(57)【要約】本発明は、内因性ＣＭＰ−シアル酸を欠く非ヒト宿主において、ＣＭＰ−シアル酸を生成するための方法を提供する。この方法は、この宿主に、細菌、哺乳動物またはハイブリッドのＣＭＰ−シアル酸生合成経路に由来する、ＣＭＰ−シアル酸合成に関与する酵素を提供することによる。シアル化糖タンパク質の生成のためにＣＭＰ−シアル酸生合成経路を発現する新規な真菌宿主も提供される。この経路は、内因性ＣＭＰ−シアル酸を欠く非ヒト宿主細胞における糖タンパク質のシアル化に特に有用である。
2007529228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを含む組換え非ヒト宿主細胞であって、ここで該宿主細胞は、ＣＭＰ−Ｓｉａを欠いている、組換え非ヒト宿主細胞。
【請求項２】
ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを含む、組換え真菌宿主細胞。
【請求項３】
ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を含む、組換え真菌宿主細胞。
【請求項４】
ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成に関与する１種以上の酵素を含む、組換え真菌宿主細胞。
【請求項５】
ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
【請求項６】
前記ＣＭＰ−Ｓｉａは、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、およびケト−３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノノン酸（ＫＤＮ）から選択されるシアル酸を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＢおよび哺乳動物のＣＭＰ−シアル酸シンターゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を発現する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ、シアル酸シンターゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼ、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスファターゼおよびＣＭＰ−シアル酸シンターゼから選択される少なくとも１つの酵素活性を発現する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ、Ｓｉａ−９−ＰおよびＳｉａからなる群より選択される少なくとも１種の中間体を生成する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞は、エリスロポエチン、サイトカイン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω、ＴＮＦ−α、顆粒球−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、ＩＬ−１ｒａ、凝固因子類、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒトプロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩおよびトロンボポエチン、ＩｇＡ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＧ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＡ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＤ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＥ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＭ抗体およびそのフラグメント、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ウロキナーゼ、カイメース、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、ＦＳＨ、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮細胞増殖因子−２、骨髄前駆細胞阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、α−フェトプロテインおよびグルコセレブロシダーゼからなる群より選択される異種治療用タンパク質を発現する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
【請求項１２】
真菌宿主細胞においてＣＭＰ−Ｓｉａを生成するための方法であって、該方法は、ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を発現する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
原核生物のＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路に由来する少なくとも１つの酵素活性を発現する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物のＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路に由来する少なくとも１つの酵素活性を発現する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法は、哺乳動物のＣＭＰ−シアル酸シンターゼ活性を発現する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
ハイブリッドＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を発現する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＢおよび哺乳動物のＣＭＰ−シアル酸シンターゼ活性から選択される少なくとも１つの酵素活性を発現する工程を包含する、請求項１２または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ酵素活性は、前記宿主細胞の核中に位置している、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＭＰ−シアル酸シンターゼは、前記宿主細胞を増殖させるための培地に、ＣＭＰ−Ｓｉａ合成において使用される１種以上の中間体基質を補充することによって増強される、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記酵素活性は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下で発現される、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現される酵素活性は、該酵素活性をコードする部分的ＯＲＦに由来する、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記発現される酵素は、別のタンパク質またはペプチドへの融合物である、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記発現される酵素は、該酵素活性を増強するかまたは弱くするように変異されている、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞は、エリスロポエチン、サイトカイン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω、ＴＮＦ−α、顆粒球−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、ＩＬ−１ｒａ、凝固因子類、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒトプロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩおよびトロンボポエチン、ＩｇＡ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＧ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＡ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＤ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＥ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＭ抗体およびそのフラグメント、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ウロキナーゼ、カイメース、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、ＦＳＨ、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮細胞増殖因子−２、骨髄前駆細胞阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、α−フェトプロテインおよびグルコセレブロシダーゼからなる群より選択される異種治療用タンパク質を発現する、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
組換え糖タンパク質を生成するための方法であって、該方法は、真菌宿主においてＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを生成する工程および該糖タンパク質を該宿主において発現させる工程を包含する、方法。
【請求項２７】
組換え糖タンパク質を生成するための方法であって、該方法は、真菌宿主においてＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を操作する工程および該糖タンパク質を該宿主において発現させる工程を包含する、方法。
【請求項２８】
前記組換え糖タンパク質は、エリスロポエチン、サイトカイン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω、ＴＮＦ−α、顆粒球−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、ＩＬ−１ｒａ、凝固因子類、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒトプロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩおよびトロンボポエチン、ＩｇＡ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＧ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＡ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＤ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＥ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＭ抗体およびそのフラグメント、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ウロキナーゼ、カイメース、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、ＦＳＨ、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮細胞増殖因子−２、骨髄前駆細胞阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、α−フェトプロテインおよびグルコセレブロシダーゼからなる群より選択される治療用タンパク質である、請求項２６または２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００４年３月１７日出願の米国仮特許出願第６０／５５４，１３９号（この開示は、その全体が本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、タンパク質のグリコシル化の分野に関する。本発明はさらに、シチジンモノホスフェート−シアル酸（ＣＭＰ−Ｓｉａ）経路において活性をコードする遺伝子を含む新規な宿主細胞に関する。この経路は、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞における糖タンパク質のシアル化に特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
シアル酸（Ｓｉａ）は、ヒトデからヒトにいたるまで、新口動物系統の動物において遍在するＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）のＮ−置換型誘導体またはＯ−置換型誘導体の特有の群である。大部分の植物、原生生物、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）および真正細菌を含め、他の生物において、これらの化合物は、存在しないと考えられている（Ｗａｒｒｅｎ，Ｌ．１９９４）。例外が同定されているものの、それらは全て、特定の細菌、原生動物および真菌を含む病原性生物においてである（Ｋｅｌｍ，Ｓ．およびＳｃｈａｕｅｒ，Ｒ．１９９７）（Ｐａｒｏｄｉ，Ａ．Ｊ．１９９３）（Ａｌｖｉａｎｏ，Ｃ．Ｓ．，Ｔｒａｖａｓｓｏｓ，Ｌ．Ｒ．ら，１９９９）。病原性真菌（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓおよびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられる）が、細胞表面糖タンパク質および糖脂質上でシアル酸を獲得する機構は、未確認のままである（Ａｌｖｉａｎｏ，Ｃ．Ｓ．，Ｔｒａｖａｓｓｏｓ，Ｌ．Ｒ．ら，１９９９）。しかし、これらの生物がシアル酸なしの培地中で増殖される場合、シアル酸残基は、細胞グリカンに見出されることが実証されている。このことは、シアル酸のデノボ合成を示唆している。これまで、シアル酸の生合成に関与する酵素は、真菌において同定されていなかった。原生動物が細胞表面グリカンをシアル化する機構は、十分に特徴づけられた。原生動物（例えば、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）は、ＣＭＰ−Ｓｉａ非依存性の機構で、シアル酸を細胞表面糖タンパク質および糖脂質に付加する外部のトランス−シアリダーゼを有する（Ｐａｒｏｄｉ，ＡＪ．１９９３）。真菌における類似のトランス−シアリダーゼの同定は、細胞グリカンへのシアル酸転移の機構を解明する一助となるが、このようなタンパク質は、未だ同定されておらず、単離もされていない。
【０００４】
真菌におけるシアル酸生合成の欠如および／または不明確さにも拘わらず、病原性細菌および哺乳動物細胞におけるシアル酸生合成は、十分に理解されている。病原性細菌の群は、シアル酸をデノボ合成して、細胞表面で起こるシアル化糖脂質を生成する能力を有すると同定された（Ｖｉｍｒ，Ｅ．，Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｅｎ，Ｓ．ら，１９９５）。これらの病原性生物の表面のシアル酸は、宿主免疫系から逃れる手段であると主に考えられているものの、これらの同じシアル酸分子はまた、高等生物における多くのプロセス（タンパク質標的化、細胞間相互作用、細胞−基質認識および接着が挙げられる）に関与していることが示された（Ｓｃｈａｕｅｒら，２０００）。
【０００５】
シアル酸の存在は、生物学的活性およびインビボでの半減期に影響を及ぼし得る（ＭａｃＤｏｕｇａｌｌら，１９９９）。例えば、シアル酸の重要性は、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）の研究において実証された。この糖タンパク質のＮ結合型グリカンの炭水化物鎖上の末端シアル酸残基は、血液からのｈＥＰＯの急激なクリアランスを防止し、インビボでの活性を改善する。ガラクトース残基が末端であるアシアロ化ｈＥＰＯ（アシアロ−ｈＥＰＯ）は、インビボでの赤血球生成活性を劇的に減少させた。この減少は、肝臓のアシアロ糖タンパク質レセプターによるこのアシアロ−ｈＥＰＯの増大したクリアランスによって引き起こされる（Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．Ｎ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．ら，１９８９）（Ｓｐｉｖａｋ，Ｊ．Ｌ．およびＨｏｇａｎｓ，Ｂ．Ｂ．１９８９）。同様に、多くの治療用糖タンパク質に末端シアル酸が存在しないと、効力が低下し得、よって、より頻繁な投与が必要になる。
【０００６】
現在利用可能な治療用糖タンパク質の多くは、哺乳動物細胞株において生成されているが、これらの系は高価であり、代表的には、低い製品力価を生じる。これらの欠点を克服するために、製薬業界では、現在新しいアプローチを調査している最中である。１つのアプローチは、真菌系において糖タンパク質を生成することである。真菌発現系は、維持するのにそれほど高価でなく、より高い力価／単位培養物を生成することができる（Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．ら，２０００）。しかし、その欠点は、真菌および哺乳動物のグリコシル化が大きく異なり、非ヒトのグリコシル化を有する治療用糖タンパク質は、ヒトにおいて免疫応答を誘発する危険性が高いことである（Ｂａｌｌｏｕ，Ｃ．Ｅ．，１９９０）。小胞体におけるＮ結合型グリコシル化の最初の段階は、真菌および哺乳動物に似ているが、ゴルジにおけるその後のプロセシングは、劇的に異なるグリカンを生じる。にも拘わらず、これらの多様なグリコシル化経路は、特許文献１、特許文献２、特許文献３、Ｃｈｏｉら，２００３およびＨａｍｉｌｔｏｎら，２００３に記載されるように、ヒト様糖タンパク質を生成するために真菌宿主を遺伝的に操作することによって克服され得る。従って、完全にシアル化されたヒト様糖タンパク質を生成することができる新規なタンパク質発現系（例えば、真菌系）を有することは、望ましい。
【０００７】
内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞の中にＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を遺伝子工学で作る（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）方法が必要である。内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主としては、大部分の加藤真核生物（例えば、真菌）、大部分の植物および非病原性細菌が挙げられる。
【０００８】
これまで、糖基質であるＣＭＰ−Ｓｉａの内因性プールからシアル化糖タンパク質を生成する真菌系は、全く同定されていなかった。よって、必要なのは、シアル化に必要なその基質が、治療様糖タンパク質の生成のために有用な量で存在することを確実にするために、ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主（例えば、真菌宿主）の中に遺伝子工学で作る方法である。
【特許文献１】国際公開第０２／００８７９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０５６９１４号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
機能的ＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−Ｓｉａ）生合成経路を、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）の中に遺伝子工学で作る方法が提供される。この方法は、哺乳動物起源、細菌起源またはその両方のいくつかの酵素を、宿主細胞（特に真菌宿主細胞）においてクローニングおよび発現することを包含する。この遺伝子工学で作られたＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路は、シアル化糖脂質、シアル化Ｏ−グリカンおよびシアル化Ｎ−グリカンをインビボで生成するために有用である。よって、本発明は、内因性シアル化を欠く非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）においてシアル化治療用糖タンパク質の生成を容易にするために有用である。
【００１０】
（ＣＭＰ−ＳｉａまたはＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路の細胞プールを含む改変宿主）
本発明は、ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを含む組換え非ヒト宿主細胞を包含し、ここで該宿主細胞は、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠いている。一実施形態において、このＣＭＰ−Ｓｉａは、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、およびケト−３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノノン酸（ＫＤＮ）から選択されるシアル酸を含む。
【００１１】
本発明はさらに、ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を含む、組換え非ヒト宿主細胞をさらに含み、ここでこの宿主細胞は、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠いている。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、ＣＭＰ−Ｓｉａの生合成に関与する１種以上の組換え酵素を含む非ヒト宿主細胞を包含し、ここでこの宿主細胞は、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠いている。
【００１３】
一実施形態において、本発明の宿主細胞は、真菌宿主細胞である。
【００１４】
一実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ、Ｓｉａ−９−ＰおよびＳｉａからなる群より選択される少なくとも１種の中間体を生成する。一実施形態において、その中間体はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃである。一実施形態において、その中間体はＭａｎＮＡｃである。一実施形態において、その中間体はＭａｎＮＡｃ−６−Ｐである。一実施形態において、その中間体はＳｉａ−９−Ｐである。一実施形態において、その中間体はＳｉａである。
【００１５】
一実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを含む。一実施形態において、このＣＭＰ−Ｓｉａは、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、およびケト−３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノノン酸（ＫＤＮ）から選択されるシアル酸を含む。
【００１６】
一実施形態において、本発明の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＢおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＡから選択される１種以上の酵素活性を発現する。
【００１７】
一実施形態において、本発明の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＢおよび哺乳動物のＣＭＰ−シアル酸シンターゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を発現する。
【００１８】
一実施形態において、本発明の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＢおよび哺乳動物のＣＭＰ−シアル酸シンターゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を発現し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ、シアル酸シンターゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼ、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスファターゼおよびＣＭＰ−シアル酸シンターゼから選択される少なくとも１つの酵素活性をさらに発現する。
【００１９】
一実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ、シアル酸シンターゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼ、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスファターゼおよびＣＭＰ−シアル酸シンターゼから選択される少なくとも１つの酵素活性を発現する。
【００２０】
一実施形態において、本発明の宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＣを発現する。一実施形態において、本発明の宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＢを発現する。一実施形態において、本発明の宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＡを発現する。
【００２１】
一実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼの酵素活性を発現する。一実施形態において、本発明の宿主細胞は、シアル酸シンターゼの酵素活性を発現する。一実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼの酵素活性を発現する。一実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの酵素活性の酵素活性を発現する。一実施形態において、本発明の宿主細胞は、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼの酵素活性を発現する。一実施形態において、本発明の宿主細胞は、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼの酵素活性を発現する。一実施形態において、本発明の宿主細胞は、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスファターゼの酵素活性を発現する。一実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼの酵素活性を発現する。
【００２２】
一実施形態において、ＮｅｕＣの酵素活性は、配列番号１３の核酸配列を含む核酸、またはその一部から発現される。一実施形態において、ＮｅｕＣの酵素活性は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのフラグメントに由来する。
【００２３】
一実施形態において、ＮｅｕＢの酵素活性は、配列番号１５の核酸配列を含む核酸、またはその一部から発現される。一実施形態において、ＮｅｕＢの酵素活性は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのフラグメントに由来する。
【００２４】
一実施形態において、ＮｅｕＡの酵素活性は、配列番号１７の核酸配列を含む核酸、またはその一部から発現される。一実施形態において、ＮｅｕＡの酵素活性は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのフラグメントに由来する。
【００２５】
一実施形態において、ＣＭＰ−シンターゼの酵素活性は、配列番号１９の核酸配列を含む核酸、またはその一部から発現される。一実施形態において、ＣＭＰ−シンターゼの酵素活性は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのフラグメントに由来する。
【００２６】
一実施形態において、ＣＭＰ−シンターゼの酵素活性は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３９７２１２の核酸配列を含む核酸、またはその一部から発現される。一実施形態において、ＣＭＰ−シンターゼの酵素活性は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＭ９０５８８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのフラグメントに由来する。
【００２７】
一実施形態において、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼの酵素活性は、配列番号２１の核酸配列を含む核酸、またはその一部から発現される。一実施形態において、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼの酵素活性は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのフラグメントに由来する。
【００２８】
一実施形態において、シアル酸アルドラーゼの酵素活性は、配列番号２３の核酸配列を含む核酸、またはその一部から発現される。一実施形態において、シアル酸アルドラーゼの酵素活性は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのフラグメントに由来する。
【００２９】
一実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ、Ｓｉａ−９−ＰおよびＳｉａからなる群より選択される少なくとも１種の中間体を生成する。一実施形態において、中間体はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃである。一実施形態において、中間体はＭａｎＮＡｃである。一実施形態において、中間体はＭａｎＮＡｃ−６−Ｐである。一実施形態において、中間体はＳｉａ−９−Ｐである。一実施形態において、中間体はＳｉａである。
【００３０】
一実施形態において、本発明の宿主細胞は、異種治療用タンパク質を発現する。一実施形態において、この治療用タンパク質は、エリスロポエチン、サイトカイン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω、ＴＮＦ−α、顆粒球−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、ＩＬ−１ｒａ、凝固因子類、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒトプロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩおよびトロンボポエチン、ＩｇＡ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＧ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＡ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＤ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＥ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＭ抗体およびそのフラグメント、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ウロキナーゼ、カイメース、尿素トリプシンインヒビター（ｕｒｅａ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、ＦＳＨ、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮細胞増殖因子−２、骨髄前駆細胞阻害因子−１（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ−１）、オステオプロテゲリン、α−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、α−フェトプロテインおよびグルコセレブロシダーゼからなる群より選択される。
【００３１】
一実施形態において、この宿主細胞は、真菌宿主由来である。一実施形態において。この真菌宿主は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群より選択される。一実施形態において、その真菌宿主は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓである。
【００３２】
一実施形態において、本発明の宿主細胞は、非病原性細菌である。別の実施形態において、本発明の宿主細胞は、植物である。
【００３３】
一実施形態において、その酵素活性は、構成性プロモーターの制御下で発現される。
【００３４】
一実施形態において、その酵素活性は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。
【００３５】
一実施形態において、その発現される酵素活性は、この酵素活性をコードする部分的ＯＲＦに由来する。
【００３６】
別の実施形態において、その発現される酵素活性は、別のタンパク質またはペプチドへの融合物である。
【００３７】
別の実施形態において、その発現される酵素は、この酵素活性を増強するかまたは弱くするように変異されている。
【００３８】
一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は、ＷＯ０２／００８７９、ＷＯ０３／０５６９１４、ＵＳ２００４／００１８５９０に記載されるような、グリコシルトランスフェラーゼ、糖輸送体およびマンノシドのセットの異種発現によってさらに改変され得る、改変オリゴ糖を有する。
【００３９】
（宿主においてＣＭＰ−Ｓｉａを生成する方法）
本発明はさらに、組換え非ヒト宿主細胞においてＣＭＰ−Ｓｉａを生成するための方法を包含し、この方法は、ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を発現する工程を包含する。
【００４０】
一実施形態において、本発明は、ＣＭＰ−Ｓｉａを生成するための方法を包含し、この方法は、ＣＭＰ−Ｓｉａの生合成に関与する１種以上の組換え酵素を非ヒト宿主細胞において発現する工程を包含する。
【００４１】
一実施形態において、本発明の宿主細胞は、真菌宿主細胞である。
【００４２】
一実施形態において、本発明の方法は、原核生物のＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路から少なくとも１種の酵素活性を発現する工程を包含する。一実施形態において、本発明の方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＢおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＡの活性からなる群より選択される少なくとも１つの酵素活性を発現する工程を包含する。
【００４３】
別の実施形態において、本発明の方法は、哺乳動物のＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路から少なくとも１種の酵素活性を発現する工程を包含する。
【００４４】
一実施形態において、本発明の方法は、哺乳動物のＣＭＰ−シアル酸シンターゼ活性を発現する工程を包含する。一実施形態において、このＣＭＰ−シアル酸シンターゼ活性は、核中に位置している。
【００４５】
一実施形態において、本発明の方法は、ハイブリッドＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を発現する工程を包含する。一実施形態において、本発明の方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＢおよび哺乳動物のＣＭＰ−シアル酸シンターゼ活性から選択される少なくとも１つの酵素活性を発現する工程を包含する。一実施形態において、このＣＭＰ−シアル酸シンターゼ活性は、核中に位置している。
【００４６】
一実施形態において、ＮｅｕＢの酵素活性は、配列番号１５の核酸配列を含む核酸、またはその一部から発現される。一実施形態において、ＮｅｕＢの酵素活性は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのフラグメントに由来する。
【００４７】
一実施形態において、ＮｅｕＡの酵素活性は、配列番号１７の核酸配列を含む核酸、またはその一部から発現される。一実施形態において、ＮｅｕＡの酵素活性は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのフラグメントに由来する。
【００４８】
一実施形態において、ＣＭＰ−シンターゼの酵素活性は、配列番号１９の核酸配列を含む核酸、またはその一部から発現される。一実施形態において、ＣＭＰ−シンターゼの酵素活性は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのフラグメントに由来する。
【００４９】
一実施形態において、ＣＭＰ−シンターゼの酵素活性は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３９７２１２の核酸配列を含む核酸、またはその一部から発現される。一実施形態において、ＣＭＰ−シンターゼの酵素活性は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＭ９０５８８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのフラグメントに由来する。
【００５０】
一実施形態において、本発明の方法は、異種治療用タンパク質を発現する宿主細胞を使用することを包含する。一実施形態において、この治療用タンパク質は、エリスロポエチン、サイトカイン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω、ＴＮＦ−α、顆粒球−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、ＩＬ−１ｒａ、凝固因子類、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒトプロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩおよびトロンボポエチン、ＩｇＡ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＧ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＡ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＤ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＥ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＭ抗体およびそのフラグメント、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ウロキナーゼ、カイメース、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、ＦＳＨ、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮細胞増殖因子−２、骨髄前駆細胞阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、α−フェトプロテインおよびグルコセレブロシダーゼからなる群より選択される。
【００５１】
一実施形態において、使用されるべき非ヒト宿主細胞は、真菌宿主に由来する。一実施形態において、この真菌宿主は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群より選択される。一実施形態において、その真菌宿主は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである。
【００５２】
一実施形態において、本発明の宿主細胞は、非病原性細菌である。別の実施形態において、本発明の宿主細胞は、植物である。
【００５３】
一実施形態において、このＣＭＰ−Ｓｉａ合成は、この非ヒト宿主細胞を増殖させるための培地に、ＣＭＰ−Ｓｉａ合成において使用される１種以上の中間体基質を補充することによって増強される。一実施形態において、この中間体は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ、Ｓｉａ−９−ＰおよびＳｉａからなる群より選択される。
【００５４】
一実施形態において、その酵素活性は、構成性プロモーターの制御下で発現される。
【００５５】
一実施形態において、その酵素活性は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。
【００５６】
一実施形態において、その発現される酵素活性は、この酵素活性をコードする部分的ＯＲＦに由来する。
【００５７】
別の実施形態において、その発現される酵素は、別のタンパク質またはペプチドへの融合物である。
【００５８】
別の実施形態において、その発現される酵素は、この酵素活性を増強するかまたは弱くするように変異されている。
【００５９】
一実施形態において、上記の方法は、ＷＯ０２／００８７９、ＷＯ０３／０５６９１４、およびＵＳ２００４／００１８５９０に記載されるような、グリコシルトランスフェラーゼ、糖輸送体およびマンノシドのセットの異種発現によってさらに改変され得る改変オリゴ糖を有する宿主の使用を包含する。
【００６０】
（組換え糖タンパク質を生成する方法）
一実施形態において、本発明は、組換え糖タンパク質を生成するための方法を提供し、この方法は、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く組換え非ヒト宿主細胞において、ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを生成する工程およびこの糖タンパク質をこの宿主において発現させる工程を包含する。一実施形態において、この宿主は、真菌宿主である。
【００６１】
別の実施形態において、本発明は、組換え糖タンパク質を生成するための方法を提供し、この方法は、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く組換え非ヒト宿主細胞の中に、ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を遺伝子工学で作る工程、およびこの糖タンパク質をこの宿主において発現させる工程を包含する。一実施形態において、この宿主は、真菌宿主である。一実施形態において、このＣＭＰ−Ｓｉａ経路は、ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールの形成を生じる。
【００６２】
別の実施形態において、本発明は、組換え糖タンパク質を生成するための方法を提供し、この方法は、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く組換え非ヒト宿主細胞において、ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成に関与する１種以上の組換え酵素を発現する工程、およびこの糖タンパク質をこの宿主において発現させる工程を包含する。一実施形態において、この宿主は、真菌宿主である。
【００６３】
本発明の実施形態のいずれかにおいて、この組換え非ヒト宿主細胞は、ＷＯ０２／００８７９、ＷＯ０３／０５６９１４およびＵＳ２００４／００１８５９０に記載されるように、非ヒト宿主においてヒト様糖タンパク質の生成に必要であり得る組換えグリコシル化酵素（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＥＲ特異的輸送体およびゴルジ特異的輸送体、オリゴ糖のプロセシングに関与する酵素、ならびに活性化オリゴ糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸）の合成に関与する酵素の異種発現によってさらに改変され得る、改変オリゴ糖を有し得る。
【００６４】
本発明の実施形態のいずれかにおいて、その宿主細胞は、異種治療用タンパク質を発現し得る。一実施形態において、この治療用タンパク質は、エリスロポエチン、サイトカイン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω、ＴＮＦ−α、顆粒球−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、ＩＬ−１ｒａ、凝固因子類、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒトプロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩおよびトロンボポエチン、ＩｇＡ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＧ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＡ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＤ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＥ抗体もしくはそのフラグメント、ＩｇＭ抗体およびそのフラグメント、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ウロキナーゼ、カイメース、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、ＦＳＨ、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮細胞増殖因子−２、骨髄前駆細胞阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、α−フェトプロテインおよびグルコセレブロシダーゼからなる群より選択される。
【００６５】
前述の発明の説明に具体的に開示される核酸、プラスミドまたはベクターを必ずしも使用しなくても、非ヒト宿主細胞に任意の様式で、単一または複数の酵素活性が、１種以上の核酸分子を使用することによって導入され得ることが理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
（発明の詳細な説明）
本明細書で別段規定されなければ、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別段要求されなければ、単数形は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本発明の方法および技術は、一般に、当該分野で周知の従来法に従って行われる。一般に、生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学と関連して用いられる命名法およびこれらの技術と、本明細書で記載されるタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションは、当該分野で周知でありかつ一般的に用いられているものである。本発明の方法および技術は、一般に、別段示されなければ、当該分野で周知の、そして本明細書全体を通して引用および議論されている種々の総括的な参考文献および具体的な参考文献において記載される、従来の方法に従って行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，および補遺〜２００２）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｕｒｅｅｎ  Ｅ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｋｕｒｔ  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｖｏｌ  Ｉ  １９７６  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｖｏｌ  ＩＩ  １９７６  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。本明細書で記載される生化学および分子生物学と関連して使用される命名法、ならびにこれらの実験手技および技術は周知のものであり、当該分野で通常使用されているものである。
【００６７】
本明細書で言及されている全ての刊行物、特許および他の参考文献は、参考として援用される。
【００６８】
以下の用語は、別段示されなければ、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００６９】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー形態をいう。この用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびにＤＮＡもしくはＲＮＡのアナログ（非天然ヌクレオチドアナログ、天然でないヌクレオチド間結合、またはその両方を含む）を包含する。この核酸は、いずれの位相配座でも存在し得る。例えば、この核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重鎖、部分二本鎖、分枝状、ヘアピン状、環状、または南京錠の配座であり得る。この用語は、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を包含する。
【００７０】
別段示されなければ、「配列番号Ｘを含む核酸」とは、核酸であって、この核酸の少なくとも一部分が（ｉ）配列番号Ｘの配列、または（ｉｉ）配列番号Ｘに相補的な配列のいずれかを有するものをいう。２者間の選択は、状況によって決められる。例えば、その核酸がプローブとして使用されるのであれば、２者間の選択は、プローブが望ましい標的に相補的であるという要件によって決められる。
【００７１】
「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー）は、その天然の宿主細胞における天然のポリヌクレオチドに天然に付随する他の細胞成分（例えば、その天然のポリヌクレオチドが通常会合されている、リボソーム、ポリメラーゼ、およびゲノム配列）から実質的に分離されているものである。この用語は、（１）その天然に存在している環境から取り出されているか、（２）「単離されたポリヌクレオチド」が、天然において見出されるポリヌクレオチドの全てまたは一部分と会合されていないか、（３）この単離されたポリヌクレオチドが天然では連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているか、あるいは（４）天然において存在していない、核酸またはポリヌクレオチドを包含する。用語「単離された」または「実質的に純粋な」はまた、組換えＤＮＡもしくはクローニングされたＤＮＡ単離物、化学合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種系により生物学的に合成されたポリヌクレオチドアナログへの言及において使用され得る。
【００７２】
しかし、「単離された」とは、そのように記載される核酸またはポリヌクレオチドが、それ自体、その天然の環境から物理的に取り出されていることを必ずしも必要としない。例えば、生物のゲノム中の内因性核酸配列は、異種配列（すなわち、この内因性核酸配列に天然では隣接しない配列）が、その内因性核酸配列に隣接して配置され、その結果、この内因性核酸配列の発現が変化される場合、本明細書では、「単離された」とみなされる。例示によれば、非天然のプロモーター配列が、（例えば、相同組換えによって）ヒト細胞のゲノム中の遺伝子の天然のプロモーターに代わって、使用され得る。その結果、この遺伝子は、変化した発現パターンを有する。この遺伝子は、これに天然で隣接する配列のうちの少なくともいくつかから分離されているので、「単離され」ていることになる。
【００７３】
核酸はまた、これが、ゲノム中の対応する核酸に対して、天然には起こらないいずれかの改変を含む場合、「単離された」とみなされる。例えば、内因性コード配列は、例えば、人の手の介入によって人工的に導入された、挿入、欠失または点変異を含む場合、「単離された」とみなされる。「単離された核酸」はまた、エピソームとして存在する核酸構築物を、その対応しない部位（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｉｔｅ）で宿主細胞染色体に組み込んだ核酸を含む。さらに、「単離された核酸」は、他の細胞物質を実質的に含まないか、組換え技術によって生成される場合に培養培地を実質的に含まないか、または化学合成される場合に化学前駆物質も他の化学物質も実質的に含まない可能性がある。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、句  参照核酸配列の「縮重改変体」は、標準的遺伝コードに従って翻訳されて、その参照核酸配列から翻訳されたアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を提供し得る、核酸配列を包含する。
【００７５】
核酸配列の文脈において用語「配列同一性パーセント」または「同一である」とは、最大一致のために整列された場合に同じである、２つの配列中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、少なくとも９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６ヌクレオチド以上にわたり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用され得る当該分野で公知の多数の種々のアルゴリズムが、存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較され得る。これらのＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）中のプログラムである。ＦＡＳＴＡは、クエリー配列とサーチ配列との間で最も良く重複する領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０（本明細書中で参考として援用される））。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントが、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラメーター（ワードサイズ  ６、およびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭファクター）とともに使用して、またはＧａｐを、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１（本明細書中に参考として援用される）中に提供されるようなそのデフォルトパラメーターとともに使用して、決定され得る。
【００７６】
用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」とは、核酸またはそのフラグメントを指す場合には、適切なヌクレオチド挿入またはヌクレオチド欠失を伴って別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列された場合に、そのヌクレオチド塩基のうちの少なくとも約５０％、より好ましくは６０％、通常は少なくとも約７０％、より通常は少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％においてヌクレオチド配列同一性が存在する（上記のような任意の周知の配列同一性アルゴリズム（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧａｐ）によって測定した場合）ことを示す。
【００７７】
あるいは、実質的な相同性または実質的類似性は、核酸またはそのフラグメントが、別の核酸にか、別の核酸の鎖にか、もしくはそれらの相補鎖に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件かでハイブリダイズする場合に、存在する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」とは、核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈においては、多数の種々の物理的パラメーターに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に認識されるような、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補的領域の長さ、およびそのハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数などの条件によって影響を受ける。当業者は、特定のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを達成するためにこれらのパラメーターを変化させる方法を知っている。
【００７８】
一般的に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、特定の条件セットの下で、特定のＤＮＡハイブリッドに関する熱融解点（Ｔｍ）よりも約２５℃低い温度にて実施される。「ストリンジェントな洗浄」とは、特定の条件セットの下で、特定のＤＮＡハイブリッドについてのＴｍよりも約５℃低い温度にて実施される。このＴｍは、完全に適合したプローブに対して標的配列のうちの５０％がハイブリダイズする温度である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）上記，９．５１頁（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。本明細書における目的のためには、「高ストリンジェンシー条件」とは、溶液相ハイブリダイゼーションに関して、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、３．０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む）、１％  ＳＤＳにおいて６５℃で８時間〜１２時間の水性ハイブリダイゼーション（すなわち、ホルムアミドを含まない）と、その後に続く、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳにおける６５℃で２０分間の２回の洗浄として、規定される。６５℃におけるハイブリダイゼーションは、多数の要因（ハイブリダイズする配列の長さおよび同一性パーセントを含む）に依存して、種々の速度にて生じることが、当業者によって認識される。
【００７９】
本発明の核酸（ポリヌクレオチドとも呼ばれる）は、ＲＮＡ形態、ｃＤＮＡ形態、ゲノムＤＮＡ形態、および合成形態のセンス鎖ならびにアンチセンス鎖の両方、ならびに上記の混合ポリマーを包含し得る。これらは、当業者によって容易に認識されるように、化学的に改変されても、生物学的に改変されてもよく、また非天然ヌクレオチド塩基を含んでも誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでもよい。そのような改変としては、例えば、標識、メチル化、アナログによる天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上の置換、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロアミデート結合、カルバメート結合など）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合など）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレート剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、および改変型結合（例えば、αアノマー核酸など））が挙げられる。また、指定された配列に水素結合および他の化学的相互作用を介して結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子が、挙げられる。そのような分子は、当該分野において公知であり、そのような分子としては、例えば、その分子の骨格中のリン酸結合をペプチド結合で置換した分子が挙げられる。
【００８０】
用語「変異した（変異型）」とは、核酸配列に対して適用される場合、核酸配列中のヌクレオチドが、参照核酸配列と比較して挿入、欠失、または変化され得ることを意味する。単一変化が、座においてなされ得る（点変異）。または複数ヌクレオチドが、単一の座において挿入、欠失、または変化され得る。さらに、１つ以上の変化が、核酸配列中の複数の座においてなされ得る。核酸配列は、当該分野で公知である任意の方法（「エラープローンＰＣＲ（ＤＮＡポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下でＰＣＲを実施して、高率の点変異がそのＰＣＲ産物の全長にわたって得られるプロセス）（例えば、Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１．ｐｐ．１１−１５（１９８９）およびＣａｌｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．およびＪｏｙｃｅ  Ｇ．Ｆ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．，２，ｐｐ．２８−３３（１９９２）を参照のこと）；ならびに「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発」（目的とする任意のクローンＤＮＡセグメントにおける部位特異的変異の生成を可能にするプロセス）（例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．およびＳａｕｅｒ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，ｐｐ．５３−５７（１９８８）を参照のこと）などの変異誘発技術が挙げられるが、これらに限定されない）によって変異され得る。
【００８１】
用語「ベクター」とは、本明細書中で使用される場合、それに結合している別の核酸を輸送することが可能な、核酸分子を指す。ベクターの型の１つは、「プラスミド」である。これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。他のベクターとしては、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、そのベクターにおいて、さらなるＤＮＡセグメントがそのウイルスのゲノム中に連結され得る（以下により詳細に考察される）。特定のベクターは、それが挿入される宿主細胞中で自律複製可能である（例えば、その宿主細胞中で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、その宿主細胞中に導入された際にその宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それによってその宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、特定の好ましいベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示可能である。そのようなベクターは、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と本明細書中で呼ばれる。
【００８２】
「作動可能に連結された」発現制御配列とは、その発現制御配列が目的遺伝子を制御するためにその目的遺伝子と連続した結合、ならびにその目的遺伝子を制御するためにトランスすなわち一定距離で作用する発現制御配列を指す。
【００８３】
用語「発現制御配列」とは、本明細書中で使用される場合、それが作動可能に連結されたコード配列の発現に影響を与えるために必要なポリヌクレオチド配列を指す。制御配列発現とは、核酸配列の転写を制御する配列、転写後事象を制御する配列、および翻訳を制御する配列である。発現制御配列としては、適切な転写開始配列、転写終結配列、転写プロモーター配列、およびエンハンサー配列；効率的ＲＮＡプロセシングシグナル（例えば、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナル）；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強させる配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定化を増強させる配列；および望ましい場合には、タンパク質分泌を増強させる配列が、挙げられる。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる。原核生物において、そのような制御配列としては、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が挙げられる。用語「制御配列」とは、発現のためにはその存在が必須であるすべての成分を最低限包含し、そしてまた、その存在が有益であるさらなる成分（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）が挙げられ得る。
【００８４】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）とは、本明細書中で使用される場合、遺伝子操作された細胞を指すことが意図される。組換え宿主細胞とは、組換えベクターが導入された細胞を包含する。このような用語は、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫もまた指すことが意図されることが、理解されるべきである。特定の改変が、変異または環境のいずれかの影響に起因して連続世代において生じ得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書中で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に依然として包含される。組換え宿主細胞は、単離細胞であっても、培養中で増殖された細胞株であってもよく、または生存組織もしくは生存生物中に存在する細胞であってもよい。用語「宿主」とは、１つ以上の「宿主細胞」を含む任意の生物もしくは植物を指すか、またはその「宿主細胞」の供給源を指す。
【００８５】
さらに、本明細書中で使用される場合、「内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く宿主細胞」とは、内因的にＣＭＰ−Ｓｉａを生成しない細胞（ＣＭＰ−Ｓｉａ経路を欠く細胞が挙げられる）を指す。本明細書中で使用される場合、「真菌宿主細胞」とは、ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く真菌宿主細胞を指す。
【００８６】
用語「ペプチド」とは、本明細書中で使用される場合、短いポリペプチドを指し、例えば、代表的には約５０アミノ酸長未満であり、より代表的には約３０アミノ酸長未満である、ポリペプチドを指す。この用語は、本明細書中で使用される場合、構造を模倣し従って生物学的機能を模倣する、アナログおよび模倣物を包含する。
【００８７】
用語「ポリペプチド」とは、天然に存在するタンパク質および天然に存在しないタンパク質の両方、それらのフラグメント、変異体、ホモログ、改変体、誘導体、およびアナログを包含する。ポリペプチドは、モノマーであっても、ポリマーであってもよい。さらに、ポリペプチドは、各々が１つ以上の別個の活性を有する複数の種々のドメインを含み得る。
【００８８】
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」とは、その起源または由来源が（１）その天然状態で付随する天然で結合していた成分とは結合していない、タンパク質もしくはポリペプチド；（２）天然では見いだされない純度で存在し、その純度は他の細胞物質の存在に対して調節され得る（例えば、同じ種由来の他のタンパク質を含まない）、タンパク質もしくはポリペプチド；（３）異なる種由来の細胞によって発現される、タンパク質もしくはポリペプチド；または（４）天然では存在しない、タンパク質もしくはポリペプチド（例えば、天然で見出されるポリペプチドのフラグメントであるか、または天然では見いだされないアミノ酸アナログもしくはアミノ酸誘導体、もしくは標準的ペプチド結合以外の結合を含む）である。従って、化学合成されたポリペプチド、または天然で由来する細胞とは異なる細胞系において合成されたポリペプチドは、その天然で結合している成分からは「単離されている」。ポリペプチドまたはタンパク質はまた、当該分野で周知のタンパク質精製技術を使用して、単離によって天然で結合している成分を実質的には含まないようにされ得る。そのように定義される場合、「単離された」とは、そう記載されるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはオリゴペプチドがその天然環境から物理的に取り出されていることを、必ずしも必要としない。
【００８９】
用語「ポリペプチドフラグメント」とは、本明細書中で使用される場合、全長ポリペプチドと比較してアミノ末端欠失および／またはカルボキシ末端欠失を有する、ポリペプチドを指す。好ましい実施形態において、そのポリペプチドフラグメントは、そのフラグメントのアミノ酸配列がその天然に存在する配列中の対応する位置と同じである、連続配列である。フラグメントは、代表的には、少なくとも５アミノ酸長、少なくとも６アミノ酸長、少なくとも７アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、もしくは少なくとも１０アミノ酸長であり、好ましくは、少なくとも１２アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１６アミノ酸長、もしくは少なくとも１８アミノ酸長であり、より好ましくは、少なくとも２０アミノ酸長であり、より好ましくは、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長、少なくとも４０アミノ酸長、もしくは少なくとも４５アミノ酸長であり、なおより好ましくは、少なくとも５０アミノ酸長もしくは少なくとも６０アミノ酸長であり、なおより好ましくは、少なくとも７０アミノ酸長である。
【００９０】
「組換えタンパク質」、「組換え糖タンパク質」、または「組換え酵素」とは、遺伝子操作により生成された、タンパク質、糖タンパク質、または酵素を（それぞれ）指す。組換えタンパク質、組換え糖タンパク質、または組換え酵素とは、宿主細胞中に導入された核酸から発現された、異種タンパク質、異種糖タンパク質、または異種酵素を（それぞれ）包含する。
【００９１】
「改変型誘導体」または「誘導体」とは、一次構造配列において実質的に相同しているが、例えば、インビボもしくはインビトロでの化学的改変および生物学的改変を含むかまたはそのネイティブポリペプチド中で見出されないアミノ酸を組み込んでいる、ポリペプチドまたはそのフラグメントを指す。そのような改変としては、当業者によって容易に認識されるような、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、標識（例えば、放射性核種による標識）、および種々の酵素的改変が挙げられる。ポリペプチドを標識するための種々の方法、およびそのような目的のために有用な種々の置換基もしくは標識は、当該分野で周知であり、それには、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈ）、標識抗リガンド（例えば、抗体）に結合するリガンド、発蛍光団、化学発光試薬、酵素、および標識リガンドに対する特異的結合対メンバーとして作用し得る抗リガンドが挙げられる。標識の選択は、必要とされる選択性、プライマーとの結合の容易さ、安定性要件、および利用可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識するための方法は、当該分野で周知である。Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２（本明細書により参考として援用される）を参照のこと。
【００９２】
用語「融合タンパク質」とは、異種アミノ酸配列に結合したポリペプチドまたはフラグメントを含む、ポリペプチドを指す。融合タンパク質は、有用である。なぜなら、それは、２つ以上の異なるタンパク質に由来する２つ以上の望ましい機能性エレメントを含むように構築され得るからである。融合タンパク質は、目的ポリペプチドに由来する少なくとも１０個連続するアミノ酸を含み、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸もしくは少なくとも３０アミノ酸を含み、なおより好ましくは少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、もしくは少なくとも６０アミノ酸を含み、なおより好ましくは、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、もしくは少なくとも１２５アミノ酸を含む。融合タンパク質は、そのポリペプチドまたはそのフラグメントコードする核酸配列を、別のタンパク質またはペプチドをコードする核酸とインフレームで構築すること、その後、その融合タンパク質を発現させることによって、組換え生成され得る。あるいは、融合タンパク質は、そのポリペプチドまたはそのフラグメントを別のタンパク質に架橋することによって、化学的に生成され得る。
【００９３】
用語「非ペプチドアナログ」とは、参照ポリペプチドの特性と類似する特性を有する化合物を指す。非ペプチド化合物はまた、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」と呼ばれ得る。例えば、Ｊｏｎｅｓ（１９９２）Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｊｕｎｇ（１９９７）Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら（１９９３），Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ；「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ」，Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ，Ｗ．Ｈ．，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．（１９９２）；Ｅｖａｎｓら，Ｊ，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）；Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ，ｐ．３９２（１９８５）；ならびに上記の各々において引用された参考文献（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。このような化合物は、しばしば、コンピューター化された分子モデリングを用いて開発される。本発明の有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣物が、同等の効果を生じるために使用され得、従って、本発明の一部であると想定され得る。
【００９４】
「ポリペプチド変異体」または「ムテイン」または「改変体」とは、ネイティブタンパク質もしくは野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の挿入、重複、欠失、再配置、または置換をその配列が含む、ポリペプチドを指す。ムテインは、
１つ以上のアミノ酸点置換（ある位置の１つのアミノ酸が、別のアミノ酸へと変化されている）、１つ以上の挿入および／または欠失（１つ異常のアミノ酸が、天然に存在するタンパク質の配列においてそれぞれ挿入または欠失されている）、ならびに／あるいはアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかもしくは両方におけるアミノ酸配列の短縮を含み得る。ムテインは、天然に存在するタンパク質と比較して、同じであるが好ましくは異なる生物学的活性を有し得る。
【００９５】
ムテインは、その野生型対応物に対して、少なくとも７０％の全体配列相同性を有する。なおより好ましくは、その野生型タンパク質に対して８０％、８５％、または９０％の全体配列相同性を有するムテインである。なおより好ましい実施形態において、ムテインは、９５％配列同一性を示し、なおより好ましくは９７％、なおより好ましくは９８％、およびなおより好ましくは９９％の全体配列同一性を示す。配列相同性は、任意の一般的配列分析アルゴリズム（例えば、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔ）によって測定され得る。
【００９６】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減するアミノ酸置換；（２）酸化に対する感受性を低減するアミノ酸置換；（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させるアミノ酸置換；（４）結合親和性または酵素活性を変化させるアミノ酸置換；および（５）そのようなアナログの他の物理化学的特性もしくは機能的特性を付与もしくは改変するアミノ酸置換である。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、１２種の従来のアミノ酸およびその略語は、従来の使用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版，Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。その１２種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸（例えば、α−，α−置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の非従来アミノ酸もまた、本発明のポリペプチドのために適切な成分であり得る。非従来アミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ｓ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書中で使用されるポリペプチドの表示法において、標準的な使用法および慣習に従って、左側方向が、アミノ末端側であり、右側方向が、カルボキシ末端方向である。
【００９８】
タンパク質は、そのタンパク質をコードする核酸配列が、第二のタンパク質をコードする核酸と類似する配列を有する場合に、その第二のタンパク質に対する「相同性」を有するか、または、その第二のタンパク質に対して「相同」である。あるいは、タンパク質は、第二のタンパク質に対して、それらの２つのタンパク質が「類似する」アミノ酸配列を有する場合に、相同である（従って、用語「相同性タンパク質」または「ホモログ」は、それら２つのタンパク質が類似するアミノ酸配列を有することを意味するように規定される）。好ましい実施形態において、相同性タンパク質は、野生型タンパク質に対して５０％の配列相同性を示すタンパク質であり、より好ましいのは、６０％配列相同性である。なおより好ましいのは、野生型タンパク質に対して８０％、８５％、または９０％の配列相同性を示す相同性タンパク質である。なおより好ましい実施形態において、相同性タンパク質は、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示す。本明細書中で使用される場合、２つのアミノ酸配列の領域（特に推測される構造的類似性に関する）の間の相同性は、機能における類似性を意味すると解釈される。
【００９９】
「相同性」が、タンパク質またはペプチドに関して使用される場合、同一ではない残基位置は、しばしば、保存的アミノ酸置換によって異なることが、認識される。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似する化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換される、アミノ酸置換である。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的には変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントすなわち相同性の程度は、その置換の保存的性質を矯正するために上向きに調節され得る。この調節を行うための手段は、当業者にとって周知である（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎら、１９９４（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０１００】
以下の６つのグループは、各々が、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む：（１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；（２）アルパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）；および（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０１０１】
ポリペプチドについての配列相同性（これはまた、配列同一性パーセントとも呼ばれる）は、代表的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，９１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７０５を参照のこと。タンパク質分析ソフトウェアは、種々の置換、欠失、および他の改変（保存的アミノ酸置換を含む）に対して割り当てられる相同性の尺度を使用して、類似する配列を一致させる。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含む。これらのプログラムは、デフォルトパラメーターを用いて使用され得、密接に関連するポリペプチド間（例えば、異なる生物種に由来する相同性ポリペプチド間、または野生型タンパク質とそのムテインとの間）の配列相同性または配列同一性を決定し得る。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を参照のこと。
【０１０２】
阻害分子配列を、異なる生物に由来する大量の配列を含むデータベースと比較する場合に好ましいアルゴリズムは、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６〜２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１〜１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．およびＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９〜６５６（特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７））。ＢＬＡＳＴｐのために好ましいパラメーターは、Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ：１０（デフォルト）；Ｆｉｌｅｔｒ：ｓｅｇ（デフォルト）；Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ：１１（デフォルト）；Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ａ  ｇａｐ：１（デフォル；Ｍａｘ．ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：１００（デフォルト）；Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：１１（デフォルト）；Ｎｏ．ｏｆ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ：１００（デフォルト）；Ｐｅｎａｌｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。
【０１０３】
相同性のために比較されるポリペプチド配列の長さは、一般的には、少なくとも約１６アミノ酸残基であり、通常は少なくとも約２０アミノ酸残基であり、より通常は少なくとも約２４アミノ酸残基であり、代表的には少なくとも約２８アミノ酸残基であり、好ましくは約３５残基よりも長い。多数の異なる生物に由来する配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが、好ましい。アミノ酸配列を使用するデータベース検索は、当該分野で公知であるｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定され得る。例えば、ポリペプチド配列は、ＦＡＳＴＡ（ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１中のプログラム）を使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡは、クエリー配列と検索配列との間の最大重複領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０（本明細書中に参考として援用される））。例えば、アミノ酸配列の間の配列同一性パーセントが、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１（本明細書中に参考として援用される）において提供されるようなそのデフォルトパラメーター（ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：２；およびＰＡＭ２５０  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）とともにＦＡＳＴＡを使用して、決定され得る。
【０１０４】
「特異的結合」とは、その環境において他の分子に結合することに優先して、２つの分子が互いに結合する能力を指す。代表的には、「特異的結合」とは、特定反応における付随的結合よりも、少なくとも２倍、より代表的には少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１００倍を上まわって区別する。代表的には、特異的結合反応の親和性または結合活性は、少なくとも１０−７Ｍ（例えば、少なくとも約１０−８Ｍまたは１０−９Ｍ）である。
【０１０５】
用語「領域」とは、本明細書中で使用される場合、生体分子の一時構造のうちの物理的に連続する部分を指す。タンパク質の場合、領域とは、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続部分によって規定される。
【０１０６】
用語「ドメイン」とは、本明細書中で使用される場合、生体分子の既知機能または予測される機能に寄与する、その生体分子の構造を指す。ドメインは、その領域または部分とともに広範囲にあり得る（ｃｏ−ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）。ドメインはまた、生体分子中の別個の非連続領域を含み得る。タンパク質ドメインの例としては、Ｉｇドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
本明細書中で使用される場合、用語「分子」とは、任意の化合物（低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などが挙げられるが、これらに限定されない）を意味し、そのような化合物は、天然化合物であっても、合成化合物であってもよい。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、「ＣＭＰ−シアル酸生合成経路」または「ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路」とは、宿主においてＣＭＰ−Ｓｉａの形成をもたらす１つ以上のグリコシル化酵素を指す。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、「ＣＭＰ−Ｓｉａプール」とは、検出可能なレベルの細胞ＣＭＰ−Ｓｉａを指す。
【０１１０】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｎ−グリカン」とは、Ｎ結合型オリゴ糖（例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基に対してアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合したオリゴ糖）を指す。Ｎ−グリカンは、共通する五糖コアＭａｎ３ＧｌｃＮａｃ２（「Ｍａｎ」とは、マンノースを指す；「Ｇｌｃ」とは、グルコースを指す；「Ｎａｃ」とは、Ｎ−アセチルを指す；ＧｌｃＮａｃとは、Ｎ−アセチルグルコサミンを指す）を有する。用語「トリマンノースコア」とは、Ｎ−グリカンに関して使用される場合はまた、構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮａｃ２（「Ｍａｎ３」）を指す。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３コア構造に付加された末梢糖（例えば、ＧｌｃＮａｃ、ガラクトース、およびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、その分枝構成要素に従って分類される（例えば、高マンノース、複合、またはハイブリッド）。
【０１１１】
「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５つ以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、代表的には、トリマンノースコアの１，３−マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮａｃと、トリマンノースコアの１，６マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮａｃとを、有する。複合Ｎ−グリカンはまた、シアル酸または誘導体（「ＮｅｕＡｃ」（「Ｎｅｕ」とはノイラミン酸を指し、「Ａｃ」とはアセチルを指す））で必要に応じて改変されたガラクトース（「Ｇａｌ」）残基を有し得る。複合Ｎ−グリカンは、代表的には、オリゴ糖で終端する少なくとも１つの分枝（例えば、ＮｅｕＡｃ−；ＮｅｕＡｃα２−６ＧａｌＮＡｃα１−；ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−；ＮｅｕＡｃα２−３／６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮａｃβ１−；ＧｌｃＮＡｃα１−４Ｇａｌβ１−（ムテインのみ）；Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−（血液基Ｈ））を有する。硫酸エステルが、ガラクトース上、ＧａｌＮＡｃ上およびＧｌｃＮＡｃ残基上に存在し得、ホスフェートエステルが、マンノース残基上に存在し得る。ＮｅｕＡｃ（Ｎｅｕ：ノイラミン酸；Ａｃ：アセチル）は、Ｏ−アセチル化され得るか、またはＮｅｕＧｌ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）によって置換され得る。複合Ｎ−グリカンはまた、「二分する（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮａｃおよびコアフコース（「ＦｕＣ」）を含む鎖内置換を有し得る。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端上に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有し、トリマンノースコアの１，６マンノースアーム上には０個以上のマンノースを有する。
【０１１２】
基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの略語である。中間体ＭａｎＮａｃは、Ｎ−アセチルマンノサミンの略語である。中間体ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐは、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−リン酸の略語である。中間体Ｓｉａ−９−Ｐは、シアル酸−９−リン酸の略語である。中間体シチジン一リン酸−シアル酸は、「ＣＭＰ−Ｓｉａ」と略される。シアル酸は、本明細書中では、「Ｓｉａ」、「Ｎｅｕ５Ａｃ」、「ＮｅｕＡｃ」または「ＮＡＮＡ」と略される。
【０１１３】
本明細書中で使用される場合、用語「シアル酸」とは、５炭素位置においてアセチル基が結合した改変された塩基性９−炭素ノイラミン酸コアを有するＮ−アセチル−５−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を共通分子が有する、一群の分子を指す。５炭素位置におけるＮｅｕ５Ａｃの一般的誘導体としては、アセチル基の代わりにヒドロキシル基を有する２−ケト−３−デオキシ−ｄ−グリセロ−ｄ−ガラクトン酸（ＫＤＮ）；ノイラミン（Ｎｅｕ）を生じる５−Ｎ−アセチル基のｄｅ−Ｎ−アセチル化；Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を生じる５−Ｎ−アセチル基のヒドロキシル化が、挙げられる。これらの４つの分子（Ｎｅｕ５Ａｃ、ＫＤＮ、ＮｅｕおよびＮｅｕ５ＧＣ）の４位、７位、８位、および９位におけるヒドロキシル基は、このグループの化合物を拡張するために、Ｏ−アセチル基、Ｏ−メチル基、Ｏ−スルフェート基、およびリン酸基でさらに置換され得る。さらに、不飽和形態およびデヒドロ形態のシアル酸が存在することが、公知である。
【０１１４】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードする遺伝子は、「ＮｅｕＣ」と略される。シアル酸シンターゼをコードする遺伝子は、「ＮｅｕＢ」と略される。ＣＭＰ−シアル酸シンターゼをコードする遺伝子は、「ＮｅｕＡ」と略される。
【０１１５】
シアル酸アルドラーゼはまた、一般的に、シアル酸リアーゼおよびシアル酸ピルビン酸リアーゼとも呼ばれる。より具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、シアル酸アルドラーゼは、ＮａｎＡと呼ばれる。
【０１１６】
用語「酵素」とは、宿主細胞グリコシル化を改変することに関して本明細書中で使用される場合、少なくとも１つの酵素活性を有する分子を指し、全長酵素、触媒的に活性なフラグメント、キメラ体、複合体などを包含する。
【０１１７】
酵素の「触媒的に活性なフラグメント」とは、検出可能なレベルの機能的（酵素的）活性を有するポリペプチドを指す。
【０１１８】
本明細書中で使用される場合、用語「分泌経路」とは、細胞質から小胞体（ＥＲ）およびゴルジ装置区画に到る新生ポリペプチドの分子フローに従う、脂質結合型オリゴ糖前駆体およびＮ−グリカン基質が連続して曝露される種々のグリコシル化酵素の一連の作業工程を指す。酵素は、この経路に沿って位置すると言われる。酵素Ｙの前の脂質結合型グリカンまたはＮ−グリカンに作用する酵素Ｘは、酵素Ｙの「上流」にある、またはその「上流」に作用すると言われる。同様に、酵素Ｙは、酵素Ｘの「下流」にある、またはその「下流」に作用すると言われる。
【０１１９】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、少なくとも１０塩基長であるポリマー形態のヌクレオチドを指す。この用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ）、およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびにＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログ（非天然ヌクレオチドアナログ、非ネイティブヌクレオチド間結合、もしくはその両方を含む）を包含する。その核酸は、任意のトポロジー構成であり得る。例えば、その核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重鎖、部分的二本鎖、分枝構造、ヘアピン構造、環状構造、またはパッドロック（ｐａｄｌｏｃｋｅｄ）構造であり得る。この用語は、一本鎖形態のＤＮＡおよび二本鎖形態のＤＮＡを包含する。本発明の核酸分子は、ＲＮＡのセンス鎖、ＲＮＡのアンチセンス鎖、ｃＤＮＡのセンス鎖およびｃＤＮＡのアンチセンス鎖、ゲノムＤＮＡのセンス鎖およびゲノムＤＮＡのアンチセンス鎖、ならびに上記の合成形態および混合ポリマーの両方を包含し得る。これらは、当業者によって容易に認識されるように、化学的もしくは生化学的に改変され得るか、または非天然ヌクレオチド塩基もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含み得る。そのような改変としては、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上をアナログで置換すること、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメート）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど））、ペンダント（ｐｅｎｄｅｎｔ）部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレート剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、および改変型結合（例えば、α−アノマー核酸など）が挙げられる。また、水素結合および他の化学的相互作用を介して指定された配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子が、挙げられる。そのような分子は、当該分野で公知であり、それには、例えば、その分子の骨格中のリン酸結合がペプチド結合で置換される分子が挙げられる。
【０１２０】
他のように規定されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
例示的な方法および材料が、下記に記載されるが、本明細書中に記載される方法および材料と類似するかまたは同等であるすべての方法および材料もまた、本発明の実施において使用され得、それらは当業者にとって周知である。本明細書中で言及されるすべての刊行物および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合には、本明細書（定義を含む）が、支配する。上記の材料、方法、および例は、例示に過ぎない。これらは、限定的なものであることは意図されない。
【０１２１】
本明細書および特許請求の範囲全体にわたって、用語「含む（包含する、含有する）
または変化形（例えば、「含んでいる（包含している、含有している）」とは、記載される整数または整数群を含むが他の整数も整数群も排除するわけではないことを意味することが、理解される。
【０１２２】
（真菌細胞において組換えＮ−グリカンの生成のためのＣＭＰ−Ｓｉａを生成するための方法）
本発明は、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く宿主細胞（例えば、真菌細胞）において機能的ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を生成するための方法を提供する。本発明はまた、ＣＭＰ−Ｓｉａ経路を発現するように改変された宿主を作製するための方法を提供する。本発明は、細胞ＣＭＰ−Ｓｉａプールを含む宿主細胞を作製するための方法をさらに提供する。
【０１２３】
上記方法は、細胞ＣＭＰ−ＳｉａプールをもたらすＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路の酵素をコードするいくつかの遺伝子のクローニングおよび発現を含み、このプールは、目的のタンパク質上にシアル化グリカンを生成する際に使用され得る。一般的に、グリカンへのシアル酸の付加には、シアリルトランスフェラーゼ、グリカンレセプター（例えば、Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮａｃ２）、およびシアリルドナー分子であるＣＭＰ−Ｓｉａの存在が必要である。高等生物（例えば、哺乳動物）におけるＣＭＰ−Ｓｉａドナー分子の合成は、四酵素多反応プロセスであり、基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃで開始してＣＭＰ−Ｓｉａを生じる（図１Ａ）。このプロセスは、細胞質で開始してシアル酸を生じ、その後、このシアル酸が、核へとトランスロケートされ、核において、ＳｉａがＣＭＰ−Ｓｉａへと変換される。その後、ＣＭＰ−Ｓｉａは、核を出て細胞質へと到り、その後、ゴルジに輸送され、ゴルジにおいて、シアリルトランスフェラーゼが、アクセプターであるグリカン上へのシアル酸の転移を触媒する。対照的に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＣＭＰ−Ｓｉａを合成するための細菌経路は、３つの酵素と２つの中間体しか含まず（図１Ｂ）、すべての反応は細胞質で生じる。
【０１２４】
従って、本発明の方法は、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞において、機能的ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を導入することによってＣＭＰ−Ｓｉａプールを生成することを包含する。遺伝子データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）から容易に入手可能なＤＮＡ配列情報を用いて、ＣＭＰ−Ｓｉａ経路に関与する酵素および／または活性（実施例１）が、クローニングされる。当業者にとって公知である標準的技術を使用して、ＣＭＰ−Ｓｉａの生合成に関与する酵素（またはその触媒的に活性なフラグメント）をコードする核酸分子が、プロモーターおよび／または本発明の選択された宿主細胞における転写を駆動可能な他の発現制御配列の転写制御下で、適切な発現ベクター中に挿入される。本発明の選択された宿主細胞中でのそのような酵素の機能的発現は、検出され得る。一実施形態において、本発明の選択された宿主細胞中のそのような酵素の機能的発現は、その酵素により形成された中間体を測定することによって、検出され得る。本発明の方法は、本明細書中で開示される特定の酵素源の使用に限定されない。
【０１２５】
（真菌における哺乳動物ＣＭＰ−シアル酸生合成経路の操作）
本発明の一実施形態において、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く宿主細胞において哺乳動物ＣＭＰ−シアル酸経路を合成するための方法が、提供される。哺乳動物および高等真核生物において、ＣＭＰ−シアル酸の合成は、細胞質において開始され、その酵素活性（ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼ、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスファターゼ）がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃがシアル酸へと変化させる（図１Ａ）。その後、そのシアル酸は、核に入り、核において、そのシアル酸は、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼによってＣＭＰ−シアル酸へと変換される。
【０１２６】
本発明の一実施形態において、上記方法は、ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路における酵素（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼ、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスファターゼ、およびＣＭＰ−シアル酸シンターゼが挙げられる）をコードするいくつかの遺伝子を、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く宿主細胞（例えば、真菌細胞）においてクローニングすることを包含する。上記遺伝子は、各々の酵素を生成するように発現され、その後の酵素反応のために使用される中間体を生成する。実施例５〜実施例８は、選択マーカーを使用してこれらの酵素を真菌宿主（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）中へと導入するための方法を記載する。あるいは、これらの酵素は、下流の中間体を生成または増加するために一緒に発現され、それによってその後の酵素は、この下流中間体に対して作用可能である。
【０１２７】
上記経路における最初の酵素は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼおよびＮ−アセチルマンノサミンキナーゼの両方である、二機能性酵素であり、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）をＮ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェート（ＭａｎＮａｃ−６−Ｐ）へと変換する（Ｈｉｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｓ．，Ｓｔａｓｃｈｅ，Ｒ．ら、１９９７）。この酵素は、元々、ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた（Ｓｔａｓｃｈｅ，Ｒ．，Ｈｉｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｓ．ら、１９９７）。好ましい実施形態において、機能的ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ酵素（そのホモログ、改変体、および誘導体を含む）をコードする遺伝子が、クローニングされ、そして内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）において発現される。別の好ましい実施形態において、上記機能的Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ酵素（そのホモログ、改変体、および誘導体を含む）をコードする遺伝子が、クローニングされ、そして宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）において発現される。より好ましい実施形態において、上記の二機能性ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ酵素（そのホモログ、改変体、および誘導体を含む）をコードする遺伝子が、クローニングされ、そして内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））において発現される。これらの遺伝子の機能的発現は、機能的アッセイを使用して検出され得る。一実施形態において、このような遺伝子の機能的発現は、ＭａｎＮＡｃ中間体およびＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ中間体の形成を検出することによって、検出され得る。
【０１２８】
上記経路中の二番目の酵素であるＮ−アセチルノイラミン酸ホスフェートシンターゼは、元々、Ｅ．ｃｏｌｉシアル酸シンターゼ遺伝子ＮｅｕＢに対する相同性に基づいて、ヒト肝臓からクローニングされた（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｓ．Ｍ．，Ｈｕｄｄｌｅｓｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ら、２０００）。この酵素は、ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐからシアル酸９−リン酸（Ｓｉａ−９Ｐ、Ｎ−アセチルノイラミネート９−リン酸、またはＮｅｕ５Ａｃ−９Ｐとも呼ばれる）への変換を触媒する。従って、好ましい実施形態において、機能的Ｎ−アセチルノイラミネート９−ホスフェートシンターゼ酵素（そのホモログ、改変体、および誘導体を含む）をコードする遺伝子が、クローニングされ、そして内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）において発現される。その宿主におけるＮ−アセチルノイラミン酸ホスフェートシンターゼの機能的発現は、機能的アッセイにおいて検出され得る。一実施形態において、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸ホスフェートシンターゼの機能的発現は、Ｓｉａ−９Ｐの形成を検出することによって検出され得る。
【０１２９】
上記経路における三番目の酵素であるＮ−アセチルノイラミネート９−ホスファターゼ（Ｓｉａ−９−ホスファターゼ）は、未だクローニングされていないが、Ｓｉａ−９−Ｐからシアル酸への変換に関与する。この酵素の活性は哺乳動物細胞においては検出されていないが、そのような活性は、真菌細胞において記載されていない。従って、Ｓｉａ−９−ホスファターゼを欠くと、上記経路における破壊が引き起こされる。従って、好ましい実施形態において、本発明の方法は、Ｓｉａ−９−ホスファターゼ遺伝子を単離して非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）中へとクローニングすることを包含する。そのような宿主としては、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および細菌細胞が挙げられる。より好ましい実施形態において、Ｓｉａ−９−ホスファターゼ遺伝子（そのホモログ、改変体、および誘導体を含む）は、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主）において発現される。その宿主におけるＳｉａ−９−ホスファターゼの機能的発現は、機能的アッセイを使用して検出され得る。一実施形態において、Ｓｉａ−９−ホスファターゼの機能的発現は、シアル酸の形成を検出することによって検出され得る。
【０１３０】
上記の哺乳動物経路における次の酵素であるＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼは、元々、この酵素を欠損している細胞株の機能的補完によってマウス下垂体からクローニングされた（Ｍｕｎｓｔｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｅｃｋｈａｒｄｔ，Ｍ．ら、１９９８）。この酵素は、シアル酸をＣＭＰ−Ｓｉａへと変換する。ＣＭＰ−Ｓｉａは、ゴルジにおけるシアリルトランスフェラーゼ反応におけるドナー基質である。従って、なおより好ましい実施形態において、機能的ＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼ酵素（そのホモログ、改変体、および誘導体を含む）をコードする遺伝子が、クローニングされ、そして内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）において発現される。その宿主におけるＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼの機能的発現は、機能的アッセイを使用して検出され得る。一実施形態において、ＣＭＰ−Ｓｉａの機能的発現は、ＣＭＰ−Ｓｉａの形成を検出することによって検出され得る。
【０１３１】
本発明の方法は、ＣＭＰ−Ｓｉａ経路における上記酵素発現の結果として非ヒト宿主において生成される上記中間体の生成をさらに包含する。好ましくは、生成される中間体としては、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ、Ｓｉａ−９−Ｐ、ＳｉａおよびＣＭＰ−Ｓｉａのうちの１つ以上が挙げられる。従って、この酵素により生成される中間体各々は、好ましくは検出される。例えば、中間体の存在または不在を検出するために、実施例１０において記載されるようなアッセイが、使用される。従って、上記方法はまた、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）において生成されるＮ−グリカン中間体を検出するためのアッセイを包含する。
【０１３２】
当業者は、ＣＭＰ−シアル酸生合成経路中の１つ以上の酵素が稀にしか利用可能ではないことは、そのような酵素が、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）において機能的に発現され得ることを示唆しないことを、認識する。現在まで、そのような宿主細胞がこれらの哺乳動物酵素を発現して機能的な新規ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を生成する能力は、記載されていない。本発明は、初めて、真菌宿主におけるＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路に関与する少なくとも１つの哺乳動物酵素（マウスＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼ（実施例８））の機能的発現を提供する。これは、上記哺乳動物経路（全体または部分）を介するＣＭＰ−Ｓｉａの生成が、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く真菌宿主および他の非ヒト宿主において可能であることを、示唆する。
【０１３３】
本明細書中に記載される発現は、本明細書中に開示される特定の酵素、遺伝子、プラスミド、および構築物の使用には限定されない。当業者は、ＣＭＰ−Ｓｉａの合成に関与する遺伝子の任意のホモログ、改変体、および誘導体を使用し得る。
【０１３４】
内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主（例えば、真菌宿主（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））においてシアル化組換え糖タンパク質を生成するために、上記の哺乳動物酵素が、ＷＯ９２／００８７９において開示されるコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを使用して発現され得、ＣＭＰ−Ｓｉａプールを生成する。このＣＭＰ−Ｓｉａプールは、シアリルトランスフェラーゼの存在化でガラクトシル化Ｎ−グリカン上に転移される。従って、本発明は、ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を、その酵素の各々を発現させ、その結果、それらの酵素が機能させること、好ましくはそれらの酵素が最適に真菌宿主において機能させることによって、真菌宿主中へと操作するための方法を提供する。哺乳動物、細菌またはハイブリッドの操作されたＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を提供する。
【０１３５】
（真菌における細菌ＣＭＰ−シアル酸生合成経路の操作）
代謝中間体であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは、真核生物および原核生物に共通し、これは、ＣＭＰ−Ｓｉａの合成を開始するための内因性基質である（図１）。この共通中間体の存在に基づいて、上記ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路は、細菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードする遺伝子、シアル酸シンターゼをコードする遺伝子、およびＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼをコードする遺伝子を組み込むことによって、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞中へと操作され得る。従って、本発明の別の局面は、内因性ＣＭＰ−Ｓｉａ経路を欠く宿主細胞中へと上記細菌性ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を操作することを包含する。内因性ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を欠く細胞における細菌Ｎｅｕ遺伝子の発現は、細胞ＣＭＰ−Ｓｉａプールの生成を可能にする。この細胞ＣＭＰ−Ｓｉａプールは、その後、目的タンパク質（例えば、組換え発現される糖タンパク質）における検出可能なレベルのシアル化を有する組換えＮ−グリカンの生成を促進し得る。ＣＭＰ−Ｓｉａの合成に関与する上記細菌酵素としては、ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃエピメラーゼ（ＮｅｕＣ）、シアル酸シンターゼ（ＮｅｕＢ）、およびＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼ（ＮｅｕＡ）が挙げられる。一実施形態において、これらの機能的酵素（そのホモログ、改変体、および誘導体を含む）をそれぞれコードするＮｅｕＣ遺伝子、ＮｅｕＢ遺伝子、およびＮｅｕＡ遺伝子が、クローニングされ、そして内因性ＣＭＰ−Ｓｉａ経路を欠く非ヒト宿主（例えば、真菌宿主）において発現される。ＮｅｕＣ遺伝子、ＮｅｕＢ遺伝子、およびＮｅｕＡ遺伝子の配列は、図２〜図４においてそれぞれ示される。これらの遺伝子の発現は、ＣＭＰ−シアル酸の生合成経路における中間体分子を生成する（図１Ｂ）。
【０１３６】
これらの３つの酵素に加えて、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからの細菌ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を合成するための方法は、２つの中間体ＭａｎＮＡｃおよびＳｉａ（図１Ｂ）の生成を包含する。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＭａｎＮＡｃへの変換は、ＮｅｕＣ遺伝子によって促進される。ＭａｎＮＡｃからＳｉａへの変換は、ＮｅｕＢ遺伝子によって促進され、基質ＳｉａからＣＭＰ−Ｓｉａへの変換は、ＮｅｕＡ遺伝子によって促進される。これらの３つの酵素（またはそのホモログ）は、これまで病原性細菌において一緒に見出されている。すなわち、これら遺伝子のうちのどの１つも、他の２つを伴わずには見出されはいない。上記哺乳動物経路と比較して、この細菌経路を宿主（例えば、真菌宿主）中に導入するには、より少ない数の遺伝子操作しか必要ではない。
【０１３７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｅｕＣ遺伝子によってコードされるＥ．ｃｏｌｉ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼは、ポリシアル酸の細菌合成に関与する最初の酵素である（Ｒｉｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｇｅｒ，Ｃ．ら、２００１）。この酵素をコードするＮｅｕＣ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｍ８４０２６．１；配列番号１３）は、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１株から単離された。この遺伝子は、３９１アミノ酸のタンパク質をコードする（配列番号１４）（図２）（Ｚａｐａｔａ，Ｇ．，Ｃｒｏｗｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら、１９９２）。コードされるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＭａｎＮａｃへの変換を触媒する。この酵素のホモログは、いくつかの病原性細菌において同定されており、この細菌としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＷＨ８１０２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｕｅｍｏｐｈｉｌａ、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉが挙げられる。一実施形態において、機能的Ｅ．ｃｏｌｉ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ酵素（ＮｅｕＣ）（そのホモログ、改変体、および誘導体を含む）をコードする遺伝子が、クローニングされ、そして内因性ＣＭＰ−Ｓｉａを欠く非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主）において発現される。この宿主におけるＮｅｕＣの機能的発現は、機能的アッセイを使用して検出され得る。一実施形態において、機能的に発現されたＮｅｕＣは、ＭａｎＮＡｃの形成を検出することによって検出され得る。
【０１３８】
細菌経路における第２の酵素は、シアル酸シンターゼ（ｓｉａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）であり、これは、数個の酵素および哺乳動物の経路に存在する中間体を迂回して、ＭａｎＮＡｃを直接Ｓｉａに変換する。この３４６アミノ酸（配列番号１６）の酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉのＮｅｕＢ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｕ０５２４８．１；配列番号１５）（図３）（Ａｎｎｕｎｚｉａｔｏ，Ｐ．Ｗ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｌ．Ｆ．ら、１９９５）によりコードされる。別の実施形態において、機能的なＥ．ｃｏｌｉのシアル酸シンターゼ酵素をコードする遺伝子（ＮｅｕＢ）（そのホモログ、改変体および誘導体を含む）は、非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）においてクローニングされ、そして発現される。宿主におけるＮｅｕＢの機能的な発現は、機能的アッセイを用いて検出され得る。１つの実施形態において、ＮｅｕＢの機能的な発現は、Ｓｉａの形成を検出することにより検出され得る。
【０１３９】
この細菌経路における第３の酵素は、ＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼであり、これは、４１９アミノ酸（配列番号１８）から構成され、そして、Ｅ．ｃｏｌｉのＮｅｕＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｊ０５０２３；配列番号１７）（図４）によりコードされる。ＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼは、ＳｉａをＣＭＰ−Ｓｉａに変換する（Ｚａｐａｔａ，Ｇ．，Ｖａｎｎ，Ｗ．Ｆ．ら、１９８９）。ＮｅｕＡ遺伝子は、ＮｅｕＣ遺伝子およびＮｅｕＢ遺伝子と同じ生物において見られる。従って、なお別の実施形態において、機能的なＥ．ｃｏｌｉのＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼ酵素をコードする遺伝子（ＮｅｕＡ）（そのホモログ、改変体および誘導体を含む）は、非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）においてクローニングされ、そして発現される。１つの実施形態において、ＮｅｕＡの機能的な発現は、ＣＭＰ−Ｓｉａの形成を検出することにより検出され得る。
【０１４０】
なお別の実施形態において、機能的な細菌のＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼをコードする遺伝子（例えば、ＮｅｕＡ）は、細菌のＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼの活性を有する触媒ドメインと、この酵素を宿主細胞の核へと標的化するように選択された、細胞ターゲティングシグナルペプチド（通常は、この触媒ドメインと結合していない）とを含む、融合タンパク質をコードする。１つの実施形態において、上記細胞ターゲティングシグナルペプチドは、ＳＶ４０のカプシドポリペプチドであるＶＰ１のドメインを含む。別の実施形態いにおいて、シグナルペプチドは、この酵素の核への正確な局在化を確実にする、哺乳動物のＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼに由来する、１以上の内因性のシグナル伝達モチーフを含む。上記融合タンパク質を作製する方法は、当該分野で周知である。
【０１４１】
Ｅ．ｃｏｌｉのＮｅｕＡ遺伝子、ＮｅｕＢ遺伝子およびＮｅｕＣ遺伝子をＰＣＲで増幅した後、この増幅されたフラグメントを、プロモーターの制御下で選択可能な酵母組み込みベクターに連結した（実施例２）。宿主株（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）を、Ｎｅｕ遺伝子フラグメントを保有する各ベクターで形質転換した後、コロニーを、ポジティブ選択を適用することによってスクリーニングした。これらの形質転換体を、ＹＰＤ培地中で増殖させた。Ｎｅｕ遺伝子の酵素活性についてのアッセイを、各形質転換の後に行なう。内因性のシアル化がない非ヒト宿主の、新規のＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路の生成に関与する細菌酵素を発現する能力は、本明細書において初めて提供される。
【０１４２】
（真菌における、ハイブリッド哺乳動物／細菌ＣＭＰ−シアル酸生合成経路の操作）
哺乳動物および細菌の両方のＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路は、ＣＴＰおよびシアル酸の両方が、ＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼに利用可能であることを必要とする。酵素の機能は対応する細菌酵素に類似するものの、哺乳動物のＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼは、核への正確な局在化を確実にする、１以上の内因性のシグナル伝達モチーフを含み得る。真核生物は、ＣＴＰの核局在化プールを有し、そして、原核生物のＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼは、この区画に局在化し得ないので、哺乳動物の酵素および細菌の酵素の両方を組合せたハイブリッドＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路は、非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）において、シアル酸およびその中間体を生成するための好ましい方法である。この目的のために、経路は、宿主細胞において操作され得、この操作は、ＮｅｕＣおよびＮｅｕＢの両方、ならびに、哺乳動物のＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼの組み込みを包含する。ＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼ酵素は、クローニングされ、そして特徴付けられた、数種の哺乳動物ホモログ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＪ００６２１５；配列番号１９）（Ｍｕｎｓｔｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｅｃｋｈａｒｄｔ，Ｍ．ら、１９９８）（例えば、マウスＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼを参照のこと）（図５）から選択され得る。好ましくは、宿主細胞は、マウスＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼとの組み合わせたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉのＮｅｕＣ）およびシアル酸シンターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉのＮｅｕＢ）で、形質転換される。このハイブリッドＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路で操作された宿主は、ドナー分子であるＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを生成する（図１２）。１つのより好ましい実施形態において、宿主において発現される酵素の組み合わせは、ドナー分子であるＣＭＰ−Ｓｉａの生成を亢進する。
【０１４３】
（真菌においてＣＭＰ−シアル酸経路中間体の生成を亢進するための、代替的な経路に関与する酵素の操作）
本発明のなお別の局面において、ＣＭＰ−シアル酸生合成の代替的な経路に関与する酵素は、非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）において操作される。例えば、中間体が、上に概説した方法のうちの１つの間に制限される場合、代替的な機構を用いてこの中間体を生成する酵素の導入が、ＣＭＰ−シアル酸またはこの経路に沿ったあらゆる中間体の生成において十分な置換物として機能することが企図される。中間体ＭａｎＮＡｃおよびＳｉａを生成するための実施形態が、本明細書中に記載されるが、このアプローチは、他の中間体を生成するために拡大され得る。さらに、これらの酵素のうちの任意のものは、以前に記載された酵素（すなわち、同じ中間体を生成する酵素）の非存在下、もしくは以前に記載された酵素（すなわち、全体的な生成を亢進することが記載された酵素）の存在下のいずれかで、哺乳動物経路、細菌経路またはハイブリッド経路のいずれかへと組み込まれ得る。
【０１４４】
上記の実施形態において、ＭａｎＮＡｃは、哺乳動物の酵素であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃキナーゼによって、または細菌の酵素であるＮｅｕＣによってのいずれかで、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから生成される。この反応のための基質であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは、内因性のＮ−グリカンを含む分子のいくつかの分類の生成において必要とされることに起因して、細胞内に、ＣＭＰ−Ｓｉａの合成のために十分な量で存在することが予測される。しかし、潜在的にシアル酸生合成経路からのＭａｎＮＡｃに対する要求量の増加に起因して、ＭａｎＮＡｃが制限的になる場合、ＭａｎＮＡｃの細胞による供給は、ＭａｎＮＡｃを生成するための基質であるＧｌｃＮＡｃと反応する、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを導入することにより増加され得る。
【０１４５】
従って、１つの実施形態において、機能的なＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ酵素をコードする遺伝子（そのホモログ、改変体および誘導体を含む）は、宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）においてクローニングされ、そして発現される。ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを用いて、ＧｌｃＮＡｃをＭａｎＮＡｃに直接変換することは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの合成に関与する２段階プロセスと比べ、より短く、より効率的なアプローチである（図６）。ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼは、容易に入手可能であり、今日、クローニングされたことが確認されている唯一のＧｌｃＮＡｃエピメラーゼは、ブタの腎臓に由来するものである（Ｍａｒｕ，Ｉ．，Ｏｈｔａ，Ｙ．ら、１９９６）（実施例３）。ブタの腎臓から単離された遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｄ８３７６６；配列番号２１）は、４０２アミノ酸（配列番号２２）（図７）のタンパク質をコードする。この酵素がクローニングされたとき、この酵素は、以前にクローニングされたブタのレニン結合タンパク質（Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，Ｆｕｋｕｉ，Ｋ．ら、１９９０）と同一であることが分かった。これは、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性を有することが確認された唯一のタンパク質であるが、数種の他のレニン結合タンパク質が、他の生物（とりわけ、ヒト、マウス、ラットおよび細菌が挙げられる）から単離されている。これらは全て、有意な相同性を有することが示されている。例えば、ヒトＧｌｃＮＡｃエピメラーゼホモログ（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｄ１０２３２．１）は、ブタＧｌｃＮＡｃエピメラーゼタンパク質と８７％の同一性および９２％の類似性を有する。これらのホモログは、配列が非常に類似しているが、ブタタンパク質が、今日、実証可能なエピメラーゼ活性を有する唯一のタンパク質である。本発明の方法は、機能的なＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性をコードするあらゆる遺伝子を用いて実施され得る。ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼの活性の存在に基づいて、非ヒト宿主細胞（例えば、真菌宿主細胞）におけるこの遺伝子のクローニングおよび発現は、ＭａｎＮＡｃの細胞内レベルを高め、それによって、ＣＭＰ−シアル酸生合成経路においてＭａｎＮＡｃを利用する酵素のための十分な基質を提供すると予測される。
【０１４６】
別の実施形態において、図８に例示されるように、シアル酸アルドラーゼが、シアル酸の細胞内レベルを高めるために使用される。この酵素（また、シアル酸リアーゼおよびシアル酸ピルビン酸リアーゼとしても公知）は、ＭａｎＮＡｃのシアル酸への可逆的な反応を直接触媒する。低濃度のＳｉａの存在下で、この酵素は、ＭａｎＮＡｃとピルビン酸の縮合を触媒し、Ｓｉａを生成する。逆に、Ｓｉａの濃度が高い場合、この酵素は、逆反応を進めて、ＭａｎＮＡｃおよびピルビン酸を生成する（Ｖｉｍｒ，Ｅ．Ｒ．およびＴｒｏｙ，Ｆ．Ａ．１９８５）。上記の実施形態において、ＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼの存在は、実質的に全てのＳｉａをＣＭＰ−Ｓｉａに変換し、従って、アルドラーゼの平衡を、ＭａｎＮＡｃとピルビン酸の縮合へとシフトさせて、Ｓｉａを生成する。好ましくは、この実施形態において使用されるシアル酸アルドラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉのＮａｎＡ遺伝子から発現されるが、本発明は、この酵素源に制限されない。この酵素の遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｘ０３３４５；配列番号２３）は、２９７アミノ酸のタンパク質（配列番号２４）（図９）（Ｏｈｔａ，Ｙ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ら、１９８５）をコードする。この酵素に近いホモログは、多くの病原性細菌（とりわけ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅが挙げられる）において見られる。さらに、ホモログはまた、マウスおよびヒトを含む哺乳動物においても存在する。シアル酸アルドラーゼ活性をコードし、真菌宿主細胞において発現させる遺伝子をクローニングすることにより、Ｓｉａの細胞内レベルが高まり、それにより、ＣＭＰ−シアル酸生合成経路においてＳｉａを利用する酵素のための十分な基質を提供する（実施例４）。
【０１４７】
（ＣＭＰ−シアル酸合成の調節：フィードバック阻害および誘導性プロモーター）
哺乳動物細胞において、ＣＭＰ−シアル酸の生成は、高度に調節される。ＣＭＰ−シアル酸は、フィードバックインヒビターとして機能し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃキナーゼに作用して、ＣＭＰ−Ｓｉａのさらなる生成を防止する（Ｈｉｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｓ．，Ｓｔａｓｃｈｅ，Ｒ．ら、１９９７）（Ｋｅｐｐｌｅｒ，Ｏ．Ｔ．，Ｈｉｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｓ．ら、１９９９）。対照的に、細菌のＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路（図１Ｂ）は、ＣＭＰ−Ｓｉａの生成を制限する、フィードバック阻害による制御機構を有さないようである（Ｒｉｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｇｅｒ，Ｃ．ら、２００１）。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉのシアル酸アルドラーゼを、上記の経路の１つに組み込むことにより、平衡バランスに依存して、この酵素が触媒する反応の方向をシフトさせ、こうして、ＳｉａをＭａｎＮＡｃへと戻す加水分解を起こす可能性を有し得る。従って、上に概説したようなシアル酸アルドラーゼが関与する方法は、ＳｉａをＣＭＰ−Ｓｉａへと迅速に変換するＣＭＰ−シアル酸シンターゼの存在を仮定すると、この逆反応が生じることを防止する。
【０１４８】
このように記載された実施形態は、ＣＭＰ−Ｓｉａの特定の生合成経路における酵素の恒常的な過剰発現をさらに詳述する。上記の中間体および／または最終生成物のいずれかの存在が、非ヒト宿主（例えば、真菌宿主）に対して有害であり得るということを示唆する文献は、現在入手可能ではないが、本発明の好ましい実施形態は、調節可能な（例えば、誘導性の）プロモーターの制御下に１以上の酵素を有する。この実施形態において、目的のタンパク質（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃキナーゼ、ＮｅｕＣおよびＧｌｃＮＡｃエピメラーゼが挙げられるがこれらに限定されない）をコードする遺伝子（またはＯＲＦ）は、誘導性のプロモーター（アルコールオキシダーゼプロモーター（ＡＯＸ１またはＡＯＸ２；Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ．，Ｂｒｕｓｔ，Ｐ．Ｆ．ら、１９８７）、ガラクトース誘導性プロモーター（ＧＡＬ１０；Ｙｏｃｕｍ，Ｒ．Ｒ．，Ｈａｎｌｅｙ，Ｓ．ら、１９８４）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（ＴＥＴ；Ｂｅｌｌｉ，Ｇ．，Ｇａｒｉ，Ｅ．ら、１９９８）が挙げられるがこれらに限定されない）の下流にクローニングされ、この酵素の制御された発現を促進し、こうして、ＣＭＰ−Ｓｉａの生成を調節する。
【０１４９】
（ＣＭＰ−シアル酸の合成における、ＣＭＰ−シアル酸および中間体化合物の検出）
本発明の方法は、内因性のＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路がない非ヒト宿主細胞において、ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを生成するための、操作された経路を提供する。この経路における各中間体の生成を評価するために、これらの中間体は、検出可能でなければならない。従って、本発明はまた、このような中間体を検出するための方法も提供する。例えば、ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを検出するための方法は、実施例１０に提供される。現在、細胞内ＣＭＰ−Ｓｉａおよびその前駆体を測定するための方法はほんの少数が文献に記載されている。初期の方法は、ペーパークロマトグラフィーおよびチオバルビツール酸分析を包含し、そして、複雑であり、かつ時間がかかることが見出された（Ｂｒｉｌｅｓ，Ｅ．Ｂ．，Ｌｉ，Ｅ．ら、１９７７）（Ｈａｒｍｓ，Ｅ．，Ｋｒｅｉｓｅｌ，Ｗ．ら、１９７３）。ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）もまた使用されるが、初期の方法は、ＣＭＰ−Ｓｉａの迅速な加水分解をもたらす、酸性の溶出を採用した（Ｒｕｍｐ，Ｊ．Ａ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．ら、１９８６）。より近年、パルス電流測定検出と組み合せてアルカリ性の溶出プロトコールを用いる、高性能アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を用いる、より頑強な方法が記載されている（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｍ．，Ｇｅｉｌｅｎ，ＣＣら、１９９６）。この方法はまた、ＣＭＰ−Ｓｉａを検出することに加えて、前駆体であるシアル酸も検出し得、従って、これらの化合物のいずれかまたは両方の細胞内での合成を確認するために有用である。
【０１５０】
（コドンの最適化およびヌクレオチドの置換）
本発明の方法は、特定の宿主（例えば、真菌宿主）におけるコードされるタンパク質の効率的な転写／翻訳のための、塩基組成の最適化と組み合せて行なわれ得る。例えば、真菌宿主に導入されたＮｅｕ遺伝子は、細菌起源であるので、塩基対組成を最適化することは必須であり得る。この最適化は、ｔＲＮＡの細胞内プールが十分であることを確実にするための、コドンの最適化を包含する。外来遺伝子（外来ＯＲＦ）は、真菌宿主における完全な転写／翻訳に対して有害なモチーフを含み得、従って、より多くの従順な配列（ａｍｅｎａｂｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に対する置換を必要とし得る。導入されたタンパク質の各々の発現は、転写の段階および翻訳の段階の両方で、それぞれ、周知のノザンブロッティング技術およびウェスタンブロッティング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，２００１）によって、追跡され得る。
【０１５１】
（ベクター）
別の局面において、本発明は、ＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を促進する活性をコードする遺伝子、プロモーター、ターミネーター、選択マーカーおよび標的化隣接領域（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含むベクター（発現ベクターを含む）を提供する。このようなプロモーター、ターミネーター、選択マーカーおよび隣接領域は、当該分野において容易に利用可能である。好ましい実施形態において、各場合におけるプロモーターは、所望の酵素反応の十分な触媒を可能にするために、特定のＯＲＦによりコードされるタンパク質の最適な発現を提供するように選択される。この工程は、恒常的であるかまたは誘導性のいずれかであるプロモーターを選択することを必要とし、そして、転写の制御されたレベルを提供する。別の実施形態において、選択されるターミネーターは、転写の十分な終結を可能にする。なお別の実施形態において、使用される選択マーカーは、各ＯＲＦに対して固有のものであり、導入されるべきＯＲＦの特定の組み合わせを含む真菌株のその後の選択を可能にする。さらなる実施形態において、各融合構築物（プロモーター、ＯＲＦおよびターミネーターをコードする）が局在化する遺伝子座は、隣接する領域を選択することにより決定される。本発明は、本明細書中に開示されるベクターの使用に制限されない。
【０１５２】
（組み込み部位）
宿主細胞の染色体に複数の遺伝子を組み込むことが必要とされる可能性があり、これは、思慮深い戦略を必要とする。操作された株が、ある範囲の異なる遺伝子で形質転換され、そして、これらの遺伝子は、発酵プロセスの間中、所望の活性が維持されることを確実にする安定な様式で形質転換される。以前に記載された酵素活性の任意の組み合わせが、宿主内に操作される必要がある。さらに、非ヒトのグリコシル化反応に特徴的であることが公知の酵素をコードする多数の遺伝子が、非ヒト宿主細胞から欠失される必要がある。真菌宿主における非ヒトグルコシル化反応に特徴的であることが公知の酵素をコードする遺伝子およびその対応するタンパク質は、多数の下等な真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓなど）において、広範に特徴的であり、それによって、下等な真核生物における公知のグリコシルトランスフェラーゼ、その活性、およびそのそれぞれの遺伝子配列のリストを提供する。これらの遺伝子は、マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、１，３マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＭＮＮ１）（Ｇｒａｈａｍ，Ｔ．およびＥｍｒ，Ｓ．１９９１）、１，２マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＫＴＲ／ＫＲＥファミリー）、１，６マンノシルトランスフェラーゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＯＣＨ１)、マンノシルリン酸トランスフェラーゼおよびそのレギュレーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＭＮＮ４およびＭＮＮ６）、ならびに、異常な（すなわち、非ヒトの）グリコシル化反応に関与するさらなる酵素からなる群より選択されるようである。
【０１５３】
望ましくない酵素をコードする遺伝子は、所望の遺伝子のための潜在的な組み込み部位として機能する。例えば、１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性は、多くの公知の下等な真核生物においてグリコシル化の証明である。α−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＯＣＨ１）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからクローン化されており（Ｃｈｉｂａら、１９９８）、そして、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性の惹起（ＷＯ  ０２／００８７９）、および、この遺伝子における変異は、マンノシル化が減少した生存可能な表現型を生成する。従って、α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子座は、グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子の組み込みに対する主要な標的である。同様に、（１）よりヒト様の様式でグリコシル化する細胞の能力を向上させること、（２）タンパク質を分泌する細胞の能力を向上させること、（３）外来タンパク質のタンパク分解を減少させること、および（４）精製を促進するプロセスまたは発酵プロセス自体の他の特徴を向上させること、が期待される、遺伝子破壊事象をもたらす、他の染色体組み込みの範囲を選択することが可能である。
【０１５４】
（宿主細胞生成株）
内因性のＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路がなく、機能的なＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を発現する宿主細胞が提供される。１つの実施形態において、機能的なＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を発現する真菌宿主細胞が提供される。好ましくは、この宿主は、シアル化反応において、シアリルトランスフェラーゼおよびグリカンアクセプター（例えば、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）の存在下で、ドナー分子として使用され得る、ＣＭＰ−Ｓｉａの細胞プールを生成する。本発明の方法を用いることにより、ＣＭＰ−Ｓｉａを生成する種々の異なる宿主が生成され得る。好ましくは、産業的な発酵プロセスにおいて十分に実施可能な真菌宿主の頑強なタンパク質生成株が選択される。例えば、グリコシル化されるアクセプターグリカンを生成するこれらの株としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ。好ましくは、本発明の改変された株は、ＷＯ  ０２／００８７９、ＷＯ  ０３／０５６９１４およびＵＳ２００４／００１８５９０（この各々は、その全体が、本明細書により参考として援用される）に提供される方法に従ってヒト様のシアル化糖タンパク質を生成するために使用される。
【０１５５】
（治療用タンパク質）
ＷＯ  ０２／００８７９、ＷＯ  ０３／０５６９１４およびＵＳ２００４／００１８５９０に記載される技術と組み合せて、本発明の方法に従って生成される真菌宿主株は、異種性の治療用タンパク質の高い力価を生成し、このタンパク質において、目的のタンパク質（例えば、組換えタンパク質）における広範種々のシアル化グリカンは、真菌宿主のような、内因性のＣＭＰ−Ｓｉａを欠失した宿主において生成される。上記タンパク質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：エリスロポエチン、サイトカイン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω、ＴＮＦ−α、顆粒球−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１ｒａのようなインターロイキン）、凝固因子（たとえば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子）、ヒトプロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩおよびトロンボポエチン、抗体；ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびこれらのフラグメント、Ｆｃ領域およびＦａｂ領域、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ウロキナーゼ、カイメース、および尿トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、ＦＳＨ、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆体阻害因子−１（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ−１）、オステオプロテゲリン、α−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、α−フェトタンパク質およびグルコセレブロシダーゼ。これらおよび他のシアル化糖タンパク質が、治療用の投与のために特に有用である。
【０１５６】
以下は、本発明の組成物および方法を例示する実施例である。これらの実施例は、限定的なものとしてみなされるべきではなく、これらの実施例は、例示のみの目的のために含められる。
【実施例】
【０１５７】
（実施例１  ＣＭＰ−シアル酸合成に関与する酵素のクローニング）
ＣＭＰ−シアル酸生合成経路を、真菌宿主細胞にクローニングするための１つの方法は、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡから、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の各々に特異的なプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉのＮｅｕＡ遺伝子、ＮｅｕＢ遺伝子およびＮｅｕＣ遺伝子を増幅する工程を包含する（それぞれ、以下の表１、ならびに図４、３および２）。
【０１５８】
哺乳動物のＣＭＰ−シアル酸生合成経路をクローニングするために、マウスのＣＭＰ−Ｓｉａ合成ＯＲＦ（図５）を、マウスの下垂体ｃＤＮＡライブラリーから、表１に示されるプライマー対を用いて増幅した。ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ（ＣＭＰ−Ｓｉａ中間体を生成するための代替的な方法において以前に議論されたもの）を、対応する遺伝子に特異的なプライマー対（表１および図７）を用いるＰＣＲを使用して、ブタｃＤＮＡから増幅した。シアル酸アルドラーゼ遺伝子（図９）を、表１に示されるプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡから増幅した。マウスの二機能性ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ遺伝子を、表１に示されるプライマー対と用いるポリメラーゼ連鎖反応を使用して、マウスの肝臓から増幅した。マウスのＮ−アセチルノイラミン酸−９−リン酸シンターゼ遺伝子を、表１に示されるプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応を使用して、マウスの肝臓から増幅した。ヒトのＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼ遺伝子を、表１に示されるプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応を使用して、ヒトの肝臓から増幅した。各場合において、ＯＲＦを、以下の熱循環（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ）条件下で、忠実度の高いＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用して増幅した：９７℃を１分間の１サイクル；９７℃を２０秒間、６０℃を３０秒間、７２℃を２分間、の２５サイクル；７２℃を２分間の１サイクル。変異がないことを確認するためのＤＮＡ配列決定の後に、各ＯＲＦの、適切な真菌発現ベクターへのサブクローニングを容易にするための、適合性の制限部位を含むプライマーを用いて、各ＯＲＦを再び増幅する。
【０１５９】
【表１】
2007529228.tif 000003
（実施例２  Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける細菌Ｎｅｕ遺伝子の発現）
ＮｅｕＣ遺伝子の１１７６ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントを、酵母組み込みベクターｐＪＮ３４８（ＧＡＰＤＨプロモーター、ＮｏｔＩ  ＡｓｃＩ  ＰａｃＩ制限部位カセット、ＣｙｃＩＩ転写ターミネーター、ポジティブ選択マーカーとしてのＵＲＡ３を含む、改変されたｐＵＣ１９ベクター）中のＮｏｔＩ−ＡｓｃＩ部位に連結して、ｐＳＨ２５６を生成した。同様に、ＮｅｕＢ遺伝子のＰＣＲ増幅フラグメント（１０４１ｂｐ）を、ＡＤＥをポジティブ選択マーカーとして用いて、ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３３５中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位に連結して、ｐＳＨ２５５を生成した。ＮｅｕＡ遺伝子の１２６０ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントを、ＡＲＧをポジティブ選択マーカーとして用いて、ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３４６中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位に連結して、ｐＳＨ２５４を生成した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓをエレクトロポレーションにより各ベクターで形質転換した後、これらの細胞を、新しく導入されたベクターのポジティブ選択を容易にするために、対応する脱落寒天プレート（ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  ａｇａｒ  ｐｌａｔｅ）の上にプレーティングした。各遺伝子の導入を確認するために、数百クローンを、それぞれの脱落プレート上に再度接ぎ、そして、２６℃において２日間増殖させた。一旦十分な材料が増殖すると、各クローンを、導入された遺伝子に特異的なプライマーを用いるコロニーＰＣＲによりスクリーニングした。Ｔａｋａｒａ製のポリメラーゼＥｘＴａｑを用いるコロニーＰＣＲのための条件は、以下の通りであった：９７℃で３分間を１サイクル；９７℃で２０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１ｋｂあたり２分間を３０サイクル；７２℃で１０分間を１サイクル。その後、コロニーＰＣＲからの数個のポジティブクローンを、２００ｍｌの増殖培地を含むバッフルフラスコ内で増殖させた。２．６８ｇ／ｌの酵母窒素ベース、２００ｍｇ／ｌのビオチン、および２ｇ／ｌのデキストロースを含む増殖培地の基本組成に、使用した株に依存して、アミノ酸を補充した。細胞を、２０ｍＭのＭａｎＮＡｃの存在下または非存在下で、この培地中で増殖させた。３０℃にて４〜６日間バッフルフラスコ内で増殖させた後、細胞をペレット状にし、そして、実施例１０に記載されるように、シアル酸経路の中間体について分析した。
【０１６０】
（実施例３  Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ遺伝子の発現）
ブタＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅フラグメントを、ＵＲＡ３をポジティブ選択マーカーとして用いて、ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３４８中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位に連結した。内因性のＧｌｃＮＡｃを生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ遺伝子フラグメントを保有するベクターで形質転換して、形質転換体をスクリーニングした。
【０１６１】
（実施例４  Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるシアル酸アルドラーゼ遺伝子の発現）
Ｅ．ｃｏｌｉのシアル酸アルドラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅フラグメントを、ＡＤＥをポジティブ選択マーカーとして用いて、ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３３５中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位に連結して、ｐＳＨ２７５を生成した。内因性のＭａｎＮＡｃを生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、シアル酸アルドラーゼ遺伝子フラグメントを保有するベクターで形質転換して、形質転換体をスクリーニングした。
【０１６２】
（実施例５  Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼをコードする遺伝子の発現）
マウスの二機能性ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ酵素をコードする遺伝子のＰＣＲ増幅フラグメントを、ＵＲＡをポジティブ選択マーカーとして用いて、ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３４８中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位に連結して、ｐＳＨ２８４を生成した。内因性のＭａｎＮＡｃを生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、上記遺伝子フラグメントを保有するベクターで形質転換して、形質転換体をスクリーニングした。
【０１６３】
（実施例６  Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸−９−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の発現）
マウスのＮ−アセチルノイラミン酸−９−リン酸シンターゼ遺伝子のＰＣＲ増幅フラグメントを、ＡＤＥをポジティブ選択マーカーとして用いて、ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３３５中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位に連結して、ｐＳＨ２８５を生成した。ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐを生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、上記遺伝子フラグメントを保有するベクターで形質転換して、形質転換体をスクリーニングした。
【０１６４】
（実施例７  Ｎ−アセチルノイラミン酸−９−ホスファターゼをコードする遺伝子の同定、クローニングおよび発現）
Ｎ−アセチルノイラミン酸−９−ホスファターゼ活性は、ラットの肝細胞のサイトゾルフラクションにおいて検出されている（Ｖａｎ  Ｒｉｎｓｕｍ，Ｊ．，Ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ｗ．１９８４）。本発明者らは、この方法を繰返し、ＮｅｕＡｃ−９−Ｐのみに対するホスファターゼ活性を含む細胞抽出フラクションを単離した。このフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は、単一のタンパク質バンドを同定する。その後、このサンプルを、ＰＤＶＦメンブレン上に電気ブロッティングし、そして、Ｎ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法により同定した。同定された配列は、単離されたタンパク質のＯＲＦの５’末端に、縮重オリゴヌクレオチドを生成することを可能にする。これらの縮重プライマーを、ラットの肝臓Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において供給されるＡＰ１プライマーと組み合せて用いることによって、製造業者の指示書に従って、全長ＯＲＦを単離した。完全なＯＲＦを、その後、ＨＩＳ遺伝子をポジティブ選択マーカーとして用いて、ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３４７（ＷＯ  ０２／００８７９）中に連結した。ＮｅｕＡｃ−９−Ｐを生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、所望の遺伝子フラグメントを保有するベクターで形質転換して、形質転換体を実施例２に記載したようにスクリーニングした。
【０１６５】
（実施例８  Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＣＭＰ−シアル酸シンターゼ遺伝子のクローニングおよび発現）
マウスのＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼ遺伝子をコードする遺伝子のＰＣＲ増幅フラグメントを、ＡＲＧ遺伝子をポジティブ選択マーカーとして用いて、ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターｐＪＮ３４６中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位に連結した。シアル酸を生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、上記遺伝子フラグメントを保有するベクターで形質転換して、形質転換体を実施例２に記載したようにスクリーニングした。同様にして、ヒトのＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＦ３９７２１２）をコードする遺伝子を、酵母組み込みベクターｐＪＮ３４６中のＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位に連結して、ベクターｐＳＨ２５７を生成した。シアル酸を生成し得るＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、エレクトロポレーションによりｐＳＨ２５７で形質転換して、ＣＭＰ−Ｓｉａを生成し得る株を生成した。
【０１６６】
（実施例９  Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、ハイブリッドＣＭＰ−Ｓｉａ経路の発現）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＪＣ３０８（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ，２００１  Ｇｅｎｅ  ２６３，１５９−１６４）を、エレクトロポレーションにより、各２０ｍｇのＮｅｕＣを含むベクター（ｐＳＨ２５６）、ＮｅｕＢを含むベクター（ｐＳＨ２５５）およびｈＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼを含むベクター（ｐＳＨ２５７）で多重形質転換（ｓｕｐｅｒ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）した。得られた細胞を、ヒスチジンを補充した最小培地（１．３４ｇ／ｌの酵母窒素ベース、２００ｍｇ／ｌのビオチン、２ｇ／ｌのデキストロース、２０ｇ／ｌの寒天および２０ｍｇ／ｌのＬ−ヒスチジンを含有する）上にプレーティングした。３０℃にて４日間インキュベートした後、数百のクローンを、ヒスチジンを補充した最小培地プレート（組成については上記を参照のこと）上に再度接ぐことによって単離した。接がれたクローンを、（実施例２に記載されたように）クローンについてコロニーＰＣＲを行なう前に、２日間増殖させた。ＮｅｕＣ、ＮｅｕＢおよびｈＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼに特異的なプライマーを用いて、形質転換したクローン中の各ＯＲＦの存在を確認した。３つ全てのＯＲＦについてポジティブな１２のクローン（ＹＳＨ９９ａ−Ｉと名付けた）を、２００ｍｌの増殖培地（２．６８ｇ／ｌの酵母窒素ベース、２００ｍｇ／ｌのビオチン、２０ｍｇ／ｌのＬ−ヒスチジンおよび２ｇ／ｌのデキストロースを含む）を含むバッフルフラスコ内で増殖させた。増殖培地にＭａｎＮＡｃを補充する効果を、２０ｍＭのＭａｎＮＡｃの存在下または非存在下で、細胞を増殖させることにより調べた。３０℃において４〜６日間、バッフルフラスコ内で増殖させた後、細胞を、ペレット状にし、そして、実施例１０に記載されるように、シアル酸経路の中間体の存在について分析した。
【０１６７】
実施例１０において概説されるアッセイを用いて、細胞の抽出物を比較すると、外因性のＣＭＰ−ＳｉａのないＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ９９ａからの細胞抽出物は、アクセプター基質上へのＳｉａの移行を示した。これは、ＣＭＰ−Ｓｉａの存在を示すものである（図１２）。モノシアル化およびジシアル化の二触角Ｎ−グリカン（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎ）の両方は、そのそれぞれの対応する時間である、２０分および２３分において溶出した。さらに、シアリダーゼの処理（実施例１１）は、シアル酸の除去を示した（図１３）。従って、記載されるハイブリッドＣＭＰ−Ｓｉａ生合成経路を有する、ＮｅｕＣ、ＮｅｕＢおよびｈＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼを含む操作された酵母株は、ＣＭＰ−シアル酸の内因性のプールを生成し得る。
【０１６８】
（実施例１０  遺伝的に変更されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の存在についてのアッセイ）
酵母細胞を、冷ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、そして、１００ｍＭの重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．５）中に懸濁し、そして、氷上に置いた。この細胞を、Ｆｒｅｎｃｈ圧力セル（ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌ）、その後に、超音波処理を用いて、溶解した。可溶性の細胞内容物を、超遠心分離により細胞片から分離した。氷冷エタノールを６０％の最終濃度までこの上清に加えて、そして、１５分間氷上に置き、その後、超遠心分離により不溶性のタンパク質を除去した。この上清を凍結し、凍結乾燥により濃縮した。乾燥したサンプルを、水（ｐＨが８．０であることを保証する）中に再懸濁し、次いで、あらかじめリンスした１０，０００  ＭＷＣＯ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎカートリッジを通して濾過した。この濾液を、Ｍｏｎｏ  Ｑイオン交換カラム上で分離し、そして、標準のＣＭＰ−シアル酸と同時に溶出した溶出フラクションをプールし、そして、凍結乾燥する。
【０１６９】
乾燥した濾液を、１００μＬの１００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）に溶解し、１１μＬ（５ｍＵ）のα−２，６シアリルトランスフェラーゼおよび３．３μＬ（１２ｍＵ）のα−２，３シアリルトランスフェラーゼを加え、そして、１０μＬの混合物を、ネガティブコントロールのために取っておいた。その後、７μＬ（１．４μｇ）の２−アミノベンズアミド標識アシアロ二触角Ｎ−グリカン（ＮＡ２、Ｇｌｙｃｏ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）を残りの混合物に加えて、その後、１０μＬをポジティブコントロールとして取っておいた。次いで、サンプルおよびコントロールの反応を、３７℃で１６時間インキュベートした。次いで、１０μＬの各サンプルを、ＧｌｙｃｏＳｅｐ−Ｃアニオン交換カラムにて、製造業者の指示書に従って分離した。各々約０．０５μｇのモノシアル化およびジシアル化の二触角グリカンから構成される別個のコントロールを、カラム上で分離して、相対的な保持時間を確立した。結果を、図１０〜１４に示す。
【０１７０】
（実施例１１  シアリダーゼ処理）
シアリルトランスフェラーゼの存在下で、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ９９ａ株からの抽出物と共に、二触角のガラクトシル化Ｎ−グリカンをインキュベートすることにより、シアル化されたＮ−グリカンが生成した。その後、このシアル化Ｎ−グリカンを、以下のようにして脱シアル化した：シアル化されたサンプルを、１０，０００分子量カットオフのＭｉｃｒｏｃｏｎカートリッジを通して、トランスフェラーゼを取り除いた。このカートリッジを、１００μＬの水で２回洗浄し、これを、元の溶離液と共にプールした。この溶離液のＨＰＬＣによる分析（図１３）は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ処理前のＨＰＬＣスペクトルと類似するスペクトルを生じた。残りのサンプルを乾燥状態まで凍結乾燥して、２５μｌの１×ＮＥＢ  Ｇ１緩衝液に再懸濁した。１００Ｕのシアリダーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃Ｐ０７２０Ｌ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）を加えた後、この再懸濁したサンプルを、３７℃にて一晩インキュベートし、その後、以前に記載されたようにＨＰＬＣ分析を行なった。
【０１７１】
（参考文献）
【０１７２】
【表２−１】
2007529228.tif 000004
【０１７３】
【表２−２】
2007529228.tif 000005
【０１７４】
【表２−３】
2007529228.tif 000006
【０１７５】
【表２−４】
2007529228.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】図１は、哺乳動物および細菌におけるＣＭＰ−シアル酸生合成経路を図示する。各経路に関与する酵素は、斜体にされている。主な基質、中間体および生成物は、太字にされている（ＰＥＰ：ホスホエノールピルビン酸；ＣＴＰ：シチジントリホスフェート）。
【図２】図２は、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質ＮｅｕＣのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｍ８４０２６．１；配列番号１３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号１４）を示す。下線が付されたＤＮＡ配列は、そのＯＲＦを増幅するためにプライマーが設計された領域である。
【図３】図３は、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質ＮｅｕＢのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｕ０５２４８．１；配列番号１５）およびその推定アミノ酸配列（配列番号１６）を示す。下線が付されたＤＮＡ配列は、そのＯＲＦを増幅するためにプライマーが設計された領域である。
【図４】図４は、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質ＮｅｕＡのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｊ０５０２３．１；配列番号１７）およびその推定アミノ酸配列（配列番号１８）を示す。下線が付されたＤＮＡ配列は、そのＯＲＦを増幅するためにプライマーが設計された領域である。
【図５】図５は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＣＭＰ−ＳｉａシンターゼのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＪ００６２１５；配列番号１９）およびその推定アミノ酸配列（配列番号２０）を示す。下線が付されたＤＮＡ配列は、そのＯＲＦを増幅するためにプライマーが設計された領域である。
【図６】図６は、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎΝＡｃ）をインビボで生成するための別の生合成経路を図示する。各経路に関与する酵素は、斜体にされている。主な基質、中間体および生成物は、太字にされている。
【図７】図７は、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ＧｌｃΝＡｃエピメラーゼのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｄ８３７６６；配列番号２１）およびそのアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。下線が付されたＤＮＡ配列は、そのＯＲＦを増幅するためにプライマーが設計された領域である。
【図８】図８は、シアレートアルドラーゼによって触媒される可逆的な反応、およびこの反応がシアル酸（Ｓｉａ）濃度に依存することを図示する。各経路に関与する酵素は、斜体にされている。主な基質、中間体および生成物は、太字にされている。
【図９】図９は、Ｅ．ｃｏｌｉシアレートアルドラーゼのＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｘ０３３４５；配列番号２３）およびそのアミノ酸配列（配列番号２４）を示す。下線が付されたＤＮＡ配列は、そのＯＲＦを増幅するためにプライマーが設計された領域である。
【図１０】図１０は、アクセプターグリカンの非存在下で、アッセイ条件（実施例１０）下でインキュベートした株ＹＳＨ９９ａからの細胞抽出物のネガティブコントロールのＨＰＬＣを示す。２６．５分間で溶出している対の２本のピークは、夾雑する細胞成分に由来する。
【図１１】図１１は、２−ＡＢ（アミノベンズアミド）標識したアクセプターグリカンの存在下でかつＣＭＰ−シアル酸を補充したアッセイ条件（実施例１０）下でインキュベートした株ＹＳＨ９９ａからのポジティブコントロール細胞抽出物のＨＰＬＣを示す。２３分間で溶出しているピークは、バイアンテナリーガラクトシル化Ｎ−グリカンの各分枝でのシアル化に対応する。２６．５分間で溶出している対になった２本のピークは、夾雑する細胞成分に由来する。
【図１２】図１２は、アクセプターグリカンの存在下で外因のＣＭＰ−シアル酸なしで、アッセイ条件（実施例１０）下でインキュベートした株ＹＳＨ９９ａからの細胞抽出物のＨＰＬＣを示す。２０分間および２３分間で溶出しているピークは、バイアンテナリーガラクトシル化Ｎ−グリカンのモノシアル化およびジシアル化に対応する。２６．５分間で溶出している対になった２本のピークは、夾雑する細胞成分に由来する。
【図１３】図１３は、ＹＳＨ９９ａ抽出物インキュベーションから得たＮ−グリカンのシアリダーゼ処理を示す。図１２に示されるサンプルを、１００Ｕ  シアリダーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）の存在下で３７℃で一晩インキュベートした。２０分間および２３分間で溶出しているピーク（モノシアル化Ｎ−グリカンおよびジシアル化Ｎ−グリカンに対応する）が、除去された。２６分間の夾雑するピークは依然として残っている。
【図１４】図１４は、市販のモノシアル化Ｎ−グリカンおよびジシアル化Ｎ−グリカンの標準物質を示す。２０分間および２３分間で溶出しているピークは、市販の標準物質Ａ１およびＡ２（Ｇｌｙｋｏ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）のモノシアル化およびジシアル化に対応する。
【図１】
2007529228.tif 000008
【図２】
2007529228.tif 000009
【図３】
2007529228.tif 000010
【図４】
2007529228.tif 000011
【図５】
2007529228.tif 000012
【図６】
2007529228.tif 000013
【図７】
2007529228.tif 000014
【図８】
2007529228.tif 000015
【図９】
2007529228.tif 000016
【図１０】
2007529228.tif 000017
【図１１】
2007529228.tif 000018
【図１２】
2007529228.tif 000019
【図１３】
2007529228.tif 000020
【図１４】
2007529228.tif 000021
【配列表】
2007529228000001.app
【国際調査報告】
2007529228.tif 000022
2007529228.tif 000023
2007529228.tif 000024
2007529228.tif 000025