有する他の成分を含有する。これらの中のものは、特に、後記に挙げる適用範囲のための組成物であると解すべきである。別の適用範囲は、先行技術から理解され、例えば、H. Uhlig, Wileyのマニュアル"Industrial enzyme and their applications "（New York, 1998）に記載されている。
【０１７４】
好ましい実施態様として、洗浄剤または清浄剤である組成物は、本発明のこの対象に包含されるべきである。
【０１７５】
本発明の実施例に示したように、驚くべきことに、本発明の好ましいプロテアーゼを含有する洗浄剤および清浄剤は、酵素を含まない組成物と比べて性能の増加が観察できた。
【０１７６】
本発明のこの対象には、全ての考えられる種類の清浄剤が含まれ、濃縮物および希釈されない形態で使用される製品の両方が含まれる（産業規模で洗浄機械において使用するためのもの、あるいは、手による洗浄または清浄のためのもの）。これらには、例えば、織物、カーペットまたは天然繊維のための洗浄製品が含まれ、これらに対して、本発明においては用語「洗浄剤」を使用する。これらのものは、例えば、機械食器洗浄用または手による食器洗浄用の洗浄製品、または硬表面（例えば、金属、ガラス、磁器、セラミック、タイル、石、被覆された表面、プラスチック、木材または皮革）のための洗浄製品も包含し；これらに対して、本発明においては用語「清浄製品」を使用する。
【０１７７】
本発明の実施態様には、先行技術によって確立され、そして／または本発明の洗浄剤または清浄剤の便宜的なあらゆる提供形態が包含される。これらには、例えば固体、粉末、液体、ゲル状またはペースト状組成物が包含され、また所望であれば、複数の相からなるか、圧縮されているか、または圧縮されていなくてよい；さらに、例えば押出物、顆粒、錠剤またはパウチ、大きな容器に充填されたものか小分けされたものを包含する。
【０１７８】
本発明のサブチリシン型のアルカリプロテアーゼに加えて、本発明の洗浄剤または清浄剤は、用途の範囲によって、別の成分、例えば別の酵素、酵素安定剤、界面活性剤（例えばノニオン、アニオンおよび／または両性界面活性剤）、および／または漂白剤、および／またはビルダー、ならびに所望によりさらなる一般的な成分（後記において詳細に説明する）を含有する。
【０１７９】
好ましい実施態様において、本発明の洗浄剤または清浄剤は、組成物の１ｇあたり２μg〜２０mg、好ましくは５μg〜１７.５mg、特に好ましくは２０μg〜１５mg、特に好ましくは５０μg〜１０mgの上記した本発明のスブチリシン型のアルカリプロテアーゼを含有する。これらの各々数値の間にある整数および整数でない全ての値が包含される。
【０１８０】
この型の組成物中のプロテアーゼ活性は、Tenside[Surfactants], Volume 7 (1970), pp. 125-132に記載した方法によって確かめられる。従って、それはＰＵ(プロテアーゼ単位)で示される。
【０１８１】
２つの洗浄剤の酵素の性能の比較において、例えば本発明の実施例にあるように、タンパク質同一と活性同一の使用との間に区別が為されるべきである。特に、別の活性をほとんど含まない組換え的に得られる調製物の場合に、タンパク質同一使用は適切である。そうすれば、同じタンパク質量が−発酵の産生収率の尺度として−同程度の結果をもたらすかどうかについての説明が可能である。全タンパク質に対する活性物質の各比率（比活性値）が異なる場合、これにより各酵素的活性が比較されるため、活性同一比較を推奨する。一般的には、低い比活性が比較的大量のタンパク質を添加することで補償され得るということがあてはまる。これは結局のところ、経済的問題である。
【０１８２】
ここで、洗浄剤および清浄剤に慣例的で重要な成分に関する網羅的でない集合は次のとおりである。各々の目的に適当なさらなる成分が代用としてまたは補助的に添加され得る。
【０１８３】
ノニオン界面活性剤は、好ましくはアルコキシル化、有利にはエトキシル化された、特に８−１８個のＣ原子およびアルコール１ molあたり平均１〜１２ molのエチレンオキシド(ＥＯ)を有する第一級アルコールが用いられ、このアルコール成分は、直線であるか、または好ましくは２位でメチル分枝していてよく、またはオキソアルコール残基に一般に存在する混合物中の直鎖残基およびメチル分岐残基を含有していてよい。しかし、１２〜１８個の炭素原子を有する天然由来のアルコール、例えば、ココヤシ油、パーム核油、獣脂またはオレイルアルコールの直鎖残基、およびアルコール１モルにつき平均２〜８ＥＯを有するアルコールエトキシレートが特に好ましい。好ましいエトキシル化アルコールは、例えば、３ＥＯまたは４ＥＯを有するＣ12-14アルコール、７ＥＯを有するＣ9-11アルコール、３ＥＯ、５ＥＯ、７ＥＯまたは８ＥＯを有するＣ13-15アルコール、３ＥＯ、５ＥＯまたは７ＥＯを有するＣ12-18アルコール、およびそれらの混合物、例えば３ＥＯ有するＣ12-14アルコールおよび５ＥＯを有するＣ12-18アルコールの混合物を包含する。記載したエトキシル化度は統計的平均値を表し、特定の産物に関しては、整数または分数になりうる。好ましいアルコールエトキシレートは、狭い同族体分布を有する（狭範囲エトキシレート、ＮＲＥ）。これらのノニオン界面活性剤に加えて、１２ＥＯより大きな脂肪アルコールも使用可能である。これらの例は、１４ＥＯ、２５ＥＯ、３０ＥＯまたは４０ＥＯを有する獣脂脂肪アルコールである。
【０１８４】
単独ノニオン界面活性剤としてまたは他のノニオン界面活性剤と組み合わせて使用しうる他の種類の好ましいノニオン界面活性剤は、アルコキシル化、好ましくはエトキシル化またはエトキシル化およびプロポキシル化した、アルキル鎖に好ましくは１〜４個の炭素原子を含有する脂肪酸アルキルエステル、特に脂肪酸メチルエステルである。
【０１８５】
有利に使用できる他の型のノニオン界面活性剤は、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）である。使用し得るアルキルポリグリコシドは一般式ＲＯ（Ｇ）Ｚで表され、式中、Ｒは、８〜２２個、好ましくは１２〜１８個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖、特に２位でメチル分岐した飽和または不飽和脂肪族基であり、Ｇは、５または６個の炭素原子を有するグリコース単位、好ましくはグルコースを表す記号である。グリコシル化度ｚは、ここでは１.０〜４.０、好ましくは１.０〜２.０、特に１.１〜１.４である。直鎖アルキルポリグルコシド、即ちアルキルポリグリコシドであって、ここでポリグリコシル基はグルコース基であり、アルキル基はｎ−アルキル基である、直鎖アルキルポリグルコシドを使用するのが好ましい。
【０１８６】
アミンオキシド型、例えばＮ−ココヤシ油アルキル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミンオキシドおよびＮ−獣脂アルキル−Ｎ,Ｎ−ジヒドロキシエチルアミンオキシド、ならびに脂肪酸アルカノールアミド型のノニオン界面活性剤も適当である。これらノニオン界面活性剤の含量は、エトキシル化脂肪アルコールが使用される量より少ないのが好ましく、その量の半分以下であるのが特に好ましい。
【０１８７】
他の好適な界面活性剤は、式(ＩＩ)で示されるポリヒドロキシ脂肪酸アミドである：
【化１】
2007533312.tif 000002
［式中、ＲＣＯは、６〜２２個の炭素原子を有する脂肪族アシル基であり；Ｒ１は、水素、１〜４個の炭素原子を有するアルキルまたはヒドロキシアルキル基であり；そして[Ｚ]は、３〜１０個の炭素原子および３〜１０個のヒドロキシル基を有する直鎖または分岐鎖ポリヒドロキシアルキル基である］。ポリヒドロキシ脂肪酸アミドは、アンモニア、アルキルアミンまたはアルカノールアミンでの還元糖の還元アミノ化、次に、脂肪酸、脂肪酸アルキルエステルまたは脂肪酸塩化物でのアシル化によって通常得られ得る既知の物質である。
【０１８８】
ポリヒドロキシ脂肪酸アミドを含む群は、式（ＩＩＩ）の化合物を包含する：
【化２】
2007533312.tif 000003
［式中、
Ｒは、７〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニル基であり、Ｒ１は、２〜８個の炭素原子を有する直鎖、分岐鎖または環状アルキル基またはアリール基であり、Ｒ２は、１〜８個の炭素原子を有する直鎖、分岐鎖または環状アルキル基またはアリール基またはオキシアルキル基であり、Ｃ1−4アルキルまたはフェニル基が好ましく、［Ｚ］は、そのアルキル鎖が少なくとも２個のヒドロキシル基で置換された直鎖ポリヒドロキシアルキル基、またはアルコキシル化、好ましくはエトキシル化またはプロポキシル化されたその基の誘導体である］。
【０１８９】
［Ｚ］は、還元糖、例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、マンノースまたはキシロースの還元アミノ化によって得るのが好ましい。Ｎ−アルコキシ−またはＮ−アリールオキシ−置換化合物を、触媒としてのアルコキシドの存在下に、脂肪酸メチルエステルと反応させることによって、所望のポリヒドロキシ脂肪酸アミドに変換しうる。
【０１９０】
使用されるアニオン界面活性剤は、例えば、スルホネートおよびスルフェート型のものである。可能なスルホネート型界面活性剤は、好ましくは、Ｃ9-13アルキルベンゼンスルホネート、オレフィンスルホネート、即ちアルケンおよびヒドロキシアルカンスルホネートの混合物、ならびに例えば末端または内部二重結合を有するＣ12-18モノオレフィンから、気体状三酸化硫黄でのスルホン化、次いでスルホン化生成物のアルカリまたは酸加水分解によって得られるものである。また、適当なものは、Ｃ12-18アルカンから、例えば、スルホ塩素化またはスルホキシド化、次に加水分解または中和によって得られるアルカンスルホネートである。同様に、α−スルホ脂肪酸のエステル（エステルスルホネート）、例えば、水素化ココヤシ油、パーム核油または獣脂脂肪酸のα−スルホン化メチルエステルも同様に適当である。
【０１９１】
他の適当なアニオン界面活性剤は、スルホン化脂肪酸グリセロールエステルである。「脂肪酸グリセロールエステル」とは、１〜３モルの脂肪酸を有するモノグリセロールのエステル化によって、または０.３〜２モルのグリセロールを有するトリグリセリドのエステル交換による調製において得られるモノエステル、ジエステルおよびトリエステルならびにそれらの混合物を意味すると解される。好ましいスルホン化脂肪酸グリセロールエステルは、６〜２２個の炭素原子を有する飽和脂肪酸、例えば、カプリン酸、カプリル酸、カプロン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸またはベヘン酸のスルホン化生成物である。
【０１９２】
好ましいアルキル（アルケニル）スルフェートは、アルカリ金属塩、特に、Ｃ12-18脂肪アルコール、例えば、ココ脂肪アルコール、獣脂脂肪アルコール、ラウリル、ミリスチル、セチルまたはステアリルアルコールまたはＣ10−20オキソアルコールの硫酸セミエステルの、およびこれらの鎖長の第二級アルコールのそれらのセミエステルのナトリウム塩である。さらに、好ましいものは、石油化学原料に対して製造される合成直鎖アルキル鎖を含有し、油脂化学原料に基づく十分な化合物と同様の分解挙動を示す、上記鎖長を有するアルキル（アルケニル）スルフェートである。洗浄技術の目的から、Ｃ12-16アルキルスルフェート、Ｃ12-15アルキルスルフェートおよびＣ14-15アルキルスルフェートは好ましい。２,３−アルキルスルフェートもまた適当なアニオン界面活性剤である。
【０１９３】
１〜６モルのエチレンオキシドでエトキシル化した直鎖または分岐鎖Ｃ7-21アルコール、例えば、平均３.５モルのエチレンオキシド（ＥＯ）を含有する２−メチル−分岐Ｃ9-11アルコール、または１〜４ＥＯを有するＣ12-18脂肪アルコールの、硫酸モノエステルも好適である。それらの高発泡特性のために、それらは比較的少量、例えば１〜５重量％の量で清浄剤に使用される。
【０１９４】
他の好適なアニオン界面活性剤は、アルキルスルホコハク酸の塩であり、これはスルホスクシネートまたはスルホコハク酸エステルともいわれ、そしてスルホコハク酸と、アルコール、好ましくは脂肪アルコール、特にエトキシル化脂肪アルコールとのモノエステルおよび／またはジエステルを示す。好ましいスルホスクシネートは、Ｃ8-18脂肪アルコール残基またはそれらの混合物を含有する。特に好ましいスルホスクシネートは、それ自体代表的なノニオン界面活性剤と考えられるエトキシル化脂肪アルコールから得られる脂肪アルコール基を含有する（説明については上記参照）。スルホスクシネートの中で、その脂肪アルコール酸基が、狭い範囲の同族体分布を有するエトキシル化した脂肪アルコールから得られたものが、特に好ましい。同様に、アルキル（アルケニル）鎖において好ましくは８〜１８個の炭素原子を有するアルキル（アルケニル）コハク酸またはその塩も使用できる。
【０１９５】
他の可能なアニオン界面活性剤は、特に石鹸である。飽和脂肪酸石鹸、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、水素化エルカ酸およびベヘン酸の塩であって、および特に天然脂肪酸、例えば、ココヤシ油、パーム核油または獣脂脂肪酸から誘導された石鹸混合物が好適である。
【０１９６】
石鹸を包含するアニオン界面活性剤は、そのナトリウム、カリウムまたはアンモニウム塩の形態において、およびモノ−、ジ−またはトリエタノールアミンのような有機塩基の可溶性塩として存在しうる。好ましくは、アニオン界面活性剤はそのナトリウムまたはカリウム塩の形態、特にそのナトリウム塩の形態で存在する。
【０１９７】
該界面活性剤は、完成製品を基準に合計含有量、好ましくは５重量％〜５０重量％、特に８重量％〜３０重量％として、本発明の清浄剤または洗浄剤中に含有され得る。
【０１９８】
本発明の洗浄剤または清浄剤は、漂白剤を含有し得る。水中でＨ2Ｏ2を生じる漂白剤として作用する化合物の中で、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム四水和物および過ホウ酸ナトリウム一水和物が特に重要である。他の使用し得る漂白剤は、例えば、ペルオキソピロリン酸塩、クエン酸塩過水和物およびＨ2Ｏ2生成過酸塩または過酸(例えば、過硫酸塩または過硫酸)である。使用し得るものは、式：Ｈ2Ｎ-ＣＯ-ＮＨ2・Ｈ2Ｏ2で示される尿素ペルオキソ水和物ペルカルバミドである。特に、硬表面を洗浄するために組成物を用いる場合、例えば機械による食器洗浄において使用する場合、所望により、有機漂白剤の群からの漂白剤を含むこともできるが、それらの使用は、原則的に織物を洗浄するための製剤においても可能である。一般的な有機漂白剤は、過酸化ジアシル、例えば過酸化ジベンゾイルである。さらなる一般的な有機漂白剤はペルオキシ酸であり、例としてアルキルペルオキシ酸およびアリールペルオキシ酸が特に挙げられる。好ましい代表例は、ペルオキシ安息香酸およびその環置換誘導体、例えばアルキルペルオキシ安息香酸であるが、ペルオキシ−α−ナフトエ酸およびモノペルフタル酸マグネシウム、脂肪族または置換脂肪族のペルオキシ酸、例えばペルオキシラウリン酸、ペルオキシステアリン酸、ε−フタルイミドペルオキシカプロン酸［フタルイミドペルオキシヘキサン酸（ＰＡＰ）］、ｏ−カルボキシベンズアミドペルオキシカプロン酸、Ｎ−ノネニルアミドペルアジピン酸、およびＮ−ノネニルアミドペルコハク酸、ならびに脂肪族およびアリール脂肪族ペルオキシジカルボン酸、例えば、１,１２−ジペルオキシカルボン酸、１,９−ジペルオキシアゼライン酸、ジペルオキシセバシン酸、ジペルオキシブラシル酸、ジペルオキシフタル酸、２−デシルジペルオキシブタン−１,４−二酸、Ｎ,Ｎ−テレフタロイル−ジ（６−アミノペルカプロン酸）を用いることができる。
【０１９９】
洗浄剤または清浄剤の漂白剤含量は、有利には過ホウ酸塩一水和物または過炭酸塩を用いて、１〜４０重量％、特に１０〜２０重量％であり得る。
【０２００】
６０℃以下の温度で洗浄する場合に、特に洗浄の前処理の場合に、改善された漂白作用を達成するために、本組成物は漂白活性化剤を含んでいてもよい。使用される漂白活性化剤は、過加水分解条件下において、好ましくは１〜１０個の炭素原子、特に２〜４個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキソカルボン酸および／または所望により置換されていてもよい過安息香酸を与える化合物であり得る。好適な物質は、上記の炭素原子数および／または所望により置換されていてもよいベンゾイル基を有するＯ−およびＮ−アシル基を有する物質である。ポリアシル化アルキレンジアミンが好ましく、特にテトラアセチルエチレンジアミン(ＴＡＥＤ)、アシル化トリアジン誘導体、特に１,５-ジアセチル-２,４-ジオキソヘキサヒドロ-１,３,５-トリアジン(ＤＡＤＨＴ)、アシル化グリコールウリル類、特に１,３,４,６-テトラアセチルグリコールウリル(ＴＡＧＵ)、Ｎ-アシルイミド類、特にＮ-ノナノイルスクシンイミド(ＮＯＳＩ)、アシル化フェノールスルホネート、特にｎ-ノナノイルオキシベンゼンスルホネートもしくはイソノナノイルオキシベンゼンスルホネート(ｎ-ＮＯＢＳもしくはイソ-ＮＯＢＳ)、アシル化ヒドロキシカルボン酸、例えばトリエチル Ｏ-アセチルシトレート(ＴＥＯＣ)、カルボン酸無水物、特に無水フタル酸、無水イサトイン酸および／または無水コハク酸、カルボキサミド、例えばＮ-メチルジアセトアミド、グリコリド、アシル化多価アルコール、特にトリアセチン、エチレングリコールジアセテート、イソプロペニルアセテート、２,５-ジアセトキシ-２,５-ジヒドロフラン、およびエノールエステル[ドイツ特許出願 ＤＥ１９６１６６９３およびＤＥ１９６１６７６７から知られる]、ならびにアセチル化ソルビトールおよびマンニトール、またはそれらの混合物［欧州特許出願  ＥＰ０５２５２３９(ＳＯＲＭＡＮ)に記載される]、アシル化糖誘導体、特にペンタアセチルグルコース(ＰＡＧ)、ペンタアセチルフルクトース、テトラアセチルキシロースおよびオクタアセチルラクトース、ならびに、アシル化され所望によりＮ-アルキル化されたグルカミンまたはグルコノラクトン、トリアゾールもしくはトリアゾール誘導体、および／または特にカプロラクタムおよび／またはカプロラクタム誘導体、好ましくはＮ-アシル化ラクタム、例えばＮ-ベンゾイルカプロラクタムおよびＮ-アセチルカプロラクタム(国際特許出願公開 ＷＯ ９４／２７９７０、ＷＯ ９４／２８１０２、ＷＯ ９４／２８１０３、ＷＯ ９５／００６２６、ＷＯ ９５／１４７５９、およびＷＯ ９５／１７４９８から知られる)である。ドイツ特許出願 ＤＥ １９６ １６ ７６９から既知の親水性置換されたアシルアセタールおよびドイツ特許出願 ＤＥ １９６ １６ ７７０および国際特許出願公開 ＷＯ ９５/１４０７５に記載のアシルラクタムも、同様に使用されるのが好ましい。ドイツ特許出願 ＤＥ ４４ ４３ １７７から既知の従来の漂白活性化剤の組合せも使用することができる。同様にニトリル誘導体、例えばシアノピリジン、ニトリルクワット、例えばＮ−アルキルアンモニウムアセトニトリル、および／またはシアノアミド誘導体も使用される。好ましい漂白活性化剤は、４-(オクタノイルオキシ)ベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｎ−ノナ��イルまたはイソノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ｎ−およびイソ-ＮＯＢＳ)、ウンデセノイルオキシベンゼンスルホネート(ＵＤＯＢＳ)、ドデカノイルオキシベンゼンスルホネート酸ナトリウム(ＤＯＢＳ)、デカノイルオキシ安息香酸(ＤＯＢＡ，ＯＢＣ １０)および／またはドデカノイルオキシベンゼンスルホネート(ＯＢＳ １２)、ならびに、Ｎ−メチルモルホリニウムアセトニトリル(ＭＭＡ)である。このような漂白活性化剤は、全組成物を基準に、通常は０．０１〜２０重量％、好ましくは０.１〜１５ 重量％、特に１重量％〜１０ 重量％の範囲の量で存在し得る。
【０２０１】
従来の漂白活性化剤に加えて、またはそれらの代わりに、「漂白触媒」が存在することもできる。これらの物質は、漂白増強遷移金属塩または遷移金属錯体、例えば、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、ＲｕまたはＭｏサレン錯体またはカルボニル錯体である。窒素含有三脚リガンドを有するＭｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｍｏ、Ｔｉ、ＶおよびＣｕ錯体、ならびにＣｏ、Ｆｅ、ＣｕおよびＲｕアミン錯体もまた漂白触媒として好適であり、ドイツ特許出願ＤＥ １９７０９２８４ Ａ１に記載の化合物を使用するのが好ましい
【０２０２】
本発明の洗浄剤または清浄剤は、一般的に１以上のビルダー、特にゼオライト、ケイ酸塩、炭酸塩、有機コビルダーを含有し、またその使用に反対する環境的な理由がなければ、リン酸塩も含有しうる。後者は、好ましい様式で、特に機械食器洗浄用の清浄剤に使用に好ましいビルダーである。
【０２０３】
一般式：ＮａＭＳｉｘＯ２ｘ＋１・ｙＨ２Ｏ［式中、Ｍはナトリウムまたは水素であり、ｘは１．６〜４、好ましくは１.９〜４．０の数値であり、ｙは０〜２０の数値であり、好ましいｘの数値は２、３または４である］の結晶性層状ケイ酸ナトリウムがここで説明され得る。この種の結晶性層状ケイ酸塩が、例えば欧州特許出願 ＥＰ １６４５１４に記載されている。好ましい上記一般式の結晶性層状ケイ酸塩は、式中、Ｍがナトリウムであり、ｘが２または３の数値である。特に、β−およびδ−ナトリウムジシリケート両方のＮａ2Ｓｉ2Ｏ5・ｙＨ2Ｏが好ましい。この種の化合物は、例えば、ＳＫＳ（登録商標）(Clariant)の名称で販売されている。即ち、ＳＫＳ−６（登録商標）は、主に式：Ｎａ２Ｓｉ２Ｏ５・ｙＨ２Ｏを有するδ−ナトリウムジシリケートであり、ＳＫＳ-７（登録商標）は、主にβ−ナトリウムジシリケートである。酸(例えばクエン酸または炭酸)とδ−ナトリウムジシリケートとの反応から、各々ＳＫＳ−９（登録商標）の名称およびＳＫＳ−１０（登録商標）の名称で市販購入し得る、カナマイト(ＮaＨＳｉ2Ｏ5・ｙＨ2Ｏ)が得られる。これらの層状ケイ酸塩の化学修飾体を使用するのが有利であることもある。例えば、層状ケイ酸塩のアルカリ度が、適切に影響を与えることができる。δ-ナトリウムジシリケートと比較して、リン酸塩または炭酸塩を用いてドープ処理された層状ケイ酸塩は、変化した結晶形態を有し、より迅速に溶解し、高いカルシウム結合能を示す。一般的実験式：ｘＮａ２Ｏ・ｙＳｉＯ２・ｚＰ２Ｏ５（ここで、ｘ対ｙの比は０.３５〜０.６の数に対応する、ｘ対ｚの比は１.７５〜１２００の数に対応し、ｙからｚの比は４〜２８００の数に対応する］で示される層状ケイ酸塩は、例えばドイツ特許出願 ＤＥ １９６ ０１ ０６３に記載されている。層状ケイ酸塩の溶解性を、特に微細に分割された層状ケイ酸塩を用いることによって増大させることもできる。結晶性層状ケイ酸塩と他の成分との化合物も使用され得る。崩壊作用に関して利点を示し、特に洗浄錠剤において使用されるセルロース誘導体との化合物、特に洗浄錠剤、クエン酸などのポリカルボキシレート、ならびにポリカルボキシレート(例えばクエン酸)またはポリマー性ポリカルボキシレート(例えばアクリル酸コポリマー)との化合物が挙げられ得る。
【０２０４】
用い得るものは、Ｎａ２Ｏ：ＳｉＯ２のモジュラスが１：２〜１：３.３、好ましくは１：２〜１：２.８、特に１：２から１：２.６を有する無定形ケイ酸ナトリウムであって、遅延溶解および二次洗浄特性を有する。従来の無定形ケイ酸ナトリウムと比較した場合の溶解遅延は、種々の方法において、例えば、表面処理、コンパウンド化、圧密/圧縮によって、または過剰乾燥によって得ることができる。本発明の範囲において、用語「無定形」とは、「Ｘ線無定形」を意味すると考えられる。このことは、Ｘ線回折実験において、ケイ酸塩は、結晶性物質に典型的な鋭いＸ線屈折を生じないが、代わりに、せいぜいこれら散乱Ｘ線の１またはそれ以上の最大値(数度単位の回折角度の幅を有する)を与えることを意味する。しかし、特に良好なビルダー特性は、電子回折実験において、ケイ酸塩粒子が、十分に規定されないかまたは鋭い回折最大値を与える場合であっても、容易に得られるであろう。これは、製品が、１０ｎｍ〜数百ｎｍの大きさの微晶質領域、多くて５０ｎｍまで、特にせいぜい２０ｎｍまでの領域を有するというような意味に解釈され得る。圧縮／圧密された無定形ケイ酸塩、コンパウンド化された無定形ケイ酸塩、および過剰乾燥されたＸ線無定形ケイ酸塩が特に好ましい。
【０２０５】
微細結晶性の結合水含有の合成ゼオライト(適切な場合に使用することができる)は、好ましくはゼオライトＡおよび／またはＰである。ゼオライトＰとしては、ゼオライトＭＡＰ（登録商標）(Crosfieldからの市販製品)が特に好ましい。しかし、ゼオライトＸならびにＡ、Ｘおよび／またはＰの混合物も好ましい。市販されており、かつ本発明の範囲内で好ましく使用しうる製品は、例えば、ゼオライトＸおよびゼオライトＡの共結晶化物(ゼオライトＸが約８０重量％)であり、これは、CONDEA Augusta S.p.A.から商品名VEGOBOND AX（登録商標）として販売されており、下記の式で示される：
ｎＮａ２Ｏ・(１-ｎ)Ｋ２Ｏ・Ａｌ２Ｏ３・(２-２.５)ＳｉＯ２・(３.５-５.５)Ｈ２Ｏ
好適なゼオライトは、平均粒度１０μm未満（容量分布、コールターカウンター法によって測定）を有し、好ましくは１８〜２２重量％、より好ましくは２０〜２２重量％の結合水を含有する。
【０２０６】
もちろん、ビルダー物質として広く知られているリン酸塩の使用は、このような使用が環境的な理由から回避されるべきでなければ可能である。多様な市販のリン酸塩の中で、洗浄剤および清浄剤業界では、アルカリ金属リン酸塩が最も重要であり、三リン酸五ナトリウムまたは三リン酸五カリウム(トリポリリン酸ナトリウムまたはカリウム)が特に好ましい。
【０２０７】
「アルカリ金属リン酸塩」は、種々のリン酸のアルカリ金属塩(特に、ナトリウム塩およびカリウム塩)の総称的な用語であり、メタリン酸(ＨＰＯ３)ｎとオルトリン酸Ｈ３ＰＯ４と、さらに高分子量のものとの間を区別することができる。これらリン酸塩は、いくつかの利点を兼ね備える：これらは、アルカリ担体として働き、機械部品上の石灰分の沈着および織布における石灰分の付着を妨ぎ、そしてさらに清浄性能に寄与する。
【０２０８】
リン酸二水素ナトリウム、ＮａＨ２ＰＯ４は、二水和物(密度１.９１ｇ／ｃｍ３、融点６０℃)および一水和物(密度２.０４ｇ／ｃｍ３)として存在する。両方の塩とも白色粉末であり、水に極めて容易に溶解し、加熱によってその結晶水を失い、２００℃で弱い酸性の二リン酸(二リン酸水素二ナトリウムＮａ２Ｈ２Ｐ２Ｏ７)に転化し、高温で三メタリン酸ナトリウム(Ｎａ３Ｐ３Ｏ９)およびMaddrellの塩(以下を参照)に転化する。ＮａＨ２ＰＯ４は酸性の反応を示す；それは、リン酸が水酸化ナトリウム溶液でｐＨ４.５に調整され、このドロ状物（mash）を噴霧乾燥した時に形成される。リン酸二水素カリウム(第一または一塩基性のリン酸カリウム、二リン酸カリウム、ＫＤＰ)ＫＨ２ＰＯ４は、密度２.３３ｇ／ｃｍ３の白色塩であり、２５３℃の融点を有し[ポリリン酸カリウム(ＫＰＯ３)Ｘの形成を伴って分解]、そして水中で容易に溶解する。
【０２０９】
リン酸水素二ナトリウム(第二リン酸ナトリウム)、Ｎａ２ＨＰＯ４は、無色結晶性の塩であり、水に極めて容易に溶解する。これは、無水型で、ならびに、２モルの水(密度２.０６６ｇ／ｃｍ３、９５゜で水を損失)、７モルの水(密度１.６８ｇ／ｃｍ３、融点４８゜、５Ｈ２Ｏの損失を伴う)、および１２モルの水(密度１.５２ｇ／ｃｍ３、融点３５゜、５Ｈ２Ｏの損失を伴う)と共に存在し、１００℃で無水になり、比較的強い加熱によって二リン酸塩Ｎａ４Ｐ２Ｏ７に転化する。リン酸水素二ナトリウムは、指示薬としてフェノールフタレインを用いて、炭酸ナトリウム溶液によってリン酸を中和することで調製される。リン酸水素二カリウム(第二または二塩基性のリン酸カリウム)、Ｋ２ＨＰＯ４は、無定形の白色塩であり、水に容易に溶解する。
【０２１０】
リン酸三ナトリウム（第三リン酸ナトリウム）、Ｎａ３ＰＯ４は、無色の結晶であり、これは１２水和物型では、１.６２ｇ／ｃｍ３の密度、および７３〜７６℃の融点(分解)を有し、１０水和物型(１９〜２０％Ｐ２Ｏ５に対応する)では、１００℃の融点を有し、無水型(３９〜４０％Ｐ２Ｏ５に対応する)では、２.５３６ｇ／ｃｍ３の密度を有する。リン酸三ナトリウムは、アルカリ性反応を伴って水に容易に溶解し、正確に１モルのリン酸二ナトリウムおよび１モルのＮａＯＨの溶液を蒸発させることによって調製される。リン酸三カリウム(第三または三塩基性のリン酸カリウム)、Ｋ３ＰＯ４は、白色であり、密度２.５６ｇ／ｃｍ３の潮解性の顆粒粉末であり、１３４０゜の融点を有し、アルカリ性反応を伴って水に容易に溶解する。これは、例えば、トーマススラグを炭素および硫酸カリウムと加熱したときに生成する。価格が高いにもかかわらず、より容易な溶解性であり、そのため高活性なリン酸カリウムは、洗浄剤産業においては、対応するナトリウム化合物よりも好ましいことが多い。
【０２１１】
二リン酸四ナトリウム(ピロリン酸ナトリウム)、Ｎａ４Ｐ２Ｏ７は、無水型(密度２.５３４ｇ／ｃｍ３、融点９８８℃、また８８０℃としても表示される)で、１０水和物(密度１.８１５〜１.８３６ｇ／ｃｍ３、融点９４℃、水の損失を伴って)としても存在する。両物質とも無色の結晶であり、アルカリ性反応を伴って水に溶解する。Ｎａ４Ｐ２Ｏ７は、リン酸二ナトリウムを、＞２００℃に加熱したときに形成するか、またはリン酸と炭酸ナトリウムを化学量論比で反応させ、この溶液を噴霧により脱水することによって形成する。この１０水和物は、重金属塩および硬度成分を錯化し、これにより水の硬度を低下させる。二リン酸カリウム(ピロリン酸カリウム)、Ｋ４Ｐ２Ｏ７は、三水和物型で存在しており、無色の密度２.３３ｇ／ｃｍ３の吸湿性粉末であり、水に可溶性であり、２５゜で１％濃度の溶液のｐＨが１０.４である。
【０２１２】
ＮａＨ２ＰＯ４またはＫＨ２ＰＯ４の縮合によって、それぞれ、高分子量のリン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムが形成する。これらの中で、環状の代表物（メタリン酸ナトリウムおよびメタリン酸カリウム）と、鎖状型物（ポリリン酸ナトリウムおよびポリリン酸カリウム）とは、区別することができる。特に後者については、多様な名称が用いられている：溶融リン酸塩または可焼リン酸塩、グラハムの塩、クロールの塩およびマドレールの塩)。全ての高級リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムは、「縮合」リン酸塩と総称される。
【０２１３】
工業的に重要な三リン酸五ナトリウム（Ｎａ５Ｐ３Ｏ10；トリポリリン酸ナトリウム)は、非吸湿性の白色の水溶性塩であり、これは無水または６Ｈ２Ｏを有する結晶化物であり、一般式：ＮａＯ-[Ｐ(Ｏ)(ＯＮａ)-Ｏ]ｎ-Ｎａ(ここでｎ＝３)の塩である。１００ｇの水中で、結晶水を含まない約１７ｇの塩が室温で溶解し、６０℃で約２０ｇが溶解し、１００゜で約３２ｇが溶解する。この溶液を１００℃で２時間加熱すると、約８％のオルトリン酸塩および１５％の二リン酸塩が加水分解により生成する。三リン酸五ナトリウムの製造の際には、リン酸を、炭酸ナトリウム溶液または水酸化ナトリウム溶液と化学量論比で反応させ、この溶液を噴霧によって脱水する。グラハムの塩および二リン酸ナトリウムと同様に、三リン酸五ナトリウムは、多くの不溶性の金属化合物(石灰石鹸などを含む)を溶解する。三リン酸五カリウム、Ｋ５Ｐ３Ｏ１０(トリポリリン酸カリウム)は、例えば、５０重量％濃度の溶液(＞２３％Ｐ２Ｏ５、２５％Ｋ２Ｏ)の形態で市販されている。ポリリン酸カリウムは、洗浄剤および清浄剤の産業において広範に使用されている。さらに、本発明の範囲内で同様に使用しうるトリポリリン酸ナトリウムカリウムも存在する。これらは、例えばトリメタリン酸ナトリウムをＫＯＨで加水分解したときに、以下のように生成する：
(ＮａＰＯ３）３＋２ＫＯＨ→Ｎａ３Ｋ２Ｐ３Ｏ１０＋Ｈ２Ｏ
【０２１４】
本発明によれば、これらを、トリポリリン酸ナトリウム、トリポリリン酸カリウム、またはこれら２つの混合物と全く同様に使用することができる：トリポリリン酸ナトリウムおよびトリポリリン酸ナトリウムカリウムの混合物、またはトリポリリン酸カリウムおよびトリポリリン酸ナトリウムカリウムの混合物、またはトリポリリン酸ナトリウムおよびトリポリリン酸カリウムおよびトリポリリン酸ナトリウムカリウムの混合物を、本発明に従って使用することもできる。
【０２１５】
本発明の洗浄剤および清浄剤において使用し得る有機コビルダーは、特にポリカルボキシレートまたはポリカルボン酸、ポリマー性ポリカルボキシレート、ポリアスパラギン酸、ポリアセタール、所望により酸化されたデキストリン、さらなる有機コビルダー(以下を参照)、およびホスホネートは、有機補助ビルダーである。これらの物質群を以下に説明する。
【０２１６】
使用しうる有機ビルダー物質は、例えば、それらナトリウム塩の形態で使用しうるポリカルボン酸であり、用語「ポリカルボン酸」とは、１を越える酸機能を保持するカルボン酸を意味するものと解される。例えば、このような使用が環境上の理由から回避されるべきでない限り、これらはクエン酸、アジピン酸、コハク酸、グルタル酸、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、糖酸、アミノカルボン酸、ニトリロ三酢酸(ＮＴＡ)、およびこれらの混合物である。好ましい塩は、クエン酸、アジピン酸、コハク酸、グルタル酸、酒石酸、糖酸、およびこれらの混合物などのポリカルボン酸の塩である。
【０２１７】
酸自体を使用することもできる。酸は、そのビルダー作用に加えて酸性化成分の特性をも有するのが普通であり、これにより、他成分との混合物に起因するｐＨが望ましくない場合に、洗浄剤または清浄剤に関する比較的低いｐＨおよび中程度のｐＨを調整するために作用する。特に、系に適合し、環境的に適合し得る酸を、ここで具体的に挙げると、例えば、クエン酸、酢酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、グリコール酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、グルコン酸、およびこれらのあらゆる所望の混合物であり得る。しかし、無機酸、特に硫酸、または塩基、特にアンモニウム、またはアルカリ金属の水酸化物も、ｐＨ調整剤として働くことができる。このような調整剤を、好ましくは２０重量％以下、特に１.２〜１７重量％の量で本発明の組成物に含有することができる。
【０２１８】
ビルダーとして、さらなるポリマー性ポリカルボキシレートは好適である；これらには、ポリアクル酸またはポリメタクリル酸のアルカリ金属塩、例えば５００〜７００００g／molの相対分子量を有するものである。
【０２１９】
本明細書の意味において、ポリマー性ポリカルボキシレートに対して付与される分子量は、特定の酸形態の重量平均分子量Ｍｗであり、それは基本的にＵＶ検出器を使用してゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定された。測定は、試験ポリマーとその構造的関係性から実際の分子量を提供する外部ポリアクリル酸標準に対して行った。これらのデータは、標準としてポリスチレンスルホン酸を使用したデータとはかなり異なる。通常、ポリスチレンスルホン酸に対して測定した分子量は、本明細書に記載した分子量よりかなり高い。
【０２２０】
好適なポリマーは、特に、好ましくは分子量２０００〜２００００g／molを有するポリアクリレートである。優れた溶解性のゆえに、この群において好ましいのは、短鎖ポリアクリレートであり、これは、２０００〜１００００ｇ／モル、特に好ましくは３０００〜５０００ｇ／モルの分子量を有する。
【０２２１】
さらなる好適なものは、コポリマー性ポリカルボキシレートであり、その中で特に、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、およびアクリル酸またはメタクリル酸とマレイン酸とのコポリマーある。アクリル酸とマレイン酸とのコポリマーは特に適することがわかり、これは５０〜９０重量％のアクリル酸および５０〜１０重量％のマレイン酸を含む。これらの相対分子量は、遊離酸に基づいて、一般に２０００〜７００００ｇ／モル、好ましくは２００００〜５００００ｇ／モル、特に３００００〜４００００ｇ／モルの範囲内である。(コ)ポリマー性ポリカルボキシレートは、粉末または水溶液の形態で使用することができる。組成物中の(コ)ポリマー性ポリカルボキシレート含量は、好ましくは０.５〜２０重量％、特に１〜１０重量％であってよい。
【０２２２】
水中での溶解性を改善するため、ポリマーは、アリルスルホン酸、例えばアリルオキシベンゼンスルホン酸およびメタアリルスルホン酸もモノマーとして含有しうる。
【０２２３】
特に、好ましいポリマーは、２を超える異なるモノマー単位の生分解性ポリマー、例えば、モノマーとしてアクリル酸およびマレイン酸の塩ならびにビニルアルコールもしくはビニルアルコール誘導体を含むポリマー、あるいは、アクリル酸および２-アルキルアリルスルホン酸の塩および糖誘導体をモノマーとして含有するポリマーである。
【０２２４】
他の好ましいコポリマーは、好ましくはアクロレインおよびアクリル酸／アクリル酸塩、またはアクロレインおよび酢酸ビニルを、モノマーとして含有するコポリマーである。
【０２２５】
また、記載できるさらなる好ましいビルダー物質は、ポリマー性アミノジカルボン酸、その塩またはその前駆体物質である。ポリアスパラギン酸またはその塩および誘導体が特に好ましい。
【０２２６】
さらなる適当なビルダー物質は、ポリアセタールであり、これは、ジアルデヒドと５〜７個の炭素原子および少なくとも３個のヒドロキシル基を有するポリオールカルボン酸との反応によって得ることができる。好ましいポリアセタールは、ジアルデヒド(例えば、グリオキサール、グルタルアルデヒド、テレフタルアルデヒドおよびこれらの混合物)から、およびポリオールカルボン酸(例えば、グルコン酸および／またはグルコヘプトン酸)から得られる。
【０２２７】
さらなる適当な有機ビルダー物質は、デキストリン、例えばデンプンの部分的加水分解によって得られる炭水化物のオリゴマーまたはポリマーである。この加水分解は、通常の方法、例えば酸-触媒プロセスまたは酵素-触媒法によって行うことができる。この加水分解生成物は、好ましくは、４００〜５０００００ｇ／モルの範囲の平均分子量を有する。ここでは、０.５〜４０、特に２〜３０の範囲内のデキストロース当量(ＤＥ)を有するポリサッカリドが好ましい。ここでＤＥとは、１００のＤＥを有するデキストロースと比較したときの、ポリサッカリドの還元作用の一般的指標である。３〜２０のＤＥを有するマルトデキストリンおよび２０〜３７のＤＥを有するドライグルコースシロップ、ならびに、２０００〜３００００ｇ／モルの範囲内の高い分子量を有する「黄色デキストリン」および「白色デキストリン」を使用することできる。
【０２２８】
このようなデキストリンの酸化誘導体は、糖環の少なくとも１つのアルコール官能基をカルボン酸官能基に酸化しうる酸化剤とデキストリンとの反応生成物である。本発明の組成物に特に好ましい有機ビルダーは、ＥＰ４７２０４２、ＷＯ９７／２５３９９およびＥＰ７５５９４４の酸化されたデンプンまたはその誘導体である。
【０２２９】
オキシジスクシネートおよびジスクシネートの他の誘導体、好ましくはエチレンジアミンジスクシネートも、さらなる適当なコビルダーである。ここでは、エチレンジアミン-Ｎ,Ｎ'-ジスクシネート(ＥＤＤＳ)は、好ましくはそのナトリウムまたはマグネシウム塩の形態で使用される。さらに、これに関連して、好ましいものはグリセロールジスクシネートおよびグリセロールトリスクシネートも好ましい。ゼオライト含有、炭酸塩含有および／またはケイ酸塩含有の製剤において使用される好適な量は、３〜１５重量％である。
【０２３０】
さらなる有効な有機コビルダーは、例えばアセチル化ヒドロキシカルボン酸およびその塩であり、所望によりラクトン形態で存在してよく、少なくとも４個の炭素原子、少なくとも１個のヒドロキシル基および多くとも２個の酸基を含有する。
【０２３１】
コビルダー特性を有するさらなる種類の物質はホスホネート類である。これらは、特にヒドロキシアルカンおよびアミノアルカンホスホネートである。特に、ヒドロキシアルカンホスホネートの中で、１−ヒドロキシエタン−１,１−ジホスホネート（ＨＥＤＰ）がコビルダーとして特に重要である。それは、ナトリウム塩として使用されのが好ましく、二ナトリウム塩は中性の反応を示し、四ナトリウム塩はアルカリ性反応（ｐＨ９）を示す。適当なアミノアルカンホスホネートは、エチレンジアミンテトラメチレンホスホネート（ＥＤＴＭＰ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホネート（ＤＴＰＭＰ）およびそれらの高級同族体である。それらは、中性反応性のナトリウム塩の形態において、例えば、ＥＤＴＭＰの６ナトリウム塩として、およびＤＴＰＭＰの７ナトリウム塩および８ナトリウム塩として使用するのが好ましい。ここでは、ホスホネートの種類の中で、ＨＥＤＰをビルダーとして使用するのが好ましい。アミノアルカンホスホネートは顕著な重金属結合能力も示す。従って、特に該組成物が漂白剤も含有する場合、アミノアルカンホスホネート、特にＤＴＰＭＰ、または前記ホスホネートの混合物を使用するのが好適である。
【０２３２】
さらに、アルカリ土類金属イオンと錯体を形成することができるあらゆる化合物をコビルダーとして使用しうる。
【０２３３】
ビルダー物質は、本発明の洗浄剤または清浄剤中に、所望により、９０重量％までの量で存在し得る。それらは、好ましくは７５重量％までの量で存在する。本発明の洗浄剤は、特に５〜５０重量％のビルダー含量を有する。硬表面を清浄するため、特に食器を機械清浄するための本発明の組成物において、ビルダー物質の含量は、特に５〜８８重量％であり、好ましくは、このような種類の組成物においては水不溶性ビルダー物質を用いない。本発明の組成物の好ましい実施態様において、特に食器の機械清浄のためには、２０〜４０重量％の水溶性有機ビルダー、特にアルカリ金属クエン酸塩、５〜１５重量％のアルカリ金属炭酸塩、および２０〜４０重量％のアルカリ金属二ケイ酸塩を含有する。
【０２３４】
洗浄剤および清浄剤の液体ないしゲル様組成物において使用され得る溶媒は、好ましくは一価もしくは多価アルコール、アルカノールアミンまたはグリコールエーテルの群から得られる、但しこれらが、所定の濃度範囲内で水と混和性である場合。これら溶媒は、好ましくは、エタノール、ｎ-またはｉ-プロパノール、ブタノール、エチレングリコールメチルエーテル、エチレングリコールエチルエーテル、エチレングリコールプロピルエーテル、エチレングリコールモノ-ｎ-ブチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールエチルエーテル、プロピレングリコールメチル、エチルまたはプロピルエーテル、ジプロピレングリコールモノメチルまたはエチルエーテル、ジイソプロピレングリコールモノメチルまたはエチルエーテル、メトキシ、エトキシまたはブトキシトリグリコール、１-ブトキシエトキシ-２-プロパノール、３-メチル-３-メトキシブタノール、プロピレングリコールｔ-ブチルエーテル、およびこれら溶媒の混合物から選択される。
【０２３５】
溶媒は、本発明の液体ないしゲル様の洗浄剤および清浄剤において、０.１〜２０重量％、好ましくは１５重量％以下、特に１０重量％以下の量で使用することができる。
【０２３６】
粘度を調節するために、１またはそれ以上の増粘剤または増粘剤系を、本発明の組成物に添加することができる。これらの高分子量物質、いわゆる膨潤剤は、通常、液体を吸収し、その過程で膨潤し、最終的には粘稠な真のまたはコロイド様溶液に変化させる。
【０２３７】
適当な増粘剤は、無機またはポリマー性の有機化合物である。無機の増粘剤には、例えば、ポリケイ酸、粘土鉱物（例えば、モンモリロナイト、ゼオライト、シリカおよびベントナイト)が含まれる。有機増粘剤は、天然ポリマー、修飾された天然ポリマーおよび全合成ポリマーの群から得られるものである。このような天然由来のポリマーは、例えば、寒天、カラギーナン、トラガカント、アラビアゴム、アルギン酸塩、ペクチン、ポリオース、グア粉末、イナゴマメ種子粉末、デンプン、デキストリン、ゼラチンおよびカゼインである。増粘剤として使用される修飾された天然物質は、特に修飾されたデンプンおよびセルロースの群からのものである。例を挙げると、カルボキシメチルセルロースおよび他のセルロースエーテル、ヒドロキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースならびに穀物粉末（pome flour）エーテルである。全合成の増粘剤は、ポリマー、例えば、ポリアクリル化合物およびポリメタクリル化合物、ビニルポリマー、ポリカルボン酸、ポリエーテル、ポリイミン、ポリアミドならびにポリウレタンである。
【０２３８】
増粘剤は、最終組成物を基準に、５重量％まで、好ましくは０.０５〜２重量％、特に好ましくは０.１〜１.５重量％の量で存在することができる。
【０２３９】
本発明の洗浄剤および清浄剤は、所望により、さらなる通常の成分として、金属イオン封鎖剤、電解質、およびさらなる助剤、例えば、蛍光増白剤、灰色化抑制剤、銀腐食抑制剤、色移行抑制剤、発泡抑制剤、研磨剤、染料および／または芳香剤、および微生物活性化合物、ＵＶ吸収剤および／または酵素安定剤を含有することができる。
【０２４０】
本発明の織物洗浄剤は、蛍光増白剤として、ジアミノスチルベンジスルホン酸の誘導体またはそのアルカリ金属塩を含有できる。例えば、４,４'-ビス（２-アニリノ-４-モルホリノ-１,３,５-トリアジニル-６-アミノ）スチルベン-２,２'-ジスルホン酸または同様に合成された化合物（モルホリノ基の代わりに、ジエタノールアミノ基、メチルアミノ基、アニリノ基または２-メトキシエチルアミノ基を保持する）が好適である。さらに、置換されたジフェニルスチリル型の増白剤、例えば、４,４'-ビス（２-スルホスチリル）ジフェニル、４,４'-ビス（４-クロロ-３-スルホスチリル）ジフェニル、または４-(４-クロロスチリル)-４'-(２-スルホスチリル)ジフェニルのアルカリ金属塩が存在することもできる。上記の蛍光増白剤の混合物を使用することもできる。
【０２４１】
灰色化抑制剤は、織物繊維から剥落した汚れを、液中に懸濁したまま維持することが目的である。このためには、通常は有機性の水溶性コロイド、例えばデンプン、にかわ、ゼラチン、デンプンもしくはセルロースのエーテルカルボン酸またはエーテルスルホン酸の塩、あるいは、セルロースもしくはデンプンの酸性硫酸エステルの塩である。酸性の基を含む水溶性ポリアミドもこの目的に適する。さらに、上記したもの以外のデンプン誘導体、例えばアルデヒドデンプンを用いることもできる。好ましいのは、セルロースエーテル、例えばカルボキシメチルセルロース(Ｎａ塩)、メチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、および混合エーテル、例えばメチルヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロース、およびこれらの混合物である。これらは、例えば、組成物に基づいて０.１〜５重量％の量である。
【０２４２】
銀腐食保護を実現するために、銀腐食保護剤を、本発明の食器用清浄剤に添加することができる。かかる阻害剤は先行技術から既知であり、例えばベンゾトリアゾール、塩化鉄(ＩＩＩ)またはＣｏＳＯ4である。例えば、欧州特許出願  ＥＰ０７３６０８４Ｂ１から知られるように、酵素と一緒に使用するのに特に適する銀腐食保護剤は、マンガン、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、コバルトまたはセリウムの塩および／または錯体であり、この錯体の金属は、酸化状態ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩで存在する。このような化合物の例は、ＭｎＳＯ4、Ｖ2Ｏ5、Ｖ2Ｏ4、ＶＯ2、ＴｉＯＳＯ4、Ｋ2ＴｉＦ6、Ｋ2ＺｒＦ6、Ｃｏ(ＮＯ3)2、Ｃｏ(ＮＯ3)3、およびこれらの混合物である。
【０２４３】
「汚れ遊離」活性化合物または汚れ忌避剤は、通常はポリマーであり、これは洗浄剤において使用したときに、洗濯物の繊維に対して汚れ忌避特性を付与し、そして／または他の洗浄成分が汚れを剥落する能力を助ける。また、硬表面用の清浄剤においてこれらを使用したときに、同等の効果を観察することができる。
【０２４４】
特に効果的であり、かつ以前から既知である汚れ遊離成分は、ジカルボン酸、アルキレングリコールおよびポリアルキレングリコール単位を有するコポリエステルである。これらの例は、ポリエチレンテレフタレートおよびポリオキシエチレングリコール(それぞれ、ＤＴ１６１７１４１およびＤＴ２２００９１１)からなる、コポリマーまたは混合ポリマーである。ドイツ特許出願公開ＤＴ２２５３０６３は、特に、二塩基性カルボン酸とアルキレンまたはシクロアルキレンポリグリコールのコポリマーを含有する酸性の組成物が記載されている。ドイツ特許出願 ＤＥ２８５７２９２およびＤＥ３３２４２５８ならびに欧州特許ＥＰ０２５３５６７では、エチレンテレフタレートおよびポリエチレンオキシドテレフタレートのポリマー、ならびに、洗浄剤におけるそれらの使用を記載している。欧州特許ＥＰ０６６９４４は、特定のモル比の、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、芳香族ジカルボン酸、およびスルホン化芳香族ジカルボン酸のコポリエステルを含有する組成物に関する。欧州特許ＥＰ０１８５４２７から、エチレンおよび／またはプロピレンテレフタレートおよびポリエチレンオキシドテレフタレート単位を有するメチル基またはエチル基で末端キャップしたポリエステル、およびこのような汚れ遊離ポリマーを含有する洗浄剤を開示している。欧州特許ＥＰ０２４１９８４は、オキシエチレン基およびテレフタル酸単位に加えて、置換されたエチレン単位およびグリセロール単位も含むポリエステルに関する。欧州特許ＥＰ０２４１９８５は、オキシエチレン基およびテレフタル酸単位に加えて、１,２-プロピレン、１,２-ブチレンおよび／または３-メトキシ-１,２-プロピレン基ならびにグリセロール単位も含み、かつＣ１〜Ｃ４アルキル基で末端キャップされたポリエステルを開示している。欧州特許出願 ＥＰ０２７２０３３は、ポリプロピレンテレフタレートおよびポリオキシエチレンテレフタレート単位を有する、Ｃ１-４アルキル基またはアシル基によって少なくとも部分的に末端基キャップされたポリエステルを開示している。欧州特許ＥＰ０２７４９０７は、スルホエチル基で末端キャップされたテレフタレート含有の汚れ遊離ポリエステルを記載している。欧州特許出願 ＥＰ０３５７２８０によれば、不飽和末端基のスルホン化によって、テレフタレート、アルキレングリコールおよびポリＣ２-４グリコール単位を有する汚れ遊離ポリエステルが調製されている。国際特許出願公開 ＷＯ９５／３２２３２は、酸性の汚れ遊離促進性芳香族ポリエステルに関する。国際特許出願公開 ＷＯ９７／３１０８５は、綿から作られる物品についての非ポリマー性の汚れ忌避活性成分であって、複数の機能性単位を有するものを開示している：第１の単位は、陽イオン性であってよく、例えば、静電的な相互作用によって綿の表面に吸着することができ、そして第２の単位は、疎水性であり、水／綿の界面に残存する活性成分に関与する。
【０２４５】
本発明の織物洗浄剤において使用するために好適な色移行抑制剤には、特にポリビニルピロリドン、ポリビニルイミダゾール、ポリマー性Ｎオキシド、例えば、ポリ(ビニルピリジンＮ-オキシド)、およびビニルピロリドンとビニルイミダゾールとのコポリマーが含まれる。
【０２４６】
機械清浄方法で使用される場合、関連の組成物に発泡抑制剤を添加するのが有利であろう。適当な発泡抑制剤の例は、高含量のＣ１８-Ｃ２４脂肪酸を有する天然または合成起源の石鹸である。適当な非界面活性剤様の発泡抑制剤の例は、有機ポリシロキサンおよび微細な所望によりシラン処理されたケイ酸とそれらの混合物、ならびにパラフィン、ワックス、微晶質ワックスおよびシラン処理されたケイ酸またはビス-ステアリルエチレンジアミドとの混合物である。様々な発泡抑制剤の混合物、例えば、シリコーン、パラフィンまたはワックスの混合物を使用するのも有利である。好ましくは、これらの発泡抑制剤、特にシリコーンおよび／またはパラフィンを含有する発泡抑制剤を、顆粒状の水溶性または水分散性の担体物質に結合させる。特に好ましいのは、パラフィンおよびビス-ステアリルエチレンジアミドの混合物が好ましい。
【０２４７】
硬表面のための本発明の清浄剤は、さらに、研磨作用を有する成分（特に、石英粉末、木材粉末、プラスチック粉末、チョークおよびガラスミクロビーズならびにこれらの混合物からなる群からの成分）を含有する。研磨剤は、本発明の清浄剤中に、好ましくは２０重量％を超えないで、特に５〜１５重量％で存在する。
【０２４８】
製品の審美的な外観を改善するため、ならびに洗浄および清浄性能に加えて、視覚的かつ感覚的に「典型的かつ錯誤のない」製品を消費者に提供するために、染料および芳香剤を、洗浄剤および清浄剤に添加する。使用され得る芳香油および／または芳香剤としては、個々の香気化合物、例えば、エステル、エーテル、アルデヒド、ケトン、アルコールおよび炭化水素型の合成生成物を使用することができる。エステル型の香気化合物は、例えば、酢酸ベンジル、イソ酪酸フェノキシエチル、酢酸ｐ-tert-ブチルシクロヘキシル、酢酸リナリル、酢酸ジメチルベンジルカルビニル、酢酸フェニルエチル、安息香酸リナリル、ギ酸ベンジル、グリシン酸エチルメチルフェニル、プロピオン酸アリルシクロヘキシル、プロピオン酸スチラリルおよびサリチル酸ベンジルである。エーテルには、例えば、ベンジルエチルエーテルが含まれ、アルデヒドには、例えば、８〜１８個の炭素原子を有する直鎖アルカナール、シトラール、シトロネラール、シトロネリルオキシアセトアルデヒド、シクラメンアルデヒド、ヒドロキシシトロネラール、リリアールおよびボージュナールが含まれ、ケトンには、例えば、イオノン、α-イソメチルイオノンおよびメチルセドリルケトンが含まれ、アルコールには、アネトール、シトロネロール、オイゲノール、ゲラニオール、リナロール、フェニルエチルアルコールおよびテルピネオールが含まれ、炭化水素には、主にテルペン(例えば、リモネンおよびピネン)が含まれる。しかし、好ましいのは、一緒になって魅力的な芳香調を生じる様々な香気物質の混合物を使用することである。また、このような芳香油は、植物起源から得られるような天然の香気物質、例えば、松根油、柑橘油、ジャスミン油、パチョリ油、バラ油またはイランイラン油、マスカテル、セージ油、カモミール油、チョウジ油、レモンバーム油、ミント油、シナモン葉油、リンデン花油、ネズ実油、ベチベル油、オリバナム油、ガルバナム油およびラブダナム油、さらに、オレンジ花油、ネロリ油、オレンジ果皮油およびビャクダン油を含んでいてもよい。通常、洗浄剤および清浄剤の染料含量は、配合物全体の０.０１重量％未満であり、芳香物は製品全体の２重量％までを構成していてよい。
【０２４９】
芳香剤は、洗浄剤および清浄剤中に直接導入することができる。しかし、清浄すべき材料への芳香剤の吸着を増強する担体に芳香剤を適用し、より遅い芳香剤の放出によって、特に処理された織物の長く持続する芳香を提供することも有利であろう。好適であると証明されてきたこのような担体物質は、例えばシクロデキストリンであり、シクロデキストリン-芳香剤の複合体を、さらなる助剤で被覆することもできる。芳香剤のためのさらなる好ましい担体は、界面活性剤の代わりにまたは界面活性剤と混合して、芳香剤を吸収することができる上記のゼオライトＸである。洗浄剤および清浄剤は、上記のゼオライトＸおよび芳香剤（これは、好ましくは、少なくとも部分的にゼオライト上に吸着されている）を含むのが好ましい。
【０２５０】
好ましい染料（その選択は、当業者にとって何の困難もない）は、高い貯蔵安定性および組成物の他の成分および光に対する非感受性を有しており、また、織物繊維を染色することがないように、織物繊維に顕著な親和性を有さない。
【０２５１】
微生物を制御するため、洗浄剤および清浄剤は、抗微生物活性成分を含有することができる。ここで、抗微生物スペクトルおよび作用機序に関して、静菌剤と殺菌剤、静真菌類剤と殺真菌類剤の間などで区別が為される。これらの群の重要な物質の例は、塩化ベンズアルコニウム、アルキルアリールスルホネート、ハロフェノールおよび酢酸フェノール水銀である。「抗微生物作用」および「抗微生物活性化合物」なる用語は、本発明の教示の範囲内では、先行技術において通常の意味を有し、これは、例えば、K.H.Wallhaeusserの「Praxis der Sterilisation、Desinfektion-Konservierung：Keimidentifizierung-Betriebshygiene」（第5版、-Stuttgart；ニューヨーク：Thieme、1995）に記載されており、そこに記載された抗微生物作用を有する全ての物質を使用することができる。適当な抗微生物活性成分は、好ましくは、以下の群から選択される。即ち、アルコール、アミン、アルデヒド、抗微生物性の酸またはそれらの塩、カルボン酸エステル、酸アミド、フェノール、フェノール誘導体、ジフェニル、ジフェニルアルカン、尿素誘導体、酸素アセタール、窒素アセタール、ならびに酸素および窒素のホルマール、ベンズアミジン、イソチオアゾリン、フタルイミド誘導体、ピリジン誘導体、抗微生物性の界面活性化合物、グアニジン、抗微生物性の両性化合物、キノリン、１,２-ジブロモ-２,４-ジシアノブタン、ヨード-２-プロピルブチルカルバメート、ヨウ素、ヨードホア、ペルオキソ化合物、ハロゲン化合物、ならびに上記所望の混合物から選択される。
【０２５２】
抗微生物活性化合物は、以下の成分から選択することができる。即ち、エタノール、ｎ-プロパノール、i-プロパノール、１,３-ブタンジオール、フェノキシエタノール、１,２-プロピレングリコール、グリセロール、ウンデシレン酸、安息香酸、サリチル酸、ジヒドロ酢酸、ｏ-フェニルフェノール、Ｎ-メチルモルホリノアセトニトリル(ＭＭＡ)、２-ベンジル-４-クロロフェノール、２,２'-メチレンビス(６-ブロモ-４-クロロフェノール)、４,４'-ジクロロ-２'-ヒドロキシジフェニルエーテル(Ｄiclosan)、２,４,４'-トリクロロ-２'-ヒドロキシジフェニルエーテル(triclosan)、クロロヘキシジン、Ｎ-(４-クロロフェニル)-Ｎ-(３,４-ジクロロフェニル)尿素、Ｎ,Ｎ'-(１,１０-デカンジイルジ-１-ピリジニル-４-イリデン)-ビス(１-オクタンアミン)ジヒドロクロリド、Ｎ,Ｎ'-ビス(４-クロロフェニル)-３,１２-ジイミノ-２,４,１１,１３-テトラアザテトラデカンジイミドアミド、グルコプロタミン、抗微生物性の界面活性第四級化合物、グアニジン(ビグアニジンおよびポリグアニジンを含む)、例えば、１,６-ビス(２-エチルヘキシルビグアニドヘキサン)ジヒドロクロリド、１,６-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-フェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')ヘキサンテトラヒドロクロリド、１,６-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-フェニル-Ｎ１,Ｎ１-メチルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')ヘキサンジヒドロクロリド、１,６-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-ｏ-クロロフェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')ヘキサンジヒドロクロリド、１,６-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-２,６-ジクロロフェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')ヘキサンジヒドロクロリド、１,６-ジ-[Ｎ１,Ｎ１'-β-(ｐ-メトキシフェニル)ジグアニド-Ｎ５,Ｎ５']ヘキサンジヒドロクロリド、１,６-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-α-メチル-β-フェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')ヘキサンジヒドロクロリド、１,６-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-ｐ-ニトロフェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')ヘキサンジヒドロクロリド、ω：ω-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-フェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')-ジ-ｎ-プロピルエーテルジヒドロクロリド、ω：ω'-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-ｐ-クロロフェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')-ジ-ｎ-プロピルエーテルテトラヒドロクロリド、１,６-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-２,４-ジクロロフェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')ヘキサンテトラヒドロクロリド、１,６-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-ｐ-メチルフェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')ヘキサンジヒドロクロリド、１,６-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-２,４,５-トリクロロフェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')ヘキサンテトラヒドロクロリド、１,６-ジ-[Ｎ１,Ｎ１'-α-(ｐ-クロロフェニル)エチルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５']-ヘキサンジヒドロクロリド、ω：ω-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-ｐ-クロロフェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')ｍ-キシレンジヒドロクロリド、１,１２-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-ｐ-クロロフェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')ドデカンジヒドロクロリド、１,１０-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-フェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')デカンテトラヒドロクロリド、１,１２-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-フェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')ドデカンテトラヒドロクロリド、１,６-ジ-(Ｎ１,Ｎ１'-ｏ-クロロフェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')ヘキサンジヒドロクロリド、１,６-ジ-[Ｎ１,Ｎ１'-ｏ-クロロフェニルジグアニド-Ｎ５,Ｎ５')ヘキサンテトラヒドロクロリド、エチレン-ビス(１-トリルビグアニド)、エチレン-ビス(ｐ-トリルビグアニド)、エチレン-ビス(３,５-ジメチルフェニルビグアニド)、エチレン-ビス(ｐ-tert-アミルフェニルビグア���ド)、エチレン-ビス(ノニルフェニルビグアニド)、エチレン-ビス(フェニルビグアニド)、エチレン-ビス(Ｎ-ブチルフェニルビグアニド)、エチレン-ビス(２,５-ジエトキシフェニルビグアニド)、エチレン-ビス(２,４-ジメチルフェニルビグアニド)、エチレン-ビス(ｏ-ジフェニルビグアニド)、エチレン-ビス(混合アミルナフチルビグアニド)、Ｎ-ブチルエチレン-ビス(フェニルビグアニド)、トリメチレンビス(ｏ-トリルビグアニド)、Ｎ-ブチル-トリメチル-ビス(フェニルビグアニド)、ならびに、対応する塩、例えば、酢酸塩、グルコン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、クエン酸塩、亜硫酸水素塩、フッ化物、ポリマレイン酸塩、Ｎ-ココアルキルサルコシン酸塩、亜リン酸塩、次亜リン酸塩、パーフルオロオクタン酸塩、ケイ酸塩、ソルビン酸塩、サリチル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、イミノ二酢酸塩、桂皮酸塩、チオシアン酸塩、アルギン酸塩、ピロメリト酸塩、テトラカルボキシ酪酸塩、安息香酸塩、グルタル酸塩、モノフルオロリン酸塩、パーフルオロプロピオン酸塩、ならびに、これら所望の混合物から選択することができる。さらに、ハロゲン化キシレンおよびクレゾール誘導体、例えばｐ-クロロメタクレゾールまたはｐ-クロロメタキシレン、ならびに植物起源、例えばスパイスまたはハーブ由来、動物起源および微生物起源の天然の抗微生物活性成分が好適である。好ましくは、抗微生物性活性を有する界面活性第四級化合物、植物起源の天然の抗微生物活性成分および／または動物起源の天然の抗微生物活性化合物、最も好ましくは、カフェイン、テオブロミンおよびテオフィリンを含む群からの植物起源の少なくとも１つの天然の抗微生物活性化合物、ならびに精油（例えば、オイゲノール、チモールおよびゲラニオール)、および／または、酵素（例えば、ミルク由来のアルブミン、リゾチームおよびラクトペルオキシダーゼ）を含む群からの動物起源の少なくとも１つの天然の抗微生物活性化合物、および／または、アンモニウム、スルホニウム、ホスホニウム、ヨードニウムまたはアルソニウム基を含有する抗微生物性を有する少なくとも１つの界面活性第四級化合物、ペルオキソ化合物、ならびに塩素化合物を使用することができる。微生物起源の物質「バクテリオシン」を使用することもできる。
【０２５３】
抗微生物活性化合物として好適な第四アンモニウム化合物(ＱＡＣ)は、一般式：(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)(Ｒ４)Ｎ＋Ｘ−を有する[ここで、Ｒ１〜Ｒ４は、同一または異なって、Ｃ１-Ｃ２２アルキル基、Ｃ７-Ｃ２８アラルキル基または複素環式基であり、ここで、２つの基、またはピリジンのように芳香族結合の場合には３つの基は、窒素原子と一緒になって、複素環、例えばピリジニウムまたはイミダゾリニウム化合物を形成し、そしてＸ−は、ハロゲンイオン、硫酸イオン、水酸化物イオンまたは同様のアニオンである]。適当な抗微生物作用のためには、これらの基の少なくとも１つは、好ましくは８〜１８個、特に１２〜１６個の炭素原子の鎖長を有する。
【０２５４】
ＱＡＣは、第三アミンとアルキル化剤（例えば、塩化メチル、塩化ベンジル、硫酸ジメチル、臭化ドデシル、それ以外ではエチレンオキシド)との反応によって調製することができる。１つの長いアルキル基および２つのメチル基を有する第三アミンのアルキル化は特に容易に進行し、２つの長い基および１つのメチル基を有する第三アミンの四級化も、穏やかな条件下で塩化メチルの補助によって行うことができる。３つの長いアルキル基またはヒドロキシ置換アルキル基を有するアミンは、反応性が低く、硫酸ジメチルを用いて四級化するのが好ましい。
【０２５５】
適当なＱＡＣは、例えば、塩化ベンズアルコニウム(Ｎ-アルキル-Ｎ,Ｎ-ジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ＣＡＳ番号８００１-５４-５)、ベンズアルコンＢ(ｍ,ｐ-ジクロロベンジルジメチル-Ｃ１２-アルキルアンモニウムクロリド、ＣＡＳ番号５８３９０-７８-６)、塩化ベンズオキソニウム(ベンジルドデシル-ビス(２-ヒドロキシエチル)アンモニウムクロリド)、臭化セトリモニウム(Ｎ-ヘキサデシル-Ｎ,Ｎ-トリメチルアンモニウムブロミド、ＣＡＳ番号５７-０９-０)、塩化ベンズエトニウム(Ｎ,Ｎ-ジメチル-Ｎ-[２-[２-[ｐ-(１,１,３,３-テトラメチルブチル)フェノキシ]エトキシ]エチル]−ベンジルアンモニウムクロリド、ＣＡＳ番号１２１-５４-０)、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、例えば、ジ-ｎ-デシルジメチルアンモニウムクロリド(ＣＡＳ番号７１７３-５１-５-５)、臭化ジデシルジメチルアンモニウム(ＣＡＳ番号２３９０-６８-３)、塩化ジオクチルジメチルアンモニウム、１-セチルピリジニウムクロリド(ＣＡＳ番号１２３-０３-５)およびヨウ化チアゾリン(ＣＡＳ番号１５７６４-４８-１)、ならびにこれらの混合物である。特に好ましいＱＡＣは、Ｃ８-Ｃ18アルキル基を有する塩化ベンズアルコニウム、特に、Ｃ12-Ｃ14アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドである。
【０２５６】
ハロゲン化ベンズアルコニウムおよび／またはハロゲン化置換ベンズアルコニウムは、例えば、Barquat（登録商標）(Lonzaより)、Marquat（登録商標）(Masonより)、Variquat（登録商標）(Witco／Sherexより)、Hyamine（登録商標）(Lonzaより)、およびBardac（登録商標）(Lonzaより)として市販購入できる。さらなる市販の抗微生物活性化合物は、Ｎ-(３-クロロアリル)ヘキサミニウムクロリド、例えばDowicide（登録商標）およびDowicil（登録商標）(Dowより)、塩化ベンズエトニウム、例えばHyamine（登録商標） 1622(Rohm & Haasより)、塩化メチルベンズエトニウム、例えばHyamine（登録商標） 10X(Rohm & Haasより)、塩化セチルピリジニウム、例えば塩化セパコール(Merrell Labsより)である。
【０２５７】
抗微生物活性化合物は、０.０００１〜１重量％、好ましくは０.００１〜０.８重量％、特に好ましくは０.００５〜０.３重量％、そして特に０.０１〜０.２重量％の量で使用される。
【０２５８】
本発明の洗浄剤または清浄剤は、処理された織物に付着し、繊維の光安定性および／または他の配合物成分の光安定性を改善するＵＶ吸収剤を含有することができる。ＵＶ吸収剤とは、紫外線放射を吸収し、吸収したエネルギーを再び長波長放射の形態(例えば、熱)で放出しうる有機物質(光保護フィルター)と解される。
【０２５９】
これらの所望の特性を有する化合物は、例えば、無放射の不活性化により活性である、ならびに、２位および／または４位に置換基を有する、化合物およびベンゾフェノンの誘導体である。さらに、置換されたベンゾトリアゾール、３位でフェニル置換されたアクリレート(２位に所望によりシアノ基を有する桂皮酸誘導体)、サリチル酸塩、有機Ｎｉ錯体および天然物質(例えば、ウンベリフェロンおよび内因性ウロカニン酸)も好適である。ビフェニル誘導体および特にスチルベン誘導体[例えば、ＥＰ０７２８７４９Ａに記載され、Tinsorb（登録商標） FDまたはTinosorb（登録商標） FR （Cibaより）として市販されている]は、特に重要である。次のものがＵＶ-Ｂ吸収剤として挙げることができる：３-ベンジリデンカンフルまたは３-ベンジリデンノルカンフルおよびこれらの誘導体、例えば３-(４-メチルベンジリデン)カンフル(ＥＰ０６９３４７１Ｂ１に記載)；４-アミノ安息香酸誘導体、好ましくは４-(ジメチルアミノ)安息香酸２-エチルヘキシルエステル、４-(ジメチルアミノ)安息香酸２-オクチルエステルおよび４-(ジメチルアミノ)安息香酸アミルエステル；桂皮酸のエステル、好ましくは４-メトキシ桂皮酸２-エチルヘキシルエステル、４-メトキシ桂皮酸プロピルエステル、４-メトキシ桂皮酸イソアミルエステル、２-シアノ-３,３-フェニル桂皮酸２-エチルヘキシル(オクトクリレン) エステル；サリチル酸のエステル、好ましくはサリチル酸２-エチルヘキシルエステル、サリチル酸４-イソプロピルベンジルエステル、サリチル酸ホモメンチルエステル；ベンゾフェノンの誘導体、好ましくは２-ヒドロキシ-４-メトキシベンゾフェノン、２-ヒドロキシ-４-メトキシ-４'-メチルベンゾフェノン、２,２'-ジヒドロキシ-４-メトキシベンゾフェノン、ベンザルマロン酸のエステル、好ましくは４-メトキシベンズマロン酸ジ-２-エチルヘキシル；トリアジン誘導体、例えばＥＰ０８１８４５０Ａ１に記載されたような２,４,６-トリアニリノ-(ｐ-カルボ-２'-エチル-１'-ヘキシルオキシ)-１,３,５-トリアジンおよびオクチルトリアゾンまたはジオクチルブタアミドトリアゾン[Uvasorb（登録商標） HEB]；プロパン-１,３-ジオン、例えば、１-(４-tert-ブチルフェニル)-３-(４'-メトキシフェニル)プロパン-１,３-ジオン；ケトトリシクロ(５.２.１.０)デカン誘導体(ＥＰ０６９４５２１Ｂ１に記載)。２-フェニルベンズイミダゾール-５-スルホン酸およびそのアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、アルキルアンモニウム、アルカノールアンモニウムおよびグルクアンモニウムの塩はさらに好適である；ベンゾフェノンのスルホン酸誘導体、好ましくは、２-ヒドロキシ-４-メトキシベンゾフェノン-５-スルホン酸およびその塩；３-ベンジリデンカンフルのスルホン酸誘導体、例えば、４-(２-オキソ-３-ボルニリデンメチル)ベンゼンスルホン酸および２-メチル-５-(２-オキソ-３-ボルニリデン)スルホン酸ならびにこれらの塩。
【０２６０】
適当な代表的ＵＶ-Ａフィルターは、特にベンゾイルメタンの誘導体、例えばＤＥ１９７１２０３３Ａ１(BASF)に記載されているような１-(４'-tert-ブチルフェニル)-３-(４'-メトキシフェニル)プロパン-１,３-ジオン、４-tert-ブチル-４'-メトキシジベンゾイルメタン(Parsol 1789)、１-フェニル-３-(４'-イソプロピルフェニル)プロパン-１,３-ジオン、およびエナミン化合物である。また、ＵＶ-ＡおよびＵＶ-Ｂフィルターは、当然ながら混合物で用いることもできる。このような可溶性物質に加えて、不溶性の光保護顔料、即ち微細に分散させた好ましくはナノ化された金属の酸化物または塩も、この目的に適する。適当な金属酸化物の例は、特に酸化亜鉛および二酸化チタンであり、さらに、鉄、ジルコニウム、ケイ素、マンガン、アルミニウムおよびセリウムの酸化物ならびにこれらの混合物である。塩としては、ケイ酸塩(タルク)、硫酸バリウムまたはステアリン酸亜鉛を用いうる。酸化物および塩は、皮膚ケアおよび皮膚保護エマルジョンおよび美容化粧品のための色素の形態で既に使用されている。この場合に、粒子は、１００ｎｍ未満、好ましくは５〜５０ｎｍ、特に１５〜３０ｎｍの平均直径を有すべきである。これらは、球の形状を有することができるが、楕円形状または球形態からいくらか逸脱した形状を有する粒子を使用することもできる。また、色素を表面処理することもできる(即ち、親水性または疎水性化できる)。代表的な例は、被覆された二酸化チタン[例えば、二酸化チタンＴ８０５(Degussa)またはEusolex（登録商標） T2000(Merck)など]である；このために適当な疎水性の被覆剤は、好ましくはシリコーンであり、特に好ましくはトリアルコキシオクチルシランまたはシメチコーンである。ミクロ化した酸化亜鉛を用いるのが好ましい。さらに好適なＵＶ光保護フィルターは、P.Finkelによる概説[SOEFW-Journal 122 (1996)、p.543]に見出すことができる。
【０２６１】
ＵＶ吸収剤は、０.０１重量％〜５重量％、好ましくは０.０３重量％〜１重量％の量で一般に使用される。
【０２６２】
洗浄力または清浄力を増大させるために、本発明の組成物はさらなる酵素を含有することができ、原則的にこの目的に使用しうることが当分野で確立されているあらゆる酵素を含有できる。これらには、特に、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼまたはオキシドレダクターゼならびに好ましくはこれらの混合物が含まれる。原則的に、これらの酵素は天然起源のものである；洗浄剤および清浄剤において使用するために、天然分子に基づく改善された変異体が利用可能であり、これらを用いるのが好ましい。本発明の組成物は、酵素を、活性なタンパク質を基準に、１×１０-８〜５重量％の合計量で含有しているのが好ましい。
【０２６３】
さらなるプロテアーゼの中では、スブチリシン型のものが好ましい。これらの例は、スブチリシンＢＰＮ'およびCarlsberg、プロテアーゼＰＢ９２、スブチリシン１４７および３０９、Bacillus lentus由来のアルカリ性プロテアーゼ、スブチリシンＤＹ、ならびに、スブチラーゼ類の酵素（より狭義にはスブチリシン類とはもはや分類されない）、サーミターゼ、プロテイナーゼＫおよびプロテアーゼＴＷ３およびＴＷ７である。さらに開発した形態にあるスブチリシンCarlsbergが、商品名 Alcalase（登録商標）としてNovozymes A/S(Bagsvaerd、デンマーク)から入手可能である。スブチリシン１４７および３０９は、商品名 Esperase（登録商標）およびSavinase（登録商標）としてNovozymes社から市販されている。Bacillus lentus ＤＳＭ ５４８３(ＷＯ９１／０２７９２Ａ１)から得られるプロテアーゼから導いた変異体は、BLAP（登録商標）と称され、特に、ＷＯ９２／２１７６０Ａ１、ＷＯ９５／２３２２１Ａ１、ＷＯ０２／０８８３４０Ａ２およびＷＯ０３／０３８０８２Ａ２に記載されている。種々のBacillus sp.およびB.gibsoniiに由来する別の使用しうるプロテアーゼが、既に記載された国際特許出願公開ＷＯ０３／０５４１８５Ａ１、ＷＯ０３／０５６０１７Ａ２、ＷＯ０３／０５５９７４Ａ２およびＷＯ０３／０５４１８４Ａ１から明らかである。
【０２６４】
さらなる使用しうるプロテアーゼは、例えば、商品名 Durazym（登録商標）、Relase（登録商標）、Everlase（登録商標）、Nafizym、Natalase（登録商標）、Kannase（登録商標）およびOvozymes（登録商標）としてNovozymes社から入手しうる酵素、商品名 Purafect（登録商標）、Purafect（登録商標）OxPおよびProperase（登録商標）としてGenencorから入手しうる酵素、商品名 Protosol（登録商標）としてAdvanced Biochemicals Ltd.(Thane、インド)から入手しうる酵素、商品名 Wuxi（登録商標）としてWuxi Snyder Bioproducts Ltd.(中国)から入手しうる酵素、商品名 Proleather（登録商標）およびProtease（登録商標）P としてAmano Pharmaceuticals Ltd.(名古屋、日本)から入手しうる酵素、ならびに、商品名 Proteinase K-16 としてKao Corp.(東京、日本)から入手しうる酵素である。
【０２６５】
本発明に関する使用し得るアミラーゼの例は、Bacillus licheniformis由来、B.amyloliquefaciens由来またはB.stearothermophilus由来のα-アミラーゼ、ならびに、洗浄剤および清浄剤において使用するためにさらに改善されたこれらの開発体である。B.licheniformis由来の酵素は、商品名 Termamyl（登録商標）としてNovozymes社から、および商品名 Purastar（登録商標） STとしてGenencor社から入手可能である。
【０２６６】
このα-アミラーゼの他の開発生成物が、商品名 Duramyl（登録商標）およびTermamyl（登録商標）ultraとしてNovozymes社から、商品名  Purastar（登録商標）OxAmとしてGenencor社から、およびKeistase（登録商標）としてDaiwa Seiko Inc.社(東京、日本)から入手可能である。B.amyloliquefaciens由来のα-アミラーゼは、商品名 BAN（登録商標）としてNovozymes社から市販されており、B.stearothermophilus由来のα-アミラーゼから得られた変異体は、商品名BSG（登録商標）およびNovamyl（登録商標）として、同様にこれらもNovozymes社から市販されている。
【０２６７】
さらに、上記目的のために、国際特許出願公開ＷＯ０２／１０３５６Ａ２に開示されているBacillus sp. Ａ７-７ (ＤＳＭ １２３６８)由来のα-アミラーゼならびにＷＯ０２／４４３５０Ａ２に開示されているB.agaradherens (ＤＳＭ ９９４８)由来のシクロデキストリン-グルカノトランスフェラーゼ(ＣＧＴアーゼ)に注目すべきである。国際特許出願公開ＷＯ０３／００２７１１Ａ２に規定されているα-アミラーゼの配列空間に属するアミロース分解酵素、ならびに、国際特許出願公開ＷＯ０３／０５４１７７Ａ２に記載されているものを使用することもできる。同様に、用い得る分子の融合生成物、例えばドイツ特許出願公開ＤＥ１０１３８７５３Ａ１に記載された融合生成物を使用することもできる。
【０２６８】
さらに、商品名 Fungamyl（登録商標）としてNovozymes社から入手しうるAspergillus nigerおよびA.oryzae由来のα-アミラーゼのさらなる開発体も好適である。さらなる市販生成物は、例えばAmylase-LT（登録商標）である。
【０２６９】
本発明の組成物は、リパーゼまたはクチナーゼを、特にこれらのトリグリセリド切断活性のゆえに、さらに適当な前駆体から過酸をその場で生成するために、含有することができる。これらには、Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus)由来の入手可能かまたはさらに開発されたリパーゼ、特にアミノ酸置換Ｄ９６Ｌを有するものが含まれる。これらは、例えば、Novozymes社から商品名 Lipolase（登録商標）、Lipolase（登録商標） Ultra、LipoPrime（登録商標）、Lipozyme（登録商標）およびLipex（登録商標）として市販されている。さらに、例えばFusarium solani pisiおよびHumicola insolensから初めて単離されたクチナーゼも使用し得る。同様に使用しうるリパーゼは、Amano社から  商品名 Lipase CE（登録商標）、Lipase P（登録商標）、Lipase B（登録商標）、およびLipase CES（登録商標）、Lipase AKG（登録商標）、Bacillis sp. Lipase（登録商標）、Lipase AP（登録商標）、Lipase M-AP（登録商標）およびLipase AML（登録商標）として入手可能である。Genencor社から入手可能な、例えばリパーゼまたはクチナーゼを使用でき、それらの出発酵素がPseudomonas mendocinaおよびFusarium solaniiから初めて単離された。列挙し得る他の重要な市販生成物は、Gist-Brocades社からの市販調製物 M1 Lipase（登録商標）およびLipomax（登録商標）、Meito Sangyo株式会社(日本)からの市販酵素 商品名 Lipase MY-30（登録商標）、Lipase OF（登録商標）およびLipase PL（登録商標）、さらにGenencor社からのLumafast（登録商標）調製物である。
【０２７０】
本発明の組成物は、特にそれらを織物処理に使用するときには、それらの目的に応じてセルラーゼを、純粋酵素として、酵素調製物として、または混合物(個々の成分がそれらの種々の効果を有利に補足する)の形態で含有することができる。これらの性能には、特に、生成物の一次洗浄性能、二次洗浄性能への寄与(再付着防止活性または灰色化抑制)、または増白化(織物に対する効果)、「ストーン・ウォッシュ」効果の発揮が含まれる。
【０２７１】
使用しうる菌類のエンドグルカナーゼ(ＥＧ)に富むセルラーゼ調製物またはそのさらなる開発体は、Novozymes社から商品名 Celluzyme（登録商標）として提供されている。また、Novozymes社から入手可能である製品Endolase（登録商標）およびCarezyme（登録商標）も、H.insolens ＤＳＭ １８００由来の５０ｋＤ-ＥＧ、４３ｋＤ-ＥＧにそれぞれ基づく。この会社からのさらなる市販製品は、Cellsoft(登録商標)およびRenozyme(登録商標)である。この後者は、国際特許出願公開ＷＯ９６／２９３９７Ａ１に基づく。改善された性能を有するセルラーゼ変異体が、例えば国際特許出願公開ＷＯ９８／１２３０７Ａ１に記載されている。同様に、国際特許出願公開ＷＯ９７／１４８０４Ａ１に開示されたセルラーゼを用い得る；例えば、Melanocarpus由来の２０ｋＤのＥＧが、AB Enzymes社(フィンランド)から商品名 Ecostone（登録商標）およびBiotouch（登録商標）として入手可能である。AB Enzymes社からのさらなる市販生成物は、Econase（登録商標）およびEcopulp（登録商標）である。Bacillus sp. ＣＢＳ ６７０.９３およびＣＢＳ ６６９.９３由来のさらなる好適なセルラーゼが、ＷＯ９６／３４０９２に開示されており、Bacillus sp.由来のＣＢＳ６７０.９３は、Genencor社から商品名 Puradax（登録商標）として入手可能である。Genencor社からのさらなる市販生成物は、「Genencor detergent cellulaseＬ」およびIndiage（登録商標）Neutraである。
【０２７２】
本発明の組成物は、具体的な問題である汚れを除去するために、「ヘミセルラーゼ」なる用語としてまとめられる追加の酵素を含有することができる。これらには、例えば、マンナナーゼ、キサンタンリアーゼ、ペクチンリアーゼ(＝ペクチナーゼ)、ペクチンエステラーゼ、ペクテートリアーゼ、キシログルカナーゼ(＝キシラナーゼ)、プルラナーゼおよびβ-グルカナーゼが包含される。好適なマンナナーゼは、例えば、商品名Gamanase（登録商標）およびPektinex AR（登録商標）としてNovozymes社から、商品名 Rohapec（登録商標） B1LとしてAB Enzymesから、および商品名 Pyrolase（登録商標）としてDiversa Corp.社(San Diego、CA、米国)から入手可能である。B.alcalophilus由来の好適なβ-グルカナーゼは、例えば国際特許出願公開ＷＯ９９／０６５７３Ａ１に開示されている。バシラス・サブチリスから調製されたβ-グルカナーゼは、商品名 Cereflo（登録商標）として Novozymes社から入手可能である。
【０２７３】
漂白作用を増大させるために、本発明の洗浄剤または清浄剤は、オキシドレダクターゼ、例えばオキシダーゼ、オキシゲナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばハロ-、クロロ-、ブロモ-、リグニン-、グルコース-またはマンガン-ペルオキシダーゼ、ジオキシゲナーゼまたはラッカーゼ（フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ)を含有することができる。好適な市販製品は、Novozymes社からのDenilite（登録商標） １および２である。有利には、関連のあるオキシドレダクターゼの活性を増強(エンハンサー)するか、または酸化性酵素と汚れの間のレドックス電位において大きな差違がある場合、電子の流れを促進(メディエーター)するために、酵素と相互作用する追加の好ましくは有機の、特に好ましくは芳香族の化合物が添加される。
【０２７４】
本発明の組成物において使用される酵素は、元々、微生物、例えばBacillus、Streptomyces、HumicolaまたはPseudomonas 属から得られ、そして／または、既知の生物工学的方法に従い、好適な微生物、例えば糸状菌類またはBacillus属のトランスジェニック発現宿主によって調製される。
【０２７５】
次いで、関連酵素の精製を、確立された既知の方法を用いて、例えば液相の沈殿、沈降、濃縮、濾過、ミクロ濾過、限外濾過、化学物質の作用、脱臭またはこれら工程の適当な組合せを用いて好都合に行う。
【０２７６】
酵素を、先行技術に従ってそれぞれ確立された形態で、本発明の組成物に添加することができる。これらには、例えば、顆粒化、押出または凍結乾燥によって得られる固体調製物、あるいは、特に液体組成物またはゲル状組成物、酵素溶液(有利には、高濃縮され、無水物であり、そして／または、安定剤と混合されている)が包含される。
【０２７７】
あるいは、酵素を、固体および液体の投与形態のために、例えば、好ましくは天然ポリマーと共に酵素溶液を噴霧乾燥または押出することによって、あるいは、カプセルの形態(例えば、酵素が固化されたゲル中に埋入されている形態)で、またはコア-シェル型の形態(酵素含有コアが水-、空気-および／または化学物質-不透性の保護層で被覆されている形態)で、封入することができる。追加される層において、他の活性化合物、例えば安定剤、乳化剤、色素、漂白剤または染料を適用することができる。このようなカプセルを、既知の方法を用いて、例えば、振動顆粒化またはロール圧密によって、あるいは、流動床法によって製造する。有利には、このような種類の顆粒は、ほこりが少なく、例えばポリマー皮膜形成剤を適用する結果として貯蔵安定性である。
【０２７８】
さらに、個々の顆粒が複数の酵素活性を示すように、２つまたはそれ以上の酵素を一緒に配合することができる。
【０２７９】
本発明の組成物中のタンパク質および／または酵素を、特に貯蔵中に、損傷（例えば不活性化、変性または分解などであり、例えば物理的影響、酸化またはタンパク質分解切断による）から保護することができる。特に組成物がプロテアーゼをも含有しているときには、タンパク質および／または酵素の微生物調製の場合に、タンパク質分解の抑制が特に好ましい。本発明の好ましい組成物は、この目的のために安定剤を含有する。
【０２８０】
安定剤の１つの群は、可逆的プロテアーゼ阻害剤である。このために、ベンズアミジン塩酸塩、ホウ砂、ホウ酸、ボロン酸またはこれらの塩もしくはそれらのエステルが使用され、それらの中で、特に芳香族基を有する誘導体、例えばオルト置換、メタ置換またはパラ置換されたフェニルボロン酸、特に４-ホルミルフェニルボロン酸、または上記化合物の塩またはエステルである。ペプチドアルデヒド、即ち還元されたＣ末端を有するオリゴペプチド、特に２〜５０個のモノマーのオリゴペプチドも適している。ペプチド型の可逆的プロテアーゼ阻害剤は、特にオボムコイドおよびロイペプチンを包含する。プロテアーゼ スブチリシンについての特異的な可逆的ペプチド阻害剤ならびにプロテアーゼと特異的ペプチド阻害剤の融合タンパク質も、本目的に適している。
【０２８１】
さらなる酵素安定剤は、アミノアルコール(例えば、モノ、ジ、トリエタノールおよびプロパノールアミンならびにこれらの混合物)、Ｃ12までの脂肪族カルボン酸、例えばコハク酸、他のジカルボン酸または上記した酸の塩である。また、末端基停止脂肪酸アミドアルコキシレートもこの目的に適する。国際特許出願公開ＷＯ９７／１８２８７に開示されているように、ビルダーとして使用される特定の有機酸は、存在する酵素をさらに安定化することができる。
【０２８２】
低級脂肪族アルコール、特にポリオール（例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはソルビトールなど）は、さらに使用されることが多い酵素安定剤である。また、リン酸ジグリセロールも、物理的影響による変性から保護する。同様に、カルシウム塩および／またはマグネシウム塩も使用される、例えば、酢酸カルシウムまたはギ酸カルシウムなどである。
【０２８３】
ポリアミドオリゴマーまたはポリマー性化合物、例えばリグニン、水溶性ビニルコポリマーまたはセルロースエーテル、アクリルポリマーおよび／またはポリアミドは、酵素調製物を、特に物理的影響またはｐＨ変動に対して安定化する。ポリアミンＮ-オキシド含有ポリマーは、酵素安定剤として、および色移行抑制剤として同時に作用する。他のポリマー性安定剤は直鎖Ｃ8-18ポリオキシアルキレンである。また、アルキルポリグリコシドは、本発明の組成物の酵素成分を安定化することもでき、さらにその性能をさらに増大させることも好ましい。架橋した窒素含有化合物は、汚れ遊離剤としておよび酵素安定剤として、二重の機能を有利に発揮する。疎水性のノニオン性ポリマーは、特に、所望により含有し得るセルラーゼを安定化する。
【０２８４】
還元剤および酸化防止剤は、酸化崩壊に対する酵素の安定性を増大させる。イオウ含有の還元剤は、この目的に対して一般的である。他の例は、亜硫酸ナトリウムおよび還元糖である。
【０２８５】
また、安定剤の組合せ、例えば、ポリオール、ホウ酸および／またはホウ砂の組合せ、ホウ酸またはホウ酸塩、還元性塩およびコハク酸または他のジカルボン酸の組合せ、あるいは、ホウ酸またはホウ酸塩とポリオールまたはポリアミノ化合物との、および還元性塩との組合せは、特に好ましく用いられる。ペプチドアルデヒド安定剤の作用は、ホウ酸および／またはホウ酸誘導体およびポリオールとの組合せによって増大し、二価カチオン、例えばカルシウムイオンの追加作用によってさらに増強される。
【０２８６】
本発明の組成物は、あらゆる考えられる形態で提供することができるので、特定の組成物に添加するのに適する任意の配合物の形態にある本発明の酵素またはタンパク質は、本発明のそれぞれの態様である。これらには、例えば、液体配合物、固体顆粒またはカプセル剤が含まれる。
【０２８７】
カプセル化された形態は、酵素または他の構成成分を他の成分、例えば漂白剤から保護するか、または制御された放出を可能にするために提案される。これらのカプセルの大きさに依存して、該カプセルはミリカプセル、ミクロカプセルおよびナノカプセルに分けられ、ミクロカプセルが酵素にとって特に好ましい。このようなカプセルは、例えば、特許国際出願公開 ＷＯ ９７／２４１７７およびＤＥ１９９１８２６７に開示されている。可能なカプセル化法は、タンパク質溶液とデンプンまたはデンプン誘導体の溶液または懸濁液との混合物から出発して、この物質中でタンパク質をカプセル化することを含む。このようなカプセル化法が、国際特許出願公開 ＷＯ ０１／３８４７１に記載されている。
【０２８８】
固体組成物の場合、タンパク質を、例えば、乾燥、顆粒化および／またはカプセル化した形態で使用することができる。それらを、別々に、即ち独立した相として、または他の構成成分と一緒に同じ相において、圧縮するかまたは圧縮せずに添加することができる。ミクロカプセル化した酵素を固体形態に加工するときには、先行技術から既知の方法、例えば噴霧乾燥、遠心除去または再可溶化を用いて、処理に起因する水溶液から水を除去することができる。このようにして得られた粒子は、通常、大きさが５０〜２００μｍである。
【０２８９】
本発明の液体、ゲル状またはペースト状の組成物に、酵素および本発明のタンパク質(先行技術に従って行うタンパク質回収から出発する)、および調製物を、濃縮された水溶液もしくは非水性溶液、懸濁液またはエマルジョンにおいて、さらにゲル形態もしくはカプセル化した形態において、または乾燥粉末として添加することができる。通常、本発明のこのような洗浄剤または清浄剤は、成分を単に混合することによって調製され、成分を固体または溶液として自動ミキサーに導入することができる。
【０２９０】
一次洗浄性能に加えて、洗浄組成物において含まれるプロテアーゼは、例えば、国際特許出願公開 ＷＯ９４/２９４２６またはＥＰ７４７４７１に開示しているように、タンパク質分解性開裂により他の酵素成分を活性化するか、または適切な作用期間の後にそれらを不活性するさらなる機能をも満たし得る。しかし、同等の調節機能が本発明のタンパク質により可能である。本発明の一実施態様は、プロテアーゼ感受性材料のカプセルを含有する組成物であり、このカプセルが、例えば、意図した時間内で本発明のタンパク質によって加水分解され、その内容物が放出される組成物である。同程度の効果が、他の多相組成物によって達成され得る。
【０２９１】
さらなる実施態様は、織物素材を処理するための、または織物の手入れのための組成物であり、この組成物は本発明のアルカリプロテアーゼを含有する。
【０２９２】
別の実施態様は、天然成分、特にウールまたはシルクを含有する繊維または織物を処理するための組成物である。
【０２９３】
特にウールまたはシルクなどの天然繊維は、特徴的な顕微鏡的な表面構造によって区別される。このような表面構造は、例えばR.Breierによる先行論文[Melliand Textilberichte、4.1.2000 (p.263)]において、ウールについて例示的に議論されているように、長期間で望ましくない影響、例えばフェルト化などをもたらし得る。このような影響を回避するために、天然原料を本発明の組成物で処理すると、本発明の組成物は、例えばタンパク質構造に基づいて剥離した表面構造を滑らかにするように寄与し、これによってフェルト化を防ぎうる。
【０２９４】
好ましい実施態様において、本発明のプロテアーゼを含有する組成物は、例えば、洗浄過程に加えることによって、洗浄後に利用するかまたは洗浄とは独立して適用することによって、ケア剤として定期的に使用されうるように、考えられる。所望の効果は、長期間にわたって織物の滑らかな表面構造を得ること、および／または生地の損傷を防止および／または軽減することである。
【０２９５】
本発明の別の対象は、織物または硬表面の機械清浄のための方法であって、この方法では、本発明のアルカリプロテアーゼがこの方法の過程の少なくとも一つにおいて活性となる。
【０２９６】
それらの中で、本発明のアルカリプロテアーゼが適用あたり４０μｇ〜４ｇ、好ましくは５０μｇ〜３ｇ、特に好ましくは１００μｇ〜２ｇ、なお特に好ましくは２００μｇ〜１ｇの量で使用され得るような方法が、好ましい。各ケースにおいて、これらの各数字の範囲の間にある全ての整数および整数でない値も包含される。
【０２９７】
これら方法には、手による方法および機械による方法の両方が含まれるが、機械による方法の方が、例えば使用量および作用時間の点で、より正確に制御することができるので好ましい。
【０２９８】
一般に、織物を清浄するための方法は、種々の清浄活性を有する物質を清浄すべき材料に適用することおよび作用時間の後にそれらを洗い流すことを含む複数の工程によって、あるいは、清浄すべき材料が洗浄剤または該組成物の溶液を用いて他のいずれかの方法で処理されることによって区別される。同様に、硬表面なる用語のもとに分類される織物以外の全ての材料を清浄するための方法にも当てはまる。全ての考えられる洗浄または清浄方法は、本発明の少なくとも１つ方法の過程において本発明のタンパク質により富化させることができ、これらの方法は本発明の態様となる。
【０２９９】
本発明の好ましい酵素は、既に天然にタンパク質溶解活性を保持しており、また、該活性をそれ以外には洗浄力を持たない媒体、例えば単なる緩衝液において発揮するので、織物の機械清浄のためのこのような方法の個々の部分工程は、所望により安定化化合物、塩または緩衝物質に加えて、本発明の酵素を、唯一の清浄活性を持つ成分として適用することもできる。これが、本発明の特に好ましい実施態様である。
【０３００】
このような方法のさらに好ましい態様は、関連のある本発明のアルカリプロテアーゼは、本発明の組成物、好ましくは本発明の洗浄剤または清浄剤のための上記記載の調製物のいずれかの範囲内で調製され得る。
【０３０１】
本発明の目的に関する好ましい実施態様は、本発明のアルカリプロテアーゼが、少なくとも一つの本方法の過程において活性となる、織物素材を処理するためのまたは織物の手入れのための方法である。
【０３０２】
それらの中で、天然成分を有する織物素材、繊維または織物のための方法が好ましく、特にウールまたはシルクを有する織物素材、繊維または織物のための方法である。
【０３０３】
これらは、例えば、材料を織物に加工するための方法、例えば抗フェルト仕上げのために調製する方法、あるいは、例えばケア成分を着古した織物の清浄に添加する方法であり得る。天然のタンパク質含有の原料に対するプロテアーゼの上記作用のゆえに、好ましい実施態様おいて、該方法は、天然成分、特にウールまたはシルクを含有する織物素材、繊維または織物を処理するための方法を包含する。
【０３０４】
本発明の別の目的は、織物または硬表面を清浄するために上記した、本発明のアルカリプロテアーゼの使用である。
【０３０５】
上記した濃度範囲は、これらの使用に当てはまる。
【０３０６】
本発明のプロテアーゼは、特に、上記特性および上記方法に従って、織物または硬表面からタンパク質を含有している汚れを除去するために使用できる。実施態様は、例えば、織物または硬表面から、染み汚れの手洗いまたは手による除去、あるいは機械的方法と組み合わせた使用である。
【０３０７】
この使用の好ましい実施態様において、関連のある本発明のアルカリプロテアーゼは、本発明の組成物、好ましくは洗浄剤または清浄剤のために上記調製物のいずれかの範囲で調製される。
【０３０８】
本発明のこの対象のさらなる実施態様は、洗浄剤または清浄剤の成分の活性化または不活性化のための、本発明のアルカリプロテアーゼの使用である。
【０３０９】
既知のように、洗浄剤または清浄剤のタンパク質成分をプロテアーゼの作用によって不活性化され得る。それ以外ではむしろ望ましくない効果をもたらすものを用いることは、本発明の目的である。同様に、例えば国際特許出願公開 ＷＯ ００/０１８３１Ａ２に開示されているように、実際の酵素とそれに適合する阻害剤のハイブリッドタンパク質である場合に、上記したようにタンパク質分解によって別の成を活性化することもできる。この種の制御の別の例は、活性成分が、その活性を保護または制御するために、タンパク質分解によって攻撃される物質中にカプセル化様式で存在している場合である。即ち、本発明のタンパク質は、特に多相製品において、不活性化反応、活性化反応または放出反応のために使用され得る。
【０３１０】
上記してきたことに対応して、下記使用もまた本発明の実施態様である：
−織物製造において、素材原料または中間製品の調製または処理のための、特に織物布製品の上の保護層を除去するための、本発明のアルカリプロテアーゼの使用；
−織物素材原料を処理するため、または織物を手入れするための本発明のアルカリプロテアーゼの使用；および、それらの中で好ましくは、
−天然成分を含有する織物素材原料、繊維または織物、特にウールまたはシルクを含有するもののための対応する使用。
【０３１１】
本発明は、また、本発明のアルカリプロテアーゼを含有している組成物の製品形態、すなわち化粧品の形態にあると理解される。これらの中のもので、ヒトの皮膚または毛髪用の全ての型の清浄および手入れ用組成物は、特に清浄組成物と解される。
【０３１２】
またプロテアーゼは、ヒト皮膚の細胞再生過程において重要な役割を果たす[T.Egelrudら、Acta Derm.Venerol.、Vol.71 (1991)、p.471-747]。したがって、プロテアーゼは、乾燥皮膚において増大するデスモソーム構造の分解を助けるために、皮膚ケア組成物における生物活性成分としても使用される。化粧品を目的とした、位置Ｒ９９Ｇ/Ａ/Ｓ、Ｓ１５４Ｄ/Ｅおよび/またはＬ２１１Ｄ/Ｅにおいけるアミノ酸交換を有するスブチリシンプロテアーゼの使用は、例えばＷＯ９７/０７７７０ Ａ１に記載されている。上記してきたことと対応して、本発明のプロテアーゼは、対応する点突然変異によって、さらに開発され得る。本発明のプロテアーゼ(特に、その活性が、例えば突然変異誘発後に、またはそれと相互作用する適当な物質の添加により制御されているプロテアーゼ)は、皮膚または毛髪清浄用組成物あるいはケア組成物における活性成分としても好適である。特に好ましいのは、上記したように、例えば巨大分子担体への結合によって安定化されており(ＵＳ５２３０８９１を参照)、そして／または、そのヒト皮膚との適合性が増大するように高アレルギー誘発性位置での点突然変異によって誘導体化されている、これらの酵素の調製物である。
【０３１３】
従って、化粧品目的のためのこの種のタンパク質分解酵素の使用も、本発明のこの対象に含まれ、特に対応する組成物、例えばシャンプー、石鹸または洗浄ローションなど、または例えばクリームの形態で提供されるケア組成物が含まれる。また、剥離用医薬品における使用またはその製造も、本発明に含まれる。
【０３１４】
洗浄剤および清浄剤および化粧用品における使用に加えて、プロテアーゼ、特にスブチラーゼの多くの適用の可能性が、先行技術において確立されている。この概説は、例えば、H.Uhligによるマニュアル「Industrial enzymes and their applications」[Wiley出版、New York、1998]に示される。全てのこれらの技術は、本発明のアルカリプロテアーゼ包含によって増強され得る。本発明のアルカリプロテアーゼを用いてさらに開発しうることがわかったときには、それらは本発明の保護の範囲内に含まれる。これは、特に下記の用途範囲を包含する：
−低分子量化合物またはタンパク質の生物化学的な分析または合成のための、本発明のアルカリプロテアーゼの使用;
−これらの中で、好ましいのはペプチド配列分析の範囲において末端キャップ基決定のための好ましい使用；
−天然物質または生物学的に有用な物質の、製造、精製または合成のための本発明のアルカリプロテアーゼの使用、好ましくは対応する組成物または方法の範囲内での使用；
−タンパク質または他の低分子量化合物の合成のための本発明のアルカリプロテアーゼの使用;
−天然素材原料、特に表面処置のための、特に皮革処理のための方法、好ましくは対応する組成物または方法における、本発明のアルカリプロテアーゼの使用;
−写真用フィルムの処理のための、特にゼラチン含有または同様の保護層の除去のための、本発明のアルカリプロテアーゼの使用；および
−食品または動物飼料の調製のための本発明のアルカリプロテアーゼの使用。
【０３１５】
基本的には、本明細書中に示された新規アルカリプロテアーゼまたは本明細書に基づく方法または使用によって増強されるあらゆる技術分野は、発明に包含される。
【０３１６】
次の実施例は本発明を説明するものであるが、実施例によって制限されるものではない。
【０３１７】
実施例
全ての分子生物学的な実施工程は、例えば、Fritsch、SambrookおよびManiatisによるマニュアル「Molecular cloning：a laboratory manual」[Cold Spring Harbour Laboratory Press、New York、1989]あるいは同等の関連研究において示されているような標準法に従う。酵素およびキットは、それぞれの製造元の指示書に従って使用した。
【実施例１】
【０３１８】
土壌環境からの細胞材料を採取すること
ドイツ国内の様々な場所から採取した土壌サンプルを水中にとり、３０分間静置し、縣濁液を沈殿させた。上清をＨＳＰ１０固体培地（０.１g 酵母抽出物（Difco, Heidelberg);０.１g カゼインペプトン、トリプシン消化物、Difco; ０.１g 可溶性デンプン(Merck, order no. 1.01251); ２g Ｎａ2ＣＯ3;１０００ mlにする蒸留水；ｐＨ１０）を有する５％寒天プレートに播種し、約２週間３０℃で培養した。得られる細菌の層状物を寒天表面から機械的に採取した。
【実施例２】
【０３１９】
発現ジーンバンクの準備
選択した発現系は、Escherichia coli ＤＨ１２ＳにおいてベクターｐＵＣ１８ (GenBank, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; access no L08752; 図５)であった。このベクターは、ＩＰＴＧの添加により誘導し得るｌａｃオペロンのβ-ガラクトシダーゼプロモーターを担持し、そのためこれらの細胞での複数のクローニング位置に組み込まれたＤＮＡの制御された発現が可能になる。ＤＨ１２Ｓ株は、ｌａｃＩｑ遺伝子型のゆえにＩＰＴＧ誘導に適切であり、それが十分に低い内生タンパク質分解活性を示すために、プロテアーゼ活性のスクリーニングに有利である。また、予備実験からＥ．coli ＪＭ１０９が同じ基準を満たすことも明らかとなった。
【０３２０】
実施例１に従って得られたサンプル由来のＤＮＡ処理を、Zhouら [(1996), Appl. Environ. Microbiol., Volume 62, pp. 316-322]に従って行った。この精製メタゲノムＤＮＡ（下記を参照されたい）を、２〜１０ kbの範囲にあるフラグメントサイズの調製のために制限酵素ＡｌｕＩを用いて分取用の部分制限に供した。
【０３２１】
この目的のために、まず至適制限インキュベーション時間を、酵素速度を記録することによって決定した。このために、ＡｌｕＩ(New England Biolabs, Schwalbach, Germany; catalog no. R0137S)の製造会社より提供された適当な反応緩衝液中でＤＮＡ（２.８μg）調製物を３７℃でインキュベーションした。該反応を、ＤＮＡ１μgあたり０.２Ｕ Ａｌu Iを添加することによって全容量(２１μl)において開始し、その後２分間隔で、各々１.５μl部をバッチから採取し、この反応を、各ケースにおいて１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ/ＨＣｌ、ｐＨ７.０；２０％グリセロール；および０.１％ ＳＤＳを添加し、０℃に冷却して、直ちに停止させた。０.７％アガロースゲル上での二次分析によって、部分消化のための至適制限時間を確認した。実施例１に従って単離されたＤＮＡ単離に対して、２〜１０ kbのサイズ範囲のフラグメントを得るためにその時間は約６〜７分間である。
【０３２２】
従って、分取用の部分消化は、３０の平行バッチで実施した。適切な反応停止後、該バッチを分取用０.７％アガロースゲル上で電気的に分離し、２−１０kb サイズのＤＮＡ含有ゲル領域を切り出し、４℃での透析チューブにおける電気溶出によりＤＮＡを単離した。最終的に、該ＤＮＡを、１/１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２.５倍容量のエタノールを用いて沈殿させ、十分な容量で取出した。存在しているであろう全ての小さなＤＮＡフラグメントをさらに分離するために、ゲル電気泳動、電気せん孔法および沈殿を反復した。
【０３２３】
そうして得られたフラグメント化されたメタゲノムＤＮＡ（４４０ ng）を、１x リガーゼ緩衝液中のＴ４ ＤＮＡリガーゼの４００ ＮＥＢユニットを添加したｐＵＣ１８ ベクター（１００ng）を含む全容量（１５μl）中で、終夜１６℃でライゲーションを行った。このベクターは、予めＳmaＩによって直線化されており、子ウシ胸腺由来のアルカリフォスファターゼによって脱リン酸化されている。
【０３２４】
コンピテントセルＥ.coli ＤＨ１２Ｓ(Gibco Life Technologies, Karlsruhe, catalog no. 18312017)の形質転換を、電気的形質転換によって行った。このために、電気せん孔法キュベット中でライゲーションバッチ（１μl）および細胞（２５μl）を混合し、１分間氷上でインキュベートし、製造指示書に従って電気せん孔器において処理した(BTX（登録商標）ECM630, Genetronics Inc. San Diego, USA)。ＳＯＣ培地(２％ バクトトリプトン;０.５％ 酵母抽出物;１０ｍＭ ＮａＣｌ；２.５ ｍＭ ＫＣｌ；ｐＨ７.０、ＮａＯＨで調整済；オートクレーブ済；１０ｍＭ ＭｇＳＯ４およびＭｇＣｌ２および２０ｍＭ Ｄ（＋）グルコースによって補充される)（１ml）に迅速に移行させた後、１時間３７℃の回復相および実施例１のとおりにＨＳＰ１０を有する寒天プレート上に播種し、次いで固体培地を入れた。
【実施例３】
【０３２５】
タンパク質分解活性のスクリーニング
Ｅ.coli ＤＨ１２Ｓでの実施例２に従って作成されたジーンバンクの品質を調べるために、生じた一次形質転換体の数および挿入体担持クローンの数を、試験プレートにおける青/白色選択によって決定した。このために、形質転換バッチの１および１０μl各部を、１００μg/mlアンプリコン、０.２ ｍＭ(または４μg/ml)ＩＰＴＧおよび０.２ｍＭ (または１μg/ml) Ｘ−Ｇａｌをさらに添加したＬＢ培地(１０g トリプトン、５g 酵母抽出物、５g ＮａＣｌ、１ml １Ｎ ＮａＯＨ／ｌ)による５％寒天プレートに播種し、終夜３７℃でインキュベートした。１０個の白色コロニー(即ち、形質転換体)から、プラスミドを、ミニ-プリパレーション(Qiagen, Hilden, Germanyのキット)によって単離し、挿入物を切り出すために(図３を参照)、制限酵素Ｓａｃ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて制限消化を行い、フラグメントを０.７％アガロースゲル上で分離した。実際に、全てのベクターは、約２〜１０kbサイズの挿入体を含有した。
【０３２６】
本発明の実施例２に従って生成したジーンバンクのスクリーニングを、２％スキムミルク粉末(Difco, order no. 232100)を加えたＬＢ培地アンプリコン/ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ(上記を参照されたい)を用いる直径１４cmの５％寒天プレート上で行った。各ケースにおいて形質転換バッチのバンク容量の力価に対応して、これらの選択寒天プレートの１０プレート上に、約１００００cfuを、ガラスビーズを用いて均一に播種した(一次播種)。
【０３２７】
３７℃で１６時間のインキュベーション後、該プレートを、２８℃で２週間インキュベートした。この間に、不透明な基質中の清澄な分解孔により、プロテアーゼを形成するクローンが明らかとなった。排出されていないプロテアーゼの検出には別の細胞溶菌は必要なかった。プラスミド介在プロテアーゼ形成の評価を、一次クローンの新たな単離、次いで適切な挿入体を含有しているｐＵＣ１８ ベクターの単離、再度の形質転換、新たなスクリーニング(上記のような；二次播種)を行った。こうして行った形質転換体は、同様にスキムミルク培地上で分解孔形成を示し、こうして、各々クローニングしたＤＮＡフラグメント上のプロテアーゼ遺伝子の位置を確認した。
【実施例４】
【０３２８】
実施例４
タンパク質分解活性クローンの配列分析
実施例３に従って得られたＨＰ７０Ｐａ_２を有するプロテアーゼ陽性クローンから、プラスミドＤＮＡを、標準的方法を用いて単離し、挿入体をＳａｃＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ消化(上記参照)によって調製し、標準的方法に従って配列決定した。ベクターに特異的であって、Ｍ１３ｆおよびＭ１３ｒと称される配列番号：１および２の挿入体を挟んでいるプライマーをまず使用して、先行技術［R.J. Kaiser et al. (1989):"Specific primer-directed DNA sequencing using automated fluorescence detection,"Nucl. Acids Res., 17 (15), pp. 6087-6102)］より知られるいわゆるプライマーウォーキングに供した。
【０３２９】
このクローンの配列決定によって、ＤＮＡ配列が配列番号：３に示されるオープンリーディングフレームを持つ領域を得た。その起源から、生物としては「未知」として記載されており、さらにこの配列はＤＮＡの単離に帰するべきであることがさらに記載される。さらに、本発明のデータ（特に配列比較による、下記を参照されたい）から、ヌクレオチド位置１〜９６はシグナルペプチドをコードし、全体のコード領域は１〜１７４６にわたると推測される。配列番号：４は、これから得られたアミノ酸配列を開示しており、起源に対して同一データを示す。
【０３３０】
記載された最も近縁の類似酵素として、Xanthomonas campestris pv. campestris(ATCC33913)由来の細胞外セリンプロテアーゼ（E.C.3.4.21.-）が見出され、GenBank(National Center for Biotechnology Informatin NCCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, U.S.A.)で、アクセス番号ＮＰ_636242を持つ。特定のデフォルトパラメーター用いて、InforMax, Inc., Bethesda, USAから得られるコンピュータープログラムベクター ＮＴＩ（登録商標）Suite 7.0によって確認したアミノ酸レベルの同一性は、ＨＰ７０に対して７５．０％同一である。この探索において見出されたさらなるタンパク質は、アミノ酸レベルでは依然最も類似性が高いことが明らかとなり、下記表１にまとめられる。
【０３３１】
【表１】
2007533312.tif 000004
【０３３２】
ＤＮＡレベルでは、Xanthomonas campestris pv. campestris (遺伝子ID XCC0851)由来の細胞外セリンプロテアーゼ（E.C.3.4.21.-）の遺伝子に対して、７４．４％の同一性を得た。
【０３３３】
すなわち、発見されたプロテアーゼは、最も高い可能性のある類似のセリンプロテアーゼである。確立されたB.lentus アルカリプロテアーゼ (ＷＯ９２/２１７６０ Ａ１)に対して２６．２％同一性の相同性がアミノ酸レベルで生じ、核酸レベルで３３．６％の同一性を生じる。
【０３３４】
表記名７０-ｐＵＣ(ＡＷＢ４０３)を有する関連ベクターを、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124, Braunschweig (http://www.dsmz.de)で、２００３年１０月２日に寄託し、受託番号 ＤＳＭ １５９７７をもつ。それによりコードされるプロテアーゼをＨＰ７０と示す。
【実施例５】
【０３３５】
タンパク質分解活性クロ−ン（ＨＰ５３Ｐa_２）の配列分析
実施例３で得られた表記名ＨＰ５３Ｐa_２を有するさらなるプロテアーゼ陽性クローンから、挿入体を実施例４のとおりに調製し、配列決定した。得られた配列は、配列番号：６および７に示した。その起源から、生物を「未知」として記載し、さらにこれらの配列は、ＤＮＡの単離に帰するべきであると考えられるべきである。さらに、本発明のデータのから（特に配列比較によって、下記を参照されたい）、ヌクレオチド位置１〜１１４はシグナルペプチドをコードし、全体のコード領域は１〜１７６１にわたると推測される。
【０３３６】
それは、別のスブチリシンプロテアーゼであり、これはアミノ酸レベルで、各ケースにおいて最も類似するものとして決定されたXanthomonas campestris pv. campestris(ATCC33913)由来の細胞外セリンプロテアーゼ（E.C.3.4.21.-）に対して、７５．４％同一の相同性を持つ。この探索においてアミノ酸レベルでは依然最も類似性が高いことが明らかとなったさらなるタンパク質を下記表２にまとめた。
【０３３７】
【表２】
2007533312.tif 000005
【０３３８】
ＤＮＡレベルでは、Xanthomonas campestris pv. campestris 由来の細胞外セリンプロテアーゼ（E.C.3.4.21.-）の遺伝子に対して、７５．０％の同一性を得た。
【０３３９】
アミノ酸レベルで２５．９％同一の相同性および核酸レベルで３３．５％の同一を、確立されたB.lentus アルカリプロテアーゼ（ＷＯ９２／２１７６０Ａ１）に対して得る。
【０３４０】
表記名５３-ｐＵＣ(ＡＷＢ４０３)を有する関連ベクターを、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124, Braunschweig (http://www.dsmz.de)で、２００３年１０月２日に寄託し、受託番号 ＤＳＭ １５９７６をもつ。それによりコードされるプロテアーゼをＨＰ５３と示す。
【実施例６】
【０３４１】
ＨＰ７０およびＨＰ５３のＣ末端削除突然変異体の産生
ＨＰ７０ｄｃ
実施例３に従って得られ、実施例４に記載された表記名ＨＰ７０Ｐa_２を持つクローンのプロテアーゼから、Ｃ’末端の３３２ｂｐを削除した。このアミノ酸配列ＨＰ７０_deltaＣを、配列番号：５に示した。その構成から、それは合成配列であり、詳説「ＤＮＡ単離、DeltaＣ」によって具体化されるということに注目されたい。配列番号：３および４に従って、位置１〜３２の断片は、シグナルペプチドと考えられ得る。
【０３４２】
このために、標準的ＰＣＲ条件下で、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＨＰ７０ｆ（配列番号：１０）およびＨＰ７０ｒ（配列番号：１１）を用いて、１４１３ｂｐサイズのＤＮＡ片を、配列番号：３に示したＤＮＡから得た。エンドヌクレアーゼＥcoＲＩおよびＢamＨＩを用いて、得られたフラグメントを処理した後、フラグメントをＥ.coli発現ベクターpＵＣ１８の対応する解裂部位へクローニングし、適当な株（例えばＥ.coliＤＨ１２Ｓ）で形質転換した。得られた形質転換体から、青色／白色選択によって、所望の候補体を、同定し、活発に発現し、次の試験のために十分量で得ることができた。
【０３４３】
実施例３に従って得られ、実施例５に記載された表記名ＨＰ５３Ｐa_２を持つクローンのプロテアーゼから、Ｃ’末端の３３０ｂｐを削除した。このアミノ酸配列ＨＰ５３_deltaＣを、配列番号：８に示した。
【０３４４】
このために、標準的ＰＣＲ条件下で、オリゴヌクレオチドＨＰ５３ｆ（配列番号：１２）およびＨＰ５３ｒ（配列番号：１３）をプライマーとして用いて、１３０３ｂｐサイズＤＮＡ片を、配列番号：６に示したＤＮＡ片から得た。エンドヌクレアーゼＢｌｐＩおよびＢamＨＩを用いて、得られたフラグメントを処理した後、フラグメントを、実施例の最初の部分において上記で得られたＥ.coli発現ベクターpＵＣ１８_ＨＰ７０_ｄｃの対応する解裂部位（これは同じエンドヌクレアーゼを用いて事前に処理されている）へクローニングした。
【０３４５】
適当な株（例えばＥ.coliＤＨ１２Ｓ）で形質転換した後、所望の候補体を、同定し、活発に発現し、ＳａｃＩＩ(ｐＵＣ_ＨＰ５３_ｄｃはこのような解裂部位を含有する)を用いる制限分析によって得られる形質転換体から次の試験のための十分量で得ることができる。
【０３４６】
その構成から、配列番号：５の場合と同じように、それは合成配列であり、詳説「ＤＮＡ単離、DeltaＣ」によって具体化されるということに注目されたい。さらに、ＨＰ７０のシグナルペプチドとして考えられるような配列番号：５の位置１〜３２断片を導入した。
【実施例７】
【０３４７】
本発明のプロテアーゼの定量的獲得およびその生物化学的特徴
本発明３〜６に従って得られた発現クローンを、ＬＢ培地(１０g トリプトン、５g 酵母抽出物、５g ＮａＣｌ、１０ｇ ＮａＯＨ／ｌ)(１００ｍｌ)中に採り出し、５００ｍｌのエーレンマイヤーフラスコにおいて、３７℃、２００ｒｐｍで振盪しながら培養した。
【０３４８】
次いで、それらを生物化学的に特徴付けた。ここでは、タンパク質分解活性を、フルオロフォア(エミッター)およびクエンチャーが結合している蛍光結合カゼイン基質(BODIPY（登録商標）FL Conjugate, Molecular Probes, Goettingen, Germany; order no. #6638)を基にした「ＭＴＰアッセイ」によって決定した。無傷の基質では、エミッターの蛍光はクエンチャーによって抑制される。カゼインの加水分解によって、オリゴペプチドと共に結合した基が、互いから分離して、対応する励起によって蛍光放出が生じる、すなわちこの強度がタンパク質の分解尺度を表す。
【０３４９】
活性決定のために、各ケースにおいて実施例５のプロテアーゼサンプル（５μl）を、所望のｐＨを有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、４.５μg/ml BODIPY(登録商標) FL ConjugateＩの全容量（１００μl）で、１時間、目的とする温度で各々インキュベートした。これ以降に示す全ての測定は、FLUOstar（登録商標）蛍光計測器(BMG Lab Technologies, Offenburg, Germany)を用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート(Opaque（登録商標） Plates, black; Corning BV Life Sciences, Schiphol-Rijk, Netherlands; order no. #3915)で実施した。
【０３５０】
至適ｐＨおよび至適温度
配列番号：７に示したプロテアーゼＨＰ５３について、下記生物化学的パラメータの結果：３７℃での至適ｐＨ：８．６、ｐＨ８．６での至適温度：３７℃。
【０３５１】
錯化剤の影響
錯化剤の影響を、上記アッセイにおいて、特に３７℃、５０℃で、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８.６）を添加することによって調べた。ＥＤＴＡを添加せずに測定した値を１００％と設定した。一方、５０℃での相対タンパク質分解活性は２７％であり、３７℃では１０％であった。
【０３５２】
安定性測定
安定性を測定するために、用いるプロテアーゼサンプルを、まず５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３ 緩衝液（ｐＨ１０.９）中で１５分間プレインキュベートし、上記アッセイにおける残存活性を、各ケースｐＨ８.６、３７℃および５０℃で測定した。プレインキュベーションはしないが、その他は同じ処理を用いる同じ抽出物の活性を、各ケース１００％と設定した。３７℃で測定した残存活性は１１％であり、５０℃で測定した残存活性は１３％であった。
【０３５３】
従って、これらの分子は、高ｐＨ値に対して比較的安定であり、温度とはほぼ独立している。
【実施例８】
【０３５４】
比較的低温での洗浄性能に対する本発明のプロテアーゼ ＨＰ７０の寄与
Eidgenoessische Material-Pruefungs- und Versuchsanstalt（EMPA）から規格化されている、汚れた標準的な織物を使用した。この場合において、下記の汚れおよび織物を使用した：Ａ(綿上の、血液／ミルク／インク)、Ｂ(ポリエステル-綿ブレンド上の、血液／ミルク／インク)、Ｃ(綿上の、卵、すす)。
【０３５５】
この試験材料を用い、洗濯計(launderometer)を用いて、種々の洗浄製品調製物の洗浄性能について試験した。このために、液比を各ケースで１：１２に設定し、洗浄を４０℃の温度で３０分間行った。該用量は、１Ｌの洗浄液体あたり、各組成物５.９ｇであった。水硬度は１６゜ドイツ硬度であった。
【０３５６】
使用した対照の洗浄剤は、以下の組成からなる基本の洗浄配合物であった(全ての値は重量％である)：４％直鎖アルキルベンゼンスルホネート(ナトリウム塩)、４％Ｃ12-Ｃ18脂肪アルコールスルフェート(ナトリウム塩)、７ＥＯを有する５.５％Ｃ12-Ｃ18脂肪アルコール、１％ナトリウム石鹸、１１％炭酸ナトリウム、２.５％無定形二ケイ酸ナトリウム、２０％過ホウ酸ナトリウム・４水和物、５.５％ＴＡＥＤ、２５％ゼオライトＡ、４.５％ポリカルボキシレート、０.５％ホスホネート、２.５％発泡抑制剤顆粒、５％硫酸ナトリウム、残り：水、光学増白剤、塩。
【０３５７】
本発明のプロテアーゼと対照のプロテアーゼと、各ケース活性が同じとなるように並行バッチにおいて処理した。対照としてB.lentus アルカリプロテアーゼ Ｆ４９(ＷＯ ９５/２３２２１ Ａ１；製造元：Biozym, Kundl, Austria)を使用した。これは、約２０００００ＰＥ／ｇの比活性(明細書中に示した方法に従って決定し得る)を持ち、そこで０.２重量％、約４００００ＰＥ／１００g組成物のＦ４９濃度および約２４００ＰＥ／ｌ洗浄液の活性を示す。各ケースにおいて０.５％プロテアーゼ、即ち２.５倍のプロテアーゼ量を含有した処方を、対応する量のナトリウム塩を分配して作成した。本発明のプロテアーゼを、同じ活性濃度で同じ基本調製物に添加した。この点において、下記の表においてＦ４９に対して示した重量％値は、正確であり、ＨＰ７０についても近似的に使用し得る。
【０３５８】
洗浄後、洗浄した織物の白さの程度を、硫酸バリウムの白さ(これを１００％に標準化化した)と比較して測定した。測定を、Datacolor SF500-2分光計において、４６０ｎｍ(ＵＶトラップフィルター３)、３０ｍｍ開口度、光沢なし、Ｄ６５光源、１０°、ｄ／８°で行った。得られた結果を反射率(％)として記載した、即ち以下の表３における各々の場合において出発値と硫酸バリウムとの比較した割合(％)である。各々において３回の測定からの平均値を示す。これらは、使用した製品の洗浄性能に対する酵素成分の寄与について、直ちに結論を導くことを可能にする。
【０３５９】
【表３】
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【０３６０】
３つの全測定系により、プロテアーゼを含まない洗浄製品と比較して、本発明のプロテアーゼＨＰ７０がタンパク質含有汚れに対する洗浄性能を改善できることを実証する。即ち、それは、例えば界面活性剤などの変性剤存在下においてもタンパク質分解活性を示す。B.lentus アルカリプロテアーゼ Ｆ４９、即ち点突然誘発変異(ＷＯ 95/23221 A1を参照)によってこの使用分野に対して至適化された分子に対して決定された値は、試験方法の正確性を実証する。測定系Ａおよび最低濃度の測定系Ｂにおいて、ＨＰ７０はＦ４９に対する結果を超えるものであった；残りの値はＦ４９に対する値と同等であった。
試験方法の正確性を評価する
【実施例９】
【０３６１】
比較的低温での洗浄性能に対する本発明のプロテアーゼ ＨＰ５３の寄与
前記試験を、本発明のプロテアーゼＨＰ５３を用いて反復した。条件は同一である。しかし、汚れＣに代えて汚れＤ（綿上の血液）について、この性能を決定した。この結果を表４に示す。
【表４】
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これらの測定系により、本発明のプロテアーゼＨＰ５３が、タンパク質不含汚れと比較して、タンパク質含有汚れに対する洗浄性能を改善できることを実証する。即ち、変性剤、例えば界面活性剤または漂白剤の存在下でタンパク質分解活性を示す。決定された値は、少なくともB.lentus アルカリプロテアーゼＦ４９に対する値と同等であり、測定系ＡおよびＢにおいて明らかに優れている。
【実施例１０】
【０３６２】
比較的低温での洗浄性能に対する本発明のプロテアーゼ ＨＰ５３ｄｃの寄与
前記した２つの実施例のとおりに、変異体ＨＰ５３ｄｃを、汚れＡ、ＢおよびＣに関するその性能寄与について試験した。条件も同一である。この結果を次の表５にまとめた。
【表５】
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これらの測定系により、本発明のプロテアーゼＨＰ５３ｄｃが、タンパク質不含汚れと比較して、タンパク質含有汚れに対する洗浄性能を改善できることを実証する。即ち、変性剤、例えば界面活性剤または漂白剤の存在下であってもタンパク質分解活性を示す。測定系ＡおよびＢにおいて決定した値は、少なくともB.lentusアルカリプロテアーゼＦ４９についての値よりも明白に優れており、系Ｃにおいては少なくとも同程度である。
【実施例１１】
【０３６３】
比較的高温での洗浄性能に対する本発明のプロテアーゼ ＨＰ５３ｄｃの寄与
前記試験を、洗浄温度６０℃で、その他は同一条件下で、２つの汚れＡおよびＢに対してＨＰ５３を用いて繰り返した。
【表６】
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６０℃の温度であっても、これらの測定系ＡおよびＢにおいて、B.lentusアルカリプロテアーゼＦ４９に比べて本発明のプロテアーゼＨＰ５３ｄｃがの卓越性がみられる。幸いにも、本発明のプロテアーゼＨＰ５３ｄｃは顕著に変性されておらず、そのため洗浄剤プロテアーゼとして特に適当である。
【０３６４】
図１：先行技術のアルカリプロテアーゼと本発明のアルカリプロテアーゼ ＨＰ７０およびＨＰ５３(配列番号：４および７)のアラインメント。
図１中：
ＨＰ７０:配列番号：４に示した本発明のアルカリプロテアーゼ;
ＨＰ５３:配列番号：７に示した本発明のアルカリプロテアーゼ;
ＳＰ：Xanthomonas campestris p.v.campestris (ATCC33913)(GenBank、アクセス番号NP_636242)細胞外セリンプロテアーゼ（EC.3.4.21.-）；
ＢＬＡＰ：Bacillus lentus DSM 5483 (ＷＯ 92/21760 A1)からのアルカリプロテアーゼ;
図２：先行技術のアルカリプロテアーゼと本発明のアルカリプロテアーゼ ＨＰ７０およびＨＰ５３(配列番号：４および７)の遺伝子のアラインメント。
図２中：
ＨＰ７０:配列番号：３に示した本発明のアルカリプロテアーゼの遺伝子;
ＨＰ５３:配列番号：６に示した本発明のアルカリプロテアーゼの遺伝子;
ＳＰ：Xanthomonas campestris p.v.campestris (ATCC33913)(GenBankで、アクセス番号NP_636242)細胞外セリンプロテアーゼ（EC.3.4.21.-）の遺伝子；
ＢＬＡＰ：Bacillus lentus DSM 5483 (ＷＯ 92/21760 A1)からのアルカリプロテアーゼの遺伝子;
【０３６５】
図３：実施例２のような発現遺伝子バンクのセットアップのために使用したプラスミドベクターｐＵＣ１８の概略図
ベクターを、ＡｌｕＩで消化されたメタゲノムＤＮＡのセットアップのためにＳｍａＩを用いて直線化した。
図３中：
ＯＲＩ：複製起源
Ｐｌａｃ：ｌａｃプロモーター；
ｌａｃＺ−α：β-ガラクトシダーゼのαペプチドに対する遺伝子
ａｍｐＲ：アンピシリン耐性媒介β-ラクタマーゼ
【０３６６】
図４：配列番号：９のコンセンサス配列の開発のための本発明の２つのプロテアーゼ ＨＰ７０（配列番号：４）およびＨＰ５３(配列番号：７)のアミノ酸配列のアラインメント
可変部Ｘとしてそこに示したアミノ酸位置は、この図の結果としてＨＰ７０またはＨＰ５３のいずれかに属し得る。
【図面の簡単な説明】
【０３６７】
【図１】図１は、先行技術のアルカリプロテアーゼと本発明のアルカリプロテアーゼ ＨＰ７０およびＨＰ５３(配列番号：４および７)のアラインメントを示す。
【図２】図２は、先行技術のアルカリプロテアーゼと本発明のアルカリプロテアーゼ ＨＰ７０およびＨＰ５３(配列番号：４および７)の遺伝子のアラインメントを示す。
【図３】図３は、実施例２の発現遺伝子バンクのセットアップのために使用したプラスミドベクターｐＵＣ１８の概略図を示す。
【図４】図４は、配列番号：９のコンセンサス配列の開発のための本発明の２つのプロテアーゼ ＨＰ７０（配列番号：４）およびＨＰ５３(配列番号：７)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年12月20日(2006.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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