(57)【要約】  本発明は、遺伝毒性物質に対する生体対象の曝露を検出し、遺伝毒性物質に対する感受性を試験し、薬剤への曝露によって引き起こされるＤＮＡ損傷を測定する方法であって、前記対象から収集した試料のＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在を検出することを含む方法を開示する。濃縮された病巣の存在はＤＮＡ損傷を示し、病巣形成の程度は曝露の程度と相関する。診断試薬は、検出可能な標識を結合させたヒトＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドを含有し、生物学的試料のＤＮＡ損傷を検出するキットは、このような試薬及びシグナル検出成分を含有する。本発明はさらに、ＦＡＮＣＤ２含有病巣を形成する能力を変更する薬剤の同定方法を開示する。特に、このような薬剤は潜在的に有用な化学増感剤であるか、または遺伝毒性物質によって引き起こされる損傷に対して防御を付与することができる。
2007521811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体対象における遺伝毒性物質への曝露の検出方法であって、
前記対象から試料を収集すること、及び
前記試料におけるＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在を検出すること
を含み、ここで病巣の存在が遺伝毒性物質に対する曝露を示す方法。
【請求項２】
前記対象がヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、末梢血、唾液、尿、擦過細胞、滲出物、口腔試料、喀痰、及び頚部擦過物から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が末梢血である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
対照試料をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
対照試料に対する病巣形成の程度が、遺伝毒性物質に対する曝露の程度を示す請求項５に記載の方法。
【請求項７】
配列番号１のヒトＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドと試料とを接触させることをさらに含み、前記リガンドが検出可能なシグナルを提供する標識と結合している請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リガンドが抗体である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標識が前記抗体に結合している請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識が、第１のリガンドに結合する第２のリガンドに結合している請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２のリガンドが抗体である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識が、比色、化学ルミネセンス、蛍光、電気化学的標識、及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記標識が蛍光色素である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出が蛍光顕微鏡法を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
患者を低用量の遺伝毒性物質に曝露すること、及び
対照試料に対してＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在を検出すること
を含み、ここで、対照試料に対する病巣形成の存在が前記患者の遺伝毒性物質に対する感受性の違いを示す、遺伝毒性物質に対する患者の感受性の試験方法。
【請求項１６】
前記試料が、末梢血、唾液、尿、擦過細胞、滲出物、口腔試料、喀痰、及び頚部擦過物からなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が末梢血である請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
対照試料に対する病巣形成の程度が、遺伝毒性物質に対する前記患者の感受性を示す請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
試料と配列番号１のヒトＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドとを接触させることをさらに含み、前記リガンドが検出可能なシグナルを提供する標識と結合している請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記リガンドが抗体である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識が前記抗体に結合している請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記標識が、第１のリガンドに結合する第２のリガンドに結合している請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２のリガンドが抗体である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記標識が、比色、化学ルミネセンス、蛍光、電気化学的標識、及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記標識が蛍光色素である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記検出が蛍光顕微鏡法を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
遺伝毒性物質に対して対象を曝露することによって引き起こされるＤＮＡ損傷の程度を測定する方法であって、
前記曝露後に前記患者の試料を収集すること、及び
対照試料に対するＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在を検出することを含み、ここで、前記対照試料に対する病巣形成の違いは前記曝露に応答するＤＮＡ損傷の違いを示し、対照試料に対する病巣形成の程度は前記曝露に応答したＤＮＡ損傷の異なる程度を示す方法。
【請求項２８】
前記試料が、末梢血、唾液、尿、擦過細胞、滲出物、口腔試料、喀痰、及び頚部擦過物からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が末梢血である請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号１のヒトＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドと試料とを接触させることをさらに含み、前記リガンドが検出可能なシグナルを提供する標識と結合している請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記リガンドが抗体である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記標識が前記抗体に結合している請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記標識は、第１のリガンドに結合する第２のリガンドに結合している請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２のリガンドが抗体である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標識が、化学ルミネセンス化合物、蛍光色素、色素原、電気化学的タグ、及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記標識が蛍光色素である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出は蛍光顕微鏡法を含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合させた配列番号１のヒトＦＡＮＣＤ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３９】
蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合させた前記ＦＡＮＣＤ２タンパク質をコードする前記配列に操作可能に結合した発現制御配列をさらに含む請求項３８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｅＧＦＰ、ｅＹＦＰ、ｅＣＦＰ、ＲＦＰを含む群から選択される請求項３８に記載の遺伝子構築物。
【請求項４１】
請求項３８に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質。
【請求項４２】
請求項３８に記載の単離されたポリヌクレオチドを発現する細胞。
【請求項４３】
第２のフルオロフォアをコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合させた、病巣形成のときＦＡＮＣＤ２と結合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４４】
蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列のフレームに融合させた前記ＦＡＮＣＤ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列に操作可能に結合した発現制御配列をさらに含む請求項４３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４５】
前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｅＧＦＰ、ｅＹＦＰ、ｅＣＦＰ、ＲＦＰを含む群から選択される請求項４３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４６】
タンパク質リンカー配列をさらに含む請求項４３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４７】
請求項４３に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質。
【請求項４８】
請求項４３に記載の単離されたポリヌクレオチドを発現する細胞。
【請求項４９】
請求項３８及び４３に記載の単離されたポリヌクレオチドを発現する細胞。
【請求項５０】
ＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を変更する試験薬剤のスクリーニング方法であって、
生物学的試料を試験化合物と接触させること、及び
対照試料に対してＦＡＮＣＤ２含有病巣中のＦＡＮＣＤ２の存在を検出することを含み、ここで対照試料に対する病巣形成の程度の違いが病巣形成において活性のある薬剤であることを示す方法。
【請求項５１】
遺伝毒性物質に生物学的試料を曝露することをさらに含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドと前記生物学的試料とを接触させることをさらに含み、前記リガンドが検出可能なシグナルを提供する標識と結合している請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記リガンドが抗体である請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記標識が、第１のリガンドに結合する第２のリガンドに結合している請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記第２のリガンドが抗体である請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記標識が、化学ルミネセンス化合物、蛍光色素、色素原、電気化学的タグ、及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記標識が蛍光色素である請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記生物学的試料が請求項４２に記載の細胞である請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記生物学的試料が請求項４８に記載の細胞である請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
前記生物学的試料が請求項４９に記載の細胞である請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
前記検出が蛍光顕微鏡法を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項６２】
前記検出が蛍光共鳴エネルギー移動を測定することを含む請求項５０に記載の方法。
【請求項６３】
ＦＡＮＣＤ２ポリペプチドのモノユビキチン化形態及びユビキチンに結合する抗体。
【請求項６４】
前記抗体がポリクローナルである請求項６３に記載の抗体。
【請求項６５】
前記抗体がモノクローナルである請求項６３に記載の抗体。
【請求項６６】
請求項６３に記載の抗体及びパッケージング材料を含む、生体対象の試料中のＦＡＮＣＤ２含有病巣の有無を検出するためのキット。
【請求項６７】
蛍光標識した第２の抗体をさらに含み、前記第２の抗体は前記第１の抗体に結合する請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
請求項３８及び４３に記載の単離されたポリヌクレオチドをさらに含む請求項６６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線及び環境毒物などの遺伝毒性物質に対する生体対象の曝露の検出に関する。癌の治療、遺伝毒性物質に対する防御のための治療化合物の同定を促進する方法もまた、提供される。
【背景技術】
【０００２】
多くの疾患において、化学療法及び放射線治療は一般的な処置となっている。このような治療方法は癌などの疾患の治療に有効に使用され得るが、生物学的に多量の放射線に曝露するとまた、遺伝毒性ストレスの原因となり得る。同様に、（原子力の生成などの）多くの工業的工程及び（核兵器などの）軍事的用途では、個体を危険濃度の遺伝毒性物質に曝露する可能性がある。このような曝露は、細胞周期停止から変異、悪性腫瘍への変換、又は細胞死までの様々な細胞応答を引き起こす可能性がある。
【０００３】
個々の遺伝的性質によって、ＤＮＡ修復機構が欠損しており、その結果として染色体に不安定さが生じている人々もいる。このような染色体の不安定さによる結果は、主に３つある。これらの個体は、（１）発育が異常で（先天性欠損）、（２）癌の素因があり、（３）放射線照射及び化学療法に対して組織が過敏でありうる。
【０００４】
重篤な症例では、このような個体は明らかな遺伝子疾患（すなわち、ファンコニ貧血症）を伴って生まれてくる可能性がある。このような疾患は、特定のＤＮＡ修復遺伝子の両対立遺伝子の完全ノックアウトによって生じる。やや重篤な症例及びより普通の症例では、個体はＤＮＡ修復遺伝子又は経路が部分的に崩壊している可能性がある。このような崩壊は、ＤＮＡ修復遺伝子「変種」、たとえば、ファンコニ貧血症（ＦＡ）遺伝子の一塩基多型の遺伝から生じる可能性がある。これらの個体の発育は正常である（すなわち、先天性欠損の症状はない）が、遺伝的欠点の唯一の臨床的後遺症は、癌の早期発症又は放射線若しくは薬剤に対する過敏性である。癌が発症する前、又は放射線／薬剤曝露による致死毒性が生じる前に、このような個体を確認することは臨床医学における重要かつ未解決の問題である。
【０００５】
放射線／化学療法の毒性を予測することは困難で、現在のところ、状況証拠に頼っている。第１に、希少な癌が早期発症する個体、または癌の強い家族歴のある個体は、常染色体の優勢または劣勢遺伝を伴うことが明らかで、潜在的に遺伝的欠損を有している可能性がある。このような場合、犯人となる癌感受性遺伝子（ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３）を配列決定して、欠損を確認するか、または除外することができる。第２に、臨床所見がはっきりせず、既成の遺伝的疾患（すなわち、皮膚のカフェオレ斑または低身長）を想起させる個体は、ＤＮＡ修復疾患が根底にある可能性がある。
【０００６】
どの癌患者にＤＮＡ修復疾患が潜んでいるかを予測するための努力は、ほとんどが無駄に終わった。ＦＡ患者及びブルーム症候群の患者は明らかに染色体切断に（無視できない）欠陥を有しているが、ＤＮＡ修復疾患がより曖昧な患者は、一般的な染色体切断研究では陽性に判定されない。特定の種類及び位置の腫瘍に応じて、すべての癌患者に標準量の放射線／化学療法が施される。これらの患者の約２％は、裏に潜むＤＮＡ修復疾患の第１の証拠として、予期せぬ重篤な毒性反応を示す可能性がある。
【０００７】
生体試料において、遺伝毒性物質に対する曝露を検出する方法（すなわち、いわゆる生物学的線量計）が当技術分野で必要とされている。遺伝毒性物質に対する個体の感受性を試験する方法もまた、当技術分野で必要とされている。遺伝毒性物質に曝露することによって個体に引き起こされる障害を測定する方法もまた、当技術分野で必要とされている。遺伝毒性物質に対する細胞の応答を変更する活性を備えた薬剤の同定方法もまた、当技術分野で必要とされている。放射線及び遺伝毒性発癌物質などの遺伝毒性物質に曝露する可能性から個体を防御する活性のある化合物を入手することもまた、非常に必要とされている。
【０００８】
発明の概要
本発明は、遺伝毒性物質に対する生体対象の曝露を検出するのに有用な方法及び組成物を開示する。これらの方法及び組成物は、ＦＡＮＣＤ２及びその他のタンパク質が遺伝毒性物質に曝露した細胞において核内病巣を形成するという所見に基づいている。本発明はまた、病巣形成のモジュレーターの同定に有用な組成物及び方法を包含する。
【０００９】
一つの態様では、本発明は、以下の段階：対象から試料を収集する段階、及び試料中のＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在を検出する段階を含む、生体対象における遺伝毒性物質に対する曝露の検出方法を提供する。病巣の存在は、遺伝毒性物質に対する曝露の指標である。対象はヒトであることができる。試料は、末梢血、唾液、尿、擦過細胞、滲出物、口腔試料、喀痰、及び頚管擦過物からなる群から選択することができる。好ましい実施形態では、試料は末梢血である。あるいは、本方法はさらに対照試料を含むことができ、対照試料に対する試料中の病巣形成の程度が遺伝毒性物質に対する対象の曝露の程度の指標である。
【００１０】
一つの実施形態では、本方法はさらに、試料と配列番号１のヒトＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドとを接触させることを含む。リガンドは、検出可能なシグナルをもたらす標識と結合している。一つの実施形態では、リガンドは抗体である。検出可能な標識を抗体に結合させることができる。あるいは、標識は、第１のリガンドに結合する第２のリガンドに結合している。第２のリガンドは抗体であることができる。検出可能な標識は、比色、化学ルミネセンス、蛍光、電気化学的標識、及びそれらの組合せからなる群から選択することができる。好ましい実施形態では、標識は蛍光色素である。一つの実施形態では、検出には蛍光顕微鏡法が含まれる。
【００１１】
本発明はまた、以下の段階：患者を低用量の遺伝毒性物質に曝露する段階、及び対照試料に対してＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在を検出する段階を含む、遺伝毒性物質に対する患者の感受性を試験する方法を特徴とする。対照試料に対する病巣形成の存在は、遺伝毒性物質に対する患者の感受性の違いを示す指標である。対照試料に対する病巣形成の程度は、遺伝毒性物質に対する患者の感受性の指標である。試料は、末梢血、唾液、尿、擦過細胞、滲出物、口腔試料、喀痰、及び頚部擦過物からなる群から選択することができる。
【００１２】
一つの実施形態では、本方法はさらに、試料と配列番号１のヒトＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドとを接触させることを含む。リガンドは、検出可能なシグナルをもたらす標識と結合している。一つの実施形態では、リガンドは抗体である。検出可能な標識を抗体に結合させることができる。あるいは、標識は、第１のリガンドに結合する第２のリガンドに結合している。第２のリガンドは抗体であることができる。検出可能な標識は、比色、化学ルミネセンス、蛍光、電気化学的標識、及びそれらの組合せからなる群から選択することができる。好ましい実施形態では、標識は蛍光色素である。一つの実施形態では、検出には蛍光顕微鏡法が含まれる。
【００１３】
別の態様では、本発明は、以下の段階：曝露後の患者から試料を収集する段階、及び対照試料に対してＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在を検出する段階を含む、遺伝毒性物質に対する患者の曝露によって引き起こされるＤＮＡ損傷の程度を測定する方法を提供する。対照試料に対する病巣形成の違いは、曝露に応答したＤＮＡ損傷の違いを示し、対照試料に対する病巣形成の程度は曝露に応答したＤＮＡ損傷の異なる程度を示す。試料は、末梢血、唾液、尿、擦過細胞、滲出物、口腔試料、喀痰、及び頚部擦過物からなる群から選択することができる。
【００１４】
別の態様では、本発明は、以下の段階：患者から試料を収集する段階、遺伝毒性物質に対して試料又は組織を曝露する段階、及び対照試料に対してＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在を検出する段階を含む、遺伝毒性物質に対する試料の感受性を測定する方法を提供する。対照試料に対する病巣形成の違いは、曝露に応答したＤＮＡ損傷の違いを示し、対照試料に対する病巣形成の程度は薬剤に対する組織の感受性の違いを示す。試料は、生体対象から収集された腫瘍試料であることができる。一つの実施形態では、遺伝毒性物質は、電離放射線又はシスプラチンからなる群から選択することができる。別の実施形態では、試料は生体対象から様々な時点で採取し、遺伝毒性物質に対する試料の感受性の変化をモニターする。
【００１５】
一つの実施形態では、方法はさらに、試料と配列番号１のヒトＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドとを接触させることを含む。リガンドは、検出可能なシグナルをもたらす標識と結合している。一つの実施形態では、リガンドは抗体である。検出可能な標識を抗体に結合させることができる。あるいは、標識は、第１のリガンドに結合する第２のリガンドに結合している。第２のリガンドは抗体であることができる。検出可能な標識は、比色、化学ルミネセンス、蛍光、電気化学的標識、及びそれらの組合せからなる群から選択することができる。好ましい実施形態では、標識は蛍光色素である。一つの実施形態では、検出には蛍光顕微鏡法が含まれる。
【００１６】
本発明の別の態様では、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合した配列番号１のヒトＦＡＣＤ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドはさらに、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合したＦＡＮＣＤ２タンパク質をコードする配列に操作可能に結合した発現制御配列を含むことができる。蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｅＧＦＰ、ｅＹＦＰ、ｅＣＦＰ、ＲＦＰを含む群から選択することができる。
【００１７】
別の態様では、本発明は、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合した配列番号１のヒトＦＡＣＤ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を提供する。ポリヌクレオチドはさらに、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合したＦＡＮＣＤ２タンパク質をコードする配列に操作可能に結合した発現制御配列を含むことができる。蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｅＧＦＰ、ｅＹＦＰ、ｅＣＦＰ、ＲＦＰを含む群から選択することができる。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明は、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合した配列番号１のヒトＦＡＣＤ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチドを発現する細胞を提供する。ポリヌクレオチドはさらに、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合したＦＡＮＣＤ２タンパク質をコードする配列に操作可能に結合した発現制御配列を含むことができる。蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｅＧＦＰ、ｅＹＦＰ、ｅＣＦＰ、ＲＦＰを含む群から選択することができる。
【００１９】
別の態様では、本発明は第２のフルオロフォアをコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合した、病巣形成のときにＦＡＮＣＤ２に結合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。病巣形成のときにＦＡＮＣＤ２に結合するタンパク質をコードする核酸は、ヒストン２ＡＸ、ＢＲＣＡ１、及びＮＢＳ１を含む群から選択することができる。ポリヌクレオチドはさらに、第２のフルオロフォアをコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合した、病巣形成のときにＦＡＮＣＤ２に結合するタンパク質をコードする配列に操作可能に結合した発現制御配列を含むことができる。蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｅＧＦＰ、ｅＹＦＰ、ｅＣＦＰ、ＲＦＰを含む群から選択することができる。ポリヌクレオチドはさらに、タンパク質リンカー配列をコードする配列を含むことができる。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、第２のフルオロフォアをコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合した、病巣形成のときにＦＡＮＣＤ２に結合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を提供する。病巣形成のときにＦＡＮＣＤ２に結合するタンパク質をコードする核酸は、ヒストン２ＡＸ、ＢＲＣＡ１、及びＮＢＳ１を含む群から選択することができる。ポリヌクレオチドはさらに、第２のフルオロフォアをコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合した、病巣形成のときにＦＡＮＣＤ２に結合するタンパク質をコードする配列に操作可能に結合した発現制御配列を含むことができる。蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｅＧＦＰ、ｅＹＦＰ、ｅＣＦＰ、ＲＦＰを含む群から選択することができる。ポリヌクレオチドはさらに、タンパク質リンカー配列をコードする配列を含むことができる。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、第２のフルオロフォアをコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合した、病巣形成のときにＦＡＮＣＤ２に結合するタンパク質をコードするＤＮＡを含む単離されたポリヌクレオチドを発現する細胞を提供する。病巣形成のときにＦＡＮＣＤ２に結合するタンパク質をコードする核酸は、ヒストン２ＡＸ、ＢＲＣＡ１、及びＮＢＳ１を含む群から選択することができる。ポリヌクレオチドはさらに、第２のフルオロフォアをコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合した、病巣形成のときにＦＡＮＣＤ２に結合するタンパク質をコードする配列に操作可能に結合した発現制御配列を含むことができる。蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｅＧＦＰ、ｅＹＦＰ、ｅＣＦＰ、ＲＦＰを含む群から選択することができる。ポリヌクレオチドはさらに、タンパク質リンカー配列をコードする配列を含むことができる。
【００２２】
一つの実施形態では、本発明は、第一の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合した配列番号１のヒトＦＡＣＤ２タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドＤＮＡ配列と、第２の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合した、病巣形成のときにＦＡＮＣＤ２と結合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチドとを発現する細胞を提供する。第２の蛍光タンパク質は、第１の蛍光タンパク質とは異なることが好ましい。ポリヌクレオチドはさらに、タンパク質リンカー配列をコードする配列を含むことができる。ポリヌクレオチドはさらに、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合したタンパク質をコードする配列に操作可能に結合した発現制御配列を含むことができる。蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｅＧＦＰ、ｅＹＦＰ、ｅＣＦＰ、ＲＦＰを含む群から選択することができる。好ましい実施形態では、蛍光タンパク質はｅＣＦＰ及びｅＹＦＰである。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、以下の段階：生物学的試料を試験化合物と接触させる段階、及び対照試料に対するＦＡＮＣＤ２含有病巣におけるＦＡＮＣＤ２の存在を検出する段階を含む、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を変更する試験薬剤をスクリーニングする方法を提供する。対照試料に対する病巣形成の程度の違いは、病巣形成に活性のある薬剤を示す指標である。本方法はさらに、遺伝毒性物質に生物学的試料を曝露することを含むことができる。
【００２４】
一つの実施形態では、本方法はさらに、生物学的試料とＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドとを接触させることを含む。リガンドは、検出可能なシグナルをもたらす標識と結合している。一つの実施形態では、リガンドは抗体である。検出可能な標識を抗体に結合させることができる。あるいは、標識は、第１のリガンドに結合する第２のリガンドに結合している。第２のリガンドは抗体であることができる。検出可能な標識は、比色、化学ルミネセンス、蛍光、電気化学的標識、及びそれらの組合せからなる群から選択することができる。好ましい実施形態では、標識は蛍光色素である。一つの実施形態では、検出には蛍光顕微鏡法が含まれる。
【００２５】
別の態様では、本方法はさらに、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合した配列番号１のヒトＦＡＣＤ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチドを発現する細胞を使用して、病巣形成を検出することを含む。ポリヌクレオチドはさらに、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合したＦＡＮＣＤ２タンパク質をコードする配列に操作可能に結合した発現制御配列を含むことができる。蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｅＧＦＰ、ｅＹＦＰ、ｅＣＦＰ、ＲＦＰを含む群から選択することができる。一つの実施形態では、病巣は蛍光顕微鏡を使用して検出される。
【００２６】
さらに別の実施形態では、本方法は、第一の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合した配列番号１のヒトＦＡＣＤ２タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドＤＮＡ配列と、第２の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合した、病巣形成のときにＦＡＮＣＤ２と結合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチドとを発現する細胞を使用して病巣形成を検出することを含む。第２の蛍光タンパク質は、第１の蛍光タンパク質と異なることが好ましい。ポリヌクレオチドはさらに、タンパク質リンカー配列をコードする配列を含むことができる。ポリヌクレオチドはさらに、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するフレームに融合したタンパク質をコードする配列に操作可能に結合した発現制御配列を含むことができる。蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｅＧＦＰ、ｅＹＦＰ、ｅＣＦＰ、ＲＦＰを含む群から選択することができる。好ましい実施形態では、蛍光タンパク質はｅＣＦＰ及びｅＹＦＰである。別の実施形態では、病巣は蛍光共鳴エネルギー移動を測定して検出される。
【００２７】
別の態様では、本発明は、遺伝毒性物質によって引き起こされる障害から生体対象を防御する方法を提供し、本方法は、参照又は対照と比較したときに生体対象においてＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成が促進されるように、生体対象に治療有効量のＦＡＮＣＤ２含有病巣形成促進物質を投与することを含む。一つの実施形態では、促進物質にはデスフェリオキサミンが含まれる。
【００２８】
さらに別の態様では、本発明は、ＦＡＮＣＤ２ポリペプチドのモノユビキチン化形態に結合する抗体を提供する。好ましくは、抗体はＦＡＮＣＤ２ポリペプチドのモノユビキチン化形態には結合するが、非ユビキチン化形態には結合しない。抗体はポリクローナルであってよい。あるいは、抗体はモノクローナルであってよい。
【００２９】
別の態様では、本発明は、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化形態に結合する抗体及びパッケージング材料を含む、生体対象の試料中のＦＡＮＣＤ２含有病巣の有無を検出するためのキットを提供する。キットはさらに蛍光標識された第２の抗体を含み、第２の抗体は第１の抗体に結合する。
【００３０】
本発明のその他の態様及び利点は、好ましい実施形態の以下の詳細な説明でさらに説明される。
【００３１】
詳細な説明
本発明は、遺伝毒性物質に対する曝露に応答してＦＡＮＣＤ２含有病巣が細胞内に形成されるという観察に基づいている。したがって、生体対象の試料におけるＦＡＮＣＤ２含有病巣の検出は、このような遺伝毒性物質に対する対象の曝露を測定するために使用することができる。
【００３２】
特許請求の範囲に記載する発明の主題をより明らかに、かつより簡潔に説明し、指摘するために、以下に記載した説明及び添付のクレームで使用した特定の用語について以下の定義が与えられる。
【００３３】
定義
「遺伝毒性物質」または「遺伝子毒物」とは、細胞に適用したときＤＮＡ損傷を引き起こす任意の化合物または処理方法のことである。このような薬剤は、化学物質または放射性物質であってよい。遺伝毒性物質とは、第１の生物学的活性がＤＮＡにおいてコードされた情報の変更である化学物質（または代謝物）である。遺伝毒性物質は、その作用機構が様々であり、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、ニトロソグアニン、及び塩化ビニルなどのアルキル化剤；ベンゾ（ａ）ピレン及びアフラトキシンＢ１などのかさ高い付加生成物；スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカルなどの活性酸素種；５−ブロモウラシルなどの塩基類縁体；アクリジンオレンジ及び臭化エチジウムなどの挿入剤を含むことができる。「化学療法剤」とも呼ばれる様々な化合物は、ＤＮＡ損傷を引き起こす作用を持つ。使用を企図する化学療法剤には、たとえば、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、及び過酸化水素もまた含まれる。「遺伝毒性物質」にはまた、γ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子照射などのＤＮＡ損傷を引き起こす放射線及び波が含まれる。さらに間接的遺伝毒性物質と呼ばれることがあるある種の化学物質は、通常の代謝酵素によって遺伝毒性物質に変換されうる。本明細書では、遺伝毒性物質とは、直接的及び間接的遺伝毒性物質のことである。遺伝毒性物質はＤＮＡに変異を引き起こし、癌の原因となり得る。「遺伝毒性物質」という用語はまた、放射線ベースにせよ、実際の化合物にせよ、１種又は複数のＤＮＡ損傷剤の組合せの使用を包含する。
【００３４】
遺伝毒性物質は種々多様なので、遺伝毒性物質への曝露は非常に様々な形態になる。化学的遺伝毒性物質に対する曝露機構には、直接的な接触、または対象による吸入が含まれうる。放射線の場合は、曝露は電離放射線源に近接することによって発生しうる。これらの遺伝毒性物質に対する曝露の性質はまた、様々でありうる。化学療法及び放射線療法の場合のように、曝露は計画的に行うことができるが、偶発的に行われる可能性もある。偶発的な曝露の例には、実験室、工場若しくは農場での化学物質に対する職業的な曝露、又は原子力発電所、診療所、研究室で、若しくは頻繁な空路移動による電離放射線に対する職業的な曝露が含まれうる。
【００３５】
本明細書では、「ＤＮＡ損傷」とは、メチル化、アルキル化による２本鎖切断、架橋結合、紫外線によって生じるチミジン２量体、及びＤＮＡ塩基に結合する酸素ラジカルによって形成される酸化的損傷を含む、細胞内のＤＮＡの化学的及び／又は物理的改変のことである。
【００３６】
タンパク質の「リガンド」には、基質、及びタンパク質に結合するその他の化合物が含まれる。一つの実施形態では、「リガンド」はＦＡＮＣＤ２に結合する抗体である。本明細書では、「ＦＡＮＣＤ２に対する抗体」または「ＦＡＮＣＤ２に結合する抗体」とは、ＦＡＮＣＤ２に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子のことである。抗体は、天然材料若しくは組換え材料から得られる完全な免疫グロブリン、又は完全な免疫グロブリンの免疫反応部分でありうる。抗体は一般的に、免疫グロブリン分子の４量体である。本発明における抗体は、たとえば、高親和性ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、人工抗体、キメラ抗体、組換え抗体、及びヒト化抗体を含む様々な形態で存在する。このような抗体は、免疫グロブリンの種類、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥから生じる。抗体という用語にはまた、組換えＤＮＡ技術を使用して作製された人工抗体、たとえば、バクテリオファージによって発現される抗体が含まれる。一つの実施形態では、望ましいリガンドは、たとえば実施例１に詳細に説明したように、モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２に結合するモノクローナル抗体である。その他のこのような抗体には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’若しくはＦ（ａｂ’）２、又はＦＡＮＣＤ２に結合するそれらのＦｅ抗体断片が含まれる。本発明はまた、ＦＡＮＣＤ２に結合する１本鎖Ｆｖ抗体断片であるリガンドを提供する。
【００３７】
他の有用な「リガンド」は、抗体の相補性決定領域を含む組換え構造物、人工抗体、又はＦＡＮＣＤ２に結合する抗体の機能的に同等な結合特性を保持するために十分なＣＤＲを共有するキメラ抗体構造物である。
【００３８】
「抗体」という用語には、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成した抗体が含まれ、このＤＮＡ分子は抗体タンパク質または抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当技術分野において利用可能でよく知られている合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られた。
【００３９】
本明細書では、「免疫学的方法」とは、限定はしないが、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ＦＡＣＳ分析、免疫蛍光顕微鏡法、免疫組織化学、及び直接競合ＥＬＩＳＡ、及びＲＩＡ技術（Ｈａｒｌｏｗら、１９８９、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓａｍｂｒｏｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を含む、当技術分野でよく知られた抗体をベースとした検出技術を含む任意の測定法を意味する。
【００４０】
本明細書では、「対象」とは、ヒト、ウシ、マウス、ラット、ブタ、及びヒツジを含む哺乳類を含む動物を意味する。対象は、任意の年齢又は発達段階であってよい。さらに、対象は、健康であるか、病気であるか、またはゲノム内に変異を含んでいてよい。対象はまた、遺伝毒性物質、治療薬、または試験薬に対して既に曝露されていてよい。さらに、非ヒト対象はさらに、トランスジェニック動物を含みうる。特に、対象は、生物の遺伝毒性物質に対する感受性を変更する導入遺伝子または変異を有しうる。
【００４１】
「試料」とは、任意の細胞若しくは組織、又は細胞若しくは組織を含有する組成物、又は対象から得られる単離物を意味する。試料は、心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、または結腸から得ることができる。遺伝毒性物質、たとえば、放射線、化学物質などに曝露した対象におけるＤＮＡ損傷の有無の検出に使用するための別の種類の生物学的試料は、白血球細胞を含有する調製物、たとえば、末梢血、喀痰、唾液、尿などであってよい。
【００４２】
本発明の第１の態様で使用されるように、「対照試料」とは、対照試料が遺伝毒性物質に対して曝露されていないこと以外は、比較する試料と同様の方法で単離された試料のことである。
【００４３】
本明細書では、「参照試料」とは、既知の量の同じ遺伝毒性物質に曝露され、比較する試料と同様の方法で単離された、試験対象とは異なる対象から得られた試料のことである。参照試料の対象は、試験対象と遺伝的に同一であるか、又は異なっていてよい。さらに、参照試料は既知の量の同じ遺伝毒性物質に曝露された、いくつかの対象から得ることができる。
【００４４】
「病巣形成の違い」とは、試験試料を対象試料または参照試料と比較したときの、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の数、大きさ、若しくは残存率の増加または減少を意味する。違いには、対照または参照試料と比較して、２倍以上または２倍以下の、たとえば、５、１０、２０、１００、１０００倍以上の増加または減少が含まれる。違いにはまた、対照または参照試料と比較して、５％以上または５％以下の、たとえば、１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、１００％以上の増加または減少が含まれる。
【００４５】
本明細書では、「低濃度」の遺伝毒性物質に対する曝露とは、生物学的試料においてＦＡＮＣＤ２含有病巣の最大数のわずか２０％を引き起こす特定の遺伝毒性物質の用量に対する曝露を意味する。試料を曝露することができる遺伝毒性物質は多数あり、このような遺伝毒性物質に対する種々の試料の感受性は様々なので、特定の遺伝毒性物質の絶対用量よりも、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成に対する用量で表現した方が好ましい。
【００４６】
本明細書では、「ＦＡＮＣＤ２含有病巣」とは、電離放射線またはアルキル化剤などの遺伝毒性物質に対して曝露したときに細胞の核内に形成されるＦＡＮＣＤ２を含むタンパク質複合体である。ＦＡＮＣＤ２含有病巣はまた、ヒストン２ＡＸ、ＢＲＣＡ１、ＲＡＤ５１、ＢＲＣＡ２、及びＮＢＳ１を含むその他のいくつかのＤＮＡ損傷応答タンパク質を含みうる。最近の研究では、電離放射線によって誘導される病巣では、ヒストン２ＡＸタンパク質がはじめに病巣に入り、次にＢＲＣＡ１及びＮＢＳ１、次いでＦＡＮＣＤ２が入ることが示唆されている。病巣形成の相対速度、病巣の残存期間、及び病巣の構成（すなわち、どのタンパク質がＦＡＮＣＤ２と相互作用するか）は、様々な種類の遺伝毒性ストレス（すなわち、ＩＲ対アルキル化剤対架橋結合ストレス）と相関関係にある可能性がある。
【００４７】
本明細書では、「ＦＡＮＣＤ２含有病巣と結合するタンパク質」とは、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成時に特異的にＦＡＮＣＤ２と結合するタンパク質のことである。これらのタンパク質は、ＢＲＣＡ１及びＮＢＳ１タンパク質を含み、ＦＡＮＣＤ２含有病巣においてＦＡＮＣＤ２と相互作用し、ＤＮＡ損傷時に形成される。現時点では、これらのタンパク質間の結合相互作用の性質についてはほとんどわかっていない。これらのタンパク質の多くは、媒介タンパク質及び翻訳後修飾によって、間接的に結合することができる。
【００４８】
「ＦＡＮＣＤ２含有病巣の検出」とは、ＦＡＮＣＤ２を含有する病巣内のＦＡＮＣＤ２の検出を意味する。ＦＡＮＣＤ２は、病巣内で結合する前にモノユビキチン化される。したがって、ＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドを使用して病巣を免疫蛍光法によって検出することを含む免疫学的方法に加えて、「ＦＡＮＣＤ２含有病巣の検出」には、免疫学的方法を使用して、モノユビキチン化形態のＦＡＮＣＤ２に特異的に結合するが、非ユビキチン化形態には結合しないリガンドを使用して、試料の抽出物中のモノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２を検出することが含まれる。最後に、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の検出はまた、検出可能な標識と結合したＦＡＮＣＤ２タンパク質、たとえば、蛍光タンパク質と融合したＦＡＮＣＤ２を使用して、ＦＡＮＣＤ２含有病巣内のＦＡＮＣＤ２を検出することを含みうる。ＦＡＮＣＤ２含有病巣は、遺伝毒性ストレスに曝露して３０分後という早期に検出することができる。しかし、ＦＡＮＣＤ２病巣は、曝露後８時間と２４時間との間で最大に達するようである。
【００４９】
本明細書では、対象の遺伝毒性物質に対する「感受性」とは、定義された用量の遺伝毒性物質に対する個々の対象の応答を意味する。特定の期間中、正常な対象と比較して、対象のＤＮＡが損傷に対して少なくとも５０％を上回る、たとえば、５５％、６０％、７５％、１００％の感受性であるとき、又は特定の期間中、損傷に対して２倍以上、たとえば、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、若しくは１０００倍を上回る感受性であるとき、対象は遺伝毒性物質に対して感受性であると考えられる。ＤＮＡ損傷は、変異、２本鎖切断の数に関して、又はその他の当技術分野で既知の手段によって測定することができる。
【００５０】
「病巣形成の程度」とは、試料中のＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成の総数または速度を意味する。病巣形成の程度は、１つの試料から別の試料へと、たとえば、細胞総数、完全な核の総数、試料の全量、又は試料の総質量に正規化することができる。本明細書では、核内における明瞭な病巣が５個より多ければ、細胞核は、「ＦＡＮＣＤ２含有病巣について陽性」と考えられる。
【００５１】
本明細書では、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を「変更する」とは、生物学的試料中のＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成の変化または変更を意味する。変更は、生物学的試料中の病巣の数、大きさ、若しくは残存率の増加または減少であってよく、対照または参照試料と比較して、２倍以上または２倍以下の、たとえば、５、１０、２０、１００、１０００倍以上の増加または減少が含まれる。変更はまた、対照または参照試料と比較して、５％以上または５％以下の、たとえば、１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、１００％以上の増加または減少であってよい。
【００５２】
「モジュレーター」とは、生体高分子（たとえば、核酸、タンパク質、非ペプチド、若しくは有機分子）などの（天然または非天然の）化合物、又は細菌、植物、真菌、若しくは動物（特に哺乳類）細胞若しくは組織などの生物学的材料から生じた抽出物、又は無機元素若しくは分子のことである。モジュレーターは、本明細書で説明したスクリーニング測定法に含めることによって、生物学的プロセスまたはプロセス群の（直接的または間接的）阻害剤若しくは活性化剤（たとえば、作動薬、部分的拮抗薬、部分的作動薬、拮抗薬、抗悪性腫瘍薬、細胞毒性剤、新生物転移若しくは細胞増殖の阻害剤、細胞増殖促進剤など）としての潜在的活性について評価される。モジュレーターの活性は、既知であるか、未知であるか、又は部分的に既知であってよい。このようなモジュレーターは、本明細書で説明した方法を使用してスクリーニングすることができる。
【００５３】
「モジュレーター候補」という用語は、本発明の１種又は複数のスクリーニング法によって推定モジュレーターとして試験される化合物のことである。通常、以下により完全に説明するように、０．０１μＭ、０．１μＭ、１．０μＭ、及び１０．０μＭなどの様々なあらかじめ決定された濃度がスクリーニングのために使用される。試験化合物対照は、試験化合物なしでのシグナルの測定、又は標的を変更することが知られている化合物に対する比較を含みうる。
【００５４】
本明細書では、ＦＡＮＣＤ２含有病巣形成の「促進剤」とは、生体対象または生物学的試料中におけるＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成の増加を引き起こす化合物のことである。促進は、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の数、大きさ、または残存率の増加であってよく、対照または参照と比較して、２倍以上、たとえば、２、５、１０、２０、１００、１０００倍以上の増加を含む。促進はまた、対照または参照と比較して、５％以上、たとえば、５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、１００％以上の増加であってよい。
【００５５】
本明細書では、ＦＡＮＣＤ２含有病巣形成の「阻害剤」とは、生体対象または生物学的試料中におけるＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成の減少を引き起こす化合物のことである。阻害は、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の数、大きさ、または残存率の減少であってよく、対照または参照と比較して、２倍以上、たとえば、２、５、１０、２０、１００、１０００倍以上の減少を含む。阻害はまた、対照または参照と比較して、５％以上、たとえば、５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、または１００％までの減少であってよい。
【００５６】
「融合タンパク質」は、少なくとも２つのポリペプチド領域、及び、場合によって、１つの連続したポリペプチドに２つのポリペプチドを操作可能に結合させる結合ペプチドを含有するタンパク質である。融合タンパク質中の少なくとも２つのポリペプチド領域は異なる材料から得られ、したがって、融合タンパク質は通常天然では結合しない２つのポリペプチド領域を含む。この少なくとも２つのポリペプチドは、いかなる順番でも結合することができる。
【００５７】
「結合配列（または結合ペプチド）」は、ペプチド結合を介して結合した１つ又は複数のアミノ酸残基を含有する。結合配列は、融合タンパク質において、結合配列とポリペプチド領域のそれぞれとの間のペプチド結合を介して異なる材料からの２つのポリペプチド領域を結合するために役立つ。好ましくは、結合配列の長さは、アミノ酸の長さが１個と２０個との間、より好ましくはアミノ酸の長さが３個と１０個との間である。
【００５８】
一般的に、融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含有する組換え宿主細胞において連続したポリペプチドとして合成され、融合タンパク質の異なる領域がリンカーペプチドのコード配列のいずれかの側でフレームに融合している。（融合タンパク質をコードする）キメラコード配列は、組換え宿主細胞において機能する（一般的に発現ベクターによってもたらされる）発現制御配列に操作可能に結合している。
【００５９】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、適切な宿主においてＤＮＡの発現を実施することができる適切な制御配列に操作可能に結合したＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物のことである。このような制御配列は、転写を実施するプロモーター、このような転写を制御する任意選択のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終止を制御する配列を含む。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または単に潜在的ゲノム挿入物であってよい。一旦適切な宿主に形質転換されると、ベクターは複製し、宿主ゲノムと独立して機能することができるか、又は、場合によっては、ゲノム自体に組み込まれうる。プラスミドは現在最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、本明細書では「プラスミド」及び「ベクター」は、時々同義に使用される。しかし、本発明には、同等の機能を果たし、当技術分野で既知の、または既知になるその他の形態の発現ベクターが含まれるものとする。
【００６０】
「操作可能に結合した」とは、連結されるコード配列及び非コード配列の発現を実施するために必要なポリヌクレオチド配列のことである。このような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物では、このような制御配列は一般的にプロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含み、真核生物では、一般的にこのような制御配列はプロモーター及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現に影響を及ぼすことができる成分を最小限含み、また、存在すると有利な他の成分、たとえば、リーダー配列及び融合相手の配列を含みうるものとする。
【００６１】
本明細書では、「医薬組成物」には薬理学的有効量のＦＡＮＣＤ２含有病巣形成のモジュレーター及び医薬上許容される担体が含まれる。本明細書では、「薬理学的有効量」、「治療有効量」、または単に「有効量」とは、企図した薬理学的、治療的、または予防的結果を生じるために有効なＦＡＮＣＤ２含有病巣形成モジュレーターの量を意味する。たとえば、所与の臨床治療が病巣形成において少なくとも２５％の促進があるときに有効と考えられるならば、治療有効量とはパラメーターにおいて少なくとも２５％の減少をもたらすために必要な量である。
【００６２】
「医薬上許容されうる担体」という用語は、治療薬を投与するための担体のことである。このような担体には、限定はしないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組合せが含まれる。この用語は、細胞培養培地を明確に除外する。経口的に薬剤を投与する場合、医薬上許容されうる担体には、限定はしないが、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤沢剤、甘味剤、矯味剤、着色剤、及び保存剤などの医薬上許容されうる添加剤が含まれる。適切な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウム及び炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム、並びにラクトースが含まれ、一方、コーンスターチ及びアルギン酸は適切な崩壊剤である。結合剤には、デンプン及びゼラチンが含まれ、一方、潤沢剤は（存在するならば）一般的にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又はタルクである。所望するならば、錠剤は、胃腸管での吸収を送らせるためにモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの物質でコーティングすることができる。
【００６３】
「医薬上許容されうる塩」とは、酸付加塩及び塩基付加塩の両方のことである。これらの塩の性質は、医薬上許容されうるならば重要ではない。酸付加塩の例には、限定はしないが、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、リン酸、ギ酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、シュウ酸、リンゴ酸、グルタミン酸、プロピオン酸、グリコール酸、グルコン酸、マレイン酸、エンボニン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、パントテン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、メシル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルゲン酸、β−ヒドロキシ酪酸、マロン酸、ガラクタル酸、ガラクツロン酸などが含まれる。適切な医薬上許容されうる塩基付加塩には、限定はしないが、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、及び亜鉛から生成される金属塩、またはＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、リジン、プロカインなどから生成される有機塩が含まれる。医薬上許容されうる塩の他の例は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：２に挙げられている。これらの塩はすべて、従来の手段によって、化合物を適切な酸または塩基で処理することによってＦＡＮＣＤ２含有病巣のモジュレーターから調製することができる。
【００６４】
ＦＡＮＣＤ２病巣
ＤＮＡ損傷に対する細胞応答は、細胞周期のチェックポイント、ＤＮＡ修復、及びアポトーシスを媒介する経路が複雑に相互作用するネットワークである。これらの経路を調べるためのモデル障害は、迅速に細胞周期のチェックポイントを誘導し、いくつかの異なる経路によって修復されるＤＮＡ２本鎖切断であった。哺乳動物細胞では、相同組換え及び非相同組換え経路の両方が利用される。哺乳動物細胞における詳細な研究によって、ＤＮＡ修復及び細胞周期チェックポイントタンパク質の複合体が電離放射線によって誘導された２本鎖切断部位に迅速に局在化することが示された。これらのタンパク質は、免疫蛍光分析によって検出できる病巣を生じる。
【００６５】
ファンコニ貧血症相補群Ｄ２（ＦＡＮＣＤ２）は、染色体の安定性及び修復に関与するタンパク質複合体の成分である。ファンコニ貧血症（ＦＡ）は、一部には、様々な癌の個人的な危険性を増大させるＤＮＡ修復機構欠損を特徴とする遺伝性疾患である。ＤＮＡ損傷に応答して、ＦＡ複合体はＦＡＮＣＤ２を活性化し、次にＢＲＣＡ１と結合する。ＦＡＮＣＤ２の活性化は、セリン２２２残基のＡＴＭキナーゼによるリン酸化によって生じる。さらに、ＦＡ経路による活性化は、ＦＡＮＣＤ２のリジン５６１のモノユビキチン化によって生じる。非修飾型では、ＦＡＮＣＤ２は核全体に拡散して存在する。ユビキチン化されると、ＦＡＮＣＤ２は核内に点または病巣を形成する。ＦＡＮＣＤ２のユビキチン化及びその後の核病巣の形成は、ＤＮＡ損傷に応答して生じる。共免疫沈降によって、Ｎａｋａｎｉｓｈｉら（２００２）は、ＦＡＮＣＤ２とＮＢＳ１との間に構造的な相互関係を発見し、これらのタンパク質がＳ期チェックポイント及びマイトマイシンＣ誘導性染色体損傷に対する耐性を媒介するために２種類の異なる集合体で相互作用する証拠を提供した。
【００６６】
少なくとも２種類の電離放射線誘導性病巣が認められ、１つはＲａｄ５１、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２タンパク質を含有し、もう１つはＭｒｅ１１−Ｒａｄ５０−ＮＢＳ１複合体を含有する。Ｒａｄ５１病巣は、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２を含有し、ＤＮＡ損傷の外因的誘導がなくてもＳ期中に出現する。
【００６７】
Ｍｒｅ１１−Ｒａｄ５０−ＮＢＳ１病巣は、照射後１０分という早期に検出することができ、ＤＮＡ修復の進行中、ＤＮＡ切断部位に明らかに存在する。これらの病巣はまた、おそらくヒトＲａｄ５０（ｈＲａｄ５０）と物理的に相互作用することによって、それらの形成に必要であることが示されたＢＲＣＡ１タンパク質と一緒に局在する。さらに、ＢＲＣＡ１と共に実施した共免疫沈降実験によって、この複合体（ＢＲＣＡ１結合監視複合体と呼ばれる）には多数の他のタンパク質が存在することが示された。これらは、ミスマッチ修復タンパク質Ｍｓｈ２、Ｍｓｈ６、及びＭｌｈ１、チェックポイントキナーゼＡＴＭ、ブルーム症候群遺伝子の産物ＢＬＭ、及び複製因子Ｃを含む。ＢＲＣＡ１、ＮＢＳ１、及びｈＭｒｅ１１はいずれも、ＡＴＭキナーゼの基質であり、ＤＮＡ切断の存在に応答してリン酸化されるようになることが示された。
【００６８】
本発明は、遺伝毒性物質型に曝露した細胞はＦＡＮＣＤ２含有病巣を形成するという発見に関連する。ＤＮＡ損傷に応答して核病巣（ＩＲＩＦ（電離放射線誘導性病巣）とも呼ばれる）を形成する多数のＤＮＡ損傷応答タンパク質が現在同定されている。
【００６９】
遺伝毒性物質に応答した用量及び時間依存性病巣形成
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究によって、（０．５から５Ｇｙの範囲の）電離放射線に対する細胞の曝露はＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化及び病巣形成の用量依存的増加を生じることが示される。病巣は、ＩＲ曝露後３０分という早期に検出することができ、病巣のピークは曝露後８時間と２４時間との間で認められる。病巣形成は、シスプラチン及びマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）などの毒物に対する細胞曝露後では（このＩＲ応答と比較して）遅くなる。この遅延はおそらく、これらの薬剤の取り込みが遅いこと、及びＤＮＡが実際に損傷を受ける前に代謝活性化が必要であることの反映であろう。重要なのは、これらの研究がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われたことである。
【００７０】
本発明によるリガンド
本発明に有用なリガンドには、ＦＡＮＣＤ２に結合する抗体が含まれる。ＦＡＮＣＤ２に結合する抗体は記載されている（米国特許出願公開番号第２００３００９３８１９Ａ１、Ｇａｒｃｉａ−Ｈｉｇｕｅｒａら、２００１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．７：２４９〜６２）。あるいは、ＦＡＮＣＤ２に結合する抗体は、本発明の抗原として、単離された、組換え、若しくは変更ＦＡＮＣＤ２、又はそれらの断片を使用して、従来の方法によって生成することができる。たとえば、ポリクローナル抗体は、選択された動物またはヒトの免疫系をＦＡＮＣＤ２抗原で従来の方法を用いて刺激し、免疫系がそれに対する天然抗体を産生することを可能にし、動物又はヒトの血液若しくはその他の生体液からこれらの抗体を収集することによって生成される。好ましくは、組換え型ＦＡＮＣＤ２を免疫原として使用する。ＦＡＮＣＤ２に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）はまた、従来の方法を用いて生成される。所望するＭＡｂを発現するハイブリドーマ細胞系は、よく知られた従来技術、たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びその多くの既知の変法によって生成される。同様に所望される高力価抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルに既知の組換え技術を適用することによって生成される。（たとえば、ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２；イギリス特許出願公開番号ＧＢ２１８８６３  ８Ａ；Ａｍｉｔら、１９８６  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３：７４７〜７５３；Ｑｕｅｅｎら、１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１００２９〜１００３３；ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／Ｗ０９００７８６１；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｈｕｓｅら、１９８８ａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５〜１２８１を参照のこと）。
【００７１】
本明細書に含まれる開示を考えれば、当業者は当技術分野で既知の技術、たとえば、本発明の抗原に対する動物またはヒトの抗体の相補的な決定領域を操作することによって、ＦＡＮＣＤ２に対するリガンドまたは抗体を作製する。たとえば、Ｅ．Ｍａｒｋ  ａｎｄ  Ｐａｄｌｉｎ、「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、４章、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１１３巻、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９４年６月）；Ｈａｒｌｏｗら、１９９９、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗら、１９８９、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３；及びＢｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６を参照のこと。
【００７２】
あるいは、ＦＡＮＣＤ２抗原を多抗原複合体として集合させ（たとえば、１９８９年１１月２日に公開された欧州特許出願０３３９６９５を参照のこと）、ＦＡＮＣＤ２に結合することができる高力価抗体を誘導するために使用する。本発明はまた、抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）及び抗抗イディオタイプ抗体（Ａｂ３）を提供する。Ａｂ２は、本発明の抗ＦＡＮＣＤ２抗体が結合する標的に特異的で、結合特異性及び生物学的活性がＦＡＮＣＤ２抗体と同様である（たとえば、Ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｊ．Ｃｅｒｎｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈｉｅｒｎａｕｘ編、１９９０  Ｊ４１７７．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ：ｐｐ．２０３〜２２９のＭ．Ｗｅｔｔｅｎｄｏｒｆｆら、「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．」を参照のこと）。これらの抗イディオタイプ抗体及び抗抗イディオタイプ抗体は、当業者によく知られた技術を使用して生成される。このような抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）は、ＦＡＮＣＤ２の内部状態（internal image）を有することができ、したがって、ＦＡＮＣＤ２と同様の目的のために有用である。
【００７３】
一般的に、ポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、及び抗原としてのＦＡＮＣＤ２に結合するその他の抗体（Ａｂ１）は、（たとえば、クロマトグラフィーカラムなどにおいて）生体組織の妨害物質からＦＡＮＣＤ２及びその類縁体を分離するため、並びに、一般的に研究手段として、及び前述のその他の種類の抗体を開発するために必須の出発物質として、ＦＡＮＣＤ２のエピトープを同定するために有用である。抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）は、同一の標的に結合するために有用で、したがってＦＡＮＣＤ２の有用なリガンドを誘発するためにＦＡＮＣＤ２の代わりに使用される。Ａｂ３抗体は、Ａｂ１が有用であるのと同じ理由で有用である。研究手段として、および、たとえばその他の妨害物質からＦＡＮＣＤ２を分離するための成分としてのその他の用途もまた、前述の抗体について企図される。
【００７４】
モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２に特異的に結合する抗体
ＦＡＮＣＤ２タンパク質の細胞全体の濃度は、ＤＮＡ損傷に応答して有意には変化しない。むしろ、ＤＮＡ損傷によってＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化並びにＦＡＮＣＤ２含有病巣の漸増が引き起こされる。ＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在を測定する代わりに、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化形態には特異的に結合するが、非ユビキチン化形態には結合しないリガンドを使用することは、当業者であれば理解するだろう。モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２の存在を検出するために、リガンドを前述の検出可能な標識と結合させることが好ましい。このようなリガンドを使用する主な利点は、当業者には理解されるように、損傷を受けていないＤＮＡを有する細胞におけるモノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２の基準濃度は一般的に低いため、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の濃度は、代理マーカーとしてモノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２の濃度を使用して、免疫蛍光顕微鏡法に追加的手段を加えて、生体対象から採取した試料において測定することができる。ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化形態（ＦＡＮＣＤ２−Ｌ）を特異的に認識する抗体は、迅速な診断薬としてかなり有用である。たとえば、この抗体は以下のために使用できる。
【００７５】
１）免疫組織化学（ＩＨ）。この抗体は、固形腫瘍（たとえば、乳癌、卵巣癌、肺癌）から調製した組織切片を調べるために使用することができる。ＩＨによる陽性シグナルは、この腫瘍がシスプラチン及び関連薬剤に耐性であることを予測するだろう。
【００７６】
２）ＦＡＣＳ分析。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、この抗体でスクリーニングすることができる。陽性シグナルは、個体が最近ＩＲまたは毒素に曝露したことと一致する活性化ＦＡＮＣＤ２の存在を示す。したがって、この抗体は、本明細書で説明した放射線線量計測定法の有用な応用範囲である。
【００７７】
３）精製ＦＡ複合体の阻害剤（モノユビキチンリガーゼ）をスクリーニングするためのハイスループット測定法。これらの阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＦＡＮＣＤ２をモノユビキチン化するＦＡ複合体の能力を阻止する。新規モノクローナル抗体は、最終生成物検出に有用な試薬である。モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２を特異的に認識するリガンドを使用したＦＡＮＣＤ２含有病巣の他の測定方法には、生体対象から収集した試料の抽出物を使用したイムノブロット分析または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、またはＦＡＣＳ分析（Ｈａｒｌｏｗら、１９９９、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）が含まれる。
【００７８】
ＩＲ曝露の高感度の基準となるのは、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化の増加である。損傷を受けていない細胞において、ＦＡＮＣＤ２−Ｓ（非ユビキチン化アイソフォーム）に対するＦＡＮＣＤ２−Ｌ（モノユビキチン化アイソフォーム）の比（Ｌ／Ｓ）は、約０．５〜０．６である。この比は、ウェスタンブロットで、Ｓバンドに対するＬバンドの濃度を比較することによって容易に計算される。ＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化の増加及びＩＲ曝露の高感度の指標となるのは、Ｌ／Ｓ比の１．０以上への変換である。
【００７９】
本発明に有用な検出可能な標識
本発明による有用な検出可能な標識は、放射活性、酵素、比色、化学ルミネセンス、蛍光、電気化学的標識、及びそれらの組合せからなる群から選択される。この態様の好ましい実施形態では、検出可能な標識は蛍光化合物である。特に好ましい実施形態では、検出可能な標識は、フルオレセイン、ローダミン、ボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）、シアニン、アレキサ、ナフトフルオレセイン、オレゴングリーン、クマリン、ダンシル、テキサスレッド、ピレン、カスケードブルー、及びアレキサ３５０、並びにそれらの誘導体からなる群から選択される。ある実施形態では、蛍光タンパク質を使用することができる。たとえば、バイオルミネセンスにおいてエネルギー移動受容体として作用する刺胞動物の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を本発明で使用することができる。本明細書では、緑色蛍光タンパク質は、緑色の蛍光を放つタンパク質であり、青色蛍光タンパク質は、青色の蛍光を放つタンパク質である。ＧＦＰは、米太平洋岸北西地区のクラゲ、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ、ウミシイタケ、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｊｆｏｒｍｉｓ、及びＰｈｉａｌｉｄｉｕｍ  ｇｒｅｇａｒｉｕｍから単離された（Ｗａｒｄら、１９８２、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３５：８０３〜８０８；Ｌｅｖｉｎｅら、１９８２、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７２Ｂ：７７〜８５）。
【００８０】
好ましい蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は改変ＧＦＰである。野生型ＧＦＰは、当技術分野で長く使用されてきた。緑色蛍光タンパク質を出発物質として、野生型ＧＦＰと比較してスペクトル特性が改変または増強された多くの改変種が得られた。たとえば、米国特許第５６２５０４８号、国際公開番号ＷＯ９７／２８２６１、国際公開番号ＷＯ９６／２３８１０を参照のこと。Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている改変ＧＦＰ  Ｗ１Ｂ及びＴＯＰＡＺが有用である。Ｗ１Ｂは、野生型ＧＦＰ配列から以下の変更、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ、Ｙ６６Ｗ７  Ｎ１４６１、Ｍ１５３Ｔ、及びＶ１６３Ａ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９〜５４４、１９９８、Ｔｓｉｅｎの５１９ページ、表１を参照のこと）を含む。ＴＯＰＡＺは、野生型ＧＦＰ配列から以下の変更、Ｓ６５Ｇ、Ｖ６８Ｌ、Ｓ７２Ａ、及びＴ２０３Ｙ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９〜５４４、１９９８、Ｔｓｉｅｎの５１９ページ、表１を参照のこと）を含む。ＧＦＰの野生型ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、国際公開番号ＷＯ９７／２８２６１の図１及び配列番号１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９〜５４４、１９９８、Ｔｓｉｅｎの図１、及びＰｒａｓｈｅｒら、１９９２、Ｇｅｎｅ  １１１：２２９に示されている。ＦＲＥＴをベースにしたスクリーニング測定法で蛍光タンパク質を使用するにあたり特に興味深いのは、Ｃｙａｎ  ＦＰ（ＣＦＰ、供与体（Ｄ））及びＹｅｌｌｏｗ  ＦＰ（ＹＦＰ、受容体（Ａ））として既知のＡ．Ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＧＦＰの変種である。一例として、ＹＦＰ変種は、ＦＡＮＣＤ２ポリペプチドとの融合タンパク質として生成されうる。融合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）並びにフルオロフォア標識化合物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）としてのＧＦＰ変種を発現するためのベクターは、当技術分野で既知である。哺乳動物細胞でＧＦＰを発現するときには、哺乳動物細胞によって好まれる２０個のコドンに一致する改変コドンを有するＧＦＰの変種を構築すると有利である（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６、７０：４６４６〜４６７５４；Ｙａｎｇら、１９９６、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２４：４５９２〜４５９３）。哺乳動物細胞においてＧＦＰ発現を改善する別の方法は、開始メチオニンの直後にさらなるコドンを使用することによって最適なリボソーム結合部位を提供することである（Ｃｒａｒｎｅｌｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３１５〜３１９）。
【００８１】
本発明による診断方法
本発明の診断方法には、生体対象から採取した試料を、好ましくは顕微鏡スライドなどの表面に固定するかまたは定着させて、ヒトＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドと接触させることが含まれる。このようなリガンドは前記に詳細に述べられており、シグナルをもたらす検出可能な標識と結合していることが好ましい。次に、試料の細胞内でＦＡＮＣＤ２の核内病巣内に濃縮されたシグナルの存在を調べる。次に、免疫蛍光顕微鏡を使用して、試料中のＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在を検出する。一つの実施形態では、ＦＡＮＣＤ２含有病巣は、ＦＡＮＣＤ２に結合する一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態では、ＦＡＮＣＤ２含有病巣は、ＦＡＮＣＤ２に結合する一次抗体に結合する２次抗体または試薬上の標識を検出することによって検出される。試料中にＦＡＮＣＤ２含有病巣が存在すれば、対象が遺伝毒性物質に曝露したことが示され、一方、拡散したシグナルが存在すれば、試料中にＤＮＡ損傷がないことが示される。さらに、対照試料と比較した試料内のＦＡＮＣＤ２含有病巣の数、大きさ、及び残存率は、細胞が保持するＤＮＡ損傷の量と正比例する。毒素または放射線曝露を定量する最良の方法は、５個以上の明瞭な病巣を有する細胞の割合の増加を測定することである。したがって、（曝露されていない）成人ヒト対照の末梢血リンパ球の集団において病巣陽性細胞（すなわち、１細胞当たりのＦＡＮＣＤ２病巣が５個を上回る細胞）はわずか１〜２％である。放射線曝露後、用量及びＸ線曝露部位に応じて病巣陽性細胞の割合が増加する（細胞集団の１０％を上回るまで）。
【００８２】
病巣形成は、時間依存的であることが知られている。対象を潜在的遺伝毒性物質で曝露した後又は曝露が疑われた後、比較的短時間内に試料を収集することが好ましい。具体的な実施形態では、試料は接触曝露後７日間しないうちに収集される。たとえば、試料は、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１２０時間後、及び１４４時間後、及び１６８時間後に収集される。特に好ましい実施形態では、試料は曝露後７２時間以内に収集される。最も好ましい実施形態では、試料は曝露後６時間と４８時間との間に収集される。
【００８３】
対照試料の存在は、遺伝毒性物質に対する曝露の定量に他の用途を提供することを当業者は理解するだろう。したがって、本発明の態様の好ましい実施形態では、本発明の診断方法にはさらに、生体対象から採取した試料を、好ましくは顕微鏡スライドなどの表面に固定するかまたは定着させて、ヒトＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドと接触させることが含まれる。次に、試料の細胞内でＦＡＮＣＤ２の核内病巣内に濃縮されたシグナルの存在を調べる。調べる段階は、限定はしないが、免疫蛍光顕微鏡法又は免疫組織化学分析を含む任意の適切な測定段階である。対照試料と比較して試験試料中にＦＡＮＣＤ２含有病巣が存在すれば、対象が遺伝毒性物質に曝露したことが示され、一方、拡散したシグナルが存在すれば、試料中のＤＮＡ損傷がないことが示される。さらに、対照試料に対する試料内のＦＡＮＣＤ２含有病巣の数、大きさ、及び残存率の違いは、遺伝毒性物質に対する曝露に応答したＤＮＡ損傷の違いを示し、参照試料に対する病巣形成の程度は曝露に応答したＤＮＡ損傷の異なる程度を示す。
【００８４】
治療前後の診断方法
本発明はさらに、放射線療法及び化学療法に対する患者の感受性を測定するための方法を提供する。一つの実施形態では、本診断方法は、化学療法または放射線療法の前に、対象または対象から取り出したリンパ球を低用量の遺伝毒性物質に対して曝露すること、好ましくは顕微鏡スライドなどの表面に固定するかまたは定着させた生体対象から採取した試料をヒトＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドと接触させることを含む。このようなリガンドは前記に詳細に述べられており、前述したようにまた、シグナルをもたらす検出可能な標識と結合していることが好ましい。次に、試料の細胞内のＦＡＮＣＤ２の核内病巣内に濃縮されたシグナルの存在を調べる。調べる段階は、限定はしないが、免疫蛍光顕微鏡法又は免疫組織化学分析を含む任意の適切な測定段階である。対照と比較してＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成が減少していることは、放射線耐性または化学物質耐性を示す。対照的に、病巣形成が増大していることは、相対的な放射線感受性または化学物質感受性を示しうる。あるいは、試料はモノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２に特異的に結合するリガンドと接触させることができる。したがって、本発明のこの態様の別の実施形態では、本発明の診断方法は、患者を低用量の遺伝毒性物質に曝露すること、及び対照試料に対してＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在を検出することを含み、対照試料に対する病巣形成の存在は患者の遺伝毒性物質に対する感受性の違いを示す。
【００８５】
さらに、この方法は、ガンマ放射線照射またはその他の化学療法剤、特にＤＮＡ損傷を引き起こすことが知られているもので治療した患者におけるＤＮＡ損傷の迅速かつ容易な評価のために使用することができる。したがって、本発明の他の実施形態は、曝露後の患者から試料を収集すること、及び対照試料に対してＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在を検出することを含む、治療薬に対する患者の曝露によって引き起こされるＤＮＡ損傷の程度を測定する診断方法である。対照試料に対する病巣形成の違いは、曝露に応答したＤＮＡ損傷の違いを示し、対照試料に対する病巣形成の程度は曝露に応答したＤＮＡ損傷の程度の違いを示す。
【００８６】
対象から収集した試料を使用した診断方法
癌を有する患者に放射線療法または化学療法を施す前に、電離放射線またはシスプラチンなどの治療薬に対する感受性を確認するために腫瘍試料を予備試験することができると有利である。このような予備試験によって、特定の癌のために最良の治療様式が使用されることを確実にする。したがって、本発明の一態様では、以下の段階：すなわち患者から試料を収集する段階、試料または組織を遺伝毒性物質に曝露する段階、及び対照試料と比較してＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在を検出する段階を含む、試料の遺伝毒性物質に対する感受性の測定方法を提供する。試料は、生体対象から採取された腫瘍生検を含みうる。対照試料に対する病巣形成の違いは、曝露に応答したＤＮＡ損傷の違いを示し、対照試料に対する病巣形成の程度は薬剤に対する組織の感受性の違いを示す。遺伝毒性ストレスを引き起こすことが知られているいかなる治療薬も、この方法で試験することができる。このような遺伝毒性物質の例には、電離放射線またはシスプラチンが含まれる。
【００８７】
ある状況においては、しばらくの間対象の腫瘍試料の進行をモニターすることが重要であり得る。たとえば、対象が腫瘍の化学療法を受けている場合、腫瘍が治療薬に対して耐性を生じたかどうかを決定することが重要であろう。したがって、別の実施形態では、本方法はさらに、様々な時点で対象の複数の試料を収集することを含む。これらの収集された試料は、同一の遺伝毒性物質に曝露され、好ましくは同濃度の遺伝毒性物質に曝露される。次に、ＦＡＮＣＤ２含有病巣は、既に説明した方法のいずれかを使用してこれらの試料で検出される。これらの試料のＦＡＮＣＤ２含有病巣を対照試料と比較することによって、さらに、これらの試料のＦＡＮＣＤ２含有病巣の変化を経時的にモニターすることによって、特定の遺伝毒性物質に対する組織の感受性が変化したかどうかを確認することができる。たとえば、時間と共にＦＡＮＣＤ２含有病巣が減少すると、その特定の遺伝毒性物質に対する試料の感受性が欠如していることを示す。
【００８８】
本発明の薬剤スクリーニング方法
ハイスループットスクリーニングは、特定の分子又は細胞プロセスを標的とする化合物の同定のために産業界及び学術業界において使用される一般的な第１段階である。以下に説明するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、試料中のＦＡＮＣＤ２病巣をモニターすることは、新規薬剤発見の有用なスクリーニング手段となる。本発明は、放射線防護薬のスクリーニング方法を提供する。
【００８９】
１）放射線防護薬自体は、末梢血リンパ球のＦＡＮＣＤ２病巣の増加を引き起こす。ＦＡＮＣＤ２病巣の基準濃度を高めることによって、放射線防護薬は、低（基準）濃度のＤＮＡ修復を活性化することができる。個体を放射線防護薬で処理し、その後遺伝毒性物質に曝露する場合、個体のＤＮＡ修復応答が増加し（刺激され）、したがって放射線損傷に対する防御の促進が引き起こされうる。
【００９０】
２）別の実施形態では、推定放射線防護薬はＦＡＮＣＤ２病巣を増加させずにＤＮＡ修復を促進することができる。低用量の遺伝毒性物質に対して曝露した後、ＦＡＮＣＤ２含有病巣をモニターすることによって、研究者は推定薬剤の相対的防御効果を評価することが可能である。たとえば、この場合、新規薬剤による放射線防御によって、遺伝毒性物質で曝露した後にＦＡＮＣＤ２の減少が生じる。
【００９１】
試験化合物のスクリーニング方法は、ＦＡＮＣＤ２含有病巣形成において活性を有する組成物を同定するのに有用であることが記載されている。このような組成物は、遺伝毒性物質に対する防御剤として、または化学増感剤として有用であり得る。これらの方法は、生物学的試料を試験化合物と接触すること、及び対照試料に対してＦＡＮＣＤ２病巣形成の存在を検出することを含む。対照試料に対する病巣形成の程度の違いは、病巣形成に活性のある薬剤を示す指標である。
【００９２】
この方法の一つの実施形態はさらに、ＦＡＮＣＤ２含有病巣を検出するために検出可能な標識と結合したＦＡＮＣＤ２リガンドを使用することを含む。この実施形態では、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を阻害する薬剤を同定するために、このようなスクリーニング方法を使用する。この方法では、たとえば遺伝毒性物質と接触させることによってＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を通常もたらす条件下で、選択された生物学的試料を試験化合物（すなわち、「試験試料」）並びに試験化合物を含まない同一試料（すなわち、「対照試料」）と接触させる。この態様では、遺伝毒性物質の濃度は、比較的多数の病巣が対照試料で再現性よく形成されるように選択される。次に、試験試料及び対照試料を、検出可能な標識と結合させたＦＡＮＣＤ２リガンドと接触させる。あるいは、試料は、モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２を特異的に認識するリガンドと接触させることができる。試験試料及び対照試料はその後、免疫蛍光顕微鏡法などの方法を使用してＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在、数、及び大きさを調べて比較する。対照試料に対する試験試料中のＦＡＮＣＤ２含有病巣の減少または欠如は、試験化合物がこの測定法においてＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を阻害することができることを示している。病巣の存在及び／又は数は、リガンド上の標識によって生じるシグナルの濃度または強度によって示される。シグナル（または発現濃度または強度）は、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在及び数を示す。試験試料の標識によって生じたシグナルを（もしあるならば）対照試料の標識によって生じたシグナルと比較するとき、試験細胞の検出可能なシグナルが少なければ、試験化合物が細胞中でＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を阻害したことを示す。たとえば、対照試料と比較したときに少なくとも１０％未満、たとえば、１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、または１００％未満までのＦＡＮＣＤ２含有病巣を示す試験試料は、細胞内でＦＡＮＣＤ２含有病巣形成を阻害する活性がある薬剤であることを示す。
【００９３】
この実施形態の別の態様では、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を促進する薬剤を同定するために、このようなスクリーニング方法を使用する。このような方法には、選択した生物学的試料を試験化合物（すなわち、「試験試料」）並びに試験化合物を含まない同一試料（すなわち、「対照試料」）と接触させることを含む。試験試料及び対照試料は、場合によって低濃度の遺伝毒性物質に曝露してよい。試験試料及び対照試料はその後、前述の方法を使用してＦＡＮＣＤ２含有病巣の存在及び数を調べて比較する。対照試料に対して試験試料中のＦＡＮＣＤ２含有病巣が少なくとも１０％、たとえば、１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、１００％、２００％、または５００％増加していれば、試験化合物がこの測定法においてＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を誘導できることを示す。
【００９４】
ＦＡＮＣＤ２病巣誘発化合物の突然変異誘発力試験
ＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成において活性を有する化合物の同定では、化合物が遺伝毒性活性を有するかどうか、または遺伝毒性を持たずにＦＡＮＣＤ２含有病巣を単に誘導するだけかどうかを決定することが必要である。遺伝毒性が多くの十分に確立された測定法の１つを使用して測定できることは当業者には理解されよう。このような方法の包括的なリストは、電子形態でも入手できるＴｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｒ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  Ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ．Ｄｒａｆｔ  Ｒｅｄｂｏｏｋ  ＩＩ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ：ＣＦＳＡＮ、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ワールドワイドウェブｗｗｗ．ｃｆｓａｎ．ｆｄａ．ｇｏｖ／〜ｒｅｄｂｏｏｋ／ｒｅｄ−ｔｏｃａ．ｈｔｍｌ）に見いだすことができる。一般的な方法には、突然変異誘発力のエイムス試験（Ａｍｅｓ、Ｂ．Ｎ．、ＭｃＣａｎｎ、Ｊ．＆Ｙａｍａｓａｋｉ、Ｅ．（１９７５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｍｕｔａｇｅｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ／ｍａｍｍａｌｉａｎ−ｍｉｃｒｏｓｏｍｅ  ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｔｅｓｔ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．３１、３４７〜３６４）、染色体異常試験（Ｇａｌｌｏｗａｙ、Ｓ．Ｍ．、Ａａｒｄｅｍａ、Ｍ．Ｊ．、Ｉｓｈｉｄａｔｅ  Ｊｒ．、Ｍ．、Ｉｖｅｔｔ、Ｊ．Ｌ．、Ｋｉｒｋｌａｎｄ、Ｄ．Ｊ．、Ｍｏｒｉｔａ、Ｔ．、Ｍｏｓｅｓｓｏ、Ｐ．、およびＳｏｆｕｎｉ、Ｔ．（１９９４）．Ｒｅｐｏｒｔ  ｆｒｏｍ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ  ｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１２、２４１〜２６１）が含まれ、これらの全体を参照により援用する。
【００９５】
簡単に言うと、エイムス試験は以下の方法を使用して実施される。この測定法の目的は、肝臓代謝系の非存在下及び存在下で、ヒスチジンを必要とする１種又は複数のサルモネラ  チフィムリウム種に対する影響を研究することによって、試験化学物質の突然変異誘発能力を評価することである。培養物を変異誘発物質に曝露すると、いくつかの細菌は化学物質相互作用によって遺伝的な変化を受け、非ヒスチジン要求状態への細菌の復帰突然変異が生じる。復帰した細菌は外部からのヒスチジンがなくても増殖し、したがって突然変異を引き起こす化学物質の能力が示される。異なる化合物種（又は異なる化合物種（類））によって様々な菌株が突然変異するので、多数の試験菌株が必要である。たとえばトリプトファンを必要とする大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の菌株などのその他の種類の細菌を使用することもまたできる。試験の基本は非常に類似しており、唯一の違いは細菌が異なるアミノ酸を必要とすることである。栄養培地に適切なサルモネラ菌株（ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７、ＴＡ１０２）を接種し、一晩インキュベートする。試験化合物の用量範囲測定は、菌株ＴＡ１００のみを使用して広範な用量範囲で実施する。細菌培養物、試験化学物質、及びＳ９ミックス（または補因子溶液）を軟寒天と共に混合して、その後最小寒天プレートに添加する。プレートをインキュベーションし、暗所で４８〜７２時間上下を逆転させる。その後、復帰突然変異コロニーの数を計数する。範囲測定に基づいて選択した用量で、さらに２種類の突然変異実験を実施する。両実験からコロニーの数を計数し、実験したそれぞれの用量について、個々のプレートの計数の平均を算出する。計数の統計学的分析を実施し、突然変異誘発力の結果を評価する。試験した化合物は変異誘発物質に曝露しなかった対照試料と比較したとき、化合物１μＭで復帰突然変異体を１０倍未満、たとえば、１０倍、８倍、５倍、２倍、１倍形成することが理想的である。
【００９６】
ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２をベースとしたスクリーニング方法
さらに別の実施形態では、スクリーニング方法は、レポーター蛍光タンパク質に融合させたＦＡＮＣＤ２を発現する遺伝子構築物を発現させて、蛍光顕微鏡を使用して細胞内のＦＡＮＣＤ２含有病巣を検出することを含む。本発明に特に有用な組換え核酸構築物には、ヒトＦＡＮＣＤ２をコードする配列またはそれらの断片及び蛍光タンパク質のインフレーム融合物を含むものが含まれる。このような核酸分子は、蛍光タンパク質標識に融合させ、遺伝子制御配列に操作可能に結合させたＦＡＮＣＤ２を含むポリペプチドをコードする。
【００９７】
本スクリーニング方法のこの実施形態はさらに、レポータータンパク質に融合させたヒトＦＡＮＣＤ２タンパク質をコードする組換え核酸構築物で形質導入された細胞を含む。本スクリーニング方法のこの実施形態は、検出方法の前記の実施形態とは異なる。この実施形態では、ＦＡＮＣＤ２含有病巣は、ＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドを必要とせずに検出される。代わりに、ＦＡＮＣＤ２に融合したレポータータンパク質を検出することによってＦＡＮＣＤ２含有病巣を直接検出する。
【００９８】
実施例４及び５で教示されるように、本発明による好ましい遺伝子構築物は、完全長ヒトＦＡＮＣＤ２のＮ末端メチオニンに融合させた増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を使用する。この遺伝子構築物を発現するＰＤ２０細胞は、遺伝毒性物質に細胞を曝露するとモノユビキチン化される融合タンパク質を発現する。さらに、ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２構築物は、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）などの遺伝毒性物質に対するこれらの細胞の過敏性を修正する。ｅＧＦＰ蛍光を検出することによって視覚化されるように、これらの細胞を遺伝毒性物質に曝露するとＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成が生じ、ＦＡＮＣＤ２またはモノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２に結合するリガンドは必要ではなくなる。
【００９９】
ＦＲＥＴをベースとしたスクリーニング方法
さらに別の実施形態では、少なくとも１種の構築物は第１のレポーター蛍光タンパク質に融合させたＦＡＮＣＤ２を発現し、第２の構築物は第２のレポーター蛍光タンパク質に融合させたＦＡＮＣＤ２含有病巣に結合した第２のタンパク質を発現する２種類の遺伝子構築物を発現する細胞内でＦＡＮＣＤ２含有病巣は検出され、ＦＡＮＣＤ２含有病巣は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって検出される。ＦＡＮＣＤ２含有病巣に結合したタンパク質の好ましい例は、ＮＢＳ１（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、２００２．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：９１３〜２０）及びＢＲＣＡ１（Ｇｒａｃｉａ−Ｈｉｇｕｅｒａら、２００１．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．７：２４９〜６２）を含む。この実施形態では、受容体及び供与体フルオロフォアとして働く２種類の蛍光レポータータンパク質を選択する。細胞を遺伝毒性物質に曝露したとき、ＦＡＮＣＤ２−蛍光レポーター融合タンパク質、及びＮＢＳ１−蛍光レポーター融合タンパク質またはＢＲＣＡ１−蛍光レポーター融合タンパク質の一方はＦＡＮＣＤ２含有病巣に結合する。一つの実施形態では、構築物が生じ、そのうちの１つはＧＦＰのシアン変種（ＣＦＰ）などの供与体蛍光タンパク質と融合したＦＡＮＣＤ２をコードする。ＮＢＳ１、ヒストン２ＡＸ、及びＢＲＣＡ１からなる群から選択された病巣結合タンパク質と融合した、供与体蛍光タンパク質、好ましくはＧＦＰの黄色変種（ＹＥＰ）をコードする他の構築物が生じる。これらの構築物は、既に記載したように、または当技術分野でよく知られた方法によって、ベクターのプロモーター配列及びターミネーター配列と操作可能に結合する。これらの２種類の蛍光タンパク質融合構築物は、別々のベクターまたは同一のベクターに配置することができる。次に、両構築物が発現するように、宿主細胞を形質転換する。両構築物の発現は、当技術分野で既知の方法を使用して（たとえば、適切な波長での蛍光顕微鏡法によって）遺伝毒性物質に対する曝露の存在下または非存在下で、ＣＦＰ及びＹＦＰの蛍光を検出することによって試験することができる。
【０１００】
２種類の蛍光タンパク質が物理的に近接していることによって、蛍光共鳴エネルギー移動の増加が生じ、ＦＲＥＴ顕微鏡、レシオイメージング、またはレシオメトリック（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）蛍光計を含む蛍光法を使用して検出することができる。ＦＬＩＰＲ（商標）などの装置は、約１秒の循環時間で２種類の異なる波長で読み取ったシグナル間を行き来できるように設定することができ、したがって、ハイスループットでの試料の測定に極めて有用である。
【０１０１】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、光子を関与させずに、蛍光供与体分子のエネルギーを受容体分子に移動させる無放射遷移である。供与体分子の励起によって、より長い波長の受容体分子の蛍光放射（すなわち、感作受容体の放射）が強まる。供与体蛍光放射の量子収量は付随して減少する。エネルギー移動効率は供与体分子と受容体分子との間の距離に強く逆比例するので、ＦＲＥＴは顕微鏡に有用な手段となった。したがって、ＦＲＥＴの出現は、２種類の分子の接近を示す非常に明確な指標である。これによって、分子の距離を測定するために「分光分析定規」としてＦＲＥＴ効率を使用することになった。
【０１０２】
最近使用できるようになった励起放射スペクトルを改変した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）変異体によって、ＧＦＰタグを細胞内マーカーとして使用することによるタンパク質−タンパク質相互作用の測定が実現された。ＧＦＰタグ付加タンパク質キメラは細胞内で発現し、蛍光になるためにいかなる化学的処理も必要としない。ＦＲＥＴはまた、青色を放射するＧＦＰ変種と緑色を放射するＧＦＰ変種との融合の間で生じうる。
【０１０３】
前述したように、供与体蛍光タンパク質標識は、光子を吸収し、エネルギーをもう１つの蛍光標識に移動させることができる。受容体蛍光タンパク質標識は、エネルギーを吸収し、光子を放出することができる。必要であれば、リンカーは結合ドメイン、配列又はポリペプチドを、直接または間接的に、中間結合によって、供与体及び受容体蛍光タンパク質または蛍光標識の一方または両方と、場合によって、非ＦＲＥＴ測定法を実施する場合には消光物質と連結する。ポリペプチド分子上の結合ドメイン、配列またはポリペプチドまたはその結合相手の相対的な順番、及びポリペプチド分子上の供与体及び受容体蛍光タンパク質標識にかかわらず、結合ドメイン、配列またはポリペプチド及びその結合相手が結合しなければＦＲＥＴは生じないことを確かめるために、リンカー及び／又は結合ドメイン、配列、核酸またはポリペプチド及び対応する結合相手によって蛍光標識の供与体及び受容体と対応する消光物質との間に十分な距離を置くことが必要である。ＷＯ９７／２８２６１により詳細に記載されているように、受容体蛍光タンパク質標識の励起スペクトルと重複する発光スペクトルを有する供与体蛍光タンパク質標識を選択することが望ましい。本発明のいくつかの実施形態では、発光スペクトルと励起スペクトルの重複によってＦＲＥＴが促進される。本発明で使用する蛍光タンパク質には、本来蛍光特性を備えたタンパク質に加えて、分子内転位または蛍光を促進する補因子の添加によって蛍光を放つタンパク質が含まれる。
【０１０４】
たとえば、バイオルミネセンスにおいてエネルギー移動受容体として作用する刺胞動物の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を本発明で使用することができる。本明細書では、緑色蛍光タンパク質は、緑色の蛍光を放つタンパク質で、青色蛍光タンパク質は、青色の蛍光を放つタンパク質である。ＧＦＰは、米太平洋岸北西地区のクラゲ、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ、ウミシイタケ、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｊｆｏｒｍｉｓ、及びＰｈｉａｌｉｄｉｕｍ  ｇｒｅｇａｒｉｕｍから単離された。（Ｗａｒｄら、１９８２、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３５：８０３〜８０８；Ｌｅｖｉｎｅら、１９８２、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７２Ｂ：７７〜８５）。有用な励起スペクトル及び発光スペクトルを有する様々なオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）関連ＧＦＰは、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａから天然に生じるＧＦＰのアミノ酸配列を変更することによって操作した（Ｐｒａｓｈｅｒら、１９９２、Ｇｅｎｅ  １１１：２２９〜２３３、Ｈｅｉｍら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１２５０１〜１２５０４、ＰＣＴＵＳ９５／１４６９２）。本明細書では、蛍光タンパク質のアミノ酸１５０個の任意の隣接した配列が、野生型オワンクラゲ緑色蛍光タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受け入れ番号Ｐ４２２１２）の、隣接しているかまたは隣接していないアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するならば、その蛍光タンパク質はオワンクラゲ関連蛍光タンパク質である。同様に、この蛍光タンパク質は、同様の標準物質を使用してＲｅｎｉｌｌａまたはＰｈｉａｌｉｄｉｕｍ野生型蛍光タンパク質と関連することができる。オワンクラゲ関連蛍光タンパク質には、たとえば、ヌクレオチド及び推定アミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｌ２９３４５、Ｍ６２６５４、Ｍ６２６５３に示されている野生型（天然型）Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＧＦＰ、及びいくつかを下に挙げた緑色蛍光タンパク質のオワンクラゲ関連遺伝子操作変種が含まれる。これらのうちいくつか、すなわち、Ｐ４、Ｐ４−３、Ｗ７及びＷ２は、野生型よりも明らかに短い波長で蛍光を発する。
【０１０５】
本発明に有用な操作された結合ドメイン、配列若しくはポリペプチド又はそれらの結合相手を含む単一の、または直列の蛍光タンパク質／ポリペプチドをコードする組換え核酸分子は、コードされた生成物に対する修飾酵素の活性のｉｎ  ｖｉｖｏ測定法のために発現させることができる。
【０１０６】
異なるリガンド、異なる検出技術などを使用した同様の測定法は、一般的に当技術分野で提供される情報を使用して当業者によって容易に設計される。
【０１０７】
本発明に有用なベクター
本発明の個別に発現する核酸分子を発現させるために有用で、当技術分野で既知かつ利用可能なベクターは幅広く存在する。特定のベクターの選択は、個別に発現する核酸によってコードされるポリペプチドの企図した使用に明らかに左右される。たとえば、選択したベクターは、細胞の種類が原核細胞であっても真核細胞であっても、所望する細胞種においてポリペプチドを発現させることができなければならない。多くのベクターは、原核細胞ベクターの複製と操作可能に結合した遺伝子配列の真核細胞での発現との両方を可能にする配列を含む。
【０１０８】
本発明で有用なベクターは、自己複製することが可能で、すなわち、ベクター、たとえばプラスミドは染色体外に存在し、その複製は宿主細胞ゲノムの複製に必ずしも直接関連していない。あるいは、ベクターの複製は、宿主染色体ＤＮＡの複製に関連させることが可能で、たとえば、ベクターはレトロウイルスベクターによって実現されるように、宿主細胞の染色体に組み込むことが可能である。
【０１０９】
本発明に有用なベクターは、配列の転写および翻訳を可能にする個別発現した配列に操作可能に結合した配列を含むことが好ましい。結合した個別発現配列の転写を可能にする配列はプロモーターを含み、場合によってはまた、結合配列の強力な発現を可能にするエンハンサー要素または要素類を含む。「転写制御配列」という用語は、プロモーターと、操作可能に結合した核酸配列に所望する発現特性（たとえば、高濃度発現、誘導発現、組織または細胞種特異的発現）を付与する任意のさらなる配列との組合せを意味する。
【０１１０】
選択されたプロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を表す任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主細胞で通常発現する遺伝子又はその他の細胞若しくは生物において通常発現する遺伝子から得ることができる。プロモーターの例には、限定はしないが、以下のものが含まれる：Ａ）原核細胞プロモーター−Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃ、ｔａｃ、またはｔｒｐプロモーター、ラムダファージＰＲまたはＰＬプロモーター、バクテリオファージＴ７、Ｔ３、Ｓｐ６プロモーター、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼプロモーター、及びＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニックアミラーゼプロモーターなど、Ｂ）真核細胞プロモーター−ＧＡＬ１、ＧＡＬ４及びその他の糖分解遺伝子プロモーターなどの酵母プロモーター（たとえば、Ｈｉｔｚｅｍａｎら、１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５、１２０７３〜１２０８０；Ａｌｂｅｒ＆Ｋａｗａｓａｋｉ、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：４１９〜４３４）、ＬＥＵ２プロモーター（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｇａｒｃｉａら、１９８９、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２１７：４６４〜４７０）、アルコール脱水素酵素遺伝子プロモーター（Ｙｏｕｎｇら、１９８２、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｉｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）、またはＴＰＩ１プロモーター（米国特許第４５９９３１１号）；多角体プロモーター（米国特許第４７４５０５１号；Ｖａｓｕｖｅｄａｎら、１９９２、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１１：７〜１１）、Ｐ１０プロモーター（Ｖｌａｋら、１９８８、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５〜７７６）、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多角体病ウイルスの塩基性タンパク質プロモーター（ＥＰ３９７４８５）、バキュロウイルス前初期遺伝子プロモーター遺伝子１プロモーター（米国特許５１５５０３７及び５１６２２２２）、バキュロウイルス３９Ｋ後初期遺伝子プロモーター（これも米国特許５１５５０３７及び５１６２２２２）、及びＯｐＭＮＰＶ前初期プロモーター２などの昆虫プロモーター；哺乳類プロモーター−ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、１９８１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４〜８６４）、メタロチオネインプロモーター（ＭＴ−１、Ｐａｌｍｉｔｅｒら、１９８３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２：８０９〜８１４）、アデノウイルス２主要後期プロモーター（Ｙｕら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９３０９〜２１）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、またはその他のウイルスプロモーター（Ｔｏｎｇら、１９９８、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８：７１９〜７２５）、さらには特定の細胞種の対象となる遺伝子の内在性プロモーター。
【０１１１】
選択されたプロモーターはまた、誘導性または組織特異性にさせる配列に結合させることができる。たとえば、選択されたプロモーターの上流に組織特異的エンハンサー要素を付加すると、プロモーターを所与の組織若しくは細胞種においてより活性化させることができる。あるいは、またはさらに、誘導性発現は、たとえば、熱変化（温度感受性）、化学処理（たとえば、金属イオン若しくはＩＰＴＧ誘導性）、または抗生物質の添加（たとえば、テトラサイクリン）による誘発を可能にするいくつかの配列要素のいずれかにプロモーターを結合することによって実現することができる。
【０１１２】
調節可能な発現は、たとえば、薬剤誘導性（たとえば、テトラサイクリン、ラパマイシン、またはホルモン誘導性）の発現系を使用して実現される。哺乳動物細胞で使用するのに特に適した薬剤制御可能なプロモーターには、テトラサイクリン制御プロモーター、ならびにグルココルチコイドステロイド、性ホルモンステロイド、エクジソン、リポ多糖（ＬＰＳ）、及びイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）調節プロモーターが含まれる。哺乳動物細胞で使用するための制御可能な発現系は、必ずしもそうでなくてもよいが、制御する薬剤に応答して非哺乳動物ＤＮＡモチーフに結合する（または結合できない）転写調節因子、及びこの転写調節因子にのみ応答する制御配列を含むことが理想的である。
【０１１３】
組織特異的プロモーターはまた、本発明の個別に発現する配列をコードする構築物において有利に使用することができる。多種多様な組織特異的プロモーターが知られている。本明細書では、「組織特異的」という用語は、所与のプロモーターが生物のすべてには満たない細胞または組織で転写的活性がある（すなわち、プロモーターのポリペプチド生成物の検出を可能にするために十分な結合配列の発現を目的とする）ということである。組織特異的プロモーターは、１種類の細胞種においてのみ活性があることが好ましいが、たとえば、特定の種類または細胞種系統（たとえば、造血細胞）において活性があってもよい。本発明に有用な組織特異的プロモーターには、天然のプロモーターに結合した遺伝子の発現方法または様式と本質的に同様な方法または様式で操作可能に結合した核酸配列の発現に必要十分な配列が含まれる。以下は、それぞれの組織においてプロモーターの発現特性を実現するために必要な配列を含有する組織特異的プロモーター及び参照文献の包括的リストであり、これらの参照文献の全内容は参照により本明細書に援用する。本発明に有用な組織特異的プロモーターの例は以下の通りである。
【０１１４】
Ｂｏｗｍａｎら、１９９５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２、１２１１５〜１２１１９は、脳特異的トランスフェリンプロモーターについて記載している；シナプシンＩプロモーターはニューロン特異的である（Ｓｃｈｏｃｈら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、３３１７〜３３２３）；ネスチンプロモーターは有糸分裂後ニューロン特異的である（Ｕｅｔｓｕｋｉら、１９９６  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、９１８〜９２４）；神経フィラメント軽鎖プロモーターはニューロン特異的である（Ｃｈａｒｒｏｎら、１９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、３０６０４〜３０６１０）；アセチルコリン受容体プロモーターはニューロン特異的である（Ｗｏｏｄら、１９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、３０９３３〜０３９４０）；及びカリウムチャンネルプロモーターは高頻度発火ニューロン特異的である（Ｇａｎら、１９９６  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５８５９〜５８６５）。当技術分野で既知のいかなる組織特異的転写制御配列も、疼痛を与えた動物から得られた個別に発現する核酸配列をコードするベクターを用いて有利に使用することができる。
【０１１５】
プロモーター／エンハンサー要素に加えて、本発明で有用なベクターはさらに適切なターミネーターを含んでいてよい。このようなターミネーターには、たとえば、ヒト成長ホルモンターミネーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、１９８３、前述）、または酵母若しくは真菌宿主用のＴＰＩ１（Ａｌｂｅｒ  ＆  Ｋａｗａｓａｋｉ、１９８２、前述）、またはＡＤＨ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、１９８５、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２０９３〜２０９９）が含まれる。
【０１１６】
本発明に有用なベクターはまた、ポリアデニル化配列（たとえば、ＳＶ４０またはＡｄ５Ｅ１ｂポリ（Ａ）配列）、及び翻訳促進配列（たとえば、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡ由来のもの）を含みうる。さらに、本発明に有用なベクターは、特定の細胞区画に組換えポリペプチドを指向させるシグナル配列をコードすることができ、あるいは、組換えポリペプチドの分泌を対象とするシグナルをコードすることができる。
【０１１７】
ａ．プラスミドベクター
個別発現する本発明のコード配列の選択された宿主細胞種における発現を可能にする任意のプラスミドベクターは、本発明での使用に許容される。本発明で有用なプラスミドベクターは、本発明で有用なベクターの前記の特徴のいずれかまたはすべてを備えていてよい。本発明に有用なプラスミドベクターの例には、限定はしないが、以下の例が含まれる：細菌−ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）ｐＢｓ、ファージスクリプト（ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）、ｐｓｉＸ１７４、ｐブルースクリプトＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核−ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、複製可能で、宿主内で生存可能であれば、任意のその他のプラスミドまたはベクターを使用することができる。
【０１１８】
ｂ．バクテリオファージベクター
本発明で有用なよく知られたバクテリオファージ由来ベクターがいくつかある。これらの中で主要なのは、挿入によってコードされるポリペプチドの誘導性発現を可能にする、ラムダＺａｐＩＩまたはラムダ−Ｚａｐ発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのラムダをベースとしたベクターである。その他には、Ｍ１３をベースとしたベクターファミリーなどの繊維状バクテリオファージが含まれる。
【０１１９】
ｃ．ウイルスベクター
いくつかの様々なウイルスベクターが本発明では有用であり、細胞内において１種又は複数の本発明の個別発現ポリヌクレオチドの導入及び発現を可能にする任意のウイルスベクターは、本発明の方法で使用するために許容される。細胞内に外来核酸を輸送するために使用できるウイルスベクターには、限定はしないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びセムリキ森林熱ウイルス（アルファウイルス）ベクターが含まれる。欠損レトロウイルスは、遺伝子導入で使用するためによく特徴付けられている（総説はＭｉｌｌｅｒ、Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１を参照のこと）。組換えレトロウイルスを作製するための、及びこのようなウイルスを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を感染させるための方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ９．１０〜９．１４、及びその他の研究室用標準マニュアルに見いだすことができる。
【０１２０】
レトロウイルスベクターに加えて、アデノウイルスは、対象となる遺伝子産物をコードし、発現するが、通常の溶菌ウイルス生活環において複製する能力に関して不活性化されているように操作することができる（たとえば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１〜４３４、及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３〜１５５を参照のこと）。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄｌ３２４またはその他のアデノウイルス株（たとえば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）から得られた適切なアデノウイルスベクターは、当業者にはよく知られている。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの他のウイルスを効率の良い複製及び増殖性生活環のためのヘルパーウイルスとして必要とする天然の欠損ウイルスである（総説は、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９を参照のこと）。Ｔｒａｓｃｈｉｎらが記載したもの（１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０）などのＡＡＶベクターは、核酸を細胞に導入するために使用することができる。様々な核酸は、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞種に導入された（たとえば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６〜６４７０、及びＴｒａｓｃｈｉｎら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４．：２０７２〜２０８１）。
【０１２１】
宿主細胞
疼痛を受けた動物で個別に発現する核酸配列をコードする遺伝子を有する組換えベクターが導入されうる細胞であって、ベクターが個別に発現する配列によってコードされるペプチドの発現を可能にする任意の細胞は、本発明で有用である。本発明の個別に発現する分子を発現させ、好ましくは検出することが可能な任意の細胞は、適切な宿主であり、宿主細胞は好ましくは哺乳動物細胞で、より好ましくはヒト細胞である。個別に発現する核酸配列を原核生物及び真核生物の両方の様々な異なる生物から得られた宿主細胞に導入するために適したベクターは、本明細書に前述されているか、又は当業者には既知である。
【０１２２】
宿主細胞は、いくつかの細菌株のいずれかなどの原核細胞であってよく、又は酵母若しくはその他の真菌細胞などの真核細胞、昆虫細胞又は両生類細胞、又は、たとえば、齧歯類、サル、若しくはヒト細胞を含む哺乳動物細胞であってよい。細胞は、初代培養細胞、たとえば、初代ヒト繊維芽細胞若しくはケラチン生成細胞であってよく、又は確立された細胞系、たとえば、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３Ｔ若しくはＣＨＯ細胞であってよい。さらに、本発明に有用な哺乳動物細胞は、表現型が正常であるか、又は発癌性が形質転換されていてよい。当業者であれば、選択された宿主細胞種を培養で容易に確立し、維持することができると考えられる。
【０１２３】
宿主細胞へのベクターの導入
本発明に有用なベクターは、当業者に既知のいくつかの適切な方法のいずれかによって、選択された宿主細胞に導入することができる。たとえば、ベクター構築物は、ラムダ若しくはＭ１３などのＥ．ｃｏｌｉバクテリオファージベクター粒子の場合は感染によって、または、プラスミドベクター若しくはバクテリオファージＤＮＡではいくつかの形質転換法のいずれかによって、適切な細菌細胞に導入することができる。たとえば、標準的な塩化カルシウムによる細菌形質転換は、細菌に裸ＤＮＡを導入するために未だに一般的に使用されているが（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）、エレクトロポレーションもまた使用することができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８８、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ））。
【０１２４】
ベクター構築物を酵母またはその他の真菌細胞に導入するために、（たとえば、Ｒｏｓｅら、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに記載されているように）化学的形質転換法が一般的に使用される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換では、たとえば、細胞を酢酸リチウムで処理して、約１０４コロニー形成単位（形質転換細胞）／ＤＮＡ（μｇ）の形質転換効率を実現する。次に、形質転換細胞を、使用した選択可能なマーカーに適切な選択培地で単離する。あるいは、またはさらに、プレートまたはプレートから取り出したフィルターをＧＦＰ蛍光で調べて、形質転換クローンを確認する。
【０１２５】
個別に発現する配列を含むベクターを哺乳動物細胞に導入するために、使用する方法はベクターの形態に左右される。プラスミドベクターは、たとえば、脂質媒介形質導入（「リポフェクション」）、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介形質導入、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム沈殿法を含むいくつかの形質導入法のいずれかによって導入することができる。これらの方法は、たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８８、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ）に詳述されている。
【０１２６】
様々な種類の形質転換細胞及び非形質転換細胞または初代細胞の一時的な形質導入に適したリポフェクション試薬及び方法は広く使用されており、リポフェクションは構築物を真核細胞、特に培養中の哺乳動物細胞に導入する魅力的な方法となっている。たとえば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＬｉｐｏＴａｘｉ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）キットは入手可能である。リポフェクションのための試薬及び方法を提供するその他の会社には、Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、ＪＢＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｐａｎ  Ｖｅｒａ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、及びＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡが含まれる。
【０１２７】
本発明のベクターで形質導入した後、構築物をうまく（染色体内または染色体外に）組み込んだ真核（たとえば、ヒト）細胞は、前述のように、耐性遺伝子がベクターによってコードされている抗生物質などの選択物質で形質導入集団の処理をするか、又は、たとえば、細胞集団のＦＡＣＳ若しくは接着培養物の蛍光走査を使用した直接スクリーニングによって、選択することができる。しばしば、両種のスクリーニングを使用することが可能で、それぞれ、ネガティブ選択を使用して、構築物を取り込んだ細胞を濃縮し、ＦＡＣＳまたは蛍光走査を使用して個別に発現するポリヌクレオチドを発現する細胞をさらに濃縮するか、又は細胞の特定のクローンを同定する。たとえば、ネオマイシン類縁体Ｇ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）によるネガティブ選択を使用して、ベクターを受け入れた細胞を同定し、蛍光走査を使用して最大範囲でベクター構築物を発現する細胞または細胞のクローンを同定することができる。
【０１２８】
本発明による試験化合物
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系にせよｉｎ  ｖｉｖｏ系にせよ、本発明はＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を促進するかまたは阻害することができる組成物をスクリーニングする方法を包含する。合成または天然の化合物の大きなライブラリーから候補モジュレーター化合物をスクリーニングすることができる。糖類、ペプチド、及び核酸をベースとした化合物の無作為合成または直接合成には、現在数多くの手段が使用されている。合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ、Ｃｏｒｎｗａｌｌ、ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ、ＮＨ）、及びＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｏｒｄ、ＣＴ）を含むいくつかの会社から市販されている。希少な化学ライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から入手できる。コンビナトリアルライブラリーは入手することも調製することもできる。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、たとえば、Ｐａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）またはＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＮＣ）から入手することができるか、又は当技術分野でよく知られた方法によって容易に生成することができる。さらに、天然及び合成的に作製されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的、及び生物化学的手段によって容易に改変される。
【０１２９】
有用な化合物は、一般的には低分子有機化合物を含む有機化合物であるが、多数の化学種内に見いだすことができる。低分子有機化合物の分子量は、５０ダルトンより大きく、さらに約２５００ダルトン未満、好ましくは約７５０ダルトン未満、より好ましくは約３５０ダルトン未満である。種類の例としては、複素環、ペプチド、糖類、ステロイドなどが含まれる。化合物は、効率、安定性、薬剤適合性などを高めるために改変することができる。薬剤の構造的同定を使用して、他の薬剤を同定、生成、またはスクリーニングすることができる。たとえば、ペプチド剤を同定する場合、非天然型アミノ酸、たとえばＤ−アミノ酸、具体的にはＤ−アラニンを使用して、アミノ末端またはカルボキシル末端を官能化することによって、たとえば、アミノ基はアシル化またはアルキル化して、カルボキシル基はエステル化またはアミド化するなどして、安定性を増強する様々な方法でそれらを改変することができる。
【０１３０】
本発明の方法によってスクリーニングすることができる候補モジュレーターには、受容体、酵素、リガンド、制御因子、及び構造タンパク質が含まれる。候補モジュレーターにはまた、核タンパク質、細胞質タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、分泌タンパク質、細胞膜関連タンパク質、血清タンパク質、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原、及び寄生生物抗原が含まれる。候補モジュレーターにはさらに、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、リンタンパク質、及び核酸（たとえば、リボザイムなどのＲＮＡまたはアンチセンス核酸）が含まれる。本発明の方法を使用してスクリーニングできるタンパク質またはポリペプチドには、ホルモン、成長因子、神経伝達物質、酵素、凝固因子、アポリポタンパク質、受容体、薬剤、癌遺伝子、腫瘍抗原、腫瘍抑制因子、構造タンパク質、ウイルス抗原、寄生生物抗原、細菌抗原、及び抗体（以下参照）が含まれる。
【０１３１】
本発明によってスクリーニングすることができる候補モジュレーターにはまた、試験細胞若しくは生物が欠損している物質、または正常な濃度より高い濃度で臨床的に効果的な物質、並びに所望しないタンパク質の翻訳を排除するように設計された物質が含まれる。本発明で使用する核酸は、前述の候補モジュレーターをコードするだけでなく、有害なタンパク質を排除する生成物を排除するかまたはコードすることができる。このような核酸配列は、アンチセンスＲＮＡ及びリボザイム、並びにそれらをコードするＤＮＡ発現構築物である。以下に説明するように、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、またはそれらをコードする遺伝子を当技術分野で既知の核酸輸送方法によって試験細胞または生物に投与することができることに注意されたい。核酸配列を不活性化することにより、標的ｍＲＮＡに特異的なリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡをコードすることができる。ハンマーヘッド型リボザイムは知られている最小のものであり、それら自体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生させたり、細胞に輸送させたりする（Ｓｕｌｌｉｖａｎ、１９９４、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０３：８５Ｓ〜９８Ｓ、Ｕｓｍａｎら、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、６：５２７〜５３３にまとめられている）。
【０１３２】
本発明による治療組成物
ＦＡＮＣＤ２含有病巣形成のモジュレーターは、有用な治療薬でありうる。たとえば、ＦＡＮＣＤ２含有病巣形成の促進剤は、遺伝毒性物質の有無にかかわらず、遺伝毒性物質に対して対象を防御するために有用でありうる。本発明のスクリーニングにおいて、またはＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を促進するその他の手段によって同定された化合物がそれ自体遺伝毒性物質でない場合、このような化合物は防御剤として有用でありうる。デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）［１−アミノ−６，１７−ジヒドロキシ−７，１０，１８，２１−テトラオキソ−２７−（ｎ−アセチルヒドロキシルアミノ）−６，１１，１７，２２−テトラアザヘプタエイコサン、ＣＡＳ登録番号７０−５１−９］は、ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の作動薬として同定された。ＤＦＯは、ＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化及び病巣集合の有力な活性化剤である。ＤＦＯは、既知の鉄のキレート剤であり、細胞内酸素ラジカルを減少させると考えられている（Ｂｒｅｕｅｒら、（２００１）Ｂｌｏｏｄ、９７、７９２〜７９８）。ＤＦＯがＦＡ／ＢＲＣＡ経路の作動薬として同定されたことは、重要な意味を有している。ＤＦＯは、臨床使用では安全な薬剤であるが、ＦＡ／ＢＲＣＡ  ＤＮＡ修復経路を刺激するようにも作用しうる。それ自体、有用で安全な遺伝毒性物質に対する防御薬でありうる。現在、既知の防御剤はほとんどない。たとえば、アミフォスチンは、放射線防御のために承認されている（Ｃｈｏｉ、（２００３）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．３０、１０〜１７）。したがって、治療量のＤＦＯは、遺伝毒性物質から対象を防御するために対象に投与することができる。それ自体が遺伝毒性作用を持たすにＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を促進するこのような薬剤には、戦争中の放射能曝露、放射能漏れの後、または火星への宇宙旅行中などの多くの用途が明らかである。
【０１３３】
同様に、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を減少させるモジュレーターには、多くの用途がある。ＦＡ／ＢＲＣＡ  ＤＮＡ修復経路を阻害する薬剤の明らかな用途は、化学療法中の化学増感剤としての用途である。いかなる腫瘍も化学療法に対して耐性を生じることは当技術分野で既知のことである。抗癌治療薬及び化学増感剤を含む併用治療は、これらの腫瘍の抗癌剤に対する耐性を大幅に減少させることができる。耐性が問題になることが示されない場合であっても、抗癌剤の投与量を減少させることができるならば、又はこのような治療が抗癌剤の副作用全体を減少させることができるならば、このような併用治療を行うことは有利であり得る。本発明で説明したスクリーニング方法を使用して、ウォルトマニン及びトリコスタチンＡはＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成の阻害剤として同定された。したがって、これらの化合物は、化学増感剤として有用でありうる。
【０１３４】
ＦＡＮＣＤ２含有病巣形成のモジュレーターを含む医薬組成物
別の実施形態では、本発明は、前項で説明したような、以下で説明するような医薬上許容できる担体を含む医薬組成物に関する。ＦＡＮＣＤ２含有病巣形成のモジュレーターを含む医薬組成物は、癌を含む様々な疾患及び障害の治療に有用で、遺伝毒性物質に対する防御薬として有用でありうる。
【０１３５】
本発明の化合物またはそれらの医薬上許容される塩は、疾患の治療的処理または予防的処理のために、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、または非経口投与用に調製することができる。経口または非経口投与のためには、本発明の化合物は従来の医薬担体及び医薬品添加物と混合して、錠剤、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、カシェ剤などの形態で使用することができる。本発明の化合物を含む組成物は、活性化合物を約０．１重量％から約９９．９重量％、約１重量％から約９８重量％、約５重量％から約９５重量％、約１０重量％から約８０重量％、または約１５重量％から約６０重量％で含有する。
【０１３６】
本明細書で開示した医薬品調製物は、標準的操作によって調製され、癌を減少、予防、または排除するために、又は電離放射線などの遺伝毒性物質に対する防御効果をもたらすために選択された用量で投与される（たとえば、ヒトを治療するために様々な抗菌剤を投与する方法の一般的説明については、その内容を本明細書に参照により援用した、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ；ならびにＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。本発明の組成物は制御放出送達システム（たとえば、カプセル）または持続放出送達システム（たとえば、生体分解性マトリックス）を使用して送達することができる。本発明の組成物の投与に適した薬物送達のための例示的な遅延型放出送達システムは、米国特許第４４５２７７５号（Ｋｅｎｔ）、第５２３９６６０号（Ｌｅｏｎａｒｄ）、第３８５４４８０号（Ｚａｆｆａｒｏｎｉ）に記載されている。
【０１３７】
本発明の医薬上許容されうる組成物は、本明細書で集合的に「担体」物質と称される、１種又は複数の非毒性の、医薬上許容されうる担体及び／又は希釈剤及び／又は補助剤及び／又は医薬品添加物、ならびに所望するならばその他の活性成分と結合した本発明の１種又は複数の化合物を含む。組成物は、トウモロコシデンプンまたはゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウム、及びアルギン酸などの通常の担体及び医薬品添加物を含有することができる。組成物は、クロスカルメロースナトリウム、微結晶性セルロース、グリコール酸デンプンナトリウム、及びアルギン酸を含有することができる。
【０１３８】
含めることができる錠剤結合剤は、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（プロビドン）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、デンプン、及びエチルセルロースである。
【０１３９】
含めることができる潤沢剤には、ステアリン酸マグネシウムまたはその他のステアリン酸金属、ステアリン酸、シリコン液、タルク、ワックス、油、及びコロイドシリカが含まれる。
【０１４０】
ペパーミント、冬緑油、サクラフレーバーなどの矯味剤もまた、使用することができる。好ましくは、投与形態の外観により美感を与えるために、又は本発明の化合物を含む生成物の同定を助けるために着色剤を添加してもよい。
【０１４１】
経口で使用するために、錠剤及びカプセルなどの固形製剤は特に有用である。持続放出型製剤または腸溶コーティング製剤も考案することができる。小児及び老人に適用するために、懸濁液、シロップ、及びチュアブル錠は特に適切である。経口で投与するために、医薬組成物は、たとえば、錠剤、カプセル、懸濁液、または液剤の形態である。医薬組成物は、治療有効量の活性成分を含有する単位用量の形態で調製されることが好ましい。このような投与単位の例は、錠剤及びカプセルである。治療目的のために、錠剤及びカプセルは、活性成分に加えて、結合剤、たとえば、アラビアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ソルビトール、若しくはトラガカント、；充填剤、たとえば、リン酸カルシウム、グリシン、ラクトース、トウモロコシデンプン、ソルビトール、若しくはスクロース；潤沢剤、たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、シリカ、若しくはタルク；崩壊剤、たとえば、バレイショデンプン；矯味剤、または着色剤、または許容されうる湿潤剤などの従来の担体を含有することができる。経口液体調製物は一般的に、水性若しくは油性溶液、懸濁液、乳剤、シロップ、またはエリキシルの形態であり、懸濁化剤、乳化剤、非水性剤、保存剤、着色剤、及び矯味剤などの従来の添加物を含有することができる。液体調製物用添加物の例には、アラビアゴム、アーモンド油、エチルアルコール、ヤシ油（分留）、ゼラチン、グルコースシロップ、グリセリン、硬化食用油脂、レシチン、メチルセルロース、メチル若しくはプロピル パラ−ヒドロキシベンゾエート、プロピレングリコール、ソルビトール、又はソルビン酸が含まれる。
【０１４２】
静脈内（ｉｖ）への使用では、本発明の化合物は通常使用される静脈注射液のいずれかで溶解させるか又は懸濁させて注入によって投与することができる。静脈注射液には、限定はしないが、生理食塩水またはリンゲル液を含めることができる。
【０１４３】
非経口投与用の製剤は、水性若しくは非水性等張滅菌注射溶液又は懸濁液の形態でありうる。これらの溶液または懸濁液は、経口投与用製剤で使用することが記載された１種又は複数の担体を有する滅菌した粉末または顆粒から調製することができる。化合物は、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、及び／又は様々な緩衝液に溶解させることができる。
【０１４４】
筋肉内製剤では、本発明の化合物または化合物を形成する適切な可溶性の塩の滅菌調製物を注射用水（ＷＦＩ）、生理食塩水、または５％グルコースなどの医薬希釈剤に溶解して投与することができる。化合物の適切な不溶性形態は、水性ベースまたは医薬上許容されうる油性ベース（たとえば、オレイン酸エチルなどの長鎖脂肪酸のエステル）中の懸濁物として調製して投与することができる。
【０１４５】
局所使用のために、本発明の化合物はまた、皮膚、または鼻及び喉の粘膜に適用するために適切な形態で調製することができ、クリーム、軟膏、液体スプレー、または吸入剤、トローチ剤、または喉塗布剤の形態をとることができる。このような局所製剤はさらに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの化合物を含有させることができ、これにより活性成分の表面透過を促進することができる。
【０１４６】
眼または耳に適用するために、本発明の化合物は、軟膏、クリーム、ローション、塗布剤、または粉末のような疎水性ベースまたは親水性ベースで調製した液体または半液体の形態で提供されうる。
【０１４７】
直腸投与のためには、本発明の化合物は、カカオ脂、ワックス、またはその他のグリセリドなどの従来の担体と混合した坐剤の形態で投与することができる。
【０１４８】
あるいは、本発明の化合物は、送達時に適切な医薬上許容されうる担体で再構成するための粉末形態であってよい。別の実施形態では、化合物の単位投与形態は、滅菌された、密閉アンプル内で適切な希釈剤に入れた化合物またはその塩の溶液でありうる。
【０１４９】
単位投与物中の本発明の化合物の量は、受容対象、投与経路、及び投与頻度に応じて変化しうる治療有効量の本発明の少なくとも１種の活性化合物を含む。受容対象とは、植物、細胞培養物、またはヒツジなどの動物若しくはヒトを含む哺乳類を意味する。
【０１５０】
本発明のこの態様では、本明細書で開示した新規組成物は、医薬上許容されうる担体中に入れられ、既知の薬剤輸送方法によって（ヒト対象を含む）受容対象に輸送される。一般的に、ｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の組成物を輸送するための本発明の方法は、当技術分野で認識されている方法において薬剤を本発明の化合物に置換するという点のみを実質的に変更して、当技術分野で認識されている薬物輸送方法を使用する。
【０１５１】
本発明の化合物は、前癌状態若しくは癌状態を治療するための、又は遺伝毒性物質に対する防御薬として使用するための方法を提供する。本明細書では、「単位用量」という用語は、所望する治療応答を誘導する治療有効量の本発明の化合物の量を意味する。「治療」という用語は、前癌状態若しくは癌状態の発生を予防するために、又は前癌状態若しくは癌状態を制御若しくは排除するために、対象に、治療有効量の少なくとも１種の本発明の化合物を投与することと定義される。「所望する治療応答」という用語は、受容対象の前癌状態または癌状態を逆戻りさせ、阻止し、または予防するように、本発明の化合物で受容対象を治療することを意味する。
【０１５２】
本発明の化合物は、１日に単回用量として、または１日当たり複数回投与するように投与することができる。治療計画は、長期間、たとえば、数日間または２週間から４週間投与することを必要としうる。投与用量当たりの量または全投与量は、疾患状態の特性及び重症度、受容対象の年齢及び一般的健康状態、受容対象の化合物に対する耐性、及び癌の種類、治療薬に対する癌の感受性、並びに使用するならば、その他の治療薬の併用、使用した治療薬の用量及び種類などの要素に左右される。
【０１５３】
本発明の化合物はまた、患者若しくは動物の食事または飼料に投与することができる。動物用の飼料は、化合物を添加することができるかまたはプレミックスに添加することができる通常の食品でありうる。
【０１５４】
本発明の化合物は、このような治療を必要とする受容対象を治療するために既知の臨床的に認可された任意の薬剤と組み合わせて、一緒に、又は別個に摂取されうる。
【０１５５】
本発明によるキット
便宜上、免疫組織化学的分析若しくは免疫蛍光顕微鏡法又は本発明によるその他の診断測定法のための一般的な試薬は、キットの形態で提供される。このようなキットは、生体対象の試料におけるＦＡＮＣＤ２含有病巣の有無を測定し、計数するために有用である。したがって、このようなキットは、対象が最近遺伝毒性物質に曝露したかどうか、対象が遺伝毒性物質に曝露した程度、及び遺伝毒性物質に対する対象の感受性を測定する診断測定法を実施するために有用である。このような診断キットは、ＦＡＮＣＤ２リガンド（たとえば、ＦＡＮＣＤ２に結合することができる抗体）または本発明のモノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２を含む。キットはまた、測定法を実施するための指示書、組織または細胞を固定するための顕微鏡スライド、固定剤、適切な株、様々な希釈剤及び緩衝液、特異的に結合した組成物を検出するための標識複合体、及びその他のシグナル発生試薬、たとえば、蛍光化合物及び色素、酵素基質、補因子、及び色素原を含みうる。他の構成要素は、蛍光または比色用の指示薬の図表、使い捨て手袋、汚染除去指示書、塗布棒または容器、及び試料調製用コップを含みうる。このようなキットは、本発明による細胞または組織のＤＮＡ損傷の有無を診断するための便利で効率的な臨床研究用手段を提供する。本発明によるキットには、適切なパッケージング手段、たとえば、試験管、組織培養プレート及びマルチウェルプレートが含まれる。リガンドは、溶液又は凍結乾燥状態で提供されうる。
【０１５６】
本発明は、以下の実施例を参照することによって説明されるが、これらは例示のために提供され、いかなる方法によっても本発明を限定するものではない。当技術分野でよく知られている標準的技術または以下に具体的に説明する技術を使用した。本明細書で引用した参考文献はすべて、参照により援用する。
【実施例】
【０１５７】
実施例１  ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化アイソフォームを特異的に認識する抗体の作製
ＦＡＮＣＤ２に対する（モノクローナル及びポリクローナル）抗体は、ＦＡＮＣＤ２のアミノ末端領域に対して生じた。これらの抗体は、ＦＡＮＣＤ２の両アイソフォーム（ＦＡＮＣＤ２−Ｓ及びＦＡＮＣＤ２−Ｌ）を認識する。抗ＦＡＮＣＤ２−Ｌ抗体を作製するために、ユビキチン（Ｕｂ）のカルボキシル末端に共有結合させたＦＡＮＣＤ２領域を含有する特異的抗原（図１０）を作製した。この抗原をマウスに注射し、モノクローナル抗体（図１１）を作製した。これらの抗体について、前述したように、特異的な診断価値をここで分析する。
【０１５８】
実施例２  試料を採取するための臨床方法
ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータに基づくとそれが病巣形成のピーク時であるので、曝露の申し立てから２４時間から４８時間して血液を採取した。再度、異なる抗血清（ＦＡＮＣＤ２、ＢＲＣＡ１、及びヒストン２ＡＸ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは実際の病巣のピーク時及び病巣の期間が著しく異なる可能性がある。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、標準的フィコール勾配を使用して単離する。次に、細胞をヒストン２ＡＸ、ＢＲＣＡ１、及びＦＡＮＣＤ２に対する特異的な抗血清で染色し、ＩＲＩＦを有する細胞の割合及び細胞当たりのＩＲＩＦの数を測定する。放射線曝露の申し立てから経過した時間の量に基づいた標準曲線を使用して、曝露したと考えられる遺伝毒性物質の用量を測定する。この用量に基づいて、遺伝毒性防御薬を必要であれば投与する。
【０１５９】
Ｉ．臨床方法
腫瘍のために放射線または遺伝毒性化学療法薬を投与されている癌患者（たとえば、頭部及び首の扁平上皮癌患者）を参加させる。放射線曝露後、曝露後の様々な時間で（すなわち、曝露後１時間、３時間、８時間、及び２４時間してから）末梢血試料を採取し、末梢血リンパ球内の病巣の数を測定する。放射線治療を受けた患者の試料の場合、照射領域には腫瘍領域のみを含むが、この領域を通過する血液（及びリンパ球）はまた、放射線曝露を受けるだろう。したがって、患者から得られた末梢血試料は、少なくとも、この領域で照射された循環リンパ球の画分の試料である。病巣の数（ｘ軸）と曝露（ｙ軸）が相関した標準曲線が作製される。その後、多くの個々の血液試料の放射線曝露を測定するためのハイスループット自動装置が開発されている。この装置は、生物学的試料の放射線または遺伝毒性物質に対する曝露を測定するための以前の測定法で使用されたのと同様の原理で作動すると考えられ、病巣に見いだされるタンパク質（ＦＡＮＣＤ２、ヒストン２ＡＸ、ＢＲＣＡ１）に対する抗体と生物学的試料を接触させ、ハイスループット自動顕微鏡を使用して試料の病巣形成を調べることを含む。
【０１６０】
実施例３  ＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化の用量依存的生成
ＤＮＡ損傷はＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化を活性化すること、及びＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化はＦＡＮＣＤ２核病巣形成と相関することを既に示した（Ｇａｒｃｉａ−Ｈｉｇｕｅｒａら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ７：２４９〜２６２、２００１）。図１３に示したように、いくつかの種類の遺伝毒性ストレス（ＭＭＣ、ＩＲ、紫外線）は、ＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化を活性化するか（パネルＡ、Ｂ、Ｃ）、又はＦＡＮＣＤ２病巣形成を活性化することができる（パネルＤ）。興味深いことに、ＦＡＮＣＤ２の活性化は時間経過依存性及び用量依存性である。この分析において、ＦＡＮＣＤ２病巣はＩＲ後わずか４時間で認められ、５ＧｙのＩＲの後で認められた（パネルＤ）。ＨｅＬａ細胞でも実施したより厳密な研究（図１２）では、０〜５Ｇｙの範囲（すなわち、低放射線曝露）の放射線であってもＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化の用量依存的増加が示され、ＦＡＮＣＤ２病巣形成が放射線曝露の非常に高感度な指標でありうることがさらに示唆される。予備研究によって、正常なヒト成人対照の初代末梢血リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで照射すると、同様の時間経過及び用量に依存したＦＡＮＣＤ２核病巣の生成が生じる（データは示さず）。
【０１６１】
実施例４  スクリーニング（化学物質を使用した予備スクリーニング）
Ｉ）ファンコニ貧血症／ＢＲＣＡ経路の阻害剤（または作動薬）のハイスループット測定法
測定法は、ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の下流にある重要な事象、ＦＡＮＣＤ２病巣の集合のために開発された。この目的のために、完全長ＦＡＮＣＤ２タンパク質のアミノ末端に融合したＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をコードする融合ｃＤＮＡ（図１）を作製した。
【０１６２】
最初に、内在性ＦＡＮＣＤ２タンパク質を発現しないＰＤ２０（ＦＡ−Ｄ２繊維芽細胞）にこのｃＤＮＡを形質導入した（図２）。ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２タンパク質は、（予測通り）ＦＡＮＣＤ２より大きく、ＤＮＡ損傷誘導性モノユビキチン化を受ける（レーン６〜９）。
【０１６３】
ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２タンパク質がＦＡ−Ａ（ファンコニ貧血症サブタイプＡ）繊維芽細胞系で発現したときは、細胞が電離放射線に曝露したときでさえもモノユビキチン化されなかった（図２、レーン１１〜１４）。これらのことを考え合わせると、これらの結果は、ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２が野生型（タグのついていない）ＦＡＮＣＤ２タンパク質と同様の作用をすることを示唆している。
【０１６４】
次に、ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２がＰＤ２０Ｆ細胞のＭＭＣ過敏性を修正できるかどうかを測定した（図３）。実際に、野生型ＦＡＮＣＤ２のように、ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２の発現によって正常なＭＭＣ耐性が回復する。
【０１６５】
ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２を発現するＰＤ２０Ｆ細胞を播種し、個々のサブクローンを単離した。１個のサブクローン（クローン７）が核内にＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２タンパク質を拡散して発現した（図４）。細胞をＩＲに曝露した後、これらの細胞は、核内に明瞭な緑色の病巣を形成した。したがって、これらの細胞はＦＡ／ＢＲＣＡ経路の拮抗薬及び作動薬のハイスループットスクリーニングのための理想的な手段である。
【０１６６】
ＩＩ．ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の低分子生物活性制御因子を同定するためのＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２発現繊維芽細胞の使用
ＩＣＣＢ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）と呼ばれるＨａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌの主要施設でスクリーニング試験は確立された。このスクリーニング測定法の一般的原理を図５に示す。
【０１６７】
低分子輸送ロボットは３８４個の細胞組織培養プレートに播種したクローン７繊維芽細胞に化合物を輸送する。２００，０００個を上回る低分子を含むいくつかの市販のライブラリーが有用である。ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の阻害剤は、ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２病巣形成を阻止することが予測され、経路の作動薬は病巣形成を促進する。
【０１６８】
測定法の具体的な詳細は図６に説明する。示したように、播種した細胞は、電離放射線で刺激する前に化合物と予備インキュベーションする（濃度約４０マイクロモルで１２時間）。この方法の重要な特徴は、２次スクリーニングの使用である（図６、ポイント番号８）。ＦＡＮＣＤ２病巣形成を阻害または活性化する（すなわち、相乗作用する）ことが最初に発見された化合物は、その後低用量範囲（１〜２０マイクロモルの範囲）でスクリーニングされ、２種類の測定法、（１）ＦＡＮＣＤ２病巣の形成及び（２）ＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化の活性化でスクリーニングされる（ウェスタンブロットスクリーニング）。この２次スクリーンニングを経た化合物は次に、シスプラチンの細胞毒性作用に対してＨｅＬａ細胞を化学物質感受性にするその能力について調べる（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ  ９：５６８〜５７４）。
【０１６９】
ＩＩＩ．ＦＡＮＣＤ２経路を阻害または活性化する特異的化合物の同定
スクリーニング測定法による個々の細胞の顕微鏡写真を図７に示す。最初に、約１０００個の既知の生物活性化合物をスクリーニングした。電離放射線（ＩＲ）などの遺伝毒性物質に対する曝露によって形成される病巣の数及び大きさを少なくとも１０％、たとえば、１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、または１００％まで減少させる薬剤は、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を阻害する薬剤であることが示される。他のスクリーニングにおいて、遺伝毒性物質に対する曝露がない場合に、曝露していない対照細胞に対してＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成について少なくとも１０％、たとえば、１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、１００％、２００％、または５００％の増加を引き起こす薬剤は、ＦＡＮＣＤ２含有病巣の形成を活性化する薬剤として示される。これらの化合物の非常に多くは、クローン７細胞がＩＲ曝露後にＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２病巣を形成する能力に対して影響を及ぼさなかった。少なくとも３個の関連化合物が最初のスクリーニングで得られ、２個はこの経路の阻害剤として機能し、１個はこの経路の活性化剤として機能した。
【０１７０】
Ａ）ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の阻害剤
ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の１つの阻害剤は、化合物ウォルトマニンであった。ウォルトマニンは、ＤＮＡ損傷応答キナーゼ、ＡＴＭ及びＡＴＲの既知の阻害剤である。ＡＴＲキナーゼは、ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の上流成分で、この経路の分子センサー装置の一部として機能することが示された（以下の図８参照）。新規キナーゼ阻害剤が豊富な、化合物のより選択的なライブラリーを、これらの化合物のいずれかがＦＡ／ＢＲＣＡ経路の阻害剤として特異的に作用するかどうかを決定するためにスクリーニングした。
【０１７１】
同定されたＦＡ／ＢＲＣＡ経路の他の阻害剤は、トリコスタチン−Ａであった。トリコスタチン−Ａは、ＨＤＡＣ（ヒストンデアセチラーゼ）として既知の広範な種類の酵素の既知の阻害剤である。ヒト細胞には少なくとも８種類の異なるＨＤＡＣ酵素がある。重要なことは、トリコスタチン−Ａ（Ｂｅｐｐｕら、（１９９０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６５、１７１７４〜９）及びＳＡＨＡ（Ｒｉｃｈｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．（１９９８）９５、３００３〜７）などのＨＤＡＣ阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍活性を有し、この種類の薬剤は現在、ヒト抗新生物薬の新たな種類として熱心に研究されている。
【０１７２】
ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の阻害剤としてのトリコスタチン−Ａの同定（及び確認）には、重要な意味がある。たとえば：
１）そのいくつかは癌患者において臨床試験がなされている、その他のＨＤＡＣ阻害剤は、現在、ＦＡ／ＢＲＣＡ経路を阻害する能力について直接試験することができる。実際、クローン７細胞におけるＦＡ／ＢＲＣＡ経路は新規ＨＤＡＣ阻害剤の有効性についての有用なバイオマーカーを提供しうる。
【０１７３】
２）ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞機能に対して広い影響を及ぼすが（ＤＮＡ修復、転写、及び有糸分裂誘発に影響を及ぼす）、実際にＦＡ／ＢＲＣＡ経路の崩壊は、所与のＨＤＡＣ阻害誘導体化合物の能力の評価において関連性のある「指標」となりうる。
【０１７４】
３）ＨＤＡＣ阻害剤は実際に、ＦＡ／ＢＲＣＡ経路によるＤＮＡ修復を阻害することによって、癌細胞の放射能増感剤及び化学増感剤として機能することができる。したがって、ＨＤＡＣ阻害剤は、放射線または細胞毒性ＤＮＡ損傷薬（すなわち、シスプラチン）と組み合わせて最も効果的に輸送することができる。
【０１７５】
Ｂ）ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の作動薬
デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）は、ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の作動薬として同定された。ＤＦＯは、ＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化及び病巣集合の強力な活性化剤である。ＤＦＯは、既知の鉄のキレート剤であり、細胞内の酸素ラジカルを減少させると考えられているが、ＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化及び病巣形成の活性化におけるその役割はまだ示されていない。
【０１７６】
実施例５  ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の分子センサー装置の決定
ＡＴＭ及びＡＴＲキナーゼの既知の阻害剤、ウォルトマニンは、ＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化及び病巣形成を阻止することが示された。したがって、この結果は、ＡＴＭ（またはＡＴＲ）がＦＡ／ＢＲＣＡ経路の上流で機能できることを示している。この仮説を試験するために、ｓｉＲＮＡによる方法を使用した（図８、Ａ、Ｂ）。ＡＴＲ、ＣＨＫ１、及びＲＰＡ１に特異的な阻害性ＲＮＡ分子（ＲＰＡ１は、ＡＴＲの既知の活性化剤であり、ＣＨＫ１はＡＴＲの既知の基質である）。興味深いことに、ＨｅＬａ細胞をこれらのｓｉＲＮＡ分子で一時的に形質導入すると、（１）ＭＭＣ誘導性及びＩＲ誘導性のＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化が減少し（図８）、（２）ＦＡＮＣＤ２病巣形成が減少し（示さず）、ＨｅＬａ細胞がＭＭＣに感作される（示さず）。この測定法（図８）の重要な特徴は、「Ｌ／Ｓ比」の算出である。この比は、ＦＡＮＣＤ２−Ｓバンドの濃度によって除したＦＡＮＣＤ２−Ｌバンドの濃度として算出される。これらのバンドの強度は、オートラジオグラフから直接測定される。たとえば、（図８Ａ）、ＭＭＣ活性化はＬ／Ｓ比を１．１７に増加させ、ＡＴＲのｓｉＲＮＡによるノックアウトはＬ／Ｓ比を０．４６（無単位値）に減少させる。
【０１７７】
これらの重要な観察に基づいて、タンパク質のＡＴＲ／ＲＰＡ１／ＣＨＫＩネットワークはＦＡ／ＢＲＣＡ経路の上流で作用することが明らかである（図９）。薬理学的操作によるこの経路の上流段階のいずれかの破壊は、その他の従来の抗新生物薬に対して癌細胞を潜在的に放射能感受性または化学物質感受性にすることができる。
【０１７８】
用途
本発明は、電離放射線などの遺伝毒性物質に対する生体対象の曝露の検出に有用である。さらに、本発明は、このような薬剤、たとえば、放射線治療に曝露する前に遺伝毒性物質に対する生体対象の感受性を測定するのに有用であり、感作した患者の過剰曝露の危険性を抑えるより個別化された治療を提供するのに有用である。本発明はまた、病巣形成の程度を変更する薬剤を同定するのに有用である。これらの薬剤は、遺伝毒性物質によって誘導されるＤＮＡ損傷に対する防御薬として有用であり、あるいは、化学療法薬と併用して使用する化学増感剤として有用でありうる。
【０１７９】
その他の実施形態
上記の明細書で記載した発行物はすべて、参照により本明細書に援用する。本発明で説明した方法及び系の様々な変更及び改変は、本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、当業者に明らかであろう。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連させて説明したが、特許請求した本発明はこのような具体的な実施形態に不当に制限されるべきではない。実際に、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するために説明した様式の様々な変更は、以下のクレームの範囲内にあるものとする。
【０１８０】
この項についての参考文献
DiTullio, R. A. , Jr. , Mochan, T. A. , Venere, M., Bartkova, J. , Sehested, M. , Bartek, J. , およびHalazonetis, T. D. (2002).53BP1 functions in an ATM-dependent checkpoint pathway that is constitutively activated in human cancer. Nat Cell Biol 4, 998-1002.
Garcia-Higuera, I., Taniguchi, T. , Ganesan, S. , Meyn, M. S., Timmers, C. , Hejna, J. , Grompe, M. , およびD'Andrea, A. D. (2001). Interaction of the Fanconi anemia proteins and BRCA1 in a common pathway. Mol Cell 7,249-262.
Lou, Z., Chin, C. C., Minter-Dykhouse, K. , およびChen, J. (2003). MDC1 regulates BRCA1 localization and phosphorylation in DNA damage checkpoint control. J Biol Chem.
Paull, T. T. , Rogakou, E. P. , Yamazaki, V. , Kirchgessner, C. U. , Gellert, M. , およびBonner, W.M. (2000). A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Curr Biol 10, 886-895.
Scully, R., Chen, J., Ochs, R. L., Keegan, K., Hoekstra, M. , Feunteun, J. , およびLivingston, D.M. (1997a). Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and phosphorylation state are initiated by DNA damage. Cell 90, 425-435.
Scully, R., Chen, J., Plug, A., Xiao, Y., Weaver, D., Feunteun, J., Ashley, T., およびLivingston, D. M. (1997b). Association of BRCA1 with Rad51 in mitotic and meiotic cells. Cell 88, 265- 275.
Scully, R., Puget, N., およびVlasakova, K. (2000). DNA polymerase stalling, sister chromatid recombination and the BRCA genes. Oncogene 19, 6176-6183.
Stewart, G. S., Wang, B., Bignell, C. R., Taylor, A. M., およびElledge, S. J. (2003). MDC1 is a mediator of the mammalian DNA damage checkpoint. Nature 421, 961-966.
Taniguchi, T., Garcia-Higuera, I., Xu, B., Andreassen, P. R., Gregory, R. C., Kim, S. T., Lane, W. S., Kastan, M. B., およびD'Andrea, A. D. (2002). Convergence of the Fanconi anemia and ataxia telangiectasia signaling pathways. Cell 109, 459-472.
Wu, X., Petrini, J. H., Heine, W. F., Weaver, D. T., Livingston, D. M., およびChen, J. (2000). Independence of R/M/N focus formation and the presence of intact BRCA1. Science 289,11.
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】図１は、ＦＡＮＣＤ２に対するＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の融合の概略モデルを示した図である。ＦＡＮＣＤ２のアミノ末端メチオニン（ＭＥＴ）にＧＦＰが直接融合したものをコードするｃＤＮＡを生成した。哺乳動物細胞にこのｃＤＮＡを形質導入すると、レポーター測定法で機能を果たす融合タンパク質の発現が生じる。
【図２】図２は、ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２融合タンパク質は、形質導入したＦＡ−Ｄ２ヒト繊維芽細胞でモノユビキチン化することによって発現し活性化されることを示す。ＦＡＮＣＤ２欠損ヒト繊維芽細胞（ＰＤ２０Ｆ）は、示したように、形質導入されなかったか（レーン１）、野生型ＦＡＮＣＤ２  ｃＤＮＡで形質導入されたか（レーン２〜５）、又はＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２融合タンパク質をコードするｃＤＮＡで形質導入された（レーン６〜９）。あるいは、ＦＡ−Ａ繊維芽細胞（ＧＭ６９１４、レーン１１〜１４）又はＨｅＬａ細胞（レーン１６〜１９）は融合タンパク質をコードするｃＤＮＡで形質導入された。示したように、細胞は未処理であるか、または遺伝毒性ストレス（電離放射線）に曝露した。全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、細胞タンパク質をＦＡＮＣＤ２に対する抗血清でイムノブロッティングした。結論：ＤＮＡ損傷は、完全長（野生型）ＦＡＮＣＤ２タンパク質又はＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２融合タンパク質のモノユビキチン化の増加を、調整された細胞では活性化するが、ＦＡ細胞では活性化しない。
【図３】図３は、ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２融合タンパク質は、ＦＡＮＣＤ２欠損ヒト繊維芽細胞のマイトマイシンＣ過敏性を機能的に補うことを示した図である。ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２タンパク質を安定して発現する形質導入ＰＤ２０Ｆ細胞の、様々な濃度のＭＭＣにおける生存について分析した。結論：ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２は機能的であり、ＰＤ２０Ｆ細胞のＭＭＣ過敏性を修正する。したがって、アミノ末端のＧＦＰ部分は、細胞においてその機能を妨害しない。
【図４】図４は、生理学的濃度のＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２タンパク質を発現し、ハイスループット薬剤スクリーニングに適したＰＤ２０Ｆ繊維芽細胞クローンの単離を示した図である。ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２タンパク質を発現するサブクローン（クローン７）は、限界希釈によって単離された。電離放射線（ＩＲ）でこのクローンを活性化すると、明瞭な緑色の病巣の集合が生じ、細胞核の蛍光背景中で確認することができる。
【図５】図５は、ファンコニ貧血症／ＢＲＣＡ経路の阻害剤及び作動薬の一般的なスクリーニング方法を示した図である。安定してＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２タンパク質を発現するヒト繊維芽細胞（クローン７）を、３８４ウェルプレートで、強力な低分子阻害剤又は作動薬化合物に曝露する。これらの化合物を予備処理した後、プレートを照射してＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化及び病巣形成を活性化する。ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２は、ＦＡ−Ａ繊維芽細胞において安定して発現するとき、ＩＲ誘導性病巣を形成することができない。ＦＡ酵素複合体を迂回する低分子作動薬は、ＦＡ細胞において病巣形成を活性化する。このような薬剤は、ＦＡの適切な処置であり得る。したがって、ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２融合タンパク質を使用してこの経路の阻害剤又は作動薬をスクリーニングする。
【図６】図６は、ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の低分子阻害剤及び作動薬の同定方法の概略を示した図である。安定してＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２を発現するヒト繊維芽細胞を３８４ウェルプレートに播種して、化学物質ライブラリーで予備処理し、電離放射線に曝露する。ＧＦＰ病巣を計算し、この経路の阻害剤又は作動薬の同定を行う。
【図７】図７は、ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の阻害剤としてのウォルトマニン及びトリコスタチン−Ａの同定を示した図である。図６で概略を示した方法を使用して、１０００個を上回る独立した化合物を含有する化学物質ライブラリーをスクリーニングした。大部分の化合物は、ＩＲ誘導性ＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２病巣の形成に影響を及ぼさなかった。２種類の化合物（トリコスタチンＡ、既知のＨＤＡＣ阻害剤、及びウォルトマニン、既知のＡＴＲキナーゼ阻害剤）は、効果的に病巣形成を阻止した。これらの結果をもとにして、細胞性ＨＤＡＣ活性（すなわち、ヒストンデアセチラーゼ活性）及びＡＴＲキナーゼ活性は、ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の上流に必要であることが示唆される。トリコスタチン−Ａ及びウォルトマニンが病巣形成を阻害する能力は、その後、用量反応及び経時変化の研究（データを示さず）で確認された。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定におけるこれらの薬剤の活性から、これらの薬剤はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて放射線及び化学療法に対して腫瘍を化学物質感受性にすることが示唆される。
【図８】図８は、細胞情報伝達タンパク質ＡＴＲ、ＲＰＡ１、及びＣＨＫ１は、ＦＡ／ＢＲＣＡ情報伝達経路の上流に必要である。ウォルトマニンによってＧＦＰ−ＦＡＮＣＤ２病巣集合が阻害されることによって、ＲＰＡ１／ＡＴＲ／ＣＨＫ１経路はこの経路の上流にあるセンサーとして機能できることが示唆された。ＲＰＡ１／ＡＴＲ／ＣＨＫ１経路を遮断するために、ｓｉＲＮＡ阻害が使用された。ＲＰＡ１、ＡＴＲ、またはＣＨＫ１をｓｉＲＮＡで一時的に形質導入すると、対応する細胞性タンパク質の発現の欠如が生じた。興味深いことに、ＦＡＮＣＤ２−Ｌ／ＦＡＮＣＤ２−Ｓ比の減少によって判断されるように、これらの処理細胞では、ＦＡＮＣＤ２のＭＭＣ（Ａ）及びＩＲ（Ｂ）誘導性モノユビキチン化が減少していた。ＦＡＮＣＡ遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡで細胞を形質導入した（レーン９、１０）。ＦＡＮＣＡに対してｓｉＲＮＡがＦＡＮＣＡ発現を減少させ（示さず）、ＦＡＮＣＤ２−Ｌ／ＦＡＮＣＤ２−Ｓ比を減少させたことは、ＦＡＮＣＡがＦＡ経路の上流で作用することをさらに示している。
【図９】図９は、ＦＡ／ＢＲＣＡ経路モデルの概略を示した図で、上流のＲＰＡ１／ＡＴＲ／ＣＨＫ１センサー装置を示す。ＦＡ／ＢＲＣＡ経路のその他の上流タンパク質を同定するために、ｓｉＲＮＡ阻害による一般的な取り組みを使用する。これらの上流標的のいずれかを阻害（たとえば、ウォルトマニンによってＡＴＲを阻害）することは、この経路の潜在的なノックアウト機構であり、シスプラチンまたはＩＲに対してヒト腫瘍細胞を感作する。
【図１０】図１０は、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化（活性化）アイソフォームに特異的なモノクローナル抗体の作製を示した図である。ヒトＦＡＮＣＤ２（アミノ酸５５４〜５６６）の内部領域に対応する１３個のアミノ酸ペプチドを作製した。このペプチドは、モノユビキチン化部位であるリジン５６１を含有する。ガンマペプチド結合を介して、ユビキチンのカルボキシル末端に対応する７個のアミノ酸ペプチド（ＧＧＲＬＲＬＣ）（配列番号３）をＫ５６１に結合させた。次に、この抗原をＫＬＨに結合させ、マウスの免疫化に使用した。結合抗原に対して血清反応を生じたマウスを殺処分し、モノクローナル抗体の作製のために脾細胞融合を実施した。
【図１１】図１１は、モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２に特異的なモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマの作製を示した図である。脾細胞融合の後、マウスハイブリドーマをサブクローニングして、ウェスタンブロット分析によって、モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２を認識する能力について上清を分析した。イムノブロットによって、モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２を特異的に認識するが、改変していないＦＡＮＣＤ２は認識しない６個のハイブリドーマを同定した。モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２に対する抗体は、放射線曝露によって活性化された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の迅速なＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）スクリーニングを提供する。
【図１２】図１２は、ＩＲ後のＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化の用量依存的生成を示した図である。対数増殖ＨｅＬａ細胞は、未処理か、又は表示したＩＲ線量に曝露した。４時間後、抗ＦＡＮＣＤ２ウェスタンブロッティングによって細胞を処理した。ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化のある程度の活性化が低線量範囲（０〜５Ｇｙ範囲の照射）のＩＲで認めることができることに注意されたい。
【図１３】図１３は、遺伝毒性ストレス後のＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化及びＦＡＮＣＤ２病巣形成の用量依存的及び時間経過依存的生成を示した図である。対数増殖するＨｅＬａ細胞を未処理か、又は表示した遺伝毒性物質（マイトマイシンＣ、ガンマ放射線、または紫外線）に曝露し、ウェスタンブロッティングによって処理するか（パネルＡ、Ｂ、Ｃ）、又は抗ＦＡＮＣＤ２ポリクローナル抗体（Ｅ３５）で免疫蛍光法（パネルＤ）によって処理した。
【図１】
2007521811.tif 000003
【図２】
2007521811.tif 000004
【図３】
2007521811.tif 000005
【図４】
2007521811.tif 000006
【図５】
2007521811.tif 000007
【図６】
2007521811.tif 000008
【図７】
2007521811.tif 000009
【図８Ａ】
2007521811.tif 000010
【図８Ｂ】
2007521811.tif 000011
【図９】
2007521811.tif 000012
【図１０】
2007521811.tif 000013
【図１１】
2007521811.tif 000014
【図１２】
2007521811.tif 000015
【図１３】
2007521811.tif 000016
【配列表】
2007521811000001.app
【国際調査報告】
2007521811.tif 000017
2007521811.tif 000018