(57)【要約】本発明は、リポソームおよびリポソームを含む組成物、その生成、ならびに増殖性疾患、伝染病、血管疾患、リウマチ病、炎症性疾患、免疫疾患、およびアレルギーを予防し治療するための使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームの全モル脂質組成物に対して、
ａ）２０ｍｏl％〜６０ｍｏl％のコレステロール（ＣＨ）、および
ｂ）２０ｍｏl％〜５０ｍｏl％のホスファチジルセリン（ＰＳ）、２０ｍｏl％〜５０ｍｏl％のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、および２０ｍｏl％〜５０ｍｏl％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）からなる群から選択される少なくとも２種の成分、
ｃ）少なくとも一種の治療剤、ならびに／あるいは少なくとも一種の診断剤
を含むリポソーム。
【請求項２】
リポソームの全モル脂質組成物に対して、ＣＨ、ＰＳ、ＰＧ、および／またはＰＥがモル比で３０ｍｏl％〜３６ｍｏl％存在する、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記リポソームの残りの脂質が、グリセリド、グリセロリン脂質、グリセロホスフィノ脂質、グリセロホスホノ脂質、スルホ脂質、スフィンゴ脂質、リン脂質、イソプレノリド、ステロイド、ステアリン、ステロール、および脂質を含む炭水化物からなる群から選択される、請求項１または２に記載のリポソーム。
【請求項４】
前記残りのリン脂質が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）またはＰＥである、請求項１〜３の一項に記載のリポソーム。
【請求項５】
ＰＳが、パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイルリノエオイルホスファチジルセリン、パルミトイルアラキドノイルホスファチジルセリン、パルミトイルドコサヘキサエノイルホスファチジルセリン、ステアロイルオレオイルホスファチジルセリン、ステアロイルリノレオイルホスファチジルセリン、ステアロイルアラキドノイルホスファチジルセリン、ステアロイルドコサヘキサエノイルホスファチジルセリン、ジカプリルホスファチジルセリン、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジフィタノイルホスファチジルセリン、ジヘプタデカノイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホスファチジルセリンジエルコイルホスファチジルセリン、ジドコサヘキサエノイルホスパチジルセリン、脳由来ＰＳ、および大豆由来ＰＳからなる群から選択され、
ＰＧが、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルリノレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルアラキドノイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルドコサヘキサエノイルホスファチジルグリセロール、ステアロイルオレオイルホスファチジルグリセロール、ステアロイルリノレオイルホスファチジルグリセロール、ステアロイルアラキドノイルホスファチジルグリセロール、ステアロイルドコサヘキサエノイルホスファチジルグリセロール、ジカプリルホスファチジルグリセロールジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジヘプタデカノイルホスファチジルグリセロール、ジフィタノイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジエライドイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノエオイルホスファチジルグリセロール、ジアラキドノイルホスファチジルグリセロール、ドコサヘキサエノイルホスファチジルグリセロール、および卵由来ＰＧからなる群から選択され、ならびに／あるいは
ＰＥが、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルアラキドノイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルアラキドノイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジヘプタデカノイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノエオイルホスファチジルグリセロール、ジアラキドノイルホスファチジルエタノールアミン、ドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミン、細菌由来ＰＥ、心臓由来ＰＥ、脳由来ＰＥ、肝臓由来ＰＥ、卵由来ＰＥ、および大豆由来ＰＥからなる群から選択される、請求項１〜４の一項に記載のリポソーム。
【請求項６】
前記脂質組成物の脂質が、本質的に、ＣＨ、ＰＳ、およびＰＧ；ＣＨ、ＰＳ、およびＰＥ；ＣＨ、ＰＧ、およびＰＥ；あるいはＣＨ、ＰＧ、ＰＳ、およびＰＥからなる、請求項１〜５の一項に記載のリポソーム。
【請求項７】
治療剤が、薬物、アジュバント、または抗原からなる群から選択される、請求項１〜６の一項に記載のリポソーム。
【請求項８】
少なくとも一種のアジュバントと、少なくとも一種の抗原を含む、請求項１〜７の一項に記載のリポソーム。
【請求項９】
前記抗原が、腫瘍抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、細菌抗原、自己免疫抗原、またはアレルゲンである、請求項７または８に記載のリポソーム。
【請求項１０】
前記腫瘍抗原が、変異または組換え細胞遺伝子の特有遺伝子産物に属するＴ細胞限定癌関連抗原、特に、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、ｐ５３、ＡＦＰ、β‐カテニン、カスパーゼ８、ｐ５３、ｐ２１Ｒａｓ変異、Ｂｃｒ‐ａｂｌ融合産物、ＭＵＭ‐１ＭＵＭ‐２、ＭＵＭ‐３、ＥＬＦ２Ｍ、ＨＳＰ７０‐２Ｍ、ＨＳＴ‐２、ＫＩＡＡ０２０５、ＲＡＧＥ、ミオシン／ｍ、７０７‐ＡＰ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＴＥＬ／Ａｍｌ１、デカイン、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ‐ＲＡＲα、ＴＥＬ／ＡＭＬＩ；癌精巣（ＣＴ）抗原、特に、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１、ＭＡＧＥファミリーのメンバー（ＭＡＧＥ‐Ａ１、ＭＡＧＥ‐Ａ２、ＭＡＧＥ‐Ａ３、ＭＡＧＥ‐Ａ４、ＭＡＧＥ‐Ａ６ＭＡＧＥ‐１０、ＭＡＧＥ‐１２）、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ‐６、ＤＡＭ‐１０、ＧＡＧＥファミリーのメンバー（ＧＡＧＥ‐１、ＧＡＧＥ‐２、ＧＡＧＥ‐３、ＧＡＧＥ‐４、ＧＡＧＥ‐５、ＧＡＧＥ‐６、ＧＡＧＥ‐７Ｂ、ＧＡＧＥ‐８）、ＮＡ‐８８Ａ、ＣＡＧ‐３、ＲＣＣ関連抗原Ｇ２５０；腫瘍ウイルス抗原、特に、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来Ｅ６  Ｅ７腫瘍性タンパク質、エプスタイン‐バーウイルスＥＢＮＡ２‐６、ＬＭＰ‐１、ＬＭＰ‐２；過剰発現抗原または組織特異的分化抗原、特に、ｇｐ７７、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ‐１／メラン‐Ａ、ｐ５３、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ‐１およびＴＰＲ‐２）、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＭＣ１Ｒ；広範に発現した抗原、特に、ＡＲＴ４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、ＣｙｐＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、ＰＲＡＭＥＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ‐１、ＳＡＲＴ‐２、ＳＡＲＴ‐３、およびＷＴ１、ならびにそれらの断片および誘導体にからなる群から選択される、請求項９に記載のリポソーム。
【請求項１１】
前記ウイルス抗原が、レトロウイルス科、特に、ＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐ＬＰ；ピコルナウイルス科、特に、ポリオウイルスおよび肝炎Ａウイルス；エンテロウイルス、特に、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス；カルシウイルス科、特に胃腸炎を引き起こす株；トガウイルス科、特に、ウマ脳炎ウイルスおよび風疹ウイルス；フラウイルス科、特に、デングウイルス、脳炎ウイルス、および黄熱病ウイルス；コロナウイルス科、特にコロナウイルス；ラブドウイルス科、特に、水泡性口内炎ウイルスおよび狂犬病ウイルス；フィロウイルス科、特に、エボラウイルスまたはおよびマールブルグウイルス；パラミクソウイルス、特に、パラインフルエンザウイルス、耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、および呼吸器合胞体ウイルス；オルトミクソウイルス科、特にインフルエンザウイルス；ブンガウイルス科、特に、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス；アレナウイルス科、特に出血熱ウイルス；レオウイルス科、特に、レオウイルス、オルビウイルス、およびロータウイルス；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科、特にＢ型肝炎ウイルス；パルボウイルス科、特にパルボウイルス；パポーバウイルス科、特に、乳頭腫ウイルス、サルウイルス‐４０（ＳＶ４０）およびポリオーマウイルス；アデノウイルス科；ヘルペスウイルス科、特に、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科、特に、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、およびポックスウイルス；およびイリドウイルス科、特にアフリカブタ熱ウイルス；ならびにＣ型肝炎からなるウイルス群から選択されるウイルスに由来する、請求項９に記載のリポソーム。
【請求項１２】
前記真菌抗原が、クリプトコックス種、特にクリプトコックスネオフォルマンス、ヒストプラスマ種、特にヒストプラスマカプスラーツム、コクシジオイデス種、特にコクシジオイデスイミティス、ブラストミセス種、特にブラストミセスデルマティティジス、クラミジア種、特にクラミジアトラコマティス、およびカンジダ種、特にカンジダアルビカンスからなる群から選択される真菌に由来する、請求項９に記載のリポソーム。
【請求項１３】
前記細菌抗原が、ヘリコバクター種、特にピロリ菌；ボレリア種、特にボレリアブルグドルフェリ；レジオネラ種、特にレジオネラニューモフィラ；マイコバクテリア種、特に、結核菌、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラール、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．ゴルドナ；ブドウ球菌種、特に黄色ブドウ球菌；ナイセリア種、特に淋菌、髄膜炎菌；リステリア種、特にリステリアモノサイトゲネス；レンサ球菌種、特に、化膿レンサ球菌、Ｂ群レンサ球菌；Ｓ．フェーカリス；Ｓ．ボビス、肺炎球菌；嫌気性レンサ球菌種；病原性カンピロバクター種；腸球菌種；ヘモフィルス種、特にインフルエンザ菌；バシラス種、特に炭疽菌；コリネバクテリウム種、特にジフテリア菌；エリシペロトリックス種、特に豚丹毒菌；クロストリジウム種、特にＣ．ペルフリンゲンス、破傷風菌；エンテロバクター種、特にエンテロバクターアエロゲネス、クレブシエラ種、特に肺炎桿菌、パスツレラ種、特にパスツレラムルトシダ、バクテロイド種；フソバクテリウム種、特にフソバクテリウムヌクレアツム；ストレプトバシルス種、特にストレプトバシルスモニリホルミス；トレポネーマ種、特にトレポネーマペルテヌ；レプトスピラ；病原性エシェリキア種；および放線菌種、特に放線菌イスラエリからなる群から選択される細菌に由来する、請求項９に記載のリポソーム。
【請求項１４】
前期薬物が、鎮痛薬、抗リウマチ薬、駆虫薬、抗アレルギー薬、抗貧血薬、抗不整脈薬、抗生物質、血管新生阻害薬、抗感染薬、抗痴呆薬（向知性薬）、抗糖尿病薬、解毒薬、制吐薬、抗眩暈薬、抗てんかん薬、止血薬、抗高浸透圧薬、抗低浸透圧薬、抗凝血剤、抗真菌剤、鎮咳薬、抗ウイルス剤、β‐受容体およびカルシウムチャンネル拮抗薬、気管支溶解剤および抗喘息薬、ケモカイン、サイトカイン、特に免疫調節サイトカイン、分裂促進因子、細胞分裂停止薬、細胞傷害性薬剤およびそのプロドラッグ、皮膚薬、催眠薬および鎮静薬、免疫抑制剤、免疫賦活薬、特に、ＮＦ‐кＢアクチベータ、ＭＡＰキナーゼ、ＳＴＡＴタンパク質、ならびに／あるいはタンパク質リン酸化酵素Ｂ／Ａｋｔ；ペプチドもしくはタンパク質薬物、特にホルモン、生理学的もしくは薬理学的分裂促進因子阻害薬、ケモカイン、サイトカイン、あるいはそのそれぞれのプロドラッグからなる群から選択される、請求項７に記載のリポソーム。
【請求項１５】
前記アジュバントが、非メチル化ＤＮＡ、特にＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフ）を含む非メチル化ＤＮＡ、特にホスホロチオ酸（ＰＴＯ）主鎖を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＴＯ  ＯＤＮ）またはリン酸ジエステル（ＰＯ）主鎖を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＯ  ＯＤＮ）；水酸化アルミニウム（ミョウバン）のゲル様沈殿物；グラム陰性菌外膜由来細菌産物、特にモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ムラミルジペプチド、およびそれらの誘導体；合成リポペプチド誘導体、特にＰａｍ３Ｃｙｓ；リポアラビノマンナン；ペプチドグリカン；ザイモサン；熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、特にＨＳＰ  ７０；ｄｓＲＮＡおよびその合成誘導体、特にポリＩ：ポリＣ；ポリカチオンペプチド、特にポリ‐Ｌ‐アルギニン；タキソール；フィブロネクチン；フラジェリン；イミダゾキノリン；アジュバント活性を有するサイトカイン、特にＧＭ‐ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ‐）２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１８、インターフェロンＩ型およびＩＩ型、特にインターフェロン‐γ、ＴＮＦ‐α；水中油滴型乳濁液、特にスクアレンからなるＭＦ５９；Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタン‐トリオレアート）、およびＱＳ‐２１、非イオン性ブロックポリマー、特にポロクサマー４０１、サポニンおよびその誘導体；ポリホスファゼン；Ｎ‐（２‐デオキシ‐２‐Ｌ‐ロイシルアミノ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル）‐Ｎ‐オクタデシルドデカノイルアミドヒドロアセタート（ＢＡＹ  Ｒ１００５）、１α、２５‐ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）；ＤＨＥＡ；ムラメチド［ＭＤＰ（Ｇｌｎ）‐ＯＭｅ］；ムラパルミチン；乳酸ならびに／あるいはグリコール酸ポリマー；ポリメタクリル酸メチル；ソルビタントリオレアート；スクワラン；ステアリルチロシン；スクアレン；テルアミド、合成オリゴペプチド、特にＭＨＣクラスＩＩによって提示されるペプチドからなる群から選択される、請求項７〜１４の一項に記載のリポソーム。
【請求項１６】
前記診断剤が、高電子密度分子、常磁性分子、超常磁性分子、放射性分子、非放射性同位元素、および蛍光分子からなる群から選択される、請求項１〜１５の一項に記載のリポソーム。
【請求項１７】
治療剤または診断剤のモル量：全脂質のモル量の比が１：１００〜１：１０であり、好ましくは１：５０〜１：２０である、請求項１〜１６の一項に記載のリポソーム。
【請求項１８】
前記リポソームの直径が５０〜２００ｎｍであり、好ましくは８０〜１５０ｎｍである、請求項１〜１７の一項に記載のリポソーム。
【請求項１９】
前記リポソームの表面電荷が陰性である、請求項１〜１８の一項に記載のリポソーム。
【請求項２０】
標的部分が、前記リポソームに取り付けられる、請求項１〜１９の一項に記載のリポソーム。
【請求項２１】
乾燥、好ましくは凍結乾燥されている、請求項１〜２０の一項に記載のリポソーム。
【請求項２２】
請求項１〜２１の一項に記載のリポソームを生成する方法であって、
ａ）ＣＨ、ならびにＰＳ、ＰＧ、およびＰＥからなる群から選択される少なくとも２種の成分を含む脂質、一種もしくは複数の治療剤および／または診断剤、ならびに液体媒体の懸濁液を形成するステップ、および
ｂ）懸濁液を均質化するステップ
を含む方法。
【請求項２３】
前記治療剤および／または前記診断剤および／または前記脂質が、本質的に液体媒体に溶解しない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記液体媒体が、Ｈ２０、塩水溶液、および緩衝液からなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２２〜２４の一項に記載の方法によって生成されたリポソーム。
【請求項２６】
請求項１〜２１または請求項２５のリポソーム、ならびにアジュバント、添加剤、緩衝液、および補助物質からなる群から選択される少なくとも一種の別の成分を含むリポソーム組成物。
【請求項２７】
前記アジュバントが、非メチル化ＤＮＡ、特にＣｐＧジヌクレオチドを含む非メチル化ＤＮＡ、特にＣｐＧ  ＰＴＯ  ＯＤＮまたはＣｐＧ  ＰＯ  ＯＤＮ；ミョウバン；グラム陰性菌外膜由来細菌産物、特にＭＰＬＡ、リポ多糖（ＬＰＳ）、ムラミルジペプチド、およびそれらの誘導体；合成リポペプチド誘導体、特にＰａｍ３Ｃｙｓ；リポアラビノマンナン；ペプチドグリカン；ザイモサン；ＨＳＰ、特にＨＳＰ  ７０；ｄｓＲＮＡおよびその合成誘導体、特にポリＩ：ポリＣ；ポリカチオンペプチド、特にポリ‐Ｌ‐アルギニン；タキソール；フィブロネクチン；フラジェリン；イミダゾキノリン；アジュバント活性を有するサイトカイン、特に、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１８、インターフェロンＩ型およびＩＩ型、特に、インターフェロン‐γ、ＴＮＦ‐α；水中油滴型乳濁液、特にスクアレンからなるＭＦ５９；Ｔｗｅｅｎ  ８０およびＳｐａｎ  ８５およびＱＳ‐２１、非イオン性ブロックポリマー、特にポロクサマー４０１、サポニンおよびその誘導体、ポリホスファゼン；ＢＡＹ  Ｒ１００５、カルシトリオール；ＤＨＥＡ；ムラメチド［ＭＤＰ（Ｇｌｎ）‐ＯＭｅ］；ムラパルミチン；乳酸ならびに／あるいはグリコール酸ポリマー；ポリメタクリル酸メチル；ソルビタントリオレアート；スクワラン；ステアリルチロシン；スクアレン；テルアミド、合成オリゴペプチド、特にＭＨＣクラスＩＩによって提示されるペプチドからなるアジュバントの群から選択される、請求項２６に記載のリポソーム組成物。
【請求項２８】
増殖性疾患、伝染病、血管疾患、リウマチ病、炎症性疾患、免疫疾患、およびアレルギーの予防用または治療用薬物を生成するための請求項１〜２１または請求項２５の一項に記載のリポソームもしくは請求項３１または３２に記載のリポソーム組成物の使用。
【請求項２９】
増殖性疾患が、胃腸路癌もしくは結腸直腸路癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、精巣癌、黒色腫、口腔粘膜異形成、浸潤性口腔癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、ホルモン依存性乳癌、ホルモン非依存性乳癌、移行細胞癌および扁平上皮細胞癌、神経芽細胞腫を含む神経系悪性腫瘍、グリア細胞腫、星細胞腫、骨肉腫、柔組織肉腫、血管腫、内分泌腫瘍、白血病を含む血液異常増殖、リンパ腫、他の骨髄増殖性疾患およびリンパ球増殖性疾患、上皮内癌、過形成病変、腺腫、線維腫、組織球増殖症、慢性炎症性増殖性疾患、血管増殖性疾患、ならびにウイルス誘発増殖性疾患からなる群から選択される請求項２８の使用。
【請求項３０】
アジュバントおよび／またはサイトカインが、リポソームまたはリポソーム組成物の投与前、投与と同時に、または投与後に投与される、請求項２８または２９の使用。
【請求項３１】
前記アジュバントが、非メチル化ＤＮＡ、特に非メチル化ＤＮＡ、特にＣｐＧジヌクレオチドを含む非メチル化ＤＮＡ、特にＣｐＧ  ＰＴＯ  ＯＤＮまたはＣｐＧ  ＰＯ  ＯＤＮ；ミョウバン；グラム陰性菌外膜由来細菌産物、特にＭＰＬＡ、リポ多糖（ＬＰＳ）、ムラミルジペプチド、およびそれらの誘導体；合成リポペプチド誘導体、特にＰａｍ３Ｃｙｓ；リポアラビノマンナン；ペプチドグリカン；ザイモサン；ＨＳＰ、特にＨＳＰ  ７０；ｄｓＲＮＡおよびその合成誘導体、特にポリＩ：ポリＣ；ポリカチオンペプチド、特にポリ‐Ｌ‐アルギニン；タキソール；フィブロネクチン；フラジェリン；イミダゾキノリン；アジュバント活性を有するサイトカイン、特にＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１８、インターフェロンＩ型およびＩＩ型、特にインターフェロン‐γ、ＴＮＦ‐α；水中油滴型乳濁液、特にスクアレンからなるＭＦ５９；Ｔｗｅｅｎ  ８０およびＳｐａｎ  ８５およびＱＳ‐２１、非イオン性ブロックポリマー、特にポロクサマー４０１、サポニンおよびその誘導体；ポリホスファゼン；ＢＡＹ  Ｒ１００５、カルシトリオール；ＤＨＥＡ；ムラメチド［ＭＤＰ（Ｇｌｎ）‐ＯＭｅ］；ムラパルミチン；乳酸および／またはグリコール酸ポリマー；ポリメタクリル酸メチル；ソルビタントリオレアート；スクワラン；ステアリルチロシン；スクアレン；テルアミド、合成オリゴペプチド、特にＭＨＣクラスＩＩによって提示されるペプチドからなるアジュバントの群から選択される、請求項３０の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソームおよびリポソームを含む組成物、その生成、ならびに増殖性疾患、伝染病、血管疾患、リウマチ病、炎症性疾患、免疫疾患、およびアレルギーを予防し治療するための使用に関する。このリポソームおよび組成物は、治療剤の送達、好ましくは抗原を造血系細胞に送達するのに特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
現在、ほとんどの治療薬は、フリーフォームで患者に投与されているが、このフリーフォームとは、溶液状であり、媒体に結合しない、または組み込まれていないことを意味する。用語「フリーフォーム」は、さらに、所与の治療剤の化学的誘導体および治療剤と形成され得る様々な付加塩を含む。しかし、特に治療剤と比較した場合、およびそのフリーフォームの抗原と比較した場合、投与送達媒体へ治療剤を取り付け、または治療剤を組み込むことによって利点が得られることが判明している。そのような媒体へ組み込みまたは取り付けることによって、所与の治療剤の全体的効力に作用する数種の要因に有利な影響を与えることができる。これらの要因には、組織特異的分配、特に当該組織中または疾患部位への優先的な蓄積、特定の細胞型への薬物または抗原のターゲティング、特に抗原提示造血細胞、例えば、樹状細胞（ＤＣ）やランゲルハンス細胞（ＬＣ）などによって取り込んだ抗原を送達するためのターゲティングが含まれる。様々な送達媒体の適合性を比較したとき、上記要因も重要ではあるが、そのような送達媒体のうち、媒体からの治療剤に特徴的な放出などの要因もその効力に重要なものとなる。
【０００３】
これらの要因の全ては、所与の治療剤の効力の改善の可能性にある程度寄与するが、そのような送達媒体に結合させ、または組み込んだ場合、新規な送達媒体に関する究極の試験は、その「フリーフォーム」の治療剤と比較した、または別の媒体と比較した、疾患動物モデルまたは患者にけるその効力である。
【０００４】
近年注目を浴びている送達媒体の一つの型は、リポソームおよびリポソーム製剤である。用語「リポソーム」は、概括的には、形成されたその脂質膜の数に応じて、水性内部を封入した単層または多層脂質構造体をさす。典型的には、リポソームは、治療剤を搭載することができ、すなわち、治療剤をリポソーム内部にカプセル化し、および／または治療剤をリポソームに取り付けもしくは脂質二重層中に組み込むことができる。そのようなリポソーム製剤は、フリーの薬物と比較して効力が増大することが示されている。例えば、ビンカアルカロイドビンクリスチンを含むリポソーム製剤は、フリーのビンクリスチンと比較した場合、白血病細胞に対して効力が非常に高いが、全体的毒性が低いことも既に示されている（Mayer et al. (1993) Cancer Chemo. Pharmacol. 33: 17-24）。リポソームは、ほぼどんな脂質からでも形成することができるので、多様な異なるリポソーム製剤が当技術分野で知られている。しかし、所与の疾患に対する薬効における個々の脂質が有する作用だけでなく、２種以上の異なる脂質のどのモル比が脂質組成物の効力を改善し、かつ／または免疫応答を上昇させるかについてはほとんど分かっていない。
【０００５】
抗原およびアジュバントをリポソーム組成物に含めて投与することは従来技術に記載されている。Li et al. (2003) Vaccine, 21: 3319には、５ｍоｌ％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の有り無しで、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（ＣＨ）を等モル量で含むリポソームの使用について記載され、このリポソームはＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＨＥＲ‐２／ｎｅｕ由来ペプチドをさらに含む。フリーの抗原の使用と比べたとき、この製剤の免疫化は上昇することが示された。
【０００６】
Mui et al. (2001) J. Pharma. Exp. Therap., 298: 1185には、ＤＳＰＣ、ＣＨ、ＤＯＤＡＰ、およびミリストイルスフィンゴシンをモル比２０：４５：２５：１０で含むリポソーム中に、フリーのＣｐＧ  ＯＤＮをカプセル化したとき、免疫刺激の上昇を観察したと開示されている。
【０００７】
Lee et al. (1992) Biochimica Biophysica Acta, 1103: 185は、リポソームによる細胞認識、すなわち、認識時のリポソームの細胞型特異性、特異的脂質頭基の影響、および表面電荷密度について研究した。彼らは、９ｍоｌ％までのホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、またはホスファチジン酸（ＰＡ）のいずれかが存在すると、アフリカザルの腎細胞へのリポソームの結合が増大することを結論付け、このリポソームはその他の点では、ＰＣおよびコレステロールをモル比で２：１含有していた。しかし、彼らは、ＰＳ、ＰＧ、ＰＡのいずれかをさらに上昇させても、これらの細胞への特異的結合は改善されなかったとも記載している。
【０００８】
Ludewig et al. (2000) Vaccine 19: 23は、リポソームペプチドワクチンによる生体内での抗原の搭載およびＤＣの活性化、ならびに得られた抗ウイルス免疫および抗腫瘍免疫について説明している。使用されたリポソームは、モル比で５：１のＰＣとコレステロールの混合物、および免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む。
【０００９】
Agrita et al. (2003) Infection and Immunity 71: 5210には、リポソームとＤＣの相互作用を改善する標的法が記載されている。使用されたリポソームには、ＰＣ、ＰＳ、コレステロールがモル比８：２：２で、またはＰＣ：ＰＧ：コレステロールが同モル比で含まれていた。ワクチンに対する高い免疫応答が示された。
【非特許文献１】Mayer et al. (1993) Cancer Chemo. Pharmacol. 33: 17-24
【非特許文献２】Li et al. (2003) Vaccine, 21: 3319
【非特許文献３】Mui et al. (2001) J. Pharma. Exp. Therap., 298: 1185
【非特許文献４】Lee et al. (1992) Biochimica Biophysica Acta, 1103: 185
【非特許文献５】Ludewig et al. (2000) Vaccine 19: 23
【非特許文献６】Agrita et al. (2003) Infection and Immunity 71: 5210
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、送達媒体として所与のリポソームの適合性、特に、抗原提示に関与する造血細胞系細胞に抗原を送達するための適合性に影響を及ぼす要因は未だ不明である。従って、効力を改善し、特に造血系細胞への送達を改善する送達媒体も依然として必要とされている。そのような送達の改善は、例えば、抗原やアジュバントなどを刺激し、かつ／または免疫応答を引き出す分子の投与に特有のものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、コレステロール（ＣＨ）を一定の範囲で含み、さらに２種の負荷電脂質、すなわち、ＰＳおよびＰＧを一定の範囲で含むリポソーム、あるいは１種の負荷電脂質、すなわち、ＰＳもしくはＰＧ、およびＰＥを一定の範囲で含むリポソームは、ＣＨと共に、ＰＳ、ＰＧ、もしくはＰＥを含まない、またはＰＳ、ＰＧ、もしくはＰＥしか含まない従来技術のリポソームと比較した場合、造血系細胞、特に樹状細胞およびランゲルハンス細胞への結合が増大し、かつ／または高い免疫応答を引き出すことを発見している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
従って、本発明の一態様は、リポソームの全モル脂質組成物に対して、
ａ）ＣＨ２０ｍоｌ％〜６０ｍоｌ％、および
ｂ）２０ｍоｌ％〜５０ｍоｌ％のＰＳ、２０ｍоｌ％〜５０ｍоｌ％のＰＧ、および２０ｍоｌ％〜５０ｍоｌ％のＰＥの群から選択される少なくとも２種の成分、
ｃ）少なくとも一種の治療剤、および／または少なくとも一種の診断剤
を含むリポソームを提供することである。
【００１３】
他の脂質と関連して６０ｍоｌ％を超えるＣＨ濃度が、規則的な脂質二重層構造の形成に有害であることは判明しており、従って、ＣＨの含有量は６０％が本発明のリポソームの上限である。他方で、コレステロール濃度を２０ｍоｌ％未満に下げると、循環からのリポソームの排出速度が増加し、それによって所与の治療化合物の生物学的半減期が減少すると思われる。好ましい実施形態では、リポソームの全モル脂質組成物に対して、ＣＨが、モル比で約２３〜約４２ｍоｌ％で存在し、より好ましくは約２６〜約３９ｍоｌ％、さらにいっそう好ましくは約３０〜約３６ｍоｌ％、最も好ましくは約３２〜約３４ｍоｌ％存在する。
【００１４】
本発明のリポソームの好ましい実施形態では、ＰＳはリポソームの全モル脂質組成物に対して、モル比で約２３〜約４２ｍоｌ％存在し、より好ましくは約２６〜約３９ｍоｌ％、さらにいっそう好ましくは約３０〜約３６ｍоｌ％、最も好ましくは約３２〜約３４ｍоｌ％存在する。
【００１５】
本発明のリポソームの好ましい実施形態では、ＰＧは、リポソームの全モル脂質組成物に対して、モル比で約２３〜約４２ｍоｌ％存在し、より好ましくは約２６〜約３９ｍоｌ％、さらにいっそう好ましくは約３０〜約３６ｍоｌ％、最も好ましくは約３２〜約３４ｍоｌ％存在する。
【００１６】
発明のリポソームの好ましい実施形態では、ＰＥはリポソームの全モル脂質組成物に対して、モル比で約２３〜約４２ｍоｌ％存在し、より好ましくは約２６〜約３９ｍоｌ％、さらにいっそう好ましくは約３０〜約３６ｍоｌ％、最も好ましくは約３２〜約３４ｍоｌ％存在する。
【００１７】
特定の好ましい実施形態では、全モル脂質組成物に対して、リポソームは、ＣＨおよびＰＳおよびＰＧのそれぞれを約２３〜約４２ｍоｌ％含み、より好ましくは約２６〜約３９ｍоｌ％、さらにいっそう好ましくは約３０〜約３６ｍоｌ％、最も好ましくは約３２〜約３４ｍоｌ％含む。
【００１８】
特定の好ましい実施形態では、全モル脂質組成物に対して、リポソームは、ＣＨおよびＰＳおよびＰＥのそれぞれを約２３〜約４２ｍоｌ％含み、より好ましくは約２６〜約３９ｍоｌ％、さらにいっそう好ましくは約３０〜約３６ｍоｌ％、最も好ましくは約３２〜約３４ｍоｌ％含む。
【００１９】
特定の好ましい実施形態では、全モル脂質組成物に対して、リポソームは、ＣＨおよびＰＧおよびＰＥのそれぞれを約２３〜約４２ｍоｌ％含み、より好ましくは約２６〜約３９ｍоｌ％、さらにいっそう好ましくは約３０〜約３６ｍоｌ％、最も好ましくは約３２〜約３４ｍоｌ％含む。
【００２０】
脂質残部、すなわち事例によっては、ＣＨ、ＰＳ、およびＰＧ；ＣＨ、ＰＳ、およびＰＥ；またはＣＨ、ＰＧ、およびＰＥのいずれでもなく、かつ加えて１００ｍоｌ％にするのに必要な脂質の量は、どんな脂質からなっていてもよい。ここでおよび本発明全体にわたって使用する用語「脂質」は、脂肪特性または脂肪様特性を有するどんな物質をもさす。一般に、脂質は、長い無極性残基（Ｘ）と、通常、水溶性極性親水性残基（Ｙ）を含み、この脂質は以下の基本式によって特徴付けることができる。
Ｘ‐Ｙｎ
【００２１】
式中、ｎは０以上である。ｎ＝０の脂質は「無極性脂質」と称し、ｎ≧１の脂質は「極性脂質」と称する。本発明の好ましいリポソームの脂質残部を構成することができる脂質は、グリセリド、グリセロリン脂質、グリセロホスフィノ脂質、グリセロホスホノ脂質、スルホ脂質、スフィンゴ脂質、リン脂質、イソプレノリド、ステロイド、ステアリン、ステロール、および脂質を含む炭水化物からなる群から選択される。
【００２２】
これらの脂質の中で、脂質残部は一種または複数のリン脂質を含むのが好ましい。そのリン脂質は、ＰＣおよびＰＥからなる群から選択するのが好ましい。
【００２３】
本発明のリポソームの好ましい実施形態は、ＣＨ、ＰＧ、およびＰＳを上記した範囲であり、好ましい範囲で含み、ＰＥを全モル脂質組成物に対して約１〜約４０ｍоｌ％の濃度でさらに含み、好ましくは約５〜約２０ｍоｌ％で、より好ましくは約８〜約１５ｍоｌ％で含む。
【００２４】
別の実施形態では、リポソームは、ＰＣを全モル脂質組成物に対して約２０〜約４０ｍоｌ％の濃度で含み、好ましくは約５〜約２０ｍоｌ％で、より好ましくは約８〜約１５ｍоｌ％で含む。
【００２５】
特定の好ましい実施形態では、本発明のリポソームの脂質は、本質的にＣＨ、ＰＳ、およびＰＧ；ＣＨ、ＰＳ、およびＰＥ；あるいはＣＨ、ＰＧ、およびＰＥからなる。この場合は、ＣＨ、ＰＳ、ＰＧ、および／またはＰＥは、上記の好ましい濃度範囲で、特に好ましい濃度範囲で存在してよい。従って、好ましい実施形態では、本発明のリポソームが、全モル脂質組成物に対して、本質的に、ＣＨ、ＰＳ、およびＰＧからなる場合、それぞれは、約２３〜約４２ｍоｌ％、より好ましくは約２６〜約３９ｍоｌ％、さらにいっそう好ましくは約３０〜約３６ｍоｌ％、最も好ましくは約３２〜約３４ｍоｌ％の範囲で存在し；ＣＨ、ＰＳ、およびＰＥからなる場合、それぞれは、約２３〜約４２ｍоｌ％、より好ましくは約２６〜約３９ｍоｌ％、さらにいっそう好ましくは約３０〜約３６ｍоｌ％、最も好ましくは約３２〜約３４ｍоｌ％の範囲で存在し；ＣＨ、ＰＧ、およびＰＥからなる場合は、それぞれは、約２３〜約４２ｍоｌ％、より好ましくは約２６〜約３９ｍоｌ％、さらにいっそう好ましくは約３０〜約３６ｍоｌ％、最も好ましくは約３２〜約３４ｍоｌ％の範囲で存在する。
【００２６】
ＰＳおよびＰＧは、それぞれ類似するホスファチジルセリン頭基およびホスファチジルグリセロール頭基を有する脂質の包括的用語である。しかし、これらの頭基に多くの異なる無極性残基を取り付けることができる。従って、異なる天然源から単離したＰＳおよびＰＧは、取り付けられた無極性残基の長さ、組成、および／または化学構造がかなり異なり、自然に存在するＰＳおよびＰＧは、通常、異なる無極性残基を有するＰＳおよびＰＧの混合物である。現在までに試験した、ＰＳおよびＰＧ混合物、あるいは純粋単離した、もしくは化学合成したＰＳおよびＰＧ化合物は全て、本発明のリポソーム中に示した範囲で、または好ましい範囲で組み込んだ場合、優れた免疫応答をもたらすが、ある種のＰＳおよびＰＧ型は、特定の強力な免疫応答を刺激することが本発明者らによって観察されており、従って、本発明のリポソーム中に使用されるＰＳは、パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン（palmitoyloleoylphosphatidylserine）、パルミトイルリノエオイルホスファチジルセリン（palmitoyllinoeoylphosphatidylserine）、パルミトイルアラキドノイルホスファチジルセリン（palmitoylarachidonoylphosphatidylserine）、パルミトイルドコサヘキサエノイルホスファチジルセリン（palmitoyldocosahexaenoylphosphatidylserine）、ステアロイルオレオイルホスファチジルセリン（stearoyloleoylphosphatidylserine）、ステアロイルリノレオイルホスファチジルセリン（stearoyllinoleoylphosphatidylserine）、ステアロイル‐アラキドノイルホスファチジルセリン（stearoyl-arachidonoylphosphatidylserine）、ステアロイルドコサヘキサエノイルホスファチジルセリン（stearoyldocosahexaenoylphosphatidylserine）、ジカプリルホスファチジルセリン（dicaprylphosphatidylserine）、ジラウロイルホスファチジルセリン（dilauroylphosphatidylserine）、ジミリストイルホスファチジルセリン（dimyristoylphosphatidylserine）、ジフィタノイルホスファチジルセリン（diphytanoylphosphatidylserine）、ジヘプタデカノイルホスファチジルセリン（diheptadecanoylphosphatidylserine）、ジオレオイルホスファチジルセリン（dioleoylphosphatidylserine）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（dipalmitoylphosphatidylserine）、ジステアロイルホスファチジルセリン（distearoylphosphatidylserine）、ジリノレオイルホスファチジルセリン（dilinoleoylphosphatidylserine）、ジエルコイルホスファチジルセリン（dierucoylphosphatidylserine）、ジドコサヘキサエノイル‐ホスパチジルセリン（didocosahexaenoyl-phospahtidylserine）、脳由来ＰＳ、および大豆由来ＰＳからなる群から選択することが好ましく、特に好ましいのはジオレオイルホスファチジルセリンである。本発明のリポソーム中に使用されているＰＧは、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（palmitoyloleoylphosphatidylglycerol）、パルミトイルリノレオイルホスファチジルグリセロール（palmitoyllinoleoylphosphatidylglycerol）、パルミトイルアラキドノイルホスファチジルグリセロール（palmitoylarachidonoylphosphatidylglycerol）、パルミトイルドコサヘキサエノイルホスファチジルグリセロール（palmitoyldocosahexaenoyl phosphatidylglycerol）、ステアロイルオレオイルホスファチジルグリセロール（stearoyloleoylphosphatidylglycerol）、ステアロイルリノレオイルホスファチジルグリセロール（stearoyllinoleoylphosphatidylglycerol）、ステアロイルアラキドノイ���ホスファチジルグリセロール（stearoylarachidonoylphosphatidylglycerol）、ステアロイルドコサヘキサエノイルホスファチジルグリセロール（stearoyldocosahexaenoylphosphatidylglycerol）、ジカプリルホスファチジルグリセロールジラウロイルホスファチジルグリセロール（dicaprylphosphatidylglycerol dilauroylphosphatidylglycerol）、ジヘプタデカノイルホスファチジルグリセロール（diheptadecanoylphosphatidyl-glycerol）、ジフィタノイルホスファチジルグリセロール（diphytanoylphosphatidylglycerol）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（dimyristoylphosphatidylglycerol）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（dipalmitoylphosphatidylglycerol）、ジエライドイルホスファチジルグリセロール（dielaidoylphosphatidylglycerol）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（distearoylphosphatidylglycerol）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（dioleoylphosphatidylglycerol）、ジリノエオイルホスファチジルグリセロール（dilinoeoylphosphatidylglycerol）、ジアラキドノイルホスファチジルグリセロール（diarachidonoylphosphatidylglycerol）、ドコサヘキサエノイルホスファチジルグリセロール（docosahexaenoylphosphatidylglycerol）、
および卵由来ＰＧからなる群から選択することが好ましく、特にジオレオイルホスファチジルグリセロールが好ましい。
【００２７】
ＰＳおよびＰＧと同様に、ＰＥもホスファチジルエタノールアミン頭基を有する脂質の総称である。ある種のＰＥは、本発明のリポソーム中に組み込まれた場合、特定の強力な免疫応答を刺激するのも本発明者らによって観察されており、従って、好ましい実施形態では、ＰＥは、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（palmitoyloleoylphosphatidylethanolamine）、パルミトイルリノレオイルホスファチジルエタノールアミン（palmitoyllinoleoylphosphatidylethanolamine）、パルミトイルアラキドノイルホスファチジルエタノールアミン（palmitoylarachidonoylphosphatidylethanolamine）、パルミトイルドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミン（palmitoyldocosahexaenoylphosphatidylethanolamine）、ステアロイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（stearoyloleoylphosphatidylethanolamine）、ステアロイルリノレオイルホスファチジルエタノールアミン（stearoyllinoleoylphosphatidylethanolamine）、ステアロイルアラキドノイルホスファチジルエタノールアミン（stearoylarachidonoylphosphatidylethanolamine）、ステアロイルドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミン（stearoyldocosahexaenoylphosphatidylethanolamine）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（dilauroylphosphatidylethanolamine）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（dimyristoylphosphatidylethanolamine）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（diphytanoylphosphatidylethanolamine）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（dipalmitoylphosphatidylethanolamine）、ジヘプタデカノイルホスファチジルエタノールアミン（diheptadecanoylphosphatidylethanolamine）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（distearoylphosphatidylethanolamine）、ジエライドイルホスファチジルエタノールアミン（dielaidoylphosphatidylethanolamine）、ジアラキドノイルホスファチジルエタノールアミン（diarachidonoylphosphatidylethanolamine）、ドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミン（docosa hexaenoylphosphatidylethanolamine）、細菌由来ＰＥ、心臓由来ＰＥ、脳由来ＰＥ、肝臓由来ＰＥ、卵由来ＰＥ、および大豆由来ＰＥからなる群から選択され、特に１，２‐ジアシル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ＰＥ、１‐アシル‐２‐アシル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ＰＥ、１，２‐ジパルミトイル‐ＰＥ、および／または１，２‐ジラウロイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ＰＥ（ＤＬＰＥ）である。
【００２８】
好ましい実施形態では、治療剤は、薬物、アジュバント、または抗原からなる群から選択される。抗原をアジュバントと共に同時投与するのが特に好ましい。抗原によって引き出された免疫応答が存在するアジュバントによって増強され得るからである。本明細書で使用する用語「アジュバント」は、抗原の投与前に、投与と共に、または投与後に投与した場合、抗原の単独投与と比較して、抗原に対する免疫応答を増大する物質をさす。従って、好ましい実施形態では、本発明のリポソームは、少なくとも一種のアジュバントおよび少なくとも一種の抗原を含む。
【００２９】
本明細書全体にわたって使用される用語「抗原」は、ヒトを含む動物で投与と同時に抗原に対する免疫応答を引き出す物質全てをさす。そのような免疫応答は、例えば、Ｂ細胞の増殖と抗体分泌、サイトカインの分泌（例えば、ＩＬ‐１、ＩＬ‐６、ＴＮＦα）によって評価される単球および／またはマクロファージの活性化、特異的表面抗原の特異的発現および／または上方もしくは下方制御（例えば、上方制御されるＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ４０、ＤＣ‐ＬＡＭＰ、および下方制御される抗原、例えば、マンノース受容体、ＤＥＣ‐２０５、ＤＣ‐ＳＩＧＮ）によって評価される樹状細胞（ＤＣ）の活性化および分化、ならびに抗原特異性Ｔ細胞が伴う体液および／または細胞介在免疫応答によって特徴付けることができ、この抗原特異性Ｔ細胞は、そのＣＤ４もしくはＣＤ８発現および適当な抗原、特に免疫応答誘発に使用したのと同じペプチド抗原での活性化（再刺激）に続くサイトカインの放出（例えばＩＦＮγ）によって特徴付けられる。ある場合には、薬物も免疫応答を引き出すことができるが、検出された免疫応答が、以下に定義した腫瘍抗原判定基準を満たす場合、そのような物質は薬物ではなく抗原と見なされる。抗原もしくはその断片は、ＭＨＣを提示でき、従って細胞介在免疫応答を引き出すことができるのが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、細菌抗原、自己抗原、またはアレルゲンである。
【００３０】
用語「腫瘍抗原」は、腫瘍に対して免疫応答を引き出す物質全てを含む。特に適当な物質は、正常細胞と比べて腫瘍細胞に豊富にある物質である。これらの物質は、腫瘍細胞内に存在し、かつ／または腫瘍細胞の外側で利用できるのが好ましい。腫瘍抗原が、腫瘍細胞内にしか存在していなくても、その抗原もしくはその断片はＭＨＣ系によって細胞表面に提示されるので、免疫系は腫瘍抗原を利用することができる。好ましい態様では、腫瘍抗原は、腫瘍細胞上および／または腫瘍細胞中に概ね排他的に存在し、同じ細胞型の正常細胞中には存在しない。
【００３１】
適当な腫瘍抗原は、例えば、同じ細胞型の腫瘍細胞と正常細胞の間のタンパク質の発現量の差をマイクロアレイをベースにした手法（Russo et al., Oncogene. 2003, 22:6497-507）を使用して分析することにより同定できる。また、ＰＣＲまたはマイクロアレイを基に腫瘍特異的変異細胞遺伝子をスクリーニング（Heller, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2002, 4:129-53）することによって、あるいは組換え発現クローニングにより抗原を血清学的に同定（SEREX; Tureci et al., Ｍоｌ Med Today. 1997, 3:342-349）することによって同定できる。当業者は、腫瘍細胞上および／または腫瘍細胞中に優先的にまたは排他的に存在する多数の物質について把握しており、その物質には、例えば、発癌遺伝子、例えば、切断型上皮細胞成長因子、葉酸塩結合タンパク質、メラノフェリン、癌胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原、ＨＥＲ２‐ｎｅｕなど、およびある種の糖鎖、例えば、上皮ムチンなどが含まれる。
【００３２】
腫瘍細胞中におよび／または腫瘍細胞上に優先的にまたは排他的に存在する物質の全てが、強力な免疫応答を引き出すわけではなく、従って、本発明のリポソームに含めるために、強力な免疫応答を引き出す腫瘍抗原を選択することが好ましい。強力な免疫応答を引き出す抗原は、増殖させるために、抗原で攻撃すると同時に、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、最も好ましくは少なくとも１５％の、その抗原で予め免疫化したマウスから単離したＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発させ、かつ／または抗原で攻撃すると同時に、好ましくは少なくとも５％、最も好ましくは少なくとも１５％の、その抗原で予め免疫化したマウスから単離したＢ細胞を誘発させる。これらの基準を満たす抗原は、治療的および／または予防的癌ワクチンで使用するための候補である。
【００３３】
特定の好ましい実施形態では、腫瘍抗原は、変異または組換え細胞遺伝子の特有遺伝子産物に属するＴ細胞限定癌関連抗原、特にサイクリン依存性キナーゼ（例えば、ＣＤＣ２、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４）、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、ｐ５３、ＡＦＰ、β‐カテニン、カスパーゼ８、ｐ５３、ｐ２１Ｒａｓ変異、Ｂｃｒ‐ａｂｌ融合産物、ＭＵＭ‐１ＭＵＭ‐２、ＭＵＭ‐３、ＥＬＦ２Ｍ、ＨＳＰ７０‐２Ｍ、ＨＳＴ‐２、ＫＩＡＡ０２０５、ＲＡＧＥ、ミオシン／ｍ、７０７‐ＡＰ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＴＥＬ／Ａｍｌ１、デカイン、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ‐ＲＡＲα、ＴＥＬ／ＡＭＬＩ；癌精巣（ＣＴ）抗原、特にＮＹ‐ＥＳＯ‐１、ＭＡＧＥファミリーのメンバー（ＭＡＧＥ‐Ａ１、ＭＡＧＥ‐Ａ２、ＭＡＧＥ‐Ａ３、ＭＡＧＥ‐Ａ４、ＭＡＧＥ‐Ａ６、ＭＡＧＥ‐１０、ＭＡＧＥ‐１２）、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ‐６、ＤＡＭ‐１０、ＧＡＧＥファミリーのメンバー（ＧＡＧＥ‐１、ＧＡＧＥ‐２、ＧＡＧＥ‐３、ＧＡＧＥ‐４、ＧＡＧＥ‐５、ＧＡＧＥ‐６、ＧＡＧＥ‐７Ｂ、ＧＡＧＥ‐８）、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１、ＮＡ‐８８Ａ、ＣＡＧ‐３、ＲＣＣ関連抗原Ｇ２５０；腫瘍ウイルス抗原、特にヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来Ｅ６  Ｅ７腫瘍性タンパク質、エプスタイン‐バーウイルスＥＢＮＡ２‐６、ＬＭＴ‐１、ＬＭＰ‐２；過剰発現抗原または組織特異的分化抗原、特にｇｐ７７、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ‐１／メラン‐Ａ、ｐ５３、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ‐１およびＴＰＲ‐２）、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＭＣ１Ｒ；広範に発現した抗原、特に、ＡＲＴ４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、ＣｙｐＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、ＰＲＡＭＥＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ‐１、ＳＡＲＴ‐２、ＳＡＲＴ‐３、およびＷＴ１、ならびにそれらの断片および誘導体からなる群から選択される。特定の好ましい腫瘍抗原は、チロシナーゼ関係タンパク質に由来する抗原である。本発明のリポソームに含めるために選択された腫瘍抗原またはその断片は、細胞介在免疫応答を刺激するのが好ましい。
【００３４】
用語「ウイルス抗原」は、ウイルスに対する、特にウイルス感染細胞に対する免疫応答を引き出す物質全てを含む。ウイルス抗原は、先に定義した強力な免疫応答を引き出すことが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、ウイルス抗原は、レトロウイルス科、特に、ＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐ＬＰ；ピコルナウイルス科、特に、ポリオウイルスおよび肝炎Ａウイルス；エンテロウイルス、特に、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス；カルシウイルス科、特に胃腸炎を引き起こす株；トガウイルス科、特に、ウマ脳炎ウイルスおよび風疹ウイルス；フラウイルス科、特に、デングウイルス、脳炎ウイルス、および黄熱病ウイルス；コロナウイルス科、特にコロナウイルス；ラブドウイルス科、特に、水泡性口内炎ウイルスおよび狂犬病ウイルス；フィロウイルス科、特に、エボラウイルスまたはおよびマールブルグウイルス；パラミクソウイルス、特に、パラインフルエンザウイルス、耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、および呼吸器合胞体ウイルス；オルトミクソウイルス科、特にインフルエンザウイルス；ブンガウイルス科、特に、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス；アレナウイルス科、特に出血熱ウイルス；レオウイルス科、特に、レオウイルス、オルビウイルス、およびロータウイルス；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科、特にＢ型肝炎ウイルス；パルボウイルス科、特にパルボウイルス；パポーバウイルス科、特に、乳頭腫ウイルス、サルウイルス‐４０（ＳＶ４０）およびポリオーマウイルス；アデノウイルス科；ヘルペスウイルス科、特に、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科、特に、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、およびポックスウイルス；ならびにイリドウイルス科、特にアフリカブタ熱ウイルス；ならびにＣ型肝炎からなる群から選択されるウイルスに由来する。特に好ましいウイルス抗原は、ＨＰＶＬ６、ＨＰＶＬ７、それらの断片および誘導体からなる群から選択される。本発明のリポソーム中に含めることができるウイルス抗原もしくはその断片は、細胞介在免疫応答を刺激するのが好ましい。
【００３５】
用語「真菌抗原」は、真菌に対して免疫応答を引き出す物質全てを含む。この真菌抗原は、先に定義した強力な免疫応答を引き出すことが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、真菌抗原は、クリプトコックス種、特にクリプトコックスネオフォルマンス、ヒストプラスマ種、特にヒストプラスマカプスラーツム、コクシジオイデス種、特にコクシジオイデスイミティス、ブラストミセス種、特にブラストミセスデルマティティジス、クラミジア種、特にクラミジアトラコマティス、およびカンジダ種、特にカンジダアルビカンスからなる群から選択される真菌に由来する。本発明のリポソーム中に含めることが好ましい真菌抗原またはその断片は、体液性免疫応答を刺激する。
【００３６】
用語「細菌抗原」は、細菌に対して免疫応答を引き出す物質全てを含む。細菌抗原は、先に定義した強力な免疫応答を引き出すのが好ましい。本発明好ましい実施形態では、細菌抗原は、ヘリコバクター種、特にピロリ菌；ボレリア種、特にボレリアブルグドルフェリ；レジオネラ種、特にレジオネラニューモフィラ；マイコバクテリア種、特に結核菌、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラール、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．ゴルドナ；ブドウ球菌種、特に黄色ブドウ球菌；ナイセリア種、特に淋菌、髄膜炎菌；リステリア種、特にリステリアモノサイトゲネス；レンサ球菌種、特に化膿レンサ球菌、Ｂ群レンサ球菌；Ｓ．フェーカリス；Ｓ．ボビス、肺炎球菌；嫌気性レンサ球菌種；病原性カンピロバクター種；腸球菌種；ヘモフィルス種、特にインフルエンザ菌；バシラス種、特に炭疽菌；コリネバクテリウム種、特にジフテリア菌；エリシペロトリックス種、特に豚丹毒菌；クロストリジウム種、特にＣ．ペルフリンゲンス、破傷風菌；エンテロバクター種、特にエンテロバクターアエロゲネス、クレブシエラ種、特に肺炎桿菌、パスツレラ種、特にパスツレラムルトシダ、バクテロイド種；フソバクテリウム種、特にフソバクテリウムヌクレアツム；ストレプトバシルス種、特にストレプトバシルスモニリホルミス；トレポネーマ種、特にトレポネーマペルテヌ；レプトスピラ；病原性エシェリキア種；および放線菌種、特に放線菌イスラエリからなる群から選択される細菌に由来する。本発明のリポソーム中に含めることが好ましい細菌抗原またはその断片は、体液性免疫応答を刺激する。
【００３７】
用語「自己免疫抗原」は、体内、特に、正常な細胞、組織、または臓器に通常存在する物質、例えば、タンパク質に対する免疫応答を引き出す物質全てを含む。自己免疫抗原は、自己免疫疾患、例えば、１型糖尿病、従来の臓器特異的自己免疫疾患、神経系疾患、リウマチ性疾患、乾癬、結合組織疾患、自己免疫血球減少症、他の自己免疫疾患などを治療し、かつ／または予防するための脱感作法に使用することができる。そのような従来の臓器特異的自己免疫は、甲状腺炎（Graves病＋Hashimoto病）、胃炎、副腎炎（Addison病）、卵巣炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、性腺機能不全、副甲状腺機能低下症、脱毛症、吸収不良症候群、悪性貧血、肝炎、抗受容体抗体疾患、白斑症を含み得る。そのような神経系疾患は、統合失調症、アルツハイマー病、うつ病、下垂体機能不全、尿崩症、乾燥症候群、多発性硬化症を含み得る。そのようなリウマチ性疾患／結合組織疾患は、リューマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）もしくはループス、強皮症、多発性筋炎、炎症性腸疾患、皮膚筋炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、血管炎、乾癬性関節炎、剥脱性乾癬皮膚炎、尋常性天疱瘡、シェーグレン症候群を含み得る。他の自己免疫関連疾患は、本明細書記載し関連技術分野で知られているような自己免疫ブドウ膜網膜炎、糸球体腎炎、心筋梗塞開心術後症候群、肺ヘモシデリン沈着症、アミロイド症、類肉腫症、アフタ性口内炎、および他の免疫関連疾患を含み得る。それぞれ示した疾患の原因となる自己免疫抗原は、当技術分野で知られており、それだけには限らないが、全て本発明のリポソーム中に含めることができる。
【００３８】
用語「アレルゲン」は、ウイルス抗原、細菌抗原、または真菌抗原ではない外来物質に対して免疫応答を引き出す物質をさす。アレルゲンは、脱感作法によってアレルギーを治療しまたは予防するために、本発明のリポソーム中に含めることができる。好ましいアレルゲンは、花粉、特に、カエデ、カバノキ、ハンノキ、ヘイゼルナッツ、ヨモギ、ビーチマウンテンセダー、オーク、クルミ、ニレ、オリーブ、スズカケノキ、ハコヤナギ、アメリカトネリコ、およびストローブマツの花粉；イネ科草本、特に、ハルガヤ、カモガヤ、ギョウギシバ、野生オート麦、ドクムギの草本；昆虫、特にダニ；食材、特に、乳や乳製品、ナッツ、特に、ピーナッツ、ヘイゼルナッツ、およびアーモンド；獣毛、特に、ネコ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、マウス、ラット、モルモット、およびウサギに由来する毛髪からなる群から選択し、または得てよい。本発明のリポソームに含めることができるそれ以上のアレルゲンは、接触過敏症を引き出す、例えば、ニッケルや銅などのアレルゲンである。
【００３９】
本発明のリポソームは、身体のある種の細胞型、すなわち、造血系細胞に対して高い親和性を示し、従ってこれらの細胞型に優先的に薬物を送達するために使用することができる。好ましい実施形態では、薬物は、鎮痛薬、抗リウマチ薬、駆虫薬、抗アレルギー薬、抗貧血薬、抗不整脈薬、抗生物質、血管新生阻害薬、抗感染薬、抗痴呆薬（向知性薬）、抗糖尿病薬、解毒薬、制吐薬、抗眩暈薬、抗てんかん薬、止血薬、抗高浸透圧薬、抗低浸透圧薬、抗凝血剤、抗真菌剤、鎮咳薬、抗ウイルス剤、β‐受容体およびカルシウムチャンネル拮抗薬、気管支溶解剤および抗喘息薬、ケモカイン、サイトカイン、特に免疫調節サイトカイン、分裂促進因子、細胞分裂停止薬、細胞傷害性薬剤およびそのプロドラッグ、皮膚薬、催眠薬および鎮静薬、免疫抑制剤、免疫賦活薬特に、ＮＦ‐кＢアクチベータ、ＭＡＰキナーゼ、ＳＴＡＴタンパク質、および／またはタンパク質リン酸化酵素Ｂ／Ａｋｔ；ペプチドもしくはタンパク質薬物、特にホルモン、生理学的もしくは薬理学的分裂促進因子阻害薬、ケモカイン、サイトカイン、あるいはそのそれぞれのプロドラッグからなる群から選択される。もちろん、本発明のリポソームは同時に一種を超える薬物を含み、あるいは一種もしくは複数の抗原および／または一種もしくは複数のアジュバントと共に、一種もしくは複数の薬物を含むことも想定されている。好ましい実施形態では、薬物は、ケモカイン、サイトカイン、分裂促進因子、細胞分裂停止薬、細胞傷害性薬剤、およびそのプロドラッグ、免疫賦活薬、ペプチドもしくはタンパク質薬物、特にホルモン、および生理学的もしくは薬理学的分裂促進因子阻害薬、ケモカイン、またはサイトカイン、あるいはそのそれぞれのプロドラッグからなる群から選択される。
【００４０】
本発明のリポソームは、顕著な細胞型特異性を示すので、診断剤をその特定の組織に優先的に送達するためにこれらを使用することもできる。診断剤を治療剤と共に含めることも想定されており、それにより患者で治療剤の送達および分布のモニタリングが可能になるはずである。リポソームが以下に定義した標的部分を含む場合は、リポソームは診断剤を含むのがよりさらに好ましく、この標的部分は、標的組織または疾患部位に本発明のリポソームを優先的に局在化するのにさらに役立つ。
【００４１】
用語「診断剤」は、蛍光測定、核磁気共鳴、コンピュータ断層撮影、またはシンチグラムを含む分析法によって直接的または間接的に検出可能な化学部分をさす。好ましい実施形態では、診断剤は、高電子密度分子、常磁性分子、超常磁性分子、放射性分子、非放射性同位元素、および蛍光分子、例えば、１３Ｎ、１５Ｏ，１８Ｆ、５１Ｇｒ、５４Ｆｅ、６０Ｃｏ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１２ｍＡｇ、１１３ｍＩｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、１４８Ａｕ、３５Ｓ、３３Ｐ、３２Ｐ、１１Ｃなど；例えば、２Ｈや１３Ｃを含む非放射性同位元素、ならびに蛍光分子、または蛍光や光などを発する分子、例えば、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、および様々な蛍光色素からなる群から選択され、それらの全ては当業者によく知られている。
【００４２】
既に述べたように、本発明のリポソームは、ある種の造血細胞系、より詳細には、樹状細胞およびランゲルハンス細胞に高い親和性を有する。様々な疾病の予防または治療を目指す免疫化／ワクチン接種法において、この特異性が、本発明のリポソームを抗原および／またはアジュバントの送達に特に相応しいものにする一方で、この特性によってリポソームは造血性細胞系細胞へ薬物を送達するための送達媒体として特に相応しいものになっている。リポソームはどんな細胞分裂停止薬物または細胞障害薬を含んでもよいが、既知の細胞分裂停止薬および細胞障害薬からは以下のものが特に好ましい：アルキル化物質、抗代謝産物、抗生物質、エポシロン、核内受容体作用薬および拮抗薬、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、白金化合物、ホルモンおよび抗ホルモン薬、インターフェロン、細胞周期依存性タンパク質キナーゼ（ＣＤＫ）阻害薬、シクロオキシゲナーゼおよび／またはリポキシゲナーゼ阻害薬、生体脂肪酸；プロスタノイド、ロイコトリエンを含む脂肪酸誘導体；タンパク質リン酸化酵素阻害薬、タンパク質ホスファターゼ阻害薬、脂質キナーゼ阻害薬、白金配位錯体、エチレンイメン、メチルメラミン、トラジン、ビンカアルカロイド、ピリミジン類似体、プリン類似体、アルキルスルホン酸、葉酸類似体、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、特にアセジアスルホン、アクラルビシン、アンバゾン、アミノグルテチミド、Ｌ‐アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ホリン酸カルシウム、カルボプラチン、カルペシタビン、カルムスチン、セレコキシブ、クロランブシル、シス‐プラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシンダプソン、ダウノルビシン、ジブロンプロプアミジン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エンジイン、エピルビシン、エポシロンＢ、エポシロンＤ、エストラムシンホスファート、エストロゲン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フラボピリドール、フロックスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミドホスフェストロール、フラゾリドン、ゲムシタビン、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシメチルニトロフラントイン、ヒドロキシプロゲステロネカプロアト、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イドクスウリジン、イホスフアミド、インターフェロンα、イリノテカン、ロイプロリド、ロムスチン、ルルトテカン、マフェニドスルファートオールアミド、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロンアセタート、メガストロールアセタート、メルファラン、メパクリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトロニダゾール、マイトマイシンＣ、ミトポドジド、ミトタン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ナリジクス酸、ニフラテル、ニフロキサジド、ニフララジン、ニフルティモックス、ニムスチン、ニノルアゾール、ニトロフラントイン、ナイトロジェンマスタード、オレオムシン、オキソリン酸、ペンタアミジン、ペントスタチン、フェナゾピリジン、フタリルスルファチアゾール、ピポブロマン、プレドニムスチン、プレドニ���ン、プロイッシン、プロカルバジン、ピリメタミン、ラルチトレキセド、ラパマイシン、ロフェコキシブ、ロシグリタゾン、サラゾスルファピリジン、スクリフラビニウムクロリド、セムスチンストレプトゾシン、スルファカルバミド、スルフアセタミド、スルファクロピリダジン、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファエチドール、スルファフラゾール、スルファグアニジン、スルファグアノール、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、ｃｏ‐トリモキサゾール、スルファメトキシジアジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモキソール、スルファニルアミド、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファチアゾール、スルフィソミジン、スタウロスポリン、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、テルチポシド、テストラクトン、テストステロンプロピオナート、チオグアニン、チオテパ、チニダゾール、トポテカン、トリアジクォン、トレオサルファン、トリメトプリム、トロホスファミド、ＵＣＮ‐０１、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ゾルビシン、あるいはそのそれぞれの誘導体もしくは類似体。次に、癌を治療するために上記の薬物の数種を同時に投与し、従って、一種を超える細胞分裂停止薬物および／または細胞障害薬を本発明のリポソーム中に含めることも想定されている。
【００４３】
本発明者らは、本発明のリポソームが、リポソームに含めたまたは取り付けた抗原に対してかなりの免疫応答を引き出すことができることを発見している。
【００４４】
アジュバントを抗原と同時投与すれば、免疫応答をさらに刺激できることが当技術分野で知られてはいても、驚くべきことに、「フリー」のアジュバントの同時投与と比較したとき、アジュバントを含むリポソームは非常に強力な免疫刺激をもたらすことを見出した。従って、好ましい実施形態では、本発明のリポソームは少なくとも一種のアジュバントを含む。アジュバントは、リポソーム内部に「フリーに」含めることができ、またはアジュバントは、リポソームを構成するどんな成分、例えば、脂質、好ましくはＰＥ、ＰＳおよび／またはＰＧ、リポソーム中に含まれるタンパク質、またはリポソーム膜に一体化したタンパク質に取り付けることができる。本発明のリポソームが、抗原およびアジュバントを含むいくつかの実施形態では、アジュバントを抗原に取り付けることもできる。
【００４５】
本発明のリポソーム中に含めることができるアジュバントは、抗原応答を少なくとも２０％増大させることが好ましく、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも２００％、最も好ましくは少なくとも１０００％増大させる。好ましいアジュバントは、以下からなる群から選択される：非メチル化ＤＮＡ、特にＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフ）を含む非メチル化ＤＮＡ、特にホスホロチオ酸（ＰＴＯ）主鎖を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＴＯ  ＯＤＮ）またはリン酸ジエステル（ＰＯ）主鎖を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＯ  ＯＤＮ）；水酸化アルミニウム（ミョウバン）のゲル様沈殿物；グラム陰性菌外膜由来細菌産物、特にモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ムラミルジペプチド、およびそれらの誘導体、合成リポペプチド誘導体、特にＰａｍ３Ｃｙｓ；リポアラビノマンナン；ペプチドグリカン；ザイモサン；熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、特にＨＳＰ  ７０；ｄｓＲＮＡおよびその合成誘導体、特にポリＩ：ポリＣ；ポリカチオンペプチド、特にポリ‐Ｌ‐アルギニン；タキソール；フィブロネクチン；フラジェリン；イミダゾキノリン；アジュバント活性を有するサイトカイン、特にＧＭ‐ＣＳＦ、インターロイキン‐（ＩＬ‐）２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１８、インターフェロンＩ型およびＩＩ型、特にインターフェロン‐γ、ＴＮＦ‐α；水中油滴型乳濁液、特にスクアレンからなるＭＦ５９；Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタン‐トリオレアート）、およびより高度に精製したＱｕｉｌ  Ａ誘導体であるＱＳ‐２１、非イオン性ブロックポリマー、特にポロクサマー４０１、サポニンおよびその誘導体、特にサポニン由来免疫賦活性断片；ポリホスファゼン；Ｎ‐（２‐デオキシ‐２‐Ｌ‐ロイシルアミノ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル）‐Ｎ‐オクタデシルドデカノイルアミドヒドロアセタート（ＢＡＹ  Ｒ１００５）、２５‐ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）；ＤＨＥＡ；ムラメチド［ＭＤＰ（Ｇｌｎ）‐ＯＭｅ］；ムラパルミチン；乳酸および／またはグリコール酸ポリマー；ポリメタクリル酸メチル；ソルビタントリオレアート；スクワラン；ステアリルチロシン；スクアレン；テルアミド、合成オリゴペプチド、特にＭＨＣＩＩに提示されたペプチド。本発明のリポソーム中に含めることができる特定の好ましいアジュバントは、群：非メチル化ＤＮＡ、特にＣｐＧジヌクレオチドを含む非メチル化ＤＮＡ（ＣｐＧモチーフ）、特にホスホロチオ酸（ＰＴＯ）主鎖を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＴＯ  ＯＤＮ）またはリン酸ジエステル（ＰＯ）主鎖を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＯ  ＯＤＮ）および合成リポペプチド誘導体、特にＰａｍ３Ｃｙｓから選択される。
【００４６】
本発明のリポソームは、２種以上のアジュバントを含むことができる。２種以上のアジュバントは、免疫系の刺激では相乗的に作用するのが好ましい。特に、アジュバントの作用の媒介に関与する異なる分子経路をアジュバントが刺激する場合に、２種のアジュバントの相乗効果を観察することができる。従って、２種以上のアジュバントを使用する場合、それぞれが異なる経路を通る免疫応答を刺激することが好ましい。免疫応答を刺激する経路は、当業者に知られており、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９経路が含まれる。従って、異なるＴＬＲ経路を刺激する２種のアジュバントをリポソーム中に含めることが好ましい。それぞれのＴＬＲ経路を刺激するアジュバントは当業者に知られている。ＴＬＲ２では、このようなアジュバントには、例えば、リポペプチド、リポアラビノマンナン、ペプチドグリカン、ザイモサンおよびＨＳＰが含まれ；ＴＬＲ３では、例えばＤＳ‐ＲＮＡ；ＴＬＲ４では、例えば、リポ多糖、ＨＳＰ、タキソール、ＲＳＶ、フィブロネクチン；ＴＬＲ５では、例えばフラジェリン；ＴＬＲ７では、例えばイミダゾキノリン；ならびにＴＬＲ９では、例えば、非メチル化ＤＮＡ、特にＣｐＧ‐ＤＮＡ；非メチル化ホスホロチオ酸（ＰＴＯ）オリゴヌクレオチド、特にＣｐＧ‐ＰＴＯオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００４７】
本発明の好ましいリポソームは、少なくとも一種の抗原、好ましくは少なくとも一種の腫瘍抗原、少なくとも１種のアジュバント、さらに好ましくは少なくとも２種のアジュバント含む。この意味において、アジュバントは、前記したように相乗的に作用するように選択することが好ましい。
【００４８】
好ましい実施形態では、本発明のリポソームは、治療剤および／または診断剤のモル量：全脂質のモル量比が１：１００〜１：１０、好ましくは１：８０〜１：１５、より好ましくは１：５０〜１：２０となるような量で治療剤および／または診断剤を含む。
【００４９】
本発明のリポソームの直径は１０〜１０００ｎｍであってよい。しかし、好ましい実施形態ではリポソームの直径は５０〜２００ｎｍであり、８０〜１５０ｎｍがより好ましい。例えば、既知の孔径の篩またはメッシュを通してリポソーム組成物を押し出すことによって、リポソームの直径に作用することができる。径を制御するこの方法や別の方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Mayhew et al. (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169-174またはOlson et al. (1979) Biochim. Biophys. Acta 557:9-23に記載されている。
【００５０】
別の実施形態では、本発明のリポソーム膜を構成する成分のどれも別の化学部分に取り付けることができる。用語、化学部分は特に限定されない。しかし、好ましい実施形態では、化学部分は以下に、より詳細に記載するような標的部分、または安定化部分である。
【００５１】
本記述全体にわたって使用されている用語「取り付ける」は、それぞれ、化学部分、特に標的部分もしくは安定化部分と、リポソームの別の成分の間の直接的もしくは間接的共有もしくは非共有結合および接続をさす。先に定義した取付けを可能にする多様な化学基は、例えば、ビオチン‐ストレプトアビジン、アミノ反応基（例えば、カルボジイミド、ヒドロキシルメチルホスフィン、イミドエステル、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル、イソチオシアナート、イソシアナート）、スルフヒドリル反応基（例えば、マレイミド、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、アジリジン）、カルボキシル反応分子（例えば、カルボジイミド、カルボジイミダゾール、ジアオアルカン）、ヒドロキシル反応基（例えば、カルボニルジイミダゾール、アルキルハロゲン、イソシアナート）を含め、当技術分野で知られており、適宜、当業者が容易に選択することができる。
【００５２】
本発明の意味内での安定化部分は、一旦、投与したならば、リポソームの循環時間を延長させる。特定の好ましい安定化部分は、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、またはＰＥＧであり、特定の好ましいＰＥＧの分子量は、約１，０００〜約１０，０００ｇ／ｍоｌであり、約５，０００ｇ／ｍоｌがより好ましい。
【００５３】
好ましい実施形態では、化学部分、特に安定化部分は、リポソーム膜を構成する分子画分にのみ取り付けられる。リポソーム膜成分の約１〜約２０ｍоｌ％が、取り付けられた化学部分を有するのが好ましく、約３〜約１０ｍоｌ％がより好ましく、約５ｍоｌ％がさらにいっそう好ましい。
【００５４】
化学部分、特に安定化部分を取り付けるための好ましいリポソーム成分は、脂質成分である。異なる化学部分を異なる脂質成分に取り付けることができるが、化学部分は本発明のリポソーム内に含まれている一種もしくは複数のリン脂質に取り付けるのが好ましい。さらに好ましい実施形態では、一種もしくは複数の化学部分をＰＥに取り付ける。特に、例えば、ＰＥＧのような安定化剤を使用する場合、取付けにはＰＥを使用する。
【００５５】
安定化部分の界面活性剤の取付けに加えて、本発明のリポソームの脂質二重層を安定させるために、タンパク質およびペプチドをリポソームに組み込むことができる。二重層安定化成分として使用することができる界面活性剤には、それだけには限らないが、Triton X-100、デオキシコラート、オクチルグルコシド、リゾホスファチジルコリンが含まれる。二重層安定化成分として使用することができるタンパク質には、それだけには限らないが、グリコホリンやチトクロム酸化酵素が含まれる。好ましい実施形態では、リポソームは、０．０５〜１５ｍоｌ％の安定化剤を含むことができる。
【００５６】
先に指摘したように、本発明のリポソームは、ある種の細胞、特に造血系細胞に優先的に結合する。いくつかの適用例では、例えば、ワクチン接種法では、抗原を造血系細胞により特異的に送達するのが望ましいこともあり得る。これは、リポソームにターゲティング手段を備え付けることによって実現することができ、この手段によって主として体内の特異的部位にリポソームを指向させることが可能になり、それが望ましくない全身的作用および／または毒性の低減に役立つ。従って、本発明のリポソームの別の実施形態では、標的部分を前記リポソームに取り付ける。先に述べたように、化学部分に関して標的部分はリポソームのどの成分にも取り付けることができる。標的部分は、ａ）リポソームの脂質成分の１種に取り付ける、ｂ）本発明のリポソーム膜に組み込むことができる膜タンパク質に取り付ける、あるいはｃ）それ自体をその脂質層に挿入し、または組込むことができるのが好ましい。
【００５７】
好ましい実施形態では、標的部分は、ペプチドもしくはタンパク質、特に、抗体もしくはその断片、一本鎖抗体もしくはその断片、受容体リガンドもしくはその断片、炭水化物、およびリガンドからなる群から選択される。
【００５８】
より詳細には、標的部分は、天然もしくは合成の受容体結合ペプチドおよびそれらの模倣体、単糖もしくはオリゴ糖、受容体リガンドもしくはその断片、抗体もしくはその断片からなる群から選択することができ、それらの全ては、ＤＣ特異的表面分子もしくは受容体、特にＣＤ５４（ＩＣＡＭ‐１）とＩＣＡＭ‐２、マンノース受容体、ＣＤ２０７（ランゲリン）、ＡＳＧＰＲ、ＣＬＥＣ‐１、ＣＬＥＣ‐２、ＤＣＩＲ、ｄｅｃｔｉｎ‐１、ＤＣ‐ＳＩＧＮ、ＤＥＣ‐２０５、ＢＤＣＡ‐２、ＴＬＲ‐１、ＴＬＲ‐２、ＴＬＲ‐３、ＴＬＲ‐４、ＴＬＲ‐５、ＴＬＲ‐７、ＴＬＲ‐９、ＣＤ４０、ＣＤ１６／３２（ＦｃγＲ‐ＩＩＩとＩＩ）、ＣＤ１１、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｄ、およびＭＨＣクラスＩＩを対象とする。
【００５９】
好ましい実施形態では、標的部分をスペーサーに取り付ける。本記述全体にわたって使用される用語「スペーサー」は、それがリポソーム成分、例えば、脂質に取り付けられたときでさえも、標的部分が到達しやすくする目的のために役立つ化学部分をさし、そうでない場合は標的部分のそのそれぞれの標的構造物への結合が立体的に妨害される。この意味内でのスペーサーの直線的伸長は少なくとも０．５ｎｍであり、スペーサーの直線的伸長は１〜１０ｎｍが好ましく、２〜５ｎｍがさらにいっそう好ましい。スペーサーは、直鎖もしくは分枝、飽和もしくは不飽和糖鎖であることが好ましい。糖鎖は、単量体構成単位の多量体反復を含むのが好ましい。それぞれの単量体構成単位の長さに応じて、単量体構成単位の２〜１０個の多量体反復が好ましい。好ましい実施形態では、スペーサーは親水性である。スペーサーは、一末端への標的部分の取付けを可能にする官能基、および他方の末端にリポソーム成分、例えば、本発明の脂質へのスペーサーの取付けを可能にする別の官能基を含むことができる。
【００６０】
好ましいスペーサーは、二機能性分子、特に、約１〜４０個の反復配列を含むことが好ましい二機能性ポリエチレンもしくはポリプロピレングリコール誘導体であり、オリゴペプチドは天然および／または合成アミノ酸を含む。このオリゴペプチドは、好ましくは１〜４０個の、好ましくは２〜２０個の、より好ましくは２〜１０個のアミノ酸含む。スペーサーの特定の好ましい構成単位は、８‐アミノ‐３，６‐ジオキサタン酸（ｄｏｏ）であり、１〜１０個のｄｏｏ反復配列を含むスペーサーが好ましい。２〜５個のｄｏｏ単位を含むスペーサーが、さらにより好ましく、３個のｄｏｏ単位を含むスペーサーが最も好ましい。リポソームと関連して、スペーサーには最適な長さがあり、それは２〜５ｎｍであることが本発明者らによって発見されている。一方で、長さが約０．５ｎｍ未満のスペーサーでは、ほとんどの場合、リポソーム表面から標的部分が取り付けられている場所までの距離が十分ではなく、効率的な相互作用、すなわち、標的部分とそのそれぞれの標的、例えば、腫瘍細胞などとの結合が行われない。他方で、約１０ｎｍより長いスペーサーは、「緩み」が増大し、これも標的部分とその標的との間の相互作用に有害である。従って、好ましい実施形態では、スペーサーの長さは約１〜約１０ｎｍであり、約２．５〜約５ｎｍが好ましい。
【００６１】
本発明のリポソームの好ましい実施形態では、標的部分は、脂質、好ましくはリン脂質、例えば、ＰＥ、ＰＧ、ＰＣ、ＰＳなどにに取り付けられ、標的部分の取付けに使用される脂質は、Ｎ‐カプロイルアミン（caproylamine）‐ＰＥ、Ｎ‐ドデカニルアミン（dodecanylamine）‐ＰＥ、ホファチジルチオエタノール（phophatidylthioethanol）、Ｎ‐［４‐（ｐ‐マレイミドメチル（maleimidomethyl））シクロヘキサン（cyclohexane）‐カルボキサミド（carboxamide）‐ＰＥ（Ｎ‐ＭＣＣ‐ＰＥ）、Ｎ‐［４‐（ｐ‐マレイミドフェニル（maleimidophenyl））ブチルアミド（butyramide）］‐ＰＥ（Ｎ‐ＭＰＢ）、Ｎ‐［３‐（２‐ピリジルジチオ（pyridyldithio））プロピオナート（propionate）］‐ＰＥ（Ｎ‐ＰＤＰ）、Ｎ‐スクシニル（succinyl）‐ＰＥ、Ｎ‐グルタリル（glutaryl）‐ＰＥ、Ｎ‐ドデカニル（dodecanyl）‐ＰＥ、Ｎ‐ビオチニル（biotinyl）‐ＰＥ、Ｎ‐ビオチニル（biotinyl）‐cａｐ‐ＰＥ、ホスファチジル（phosphatidyl）‐（エチレングリコール(ehtylene glycol)）、ＰＥ‐ポリエチレングリコール（polyethylene glycol）（ＰＥＧ）‐カルボン酸（carboxylic acid）、ＰＥ‐ＰＥＧ‐マレイミド（maleimide）、ＰＥ‐ＰＥＧ‐ＰＤＰ、ＰＥ‐ＰＥＧ‐アミン（amine）、ＰＥ‐ＰＥＧ‐ビオチン（biotin）、ＰＥ‐ＰＥＧ‐ＨＮＳ、ジパルミトイルグリセロスクシニル（dipalmitoyl glycerosuccinyl）‐リジン（lysine）、α‐メトキシ（methoxy）‐ω‐（１，２‐ジオクタデセノイルオキシグリセリル（dioctadecenoyloxy glyceryl)）（ＤＯ）、α‐メトキシ（methoxy）‐ω‐（１，２‐ジテトラデセノイルオキシグリセリル（ditetradecenoyloxy glyceryl)）（ＤＴ）からなる群から選択されるのが好ましい。
【００６２】
先に述べた主成分のように、および多くの実施形態では、本発明のリポソーム膜を構成する唯一の成分は脂質である。しかし、本発明のある態様では、リポソーム膜は、脂質層中に挿入し／組み込むことができる成分をさらに含むことができる。そのような成分の例には、一個もしくは複数の膜貫通ドメイン、ＧＰＩ‐アンカー、リポペプチドや糖脂質などの他の両親媒性分子、あるいは一種もしくは複数の脂肪酸、脂質、または他の疎水性部分に接合しまたは融合された分子を含め、親水性部分を有するタンパク質がある。そのような分子は、例えば、リポソームに標的化能力を付与することができ、すなわち、そのような分子は先に定義した標的部分であってよく、または酵素機能を有していてよい。
【００６３】
ＰＥに対して負荷電成分ＰＳまたはＰＧが存在すること、好ましい実施形態では、ＰＳとＰＧ双方が存在することによって、従来技術のリポソームよりも強力な免疫応答を引き出すリポソームがもたらされることが、本発明者らによって発見されているので、リポソームの正味表面電荷は、陰性であり、すなわち、リポソーム中の正電荷量の脂質を越える負荷電量の脂質をリポソームが含むのが好ましい。
【００６４】
本発明のリポソームは構造が安定しており、生成後、周囲の薬物溶液または緩衝液を除去するために、例えば、ろ過することができる。治療剤および／または診断剤を用いて、または用いずに「純粋な」リポソームを使用することもできるが、その安定性によって、容易な乾燥状態での貯蔵を促進するために、リポソームから本質的に液体全てを除去することも可能である。従って、本発明のリポソームは、乾燥形で、好ましくは凍結乾燥形で供給することができる。これらのリポソームは、使用時点で水溶液および／または緩衝液を添加することによって容易に再含水させることができる。
【００６５】
治療もしくは診断化合物は、リポソーム内部に含め、または親油性薬物の場合には脂質二重層内もしくは層間にも含めることが特に好ましい。リポソームに所与の治療剤および／または診断剤を「搭載」するために、従来技術の様々な方法を利用することができる。その最も単純な形では、リポソーム形成中に治療または診断剤を脂質成分と混合する。他の受動的な搭載方法には、脱水再含水法（Kirby & Gregoriadis (1984) Biotechnology 2:979）、逆相蒸発法（Szoka & Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75:4194-）、または界面活性剤除去法（Milsmann et al. (1978) Biochim. Biophys. Acta 512:147-155）が含まれる。しかし、これらの技術は、搭載中、しばしば、かなりの量の治療剤および／または診断剤の損失を招き、これは治療または診断剤が高価な場合には特に欠点である。
【００６６】
治療剤および／または診断剤をカプセル化するための他の方法には、いわゆる「遠隔搭載」または「能動的搭載」が含まれ、その際、予備成形したリポソームの外部と内部間の勾配、例えば、ｐＨ勾配または塩勾配に基づいて、治療または診断剤を勾配に従ってリポソーム中に輸送する（参照、例えば、Cheung et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1414:205-216；Cullis et al. (1991) Trends Biotechnol. 9:268-272；Mayer et al. (1986) Chem. Phys. Lipids 40:333-345）。
【００６７】
ほとんどの能動的および受動的な搭載手順では、溶媒中に治療および／または診断化合物を可溶化する必要がある。化合物、特に疎水性化合物、または高分子量化合物、例えば、ペプチドもしくはタンパク質などでは、水性溶媒中への可溶化は困難であることを証明でき、これは搭載を非効率的に、すなわち、特に、高価な化合物を不経済なものにしかねない。従って、そのような場合には水性溶媒を使用するのではなく、従来技術では有機溶媒が使用されてきた。しかし、有機溶媒を含むリポソームまたはリポソーム組成物の投与は、有機溶媒が生体適合性に問題があり、従って投与前にそれらを除去しなくてはならず実施不可能であることが多い。しかし、本発明者らは、今回、以下を含む方法によって本発明のリポソームを効率よく生成できることを発見した。
ａ）ＣＨを上記したモル範囲であり、かつ好ましい範囲で、ならびにＰＳ、ＰＧ、およびＰＥからなる群から選択される少なくとも２種の成分を上記したモル範囲であり、かつ好ましい範囲で含む脂質、一種もしくは複数の治療剤および／または診断剤、ならびに液体媒体の懸濁液を形成するステップ、ならびに
ｂ）懸濁液を均質化するステップ。
【００６８】
好ましい実施形態では、脂質、および／または治療剤、および／または診断剤は、本質的に、液体媒体に溶解しない。治療剤および／または診断剤は、本質的に溶解しないのが好ましい。液体媒体は、Ｈ２０、塩水溶液、および／または緩衝液が好ましい。好ましい脂質、および治療剤、および／または診断剤は上記した範囲であり、好ましい範囲で使用する。
【００６９】
それ以上の受動的および能動的搭載技術は、当技術分野で周知であり、それらは全て、それだけには限らないが、本発明のリポソームを生成するために当業者が使用することができる。所与の任意の治療および／または診断化合物に最も効率的な搭載方法は、十分に確立された手順により常法の実験によって決定することができる。通常調整する変数は、ｐＨ、温度、塩の型、塩濃度、緩衝液の型などである。
【００７０】
好ましい実施形態では、治療剤および／または診断剤は、遠隔搭載によってリポソーム中に搭載する。この方法によって搭載しようとする物質の損失が非常に少なくなるからである。好ましい実施形態では、搭載にはｐＨ勾配を使用する。搭載しようとする物質に応じて、通常、リポソーム内部をその外部に対して酸性化する。内部をｐＨ１〜６にした後、治療剤および／または診断剤を搭載するのが好ましい。
【００７１】
従って、本発明の別の態様は、上記方法の１つ、特に、ＣＨ、ならびにＰＳ、ＰＧ、およびＰＥからなる群から選択される少なくとも一種の成分を含む脂質、一種もしくは複数の治療剤および／または診断剤、ならびに液体媒体の懸濁液を形成するステップ、ならびに懸濁液を均質化するステップの方法によって生成されたリポソームである。
【００７２】
本発明の別の態様は、アジュバント、添加剤、緩衝液および補助物質からなる群から選択される物質を含む液体媒体に本発明のリポソームを含むリポソーム組成物である。液体媒体は、ＰＢＳやリンゲル液などの生体適合性水性媒体であることが好ましい。液体媒体は、少なくとも一種のアジュバントを含むことが好ましい。
【００７３】
この意味において、用語、アジュバントは上記の意味と同じ意味である。本発明のリポソーム組成物に含めることができる好ましいアジュバントは、ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフ）を含む非メチル化ＤＮＡ、特に、ホスホロチオ酸（ＰＴＯ）主鎖を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＴＯ  ＯＤＮ）またはリン酸ジエステル（ＰＯ）主鎖を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＯ  ＯＤＮ）；水酸化アルミニウム（ミョウバン）のゲル様沈殿物；グラム陰性菌外膜由来細菌産物、特にモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ムラミルジペプチド、およびそれらの誘導体；合成リポペプチド誘導体、特にＰａｍ３Ｃｙｓ；リポアラビノマンナン；ペプチドグリカン；ザイモサン；熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、特にＨＳＰ７０；ｄｓＲＮＡおよびその合成誘導体、特にポリＩ：ポリＣ；ポリカチオンペプチド、特にポリ‐Ｌ‐アルギニン；タキソール；フィブロネクチン；フラゲリン；イミダゾキノリン；アジュバント活性を有するサイトカイン、特にＧＭ‐ＣＳＦ、インターロイキン‐（ＩＬ‐）２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１８、インターフェロンＩ型およびＩＩ型、特にインターフェロン‐γ、ＴＮＦ‐α；水中油滴型乳濁液、特にスクアレンからなるＭＦ５９；Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタン‐トリオレアート）、より高度に精製したＱｕｉｌ  Ａ誘導体であるＱＳ‐２１、非イオン性ブロックポリマー、特にポロクサマー４０１、サポニンおよびその誘導体、特にサポニン由来免疫賦活性断片；ポリホスファゼン；Ｎ‐（２‐デオキシ‐２‐Ｌ‐ロイシルアミノ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル）‐Ｎ‐オクタデシルドデカノイルアミドヒドロアセタート（ＢＡＹ  Ｒ１００５）、２５‐ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）；ＤＨＥＡ；ムラメチド［ＭＤＰ（Ｇｌｎ）‐ＯＭｅ］；ムラパルミチン；乳酸および／またはグリコール酸ポリマー；ポリメタクリル酸メチル；ソルビタントリオレアート；スクワラン；ステアリルチロシン；スクアレン；テルアミド、合成オリゴペプチド、特にＭＨＣＩＩに提示されたペプチドからなる群から選択される。本発明のリポソーム中に含めることができる特定の好ましいアジュバントは、非メチル化ＤＮＡ、特に、ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフ）を含む非メチル化ＤＮＡ、特に、ホスホロチオ酸（ＰＴＯ）主鎖を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＴＯ  ＯＤＮ）またはリン酸ジエステル（ＰＯ）主鎖を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＯ  ＯＤＮ）および合成リポペプチド誘導体、特にＰａｍ３Ｃｙｓ群から選択される。
【００７４】
リポソーム組成物中に含まれるリポソームは、抗原、特に腫瘍抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、細菌抗原、自己抗原、またはアレルゲンを含むのが好ましい。本発明のリポソーム組成物の一実施形態では、リポソームは少なくとも一種の抗原を含み、リポソーム組成物は少なくとも一種のアジュバントを含む。このアジュバントをリポソーム中に含めることができ、かつ／またはリポソームが含まれている液体媒体内に含めることができる。好ましくは、少なくとも一種のアジュバントは、リポソームとリポソームが含まれている液体媒体双方に含める。リポソーム内外のアジュバントは、相乗的に作用して免疫刺激を増強するのがさらに好ましい。そのような相乗的作用を実現するために、アジュバントが異なる分子経路、特に前記した異なるＴＬＲ経路に作用するのが好ましい。さらに、リポソーム組成物は、リポソームの外側に、アジュバント活性を有するサイトカイン、例えば、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１８、インターフェロンＩ型およびＩＩ型、特にインターフェロン‐γ、またはＴＮＦ‐αなどを含むのが好ましい。ＧＭ‐ＣＳＦの使用が特に好ましく、すなわち、リポソーム外側にＧＭ‐ＣＳＦを含み、リポソーム内側に別のアジュバント、好ましくは上記の好ましいアジュバントの一つ含むリポソーム組成物である。
【００７５】
本発明のリポソームおよび／または本発明のリポソーム組成物は、安定剤を含むのが好ましく、安定剤は、α‐トコフェロールまたは炭水化物、特にグルコース、ソルビトール、スクロース、マルトース、トレハロース、ラクトース、セルビオース、ラフィノース、マルトトリオース、またはデキストランからなる群から選択される。
【００７６】
本発明のリポソームおよび／またはリポソーム組成物は、疾患を治療し、または予防するために使用される免疫化／ワクチン接種法として、治療剤および／診断剤をある種の細胞型に、特に造血細胞系細胞に送達するための有能な送達媒体であることが示され、従って本発明の別の態様は、増殖性疾患、伝染病、血管疾患、リウマチ病、炎症性疾患、免疫疾患、特に自己免疫疾患およびアレルギーの予防用または治療用薬物を生成するための本発明のリポソームまたは本発明のリポソーム組成物の使用である。
【００７７】
リポソームまたはリポソーム組成物は、筋肉内、静脈内、鼻腔内、腹腔内、皮内もしくは皮下、および結節内施用を含む様々な方式によって投与することができる。化合物を疾患部位に直接注射することもできる。リポソームは、他のワクチン接種／免疫化法で通常使用されている量および間隔で投与し、または薬物送達の場合にはフリーの薬物で通常使用されている服用量で投与する。
【００７８】
本発明者らが実施した実験では、このリポソームおよびリポソーム組成物は、腫瘍の治療および／または予防に優れた効力を有することが示され、従って好ましい実施形態では、治療または予防しようとする増殖性疾患は、胃腸路癌もしくは結腸直腸路癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、精巣癌、黒色腫、口腔粘膜異形成、浸潤性口腔癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、ホルモン依存性乳癌、非依存性乳癌、移行細胞癌および扁平上皮細胞癌、神経芽細胞腫を含む神経系悪性腫瘍、グリア細胞腫、星細胞腫、骨肉腫、柔組織肉腫、血管腫、内分泌腫瘍、白血病を含む血液異常増殖、リンパ腫、他の骨髄増殖性疾患およびリンパ球増殖性疾患、上皮内癌、過形成病変、腺腫、線維腫、組織球増殖症、慢性炎症性増殖性疾患、血管増殖性疾患、ならびにウイルス誘発増殖性疾患からなる群から選択される。
【００７９】
本発明のリポソームおよび組成物の好ましい使用では、リポソームまたはリポソーム組成物の投与前、投与と同時に、または投与後に、一種もしくは複数のアジュバント、およびまたはサイトカインを投与する。ここで使用する用語、アジュバントは既に定義されている。好ましいアジュバントは、ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフ）を含む非メチル化ＤＮＡ、特に、ホスホロチオ酸（ＰＴＯ）主鎖を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＴＯ  ＯＤＮ）またはリン酸ジエステル（ＰＯ）主鎖を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＯ  ＯＤＮ）；水酸化アルミニウム（ミョウバン）のゲル様沈殿物；グラム陰性菌外膜由来細菌産物、特にモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ムラミルジペプチド、およびそれらの誘導体；合成リポペプチド誘導体、特にＰａｍ３Ｃｙｓ；リポアラビノマンナン；ペプチドグリカン；ザイモサン；熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、特にＨＳＰ  ７０；ｄｓＲＮＡおよびその合成誘導体、特にポリＩ：ポリＣ；ポリカチオンペプチド、特にポリ‐Ｌ‐アルギニン；タキソール；フィブロネクチン；フラゲリン；イミダゾキノリン；アジュバント活性を有するサイトカイン、特にＧＭ‐ＣＳＦ、インターロイキン‐（ＩＬ‐）２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１８、インターフェロンＩ型およびＩＩ型、特にインターフェロン‐γ、ＴＮＦ‐α；水中油滴型乳濁液、特にスクアレンからなるＭＦ５９；Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタン‐トリオレアート）、より高度に精製したＱｕｉｌ  Ａ誘導体であるＱＳ‐２１、非イオン性ブロックポリマー、特にポロクサマー４０１、サポニンおよびその誘導体、特にサポニン由来免疫賦活性断片；ポリホスファゼン；Ｎ‐（２‐デオキシ‐２‐Ｌ‐ロイシルアミノ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル）‐Ｎ‐オクタデシルドデカノイルアミドヒドロアセタート（ＢＡＹ  Ｒ１００５）、２５‐ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）；ＤＨＥＡ；ムラメチド［ＭＤＰ（Ｇｌｎ）‐ＯＭｅ］；ムラパルミチン；乳酸および／またはグリコール酸ポリマー；ポリメタクリル酸メチル；ソルビタントリオレアート；スクワラン；ステアリルチロシン；スクアレン；テルアミド、合成オリゴペプチド、特にＭＨＣＩＩに提示されたペプチドからなるアジュバントの群から選択される。本発明のリポソームまたはリポソーム組成物の投与前、投与中、または投与後に投与することができる特定の好ましいアジュバントは、アジュバント活性を有するサイトカイン、特にＧＭ‐ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ‐）２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１８、インターフェロンＩ型およびＩＩ型、特にインターフェロン‐γ、またはＴＮＦ‐αである。
【００８０】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれている。以下の実施例に開示した技術は、本発明の実施にあたって首尾よく機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従ってその実施に好ましい方式とみなし得ることを当業者には理解されたい。しかし、本開示に照らして、添付の特許請求の範囲に記載した本発明の趣旨と範囲を逸脱することなしに、開示した具体的実施形態では多くの変化を行うことができることを当業者は理解すべきものとする。引用した参照文献は全て、参照により本明細書に組み込む。
【実施例１】
【００８１】
ＡＶＥ３およびＡＶＥ５を抗原提示細胞へ結合
様々な型の抗原提示細胞への結合について、様々なリポソーム製剤：ＡＶＥ３（コレステロール、ＤＬＰＥ、ＤＯＰＳはモル比で１：１：１）、ＡＶＥ５（コレステロール、ＤＬＰＥ、ＤＯＰＧはモル比で１：１：１）、またはＡＶＥ１４（コレステロール、ＤＬＰＥ、ＥＰＣモル比で１：１：１）を分析した。脂質は全て、Avanti Polar Lipids（米国）、Calbiochem（米国）、またはLipoid GmbH（ドイツ国）から購入し、さらに精製することなく使用した。リポソームは、乾燥脂質フィルムから含水によって調製した。この目的のために、脂質をクロロホルムまたはクロロホルム／メタノール（１：１）に溶解し、示した割合で混合した。結合を調査するために、０．３ｍоｌ％のローダミン標識ＤＰＰＥを加えた。ロータリーエバポレーターを使用して脂質を乾燥し、残留溶媒を高真空除去した。次いで、脂質フィルムに１０ｍｍоｌ／ｌのヘペスｐＨ７．４を含水させて最終脂質濃度１０μｍоｌ／mｌにした。リポソームを５０ｎｍ膜を通して２１回押し出した。調製したリポソームは全て、平均径が８０〜１１０ｎｍであった。平均ゼータ電位は、ＡＶＥ３では‐６７ｍＶ、ＡＶＥ５では‐４３ｍＶ、およびＡＶＥ１４では‐１２ｍＶであった。
【００８２】
未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨から採取した骨髄細胞からマウス樹状細胞を発生させ、ｍＧＭ‐ＣＳＦの存在下で６日間培養した。これらの骨髄由来樹状細胞（ｂｍＤＣ）を無血清培地または１０％のＦＣＳを含む培地中、０．２〜１．３ｍｍоｌ／ｌのローダミン標識リポソーム製剤と共に、８℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２度洗浄し、ＣＤ１１ｃ‐ＦＩＴＣに対するモノクローナル抗体を用いてＤＣを対比染色剤で着色し、フローサイトメトリーによって分析した。結果（図１）として、負荷電ＰＳもしくはＰＧ含有リポソーム（ＡＶＥ３およびＡＶＥ５）は、マウスｂｍＤＣに強く結合するが、ＡＶＥ１４リポソームは結合しないことが示された。これらの実験では、１０％のＦＣＳの存在下でインキュベートされたリポソームでは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）分析によって定量されたように強い結合が観察された（図２）。さらに、３７℃で細胞をインキュベートすることによって蛍光強度は改善された（図２）。
【００８３】
それ以上の研究では、マウス脾臓由来抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ｔ細胞、またはＢ細胞への結合を分析した。抗ＭＨＣ  ＩＩ抗体での染色によってＡＰＣ、抗ＣＤ３抗体での染色によってＴ細胞、抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０での染色によってＢ細胞が同定された。
【００８４】
この研究によって、ＡＶＥ３またはＡＶＥ５はＡＰＣおよびＢ細胞へ強力に結合することが実証されたが、ＡＶＥ１４はほんのわずかにしか結合しないことが観察された（図４）。
【００８５】
１週間末梢血単核細胞を培養して得られたヒトマクロファージまたは樹状細胞を用いて、ＡＶＥ３と、ＩＬ‐４およびＧＭ‐ＣＳＦの強力な結合も観察された（図４）。それに反して、３５ｍоｌ％のコレステロール、３２．１ｍоｌ％のＰＯＰＣ、１４．７ｍоｌ％のＤＬＰＥ、１８．２ｍоｌ％の乳ＳＭからなるＰＣリポソームは、これらの細胞に非常に弱い結合しか示さなかった。
【００８６】
免疫化に使用したリポソームが皮膚ランゲルハンス細胞（ＬＣ）に結合するかどうかさらに分析した。これらの細胞が、皮内ワクチン接種に続いて抗原を捕獲する最初の細胞だからである。主要なＬＣをマウス皮膚から単離し、記載の通りリポソームと共にインキュベートした。約６０％のＭＨＣクラスＩＩ＋ＬＣがＡＶＥ３リポソームと結合した（図５Ａ、Ｂ）。さらに、先に記載した通り、マウスＣＤ１１ｃ＋ｂｍＤＣもＡＶＥ３リポソームに結合した。さらに、ＤＣのＣＤ１１ｃ＋集団中のうち、約５４％がＡＶＥ３リポソームに結合するが、対照リポソームＡＶＥ１４には結合しなかった（図５Ｃ、Ｄ）。ＦＡＣＳ分析に並行して、ＡＶＥリポソームとｂｍＤＣの結合も蛍光顕微鏡によって分析した（図５）。ｂｍＤＣでは強力な細胞内蛍光が観察され、ＤＣへの結合後、リポソームが内部移行するようになることが示された。
【００８７】
これらの実験は、ＡＶＥ３だけでなくＡＶＥ５も、様々な免疫系抗原提示細胞に対して強力な結合活性を有することを実証している。この結合は、血清タンパク質の存在下３７℃でも観察され、これらのリポソームが、生理学的条件下でこれらの細胞への結合活性を示すことを証明している。
【実施例２】
【００８８】
ホスファチジルセリン、コレステロール、およびホスファチジルエタノールアミン濃度が抗原提示細胞への結合に及ぼす影響
第一の実験では、マウス脾臓から単離した樹状細胞、Ｂ細胞、およびＴ細胞への結合に及ぼす様々なホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）の濃度の影響を分析した。他の脂質濃度を一定に維持するために、検出用に０．３ｍоｌ％のローダミン標識ＰＥを添加して、以下のリポソームを生成した：ＡＶＥ３１（２５ｍоｌ％のコレステロール、２５ｍоｌ％のＤＬＰＥ、３３．３ｍоｌ％のＤＯＰＳ、１６．７ｍоｌ％のＰＯＰＣ）、ＡＶＥ３１‐１０ＰＳ（２５ｍоｌ％のコレステロール、２５ｍоｌ％のＤＬＰＥ、１０ｍоｌ％のＤＯＰＳ、４０ｍоｌ％のＰＯＰＣ）、ＡＶＥ３１‐５０ＰＳ（２５ｍоｌ％のコレステロール、２５ｍоｌ％のＤＬＰＥ、５０ｍоｌ％のＤＯＰＳ）。マウス脾細胞を４〜８℃でリポソームと共にインキュベートした。抗ＣＤ１１ｃ抗体を用いた対比染色によってＤＣ、抗ＣＤ３抗体を用いてＴ細胞、および抗ＣＤ４５Ｒ抗体を用いてＢ細胞を同定した。全てのリポソーム（２００ｎｍоｌの脂質と共にインキュベートした５×１０５個の脾細胞）で、ＤＣだけでなくＢ細胞に対する強力な結合が観察されたが、Ｔ細胞とは弱い結合しか観察されなかった。ＤＣへの強力な結合を示す、ＰＳ濃度依存性結合は、３３．３および５０ｍоｌ％（約８０〜９０％のＣＤ１１ｃ陽性細胞が結合）で観察されたが、１０ｍоｌ％ではＰＳ結合は約６５％に低減された（図６）。同様の結合特性は、培地中、１０％のＦＣＳが存在する際にも観察された。これらの実験によって、ＤＣや、Ｂ細胞などの他の抗原提示細胞に対する最も強力な結合がＰＳ濃度２０〜５０ｍоｌ％で観察されることが明瞭に実証された。この結合挙動は、１０％のＦＣＳの存在下でも同様に観察された。
【００８９】
第２の実験では、樹状細胞、Ｂ細胞、およびＴ細胞への結合に及ぼす様々なコレステロール濃度の影響を分析した。検出用に０．３ｍоｌ％のローダミン標識ＰＥを添加して、以下のリポソームを生成した：ＡＶＥ３２（３３．３ｍоｌ％のコレステロール、２５ｍоｌ％のＤＬＰＥ、２５ｍоｌ％のＤＯＰＳ、１６．７ｍоｌ％のＰＯＰＣ）、ＡＶＥ３２‐１０Ｃｈｏｌ（１０ｍоｌ％、コレステロール、２５ｍоｌ％のＤＬＰＥ、２５ｍоｌ％のＤＯＰＳ、４０ｍоｌ％のＰＯＰＣ）、ＡＶＥ３２‐５０Ｃｈｏｌ（５０ｍоｌ％、コレステロール、２５ｍоｌ％のＤＬＰＥ、２５ｍоｌ％のＤＯＰＳ）。マウス脾細胞を４〜８℃でリポソームと共にインキュベートした。上記した抗体染色によってＤＣ、Ｂ細胞、およびＴ細胞が同定された。再度、ＤＣおよびＢ細胞への強力な結合が観察された。結合はコレステロール濃度に依存しており、最も強力な結合は５０ｍоｌ％のコレステロールで観察された（図７）。
【００９０】
第３の実験では、樹状細胞、Ｂ細胞、およびＴ細胞への結合に及ぼす様々なホスファチジルエタノールアミン濃度の影響を分析した。検出用に０．３ｍоｌ％のローダミン標識ＰＥを添加して、以下のリポソームを生成した：ＡＶＥ３３‐０ＰＥ（２５ｍоｌ％のコレステロール、２５ｍоｌ％のＤＯＰＳ、５０ｍоｌ％のＰＯＰＣ）、ＡＶＥ３３‐１０ＰＥ（２５ｍоｌ％のコレステロール、１０ｍоｌ％のＤＬＰＥ、２５ｍоｌ％のＤＯＰＳ、４０ｍоｌ％のＰＯＰＣ）、ＡＶＥ３３‐２０ＰＥ（２５ｍоｌ％のコレステロール、２０ｍоｌ％のＤＬＰＥ、２５ｍоｌ％のＤＯＰＳ、３０ｍоｌ％のＰＯＰＣ）、ＡＶＥ３３‐３３ＰＥ（２５ｍоｌ％のコレステロール、３３．３ｍоｌ％のＤＬＰＥ、２５ｍоｌ％のＤＯＰＳ、１６．７ｍоｌ％のＰＯＰＣ）、ＡＶＥ３３‐５０ＰＥ（２５ｍоｌ％のコレステロール、５０ｍоｌ％のＤＬＰＥ、２５ｍоｌ％のＤＯＰＳ）。マウス脾細胞を４〜８℃でリポソームと共にインキュベートした。上記した抗体染色によってＤＣ、Ｂ細胞、およびＴ細胞が同定された。ＰＥ濃度を上昇させると、ＤＣへのリポソームの結合が増大し、Ｂ細胞およびＴ細胞への結合もある程度増えた（図８）。この知見は、ＰＥ濃度を上昇させると、リポソームの結合および取込みが改善されることを実証している。
【００９１】
最終実験では、ＤＣへ結合させるための、ＰＳ、ＰＧ、ＰＥ、Ｃｈｏｌ、およびＰＣの様々な組成からなるリポソームを分析した。検出用に０．３ｍоｌ％のローダミン標識ＰＥを添加して、以下のリポソームを試験した：ＡＶＥ３（ＤＯＰＳ、ＤＬＰＥ、Ｃｈｏｌモル比で１：１：１）、ＡＶＥ５（ＤＯＰＧ、ＤＬＰＥ、Ｃｈｏｌモル比で１：１：１）、ＡＶＥ１４（ＥＰＣ、ＤＬＰＥ、Ｃｈｏｌモル比で１：１：１）、ＡＶＥ４１（ＤＯＰＳ、ＤＯＰＧ、Ｃｈｏｌモル比で１：１：１）、ＡＶＥ４３（ＤＯＰＳ、ＤＰＰＣ、Ｃｈｏｌモル比で１：１：１）、およびＡＶＥ４４（ＤＯＰＧ、ＤＰＰＣ、Ｃｈｏｌモル比で１：１：１）。組成を下表１に要約する。
【００９２】
【表１】
2007515452.tif 000002
【００９３】
１０％のＦＣＳの存在下または非存在下、培地中、４℃または３７℃でマウス脾細胞をリポソームと共にインキュベートした。上記したように抗体染色によってＤＣを同定した。先に観察されたように（実施例１）、ＡＶＥ３およびＡＶＥ５は、樹状細胞に強く結合するが、ＡＶＥ１４は非常に弱い結合しか示さなかった。ＡＶＥ３のＰＥをＰＣに（＝ＡＶＥ４３）またはＡＶＥ５のＰＥをＰＣに（＝ＡＶＥ４４）変えると、ＤＣへの結合が劇的に減少したが、これは平均蛍光強度およびＤＣへの結合した細胞の割合によって判明した（図９）。３７℃でリポソームを分析した場合、この差は最も強く、ＤＣによるリポソームの取込みにＰＥがなんらかの作用を及ぼすことを示していた。この知見は、ＡＶＥ３またはＡＶＥ５中のＰＥの存在は、樹状細胞への結合、および同細胞による取込みに有益な効果があることを明瞭に実証している。この知見はまた、ＰＳまたはＰＧ非存在下のＰＥ（＝ＡＶＥ１４）は、リポソームがＤＣへ結合するには十分でないことも示している。しかし、驚くべきことに、等モル量のＰＳ、ＰＧ、およびコレステロールからなるリポソーム（ＡＶＥ４１）は、ＡＶＥ３またはＡＶＥ５の結合活性と同様の結合活性を示すことが判明した（図９）。この知見は、コレステロールと組み合せて２種の負荷電リン脂質（ＰＳおよびＰＧ）からなるリポソームは、コレステロール、ＰＥ、およびＰＳもしくはＰＧのどちらかからなるリポソームの代用とすることができることを示している。
【実施例３】
【００９４】
注射部位および流入領域リンパ節での持続性リポソーム沈着
異なるリポソーム製剤の生体内での利用能および安定性を評価するために、ローダミン標識ＡＶＥ３またはＡＶＥ１４リポソーム（実施例１を参照）をＣ５７ＢＬ／６マウス脇腹または後肢足蹠に皮内注射した。異なる時点で、注射部位から得た皮膚および流入領域リンパ節を包埋し凍結切片を調製した（図ｌ０Ａ）。ＡＶＥ３の注射後７日目まで皮膚内に強力な蛍光シグナルが観察されたのに対して、ＡＶＥ１４リポソームの場合には有意な蛍光を検出することができなかった（図ｌ０Ａ）。さらに、流入領域リンパ節では、ＡＶＥ３の場合にのみ注射後７日目まで蛍光を検出することができたのに対して、中性リポソーム（ＡＶＥ１４）は注射から１６時間後、弱い蛍光しか検出することができなかった。これらの知見は、ＡＶＥ３によって注射部位および流入領域リンパ節で持続性沈着がもたらされることを示している。
【実施例４】
【００９５】
樹状細胞によるカプセル化化合物の取込みおよび流入領域リンパ節での局在化
さらに、リポソーム封入化分子が、ＤＣ／ＬＣによっても取り込まれ、リンパ系に輸送されることを実証するために、Ｃｙ３標識非ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）をＡＶＥ３リポソーム中にカプセル化した（実施例６を参照）。ＤＣ／ＬＣに働くＣｐＧ  ＯＤＮ媒介活性化作用を排除し、それによってそれら遊走に働く作用を排除するために非ＣｐＧ  ＯＤＮをカプセル化した。脇腹または後肢足蹠に皮内注射してから２４時間後、リンパ節（ＬＮ）を採取し、単一細胞懸濁液を調製し、ＦＡＣＳによって分析した。後肢足蹠に注射したマウスの非常に多くのＤＣ（１４．７％）が、リポソーム封入化Ｃｙ３‐ＯＤＮを取り込んだが、脇腹に皮内注射したマウスのＤＣは数個しか取り込まなかった（図１０Ｂ、Ｃ）。
【実施例５】
【００９６】
抗原ペプチドをＡＶＥ３およびＡＶＥ５へカプセル化
抗原ペプチドＴＲＰ‐２（SVYDFFVWL）をＡＶＥ３またはＡＶＥ５中にカプセル化した（組成については実施例１を参照）。脂質を２９．４ｍｇのＴＲＰ‐２とモル比で１：２０で混合し、５０ｍｌのＤｕｒａｎガラス製ボトルに充填した。５０ｇのヘペス緩衝液（１０ｍｍоｌ／ｌ、ｐＨ７．４）を加え、Ultra−Turrax T8分散装置（IKAWerke, Staufen、ドイツ国）によって、混合物を５５℃の温浴中約２５０００ｒｐｍで３０分間攪拌した。Ultra‐Turraxは、Ｓ８Ｎ‐８Ｇ分散エレメントを具備していた。その間、ボトルをボルテックスで数回攪拌して、ボトルの隅で沈殿が生じるのを回避した。均質な懸濁液を得た後、蒸発した水分を交換し、調製物をEmulsiflex C‐5 ホモジナイザ（Avestin Inc., Ottawa、カナダ国）に移した。均質化ノズル前５０．０００〜１５０．０００ｋＰａで以下の均質化を３０分間実施したが、ホモジナイザ圧力は３００ｋＰａであった。このステップの最後で、フィルタユニットを挿入し、孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を用いて５分間リポソーム分散体をろ過した後、滅菌ろ過を行った。１日貯蔵した後、粒径を光子相関分光法によって測定し、リポソーム中のＴＲＰ‐２の量をＨＰＬＣ分析によって測定した。リポソーム径は１３０〜１８０ｎｍであった。カプセル化効率は、２３０〜３００μｇ／ｍｌ（３９〜５１％）の範囲であった。
【００９７】
１０、２０、または４０ｍоｌ％のホスファチジルセリンを含む、様々なＡＶＥ３ベース製剤を並行比較することによって、ＰＳ濃度を上昇させるとカプセル化効率が改善することが実証された。以下の製剤を試験した：ＡＶＥ３‐１０ＰＳ（３３．３ｍоｌ％のコレステロール、３３．３ｍоｌ％のＤＬＰＥ、１０ｍоｌ％のＤＯＰＳ、２３．３ｍоｌ％のＰＯＰＣ）、ＡＶＥ３‐２０ＰＳ（３３．３ｍоｌ％のコレステロール、３３．３ｍоｌ％のＤＬＰＥ、２０ｍоｌ％のＤＯＰＳ、１３．３ｍоｌ％のＰＯＰＣ）、ＡＶＥ３‐４０ＰＳ（３３．３ｍоｌ％のコレステロール、２６．７ｍоｌ％のＤＬＰＥ、４０ｍоｌ％のＤＯＰＳ）、およびＡＶＥ１４（実施例１を参照）。カプセル化効率は、ＡＶＥ３‐１０ＰＳで２８％、ＡＶＥ３‐２０ＰＳで３４％、ＡＶＥ３‐４０ＰＳで４３％、およびＡＶＥ１４で１３％であった。リポソーム径は、１００〜１２０ｎｍの範囲であった。この知見は、ＰＳは抗原ペプチドのカプセル化に影響し、ＰＳ濃度が高いほどカプセル化が改善されることを実証している。
【実施例６】
【００９８】
オリゴヌクレオチドをＡＶＥ３へカプセル化
クロロホルム、またはクロロホルム：メタノール（１：１）に溶解させた脂質（４０μｍоｌ／ｍｌ）（ＡＶＥ３の脂質組成については実施例１を参照）を３０ｍｂａｒおよび３４℃のロータリーエバポレーターで１５分間乾燥させた。得られた脂質フィルムをさらに１０ｍｂａｒの真空チャンバで乾燥した。その後、１０ｍｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドＣｐＧ‐１８２６または非ＣｐＧ‐１９８２（ホスホロチオ酸（ＰＴＯ）およびリン酸ジエステル（ＰＤＯ）としてＣｐＧ‐１８２６、５'‐ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ‐３'；非ＣｐＧ‐１９８２‐ＰＴＯ、５'‐ＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＴ‐３'）を含む等張ヘペス緩衝液（１０ｍｍоｌ／ｌ、ｐＨ７．４）１ｍｌに数個のガラスビーズを入れたロータリーエバポレーターで乾燥フィルムを含水させた。次いで、分散体を孔径５０ｎｍのポリカーボネート膜を通して２１回押し出した。フリーのオリゴヌクレオチドを除去するために、リポソーム懸濁液をセファロースＣＬ‐４Ｂカラム（Pharmacia、スウェーデン国）によるサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。採取したリポソーム画分をカットオフ３００００ＭＷのVivaspin濃縮装置（Vivascience、ドイツ国）を使用し、限外濾過濃縮した。最後に、小胞を２００ｎｍの滅菌フィルタ膜でろ過した。水力学的直径をZetasizer 3000HS（Malvern, Herrenberg、ドイツ国）を使用し測定した。カプセル化したオリゴヌクレオチドをイオン交換ＨＰＬＣによって定量した。リポソーム径は１００〜１２５ｎｍであった。カプセル化効率は４〜７％の範囲であった。ホスホロチオ酸またはリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドでは差は観察されず、ホスホロチオ酸およびリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドはＡＶＥ３リポソームにカプセル化できることが証明された。
【実施例７】
【００９９】
Ｐａｍ３Ｃｙｓおよび抗原ペプチドをＡＶＥ３へカプセル化
クロロホルム、またはクロロホルム：メタノール（１：１）に溶解させた脂質（実施例１を参照）およびＰａｍ３Ｃｙｓ（２．５ｍоｌ％）、ならびにＤＭＳＯに溶解させた抗原ペプチドを１０ｍｂａｒおよび３４℃のロータリーエバポレーターで６０分間乾燥させた。得られた脂質フィルムをクロロホルム中に分解し、再度先に記載した通り乾燥した。滑らかで均質なフィルムを得られるまでこのステップを繰り返し、続いて１０ｍｂａｒの真空チャンバで残留溶媒を除去した。次いで、１ｍｌの等張ヘペス緩衝液（１０ｍｍоｌ／ｌ、ｐＨ７．４）に数個のガラスビーズを入れたロータリーエバポレーターで乾燥フィルムを含水させた。得られた分散体を２１回孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通して押し出した。この手順の最後で製剤を滅菌ろ過した。
【実施例８】
【０１００】
モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）および抗原ペプチドをＡＶＥ３へカプセル化
クロロホルム、またはクロロホルム：メタノール（１：１）に溶解させた脂質（実施例１を参照）およびＭＰＬＡ（５％もしくは１０％（ｗ／ｗ））、ならびにＤＭＳＯに溶解させた抗原ペプチドを１０ｍｂａｒおよび３４℃のロータリーエバポレーターで６０分間乾燥させた。得られた脂質フィルムをクロロホルム中に分解し、再度先に記載した通り乾燥した。滑らかで均質なフィルムが得られるまでこのステップを繰り返し、続いて１０ｍｂａｒの真空チャンバで残留溶媒を除去した。次いで、１ｍｌの等張ヘペス緩衝液（１０ｍｍоｌ／ｌ、ｐＨ７．４）に数個のガラスビーズを入れたロータリーエバポレーターで乾燥フィルムを含水させた。得られた分散体を２１回孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通して押し出した。この手順の最後で製剤を滅菌ろ過した。
【実施例９】
【０１０１】
ＡＶＥ３カプセル化ＣｐＧＰＴＯオリゴヌクレオチドがＢ細胞増殖を誘発
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞増殖を誘発すると記載されてきた。フリーのまたはカプセル化ＣｐＧホスホロチオ酸オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ‐ＰＴＯ）（実施例６を参照）がマウスＢ細胞の増殖に及ぼす作用（図１１Ａ）を比較した。ＡＶＥ３カプセル化ＣｐＧは、未カプセル化ＣｐＧ‐ＰＴＯと同じ活性を示すことが判明した（図１０）。Ｂ細胞増殖の誘発は、施用されたＯＤＮの濃度に依存し、強力なＢ細胞増殖は５０〜２００ｎｍоｌ／ｌのカプセル化ＯＤＮで観察された。同様の値は、異なる濃度でカプセル化されたＣｐＧ‐ＯＤＮ（４．６μｇ／μｍоｌ脂質〜９３．５μｇ／μｍоｌ脂質）でも得られた。フリーのまたはカプセル化した非ＣｐＧ‐ＯＤＮを使用した際には、Ｂ細胞増殖の誘発は観察されなかった（図１１Ｂ）。この知見は、ＡＶＥ３カプセル化ＣｐＧ‐ＯＤＮが生物学的に活性であることを実証している。
【実施例１０】
【０１０２】
ＡＶＥ３がＣｐＧ‐ＰＤＯオリゴヌクレオチドを分解から保護
濃度５〜２００ｎｍоｌ／ｌのＯＤＮを使用し、フリーのまたはＡＶＥ３カプセル化形のＢ細胞増殖の誘発について、ＣｐＧホスホロチオ酸（ＣｐＧ‐ＰＴＯ）またはＣｐＧリン酸ジエステル（ＣｐＧ‐ＰＤＯ）オリゴヌクレオチド（実施例６を参照）を分析した。フリーのおよびカプセル化ＣｐＧ‐ＰＴＯによって、濃度に依存したＢ細胞増殖の誘発がもたらされた（図１２）。誘発は、同様にＡＶＥ３カプセル化ＣｐＧ‐ＰＤＯでも観察された。低濃度（５〜１０ｎｍоｌ／ｌ）では、カプセル化ＣｐＧ‐ＰＴＯよりもカプセル化ＣｐＧ‐ＰＤＯで強力な誘発が観察された。高い濃度（５０〜２００ｎｍоｌ／ｌ）では、誘発は、カプセル化ＣｐＧ‐ＰＴＯの方が高かった。最も興味深いことに、フリーのＣｐＧ‐ＰＤＯは、極めて可能性が高い急速分解のために、これらの濃度では全く増殖を誘発しなかった。従って、ＡＶＥ３リポソームは、リン酸ジエステルオリゴヌクレオチドなどの感受性化合物が分解されないように保護することができ、活性形での分子の送達を可能にする。
【実施例１１】
【０１０３】
リポソームワクチン接種後に特異的かつ高結合性Ｔ細胞免疫応答の誘発
抗原モデルペプチドとしてＴＲＰ‐２ペプチド（SVYDFFVWL）を使用し、マウスで免疫応答の発生に及ぼす様々なＡＶＥ３ベース製剤の作用を分析した。このペプチドは、ヒトＨＬＡ‐Ａ＊０２０１によって提示されたが、マウスＭＨＣクラスＩ分子Ｈ‐２Ｋｂおよび同質遺伝子的Ｂ１６黒色腫細胞系によっても提示された。この目的のために、後肢足蹠への一回の注射によってマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を免疫化した。４日後、マウスを屠殺し、流入領域リンパ節を取り出し、ＩＬ‐２の存在下で６、７日間リンパ節の細胞を培養した。次いで、抗原ペプチド（ＴＲＰ‐２）または無関係なペプチド（ＯＶＡペプチド、SIINFEKL）で細胞を刺激した。１６時間後、サイトカイン分泌アッセイによりＩＦＮγの産生についてＣＤ８陽性細胞を分析した。全ての実験で、ヨウ化プロピジウムを用いた染色によって死細胞を除外した。
【０１０４】
初期実験では、１頭につき５０〜１００μｇの濃度のフリーのＴＲＰ‐２によって、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の強力な誘発がもたらされたことが判明した。未カプセル化ＣｐＧでは１頭につき２．５〜５ｎｍоｌの濃度で強力な免疫応答が得られた。
【０１０５】
１００μｇの未カプセル化ＴＲＰ‐２の存在下で、様々な濃度のＡＶＥ３カプセル化ＣｐＧ‐ＰＴＯの作用（図１３）を分析した。この実験によって、１．３ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＯＤＮ濃度付近でＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の強力な誘発が示された。濃度を高くしても免疫応答は改善せず、少量のカプセル化ＣｐＧ‐ＰＴＯでもＴ細胞応答の誘発には十分なことが示された。
【０１０６】
５ｎｍоｌのフリーのＣｐＧ‐ＰＴＯの存在下でのＡＶＥ３カプセル化ＴＲＰ‐２の滴定では、１頭につき１０〜２０μｇのペプチドで、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の強力な誘発が示された（図１４）。１０μｇのＡＶＥ３カプセル化ＴＲＰ‐２の存在下でのフリーのＣｐＧ‐ＰＴＯの滴定では、１頭につき５〜１０ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯで、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の強力な誘発が示された（図１５）。
【０１０７】
別の実験では、リポソームＴＲＰ‐２およびリポソームＣｐＧ‐ＰＴＯの作用（図１６）を比較した。１頭につき１０μｇのＡＶＥ３カプセル化ＴＲＰ‐２を使用し、１頭につき０．６〜２．５ｎｍоｌのＡＶＥ３カプセル化ＣｐＧ‐ＰＴＯで、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の強力な誘発が見出された。１頭につき１．３ｎｍоｌのＡＶＥ３カプセル化ＣｐＧ‐ＰＴＯを施用し、１０〜２０μｇのＡＶＥ３カプセル化ＴＲＰ‐２で、ＡＶＥ３カプセル化ＣｐＧ‐ＰＴＯの強力な誘発（図１７）が観察された。未カプセル化ＴＲＰ‐２およびＣｐＧ‐ＰＴＯの使用と比較して、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の同じ誘発は、１００μｇのフリーのＴＲＰ‐２および５ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯを使用した場合にのみ観察された。従って、これらの化合物をＡＶＥ３へカプセル化することによって、抗原ペプチドおよびＣｐＧ‐ＰＴＯの量を１／４〜１／１０倍に削減できるようになる（図１８）。
【０１０８】
ＴＲＰ‐２のＡＶＥ３へのカプセル化またはＡＶＥ５へのカプセル化を比較することによって、１頭につき１０μｇの施用ペプチド濃度では、ＡＶＥ５よりもＡＶＥ３をワクチン接種した後に、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞のはるかに強力な誘発が観察されたことが示され、これにはアジュバントとしてＣｐＧ‐ＰＴＯを同時施用する必要があった。ＣｐＧ‐ＰＴＯ単独またはアジュバントを用いないリポソームでは、有意なレベルのＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞（図１９）はもたらされなかった。
【０１０９】
別の実験組では、リポソームワクチン接種後の細胞障害性Ｔリンパ球の抗原特異性（図２０）を分析した。上記のように、ＡＶＥ３カプセル化ＴＲＰ‐２またはフリーのＴＲＰ‐２およびＣｐＧ‐ＰＴＯによってマウスを免疫化した。次いで、Ｈ‐２Ｋｂに対してＴＲＰ‐２を提示することが判明しているマウス黒色腫細胞系Ｂ１６．Ｆ１、潜在的なＮＫ細胞の活性を排除するために、ＴＲＰ‐２をパルスしたＥＬ４細胞、ＯＶＡペプチドをパルスしたＥＬ４細胞、未パルスのＥＬ４細胞、およびＹＡＣ‐１細胞を標的として使用し、リンパ節から調製した細胞の細胞毒性を試験した。１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２および１．３ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＴＯによる免疫化後、細胞比を標的とした様々なエフェクタで、ＴＲＰ‐２提示細胞（Ｂ１６．Ｆ１、およびＴＲＰ‐２をパルスしたＥＬ４）の特異的ＣＴＬ媒介溶解を実証した。ＹＡＣ‐１細胞は死滅しないことが観察され、ＣＴＬは抗原特異的を示すが、ＮＫ様細胞障害活性は示さないことが示唆された。上記のように、フリーのＴＲＰ‐２の１０倍を超える量、およびＣｐＧ‐ＰＴＯの４倍を超える量が、同じＣＴＬ応答を誘発するのに必要であった。
【０１１０】
ＣＴＬは、ＤＣの成熟を誘発する因子を産生することができ、従って特に、それらが高頻度に存在する場合、それ自体で同時刺激的環境を作出すると思われる。従って、検出のために、ＴＲＰ‐２またはＯＶＡ対照ペプチドをパルスしたＨ‐２Ｋｂ二量体を使用した免疫化から０〜４日後の、血中でのＴＲＰ‐２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度（図２１）を測定した。未処置マウスを１００μｇのＴＲＰ‐２と５ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯを含む生理食塩水、１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２と５ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯを含む生理食塩水、１０μｇのＴＲＰ‐２リポソームと１．３ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯリポソームでワクチン接種し、または未処理のまま残した。ワクチン接種直後（０日目）、またはワクチン接種後１、２、および４日目に特異的Ｔ細胞の頻度を測定した。生理食塩水中のみならずリポソームＴＲＰ‐２とＣｐＧを含む生理食塩水中でのワクチンでも有意な数の特異的ＣＴＬを誘発することができなかった。リポソームにカプセル化したＴＲＰ‐２およびＣｐＧでのワクチン接種でのみ、かなりの数の特異的Ｔ細胞集団が得られた（全ＣＤ８＋集団中に５％のＴＲＰ‐２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）。
【０１１１】
最後に、リポソームＴＲＰ‐２またはフリーのＴＲＰ‐２のそれぞれで免疫化した動物のＴＲＰ‐２特異的ＣＴＬの結合力（図２１）を比較した。数度の免疫化後、ＩＦＮγ＋産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、脾細胞中では上昇しＬＮ中では減少した（図２２Ａ）。これは、活性化したＴ細胞はＬＮを離れ血管および脾臓に侵入するということを反映しているかもしれない。興味深いことに、リポソームＴＲＰ‐２で一回免疫化後、フリーのＴＲＰ‐２で免疫化したマウスと比較して、著しく多くのＩＦＮγ＋Ｔ細胞がＬＮ中で検出された（図２２Ｂ）。ＩＦＮγ分泌アッセイと並行して、ナイロン‐ウールカラム濃縮脾細胞を高用量のＴＲＰ‐２（１０−６ｍоｌ／ｌ）および低用量のＴＲＰ‐２（１０−９ｍоｌ／ｌ）で５日間培養し、ＡＴＰｌｉｔｅ（商標）‐Ｍシステムを使用して細胞増殖を定量した。低用量ＴＲＰ‐２（１０−９ｍоｌ／ｌ）に対するその増殖によって評価されたように、リポソームＴＲＰ‐２による一回免疫化によって、数個の高結合性Ｔ細胞しか生じなかった（図２２Ｃ）。しかし、免疫化を繰り返すと、低用量ＴＲＰ‐２にだけ応答し高用量ＴＲＰ‐２には応答しないで、高結合性Ｔ細胞に向かって変化した。リポソームＴＲＰ‐２対フリーのＴＲＰ‐２を直接比較すると、２回の免疫化後、フリーフォームは、低高結合性Ｔ細胞および高結合性Ｔ細胞からなる脾細胞のポリクローナル応答をより多く生じることが分かる。それに反して、リポソームＴＲＰ‐２による免疫化では、ほんの少数の低結合性Ｔ細胞しか生じない。増殖特異性を探し求めて、Ｈ‐２Ｋｂ結合ＯＶＡペプチドSIINFEKLを使用した。これは、高結合性Ｔ細胞でクロスプライミングによって部分的増殖を誘発した。未処理動物の脾細胞を対照として使用し、背景レベルでの増殖を証明した。
【０１１２】
これらの実験は、特異的かつ高結合性Ｔ細胞は、ＡＶＥ３カプセル化抗原ペプチドによる免疫化後に生じることを実証している。強力な免疫応答の誘発には、未カプセル化化合物と比較して、かなり低い濃度のカプセル化ペプチドおよびアジュバントが必要である。
【実施例１２】
【０１１３】
ＡＶＥ３カプセル化ＴＲＰ‐２ペプチドの抗腫瘍効果
Ｂ１６．Ｆ１マウス黒色腫細胞の皮下腫瘍モデルで、予防的設定を使用し抗腫瘍効果を分析した（図２３）。一週間空けて２度、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）は後肢足蹠に免疫化した。最後の免疫化から１週間後、２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を含む総容量２００μｌのＨＢＳＳ中によりマウスを皮下接種した。高用量（１００μｇのＴＲＰ‐２＋５ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯ）および低用量（１０μｇのＴＲＰ‐２＋１．３ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯ）のワクチンを含む生理食塩水による免疫化後腫瘍増殖と、低用量のリポソームワクチン（１０μｇのＴＲＰ‐２＋１．３ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯ）による免疫化後腫瘍増殖を比較した。ワクチンを含む生理食塩水によって免疫化したマウスの腫瘤は、未処理マウスの腫瘍に類似し、Ｂ１６接種から１７日後にリポソームワクチンによって免疫化したマウスの腫瘤よりも約１４倍大きかった（図２３Ａ）。Ｂ１６黒色腫細胞の移植後生存期間（図２３Ｂ）も調査した。ワクチンを含む生理食塩水では有意な生存率の上昇は実現できなかった（平均生存時間：未処理１７日、高用量生理食塩水１９日、低用量生理食塩水２１日）。リポソームワクチンによってマウスを免疫化した場合、平均生存時間は著しく長期化されて２８日間になった（ｎ＝５、ｐ＜０．０１７２対未処理）。リポソーム抗原およびアジュバントで処理した１頭のマウスは、完全に腫瘍を拒絶し、１２０日以上腫瘍がないまま過した。
【０１１４】
第２の実験では、治療設定でＢ１６腫瘍細胞に対するワクチン接種（図２４）も調査した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群につき５頭）は、１×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を含む総容量２００μｌのＨＢＳＳを皮下接種した。４日後に、一週間空けてマウスを２度免疫化した。腫瘍増殖をモニターし、腫瘍が直径１．５ｃｍになり、または潰瘍化した時にマウスを安楽死させた。低用量のリポソームワクチンによる免疫化後腫瘍増殖と、未処理マウスの腫瘍増殖を比較した。未処理マウスの腫瘤は、Ｂ１６接種から１７日後リポソームワクチンによって免疫化したマウスの腫瘤の約２３倍であった（図２４Ａ）。Ｂ１６黒色腫細胞の移植後生存期間（図２４Ｂ）も調査した。生存率の有意な上昇は、リポソームワクチンによって実現することができた（平均生存時間：未処理２０日、低リポソーム用量３８日、ｎ＝１０、ｐ＜０．００１２）。さらに、２頭のマウスは完全に腫瘍を拒絶し、腫瘍がないまま１８０日間を越えて過ごし、攻撃から７週間以内に脱色素（白斑症）の徴候が示され、ＴＲＰ２特異的Ｔ細胞応答を実証し、同様にメラニン細胞もＴＲＰ‐２を発現した。
【０１１５】
次に、予防的設定を使用し、Ｂ１６．Ｆ１肺転移モデルで抗腫瘍効果（図２５）を分析した。生体内での細胞障害性Ｔ細胞を準備刺激するために、マウス（１群につき１０頭）は、一週間空けて２度後肢足蹠に免疫化した。最後の免疫化から１週間後、レシピエントＣ５７ＢＬ／６マウスに２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を含む総容量２００μｌのＨＢＳＳを尾静脈注射によって接種した。腫瘍細胞接種後２０日目に、マウスを殺し肺転移数を測定した。腫瘍攻撃から２０日後、リポソームワクチン（１０μｇのＴＲＰ‐２＋１．３ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯ）により免疫化したマウスの平均肺転移数は７．７±０．９８（平均±ＳＥＭ）であったが未処理マウスでは５０．７±４．３３に達した（図２５）。転移コロニー数は、リポソームワクチン接種後約９０％減少し（図２５）、生じた免疫応答がＢ１６の転移を抑制したことを示した。さらに、リポソームのアジュバントのみ（１．３ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯ）によりワクチン接種したマウスは、腫瘍攻撃に対して保護されなかった（平均４４．７５±１０．０８）。従って、抗腫瘍効果がＣｐＧそれ自体に対する作用のためである場合を排除することができた。
【０１１６】
要約すると、予防的設定および治療的設定での生体内実験は、（ｉ）高用量の生理食塩水ワクチンは腫瘍からの保護を誘発しない、（ｉｉ）低用量の本発明者らのリポソームワクチンは致死性皮内または静脈内腫瘍攻撃からマウスを保護する、（ｉｉｉ）観察された作用はＣｐＧ‐ＰＴＯの作用ではないことを実証した。
【実施例１３】
【０１１７】
ワクチン接種のアジュバントとしてのＣｐＧリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドのＡＶＥ３媒介物
実施例１０に示すように、ＡＶＥ３は、血漿成分による分解から、リン酸ジエステルオリゴヌクレオチドなどの感受性化合物を保護することができる。未カプセル化ＣｐＧ‐ＰＤＯ  ＯＤＮではなく、リポソームＣｐＧ‐ＰＤＯ  ＯＤＮは、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の産生によって定量されるように、マウスで免疫応答を誘発することができた（図２６）。高免疫賦活が得られるリポソームＣｐＧ‐ＰＤＯの最適の濃度を判定するために、１頭につき１０μｇのＡＶＥ３カプセル化ＴＲＰ‐２および異なる量のＣｐＧ‐ＰＤＯによるワクチン接種後、用量応答分析および活性化Ｔリンパ球中のＩＦＮγ分泌の測定を実施した。１頭につき０．３〜１．３ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＤＯ  ＯＤＮは、同様の免疫応答を誘発する（図２７）。さらに、リポソームにカプセル化したリン酸ジエステルおよびホスホロチオ酸ＣｐＧ‐ＯＤＮの効力を比較した。この目的のために、用量応答分析を実施し、活性化Ｔリンパ球のＩＦＮγ分泌を測定した。１頭につき０．３〜１．３ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＤＯ  ＯＤＮは、リポソームＣｐＧ‐ＰＴＯよりも高い免疫応答を誘発した（図２８）。０．３ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＴＯは、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞を生成しなかったので、これらのデータはＣｐＧ‐ＰＤＯ  ＯＤＮは、ＡＶＥ３にカプセル化した場合、低濃度でＣｐＧ‐ＰＴＯよりも強力なアジュバントであることを示している。
【０１１８】
次いで、予防的設定を使用するＢ１６．Ｆ１マウス黒色腫細胞の皮下腫瘍モデルでの抗腫瘍効果（図２９）を分析した。一週間空けて２度、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の後肢足蹠に免疫化した。最後の免疫化から１週間後、マウスは２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を含む総容量２００μｌのＨＢＳＳを皮下接種した。１頭につき１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２と組み合せて０．３ｎｍоｌのリポソームカプセル化リン酸ジエステルＣｐＧ  ＯＤＮを含む低用量リポソームワクチンにより免疫化後、腫瘍増殖を分析した。未処理マウスの腫瘤は、Ｂ１６接種から１３日後、リポソームワクチンによって免疫化したマウスの腫瘤の約３．５倍大きかった。この知見は、カプセル化ＣｐＧ‐ＰＯ  ＯＤＮが抗腫瘍免疫応答を誘発するためのアジュバントとして役立ち得ることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】ＤＣへのリポソーム製剤の結合を示す図である。様々な濃度のリポソームを分析した、骨髄由来マウス樹状細胞（ｂｍＤＣ）へのＡＶＥ３およびＡＶＥ５の結合、ＡＶＥ１４の非結合。８℃でインキュベーションを実施し、結合をＣＤ１１ｃ陽性細胞への％相対結合として表した。
【図２】ＤＣへのリポソーム製剤の結合を示す図である。１０％のＦＣＳの非存在または存在下、インキュベーション時間に依存した、４℃または３７℃でのマウスｂｍＤＣへのＡＶＥ３およびＡＶＥ５の結合、ＡＶＥ１４の非結合。結合を平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示す。
【図３】ＡＰＣおよびＢ細胞へのＡＶＥ３およびＡＶＥ５の結合を示す図である。マウスＡＰＣおよびＢ細胞へのＡＶＥ３およびＡＶＥ５の結合、Ｔ細胞へのほんのわずかな結合。
【図４】ヒトマクロファージおよび樹状細胞へのＡＶＥ３の結合を示す図である。ヒトマクロファージおよび末梢血単核細胞由来樹状細胞へのＡＶＥ３の結合。ローダミン標識ＡＶＥ３の結合をフローサイトメトリーによって分析した。陰性対照としてＰＣリポソーム（ＡＶＥ１４）を含めた。
【図５】ランゲルハンス細胞に結合するＡＶＥ３を示す図である。リポソームなしにインキュベートした細胞（Ａ）と比較して、ローダミン標識ＡＶＥ３は、マウス皮膚から単離したランゲルハンス細胞に強く結合する（Ｂ）。強力なＡＶＥ３の結合は、ｂｍＤＣでも観察される（Ｃ）が、対照リポソームＡＶＥ１４は、これらの細胞には結合しない（Ｄ）。顕微鏡によって可視化したｂｍＤＣとＡＶＥ３の結合および内部移行。下段左図のリンパ球は、いかなるＡＶＥ３結合も示さない。位相差顕微鏡（Ｅ）および蛍光顕微鏡（Ｆ）。
【図６】ホスファチジルセリン含有量の影響を示す図である。ＤＣ、Ｂ細胞、およびＴ細胞への結合に対するホスファチジルセリン濃度の影響を評価した。培地中４〜８℃で結合を実施した。
【図７】コレステロール含有量の影響を示す図である。ＤＣ、Ｂ細胞、およびＴ細胞へのリポソームの結合に対するコレステロール含有量の影響を評価した。培地中４〜８℃で結合を実施した。
【図８】ホスファチジルエタノールアミン含有量の影響を示す図である。ＤＣ、Ｂ細胞、およびＴ細胞へのリポソームの結合および内部移行に対するホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）含有量の影響を評価した。１０％の血清を含め、または含めず、それぞれ、４℃および３７℃で結合を実施した。ヨウ化プロピジウム染色（１μｇ／ｍｌ）によって死細胞を除外した。
【図９】ＤＣへの結合に対する異なる脂質組成物の影響を示す図である。１０％のＦＣＳの存在下または非存在下、培地中で４℃または３７℃で実施した結合を評価した。この実験は、ＤＣへの結合に対する、等モル量のＰＥおよびコレステロールと組み合せた、ＰＳまたはＰＧの有益な効果を実証する。さらに、ＰＳ、ＰＧ、およびコレステロールからなるリポソーム、すなわち、２種の負荷電脂質を含むリポソームは、一種の負荷電リン脂質（ＰＳまたはＰＧ）、ＰＥ、およびコレステロールからなるリポソームと同様の結合活性を示す。（Ａ）および（Ｃ）４℃でのインキュベーション、（Ｂ）および（Ｄ）３７℃でのインキュベーション、（Ａ）および（Ｂ）ＤＣへの結合の平均蛍光強度、（Ｃ）および（Ｄ）細胞結合リポソームのパーセント。
【図１０】リポソーム沈着を示す図である。（Ａ）注射部位での持続的なリポソームの沈着。注射から７日後、ローダミン標識ＡＶＥ３では注射部位（皮膚）に強力な蓄積が検出できたが、流入領域リンパ節でも検出された。それに反して、ＡＶＥ１４は、これらの臓器で蓄積を示さなかった。ＦＡＣＳ分析によって示されたように、脇腹に皮内注射されたマウス（Ｃ）のリンパ節から得たＤＣと比較して、後肢足蹠に注入されたマウス（Ｂ）では、リポソームに封入されたＯＤＮは、ＤＣ（ＭＨＣ‐ＩＩ陽性細胞）によって取り込まれ、流入領域リンパ節に輸送された。
【図１１−１】Ｂ細胞増殖の誘発を示す図である。（Ａ）ＡＶＥ３にカプセル化されたＣｐＧ‐ＰＴＯオリゴヌクレオチドは、フリーのＣｐＧ‐ＰＴＯによる誘発に匹敵してＢ細胞増殖を誘発する。（Ｂ）非ＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた場合、効果は観察されず、Ｂ細胞増殖がＣｐＧオリゴヌクレオチドによって特異的に媒介されたことが証明された。
【図１１−２】Ｂ細胞増殖の誘発を示す図である。（Ａ）ＡＶＥ３にカプセル化されたＣｐＧ‐ＰＴＯオリゴヌクレオチドは、フリーのＣｐＧ‐ＰＴＯによる誘発に匹敵してＢ細胞増殖を誘発する。（Ｂ）非ＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた場合、効果は観察されず、Ｂ細胞増殖がＣｐＧオリゴヌクレオチドによって特異的に媒介されたことが証明された。
【図１２】ＣｐＧ‐ＰＴＯおよびＣｐＧ‐ＰＤＯの生物活性の比較を示す図である。細胞をＣＦＳＥで標識した後、終濃度０〜０．２μｍоｌ／ｌでＯＤＮを含む生理食塩水またはリポソームによって４８時間刺激した。（黒色ダイヤモンド）ＣｐＧ‐ＰＴＯを含む生理食塩水、（灰色ダイヤモンド）ＣｐＧ‐ＰＤＯを含む生理食塩水、（黒色四角）リポソームＣｐＧ‐ＰＴＯ、（灰色四角）リポソームＣｐＧ‐ＰＤＯ。ヨウ化プロピジウム染色によって死細胞を除外した。
【図１３】リポソームＣｐＧ‐ＰＴＯの滴定を示す図である。０．３〜１０ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＴＯ  ＯＤＮと混合した１００μｇのＴＲＰ‐２によってマウスを免疫化した。データは、ＴＲＰ２（５μｍоｌ／ｌ）での再刺激から１６時間後、ＣＤ８＋集団中のＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の割合を示す。無関係なペプチド（Ｏｖａ‐ペプチドSIINFEKL）で再刺激すると、１．０％未満のＩＦＮγ＋細胞がもたらされた。ヨウ化プロピジウム染色によって死細胞を除外した。
【図１４】リポソームＴＲＰ‐２の滴定を示す図である。一週間間隔で２度ＡＶＥ３／ＴＲＰ２と５ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯ（ＣｐＧ）でマウスを免疫化した。免疫化に使用したＴＲＰ２の全量は１〜５０μｇ／頭（２頭／群）であった。データは、ＴＲＰ２（５μｍоｌ／ｌ）での再刺激から１６時間後、ＣＤ８＋集団中のＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の割合を示す。無関係なペプチド（Ｏｖａ‐ペプチドSIINFEKL）で再刺激すると、０．５％未満のＩＦＮγ＋細胞がもたらされた。
【図１５】ＣｐＧ‐ＰＴＯを含む生理食塩水と１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２の滴定を示す図である。０〜１０ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯ  ＯＤＮと混合した１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２でマウスを免疫化した。データは、ＴＲＰ２（５μｍоｌ／ｌ）での再刺激から１６時間後、ＣＤ８＋集団中のＩＦＮγ分泌Ｔ細胞のパーセントを示す。無関係なペプチド（Ｏｖａ‐ペプチドSIINFEKL）で再刺激すると、１．０％未満のＩＦＮγ＋細胞がもたらされた。ヨウ化プロピジウム染色によって死細胞を除外した。
【図１６】リポソームＣｐＧ‐ＰＴＯの滴定を示す図である。０．３〜５ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＴＯ  ＯＤＮと混合した１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２でマウスを免疫化した。データは、ＴＲＰ２（５μＭ）での再刺激から１６時間後、ＣＤ８＋集団中のＩＦＮγ分泌Ｔ細胞のパーセントを示す。無関係なペプチド（Ｏｖａ‐ペプチドSIINFEKL）で再刺激すると、１．０％未満のＩＦＮγ＋細胞がもたらされた。ヨウ化プロピジウム染色によって死細胞を除外した。
【図１７】リポソームＴＲＰ‐２およびＣｐＧの滴定を示す図である。ＴＲＰ‐２およびＣｐＧ  ＯＤＮの濃度に依存する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発。ＢＬ６マウス後肢足蹠に、（Ａ）様々な量のフリーのＴＲＰ‐２（□）またはリポソームカプセル化ＴＲＰ‐２（■）を５ｎｍоｌのフリーのＣｐＧ  ＯＤＮと共に注射し、あるいは（Ｂ）段階的用量のフリーのＣｐＧ  ＯＤＮ（□）またはリポソームカプセル化ＣｐＧ  ＯＤＮ（■）を１０μｇのリポソームカプセル化ＴＲＰ‐２と共に注射し、あるいはＣ  １００μｇのフリーの（フリーのＴＲＰ‐２）または１０μｇのリポソームカプセル化ＴＲＰ‐２（リポソームＴＲＰ‐２）を１．３ｎｍоｌのリポソームカプセル化ＣｐＧ  ＯＤＮと共に注射し、４日後に流入領域ＬＮからリンパ球を単離し、さらに６日間低用量のＩＬ‐２（３０Ｕ／ｍｌ）の存在下、試験管内で培養した。５μｍоｌ／ｌのＴＲＰ‐２および対照ペプチドSIINFEKLでリンパ球を終夜刺激し、ＩＦＮγ捕獲アッセイを実施した。対照ペプチドSIINFEKLでは、ＩＦＮγ陽性細胞の割合は常に０．５％未満であった。２回の類似実験の１回から得た代表的なデータを示す。
【図１８】抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発を示す図である。１．３ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＴＯ  ＯＤＮと混合した２．５〜２０μｇのリポソームＴＲＰ‐２でマウスを免疫化した。データは、ＴＲＰ２（５μｍоｌ／ｌ）での再刺激から１６時間後、ＣＤ８＋集団中のＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の割合を示す。無関係なペプチド（Ｏｖａ‐ペプチドSIINFEKL）で再刺激すると、１．０％未満のＩＦＮγ＋細胞がもたらされた。ヨウ化プロピジウム染色によって死細胞を除外した。
【図１９】ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋の誘発の比較を示す図である。ＡＶＥ３またはＡＶＥ５にカプセル化した２０μｇのＴＲＰ‐２でワクチン接種後、フリーのＣｐＧ‐ＰＴＯの存在下または非存在下でＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞の誘発を比較。ペプチドなしに、または対照Ｏｖａ‐ペプチド（SIINFEKL）を用いて、終夜再評価すると、０．５％未満のＩＦＮγ＋細胞がもたらされた。各免疫化群につき２頭のマウスを使用した。
【図２０】免疫化後のＣＴＬ誘発の比較を示す図である。マウスを１００μｇのＴＲＰ‐２と５ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯを含む両生理食塩水（Ａ）または１０μｇのＴＲＰ‐２と１．３ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯを含む両リポソーム（Ｂ）で免疫化した。
【図２１】リポソームワクチン接種によって血中に特異的Ｔ細胞が高頻度でもたらされたことを示す図である。マウスは、１００μｇのＴＲＰ‐２と５ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯを含む生理食塩水（赤色）、１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２と５ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯを含む生理食塩水（橙色）、１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２と１．３ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＴＯのいずれかによって免疫化し、または未処理のまま残した（青色）。投与量は、１頭ごとに注射した量である。ヨウ化プロピジウム染色によって死細胞を除外した。
【図２２】リポソームカプセル化ＴＲＰ‐２とＣｐＧ‐ＰＴＯによるワクチン接種を示す図である。リポソームカプセル化ＴＲＰ‐２とＣｐＧ‐ＰＴＯによるワクチン接種によって高結合性Ｔ細胞が得られた。ＢＬ６マウスに１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２または１００μｇのフリーのＴＲＰ‐２と５ｎｍоｌのフリーのＣｐＧ  ＯＤＮとを１週間毎に３回までワクチン接種した。最後の免疫化から１週間後、脾臓（Ａ）およびリンパ節（ＬＮ）（Ｂ）からリンパ球を単離し、記載した通りＩＦＮγ捕獲アッセイを実施した。Ｃ．リポソームＴＲＰ‐２およびフリーのＴＲＰ‐２とＣｐＧ  ＯＤＮでワクチン接種後のＴ細胞の結合力。最後の免疫化から１週間後、脾細胞をナイロン‐ウール濃縮し、５日間、試験管内で低用量のＩＬ２（３０Ｕ／ｍｌ）と共に、高用量ＴＲＰ‐２（１０−６ｍоｌ／ｌ）もしくは低用量ＴＲＰ‐２（１０−９ｍоｌ／ｌ）、または対照ペプチドSIINFEKL（１０−６ｍоｌ／ｌ）の存在下で培養した。ＡＴＰ含有量を測定する発光アッセイベース検出系によって増殖を推定した。抗ＴＣＲと抗ＣＤ２８ｍＡｂの存在下での脾細胞の増殖を１００％に設定した。２回の類似実験の１回から得た代表的なデータを示す。
【図２３】予防的設定において、（Ａ）低用量のリポソームワクチン接種によって腫瘍増殖が防止され、（Ｂ）生存が延長されることを示す図である。マウスを１００μｇのＴＲＰ‐２と５ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯを含む生理食塩水（紺色、ｎ＝４）、１０μｇのＴＲＰ‐２と１．３ｎｍоｌのＣｐＧ‐ＰＴＯを含む生理食塩水（水色、ｎ＝４）、１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２と１．３ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＴＯ（緑色、ｎ＝４）によって２度免疫化し、または未処理のまま残した（赤色、ｎ＝４）。マウスに２×１０５個のＢ１６黒色腫細胞を皮下接種した。腫瘍の大きさを９日目から測定した。
【図２４】治療的設定における、（Ａ）リポソームワクチン接種後の腫瘍拒絶、および（Ｂ）生存の延長を示す図である。１×１０５個のＢ１６黒色腫細胞をマウスに皮下接種した後、マウスを１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２と１．３ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＴＯによって２度免疫化（緑色、ｎ＝１０）し、または未処理のまま残した（赤色、ｎ＝１０）。腫瘍の大きさを１０日目から測定した。Ｐ＜０．００１２：低リポソーム用量対未処理）。
【図２５】予防的設定での免疫化後の肺中Ｂ１６黒色腫転移コロニー数を示す図である。１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２と１．３ｎｍоｌのリポソームＣｐＧＰＴＯ（免疫化、ｎ＝１２）、１．３ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＴＯ（ＡＶＥ３／ＣｐＧ、ｎ＝８）によってマウスを２度免疫化し、または未処理のまま残した（未処理、ｎ＝７）。最後の免疫化から１週間後、マウスに尾静脈注射によりＢ１６黒色腫細胞の致死注射を１回施した。肺のコロニーをカウントした。‐‐‐，各群の平均転移コロニー。有意差（スチューデントｔ検定）が見出された：免疫化対未処理、ｐ＜０．０００１、免疫化対ＡＶＥ３／ＣｐＧ、ｐ＜０．０００３。
【図２６】ＣｐＧ‐ＰＤＯのリポソームカプセル化によってアジュバントの効率が改善したことを示す図である。５ｎｍоｌのＣｐＧを含む生理食塩水（生理食塩水）または１．３ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＤＯ（リポソーム）と混合した１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２でマウスを免疫化した。（ｎｏ）未処理、（ＴＲＰ‐２）５μｍоｌ／ｌのＴＲＰ‐２ペプチドにより試験管内で１６時間再刺激、（ＯＶＡ）５μｍоｌ／ｌのＯＶＡペプチドにより試験管内で１６時間再刺激。ヨウ化プロピジウム染色によって死細胞を除外した。
【図２７】リポソームＣｐＧ‐ＰＤＯの滴定を示す図である。０．３〜２．５ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＤＯと混合した１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２でマウスを免疫化した。（ｎｏ）未処理、（ＴＲＰ‐２）５μｍоｌ／ｌのＴＲＰ‐２ペプチドにより試験管内で１６時間再刺激、（ＯＶＡ）５μｍоｌ／ｌのＯＶＡペプチドにより試験管内で１６時間再刺激。ヨウ化プロピジウム染色によって死細胞を除外した。
【図２８】リポソームＣｐＧ‐ＰＤＯとリポソームＣｐＧ‐ＰＴＯの比較を示す図である。０．３ｎｍоｌもしくは１．３ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＤＯまたはリポソームＣｐＧ‐ＰＴＯと混合した１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２でマウスを免疫化した。（ｎｏ）未処理、（ＴＲＰ‐２）５μｍоｌ／ｌのＴＲＰ‐２ペプチドにより試験管内で１６時間再刺激、（ＯＶＡ）５μｍоｌ／ｌのＯＶＡペプチドにより試験管内で１６時間再刺激。ヨウ化プロピジウム染色によって死細胞を除外した。
【図２９】低用量のリポソームワクチン接種が、腫瘍増殖を低減させることを示す図である。１０μｇのリポソームＴＲＰ‐２と０．３ｎｍоｌのリポソームＣｐＧ‐ＰＤＯ（１３ｎｍоｌ／ｋｇ）（緑色、ｎ＝４）によってマウスを２度免疫化し、または未処理のまま残した（赤色、ｎ＝４）。マウスに２×１０５個のＢ１６黒色腫細胞を皮下接種した。８日目から腫瘍の大きさを測定した。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２５】
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【図２７】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１７】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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