(57)【要約】  真核生物ゲノム中へのレトロウイルス様核酸を含むトランスジーンのインテグレーションを標的化する方法において、該ゲノムは、エンドヌクレアーゼによって除去され、該トランスジーンがこの開裂部位で導入される、このエンドヌクレアーゼは、多くのｒＤＮＡ座中のある部位に特異的であり、トランスジーンの導入を媒介するインテグラーゼと融合される。該融合タンパク質は新規である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物ゲノム中へのレトロウイルス様核酸を含むトランスジーンのインテグレーションを標的化する方法であって、
該ゲノムは、核酸を結合する制限酵素によって標的化され、該トランスジーンはその結合部位で導入される、
ここで、該エンドヌクレアーゼは、多くのｒＤＮＡ座におけるある部位に特異的であり、トランスジーンの導入を媒介するインテグラーゼと融合されている、方法。
【請求項２】
ゲノムがヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
インテグラーゼがレンチウイルスインテグラーゼである、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項４】
インテグラーゼがＨＩＶ-１インテグラーゼである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
エンドヌクレアーゼがＩ-ＰpoＩである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求項１で定義したインテグラーゼと融合した請求項１に定義されたエンドヌクレアーゼを含む、融合タンパク質。
【請求項７】
ＨＩＶ-１インテグラーゼおよびＩ-ＰpoＩからのものである、請求項６記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
この発明は、インテグラーゼ融合タンパク質、および組込み遺伝子治療ベクターを用いるその使用に関する。
【０００２】
本発明の従来技術 
組込みベクター（integrating vector）、特に遺伝子治療のために設計されたレトロウイルスを基にしたベクターは、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症(Ｘ-ＳＣＩＤ)に罹患した小児患者を対象としたレトロウイルス遺伝子治療試験に関連する副作用のために、望ましくない評判を得ている。該処置は明らかに有益であったが、処置を受けた子供の１０人の内２名は、オンコジーンに近いレトロウイルスゲノムのインテグレーションの結果として、白血病様疾患を発病した(Marshall, 2003)。これらの副作用は、組込みベクターの安全性について多くの関心をあつめた。
【０００３】
ハイブリッドベクターは、標的とされるトランスジーンのインテグレーションを可能にする。バキュロウイルス-、アデノ関連ウイルス-ベクター(Palombo et al., 1998)は、症例のおおよそ４１％でＡＡＶＳ１部位へ、３-３５％の効率でＡｄ-ＡＡＶハイブリッドへトランスジーンのインテグレーションを標的化した(Recchia et al., 1999)。一過的なＲｅｐ発現による部位特異的インテグレーションを媒介するために設計されたＡＡＶベクターは、４２％の標的化効率を達成した(Satoh et al., 2000)。標的化されるトランスジーンのインテグレーションのための、より効率的で、安全な遺伝子治療ベクターが必要とされている。
【０００４】
レトロウイルスのインテグレーションメカニズムを試験する最も初期のイン・ビトロアッセイでは、感染細胞から直接単離されたプレインテグレーション複合体(ＰＩＣ)を用いた(Brown et al., 1987; Farnet &Haseltine, 1990; Lee & Coffin, 1990)。より最近のアッセイは、様々なレトロウイルスの組換え精製ＤＮＡ分子の末端に似せた短い合成オリゴヌクレオチド基質と組合せて、様々なレトロウイルの組換え精製されたＩＮ(インテグラーゼ)タンパク質を使用される。至適条件において、これらのアッセイから、精製インテグラーゼのみがインテグレーションの重要な過程、即ち３’末端のプロセシングおよび３’末端のジョイニング(鎖移転)反応を触媒できることが示された(Bushman & Craigie, 1991; Craigie et al., 1990;Katz et al., 1990)。
【０００５】
ＩＮの３’末端プロセシング活性は、その精製タンパク質およびＵ５またはＵ３ＬＴＲのいずれかの末端から得られた配列を含む放射標識した二本鎖オリゴヌクレオチド含有配列を必要とする(Chow, 1997; Brown, 1997)。ゲル電気泳動は、通常、基質由来の短い生成物を分離するのに使用される。３’末端ジョイニング(鎖移転)反応は、類似組成物を用いて行われ得るが、この基質は「予めプロセシングされる」こともある、即ち３’修飾過程のあいだに解裂されたジヌクレオチドを欠損していることもある。該ＩＮは、イン・ビトロで該インテグレーションの標的の特定の外観を認識しない、そのため該標的は、基質と同一分子または環状プラスミドＤＮＡいずれかであり得る。ジョイニング反応は、ゲル電気泳動において、挿入ＤＮＡよりも長い産物の出現によってアッセイされ得る。該インテグレーション産物は、所望により、最初にフェノールクロロホルム抽出され、エタノール沈殿され、その後それらはＰＣＲのテンプレートとして機能し得る(Chow, 1997)。様々な大きさの産物を検出し易くできることに加えて、ＰＣＲを使用して、可能なインテグレーションのホットスポットとＨＩＶ-１ＤＮＡ インテグレーションによって作成された特徴的な５bpの重複を明らかにするためにインテグレーション部位の配列決定を促進できる。このジョイニング部位は、wtＨＩＶ-１ ＩＮに対しては主にランダムであり、そのため産物の長さは非常に変化し得る(Chow, 1997; Brown, 1997)。
【０００６】
標的ＤＮＡへの２つのウイルスＤＮＡ末端の協調的インテグレーション(３’末端ジョイニングまたは鎖移転）は、イン・ビトロで達成するには難しい。上記のようなイン・ビトロ アッセイは、しばしば標的ＤＮＡの１つの鎖への１つのＤＮＡ末端のジョイニングを生じる(ハーフサイト・インテグレーション)(Chow, 1997; Brown, 1997)。協調的インテグレーションは、フルサイト・インテグレーションに必要とされる補足酵素を提供する(ＩＮに加えて)単離したＰＩＣを用いて、より正確に研究され得る(下記を参照されたい)。環状プラスミドＤＮＡは、インテグレーションの標的として使用され、このイベントは、組換え産物中の選択マーカーの存在によって、またはサザンブロッティングによってアッセイされ得る。組換えＨＩＶ-１ ＩＮが、イン・ビトロで高効率のフルサイト・インテグレーションを行うために、ウイルスにコード化されたヌクレオキャプシド(ＮＣ)タンパク質(Carteau et al., 1999)または宿主由来ＨＭＧ-Ｉ(Ｙ)(Hindmarsh et al., 1999)を必要とすることが示されてきたように、該アッセイはイン・イボでのレトロウイルスのインテグレーションによく似ている。少なくともウイルスＮＣがイン・ビトロでフルサイト・インテグレーションを必要とすることが共通認識ではあるが(例えば、Brown, 1997; Carteau et al., 1999)、Sinhaら(2002)は、組換えＩＮのみを用いて、イン・ビトロで細胞性またはウイルス性タンパク質のコファクターが存在しない２つのドナー末端のフルサイト・インテグレーションを得ることができることを示唆している。かれらは、組換え野生型ＩＮがフルサイト・インテグレーションを媒介できる重要な要因は、その精製およびインテグレーションアッセイにおける高ＩＮ濃度の回避であることを結論づけた。しかし、彼らがフルサイト・インテグレーション産物を説明した反応末端産物は、標的ＤＮＡあたりに２つのＬＴＲ末端(Ｕ５およびＵ３ＬＴＲ)の協調的挿入を包含し、ＬＴＲが同一基質分子分子または２つの別々の基質分子由来であったかどうかを区別しない。このような協調的インテグレーション産物は、プロウイルスを形成するレトロウイルスゲノムのフルサイト・インテグレーション産物とは比較できない。
【０００７】
ＨＩＶ ビリオン-関連タンパク質 ＶｐｒおよびＶｐｘは、異種融合タンパク質としてトランスでそれらの発現によってウイルス粒子中にタンパク質(ウイルスまたは非ウイルス)を送達するための伝達手段として使用され得る(Wu et al., 1995, 1996 a and b, 1997)。ＨＩＶ-１ Ｖｐｒとのタンパク質の融合は、ＶｐｒおよびＧａｇにおけるp６タンパク質のＣ末端との間の相互作用を介するウイルス産生細胞中で新規に形成されたウイルスを標的とする(Kondo & Gottlinger, 1996; Lu et al., 1995)。即ち、ＩＮを削除したＨＩＶ-１ ビリオンでのインテグラーゼ(ＩＮ)機能の相補性を達成すること(Wu et al., 1995)、および同様のＩＮ-欠損ビリオン中にＩＮ-融合タンパク質(例えば、ＩＮ-ＬｅｘＡ)を導入すること(Holmes-Son & Chow, 2000)が可能となる。また、トランス-パッケージ化インテグラーゼ融合タンパク質は、正しいインテグレーションを媒介し、ＩＮ-欠損ウイルス(Holmes-Son & Chow, 2002)の伝染力を回復させることができる。
【０００８】
３．本発明の要旨
ウイルスのプレインテグレーション複合体または短いオリゴヌクレオチドと共に精製ＩＮ(インテグラーゼタンパク質)を用いるイン・ビトロ系は、インテグレーション反応における重要な問題、ならびに標的細胞におけるレトロウイルス感染を阻害し得る方法を明らかにするのに役立つ。ＨＩＶ-１インテグラーゼを、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に融合して、レトロウイルスインテグレーションを管理する可能性を試験する。イン・ビトロでの融合タンパク質の活性を試験することにより、ＩＮと共に配列特異的タンパク質が、ＩＮと融合したタンパク質により認識される部位でまたは近位部位に基質配列を組込み得ることが示された。
【０００９】
特定の実施態様は、ＨＩＶ-１ ＩＮおよび配列特異的帰巣性エンドヌクレアーゼＩ-ＰpoＩ (Ｈ９８Ａ由来のＯＲ Ｉ-ＰpoＩの変異体）からなる新規融合タンパク質であって、これは遺伝子治療ベクターの安全性および標的化インテグレーションを促進し得るものである。これは、帰巣性エンドヌクレアーゼＩ-ＰpoＩが真核生物の保存された２８Ｓ ｒＤＮＡ反復配列に存在するその帰巣性部位を認識して解裂するため、有用であり得る。ＨＩＶ-１ ＩＮが、レトロウイルス様基質配列のインテグレーションを媒介するために設計される一方、Ｉ-ＰpoＩは、真核生物ゲノムにおける多くのrＤＮＡ座へのインテグレーションを標的とするように設計される。
【００１０】
本発明のより一般的な説明は、真核生物ゲノム中でのレトロウイルス様核酸を含むトランスジーンの標的化インテグレーションのための方法である。この方法では、該ゲノムは核酸を結合する制限酵素によって標的化され、該トランスジーンは結合部位で導入される、ここで該制限酵素は多くのｒＤＮＡ座中の部位に特異的であって、トランスジーンの導入を媒介するインテグラーゼと融合される。
【００１１】
トランスジーンの性質は重大ではない；それは、遺伝子治療のためにレトロウイルスを基にしたベクターを提供し得るどのようなものでもよい。かかるトランスジーンはよく知られている。用語「レトロウイルス様」とは、所望のインテグラーゼと適合し得るあらゆる核酸を意味する。例えば、インテグラーゼは、レトロウイルス科(例えば、マウスレトロウイルス、レンチウイルス、例えばＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ、ＢＩＶ、ＶＭＶ)のファミリー由来のものである。
【００１２】
あらゆる真核生物のゲノムは、基本的には本発明に従って修飾され得るが、特に該方法はヒトに適当である。この意図は、ゲノムにおけるインテグレーション、例えばリボゾーマル部位または別の部位を意図しており、その中には遺伝子産物ではなく、多くの複写物が存在する(即ち、過剰)。ゲノムあたりに標的遺伝子の多数の複写物が存在する場合、インテグレーション方法がより効率的（多数の標的）であり、安全(全てのゲノムリボゾーマル遺伝子複写物が必要という訳ではない)であり、そして重要な遺伝子との干渉の尤度が低下され、こうして挿入突然変異誘発を低下し得るという利点を持つ。該エンドヌクレアーゼ、例えばＩ-ＰpoＩは、これらの複数部位で特異的に解裂する。別の適当な酵素はＣｒｅＩである。
【００１３】
インテグラーゼは、意図される目的に従って選択され得る。通常、それはレンチウイルスインテグラーゼであり、そのうちのＨＩＶ-１ インテグラーゼは一つの例である。
【００１４】
少なくともその特定の態様において、融合タンパク質およびそれをコードしているポリヌクレオチドは、新規である。タンパク質は、ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを用いて適当な宿主を形質転換すること、および該宿主中または宿主からタンパク質を発現することによって産生され得る。好ましい宿主はバキュロウイルスである。
【００１５】
例示的な新規融合タンパク質ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩは、遺伝子治療用途に有用である。新規融合タンパク質は、ヒトのゲノムにおいてベニン（benign）座中へのレトロウイルス様ＤＮＡの標的化インテグレーションを触媒することができる。また、本明細書で報告された試験は、イン・ビトロでＩＮ-Ｉ-ＰpoＩ融合タンパク質活性を試験するために必要とされるＤＮＡ構築体の調製を包含する。帰巣性エンドヌクレアーゼＩ-ＰpoＩは、ヒトの２８Ｓ ｒＤＮＡに存在するその標的部位を認識し、解裂する(Monnat et al., 1999)。ＨｌＶ-ｌ ＩＮとの結合において、それは、ヒトにおけるそのｒＤＮＡ部位中への治療用遺伝子のＩＮ-媒介性のインテグレーションを標的とするように設計される。異種遺伝子発現は、酵母rＤＮＡ中のＩ-ＰpoＩ部位からであると以前に報告されている(Lin & Vogt, 2000);これは、機能タンパク質が真核生物細胞のrＤＮＡから、pol Ｉ 転写物として発現され得ることを示す。
【００１６】
４Ａ．本発明の詳細な説明
本発明は、好ましい実施態様に関して説明される。これは、ＨＩＶ-１ ＩＮおよびＨＥ Ｉ-ＰpoＩまたはＩ-ＰpoＩの突然変異型Ｈ９８Ａからなる新規融合タンパク質のインテグレーション活性および標的化能力を試験するために必要な成分を産生することを包含する。この目的には、
１-ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩおよびＩＮ-Ｈ９８Ａ融合タンパク質、ならびに wtＨＩＶ-１ ＩＮ (コントロール ＩＮ)の発現に必要とされるＤＮＡ構築体を作成すること、
２-ＬＴＲに挟まれたインテグレーション基質を設計および作成すること、
３-Ｉ-ＰpoＩ認識配列を含有するインテグレーション標的プラスミドを生成すること、
４-バクテリア宿主における新規融合タンパク質を産生すること、
が包含される。
【００１７】
いくつかの一般的な態様は次のとおりである：ポリペプチドインテグラーゼ、特にレンチウイルスインテグラーゼおよびＤＮＡ-結合活性、特にヒトrＤＮＡに関する；ポリヌクレオチドおよびそれをコードしているベクター；形質転換した宿主におけるその発現および産生；それを含む投与用組成物；および治療における、特に標的化遺伝子インテグレーションにおけるその使用。
【００１８】
イン・ビトロでのインテグレーションアッセイの可能な最終結果を意識して、本明細書に記載した研究は、融合タンパク質ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩの標的化能力を試験する際の第一歩のための最小限の構成成分を提供することを意図していた。可能なハーフサイト・インテグレーション産物から、ＨＩＶ-１インテグラーゼが、キメラ組換え融合タンパク質におけるその活性を保持することを明らかにし得る。標的ＤＮＡプラスミドに対するインテグレーション部位の分析は、ＨＩＶ-１ インテグラーゼに融合したタンパク質による標的化の可能性を明らかにし得る。また、Ｉ-ＰpoＩまたはＩＮに融合したその突然変異型の(Ｉ-ＰpoＩ-)Ｈ９８Ａのエンドヌクレアーゼ様活性は、Ｉ-ＰpoＩ 認識部位プラスミドｐＰＰＯ部位を用いる簡単な解裂実験によって評価され得る。もしイン・ビトロでのインテグレーション実験がフルサイト・インテグレーション産物を生じるならば、これらイベントのスクリーニングを容易にするためにインテグレーション基質中にマーカー遺伝子(ＥＧＦＰ)が包含される。インテグレーション部位は、いずれの場合においてもＰＣＲまたはＲＥ消化によってスクリーニングされ得る、言い換えれば放射活性標識がオートラジオグラムによる迅速な観察のためにインテグレーション基質に導入され得る。予測されるイン・ビトロでのインテグレーション過程の概略が、図１に提供される。
【００１９】
図１において、(Ａ)は、〜２６５０ bpsのＨｌＶ-１ ドナー ｒＤＮＡ基質の概略表示である。色塗りされたボックス（solid box）は、ＥＧＦＰ(増強緑色蛍光タンパク質)のための発現カセットを示す。（Ｂ）は、アクセプターＤＮＡ(ｐＰＰＯ部位およびコントロールとしてpＢluescriptＩＩ）、インテグレーション・ドナーＤＮＡ(pＢ２ＬＴＲ＋ＥＧＦＰからの基質)および精製されたＨＩＶ-１ ＩＮ(cＩＮ)、ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩまたはＩＮ-Ｈ９８Ａタンパク質との、イン・ビトロでのインテグレーション反応の概略表示である。可能な産物は、両方のドナーＤＮＡ末端(左)の協調的インテグレーションから、および１つの末端インテグレーション・イベントによって、２以上の(中)または１つの(右)ドナーＤＮＡ分子による非協調的インテグレーションから生じるものを包含する。
【００２０】
融合タンパク質ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩまたはＩＮ-Ｈ９８Ａを用いておそらく達成され得る目的とするインテグレーションを試験するために、Ｉ-ＰpoＩに対する認識部位を有するインテグレーション標的プラスミドが構築された。この認識部位に対する１５bp配列は、Ｉ-ＰpoＩを用いる開示された試験から採用された(Mannino et al., 1999; Monnat et al., 1999; Ellison & Vogt, 1993; Argast et al., 1998)。認識部位を、２つの相補的なオリゴヌクレオチドＧ５１５およびＧ５１７(添付書類Ｉ、表Ｉ-４)をハイブリダイズすることによって生成し、その後に該リンカーを、pＢluescript(Stratagene)のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。該リンカーの挿入を、Ｉ-ＰpoＩ(Promega)解裂および配列決定の両方によって評価した。Ｉ-ＰpoＩ認識部位を含まないpＢluescriptを、wtＨＩＶ-１ ＩＮ(この研究におけるcＩＮ)およびタンパク質ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩおよびＩＮ-Ｈ９８Ａのインテグレーションパターンにおいて起こりうる違いを明らかにするために、イン・ビトロでのインテグレーション試験のためのコントロールプラスミドとして機能するようにした。
【００２１】
ＨＩＶ-１インテグラーゼ、同様の他のレトロウイルスインテグラーゼは、長い末端反復配列(ＬＴＲ)のＵ３およびＵ５領域に位置するウイルスＤＮＡの末端での特異的な態様を認識する(Brown,1997)。ＬＴＲ末端は、レトロウイルスのインテグレーションメカニズムによる認識のためにｃｉｓで必要とされると考えられる唯一のウイルス配列である。短く不完全な逆位繰返し配列は、マウスおよび鳥類レトロウイルスの両方においてＬＴＲの外側末端に存在する(Reicin et al., 1995）。レトロウイルスＤＮＡ末端(位置１および２は、３’末端プロセシングされたヌクレオチオド）において最も外側の３および４位に位置する端付近のＣＡと共に、これらの配列は、両方のイン・ビトロおよびイン・ビトロでの正しいプロウイルスインテグレーションにとって必要および十分である。しかし、ＣＡジヌクレオチドに対する配列の内側は、最良のＩＮ活性のために重要であることがわかった(Brin & Leis, 2002a; Brin & Leis, 2002b; Brown, 1997)。ＨＩＶ-１ ＬＴＲの末端１５bpは、イン・ビトロでの、正しい３’末端プロセシングおよび鎖移転反応にとって重要であることを示した(Reicin et al., 1995; Brown, 1997)。長い基質は、結合相互作用が、ウイルスＤＮＡ末端から少なくとも１４-２１bp内側に伸張することを示すＨＩＶ-１ ＩＮによって、短いものよりも、より効率的に使用される。BrinおよびLeis (2002a)は、ＨＩＶ-１ ＬＴＲの特異的態様を分析し、Ｕ３およびＵ５ ＬＴＲ認識配列の両方が、Ｕ５ＬＴＲがイン・ビトロでのＩＮプロセシングのためのより有効な基質であっても、ＩＮ-触媒された協調的ＤＮＡインテグレーションに、必要とされることを結論づけた(Bushman & Craigie, 1991; Sherman et al., 1992)。ＩＮ認識配列の位置１７-２０が、協調的なＤＮＡインテグレーションメカニズムに必要とされるが、ＨＩＶ-１ ＩＮは、逆位鎖近くのＣＡジヌクレオチドから伸張しているＵ３およびＵ５末端の両方において、十分なバリエーションを許容する(Brin & Leis, 2002b)。
【００２２】
この研究のために、ウイルスＬＴＲの野生型２０ｂｐＨＩＶ-１ ＩＮ 認識部位を、イン・ビトロでの協調的インテグレーションのためのミニドナーＤＮＡ基質を使用したBrin および Leis (2002a)らから採用した。ＥＧＦＰ発現カセットが、５’および３’ＬＴＲを含有したpＢluescriptの間でクローニングされ得るように、デオキシオリゴヌクレオチドを設計した。さらに、正しく平滑断端されるＬＴＲ-ＥＧＦＰ-ＬＴＲ (２ＬＴＲ-ＥＧＦＰ)インテグレーション基質構築体を消化し得る特異なＳcaＩ 部位を含有するように、５’および３’ＬＴＲを設計した。平滑断端されるインテグレーション基質を予めプロセシングされたもののかわりに作成した、というのはＩＮによって触媒される３’末端プロセシングおよび鎖移転反応の両方を検出できるからである。バクテリアで形質転換され、そして生物学的アッセイにおいて選択され得るフルサイト・インテグレーション産物を認識できるように、ＥＧＦＰマーカー遺伝子はＬＴＲの間に挿入された(Brin & Leis, 2002a)。構築体ｐＢＶboostＦＧ＋ＥＧＦＰからＥＧＦＰ発現カセットはクローニングされ、昆虫細胞、哺乳動物細胞およびバクテリアにおいてタンパク質発現のためのプロモーターを担持する。これらの全てのプロモーターは、pＢluescripにクローニングされたＬＴＲ-ＥＧＦＰ構築体中に保持され、イン・ビトロでの組込み体（integrant)のさらなる生物学的アッセイのための宿主の可能な交換を容易にする。
【００２３】
ＨＩＶ-１のインテグラーゼは、ＤＮＡ結合タンパク質に融合した場合にその活性を保持し、また配列特異的タンパク質によって標的化されるようになることが示された(Bushman, 1994; Bushman, 1995; Goulaouic & Chow, 1996; Pavletich & Pabo, 1991; Bushman & Miller, 1997; Holmes-Son & Chow, 2000)。この試験において、ＨＩＶ-１ インテグラーゼ(ＡＦ０２９８８４、クローンＨＸＢ２）についての遺伝子は、帰巣性エンドヌクレアーゼ Ｉ-ＰpoＩ (Ｍ３８１３１)に、そしてＨ９８Ａを形成するその変異体に融合された。また、wtＨＩＶ-１ ＩＮの１つの形態を、別のイン・ビトロ試験のためのコントロールを提供するためにサブクローニングした。その融合パートナーへのＩＮの融合を、pＢluescript中にcＤＮＡをサブクローニングすることによって達成した。次に、ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩ、ＩＮ-Ｈ９８ＡおよびcＩＮのｃＤＮＡを、ゲートウェイTM・クローニング技術(Invitrogen)のバクテリオファージλ組換え系(Landy,1989)を基にした組換えクローニングと適合し得るユニバーサル発現ベクターであるｐＢＶboostＦＧに移入した。このベクター中で構築体ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩ、ＩＮ-Ｈ９８ＡおよびcＩＮをクローニングする利点は、様々な細胞においてクローニングされた遺伝子の発現を駆動するベクターの多用性にある。また、cＤＮＡをこのベクターにクローニングすることは、簡単であり、バキュロウイルスのバクミドが、ｐＢＶboostＦＧにある構築体から容易に生成され得るという利点を有する。バキュロウイルスは、昆虫細胞中で組換え遺伝子を発現する際に、また最近は哺乳動物細胞遺伝子送達ベクターとして長い間使用されている(Kost & Condreay, 2002; Huser & Hofmann, 2003)。
【００２４】
従前の試験において触媒活性であるバクテリア発現したＨＩＶ-１ｚ ＩＮを得ることができるので、ＩＮおよびその融合構築体ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩおよびＩＮ-Ｈ９８Ａを、Ｅ.coliでまず産生させた。２つのバクテリア株を使用して、適当な発現宿主を見出した。バクテリア株Ｅ.coli ＢＬ２１(ＤＥ３)およびＢＬ２１-ＡＩの両方で、コントロール(wt)インテグラーゼおよび融合構築体ＩＮ-Ｈ９８Ａタンパク質の発現が、免疫ブロッティングの特異的抗インテグラーゼおよび抗ポリヒスチジン抗体染色によって観察されるように、両方の組換えタンパク質の高いタンパク質発現レベルを生じた。融合タンパク質ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩの発現を達成することは困難であり、タンパク質のわずかな量しか免疫ブロットにて検出できなかった。
【００２５】
融合タンパク質ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩがｗｔＩ-ＰpoＩよりも高い配列縮重(おそらく、ＩＮによる非特異的ＤＮＡ結合のために)を示すこと、またはバクテリアに有害である新規酵素活性を有することが、説明できる。増殖阻害は、バクテリアを用いる実験の後の発現について試験した昆虫細胞では観察されなかった。これらの結果は、新規融合タンパク質ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩが、いくつかの酵素活性、おそらく増強されたＤＮＡ解裂触媒作用を含有すること、および発現構築体自身が機能的であることを示唆する。さらに、昆虫細胞でのＩＮ-Ｉ-ＰpoＩの発現から得られた良好な結果は、バクテリアでの産生問題に関連する問題を克服する。
【００２６】
組換えバキュロウイルスゲノム(Autographa californica 核多角体病ウイルス；ＡｃＭＮＰ)を、部位特異的転位メカニズムによって、ｐＢＶboostＦＧ内に含まれたcＩＮ、ＩＮ-１-ＰpoＩおよびＩＮ-Ｈ９８ＡのcＤＮＡをバキュロウイルスゲノムに移入することによって作成した(Landy, 1989; Bac-to-Bac Baculovirus Systemas;Invitrogen; Luckow et al., 1993)。そうして、タンパク質産生が昆虫細胞において生じ、それが成功したと証明された。細胞性ＤＮＡにおけるインテグレーションパターンを観察するために、精製タンパク質およびインテグレーション基質が様々な細胞核に導入され得る。１５-１８日間続くＩ-ＰpoＩ構成的発現から、４０％よりも低いヒト細胞(ＨＴ-１０８０ヒト繊維肉腫細胞)が生存していたので (Monnat et al., 1999)、該エンドヌクレアーゼ切断活性なＩ-ＰpoＩは、真核生物細胞に対して毒性であり得る。ヒト細胞で発現したＩ-ＰpoＩは、ＨＥコード化プラスミドのトランスフェクション２４時間後、４８時間後に、２８Ｓ rＤＮＡに存在する約１０％のその帰巣性部位を解裂し得る(Monnat et al., 1999)。ＨＩＶ-１ＩＮと融合した場合にその活性が高すぎるなら、エンドヌクレアーゼ切断不活性形態のＨ９８Ａによって、この部位の解裂を触媒する帰巣性エンドヌクレアーゼを含まないｒＤＮＡ中へのインテグレーションを標的とする手段が提供されるべきである。また、酵素の構造および活性部位の残基がよく知られているため、低いＤＮＡ解裂活性または修飾された配列特異性を有するＩ-ＰpoＩ酵素を設計することが可能であるはずである(Jurica & Stoddard, 1999; Galburt et al., 2000; Chevalier & Stoddard, 2001)。ＨＩＶ-１ ＤＮＡに似た基質配列のインテグレーションを標的とする融合タンパク質は、例えばBushman および Miller (1997)のトランス（trans）アプローチを用いて、ＩＮ-変異したＨＩＶ-１ ビリオンに導入され得る。また、バキュロウイルスハイブリッドは、同じアプローチで試験され得る。
【００２７】
本発明の一つの実施態様において、ＩＮ-融合タンパク質は、"それら天然の範囲"において、即ちインテグレーション過程でアシストすると知られている他のＨＩＶ-１ タンパク質との関連において、使用される。ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩおよびその変異体ＩＮ-Ｈ９８Ａは、ＩＮ-融合タンパク質が融合されるＨＩＶ-１ Ｖｐｒのアシストによって、新規に形成するＨＩＶ-１ウイルス粒子に対しての標的となる。Ｖｐｒは、新規ウイルスが増殖し始めた後、ウイルスプロテアーゼによって該融合タンパク質から解裂される。こうして、標的化トランスジーンのインテグレーションは、細胞培養および動物またはイン・ビトロにおいて新規融合インテグラーゼ含有レンチウイルスを用いることによるか、またはＩＮ-Ｉ-ＰpoＩ／ＩＮ-Ｈ９８Ａ含有プレインテグレーション複合体(ＰＩＣ)を抜き出し、これらをインテグレーションアッセイで前記したように組換え産生されたタンパク質の代わりにイン・ビトロで使用することによって、試験され得る。
【００２８】
この実施態様の例において、ＩＮの触媒的コアドメイン中のアミノ酸Ｄ６４(アスパラギン酸塩）は、メガプライマーを基にした方法を介して、Ｖ（バリン)に変異された。この変異は、ＩＮによって酵素活性を低下させることが知られている。変異されたフラグメントは、レンチウイルス産生プラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥにクローニングされた。
【００２９】
ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩおよびＩＮ-Ｈ９８Ａ遺伝子を、真核生物発現プラスミドにクローニングし、ＨＩＶ-１ Ｖｐｒ遺伝子(ｐＬＲ２Ｐから；Beatrice Hahn, UAB)を融合遺伝子の前にクローニングした。Ｖｐｒ遺伝子に続いてプロテアーゼ解裂部位があり、トランス-パッケージング後にＩＮ-融合タンパク質からＶｐｒを除去が可能である。
【００３０】
レンチウイルスベクターを、ＩＮ-Ｈ９８Ａコード化発現プラスミドがトランスフェクションされた４つのプラスミドＤＮＡ混合物に添加されること以外は、標準的プロトコ-ルに従って作成した。これらの予備的なトランス-パッケージング試験では、ウイルスを、ｗｔＩＮコード化ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥを用いて作成した。
【００３１】
新規レンチウイルスベクター粒子へのＶｐｒ-ＩＮ-Ｈ９８Ａ融合タンパク質のトランス-パッケージングは成功した。
【００３２】
４ｂ 材料および方法
４.１  ＤＮＡ操作における一般的な方法
４.１.１  ＰＣＲ 
ＰＣＲ反応を、添付書類ＩＩに挙げたプログラムを用いて、サーマルサイクラー(PTC-200 Peltier Thermal Cycler, MJ Research)を用いて行った。異なるテンプレートを増幅する際に使用したプライマーを、添付書類Ｉに記載した。ＨＩＶ-１インテグラーゼ、Ｉ-ＰpoＩおよびＩ-ＰpoＩ h９８Ａを形成するその変異体についての遺伝子を、Ｐfuポリメラーゼを用いて増幅させた(MBI Fermentas)。ＧＷ-ＰＣＲ(サブセクション４.３.１)を、FailSafeTMＰＣＲ ＰreＭix 選択キット(Epicentre)を用いて行った。様々なクローニング構築体を確認するために使用したコロニーＰＣＲ（４.１.９)および他のＰＣＲ反応では、DyNAzymeRTＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ(Finnzymes)およびその推奨緩衝液を使用した。
【００３３】
４.１.２  ＡＧＥおよびゲル抽出
この研究を通して、アガロースゲル電気泳動(ＡＧＥ)のためのゲルを、０.８〜１gram のアガロース (Promega)を、ＴＢＥまたはＴＡＥ-緩衝液(０.８または１％ゲル、w/v)（１００ml）に溶解することによって調製した。エチジウムブロマイド(ＥｔＢｒ)を、成型する前に終濃度０.４μg/mlで添加した。ゲルを、１〜４時間７０-１２０ ボルト(Ｖ)で流し、ＤＮＡを、ＵＶ-Ｔransilluminator(M-20UVP, Upland, CA, USA)により可視化した。
【００３４】
ＤＮＡのゲル抽出のために、０.８％ＴＢＥまたはＴＡＥゲルを成型した。抽出されるべきＤＮＡバンドを、外科用メスを用いてゲルから切り出した。薄片中に捕捉されたＤＮＡを、製造者指示書に従ってゲル抽出用キット(GenElute(登録商標) Agarose Spin Columns, SIGMA)を用いて抽出した。
【００３５】
４.１.３  ＤＮＡ精製、濃縮および沈殿
異なる起源からのＤＮＡ(ゲル抽出、ＰＣＲ、消化物などから）を、Wizard（登録商標）Plus DNA Clean Up Kit (Promega)を用いて精製して濃縮するか、またはＮａ-Ａｃ-アルコール沈殿方法(Sambrook & Russell, 2001)を用いた。通常、ＤＮＡを、滅菌エンドヌクレアーゼ不含水（３０-５０μl）に溶出または溶解した。溶出物中のＤＮＡの濃度およびその純度を、分光分析器により決定した。
【００３６】
４.１.４  ＤＮＡ濃度測定
ＤＮＡ濃度測定のために、サンプルを滅菌水またはＴＥ(１：１００)に希釈した。サンプル中のＤＮＡ濃度を、５０ng/mlの溶液がＡ２６０値の１を示すと仮定して、２６０nm(および２８０ｎｍ)での吸光度を測定することによって分光学的に決定した。サンプルの純度を、純粋なＤＮＡ溶液中の割合が〜１.８である(Sambrook & Russell, 2001)ことを仮定して、２６０と２８０ｎｍ(Ａ２６０/Ａ２８０)との吸光度の割合から決定した。吸光度測定を、ＵＶ/可視光の分光分析器(Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech)を用いて行った。
【００３７】
４.１.５  ＤＮＡ消化物
この研究において全ての消化物を、制限酵素(ＲＥ)およびNew England Biolabs (NEB)または MBI Fermentasからのそれらと関連のある緩衝液を用いて行った。消化を、各酵素に対して適当な温度および緩衝液条件については製造者指示書に従って行った。消化中のＤＮＡ濃度を、およそ０.１-０.５μg/μｌに調整した。少なくとも１Ｕ(ユニット）の酵素を、ＤＮＡの全てのμgに用いるが、１０％よりも低い消化容量がＲＥからなる。基本的に２時間または一晩(ｏ／ｎ)で消化を実施した。
【００３８】
ＲＥ消化(制限分析)による様々なクローニングからのプラスミド調製物を評価する場合、通常、該反応を、下記に示したとおりに組み立てて、１-２時間、各酵素にとって適当な温度でインキュベートし、１％ＴＢＥゲル(w/v)上で泳動した。
２μｌ  プラスミド ＤＮＡ 
２μｌ  １０ｘ ＲＥ緩衝液
２μｌ  １０ｘ ＢＳＡ(特定のＮＥＢ酵素についてのみ)
０.５μｌ 各ＲＥ
Ｈ２０ ad ２０μｌ
【００３９】
４.１.６  ＤＮＡライゲーション
直線化したベクター中への挿入物のライゲーションは、近接した５'-リン酸基および３'水酸基の間の新規ホスホジエステル結合の形成を包含する。この試験において、ライゲーション反応を、５-１５Ｕ のバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＭＢＩ)、１ｘＴ４リガーゼ緩衝液、消化したベクターの可変量(５０-１５０ng)およびベクターＤＮＡを超える少なくとも３ｘモル過剰の挿入ＤＮＡを用いて通例的に行った。全てのライゲーション成分を、滅菌エッペンドルフチューブ中で混合し、滅菌エンドヌクレアーゼを含まない水を用いて、１０または１５μｌまで反応容量にした。結合末端のライゲーションを、通常室温（ＲＴ、２２℃)で３０-６０分間、そして平滑断端ライゲーションを１６℃で一晩(ｏ／ｎ)インキュベートした。バックグラウンドライゲーションコントロール(水を挿入ＤＮＡに置換する)を、非組換え体のバックグラウンドレベルを決定するために、挿入ライゲーションに従って常に実施した。
【００４０】
４.１.７  バクテリア形質転換
ライゲーション混合物(おおよそ５００および２５０pgＤＮＡ/μｌ)の希釈物を、コンピテントバクテリア３０μｌあたりの各希釈物（１μｌ）を用いて、コンピテントＥ.coli ＤＨ５α細胞(Gibco)を形質転換するために使用した。形質転換の前に、Ｔ４ ＤＮＡ-リガーゼを、ライゲーション混合物を６５℃で１０分間インキュベートすることにより不活性化した。形質転換を、次のようにヒートショック法により行った：希釈したライゲーション混合物を、冷やしたエッペンドルフチューブ中でＤＨ５α細胞と共に混合し、穏やかにタッピングし、３０分間氷上にたたせた。バクテリアを−／＋４２℃の水浴で４０秒ヒートショックに供し、２分間氷上に置いた。次いで、ｌｘＳＯＣ(８０μ1)をバクテリアに加え、振盪インキュベーター中で該細胞を１時間(３７℃、２５０rpm)回復させた。細胞を、形質転換したバクテリアの選択のために適当な抗生物質を加えたＬＢ(Luria-Bertani)寒天プレート上に広げた。組換えpＢluescript クローンの青/白色選択を用いる場合、２％ Ｘ-Ｇａｌ(５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-ガラコシド) (５０μl)を、プレート表面に広げて、バクテリアを播種する前に３０〜６０分間吸収させた。pＢluescript中のlacＺ-遺伝子に対する誘導物質であるＩＰＴＧ(イソプロピルチオ-ｐ-Ｄ-ガラクトシド)（３０μｌ）を、直接プレート上でバクテリアと混合した。
【００４１】
ライゲーションコントロール反応に加えて、陽性および陰性形質転換コントロールを、同時に行い、ライゲーション混合反応について全て同じ処置を行った。陽性形質転換コントロールは、インタクトなプラスミドＤＮＡを用いて形質転換されたバクテリアを含み、陰性コントロール形質転換はあらゆるＤＮＡの代わりに滅菌水を用いる。陽性コントロールは、形質転換反応方法が効率的に作動することを示し、陰性コントロールは、形質転換中に起こり得るＤＮＡ汚染を明らかにするために使用される。寒天プレートを、３７℃ ｏ／ｎ でインキュベートした。
【００４２】
４.１.８  プラスミドＤＮＡの精製および分析
形質転換の次の日、１つの白色コロニーを、ＬＢプレートから選択し、適当な抗生物質を添加した１ｘＬＢ（５ml）に植菌した。
バクテリアを、１２-１６時間、振盪インキュベーター(２５０rpm、３７℃で)中で増殖させ、プラスミドの収量を増加させた。次の日に、各バクテリア培養物（２-５ml）を採収し、プラスミドＤＮＡを、ミニスケールプラスミド調製キットを用い、製造者指示説明書に従って単離した(Wizard（登録商標）Plus SV Minipreps DNA Purification System, Promega)。プラスミド調製物を、様々な制限酵素消化およびアガロースゲル電気泳動によって同定した。グリセロールストックを、９９＋％グリセロール(Sigma)と等量のバクテリアｏ／ｎ培養物を混合して継代したクローンから各々作成し、次いで−２０℃で貯蔵した。
【００４３】
４.１.９  コロニーＰＣＲ
時折、クローニングの成功を、まずミニスケールプラスミド調製物を評価する代わりにコロニーＰＣＲによって評価した。コロニーＰＣＲは、ＰＣＲのためのテンプレートとしてバクテリアコロニーを用いてクローニングの成功を迅速に検出できる。試験されるべきコロニーの各組について、ＰＣＲプレミックス(マスターミックス)を調製した(下記を参照されたい)。プレミックスを滅菌エッペンドルフチューブに均等に分注し、テンプレートとして機能するバクテリアを、全てのコロニーを選び取らないように注意して、ピペットの先端とそのコロニーとを静かに接触させ、それをＰＣＲチューブ中に流し入れて導入した。あるいは、コロニーを、適当な抗生物質を有する１ＸＬＢ（５０μｌ）中に懸濁させ、２時間振盪インキュベーター(３７℃、２５０rpm)で増殖させ、次いで該培養物（２μ１）を修飾したコロニーＰＣＲ反応に使用した。後者の方法を用いて、多数のコロニーを、９６-ウェルプレート上で同時にスクリーニングした。ＰＣＲを、プログラムDPESAEKE(添付書類ＩＩ)および下記反応条件を用いて行った。ＰＣＲ産物を、１％ＴＢＥゲルでＡＧＥによって確認した。
１つの２０μｌのＰＣＲ反応は、次のものを含む：
１５μｌ(または１３μl)ＰＣＲグレードの水
２μｌ  １０ｘ Dynazyme ＰＣＲ緩衝液(ＭｇＣｌ２を有する)
１μｌ  ＤＭＳＯ(ジメチルスルホキシド、終濃度５％)
０.５μｌ  ｄＮＴＰ(１０ｍＭ)
０.５μｌ  プライマーＴ３
０.５μｌ  プライマー Ｔ７(pＢluescriptのための標準的プライマー)
０.５μｌ(ｌＵ)  DyNAzymeTMＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ (Finnzymes)
(２μlのバクテリア培養物またはテンプレートとして選択したコロニー）
【００４４】
４.１.１０  オリゴデオキシリボヌクレオチドハイブリダイゼ-ションによるＤＮＡリンカーの作成
合成の相補的オリゴデオキシリボヌクレオチド(１nmol)の等量を、滅菌エンドヌクレアーゼ不含水（１００μｌ）またはＴＥ（１００μｌ）中に混合した。この溶液を、鎖を変性させるために９５℃で１０分間インキュベートし、ゆっくりとブロックの内側で室温(ＲＴ)に冷却させた。ゆっくと冷却することによって、あらゆる相補的でない対合や不都合な二次構造立体構造を持たずに、鎖が正しくアニーリングすることが確実になる。
【００４５】
４.１.１１  組換え構築体の配列評価
全てのＤＮＡ構築体の配列決定を、AI Virtanen Institute for Molecular Sciences（Kuopio）のＤＮＡ合成および配列決定設備において、２つの自動化ＤＮＡシークエンサーで行った(ALF and ALFexpress, Pharmacia)。１μｇのテンプレートＤＮＡが、各配列決定反応に必要であった。様々なサンプルを配列決定するために用いたプライマーを、表４.６-Ｉに挙げた。全ての配列決定の結果は、DNAMAN(version 5.2. 9, Lynnon BioSoft)を用いて行った。
【００４６】
４.２  ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩ、ＩＮ-Ｈ９８ＡおよびcＩＮの発現構築体の作成
ＨＩＶ-１インテグラーゼ (Groarke, Hughes, Dutko; Hong et al., 1993 ;Sioud & Drilca, 1991)、Ｉ-ＰpoＩ(Muscarella & Vogt 1989, Muscarella et al., 1990) およびＩ-ＰpoＩh９８aのための遺伝子を、まずＰＣＲ増幅させ(Arnheim & Erlich 1992)、次いでＥｃｏＲＶ消化したpＢluescript中にサブクローニングした。サブクローニングした遺伝子を融合させて、構築体ｐＩＰ(ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩ)およびｐＩＨ(ＩＮ-Ｈ９８Ａ;プラスミドマップについては図４.５-１を参照されたい)を作成した。これらの遺伝子融合を修飾し、GATEWAYTMCloning Technology(GibcoBRL(登録商標), Life Technologies)を用いて、発現(目的)ベクターｐＢＶboostＦＧに形質導入した。
【００４７】
４.２.１  ＩＮ、cＩＮ、Ｉ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａについての遺伝子のpＢluescriptへのサブクローニング
ＨＩＶ-１ＩＮ、Ｉ-ＰpoＩおよびＩ-ＰpoＩh９８a遺伝子のためのcＤＮＡを、プラスミドｐＬＪＳ１０、pＣＮＰｐｏ６およびpＣＮＰｐｏ６ h９８aから各々得た。プラスミド ｐＬＪＳ１０を、ＡＩＤＳ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨのthe AIDS Research and Reference Reagent Program, Division を通じて得た:ｐＬＪＳ１０はDrs. JM Groarke, JV Hughes, および FJ Dutko から得た。プラスミドpＣＮＰpo６およびpＣＮＰpo６h９８aを、Prof. Raymond J. MonnatJr., University of Washington, Seattle.のご厚意により得た。
【００４８】
各遺伝子(添付書類Ｉ)について特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、プラスミド提供者から得た配列情報およびＧenＢank (accession ＃s:IN-AF029884;Ｉ-ＰpoＩ-Ｍ38131 ;Ｉ-ＰpoＩ(h９８Ａ)-1CYQC)を基にして設計した。３'ＩＮ(TAG CopenhagenA/Sで合成した)以外の全てのプライマーを、A.I Virtanen Institute for Molecular Sciences, KuopioのＤＮＡ合成および配列決定装置において、ＡＢＩ ＤＮＡ合成機器を用いて合成した。クローニングの目的のために新規制限酵素部位を、プライマー(添付書類Ｉ)に包含した。
【００４９】
ＰＣＲ反応を、次のとおりに組み立て、遺伝子ＩＮ、cＩＮ、Ｉ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａを増幅させるためにprogram DS2006 (添付書類ＩＩ)を用いて行った。プライマーＦ９９２および３'ＩＮを用いてＩＮを増幅した；Ｆ９９２および３'cＩＮをcＩＮに用いた。後者の点突然変異がこのプライマー配列で同時に起こらなかったため、両方のＩ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａを、同じプライマー対(Ｆ９８７およびＧ７)を用いて増幅させた。全ての挿入物を、組換えＰfuポリメラーゼ(MBI Fermentas)を用いて、下記の成分を含む４０μlの反応において増幅させた：
２７μｌ ＰＣＲグレードの水
４μｌ 組換えＰfu ポリメラーゼ (＋ＭｇＳＯ４)のための１０ｘ緩衝液
１μｌ ＤＭＳＯ (ジメチルスルホキシド、Ｃfinal ２.５％)
１μｌ ｄＮＴＰ(１０mＭ）
２μｌ ５'プライマー(２０μＭ)
２μｌ ３'プライマー（２０μＭ）
１μｌ Ｐfuポリメラーゼ(２.５Ｕ)
２μｌ テンプレートＤＮＡ
(ｐＬＪＳ１０、pＣＮＰpo６およびpＣＮＰpo６h９８aの１：１００希釈)
【００５０】
ＰＣＲ反応を、１％ＴＢＥゲルにおいてこの反応のアリコートをＡＧＥ泳動により確認した。次いで、この残りＰＣＲ産物を、０.８％ＴＡＥ-ゲル上で泳動させ、正しいＰＣＲ産物を抽出した。予測されたＰＣＲ産物に対応するバンドをゲル抽出し、４.１で説明したように精製した。溶出物中のＤＮＡ濃度およびその純度を、分光学的に決定した(４.１.４)。
【００５１】
Ｐfuポリメラーゼによって増幅したＰＣＲ産物は平滑断端を持つ、そのため平滑断端クローニングを、ファージミドpＢluescript(pＢluescript（登録商標）ＩＩ ＳＫ-−／＋，Stratagene)中へ、ＩＮ、cＩＮ、Ｉ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａについての遺伝子をサブクローニングに用いた。pＢluescriptを、平滑断端カッターＥｃｏＲＶ(MBI)を用いてそれを消化することによって直線化した−／＋３７℃でのインキュベーション２時間後、該消化物を、アリコートを１％ＴＢＥゲルで泳動することによって確認した。インタクトで、未消化のスーパーコイルＤＮＡの残存量から直線化ベクターを分離するために、全サンプルを、GenEluteTMAgarose Spin Columnsを用いてゲル抽出し、ＤＮＡ Clean Up Kitで精製した。
【００５２】
ＥｃｏＲＶ消化したpＢluescriptへのＩＮ、cＩＮ、Ｉ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａの平滑断端ライゲーションを、各々ライゲーションミックス[ベクター；１００ng、２μ1 Ｔ４ リガーゼ(１０Ｕ)、１μｌ １０Ｘ Ｔ４リガーゼ緩衝液、１００〜１２５ng の挿入ＤＮＡ（ゲル抽出し、精製したＰＣＲ産物)および３.５μl Ｈ２Ｏ]を−／＋１６℃ ｏ／ｎでインキュベートすることにより行った。
【００５３】
ライゲーション混合物を、サブセクション４.１.７に記載したとおりにコンピテントＥ.coli ＤＨ５α細胞中に形質転換した。バクテリアを、アンピシリン(７５μg/ml)および５０μl Ｘ-galを加えたＬＢプレートに播種した。ＩＰＴＧ（３０μl）を播種する前にバクテリアと混合した。プレートを３７℃ ｏ／ｎでインキュベートした。次の日、白色の単離コロニーを、ＬＢａｍｐプレートから選び取り、ＬＢａｍｐ培地（５ｍｌ）中で培養し、該培養物を、セクション４.１.８に記載したようにプラスミド調製物に処理した。プラスミド調製物を、制限分析およびゲル電気泳動によって同定した。ＩＮおよびcＩＮミニプレップを、ＥｃｏＲＩ(ＮＥＢ)で消化した。正確な調製物を、ＰａｃＩおよびＸｂａＩ(ＮＥＢ)(cＩＮ-クローンについてはＰａｃＩおよびＳｆｉＩ)を用いて消化することによってさらに評価し、この部位をＰＣＲ中にＩＮ遺伝子に導入した。同様に、Ｉ-ＰpoＩまたはＨ９８Ａを含有するプラスミドを、ＢａｍＨＩ-消化、およびＳpeＩ-ＳfiＩ-二重消化(ＮＥＢ)によって評価した。全ての消化物を、先に記載したようにＡＧＥによって確認した。pＢluescriptでの正確なクローンを、インテグラーゼについてはｐＢＩＮと命名し、コントロールインテグラーゼについてはｐＢcＩＮと命名し、Ｉ-ＰpoＩについてはｐＢＩＰpoＩ、そしてＨ９８ＡについてはｐＢＨ９８Ａと命名した。
【００５４】
４.２.２  ＩＮおよびＩ-ＰｐｏＩ／Ｈ９８Ａからの融合遺伝子の作成
２つの遺伝子(Ｉ-ＰpoＩまたはＨ９８ＡのいずれかとのＩＮ)の融合を、サブクローニングを基にした制限酵素により達成した(Sambrook & Russel, 2001)。まず、pＢluescript中の挿入物の方向を、様々なＲＥ-消化物によって導きだした。ＩＮ遺伝子は、pＢluescriptにおいて一方向に位置することがわかり、それはプラスミドからＸｂａＩ消化によってその３’末端から分離され得るが、その５'末端からのプラスミドに結合したままである。Ｉ-ＰpoＩおよびＨ９８ＡをＳpeＩで消化し、それらのプラスミドから分離することがわかった。
【００５５】
ｐＢＩＮを、ＸｂａＩにより消化して、挿入されるべきＳpeＩ消化したｐＢＩＰpoＩまたはｐＢＨ９８Ａフラグメントのために、付着末端(一緒に結合され得る互い違い切断末端）を作成した。ＳＡＰ(エビアルカリホスファターゼ、１un／μl)（２μｌ）を、バックグラウンドレベルを最小にするため、即ち非結合ｐＢＩＮプラスミドを、自己結合やライゲーションミックスとの形質転換を防ぐため、ｐＢＩＮ-消化に添加した。Ｉ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａ挿入物を、ＳpeＩを用いるそれらのプラスミドから消化し、フラグメントを０.８％ＴＢＥゲルから抽出した。精製したＩ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａフラグメントを、前記したような同じ条件(セクション４.１.６)を用いて、直線化かつ精製されたｐＢＩＮに個々に結合させた。ライゲーション混合物を、セクション４.１.７に記載のとおりに形質転換した。得られるコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出する代わりに、成功したクローンを、コロニーＰＣＲ(４.１.９)によって確認した。予測された結果を示すコロニーを、ＬＢａｍｐ（５ml）に植菌し、セクション４.１.８のとおりにミニプレップに処理した。ミニプレップを、ＰvuＩＩ消化物およびＡＧＥによって評価した。それぞれに関して２つのcＤＮＡの方向を、消化したサンプルから導いた。正しく方向付けされたクローンを、インテグラーゼＩ-ＰpoＩ融合をｐＩＰと命名し、インテグラーゼＨ９８Ａ融合をｐＩＨと命名した。各構築体のクローンを、配列決定(４.６）によって確認した。
【００５６】
４.２.３  変異体の修正
クローンｐＩＰ５およびｐＩＨ５の配列決定から、pＢcＩＮ５クローンには存在しないＩＮ遺伝子の位置２１２におけるナンセンス突然変異が明らかになった。ｐＩＰ５およびｐＩＨ５を、次のようにpＢcＩＮ５を利用して修復した:５２７bpsのフラグメントをＰａｃＩおよびＡｆｌＩＩを用いて、ｐＩＰ５およびｐＩＨ５から消化し、pＢcＩＮ５からの未変異フラグメント以外の対応するものによって置換した。ｐＩＰ５およびｐＩＨ５からのプラスミドバックボーンをゲル抽出し、変異を含有する挿入フラグメントを排除した。ｐＢcＩＮからの校正フラグメント切断を単離し、精製し、次いで消化したｐＩＰおよびｐＩＨプラスミド中への結合に使用した。ライゲーション、形質転換およびプラスミド単離物を、セクション４.１で述べたように行った。成功したクローンを配列決定によってのみ評価した。pkorj.ＩＰ３、pkorj.ＩＨ７と命名したクローンを、表４.６-Ｉに挙げたプライマーを用いて配列決定した。
【００５７】
４.２.４  発現ベクターの構築
バクテリア、昆虫および哺乳動物細胞で発現し得る融合遺伝子ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩおよびＩＮ-Ｈ９８Ａ、ならびにcＩＮクローンを、構築体へ変えるために、全ての挿入物を、新規発現ベクター中へサブクローニングした。組み換えを基にしたGATEWAYTM Cloning Technology(GibcoBRL（登録商標), Life Technologies)を先ず使用して、ＢＰ-反応を基にした組み換えによって、ドナープラスミドｐＤＯＮＲTM(Invitrogen)中にＧＷ-ＰＣＲ-修飾した遺伝子を導入した。このプラスミドから、様々な生物におけるトランスジーン発現に必要なプロモーターエレメントを持つ修飾された目的ベクターｐＢＶboostＦＧに対するＬＲ反応を介して、遺伝子を再び形質導入した。ポリヒスチジンタグ(６ｘＨis)を、融合遺伝子の５'末端に導入した。
【００５８】
４.２.４.１  ゲートウェイ(ＧＷ)-ＰＣＲ
pkorj.ＩＰ３、pkorj.ＩＨ７およびpＢcＩＮ５のエントリークローンをゲートウェイ組み換え技術により作成するために、ＤＮＡエレメント(attＢ１およびattＢ２)を、ＰＣＲによる遺伝子の５'末端に導入した。プライマー(添付書類Ｉ、表１-２)を配列attＢ１およびattＢ２を含有するように設計し、５'プライマーを、さらなるタンパク質精製を促進するように６つ余分なヒスチジンをコードするコドンを含むようにさらに修飾した。ＰＣＲを、緩衝液Ａ〜Ｌ（ｄＮＴＰを含有する緩衝塩溶液、多様な量のＭｇＣｌ２およびベタインを含むFailSafe PCR エンハンサー)、FailSafe PCR 酵素ミックス(ＤＮＡポリメラーゼ)およびプログラムGW-2701 または GW-cＩＮ (添付書類ＩＩ)を包含するFailSafeTMPCR PreMix Selection Kit (Epicentre)を用いて行った。各テンプレート（１-３ｎｇ）(pkorj.ＩＰ３、pkorj.ＩＨ７またはpBcＩＮ)を、ＰＣＲ反応（５０μｌ）のために使用した。該産物を、前記したとおりに０.８％ＴＢＥゲルからゲル抽出し、エタノール沈殿によって濃縮した。
【００５９】
４.２.４.２  ＢＰおよびＬＲ反応による最終発現ベクターの構築
ＢＰ反応を、製造者の指示書に従ってプラスミドpkorj.ＩＰ３、pkorj.ＩＨ７およびpＢcＩＮ５について行い、該産物をＥ.coli ＤＨ５α細胞(４.１.７)に形質転換した。プラスミド調製物を、４.１.８に記載したように行った。得られるドナープラスミド調製物(エントリークローン)を、ＰvuＩＩ(ＭＢＩ)消化によって確認し、その後次のＬＲ反応のためにそれらをテンプレートとして提供した。トランスジーンが目的ベクター(この研究においてはｐＢＶboostＦＧ)中にドナーベクターから形質導入されるようになる場合のＬＲ反応を、製造指示書に従って同様に行い、ＤＨ５α細胞中に形質転換した。得られるコロニーからのプラスミド調製物を、ＰvuＩＩ消化によって確認した。最終目的ベクターにおける遺伝子構築体を、プライマーＧ５０２、Ｇ５５０、Ｇ４４９およびＧ４４８(添付書類Ｉ、表Ｉ-３)を用いる配列決定によって確認した。pＤＩＰ２、pＤＩＨｌおよびｐＤcＩＮｌと命名した正確なクローンを、バクテリアのタンパク質産生（４.６)に用いた。
【００６０】
４.３  インテグレーション標的プラスミド(ｐＰＰＯ部位)の調製
Ｉ-ＰpoＩエンドヌクレアーゼの解裂部位についての配列を、酵素を用いる以前に開示された試験(Mannino et al., 1999; Monnat et al., 1999; Ellison & Vogt, 1993; Argast et al., 1998)から採用した。Ｉ-ＰpoＩについて１つの特異的解裂部位を含有したプラスミドを調製するために、Ｉ-ＰpoＩ 認識配列を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドを、pＢluescriptのＥｃｏＲＶ部位に挿入した。認識部位を含んでいる２つの５'リン酸化された１５量体相補的オリゴヌクレオチド鎖Ｇ５１５およびＧ５１７(添付書類Ｉ、表Ｉ-４)をアニーリングし、二本鎖部位（Ｉ-Ｐpo-オリゴ)を形成させた。等量の該鎖を混合し、セクション４.１.１０で説明したようにハイブリダイズした。
【００６１】
pＢluescriptを、前記したようにＥｃｏＲＶで消化し、ＳＡＰ(２Ｕ)で処理し、ゲル抽出し、４.１に記載したように精製した。リンカーＩ-Ｐpo-オリゴを、直線化かつ精製したプラスミドに、消化したプラスミド(２２５ng)よりも１５ｘ モル過剰の挿入物(１７.５ng)を用いて結合させ、該反応混合物を、ウィークエンドにわたって(o/we)１６℃でインキュベートした。希釈したライゲーション混合物を、前記したとおりのヒートショック方法を用いて、ＤＨ５α細胞中に形質転換した。ミニスケールプラスミド調製物を、セクション４.１.７のとおりに、選択したバクテリアコロニー由来の増殖した培養物から処理し、Ｉ-ＰpoＩ(Promega）による消化によって確認した。
【００６２】
４.４  インテグレーション(pＢ２ＬＴＲ＋ＥＧＦＰ)のための基質作成
イン・ビトロ試験のためのインテグレーション基質を生成するために、ウイルスの長い末端の反復末端に類似している二本鎖ドナーＤＮＡを作成した。最初に、両方のＬＴＲ(３'および５'ＬＴＲ)について、２つの相補的なおよび５'リン酸化された３０量体オリゴデオキシリボヌクレオチドを、ＨＩＶ-１インテグラーゼを用いるイン・ビトロ実験(Brin and Leis, 2002a)を用いる試験から得た配列情報に基づいて合成した。５’および３’ＬＴＲ(Ｇ６０４＋Ｇ６０５およびＧ５６９＋Ｇ５７０各々；添付書類Ｉ、表１-４)相補的なオリゴヌクレオチドの等モル量(１００pmol）を、４.１.１０に前記したようにアニーリングした。
【００６３】
pＢluescriptを、ＳpeＩで消化し、０.８％ＴＢＥゲルから抽出し、前記したように精製した。次いで、直線化したプラスミドを、ＫpnＩで消化し、ＳＡＰ（２Ｕ)で処理し、ゲル抽出し、精製した。該ベクター（２００ng）を、３'ＬＴＲ調製物(２５ng)（２.５μｌ）を含有する標準的なライゲーション反応（１５μ1）に用いた。ライゲーションを、さらに３０分間室温で実施し、その後この容量を、Ｔ４リガーゼ緩衝液(１０Ｘ) （０.５μl）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１μｌ）、Ｈ２０（１μｌ）および５'ＬＴＲ調製物(２５ng)（２.５μｌ）を添加して、２０μｌまで増加させた。ライゲーションを、さらに３０分間継続し、その後リガーゼを不活性化し、該混合物をＤＨ５α細胞中に形質転換した(４.１.７)。次の日に、明るいブルーコロニーをプラスミド調製物のために処理し、これをＳcaＩ消化によって確認した。マーカー遺伝子カセットを、ＬＴＲの間に挿入する前に、これらのpＢ２ＬＴＲ-プラスミド調製物の一つ(＃１)を配列決定によって確認した。
【００６４】
ＬＴＲ-配列の間に挿入されるべき２５６１bp ＥＧＦＰ(増強された緑色蛍光を）-カセットを、ｐＢＶboostＦＧ＋ＥＧＦＰからＳphＩ 消化し、ゲル抽出し、前記したように精製した。pＢ２ＬＴＲ＃ｌ(５’および３’ＬＴＲを含有する)を、ＳphＩによって消化し、ＳＡＰによって処理した。ＥＧＦＰマーカー遺伝子カセットを、消化されたプラスミド（１１０ng）、ＥＧＦＰ-挿入物のその３倍のモル量(約２８０ng)、１２.５Ｕ Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよび１０ Ｘ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（１.５μl）を含有する１５μｌのライゲーション反応において、消化かつ精製されたｐＢ１に結合した。まず、ライゲーションを、１時間室温で行い、冷却装置内（＋８℃)ｏ／ｗｅで継続した。希釈したライゲーション混合物およびそのコントロールを、ＤＨ５α-Ｅ.coli細胞中に形質転換した。１０個の得られた白色コロニーを、ＳcaＩ-消化によって確認したプラスミド調製物のために選択した。正確なクローンを、pＢ２ＬＴＲ+ＥＧＦＰ(番号１-１０)と命名し、ＳcaＩ消化および配列決定によって確認した。
【００６５】
４.５  組換え構築体の配列評価
異なるプラスミドを配列決定する際に使用したプライマーを、添付書類Ｉに列挙した。
プラスミドｐＩＰ５およびｐＩＨ５(４.２.３から)、さらにそれらの正確なバージョンの pkorj.ＩＰ３およびpkorj.ＩＨ７(４.２.４から)を、表４.５-Ｉに挙げた４つのプライマーを用いて配列決定した。pＢcＩＮ５、pＰＰＯsite６、ならびにpＢ２ＬＴＲ＋Ｅ６ クローンをプライマーＴ７およびＴ３によって配列決定した。ｐＢＶboostＦＧにおける発現クローンpＤＩＰ２およびpＤＩＨ１を、プライマーＧ５０２、Ｇ５５０、Ｇ４４８およびＧ４４９を用いて配列決定した。pＤcＩＮを、プライマーＧ５０２およびＧ５５０を用いて配列決定した。全ての配列決定の結果を、DNAMAN(version 5.2. 9, Lynnon BioSoft)を用いて分析した。発現プラスミドを除く全てのＤＮＡ構築体を、図２に示した。
【表１】
2007535308.tif 000002
【００６６】
４.６  バクテリアのタンパク質発現
コンピタントＥ.coli株 ＢＬ２１(ＤＥ３)(Stratagene）およびＢＬ２１-ＡＩTMOne Shoe(登録商標)(Invitrogen life technologies, catalogue no. C6070-03)を、タンパク質産生のための発現宿主として使用した。感染０時間、１時間および３時間後の時点で、タンパク質発現の実験中に採取し、グリセロールストックを各試験したクローンから作成した。タンパク質産生を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ(4.7.1)およびウエスタンブロット(4.7.2)で分析した。
【００６７】
４.６.１  分析スケ-ルバクテリアタンパク質産生
まず、タンパク質産生をＥ.coli BL21 (ＤＥ３)株において実施した。バクテリアを発現ベクターpＤＩＰ２、pＤｌＨ１およびpＤcＩＮ１およびpＩＮＳＤ.Ｈｉｓを用いて形質転換した。Ｈisタグ付加ＨＩＶ-１ ＩＮ をコードしているプラスミドpＩＮＳＤ.Ｈｉｓを、Robert Craigie博士から、ＡＩＤＳ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨのAIDS Research and Reference Reagent Program, Divisionを通じて得た。形質転換を、次のように行った：グリセロールストックからのバクテリアまたは非形質転換コロニーを、「新しいプレート」を作成するために、形質転換一日前にＬＢプレートに塗り広げて、生存コロニーを得る。その次の日に、単離したコロニーを、１０μ1の植菌ループを用いて選択し、冷（＋４℃)ＣａＣｌ２（１００μl）に懸濁した。懸濁したバクテリアを１５分間氷上でインキュベートし、それらをＤＮＡ取込みのためのコンピテントとした。ＤＮＡを、懸濁液に添加し(おおよそ５０〜１００ng、０.５〜１μｌ)、その後、該混合物を氷上で３０分間インキュベートした。次いで、該細胞を、４２℃で４５秒ヒートショックに供し、直ぐに２分間氷上に置いた。Ｓ.Ｏ.Ｃ.(４５０μl)を細胞に添加し、その後それらを３０-６０分振盪インキュベーター(３７℃、２３０rpm)中で回復させた。形質転換混合物の様々な量(５０〜１５０μl)を、ＬＢｇプレート上 (ゲンタマイシンを加えたＬＢプレート)に播種し、３７℃でo/nインキュベートした。
【００６８】
次の日、いくつかのコロニーを、各形質転換構築体から選択し、ＯＤ６００(６００nmでの培養物の光学密度)が０.６-１.０に達するまで、ゲンタマイシン(７μg/ml)を加えた１ｘＬＢ（５ml）中で３７℃２５０rpmで培養した。これらの初期培養物から、新しいＬＢｇ(初期培養物の１:２０希釈)（３.８ml）を植菌するために２００μｌを使用した。非形質転換ＢＬ２１(ＤＥ３)サンプルを、全ての実験中に発現サンプルと共にコントロールとして処理した。
【００６９】
植菌した培養物を、それらが中程度の対数増殖期(ＯＤ６００〜４)に達するまで、１.５〜３時間、３７℃、２５０rpmで増殖させた。タンパク質産生を、ＩＰＴＧを１ｍＭの終濃度まで添加して誘導した。誘導前に、サンプル（１ml）(未誘導、０時間)を、各培養物から収集した。別のサンプル（１ml）を誘導後ｌｈおよび３h(または４時間までの各全ての時間)採取した。収集した後、全てのサンプルを、直ぐに遠心分離(４０００xg、２分間)によって沈殿させ、滅菌水（２０〜６０μl）に懸濁させ、４ｘＳＤＳ-ＰＡＧＥサンプル緩衝液で希釈した。次いで、サンプルを、９５℃で５分間加熱し、細胞を溶解させ、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析するまで-２０℃で貯蔵した。サンプルの一部は、この時点では沸騰させないが、-２０℃で直ぐに貯蔵した。
【００７０】
また、タンパク質産生を、Ｅ.coli 株ＢＬ２１-ＡＩTMOne Shoe（登録商標）(Invitrogen)で試験した。ＢＬ２１-ＡＩTMの１つまたは、半分のバイアル(５０または２５μｌ)を各構築体pＤＩＰ２、pＤＩＨ１およびpＤcＩＮＬの形質転換に使用した。形質転換を、セクション４.１.７．に記載した基本的な形質転換方法に従って行った。３つの形質転換体(コロニー)を、各構築体から選択し、初期培養をＢＬ２１(ＤＥ３)について記載したように増殖させた。これらの培養物から、２００μlを用いて、新しいＬＢｇ(初期培養の１：２０希釈)(３.８ ml)に植菌した。非形質転換ＢＬ２１-ＡＩサンプルを、コントロールとして処理した。植菌したＢＬ２１-ＡＩ-培養物を、１.５〜３時間３７℃または３０℃、２５０rpmで、培養物のＯＤ６００が約０.４になるまで増殖させた。タンパク質産生を、Ｌ-アラビノース（２０％ストック溶液、Invitrogen)を０.２％の最終濃度になるまで、そしてＩＰＴＧを１ｍＭ、０.１ｍＭまたは０.０１ｍＭの終濃度になるまで添加することによって誘導した。また、増殖培地中でグルコースの影響を、ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩタンパク質(pＤＩＨから)の産生について試験した。グルコースを、０.１％の終濃度まで添加し、全ての他の過程を前記のとおりに行った。タンパク質分解に対する低い増殖温度(３０℃)の影響を試験する場合を除いて、発現培養物を、通常３７℃で増殖させた。タンパク質産生サンプルを収集し、ＢＬ２１(ＤＥ３)サンプルと同様に処理した。
【００７１】
４．７  タンパク質の特徴付け
バクテリアタンパク質発現からのサンプルを、収集後直ぐにＳＤＳ-ＰＡＧＥ用に調製した。ゲル上で泳動する前に、サンプルを５分間９５℃で加熱し、氷上に置いた。ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを、ニトロセルロースフィルター上でブロッティング(ウエスタンブロット)し、ブロッティングタンパク質を特異的かつ高感度の抗体染色によって同定した。抗体を用いるタンパク質の検出を、二次抗体に結合したアルカリホスファターゼ活性(Blake et al., 1984)を基準にした。
【００７２】
４．７．１．ＳＤＳ-ＰＡＧＥ
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を、Mini Protean ＩＩ（登録商標）または Mini Protean ＩＩＩ（登録商標）機器 (BIO-RAD)を用いて行った。まず、１０％泳動ゲルおよび４％スタッキングゲルを形成させた(添付書類ＩＶ；Sambrook & Russell, 2001)。分子量マーカー（１０μｌ）(SeeBlue(登録商標) Pre-Stained Standard, Invitrogen)およびサンプル（２０〜５０μｌ）およびコントロールを、スタッキングゲルのウェルで泳動させた。まず、該ゲルを、サンプルについて１０〜２０分間１００Ｖで泳動させ、濃縮(スタッキング)ゲルを介して移動させた。次いで電圧を１８０Ｖ(またはMini ProteanＩＩＩTM機器に対して２００Ｖ)まで上げ、ゲルをさらに〜６０分間泳動させた。
【００７３】
４．７．２  イムノブロッティング(ウエスタンブロット) 
ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離したタンパク質を、製造者指示書に従って、BIO-RAD Mini Trans-Blot (登録商標)機器を用いて、ニトロセルロース膜(BIO-RAD Trans-Blot Transfer Medium Pure Nitrocellulose Membrane＝０.２μm)に転写した。この転写を、冷コダック（Kodak）緩衝液中に、１００Ｖ、１時間で泳動させ、その後にこのブロットを、５分間０.５Ｍ ＴＢＳ緩衝液に浸積した。フィルター上の全てのタンパク質を、ポンソーＳ染色溶液を用いて膜を染色し、ブロットを染料により覆うことによって視覚化した(室温で５分間攪拌)。該反応を、膜を数回蒸留水で洗浄することによって停止した。次いで、膜を、ブロッキング溶液（５％ 無脂肪乾燥ミルク(ＮＦＤＭ)をＴＢＳ緩衝液で新たに作成した)にうつし、６０分間室温または４℃o/nで、回転振盪機上で振盪した。
【００７４】
この試験で使用した一次抗体は、（１）ＨＩＶ-１インテグラーゼペプチドに対する抗血清：aa ２３-３４(NIH AIDS Research & Reference Reagent Program,catalogue ＃757) および（２）マウス由来のモノクローナル抗-ポリ-ヒスチジン-アルカリ性ホスファターゼ・コンジュゲート(SIGMA)であった。（１）についての二次抗体は、ヤギ抗-ウサギＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)-ＡＰ コンジュゲート(BIO-RAD)であった。抗体検出段階での全てのインキュベーションを、回転振盪機上で行った。
【００７５】
ブロッキングの後、ブロットを、５分間ＴＢＳ-ツィーンで洗い流し、一次抗体溶液（ＴＢＳツィーン中で新しく作成した５％ＮＦＤＭ中の抗ＩＮおよび抗Ｈｉｓタグの両方で１：２０００、１０ml/膜)中で、１時間室温でインキュベーションした。抗インテグラーゼ染色を用いる場合、非結合一次抗体を、ＴＢＳツィーンで洗浄した(４ｘ５分間)。次いで、該ブロットを、１時間室温で、酵素結合二次抗体溶液中でインキュベートした(５％ＮＦＤＭ-ＴＢＳツィーン中のヤギ抗-ラビットＩｇＧ、１:３０００)。膜を、ＴＢＳツィーンですすぎ(４ｘ５分間)、非結合二次抗体を排除した。抗-ポリヒスチジン抗体染色を用いる場合、ブロットを、一次抗体のプロ-ブ化した後にＴＢＳ-ツィーン(４ｘ５分間)ですすぎ、二次抗体は用いなかった。
【００７６】
タンパク質の比色分析検出の前に、膜を、インキュベートをおおよそ５分間継続してＡＰＡ-緩衝液で平衡化した。検出を、このフィルターをＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質溶液 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)、ＡＰＡ緩衝液中のＮＢＴ／ＢＣＩＰ（１６μl/ml）中で、フィルターあたり５ml、室温で５〜１５分間インキュベートすることによって達成した。該着色反応を、脱イオン水によって数回膜を洗浄することによって停止させた。フィルターを乾燥させて、染色結果を分析した。
【００７７】
５．結果
５.１  cＩＮ、ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩおよびＩＮ-Ｈ９８Ａの発現構築体の作成
プラスミドpＬＪＳ１０は、ＨＩＶ-１インテグラーゼ（ＩＮ）(Hong et al., 1993; Sioud & Drilca, 1991)のための遺伝子を含有する。プラスミドpＣＮＰｐo６は、粘菌類Physarum Polycephalum (Muscarella & Vogt, 1989; Muscarella et al., 1990)由来の帰巣性エンドヌクレアーゼＩ-ＰpoＩをコードした真核生物イントロンに対する遺伝子を含有する。プラスミドpＣＮＰpo６ h９８a中のＩ-ＰpoＩ遺伝子(Ｉ-ＰpoＩ)は、位置９８にあるアミノ酸残基のヒスチジンをアラニンに置換する変異を有する。酵素活性部位におけるヒスチジン９８(Ｈ９８)は、ＤＮＡ解裂の効率的触媒について重要であり、アラニンへのその変異はタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を大幅に低下させる(Mannino et al., 1999)。そのため、この研究を通じて、変異したＨ９８Ａおよびエンドヌクレアーゼ的切断的に不活性なＩ-ＰpoＩ遺伝子はＨ９８Ａと呼ばれる。プラスミドpＬＪＳ１０、pＣＮＰpo６およびpＣＮＰpo６ h９８aは、それら配列の予備的確認をせずに使用に供された。
【００７８】
５.１.１  ＩＮ、Ｉ-ＰpoＩ、Ｈ９８ＡおよびcＩＮについての遺伝子のサブクローニング
ＨＩＶ-１インテグラーゼ、Ｉ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａについての遺伝子を、セクション４.２.１.に記載の通りにＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ増幅に使用したプライマー(添付書類Ｉ、表Ｉ-１)を、遺伝子の５’および３’末端で新規にＲＥ部位を導入するように設計した。２つのバージョンをＩＮ遺伝子より作成した：一つは、そのＰＣＲ-作成された３'ＸｂａＩ末端から、５'-ＳpeＩ末端Ｉ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａ(ＩＮ）に結合され、もう一つは、融合パートナー(cＩＮ;コントロールＩＮ)を含まずに発現されるようなものである。ＰＣＲ反応を、１％ＴＢＥゲル上で確認した。インテグラーゼ遺伝子のＰＣＲ産物は８７０bpsの長さであり、Ｉ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａ遺伝子からの産物は５７０bpsであった。
【００７９】
pＢluescript(Stratagene)中でＰＣＲ産物をサブクローニングするために、プラスミドを、平滑断端カッターＥｃｏＲＶを用いて消化し、ゲル抽出し、精製した。消化されたベクターのゲル抽出により、通常、非組換え体の親のベクターから生じるバックグラウンドレベルが強く低下する。Ｐfuポリメラーゼによって作成された平滑断端ＰＣＲ産物は、直線化プラスミド中に挿入物を結合する際に必要とされる５'リン酸塩を欠くので、ＳＡＰを使用しなかった。ゲル抽出のために直線化したpＢluescriptは２９６１bpsの長さであった。
【００８０】
ＰＣＲ-増幅された挿入物ＩＮ、cＩＮ、Ｉ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａを、サブセクション４.２.２に記載のとおりにＥｃｏＲＶ消化したpＢluescriptに結合させた。リガーゼの選択は、平滑断端および共結合ＤＮＡフラグメント(Sambrook および Russel, 2001)の両方を結合させるその能力からバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ(ＭＢＩ)であった。ＥcoＲＶ-消化されたpＢluescriptとＩＮ、cＩＮ、Ｉ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａの結合混合物を、Ｅ.coli ＤＨ５α細胞中に形質転換した。形質転換前に、ライゲーション混合物を、１０分間６５℃に加熱し、リガーゼを不活性化した。熱不活性化過程を、２オーダーの規模まで形質転換体の数を増加させ得る(Michelsen, 1995)。発生したコロニーの内、全ての構築体のミニプレップを、前記したとおりに制限分析(４.１.５)およびＡＧＥによって確認した。
【００８１】
ＩＮおよびcＩＮ含有クローンをスクリーニングするために、ミニプレップを、ＥｃｏＲＩを用いてまず消化した。成功したクローンは、ＴＢＥゲルにおいて可視化した場合に(図５.１.１-ＩＩＩ、ライン３-５)、サイズ４６５および３３６６bpsの２つのバンドとして出現すると考えられた。予測した結果を示すミニプレップを、さらにＲＥの、ＰａｃＩおよびＸｂａＩまたはＰａｃＩおよびcＩＮ-クローンについてはＳｆｉＩを用いる二重消化によって確認した。これらの部位を、ＰＣＲ反応における挿入末端に導入した。正確なクローンを、ＩＮおよびcＩＮ遺伝子に対応する８７０bpの大きさのフラグメントの分離によって可視化し得る。
【００８２】
同様に、Ｉ-ＰpoＩまたはＨ９８Ａのいずれかを含有するプラスミドを、ＢａｍＨＩを用いてプラスミド調製物を消化することによって調べた。正確なクローンは、３３６および３２０２bpsの２つのバンドとして出現すると考えられる。クローンを、挿入特異的制限酵素ＳpeＩおよびＳｆｉＩを用いる二重消化によってさらに確認し、これは５７０bpの大きさのＩ-ＰpoＩまたはＨ９８Ａ挿入物を作った。pＢluescriptにおけるこの挿入物の正確なクローンを、インテグラーゼについてはｐＢＩＮ、コントロールインテグラーゼについてはｐＢcＩＮ、Ｉ-ＰpoＩについてはｐＢＩＰpoＩ、およびＨ９８ＡについてはｐＢＨ９８Ａと命名した。各々正確なクローンの一つを選択し、融合遺伝子構築体を作成する際に使用した。
【００８３】
５.１.２  融合遺伝子ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩおよびＩＮ-Ｈ９８Ａの作成
ｐＢＩＮ中に存在するＩＮ遺伝子を、pＢＩＰpoＩおよびpＢＨ９８Ａから得られたＩ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａフラグメントと融合させた。それらの関連プラスミドにおける遺伝子の方向を、ＲＥ消化物によって推定した。pＢＩＮをＸｂａｌにより消化し、その５'末端は、プラスミドに結合したままであることが見出されたが、一方で、遺伝子の３’末端はプラスミドの直鎖化に伴って解離された。インテグラーゼの３’末端中へＩ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａフラグメントの融合を考慮すると、この方向は至適であった。これに対して、ｐＢＩＰpoＩおよびｐＢＨ９８Ａのクローンは、ＳpeＩによって消化された場合に挿入されたトランスジーンを分離させることがわかり、この酵素はＸｂａＩによって作成された互い違いの切断と適合し得る末端を産生する。この分離が生じたのは、挿入物３’末端(図３)に隣接するプラスミドバックボーンに、別のＳpeＩ-部位が残っているためであった。そのため、ＩＮとＩ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａの融合は、ＸｂａＩ直線化されたｐＢＩＮへ、ＳpeＩ切断「融合パートナー遺伝子」フラグメントを結合することによって達成された。
【００８４】
ＸｂａＩ直線化されたｐＢＩＮとＩＳpeＩ消化された-ＰpoＩまたはＨ９８Ａのフラグメントを含有するライゲーション混合物を、４.１.７.に記載のとおりに、ＤＨ５α細胞に形質転換した。ランダムに選択されたコロニーからのミニスケールプラスミド調製に直接処理する代わりに、望ましい遺伝子融合物を有するクローンを、コロニーＰＣＲ(４.１.９)によって、まずスクリーニングした。〜１６１０bps(pＢluescriptから１７０bp＋融合挿入物からの１４４０bp)のＰＣＲ産物は、Ｉ-ＰpoＩまたはＨ９８Ａと融合したＩＮ遺伝子を有するコロニー由来と考えられ、一方、挿入されたＩＮ遺伝子のみを有するプラスミド(「バックグラウンド」クローン)は、〜１０４０bps(１７０＋８７０bp)の産物を与える。予測される１６１０bpを示すコロニーを使用して、ＬＢａｍｐ（５mｌ）を植菌し、培養物を４.１に前記したとおりにミニプレップに処理した。
【００８５】
フラグメントの５’および３’末端の両方が、消化されたベクターと適合し得る末端を持つために、ＳpeＩ消化したＩ-ＰpoＩまたはＨ９８Ａフラグメントは、２つの方向(図４aおよび４ｂ)でＸｂａＩ消化されたｐＢＩＮに結合するようになり得る。ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩまたはＩＮ-Ｈ９８Ａ融合を含有するプラスミド調製物を、ＰvuＩＩ消化によって確認した。遺伝子融合の存在を示すことに加えて、ＰvuＩＩ消化は、それぞれに関する挿入物の方向を明らかにした。ＩＮに融合した遺伝子の正しい方向は、融合遺伝子にコードされた新規タンパク質の機能性を主に考慮している。
【００８６】
所望の融合(即ち、Ｉ-ＰpoＩまたはＨ９８Ａの５'末端はインテグラーゼの３’末端に結合した、図４ｂ）は、ＰvuＩＩによって消化した場合、サイズ３０６、７２８、８６１および約２５００bpsの４つのバンドを生じる。誤った方向では、３０６、４０３および１１８６および約２５００bpsのバンドを生じる。正しい方向性を持ったクローンを、インテグラーゼＩ-ＰpoＩ融合物をｐＩＰ、インテグラーゼＨ９８Ａ融合物をｐＩＨと命名した。
【００８７】
５.１.２.１  配列決定の結果
プラスミドpＢcＩＮ５、ｐＩＰ５およびｐＩＨ５を、pＢluescriptの標準的プライマーＴ７およびＴ３を用いて配列決定した。各配列決定反応は、pＢluescript中のトランスジーン配列の約５００bp伸張した２方向配列を提供した。プラスミドｐＩＰ５およびｐＩＨ５を、プライマーＧ４４８およびＧ４４９(表４．６-１)を用いてさらに配列決定した。これらのプライマーを用いて、融合遺伝子の中心領域の反対方向でアニーリングするように設計し、Ｔ３およびＴ７を用いて得られない配列領域を増幅させた。配列決定の結果を、得られる配列と、鋳型配列［ＡＦ０２９８８４(ＨＩＶ-１ＩＮ)、Ｍ３８１３１(Ｉ-Ｐｐｏｌ)］およびプラスミドpＣＮＰpo６およびpＣＮＰpo６ h９８aの配列とを比較することによるDNAMAN(version 5.2.9, Lynnon BioSoft)を用いて分析した。
【００８８】
pＢcＩＮ５におけるコントロールインテグラーゼ遺伝子の配列は、変異したコドンによってコードされたアミノ酸残基に影響を及ぼさなかったサイレント点変異誘発とは異なり、正しいことがわかった。これに対して、プラスミドｐＩＰ５およびｐＩＨ５の両方は、ＩＮ遺伝子の位置２１２のナンセンス変異によって影響された。この変異は、変異プラスミドの修正を必須とする発現タンパク質の大幅な切除を引き起こす。また、プラスミドｐＩＰ５およびｐＩＨ５中のＩ-ＰpoＩおよびＨ９８Ａコード部分は、プラスミド(pＣＮＰＰｏ６およびpＣＮＰＰｏ６ h９８a)提供者から得た配列情報とは異なった。この結果を評価するために、融合構築体(ｐＩＰ２およびｐＩＨ７)由来の第二のクローンを、ｐＩＰ５およびｐＩＨ５(表４.５-１)と同一プライマーを用いて配列決定した。
【００８９】
親のプラスミドpＣＮＰＰo６およびpＣＮＰpo６h９８aを、プライマーＧ７およびＦ９８７(添付書類Ｉ）を用いて配列決定した。これらのプラスミドの実際の配列が、プラスミド提供者によって与えられた最初の配列情報とは異なること、そして予測した１以上の位置(pＣＮＰpo６h９８aにおけるＨｉｓ９８変異)において互いとは異なることがわかった。配列決定pＣＮＰＰo６およびpＣＮＰＰo６h９８aから得た配列は、プラスミド提供者によって示された配列情報よりも、Ｉ-ＰpoＩ(Ｍ３８１３１)の野生型配列に、より類似していることがわかった(図５)。また、予測されるＨ９８Ａ変異の外側の配列の違いは、異なるコドンによってコードされるアミノ酸に対して効果を持たないことがわかった。そのため、pＩＰ５から得たＩ-ＰpoＩおよびＨ９８ａコード化配列およびpＩＨ５も、それらが野生型タンパク質のアミノ酸配列に対応していたため、正しいものであった。
【００９０】
図５において、代表的な同一配列、コンセンサス（「star」-)配列中のギャップは、配列の違いを示す。第一のギャップ（１）における塩基の違いは、影響されるコドンによってコードされたアミノ酸配列に対して影響は示さない。(２)における違いは、pＣＮＰpo６h９８aの提供者（コドンは太字で示し、ｗｔはＨｉｓをコードし、変異したコドンはＡｌａをコードする)から得られる配列中のＧＣＮとして示されるＨｉｓ９８変異以外はサイレントである。(３)の場合は、Ｉ-ＰpoＩのｗｔ配列と比較して親のプラスミドの配列の違いを示すが、プラスミドpＣＮＰpo６h９８aの実際の配列は、ｗｔ配列と同一であることがわかった。プラスミドpＣＮＰpo６は、予測されたＨｉｓ９８コード化トリプレットにおいてｗｔ配列とは唯一相違した。
【００９１】
５.１.３  ｐＩＰ５およびｐＩＨ５における変異の修正
pＢcＩＮ５におけるＩＮ遺伝子は、ｐＩＰ５およびｐＩＨ５融合挿入プラスミドの位置２１２に見出されたナンセンス変異を含有しなかった。これは、幾分、異なる目的(異なるプライマーを持つ；添付書類Ｉ)に対してインテグラーゼ遺伝子を増幅するために使用した別のＰＣＲ反応を理由とする、そして一つの反応におけるＰＣＲ産物に関する起こりうる不均質性を理由とする。
【００９２】
ナンセンス変異を担持するｐＩＰ５およびｐＩＨ５プラスミドを、ｐＢcＩＮ中の変異していないＩＮ遺伝子を利用して修復した。５２７bpsのフラグメントを、ＰａｃＩおよびＡｆＩＩを用いて変異していないpＢcＩＮ５から分離した。ｐＩＰ５およびｐＩＨ５を、２つの酵素を用いて同様に消化し、ＳＡＰを用いて処理した。ゲルから抽出し、精製したｐＢcＩＮフラグメント(５２７bp)を、対応するフラグメントを欠いている、消化、ゲルから抽出され、精製したｐＩＰ５およびｐＩＨ５(３８８０bp)のプラスミドバックボーンに結合された。結合が成功したクローンを、プラスミド調製物を配列決定することによって唯一確認し得た。成功したクローンを見出す可能性を増加させるために、ミニプレップを、低いレベルのバックグラウンド(ライゲーション)コントロールコロニーを有する形質転換体からのみ調製した。修正されたｐＩＰ５およびｐＩＨ５(プラスミドpkorj.ＩＰ３、pkorj.ＩＨ７)の最初の配列決定したサンプルは、ナンセンス変異を欠くことが判り、変異の修正は成功した。新規融合遺伝子調製物を、ゲートウェイＰＣＲにおいて使用した。
【００９３】
５.１.４  ゲートウェイ（ＧＷ)ＰＣＲ
ゲートウェイＰＣＲ(４.２.５.１)を、attＢ１/Ｂ２-部位および５'Ｈｉｓタグ導入化プライマー(添付書類Ｉ、表１-２)およびFailSafeTM PCR PreMix 選択キット(Epicentre)を用いて行った。プライマーＧ４４５(５')、Ｇ２３８(３'ＩＮ-ＰｐｏおよびＩＮ-Ｈ９８Ａ)およびＧ４０２(３'cＩＮ)の長さは、各々８６、７０および５４bpsであり、そのため１１０または１０４bpsは、挿入末端全体に新規に導入される。増幅pkorj.ＩＰ３、pkorj.ＩＨ７からのＰＣＲ産物の考えられるサイズは、１４４０＋１１０＝１５５０bpsであり、pＢcＩＮ５については９７４bps(８７０＋１０４)であった。ＰＣＲ反応を、０.８％ＴＢＥゲルで泳動させ、正しいサイズのバンドをゲル抽出し、精製した。
【００９４】
５.１.５  最終発現ベクターの構築
ＢＰ反応を、製造者指示書(GATEWAYTM Cloning Technology,GibcoBRLt), Life Technologies)に従って、プラスミドpkorj.ＩＰ３、pkorj.ＩＨ７およびpＢcＩＮ５のＧＷ-ＰＣＲ産物のために行った。得られるエントリークローン(pDONRTM プラスミド 調製物)を、ＰvuＩＩ(ＭＢＩ）消化によって確認した。正しいクローンを、ＩＮ-ＰｐｏおよびＩＮ-Ｈ９８Ａ融合遺伝子から作成されたプラスミド調製物の場合に、２４８０、８１０および５６０bpsの３つのバンドの存在によって同定した。cＩＮ遺伝子(pEntryCＩＮ 1-3)を担持するエントリークローンを、ＰvuＩＩを用いて同様に制限分析した。空のプラスミドは６０２bpフラグメントを提供するが、正しいクローンは、〜８５０bp フラグメントの分離物として可視化される。
【００９５】
エントリークローンプラスミド(pIPentry3、pIHentry1およびpEntryCＩＮ1)と目的ベクターｐＢＶboostＦＧとの間のＬＲ反応によって作成された目的ベクターを、製造者指示書に従って同様に実施した。ミニプレップを、ＬＲ-反応から得られるコロニーのクローンから処理し、ＰvuＩＩ消化によって確認した。正しい発現クローンpＤＩＰ１-５およびpＤＩＨ１-５を、約４８００、２６００、８００、５４２および１４４bpサイズの５つのバンドの出現によって特徴付けた。ＰvuＩＩ消化したインタクトなプラスミドｐＢＶboostＦＧを、コントロール(サイズ４９７３、２６８４、１４３３および１４４bpsの４つのバンドを生じる)として目的プラスミド消化物の隣で泳動した。cＩＮを含有する正しい発現プラスミドを、ＰvuＩＩ(図５.１.５-ＩＶ)による消化に対する約８００bpsフラグメントの分離によって同定できる。考えられるパターンを示すクローンを、pＤＩＰ、pＤＩＨおよびｐＤcＩＮと命名し、最初のＤは目的プラスミドを表す。
【００９６】
最終発現ベクター(クローンpＤＩＰ２、pＤＩＨ１およびｐＤcＩＮ １)における遺伝子構築体を、表４.１.５-Ｉに列挙したプライマーを用いる配列決定によって評価した。配列決定の結果は、クローンpＤＩＰ２、pＤＩＨｌおよびpＤcＩＮ１が正しいことを明らかにした。これらのプラスミド調製物を、バクテリアタンパク質産生(４.６)に使用した。
【００９７】
５.２  インテグレーション標的プラスミド(pＰＰＯ部位)を調製すること
Ｉ-ＰpoＩについての解裂部位を含有するプラスミドを調製するために、Ｉ-ＰpoＩ認識配列を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＥｃｏＲＶ部位中に挿入した。１５bp認識配列を含有するオリゴヌクレオチドリンカー(Ｉ-Ｐpo-オリゴ)の調製、ならびにプラスミドｐＰＰＯ部位を作成する際の他の過程はセクション４.３に記載される。
【００９８】
ｐＰＰＯ部位-プラスミドミニプレップを、酵素Ｉ-ＰpoＩ(Promega)を用いる制限分析によって確認した。Ｉ-Ｐpo-リンカーを担持するクローンは、消化によって直線化した。さらに、１つのクローン(pＰＰＯ部位＃６)を、プライマーＴ７およびＴ３を用いてプラスミドを配列決定することによってさらに確認した。配列決定から、Ｉ-Ｐpo-リンカーが、ＥｃｏＲＶ消化されたpＢluescriptにおいて２つのコピーとして導入されたということが明らかとなった。リンカーの配列は正しかった。
【００９９】
５.３  インテグレーションのための基質作成(pＢ２ＬＴＲ+ＥＧＦＰ)
ＨＩＶ-１インテグラーゼ基質のための要件は次のとおりである；それは、平滑末端で二本鎖ＤＮＡであって、ウイルス５’および３’長い末端反復末端(ＬＴＲ)(Brown, 1997)の各々の少なくとも１５塩基対によってフランキングされたＤＮＡであるべきである。ＬＴＲの末端２０塩基対は、ＨＩＶ-１ ＩＮによってインテグレーションに必要な重大な配列を含有し、最も重要なジヌクレオチド３'ＣＡの２つの塩基は、各ＬＴＲの末端から離れている(Brin & Leis, 2002a）。
【０１００】
ＬＴＲ末端を、pＢluescriptへ簡単にクローニングできるように、そして後にＬＴＲの間のマーカー遺伝子カセットを挿入できるように設計する（図６を参照されたい)。５'ＬＴＲを、その５’末端からのＫpnＩ-消化したpＢluescriptに、そしてその３’末端からのもう一つのＬＴＲに適するように設計した。３'ＬＴＲを、その３’末端のＳpeＩ部位からpＢluescriptに結合するように、そしてそのＳphＩ部位からの５'ＬＴＲと結合するように設計した。さらに、余分なエンドヌクレアーゼ解裂部位を、両方のＬＴＲ配列に導入した：ＬＴＲ配列に部分的にはめ込まれたＳcaＩ部位は、その両方の３’末端において、重要なＣＡジヌクレオチドを担持するＬＴＲ末端に挟まれたＥＧＦＰカセットの開放を可能にする。２つのヌクレオチドはＬＴＲ末端からはなれている。
【０１０１】
図５において、上流配列は５'ＬＴＲを示し、下流配列は３'ＬＴＲに対応する。ＳcaＩの制限部位には下線が引かれ、各３’末端におけるＣＡ-ジヌクレオチドは太字である。
【０１０２】
５’および３’ＬＴＲの調製、ならびにＫpnＩおよびＳpeＩ消化されたpＢluescriptへのそれらの結合は、セクション４.４に記載される。ミニプレップを、ＭＣＳに挿入された短いＬＴＲ配列(αフラグメント遺伝子の読み取りを部分的に妨害される)をおそらく持っている明るいブルーコロニーから処理した。プラスミド調製物(pＢ２ＬＴＲ＃１-３)を、ＳcaＩ(ＭＢＩ)を用いる制限分析によって確認した。２つのＬＴＲの挿入を、pＢluescript中のすでに存在している部位に加えて、ＳcaＩのための２つの制限部位を作成した。即ち、両方のＬＴＲを有する正しいクローンは、pＢluescriptからの１１６０bpsの長鎖フラグメントの分離によって(ＬＴＲの間の配列は、その短さのために検出できない)同定される。ＬＴＲ間のマーカー遺伝子カセットを挿入するまえに、pＢ２ＬＴＲ-プラスミド調製物(pＢ２ＬＴＲ＃１)を、配列決定によって確認した。プライマーＴ７およびＴ３を用いて得られた配列決定の結果は、予測されるような、即ち正しく挿入された５’および３’ＬＴＲの両方を有するプラスミドを示した。
【０１０３】
ｐＢＶboostＦＧ-ＥＧＦＰからＥＧＦＰマーカー遺伝子カセットを含有する３重プロモーターを、ＳphＩを用いて切断した。カセットを、４.４に記載のしたような５'および３'ＬＴＲ(pＢ２ＬＴＲ＃1)を担持するpＢluescript構築体に導入した。２６２０bpカセットの挿入は、平滑断端ＥＧＦＰカセットを含まないように設計されたミニプレップをＳcaＩを用いて消化することによって確認できる。正しいクローンを、ＥＧＦＰマーカー遺伝子カセット(約２６２０bp)の分離およびプラスミドバックボーンから得られる約１１００および１８００bpsの２つのバンドによって同定した。制限分析は、８/１０の試験したミニプレップが正しいことを示した。ＥＧＦＰカセットの配列は、ｐＢＶboostＦＧにおいてその配列確認後に修飾されていなかったので、正しいと考えられた。ＬＴＲに関するカセットの方向は、カセットそれ自身がＥＧＦＰの発現に必要なプロモーターエレメントを担持するため、重要ではなかった。
【０１０４】
５．４  バクテリアタンパク質産生および分析
融合遺伝子ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩおよびＩＮ-Ｈ９８Ａを、それらがコードする新規融合タンパク質の機能性を試験するため、およびそれを元々のＨＩＶ-１ インテグラーゼ (クローンＨＸＢ２、この研究ではcＩＮ)の活性と比較するために作成した。遺伝子を、タンパク質を産生し得るために目的ベクター(ｐＢＶboostＦＧ)にうつした。タンパク質産生実験を、Ｅ.coli 株ＢＬ２１(ＤＥ３)(Stratagene)および発現宿主としてＢＬ２１-ＡＩTMOne Shots（登録商標)(Invitrogen)を用いて、バクテリア細胞で行った。
【０１０５】
５.４.１  ＳＤＳ-ＰＡＧＥのためのサンプル収集および調製
バクテリアを、４.１.７に記載したように発現ベクターpＤＩＰ２、pＤＩＨ１およびｐＤcＩＮ１を用いて形質転換した。発現試験のための陽性コントロールとして、またプラスミドpＩＮＳＤ.Ｈｉｓ(Engelman および Craigie 1992, Craigie et al 1995)を、発現宿主バクテリアに形質転換した。バクテリアコロニーを、細胞密度がＯＤ６００値０.６-１に達するまで、振盪インキュベーターにおいて増殖させた。この段階で、培養物の一部を、新しいＬＢｇ培地に植菌し、実際の発現培養物をつくった。グリセロールストックを、各クローンの残存開始培養物から作成した。発現培養物を、所望のタンパク質を過剰発現するバクテリアの能力を最高にするために、細胞密度が中間対数増殖期(ＯＤ６００〜０.４)に達するまで増殖させた。ウエスタンブロットのためのコントロールとして、非形質転換バクテリアサンプルを、実際の発現サンプル(および陽性コントロール)と共に処理した。
【０１０６】
Ｅ.coli ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞培養におけるタンパク質産生を、ＩＰＴＧ(１００ｍＭ)をｌｍＭの終濃度(ｃfinal)まで添加することによって誘導した。ＩＰＴＧの添加により、ｌａｃＵＶ５プロモーターからのＲＮＡポリメラーゼＴ７(Ｔ７ＲＮＡＰ)の発現を誘導する。しかし、Ｔ７プロモーターの発現は漏出性である、即ちこの細胞において誘導因子の非存在下でも「オン」である。これは異種タンパク質の非誘導性発現をもたらす可能性があり、タンパク質産物が毒性である場合に不都合を示し得る。実際に、pＤＩＰ２の遺伝子産物が、ＬＢプレート上で形質転換されたバクテリアの増殖、さらにＬＢ培地におけるバクテリア培養物の成長を妨害することを観察した。そのため、厳密な発現コントロールは、バクテリアタンパク質産生に関連のある問題であった。
【０１０７】
ＢＬ２１-ＡＩTM One Shot(登録商標)細胞を、ＩＰＴＧ(ｃfinal-０.０１ｍＭ)およびＬ-アラビノース(ｃfainal ０.２％)の添加によって誘導した。Ｌ-アラビノースの誘導は、ＢＬ２１-ＡＩにおいてaraＢＡＤプロモーター(ＰＢＡＤ)(Lee 1980, Lee et al., 1987)からのＴ７ＲＮＡＰの発現を誘導するために必要であった。Ｔ７ＲＮＡＰレベルはＢＬ２１-ＡＩにおいて厳密に制御され得るために、この株は可能な毒性遺伝子を発現するために特に適当であると考えられた。様々な量のＩＰＴＧを、過剰発現したタンパク質の安定性に対する様々な誘導レベルの効果を試験するためにスクリーニングした。また、異なる増殖条件(低温度、グルコースの添加)を、同じ目的で試験した。
【０１０８】
株ＢＬ２１(ＤＥ３)およびＢＬ２１-ＡＩの両方は、バクテリア細胞中で発現した異種タンパク質の分解を引き起こすプロテアーゼ ｌｏｎおよびＯｍｐＴ(外膜プロテアーゼ)の欠損株である(Grodberg & Dunn, 1988; Studier & Moffat, 1986)。即ち、これらのプロテアーゼの欠失により、異種タンパク質発現試験でのタンパク質分解の可能性が低下する。
【０１０９】
異種タンパク質の発現および安定性についての理想的な時間を定義するために、１時間、２時間、３時間および４時間(または、それらの内のいくつか)の時点を、両方の株を用いる発現実験中に採取した。サンプルを、誘導(Ｏｈ、ＵＩ)前に培養物から採取し、基底タンパク質発現のレベルを評価した。全てのサンプルを収集し、セクション４.７に記載のとおりに調製した。細胞のペレット化直後にサンプルを沸騰させることは、細胞を溶解させ、宿主細胞内プロテアーゼを不活性化するために重要であった。ＢＬ２１(ＤＥ３)形質転換体から得られたサンプルの一部を、サンプル調製直後に凍結させ(細胞のペレット化およびＳＤＳ-ＰＡＧＥサンプル緩衝液の添加)、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で泳動する直線に沸騰させた。タンパク質産生を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ(４.７.１)およびウエスタンブロッティング(４.７.２)によって分析した。
【０１１０】
５.４.２  ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング
変性ＳＤＳ-ＰＡＧＥを、４.７.１に記載のとおりに行った。タンパク質を、ウエスタンブロットの間にニトロセルロース膜上にブロッティングし、４.７.２に記載したとおりに染色した。ポリ-ヒスチジン認識抗体による染色から、Ｎ-末端６xＨｉｓ融合を担持するフラグメントのサイズが明らかになり、一方でＨＩＶ-１インテグラーゼ特異抗体による染色から、ＩＮタンパク質のＮ-末端領域(アミノ酸２３-３４）を担持する全てのフラグメントが明らかになった。Ｉ-ＰpoＩ特異抗体は使用できなかったが、タンパク質から得られたｐＤcＩＮと比較して、pＤＩＰ２およびpＤＩＨ１発現培養物から得たタンパク質のサイズの違いは、正しい融合タンパク質の存在を明らかにした。ｐＤcＩＮから発現したタンパク質産物は、３２ｋＤａ(単量体のwtＨＩＶ-１ インテグラーゼとして）であると考えられ、ＩＮ-Ｈ９８Ａ(pＤＩＨ)およびＩＮ-Ｉ-ＰpoＩ(pＤＩＰ)の融合物５０ｋＤａ(３２ｋＤａの＋Ｉ-ＰpoＩまたはモノマ-あたり１８ｋＤａのＨ９８Ａ)であると考えられる。免疫ブロット染色のための陽性コントロールを、ｐＤcＩＮ１、pＤＩＰ２およびpＤＩＨ１からの発現サンプルを処理したような同じ方法で、プラスミドpＩＮＳＤ.Ｈｉｓから調製した。このＨｉｓタグ付加コントロールは、この研究において使用した両抗体と反応し、クローニングされたインテグラーゼのサイズおよびタンパク質のＮ末端のポリ-ヒスチジンタグの存在を明らかにした。
【０１１１】
ＢＬ２１(ＤＥ３)における発現サンプルから得た免疫ブロットは、染色手順において特異抗体の相互作用から生じる予測したタンパク質のバンドの存在を示した。pＤＩＨ、pＤＩＰおよびｐＤcＩＮの正しいサイズの遺伝子産物に加え、多数の小さなバンドは、このブロットに存在した。タンパク質は発現経路のある時点で分解にされると考えられ、おそらくＴ７プロモーター由来の強力な基底発現および細胞内での間接的な大量の異種タンパク質が原因であろう。異種タンパク質の発現は、タンパク質の不安定性に関与すると考えられたＢＬ２１(ＤＥ３)培養物の非誘導状態で既に存在した。
【０１１２】
発現プラスミドpＤＩＰ２で形質転換した場合に、培養したＥ.coli ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞において、バクテリア増殖の顕著な阻害を観察した。第一に、バクテリアをpＤＩＰ２で形質転換した場合、どのようなコロニーを得ることも困難であった。第二に、初期培養物、ならびにpＤＩＰ２形質転換されたＢＬ２１(ＤＥ３)細胞の発現培養物の両方は、仮に増殖しても非常に遅い増殖であった。最終的に、誘導されたpＤＩＰ２形質転換ＢＬ２１(ＤＥ３)培養物から抽出され得る細胞は、非常に少量の発現ＩＮ-Ｉ-ＰpoＩタンパク質を有した。
【０１１３】
毒性タンパク質の発現に対してより適切な株で発現した場合に、pＤＩＰ２、pＤＩＨ１およびｐＤcＩＮ１の発現産物がより安定であるかどうかを試験するために、Ｅ.coli 株 ＢＬ２１-ＡＩ(図５.４.２-ＩＩ〜５.４.２-Ｖ)を用いて実験を繰り返した。イムノブロッティングの結果は、ＢＬ２１(ＤＥ３)よりもＢＬ２１-ＡＩにおいて、低い基底発現のレベルを示したが、タンパク質安定性における明白な増強は観察できなかった。ＩＰＴＧ誘導の様々なレベルは、ＤcＩＮ１およびpＤＩＨ１からの発現レベルを変化させなかった、それらいずれもタンパク質の安定性には影響しなかった。
【０１１４】
pＤＩＰ２からのＩＮ-Ｉ-ＰpoＩタンパク質の発現は、pＤＩＰ２感染ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞によってすでに観察されたように妨害された。即ち、タンパク質産物は、この研究で使用した発現宿主について毒性であると考えられた。ＬＢプレートおよび増殖培地へのグルコース（０.１％)の添加を、pＤＩＰ２を用いて試験した、というのはＢＬ２１-ＡＩ細胞[ＢＬ２１-ＡＩ細胞(Invitorogen)のためのマニュアルおよびそれらの引例]における毒性遺伝子からの基底レベルの発現と関連のある問題を防ぎ得るためである。グルコースの添加により、タンパク質の発現レベルに対する強力な抑制効果を持つことが見出されたが、タンパク質分解に対する顕著な改善は観察されなかった。
【０１１５】
【表２−１】
2007535308.tif 000003
【表２−２】
2007535308.tif 000004
【０１１６】
【表２−３】
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【０１１７】
【表２−４】
2007535308.tif 000006
【０１１８】
【表２−５】
2007535308.tif 000007
【０１１９】
【表２−６】
2007535308.tif 000008
【０１２０】
【表２−７】
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【０１２１】
【表２−８】
2007535308.tif 000010
本明細書に明記したあらゆる書類の内容は、出典明示により本明明細書の一部に含まれる。
【０１２２】
添付書類Ｉ
【表３】
2007535308.tif 000011
【０１２３】
【表４】
2007535308.tif 000012
【０１２４】
【表５】
2007535308.tif 000013
【０１２５】
【表６】
2007535308.tif 000014
【０１２６】
添付書類ＩＩ
【表７】
2007535308.tif 000015
【０１２７】
添付書類ＩＩＩ
１）GeneRuler TM 100bp  DNA Ladder (MBI)
２）GeneRuler TM 1kbp  DNA Ladder (MBI)
３）GeneRuler TM DNA Ladder Mix (MBI)
４）１Kb  DNA Ladder (NEB)
【０１２８】
【表８−１】
2007535308.tif 000016
【表８−２】
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【０１２９】
【表８−３】
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【０１３０】
【表８−４】
2007535308.tif 000019
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
原文に特記なし
【図１】
2007535308.tif 000020
【図２】
2007535308.tif 000021
【図３】
2007535308.tif 000022
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月20日(2007.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007535308000001.app
【国際調査報告】
2007535308.tif 000026
2007535308.tif 000027
2007535308.tif 000028
2007535308.tif 000029