(57)【要約】  カベオラ、Ｇドメインならびに他の形質膜ドメインおよび成分の作用を介して分子を細胞内、特に内皮細胞内に送達し得る機構および経路が記載され、それらはカベオラのタンパク質に対する抗体または受容体、ならびに抗体またはリガンドに結合する作用物質を含む送達系であり、作用物質を内皮に、および／または内皮を横切って、例えば画像化目的のために送達するのに用いられ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結像剤を、組織特異的な様式で、血管内皮の管腔表面へ、血管内皮の管腔表面内へ、および／または血管内皮の管腔表面を横切って送達する方法であって、
ａ）  輸送剤成分および結像剤成分を含有する目的の作用物質を選択し、ここで該輸送剤成分が、管腔表面との接触の際に、血管内皮の管腔表面の成分に、または血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化し、かつここで該輸送剤が結合および局在化する成分が組織特異的である工程；ならびに
ｂ）  該血管系の管腔表面を該目的の作用物質と接触させる工程
を含み、それによって該結像剤を、組織特異的な様式で、血管内皮の管腔表面へ、血管内皮の管腔表面内へ、および／または血管内皮の管腔表面を横切って送達する方法。
【請求項２】
該輸送剤成分が血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化し、該血管内皮の管腔表面のマイクロドメインが、カベオラ；Ｇドメイン；およびＧドメイン関連カベオラからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該輸送剤成分が血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化し、該血管内皮の管腔表面のマイクロドメインがカベオラである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該組織が悪性である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該輸送剤成分が、抗体、ペプチド、ウイルス、受容体、リガンドおよび核酸からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該輸送剤成分が抗体である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該結像剤成分が、放射性剤；造影剤；磁性剤；常磁性剤；免疫リポソーム（immunoliposome）；および検出剤を誘導する遺伝子ベクターまたはウイルスからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
該輸送剤成分が、腫瘍の血管内皮の管腔表面の成分に、または腫瘍の血管内皮の管腔表面のマイクロドメインに結合および局在化する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ａ）  輸送剤成分および結像剤成分を含有する目的の作用物質を個体に投与し、ここで該輸送剤成分が血管内皮の管腔表面の成分に、または血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化し、かつここで該輸送剤が結合および局在化する成分が癌に特異的である工程；ならびに
ｂ）  該目的の作用物質の濃縮の有無について該個体を評価し、ここで該目的の作用物質の濃縮の存在が癌の存在の指標となる工程
を含む、癌の有無について個体を評価する方法。
【請求項１０】
該輸送剤成分が血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化し、該血管内皮の管腔表面のマイクロドメインが、カベオラ；Ｇドメイン；およびＧドメイン関連カベオラからなる群より選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該輸送剤成分が血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化し、該血管内皮の管腔表面のマイクロドメインがカベオラである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該輸送剤成分が、抗体、ペプチド、ウイルス、受容体、リガンドおよび核酸からなる群より選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該輸送剤成分が抗体である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該結像剤成分が、放射性剤;造影剤;磁性剤；常磁性剤；免疫リポソーム；および検出剤を誘導する遺伝子ベクターまたはウイルスからなる群より選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
該目的の作用物質が治療剤を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
個体に、輸送剤成分および結像剤成分を含有する結像剤を投与する工程を含み、ここで該輸送剤成分が、管腔表面との接触の際に、血管内皮の管腔表面の成分に、または血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化し、かつここで該輸送剤が結合および局在化する成分が組織特異的である、個体の物理的結像を行う方法。
【請求項１７】
該輸送剤成分が血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化し、該血管内皮の管腔表面のマイクロドメインが、カベオラ；Ｇドメイン；およびＧドメイン関連カベオラからなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
輸送剤成分および結像剤成分を含有し、ここで該輸送剤成分が、管腔表面との接触の際に、血管内皮の管腔表面の成分に、または血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化し、かつここで該輸送剤が結合および局在化する成分が組織特異的である、結像剤。
【請求項１９】
該輸送剤成分が血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化し、該血管内皮の管腔表面のマイクロドメインが、カベオラ；Ｇドメイン；およびＧドメイン関連カベオラからなる群より選択される、請求項１８記載の輸送剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、1995年9月8日付出願の米国仮特許出願第60／003,453号の恩恵を主張している、現在は米国特許第5，776,770号である1996年1月4日付出願の米国出願第08／582,917号の一部継続出願（または継続出願）である、英語で公開されている1996年9月5日付出願のPCT国際出願第US96／14177号の米国国内段階である、現在は米国特許第6,255,457号である1998年6月25日付出願の米国出願第09／029,459号の継続出願である、現在は放棄されている2000年12月11日付出願の米国出願第09／734,490号の一部継続出願である、2002年1月24日付出願の米国出願第10／056,230号の一部継続出願である、2003年7月31日付出願の米国出願第10／631,481号に対して優先権を主張すると共にその継続出願であり、また、前記1996年9月5日付出願のPCT出願第US96／14177号は、1996年5月31日付出願の米国仮特許出願第60／018,791号の恩恵および1996年5月24日付出願の米国仮特許出願第60／018,301号の恩恵も主張している。これらの出願の教示は、その全体が参照によって本明細書中に援用される。
【０００２】
政府支援
本明細書中に記載の研究は、合衆国国立衛生研究所からの認可HL43278、HL52766、HL58216およびIA33372により一部支持されている。米国政府は本発明における特定の権利を有している。
【０００３】
発明の背景
分子医学により、分子生物学における最先端の技術を用いて新しい治療法が数多く発見されている。新しい薬物を設計するために、所望の細胞型に対する薬理学的作用をスクリーニングする高処理量インビトロアッセイが頻繁に用いられている。
かかる作用物質は、インビトロでの成功によって確かに正当化されるものの、隣接器官に影響を与えることなく効き目を発揮するのに十分な量の作用物質が組織内の標的細胞に到達しなければならないインビボでは、かなり効果が低いことが多い（Jain, R.K., Nat Med 4: 655-7（1998））。投与経路によっては、内皮および／または上皮は、多くの薬物、抗体および遺伝子ベクターの、薬理学的作用の目的の標的部位、すなわち組織内の細胞へのインビボ接触能（accessibility）を著しく制限する有効な障壁を形成する（（Jain, R.K., Nat Med 4: 655-7（1998）；Miller, N.およびVile, R., FASEB J. 9: 190-199（1995）；Thrush, G.R.ら、Ann. Rev. Immunol. 14: 49-71（1996）；Tomlinson, E., Advanced Drug Delivery Reviews 1: 87-198（1987））。例えば、組織透過が少ないと、細胞特異的抗原に多くのモノクローナル抗体が到達してインビボで組織または細胞を指向した薬剤を効果的に送達することが妨げられる（Jain, R.K., Nat Med 4: 655-7（1998）；Thrush, G.R.ら、Ann. Rev. Immunol. 14: 49-71（1996）；Tomlinson, E., Advanced Drug Delivery Reviews 1: 87-198（1987）；Dvorak, H.F.ら、Cancer Cells 3: 77-85（1991）；Weinstein, J. N.およびvan Osdol, W., Int. J. Immunopharmacol. 14: 457-463（1992））。たいていの器官内の微小血管内皮は、血液によって運ばれる分子および細胞が下側にある間隙および組織細胞へ自由に横切ることに対する有効な障壁として作用する（Schnitzer, J.E., Trends in Cardiovasc. Med. 3: 124-130（1993）；Renkin, E.M., J. Appl. Physiol. 134: 375-382（1985））。周囲の組織細胞の代謝必要性を満たすために、本質的循環血高分子を内皮下空間へ経内皮輸送する特異的輸送機構が存在すると考えられている（Schnitzer, J.E., Trends in Cardiovasc. Med. 3: 124-130（1993））。
【０００４】
連続内皮は、循環している分子がそこに入ることができる管腔血管空間に対して開口している、カベオラと呼ばれる原形質膜にはっきりした、フラスコ状陥入を含んでいる（Schneeberger, E.E.およびHamelin, M., Am. J. Physiol. 247: H206-H217（1984）；Milici, A.J.ら、J. Cell Biol. 105: 2603-2612（1987）；Ghitescu, L.ら、J. Cell Biol. 102: 1304-1311（1986））。これらのカベオラは、高分子が細胞内への、およびおそらく細胞を横切る輸送経路を提供し得る（Schnitzer, J.E., N. Engl. J. Med. 339: 472-4（1998）；Schnitzer, J.E., Trends in Cardiovasc. Med. 3: 124-130（1993）；Renkin, E.M., J. Appl. Physiol. 134: 375-382（1985）；Schneeberger, E.E.およびHamelin, M., Am. J. Physiol. 247: H206-H217（1984）；Milici, A.J.ら、J. Cell Biol. 105: 2603-2612（1987）；Ghitescu, L.ら、J. Cell Biol. 102: 1304-1311（1986））。一部の研究者らは、細胞の内側の他の膜に付着せずに自由に存在している原形質膜小胞はほとんどないという形態学的研究に基づき、カベオラは動的構造でなく、むしろ静的構造であると結論付けている（Severs, N.J., J. Cell Sci. 90: 341-8（1988）；Rippe, B.およびHaraldsson, B., Acta Physiol. Scand. 131: 411-428（1987）；Bundgaard, M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 6439-6442（1979）；Bundgaard, M., Federation Proc. 42: 2425-2430（1983））。しかし、カベオラは、ダイナミン媒介GTP依存分裂過程を介して原形質膜から出芽し得（Oh, P.ら、J. Cell Biol. 141: 101-114（1998）；Schnitzer, J.E.ら、Science 274: 239-242（1996））、主要機能性のドッキングタンパク質および融合タンパク質を含んでいる（Schnitzer, J.E.ら、Science 274: 239-242（1996）；MacIntosh, D.P.およびSchnitzer, J.E., Am. J. Physiol. 277: H2222-2232（1999）；Schnitzer, J.E.ら、Science 269: 1435-1439（1995）；Schnitzer, J.E.ら、J. Biol. Chem. 270: 14399-14404（1995）；Schnitzer, J.E.ら、Am. J. Physiol. 37: H48-H55（1995））。カベオラが細胞を通過して積み荷を輸送（トランスサイトーシス）できるかどうかは、インビボで高い親和性および特異性でカベオラを標的化できるプローブを用いた場合と、物理的には同一であるが、標的化しない対照プローブを用いた場合との比較分析が不可能であったことが主な理由で、これまでに証明されていない。インビボで効率良く薬剤を送達することを促進するために細胞障壁を克服する際のカベオラの有用性は、これまで知られていなかった。
【０００５】
発明の概要
本発明は、細胞表面または原形質膜のマイクロドメインまたは成分を単離および精製する方法；該方法によって得られる精製マイクロドメインおよび成分（例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、糖脂質）；該精製マイクロドメインおよび成分に対する抗体；ならびにその使用に関する。カベオラ、GPIアンカータンパク質（Gドメイン）のマイクロドメイン、および本質的にカベオラとGドメインとからなる膜フラグメントを含む原形質膜のマイクロドメインを精製する方法、並びに該方法によって得られる精製マイクロドメイン、およびその用途が本明細書中に記載される。また、界面活性剤感受性（界面活性剤可溶性）マイクロドメインおよび細胞骨格成分を精製する方法、並びに該方法によって得られる精製マイクロドメイン、およびこれらの成分の使用も本明細書中に記載される。
【０００６】
本発明の方法により精製された原形質膜成分は、薬物、結像剤、DNA分子または種々の細胞（例えば、上皮、内皮、脂肪細胞）内の抗体などの分子の輸送において直接的または間接的に有用である。例えば、内皮内のカベオラに標的化されたこのような作用物質は、カベオラによって内皮内へ、および／または内皮を横切って輸送されるため、薬物をはじめとする多くの分子が循環血から大部分の組織に侵入することを妨げる臨界障壁を打ち破るのに有用である。
【０００７】
本明細書中に記載のように同定されたカベオラおよび他の原形質膜成分を用いて、カベオラ、Gドメイン（脂質ラフト）ならびに他の原形質膜ドメインおよび成分の作用を介して分子が細胞、特に内皮細胞内へ送達されうる機構または経路を確認することができる。例えば、ある態様において、カベオラ内に存在する分子を、カベオラタンパク質または受容体に対する抗体または天然リガンドにより標的化させることで、抗体またはリガンドに結合させた作用物質を、内皮へ、内皮内へ、および／または内皮を横切って運ぶことができる。該抗体またはリガンドに結合させることができる代表的な作用物質としては、例えば、ペプチドまたは小型有機分子を含む薬物；治療用または診断用ペプチド／タンパク質をコードする遺伝子；または別の抗体が挙げられる。抗体またはリガンドは個体に導入することができ、該個体内で作用物質を送達するように作用する。あるいは、別の態様において、ペプチドまたは小型有機分子を含む薬物；治療用または診断用ペプチド／タンパク質をコードする遺伝子；または抗体などの作用物質を導入するなどして精製カベオラを修飾して、薬物送達ビヒクルとして機能させることができる。生じた修飾精製カベオラは、個体に導入することができ、該個体内で作用物質を送達するように作用する。
【０００８】
従って、本明細書中に記載されたような精製カベオラ、Gドメイン（脂質ラフト）、並びに同時単離カベオラおよびGドメインは、細胞内または経細胞輸送および細胞表面シグナル伝達および連絡に関与する分子およびタンパク質の同定に有用である。従って、これらは、分子を原形質膜に送達することができ、必要に応じて、細胞に侵入させ、細胞の片側から反対側へ通過させ、または細胞の機能を変化させるシグナルを提供することができる新しい手段を確認することを可能にする。例えば、精製カベオラおよび精製Gドメイン（脂質ラフト）を用いて、特定のプローブまたは抗体を作製することができる。カベオラに対してまたは精製Gドメインに対して特異的な抗体またはリガンドをベクターとして用いて、該カベオラまたはGドメインを標的化したり、分子の原形質膜内への、および／または原形質膜を横切る輸送に影響を与えたりできる。かかるベクターを用いて、薬物、遺伝子または抗体などの作用物質を細胞内へ、および／または細胞を横切って送達することができ、特に作用物質を内皮内へ、および／または内皮を横切って送達することができる。ベクターは、活性成分（例えば、薬物、遺伝子、抗体または他の作用物質）および輸送成分（例えば、カベオラに対してまたはカベオラ内のタンパク質、ペプチドまたはリガンドに対して特異的な抗体またはリガンド）を含むことができる。
【０００９】
さらに、本発明の精製カベオラおよびGドメインを用いて、薬物、結像剤、遺伝子または抗体などの作用物質を細胞内へ、および／または細胞を横切って送達することができ、特に作用物質を内皮内へ、および／または内皮を横切って送達することができる。また、これらのドメインを、輸送ビヒクルとして用いることもできる。例えば、精製カベオラまたは精製Gドメインに付加されたかその中に天然に見出される脂質アンカー分子は、末梢血循環に導入されると血管内皮と相互作用し、その内皮に移行させることができる（原形質膜内に直接導入されることを含む）。
【００１０】
さらなる態様において、組織特異的様式で血管内皮の管腔表面へ、管腔表面内へ、および／または管腔表面を横切って結像剤を送達する方法において、本明細書中に記載の発見を用いることができる。目的の作用物質が選択されるが、該作用物質には輸送剤成分および結像剤成分が含まれ、該輸送剤成分は、管腔表面と接触すると、血管内皮の管腔表面の成分または血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化し、該作用物質が結合および局在化する該マイクロドメインの成分は組織特異的である。マイクロドメインとしては、例えば、カベオラ；Gドメイン（脂質ラフト）；Gドメイン関連カベオラ；または組織特異的な細胞表面上の別の成分であり得る。血管系の管腔表面を目的の作用物質と接触させることで、結像剤を組織特異的様式で血管内皮の管腔表面へ、管腔表面内へ、および／または管腔表面を横切るように送達する。具体的な態様において、組織は悪性組織（例えば、癌、腫瘍、腫瘍血管系）であり得る。輸送剤成分としては、例えば、抗体、ペプチド、ウイルス（例えば、不活化ウイルス）、受容体、リガンドまたは核酸、あるいは別の同様の分子であり得る。結像剤成分としては、例えば、放射性剤（例えば、放射性ヨウ素、テクネチウム、イットリウム）または他の放射性薬品；造影剤（例えば、ガドリニウム、マンガン、硫酸バリウム、ヨウ素処理またはヨウ素非処理剤；イオン性剤または非イオン性剤）；磁性剤または常磁性剤；リポソーム（例えば、放射性剤、造影剤または他の結像剤を担持）；検出剤を誘導する遺伝子ベクターまたはウイルス（例えば、ルシフェラーゼまたは他の蛍光ポリペプチドを含む）；または他の結像剤であり得る。本方法をさらに用いて、目的の作用物質を投与した後、個体を評価して所定濃度の目的の作用物質が存在するかどうかを測定することにより、癌の存在または非存在について個体を調べることができる。所定濃度の目的の作用物質の存在は、癌の存在を示している。また、本発明は、輸送剤成分および結像剤成分を含む結像剤を個体に投与することにより該個体の物理的結像を行うために用いることもでき、該輸送剤成分は、管腔表面と接触すると、血管内皮の管腔表面の成分または血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化し、この作用物質が結合および局在化する該成分は組織特異的である。本方法で、正常および異常な病状を視覚化および／または検出することができ、また、本方法を用いて、器官または腫瘍の型の程度、寸法および／または数を定量化または測定することができる。従って、疾患の程度を推定することができ、例えば、臨床的診断および／または予後診断に用いられる。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、原形質膜マイクロドメインおよび成分を精製する方法；精製原形質膜マイクロドメインおよび成分を製造する方法；精製原形質膜マイクロドメインおよび成分に対して特異的な抗体；およびこれらの精製原形質膜マイクロドメインおよび成分の使用に関し、これらは、細胞内または経細胞輸送、または細胞表面シグナル伝達および連絡、並びに（例えば、作用物質の送達のため、または遺伝子治療のための）内皮の標的化に関与する分子の同定を包含する。結像法における本発明に係わる発見の使用を本明細書中に記載し、続いて、精製法および精製された成分の使用を記載する。
【００１２】
結像
本発明は、物理的結像のため、例えば、癌（腫瘍）の存在について個体を評価する際に用いるために、組織特異的様式で結像剤を送達する方法に関するものであり、また、その作用物質自体、および物理的結像の際に用いる薬剤製造用の前記作用物質の使用に関する。本発明の方法において、結像剤は、目的の作用物質を介して組織特異的様式で血管内皮の管腔表面へ、管腔表面内へ、および／または管腔表面を横切って送達される。目的の作用物質には、輸送剤成分および結像剤成分が含まれ、該輸送剤成分は、血管内皮の管腔表面と接触すると、血管内皮の管腔表面の成分または血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化する。作用物質が結合および局在化する該成分は組織特異的である。「組織特異的」とは、作用物質が、特定の型の組織（例えば、肺、血管系、肺の血管系）に対して、または特定の組の組織（例えば、肺と肝臓、肺の血管系と肝臓）に対して優先的または選択的に結合することを意味する。マイクロドメインとは、例えば、カベオラ；Gドメイン（脂質ラフト）；Gドメイン関連カベオラ；または血管内皮の管腔表面の他のマイクロドメインであり得る。血管系の管腔表面を目的の作用物質と接触させることで、結像剤を組織特異的様式で血管内皮の管腔表面へ、管腔表面内へ、および／または管腔表面を横切るように送達する。
【００１３】
輸送剤成分は、例えば、抗体、ペプチド、ウイルス（例えば、不活化ウイルス）、受容体、リガンドまたは核酸であり得るか、あるいは、血管内皮の管腔表面の成分に、または血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に、組織特異的様式で結合するという条件で、別の作用物質であり得る。結像剤成分（結像剤および、必要に応じて、結像剤成分を輸送剤成分に結合させる手段などの他の成分を含む）は、例えば、放射性剤（例えば、放射性ヨウ素、テクネチウム、イットリウム）または他の放射性薬品；造影剤（例えば、ガドリニウム、マンガン、硫酸バリウム、ヨウ素処理またはヨウ素非処理剤；イオン性剤または非イオン性剤）；磁性剤または常磁性剤；リポソーム（例えば、放射性剤、造影剤または他の結像剤を担持）；検出剤を誘導する遺伝子ベクターまたはウイルス（例えば、ルシフェラーゼまたは他の蛍光ポリペプチドを含む）；または結像研究（例えば、CT、X線透視、SPECT結像、光学的結像、PET、MRI、ガンマ結像）に用いることができる任意の他の結像剤であり得る。
【００１４】
個体の物理的結像を行う方法において、目的の作用物質を用いることができる。本明細書中で用いられる「物理的結像」とは、個体の体の全体または一部の結像（例えば、前述の結像研究法による）を意味する。物理的結像は「陽性」であり得る、すなわち、物理的結像を用いて、特定の型の組織または病変の存在を検出することができる。例えば、ある態様において、陽性物理的結像を用いて、転移性腫瘍などの腫瘍（癌）の存在または非存在を検出することができる。あるいは、別の態様において、陽性物理的結像を用いて、器官の存在または非存在など、正常（非疾患）組織の存在または非存在を検出することができる。あるいは、物理的結像は「陰性」であり得る、すなわち、物理的結像を用いて、特定の型の組織の非存在を検出することができる。例えば、ある態様において、陰性物理的結像を用いて、正常組織の存在または非存在を検出することができ、非存在は、病状に一致する機能の喪失を示す。陽性および陰性物理的結像のいずれも、正常および異常病状の両方を視覚化および／または検出することができ、また、この結像を用いて、器官または腫瘍の型の程度、寸法および／または数を定量化または測定することができる。従って、疾患の程度を推定することができ、例えば、臨床的診断および／または予後診断が容易になる。
【００１５】
物理的結像のために、結像剤が個体に投与される。結像剤には、輸送剤成分および結像剤成分が含まれ、該輸送剤成分は、管腔表面と接触すると、血管内皮の管腔表面の成分または血管内皮の管腔表面のマイクロドメイン（例えば、カベオラ、Gドメイン（脂質ラフト））の成分に結合および局在化し、作用物質が結合および局在化する該成分は組織特異的である。
【００１６】
かかる物理的結像の方法を用いて、例えば、癌の存在または非存在、あるいは広がりについて個体を（例えば、前述のような「陽性」結像により）評価することができる。これらの態様において、輸送剤成分は、癌（腫瘍）の血管内皮の管腔表面の成分または癌（腫瘍）の血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化する。個体に目的の作用物質を投与（例えば、静脈投与）して、この個体を所定濃度の目的の作用物質の存在または非存在について評価する。本明細書中で用いられる「所定濃度」とは、個体の体内の特定の位置における目的の作用物質の量であり、個体内の目的の作用物質の単なる循環または拡散から予想されるより多い量をいう。所定濃度とは、目的の作用物質が癌に結合することの指標であり、癌の存在を示す。これらの方法を用いて、原発腫瘍のみならず、転移の存在または非存在について個体を評価することができる。
【００１７】
他の態様において、本方法を用いて、器官または身体系の正常（非疾患）機能の存在または非存在について個体を（例えば、前述のような「陰性」結像により）評価することができる。これらの態様において、輸送剤成分は、病的（異常）組織ではなく正常組織の血管内皮の管腔表面の成分または血管内皮の管腔表面のマイクロドメインの成分に結合および局在化する。個体に作用物質を投与して、該個体を目的の作用物質の非存在（または存在）について評価する。目的の作用物質が輸送剤成分により標的化された構造内の他の部分に存在することと併せて、目的の作用物質が輸送剤成分により標的化された構造内には存在しないことは、病変の存在と一致する機能の喪失を示している。
【００１８】
必要に応じて、目的の作用物質は、さらに、治療剤を含むことができる。本明細書中で用いられる「治療剤」とは、腫瘍または他の病変を標的化して破壊する作用物質（例えば、化学治療剤）、または腫瘍もしくは病変の個体への影響を低減または除去する作用物質を意味する。
【００１９】
精製法
血漿マイクロドメインおよび本明細書中に記載の成分を精製および／または生成する方法を、その原形質膜が所望の成分を含む任意の細胞型（例えば、内皮、上皮、および脂肪細胞）について実施することができる。本発明の方法により単離することができる成分としては、カベオラ、Gドメイン、Gドメイン関連カベオラから本質的になる膜フラグメント、界面活性剤可溶性成分および細胞骨格成分が挙げられる。
【００２０】
ある態様において、本方法は、本明細書中に記載の方法により内皮細胞原形質膜などの原形質膜から精製されたカベオラに関する。実施例１および２に詳細に記載し、図１に概略的に示すように、単離された管腔内皮細胞原形質膜から、高度に精製されたカベオラが得られる。本発明のカベオラは、形態学的および生化学的基準の両方に基づいて精製される。これらは、GPIアンカータンパク質のマイクロドメイン、GPIアンカータンパク質およびRab5（以下に記載のような、界面活性剤耐性複合体中で見られるグアノシン三燐酸（GTP）結合タンパク質）を実質的に含まない。電子顕微鏡検査によれば、このフラクションは、主に直径が1000Å未満であるやや均質な小胞集団を含み、カベオラの形態学的に特徴のある外観を有する（Schnitzer, J.E.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1759（1995））。陽イオン性コロイド状シリカ粒子で細胞（内皮細胞など）の表面を被覆し、シリカ被覆細胞原形質膜を、細胞の残部および任意の関連する組織から分離して、シリカ被覆細胞原形質膜を生成し、膜破壊技術（せん断または音波処理など）により膜からカベオラ（シリカ粒子付着側と反対の膜側に存在）を除去し、他の原形質膜成分（GPIアンカータンパク質に富むがカベオラおよびカベオリンを欠く残留シリカ被覆原形質膜を含む）からカベオラを分離することにより、精製カベオラを得ている。この分離は、ショ糖密度ゲル遠心分離法などによって密度に基づいて行われる。ある態様において、内皮細胞原形質膜が、界面活性剤（例えば、Triton X-100）の存在下に、適温（例えば、およそ4℃〜8℃）でホモジナイズ中にせん断に付される。カベオラは低温においてのみ界面活性剤耐性があるので、界面活性剤を用いる場合は、低温が必要である。生理的温度（37℃）において、カベオラは界面活性剤により可溶化される。界面活性剤は、原形質膜上の付着点からのカベオラの除去を促進することから、除去工程を促進するものと思われるが、該工程にとって必要不可欠ではない。第二の態様において、内皮細胞原形質膜は、界面活性剤の非存在下に均質化中にせん断に付される。
【００２１】
いずれの態様においても、カベオラが他の細胞膜成分から分離し、精製カベオラが単離される結果となる。精製カベオラの特性付けでは、カベオリン；糖脂質GM1；細胞膜Ca2+依存アデノシン三燐酸；およびイノシトール1,4,5-三燐酸受容体が非常に富むことがわかった。これらの4つの分子はいずれも、独立した手段（電子顕微鏡による位置確認）により、ほぼカベオラ内に限定される細胞表面上に存在していることが示されているため（Dupree, P.ら、EMBO J. 12: 1597（1993）；Parton, R.G., J. Histochem. Cytochem. 42: 155（1994）；Rothberg, K.G.ら、Cell 68: 673（1992）；Montessano, R.ら、Nature 296: 651（1982）；Fujimoto, T.ら、J. Cell. Biol. 119: 1507（1992）；Fujimoto, T., J. Cell. Biol. 120: 1147（1993））、カベオラの重要なマーカーを表している。これら4つのカベオラマーカーはいずれも、シリカ被覆原形質膜ペレット内に十分に存在し、ほぼ全てが精製カベオラに分画される。他の膜フラクションに残留するとしても僅かにしか残留しない。対照的に、全てシリカ被覆原形質膜フラクション（P）に十分に存在していたアンギオテンシン変換酵素、バンド4.1およびβ-アクチンは、殆ど全部が精製カベオラから排除される。
【００２２】
さらなる態様において、本方法は、内皮細胞原形質膜などの原形質膜から精製されたGPIアンカータンパク質（Gタンパク質）のマイクロドメインに関する。GPIアンカータンパク質のマイクロドメインは、カベオラ、カベオリンおよびGM1（以下に記載のように、カベオラ内部で金標識で局在化されている脂質アンカーコレラ毒素結合性ガングリオシド）を実質的に含まないように精製されている。実施例３に記載し、図２に概略的に示したように、最初に細胞から（例えば、実施例１に記載のようにシリカ被覆を用いて）単離しカベオラが除去されている細胞原形質膜（例えば、内皮原形質膜）からGドメインを単離した。単離したカベオラ除去シリカ被覆原形質膜を、シリカ粒子と原形質膜との静電相互作用を低減／最小化させるのに十分に高い塩濃度に付したところ、粒子から原形質膜が分離した。生じた非被覆原形質膜（あらかじめカベオラが除去されている）を、界面活性剤（例えば、Trion X-100）の存在下で膜破壊技術（例えば、せん断）に付した後、密度に基づいて成分を分離する分離技術（例えば、ショ糖密度遠心分離）に付したところ、インタクトな（intact）Gドメインを単離した。これは、密度が低く、界面活性剤不溶性（耐性）膜マイクロドメインであり、GPIアンカータンパク質に富み、実質的にカベオラを含んでいない。
【００２３】
本明細書に示したデータから、その一部がカベオラの開口部または首部における環状領域としてカベオラに関連している可能性のある拡散制限性マイクロドメイン中にGPIアンカータンパク質が分配されることがわかる。カベオラとGドメインのどちらも界面活性剤可溶化に耐性があるので、カベオラの開口部を取り囲む通常は平坦な膜領域を原形質膜から切り出し、カベオラが付着したままであって、通常は小胞の内部にあるが、界面活性剤抽出時には小胞の外側に配されることがあるインタクトな大型小胞が形成される。シリカ被覆は、このマイクロドメインとカベオラとの同時単離を妨げ、カベオラおよびGドメインを別々に単離させることができる。
【００２４】
別の態様において、本発明は、本質的にカベオラとGドメイン（その一部は互いに関連し合う）とから成り、例えば、内皮細胞原形質膜から精製される原形質膜ドメインに関する。本明細書中で用いられる「関連」という用語は、カベオラの一部が、分離しているのではなく、Gドメインに付着していることを示す。実施例４に記載し、図３に概略的に示すように、本質的にカベオラ、Gドメイン、およびGドメイン関連カベオラからなる原形質膜ドメインは、前述のように、カベオラが付着したままのシリカ被覆細胞膜を単離し；シリカ被覆細胞原形質膜を高塩濃度に付して、膜からシリカ被覆を分離し、Triton X-100などの適当な界面活性剤の存在下で、膜をせん断または音波処理などの膜破壊技術に付することにより生成される。これにより、Gドメイン関連カベオラをはじめとする種々の成分に膜が分離される。本質的にカベオラ、Gドメイン、Gドメイン関連カベオラからなるドメインは、界面活性剤耐性であり、ショ糖密度遠心分離などによって密度に基づき他の成分から分離することができる。
【００２５】
別の態様において、細胞原形質膜の他の成分を単離することができる。かかる成分としては、前述のように、カベオラ、Gドメイン、またはGドメイン関連カベオラの単離後に残留する界面活性剤可溶性成分または細胞骨格成分が挙げられる。これらの他の成分は、カベオラおよび／またはGドメインを実質的に含まない。例えば、前述のように、カベオラを実質的に含まないGドメインの単離後、残留する界面活性剤可溶性成分を単離し、精製することができる。
【００２６】
これらの発見の結果、GPIアンカータンパク質のマイクロドメインおよび他の細胞成分を実質的に含まないカベオラ；カベオラおよび他の細胞成分を実質的に含まないGドメイン；および本質的にカベオラ、GドメインおよびGドメイン関連カベオラからなる同時単離原形質膜マイクロドメインを単離するための方法を利用することができるようになった。該カベオラ、Gドメインおよび／または同時単離原形質膜マイクロドメインは、任意の組織に由来する任意の内皮細胞原形質膜から単離することができる。内皮原形質膜の由来先として用いることができる組織としては、血管組織、肺組織、心臓組織、脳組織、腎臓組織、肝臓組織および内分泌組織が挙げられ、血管系、肺、心臓、肝臓、腎臓、脳および他の器官が含まれる。例えば、カベオラ、Gドメインおよび／または同時単離原形質膜ドメインは、血管を介する灌流により血管内皮から単離したり、腸を介する灌流により腸上皮から単離したりすることができる。さらに、カベオラ、Gドメインおよび／または同時単離原形質膜ドメインは、培地中で成長したものなど種々の細胞から単離することもできる。
【００２７】
本発明の具体的な態様において、内皮細胞膜に隣接する管腔空隙に付着性のある第1のイオン性物質を灌流することにより内皮細胞膜の管腔表面上に該イオン性物質の被覆を形成させることによって、まず細胞膜を単離し、該イオン性物質被覆の管腔表面に、第1のイオン性物質と反応性のある反対電荷のイオン性物質を接触させることにより該被覆を架橋して内皮膜に付着した薄皮（薄膜−内皮膜複合体と呼ぶ）を形成させ、寸法または密度の相違に基づく方法（例えば、遠心分離法による）により他の組織要素から該複合体を分離して、被覆膜ペレットを製造することにより、特定のマイクロドメインを内皮細胞原形質膜から単離する。続いて、特定のマイクロドメインを単離することができる。例えば、界面活性剤の存在または非存在下、ホモジナイズ中のせん断により被覆膜からカベオラを除去し、ショ糖密度勾配遠心分離法などによって密度に基づいて他の成分から該カベオラを単離することにより、カベオラを単離することができる。この方法により単離されたカベオラは、Gドメインを実質的に含まない。あるいは、カベオラを単離および除去した後に被覆膜を単離し、該被覆膜を高塩濃度に付してシリカ被覆を除去し、該膜を単離することによりGドメインを単離することができる。この方法により単離されたこれらの膜は、本質的にGドメインからなる。
【００２８】
本発明の好ましい態様において、第1のイオン性物質はコロイド状シリカであり、第2のイオン性物質はアクリルポリマーである。多くの選択肢のうちの一つに、磁性粒子を用いて膜を被覆した後で、標準的磁気技術を用いて単離することができるものがある。
【００２９】
精製カベオラ、GPIアンカータンパク質の精製マイクロドメイン、およびGドメイン関連カベオラを含む精製同時単離血漿マイクロドメインは、細胞内または経細胞輸送に関与する分子およびタンパク質の同定に有用である。さらに、カベオラおよびGドメインは精製されるため、これを用いて、カベオラまたはマイクロドメインのいずれかに限定されるが両方には存在しないタンパク質を識別し同定することができる。
【００３０】
抗体
ある態様において、精製カベオラを用いて、標準的技術により、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかの抗体を生成させることができる。本明細書中で用いられる「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方、およびカベオラと反応する複数の抗体の混合物（例えば、カベオラと反応する異なる型のモノクローナル抗体の混合物）を含む。抗体という用語はさらに、抗体全体および／またはその生物学的機能性のフラグメント、複数種由来の部分を含むキメラ抗体、ヒト化抗体および二価機能性抗体を含む。用いることができる生物学的機能性抗体フラグメントは、精製カベオラに抗体フラグメントを結合するのに十分なフラグメントである。一旦抗体が惹起されると、精製カベオラに結合する能力について評価される。従来法を用いて、この評価を行うことができる。
【００３１】
キメラ抗体は、2つの異なる種に由来する部分（例えば、一つの種に由来する定常領域および別の種に由来する可変または結合領域）を含み得る。2つの異なる種に由来する部分は、従来技術により化学的に結合され得るか、または遺伝子工学技術を用いて単一の連続タンパク質として調製することができる。キメラ抗体の軽鎖および重鎖の両方の部分のタンパク質をコードするDNAは、連続タンパク質として発現され得る。
【００３２】
精製カベオラと反応するモノクローナル抗体（mAb）は、体細胞ハイブリダイゼーション技術（KohlerおよびMilstein、Nature 256: 495-497（1975））、インサイチュ技術およびファージライブラリー法などの種々の技術を用いて製造することができる。例えば、精製カベオラは免疫原として用いることができる。あるいは、カベオラにおいて見られるタンパク質の部分に相当する合成ペプチドを、免疫原として用いることができる。動物をそのような免疫原で免疫化し、抗体産生脾臓細胞を得る。免疫化した動物の種は、所望のmAbの特異性によって異なる。抗体産生細胞を、不死化細胞（例えば、骨髄腫細胞）と融合して、抗体を分泌することができるハイブリドーマを作製する。融合しなかった残りの抗体産生細胞および不死化細胞を除去する。所望の抗体を産生するハイブリドーマを、従来技術を用いて選択し、選択したハイブリドーマをクローニングし培養する。
【００３３】
モノクローナル抗体の産生のために前述と同様の様式で、動物を免疫化することによりポリクローナル抗体を調製することができる。精製カベオラと反応する抗体が産生される条件下に動物を維持する。所望の抗体価に達したときに、動物から採血する。ポリクローナル抗体を含む血清（抗血清）を、他の血液成分から分離する。ポリクローナル抗体含有血清は、必要に応じて、特定の型の抗体のフラクション（例えば、IgG，IgM）にさらに分離することができる。
【００３４】
あるいは、本明細書中に記載のように得られたいずれの膜フラクションも可能であるように、精製Gドメインまたは精製シリカ被覆膜を用いて、抗体を生成させることもできる。いずれのフラクションからのタンパク質の部分に相当する合成ペプチドも用いることができる。精製カベオラを用いて、カベオラを結合する抗体を同定することができる。あるいは、精製Gドメインを用いて、Gドメインを結合する抗体を同定することができる。
【００３５】
前述のような抗体を用いて、さらに、細胞内および経細胞輸送に関連するタンパク質を同定することができる。例えば、内皮内での輸送を妨害するか否かを判定するために、抗体を内皮に適用することができる。抗体はさらに、作用物質を、内皮内へ、および／または内皮を横切って送達するベクターとして用いることができる。例えば、以下の実施例８および９に記載のように、主に精製カベオラ内で見つかる抗原を認識すると共にインビボでの組織特異的トランスサイトーシスのために用いることができるモノクローナル抗体が生成されている。抗体の大部分が内皮を認識し、ごく一部のものが連続内皮に特異的である。さらに、組織特異的な抗体を生成させることができる。実施例８に記載の抗体のうちの2つは、肺組織を認識する。抗体、薬物、遺伝子、診断剤または他の分子などの作用物質を、特定の組織、特に特定の組織のカベオラに送達させて、該作用物質を内皮へ、および／または内皮を横切って送達することができるようにするための輸送剤として組織特異的抗体を用いることができる。
【００３６】
内皮の標的化
本発明の精製されたカベオラまたはGドメインを用いて、作用物質の送達のため、または遺伝子治療のためのように、内皮を標的とすることもできる。カベオラまたはGドメインを標的とする作用物質は、より容易に細胞に送達されてもよく、必要に応じて、細胞に入り、細胞の一方の側から他の側に横切り、またはその機能を変えるシグナルを細胞に提供されてもよい。例えば、Gドメインにまたはカベオラ中のタンパク質（例えば、インスリン受容体）に結合する抗体、薬物または他の分子のような作用物質は、カベオラまたはGドメインを標的とし、それにより、上皮に入るおよび／または上皮を横切るように動いてもよい。そのような抗体、薬物または他の分子を、カベオラまたはGドメインを標的とする作用物質にもう一つの作用物質（薬物または遺伝子等）を結合させることにより、輸送剤として用いることもできる。このように、GPIアンカータンパク質の精製されたカベオラおよび精製されたマイクロドメインは、作用物質を内皮層を横切るように運ぶ、輸送ビヒクルとしても有用である。Gドメインとカベオラとの物理的結合は、それらの間での機能的相互作用を指示し、従って、これらの構造は、シグナル変換と膜輸送とを組み合わせることによりリガンドプロセッシングのためのプラットフォームを提供し得る。天然リガンドまたは抗体をGPI結合タンパク質に結合させることは、クラスター形成（Schroeder, R.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 12130（1994）；Mayor, S.ら, Science 264: 1948（1994））、ポトサイトーシス（potocytosis）を介するカベオラによる内在化（Anderson, R.G.W.ら, Science 255: 410（1992）；Rothberg, G.ら, J. Cell. Biol. 111: 2931（1990））またはエンドサイトーシス（Keller, E.A.ら，EMBO J., 3: 863（1992）；Bamezai, A.ら，Eur. J. Immunol. 22: 15（1992）；Parton, R.G.ら，J. Cell. Biol. 127: 1199（1994））、および細胞活性化（Thompson, L.F.ら, J. Immunol. 143: 1815（1989）；Korty, P.E.ら, J. Immunol. 146: 4092（1991）；Davies, L.S., J. Immunol. 141: 2246（1988））さえ誘導することができる。シグナリングは、カベオラプロセッシングを調節し得（Parton, R.G.ら, J..Cell Biol. 127: 1199（1994）；Smart, E.J.ら，J. Cell. Biol. 124: 307（1994））、およびシグナリングの種々の媒介物質がカベオラ中に存在し得る（Schnitzer, J.E.ら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 92: 1759（1995）；Fujimoto, T.ら, J. Cell. Biol. 119: 1507（1992）；Fujimoto, T., J. Cell. Biol. 120: 1147（1993）；Schnitzer, J.E.ら, J. Biol. Chem. 270: 14399（1995））。最後に、表面結合分子が、内皮中のカベオラによりエンドサイトーシスまたはトランスサイトーシスされる（Montessano, R.ら, Nature 296: 651（1982）；Schnitzer, J.E., Trends Cardiovasc. Med. 3: 124（1993）；Oh, P.ら, J. Cell Biol. 127: 1217（1994）；SchnitzerおよびOh, P., J. Biol. Chem. 269: 6072（1994）；Millici, A.J.ら, J. Cell Biol. 105: 2603（1987）；Schnitzer, J.E.ら, J. Biol. Chem. 264: 24544（1992）；Schnitzer, J.E.およびBravo, J., J. Biol. Chem. 268: 7562（1993））。カベオラの分解は、そのような輸送を妨げ（Oh, P.ら, J. Cell Biol. 127: 1217（1994））、精製されたカベオラの分子マッピングにより、制御されたN−エチルマレイミド感受性小胞輸送に必要なSNARE融合タンパク質およびグアノシントリホスファターゼの存在が明らかになる（Schnitzer, J.E.ら, J. Biol. Chem. 270: 14399（1995）；Schnitzer, J.E.ら, Am. J. Physiol. 37: 1148（1995））。従って、本明細書中に記載のように内皮カベオラの精���の結果として、カベオラが本当に小胞キャリアであり、シグナリングをキャリア輸送に組み合わせる分子機構を含むことが明らかになった。クラスター形成、シグナリングおよび小胞輸送を介する動的リガンドプロセッシングは、GPI結合タンパク質マイクロドメインをカベオラと結合させることにより、またはおそらくはカベオラ形成によっても起こり得る。そのような特殊で明確なマイクロドメインは、シグナリング分子を構成するためのみならず、表面結合リガンドを区別して処理するために、別々に存在するかまたは互いに結合し得る。
【００３７】
すなわち、カベオラ（および、GPIアンカータンパク質のような結合した膜成分）は、多くの型の細胞膜の中へおよび膜を横切る分子の輸送において重要な役割を果たし、特に、内皮の中におよび／または内皮を横切るように分子を輸送することに関与し、その結果、内皮障壁を横切る。これは、その下にある組織に利用できるようになれば有益な効果を有することができる薬物および他の作用物質のような物質の通過に対する障壁として体内の多くの組織において内皮が奏する効果故に、かなり興味深く価値がある。本明細書中に記載の研究により、細胞膜、特に内皮細胞膜を横切る輸送を容易にすることができ、必要に応じて、組織特異的方式（すなわち、細胞型特異的なカベオラおよび／またはGPIアンカータンパク質により選択された組織型またはいくつかの型に指向される）で行なうことができる手段を確認することが可能になる。イオン、小分子、タンパク質および水でさえも含む種々の分子を内皮細胞のような細胞中に輸送することを媒介、制御および／または調節することに加え、カベオラは、細胞表面シグナル変換および伝達において役割を有する。最近の研究により、カベオラが、細胞間と周囲組織間と流体間での相互作用においても作用し得、そうする間に、それらがメッセンジャー分子（例えば、CAMP、カルシウム）を貯蔵および処理し、非受容体チロシンキナーゼのようなキナーゼを用いてリン酸化カスケードを開始することが示された（例えば、Anderson, R.G.W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10909-10913（1993）；Anderson, R.G.W., Current Opinion in Cell Biology 5: 647-652（1993）を参照）。
【００３８】
その結果、精製されたカベオラ、Gドメインおよび本質的にカベオラとGドメインからなる膜ドメイン、並びに精製されたカベオラ、Gドメインまたは本質的にカベオラとGドメインからなる膜ドメインに特異的な抗体を利用できることにより、薬物および診断薬のような分子を、内皮細胞膜のような細胞膜におよび／または膜を横切るように送達すること、ならびにカベオラおよび／またはGドメイン中に存在またはそれらと結合することならびにシグナル変換および伝達において役割を果たすことが示された分子と相互作用することによる等の細胞シグナリングおよび伝達を変化させることが可能になる。例えば、本発明の精製されたカベオラは、構成タンパク質および他の成分として特徴付けられ、種々の細胞型（一般的効果を細胞に付与するため）または特異的細胞型（選択的効果を付与するため）のいずれかにおいて、輸送またはシグナル変換および伝達において重要な役割を果たす成分を確認するためにさらに評価されることができる。
【００３９】
例えば、ある態様において、癌治療のためのイムノトキシン（腫瘍または他の悪性組織へ送達すべき）または心臓症状の治療のための選択的刺激薬（心臓組織に送達すべき、より具体的には、下側にあり通常は接近が難しい心筋細胞に対する心臓内皮障壁を横切って送達すべき）のような薬物の輸送を向上させる原形質膜成分を確認することができる。あるいは、別の態様において、治療用タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子または核酸のような作用物質の輸送を向上させる成分を確認することができる。例えば、腫瘍または腫瘍血管系中のカベオラにおいてのみ見られる／それに係わるタンパク質またはポリペプチドのような、癌（腫瘍）に特異的であると確認されている成分を標的化して、腫瘍除去性因子をコードする核酸の輸送、または内因性腫瘍除去性因子もしくは、局所的（腫瘍）内皮細胞を損傷するまたは、腫瘍を養う血管を閉塞させ従って本質的に腫瘍を梗塞させる局所的血管内凝固を引き起こすもう一つの因子の生成を増加させるタンパク質の輸送を容易にすることができる。
【００４０】
あるいは、さらなる態様において、上皮細胞のような細胞中への遺伝子送達を容易にする原形質膜成分を確認することができ、その中で治療用または診断用タンパク質もしくはペプチドまたはアンチセンス核酸を生成するように遺伝子が処理される。例えば、抗凝固または血液希釈性タンパク質を生成および分泌するために、目的が、遺伝子を血管に導入することである場合、適切な標的は内皮、特に心臓組織中の内皮である。心臓および／または血管中の内皮細胞原形質膜中に存在する（そしておそらく、それらに独自の）カベオラおよび／またはGPIアンカータンパク質を、本明細書中に記載の精製されたカベオラおよび／またはGドメインを用いて確認することができ、遺伝子送達ビヒクル（プラスミドもしくはウイルスベクター、またはタンパク質もしくはペプチド−DNA結合体等）を心臓組織および／または血管に標的化または指向させるために用いることができる。あるいは、特定の組織中に存在するまたはそれに独自であるカベオラおよび／またはGPIアンカータンパク質に対する抗体を用いて、遺伝子送達ビヒクルを特定の組織に標的化または指向させることができる。同様に、カベオラまたはGドメインにおいて見られる脂質アンカータンパク質を、末梢血循環に導入することができ、そこで、それらは、血管の上皮と相互作用し、血管上皮に転移させることができる。
【００４１】
さらに、内皮は、その局所的組織微環境において複数の物理的かつ化学的因子に反応性であり、癌、アテローム性動脈硬化、糖尿病性微小血管症および心臓虚血のような多くの血管および血管外疾患において一次的または二次的役割を果たす（Folkman, J., Nature Medicine 1: 27-30（1995））。従って、腫瘍血管中に存在するタンパク質を、隣接非悪性組織を避けつつ選択的破壊のために腫瘍内皮を標的とする作用物質を直接送達することにより、指向的治療において標的化することができる。
【００４２】
カベオラ、GPIアンカータンパク質または他の原形質膜ドメインの作用により細胞に入るべき薬物または他の作用物質の指向的送達は、カベオラ、Gドメインまたは他の原形質膜ドメインの成分と比較的高い親和性相互作用を有する分子（抗体、ペプチド、ウイルス、リガンド等）を、「プローブ」または輸送分子として用いることにより実施されることができる。プローブまたは輸送分子は、それ自体、内皮細胞のような細胞へのその侵入が望ましい薬物または作用物質であり得るか、または細胞へのその侵入が望ましい二次分子に付着することができる。輸送分子および付着分子は、血液から抽出され、カベオラの作用により標的化組織中に蓄積する。例えば、実施例8に記載の抗体のような、肺のカベオラにおいてのみ見られるタンパク質を認識する抗体または他の分子を用いて、抗体もしくは他の分子であり得るまたはその作用により送達することができる薬物を、治療または診断目的で肺組織に導くことができる。作用物質は、肺カベオラを介して肺組織に蓄積し、従って、所望の効果のために組織に利用可能になる。同様に、そのようなプローブまたは輸送分子（特定の組織型においてカベオラを標的化する、または通常、多くの組織型上のカベオラと結合する）を用いて、薬物または他の作用物質を種々の組織型に導入することができる。
【００４３】
プローブまたは輸送分子について標的化されることができるカベオラまたはGドメインのタンパク質および他の成分を、本発明の精製されたカベオラまたはGドメインを用いて同定することができる。逆に、本明細書中に記載の精製されたカベオラまたはGドメインを用いて、プローブまたは輸送分子を同定することもできる。そのような分子を同定するために、二次元ゲル分析それに続くマイクロ塩基配列決定、既知のタンパク質に対する抗体を用いるウエスタンブロット（本明細書中に記載の）、または前述の抗体を用いるブロッティングを含む標準的アッセイを用いることができる。
【００４４】
精製されたカベオラ、Gドメインおよび、カベオラとGドメインとから本質的になる膜フラグメントを、送達ビヒクルとして用いることもできる。例えば、精製されたカベオラを、意図する組織に送達すべき薬物または他の作用物質（例えば、化学治療剤）を含むように修飾することができる。修飾された精製カベオラを、静脈内、筋肉内、局所または吸入スプレーのような適切な経路により、作用物質を必要としている個体に導入する。例えば、作用物質を含む修飾カベオラを、エアロゾルまたは吸入スプレーにより、肺癌用の化学治療剤を必要としている個体の肺に投与することができる。肺組織において、カベオラは送達ビヒクルとして作用し、作用物質が病的細胞に送達される。
【００４５】
本発明を、以下の実施例によりさらに説明する。
【００４６】
実施例
細胞が組織から単離され培地中で成長させたとき、細胞表面、特に内皮細胞からのカベオラの実質的損失があり得る（J.E. Schnitzerら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 199: 11（1994）。そのような損失（しばしば、100倍より大きい）は、原形質膜の組織における実質的変化を表し、カベオラ機能およびGPI結合タンパク質クラスター形成における主要な阻害を反映し得る。従って、GPIアンカータンパク質とカベオラとの間の関係を、細胞培養の潜在的影響を避け、抗体効果器および細胞内区画からの汚染を避ける条件下で調べた。
【００４７】
本明細書中に記載の膜サブフラクションの全てを、サブフラクションの比較において変数の数と一致および制限するために、界面活性剤に曝露した後に単離した。しかしながら、効率は低いが、界面活性剤を用いることなくシリカ被覆膜ペレットからカベオラをせん断および単離することができる。Triton  X-100を省略し、せん断目的で、ホモジネート化ストロークの数を12から48または60回に増やした以外は、（Kurzhalia, T.V.ら, Trends Cell Biol. 5: 187-189（1995））に記載のように、カベオラ単離のために通常のプロトコールに従った。
【００４８】
ラット肺微小血管系からの内在するカベオラを有する管腔内皮原形質膜を選択的に単離するため、および原形質膜フラクションからカベオラを精製するために、以下の方法および材料を用いた。
【００４９】
方法
抗体
カベオラに対するマウスモノクローナル抗体は、ZymedまたはTransduction Laboratories（Lexington, KY）から得；アンギオテンシン変換酵素（ACE）に対するウサギポリクローナル抗体はR. Skidgel（イリノイ大学）から得；バンド4.1に対するウサギポリクローナル抗体はV. Marchesi（エール大学）から得；Ca2+-ATPaseに対するマウスモノクローナル抗体は、Affinity BioReagents（Neshanic Station, NJ）から得；β-アクチンに対するマウスモノクローナル抗体はSigmaから得；ならびにIP3受容体に対するヤギポリクローナル抗体は、Solomon H. SnyderおよびAlan Sharp（ジョーンズ・ホプキンス大学）から得た。他の試薬のための供給源は、前述と同様とした（Schnitzer, J.E.ら, J. Cell Biol. 127: 1217（1994）；Schnitzer, J.E.およびBravo, J., J. Biol. Chem. 268: 7562（1993）；Schnitzer, J.E.およびOh, P., J. Biol. Chem. 269: 6072（1994）；ならびにJacobson, B.S.ら, Eur. J. Cell Biol. 58: 296（1992））。
【００５０】
管腔内皮細胞表面のシリカ被覆についてのラット肺のインサイチュ灌流
麻酔をかけた雄Sprague-Dawleyラットの肺を、気管切開後に酸素を供給し、次に、（Schnitzer, J.E.およびOh, P., J. Biol. Chem. 269: 2072（1994）；Jacobson, B.S.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 199: 11（1994））に記載のように灌流した。簡単に言えば、右心室に、30μMニトロプルシドおよびヘパリン175単位を含むpH7．4で0.5mlのリンガー液（111mM NaCl／2.4mM KCl／1mM MgSO4／5.5mM glucose／5mM Hepes／0.195mM   NaHCO3）を注入してから、肺動脈にカニューレ挿入した。肺を、以下の溶液（特記した以外は全て10〜12℃）で以下の順番で8〜10mmHg（1mmHg＝133Pa）で灌流した：（i）30μMニトロプルシドを含む酸素化リンガー液を室温で90秒間および次に10〜12℃で3．5分間；（ii）MBS（125mM NaCl／20mM Mes, pH6.0）で90秒間；（iii）MBS中の1％コロイド状シリカ；（iv）血管系から遊離シリカを除くためにMBSで90秒間；（v）膜結合シリカを架橋し保護するためにMBS中の1％ポリアクリル酸ナトリウムで90秒間、ならびに（vi）プロテアーゼ阻害剤を含むHepes緩衝ショ糖8〜10ml［HBS＋、pH7、0.25Mショ糖、25mM Hepes、ロイペプチン（10μg／ml）、ペプスタチンA（10μg／ml）、o−フェナントロリン（10μg／ml）、4−（2−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド（10μg／ml）およびトランス−エポキシスクシニル−L−ロイシンアミド（4−グアニドノ）ブタン（50μg／ml）］。肺を切除し、冷たいHBS＋に浸漬した。
【００５１】
管腔内皮細胞膜の精製
冷却したラット肺を秤量し、破砕氷中に固定したアルミニウムブロック上のプラスチック皿中でレーザーブレードで刻み、次に、1800rpmで回る高速ローターを有するC型テフロン乳棒／ガラスホモジナイザー中でのホモジネート化（12ストローク）のために20mlの冷たいHBS＋に添加した。0.53μm Nytexネット続いて0.3μmネットを通して濾過した後、ホモジネートを20mM KClを含む102％（wt／vol）Nycodenz（Accurate Chemical and Scientific）と混合して50％最終溶液を作り、20mM KClに加えてHBSを含む55〜70％Nycodenz連続勾配上に層状に乗せた。ベックマンSW28ローター中で15000rpmにて4℃で30分間遠心分離した後、ペレットを、1ml MBS中に懸濁し、Pと名づけた。
【００５２】
シリカ被覆内皮細胞膜からのカベオラの精製
前述の懸濁膜ペレット（P）に冷たい10％（vol／vol）Triton X-100を添加して最終濃度1％とした。4℃で10分間、転頭運動させた後、懸濁液を、AA型テフロン乳棒／ガラスホモジナイザー（10ストローク）中でホモジネート化し、次に、40％ショ糖および20mM KClに加えた。20mM KCl中の35〜0％ショ糖勾配を、ベックマンSW55ローター管中のホモジネート上に重層し、30000rpmで4℃で一晩遠心分離した。10％ショ糖と16％ショ糖との間で明らかに見える膜層を集め、Vを標識し、次に、MBSで3倍に希釈してから、13,000xgで4℃で2時間遠心分離した。得られるペレットを、電子顕微鏡観察のため、またはさらなる分析のために処理した。カベオラの単離のために条件を最適化しようとする際に、低密度カベオラフラクションは、カベオラの収率が減少したときを除いて、（i）遠心分離中のショ糖勾配中のTriton X-100の存在、および（ii）ホモジネート化中のTriton X-100の非存在、によって変わらないことが分かった。Triton X-100は、原形質膜からのカベオラのせん断除去を容易にするようである。
【００５３】
ELISA
前述のショ糖密度遠心分離の後、150μlの33個のフラクションを集め、ペレットを150μlのMBS（フラクション34）に懸濁した。各フラクションのアリコート（50〜100μl）を96ウェルトレーの個々のウェルに入れ、一晩乾燥した。洗浄後、ウェルをELISA洗浄緩衝液（EWB：2％ オボアルブミン／2mM CaCl2／164M NaCl／57mM リン酸, pH7.4）で1時間ブロックし、カベオラまたはACEに対する抗体（1：200）を含むEWBと1時間インキュベートし、EWB中で1分間、3回洗い、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したレポーター抗体（EWB中に1：500）とインキュベートし、再び洗浄した。基質溶液（50mM Na2HPO4／25mMクエン酸／0．12％ o−フェニレンジアミン二塩酸塩／0.03％ H2O2）を添加し、4M H2SO4を用いて反応を停止してから、Molecular Devices Thermomaxマイクロプレートリーダーでシグナルを読んだ。
【００５４】
SDS／PAGEおよび免疫ブロット
（Sargiacomo, M.ら, J. Cell Biol. 122: 789（1993）；Lisanti, M.P.ら，J. Cell. Biol. 123: 595（1993）；Montessano, R.ら, Nature 296: 651（1982））に報告されているように、一次抗体続いて適切な125I−標識レポーター抗体を用いる免疫ブロットのためのニトロセルロースまたはポリ（ビニリデンジフルオライド）（Immobilon；Millipore）フィルターへの銀染色または電気転写（electrotransfer）による直接分析のために5〜15％ゲル中のSDS／PAGEにより種々の組織フラクションのタンパク質を可溶化し分離した。バンド強度をPhosphorImager（Molecular Dynamics）、オートラジオグラムのデンシトメトリー、および／またはγ放射能活性の直接カウントにより定量した。Bio-Rad BCAキットを用いてタンパク質アッセイを行った。
【００５５】
実施例１  被覆膜ペレット（P）の単離
内皮細胞表面と結合したカベオラの単離は多くの困難を有している。内皮は、どの器官においても細胞の種々の集団の小さな割合しか示さない。不運なことに、一次供給源としてまたは、培地での成長のために組織から内皮細胞を単離することは、細胞表面カベオラの非常に大きな損失を含む形態学的変化をもたらす（Schnitzer, J.E.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 199: 11（1994））。また、原形質膜カベオラに寸法および密度が非常に類似し,ならびにカベオラマーカータンパク質カベオリン（Dupree, P.ら, EMBO J. 12: 1597（1993）；Kurzchalia, T.V.ら, J ．Cell Biol. 118: 1003（1992））を含み得る非被覆小胞を、トランスゴルジ網のような他の細胞区画に見つけ得る。さらに、カベオラは細胞型に従って変化する（Izumi, T.ら, J. Electron Microsc. 38: 47（1989））。前記問題を克服するために、インサイチュのラット肺からのカベオラと結合した管腔内皮原形質膜を高い収率および純度で最初に単離する手法を用いた。次に、カベオラを、この膜フラクションから除去および単離した。
【００５６】
インサイチュで灌流したラット肺からの管腔内皮細胞膜の精製
ラット肺微小血管系を、肺動脈を通して正電荷を有するコロイド状シリカ溶液で灌流して、正常では循環血に曝露されている管腔内皮細胞膜を被覆し、意図するこの特定の膜を特徴付ける安定接着性シリカ薄膜を作った(Jacobson, B.S.ら, Eur. J. Cell. Biol. 58: 296（1992））。そのような被覆により、膜密度が増加し、原形質膜に非常に強力に付着したために、組織ホモジネート化後、カベオラが付着したシリカ被覆膜の大きなシートが、高密度媒体を通す遠心分離（Jacobson, B.S.ら, Eur. J. Cell. Biol. 58: 296（1992））により、他の細胞膜および断片から容易に単離された。シリカ被覆膜は、内皮細胞表面マーカーについて充分に富んでおり、他の組織成分からの汚染はほとんど無かった。過去の研究（Jacobson, B.S.ら, Eur. J. Cell. Biol. 58: 296（1992））に示されるように、典型的な単離膜シートは、一方の側に付着したカベオラ、および他の側の上のシリカ被覆を有していた。SDS／PAGEにより、シリカ被覆膜は、出発肺ホモジネートから全く異なるタンパク質プロフィールを有していた。さらに、定量的免疫ブロットにより、カベオリンのような内皮の表面上に発現されることが知られている幾つかのタンパク質用の出発組織ホモジネート物に比べて、シリカ被覆膜ペレットが30倍まで増加していることが明らかになった（Dupree, P.ら，EMBO J. 12: 1597（1993））およびACE（Caldwell, P.R.B.ら, Science 191: 1050（1976））。逆に、細胞内小器官のタンパク質（シトクロムオキシダーゼおよびリボホリン）ならびに他の肺組織細胞の原形質膜（線維芽細胞表面抗原）を、この膜フラクションから除去した。
【００５７】
カベオラ用のマーカーとしてのカベオリンの界面活性剤耐性
カベオリンを、カベオラ用の生化学的マーカーとして用い；シリカ被覆膜において充分に発現されているカベオリンが、Triton X-100または3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネートを用いるが、オクチルβ-D-グルコシド、SDS、デオキシコレートおよびNonidet P-40を含む他の界面活性剤を用いない4℃〜8℃でのホモジネート化による可溶化に耐性であることが分かった。SDS／PAGEにより、シリカ被覆膜中の多くのタンパク質がTriton X-100により可溶化されたが、他のものは可溶化されず、遠心分離により沈殿させ得ることが明らかになった。免疫ブロットは、カベオリンおよび細胞骨格タンパク質バンド4.1が、Triton不溶性フラクションに沈殿するが、ACEがTriton可溶性フラクションにおいて主に見つかることを示した。
【００５８】
実施例２  精製されたカベオラ（V）の単離
シリカ被覆膜ペレット（P）中のシリカ被覆と反対側の原形質膜の細胞質側に付着したカベオラを、Triton X-100の存在または非存在下における4℃でのホモジネート化中のせん断により膜から剥いだ。次に、これらを、ショ糖密度勾配遠心分離により単離して、生化学的および形態学的に異なるカベオラ小胞（V）のホモジネート集団を形成した。この技術を、図1に模式的に表す。
【００５９】
シリカ被覆膜から剥れた小胞の単離
Triton X-100中のシリカ被覆膜（P）を、ホモジナイザー中でのせん断により突出しているカベオラから剥がし、次に、ショ糖密度遠心分離に付してカベオラを単離した。ショ糖勾配からの34個のフラクションの分析により、ACEのものから充分に離れたカベオリンについてのピーク信号が明らかになった。小胞の（P-V）の除去後に、シリカ被覆膜においてカベオリンはほとんど検出されなかった。その大部分は、10〜16％ショ糖（フラクション6〜10）において可視膜バンド中にあり、それを集め、小胞についてのVを標識し、電子顕微鏡、SDS／PAGEおよび免疫ブロットにより試験した。
【００６０】
カベオラとしての単離小胞の特徴付け
3つの主要膜フラクション：最初のシリカ被覆膜（P）、単離された小胞（V）および、小胞除去後のシリカ被覆膜ペレット（P-V）について、電子顕微鏡観察を行った（Dvorak, A.M., J. Electron Microsc. Tech. 6: 255（1987））。Pにおいては、小さな膜に結合した電子顕微鏡で明るく見える開口、または窓が、好ましい断面における多くの小胞中で見ることができ、明らかに、直接細胞膜表面におけるカベオラの小孔の部分ではなかった。これらの窓は、古くに（Palade, G.E.およびBruns, R.R., J. Cell Biol. 37: 633（1968））に記載されているように、内皮カベオラの特徴であり、おそらく、小胞の鎖の一部として別の小胞に既に付着していることを示す。P-Vフラクションは、カベオラが付着していないシリカ被覆膜を含んでいた。Vフラクションは、直径が主に50〜100nmである小さな非被覆小胞のやや均一な分布を含んでいた。高倍率により、インビボでのカベオラについて典型的な小胞構造が明らかになった。単一原形質膜小胞および膜結合小胞の鎖が存在していた。カベオラに特徴的な窓は、多くの小胞において容易に見ることができた。いくつかの小胞は、なお、インビボでの内皮の原形質膜に付着しているカベオラにおけるように、狭くなった首を維持していた。高倍率により、単離されたカベオラ中の中心の膜結合窓が示された。最初にインビボで記載（Palade, G.E.およびBruns, R.R., J. Cell Biol. 37: 633（1968））された中心の密な丸いノブを、これらの窓のいくつかにおいて見ることができた（未公表観察）。
【００６１】
生化学的観察により、単離された小胞について独自のタンパク質プロフィールが示され、出発膜ペレットと比較して種々のタンパク質が明らかに増加しているのみならず、他のタンパク質が排除されていた。免疫ブロットは、カベオリン、原形質膜Ca2+-ATPaseおよびIP3受容体についてVが著しく増加しており、最初の膜と比べて、カベオリンおよびIP3受容体について13倍増加していることを示した（以下、表1を参照）。さらに、カベオラの除去後に、シリカ被覆膜（P-V）中に残ったこれらのタンパク質についてシグナルは殆ど無かった。定量した免疫ブロットは、これらの3つの内在性膜タンパク質が、Triton可溶化に耐性があり、精製されたカベオラ中で濃縮されていたことを示した（図4）。Ca2+ポンプ（Ca2+ATPase）、IP3受容体（IP3R）およびカベオリンについてのシグナルの80〜95％が、カベオラフラクション中にあった。対照的に、バンド4．1およびACEは排除された。これらの精製されたカベオラは、細胞表面全体には自由に分布されていないがこの小器官に選択的に局在化されている少なくとも3つの残留タンパク質を有する原形質膜のマイクロドメインを示した。
【００６２】
カベオラの精製の程度は、カベオリンについての相対的増加量により示される（以下、表1を参照）。収率については、インサイチュでの微小血管の90％より多くがシリカで被覆され、シリカ被覆膜の少なくとも80％が、ラット肺ホモジネートからペレット化されたことが既に示されている（Jacobson, B.S.ら，Eur. J. Cell. Biol. 58: 296（1992））。膜ペレット（P）の中におけるカベオリンの回収は、出発ホモジネート中で検出される合計の10％であり、これは、内皮の管腔側からのカベオリン含有小胞の原形質膜サブセットのみが単離されるという概念に一致していた。最初のシリカ被覆膜（P）から直接由来した原形質膜カベオラの収率は、カベオリンについてELISAおよび免疫ブロットにより示されたように4つの別々の実験において53％から60％に及んだ。全体としては、全タンパク質の約5μgが単離され、これは、出発肺ホモジネート中のカベオラの約5〜6％を表していた。
【００６３】
【表１】
2007511463.tif 000002
【００６４】
データは、新しい実験／抗原および先に報告された結果（Jacobson, B.S.ら, Eur. J. Cell. Biol. 58: 296（1992））を複合して示す。免疫ブロットの定量化されたバンド強度を、タンパク質の単位当たりに標準化してから、少なくとも2つの測定の平均としての比を計算した。値0は、Pにおいて検出されないがHにおいて見られる抗原を示し、--は実施していないことを示す。
【００６５】
実施例３  GPIアンカータンパク質（G）のマイクロドメインの単離
外側膜表面のシリカ被覆は、GPIアンカータンパク質が、種々の界面活性剤と相互作用し、細胞膜からのカベオラでない界面活性剤耐性のマイクロドメインの分離を妨げる方法を変えた。陽イオン性シリカ粒子は、陰イオン性細胞表面と相互作用して、膜分子を固定することにより、小胞化または横方向再配列に対して安定化させる（Chaney, C.K.およびJacobson, B.S., J. Biol. Chem. 258: 10062（1983）；Patton, W.F.ら, Electrophoresis 11: 79（1990））。シリカ粒子は細胞表面を均一に被覆するが、その寸法故にカベオラと結合またはカベオラ中に存在することが殆ど無かったので、全てでなくても大部分の非小胞領域の一方の側に強固に付着することにより原形質膜が安定化されるようである（Schnitzer, J.E.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1759（1995）；Jacobson, B.S.ら, Eur. J. Cell Biol. 58: 296（1992））。この接着性薄膜により、膜の反対側のカベオラが、ホモジネート化によりせん断除去させ、他の界面活性剤耐性ドメインを含む他の膜からの汚染は殆ど無かった。逆に、シリカ被覆が無い場合、カベオラと非カベオラ界面活性剤耐性膜の両方を同時単離した。
【００６６】
シリカ被覆が、GPIアンカータンパク質に富む界面活性剤不溶性膜の放出を防止したので、これらのドメインを別々にカベオラから単離することができた。これを行う方法を、図2に概略的に示す。カベオラが剥れたシリカ被覆膜（P-V）を、2M KH2PO4とインキュベートし、続いて、Triton X-100中、4℃でホモジネート化した。この手順により、形態学的および生化学的基準（データ示さず）によりカベオラを有さず直径が150nmを超える小胞を含んでいた膜フラクション（G）のショ糖密度勾配遠心分離による単離が行われた。
【００６７】
実施例４  GPIアンカータンパク質のカベオラおよびマイクロドメインを含む膜フラクションの単離（TI）
前述と類似の方法を用いて、図3に概略的に示すように、カベオラ、GドメインおよびGドメインに結合されたカベオラを含む膜フラクションを単離した。シリカ被覆膜薄膜の単離中に塩濃度が増加し、これが、陽イオン性シリカ粒子とポリアニオン性細胞表面との間の静電相互作用を充分に低下させて、（P）におけるシリカ被覆膜薄膜から原形質膜を剥離した。これらの条件下に、インタクトな膜を分離し、Triton X-100を添加して、低密度の界面活性剤耐性膜（TI）を、前述のようにショ糖密度勾配遠心分離により単離した。
【００６８】
実施例５  種々の膜サブフラクションのタンパク質分析
シリカ被覆内皮細胞膜（P）について、異なる界面活性剤抽出を行った。等量の再懸濁されたPを、種々の界面活性剤（β-OG、β-オクチルグルコシド；デオキシコレートナトリウム；Triton X-100）と一緒に4℃で1時間、攪拌しつつインキュベートしてから、13,000gで2時間遠心分離した。可溶性タンパク質（S）および沈殿した不溶性タンパク質（I）を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分別（10μg／レーン）し、ニトロセルロースまたはImmobilon（Millipore）フィルターに移し、当量の、カベオリン、5’-NT、バンド4.1、GMおよびuPARのための特異的抗体、ならびに（Schnitzer, J.E.およびOh, P., J. Biol. Chem. 269: 6072（1994）；Milci, A.J.ら, J. Cell Biol. 105: 2603（1987））に記載のような適切な125−I−標識二次抗体を用いて、免疫ブロット分析に付した。試験した他のタンパク質には、アンギオテンシン変換酵素を含んでおり、これを、全てのこれらの界面活性剤および炭酸脱水酵素により可溶化し、これを、5’-NTと同様に可溶化した（未公表データ）。ラット肺ホモジネートからのタンパク質（H）、ショ糖密度勾配遠心分離により単離されたTriton X-100不溶性膜（TI）、および沈殿したペレット（R）も、二次抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）に結合し、ECL化学発光基質（Amersham）を用いて結合を検出した以外は、前述のような免疫ブロット分析に付した。
【００６９】
Pについて行なった界面活性剤抽出研究により、カベオリンおよび5’-ヌクレオチダーゼ（5’-NT）を可溶化する種々の界面活性剤の性能における相違が明らかになった。カベオリンは、β-オクチルグルコシド、CHAPS、デオキシコレート、NP-40およびSDS（Triton X-100以外）により部分的に可溶化されたが、5’-NTは、SDSおよびデオキシコレートによってのみ可溶性にされた（データは示さず）。Lisanti, M.P.ら, （J. Cell. Biol. 126: 111（1994））において行われたようなラット肺組織を用いた単離は、カベオリンおよびGPIアンカータンパク質（この例では、5’-NT）の両方が、単離されたTriton X-100不溶性膜（TI）中に存在し（データを示さず）、先の研究（Sargiacomo, M.ら, J. Cell. Biol. 122: 769（1993）；Lisanti, M.P.ら, J. Cell Biol. 123: 595（1993）；Change, W.-J.ら, J. Cell Biol. 126: 127（1994）;およびLisanti, M.P.ら，J. Cell Biol. 126: 111（1994））に一致することを示した。TIについて行われた異なる界面活性剤抽出研究は、GPIアンカータンパク質が、予想されるように、β−オクチルグルコシド、CHAPS、デオキシコレートおよびSDSにより効果的に可溶化されたことを示した（Brown, D.A.およびRose, J.K., Cell 68: 533（1992）；Letarte-Murhead, M.ら, Biochem. J. 143: 51（1974）；Hoessli, D.およびRunger-Brandle, E., Exp. Cell. Res. 166: 239（1985）；Hooper, N.M.およびTurner, A.J., Biochem. J 250: 865（1988）；Sargiacomo, M.ら, J. Cell. Biol. 122: 789（1993）；Lisanti, M.P.ら, J. Cell. Biol. 123: 595（1993））。このパターンは、Pにおける5’-NTについての溶解性のパターンと異なるが、Pにおけるカベオリンについてのそれと類似していた。
【００７０】
カベオリンおよびガングリオシドGM1に富む精製カベオラにおけるGPIアンカータンパク質の欠損も示された。脂質が固定されたコレラトキシン結合性ガングリオシドGM1は、カベオラの内側において金標識と共に局在化させ（Parton, R.．G., J. Histochem. Cytochem. 42: 155（1994）；Montessano, R.ら, Nature 296: 651（1982））、カベオラマーカーとして用いた。全肺ホモジネート（H）、シリカ被覆管腔内皮膜（P）、精製されたカベオラ（V）、およびカベオラ剥離後に再沈殿したシリカ被覆膜（P-V）を前述のように免疫ブロット分析に付した。GM1は、免疫ブロットのみならず、HRP−結合コレラトキシンを用いた直接ブロットによっても検出された。カベオリンおよびガングリオシドGM1に富む精製カベオラは、GPIアンカータンパク質に欠き、Vは90％より多くのGM1を含んでいた。カベオラを欠く残りの膜は検出可能なGM1を欠いたが、これは、GPIアンカータンパク質に富んでいた。さらに、カベオリンと同様に、5’-NTおよびウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性化受容体（uPAR）は、出発ラット肺ホモジネート（H）と比べて、Pに富んでいた。しかしながら、カベオリンとは異なり、これらのタンパク質はVに富まなかったが、これらは、残留カベオラを含んでいたとしても僅かにしか含まないカベオリンが剥れた再沈殿シリカ被覆膜（P-V）と殆ど全体的に結合を維持していた。カベオリンについてのシグナルの95％より多くが、Vにおいて検出され、P-Vには4％未満が残っていた。逆に、5’-NTおよびuPARは95％より多くがP-V中に残っており、V中には3％未満であった。従って、これらのGPIアンカータンパク質は、カベオリンに結合されていないし、単離されたカベオリンに富むカベオラ中で濃縮もされていなかった。従って、インビボでの内皮細胞表面上に存在するカベオラ（Kurzchalia, T.V.ら, J. Cell Biol. 118: 1003（1992）；Dupree, P.Iら, EMBO J. 12: 1597（1993）；Rothberg, K.G.ら, Cell 68: 673（1992）；Fujimoto, T.ら, J. Cell. Biol. 119: 1507（1992）；Fujimoto, T., J. Cell. Biol. 120: 1147（1993））と同様に、精製されたカベオラ（V）は、カベオリン、原形質膜Ca2+−依存性アデノシントリホスファターゼおよびイノシトール1,4,5-三リン酸受容体に富んでいた。対照的に、アンギオテンシン変換酵素、バンド4.1およびβ-アクチンを含む、P中に豊富に存在する他のマーカーは、ほとんど全てが、Vから除去された。
【００７１】
シリカ被覆膜から別々に単離されたGPIアンカータンパク質も、シリカおよびRP（シリカ含有物質の再沈殿ペレット）からのP-Vを用いて、前述のように行われる免疫ブロット分析に付した。カベオラを既に剥がしたシリカ被覆膜ペレット（P-V）を、125mM NaClおよび等体積の4M K2HPO4および0.2％ポリアクリル酸（pH9.5）と共に、20mM 2-IN-モルフォリノエタンスルホン中に再懸濁した。溶液を冷却下に音波処理（10秒で10回）し、ローター上で室温（20℃）で8時間混合し、再び音波処理（10秒で5回）した。Triton X-100を1％まで添加し、製剤を、次に、4℃で10分間混合し、AA型テフロン組織グラインダー（Thomas Scientific, Swedesboro, NJ）と共にホモジネート化した。任意のインタクトな浮遊界面活性剤耐性膜を分離し、前述のようなショ糖密度勾配遠心分離によりこのホモジネートから単離した。P-V中のカベオリンは、カベオラの剥離後に小さな残留シグナルを示す（VとP-Vを比較）。GM1はP-Vにおいても、また予想されたように、GまたはRPにおいても検出できなかった（データを示さず）。Gは、GPI結合タンパク質（5’-NT、uPARおよびCA）に富むが、カベオリンおよびGM1を欠く。同様に行ったが高塩濃度を用いなかった対照実験は、ショ糖勾配において検出可能な膜を生成しなかった（データを示さず）。Gは、カベオリンを欠いたが、複数のGPIアンカータンパク質：5’-NT、uPARおよび炭酸脱水酵素（CA）に富んでいた。これらの結果は、GPIアンカータンパク質に富むがカベオリンを欠く特徴ある界面活性剤耐性原形質膜が、カベオラから別々に単離されたことを示した。GPIアンカータンパク質に富むがカベオリンを欠く大きな小胞からなる同様の界面活性剤耐性膜を、いずれもカベオラを欠きカベオリンを発現しないリンパ球および神経芽腫細胞からも単離した（Fra, A.M.ら, J. Biol. Chem. 269: 30745（1994）；Gorodinsky, A. およびHarris, D.A., J. Cell Biol. 129: 619（1995））。
【００７２】
Triton X-100を用いずに単離されたカベオラの免疫ブロット分析も行った。如何なる界面活性剤に曝露することなくカベオラを精製した。前述のように、Triton X-100に曝露することなくカベオラを単離することができるが、効率は低い。Triton X-100を省くと共に、せん断の目的で、ホモジネート化ストロークの数を12から48〜60回に増やす以外は、カベオラ単離のために通常のプロトコールに従った。これらのカベオラ（V'）およびそれらを剥がした膜（P'-V'）を、前述のような免疫ブロット分析に付した。結果は、界面活性剤を用いずに精製されたカベオラから得られたものに一致し、カベオリンおよびGM1はV'に富んでいたが、GPIアンカータンパク質は、ほとんど完全に、界面活性剤を含まない精製カベオラ（V'）から除去された。
【００７３】
光退色後の蛍光回復により膜拡散を試験した他の研究は、固定フラクション中に存在するGPIアンカータンパク質の大きなフラクション（20〜60％）を検出した（Hannan, L.A.ら, J. Cell. Biol. 120: 353（1993）；Brown, D.A.およびRose, J.K., Cell 68: 533〜544（1992）；Zhang, F.ら, J. Cell Biol. 115: 75（1991）；Zhang, F.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5231（1992））。界面活性剤可溶性を試験することにより、界面活性剤耐性マイクロドメイン中のGPI結合タンパク質について同様の割合が検出され、これは、このフラクションが、拡散研究において検出される固定フラクションに相当することを示している。特殊化された糖脂質ドメインは、界面活性剤抽出に耐性であり、GPI結合タンパク質の残りの界面活性剤耐性クラスターに必要である（Schroeder, R.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 12130（1994）；Brown, D.A.およびRose, J.K., Cell 68: 533（1992）；Letarte-Murhead, M.ら, Biochem. J. 143: 51（1974）；Hoessli, D.およびRunger-Brandle, E., Exp. Cell. Res. 166: 239（1985）；Hooper, N.M.およびTurner, A.J., Biochem. J. 250: 865（1988）；Sargiacomo, M.ら, J. Cell. Biol. 122: 789（1993）；Lisanti, M.P.ら, J. Cell. Biol. 123: 595（1993））。原形質膜からのコレステロールの除去は、そのようなクラスターの形成を分解または防止し、GPIアンカータンパク質のランダムな自由分布を保証し得る（Rothberg, K.G.ら, J. Cell Biol. 111: 2931（1990））。予想されるように、コレステロール除去は、GPI結合タンパク質の界面活性剤可溶化への耐性を低下させ（Sargiacomo, M.ら, J. Cell. Biol. 122: 789（1993）；Lisanti, M.P.ら, J. Cell. Biol. 123: 595（1993））、自由に拡散しているGPIアンカータンパク質が、糖脂質ドメイン中の可動性の少ないGPIアンカータンパク質よりも、界面活性剤により、実際、より容易に可溶化されるという概念に一致する。さらに、糖脂質の非存在下に、GPIアンカータンパク質は、冷たいTriton X-100により膜から容易に可溶化され；適切な糖脂質の添加により可溶性は低下する（Schroeder, R.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 12130（1994））。従って、細胞表面においてランダムに分布しているGPIアンカータンパク質は、界面活性剤抽出に感受性であるべきで、実際、本明細書中に示す割合は、分散研究からの割合に一致する。非シリカ被覆ラット肺のホモジネートにおいて、約60％のCAと75％の5’-NTが、Triton X-100により4℃で可溶化される。さらに、シリカ被覆膜上で行われた質量バランスは、約20％の5’-NTおよび40％のCAを、インタクトな界面活性剤耐性膜フラクションTI中で単離し得ることを示した。
【００７４】
従って、GPIアンカータンパク質の実質的であるが可変のフラクションが、単に界面活性剤抽出の結果ではなさそうである、界面活性剤耐性糖脂質マイクロドメインに動的に分けられた細胞表面上に存在し、ならびにこのフラクションの寸法が、細胞型、培地およびリガンドまたは抗体露出に依存し得るようである。
【００７５】
GPIのような脂質アンカーは、タンパク質が選択的に分割される性能を制御することができるが、特殊化されたマイクロドメイン中では逆であり、従って、標的化機能を補助し得る。GPIアンカーは、界面活性剤耐性膜との結合（Rodgers, W.ら, Mol. Cell. Biol. 14: 5364（1994））、膜拡散（Hannan, L.A.ら, J. Cell. Biol. 120: 353（1993）；Zhang, F.ら, J. Cell. Biol. 115: 75（1991）；Zhang, F.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5231（1992））、細胞表面への分極送達（Brown, D.ら, Science 245: 1499（1989）；Simons, K.およびvan Meer, G., Biochemistry 27: 6197（1988）：Garcia, M.ら, J. Cell Sci. 104: 1281（1993））、細胞活性化（Su, B.ら, J. Cell Biol. 112: 377（1991））ならびに内在化の速度および経路（Keller, E.-A.ら, EMBO J., 3: 863（1992））に直接影響する。NRTKおよび、Rab5のようなグアノシン三リン酸（GTP）結合タンパク質を含む他の脂質結合タンパク質が、界面活性剤耐性複合体中で見出される（Sargiacomo, M.ら, J. Cell. Biol. 122: 789（1993）；Lisanti, M.P.ら, J. Cell. Biol. 123: ：595（1993）；Chang, W.-J.ら, J. Cell. Biol. 126: 127（1994）;Lisanti, M.P.ら, J. Cell. Biol. 126: 111（1994）；Rodgers, W.ら, Mol. Cell. Biol. 14: 5364（1994）；Arreaza, G.ら, J. Biol. Chem. 269: 19123（1994）；Shenoy-Scaria, A.M.ら, J. Cell Biol. 126: 353（1994））。最近の分析により、種々のNRTK（YesおよびLyn，未公表データ）ヘテロ三量体GTP結合タンパク質（αおよびβγサブユニット）（Schnitzer, J.E.ら, J. Biol. Chem. 270: 14399（1995））、ならびに、Rab5では無い、未だ確認されていない低分子のGTP結合タンパク質（Schnitzer, J.E.ら, J. Biol. Chem. 270: 14399（1995））が、精製されたカベオラ中に実際に存在することが明らかになっている。
【００７６】
実施例６  電子顕微鏡のVおよびTI調製
VおよびTIの調製を、電子顕微鏡下で観察して、カベオラが、低密度Triton不溶性膜と同等であるか決めた。Schnitzer, J.E.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1759-1763（1995）に記載のように、膜単離物に対して電子顕微鏡観察を行った。この教示を、本明細書中に参考のために援用する。
【００７７】
シリカ被覆ラット肺内皮膜から精製された小胞（V）の電子顕微鏡観察により、V単離物が、典型的なカベオラ形態を有する小さな小胞（100nm以下）のホモジネート集団を示すことが示された。単離手順に拘わらず、多くのカベオラが、その特徴的フラスコ形状を維持した。
【００７８】
シリカ被覆せずに単離された界面活性剤耐性膜（TI）は、より小さなカベオラ小胞（100nm未満）およびいくつかの非小胞化線状膜シートと共に散在している多くのより大きな小胞（直径が150nmより大きく700nmより小さい）からなっていた。典型的なカベオラは、しばしば、より大きな小胞の内側に付着しているようである。多くの好ましい断面において、より大きな球状小胞に付着している特徴的フラスコ状カベオラが明らかであり、これは、これらの2つの界面活性剤耐性膜ドメインが、ユニットとして互いに結合してから、膜中で分かれることを示していた。
【００７９】
実施例７  コロイド状金免疫標識
界面活性剤耐性膜単離物（TI）を、CAまたはGM1の金標識のためにアガロース中に埋め込んだ。脂質結合分子の、コレラトキシン結合性ガングリオシドGM1を、カベオラ中で金標識と共に局在化させ（Parton, R.G., J. Histochem. Cytochem. 42: 155（1994）；Montesano, R.ら, Nature 296: 651（1982））、従って、カベオラ用のマーカーとして用いた。全体としては、非カベオラ小胞からのカベオラ小胞の識別における寸法基準は明らかであった。従って、電子顕微鏡写真において明確に観察される小胞を、2つの群に分けた：直径が80nm未満ものもと、直径が150nmを超えるもの。この寸法基準は、非カベオラ小胞からのカベオラの分離において絶対的であると考えることができないのは、例えば、一部のカベオラが互いの結合を維持し、より大きな小胞を形成することができたからである。それにも拘わらず、免疫標識の結果は、カベオラマーカーとしてのGM1の使用を支持し、寸法基準を実体化した。
【００８０】
低倍率においては、TIの免疫金標識は、主により大きな小胞および線状膜の表面にCAを局在したが、より小さなカベオラの上には局在化しなかった。全ての金は、背景標識があっても殆ど無い膜に付着する。より高い倍率においては、像は、金で標識した大きな小胞に明らかに付着した、またはカベオラの首部に付着した標識膜ストランドに結合した非標識カベオラを明らかにした。非免疫血清を用いる対照実験は、膜の標識を殆ど示さず、試験した視野当たりに時折金粒子が検出されるだけであり、アガロース単独の背景標識に相当するようである。対照的に、より高い倍率の顕微鏡写真は、GM1についての免疫金標識が、カベオラの内側でしばしば検出され、カベオラが結合したより大きな小胞または残存膜の標識は殆ど無いことを明らかにした。この結果は、生化学的データおよび、細胞上で行われるGM1の金局在化と一致した（Parton, R.G., J. Histochem. Cytochem. 42: 155（1994）；Montesano, R.ら, Nature 296: 651（1982））。結合体に加えて10倍モル過剰のモノマーコレラトキシンを用いて行った対照実験は、金について殆ど完全な非存在を示した。
【００８１】
培養細胞中のGPIアンカータンパク質の免疫局在化を試験した幾つかの以前の研究は、これらのタンパク質がカベオラ中に存在すると結論したが（Rothberg, K.G.ら, J. Cell. Biol. 110: 637（1990）；Ying, Y.ら, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 57: 593（1992）；Ryan, U.S.ら, J. Appl. Physiol. 53: 914（1982）；Stahl, A.およびMueller, B.M., J. Cell Biol. 129: 335（1995））、公表された電子顕微鏡写真を再検査すると、カベオラのすぐ内側には殆ど金標識が無いことが分かる。この標識のほとんど全てが、カベオラの首部に直接付着しているがその一部ではない平坦な原形質膜上のカベオラに実際に隣接している。カベオラの内側で明らかな標識の量が少ないこと、および観察されるクラスター形成の程度は、抗体の架橋により人工的に誘発されることができる（Mayor, S.ら, Science 264: ：1948（1994））。本明細書中に提供されたデータは、GPIアンカータンパク質がカベオラ中には存在しないが、カベオラに隣接する膜に付着していることを確認している。
【００８２】
これは、GPIアンカータンパク質が、決してカベオラに入ることができないことを示しているのではない。抗体架橋アルカリホスファターゼは、エンドサイトーシスしてエンドソームおよびリソソームに対して、クラスター形成し、ゆっくりとカベオラに入り（Parton, R.G.ら, J. Cell Biol. 127: 1199（1994））、このことは、結合、クラスター形成、内在化および分解がアルブミンの場合よりもかなり迅速であるプロセスを除いて、カベオラによる修飾アルブミンの内在化の研究に一致している（Oh, P.ら, J. Cell Biol. 127: 1217（1994）；Schnitzer, J.E.ら, J. Biol. Chem. 264: 24544（1992）；Schnitzer, J.E.およびBravo, J., J. Biol. Chem. 268: 7562（1993））。少なくともGPI結合タンパク質についての細胞表面プロセッシングは、おそらく、3つの異なる連続的工程：（i）カベオラの近くのマイクロドメイン中へのGPIアンカータンパク質の移動（多分、リガンドによる）を誘発して、それにより、あらかじめ遊離分子の直接隔離またはおそらくは幾つかの小さなクラスターを集めることにより、GPI結合タンパク質の局所的濃度を増加させる工程；（ii）カベオラ中への結果としての移動工程；および（iii）光サイトーシスまたはエンドサイトーシスのための、膜からのカベオラの分裂または出芽工程を含むようである。
【００８３】
実施例８  インサイチュでの内皮の原形質膜およびカベオラに対して生成されたモノクローナル抗体
管腔内皮細胞表面は、血管緊張、毛細血管透過性、炎症および凝固を含む多くの機能の媒介を補助することにより心臓血管ホメオスタシスを維持するために循環血液と直接相互作用する臨界界面である。この表面は、静脈中に注射された薬物に直接接触することができ、選択的薬物および遺伝子送達のための有用な器官特異的内皮標的を含むことができる。さらに、多くの内皮の表面で豊富に見られるカベオラは、血液分子およびおそらくは血管標的化薬物を内皮中におよび内皮を横切るように輸送するための小胞経路を提供する。
【００８４】
特異的モノクローナル抗体（mAb）を生成させるために、管腔内皮細胞原形質膜が、インサイチュ被覆手順（Science 269: 1435〜1439（1995））によりラット肺組織から直接、そのカベオラと共に精製された。モノクローナル抗体は、免疫原として100μgのPを用いて、標準的技術により生成させた。96ウェルトレー上に吸着されたシリカ被覆管腔内皮細胞原形質膜をELISAにより認識する100個を超えるハイブリドーマを生成させた。20個の安定なクローンが確立され、そのmAbを、ウエスタンブロットおよび組織免疫細胞学により分析した。
【００８５】
さらなる研究から、2つの抗体を排除した。ELISAによりシリカ被覆原形質膜中でおよび免疫顕微鏡検査により組織切片中で抗原を認識したので、おそらくはタンパク質変性の結果として、ウエスタンブロット中にこれら2つが成功しなかったからである。
【００８６】
3つの抗体（167、278、461）は、それらのシグナルが（P）および（P−V）においてしか見られなかったので、カベオラ中で分子を認識しなかった。7つのmAb（833, 472, 154, 228, 302, 309および別のmAb）は、（V）で豊富であるが（P−V）で殆ど完全に存在しないことに基づき、精製されたカベオラ（V）中で主に見られる抗原を認識した。2つの抗体（833および472）は、免疫ブロットおよび組織免疫染色の両方により評価されるように、肺組織中の微小血管内皮の表面と反応した。抗体833および472は、それぞれ約85および90kDaのP中のタンパク質について単一特異的のようであった。デンシトメトリーにより、両方の抗原が、出発肺ホモジネート（H）に比べてPにおいて非常に豊富であり（833について78倍、472について23倍）、カベオラが剥れたシリカ被覆膜（P-V）に比べて精製カベオラ（V）においても豊富である（833について60倍、472について7倍）ことが明らかになった。さらに、833および472のシグナルの、細胞表面上における、市販の抗体により認識されるカベオリンのものとの著しい共局在化が見られた。
【００８７】
他の抗体の全てが、出発肺ホモジネート（H）と比べて、シリカ被覆内皮細胞原形質膜（P）において豊富な、特定のタンパク質を認識した。多くの場合、出発肺ホモジネート中に抗原を検出するのは困難であるが、Pにおいて抗原は容易に明らかとなり、精製により提供される有意な濃縮を反映している。
【００８８】
提示した組織から可溶化したタンパク質20μgを用いて、前述のように、全組織溶解物に対してウエスタン分析を行った（Schnitzer, J.E.ら, Science 269: 1435-1439（1995）；Schnitzer, J.E.ら, J. Biol. Chem. 270: 14399-14404（1995）；Schnitzer, J.E.およびOh, P., J. Biol. Chem. 269: 6071-6082（1994））。一部の抗原、特に、内皮において排他的に発現される抗原は、全組織溶解物のウエスタン分析により検出することができないようであるので、種々のラット組織を免疫組織化学および顕微鏡検査によってもスクリーニングした。免疫染色を行うため、ラットの器官を、血液を洗い流し、次に、PBS中の冷たい4％パラホルムアルデヒドの灌流により固定した。気管支をOCT化合物（Miles；Elkhart，IN）で満たすことにより、肺実質を拡張させた。小さな組織試料を、パラホルムアルデヒド中で2〜3時間固定し、冷たい30％ショ糖で一晩浸潤し、次に、OCT中−70℃で凍結させた。凍結した5μmの切片を切断し、ポリ−l−リシン被覆ガラススライドの上に乗せた。室温において、その切片を30分間乾燥し、PBS中で10分間洗い、メタノール中の0．6％過酸化水素で10分間処理し、再び洗浄し、5％ヒツジ血清で30分間ブロッキングし、次に、1μg／mlの精製Iggと共に1時間インキュベートした。洗浄後、組織切片を、ブロッカー中、10μg／mlのビオチン標識ヒツジ抗マウスIgG（The Binding Site；Biurmingham, U＜）と共に30分間インキュベートし、洗浄し、ブロッカー中、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Biogenex；San Roman, CA）に結合した1μg／mlのストレプトアビジンと共に20分間インキュベートした。洗浄後、組織を、酵素基質3-アミノ-9-−エチルカルバゾール（Zymed, South San Francisco, CA）と共に3〜5分間インキュベートしてから、蒸留水で基質を濯ぎ流した。組織を、ヘマトキシリンで対比染色し、濯ぎ、乾燥し、マウンティングゲル（Biomeda；Foster, CA）を用いてカバースリップで覆った。
【００８９】
試験した最初の組織（肺、心臓、脳、肝臓、腎臓、副腎、精巣、腸、骨格筋および脾臓）に基づき、全組織溶解物のウエスタンブロットおよびホルムアルデヒド固定組織切片の免疫組織化学染色の両方が、833および472の両方について良好な肺特異性を示した。これらは、肺組織中のみで内皮と反応し、大血管を染色しなかった。これは、微小血管特異性を示している。特に気管支において明白な肺上皮細胞も、非反応性である。これに対して、他のモノクローナル抗体の多くが、多くの異なる組織中、ならびに大血管および小血管の両方において内皮を染色した。ラット器官のスクリーニングにより、これらのmAbの大部分が全ての内皮を認識するが、連続内皮に特異的なものは少ないことが示された。mAb 167は、ELISAによりスクリーニングされた血清と反応性があるので、これを、さらなる当面の研究から除去した。
【００９０】
さらに多くの器官およびカベオラ特異的抗体（833, 472, 154, 228, 302および309）を、全ての組織内皮を認識し陽性対照として作用するmAb 881と同様に、さらに試験する。2つの肺特異的抗体mAb 833および472を用いて、インビボでの免疫標的化を評価した。mAb 833および472 IgGを精製し、Iodogenで放射性ヨウ素標識し、脱塩して遊離125Iを除去した。10mg／mlのラット血清アルブミン（Sigma；St．Louis，MO）中に希釈した標識IgG 10μgを含む500μlを、雄Sprague-Dawleyラット（150〜200g）の尾静脈に注射して、インビボでの免疫標的化を評価した。内皮細胞表面において露出していない抗原であるビンクリンを認識する陰性対照抗体も用いた。30分後、ラットに、300Uケタミンおよび10mgキシラジンを用いて末端に麻酔してから、開胸し、心臓穿刺により血液を除去（1ml）した。提示の組織を取り出して秤量してから、γ放射能を計数した。組織1g当たりの抗体の量を、各抗体の特異的活性を用いて計算した。研究した第1の組のラットにおいて、組織の血液の体積を測定してから差し引くことにより実際の組織取り込み量を測定するために、51Cr標識赤血球も注射した（Bernareggi, A.およびRowland, M., J. Pharmacokin. Biopharm. 19: 21-50（1991））。低血中濃度故に、この補正は、組織中に検出されるmAb 833および472と比べて無視できた。従って、実施を中断した。
【００９１】
丁度30分で、各抗体について、かなり異なる生体内分布が現れた。各異なる抗体を、3匹の異なるラットに注射すると、殆ど同じ結果が得られた。非標的化陰性対照抗体は、反応性が低く、血中の非常に多い数により示されるように主に血管内に留まる。予想されるように、肝臓は、この抗体を最も著しく取り込んだ。逆に、472と833の両方が非常に低い血球数（833について、対照の10倍よりもさらに低い）および肺における非常に著しい組織取り込み（833について、対照の50倍より多い）を示した。両者が、肝臓中の別の標的を認識しない全ての抗体について予想されるように、対照抗体に匹敵する、同様に低い肝臓中の取り込みのレベルを示した。最も重要なことに、mAb 833が、肺において最も迅速かつ著しく、特異的に蓄積するようであり、他の器官において殆ど検出されなかった。質量バランス分析は、注入量（各10μg）の平均で75±6.4％（833；67から87％の範囲）および16±1.1％（472）が、丁度30分で肺組織に標的化されることを示した。両方の結果が、肺組織において見られる非標的化抗体の1.4％と明確な対照をなす。これらの標的化抗体の両方が、注入量の0．2〜4％の最大組織取り込み量を達成するために1週間までを必要とする種々の標的化モノクローナル抗体を用いる過去レポート（part reports）を著しく超えた（Tomlinson, E., Advanced Drug Delivery Reviews 1: 87-198（1987）；Ranney, D.F., Biochem. Pharmacol. 35: 1063-1069（1986）；Holton, O.D.ら, J. Immunol. 139: 3041-3049（1987）；ならびにPimm, M.V.およびBaldwin, R.W., Eur. J. Clin. Oncol. 20: 515-524（1984））。注入後24時間でも、mAb 833の注入量の46％が、なお肺組織中に残り、これは、カベオラによる内皮中へのまたは内皮を横切る予想される輸送に一致していた（Schnitzer, J.E., Trends in Cardiovasc. Med. 3: 124-130（1993）；Schnitzer, J.E.およびOh, P., J. Biol. Chem. 269: 6072-6082（1994）；Schnitzer, J.E.ら, J. Cell. Biol. 127 1217-1232（1994））。
【００９２】
結果を展望するために、薬物の局在化および標的化を評価するための承認された薬学的基準は、治療指数が対数単位の半分または約3倍増加すべきということである。すなわち、真の標的化法は、非標的器官中の通常レベルを肺増加の1／3未満増加させるべきである（Ranney, D.F., Biochem. Pharmacol. 35: 1063-1069（1986））。mAb 833については、非肺器官中への取り込みが最小限に変化する、または対照IgGから低下さえする一方、肺の取り込みは50倍増加する。組織標的化指数（TTI）（組織中の抗体／組織のg／血中の抗体／gまたは血液（g or blood））および組織選択性指数（TSI）（組織中のIgGを標的化するためのTTI／同じ組織中の対照IgGを標的化しないためのTTI）の計算によるより厳格な評価により、833による優れた標的化、および平均TTIが56で平均TSIが150である肺についての優れた選択性が明らかになった。mAb 472は、肺（34）について優れたTTIを示すが、幾つかの他の組織も標的化した（脾臓、TTI＝8.2，腎臓、TTI＝4.1、および副腎、TTI＝4.6）。これに対して、対照IgGは有意な標的化を欠き、試験した全ての器官についてTTIは1未満であり、肝臓についての最大値は0.36であった。最後に、833について観察される迅速な選択的組織標的化は、静脈内注射を必要とせず、動脈から注射したときに容易に検出することができ、それにより、全身性の
循環の通過が、まず、肺に達する前に起こった。開胸ラットの右または左心室へのmAb 833の直接の注入の比較は、循環において僅か15分後でも、両方の注射についてのTTIが既に10を超え（左心室について11、右心室について16）、肝臓を含む試験した全ての他の組織については1を超えることを示した。このレベルの組織特異性、標的化および取り込みの速さは、前例がない。
【００９３】
インビボでの発見を考慮して、472の取り込みを示す非肺組織を含むように、さらなる組織免疫染色研究を行った。弱いシグナルが、ホルムアルデヒド固定脾臓において検出されたが、他の組織においては検出されなかった。検体をアセトンでより穏やかに固定した場合、mAb 472が、肺、腎臓、副腎および脾臓における微小血管を染色するが、心臓、肝臓、腸、脳、筋肉および精巣における微小血管は染色しないことが明らかであった。この組織分布は、前述のインビボでの発見を支持する。ここでも、mAb 833は、肺においてのみ微小血管内皮を染色した。
【００９４】
これらの器官特異的抗体は、接触可能な器官特異的標的が、インビボの内皮細胞表面上に存在し、正常および疾患組織中の標的を含む、特定器官または組織に作用物質を局在化または標的化する手段を提供することを示している。
【００９５】
実施例９  組織特異的トランスサイトーシスのための内皮および動的カベオラの標的化
方法
抗体産生
モノクローナル抗体を、免疫原としてシリカ被覆管腔内皮細胞原形質膜（P）100μgを用いて標準的体細胞ハイブリダイゼーションにより生成させ、96ウェルトレー上に吸着されたPを用いたELISAによりスクリーニングした。
【００９６】
インビボ生体内分布研究
IgGを、Gタンパク質クロマトグラフィー（Pierce，Rockford，IL）により精製し、Iodogen（25）を用いて125Iで放射標識した。ラット尾静脈に、ラット血清アルブミン（10mg／ml）500μl中の125I−IgG 10μgを注射した。30分後、ラットを開胸、心臓穿刺による血液サンプリング、および器官除去のために麻酔した。γ放射能を計数する前に組織を秤量して、抗体／組織1gを測定した。最初の研究において、51Cr標識赤血球を注射して、組織血液体積を差し引くことにより、実際の組織取り込み量を測定した。TX3.833については、この補正は無視でき、実施を中断した。
【００９７】
抗体−Au共役体
コロイド状金（平均直径6nm）（EM Sciences，Fort Washington, PA）の単分散溶液を、K2CO3でpH9.2に調節してから、精製されたIgGを加え30分間迅速に攪拌した。最後の5分間、0.5mg／mlの濃度までPEG（Mr20,000）を加えた。105,000xgで4℃で1時間遠心分離後、緩いペレットを集め、5mMリン酸塩中に再懸濁してから、50mM Trisに対して透析し、その間に、NaClをゆっくりと濃度が150mMになるまで添加した。調製の48時間以内に結合体を用いた。
【００９８】
インサイチュおよびインビボで灌流した抗体−Au複合体の追跡
インサイチュ実験のために、ラット肺の頭側葉を、10mmHgでPBS＋（3％BSAおよび14mMグルコースを含むPBS）により37℃で灌流し、続いて6mlのTX3．833-Auまたは、PBS＋中の対照マウスIgG1-Au（OD540＝18）で灌流した。肺動脈灌流を、肺の全ての他の葉の結紮排除により頭側葉に限定した。2、5、10または15分後、該葉を37℃で6mlのPBS＋で洗ってから、0．1Mカコジル酸ナトリウム（KII）中の2％パラホルムアルデヒドおよび2．5％グルタルアルデヒドで灌流固定した。除去された葉を、（Oh, P.,ら, J. Cell Biol. 141: 101-114（1998））に記載のようにEpon包埋および電子顕微鏡検査（EM）のために処理した。インビボでのTX3.833-Auを追跡するために、TX3.833-Au（15nm）共役体（500μg Ab）を、ラット尾静脈に直接注射した。15分後、ラットに筋肉内麻酔を投与し、前述のように、肺を、PBS＋および続いてKIIで洗い、EMのために処理した（Oh, P., ら, 前記）。
【００９９】
形態測定
ランダムに選択した視野を試験し、49,500xの最終的倍率で記録した。（Milici, A.J.ら, J. Cell Biol. 105: 2603-2612（1987）；Oh, P.,ら, J. Cell Biol. 141: 101-114（1998））に記載のように、画像解析機（Analytical Imaging Concepts, Roswell, GA）を用いて、カベオラ／線状原形質膜の単位面積（4μm）および間隙／各区画の単位表面積（μm2）における金粒子の数を決めた。その首部により管腔または反管腔側原形質膜に明らかに付着していた150個を超えるはっきりした外見上単一のカベオラ（切片内で他の結合性カベオラまたはその一部が見られない）において見られる金粒子の数を定量した。切断による多様性を最小限にするために、その直径が50nmを超えるカベオラのみを用いた。
【０１００】
免疫結合
Iodogen（Fraker, P.J.およびSpeck, J.C., Biochem. Biophys. Res. Comm．80: 849-857（1978））を用いて、抗体への125Iの結合を行った。脱グリコシル化リシンA鎖（dgRA）（Sigma, St. Louis, MO）を放射性ヨウ素標識し（Fraker, P.J.およびSpeck, J.C., 前記）、5mMジチオトレイトールで還元し、リン酸EDTA緩衝液（pH7.5）中でSephadex G25（Pharmacia；Piscataway, NJ）カラムを通して濾過した。N-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオ）-プロピオネート（SPDP）およびスルホスクシンイミジル4-（N−マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）（Pierce, Rockford, IL）を用いて、それぞれジスルヒド結合またはチオエーテル結合によりdgRAまたは125I-dgRAを抗体に共役させた（Cumber, A.J.ら, Methods in Enzymology 112: 207-225（1985））。抗体共役体は、Gタンパク質親和性単離したものであった。
【０１０１】
結果
肺カベオラに特異的な新規抗体
組織特異的血管標的を確認し、カベオラがインビボの選択的輸送において機能し得るか検討するために、ラット肺Pおよびそれらの付着したカベオラに対するマウスモノクローナル抗体を生成させた（Schnitzer, J.E.ら, Science 269: 1435-1439（1995）；Oh, P.およびSchnitzer, J.E. Cell Biology中：A Laboratory Handbook, Celis, J.編（Academic Press, Orlando）, Vol.2, pp.34-36（1998））。スクリーニングにより、組織およびカベオラの両方に特異的であると思われるIgG1モノクローナル抗体のTX3.833を確認した。免疫ブロットにより、TX3.833が、肺において発現されているが他の組織において発現されておらず組織ホモジネート（H）と比べて肺Pにおいて豊富である90kDaタンパク質を特異的に認識することが分かった。肺Pをさらにサブフラクション化してカベオラ（V）を単離することは、カベオリン−1に似ているが脂質ラフトマーカーの5’ヌクレオチダーゼ（5’NT）に似ていないカベオラにおいてこの抗原が濃縮されることを示した。等しいタンパク質負荷条件下に行ったデンシトメトリーは、Hに対するPおよびPに対するVの両方においてこの抗原が15倍より多く豊富になっていることを明らかにした（Hに対するVにおいて225倍を超える）（N＝3）。カベオリン−1抗体を用いてVから単離されたカベオリン-1被覆カベオラにおいてもTX3．833抗原が検出された（Oh, P.およびSchnitzer, J.E., J. Biol. Chem. 274: 23144-23154（1999））（データを示さず）。
【０１０２】
Pの抗体マッピングは、トランスフェリン受容体、トロンボモジュリン、5’NTおよびカベオリン−1の発現が異なる、器官間の内皮のかなりの分子多様性を明らかにする。TX3.833抗原は、肺からのPにおいてのみ検出され、他の器官においては検出されない。Rat組織免疫染色により、肺胞微小血管におけるTX3.833の反応性を確認したが、気管支上皮、大きな肺血管、または心臓、肝臓、脳、腎臓、腸、骨格筋、精巣、肺、脾臓、皮膚および副腎の任意の血管においては反応性がなかった（データは示さず）。より重要なことに、超薄凍結肺組織切片で行われた免疫金EMは、TX3.833が、微小血管内皮中のカベオラの球部および首部と主に結合し、クラスリン被覆ピットまたは上皮細胞（それらのカベオラを含む）とは結合しないことを示した。大血管内皮および、心臓組織または非特異的マウスIgG1を用いる対照は、陰性であった（データは示さず）。従って、TX3.833は、肺の微小血管内皮のカベオラにおいて選択的に発現されるが他の組織では発現されない90kDa抗原を特異的に認識する。
【０１０３】
インビボでの組織標的化
インビボでの可能な組織特異的免疫標的化を評価するために、精製された放射性ヨウ素標識TX3.833または対照IgG1を、ラット尾静脈に注射した。各抗体について異なる生体内分布は、注射後30分でかなり明確であった。TX3.833は、迅速かつ実質的な肺取り込みを示し、他の器官では殆ど検出されず（値≦対照IgGに対して）、血中濃度が非常に低かった（10倍＜対照）。TX3.833の注射量の89％まで、平均75±6.4％を、丁度30分で肺に標的化した。過去レポート（Holton, O.D.ら, J. Immunol. 139: 3041-3049（1987））におけるように、対照IgGが低い組織取り込み率で血液中に残り、明らかにFｃ受容体によるIgG隔離故に肝臓で最も多かった。対照IgGでなく非標識TX3.833が、肺蓄積を89％阻害し、血中濃度を15倍よりも高く増加させたので、TX3.833の肺親和性は特異的であった。スクリーニングで生成した他の抗体は、幾つかの組織において内皮細胞表面抗原を認識し、インビボで複数の組織において蓄積した（データは示さず）。TX3.833の取り込みは、注射量の0.2〜4％の最大組織取り込みを達成するのに1週間まで必要とすることがある種々の標的化プローブ（ペプチドおよびモノクローナル抗体）を記載している過去レポートを有意に超えている（Tomlinson, E., Advanced Drug Delivery Reviews 1: 87-198（1987）；Weinstein, J.N.およびvan Osdol, W., Int. J. Immunopharmacol. 14: 457-463（1992）；Holton, O.D.ら, J. Immunol. 139: 3041-3049（1987）；Pimm, M.V.およびBaldwin, R.W., Eur. J. Clin. Oncol. 20: 515-524（1984）；Arap, W.ら, Science 279: 377-380（1998）；Hughes, B.J.ら, Cancer Res. 49: 6214-6220（1989）；Pasqualini, R.およびRuoslahti, E., Nature 380: 364-366（1996）；Chistofidou-Solomidou, M.ら, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 278: L794-805（2000））。注射後24時間でも、TX3.833の46％がなお肺に残っていた。
【０１０４】
組織標的化指数（TTI＝組織中の抗体／組織のg／血液中の抗体／血液のg）および組織選択性指数（TSI＝標的化IgGについてのTTI／対照IgGについてのTTI）の計算により、平均TTIが56でありTSIが150であるTX3.833の肺標的化が確認された。対照IgGは、試験した全ての器官についてTTI＜1で標的化を欠いた（肝臓中での最大が0.36）。最後に、15分後でも右心室対左心室へのTX3.833注入により、両注入について肺についてTTI＞10であり他の組織についてTTI＜1となった。従って、TX3.833肺親和性は、肺循環の初回通過ではなく、肺微小血管内皮に限定される抗原発現に依存する。
【０１０５】
インサイチュでの抗体標的化肺カベオラのトランスサイトーシス
カベオラの、可能なTX3.833の標的化および輸送を評価するために、コロイド状金粒子に結合したTX3.833（TX3.833-Au）を、ラット肺動脈を通して灌流した。EMおよび形態測定分析により、カベオラへの特異的かつ迅速なTX3.833-Au標的化およびその後の標的化された積み荷の経内皮輸送が明らかになった。2〜3分以内に、大部分がその首部（隔壁の上または近く）において、またはカベオラの球部内に浸透して、接触可能な管腔カベオラに結合している内皮細胞表面においてTX3.833-Auが見つかった。反管腔側細胞表面に付着した細胞のさらに内側に配されたカベオラ、クラスリン被覆ピットおよび小胞、または内皮下空間に、TX3.833-Auは殆ど検出されないか検出されなかった。5分後、カベオラ系中へのTX3.833-Auの浸透が増加し、より多くのカベオラが、管腔表面、細胞のさらに内側、および反管腔側表面において結合しているものを含む金粒子を含んでいた。場合によっては、内皮下空間に開いている（まだ出ていない）反管腔側カベオラの内側において金粒子が見られた。10分までに、反管腔側カベオラから内皮下空間に内皮を出る多くの金粒子が検出された。血管周囲空間中の金の量は増加していたが、大部分が基底／反管腔側内皮細胞原形質膜（内皮下空間）に近接して残っていた。金粒子は、ブドウ状カベオラ構造においても観察された。エンドソーム等の細胞内小器官へのカベオラを介したエンドサイトーシスの証拠は殆ど無かった。内皮細胞間結合部に近い管腔領域で蓄積するTX3．833−Auが見られる場合があるが、結合部の出口における間隙において金は殆どまたは全く見られず、これは、この経路を通過する輸送の欠如、および金粒子の予想されるサイズ排除に一致する。15分後、TX3.833-Auがなお輸送されており、多くの管腔、反管腔側および内在化しているらしいカベオラ中に存在した。金粒子が、組織の間隙中に蓄積を続けた。
【０１０６】
幾つかの偶然の場合、カベオラの首または口部からの金粒子の放出が捕らえられた。金粒子が、カベオラの開口に直に隣接している領域においてクラスターとして見られ、まとまって出ていき、下側空間内に自由に分散を開始しているらしい。例えば、クラスターは原形質膜上で見られ、時には、カベオラ隔壁でまたはその近くで見られた。時には、それ以外は空の反管腔側カベオラの首部のすぐ内側でも1または2個の金粒子が見つかった。近接して他の金粒子は見られなかった。形態測定分析は、反管腔側カベオラを出るのと同様の数の金粒子が管腔カベオラに入ったことを示した。2.5分で、原形質膜に明らかに付着している標識管腔カベオラは、平均で6.4±0.5個の粒子／カベオラを有しており、全管腔カベオラの25％未満が、非標識または場合によっては1もしくは2個の金粒子を示した。10分までに、標識された管腔および反管腔側カベオラの内側の金粒子の平均数は、それぞれ、6.3±0.3および7.1±0.6個であったが、ここでも、カベオラの一部（25％未満）は標識が殆どまたは全く無かった。最後に、反管腔側カベオラの首部を出る金粒子の平均数は6.7±0.8個であった。6〜7個の金粒子／カベオラのこの量的取り込み、輸送および放出は、カベオラによる標的化分子積み荷の別個のトランスサイトーシスに一致する。
【０１０７】
TX3.833-Auと、異なる結合特異性を有する物理的に同一のプローブ（すなわち、全ての150kDa IgG1が同様にして同じ寸法の金粒子に結合）とを比較することにより、TX3．833が金をカベオラに特異的に標的化できることが、肺微小血管内皮を通過するその輸送を媒介することが分かった。対照mIgG-Auは、15分後でも、カベオラ内に蓄積せず、内皮細胞障壁を克服もしなかった。大部分の試験視野は、金粒子を欠き、検出された場合には、原形質膜の平坦領域上に、および一部のカベオラの管腔開口または隔壁の近くに主にクラスターを形成した。細胞表面、細胞の内側、および血管周囲空間には金粒子が殆ど見られず、これは、内皮細胞障壁により空間からプローブが予想通りに排除されていること、およびプローブがカベオラを標的化できないことに一致している。形態測定分析は、カベオラへの侵入および間隙での蓄積の両方が、mIgG-Auよりも、TX3.833-Auについて有意に多いことを示した。さらなる対照として、脂質ラフトにおいて濃縮されているがカベオラにおいて濃縮されていないGPIアンカー内皮細胞表面マーカー（Schnitzer, J.E.ら, Science 269: 1435-1439（1995））である5’NT（5’NT-IgG−Au）に対する金結合抗体を試験した。5’NT-IgG-Auは、カベオラ隔壁におけるまたはその近くの場合がある原形質膜上で、主にクラスターとして肺内皮細胞表面に結合した。5’NT-IgG-Auは、15分後でも内皮を横切って間隙中に蓄積することはなかった。同等の条件下に脂質ラフトを標的化すると、迅速なトランスサイトーシスが得られない。従って、間隙に輸送されたTX3.833-Auは、カベオラを標的化することに依存する。
【０１０８】
連続的トランスサイトーシス
TX3.833-Auを用いて15分後に、薄くなった内皮が肺胞上皮に近接して並置されている場合、基底膜を通して濾過された内皮下空間に蓄積された金粒子の一部が、上皮カベオラに取り込まれ、細胞内におよび細胞を横切るように輸送されることも発見された。金粒子は、時には、エンドソーム様構造であり、カベオラ開口を出て空気空間に入る。驚くべきことに免疫金EMにより上皮中にTX3.833抗原は殆ど検出されなかったが、上皮から内皮を分離している間隙空間が充分に小さく、トランスサイトーシスした金粒子がより高度に濃縮される場合、上皮カベオラは、液相機構により金粒子を取り込み、輸送することができた。おそらくより高い可能性で、TX3.833抗原が、上皮カベオラ中でより低いレベルで発現される。すなわち、カベオラによる経細胞輸送は、内皮中のみならず上皮中でも起こり、この連続的トランスサイトーシスを用いて、迅速に両方の細胞障壁を克服することができる。
【０１０９】
TX3.833が動的カベオラを標的化する
一部のカベオラは静的である（Severs, N.J., J. Cell Sci 90: 341-8（1988）；Rippe, b.およびHaraldsson, B., Acta Physiol. Scand 131: 411-428（1987）；Bundgaard, M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 6439-6441（1979）；Bundgaard, M., Federation Proc. 42: 2425-2430（1983））。TX3.833が、出芽することができる動的カベオラを標的化するかどうか調べるために、再構成された出芽アッセイ（Oh, P.ら, J. Cell Biol. 141: 101-114（1998）；Schnitzer, J.E.ら, Science 274: 239-242（1996））を、TX3.833を灌流した肺からのPについて行った。GTPは、注入したTX3.833並びにカベオリン−1およびTX3.833抗原を含むがβ-アクチンは含まない遊離浮遊小胞として集められたカベオラの原形質膜出芽を誘発した。この出芽は、活性ダイナミンを有するGTPを必要とし、加水分解不可能なGTPγSおよびK44A変異ダイナミン（Oh, P.ら, 前記）により阻害された。従って、TX3.833は、実際、原形質膜から分裂して遊離輸送小胞を形成するためにダイナミンによるGTP加水分解を必要とする動的カベオラを標的化することができる。
【０１１０】
インビボでのカベオラ標的化およびトランスサイトーシスの追跡
循環血液中のタンパク質およびおそらく他の要素が、内皮細胞グリコカリックスの制限性を増し、カベオラへの接触を防止することができる（Schneeberger, EE.およびHamelin, M., Am. J. Physiol. 247: H206-H217（1984））。TX3.833が肺カベオラをインビボで標的化する能力を試験するために、TX3.833-Auをラット尾静脈に注射し、15分後、肺組織をEMのために処理した。TX3.833-Auは、肺内皮カベオラをかなり選択的に標的化することができた。管腔、反管腔側および外見上細胞質のカベオラ中で金標識を検出することができた。トランスサイトーシスが観察され、インビボでの正常な生理学的条件下に、反管腔側カベオラを出て下側の内皮下空間に入る金粒子が見られた。インビボでのカベオラ標的化およびトランスサイトーシスのこの視覚化は、本明細書中に記載の薬物の抗体特異的標的化、および125I-TX3.833（注射後10分）が100倍＞125I−対照IgG（データは示さず）の水準でVにおいて豊富になることを示す肺サブフラクション分析に一致した。
【０１１１】
TX3.833-薬物結合体の肺特異的送達および生物学的効果
インビボで肺カベオラを標的化する抗体は、組織特異的薬物送達を達成するためのキャリアとして有用であり得た。標的化ベクターとしてTX3.833を試験するために、これを、種々の薬物に結合し、天然薬物に対する免疫共役体のインビボ送達を試験した。全てのTX3.833-薬物結合体は、薬物単独よりも172倍まで大きい非常に増加した肺標的化を示した（補足表１）。
【０１１２】
【表２】
2007511463.tif 000003
【０１１３】
各値は、平均（N≧2）を表す。IV注射の30分後、肺取り込みを、天然または結合放射性標識薬物について組織1g当たりの最初の注射量の百分率（注射％／g）として測定した。薬物送達の増大を、天然薬物に対する抗体−薬物結合体として示す。「肺中％」は、肺の中の全薬物を最初の投与量の％として表す。3H−ダウノマイシン（”Daun；”DuPont NEN, Boston, MA）のTX3.833への結合を、（Hurwitz, E.ら（1975）Cancer Res. 35, 1175-1181）に記載のように行った。他の結合体が方法に記載されている。タンパク質を最小限に修飾する結合手順（Cumber, A.J.ら, Methods in Enzymology 112: 207-225（1998））、すなわち、放射性ヨウ素への結合により、標的化の程度が最も大きくなる（172倍＞ヨウ素単独）。他の結合体（抗体−抗原結合を許容する手順（Oh, P.およびSchnitzer, J.E., Cell Biology中：A Laboratory Handbook， Celis, J.編（Academic Press, Orlando）, Vol.2, pp.34-36（1998））は、27〜50倍大きな肺送達を提供した。生体内分布分析は、TX3.833抗体が、実際に、種々の薬物を肺に特異的に標的化することを示した。
【０１１４】
標的化薬物の生物学的効果を、少量で高度に毒性であるが、細胞質中へのA鎖放出のための細胞による内在化およびその後の細胞死を必要とするdgRAイムノトキシンを用いて試験した（McIntosh, D.P.ら, FEBS Lett. 164: 17-20（1983））。静脈内注射後、24時間後のような6時間以上後に、TX3.833-dgRA処理ラットは、急性呼吸窮迫および全身倦怠感（非常に迅速で浅い呼吸；呼吸時に安静および集中を維持）を示した。組織学的組織試験は、浮腫を伴う肺組織破壊、血液浸潤、および中隔の肥厚を示したが、他へは検出可能な損傷は示さなかった。EMは、内皮結合一体性の喪失、内皮細胞と上皮細胞との両方の著しい膜小胞化、および肺胞空間における界面活性剤の存在も示した。対照で24時間処理したラット（同等水準の対照IgG-dgRA、非結合TX3.833、天然dgRA単独、または結合していないがdgRAを伴うTX3．833）は、臨床的および組織学的に正常であると思われた。肺内皮および上皮細胞への損傷は、TX3.833-Auの内皮トランスサイトーシス、および下側の組織細胞による取り込みに一致している。従って、蓄積データは、薬物を内皮カベオラに導くことが、組織特異的標的化、組織の内側の細胞への接触のためのトランスサイトーシス、およびインビボでの局在化した生物学的効果を提供し得ることを示している。
【０１１５】
考察
意図する標的組織細胞に到達するための多くの指向的療法の失敗から、この20年で、血管標的化の概念が発展した（Tomlinson, E., Advanced Drug Delivery Reviews 1: 87-198（1987）；Schnitzer, J.E., N. Engl. J. Med. 339: 472-4(1998)；Schnitzer, J.E., Trends in Cardiovasc. Med. 3: 124-130（1993）；Denekamp, J., Progr. Appli. Microcirc. 4: 28-38（1984）；Burrows, F.J.およびThorpe, P.E., Pharmacol. Ther. 64: 155-174（1994））。内皮を標的化することは、その固有のIV接触能故に、潜在力があるが、今まで、重要なインビボでの「原理の証拠」を必要としている。血管内皮上で組織特異的標的を確認し、血管標的化のために組織特異的プローブを開発するために、多くの試行がなされたが（Hughes, B.J.ら, Cancer Res. 39: 6214-6220（1989）；Pasqualini, R.およびRuoslahti, E., Nature 380: 364-366（1996）、インビボでの指向的送達は、理論的期待を満たさなかった。肺標的化モノクローナル抗体が報告されているが、抗原が、幾つかの器官の内皮を含む多くの細胞により発現されるトロンボモジュリンである（Hughes, B.J.ら，前記）。汎内皮マーカーのPECAMを免疫標的化することは、肺への送達を向上（対照IgGに対して5倍）させ得るが、抗体をビオチン化しストレプトアビジン（36）と複合したときのみである。組織誘導性ペプチドのためのインビボでのファージ提示ライブラリーをスクリーニングすると、穏やかに増加した組織送達が提供され（Arap，W．ら，Science 279: 377-380（1998）；Pasqualini, R.およびRuoslahti, E., Nature 380: 364-366（1996）；Rajotte, D.ら, J. Clin. Invest. 102: 430-7（1998））、注入投与量の1％未満であり、相対的標的化指数は対照ファージの2〜35倍であり、送達は脳への3〜80倍であった（周知の血液脳関門は、予想通り、非特異的結合および取り込みが最低限であることに注目されたい）。この最後の基準を用いると、TX3.833標的化指数は、肺について脳の1000倍よりも大きい。プローブとしてのTX3.833は、特異性および親和性を有すると共に、インビボでの高レベルの組織標的化の理論的予想を達成することにより血管標的化戦略を初めて有効にする組織および細胞選択性を有する。おそらくより重要なことには、これは、下側の組織細胞に接触するために内皮細胞障壁を克服するように、動的カベオラを標的化する。
【０１１６】
輸送経路および機構
蓄積されたインビボおよびインサイチュでのデータは次のことを示す：i）カベオラは組織特異的内皮細胞を含み得ること、ii）抗体は、特定の組織における微小血管内皮のカベオラを選択的かつ迅速に標的化してそのカベオラに入ることができること、およびiii）カベオラを標的化することが、対照抗体に対して経内皮輸送および組織蓄積を著しく増加させること（TTI≧150）。特定のカベオラ抗原を認識する能力においてTX3.833と異なる、物理的に類似しているアイソタイプ適合性対照抗体を用いて、輸送または組織蓄積はほとんど見られない。すなわちそれは、カベオラへの特異的侵入でありカベオラ内での結合であり、内皮細胞表面または脂質ラフトのような別のマイクロドメインに結合せず、TX3.833−Auの迅速かつ選択的経内皮輸送を媒介するカベオラによる液相取り込みもない。細胞障壁を横切るカベオラ標的化免疫プローブの段階的な時間依存性動作は、非特異的輸送経路（すなわち、細胞間結合）および以前に（Bundgaard, M., Federation Proc. 42: 2425-2430（1983））により論理的に提案されているような静的な分岐カベオラ系の反管腔側側面の充填により説明することができない。適当な対照から、今では、カベオラが選択的経内皮輸送を媒介することができるが、このトランスサイトーシスの正確な機構はさらなる解明が必要であることが明らかである。
【０１１７】
部位指向薬物送達への適用
選択的カベオラ標的化戦略は、多くの疾患の治療のための指向的治療送達に有用であり得る。単一組織における内皮の管腔表面においてカベオラを標的化することにより、カベオラが抗体を血液から直接標的組織に輸送することができる場合、抗体が、実際、インビボでの部位指向性送達を提供することができ、丁度30分で組織蓄積が89％にも達することが分かった。この肺特異的蓄積の多くが、カベオラ標的化輸送により肺内皮細胞障壁を横切って下側の組織細胞による取り込みに利用できるようになった抗体である。ここで、このプロセスがEMにより視覚化されて、TX3.833が金粒子を肺カベオラに導いて循環血液から組織中への迅速な経内皮輸送させることが示された。多くの薬物および遺伝子ベクターと同様に、金粒子は、単独または対照抗体に結合されて、内皮細胞障壁を容易に横切ることができない。潜在力のある薬物またはトキシンに結合されると、TX3.833による薬物送達は肺に選択的であり、172倍まで高められる。TX3.833-dgRA結合体は、主に肺胞内皮および上皮細胞の破壊により、肺を選択的に損傷した。従って、カベオラを標的化している抗体は、組織の下側の細胞への送達を通常は制限する内皮細胞障壁を克服することにより組織特異的薬物送達および生物学的効果を提供するためのキャリアとなり得る。
【０１１８】
内皮中のカベオラの基本的輸送機能の研究のために、本明細書中に提供されたデータは、カベオラが、実際、内皮および上皮中の選択された積み荷をトランスサイトーシスすることができることを示す。インビボで肺を標的化する肺、微小血管およびカベオラ特異的モノクローナル抗体が生成された。血管内投与後、TX3．833は、肺微小血管内皮の動的カベオラを迅速に標的化し、細胞を横切って迅速に輸送されて、間隙空間に放出され、そこで、下側上皮細胞のカベオラにより取り込まれて肺胞空間に輸送され得る。このように、カベオラは選択的かつ有用な小胞輸送経路を提供し、選択された内因性分子をエンドサイトーシスまたはトランスサイトーシスかつ選択するのみならず、インビボでの効果的な部位指向性治療的送達に対するかつては克服できないように思えた細胞障壁を克服することができる。さらに、内皮細胞原形質膜およびそれらのカベオラのプロテオミクス的分析により、正常な器官および種々の固体腫瘍において異なって発現される幾つかの組織特異的タンパク質が明らかになる（未公開データ）。従って、内皮および上皮のカベオラを標的化する戦略は、インビボでの種々の疾患の部位指向性の薬物および遺伝子治療を達成するための刺激的可能性を提供する。
【０１１９】
実施例１０  インビボでの肺特異的結像のための肺血管内皮およびそのカベオラの標的化
管腔内皮細胞表面の循環への接触能故に、血管系は、薬物および遺伝子送達のみならず、単一の器官／組織またはさらには小さな組織の組の分子結像のための理論的標的である。トランスサイトーシス小胞（カベオラ）は、血液高分子のエンドサイトーシスおよび／またはトランスサイトーシスのための原形質膜から出芽することができる内皮の表面上の動的構造である。管腔内皮細胞原形質膜およびそれらのカベオラを、種々の器官から直接精製した。これらの内皮膜を用いて、内皮細胞表面のプロテオミクスマップを作り、内皮細胞表面およびそのカベオラにおける分子に対するモノクローナル抗体を生成させた。例えば、SDS−PAGEおよび2Dゲル電気泳動は、内皮細胞表面およびそのカベオラにおけるタンパク質発現における異なる組織間のかなりの不均質さを明らかにした。組織特異的タンパク質を、質量分析法およびデータベース検索により確認した。適当な特定のポリペプチドに対する抗体を用いて、タンパク質の組織特異性を確認した。TX3.833と表されると共に先に詳細に説明したあるかかる抗体は、肺においてのみ微小血管内皮のカベオラにおいてかなり選択的に発現される肺特異的タンパク質を認識する。生体内分布分析およびIV注射したTX3.833の全体SPECT結像は、認識された抗原の、著しい選択的肺組織蓄積への接触能を明らかにする。動的結像は、「コールド（cold）」対照抗体ではなく「コールド」TX3.833抗体の添加と競合することができる尾静脈注射の数分以内の放射性標識TX3.833抗体の、肺領域への迅速な取り込みおよび標的化を示す。別の抗体は、カベオラ中に存在しない肺特異的であるらしい内皮細胞表面タンパク質を標的化し、肺選択的結像も可能にするが、動作は遅いようである。従って、内皮細胞表面においておよび特にそのカベオラ中で異なって発現されているタンパク質を標的化することを、インビボでの指向的分子結像および標的化に用いることができる。
【０１２０】
本発明は好ましい態様を参照して具体的に示し説明したが、当業者は、添付の請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形態および細部を種々に変化させ得ることを理解するであろう。本明細書中に引用された全ての参考文献の教示は、参照によってその全体が援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】高度に精製された原形質膜カベオラの単離の模式図である。
【図２】原形質膜からのGPIアンカータンパク質マイクロドメインの単離の模式図である。
【図３】GPIアンカータンパク質マイクロドメインと結合されたカベオラの単離の模式図である。
【図４】原形質膜サブフラクション中の特定のタンパク質の分布％を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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