(57)【要約】医薬を送達する安定リポソーム組成物は（ａ）適切な水性媒体；（ｂ）適切なホスホリピッドから形成されたリポソーム；（ｃ）前記リポソームに少なくとも部分的に封入され、かつ（ｉ）親油性アミンおよび製薬的に許容し得る酸であって、誘起酸または無機酸から選ばれる酸、および（ｉｉ）親油性アミンの製薬的に許容し得る有機酸塩、および任意に製薬的に許容し得る有機酸を含む製薬的に許容し得る酸、から選ばれる、少なくとも１種の製薬剤を含み、前記組成物中に存在する前記製薬的に許容し得る酸の量は前記リポソーム組成物のｐＨが前記製薬的に活性な親油性アミンのアミノ基のｐＫａよりも低いかまたはほぼ等しい。さらに、組成物、キット、それらの調製方法、組成物をオートクレービングにより安定性を向上させる方法、安定リポソーム組成物の同定方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬を送達する安定リポソーム組成物であって、
（ａ）適切な水性媒体；
（ｂ）適切なホスホリピッドから形成されたリポソーム；
（ｃ）前記リポソームに少なくとも部分的に封入され、かつ
（ｉ）親油性アミンおよび製薬的に許容し得る酸であって、誘起酸または無機酸から選ばれる酸、および
（ｉｉ）親油性アミンの製薬的に許容し得る有機酸塩、および任意に製薬的に許容し得る有機酸を含む製薬的に許容し得る酸、から選ばれる、少なくとも１種の製薬剤を含み、
前記組成物中に存在する前記製薬的に許容し得る酸の量は前記リポソーム組成物のｐＨが前記製薬的に活性な親油性アミンのアミノ基のｐＫａよりも低いかまたはほぼ等しいことを特徴とする安定リポソーム組成物。
【請求項２】
医薬を送達する無菌かつ安定リポソーム組成物であって、
（ａ）適切な水性媒体；
（ｂ）適切なホスホリピッドから形成されたリポソーム；
（ｃ）前記リポソームに少なくとも部分的に封入され、かつ
（ｉ）親油性アミンおよび製薬的に許容し得る酸であって、誘起酸または無機酸から選ばれる酸、および
（ｉｉ）親油性アミンの製薬的に許容し得る有機酸塩、および任意に製薬的に許容し得る有機酸を含む製薬的に許容し得る酸、から選ばれる、少なくとも１種の製薬剤を含み、
前記組成物は、ある実施形態では不活性雰囲気下で、オートクレーブされ、かつ、前記組成物中に存在する前記製薬的に許容し得る酸の量は前記リポソーム組成物のｐＨが前記製薬的に活性な親油性アミンのアミノ基のｐＫａよりも低いかまたはほぼ等しいことを特徴とする安定リポソーム組成物
【請求項３】
製薬剤を送達する本発明の前記安定リポソーム組成物の製造方法であって、下記：
（ａ）適切な水性媒体を用意する工程；
（ｂ）適切なホスホリピッドを用意する工程；
（ｃ）前記リポソームに少なくとも部分的に封入されることが可能であり、かつ
（ｉ）親油性アミンおよび製薬的に許容し得る酸であって、有機酸または無機酸から選ばれる酸、および
（ｉｉ）親油性アミンの製薬的に許容し得る有機酸塩、および任意に製薬的に許容し得る有機酸を含む製薬的に許容し得る酸、から選ばれる、少なくとも１種の製薬剤を含み、前記組成物中に存在する前記製薬的に許容し得る酸の量は前記リポソーム組成物のｐＨが前記製薬的に活性な親油性アミンのアミノ基のｐＫａよりも低いかまたはほぼ等しい少なくとも１種の製薬剤を用意する工程；
（ｄ）前記水性媒体、前記ホスホリピッドおよび前記製薬剤を配合して前記リポソーム組成物を形成する工程；および（ｅ）前記組成物を滅菌するのに有効な条件下で前記リポソーム組成物をオートクレーブし、それにより前記オートクレービング前の安定性に対して向上した安定性を有する組成物を得る工程を備える、安定リポソーム組成物の製造方法。
【請求項４】
オートクレーブし、前記素子得物の凝固点より高い温度で貯蔵した際に、下記の特性
（ｉ）約５％以下の封入率（パーセント）の変化；
（ｉｉ）約１０重量％以下のホスホリピッド含量の変化；
（ｉｉｉ）化学的加水分解および／または酸化による約５重量％以下の親油性アミンの含量の変化；
（ｉｖ）可視的凝集体の形成がないこと；および
（ｖ）光学定に決定される約１０％以下の中央粒径の変化、の１つ以上を少なくとも１年の期間にわたって示す組成物が提供される
ことを特徴とする請求項２記載の無菌かつ安定リポソーム組成物。
【請求項５】
患者に医薬を送達するキットであって、前記キットは使用用のインストラクションと、請求項１に記載の安定リポソーム組成物を含むとともに患者による吸入用の前記組成物のエロゾル液滴を生成する装置とを備えたことを特徴とするキット。
【請求項６】
リポソーム組成物の安定性向上方法であって、下記：
（ａ）適切な水性媒体を用意する工程；
（ｂ）適切なホスホリピッドを用意する工程；
（ｃ）前記リポソームに少なくとも部分的に封入されることが可能であり、かつ
（ｉ）親油性アミンおよび製薬的に許容し得る酸であって、誘起酸または無機酸から選ばれる酸、および
（ｉｉ）親油性アミンの製薬的に許容し得る有機酸塩、および任意に製薬的に許容し得る有機酸を含む製薬的に許容し得る酸、から選ばれる、少なくとも１種の製薬剤を含み、前記組成物中に存在する前記製薬的に許容し得る酸の量は前記リポソーム組成物のｐＨが前記製薬的に活性な親油性アミンのアミノ基のｐＫａよりも低いかまたはほぼ等しい少なくとも１種の製薬剤を用意する工程；
（ｄ）前記水性媒体、前記ホスホリピッドおよび前記製薬剤を配合して前記リポソーム組成物を形成する工程；および（ｅ）前記組成物を滅菌するのに有効な条件下で前記リポソーム組成物をオートクレーブし、それにより前記オートクレービング前の安定性に対して向上した安定性を有する組成物を得る工程を備える、リポソーム組成物の安定性向上方法。
【請求項７】
相安定性リポソーム組成物の同定方法であって、下記：
（ａ）ホスホリピッド、水溶液、製薬剤、および任意にエタノールとステロールを含むリポソーム組成物水性媒体を用意する工程；
（ｂ）任意に前記リポソーム組成物の質量中央径（ｄ（０．５））を決定する工程；
（ｃ）前記リポソーム組成物を約１０００ｇと約５０００ｇの間において約４℃で約２時間遠心する工程；
（ｄ）任意に前記遠心工程（ｃ）後の前記リポソーム組成物の上清部分の質量中央径（ｄ（０．５））を決定する工程；
（ｅ）前記遠心後の溶液の前記質量中央径（ｄ（０．５））の、前記遠心前の前記溶液の前記質量中央径（ｄ（０．５））に対する比を計算する工程を含み、
相安定リポソーム組成物を、前記組成物が工程（ｅ）における比約０．６以上を有する場合に、そのようなものとして同定することを特徴とする相安定性リポソーム組成物の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜リピッドに基づく組成物に関し、さらに詳しくは医薬を送達するのに用いられる安定なリポソーム並びにそれらの製造および使用方法に関し、特に医薬を送達するのに用いられる滅菌した安定リポソーム組成物並びにそれらの製造および使用方法に関するするものである。
【背景技術】
【０００２】
脂質小胞としても知られるリポソームは完全に閉じられた脂質二重層膜であり、ある体積の水系媒体を中に捕捉して含んでいる。脂質二重層はしばしばレシチンおよびその関連物質、例えば糖脂質のようなリン脂質からなる。リポソームは単一膜の二重層を有する単層でも、１つより多い膜の二重層を有する多層でもよいが、種々の膜二重層の間に水系スペースを有する。二重層は２つの脂質単層からなり、脂質単層はそれぞれ相互に向かって配向された疎水性部分を有し、親水性部分は水相に向かって外方に面している。
【０００３】
リポソームはリン脂質その他の適切な両親媒性分子が水または水溶液中で膨潤することが可能である場合に形成される。この工程の間、水溶性物質が水相に含まれていると、この物質は脂質二重層の間の水相中に捕捉されることがある。同様に、親油性部室は脂質中に溶解されることが可能であり、二重層自体の中に取り込まれることが可能である。もっとも、親油性物質が極性基をも有している場合は、この基は内側または外側の水相中に延びていることがある。リポソーム中への物質の封入は当技術において知られている多数の方法によって達成することが可能である。もっとも一般的に用いられる方法は、有機溶媒を揮発させてフラスコの器壁にリン脂質の薄膜を成形することを含む。このフィルムが適切な水性媒体中に分散されると、リポソームが形成される。あるいはまた、リポソームは適切な脂質を水性媒体中に懸濁させることにより形成することが可能である。次いで、この混合物を超音波処理（高周波音波により攪拌）して閉じた小胞の分散物とする。リポソームを形成するさらなる方法は脂質をエタノールと水中で急速混合することである。これはしばしば脂質を水溶液中に射出することにより達成される。
【０００４】
脂質二重層膜はしばしば細胞膜と同様に機能する。従って、従ってそれらはなんらかの生物学的性質、例えば、生細胞の環境中に容易に取り込まれる能力を示す。リポソームはあたかもそれらが細胞小器官であるかのように、生細胞と融合する。その結果、最近リポソームをキャリアとして用いて特定の生物学的または医薬的性質を有する化合物を患者に送達することにおおいに関心が集まっている。
【０００５】
リポソームを医薬その他を送達し標的捕捉する手段として使用することに関して困難が生じている。特に問題となるのは、従来の処方で従来の技法に従って作製されたリポソームは時間が経過するとしばしば相が不安定になり、それによりそのような組成物が工業的に、特に製薬工業において不適当となることである。これは、貯蔵時にリポソームの漏れ、破壊、沈降および相分離、融合、凝集またはゲル化を招来する可能性がある。
【０００６】
リポソームの貯蔵安定性を向上する既知の技法としては、安定剤として化学的添加物を使用したり、または乾燥粉末製剤を調整したりすることなどが挙げられる。賦形安定剤を用いてリポソームを安定化する方法の例としては、特許文献１（米国特許第４、８１８、５３７号明細書）、特許文献２（米国特許第５、１００、６６２号明細書）、特許文献３（米国特許第５、２９４、１１２号明細書）、特許文献４（米国特許第４、８０４、５３９号明細書）および特許文献５（米国特許第５、９６２、０１５号明細書）に開示されているものが挙げられる。リポソーム用安定剤はカチオン領域、例えばトリエタノールアミンを有する両性分子を慣用の化粧用緩衝液中に含むものである。これらの分子を添加してリポソームの凝集を阻止することが可能である。それにも拘らず、トリエタノールアミンは充分な貯蔵安定性と加工安定性を提供していない。４級アルキル化ポリマー、例えばステアルジモニウムヒドロキシセルロースを用いて酸性の生物活性成分を含有するレシチン型リポソームを安定化している。比較的長鎖のアルキルアミン、例えばステアリルアミンもリポソームを安定化するのに用いられているが、これらの長鎖アルキルアミン類は高濃度になると毒性になり易く、製薬用途には望ましくない。
【０００７】
リポソームを安定化するのに用いられる他の技法としては凍結乾燥または噴霧乾燥法が挙げられる。これらの工程は製造が複雑になり患者にリポソームを投与する前に再構成が必要になる。再構成は最終的に外来診療の場で使用できる製品には望ましくない。
【０００８】
リポソームの送達に適している一つの特定の領域は吸入医薬製品である。多くの吸入医薬が水溶液により送達され、この水溶液は水性エロゾル液滴を生成することが可能な装置から放出される。吸入医薬製品に対する規制要件は、これらの製品が無菌処方として提供されるべきことを要求している。従前は、リポソーム処方の滅菌方策は滅菌ろ過または保存剤の添加に集中していた。非経口（静脈内（ｉｖ）、筋肉内（ｉｍ）、皮下（ｓｃ））経路または吸入（肺もしくは鼻）経路による送達用の治療用リポソーム処方は無菌製剤でなければならない。
【０００９】
オートクレービング（ａｕｔｏｃｌａｖｉｎｇ；オートクレーブすること、オートクレーブにかけること）による製薬溶液の最終的滅菌はよく確立されている。しかしながら、従来は、リポソームはオートクレービングの厳しい条件には不安定であり、リポソームの凝集、融合、ゲル化が貯蔵の際とほとんど同様に生じるだけでなく、例えば特許文献６（国際特許出願公開第２００４／２００６号パンフレット、第１１頁第６〜１０行）に記載されているように、リポソームのサイズまたはサイズ分布、脂質の加水分解／酸化、封入された医薬の負所望の化学的分解および放出も起きる。
【００１０】
過去に色々のグループがリポソーム組成物のオートクレービングに関連した安定性の問題を取り扱うことを試みた。例えば、特許文献７（米国特許第５、５５４、３８２号明細書）および特許文献８（米国特許第５、７７６、４８６号明細書）はともにリポソームの滅菌製造方法に関するものであるが、リポソームは滅菌するのが難しく、滅菌は成分部分−脂質、緩衝液、医薬および水−をそれぞれ独立にオートクレーブまたはろ過により滅菌し、ついで滅菌環境において混合することにより達成されることを教示している。これらの特許文献の教示によると、リポソームを加熱するとリポソームに回復不能の損傷を生じるので最終製品の加熱滅菌は不可能である。
【００１１】
特許文献９（米国特許第５、５４２、９３５号明細書）の教示によると、リポソームを加熱するとリポソームに回復不能の損傷を生じるので最終製品の加熱滅菌は不可能であるが、気体状前駆体充填多層脂質懸濁液はオートクレーブすることが可能である。オートクレービングは気体状脂質のサイズを変えなかった。
【００１２】
特許文献１０（米国特許第６、０７１、４９５号明細書）および特許文献１１（米国特許第６、４７９、０３４号明細書）も前駆体リポソーム、すなわち医薬ペイロード（弾頭）のないリポソームのオートクレービングを教示している。
【００１３】
特許文献１２（米国特許第５、８３４、０２５号明細書）の教示によると、エステル基リポソームはオートクレーブすることができず、また古細菌（ａｒｃｈａｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）から得られたエーテル脂質を用いて作製されたリポソームはオートクレーブできる。エステル基リポソーム、例えばホスファチジルコリンの安全性はよく確立されているが、いずれの脂質の毒性プロフィルは知られていない。
【００１４】
特許文献１３（米国特許第５、２３０、８９９号明細書）はごくわずかの水分、すなわち固形分に対して３００モル以下の量で存在するのに充分な水しか含まないプレリポソーム・ゲルのオートクレービングを記載している。同様に、特許文献１４（米国特許第６、４２４、８５７号明細書）は、小さい（直径１００ｎｍ）空の（すなわち、医薬のない）リポソームをオートクレーブしているが粒径の変化が報告されていない。
【００１５】
特許文献１５（米国特許第５、６７６、９２８号明細書）は帯電したホスホリピッドを含ませることで安定化した多層リポソームのオートクレーブを記載している。この特許文献に記載の発明は少なくとも１種の撮像材を含む診断用組成物を対象とするものである。
【００１６】
全体として、従来技術は最終の医薬含有リポソーム製剤の末端滅菌（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ）工程として熱を使用することを避けることを教示しており、リポソームの末端滅菌時に相安定性が向上することは教示も示唆もしていない。
【００１７】
従って、リポソーム製剤の無菌性と火成性は、一般に、直径０．２ミクロン未満のリポソームを含有する製剤に対して０．２ミクロンのフィルターを通すろ過を使用するか、より大きいリポソームに対して無菌条件を適用することに限定されていた。γ線照射は水性リポソーム懸濁液の受け入れ難い分解を引き起こすため受け入れ難いと観られている（例えば、非特許文献１［ダーン・クロメリン、「医薬投与形態としてのリポソーム」、製薬技術百科事典、第１９巻第１３頁］（Ｄａａｎ  Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ  ９，ｐａｇｅ  １３）参照）。
【００１８】
このように、無菌ろ過はリポソームが充分に小さくて０．２ミクロンのフィルター・システムを通過する場合に限っての選択肢である。リポソーム処方の目的が所与の作用部位における医薬の滞留時間を向上させることであるならば、より大きな多層リポソームが望ましい。１〜５ミクロンのリポソームが肺への送達に適しているが、明かに末端無菌ろ過（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ｆｉｔｒａｔｉｏｎ）には適していない。
【００１９】
過去には、保存剤および制菌剤を肺吸入製品に添加していた。気管支拡張剤処方に含められると、これらの保存剤の多くは肺狭窄を引き起し、気管支拡張剤の有益な効果を帳消しにしてしまう。従って、保存剤を肺疾患用リポソーム処方に添加することは注意して行うべきであり、望ましいものとは考えられない。
【００２０】
リポソームの送達が適していると思われる他の特定の領域は１種以上の活性成分の徐放組成物、例えば特許文献１６（米国再発行特許第３８、４０７号明細書、譲受人デラックス・セラピューティクス社）に開示されている処方用である。係る組成物は非封入部分からの医薬の急速な発現に続いてリポソーム封入有効成分の持続放出からの徐放がなされる。そのような組成物に対する規制要件は同様に封入された医薬の割合（パーセント）が時間が経っても一貫していること、および時間が経っても化学的および相安定性を有することを要求している。
【００２１】
【特許文献１】米国特許第４、８１８、５３７号明細書
【特許文献２】米国特許第５、１００、６６２号明細書
【特許文献３】米国特許第５、２９４、１１２号明細書
【特許文献４】米国特許第４、８０４、５３９号明細書
【特許文献５】米国特許第５、９６２、０１５号明細書
【特許文献６】国際特許出願公開第２００４／２００６号パンフレット、第１１頁第６〜１０行
【特許文献７】米国特許第５、５５４、３８２号明細書
【特許文献８】米国特許第５、７７６、４８６号明細書
【特許文献９】米国特許第５、５４２、９３５号明細書
【特許文献１０】米国特許第６、０７１、４９５号明細書
【特許文献１１】米国特許第６、４７９、０３４号明細書
【特許文献１２】米国特許第５、８３４、０２５号明細書
【特許文献１３】米国特許第５、２３０、８９９号明細書
【特許文献１４】米国特許第６、４２４、８５７号明細書
【特許文献１５】米国特許第５、６７６、９２８号明細書
【特許文献１６】米国再発行特許第３８、４０７号明細書
【非特許文献１】ダーン・クロメリン著、「医薬投与形態としてのリポソーム」、製薬技術百科事典、第１９巻第１３頁（Ｄａａｎ  Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ  ９，ｐａｇｅ  １３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
従って、安定性が改善されたリポソーム処方、特に、相安定かつ化学的に安定な、それ故製薬用途に適している、医薬製品の無菌および安定リポソーム処方を開発する一般的な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の範囲に含まれるのは安定リポソーム組成物および相安定製剤の調製方法である。本発明の目的のための安定リポソーム製剤は分散されたリポソームがそれらの当初の性質を実質的に維持し、所望の品質保持期間（ｓｈｅｌｆ−ｌｉｆｅ）の間、連続相全体に実質的に均一に分布した状態が保たれるものである。本発明の安定リポソーム組成物は相変化、沈降およびオートクレービングにより滅菌されるときに微生物の汚染を示さない。本発明の安定リポソーム組成物はリポソーム成分または封入された医薬成分の酸化または加水分解による化学的分解が最低限である。
【００２４】
従って、本発明の一態様において、医薬を送達する安定リポソーム組成物であって、（ａ）適切な水性媒体；（ｂ）適切なホスホリピッドから形成されたリポソーム；（ｃ）前記リポソームに少なくとも部分的に封入され、かつ（ｉ）親油性アミンおよび製薬的に許容し得る酸であって、誘起酸または無機酸から選ばれる酸、および（ｉｉ）親油性アミンの製薬的に許容し得る有機酸塩、および任意に製薬的に許容し得る有機酸を含む製薬的に許容し得る酸、から選ばれる、少なくとも１種の製薬剤を含み、前記組成物中に存在する前記製薬的に許容し得る酸の量は前記リポソーム組成物のｐＨが前記製薬的に活性な親油性アミンのアミノ基のｐＫａよりも低いかまたはほぼ等しいことを特徴とする安定リポソーム組成物が提供される。本発明のある実施形態では、前記組成物はオートクレーブされ、それにより無菌かつ安定リポソーム組成物が提供される。
【００２５】
本発明の組成物の一態様において、前記リポソーム組成物のｐＨは前記親油性アミンのアミノ基のｐＫａにほぼ等しく、かつ前記親油性アミンの約５０％が前記組成物中でプロトン化されている。さらに別の態様において、前記リポソーム組成物のｐＨは前記親油性アミンのアミノ基のｐＫａよりも小さく、前記親油性アミンの大部分が前記組成物中でプロトン化されているか、または前記組成物は前記親油性アミンのアミノ基のｐＫａよりも約１  ｐＨ単位〜約２  ｐＨ単位低い。本発明のさらに別の態様において、前記リポソーム組成物のｐＨは約４と前記親油性アミンのアミノ基のｐＫａの間である。ある実施形態では、ｐＨは約４と約７の間であるか、または約４．５と約６の間、あるいは５と約６の間である。
【００２６】
本発明のさらに別の態様において、前記組成物はさらにコレステロールおよび／またはエタノールを含む。本発明の一態様において、エタノールは前記リポソーム組成物の全体積の約２．５％と約１０％の間で存在する。
【００２７】
本発明のさらに別の態様において、本発明の前記リポソーム組成物はほぼ生理学的ｐＨにおける正味電荷を有する。本発明の一態様において、前記ホスホリピッドはホスファチジルコリンを含む。
【００２８】
本発明のさらに別の態様において、前記組成物の前記水性媒体は水を含む。
【００２９】
本発明のさらに別の態様において、前記製薬剤は前記リポソーム粒子に封入されているとともに本発明の前記組成物の前記水性媒体中に遊離している。ある実施形態では、リポソーム封入製薬剤の割合（パーセント）は前記リポソーム組成物中に存在する製薬剤の全量の約５０％〜約９０％であるか、または前記リポソーム組成物中に存在する製薬剤の全量の約６０％〜約８０％であるか、または前記リポソーム組成物中に存在する製薬剤の全量の約５０％〜約７５％である。
【００３０】
本発明のさらに別の態様において、前記リポソーム組成物の製薬的に許容し得る酸は有機酸または無機酸を含む。
【００３１】
本発明のさらに別の態様において、前記リポソーム組成物のリポソーム粒子は質量中央径（ｍａｓｓ  ｍｅｄｉａｎ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）（ｄ（０．５））が約１０ミクロン未満である。ある実施形態では、前記質量中央径は約６ミクロン未満、または約４ミクロン未満または約２ミクロン未満である。
【００３２】
本発明のさらに別の態様において、前記オートクレーブされたリポソーム組成物は少なくとも約１年、または１８カ月、または２年の間前記リポソーム組成物の凝固点より高い温度において物理的および化学的に安定である。
【００３３】
本発明のさらに別の態様において、前記親油性アミンは生理学的ｐＨにおいてｌｏｇＰ値が約１．０よりも大きい親油性アミンを含む。ある実施形態では、前記親油性アミンは生理学的ｐＨにおいてｌｏｇＰ値が約２と約５の間である。
【００３４】
本発明の一態様において、前記リポソーム組成物のある実施形態は、不活性雰囲気下のオートクレービング、例えば不活性雰囲気下、最低約１５分間約１２１℃の温度でのオートクレービングを含むオートクレービングに対して物理的および化学的に安定である。
【００３５】
本発明のさらに別の態様において、製薬剤の前記組成物中に存在するホスホリピッドに対する比はほぼ１：１００モル／モルと１：１０モル／モルの間である。前記ホスホリピッドの存在量はまた本発明の組成物中では約１．５ｍＭ以上である。
【００３６】
本発明の組成物では、前記リポソーム組成物中の医薬の封入率（パーセント）は少なくとも２０カ月の期間にわたって実質的に安定であることが可能である。また、本発明の組成物は、オートクレービングすると、少なくとも２０カ月の期間にわたって物理的および化学的に安定であることが可能である。この場合、ホスホリピッドの量は少なくとも２０ヶ月の期間にわたって１０％（重量／重量）を越えて化学的加水分解または酸化により減少することはない。あるオートクレーブされた組成物では、ホスホリピッドの量は少なくとも２０ヶ月の期間にわたって前記リポソーム組成物の約３ｍｇ／ｍｌを越えて化学的加水分解または酸化により減少することはない。同様に、本発明のオートクレーブされた楚々英物では、前記親油性アミンは少なくとも２０ヶ月の期間にわたって５％、または２％（重量／重量）を越えて化学的に分解されることはない。
【００３７】
本発明のさらに別の態様において、医薬を送達する無菌かつ安定リポソーム組成物であって、（ａ）適切な水性媒体；（ｂ）適切なホスホリピッドから形成されたリポソーム；（ｃ）前記リポソームに少なくとも部分的に封入され、かつ（ｉ）親油性アミンおよび製薬的に許容し得る酸であって、有機酸または無機酸から選ばれる酸、および（ｉｉ）親油性アミンの製薬的に許容し得る有機酸塩、および任意に製薬的に許容し得る有機酸を含む製薬的に許容し得る酸、から選ばれる、少なくとも１種の製薬剤を含み、前記組成物は、ある実施形態では不活性雰囲気下で、オートクレーブされ、かつ、前記組成物中に存在する前記製薬的に許容し得る酸の量は前記リポソーム組成物のｐＨが前記製薬的に活性な親油性アミンのアミノ基のｐＫａよりも低いかまたはほぼ等しいことを特徴とする安定リポソーム組成物が提供される。
【００３８】
本発明のさらに別の態様において、製薬剤を送達する本発明の前記安定リポソーム組成物の製造方法であって、下記：（ａ）適切な水性媒体を用意する工程；（ｂ）適切なホスホリピッドを用意する工程；（ｃ）前記リポソームに少なくとも部分的に封入されることが可能であり、かつ（ｉ）親油性アミンおよび製薬的に許容し得る酸であって、有機酸または無機酸から選ばれる酸、および（ｉｉ）親油性アミンの製薬的に許容し得る有機酸塩、および任意に製薬的に許容し得る有機酸を含む製薬的に許容し得る酸、から選ばれる、少なくとも１種の製薬剤を含み、前記組成物中に存在する前記製薬的に許容し得る酸の量は前記リポソーム組成物のｐＨが前記製薬的に活性な親油性アミンのアミノ基のｐＫａよりも低いかまたはほぼ等しい少なくとも１種の製薬剤を用意する工程；（ｄ）前記水性媒体、前記ホスホリピッドおよび前記製薬剤を配合して前記リポソーム組成物を形成する工程；および（ｅ）前記組成物を滅菌するのに有効な条件下で前記リポソーム組成物をオートクレーブし、それにより前記オートクレービング前の安定性に対して向上した安定性を有する組成物を得る工程を備える、安定リポソーム組成物の製造方法が提供される。
【００３９】
本発明のさらに別の態様において、本発明の無菌かつ安定リポソーム組成物であって、オートクレーブし、前記素子得物の凝固点より高い温度で貯蔵した際に、下記の特性
（ｉ）約５％以下の封入率（パーセント）の変化；（ｉｉ）約１０重量％以下のホスホリピッド含量の変化；（ｉｉｉ）化学的加水分解および／または酸化による約５重量％以下の親油性アミンの含量の変化；（ｉｖ）可視的凝集体の形成がないこと；および（ｖ）光学定に決定される約１０％以下の中央粒径の変化、の１つ以上を少なくとも１年の期間にわたって示す組成物が提供される。
【００４０】
本発明のさらに別の態様において、本明細書中に開示された方法により調製される安定リポソーム組成物が提供される。
【００４１】
本発明のさらに別の態様において、本明細書中に開示された方法により調製される安定かつ無菌リポソーム組成物が提供される。
【００４２】
本発明のさらに別の態様において、リポソーム組成物の安定性向上方法であって、下記：（ａ）適切な水性媒体を用意する工程；（ｂ）適切なホスホリピッドを用意する工程；（ｃ）前記リポソームに少なくとも部分的に封入されることが可能であり、かつ（ｉ）親油性アミンおよび製薬的に許容し得る酸であって、誘起酸または無機酸から選ばれる酸、および（ｉｉ）親油性アミンの製薬的に許容し得る有機酸塩、および任意に製薬的に許容し得る有機酸を含む製薬的に許容し得る酸、から選ばれる、少なくとも１種の製薬剤を含み、前記組成物中に存在する前記製薬的に許容し得る酸の量は前記リポソーム組成物のｐＨが前記製薬的に活性な親油性アミンのアミノ基のｐＫａよりも低いかまたはほぼ等しい少なくとも１種の製薬剤を用意する工程；（ｄ）前記水性媒体、前記ホスホリピッドおよび前記製薬剤を配合して前記リポソーム組成物を形成する工程；および（ｅ）前記組成物を滅菌するのに有効な条件下で前記リポソーム組成物をオートクレーブし、それにより前記オートクレービング前の安定性に対して向上した安定性を有する組成物を得る工程を備える、リポソーム組成物の安定性向上方法が提供される。
【００４３】
本発明の前記組成物は製薬製品の肺送達に特に適している。本発明のある実施形態では、前記組成物はさらにコレステロールとエタノールの少なくとも一方を含む。本発明のある実施形態では、前記組成物はオートクレービングに対して安定である。
【００４４】
本発明の一つの利点は前記組成物は安定であり、貯蔵時に融合、分離、沈殿、凝集またはゲル化しないことである。従って、それらは少なくとも１週間、しばしばもっと長く、いくつかの実施形態では１２ヶ月を越えて、または１８カ月を越えて、あるいは２年を越えて均一な組成物のままである。従って、そのような組成物の品質保持期間は延びる。これにより、より翁バッチから均等に単位用量を分配することが可能であり、割当（ａｌｌｏｃａｔｉｏｎ）前に組成物を再構成する必要がない。
【００４５】
長期相安定性は製薬的に適切な処方を規定する処方の特徴の一つである。処方が長期間安定であるならば、その処方は多くの利点を提供する。本発明の相安定リポソーム組成物は最終製薬製剤の最終的な充填工程をより着実なものにし、前記製薬処方の最終充填は充填前または充填の際に製品が沈降または分離するのではないかという新派により制約を受けることはない。また、本発明の相安定リポソーム組成物は同じバッチから充填される異なる個々のガラスビン（ｖｉａｌ）間の含有量を均一にする。また、本発明の相安定リポソーム組成物を含む最終製薬容器からの個々のサンプリングは用量毎により均一になり、それにより患者の安全性が改善され、使用前に患者が組成物を完全に震盪しなくてもよくなる。これは高齢患者にとって特に有利である。リポソーム封入医薬組成物が相分離すると、サンプルが処方のより高密度の層または沈降物から採られた場合、患者が高過ぎる用量を受け取るおそれがある。あるいは、サンプルがより低密度の層から採られると、患者は用量不足となるおそれがあり、またはサンプルが透明な上清から採られた場合は有効薬用量を受け取れないことになる。本発明は用量毎に用量再現性のある用量の信頼のおける組成物および方法を提供するものである。
【００４６】
本発明の組成物は安定にするために化学的添加物を必要としない。本発明のリポソームは親油性アミンと酸、例えば有機酸を含み、前記酸は前記リポソーム組成物のｐＨが前記親油性アミンのアミノ基のｐＫａ値にほぼ等しいかそれより少なくなるような濃度で存在する。ただし、最終溶液のｐＨは、典型的にはｐＨ約４より低い場合に見られるような前記リポソーム組成物の安定性を危うくするようなものであってはならない。ｐＨがｐＫａにほぼ等しいかそれよりも低いと、親油性アミンの少なくとも実質的部分が前記組成物中で正に帯電することが保証される。本発明の一態様において、前記製薬剤は親油性アミンと対イオンとして有機酸、例えばクエン酸フェンタニルを含む。これは、エタノール相に溶解した遊離塩基フェンタニルを水相中のクエン酸と結合させ、これらの相を他の成分ともに結合して本発明の意味内のクエン酸フェンタニルを得る。あるいはまた、例えばフェンタニル医薬の塩の形態、例えばクエン酸フェンタニルを購入し、リポソーム組成物の調製に使用してもよい。ある実施形態では、酸、例えばクエン酸の追加量を前記組成物に添加して前記リポソーム組成物のｐＨを調製して前記親油性アミンのアミノ基のｐＫａにほぼ等しいか、またはそれよりも低くなるようにすることが必要である。ただし、前記リポソーム溶液のｐＨは、組成物の化学的安定性が典型的に存する４より低くなってはならない。さらなる化学的添加物なしにリポソームを安定化する能力は、前記化学的添加物に由来する副作用の危険が除かれるので、患者に投与することが企図されている組成物にとって特に望ましい。
【００４７】
本発明の実施形態では、前記リポソーム組成物はオートクレーブするとさらに安定になる。本発明のリポソーム組成物をオートクレーブすることが可能であることは前記処方を安定化する容易な方法を提供する。ろ過とは異なり、オートクレーブ可能なリポソーム組成物はリポソームをより大きくすることを可能にし、従ってより高度の医薬封入が可能になる。さらに、リポソーム組成物をオートクレーブすることが可能であることにより、一般には、特に肺疾患用処方にとって望ましくはない保存剤または制菌剤を添加する必要がなくなる。
【００４８】
本発明のさらなる態様によると、前記リポソーム組成物を医薬として使用する方法が提供される。
【００４９】
本発明のさらなる態様によると、前記安定リポソーム組成物は包装された調合薬およびキット並びに治療薬の肺送達に使用される、安定リポソーム組成物の水性エロゾル液滴を生成することが可能な装置中に含まれる。
【００５０】
本発明の別の態様において、前記ホスホリピッドはホスファチジルコリンを含む、安定リポソーム組成物、その製造方法、およびその使用が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
本発明のこれらおよび他の特徴は添付図面を参照した下記の詳細な説明からより明かになるであろう。
【００５２】
以下の説明において、本発明の完全な理解のために多数の特定の詳細を開示しているが、本発明はこれらの特定の詳細なしに実施可能であることが了解される。
【００５３】
本発明の方法は一連の工程として説明され、特許請求の範囲にも記載されている。これらの方法および関連する工程は任意の論理的順序で行うことが可能であることが了解される。さらに、これらの方法は、本発明の範囲内で、単独でも、あるいはそのような方法および工程の前、最中、または後に行われる他の手順および処理と組み合わせて行ってもよい。
【００５４】
リポソーム組成物の成分
本発明はリポソームに製薬剤を取り込み、長期間相安定であるリポソーム組成物を提供する。本発明のリポソーム組成物は親油性アミンと酸、例えば有機酸を含み、前記酸は前記リポソーム組成物のｐＨが前記親油性アミンのアミノ基のｐＫａ値にほぼ等しいかそれより少なくなるような濃度で存在する。ただし、最終溶液のｐＨは、典型的にはｐＨ約４より低い場合に見られるような前記リポソーム組成物の安定性を危うくするようなものであってはならない。ｐＨがｐＫａにほぼ等しいかそれよりも低いと、親油性アミンの少なくとも実質的部分が前記組成物中で正に帯電することが保証される。本発明のある実施形態では、製薬剤は既に親油性アミンと許容し得る酸との塩であることができる。本発明の組成物は貯蔵時に少なくとも１週間、そして多くの場合もっと長く、好ましくは１年以上、相安定である。
【００５５】
ある実施形態では、前記製薬剤は親油性アミンと対イオンとしての有機酸、例えばクエン酸フェンタニルを含む。これは、エタノール相に溶解した遊離塩基フェンタニルを水相中のクエン酸と結合させ、これらの相を他の成分ともに結合して本発明の意味内のクエン酸フェンタニルを得る。あるいはまた、例えばフェンタニル医薬の塩の形態、例えばクエン酸フェンタニルを購入し、リポソーム組成物の調製に使用してもよい。ある実施形態では、酸、例えばクエン酸の追加量を前記組成物に添加して前記リポソーム組成物のｐＨを調製して前記親油性アミンのアミノ基のｐＫａにほぼ等しいか、またはそれよりも低くなるようにすることが必要である。ただし、前記リポソーム溶液のｐＨは、組成物の化学的安定性が危うくなる４より低い範囲になってはならない。
【００５６】
本発明のリポソーム組成物はホスホリピッドの閉じた二重層により形成されたリポソームを含有する。製薬剤を送達するように企図されたリポソームを形成する適切なホスホリピッドは当技術において既知であり、限定されるものではないが、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびホスファチジル・グリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、プラズマローゲン、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）が挙げられる。本発明のリポソーム組成物を形成するのに用いられる脂質は帯電しているかまたは中性である。ある実施形態では、ホスファチジルコリンから形成されたリポソームが好ましいが、その理由はそれらリポソームが一般に患者に投与されたときにより良好であるからであり、製薬剤は中性ホスホリピッドをより良く取り込むからである。他の実施形態では、正に帯電したリポソームが望ましい。
【００５７】
コレステロールのようなステロール類はごく普通にリポソーム組成物に添加されてリポソームの安定性を向上するとともにリポソームの生細胞への取り込みを促進する。「コレステロール」という用語はコレステロール誘導体、例えば（３−ヒドロキシ−５，６−コレステン）および関連する類縁体、例えば３−アミノ−５，６−コレステンおよび５，６−コレステン；コレスタン、コレスタノールおよび関連する類縁体、例えば３−ヒドロキシコレスタン；および帯電コレステロール誘導体、例えばコレステリルβ−アラニンおよびコレステリル・ヘミサクシネートを含むものである。ある実施形態では、コレステロールは存在するホスホリピッドの重量の約０％〜約３０％存在する。他の実施形態では、コレステロールはホスホリピッドの重量の約１０％以下である。
【００５８】
本発明の製薬剤は治療目的で患者に投与することが可能な剤である。本発明の剤は製薬的に許容し得る親油性アミンおよびそれらの塩からなる群から選ばれる。本発明の親油性アミンは有機溶媒可溶性（親油性）部分並びに生理学的ｐＨで正に帯電したアミン部分からなる分子をいう。本発明の適切な親油性アミンは約３〜約８のｐＨ範囲にわたって正に帯電したアミノ基を有する。
【００５９】
適切な製薬剤は、限定されるものではないが、下記のものを含む。
【００６０】
【表１】
2007511545.tif 000002
【００６１】
本発明の適切な親油性アミンはｌｏｇＰ値が生理学的ｐＨにおいて約１．０より大きい（すなわちオクタノール／水の分配係数が１０より大きい）、好ましくは約２と約５の間の親油性アミンを用いてなる。本発明のある実施形態による親油性アミンとしてはｌｏｇＰ値が４．２５であることが報告されているフェンタニル、ｌｏｇＰ値が２．３７であるオンダンセトロン、ｌｏｇＰ値が１．０５であるスマトリプタン、およびｌｏｇＰ値が３．８２であるプロクロルペラジンが挙げられる。
【００６２】
本発明の酸は任意の製薬的に許容し得る酸である。好適な酸としては有機酸および無機酸が挙げられ、生物活性と医薬の性質を保持する酸並びに生物学的にまたは他の理由で望ましくない酸を含む。それらの例としては、限定されるものではないが、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、酪酸、炭酸、カプロン酸、クエン酸、桂皮酸、デカン酸、エナンチオ酸、フマル酸、フロン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グリセリン酸、馬尿酸、塩酸、乳酸、ラクトビオン酸、マンデリン酸、リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、蓚酸、パルミチン酸、ピバリン酸、ピコリン酸、リン酸、プロピオン酸、コハク酸、サリチル酸、ステアリン酸、硫酸、酒石酸、ウンデシル酸、およびバレリン酸が挙げられる。
【００６３】
製薬剤を送達するのに用いられるリポソーム組成物は患者が生理的に耐えられるｐＨを有することが好ましい。例えば、吸入用組成物に対しては、肺組織のｐＨが６．８〜６．９であると報告されている。本発明のリポソーム組成物のｐＨは典型的には約ｐＨ４と約ｐＨ８の間の値を持つ。一実施形態では、例えば組成物がオートクレーブされている実施形態では、本発明のリポソーム組成物のｐＨは約ｐＨ４と約ｐＨ７の間である。他の実施形態では、例えば組成物がオートクレーブされている実施形態では、本発明のリポソーム組成物のｐＨは約ｐＨ５と約ｐＨ６の間である。本発明のリポソーム組成物はｐＨ約４より低いｐＨで相安定であることが可能であるけれども、そのような処方は典型的には化学的に安定ではなく、時間が経過すると、他の反応の中でもとりわけホスホリピッドの酸化および／または加水分解がより低いｐＨ値において起き得る。
【００６４】
本発明においては、組成物のｐＨは親油性アミン有効成分のアミノ基のｐＫａよりも低いか、またはこれにほぼ等しい。一実施形態では、溶液のｐＨはｐＨ単位にして約１と２親油性アミンのアミノ基のｐＫａよりも低い。ｐＫａよりも低いｐＨ値を持つと、親油性アミンのアミノ基の大部分が正に帯電する。
【００６５】
エタノールは普通、特にエタノールを用いて通常の方法によりリポソームを形成している場合、リポソーム組成物の部分を形成する。代替物が利用可能であるが、不所望の毒性を有しないものまたは吸入時に刺激性であることが知られていないものに限定される。好適な代替物としては、グリコール類およびグリセロール類であるそのような条件に合致するものである。本発明のリポソーム組成物中に存在するエタノールの含有量は本発明の安定リポソーム組成物を生じるものであればいずれでもよい。ある実施形態では、エタノールの濃度は前記リポソーム組成物の全体積の約２．５％と約１０％の間である。体積の１０％より多いエタノールを有する組成物も本発明の範囲内であるが、濃度が全体積の１５％に近づきまたは１５％を越えると、例えば２０％では、形成されるリポソーム粒子の品質が悪くなり始める。
【００６６】
本発明の水性媒体は導かれたリポソーム組成物の形成に干渉しない任意の生理的に許容可能な水溶液、例えば緩衝液または水であり得る。ある実施形態では、緩衝液は低イオン強度の緩衝液を含む。乾燥液については、イオン強度が充分に低いものを用いて形成されたリポソームが製薬剤を封入する効率に影響を与えない用にする必要がある。好適な一実施形態では、水溶液は水である。
【００６７】
ある実施形態では、追加の賦形剤、例えば酸化防止化合物を本発明のリポソーム組成物に添加する。他の実施形態では、ホスホリピッドのほぼ１または２％以下（重量／重量）、典型的には組成物の全体積の０．０１〜０．１％添加する。本発明の組成物に添加することが可能な追加成分は相安定リポソーム組成物に影響を与えないもののみを含み、したがって組成物の健全性を損なわない。好適な一実施形態では、前記組成物は酸、ホスホリピッド、水溶液および任意にエタノールおよびステロールを含む製薬剤から本質的になる。
【００６８】
リポソーム組成物の調製
当業者には了解されるように、本発明のリポソーム組成物はリポソームを調製しサイジングする標準的方法により調製することが可能である。これらには脂質膜の水和、溶媒射出、および逆相蒸発を含む。
【００６９】
以下の特定の例におけるリポソーム組成物をエタノール相と水相を混合することにより調製した。前記エタノール相はエタノール、製薬剤、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを含むものであった。製薬剤は親油性アミン類からなる一群の医薬から選ばれた。水相は注射用水と酸により提供されたアミンに対する負の対イオンを含むものであった。製薬剤が親油性アミンと酸の塩である場合、水相は注射用水であった。ある実施形態では、前記酸は塩酸を含み、これはエタノール相に添加することができ、これを過ぎに水相と混合する。これは親油性アミンと所望のアミンのリポソーム組成物の調製に使用することが可能である。この場合、アミンはその塩の形態では利用できない。
【００７０】
前記水相は相安定に悪影響を与えない酸の追加量を含んでいてもよい。混合全の両相を約５６℃〜６０℃の温度に加熱する。体積１リットル未満の小規模の調製には、これら２つの相を混合して７５〜８０ｒｐｍの環境シェーカーに置く。リポソーム小胞が形成されると、混合物をさらに１０分間５６〜６０ｒｐｍで震盪する。次いで、混合物をシェーカーから取り出し、室温にほぼ２時間かけて冷却した。リポソーム組成物のより大規模な調製のために、温度制御装置を備えた反応器内でエタノールを攪拌された水相に添加する。この混合物を５６℃〜６０℃で１０分間撹拌し、次いで室温まで２時間かけて冷却する。安定組成物は１週間にわたって貯蔵した際に均質のままであり、相分離しないことを特徴とする。一般に、リポソーム組成物が得られる限り、試薬を任意の順序で相互に混合または相互に添加することが可能であることが見出された。
【００７１】
ある実施形態では、エタノール相を水相に添加する速度は、特にリポソームのより大体積のバッチを調製するときは、形成されるリポソームの粒径分布に影響することが見出されている。この場合、水相をエタノール相に添加することは実際的ではない。ある実施形態では、リポソームの粒径はエタノールを水に添加する速度が遅くなるにつれて遅くなることが見出されている。本発明のリポソーム組成物は広範囲の粒径分布を持つものを含むことが了解されるべきである。
【００７２】
本発明を説明するために種々の処方が種々の親油性アミン、酸またはその塩を用いて図１および図４に示すように調製された。
【００７３】
この方法を用いて、リポソーム組成物の全体積が３０ｍｌという小さなバッチ並びに１リットル、２．５リットル、５リットルおよび１５リットルのより大きなバッチを含む種々のバッチ・サイズを実施例４に記載するように調製した。調製されたリポソーム組成物は小体積および大体積のいずれのものも経時安定性が好適であった。１リットルと１５リットルの間のバッチで作製されたリポソーム組成物を検討したところ、匹敵する化学的および物理的安定性、リポソーム粒子の質量中央径、および匹敵する有効成分の封入率（パーセント）を有することが示された。
【００７４】
本発明の製薬組成物は、肺システムを通る吸入により、局所的に、非経口的に等を含む多くの方法で投与することが可能である。前記組成物は点眼投薬形態および注射投薬形態を含むことが可能であり、医療診断製品を含むことが可能である。
【００７５】
本明細書における「非経口的」という用語は当業者には了解されるように［例えば、ステッドマン医学辞典、第２５版、１９９０年（ウイリアム・アンド・ウィルキンス）（Ｓｔｅｄｍａｎ'ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，２５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）参照］、胃腸管を通る以外の任意の経路を含む意味のものであり、特に物質を生体内に静脈、皮下、筋肉内または皮内注射により導入することをいう。前記製薬組成物は無菌注射製剤の形態、例えば無菌注射可能水性または油性懸濁液あるいは噴霧療法による投与用の吸入製品であってもよい。処方が相安定であれば、エンド・ユーザーにより種々の装置、例えば頂部供給式および底部供給式噴霧器を用いて向きに無関係に（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）使用することが可能である。
【００７６】
リポソーム安定性−物理的および化学的安定性
本発明の目的のためには、「安定リポソーム組成物」は分散したリポソームが」が実質的に当初の性質を保持するとともに連続相全体に実質的に均一に分布されたままであり、かつ所望の品質保存期間にわたって最低限の化学的分解しか示さないものをいう。
【００７７】
本明細書において使用されているように、リポソーム組成物の「物理的安定性」という用語は、貯蔵時間にわたってリポソームの性質、例えばリポソームのサイズ（質量中央径ｄ（０．５））、封入された医薬の、組成物中において遊離の医薬に対する比、組成物の沈降、凝集または光散乱性の顕著な変化が存在しないことをいう。
【００７８】
本明細書において使用されるように、「粒径分布」または「ＰＳＤ」は当業者に周知の動的光散乱技法により、例えばマルバーン・マスターサイザー（登録商標）２０００を用いて測定されたリポソーム分散物における粒径分をいう。リポソーム組成物の粒径分布を報告する簡便な方法は粒子の質量中央径を参照し、かつ、サンプルの５０％が小さいリポソームに関連し、サンプルの５０％が大きいリポソームに関連するリポソームの中央サイズを表す値ｄ（０．５）を報告することによる。本発明のリポソームの粒径の好適な範囲は約１０ミクロン未満、好ましくは約６ミクロン未満、または約４ミクロン未満、または約２ミクロン未満である。当業者には了解されるように、粒径の所望の範囲は用途によって変わる。例えば、１〜３ミクロンの範囲内に入るｄ（０．５）値はリポソームの吸入可能なサイズ内に入るリポソームの割合（パーセント）を最大にすることが可能である。
【００７９】
種々の処方に対する「パーセント封入」、または封入比、または％Ｅはリポソーム内に封入された親油性アミンの前記組成物中の親油性アミンの全量に対するパーセントをいう。本発明のリポソーム中の親油性アミンのパーセント封入はリポソーム内に取り込まれた製薬剤のパーセントとして表現される。好適な封入率の範囲は約５０％〜約９０％、好ましくは約６０％〜約８０％、さらに好ましくは約５０％〜約７５％である。当業者には分かるように、種々のパーセント封入率は異なる用途に対して有益であり、特に所望の医薬製品の作用の当初の開始時と作用の全期間によってきまる。
【００８０】
プラセボ・リポソームは上述のようにして調製され製薬剤を含まない。従って、これらのプラセボ・リポソームはホスホリピッド、コレステロール、エタノール、水および場合によって塩のみを含む。これらのリポソームは不安定であり、調製後数時間乃至数日で相分離が起きた。
【００８１】
上述のようにして調製されたが親油性アミン医薬の遊離塩基を製薬剤として含有するリポソームも貯蔵時に不安定であった。製薬的に許容し得る酸はこれら組成物には添加しなかった。調整後数日以内に相分離が認められた。
【００８２】
親油性アミンの遊離塩基のプロトン化された形態である塩基イオンと対応する酸対イオンを含むリポソームは安定リポソーム製剤を提供することが見出された。特に、ある実施形態では、酸：アミンのモル比は約１０：１〜１：１０（モル濃度／モル濃度（ｍｏｌａｒ／ｍｏｌａｒ））の範囲内がリポソームの安定性を改善するのに有効であることが見出された。３：１と１：３の間のより狭い酸：アミン比も有効である。さらに、これらのリポソームもオートクレービングに対して安定であることが見出された。製薬剤、すなわち親油性アミンと有機酸の塩を用いて調製されたリポソームも貯蔵時安定性を示し、かつオートクレービングに対して安定である。
【００８３】
リポソームから医薬候補を消耗させる条件下でリポソーム封入医薬製品の透析をすると相分離したリポソーム組成物が生じる。以下の表１において、種々のリポソーム組成物が記載された期間にわたって透析された。水性溶媒として水を用いた本発明の安定リポソーム組成物は透析後、透析前と実質的に同じ封入率（パーセント）を示した。
【００８４】
【表２】
2007511545.tif 000003
【００８５】
意外にも、本発明のリポソーム封入医薬製品をオートクレーブすると、適切に安定かつ無菌のリポソーム封入医薬製品が得られる。さらに意外なことに、ある場合には、前記安定リポソーム封入医薬製品はオートクレーブ前の安定製品に対して安定性の向上を示した。そのようなものとして、本発明の他の態様において、リポソーム組成物の安定性向上方法であって、本発明のリポソーム組成物を負活性雰囲気下でオートクレーブする方法が提供される。たとえそのような組成物はそれらの用途に対して、例えば局所用組成物のように、無菌である必要がないとしても、リポソームの安定性を向上する方法においてオートクレービング工程を用いることが可能である。
【００８６】
本発明で用いるのに適切なオートクレービング条件としては、リポソーム封入医薬製品の滅菌を可能にし、かつ組成物の経時化学的安定性が実質的に低下させない条件が挙げられる。ある実施形態では、リポソーム封入医薬製品は約１２１℃で最低約１５分間、窒素またはアルゴンのような負活性雰囲気下でオートクレーブされる。一実施形態では、負活性雰囲気は一般に約１．５％未満の酸素を含有するものである。より高い温度も時間を短くして同様に用いることが可能である。処方が加熱／冷却サイクルに耐え得るならば、その場合は、末端滅菌すると着実、迅速かつ安価な無菌医薬製品の調製方法が得られる。
【００８７】
図１および図４に示すように、種々の親油性アミン、有機酸またはそれらの塩を用いて多数の処方が調製され、それらの安定性が試験され、本発明の安定組成物およびその製造方法がさらに説明される。
【００８８】
本発明の特等は、リポソーム封入医薬製品組成物が均質な分散物を構成していることにある。ある組成物では、前記均質分散物は半透明の外観を有し、それらが均質に分散されているので、末端ユーザーが乳濁した投与形態に対してそのような工程を含める傾向がみられるにもかかわらず、投与前に震盪する必要がない。前記安定組成物は長期間にわたって物理的および化学的に安定であることが観察され、いかなる可視的凝集体も、ある実施形態では２４ヶ月後でさえも示さなかった。不安定リポソーム封入医薬製品はある期間経過すると沈殿、分離および凝集を示す。
【００８９】
本発明において、安定リポソーム組成物は相安定であり凝集体を実質的に形成しないもの、好ましくは少なくとも約１年、さらに好ましくは少なくとも約１８カ月以上、さらに好ましくは少なくとも約２４カ月にわたって凝集体を形成しないものである。もっとも、この期間は特に送達されるべき有効成分および送達の態様に応じて適宜長くしたり、短くしたりすることが可能である。
【００９０】
リポソーム組成物の相安定性も本明細書の実施例３に記載されたような手順により予測することが可能である。前記手順ではリポソーム粒子のｄ（０．５）値とリポソーム組成物の遠心上清の不透明値（ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ）を測定する。さらなる詳細は以下の実施例に記載されている。
【００９１】
さらに、本発明の安定リポソーム封入医薬製品は貯蔵時の粒径が経時で実質的に一貫していることを特徴としており、上述したようにオートクレービングにより滅菌された安定リポソーム封入医薬製品を含む。例えば、下記実施例４は本発明の種々のリポソーム組成物の粒径分布が貯蔵後２０カ月までの期間にわたって実質的に変化しないままであったことを示し、本発明の処方は貯蔵時間にわたって実質的に柳気鋭が安定であることを証明している。さらなる詳細は以下の実施例に記載されている。
【００９２】
さらに、本発明の安定リポソーム封入医薬製品は貯蔵時に実質的に経時安定な有効成分封入率を特徴とし、上述したようにオートクレービングにより滅菌された安定リポソーム封入医薬製品を含む。本発明のある組成物をオートクレーブすると有効成分の封入率（パーセント）がオートクレービング前の有効成分の封入率（パーセント）に対して影響があることが示されているが、ここで述べた封入率（パーセント）の経時変化はオートクレーブしなかったか、またはオートクレービングに引き続き貯蔵下際の組成物の封入率（パーセント）の経時変化をいうものであることが了解されるべきである。また、遊離医薬の封入された医薬に対する所望の割合（パーセント）は本組成物の使用において有効成分の性質、所望の用量および所望の治療効果に対する遊離医薬と封入された医薬の相対的な寄与率に応じて変えることが可能であることが了解されるべきである。
【００９３】
リポソームの物理的安定性を実証するために、下記実施例４は本発明の種々のリポソーム組成物の有効成分の封入率（パーセント）の不活性雰囲気下で２０カ月までの期間にわたる安定性を示す。さらなる詳細は以下の実施例に記載されている。
【００９４】
さらに、本発明の安定リポソーム組成物は、実質的に化学的に経時安定であることを特徴とする。本明細書において使用されているように、「化学的安定性」という用語は、最終組成物中の親油性アミン、酸、ホスホリピッド、コレステロールその他の成分の化学的構造に顕著な変化が存在しないことをいう。有効成分については、特に親油性アミンについては、化学的に安定であるとは、貯蔵期間にわたって有効成分の約５％未満、好ましくは約２％未満の分解または効力の変化があることと定義される。ホスホリピッド担体については、化学的安定性は加水分解または酸化によりリポソームの分解のせいで約１０％未満のホスホリピッド含有量の損失が存在することと定義される。
【００９５】
ある実施形態では、本発明のリポソーム組成物は４℃、ｐＨ４にいて酸素が若干存在する状態で少なくとも１年間実質的に安定であることが見出された。他の実施態様では、下記実施例４に示すように、本発明のリポソーム組成物のホスファチジルコリンの化学的安定性は２０カ月までの期間にわたって実質的に不変であることが見出された。さらなる詳細は以下の実施例に記載されている。
【００９６】
本発明のリポソーム組成物のｐＨは典型的に約Ｈ４と約ｐＨ８の間のｐＨ値において相および化学的安定性をともに有する。一実施形態では、本発明のリポソームは約Ｈ４と約ｐＨ７の間のｐＨ値において相および化学的安定性を有する。他の実施形態では、本発明のリポソームは約Ｈ４．５と約ｐＨ６．５の間、または約Ｈ５と約ｐＨ６の間のｐＨ値において相および化学的安定性を有する。本発明のリポソーム組成物は約４未満のｐＨ値において相安定であることがあるけれども、そのような処方は典型的には化学的に安定ではなく、他の反応中、特にホスホリピッドの酸化および／または加水分解がそのような低いｐＨにおいて時間の経過とともに認めうるほどに起きることがある。
【００９７】
本発明のリポソーム組成物は帯電したアミノ基を有する親油性をリポソーム組成物に安定性を付与する有効成分として含む。帯電した親油性アミンの不存在かで調製されたリポソームは不安定であり急速に沈降することが観察された。リポソームの調製において慣用されるホスホリピッドとしてはホスファチジルコリンが挙げられる。いかなる特定の理論にも拘束されるつもりはないが、以下は、リポソーム組成物の安定化または脱安定化に寄与すると考えられる装具作用および力の説明である。生理的ｐＨ範囲において、ホスファチジルコリンは正味ゼロ電荷の中性分子として振る舞う。生理的ｐＨにおいて、ホスファチジル基の負電荷はコリン部分の４級アンモニウム窒素野電荷と平衡している。リポソーム内で、ホスファチジルコリン分子は一般に並列に整列しており、そのため１分子の正に帯電したコリン基は隣接する脂質分子のホスファチジル基と電気的に相互作用する。そのようなリポソーム製剤の正味電荷は（ゼータ電位測定により反映されているように）ゼロである。リポソーム製剤内に非帯電医薬を包含させてもリポソームの正味電荷は変化しない。親油性アミン医薬を用いるリポソームを安定化はリポソーム組成物のｐＨをｐＨが親油性アミンのｐＫａとほぼ等しいかまたはそれより低くなるように選択して、親油性アミンに正電荷を増加させるようにすることにより達成される。正に帯電した親油性アミンはそれゆえリポソーム構造のホスホリピッド二重層内に、アミンの正電荷が負に帯電したホスファチジル部分とより密接に整列するように、挿入可能になり、リポソームの表面の電荷のバランスを崩して生理的ｐＨにおいて正に帯電したリポソームを形成することが考えられる。親油性アミンのｐＫａよりも低いｐＨであることにより、このように方面に帯電したリポソームを配することによって、医薬のリポソーム処方自体における安定剤としての役割を向上させることが可能になる。帯電したリポソームはこのように相互に反発して凝集に対する抵抗性を与える。これも同様に、親油性アミンおよびその塩並びに製薬的に許容し得る酸を含まない安定プラセボ・リポソーム組成物を調製することができないことを説明できるであろう。さらに、これも同様に、大半が非帯電の中性分子として提供された親油性アミンを有する安定リポソーム組成物を調製することができないことを説明できるであろう。
【００９８】
従って、本発明では、本発明のリポソーム組成物のｐＨは親油性アミン有効成分のアミノ基のｐＫａ値にほぼ等しいかそれより低い。
【００９９】
上述した、そして本発明の範囲内で安定性に関して用いられた種々の範囲は近似値であり、指針であり、得られる組成物が上述のように安定である限り、任意の変形例を含めることが可能であることが当業者には了解されるべきである。
【０１００】
本発明の利点は以下の実施例によりさらに説明される。これらの実施例およびここに記載した特定の詳細は説明のためだけに示されたものであり、特許請求の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１０１】
（実施例１−リポソームの調製）
リポソーム製剤の各試験バッチを、精製大豆レシチン１．２ｇ、３ｇのエタノールに溶解し５６℃に温めたコレステロール０．１２ｇを用いて調製した。いくつかの製剤では、エタノール相も親油性アミンまたは親油性アミンの塩（図１）を最終処方の目標濃度を与える量で含有していた。エタノール相にすべての構成成分を溶解した後、このエタノール溶液を、５６℃に温めた水溶液２７ｇと混合した。この水相は任意に種々の酸または塩を図１に示すように含有していた。これら２つの液相を混合した後、混合物を５６℃で十分間、オービタル・シェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）で震盪し、ついで周囲温度に徐冷した。多層リポソームの存在を顕微鏡検査により確認した。選択されたリポソーム製剤を１２１℃で１５分間オートクレーブした。
【０１０２】
本発明のリポソーム製剤の相安定性のお蔭で製薬的に有用なリポソーム製剤が提供される。実施例１に記載された製剤の相安定性を沈降および凝集体の形成について目視観察した。相安定性が充分でない製剤は典型的に非常に速く、しばしば一夜で沈降するが、他は数年間貯蔵後も沈降の兆候を示さない。相安定リポソームの可視的外観の例を図２ａに示す。一方、図２ｂに示す相不安定製剤の可視的外観は明かに沈降と相分離を示す。
【０１０３】
図１を参照すると、製薬剤を欠くプラセボ・リポソーム組成物が一般に相不安定であり、かつ急速に沈降した。ｐＨ範囲４〜７にわたって、オートクレーブされなかった図１のプラセボ・リポソームは相不安定である（図３ａ）。相安定に見えるプラセボ・リポソーム製剤は一般に極端なｐＨ、すなわちｐＨ３未満およびｐＨ８より高い、化学的安定性が一般に危うくなるｐＨに関連している。
【０１０４】
図１を参照すると、親油性アミンの塩を添加するとリポソーム製剤に安定化効果があることが見出された。これに対して、親油性アミンフェンタニルのみを含有する（酸対イオンなし）リポソーム製剤は不安定である。しかしながら、処方中の酸の割合が増加するにつれて、製剤の相安定性が増加した。親油性アミンの安定化効果を適切な酸の濃度と組み合わせると、オートクレーブ前に図３ｂに示すように約７未満のｐＨ値で相安定であるリポソーム製剤が得られる。プラセボ処方と対照的に、親油性アミンを含有するリポソーム製剤は約ｐＨ４〜約ｐＨ６のｐＨ範囲にわたって相安定であるが、塩化ナトリウムを含有する製剤は例外である。
【０１０５】
（実施例３−オートクレーブされた組成物を含む種々のリポソーム封入医薬組成物の安定性）
製薬工業において、無菌処方は「末端滅菌されている」、すなわち個々のガラスビンに充填された後オートクレーブ滅菌される。オートクレービングによる本発明の末端滅菌リポソーム封入医薬製品は製薬工業に使用するのに好適な個々に包装された安定かつ無菌リポソーム製剤を提供することができる。
【０１０６】
上述のように、リポソームのオートクレービングに関するさまざまな従来技術文献は当業者に広く支持されている見解、特にホスファチジルコリンに基づくリポソームが脆く、オートクレービングの厳しい条件に対して不安定であり、リポソームの凝集、サイズやサイズ分布、脂質の加水分解／酸化、化学的分解および封入された医薬の不所望の放出（例えば国際出願公開第２００４／００２４６８号パンフレット）を招来することを示している。ここに説明したように、本発明のリポソーム組成物の実施形態はオートクレービングに耐えることができるだけでなく、オートクレービング後に草案手製が向上していることが分かる。さらに、本発明のリポソーム組成物の安定性に関する下記のパラメータ、すなわち、ｐＨ、粒径分布、脂質加水分解、脂質酸化、および相安定性をオートクレービングの前後で測定したところ、さらに、オートクレービングの本発明の組成物に対する効果が実証された。これらのパラメータのそれぞれについての説明は下記の通りである。
【０１０７】
種々の親油性アミンを塩基として添加し、種々の量の種々の酸と組み合わせて用いてリポソーム製剤を調製した。リポソーム製剤の各試験バッチを精製大豆レシチン１．２ｇ、３ｇのエタノールに溶解し５６℃に温めたコレステロール０．１２ｇ、および親油性アミンの塩基をエタノール３ｇに溶解し、５６℃に温めたものを用いて調製した。２７ｇの注射用水に任意に種々の酸または塩基を添加した水相を、５６℃に温めた。試験酸がパルミチン酸である処方において、この酸はエタノール相に溶解し、他の酸は水相に溶解した。エタノール相に全ての構成成分を溶解した後、エタノール溶液を水溶液に添加し、混合物を５６℃で十分間、オービタル・シェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）で震盪し、ついで周囲温度に徐冷した。多層リポソームの存在を顕微鏡検査により確認した。選択されたリポソーム製剤を１２１℃で２０分間オートクレーブした。
【０１０８】
リポソーム組成物の種々のパラメータをオートクレービング前後で測定して組成物の物理的安定性と化学的安定性を明かにした。
【０１０９】
図４はリポソーム製剤、ｐＨ、オートクレービング前後の粒径、オートクレービング前後の相安定性指数の一覧である。
【０１１０】
ｐＨに関する安定性：  リポソームのオートクレービングに関する問題はホスホリピッドまたは医薬成分の化学的分解の可能性があることである。処方において化学的分解があるとｐＨの変化に反映されることが多い。図５に示すように、本発明のリポソーム組成物のオートクレービング後のｐＨとオートクレービング前のｐＨの関係は一般に式  ｐＨ（後）＝ｐＨ（前）  と書くことができ、当初ｐＨ７未満であった処方のｐＨに変化がないことを示している。オートクレービング前にわずかにアルカリ性であったリポソーム製剤は特にｐＨ＞８の処方は、オートクレービング後は低いｐＨを有し、グラフ上の点は所望の直線関係から逸れる。処方をより高いｐＨ値においてオートクレーブすると、処方の英文の化学的分解が起きることが明らかである。
【０１１１】
オートクレービングのホスファチジルコリン含有量への影響：  リポソームをオートクレーブする際の問題はエステル基ホスホリピッド、例えばホスファチジルコリンが加水分解される可能性があることである。本発明の１２の処方のオートクレービング前後のホスファチジルコリン濃度を決定した。１２種の異なるリポソーム処方のオートクレービング前後のホスファチジルコリン濃度を決定した。ホスファチジルコリンとその関連する加水分解生成物であるリソホスファチジルコリンを正常相ＨＰＬＣによりシリカ−ジオールカラムを使用し蒸発光散乱検出で溶離液Ａ（ｎ−ヘキサン：２−プロパノール：酢酸：トリエチルアミン  ８１．４：１７：１．５：０．８）から溶離液Ｂ（２−プロパノール：水：酢酸：トリエチルアミン  ８４．４：１４：１．５：０．０８）へ１．５〜２ｍＬ／ｍｉｎの流速で１５分かけて決定した。
【０１１２】
図４からの１２種類の処方を選択して図４の処方の全範囲ｐＨ値を網羅した。加水分解は、図６に示すように、４未満のｐＨ値または１０より高いｐＨ値において顕著であり得るが、本発明のリポソーム製剤は４と９の間、好ましくはｐＨ４とｐＨ７の間でオートクレーブすることが可能であり、ホスホリピッド、の顕著な損失がなく、典型的には１０％損失より低く、さらに好ましくは５％損失よりも低い。
【０１１３】
脂質酸化に対するオートクレービングの影響：  オートクレービングの際の脂質の酸化は処方を不活性雰囲気下で調製し、充填することにより最低限になった。下記表２は製薬剤としてフェンタニル：クエン酸（１：１）を含有するリポソーム組成物についてのオートクレービング後の脂質酸化の変化を要約したものである。脂質成分の酸化は比色分析法により試験した。脂質を含有するサンプルのすべてと標準とを酸化第一鉄／キシレノール・オレンジ（ＦＯＸ）試薬と反応させて５６２ｎｍで測定し、サンプルの吸収読取値から引き算した。定量はクメンヒドロペルオキシドの標準曲線に対して行った。酸素の排除はオートクレービング工程の際の酸化を防止することが観察された。
【０１１４】
【表３】
2007511545.tif 000004
【０１１５】
相安定性指数に対するオートクレービングの影響：  本発明のリポソーム組成物の相安定性は製薬的に有用なリポソーム組成物を提供する。充分に相安定でないリポソーム組成物は典型的には図２ｂに示すタイプの沈降を非常に速く、しばしば一夜で示すが、他のものは貯蔵数週間後になって沈降を示すことがある。ある実施形態では、製薬製品に対する所望の品質保持期間は特定の貯蔵条件下で２年以上である。例えば、一実施形態では、有効成分／有機酸としてクエン酸フェンタニルを含有する本発明のリポソーム組成物は４℃において２年にわたって製品が相安定性を保持したことを示した。
【０１１６】
新薬候補の処方開発の際、数ヶ月または数年の期間の実時間で安定性を監視して相安定性を評価することは実際的ではない。そのため、本発明者は遠心を用いてリポソーム組成物の長期間の相安定性を予測する分析ツールを提供する方法を開発した。
【０１１７】
試験においては、リポソーム組成物を上述のように調製し、図４に要約した。リポソームの粒径分布を、分散剤中のリポソームを注射用水で希釈してからマルバーン・マスターサイザー（登録商標）２０００を用いて光散乱方法により行った。リポソーム組成物のサンプルを取り出し、マルバーン・マスターサイザーを用いて粒径分布を測定した。リポソーム組成物の質量中央径（ｄ（０．５））を記録した。各リポソーム製剤の３ｍｌアリコートを２、２９２ｇにおいて４℃２時間遠心した。遠心後、サンプルのアリコートを遠心されたサンプルの最上層から取り出し、マルバーン・マスターサイザーを用いて粒径を測定した。上清の最上層の平均質量中央径を記録した。
【０１１８】
本手順により試験したリポソーム組成物の例を図８ａ〜８ｃに示した。サンプルは相安定であり、遠心すると、図８ａに示すように、遠心管の底部の固形ペレットと、透明な上清とを生じた。マルバーン・マスターサイザーを用いて測定すると、不透明値がほぼゼロであることから確認されるように、上清中には粒子がほとんど検出されなかった。不透明値は当業者にリポソームの体積量を決定する適切な試験法として周知である。サンプルが相安定であると、遠心後、ペレットが一つも目視できず、遠心管内のサンプルは均一な分散物のままである。マルバーン・マスターサイザーを用いて測定すると、不透明値により上清中に多数のリポソームが存在することが確認され、リポソームの質量中央径は出発処方で記録された値の一般に６０％〜１００％であった。
【０１１９】
ｄ（０．５）値を粒径分布の一貫性のマーカーとして用い、相安定指数（ＰＳ指数）を下記式により定義する。
相安定性指数＝ｄ（０．５）遠心後／ｄ（０．５）遠心前
【０１２０】
サンプルがここに定義したように相安定であるときは、遠心後、可視的ペレットが存在せず、リポソームは図８ｃの液相全体に均一に分布したままであることが分かった。ＰＳ指数は約０．６よりも大きかった。
【０１２１】
サンプルが中間の相安定性を持つ場合は、遠心後、目視検査すると、密度勾配または部分的ペレットが図８ｂに示すように認められ、典型的にはＰＳ指数はほぼ０．１以上、かつほぼ０．６以下である。中間の相安定性を持つ組成物をさらに説明するために、図９は中間相安定性のリポソーム組成物の写真を示す。遠心後、若干のリポソームが沈降し、ペレットが可視的になる。上清は透明ではなく、若干のリポソームが懸濁状態のままであった。この写真はバックライトを当ててペレットと上清の境界がはっきり目視できるようにした。
【０１２２】
種々のリポソーム組成物のＰＳ指数をこの方法を用いて組成物のオートクレービング前後の双方について測定し、得られたデータを図４に纏めた。
【０１２３】
全体として、医薬の遊離塩基のみを含有する処方は、オートクレービングの前後で、一般に相不安定であった。唯一の例外はスマトリプタンを用いた処方であった。しかしながら、スマトリプタンは最終処方のｐＨにおいて電荷を有するが、他の全ての分子は最終処方のｐＨにおいて非帯電であるかまたは部分的にのみ帯電しているに過ぎない。
【０１２４】
全体として、リポソーム処方をオートクレーブするとＰＳ指数が０．６より大きいことを特徴とするリポソーム処方の数が増加する。これは表３に以下のように纏められている。
【０１２５】
【表４】
2007511545.tif 000005
【０１２６】
オートクレービングに先立って、処方の５１％は一般に相安定性が乏しいか、まったく無く、処方の２６％だけが優れた相安定性を有する。オートクレービング後、相安定性リポソーム製剤の数が急激に増加して全ての製剤の６２％を超えた。
【０１２７】
適切な量の酸を添加すると、製剤のｐＨをｐＫａよりも低い範囲に滴定して親油性アミンのアミノ基の数の増加が促進されるようにすることができた。約４と約７の間のｐＨにおいて、そしてオートクレービング工程後に、リポソームは顕著な相安定性を示した。図１０および図１１はオートクレービング前後のフェンタニルを図４の親油性アミンとして含有するリポソーム製剤の相安定性指数を比較している。図１０では、グラフはオートクレービング前は、処方は遠心時に沈降し易いが、これはＰＳ指数が低いことにより反映されている。対照的に、オートクレービング後、フェンタニルのｐＫａ（ｐＫａ＝７．３）の値よりも低いｐＨ値を持つ処方はすべて相安定であった。
【０１２８】
図１２および図１３を参照すると、これらのグラフは、親油性アミンとしてオンダンセトロン（ｐＫａ  −  ７．４）を含有する図４のリポソーム製剤のオートクレービング前後の相安定性指数を比較している。オンダンセトロンを有する組成物については、フェンタニルの場合よりも大きなデータの散乱が観察されるが、これは処方の２つの主要クラス、パルミチン酸を含有する処方と高濃度オンダンセトロンを含有する処方とに起因するものであることが分かる。パルミチン酸含有処方は粘稠な混合物を形成し易すく、かつリポソーム含有量の均一性が少ないため挙動がよくない。オンダンセトロンの高濃度（２．４ｍＭ）においては医薬の可視的結晶が観察された。これら２つのサブクラスの処方が除外されると、オンダンセトロン処方の傾向はフェンタニルと一致し、すなわちオートクレービング後、親油性アミンのｐＫａより低いｐＨ値を持つ処方は相安定である（図１４および図１５）。
【０１２９】
図４のスマトリプタンを含有する組成物に関する図１６および図１７を参照すると、遊離医薬を有する処方のみが最初の調製時に相安定であった。他の医薬の場合と同様に、処方をより低いｐＨに滴定すると、オートクレービング後に数の処方に相安定性が多付与された。必要とされるｐＨはスマトリプタンについてはより低い。重要なのは、スマトリプタンは親油性アミンであるが、スマトリプタンはその構造中にスルホンアミド基も有し、多数のイオン化可能な基と相当するｐＫａ値を有し、オクタノール／水の分配係数が最も低い（ＬｏｇＰ＝１．０５）
【０１３０】
図４のプロクロルペラジンを含有する組成物に関する図１８および図１９を参照すると、これらの処方はオートクレービングの前後の双方において相安定であることが見出された。オートクレービングはより高いｐＨにおける処方にのみ負の影響を有することが示されていが、これは他の医薬を用いた処方とは異なる。プロクロルペラジンはより高いｐＫａ  ８．１を有するが、これはオンダンセトロンまたはフェンタニルのいずれよりも高い。オンダンセトロンを用いた処方の多くは完全に２ｐＨ単位だけｐＫａが低い。
【０１３１】
リポソームの粒径：  従来技術はリポソームのオートクレービング後、サイズが顕著に変化することを示唆している。リポソームの粒径分布は、リポソームを注射用水で希釈してからマルバーン・マスターサイザー（登録商標）２０００を用いて光散乱方法により行った。オートクレービング後ＰＳ指数＞０．６の製剤を用いた我々の研究結果は、測定された生の製剤またはオートクレーブされた製剤の遠心前に測定された、リポソームの測定されたｄ（０．５）はオートクレービング後少し増加するが、処方の大部分は３３％未満のリポソームのサイズ増加を示す。リポソームのサイズのより大きな変化が、図７に示すように、ｐＨ４未満またはｐＨ７より高いｐＨ値を持つ処方について記録された。上述のように、処方全体の物理的および化学的安定性を最適化するために、処方の好適なｐＨ範囲は約ｐＨ４〜７であり、好ましくは５〜６の間である。
【０１３２】
（実施例４−貯蔵安定性）
遊離フェンタニルとリポソーム封入フェンタニルの混合物を含有する製剤はエタノール相を水相と種々のバッチサイズで混合することにより調製された。エタノール相はエタノール、クエン酸フェンタニル、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを用いてなるものであった。水相は注射用水を用いてなるものであった。混合前に、両相を約５６℃〜６０℃に加熱した。２つの相を混合して、混合物をさらに１０分間５６℃〜６０℃で混合した。この混合物を室温まで約２時間かけて冷却した。典型的には、最終水性処方は１ｍｌ当り、フェンタニル５００ｍｃｇ（クエン酸フェンタニル８００ｍｃｇとして）、ホスファチジルコリン４０ｍｇ、コレステロール４ｍｇ、およびエタノール１００ｍｇを注射用水中に溶解したものである。充填後、製剤を最終的滅菌のためにオートクレーブする（若干の空気が存在する）。際集成材は３０〜４０％のフェンタニルを遊離医薬として含有し、残部（７０〜６０％）は封入された部分にある。
【０１３３】
【表５】
2007511545.tif 000006
【０１３４】
水性リポソーム製剤を４℃で貯蔵し、粒径分布の安定性および医薬封入率の変化を監視した。リポソームの粒径分布は、分散剤中のリポソームをろ過した灌漑用水で希釈してからマルバーン・マスターサイザー（登録商標）２０００を用いて光散乱方法により行った。リポソーム内の医薬の封入率（パーセント）を、リポソームを高遠心力（ｇｍａｘ２７７８１６）において４℃で２時間遠心することにより行った。非常に相安定性の高い処方用の適切なペレットを形成するためには極端な条件が必要であった。上清とペレットの双方の医薬を逆相ＨＰＬＣによりＣ８カラムをＵＶ検知器と４０／４０／２０酢酸アンモニウム緩衝液／メタノール／アセトニトリル緩衝液を用いて分析した。純正サンプル注入して質量バランスを計算した。封入率（パーセント）は次式により計算される。
【０１３５】
【数１】
2007511545.tif 000007
【０１３６】
ここに、Ｃ（ペレット）はペレット中の医薬の濃度であり、Ｃ（上清）は上清中の医薬の濃度である。
【０１３７】
粒径分布、封入率（パーセント）、またはホスファチジルコリン含有量を観察した。製剤は視覚的検査により相安定であり、１５リットルのロットからのサンプルについては、粒径指数は１９カ月貯蔵後に０．７２であった。
【０１３８】
本発明の実施形態をここに説明したが、当業者は本発明の範囲から逸脱することなく種々変更可能であることが了解される。さらに当業者には本発明の種々の実施形態の要素を任意の論理的順序で組み合わせることが可能であることが了解される。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】種々のリポソーム組成物および前記組成物のオートクレービングの前後の相安定性の視覚分析の結果を纏めて示す表図である。
【図２】本発明の相安定リポソーム組成物製剤（図２ａ）の外観を調製および貯蔵後分離するリポソーム組成物の外観（図２ｂ）と比較して示す図である。
【図３】親油性アミン製薬剤を欠くプラセボ・リポソームの相安定性を処方のｐＨの関数として（図３ａ）、および親油性アミンの組成物に対する安定化効果をｐＨの関数として（図３ｂ）示す図である。
【図４】種々のリポソーム製剤、ｐＨ、オートクレービング前後の粒径（ｄ（０．５））、およびオートクレービング前後の相安定性の一覧表を示す表図である。
【図５】本発明のリポソーム組成物のオートクレービング後のｐＨ対オートクレービング後にｐＨの関係を示すグラフである。
【図６】種々のリポソーム組成物に対するオートクレービング後のホスファチジルコリン含有量の％変化をオートクレービング前に含有量と比較してｐＨの関数としてプロットしたグラフである。
【図７】種々のリポソーム組成物に対するオートクレービング後の粒径分布の％変化をオートクレービング前に粒径分布と比較してｐＨの関数としてプロットしたグラフである。
【図８】図８ａは不安定リポソーム組成物を示す写真であり、図８ｂは中間の安定性を有するリポソーム組成物を示す写真であり、図８ｃは本発明の安定リポソーム組成物を示す写真である。
【図９】中間の安定性を有するリポソーム組成物を示す写真である。
【図１０】図４のフェンタニル組成物の相安定性指数をオートクレービング前にｐＨの関数としてプロットしたグラフである。
【図１１】図１０のフェンタニル含有組成物の相安定性指数をオートクレービング後のｐＨの関数としてプロットしたグラフである。
【図１２】図４のオンダンセトロンを含有するリポソーム組成物の相安定性指数をオートクレービング前にｐＨの関数としてプロットしたグラフである。
【図１３】図１２のオンダンセトロンを含有するリポソーム組成物の相安定性指数をオートクレービング後にｐＨの関数としてプロットしたグラフである。
【図１４】図４のオンダンセトロンを含有するリポソーム組成物の相安定性指数をオートクレービング前にｐＨの関数としてプロットし、パルミチン酸を含有する処方および２．４ｍｍｏｌオンダンセトロンを有する処方を除外したグラフである。
【図１５】図１４のオンダンセトロンを含有するリポソーム組成物の相安定性指数をオートクレービング後にｐＨの関数としてプロットし、パルミチン酸を含有する処方および２．４ｍｍｏｌオンダンセトロンを有する処方を除外したグラフである。
【図１６】図４のスマトリプタンを含有するリポソーム組成物の相安定性をオートクレービング前にｐＨの関数としてプロットしたグラフである。
【図１７】図１６のスマトリプタンを含有するリポソーム組成物の相安定性をオートクレービング後にｐＨの関数としてプロットしたグラフである。
【図１８】図４のプロクロルペラジンを含有するリポソーム組成物の相安定性をオートクレービング前にｐＨの関数としてプロットしたグラフである。
【図１９】図１８のスマトリプタンを含有するリポソーム組成物の相安定性をオートクレービング後にｐＨの関数としてプロットしたグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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