(57)【要約】本発明は、例えば、ｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２もしくはｔｉｍ−４の活性を調節する因子またはｔｉｍ−１とｔｉｍ−４との間もしくはｔｉｍ−２とｔｉｍ−２リガンドとの間の物理的相互作用を調節する因子を被験体に投与することにより、被験体における免疫応答を調節する方法に関する。免疫応答としては、自己免疫障害、移植寛容、ならびにＴｈ１媒介性の応答および障害およびＴｈ２媒介性の応答および障害が挙げられるがこれらに限定されない。本発明はまた、ｔｉｍ−１とｔｉｍ−４との間の物理的相互作用を調節する因子を同定するための新規アッセイに関する。さらに、本発明は、新規可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドおよびこれをコードする核酸に関する。
2007529204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈ１媒介性障害を処置する必要のある被験体においてＴｈ１媒介性障害を処置または予防する方法であって、該方法は、該被験体におけるｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２またはｔｉｍ−４の発現または活性を低減する因子の治療有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記Ｔｈ１媒介性障害が自己免疫疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、１型糖尿病、橋本甲状腺炎、クローン病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、胃炎、自己免疫肝炎、溶血性貧血、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性ブドウ膜網膜炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、糸球体腎炎、ギヤン−バレー症候群、乾癬および重症筋無力症からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｔｈ１媒介性障害が、対移植片性宿主病（ｈｏｓｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｇｒａｆｔ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＨＶＧＤ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｔｈ１媒介性障害が、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体が、器官移植レシピエントである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体が、同種異系細胞のレシピエントである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記因子が、ｔｉｍ−１ポリヌクレオチド、ｔｉｍ−２ポリヌクレオチドまたはｔｉｍ−４ポリヌクレオチドに特異的なＲＮＡｉアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記因子が、ｔｉｍ−１のｔｉｍ−４に対する結合を低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記因子が、ｔｉｍ−１のｔｉｍ−４に対する結合を競合的に阻害する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記因子が、
（ｉ）ｔｉｍ−１もしくはｔｉｍ−４に特異的に結合し得る、抗体；または
（ｉｉ）ｔｉｍ−１もしくはｔｉｍ−４に特異的に結合し得る、そのフラグメント
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記因子が、
（ｉ）ｔｉｍ−１もしくはｔｉｍ−４に特異的に結合し得る、抗体；または
（ｉｉ）ｔｉｍ−１もしくはｔｉｍ−４に特異的に結合し得る、そのフラグメント
のいずれも含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記因子が、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；または
（ｖ）配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｔｉｍ−４ポリペプチドと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
を含むポリペプチドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記因子が、
（ａ）ヒト血清アルブミン；または
（ｂ）免疫グロブリンのＦｃドメイン
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記因子が、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９；
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；または
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
を含むポリペプチドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記因子が、ｔｉｍ−２のセマホリン４Ａ（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ４Ａ）に対する結合を競合的に阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記因子が、
（ｉ）配列番号１３のアミノ酸２５〜１２７；または
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸２５〜１２７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
を含むポリペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記因子が、
（ａ）ヒト血清アルブミン；または
（ｂ）免疫グロブリンのＦｃドメイン
をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｔｈ２媒介性障害を処置する必要のある被験体においてＴｈ２媒介性障害を処置または予防する方法であって、該方法は、該被験体におけるｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２またはｔｉｍ−４の発現または活性を増加させる因子の治療有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
前記Ｔｈ２媒介性障害が、アトピー性障害である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｔｈ２媒介性障害が、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、胃腸のアレルギー、食物アレルギー、好中球増加症、結膜炎または糸球体腎炎である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記因子が、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；または
（ｖ）配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｔｉｍ−４ポリペプチドと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
を含むポリペプチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記因子が、
（ａ）ヒト血清アルブミン；または
（ｂ）免疫グロブリンのＦｃドメイン
をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記因子が、ｔｉｍ−１の細胞内ドメインのリン酸化を増加させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
Ｔｈ１免疫応答を促進する必要のある被験体においてＴｈ１免疫応答を促進する方法であって、該方法は、ｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２またはｔｉｍ−４の活性を上昇させる因子の治療有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記被験体が過形成性状態に罹患している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記過形成性状態が、腎臓ガン、カポージ肉腫、慢性白血病、前立腺ガン、乳ガン、肉腫、膵臓ガン、白血病、卵巣癌腫、直腸ガン、咽喉ガン、黒色腫、結腸ガン、膀胱ガン、リンパ腫、肥満細胞腫、肺ガン、乳腺腺癌（ｍａｍｍａｒｙ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、咽頭扁平上皮ガン、精巣ガン、胃腸ガン、もしくは胃ガン、またはそれらの組合せである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
被験体における移植寛容を増加させるための方法であって、ｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２またはｔｉｍ−４の活性を低減する因子の治療有効量を該被験体に投与し、それにより被験体における移植寛容を増加させる工程を包含する、方法。
【請求項２９】
前記因子が、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３と少なくとも９０％同一である、アミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；または
（ｖ）配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｔｉｍ−４ポリペプチドと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
を含むポリペプチドを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記因子が、
（ａ）ヒト血清アルブミン；または
（ｂ）免疫グロブリンのＦｃドメイン
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
ｔｉｍ−１ポリペプチドとｔｉｍ−４ポリペプチドとの間の結合を調節する因子を同定する方法であって：
（ａ）該ｔｉｍ−１ポリペプチドと該ｔｉｍ−４ポリペプチドとを、試験因子の存在下で接触させる工程；および
（ｂ）該ｔｉｍ−１ポリペプチドと該ｔｉｍ−４ポリペプチドとの結合に対する該試験因子の影響を決定する工程
を包含し、それにより、該ｔｉｍ−１ポリペプチドと該ｔｉｍ−４ポリペプチドとの間の結合を調節する因子が同定される、方法。
【請求項３２】
免疫応答を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）ｔｉｍ−１ポリペプチドとｔｉｍ−４ポリペプチドとを、試験因子の存在下で接触させる工程；および
（ｂ）該ｔｉｍ−１ポリペプチドと該ｔｉｍ−４ポリペプチドとの結合に対する該試験因子の影響を決定する工程
を包含し、それにより、免疫応答を調節する因子が同定される、方法。
【請求項３３】
工程（ｂ）が、前記試験因子の存在下でのｔｉｍ−１／ｔｉｍ−４複合体の形成を、適切なコントロールと比較する工程を包含する、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記適切なコントロールが、前記試験因子の非存在下での第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの間での複合体の形成を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記因子が、ｔｉｍ−１とｔｉｍ−４との間での結合を増加させる、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記因子が、ｔｉｍ−１とｔｉｍ−４との間での結合を減少させる、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記因子が、低分子化合物、抗体またはポリペプチドである、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
第一のポリペプチドもしくは第二のポリペプチドまたはその両方が、細胞において発現される、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記複合体の形成を検出する工程が、レポーター遺伝子の発現を検出することを包含し、ここで、該レポーター遺伝子の発現は、該複合体の形成に依存する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第一のポリペプチドもしくは第二のポリペプチドまたはその両方が、蛍光分子で標識される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記ｔｉｍ−４ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；または
（ｖ）配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｔｉｍ−４ポリペプチドと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
を含む、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｔｉｍ−１ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９；
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；または
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
を含む、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
ｔｉｍ−４のｔｉｍ−１に対する結合に寄与する、ｔｉｍ−４中のアミノ酸残基を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）（ｉ）ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインを含むポリペプチドであって、ここで該ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインが、配列番号４の残基３１〜１３４に示すｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインに対して１と１０との間のアミノ酸残基置換を有する、ポリペプチドと
（ｉｉ）ｔｉｍ−４に結合し得る、ｔｉｍ−１ポリペプチドと
を接触させる工程
（ｂ）該ポリペプチドと該ｔｉｍ−１ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出する工程；および
（ｃ）該複合体の形成を適切なコントロールに対して比較する工程
を包含し、ここで、該複合体の形成の程度が、該適切なコントロールと異なるならば、アミノ酸は、ｔｉｍ−１への結合に寄与すると同定される、方法。
【請求項４４】
前記適切なコントロールが、
（ｉ）前記ｔｉｍ−１ポリペプチドと、
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３または配列番号４のアミノ酸３１〜１３４を含む、コントロールポリペプチドと
の間での複合体の形成を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｔｉｍ−１ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９；
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；または
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
試験ポリペプチドがｔｉｍ−１ポリペプチドに結合するか否かを決定する方法であって、該試験ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸３１〜１３３に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、該方法が、
（ａ）該試験ポリペプチドをｔｉｍ−１ポリペプチドと接触させる工程；および
（ｂ）該試験ポリペプチドと該ｔｉｍ−１ポリペプチドとの間での複合体の形成を検出する工程
を包含し、ここで、複合体が形成されるならば、該試験ポリペプチドは、該ｔｉｍ−１ポリペプチドに結合すると決定される、方法。
【請求項４７】
前記ｔｉｍ−１ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９；
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；または
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
試験ポリペプチドがｔｉｍ−４ポリペプチドに結合するか否かを決定する方法であって、該試験ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸２１〜１２６に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、該方法が、
（ａ）該試験ポリペプチドをｔｉｍ−４ポリペプチドと接触させる工程；および
（ｂ）該試験ポリペプチドと該ｔｉｍ−４ポリペプチドとの間での複合体の形成を検出する工程
を包含し、ここで、複合体が検出されるならば、該試験ポリペプチドは、該ｔｉｍ−４ポリペプチドに結合すると決定される、方法。
【請求項４９】
前記ｔｉｍ−４ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；または
（ｖ）配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｔｉｍ−４ポリペプチドと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
被験体におけるアトピー性疾患を予防する方法であって、該方法は、治療有効量のポリペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、該ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；または
（ｖ）配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｔｉｍ−４ポリペプチドと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
を含む、方法。
【請求項５１】
Ａ型肝炎感染を処置または予防する必要のある被験体におけるＡ型肝感染を処置または予防する方法であって、該方法は、治療有効量のポリペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、該ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；または
（ｖ）配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｔｉｍ−４ポリペプチドと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
を含む、方法。
【請求項５２】
前記被験体が、Ａ型肝炎に罹患していない、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記被験体が、Ａ型肝炎ウイルスに感染していない、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記被験体が、抗Ａ型肝炎抗体についてセロネガティブである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記被験体が小児である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記アトピー性疾患が、喘息、鼻炎、湿疹および枯草熱からなる群より選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメイン、ｔｉｍ−４細胞内ドメイン、および短縮型ｔｉｍ−４ムチンドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ｔｉｍ−４膜貫通ドメインを含まない、ポリペプチド。
【請求項５８】
前記ポリペプチドが、ヒトポリペプチドまたはマウスポリペプチドである、請求項５７に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
前記ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインが、配列番号３のアミノ酸３１〜１３３を含む、請求項５７に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
前記ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインが、配列番号４のアミノ酸３１〜１３４を含む、請求項５７に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
配列番号９に示すアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６２】
配列番号１１に示すアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６３】
免疫グロブリンのＦｃドメインまたはアルブミンポリペプチドをさらに含む、請求項５７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６４】
組成物であって、請求項５７に記載の単離されたポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項６５】
請求項５７に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項６６】
ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインおよび短縮型ｔｉｍ−４ムチンドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ｔｉｍ−４膜貫通ドメインもｔｉｍ−４細胞内ドメインも含まない、ポリペプチド。
【請求項６７】
配列番号１０に示すアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６８】
免疫グロブリンのＦｃドメインまたはアルブミンポリペプチドをさらに含む、請求項６６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６９】
組成物であって、請求項６６に記載の単離されたポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項７０】
請求項６６に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項７１】
Ｔ細胞増幅の増強を必要とする被験体におけるＴ細胞増幅を増強する方法であって、該方法は、Ｔ細胞増幅を増強するに十分な量のｔｉｍ−４ポリペプチドを該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項７２】
前記被験体が病原体に罹患している、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
Ｔ細胞増幅の抑制を必要とする被験体においてＴ細胞増幅を抑制する方法であって、該方法は、Ｔ細胞増幅を抑制するに十分な量のｔｉｍ−４ポリペプチドを該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項７４】
前記被験体がＴｈ１媒介性障害またはＴｈ２媒介性障害に罹患している、請求項７３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００４年３月１２日に出願された米国特許出願第６０／５５２，５２３号（発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＩＭＭＵＮＥ  ＲＥＳＰＯＮＳＥＳ  ＢＹ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＩＭ−１  ＡＮＤ  ＴＩＭ−２  ＦＵＮＣＴＩＯＮ」）、および２００４年１０月２７日に出願された米国特許出願第６０／６２２，５５９号（発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＩＭＭＵＮＥ  ＲＥＳＰＯＮＳＥＳ  ＢＹ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＩＭ−１  ＡＮＤ  ＴＩＭ−４  ＦＵＮＣＴＩＯＮ」）の出願日の利益を主張する。参照される出願の全ての教示は、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府の資金提供を受けた研究または開発に関する記述）
本明細書において記載される発明は、全体的にまたは部分的に、米国国立保健研究所助成金第１ＲＯ１ＮＳ０４５９３７−０１号、同第２Ｒ０１ＮＳ３５６８５−０６号、同第２Ｒ３７ＮＳ３０８４３−１１号、同第１ＲＯ１ＡＩ４４８８０−０３号、同第２Ｐ０１ＡＩ３９６７１−０７号、同第１ＰＯ１ＮＳ３８０３７−０４号、および同第１Ｆ３１ＧＭ２０９２７−０１号によって、支援された。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
外部要因または内部要因に対する過剰な免疫応答は、Ｔｈ１またはＴｈ２によって媒介される疾患として特徴付けられ得る疾患をもたらし得る。Ｔｈ２媒介性疾患の例である喘息、アレルギー性鼻炎（枯草熱）、アトピー性皮膚炎（湿疹）、および食物アレルギーは、非常に蔓延しており、一般人口の２０％〜４０％が罹患しており、主要な公衆衛生問題となっている。これらの障害のための経済的負担は、莫大である。喘息のみについても、概算される１９９６年の保健医療負担は、１４０億ドルであった。加えて、全てのアトピー性疾患の罹患率は、先進工業国において過去２０年間にわたって未だ明らかでない理由のために劇的に増加している。先進工業国における喘息の蔓延（これについての数が最も正確である）は、１９８２年から２倍に増加しており、２０２０年までに罹患率がさらに２倍に増加することが予測されている。
【０００４】
Ｔｈ１障害である関節リウマチ（ＲＡ）は、白色人種間で約１％の罹患率（非特許文献１）を有する一般的なヒト自己免疫疾患であり、現在２５０万人の米国人が罹患している。ＲＡは、滑膜性の連結の慢性炎症と、活性化されたＴ細胞、マクロファージ、およびプラズマ細胞による浸潤とによって特徴付けられ、進行性の関節軟骨の破壊をもたらす。ＲＡは、関節疾患の最も重篤な形態である。別のＴｈ１障害である多発性硬化症（ＭＳ）は、最も一般的な中枢神経系（ＣＮＳ）脱髄疾患であって、北米において３５０，０００個体（０．１％）、世界中で１１０万人が罹患している。一般に、ＭＳは、抗原（Ａｇ）提示細胞（ＡＰＣ）上に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子と結合した特異的なミエリンポリペプチドを認識する、炎症促進性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）ＣＤ４  Ｔ（Ｔｈ１）細胞によって部分的に媒介される自己免疫疾患であると考えられている。Ｔｈ１媒介性障害の別の例であるヒトＩ型糖尿病すなわちインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、膵臓ランゲルハンス島のβ細胞の自己免疫性の破壊によって特徴付けられる。β細胞の枯渇は、血中のブドウ糖のレベルの調節不能をもたらす。ヒトにおいては、長い前駆症状期が、糖尿病の発病に先立つ。この期間の間に、膵臓β細胞の機能の段階的な喪失が存在する。疾患の発症には、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、およびチロシンホスファターゼＩＡ２（ＩＡ２）に対する自己抗体の存在が関与する。
【０００５】
Ｔヘルパー（Ｔｈ）サブセットは、別個のサイトカインの様式を生じる能力、および特定の免疫応答を促進する能力によって、識別される。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮγを産生し、細胞内病原体に対して指向される細胞性免疫を促進する。反対に、Ｔｈ２細胞は、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を産生し、肥満細胞および好酸球を活性化し、さらにＢ細胞を細胞外病原体に対して指向させる。
【０００６】
極性化したＴｈ細胞によって産生される特異的なサイトカインは、前駆体Ｔｈ細胞の分化を促進する主要なエフェクターであるが、これらの細胞はまた、もう一方のサブセットの機能的活性を相互調節（ｃｒｏｓｓｒｅｇｕｌａｔｅ）する。例えば、ＩＬ−４は、Ｔｈ２エフェクターへのＴｈｐ細胞の分化の促進における強力な因子であることが報告される。加えて、ＩＬ−４は、ＩＦＮγの産生を拮抗する。Ｔｈ２細胞によって産生される別のサイトカインであるＩＬ−１０もまた、Ｔｈ１の発達およびＩＦＮγ誘導性のマクロファージの機能を阻害することが説明されている。反対に、Ｔｈ１細胞によって産生されるＩＦＮγは、Ｔｈ１の発達を増強し、Ｔｈ２細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を阻害する。特異的なＴｈ細胞サブセットの発達を促進しながら、同時にもう一方の発達運命（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｔｎａｌ  ｆａｔｅ）を阻害するという、これらのサイトカインの能力は、漸進的に極性化する応答をもたらす。
【非特許文献１】Ｈａｒｒｉｓ，Ｂ．Ｊ．ら、「Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ」、１９９７年、ｐ．８９８−９３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、Ｔｈ１応答またはＴｈ２応答の発達を促進または阻害する新規の治療の必要性が存在する。そのような新規の治療は、自己免疫疾患およびアレルギー性疾患を処置するために、移植された組織の免疫寛容を増強するために、または癌を罹患した個体において免疫寛容を低下させるために、使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、広義には、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞の活性化を調節するための試薬、組成物、および方法、ならびに免疫応答を調節するための試薬、組成物、および方法に関する。本発明は、部分的には、本明細書において記載される、ｔｉｍ−１とｔｉｍ−４とがポリペプチド複合体を形成し、そしてこの複合体の形成がＴ細胞の活性化および免疫応答を調節するという、予想外の知見に基づく。いくつかの局面において、本発明は、Ｔｈ１媒介性障害の処置を必要とする被験体における、そのようなＴｈ１媒介性障害を処置または予防する方法を提供し、この方法は、ｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２、またはｔｉｍ−４の発現または活性を低減させる治療有効量の薬剤を、その被験体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この被験体は自己免疫疾患に罹患している。本発明の関連する局面は、Ｔｈ１応答の誘導を必要とする被験体（例えば、癌のような過形成状態に罹患した被験体）においてＴｈ１応答を誘導するための方法を提供する。本発明の関連する局面はまた、Ｔｈ２障害に罹患した（例えば、喘息を有するまたはアレルギー性疾患を有する）被験体を処置するための方法、またはＴｈ２応答が有益である被験体（例えば、自己免疫疾患に罹患した被験体）においてＴｈ２応答を誘導するための方法を提供する。
【０００９】
本発明は、被験体において免疫寛容／移植寛容を調節する方法を、さらに提供し、この方法は、ｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２、またはｔｉｍ−４の活性を調節する治療有効量の薬剤を被験体に投与し、それによって免疫寛容を調節する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この薬剤は、ｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２、またはｔｉｍ−４の発現または活性を低減させることによって、免疫寛容／移植寛容を増強する。他の実施形態において、この薬剤は、ｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２、またはｔｉｍ−４の発現または活性を増大することによって、免疫寛容を低下させる。
【００１０】
本発明は、Ｔ細胞の増殖の増強または抑制を必要とする被験体において、Ｔ細胞の増殖を増強または抑制する方法をさらに提供し、この方法は、Ｔ細胞の増殖を増強または抑制するのに十分な量のｔｉｍ−４ポリペプチドを、この被験体に投与する工程を包含する。
【００１１】
本発明の別の局面は、Ａ型肝炎感染を処置する方法、Ａ型肝炎感染を予防する方法、またはＡ型肝炎感染を罹患する可能性を減少させる方法を提供する。一実施形態において、Ａ型肝炎感染は、治療有効量の（ｉ）ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインを含むポリペプチド、あるいは（ｉｉ）ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインおよび／またはｔｉｍ−４ムチンドメインに対して高いアミノ酸配列相同性もしくはアミノ酸配列類似性を有する配列を含むポリペプチドを、被験体に投与することによって、処置される。本発明の関連する局面は、治療有効量の、ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインを含むポリペプチド、あるいはｔｉｍ−４  ＩｇＶドメイン、ｔｉｍ−４ムチンドメイン、またはその両方に対して高いアミノ酸配列相同性もしくはアミノ酸配列相似性を有する配列を含むポリペプチドを、被験体に投与することによって、その被験体においてアトピー性疾患を予防するか、またはアトピー性疾患を罹患する可能性を減少させる方法を提供する。他の実施形態において、このポリペプチドは、ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインまたはｔｉｍ−４ムチンドメインに対して高いアミノ酸配列同一性もしくはアミノ酸配列相似性を共有するドメインを含む。
【００１２】
本発明はまた、ｔｉｍ−１／ｔｉｍ−４複合体の形成を調節する因子を同定する方法（例えば、複合体形成を促進または遮断する因子、またはｔｉｍ−４の結合の際にｔｉｍ−１の活性化を妨げる因子を同定する方法）を提供する。本発明の別の局面は、ｔｉｍ−１へのｔｉｍ−４の結合を模倣する因子（例えば、ｔｉｍ−１の活性化の促進においてｔｉｍ−４の代理物として作用し得、従って免疫応答を調節する因子）を同定する方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、新規のｔｉｍ−４ポリペプチド、そのようなポリペプチドを含有する組成物、およびそれらをコードする核酸を提供する。特定の局面は、膜に結合（ａｎｃｈｏｒ）されない可溶性のｔｉｍ−４ポリペプチドを提供する。好ましい可溶性ペプチドとしては、ＩｇＶおよびムチンドメインのＮ末端部分を含むがｔｉｍ−４の膜貫通ドメインを含まないペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態において、可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドはさらに、ｔｉｍ−４の細胞内ドメインを含む。可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドは、ｔｉｍ−１に結合して免疫応答を調節する薬剤として使用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．概要）
本発明は、概して、免疫応答を調節するための新規の方法および薬剤を提供する。本発明の方法は、被験体の免疫応答をＴｈ１応答またはＴｈ２応答に調節することを可能にする。Ｔｈ１応答およびＴｈ２応答は、部分的には、互いに排他的である。何故なら、ナイーブＣＤ４＋Ｔヘルパーは、Ｔｈ１エフェクター細胞またはＴｈ２エフェクター細胞のいずれかへと発達し、各々は異なるサイトカインプロファイルを秘めているからである。従って、Ｔｈ１媒介性障害を誘導するための本発明の方法は、Ｔｈ２媒介性障害を有する被験体にとって有用であり得、一方、被験体においてＴｈ２応答を誘導する方法は、Ｔｈ２障害を有する被験体にとって有用である。
【００１５】
本発明の一局面は、免疫応答の調節を必要とする被験体において免疫応答を調節する方法を提供し、この方法は、治療有効量の、ｔｉｍ−１とｔｉｍ−４との間の結合を調節する薬剤を、被験体に投与する工程を包含する。本明細書において記載される方法の一実施形態において、この免疫応答とは、Ｔｈ１免疫応答の増大であり、この薬剤は、ｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２、またはｔｉｍ−４の活性または発現を増大する（例えば、ｔｉｍ−１とｔｉｍ−４との間の結合を増進する薬剤）。本明細書において記載される方法の別の実施形態において、この免疫応答とは、Ｔｈ２免疫応答の増大であり、この薬剤は、ｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２、またはｔｉｍ−４の活性または発現を低下させる（例えば、ｔｉｍ−１とｔｉｍ−４との間の結合を低下させる薬剤）。
【００１６】
本発明は、Ｔｈ１媒介性障害に対する処置を必要とする被験体において、Ｔｈ１媒介性障害を処置するか、予防するか、またはＴｈ１媒介性障害を罹患する可能性を低下させる方法をさらに提供し、この方法は、治療有効量の、ｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２、もしくはｔｉｍ−４の発現または活性を低下させる薬剤を、この被験体に投与する工程を包含する。Ｔｈ１媒介性障害として、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、橋本甲状腺炎、クローン病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、胃炎、自己免疫性肝炎、溶血性貧血、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性ブドウ膜網膜炎（ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、糸球体腎炎、ギヤン−バレー症候群、乾癬、および重症筋無力症）が挙げられる。Ｔｈ１媒介性障害としてはまた、対移植片宿主病（ＨＶＧＤ）および対宿主移植片病が挙げられる。
【００１７】
本発明は、Ｔｈ２媒介性障害に対する処置を必要とする被験体において、Ｔｈ２媒介性障害を処置するか、予防するか、またはＴｈ２媒介性障害を罹患する可能性を低下させる方法をさらに提供し、この方法は、治療有効量の、ｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２、もしくはｔｉｍ−４の発現または活性あるいはその両方を増大する薬剤を、この被験体に投与する工程を包含する。一実施形態において、Ｔｈ２媒介性障害は、アトピー性障害である。別の実施形態において、Ｔｈ２媒介性障害は、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、胃腸のアレルギー、食品アレルギー、好酸球増加、結膜炎、または糸球体腎炎である。
【００１８】
一つの特定の実施形態において、本明細書において記載される方法で使用される、免疫応答を調節するための薬剤は、以下を含むポリペプチドを含有する：（ｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３；（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４；（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３と少なくとも９０％同一または類似であるアミノ酸配列；または（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４と少なくとも９０％同一または類似であるアミノ酸配列；または（ｖ）配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｔｉｍ−４ポリペプチドと、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列。
【００１９】
別の特定の実施形態において、本明細書において記載される方法で使用される、免疫応答を調節するための薬剤は、以下を含むポリペプチドを含有する：（ｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６と少なくとも９０％同一もしくは類似であるアミノ酸配列；または（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９と少なくとも９０％同一もしくは類似であるアミノ酸配列。別の実施形態において、この薬剤は、配列番号１のアミノ酸１３０〜２３７、配列番号２のアミノ酸１２７〜２８８、配列番号３のアミノ酸１３４〜３１８、もしくは配列番号４のアミノ酸１３６〜２８１と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、同一もしくは類似であるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
本明細書において記載される一実施形態において、本明細書において記載される方法において使用される、免疫応答を調節するための薬剤は、ｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２、またはｔｉｍ−４に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを含有する。特定の実施形態において、この薬剤は、ｔｉｍ−４に結合する抗体である；この抗体またはフラグメントは、例えば、ｔｉｍ−４のＩｇＶおよび／またはムチンドメインに結合し得る。別の実施形態において、この薬剤は、ｔｉｍ−１およびｔｉｍ−４、またはｔｉｍ−２およびセマホリン−４Ａ（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ−４Ａ）に対して特異的な、二重特異性抗体である。ｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２、およびｔｉｍ−４の活性を低下させる薬剤として、アンチセンスＲＮＡ試薬が挙げられる。別の実施形態において、この薬剤は、配列番号１のアミノ酸１３０〜２３７、配列番号２のアミノ酸１２７〜２８８、配列番号３のアミノ酸１３４〜３１８、または配列番号４のアミノ酸１３６〜２８１と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％、同一または類似であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する。薬剤はまた、ペプチド模倣物および低分子（すなわち、２ｋＤａ未満の非ペプチド化合物）を含む。
【００２１】
本発明は、薬物送達の方法をさらに提供する。この方法は、部分的に、ｔｉｍ−１およびｔｉｍ−４が物理的複合体（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成し、この相互作用が免疫応答を調節するという、予想外の知見に基づく。本発明の一局面は、ｔｉｍ−１ポリペプチドとｔｉｍ−４ポリペプチドとの間の結合を調節する薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）試験薬剤の存在下で、ｔｉｍ−１ポリペプチドとｔｉｍ−４ポリペプチドとを接触させる工程；および（ｂ）ｔｉｍ−１ポリペプチドとｔｉｍ−４ポリペプチドとの結合に対するその試験薬剤の効果を決定する工程；それによって、ｔｉｍ−１ポリペプチドとｔｉｍ−４ポリペプチドとの間の結合を調節する薬剤を同定する工程。本発明はまた、免疫応答を調節する薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）試験薬剤の存在下で、ｔｉｍ−１とｔｉｍ−４とを接触させる工程；および（ｂ）ｔｉｍ−１ポリペプチドとｔｉｍ−４ポリペプチドとの結合に対するその試験薬剤の効果を決定する工程；それによって、免疫応答を調節する薬剤を同定する工程。一実施形態において、工程（ｂ）は、試験薬剤の存在下におけるｔｉｍ−１／ｔｉｍ−４複合体の形成を、適切なコントロールと比較する工程を包含する。特定の実施形態において、その適切なコントロールとして、この試験試薬の非存在下における第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの間の複合体の形成が挙げられる。
【００２２】
別の実施形態において、上記の第一のポリペプチドまたは第二のポリペプチドまたは両方が、一つの細胞において発現される。別の実施形態において、上記の複合体の形成を検出する工程は、レポーター遺伝子の発現を検出する工程を包含し、ここで、このレポーター遺伝子の発現は、この複合体の形成に依存的である。別の実施形態において、この第一のポリペプチドまたは第二のポリペプチドまたは両方が、蛍光分子で標識される。別の実施形態において、上記のｔｉｍ−４ポリペプチドは、以下を含む：（ｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３；（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４；（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３と少なくとも９０％同一もしくは類似のアミノ酸配列；または（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４と少なくとも９０％同一もしくは類似のアミノ酸配列；または（ｖ）配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｔｉｍ−４ポリペプチドと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列。さらに別の実施形態において、上記のｔｉｍ−１ポリペプチドは、以下を含む：（ｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６と少なくとも９０％同一もしくは類似であるアミノ酸配列；または（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９と少なくとも９０％同一もしくは類似であるアミノ酸配列。別の実施形態において、このｔｉｍ−１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１３０〜２３７または配列番号２のアミノ酸１２７〜２８８と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％同一または類似であるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
ｔｉｍ−１とｔｉｍ−４との間の結合を調節する薬剤を同定するための上記の方法は、ｔｉｍ−１とｔｉｍ−４との間の結合を増進する薬剤、およびｔｉｍ−１とｔｉｍ−４との間の結合を低下させる薬剤の両方を同定するために使用され得る。この方法は、どれか特定の型の薬剤を同定することに限定されない。この薬剤は、例えば、低分子化合物、抗体、ポリペプチド、核酸、または炭水化物であり得る。
【００２４】
加えて、本発明の一局面は、ｔｉｍ−４とｔｉｍ−１との間の結合に寄与するｔｉｍ−４中のアミノ酸残基を同定する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）（ｉ）ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインを含有するポリペプチド（ここで、このｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインは、配列番号３の残基３１〜１３３または配列番号４の残基３１〜１３４に示されるようなｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインと比較して、１〜１０個の間のアミノ酸置換を有する）と（ｉｉ）ｔｉｍ−４に結合し得るｔｉｍ−１ポリペプチドとを接触させる工程；（ｂ）上記のポリペプチドとｔｉｍ−１ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出する工程；ならびに（ｃ）この複合体の形成を、適切なコントロールと比較する工程（ここで、複合体形成の範囲がその適切なコントロールと異なる場合、一アミノ酸が、ｔｉｍ−１への結合に寄与するものとして同定される）。
【００２５】
本発明の関連する局面は、ｔｉｍ−１へのｔｉｍ−４の結合に寄与するｔｉｍ−４中のアミノ酸残基を同定する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）（ｉ）ｔｉｍ−４ムチンドメインを含むポリペプチド（ここで、このｔｉｍ−４ムチンドメインは、配列番号３の残基１３４〜３１８または配列番号４の残基１３６〜２８１に示されるようなｔｉｍ−４ムチンドメインと比較して、１〜１０個の間のアミノ酸置換を有する）と（ｉｉ）ｔｉｍ−４に結合し得るｔｉｍ−１ポリペプチドとを接触させる工程；（ｂ）上記のポリペプチドとｔｉｍ−１ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出する工程；ならびに（ｃ）この複合体の形成を、適切なコントロールと比較する工程（ここで、複合体形成の範囲がその適切なコントロールと異なる場合、一アミノ酸が、ｔｉｍ−１への結合に寄与するものとして同定される）。
【００２６】
ｔｉｍ−１へのｔｉｍ−４の結合に寄与するｔｉｍ−４中のアミノ酸残基を同定するための上記の方法の一実施形態において、その適切なコントロールとして、（ｉ）上記のｔｉｍ−１ポリペプチドと（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３および／または配列番号３のアミノ酸１３４〜３１８を含むコントロールポリペプチドとの間の複合体形成が挙げられる。別の実施形態において、このｔｉｍ−１ポリペプチドは、以下を含む：（ｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６もしくは配列番号１のアミノ酸１３０〜２３７と少なくとも９０％同一もしくは類似のアミノ酸配列；または（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９もしくは配列番号２のアミノ酸１２７〜２８８と少なくとも９０％同一もしくは類似のアミノ酸配列。
【００２７】
本発明の別の局面は、試験ポリペプチドがｔｉｍ−１ポリペプチドに結合するか否かを決定する方法を提供し、ここでこの試験ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸３１〜１３３と少なくとも９０％同一または類似であるアミノ酸配列を含み、この方法は、以下を包含する：（ａ）この試験ポリペプチドとｔｉｍ−１ポリペプチドとを接触させる工程；および（ｂ）この試験ポリペプチドとｔｉｍ−１ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出する工程（ここで、複合体が検出される場合、この試験ポリペプチドは、このｔｉｍ−１ポリペプチドに結合すると決定される）。一例示的実施形態において、このｔｉｍ−１ポリペプチドは、以下を含む（ｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸２１〜１２６もしくは配列番号１のアミノ酸１３０〜２３７と少なくとも９０％同一もしくは類似のアミノ酸配列；または（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２１〜１２９もしくは配列番号２のアミノ酸１２７〜２８８と少なくとも９０％同一もしくは類似のアミノ酸配列。
【００２８】
本発明の別の局面は、試験ポリペプチドがｔｉｍ−４ポリペプチドに結合するか否かを決定する方法を提供し、ここでこの試験ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２１〜１２６または配列番号１のアミノ酸１３０〜２３７と少なくとも９０％同一または類似であるアミノ酸配列を含み、この方法は、以下を包含する：（ａ）この試験ポリペプチドとｔｉｍ−４ポリペプチドとを接触させる工程；および（ｂ）この試験ポリペプチドとｔｉｍ−４ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出する工程（ここで、複合体が検出される場合、この試験ポリペプチドは、このｔｉｍ−４ポリペプチドに結合すると決定される）。一実施形態において、このｔｉｍ−４ポリペプチドは、以下を含む：（ｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３；（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４；（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３もしくは配列番号３のアミノ酸１３４〜３１８と少なくとも９０％同一もしくは類似するアミノ酸配列；または（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４もしくは配列番号４のアミノ酸１３６〜２８１と少なくとも９０％同一もしくは類似するアミノ酸配列；または（ｖ）配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｔｉｍ−４ポリペプチドと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列。
【００２９】
本発明の別の局面は、被験体において、アトピー性疾患を予防するか、またはアトピー性疾患を罹患する可能性を低下させる方法を提供し、この方法は、以下（ｉ）〜（ｖ）を含む治療有効量のポリペプチドをこの被験体に投与する工程を包含する：（ｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３；（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４；（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３と少なくとも９０％同一もしくは類似するアミノ酸配列；または（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４もしくは配列番号４のアミノ酸１３６〜２８１と少なくとも９０％同一もしくは類似であるアミノ酸配列；または（ｖ）配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｔｉｍ−４ポリペプチドと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列。
【００３０】
本発明の別の局面は、Ａ型肝炎感染に対する処置を必要とする被験体において、Ａ型肝炎を処置するか、予防するか、またはＡ型肝炎を罹患する可能性を低減させる方法を提供し、この方法は、以下（ｉ）〜（ｖ）を含む治療有効量のポリペプチドをこの被験体に投与する工程を包含する：（ｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３；（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４；（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３もしくは配列番号３のアミノ酸１３４〜３１８と少なくとも９０％同一もしくは類似であるアミノ酸配列；または（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸３１〜１３４もしくは配列番号４のアミノ酸１３６〜２８１と少なくとも９０％同一もしくは類似であるアミノ酸配列；または（ｖ）配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｔｉｍ−４ポリペプチドと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列。一実施形態において、この被験体は、Ａ型肝炎をまだ罹患していない。別の実施形態において、この被験体は、まだＡ型肝炎ウイルスに感染していない。さらに別の実施形態において、この被験体は、抗Ａ型肝炎抗体についてセロネガティブである。別の実施形態において、この被験体は、小児である。別の実施形態において、上記のアトピー性疾患は、喘息、鼻炎、湿疹、および枯草熱からなる群より選択される。
【００３１】
本発明の別の局面は、新規の可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドを提供する。一局面は、ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメイン、ｔｉｍ−４細胞内ドメイン、および短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｔｉｍ−４ムチンドメインを含む、単離されたポリペプチドを提供し、ここで、このポリペプチドは、ｔｉｍ−４膜貫通ドメインを含まない。本発明の別の局面は、ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインおよび短縮型ｔｉｍ−４ムチンドメインを含む単離されたポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、ｔｉｍ−４膜貫通ドメインもｔｉｍ−４細胞内ドメインも含まない。好ましい実施形態において、この可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドは、哺乳動物のポリペプチド（例えば、ヒトまたはマウスのポリペプチド）である。一つの特定の実施形態において、この可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸３１〜１３３または配列番号４のアミノ酸３１〜１３４を含む。別の実施形態において、この可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２において示される配列を含むが、他の実施形態においては、この可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドは、シグナル配列を含まない。いくつかの実施形態において、この可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドは、別のポリペプチド（例えば、この可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドのインビボでの安定性を高めるポリペプチド）に融合される。いくつかの実施形態において、この融合ポリペプチドとしては、免疫グロブリンのＦｃドメインまたはアルブミンポリペプチドが挙げられる。本発明は、本明細書において記載される可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドをコードする核酸、ならびに、このｔｉｍ−４可溶性ポリペプチドと薬学的に受容可能なキャリアとを含有する組成物を、さらに提供する。
【００３２】
（ＩＩ．定義）
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語は、ここに集められる。他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本明細書発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３３】
不定冠詞「一つの（ａ）」および「一つの（ａｎ）」とは、本明細書において、この冠詞の文法的目的語の一つ（ｏｎｅ）または一つより多く（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）（すなわち、少なくとも一つ）を指すために使用される。例えば、「一つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、一つの要素（ｏｎｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）または一つより多くの要素（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を意味する。
【００３４】
用語「含む」とは、本明細書において、句「（〜を）含むが（それに）限定されない」を意味するように使用され、そしてこの句と交換可能に使用される。
【００３５】
用語「または」とは、本明細書において、文脈が明らかに他を示さない限り、用語「および／または」を意味するように使用され、そしてこの用語と交換可能に使用される。
【００３６】
用語「例えば（ｓｕｃｈ  ａｓ）」とは、本明細書において、句「例えば、（〜である）が、（それに）限定されない」を意味するように使用され、そしてこの句と交換可能に使用される。
【００３７】
用語「核酸」とは、ポリヌクレオチド（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および、適切な場合は、リボ核酸（ＲＮＡ））を指す。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチドアナログから作製されるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかのアナログ、および、記載される実施形態に適用可能であるように、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖のポリヌクレオチドを含むことが理解されるべきである。
【００３８】
用語「予防する」とは、当該分野において認知されており、ある状態（例えば、局所再発（例えば、疼痛）、疾患（例えば、癌）、症候群複合体（例えば、心不全）または任意の他の医学的状態）に関して使用される場合、当該分野においてよく理解されており、その状態の発症の前にある組成物を投与する工程を包含し、その組成物は、その組成物を与えられない被験体と比較して、被験体における、医学的状態の症状の頻度を低下させ、その症状の重篤度を低減させ、またはその状態の症状の発症を遅延させる。従って、癌の予防とは、例えば、予防的処置を受ける患者の集団において、未処置のコントロール集団と比較して、検出可能な癌性増殖物の数を減少させること、および／または、処置集団において、未処置のコントロール集団に対して、検出可能な癌性増殖物の出現を（例えば、統計学的におよび／または臨床学的に有意な量で）遅延させることを含む。感染の予防とは、例えば、処置集団において、未処置コントロール集団に対して、その感染の診断の数を減少させること、および／または、処置集団において、未処置コントロール集団に対して、その感染の症状の発症を遅延させることを含む。疼痛の予防とは、例えば、処置集団において、未処置コントロール集団に対して、被験体が経験する疼痛感覚の頻度を低下させ、その疼痛感覚の重篤度を低減させるか、あるいは、その疼痛感覚を遅延させることを含む。
【００３９】
用語「有効量」とは、本明細書において使用される場合、所望の結果を達成するために必要である投薬量で効果的な量、かつ所望の結果を達成するために必要である期間にわたって効果的な量として定義される。本発明の化合物の有効量は、その動物の疾患の状態、年齢、性別、および体重のような要因に従って変化し得る。投薬レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整され得る。例えば、いくつかの分割用量が毎日投与されてもよいし、または、用量は、治療状況の緊急の要件によって必要とされる量と釣り合うように減量されてもよい。
【００４０】
「被験体」とは、本明細書において使用される場合、任意の脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。被験体の例としては、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類、および魚類が挙げられる。
【００４１】
目的のポリペプチドの「改変体」とは、本明細書において使用される場合、一個以上のアミノ酸によって変更されたアミノ酸配列を指す。この改変体は、置換されたアミノ酸が類似の構造的特性または化学的特性を有する「保存的」変化（例えば、イソロイシンによるロイシンの置換）を有し得る。より稀には、改変体は、「非保存的」変化（例えば、トリプトファンによるグリシンの置換）を有し得る。また、同様のより主要でない改変として、アミノ酸欠失もしくはアミノ酸挿入、またはその両方が挙げられる。生物学的活性または免疫学的活性を失うことなく置換、挿入、または欠失され得るアミノ酸残基の決定の手引きは、当該分野において周知のコンピュータープログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア）を使用して見出され得る。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「Ｔｈ１関連障害」とは、標準（例えば、正常なコントロール）と比較して異常な（例えば増大した）Ｔｈ１細胞活性（例えば、増大したＴｈ１細胞の応答）または異常なＴｈ１細胞の数と関連する疾患または状態である。Ｔｈ１関連障害の例としては、例えば、自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、およびクローン病）が挙げられる。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「Ｔｈ２関連障害」とは、標準（例えば、正常なコントロール）と比較して異常な（例えば増大した）Ｔｈ２細胞活性（例えば、増大したＴｈ２細胞の応答）または異常なＴｈ２細胞の数と関連する疾患または状態である。Ｔｈ２障害の例としては、例えば、喘息、アレルギー、および抗体成分と関連する障害（例えば、関節リウマチ）が挙げられる。
【００４４】
用語「アナログ」とは、本明細書において使用される場合、基準配列からの一個以上のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むが、それらに限定されない。アミノ酸置換は、保存的性質または非保存的性質のものであり得る。保存的アミノ酸置換は、本発明のポリペプチドの一個以上のアミノ酸を、類似の電荷、大きさ、および／または疎水性の特徴のアミノ酸で置き換えることを伴う。保存的置換のみが行われる場合、生じるアナログは機能的に等価である。非保存的置換は、そのアミノ酸配列の一個以上のアミノ酸を、非類似の電荷、大きさ、および／または疎水性の特徴を保有する一個以上のアミノ酸で置き換えることを伴う。アミノ酸挿入は、単一アミノ酸残基、または長さが２〜１５個のアミノ酸の範囲の一連のアミノ酸からなり得る。欠失は、そのアミノ酸配列からの一個以上のアミノ酸または不連続部分の除去からなる。欠失したアミノ酸は、隣接していても隣接していなくともよい。
【００４５】
（ＩＩＩ．Ｔｉｍのアミノ酸配列および核酸配列）
ヒトおよびマウスのｔｉｍポリペプチドの配列は、配列番号１〜１４において、ならびに、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０３／００２７２２号、米国特許第６，０６６，４９８号、同第６，２０４，３７１号、同第６，２８８，２１８号、同第６，０８４，０８３号、同第６，４１４，１１７号、および同第６，５６２，３４３号において、ならびに、米国特許出願公開第２００３／００６９１９６号および同第２００３／０１２４１１４号において記載され、これらの教示は、その全体が本明細書によって参考として援用される。本発明のｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２、およびｔｉｍ−４の核酸およびポリペプチドは、以下に記載される核酸およびその配列の改変体を含むことが、さらに理解される。改変体ヌクレオチド配列は、（例えば、置換、付加、または欠失によって）一個以上のヌクレオチドが異なる配列（例えば、対立遺伝子の改変体）を含み；そして、従って、（例えば、遺伝子コードの縮重に起因して）野生型のｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２、またはｔｉｍ−４のヌクレオチドのコード配列のヌクレオチド配列と異なるコード配列を含む。例えば、ｔｉｍ−１のＩｇＶドメインをコードする核酸は、野生型ｔｉｍ−１の配列と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一の配列を含む核酸であり得る。
【００４６】
マウスおよびヒトのｔｉｍ−１のポリペプチドおよび核酸の配列は、米国特許出願公開第２００３／０１２４１１４号において記載され、その内容は、その全体が本明細書によって参考として援用される。ヒトｔｉｍ−１のポリペプチドはまた、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０３６３３８（配列番号１）として開示され、およびそのｃＤＮＡの核酸配列は、ＮＭ＿０１２２０６（配列番号５）として開示される。マウスｔｉｍ−１のアミノ酸配列および核酸（ｃＤＮＡ）配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿５９９００９（配列番号２）およびＮＭ＿１３４２４８（配列番号６）として開示される。ｔｉｍ−１はまた、科学文献において、ＨＡＶＣＲ１、ＫＩＭ１、ＴＩＭ１、ＨＡＶＣＲ、ＫＩＭ−１、およびＴＩＭＤ１としても言及されてきた。
【００４７】
天然に存在するヒトのｔｉｍ−１の対立遺伝子のアミノ酸配列および核酸配列は、米国特許出願公開第２００３／０１２４１１４中の配列番号１７〜２８に開示される。これらの配列は、本明細書において参考として援用される。ヒトのｔｉｍ−１のＩｇＶドメインは、配列番号１の残基２１〜１２６にわたり、一方、マウスのｔｉｍ−１のＩｇＶドメインは、配列番号２の残基２１〜１２９にわたる。ヒトのｔｉｍ−１のムチンドメインは、残基１３０〜２３７にわたる。マウスのｔｉｍ−１のムチンドメインは、残基１２７〜２８８にわたる。ヒトおよびマウスのｔｉｍ−１のさらなるドメイン（例えば、シグナル配列、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン）は、ＭｃＩｎｔｉｒｅら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）；２（１２）：１１０９−１６に記載され、本明細書において参考として援用される。
【００４８】
類似の３０５アミノ酸膜タンパク質である、マウスのＴＩＭ−２は、マウスのＴＩＭ−１と６４％の同一性を有し、ラットのＫＩＭ−１と６０％の同一性を有し、そしてｈＨＡＶｃｒ−１と３２％の同一性を有する。ＴＩＭ−１のように、ＴＩＭ−２は、二つの細胞外Ｎ−結合型グリコシル化部位と、多数のＯ−結合型グリコシル化部位を備えた、セリン、スレオニンが豊富なムチンドメインとを有する。ＴＩＭ−２はまた、細胞内チロシンキナーゼリン酸化モチーフであるＲＴＲＣＥＤＱＶＹを有する。マウスのＴＩＭ−２のポリペプチドおよび核酸の配列は米国特許公開出願第２００３／０１２４１１４号中に、各々配列番号５および配列番号８として記載される。さらなるマウスｔｉｍ−２配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿５９９０１０およびＮＭ＿１３４２４９として記載される。マウスｔｉｍ−２のＩｇＶドメインは、配列番号１３の位置２５付近から位置１２７まで広がる。
【００４９】
マウスおよびヒトのｔｉｍ−４のポリペプチドおよび核酸の配列は、米国特許出願公開第２００３／０１２４１１４号に記載され、その内容は本明細書によってその全体が参考として援用される。ヒトｔｉｍ−４のアミノ酸配列（配列番号３）および核酸（ｃＤＮＡ）配列（配列番号７）は、米国特許出願公開第２００３／０１２４１１４号に、各々配列番号３３および配列番号３４として開示され、一方、ｔｉｍ−４の対立遺伝子改変体のアミノ酸配列および核酸（ｃＤＮＡ）配列もまた、同明細書において各々配列番号３５および配列番号３６として開示される。マウスｔｉｍ−４の二つのアミノ酸配列は、配列番号４（ＮＰ＿８４８８７４）および配列番号１２として開示される。配列番号１２に対応する核酸配列は、配列番号３（ＮＭ＿１７８７５９）として示される。ヒトｔｉｍ−４のＩｇＶドメインは、配列番号３の残基３１〜１３３にわたり、一方、マウスｔｉｍ−４のＩｇＶドメインは、配列番号４の残基３１〜１３４にわたる。ヒトｔｉｍ−４のムチンドメインは、配列番号３の残基１３４〜３１８にわたる。マウスｔｉｍ−４のムチンドメインは、配列番号４の残基１３４〜２８１にわたる。
【００５０】
本発明はまた、新規のｔｉｍ−４ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸を提供する。本発明の一局面において、これらの新規のｔｉｍ−４ポリペプチドは、一個以上のエキソンを欠失し、その結果として、Ｎ末端、Ｃ末端、もしくは内部配列のいずれかを欠失するポリペプチド、またはエキソンの欠失の結果としてフレームシフトしたリーディングフレームを有するポリペプチドを生じる。一実施形態において、本発明は、膜貫通ドメインを欠失する可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドを提供する。別の実施形態において、本発明は、膜貫通ドメインを欠失しムチンドメインの全部または一部を欠失する可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドを提供する。一実施形態において、これらの可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドは、１０〜４０個のアミノ酸、１５〜３０個のアミノ酸、またはより好ましくは、１８〜２５個の間のアミノ酸をムチンドメインのＣ末端終末から欠失する。一実施形態において、これらの新規の可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、これらの可溶性ヒトｔｉｍ−４ポリペプチドは、配列番号３の残基２８２〜３３７を欠失する。本発明はまた、これらの可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００５１】
本発明の核酸は、上で記載されるポリペプチドの改変体を含む核酸を含むことが、さらに理解される。改変体ヌクレオチド配列は、一個以上のヌクレオチドが、例えば、置換、付加、または欠失によって異なる配列（例えば、対立遺伝子改変体）を含み；そして、従って、（例えば、遺伝子コードの縮重に起因して）野生型のｔｉｍ−１またはｔｉｍ−４のヌクレオチドのコード配列のヌクレオチド配列と異なるコード配列を含む。例えば、ｔｉｍ−１のＩｇＶドメインをコードする核酸は、野生型ｔｉｍ−１のＩｇＶドメインの配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％同一または類似の配列を含む核酸であり得る。ヒトおよびマウスのｔｉｍポリペプチドの配列は、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０３／００２７２２号、米国特許第６，０６６，４９８号、同第６，２０４，３７１号、同第６，２８８，２１８号、同第６，０８４，０８３号、同第６，４１４，１１７号、および同第６，５６２，３４３号、ならびに米国特許出願公開第２００３／００６９１９６号および同第２００３／０１２４１４４号に記載され、それらの教示は、ｔｉｍ−１、ｔｉｍ−２、ｔｉｍ−３、およびｔｉｍ−４についての任意の核酸またはアミノ酸の配列、それらの改変体およびフラグメントを含めて、本明細書によって、その全体が参考として援用される。
【００５２】
遺伝子コードの縮重に起因して野生型配列と異なる単離された核酸またはそれらによって生じるポリペプチド産物もまた、本発明の範囲内にある。例えば、多数のアミノ酸が、一種より多いトリプレットによって指定される。同じアミノ酸を特定するコドン、または同義コドン（ｓｙｎｏｎｙｍ）（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンについての同義コドンである）は、そのポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を生じ得る。当業者は、特定のポリペプチドをコードする核酸の一個以上のヌクレオチドのこれらの改変が、天然の対立遺伝子改変体に起因して、所与の種の個体間に存在することを理解する。
【００５３】
本発明は、ポリペプチドまたは核酸を使用する方法を提供し、ここで、この核酸またはポリペプチドは、別の核酸またはポリペプチドと、指定される程度の配列同一性または配列類似性を共有する。二つのアミノ酸配列または二つの核酸配列の同一性のパーセントを決定するために、これらの配列は、最適な比較を目的としてアラインメントされる（例えば、最適なアラインメントのために、第一および第二のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップが挿入され得、非相同配列は、比較の目的に関して無視される）。好ましい実施形態において、基準配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上が、比較目的のためにアラインメントされる。対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが、次いで比較される。第一の配列中の一つの位置が、第二の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、従って、その分子はその位置では同一である（本明細書において使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」とは、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。二つの配列の間の同一性のパーセントは、これらの配列によって共有される同一な位置の数の関数である（この二つの配列の最適なアラインメントのために挿入されることが必要なギャップの数および各々のギャップの長さを考慮する）。
【００５４】
配列の比較、ならびに二つの配列の間の同一性および類似性のパーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、第１部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年）。
【００５５】
一実施形態において、二つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能である）を使用して決定される。特定の実施形態において、以下のパラメーターがＧＡＰプログラムにおいて使用される：Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、および、１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウェイト（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）および１、２、３、４、５、または６のレングスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）。さらに別の実施形態において、二つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能である）を使用して決定される。例示的なパラメーターとしては、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクス、および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイト、および１、２、３、４、５、または６のレングスウェイトの使用が挙げられる。
【００５６】
別の実施形態において、二つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み付け残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップレングスペナルティ（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）、および４のギャップペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）を用いて、決定される。
【００５７】
別の実施形態において、二つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の最適な全体的なアラインメントは、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．，６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づく、ＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列および対象となる配列は、両方がヌクレオチド配列であるか、または両方がアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全体的な配列アラインメントの結果は、同一性パーセントに換算して表される。一実施形態において、アミノ酸配列同一性は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．，６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づく、ＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して行われる。特定の実施形態において、アミノ酸アラインメントの同一性パーセントおよび類似性パーセントを算出するために使用されるパラメーターは、以下を含む：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ１５０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、およびＧａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、より低い程度の同一性（例えば、少なくとも６０％の同一性）を有するが、ｔｉｍ−１ポリペプチドまたはｔｉｍ−４ポリペプチドによって実施される機能と同じ機能の一つ以上を実施するために十分な類似性を有するポリペプチドを含む。類似性は、保存的なアミノ酸置換によって決定される。そのような置換は、あるポリペプチド中の所与のアミノ酸を、類似の特徴を有する別のアミノ酸によって置換する置換である。保存的置換は、表現型の上ではサイレントであり得る。保存的置換として代表的に見られるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間での一つから別のものへの置き換え、ヒドロキシル残基であるＳｅｒとＴｈｒとの交換、酸性残基であるＡｓｐとＧｌｕとの交換、アミド残基であるＡｓｎとＧｌｎとの間の置換、塩基性残基であるＬｙｓとＡｒｇとの交換、ならびに芳香族残基であるＰｈｅ、Ｔｙｒの間での置き換えである。表現型の上でサイレントであり得るアミノ酸変化に関するさらなる手引きは、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において見出される。
【００５９】
本発明のいくつかの局面は、ポリペプチドを提供するか、またはそれらのポリペプチドを使用することに関する治療方法を提供し、ここで、このポリペプチドは、少なくとも部分的には、基準配列に対して定義される。例えば、本発明によって提供されるいくつかの方法は、免疫応答を調節する必要がある被験体において免疫応答を調節する方法を提供し、この方法は、この被験体に、配列番号３（参照配列）のアミノ酸３１〜１３３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を投与する工程を包含する。従って、このようなポリペプチドは、特定のパーセンテージの参照配列と同一でないアミノ酸残基を有し得る。一つの好ましい実施形態において、これらの非同一の残基は、これらの残基が同一でない残基と類似の化学特性を有する。類似の特性を有する群は、以下のアミノ酸を含む：Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｑ；Ｈ、Ｋ、Ｒ；Ｙ、ＦおよびＷ；Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｃ、Ａ；およびＳ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ａ。別の実施形態において、同一でない残基は、参照配列と、少なくとも一つの進化的に関係する種における（例えば、同じ目の中の種における）オーソロガス配列との間で、進化的に保存されない残基である。哺乳動物の参照配列の場合、好ましい実施形態において変異させられ得るアミノ酸は、参照配列と別の哺乳動物種におけるオーソロガス配列との間で保存されないアミノ酸である。例えば、本発明の方法において使用されるポリペプチドが、ヒトｔｉｍ−４のＩｇＶドメインと９０％同一であるアミノ酸配列を含むと言われる場合、それならば、このポリペプチドは、ｔｉｍ−４のＩｇＶドメインと、マウス、ラット、ブタ、および／またはニワトリのｔｉｍ−４のＩｇＶドメインとが異なる位置に、非同一の残基を有し得る。
【００６０】
本発明は、本明細書において記載される障害のいずれかを処置する医薬の製造のための薬剤を、さらに提供する。薬剤を被験体に投与することによって障害を処置または予防するための、本明細書において開示される任意の方法は、その障害を処置するための医薬の製造におけるこの薬剤の使用に適用され得る。例えば、一つの特定の実施形態において、ｔｉｍ−１ＩｇＶ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｔｈ１媒介性障害の処置のための医薬の製造において使用され得る。
【００６１】
特定の局面において、本開示は、単離形態および／または精製形態の可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドを利用可能にする。この単離形態および／または精製形態のポリペプチドは、通常はこのポリペプチドに結合している他のポリペプチド、もしくはこのポリペプチドを含む特定の複合体から単離されるか、またはそうでなければ、このような他のポリペプチドもしくは複合体を実質的に含まない。特定の実施形態において、可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。二つのポリペプチド間でのアミノ酸同一性は、初めに二つのポリペプチドの配列を、アラインメントアルゴリズム（例えば、ＰＡＭ２５０マトリクスに基づくアルゴリズム）を使用してアラインメントすることによって、決定され得る。
【００６２】
特定の実施形態において、可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドであり、好ましくは、ここで、この部分は、機能的部分（例えば、Ｔｈ１／Ｔｈ２活性を調節するのに十分である部分、またはｔｉｍ−１に結合し得る部分）である。一実施形態において、この部分は、ｔｉｍ−４のＩｇＶドメインを含む。いくつかの実施形態において、上記の可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドは、保存的アミノ産置換を含む。特定の実施形態において、可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドは、精製されるか、または部分的に精製される。いくつかの実施形態において、上記の可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドは、シグナル配列を含めて、またはシグナル配列なしで、配列番号９〜１２に示される配列を含む。
【００６３】
本発明は、可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドと非相同性ポリペプチドとを含有する、融合ポリペプチドをさらに含む。一実施形態において、この可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドは、ＩｇＶドメインを含むが、ムチンドメインの少なくとも一部を欠失し、そして膜貫通ドメインを欠失し、そして必要に応じて細胞内ドメインを欠失する。特定の実施形態において、可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドと免疫グロブリン成分とを含む融合ポリペプチドが提供される。例示的な免疫グロブリン成分は、ヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃドメインのような定常領域である（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，ｐｐ．３３−４６（１９９５））。可溶性のレセプター−ＩｇＧ融合ポリペプチドは、一般的な免疫学的試薬であり、それらの構築のための方法は当該分野において公知であり（例えば、米国特許第５，２２５，５３８号、同第５，７６６，８８３号、および同第５，８７６，９６９号を参照されたい）、これらの全ては参考として援用される。いくつかの実施形態において、本発明の可溶性ペプチドは、Ｆｃ改変体に融合される。
【００６４】
関連する実施形態において、本発明の改変ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域を備えるｔｉｍ−４融合ポリペプチドを含む。公知のことであるが、各々の免疫グロブリン重鎖定常領域は、４つまたは５つのドメインを含む。これらのドメインは、順番に以下のように名付けられる：ＣＨ１−ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）。これらの重鎖ドメインのＤＮＡ配列は、免疫グロブリンのクラスの間で交差相同性（ｃｒｏｓｓ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有する。例えば、ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＩｇＡおよびＩｇＤのＣＨ２ドメインと相同性であり、ＩｇＭおよびＩｇＥのＣＨ３ドメインと相同性である。本明細書において使用される場合、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリン鎖の定常領域のカルボキシル末端部分、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常領域またはその一部分を意味することが理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）一つのＣＨ１ドメイン、一つのＣＨ２ドメイン、および一つのＣＨ３ドメイン、２）一つのＣＨ１ドメインおよび一つのＣＨ２ドメイン、３）一つのＣＨ１ドメインおよび一つのＣＨ３ドメイン、４）一つのＣＨ２ドメインおよび一つのＣＨ３ドメイン、または５）二つ以上のドメインの組み合わせおよび免疫グロブリンヒンジ領域を、含み得る。好ましい実施形態において、この免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも一つの免疫グロブリンヒンジ領域、一つのＣＨ２ドメイン、および一つのＣＨ３ドメインを含み、好ましくは、ＣＨ１ドメインを欠失する。
【００６５】
一実施形態において、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３、または４）である。免疫グロブリンの他のクラスであるＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）、およびＩｇＭ（Ｉｇμ）が使用されても良い。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択肢は、米国特許第５，５４１，０８７号、および同第５，７２６，０４４号において詳細に考察される。特定の結果を達成するための、特定の免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当該分野における技術のレベルの範囲内であると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の一部は、好ましくは、少なくともヒンジドメインの一部、そして好ましくは、少なくとも、ＦｃγのＣＨ３ドメインの一部、またはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭのいずれかの相同的なドメインの一部を含む。
【００６６】
さらに、上記の免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失が、本発明の実施において有用であり得ることが、企図される。一例は、上部ＣＨ２領域にアミノ酸置換を導入し、Ｆｃレセプターに対する親和力が低下したＦｃ改変体を作製することである（Ｃｏｌｅら（１９９７）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１５９：３６１３）。当業者は、周知の分子生物学的手法を使用して、そのような構築物を調製し得る。
【００６７】
さらなる実施形態において、上記の融合ポリペプチドは、この融合ポリペプチドのインビボでの安定性を高めるために、またはその生物学的活性もしくは局所性を調節するために、またはこの融合ポリペプチドの精製を容易にするために、可溶性ｔｉｍ−４ポリペプチドと第二の非相同性ポリペプチドとを含む。ｔｉｍ−４可溶性融合ポリペプチドを生成するために使用することができる他の例示的な非相同性ポリペプチドとして、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、ポリペプチドＡ、ポリペプチドＧ、および免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合ポリペプチド（ＭＢＰ）（これらは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの単離のために特に有用である）が挙げられるが、これらに限定されない。アフィニティー精製の目的のために、アフィニティークロマトグラフィーのための適切な基質（例えば、グルタチオン結合樹脂、アミラーゼ結合樹脂、ニッケル結合樹脂、またはコバルト結合樹脂）が使用される。当該分野において周知の別の融合ドメインは、緑色蛍光ポリペプチド（ＧＦＰ）である。融合ドメインとしてはまた、「エピトープタグ」が挙げられる。これは、通常は短いペプチド配列であり、これに対して特異的な抗体が利用可能である。特異的なモノクローナル抗体が容易に利用可能である周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。いくつかの場合において、これらの融合ドメインは、（例えば、第Ｘａ因子またはトロンビンのための）タンパク質切断部位を有し、適切なプロテアーゼがこの融合ポリペプチドを部分的に分解し、それによって組み替えポリペプチドをそこから切り離すことを可能とする。切り離されたポリペプチドは、次いで、その後のクロマトグラフィー分離によって、融合ドメインから単離され得る。
【００６８】
好ましくは、典型的には循環系において２０時間より長い半減期を有する安定な血漿ポリペプチドが、ｔｉｍ−４との融合ポリペプチドを構築するために使用される。このような血漿ポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：免疫グロブリン、血清グロブリン、リポポリペプチド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、アポリポポリペプチド（ａｐｏｌｉｐｏｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、およびトランスフェリン。可溶性ｔｉｍ−４分子を特定の細胞型または組織型へと指向させ得る配列もまた、特異的に限局した可溶性ｔｉｍ−４融合ポリペプチドを作製するために、可溶性ｔｉｍ−４に結合され得る。
【００６９】
一つの好ましい実施形態において、本発明は、アルブミンに対するｔｉｍ−４融合を提供する。本明細書において使用される場合、「アルブミン」とは、集合的に、アルブミンのポリペプチドもしくはアミノ酸配列、またはアルブミンの一つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するアルブミンのフラグメントもしくは改変体を指す。特に、「アルブミン」とは、ヒトアルブミンもしくはそのフラグメント（ＥＰ  ２０１  ２３９、ＥＰ  ３２２  ０９４、  ＷＯ９７／２４４４５、ＷＯ９５／２３８５７を参照のこと）、特に、ヒトアルブミンの成熟形態、または他の脊椎動物由来のアルブミンを指す。特に、本発明のアルブミン融合ポリペプチドとしては、ヒトアルブミンおよびヒトアルブミンのフラグメントの天然に存在する多型改変体（ＷＯ９５／２３８５７を参照のこと）（例えば、ＥＰ  ３２２  ０９４において開示されるフラグメント（すなわち、ＨＡ（Ｐｎ）であり、ここでｎは３６９〜４１９である）が挙げられ得る。アルブミンは、任意の脊椎動物、特に、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタ）に由来し得る。非哺乳動物のアルブミンとして、雌鶏およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。上記のアルブミン融合ポリペプチドのアルブミン部分は、ｔｉｍ−４ポリペプチドまたはｔｉｍ−１ポリペプチドと異なる動物由来であってもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態において、アルブミン融合ポリペプチドのアルブミン部分は、血清アルブミンのフラグメントに対応する。血清アルブミンポリペプチドのフラグメントとして、一つ以上の残基がアミノ末端またはＣ末端から欠失しているポリペプチドが挙げられる。一般的に、ＨＡのフラグメントまたは改変体は、少なくとも１００アミノ酸長であり、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸長である。このＨＡ改変体は、ＨＡの少なくとも一つの完全なドメインからなり得るか、または代替的には、ＨＡの少なくとも一つの完全なドメインを含み得る。ヒトアルブミンのドメインは、米国特許出願公開第２００４／０１７１１２３号において記載される。
【００７１】
特定の実施形態において、本発明は、可溶性Ｔｉｍ−４ポリペプチドをコードする核酸を含む。さらなる実施形態において、本発明はまた、可溶性Ｔｉｍ−４ポリペプチドおよび関連する誘導体を含む宿主細胞に関する。この宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本発明のポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用して）、酵母または哺乳動物細胞において発現され得る。１つの実施形態において、可溶性Ｔｉｍ−４ポリペプチドは、哺乳動物細胞によって生成されそして分泌され、そして可溶性Ｔｉｍ−４ポリペプチドは、培養培地から精製される。他の可溶性宿主細胞は、当業者に公知である。従って、本発明の幾つかの実施形態は、可溶性Ｔｉｍ−４ポリペプチドを産生する方法にさらに関する。
【００７２】
治療効力もしくは予防効力または安定性（例えば、エキソビボでの有効期間およびインビボでのタンパク分解性分解に対する耐性）を増強するために、このＴｉｍ−４ポリペプチドの構造を改変することもまた、可能である。このような改変ポリペプチドは、このポリペプチドの天然に存在する形態の少なくとも１つの活性を維持するように設計される場合、本明細書中でより詳細に記載されるＴｉｍ−４ポリペプチドの機能的な等価物であるとみなされる。このような改変ポリペプチドは、例えばアミノ酸の置換、欠失または付加によって産生され得る。
【００７３】
例として、例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる単独の置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、トレオニンのセリンによる置換などの、アミノ酸の構造的に関連するアミノ酸による置換（すなわち、保存的変異）は、得られる分子の生物学的活性に大きな効果を有さないと予測することは、妥当である。保存的置換は、アミノ酸の側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は、４つのファミリーに分類され得る：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非電化極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時々、芳香族アミノ酸としても分類される。類似の様式において、アミノ酸レパートリーは、以下のように分類され得る：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン（セリンおよびトレオニンは、必要に応じて脂肪族ヒドロキシルとして別に分類される）；（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン；および（６）硫黄含有＝システインおよびメチオニン。（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ編，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．（１９８１）を参照のこと。）ポリペプチドのアミノ酸配列における変化が機能的ホモログを生じるか否かは、野生型ポリペプチドと類似の様式で細胞内応答を引き起こす改変体ポリペプチドの能力が評価されることにより、容易に決定され得る。例えば、Ｔｉｍ−４ポリペプチドのこのような改変形態は、例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴｈ２細胞によるサイトカインの分泌を調節する改変形態の能力、またはＴｉｍ−１ポリペプチドに結合する改変形態の能力について、評価され得る。１以上の置換が起こっているポリペプチドは、同様の様式により、容易に試験され得る。
【００７４】
本発明によって提供されるかまたは本発明の方法において使用されるＴｉｍ−１ポリペプチド、Ｔｉｍ−２ポリペプチドまたはＴｉｍ−４ポリペプチドの幾つかは、転写後修飾をさらに含み得る。例示的な転写後ポリペプチド修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰリボシル化、ユビキチン結合、糖化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化またはポリペプチド側鎖の付加もしくは疎水基の付加が挙げられる。結果として、修飾可溶化ポリペプチドは、非アミノ酸要素（例えば、脂質、多糖類もしくは単糖類、およびリン酸）を含み得る。
【００７５】
本発明の１つの特定の実施形態において、このＴｉｍ−１ポリペプチド、Ｔｉｍ−２ポリペプチドまたはＴｉｍ−４ポリペプチドの修飾形態（例えば、Ｔｉｍ−４可溶化ポリペプチド）は、この可溶化ポリペプチドのポリペプチドでないポリマーへの結合を含む。１つの特定の実施形態において、このポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン類であり、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に記載の様式である。ＰＥＧは周知の水溶性ポリマーであり、市販されているかまたは当該分野で周知の方法（ＳａｎｄｌｅｒおよびＫａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第３巻，ｐ．１３８−１６１）に従うエチレングリコールの開環重合によって調製され得る。用語「ＰＥＧ」は、大きさまたはＰＥＧの末端における修飾に関係なく任意のポリエチレングリコール分子を含むように広く使用され、以下の式で表され得る：Ｘ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（１）、ここで、ｎは２０〜２３００であり、そしてＸはＨまたは末端の修飾（例えば、Ｃ１−４アルキル）である。１つの実施形態において、本発明のＰＥＧは、１つの末端をヒドロキシまたはメトキシで終わる（すなわち、ＸはＨまたはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である）。ＰＥＧは、結合反応に必要であるか、この分子の化学合成から生じたか、またはこの分子の部分の最適距離のためのスペーサーである、さらなる化学基を含み得る。さらに、このようなＰＥＧは、１以上のＰＥＧ側鎖からなり得、これらは一緒に結合する。１以上のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、多肢（ｍｕｌｔｉａｒｍｅｄ）ＰＥＧまたは分枝ＰＥＧと呼ばれる。分枝ＰＥＧは、例えば、ポリエチレンオキシドの種々のポリオール（グリセロール、ペンタエリトリトール（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｏｌ）およびソルビトールが挙げられる）への付加によって調製され得る。例えば、４肢の（ｆｏｕｒ−ａｒｍｅｄ）分枝ＰＥＧは、ペンタエリトリトールおよびエチレンオキシドから調製され得る。分枝ＰＥＧは、例えば、欧州特許第０４７３０８４号および米国特許第５，９３２，４６２号に記載される。ＰＥＧの１つの形態は、リジンの第一級アミノ基を介して結合する２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）を含む（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６（１９９５）６２−６９）。
【００７６】
ペプチドまたはポリペプチドへのＰＥＧ結合体化は、一般に、ＰＥＧの活性化、および標的ポリペプチド／ペプチドへもしくはリンカー（この後、活性化しそして標的ポリペプチド／ペプチドに結合する）への活性化ＰＥＧ中間体の直接的な結合を包含する（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，３５７１（１９７７）およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，３５８２（１９７７）、ＺａｌｉｐｓｋｙらおよびＨａｒｒｉｓら：Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ編）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２；第２１章および第２２章を参照のこと）。
【００７７】
当業者は、例えば、ペグ化Ｔｉｍ−４ポリペプチドまたはペグ化Ｔｉｍ−１ポリペプチドが治療的にどのように使用されるか、所望の投薬量、循環時間、タンパク分解に対する耐性、免疫原性、および他の考慮事項に基づいて、ＰＥＧについての適切な分子量を選択し得る。ＰＥＧおよびポリペプチドの特性の増強のためのその使用の議論については、Ｎ．Ｖ．Ｋａｔｒｅ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０：９１−１１４（１９９３）を参照のこと。
【００７８】
本発明の１つの実施形態において、ＰＥＧ分子は、活性化されて、Ｔｉｍ−４ポリペプチドまたはＴｉｍ−１ポリペプチド上のアミノ基と（例えば、リジンと）反応し得る（Ｂｅｎｃｈａｍ  Ｃ．Ｏ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３１，２５（１９８３）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．ら，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１，１４１（１９８５）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら，Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｄｒｓ  ９−１１０  ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４６９（１９９９）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら，Ｅｕｒｏｐ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，１９，１１７７−１１８３（１９８３）；Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｃ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２，１１９−１２８（１９９０））。別の実施形態において、ＰＥＧ分子は、Ｔｉｍ−４上またはＴｉｍ−１上のスルフヒドリル基に結合され得る（Ｓａｒｔｏｒｅ，Ｌ．ら，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７，４５（１９９１）；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら，Ｂｉｏｃｏｎ．Ｃｈｅｍ．，７，３６３−３６８（１９９６）；Ｇｏｏｄｓｏｎら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８，３４３；米国特許第５，７６６，８９７号）。米国特許第６，６１０，２８１号および同第５，７６６，８９７号は、スルフヒドリル基に結合され得る例示的な反応性ＰＥＧ種を記載する。幾つかの実施形態において、ペグ化Ｔｉｍ−４ポリペプチドまたはペグ化Ｔｉｍ−１ポリペプチドは、Ｎ末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合するＰＥＧ分子を含む。部位特異的Ｎ末端還元アミノ化は、Ｐｅｐｉｎｓｋｙら，（２００１）ＪＰＥＴ，２９７，１０５９および米国特許第５，８２４，７８４号に記載される。他の利用可能な求核性アミノ基を用いるポリペプチドの還元アミノ化のためのＰＥＧアルデヒドの使用は、米国特許第４，００２，５３１号、Ｗｉｅｄｅｒら，（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，１２５７９およびＣｈａｍｏｗら，（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５，１３３において記載される。
【００７９】
（ＩＶ．免疫応答を調節する方法）
本発明の１つの局面は、被験体における免疫応答を調節する方法（例えば、Ｔｈ１応答またはＴｈ２応答、免疫寛容および移植寛容の調節であるが、これらに限定されない）を提供する。用語「調節」は、本明細書中で使用される場合、上昇または低下をいう。好ましい実施形態において、被験体はヒトである。別の実施形態において、被験体は哺乳動物（例えば、マウス）である。
【００８０】
本発明の１つの特定の局面は、このような処置を必要とする被験体において、Ｔｈ１媒介性障害を処置するか、予防するかまたはその罹患しやすさを低下する方法を提供し、この方法は、被験体にＴｉｍ−１、Ｔｉｍ−２、Ｔｉｍ−４の発現もしくは活性またはその両方を低減する因子、あるいはＴｉｍ−１のＴｉｍ−４への結合またはＴｉｍ−２のセマホリン−４Ａへの結合を低減する因子の治療有効量を投与する工程を包含する。セマホリン４Ａのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０７１７６２号として記載される。本発明の別の局面は、それを必要とする被験体において、Ｔｈ−１媒介性免疫応答を低下するか、阻害するか、抑制するか、改善させるか、または遅延させる方法の特徴を有し、その方法は、被験体にＴｉｍ−１アンタゴニスト、Ｔｉｍ−２アンタゴニストまたはＴｉｍ−４アンタゴニストを投与する工程、例えば、Ｔｉｍ−１アンタゴニスト、Ｔｉｍ−２アンタゴニストまたはＴｉｍ−４アンタゴニストを、被験体におけるこのＴｈ−１媒介性免疫応答を低下するか、阻害するか、抑制するか、改善するか、または遅延させるために十分な量で投与する工程を、包含する。
【００８１】
Ｔｈ２媒介性障害とは対照的に、「Ｔｈ−１媒介性障害」は、本明細書中で使用される場合、Ｔｈ１免疫応答の発生に関連する障害をいう。「Ｔｈ１免疫応答」は、本明細書中で使用される場合、少なくとも１つのＴｈ１サイトカインまたはＴｈ１抗体の誘導をいう。好ましい実施形態において、１より多いＴｈ１サイトカインまたはＴｈ１抗体が誘導される。従って、Ｔｈ１媒介性疾患は、Ｔｈ１応答の誘導に関連する疾患であり、少なくとも１つのＴｈ１サイトカインもしくはＴｈ１抗体の部分的または完全な誘導か、あるいは少なくとも１つのＴｈ１サイトカインもしくはＴｈ１抗体のレベルの上昇をいう。これらの障害は、当該分野で公知であり、例えば、（特に器官特異的）自己免疫疾患、乾癬、Ｔｈ１炎症性障害、細胞外寄生生物による感染（例えば、蠕虫に対する応答）、固体器官同種移植拒絶（例えば、急性腎臓同種移植拒絶）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）感染に関連する症状（例えば、ＨＢＶ急性期または回復期）、慢性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）感染、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、多発性硬化症（ＭＳ）、亜急性リンパ球性甲状腺炎（「潜在性甲状腺炎」）、クローン病、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、急性対宿主性移植片病（ＧｖＨＤ）、糸球体腎炎、抗糸球体基底膜病、ヴェーゲナー肉芽種症、炎症性ミオパシー、シェーグレン症候群、ベーチェット症候群（Ｂｅｈｇｅｔ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、関節リウマチ、ライム関節炎および未解明の反復流産が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
幾つかの実施形態において、Ｔｈ１媒介性障害は、アテローム性動脈硬化、細胞外寄生生物による感染、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）感染に関連する症状（例えば、ＨＢＶ急性期または回復期）、慢性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）感染、潜在性甲状腺炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、糸球体腎炎、抗糸球体基底膜病、ヴェーゲナー肉芽種、炎症性ミオパシー、シェーグレン症候群、ベーチェット症候群、関節リウマチおよび未解明の反復流産からなる群より選択される。
【００８３】
Ｔｈ１媒介性免疫応答を低下するための本明細書中に記載される方法は、被験体における自己免疫疾患を処置するために、特に有用である。１つの実施形態において、被験体においてＴｈ１応答を低下するための本発明の方法は、自己免疫疾患に罹患しているか、または自己免疫疾患の発症のリスクが高い被験体を指向する。「自己免疫疾患」は、被験体自身の抗体が宿主組織に反応するか、または免疫エフェクターＴ細胞が内因性の自己のペプチドに対して自己応答し、組織の破壊を引き起こす疾患のクラスである。従って、免疫応答は、被験体自身の抗原に対して惹起され、自己抗原と呼ばれる。「自己抗原」は、本明細書中で使用される場合、正常な宿主組織の抗原をいう。正常な宿主組織は、ガン細胞を含まない。従って、自己抗原に対して惹起される免疫応答は、自己免疫疾患の文脈において、所望されない免疫応答であり、正常組織の破壊および損傷に対して寄与するが、他方で、ガン抗原に対して惹起される免疫応答は望ましい免疫応答であり、腫瘍またはガンの破壊に寄与する。
【００８４】
自己免疫疾患としては、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、グレーヴズ病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アディソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性および自己免疫糖尿病（１型糖尿病；インスリン依存性糖尿病）が挙げられるが、これらに限定されない。近年、自己免疫疾患は、アテローム硬化症およびアルツハイマー病をも含むことがわかっている。１つの特定の実施形態において、自己免疫疾患は、多発性硬化症、１型糖尿病、橋本甲状腺炎、クローン病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、胃炎、自己免疫肝炎、溶血性貧血、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性ブドウ膜網膜炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、糸球体腎炎、ギヤン−バレー症候群、乾癬および重症筋無力症からなる群より選択される。別の実施形態において、Ｔｈ１媒介性障害は、対移植片性宿主病（ＨＶＧＤ）である。関連の実施形態において、被験体は、器官または組織の移植レシピエントである。
【００８５】
本発明のなお別の局面は、被験体における移植寛容を増加させるための方法を提供し、この方法は、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２またはＴｉｍ−４の機能を低減する因子の治療有効量をこの被験体に投与する工程を包含する。１つの特定の実施形態において、この被験体は、同種異系移植のレシピエントである。この移植片は、任意の器官または組織の移植片であり得、この組織としては、心臓、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、骨髄、皮膚または軟骨が挙げられるが、これらに限定されない。移植寛容とは、本明細書中で使用される場合、レシピエントの免疫系によるドナー器官の拒絶の欠如をいう。その上さらに、この因子は、組織移植または細胞移植の拒絶を予防するか、またはその受けやすさを低減するために使用され得る。
【００８６】
本発明の別の局面は、免疫寛容を低減し、そしてＴｈ１活性化を必要とする被験体におけるＴｈ１活性化を増加する方法を提供し、この方法は、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２もしくはＴｉｍ−４の発現または活性を増加する因子（すなわち、Ｔｉｍ−１アゴニスト、Ｔｉｍ−２アゴニストもしくはＴｉｍ−４アゴニスト）、またはＴｉｍ−１のＴｉｍ−４への結合またはＴｉｍ−２のセマホリン４Ａへの結合を増加する因子の治療有効量を被験体に投与する工程を包含する。免疫寛容における低減は、ガン免疫療法において有益であり得る。免疫系は、腫瘍抗原に対する耐性を発達させ得るので、従って、腫瘍に免疫監視機構を回避させてしまうことがある。本発明の１つの局面は、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２またはＴｉｍ−４の活性を増加する因子、またはＴｉｍ−１のＴｉｍ−４への結合またはＴｉｍ−２のセマホリン４Ａへの結合を増加する因子量を、過形成性状態に罹患する被験体に投与する工程を包含する。
【００８７】
用語「ガン」および「腫瘍」は、相互交換可能に使用され、どちらも、過形成性状態をいう。１つの実施形態において、ガンは、カポージ肉腫、慢性白血病、前立腺ガン、乳ガン、肉腫、膵臓ガン、白血病、卵巣癌腫（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、直腸ガン、咽喉ガン（ｔｈｒｏａｔ  ｃａｎｃｅｒ）、黒色腫、結腸ガン、膀胱ガン、リンパ腫、肥満細胞腫、肺ガン、乳腺腺癌（ｍａｍｍａｒｙ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、咽頭扁平上皮ガン（ｐｈａｒｙｎｇａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および胃腸ガンまたは胃ガンからなる群より選択される。別の実施形態において、ガンは、基底細胞癌、胆道ガン；膀胱ガン；骨肉腫；脳腫瘍およびＣＮＳガン；乳ガン（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）；子宮頸ガン（ｃｅｒｖｉｘ  ｃａｎｃｅｒ）；絨毛ガン；結腸ガンおよび直腸ガン；結合組織ガン；消化器系のガン；子宮内膜ガン；食道ガン；目のガン；頭部および頚部のガン；胃ガン（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）；上皮内新生物；腎臓ガン；咽喉ガン；白血病；肝臓ガン；肺ガン（例えば、小細胞および非小細胞）；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；黒色腫；骨髄腫；神経芽腫；口腔ガン（例えば、唇、舌、口および咽頭）；卵巣ガン（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ）；膵臓ガン；前立腺ガン；網膜芽腫；横紋筋肉腫；直腸ガン；呼吸器系のガン；肉腫；皮膚ガン；胃ガン（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）；精巣ガン；甲状腺ガン；子宮ガン（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｃａｎｃｅｒ）；泌尿器系のガンならびに他の癌腫および肉腫からなる群より選択される。
【００８８】
なお別の局面において、本発明は、それを必要とする被験体において、Ｔｈ２関連応答（例えば、アレルギー性応答または喘息性応答）を低減するか、阻害するか、抑制するか、改善するかまたは遅延させる方法の特徴を有し、この方法は、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２もしくはＴｉｍ−４の発現または活性を増加させる因子（すなわち、Ｔｉｍ−１アゴニスト、Ｔｉｍ−２アゴニストもしくはＴｉｍ−４アゴニスト）、またはＴｉｍ−４のＴｉｍ−１への結合またはＴｉｍ−２のセマホリン４Ａへの結合を増加させる因子を被験体に投与する工程を包含する。
【００８９】
「Ｔｈ２媒介性障害」は、本明細書中で使用される場合、Ｔｈ２免疫応答の発生に関連する疾患をいう。「Ｔｈ２免疫応答」は、本明細書中で使用される場合、少なくとも１つのＴｈ２サイトカインまたはＴｈ２抗体の誘導をいう。好ましい実施形態において、１より多いＴｈ２サイトカインまたはＴｈ２抗体が誘導される。従って、Ｔｈ２媒介性疾患は、Ｔｈ２応答の誘導に関連する疾患であり、少なくとも１つのＴｈ２サイトカインもしくはＴｈ２抗体の部分的または完全な誘導か、あるいは少なくとも１つのＴｈ２サイトカインもしくはＴｈ２抗体のレベルの上昇をいう。これらの障害は当該分野で公知であり、例えば、喘息およびアレルギー（アレルギー性鼻炎、胃腸のアレルギー（食物アレルギーを含む）が挙げられる）のようなアトピー性状態、好酸球増加症、結膜炎または糸球体腎炎、寄生虫のような特定の病原体感受性（例えば、リーシュマニア症）および特定のウイルス（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む）感染および特定の細菌（ヒト結核菌を含む）感染、ならびにらい腫が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、Ｔｈ２関連応答は、喘息またはアレルギーである。
【００９０】
喘息とは、本明細書中で定義される場合、個体における一定時間にわたる可逆性の気流制限をいう。喘息は、気道の壁における好酸球、肥胖細胞、好塩基球およびＣＤ２５＋Ｔリンパ球のような細胞の存在によって特徴付けられる。種々の連絡特性および生物学的エフェクター特性を有するサイトカインの活性ゆえに、これらの細胞の間には密接な相互作用がある。
【００９１】
ケモカインは、細胞を炎症の部位に誘引し、そしてサイトカインはこれらを活性化し、粘膜の炎症および損傷が生じる。この過程の慢性により、基底膜の肥厚および線維症のような、二次的な変化が生じる。この疾患は、種々の刺激に対する気道の応答性亢進の増大、および気道の炎症によって特徴付けられる。喘息と診断された患者は、一般に、長期にわたり多数の指標を有し、この指標としては、喘鳴、喘息性の発作およびメタコリン吸入に対する陽性の応答（すなわち、約４ｍｇ／ｍｌ以下のメタコリン吸入におけるＰＣ２０）が挙げられる。診断のためのガイドラインは、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｔｈｍａ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｓｔｈｍａ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，１９９１，Ｐｕｂ．Ｎｏ．９１−３０４２において見出され得る。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、「アレルギー」は、物質（アレルゲン）に対する後天性の過敏症をいうべきである。アレルギー状態としては、湿疹、アレルギー性鼻炎または鼻感冒、枯草熱、気管支喘息、じんま疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）（じんま疹（ｈｉｖｅｓ））および食物アレルギー、ならびに他のアトピー性状態が挙げられる。「アレルギーを有する被験体」は、アレルゲンに対する応答において、アレルギー応答を有するか、またはこれを発生する危険性のある被験体である。「アレルゲン」とは、感受性の被験体において、アレルギー応答または喘息性応答を誘導し得る物質をいう。アレルゲンの一覧は膨大であり、花粉、昆虫の毒物、動物の鱗屑（ｄａｎｄｅｒ）、塵、真菌の胞子および薬物（例えば、ペニシリン）が挙げられ得る。
【００９３】
目的となるアレルゲンとしては、食物（例えば、イチゴ、ラッカセイ、牛乳ポリペプチド、卵白など）の中に見出される抗原が挙げられる。他の目的となるアレルゲンとしては、種々の空気によって運ばれる抗原が挙げられ、例えば、花粉、動物の鱗屑、家ダニの糞などが挙げられる。分子的にクローニングされたアレルゲンとしては、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｙｏｎｙｓｓｉｎｕｓ（ＤｅｒＰＩ）；ライ麦の花粉由来のＬｏｌ  ｐｌ−Ｖ；多くの昆虫の毒物（ブルドッグアリであるＭｙｒｍｅｃｉａ  ｐｉｌｏｓｕｌａ由来の毒物；Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａハチ毒物ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２および抗原５Ｓ；黄色の体毛（ｊａｃｋｅｔ）のＶｅｓｐｕｌａ  ｍａｃｕｌｉｆｒｏｎｓ由来のホスホリパーゼおよび白い顔のスズメバチＤｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ  ｍａｃｕｌａｔａ由来のホスホリパーゼ）を含む）；非常に多くの花粉ポリペプチド（カバノキの花粉、ブタクサの花粉、Ｐａｒｏｌ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの主要なアレルゲン）および交差反応性のアレルゲンＰａｒｊｌ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ由来）、ならびに他の大気中の花粉（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ、ヨモギ種、イネ科（ｇｒａｍｉｎｅａｅ）などを含む））が挙げられる。目的となる他のアレルゲンは、吸血性の節足動物（例えば、カ（ハマダラカ種、ヤブカ種、ハボシカ種（Ｃｕｌｉｓｅｔａ  ｓｐ．）、アカイエカ種；ハエ（サシチョウバエ種、ヌカカ種（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．））、特にブユ、メクラアブおよびヌカカを含む双翅目）；マダニ（カクマダニ種（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｅｒ  ｓｐ．）、ヒメダニ種（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｓｐ．）、Ｏｔｏｂｉｕｓ種（Ｏｔｏｂｉｕｓ  ｓｐ．））；ノミ、例えばノミ目（ネズミノミ属、ヒトノミ属およびイヌノミ属を含む）によって引き起こされるアレルギー性皮膚炎の原因であるものである。特定のアレルゲンは、多糖類、脂肪酸部分、ポリペプチドなどであり得る。
【００９４】
本発明に従い、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２またはＴｉｍ−４の活性を調節するかまたはＴｉｍ−１とＴｉｍ−４との間の複合体形成を調節する因子は、他の組成物および手順と組み合わせられて、免疫応答の調節のために、または障害もしくは状態の処置のために使用され得る。例えば、腫瘍は、従来的に外科手術、放射線照射または化学療法によって処置され得る。Ｔｉｍ−１の活性を増加する因子（例えば、Ｔｉｍ−４−ＩｇＧ融合ポリペプチド）は、微小転移の休止を拡大し、かつ任意の残留の原発性腫瘍を安定化させるために、その後、患者に投与され得る。
【００９５】
さらに、本明細書中で記載される方法は、免疫応答を調節するために、米国特許出願第６０／５０８３１９号（本明細書によりその全体が参考として援用される）に記載の方法と組み合わせられ得る。例えば、被験体におけるＴｈ１応答を増大させるための方法は、被験体に以下を投与する工程を包含し得る：（ｉ）ガレクチン−９のＴｉｍ−３への結合をブロックする因子（例えば、Ｔｉｍ−３Ｉｇポリペプチド）、および（ｉｉ）Ｔｉｍ−１活性を増加する因子（例えば、Ｔｉｍ−４−Ｉｇ融合物）。当業者は、因子の組み合わせは可能であり得ることを理解する。好ましい方法の組み合わせは、Ｔｉｍ−３の活性およびＴｉｍ−１／Ｔｉｍ−４のいずれかの活性が反対の方向に調節される（例えば、Ｔｉｍ−３活性を増加しＴｉｍ−１／Ｔｉｍ−４活性を低減するか、またはその逆）方法である。米国特許公報第２００４／０００５３２２号もまた、Ｔｉｍ−３関連因子および本明細書中で記載される方法と組み合わせて使用され得る組成物を記載する。
【００９６】
本発明は、それを必要とする被験体におけるＴ細胞増殖を増強するかまたは抑制する方法をさらに提供し、この方法は、Ｔ細胞増殖を増強または抑制するために十分な量のＴｉｍ−４ポリペプチドを被験体に投与する工程を包含する。このような方法は、部分的に、Ｔｉｍ−４：Ｉｇ融合タンパク質が、用量依存的様式でＴ細胞増殖を抑制または増強し得るという予期せぬ知見に由来する。Ｔ細胞応答の増強は、病原体（ウイルスのような感染性因子を含む）に罹患した被験体にとって有利であり得る。Ｔ細胞の応答の抑制は、Ｔｈ１媒介性疾患またはＴｈ２媒介性疾患に罹患した被験体にとって有利であり得る。
【００９７】
Ｔｉｍ−４ポリペプチド（例えば、Ｔｉｍ−４：Ｉｇ融合ポリペプチド）の適切な投薬量は、インビトロのデータまたはインビボのデータから外挿され得る（例えば、実施例１６において提供される）。当業者は、単純な滴定実験を実施して、被験体を処置するために必要な量を決定し得る。例えば、Ｔ細胞のサンプルは被験体から得られ得、Ｔｉｍ−４因子に対する用量応答曲線が作成されて、この被験体におけるＴ細胞増殖を増強するかまたは抑制するかのどちらかのための最適な投薬量が同定され得る。本発明の組成物の用量は、被験体および使用される特定の投与経路に依存して変化し得る。組成物に基づき、この用量は、連続的なポンプなどにより連続的に送達され得るか、または１回、２回またはそれ以上の別々の機会で定期的な間隔で送達され得る。特定の組成物の多回用量の望ましい時間間隔は、当業者により、過度の実験なしで決定され得る。
【００９８】
本発明の別の局面は、アトピー性疾患の罹患を予防するか、または罹患する可能性を低減する方法を提供する。アトピー性疾患は、遺伝的に罹患しやすい個体において、環境的に誘導された免疫応答の結果として発症する、複雑な遺伝形質である。アトピー性個体および非アトピー性個体の両方は、同じ環境要因に曝されるが、アトピー性個体を非アトピー性個体と識別する遺伝的相違は、ある個体においてアトピー性疾患（気道、皮膚または胃腸管におけるアレルギー性炎症、および血清ＩｇＧの上昇、好酸球増化ならびに喘鳴、くしゃみまたはじんま疹の症状によって明らかになる）をもたらす。さらに、アレルギー性炎症応答は、高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１３（好酸球、肥胖細胞、好塩基球およびＩｇＥを産生するＢ細胞の増殖、分化および／または補充を増大する）を産生するＴｈ２リンパ球の存在によって特徴付けられる。
【００９９】
本発明の１つの特定の局面は、被験体においてアトピー性疾患の罹患を予防するかまたは罹患する可能性を低減する方法を提供し、この方法は、治療有効量のポリペプチドを被験体に投与する工程を包含し、このポリペプチドとしては、以下が挙げられる：（ｉ）配列番号３のアミノ酸の３１〜１３３；（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸の３１〜１３４；（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸３１〜１３３と少なくとも９０％同一または類似であるアミノ酸配列；もしくは（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸の３１〜１３４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；または（ｖ）配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴｉｍ−４ポリペプチドと少なくとも９０％同一または類似であるアミノ酸配列。
【０１００】
幾つかの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号３または配列番号４に示される配列、あるいはこのような配列のセグメント（例えば、ＩｇＶドメインまたはムチンドメイン）と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一または類似であるアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは、例えば、配列番号３の残基３１〜１３３と９８％同一または類似である配列を有するドメインを含んでいてもよく、その後、配列番号３とは相同性をほとんど共有しないかまたは全く共有しない配列のセグメントが続く（例えば、免疫グロブリンのＦｃドメインが続く）。
【０１０１】
本発明によって提供される、アトピー性疾患の罹患を予防するかまたは罹患する可能性を低減するための方法は、出願人による、Ａ型肝炎ウイルス（Ｔｉｍ−１に結合する）による感染とアトピー性疾患に罹患する可能性の低下がもたらされたこととの間の関連と同時の、Ｔｉｍ−４がＴｉｍ−１に結合することの発見に、部分的に基づく（ＭｃＩｎｔｉｒｅ  ＪＪら，（２００３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｌｉｎｋ  ｔｏ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ；４２５（６９５８）：５７６  ；ｖｏｎ  Ｈｅｒｔｚｅｎ  ＬＣ，（２０００）Ｐｕｚｚｌｉｎｇ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｌａｔｅｒ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  ａｔｏｐｙ  Ａｎｎ  Ｍｅｄ．；３２（６）：３９７−４００；ＢｏｄｎｅｒＣら（２０００）Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｏｎｓｅｔ  ｗｈｅｅｚｅ  ａｎｄ  ａｔｏｐｙ．Ｔｈｏｒａｘ．５５（５）：３８３−７）。従って、幾つかの実施形態において、アトピー性疾患の罹患を予防するかまたは罹患する可能性を低減するための方法は、以前にＡ型肝炎ウイルスに感染したことのない被験体においてアトピー性疾患の罹患を予防するかまたは罹患する可能性を低減する方法であり、一方、関連の実施形態においては、この被験体は、抗Ａ型肝炎抗体についてセロネガティブである。別の実施形態において、この被験体は、子供であるか、または１０歳未満の被験体である。本明細書中に記載される方法の別の実施形態において、このアトピー性疾患は、喘息、鼻炎、湿疹および枯草熱からなる群より選択される。
【０１０２】
本明細書中で記載される幾つかの方法は、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２、Ｔｉｍ−４の発現もしくは活性、またはその両方を低減するか、あるいは、Ｔｉｍ−１のＴｉｍ−４への結合またはＴｉｍ−２のセマホリン４Ａへの結合を低減する因子（すなわち、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２またはＴｉｍ−４のアンタゴニスト）を使用する。本明細書中で記載される方法の幾つかの実施形態において、治療剤は、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２またはＴｉｍ−４に特異的に結合可能な（ｉ）抗体または（ｉｉ）そのフラグメントを、含有しない。別の実施形態において、この治療剤は、ウイルスタンパク質（例えば、肝炎ウイルス由来のウイルスタンパク質）を含有しない。
【０１０３】
幾つかの実施形態において、Ｔｉｍ−１アンタゴニスト、Ｔｉｍ−２アンタゴニストまたはＴｉｍ−４アンタゴニストは、ＲＮＡｉアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖ＲＮＡ分子）または二本鎖ＲＮＡを産生可能なＤＮＡ構築物を含む。二本鎖ＲＮＡとしては、ヘアピンＲＮＡおよび２本の相補的一本鎖ＲＮＡ分子によって形成されるＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡのコード鎖（センス鎖）に対し相補的である（またはアンチセンスの）比較的短い核酸である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的にＲＮＡベースであるが、ＤＮＡベースであってもよい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多くの場合、その安定性を増大するように改変される。
【０１０４】
理論にとらわれることなく、これらの比較的短いオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡへの結合は、二本鎖ＲＮＡの伸展を誘導し、それによって内因性リボヌクレアーゼによるｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられている。さらに、時々、このオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡのプロモーターの近位に結合するように特異的に設計され、そしてこれらの環境の下、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳にさらに干渉する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの機能による特異的機構に関係なく、その細胞、組織または器官への投与は、特異的ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを分解させる。従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のポリペプチドの発現および／または活性を低減する。
【０１０５】
このオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはこれらのキメラ混合物、誘導体もしくは改変種であり得、一本鎖または二本鎖であり得る。このオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され得、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善する。このオリゴヌクレオチドは、（例えば、宿主細胞レセプターを標的するための）ペプチド、細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２；ＰＣＴ出願公開第ＷＯ８８／０９８１０号（１９８８年１２月１５日公開）を参照）もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ８９／１０１３４号、１９８８年４月２５日公開を参照）を横切る輸送を容易にする化合物、ハイブリダイゼーション誘発切断因子（例えば、Ｋｒｏｌら，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６を参照）、または介在因子（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｚｏｎ，１９８８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照）のような、他の付属の基を含み得る。このために、このオリゴヌクレオチドは、別の分子と結合体化し得る。
【０１０６】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変塩基部分を含み得、これは、以下を含むがこれらには限定されない群から選択される：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−インドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシトリエチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリン。
【０１０７】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された糖部分もまた含み得、これは、以下を含むがこれらには限定されない群から選択される：アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソース。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然のペプチド様骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）もまた含み得る。このような分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーと呼ばれ、例えば、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：１４６７０およびＥｇｌｏｍら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６において記載される。ＰＮＡオリゴマーの１つの利点は、ＤＮＡの中性骨格ゆえに、媒体のイオン強度から本質的に独立して相補的ＤＮＡに結合するその能力である。なお別の実施形態において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変リン酸骨格を含み、これは、以下からなる群より選択される：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはこれらのアナログ。
【０１０８】
なおさらなる実施形態において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アノマーのオリゴヌクレオチドである。アノマーのオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、この二本鎖ハイブリッドにおいて、通常の単位とは対照的に、これらの鎖は互いに平行する（Ｇａｕｔｉｅｒら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）であるか、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら，１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）である。
【０１０９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的方法によって（例えば、（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されるような）自動化ＤＮＡ合成装置の使用によって）合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９）によって合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、微細孔性ガラスポリマー支持体（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔ）などの使用によって調製され得る（Ｓａｒｉｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：７４４８−７４５１）。
【０１１０】
適切なオリゴヌクレオチドの選択は、当業者によって容易に実施され得る。特定のポリペプチドをコードする核酸配列が与えられると、当業者は、この配列に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し得、そしてこれらのオリゴヌクレオチドがこの特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに特異的に結合しその分解を媒介することをインビトロ系またはインビボ系において確認するために、これらのオリゴヌクレオチドを試験し得る。特定のｍＲＮＡに結合しその分解を媒介するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するために、このオリゴヌクレオチドによって認識される配列が、この特定のｍＲＮＡに対して独特であるか、または実質的に独特であることが重要である。例えば、ｍＲＮＡにわたって頻繁に繰り返される配列は、特定のｍＲＮＡを特異的に認識しかつ分解するオリゴヌクレオチドの設計のために理想的な選択ではないかもしれない。当業者は、オリゴヌクレオチドを設計し得、そしてこのオリゴヌクレオチドの配列を公に利用可能なデータベースに寄託された核酸配列と比較して、この配列が特定のポリペプチドについて特異的であるかまたは実質的に特異的であることを確認し得る。
【０１１１】
別の例において、１つより多いｍＲＮＡに結合し、その分解を媒介するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することが所望され得る。１つの例において、このｍＲＮＡは、イソ型または機能的に重複するポリペプチドのような関連するポリペプチドをコードし得る。このような場合、当業者は、これらの関連するポリペプチドをコードする核酸配列を並べ、そして両方のｍＲＮＡを認識するオリゴヌクレオチドを設計し得る。
【０１１２】
アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを細胞に送達するために、多くの方法が開発されている：例えば、アンチセンス分子は、組織部位内に直接注射され得るか、または所望の細胞を標的化するように設計された改変アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上に発現されるレセプターまたは抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に結合されたアンチセンス）は、全身的に投与され得る。
【０１１３】
しかし、特定の例において、内因性のＴｉｍ−１  ｍＲＮＡ、Ｔｉｍ−２  ｍＲＮＡまたはＴｉｍ−４  ｍＲＮＡにおける翻訳を抑制するために十分なこのアンチセンスの細胞内濃度を達成することは、困難であり得る。従って、別のアプローチは、組換えＤＮＡ構築物を使用し、この組換えＤＮＡ構築物において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、強力なｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下に置かれている。例えば、ベクターは、細胞によって取り込まれ、そしてアンチセンスＲＮＡの転写を指向するように、インビボに導入され得る。このようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するように転写され得る限り、エピソームに留まっても、または染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ技術方法によって構築され得る。ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または哺乳動物細胞における複製および発現のために使用される当該分野で公知の他のベクターであり得る。このアンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物細胞（好ましくはヒト細胞）で作用する、当該分野で公知の任意のプロモーターによるものであり得る。このようなプロモーターは、誘導性であっても、構成的であってもよい。このようなプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’の長い末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）など。任意の型のプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターが、組織部位内に直接的に導入され得る組換えＤＮＡ構築物を調製するために使用され得る。あるいは、投与が別の経路によって（例えば、全身的に）達成され得る場合に、所望の組織に選択的に感染するウイルスベクターが使用され得る。
【０１１４】
ＲＮＡｉ構築物は、標的遺伝子の発現を特異的にブロックし得る二本鎖ＲＮＡを含む。「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、植物および虫（ｗｏｒｍ）において観察された現象に最初に適用された用語であり、ここで、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、特異的かつ転写後様式で遺伝子発現をブロックする。理論にとらわれることなく、ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡ分解に関連すると考えられるが、生物学的機構は、現在研究の盛んな分野である。作用の機構に関する幾つかの謎にもかかわらず、ＲＮＡｉは、インビボまたはインビトロにおける遺伝子発現を阻害する有用な方法を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ｄｓＲＮＡ」は、ｓｉＲＮＡ分子をいうか、または二本鎖特徴を含みかつ細胞内でｓｉＲＮＡへとプロセシングされ得る他のＲＮＡ分子（例えば、ヘアピンＲＮＡ部分）をいう。用語「機能喪失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」は、本発明のＲＮＡｉ方法によって阻害される遺伝子をいう場合、ＲＮＡｉ構築物の非存在下におけるレベルと比較した場合の、遺伝子の発現のレベルにおける低下をいう。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、語句「ＲＮＡｉを媒介する」とは、例えば、分解が、配列非依存的なｄｓＲＮＡ応答（例えば、ＰＫＲ応答）によるよりむしろ配列特異的様式で起こる場合、ＲＮＡｉプロセスによって分解されるＲＮＡを識別する能力をいう（示す）。
【０１１６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＲＮＡｉ構築物」は、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡおよびインビボで分解されてｓｉＲＮＡを形成し得る他のＲＮＡ種を含む、本明細書を通じて使用される一般名である。本明細書中で、ＲＮＡｉ構築物はまた、細胞においてｄｓＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡ形成する転写物および／またはインビボでｓｉＲＮＡを産生する転写物を産生し得る発現ベクター（ＲＮＡｉ発現ベクターとも呼ばれる）を含む。
【０１１７】
「ＲＮＡｉ発現ベクター」（本明細書中で「ｄｓＲＮＡコードプラスミド」とも呼ばれる）とは、ＲＮＡを発現する（転写する）ために使用される、複製可能な核酸構築物をいい、このＲＮＡは、この構築物が発現される細胞においてｓｉＲＮＡ部分を産生し得る。このようなベクターは、転写単位を含み、この転写単位は、以下の集合体を含む：（１）遺伝子発現において調節的な役割を有する遺伝因子（例えば、プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー）であって（２）に作動可能に連結される遺伝因子、（２）二本鎖ＲＮＡ（細胞内においてアニーリングしてｓｉＲＮＡを形成する２つのＲＮＡ部分、またはｓｉＲＮＡにプロセシングされる一本鎖ヘアピンＲＮＡ）を産生するように転写される「コード」配列、および（３）適切な転写開始配列および転写終止配列。プロモーターおよび他の調節因子の選択は、一般に、意図する宿主細胞に従って変わる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、多くの場合、「プラスミド」の形態（環状二本鎖ＤＮＡループをいい、そのベクター形態において、染色体に結合しない）である。本明細書中において、「プラスミド」および「ベクター」は、相互交換可能に使用され、プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用される形態である。しかし、本発明はまた、等価の機能をもたらす他の形態の発現ベクター（後に、本明細書が属する当該分野において公知となる）をも含むことを意図する。
【０１１８】
ＲＮＡｉ構築物は、細胞の生理学的条件下で、阻害される遺伝子（すなわち、「標的」遺伝子）のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部分のヌクレオチド配列にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含む。二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介する能力を有するために十分なだけ、天然のＲＮＡに類似することを必要とする。従って、本発明は、遺伝子変異、鎖多型性または進化多様性に起因して発現され得る配列バリエーションに耐え得るという利点を有する。標的配列とＲＮＡｉ構築物配列との間の耐え得るヌクレオチド不適合の数は、５塩基対中１塩基対、または１０塩基対中１塩基対、または２０塩基対中１塩基対、または５０塩基対中１塩基対を超えない。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心における不適合は、最も致命的であり、標的ＲＮＡの切断を本質的に消滅し得る。対照的に、標的ＲＮＡに対し相補的であるｓｉＲＮＡ鎖の３’末端におけるヌクレオチドは、標的認識の特異性に重要な貢献をしない。
【０１１９】
配列同一性は、配列の比較および当該分野で公知のアラインメントアルゴリズム（ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１およびこの文献中に引用された文献を参照のこと）、ならびにヌクレオチド配列間の相違百分率を（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムにおいて実行される、標準パラメーターを用いたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）によって）計算することにより、最適化され得る。阻害性ＲＮＡと標的遺伝子の部分との間の９０％を超える配列同一性、またはさらに１００％配列同一性が、好ましい。あるいは、このＲＮＡの二本鎖領域は、標的遺伝子転写産物の部分とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列として機能的に規定され得る（例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間のハイブリダイゼーション、その後洗浄）。
【０１２０】
ＲＮＡｉ構築物の産生は、化学的合成方法または組換え核酸技術によって実施され得る。標的細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼが、インビボで転写を媒介し得るか、またはクローニングされたＲＮＡポリメラーゼが、インビトロの転写のために使用され得る。このＲＮＡｉ構築物は、リン酸−糖骨格またはヌクレオシドのどちらかに対する（例えば、細胞内ヌクレアーゼに対する感受性を低下させるか、バイオアベイラビリティーを改善するか、処方特性を改善するか、および／または他の薬物動態学特性を変化させるための）改変を含み得る。例えば、天然のＲＮＡのホスホジエステル結合は、少なくとも１つの窒素異種原子または硫黄異種原子を含むように改変され得る。ＲＮＡ構造における改変は、特異的遺伝子阻害を可能にする一方で、ｄｓＲＮＡに対する一般的応答を避けるように作製され得る。同様に、塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性をブロックするように改変され得る。ＲＮＡｉ構築物は、酵素学的に産生され得るか、または部分的に／全体的に有機合成によって産生され得、任意の改変リボヌクレオチドが、インビトロ酵素合成またはインビトロ有機合成によって導入され得る。
【０１２１】
ＲＮＡ分子を化学的に修飾する方法が、ＲＮＡｉ構築物を修飾するために適合され得る（例えば、Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：７７６−７８０；Ｗｉｌｓｏｎら（１９９４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇ  ７：８９−９８；Ｃｈｅｎら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：２６６１−２６６８；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎら（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ７：５５−６１を参照）。例示にしか過ぎないが、ＲＮＡｉ構築物の骨格は、オリゴマー修飾または糖修飾を含むホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホジチオエート、キメラメチルホスホネート−ホスホジエステル、ペプチド核酸、５−プロピニル−ピリミジンによって修飾され得る（例えば、２’−置換リボヌクレオシド、α−立体配置）。
【０１２２】
二本鎖構造は、一本鎖自己相補的ＲＮＡ鎖または２本の相補的ＲＮＡ鎖によって形成され得る。ＲＮＡ二本鎖形成は、細胞の中および外のどちらで開始されてもよい。このＲＮＡは、少なくとも１細胞につき１コピーの送達を可能にする量で導入され得る。より高用量（例えば、１細胞につき少なくとも５コピー、１０コピー、１００コピー、５００コピーまたは１０００コピー）の二本鎖物質は、より効果的な阻害をもたらし、一方、より低用量もまた、特異的適用のために有用であり得る。阻害は、配列特異的であり、このＲＮＡの二本鎖領域に対応するヌクレオチド配列は、遺伝子阻害のために標的化される。
【０１２３】
特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ構築物は、「低分子干渉性ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」である。これらの核酸は、約１９〜３０ヌクレオチド長であり、より好ましくは、２１〜２３ヌクレオチド長であり、例えば、より長い二本鎖ＲＮＡのヌクレアーゼ「小断片化（ｄｉｃｉｎｇ）」によって産生されるフラグメントに対応する長さである。ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体を漸増し、かつ特異的配列に対形成することにより、この複合体を標的ｍＲＮＡへ導くと理解されている。結果として、標的ｍＲＮＡは、ポリペプチド複合体におけるヌクレアーゼによって分解される。特定の実施形態において、２１〜２３ヌクレオチドｓｉＲＮＡ分子は、３’水酸基を含む。
【０１２４】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、当業者に公知の多くの技術を用いて得られ得る。例えば、ｓｉＲＮＡは、当該分野で公知の方法を用いて、化学合成され得るか、または組換え的に産生され得る。例えば、短いセンスＲＮＡオリゴマーおよび短いアンチセンスＲＮＡオリゴマーは、合成され、そして、アニールされて、各末端で２ヌクレオチド突出した二本鎖ＲＮＡ構造を形成し得る（Ｃａｐｌｅｎら（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９８：９７４２−９７４７；Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ，２０：６８７７−８８）。これらの二本鎖ｓｉＲＮＡ構造は、次いで、受動的取り込みまたは以下に記載されるような選択した送達系により、細胞に直接導入され得る。
【０１２５】
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ構築物は、例えば、小断片化酵素（ｅｎｚｙｍｅ  ｄｉｃｅｒ）の存在下で、より長い二本鎖ＲＮＡのプロセシングによって産生され得る。１つの実施形態において、ショウジョウバエのインビトロ系が、使用される。この実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ショウジョウバエ胚由来の可溶性抽出物と組み合わせられ、それによって組み合わせを産生する。この組み合わせは、ｄｓＲＮＡが約２１〜約２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子にプロセシングされる条件下で維持される。
【０１２６】
このｓｉＲＮＡ分子は、当業者に公知の多くの技術を用いて精製され得る。例えば、ゲル電気泳動が、ｓｉＲＮＡを精製するために使用され得る。あるいは、非変性方法（例えば、非変性カラムクロマトグラフィー）が、このｓｉＲＮＡを精製するために使用され得る。さらに、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、グリセロール勾配遠心分離法、抗体による親和性精製が、ｓｉＲＮＡを精製するために使用され得る。
【０１２７】
特定の好ましい実施形態において、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子の鎖は、約１〜約６ヌクレオチド長であるが、約２〜４ヌクレオチド長であり得る、３’突出を有する。より好ましくは、３’突出は、１〜３ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、１つの鎖は、３’突出を有し、他方の鎖は、平滑末端であるか、またはやはり突出を有する。突出の長さは、各鎖において、同じであっても異なっていてもよい。ｓｉＲＮＡの安定性をさらに増強するために、３’突出は、分解に対して安定化される。１つの実施形態において、このＲＮＡは、プリンヌクレオチド（例えば、アデノシンヌクレオチドまたはグアノシンヌクレオチド）を含むことによって安定化され得る。あるいは、ピリミジンヌクレオチドの改変アナログによる置換（例えば、２’デオキシチミジン（ｄｅｏｘｙｔｈｙｉｎｉｄｉｎｅ）によるウリジンヌクレオチド３’突出の置換は、耐性であり、ＲＮＡｉの有効性に影響しない。２’水酸基の非存在は、組織培養培地中における突出のヌクレアーゼ抵抗性を有意に増強し、インビボでも有益であり得る。
【０１２８】
他の実施形態において、ＲＮＡｉ構築物は、長い二本鎖ＲＮＡの形態である。特定の実施形態において、このＲＮＡｉ構築物は、少なくとも２５塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基または４００塩基である。特定の実施形態において、このＲＮＡｉ構築物は、４００〜８００塩基長である。この二本鎖ＲＮＡは、細胞内で分解され得、例えば、細胞内でｓｉＲＮＡ配列を産生する。しかし、長い二本鎖ＲＮＡのインビボにおける使用は、おそらく、配列依存的ｄｓＲＮＡ応答によって引き起こされ得る悪影響ゆえに、常には実用的ではない。このような実施形態において、インターフェロンまたはＰＫＲの効果を低減する、局部的送達系および／または局部的送達因子の使用が好ましい。
【０１２９】
特定の実施形態において、このＲＮＡｉ構築物は、ヘアピン構造の形態である（ヘアピンＲＮＡと名付けられる）。このヘアピンＲＮＡは、外来的に合成され得るか、またはインビボでＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからの転写によって形成され得る。哺乳動物細胞における遺伝子サイレンシングのためのこのようなヘアピンＲＮＡの作製および使用の例は、例えば、Ｐａｄｄｉｓｏｎら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，２００２，１６：９４８−５８；ＭｃＣａｆｆｒｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８：３８−９；ＭｃＭａｎｕｓら，ＲＮＡ，２００２，８：８４２−５０；Ｙｕら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００２，９９：６０４７−５２に記載される。好ましくは、このようなヘアピンＲＮＡは、細胞において、または動物において、所望の遺伝子の連続的かつ安定的な抑制を確実にするように操作される。細胞においてヘアピンＲＮＡをプロセシングすることにより、ｓｉＲＮＡが産生され得ることは、当該分野で公知である。
【０１３０】
なお他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（例えば、転写産物）を送達するためにプラスミドが使用される。このような実施形態において、このプラスミドは、ＲＮＡｉ構築物のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれについての「コード配列」を含むように設計される。このコード配列は、例えば、逆位のプロモーターに隣接される同じ配列であってもよく、または、それぞれ別々のプロモーターの転写制御下の２つの別々の配列であってもよい。コード配列が転写された後、この相補的ＲＮＡは、塩基対を転写して、二本鎖ＲＮＡを形成する。
【０１３１】
ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／７７３５０号は、トランスジーンの二方向性転写（真核生物細胞において、同じトランスジーンのセンスＲＮＡ転写物およびアンチセンスＲＮＡ転写物の両方を生じる）のための例示的なベクターを記載する。従って、特定の実施形態において、本発明は、以下の独特の特性を有する組換えベクターを提供する：これは、反対の方向に配列され、かつ目的のＲＮＡｉ構築物についてのトランスジーンに隣接する、２つの重複する転写単位を有するウイルスのレプリコンを含み、ここで、この２つの重複する転写単位は、宿主細胞において、同じトランスジーンフラグメント由来のセンスＲＮＡ構築物およびアンチセンスＲＮＡ構築物の両方を生じる。
【０１３２】
ＲＮＡｉ構築物は、標的核酸配列と同一であるかもしくは実質的に同一である二本鎖ＲＮＡの長い伸展、または標的核酸配列の一領域のみと同一であるかもしくは実質的に同一である二本鎖ＲＮＡの短い伸展のどちらかを含み得る。長いＲＮＡｉ構築物または短いＲＮＡｉ構築物のどちらかを作製する例示的な方法およびこれを送達する例示的な方法は、例えば、国際出願第ＷＯ０１／６８８３６号および同第ＷＯ０１／７５１６４号において見出され得る。
【０１３３】
別の実施形態において、Ｔｉｍ−１アンタゴニスト、Ｔｉｍ−２アンタゴニストまたはＴｉｍ−４アンタゴニストは、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２またはＴｉｍ−４の発現レベルを低下するリボザイム分子である。ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子は、Ｔｉｍ−１  ｍＲＮＡ、Ｔｉｍ−２  ｍＲＮＡまたはＴｉｍ−４  ｍＲＮＡの翻訳を防止するために使用され得る（例えば、ＰＣＴ国際出願公報第ＷＯ９０／１１３６４号、１９９０年１０月４日公開；Ｓａｒｖｅｒら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５および米国特許第５，０９３，２４６号を参照のこと）。部位特異的認識配列においてｍＲＮＡを切断するリボザイムが、特定のｍＲＮＡを破壊するために使用され得る場合、ハンマーヘッドリボザイム（ｈａｍｍｅｒ  ｈｅａｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）の使用が、好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、隣接領域によって決定される位置でｍＲＮＡを切断し、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する。標的ｍＲＮＡが、２塩基の以下の配列：５’−ＵＧ−３’を有することが、唯一必要である。ハンマーヘッドリボザイムの構築および産生は、当該分野で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５−５９１においてより完全に記載される。
【０１３４】
本明細書中で記載される方法において使用され得るリボザイムとしてはまた、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（本明細書中で以後「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）が挙げられ、これは、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａにおいて天然に存在し（ＩＶＳまたはＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして公知である）、Ｔｈｏｍａｓ  Ｃｅｃｈおよび共同研究者によって広範に記載されている（Ｚａｕｇら，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：５７４−５７８；ＺａｕｇおよびＣｅｃｈ，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１：４７０−４７５；Ｚａｕｇら，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２４：４２９−４３３；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｔｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．による国際特許出願公開第ＷＯ８８／０４３００号；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ，１９８６，Ｃｅｌｌ，４７：２０７−２１６）。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、８塩基対の活性部位を有し、これは、その後標的ＲＮＡの切断が起こる場所でその標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする。本発明は、８塩基対の活性部位配列を標的する、Ｃｅｃｈ型リボザイムを含む。
【０１３５】
アンチセンスアプローチにおいて、リボザイムは、改変オリゴヌクレオチドからなり得（例えば、安定性、標的化などの改善のため）、そして、インビボまたはインビトロで細胞に送達され得る。送達の好ましい方法は、強力な構成的ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下でのリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物の使用を包含し、それによって、トランスフェクトされた細胞が、標的化したｍＲＮＡを破壊し、そして翻訳を阻害するために十分な量のこのリボザイムを産生する。リボザイムはアンチセンス分子と似ていないので、触媒的であり、有効性のためにより低い細胞内の濃度が必要とされる。
【０１３６】
本明細書中で記載される方法の別の実施形態において、Ｔｉｍ−１アンタゴニスト、Ｔｉｍ−２アンタゴニストまたはＴｉｍ−４アンタゴニストは、抗Ｔｉｍ−１抗体、抗Ｔｉｍ−２抗体または抗Ｔｉｍ−４抗体を含む。Ｔｉｍ−１細胞外ドメイン、Ｔｉｍ−２細胞外ドメインまたはＴｉｍ−４細胞外ドメインに結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、当業者によって産生され得、そしてこれらの抗体は、Ｔｉｍ−１のＴｉｍ−４への結合をブロックするその能力について、本発明によって提供される方法を用いてさらに試験され得る。好ましいアンタゴニスト抗体は、それら自身がＴｉｍ−１活性またはＴｉｍ−４活性のアクチベーターとして作用することなく、Ｔｉｍ−１またはＴｉｍ−４の間の結合相互作用をブロックする。実施例についての実験手順において記載されるアッセイを用いて、当業者は、候補抗体がＴｉｍ−１のアクチベーターであり、従って、Ｔｈ１応答の誘導因子およびＴｈ２応答のインヒビターの両方である場合を決定し得る。このような試験は、抗体を投与してマウスを免疫すること、およびこのマウスの脾臓について単離されたＴ細胞によるインビトロ増殖およびサイトカイン産生を試験することによって実施され得る。Ｔｈ２応答を増大する（またはＴｈ１応答を低減する）ために好ましい抗体は、Ｔｉｍ−１リガンドのＴｉｍ−４リガンドへの結合をブロックし、かつ、Ｔｉｍ−１の活性化を誘導しない。Ｔｉｍ−１の活性化は、例えば、Ｔｉｍ−１の細胞内チロシンリン酸化をモニタリングすることによってモニタリングされ得る。
【０１３７】
用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。このような抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、ＩｇＧクラス、ＩｇＭクラス、ＩｇＡクラス、ＩｇＥクラスおよびＩｇＤクラスのいずれかに関連し、これらのクラスは、分子に存在する重鎖の性質によって互いに異なる。特定のクラスは、サブクラスをも有する（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書中の抗体への言及は、ヒト抗体の種類の全てのこのようなクラス、サブクラスおよび型の言及を含む。Ｔｉｍ−１ポリペプチドもしくはＴｉｍ−４ポリペプチドに対する抗体はまた、Ｔｉｍ−１ポリペプチドもしくはＴｉｍ−４ポリペプチドまたはＴｉｍ−１ポリペプチドのフラグメントもしくはＴｉｍ−４ポリペプチドのフラグメントを含む融合ポリペプチドに対する抗体も含む。
【０１３８】
Ｔｉｍ−１ポリペプチド、Ｔｉｍ−２ポリペプチドまたはＴｉｍ−４ポリペプチドは、抗原またはその部分もしくはフラグメントとして使用され得、そしてさらに、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の調製のための標準的技術を用いてこの抗原に免疫特異的に結合する抗体を産生するためのイムノゲンとして使用され得る。抗原のイムノゲンとしての使用のための抗原性ペプチドフラグメントとしては、例えば、アミノ末端領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号１〜４に示すアミノ酸配列）の少なくとも７アミノ酸残基を含み、そしてそのエピトープを含むことにより、このペプチドに対して惹起される抗体が、全長ポリペプチドまたはこのエピトープを含む任意のフラグメントと特異的免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドによって含まれる好ましいエピトープは、ポリペプチドの表面上に位置するポリペプチドの領域であり、通常、これらは親水性領域である。好ましい実施形態において、この抗原性ペプチドは、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２またはＴｉｍ−４のＩｇＶドメインおよび／またはムチンドメインのセグメントまたは全体を含む。
【０１３９】
幾つかの実施形態において、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープは、Ｔｉｍ−１ポリペプチド、Ｔｉｍ−２ポリペプチドまたはＴｉｍ−４ポリペプチドの領域であり、この領域は、このポリペプチドの表面上に位置する（例えば、親水性領域）。Ｔｉｍ−１ポリペプチドまたはＴｉｍ−４ポリペプチドの疎水性分析は、Ｔｉｍ−１ポリペプチドまたはＴｉｍ−４ポリペプチドのどの領域が、特に親水性であり、従って、抗体産生を標的化するために有用な表面の残基をコードする可能性が高いかを示す。抗体産生を標的化するための手段として、親水性の領域および疎水性の領域を示すヒドロパシープロット（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｐｌｏｔ）が、当該分野で周知の任意の方法（例えば、フーリエ変換を用いるかまたは用いないＫｙｔｅ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法またはＨｏｐｐ  Ｗｏｏｄｓ法が挙げられる）によって作成され得る。例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照。抗原ポリペプチド内の１以上のドメインに特異的な抗体、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログまたはオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）もまた、本明細書中で提供される。幾つかの実施形態において、Ｔｉｍ−１またはＴｉｍ−４の誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログが、これらのペプチド成分に免疫特異的に結合する抗体の産生においてイムノゲンとして使用され得る。
【０１４０】
当該分野で公知の種々の手順が、本発明のポリペプチドまたはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログまたはオルソログに対して指向されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生のために使用され得る。例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。これらの抗体の幾つかは、以下に記載される。
【０１４１】
用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中で使用される場合、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の１つの分子種のみを含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団における全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、ＭＡｂに対する独特の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープによって免疫応答し得る抗原結合部位を含む。
【０１４２】
モノクローナル抗体は、（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５によって記載されるような）ハイブリドーマ方法を用いて調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主動物は、代表的に、免疫因子によって免疫されて、この免疫因子に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生可能であるリンパ球を誘発する。あるいは、このリンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０１４３】
本発明のポリペプチド抗原を指向する抗体としては、さらに、ヒト化抗体またはヒト抗体が挙げられ得る。これらの抗体は、ヒトへの投与に適し、投与した免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を引き起こさない。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合配列）であり、これは、主にヒト免疫グロブリンの配列からなり、そして非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含む。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列に置換することにより、実施され得る（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと）。
【０１４４】
Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２またはＴｉｍ−４に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当該分野で公知の技術によって産生され得る。これらの抗体フラグメントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）抗体分子のパパインおよび還元剤による処理によって産生されるＦａｂフラグメント、および（ｉｖ）Ｆｖフラグメント。
【０１４５】
本明細書中で記載される方法の幾つかの実施形態において、Ｔｉｍ−１アンタゴニスト、Ｔｉｍ−２アンタゴニストまたはＴｉｍ−４アンタゴニストは、モノクローナル抗体（好ましくはヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体）を含み、これらの抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。本発明の場合において、１つの結合特異性は、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２またはＴｉｍ−４についての結合特異性である。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、有利に、細胞表面ポリペプチドまたはレセプターもしくはレセプターサブユニットである。
【０１４６】
本明細書中で記載される方法の幾つかの実施形態において、Ｔｉｍ−１アンタゴニスト、Ｔｉｍ−２アンタゴニストまたはＴｉｍ−４アンタゴニストは、Ｔｉｍ−１ポリペプチド、Ｔｉｍ−２ポリペプチドまたはＴｉｍ−４ポリペプチド、それらのアナログ、改変体またはフラグメントを含む。１つの実施形態において、このアンタゴニストは、Ｔｉｍ−１  ＩｇＶドメイン、Ｔｉｍ−２  ＩｇＶドメイン、Ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメイン、Ｔｉｍ−１  ムチンドメイン、Ｔｉｍ−２  ムチンドメイン、Ｔｉｍ−４  ムチンドメイン、またはこれらの組み合わせを含む。別の実施形態において、このアンタゴニストは、Ｔｉｍ−１  ＩｇＶドメイン配列、Ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメイン配列、Ｔｉｍ−２  ＩｇＶドメイン配列、Ｔｉｍ−１  ムチンドメイン配列、Ｔｉｍ−２  ムチンドメイン配列またはＴｉｍ−４  ムチンドメイン配列に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一または類似であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。理論にとらわれることなく、このようなアンタゴニストは、Ｔｉｍリガンドのうちの１つを、Ｔｉｍポリペプチドに結合しなくてもよいように滴定することによって作用し得る。このような滴定は、例えば、結合部位の立体構造上の閉鎖によって起こり得る。
【０１４７】
本発明における使用のためのキメラポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、標準的組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントが、従来技術に従って（例えば、連結反応のための平滑末端化またはすれた末端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）化、適切な末端を提供するための制限酵素消化、突出末端の適切な埋め合わせ（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、所望しない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結反応を利用することによる）、インフレームで互いに連結される。別の実施形態において、この融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントについてのＰＣＲ増幅が、２つの連続的な遺伝子フラグメントの間の相補的突出を生じるようなアンカープライマーを用いて実施され得、その後、これらのフラグメントはアニーリングされ、そしてキメラ遺伝子配列を産生するように再増幅され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２を参照のこと）。その上、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２またはＴｉｍ−４をコードする核酸は、このような発現ベクター内にクローニングされ得、それによってこの融合部分は、インフレームでこの免疫グロブリンポリペプチドと連結される。
【０１４８】
幾つかの実施形態において、アンタゴニストは、Ｔｉｍ−１改変体配列、Ｔｉｍ−２改変体配列またはＴｉｍ−４改変体配列を含む。これらの改変体配列は、天然に存在するＴｉｍ−１配列、Ｔｉｍ−２配列またはＴｉｍ−４配列中に変異を有し、この変異は、変異形態とその結合パートナーとの間の結合に、変異のない配列に対するよりも、より高い親和性の結合をもたらす。幾つかの実施形態において、ＴｉｍポリペプチドまたはＴｉｍポリペプチド部分は、天然に存在するＴｉｍ配列（野生型）において変異を有する改変体Ｔｉｍポリペプチドとして提供され、この変異は、タンパク分解に対して（変異のない配列に対し）より抵抗性のＴｉｍ配列を生じる。
【０１４９】
第２のポリペプチド（すなわち、Ｔｉｍ−１配列、Ｔｉｍ−２配列またはＴｉｍ−４配列が融合するポリペプチド）は、好ましくは、可溶性である。幾つかの実施形態において、この第２のポリペプチドは、結合したポリペプチドの半減期（例えば、血清半減期）を延長する。幾つかの実施形態において、この第２のポリペプチドは、この融合ポリペプチドの第２のＴｉｍ−１ポリペプチドとの会合を容易にする配列を含む。好ましい実施形態において、この第２のポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリンポリペプチドの領域を含む。免疫グロブリン融合ポリペプチドは、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５，  ５１６，９６４号；同第５，２２５，５３８号；同第５，４２８，１３０号；同第５，５１４，５８２号；同第５，７１４，１４７号；および同第５，４５５，１６５号において記載される。幾つかの実施形態において、この第２のポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチドを含む。あるいは、この第２のポリペプチドは、全長未満の免疫グロブリン（例えば、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ＦｖまたはＦｃ）を含む。好ましくは、この第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖を含む。より好ましくは、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含む。幾つかの実施形態において、この第２のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能より低いエフェクター機能を有する。Ｆｃエフェクター機能としては、例えば、Ｆｃレセプター結合、補体の固定化およびＴ細胞枯渇活性が挙げられる（例えば、米国特許第６，１３６，３１０号を参照）。Ｔ細胞枯渇活性、Ｆｃエフェクター機能および抗体安定性をアッセイする方法は、当該分野で公知である。１つの実施形態において、この第２のポリペプチドは、Ｆｃレセプターに対して低い親和性を有するか、または親和性を有さない。代替の実施形態において、この第２のポリペプチドは、補体ポリペプチドＣ１ｑに対して低い親和性を有するか、または親和性を有さない。
【０１５０】
１つの好ましい実施形態において、本明細書中に記載される方法において使用されるアンタゴニストは、例えば、ペプチドまたはオリゴヌクレオチド以外の、約２，０００ダルトン未満の分子量の有機低分子であり、Ｔｉｍ−１のＴｉｍ−４への結合またはＴｉｍ−２のセマホリン４Ａへの結合をブロックするか、またはＴｉｍ−４結合におけるＴｉｍ−１活性を防ぐ。このような因子は、例えば、本発明によって提供される方法を使用して同定され得る。別の実施形態において、この因子は、ペプチドまたはペプチド誘導体であり、これは、Ｔｉｍ−１のＴｉｍ−４に結合する部分（またはその逆）を構造的に模倣する。本明細書中で記載される方法の幾つかは、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−４の発現または活性またはその両方を増大するか、またはＴｉｍ−１のＴｉｍ−４への結合を低減する因子（すなわち、Ｔｉｍ−１アンタゴニストまたはＴｉｍ−４アンタゴニスト）を使用する。
【０１５１】
幾つかの実施形態において、本明細書中で記載される方法においてＴｉｍ−１活性またはＴｉｍ−４活性を増加する因子は、抗体である。抗体は、Ｔｉｍ−１に結合してＴｉｍ−４の結合を模倣し、Ｔｈ２応答の細胞内シグナル伝達および阻害をもたらす。Ｔｉｍ−１およびＴｉｍ−４に対する抗体は、前の節で記載されたように産生され得る。例えば、Ｔｉｍ−１の細胞外ドメインに結合する抗体が産生され得、そしてこの抗体がＴｉｍ−１の活性を促進するかまたは阻害するかのどちらであるかを決定するために、この抗体は試験され得る。
【０１５２】
１つの特異的実施形態において、このアゴニストは、Ｔｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体に結合する抗体を含む。理論にとらわれることなく、Ｔｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体に結合する抗体は、複合体形成を安定化し得るかまたは促進し得、従って、Ｔｉｍ−１シグナル伝達および／またはＴｉｍ−４シグナル伝達を増大する。Ｔｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体に結合する抗体は、動物をＴｉｍ−１／Ｔｉｍ−４ポリペプチド複合体（例えばその細胞外ドメインの間の複合体）で免疫することによって、産生され得る。あるいは、この抗体は、無作為抗体ライブラリーからのインビトロ選択技術によって、Ｔｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体に結合する抗体を選択することにより、産生され得る。
【０１５３】
本明細書中で記載される方法の幾つかの実施形態において、Ｔｉｍ−１アゴニスト、Ｔｉｍ−２アゴニストまたはＴｉｍ−４アゴニストは、Ｔｉｍ−１ポリペプチド、Ｔｉｍ−２ポリペプチドまたはＴｉｍ−４ポリペプチド、そのアナログ、改変体またはフラグメントを含む。１つの実施形態において、このアゴニストは、Ｔｉｍ−１  ＩｇＶドメイン、Ｔｉｍ−２  ＩｇＶドメイン、Ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメイン、Ｔｉｍ−１  ムチンドメイン、Ｔｉｍ−２  ムチンドメイン、Ｔｉｍ−４  ムチンドメインまたはこれらの組み合わせを含む。別の実施形態において、このアゴニストは、Ｔｉｍ−１  ＩｇＶドメイン、Ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメイン、Ｔｉｍ−１  ムチンドメインまたはＴｉｍ−４  ムチンドメインと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一または類似であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。理論にとらわれることなく、このようなアゴニストは、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２またはＴｉｍ−４の活性を構造的に模倣することにより作用し得る。１つの実施形態において、このアゴニストは、Ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインおよび／またはＴｉｍ−４ムチンドメインを含む。別の実施形態において、このアゴニストは、ポリペプチドの二量体を含み、各々は、Ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインポリペプチドおよび／またはＴｉｍ−４ムチンドメインポリペプチドを含む。このようなアゴニストは、Ｔｉｍ−１レセプターを架橋しそして活性化するために使用され得る。他の実施形態において、このポリペプチドアゴニストは、このポリペプチドをコードする核酸として、例えばアデノウイルスを通して投与され得る。
【０１５４】
Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−２もしくはＴｉｍ−４、またはアゴニストとして用いられるこれらのポリペプチドの活性フラグメントは、本明細書中に記載される方法における使用のために、免疫グロブリンのようなキャリア分子と融合され得る。例えば、Ｔｉｍ−１の可溶性形態は、「リンカー」配列を通して免疫グロブリンのＦｃ部分と融合され得るか、またはこの免疫グロブリンのＦｃ部分と融合され得る。他の融合ポリペプチド（例えば、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＬｅｘＡ、またはＭＢＰ（すなわち、マルトース結合ポリペプチド）との融合ポリペプチド）がまた、使用され得る。さらなる実施形態において、Ｔｉｍ−４アゴニスト融合ポリペプチドまたはＴｉｍ−１アゴニスト融合ポリペプチドは、１以上のさらなる部分と結合され得る。例えば、Ｔｉｍ−４融合ポリペプチドまたはＴｉｍ−１融合ポリペプチドは、さらに、ＧＳＴ融合ポリペプチドに結合され得、ここで、このＴｉｍ−１融合ポリペプチド配列は、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合される。このような融合ポリペプチドは、Ｔｉｍ−４融合ポリペプチドまたはＴｉｍ−１融合ポリペプチドの精製を容易にし得る。別の実施形態において、この融合ポリペプチドは、そのＮ末端に、異種シグナル配列（すなわち、Ｔｉｍ−４核酸またはＴｉｍ−１核酸によって天然にコードされるポリペプチドにおいて存在しないポリペプチド配列）を含み得る。例えば、天然のＴｉｍ−４シグナル配列またはＴｉｍ−１シグナル配列は、移動されて、別のポリペプチド由来のシグナル配列と共に配置され得る。
【０１５５】
幾つかの実施形態において、天然に存在するＴｉｍ−４配列またはＴｉｍ−１配列中に変異を有するＴｉｍ−１改変体配列、Ｔｉｍ−２改変体配列またはＴｉｍ−４改変体配列を含むアゴニストは、この変異形態とその結合パートナーとの間に、変異のない配列と比較してより高い親和性結合を生じる（例えば、変異体Ｔｉｍ−１ポリペプチドはＴｉｍ−４ポリペプチドに対してより高い親和性結合を生じる）。幾つかの実施形態において、Ｔｉｍ−１部分、Ｔｉｍ−２部分またはＴｉｍ−４部分は、天然に存在するＴｉｍ配列（野生型）中に変異を有する改変体ポリペプチドとして提供され、タンパク分解に対し（変異のない配列と比較して）より抵抗性のポリペプチドを生じる。例えば、Ｔｉｍタンパク質上のセリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼまたはシステインプロテアーゼについてのプロテアーゼ切断部位が、除去され得る。
【０１５６】
１つの好ましい実施形態において、本明細書中に記載される方法において使用されるアゴニストは、有機低分子（例えば、ペプチドまたはオリゴヌクレオチド以外の、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する有機低分子）であり、これは、Ｔｉｍ−１のＴｉｍ−４への結合を促進するか、またはＴｉｍ−４のＴｉｍ−１への結合の非存在下でＴｉｍ−１活性化を引き起こす。このような因子は、例えば、本発明によって提供される方法を使用して同定され得る。別の実施形態において、この因子は、Ｔｉｍ−１に結合するＴｉｍ−４の部分、またはセマホリン４Ａに結合するＴｉｍ−２の部分を構造的に模倣するペプチドまたはペプチド誘導体である。このようなペプチドは、Ｔｉｍ−１もしくはＴｉｍ−４の活性化を誘導することにより、そしてそのリガンドまたはアンタゴニストの活性化をＴｉｍタンパク質の間の結合について競合することによって、アゴニストとして作用し得る。
【０１５７】
（Ｖ．Ｔｉｍ−１とＴｉｍ−４との間の結合を調節する因子の同定）
本発明の別の局面は、免疫応答を調節する因子を同定する方法を提供し、この方法は、例えば、Ｔｉｍ−１とＴｉｍ−４との間の結合を調節する因子を同定することによる。本明細書中に記載される方法を使用して同定される因子は、ＴＨ１応答およびＴＨ２応答の調節を必要とする被験体において、ＴＨ１応答およびＴＨ２応答を調節するために使用され得る。Ｔｉｍ−１／Ｔｉｍ−４相互作用をブロックする因子は、Ｔｉｍ−１の活性化を防止することが予測され、結果として、Ｔｈ２活性化を増大し、そしてＴｈ１活性化を低減する。
【０１５８】
１つの局面において、本発明によって記載されるようなＴｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体の同定は、Ｔｉｍ−１ポリペプチドおよびＴｉｍ−４ポリペプチドの構造的特徴（Ｘ線結晶学、ニューロン回折、核磁気共鳴分析法および当業者に周知の他の技術を用いて決定され得る）に基づき、複合体形成のためのアゴニストおよびアンタゴニストの理論的な設計を容易にする。理論的薬物設計のための方法は、当該分野で周知である（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｗｅｉｎｅｒ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｖ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第７１９号，Ａｂｂｙ  Ｌ．Ｐａｒｒｉｌｌ（編），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９９９）；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｋｌａｕｓ  Ｇｕｂｅｒｎａｔｏｒ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（１９９８））を参照）。
【０１５９】
本発明の別の局面は、Ｔｉｍ−１とＴｉｍ−４との間の複合体の形成を促進するかまたはブロックする因子をスクリーニングするための方法を提供する。このような方法は、インビトロまたは細胞内で実施され得、そしてこれらは、全長ポリペプチドを用いて実施されても、または１つのポリペプチドもしくは両ポリペプチドの可溶性形態を用いて実施されてもよい。本明細書中に記載されるスクリーニング方法の幾つかの実施形態において、Ｔｉｍ−１またはＴｉｍ−４のＩｇＶドメインおよび必要に応じてムチンドメインを含む可溶性ポリペプチドが、使用され得る。種々の他の試薬が、このスクリーニングアッセイに含まれ得る。これらは、塩、天然ポリペプチド（例えば、アルブミン）、界面活性剤などのような試薬を含み、これらは、最適なポリペプチド−ポリペプチド結合を容易にし、そして／または非特異的相互作用またはバックグラウンドの相互作用を減少する。このアッセイの有効性を改善する試薬（例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤など）もまた、使用され得る。成分の混合物は、必要な結合を提供する任意の順番で加えられる。インキュベーションは、任意の適切な温度（代表的には４℃と４０℃との間）で実施される。インキュベーション時間は、最適な活性のために選択されるが、高速ハイスループットスクリーニングを容易にするために最適化されてもよい。代表的には、０．１時間と１時間との間が、インビトロアッセイのために十分である。
【０１６０】
本発明の因子の同定のための方法は、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）における化合物のライブラリーのスクリーニング（各ウェル中の異なる試験化合物または試験化合物群による）のために非常に適している。特に、この方法は、コンビナトリアルライブラリーと共に使用され得る。これらの方法は、任意の受容可能な小型化の方法を通して、アッセイ系において「小型化」され得る。これらの方法としては、マルチウェルプレート（例えば、１プレートにつき２４ウェル、４８ウェル、９６ウェルまたは３８４ウェル）、マイクロチップまたはスライドガラスが挙げられるが、これらに限定されない。このアッセイは、マイクロチップ支持体上で実施されるようにサイズにおいて縮小され得、有益にも、試薬または他の物質のより少ない量に関連する。高処理スクリーニングに役立つプロセスの任意の小型化は、本発明の範囲内である。
【０１６１】
本発明の１つの特定の局面は、Ｔｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの間の結合を調節する因子を同定する方法を提供し、この方法は、以下の工程：（ａ）試験因子存在下でＴｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとを接触させる工程；および（ｂ）Ｔｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの結合に対するこの試験因子の効果を決定する工程を包含し、それにより、Ｔｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの間の結合を調節する因子を同定する。
【０１６２】
本発明の関連の局面は、免疫応答を調節する因子を同定する方法を提供し、この方法は、以下の工程：（ａ）試験因子存在下でＴｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとを接触させる工程；および（ｂ）Ｔｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの結合に対するこの試験因子の効果を決定する工程を包含し、それにより、免疫応答を調節する因子を同定する。
【０１６３】
本発明の幾つかの局面において、この因子は、インビトロアッセイを通して同定される。本開示の視点において種々のアッセイ形式が十分であり、本明細書中で特別に記載しないこれらのアッセイは、やはり当業者によって理解される。ポリペプチド複合体の形成、酵素活性のような条件を見積もるアッセイ形式は、多くの異なった形態で作製され得、そして無細胞系ベースのアッセイ（例えば、精製ポリペプチドまたは細胞溶解物）および細胞ベースのアッセイ（インタクトな細胞を用いる）を含む。Ｔｉｍ−１またはＴｉｍ−４に結合する因子を検出するために、単純な結合アッセイもまた、使用され得る。このような結合アッセイもまた、Ｔｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの間の相互作用を破壊することによって作用する因子を同定し得る。試験される因子は、例えば、細菌、酵母または他の生物によって産生され得る（例えば、天然産物）か、化学的に産生され得る（例えば、低分子（ペプチド模倣物が挙げられる））か、または組換え的に産生され得る。Ｔｉｍ−１およびＴｉｍ−４は、膜貫通ポリペプチドであるので、このアッセイおよび方法の好ましい実施形態には、Ｔｉｍ−１とＴｉｍ−４との間の複合体形成を調節する因子を、これらの全長ポリペプチドよりもむしろこれらのポリペプチドの可溶性形態を使用して、同定することが記載される。可溶性形態としては、膜貫通ドメインを欠く形態および／またはＩｇＶドメインまたはそのフラグメントを含む形態であって、これらの結合する能力を維持する形態が挙げられる。
【０１６４】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する、多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所定の時間内に調べられる化合物の数を最大化するために、高処理アッセイが望ましい。無細胞系において実施される本発明のアッセイ（精製ポリペプチドもしくは半精製ポリペプチドで展開され得るかまたは溶解物で展開され得る）は、迅速な展開および分子標的における（試験化合物によって媒介される）変化の比較的容易な検出を可能にする、「一次」スクリーニングであることが、しばしば好ましい。さらに、試験化合物の細胞毒性および／またはバイオアベイラビリティーの効果は、インビトロ系では一般に無視され得るが、その代わりこのアッセイは、主に分子標的に対するこの薬物の効果に焦点を当て、これは、他のポリペプチドとの結合親和性またはこの分子標的の酵素的特性の変化において明らかになり得る。
【０１６５】
本発明のアッセイの好ましいインビトロ実施形態において、再構成されたＴｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体は、少なくとも半精製ポリペプチドの再構成混合物を含む。「半精製」により、再構成混合物において使用されるポリペプチドが、既に他の細胞ポリペプチドまたはウイルスポリペプチドから分離されていることが意味される。例えば、細胞溶解物とは対照的に、Ｔｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体形成に関わるこのポリペプチドは、この混合物中に、この混合物中の他の全てのポリペプチドと比べて、少なくとも５０％の純度（より好ましくは９０〜９５％の純度）で存在する。本発明の方法の特定の実施形態において、この再構成ポリペプチド混合物は、高度に精製されたポリペプチドを混合することによって派生し、それにより、この再構成混合物は、Ｔｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体の集合および／または解離を測定する能力に干渉し得るかまたはさもなくばこれを変更し得る他のポリペプチド（例えば、細胞起源またはウイルス起源）を、実質的に欠いている。
【０１６６】
試験因子の存在または非存在におけるＴｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体のアッセイは、反応物を収容するために適した任意の容器において達成され得る。例としては、マイクロタイタープレート、試験管および微小遠心管が挙げられる。スクリーニングアッセイにおいて、試験因子の効果は、例えば、試験因子の効果を、この反応の速度論、定常状態および／または終末点において評価することによって評価され得る。
【０１６７】
本発明の１つの実施形態において、Ｔｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体の集合または安定性に干渉するその能力に基づく阻害因子を検出する薬物スクリーニングアッセイが、作製され得る。例示的な結合アッセイにおいて、目的の化合物は、Ｔｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体を含む混合物と接触される。Ｔｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体の検出および定量は、２つのポリペプチド間の相互作用の阻害（または増強）におけるこの化合物の効力を検出するための手段を提供する。この化合物の効力は、種々の濃度の試験化合物を用いて得られたデータ由来の用量応答曲線を作成することによって評価され得る。さらに、コントロールアッセイもまた、比較のための基線を提供するために実施され得る。コントロールアッセイにおいて、複合体の形成は、試験化合物の非存在下で定量される。
【０１６８】
複合体形成は、種々の技術によって検出され得る。例えば、複合体の形成における調節は、例えば、検出可能に標識されたポリペプチド（例えば、放射性標識ポリペプチド、蛍光標識ポリペプチドまたは酵素標識ポリペプチド）の、イムノアッセイによる使用かまたはクロマトグラフィー検出による使用によって、定量され得る。表面プラスモン共鳴系（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入可能である）もまた、ポリペプチド−ポリペプチド相互作用を検出するために使用され得る。
【０１６９】
本明細書中で記載されるポリペプチドおよびペプチドは、固定化され得る。１つのポリペプチドの未複合体化形態からの複合体の分離を容易にし、そしてこのアッセイの自動化に適応させるために、ペプチドおよびポリペプチドを固定化することが、しばしば所望される。ペプチドおよびポリペプチドは、任意の固体マトリックス（例えば、プレート、ビーズまたはフィルター）上に固定化され得る。マトリックス上に固定化され得るペプチドまたはポリペプチドは、このポリペプチドに結合する反応基を含み得る。あるいは、またはこれと組み合わせて、このポリペプチド中のシステインのような反応基は、マトリックスに反応しそして結合し得る。別の実施形態において、このポリペプチドは、このマトリックスに対する高い結合親和性を有する別のポリペプチドとの融合ポリペプチド（例えば、ビオチンと高い親和性で結合するストレプトアビジンへの融合ポリペプチド）として発現され得る。
【０１７０】
例示的な実施形態において、このポリペプチドを不溶性マトリックスに結合させるドメインを付加する融合ポリペプチドが、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＴＩＭ−１−ＩｇＶ−ドメイン融合ポリペプチド（グルタチオントランスフェラーゼに融合するＴｉｍ−１のＩｇＶドメインを含む）が、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸収され得、これは、次いでＴｉｍ−４またはその可溶性フラグメント（例えば、３５Ｓ標識ポリペプチド）および試験化合物と合わせられ、そして複合体形成を助ける条件下でインキュベートされる。インキュベーション後、未結合相互作用ポリペプチドを完全に除去するためにこのビーズは洗浄され、そしてマトリックスビーズ結合放射性標識が、直接的に検出される（例えば、ビーズがシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）中に入れられる）か、またはこの複合体が解離させられた後の上清において検出される（例えば、マイクロタイタープレートが使用される場合）。あるいは、未結合ポリペプチドを洗い流した後、この複合体は、このマトリックスから解離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離され、そして相互作用ポリペプチドのレベルは、このゲルから標準的電気泳動技術を用いて定量されたマトリックス結合画分において見出される。
【０１７１】
上述のアッセイの種々の改変が、本発明の範囲内に含まれることが理解される。例えば、このポリペプチドの役割は、置き換えられ得る。すなわち、Ｔｉｍ−４ポリペプチドが、固体支持体に固定化され得、そしてＴｉｍ−１ポリペプチドを含む溶液が、結合したＴｉｍ−４ポリペプチドと接触させられ得る。さらに、固定化ポリペプチドまたは遊離のポリペプチドは、結合アッセイの前に試験化合物に曝露され得、そしてこの事前曝露の効果が、コントロールと比較して評価され得る。この様式において同定された化合物はまた、Ｔｉｍ−１のＴｉｍ−４への結合またはその逆を阻害する。あるいは、この試験化合物は、Ｔｉｍ−１とＴｉｍ−４とを混合した後に加えられ得る。このようなアッセイにおいて結合のレベルを低下させるために有効な化合物は、Ｔｉｍ−４ポリペプチドからＴｉｍ−１ポリペプチドを置換するか、またはその逆である。
【０１７２】
ウエスタンブロットに加えて、他の、より迅速な検出スキーム（例えば、マルチウェルＥＬＩＳＡ型アプローチ）が、使用され得る。例えば、（例えば、上記のＧＳＴ方法により）部分的に精製されたＴｉｍ−１ポリペプチドが、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）中のウェルの底に、このポリペプチドを含有する溶液のプレート内への導入によって付着され得、そしてこのポリペプチドは、プラスチックに結合させられる。次いで、ポリペプチド過剰含有溶液が洗い流され、そしてブロック溶液（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する）が、非特異的結合部位をブロックするために導入される。次いで、このプレートは、数回以上洗浄され、そしてＴｉｍ−４ポリペプチドを含有する溶液、および（コントロールに対し）実験ウェルの場合は試験化合物が加えられる。異なるウェルは、異なる試験化合物、異なる濃度の同じ試験物質、異なるＴｉｍ−１ポリペプチドもしくは異なるＴｉｍ−４ポリペプチド、または異なる濃度のＴｉｍ−１ポリペプチドもしくはＴｉｍ−４ポリペプチドを含み得る。さらに、この検出スキームに対する種々の改変が行われ得ることが理解される。例えば、マルチウェルプレートのウェルは、Ｔｉｍ−１ポリペプチドよりもむしろＴｉｍ−４ポリペプチドを含むポリペプチドでコートされて、結合相互作用が遊離のＴｉｍ−１ポリペプチドの添加においてアッセイされ得る。このウェルはまた、固定化のためのこのポリペプチドの付着を増強する化合物および／または非特異的結合のレベルを低下する化合物で事前コートされ得る。例えば、このウェルは、グルタチオンを含むように誘導体化され得、そしてＢＳＡで事前コートされて、結合部位が曝露される公知の方向でポリペプチドの固定化の付着を促進し得る。
【０１７３】
このようなアッセイにおいて有用な検出方法としては、抗体ベースの方法（すなわち、「遊離の」ポリペプチドを指向する抗体）、「遊離の」ポリペプチド中に組み込まれたレポーター部分の直接検出（例えば、蛍光標識）、および近位エネルギー移動方法（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、固定化ポリペプチドまたは固体支持体中に組み込まれた分子の蛍光またはシンチレーションを生じる、放射活性の「遊離の」ポリペプチド）が挙げられる。
【０１７４】
Ｔｉｍ−１ポリペプチドのＴｉｍ−４ポリペプチドへの結合に影響し得る化合物を同定するための本発明の方法のなお別のバリエーションは、親和性バイオセンサー方法の使用を介する。このような方法は、圧電効果、電気化学または光学的方法に基づいていてもよい（例えば、楕円偏光法、光導波（ｏｐｔｉｃａｌ  ｗａｖｅ  ｇｕｉｄａｎｃｅ）および表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ））。ＳＰＲは、分子相互作用を実時間でモニタリングするために特に有益であり、上述の方法よりも、ポリペプチド間の結合相互作用に対する試験化合物の効果の高感度かつ広範囲の分析を可能にする。しかし、この利点は、この技術の（マルチウェルプレートベースの方法と比較して）より低い処理性能によって幾らか相殺される。
【０１７５】
本明細書中で上述したように、試験化合物は、この化合物がＴｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの結合に対して何らかの効果を有し（すなわち、この化合物がこの結合を増加するかまたは低減し）、そしてこの効果が閾値（本発明の実施者によって上述のように所望のレベルに設定されて、例えば、結合における数倍の増加または数倍の低減）を超える場合、Ｔｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの間の結合に効果を有するということができる。結合に対する好ましい作用は、有意な効果である。用語「有意な」とは、本明細書中で、特に「有意な効果」の語において使用される場合、比較される２群の間の定量可能なパラメーターにおける相違であって、標準的統計的試験を使用して統計的に有意であることをいう。本明細書中に記載される方法の幾つかの実施形態において、工程（ｂ）は、試験因子の存在下におけるＴｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体の形成を、適切なコントロールと比較する工程を包含する。幾つかの実施形態において、適切なコントロールは、試験される因子または化合物の非存在下における第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の複合体の形成を含む。
【０１７６】
従って、本発明の実施形態において、Ｔｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの間の結合に作用する化合物についてのスクリーニングの方法が提供され、この方法は以下：（ａ）Ｔｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとを試験化合物の存在下で接触させる工程；（ｂ）Ｔｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの結合に対するこの試験化合物の効果を決定する工程；および（ｃ）結合の程度に対する測定された効果が閾値を超える場合、この化合物を有効と同定する工程を包含する。
【０１７７】
用語「Ｔｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの間の結合に影響する」は、試験化合物が、その存在下におけるＴｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの間の結合を、その非存在下におけるＴｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの間の結合（コントロール）と比較した場合に、相違を生じることをいう。この結合における差異は、有意な相違であることが好ましい。特定の実施形態において、有意な相違は、結合における少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％もしくは５００％の増大または減少を含む。この化合物は、Ｔｉｍ−１の結合を阻害するかもしくは増強し得るか、またはＴｉｍ−１への影響においてアンタゴニストもしくはアゴニストとして作用し得るか、あるいは他のアゴニストもしくはアンタゴニストの影響を増大する化合物として作用し得る。Ｔｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの間の結合に対する試験化合物の影響を定量するために使用される測定の型は、使用されるアッセイ方法および検出方法の型に依存し、そしてこれは、当業者によって容易に決定され得る。例えば、ウエスタンブロットを検出のための手段として利用する生物学的スクリーニングを使用する場合、結合は、デンシトメトリーを使用して測定され得る。濃度測定値は基準化され得、そして閾値が、一連のコントロールサンプル間のシグナルにおけるバリエーションの量に基づいて（すなわち、試験化合物を用いずに）、設定され得る。このバリエーションが小さいほど、信頼性のある検出をされる試験化合物の効果はより小さくなる。
【０１７８】
本発明のアッセイのなおさらなる実施形態において、このアッセイを支える細胞培養技術を活用して、Ｔｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体は、細胞全体（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ）において産生される。例えば、以下で記載されるように、Ｔｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体は、真核生物細胞培養系（例えば、哺乳動物細胞および酵母細胞）において構成され得る。当業者に公知の他の細胞が、使用され得る。細胞全体においてこのアッセイを作製することについての利点としては、このインヒビターの治療における使用が必要とされる環境により近く近似する環境において機能的であるインヒビターを検出する能力が挙げられ、この因子の細胞内への侵入を果たす能力を含む。その上さらに、このアッセイの特定のインビボ実施形態（例えば、以下に挙げる実施例）は、試験化合物の高処理分析を受容可能である。Ｔｉｍ−１／Ｔｉｍ−４複合体の成分は、このアッセイを支持するために選択された細胞に対して内因性であり得る。あるいは、幾つかまたは全ての成分は、外来性供給源に由来し得る。例えば、融合ポリペプチドは、組換え技術によって（例えば、発現ベクターの使用を通して）、そしてこの融合ポリペプチド自体またはこれをコードするｍＲＮＡを微量注入することによって、細胞内に導入され得る。
【０１７９】
なお別の実施形態において、Ｔｉｍ−１ポリペプチドおよびＴｉｍ−４ポリペプチドは、相互作用捕捉アッセイ（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｒａｐ  ａｓｓａｙ）を作製し、その後、ポリペプチド同士の結合を壊す因子を検出するために使用され得る（また、米国特許第６，２００，７５９号および同第５，９２５，５２３号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；ならびにＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６を参照）。
【０１８０】
酵母ツーハイブリッドポリペプチド相互作用アッセイもまた、Ｔｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの結合に影響する化合物を同定するために使用され得る。このアッセイは、ほとんどの真核生物細胞転写アクチベーターはモジュール式であり、すなわち、これらのアクチベーターは代表的に、転写を活性化する活性化ドメインおよびこのアクチベーターをＤＮＡ分子の適切な領域に局在化するＤＮＡ結合ドメインを含むという知見に基づく。
【０１８１】
ツーハイブリッド系において、第１の融合ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインと融合する一対の相互作用するポリペプチドのうちの１つを含み、そして第２の融合ポリペプチドは、転写活性化ドメインに融合する一対の相互作用するポリペプチドのもう一方を含む。２つの融合ポリペプチドは、同じ細胞内で独立して発現され、そして融合体の「相互作用するポリペプチド」部分間の相互作用は、転写活性化因子の機能を再構成し、この因子は、レポーター遺伝子の転写の活性化により検出される。少なくとも２つの異なる細胞ベースのツーハイブリッドポリペプチド−ポリペプチド相互作用アッセイ系は、結合相互作用を評価するかおよび／または相互作用するポリペプチドを同定するために使用されている。一対の融合ハイブリッドポリペプチドを両方使用し、ここで、この一対のうちの１つは転写活性化因子の転写活性化ドメインに融合する第１の２つの「相互作用」ポリペプチドを含み、そして一対のうちのもう一方は、転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインに融合する第２の２つの「相互作用」ポリペプチドを含む。
【０１８２】
別の実施形態において、ポリペプチドのうちの１つは細胞上に（例えば細胞表面上に）発現され、ここで、他のポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは組換えポリペプチドであり、精製されているかまたは部分的に精製されており、そして複合体の形成が可能になるように細胞に接触される。
【０１８３】
幾つかの実施形態において、Ｔｉｍ−１とＴｉｍ−４との間の結合相互作用を調節することが同定されている因子は、機能的効果（例えば、インビトロまたはインビボでの、Ｔ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２応答の誘導に対するその効果）について、例えば実施例の節で記載するアッセイの使用により、さらに評価され得る。
【０１８４】
試験因子または試験化合物は、試験することを望まれる任意の因子または化合物であり得、これらとしては、ポリペプチド（抗体を含む）、ペプチド、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、核酸を含む）、炭水化物、有機化合物、無機化合物、天然産物、ライブラリー抽出物、体液およびＴｉｍ−１ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの間の結合に影響することについて試験することを望まれる他のサンプルが挙げられるが、これらに限定されない。特に、この試験化合物は、Ｔｉｍ−１ポリペプチドのペプチド模倣物またはそのフラグメントであり得る。幾つかの実施形態において、この試験因子は、精製されるかまたは部分的に精製され、一方、他の実施形態においては精製されない。
【０１８５】
試験因子は、多くの化学的クラスを含むが、代表的には、これらは有機分子であり、好ましくは有機低分子であり、５０ダルトンより大きく約２，５００ダルトン未満の分子量を有する。試験因子は、ポリペプチドとの構造的相互作用のために必要な官能基を含み、特に水素結合を含み、そして代表的には少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を、好ましくは少なくとも２つの官能化学基を含む。この試験因子は、しばしば、環式炭素もしくはヘテロ環式構造および／または芳香族構造またはポリ芳香族構造を含み、上記の官能基による１以上の置換を有する。試験因子はまた、生物分子の間に見出され得、この分子としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペプチド、多糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログまたはこれらの組み合わせ。
【０１８６】
試験因子は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む、広範な種々の供給源から得られる。例えば、広範な種々の有機化合物および生体分子の無作為合成および定方向の（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）（無作為オリゴヌクレオチドおよび無作為オリゴペプチドの発現を含む）合成について、多くの手段が利用可能である。低分子の有機／ペプチドのライブラリーは、例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１４：８３；Ａｆｆｙｍａｘ、米国特許第５，３５９，１１５号および同第５，３６２，８９９号；Ｅｌｌｍａｎ、米国特許第５，２８８，５１４号；Ｓｔｉｌｌら、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９４／０８０５１号；Ｃｈｅｎら（１９９４）ＪＡＣＳ  １１６：２６６１；Ｋｅｒｒら（１９９３）ＪＡＣＳ  １１５：２５２；ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９２／１００９２号、同第ＷＯ９３／０９６６８号および同第ＷＯ９１／０７０８７号；ならびにＬｅｒｎｅｒら、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９３／２０２４２号に記載されるようなコンビナトリアル技術を使用して作製され得る。
【０１８７】
あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーが、利用可能であるかまたは容易に作製され得る。さらに、天然のまたは合成的に作製されたライブラリーおよび化合物は、従来的な化学的手段、物理的手段および生化学的手段を通して用意に修飾され得、そしてコンビナトリアルライブラリーを作製するために使用され得る。公知の薬理学的因子は、定方向（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）であるかまたは無作為な化学的修飾（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）など）を受けて、構造的アナログを産生し得る。
【０１８８】
他の実施形態において、試験因子は、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−４またはこれらのフラグメントのペプチド模倣物である。ペプチド模倣物は、ペプチドおよびポリペプチドに基づくか、またはこれらに由来する化合物である。本発明において使用され得るペプチド模倣物は、代表的に、天然でないアミノ酸を用いる公知のアナログペプチド配列の構造的修飾（例えば、立体配置的制限、等配電子置換など）によって得られ得る。このペプチド模倣物は、ペプチドと非ペプチド合成構造との間の構造的空間の連続体を構成する；従って、ファルマコフォア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）をはっきりさせる（ｄｅｌｉｎｅａｔｅ）ため、およびペプチドを親アナログペプチドの活性を有する非ペプチド化合物に翻訳することを補助するために、アナログペプチド模倣物が有用であり得る。
【０１８９】
その上、本開示から明らかであるように、このＴｉｍ−１配列およびＴｉｍ−４配列のミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）が、提供され得る。このようなペプチド模倣物は、非加水分解性になること（例えば、プロテアーゼまたは対応するペプチドを分解する他の生理学的条件に対する安定性の増大）、特異性および／または効力の増大、ならびにペプチド模倣物の細胞内局在のための細胞透過性の増大などの特性を有し得る。例示目的のために、本発明のペプチドアナログが生成されて使用され得、例えば、ベンゾジアゼピン（例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編，ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８を参照）、置換γラクタム環（Ｇａｒｖｅｙら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編，ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８，ｐｌ２３）、Ｃ−７模倣物（Ｈｕｆｆｍａｎら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編，ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８，ｐ．１０５）、ケト−メチレンプソイドペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎら（１９８６）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２９：２９５；およびＥｗｅｎｓｏｎら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（第９回Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍの予稿集）Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ，１９８５）、β−ターンジペプチドコア（Ｎａｇａｉら（１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２６：６４７；およびＳａｔｏら（１９８６）Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ  １：１２３１）、α−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １２６：４１９；およびＤａｎｎら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １３４：７１）、ジアミノケトン（Ｎａｔａｒａｊａｎら（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １２４：１４１）、および修飾メチレンアミノ（Ｒｏａｒｋら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編，ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８，ｐｌ３４）である。また、一般に、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編，ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８におけるＳｅｓｓｉｏｎ  ＩＩＩ：Ａｎａｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓを参照のこと。
【０１９０】
目的のアナログペプチド模倣物を作製するために実施され得る種々の側鎖置換に加えて、本発明は、ペプチド二次構造の構造的に制限された模倣物の使用を特に企図する。多くの代替が、ペプチドのアミド結合について開発されている。アミノ結合の頻繁に利用される代替は、以下の基を含む：（ｉ）トランス−オレフィン、（ｉｉ）フルオロアルケン、（ｉｉｉ）メチレンアミノ、（ｉｖ）ホスホンアミド、および（ｖ）スルホンアミド。
【０１９１】
幾つかの実施形態において、試験因子は、Ｔｉｍ−１ポリペプチドまたはＴｉｍ−４ポリペプチドの間の結合に影響し得るか否かを決定する前に、Ｔｉｍ−１ポリペプチドまたはＴｉｍ−４ポリペプチドに結合するその能力について、事前に選択される。１つの実施形態において、試験因子は、最初、Ｔｉｍ−１ポリペプチドまたはＴｉｍ−４ポリペプチドに結合するその能力について選択され得る。この試験因子は、試験因子のライブラリー（例えば、ペプチドライブラリーまたはファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって事前に選択され得る。
【０１９２】
（ＶＩ．Ｔｉｍ−１およびＴｉｍ−４の改変体およびアナログを同定する方法）
本発明の別の局面は、変更された結合活性を有するか、または変更された機能を有する、Ｔｉｍ−１ポリペプチドまたはＴｉｍ−４ポリペプチドの改変形態を同定する方法を提供する。１つの局面において、本発明は、野生型Ｔｉｍ−４と比較して変更された結合特性を有するＴｉｍ−４ポリペプチドを同定する方法を提供する。１つの実施形態において、Ｔｉｍ−４ポリペプチドは、そのＮ末端もしくはＣ末端またはその両方において切断を含み、そしてＴｉｍ−１ポリペプチドへの結合について試験される。このようなアプローチは、例えば、Ｔｉｍ−１に結合するその能力を保持する最小のＴｉｍ−４フラグメントを同定することを可能にする。Ｔｉｍ−４フラグメントは、第２のポリペプチド（例えば、ＩｇドメインまたはアッセイのためのＧＳＴ融合ポリペプチド）に融合し得る。さらに、変異（例えば、１以上のアミノ酸位置において欠失、挿入または置換を生じる変異であるが、これに限定されない）が、（ａ）全長Ｔｉｍ−４ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント内、または（ｂ）Ｔｉｍ−１ポリペプチドへの結合が可能なＴｉｍ−４フラグメントをコードするＤＮＡセグメント内に導入され得、そして変異体Ｔｉｍ−４フラグメントの能力が、この変異体ポリペプチドはＴｉｍ−１ポリペプチドに対し変更された結合親和性を有するか否かを決定するために試験される。別の局面において、本発明は、野生型Ｔｉｍ−１と比較して変更された結合特性を有するＴｉｍ−１ポリペプチドを同定する方法を提供し、これは、野生型Ｔｉｍ−４と比較して変更された結合特性を有するＴｉｍ−４ポリペプチドの同定に類似する。
【０１９３】
Ｔｉｍ−４変異体およびＴｉｍ−１変異体の作製が、例えば変異体ポリペプチドライブラリーの当業者に公知の任意の技術を通した作製によって達成され得る。クローニングされた遺伝子のインビトロ変異誘発についての技術は、公知である。変異を走査するためのプロトコルの例は、Ｇｕｓｔｉｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：２２（１９９３）；Ｂａｒａｎｙ，Ｇｅｎｅ  ３７：１１１−２３（１９８５）；Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉら，Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １９９：５３７−９（１９８５）；およびＰｒｅｎｔｋｉら，Ｇｅｎｅ  ２９：３０３−１３（１９８４）において見出され得る。部位特異的変異誘発のための方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，ｐｐ．１５．３−１５．１０８；Ｗｅｉｎｅｒら，Ｇｅｎｅ  １２６：３５−４１（１９９３）；Ｓａｙｅｒｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：５９２−６（１９９２）；ＪｏｎｅｓおよびＷｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：５２８−３０（１９９２）；Ｂａｒｔｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：７３４９−５５（１９９０）；ＭａｒｏｔｔｉおよびＴｏｍｉｃｈ，Ｇｅｎｅ  Ａｎａｌ  Ｔｅｃｈ  ６：６７−７０（１９８９）；ならびにＺｈｕ  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７７：１２０−４（１９８９）において見出され得る。アミノ酸置換は、含まれる残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて行われ得る。他の実施形態において、変異は、無作為に作製される。
【０１９４】
変更された結合特性を有するＴｉｍ−１ポリペプチドまたはＴｉｍ−４ポリペプチドとは、それぞれ、Ｔｉｍ−４またはＴｉｍ−１についての変更された親和性を有するポリペプチドをいう。幾つかの特定の実施形態において、変異体ポリペプチドは、ある生理学的条件下で非変異形態と同じ結合親和性を有するが、他の条件下では異なる親和性を有する。例えば、Ｔｉｍ−４ポリペプチドは、（ａ）少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＴｉｍ−４  ＩｇＶドメイン；（ｂ）必要に応じてＴｉｍ−４ムチンドメイン；および（ｃ）必要に応じてヒトＩｇドメインまたは親和性タグからなり、Ｔｉｍ−１ポリペプチドに対する結合について試験され得る。このＴｉｍ−４ポリペプチドは、３７℃では変異を有さない等価のＴｉｍ−４ポリペプチドと同じ結合親和性でＴｉｍ−１に結合するが、３５℃では異なる結合親和性を有することが見出され得る。同様に、変異体ペプチドは、別のパラメーター（例えば、ｐＨあるいは一価イオンもしくは二価イオンの存在または非存在）が変化する場合に、異なる活性を示し得る。
【０１９５】
本発明の別の局面は、Ｔｉｍ−４のＴｉｍ−１への結合に貢献するＴｉｍ−４におけるアミノ酸残基を同定する方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）（ｉ）Ｔｉｍ−４  ＩｇＶドメインを含むポリペプチドであって、このＴｉｍ−４  ＩｇＶドメインは、配列番号３の残基３１〜１３３に示されるＴｉｍ−４  ＩｇＶドメインと比較して１と１０との間のアミノ酸置換を有する、ポリペプチドと（ｉｉ）Ｔｉｍ−４に結合可能であるＴｉｍ−１ポリペプチドとを接触させる工程；（ｂ）このポリペプチドとこのＴｉｍ−１ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出する工程；および（ｃ）この複合体の形成を適切なコントロールに対して比較する工程であって、ここで、複合体形成の程度が適切なコントロールから異なる場合、アミノ酸はＴｉｍ−１への結合に貢献することが同定される。
【０１９６】
１つの実施形態において、この適切なコントロールは、（ｉ）Ｔｉｍ−１ポリペプチドと（ｉｉ）配列番号３に示されるＴｉｍ−４  ＩｇＶドメインのアミノ酸配列を含むコントロールポリペプチドとの間の複合体の形成を含む。別の実施形態において、適切なコントロールは、所定の閾値レベルを含む。別の実施形態において、Ｔｉｍ−１ポリペプチドは、配列番号１の残基２１〜１２６に示すＴｉｍ−１  ＩｇＶドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一または類似である配列を含む。別の実施形態において、このポリペプチドは、Ｔｉｍ−４ムチンドメインをさらに含む。関連の実施形態において、このポリペプチドは、Ｔｉｍ−４ムチンドメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一または類似である配列を含む。
【０１９７】
本発明の別の局面は、Ｔｉｍ−１のＴｉｍ−４への結合に貢献するＴｉｍ−１におけるアミノ酸残基を同定する方法を提供し、この方法は、以下：（ｉ）Ｔｉｍ−１  ＩｇＶドメインを含むポリペプチドであって、このＴｉｍ−１  ＩｇＶドメインは、配列番号１の残基２１〜１２６に示されるＴｉｍ−１  ＩｇＶドメインと比較して１と１０との間のアミノ酸置換を有する、ポリペプチドと（ｉｉ）Ｔｉｍ−２に結合可能であるＴｉｍ−４ポリペプチドまたはそのフラグメントとを接触させる工程；（ｂ）このポリペプチドとこのＴｉｍ−４１ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出する工程；および（ｃ）この複合体の形成を適切なコントロールに対して比較する工程であって、ここで、複合体形成の程度が適切なコントロールから異なる場合、アミノ酸はＴｉｍ−４への結合に貢献することが同定される。
【０１９８】
本発明の関連の局面は、試験ポリペプチドがＴｉｍ−１ポリペプチドに結合するか否かを決定する方法を提供し、ここで、この試験ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸３１〜１３３に少なくとも９０％同一または類似であるアミノ酸配列を含み、この方法は、以下：（ａ）試験ポリペプチドを、Ｔｉｍ−１ポリペプチドに接触させる工程；および（ｂ）この試験ポリペプチドとＴｉｍ−１ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出する工程を包含し、ここで、複合体が検出される場合に、この試験ポリペプチドは、Ｔｉｍ−１ポリペプチドに結合することが決定される。１つの実施形態において、この試験ポリペプチドは、配列番号３の残基３１〜１３３または配列番号４の残基３１〜１３４に示されるＴｉｍ−４  ＩｇＶドメインに少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％同一または類似である配列を含む。別の実施形態において、この試験ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴｉｍ−４ポリペプチドに少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％同一または類似である配列を含む。
【０１９９】
別の実施形態において、この試験ポリペプチドは、その精製を容易にするか、またはインビボで安定性もしくは活性の増強を与えるポリペプチド配列（例えば、Ｆｃ免疫グロブリンドメインまたはアフィニティタグ）を含む。
【０２００】
本発明の別の局面は、試験ポリペプチドがＴｉｍ−４ポリペプチドに結合するか否かを決定する方法を提供し、ここで、この試験ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２１〜１２６と少なくとも９０％同一または類似であるアミノ酸配列を含む。この方法は、以下：（ａ）この試験ポリペプチドをＴｉｍ−４ポリペプチドと接触させる工程；および（ｂ）この試験ポリペプチドとＴｉｍ−４ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出する工程を包含し、ここで、複合体が検出される場合、この試験ポリペプチドはＴｉｍ−４ポリペプチドに結合することが決定される。１つの実施形態において、この試験ポリペプチドは、配列番号１の残基２１〜１２６または配列番号２の残基２１〜１２９に示されるＴｉｍ−１  ＩｇＶドメインと少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％同一または類似である配列を含む。別の実施形態において、この試験ポリペプチドは、その精製を容易にするか、またはインビボで安定性または活性を増強するポリペプチド配列（例えばＦｃ免疫グロブリンドメインもしくはアフィニティタグ）を含む。
【０２０１】
試験ポリペプチドがＴｉｍ−１ポリペプチドまたはＴｉｍ−４ポリペプチドに結合するか否かを決定するための本明細書中で記載される方法の１つの実施形態において、この試験ポリペプチドは、例えば、前の節で記載されるようなＴｉｍ−１またはＴｉｍ−４のペプチド模倣物である。可能性のある生物活性のペプチド模倣物を設計するために有用であるコンピュータープログラムは、米国特許第５，３３１，５７３号（その開示は本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０２０２】
（ＶＩＩ．処方物）
本明細書中で記載される治療剤は、薬学的組成物として処方され得る。本発明に従う使用のための薬学的組成物は、１以上の薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を用いて、従来様式で処方され得る。従って、この化合物ならびにその薬学的に受容可能な塩および溶媒化合物は、例えば、エアロゾル経路、静脈内経路、経口経路または局所経路によって投与するために処方され得る。この投与としては、病変内局注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射；輸液；リポソーム媒介性送達；局所送達、髄腔内送達、歯肉ポケット送達、直腸経由の送達、気管支内送達、鼻送達、経粘膜送達、腸送達、経口送達、眼送達または耳送達が挙げられ得る。
【０２０３】
本発明の例示的な組成物は、送達系（例えば、リポソーム系）に混合されたＲＮＡｉを含有し、かつ、必要に応じて受容可能な賦形剤を含有する。好ましい実施形態において、この組成物は、注射のために処方される。
【０２０４】
技術および処方物は、一般に、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて見出され得る。全身投与については、注射が好ましく、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射および皮下注射が挙げられる。注射のために、本発明の化合物は、液体溶液中に、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液（例えば、ハンクス溶液またはリンガー溶液）中に処方され得る。さらに、この化合物は、固体形態で処方されて、使用直前に溶解され得るかまたは懸濁され得る。凍結乾燥形態もまた、挙げられる。
【０２０５】
経口投与のために、この薬学的組成物は、例えば、従来手段によって薬学的に受容可能な賦形剤と共に調製される錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。この賦形剤は、例えば、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（例えば、乳糖、微結晶性セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；潤沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）である。この錠剤は、当該分野で周知の方法でコートされ得る。経口投与のための液体調製剤は、例えば、溶液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤の形態をとり得るか、またはこれらは水もしくは他の適切なビヒクルによる使用前の構成のための乾燥製品として存在し得る。このような液体調製剤は、従来手段によって薬学的に受容可能な添加剤と共に調製され得る。この添加剤は、例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または摂食可能な水素化脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、ａｔｉｏｎｄ油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）および保存剤（例えば、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）である。この調製剤はまた、必要に応じて緩衝化塩、香料添加剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。
【０２０６】
経口投与のための調製剤は、活性化合物を徐放させるために適切に処方され得る。口腔内投与のために、この組成物は、従来様式で処方された錠剤またはロゼンジの形態をとり得る。吸入による投与のために、本発明に従う使用のための化合物は、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素または他の適切な気体）の使用により与圧パックまたはネブライザーから与えられるエアロゾルスプレーの形態で簡便に送達される。与圧エアロゾルの場合、単位投薬量は、計測された量を送達するバルブの提供によって決定され得る。例えば、吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）または吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）における使用のためのゼラチンのようなカプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合物および適切な粉末ベース（例えば、乳糖またはデンプン）を含有するように処方され得る。
【０２０７】
この化合物は、注射による（例えば、ボーラス注射または連続的輸液による）非経口投与のために処方され得る。注射のための処方物は、保存剤を加えた単位投薬形態（例えばアンプル中または多回用量容器中）で与えられ得る。この組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液剤または乳剤の形態をとり得、そして処方のための（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ）薬剤（例えば、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤）を含有し得る。あるいは、この活性成分は、適切なビヒクル（例えば、無菌無発熱物質水）による使用前の構成のための粉末形態であり得る。
【０２０８】
この化合物はまた、例えば、従来の坐剤ベース（例えば、カカオ脂または他のグリセリド）を含有する直腸組成物（例えば、坐剤または滞留浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｎｅｍａ））に処方され得る。
【０２０９】
上述の処方物に加え、また、この化合物は、蓄積（ｄｅｐｏｔ）調製剤としても処方され得る。このような長時間活性の処方物は、移植（例えば、皮下移植または筋肉内移植）によって投与され得るか、または筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば、この化合物は、適切なポリマー物質または疎水性物質によって（例えば、受容可能な油中の乳剤として）処方され得るか、またはイオン交換樹脂によって処方され得るか、またはやや不溶性の誘導体（例えば、やや不溶性の塩）として処方され得る。
【０２１０】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によってもよい。経粘膜投与または経皮投与のために、浸透するべき障壁に対して適切な浸透剤が、処方において使用される。このような浸透剤は、一般に当該分野で公知であり、例えば、経粘膜投与のための胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられ、さらに、浸透を容易にするために界面活性剤が使用され得る。経粘膜投与は、鼻用スプレーを通してまたは坐剤を用いて投与され得る。局所投与について、本発明のオリゴマーは、当該分野で公知の軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤またはクリーム剤に処方される。洗浄溶液はまた、治癒を促進して損傷または炎症を処置するために局所的に使用され得る。
【０２１１】
この組成物は、所望される場合、活性成分を含有する１以上の単位投薬形態を含み得るパックデバイスまたはディスペンサーデバイス中で与えられ得る。このパックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を備え得る（例えば、ブリスターパック）。このパックデバイスまたはディスペンサーデバイスに、投与のための指示書を添付し得る。
【０２１２】
本発明の核酸、オリゴマーの投与を含む治療は、種々の投与様式（全身投与、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与または局所（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）投与が挙げられる）のために処方され得る。技術および処方物は、一般に、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて見出され得る。全身投与については、注射が好ましく、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、結節内注射および皮下注射が挙げられ、注射のために、本発明のオリゴマーは、液体溶液中に、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液（例えば、ハンクス溶液またはリンガー溶液）中に処方され得る。さらに、このオリゴマーは、固体形態で処方されて、使用直前に溶解され得るかまたは懸濁され得る。凍結乾燥形態もまた、挙げられる。
【０２１３】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によってもよいか、または化合物が経口的に投与されてもよい。経粘膜投与または経皮投与のために、浸透するべき障壁に対して適切な浸透剤が、処方物において使用され得る。このような浸透剤は、一般に当該分野で公知であり、例えば、経粘膜投与のための胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。さらに、浸透を容易にするために界面活性剤が使用され得る。経粘膜投与は、鼻用スプレーを通してまたは坐剤を用いて投与され得る。経口投与のために、このオリゴマーは、従来の経口投与形態（例えば、カプセル剤、錠剤および強壮薬）で処方される。局所投与について、本発明のオリゴマーは、当該分野で公知の軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤またはクリーム剤に処方される。
【０２１４】
本発明の薬剤および組成物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０の決定（集団の５０％に致命的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効である用量）の決定のための、細胞培養物または実験動物における標準的薬学的手順によって決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療の指標であり、そしてＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表され得る。大きな治療誘導性を示す化合物が、好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用され得るが、非感染細胞に対する損傷の可能性を最小化するためにこのような化合物を冒された組織の部位に対して標的化し、それによって副作用を低減する送達系を設計するために、注意が払われるべきである。
【０２１５】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための範囲の投薬量を処方するために使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、ＥＤ５０を含み毒性をほとんどもしくは全く有さない循環濃度の範囲内である。この投薬量は、使用される投薬形態および使用される投与経路に依存して、この範囲内で変わり得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療的に有効な投薬量が、まず細胞培養アッセイから見積もられ得る。動物モデルにおいて、細胞培養物中で決定されるＩＣ５０（すなわち、最大の半分の症状の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む範囲の循環血漿濃度を達成する用量が処方され得る。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０２１６】
本明細書中に記載される方法の１つの実施形態において、この薬剤の有効量は、被験体の体重１ｋｇあたり約１ｍｇと約５０ｍｇとの間である。１つの実施形態において、この薬剤の有効量は、被験体の体重１ｋｇあたり約２ｍｇと約４０ｍｇとの間である。１つの実施形態において、この薬剤の有効量は、被験体の体重１ｋｇあたり約３ｍｇと約３０ｍｇとの間である。１つの実施形態において、この薬剤の有効量は、被験体の体重１ｋｇあたり約４ｍｇと約２０ｍｇとの間である。１つの実施形態において、この薬剤の有効量は、被験体の体重１ｋｇあたり約５ｍｇと約１０ｍｇとの間である。
【０２１７】
本明細書中で記載される方法の１つの実施形態において、この薬剤は、少なくとも週に１回投与される。１つの実施形態において、この薬剤は、毎日投与される。１つの実施形態において、この薬剤は、隔日で投与される。１つの実施形態において、この薬剤は、６日〜８日毎に投与される。１つの実施形態において、この薬剤は、毎週投与される。
【０２１８】
被験体に投与するための化合物および／または薬剤の量について、当業者は、いかにして適切な量を決定するかを知っている。本明細書中で使用される場合、用量または量は、障害を阻害すること、障害を処置すること、被験体を処置することまたは被験体を障害に罹患することから予防することのいずれかのために十分な用量または量である。この量が、有効量とみなされ得る。当業者は、どの量が被験体を処置するために必要とされるかを決定するための単純な滴定実験を実施し得る。本発明の組成物の投薬量は、被験体および使用される特定の投与経路に依存して変わり得る。１つの実施形態において、この投薬量は、被験体の体重１ｋｇあたり約０．１μｇから約１００，０００μｇまでの範囲におよび得る。この組成物に基づき、この用量は、連続的に（例えば、連続ポンプによって）送達され得るか、または定期的な間隔で送達され得る。例えば、１以上の別々の場合にである。特定の組成物の多回用量の所望される時間間隔は、当業者によって過度の実験をすることなく決定され得る。
【０２１９】
有効量は、とりわけ、化合物の大きさ、化合物の生物分解性、化合物の生物活性および化合物のバイオアベイラビリティーに基づき得る。この化合物が迅速に崩壊せず、生物利用可能でかつ非常に活性である場合、有効であるためにより少ない量が必要であり得る。この有効量は、当業者に公知である。これはまた、この化合物の形態、この化合物の大きさおよびこの化合物の生物活性にも依存する。当業者は、バイオアッセイにおいて生物活性を決定して、それにより有効量を決定するための化合物についての実験的活性試験を、慣用的に実施し得る。上記方法の１つの実施形態において、この化合物の有効量は、被験体の体重１ｋｇあたり約１．０ｎｇから約１００ｍｇまでを含有する。上記方法の別の実施形態において、この化合物の有効量は、被験体の体重１ｋｇあたり約１００ｎｇから約５０ｍｇまでを含有する。上記方法の別の実施形態において、この化合物の有効量は、被験体の体重１ｋｇあたり約１μｇから約１０ｍｇまでを含有する。上記方法の別の実施形態において、この化合物の有効量は、被験体の体重１ｋｇあたり約１００μｇから約１ｍｇまでを含有する。
【０２２０】
この化合物、組成物および／または薬剤がいつ投与されるべきであるかについて、当業者は、このような化合物および／または薬剤をいつ投与するかを決定し得る。この投与は、一定期間または定期的または特定の間隔について、一定であり得る。この化合物は、毎時間、毎日、毎週、毎月、毎年（例えば、徐放形態で）、または１回の送達で送達され得る。この送達は、一定期間について連続的な送達であり得る（例えば、静脈内送達）。本明細書中に記載される方法の１つの実施形態において、この薬剤は、少なくとも１日に１回投与される。本明細書中に記載される方法の１つの実施形態において、この薬剤は、毎日投与される。本明細書中に記載される方法の１つの実施形態において、この薬剤は、隔日で投与される。本明細書中に記載される方法の１つの実施形態において、この薬剤は、６日〜８日毎に投与される。本明細書中に記載される方法の１つの実施形態において、この薬剤は、毎週投与される。
【０２２１】
本明細書中に記載される、ポリペプチドを含有する薬剤が被験体に投与される方法の幾つかの実施形態において、このポリペプチドは、このようなポリペプチドをコードする遺伝子を投与することによって被験体に投与される。治療用ポリペプチドの発現構築物（例えば、野生型またはムテインのＴｉｍ−４  ＩｇＶドメインを含むポリペプチド）は、任意の生物学的に有効なキャリア（例えば、インビボで細胞を組換え融合遺伝子により有効にトランスフェクトすることが可能な任意の処方物または組成物）中で投与され得る。アプローチは、被験体の融合遺伝子のウイルスベクター（組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよび単純ヘルペスウイルス−１または組換え細菌プラスミドもしくは組換え真核生物プラスミドが挙げられる）への挿入を含む。ウイルスベクターは、細胞を直接トランスフェクトするために使用され得る。プラスミドＤＮＡは、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクチン）または誘導体化（例えば、抗体結合体化）、ポリリジン結合体、グラマシジンＳ、人工ウイルスエンベロープまたは他のこのような細胞内キャリアの補助、ならびに、インビボで実施されるこの遺伝子構築物またはＣａＰＯ４沈殿物の直接的な注射によって送達され得る。適切な標的細胞の導入が遺伝子治療の重要な第１の工程を表すので、特定の遺伝子送達系の選択は、意図した標的の表現型および投与の経路（例えば、局所的または全身的）のような要因に依存することが理解される。さらに、例えばウイルスベクター内に含まれるｃＤＮＡによってウイルスベクター内にコードされる分子は、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞内で効率的に発現される。
【０２２２】
レトロウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターは、一般に、異種遺伝子のインビボ導入（特に、ヒトへ）のために選択される組換え遺伝子送達系として理解される。これらのベクターは、遺伝子の細胞への効率的な送達を提供し、そして導入された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡ内に安定的に組み込まれる。レトロウイルスの使用のための主要な、あらかじめ必要とされることは、特に、野生型ウイルスの細胞集団における拡散の可能性に関して、その使用の安全性を確実にすることである。複製欠損のレトロウイルスのみを産生する特殊化した細胞株（「パッケージング細胞（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ）」と呼ぶ）の開発は、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性を増大し、そして欠損レトロウイルスは、遺伝子治療目的のための遺伝子導入における使用のためによく特徴付けられている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１を参照のこと）。従って、レトロウイルスコード配列の部分（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）がＣＫＩポリペプチドをコードする核酸によって置換されている組換えレトロウイルスは、レトロウイルス複製欠損をもたらす。この複製欠損レトロウイルスは、次いで、ビリオン内にパッケージングされ、標準的技術を用いてヘルパーウイルスの使用を通して標的細胞に感染するために使用され得る。組換えレトロウイルスを産生するためおよびインビトロまらがインビボでこのようなウイルスによって細胞を感染させるためのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），９．１０−９．１４節および他の標準的実験室手引きにおいて見出され得る。適切なレトロウイルスの例としては、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられ、これらは当業者に周知である。エコトロピックレトロウイルス系および両栄養性レトロウイルス系の両方を調製するための適切なパッケージングウイルス株の例としては、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍが挙げられる。レトロウイルスは、種々の遺伝子を多くの異なる細胞型（神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞が挙げられる）にインビトロおよび／またはインビボで導入するために使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５−１；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ��．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙら（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１−  ６４７；Ｄａｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；国際特許出願第ＷＯ８９／０７１３６号；国際特許出願第ＷＯ８９／０２４６８号；国際特許出願第ＷＯ８９／０５３４５号；および国際特許出願第ＷＯ９２／０７５７３号を参照）。
【０２２３】
さらに、レトロウイルスおよび必然的にレトロウイルスベースのベクターの感染範囲を、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージングポリペプチドを改変することによって限定することが可能であることが示されている（例えば、国際特許出願第ＷＯ９３／２５２３４号、国際特許出願第ＷＯ９４／０６９２０号および国際特許出願第ＷＯ９４／１１５２４号を参照のこと）。例えば、レトロウイルスベクターの感染範囲を改変するための戦略としては、以下が挙げられる：細胞表面抗原に特異的な抗体のウイルスｅｎｖポリペプチドとの結合（Ｒｏｕｘら（１９８９）ＰＮＡＳ  ８６：９０７９−９０８３；Ｊｕｌａｎら（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：３２５１−３２５５；およびＧｏｕｄら（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６３：２５１−２５４）；または細胞表面リガンドのウイルスｅｎｖポリペプチドとの結合（Ｎｅｄａら（１９９１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：１４１４３−１４１４６）。結合は、ポリペプチドまたは他の種類（例えば、ｅｎｖポリペプチドをアシアロ糖ポリペプチドに変換する乳糖）との化学的架橋の形態であってもよく、ならびに融合ポリペプチド（例えば、単鎖抗体／ｅｎｖ融合ポリペプチド）の産生によってであってもよい。この技術は、特定の組織型を限定するかまたは特定の組織型に対する感染を指向するために有用であり、かつまた、エコトロピックベクターを両栄養性ベクターに変換するためにも使用され得る。
【０２２４】
上で説明したようなウイルス導入方法に加えて、非ウイルス性の方法もまた、目的のポリペプチドの動物の組織における発現を引き起こすために使用され得る。遺伝子導入の非ウイルス性の方法のほとんどは、哺乳動物細胞による高分子の取り込みおよび細胞内輸送のために使用される正常な機構に依存する。好ましい実施形態において、本発明の非ウイルス性遺伝子送達系は、標的細胞による遺伝子の取り込みのためのエンドサイトーシス経路に依存する。この型の例示的な遺伝子送達系としては、リポソーム送達系、ポリリジン結合体および人工ウイルスエンベロープが挙げられる。
【０２２５】
代表的な実施形態において、目的のポリペプチドの１つをコードする遺伝子は、その表面に正電荷を帯びたリポソーム（例えばリポフェクチン）内に捕捉され得、このリポソームは、（必要に応じて）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体でタグ標識される（Ｍｉｚｕｎｏら（１９９２）Ｎｏ  Ｓｉｎｋｅｉ  Ｇｅｋａ  ２０：５４７−５５１；国際特許公開第ＷＯ９１／０６３０９号；日本国特許出願第１０４７３８１号；および欧州特許公報ＥＰ−Ａ−４３０７５）。例えば、神経膠腫細胞のリポフェクチンは、神経膠腫関連抗原に対するモノクローナル抗体でタグ標識されたリポソームを使用して実施され得る（Ｍｉｚｕｎｏら（１９９２）Ｎｅｕｒｏｌ．Ｍｅｄ．Ｃｈｉｒ．３２：８７３−８７６）。
【０２２６】
臨床状況において、この遺伝子送達系は、それぞれが当該分野で知られる任意の多くの方法によって患者に導入され得る。例えば、遺伝子送達系の薬学的調製物は、（例えば、静脈内注射によって）全身的に導入され得、そして標的細胞の特異的な形質転換は、遺伝子送達ビヒクルによって提供されるトランスフェクションの特異性、転写調節配列の遺伝子発現制御に起因する細胞型または組織型の発現、またはこれらの組み合わせから主に生じる。他の実施形態において、組換え遺伝子の最初の送達は、非常に局在化された動物への導入に、より限定されている。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、カテーテル（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）または定位的注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：３０５４−３０５７）によって導入され得る。
【０２２７】
（配列表の記載）
配列番号１は、Ｔｉｍ−１ヒトポリペプチドである。この配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０３６３３８として記載される。
【０２２８】
配列番号２は、Ｔｉｍ−１マウスポリペプチドである。この配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿５９９００９として記載される。
【０２２９】
配列番号３は、Ｔｉｍ−４ヒトポリペプチド改変体＃１である。
【０２３０】
配列番号４は、Ｔｉｍ−４マウスポリペプチドである。この配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿８４８８７４として記載される。
【０２３１】
配列番号５は、Ｔｉｍ−１ヒト核酸である。この配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０１２２０６として記載される。
【０２３２】
配列番号６は、Ｔｉｍ−１マウス核酸である。この配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＭ＿１３４２４８として記載される。
【０２３３】
配列番号７は、Ｔｉｍ−４ヒト核酸改変体＃１である。
【０２３４】
配列番号８は、Ｔｉｍ−４マウス核酸である。この配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＭ＿１７８７５９として記載される。
【０２３５】
配列番号９は、エキソン６およびエキソン７を欠失するマウスＴｉｍ−４の可溶性形態である。
【０２３６】
配列番号１０は、エキソン６を欠失するマウスＴｉｍ−４のイソ型である。エキソン６の欠失は、続くエキソン５のフレームシフトを生じる。
【０２３７】
配列番号１１は、エキソン６およびエキソン７を欠失するマウスＴｉｍ−４の可溶性形態に類似するヒトＴｉｍ−４の可溶性形態である。
【０２３８】
配列番号１２は、Ｔｉｍ−４マウスポリペプチド改変体である。
【０２３９】
配列番号１３は、Ｔｉｍ−２マウスポリペプチド（ＮＰ＿５９９０１０）である。
【０２４０】
（例示）
本発明はここで、一般的に記載される。本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解される。以下の実施例は、本発明の特定の局面および実施形態の例示を目的として単に含まれ、他のＤＮＡマイクロアレイ、細胞型、因子、構築物、またはデータ分析方法（いずれも限定されない）が、本願発明の発明の範囲から逸脱することなく用いられ得ると、本明細書上記および以下の実施例から当業者が理解するように、本発明を限定することは意図していない。
【０２４１】
本願のどこかで参照した任意の特許、特許出願、特許公報、または科学文献の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２４２】
（実験の節の要旨）
本明細書中に記載の実施例は、Ｔｉｍ−２がＴｈ２細胞で優先的にアップレギュレートされることを実証する。Ｔｉｍ−２の機能的役割と取り組むために、Ｔｉｍ−２に対するモノクローナル抗体およびＴｉｍ−２のドメインおよびＦｃ免疫グロブリン鎖を含む融合ポリペプチドを作製した。これらの実施例は、Ｔｉｍ−２  Ｉｇの投与がＴ細胞活性化およびＴｈ２サイトカインの産生を誘導することを示す。さらに、Ｔｉｍ−２  ＩｇをＴｈ１媒介性疾患（例えば、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ））の誘導の間に投与した場合、疾患の臨床徴候が有意に減少した。末梢寛容の誘導の間に投与された場合、Ｔｉｍ−２Ｉｇは、移植寛容（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を促進し得る。まとめて考えると、これらのデータは、Ｔｉｍ−２がＴｈ２分化細胞上に発現されること、およびＴｉｍ−２とそのリガンドとの間の相互作用のブロックがＴｈ２応答を拡大し、それにより、自己免疫疾患ＥＡＥの発症および重篤度が遅延し、移植寛容が増強されることを示唆する。さらに、これらの実施例は、Ｔｉｍ１／Ｆｃ融合ポリペプチドの投与が、マウス島移植モデルにおいて同種移植片寛容を促進することを示す。
【０２４３】
これらの実施例はまた、Ｔｉｍ−４がＴｉｍ−１についての天然のリガンドであることを実証し、そしてＴｉｍ−４発現が免疫区画に制限され、この区画内でＴｉｍ−４の発現がマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）に制限されることを示す。可溶性Ｉｇ融合ポリペプチドを用いて、Ｔｉｍ−４はＴｉｍ−１に特異的に結合すること、およびこの相互作用が抗Ｔｉｍ−１抗体により阻害されることが見出された。さらに、Ｔｉｍ−１−Ｉｇのインビボでの投与は、ＴＨ２細胞の優先的増幅をもたらし、一方、Ｔｉｍ−４−ＩｇはＴ細胞増殖を刺激した。これらの実施例は、Ｔｉｍ−４−Ｔｉｍ−１相互作用がＴ細胞増幅に必要なシグナルを送達するというモデルを支持する。
【実施例】
【０２４４】
（実験手順）
（抗体、マウスおよびＩｇ融合ポリペプチド）
全ての動物実験を、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｒｅａ  Ｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌｓ（プロトコル６９６）の承認に従って行った。全てのマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製のＦＡＣＳ分析で用いた抗体は、以下の通りであった：ＦＩＴＣ標識抗マウス：Ｂ２２０、ＣＤ３ε、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ４；ＰＥ標識抗マウス：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０；ストレプトアビジン−ＰＥ、および特異的アイソタイプコントロール。二次ＰＥ標識検出試薬ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ、ヤギ抗ラットＩｇ（Ｈ＋Ｌ）、およびヤギ抗マウスＩｇＧ２ａは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからであった。抗ＨＡ−ビオチン（クローン１２ＣＡ５）は、Ｒｏｃｈｅからであった。抗Ｔｉｍ−３（２Ｃ１２）は、以前に記載されており（Ｍｏｎｎｅｙら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１５，５３６−５４１）、そして抗Ｔｉｍ−１（３Ｂ３）は、近年作製された。目的のポリペプチドの細胞外領域をｈｕＩｇＧ１のＦｃテールに融合した全てのＩｇ融合ポリペプチドは、Ｃｈｉｍｅｒｉｇｅｎによって作製された。
【０２４５】
（ＴＨ１およびＴＨ２の細胞株およびクローン）
ハトシトクロムｃ特異的ＴＨ１クローンであるＡＥ７、およびコンアルブミンＡ特異的ＴＨ２クローンであるＤ１０．Ｇ４を、以前（Ｓａｂａｔｏｓら（２００３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４，１１０２−１１１０）に記載されたとおりの静止−刺激プロトコルにおいて維持した。ＤＯ１１．１０  ＴｃＲ  ＴｇのＴＨ１およびＴＨ２の細胞株を、以前に記載されたとおりにインビトロで作製し、そして好首尾の極性化（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）が、細胞内サイトカイン染色（Ｍｏｎｎｅｙら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１５，５３６−５４１）により、各回の再刺激後に確認された。
【０２４６】
（トランスフェクタント）
Ｔｉｍ−４トランスフェクタントおよびＴｉｍ−１トランスフェクタントを、ｐＤｉｓｐｌａｙベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において作製した。Ｔｉｍ−４を、クローニングしたｃＤＮＡから、以下のプライマーを用いて増幅した：
【０２４７】
【化１】
2007529204.tif 000003
増幅された生成物は、ベクターのＮ末端ＨＡタグの切断を回避するために、そしてベクターのシグナル配列を利用するために、Ｔｉｍ−４シグナル配列を欠いていた。Ｔｉｍ−４−ｐＤｉｓｐｌａｙ構築物を、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いてＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、そして１．５μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、安定なトランスフェクタントが選択された。Ｔｉｍ−１を、クローニングされたｃＤＮＡから以下のプライマーを用いて増幅した：
【０２４８】
【化２】
2007529204.tif 000004
そして、Ｔｉｍ−１−ｐＤｉｓｐｌａｙ構築物を、上記の通り、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてマウスＴｉｍ−１  ｃＤＮＡを含むｐＥＦ６およびピューロマイシン耐性遺伝子でコトランスフェクトすることにより、ＣＨＯ−Ｔｉｍ−１細胞を作製した。細胞を、ピューロマイシンおよびブラスチシジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）を用いて選択し、そしてポリクローナルラット抗Ｔｉｍ−１血清を用いてフローサイトメトリーによってＴｉｍ−１発現について選別し、次いでサブクローニングした。ＣＨＯ−Ｔｉｍ−３トランスフェクタントは、以前に記載された（Ｍｏｎｎｅｙら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１５，５３６−５４１）。
【０２４９】
（細胞分離および刺激）
ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、およびＢ２２０＋細胞を、ＭＡＣＳ  ＬＳ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）中のＭＡＣＳ  Ｓｏｒｔ磁気ビーズによるポジティブ選択により脾臓およびリンパ節から精製し、そしてＣＤ３＋  Ｔ細胞を、ネガティブ選択カラム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により精製した。細胞の純度を、フローサイトメトリーによってチェックした。
【０２５０】
総脾細胞または精製したＣＤ１１ｂ＋集団もしくはＣＤ１１ｃ＋集団を、１ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ）で４２時間〜４８時間刺激した。Ｔ細胞を活性化するために、総脾細胞または精製したＣＤ３＋  Ｔ細胞を、１μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて４２時間〜４８時間刺激した。精製したＣＤ３＋  Ｔ細胞をまた、０．５μｇ／ウェルの抗ＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および０．５μｇ／ウェル抗ＣＤ２８（クローン３７．５１，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で３７℃にて２時間コーティングした２４ウェルプレート中で４２時間〜４８時間刺激した。全ての刺激を、以前に記載された、ｒＩＬ−２を欠く完全培地（Ｓａｂａｔｏｓら（２００３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４，１１０２−１１１０）中で行った。
【０２５１】
（ＤＣ作製）
インビトロでのＤＣ作製のために、骨髄細胞をＣＢ６Ｆ１大腿骨から洗い流し、ＲＢＣを溶解し、そして残りの細胞を、２０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦまたは２００ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ３Ｌとともに１０６／ｍｌでプレーティングした。ＧＭ−ＣＳＦ刺激にて５日後、またはＦｌｔ３Ｌ刺激にて８日後、４０ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳをいくつかの培養物に１２時間から１４時間にわたって添加した。細胞を、ＧＭ−ＣＳＦについて合計６日間およびＦｌｔ３Ｌについて合計９日間の後に収集した。成熟骨髄性細胞を、上記の通りＭＡＣＳ磁気ビーズを用いたＣＤ８６＋細胞についてのポジティブ選択により、ＧＭ−ＣＳＦ誘導性ＤＣ細胞から分離した。Ｆｌｔ３Ｌ誘導性細胞から、Ｇｒ−１抗体を用いたＭＡＣＳネガティブ選択により、顆粒球を枯渇した（主にＣＤ１１ｃ＋集団を生じる）。いくつかのＦｌｔ３Ｌ誘導性ＤＣから、ＭＡＣＳによりＢ２２０＋プラズマ細胞様（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ）画分を枯渇した。
【０２５２】
インビボでのＤＣ作製のために、ＣＢ６Ｆ１マウスに、２×１０６個のＦｌｔ３Ｌ分泌ＣＭＳ５細胞（Ｄｅｖｉｎ  Ｔｕｒｎｅｒからの寛大なる寄贈）を皮下注射した。脾臓を９日後に収集、そして総ＣＤ１１ｃ＋集団を上記の通りの顆粒球枯渇によって得て、そしてＤＣ型を、ＭＡＣＳポジティブ選択を用いて細胞表面マーカーにより分離した。
【０２５３】
（定量的ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲ）
総ＲＮＡを、Ｔｒｉａｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から抽出した。次いで、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、０．６単位／μｇ  ＤＮＡｓｅ１（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて室温にて１５秒間の消化に供した。逆転写を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｔａｑｍａｎ（登録商標）逆転写酵素試薬を用いて（プライマーとしてランダムヘキサマーおよびオリゴヌクレオチドｄＴの両方を用いて）、１〜２μｇの消化したＲＮＡについて行った。Ｔｉｍ−４および内部参照ＧＡＰＤＨの発現レベルを、それぞれ、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）またはＶＩＣ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標識したプローブを用い、そしてクエンチャーとしてＴＡＭＲＡを用いた多重ＰＣＲによって同時に測定した。Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブを、Ｔｉｍ−４のエキソン３：エキソン４の連結部を含むように、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｖ１．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計した。これらのプライマーは、５’−ＣＡＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡＣＡＡ−３’および５’−ＴＧＡＴＴＧＧＡＴＧＣＡＧＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’であり、そしてプローブは６ＦＡＭ−５’−ＡＡＡＡＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＣＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧ−３’−ＴＡＭＲＡであった。ＧＡＰＤＨプライマーおよびプローブのセットを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＰＣＲを、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。比較閾値サイクル（ＣＴ）を用いて、遺伝子発現を決定した。各サンプルにつき、Ｔｉｍ−４  ＣＴ値を、式ΔＣＴ＝ＣＴＴＩＭ−４−ＣＴＧＡＰＤＨを用いて正規化した。相対発現を決定するために、平均ΔＣＴを決定し、そして相対Ｔｉｍ−４発現を、発現２−ΔＣＴを用いて算出した。
【０２５４】
（抗Ｔｉｍ−１を用いたブロッキング）
Ｔｉｍ−４を発現する細胞を、３５０μｇ／ｍｌの抗Ｔｉｍ−１または抗Ｔｉｍ−３とともに氷上で１時間予めインキュベートした５μｇ／ｍｌのＴｉｍ−１−Ｉｇで染色した。抗マウスＩｇＧ２ａ−ＰＥを検出用に用いた。Ｔｉｍ−１を発現する細胞を、３５０μｇ／ｍｌの抗Ｔｉｍ−１または抗Ｔｉｍ−３とともに氷上で１時間インキュベートし、その後、１μｇ／ｍｌのＴｉｍ−４−Ｉｇをこの混合物に添加して、抗ｈｕＩｇＧ−ＰＥを用いて検出した。
【０２５５】
（増殖アッセイおよびＥＬＩＳＡ）
雌性ＳＪＬ／Ｊマウス（６〜１２週齡）の各側腹部に、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ）中に乳化した５０〜１００μｇのＰＬＰ１３９−１５１ペプチド（ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ）（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を皮下注射した。マウスに、１００μｇのＴｉｍ−１−ＩｇもしくはＴｉｍ−４−Ｉｇ、１００μｇのコントロールｈＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）、またはＰＢＳ（Ｉｇ融合ポリペプチドと同じ体積）のいずれかを１日おきに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した（免疫と同日（０日目）に開始し、８日目まで続けた）。マウスを１０日目に屠殺し、そして脾臓を取り出した。細胞を、０〜１００μｇ／ｍｌで添加したＰＬＰ１３９−１５１を含む完全培地中、丸底９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）中に５×１０５細胞／ウェルでプレーティングした。４８時間後、培養上清を、サイトカインＥＬＩＳＡのために取り出し、そしてプレートに１μＣｉ３［Ｈ］チミジン／ウェルを１６時間〜１８時間パルスした。取り込まれた放射標識チミジンを、Ｂｅｔａ  Ｐｌａｔｅシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｉｎｃ）を利用して測定した。このデータを、三連のウェルでの１分間あたりの平均カウント（ｃ．ｐ．ｍ．）として提示する。サイトカイン産生を、以前に記載された（Ｓａｂａｔｏｓら（２００３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４，１１０２−１１１０）とおりに定量的捕捉ＥＬＩＳＡによって測定した。
【０２５６】
どの細胞が増殖したかを決定するために、総脾細胞を、上記のとおり、Ｂ２２０＋集団、ＣＤ１１ｂ＋集団、およびＣＤ３＋集団に分離した。次いで、細胞を、三連のウェル中、２００μｌ／ウェルの合計体積において、２×１０５個の各ＡＰＣ型とともに１０５個のＴ細胞を用いて組み換えた。増殖を、上記のとおりに、４８時間後に測定した。
【０２５７】
（補助刺激アッセイ）
ＣＤ３＋  Ｔ細胞を総リンパ節細胞から精製し、次いで３７℃にて１時間、組織培養ディッシュにプレーティングして、あらゆる残りのＡＰＣを除去した。非接着細胞を除去し、そして本文に示した濃度で抗体または融合ポリペプチドでコーティングした平底９６ウェルプレートに１ウェルあたり１０５個の細胞を播種した。プレートを３７℃にて２時間コーティングし、次いでＰＢＳで２〜３回洗浄した。４８時間後、プレートを１μＣｉの３［Ｈ］チミジン／ウェルで１６時間〜１８時間パルスし、そしてＴ細胞の増殖を三連のウェルで３［Ｈ］チミジン取り込みにより決定した。統計学的有意性を、全ての反復実験からのデータを用いたＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により決定した。
【０２５８】
（実施例１：Ｔｈ２細胞におけるＴｉｍ−２発現の同定）
ＲＮＡレベルでのＴｉｍ−２の発現を決定するために、出願人らは、サイクルサンプル半定量ＰＣＲを利用した。Ｔｉｍ−２は、未刺激のＴｈ２細胞クローンにおいて発現され、Ｔｈ１においては発現されなかった（図１Ａ）。Ｔｉｍ−２メッセージのレベルは、Ｄ０１１．１０  ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴｈ２表現型に向けて極性化されると増加した（図１Ｂ）。対照的に、Ｔｉｍ−２メッセージの量は、Ｔｈ１経路への極性化を低下させた細胞において、検出不可能かまたは低かった（図１Ｂ）。これらのデータは、Ｔｉｍ−２がＴｈ１細胞ではなくＴｈ２細胞において識別的に発現されることを示唆する。
【０２５９】
（実施例２：Ｔｉｍ−１  Ｉｇ融合ポリペプチドおよびＴｉｍ−２  Ｉｇ融合ポリペプチドの構築）
Ｔｉｍ−１およびＴｉｍ−２の潜在的リガンドを同定するため、ならびにＴｉｍ−１およびＴｉｍ−２とそれらのリガンドとの間の機能的なインビボでの関係に取り組むために、出願人らは、Ｔｉｍ−１  Ｉｇ融合ポリペプチドおよびＴｉｍ−２  Ｉｇ融合ポリペプチドを構築した。それぞれの場合、細胞外ＩｇＶおよびムチンドメインをコードするｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１  ＦｃテールをコードするｃＤＮＡに融合した。Ｔｉｍ−２構築物をＮＳ．１細胞に安定的にトランスフェクトし、そしてＴｉｍ−１構築物をＣＨＯ細胞に安定的にトランスフェクトした。融合ポリペプチドを、得られた上清からカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【０２６０】
（実施例３：活性化抗原提示細胞でのＴｉｍ−１およびＴｉｍ−２のリガンドの発現）
Ｔｉｍ−１およびＴｉｍ−２の役割を調べるために、出願人らはＴｉｍ−２  融合ポリペプチドを利用して、Ｔｉｍ−２リガンドを発現する細胞集団を同定した。種々の細胞株を、Ｔｉｍ−１  Ｉｇ融合ポリペプチドおよびＴｉｍ−２  Ｉｇ融合ポリペプチドの両方で染色した。非活性化樹状細胞、およびマクロファージは両方とも、Ｔｉｍ−１リガンドの低い発現を実証した。興味深いことに、静止集団はいずれも、Ｔｉｍ−２リガンドを発現しなかった。しかし、ＬＰＳおよびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）で活性化した場合、樹状細胞株およびマクロファージ細胞株は、Ｔｉｍ−１リガンドの発現をアップレギュレートし、そしてＴｉｍ−２リガンドの発現を誘導した（図２Ａおよび図２Ｂ）。Ｔｉｍ−１リガンドおよびＴｉｍ−２リガンドの発現の増加は、これらの細胞サブセットでのＭＨＣクラスＩＩ、ならびにＢ７−１およびＢ７−２の発現のアップレギュレーションと同時であった。調べた精製された全てのＴ細胞集団は、未刺激であろうと特異的に活性化されようと、Ｔｉｍ−１リガンドおよびＴｉｍ−２リガンドの両方について負に染色された。まとめて考えると、このデータは、Ｔｉｍ−１リガンドおよびＴｉｍ−２リガンドが活性化樹状細胞およびマクロファージで発現されることを示し、相互作用がＴ細胞および活性化抗原提示細胞を含むことを示唆する。
【０２６１】
（実施例４：Ｔ細胞増殖およびＴｈ２サイトカイン産生のＴｉｍ−１融合ポリペプチドおよびＴｉｍ−２融合ポリペプチドによる誘導）
Ｔｉｍ−１およびＴｉｍ−２はＴｈ２細胞において発現されるので、出願人らは、インビボ免疫応答におけるこれらの分子の役割に興味を持った。これに取り組むために、ＳＪＬ／Ｊマウスに、ＣＦＡ中のＰＬＰ１３９−１５１を免疫し、そしてＴｉｍ−１  Ｉｇ、Ｔｉｍ−２  Ｉｇ、ヒトＩｇＧまたはＰＢＳ（希釈剤コントロール）を投与した。脾臓およびリンパ節を収集し、そしてインビトロで再刺激して、融合ポリペプチドの存在下での増殖応答およびサイトカインプロファイルを調べた。コントロールマウスからの脾細胞は、ＰＬＰ  １３９−１５１に対する増殖における用量依存性増加を実証した（図３Ｂおよび図４Ｂ）。対照的に、Ｔｉｍ−１  ＩｇまたはＴｉｍ−２  Ｉｇのいずれかで処置したマウスは、抗原の非存在下で、有意に高い基底増殖応答を実証し（図３Ａおよび図４Ａ）、そしてＰＬＰ  １３９−１５１の存在下で増殖における低い用量依存性増加を実証した（図３Ｂおよび図４Ｂ）。これらのデータは、Ｔｉｍ−１ＩｇまたはＴｉｍ−２Ｉｇを用いた処置が、インビボでの細胞の過剰活性化をもたらし、その結果、インビトロで抗原の非存在下でこれらが増殖し続けることを示唆する。
【０２６２】
これらの実験からの上清を、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の産生について、再刺激の４８時間後にＥＬＩＳＡにより分析した。Ｔｉｍ−１  Ｉｇ処理マウスおよびＴｉｍ−２  Ｉｇ処理マウス由来の脾細胞全体は、多量のＩＬ−２を分泌し、これは、観察された高い基底増殖と一貫していた（図３Ｃおよび図４Ｃ）。興味深いことに、Ｔｉｍ−１  Ｉｇ処理マウス由来の上清およびＴｉｍ−２  Ｉｇ処理マウス由来の上清の両方において、多量のＩＬ−４およびＩＬ−１０が検出され、そしてＩＦＮγはほとんど検出されないかまたは全く検出されなかった（図３Ｃおよび図４Ｃ）。ｈＩｇＧ処理マウスおよびＰＢＳ処理マウスの両方に由来する細胞は、ＩＬ−２およびＩＦＮγの発現を有するＴｈ１プロファイルを実証した（図３Ｃおよび図４Ｃ）。抗原の非存在下で、検出可能なレベルのサイトカインは上清中に存在しなかった。Ｔｉｍ−１  Ｉｇ処理マウス由来の細胞およびＴｉｍ−２  Ｉｇ処理マウス由来の細胞は、ＩＬ−２分泌ならびに低いレベルのＩＬ−４およびＩＬ−１０を実証したが、これらは、抗原再刺激によって顕著に増加した（図３Ｃおよび図４Ｃ）。対照的に、コントロールマウス由来の細胞は、抗原の非存在下でＩＬ−２がほとんどまたは全くないことおよびＩＦＮγが検出可能でないことを実証した（図３Ｃおよび図４Ｃ）。まとめて考えると、これらの結果は、Ｔｉｍ−１  ＩｇおよびＴｉｍ−２  ＩｇがＴｈ２型Ｔ細胞およびサイトカインの増幅を生じ得ることを示唆する。さらに、これらの２つの融合ポリペプチドの投与は、非常に偏ったＴｈ１動物モデルにおいてＴｈ２応答を生じる。
【０２６３】
Ｔｉｍ−２  Ｉｇマウス、ｈＩｇＧマウスまたはＰＢＳマウスからの脾臓およびリンパ節からの広範な抗原提示細胞集団およびＴ細胞の精製は、どの細胞サブセット（Ｔ、Ｂ、マクロファージまたはＤＣ）も、抗原単独の非存在下での高い基底レベルの増殖の原因ではないことを実証した。さらに、いずれの細胞サブセットも、抗原の非存在下で観察されたサイトカインプロファイルの原因ではなかった。Ｔｉｍ−２  Ｉｇ処理マウス由来の細胞において観察されたバックグラウンド増殖応答は、Ｔｉｍ−２  Ｉｇ処理動物またはコントロール動物のいずれか由来の抗原提示細胞の存在下でＴｉｍ−２  ＩｇＴ細胞を用いて再構成され得る。Ｔｉｍ−２Ｉｇ処理マウス由来のＡＰＣ集団をコントロールマウス由来のＴ細胞とともにインキュベートすることは、高い基底増殖応答を生じなかった。このことは、ＡＰＣが、観察された高い増殖バックグラウンドの原因ではないことを示す。さらに、サイトカイン産生は、Ｔ細胞を抗原提示細胞とともに培養した場合にのみ検出された。このことは、ＴＩＭ−２  Ｉｇ処理マウス由来の細胞において観察された増殖およびＴｈ２サイトカイン産生が、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の相互作用に依存することを示唆する。
【０２６４】
（実施例５．ＥＡＥの発症および重篤度を遅延させるためのＴｉｍ−１融合ポリペプチドまたはＴｉｍ−２融合ポリペプチドの投与）
Ｔｈ１に基づく環境においてＴｉｍ−１  ＩｇおよびＴｉｍ−２  ＩｇがＴｈ２に偏った免疫応答を生じる能力に起因して、出願人らは、Ｔｉｍ−１−Ｔｉｍ−１リガンド相互作用およびＴｉｍ−２−Ｔｉｍ−２リガンド相互作用が、Ｔｈ１に基づく自己免疫疾患の誘導および病因に対して有する影響に興味を抱いた。この問題の解決に取り掛かるために、出願人らは、ＳＪＬ／Ｊマウスを脳炎誘発性（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｅｎｉｃ）ペプチドＰＬＰ  １３９−１５１で免疫して、Ｔｈ１媒介性自己免疫疾患の１つであってヒトの疾患である多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導した。ＳＪＬ／Ｊマウスを、完全フロイントアジュバント中のＰＬＰ  １３９−１５１で免疫して、疾患を誘導した。疾患について免疫したマウスにまた、Ｔｉｍ−１  Ｉｇ、Ｔｉｍ−２  Ｉｇ、ｈＩｇＧ、またはＰＢＳを投与し、そして臨床的徴候について３０日間にわたってモニタリングした。ｈＩｇＧまたはＰＢＳを与えたマウスは、予想された疾患の再発−軽減の経過を示した（図５および図６）。対照的に、Ｔｉｍ−２  Ｉｇ融合ポリペプチドが投与されたマウスは、免疫の２４日後まで、軽度の麻痺を示したかまたは麻痺を全く示さなかった。Ｔｉｍ−２  Ｉｇ処理マウスは、１．５というピーク臨床疾患スコアを示し、このスコアは、コントロールで処理したマウスのスコアよりも有意に低かった（図５）。Ｔｉｍ−１  Ｉｇで処理したマウスは、疾患の発症におけるわずかな遅延を実証し、そしてまた、有意に低い疾患重篤度を示した（図６）。
【０２６５】
まとめて考えると、これらのデータは、Ｔｉｍ−１およびＴｉｍ−２がＴｈ２細胞上に識別的に発現されること、ならびにこれらの融合ポリペプチドのインビボでの投与が、Ｔｈ１に偏った系においてさえもＴｈ２応答を生じることを実証する。さらに、Ｔｈ１媒介性自己免疫疾患の誘導の間にＴｉｍ−１  ＩｇまたはＴｉｍ−２  Ｉｇでマウスを処理することは、発症および臨床症状の重篤度を遅延させ、治療操作に関する可能な標的を提供する。
【０２６６】
（実施例６．Ｔｉｍ−２はＴｈ２細胞上で識別的に発現される）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢａｌｂ／ｃマウス由来の未刺激のＴ細胞を、ＩＬ−１２および抗ＩＬ−４（Ｔｈ１）の存在下またはＩＬ−４および抗ＩＬ−１２（Ｔｈ２）の存在下という条件で抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を用いて極性化させた。ＲＮＡを細胞から抽出し、そしてｃＤＮＡを作成した。特異的Ｔａｑｍａｎプライマーおよびプローブを用いて、Ｔｉｍ−２発現をＧＡＰＤＨに対して決定した。Ｔｉｍ−２発現は、Ｔｈ１細胞と比較して、Ｔｈ２細胞において優先的にアップレギュレートされた（図７）。
【０２６７】
（実施例７．Ｔｉｍ−１リガンドおよびＴｉｍ−２リガンドは、活性化された抗原提示細胞上に発現される）
Ｂ２２０（Ｂ細胞）、ＧＤ１１ｂ（マクロファージおよび樹状細胞）およびＣＤ１１ｃ（樹状細胞）をＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓から精製し、そしてＬＰＳおよびインターフェロンγで活性化した。活性化の２４時間後、細胞を、ｈＩｇＧ（赤線）、ビオチン化Ｔｉｍ−１  Ｉｇ（緑線）、またはビオチン化Ｔｉｍ−２  Ｉｇ（青線）いずれかで染色した。ストレプトアビジン−ＰＥを、二次検出試薬として用いた。全てのサンプルを、フローサイトメトリーによって分析した。Ｔｉｍ−１リガンドおよびＴｉｍ−２リガンド発現の両方とも、活性化抗原提示細胞上でアップレギュレートされた（図８）。
【０２６８】
（実施例８．Ｔｉｍ１／Ｆｃ融合ポリペプチドの投与は、マウス島移植モデルにおける同種移植片寛容を促進する）
Ｔ細胞依存性自己免疫応答、拒絶または寛容の結果は、しばしば、ｉ）細胞障害性Ｔ細胞とｉｉ）免疫調節性Ｔ細胞との間のバランスに依存する。本発明者らの以前の研究は、Ｔｈ１のＴｈ２に対する免疫の偏りの機構が、少なくとも部分的に、Ｔ調節因子機能を増強することにより、同種移植片寛容を促進することを示す。Ｔｉｍ１／ＦｃまたはＴｉｍ２／Ｆｃの投与はＴｈ１のＴｈ２に対する免疫の偏りを誘導し得るので、出願人らは、Ｔｉｍ１／ＦｃおよびＴｉｍ２／Ｆｃ処置が同種移植片寛容を促進すると仮定する。
【０２６９】
出願人らは、主要組織適合性関門および副組織適合性関門を打ち消す島同種移植片モデルを利用した。単独治療としてＴｉｍ１／Ｆｃを用いる短期処理は、未処理群における２８日目での平均移植片生存と比較して、副組織適合性関門を打ち消す３匹のレシピエントの全てにおいて、拒絶を防止するに十分であり、永続的な島同種移植片生存に十分である（図９）。類似の結果が、Ｔｉｍ２／Ｆｃ処理レシピエントにおいて観察される。Ｔｉｍ２／Ｆｃの投与は、３匹のレシピエントにおける島同種移植片拒絶の有意な遅延および１匹のレシピエントにおける永続的な移植をもたらす（図１０）。さらに、最適未満の用量の抗ＣＤ１５４（ＭＲ１）抗体と組み合わせたＴｉｍ２／Ｆｃ処理は、ＭＨＣが完全に不一致の厳しいマウス系統組合せの５匹全てのレシピエントにおいて、永続的な島同種移植片の移植を付与する（図１１）。
【０２７０】
これらのデータは、Ｔｉｍ１／Ｆｃ処理およびＴｉｍ２／Ｆｃ処理がＴｈ１のＴｈ２への免疫の偏りを促進し、Ｔ調節因子機能を増強し、そして同種移植片寛容を促進することを示唆する。
【０２７１】
（実施例９：Ｔヘルパーサブセットではなく、マクロファージおよび成熟樹状細胞におけるＴｉｍ−４の発現）
これまでに特徴付けられたＴｉｍ分子はＴ細胞応答に関与するため（Ｋｕｃｈｒｏｏら（２００３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３，４５４−４６２）、出願人らは、Ｔｉｍ−４もまた免疫器官において発現されるか否かを最初に決定した。多重組織ｃＤＮＡパネルについてのリアルタイム定量ＰＣＲは、Ｔｉｍ−４  ｍＲＮＡがマウスの脾臓およびリンパ節において発現され、肺、肝臓および胸腺における発現は非常に低いことを示した（図１２Ａ）。免疫器官へのこの明らかな制限は、Ｔｉｍ−４が免疫学的に関連のある分子であることを示唆した。
【０２７２】
出願人らは次に、Ｔｉｍ−４もまた、ＴＨ１サブセットにおいてＴＨ２サブセットと比較して識別的に発現され得るか否かを分析した。出願人らは定量的ＰＣＲを用いて、ＴＨ１（ＡＥ７）クローンおよびＴＨ２（Ｄ１０．Ｇ４）クローン、ならびにＴＨ１系列またはＴＨ２系列へとインビトロで極性化させたＤＯ１１．１０トランスジェニックＴ細胞におけるＴｉｍ−４  ｍＲＮＡ発現を検出した。これらの細胞を、各回の極性化後に分析して、Ｔｉｍ−４発現の反応速度を決定した。３回目のインビトロ極性化によってこれらのＴＨ１細胞はＴｉｍ−３を特異的に発現し、そしてＴＨ２細胞はＴｉｍ−２を特異的に発現する（Ｍｏｎｎｅｙら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１５，５３６−５４１）が、Ｔｉｍ−４  ｍＲＮＡは、４回の極性化を通して、ＴＨ１細胞またはＴＨ２細胞のいずれでも検出されなかった（図１２Ｂ）。従って、Ｔｉｍ−４は、免疫系内で、これまで特徴付けられた他のＴｉｍ分子の発現パターンとは異なる発現パターンを有するようであった。Ｔｉｍ−４  ｍＲＮＡが脾臓において高度に発現されたので、出願人らは次に、脾臓内のどの細胞型がＴｉｍ−４  ｍＲＮＡを発現するかをアッセイした。ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、およびＢ２２０＋細胞（それぞれ、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞を主に表す）を、ＳＪＬ／ＪマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から、ポジティブ選択によって単離した。これらの細胞について行った定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＣＤ１１ｂ＋細胞およびＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＴｉｍ−４  ｍＲＮＡの高発現、ならびにＢ２２０＋サブセットにおける、より低い程度の発現を明らかにした（図１２Ｃ）。しかし、出願人らは、Ｔ細胞においてＴｉｍ−４  ｍＲＮＡを検出しなかった。それゆえ、Ｔｉｍ−４は、脾性抗原提示細胞（ＡＰＣ）において発現されるがＴ細胞においては発現されないようである。
【０２７３】
抗原提示細胞は、極めて不均質な細胞群を表すので、出願人らは、どの型のＡＰＣがＴｉｍ−４  ｍＲＮＡを主に発現し得るのかを同定しようとした。出願人らは、本発明者らの注意を、樹状細胞サブセットに向けた。なぜなら、これらの専門の抗原提示細胞の異なる集団は、異なる型のＴヘルパー細胞応答を優先的に誘導することが報告されているからである（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈら（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５，６２０−６２６；Ｒｉｓｓｏａｎら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３，１１８３−１１８６）。樹状細胞を、リポ多糖（ＬＰＳ）を添加したかまたは添加していない、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）とともにインキュベートした骨髄細胞からインビトロで作製した。ＧＭ−ＣＳＦ誘導性ＤＣは、主に骨髄系列のものであり、一方、Ｆｌｔ３Ｌ処理は、骨髄様ＤＣ型およびリンパ様ＤＣ型の混合物を生じる（Ｂｒａｓｅｌら（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９６，３０２９−３０３９；Ｇｉｌｌｉｅｔら（２００２）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９５，９５３−９５８；Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙら（１９９６）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４，１９５３−１９６２）。ＬＰＳ処理はＤＣを成熟させ、そしてＦｌｔ３Ｌ処理培養物におけるリンパ様ＤＣの優先的増殖を引き起こす（Ｂｒａｓｅｌら（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９６，３０２９−３０３９）。Ｔｉｍ−４  ｍＲＮＡは、Ｆｌｔ３Ｌによって生成され、そしてＬＰＳを用いて成熟させた細胞において最も高度に発現された（図１２Ｄ）。これらのＴｉｍ−４ポジティブ細胞は、リンパ系列のものであり、形質細胞系のものではなかった。なぜなら、これらの集団は、Ｂ２２０＋細胞が枯渇していたからである。発現は、未成熟骨髄型ＤＣにおいても成熟骨髄型ＤＣにおいても見られなかった。成熟リンパ様樹状細胞におけるＴｉｍ−４  ｍＲＮＡ発現のこの観察をさらにひろげるために、マウスをＦｌｔ３Ｌ産生細胞で処理し、そして処理したマウス由来の脾細胞を選別して種々の集団にした。上記の観察と一貫して、最大のＴｉｍ−４発現が、大部分の成熟樹状細胞において観察された。これらの成熟樹状細胞はＣＤ１１ｃおよびＣＤ８の両方を発現する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｄｅｌ  Ｈｏｙｏら（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９，９９９−１００４）（図１２Ｅ）。まとめて考えると、これらのデータは、Ｔｉｍファミリーの他のメンバーとは異なり、Ｔｉｍ−４は、Ｔ細胞において発現されないが、その代わり、ＡＰＣ（特に、成熟ＣＤ）に存在することを示す。
【０２７４】
Ｔｉｍ−４がポリペプチドとして発現され得るか否かを決定するために、出願人らは、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ２９３細胞を、Ｎ末端ＨＡタグを有するＴｉｍ−４をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトし、そして抗ＨＡ抗体染色により、両方の細胞型の表面でのその発現を観察することができた（図１４、図１５）。さらに、出願人らは、約６０ｋＤａのバンドが、抗ＨＡを用いて、これらの細胞から免疫ブロットされ得ることを実証することができた。これらのデータは、Ｔｉｍ−４がｍＲＮＡレベルで存在するだけでなく、機能的ポリペプチドへと翻訳され得ることを示唆する。
【０２７５】
（実施例１１：活性化されたＴ細胞およびＢ細胞におけるＴｉｍ−４リガンドの発現）
潜在的Ｔｉｍ−４リガンド（Ｔｉｍ−４Ｌ）の発現パターンを同定および分析するために、出願人らは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃテールに融合したＴｉｍ−４の細胞外ＩｇＶドメインおよびムチンドメインからなる可溶性Ｉｇ融合ポリペプチド（Ｔｉｍ−４−Ｉｇ）を作製した。この融合ポリペプチドを、フローサイトメトリーにおいて用いて、ＳＪＬ／Ｊマウスの脾細胞におけるＴｉｍ−４Ｌの発現を検出した。未刺激の脾細胞において、Ｔｉｍ−４Ｌは、Ｂ（Ｂ２２０＋）細胞集団において見ることができたが、Ｔ（ＣＤ３＋）細胞においては見ることができなかった；しかし、ＬＰＳおよびインターフェロン（ＩＦＮ）−γ処理によって活性化すると、Ｔｉｍ−４Ｌは、大部分のＢ細胞および大多数のＣｏｎＡ活性化Ｔ細胞において見られた（図１３）。それゆえ、Ｔｉｍ−４は抗原提示細胞上に発現されるのに対し、Ｔｉｍ−４Ｌは活性化されたＢ細胞およびＴ細胞上に発現されるようであった。この発現パターン、ならびにＴｉｍファミリーメンバー間での構造的類似性により、本発明者らは、Ｔｉｍ−４が、活性化されたＴ細胞上に発現される以前に同定されたＴｉｍ分子のうちの１つと相互作用し得るか否かを調べた。Ｔｉｍ−３は、全ての活性化Ｔ細胞上に発現されるわけではなく、むしろ、最終的に分化したＴＨ１細胞においてのみアップレギュレートされ、そしてＢ細胞上には発現されない。それゆえ、Ｔｉｍ−３は、Ｔｉｍ−４についてのリガンドとして作用しないようであったが、Ｔｉｍ−１およびＴｉｍ−２は、Ｔｉｍ−４との相互作用についての潜在的候補のままであった。
【０２７６】
（実施例１２：Ｔｉｍ−４についての内因性リガンドとしてのＴｉｍ−１の同定）
Ｔｉｍ−４が別のＴｉｍ分子と相互作用し得るか否かを決定するために、出願人らは、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−３またはＴｉｍ−４を細胞表面上に発現するＣＨＯ細胞トランスフェクタントを利用し、そして種々のＴｉｍ融合ポリペプチド（Ｔｉｍ−１−Ｉｇ、Ｔｉｍ−２−Ｉｇ、Ｔｉｍ−４−Ｉｇ）を細胞表面染色のために用いた。Ｔｉｍ−４−Ｉｇは、Ｔｉｍ−１トランスフェクタントを結合したが、Ｔｉｍ−３トランスフェクタントにもＴｉｍ−４トランスフェクタントにも結合しなかった（図１４Ａ）。逆に、Ｔｉｍ−１−Ｉｇは、Ｔｉｍ−４トランスフェクタントに結合したが、Ｔｉｍ−１トランスフェクタントにもＴｉｍ−３トランスフェクタントにも結合しなかった（図１４Ａ）。Ｔｉｍ−１−Ｉｇ融合ポリペプチドを用いたＴｉｍ−４トランスフェクタントの染色は、全長Ｔｉｍ−１−Ｉｇ（Ｔｉｍ−１  ＩｇＶドメインおよびムチンドメインを含む）を利用するかまたはＴｉｍ−１−Ｉｇ（ＩｇＶドメインのみを含む）を利用するか否かにかかわらず観察された（図１４Ａ）。対照的に、Ｔｉｍ−２−Ｉｇ融合ポリペプチド（これもまた、細胞外ＩｇＶドメインおよびムチンドメインからなる）は、アッセイしたいずれのトランスフェクタントも染色せず、そしていずれの融合ポリペプチドも、ＣＨＯ−Ｔｉｍ−２トランスフェクタントに結合しなかった。このデータは、Ｔｉｍ−４がＴｉｍ−１と相互作用し、Ｔｉｍ−１と相同性を共有するＴｉｍ−２とは相互作用しないことを示す（ＭｃＩｎｔｉｒｅら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２５，５７６）。
【０２７７】
この相互作用の特異性を評価するために、出願人らは、抗Ｔｉｍ−１モノクローナル抗体がＴｉｍ−１−Ｔｉｍ−４結合をブロックし得るか否かを試験した。この抗体は、Ｔｉｍ−１分子のＩｇＶ領域に対して作製された。それゆえ、この抗体は、Ｔｉｍ−１ムチンドメインとは相互作用しないはずである。まず、全長Ｔｉｍ−１を発現するＴｉｍ−１トランスフェクタントを、抗Ｔｉｍ−１とともにインキュベートし、次いでＴｉｍ−４−Ｉｇで染色した。この抗Ｔｉｍ−１とともに予めインキュベートすることにより、Ｔｉｍ−１トランスフェクタントに対するＴｉｍ−４−Ｉｇ結合が減少したが、この結合を完全には除去しなかった。対照的に、抗Ｔｉｍ−３とともにインキュベートすること（Ｍｏｎｎｅｙら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１５，５３６−５４１）（コントロールとして）は、Ｔｉｍ−４−Ｉｇ結合に対してほとんど影響を有さなかった（図１４Ｂ）。このブロッキングの不完全な性質は、Ｔｉｍ−１トランスフェクタントが全長Ｔｉｍ−１分子を発現するのに対し、この抗体はＩｇＶドメインのみに結合し、従って、Ｔｉｍ−４とＴｉｍ−１との間の相互作用の一部は、Ｔｉｍ−１ムチンドメインを含み得ることを示すという事実に起因するようであった。相互実験では、Ｔｉｍ−１−Ｉｇ融合ポリペプチド（Ｔｉｍ−１  ＩｇＶドメインのみを含む）を、抗Ｔｉｍ−１とともに予めインキュベートし、次いでＴｉｍ−４トランスフェクタントを染色するために用いた。抗Ｔｉｍ−１とともにＴｉｍ−１−Ｉｇをインキュベートすることにより、Ｔｉｍ−４トランスフェクタントへの融合ポリペプチドの結合が完全に除去され、一方、抗Ｔｉｍ−３とともにインキュベートすることにより、その結合は変化しなかった（図１４Ｂ）。まとめて考えると、これらの実験は、トランスフェクタントについて見られた染色がＴｉｍ−４とＴｉｍ−１との間の特異的相互作用を表し、この相互作用が、抗Ｔｉｍ−１抗体とともに事前にインキュベートすることによりブロックされ得ることを示した。
【０２７８】
（実施例１３：Ｔｉｍ−４がＴｉｍ−１保有Ｔ細胞に特異的に結合することの実証）
トランスフェクトした細胞に対するＴｉｍ−４とＴｉｍ−１との間のインビトロでの相互作用を観察した後に、出願人は、このような相互作用が、Ｔ細胞上に天然で発現されたＴｉｍ−１を用いて、生じ得るか否かを決定しようとした。出願人は、Ｔｉｍ−４−Ｉｇが活性化Ｔ細胞を染色したことを以前に観察した（図１３）ので、未刺激のＳＪＬ／Ｊマウス由来のＣＤ３＋Ｔ細胞を活性化し、次いでＴｉｍ−１の発現およびそのＴｉｍ−４−Ｉｇ結合能力について評価した。Ｔｉｍ−１は、未活性化Ｔ細胞において最少に発現され、そして活性化されるとＴ細胞においてアップレギュレートされた（図１５Ａ）。このＴｉｍ−１の発現パターンは、他者によって観察された発現パターンと一貫していた。これらのＴ細胞へのＴｉｍ−４−Ｉｇの結合は、Ｔｉｍ−４−Ｉｇが活性化されたＴ細胞を染色するが、非活性化Ｔ細胞を染色しないという点で、Ｔｉｍ−１発現と直接的に相関していた。活性化されたＴ細胞へのＴｉｍ−４−Ｉｇのこの結合は、抗Ｔｉｍ−１により部分的にブロックされたが、抗Ｔｉｍ−３によってはブロックされなかった（図１５Ｂ）。Ｔｉｍ−１トランスフェクタントを用いた場合に見られるように、活性化されたＴ細胞へのＴｉｍ−４−Ｉｇ結合をブロックすることは、完全ではなかった。このことは、ＩｇＶに加えて、Ｔｉｍ−１ムチンドメインもまた、Ｔｉｍ−１−Ｔｉｍ−４相互作用に関与し、それゆえ、ＩｇＶドメインのみに結合する抗体は、活性化されたＴ細胞上のＴｉｍ−１へのＴｉｍ−４−Ｉｇの結合を完全に防止できなかったという考えをさらに支持する。
【０２７９】
活性化されたＴ細胞上でのＴｉｍ−４とＴｉｍ−１との間の明らかな相互作用を考慮して、出願人らは、この相互作用が、活性化されたＴＨ１細胞または活性化されたＴＨ２細胞上で優先的に生じるか否かを決定しようとした。このために、出願人らは、インビトロで極性化させた、活性化ＤＯ１１．１０  ＴＣＲトランスジェニックのＴＨ１細胞およびＴＨ２細胞上でのＴｉｍ−４−Ｉｇの結合を試験し、そしてこれらの細胞をＴｉｍ−１発現について並行して調べた。Ｔｉｍ−１は活性化されたＴＨ１細胞および活性化されたＴＨ２細胞の両方において発現されたが、これは、活性化されたＴＨ１細胞と比較して、活性化されたＴＨ２上で、より高度に発現された（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）。Ｔｉｍ−１発現と一貫して、Ｔｉｍ−４−Ｉｇは、ＴＨ１細胞よりも高い比率のＴＨ２細胞を染色した。ＴＨ１サブセットおよびＴＨ２サブセットへのこれらの細胞の好首尾の極性化は、細胞内染色によって確認された。この細胞内染色は、極性化したＴＨ１細胞が、多量のＩＦＮ−γを生じ、インターロイキン（ＩＬ）−４またはＩＬ−１０はごくわずかであること；対照的にＴＨ２細胞は、多量のＩＬ−４およびＩＬ−１０を生じるが、ＩＦＮ−γはほとんど生じないことを実証した（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）。これらのデータは、Ｔｉｍ−４−Ｉｇが活性化されたＴ細胞を結合し得ること、および極性化されると、ＴＨ１細胞上でよりも多くの結合がＴＨ２細胞上に存在することを実証した。
【０２８０】
（実施例１４：樹状細胞およびマクロファージ上でのＴｉｍ−１Ｌの発現）
Ｔｉｍ−４はマクロファージおよびＤＣにおいて発現されるがＴ細胞においては発現されないので、出願人らは、可溶性Ｔｉｍ−１−Ｉｇが通常のインビボ由来のマクロファージおよびＤＣに結合するか否かを分析した。実際に、インビボ由来のマクロファージおよびＤＣ（精製されたＣＤ１１ｂ＋脾臓性サブセットおよびＣＤ１１ｃ＋脾臓性サブセット）は、ＬＰＳおよびＩＦＮ−γを用いた活性化後にＴｉｍ−１−Ｉｇに特異的に結合した。対照的に、調べた精製されたＴ細胞集団（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）は、活性化されていようと活性化されていまいと、Ｔｉｍ−１−Ｉｇに結合しなかった。観察された染色が特異的であることを確実にするために、出願人は、抗Ｔｉｍ−３をコントロールとして用い、抗Ｔｉｍ−１を用いてブロッキング研究を行った。抗Ｔｉｍ−１を用いてＴｉｍ−１−Ｉｇを予めインキュベートすることは、活性化されたＣＤ１１ｂ＋細胞および活性化されたＣＤ１１ｃ＋細胞上で観察される染色を阻害した（図１６）。染色の阻害は、抗Ｔｉｍ−３との事前インキュベーションによって観察されず、このことは、観察された染色がＴｉｍ−１とそのリガンドを発現するマクロファージおよびＤＣとの間での特異的相互作用に起因することを確認した。これらの研究は、Ｔｉｍ−１およびＴｉｍ−４が、結合をインビトロ由来のＣＨＯトランスフェクタント上で調べた場合に相互作用するだけでなく、Ｔｉｍ−４−Ｉｇが、（ＴＨ１細胞へのより弱い結合が観察されたが）活性化されたＴＨ２細胞上に強固に結合し、一方、Ｔｉｍ−１−Ｉｇがインビボ由来の活性化されたマクロファージおよび活性化されたＤＣに結合することを実証した。
【０２８１】
（実施例１５：インビボでのＴｉｍ−１−Ｉｇ投与は、Ｔｈ２応答を増強する）
Ｔｉｍ−１は、全ての活性化されたＴ細胞上で発現されるので、出願人らは、Ｔｉｍ−１−Ｔｉｍ４相互作用が全てのＴ細胞の増幅およびエフェクター機能を調節するのに役立ち得ると仮定した。しかし、この効果は、ＴＨ２細胞上でより大きいかもしれない。なぜなら、Ｔｉｍ−１は、ＴＨ２細胞上では、ＴＨ１細胞上よりも高度に発現されるからである。Ｔｉｍ−１は多くの組織で発現され、そしてその細胞内テールは、推定チロシンリン酸化モチーフを含み、一方、Ｔｉｍ−４  ｍＲＮＡ発現は脾臓およびリンパ節に主に制限され、そしてそのテールは推定シグナル伝達モチーフを欠く。それゆえ、出願人らは、マウスを可溶性Ｔｉｍ−１−Ｉｇで処理することを選択した。可溶性Ｔｉｍ−１−Ｉｇは、ＡＰＣの表面上のＴｉｍ−４に特異的に結合して、Ｔｉｍ−４を共にクラスター形成させ（ｃｏ−ｃｌｕｓｔｅｒ）そしてＴｉｍ−１を介してＴ細胞へと送達されるシグナルを増強するか、またはＴｉｍ−１とＴｉｍ−４との間の相互作用をブロックするかのいずれかであると予測される。インビボでの免疫応答の間にＴｉｍ−１−Ｉｇを投与することの機能的影響を調査するために、出願人らは、プロテオリピドポリペプチド（ＰＬＰ）１３９−１５１ペプチド（これは、強力なＴＨ１応答を誘導する）で免疫したＳＪＬ／ＪマウスにおけるＴ細胞応答へのＴｉｍ−１−Ｉｇ処理の効果を試験した。
【０２８２】
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化したＰＬＰ  １３９−１５１ペプチドで免疫したＳＪＬ／Ｊマウスに、Ｔｉｍ−１−Ｉｇまたはコントロール試薬（ＰＢＳまたはヒトＩｇＧ１）を投与した。免疫および処理したマウス由来の脾臓細胞を、増殖およびサイトカイン応答についてインビトロで試験した。免疫し、そしてコントロールのヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ）またはＰＢＳで処理したマウス由来の脾臓細胞は、抗原の非存在下ではバックグラウンド増殖がほとんどないことを実証した。対照的に、Ｔｉｍ−１−Ｉｇ処理マウス由来の細胞は、インビトロでの抗原再刺激の非存在下でさえも、顕著な基底増殖を示した（図６ａ）。ＰＬＰ抗原を用いた再刺激によって、両方のコントロール群由来の細胞は、ＰＬＰ  １３９−１５１への特異的用量依存性増殖を実証した。しかし、Ｔｉｍ−１−Ｉｇ処理マウス由来の脾臓細胞は、抗原の添加によって、バックグラウンドに対する中程度の増殖増加のみを示した（図１７Ａ）。同様に、高いバックグラウンド増殖が、何のペプチドもないＣＦＡ単独で免疫し、Ｔｉｍ−１−Ｉｇで処理したマウスから観察された。このことは、この増殖応答が、特定の抗原のみに制限されなかったことを示す。これらのデータは、Ｔｉｍ−１−Ｉｇでの処理が、インビボでの細胞の過剰活性化をもたらし、その結果、この細胞が、抗原刺激なしでインビトロにて増殖し続けることを示唆する。
【０２８３】
これらの実験からの上清を、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０の産生について分析した。Ｔｉｍ−１−Ｉｇ処理マウス由来の脾臓細胞は、抗原刺激の非存在下で多量のＩＬ−２を分泌した。このことは、観察された高い基底増殖と一貫していた。多量のＩＬ−１０およびＩＦＮ−γもまた、再活性化なしで産生された。一方、免疫したコントロール（ｈＩｇＧおよびＰＢＳ）処理マウス由来の脾臓細胞は、インビトロでの抗原刺激の非存在下での、ずっと低いバックグラウンドサイトカイン産生を実証した。ごく少量のＩＬ−４が、再活性化なしでＴｉｍ−１−Ｉｇ処理細胞から産生されたが、コントロール処理細胞から検出可能なものはなかった。これは、ＰＬＰペプチドでのＳＪＬ／Ｊマウスの免疫が強力なＴＨ１応答を誘導し、ＴＨ２応答を阻害するという事実に起因し得る。ＰＬＰ  １３９−１５１を用いてインビトロで再刺激すると、コントロール処理マウス由来の細胞は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの産生を伴う、予想されたＴＨ１プロファイルを実証した（図１７Ｂ）。Ｔｉｍ−１−Ｉｇ処理マウス由来の脾臓細胞は、これらの細胞から観察された連続した非用量依存性増幅とさらに一貫して、再刺激によりＩＬ−２を産生し続けた（図１７Ｃ）。コントロール処理マウス由来の細胞とは対照的に、Ｔｉｍ−１−Ｉｇ処理マウス由来の脾臓細胞は、抗原再刺激をされると、多量のＩＬ−４およびＩＬ−１０を産生した。このことは、Ｔｉｍ−１−Ｉｇ処理が、再刺激をされるとＴＨ２細胞を優先的に増幅することを示す。脳炎誘発性ＰＬＰペプチドでのＳＪＬ／Ｊマウスの免疫は、（ＰＢＳ処理コントロールマウスおよびｈＩｇＧ処理コントロールマウスにおいて見られるように）ＴＨ１細胞およびサイトカインの誘導をもたらしたのに対し、Ｔｉｍ−１−Ｉｇでの処理は、抗原特異的ＩＦＮ−γ産生を阻害した（図１７Ｂ）。ＣＦＡ中のＰＬＰ  １３９−１５１で免疫したＳＪＬ／Ｊマウスは、顕著なＴＨ１応答を発達させ、そしてこの設定で投与されたＴｉｍ−１−Ｉｇは、ＩＦＮ−γ産生の阻害とともに、ＴＨ２サイトカイン（ＩＬ−４およびＩＬ−１０）の産生をもたらした。
【０２８４】
これがまたＴＨ２に偏った免疫応答についても当てはまるかを決定するために、出願人らは、Ｂａｌｂ／ｃマウスをミョウバン中のＯＶＡ  ３２３−３３９ペプチドで免疫し、そして上記のとおりにＴｉｍ−１−Ｉｇを投与した。ＴＨ２に偏ったこれらの条件下では、Ｔｉｍ−１−Ｉｇはまた、ＩＬ−２サイトカイン、ＩＬ−４サイトカインおよびＩＬ−１０サイトカインの産生の増加を伴って、しかし、ＩＦＮ−γの増加は伴わずに、基底増殖を増強した（図１９）。まとめて考えると、これらの結果は、Ｔｉｍ−１−ＩｇがＴｉｍ−１−Ｔｉｍ−４相互作用にインビボで影響を与え、Ｔ細胞の過剰活性化をもたらし、その結果、これらがエキソビボで増殖し続け、ＴＨ１サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）およびＴＨ２サイトカイン（ＩＬ−４およびＩＬ−１０）の両方を産生し続けたことを示唆する。抗原再刺激のないＴｉｍ−１−Ｉｇ処理マウス由来の脾臓細胞は有意な量のＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０を産生し続けたが、インビトロでの抗原を用いたこれらの細胞の再活性化は、ＴＨ１に偏った免疫プロトコルにおいてさえ、ＴＨ１応答の阻害およびＴＨ２細胞の増幅をもたらした。これが、ＴＨ２細胞の、活性化によって誘導された細胞死または増幅に起因したＴＨ１細胞の優先的な欠失に起因するものであるか否かが決定されるべきままである。このデータから、Ｔｉｍ−１がインビボでネガティブシグナルまたはポジティブシグナルを送達するか否か、すなわち、Ｔｉｍ−１−ＩｇがＴｉｍ−１とＴｉｍ−４との間のネガティブ相互作用をブロックするかまたはポジティブ相互作用を促進するかは不明確であった。それゆえ、出願人らは、Ｔｉｍ−４−Ｉｇ（これは、Ｔｉｍ−１に結合する）を用いて、Ｔｉｍ−１に直接結合する試薬がインビボおよびインビトロにおいてどのような効果を有し得るかを決定した。
【０２８５】
（実施例１６：Ｔｉｍ−４−Ｉｇは、Ｔ細胞増幅を補助刺激する）
Ｔｉｍ−４−ＩｇがＴ細胞増殖およびサイトカイン産生を刺激し得るかまたは阻害し得るかを決定するために、出願人らは、ＣＦＡ中のＰＬＰ  １３９−１５１で免疫したＳＪＬ／ＪマウスをＴｉｍ−４−Ｉｇ、ｈＩｇＧ、またはＰＢＳで上記のとおり処理した。処理したマウス由来の脾臓細胞を、増殖応答およびサイトカイン応答についてインビトロで再度試験した。Ｔｉｍ−１−Ｉｇ処理脾細胞と同様に、Ｔｉｍ−４−Ｉｇ処理脾細胞は、抗原再刺激の非存在下で高い基底増殖を示した（図１８Ａ）。さらに、Ｔｉｍ−４−Ｉｇ処理脾細胞は、再刺激なしでは、多量のＩＬ−２およびＩＦＮ−γを生じたが、低濃度のＩＬ−４およびＩＬ−１０を生じた。Ｔｉｍ−４はＴｉｍ−１を結合し、Ｔｉｍ−１はＴ細胞上に発現されるので、出願人らは、高いバックグラウンド増殖が高増殖性Ｔ細胞に起因するのか、または他の細胞型に起因するのかを疑問に思った。この高いバックグラウンド応答を担う細胞の正体を決定するために、出願人らは、Ｔｉｍ−４−Ｉｇ処理脾細胞およびｈＩｇＧ処理脾細胞を分離してＣＤ１１ｂ＋集団、Ｂ２２０＋集団、およびＣＤ３＋集団にし、次いでこれらを単独で培養したかまたはこれらをインビトロで組換え、そして抗原再刺激なしでのそれらの増殖能力を測定した。Ｔｉｍ−４−Ｉｇ処理Ｔ細胞はＡＰＣの非存在下で増殖したが、ｈＩｇＧ処理Ｔ細胞はＡＰＣの非存在下で増殖せず、そしていずれのＡＰＣ集団も単独では増殖しなかった（図１８Ｂ）。しかし、Ｔｉｍ−４−Ｉｇ処理Ｔ細胞をこれらのＡＰＣ集団のいずれかと合わせた場合、さらにより多くの増殖が検出された。Ｔ細胞増殖におけるこの増加は、ＡＰＣ源に依存しなかった。なぜなら、Ｔｉｍ−４−Ｉｇ処理マウスまたはｈＩｇＧ処理マウスのどちらかからのＡＰＣは、匹敵する量のＴ細胞増殖を誘導し得たからである。類似の増殖応答は、ｈＩｇＧ処理Ｔ細胞を含むいずれの培養物からも観察されなかった。このデータは、Ｔｉｍ−４−Ｉｇ処理脾細胞による過剰増殖が、Ｔ細胞に対するＴｉｍ−４−Ｉｇの影響に完全に起因することを示した。
【０２８６】
Ｔ細胞がＴｉｍ−４−Ｉｇによって最も影響を受ける集団であることを決定した後、出願人らは、Ｔｉｍ−４−ＩｇがＴ細胞をインビトロで直接的に補助刺激し得るか否かを評価した。精製されたＳＪＬ／ＪＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｔｉｍ−４−Ｉｇ（またはコントロールとしてｈＩｇＧもしくはｈＣＴＬＡ４−Ｉｇ）と一緒に抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いて刺激した。Ｔｉｍ−４−ＩｇはＴ細胞上のＴｉｍ−１に結合し、この系にはＡＰＣは存在しないので、ブロックすべき天然のＴｉｍ−４−Ｔｉｍ−１相互作用は存在しなかった；それゆえ、観察される任意の影響は、Ｔｉｍ−１シグナル伝達を通してＴ細胞へと媒介されると予測される。興味深いことに、出願人らは、用いたＴｉｍ−４−Ｉｇの濃度に依存して定性的に異なる結果を観察した。Ｔ細胞が、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８を用いて最適未満で刺激された場合（図１８Ｃ、左のパネル）、出願人らは、Ｔｉｍ−４−Ｉｇが添加された際の、増殖における大きな増加を観察した。出願人らはまた、低濃度のＴｉｍ−４−Ｉｇでのわずかな増殖阻害を観察した（ｐ＝０．０３）。コントロールｈＩｇＧまたはｈＣＴＬＡ４−Ｉｇの添加は、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８媒介性増殖に対する影響がほとんどないことを示した。また、Ｔｉｍ−４−Ｉｇは抗ＣＤ３単独と組み合わせた場合、増殖を変更しなかった。このことは、Ｔ細胞増幅を刺激するためにＣＤ３およびＣＤ２８の両方のシグナル伝達を必要としたことを示す。Ｔｉｍ−４−Ｉｇが低濃度でＴ細胞増殖を本当に阻害したか否かを決定するために、精製したＣＤ３＋Ｔ細胞を、より高濃度の抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で刺激し（図１８Ｃ、右パネル）、そして再度アッセイして、どのようにしてＴｉｍ−４−ＩｇがＴ細胞増幅に影響を与えるかを決定した。抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８は単独で、これらのＴ細胞からの多量の増殖を誘導し、そしてより低い濃度のＴｉｍ−４−Ｉｇの添加は、この増殖を強く阻害した（ｐ＝０．００７）。より高い濃度のＴｉｍ−４−Ｉｇでは、増殖は、正常に戻ったかまたは抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８単独を用いて観察されたよりも増強された（図１８Ｃ）。全体として、Ｔｉｍ−４−Ｉｇが、（おそらく、Ｔ細胞上のそのリガンドを架橋し、そして活性化シグナルを送達することによって）Ｔ細胞増殖を補助刺激し得ることが明らかである。
【０２８７】
【表１−１】
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【０２８８】
【表１−２】
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【０２８９】
【表１−３】
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【０２９０】
【表１−４】
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【０２９１】
【表１−５】
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【０２９２】
【表１−６】
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【０２９３】
【表１−７】
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【図面の簡単な説明】
【０２９４】
【図１Ａ】図１は、Ｔｈ２細胞において、Ｔｉｍ−２  ｍＲＮＡが優先的に発現されることを示す。（Ａ）Ｔｈ１（ＡＥ７）クローンおよびＴｈ２（Ｄ１０Ｇ４）クローンから生成されたｃＤＮＡを、Ｔｉｍ−２プライマーおよびＴｉｍ−３プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲに供した。産物を、１．２％アガロースゲルで分離した。
【図１Ｂ】図１は、Ｔｈ２細胞において、Ｔｉｍ−２  ｍＲＮＡが優先的に発現されることを示す。（Ｂ）Ｄ００１．１０  ＴＣＲトランスジェニックＣＤ４  Ｔ細胞を、Ｔｈ１またはＴｈ２極性化条件の存在下で、ＯＶＡ  ３２３−３３９を用いて刺激した。各々の刺激の一巡の最後にＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを生成した。ｃＤＮＡを、特異的なＴｉｍ−２プライマーを使用するサイクルサンプルＰＣＲに供した。産物を、１．５％アガロースゲルで分離した。
【図２Ａ】図２は、Ｔｉｍ−２リガンドが、活性化されたＡＰＣで発現されることを示す。樹状細胞株Ｄ２ＳＣ／１、およびマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４を、２０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳおよび５ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγの存在下または非存在下でインキュベートした。活性化の４８時間後に、細胞を収集し、ビオチン化Ｔｉｍ−２Ｉｇ、ビオチン化Ｔｉｍ−１Ｉｇ、ビオチン化Ｔｉｍ−３Ｉｇ、またはビオチン化ｈＩｇＧのいずれか、および二次検出試薬としてストレプトアビジン−ＰＥを用いて染色した。細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。
【図２Ｂ】図２は、Ｔｉｍ−２リガンドが、活性化されたＡＰＣで発現されることを示す。樹状細胞株Ｄ２ＳＣ／１、およびマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４を、２０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳおよび５ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγの存在下または非存在下でインキュベートした。活性化の４８時間後に、細胞を収集し、ビオチン化Ｔｉｍ−２Ｉｇ、ビオチン化Ｔｉｍ−１Ｉｇ、ビオチン化Ｔｉｍ−３Ｉｇ、またはビオチン化ｈＩｇＧのいずれか、および二次検出試薬としてストレプトアビジン−ＰＥを用いて染色した。細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。
【図３】Ｔｉｍ−２Ｉｇの投与は、過剰増殖を誘導し、Ｔｈ２サイトカインを誘導する。ＳＪＬマウスを、ＰＬＰ  １３９−１５１で免疫して、Ｔｉｍ−２Ｉｇ、またはコントロールとしてｈＩｇＧもしくはＰＢＳのいずれかで処理した。免疫の１０日後に器官を収集して、増殖およびサイトカイン産生について評価した。Ｔｉｍ−２Ｉｇ（白抜き三角形）；ＰＢＳ（黒丸）；ｈＩｇＧ（黒正方形）。（Ａ）全脾臓細胞を、抗原の非存在下で４８時間インキュベートした。増殖を、Ｈ３−チミジンの結合によって評価した。（Ｂ）全脾臓細胞を、濃度が漸増するＰＬＰ  １３９−１５１ペプチドと共に、４８時間培養した。増殖を、Ｈ３−チミジンの結合によって測定した。（Ｃ）上清を、３（Ａ）および（Ｂ）において記載される培養物から収集し、そして、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０の発現を、ＥＬＩＳＡによって評価した。
【図４】図４は、Ｔｉｍ−１Ｉｇの投与は、過剰増殖を誘導し、Ｔｈ２サイトカインを誘導することを示す。ＳＪＬマウスを、ＰＬＰ  １３９−１５１で免疫して、Ｔｉｍ−１Ｉｇ、またはコントロールとしてｈＩｇＧもしくはＰＢＳのいずれかで処理した。免疫の１０日後に器官を収集して、増殖およびサイトカイン産生について評価した。Ｔｉｍ−１Ｉｇ（白丸）；ＰＢＳ（黒三角形）；ｈＩｇＧ（黒正方形）。（Ａ）全脾臓細胞を、抗原の非存在下で４８時間培養した。増殖を、Ｈ３−チミジンの結合によって評価した。（Ｂ）全脾臓細胞を、濃度が漸増するＰＬＰ  １３９−１５１ペプチドと共に、４８時間培養した。増殖を、Ｈ３−チミジンの結合によって評価した。（Ｃ）上清を、４（Ａ）および（Ｂ）において記載される培養物から収集し、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０の発現を、ＥＬＩＳＡによって評価した。
【図５】図５は、ＥＡＥの誘導の間のＴｉｍ−２Ｉｇの投与が、疾患の発症および重篤化を遅延させることを示す。ＳＪＬ／Ｊマウスを、ＣＦＡ中の７５ｕｇのＰＬＰ  １３９−１５１ペプチドで免疫して、そして百日咳毒素を静脈内注射した。マウスを、Ｔｉｍ−２Ｉｇ、またはコントロールとしてＰＢＳもしくはｈＩｇＧのいずれかで、第０日目から第８日目まで隔日で処置した。マウスを、ＥＡＥの臨床的徴候についてモニタリングした。
【図６】図６は、ＥＡＥの誘導の間のＴｉｍ−１Ｉｇの投与が、疾患の発症および重篤化を遅延させることを示す。ＳＪＬ／Ｊマウスを、ＣＦＡ中の７５ｕｇのＰＬＰ  １３９−１５１ペプチドで免疫して、そして百日咳毒素を静脈内注射した。マウスを、Ｔｉｍ−１Ｉｇ、またはコントロールとしてＰＢＳもしくはｈＩｇＧのいずれかで、第０日目から第８日目まで隔日で処置した。マウスを、ＥＡＥの臨床的徴候についてモニタリングした。
【図７】図７は、Ｔｉｍ−１リガンドおよびＴｉｍ−２リガンドが、活性化された抗原提示細胞上に発現されることを示す。Ｂ２２０（Ｂ細胞）、ＣＤ１１ｂ（マクロファージおよび樹状細胞）、およびＣＤ１１ｃ（樹状細胞）を、Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓から精製し、ＬＰＳおよびインターフェロンγを用いて活性化した。活性化の２４時間後に、細胞を、ｈＩｇＧ（赤線）、ビオチン化Ｔｉｍ−１Ｉｇ（緑線）、またはビオチン化Ｔｉｍ−２Ｉｇ（青線）のいずれかを用いて染色した。ストレプトアビジン−ＰＥを、二次検出試薬として使用した。全てのサンプルを、フローサイトメトリーによって分析した。Ｔｉｍ−１リガンドおよびＴｉｍ−２リガンドの両方の発現は、活性化された抗原提示細胞上でアップレギュレートされた。
【図８】図８は、Ｔｈ１極性化細胞株およびＴｈ２極性化細胞株におけるＴｉｍ−２の発現を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢａｌｂ／ｃマウス由来のナイーブなＴ細胞を、抗ＣＤ３／Ｃ２８刺激を使用して、ＩＬ−１２＋抗Ｉｌ−４（Ｔｈ１）条件またはＩＬ−４＋抗ＩＬ−１２（Ｔｈ２）条件下で極性化した。ＲＮＡを細胞から抽出し、ｃＤＮＡを生成した。特異的なＴａｑｍａｎプライマーとプローブとを使用して、ＧＡＰＤＨに相対的なＴｉｍ−２の発現量を決定した。Ｔｉｍ−２発現は、Ｔｈ１細胞と比較して、Ｔｈ２細胞において優先的にアップレギュレートされた。
【図９】図９は、Ｔｉｍ１／Ｆｃ単独治療が、軽度に不適合（ｍｉｎｏｒ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）な膵島同種移植片の生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）を可能にすることを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｔｏｃｉｎの２４０ｍｇ／ｋｇの用量での単一の腹腔内注射によって、糖尿病にした。ＤＢＡ／２ドナー由来の膵島同種移植片を、右腎臓の腎被膜（ｒｅｎａｌ  ｃａｐｓｕｌｅ）の下に移植した。このレシピエントを、０．２５ｍｇ／マウスの用量のＴｉｍ１／Ｆｃで、移植の第０日目、第２日目、および第４日目に処置した。
【図１０】図１０は、Ｔｉｍ２／Ｆｃ単独治療が、拒絶を遅延して、軽度に不適合な膵島同種移植片の生着を許容することを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｔｏｃｉｎの２４０ｍｇ／ｋｇの用量での単一の腹腔内注射によって、糖尿病にした。ＤＢＡ／２ドナー由来の膵島同種移植片を、右腎臓の腎被膜の下に移植した。このレシピエントを、０．２５ｍｇ／マウスの用量のＴｉｍ２／Ｆｃで、移植の第０日目、第２日目、および第４日目に処置した。
【図１１】図１１は、Ｔｉｍ２／Ｆｃが、抗ＣＤ１５４と共同作用してＭＨＣ不適合同種移植片寛容を増進させることを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｔｏｃｉｎの２６０ｍｇ／ｋｇの用量での単一の腹腔内注射によって、糖尿病にした。ＤＢＡ／２ドナー由来の膵島同種移植片を、右腎臓の腎被膜の下に移植した。このレシピエントを、０．２５ｍｇ／マウスでの用量のＴｉｍ２／Ｆｃで、移植の第０日目、第２日目、および第４日目に処置し、０．２５ｍｇ／マウスの用量でのＭＲ１で、移植の第０日目および第２日目に処置した。
【図１２Ａ】図１２は、Ｔｉｍ−４が、マクロファージおよび成熟樹状細胞においては発現されるが、Ｔ細胞においては発現されないことを示す。（ａ）Ｔａｑｍａｎ定量ＰＣＲを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製の多組織ｃＤＮＡパネル上で、二重ウェル中で行い、種々のマウスの器官におけるＴｉｍ−４のｍＲＮＡを分析した。
【図１２Ｂ】図１２は、Ｔｉｍ−４が、マクロファージおよび成熟樹状細胞においては発現されるが、Ｔ細胞においては発現されないことを示す。（ｂ）ＤＯ１１．１０  ＴｃＲトランスジェニックＴ細胞を、インビトロでＴＨ１株またはＴＨ２株へと極性化し、ＲＮＡを、各々の再刺激の一巡の後の静止細胞から調製した。ＲＮＡをまた、長期Ｔ細胞クローンＡＥ７（ＴＨ１）およびＤ１０．Ｇ４（ＴＨ２）、ならびにＣＨＯ−Ｔｉｍ−４安定形質移入体からも調製した。データは、２回の実験の代表値である。
【図１２Ｃ】図１２は、Ｔｉｍ−４が、マクロファージおよび成熟樹状細胞においては発現されるが、Ｔ細胞においては発現されないことを示す。（ｃ）ＳＪＬ／Ｊの脾臓細胞およびリンパ節細胞を、ＣＤ１１ｂ＋集団、ＣＤ１１ｃ＋集団、Ｂ２２０＋集団、およびＣＤ３＋集団へと精製した。データは、５回以上の実験の代表値である。
【図１２Ｄ】図１２は、Ｔｉｍ−４が、マクロファージおよび成熟樹状細胞においては発現されるが、Ｔ細胞においては発現されないことを示す。（ｄ）樹状細胞を、インビトロで、骨髄細胞から、ＧＭ−ＣＳＦまたはＦｌｔ３Ｌを使用して生成し、一部の細胞を、ＬＰＳで刺激した。Ｆｌｔ３Ｌによって生成された細胞は、形質細胞様部分を失っていた。データは、２回の実験の代表値である。
【図１２Ｅ】図１２は、Ｔｉｍ−４が、マクロファージおよび成熟樹状細胞においては発現されるが、Ｔ細胞においては発現されないことを示す。（ｅ）樹状細胞を、インビボで、ＣＭＳ５  Ｆｌｔ３Ｌ産生腫瘍細胞を注入されたＣＢ６Ｆ１マウスから生成した。Ｔ細胞とＢ細胞とを欠く脾性細胞を、示される集団へと分離した。示される全ての細胞型を、Ｔｉｍ−４  Ｔａｑｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲに供し、Ｔｉｍ−４のｍＲＮＡの発現を定量した。全てのデータは、三重ウェルにおいて行われた、ＧＡＰＤＨ発現に対して相対的なＴｉｍ−４発現量として表される。
【図１３】図１３は、Ｔｉｍ−４リガンドが、Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞上に発現されることを示す。全てのＳＪＬ／Ｊ脾臓細胞（未刺激であるか、またはＬＰＳおよび（Ｂ細胞に関しては）ＩＦＮ−γによって、もしくは（Ｔ細胞に関しては）ＣｏｎＡによって活性化されるかのいずれか）を、Ｂ２２０−ＦＩＴＣまたはＣＤ３−ＦＩＴＣおよびＴｉｍ−４−Ｉｇで（検出のために抗ヒトＩｇＧ−ＰＥを使用して）染色した。データは、４回の別々の実験の代表値である。
【図１４Ａ】図１４は、Ｔｉｍ−４が、Ｔｉｍ−１と特異的に相互作用することを示す。（ａ）Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−３、またはＴｉｍ−４のｃＤＮＡをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、Ｔｉｍ−１−Ｉｇで（抗ｍＩｇＧ２ａ−ＰＥで検出し、二次抗体単独をコントロールとして用いて）、Ｔｉｍ−２−ＩｇまたはＴｉｍ−４−Ｉｇで（両方を抗ｈＩｇＧ−ＰＥで検出し、ｈＩｇＧをコントロールとして用いて）染色した。Ｔｉｍ−１およびＴｉｍ−３を、各々、モノクローナルの抗Ｔｉｍ−１または抗Ｔｉｍ−３を用いて、細胞表面上で可視化し、Ｔｉｍ−４を、ビオチン化抗ＨＡで検出した（ストレプトアビジン−ＰＥを用いて可視化した；全てをアイソタイプコントロールと比較する）。データは、１０回以上の実験の代表値である。
【図１４Ｂ】図１４は、Ｔｉｍ−４が、Ｔｉｍ−１と特異的に相互作用することを示す。（ｂ）Ｔｉｍ−１またはＴｉｍ−４をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞Ｔｉｍ−１−ＩｇまたはＴｉｍ−４−Ｉｇを用いて、先のように染色した。特異的な染色を評価するために、Ｔｉｍ−１−Ｉｇを、抗Ｔｉｍ−１または抗Ｔｉｍ−３と共にプレインキュベートして、次いで、Ｔｉｍ−４形質移入体を染色するために使用した。加えて、Ｔｉｍ−１形質移入体を、抗Ｔｉｍ−１または抗Ｔｉｍ−３と共にプレインキュベートして、次いで、Ｔｉｍ−４−Ｉｇで染色した。データは、５回以上の実験の代表値である。
【図１５Ａ】図１５は、正常Ｔ細胞でＴｉｍ−４−Ｔｉｍ−１相互作用が観察され得ることを示す。（ａ）ＣＤ３＋細胞を、全脾細胞から精製して、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で活性化した。細胞を、先のように、抗Ｔｉｍ−１またはＴｉｍ−４−Ｉｇで染色した。
【図１５Ｂ】図１５は、正常Ｔ細胞でＴｉｍ−４−Ｔｉｍ−１相互作用が観察され得ることを示す。（ｂ）全脾細胞を、ＣｏｎＡで刺激して、先のように、抗ＣＤ３またはＴｉｍ−４−Ｉｇで染色した。細胞を、抗Ｔｉｍ−１または抗Ｔｉｍ−３のいずれかと共にプレインキュベートし、その後、Ｔｉｍ−４−Ｉｇで染色し、示したＴｉｍ−４−Ｉｇ結合のＴｉｍ−１特異性を評価した。
【図１５Ｃ】図１５は、正常Ｔ細胞でＴｉｍ−４−Ｔｉｍ−１相互作用が観察され得ることを示す。（ｃ）インビトロでＴＨ１株またはＴＨ２株へ極性化されたＤＯ１１．１０  ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、ＰＭＡ＋イオノマイシン＋Ｇｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐで３時間にわたって活性化して、次いで、先のように、抗Ｔｉｍ−１またはＴｉｍ−４−Ｉｇで染色した。刺激された細胞をまた、細胞外を抗ＣＤ４抗体、細胞内をサイトカイン抗体でも染色し、それらの細胞のＴＨ１株またはＴＨ２株への極性を確認した。全てのデータは、少なくとも４回の実験の代表値である。
【図１５Ｄ】図１５は、正常Ｔ細胞でＴｉｍ−４−Ｔｉｍ−１相互作用が観察され得ることを示す。（ｄ）インビトロでＴＨ１株またはＴＨ２株へ極性化されたＤＯ１１．１０  ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、ＰＭＡ＋イオノマイシン＋Ｇｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐで３時間にわたって活性化して、次いで、先のように、抗Ｔｉｍ−１またはＴｉｍ−４−Ｉｇで染色した。刺激された細胞をまた、細胞外を抗ＣＤ４抗体、細胞内をサイトカイン抗体でも染色し、それらの細胞のＴＨ１株またはＴＨ２株への極性を確認した。全てのデータは、少なくとも４回の実験の代表値である。
【図１６】図１６は、Ｔｉｍ−１−Ｉｇが、エキソビボで、活性化されたＣＤ１１ｂ＋細胞およびＣＤ１１ｃ＋細胞に特異的に結合することを示す。ＤＯ１１．１０  ＴｃＲトランスジェニックマウスまたはＢａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓細胞を、ＬＰＳおよびＩＦＮ−γで刺激した。ＣＤ１１ｂ＋細胞およびＣＤ１１ｃ＋細胞を、ＭＡＣＳカラム精製によって精製して、抗Ｔｉｍ−１モノクローナル抗体または抗Ｔｉｍ−３モノクローナル抗体の存在下または非存在下において、ビオチン化Ｔｉｍ−１−Ｉｇで染色した。ストレプトアビジン−ＰＥを、二次検出試薬として使用した。データは、２回の実験の代表値である。
【図１７Ａ】図１７は、Ｔｉｍ−１−Ｉｇの投与が、Ｔ細胞の過剰増殖をもたらすことを示す。（ａ）インビボでＴｉｍ−１−ＩｇまたはコントロールとしてｈＩｇＧもしくはＰＢＳで処置された、免疫されたＳＪＬ／Ｊマウス由来の脾細胞を、インビトロで４８時間にわたりＰＬＰ１３９−１５１ペプチド再刺激と共に培養した。４８時間後に、３［Ｈ］チミジン結合によって、三重ウェル中で増殖を測定した。
【図１７Ｂ】図１７は、Ｔｉｍ−１−Ｉｇの投与が、Ｔ細胞の過剰増殖をもたらすことを示す。（ｂ）６ａにおいて記載する実験由来の培養上清を、ＰＬＰ  １３９−１５１抗原刺激と共にインビトロで４８時間培養した後で取得し、サイトカインＥＬＩＳＡにおいて使用した；ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γ産生を示す。個々のマウス（ｎ＝６）由来の脾細胞を、別々に分析し、全てのマウスについての平均データを示す。誤差バーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．値を表す。データは、４回の別々の実験の代表値である。黒菱形、ＰＢＳ処理；黒正方形、ｈＩｇＧ処理；白三角形、Ｔｉｍ−１−Ｉｇ処理。
【図１８Ａ】図１８は、Ｔｉｍ−４−Ｉｇが、インビボでＴ細胞の過剰増殖を誘導し、インビトロでＴ細胞の増殖を共刺激することを示す。（ａ）インビボでＴｉｍ−４−ＩｇまたはコントロールとしてｈＩｇＧもしくはＰＢＳで処置された、免疫されたＳＪＬ／Ｊマウス由来の脾臓細胞を、インビトロで４８時間ペプチド再刺激なしで培養した。４８時間後に、３［Ｈ］チミジン結合によって、三重ウェル中で増殖を測定した。これらのウェルからの上清を、インビトロでの４８時間のペプチド再刺激なしの培養の後で取得し、サイトカインＥＬＩＳＡにおいて使用し、抗原再刺激なしで自然に産生されたサイトカインの量を試験した。２種の異なるマウス由来の脾細胞を、各々、三連分析し、平均値を示す。
【図１８Ｂ】図１８は、Ｔｉｍ−４−Ｉｇが、インビボでＴ細胞の増殖を誘導し、インビトロでＴ細胞の増殖を共刺激することを示す。（ｂ）インビボでＴｉｍ−４−Ｉｇ（Ｔ４）またはｈＩｇＧ（Ｈｕ）で処置された、２個体の免疫されたＳＪＬ／Ｊマウスからプールされた脾臓細胞を、ＣＤ１１ｂ＋（Ｍａｃ）集団、Ｂ２２０＋（Ｂ）集団、およびＣＤ３＋（Ｔ）集団に分けて、ペプチド再刺激なしで再び組合せた。４８時間後に、３［Ｈ］チミジン結合によって、増殖を測定した。
【図１８Ｃ】図１８は、Ｔｉｍ−４−Ｉｇが、インビボでＴ細胞の増殖を誘導し、インビトロでＴ細胞の増殖を共刺激することを示す。（ｃ）精製されたＳＪＬ／Ｊ  Ｔ細胞を、示される濃度での抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、およびＴｉｍ−４−Ｉｇ、またはコントロールＩｇで被覆されたプレート上で刺激した。４８時間後に、３［Ｈ］チミジン結合によって、三重ウェル中で増殖を測定した。データは、２回の同一の実験（左のパネル）または５回の同一の実験（右のパネル）の代表値である。全ての誤差バーは、同型（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）のウェルからのＳ．Ｅ．Ｍ．値を表す。
【図１９Ａ】図１９は、Ｔｉｍ−１−Ｉｇ投与が、インビボで、ＴＨ２に偏った系において、過剰増殖およびＴＨ２応答の増強を誘導することを示す。メスのＢａｌｂ／ｃマウスに、５０μｇのＯＶＡ  ３２３−３３９および４ｍｇのＩｍｊｅｃｔミョウバン（Ｐｉｅｒｃｅ）を腹腔内注射し、次いで、５０μｇのＯＶＡ  ３２３−３３９および２ｍｇのミョウバンで、７日後に腹腔内で追加免疫した。マウスに、１００μｇのＴｉｍ−１−Ｉｇ、ｈＩｇＧ、または２５０μｌのＰＢＳを、腹腔内で５回注射した：免疫の４時間前、および第７日目の追加免疫の４時間前、ならびに免疫後の第２日目、第４日目、および第１０日目。第１４日目に、マウスを屠殺し、脾細胞を増殖およびサイトカインについてアッセイした。（ａ）脾細胞を、インビトロで４８時間にわたりＯＶＡ  ３２３−３３９ペプチドと共に培養した。４８時間後に、３［Ｈ］チミジン結合によって、三重ウェル中で増殖を測定した。
【図１９Ｂ】図１９は、Ｔｉｍ−１−Ｉｇ投与が、インビボで、ＴＨ２に偏った系において、過剰増殖およびＴＨ２応答の増強を誘導することを示す。メスのＢａｌｂ／ｃマウスに、５０μｇのＯＶＡ  ３２３−３３９および４ｍｇのＩｍｊｅｃｔミョウバン（Ｐｉｅｒｃｅ）を腹腔内注射し、次いで、５０μｇのＯＶＡ  ３２３−３３９および２ｍｇのミョウバンで、７日後に腹腔内で追加免疫した。マウスに、１００μｇのＴｉｍ−１−Ｉｇ、ｈＩｇＧ、または２５０μｌのＰＢＳを、腹腔内で５回注射した：免疫の４時間前、および第７日目の追加免疫の４時間前、ならびに免疫後の第２日目、第４日目、および第１０日目。第１４日目に、マウスを屠殺し、脾細胞を増殖およびサイトカインについてアッセイした。（ｂ）培養上清を、インビトロでのＯＶＡ  ３２３−３３９再刺激の４８時間後に取得して、サイトカインＥＬＩＳＡに使用した；ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０の産生を示す。有意なＩＦＮ−γ産生は観察されなかった。個々のマウス（ｎ＝３）由来の脾細胞を、別々に、三重ウェルで分析した。全ての３個体のマウスについての平均値を示す。黒正方形、インビボＢＰＳ処理；黒菱形、インビボｈＩｇＧ処理；白三角形、インビボＴｉｍ−１−Ｉｇ処理。
【図２０】図２０は、２種の水溶性形態のｔｉｍ−４を生じる、マウスｔｉｍ−４遺伝子座の選択的スプライシングの図解を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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