(57)【要約】本発明は、単一の増幅可能なプラスミドの構築を容易にするプラスミドシステムを提供し、このプラスミドは、独立した発現カセットを含み得る能力を有し、このプラスミドシステムは、抗体およびレセプターのようなマルチサブユニット複合タンパク質を発現する能力を有する。本発明は、とりわけ、ベクターの構築における均一性の維持を補助し得る、望ましい一般的なプラスミド発現系を提供し、この発現系は、下流のプロセッシングにおける可変性を減少すると同時に、複合的なタンパク質による治療計画の実行を容易にし、かつ時間間隔を顕著に減少する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミドシステムであって、以下のコンテナー：
（ａ）以下：
Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｓｎａ  Ｂ１、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ、Ａｓｐ  ７１８、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｐａｅ  Ｒ７１、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ａｃｃ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＶ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂａｍ  Ｈ１、Ｄｓａ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、Ｅｃｌ  ＸＩ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｘｍａ  ＩＩＩ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｂｓｒ  ＧＩ、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、
の第１のマルチクローニングサイトを含む、第１のユニバーサルトランスファーベクター；
（ｂ）以下：
Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｓｇｒ  ＡＩ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｒｓｒ  ＩＩ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓｎａ  Ｂ１、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ、Ａｓｐ  ７１８、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｐａｅ  Ｒ７１、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ａｃｃ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＶ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂａｍ  Ｈ１、Ｄｓａ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、Ｅｃｌ  ＸＩ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｘｍａ  ＩＩＩ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、
の第２のマルチクローニングサイトを含む、第２のユニバーサルトランスファーベクター；および
（ｃ）以下：
Ｓｇｒ  ＡＩ、Ｓｒｆ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｒｓｒ  ＩＩ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｆｓｅ  １、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｂｓｒ  ＧＩ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｂｂｖ  Ｃ１、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、
の第３のマルチクローニングサイトを含む、増幅可能なベクター；
を別個に含む、プラスミドシステム。
【請求項２】
前記第１のユニバーサルトランスファーベクターは、図２のプラスミド地図を含み、前記第２のユニバーサルトランスファーベクターは、図１のプラスミド地図を含み、そして前記増幅可能なベクターは、図３のプラスミド地図を含む、請求項１に記載のプラスミドシステム。
【請求項３】
前記第１のユニバーサルトランスファーベクターの前記マルチクローニングサイトは、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のプラスミドシステム。
【請求項４】
前記第２のユニバーサルトランスファーベクターの前記マルチクローニングサイトは、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のプラスミドシステム。
【請求項５】
前記増幅可能なベクターの前記マルチクローニングサイトは、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のプラスミドシステム。
【請求項６】
少なくとも１つの前記プラスミドは、前記マルチクローニングサイトの上流か、または該マルチクローニングサイト内に配置されるプロモーターを含む、請求項１に記載のプラスミドシステム。
【請求項７】
前記プロモーターは、ＳＲαプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスの末端反復配列（ＭＭＴＶ  ＬＴＲ）、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の最初期プロモーターおよびマウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）の最初期プロモーターから選択される、請求項６に記載のプラスミドシステム。
【請求項８】
前記第１のユニバーサルトランスファーベクターは、図１０のプラスミド地図を含む、請求項７に記載のプラスミドシステム。
【請求項９】
前記第２のユニバーサルトランスファーベクターは、図１１のプラスミド地図を含む、請求項７に記載のプラスミドシステム。
【請求項１０】
前記増幅可能なベクターは、図９のプラスミド地図を含む、請求項７に記載のプラスミドシステム。
【請求項１１】
前記第１のユニバーサルトランスファーベクターは、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のプラスミドシステム。
【請求項１２】
前記第２のユニバーサルトランスファーベクターは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のプラスミドシステム。
【請求項１３】
前記増幅可能なベクターは、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のプラスミドシステム。
【請求項１４】
少なくとも１つの前記ユニバーサルトランスファーベクターは、ターミネーター／ポリＡ付加部位を含む、請求項１に記載のプラスミドシステム。
【請求項１５】
前記増幅可能なベクターは、ＤＨＦＲ遺伝子を含む、請求項１に記載のプラスミドシステム。
【請求項１６】
プラスミドシステムであって、以下のコンテナー：
（ａ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む第１のユニバーサルトランスファーベクター；
（ｂ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む第２のユニバーサルトランスファーベクター；および
（ｃ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む増幅可能なベクター；
を別個に含む、プラスミドシステム。
【請求項１７】
上記カセットは、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖をコードする、請求項１に記載のプラスミドシステム。
【請求項１８】
前記第１のユニバーサルトランスファーベクターまたは前記第２のユニバーサルトランスファーベクターは、１つ以上の発現カセットの第１の組を含み、前記他のユニバーサルトランスファーベクターは、１つ以上の発現カセットの第２の組を含み、そして前記増幅可能なベクターは、該発現カセットの第１の組および該発現カセットの第２の組を含み；ここで：
（ａ）該１つ以上の発現カセットの第１の組は、抗ＩＬ５免疫グロブリン重鎖遺伝子の発現カセットを含み、そして該１つ以上の発現カセットの第２の組は、抗ＩＬ５免疫グロブリン軽鎖遺伝子の発現カセットを含むか；
（ｂ）該１つ以上の発現カセットの第１の組は、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン重鎖遺伝子の発現カセットを含み、そして該１つ以上の発現カセットの第２の組は、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン軽鎖遺伝子の発現カセットを含むか；
（ｃ）該１つ以上の発現カセットの第１の組は、バイシストロンの遺伝子発現カセットを含む発現カセットを含み、該バイシストロンの遺伝子は、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン軽鎖遺伝子およびＩＬ−２レセプターα遺伝子を含み、ここで該遺伝子は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって連結され、そして該１つ以上の発現カセットの第２の組は、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン重鎖遺伝子の発現カセットおよびハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットであるか；または
（ｄ）該１つ以上の発現カセットの第１の組は、抗ＩＬ１０免疫グロブリン重鎖遺伝子の発現カセットを含み、そして該１つ以上の発現カセットの第２の組は、抗ＩＬ１０免疫グロブリン軽鎖遺伝子の発現カセットおよびハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットを含む；
請求項１に記載のプラスミドシステム。
【請求項１９】
前記増幅可能なベクターは、図４〜図７から選択される図に示されるプラスミド地図を含む、請求項１８に記載のプラスミドシステム。
【請求項２０】
前記増幅可能なベクターは、配列番号６〜配列番号９から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載のプラスミドシステム。
【請求項２１】
前記第１のユニバーサルトランスファーベクター、前記第２のユニバーサルトランスファーベクター、または前記増幅可能なベクターは、マトリックス結合領域を含む、請求項１に記載のプラスミドシステム。
【請求項２２】
前記増幅可能なベクターは、（ａ）抗ＩＧＦＲ抗体の重鎖または抗ＩＬ１０抗体の重鎖および（ｂ）ピューロマイシン耐性マーカーまたはハイグロマイシン耐性マーカーを含む、請求項２１に記載のプラスミドシステム。
【請求項２３】
前記増幅可能なベクターは、図１３〜図１６からなる群より選択されるプラスミド地図によって特徴付けられる、請求項２１に記載のプラスミドシステム。
【請求項２４】
前記増幅可能なベクターは、配列番号２４〜配列番号２７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載のプラスミドシステム。
【請求項２５】
２つ以上の型のペプチドを含むタンパク質を産生するための方法であって、以下の工程：
（ａ）１つ以上の発現カセットの組を、以下：
Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｓｎａ  Ｂ１、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ、Ａｓｐ  ７１８、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｐａｅ  Ｒ７１，  Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ａｃｃ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＶ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂａｍ  Ｈ１、Ｄｓａ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、Ｅｃｌ  ＸＩ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｘｍａ  ＩＩＩ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｂｓｒ  ＧＩ、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、
の第１のマルチクローニングサイトを含む、第１のユニバーサルトランスファーベクター中に導入する工程；
（ｂ）１つ以上の異なる発現カセットの組を、以下：
Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｓｇｒ  ＡＩ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｒｓｒ  ＩＩ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓｎａ  Ｂ１、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ、Ａｓｐ  ７１８、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｐａｅ  Ｒ７１、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ａｃｃ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＶ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂａｍ  Ｈ１、Ｄｓａ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、Ｅｃｌ  ＸＩ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｘｍａ  ＩＩＩ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、
の第２のマルチクローニングサイトを含む、第２のユニバーサルトランスファーベクター中に導入する工程；
（ｃ）該カセットを該トランスファーベクターから、以下：
Ｓｇｒ  ＡＩ、Ｓｒｆ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｒｓｒ  ＩＩ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｆｓｅ  １、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｂｓｒ  ＧＩ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｂｂｖ  Ｃ１、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、
の第３のマルチクローニングサイトを含む、増幅可能なベクター中に移動させる工程；および
（ｄ）該カセットの発現を引き起こす工程；
を包含する、方法。
【請求項２６】
前記第１のユニバーサルトランスファーベクター、前記第２のユニバーサルトランスファーベクター、または前記増幅可能なベクターは、マトリックス結合領域を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記増幅可能なベクターは、（ａ）抗ＩＧＦＲ抗体の重鎖または抗ＩＬ１０抗体の重鎖、および（ｂ）ピューロマイシン耐性マーカーまたはハイグロマイシン耐性マーカーを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅可能なベクターは、図１３〜図１６からなる群より選択されるプラスミド地図によって特徴付けられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記増幅可能なベクターは、配列番号２４〜配列番号２７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２５に記載の方法であって、前記タンパク質を精製する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３１】
請求項２５に記載の方法であって、ここで以下：
（ａ）１つの発現カセットは、抗ＩＬ５免疫グロブリン重鎖をコードし、そして他の発現カセットは、抗ＩＬ５免疫グロブリン軽鎖をコードするか；
（ｂ）１つの発現カセットは、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン重鎖をコードし、そして他の発現カセットは、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン軽鎖をコードするか；
（ｃ）１つの発現カセットは、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン軽鎖およびＩＬ−２レセプターαサブユニットをコードするバイシストロンの遺伝子を含み、該遺伝子は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって連結されており、そして他の発現カセットは、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン重鎖およびＨＹＧ−Ｂをコードするか；または
（ｄ）１つの発現カセットは、抗ＩＬ１０免疫グロブリン重鎖をコードし、そして他の発現カセットは、抗ＩＬ１０免疫グロブリン軽鎖およびＨＹＧ−Ｂをコードする、
方法。
【請求項３２】
抗ＩＧＦＲ１抗体を産生するための方法であって、以下の工程：
（ａ）配列番号１８および配列番号２２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、または配列番号１６および配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む発現カセットを、以下：
Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｓｎａ  Ｂ１、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ、Ａｓｐ  ７１８、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｐａｅ  Ｒ７１、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ａｃｃ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＶ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂａｍ  Ｈ１、Ｄｓａ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、Ｅｃｌ  ＸＩ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｘｍａ  ＩＩＩ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｂｓｒ  ＧＩ、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、
の第１のマルチクローニングサイトを含む、第１のユニバーサルトランスファーベクター中に導入する工程；
（ｂ）該第１のベクター中に導入されない他の発現カセットを、以下：
Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｓｇｒ  ＡＩ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｒｓｒ  ＩＩ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓｎａ  Ｂ１、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ、Ａｓｐ  ７１８、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｐａｅ  Ｒ７１、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ａｃｃ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＶ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂａｍ  Ｈ１、Ｄｓａ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、Ｅｃｌ  ＸＩ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｘｍａ  ＩＩＩ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、
の第２のマルチクローニングサイトを含む、第２のユニバーサルトランスファーベクター中に導入する工程；
（ｃ）該カセットを該トランスファーベクターから、以下：
Ｓｇｒ  ＡＩ、Ｓｒｆ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｒｓｒ  ＩＩ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｆｓｅ  １、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｂｓｒ  ＧＩ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｂｂｖ  Ｃ１、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、
の第３のマルチクローニングサイトを含む、増幅可能なベクター中に移動させる工程；および
（ｄ）該カセットの発現を引き起こす工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記抗体を精製する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３４】
配列番号１８および配列番号２２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７および配列番号２１から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号１６および配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５および配列番号１９から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記発現カセットは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターに作動可能に連結される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１に記載のプラスミドシステムならびに、以下：
（ｉ）滅菌蒸留水；
（ｉｉ）リン酸カルシウム形質転換試薬である、ＣａＣｌ２および２×ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水；
（ｉｉｉ）ＤＥＡＥ−デキストラン形質転換試薬である、リン酸緩衝化生理食塩水中のクロロキンおよびリン酸緩衝化生理食塩水；
（ｉｖ）ＤＯＴＡＰ／コレステロールの粗リポソーム；
（ｖ）形質転換受容性のＥ．Ｃｏｌｉ；
（ｖｉ）Ｄｕｌｂｅｃｃｏ／Ｖｏｇｔ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ必要最小培地（ＤＭＥＭ）
（ｖｉｉ）ウシ胎仔血清
（ｖｉｉｉ）ｌｕｒｉａブロス培地；および
（ｉｘ）該プラスミドシステムの使用についての指示書、
から選択される１つ以上の構成要素を備える、キット。
【請求項３８】
配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２から選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３９】
配列番号６〜配列番号９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願番号第６０／５１９，２３０号（２００３年１１月１２日出願）の利益を主張し、この出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
マルチサブユニットタンパク質についての単一の増幅可能な発現プラスミドの構築を容易にするプラスミドシステム。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
任意の哺乳動物細胞ベースのタンパク質による治療の開発は、有効な発現系を必要とする。理想的には、マルチサブユニットタンパク質（例えば、抗体）が、産生されなければならない場合、各ポリペプチドは、単一のプラスミドから発現されるべきである。市販の発現プラスミドを使用する、複数の遺伝子を含む発現ベクターの構築は、問題を抱えている。代表的には、現在入手可能な発現プラスミドのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）は、複数の発現カセットの挿入には不適当である。現在入手可能な発現プラスミドのマルチクローニングサイトは、比較的に少数の制限酵素認識部位を含む。理想的には、複数のポリペプチドの発現のための発現プラスミドは、多数の、一般的な制限酵素認識部位およびまれな制限酵素認識部位を含む、大きなマルチクローニングサイトを有し得る。
【０００４】
本発明は、とりわけ、ベクターの構築における均一性の維持を補助し得る、望ましい一般的なプラスミド発現系を提供し、この発現系は、下流のプロセッシングにおける可変性を減少すると同時に、複合的なタンパク質による治療計画の実行を容易にし、かつ時間間隔を顕著に減少する。本発明は、哺乳動物の発現に対するこのような一般的プラスミドプラットフォーム、および種々のポリペプチドの生成のためのその使用を含む。このプラットフォームは、インターフェロンのような単純タンパク質、ならびに抗体のような大きくて複合的なマルチサブユニットタンパク質の発現に使用されるのに十分に順応性である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、プラスミドシステムであって、以下のコンテナー：（ａ）以下：Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｓｎａ  Ｂ１、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ、Ａｓｐ  ７１８、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｐａｅ  Ｒ７１、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ａｃｃ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＶ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９１、Ａｐａ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂａｍ  Ｈ１、Ｄｓａ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、Ｅｃｌ  ＸＩ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｘｍａ  ＩＩＩ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｂｓｒ  ＧＩ、Ｂｓｓ  ＨＩＩの第１のマルチクローニングサイトを含む、第１のユニバーサルトランスファーベクター（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ）；（ｂ）以下：Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｓｇｒ  ＡＩ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｒｓｒ  ＩＩ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓｎａ  Ｂ１、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ、Ａｓｐ  ７１８、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｐａｅ  Ｒ７１、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ａｃｃ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＶ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂａｍ  Ｈ１、Ｄｓａ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、Ｅｃｌ  ＸＩ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｘｍａ  ＩＩＩ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｂｓｓ  ＨＩＩの第２のマルチクローニングサイトを含む、第２のユニバーサルトランスファーベクター；そして（ｃ）以下：Ｓｇｒ  ＡＩ、Ｓｒｆ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｒｓｒ  ＩＩ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｆｓｅ  １、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｂｓｒ  ＧＩ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｂｂｖ  Ｃ１、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉの第３のマルチクローニングサイトを含む、増幅可能なベクターを別個に含むプラスミドシステムを提供する。本発明の実施形態において、このプラスミドシステムは、以下のベクターを含む：図２のプラスミド地図を含む第１のユニバーサルトランスファーベクター、図１のプラスミド地図を含む第２のユニバーサルトランスファーベクター、および図３のプラスミド地図を含む増幅可能なトランスファーベクター。別の実施形態において、この第１のユニバーサルトランスファーベクターのマルチクローニングサイトは、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を含み；この第２のユニバーサルトランスファーベクターのマルチクローニングサイトは、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を含み；そして、この増幅可能なトランスファーベクターのマルチクローニングサイトは、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含む。本発明の実施形態において、このユニバーサルトランスファーベクターまたはこの増幅可能なベクターのいずれかは、マトリックス結合領域（ＭＡＲ；例えば、ニワトリリゾチームのＭＡＲ）を含む。
【０００６】
本発明の別の実施形態において、このプラスミドシステムは第１のユニバーサルトランスファーベクターおよび第２のユニバーサルトランスファーベクター（上述）のみを含む。
【０００７】
本発明の別の実施形態において、少なくとも１つのプラスミドは、このマルチクローニングサイトの上流か、またはこのマルチクローニングサイト内に配置される、プロモーター（例えば、ＳＲαプロモーター、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の最初期プロモーターおよびマウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）の最初期プロモーター）を含む。この実施形態において、好ましくは、この第１のユニバーサルトランスファーベクターは、図１０のプラスミド地図を含み；この第２のユニバーサルトランスファーベクターのマルチクローニングサイトは、図１１のプラスミド地図を含み；そして、この増幅可能なトランスファーベクターのマルチクローニングサイトは、図９のプラスミド地図を含む。この実施形態において、この第１のユニバーサルトランスファーベクターのマルチクローニングサイトは、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含み；この第２のユニバーサルトランスファーベクターのマルチクローニングサイトは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含み；そして、この増幅可能なトランスファーベクターのマルチクローニングサイトは、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０００８】
本発明の別の実施形態としては、上記マルチクローニングサイト中に配置される、ターミネーター／ポリＡ付加部位を含む少なくとも１つのユニバーサルトランスファーベクターを含むプラスミドシステムが挙げられ、ここでこのターミネーター／ポリＡ付加部位の位置は、マルチクローニングサイト中に配置された遺伝子がターミネーター／ポリＡ付加部位に作動可能に連結されるような位置である。
【０００９】
本発明のプラスミドシステムにおける上記増幅可能なベクターは、増幅のための選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ遺伝子）を含む。
【００１０】
本発明の実施形態において、本発明のプラスミドシステムは、以下のコンテナー：（ａ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む第１のユニバーサルトランスファーベクター；（ｂ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む第２のユニバーサルトランスファーベクター；および（ｃ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む増幅可能なベクターを別個に含む。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、この第１のユニバーサルトランスファーベクターまたはこの第２のユニバーサルトランスファーベクターが、１つ以上の発現カセットの第１の組を含み、他のユニバーサルトランスファーベクターが、１つ以上の発現カセットの第２の組を含み、そしてこの増幅可能なベクターが、この発現カセットの第１の組およびこの発現カセットの第２の組を含む、プラスミドシステムを含み；ここでこの発現カセットは、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖（例えば、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン鎖、抗ＩＬ１０免疫グロブリン鎖または抗ＩＬ５免疫グロブリン鎖）をコードする；例えば、ここで（ａ）この１つ以上の発現カセットの第１の組は、抗ＩＬ５免疫グロブリン重鎖遺伝子の発現カセットを含み、そしてこの１つ以上の発現カセットの第２の組は、抗ＩＬ５免疫グロブリン軽鎖遺伝子の発現カセットを含むか；（ｂ）この１つ以上の発現カセットの第１の組は、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン重鎖遺伝子の発現カセットを含み、そしてこの１つ以上の発現カセットの第２の組は、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン軽鎖遺伝子の発現カセットを含むか；（ｃ）この１つ以上の発現カセットの第１の組は、バイシストロンの遺伝子発現カセットを含む発現カセットを含み、このバイシストロンの遺伝子は、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン軽鎖遺伝子およびＩＬ２レセプターα遺伝子を含み、ここでこれらの遺伝子は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって連結され、そしてこの１つ以上の発現カセットの第２の組は、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン重鎖遺伝子の発現カセットおよびハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ−ｂ）の発現カセットであるか；または（ｄ）この１つ以上の発現カセットの第１の組は、抗ＩＬ１０免疫グロブリン重鎖遺伝子の発現カセットを含み、そしてこの１つ以上の発現カセットの第２の組は、抗ＩＬ１０免疫グロブリン軽鎖遺伝子の発現カセットおよびハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットを含む。本発明の実施形態において、この増幅可能なベクターは、図４〜図７から選択される図に示されるプラスミド地図を含む。例えば、この増幅可能なベクターは、配列番号６〜配列番号９から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。
【００１２】
本発明の実施形態において、このプラスミドシステムは、増幅可能なベクターｐｉｎＡＩＬ１０／ＭＡＲ（−）；ｐＡＩＬ１０Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）；ｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２／ＭＡＲ（−）またはｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）を含む。本発明の実施形態において、このプラスミドｐｉｎＡＩＬ１０／ＭＡＲ（−）；ｐＡＩＬ１０Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）；ｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２／ＭＡＲ（−）およびｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）は、それぞれ、図１３〜図１６によって特徴付けられる。本発明の別の実施形態において、このプラスミドｐｉｎＡＩＬ１０／ＭＡＲ（−）；ｐＡＩＬ１０Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）；ｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２／ＭＡＲ（−）およびｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）は、配列番号２４〜配列番号２７から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
本発明はまた、２つ以上の型のポリペプチドを含むタンパク質を発現するための方法を提供し、この方法は、以下の工程：（ａ）１つ以上の発現カセットの組を第１のユニバーサルトランスファーベクター中に導入する工程；（ｂ）１つ以上の異なる発現カセットの組を第２のユニバーサルトランスファーベクター中に導入する工程；（ｃ）このカセットをこのトランスファーベクターから増幅可能なベクター中に移動させる工程；（ｄ）このカセットの発現を引き起こす工程；および（ｅ）必要に応じて、このペプチドを単離／精製する工程を包含し；ここでこのベクターは、本発明のキット中に提供される。本発明の１つの実施形態において、この第１のユニバーサルトランスファーベクターは、図２もしくは図１０のプラスミド地図、または配列番号２もしくは配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、この第２のユニバーサルトランスファーベクターは、図１もしくは図１１のプラスミド地図、または配列番号１もしくは配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含む。本発明の別の実施形態において、この増幅可能なトランスファーベクターは、図３もしくは図９のプラスミド地図、または配列番号３もしくは配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
本方法の実施形態において、抗ＩＧＦＲ重鎖または抗ＩＬ１０重鎖は、増幅可能なベクターにおいて発現され、このベクターは、ＭＡＲおよびハイグロマイシン耐性遺伝子またはピューロマイシン耐性遺伝子のいずれかを含み、このベクターは、ｐｉｎＡＩＬ１０／ＭＡＲ（−）；ｐＡＩＬ１０Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）；ｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２／ＭＡＲ（−）およびｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）から選択される。本発明の別の実施形態において、これらのプラスミドｐｉｎＡＩＬ１０／ＭＡＲ（−）；ｐＡＩＬ１０Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）；ｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２／ＭＡＲ（−）およびｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）は、それぞれ、図１３〜図１６によって特徴付けられる。本発明の別の実施形態において、これらのプラスミドｐｉｎＡＩＬ１０／ＭＡＲ（−）；ｐＡＩＬ１０Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）；ｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２／ＭＡＲ（−）およびｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）は、配列番号２４〜配列番号２７から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
２つ以上の型のポリペプチドを含むタンパク質を発現するための本方法の実施形態において、上記発現カセットは、免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖（例えば、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン鎖、抗ＩＬ５免疫グロブリン鎖または抗ＩＬ１０免疫グロブリン鎖）をコードする；例えば：（ｉ）１つの発現カセットは、抗ＩＬ５免疫グロブリン重鎖をコードし、そして他の発現カセットは、抗ＩＬ５免疫グロブリン軽鎖をコードするか；（ｉｉ）１つの発現カセットは、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン重鎖（例えば、配列番号１７もしくは配列番号２１のポリヌクレオチド、または配列番号１８もしくは配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチド）をコードし、そしてこの他の発現カセットは、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン軽鎖（例えば、配列番号１５もしくは配列番号１９のポリヌクレオチド、または配列番号１６もしくは配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）をコードするか；（ｉｉｉ）１つの発現カセットは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって連結された、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン軽鎖およびＩＬ２レセプターα−サブユニットをコードするバイシストロンの遺伝子を含み、およびこの他の発現カセットは、抗ＩＧＦＲ１免疫グロブリン重鎖およびＨＹＧ−Ｂをコードするか；あるいは（ｉｖ）１つの発現カセットは、抗ＩＬ１０免疫グロブリン重鎖をコードし、そしてこの他の発現カセットは、抗ＩＬ１０免疫グロブリン軽鎖およびＨＹＧ−Ｂをコードする。
【００１６】
本発明の１つの実施形態において、上記増幅可能なベクターは図４〜図７から選択される図中のプラスミド地図を含む。この増幅可能なベクターは、配列番号６〜配列番号９から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。
【００１７】
本発明の範囲はまた、ポリペプチドを産生するための本発明の方法のいずれかによって産生される任意の生成物（例えば、抗ＩＧＦＲ１抗体、抗ＩＬ５抗体または抗ＩＬ１０抗体の鎖のような任意の免疫グロブリン鎖）を包含する。
【００１８】
２つ以上の型のポリペプチドを含むタンパク質を発現するための本方法の実施形態において、発現は、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞のような真核細胞）中で起こる。
【００１９】
本発明はまた、以下の工程：（ａ）配列番号１８および配列番号２２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、または配列番号１６および配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを、以下：Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｓｎａ  Ｂ１、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ、Ａｓｐ  ７１８、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｐａｅ  Ｒ７１、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ａｃｃ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＶ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂａｍ  Ｈ１、Ｄｓａ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、Ｅｃｌ  ＸＩ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｘｍａ  ＩＩＩ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｂｓｒ  ＧＩ、Ｂｓｓ  ＨＩＩの第１のマルチクローニングサイトを含む、第１のユニバーサルトランスファーベクター（例えば、ｐＵＨＬＳまたはＰＵＨＳＲｓｔｏｐＬＳ）中に導入する工程；（ｂ）この第１のベクター中に導入されない他の発現カセットを、以下：Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｓｇｒ  ＡＩ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｒｓｒ  ＩＩ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓｎａ  Ｂ１、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ、Ａｓｐ  ７１８、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｐａｅ  Ｒ７１、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ａｃｃ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＶ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂａｍ  Ｈ１、Ｄｓａ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、Ｅｃｌ  ＸＩ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｘｍａ  ＩＩＩ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｂｓｓ  ＨＩＩの第２のマルチクローニングサイトを含む、第２のユニバーサルトランスファーベクター（例えば、ｐＵＬＬＳまたはＰＵＬＳＲｓｔｏｐＬＳ）中に導入する工程；（ｃ）必要に応じて、このカセットをこのトランスファーベクターから、以下：Ｓｇｒ  ＡＩ、Ｓｒｆ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｒｓｒ  ＩＩ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｆｓｅ  １、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｂｓｒ  ＧＩ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｂｂｖ  Ｃ１、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉの第３のマルチクローニングサイトを含む、増幅可能なベクター（ｐＸＢＬＳまたはｐＳＲＸＢＬＳ）中に移動させる工程；（ｄ）このカセットの発現を引き起こす工程；および（ｅ）必要に応じて、この抗体を単離／精製する工程、を包含する抗ＩＧＦＲ１抗体を産生するための方法を含む。配列番号１８および配列番号２２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７および配列番号２１から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。配列番号１６および配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５および配列番号１９から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。本発明の１つの実施形態において、この発現カセットは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターに作動可能に連結される。本発明の範囲は、上記の発現カセットが、免疫グロブリンの定常領域（例えば、κまたはγ１またはγ２またはγ３またはγ４のいずれか１つの定常領域）に連結される実施形態を含む。
【００２０】
本発明はまた、本発明のプラスミドシステムならびに以下から選択される１つ以上の構成要素を備えるキットを提供する：（ｉ）滅菌蒸留水；（ｉｉ）リン酸カルシウム形質転換試薬である、ＣａＣｌ２および２×ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水；（ｉｉｉ）ＤＥＡＥ−デキストラン形質転換試薬である、リン酸緩衝化生理食塩水中のクロロキンおよびリン酸緩衝化生理食塩水；（ｉｖ）ＤＯＴＡＰ／コレステロールの粗リポソーム；（ｖ）形質転換受容性のＥ．Ｃｏｌｉ；（ｖｉ）Ｄｕｌｂｅｃｃｏ／Ｖｏｇｔ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ必要最小培地（ＤＭＥＭ）；（ｖｉｉ）ウシ胎仔血清；（ｖｉｉｉ）ｌｕｒｉａブロス培地；および（ｉｘ）このプラスミドシステムの使用についての説明書。
【００２１】
本発明の１つの実施形態としては、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２のヌクレオチド配列を含む１本鎖のポリヌクレオチドまたは２本鎖のポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）が挙げられる。
【００２２】
本発明はまた、配列番号６〜配列番号９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むプラスミドを包含する。
【００２３】
本発明の範囲は、以下のプラスミド地図のいずれかと実質的に同一であるプラスミド地図を含むプラスミドを有する、任意のプラスミドまたはプラスミドシステムを含む。
【００２４】
（詳細な説明）
本発明は、任意の細胞における（例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞または昆虫細胞における）組換えタンパク質の発現に有用なプラスミドシステムを提供する。このプラスミドシステムは、広範な組換えタンパク質（インターフェロンのような単純タンパク質から抗体のような複合タンパク質の範囲にある）の任意の細胞ベースの発現に従う。このシステムは、多くの一般的な制限酵素認識部位およびまれな制限酵素認識部位を提供して種々の発現カセットを収容する。このことはまた、発現カセット（例えば、プロモーター、エンハンサー、およびターミネーター、ならびに抗生物質耐性マーカー）の種々のエレメントの選択における自由度を提供する。このプラスミドはまた、単なるトランスファーベクターとして使用され得る。このシステムは、一時的な発現ならびに安定な発現の両方についての能力を提供する。このｐＸＢＬＳベクターは、ＤＨＦＲ欠損哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ  ＤＸＢ−１１およびＣＨＯ  ＤＧ４４）における、プラスミドの選択および増幅のために、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）コード領域を保有する。従って、このシステムは、遺伝子増幅および遺伝子選択に利用される安定なクローンを単離するために使用され得る。このプラスミドシステムは、２つの一般的なトランスファープラスミド（ｐＵＨＬＳおよびｐＵＬＬＳ）を含み、これらのプラスミドは、抗体のような複合タンパク質の一部の発現を行うのに有用である。従って、このシステムは、ユニバーサルベクターによる同時トランスフェクションおよびｐＸＢＬＳによる単独のトランスフェクションを提供する。種々の部分のこのような別々の発現を生じるプラスミドシステムのシステムの能力は、都合が良い。なぜなら、この複合タンパク質の全部の発現を分析するために、マルチサブユニットタンパク質の個々のユニットの発現について、ときとして、より深い見識を得る必要があるからである。このシステムはまた、マルチサブユニットタンパク質の発現のためのプラスミドにおける複数の遺伝子の方向性から生じる、指向性の変異性の効果について取り組むために使用され得る。従って、複数の発現カセットを配置する方法は、複合タンパク質の最適な発現のための方法に帰着し得る。
【００２５】
本発明のプラスミドシステムは、複数のポリペプチド（抗ＩＬ５抗体、抗ＩＧＦＲ１抗体、ＩＬ２レセプターの膜ドメインおよび抗ＩＬ１０抗体が挙げられる）の高レベルの発現を生じることを実証した。他のタンパク質（インターフェロン、フィブリノゲン、イオンチャネル、細菌のポーリン（例えば、ｏｍｐＦ）およびニコチン性アセチルコリンレセプター（ｎＡＣｈＲ）が挙げられる）もまた、本発明のプラスミドシステムにおいて発現され得る。
【００２６】
本発明の１つの実施形態において、上記プラスミドシステムは、完全なヒトの、モノクローナル抗ＩＧＦＲ１抗体である１５Ｈ１２／１９Ｄ１２の軽鎖および重鎖を含み、この抗体はまた、１５Ｈ１２または１９Ｄ１２と称され得る。
【００２７】
上記プラスミドシステムについての部分は、キットの一部として、別々にか、または適宜提供され得る。
【００２８】
本発明は、以下の表１に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはこれらの配列からなるポリヌクレオチドのいずれかを、個別にか、またはプラスミドシステムもしくはキットの一部として含む。本発明のポリヌクレオチドは、任意の形態であり得、この形態としては、環状、直鎖状、２本鎖状、または１本鎖状が挙げられる。
【００２９】
【表１−１】
2007510434.tif 000002
【００３０】
【表１−２】
2007510434.tif 000003
【００３１】
（分子生物学）
本発明に従って、当該分野の技術の範囲内で、従来の分子生物学の技術、微生物学の技術、および組換えＤＮＡ技術が、使用され得る。このような技術は、文献で説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （本明細書中で「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１巻および第２巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ（１９９４）を参照のこと。
【００３２】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」は、１本鎖形態、２本鎖形態またはその他の形態における、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、またはそれらのリン酸エステルアナログのいずれか（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）のポリマー形態を包含する。
【００３３】
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）における一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも称される）であり、２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。
【００３４】
「コード配列」または発現産物（ＲＮＡもしくはペプチド）を「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」配列は、発現された場合に、その産物の産生を生じるヌクレオチド配列である。
【００３５】
用語「遺伝子」は、リボヌクレオチドまたはアミノ酸の特定の配列をコードするか、またはそれに対応するＤＮＡ配列を意味し、この特定の配列は、１つ以上のＲＮＡ分子、タンパク質または酵素の、全てかまたは一部を含み、そして例えば、その遺伝子が発現される条件を決定する調節ＤＮＡ配列（例えば、プロモーター配列）を含んでも含まなくてもよい。遺伝子は、ＤＮＡから、アミノ酸へと翻訳されてもされなくてもよいＲＮＡに転写され得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、核酸を指し、この核酸は概して、約３００ヌクレオチド（例えば、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１７５ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド）に過ぎず、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、または目的の遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは他の核酸をコードするｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能であり得る。オリゴヌクレオチドは、通常、１本鎖であるが、２本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐヌクレオチド、３Ｈヌクレオチド、１４Ｃヌクレオチド、３５Ｓヌクレオチド、または標識（例えば、ビオチン）が共有結合したヌクレオチドの取り込みによって標識され得る。１つの実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用され得る。別の実施形態において、オリゴヌクレオチド（片方または両方とも標識され得る）は、この遺伝子の全長もしくはフラグメントをクローニングするためか、または核酸の存在を検出するためのＰＣＲプライマーとして使用され得る。一般的に、オリゴヌクレオチドは、好ましくは核酸合成機によって、合成によって調製される。
【００３７】
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」もしくは「ポリペプチド配列」、または「アミノ酸配列」とは、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド中の、一連の２つ以上のアミノ酸をいう。
【００３８】
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の隣接する列を包含する。
【００３９】
用語「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたポリペプチド」は、それぞれ、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ分子もしくはＤＮＡ分子、または混合されたポリマー）あるいはポリペプチドを包含し、これは、部分的にかまたは完全に、細胞中もしくは組換えＤＮＡ発現系中に、通常見出される他の構成要素または任意の他の混入物から分離される。これらの構成要素としては、細胞膜、細胞壁、リボソーム、ポリメラーゼ、血清成分および外来性のゲノム配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、好ましくは本質的に、分子の均質な組成物であるが、いくらかの異種成分を含み得る。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、ＤＮＡの「ＰＣＲ増幅」は、ＤＮＡ配列の混合物内の特定のＤＮＡ配列の濃度を増加するためのポリメラーゼ連鎖反応の使用を包含する。ＰＣＲの記載については、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４８７を参照のこと。遺伝子は、例えば、細胞中のプラスミドにおいて増幅され得る。増幅可能な選択マーカーを含むが、内因性のマーカー遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）を欠くプラスミドを有する細胞は、メトトレキセート（例えば、ＤＨＦＲ遺伝子が、そのプラスミド上にある場合）のような選択因子の量を増加することによって選択され得る。代表的に、この手順は、この細胞中の増幅可能な選択マーカー含むプラスミドのコピー数を増加させる。
【００４２】
用語「宿主細胞」は、その細胞による物質の産生のために（例えば、その細胞による遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはタンパク質の、発現または複製）任意の手段によって、選択されるか、改変されるか、トランスフェクトされるか、形質転換されるか、増殖されるか、または使用されるかもしくは操作される任意の生物の任意の細胞を包含する。例えば、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌であってもＣＨＯ細胞のような真核細胞であってもよい。
【００４３】
「カセット」または「発現カセット」とは、規定された制限酵素認識部位においてベクター中に挿入され得る発現産物（例えば、ペプチドまたはＲＮＡ）をコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡのセグメントを指す。ＤＮＡコード配列は、プロモーターおよび／もしくはターミネーターならびに／またはポリＡシグナルに、作動可能に連結され得る。
【００４４】
核酸の配列は、当業者に公知の方法（例えば、化学的な配列決定または酵素的な配列決定）のいずれかによって決定され得る。ＤＮＡの「化学的な配列決定」としては、ＤＮＡが、個々の塩基特異的反応を使用して無作為に切断されるＭａｘａｍａおよびＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７７）７４：５６０）のような方法が挙げられる。ＤＮＡの「酵素的な配列決定」としては、Ｓａｎｇｅｒ法（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３）のような方法が挙げられる。
【００４５】
本発明は、天然の調節（発現制御）配列によってはさまれた本発明の核酸を包含し、この配列は、プロモーター、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、反応エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’非コード配列および３’非コード配列などに関連し得る。
【００４６】
「内部リボソーム侵入部位」「ＩＲＥＳ」は、一般的に、当該分野において公知である。リボソーム内部進入部位は、ｅＩＦ４Ｇ（Ｊｏｈａｎｎｅｓら、ＲＮＡ  ４：１５００−１５１３（１９９８））、ＤＡＰ５（Ｈｅｎｉｓ−Ｋｏｒｅｎｂｌｉｔら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：４９６−５０６（２０００））、ｃ−Ｍｙｃ（Ｓｔｏｎｅｌｅｙら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：１１６２−１１６９（２０００））、ＮＦ−κ−ｂ抑制因子（Ｏｕｍａｒｄら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：２７５５−２７５９（２０００））、ＶＥＧＦ（Ｈｕｅｚら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８：６１７８−６１９０（１９９８））、ＦＧＦ−２（Ｃｒｅａｎｃｉｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：２７５−２８１（２０００））、ＰＤＧＦ−Ｂ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２：９３５６−９３６２（１９９７））アポトーシスにおけるＸ染色体連鎖性インヒビター（ＸＩＡＰ）（Ｈｏｌｃｉｋら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：４１７４−４１７７（２０００））、Ａｐａｆ−１（Ｃｏｌｄｗｅｌｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：８９９−９０５（２０００））、およびＢｉＰ（Ｍａｃｅｊａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４（１９９１））を含む１種または数種の遺伝子において同定されている。
【００４７】
一般的に、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合（例えば、直接または他のプロモーター結合タンパク質もしくプロモーター結合物質を介して）し、コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。一般的に、プロモーター配列は、転写阻害部位によって３’末端に結合され、そして上流（５’方向）に伸長して、任意のレベルでの転写の開始に必要な、最小限の数の塩基および要素を含む。このプロモーター配列内には、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与する。転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１による遺伝子地図作製によって適宜規定される）、ならびにタンパク質結合ドメイン（共通配列）が見出され得る。このプロモーターは、他の発現制御配列（エンハンサー配列およびリプレッサー配列が挙げられる）。この配列としては、または本発明の核酸に作動可能に結合し得る。
【００４８】
コード配列は、上記配列が、この配列の発現を誘導するかまたは制御する場合に、「制御下にある」、「機能的に関連する」、「作動可能に連結する」または「作動可能に結合する」、細胞中の転写制御配列および翻訳制御配列である。例えば、遺伝子に直接、作動可能に連結したプロモーターは、コード配列のＲＮＡへの、好ましくはｍＲＮＡへのＲＮＡポリメラーゼ媒介性の転写を誘導し、次いでこのＲＮＡは、ＲＮＡスプライシングされ（イントロンを含む場合）、そして必要に応じてコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳され得る。遺伝子に対して作動可能に連結されたターミネーター／ポリＡシグナルは、この遺伝子のＲＮＡへの転写を終了させ、そしてこのＲＮＡ上へのポリＡシグナルの付加を誘導する。
【００４９】
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子配列、ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列中の情報を明白になるようにするか、または明白にさせることを意味する（例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関係する細胞の機能を活性化することによってタンパク質を産生すること）。「発現する」および「発現」は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写、およびＲＮＡのタンパク質への翻訳を包含する。ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質のような「発現産物」を形成する細胞に発現されるか、またはその細胞によって発現される。またこの発現産物自体は、この細胞によって「発現された」といわれる。
【００５０】
用語「形質転換」は、核酸の細胞中への導入を意味する。この導入された遺伝子または配列は、「クローン」と称され得る。この導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受容する宿主細胞は、「形質転換され」、そしてこの細胞は「形質転換体」または「クローン」である。この宿主細胞に対して導入されたＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の供給源（この宿主細胞に関して同一の属または同一の種の細胞）から、あるいは異なる属または異なる種の細胞に由来し得る。当該分野において周知である形質転換方法の例としては、リポソーム送達、エレクトロポレーション、ＣａＰＯ４形質転換、ＤＥＡＥ−デキストラン形質転換、マイクロインジェクションおよびウイルス感染が挙げられる。
【００５１】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを含む。用語「ベクター」とは、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が、宿主細胞に導入され、その結果、この宿主細胞を形質転換し、そして必要に応じて、この導入された配列の発現および／または複製を促進し得るビヒクル（例えば、プラスミド）を指し得る。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドは、発現系において発現し得る。用語「発現系」は、宿主細胞と適合性のベクターとを意味し、これらは、適切な条件下で、このベクターによって運ばれ、そしてこの宿主細胞に導入されるタンパク質または核酸を発現し得る。一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫細胞とバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞とプラスミド、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣおよびウイルス（例えば、アデノウイルスおよびアデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ））のようなベクターが挙げられる。
【００５３】
（プラスミド）
１つの実施形態において、本発明は、マルチクローニングサイト、複製起点、および選択マーカーを含む第１のユニバーサルトランスファーベクター；マルチクローニングサイト、複製起点および選択マーカーを含む第２のユニバーサルトランスファーベクター、ならびにマルチクローニングサイト、プロモーター、複製起点または染色体の組み込み部位、ポリアデニル化部位および増幅可能な選択マーカーを含む増幅可能なベクターを備えるキットを含む。一般的に、このマルチクローニングサイトは、約２０個、２５個または３０個の制限酵素認識部位を含む。
【００５４】
本発明のプラスミドは、当該分野において公知の１個または数個の増幅可能なマーカーのいずれかを含み得る。増幅可能なマーカーの使用は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（１９８９）で議論される。薬物耐性の哺乳動物細胞における遺伝子増幅についての有用な選択マーカーとしては、ＤＨＦＲ（ＭＴＸ（メトトレキサート）耐性）（Ａｌｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２５３：１３５７（１９７８）；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５６７（１９８０））；メタロチオネイン（カドミウム耐性）（Ｂｅａｃｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２１０（１９８１））；ＣＡＤ（Ｎ−（ホスホノアセチル）−ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）耐性）（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：８６７９（１９７９））；アデニル酸デアミナーゼ（コホルマイシン（ｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）耐性）（Ｄｅｂａｔｉｓｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１７７６（１９８６））；ＩＭＰ  ５’−デヒドロゲナーゼ（ミコフェノール酸耐性）（Ｈｕｂｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３１５１（１９８１））および当該分野において公知の他のマーカー（例えば、Ｋａｕｆｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５３７−５６６（１９８８）に概説される）が挙げられる。
【００５５】
１つの実施形態において、メタロチオネインプロモーターの制御下での上記メタロチオネインＩＩ  Ａの遺伝子は、ＣＨＯ−Ｋ１のような細胞株において増幅可能な選択マーカーである。増幅は、この細胞培養物へのＣｄ２＋またはＺｎ２＋の添加によって誘導され得る。
【００５６】
本発明のプラスミドは、当該分野において公知の、他の真核細胞性の、増幅不可能なマーカーを導入され得る。本発明の実施形態において、薬物耐性マーカーは、ハイグロマイシンに対する耐性を与えるハイグロマイシンＢ遺伝子である。他のマーカーとしては、Ｇ４１８耐性遺伝子が挙げられる。本発明のプラスミドはまた、原核細胞の、抗生物質耐性マーカー（例えば、アンピシリン耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子）を含む。
【００５７】
本発明のプラスミドはまた、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）を含む。一般的に、ＭＡＲは、細胞骨格についての線維性マトリックスアナログの一部である核タンパク質に特異的に結合し得るＤＮＡ配列である。１つの実施形態において、このＭＡＲは、ニワトリリゾチームＭＡＲである。
【００５８】
遺伝子発現を制御するために使用され得るプロモーターとしては、ＳＲαプロモーター（Ｔａｋｅｂｅら、Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏ．８：４６６−４７２（１９８８））、ヒトＣＭＶの最初期プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０（１９８５）；Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１−１０５（１９８６））、マウスＣＭＶの最初期プロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０（１９８１））、Ｏｒｇｙｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａの最初期プロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２（１９８２））；βラクタマーゼプロモーターのような原核細胞の発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１（１９７８））、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５（１９８３）；および酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント（例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーターもしくはＧＡＬ１０プロモーター）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーターまたはアルカリホスファターゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
ウイルスの長い末端反復プロモーター（例えば、マウス乳腺癌ウイルスの長い末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）（Ｆａｓｅｌら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１（１）：３−７（１９８２））、モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復（Ｒｅｄｄｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（９）：５２３４−５２３８（１９８０））、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列（Ｖａｎ  Ｂｅｖｅｒｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（６）：３３０７−３３１１（１９８０））、ＨＩＶ  ＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢ１００２４５）、ウシ泡末状ウイルスＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＣ００１８３１）、ＲＳＶ  ５’−ＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｋ０００８７）、ＨＩＶ−２  ＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＣ００１７２２）、鳥類のレトロウイルスのＬＴＲ（Ｊｕら、Ｃｅｌｌ  ２２：３７９−３８６（１９８０））およびヒトヘルペスウイルスのＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＣ００１８０６））は、本発明のプラスミドに含まれ得る。
【００６０】
他の受容可能なプロモーターとしては、ヒトＣＭＶプロモーター、ヒトＣＭＶ５プロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、肝特異的発現のためのハイブリッドＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶの最初期プロモーターと、ヒトα１−抗トリプシン（ＨＡＴ）プロモーターもしくはヒトアルブミン（ＨＡＬ）プロモーターのいずれかの転写プロモーター要素とを連結することによって作製される）、または肝細胞癌特異的発現のためのプロモーター（例えば、ヒトアルブミン（ＨＡＬ；約１０００ｂｐ）もしくはヒトα１−抗トリプシン（ＨＡＴ；約２０００ｂｐ）は、ヒトミクログロブリンおよびビクニン前駆体遺伝子（ＡＭＢＰ）の１４５ｂｐの長いエンハンサーエレメントと組み合わせられる；ＨＡＬ−ＡＭＢＰおよびＨＡＴ−ＡＭＢＰ）が挙げられる。
【００６１】
さらに、Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼプロモーターまたはｔａｃプロモーターのような細菌のプロモーターは、発現を制御するために使用され得る。
【００６２】
プロモーター（例えば、ＳＲαプロモーター）は、上記カセットに連結され、次いでトランスファーベクター（例えば、ｐＵＬＬＳまたはｐＵＨＬＳ）に移され得る。別の実施形態において、このトランスファーベクターは、マルチクローニングサイトの上流にプロモーターを含み得る（例えば、ｐＵＬＳＲｓｔｏｐＬＳまたはｐＵＨＳＲｓｔｏｐＬＳ）。プロモーターに連結されていない遺伝子が、このマルチクローニングサイトに挿入される場合、その遺伝子は、この上流のプロモーターに作動可能に連結される。
【００６３】
本発明のなお別の実施形態において、プロモーターに連結されていないトランスファーベクター中の遺伝子は、マルチクローニングサイトの上流にプロモーター（ＳＲαプロモーター）を含む増幅可能なベクター（ｐＳＲＸＢＬＳ）中に移され得る。未連結の遺伝子が、マルチクローニングサイト中に配置される場合、この遺伝子は、このプロモーターに作動可能に連結される。
【００６４】
本発明のプラスミドはまた、このプラスミドにおける遺伝子の転写の終結および転写産物へのポリＡ尾部の付加のためのポリアデニル化シグナル／ターミネーターを含む。例えば、ニワトリβグロビンターミネーター／ポリＡシグナルが、本発明のプラスミド中に含まれ得る。他の受容可能なポリＡシグナルとしては、ＳＶ４０ポリＡシグナルおよびウシ成長ホルモンポリＡシグナルが挙げられる。
【００６５】
本発明の１つの実施形態において、上記増幅可能なベクターは、以下の制限酵素認識部位：Ｓｇｒ  ＡＩ、Ｓｒｆ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｒｓｒ  ＩＩ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｆｓｅ  １、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｂｓｒ  ＧＩ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｂｂｖ  Ｃ１、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉを含むマルチクローニングサイトを含み；例えば、ここでこの増幅可能なベクターのマルチクローニングサイトは、ｐＸＢＬＳのマルチクローニングサイトである：
【００６６】
【化１】
2007510434.tif 000004
【００６７】
本発明の実施形態において、ユニバーサルトランスファーベクターは、以下の制限酵素認識部位：Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｓｎａ  Ｂ１、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ、Ａｓｐ  ７１８、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｐａｅ  Ｒ７１、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ａｃｃ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＶ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂａｍ  Ｈ１、Ｄｓａ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、Ｅｃｌ  ＸＩ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｘｍａ  ＩＩＩ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｂｓｒ  ＧＩ、Ｂｓｓ  ＨＩＩを含むマルチクローニングサイトを含み；例えば、ここでこのトランスファーベクターのマルチクローニングサイトは、ｐＵＨＬＳのマルチクローニングサイトである：
【００６８】
【化２】
2007510434.tif 000005
【００６９】
ユニバーサルトランスファーベクターは、以下の制限酵素認識部位：Ｂｓｓ  ＨＩＩ、Ｓｇｒ  ＡＩ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｒｓｒ  ＩＩ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓｎａ  Ｂ１、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ、Ａｓｐ  ７１８、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｐａｅ  Ｒ７１、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ａｃｃ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＶ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ｅｃｏ  Ｏ１０９Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ｂｓｐ  ＥＩ、Ｂａｍ  Ｈ１、Ｄｓａ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、Ｅｃｌ  ＸＩ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｘｍａ  ＩＩＩ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｂｓｓ  ＨＩＩを含むマルチクローニングサイトを含み得；例えば、ここでこのトランスファーベクターのマルチクローニングサイトは、ｐＵＬＬＳのマルチクローニングサイトである：
【００７０】
【化３】
2007510434.tif 000006
【００７１】
本発明は、示される方向もしくは反対の方向に、上記のマルチクローニングサイトを含む、増幅可能なベクターまたはユニバーサルトランスファーベクターを企図する。
【００７２】
本発明のプラスミドは、標的ポリペプチドの発現のために任意の細胞株中に導入され得る。本発明の１つの実施形態において、このプラスミドは、哺乳動物細胞株（好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株）中に導入される。一般的に使用される細胞株は、増幅可能な主要マーカーとしてＤＨＦＲ  ｃＤＮＡを使用してＤＨＦＲ＋表現型へと形質転換され得るＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞株である。このような公知のＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞株の１つは、ＤＸ−Ｂ１１またはＤＧ−４４である。別の実施形態において、本発明のプラスミドは、下等真核生物の細胞株（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓまたはＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）中に導入され得る。さらに、本発明のプラスミドはまた、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、ｓｆ９細胞、ｓｆ２１細胞）、両生類の細胞（例えば、Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）、植物細胞（例えば、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）および鳥類の細胞に由来するような高等真核生物の非哺乳動物細胞株中に導入され得る。
【００７３】
本発明のプラスミドはまた、細菌細胞中に導入され得る。１つの実施形態において、形質転換受容性のＥ．ｃｏｌｉが、形質転換される。適切なＥ．ｃｏｌｉの例としては、ＤＨ１、ＤＨ５、ＤＨ５α、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＳＵＲＥ、ＳＣＳ１１０、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ  １０およびＨＢ１０１が挙げられる。
【００７４】
プラスミドは、当該分野において一般的に公知である多くの方法のいずれかによって細胞中に導入され得る。例えば、本発明のプラスミドが用いられ、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン法またはリポソーム法によって細胞を形質転換し得る。
【００７５】
本発明のプラスミドは、任意の遺伝子または遺伝子の組み合わせを含み得る。本発明の実施形態において、このプラスミドは、重鎖免疫グロブリン遺伝子および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む。この免疫グロブリン鎖は、ＩＬ−５、ＩＧＦＲ１またはＩＬ−１０のような任意の抗原を特異的に認識する抗体の一部であり得る。レセプターまたはレセプターサブユニットもまた、発現され得る。例えば、ＩＬ−２レセプターまたはその一部分（例えば、膜ドメイン）をコードする遺伝子は、本発明のプラスミド中に含まれ得る。
【００７６】
その全体が本明細書中に参考として援用される米国特許出願第１０／４４３，４６６号（２００３年５月２２日出願）は、抗ＩＧＦＲ１抗体の、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。その出願で開示された、軽鎖可変領域および重鎖可変領域のいずれかは、本発明のプラスミドシステム中に組み込まれ、そして発現され得る。１つの実施形態において、抗ＩＧＦＲ１抗体の、軽鎖可変領域は、配列番号１５もしくは配列番号１９に示されるヌクレオチド配列によってコードされるか、または配列番号１６もしくは配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドであり、そして／あるいは抗ＩＧＦＲ１抗体の重鎖可変領域は、配列番号１７もしくは配列番号２１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるか、または配列番号１８もしくは配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドである。
【００７７】
抗ＩＧＦＲ１抗体の、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖をコードする発現カセットは、ｐＵＬＬＳまたはｐＵＨＬＳのいずれかのマルチクローニングサイト中に、各々、導入され得る。好ましくは、発現カセット中の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖は、γ１、γ４またはκのような免疫グロブリンの定常領域に連結される。好ましくは、その後この発現カセットは、次いでこの軽鎖および重鎖の発現を生じるのに適した細胞中に導入される増幅可能なベクターｐＸＢＬＳ中に挿入される。例えば、抗ＩＧＦＲ１抗体の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含むこのプラスミド（ｐＡＩＧＦＲＶ３）は、この鎖が発現されるｄｈｆｒ−哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１）中に導入され得る。
【００７８】
（キット）
本発明のプラスミドシステムは、キットで提供され得る。本発明のキットは、このプラスミドシステムに加えて、このプラスミドシステムの使用において利用され得る任意の試薬を含み得る。１つの実施形態において、このキットは、上記プラスミドを哺乳動物細胞に形質転換のために必要な試薬を含む。例えば、このキットは、リン酸カルシウムによる形質転換手順のための試薬を含み得る：塩化カルシウム、緩衝液（例えば、２×ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水）、および滅菌蒸留水。別の実施形態において、このキットは、ＤＥＡＥ−デキストランによる形質転換のための試薬を含む：ＰＢＳ中のクロロキン、ＰＢＳ中のＤＥＡＥ−デキストランおよびリン酸緩衝化生理食塩水。なお別の実施形態において、リポソームによる形質転換のための試薬が、このキット中に含まれる：ＤＯＴＡＰ／コレステロール押出リポソームから押し出されるリポソーム。例えば、このキットは、カチオン性の脂質ベースのトランスフェクション試薬ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含み得る。
【００７９】
このキットは、本発明のプラスミドによる細菌の形質転換に必要な試薬を含み得る。例えば、このキットは、形質転換受容性の細菌（例えば、ＤＨ１、ＤＨ５、ＤＨ５α、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＳＵＲＥ、ＳＣＳ１１０、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ  １０またはＨＢ１０１）を含み得る。
【００８０】
このキットは、増殖培地または増殖培地を作製するのに必要な試薬を含み得る。例えば、１つの実施形態において、このキットは、ウシ胎仔血清または哺乳動物細胞の増殖のためのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ／Ｖｏｇｔ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ（Ｈａｒｒｙ  Ｅａｇｌｅ）最小必要培地）を含み得る。別の実施形態において、このキットは、粉末のｌｕｒｉａブロス培地、または細菌の増殖に対して適切な抗生物質（例えば、アンピシリンもしくはカナマイシン）を含むｌｕｒｉａブロスプレートを含み得る。
【００８１】
このキット中に供給される構成要素は、適切なバイアルまたは容器（例えば、プラスチックバイアルもしくはガラスバイアル）中に提供される。このキットは、保存のための適切なラベル指示および使用のための適切な指示書を含み得る。
【００８２】
（タンパク質発現およびタンパク質精製）
本発明のプラスミドシステムにおいて産生されるポリペプチドは、標準的な方法（塩析またはアルコール沈殿、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、精製タグとの結合において使用される）、調製用ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、カチオン交換クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィーおよび分配クロマトグラフィー、ならびに向流分配が挙げられるが、これらに限定されない）によって精製され得る。このような精製方法は、当該分野において周知であり、そして例えば、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８２巻，Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹに開示される。
【００８３】
特に、ポリペプチドが、細胞の供給源または組織の供給源から単離される場合に、アッセイ系中に１つ以上のタンパク質分解酵素のインヒビター（例えば、フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）、Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ、ペプスタチン、ロイペプチン、キモスタチンおよびＥＤＴＡ）を含むことが好ましい。
【００８４】
本発明のポリペプチドは、２次的なポリペプチドまたはポリヌクレオチド部分と融合され得、これらは「タグ」と称され得る。タグは、例えば、発現後のポリペプチドの精製または検出を容易にするために使用され得る。融合されたポリペプチドは、例えば、発現されるべきポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端上または３’末端上にタグをコードするポリヌクレオチドのインフレームでの挿入によって構築され得る。その後、この融合されたポリヌクレオチドは、本発明のプラスミドシステムにおいて発現され得る。このようなタグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、セルロース結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ、およびｍｙｃタグが挙げられる。検出可能なタグ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１３ｍＩｎ、７６Ｂｒ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎおよび６８Ｇａもまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを標識するために使用され得る。このような融合産物を構築しそして使用するための方法は、当該分野において、非常に慣習的であり、かつ周知である。
【実施例】
【００８５】
以下の実施例は、さらに本発明を開示するが、その制限として解釈されるべきではない。本発明の分野は、任意の分野を含み、そして上記、下記のプラスミドを以下の実施例において、個々にかまたはキットの一部として含む。また本発明は、本発明の分野内において、以下に示す実施例の方法の全てまたはいずれかを包含する。
【００８６】
（実施例１：増幅可能なクローニングベクターである、ｐＳＲＸＢＬＳおよびｐＸＢＬＳの構築）
この実施例は、哺乳動物の発現ベクターであるｐＳＲＸＢＬＳおよびｐＸＢＬＳの構築を記載する。広いマルチクローニングサイトをｐＤＳＲＧにおいてＳＲαプロモーターの下流にｐＳＲＸＢＬＳを生成するために挿入した。ｐＸＢＬＳ、ｐＳＲＸＢＬＳの誘導体は、任意のプロモーターを欠く。両方のプラスミドは、１つ以上の発現カセット（例えば、抗体遺伝子の重鎖ｃＤＮＡおよび軽鎖ｃＤＮＡのための）が容易に挿入され得る増幅可能なベクターとして機能し得る。
【００８７】
１５５ｂｐのマルチクローニングサイト（ｐＤＳＲＧ−ｘｂａ−ｘｈｏ）を設計し、ＰＣＲによって合成し、そしてＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において、最初にクローニングした。その後、これは、ｐＤＳＲＧのＸｈｏＩ部位およびＸｂａＩ部位にクローニングされ、ｐＳＲＸＢＬＳを生じた。このＳＲαプロモーターを、ｐＳＲＸＢＬＳベクター中に保持した。
【００８８】
ｐＳＲＸＢＬＳを、さらに、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化してＳＲαプロモーターを除去した。その後、この末端をＫｌｅｎｏｗ処理しによって塞ぎ、そして再度ライゲーションし、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を再度生じてｐＸＢＬＳを構築した。
【００８９】
（実施例２：ユニバーサルトランスファーベクターであるｐＵＨＬＳ、ｐＵＬＬＳおよびこれらの子孫の構築）
この実施例は広いマルチクローニングサイトを有し、そしてプロモーターおよびターミネーター／ポリＡ部位を保有する、ユニバーサルトランスファーベクターならびにその子孫の各々を記載する。ｐＵＨＬＳおよびｐＵＬＬＳは、ユニバーサルトランスファーベクターであり、そしてｐＵＨＳＲｓｔｏｐＬＳおよびｐＵＬＳＲｓｔｏｐＬＳは、ＳＲαプロモーターおよびニワトリβグロビンターミネーターを保有する、これらに対応する子孫である。このプラスミドシステムはまた、大きくて複雑なタンパク質の異なるサブユニットが、これらのベクターにおいて別個に発現され得ることを構成する。その後、各サブユニットに対しての発現カセットを、単一のベクター（ｐＸＢＬＳまたはｐＳＲＸＢＬＳ）に移して、トランスフェクション、組み込み、マルチサブユニットタンパク質の等モルの産生を容易にし得る。
【００９０】
２つのマルチクローニングサイト（１６０ｂｐのユニバーサルプラスミドプライマー１および１６６ｂｐのユニバーサルプラスミドプライマー２による）を設計してｐＵＨＬＳおよびｐＵＬＬＳを構築した。このクローニングサイトの両方をＰＣＲによって合成し、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローニングし、その後、ｐＣＲＳｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢｓｓＨＩＩ部位にクローニングした。従って、このｐＣＲＳｃｒｉｐｔの最初のマルチクローニングサイトは、新しく合成されたマルチクローニングサイトにより置換した。この新しいベクターである、ｐＵＨＬＳおよびｐＵＬＬＳは、それぞれ、ユニバーサルプラスミドプライマー１およびユニバーサルプラスミドプライマー２から得た。
【００９１】
ニワトリβグロビンターミネーターの２４９ｂｐ領域（ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いる消化によってｐＤＳＲＧから得た）を、それぞれ、ＢａｍＨＩ部位およびＸｂａＩ部位にて、ｐＵＨＬＳならびにｐＵＬＬＳの両方に挿入してｐＵＨｓｔｏｐＬＳおよびｐＵＬｓｔｏｐＬＳを生成した。このＳＲαプロモーターおよびこれに付随するイントロン（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩによる消化によるｐＤＳＲＧから得られた）をＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＸｈｏＩ部位にてｐＵＨｓｔｏｐＬＳならびにｐＵＬｓｔｏｐＬＳ中に挿入して、それぞれ、ｐＵＨＳＲｓｔｏｐＬＳおよびｐＵＬＳＲｓｔｏｐＬＳを生成した。
【００９２】
（実施例３：ｐＡＩＬ５Ｖ１の構築）
単一のベクターにおける抗体の重鎖および抗体の軽鎖についてのｐＡＩＬ５Ｖ１の構築は、ここに記載される。それらの方向の変化は別として、２つの型のプラスミドを構築した。第１のプラスミドは、増幅についての選択のためのｄｈｆｒマーカーのみを保有する。第２の型の発現プラスミドは、ハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇ）のための遺伝子を伴うｄｈｆｒマーカーを保有する。これは、増幅についての選択性を伴うか、またはそれを伴わないかという多能性を付加する。
【００９３】
抗ヒトＩＬ５のヒトモノクローナル抗体の重鎖遺伝子（ＭＡｂ）を単離し、そしてｐＵＨＳＲｓｔｏｐＬＳにＥｃｏＲＩ部位およびＸｍａＩ部位にて挿入してｐＵＳＲＨＬＳを生成した。抗ヒトＩＬ５  ＭＡｂの軽鎖遺伝子を単離し、そしてｐＵＬＳＲｓｔｏｐＬＳにＥｃｏＲＩ部位およびＡｐａＩ部位にて挿入してｐＵＳＲＬＬＳを生成した。
【００９４】
ｈＣＭＶの最小プロモーター（ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＩでの消化に由来する）を、ｐＵＳＲＨＬＳおよびｐＵＳＲＬＬＳにおいて、ＳＲαプロモーターに置換し、このＳＲαプロモーターを、ＳｎａＢＩおよびＥｃｏＲＩでの消化によって除去してｐＵｈＣＭＶＨＬＳおよびｐＵｈＣＭＶＬＬＳを生成した。このＴＫ−ハイグロマイシン遺伝子（ＴＫ／Ｈｙｇ）をＦｓｅＩ部位にてｐＵｈＣＭＶＨＬＳに挿入してｐＵＨｈｙｇ（＋）ｈＣＭＶＬＳおよびｐＵＨｈｙｇ（−）ｈＣＭＶＬＳを構築した。この軽鎖抗体のカセットを、ＰａｃＩおよびＳｒｆＩでの消化によって、ｐＵｈＣＭＶＬＬＳからＢｓｓＨＩＩ部位においてｐＸＢＬＳに移してｐＡＩＬ５Ｌ（−）ｈＣＭＶＬＳおよびｐＡＩＬ５Ｌ（＋）ｈＣＭＶＬＳを構築した。この重鎖抗体カセットをｐＵＨｈｙｇ（−）ｈＣＭＶＬＳから、ＢｓｓＨＩＩ部位においてｐＡＩＬ５Ｌ（−）ｈＣＭＶＬＳに移してｐＡＩＬ５Ｖ１を生成した。
【００９５】
（実施例４：ｐＡＩＧＦＲＶ３の構築）
抗ＩＧＦＲ１モノクローナル抗体である１９Ｄ１２／１５Ｈ１２を発現するハイブリドーマに由来する可変領域をコードするｃＤＮＡを単離し、そしてＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングした。抗体１９Ｄ１２／１５Ｈ１２の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列ならびにヌクレオチド配列は、その全体が参考として本明細書中に援用される米国特許出願第１０／４４３，４６６号（２００３年５月２２日出願）に示される。この重鎖を抗ＩＧＦＲ１の可変領域の重鎖についてのｃＤＮＡを含むＴＡベクターのＥｃｏＲＩ部位およびＡｐａＩ部位から、ｐＵｈＣＭＶＨＬＳ（上述）の同部位へ移して抗ＩＧＦＲ１の軽鎖についてのｃＤＮＡを含むｐＵｈＣＭＶＩＧＦＲＨＬＳを構築した。選択に関して、ＴＫ−ハイグロマイシン耐性カセットを、ｐＵｈＣＭＶＩＧＦＲＨＬＳのＦｓｅＩ部位に挿入してｐＵｈＣＭＶＨｙｇ（−）ＩＧＦＲＨＬＳを構築した。この軽鎖をＴＡプラスミドのＥｃｏＲＩ部位およびＢｂｓＩ部位からｐＵｈＣＭＶＬＬＳ（上述）の同部位に移してｐＵｈＣＭＶＩＧＦＲＬＬＳを構築した。その後、軽鎖発現カセットの全体をｐＵｈＣＭＶＩＧＦＲＬＬＳからＰａｃＩ部位およびＳｒｆＩ部位にてｐＸＢＬＳに移してｐＡＩＧＦＲＬＬＳを構築した。このハイグロマイシン発現カセットを伴う重鎖発現カセットをＢｓｓＨＩＩ部位にてｐＡＩＧＦＲＬＬＳに移してｐＡＩＧＦＲＶ１およびｐＡＩＧＦＲＶ３を構築した（ｐＩＡＧＦＲＶ１は、本質的に、重鎖遺伝子およびＴＫ−Ｈｙｇ遺伝子の方向が反対であることを除いてｐＡＩＧＦＲＶ３と同一である）。
【００９６】
（実施例５：ｐＡＩＬ１０Ｖ３の構築）
１２Ｇ８（ＩＬ−１０を認識するラット抗体である）の可変領域をコードするｃＤＮＡを単離した。１２Ｇ８の重鎖可変領域を、ｐＵｈｙｇ（−）ＩＧ１ＦＲｈｕＨプラスミドのＫｐｎＩ部位およびＡｐａＩ部位に移してｐＵＩＬ１０Ｈを構築した。このｐＵｈｙｇ（−）ＩＧ１ＦｒｈｕＨプラスミドは、ＩｇＧ１のｃＤＮＡカセットおよびＴＫ−ハイグロマイシンカセットを伴うＩＧＦＲ１の可変領域についての改変ｃＤＮＡを保有する。１２Ｇ８の軽鎖可変領域をｐＡＩＬ５（−）ｈＣＭＶＬＳのＥｃｏＲＩ部位およびＡｐａＩ部位に移してｐＡＩＬ１０（−）Ｌを構築した。このｐＵＩＬ１０Ｈに由来する重鎖発現カセットを、ＢｓｓＨＩＩ制限酵素認識部位にてｐＡＩＬ１０（−）Ｌに移してｐＡＩＬ１０Ｖ３を構築した。
【００９７】
（実施例６：ｐＡＩＧ１ＦＲ（−）ＩＬ２ＬＳの構築）
ｐＡＩＧ１ＦＲ（−）ＩＬ２ＬＳを、３工程のプロセスで構築した。この構築プロセスをＩＲＥＳ−ＩＬ２Ｒα要素のｐＵＬｓｔｏｐＬＳへの移動によって開始した。ＩＲＥＳ−ＩＬ２Ｒαを含むプラスミド（ｐｍｅ１８ＩＲＥＳ）を、ＳｐｅＩ制限酵素およびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、そしてこのＮｏｔＩ部位を、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を使用して完全に塞いでＩＲＥＳ−ＩＬ２Ｒαエレメントを誘導した。同時に、ｐＵＬｓｔｏｐＬＳを、ＥｃｏＲＶ酵素およびＳｐｅＩ酵素で消化し、そしてこのＳｐｅＩ部位を、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を使用して塞ぎ、そしてＩＲＥＳ−ＩＬ２Ｒαエレメントと一緒にライゲーションしてｐＵＬｓｔｏｐＩＲＥＳＩＬ２Ｒを構築した。さらに、ｐＵＬｓｔｏｐＩＲＥＳＩＬ２Ｒを、ＳｐｅＩ酵素およびＸｂａＩ酵素で消化し、そしてＳｐｅＩ部位を、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いて完全に塞いだ。また、ｐＵｈＣＭＶＩＧＦＲＬＬＳを、ＸｂａＩ酵素およびＢｓｐＥＩ酵素を用いて消化し、そしてこのＢｓｐＥＩ部位を、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いて完全に塞ぎ、そしてｐＵＬｓとｐＩＲＥＳＩＬ２Ｒから得たＸｂａＩ−ＳｐｅＩフラグメントと一緒にライゲーションしてｐＵＩＧＦＲＬ−ＩＲＥＳＩＬ２Ｒを構築した。ＩＧＦＲ１のこの重鎖発現カセットを、ｐＵｈｙｇ（−）ＩＧ１ＦＲｈｕＨから、ＢｓｓＨＩＩ制限酵素認識部位にてｐＵＩＧＦＲＬ−ＩＲＥＳＩＬ２Ｒに移してｐＡＩＧＦＲ（−）ＩＬ２ＬＳを構築した。
【００９８】
（実施例７：抗ＩＧＦＲ１モノクローナル抗体１９Ｄ１２を発現するための細胞株の開発）
この実施例において、１９Ｄ１２抗体（ＬＣＦ／ＨＣＡ）を発現する細胞株の開発および増殖が、提供された。
【００９９】
ＤＸＢ１１細胞培養。細胞を、１０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３００７１．０３；Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を加えた、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを含むＭＥＭ  Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯカタログ番号１２５７１−０６３；Ｇｉｂｃｏ−ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で増殖させた。
【０１００】
ハイグロマイシン選択培地。細胞を、トランスフェクション後４８時間にて分割した。細胞を、１０％の透析されたＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３００７９．０３）を加え、ハイグロマイシンＢ（ＣＬＯＮＴＥＣＨカタログ番号８０５７−１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を３００μｇ／ｍＬにて加えた、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを含まないＭＥＭ  Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯカタログ番号１２５６１−０５６；）中で増殖させた。
【０１０１】
サブクローニング培地。サブクローニングを、１０％の透析されたＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３００７９．０３）を加えた、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを含まないＭＥＭ  Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯカタログ番号１２５６１−０５６）中で行った。
【０１０２】
メトトレキサート（ＭＴＸ）増幅培地。メトトレキサート増幅を１０％の透析されたＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３００７９．０３）を加えて、ＭＴＸ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ８４０７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、それぞれ、２０ｎＭ、８０ｎＭおよび３２０ｎＭにて加えたリボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを含まないＭＥＭ  Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯカタログ番号１２５６１−０５６）中で実施した。
【０１０３】
無血清懸濁液に対する適合のための培地。無血清懸濁液に対する適合を、２０ｍｌ／ＬのＬ−グルタミンを２００ｍＭ（ＧＩＢＣＯカタログ番号２５０３０−０８１）および１０ｍｌ／Ｌの脂質（コレステロールが豊富）（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｌ４６４６）を補充したＣＨＯタンパク質非含有培地（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ５４６７）中で行った。
【０１０４】
３Ｌの産生バッチについての栄養培地。２００ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯカタログ番号２５０３０−０８１）およびグルコース溶液（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ８７６９）を、産生を実行する間の栄養として供給した。
【０１０５】
トランスフェクション法およびサブクローニング法。ＤＸＢ１１細胞を、トリプシン処理し、計測し、そしてトランスフェクションの前日に２×１０６細胞／Ｔ２５フラスコにてまき、その結果、トランスフェクションの当日中に５０〜９０％のコンフルーエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）になった。トランスフェクションを、２．５μｇ  ＤＮＡ（ｐＡＩＧＦＲＶ３）／Ｔ２５フラスコおよびＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＰＬＵＳＴＭ試薬（ＧＩＢＣＯカタログ番号１０９６４−０１３）を使用して行った。ｖｅｎｄｏｒの指示書に従って、このＤＮＡを、最初にＰＬＵＳ試薬と複合体化し、ＤＮＡ−ＰＬＵＳ複合体を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬と混合し、その後このＤＮＡ−ＰＬＵＳ−ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ複合体を使用して上記細胞をトランスフェクトした。この細胞を、５％のＣＯ２にて３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、ＤＸＢ１１細胞培養培地を所望の容量添加し、この細胞および培地を、Ｔ７５フラスコに移し、そしてこの細胞を、２日間増殖させた。この培地を、ハイグロマイシン選択培地で交換し、そしてこの細胞を、１０日間から２週間増殖させた。いくつかの細胞を、この段階において層にし、この残りの細胞を９６ウェルプレート中にサブクローンした。
【０１０６】
サブクローニングを、サブクローニング培地を用いて９６ウェルプレート中で開始した。単一クローンを、２４ウェルプレート、６ウェルプレート、Ｔ−２５フラスコおよびＴ−７５フラスコ中で連続的に増殖させた後、十分な発現をＥＬＩＳＡによって各段階にて検出した。メトトレキサート培地を、増幅のために、２０〜３０％に密集した培養物に添加した。増幅を、２０ｎＭ、４０ｎＭ、８０ｎＭおよび３２０ｎＭのメトトレキサートにて１０日間から２週間実施した。増幅の後、この培地を、サブクローニング培地に交換し、そしてこの細胞を約１０％コンフルーエンスになるまで増殖させた。この細胞を、この段階にて別の回のサブクローニングに供した。２回目のサブクローニングの後、この細胞を、Ｔ−２５フラスコの段階にて指定された培地を伴う無血清懸濁培養物に対する適合に供した。連続して、血清を、無血清適合培地を用いる希釈によって上記培地から排除し、そして最後にこの細胞を２．５％の血清を含む振盪フラスコに移した。残りの血清を、この培養物の引き続く希釈によって除去した。この無血清培養物を、３リットルの容量にした。
【０１０７】
（実施例８：抗ＩＬ−５抗体を発現する細胞の増殖）
凍結したバイアルから得たｐＡＩＬ５Ｖ１を有する細胞を解凍し、そしてＣＨＯタンパク質非含有培地（０．５７ｇ／ＬのＬグルタミンを補充したＣ−５４６７）を使用する懸濁液中で増殖させた。全ての培養物を、３７℃の、７．５％  ＣＯ２のインキュベーター中か、または３７℃に設定されかつ７．５％のＣＯ２を供給するロッカーバッグ（ｒｏｃｋｅｒ  ｂａｇ）プラットフォーム上に維持した。この種菌列を、振盪フラスコ中で培養を開始し、そして２リットルの培養実施容量で２０リットルバッグを開始するのに十分な培養物が存在するまで、連続的に継代しそしてスケールアップした。このバッグが、所定の分割基準に達する場合、そのバッグは、１０リットルの培養実施容量までスケールアップされる。このバッグが、所定の分割基準に達する場合、そのバッグは分割され、そしてこの残りの培養物は、別の２０リットルのロッカーバッグ（１０リットルの培養実施容量）を平行して開始するために使用される。この２つのロッカーバッグが、適切な分割密度に達する場合、これらのバッグは、生産用バイオリアクターに播種するために使用される。振盪フラスコおよびロッカーバッグは、生存可能な細胞密度が、１×１０６〜１．５×１０６生存可能な細胞／ｍＬに達する場合、代表的には、１：４の希釈液に分割される。この種菌貯留液は、１：４に希釈されて上記バイオリアクター中に投入される。
【０１０８】
【化４】
2007510434.tif 000007
【０１０９】
（実施例９：抗ＩＬ１０抗体を精製するためのプロセス）
この実施例は、ｐＡＩＬ１０Ｖ３によってコードされる抗ＩＬ１０抗体を２００リットルのＣＨＯ細胞発酵から精製するためのプロセスを記載する。この工程は、以下：
・０．２μｍのフィルター連続して有する正に帯電したＣＵＮＯフィルターを用いる濾過によって、細胞培養物の上清を回収する工程。
・ｐＨ３．０によって溶出されるＡｍｅｒｓｈａｍ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（４Ｌ）でのアフィニティーカラムクロマトグラフィーの工程。
・２０〜２２℃でｐＨ３．５にて１時間のインキュベーションの後に、ｐＨを５．５に調整することによるウイルスの不活性化。
・２５０ｍＭ  ＮａＣｌまでの２０ＢＶ勾配によって溶出されるｐＨ５．５でのＥＭＤ  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＥ  ＨｉＣａｐ（４Ｌ）でのカチオン交換クロマトグラフィー。
・２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中への濃縮（２×）／ダイアフィルトレーション（１０×）。
・フロー−スルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）モードにおけるＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｑ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ上でのアニオン交換クロマトグラフィー。この保持されないピークは貯留され、そしてｐＨ５．５に調整される。
・Ｐｌａｎｏｖａフィルター（２〜４つの０．１ｍ２  Ｐｌａｎｏｖａ  ２０フィルターを連続して有する１つの０．１ｍ２  Ｐｌａｎｏｖａ  ３５）を用いるウイルスの濾過。
・２０ｍＭ  酢酸ナトリウム中への濃縮（６×〜１０×）およびダイアフィルトレーション（１０×）の後に、濾過（０．２μｍ）する工程。
を包含する。
【０１１０】
このプロセスは、ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて＞９９％の純度である物質を与える。全体の収率は、７０％である。
【０１１１】
（実施例１０：抗ＩＧＦＲ１抗体の発現および抗ＩＬ−１０抗体の発現）
この実施例において、抗ＩＧＦＲ抗体鎖および抗ＩＬ−１０抗体鎖を含む発現プラスミドを構築し、ここでこの抗体鎖の遺伝子は、このプラスミド中でＭＡＲエレメント（Ｓｅｌｅｘｉｓ；Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０７（２）：９５−１０５（２００４）；Ｓｔｉｅｆら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：３４３−３４５（１９８９）；Ｐｈｉ−Ｖａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２３０２−２３０７（１９９０）；Ｋａｌｏｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１９８−２０７（１９９５））に隣接して位置している。このＭＡＲエレメントは、上記宿主の染色体中に安定して統合され、その後、この細胞中に組み込まれる組換え体遺伝子の発現を補助する約３ｋｂのＤＮＡエレメントである。
【０１１２】
このＭＡＲエレメントを、哺乳動物の発現プラスミド（ｐＡＩＬ１０Ｖｉ（ハイグロマイシン発現カセットを伴う抗ＩＬ１０発現カセットを有する）、ｐＡＩＬ１０Ｖ１／ｐｕｒｏ（ハイグロマイシン発現カセットの代わりにピューロマイシン発現カセットを伴う抗ＩＬ１０発現カセットを有する）、ｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２Ｖ１（ハイグロマイシン発現カセットを伴う抗ＩＧＦＲ１発現カセットを有する）およびｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２Ｖ／ｐｕｒｏ（ハイグロマイシン発現カセットの代わりにピューロマイシン発現カセットを伴う抗ＩＧＦＲ１発現カセットを有する））中に挿入した。各プラスミドはすでに、４つの独立した哺乳動物の発現カセットを含んだ。
【０１１３】
このベクターｐＰＡＧ０１は、約３ｋｂのニワトリリゾチームのマトリックス結合領域（ＭＡＲ）のＤＮＡエレメントを含んだ。ユニバーサルベクターの１つであるｐＵＬＬＳを、制限酵素Ａｇｅ１および制限酵素ＢａｍＨ１によって消化し、そして再度ライゲーションした後にその末端をＫｌｅｎｏｗ酵素によって塞いでベクターｐＵＬＬＳｍｏｄを構築した。上記ｐＰＡＧ０１プラスミドを、ＢａｍＨ１およびＸｂａ１によって消化し、上記ＭＡＲエレメントを、ｐＵＬＬＳｍｏｄ上の同じ部位に移してプラスミドｐＵＬＭＡＲを構築した。最後にこのＭＡＲエレメントを、抗ＩＬ１０および抗ＩＧＦＲ１を発現するプラスミドに移した。ｐＵＬＭＡＲを、ＢｓｓＨＩＩによって消化し、そしてＭＡＲエレメントを含むフラグメントを、ｐＡＩＬ１０Ｖｉ、ｐＡＩＬ１０Ｖ１／ｐｕｒｏ、ｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２Ｖ１およびｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２Ｖ１／ｐｕｒｏのＡｓｃ１部位に移して、ｐｉｎＡＩＬ１０／ＭＡＲ（−）、ｐＡＩＬ１０Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）、ｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２／ＭＡＲ（−）およびｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）を、それぞれ構築した。
【０１１４】
このＭＡＲ含有プラスミドを、ＣＨＯ細胞株、ＤＸＢ１１細胞中に導入し、そして抗体鎖を発現した。この抗体鎖の発現を、ＥＬＩＳＡ分析およびＨＰＬＣ分析によって確認した。ＨＰＬＣ分析において、このＣＨＯ細胞から単離したタンパク質を、逆相カラムまたはプロテイン−Ａカラムを使用して分画した。溶出したタンパク質を、Ａ２８０ｎｍにて分光光学的に検出した。
【０１１５】
本発明は、本明細書中に記載された特定の実施形態によって、本発明の範囲が制限されるべきではない。実際には、本明細書中に記載される発明に対する付加における本発明の種々の改変は、これまでの記述から当業者にとって明らかとなる。このような改変は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【０１１６】
特許、特許出願、刊行物、製品に関する文書およびプロトコルは、本出願全体に列挙され、これらの開示は、全ての目的についてその全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ユニバーサルトランスファーベクターｐＵＬＬＳのプラスミド地図。Ａｍｐ：開始：１９５５  終止：２８１２。Ｃｏｌ  Ｅ１起点：開始：１０１２  終止：１９５２。マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）：開始：６２０  終止：７７２。ｆ１（＋）起点：開始：３  終止：４５９。
【図２】ユニバーサルトランスファーベクターｐＵＨＬＳのプラスミド地図。Ａｍｐ：開始：１９４９  終止：２８０６。ＭＣＳ：開始：６２０  終止：７６６。ｆ１（＋）起点：開始：３  終止：４５９。Ｃｏｌ  Ｅ１起点：開始：１００６  終止：１９４６。
【図３】増幅可能なベクターｐＸＢＬＳのプラスミド地図。ＳＶ４０  Ｔ−抗原（ｔ  ＡＧ）イントロン：開始：５４３１  終止：６００。ＳＶ４０  ＰＯＬＹ  Ａシグナル：開始：５１８４  終止：５４３２。ＭＣＳ：開始：５０３７  終止：５１８３。アンピシリン耐性（Ａｍｐ）：開始：３９６５  終止：４８２８。ｐＢＲ  ＯＲＩ：開始：３２０７  終止：３２０７。ｐＢＲ３２２配列：開始：３０２０  終止：５０３３。ｐＢＲ３２２配列：開始：２８１１  終止：３０１９。ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター：開始：１３４８  終止：２８１０。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ：開始：６０１  終止：１３４７。
【図４】ｐＡＩＬ５Ｖ１のプラスミド地図。ＣＭＶプロモーターによって駆動される、抗ＩＬ−５抗体重鎖（ＶＤＪ−ＩｇＧ４）の発現カセットおよび抗ＩＬ−５抗体軽鎖（ＶＤＪ−ＩｇＫ）の発現カセットは、ＴＫプロモーター（ＴＫ／Ｈｙｇ）によって駆動されるハイグロマイシンＢ発現カセットと一緒にｐＸＢＬＳのマルチクローニングサイトに挿入される。ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン：開始：１２１７７  終止：６００。ＳＶ４０  ＰＯＬＹＡシグナル：開始：１１９３０  終止：１２１７８。ＣＭＶプロモーター：開始：１１２３８  終止：１１８９２。Ｔ７プロモーター／プライミング部位：開始：１１２１９  終止：１１２３８。ＶＤＪ（抗ＩＬ−５軽鎖）：開始：１０７１８  終止：１１１４８。ＩＧκ（抗ＩＬ−５軽鎖）：開始：１０３８２  終止：１０７１７。βグロビンポリＡシグナル：開始：１０１２６  終止：１０３７４。ＴＫ／Ｈｙｇ：開始：８１６１  終止：１００３３。βグロビンポリＡシグナル：開始：７８７７  終止：８１１５。ＩＧＧ４−ＣＨ３（抗ＩＬ−５抗体重鎖）：開始：７５１７  終止：７８３４。ＩＧＧ４−ＣＨ２（抗ＩＬ−５抗体重鎖）：開始：７０８７  終止：７４１９。ＩＧＧ４−ＨＩＮＧＥ（抗ＩＬ−５抗体重鎖）：開始：６９３３  終止：６９６８。ＩＧＧ４−ＣＨ１（抗ＩＬ−５抗体重鎖）：開始：６２４７  終止：６５４０。ＶＤＪ（抗ＩＬ−５抗体重鎖）：開始：５８１３  終止：６２４７。Ｔ７プロモーター／プライミング部位：開始：５７２３  終止：５７４２。ＣＭＶプロモーター：開始：５０６９  終止：５７２３。ＡＰｒ（アンピシリン耐性）：開始：３９６５  終止：４８２８。ＰＢＲ  ＯＲＩ：開始：３２０７  終止：３２０７。ｐＢＲ３２２配列：開始：３０２０  終止：５０３３。ｐＢＲ３２２配列：開始：２８１１  終止：３０１９。ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター：開始：１３４８  終止：２８１０。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ：開始：６０１  終止：１３４７。
【図５】ｐＡＩＧＦＲＶ３のプラスミド地図。ＣＭＶプロモーターによって駆動される、抗ＩＧＦＲ１抗体重鎖（ＶＤＪ−ＩｇＧ４）の発現カセットおよび抗ＩＧＦＲ１抗体軽鎖（ＶＤＪ−ＩｇＫ）の発現カセットは、ＴＫプロモーター（ＴＫ−ハイグロマイシン）によって駆動されるハイグロマイシンＢの発現カセットと一緒にｐＸＢＬＳのマルチクローニングサイトに挿入される。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ（プラスミド増幅のためのそのプロモーター（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）を伴う）およびハイグロマイシンＢコード配列（哺乳動物細胞中での選択のためのそのＴＫプロモーターを伴う）が、示される。ＡＰ（Ｒ）：開始：３９６５  終止：４８２８。ＩｇＧ１非ゲノム領域：開始：７２３４  終止：８２１４。１１Ｄ８ハイブリドーマのＩＧＦＲ１のＶＤＪ：開始：８２１４  終止：８６４１。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ：開始：６０１  終止：１３４７。ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン：開始：１１６０３  終止：６００。ヒト抗ＩＧＦＲ遺伝子のκ鎖：開始：９７６１  終止：１００９６。軽鎖についてのヒト抗ＩＧＦＲ遺伝子のＶＤＪドメイン：開始：１００９７  終止：１０４７７。ｐＢＲ３２２配列：開始：２８１１  終止：３０１９。ｐＢＲ３２２配列：開始：３０２０  終止：５０３３。ＴＫ−ハイグロマイシン：開始：５０５３  終止：６９２５。βグロビンポリＡシグナル：開始：６９７１  終止：７２０９。βグロビンｐＡシグナル：開始：９５０５  終止：９７５３。ＳＶ４０  ＰＯＬＹＡ：開始：１１３５６  終止：１１６０４。ＭＭＴＶ−ＬＴＲ：開始：１３４８  終止：２８１０。ＣＭＶプロモーター：開始：１０６６４  終止：１１３１８。Ｔ７プロモーター／プライミング部位：開始：８７２３  終止：８７４２。ＣＭＶプロモーター：開始：８７４２  終止：９３９６。Ｔ７プロモーター／プライミング部位：開始：１０６４５  終止：１０６６４。ｐＢＲ  ＯＲＩ：開始：３２０７  終止：３２０７。
【図６】ｐＡＩＧ１ＦＲ（−）ＩＬ２ＬＳのプラスミド地図。このプラスミドは、抗ＩＧＦＲ１抗体およびＩＬ２レセプターの膜ドメインの発現を駆動する。抗ＩＧＦＲ１重鎖および抗ＩＧＦＲ１軽鎖、末端切断されたＩＬ２レセプター、ならびにハイグロマイシンＢを含む４つの遺伝子を含む３つの独立した発現カセットは、ｐＸＢＬＳのマルチクローニングサイトに組み込まれる。ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン：開始：１３０６６  終止：６００。ＳＶ４０  ＰＯＬＹＡ：開始：１２８１９  終止：１３０６７。ＣＭＶ：開始：１２１１５  終止：１２７６９。Ｔ７プロモーター／プライミング部位：開始：１２０９６  終止：１２１１５。ＶＤＪ（抗ＩＧＦＲ１軽鎖）：開始：１１５４８  終止：１１９２８。κ（Ｋａｐ；抗ＩＧＦＲ１軽鎖）：開始１１２１２  終止：１１５４７。ＩＲＥＳ：開始：１０６２１  終止：１１１９５。ＩＬ−２Ｒα：開始：９７８７  終止：１０６１５。βグロビンポリＡシグナル（β−グロビンｐＡ）：開始：９５０５  終止：９７５３。ＣＭＶ：開始：８７４２  終止：９３９６。Ｔ７プロモーター／プライミング部位：開始：８７２３  終止：８７４２。ＶＤＪ（１１Ｄ８ハイブリドーマの抗ＩＧＦＲ１重鎖）：開始：８２１４  終止：８６４１。ＩｇＧ１（１１Ｄ８ハイブリドーマの抗ＩＧＦＲ１重鎖）：開始：７２３４  終止：８２１４。βグロビンポリＡシグナル（ｂ−グロビンｐＡ）：開始：６９７１  終止：７２０９。ＴＫ−ハイグロマイシン：開始：５０５３  終止：６９２５。ＡＰｒ：開始：３９６５  終止：４８２８。ｐＢＲ  ＯＲＩ：開始：３２０７  終止：３２０７。ｐＢＲ３２２配列：開始：３０２０  終止：５０３３。ｐＢＲ３２２配列：開始：２８１１  終止：３０１９。ＭＭＴＶ−ＬＴＲ：開始：１３４８  終止：２８１０。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ：開始：６０１  終止：１３４７。
【図７】ｐＡＩＬ１０Ｖ３のプラスミド地図。このプラスミドは、抗ＩＬ−１０の発現を駆動する。ＣＭＶプロモーターによって駆動される抗ＩＬ−１０抗体重鎖（ＶＤＪ−ＩｇＧ４）および抗ＩＬ−１０抗体軽鎖（ＶＤＪ−ＩｇＫ）の発現カセットは、ＴＫプロモーター（ＴＫ−ハイグロマイシン）によって駆動されるハイグロマイシンＢの発現カセットと一緒にｐＸＢＬＳのマルチクローニングサイトに挿入される。ｄｈｆｒ  ｃＤＮＡ（プラスミド増幅のためのプロモーター（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）およびハイグロマイシンＢコード配列（哺乳動物細胞における選択のためのＴＫプロモーターを伴う））が、示される。ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン：開始：１１５０７  終止：６００。ＳＶ４０  ＰＯＬＹＡシグナル：開始：１１２６０  終止：１１５０８。ＣＭＶ：開始：１０５６８  終止：１１２２２。Ｔ７プロモーター／プライミング部位：開始：１０５４９  終止：１０５６８。ＶＤＪ−ＩｇＫ（抗ＩＬ１０ラット抗体１２Ｇ８軽鎖）：開始：９７３９  終止：１０４６８。βグロビンポリＡシグナル：開始：９４７８  終止：９７２６。ＣＭＶプロモーター：開始：８７１５  終止：９３６９。Ｔ７プロモーター／プライミング部位：開始：８６９６  終止：８７１５。ＶＤＪ（抗ＩＬ１０ラット抗体１２Ｇ８重鎖）：開始：８２１４  終止：８６４４。ＩｇＧ１非ゲノム領域（抗ＩＬ１０ラット抗体１２Ｇ８重鎖）：開始：７２３４  終止：８２１４。βグロビンポリＡシグナル：開始：６９７１  終止：７２０９。ＴＫプロモーターが駆動するハイグロマイシン遺伝子（ＴＫ−ハイグロマイシン）：開始：５０５３  終止：６９２５。ＡＰｒ：開始：３９６５  終止：４８２８。ｐＢＲ  ＯＲＩ：開始：３２０７  終止：３２０７。ｐＢＲ３２２配列：開始：３０２０  終止：５０３３。ｐＢＲ３２２配列：開始：２８１１  終止：３０１９。ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター：開始：１３４８  終止：２８１０。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ：開始：６０１  終止：１３４７。
【図８】ｐＤＳＲＧのプラスミド地図。このプラスミドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ；Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９）に寄託される（カタログ番号６８２３３）。このプラスミドは、プラスミド増幅のために、ｄｈｆｒ（−）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でメトトレキサートの存在下において、ＳＲαプロモーター、強力なＳＶ４０ベースのプロモーターおよびジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡを含む。ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン：開始：６３７１  終止：６００。ＳＶ４０  ＰＯＬＹＡシグナル：開始：６１２４  終止：６３７２。ＳＲαプロモーター：開始：５４８６  終止：６１２３。βグロビンポリＡシグナル：開始：５０３８  終止：５２９８。ＡＰｒ：開始：３９６５  終止：４８２８。ｐＢＲ３２２配列：開始：３０２０  終止：５０３３。ｐＢＲ３２２配列：開始：２８１１  終止：３０１９。ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター：開始：１３４８  終止：２８１０。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ：開始：６０１  終止：１３４７。
【図９】ｐＳＲＸＢＬＳのプラスミド地図。ｐＳＲＸＢＬＳは、ｐＤＳＲＧのマルチクローニングサイトを広いマルチクローニングサイトに置き換えたｐＤＳＲＧの直系子孫である。ｐＳＲＸＢＬＳは、ｐＸＢＬＳの親プラスミドである。ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン：開始：６０６５  終止：６００。ＳＶ４０  ＰＯＬＹＡシグナル：開始：５８１８  終止：６０６６。ＳＲαプロモーター：開始：５１８０  終止：５８１７。ＭＣＳ：開始：５０３８  終止：５１７９。Ａｍｐ（Ｒ）：開始：３９６５  終止：４８２８。ｐＢＲ  ＯＲＩ：開始：３２０７  終止：３２０７。ｐＢＲ３２２配列：開始：３０２０  終止：５０３３。ｐＢＲ３２２配列：開始：２８１１  終止：３０１９。ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター：開始：１３４８  終止：２８１０。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ：開始：６０１  終止：１３４７。
【図１０】ｐＵＨＳＲｓｔｏｐＬＳのプラスミド地図。ｐＵＨＳＲｓｔｏｐＬＳは、ＳＲαプロモーターおよび２４９ｂｐのニワトリβ−グロビンターミネーターを保有するｐＵＨＬＳについての子孫プラスミドである。このプラスミドは単独で、目的の遺伝子のいずれかを発現するために使用され得る。また、このプラスミドは、全ての発現カセットが単一のプラスミド上で構築され得るｐＸＢＬＳに、複合タンパク質の一部の、完全な発現カセットを移動させるトランスファーベクターとして使用され得る。Ａｍｐ：開始：２９７５  終止：３８３２。Ｃｏｌ  Ｅ１起点：開始：２０３２  終止：２９７２。イントロンを含むＳｒαプロモーター：開始：９５５  終止：１７６４。βグロビンポリＡシグナル：開始：６７３  終止：９１１。ｆ１（＋）起点：開始：３  終止：４５９。
【図１１】ｐＵＬＳＲｓｔｏｐＬＳのプラスミド地図。ｐＵＬＳＲｓｔｏｐＬＳは、ＳＲαプロモーターおよび２４９ｂｐのニワトリβ−グロビンターミネーターを保有するｐＵＬＬＳについての子孫プラスミドである。このプラスミドは単独で、目的の遺伝子のいずれかを発現するために使用され得る。また、このプラスミドは、全ての発現カセットが単一のプラスミド上で構築され得るｐＸＢＬＳに、複合タンパク質の一部の、完全な発現カセットを移動させるトランスファーベクターとして使用され得る。Ａｍｐ：開始：２９８１  終止：３８３８。Ｃｏｌ  Ｅ１起点：開始：２０３８  終止：２９７８。βグロビンポリＡシグナル：開始：１５１２  終止：１７６０。Ｓｒαプロモーター：開始：６６５  終止：１４７４。ｆ１（＋）起点：開始：３  終止：４５９。
【図１２】ｐＰＡＧ０１のプラスミド地図。このプラスミドは、Ｘｂａ１部位およびＢａｍＨ１部位にはさまれたＳｅｌｅｘｉｓ（Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の約３ｋｂのニワトリリゾチームＭＡＲを含む。ＡＰ（Ｒ）（ｂｌａ遺伝子−Ａｐ（ｒ）決定因子）：開始：４１６５  終止：５０２２。Ｓｅｌｅｘｉｓ  Ｉｎｃ．５’ｌｙｓ  ＭＡＲ：開始：１  終止：２９６０。Ｐ（ＬＡＣ）：開始：３０４３  終止：３０４３。Ｐ（ＢＬＡ）（ｂｌａ遺伝子プロモーター）：開始：５０５７  終止：５０５７。複製起点ＯＲＩ（ＲＮａｓｅＨ切断点）：開始：３４０３  終止：３４０３。
【図１３】ｐｉｎＡＩＬ１０／ＭＡＲ（−）のプラスミド地図。図１３は、ハイグロマイシン耐性マーカーを含む抗ＩＬ１０遺伝子の重鎖発現カセットに並列されるニワトリリゾチームＭＡＲエレメントを有するプラスミド（ｐｉｎＡＩＬ１０／ＭＡＲ（−））の地図を記載する。ＡＰ（Ｒ）：開始：３９６５  終止：４８２８。ＭＡＲ−ｌｙｓ（ＭＡＲ−ｌｙｓは、マトリックス結合領域である）：開始：５０８７  終止：８０４５。ＶＤＪ（抗ＩＬ１０（１２Ｇ８）のＶＤＪ領域）：開始：８９２８  終止：９３６９。ＩｇＧ１（ＩｇＧ１非ゲノム領域）：開始：９３７４  終止：１０３５４。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ：開始：６０１  終止：１３４７。ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン：開始：１４８９７  終止：６００。ＶＤＪ−ＩｇＫ（１２Ｇ８軽鎖（抗ＩＬ１０）についてのＶＤＪ−ＩｇＫ）：開始：１３０２６  終止：１３７５５。ｐＢＲ３２２配列：開始：２８１１  終止：３０１９。ｐＢＲ３２２配列：開始：３０２０  終止：５０３３。ＴＫ−ハイグロマイシン：開始：１０６６３  終止：１２６７２。βグロビンポリＡシグナル：開始：１０３７９  終止：１０６１７。βグロビンｐＡシグナル：開始：１２７６５  終止：１３０１３。ＳＶ４０  ＰＯＬＹＡ：開始：１４６５０  終止：１４８９８。ＭＭＴＶ−ＬＴＲ：開始：１３４８  終止：２８１０。ｈＣＭＶ／イントロン（ハイブリッドのイントロンを含むヒトＣＭＶプロモーター）：開始：８０７７  終止：８９１８。ｈＣＭＶ／イントロン（ヒトＣＭＶプロモーターおよびハイブリッドのイントロン）：開始：１３７７１  終止：１４６１２。ｐＢＲ  ＯＲＩ：開始：３２０７  終止：３２０７。
【図１４】ｐＡＩＬ１０Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）のプラスミド地図。図１４は、ハイグロマイシン耐性マーカーの代わりにピューロマイシンを含む抗ＩＬ１０遺伝子の重鎖発現カセットに並列されるニワトリリゾチームＭＡＲエレメントを有するプラスミド（ｐＡＩＬ１０／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−））の地図を記載する。ＡＰ：開始：３９６５  終止：４８２８。ＭＡＲ−ｌｙｓ（ＭＡＲ−ｌｙｓは、マトリックス結合領域である）：開始：５０８７  終止：８０４５。ＶＤＪ：開始（抗ＩＬ１０（１２Ｇ８）のＶＤＪ領域）：８９２８  終止：９３６９。ＩｇＧ１（ＩｇＧ１非ゲノム領域）：開始：９３７４  終止：１０３５４。ＰＵＲＯ：開始：１１６７４  終止：１２９０５。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ：開始：６０１  終止：１３４７。ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン：開始：１５０７０  終止：６００。ＶＤＪ−ＩｇＫ（１２Ｇ８軽鎖（抗ＩＬ１０）についてのＶＤＪ−ＩｇＫ）：開始：１３１９９  終止：１３９２８。（相補的）ｐＢＲ３２２配列：開始：２８１１  終止：３０１９。ｐＢＲ３２２配列：開始：３０２０  終止：５０３３。βグロビンポリＡシグナル：開始：１０３７９  終止：１０６１７。ＳＶ４０  ＰＯＬＹＡ：開始：１０７８４  終止：１０７８９。βグロビンポリＡシグナル：開始：１２９３８  終止：１３１８６。ＳＶ４０  ＰＯＬＹＡ：開始：１４８２３  終止：１５０７１。ＭＭＴＶ−ＬＴＲ：開始：１３４８  終止：２８１０。ｈＣＭＶ／イントロン（ハイブリッドのイントロンを含むヒトＣＭＶプロモーター）：開始：８０７７  終止：８９１８。ＨＣＭＶ−ＭＩＥ：開始：１０９０２  終止：１１６６０。ｈＣＭＶ／イントロン（ヒトＣＭＶプロモーターおよびハイブリッドのイントロン）：開始：１３９４４  終止：１４７８５。（相補的）ｐＢＲ  ＯＲＩ：開始：３２０７  終止：３２０７。
【図１５】ｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２／ＭＡＲ（−）のプラスミド地図。図１５は、ハイグロマイシン耐性マーカーを含む抗ＩＧＦＲ１遺伝子の重鎖発現カセットに並列されるニワトリリゾチームＭＡＲエレメントを有するプラスミドの地図を記載する。ＡＰ（Ｒ）：開始：３９６５  終止：４８２８。ＭＡＲ−ｌｙｓ（ＭＡＲ−ｌｙｓは、マトリックス結合領域である）：開始：５０８７  終止：８０４５。ＶＤＪ（１１Ｄ８ハイブリドーマのＩＧＦＲ１のＶＤＪ）：開始：８９７４  終止：９４０１。ＩｇＧ１（ＩｇＧ１非ゲノム領域）：開始：９４０１  終止：１０３８１。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ：開始：６０１  終止：１３４７。ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン：開始：１４９２４  終止：６００。κ（κ鎖）：開始：１３０６３  終止：１３３８６。ＶＤＪ（ＩＧＦＲ１のＶＤＪ（ＬＣｄ、ヒト生殖系列配列））：開始：１３３８７  終止：１３７６４。ｐＢＲ３２２：開始：２８１１  終止：３０１９。ｐＢＲ３２２：開始：３０２０  終止：５０３３。ＴＫ−ハイグロマイシン：開始：１０６９０  終止：１２６９９。βグロビンポリＡシグナル：開始：１０４０６  終止：１０６４４。βグロビンｐＡシグナル：開始：１２７９２  終止：１３０４０。ＳＶ４０  ＰＯＬＹＡ：開始：１４６７７  終止：１４９２５。ＭＭＴＶ−ＬＴＲ：開始：１３４８  終止：２８１０。ｈＣＭＶ／イントロン（ハイブリッドのイントロンを含むヒトＣＭＶプロモーター）：開始：８０７７  終止：８９１８。ｈＣＭＶ／イントロン（ヒトＣＭＶプロモーターおよびハイブリッドのイントロン）：開始：１３７８６  終止：１４６２７。ｐＢＲ  ＯＲＩ：開始：３２０７  終止：３２０７。
【図１６】ｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２Ｖ１／ｐｕｒｏ／ＭＡＲ（−）のプラスミド地図。図１６は、ハイグロマイシン耐性マーカーの代わりにピューロマイシンを含む抗ＩＧＦＲ１遺伝子の重鎖発現カセットに並列されるニワトリリゾチームＭＡＲエレメントを有するプラスミドの地図を記載する。ＡＰ（Ｒ）：開始：３９６５  終止：４８２８。ＭＡＲ−ｌｙｓ（ＭＡＲ−ｌｙｓは、マトリックス結合領域である）：開始：５０８７  終止：８０４５。ＶＤＪ（１１Ｄ８ハイブリドーマのＩＧＦＲ１のＶＤＪ）：開始：８９７４  終止：９４０１。ＩｇＧ１（ＩｇＧ１非ゲノム領域）：開始：９４０１  終止：１０３８１。ＰＵＲＯ（Ｒ）：開始：１１７０１  終止：１２９３２。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ：開始：６０１  終止：１３４７。ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン：開始：１５０９７  終止：６００。κ（κ鎖）：開始：１３２３６  終止：１３５５９。ＶＤＪ（ＩＧＦＲ１のＶＤＪ（ＬＣｂ、ヒト生殖系列配列））：開始：１３５６０  終止：１３９３７。ｐＢＲ３２２：開始：２８１１  終止：３０１９。ｐＢＲ３２２：開始：３０２０  終止：５０３３。βグロビンポリＡシグナル：開始：１０４０６  終止：１０６４４。ＳＶ４０  ＰＯＬＹＡ：開始：１０８１１  終止：１０８１６。βグロビンｐＡシグナル：開始：１２９６５  終止：１３２１３。ＳＶ４０  ＰＯＬＹＡ：開始：１４８５０  終止：１５０９８。ＭＭＴＶ−ＬＴＲ：開始：１３４８  終止：２８１０。ｈＣＭＶ／イントロン（ハイブリッドのイントロンを含むヒトＣＭＶプロモーター）：開始：８０７７  終止：８９１８。ＨＣＭＶ−ＭＩＥ：開始：１０９２９  終止：１１６８７。ｈＣＭＶ／イントロン（ヒトＣＭＶプロモーターおよびハイブリッドのイントロン）：開始：１３９５９  終止：１４８００。ｐＢＲ  ＯＲＩ：開始：３２０７  終止：３２０７。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年6月12日(2006.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2007510434.tif 000115
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