(57)【要約】プロテアーゼヘプシンは、卵巣癌およびその他の悪性腫瘍で特異的に過剰発現される。多数のヘプシンペプチドがヘプシンに対する免疫反応を誘導することができ、従って、卵巣癌およびその他の悪性腫瘍に対する免疫療法の監視および開発においてこれらペプチドの潜在能力を実証する。卵巣癌細胞、前立腺癌細胞および腎癌細胞に対するマーカーとして有用なヘプシンタンパク質変異体も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体にヘプシンに対するワクチンを接種する方法であって、
ヘプシンタンパク質またはその断片を個体に接種する工程を含み、
前記ヘプシンまたはその断片が前記個体において免疫反応を誘導することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ヘプシンタンパク質またはその断片が、ペプチド負荷(peptide-loaded )樹状細胞に存在するかまたは発現ベクターから発現されたものであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記個体が癌に罹患しているか、癌に罹患している疑いがあるか、または癌に罹患する危険性があり、その癌が卵巣癌、肺癌、前立腺癌および結腸癌より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ヘプシン断片の長さが、約９残基長から約２０残基長であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ヘプシン断片が、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１８９、１９０および１９１より成る群から選択される配列からなることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ヘプシンタンパク質またはその断片が、配列番号１９５のアミノ酸配列を有するヘプシン変異体に由来することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
ヘプシンに対する免疫活性化細胞を作成する方法であって、
免疫細胞をヘプシンタンパク質またはその断片に暴露する工程を含み、
前記ヘプシンタンパク質またはその断片への前記暴露が前記免疫細胞を活性化し、それによってヘプシンに対する免疫活性化細胞が産生されることを特徴とする方法。
【請求項８】
前記免疫細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞および樹状細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ヘプシンタンパク質またはその断片が、配列番号１９５のアミノ酸配列を有するヘプシン変異体に由来することを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記ヘプシン断片の長さが、約９残基長から約２０残基長であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記断片が、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１８９、１９０および１９１より成る群から選択される配列からなることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記樹状細胞が前記暴露に先がけて個体から単離され、活性化樹状細胞が前記暴露の後に前記個体に再導入されることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１３】
前記個体が、癌に罹患しているか、癌に罹患している疑いがあるか、または癌に罹患する危険性があり、その癌が卵巣癌、肺癌、前立腺癌および結腸癌より成る群から選択されることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
個体中のヘプシンを標的とする免疫治療法であって、
ａ）前記個体から樹状細胞を単離し；
ｂ）前記樹状細胞においてヘプシンタンパク質またはその断片を発現させ；さらに
ｃ）前記樹状細胞を前記個体に移入する；工程を含み、
前記樹状細胞が前記個体においてヘプシン特異的免疫反応を活性化し、それによって前記個体においてヘプシンを標的とする免疫治療がなされることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記個体が、癌に罹患しているか、癌に罹患している疑いがあるか、または癌に罹患する危険性があり、その癌が卵巣癌、肺癌、前立腺癌および結腸癌より成る群から選択されることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記樹状細胞におけるヘプシンの発現が、トランスフェクション、形質導入、およびヘプシンタンパク質またはその断片の前記樹状細胞への負荷より成る群から選択される手段によって得られることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記ヘプシンタンパク質またはその断片が、配列番号１９５のアミノ酸配列を有するヘプシン変異体に由来することを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記ヘプシン断片の長さが、約９残基長から約２０残基長であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
前記ヘプシン断片が、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１８９、１９０および１９１より成る群から選択される配列から成ることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
個体中のヘプシンを標的とする免疫治療法であって、
ａ）前記個体から樹状細胞を単離し；
ｂ）前記樹状細胞においてヘプシンタンパク質またはその断片を発現させ； 
ｃ）前記個体から単離されたＴ細胞を含む免疫細胞を前記樹状細胞に暴露し、それによって該免疫細胞からヘプシン特異的Ｔ細胞を作成し；さらに
ｄ）前記免疫細胞を前記個体に移入して戻し、その際に該免疫細胞が個体においてヘプシン特異的免疫反応を活性化し、それによって該個体においてヘプシンを標的とする免疫治療がなされることを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記個体が、癌に罹患しているか、癌に罹患している疑いがあるか、または癌に罹患する危険性があり、その癌が卵巣癌、肺癌、前立腺癌および結腸癌より成る群から選択されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記樹状細胞におけるヘプシンの発現が、トランスフェクション、形質導入、およびヘプシンタンパク質またはその断片の前記樹状細胞への負荷より成る群から選択される手段によって得られることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記ヘプシンタンパク質またはその断片が、配列番号１９５のアミノ酸配列を有するヘプシン変異体に由来することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記ヘプシン断片の長さが、約９残基長から約２０残基長であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
前記ヘプシン断片が、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１８９、１９０および１９１より成る群から選択される配列からなることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
ヘプシンまたはヘプシンペプチドでの個体へのワクチン接種の効果を監視する方法であって、
ヘプシンまたはヘプシンペプチドを前記個体に接種し;
前記個体からＴ細胞を単離し；さらに
前記ヘプシンまたはヘプシンペプチドにより誘導された免疫反応を測定する；工程を含み、
正常な個体からの細胞により示された免疫反応と比較して免疫反応レベルが高められた場合に、前記個体がヘプシンまたはヘプシンペプチドでワクチン接種されたことが示唆されることを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記免疫反応が、前記ヘプシンまたはヘプシンペプチドにより誘導されたＴ細胞増殖、前記ヘプシンまたはヘプシンペプチドに特異的なサイトカイン分泌Ｔ細胞の頻発、および前記ヘプシンまたはヘプシンペプチドに特異的なＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の頻発より成る群から選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記ヘプシンまたはヘプシンペプチドが、配列番号１９５のアミノ酸配列を有するヘプシン変異体に由来することを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記ヘプシンペプチドが、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１８９、１９０および１９１より成る群から選択される配列からなることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
細胞における内因性ヘプシンの発現を阻害する方法であって、
前記細胞に、配列番号１８８の配列に相補的な配列を含むベクターを導入する工程を含み、
前記細胞における前記ベクターの発現が、内因性ヘプシンのｍＲＮＡにハイブリダイズするヘプシンアンチセンスｍＲＮＡを産生し、それによって前記細胞における内因性ヘプシンの発現が阻害されることを特徴とする方法。
【請求項３１】
細胞におけるヘプシンタンパク質を阻害する方法であって、
ヘプシンタンパク質またはその断片に特異的な抗体を前記細胞に導入する工程を含み、
前記ヘプシンタンパク質またはその断片への前記抗体の結合が、前記細胞におけるヘプシンタンパク質を阻害することを特徴とする方法。
【請求項３２】
前記ヘプシンタンパク質の断片が、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１８９、１９０および１９１より成る群から選択される配列からなることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記ヘプシンタンパク質またはその断片が、配列番号１９５のアミノ酸配列を有するヘプシン変異体に由来することを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
治療的部分とヘプシンまたはヘプシン変異体に特異的な標的部分とを有する化合物を、個体に投与する工程を含むことを特徴とする、個体への標的治療方法。
【請求項３５】
前記ヘプシン変異体が、配列番号１９５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記標的部分が、ヘプシンに特異的な抗体、およびヘプシンと結合するリガンドまたはリガンド結合領域より成る群から選択されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記治療的部分が、放射性同位元素、毒素、化学療法剤、免疫刺激剤および細胞毒性剤より成る群から選択されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
前記個体が、卵巣癌、肺癌、前立腺癌および結腸癌より成る群から選択される癌に罹患していることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
（i）適切なアジュバント、ならびに（ii）完全長のヘプシンタンパク質、ヘプシンタンパク質の断片、ヘプシンタンパク質変異体およびヘプシンタンパク質変異体の断片より成る群から選択されるタンパク質を含む免疫組成物。
【請求項４０】
前記ヘプシン変異体またはその断片が、配列番号１９５のアミノ酸配列を有するヘプシン変異体に由来することを特徴とする請求項３９の免疫組成物。
【請求項４１】
前記ヘプシンタンパク質の断片の長さが、約９残基長から約２０残基長であることを特徴とする請求項３９の免疫組成物。
【請求項４２】
前記ヘプシンタンパク質の断片が、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１８９、１９０および１９１より成る群から選択される配列から成ることを特徴とする請求項３９の免疫組成物。
【請求項４３】
配列番号１８８の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
請求項４３のオリゴヌクレオチドと、生理学的に許容可能なキャリアとを含む組成物。
【請求項４５】
有効量の請求項４３記載のオリゴヌクレオチドを個体に投与する工程を含むことを特徴とする、治療を必要とする個体において新生物症状の治療を行う方法。
【請求項４６】
前記新生物症状が、卵巣癌、肺癌、前立腺癌および結腸癌より成る群から選択されることを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
ヘプシン活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ヘプシンタンパク質を含む検体を化合物に接触させ；さらに
（ｂ）ヘプシンプロテアーゼ活性を測定する；工程を含み、
前記化合物の非存在下におけるヘプシンプロテアーゼ活性と比較して、前記化合物の存在下における前記ヘプシンプロテアーゼ活性が相対的に低下した場合に、前記化合物がヘプシン活性を阻害することが示唆されることを特徴とする方法。
【請求項４８】
配列番号１９５のアミノ酸配列またはその断片を含むヘプシン変異体をコードする単離ＤＮＡ。
【請求項４９】
配列番号１９５のアミノ酸配列またはその断片を含む、単離および精製ヘプシンタンパク質変異体。
【請求項５０】
個体における腫瘍細胞を検出する方法であって、
前記個体から生物学的検体を得て；さらに
ヘプシンタンパク質またはヘプシンタンパク質変異体の発現を検出する；工程を含み、
前記検体中におけるヘプシンタンパク質または変異体の発現が、前記個体における腫瘍細胞の存在を示唆することを特徴とする方法。
【請求項５１】
前記ヘプシン変異体が、配列番号１９５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記発現の検出が、ＤＮＡレベルまたはタンパク質レベルで行われることを特徴とする請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
前記腫瘍細胞が、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞および腎臓癌細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
前記生物学的検体が、血液、尿、間質液、腹水、腫瘍組織生検試料および循環腫瘍細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項５０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
概して、本発明は分子生物学および医薬の分野に関する。より詳細には、本発明は癌の研究および診断の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
悪性細胞が増殖、拡散または転移するためには、局所の宿主組織に浸潤し、原発性腫瘍から解離または流出し、血流中に進入しさらにその中で生存し、標的組織の表面に侵入することにより移植し、さらに新規のコロニー増殖（血管新生の誘導因子および成長因子の導入を含む）を誘導する環境を確立する能力を有していなければならない。この過程の間に、基底膜および結合組織などの天然組織バリアが崩壊されなければならない。これらのバリアは、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカンおよび細胞外マトリックス糖タンパク質を含む。原発性腫瘍を包囲する天然バリアおよび転移性浸潤部位での天然バリアの両方の天然バリアの崩壊は、細胞外プロテアーゼのマトリックスの作用により生じると考えられている。
【０００３】
プロテアーゼは、以下の４種類のファミリー：セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびシステインプロテアーゼに分類される。多くのプロテアーゼが、ヒト疾患の進行に関与することが認められており、これらの酵素が新規治療薬としての阻害剤開発の標的となっている。一部の特定プロテアーゼが、様々な群の癌において誘導および過剰発現されており、それ自体が早期診断マーカーの潜在的候補であり、可能性のある治療的介入のための標的である。いくつかの例を表１に示す。
【０００４】
個体のプロテアーゼのダウンレギュレーションまたは阻害、および浸潤能または悪性度の低下を支持する多くの証拠が存在する。Clarkらによる研究では、ヒトの肺小細胞癌のin vitro増殖の阻害が、一般的なセリンプロテアーゼ阻害剤を用いて明らかにされた。より最近になって、Torres-Rosedo らは(1993)、セリンプロテアーゼヘプシン遺伝子に対して特異的なアンチセンス阻害剤を用いて肝癌細胞の増殖の阻害を明らかにした。黒色腫細胞の転移能力もメタロプロテアーゼの合成阻害剤（batimastat）を用いてマウスモデルにおいて低下することが示されている。Powellら（1993）は、非転移性前立腺癌の細胞株における細胞外プロテアーゼの発現により悪性進行が促進されることを確認する証拠を発表した。具体的には、転移促進が、PUMP-1メタロプロテアーゼ遺伝子の導入後および発現後に示された。相対的に非転移性である細胞型に対する細胞表面のプロテアーゼの発現によりそのような細胞の浸潤能が増大するとの概念を支持する多くのデータも存在する。
【０００５】
これまでのところ、卵巣癌は婦人科の悪性過形成を有する女性における第１番目の死亡原因であり続けている。このような癌と診断された女性の約７５％は、初回診断時にすでに同疾患の進行病期（IIIおよびIV）に至っている。過去２０年の間、これら患者に対する診断及び５年生存率のいずれも大幅には改善されていない。これは、同疾患が既に進行病期の状態で初めて検出される率が高いことが実質的な原因である。従って、早期診断を改善する新規マーカーを開発し、それによって初回診断時に進行病期で検出される確率を低下させることが未だ課題であり続ける。１つの組織から離れて別の組織の表面に再度取り付く能力によって、この疾患に関連する罹患率および死亡率がもたらされる。このため、細胞外プロテアーゼは、悪性の卵巣過形成のマーカーとしての優れた候補であると考えられる。
【０００６】
従って、先行技術は、特に卵巣癌に対する、早期診断の指標として有用な腫瘍マーカーを欠く。本発明は、当技術分野においてこの長年のニーズと要望を満たす。
【表１】
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【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、８０％の卵巣癌およびその他の腫瘍の表面に特異的に関連することが本明細書中で明らかにされているヘプシンプロテアーゼの存在を示す組織中のヘプシンｍＲＮＡをスクリーニングすることにより、例えば卵巣癌などの癌の検出を可能とする。プロテアーゼは、腫瘍の増殖および転移に不可欠な要素と考えられていることから、その存在有無を示すマーカーは癌の診断に有用である。さらに本発明は、治療（すなわち、ヘプシンの阻害またはヘプシン発現の阻害による）、標的療法およびワクチン接種などに対して有用である。
【０００８】
本発明の一態様において、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞または腎臓癌細胞に対するマーカーとして有用であるヘプシンタンパク質の変異体またはその断片を提供する。
【０００９】
別の一実施形態では、本発明は、個体にヘプシンに対するワクチン接種を行う方法を提供するか、またはヘプシンタンパク質またはその断片をコードする発現ベクターを個体に接種することによりヘプシンに対する免疫活性化細胞を作成する方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、個体におけるヘプシンを標的とする免疫治療法であって、個体から採取した末梢血からin vitroで樹状細胞を作成し、これらの樹状細胞にヘプシンタンパク質またはその断片を負荷し(loading)、次にこれらの樹状細胞を単回投与または複数回投与でその個体に戻す手順を含む。ヘプシン負荷(hepsin-loaded)樹状細胞またはヘプシン発現樹状細胞は、in vitroのヘプシン特異的Ｔ細胞反応の刺激にも用いることができ、続いて該個体が自己由来のヘプシン特異的Ｔ細胞を投与される養子免疫療法が実施される。
【００１１】
ヘプシンまたはヘプシンペプチドを用いた個体へのワクチン接種の効果を監視する方法も提供される。該方法は、該ヘプシンまたはヘプシンペプチドに応答する免疫反応を測定することを含み、該ヘプシンまたはヘプシンペプチドへの免疫反応の誘導が、該個体が前記ヘプシンまたはヘプシンペプチドでワクチン接種されたことを示唆することを特徴とする。
【００１２】
本発明の別の実施形態では、アンチセンスヘプシンｍＲＮＡをコードするベクターまたはヘプシンタンパク質と結合する抗体を細胞中に導入することにより細胞中のヘプシンの発現を阻害する方法が提供される。
【００１３】
さらに別の実施形態では、化合物を個体に投与する工程を含み、化合物は標的部分および治療的部分を有し、該標的部分がヘプシンに対して特異的であることを特徴とする個体への標的治療の方法が提供される。
【００１４】
さらに別の実施形態において、配列番号１８８に相補的である配列を有するヘプシンタンパク質の免疫性断片またはオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。また、有効量のオリゴヌクレオチドによって、新生物症状(neoplastic state)の治療をこのような治療を必要とする個体に対して行う方法が実施されている。
【００１５】
一般的に、前記方法で述べられたヘプシンまたはヘプシンの断片は、配列番号１９５のアミノ酸配列を有する変異体などのヘプシン変異体と野生型ヘプシンとの両方を対象とする。
【００１６】
本発明のその他および更なる態様、特徴および利点は、以下に記載の本発明の現在における好ましい実施形態の説明から明らかになる。これらの実施形態は開示目的で記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、卵巣癌細胞のマーカーとしてヘプシンプロテアーゼまたはヘプシン変異体を特定した。他のプロテアーゼと多様に組み合わせて、ヘプシンの発現は個々の腫瘍型の特性を示す。そのような情報は診断検査（アッセイまたは免疫組織化学）および予後評価（表現パターンにより特定される）の基礎となる。
【００１８】
腫瘍増殖、浸潤および転移の長期的な治療は、既存の化学療法剤では成功していない。化学療法を複数サイクル実施後、大部分の腫瘍は薬剤に対して耐性となる。本発明は、新規薬剤の設計のために、抗体、プロテアーゼ阻害剤またはプロテアーゼに対するアンチセンス手段のいずれかを用いた新規な治療的介入の標的として、ヘプシンおよびヘプシンタンパク質変異体を特定する。
【００１９】
一般的に、以下の様々な実施形態で言及しているヘプシンの用語は、野生型ヘプシンおよびヘプシン変異体の両方を指す。ヘプシン変異体の１例は配列番号１９５のアミノ酸配列を有する。
【００２０】
一実施形態において本発明は、個体にヘプシンに対するワクチン接種を行う方法に関するものであり、（i）ヘプシンタンパク質またはそのペプチドをコードする発現ベクターまたは（ii）ペプチドを負荷された樹状細胞を、個体に接種する工程を含む。ヘプシンまたはそのペプチドの発現は、個体で免疫反応を誘導し、それによって個体にヘプシンに対するワクチン接種を行う。個体が、例えば卵巣癌、肺癌、前立腺癌および結腸癌などの癌を患っているか、またはそれら癌に罹患する危険性がある場合には、一般的にこの方法が適応可能である。好ましいヘプシンペプチドの配列は、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１８９、１９０および１９１である。他の実施形態では、該ヘプシンタンパク質またはそのペプチドは、配列番号１９５のアミノ酸配列を有するヘプシン変異体に由来する。
【００２１】
本発明はまた、ヘプシンタンパク質またはその断片に免疫細胞を暴露する工程を含む、ヘプシンに対する免疫活性細胞を作成する方法も提供する。通常、ヘプシンタンパク質またはその断片への暴露により免疫細胞が活性化し、それによってヘプシンに対する免疫活性細胞を産生する。一般的に、免疫活性細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞および／または樹状細胞である。好ましくは、ヘプシン断片は９残断片から２０残基断片であり、より好ましくは配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１８９、１９０または１９１である。別の一実施形態では、該ヘプシンタンパク質または断片は配列番号１９５のアミノ酸配列を有するヘプシン変異体に由来する。多くの場合、樹状細胞は暴露に先立ち個体から単離され、さらに暴露に続いて個体に再導入される。典型的には個体は、例えば卵巣癌、肺癌、前立腺癌および結腸癌などの癌に罹患しているか、またはそれら癌に罹患する危険性がある。
【００２２】
本発明は、個体においてヘプシンを標的とする免疫治療法も提供する。一実施形態では、該方法は、個体から採取された抹消血からin vitro樹状細胞を作成し、リポフェクションまたはその他の手段によりヘプシンタンパク質またはその断片をこれらの樹状細胞に負荷し、続いてこれらの樹状細胞を単回投与または複数回投与により同個体に戻すことを含む。ヘプシンは、組換えＤＮＡベクターによる形質導入後に、これらの樹状細胞において発現されてもよい。または、ヘプシン負荷樹状細胞またはヘプシン発現樹状細胞を用いてin vitroでヘプシン特異的Ｔ細胞反応を誘導し、続いて該個体に自己のヘプシン特異的Ｔ細胞が投与される養子免疫療法を実施することが可能である。典型的には、個体は、例えば卵巣癌、肺癌、前立腺癌および結腸癌などの癌に罹患しているか、またはそれら癌に罹患する危険性がある。一般的に完全長または断片のヘプシンタンパク質は単離された樹状細胞中に発現される。好ましくは、断片は９残基断片から２０残基断片であり、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１８９、１９０または１９１であることがさらに好ましい。または、ヘプシンタンパク質またはその断片は、配列番号１９５のアミノ酸配列を有するヘプシン変異体に由来するものであってもよい。
【００２３】
配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１８９、１９０または１９１に示されるようなヘプシンまたはヘプシンペプチドを用いて、個体にワクチン接種することの効果を監視する方法も提供されている。該方法は、ワクチン接種された個体から得たＴ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する工程、および該ヘプシンまたはヘプシンペプチドに特異的な免疫反応を測定する工程を含む。免疫反応が、正常な個体から得た細胞により示された免疫反応に比べて高められた場合に、該個体が該ヘプシンまたはヘプシンペプチドによってワクチン接種されたことが示唆される。一般的に、ヘプシン特異的Ｔ細胞の増殖量が増加する、ヘプシン特異的Ｔ細胞の頻度が増加する、またはヘプシン特異的サイトカイン分泌Ｔ細胞の頻度が増加する場合には、個体はヘプシンに対してワクチン接種されている。テトラマー分析およびエリスポットアッセイなどの当業界で周知の標準的アッセイを用いて、ヘプシン特異的Ｔ細胞の頻度およびヘプシン特異的サイトカイン分泌Ｔ細胞の頻度をそれぞれ測定することができる。
【００２４】
本発明の別の態様では、細胞中のヘプシンの発現を阻害する方法を提供し、その方法は、配列番号１８８に相補的な配列を含むベクターを細胞中に導入する工程を含み、ベクターの発現によって細胞中にヘプシンアンチセンスＲＮＡが産生される。ヘプシンアンチセンスＲＮＡは内因性ｍＲＮＡにハイブリダイズすることによって、細胞中のヘプシンの発現を阻害する。
【００２５】
ヘプシンの発現は抗体によっても阻害することができる。ヘプシンタンパク質またはその断片に特異的な抗体を細胞に導入し、ヘプシンに抗体が結合するとヘプシンタンパク質が阻害される。好ましくは、ヘプシン断片は９残基断片から２０残基断片までであり、より好ましくは、断片は、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１８９、１９０または１９１である。別の一実施形態では、該ヘプシンタンパク質またはその断片は配列番号１９５のアミノ酸配列を有するヘプシン変異体に由来する。
【００２６】
本発明はまた、個体への標的治療の方法に関するものであり、その方法は、標的部分および治療的部分を含む化合物を個体に投与する工程を含み、治療的部分がヘプシンに特異的であることを特徴とする。好ましくは、標的部分は、ヘプシンに特異的な抗体、またはヘプシンと結合するリガンドまたはリガンド結合領域である。同様に治療的部分は好ましくは、放射性同位元素、毒素、化学療法剤、免疫刺激剤または細胞毒性剤である。一般的に個体は、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌またはその他ヘプシンが過剰発現される癌などの疾患に罹患している。
【００２７】
本発明はさらに、適切なアジュバントおよび免疫原性完全長ヘプシンタンパク質またはその断片を含む免疫組成物に関するものである。好ましくは、断片は９残基断片から２０残基断片であり、より好ましくは、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、８９、１０８、１０９、１２８、１２９、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１８９、１９０または１９１である。別の一実施形態では、該ヘプシンタンパク質または断片は配列番号１９５のアミノ酸配列を有するヘプシン変異体に由来する。
【００２８】
本発明はまた、配列番号１８８またはその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドも提供する。本発明はさらに、上記オリゴヌクレオチドおよび生理的に許容可能な担体を含む組成物、ならびに、有効用量の上記オリゴヌクレオチドを個体に投与する工程を含む、そのような治療を必要とする個体に新生物症状の治療を行う方法を提供する。典型的には新生物症状は、卵巣癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌またはその他ヘプシンが過剰発現される癌であってよい。
【００２９】
本発明の範囲と精神から逸脱することなく、本明細書中に開示された発明に対して様々な置換および修飾がなされてもよいことは、当業者にとっては明白である。
【００３０】
本発明によると、従来の分子生物学、微生物学および当業の技術分野の範囲内にあるＤＮＡ組み換え技術が採用可能である。このような技術は文献中に十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ分子クローニング：試験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２））；ＤＮＡクローニング：実践的取り組み（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．１９８５））；オリゴヌクレオチドの合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４））；核酸ハイブリダイゼイション（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄ．１９８５））；転写と翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄ．１９８４））；動物の細胞培養（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８６））；固定化細胞および固定化酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，分子クローニングに対する実践ガイド（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４））を参照のこと。
【００３１】
本明細書中に使用されるように、用語「ｃＤＮＡ」は、遺伝子のｍＲＮＡ転写産物のＤＮＡのコピーを指すものとする。
【００３２】
本発明は、ヘプシンタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを包含し、そのベクターは、ホスト内で複製可能であり、さらに、機能的に連結した、ａ）複製起点；ｂ）プロモーター；およびｃ）ヘプシンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。好ましくは、本発明のベクターは、配列番号１８８に示されるＤＮＡ配列の一部を含む。ベクターを使用して、ヘプシンタンパク質、ヘプシンタンパク質の断片またはアンチセンスヘプシンＲＮＡをコードする核酸を増幅および／または発現させることができる。さらに、ベクターは、免疫活性組成物、ヘプシンタンパク質またはその断片を含む融合タンパク質をコードする核酸を発現することができる。これらのベクターは、個体においてヘプシンに対するワクチン接種を行う方法において有用であると思われる。
【００３３】
発現ベクターは、複製可能な構築体であり、ポリペプチドをコードする核酸配列が、細胞においてポリペプチドの発現をもたらすことが可能な適切な制御配列に機能的に連結している。このような制御配列の必要性は、選択される細胞および選択される形質転換の方法により異なる。一般的に制御配列は、転写プロモーターおよび／または転写エンハンサー、適切なｍＲＮＡのリボソーム結合部位ならびに転写および翻訳の終了を制御する配列を含む。当業者に周知の方法が、適切な転写および翻訳の制御信号を有する発現ベクターを構築するために使用可能である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら分子クローニング：試験室マニュアル（第２版）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９），（２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．））を参照のこと。遺伝子およびその転写制御配列は、該転写制御配列が遺伝子の転写を効果的に制御する場合に「機能的に連結している」と定義される。本発明のベクターは、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含むが、それのみに限定されない。本発明の好ましいウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０ウイルスまたはヘルペスウイルスに由来するベクターである。
【００３４】
本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、２つまたはそれ以上、好ましくは３つより多くの、リボヌクレオチドからなる分子と定義される。その正確なサイズは多くの要因に依存し、その要因自体は、オリゴヌクレオチドの究極的な機能および用途に依存する。本明細書中で用いられている用語「プライマー」は、自然に生じたか（精製された制限消化物など）または合成によって作られたかの別を問わず、適切な条件下、すなわちヌクレオチドおよび例えばＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在下ならびに適切な温度およびｐＨ条件下に置かれた場合に、核酸に相補的な鎖の合成を開始することが可能であるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよく、誘発剤の存在下で所望の伸長産物の合成を開始するのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、配列および／またはプライマーの相同性ならびに使用方法を含む多くの要因に依存する。例えば、診断用途において、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的配列の複雑さに依存して、通常１５−２５またはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、それ未満のヌクレオチドを含有する場合もある。
【００３５】
本明細書中で用いられている「実質的に純粋なＤＮＡ」とは、環境中の分子の一部または全体の分離（部分的または全体的な精製）、または本発明のＤＮＡに隣接する配列の変更によって、そのＤＮＡが自然に生じる環境の一部ではないＤＮＡを指す。従って、この用語は、例えば、ベクター、自己複製プラスミドまたはウイルス、あるいは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに、組み込まれた組換えＤＮＡ；あるいは、他の配列から独立した個別の分子（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または制限エンドヌクレアーゼ消化により産生されたｃＤＮＡまたはゲノムまたはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。その用語は、例えば融合タンパク質のような付加的ポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。さらに、配列番号１８８に示されたヌクレオチドの一部を含みかつヘプシンまたはその断片の選択的スプライシング変異体をコードする組換えＤＮＡも含まれる。
【００３６】
ヘプシン変異体は本明細書中に開示されている。従って、本発明は、配列番号１９５のアミノ酸配列またはその断片を含むヘプシン変異体をコードする単離ＤＮＡも対象にしている。ヘプシン変異体は、検体中の腫瘍細胞を検出する際に有用であり、その方法は配列番号１９５のアミノ酸配列またはその断片を含むヘプシンタンパク質変異体の発現を検出する工程を含み、検体中のヘプシン変異体の発現の存在は、検体が腫瘍細胞を含むことを示唆する。一般的に、ヘプシン変異体の発現の検出はＤＮＡレベルまたはタンパク質レベルで実施可能である。代表的な腫瘍細胞として、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞および腎癌細胞が挙げられる。
【００３７】
本発明は、本明細書中に開示されているヘプシンまたはヘプシン変異体をコードするヌクレオチドの配列に対して、少なくとも約７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％（例えば少なくとも８０％）、および最も好ましくは９０％の配列同一性を有するＤＮＡ群を包含する。２つの配列間の同一性は、マッチングするまたは同一の位置の数の一次関数である。この２つの配列の両方における位置が、同一の単量サブユニットにより占められる場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおいてある位置がアデニンにより占められていれば、その位置でそれらは同一である。例えば、１０ヌクレオチド長の配列において７つの位置が、第２の１０ヌクレオチド長の配列の対応位置と同一であれば、２つの配列は７０％の配列同一性を有する。比較する配列の長さは、一般的に５０ヌクレオチド以上であり、好ましくは６０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは７５ヌクレオチド以上、および最も好ましくは１００ヌクレオチドである。配列の同一性は、典型的に配列解析ソフトウェア（例えば、ジェネティックコンピュータグループ社（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＣ））のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、１７１０、ユニバーシティアベニュー、マディソン（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ），ＷＩ  ５３７０５）を用いて測定される。
【００３８】
さらに本発明は、例えば選択的ｍＲＮＡスプライシングまたは選択的タンパク質プロセシングの産物のように少なくとも部分的に配列番号１８８の一部によってコードされているか、あるいはヘプシン配列の一部が欠失した、ヘプシンまたはヘプシン変異タンパク質も含む。断片または完全なヘプシンポリペプチドは、例えば標識、リガンド、または抗原性を高める手段として作用する他のポリペプチドに共有結合させてもよい。
【００３９】
実質的に純粋なヘプシンタンパク質は、例えば自然源からの抽出；ヘプシンポリペプチドをコードする組換え核酸の発現；タンパク質の化学的合成；によって得ることができる。純度は、例えば、ヘプシンに対して特異的な抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーのようなカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法またはＨＰＬＣ分析などの、任意の適切な方法により測定することができる。タンパク質は、その天然状態でそれに付随する汚染物質の少なくとも一部から分離されている場合、自然に関連する成分を実質的に含まない。従って、化学合成されるか、またはタンパク質が自然発生する細胞とは異なる細胞系において製造されたタンパク質は、当然、その自然に関連する成分を実質的に含まないであろう。その結果、実質的に純粋なタンパク質は、真核生物タンパク質が天然では生じない、大腸菌、その他の原核生物または任意の他の生物において合成された真核生物タンパク質を含む。
【００４０】
実質的に完全長のタンパク質に加えて、発明は、ヘプシンまたはヘプシン変異体タンパク質の断片（例えば、抗原断片）も含む。本明細書中で用いられているように、ポリペプチドに適用されている「断片」の用語は、通常１０残基以上、より典型的には２０残基以上、および好ましくは３０残基以上（例えば５０）の長さであるが、完全長の完全配列よりは短い。ヘプシンタンパク質の断片は、当業者に公知の方法、例えば天然のまたは組換えのヘプシンタンパク質の酵素消化、ヘプシンの特定断片をコードする発現ベクターを用いる組換えＤＮＡ技術、または化学合成により、作成可能である。候補断片のヘプシンの特性を示す能力（例えばヘプシンに特異的な抗体への結合）は、当業界で公知の方法により評価可能である。
【００４１】
純粋なヘプシンまたはヘプシンの抗原断片を用いて、当業者に公知の標準的プロトコールを採用することにより、新規抗体の作成または既存の抗体（例えば診断用アッセイにおける陽性対照など）の試験が可能である。本発明は、例えばウサギにおいて免疫原としてヘプシンまたはヘプシンの断片を用いて作成されるポリクローナル抗血清を含む。当業者に公知のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体作成の標準的プロトコールを用いる。組換えヘプシンのｃＤＮＡクローンを同定しさらに他のｃＤＮＡクローンからそれらを区別する能力について、この手順により作成されたモノクローナル抗体をスクリーニングすることができる。
【００４２】
本発明は、完全な抗ヘプシンモノクローナル抗体のみではなく、例えばＦａｂ（抗原結合断片）または（Ｆａｂ）２断片などの免疫活性抗体断片；組換え一本鎖Ｆｖ分子；または、例えば、マウス由来のような１つの抗体の結合特異性部分を含む抗体と、ヒト由来のような別の抗体の残りの部分を含む抗体との、キメラ分子；を包含する。
【００４３】
一実施形態では、抗体またはその断片は、毒素、あるいは、当業界で周知の放射性標識、非放射性同位体標識、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識、酵素標識、または比色標識などの検出可能な標識に、結合させてもよい。適切な毒素の例には、ジフテリア毒素、Ｐｓｕｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）外毒素Ａ、リシンおよびコレラ毒素がある。適切な酵素標識の例には、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼなどがある。適切な放射性同位元素標識の例には、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃなどを含む。
【００４４】
In vivo診断の目的において、常磁性同位体もこの発明の方法に基づき用いることができる。磁気共鳴画像法に有用な元素は多数にのぼる。In vivo磁器共鳴画像法に関する検討に対しては、例えばＳｃｈａｅｆｅｒら（１９８９，ＪＡＣＣ１４：４７２−４８０）；Ｓｈｒｅｖｅ  ら（１９８６，Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．３：３３６−３４０）；Ｗｏｌｆ，Ｇ．Ｌ．（１９８４，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．ＮＭＲ１６：９３−９５）；Ｗｅｓｂｅｙら（１９８４，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．ＮＭＲ１６：１４５−１５５）；Ｒｕｎｇｅら（１９８４，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．１９：４０８−４１５）を参照のこと。適切な蛍光標識の例には、フルオレセイン標識、イソチオシアレート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、オプサルデヒド標識、フルオレスカミン標識などがある。化学発光標識の例には、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウム・エステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸塩標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識がある。
【００４５】
当業者であれば、本発明に従って採用可能なその他の適切な標識については知っているであろう。抗体またはその断片に対するこれらの標識の結合は、当業者に一般に公知でありおよび使用できる標準的な技法を用いて達成可能である。その典型的な手法は、Ｋｅｎｎｅｄｙら（１９７６，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｅｎ．Ａｃｔａ ７０，１−３１）；およびＳｃｈｕｒｓら（１９７７，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８１,１−４０）に記述されている。後者によって記述された結合技法はグルタールアルデヒド法、過ヨウ素法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル法である。これらの方法のすべては参照により本明細書中に組み入れられる。
【００４６】
以下の例は、本発明の様々な実施形態を例示する目的で示されたものであり、いずれの態様においても、本発明を限定することは意図されていない。本明細書中に本来備わっているそれらの目的、結果および便益に加え、本発明が目的を実行し、記述された結果と便益を得るために良好に適用されることを、当業者は容易に理解するであろう。その範囲内での変更および特許請求の範囲に包含される他の用途が、当業者には想起されるであろう。
【実施例１】
【００４７】
重複プライマーおよび特異的プライマーを用いたセリンプロテアーゼの増幅
ゲノムＤＮＡを含まないと思われるｃＤＮＡの調製物のみを遺伝子発現分析に用いた。セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼに対して重複プライマーを調製した。プライマーは、セリンプロテアーゼ、すなわちヒスチジン．．．アスパラギン酸．．．およびセリンの触媒三つ組残基の周囲のアミノ酸の共通配列に対して合成した。センス（ヒスチジンおよびアスパラギン酸）重複プライマーおよびアンチセンス（アスパラギン酸およびセリン）重複プライマー両方の配列を表２に示す。
【００４８】
数種のプロテアーゼ存在物を、漿液性嚢胞腺癌から得たｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により同定し、サブクローン化した。従って、本明細書中に記載のプロテアーゼは、卵巣癌の最も一般的な形態であるこの種の癌の表面活性を反映する。出願人は粘液性腫瘍型および明細胞型に固有の類似の塩基対サイズのＰＣＲ増幅バンドも示している。卵巣癌の約２０−２５％は、粘液性、明細胞性または子宮内膜性のいずれかに分類される。
【００４９】
ＰＣＲ産物の同一性を確認するため、すべての適切なバンドをＰｒｏｍｅｇａＴ−ベクタープラスミドに連結し、その連結生成物を用いて、選択培地上に増殖したＪＭ１０９細胞（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を形質転換した。個々のコロニーを選択、培養後にプラスミドＤＮＡをＷＩＺＡＲＤ  ＭＩＮＩＰＲＥＰ（商標）ＤＮＡ精製システム（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））により単離した。配列挿入は、Ｐｒｉｓｍ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｄｙｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓサイクル配列キット（アプライドバイオシステム社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて実施した。残存する染料ターミネーターは、ＣＥＮＴＲＩＳＥＰ  ＳＰＩＮ（商標）カラム（プリンストンセパレーション社（Ｐｒｉｎｓｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ））を用いて、完全シークエンシング反応から除外し、検体をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３Ａ  ＤＮＡシークエンシングシステムに装填した。セリンプロテアーゼプライマーに対するサブクローニングおよび配列決定の結果を表３に要約する。
【表２】
2007503817.tif 000003
【表３】
2007503817.tif 000004
【００５０】
腫瘍のｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物の配列決定により、これらの遺伝子の潜在的候補を確認する。３つの新規遺伝子はすべて、セリンプロテアーゼファミリーに属する遺伝子に一致する触媒三つ組残基の配列内に保存残基を有する。
【００５１】
出願人は、センスヒスチジンおよびアンチセンスアスパラギン酸、ならびにセンスヒスチジンおよびアンチセンスセリンを用いて、正常なｃＤＮＡおよび癌のｃＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物を比較した。それらプライマー対に対して約２００ｂｐと５００ｂｐの期待されたＰＣＲ産物が認められた（アスパラギン酸はヒスチジンから約５０−７０アミノ酸分下流に、セリンはヒスチジンからカルボキシ末端方向に約１００−１５０アミノ酸の位置に認められた）。
【００５２】
図１は、アガロースゲルの染色により示された、正常なｃＤＮＡと癌のｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物の比較を表す。レーン２では、２つの明瞭なバンドがプライマリー対のセンス−Ｈｉｓ／アンチセンス−ＡＳＰ（ＡＳ１）において現れ、レーン４のセンス−Ｈｉｓ／アンチセンス−Ｓｅｒ（ＡＳ２）プライマリー対の癌のレーンでは、約５００ｂｐの複数のバンドが認められる。
【実施例２】
【００５３】
ノーザンブロット分析
ノーザンブロット法によりこれら候補遺伝子の発現を検査することにより重要な情報が得られる。正常な成体の多組織ブロット法の分析により、プロテアーゼを発現可能な正常組織を同定する機会が提供される。最終的には、治療的介入のためにプロテアーゼを阻害する戦略を開発するには、正常組織中の候補遺伝子の発現を理解することが不可欠である。
【００５４】
重大な情報がノーザンブロット法による胎児組織の分析により期待されている。癌において過剰発現される遺伝子の多くは、器官形成中に高発現される。指摘したように、肝癌細胞からクローン化され、卵巣癌中に過剰発現されるヘプシン遺伝子は、胎児肝に過度に発現される。ヘプシン遺伝子の発現は、胎児腎中にも検出されることから、腎癌での発現に対する候補となり得る。
【００５５】
胎児組織に加え、正常な成体の多組織における遺伝子の発現を試験するノーザンブロット用パネルが市販されている（クロンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ））。そのような評価手段は、腫瘍組織対正常組織における個々の転写物の過剰発現を確認するために重要であるのみならず、転写物の大きさを確認し、さらに選択的スプライシングまたは他の転写物の改変が卵巣癌で生じ得るか否かを特定する機会も提供する。
【００５６】
ノーザンブロット分析は以下のように実施した：１０μｇのｍＲＮＡを１％ホルムアルデヒドアガロースゲル上に添加し、電気泳動を実施し、さらにＨｙＢｏｎｄ−Ｎ＋（商標）ナイロン膜（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））上にブロットした。３２Ｐ−標識したｃＤＮＡプローブをＰｒｉｍｅ−ａ−Ｇｅｎｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて作成した。特異的プライマーにより増幅されたＰＣＲ産物をプローブとして用いた。ブロットを３０分間プレハイブリダイズさせ、その後、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（商標）のハイブリダイゼーション溶液（クロンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ））中において３２Ｐ−標識したｃＤＮＡプローブを用いて６８℃で６０分間ハイブリダイズさせた。β−チューブリンプローブを用いて、相対的ゲル装填量を特定するための対照ハイブリダイゼーションを実施した。
【００５７】
脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、末梢血白血球、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓を服務正常なヒト組織ならびに正常なヒト胎児組織（ヒト多組織ノーザンブロット(Human Multiple Tissue Northern Blot)；クロンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ））を同一のハイブリダイゼーション手順を用いてすべて検査した。
【００５８】
正常な卵巣および卵巣癌におけるＰＣＲ増幅を比較した実験により、腫瘍組織中のｍＲＮＡにおける過剰発現および／または変性が示唆された。ＴＡＤＧ−１４のノーザンブロット分析は、１．４ｋｂのサイズの転写を確認し、データは卵巣癌における過剰発現を示している（図２）。陽性プラークをスクリーニングするためにＰＣＲと特異的な２５０ｂｐのＰＣＲ産物の両方を用いた単離および精製により、１．２ｋｂのＴＡＤＧ−１４のクローンが得られた。その他のプロテアーゼは、表２の適切なプライマーを用いて同一の方法により増幅した。
【実施例３】
【００５９】
セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼに対応するＰＣＲ産物
低悪性腫瘍または癌のいずれかにおける固有の発現に基づき、ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ産物をクローン化し、配列決定し、ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列に基づき同定した適切な遺伝子をＧＣＧデータベースおよびＥＳＴデータベースに保存した。図３、４および５は、正常組織と癌組織を比較した、セリンプロテアーゼ（図３）、システインプロテアーゼ（図４）およびメタロプロテアーゼ（図５）に対する重複プライマーを用いたＰＣＲ産物の陳列を示す。癌組織対正常組織における差異発現に注目する。Ｓａｋａｎａｒｉら（１９８９）の方法に基づき正常組織、低悪性組織および顕性卵巣癌組織におけるｍＲＮＡ発現を比較することにより、（セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼの）内因性の酵素活性に関連する保存配列に対する重複ｃＤＮＡプライマー（表２を参照のこと）を用いてそれらプロテアーゼを同定した。
【実施例４】
【００６０】
セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼ群に関して、ヒスチジン領域のプライマーセンスであるＳ１を、アンチセンスプライマーであるＡＳ２と併用して以下のプロテアーゼを同定した：
（ａ）ヘプシン：培養肝癌細胞の増殖に不可欠であり、かつ肝癌細胞で高発現される細胞表面プロテアーゼであることが分かっている肝癌細胞からクローンされたトリプシン様セリンプロテアーゼ（図３、レーン４）；
（ｂ）補体Ｂ因子（第ＩＸヒト因子）：凝固カスケードに関与し、かつ腫瘍細胞に関連したフィブリン分解産物の産生および蓄積に関連するプロテアーゼ（図３、レーン４）。補体Ｂ因子は第Ｘ凝固因子（クリスマス因子）のファミリーに属する。内因性経路の一部として、補体Ｂ因子は、Ｃａ２＋リン脂質および第VIIIa e５因子の存在下で第Ｘ凝固因子のタンパク質活性化を触媒する；および
（ｃ）ヒト角質層由来の皮膚細胞の落屑に関与する角質層キモトリプシン分解酵素（ＳＣＣＥ）セリンプロテアーゼ（図３、レーン４）。ＳＣＣＥは、表皮の角質細胞で発現され、角化層内の粘着性組織を分解するように機能するため、皮膚表面の継続した脱落が生じる。
【実施例５】
【００６１】
システインプロテアーゼ
システインプロテアーゼ群では、システインプロテアーゼに対する重複センスプライマーおよび重複アンチセンスプライマーを用いて、正常な卵巣癌組織と比べた時の卵巣癌での過剰発現により１つの独特なＰＣＲ産物を同定した（図４、レーン３−５）。このＰＣＲ産物をクローニングし、さらに配列決定することにより、カテプシンＬの配列を同定した。カテプシンＬは、その発現および分泌が悪性転換、成長因子および腫瘍プロモーターにより誘導されるリソソームのシステインプロテアーゼである。多くのヒト腫瘍（卵巣腫瘍を含む）は、高レベルのカテプシンＬを発現する。カテプシンＬシステインプロテアーゼは、ストロメライシンファミリーに属し、強力なエラスターゼ活性とコラーゲナーゼ活性とを有する。公表されたデータは、卵巣の粘液性嚢胞腺癌に罹患した患者の血清中の濃度上昇を示唆する。これまで、他の卵巣腫瘍で発現されることは示されていない。
【実施例６】
【００６２】
メタロプロテアーゼ
メタロプロテアーゼに対する重複センスプライマーおよび重複アンチセンスプライマーを用いて、正常な卵巣組織には存在しない１つの独特なＰＣＲ産物を腫瘍組織中に検出した（図５、レーン２−５）。この産物をサブクローニングおよび配列決定することにより、その産物が、適切な領域においていわゆるＰＵＭＰ−１（ＭＭＰ−７）遺伝子と完全な相同性を有することが示された。この亜鉛結合メタロプロテアーゼは、シグナル配列を有するプロ酵素として発現され、ゼラチンの消化およびコラーゲナーゼの消化において活性を有する。ＰＵＭＰ−１は、結腸直腸癌１０例中９例において誘導され、正常な結腸組織と比べ過剰発現されることも認められており、この疾患の進行におけるこの基質の役割が示唆されている。
【実施例７】
【００６３】
ヘプシンの発現
ヘプシンのｍＲＮＡ発現を、定量的ＰＣＲ法を用いて検出、測定した。定量的ＰＣＲ法は、一般的にＮｏｏｎａｎら（１９９０）の方法に従い実施された。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた：
ヘプシンの順方向５'−ＴＧＴＣＣＣＧＡＴＧＧＣＧＡＧＴＧＴＴＴ−３'（配列番号８）および逆方向５'−ＣＣＴＧＴＴＧＧＣＣＡＴＡＧＴＡＣＴＧＣ−３'（配列番号９）；β−チューブリンの順方向５'−ＴＧＣＡＴＴＧＡＣＡＡＣＧＡＧＧＣ−３'（配列番号１８）および逆方向５'−ＣＴＧＴＣＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＴＧ−３'（配列番号１９）。
【００６４】
β−チューブリンは内部対照として用いた。増幅遺伝子の推定サイズは、ヘプシンでは２８２ｂｐであり、β−チューブリンでは４５４ｂｐであった。この研究に用いたプライマーの配列は、ヘプシンに対してはＬｅｙｔｕｓら（１９８８）が示したｃＤＮＡ配列に基づき、またβ−チューブリンに対してはＨａｌｌら（１９８３）が示したｃＤＮＡ配列に基づき、設計した。
【００６５】
ＰＣＲ反応混合物は、従来技術で変換されたｍＲＮＡ（５０ｎｇ）に由来するｃＤＮＡ、ヘプシン遺伝子およびβ−チューブリン遺伝子の両方に対するセンスおよびアンチセンスプライマー（５μｍｏｌ）、２００μｍｏｌのｄＮＴＰｓ、５μＣｉのα−３２ＰｄＣＴＰおよび最終容量２５μl中反応緩衝剤（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を含む０．２５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、から構成される。標的配列は、β−チューブリン遺伝子と同時に増幅した。ＰＣＲ３０サイクルをサーマルサイクラー（パーキン−エルマーシータス社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ））中で実施した。ＰＣＲの各サイクルは、９５℃で３０秒間の変性、６３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長を含む。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル上で分離し、各ＰＣＲ産物の放射活性をＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（商標）（モルキュラーダイナミクス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ））を用いて特定した。平均値の比較にはStudent's-t検定を用いた。
【００６６】
ヘプシンは、肝癌細胞からクローン化されたトリプシン様セリンプロテアーゼである。ヘプシンは、そのアミノ末端領域により形質膜に固着され、それによってその触媒領域を細胞外マトリックスに暴露する細胞外プロテアーゼ（分泌シグナル配列を含む酵素）である。ヘプシンは、乳癌細胞株および末梢神経細胞において発現されることも明らかにされている。ヘプシンは、以前は決して卵巣癌と関連付けられなかった。ヘプシン遺伝子に対する特異的プライマーを合成し、胎児組織および卵巣組織（正常組織および卵巣癌組織の両方）のノーザンブロットを用いてヘプシンの発現を調べた。
【００６７】
図１０Ａは、ヘプシンが様々な病理組織型の卵巣癌で発現されるが、正常な卵巣では発現されないことを示している。図１０Ｂは、ヘプシンが、予想通りに胎児肝および胎児腎で発現されるが、胎児脳および胎児肺では極めて低量かまったく発現されないことを示している。図１０Ｃは、ヘプシンの過剰発現が正常な成体組織には認められないことを示している。バックグラウンドレベルを超える軽度の発現が成体の前立腺に認められる。両方のノーザンブロットにおいて同定されたｍＲＮＡは、ヘプシン転写物に対し適切なサイズであった。正常卵巣１０例および卵巣腫瘍４４例において、β−チューブリンおよびヘプシンに対する特定のプライマーを用いた定量的ＰＣＲアッセイによりヘプシンの発現を調べ、３５サイクルに亘り直線的であることが認められた。発現は、内部対照である３２Ｐ−β−チューブリンバンドに対する３２Ｐ−ヘプシンバンドの割合として示した。
【００６８】
正常（Ｎ）、粘液性（Ｍ）および漿液性（Ｓ）の低悪性（ＬＭＰ）腫瘍、および癌（ＣＡ）においてヘプシンの発現を調べた。図１１Ａは、ヘプシンおよび内部対照であるβ−チューブリンの定量的ＰＣＲを示す。図１１Ｂは、正常卵巣、ＬＭＰ腫瘍および卵巣癌におけるヘプシン対β−チューブリンの発現の割合を示している。ヘプシンｍＲＮＡの発現量は、正常卵巣のレベルと比較してＬＭＰ腫瘍（ｐ＜０．００５）および癌（ｐ＜０．０００１）で有意に高値であることが示された。正常卵巣の全１０例は、比較的低値のヘプシンｍＲＮＡの発現量を示した。
【００６９】
ヘプシンｍＲＮＡは、一部の低悪性腫瘍を含む卵巣癌の大部分の病理組織型で高度に過剰発現される（図１１Ａおよび１１Ｂ）。最も注目すべきこととして、ヘプシンは、試験に供した漿液性腫瘍、子宮内膜性腫瘍および明細胞癌において高発現される。ヘプシンは一部の粘液性腫瘍で高発現されるが、大部分の粘液性腫瘍では過剰発現されない。
【００７０】
表４に示す卵巣癌の新鮮凍結組織の腫瘍組織バンクを評価に用いた。悪性腫瘍以外の医学的理由で切除された正常卵巣約１００検体を手術により入手し、それは対照として利用可能であった。
【００７１】
腫瘍バンクからの腫瘍約１００検体を評価したが、それらには境界腫瘍または低悪性腫瘍および卵巣癌を含む大部分の卵巣癌の病理組織の亜型が包含されていた。このアプローチは、正常組織、低悪性腫瘍および卵巣癌の遺伝子の発現を比較するために、新鮮凍結組織（正常および悪性の両方）から調製されたｍＲＮＡを用いることを含む。ｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡは、β−チューブリンプライマーおよびｐ５３プライマーの両方を用いて、公知のイントロン−エクソンスプライシング領域を包含するプライマーで調製したすべての調製物をチェックすることによって、ゲノムＤＮＡを含まないと思われた。
【００７２】
ヘプシン特異的プライマー（表２を参照のこと）を用いた定量的ＰＣＲにより、正常組織８検体、低悪性腫瘍１１検体および癌１４検体（粘液性タイプおよび漿液性タイプの両方）において、セリンプロテアーゼ ヘプシン遺伝子の発現を特定した（β−チューブリンのメッセージに対するプライマーを内部標準として用いた）（表５）。これらのデータにより、低悪性腫瘍および顕性癌の両方を含む卵巣癌における、ヘプシン表面のプロテアーゼ遺伝子の過剰発現が確認された。ヘプシンの発現は、低悪性腫瘍中において正常レベルを超えて上昇し、この群の高ステージの腫瘍（ステージIII）では低ステージの腫瘍（ステージI）に比べてヘプシンの発現量が多かった（表６）。顕性癌では、漿液性腫瘍が最も高いヘプシン発現レベルを示す一方、粘液性腫瘍は高ステージの低悪性腫瘍群に匹敵するヘプシン発現レベルを示す（図６および７）。
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【実施例８】
【００７３】
ＳＣＣＥおよびＰＵＭＰ−１の発現
ＳＣＣＥ特異的プライマー（図８）およびＰＵＭＰ−１特異的プライマー（図９）の両方を用いた試験から、卵巣癌でのこれらのプロテアーゼの過剰発現が示されている。
【実施例９】
【００７４】
本明細書中で検出されたプロテアーゼの要約
本明細書中に記載した大部分のプロテアーゼは、５００ｂｐのＰＣＲ産物（図１、レーン４）から産出されたセンス−Ｈｉｓ／アンチセンス−Ｓｅｒプライマー対から同定した。一部の酵素は良く知られており、それぞれの簡潔な要約を以下に示す。
【００７５】
角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）
同定されたＰＣＲ産物は、角質層キモトリプシン酵素のセンス−Ｈｉｓ／アンチセンス−Ｓｅｒの触媒領域である。この細胞外プロテアーゼは、クローン化および配列決定され、さらに、表皮中の角質細胞表面に発現されることが示された。角質層キモトリプシン酵素は、キモトリプシン様セリンプロテアーゼであり、その機能は皮膚の角質層中の細胞内結合組織の触媒能低下にあると示唆されている。この触媒能低下により皮膚表面からの継続的脱落（皮膚の落屑）が生じる。角質層キモトリプシン酵素の細胞下の局在位置は、正常な非手掌足底表皮の角質層および肥厚性足底角質層の結合部の顆粒層上部である。角質層キモトリプシン酵素は、角質層にのみ関連し、これまでいずれの癌組織中にも認められていない。
【００７６】
ＰＣＲ産物を用いてノーザンブロットを調べて、胎児組織中および卵巣癌中の角質層キモトリプシン酵素の発現を特定した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。注目すべきこととして、胎児のノーザンブロットでの角質層キモトリプシン酵素のメッセンジャーＲＮＡは、ほぼ存在が検出されなかった（プローブまたはノーザンブロットの問題は、適切な対照を用いることにより除外した）。かすかなバンドが胎児腎に現れた。一方、角質層キモトリプシン酵素ｍＲＮＡは卵巣癌のｍＲＮＡには多量に存在した（図１２Ｂ）。２種類の適切なサイズの転写物が角質層キモトリプシン酵素に認められた。ヘプシン解析に用いられたｃＤＮＡの同一パネルを角質層キモトリプシン酵素の発現に対して用いた。
【００７７】
ノーザンブロットの正常な卵巣のレーンには角質層キモトリプシン酵素の発現は検出されなかった。挿入マーカー（β−チューブリン）を含むすべての候補遺伝子の比較により、この観察結果が先入観によるものではないとの確認を得た。β−チューブリン内部対照用プライマーと共に角質層キモトリプシン酵素のプライマーを用いた定量的ＰＣＲにより、卵巣癌での角質層キモトリプシン酵素のｍＲＮＡの発現を確認したが、正常な卵巣組織での発現は確認できなかった（図１３）。
【００７８】
図１３Ａは、正常卵巣組織および卵巣癌から得た角質層キモトリプシン酵素のｃＤＮＡの定量的ＰＣＲを用いた比較を表している。図１３Ｂは、卵巣組織１０例および卵巣癌組織４４例における、β−チューブリン内部対照標準に対する角質層キモトリプシン酵素の割合を表している。この場合も、角質層キモトリプシン酵素が卵巣癌で高度に過剰発現されることが認められた。一部の粘液性腫瘍が角質層キモトリプシン酵素を過剰発現するものの、その大部分はそれに該当しないことも認められた。
【００７９】
プロテアーゼＭ
プロテアーゼＭはＨｉｓ−−ｓｅｒプライマー対のサブクローンにより同定された。このプロテアーゼは、最初にＡｎｉｓｏｗｉｃｚら（１９９６）によってクローン化され、癌で過剰発現されることが示された。予備試験の評価からこの酵素は卵巣癌で過剰発現されることが示されている（図１４）。
【００８０】
補因子Iおよび補体因子Ｂ
凝固経路に関連する数種のセリンプロテアーゼにもサブクローン化を実施した。これら酵素の発現に関する定量的ＰＣＲによる正常および卵巣癌の評価は、正常卵巣組織と比較した場合にこのｍＲＮＡが卵巣癌で明らかには過剰発現されていないことを示した。同一パネルの腫瘍を各候補プロテアーゼの評価に用いたことに留意すべきである。
【００８１】
ＴＡＤＧ−１２
ＴＡＤＧ−１２は、センス−Ｈｉｓ／アンチセンス−Ａｓｐのプライマー対から同定した（図１、レーン１および２を参照のこと）。レーン２の両方のＰＣＲ産物をサブクローン化した後、２００ｂｐの産物が、ＧｅｂＢａｎｋに含まれていない独特なプロテアーゼ様配列を含んでいた。この２００ｂｐの産物は、セリンプロテアーゼのファミリーのＨｉｓ−Ａｓｐ領域に共通する保存アミノ酸の多くを含む。２つ目のより大きなＰＣＲ産物（３００ｂｐ）は、ＴＡＤＧ−１２（Ｈｉｓ−Ａｓｐ配列）と高い相同性を有することが示されたが、約１１００ｂｐの独特な配列も含んでいた。特異的プライマーの合成およびそれに続く３つの異なる腫瘍から得られたＰＣＲ産物の配列決定により、大きい方のＰＣＲ産物（卵巣癌の約５０％に存在する）は、その配列の５末端付近（およびヒスチジン付近）に約１００ｂｐの挿入部分を含むことが示された。スプライシング部位の位置が適切でありかつその挿入部分がオープンリーディングフレームを含まないという事実から、その挿入部分は保持されたゲノムイントロンであると考えられる（図１５を参照）。このことは、全卵巣癌の半数程度における、イントロンの保持を生じさせるスプライシング部位突然変異の可能性、またはＴＡＤＧ−１２遺伝子での配列転座の可能性を示唆する。
【００８２】
ＴＡＤＧ−１３およびＴＡＤＧ−１４
特異的プライマーをＴＡＤＧ１３−およびＴＡＤＧ−１４に対して合成し、正常組織および卵巣癌組織での遺伝子発現を評価した。卵巣組織のノーザンブロット分析により、ＴＡＤＧ−１４遺伝子の転写物は約１．４ｋｂであり、卵巣癌組織で発現されることが示されたが（図１６Ａ）、正常組織では著明な転写物は認められなかった。特異的プライマーを用いた定量的ＰＣＲ試験において、正常卵巣での発現と比較して卵巣癌組織でＴＡＤＧ−１４発現が増大することが認められた（図１６Ｂ）。ＴＡＤＧ−１４に対する特異的ＰＣＲ産物の存在が、ＨｅＬａライブラリー中および卵巣癌ライブラリー中の両方で確認された。ＴＡＤＧ−１４に対応する数種類の候補配列を、ＨｅＬａライブラリーからスクリーニングおよび単離した。
【００８３】
配列の相同性から、明らかにこれらの遺伝子はセリンプロテアーゼのファミリーに適合する。しかし、ＴＡＤＧ−１３およびＴＡＤＧ−１４は、本発明の特定プライマーにより正常細胞および腫瘍細胞で評価することが可能であり、さらに、これらの遺伝子の発現の有無が特定腫瘍タイプに対する診断または治療の選択に有用である、これまでに報告されていない遺伝子である。
【００８４】
ＰＵＭＰ−１
金属結合領域および保存ヒスチジン領域に対する重複プライマーを用いる同様の方法において、マトリックスメタロ−プロテアーゼ７（ＭＭＰ−７）と同一の差異発現されるＰＣＲ産物を同定し、本明細書中ではＰＵＭＰ−１と称する。ＰＵＭＰ−１に特異的なプライマーを用いたＰＣＲの実施により、ノーザンブロット分析用に２５０ｂｐの産物を作成した。
【００８５】
ＰＵＭＰ−１は、胎児肺組織および胎児腎組織で差異発現された。図１７Ａは、ヒト胎児組織でのＰＵＭＰ−１の発現を示しているが、一方、胎児脳および胎児肝のいずれにおいても転写産物は検出できなかった。図１７Ｂは、ノーザンブロット分析を用いて正常卵巣および癌の亜群におけるＰＵＭＰ−１の発現を比較している。注目するべきこととして、ＰＵＭＰ−１は卵巣癌組織で発現され、この場合も、正常組織では転写産物の存在は検出されなかった。ＰＵＭＰ−１ｍＲＮＡの正常組織での発現と卵巣癌での発現を比較する定量的ＰＣＲにより、この遺伝子が悪性度の低い漿液性腫瘍の大部分を含む漿液性癌で高発現され、この場合も粘液性腫瘍では発現レベルが低いことが示された（図１８および１８Ｂを参照）。一方、ＰＵＭＰ−１は、これまでに粘液性腫瘍において過剰発現が最も高頻度で認められるプロテアーゼである（表７参照のこと）。
【００８６】
カテプシン−Ｌ
個々のシステイン残基およびヒスチジン残基を取り囲む保存領域に対する重複システインプロテアーゼプライマーを用いて、数種の漿液性癌においてカテプシン−Ｌプロテアーゼを同定した。正常組織および卵巣腫瘍組織におけるカテプシン−Ｌの発現についての最初の評価により、カテプシン−Ｌプロテアーゼの転写物が正常組織および腫瘍組織の両方に存在することが示された（図１９）。一方、本発明のその他のプロテアーゼとの組み合わせでの存在の有無により、特定腫瘍タイプの同定および治療選択が可能となる。
【００８７】
要約
セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼの保存領域に対する重複プライマーは、卵巣癌で過剰発現されるｍＲＮＡｓの遺伝子セットをもたらした。明らかに過剰発現される遺伝子は、セリンプロテアーゼ、ヘプシン、角質層キモトリプシン酵素、プロテアーゼＭ  ＴＡＤＤＧ１２、ＴＡＤＧ１４およびメタロプロテアーゼＰＵＭＰ−１を含む（図１９および表７参照のこと）。図１４に要約された正常組織および卵巣腫瘍組織のノーザンプロット分析により、ヘプシン、角質層キモトリプシン酵素、ＰＵＭＰ−１およびＴＡＤＧ−１４の過剰発現が明らかになった。装填量を制御するためにβ−チューブリンプローブを含めた。
【００８８】
大抵、これらのタンパク質はこれまで卵巣癌細胞の細胞外マトリックスに関連付けられなかった。本明細書中に開示された３つの新規候補セリンプロテアーゼを初めとして、転移性癌の増殖、シェディング、浸潤およびコロニー形成に寄与する可能性のあるプロテアーゼのパネルは、これまで記載されたことはなかった。悪性増殖または悪性程度のいずれかに関連する細胞外プロテアーゼパネルの確立は、診断マーカーまたは予後マーカーを同定する機会およびこれらプロテアーゼの抑制またはダウンレギュレーションによる治療的介入の機会を提供する。
【００８９】
腫瘍に特異的なプロテアーゼの適切な領域をコードする即席の遺伝子特異的プライマーが手軽に入手可能であることから、ノーザン分析およびサザン分析を用いた特異的ｃＤＮＡプローブの増幅が可能となり、組織中の癌の存在を検出するためのマーカーとしてのプローブの使用が可能となる。プローブにより、正常卵巣と比べて、初期ステージおよび進行期ステージの癌のみならず低悪性腫瘍における遺伝子発現のより広範な評価も可能となる。すべての癌の亜群から得た新鮮凍結組織のパネルの評価（表４）により、あるプロテアーゼが初期ステージの疾患または特定の癌の亜群に顕著に発現されるか否かの特定が可能となる。各遺伝子の発現が腫瘍の進行における特定ステージに限定されるか否かおよび／または転移性病変に関連するか否かも特定された。プロテアーゼの特定の組み合わせを検出することは、特定の腫瘍型の特性を同定することであり、診断と治療の選択に対して有用な情報をもたらす。特定腫瘍型は、各特定腫瘍の特有の発現パターンにより正確に診断され得る。
【表７】
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【実施例１０】
【００９０】
ヘプシンペプチドのランキング
ワクチンまたは免疫刺激に関して、ヘプシンタンパク質の個別の９−１１ｍｅｒペプチドを調べて、一般住民における上位８つのハプロタイプに対する各ペプチドの結合をランク付けした（Ｐａｒｋｅｒら（１９９４））。この分析に用いたコンピュータプログラムは、米国国立衛生研究所のウェブサイトに掲載されている。表８は、特定ＨＡＬ対立形質（HLA allele）に対する各ペプチドの結合の予想半減期に基づいたペプチドランキングを示す。より長い半減期は、ペプチドと特定ＨＬＡ(ヒト白血球抗原)分子とのより強い会合を示唆する。ＨＬＡ対立形質に強く結合するヘプシンペプチドは推定上の免疫原であり、ヘプシンに対して個体にワクチン接種するために用いられる。
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【実施例１１】
【００９１】
ヒトＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に対する標的エピトープとしてのヘプシンペプチド
２つのコンピュータプログラムを用いて、ＨＬＡクラスＩ分子の結合モチーフを含む９−ｍｅｒのペプチドを同定した。Ｐａｒｋｅｒらにより考案された計画（１９９４）に基づいた１つ目のプログラムは、米国立衛生研究所の情報技術センターのＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ（生物情報科学および分子分析部門，ＢＩＭＡＳ）により開発され、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩとして公知の２番目のプログラムは、ドイツのＴｕｂｉｎｇｅｎ大学（ドイツ）のＲａｍｍｅｎｓｅｅらにより考案された。
【００９２】
ＨＬＡ Ａ２．１結合モチーフを含むペプチドを合成し、ＨＬＡ Ａ２．１結合能を直接試験した。この技術は、ペプチドトランスポーター欠損ペプチドであり、従ってペプチドを負荷しさらに表面発現のためにＨＬＡクラスＩフォールディングを安定化させることができないため内因性ＨＬＡクラスＩの発現量が少ないＴ２細胞を用いる。ＨＬＡ Ａ２．１（Ａ*０２０１）に結合可能な内因性ペプチドの添加は、フローサイトメトリーにより明らかにされたように（Ｎｉｊｉｍａｎら（１９９３））細胞表面で適切に折り畳まれたＨＬＡ Ａ２．１分子数を増やすことができることが示されている。
【００９３】
以下に記載のように正常な成体ドナーから特異的ＣＤ８＋ＣＬＴ反応を誘導する能力について、ＨＬＡ Ａ２．１以外のＨＬＡクラスＩ分子に対する結合モチーフを有するペプチドを直接試験した。
【００９４】
単球由来のＤＣを、適切なＨＬＡタイプを有する健常成体ドナーから採取された末梢血から作成した。接着性単球を標準的技術（Ｓａｎｔｉｎら（２０００））に従い、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４Ａを添加したＡＩＭ−Ｖ培地（ギブコ−ＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ））中で培養した。５−６日後、ＰＧＥ２、ＩＬ−１ｂおよびＴＮＦａを加えてさらに４８時間ＤＣを成熟させた。
【００９５】
成熟ＤＣにペプチドを負荷し（２×１０６のＤＣに１ｍｌの無血清ＡＩＭ−Ｖ培地に３７℃で２時間５０ｍｇ／ｍ１のペプチドを負荷）、ＡＩＭ−Ｖ培地中または５％ヒトＡＢ型血清を添加したＡＩＭ−Ｖ培地中で１×１０６／ｍ１の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と一緒に培養する前に１回洗浄した。ＰＢＭＣ対ＤＣ比は２０：１〜３０：１の間とした。７日後、ペプチド負荷放射線照射自己ＤＣまたはＰＢＭＣで、それぞれ１０：１〜２０：１または１：１〜１：１０の間の反応物対刺激物の比率で反応性Ｔ細胞を再刺激した。この時点で培養物に組換えヒトＩＬ−２（１０−１００Ｕ／ｍｌ）を加え、新鮮培地にＩＬ−２を添加した培地を２−４日毎に５０−７５％取り替えて供給した。１４−２１日毎のペプチド再刺激によりＴ細胞株を樹立および維持した。２回目または３回目の抗原刺激後に、抗ＣＤ８連結磁気ビーズ（ダイナル社（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．））を用いたポジティブセレクションにより反応性細胞であるＣＤ８＋Ｔ細胞を精製した。
【００９６】
ペプチド特異的細胞傷害性を標準的な５−６時間のマイクロウェル５１Ｃｒ放出アッセイ（Ｎａｚａｒｕｋら（１９９８））により試験した。自己ＥＢＶ−形質転換リンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）にペプチド（５０ｎｇ／ｍｌ、３７℃で１時間）を負荷し、続いて５１Ｃｒで標識した（２００−３００ｍｌ中に５０ｍＣｉ、３７℃で１時間）。１０：１から１．２５：１の間のエフェクター：標的比率で、ペプチド負荷５１Ｃｒ標識ＬＣＬをＣＤ８＋Ｔ細胞と共に培養した。細胞傷害性は、培養物の上清中に放出された５１Ｃｒの割合（％）として記録した。
【００９７】
ヘプシンペプチド１７０−１７８
ヘプシンペプチド１７０−１７８（配列番号２８）は、Ｔ２細胞におけるＡ２．１発現のアップレギュレーションにより示されるように（データは示されていない）、ＨＬＡ Ａ２．１結合ペプチドである。ヘプシン１７０−１７８に対して特異的なＣＤ８＋ＣＴＬは、ペプチド負荷自己ＬＣＬを殺傷したが、対照であるペプチドを含まないＬＣＬは殺傷しなかった（図２０）。異種ＨＬＡ Ａ２．１を発現するペプチド負荷ＬＣＬは効率的に殺傷されたが、ＨＬＡ Ａ２.１を欠く標的は殺傷されなかった。ナチュラルキラー感受性Ｋ５６２細胞は溶解されなかった。ヘプシン１７０−１７８負荷ＬＣＬに対する細胞傷害性は、非多形ＨＬＡクラスＩ決定基に対して特異的なＭＡｂでブロックされ、溶解（殺傷）はＨＬＡクラスＩ拘束性であることが確認された。細胞傷害性は、ＨＬＡ Ａ２．１に対して特異的なＭＡｂによってもブロックされた。
【００９８】
ヘプシンペプチド１７２−１８０
ヘプシンペプチド１７２−１８０（配列番号１４８）は、ＨＬＡ Ｂ２７と結合することがコンピュータ解析により予測された。このことは直接には証明されていないが、細胞傷害性アッセイは、ヘプシン１７２−１８０に特異的なＣＤ８＋ＣＴＬが、ペプチド負荷ＨＬＡ Ｂ２７発現自己および異種ＬＣＬを殺傷できるが、異種ＨＬＡ Ｂ２７を発現しないペプチド負荷ＬＣＬまたはペプチドを含まない対照ＬＣＬを認識できないことを示した。（図２１）。ナチュラルキラー感受性Ｋ５６２細胞は溶解されなかった。ヘプシン１７２−１８０負荷ＬＣＬに対する細胞傷害性は、非多形ＨＬＡクラスＩ決定基に対して特異的なＭＡｂによりブロックすることができ、溶解はＨＬＡクラスＩ拘束性であることが確認された。
【００９９】
ヘプシンペプチド４２−５１
ヘプシンペプチド４２−５１（配列番号１８９）は、ＨＬＡ Ａ*０２０１と結合することがコンピュータ解析により予測された。ヘプシン４２−５１に特異的なＣＤ８＋ＣＴＬによりペプチド負荷自己ＬＣＬが殺傷されたが、対照であるペプチドを含まないＬＣＬは殺傷されなかった（図２２）。異種ＨＬＡ Ａ*０２０１を発現するペプチド負荷ＬＣＬは効率的に殺傷されたが、ＨＬＡ Ａ*０２０１を欠く標的は殺傷されなかった。ナチュラルキラー感受性Ｋ５６２細胞は溶解されなかった。ヘプシン４２−５１が負荷されたＬＣＬに対する細胞傷害性は、非多形ＨＬＡクラスＩ決定基に対して特異的なＭＡｂによりブロックすることができ、溶解はＨＬＡクラスＩ拘束性であることが確認された。細胞傷害性は、ＨＬＡ Ａ２．１に対して特異的であるＭＡｂによってもブロックされた。
【０１００】
ヘプシンペプチド２８４−２９３
ヘプシンペプチド２８４−２９３（配列番号１９０）は、ＨＬＡ Ａ*０２０１と結合することがコンピュータ解析により予測された。ヘプシン２８４−２９３に特異的なＣＤ８＋ＣＴＬによりペプチド負荷自己ＬＣＬが殺傷されたが、対照であるペプチドを含まないＬＣＬは殺傷されなかった（図２３）。異種ＨＬＡ Ａ＊０２０１を発現するペプチド負荷ＬＣＬは効率的に殺傷されたが、ＨＬＡ Ａ＊０２０１を欠く標的は殺傷されなかった。ナチュラルキラー感受性Ｋ５６２細胞は溶解されなかった。ヘプシン２８４−２９３が負荷されたＬＣＬに対する細胞傷害性は、非多形ＨＬＡクラスＩ決定基に対して特異的なＭＡｂによりブロックすることができ、溶解はＨＬＡクラスＩ拘束性であることが確認された。
【０１０１】
ヘプシンペプチド３０８−３１７
ヘプシンペプチド３０８−３１７（配列番号１９１）は、ＨＬＡ Ａ＊０２０１と結合することがコンピュータ解析により予測された。ヘプシン３０８−３１７に特異的なＣＤ８＋ＣＴＬによりペプチド負荷自己ＬＣＬが殺傷されたが、対照であるペプチドを含まないＬＣＬは殺傷されなかった（図２４）。異種ＨＬＡ Ａ*０２０１を発現するペプチド負荷ＬＣＬは効率的に殺傷されたが、ＨＬＡ Ａ*０２０１を欠く標的は殺傷されなかった。ナチュラルキラー感受性Ｋ５６２細胞は溶解されなかった。ヘプシン３０８−３１７が負荷されたＬＣＬに対する細胞傷害性は、非多形ＨＬＡクラスＩ決定基に対して特異的なＭＡｂによりブロックすることができ、溶解はＨＬＡクラスＩ拘束性であることが確認された。
【実施例１２】
【０１０２】
ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖反応を誘導する組換え完全長ヘプシン
以下の実施例は、組換え完全長ヘプシンを負荷された樹状細胞は、ヘプシンに対するＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖反応の両方を誘導できることを示す。
【０１０３】
ヘプシン由来のペプチドを負荷された樹状細胞（ＤＣ）が、健常成体においてＨＬＡ Ａ２.１拘束性およびＨＬＡ Ｂ２７拘束性のＣＤ８＋ＣＴＬ反応を効率的に刺激し得ることを示す上記に開示されている結果は、ヘプシンが卵巣癌の樹状細胞ベースの免疫療法の標的としての第一候補となり得ることを示唆する。さらに、免疫療法目的のための標的抗原としてのヘプシンの有用性は、卵巣癌に限定されないであろう。最近の一連の遺伝子発現のプロファイリング研究により、ヘプシンが前立腺癌の重要な腫瘍マーカーとして同定された。ヘプシンは、一貫して前立腺癌で高発現されたが、良性の前立腺肥大症では高発現されなかった（Ｌｕｏら（２００１））；Ｍａｇｅｅら（２００１）；Ｗｅｌｓｈら（２００１）；Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎら（２００１）およびＳｔａｍｅｙら（２００１））。これらの報告内容は、ヘプシンが前立腺癌の樹状細胞ベース免疫療法の標的としての第一候補にもなり得るとの提案を強く支持する。
【０１０４】
しかしながら、ペプチドの使用は、既定のＨＬＡクラスＩタイプに対する反応を限定し、それによって患者選択に制限が課せられる。完全長の組換え腫瘍抗原を負荷された樹状細胞を用いればこの問題は回避され、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応およびヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞反応の両方を誘導可能であるとの見込みをもたらし、後者は効果的な抗腫瘍免疫の誘導および維持において重要な役割を担うと考えられる。さらに、潜在的に重要な完全長の腫瘍抗原の使用による便益は、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応が自然に処理されたエピトープに対して誘導され、そのことは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が標的卵巣癌細胞により自然に処理および提示された内因的に合成された抗原を認識する可能性を著明に高める。
【０１０５】
ヘプシンｃＤＮＡをＩＰＴＧ誘導性のｐＱＥ−３０ベクター（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））内でクローン化し、大腸菌で発現させた。アミノ末端での６ｘ−ヒスチジンタグの付加は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂によるアフィニティー精製を促進する。樹状細胞は、上述したように末梢血単球前駆体に由来する。成熟樹状細胞は、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子、補助シグナル分子（例えば、ＣＤ８６およびＣＤ４０）およびＣＤ８３（成熟樹状細胞で発現するが、未成熟単球由来樹状細胞では発現しない）を高発現するが、ＣＤ１４（マクロファージおよび単球マーカー）を発現しない。
【０１０６】
ヘプシン特異的Ｔ細胞の増殖を誘導するため、ＤＯＴＡＰリポフェクションにより、精製した組換えヘプシンを成熟樹状細胞に負荷した。簡潔に言えば、５００ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ），ＮＹ）において、２５ｍｇのヘプシンを１５ｍｇのＤＯＴＡＰ（ロシュアプアイドサイエンス社（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ），インディアナポリス(Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ)，ＩＮ）と混合した。この混合物を３７℃で２時間まで１−２×１０６個の樹状細胞と共にインキュベートした。５％ヒトＡＢ型血清を加えたＡＩＭ−Ｖ培地中、３０：１の反応物−刺激物比で、健常成体ドナーから得た自己末梢血リンパ球と共にヘプシン負荷樹状細胞を共培養した。７−１０日後、１０：１の反応物−刺激物比で、ヘプシン負荷樹状細胞で反応性Ｔ細胞を再刺激した。Ｔ細胞培養物に組換えＩＬ−２（１０−１００Ｕ／ｍｌ）を添加し、ＩＬ−２を加えた培地を２−４日毎に５０−７５％取り替えて供給した。その後１４日毎にヘプシン負荷ＤＣでの再刺激によりＴ細胞株を維持した。３回目の再刺激前に、必要に応じて抗ＣＤ４＋Ｔ細胞および抗ＣＤ８＋Ｔ細胞連結磁気ビーズを用いたポジティブセレクションにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を精製した。得られた集団は、フローサイトメトリーによれば９８％を超える純度であった。
【０１０７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、それぞれ４回目および５回目の継代後にマイクロウェルリンパ球増殖アッセイで試験した。ＤＯＴＡＰリポフェクション（５×１０３／ウェル）によりヘプシンを負荷した樹状細胞またはＤＯＴＡＰのみ（５×１０４３／ウェル）で処理した対照樹状細胞と共に、Ｔ細胞（２×１０４／ウェル）を培養した。アッセイは７２時間培養して行った。増殖反応は、各マイクロウェル培養物に３Ｈ−チミジン（１ｍＣｉ／ウェル）を最後の２４時間添加して測定した。測定結果は、刺激指数（単独培養したＴ細胞による３Ｈ−チミジンの取込み量に対する樹状細胞を用いて培養したＴ細胞による３Ｈ−チミジンの取込み量の比率）として計算した３つのマイクロウェルの平均として示す。
【０１０８】
対照樹状細胞による刺激に反応した一部の環境増殖が認められたが、このアッセイは、ヘプシンを負荷した樹状細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方による有意な抗原特異的リンパ球増殖反応を誘導できることを明確に示す（図２５）。これらの結果は、腫瘍標的抗原としてヘプシンを用いた樹状細胞ベース免疫療法の可能性を強調する。
【０１０９】
完全長のヘプシンを発現する組換えアデノウイルスに感染した自己樹状細胞の認識によって示されるように、ヘプシン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、内因的に合成されたヘプシン抗原を発現する標的細胞も認識する（図２６）。ヘプシン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヘプシン腫瘍抗原を処理および提示する標的を認識すると、ＩＦＮｇも発現する（図２７）。ＩＦＮｇは、エフェクターＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の反応を支援するＴｈ１ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の反応のための重要サイトカインであることから、ＩＦＮｇの発現は重要である。ＩＦＮｇは、抗腫瘍免疫において直接的な腫瘍特異的細胞傷害性反応よりも重要な役割も果たし得る。
【０１１０】
要約すれば、本発明は、特にヘプシンを標的とし、さらにヘプシンを発現する腫瘍の治療に適用される、免疫療法用途を提供する。標的疾患には卵巣癌および前立腺癌が含まれるが、ヘプシンの発現が証明され得る任意のその他の悪性腫瘍も含む。免疫療法用途は下記のものを含むがそれらに限定されるものではない：免疫療法はヘプシン負荷樹状細胞のワクチン接種の形態をとることが可能であり、その療法では、樹状細胞を患者から採取した抹消血からin vitroで作成し、リポフェクション法またはその他の方法によりヘプシンを負荷し、続いて、単回投与または複数回投与のいずれかにより自己細胞ワクチンとして患者に戻す。ヘプシンは、組換えＤＮＡベクターを用いた形質導入後に樹状細胞で発現させることも可能であり、そのようなヘプシン形質導入樹状細胞は、次に細胞ワクチンとして用いることができる。
【０１１１】
単独でまたはその他の免疫学的活性成分との融合タンパク質としてのいずれでヘプシンを発現する組換えＤＮＡベクターは、ヘプシンを発現する腫瘍の治療のためのＤＮＡワクチンとして用いることが可能である。ヘプシンを負荷された樹状細胞またはヘプシンを発現する樹状細胞は、in vitroで抗原特異的Ｔ細胞反応を誘導するのに用いることができ、その後、患者に自己ヘプシン特異的Ｔ細胞が投与される養子免疫療法が実施される。
【０１１２】
ヘプシンに基づくモノクローナル抗体療法も明らかである。ヘプシンは、腫瘍細胞の表面において膜貫通タンパク質として発現される。ヘプシンに特異的なヒトモノクローナル抗体またはキメラヒト化モノクローナル抗体の構築は、ヘプシンを発現する悪性腫瘍の免疫療法のための魅力的な選択肢を提供する。
【実施例１３】
【０１１３】
ヘプシンペプチド１７０−１７８に特異的なＣＤ８＋ＣＴＬは、内因的に発現されたヘプシン腫瘍抗原を認識する
ペプチド特異的ＣＤ８＋ＣＴＬが、内因的に発現されたヘプシン腫瘍抗原を処理および提示する標的を認識できるか否かを特定するため、フローサイトメーター技術により発現量を直接監視する手段として、共にグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と結合したヘプシンおよびＳＣＣＥを発現する組換えアデノウイルスを構築した。ヘプシン１７０−１７８に特異的なＣＤ８＋ＣＴＬは、完全長のヘプシン抗原（Ａｄ−ＧＦＰ／ヘプシン）を発現する組換えアデノウイルスに感染した自己標的を認識および殺傷したが、Ａｄ−ＧＦＰ／ＳＣＣＥに感染した標的は認識しないことが認められた（図２８）。これらの結果は、ヘプシン１７０−１７８ペプチドが、ヘプシン特異的ＣＤ８＋ＣＴＬのための自然に処理および提示されたＣＴＬエピトープであることを示す。
【実施例１４】
【０１１４】
ヘプシン変異体
セリンプロテアーゼファミリーのメンバーは、腫瘍によって高発現および分泌されるため、それらは診断および治療の潜在的標的となり得る。これらの酵素の多くが、腫瘍により優勢的に産生されるが、しばしば少数の正常な組織においてもある程度発現される。
【０１１５】
より特異的な腫瘍の診断および標的化の可能性をさらに高めるために、酵素ファミリーに属する可能性のある独特な配列を提供することが有用であろう。本実施例は、ヘプシン酵素の転写変異体を開示する。ヘプシン変異体は、腫瘍におけるヘプシンの認識に潜在的特異性をもたらすことができる独特なイントロン配列を含む。
【０１１６】
ヘプシン遺伝子の完全転写物を潜在的変異体に関して調べた時、エクソン１２とエクソン１３との間のイントロン配列を含む１つの変異体が検出された。卵巣癌および前立腺癌から得た組織および正常組織のＰＣＲ分析は、イントロン１２の完全配列を含むヘプシン変異体の発現のためのより大きなサイズでかつ適切な長さのＰＣＲバンドの発現を確認した。
【０１１７】
図２９は、卵巣癌および前立腺癌におけるヘプシン変異体の発現を示す。より広範な前立腺癌群を調べることにより、調べた前立腺癌のすべてでこの変異体ヘプシンＶ１２の存在が示された（図３０）。これまでのところ、ヘプシンＶ１２は４／６例の卵巣癌と１０／１０例の前立腺癌で発現が認められている。
【０１１８】
センスプライマーおよびアンチセンスプライマーをヘプシンのエクソン１２および１３に対して作成した（ヘプシンＶセンス  ５'−ＧＣＧ ＧＴＧ ＧＴＣ ＣＣＴ ＴＴＧ ＴＧＴ ＧＴ−３'，配列番号１９２；ヘプシンＶアンチセンス  ５'−ＡＡＧ ＡＧＣ ＡＴＣ ＣＣＧ ＴＣＡ ＴＣＡ ＧＧ−３'，配列番号１９３）。すべてのＰＣＲは、５０ｎｇのｍＲＮＡから得られた卵巣癌ｃＤＮＡ、それぞれ５ｐｍｏ１のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー、０．２ｎｍｏ１のｄＮＴＰｓ、２．５ｎｍｏｌのＭｇＣ１２および１ｘ緩衝液中のＴａｑポリメラーゼ１Ｕから成る２０ｕ１の反応物中で実施した。この混合液に９４℃で１．５分の変性を施し、続いて下記を含む３５サイクルのＰＣＲを実施した：９４℃で３０秒間の変性、各プライマーセットに対して適切な温度で３０秒間のアニーリング、およびサイクル後の７２℃で１分間の伸長、最終サイクルではさらに７分間の伸長を含む。
【０１１９】
イントロン１２の配列が含まれると、追加されたイントロン配列の中央当たりに停止コドンが存在するため、転写サイズの伸長（図３１）、および修飾アミノ酸配列をもたらした（図３２）。ヘプシンのイントロン１２の発現に関するＥＳＴデータの分析は、腎の明細胞癌およびジャーカット細胞株にイントロン１２の存在を示唆する。ヘプシンのイントロン１２に由来する切断アミノ酸配列の存在は、この変異体を発現する腫瘍のより特異的な診断および標的化の可能性を提供する。対象となる腫瘍は、卵巣癌、前立腺癌および腎癌を含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
ヘプシン変異体の免疫原性は以下のように評価することができる。ヘプシン変異体は、単一ペプチド（例えばアミノ酸１６個のペプチド）として合成することができ、さらにこれらペプチドを用いて樹状細胞（ＤＣ）をパルスすることができる。あるいは、１２番目のエクソンからの変異配列およびフランキング配列を組み込んだペプチドを合成することができる。後者のアプローチの理論的根拠は、エクソン−イントロン接合が新規な免疫原性エピトープをコードし得ることである。次に、各ペプチドによりパルスされた自己刺激細胞（ＬＣＬまたはＤＣ）に対する増殖アッセイでＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の反応を評価することができる。ＣＤ８＋ＣＴＬ反応は、完全長のヘプシンを発現する組換えアデノウイルスに感染した自己マクロファージ標的、および変異抗原を発現する自己腫瘍細胞またはＨＬＡ適合腫瘍細胞に対して試験することができる。
【０１２１】
下記の参考文献を本明細書中で引用した：
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Welsh et al.,Cancer Res.61:5974-5978(2001)
本明細書に記載されたすべての特許または文献は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示す。さらに、これらの特許および文献は、各文献が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが指示されたのと同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１は、正常なｃＤＮＡおよび癌のｃＤＮＡに由来するＰＣＲ産物のアガロースゲルの比較を示す。
【図２】図２は、ヘプシン、ＳＣＣＥ、ＰＵＭＰ−１、ＴＡＤＧ−１４およびβ−チューブリンのプローブを用いた卵巣癌のノーザンブロット分析を示す。
【図３】図３は、セリンプロテアーゼ重複プライマー群を用いた増幅を示す：正常なｃＤＮＡ（レーン１）および腫瘍のｃＤＮＡ（レーン２）を用いた、アスパラギン酸アンチセンス（ＡＳ１）とヒスチジンセンス（Ｓ１）プライマーでの増殖；ならびに正常なｃＤＮＡ（レーン３）および腫瘍のｃＤＮＡ（レーン４）を用いた、セリンアンチセンス（ＡＳ２）とヒスチジンセンス（Ｓ１）プライマーでの増殖。
【図４】図４は、システインプロテアーゼ重複プライマーを用いた増幅を示す。正常細胞（レーン１）、低悪性細胞（レーン２）、漿液性細胞（レーン３）、粘液癌（レーン４）および明細胞癌（レーン５）。
【図５】図５は、メタロプロテアーゼ重複プライマーを用いた増幅を示す。正常細胞（レーン１）、低悪性細胞（レーン２）、漿液性細胞（レーン３）、粘液癌（レーン４）および明細胞癌（レーン５）。
【図６】図６は、セリンプロテアーゼであるヘプシンに対する特異的プライマーによる増幅を示す。正常細胞（レーン１−３）、低悪性腫瘍（レーン４−８）および卵巣癌（レーン９−１２）での発現。
【図７】図７は、正常細胞、低悪性腫瘍および卵巣癌におけるヘプシンの発現量を示す。Ｓは漿液性、Ｍは粘液性、ＬＭＰは低悪性腫瘍を示す。
【図８】図８は、正常細胞、低悪性腫瘍および卵巣癌におけるセリンプロテアーゼ角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）の発現を示す。
【図９】図９は、正常細胞（レーン１−２）および卵巣癌組織（レーン３−１０）におけるメタロプロテアーゼＰＵＭＰ−１（ＭＭＰ−７）の遺伝子発現を示す。
【図１０】図１０Ａは、正常卵巣および卵巣癌におけるヘプシン発現のノーザンブロット分析を示す。レーン１は正常卵巣（症例１０）；レーン２は漿液性癌（症例３５）；レーン３は粘液癌（症例４８）；レーン４は子宮内膜性癌（症例５１）およびレーン５は明細胞癌（症例５４）である。症例３５、５１および５４では、ヘプシン１．８ｋｂの転写産物の１０倍を超える増加が認められた。図１０Ｂは、正常なヒト胎児におけるヘプシンのノーザンブロット分析を示す。図１０Ｃは、成体組織におけるヘプシンのノーザンブロット分析を示す。ヘプシン転写産物の有意な過剰発現が、胎児肝および胎児腎の両方に認められる。注目すべきことに、ヘプシンの過剰発現は成体組織中には認められない。バックグラウンド値を超える軽度の発現が成体の前立腺中に認められる。
【図１１】図１１Ａは、正常組織（Ｎ）、粘液性（Ｍ）および漿液性（Ｓ）の低悪性（ＬＭＰ）腫瘍、および癌（ＣＡ）におけるヘプシン発現を示す。β−チューブリンが内部対照として用いられた。図１１Ｂは、正常卵巣、ＬＭＰ腫瘍および卵巣癌におけるヘプシン：β−チューブリンの割合を示す。ヘプシンのｍＲＮＡ発現量は、正常卵巣と比べて、ＬＭＰ腫瘍（ｐ＜０．００５）および癌（ｐ＜０．０００１）において有意に増加した。正常卵巣１０症例すべてが相対的に低レベルのヘプシンｍＲＮＡ発現を示す。
【図１２】図１２Ａは、胎児組織におけるＳＣＣＥ遺伝子のｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析を示す。図１２Ｂは、卵巣組織におけるＳＣＣＥ遺伝子のｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析を示す。
【図１３】図１３Ａは、正常な卵巣および卵巣癌から得たＳＣＣＥのｃＤＮＡの定量的ＰＣＲの比較を示す。図１３Ｂは、正常組織１０例および卵巣癌組織４４例におけるβ−チューブリンに対するＳＣＣＥの割合を比較した棒グラフを示す。
【図１４】図１４は、正常組織および卵巣癌でのプロテアーゼＭのｍＲＮＡの発現の定量的ＰＣＲによる比較を示す。
【図１５】図１５は、Ｈｉｓ５’の末端付近の挿入部分を含むＴＡＤＧ−１２触媒ドメインを示す。
【図１６】図１６Ａは、正常組織および卵巣癌におけるＴＡＤＧ−１４の発現を比較したノーザンブロット分析を示す。図１６Ｂは、正常組織および癌のｃＤＮＡにおける、ＴＡＤＧ−１４に対する特異的プライマーを用いた予備的な定量的ＰＣＲ増幅を示す。
【図１７】図１７Ａは、ヒト胎児組織におけるＰＵＭＰ−１遺伝子のノーザンブロット分析を示す。図１７Ｂは、正常な卵巣および卵巣癌におけるＰＵＭＰ−１遺伝子のノーザンブロット分析を示す。
【図１８】図１８Ａは、β−チューブリン内部対照による定量的ＰＣＲを用いた正常組織および癌組織におけるＰＵＭＰ−１の発現の比較を示す。図１８Ｂは、正常組織１０例および卵巣癌４４例におけるβ−チューブリン内部対照と比較したＰＵＭＰ−１のｍＲＮＡ発現比を示す。
【図１９】図１９は、ヘプシン、ＳＣＣＥ、プロテアーゼＭ、ＰＵＭＰ−１遺伝子およびカテプシンＬ遺伝子のＰＣＲ増幅産物の比較を示す。
【図２０】図２０は、５時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおけるヘプシン１７０−１７８ペプチドのＣＤ８＋ＣＴＬ認識を示す。標的はヘプシン１７０−１７８（閉環）が負荷されたＬＣＬおよび対照ＬＣＬ（開環）であった。
【図２１】図２１は、５時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおけるヘプシン１７２−１８０ペプチドのＣＤ８＋ＣＴＬ認識を示す。標的はヘプシン１７０−１８０（閉環）が負荷されたＬＣＬおよび対照ＬＣＬ（開環）であった。
【図２２】図２２は、５時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおけるヘプシン４２−５１ペプチドのＣＤ８＋ＣＴＬ認識を示す。標的はヘプシン４２−５１（四角形）が負荷されたＬＣＬ、対照ＬＣＬ（三角形）およびＫ５６２細胞（ダイヤモンド形）であった。
【図２３】図２３は、５時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおけるヘプシン２８４−２９３ペプチドのＣＤ８＋ＣＴＬ認識を示す。標的はヘプシン２８４−２９３（閉環）が負荷されたＬＣＬ、対照ＬＣＬ（開環）であった。
【図２４】図２４は、５時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおけるヘプシン３０８−３１７ペプチドのＣＤ８＋ＣＴＬ認識を示す。標的細胞はヘプシン３０８−３１７が負荷されたまたは負荷されていないＬＣＬであった。
【図２５】図２５は、完全長のヘプシンタンパク質により誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖反応を示す。色の付いたヒストグラムはヘプシンが負荷された樹状細胞により誘導されたＴ細胞に対する刺激指数を表し、空のヒストグラムは対照樹状細胞により誘導されたＴ細胞に対する刺激指数を表す。
【図２６】図２６は、組換えアデノウイルス発現ヘプシンに感染したＤＯＴＡＰ／ヘプシン負荷樹状細胞（ＤＣ）認識ＤＣによる刺激を通じて誘導されたドナー１名から得たヘプシン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞系を示す。増殖アッセイの結果は刺激指数として表す。標的は、ヘプシンを発現する組換えアデノウイルスに感染し、かつグリーン蛍光タンパク質で標識した樹状細胞（黒棒）またはグリーン蛍光タンパク質で標識したのみの樹状細胞（白棒）である。
【図２７】図２７は、完全長の組換えヘプシンに特異的なドナー１のＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮｇの産生に対するＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＤＯＴＡＰのみにより処理（左側のパネル）された対照ＬＣＬまたはＤＯＴＡＰ／ヘプシンを用いてパルスされたＬＣＬ（右側のパネル）により一晩刺激を加えた。
【図２８】図２８は、内生的に処理および提示されたヘプシン腫瘍抗原のペプチド特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ認識を示す。ヘプシンペプチド１７０−１７８でパルスした樹状細胞を用いた刺激によってＣＴＬを誘導した。Ａｄ−ＧＦＰ／ヘプシン（三角形）に感染させた自己由来のマクロファージ、Ａｄ−ＧＦＰ−ＳＣＣＥ（ダイヤモンド形）に感染させたマクロファージ、ヘプシン１７０−１７８ペプチドでパルスしたマクロファージ（四角形）、または対照の未処理マクロファージ（黒丸形）に対して、標準的な５時間の５１Ｃｒ−放出アッセイで細胞傷害性を試験した。
【図２９】図２９は、卵巣癌および前立腺癌におけるヘプシンの発現およびヘプシンタンパク質変異体の発現を示す。
【図３０】図３０は、前立腺癌におけるヘプシンタンパク質変異体のＰＣＲ分析を示す。
【図３１】図３１は、ヘプシンおよびヘプシンイントロン１２変異体の転写産物およびオープンリーディングフレームの図解を示す。
【図３２】図３２は、ヘプシンとヘプシンタンパク質変異体のアミノ酸配列の比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年12月18日(2006.12.18)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007503817000001.app
【国際調査報告】
2007503817.tif 000088
2007503817.tif 000089
2007503817.tif 000090
2007503817.tif 000091