(57)【要約】リソソームへ局在する標的化酸性αグルコシダーゼ治療剤が提供される。この標的化治療剤は、治療剤剤ＧＡＡ、並びに細胞の外側表面上のレセプターに結合する標的部分を含み、これによってレセプターが内在化されるとこの標的化治療剤の適切な細胞内局在が可能となる。また、本発明の実践に関係する核酸、細胞、および手法が提供される。ＧＡＡの少なくとも一部およびペプチドタグを含む治療因子を含む標的化治療剤もまた提供される。このペプチドタグは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基６８、６９、７０、７１、７２、７８９、７９０、７９１、７９２および７９３からなる群より選択されるアミノ酸残基に直接または間接的に連結される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のアミノ酸残基７０〜７９０に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列またはそのフラグメントおよび標的細胞の表面上にあるレセプターの細胞外ドメインに結合する標的ドメインを含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基８８０〜９５２に少なくとも５０％同一な配列と会合しない、ポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基７０〜７９０またはそのフラグメントを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記標的ドメインが、ヒトリソソームへの前記ポリペプチドの局在化を可能にさせる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記標的ドメインが、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター部分を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４８〜５５を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８〜２８および４１〜６１またはヒトカチオン非依存性マンノース−６−ホスフェートレセプターに結合するその配列改変体を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸残基８〜８７またはそれらの配列改変体を含み、ここで該配列改変体は、前記ヒトカチオン非依存性マンノース−６−ホスフェートレセプターに結合する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのＲ６８Ａ変異を含む、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのＣ末端切断型またはその配列改変体を含み、該切断が位置６２から始まる、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記標的ドメインは、アミノ酸配列のＮ末端に直接融合される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記標的ドメインが、該標的ドメインとアミノ酸配列との間のスペーサーにより該アミノ酸配列のＮ末端に融合される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記スペーサーが、１０〜２５アミノ酸長である、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記スペーサーが、グリシン残基を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記スペーサーが、αヘリックス構造を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記スペーサーが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓに少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）の少なくとも一部およびペプチドタグを含む治療因子を含む標的化治療剤であって、該ペプチドタグは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基６８、６９、７０、７１、７２、７８９、７９０、７９１、７９２および７９３からなる群より選択されるアミノ酸残基に直接または間接的に連結される、標的化治療剤。
【請求項１８】
前記アミノ酸残基が、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基６８〜７２からなる群より選択される、請求項１７に記載の標的化治療剤。
【請求項１９】
前記治療剤が、ヒトＧＡＡのアミノ残残基７０〜９５２を含む、請求項１７に記載の標的化治療剤。
【請求項２０】
前記ペプチドタグが、ヒトＧＡＡのアミノ残基７０に連結される、請求項１９に記載の標的化治療剤。
【請求項２１】
前記ペプチドタグが、細胞外レセプターに対するリガンドである、請求項１７に記載の標的化治療剤。
【請求項２２】
請求項２１に記載の標的化治療剤であって、前記ペプチドタグが、標的細胞の表面上にあるレセプターの細胞外ドメインに結合する標的ドメインであり、該レセプターの内在化の際に、ヒトリソソームへの該治療因子の局在化を可能にする、標的化治療剤。
【請求項２３】
前記標的ドメインが、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター部分を含む、請求項２２に記載の標的化治療剤。
【請求項２４】
前記ペプチドタグが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸残基４８〜５５を含む、請求項２２に記載の標的化治療剤。
【請求項２５】
請求項２２に記載の標的化治療剤であって、前記ペプチドタグは、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸残基８〜２８および４１〜６１またはヒトカチオン非依存性マンノース−６−ホスファターゼレセプターに結合するそれらの配列改変体を含む、標的化治療剤。
【請求項２６】
請求項２２に記載の標的化治療剤であって、前記ペプチドタグは、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸残基８〜８７またはそれらの配列改変体を含み、該配列改変体は、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−ホスファターゼレセプターに結合する、標的化治療剤。
【請求項２７】
前記ペプチドタグが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのＲ６８Ａ変異を含む、請求項２６に記載の標的化治療剤。
【請求項２８】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのＣ末端切断型またはそれらの配列改変体を含み、該切断が位置６２から始まる、請求項２４に記載の標的化治療剤。
【請求項２９】
前記治療因子と前記ペプチドタグとの間にスペーサーをさらに含む、請求項１７に記載の標的化治療剤。
【請求項３０】
前記スペーサーが、グリシン残基を含む、請求項２９に記載の標的化治療剤。
【請求項３１】
前記スペーサーが、αへリックス構造である、請求項２９に記載の標的化治療剤。
【請求項３２】
前記スペーサーが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓに少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の標的化治療剤。
【請求項３３】
ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のアミノ酸残基７０〜７９０に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドのオープンリーディングフレームを含む核酸配列であって、該オープンリーディングフレームは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基８８０〜９５２に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含まない、核酸配列。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基７０〜７９０またはそのフラグメントを含む、請求項３３に記載の核酸配列。
【請求項３５】
前記核酸配列が、ＤＮＡ配列である、請求項３３に記載の核酸配列。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが、標的細胞の表面上にあるレセプターの細胞外ドメインに結合する標的ドメインをさらに含み、該レセプターの内在化の際に、ヒトリソソームへの該ポリペプチドの局在化を可能にさせる、請求項３３に記載の核酸配列。
【請求項３７】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸残基８〜８７またはその配列改変体を含み、ここで該配列改変体は、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−ホスファターゼレセプターに結合する、請求項３６に記載の核酸配列。
【請求項３８】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのＲ６８Ａ変異を含む、請求項３７に記載の核酸配列。
【請求項３９】
請求項３３に記載の核酸配列を含む、細胞。
【請求項４０】
ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のアミノ酸残基８８０〜９５２に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドのオープンリーディングフレームを含む核酸配列であって、該オープンリーディングフレームは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基７０〜７９０に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含まない、核酸配列。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基８８０〜９５２またはそのフラグメントを含む、請求項４０に記載の核酸配列。
【請求項４２】
前記核酸配列が、ＤＮＡ配列である、請求項４１に記載の核酸配列。
【請求項４３】
請求項４０に記載の核酸配列を含む、細胞。
【請求項４４】
ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のアミノ酸残基８８０〜９５２に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基７０〜７９０に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列と会合しない、ポリペプチド。
【請求項４５】
前記アミノ酸配列が、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基８８０〜９５２またはそのフラグメントを含む、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
第一の核酸配列および第二の核酸配列を含む細胞であって、
該第一の核酸配列は、ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のアミノ酸残基７０〜７９０に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む第一のポリペプチドの第一のオープンリーディングフレームを含み、そして
該第二の核酸配列は、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基８８０〜９５３に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む第二のポリペプチドの第二のオープンリーディングフレームを含み、
（ｉ）該第一のオープンリーディングフレームは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基８８０〜９５２に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含まず、そして
（ｉｉ）該第二のオープンリーディングフレームは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基７０〜７９０に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含まない、
細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本出願は、２００４年２月１０日に申請された米国出願番号６０／５４３，８１２（参考としてその内容が援用される。）の優先権の利益を要求する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）は、マルトース、並びに、グリコーゲンの外鎖を含むその他直鎖オリゴサッカライドにおけるアルファ１−４結合を加水分解するリソソーム酵素であり、これによってリソソーム内で過剰なグリコーゲンを分解する（Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｃｒｉｖｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２００１），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ  ＹｏｒｋのＨｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），ｐ．３３８９−３４２０（非特許文献１））。他の哺乳類リソソーム酵素と同様、ＧＡＡは細胞質ゾル内で合成されてＥＲを通過し、このＥＲにてＮ結合高マンノース型炭水化物でグリコシル化される。ゴルジ体では、リソソームタンパク質をリソソームへ標的化させるマンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）が付加することによって、リソソームタンパク質上で高マンノース炭水化物が修飾される。Ｍ６Ｐ修飾タンパク質は、２つのＭ６Ｐレセプターのうちのいずれかとの相互作用を介してリソソームへ送達される。最も好ましい修飾形態は、２つのＭ６Ｐが高マンノース炭水化物に付加した状態である。
【０００３】
リソソームにおいてＧＡＡ活性が不十分であると、酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ）、ＩＩ型糖尿病（ＧＳＤＩＩ）、ＩＩ型糖原病、あるいはＧＡＡ欠損症とも呼ばれる疾患であるポンペ病に帰着する。ＧＡＡをコードする遺伝子における様々なミスセンス変異並びにナンセンス変異によって、この酵素活性の低下が生じる。その結果、ポンペ病を有する患者の全ての細胞のリソソームにグリコーゲンが蓄積する。グリコーゲンの蓄積は特に、心筋並びに骨格筋、肝臓、並びに他の組織のリソソームにて最も顕著である。蓄積したグリコーゲンは最終的に筋機能を損なう。ポンペ病で最も重篤なものは、心肺機能不全によって２歳になる前に死亡する。
【０００４】
現在、ポンペ病を治癒する、あるいはポンペ病の進行を緩和するのに利用できる認可された治療法は存在しない。目下臨床試験中の酵素置換治療では、投与した組換えＧＡＡが筋肉並びに肝組織内の細胞に取り込まれ、これらの細胞内のリソソームへ、Ｍ６Ｐ依存的な方法で輸送されることが必要とされる。しかしながら、最近のポンペ酵素置換治療試験にて使用される２つの酵素源である遺伝子加工したＣＨＯ細胞並びに遺伝子導入ウサギ乳にて産生された組換えＧＡＡは、極少量のＭ６Ｐしか含有しない（Ｖａｎ  Ｈｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９３（１）：６５−７０（非特許文献２）；並びに米国特許第６，５３７，７８５号（特許文献１））。よって、組換えＧＡＡのリソソームへのＭ６Ｐ依存的送達は効率が悪く、大量の投与量と高頻度の注入とが必要とされる。従って、新しく、より簡便で、より良い効率の、且つより費用効果の高い、治療的ＧＡＡ酵素を患者リソソームへ指向させるための方法が、依然必要とされている。
【特許文献１】米国特許第６，５３７，７８５号明細書
【非特許文献１】Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ら、（２００１）、Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｃｒｉｖｅｒら編（２００１），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．３３８９−３４２０
【非特許文献２】Ｖａｎ  Ｈｏｖｅら、（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９３（１）：６５−７０
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（本発明の概要）
本発明は、ペプチドタグを基礎とした標的化戦略を用いることによって、ヒトＧＡＡもしくはＧＡＡ様酵素を患者リソソームへ、Ｍ６Ｐ非依存的に指向させることを可能とする。結果として、本発明はＧＡＡもしくはＧＡＡ様酵素の標的細胞内への効果的な送達を提供する。
【０００６】
本発明は一部、ＧＡＡタンパク質のそれぞれに異なる一部分であるペプチドをコードする複数のオープンリーディングフレーム（開放解読枠）を使用し、組換えによってＧＡＡを発現させることができるという発見に関係する。共に用いた場合、結果できるポリペプチドは協働して所望する酵素活性を提供することができる。
【０００７】
従って、本発明は一側面において、ヒトＧＡＡの７０−７９０番アミノ酸残基と５０％以上同一（例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは１００％同一。）あるいはこれらのフラグメントのアミノ酸配列を含有するポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードする核酸配列（ＤＮＡ配列等）に関係する。このオープンリーディングフレームは、ヒトＧＡＡの８８０−９５２番アミノ酸残基と５０％以上同一（例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは１００％同一。）のアミノ酸配列を含有しない。
【０００８】
別の側面において本発明は、ヒトＧＡＡの８８０−９５２番アミノ酸残基と５０％以上同一（例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは１００％同一。）あるいはこれらのフラグメントのアミノ酸配列を含有するポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードする核酸配列（ＤＮＡ配列等）に関係する。このオープンリーディングフレームは、ヒトＧＡＡの７０−７９０番アミノ酸残基と５０％以上同一（例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは１００％同一。）のアミノ酸配列を含有しない。
【０００９】
本発明はまた、当該核酸配列の一方あるいは両方を含有する細胞に関係する。
【００１０】
一実施例において本発明の核酸はまた、ＧＡＡポリペプチドに融合するペプチドタグをコードする。好ましいペプチドタグは、細胞外レセプターに対するリガンドである。一部の実施例において、ペプチドタグは、標的細胞表面にあるレセプターの細胞外ドメインに結合する標的ドメインであり、このレセプターが内在化されると、ヒト・リソソーム内へのポリペプチドの局在が起こる。一実施齢において、この標的ドメインは、カチオン非依存性マンノース６−リン酸レセプター結合能を有するウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター部分を含有する。別の実施例において標的ドメインには、ＩＧＦ−ＩＩの１つもしくは複数のアミノ酸配列（例えば、少なくとも４８−５５番アミノ酸、少なくとも８−２８番並びに４１−６１番アミノ酸；あるいは少なくとも８−８７番アミノ酸）、あるいはこれらの配列改変体（例えばＲ６８Ａ）、あるいはカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合するこれらの切断型（例えば６２番目からＣ末切断されたもの。）が組み入れられている。一実施例においてペプチドタグは、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端あるいはＣ末端に直接融合されている。別の具体的な実施例においてペプチドタグは、スペーサーによってＧＡＡポリペプチドのＮ末端あるいはＣ末端に融合されている。一実施例においてペプチドタグは、１０−２５個のアミノ酸から成るスペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドに融合されている。別の具体的な実施例においてペプチドタグは、アミノ酸配列ＧＧＧＴＶＧＤＤＤＤＫと５０％以上同一のスペーサーによってＧＡＡに融合されている。
【００１１】
本発明はまた、本発明の核酸によってコードされたポリペプチド、並びにこれらのポリペプチドを含有する製薬調製物に関係する。
【００１２】
本発明はまた、一部、ペプチドタグが融合することのできるＧＡＡの特定部位に関する正しい認識に関係する。従って、別の一側面において本発明は、ヒトＧＡＡあるいはこれの一部分の、６８、６９、７０、７１、７２、７７９、７８７、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、あるいは７９６番アミノ酸に融合するペプチドタグを有する標的化治療物質に関係する。この標的化治療物質には、例えばヒトＧＡＡの７０−９５２番アミノ酸残基、あるいは７０−７９０番アミノ酸残基等より小さな部分を含有することができる。一実施例において、ペプチドタグは７０番アミノ酸、あるいは７０番アミノ酸から１つあるいは２つ目の位置内にあるアミノ酸に融合する。例えば、一部のペプチドタグは、標的細胞表面にあるレセプターの細胞外ドメインに結合する標的ドメインであり、このレセプターが内在化されてこの治療剤剤のヒト・リソソームへの局在が可能となる。一実施例においてこの標的ドメインには、カチオン非依存性マンノース６−リン酸レセプターに結合することができるウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター部分が含まれる。別の実施例において、標的ドメインには、ＩＧＦ−ＩＩの１つ以上のアミノ酸（例えば少なくとも４８−５５番アミノ酸；少なくとも８−２８番および４１−６１番アミノ酸；もしくは少なくとも８−８７番アミノ酸。）、あるいはこれらの変形アミノ酸配列（例えばＲ６８Ａ）、あるいはカチオン非依存性マンノース６−リン酸レセプターに結合することができるこれらの切断型（例えば６２番目からのＣ末切断型）が組み入れられている。このペプチドタグは直接、あるいはスペーサーによってＧＡＡポリペプチドと融合される。一実施例においてペプチドタグは、１０−２５個のアミノ酸から成るスペーサーによってＧＡＡポリペプチドに融合されている。別の具体的な実施例においてペプチドタグは、へリックス構造を含有するスペーサーによってＧＡＡポリペプチドに融合されている。別の具体的な実施例においてペプチドタグは、アミノ酸配列ＧＧＧＴＶＧＤＤＤＤＫと５０％以上同一のスペーサーによってＧＡＡポリペプチドに融合される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（本発明の詳細）
本発明は、例えばヒト心筋細胞並びに筋細胞等、哺乳類細胞のリソソームへ、より効果的に標的輸送されるＧＡＡを作成する手段を提供する。ＧＡＡはファミリー３１グルコシドヒドロリアーゼの一つである（図１−１から１−１４）。ヒトＧＡＡは１１０  ｋＤａｌの前駆体として合成される（Ｗｉｓｓｅｌａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３）：２２２３−３１）。この酵素の成熟体は、７０  ｋＤａｌ  および７６  ｋＤａｌの単量体から成る複合体である（Ｗｉｓｓｅｌａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３）：２２２３−３１）。酵素前駆体は、７つの潜在的グリコシル化部位を持ち、このうち４つが成熟酵素でも保持される（Ｗｉｓｓｅｌａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３）：２２２３−３１）。後期エンドソームあるいはリソソームにて、成熟酵素を作り出すタンパク質分解性開裂切断が発生する（Ｗｉｓｓｅｌａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３）：２２２３−３１）。
【００１４】
７０  ｋＤａｌおよび７６  ｋＤａｌの成熟種には、Ｃ末端の１６０のアミノ酸が存在しない。しかし、例えばＶａｌ９４９Ａｓｐ等、ＧＡＡの完全な失活に繋がる特定のポンペ対立遺伝子はこの領域に位置する（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６２：９９１）。この変異体の表現系から、７０  ｋＤａｌ  あるいは７６  ｋＤａｌ種の一部分ではなく、このタンパク質のＣ末端部分が、タンパク質の機能において重要な役割を果たしていることが示唆される。プロセッシングの過程で残りのタンパク質部分から分離するが、このタンパク質のＣ末端部分が、主要タンパク質種と依然会合していると最近報告されている（Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｏｖ．１，２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  ４０４００８２００）。従って、Ｃ末端残基は、タンパク質の触媒活性にも直接的な役割を果たしていると考えられる。あるいは、このＣ末端残基は、このタンパク質のＮ末端部分の正しい折り畳み構造の形成の促進に関係している可能性がある。
【００１５】
関連するタンパク質であるスクラーゼ−イソマルターゼのある特定の対立遺伝子の動きから、後者の可能性が支持されている。この酵素族には、１本のポリペプチド上に一列に並んだ２つの別個であるが類似するグリコシドヒドロリアーゼ触媒領域を含有する、スクラーゼ−イソマルターゼ（ＳＩ）タンパク質が含まれる。これら各々はＧＡＡポリペプチド全体と大きさが同じであり、この２つの触媒領域は、ＧＡＡと３６％並びに３９％同一部分を持つ。ＳＩは小腸刷子縁細胞にて発現し、アミノ末端膜通過ドメインによって触媒領域を腸管腔に向け、この分極細胞の先端膜に局在する。先端膜に達すると、トリプシンによって近アミノ基イソマルターゼ領域からスクラーゼ領域が開裂切断し、イソマルターゼ領域は依然結合した状態で膜に留まる。最近の研究によって、正しい折り畳み構造と、続くイソマルターゼ領域の輸送とに、スクラーゼ領域が必要であることが示されている。即ち、スクラーゼは、イソマルターゼ領域の折り畳みに必要な分子内シャペロンであると言われている（Ｊａｃｏｂ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３２１４１）。
【００１６】
多数の、遺伝子加工したＧＡＡカセットの発現分析によって、成熟ポリペプチドから開裂分離するが、尚、哺乳類細胞が機能性タンパク質を分泌するのに必要な２つの領域の同定が可能となった。我々が現在理解するＧＡＡの構成を図２にまとめる。前駆体ポリペプチドは、シグナル配列およびこれに隣接する推定的な膜通過領域、３つのＳ−Ｓ結合を包含する約４５個のアミノ酸から成るシステインに富む領域であってタンパク質−タンパク質あるいはタンパク質−炭水化物の相互作用に関係すると考えられている三つ葉形領域（ＰＦＡＭ  ＰＦ０００８８）、（Ｔｈｉｍ（１９８９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５０：８５）、成熟７０／７６  ｋＤａｌポリペプチドによって限定される領域、並びにＣ末端領域を有する。ＳＩの三つ葉形領域内の変異は、ＳＩの先端膜選別様式に影響を及ぼす（Ｓｐｏｄｓｂｅｒｇ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２３５０６）。例１並びに例２にて示したデータは、機能性ＧＡＡの生成には三つ葉形領域とＣ末端領域の双方が必要であることを示している。Ｃ末端領域は、タンパク質折り畳みの過程で三つ葉形領域と相互作用し、恐らくはこの三つ葉形領域内で適切なＳ−Ｓ結合形成を促進する可能性がある。
【００１７】
本発明の一実施例において、ペプチドタグをコードするＤＮＡ配列は、フレーム内で、Ｃ末領域を除くＧＡＡポリペプチド全体をコードするＧＡＡカセットの３’末端に融合する。このカセットは、別のポリペプチドとしてＧＡＡのＣ末領域をも発現する哺乳類細胞にて共発現する。
【００１８】
次にこのＣ末領域が７０／７６  ｋＤａｌ  種と協働してトランスに機能し、活性型ＧＡＡが生成される。触媒領域とＣ末領域の境界は、ファミリー３１ヒドロリアーゼ類の大半には存在せず、ＧＡＡ内の４つの連続するプロリン残基を含有する１８個未満のアミノ酸から成る短鎖領域上に存在することから、７９１番残基周辺に存在する模様である。実際、成熟体に会合するＣ末領域が７９２番アミノ酸残基から始まると、現在報告されている（Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｏｖ．１，２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，印刷前原稿  ４０４００８２００）。
【００１９】
安定した細胞系を作り出すために、哺乳類細胞に導入した１つのプラスミド構成体から双方のポリペプチドを発現させることによって、共発現を達成することができる。発現は、当該プラスミド上の２つのプロモーターによって、あるいはこの２つのカセットがＩＲＥＳ部位によって分離されている２シストロン性構成体の発現を誘導する１つのプロモーターによって誘導される。あるいは、別個の選択マーカーを有する別々のプラスミドを連続的に用いて、双方のタンパク質を発現する細胞系を構築することができる。
【００２０】
これらの融合で使用されるペプチドタグをＩＧＦ−ＩＩから誘導して作製し、ＣＩ−ＭＰＲに標的化することができる。あるいは、筋管表面のレセプターに選択的に結合するペプチドタグを採用することができる。当該ペプチドについては記載がある（Ｓａｍｏｙｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  Ｎｅｒｖｅ  ２２：４６０；  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，３２９，５０１）。Ｆｃレセプター、ＬＤＬレセプター、あるいはトランスフェリンレセプター等他の細胞表面レセプターもまた適切な標的であり、ＧＡＡの標的指向を促進させることができる。
【００２１】
本発明の別の実施例では、このペプチドタグをコードするカセットは、例えば７９１番の位置等、７０／７６  ｋＤａｌポリペプチドとＣ末領域との結合部で、野生型ＧＡＡコード配列内に挿入される。これによって１つのキメラポリペプチドができる。このペプチドタグはこの構成においてその同種レセプターに結合できない可能性があるため、プロテアーゼ開裂切断部位をペプチドタグのすぐ下流に挿入することもできる。正しく折り畳まれた形態でタンパク質が生成された際には、Ｃ末領域をプロテアーゼ処理によって切断することができる。
【００２２】
ヒト血清に通常みられるプロテアーゼが作用するプロテアーゼ開裂切断部位を採用することが所望される場合がある。このような方法で、標的化ＧＡＡをプロドラッグの形態で血流内に導入し、血清中に存在するプロテアーゼによって摂取されるよう活性化させることが可能である。これによって酵素の分配が改善される可能性もある。前記のように、このペプチドタグはＧＩＬＴタグあるいは筋特異的タグでも有りうる。
【００２３】
本発明の別の実施例において、タグは、酵素活性が維持されるようＧＡＡのＮ末端にて融合される（例３）。Ｎ末端融合の場合、異種シグナルペプチドが野生型ＧＡＡのシグナルペプチドに置換されることによって、酵素分泌レベルに影響を及ぼすことが可能である。
【００２４】
ＧＡＡシグナルペプチドはＥＲにて切断されず、このためＧＡＡはＥＲ内で膜結合状態となる（Ｔｓｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．１５（５）：９４５−９５２）。一部の細胞型では、ＥＲの膜トポロジーを保持したまま細胞膜に結合したこの酵素を確認することができる。これは恐らく、シグナルペプチドが切断されないことに起因する（Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ内，Ｖａｌｌｅ，ｅｄ．，２００１，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３３８９−３４２０）。配列分析から、シグナルペプチドに隣接する膜通過領域の存在が示唆されており、これによって恐らく、特定の状態下で酵素が膜に結合した状態のまま保持される。
【００２５】
シグナルペプチドを介したＧＡＡの膜への結合は、酵素が正しくリソソームへ指向する際の重要な寄与因子である可能性がある。これが起こるのに、２つの経路が考えられる。：一つは、膜結合が直接このタンパク質をリソソームへ向かわせる可能性である。もう一つは、膜結合によってＧＡＡがゴルジ体内に留まる時間が長くなり、このためタンパク質に付加するマンノース６リン酸が増加する可能性である。これは最終的に、リソソームへ選別される酵素の割合が増加する効果を有することとなる。いずれの場合も、膜結合が妨げられると、生成された酵素の大半が分泌され、また、後者のモデルが正しければ、この分泌された酵素が有するマンノース６リン酸は少なくなっていることとなる。
【００２６】
ＧＡＡのシグナルペプチドおよび隣接するアミノ酸配列をＧＡＡ用の代替シグナルペプチドに置換することによって、ＧＡＡの膜結合の崩壊を達成することができる。ＧＡＡのＧＩＬＴ標的指向に関して、キメラ遺伝子は、野生型シグナルペプチドの開裂切断部位あるいは適切な下流部位にて、ＧＡＡのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを包含するＩＧＦ−ＩＩタグを含有する。当該キメラ融合体は、高濃度に分泌され、且つＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する高親和性リガンドを含有する組換えＧＡＡの生成を目指すこととなる。
（細胞内標的ドメイン）
本発明は、このタンパク質に対する細胞性レセプターに特異的に結合するタンパク質あるいはタンパク質類似体を使用して、治療剤剤がリソソームへ標的指向できるようにする。細胞表面外側はトポロジー的に、エンドソーム、リソソーム、ゴルジ並びに小胞体の区画と等価である。即ち、適切なレセプター（１個あるいは複数。）との相互作用を介した分子のエンドサイトーシスによって、膜を通過することなく、任意のこれら区画への分子の輸送が可能となる。ある遺伝的欠損症が任意のこれら区画内における特定の酵素活性の欠損に帰結するのであれば、適切なレセプターに対するリガンドを貼付することによって治療性タンパク質の送達を達成することができる。
【００２７】
レセプター結合タンパク質を細胞膜からゴルジ体あるいは（且つ）小胞体へ向かわせる複数の経路の特性が明らかにされている。即ち、例えば１つ以上のこれら細胞内輸送経路を利用するＳＶ４０、コレラ毒素、あるいは植物性毒素リシン由来の標的部分を使用することによって、治療剤を細胞内の所望する部位に標的化させることができる。いずれの場合も、この物質が細胞外側に結合することによって取り込みが開始される。例えば、ＳＶ４０はＭＨＣクラスＩレセプターに結合し、コレラ毒素はガングリオシドＧＭ１に結合する。またリシンは、細胞表面にある末端のガラクトースによって糖脂質並びに糖タンパク質に結合する。この第一段階の後、分子は多様な経路によってＥＲに到達する。例えばＳＶ４０は、カベオラエンドサイトーシスに入り、ゴルジを経由しない２段階工程にてＥＲに到達し、一方コレラ毒素はカベオラエンドサイトーシスに入るがＥＲに到達する前にゴルジを通過する。
【００２８】
コレラ毒素あるいはリシンに関係する標的部分を使用する場合、コレラ毒素あるいはリシンの毒性を避けることが重要である。コレラ毒素とリシンは共に異種同義タンパク質であり、細胞表面結合領域と毒性に関係する触媒活性とが別個のポリペプチドに存在する。即ち、毒性に係わるポリペプチドを持たず、レセプター結合ポリペプチドを含有する標的部分を構成することができる。例えばリシンの場合、サブユニットＢはタンパク質の内在化に係わるガラクトース結合活性を有し、治療性タンパク質に融合させることができる。さらにサブユニットＡを用いて細胞内局在性を改善させる場合、正しく折り畳まれるが触媒的には不活性であるＡ鎖の変異体（ムテイン）を、サブユニットＢ−治療剤剤融合タンパク質と共に使用することができる。
【００２９】
ゴルジ体から外へ出たＥＲ標的指向性タンパク質を回収するＫＤＥＬレセプターを介して、ゴルジ体へ送達されたタンパク質を小胞体（ＥＲ）へ輸送することができる。即ち、治療性タンパク質をゴルジ体へ指向させる標的ドメインの末端にＫＤＥＦ部分を含有させることによって、その後ＥＲへ局在させることが可能となる。例えば、ｐＨ７．４あるいは約ｐＨ７．４およびｐＨ５．５あるいは約ｐＨ５．５の双方にて、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに結合する標的部分（例えば抗体、あるいはファージディスプレイ、酵母ツーハイブリッド、チップベースアッセイ、並びに溶液ベースアッセイ等のハイスループットスクリーニング等によって同定されるペプチド。）によって、治療性薬剤をゴルジ体へ指向させることができ、さらにＫＤＥＬモチーフを加えることでＥＲへの標的化が可能となる。
（リソソーム指向部分）
本発明によって治療性薬剤のリソソームへの標的化が可能となる。例えば、引き続いてリソソームを通過する細胞膜レセプターの結合を介して、標的指向が生じる場合がある。あるいは、引き続いて後期エンドソームを通過する細胞質レセプターの結合を介して標的指向が生じる場合もあり、その後治療剤剤は後期エンドソームからリソソームへ移動することができる。好ましいリソソーム標的指向機構には、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合が関係する。
（カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター）
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、哺乳類組織にて広く発現する、２７５  ｋＤａ
一本鎖の経膜糖タンパク質である。これはＭ６Ｐに結合する２つの哺乳類レセプターの内の１つであり、他方はカチオン依存性Ｍ６Ｐレセプターと呼ばれている。カチオン依存性Ｍ６Ｐレセプターでは、Ｍ６Ｐとの結合に２価カチオンを必要とするが、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは必要としない。これらのレセプターは、リソソーム酵素上の高マンノース炭水化物におけるＭ６Ｐ部分を認識し、これを介してリソソーム酵素類の輸送に重要な役割を果たしている。カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの細胞外ドメインは、レセプターの別々の部位にて様々な種類のリガンドと結合する１５の類似領域（「リピート」）を含有する。
【００３０】
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、２つの、Ｍ６Ｐに対する結合部位を含有する。：１つはリピート１−３に位置し、他方はリピート７−９に位置する。このレセプターは、μＭ単位の解離定数で１価のＭ６Ｐリガンドと結合し、２価のＭ６ＰリガンドとはｎＭ単位の解離定数で結合する。恐らくこれはレセプターのオリゴマー化に起因する。このレセプターによるＩＧＦ−ＩＩの取り込みは、このレセプターに対するリソソーム酵素のような多価Ｍ６Ｐリガンドの同時的結合によって増大する。
【００３１】
またカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、標的指向部位として利用することのできる３つ以上の別個のリガンドに対する結合部位を含有する。カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、ｐＨ  ７．０あるいは約ｐＨ  ７．０にて、約１４  ｎＭの解離定数でＩＧＦ−ＩＩと結合し、これは基本的にリピート１１との相互作用が仲介する。ＩＧＦ−ＩＩをリソソームへ標的指向させる際の機能と一致して、ｐＨ  ５．５あるいは約ｐＨ  ５．５にて解離定数は約１００倍増加し、酸性後期エンドソーム内でＩＧＦ−ＩＩの解離を促進する。このレセプターは、高分子量のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−ＩＩ形態物を結合することができる。
【００３２】
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに対するさらに別の有用なリガンドは、レチノイン酸である。レチノイン酸は２．５  ｎＭの解離定数でレセプターと結合する。レチノイン酸を用いたカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの光親和性標識は、ＩＧＦ−ＩＩあるいはＭ６Ｐのレセプターへの結合を妨げず、これはレチノール酸がレセプターの別の部位で結合することを示唆する。レチノイン酸がレセプターと結合すると、レセプターの細胞内分布が変わり、細胞質性媒体中のレセプターがより集合した状態となって、Ｍ６Ｐ修飾βグルコシダーゼの取り込みも促進される。レチノイン酸は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合能を妨げることなく、治療性薬剤にこれを結合させるのに利用することのできる光活性化部分を有する。
【００３３】
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターはまた、９μＭの解離定数で、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター（ｕＰＡＲ）と結合する。ｕＰＡＲは、大半の種類の細胞の表面上にあるＧＰＴアンカー型レセプターであり、ここでｕＰＡＲは接着分子として機能し、さらにプラスミノーゲンおよびＴＧＦ−βのタンパク質分解活性化にて機能する。ｕＰＡＲのＣＩ−Ｍ６Ｐへの結合によって、ＣＩ−Ｍ６Ｐはリソソームへ向かい、これによってその活性が調節される。即ち、ｕＰＡＲの細胞外ドメインあるいは、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合能を持つこれの一部分を治療剤剤に融合させることによって、薬剤をリソソームへ標的指向させることが可能である。
ＩＧＦ−ＩＩ
好ましい実施様態においてリソソーム標的化タンパク質は、マンノース６リン酸非依存的にカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター／ＩＧＦ−ＩＩレセプターと結合するタンパク質、ペプチド、あるいはその他の部分である。都合のよいことに、この実施様態は、ＬＳＤタンパク質の取り込みに関する通常の生物機構を模擬しているが、マンノース６リン酸には非依存的である。
【００３４】
例えば、ＩＧＦ−ＩＩ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡをＬＳＤ遺伝子カセットの３’末端へ融合させることによって、様々な種類の細胞に取り込まれ、リソソームへ輸送することが可能な融合タンパク質が創出される。あるいは、ＩＧＦ−ＩＩ前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡをＬＳＤ遺伝子カセットの３’末端へ融合させるともできる。；この前駆体は、哺乳類細胞内で開裂切断されてＩＧＦ−ＩＩ成熟ポリペプチドを作るカルボキシル末端部分を包含するが、ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドは割愛されることが好ましい（あるいはＬＳＤ遺伝子カセットの５’末端へ移す。）。一旦タンパク質が単離されればさらなる修飾の必要がないため、この方法はグリコシル化が係わる手法と比較して、簡便性および費用効果等多数の利点を有する。
【００３５】
ＩＧＦ−ＩＩは特異的にＭ６Ｐレセプターを標的指向することが好ましい。特に、高い親和性でＭ６Ｐレセプターに結合するが、認識されるほどの親和力では他の２つのレセプターと結合しないタンパク質に帰着する、ＩＧＦ−ＩＩポリペプチド内の変異は有用である。また、ＩＧＦ−ＩＩ／ＧＩＬＴ構成物の排斥を避けるため、ＩＧＦ-ＩＩを修飾して血清ＩＧＦ結合タンパク質との結合を最小にすることができる（Ｂａｘｔｅｒ（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２７８（６）：９６７−７６）。多数の研究が、ＩＧＦ結合タンパク質の結合に必要な、ＩＧＦ−Ｉ並びにＩＧＦ−ＩＩ中のアミノ酸残基に焦点を当てている。Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する高親和結合性の保持並びにＩＧＦ−結合タンパク質に対する親和性の低下に関して、これらのアミノ酸残基における変異を有する構成物を試験選抜することができる。例えば、ＩＧＦ−ＩＩのＰｈｅ２６をＳｅｒに置換すると、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合には影響を与えずに、ＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦＢＰ−１および−６に対する親和性が低下すると報告されている（Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：（１３）９２４６−５４）。Ｐｈｅ１９をＳｅｒ、並びにＧｌｕｅ９をＬｙｓ等、他の置換も有益であることが可能である。ＩＧＦ−ＩＩと共に高度に保存されているＩＧＦ−Ｉの一領域内における、単独あるいは共同的な相似性変異は、ＩＧＦ−ＢＰ結合の著しい低下に帰結する（Ｍａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８（４８）：１５８６３−７０）。
【００３６】
別のアプローチは、高い親和性でＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合することができる、ＩＧＦ−ＩＩの最小領域を同定することである。ＩＧＦ−ＩＩのＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプター結合に関係するアミノ酸残基は、その大半がＩＧＦ−ＩＩの一表面に群集する（Ｔｅｒａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（２３）：５５９０−７）。ＩＧＦ−ＩＩの３次構造は通常、３つのＳ−Ｓ結合によって維持されているが、ＩＧＦ−ＩＩのＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプター結合面上のアミノ酸配列を組み入れたペプチドを、正確な折り畳み構造と結合活性とを有するよう設計することができる。当該最小結合性ペプチドは、非常に好ましい標的指向部位である。４８−５５番アミノ酸周辺領域に基づいて設計されたペプチドを、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合性に関して試験することができる。あるいは、ペプチドの無作為ライブラリーを、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合能に関して、酵母ツーハイブリッド法あるいはファージディスプレイ型アッセイによって試験選抜することができる。
【００３７】
（血液脳関門）
リソソーム蓄積症に対する治療における一つの対処すべき問題点は、これらの疾患の多くでは神経学的事項が強く関係している点である。血流内に投与した治療性酵素は通常、血液脳関門を通過することができず、このため疾患に伴う神経学的症状を軽減することができない。しかしＩＧＦ−ＩＩは、経細胞輸送を介して血液脳関門を通過する輸送を促進すると報告されている（Ｂｉｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４６（１−３）：２４７−７７９）。即ち、適切に設計されたＧＩＬＴ構成物は血液脳関門を通過できるはずであり、リソソーム蓄積症に伴う神経症状の治療手段を提供する最初のものである。この構成物は例１２に記載したようにＧＵＳマイナス  マウスを使用して試験することができる。血液から神経組織に到達することのできる標的化治療剤の設計、構成、並びに試験に関する詳細は、２００１年１０月１６日に提出されたＵ．Ｓシリアル番号Ｎｏ．６０／３２９，６５０、並びに２００２年４月３０日に提出されたＵ．Ｓシリアル番号Ｎｏ．１０／１３６，６３９にて開示されている。
【００３８】
（ＩＧＦ−ＩＩの構造）
ＩＧＦ−ＩＩのＮＭＲ構造は、２つのグループが解明している（Ｔｅｒａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（２３）：５５９０−７；Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２）：３８５−４０１）（例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  登録記号  １ＩＧＬを参照する。）。ＩＧＦ−ＩＩの全体的特徴はＩＧＦ−Ｉおよびインスリンに似る。ＩＧＦ−ＩＩのＡ領域並びにＢ領域は、インスリンのＡ鎖並びにＢ鎖に相当する。２次構造の特徴には、Ｂ領域の１１−２１番アミノ酸残基に渡るアルファへリックスが２２−２５番残基における反転部によって２６−２８番残基における短いベータ鎖と繋がっている点が含まれる。ＩＧＦ−ＩＩのＡ領域では、４２−４９番並びに５３−５９番残基に渡るアルファヘリックスが逆平行に位置し、これらはＢ領域のヘリックスに対し垂直にてなっている。３つあるＳ−Ｓ結合の内の２つ並びに保存されている疎水性残基によって形成された疎水性分子群が、これら２次構造の特性を安定化している。Ｎ末端並びにＣ末端は、３１−４０番残基の間の領域のように、依然明確には確定されてない。
【００３９】
ＩＧＦ−ＩＩはＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６Ｐレセプター並びにＩＧＦ−Ｉレセプターに、比較的高い親和性で結合し、インスリンレセプターとはより低い親和性で結合する。ＩＧＦ−ＩＩはまた、多数の血清ＩＧＦＢＰと相互作用する。
【００４０】
（ＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６Ｐレセプターへの結合）
ＩＧＦ−ＩＩの４８−５０番残基（Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ）をインスリンの相当する残基（Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ）に置換する、あるいは５４−５５番残基（Ａｌａ  Ｌｅｕ）をＩＧＦ−Ｉの相当する残基（Ａｒｇ  Ａｒｇ）に置換すると、ＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６Ｐレセプターへの結合性低下に帰着するが、ＩＧＦ−Ｉ並びにインスリンレセプターへの結合は維持される（Ｓａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（３１）：２０６２５−３５）。
【００４１】
ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩは、４８−５０番残基の領域に共に同一の配列および構造を持つが、ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する親和性は１０００倍異なる。ＮＭＲ構造分析によって、ＩＧＦ−ＩＩの５３−５８番残基の領域（ＩＧＦ−Ｉの５４−５９番残基）にて、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩとの構造的差異が示されている。：ＩＧＦ−ＩＩ  はＩＧＦ−Ｉよりもアルファヘリックスがより明確であり、ＩＧＦ−Ｉとは異なり５３番並びに５４番残基周辺の主鎖に折れ曲がりは存在しない（Ｔｏｒｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２）：３８５−４０１）。この構造的差異はＩＧＦ−ＩＩ内のＡｌａ５４およびＬｅｕ５５がＩＧＦ−ＩではＡｒｇ５５並びにＡｒｇ５６に置き換わっていることに関係する。この領域の荷電性残基の存在が直接ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合を妨げる、あるいは荷電性残基によって生じる構造変化がＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合変化を生みだすといういずれかの可能性がある。いずれの場合も、ＩＧＦ−Ｉの２つのＡｒｇが非荷電性残基に置換されていることが、ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する高親和性をもたらした（Ｃａｃｃｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｉａｎ  １４（３）：１４６−５３）。即ち、これの部位における正に荷電したアミノ酸残基の存在が、ＩＧＦ−ＩＩへの結合性の失活に関係している。
【００４２】
ＩＧＦ−ＩＩは、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのリピート１１に結合する。実際、リピート１１のみをカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの膜通過領域並びに細胞質領域に融合させたミニレセプターは、ＩＧＦ−ＩＩに結合することができ（完全長レセプターの親和力の約１０分の１の親和力で。）、ＩＧＦ−ＩＩの内在化とリソソームへの送達を仲介する（Ｇｉｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３６９７−３３７０３）。Ｍ６Ｐレセプターの領域１１の構造は判明している（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  の登録記号は１ＧＰ０  並びに  １ＧＰ３。；  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＥＭＢＯ  Ｊ．２１（５）：１０５４−１０６２）。推定されるＩＧＦ−ＩＩ結合部位は、ＩＧＦ−ＩＩの疎水性アミノ酸と相互作用すると考えられる疎水性ポケットであり、候補となるＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸には、８番ロイシン、４８番フェニルアラニン、５４番アラニン、および５５番ロイシンが含まれる。リピート１１はＩＧＦ−ＩＩと結合することができるが、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのより大きな部分（例えばリピート１０−１３、あるいは１−１５）を含有する構成物は一般に、より大きな親和力で、またより大きくｐＨに依存してＩＧＦ−ＩＩと結合する（例えばＬｉｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２６）：２３９８６−２３９９１を参照する）。
【００４３】
（ＩＧＦ−Ｉレセプターへの結合）
ＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸残基、Ｔｙｒ２７をＬｅｕに、あるいはＬｅｕ４３をＶａｌに、Ｓｅｒ２６をＰｈｅに置換すると、ＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−Ｉレセプターに対する親和性がそれぞれ９４倍、５６倍、４倍低下する（Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２）：３８５−４０１）。ヒトＩＧＦ−ＩＩの１−７番残基が欠失するとＩＧＦ−Ｉレセプターへの親和性が３０倍減少し、同時にラットＩＧＦ−ＩＩレセプターへの親和性が１２倍増加する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３０）：１８０１３−８）。ＩＧＦ−ＩＩのＮＭＲ構造は、Ｔｈｒ７が、９Ｃｙｓ−４７ＣｙｓのＳ−Ｓ結合の近辺且つ４８番Ｐｈｅ並びに５０番Ｓｅｒ残基の近くに位置していることを示している。Ｔｈｒ７とこれらのアミノ酸残基との相互作用は、ＩＧＦ−Ｉレセプター結合に必要な、たわみやすいＮ末端６残基ペプチドを安定化させることができる（Ｔｅｒａｓａｗａ  ｅｔ  ｌａ．（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２（２３）５５９７−７）。同時にこの相互作用は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合を調節することができる。ＩＧＦ−ＩＩのＣ末端（６２−６７番残基）切断もまた、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの親和性を５倍低下させる模様である（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８１（２）：９０７−１４）。
【００４４】
（ＩＧＦ−ＩＩの欠失変異）
ＩＧＦ−Ｉレセプター並びにカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに対する結合面は、ＩＧＦ−ＩＩの別個の面にある。構造データおよび変異データに基づいて、ヒトＩＧＦ−ＩＩよりも著しく小さい機能的なカチオン非依存性Ｍ６Ｐ結合領域を構築することができる。例えば、アミノ末端１−７番アミノ酸あるいは（且つ）カルボキシル末端６２−６７番残基は削除あるいは置換することができる。さらに、２９−４０番アミノ酸を、これ以外の部分のポリペプチドの折り畳みあるいはカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合性を変えることなく、削除あるいは置換することができる可能性もある。即ち、８−２８番および４１−６１番アミノ酸を包含する標的部分を構築することができる。これらのアミノ酸の区間は恐らく、直接連結する、あるいはリンカーによって分けられた状態にすることができる。あるいは、８−２８番および４１−６１番アミノ酸を別個のポリペプチド鎖上にて提供することができる。ＩＧＦ−ＩＩと相同性があり、ＩＧＦ−ＩＩの構造と密接に関係する３次構造を持つインスリンの相当する領域には、たとえ別個のポリペプチド鎖に存在していても、再び正しく折り畳まれて適正な３次構造となることを可能にするのに十分な構造的情報が存在している（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２７９−２８１）。即ち、例えば、８−２８番アミノ酸あるいはこれらの保存的置換変異体を治療剤剤に融合させることができると考えられる。；この結果できる融合タンパク質を、４１−６１番アミノ酸あるいはこれらの保存的置換変異物と混和して患者に投与することができると考えられる。
【００４５】
ＩＧＦ−ＩＩタグの正確な提示および折り畳みを促進する目的で、ＩＧＦ−ＩＩのより長い部分を使用することができる。例えば、１−６７番もしくは１−８７番アミノ酸残基、あるいは全前駆体を包含するＩＧＦ−ＩＩタグを使用することができる。
【００４６】
（ＩＧＦ結合タンパク質への結合）
ＩＧＦ−ＩＩ並びに関連する構成物を修飾して、ＩＧＦＢＰ類への親和性を低下させ、これによって標的タンパク質の生物利用性を増進させることができる。
【００４７】
ＩＧＦ−ＩＩの２６番フェニルアラニンをセリン残基に置換すると、ＩＧＦＢＰ１〜５への結合性が５〜７５倍低下する（Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１３）：９２４６−５４）。ＩＧＦ−ＩＩの４８−５０番残基をスレオニン−セリン−イソロイシン残基に置換すると、大部分のＩＧＦＢＰへの結合が１００倍以上低下する（Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１３）：９２４６−５４）。；しかし、これらのアミノ酸残基はカチオン非依存性マンノース６リン酸レセプターの結合にも重要である。ＩＧＦ−Ｉレセプターへの結合を妨げるＹ２７Ｌ置換は、ＩＧＦＢＰ３および酸不安定性サブユニットとの三重複合体形成を干渉する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４４）：２７９３６−４２）。；この三重複合体は、循環系内の大半のＩＧＦ−ＩＩを捕捉する（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ  Ａｎａｌ．１３（４）：１６６−７２）。また、ＩＧＦ−ＩＩの最初の６残基を削除すると、ＩＧＦＢＰ結合を干渉する（Ｌｕｔｈｉｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５（２）：４８３−９０）。
【００４８】
ＩＧＦ−ＩのＩＧＦＢＰ類との相互作用に関する研究から、１６番フェニルアラニンをセリンに置換しても２次構造に影響しないが、ＩＧＦＢＰ結合性が４０から３００倍低下することがさらに明らかになった（Ｍａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８（４８）：１５８６３−７０）。また９番グルタミンをリジンに変えても、ＩＧＦＢＰ結合性は著しく低下する。さらに、９番リジン／１６番セリンの二重変異体は、最も低いＩＧＦＢＰ結合性を呈した。ＩＧＦ−ＩＩにおけるこれらの変異体については、これまでに試験されていないが、ＩＧＦ−Ｉ並びにＩＧＦ−ＩＩのこの領域間のアミノ酸配列の保存性から、ＩＧＦ−ＩＩで同様の変異を起こした場合（１２番グルタミン酸をリジン／１９番フェニルアラニンをセリン）、同様の影響が認められるであろうことが示唆される。
【００４９】
（ＩＧＦ−ＩＩとの相同性）
ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列、あるいはカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合に影響を及ぼすこれらの一部分を参照配列として使用して、本発明の方法にて成功するという合理的な期待を持つのに十分なアミノ酸類似性を候補配列が有しているか否かを判定することもできる。様々な配列は、ヒトＩＧＦ−ＩＩと少なくとも７０％の類似性あるいは６０％の同一性があることが好ましく、より好ましくは少なくとも７５％の類似性あるいは６５％の同一性があり、少なくとも８０％の類似性あるいは７０％の同一性があることがさらに好ましい。
【００５０】
ペプチド領域候補が必要とされるパーセンテージのヒトＩＧＦ−ＩＩとの類似性あるいは同一性を有しているか否かを判定するため、最初に、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７に記載されているダイナミック・プログラミング・アルゴリズムを、ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：１０９１５−１０９１９の図２に記載されているＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスと組み合わせて使用し、候補アミノ酸配列とヒトＩＧＦ−ＩＩとを配列比較する。本発明に関して、ギャップ挿入ペナルティの適切な値は−１２であり、ギャップ伸張ペナルティに適切な値は−４である。ＧＣＧプログラム・スイート（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）等、Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムとＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスとを使用する配列比較を実行するコンピュータープログラムは市販されており、当分野の技術者によって広く使用されている。
【００５１】
候補配列と参照配列との比較を実行すると、パーセント類似性スコアを計算することもできる。互いの類似性に従って、各配列の個々のアミノ酸を順に比較する。比較する２つのアミノ酸に対応するＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスにおける値がゼロあるいはマイナス値である場合、ペアワイズ類似性スコアはゼロである。；そうでない場合、ペアワイズ類似性スコアは１．０である。この一次類似性スコアは、比較するアミノ酸のペアワイズ類似性スコアの総和である。次にこの一次スコアを、候補配列あるいは参照配列のより小さい方のアミノ酸数で割って標準化する。この標準化した一次スコアが類似性パーセントである。あるいは、同一性パーセントを計算するために、各配列の配列比較するアミノ酸を再び続けて比較する。アミノ酸が同一ではない場合、ペアワイズ同一性スコアはゼロである。；そうでない場合、ペアワイズ同一性スコアは１．０である。一次同一性スコアは、同一性比較したアミノ酸の総和である。この一次スコアを、候補配列あるいは参照配列のより小さい方のアミノ酸数で割って標準化する。この標準化した一次スコアが同一性パーセントである。類似性パーセント並びに同一性パーセントを計算する目的のためには、挿入並びに欠失は考慮しない。従って、初回配列比較ではギャップペナルティを使用するが、この計算では使用しない。
【００５２】
（ＩＧＦ−ＩＩの構造類似体）
判明しているヒトＩＧＦ−ＩＩ並びにカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの構造によって、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，２２６，６０３並びにＮｏ．６，２７３，５９８にて議論されているもの等、コンピューター支援の設計原理を用いて、ＩＧＦ−ＩＩ類似体並びに他のカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合タンパク質の設計が可能である。例えば、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．のＢｉｏｓｙｍから市販されているＩＮＳＩＧＨＴＩＩ、ＤＩＳＣＯＶＥＲ，あるいはＤＥＬＰＨＩ、もしくはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．から市販されているＱＵＡＮＴＡあるいはＣＨＡＲＭＭ等、一般的なモデル作製コンピュータープログラムを備えたコンピューターで、周知されているＩＧＦ−ＩＩの原子座標が得られる。これらあるいはその他のプログラムソフトウエアによって、分子構造解析並びに、構造並びに分子内相互作用に対する分子交換の影響を予測するシミュレーションが可能となる。例えば、このソフトウエアを使用して、分子内水素結合あるいはイオン結合をさらに形成する能力を有する修飾類似体の同定を行うことができ、標的レセプターに対する類似体の親和性が改善される。
【００５３】
またこのソフトウエアによって、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合面の少なくとも一部分に表れるものに似た構造的化学的特性を有するペプチド並びに有機分子の設計が可能となる。このレセプター結合面に寄与するものは主に、レセプター結合面を限定するアミノ酸群の側鎖内に存在する、化学的に相互作用する部分の空間配置であるため、本発明の好ましい一様態は、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合面を構成するアミノ酸側鎖にある化学部分の空間関係を模擬する空間関係において化学的に相互作用する部分を持つ骨格を有する合成有機分子の設計並びに作製に関係する。好ましい化学部分には、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合面を構成するアミノ酸のアミノ酸側鎖によって限定される化学部分が含まれるが、これらに限定されない。よって、ＩＧＦ−ＩＩ類似体のレセプター結合面はアミノ酸残基から構成される必要はなく、そこに位置する化学部分から構成される必要があることが理解される。
【００５４】
例えば、関連する化学部分の同定に基づいて、一般的なコンピュータープログラムを使用する技術者は、適切なキャリアーとなる骨格上に位置するレセプター相互作用性化学部分を有する小分子を設計することができる。有用なコンピュータープログラムは、例えば、Ｄｉｘｏｎ（１９９２）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １０：３５７−３６３；Ｔｓｃｈｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３８６３−３８７０；並びにＥｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：１９９−２２１に記載されており、参考のため、これらの公開文献をこの明細に添付する。
【００５５】
「ＣＡＶＥＡＴ」と名付けられた、ある一コンピュータープログラムは、例えば、所望する化学部分の空間位置を有する構造に関して、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ等のデータベースを検索する（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ」（Ｒｏｂｅｒｔ，Ｓ．Ｍ．編）内Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．ｐｐ  １８２−１９６（１９８９））。このＣＡＶＥＡＴというプログラムは、テンダミスタット３次元構造における選択したアミノ酸側鎖の配向に基づいて、７４アミノ酸残基のαアミラーゼインヒビターであるテンダミスタット類似体を設計するために使用されている（上記Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９））。
【００５６】
あるいは、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合活性を模擬する一連の類似体の同定に基づき、技術者が定量的構造活性相関（ＱＡＳＲ）を導き、第三のモルフォゲン類似体の新規設計を支援するのを援助する、様々なコンピュータープログラムを技術者が使用する場合もある。他の有用なコンピュータープログラムは、例えばＣｏｎｎｏｌｌｙ−Ｍａｒｔｉｎ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：５８７−６１３；Ｄｉｘｏｎ（１９９２）上記；並びにＷａｓｚｋｏｗｙｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｎｍ．３７：３９９４−４００２にて記載されている。
【００５７】
（融合接合部）
ＧＡＡがペプチドタグあるいは標的ドメインを有する融合タンパク質として発現される場合、このペプチドタグをＧＡＡポリペプチドに直接融合させる、あるいはリンカーによってＧＡＡポリペプチドから離れた状態にすることができる。アミノ酸リンカーには、天然タンパク質でその位置に現れるもの以外のアミノ酸配列が組み入れらており、一般に柔軟性を持つよう、あるいは２つのタンパク質部分の間にαヘリックス等の構造が挿入されるよう設計される。リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＰｒｏあるいはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ等、比較的短いものであることができ、もしくは、例えば１０−２５アミノ酸の長さ等、より長いものであることができる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）から成る３〜４個の同一部分から成る柔軟な繰返しリンカー、並びにアミノ酸配列（ＥＡＡＡＫ）から成る２〜５個の同一部分から成るαヘリックス繰返しリンカーが記載されている（Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５７：８２９−８３８）。ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質に関して、ＧＧＧＧＴＶＧＤＤＤＤＫという他のリンカーの使用も報告されている（ＤｉＦａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６：４０７−４１３）。ヒト血清タンパク質のαヘリックス部位が組み入れられたリンカーを使用して、リンカー領域の免疫抗原性を最小にすることができる。
【００５８】
融合接合部位は、正しい折り畳みおよび融合相手双方の活性を促し、且つ成熟体となる前にＧＡＡポリペプチドからペプチドタグが分離するのを防ぐよう、注意して選択されるべきである。図３は、図２にて説明するＧＡＡタンパク質の構成モデルに基づいて、ＧＩＬＴタグＧＡＡを作製するための４つの典型的な方策を説明する。
１．アミノ末端にタグを融合する。
２．三つ葉型領域と成熟体部分との間にタグを挿入する。
３．成熟体部分とＣ末端領域との間にタグを挿入する。
４．切断したＧＡＡのＣ末端にタグを融合し、Ｃ末領域を共発現させる。
例えば、標的ドメインは、直接あるいはスペーサーによって、ＧＡＡの７０番アミノ酸に融合させることができる。これはタンパク質の発現、ＧＡＡ部分の触媒活性、および例４に記載した標的部分による正しい標的指向が可能な部位である。あるいは、成熟ポリペプチドからＧＡＡのＣ末端領域が分離する開裂部位、あるいはその近辺に、標的ドメインを融合させることができる。これによって、内部に標的ドメインを持つＧＡＡタンパク質の合成が可能となり、これは、随意で開裂分離させて標的ドメインから、開裂部位の位置に応じて成熟ポリペプチドあるいはＣ末端領域を分離することができる。あるいは、発現構成物のオープンリーディングフレーム内にＣ末端配列を組み入れることなく、７９１番部位の近辺にて成熟ポリペプチドを融合タンパク質として合成することができる。
【００５９】
ＧＩＬＴタグの折り畳みを促すため、融合接合部位に隣接するＧＡＡアミノ酸残基を修飾することができる。例えば、ＧＡＡのシステイン残基がＧＩＬＴタグの正しい折り畳みを妨げる可能性があるため、ＧＡＡの末端９５２番システインを欠失させる、あるいはセリンと置換させてＧＩＬＴタグのＣ末端に適合させることができる。また、ＧＩＬＴタグは、末尾Ｃｙｓ９５２の直ぐ手前に融合させることもできる。末尾Ｃｙｓ９５２をセリンに変異させると共に、末尾から２番目となるＣｙｓ９３８をプロリンに換えることができる。
【００６０】
あるいは、タグをＧＡＡポリペプチドに、化学的に結合させることができる。
【００６１】
（標的部分の親和性）
標的部分は、マイクロ未満の解離定数で標的レセプターと結合することが好ましい。一般に、解離定数がより低ければ（例えば１０−７  Ｍ未満、あるいは１０−８  Ｍ未満、１０−９  Ｍ未満。）、より好ましい。解離定数は、Ｌｉｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２６）：２３９８６−２３９９１に記載されているような、表面プラスモン共鳴によって測定することが好ましい。標的レセプターの細胞外ドメイン（例えばカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのリピート１−１５。）の可溶形態を作り、アビジン−ビオチン相互作用を介してチップに固定する。チップ上を、標的部分を通過させて反応速度定数および平衡定数を検出し、チップ表面に会合する質量の変化を測定することによって算出する。
（アミノ酸配列類似性の計算）
触媒領域あるいはシャペロン領域、細胞内標的ドメインとして作用する可能性のある、開示したアミノ酸配列の異型体を作る目的で、例えばＩＧＦ−ＩＩ等、この明細にて開示される天然に存在するαグリコシダーゼあるいは細胞内標的ドメインのうち任意の１つ以上を参照配列として使用して、候補配列が本発明の方法において合理的な成功の可能性を持つのに十分なアミノ酸類似性を有するか否かを判定することができる。例えば、触媒領域の異型アミノ酸配列は、開示した、天然に存在する酸性アルファグルコシダーゼ触媒領域に対し５０％以上の類似性もしくは３０％以上の同一性を有し、好ましくは５５％以上の類似性もしくは３５％以上の同一性、より好ましくは６０％以上の類似性もしくは４０％以上の同一性、より好ましくは６５％以上の類似性もしくは４５％以上の同一性、より好ましくは７０％以上の類似性もしくは５０％以上の同一性、より好ましくは７５％以上の類似性もしくは５５％以上の同一性、より好ましくは８０％以上の類似性もしくは６０％以上の同一性、より好ましくは８５％以上の類似性もしくは６５％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の類似性もしくは７０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の類似性もしくは７５％以上の同一性、さらに最も好ましいのは８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、あるいは９５％の同一性を有する。シャペロン領域の異型アミノ酸配列は、開示した、天然に存在する酸性アルファグルコシダーゼのシャペロン領域に対し４０％以上の類似性もしくは２０％以上の同一性を有し、好ましくは４５％以上の類似性もしくは２５％以上の同一性、より好ましくは５０％以上の類似性もしくは３０％以上の同一性、より好ましくは５５％以上の類似性もしくは３５％以上の同一性、より好ましくは６０％以上の類似性もしくは４０％以上の同一性、より好ましくは６５％以上の類似性もしくは４５％以上の同一性、より好ましくは７０％以上の類似性もしくは５０％以上の同一性、より好ましくは７５％以上の類似性もしくは５５％以上の同一性、より好ましくは８０％以上の類似性もしくは６０％以上の同一性、より好ましくは８５％以上の類似性もしくは６５％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の類似性もしくは７０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の類似性もしくは７５％以上の同一性、さらに最も好ましいのは８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、あるいは９５％の同一性を有する。標的ドメインの異型アミノ酸配列は、開示した、天然に存在する標的ドメインに対し７０％以上の類似性もしくは６０％以上の同一性を有し、より好ましくは７５％以上の類似性もしくは６５％以上の同一性、より好ましくは８０％以上の類似性もしくは７０％以上の同一性、より好ましくは８５％以上の類似性もしくは７５％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の類似性もしくは８０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の類似性もしくは８５％以上の同一性、さらに最も好ましいのは９０％の同一性、あるいは９５％の同一性を有する。
【００６２】
候補ペプチドが、参照ポリペプチドあるいはペプチドオリゴマーに対して必要とする割合の類似性あるいは同一性を有しているか否かを判定するため、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７にて記載されているダイナミック・プログラミング・アルゴリズムを用いて、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２），「Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ」ＰＮＡＳ（１９９２  Ｎｏｖ），８９：１０９１５−１０９１９の図２に記載されているＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスを併用し、候補アミノ酸配列と参照アミノ酸配列とを最初に配列比較する。本発明に関して、ギャップ挿入ペナルティの適切な値は−１２であり、ギャップ伸張ペナルティの適切な値は−４である。ＧＣＧプログラムスイート（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）等、Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムとＢＬＯＡＵＭ６２マトリックスとを使用して配列比較を実行するコンピュータープログラムは市販されており、当分野の技術者によって広く使用されている。
【００６３】
候補配列と参照配列との配列比較を実行すると、パーセント表示の類似性スコアが算出される場合がある。各配列の個々のアミノ酸は、類似性に従って連続的に互いに比較される。この２つの配列比較するアミノ酸に対応する、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス内の値がゼロあるいはマイナス値であれば、ペアワイズ類似性スコアはゼロである。；そうでなければペアワイズ類似性スコアは１．０である。一次類似性スコアは、比較したアミノ酸のペアワイズ類似性スコアの総和である。次にこの一次スコアを、候補配列あるいは参照配列のより小さい方のアミノ酸数で割って標準化する。この標準化した一次スコアは、パーセントで表した類似性である。あるいは、同一性パーセントを計算するため、各アミノ酸配列の配列比較したアミノ酸を再び連続的に比較する。アミノ酸が同一でなければ、ペアワイズ同一性スコアはゼロであり、他方のペアワイズ同一性スコアは１．０１である。この一次同一性スコアは、同一である比較したアミノ酸の総和である。次にこの一次スコアを、候補配列あるいは参照配列のより小さい方のアミノ酸数で割って標準化する。標準化した一次スコアは、パーセンテージで表す同一度である。従って初回の配列比較ではギャップペナルティを用いるが、この計算では用いない。
（投与）
本発明に従って作製した標的化治療剤は、任意の経路で哺乳類レセプターに投与することができる。即ち、適合性に応じて、投与は経口あるいは非経口であることができ、これには静脈経由投与経路並びに腹腔内投与経路が含まれる。さらに、投与は治療剤剤から成るボーラスの定期注入によるものであることができ、もしくは、外部にある貯蔵物（例えば静脈注入用バッグ）から静脈経由投与あるいは腹腔内投与によって、より連続的に行うことができる。一部の特定の実施様態において、本発明の治療剤剤は製薬等級であることができる。即ち、一部の実施様態は、ヒトに投与するのに必要とされる精製標準法並びに品質管理に従う。また獣医学への利用は、この明細で使用される使用目的の範囲内に収まる。
【００６４】
獣医学およびヒトの双方のために、医療に使用するための本発明の治療剤剤から成る組成物は、典型的には、これらのための薬学的に許容される担体および随意で他の成分（１個または複数）と合わせて、当該治療剤剤を包含する。この担体は、組成物の他の成分に適合し、これの受容者にとって心身有害なものではないという点で、「許容される」ものであることができる。これに関して、薬学的に許容される担体とは、薬学的投与に適合する任意且つ全ての溶媒、並びに分散媒質、コーティング剤、抗細菌剤並びに抗真菌剤、等張剤並びに吸収遅延剤等を包含することが意図される。薬学的活性物質のための当該溶媒並びに薬剤の使用については、当分野で周知されている。一般的な溶媒あるいは薬剤がこの活性化合物に適合しない場合を除き、この組成物におけるこれらの使用が企図される。また、補助的活性物質（本発明に従って同定されるもの、あるいは（且つ）当分野で周知されているもの。）をこの組成物に組み入れることができる。便利のため、この組成物を単位投与量形態物にて提供することができ、組成物は薬学・微生物学の分野でよく周知されている任意の方法によって調製することができる。一般に、一部の組成物は、治療剤剤を液体担体あるいは微細に分割された固体担体あるいはその両方と合わせ、次に必要に応じてこの製品を所望する組成物に成形することによって調製される。
【００６５】
本発明の製薬組成物は、意図する投与経路に適合するよう調剤される。投与経路の例には、例えば静脈内投与、皮膚内投与、吸入、経皮（局所）投与、経粘膜投与、並びに直腸投与等、経口あるいは非経口投与が含まれる。非経口投与、皮膚内投与、あるいは皮下投与のために使用される溶液あるいは懸濁液には、以下の成分を含めることができる。：注入用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、あるいは他の合成溶媒等の滅菌稀釈剤；ベンジルアルコールあるいはメチルパラベン等の抗細菌剤；アスコルビン酸あるいは重硫酸ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸等のキレート剤；酢酸、クエン酸、あるいはリン酸等の緩衝液、並びに塩化ナトリウムあるいはデキストロース等の浸透圧調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸あるいは水酸化ナトリウム等、酸あるいは塩基で調整することができる。
【００６６】
経口あるいは非経口投与のための有用な溶液は、薬学分野にてよく周知されている任意の方法によって調製することができ、例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（Ｇｅｎｎｎａｒｏ，Ａ．，ｅｄ．），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．，１９９０にて記載されている。また経口投与のための組成物は、バッカル投与のためのグリコール酸塩、直腸投与のためのメトキシサリチル酸、あるいは経膣投与のためのｃｕｔｒｉｃ酸を包含することができる。経口調製物は、ガラスあるいはプラスチックでできたアンプル、使い捨て注射器、あるいは複数回投与用バイアルに封入することができる。また直腸投与のための座薬は、ココアバター、その他のグリセリド、あるいは常温で固体且つ体温で液体となる他の組成物等の非刺激性の医薬品添加物と共にこの薬剤を混合することによって調製することができる。また組成物は、例えば、ポリエチレングリコール等のポリアキレングリコール、植物由来の油、硬化ナフタリン等を包含することができる。直接投与のための組成物は、グリセロール並びに高粘度の他の構成物を包含することができる。これら治療剤剤のための、潜在的に有用な経口投与用担体には、エチレン−酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型輸滴システム、並びにリポソームが含まれる。吸入投与のための組成物は、医薬品添加物として例えば乳糖を含有することができ、あるいは、例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩並びにデオキシコール酸塩等の水性溶液、もしくは点鼻液の形態で投与するための油性溶液、もしくは経鼻的に投与するジェルとして存在ことができる。また直腸送達のためには停留浣腸を用いることができる。
【００６７】
経口投与に適する本発明の組成物は、カプセル、ゼラチンカプセル、小袋、錠剤、トローチ、あるいはロゼンジ等、各々が前決定された量の薬剤を含有する個別単位物の形態；粉末あるいは顆粒の形態；水性液体あるいは非水性液体の溶液あるいは懸濁液の形態；水中油型乳液あるいは油中水型乳液の形態、であることができる。またこの治療剤剤は、ボーラス、舐剤、あるいは軟膏の形態で投与することができる。錠剤は、随意で１つ以上の補助成分と共に、圧縮あるいは成形することによって作ることができる。圧縮錠剤は、適切な機械にて、粉末あるいは顆粒等非流動形態にある薬剤を圧縮することによって調製することができ、随意で結合剤、潤滑剤、不活性稀釈剤、界面活性剤あるいは分散剤と混合され得る。成形錠剤は、適切な機械にて、粉末にした薬剤と不活性液体稀釈剤で湿潤させた適切な担体との混合物を成形することによって作製することができる。
【００６８】
経口組成物は一般に、不活性稀釈剤あるいは食用の担体を包含する。経口的な治療剤剤投与という目的のため、活性化合物を医薬品添加物に取り入れることができる。マウスウオッシュとして使用するための液体担体を使用して調製される経口組成物は、液体担体中にこの化合物を包含し、経口的に投与されて迅速に摂取され、吐き出されるかあるいは飲み込まれる。薬学的に適合する結合剤および（あるいは）添加物を、組成物の一部として包含させることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、任意の以下の成分、あるいは同様の性質の化合物を含有することができる。：ミクロクリスタリンセルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチン等の結合剤、澱粉あるいは乳糖等の医薬品添加物、アルギン酸もしくはプリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、トウモロコシ澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムあるいはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）等の潤滑剤、二酸化ケイ素コロイド等の滑剤、ショ糖あるいはサッカリン等の甘味料、もしくは、ペパーミントあるいはサリチル酸メチル、オレンジ香料等の香味剤。
【００６９】
注入使用に適する製薬組成物は、滅菌水溶液（水に可溶性の場合。）もしくは分散液、並びに滅菌注入液あるいは分散液を即座に調製するための滅菌粉末を包含することができる。静脈経由投与については、適切な担体として、生理食塩水、制菌水、クレモホールＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、あるいはリン酸緩衝生理食塩水液（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は滅菌することができ、さらに容易に注射可能な状態となる程度に流動的であることができる。組成物は製造状態および保管状態下で安定であることができ、細菌並びに真菌等の微生物の汚染作用から組成物を保護することができる。担体は、例えば水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、並びに液体ポリエチレングリコール等。）、並びにこれらから成る適切な混合物を含有する溶媒あるいは分散溶媒であることができる。例えば、レシチン等のコーティングを使用することによって、分散の場合必要とされる粒子サイズを維持することによって、並びに界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用に対する予防は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、様々な抗細菌剤並びに抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、例えば糖類、マンニトール並びにソルビトール等の高分子アルコール、塩化ナトリウム等の等張剤を、組成に加えることが好ましいこととなる。注入可能な組成物の長時間に渡る吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム並びにゼラチン等、吸収を遅らせる薬剤を組成に加えることによって達成することができる。
【００７０】
滅菌注入用溶液は、必要に応じて、先に列挙した１成分あるいは成分の組み合わせと共に、必要量の活性化合物を適切な溶媒に混合し、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散剤は、この活性化合物を、基本となる分散溶媒と先に列挙したものの中から必要とされる他の成分とを含有する滅菌担体に混合することによって調製される。滅菌注入用溶液調製に使用するための滅菌粉末の場合、調製方法には、真空乾燥並びに、前もって濾過滅菌した任意の所望する別の成分から成る溶液から、この成分が加わった活性成分の粉末を作り出す凍結乾燥が含まれる。
【００７１】
関節内投与に適する組成物は、例えば水性ミクロクリスタリン懸濁液から成る形態等、ミクロクリスタリンの形態であることができる治療剤剤から成る滅菌水性調製物の形態であることができる。また、関節内投与並びに眼投与の双方に関して、リポソーム組成物あるいは生分解性ポリマー系を本治療剤剤に使用することができる。
【００７２】
眼処置を含め、局所投与に適切な組成物には、リニメント剤、ローション剤、ゲル剤、塗布剤、クリームあるいは軟膏、ペースト等の水中油型あるいは油中水型乳剤、点滴剤等の溶液あるいは懸濁液等の液体もしくは半液体調製物が含まれる。皮膚表面への局所投与のための組成物は、この治療剤剤を、ローション剤、クリーム、軟膏、あるいは石鹸等、皮膚医学的に許容される担体に分散することによって調製することができる。一部の実施様態では、フィルムあるいは層を皮膚上に形成して塗布を局所的な書ものとし、除去されるのを妨げることができる担体が有用である。組織表面への接着が所望される場合、この組成物は、フィブリノーゲン−トロンビン構成物あるいは他の生物性接着物に分散させた治療剤剤を包含することができる。続いてこの治療剤剤を、所望する組織表面に塗布、噴霧、あるいは別の方法で投与することができる。内部組織表面への局所投与に関しては、液体組織接着物あるいは、組織表面への吸着を促進することが判明している他の物質にこの薬剤を分散させることができる。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースあるいはフィブリノーゲン／トロンビン溶液を使用して好結果を得ることができる。あるいは、ペクチンコーティング組成物等の組織コーティング溶液を使用することができる。
【００７３】
喘息用等の吸入治療に関しては、スプレー剤に分散させた粉末（自己推進組成物あるいはスプレー組成物）の吸入を利用することができ、あるいはネブライザー、アトマイザーを使用することができる。当該組成物は、粉末吸入装置あるいは自己推進粉末分散組成物から肺に投与するための、微細に粉砕した粉末から成る形態であることができる。自己推進溶液並びにスプレー組成物の場合、所望するスプレー特性（例えば、所望する粒子サイズを有するスプレーを作る能力。）を有するバルブを選択する、あるいは活性成分を、調節された粒子サイズの懸濁粉末として混合する、のいずれかによって効果を達成することができる。吸入による投与に関して、この治療剤剤は、例えば二酸化炭素等の気体等の適切な推進剤を含有する加圧容器あるいはディスペンサー、もしくはネブライザーから出る、エアロゾルスプレーの形態で送達することもできる。点鼻投与も用いることができる。
【００７４】
また、経粘膜的あるいは経皮的手段による全身投与が可能である。経粘膜投与あるいは経皮投与に関して、浸透させようとする障壁に適する浸透剤が組成物中にて使用される。当該浸透剤は一般に、当分野の技術者に周知されており、これには、例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩、並びにフィルシド酸（ｆｉｌｓｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻スプレーあるいは座薬の使用を介して達成することができる。経皮投与に関しては、治療剤剤は、典型的には、当分野で一般に周知されているような軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、膏薬（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤、あるいはクリーム剤中に調剤される。
【００７５】
一実施例においてこの治療剤剤は、インプラント並びにマイクロカプセル化送達系を含む徐放性組成物等、身体からの急速な除去に対する保護作用を呈することなる担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、並びにポリ乳酸等、生分解性生物適合高分子を使用することができる。当該組成物を調製するための方法は、当分野の技術者には明白であろう。また原材料はＡｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ並びにＮｏｖａ  Ｐｎａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されており、入手することができる。またリポソーム懸濁液を薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，５２２，８１１にて記載されているように、当分野の技術者に周知されている方法に従って調製することができる。またミクロソーム並びに微小粒子も使用することができる。
【００７６】
経口構成物あるいは非経口構成物は、投与を容易にし、且つ投与量を一定するための単位投与量の形態に調剤することができる。単位投与量の形態とは、治療を受ける患者のための単位投与量として適切な物理的に別々の単位物を指し、各単位物は、必要とされる製薬担体を併用して所望する治療効果が生じるよう計算されて前決定された量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与量形態物の内訳は、活性化合物独自の特性並びに達成されることとなる特定の治療効果、および個々を治療するための当該活性化合物を混合する技術における本質的な限界によって定められ、且つ直接これらに応じて変わる。
【００７７】
一般に、本発明に従って同定される治療剤剤は、例えば所望する効果を誘導するのに十分な時間、標的組織が適切は濃度の薬剤を維持する量等、治療的有効量にて、ヒトあるいは他の哺乳類への非経口投与あるいは経口投与のために組成することができる。さらに本発明の治療剤剤は、単独で、あるいは、特定の疾患あるいは対象とする兆候に対して有益となる効果を有することが判明している他の分子と組み合わせて投与することができる。例示のみであるが、有用な補助因子には、防腐剤、抗生剤、抗ウイルス剤並びに抗真菌剤、および鎮痛剤並びに麻酔剤等、症状を緩和する補助因子が含まれる。
【００７８】
治療性構成物にて送達されることとなる、本発明に従って同定される治療剤の有効濃度は、投与される薬剤の所望される最終投与量、並びに投与の経路等、多数の要因によって異なることとなる。また投与されるべき好ましい投与量は、治療される疾患あるいは兆候の種類並びに範囲、具体的な患者の全身の健康状態、送達される治療剤剤の相対的な生物学的効力、治療剤剤の組成、組成物中の医薬品添加物の有無並びにその種類、並びに投与経路等の変動要因によって異なる可能性もある。一部の実施例において本発明の治療剤剤は、先に記載した非ヒト霊長類並びにげっ歯類を用いた哺乳類での研究から推断される典型的な単位投与物を用いて各人へ与えることができる。上記のように、単位投与物とは、例えば患者へ投与することができ、且つ扱いおよび包装が容易な１回分投与物を指し、当該治療剤剤、あるいは当該治療剤剤と固体もしくは液体の製薬稀釈剤あるいは担体との混合物のいずれかから成る、物理的および生物的に安定した単位投与物であり続ける。
【００７９】
一部の実施様態では、生物体を遺伝子加工して本発明に従って同定される治療剤剤を作製する。これらの生物体は回収のためこの治療剤剤を放出することができる、あるいは患者に直接導入することができる。別の系統の実施様態では、本発明に従って同定される治療剤剤の担体として使うために、細胞を利用することができる。
【００８０】
また本発明の治療剤剤には、「プロドラッグ」誘導体が含まれる。プロドラッグという語は、薬理学的に不活性な（あるいは一部不活性な）、活性成分を放出あるいは活性化するために生物体内部にて自発的あるいは酵素的な生体内変化を必要とする親化合物の誘導体を指す。プロドラッグは、代謝状態下で開裂分離することが可能な官能基を持つ、本発明の治療剤剤の変形体あるいは誘導体である。プロドラッグは生理学的状態下で加溶媒分解を受ける、あるいは酵素分解を受けると、生体内で薬学的に活性である本発明の治療剤剤となる。本発明のプロドラッグは、生体内で活性薬剤成分を放出するあるいは活性化するために必要な生体内変換の段階数に応じて、シングル、並びにダブル、トリプル等と呼ばれることが可能であり、これは前駆型形態物中に存在する機能性部分の数を示す。プロドラッグ形態物はしばしば、哺乳類生物体における溶解性、組織適合性、あるいは徐放性という利点を提供する（Ｂｕｎｄｇａｒｄ，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｐｐ．７−９，２１−２４、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  １９８５並びにＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ，ｐｐ．３５２−４０１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９２を参照する。）。さらに、本発明のプロドラッグ誘導体を他の特性と組み合わせて生物利用性を増大させることができる。
【実施例】
【００８１】
（実施例１：ＧＡＡのトランス発現）
以下のプライマーを使用して、ヒトＧＡＡ７９１−９５２番残基（Ｃ末端領域）に融合させたヒトＩＧＦ−ＩＩシグナル配列を含有する遺伝子カセットを作製した。
【００８２】
【化１】
2007521818.tif 000002
ＧＡＡ４１  並びにＧＡＡ２７を使用し、ＰＣＲによってＧＡＡのＣ末端領域を増幅した。増幅したフラグメントは、５’末端にＡｓｃ  Ｉ部位を含有する。次に、３’末端にＡｓｃ  Ｉ部位を有するＩＧＦ−ＩＩシグナル配列（１−２５番残基）をコードするＳＳ  Ｎ−タグを、Ａｓｃ  Ｉ部位にてＧＡＡ  Ｃ末端領域に融合させ、ｐＣＥＰ４内でこのカセットをクローン化してｐＣＥＰ−ＳＳ−ＧＡＡ−７９１−９５２プラスミドを作製した。このＳＳ  Ｎ−タグ核酸配列を以下に示す。
ＳＳ  Ｎ−タグのＤＮＡ配列：
【００８３】
【化２】
2007521818.tif 000003
以下のさらに別のプラスミドを同様に作製した。：ＧＡＡのＣ末端８１７−９５２番残基を欠くｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２、並びにｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２と類似するがＣ末端ＧＩＬＴΔ１−７タグを追加したｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２−ＧＩＬＴΔ１−７。８１６番アミノ酸残基の後に停止コドンを導入することによってＧＡＡΔ８１７−９５２を作製した。クローニングの工程を簡便にするため、この停止コドンの後に３’末端ＸｂａＩ制限部位を配置した。また５’末端はＥｃｏＲＩ制限部位を含有する。ＧＡＡΔ８１７−９５２のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
ＧＡＡΔ８１７−９５２のＤＮＡ配列。
【００８４】
【化３】
2007521818.tif 000004
2007521818.tif 000005
ＧＡＡΔ８１７−９５２のアミノ酸配列：：
【００８５】
【化４】
2007521818.tif 000006
2007521818.tif 000007
ＧＡＡ  Ｃ末端領域が、トランスに発現させた時に機能するか否かを判定するため、ｐＣＥＰ−ＳＳ−ＧＡＡ−７９１−９５２を単独で、並びにｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２プラスミドあるいはｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２−ＧＩＬＴΔ１−７プラスミドのいずれか一方と組み合わせて、ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入した。またコントロールとして、ｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２並びにｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２−ＧＩＬＴΔ１−７を単独でＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入した。実験には遺伝子導入の標準法を用いた。１プラスミドの遺伝子導入については、１μｇのプラスミドＤＮＡを使用した。遺伝子共導入については、各々０．５μｇのプラスミドＤＮＡを使用した。全ＤＮＡから成る１μｇを、９６μＬの血清を含まないＨＥＫ２９３増殖培地および４μＬのＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）に、製造者が指示ように混合した。１．５  ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、１０％加熱不活性化ＦＢＳ、および４  ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉａ  １  ｍＬ中にて、１２ウェルプレート中で増殖するＨＥＫ２９３細胞から成る複製ウェル各々に、この混合物５０μＬを加えた。細胞は５％ＣＯ２下３７℃で２〜３日間、培養した。
【００８６】
増殖培地を回収し、ＧＡＡ活性を判定するため記載されているように分析した（Ｒｅｕｓｅｒ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３０：１３２−１４３）。プラスミド１個を移入したＨＥＫ２９３細胞から回収した培地では、ＧＡＡ活性は検出されなかった。反対に、ｐＣＥＰ−ＳＳ−ＧＡＡ−７９１−９５２と、ｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２あるいはｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２−ＧＩＬＴΔ１−７のいずれか一方とを共導入したＨＥＫ２９３細胞から回収した培地には、ＧＡＡ活性が存在した（表１）。
【００８７】
従って、ｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２並びにｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２−ＧＩＬＴΔ１−７という２つのＣ末端欠失構成物のみが、Ｃ末端領域プラスミドであるｐＣＥＰ−ＧＡＡ−７９１−９５２と共発現した際に機能性タンパク質を発現する。この実験から、ＧＡＡのＣ末端領域はトランスに共発現させると、成熟Ｎ末端領域と協働することが示された。
【００８８】
表１  ＧＡＡ  Ｃ末端領域およびＮ末端領域の一過性遺伝子共導入。
【００８９】
【表１】
2007521818.tif 000008
（実施例２  効果的なＧＡＡトランス発現に必要な領域）
実施例１で記載した一過性遺伝子共導入実験では、ＧＡＡの７９２−８１７番アミノ酸残基を含む領域が、トランス発現構成物の双方の半分に存在する。重複するこれらの領域が効果的なトランス発現に必要であるか否かを判定するために、１対の構成物、ｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ７９１−９５２−ＧＩＬＴΔ１−７とｐＣＥＰ−ＳＳ−ＧＡＡ−７９１−９５２を、重複部分を持たないように設計し、７９１番部位にＧＩＬＴタグを融合させた。表２に示したように一過性共導入実験から、効果的なＧＡＡのトランス発現には、Ｃ末端領域内の７９２−８１７番アミノ酸の存在が必要であることが例証された。
【００９０】
表２、効果的なＧＡＡのトランス発現には、７９２−８１７番アミノ酸が必要である。
【００９１】
【表２】
2007521818.tif 000009
（実施例３  内部ＧＩＬＴタグを有するＧＡＡタンパク質の構築）
初めに、ＰＣＲを用いて、完全ヒトＧＡＡ配列（配列番号＿）の２３７０番ヌクレオチドの後にヌクレオチド配列ＧＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号＿）を挿入した。この挿入によってＡｌａ７９１の前にＡｓｃＩ制限部位が形成される。ＧＩＬＴタグは、以下のＤＮＡオリゴマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【００９２】
【化５】
2007521818.tif 000010
増幅したＧＩＬＴタグは各末端にＡｓｃＩ制限部位を含有する。このＧＩＬＴタグはＡｓｃＩで切断されて、上記のようにＧＡＡのＡｌａ７９１の前にあるＡｓｃＩ部位に挿入される。ＤＮＡ塩基配列決定法によって、ＧＩＬＴ挿入のフレーム内方向性を確認した。Ａｌａ７９１の前の内部ＧＩＬＴタグを含有するこのＧＡＡカセットを、ｐＣＥＰ−ＧＡＡ−ＩＲＧＩＬＴ−４と名付けたプラスミドにて、ｐＣＥＰ４ベクター内で発現させた。ｐＣＥＰ−ＧＡＡ−ＩＲＧＩＬＴ−４はＧＡＡコーディング配列内部にＰＣＲによって生じたＴ１７１２Ｃ変異を有することが認められた。この構成物は、機能性ＧＡＡタンパク質を産生した。
（実施例４  Ｎ末端ＧＩＬＴタグを有するＧＡＡ欠失構成物）
Ｎ末端ＧＡＡ発現に適する１組５つのタグ（Ｎ−タグ）を、表３に示したプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって作製した。このＧＩＬＴ  Ｎ−タグは、野生型ＩＧＦ−ＩＩシグナル配列とＧＩＬＴ完全エピトープ（抗原決定基）とを含有する。ＳＳ  Ｎ−タグは、ＩＧＦ−ＩＩシグナル配列のみを含有する。
【００９３】
例えば、ＧＩＬＴΔ１−７Ｎ−タグは、ＩＧＦ−ＩＩシグナル配列とＧＩＬＴエピトープである８−６７番残基を含有する。これは３回のＰＣＲ反応によって作製した。：（１）ＩＧＦ１並びにＩＧＦ４プライマーを使用する、ヒトＩＧＦ−ＩＩ  ＤＮＡテンプレート（鋳型）からのＰＣＲ増幅。；（２）ＩＧＦ２並びにＩＧＦ７プライマーを使用する、ヒトＩＧＦ−ＩＩ  ＤＮＡテンプレートからのＰＣＲ増幅。；（３）ＩＧＦ１並びにＩＧＦ７プライマーを使用する、最初の２つのＰＣＲ反応産物からのＰＣＲ増幅。
【００９４】
ＧＩＬＴΔ２−７Ｎ−タグは、ＩＧＦ−ＩＩシグナル配列と、８−６７番残基の前にＧＩＬＴエピトープである１番残基とを含有する。これは３回のＰＣＲ反応によって作製した。：（１）ＩＧＦ１並びにＩＧＦ５プライマーを使用する、ヒトＩＧＦ−ＩＩ  ＤＮＡテンプレートからのＰＣＲ増幅。；（２）ＩＧＦ３並びにＩＧＦ７プライマーを使用する、ヒトＩＧＦ−ＩＩ  ＤＮＡテンプレートからのＰＣＲ増幅。；（３）ＩＧＦ１並びにＩＧＦ７プライマーを使用する、最初の２つのＰＣＲ反応産物からのＰＣＲ増幅。
【００９５】
ＳＳＧＡＡ−ＧＩＬＴ  Ｎ−タグは、ＧＩＬＴ完全エピトープの手前に１−６９番残基内ＧＡＡシグナル配列を含有する。これは３回のＰＣＲ反応によって作製した。：（１）ＧＡＡ１３並びにＧＩ１プライマーを使用する、ヒトＧＡＡ  ＤＮＡテンプレートからのＰＣＲ増幅。；（２）ＧＩ２並びにＩＧＦ７プライマーを使用する、ヒトＩＧＦ−ＩＩ  テンプレートからのＰＣＲ増幅。；（３）ＧＡＡ１３並びにＩＧＦ７プライマーを使用する、最初の２つのＰＣＲ反応産物からのＰＣＲ増幅。
【００９６】
各Ｎ−タグは、５’ＥｃｏＲＩ制限部位と３’ＡｓｃＩおよびＸｂａＩ部位を含有する。ＡｓｃＩ部位を利用して、以下に記載するＧＡＡ  Ｎ末端欠失構成物に各タグを融合させた。
【００９７】
表３  Ｎ末端タグ構成物
【００９８】
【表３】
2007521818.tif 000011
2007521818.tif 000012
ヒトＧＡＡ  Ｎ末端のＤＮＡ配列部位を削除し、ＰＣＲ技術を用いてＡｓｃＩ制限部位に置換した。欠失部位を限定するために使用した５’ＤＮＡオリゴマーを以下に列挙する（表４）。５’オリゴマーをＧＡＡコーディング配列内の様々な３’オリゴマーと対合させ、次に結果できるＤＮＡフラグメントを、完全Ｃ末端ＧＡＡコーディング配列に融合させた。Ｎ末端ＡｓｃＩ部位を先に列挙した５つのＮ末端タグ（Ｎ−タグ）の内の１つに融合させて発現カセットを完成させた（表４）。
【００９９】
表４  ＧＡＡ  Ｎ末端欠失構成物
ＧＡＡコーディング配列に相補的な配列は大文字。ＥｃｏＲＩ並びにＡｓｃＩ制限部位は小文字。
【０１００】
【表４】
2007521818.tif 000013
表４に列挙した発現カセットは、共通するＡｓｃＩ部位でＮ末端ＧＡＡ欠失体に融合させたＮ末端タグ（Ｎ−タグ）を含有する。これらのカセットをｐＣＥＰ４発現ベクターの多重クローニング部位内でクローン化し、ＦｕＧｅｎｅ６遺伝子移入試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨＥＫ２９３内に移入した。遺伝子移入後２〜３日目に一過性発現の培地を回収し、標準酵素アッセイ法（Ｒｅｕｓｅｒ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３０：１３２−１４３）を用いて、分泌されたＧＡＡ活性について分析した。
【０１０１】
表５  Ｎ−タグＧＡＡ構成物の相対的一過性発現量
【０１０２】
【表５】
2007521818.tif 000014
2007521818.tif 000015
これらの結果が示すように、１−８０番残基を含むＧＡＡのＮ末端部分は一過性発現に必要ないが、三つ葉形領域を乱すあるいは削除する欠失は機能性タンパク質を作らない。
【０１０３】
さらに、表６に示したように、異種同義のシグナルペプチドを、この場合ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドであるが、適切に配置することによってＧＡＡの分泌を向上させることができる。ＧＡＡの５６番あるいは７０番残基のいずれかにＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドを配置することによって、野生型ＧＡＡと比較してＧＡＡの分泌が３倍増加したが、２９番部位へＩＧＦ−ＩＩペプチドを配置した場合には増加しなかった。これはＧＡＡシグナルペプチドに隣接する、推定される膜通過領域が停留することに起因する可能性がある。
【０１０４】
表６  ＧＡＡシグナル配列の位置を変えると、ＧＡＡ分泌に影響を及ぼす。
【０１０５】
【表６】
2007521818.tif 000016
しかし、野生型ＧＡＡシグナルペプチドおよび膜通過領域を、異種同義シグナルペプチドに置換すると、このタンパク質に伴うマンノース６リン酸依存性細胞内取り込み量が低下する。（図４）。取り込み実験はＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００４０００５３０９並びにＮｏ．２００４０００６００８にて記載されており、この内容を参考のためこの明細に添付する。図４で説明するように、ｐＣＥＰ−ＳＳ−ＧＡＡΔ１−６９のポンペ繊維芽細胞内への取り込み量は、野生型ｐＣＥＰ−ＧＡＡの３分の１であった。
【０１０６】
反対に、図５にて説明するように、ｐＣＥＰ−ＳＳ−ＧＡＡΔ１−６９の取り込みと、ＧＩＬＴタグを有する構成物、ｐＣＥＰ−ＳＳ−ＧＩＬＴΔ２−７−ＧＡＡΔ１−６９とを比較することによって、ＧＩＬＴタグが、ＩＧＦ−ＩＩにより競合され得る特異的な取り込みを促進することが明白となった。即ち、ペプチドタグを７０番の位置に配置することによって融合タンパク質の効果的な発現とＧＡＡ活性とが可能になるだけでなく、正しく折り畳まれて利用可能なペプチドタグが得られ、これによってレセプターが仲介する標的細胞内への取り込みが可能となる。
（実施例５  ＧＩＬＴ１−８７タグ並びにその変形体を有する構成物）
Ｎ末端ＧＩＬＴタグが正しく折り畳まれる可能性を増大させるため、ＩＧＦ−ＩＩの１−８７番残基に渡る、より長い種類のＧＩＬＴタグを作製した。この追加されるＩＧＦ−ＩＩ配列でもレセプター系都合能を示すはずであり、タグの心部に関してより野生型に近い折り畳み構造が得られるはずである。このＧＩＬＴ−１−８７タグをＧＡＡの５６番並びに７０番の部位に融合させ、それぞれＧＩＬＴ１−８７−ＧＡＡ５６−９５２並びにＧＩＬＴ１−８７−ＧＡＡ７０−９５２とした。ＧＩＬＴ１−８７−ＧＡＡ５６−９５２のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
ＧＩＬＴ１−８７−ＧＡＡ５６−９５２のＤＮＡ配列：
【０１０７】
【化６】
2007521818.tif 000017
2007521818.tif 000018
2007521818.tif 000019
ＧＩＬＩ１−８７−ＧＡＡ５６−９５２のアミノ酸配列：
【０１０８】
【化７】
2007521818.tif 000020
ＧＩＬＩ１−８７−ＧＡＡ７０−９５２のＤＮＡ配列：
【０１０９】
【化８】
2007521818.tif 000021
2007521818.tif 000022
2007521818.tif 000023
ＧＩＬＩ１−８７−ＧＡＡ７０−９５２のアミノ酸配列：
【０１１０】
【化９】
2007521818.tif 000024
2007521818.tif 000025
５’Ａｓｐ７１８部位を、ｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８部位にクローン化し、３’Ｘｂａ部位はクレノウで平滑末端化してｐＣＥＰ４のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化し、それぞれｐＣＥＰ  −ＧＩＬＴ１−８７−ＧＡＡ５６−９５２並びにｐＣＥＰ  −ＧＩＬＴ１−８７−ＧＡＡ７０−９５２とした。またこの構成物はＧｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏリンカー配列を含有する（ＡｓｃＩ部位）。これらの構成物はＧＡＡ酵素活性を持つタンパク質を発現する。
【０１１１】
さらに、Ｒ６８Ａ変形体をＧＩＬＴ１−８７タグに導入して、ＧＩＬＴタグ内部の潜在的タンパク質分解部位を削除した（ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ）。ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ  のＤＮＡ配列（配列番号＿）並びにアミノ酸配列（配列番号＿）を以下に示す（下線は変異した配列。）。
ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ  のＤＮＡ配列（配列番号＿）
【０１１２】
【化１０】
2007521818.tif 000026
ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ  のアミノ酸配列（配列番号＿）
【０１１３】
【化１１】
2007521818.tif 000027
このタグをＧＡＡの５６番並びに７０番部位に融合させると、ｐＣＥＰ  −ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ  −ＧＡＡ５６−９５２並びにｐＣＥＰ  −ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ  −ＧＡＡ７０−９５２となる。これらの構成物は、ＧＡＡ酵素活性を持つタンパク質を発現した。
【０１１４】
さらに、ＧＩＬＴ１−８７タグ内の３つのＳｅｒ／Ｔｈｒ残基を置換する点変異を導入し、グリコシル化部位を削除した（ΔＧＳ）（ＧＩＬＴ１−８７−ΔＧＳ）。ＧＩＬＴ１−８７−ΔＧＳのＤＮＡ配列（配列番号＿）並びにアミノ酸配列（配列番号＿）を以下に示す（下線は変異した配列。）。
【０１１５】
ＧＩＬＴ１−８７−ΔＧＳのＤＮＡ配列。
【０１１６】
【化１２】
2007521818.tif 000028
ＧＩＬＴ１−８７−ΔＧＳのアミノ酸配列。
【０１１７】
【化１３】
2007521818.tif 000029
この修飾したＧＩＬＴタグをＧＡＡの７０番部位に融合させて、ｐＣＥＰ  −ＧＩＬＴ１−８７−ΔＧＳ  −ＧＡＡ７０−９５２を得た。この構成物は、ＧＡＡ酵素活性を持つタンパク質を発現した。
【０１１８】
さらに、Ｒ６８ＡとΔＧＳの両方の修飾を取り込んだＧＩＬＴタグ修飾体を作製した（ＧＩＬＴ１−８７−  Ｒ６８Ａ−ΔＧＳ）。ＧＩＬＴ１−８７−  Ｒ６８Ａ−ΔＧＳのＤＮＡ配列（配列番号＿）並びにアミノ酸配列（配列番号＿）を以下に示す（下線は変異した配列。）。
ＧＩＬＴ１−８７−  Ｒ６８Ａ−ΔＧＳのＤＮＡ配列（配列番号＿）。
【０１１９】
【化１４】
2007521818.tif 000030
ＧＩＬＴ１−８７−  Ｒ６８Ａ−ΔＧＳのアミノ酸配列（配列番号＿）。
【０１２０】
【化１５】
2007521818.tif 000031
この修飾したＧＩＬＴ１−８７−  Ｒ６８Ａ−ΔＧＳを用いて、構成物ｐＣＥＰ  −ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８ＡΔＧＳ  −ＧＡＡ５６−９５２並びにｐＣＥＰ  −ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８ＡΔＧＳ  −ＧＡＡ７０−９５２を作製した。双方の構成物は、ＧＡＡ酵素活性を持つタンパク質を発現した。
【０１２１】
ＧＩＬＴタグをＧＡＡの５６番部位に融合させた上記タンパク質に関して、ウエスタンブロットを実施した。図６に図示するように、前駆体タンパク質は完全長を有し、ＩＦＧ−ＩＩタグを含有する。ΔＧＳ変異によって、僅かだが迅速な移動性を持つタンパク質が生じ、これは炭水化物部分を持たないものと一致する。
（実施例６  より長い改変ＧＩＬＴタグを有するさらに別の構成物）
ＩＧＦ−ＩＩタグが野生型に折り畳まれる環境を提供するために、８−１５６番アミノ酸を包含するＩＧＦ−ＩＩの前駆体を、ＧＡＡの７９１番部位に融合させる内在タグとして使用した。さらに、ＩＧＦ−ＩＩタグ内部の８７番部位下流の開裂分離を促進するため、ＩＧＦ−ＩＩ配列内に変異Ｅ６７ＡおよびＤ６９Ｓを起こしてＰ２／Ｐ１タンパク質分解酵素プロセッシング部位を導入した。結果できる構成物ｐＣＥＰ−ＧＡＡ−７９１ＩＧＦ２−Ｐ２／Ｐ１は、ＧＡＡ酵素活性を有するタンパク質を産生する。ｐＣＥＰ−ＧＡＡ−７９１ＩＧＦ２−Ｐ２／Ｐ１のＤＮＡ配列並びにアミノ酸配列を以下に示す。
ｐＣＥＰ−ＧＡＡ−７９１ＩＧＦ２−Ｐ２／Ｐ１のＤＮＡ配列
【０１２２】
【化１６】
2007521818.tif 000032
2007521818.tif 000033
2007521818.tif 000034
ｐＣＥＰ−ＧＡＡ−７９１ＩＧＦ２−Ｐ２／Ｐ１のアミノ酸配列：
【０１２３】
【化１７】
2007521818.tif 000035
2007521818.tif 000036
Ｎ末端（例えば７０番部位。）に融合させたＧＩＬＴタグの提示あるいは（且つ）折り畳みをさらに改善するため、ＧＩＬＴΔ２−７タグのＮ末端とＧＡＡの７０番融合部位との間に、Ｇｌｙ−  Ｇｌｙ−  Ｇｌｙ−  Ｇｌｙ−  Ｇｌｙ−Ｐｒｏという配列のスペーサーを挿入して、ｐＣＥＰ−  ＧＩＬＴΔ２−７−  ｓｐｃｒ１−ＧＡＡ７０−９５２を作製した。この構成物はＧＡＡ酵素活性を有するタンパク質を発現した。
（実施例７  ＡｓｃＩ制限部位を挿入したＧＡＡ構成物）
標準分子技法に従って、７８３−７９１番アミノ酸残基から成るＧＡＡ領域内に、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（ＡｓｃＩ制限部位）から成る挿入を含有する構成物を作製した。表７に示すように、ＡｓｃＩ制限部位を挿入することによって一過的なＧＡＡ酵素発現レベルが上昇する。恐らくこの挿入によって、酵素は高親和性形態に変化すると考えられる。通常、前駆体ＧＡＡは、７８３−７９１番の境界領域にて開裂分離した後に高親和性ＧＡＡ形態に成熟する（Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。分離後、Ｎ末端領域とＣ末端領域は会合した状態のままであると報告されている（Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０１２４】
表７  ＡｓｃＩ制限部位を挿入すると一過性発現が上昇する。
【０１２５】
【表７】
2007521818.tif 000037
この３つのアミノ酸残基を挿入することで前駆体ＧＡＡの開裂分離が促進されるか否かを判定するため、野生型ＧＡＡとＧＡＡ−７９１Ａｓｃタンパク質を比較するウエスタンブロットを、抗ＧＡＡポリクローナル抗体を用いて行った。図７で示すように、ＧＡＡ−７９１Ａｓｃは、野生型ＧＡＡと同程度の移動性を有して移動した。これはこの３つの残基を挿入してもタンパク質分解を促進しないことを示唆している。
【０１２６】
酵素活性が増すことに対する別の説明は、境界領域内へアミノ酸残基を挿入することによって、２つの領域部分に分離することなく高親和性形態への構造変換が起きたというものである。これは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて試験することができ、Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４にて記載されているように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにてＧＡＡ−７９１Ａｓｃの結合親和力を野生型と比較する。
【０１２７】
さらに、７９１Ａｓｃ部位の挿入と、６９番部位におけるＮ末端ＧＩＬＴタグとを組み合わせるために、構成物ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７−ＧＡＡ７０−９５２−７９１Ａｓｃを作製した。
（実施例８  遺伝子加工したタンパク質分解部位を有する内部ＧＩＬＴタグ）
活性型内部ＧＩＬＴタグを作製するため、タグの下流部にてＸ因子制限プロテアーゼ部位で遺伝子加工したＧＡＡの７７９−７９６番領域内にタグを配置するよう実験を企画した。発現したタンパク質をＸａ因子で処理することによって、ＧＡＡのＣ末端部分が放出され、露出した活性ＧＩＬＴタグを現す可能性が潜在的にある。
【０１２８】
従って、下流にＸ因子プロテアーゼ部位を有するＧＩＬＴタグを、ＧＡＡ内の７８７番、７７９番、並びに７９６番部位に配置した。結果生じるこれら３つのタンパク質は全て、ＧＡＡ酵素活性を持っていた。図８に示すように、ウエスタン分析にて、３つのタンパク質は全て、抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体によってプローブされるＧＩＬＴタグを含有していた。３つのタンパク質調製物は全て、完全な長さの前駆体が存在する場合と同じ移動比（Ｍｒ  １２０，０００〜１４０，０００）のバンドを有していた。また３つのタンパク質調製物は全て、より早く移動する中間バンド（Ｍｒ  ８５，０００〜１００，０００）を有し、このバンドはＧＩＬＴタグを保持していた。Ｘａ因子でこれらのタンパク質を処理すると、完全長バンドはほぼ全てなくなり、中間バンドは僅かに低分子方向へ転換する。このＸａ処理中間バンドはＧＩＬＴタグを保持している。
【０１２９】
ＧＡＡ配列内にＧＩＬＴＸａタグが存在することによって、Ｘ因子部位の下流部位でタンパク質酵素分解が促進されるという可能性がある。８１６番部位は、成熟に関係するＧＡＡプロセッシング部位であると報告されている。
【０１３０】
予測されるＧＡＡ  Ｃ末端プロセッシングモデルを、図８に示す。
（実施例９  ヒト／マウスＧＡＡハイブリッド）
ＧＩＬＴタグの折り畳みを改善するため、ヒトＧＡＡの７９１番、７９６番、８１６番、８８１番、並びに９２０番部位のアミノ酸に融合点を有する、ヒトＧＡＡ  Ｎ末端とマウスＧＡＡ  Ｃ末端とから構成されるキメラタンパク質を構築した。融合点にて、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ配列を含有するＡｓｃＩ制限部位を導入した。
【０１３１】
詳細を述べると、ヒト／マウスＧＡＡキメラタンパク質は、ヒトＧＡＡのＣ末端部分を対応するマウスＧＡＡのＣ末端配列に置換して作製した。共通するリンカー配列ｇｇｃｇｃｇｃｃｇにてヒト部分とマウス部分とを融合させることによって、ＤＮＡカセットを構築した。このカセットは独自のＡｓｃＩ部位を含有し、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（ＧＡＰ）配列をコードする。ＧＡＡハイブリッドのマウス部分は、以下に列挙するプライマーを使用して、ＰＣＲによって作製した。これらのプライマーはヒトＧＡＡ配列へ融合するための５’ＡｓｃＩ部位と、ｐＣＥＰベクターのＮｏｔＩ部位内でクローニングするための３’ＮｏｔＩ部位を含有する。
【０１３２】
表８  ヒト／マウスＧＡＡハイブリッド
【０１３３】
【表８】
2007521818.tif 000038
マウスＧＡＡヌクレオチド配列：
【０１３４】
【化１８】
2007521818.tif 000039
2007521818.tif 000040
2007521818.tif 000041
マウスＧＡＡアミノ酸配列：
【０１３５】
【化１９】
2007521818.tif 000042
このキメラＧＡＡカセットをＨＥＫ２９３細胞に、例１に記載したように導入した。２つの安定した遺伝子導入系からＧＡＡの発現量を判定した。表８に示すように、８８１番部位での融合物が、最も高い酵素発現量を示した。８８１番部位融合ハイブリッドのウエスタン分析は、発現した前駆体タンパク質の大きさが、野生型ＧＡＡと類似することを示している。
【０１３６】
表９  ヒト／マウスＧＡＡハイブリッドの発現
【０１３７】
【表９】
2007521818.tif 000043
このハイブリッドのＣ末端におけるマウスＧＡＡ配列の存在が、ＧＩＬＴタグの存在に適合するか否かを判定するために、さらに実験を行った。よって、上記に列挙した完全な長さの、５つのヒト／マウスＧＡＡハイブリッドの各Ｃ末端にＧＩＬＴΔ１−７タグを融合し、各々の発現量を測定した。また、マウスＧＡＡハイブリッドのＣ末端８８１番部位とＧＩＬＴのＮ末端とを、２９番あるいは５６番、７０番、８１番部位にて組み合わせる構成物を作製した。発現量を上記のように判定した。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１−１】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−２】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−３】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−４】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−５】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−６】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−７】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−８】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−９】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−１０】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−１１】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−１２】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−１３】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−１４】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図２】図２はＧＡＡタンパク質の説明図。
【図３】図３は、ペプチドタグＧＡＡを創出するための典型的方策を示す。
【図４】図４は、野生型ＧＡＡ並びにＳＳ−ＧＡＡΔ１−６９を用いた典型的な取り込み実験を示す。
【図５】図５は、ＳＳ−ＧＡＡΔ１−６９およびＳＳ−ＧＬＴΔ２−７−ＧＡＡΔ１−６９を用いた典型的な取り込み実験を示す。
【図６】図６は、１−８７−ＩＧＦ  ＩＩタグＧＡＡタンパク質の典型的なウエスタンブロット分析を示す。：左側は抗ＧＡＡ抗体でプローブしたもの。；右側は抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体でプローブしたもの。レーン１：ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴ１−８７−ＧＡＡ５６−９５２；レーン２：ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ−ＧＡＡ５６−９５２−１；レーン３：ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ−ΔＧＳ−ＧＡＡ５６−９５２−１；レーン４：ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７−ｓｐｃｒ１−ＧＡＡ７０−９５２−１；レーン５：ｐＣＥＰ−ＧＡＡ；レーン６：ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴ−ＧＡＡ２９−９５２。
【図７】図７は、野生型ＧＡＡとＧＡＡ−７９１Ａｓｃのタンパク質分解を比較する、典型的なウエスタンブロット分析を示す。
【図８】図８は、野生型ＧＡＡと、下流のＸ因子プロテアーゼ部位、ＧＡＡ７８７ＧＩＬＴＸａ、ＧＡＡ７７９ＧＩＬＴＸａ、並びにＧＡＡ７９６  ＧＩＬＴＸａにて遺伝子加工したＧＩＬＴタグを有するＧＡＡ構成物とを比較する、典型的なウエスタンブロット分析を示す。また、ＧＡＡ  Ｃ末端プロセッシングモデルを示す。
【図１−１】
2007521818.tif 000044
【図１−２】
2007521818.tif 000045
【図１−３】
2007521818.tif 000046
【図１−４】
2007521818.tif 000047
【図１−５】
2007521818.tif 000048
【図１−６】
2007521818.tif 000049
【図１−７】
2007521818.tif 000050
【図１−８】
2007521818.tif 000051
【図１−９】
2007521818.tif 000052
【図１−１０】
2007521818.tif 000053
【図１−１１】
2007521818.tif 000054
【図１−１２】
2007521818.tif 000055
【図１−１３】
2007521818.tif 000056
【図１−１４】
2007521818.tif 000057
【図２】
2007521818.tif 000058
【図３】
2007521818.tif 000059
【図４】
2007521818.tif 000060
【図５】
2007521818.tif 000061
【図６】
2007521818.tif 000062
【図７】
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【図８】
2007521818.tif 000064
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月22日(2006.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のアミノ酸残基７０〜７９０に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列またはそのフラグメントおよび標的細胞の表面上にあるレセプターの細胞外ドメインに結合する標的ドメインを含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基８８０〜９５２に少なくとも５０％同一な配列と会合しない、ポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基７０〜７９０またはそのフラグメントを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記標的ドメインが、ヒトリソソームへの前記ポリペプチドの局在化を可能にさせる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記標的ドメインが、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター部分を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４８〜５５を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８〜２８および４１〜６１またはヒトカチオン非依存性マンノース−６−ホスフェートレセプターに結合するその配列改変体を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸残基８〜８７またはそれらの配列改変体を含み、ここで該配列改変体は、前記ヒトカチオン非依存性マンノース−６−ホスフェートレセプターに結合する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのＲ６８Ａ変異を含む、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのＣ末端切断型またはその配列改変体を含み、該切断が位置６２から始まる、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記標的ドメインは、アミノ酸配列のＮ末端に直接融合される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記標的ドメインが、該標的ドメインとアミノ酸配列との間のスペーサーにより該アミノ酸配列のＮ末端に融合される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記スペーサーが、１０〜２５アミノ酸長である、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記スペーサーが、グリシン残基を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記スペーサーが、αヘリックス構造を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記スペーサーが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓに少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）の少なくとも一部およびペプチドタグを含む治療因子を含む標的化治療剤であって、該ペプチドタグは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基６８、６９、７０、７１、７２、７８９、７９０、７９１、７９２および７９３からなる群より選択されるアミノ酸残基に直接または間接的に連結される、標的化治療剤。
【請求項１８】
前記アミノ酸残基が、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基６８〜７２からなる群より選択される、請求項１７に記載の標的化治療剤。
【請求項１９】
前記治療剤が、ヒトＧＡＡのアミノ残残基７０〜９５２を含む、請求項１７に記載の標的化治療剤。
【請求項２０】
前記ペプチドタグが、ヒトＧＡＡのアミノ残基７０に連結される、請求項１９に記載の標的化治療剤。
【請求項２１】
前記ペプチドタグが、細胞外レセプターに対するリガンドである、請求項１７に記載の標的化治療剤。
【請求項２２】
請求項２１に記載の標的化治療剤であって、前記ペプチドタグが、標的細胞の表面上にあるレセプターの細胞外ドメインに結合する標的ドメインであり、該レセプターの内在化の際に、ヒトリソソームへの該治療因子の局在化を可能にする、標的化治療剤。
【請求項２３】
前記標的ドメインが、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター部分を含む、請求項２２に記載の標的化治療剤。
【請求項２４】
前記ペプチドタグが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸残基４８〜５５を含む、請求項２２に記載の標的化治療剤。
【請求項２５】
請求項２２に記載の標的化治療剤であって、前記ペプチドタグは、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸残基８〜２８および４１〜６１またはヒトカチオン非依存性マンノース−６−ホスファターゼレセプターに結合するそれらの配列改変体を含む、標的化治療剤。
【請求項２６】
請求項２２に記載の標的化治療剤であって、前記ペプチドタグは、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸残基８〜８７またはそれらの配列改変体を含み、該配列改変体は、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−ホスファターゼレセプターに結合する、標的化治療剤。
【請求項２７】
前記ペプチドタグが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのＲ６８Ａ変異を含む、請求項２６に記載の標的化治療剤。
【請求項２８】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのＣ末端切断型またはそれらの配列改変体を含み、該切断が位置６２から始まる、請求項２４に記載の標的化治療剤。
【請求項２９】
前記治療因子と前記ペプチドタグとの間にスペーサーをさらに含む、請求項１７に記載の標的化治療剤。
【請求項３０】
前記スペーサーが、グリシン残基を含む、請求項２９に記載の標的化治療剤。
【請求項３１】
前記スペーサーが、αへリックス構造である、請求項２９に記載の標的化治療剤。
【請求項３２】
前記スペーサーが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１）に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の標的化治療剤。
【請求項３３】
ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のアミノ酸残基７０〜７９０に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドのオープンリーディングフレームを含む核酸配列であって、該オープンリーディングフレームは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基８８０〜９５２に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含まない、核酸配列。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基７０〜７９０またはそのフラグメントを含む、請求項３３に記載の核酸配列。
【請求項３５】
前記核酸配列が、ＤＮＡ配列である、請求項３３に記載の核酸配列。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが、標的細胞の表面上にあるレセプターの細胞外ドメインに結合する標的ドメインをさらに含み、該レセプターの内在化の際に、ヒトリソソームへの該ポリペプチドの局在化を可能にさせる、請求項３３に記載の核酸配列。
【請求項３７】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸残基８〜８７またはその配列改変体を含み、ここで該配列改変体は、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−ホスファターゼレセプターに結合する、請求項３６に記載の核酸配列。
【請求項３８】
前記標的ドメインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのＲ６８Ａ変異を含む、請求項３７に記載の核酸配列。
【請求項３９】
請求項３３に記載の核酸配列を含む、細胞。
【請求項４０】
ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のアミノ酸残基８８０〜９５２に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドのオープンリーディングフレームを含む核酸配列であって、該オープンリーディングフレームは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基７０〜７９０に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含まない、核酸配列。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基８８０〜９５２またはそのフラグメントを含む、請求項４０に記載の核酸配列。
【請求項４２】
前記核酸配列が、ＤＮＡ配列である、請求項４１に記載の核酸配列。
【請求項４３】
請求項４０に記載の核酸配列を含む、細胞。
【請求項４４】
ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のアミノ酸残基８８０〜９５２に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基７０〜７９０に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列と会合しない、ポリペプチド。
【請求項４５】
前記アミノ酸配列が、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基８８０〜９５２またはそのフラグメントを含む、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
第一の核酸配列および第二の核酸配列を含む細胞であって、
該第一の核酸配列は、ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のアミノ酸残基７０〜７９０に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む第一のポリペプチドの第一のオープンリーディングフレームを含み、そして
該第二の核酸配列は、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基８８０〜９５３に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む第二のポリペプチドの第二のオープンリーディングフレームを含み、
（ｉ）該第一のオープンリーディングフレームは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基８８０〜９５２に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含まず、そして
（ｉｉ）該第二のオープンリーディングフレームは、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基７０〜７９０に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含まない、
細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本出願は、２００４年２月１０日に申請された米国出願番号６０／５４３，８１２（参考としてその内容が援用される。）の優先権の利益を要求する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）は、マルトース、並びに、グリコーゲンの外鎖を含むその他直鎖オリゴサッカライドにおけるアルファ１−４結合を加水分解するリソソーム酵素であり、これによってリソソーム内で過剰なグリコーゲンを分解する（Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｃｒｉｖｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２００１），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ  ＹｏｒｋのＨｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），ｐ．３３８９−３４２０（非特許文献１））。他の哺乳類リソソーム酵素と同様、ＧＡＡは細胞質ゾル内で合成されてＥＲを通過し、このＥＲにてＮ結合高マンノース型炭水化物でグリコシル化される。ゴルジ体では、リソソームタンパク質をリソソームへ標的化させるマンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）が付加することによって、リソソームタンパク質上で高マンノース炭水化物が修飾される。Ｍ６Ｐ修飾タンパク質は、２つのＭ６Ｐレセプターのうちのいずれかとの相互作用を介してリソソームへ送達される。最も好ましい修飾形態は、２つのＭ６Ｐが高マンノース炭水化物に付加した状態である。
【０００３】
リソソームにおいてＧＡＡ活性が不十分であると、酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ）、ＩＩ型糖尿病（ＧＳＤＩＩ）、ＩＩ型糖原病、あるいはＧＡＡ欠損症とも呼ばれる疾患であるポンペ病に帰着する。ＧＡＡをコードする遺伝子における様々なミスセンス変異並びにナンセンス変異によって、この酵素活性の低下が生じる。その結果、ポンペ病を有する患者の全ての細胞のリソソームにグリコーゲンが蓄積する。グリコーゲンの蓄積は特に、心筋並びに骨格筋、肝臓、並びに他の組織のリソソームにて最も顕著である。蓄積したグリコーゲンは最終的に筋機能を損なう。ポンペ病で最も重篤なものは、心肺機能不全によって２歳になる前に死亡する。
【０００４】
現在、ポンペ病を治癒する、あるいはポンペ病の進行を緩和するのに利用できる認可された治療法は存在しない。目下臨床試験中の酵素置換治療では、投与した組換えＧＡＡが筋肉並びに肝組織内の細胞に取り込まれ、これらの細胞内のリソソームへ、Ｍ６Ｐ依存的な方法で輸送されることが必要とされる。しかしながら、最近のポンペ酵素置換治療試験にて使用される２つの酵素源である遺伝子加工したＣＨＯ細胞並びに遺伝子導入ウサギ乳にて産生された組換えＧＡＡは、極少量のＭ６Ｐしか含有しない（Ｖａｎ  Ｈｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９３（１）：６５−７０（非特許文献２）；並びに米国特許第６，５３７，７８５号（特許文献１））。よって、組換えＧＡＡのリソソームへのＭ６Ｐ依存的送達は効率が悪く、大量の投与量と高頻度の注入とが必要とされる。従って、新しく、より簡便で、より良い効率の、且つより費用効果の高い、治療的ＧＡＡ酵素を患者リソソームへ指向させるための方法が、依然必要とされている。
【特許文献１】米国特許第６，５３７，７８５号明細書
【非特許文献１】Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ら、（２００１）、Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｃｒｉｖｅｒら編（２００１），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．３３８９−３４２０
【非特許文献２】Ｖａｎ  Ｈｏｖｅら、（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９３（１）：６５−７０
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（本発明の概要）
本発明は、ペプチドタグを基礎とした標的化戦略を用いることによって、ヒトＧＡＡもしくはＧＡＡ様酵素を患者リソソームへ、Ｍ６Ｐ非依存的に指向させることを可能とする。結果として、本発明はＧＡＡもしくはＧＡＡ様酵素の標的細胞内への効果的な送達を提供する。
【０００６】
本発明は一部、ＧＡＡタンパク質のそれぞれに異なる一部分であるペプチドをコードする複数のオープンリーディングフレーム（開放解読枠）を使用し、組換えによってＧＡＡを発現させることができるという発見に関係する。共に用いた場合、結果できるポリペプチドは協働して所望する酵素活性を提供することができる。
【０００７】
従って、本発明は一側面において、ヒトＧＡＡの７０−７９０番アミノ酸残基と５０％以上同一（例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは１００％同一。）あるいはこれらのフラグメントのアミノ酸配列を含有するポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードする核酸配列（ＤＮＡ配列等）に関係する。このオープンリーディングフレームは、ヒトＧＡＡの８８０−９５２番アミノ酸残基と５０％以上同一（例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは１００％同一。）のアミノ酸配列を含有しない。
【０００８】
別の側面において本発明は、ヒトＧＡＡの８８０−９５２番アミノ酸残基と５０％以上同一（例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは１００％同一。）あるいはこれらのフラグメントのアミノ酸配列を含有するポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードする核酸配列（ＤＮＡ配列等）に関係する。このオープンリーディングフレームは、ヒトＧＡＡの７０−７９０番アミノ酸残基と５０％以上同一（例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは１００％同一。）のアミノ酸配列を含有しない。
【０００９】
本発明はまた、当該核酸配列の一方あるいは両方を含有する細胞に関係する。
【００１０】
一実施例において本発明の核酸はまた、ＧＡＡポリペプチドに融合するペプチドタグをコードする。好ましいペプチドタグは、細胞外レセプターに対するリガンドである。一部の実施例において、ペプチドタグは、標的細胞表面にあるレセプターの細胞外ドメインに結合する標的ドメインであり、このレセプターが内在化されると、ヒト・リソソーム内へのポリペプチドの局在が起こる。一実施齢において、この標的ドメインは、カチオン非依存性マンノース６−リン酸レセプター結合能を有するウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター部分を含有する。別の実施例において標的ドメインには、ＩＧＦ−ＩＩの１つもしくは複数のアミノ酸配列（例えば、少なくとも４８−５５番アミノ酸、少なくとも８−２８番並びに４１−６１番アミノ酸；あるいは少なくとも８−８７番アミノ酸）、あるいはこれらの配列改変体（例えばＲ６８Ａ）、あるいはカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合するこれらの切断型（例えば６２番目からＣ末切断されたもの。）が組み入れられている。一実施例においてペプチドタグは、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端あるいはＣ末端に直接融合されている。別の具体的な実施例においてペプチドタグは、スペーサーによってＧＡＡポリペプチドのＮ末端あるいはＣ末端に融合されている。一実施例においてペプチドタグは、１０−２５個のアミノ酸から成るスペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドに融合されている。別の具体的な実施例においてペプチドタグは、アミノ酸配列ＧＧＧＴＶＧＤＤＤＤＫ（配列番号１）と５０％以上同一のスペーサーによってＧＡＡに融合されている。
【００１１】
本発明はまた、本発明の核酸によってコードされたポリペプチド、並びにこれらのポリペプチドを含有する製薬調製物に関係する。
【００１２】
本発明はまた、一部、ペプチドタグが融合することのできるＧＡＡの特定部位に関する正しい認識に関係する。従って、別の一側面において本発明は、ヒトＧＡＡあるいはこれの一部分の、６８、６９、７０、７１、７２、７７９、７８７、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、あるいは７９６番アミノ酸に融合するペプチドタグを有する標的化治療物質に関係する。この標的化治療物質には、例えばヒトＧＡＡの７０−９５２番アミノ酸残基、あるいは７０−７９０番アミノ酸残基等より小さな部分を含有することができる。一実施例において、ペプチドタグは７０番アミノ酸、あるいは７０番アミノ酸から１つあるいは２つ目の位置内にあるアミノ酸に融合する。例えば、一部のペプチドタグは、標的細胞表面にあるレセプターの細胞外ドメインに結合する標的ドメインであり、このレセプターが内在化されてこの治療剤剤のヒト・リソソームへの局在が可能となる。一実施例においてこの標的ドメインには、カチオン非依存性マンノース６−リン酸レセプターに結合することができるウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター部分が含まれる。別の実施例において、標的ドメインには、ＩＧＦ−ＩＩの１つ以上のアミノ酸（例えば少なくとも４８−５５番アミノ酸；少なくとも８−２８番および４１−６１番アミノ酸；もしくは少なくとも８−８７番アミノ酸。）、あるいはこれらの変形アミノ酸配列（例えばＲ６８Ａ）、あるいはカチオン非依存性マンノース６−リン酸レセプターに結合することができるこれらの切断型（例えば６２番目からのＣ末切断型）が組み入れられている。このペプチドタグは直接、あるいはスペーサーによってＧＡＡポリペプチドと融合される。一実施例においてペプチドタグは、１０−２５個のアミノ酸から成るスペーサーによってＧＡＡポリペプチドに融合されている。別の具体的な実施例においてペプチドタグは、へリックス構造を含有するスペーサーによってＧＡＡポリペプチドに融合されている。別の具体的な実施例においてペプチドタグは、アミノ酸配列ＧＧＧＴＶＧＤＤＤＤＫ（配列番号１）と５０％以上同一のスペーサーによってＧＡＡポリペプチドに融合される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（本発明の詳細）
本発明は、例えばヒト心筋細胞並びに筋細胞等、哺乳類細胞のリソソームへ、より効果的に標的輸送されるＧＡＡを作成する手段を提供する。ＧＡＡはファミリー３１グルコシドヒドロリアーゼの一つである（図１−１から１−１４）。ヒトＧＡＡは１１０  ｋＤａｌの前駆体として合成される（Ｗｉｓｓｅｌａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３）：２２２３−３１）。この酵素の成熟体は、７０  ｋＤａｌ  および７６  ｋＤａｌの単量体から成る複合体である（Ｗｉｓｓｅｌａａｒ  ｅｔ
ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３）：２２２３−３１）。酵素前駆体は、７つの潜在的グリコシル化部位を持ち、このうち４つが成熟酵素でも保持される（Ｗｉｓｓｅｌａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３）：２２２３−３１）。後期エンドソームあるいはリソソームにて、成熟酵素を作り出すタンパク質分解性開裂切断が発生する（Ｗｉｓｓｅｌａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３）：２２２３−３１）。
【００１４】
７０  ｋＤａｌおよび７６  ｋＤａｌの成熟種には、Ｃ末端の１６０のアミノ酸が存在しない。しかし、例えばＶａｌ９４９Ａｓｐ等、ＧＡＡの完全な失活に繋がる特定のポンペ対立遺伝子はこの領域に位置する（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６２：９９１）。この変異体の表現系から、７０  ｋＤａｌ  あるいは７６  ｋＤａｌ種の一部分ではなく、このタンパク質のＣ末端部分が、タンパク質の機能において重要な役割を果たしていることが示唆される。プロセッシングの過程で残りのタンパク質部分から分離するが、このタンパク質のＣ末端部分が、主要タンパク質種と依然会合していると最近報告されている（Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｏｖ．１，２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  ４０４００８２００）。従って、Ｃ末端残基は、タンパク質の触媒活性にも直接的な役割を果たしていると考えられる。あるいは、このＣ末端残基は、このタンパク質のＮ末端部分の正しい折り畳み構造の形成の促進に関係している可能性がある。
【００１５】
関連するタンパク質であるスクラーゼ−イソマルターゼのある特定の対立遺伝子の動きから、後者の可能性が支持されている。この酵素族には、１本のポリペプチド上に一列に並んだ２つの別個であるが類似するグリコシドヒドロリアーゼ触媒領域を含有する、スクラーゼ−イソマルターゼ（ＳＩ）タンパク質が含まれる。これら各々はＧＡＡポリペプチド全体と大きさが同じであり、この２つの触媒領域は、ＧＡＡと３６％並びに３９％同一部分を持つ。ＳＩは小腸刷子縁細胞にて発現し、アミノ末端膜通過ドメインによって触媒領域を腸管腔に向け、この分極細胞の先端膜に局在する。先端膜に達すると、トリプシンによって近アミノ基イソマルターゼ領域からスクラーゼ領域が開裂切断し、イソマルターゼ領域は依然結合した状態で膜に留まる。最近の研究によって、正しい折り畳み構造と、続くイソマルターゼ領域の輸送とに、スクラーゼ領域が必要であることが示されている。即ち、スクラーゼは、イソマルターゼ領域の折り畳みに必要な分子内シャペロンであると言われている（Ｊａｃｏｂ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３２１４１）。
【００１６】
多数の、遺伝子加工したＧＡＡカセットの発現分析によって、成熟ポリペプチドから開裂分離するが、尚、哺乳類細胞が機能性タンパク質を分泌するのに必要な２つの領域の同定が可能となった。我々が現在理解するＧＡＡの構成を図２にまとめる。前駆体ポリペプチドは、シグナル配列およびこれに隣接する推定的な膜通過領域、３つのＳ−Ｓ結合を包含する約４５個のアミノ酸から成るシステインに富む領域であってタンパク質−タンパク質あるいはタンパク質−炭水化物の相互作用に関係すると考えられている三つ葉形領域（ＰＦＡＭ  ＰＦ０００８８）、（Ｔｈｉｍ（１９８９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５０：８５）、成熟７０／７６  ｋＤａｌポリペプチドによって限定される領域、並びにＣ末端領域を有する。ＳＩの三つ葉形領域内の変異は、ＳＩの先端膜選別様式に影響を及ぼす（Ｓｐｏｄｓｂｅｒｇ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２３５０６）。例１並びに例２にて示したデータは、機能性ＧＡＡの生成には三つ葉形領域とＣ末端領域の双方が必要であることを示している。Ｃ末端領域は、タンパク質折り畳みの過程で三つ葉形領域と相互作用し、恐らくはこの三つ葉形領域内で適切なＳ−Ｓ結合形成を促進する可能性がある。
【００１７】
本発明の一実施例において、ペプチドタグをコードするＤＮＡ配列は、フレーム内で、Ｃ末領域を除くＧＡＡポリペプチド全体をコードするＧＡＡカセットの３’末端に融合する。このカセットは、別のポリペプチドとしてＧＡＡのＣ末領域をも発現する哺乳類細胞にて共発現する。
【００１８】
次にこのＣ末領域が７０／７６  ｋＤａｌ  種と協働してトランスに機能し、活性型ＧＡＡが生成される。触媒領域とＣ末領域の境界は、ファミリー３１ヒドロリアーゼ類の大半には存在せず、ＧＡＡ内の４つの連続するプロリン残基を含有する１８個未満のアミノ酸から成る短鎖領域上に存在することから、７９１番残基周辺に存在する模様である。実際、成熟体に会合するＣ末領域が７９２番アミノ酸残基から始まると、現在報告されている（Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｏｖ．１，２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，印刷前原稿  ４０４００８２００）。
【００１９】
安定した細胞系を作り出すために、哺乳類細胞に導入した１つのプラスミド構成体から双方のポリペプチドを発現させることによって、共発現を達成することができる。発現は、当該プラスミド上の２つのプロモーターによって、あるいはこの２つのカセットがＩＲＥＳ部位によって分離されている２シストロン性構成体の発現を誘導する１つのプロモーターによって誘導される。あるいは、別個の選択マーカーを有する別々のプラスミドを連続的に用いて、双方のタンパク質を発現する細胞系を構築することができる。
【００２０】
これらの融合で使用されるペプチドタグをＩＧＦ−ＩＩから誘導して作製し、ＣＩ−ＭＰＲに標的化することができる。あるいは、筋管表面のレセプターに選択的に結合するペプチドタグを採用することができる。当該ペプチドについては記載がある（Ｓａｍｏｙｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  Ｎｅｒｖｅ  ２２：４６０；
ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，３２９，５０１）。Ｆｃレセプター、ＬＤＬレセプター、あるいはトランスフェリンレセプター等他の細胞表面レセプターもまた適切な標的であり、ＧＡＡの標的指向を促進させることができる。
【００２１】
本発明の別の実施例では、このペプチドタグをコードするカセットは、例えば７９１番の位置等、７０／７６  ｋＤａｌポリペプチドとＣ末領域との結合部で、野生型ＧＡＡコード配列内に挿入される。これによって１つのキメラポリペプチドができる。このペプチドタグはこの構成においてその同種レセプターに結合できない可能性があるため、プロテアーゼ開裂切断部位をペプチドタグのすぐ下流に挿入することもできる。正しく折り畳まれた形態でタンパク質が生成された際には、Ｃ末領域をプロテアーゼ処理によって切断することができる。
【００２２】
ヒト血清に通常みられるプロテアーゼが作用するプロテアーゼ開裂切断部位を採用することが所望される場合がある。このような方法で、標的化ＧＡＡをプロドラッグの形態で血流内に導入し、血清中に存在するプロテアーゼによって摂取されるよう活性化させることが可能である。これによって酵素の分配が改善される可能性もある。前記のように、このペプチドタグはＧＩＬＴタグあるいは筋特異的タグでも有りうる。
【００２３】
本発明の別の実施例において、タグは、酵素活性が維持されるようＧＡＡのＮ末端にて融合される（例３）。Ｎ末端融合の場合、異種シグナルペプチドが野生型ＧＡＡのシグナルペプチドに置換されることによって、酵素分泌レベルに影響を及ぼすことが可能である。
【００２４】
ＧＡＡシグナルペプチドはＥＲにて切断されず、このためＧＡＡはＥＲ内で膜結合状態となる（Ｔｓｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．１５（５）：９４５−９５２）。一部の細胞型では、ＥＲの膜トポロジーを保持したまま細胞膜に結合したこの酵素を確認することができる。これは恐らく、シグナルペプチドが切断されないことに起因する（Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ内，Ｖａｌｌｅ，ｅｄ．，２００１，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３３８９−３４２０）。配列分析から、シグナルペプチドに隣接する膜通過領域の存在が示唆されており、これによって恐らく、特定の状態下で酵素が膜に結合した状態のまま保持される。
【００２５】
シグナルペプチドを介したＧＡＡの膜への結合は、酵素が正しくリソソームへ指向する際の重要な寄与因子である可能性がある。これが起こるのに、２つの経路が考えられる。：一つは、膜結合が直接このタンパク質をリソソームへ向かわせる可能性である。もう一つは、膜結合によってＧＡＡがゴルジ体内に留まる時間が長くなり、このためタンパク質に付加するマンノース６リン酸が増加する可能性である。これは最終的に、リソソームへ選別される酵素の割合が増加する効果を有することとなる。いずれの場合も、膜結合が妨げられると、生成された酵素の大半が分泌され、また、後者のモデルが正しければ、この分泌された酵素が有するマンノース６リン酸は少なくなっていることとなる。
【００２６】
ＧＡＡのシグナルペプチドおよび隣接するアミノ酸配列をＧＡＡ用の代替シグナルペプチドに置換することによって、ＧＡＡの膜結合の崩壊を達成することができる。ＧＡＡのＧＩＬＴ標的指向に関して、キメラ遺伝子は、野生型シグナルペプチドの開裂切断部位あるいは適切な下流部位にて、ＧＡＡのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを包含するＩＧＦ−ＩＩタグを含有する。当該キメラ融合体は、高濃度に分泌され、且つＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する高親和性リガンドを含有する組換えＧＡＡの生成を目指すこととなる。
（細胞内標的ドメイン）
本発明は、このタンパク質に対する細胞性レセプターに特異的に結合するタンパク質あるいはタンパク質類似体を使用して、治療剤剤がリソソームへ標的指向できるようにする。細胞表面外側はトポロジー的に、エンドソーム、リソソーム、ゴルジ並びに小胞体の区画と等価である。即ち、適切なレセプター（１個あるいは複数。）との相互作用を介した分子のエンドサイトーシスによって、膜を通過することなく、任意のこれら区画への分子の輸送が可能となる。ある遺伝的欠損症が任意のこれら区画内における特定の酵素活性の欠損に帰結するのであれば、適切なレセプターに対するリガンドを貼付することによって治療性タンパク質の送達を達成することができる。
【００２７】
レセプター結合タンパク質を細胞膜からゴルジ体あるいは（且つ）小胞体へ向かわせる複数の経路の特性が明らかにされている。即ち、例えば１つ以上のこれら細胞内輸送経路を利用するＳＶ４０、コレラ毒素、あるいは植物性毒素リシン由来の標的部分を使用することによって、治療剤を細胞内の所望する部位に標的化させることができる。いずれの場合も、この物質が細胞外側に結合することによって取り込みが開始される。例えば、ＳＶ４０はＭＨＣクラスＩレセプターに結合し、コレラ毒素はガングリオシドＧＭ１に結合する。またリシンは、細胞表面にある末端のガラクトースによって糖脂質並びに糖タンパク質に結合する。この第一段階の後、分子は多様な経路によってＥＲに到達する。例えばＳＶ４０は、カベオラエンドサイトーシスに入り、ゴルジを経由しない２段階工程にてＥＲに到達し、一方コレラ毒素はカベオラエンドサイトーシスに入るがＥＲに到達する前にゴルジを通過する。
【００２８】
コレラ毒素あるいはリシンに関係する標的部分を使用する場合、コレラ毒素あるいはリシンの毒性を避けることが重要である。コレラ毒素とリシンは共に異種同義タンパク質であり、細胞表面結合領域と毒性に関係する触媒活性とが別個のポリペプチドに存在する。即ち、毒性に係わるポリペプチドを持たず、レセプター結合ポリペプチドを含有する標的部分を構成することができる。例えばリシンの場合、サブユニットＢはタンパク質の内在化に係わるガラクトース結合活性を有し、治療性タンパク質に融合させることができる。さらにサブユニットＡを用いて細胞内局在性を改善させる場合、正しく折り畳まれるが触媒的には不活性であるＡ鎖の変異体（ムテイン）を、サブユニットＢ−治療剤剤融合タンパク質と共に使用することができる。
【００２９】
ゴルジ体から外へ出たＥＲ標的指向性タンパク質を回収するＫＤＥＬレセプターを介して、ゴルジ体へ送達されたタンパク質を小胞体（ＥＲ）へ輸送することができる。即ち、治療性タンパク質をゴルジ体へ指向させる標的ドメインの末端にＫＤＥＦ（配列番号２）部分を含有させることによって、その後ＥＲへ局在させることが可能となる。例えば、ｐＨ７．４あるいは約ｐＨ７．４およびｐＨ５．５あるいは約ｐＨ５．５の双方にて、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに結合する標的部分（例えば抗体、あるいはファージディスプレイ、酵母ツーハイブリッド、チップベースアッセイ、並びに溶液ベースアッセイ等のハイスループットスクリーニング等によって同定されるペプチド。）によって、治療性薬剤をゴルジ体へ指向させることができ、さらにＫＤＥＬモチーフを加えることでＥＲへの標的化が可能となる。
（リソソーム指向部分）
本発明によって治療性薬剤のリソソームへの標的化が可能となる。例えば、引き続いてリソソームを通過する細胞膜レセプターの結合を介して、標的指向が生じる場合がある。あるいは、引き続いて後期エンドソームを通過する細胞質レセプターの結合を介して標的指向が生じる場合もあり、その後治療剤剤は後期エンドソームからリソソームへ移動することができる。好ましいリソソーム標的指向機構には、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合が関係する。
（カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター）
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、哺乳類組織にて広く発現する、２７５  ｋＤａ一本鎖の経膜糖タンパク質である。これはＭ６Ｐに結合する２つの哺乳類レセプターの内の１つであり、他方はカチオン依存性Ｍ６Ｐレセプターと呼ばれている。カチオン依存性Ｍ６Ｐレセプターでは、Ｍ６Ｐとの結合に２価カチオンを必要とするが、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは必要としない。これらのレセプターは、リソソーム酵素上の高マンノース炭水化物におけるＭ６Ｐ部分を認識し、これを介してリソソーム酵素類の輸送に重要な役割を果たしている。カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの細胞外ドメインは、レセプターの別々の部位にて様々な種類のリガンドと結合する１５の類似領域（「リピート」）を含有する。
【００３０】
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、２つの、Ｍ６Ｐに対する結合部位を含有する。：１つはリピート１−３に位置し、他方はリピート７−９に位置する。このレセプターは、μＭ単位の解離定数で１価のＭ６Ｐリガンドと結合し、２価のＭ６ＰリガンドとはｎＭ単位の解離定数で結合する。恐らくこれはレセプターのオリゴマー化に起因する。このレセプターによるＩＧＦ−ＩＩの取り込みは、このレセプターに対するリソソーム酵素のような多価Ｍ６Ｐリガンドの同時的結合によって増大する。
【００３１】
またカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、標的指向部位として利用することのできる３つ以上の別個のリガンドに対する結合部位を含有する。カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、ｐＨ  ７．０あるいは約ｐＨ  ７．０にて、約１４  ｎＭの解離定数でＩＧＦ−ＩＩと結合し、これは基本的にリピート１１との相互作用が仲介する。ＩＧＦ−ＩＩをリソソームへ標的指向させる際の機能と一致して、ｐＨ  ５．５あるいは約ｐＨ  ５．５にて解離定数は約１００倍増加し、酸性後期エンドソーム内でＩＧＦ−ＩＩの解離を促進する。このレセプターは、高分子量のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−ＩＩ形態物を結合することができる。
【００３２】
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに対するさらに別の有用なリガンドは、レチノイン酸である。レチノイン酸は２．５  ｎＭの解離定数でレセプターと結合する。レチノイン酸を用いたカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの光親和性標識は、ＩＧＦ−ＩＩあるいはＭ６Ｐのレセプターへの結合を妨げず、これはレチノール酸がレセプターの別の部位で結合することを示唆する。レチノイン酸がレセプターと結合すると、レセプターの細胞内分布が変わり、細胞質性媒体中のレセプターがより集合した状態となって、Ｍ６Ｐ修飾βグルコシダーゼの取り込みも促進される。レチノイン酸は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合能を妨げることなく、治療性薬剤にこれを結合させるのに利用することのできる光活性化部分を有する。
【００３３】
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターはまた、９μＭの解離定数で、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター（ｕＰＡＲ）と結合する。ｕＰＡＲは、大半の種類の細胞の表面上にあるＧＰＴアンカー型レセプターであり、ここでｕＰＡＲは接着分子として機能し、さらにプラスミノーゲンおよびＴＧＦ−βのタンパク質分解活性化にて機能する。ｕＰＡＲのＣＩ−Ｍ６Ｐへの結合によって、ＣＩ−Ｍ６Ｐはリソソームへ向かい、これによってその活性が調節される。即ち、ｕＰＡＲの細胞外ドメインあるいは、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合能を持つこれの一部分を治療剤剤に融合させることによって、薬剤をリソソームへ標的指向させることが可能である。
ＩＧＦ−ＩＩ
好ましい実施様態においてリソソーム標的化タンパク質は、マンノース６リン酸非依存的にカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター／ＩＧＦ−ＩＩレセプターと結合するタンパク質、ペプチド、あるいはその他の部分である。都合のよいことに、この実施様態は、ＬＳＤタンパク質の取り込みに関する通常の生物機構を模擬しているが、マンノース６リン酸には非依存的である。
【００３４】
例えば、ＩＧＦ−ＩＩ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡをＬＳＤ遺伝子カセットの３’末端へ融合させることによって、様々な種類の細胞に取り込まれ、リソソームへ輸送することが可能な融合タンパク質が創出される。あるいは、ＩＧＦ−ＩＩ前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡをＬＳＤ遺伝子カセットの３’末端へ融合させるともできる。；この前駆体は、哺乳類細胞内で開裂切断されてＩＧＦ−ＩＩ成熟ポリペプチドを作るカルボキシル末端部分を包含するが、ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドは割愛されることが好ましい（あるいはＬＳＤ遺伝子カセットの５’末端へ移す。）。一旦タンパク質が単離されればさらなる修飾の必要がないため、この方法はグリコシル化が係わる手法と比較して、簡便性および費用効果等多数の利点を有する。
【００３５】
ＩＧＦ−ＩＩは特異的にＭ６Ｐレセプターを標的指向することが好ましい。特に、高い親和性でＭ６Ｐレセプターに結合するが、認識されるほどの親和力では他の２つのレセプターと結合しないタンパク質に帰着する、ＩＧＦ−ＩＩポリペプチド内の変異は有用である。また、ＩＧＦ−ＩＩ／ＧＩＬＴ構成物の排斥を避けるため、ＩＧＦ-ＩＩを修飾して
血清ＩＧＦ結合タンパク質との結合を最小にすることができる（Ｂａｘｔｅｒ（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２７８（６）：９６７−７６）。多数の研究が、ＩＧＦ結合タンパク質の結合に必要な、ＩＧＦ−Ｉ並びにＩＧＦ−ＩＩ中のアミノ酸残基に焦点を当てている。Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する高親和結合性の保持並びにＩＧＦ−結合タンパク質に対する親和性の低下に関して、これらのアミノ酸残基における変異を有する構成物を試験選抜することができる。例えば、ＩＧＦ−ＩＩのＰｈｅ２６をＳｅｒに置換すると、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合には影響を与えずに、ＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦＢＰ−１および−６に対する親和性が低下すると報告されている（Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：（１３）９２４６−５４）。Ｐｈｅ１９をＳｅｒ、並びにＧｌｕｅ９をＬｙｓ等、他の置換も有益であることが可能である。ＩＧＦ−ＩＩと共に高度に保存されているＩＧＦ−Ｉの一領域内における、単独あるいは共同的な相似性変異は、ＩＧＦ−ＢＰ結合の著しい低下に帰結する（Ｍａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８（４８）：１５８６３−７０）。
【００３６】
別のアプローチは、高い親和性でＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合することができる、ＩＧＦ−ＩＩの最小領域を同定することである。ＩＧＦ−ＩＩのＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプター結合に関係するアミノ酸残基は、その大半がＩＧＦ−ＩＩの一表面に群集する（Ｔｅｒａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（２３）：５５９０−７）。ＩＧＦ−ＩＩの３次構造は通常、３つのＳ−Ｓ結合によって維持されているが、ＩＧＦ−ＩＩのＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプター結合面上のアミノ酸配列を組み入れたペプチドを、正確な折り畳み構造と結合活性とを有するよう設計することができる。当該最小結合性ペプチドは、非常に好ましい標的指向部位である。４８−５５番アミノ酸周辺領域に基づいて設計されたペプチドを、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合性に関して試験することができる。あるいは、ペプチドの無作為ライブラリーを、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合能に関して、酵母ツーハイブリッド法あるいはファージディスプレイ型アッセイによって試験選抜することができる。
【００３７】
（血液脳関門）
リソソーム蓄積症に対する治療における一つの対処すべき問題点は、これらの疾患の多くでは神経学的事項が強く関係している点である。血流内に投与した治療性酵素は通常、血液脳関門を通過することができず、このため疾患に伴う神経学的症状を軽減することができない。しかしＩＧＦ−ＩＩは、経細胞輸送を介して血液脳関門を通過する輸送を促進すると報告されている（Ｂｉｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４６（１−３）：２４７−７７９）。即ち、適切に設計されたＧＩＬＴ構成物は血液脳関門を通過できるはずであり、リソソーム蓄積症に伴う神経症状の治療手段を提供する最初のものである。この構成物は例１２に記載したようにＧＵＳマイナス
マウスを使用して試験することができる。血液から神経組織に到達することのできる標的化治療剤の設計、構成、並びに試験に関する詳細は、２００１年１０月１６日に提出されたＵ．Ｓシリアル番号Ｎｏ．６０／３２９，６５０、並びに２００２年４月３０日に提出されたＵ．Ｓシリアル番号Ｎｏ．１０／１３６，６３９にて開示されている。
【００３８】
（ＩＧＦ−ＩＩの構造）
ＩＧＦ−ＩＩのＮＭＲ構造は、２つのグループが解明している（Ｔｅｒａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（２３）：５５９０−７；Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２）：３８５−４０１）（例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  登録記号  １ＩＧＬを参照する。）。ＩＧＦ−ＩＩの全体的特徴はＩＧＦ−Ｉおよびインスリンに似る。ＩＧＦ−ＩＩのＡ領域並びにＢ領域は、インスリンのＡ鎖並びにＢ鎖に相当する。２次構造の特徴には、Ｂ領域の１１−２１番アミノ酸残基に渡るアルファへリックスが２２−２５番残基における反転部によって２６−２８番残基における短いベータ鎖と繋がっている点が含まれる。ＩＧＦ−ＩＩのＡ領域では、４２−４９番並びに５３−５９番残基に渡るアルファヘリックスが逆平行に位置し、これらはＢ領域のヘリックスに対し垂直にてなっている。３つあるＳ−Ｓ結合の内の２つ並びに保存されている疎水性残基によって形成された疎水性分子群が、これら２次構造の特性を安定化している。Ｎ末端並びにＣ末端は、３１−４０番残基の間の領域のように、依然明確には確定されてない。
【００３９】
ＩＧＦ−ＩＩはＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６Ｐレセプター並びにＩＧＦ−Ｉレセプターに、比較的高い親和性で結合し、インスリンレセプターとはより低い親和性で結合する。ＩＧＦ−ＩＩはまた、多数の血清ＩＧＦＢＰと相互作用する。
【００４０】
（ＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６Ｐレセプターへの結合）
ＩＧＦ−ＩＩの４８−５０番残基（Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ）をインスリンの相当する残基（Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ）に置換する、あるいは５４−５５番残基（Ａｌａ  Ｌｅｕ）をＩＧＦ−Ｉの相当する残基（Ａｒｇ  Ａｒｇ）に置換すると、ＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６Ｐレセプターへの結合性低下に帰着するが、ＩＧＦ−Ｉ並びにインスリンレセプターへの結合は維持される（Ｓａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（３１）：２０６２５−３５）。
【００４１】
ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩは、４８−５０番残基の領域に共に同一の配列および構造を持つが、ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する親和性は１０００倍異なる。ＮＭＲ構造分析によって、ＩＧＦ−ＩＩの５３−５８番残基の領域（ＩＧＦ−Ｉの５４−５９番残基）にて、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩとの構造的差異が示されている。：ＩＧＦ−ＩＩ  はＩＧＦ−Ｉよりもアルファヘリックスがより明確であり、ＩＧＦ−Ｉとは異なり５３番並びに５４番残基周辺の主鎖に折れ曲がりは存在しない（Ｔｏｒｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２）：３８５−４０１）。この構造的差異はＩＧＦ−ＩＩ内のＡｌａ５４およびＬｅｕ５５がＩＧＦ−ＩではＡｒｇ５５並びにＡｒｇ５６に置き換わっていることに関係する。この領域の荷電性残基の存在が直接ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合を妨げる、あるいは荷電性残基によって生じる構造変化がＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合変化を生みだすといういずれかの可能性がある。いずれの場合も、ＩＧＦ−Ｉの２つのＡｒｇが非荷電性残基に置換されていることが、ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する高親和性をもたらした（Ｃａｃｃｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｉａｎ  １４（３）：１４６−５３）。即ち、これの部位における正に荷電したアミノ酸残基の存在が、ＩＧＦ−ＩＩへの結合性の失活に関係している。
【００４２】
ＩＧＦ−ＩＩは、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのリピート１１に結合する。実際、リピート１１のみをカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの膜通過領域並びに細胞質領域に融合させたミニレセプターは、ＩＧＦ−ＩＩに結合することができ（完全長レセプターの親和力の約１０分の１の親和力で。）、ＩＧＦ−ＩＩの内在化とリソソームへの送達を仲介する（Ｇｉｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３６９７−３３７０３）。Ｍ６Ｐレセプターの領域１１の構造は判明している（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  の登録記号は１ＧＰ０  並びに  １ＧＰ３。；  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＥＭＢＯ  Ｊ．２１（５）：１０５４−１０６２）。推定されるＩＧＦ−ＩＩ結合部位は、ＩＧＦ−ＩＩの疎水性アミノ酸と相互作用すると考えられる疎水性ポケットであり、候補となるＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸には、８番ロイシン、４８番フェニルアラニン、５４番アラニン、および５５番ロイシンが含まれる。リピート１１はＩＧＦ−ＩＩと結合することができるが、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのより大きな部分（例えばリピート１０−１３、あるいは１−１５）を含有する構成物は一般に、より大きな親和力で、またより大きくｐＨに依存してＩＧＦ−ＩＩと結合する（例えばＬｉｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２６）：２３９８６−２３９９１を参照する）。
【００４３】
（ＩＧＦ−Ｉレセプターへの結合）
ＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸残基、Ｔｙｒ２７をＬｅｕに、あるいはＬｅｕ４３をＶａｌに、Ｓｅｒ２６をＰｈｅに置換すると、ＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−Ｉレセプターに対する親和性がそれぞれ９４倍、５６倍、４倍低下する（Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２）：３８５−４０１）。ヒトＩＧＦ−ＩＩの１−７番残基が欠失するとＩＧＦ−Ｉレセプターへの親和性が３０倍減少し、同時にラットＩＧＦ−ＩＩレセプターへの親和性が１２倍増加する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３０）：１８０１３−８）。ＩＧＦ−ＩＩのＮＭＲ構造は、Ｔｈｒ７が、９Ｃｙｓ−４７ＣｙｓのＳ−Ｓ結合の近辺且つ４８番Ｐｈｅ並びに５０番Ｓｅｒ残基の近くに位置していることを示している。Ｔｈｒ７とこれらのアミノ酸残基との相互作用は、ＩＧＦ−Ｉレセプター結合に必要な、たわみやすいＮ末端６残基ペプチドを安定化させることができる（Ｔｅｒａｓａｗａ  ｅｔ  ｌａ．（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２（２３）５５９７−７）。同時にこの相互作用は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合を調節することができる。ＩＧＦ−ＩＩのＣ末端（６２−６７番残基）切断もまた、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの親和性を５倍低下させる模様である（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８１（２）：９０７−１４）。
【００４４】
（ＩＧＦ−ＩＩの欠失変異）
ＩＧＦ−Ｉレセプター並びにカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに対する結合面は、ＩＧＦ−ＩＩの別個の面にある。構造データおよび変異データに基づいて、ヒトＩＧＦ−ＩＩよりも著しく小さい機能的なカチオン非依存性Ｍ６Ｐ結合領域を構築することができる。例えば、アミノ末端１−７番アミノ酸あるいは（且つ）カルボキシル末端６２−６７番残基は削除あるいは置換することができる。さらに、２９−４０番アミノ酸を、これ以外の部分のポリペプチドの折り畳みあるいはカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合性を変えることなく、削除あるいは置換することができる可能性もある。即ち、８−２８番および４１−６１番アミノ酸を包含する標的部分を構築することができる。これらのアミノ酸の区間は恐らく、直接連結する、あるいはリンカーによって分けられた状態にすることができる。あるいは、８−２８番および４１−６１番アミノ酸を別個のポリペプチド鎖上にて提供することができる。ＩＧＦ−ＩＩと相同性があり、ＩＧＦ−ＩＩの構造と密接に関係する３次構造を持つインスリンの相当する領域には、たとえ別個のポリペプチド鎖に存在していても、再び正しく折り畳まれて適正な３次構造となることを可能にするのに十分な構造的情報が存在している（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２７９−２８１）。即ち、例えば、８−２８番アミノ酸あるいはこれらの保存的置換変異体を治療剤剤に融合させることができると考えられる。；この結果できる融合タンパク質を、４１−６１番アミノ酸あるいはこれらの保存的置換変異物と混和して患者に投与することができると考えられる。
【００４５】
ＩＧＦ−ＩＩタグの正確な提示および折り畳みを促進する目的で、ＩＧＦ−ＩＩのより長い部分を使用することができる。例えば、１−６７番もしくは１−８７番アミノ酸残基、あるいは全前駆体を包含するＩＧＦ−ＩＩタグを使用することができる。
【００４６】
（ＩＧＦ結合タンパク質への結合）
ＩＧＦ−ＩＩ並びに関連する構成物を修飾して、ＩＧＦＢＰ類への親和性を低下させ、これによって標的タンパク質の生物利用性を増進させることができる。
【００４７】
ＩＧＦ−ＩＩの２６番フェニルアラニンをセリン残基に置換すると、ＩＧＦＢＰ１〜５への結合性が５〜７５倍低下する（Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１３）：９２４６−５４）。ＩＧＦ−ＩＩの４８−５０番残基をスレオニン−セリン−イソロイシン残基に置換すると、大部分のＩＧＦＢＰへの結合が１００倍以上低下する（Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１３）：９２４６−５４）。；しかし、これらのアミノ酸残基はカチオン非依存性マンノース６リン酸レセプターの結合にも重要である。ＩＧＦ−Ｉレセプターへの結合を妨げるＹ２７Ｌ置換は、ＩＧＦＢＰ３および酸不安定性サブユニットとの三重複合体形成を干渉する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４４）：２７９３６−４２）。；この三重複合体は、循環系内の大半のＩＧＦ−ＩＩを捕捉する（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ  Ａｎａｌ．１３（４）：１６６−７２）。また、ＩＧＦ−ＩＩの最初の６残基を削除すると、ＩＧＦＢＰ結合を干渉する（Ｌｕｔｈｉｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５（２）：４８３−９０）。
【００４８】
ＩＧＦ−ＩのＩＧＦＢＰ類との相互作用に関する研究から、１６番フェニルアラニンをセリンに置換しても２次構造に影響しないが、ＩＧＦＢＰ結合性が４０から３００倍低下することがさらに明らかになった（Ｍａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８（４８）：１５８６３−７０）。また９番グルタミンをリジンに変えても、ＩＧＦＢＰ結合性は著しく低下する。さらに、９番リジン／１６番セリンの二重変異体は、最も低いＩＧＦＢＰ結合性を呈した。ＩＧＦ−ＩＩにおけるこれらの変異体については、これまでに試験されていないが、ＩＧＦ−Ｉ並びにＩＧＦ−ＩＩのこの領域間のアミノ酸配列の保存性から、ＩＧＦ−ＩＩで同様の変異を起こした場合（１２番グルタミン酸をリジン／１９番フェニルアラニンをセリン）、同様の影響が認められるであろうことが示唆される。
【００４９】
（ＩＧＦ−ＩＩとの相同性）
ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列、あるいはカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合に影響を及ぼすこれらの一部分を参照配列として使用して、本発明の方法にて成功するという合理的な期待を持つのに十分なアミノ酸類似性を候補配列が有しているか否かを判定することもできる。様々な配列は、ヒトＩＧＦ−ＩＩと少なくとも７０％の類似性あるいは６０％の同一性があることが好ましく、より好ましくは少なくとも７５％の類似性あるいは６５％の同一性があり、少なくとも８０％の類似性あるいは７０％の同一性があることがさらに好ましい。
【００５０】
ペプチド領域候補が必要とされるパーセンテージのヒトＩＧＦ−ＩＩとの類似性あるいは同一性を有しているか否かを判定するため、最初に、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７に記載されているダイナミック・プログラミング・アルゴリズムを、ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：１０９１５−１０９１９の図２に記載されているＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスと組み合わせて使用し、候補アミノ酸配列とヒトＩＧＦ−ＩＩとを配列比較する。本発明に関して、ギャップ挿入ペナルティの適切な値は−１２であり、ギャップ伸張ペナルティに適切な値は−４である。ＧＣＧプログラム・スイート（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）等、Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムとＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスとを使用する配列比較を実行するコンピュータープログラムは市販されており、当分野の技術者によって広く使用されている。
【００５１】
候補配列と参照配列との比較を実行すると、パーセント類似性スコアを計算することもできる。互いの類似性に従って、各配列の個々のアミノ酸を順に比較する。比較する２つのアミノ酸に対応するＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスにおける値がゼロあるいはマイナス値である場合、ペアワイズ類似性スコアはゼロである。；そうでない場合、ペアワイズ類似性スコアは１．０である。この一次類似性スコアは、比較するアミノ酸のペアワイズ類似性スコアの総和である。次にこの一次スコアを、候補配列あるいは参照配列のより小さい方のアミノ酸数で割って標準化する。この標準化した一次スコアが類似性パーセントである。あるいは、同一性パーセントを計算するために、各配列の配列比較するアミノ酸を再び続けて比較する。アミノ酸が同一ではない場合、ペアワイズ同一性スコアはゼロである。；そうでない場合、ペアワイズ同一性スコアは１．０である。一次同一性スコアは、同一性比較したアミノ酸の総和である。この一次スコアを、候補配列あるいは参照配列のより小さい方のアミノ酸数で割って標準化する。この標準化した一次スコアが同一性パーセントである。類似性パーセント並びに同一性パーセントを計算する目的のためには、挿入並びに欠失は考慮しない。従って、初回配列比較ではギャップペナルティを使用するが、この計算では使用しない。
【００５２】
（ＩＧＦ−ＩＩの構造類似体）
判明しているヒトＩＧＦ−ＩＩ並びにカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの構造によって、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，２２６，６０３並びにＮｏ．６，２７３，５９８にて議論されているもの等、コンピューター支援の設計原理を用いて、ＩＧＦ−ＩＩ類似体並びに他のカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合タンパク質の設計が可能である。例えば、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．のＢｉｏｓｙｍから市販されているＩＮＳＩＧＨＴＩＩ、ＤＩＳＣＯＶＥＲ，あるいはＤＥＬＰＨＩ、もしくはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．から市販されているＱＵＡＮＴＡあるいはＣＨＡＲＭＭ等、一般的なモデル作製コンピュータープログラムを備えたコンピューターで、周知されているＩＧＦ−ＩＩの原子座標が得られる。これらあるいはその他のプログラムソフトウエアによって、分子構造解析並びに、構造並びに分子内相互作用に対する分子交換の影響を予測するシミュレーションが可能となる。例えば、このソフトウエアを使用して、分子内水素結合あるいはイオン結合をさらに形成する能力を有する修飾類似体の同定を行うことができ、標的レセプターに対する類似体の親和性が改善される。
【００５３】
またこのソフトウエアによって、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合面の少なくとも一部分に表れるものに似た構造的化学的特性を有するペプチド並びに有機分子の設計が可能となる。このレセプター結合面に寄与するものは主に、レセプター結合面を限定するアミノ酸群の側鎖内に存在する、化学的に相互作用する部分の空間配置であるため、本発明の好ましい一様態は、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合面を構成するアミノ酸側鎖にある化学部分の空間関係を模擬する空間関係において化学的に相互作用する部分を持つ骨格を有する合成有機分子の設計並びに作製に関係する。好ましい化学部分には、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合面を構成するアミノ酸のアミノ酸側鎖によって限定される化学部分が含まれるが、これらに限定されない。よって、ＩＧＦ−ＩＩ類似体のレセプター結合面はアミノ酸残基から構成される必要はなく、そこに位置する化学部分から構成される必要があることが理解される。
【００５４】
例えば、関連する化学部分の同定に基づいて、一般的なコンピュータープログラムを使用する技術者は、適切なキャリアーとなる骨格上に位置するレセプター相互作用性化学部分を有する小分子を設計することができる。有用なコンピュータープログラムは、例えば、Ｄｉｘｏｎ（１９９２）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １０：３５７−３６３；Ｔｓｃｈｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３８６３−３８７０；並びにＥｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：１９９−２２１に記載されており、参考のため、これらの公開文献をこの明細に添付する。
【００５５】
「ＣＡＶＥＡＴ」と名付けられた、ある一コンピュータープログラムは、例えば、所望する化学部分の空間位置を有する構造に関して、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ等のデータベースを検索する（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ」（Ｒｏｂｅｒｔ，Ｓ．Ｍ．編）内Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．ｐｐ  １８２−１９６（１９８９））。このＣＡＶＥＡＴというプログラムは、テンダミスタット３次元構造における選択したアミノ酸側鎖の配向に基づいて、７４アミノ酸残基のαアミラーゼインヒビターであるテンダミスタット類似体を設計するために使用されている（上記Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９））。
【００５６】
あるいは、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合活性を模擬する一連の類似体の同定に基づき、技術者が定量的構造活性相関（ＱＡＳＲ）を導き、第三のモルフォゲン類似体の新規設計を支援するのを援助する、様々なコンピュータープログラムを技術者が使用する場合もある。他の有用なコンピュータープログラムは、例えばＣｏｎｎｏｌｌｙ−Ｍａｒｔｉｎ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：５８７−６１３；Ｄｉｘｏｎ（１９９２）上記；並びにＷａｓｚｋｏｗｙｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｎｍ．３７：３９９４−４００２にて記載されている。
【００５７】
（融合接合部）
ＧＡＡがペプチドタグあるいは標的ドメインを有する融合タンパク質として発現される場合、このペプチドタグをＧＡＡポリペプチドに直接融合させる、あるいはリンカーによってＧＡＡポリペプチドから離れた状態にすることができる。アミノ酸リンカーには、天然タンパク質でその位置に現れるもの以外のアミノ酸配列が組み入れらており、一般に柔軟性を持つよう、あるいは２つのタンパク質部分の間にαヘリックス等の構造が挿入されるよう設計される。リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＰｒｏあるいはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３）等、比較的短いものであることができ、もしくは、例えば１０−２５アミノ酸の長さ等、より長いものであることができる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ（配列番号４））から成る３〜４個の同一部分から成る柔軟な繰返しリンカー、並びにアミノ酸配列（ＥＡＡＡＫ（配列番号５））から成る２〜５個の同一部分から成るαヘリックス繰返しリンカーが記載されている（Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５７：８２９−８３８）。ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質に関して、ＧＧＧＧＴＶＧＤＤＤＤＫ（配列番号１）という他のリンカーの使用も報告されている（ＤｉＦａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６：４０７−４１３）。ヒト血清タンパク質のαヘリックス部位が組み入れられたリンカーを使用して、リンカー領域の免疫抗原性を最小にすることができる。
【００５８】
融合接合部位は、正しい折り畳みおよび融合相手双方の活性を促し、且つ成熟体となる前にＧＡＡポリペプチドからペプチドタグが分離するのを防ぐよう、注意して選択されるべきである。図３は、図２にて説明するＧＡＡタンパク質の構成モデルに基づいて、ＧＩＬＴタグＧＡＡを作製するための４つの典型的な方策を説明する。
１．アミノ末端にタグを融合する。
２．三つ葉型領域と成熟体部分との間にタグを挿入する。
３．成熟体部分とＣ末端領域との間にタグを挿入する。
４．切断したＧＡＡのＣ末端にタグを融合し、Ｃ末領域を共発現させる。
例えば、標的ドメインは、直接あるいはスペーサーによって、ＧＡＡの７０番アミノ酸に融合させることができる。これはタンパク質の発現、ＧＡＡ部分の触媒活性、および例４に記載した標的部分による正しい標的指向が可能な部位である。あるいは、成熟ポリペプチドからＧＡＡのＣ末端領域が分離する開裂部位、あるいはその近辺に、標的ドメインを融合させることができる。これによって、内部に標的ドメインを持つＧＡＡタンパク質の合成が可能となり、これは、随意で開裂分離させて標的ドメインから、開裂部位の位置に応じて成熟ポリペプチドあるいはＣ末端領域を分離することができる。あるいは、発現構成物のオープンリーディングフレーム内にＣ末端配列を組み入れることなく、７９１番部位の近辺にて成熟ポリペプチドを融合タンパク質として合成することができる。
【００５９】
ＧＩＬＴタグの折り畳みを促すため、融合接合部位に隣接するＧＡＡアミノ酸残基を修飾することができる。例えば、ＧＡＡのシステイン残基がＧＩＬＴタグの正しい折り畳みを妨げる可能性があるため、ＧＡＡの末端９５２番システインを欠失させる、あるいはセリンと置換させてＧＩＬＴタグのＣ末端に適合させることができる。また、ＧＩＬＴタグは、末尾Ｃｙｓ９５２の直ぐ手前に融合させることもできる。末尾Ｃｙｓ９５２をセリンに変異させると共に、末尾から２番目となるＣｙｓ９３８をプロリンに換えることができる。
【００６０】
あるいは、タグをＧＡＡポリペプチドに、化学的に結合させることができる。
【００６１】
（標的部分の親和性）
標的部分は、マイクロ未満の解離定数で標的レセプターと結合することが好ましい。一般に、解離定数がより低ければ（例えば１０−７  Ｍ未満、あるいは１０−８  Ｍ未満、１０−９  Ｍ未満。）、より好ましい。解離定数は、Ｌｉｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２６）：２３９８６−２３９９１に記載されているような、表面プラスモン共鳴によって測定することが好ましい。標的レセプターの細胞外ドメイン（例えばカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのリピート１−１５。）の可溶形態を作り、アビジン−ビオチン相互作用を介してチップに固定する。チップ上を、標的部分を通過させて反応速度定数および平衡定数を検出し、チップ表面に会合する質量の変化を測定することによって算出する。
（アミノ酸配列類似性の計算）
触媒領域あるいはシャペロン領域、細胞内標的ドメインとして作用する可能性のある、開示したアミノ酸配列の異型体を作る目的で、例えばＩＧＦ−ＩＩ等、この明細にて開示される天然に存在するαグリコシダーゼあるいは細胞内標的ドメインのうち任意の１つ以上を参照配列として使用して、候補配列が本発明の方法において合理的な成功の可能性を持つのに十分なアミノ酸類似性を有するか否かを判定することができる。例えば、触媒領域の異型アミノ酸配列は、開示した、天然に存在する酸性アルファグルコシダーゼ触媒領域に対し５０％以上の類似性もしくは３０％以上の同一性を有し、好ましくは５５％以上の類似性もしくは３５％以上の同一性、より好ましくは６０％以上の類似性もしくは４０％以上の同一性、より好ましくは６５％以上の類似性もしくは４５％以上の同一性、より好ましくは７０％以上の類似性もしくは５０％以上の同一性、より好ましくは７５％以上の類似性もしくは５５％以上の同一性、より好ましくは８０％以上の類似性もしくは６０％以上の同一性、より好ましくは８５％以上の類似性もしくは６５％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の類似性もしくは７０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の類似性もしくは７５％以上の同一性、さらに最も好ましいのは８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、あるいは９５％の同一性を有する。シャペロン領域の異型アミノ酸配列は、開示した、天然に存在する酸性アルファグルコシダーゼのシャペロン領域に対し４０％以上の類似性もしくは２０％以上の同一性を有し、好ましくは４５％以上の類似性もしくは２５％以上の同一性、より好ましくは５０％以上の類似性もしくは３０％以上の同一性、より好ましくは５５％以上の類似性もしくは３５％以上の同一性、より好ましくは６０％以上の類似性もしくは４０％以上の同一性、より好ましくは６５％以上の類似性もしくは４５％以上の同一性、より好ましくは７０％以上の類似性もしくは５０％以上の同一性、より好ましくは７５％以上の類似性もしくは５５％以上の同一性、より好ましくは８０％以上の類似性もしくは６０％以上の同一性、より好ましくは８５％以上の類似性もしくは６５％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の類似性もしくは７０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の類似性もしくは７５％以上の同一性、さらに最も好ましいのは８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、あるいは９５％の同一性を有する。標的ドメインの異型アミノ酸配列は、開示した、天然に存在する標的ドメインに対し７０％以上の類似性もしくは６０％以上の同一性を有し、より好ましくは７５％以上の類似性もしくは６５％以上の同一性、より好ましくは８０％以上の類似性もしくは７０％以上の同一性、より好ましくは８５％以上の類似性もしくは７５％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の類似性もしくは８０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の類似性もしくは８５％以上の同一性、さらに最も好ましいのは９０％の同一性、あるいは９５％の同一性を有する。
【００６２】
候補ペプチドが、参照ポリペプチドあるいはペプチドオリゴマーに対して必要とする割合の類似性あるいは同一性を有しているか否かを判定するため、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７にて記載されているダイナミック・プログラミング・アルゴリズムを用いて、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２），「Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ」ＰＮＡＳ（１９９２  Ｎｏｖ），８９：１０９１５−１０９１９の図２に記載されているＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスを併用し、候補アミノ酸配列と参照アミノ酸配列とを最初に配列比較する。本発明に関して、ギャップ挿入ペナルティの適切な値は−１２であり、ギャップ伸張ペナルティの適切な値は−４である。ＧＣＧプログラムスイート（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）等、Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムとＢＬＯＡＵＭ６２マトリックスとを使用して配列比較を実行するコンピュータープログラムは市販されており、当分野の技術者によって広く使用されている。
【００６３】
候補配列と参照配列との配列比較を実行すると、パーセント表示の類似性スコアが算出される場合がある。各配列の個々のアミノ酸は、類似性に従って連続的に互いに比較される。この２つの配列比較するアミノ酸に対応する、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス内の値がゼロあるいはマイナス値であれば、ペアワイズ類似性スコアはゼロである。；そうでなければペアワイズ類似性スコアは１．０である。一次類似性スコアは、比較したアミノ酸のペアワイズ類似性スコアの総和である。次にこの一次スコアを、候補配列あるいは参照配列のより小さい方のアミノ酸数で割って標準化する。この標準化した一次スコアは、パーセントで表した類似性である。あるいは、同一性パーセントを計算するため、各アミノ酸配列の配列比較したアミノ酸を再び連続的に比較する。アミノ酸が同一でなければ、ペアワイズ同一性スコアはゼロであり、他方のペアワイズ同一性スコアは１．０１である。この一次同一性スコアは、同一である比較したアミノ酸の総和である。次にこの一次スコアを、候補配列あるいは参照配列のより小さい方のアミノ酸数で割って標準化する。標準化した一次スコアは、パーセンテージで表す同一度である。従って初回の配列比較ではギャップペナルティを用いるが、この計算では用いない。
（投与）
本発明に従って作製した標的化治療剤は、任意の経路で哺乳類レセプターに投与することができる。即ち、適合性に応じて、投与は経口あるいは非経口であることができ、これには静脈経由投与経路並びに腹腔内投与経路が含まれる。さらに、投与は治療剤剤から成るボーラスの定期注入によるものであることができ、もしくは、外部にある貯蔵物（例えば静脈注入用バッグ）から静脈経由投与あるいは腹腔内投与によって、より連続的に行うことができる。一部の特定の実施様態において、本発明の治療剤剤は製薬等級であることができる。即ち、一部の実施様態は、ヒトに投与するのに必要とされる精製標準法並びに品質管理に従う。また獣医学への利用は、この明細で使用される使用目的の範囲内に収まる。
【００６４】
獣医学およびヒトの双方のために、医療に使用するための本発明の治療剤剤から成る組成物は、典型的には、これらのための薬学的に許容される担体および随意で他の成分（１個または複数）と合わせて、当該治療剤剤を包含する。この担体は、組成物の他の成分に適合し、これの受容者にとって心身有害なものではないという点で、「許容される」ものであることができる。これに関して、薬学的に許容される担体とは、薬学的投与に適合する任意且つ全ての溶媒、並びに分散媒質、コーティング剤、抗細菌剤並びに抗真菌剤、等張剤並びに吸収遅延剤等を包含することが意図される。薬学的活性物質のための当該溶媒並びに薬剤の使用については、当分野で周知されている。一般的な溶媒あるいは薬剤がこの活性化合物に適合しない場合を除き、この組成物におけるこれらの使用が企図される。また、補助的活性物質（本発明に従って同定されるもの、あるいは（且つ）当分野で周知されているもの。）をこの組成物に組み入れることができる。便利のため、この組成物を単位投与量形態物にて提供することができ、組成物は薬学・微生物学の分野でよく周知されている任意の方法によって調製することができる。一般に、一部の組成物は、治療剤剤を液体担体あるいは微細に分割された固体担体あるいはその両方と合わせ、次に必要に応じてこの製品を所望する組成物に成形することによって調製される。
【００６５】
本発明の製薬組成物は、意図する投与経路に適合するよう調剤される。投与経路の例には、例えば静脈内投与、皮膚内投与、吸入、経皮（局所）投与、経粘膜投与、並びに直腸投与等、経口あるいは非経口投与が含まれる。非経口投与、皮膚内投与、あるいは皮下投与のために使用される溶液あるいは懸濁液には、以下の成分を含めることができる。：注入用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、あるいは他の合成溶媒等の滅菌稀釈剤；ベンジルアルコールあるいはメチルパラベン等の抗細菌剤；アスコルビン酸あるいは重硫酸ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸等のキレート剤；酢酸、クエン酸、あるいはリン酸等の緩衝液、並びに塩化ナトリウムあるいはデキストロース等の浸透圧調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸あるいは水酸化ナトリウム等、酸あるいは塩基で調整することができる。
【００６６】
経口あるいは非経口投与のための有用な溶液は、薬学分野にてよく周知されている任意の方法によって調製することができ、例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（Ｇｅｎｎｎａｒｏ，Ａ．，ｅｄ．），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．，１９９０にて記載されている。また経口投与のための組成物は、バッカル投与のためのグリコール酸塩、直腸投与のためのメトキシサリチル酸、あるいは経膣投与のためのｃｕｔｒｉｃ酸を包含することができる。経口調製物は、ガラスあるいはプラスチックでできたアンプル、使い捨て注射器、あるいは複数回投与用バイアルに封入することができる。また直腸投与のための座薬は、ココアバター、その他のグリセリド、あるいは常温で固体且つ体温で液体となる他の組成物等の非刺激性の医薬品添加物と共にこの薬剤を混合することによって調製することができる。また組成物は、例えば、ポリエチレングリコール等のポリアキレングリコール、植物由来の油、硬化ナフタリン等を包含することができる。直接投与のための組成物は、グリセロール並びに高粘度の他の構成物を包含することができる。これら治療剤剤のための、潜在的に有用な経口投与用担体には、エチレン−酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型輸滴システム、並びにリポソームが含まれる。吸入投与のための組成物は、医薬品添加物として例えば乳糖を含有することができ、あるいは、例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩並びにデオキシコール酸塩等の水性溶液、もしくは点鼻液の形態で投与するための油性溶液、もしくは経鼻的に投与するジェルとして存在ことができる。また直腸送達のためには停留浣腸を用いることができる。
【００６７】
経口投与に適する本発明の組成物は、カプセル、ゼラチンカプセル、小袋、錠剤、トローチ、あるいはロゼンジ等、各々が前決定された量の薬剤を含有する個別単位物の形態；粉末あるいは顆粒の形態；水性液体あるいは非水性液体の溶液あるいは懸濁液の形態；水中油型乳液あるいは油中水型乳液の形態、であることができる。またこの治療剤剤は、ボーラス、舐剤、あるいは軟膏の形態で投与することができる。錠剤は、随意で１つ以上の補助成分と共に、圧縮あるいは成形することによって作ることができる。圧縮錠剤は、適切な機械にて、粉末あるいは顆粒等非流動形態にある薬剤を圧縮することによって調製することができ、随意で結合剤、潤滑剤、不活性稀釈剤、界面活性剤あるいは分散剤と混合され得る。成形錠剤は、適切な機械にて、粉末にした薬剤と不活性液体稀釈剤で湿潤させた適切な担体との混合物を成形することによって作製することができる。
【００６８】
経口組成物は一般に、不活性稀釈剤あるいは食用の担体を包含する。経口的な治療剤剤投与という目的のため、活性化合物を医薬品添加物に取り入れることができる。マウスウオッシュとして使用するための液体担体を使用して調製される経口組成物は、液体担体中にこの化合物を包含し、経口的に投与されて迅速に摂取され、吐き出されるかあるいは飲み込まれる。薬学的に適合する結合剤および（あるいは）添加物を、組成物の一部として包含させることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、任意の以下の成分、あるいは同様の性質の化合物を含有することができる。：ミクロクリスタリンセルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチン等の結合剤、澱粉あるいは乳糖等の医薬品添加物、アルギン酸もしくはプリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、トウモロコシ澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムあるいはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）等の潤滑剤、二酸化ケイ素コロイド等の滑剤、ショ糖あるいはサッカリン等の甘味料、もしくは、ペパーミントあるいはサリチル酸メチル、オレンジ香料等の香味剤。
【００６９】
注入使用に適する製薬組成物は、滅菌水溶液（水に可溶性の場合。）もしくは分散液、並びに滅菌注入液あるいは分散液を即座に調製するための滅菌粉末を包含することができる。静脈経由投与については、適切な担体として、生理食塩水、制菌水、クレモホールＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、あるいはリン酸緩衝生理食塩水液（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は滅菌することができ、さらに容易に注射可能な状態となる程度に流動的であることができる。組成物は製造状態および保管状態下で安定であることができ、細菌並びに真菌等の微生物の汚染作用から組成物を保護することができる。担体は、例えば水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、並びに液体ポリエチレングリコール等。）、並びにこれらから成る適切な混合物を含有する溶媒あるいは分散溶媒であることができる。例えば、レシチン等のコーティングを使用することによって、分散の場合必要とされる粒子サイズを維持することによって、並びに界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用に対する予防は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、様々な抗細菌剤並びに抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、例えば糖類、マンニトール並びにソルビトール等の高分子アルコール、塩化ナトリウム等の等張剤を、組成に加えることが好ましいこととなる。注入可能な組成物の長時間に渡る吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム並びにゼラチン等、吸収を遅らせる薬剤を組成に加えることによって達成することができる。
【００７０】
滅菌注入用溶液は、必要に応じて、先に列挙した１成分あるいは成分の組み合わせと共に、必要量の活性化合物を適切な溶媒に混合し、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散剤は、この活性化合物を、基本となる分散溶媒と先に列挙したものの中から必要とされる他の成分とを含有する滅菌担体に混合することによって調製される。滅菌注入用溶液調製に使用するための滅菌粉末の場合、調製方法には、真空乾燥並びに、前もって濾過滅菌した任意の所望する別の成分から成る溶液から、この成分が加わった活性成分の粉末を作り出す凍結乾燥が含まれる。
【００７１】
関節内投与に適する組成物は、例えば水性ミクロクリスタリン懸濁液から成る形態等、ミクロクリスタリンの形態であることができる治療剤剤から成る滅菌水性調製物の形態であることができる。また、関節内投与並びに眼投与の双方に関して、リポソーム組成物あるいは生分解性ポリマー系を本治療剤剤に使用することができる。
【００７２】
眼処置を含め、局所投与に適切な組成物には、リニメント剤、ローション剤、ゲル剤、塗布剤、クリームあるいは軟膏、ペースト等の水中油型あるいは油中水型乳剤、点滴剤等の溶液あるいは懸濁液等の液体もしくは半液体調製物が含まれる。皮膚表面への局所投与のための組成物は、この治療剤剤を、ローション剤、クリーム、軟膏、あるいは石鹸等、皮膚医学的に許容される担体に分散することによって調製することができる。一部の実施様態では、フィルムあるいは層を皮膚上に形成して塗布を局所的な書ものとし、除去されるのを妨げることができる担体が有用である。組織表面への接着が所望される場合、この組成物は、フィブリノーゲン−トロンビン構成物あるいは他の生物性接着物に分散させた治療剤剤を包含することができる。続いてこの治療剤剤を、所望する組織表面に塗布、噴霧、あるいは別の方法で投与することができる。内部組織表面への局所投与に関しては、液体組織接着物あるいは、組織表面への吸着を促進することが判明している他の物質にこの薬剤を分散させることができる。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースあるいはフィブリノーゲン／トロンビン溶液を使用して好結果を得ることができる。あるいは、ペクチンコーティング組成物等の組織コーティング溶液を使用することができる。
【００７３】
喘息用等の吸入治療に関しては、スプレー剤に分散させた粉末（自己推進組成物あるいはスプレー組成物）の吸入を利用することができ、あるいはネブライザー、アトマイザーを使用することができる。当該組成物は、粉末吸入装置あるいは自己推進粉末分散組成物から肺に投与するための、微細に粉砕した粉末から成る形態であることができる。自己推進溶液並びにスプレー組成物の場合、所望するスプレー特性（例えば、所望する粒子サイズを有するスプレーを作る能力。）を有するバルブを選択する、あるいは活性成分を、調節された粒子サイズの懸濁粉末として混合する、のいずれかによって効果を達成することができる。吸入による投与に関して、この治療剤剤は、例えば二酸化炭素等の気体等の適切な推進剤を含有する加圧容器あるいはディスペンサー、もしくはネブライザーから出る、エアロゾルスプレーの形態で送達することもできる。点鼻投与も用いることができる。
【００７４】
また、経粘膜的あるいは経皮的手段による全身投与が可能である。経粘膜投与あるいは経皮投与に関して、浸透させようとする障壁に適する浸透剤が組成物中にて使用される。当該浸透剤は一般に、当分野の技術者に周知されており、これには、例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩、並びにフィルシド酸（ｆｉｌｓｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻スプレーあるいは座薬の使用を介して達成することができる。経皮投与に関しては、治療剤剤は、典型的には、当分野で一般に周知されているような軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、膏薬（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤、あるいはクリーム剤中に調剤される。
【００７５】
一実施例においてこの治療剤剤は、インプラント並びにマイクロカプセル化送達系を含む徐放性組成物等、身体からの急速な除去に対する保護作用を呈することなる担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、並びにポリ乳酸等、生分解性生物適合高分子を使用することができる。当該組成物を調製するための方法は、当分野の技術者には明白であろう。また原材料はＡｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ並びにＮｏｖａ  Ｐｎａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されており、入手することができる。またリポソーム懸濁液を薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，５２２，８１１にて記載されているように、当分野の技術者に周知されている方法に従って調製することができる。またミクロソーム並びに微小粒子も使用することができる。
【００７６】
経口構成物あるいは非経口構成物は、投与を容易にし、且つ投与量を一定するための単位投与量の形態に調剤することができる。単位投与量の形態とは、治療を受ける患者のための単位投与量として適切な物理的に別々の単位物を指し、各単位物は、必要とされる製薬担体を併用して所望する治療効果が生じるよう計算されて前決定された量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与量形態物の内訳は、活性化合物独自の特性並びに達成されることとなる特定の治療効果、および個々を治療するための当該活性化合物を混合する技術における本質的な限界によって定められ、且つ直接これらに応じて変わる。
【００７７】
一般に、本発明に従って同定される治療剤剤は、例えば所望する効果を誘導するのに十分な時間、標的組織が適切は濃度の薬剤を維持する量等、治療的有効量にて、ヒトあるいは他の哺乳類への非経口投与あるいは経口投与のために組成することができる。さらに本発明の治療剤剤は、単独で、あるいは、特定の疾患あるいは対象とする兆候に対して有益となる効果を有することが判明している他の分子と組み合わせて投与することができる。例示のみであるが、有用な補助因子には、防腐剤、抗生剤、抗ウイルス剤並びに抗真菌剤、および鎮痛剤並びに麻酔剤等、症状を緩和する補助因子が含まれる。
【００７８】
治療性構成物にて送達されることとなる、本発明に従って同定される治療剤の有効濃度は、投与される薬剤の所望される最終投与量、並びに投与の経路等、多数の要因によって異なることとなる。また投与されるべき好ましい投与量は、治療される疾患あるいは兆候の種類並びに範囲、具体的な患者の全身の健康状態、送達される治療剤剤の相対的な生物学的効力、治療剤剤の組成、組成物中の医薬品添加物の有無並びにその種類、並びに投与経路等の変動要因によって異なる可能性もある。一部の実施例において本発明の治療剤剤は、先に記載した非ヒト霊長類並びにげっ歯類を用いた哺乳類での研究から推断される典型的な単位投与物を用いて各人へ与えることができる。上記のように、単位投与物とは、例えば患者へ投与することができ、且つ扱いおよび包装が容易な１回分投与物を指し、当該治療剤剤、あるいは当該治療剤剤と固体もしくは液体の製薬稀釈剤あるいは担体との混合物のいずれかから成る、物理的および生物的に安定した単位投与物であり続ける。
【００７９】
一部の実施様態では、生物体を遺伝子加工して本発明に従って同定される治療剤剤を作製する。これらの生物体は回収のためこの治療剤剤を放出することができる、あるいは患者に直接導入することができる。別の系統の実施様態では、本発明に従って同定される治療剤剤の担体として使うために、細胞を利用することができる。
【００８０】
また本発明の治療剤剤には、「プロドラッグ」誘導体が含まれる。プロドラッグという語は、薬理学的に不活性な（あるいは一部不活性な）、活性成分を放出あるいは活性化するために生物体内部にて自発的あるいは酵素的な生体内変化を必要とする親化合物の誘導体を指す。プロドラッグは、代謝状態下で開裂分離することが可能な官能基を持つ、本発明の治療剤剤の変形体あるいは誘導体である。プロドラッグは生理学的状態下で加溶媒分解を受ける、あるいは酵素分解を受けると、生体内で薬学的に活性である本発明の治療剤剤となる。本発明のプロドラッグは、生体内で活性薬剤成分を放出するあるいは活性化するために必要な生体内変換の段階数に応じて、シングル、並びにダブル、トリプル等と呼ばれることが可能であり、これは前駆型形態物中に存在する機能性部分の数を示す。プロドラッグ形態物はしばしば、哺乳類生物体における溶解性、組織適合性、あるいは徐放性という利点を提供する（Ｂｕｎｄｇａｒｄ，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｐｐ．７−９，２１−２４、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  １９８５並びにＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ，ｐｐ．３５２−４０１，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９２を参照する。）。さらに、本発明のプロドラッグ誘導体を他の特性と組み合わせて生物利用性を増大させることができる。
【実施例】
【００８１】
（実施例１：ＧＡＡのトランス発現）
以下のプライマーを使用して、ヒトＧＡＡ７９１−９５２番残基（Ｃ末端領域）に融合させたヒトＩＧＦ−ＩＩシグナル配列を含有する遺伝子カセットを作製した。
【００８２】
【化１】
2007521818.tif 000065
ＧＡＡ４１  並びにＧＡＡ２７を使用し、ＰＣＲによってＧＡＡのＣ末端領域を増幅した。増幅したフラグメントは、５’末端にＡｓｃ  Ｉ部位を含有する。次に、３’末端にＡｓｃ  Ｉ部位を有するＩＧＦ−ＩＩシグナル配列（１−２５番残基）をコードするＳＳ  Ｎ−タグを、Ａｓｃ  Ｉ部位にてＧＡＡ  Ｃ末端領域に融合させ、ｐＣＥＰ４内でこのカセットをクローン化してｐＣＥＰ−ＳＳ−ＧＡＡ−７９１−９５２プラスミドを作製した。このＳＳ  Ｎ−タグ核酸配列を以下に示す。
ＳＳ  Ｎ−タグのＤＮＡ配列（配列番号８）：
【００８３】
【化２】
2007521818.tif 000066
以下のさらに別のプラスミドを同様に作製した。：ＧＡＡのＣ末端８１７−９５２番残基を欠くｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２、並びにｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２と類似するがＣ末端ＧＩＬＴΔ１−７タグを追加したｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２−ＧＩＬＴΔ１−７。８１６番アミノ酸残基の後に停止コドンを導入することによってＧＡＡΔ８１７−９５２を作製した。クローニングの工程を簡便にするため、この停止コドンの後に３’末端ＸｂａＩ制限部位を配置した。また５’末端はＥｃｏＲＩ制限部位を含有する。ＧＡＡΔ８１７−９５２のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
ＧＡＡΔ８１７−９５２のＤＮＡ配列（配列番号９）。
【００８４】
【化３】
2007521818.tif 000067
2007521818.tif 000068
ＧＡＡΔ８１７−９５２のアミノ酸配列（配列番号１０）。
【００８５】
【化４】
2007521818.tif 000069
2007521818.tif 000070
ＧＡＡ  Ｃ末端領域が、トランスに発現させた時に機能するか否かを判定するため、ｐＣＥＰ−ＳＳ−ＧＡＡ−７９１−９５２を単独で、並びにｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２プラスミドあるいはｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２−ＧＩＬＴΔ１−７プラスミドのいずれか一方と組み合わせて、ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入した。またコントロールとして、ｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２並びにｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２−ＧＩＬＴΔ１−７を単独でＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入した。実験には遺伝子導入の標準法を用いた。１プラスミドの遺伝子導入については、１μｇのプラスミドＤＮＡを使用した。遺伝子共導入については、各々０．５μｇのプラスミドＤＮＡを使用した。全ＤＮＡから成る１μｇを、９６μＬの血清を含まないＨＥＫ２９３増殖培地および４μＬのＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）に、製造者が指示ように混合した。１．５  ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、１０％加熱不活性化ＦＢＳ、および４  ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉａ  １  ｍＬ中にて、１２ウェルプレート中で増殖するＨＥＫ２９３細胞から成る複製ウェル各々に、この混合物５０μＬを加えた。細胞は５％ＣＯ２下３７℃で２〜３日間、培養した。
【００８６】
増殖培地を回収し、ＧＡＡ活性を判定するため記載されているように分析した（Ｒｅｕｓｅｒ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３０：１３２−１４３）。プラスミド１個を移入したＨＥＫ２９３細胞から回収した培地では、ＧＡＡ活性は検出されなかった。反対に、ｐＣＥＰ−ＳＳ−ＧＡＡ−７９１−９５２と、ｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２あるいはｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２−ＧＩＬＴΔ１−７のいずれか一方とを共導入したＨＥＫ２９３細胞から回収した培地には、ＧＡＡ活性が存在した（表１）。
【００８７】
従って、ｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２並びにｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ８１７−９５２−ＧＩＬＴΔ１−７という２つのＣ末端欠失構成物のみが、Ｃ末端領域プラスミドであるｐＣＥＰ−ＧＡＡ−７９１−９５２と共発現した際に機能性タンパク質を発現する。この実験から、ＧＡＡのＣ末端領域はトランスに共発現させると、成熟Ｎ末端領域と協働することが示された。
【００８８】
表１  ＧＡＡ  Ｃ末端領域およびＮ末端領域の一過性遺伝子共導入。
【００８９】
【表１】
2007521818.tif 000071
（実施例２  効果的なＧＡＡトランス発現に必要な領域）
実施例１で記載した一過性遺伝子共導入実験では、ＧＡＡの７９２−８１７番アミノ酸残基を含む領域が、トランス発現構成物の双方の半分に存在する。重複するこれらの領域が効果的なトランス発現に必要であるか否かを判定するために、１対の構成物、ｐＣＥＰ−ＧＡＡΔ７９１−９５２−ＧＩＬＴΔ１−７とｐＣＥＰ−ＳＳ−ＧＡＡ−７９１−９５２を、重複部分を持たないように設計し、７９１番部位にＧＩＬＴタグを融合させた。表２に示したように一過性共導入実験から、効果的なＧＡＡのトランス発現には、Ｃ末端領域内の７９２−８１７番アミノ酸の存在が必要であることが例証された。
【００９０】
表２、効果的なＧＡＡのトランス発現には、７９２−８１７番アミノ酸が必要である。
【００９１】
【表２】
2007521818.tif 000072
（実施例３  内部ＧＩＬＴタグを有するＧＡＡタンパク質の構築）
初めに、ＰＣＲを用いて、完全ヒトＧＡＡ配列の２３７０番ヌクレオチドの後にヌクレオチド配列ＧＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号１１）を挿入した。この挿入によってＡｌａ７９１の前にＡｓｃＩ制限部位が形成される。ＧＩＬＴタグは、以下のＤＮＡオリゴマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【００９２】
【化５】
2007521818.tif 000073
増幅したＧＩＬＴタグは各末端にＡｓｃＩ制限部位を含有する。このＧＩＬＴタグはＡｓｃＩで切断されて、上記のようにＧＡＡのＡｌａ７９１の前にあるＡｓｃＩ部位に挿入される。ＤＮＡ塩基配列決定法によって、ＧＩＬＴ挿入のフレーム内方向性を確認した。Ａｌａ７９１の前の内部ＧＩＬＴタグを含有するこのＧＡＡカセットを、ｐＣＥＰ−ＧＡＡ−ＩＲＧＩＬＴ−４と名付けたプラスミドにて、ｐＣＥＰ４ベクター内で発現させた。ｐＣＥＰ−ＧＡＡ−ＩＲＧＩＬＴ−４はＧＡＡコーディング配列内部にＰＣＲによって生じたＴ１７１２Ｃ変異を有することが認められた。この構成物は、機能性ＧＡＡタンパク質を産生した。
（実施例４  Ｎ末端ＧＩＬＴタグを有するＧＡＡ欠失構成物）
Ｎ末端ＧＡＡ発現に適する１組５つのタグ（Ｎ−タグ）を、表３に示したプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって作製した。このＧＩＬＴ  Ｎ−タグは、野生型ＩＧＦ−ＩＩシグナル配列とＧＩＬＴ完全エピトープ（抗原決定基）とを含有する。ＳＳ  Ｎ−タグは、ＩＧＦ−ＩＩシグナル配列のみを含有する。
【００９３】
例えば、ＧＩＬＴΔ１−７Ｎ−タグは、ＩＧＦ−ＩＩシグナル配列とＧＩＬＴエピトープである８−６７番残基を含有する。これは３回のＰＣＲ反応によって作製した。：（１）ＩＧＦ１並びにＩＧＦ４プライマーを使用する、ヒトＩＧＦ−ＩＩ  ＤＮＡテンプレート（鋳型）からのＰＣＲ増幅。；（２）ＩＧＦ２並びにＩＧＦ７プライマーを使用する、ヒトＩＧＦ−ＩＩ  ＤＮＡテンプレートからのＰＣＲ増幅。；（３）ＩＧＦ１並びにＩＧＦ７プライマーを使用する、最初の２つのＰＣＲ反応産物からのＰＣＲ増幅。
【００９４】
ＧＩＬＴΔ２−７Ｎ−タグは、ＩＧＦ−ＩＩシグナル配列と、８−６７番残基の前にＧＩＬＴエピトープである１番残基とを含有する。これは３回のＰＣＲ反応によって作製した。：（１）ＩＧＦ１並びにＩＧＦ５プライマーを使用する、ヒトＩＧＦ−ＩＩ  ＤＮＡテンプレートからのＰＣＲ増幅。；（２）ＩＧＦ３並びにＩＧＦ７プライマーを使用する、ヒトＩＧＦ−ＩＩ  ＤＮＡテンプレートからのＰＣＲ増幅。；（３）ＩＧＦ１並びにＩＧＦ７プライマーを使用する、最初の２つのＰＣＲ反応産物からのＰＣＲ増幅。
【００９５】
ＳＳＧＡＡ−ＧＩＬＴ  Ｎ−タグは、ＧＩＬＴ完全エピトープの手前に１−６９番残基内ＧＡＡシグナル配列を含有する。これは３回のＰＣＲ反応によって作製した。：（１）ＧＡＡ１３並びにＧＩ１プライマーを使用する、ヒトＧＡＡ  ＤＮＡテンプレートからのＰＣＲ増幅。；（２）ＧＩ２並びにＩＧＦ７プライマーを使用する、ヒトＩＧＦ−ＩＩ  テンプレートからのＰＣＲ増幅。；（３）ＧＡＡ１３並びにＩＧＦ７プライマーを使用する、最初の２つのＰＣＲ反応産物からのＰＣＲ増幅。
【００９６】
各Ｎ−タグは、５’ＥｃｏＲＩ制限部位と３’ＡｓｃＩおよびＸｂａＩ部位を含有する。ＡｓｃＩ部位を利用して、以下に記載するＧＡＡ  Ｎ末端欠失構成物に各タグを融合させた。
【００９７】
表３  Ｎ末端タグ構成物
【００９８】
【表３】
2007521818.tif 000074
2007521818.tif 000075
ヒトＧＡＡ  Ｎ末端のＤＮＡ配列部位を削除し、ＰＣＲ技術を用いてＡｓｃＩ制限部位に置換した。欠失部位を限定するために使用した５’ＤＮＡオリゴマーを以下に列挙する（表４）。５’オリゴマーをＧＡＡコーディング配列内の様々な３’オリゴマーと対合させ、次に結果できるＤＮＡフラグメントを、完全Ｃ末端ＧＡＡコーディング配列に融合させた。Ｎ末端ＡｓｃＩ部位を先に列挙した５つのＮ末端タグ（Ｎ−タグ）の内の１つに融合させて発現カセットを完成させた（表４）。
【００９９】
表４  ＧＡＡ  Ｎ末端欠失構成物
ＧＡＡコーディング配列に相補的な配列は大文字。ＥｃｏＲＩ並びにＡｓｃＩ制限部位は小文字。
【０１００】
【表４】
2007521818.tif 000076
表４に列挙した発現カセットは、共通するＡｓｃＩ部位でＮ末端ＧＡＡ欠失体に融合させたＮ末端タグ（Ｎ−タグ）を含有する。これらのカセットをｐＣＥＰ４発現ベクターの多重クローニング部位内でクローン化し、ＦｕＧｅｎｅ６遺伝子移入試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨＥＫ２９３内に移入した。遺伝子移入後２〜３日目に一過性発現の培地を回収し、標準酵素アッセイ法（Ｒｅｕｓｅｒ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３０：１３２−１４３）を用いて、分泌されたＧＡＡ活性について分析した。
【０１０１】
表５  Ｎ−タグＧＡＡ構成物の相対的一過性発現量
【０１０２】
【表５】
2007521818.tif 000077
2007521818.tif 000078
これらの結果が示すように、１−８０番残基を含むＧＡＡのＮ末端部分は一過性発現に必要ないが、三つ葉形領域を乱すあるいは削除する欠失は機能性タンパク質を作らない。
【０１０３】
さらに、表６に示したように、異種同義のシグナルペプチドを、この場合ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドであるが、適切に配置することによってＧＡＡの分泌を向上させることができる。ＧＡＡの５６番あるいは７０番残基のいずれかにＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドを配置することによって、野生型ＧＡＡと比較してＧＡＡの分泌が３倍増加したが、２９番部位へＩＧＦ−ＩＩペプチドを配置した場合には増加しなかった。これはＧＡＡシグナルペプチドに隣接する、推定される膜通過領域が停留することに起因する可能性がある。
【０１０４】
表６  ＧＡＡシグナル配列の位置を変えると、ＧＡＡ分泌に影響を及ぼす。
【０１０５】
【表６】
2007521818.tif 000079
しかし、野生型ＧＡＡシグナルペプチドおよび膜通過領域を、異種同義シグナルペプチドに置換すると、このタンパク質に伴うマンノース６リン酸依存性細胞内取り込み量が低下する。（図４）。取り込み実験はＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００４０００５３０９並びにＮｏ．２００４０００６００８にて記載されており、この内容を参考のためこの明細に添付する。図４で説明するように、ｐＣＥＰ−ＳＳ−ＧＡＡΔ１−６９のポンペ繊維芽細胞内への取り込み量は、野生型ｐＣＥＰ−ＧＡＡの３分の１であった。
【０１０６】
反対に、図５にて説明するように、ｐＣＥＰ−ＳＳ−ＧＡＡΔ１−６９の取り込みと、ＧＩＬＴタグを有する構成物、ｐＣＥＰ−ＳＳ−ＧＩＬＴΔ２−７−ＧＡＡΔ１−６９とを比較することによって、ＧＩＬＴタグが、ＩＧＦ−ＩＩにより競合され得る特異的な取り込みを促進することが明白となった。即ち、ペプチドタグを７０番の位置に配置することによって融合タンパク質の効果的な発現とＧＡＡ活性とが可能になるだけでなく、正しく折り畳まれて利用可能なペプチドタグが得られ、これによってレセプターが仲介する標的細胞内への取り込みが可能となる。
（実施例５  ＧＩＬＴ１−８７タグ並びにその変形体を有する構成物）
Ｎ末端ＧＩＬＴタグが正しく折り畳まれる可能性を増大させるため、ＩＧＦ−ＩＩの１−８７番残基に渡る、より長い種類のＧＩＬＴタグを作製した。この追加されるＩＧＦ−ＩＩ配列でもレセプター系都合能を示すはずであり、タグの心部に関してより野生型に近い折り畳み構造が得られるはずである。このＧＩＬＴ−１−８７タグをＧＡＡの５６番並びに７０番の部位に融合させ、それぞれＧＩＬＴ１−８７−ＧＡＡ５６−９５２並びにＧＩＬＴ１−８７−ＧＡＡ７０−９５２とした。ＧＩＬＴ１−８７−ＧＡＡ５６−９５２のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
ＧＩＬＴ１−８７−ＧＡＡ５６−９５２のＤＮＡ配列（配列番号３０）：
【０１０７】
【化６】
2007521818.tif 000080
2007521818.tif 000081
2007521818.tif 000082
ＧＩＬＩ１−８７−ＧＡＡ５６−９５２のアミノ酸配列（配列番号３１）：
【０１０８】
【化７】
2007521818.tif 000083
ＧＩＬＩ１−８７−ＧＡＡ７０−９５２のＤＮＡ配列（配列番号３２）：
【０１０９】
【化８】
2007521818.tif 000084
2007521818.tif 000085
2007521818.tif 000086
ＧＩＬＩ１−８７−ＧＡＡ７０−９５２のアミノ酸配列（配列番号３３）：
【０１１０】
【化９】
2007521818.tif 000087
2007521818.tif 000088
５’Ａｓｐ７１８部位を、ｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８部位にクローン化し、３’Ｘｂａ部位はクレノウで平滑末端化してｐＣＥＰ４のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化し、それぞれｐＣＥＰ  −ＧＩＬＴ１−８７−ＧＡＡ５６−９５２並びにｐＣＥＰ  −ＧＩＬＴ１−８７−ＧＡＡ７０−９５２とした。またこの構成物はＧｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏリンカー配列を含有する（ＡｓｃＩ部位）。これらの構成物はＧＡＡ酵素活性を持つタンパク質を発現する。
【０１１１】
さらに、Ｒ６８Ａ変形体をＧＩＬＴ１−８７タグに導入して、ＧＩＬＴタグ内部の潜在的タンパク質分解部位を削除した（ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ）。ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ  のＤＮＡ配列（配列番号３４）並びにアミノ酸配列（配列番号３５）を以下に示す（下線は変異した配列。）。
ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ  のＤＮＡ配列（配列番号３４）
【０１１２】
【化１０】
2007521818.tif 000089
ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ  のアミノ酸配列（配列番号３５）
【０１１３】
【化１１】
2007521818.tif 000090
このタグをＧＡＡの５６番並びに７０番部位に融合させると、ｐＣＥＰ  −ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ  −ＧＡＡ５６−９５２並びにｐＣＥＰ  −ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ
−ＧＡＡ７０−９５２となる。これらの構成物は、ＧＡＡ酵素活性を持つタンパク質を発現した。
【０１１４】
さらに、ＧＩＬＴ１−８７タグ内の３つのＳｅｒ／Ｔｈｒ残基を置換する点変異を導入し、グリコシル化部位を削除した（ΔＧＳ）（ＧＩＬＴ１−８７−ΔＧＳ）。ＧＩＬＴ１−８７−ΔＧＳのＤＮＡ配列（配列番号３６）並びにアミノ酸配列（配列番号３７）を以下に示す（下線は変異した配列。）。
【０１１５】
ＧＩＬＴ１−８７−ΔＧＳのＤＮＡ配列（配列番号３６）。
【０１１６】
【化１２】
2007521818.tif 000091
ＧＩＬＴ１−８７−ΔＧＳのアミノ酸配列（配列番号３７）。
【０１１７】
【化１３】
2007521818.tif 000092
この修飾したＧＩＬＴタグをＧＡＡの７０番部位に融合させて、ｐＣＥＰ  −ＧＩＬＴ１−８７−ΔＧＳ  −ＧＡＡ７０−９５２を得た。この構成物は、ＧＡＡ酵素活性を持つタンパク質を発現した。
【０１１８】
さらに、Ｒ６８ＡとΔＧＳの両方の修飾を取り込んだＧＩＬＴタグ修飾体を作製した（ＧＩＬＴ１−８７−  Ｒ６８Ａ−ΔＧＳ）。ＧＩＬＴ１−８７−  Ｒ６８Ａ−ΔＧＳのＤＮＡ配列（配列番号３８）並びにアミノ酸配列（配列番号３９）を以下に示す（下線は変異した配列。）。
ＧＩＬＴ１−８７−  Ｒ６８Ａ−ΔＧＳのＤＮＡ配列（配列番号３８）。
【０１１９】
【化１４】
2007521818.tif 000093
ＧＩＬＴ１−８７−  Ｒ６８Ａ−ΔＧＳのアミノ酸配列（配列番号３９）。
【０１２０】
【化１５】
2007521818.tif 000094
この修飾したＧＩＬＴ１−８７−  Ｒ６８Ａ−ΔＧＳを用いて、構成物ｐＣＥＰ  −ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８ＡΔＧＳ  −ＧＡＡ５６−９５２並びにｐＣＥＰ  −ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８ＡΔＧＳ  −ＧＡＡ７０−９５２を作製した。双方の構成物は、ＧＡＡ酵素活性を持つタンパク質を発現した。
【０１２１】
ＧＩＬＴタグをＧＡＡの５６番部位に融合させた上記タンパク質に関して、ウエスタンブロットを実施した。図６に図示するように、前駆体タンパク質は完全長を有し、ＩＦＧ−ＩＩタグを含有する。ΔＧＳ変異によって、僅かだが迅速な移動性を持つタンパク質が生じ、これは炭水化物部分を持たないものと一致する。
（実施例６  より長い改変ＧＩＬＴタグを有するさらに別の構成物）
ＩＧＦ−ＩＩタグが野生型に折り畳まれる環境を提供するために、８−１５６番アミノ酸を包含するＩＧＦ−ＩＩの前駆体を、ＧＡＡの７９１番部位に融合させる内在タグとして使用した。さらに、ＩＧＦ−ＩＩタグ内部の８７番部位下流の開裂分離を促進するため、ＩＧＦ−ＩＩ配列内に変異Ｅ６７ＡおよびＤ６９Ｓを起こしてＰ２／Ｐ１タンパク質分解酵素プロセッシング部位を導入した。結果できる構成物ｐＣＥＰ−ＧＡＡ−７９１ＩＧＦ２−Ｐ２／Ｐ１は、ＧＡＡ酵素活性を有するタンパク質を産生する。ｐＣＥＰ−ＧＡＡ−７９１ＩＧＦ２−Ｐ２／Ｐ１のＤＮＡ配列並びにアミノ酸配列を以下に示す。
ｐＣＥＰ−ＧＡＡ−７９１ＩＧＦ２−Ｐ２／Ｐ１のＤＮＡ配列（配列番号４０）
【０１２２】
【化１６】
2007521818.tif 000095
2007521818.tif 000096
2007521818.tif 000097
ｐＣＥＰ−ＧＡＡ−７９１ＩＧＦ２−Ｐ２／Ｐ１のアミノ酸配列（配列番号４１）：
【０１２３】
【化１７】
2007521818.tif 000098
2007521818.tif 000099
Ｎ末端（例えば７０番部位。）に融合させたＧＩＬＴタグの提示あるいは（且つ）折り畳みをさらに改善するため、ＧＩＬＴΔ２−７タグのＮ末端とＧＡＡの７０番融合部位との間に、Ｇｌｙ−  Ｇｌｙ−  Ｇｌｙ−  Ｇｌｙ−  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３）という配列のスペーサーを挿入して、ｐＣＥＰ−  ＧＩＬＴΔ２−７−  ｓｐｃｒ１−ＧＡＡ７０−９５２を作製した。この構成物はＧＡＡ酵素活性を有するタンパク質を発現した。
（実施例７  ＡｓｃＩ制限部位を挿入したＧＡＡ構成物）
標準分子技法に従って、７８３−７９１番アミノ酸残基から成るＧＡＡ領域内に、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（ＡｓｃＩ制限部位）から成る挿入を含有する構成物を作製した。表７に示すように、ＡｓｃＩ制限部位を挿入することによって一過的なＧＡＡ酵素発現レベルが上昇する。恐らくこの挿入によって、酵素は高親和性形態に変化すると考えられる。通常、前駆体ＧＡＡは、７８３−７９１番の境界領域にて開裂分離した後に高親和性ＧＡＡ形態に成熟する（Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。分離後、Ｎ末端領域とＣ末端領域は会合した状態のままであると報告されている（Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０１２４】
表７  ＡｓｃＩ制限部位を挿入すると一過性発現が上昇する。
【０１２５】
【表７】
2007521818.tif 000100
この３つのアミノ酸残基を挿入することで前駆体ＧＡＡの開裂分離が促進されるか否かを判定するため、野生型ＧＡＡとＧＡＡ−７９１Ａｓｃタンパク質を比較するウエスタンブロットを、抗ＧＡＡポリクローナル抗体を用いて行った。図７で示すように、ＧＡＡ−７９１Ａｓｃは、野生型ＧＡＡと同程度の移動性を有して移動した。これはこの３つの残基を挿入してもタンパク質分解を促進しないことを示唆している。
【０１２６】
酵素活性が増すことに対する別の説明は、境界領域内へアミノ酸残基を挿入することによって、２つの領域部分に分離することなく高親和性形態への構造変換が起きたというものである。これは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて試験することができ、Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４にて記載されているように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにてＧＡＡ−７９１Ａｓｃの結合親和力を野生型と比較する。
【０１２７】
さらに、７９１Ａｓｃ部位の挿入と、６９番部位におけるＮ末端ＧＩＬＴタグとを組み合わせるために、構成物ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７−ＧＡＡ７０−９５２−７９１Ａｓｃを作製した。
（実施例８  遺伝子加工したタンパク質分解部位を有する内部ＧＩＬＴタグ）
活性型内部ＧＩＬＴタグを作製するため、タグの下流部にてＸ因子制限プロテアーゼ部位で遺伝子加工したＧＡＡの７７９−７９６番領域内にタグを配置するよう実験を企画した。発現したタンパク質をＸａ因子で処理することによって、ＧＡＡのＣ末端部分が放出され、露出した活性ＧＩＬＴタグを現す可能性が潜在的にある。
【０１２８】
従って、下流にＸ因子プロテアーゼ部位を有するＧＩＬＴタグを、ＧＡＡ内の７８７番、７７９番、並びに７９６番部位に配置した。結果生じるこれら３つのタンパク質は全て、ＧＡＡ酵素活性を持っていた。図８に示すように、ウエスタン分析にて、３つのタンパク質は全て、抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体によってプローブされるＧＩＬＴタグを含有していた。３つのタンパク質調製物は全て、完全な長さの前駆体が存在する場合と同じ移動比（Ｍｒ
１２０，０００〜１４０，０００）のバンドを有していた。また３つのタンパク質調製物は全て、より早く移動する中間バンド（Ｍｒ  ８５，０００〜１００，０００）を有し、このバンドはＧＩＬＴタグを保持していた。Ｘａ因子でこれらのタンパク質を処理すると、完全長バンドはほぼ全てなくなり、中間バンドは僅かに低分子方向へ転換する。このＸａ処理中間バンドはＧＩＬＴタグを保持している。
【０１２９】
ＧＡＡ配列内にＧＩＬＴＸａタグが存在することによって、Ｘ因子部位の下流部位でタンパク質酵素分解が促進されるという可能性がある。８１６番部位は、成熟に関係するＧＡＡプロセッシング部位であると報告されている。
【０１３０】
予測されるＧＡＡ  Ｃ末端プロセッシングモデルを、図８に示す。
（実施例９  ヒト／マウスＧＡＡハイブリッド）
ＧＩＬＴタグの折り畳みを改善するため、ヒトＧＡＡの７９１番、７９６番、８１６番、８８１番、並びに９２０番部位のアミノ酸に融合点を有する、ヒトＧＡＡ  Ｎ末端とマウスＧＡＡ  Ｃ末端とから構成されるキメラタンパク質を構築した。融合点にて、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ配列を含有するＡｓｃＩ制限部位を導入した。
【０１３１】
詳細を述べると、ヒト／マウスＧＡＡキメラタンパク質は、ヒトＧＡＡのＣ末端部分を対応するマウスＧＡＡのＣ末端配列に置換して作製した。共通するリンカー配列ｇｇｃｇｃｇｃｃｇ（配列番号１１）にてヒト部分とマウス部分とを融合させることによって、ＤＮＡカセットを構築した。このカセットは独自のＡｓｃＩ部位を含有し、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（ＧＡＰ）配列をコードする。ＧＡＡハイブリッドのマウス部分は、以下に列挙するプライマーを使用して、ＰＣＲによって作製した。これらのプライマーはヒトＧＡＡ配列へ融合するための５’ＡｓｃＩ部位と、ｐＣＥＰベクターのＮｏｔＩ部位内でクローニングするための３’ＮｏｔＩ部位を含有する。
【０１３２】
表８  ヒト／マウスＧＡＡハイブリッド
【０１３３】
【表８】
2007521818.tif 000101
マウスＧＡＡヌクレオチド配列(配列番号５２)：
【０１３４】
【化１８】
2007521818.tif 000102
2007521818.tif 000103
2007521818.tif 000104
マウスＧＡＡアミノ酸配列(配列番号５３)：
【０１３５】
【化１９】
2007521818.tif 000105
このキメラＧＡＡカセットをＨＥＫ２９３細胞に、例１に記載したように導入した。２つの安定した遺伝子導入系からＧＡＡの発現量を判定した。表８に示すように、８８１番部位での融合物が、最も高い酵素発現量を示した。８８１番部位融合ハイブリッドのウエスタン分析は、発現した前駆体タンパク質の大きさが、野生型ＧＡＡと類似することを示している。
【０１３６】
表９  ヒト／マウスＧＡＡハイブリッドの発現
【０１３７】
【表９】
2007521818.tif 000106
このハイブリッドのＣ末端におけるマウスＧＡＡ配列の存在が、ＧＩＬＴタグの存在に適合するか否かを判定するために、さらに実験を行った。よって、上記に列挙した完全な長さの、５つのヒト／マウスＧＡＡハイブリッドの各Ｃ末端にＧＩＬＴΔ１−７タグを融合し、各々の発現量を測定した。また、マウスＧＡＡハイブリッドのＣ末端８８１番部位とＧＩＬＴのＮ末端とを、２９番あるいは５６番、７０番、８１番部位にて組み合わせる構成物を作製した。発現量を上記のように判定した。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１−１】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−２】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−３】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−４】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−５】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−６】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−７】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−８】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−９】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−１０】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−１１】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−１２】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−１３】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図１−１４】図１−１から１−１４は、グリコシドヒドロリアーゼ・ファミリー３１から選択した物の、アミノ酸配列配列を示す。
【図２】図２はＧＡＡタンパク質の説明図。
【図３】図３は、ペプチドタグＧＡＡを創出するための典型的方策を示す。
【図４】図４は、野生型ＧＡＡ並びにＳＳ−ＧＡＡΔ１−６９を用いた典型的な取り込み実験を示す。
【図５】図５は、ＳＳ−ＧＡＡΔ１−６９およびＳＳ−ＧＬＴΔ２−７−ＧＡＡΔ１−６９を用いた典型的な取り込み実験を示す。
【図６】図６は、１−８７−ＩＧＦ  ＩＩタグＧＡＡタンパク質の典型的なウエスタンブロット分析を示す。：左側は抗ＧＡＡ抗体でプローブしたもの。；右側は抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体でプローブしたもの。レーン１：ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴ１−８７−ＧＡＡ５６−９５２；レーン２：ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ−ＧＡＡ５６−９５２−１；レーン３：ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴ１−８７−Ｒ６８Ａ−ΔＧＳ−ＧＡＡ５６−９５２−１；レーン４：ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７−ｓｐｃｒ１−ＧＡＡ７０−９５２−１；レーン５：ｐＣＥＰ−ＧＡＡ；レーン６：ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴ−ＧＡＡ２９−９５２。
【図７】図７は、野生型ＧＡＡとＧＡＡ−７９１Ａｓｃのタンパク質分解を比較する、典型的なウエスタンブロット分析を示す。
【図８】図８は、野生型ＧＡＡと、下流のＸ因子プロテアーゼ部位、ＧＡＡ７８７ＧＩＬＴＸａ、ＧＡＡ７７９ＧＩＬＴＸａ、並びにＧＡＡ７９６  ＧＩＬＴＸａにて遺伝子加工したＧＩＬＴタグを有するＧＡＡ構成物とを比較する、典型的なウエスタンブロット分析を示す。また、ＧＡＡ  Ｃ末端プロセッシングモデルを示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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