(57)【要約】  本発明は、インターα阻害剤タンパク質（ＩαＩｐ）に関連する。本発明はさらに、ＩαＩｐ組成物を精製するための方法、及び敗血症及び敗血症性ショック、リウマチ様関節炎、ガン並びに感染性疾患のようなヒト疾患を治療するためのその使用に関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレαタンパク質（ＰαＩ）が生理学的割合で存在する、ＩαＩ及びＰαＩを含有する血漿分画物を、血漿から単離すること、及び
血漿分画物を精製して、ＩαＩｐの純度が約８５％〜約１００％の範囲にあるＩαＩｐ組成物を得ること、
からなるＩαＩ及びＰαＩを生理学的割合で含む、血漿由来のＩαＩｐ組成物を製造するための方法。
【請求項２】
単離が、固相抽出によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固相抽出が、ＤＥＡＥセファデックスによるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
単離が、血漿をクロマトグラフィー処理するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
クロマトグラフィーが、アニオン交換クロマトグラフィーによるものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アニオン交換クロマトグラフィーが粒子に基づいたものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
粒子が、ＤＥＡＥセファロース、ＤＥＡＥセファデックスＡ５０、トヨパールＤＥＡＥ、ＴＭＡＥフラクトゲル、ＤＥＡＥフラクトゲル又はＱセファロースのような固定化アニオン交換基を含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
血漿をクロマトグラフィー処理することが、モノリシック支持体によって行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
モノリシック支持体が、ＤＥＡＥ−ＣＩＭ又はＱ−ＣＩＭのような固定化されたアニオン交換リガンドを有するＣＩＭである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
血漿分画物が、凝固因子ＩＸの精製から得られる副分画物を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
血漿分画物が、プロトロンビン複合体濃縮物の精製からの副分画物を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
血漿分画物が、血漿の低温沈降反応から生じる低温沈降上清として単離される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
血漿分画物が、クリオプア血漿である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
血漿分画物が、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、ネコ又はイヌに由来する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
血液を得ることをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
血漿を得ることをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
凝固因子ＩＸの精製から得られる副分画物を得ることをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
プロトロンビン複合体濃縮物の精製からの副分画物を得ることをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
血漿の低温沈降反応から生じる低温沈降上清を得ることをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
クリオプア血漿を得ることをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
精製することが、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーによって実施される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
精製することが、アフィニティクロマトグラフィーによって実施される、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
アフィニティクロマトグラフィーがヘパリンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
精製することが、イオン交換クロマトグラフィー及びヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーによって実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
血漿分画物に存在するＩαＩ及びＰαＩが、約６０，０００〜約２８０，０００ｋＤａの見かけの分子量を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
分子量が、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
血漿分画物をさらに精製することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
さらに精製することが、ヘパリンアフィニティカラムに通すこと、及び素通り（非結合）画分を集めることによって実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
血漿分画物及び／又は精製されたＩαＩｐを、ウイルス不活性化することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ウイルス不活性化することが、溶媒／界面活性剤処理又は熱不活性化によって実施される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
熱不活性化が、約５５℃〜約６５℃の温度であるか、又は７０℃〜１２０℃における乾熱である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
安定化剤の添加をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
精製されたＩαＩｐの低温殺菌又は約７０℃〜約１２０℃における乾熱処理をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
精製されたＩαＩｐのアニオン交換クロマトグラフィー処理をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
アニオン交換クロマトグラフィーがＤＥＡＥセファロースである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＩαＩｐ組成物が１時間を超える半減期を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ＩαＩｐ組成物が５時間を超える半減期を有する、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
ＩαＩｐ組成物が、トリプシン阻害の高い比活性を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
トリプシン阻害の比活性が、約１０００〜約２０００ＩＵ／ｍｇである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレαタンパク質（ＰαＩ）が生理学的割合で存在し、その純度が約８５％〜約１００％であるＩαＩ及びＰαＩの混合物を含有してなる、ＩαＩｐの組成物。
【請求項４１】
ＩαＩｐが、約６０％〜約８０％のＩαＩ及び約４０％〜約２０％のＰαＩを含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
生理学的割合が、ヒト血漿において自然の状態で現れるＩαＩ対ＰαＩの比率である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
タンパク質が、ヒト疾患を治療するために使用される、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４４】
ヒト疾患が、急性炎症性疾患、敗血症、重篤なショック、敗血症性ショック、リウマチ様関節炎、ガン、ガン転移、外傷／傷害、感染性疾患及び早期陣痛である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
安定化剤をさらに含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４６】
安定化剤が、アルブミン、ポリエチレングリコール、α，α−トレハロース、アミノ酸、塩、グリセロール、ω−アミノ酸、糖、又はそれらの組合せである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレαタンパク質（ＰαＩ）の混合物を含み、ＩαＩ及びＰαＩが、生理学的割合で前記混合物中に存在し、かつ、トリプシン阻害の高い比活性を有するものである、ＩαＩｐの組成物。
【請求項４８】
ＩαＩｐが、約６０％〜約８０％のＩαＩ及び約４０％〜約２０％のＰαＩを含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
生理学的割合が、ヒト血漿において自然の状態で現れる比率である、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５０】
タンパク質が、ヒト疾患を治療するために使用される、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５１】
ヒト疾患が、急性炎症性疾患、敗血症、重篤なショック、敗血症性ショック、リウマチ様関節炎、ガン、ガン転移、感染性疾患及び早期陣痛である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
安定化剤をさらに含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５３】
安定化剤が、アルブミン、ポリエチレングリコール、α，α−トレハロース、アミノ酸、塩、グリセロール、ω−アミノ酸、糖、又はそれらの組合せである、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレαタンパク質（ＰαＩ）の混合物を含み、ＩαＩ及びＰαＩが、生理学的割合で前記混合物中に存在し、かつ、１時間を超える半減期を有するものである、ＩαＩｐの組成物。
【請求項５５】
ＩαＩｐが、約６０％〜約８０％のＩαＩ及び約４０％〜約２０％のＰαＩを含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
ＩαＩｐ組成物が、少なくとも５時間の半減期を有する、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
ＩαＩｐ組成物が、少なくとも１０時間の半減期を有する、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５８】
生理学的割合が、ヒト血漿において自然の状態で現れる比率である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５９】
タンパク質が、ヒト疾患を治療するために使用される、請求項５４に記載の組成物。
【請求項６０】
ヒト疾患が、急性炎症性疾患、敗血症、重篤なショック、敗血症性ショック、リウマチ様関節炎、ガン、ガン転移、感染性疾患及び早期陣痛である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
安定化剤をさらに含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項６２】
安定化剤が、アルブミン、ポリエチレングリコール、α，α−トレハロース、アミノ酸、塩、グリセロール、ω−アミノ酸、糖、又はそれらの組合せである、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレαタンパク質（ＰαＩ）の混合物を含み、ＩαＩ及びＰαＩが、生理学的割合で前記混合物中に存在し、かつ、３つの重鎖（Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）のうちの少なくとも１つと会合したインターα阻害タンパク質の軽鎖を含むものである、ＩαＩｐの組成物。
【請求項６４】
ＩαＩｐが、約６０％〜約８０％のＩαＩ及び約４０％〜約２０％のＰαＩを含む、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
生理学的割合が、ヒト血漿において自然の状態で現れるＩαＩ対ＰαＩの比率である、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６６】
タンパク質が、ヒト疾患を治療するために使用される、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６７】
ヒト疾患が、急性炎症性疾患、敗血症、重篤なショック、敗血症性ショック、リウマチ様関節炎、ガン、ガン転移及び感染性疾患である、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
安定化剤をさらに含む、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６９】
安定化剤が、アルブミン、ポリエチレングリコール、α，α−トレハロース、アミノ酸、塩、グリセロール、ω−アミノ酸、糖、又はそれらの組合せである、請求項６３に記載の組成物。
【請求項７０】
インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレαタンパク質（ＰαＩ）の混合物を含み、ＩαＩ及びＰαＩが、生理学的割合で前記混合物中に存在し、かつ、４つの重鎖（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４）のうちの少なくとも１つと会合したインターα阻害タンパク質の軽鎖を含むものである、ＩαＩｐの組成物。
【請求項７１】
ＩαＩｐが、約６０％〜約８０％のＩαＩ及び約４０％〜約２０％のＰαＩを含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
生理学的割合が、ヒト血漿において自然の状態で現れるＩαＩ対ＰαＩの比率である、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７３】
タンパク質が、ヒト疾患を治療するために使用される、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７４】
ヒト疾患が、急性炎症性疾患、敗血症、重篤なショック、敗血症性ショック、リウマチ様関節炎、ガン、ガン転移、感染性疾患及び早期陣痛である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
安定化剤をさらに含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７６】
安定化剤が、アルブミン、ポリエチレングリコール、α，α−トレハロース、アミノ酸、塩、グリセロール、ω−アミノ酸、又はそれらの組合せである、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレαタンパク質（ＰαＩ）の混合物を含み、ＩαＩ及びＰαＩが、生理学的割合で前記混合物中に存在し、請求項１〜３９のいずれかに従って作製されるものである、ＩαＩｐの組成物。
【請求項７８】
追加の治療剤をさらに含む、請求項４０〜７７のいずれかに記載の組成物。
【請求項７９】
追加の治療剤が、抗ガン剤、抗炎症剤、抗凝固剤又は免疫調節剤である、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
請求項４０、４７、５４、６３、７０又は７７のいずれかに記載される治療に有効な組成物、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項８１】
請求項１〜３９のいずれかに記載される方法によって作製される、ＩαＩｐの治療有効量を投与することを含む、患者における炎症関連障害、ガン又は感染性疾患を治療する方法。
【請求項８２】
ＩαＩｐが、患者から単離される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
患者が、ヒト、ウシ、ブタ、ヤギ又は霊長類である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
ＩαＩｐが、錠剤、カプセル又は注射剤として投与される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
ＩαＩｐが、少なくとも８５％の純度である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
ＩαＩｐが、約８５％〜約１００％の純度である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８７】
ＩαＩｐが、約６０％〜約８０％のＩαＩ及び約４０％〜約２０％のＰαＩを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８８】
（ａ）患者において、下記：
（ｉ）      ＩαＩのレベル；
（ｉｉ）    ＰαＩのレベル；
（ｉｉｉ）  ＩαＩｐのレベル；
（ｉｖ）    Ｈ３のレベル；
（ｖ）      Ｈ４のレベル；
（ｖｉ）    Ｈ１のレベル；
（ｖｉｉ）  Ｈ２のレベル；及び
（ｖｉｉｉ）ＬＣのレベル
の１つ又はそれ以上の処置前レベルを決定すること、並びに
（ｂ）治療有効量のＩαＩｐを患者に投与すること、
を含む、急性炎症性疾患、敗血症、重篤なショック、敗血症性ショック、リウマチ様関節炎、ガン、ガン転移、感染性疾患又は早期陣痛について、患者を治療する方法。
【請求項８９】
（ｃ）ＩαＩｐによる初期処置の後の、処置後のレベルの１つ又はそれ以上を決定することをさらに含み、ＩαＩｐのレベルの調節が、治療が好ましい臨床的応答を生じさせているという指標である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
調節が、ＩαＩｐのレベルに於いて増大することである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
ＩαＩ、ＰαＩ、ＩαＩｐ、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１、Ｈ２及びＬＣのレベルが免疫学的方法によって決定される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
患者が、炎症、腫瘍侵入、腫瘍転移、敗血症、敗血症性ショック、リウマチ様関節炎、早期陣痛、ガン又は感染性疾患を有することで特定される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
初期処置の期間が、定常状態の血漿中ＩαＩｐ濃度に到達するのに要する時間である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９４】
追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９５】
追加の治療剤が、抗ガン剤、抗炎症剤、抗凝固剤又は免疫調節剤である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
下記：
（ｉ）      ＩαＩ；
（ｉｉ）    ＰαＩ；
（ｉｉｉ）  ＩαＩｐ；
（ｉｖ）    Ｈ３；
（ｖ）      Ｈ４；
（ｖｉ）    Ｈ１；
（ｖｉｉ）  Ｈ２；及び
（ｖｉｉｉ）ＬＣ
の１つ又はそれ以上のレベルを検出するために、患者から取得したサンプルをアッセイし、検出されたレベルが、ＩαＩｐ療法に対して好ましい応答をする患者を特定することを含む、ＩαＩｐ療法に対する応答を予測するための方法。
【請求項９７】
検出されたレベルが、ＩαＩ及びＰαＩのレベルに於いて減少しているものである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
（ａ）下記：
（ｉ）      ＩαＩのレベル；
（ｉｉ）    ＰαＩのレベル；
（ｉｉｉ）  ＩαＩｐのレベル；
（ｉｖ）    Ｈ３のレベル；
（ｖ）      Ｈ４のレベル；
（ｖｉ）    Ｈ１のレベル；
（ｖｉｉ）  Ｈ２のレベル；及び
（ｖｉｉｉ）ＬＣのレベル；
の１つ又はそれ以上の患者に於ける処置前レベルを決定すること、
（ｂ）治療有効量のＩαＩｐを患者に投与すること、及び
（ｃ）ＩαＩｐによる初期処置の後の患者に於けるレベルの１つ又はそれ以上を決定することを含み、ＩαＩｐによる処置後の患者に於けるレベルが増大することが、患者がＩαＩｐによる治療に対して好ましい臨床的応答を有しそうであるということを示すものである、ＩαＩｐ療法を受けている患者の進行をモニターする方法。
【請求項９９】
下記：
（ｉ）      ＩαＩ；
（ｉｉ）    ＰαＩ；
（ｉｉｉ）  ＩαＩｐ；
（ｉｖ）    Ｈ３；
（ｖ）      Ｈ４；
（ｖｉ）    Ｈ１；
（ｖｉｉ）  Ｈ２；及び
（ｖｉｉｉ）ＬＣ；
のうちの１つ又はそれ以上、並びに治療に使用するための説明書を含む、ＩαＩｐ療法のためのキット。
【請求項１００】
ＩαＩｐの入った容器、及びＩαＩｐを患者に投与するための指示が書かれているラベル又は能書、を含む組成物。
【請求項１０１】
請求項４０、４７、５４、６３、７０又は７７のいずれかに記載される組成物、及び治療に使用するための説明書、を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、仮特許出願第６０／ 「２００３年１１月８日出願；発明の名称：治療に使用するのためのヒト血漿由来のインターα阻害タンパク質製剤及び組成物」に開示された主題に関連し、その開示を参照してその全てを本明細書に取り込む。
【０００２】
（政府の助成）
本発明の一部は、米国立衛生研究所のグラント第Ｒ０１  ＧＭ０５３００８号、同第Ｒ０１  ＧＭ０５７４６８号及び同第Ｒ４３  ＧＭ０６５６６７号に基づく助成を受けてなされたものである。
【背景技術】
【０００３】
インターα阻害タンパク質（ＩαＩｐ）ファミリーは、一群の血漿関連のセリンプロテアーゼ阻害剤である。このファミリーのメンバーは、グリコサミノグリカンによって共有結合的に連結される重鎖及び軽鎖ポリペプチドサブユニットから構成される。軽鎖は、ビクニンとも呼ばれており、分子のセリンプロテアーゼ阻害活性を担っている。「ビクニン」の名称は、Ｋｕｎｉｔｚ型の２つのプロテアーゼ阻害ドメインの存在を反映している。正常な血漿では、ビクニンは、２２５ｋＤａの分子量を有するインターα阻害剤（ＩαＩ）、及び１２０ｋＤａの分子量を有するプレα阻害剤（ＰαＩ）として、複合体の形態でほとんどが見出されている。ＩαＩでは、ビクニンが２つの重鎖ポリペプチド鎖（Ｈ１及びＨ２）に連結されており、これに対して、ＰαＩでは、１つだけの重鎖（Ｈ３）がビクニンに連結されている。これらの複合体化された形態では、ビクニンは、タンパク質分解による部分的な分解（活性を調節するための手段として役立つ機構）により放出されるまでは不活性のままである。複合体から切断された後、活性化されたビクニンは、腎糸球体ろ過（その低い分子量によって、及び受容体媒介による取り込みによって、促進されるプロセス）によって、血漿から迅速に除かれる。米国特許第６，４８９，１２８号及び同第６，６６０，４８２号は、ガン及び敗血症を診断することへの使用にそれぞれ関連する。転移を阻害する方法、及び敗血症を治療する方法もまた開示されるが、それらの組成物は実質的に純粋でなく、また、安定性（すなわち、短い半減期）の問題を有していた。
【０００４】
抗生物質が５０年以上前に導入され、実際に、敗血症により誘導される死亡が５５％〜３５％への減少を見せたにもかかわらず、医薬は、敗血症患者の死亡における著しい減少の恩恵を受けていない。現実には、敗血症は集中治療室における主要な死因の１つであり続けており、非常に多数の敗血症患者が敗血症性ショック及び多臓器不全のために死亡している。敗血症は、感染（例えば、細菌感染）に対する全身性の応答である。敗血症は、一般には、グラム陰性細菌からの内毒素によって、又はグラム陽性細菌からの外毒素（これは内毒素様の応答を開始させ得る）によって引き起こされる。その全身性の応答は、血圧の急激な低下、心臓血管の崩壊、及び／又は多臓器不全によって特徴づけられる、敗血症性ショックを生じさせる。敗血症性ショックと診断された患者の死亡率は３５〜４５％もの高さになっている。敗血症を迅速かつ確実に治療することは、従来の薬物療法を使用した場合、困難である。
【０００５】
敗血症及び敗血症性ショックは、先天性免疫系及び凝固系の活性化と関連する。敗血症及び敗血症性ショックは、臨床的には、全身炎症、凝固障害、低血圧及び多臓器不全によって特徴づけられる（J. -L. Vincent et al,, Annuals of Medicine 34 (2002) 606-613）。重篤な敗血症のときには、特定のプロテアーゼのネットワークにより、凝固因子、線溶系因子及び補体因子が活性化される。これらのプロテアーゼはまた、組織及び器官の損傷を開始させ、かつ、血漿中の凝固因子及び補体因子の非特異的なタンパク質分解を高める（J. Wite et al., Intensive Care Medicine 8 (1982) 215-222; S. J. Weiss, New England Journal of Medicine 320 (1989) 365-376）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヒト血漿からインターα阻害タンパク質（ＩαＩｐ）を精製するための方法、そして、敗血症、急性炎症性疾患、重篤なショック、敗血症性ショック、リウマチ様関節炎、ガン、ガン転移、感染性疾患及び早期陣痛のようなヒト疾患を治療する、又は、敗血症、急性炎症性疾患、重篤なショック、敗血症性ショック、リウマチ様関節炎、ガン、ガン転移、感染性疾患及び早期陣痛と関連する死亡の危険性を低減させる、ためのそれらの使用、に関連する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの態様によれば、血漿由来のＩαＩｐの組成物（ここに於いて、ＩαＩ及びＰαＩが生理学的割合で混合物に存在する）を製造するための方法は、ＩαＩ及びＰαＩ（ここに於いて、ＩαＩ及びＰαＩが生理学的割合で存在する）を含有する血漿分画物を血漿から単離すること；及び、血漿分画物を精製して、ＩαＩｐの純度が約８５％〜約１００％の範囲にあるＩαＩｐ組成物を得ること、を含む。
【０００８】
別の態様によれば、ＩαＩｐの組成物は、インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレα阻害タンパク質（ＰαＩ）の混合物を含み、ここに於いて、ＩαＩ及びＰαＩが純度約８５％〜約１００％の範囲にある生理学的割合で前記混合物に存在する。
関連した態様では、ＩαＩｐの組成物は、インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレα阻害タンパク質（ＰαＩ）の混合物を含み、ここに於いて、ＩαＩ及びＰαＩが生理学的割合で前記混合物に存在し、かつ、トリプシン阻害の高い比活性を有している。
別の関連した態様では、ＩαＩｐの組成物は、１時間を超える半減期を有するＩαＩ及びＰαＩを含む。
さらに別の関連した態様では、ＩαＩｐの組成物は、ＩαＩ及びＰαＩを含み、ここに於いて、ＩαＩ及びＰαＩが、３つの重鎖（Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）のうちの少なくとも１つと会合したインターα阻害タンパク質の軽鎖から構成される。
【０００９】
別の関連した態様では、ＩαＩｐの組成物は、インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレα阻害タンパク質（ＰαＩ）の混合物を含み、ここに於いて、ＩαＩ及びＰαＩが、生理学的割合で混合物に存在し、４つの重鎖（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４）のうちの少なくとも１つと会合したインターα阻害タンパク質の軽鎖を含む。
なおさらに別の関連した態様では、ＩαＩｐの組成物は、ＩαＩ及びＰαＩが生理学的割合で存在するところの、ＩαＩ及びＰαＩを含有する血漿分画物を血漿から単離すること；及び、血漿分画物を精製して、ＩαＩｐの純度が約８５％〜約１００％の範囲にあるＩαＩｐ組成物を得ること、を含む方法に従って作製される。
【００１０】
別の態様では、本発明による医薬組成物は、治療に有効な、本明細書中に記載されるようなＩαＩｐの組成物、及び医薬的に許容される担体を含む。
【００１１】
別の態様は、患者における炎症関連疾患、ガン又は感染性疾患を、治療する方法に関連し、この場合、この方法は、下記に記載される方法のいずれかによって製造されるＩαＩｐの治療有効量を投与することを含む。
【００１２】
別の関連した態様では、患者を治療する方法は、ＩαＩ、ＰαＩ、ＩαＩｐ、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１、Ｈ２及びＬＣのうちの１つ又はそれ以上の処置前レベルを決定すること；及び、治療有効量のＩαＩｐを患者に投与すること、を含む。
関連した態様では、ＩαＩｐによる治療に対する応答を予測するための方法が記載される。この方法は、患者から得られたサンプルをアッセイして、ＩαＩ、ＰαＩ、ＩαＩｐ、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１、Ｈ２及びＬＣのうちの１つ又はそれ以上のレベルを検出することを含み、この場合、検出されたレベルにより、ＩαＩｐによる治療に対する好ましい応答をもたらし得る患者が特定される。
【００１３】
別の関連した態様では、ＩαＩｐ療法により治療されている患者の進行をモニターする方法が記載され、この方法は、ＩαＩ、ＰαＩ、ＩαＩｐ、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１、Ｈ２及びＬＣのうちの１つ又はそれ以上の処置前レベルを決定すること；治療有効量のＩαＩｐを患者に投与すること；及び、ＩαＩｐによる初期処置の後で、患者におけるレベルの１つ又はそれ以上のレベルを決定すること、ここに於いて、ＩαＩｐによる次の治療で患者のレベルが増大することが、患者がＩαＩｐによる治療に対して好ましい臨床的応答を有しそうであることを示すこと、を含む。
【００１４】
別の態様では、ＩαＩｐによる治療のためのキットが記載され、このキットは、ＩαＩ、ＰαＩ、ＩαＩｐ、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１、Ｈ２及びＬＣのうちの１つ又はそれ以上と、治療に使用するための説明書とを含む。
関連した態様では、ＩαＩｐを含む容器、及びＩαＩｐを患者に投与するための指示を伴うラベル又は包装添付文書を含む組成物が記載される。
さらなる関連した態様では、上記に記載されるような組成物、及び治療に使用するための説明書を含むキットが記載される。
本発明の他の実施形態が下記に開示される。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
ＩαＩｐを血漿から精製するための新規な方法が本明細書中に開示される。さらに、急性炎症性疾患、敗血症、重篤なショック、敗血症性ショック、リウマチ様関節炎、ガン、ガン転移、感染性疾患及び早期陣痛を治療するために患者に投与するための、精製されたＩαＩｐの治療用組成物が、本明細書中に開示される。
【００１６】
以前より公知の精製物は、ウエスタンブロット分析によって８０ｋＤａのバンドとして検出される、第Ｘ因子（ＦＸ）による混入を含有していた。ＦＸはまた、凝固アッセイでも検出された。ＦＸは血栓形成性であると見なされ、また、ヒトに投与されたならば、有害であり得るので、ＦＸの除去は重要である。本明細書中に記載される方法によって、以前のＩαＩｐ組成物のＦＸ混入問題が解決される。
【００１７】
インターα阻害タンパク質（ＩαＩｐ）は、比較的高い濃度（４００〜８００ｍｇ／Ｌ）でヒト血漿において見出される構造的に関連したセリンプロテアーゼ阻害剤のファミリーである。ＩαＩｐは、トリプシン型プロテアーゼの阻害剤として機能する大きい多成分複合体である。他の阻害剤分子とは異なり、このファミリーの阻害剤は、コンドロイチン硫酸鎖によって特徴的に共有結合的に連結されたポリペプチド鎖（軽鎖及び重鎖）の組合せからなる。インターα阻害タンパク質の重鎖（Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）はヒアルロン酸結合タンパク質とも呼ばれている。ヒト血漿において見出される主要な形態は、インターα阻害剤（ＩαＩ）（これは、２つの重鎖（Ｈ１＆Ｈ２）と、１つだけの軽鎖（Ｌ）とからなる）、及びプレα阻害剤（ＰαＩ）（これは、１つの重鎖（Ｈ３）と、１つの軽鎖（Ｌ）とからなる）である。軽鎖（これはビクニン（ｂｉ−ｋｕｎｉｔｚ阻害剤）とも呼ばれており、２つのＫｕｎｉｔｚドメインを有する）は、血漿中のセリンプロテアーゼを広範囲に阻害することが知られている。複合体は、好中球エラスターゼ、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、カテプシンＧ及びアクロシンを含む一連のプロテアーゼの阻害において重要であることが示されている。
【００１８】
ＩαＩ及びＰαＩはまた、Ｈ４（ＩαＩｐタンパク質の別の重鎖）と複合体形成することが見出されている。本発明によるＩαＩｐ組成物のある実施形態は、ＰαＩと、ＩαＩと、又はＰαＩ及びＩαＩの両方との複合体で、Ｈ４を含有する。
【００１９】
何らかの科学的理論による拘束を望まないが、本発明者らは、ＩαＩｐの重鎖が、複合体から遊離した後、ＨＡと結合し、これにより、ＨＡがその受容体（ＣＤ４４）と結合することを妨げていると推測している。ＩαＩｐの重鎖が存在しない場合、ＨＡはＣＤ４４に結合し、前炎症性因子（例えば、ＴＮＦ−α）の分泌を開始させ、炎症を引き起こす。一方で、ＩαＩｐの軽鎖は、複合体から遊離すると、抗プロテアーゼ活性を示す。
【００２０】
「ＩαＩｐ組成物」は、ＩαＩ及びＰαＩを生理学的割合で含むＩαＩｐタンパク質の調製物を示す。生理学的割合は、本明細書中で使用される場合、感染又は病気に罹っていない人又は動物において見出される割合、及び／又はヒト血漿において自然の状態で現れるＩαＩ対ＰαＩの比率を含むことが意図される。生理学的割合は、通常の場合、ＩαＩが約６０％〜約８０％であり、かつ、ＰαＩが約４０％〜約２０％である。生理学的割合は、患者の遺伝的構成における正常な変化に起因して、これらの範囲から変化することができる。
【００２１】
本明細書中で使用される「インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレαタンパク質（ＰαＩ）の混合物」は、ＩαＩ及びＰαＩ複合体の両方を含有する組成物を示す。混合物はまた、ＩαＩｐ複合体を単離するために使用される緩衝剤、塩又は他の成分を含有する場合がある。特定の態様において、ＩαＩ及びＰαＩは、生理学的割合で混合物として存在する。
【００２２】
血漿分画物に存在するＩαＩ及びＰαＩは、約６０，０００〜約２８０，０００ｋＤａの見かけ分子量を有する。分子量はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定することができる。
【００２３】
本明細書中で使用される「半減期」は、投与されたＩαＩｐが投与時に活性である量の半分となる時間を示す。本発明によるＩαＩｐ組成物は、例えば、約１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、７．５時間又は１０時間を超える半減期を有する。好ましい実施形態において、ＩαＩｐ組成物は、約５時間を超える半減期を有する。特に好ましい実施形態において、ＩαＩｐ組成物は約１０時間を超える半減期を有する。例えば、長期間にわたって患者に投与されるためには、より少ない投薬量が要求されるので、より長い半減期が好ましい。
【００２４】
本発明のＩαＩｐ組成物は、トリプシン阻害の高い比活性を有する場合がある。本発明によるＩαＩｐ組成物のトリプシン阻害の比活性は、約１０００〜約２０００ＩＵ／ｍｇで変化できる。好ましくは、トリプシン阻害の比活性は、１２００ＩＵ／ｍｇを超え、さらにより好ましくは、約１５００ＩＵ／ｍｇを超える。トリプシン阻害の比活性は、例えば、Ｌ−ＢＡＰＡを基質として使用するトリプシン阻害アッセイによって測定することができる。「ＨＵ  Bergmeyer編、第５巻、第３版、119 (1984) Verlag Chemie, Weinheim」、「Chromogenic substrate for the assay of trypsin」、「R. Geiger, H. Fritz, Methods of Enzymatic Analysis」を参照されたい。
【００２５】
ＩαＩｐの組成物は、３つの重鎖（Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）のうちの少なくとも１つと会合したインターα阻害タンパク質の軽鎖を含む、インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレαタンパク質（ＰαＩ）の混合物（この場合、ＩαＩ及びＰαＩが生理学的割合で前記混合物に存在する）である場合がある。本発明による組成物はまた、４つの重鎖（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４）のうちの少なくとも１つと会合したインターα阻害タンパク質の軽鎖を有する場合がある。ＩαＩｐ複合体における各タンパク質の例は下記の通りである：ビクニン、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＡＡＢ８４０３１、Ｐ０２７６０；Ｈ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：Ｐ１９８２７、ＮＰ＿００２２０６；Ｈ２、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＮＰ＿００２２０７、Ｐ１９８２３；Ｈ３、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＮＰ＿００２２０８；Ｈ４、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：Ｑ１４６２４、ＮＰ＿００２２０９；これらは各々がその全体において参考として本明細書中に組み込まれる。
【００２６】
本明細書中で使用される「血漿由来の」は、元は血漿から単離又は精製されていることを示す。すなわち、組成物の自然環境は、血漿である。
【００２７】
本明細書中で使用される「血漿分画物」は、元は血漿に由来した、単離工程又は精製工程（例えば、クロマトグラフィー）からの分画物である。本発明による血漿分画物は、例えば、凝固因子ＩＸの精製から得られた副分画物、プロトロンビン(prothrombin)複合体濃縮物の精製からの副分画物、血漿の低温沈降（これは、Ｈｏｆｆｅｒらの「Journal of Chromatography B 669 (1995) 187-196」に記載される）から生じる低温沈降上清、又は、クリオプア(cryo-poor)血漿であり得る。クリオプア血漿は本明細書中では低温沈降上清と交換可能に使用される。クリオプア血漿は、低温沈降から得られる上清である。
【００２８】
本発明による副分画物の一例が、凝固因子ＩＸの精製から得られる分画物である。ＩαＩ／ＰαＩの混合物は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の精製時に生じた副分画物に存在することが示されている。凝固因子ＩＸの精製から得られる副分画物を得る方法が、Ｈｏｆｆｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ６６９（１９９５）、１８７〜１９６）に記載される（これはその全体が参考として本明細書により組み込まれる）。副分画物の他の例には、Ｄ．Ｊｏｓｉｃらの「Thrombosis Research, 100 (2000), 433-441」（これはその全体が参考として本明細書により組み込まれる）に記載されるように、ＦＩＸ精製からの副分画物、又はプロトロンビン複合体濃縮物の精製からの副分画物；及び、血漿の低温沈降から生じる低温沈降上清として単離された副分画物が含まれる。（例えば、好適な低温沈降法が、Ｈｏｆｆｅｒらの「Journal of Chromatography B 669 (1995) 187-196」に記載される）。ＩαＩｐ複合体を血液から精製するために有用である他の血漿分画物には、強アニオン交換分画物及びモノリスクロマトグラフィー分画物が含まれ、これらは下記に実施例において記載される。
血漿分画物は、本発明によれば、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、ネコ又はイヌの供給源から得られる。
【００２９】
本明細書中で使用される用語「得ること」は、本発明を実施する際に使用される物質の１つ又はそれ以上を購入すること、合成すること、単離すること、又は他の方法で取得することを含む。
【００３０】
従って、「血液を得ること」は、本明細書中で使用される場合、血液を、例えば、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、ネコ又はイヌの供給源から取得することを含む。血液は、例えば、血液銀行、病院、ホスピス、民間企業、研究財団又は任意の他の血液供給元から取得及び／又は購入することができる。
【００３１】
「血漿を得ること」は、本明細書中で使用される場合、血漿を、例えば、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、ネコ又はイヌの供給源から取得することを含む。血漿は、例えば、血液銀行、病院、ホスピス、民間企業、研究財団又は任意の他の血液供給元から取得及び／又は購入することができる。一方、血漿はまた、血液が得られると、血液から単離することができる。血漿を単離する好適な方法には、重力及び遠心分離が含まれる。
【００３２】
本明細書中で使用される「凝固因子ＩＸの精製から得られる副分画物を得ること」は、凝固因子ＩＸの精製から得られる副分画物を、例えば、第ＩＸ因子を日常的に精製する企業又は病院から取得及び／又は購入することを含む。
【００３３】
本明細書中で使用される「プロトロンビン複合体濃縮物の精製からの副分画物を得ること」は、そのような副分画物を、例えば、プロトロンビン複合体を精製する企業、研究組織又は病院から取得及び／又は購入することを含む。
【００３４】
本明細書中で使用される「血漿の低温沈降から生じる低温沈降上清を得ること」は、低温沈降上清を、例えば、本発明における使用のために好適な様式で血漿を低温沈降させる病院、研究組織又は企業から取得及び／又は購入することを含む。
【００３５】
「固体支持体」は、捕獲試薬により誘導体化され得るか、又は、そうでない場合には、捕獲試薬に結合させることができる固体物質を示す。例示的な固体支持体には、プロープ、マイクロタイタープレート及びクロマトグラフィー樹脂が含まれる。
【００３６】
「吸着」は、吸着試薬又は捕獲試薬に対する分析物の検出可能な非共有結合性の結合を示す。吸着剤表面は、吸着剤（これは「捕獲試薬」又は「親和性試薬」とも呼ばれる）が結合する表面を示す。吸着剤は、分析物（例えば、標的のポリペプチド又は核酸）と結合することができる任意の物質である。
【００３７】
クロマトグラフィー吸着剤は、クロマトグラフィーにおいて一般的に使用される物質を示す。クロマトグラフィー吸着剤には、例えば、イオン交換材、金属キレーター（例えば、ニトリロ酢酸又はイミノ二酢酸）、固定化された金属キレーター、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、染料、単純な生体分子（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、単純な糖及び脂肪酸）、及び混合型モードの吸着剤（例えば、疎水性誘引／静電的反発の吸着剤）が含まれる。
【００３８】
生物特異的吸着剤は、生体分子（例えば、核酸分子（例えば、アプタマー）、ポリペプチド、多糖類、脂質、ステロイド、又はこれらのコンジュゲート体（例えば、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、核酸（例えば、ＤＮＡ）−タンパク質コンジュゲート）を含む吸着剤を示す。特定の場合において、生物特異的吸着剤は、多タンパク質性の複合体、生物学的膜又はウイルスなどの高分子構造体であり得る。生物特異的吸着剤の例としては、抗体、受容体タンパク質及び核酸である。生物特異的吸着剤は、一般的に、クロマトグラフィー吸着剤よりも標的分析物に対してより大きい特異性を有する。
【００３９】
「溶出液」又は「洗浄液」は、吸着剤表面に対する分析物の吸着に影響する又は変化させる、及び／又は非結合物質を表面から除く、ために使用される薬剤、一般的には溶液を示す。溶出液の溶出特性は、例えば、ｐＨ、イオン強度、疎水性、カオトロピズム(chaotropizm)の程度、界面活性剤の強さ、及び温度に依存している。
【００４０】
「分析物」は、検出されることが所望されるサンプルの任意の成分を示す。この用語はサンプル中の１つだけの成分又は多数の成分を示すことができる。
【００４１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書中では同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを示す。これらの用語は、自然に存在するアミノ酸ポリマーと同様に、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、対応する自然に存在するアミノ酸の類似物(analogs)又は模倣物(mimetics)である、アミノ酸ポリマーに対して適用される。ポリペプチドは、例えば、糖タンパク質を形成させるために炭水化物残基を付加することによって、修飾することができる。「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、非糖タンパク質と同様に、糖タンパク質を含む。
【００４２】
「免疫アッセイ」は、抗原（例えば、ＩαＩｐ複合体）と特異的に結合するために、抗体を使用するアッセイである。免疫アッセイは、抗原を単離し、標的化し、及び／又は定量するための特定の抗体の特異的な結合特性の使用によって特徴づけられる。
【００４３】
「抗体」は、エピトープ（例えば、抗原）と特異的に結合し、そして認識する、１つの免疫グロブリン遺伝子又はそれ以上の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にはコードされるポリペプチドリガンド又はそのフラグメントを示す。認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ及びλの軽鎖定常領域遺伝子、α、γ、δ、ε及びμの重鎖定常領域遺伝子、ならびに、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。抗体が、例えば、完全な免疫グロブリンとして、又は、様々なペプチダーゼを用いた消化によって作製される数多くの十分に特徴づけられたフラグメントとして存在する。これには、例えば、Ｆａｂ′フラグメント及びＦ（ａｂ）２フラグメントが含まれる。抗体には、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ならびにヒト化抗体、そして同様に、Ｆａｂ又は他の免疫グロブリン発現ライブラリーの生成物を含むＦａｂフラグメントが含まれる。
【００４４】
抗体に「特異的（又は選択的）に結合する」、又は「との特異的（又は選択的）な免疫反応性を有する」という表現は、タンパク質又はペプチドを示すとき、タンパク質及び他の生物学的物質の不均一な集団におけるタンパク質の存在を決定することができる結合反応を示す。従って、示された免疫アッセイ条件のもとでは、指定された抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍で特定のタンパク質に結合し、かつ、サンプルに存在する他のタンパク質には著しい量で実質的に結合しない。そのような条件のもとでの抗体に対する特異的な結合では、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体が要求される場合がある。例えば、特定の種（例えば、ラット、マウス又はヒトなど）からのＩαＩｐ複合体に対して惹起されたポリクローナル抗体を、ＩαＩｐ複合体との特異的な免疫反応性を有し、かつ、ＩαＩｐ複合体の多型の変異体及び対立遺伝子体を除いて、他のタンパク質との特異的な免疫反応性を有しない、そのようなポリクローナル抗体のみを得るために選択することができる。この選択は、他の種に由来するＩαＩｐ複合体分子と交差反応する抗体を除くことによって達成することができる。様々な免疫アッセイ形式を、特定のタンパク質との特異的な免疫反応性を有する抗体を選択するために使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが、タンパク質との特異的な免疫反応性を有する抗体を選択するために日常的に使用される（例えば、特異的な免疫反応性を決定するために使用することができる免疫アッセイ形式及び条件の記載については、「Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual(1988)」を参照のこと）。一般的に、特異的又は選択的な反応は、バックグラウンドのシグナル又はノイズの少なくとも２倍であり、より一般的には、バックグラウンドよりも１０倍から１００倍大きい。
【００４５】
本明細書中で使用される「機能的に等価」は、本明細書中に記載されるＩαＩｐタンパク質と実質的に類似するインビボ又はインビトロ活性（例えば、敗血症における軽減を達成すること）を示すことができる任意のタンパク質を示す。
【００４６】
ＩαＩｐ生成物の構造及び純度は、例えば、当業者には公知のＨＰＬＣ又は他のクロマトグラフィー方法によって確認することができる。
【００４７】
本明細書中で使用される「ＩαＩｐ複合体」は、欠失、挿入、付加及び置換を含有するタンパク質を含めて、ＩαＩｐタンパク質の自然に存在する生物学的に活性な変異体のすべてを含むことが意図される。ＩαＩｐタンパク質の「自然の変異体」は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が変化している配列を有する、血漿から得られるペプチドとして定義される。変異体は、置換されたアミノ酸が類似する構造的性質又は化学的性質を有する「保存的」変化（例えば、イソロイシンによるロイシンの置換）を有することができる。他の実施形態では、変異体は「非保存的」変化（例えば、トリプトファンによるグリシンの置換）を有することができる。類似する変化にはまた、アミノ酸の欠失又は挿入、又はその両方が含まれる。どのアミノ酸残基が、そして、どのくらいの数のアミノ酸残基が、生物学的又は免疫学的活性を損なうことなく、置換、挿入又は欠失されるかを決定する指針は、当分野で周知のコンピュータープログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトエウエア）を使用して見出すことができる。
【００４８】
「欠失」は、１つ又はそれ以上のアミノ酸又はヌクレオチド残基がそれぞれ存在しない、アミノ酸又はヌクレオチド配列のいずれかにおける変化として定義される。
【００４９】
「挿入」又は「付加」は、自然に存在するＩαＩｐ複合体と比較して、１つ又はそれ以上のアミノ酸又はヌクレオチド残基の付加がそれぞれ生じている、アミノ酸又はヌクレオチド配列におけるそのような変化である。
【００５０】
「置換」は、１つ又はそれ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを、異なるアミノ酸又はヌクレオチドによってそれぞれ置換することから生じる。
【００５１】
「生物学的に活性な」という用語は、自然に存在するＩαＩｐ複合体の構造的な、調節の又は生化学的な機能を有することを示す。同様に、「免疫学的に活性な」は、適切な動物又は細胞において特異的な免疫応答を誘導し、かつ、特異的な抗体と結合する、自然の、組換えの又は合成のＩαＩｐ複合体あるいはそれらの任意のオリゴペプチドの能力を定義する。
【００５２】
本明細書中で使用される「誘導体」という用語は、ＩαＩｐ複合体をコードする核酸、又は、コードされたＩαＩｐ複合体の化学的修飾を示す。そのような修飾の例示には、アルキル、アシル又はアミノ基による水素の置換がある。核酸誘導体は、自然のＩαＩｐ複合体の本質的な生物学的特性を保持するポリペプチドをコードする。
【００５３】
本明細書中で使用される「精製すること」は、望ましくない又は混入しているタンパク質、又はある成分をＩαＩｐから除いて、精製されたＩαＩｐ複合体を作製する工程又はプロセスを示す。例えば、ＩαＩ及びＰαＩを生理学的割合で含有する血漿分画物を、ＩαＩｐ組成物を精製するために、一連のクロマトグラフィー工程によって処理することができる。
【００５４】
本明細書中で使用される「単離すること」は、ＩαＩ及びＰαＩを生理学的割合で含有する血漿から、血漿分画物を作製することを示す。例えば、血漿分画物を単離することは、血漿をクロマトグラフィー処理することによって本発明に従って達成することができる。単離されることは、その元の環境（例えば、自然に存在するならば、自然の環境）から取り除かれた物質を示しており、その自然の状態から「人の手によって」変化させられている。例えば、単離されたポリペプチド又はタンパク質は血漿の成分であるか、あるいは、細胞内に含有されるが、そのような血漿又は特定の細胞はそのポリペプチドの元の環境ではないと考えられるので、「単離された」と見なすことができる。
【００５５】
クロマトグラフィー処理するとは、本明細書中で使用される場合、アニオン交換クロマトグラフィーを含んでもよい。アニオン交換クロマトグラフィーは、粒子に基づいてもよい（例えば、ＤＥＡＥセファロース(Sepharose)、ＤＥＡＥセファデックス(Sephadex)Ａ５０、トヨパール(Toyopearl)ＤＥＡＥ、ＴＭＡＥフラクトゲル(Fractogel)、ＤＥＡＥフラクトゲル又はＱセファロース）。アニオン交換クロマトグラフィーはまた、モノリシック支持体によるものであり得る（例えば、固定化されたアニオン交換リガンドを有するＣＩＭ、例えば、ＤＥＡＥ−ＣＩＭ又はＱ−ＣＩＭなど）。セファロースは、高分子をゲルろ過により分離するための高分子量物質用の、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州）の商品名である。アニオン交換カラムは、マトリックス及びリガンドの２つの成分を有する。マトリックスは、例えば、セルロース、デキストラン、アガロース又はポリスチレンであり得る。リガンドは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又は第四級アンモニウム官能基であり得る。アニオン交換カラムの強さは、リガンドのイオン化状態を示す。強アニオン交換カラム（例えば、第四級アンモニウムリガンドを有するアニオン交換カラム）は、永続的な正電荷を広いｐＨ範囲にわたって有する。弱アニオン交換カラム（例えば、ＤＥＡＥ及びＰＥＩなど）では、正電荷の存在がカラムのｐＨに依存する。強アニオン交換カラム（例えば、ＱセファロースＦＦ）又は金属キレート化セファロース（例えば、Ｃｕ２＋キレート化セファロース）が好ましい。アニオン交換カラムには、一般に、α−グルコシダーゼのｐＩを超えるｐＨで、低塩緩衝液が負荷される。
【００５６】
本発明のＩαＩｐ組成物は、好ましくは、純度が約８５％〜約１００％である。本明細書中で使用される「純粋即ち純度が１００％（pure）」という用語は、その自然の環境から取り出され、単離され、又は分離され、そして、ＩαＩｐが自然の状態で会合する他の成分と、少なくとも約８５％〜約１００％会合していない（好ましくは９０％、より好ましくは９５％会合していない）ＩαＩｐ組成物を示す。好ましい実施形態において、実質的に精製されたタンパク質は、組成物に於いて８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９９％、又はさらにより多くのタンパク質から構成される。
【００５７】
「均一に精製されている」ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質とは、本発明に適用される場合、これらのペプチド、ポリペプチド又はタンパク質が、実質的に他のタンパク質及び生物学的成分を含まないレベルの純度を有している、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質であることを意味する。任意の好適な材料及び方法を、血漿の単離工程を行い、精製されたＩαＩｐを得るために使用することができる。
【００５８】
一般的に、ＩαＩｐの調製では、サンプルの単離、及び目的とするタンパク質を含有することが明らかにされた分割物の回収を伴う。単離方法には、例えば、固相抽出、クロマトグラフィー、例えば、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、系列抽出(sequential extraction)、ゲル電気泳動及び液体クロマトグラフィーが含まれる。調製ではまた、精製することを含むことができ、これには、複数のクロマトグラフィー工程（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、連続抽出、ゲル電気泳動及び液体クロマトグラフィー）を含むことができる。
【００５９】
本発明の１つの実施形態では、サンプルをアニオン交換クロマトグラフィーによって２回精製することができる。アニオン交換クロマトグラフィーは、サンプル中のタンパク質を、大雑把に言って、その電荷特性に従って精製することを可能にする。例えば、Ｑアニオン交換樹脂を使用することができ（例えば、Q HyperD F, Biosepra）、また、サンプルを、異なるｐＨを有する溶出液を用いて連続して溶出することができる。アニオン交換クロマトグラフィーは、他のタイプの生体分子からより負側に荷電しているサンプル中の生体分子の分離を可能にする。高いｐＨを有する溶出液を用いて溶出されるタンパク質は、弱く負に荷電していることが考えられ、低いｐＨを有する溶出液を用いて溶出される画分は、強く負に荷電していることが考えられる。従って、サンプルの複雑性を減少させることに加えて、アニオン交換クロマトグラフィーでは、タンパク質がその結合特性に従って分離される。
【００６０】
さらに別の実施形態では、サンプルをヘパリンクロマトグラフィーによってさらに精製することができる。ヘパリンクロマトグラフィーは、ヘパリンとの親和性相互作用及び電荷特性にも基づいて、サンプル中のＩαＩｐ複合体のさらなる精製を可能にする。ヘパリン（硫酸化ムコ多糖類）は、正荷電成分を有するＩαＩｐ複合体と結合する、従って、サンプルを、異なるｐＨ又は塩濃度を有する溶出液を用いて、連続して溶出することができる。低いｐＨを有する溶出液を用いて溶出されたＩαＩｐ複合体は、弱く正に荷電している可能性がより高い。高いｐＨを有する溶出液を用いて溶出されたＩαＩｐ複合体は、強く正に荷電している可能性がより高い。従って、ヘパリンクロマトグラフィーはまた、サンプルの複雑性を低下させ、かつ、ＩαＩｐ複合体をその結合特性に従って分離する。
【００６１】
ＩαＩｐ複合体は、支持体（例えば、任意のバイオチップ、マルチウエルマイクロタイタープレート、樹脂、又はタンパク質の存在に対して続いてプローブされるニトロセルロース膜のようなもの）に固定化された捕獲試薬を用いて捕獲することができる。具体的には、本発明のＩαＩｐ複合体を、表面増強レーザー脱着／イオン化（ＳＥＬＤＩ）タンパク質バイオチップ上で捕獲することができる。捕獲は、クロマトグラフィー表面又は生物特異的表面において可能である。反応性の表面を有するＳＥＬＤＩタンパク質バイオチップはどれも、本発明のＩαＩｐ複合体を捕獲及び検出するために使用することができる。これらのバイオチップは、ＩαＩｐ複合体を特異的に捕獲する抗体を用いて誘導体化することができ、又は、免疫グロブリンと結合するプロテインＡ又はプロテインＧのような捕獲試薬を用いて誘導体化することができる。その場合、ＩαＩｐ複合体は、特異的な抗体を使用して溶液中で捕獲することができ、捕獲されたＩαＩｐ複合体を、捕獲試薬によってチップ上で単離することができる。
【００６２】
タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの精製度を定量するための様々な方法が、本発明の開示を考慮して当業者には理解される。これらには、例えば、分画物の特異的なタンパク質活性を測定すること、又はゲル電気泳動によって分画物内の多数のポリペプチドを評価すること、が含まれる。
【００６３】
本明細書中下記において詳しく記載されるそのような技術に加えて、タンパク質精製に於いて使用される好適な様々な他の技術が、当業者に周知されている。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ及び抗体などを用いた、又は熱変性による沈殿化、それに続く遠心分離；例えば、イオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、レクチンアフィニティ、免疫アフィニティ等のクロマトグラフィー及び他のアフィニティクロマトグラフィーの工程のようなクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動法；ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ；並びに、そのような及び他の技術の組合せが含まれる。その上、望ましいと考えられるならば、追加の精製工程を、当分野で標準的である方法を用いることができる。これらの方法は十分に、タンパク質の高い純度の調製物をもたらすことができる。
【００６４】
他の実施形態では、ゲルクロマトグラフィー、又は分子篩クロマトグラフィーを使用することができる。ゲルクロマトグラフィーは、分子サイズに基づいた、特別な型の分配クロマトグラフィーである。このゲルクロマトグラフィーの基礎となる理論は、小さい細孔を含有する不活性な物質の非常に小さい粒子を用いて調製されるカラム中で、分子が細孔の中又は細孔の近くを通過する際に、そのサイズに依存して、より大きな分子がより小さい分子から分離されることである。作製される物質の粒子が、その分子を吸着しない限り、流速を決定する唯一の因子はサイズである。従って、分子は、形状が比較的一定である限り、サイズが小さくなっていく順に、カラムから溶出される。ゲルクロマトグラフィーは、ｐＨ、イオン強度、温度等のような他の全ての要因に依存せず、分子の異なるサイズで分離することでは最高のものである。事実上吸着がなく、帯域の広がりがほとんどなく、従って、溶出体積は単純に分子量に関連づけられる。
【００６５】
他の実施形態では、アフィニティクロマトグラフィーを使用することができる。アフィニティクロマトグラフィーは、単離される物質と、その物質が特異的に結合することができる分子との特異的な親和性に基づいたクロマトグラフィー手法である。これは、例えば、受容体−リガンド型の相互作用である。カラム材は、結合パートナーの一方を不溶性マトリックスに共有結合的にカップリングすることによって合成することができる。その場合、カラム材はその物質を溶液から特異的に吸着することができる。溶出は、例えば、結合が生じない条件に変化させること（例えば、ｐＨ、イオン強度及び温度を変化させること）によって生じる。
【００６６】
本明細書中に記載される方法は、大規模な製造を許容でき、また、治療的投与のために好適な形態で、ＩαＩｐ複合体及びＨ４をはじめとするタンパク質をもたらす。
本明細書中に記載される単離工程又は精製工程はいずれも、所望されるならば、より高い純度を得るために繰り返すことができる。クロマトグラフィー工程は回分式又はカラム形式であり得る。
【００６７】
本発明の血漿由来のＩαＩｐ組成物を製造するための好ましいプロセスでは、ＩαＩ及びＰαＩを含有し、かつ、ＩαＩ及びＰαＩが生理学的割合で存在する、血漿分画物を血漿から単離すること；及びこの血漿分画物を精製して、純度が約８５％〜約１００％であるＩαＩｐ組成物を得ること、が含まれる。
本発明によるプロセスではまた、例えば、ヘパリンアフィニティカラムに通し、素通り（非結合）画分を集めることによって血漿分画物をさらに精製することを含むことができる。
【００６８】
本発明を実施することにおいて有用なプロセスではまた、精製及び単離工程の前及び／又は後において、血漿分画物及び／又は精製されたＩαＩｐのウイルス不活性化を含むことができる。典型的なプロセスでは、溶媒／界面活性剤処理又は熱不活性化によるウイルス不活性化が含まれる。本発明の組成物の熱的活性化又は低温殺菌は、例えば、約５５℃〜約６５℃の温度で、又は７０℃〜１２０℃における乾熱であってもよい。
【００６９】
溶媒・界面活性剤処理の場合、溶媒及び界面活性剤の特定の組合せ（例えば、１％のＴｗｅｅｎ−８０と組み合わせられた０．３％のトリ−ｎ−ブチルリン酸（ＴｎＢＰ）、２４℃にて６時間）が、包膜ウイルス(enveloped viruses)を不活性化するために効果的である（Horowitzら  (1985)、 Transfusion 25, 516-522）。あるいは、安定化剤の存在下、５５〜６５℃での分画物又は精製されたＩαＩｐの低温殺菌は、存在する何らかのウイルスを不活性化するために十分である。
【００７０】
精製又は単離工程の間において、安定化剤を加えることができる。ＩαＩｐの最終的な組成物もまた安定化剤を含有する場合がある。例えば、適した安定化剤には、アルブミン、ポリエチレングリコール、α，α−トレハロース、アミノ酸、塩、グリセロール、及びリシン、ポリリジン、アルギニン、ε−アミノカプロン酸及びトラネキサム酸のようなω−アミノ酸、スクロースのような糖、又はそれらの組合せが含まれる。
【００７１】
本発明のＩαＩｐタンパク質及び組成物は、ヒト疾患を治療するために使用することができる。そのような疾患には、例えば、急性炎症性疾患、敗血症、重篤なショック、敗血症性ショック、リウマチ様関節炎、ガン、ガン転移、早期陣痛及び感染性疾患が含まれる。疾患を治療するために使用されるＩαＩｐ組成物は、ＩαＩ及びＰαＩを含有し、かつ、ＩαＩ及びＰαＩが生理学的割合で存在する血漿分画物を血漿から単離すること；及び、この血漿分画物を精製して、ＩαＩｐの純度が約８５％〜約１００％の範囲にあるＩαＩｐ組成物を得ること、によって作製することができる。
【００７２】
本発明はまた、ＩαＩｐの医薬組成物を含む。ＩαＩｐの医薬組成物は、医薬的に許容され得る担体と共に、本明細書中に記載されるＩαＩｐ組成物のいずれかの治療有効量を有するものである。
例えば、本発明による医薬組成物は、インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレαタンパク質（ＰαＩ）の混合物であり、この混合物にＩαＩ及びＰαＩが生理学的割合で存在し、かつ、純度が約８５％〜約１００％の範囲にあるところの、治療有効量のＩαＩｐ組成物であり得る。医薬組成物はまた、インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレαタンパク質（ＰαＩ）の混合物であり、この混合物にＩαＩ及びＰαＩが生理学的割合で存在し、かつ、３つの重鎖（Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）のうちの少なくとも１つと、又はＨ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４のうちの少なくとも１つと会合したインターα阻害タンパク質の軽鎖を含むところの、治療有効量のＩαＩｐ組成物であり得る。医薬組成物はまた、インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレαタンパク質（ＰαＩ）の混合物であり、この混合物にＩαＩ及びＰαＩが生理学的割合で存在し、かつ、トリプシン阻害の高い比活性を有するところの、治療有効量のＩαＩｐ組成物であり得る。医薬組成物はまた、インターα阻害タンパク質（ＩαＩ）及びプレαタンパク質（ＰαＩ）の混合物であり、この混合物にＩαＩ及びＰαＩが生理学的割合で存在し、かつ、１時間、５時間又は１０時間よりも大きい半減期を有するところの、治療有効量のＩαＩｐ組成物であり得る。
【００７３】
「医薬的に許容され得る担体又は補助剤」という用語は、本発明の組成物と一緒に患者に投与することができる担体又は補助剤で、組成物の治療有効量を送達するために十分な用量で投与されたとき、その薬理学的活性を無効にせず、かつ非毒性である担体又は補助剤を示す。
【００７４】
本発明の医薬組成物において使用され得る医薬的に許容され得る担体、補助剤又は媒体には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸塩のような自己乳化性薬物送達システム（ＳＥＤＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ又は他の類似するポリマー送達マトリックスのような薬学的投薬形態物において使用される界面活性剤、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸塩のような緩衝剤物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩など）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリラート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンのブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂が含まれるが、これらに限定されるものではない。α−、β−及びγ−シクロデキストリンのようなシクロデキストリン、又は、２−及び３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含むヒドロキシアルキルシクロデキストリンのような化学修飾された誘導体、又は他の可溶化された誘導体もまた、本明細書中に記載される組成物の送達を高めるために、都合よく使用することができる。
【００７５】
本発明の医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸に、鼻腔に、口内に、膣に、又は埋め込まれたリザーバーを介して投与することができ、好ましくは、経口投与又は注射による投与によって投与することができる。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、任意の従来型の非毒性の医薬的に許容される担体、補助剤又は媒体を含有することができる。場合により、配合物のｐＨを、配合された組成物又はその送達形態物の安定性を高めるために、医薬的に許容され得る酸、塩基又は緩衝剤を用いて調節することができる。本明細書中で使用される用語の非経口的とは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、クモ膜下、病巣内及び頭蓋内の注射技術又は注入技術を含む。適した投与方法は、錠剤、カプセルとして、又は、静脈内注射によってであり、注射可能な投与形態物が特に好まれる。
【００７７】
医薬組成物は、例えば、無菌の注射可能な水性又は油性懸濁物として、無菌の注射可能な調製物の形態であり得る。このような懸濁物は、適した分散化剤又は湿潤化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０のような）及び懸濁化剤を使用して、当技術分野で公知の技術に従って配合することができる。無菌の注射可能な調製物はまた、例えば、１，３−ブタンジオールにおける溶液のような、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤又は溶媒に於いて、無菌の注射可能な溶液又は懸濁物であり得る。許容される媒体及び溶媒には、マンニトール、水、リンゲル液及び等張性の塩化ナトリウム溶液が含まれる。加えて、無菌の固定油が、溶媒又は懸濁化媒体として従来から用いられている。この目的のために、任意の無刺激性の固定油を用いることができ、これには、合成されたモノ−又はジ−グリセリドが含まれる。オレイン酸のような脂肪酸及びそのグリセリド誘導体は、自然の医薬的に許容され得るオリーブ油又はひまし油のようなオイル、特にそのポリオキシエチル化体において、注射物の調製において有用である。これらのオイル溶液又はオイル懸濁物はまた、医薬的に許容されるエマルション及び懸濁物のような投薬形態物の配合において、一般に使用される長鎖アルコールの希釈剤又は分散剤、あるいは、カルボキシメチルセルロース又は類似する分散化剤を含有することができる。医薬的に許容され得る固体、液体又は他の投薬形態物の製造において一般に使用される、Ｔｗｅｅｎ又はＳｐａｎのような他の一般的に使用されている界面活性剤、及び／又は他の類似する乳化剤又は生物学的利用能の増強剤もまた、製剤の目的のために使用することができる。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、カプセル、錠剤、エマルション及び水性の懸濁物、分散物、及び溶液（これらに限定されないが）を含む、任意の経口的に許容され得る投薬形態物で経口投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、一般に使用される担体には、ラクトース及びコーンスターチが含まれる。ステアリン酸マグネシウムのような滑剤もまた、一般的に加えられる。カプセル形態での経口投与のために、有用な希釈剤には、ラクトース及び乾燥されたコーンスターチが含まれる。水性の懸濁物及び／又はエマルションが経口投与されるとき、有効成分は、乳化剤及び／又は懸濁化剤との組合せで油相に懸濁又は溶解することができる。所望されるならば、ある種の甘味剤及び／又は香味料及び／又は着色剤を加えることができる。
【００７９】
本発明の医薬組成物はまた、直腸投与のための坐薬の形態で投与することができる。このような組成物は、本発明の組成物を、室温で固体であるが、直腸温度では液体であり、従って、直腸で融解して、有効成分を放出する好適な非刺激性の賦形剤と混合することによって調製することができる。そのような物質には、カカオバター、密ろう及びポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
本発明の医薬組成物の局所投与は、所望される治療が局所的適用によって容易に近づける区域又は器官に関係するときに有用である。皮膚に対する局所的な適用のために、医薬組成物は、担体に懸濁又は溶解されている有効成分を含有する適した軟膏を用いて配合されるであろう。本発明の組成物の局所投与のための担体には、鉱物油、鉱油、白色鉱油、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン組成物、乳状ワックス及び水が含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは、医薬組成物は、適した乳化剤とともに担体に懸濁又は溶解されている有効成分を含有する、適したローション又はクリームを用いて配合することができる。適した担体には、鉱油、ソルビタンモノステアラート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物はまた、直腸坐薬配合物によって、又は適した浣腸配合物において下部腸管に局所適用することができる。局所的経皮パッチもまた本発明に含まれる。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、鼻腔エアロゾル又は吸入によって投与することができる。そのような組成物は、製薬配合の分野で周知の技術に従って調製され、また、ベンジルアルコール又は他の適した保存剤、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は当技術分野で公知の他の可溶化剤もしくは分散化剤を用いて、生理的食塩水における溶液として調製することができる。
【００８２】
患者における炎症関連疾患、例えば、リウマチ様関節炎、敗血症及び敗血症性ショック、頭部外傷／障害及び髄膜炎、炎症性腸疾患（クローン病）、慢性閉塞性肺疾患、鼻炎など；ガン、早期陣痛、又は感染性疾患を本発明に従って治療する方法では、本発明の方法に従って作製されるＩαＩｐ組成物の治療有効量を投与することを含むことができる。
【００８３】
本明細書における組成物は、約１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投薬量で、好ましくは、１回の服用あたり５００ｍｇ〜１０００ｍｇの投薬量で、４時間〜１２０時間毎に投与され、又は、特定の薬物の要求に従って投与される。本明細書における方法では、所望される効果又は明言された効果を達成するために組成物の有効量を投与することが意図される。一般には、本発明の医薬組成物は、１日あたり約１回〜約６回で投与されるか、あるいは連続注入として投与される。そのような投与は長期治療又は救急治療として使用することができる。単回投薬形態物を作製するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される宿主及び特定の投与様式に依存して変化する。一般的な調製物は、約５％〜約９５％（ｗ／ｗ）の有効な組成物を含有する。あるいは、そのような調製物は、約２０％〜約８０％の有効な組成物を含有する。
【００８４】
上記で示された用量よりも低い又は大きい用量が好都合である場合がある。任意の特定の患者のための具体的な投薬量及び治療様式は、用いられる具体的な組成物の活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、排出速度、薬物の組合せ、疾患の重篤度及び経過、病状及び症状、疾患・病状・症状に対する患者の素因、並びに治療医師の判断を含む、様々な要因に依存する。
【００８５】
病状が改善したとき、本発明の組成物又は併用物の維持用量を、必要ならば、投与することができる。その後、投薬量又は投与頻度、あるいは、その両方を、症状が所望のレベルに軽減されて、治療を終えるときには、改善された病状が保持されるレベルに、症状の関数として下げることができる。しかしながら、患者は、疾患症状が再発した場合には、長期間に基づく間断的な治療を必要とする。病状の改善はまた、肝臓におけるＩαＩｐのレベルに基づいて判断することができる。ＩαＩｐの正常な生理学的レベルが肝臓において見出され、また、患者又は治療医師によって患者症状が改善されていると判断されるならば、患者は維持用量により治療することができる。
【００８６】
本発明の組成物が、ＩαＩｐ組成物及び１つ又はそれ以上の追加の治療剤又は予防剤との組合せを含むとき、組成物及び追加の薬剤はともに、単独治療様式において通常的に投与される投薬量の約１％〜１００％、より好ましくは約５％〜９５％の投薬量レベルで存在すべきであろう。追加の薬剤は、多回服薬療法の一部として、本発明の組成物とは別々に投与することができる。あるいは、そのような薬剤は、単一投薬形態物の一部として、又は本発明の組成物と一緒に混合されて一組成物であってもよい。
【００８７】
急性炎症性疾患、敗血症、重篤なショック、敗血症性ショック、リウマチ様関節炎、ガン、ガン転移、感染性疾患及び／又は早期陣痛について患者を治療するための方法では、ＩαＩ、ＰαＩ、ＩαＩｐ、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１、Ｈ２及びＬＣのうちの１つ又はそれ以上の、処置前レベルを決定する工程；及び治療有効量のＩαＩｐを患者に投与する工程が含まれる。ＩαＩ、ＰαＩ、ＩαＩｐ、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１、Ｈ２及びＬＣの処置前レベルは、ＩαＩｐ又はＩαＩｐ複合体タンパク質のいずれかの最初の投与の前での患者における、そのようなタンパク質のレベルである。処置後レベルは、ＩαＩｐの投与後において測定されたＩαＩｐのレベルである。本発明の方法は、ＩαＩｐによる初期処置の後で、ＩαＩ、ＰαＩ、ＩαＩｐ、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１、Ｈ２及びＬＣのうちの１つ又はそれ以上の処置後レベルを決定することを含む。ＩαＩｐのレベルにおける変化は、その治療が好ましい臨床的応答を生じさせていることの目安である。初期処置期間は、ＩαＩｐの血漿中濃度が定常状態を達成するために必要とされる時間である。
【００８８】
ＩαＩ、ＰαＩ、ＩαＩｐ、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１、Ｈ２及び／又はＬＣのレベルは、例えば、免疫学的方法によって決定することができる。例えば、ＩαＩｐ複合体を、例えば、気相イオン分光測定法、光学的方法、電気化学的方法、原子間力顕微鏡、高周波法、表面プラズモン共鳴、偏光解析法の免疫学的方法及び原子間力顕微鏡法をはじめとする様々な検出方法によって検出及び／又は測定することができる。
【００８９】
別の実施形態では、免疫アッセイを、サンプル中のＩαＩｐ複合体を検出及び分析するために使用することができる。この方法は、（ａ）ＩαＩｐ複合体に特異的に結合する抗体を提供すること；（ｂ）サンプルを抗体と接触させること；及び（ｃ）サンプル中のＩαＩｐ複合体に結合した抗体の複合体の存在を検出すること、を含む。本発明の方法において使用される適した抗体には、ＭＡｂ６９．３１、ＭＡｂ６９．２６、抗ＩαＩｐポリクローナル抗体（Ｒ１６又はＲ２０）、及び抗ビクニンモノクローナル抗体又は抗ビクニンポリクローナル抗体が含まれる。
【００９０】
免疫アッセイは、抗原（例えば、ＩαＩｐ複合体）と特異的に結合するために抗体を使用するアッセイである。免疫アッセイは、抗原を単離し、標的化し、及び／又は定量するために、特定の抗体の特異的な結合特性を使用することによって特徴づけられる。抗体に「特異的（又は選択的）に結合する」、又は、「との特異的（又は選択的）な免疫反応性を有する」の表現は、タンパク質又はペプチドを示すとき、タンパク質及び他の生物学的物質の不均一な集団におけるタンパク質の存在を決定することができる結合反応を示す。従って、示された免疫アッセイ条件のもとでは、指定された抗体はバックグラウンドの少なくとも２倍で特定のタンパク質に結合し、かつ、サンプルに存在する他のタンパク質には著しい量で実質的に結合しない。そのような条件下での抗体に対する特異的な結合では、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体が要求されることがある。例えば、ラット、マウス又はヒトのような特定の種からのＩαＩｐ複合体に対して惹起されたポリクローナル抗体を、ＩαＩｐ複合体との特異的な免疫反応性を有し、かつ、ＩαＩｐ複合体の多型の変異体及び対立遺伝子体を除いて、他のタンパク質との特異的な免疫反応性を有しない、そのようなポリクローナル抗体のみを得るために選択することができる。この選択は、他の種に由来するＩαＩｐ複合体分子と交差反応する抗体を除くことによって達成することができる。
【００９１】
ＩαＩｐを用いた治療のために適した患者は、炎症、外傷／傷害、腫瘍侵入、腫瘍転移、敗血症、敗血症性ショック又は感染性疾患を有するとして特定することができる。そのような患者は自身によって確認されるるか、あるいは、炎症、腫瘍侵入、腫瘍転移、敗血症、敗血症性ショック又は感染性疾患を有するとして医者によって診断される。患者は、霊長類、ヒト又は他の動物であり得る。
【００９２】
方法ではまた、他の治療剤の同時投与が含まれる。例えば、追加の治療剤は、抗ガン剤、抗炎症剤、抗凝固剤又は免疫調節剤であり得る。例えば、ジデオキシヌクレオシドとして、例えば、ジドブジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）及び２’，３’−ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、ラミブジン（３ＴＣ）、スタブジン（ｄ４Ｔ）、並びにＴＲＩＺＩＶＩＲ（アバカビル＋ジドブジン＋ラミブジン）；非ヌクレオシド、例えば、エファビレンツ（ＤＭＰ−２６６、DuPont Pharmaceuticals/ Bristol Myers Squibb）、ネビラピン（Boehringer Ingeleheim）及びデラビリジン（Pharmacia-Upjohn）；Ｒｏ３−３３３５及びＲｏ２４−７４２９のようなＴＡＴ拮抗薬；プロテアーゼ阻害剤、例えば、インジナビル（Merck）、リトナビル（Abbott）、サキナビル（Hoffmann LaRoche）、ネルフィナビル（Agouron Pharmaceuticals）、１４１Ｗ９４（Glaxo-Wellcome）、アタザナビル（Bristol Myers Squibb）、アンプレナビル（GlaxoSmithKline）、ホスアンプレナビル（GlaxoSmithKline）、チプラナビル（Boehringer Ingeleheim）、ＫＡＬＥＴＲＡ（ロピナビル＋リトナビル、Ａｂｂｏｔｔ）及び９−（２−ヒドロキシエトキシメチル）グアニン（アシクロビル）のような他の薬剤；インターフェロン（例えば、α−インターフェロン）、インターロイキンＩＩ及びホスホノホルマート（Foscarnet）、あるいは、進入阻害剤（例えば、Ｔ２０（エンフビルチド、Roche/ Trimeris）又はＵＫ−４２７，８５７（Pfizer））、レバミソール又はチモシン、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、パクリタキセル、フルロウラシル、カペシタビン、ゲムシタビン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、マイトマイシン、ゲフィチニブ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、アセトアミノフェン、ミソニダゾール、アミホスチン、タムスロシン、フェナゾピリジン、オンダンセトロン、グラニセトロン、アロセトロン、パロノセトロン、プロメタジン、プロクロルペラジン、トリメトベンズアミド、アプレピタント、アトロピンとのジフェノキシラート、及び／又はロペラミドである。抗トロンビンＩＩＩのような抗凝固剤、活性化プロテインＣ、及びフューリン阻害剤のようなプロテアーゼ阻害剤など。
【００９３】
方法はまた、患者から得られたサンプルをアッセイして、ＩαＩ、ＰαＩ、ＩαＩｐ、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１、Ｈ２及びＬＣのうちの１つ又はそれ以上のレベルを検出することによって、ＩαＩｐによる治療に対する応答を予測することが含まれ、この場合、検出されたレベルにより、ＩαＩｐによる治療に対する好ましい応答をもたらせる患者が特定される。例えば、ＩαＩ及び／又はＰαＩの検出可能なレベルにおける減少は、患者がＩαＩｐの投与から利益を受けることができることを示す。
【００９４】
方法ではまた、ＩαＩ、ＰαＩ、ＩαＩｐ、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１、Ｈ２及びＬＣのうちの１つ又はそれ以上の処置前レベルを決定すること；治療有効量のＩαＩｐを患者に投与すること；及び、ＩαＩｐによる初期処置の後の患者におけるレベルの１つ又はそれ以上のレベルを決定すること、によってＩαＩｐ療法により治療されている患者の進行をモニターすることが含まれ、ここに於いて、ＩαＩｐによる治療の後での患者におけるレベルの増大は、患者がＩαＩｐによる治療に対する好ましい臨床的応答を有しそうであることを示す。
【００９５】
ＩαＩｐによる治療のためのキットは、ＩαＩ、ＰαＩ、ＩαＩｐ、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１、Ｈ２及びＬＣの１つ又はそれ以上と、治療に使用するための説明書とを含むことができる。キットは、本明細書中に記載されるＩαＩｐ組成物と、使用のための説明書とを有することもまた意図される。例えば、キットは、ＩαＩ及びＰαＩと、投薬量、投与形態及び貯蔵条件に関する情報を提供する説明書とを有することができる。
ＩαＩｐを含む容器、及びＩαＩｐを患者に投与するための指示を伴うラベル又は包装添付文書もまた意図される。説明書は、投薬量、投与形態及び貯蔵条件のための指示を提供することができる。
【００９６】
（実施例）
本発明は、以下に記載される実施例に限定されると解釈されるものではなく、むしろ、本明細書中に提供される如何なる適用、及び当業者の技術に含まれるすべての均等な変形をも含むものと解釈されたい。
【実施例１】
【００９７】
（ＩαＩｐ複合体の一部としてのＨ４の特長づけ）
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法による分析では、重鎖４（Ｈ４）もまた１２５ｋＤａのバンド（ＰαＩ）及び２５０ｋＤａのバンド（ＩαＩ）の両方に存在することが示された（データは示されず）。２５０ｋＤａのバンドにおけるＨ４の存在が、より顕著である。このことは、ＩαＩ（Ｈ１＋Ｈ２＋ＬＣ）及びＰαＩ（Ｈ３＋ＬＣ）とは異なる別の複合体タンパク質が本発明のいくつかの組成物では存在し得ることを示唆している。これまでのところ、Ｈ４は複合体化形態では記載されていない。遊離状態のＨ４は１２５ｋＤａ又は２５０ｋＤａよりも小さい。質量分析法の結果により、本発明者らは、Ｈ４がビクニン（軽鎖）又は他の何かとの複合体で存在しているのではないかと考える。
【実施例２】
【００９８】
（敗血症の動物モデル）
オスのスプラーグドーリー(Sprague-Dawley)ラット（２７５ｇ〜３２５ｇ）を温度制御の部屋において１２時間の明暗周期で飼育し、ラットには標準的なＰｕｒｉｎａラット規定食を与えた。敗血症を誘導する前に、ラットを水を自由に摂取させる以外は一晩絶食させた。ラットをイソフルラン吸入により麻酔し、腹側頸部、腹部及び鼠径部の毛を剃り、その部分を１０％のポビドンヨウ素により洗浄した。２ｃｍの中線腹部切開を行った。盲腸を露出させ、腸閉塞を避けるために回盲弁の丁度末端で結紮し、１８ゲージのニードルにより２回穿刺し、少量の糞便が穴から流れることを可能にするようにわずかに圧迫し、その後、腹腔に戻した。その後、腹部切開を層状に閉じた。偽手術の動物（すなわち、対照動物）は、同じ手順を受けたが、盲腸の結紮又は穿刺のいずれも行われなかった。動物を、手術後直ちに皮下への３ｍｌ／１００ｇＢＷの規定食塩水により蘇生させた。その後、動物を、組織サンプルの採取のために、盲腸結紮・穿刺（ＣＬＰ）又は偽手術の後の様々な間隔で麻酔した。すべての実験は、実験動物の使用に関する国立衛生研究所の指針に従って行われた。この計画は、Ｎｏｒｔｈ  Ｓｈｏｒｅ−Ｌｏｎｇ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｊｅｗｉｓｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの施設内動物管理使用委員会によって承認された。
【００９９】
（ヒトＩαＩｐの調製及び投与）
ヒトＩαＩｐ（ＩαＩ及びＰαＩの両方）を、凝固因子ＶＩＩＩをヒト血漿から精製するために設計された手法の副産物として単離した。この手法は低温沈降物のイオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを伴う。約７０％の純度がクロマトグラフィー分離後に達成された。このＩαＩｐ含有調製物は、毒性、血栓形成性又は低血圧に関して副作用をほとんど有していない。敗血症発症後の１、５、１０時間又は１０及び２０時間で、左大腿静脈に、イソフルラン麻酔下、ポリエチレン−５０チューブをカニューレ挿入した。３０ｍｇ／ｋｇＢＷの用量でのヒトＩαＩｐ濃縮物、又は等体積の媒体（規定食塩水、１．５ｍｌ／ラット）を、一定の注入速度で３０分かけて、大腿カテーテルを介して静脈内投与した。ヒトＩαＩｐの投与は、以前の実験では、注入期間中又はその後において平均動脈圧又は心拍数を変化させなかった（データは示されず）。
【０１００】
（肝臓ビクニン遺伝子のＲＮＡ抽出及び測定）
肝臓は、ビクニンの主要な供給源と考えられる。従って、本発明者らは肝臓におけるビクニンのｍＲＮＡ発現を測定した。総ＲＮＡをＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Molecular Research Center, Cincinnati, OH）によって肝臓から抽出した。１００ｍｇの肝臓組織を１．５ｍｌのＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔにおいてホモジナイズし、クロロホルムの添加によって水相及び有機相に分離し、遠心分離した。ＲＮＡをイソプロパノールの添加によって水相から沈殿させ、エタノールにより洗浄した。ペレットを０．１％のＤＥＰＣで処理した脱イオン化蒸留水に溶解した。ＲＮＡの濃度及び純度を、２６０及び２８０ｎｍにおいて吸光度を測定することによって決定した。各組織に由来する５μｇのＲＮＡを、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのｄＮＴＰ、２０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤、２．５ｍＭのオリゴｄ（Ｔ）１６プライマー、及び５０Ｕの逆転写酵素を含有する２０μｌの反応体積に逆転写した。逆転写反応液を４２℃にて１時間インキュベーションし、その後９５℃で５分間加熱した。１μｌのｃＤＮＡを、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、及び０．７ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する、２５μｌのＰＣＲ混合物において、ラットのビクニン（６３３ｂｐ）（５’ＴＧＡＣＧＡＡＴＡＴＧＣＣＡＴＴＴＴＣＣ３’、５’ＣＣＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣＴＴＧＣＡＣＴＣＣ３’）（受入番号Ｓ８７５４４）、ラットのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ７（Ｇ３ＰＤＨ）（２４）（９８３ｂｐ）（５’ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣ３’、５’ＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ３’）に対して特異的な、３’及び５’プライマーのそれぞれ０．１５μＭを用いて、増幅した。ＰＣＲをＢｉｏ−Ｒａｄサーマルサイクラーで行った。ＲＴ−ＰＣＲ後、５μｌの反応混合物を、０．２２μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する、１．２％のＴＢＥアガロースゲルで電気泳動した。その後、ゲルを展開させ、バンドの強度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ画像システム（Hercules、CA）を使用してＧ３ＰＤＨによって正規化した。
【０１０１】
（タンパク質の放射性ヨウ素化及びＩαＩｐ半減期の決定）
精製されたＩαＩｐを、１，３，４，６−テトラクロロ−３ａ−６ａ−ジフェニルグリコルリル（ＩＯＤＯ−ＧＥＮヨウ素化試薬；Pierce, Rockford, IL）を使用してＮａ１２５Ｉ（Amersham, Arlington Heights, IL）により放射性ヨウ素化した。取り込まれなかった１２５Ｉを、反応混合物をＥｘｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ＧＦ−５脱塩カラム（Pierce）に加えることによって除いた。放射能をガンマカウンタ（Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ）で測定した。ＣＬＰ又は偽手術の後１２時間で、動物をイソフルリン吸入により麻酔した。鎮静の定常状態をナトリウムペントバルビタール（約３０ｍｇ／ｋｇＢＷ）のその後の静脈内注射により維持した。ポリエチレン−５０カテーテルを右頸静脈及び左大腿動脈に設置し、１２５Ｉ標識のＩαＩｐのボーラス注射（約５００，０００ｃｐｍ／ラット）を、頸静脈カニューレを介して施した。シリンジにおける残留放射能をガンマカウンタにより測定し、その放射能カウントを最初の注射前のカウントから引いて、正味の注射された放射能を求めた。血液サンプルを、循環における１２５Ｉ−ＩαＩｐの半減期（ｔ１／２）を求めるために、注射後直ちに、そしてその後、８時間の間に２時間毎に採取した。各サンプルにおける放射能（ｃｐｍ）をガンマカウンタにより測定した。ｔ１／２を、Ｗｕ  Ｒ、Ｚｈｏｕ  Ｍ、Ｃｕｉ  Ｘら（Ｇｈｒｅｌｉｎクリアランスは多菌性敗血症の後期段階では低下する、Int J Mol Med. 2003, 12: 777-782）に従って計算した。
【０１０２】
（生存の検討）
ＣＬＰを上記のように行った。ＣＬＰ後１、５、１０時間又は１０及び２０時間で、ヒトＩαＩｐ濃縮物（３０ｍｇ／ｋｇＢＷ）又は媒体（規定食塩水、１．５ｍｌ／ラット、ＣＬＰ後１時間にて、又はＣＬＰ後１０時間及び２０時間にて）を静脈内注入した、ＣＬＰ後２０時間にて、壊死した盲腸を切除し、腹腔を４０ｍｌの暖かい滅菌された規定食塩水溶液を使用することによって２回洗浄した。その後、腹部切開を層状に閉じた。ＣＬＰ動物における盲腸切除の手法は、敗血症病巣を可能ならいつでも除去しなければならない臨床的状況を模倣するために行った。その後、動物には食物及び水を自由に取らせ、そして、動物を、生存を記録するために１０日間モニターした。
【０１０３】
（統計学的分析）
結果は平均値±ＳＥとして表される。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びチューキー検定を使用して、異なる実験動物群を比較した。生存率をカプラン・マイヤー法によって推定し、ログランク検定によって比較した。値における違いは、Ｐ＜０．０５ならば、有意であると見なした。
【０１０４】
（ＣＬＰ後のビクニンのｍＲＮＡ発現における変化）
ビクニンはＩαＩｐの活性な部分である。肝臓はビクニンの主要な供給源である。従って、本発明者らは、ＩαＩｐの産生を示すために、肝臓におけるビクニンのｍＲＮＡ発現を選んでいる。図３に示されるように、肝臓におけるビクニンのｍＲＮＡ発現はＣＬＰ後５時間では変化しない、しかしながら、ＣＬＰ後２０時間で３２％の減少が、偽手術の動物と比較して見出された（Ｐ＜０．０５）。
【０１０５】
（ＣＬＰ後の１２５Ｉ−ＩαＩｐの半減期における変化）
ＩαＩｐの半減期を、敗血症発症後１２時間で注射された放射能標識ＩαＩｐの血中レベルの変化を測定することによって評価した。図４に示されるように、１２５Ｉ−ＩαＩｐのｔ１／２が、ＣＬＰ後、５．６±０．３時間〜１１．８±２．７時間に著しく増大した（Ｐ＜０．０５）。
【０１０６】
（生存率に対するＩαＩｐの効果）
ＣＬＰ及び盲腸切除の後における生存率は、（ＣＬＰ後１時間での）１回の媒体投与の場合、２日目で７５％であり、５〜１０日目では５０％に低下した（図５）。しかしながら、ＣＬＰ後１時間でのヒトＩαＩｐの投与は、１０日間の観察期間中を通して、生存率を９２％に改善させた（Ｐ＜０．０５；図５）。ＣＬＰ後５時間又は１０時間でのヒトＩαＩｐの投与は、生存率を６４％及び７３％にそれぞれ改善させたが、これらの改善は統計学的には有意ではなかった（図６）。ＣＬＰ及び盲腸切除の後における生存率は、（ＣＬＰ後１０時間及び２０時間での）２回の媒体投与の場合、２日目で５６％であり、５〜１０日目では４４％に低下した（図７）。これは、１回の媒体投与（図５）と比較して、著しく異なっていなかった。しかしながら、ＣＬＰ後１０時間及び２０時間でのヒトＩαＩｐの投与は、１０日間の観察期間中を通して、生存率を８１％に改善させ、これは、媒体群と比較して、著しく異なっていた（Ｐ＜０．０５；図７）。
【０１０７】
敗血症は、全身炎症、凝固障害、呼吸不全、心筋機能不全、腎不全及び神経認知欠如によって特徴づけられる臨床的症候群である。この症候群は、侵入微生物による内因性の炎症性媒介因子の過度な始動から生じていると一般には推定されている。このような媒介因子には、活性化された単球、マクロファージ、内皮細胞及び好中球によって放出される物質、例えば、サイトカイン、反応性の酸素化学種、及びプロテアーゼなどが含まれる。重篤な炎症性応答では、多形核球の顆粒球を含む様々な血液細胞及び組織細胞が、リソソームプロテイナーゼを細胞外及び循環内に放出する。そのようなプロテアーゼ、並びに食作用（ファゴサイトーシス）中に産生される通常的な細胞内の酸化性因子は、組織及び器官の損傷を開始させ、そして、血漿の凝固因子及び補体因子の非特異的なタンパク質分解を高めることができる。好中球プロテイナーゼ（特に、ヒト白血球エラスターゼ）の放出は、敗血症患者における合併症の進行に関係している。それらの血漿中レベルは、感染により誘導される炎症の重篤度と緊密に相関しており、来るべき臓器不全を大いに予測することができる。
【０１０８】
ヒトにおける敗血症性ショックのときには、プロテアーゼの上昇した活性に加えて、ＩαＩｐの低下した血漿中レベルが報告されている。ＩαＩｐの濃度がひどく低下した患者は、死亡率がより大きい。本発明者らの結果は、肝臓におけるビクニンの遺伝子発現が、ＣＬＰ動物では、偽手術の動物の場合よりも著しく低いことを示している。インターα阻害剤ファミリーにおけるタンパク質に関連づけられたｍＲＮＡの発現を、霊長類、ブタ及び齧歯類において様々な組織で調べた。これらの検討は、ＩαＩｐファミリーのすべてのメンバーの源である遺伝子が主として肝臓において転写されることを示している。本発明者らの結果はまた、他の器官（すなわち、腸及び腎臓）におけるビクニンの遺伝子発現が、偽手術体と比較して、ＣＬＰ後の５時間又は２０時間で著しく変化しなかったことを示している（データは示されず）。
【０１０９】
ＣＬＰ後２０時間で肝臓においてだけ観測された著しいダウンレギュレーションは、この器官がＩαＩｐの重要な供給源であり得ること、及び、その上、敗血症の後期段階では、肝臓におけるビクニン遺伝子の発現が著しく減少することを示唆している。治療的には、ビクニンは、胃切除後の膵炎を防止するため、又は心臓手術後の臓器傷害を弱めるため、の予防的治療としてヒトにおいて有益な効果を有することが報告されている。致死性の大腸菌菌血症の急性イヌモデルにおけるビクニンの効果を調べた検討では、血行力学的変数の改善及び心拍出量及び平均動脈圧の正常化、を伴った類似する結果が示された。ビクニンの血漿中の半減期は非常に短い（約１０分）ので、この薬剤の持続した有益な効果を維持するために、ビクニンの半減期を伸ばすことは重要であると考えられる。本発明者らの結果は、偽手術動物におけるＩαＩｐの半減期が５．６時間であることを示している。放射性標識されたＩαＩｐが敗血症発症後の１２時間で注射されたとき、本発明者らは、ＩαＩｐの半減期が１１．８時間に伸びたことを見出した。これらの結果は、ＩαＩｐのクリアランスが、敗血症期間中に著しく低下したことを示している。しかしながら、クリアランスが低下した場合でさえ、ＩαＩｐの血漿中レベルは敗血症の患者では著しくより低いままである。本発明者らの以前の検討は、敗血症発症後の早期（すなわち、ＣＬＰ後１時間）での低純度のＩαＩｐの投与は、心拍出量及び全身酸素送達を維持し、かつ、全身酸素消費及び全身酸素除去率を増大させたことを示している。その上、ＩαＩｐは、ＣＬＰ後２０時間で、ＴＮＦαの産生をダウンレギュレーションし、かつ、肝細胞の傷害及び乳酸アシドーシスを弱めた。加えて、敗血症発症後１時間でのＩαＩｐの投与は敗血症動物において生存を改善した。
【０１１０】
ヒトＩαＩｐタンパク質を工業的規模の血漿分画の副産物として単離した。この単離方法は、主要な血漿形態のビクニン含有タンパク質（ＩαＩ及びＰαＩ）を高度に、かつ同時に濃縮する。従って、この調製では、血漿ＩαＩｐの生理学的組成物が得られる。死亡について実施された検討の結果は、ＣＬＰ後１時間でのＩαＩｐの投与により、生存率がＣＬＰ及び盲腸切除の後の１０日間で５０％〜９２％に改善されたことを示している。ＣＬＰ後５時間又は１０時間でのヒトＩαＩｐの投与は、生存率を６４％及び７３％にそれぞれ改善したが、これらの改善は統計学的には有意ではなかった。
【０１１１】
しかしながら、ＣＬＰ後１０時間又は２０時間でのヒトＩαＩｐの投与は、生存率を４４％〜８１％に著しく改善させた。従って、ＩαＩｐは、多菌性の敗血症の進行時における生存を改善するための有用な補助剤である。まとめると、肝臓におけるビクニンの遺伝子発現は敗血症時に減少し、ＩαＩｐの半減期が５．６±０．３時間〜１１．８±２．７時間に増大した。このことは、低下したクリアランスにもかかわらず、敗血症におけるビクニンのダウンレギュレーションを示唆している。ＣＬＰ後１時間でのＩαＩｐの投与は、生存率を５０％〜９２％に改善し、これに対して、ＩαＩｐがＣＬＰ後５時間又は１０時間で投与されたときには、著しい改善が認められなかった。しかしながら、ＣＬＰ後１０時間及び２０時間でのＩαＩｐの２回の注入は、生存率を４４％〜８１％に増大させた。ヒトＩαＩｐの遅延した、しかし、繰り返された投与は、ＣＬＰ後の生存を改善している。
【実施例３】
【０１１２】
（ＩαＩｐの精製）
ＤＥＡＥセファデックスＡ５０を用いた固相抽出の後の、透析又は限外ろ過／透析ろ過された溶出物を加えた後、弱く結合した成分が、０．２８Ｍの塩化ナトリウムを含有する０．００５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．００５５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラムから溶出させる（これは、Ｈｏｆｆｅｒら（Journal of Chromatography B 669 (1995) 187-196）に記載される）。前の工程において、カラムを、０．２０Ｍの塩化ナトリウムを含有する０．００５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．００５５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）により洗浄した。
０．００５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対する透析又は限外ろ過／透析ろ過（ＵＦ／ＤＦ）の後、溶出液をヒドロキシルアパタイトカラムに加えた。ＩαＩｐタンパク質はカラムに結合せず、ＩαＩｐタンパク質を素通り画分として集めた。混入しているタンパク質（主に、ＦＩＩ、ＦＶＩＩ及びＦＸ）を、リン酸ナトリウム緩衝液の増大する濃度によるグラジエントを使用して溶出させることができる。ＩαＩ／ＰαＩ分画物は、９０％を超える標的タンパク質（主に、ＩαＩ及びＰαＩ）を含有する。
【実施例４】
【０１１３】
（第ＩＸ因子の素通り画分からのＩαＩｐの精製）
ヘパリンセファロースアフィニティクロマトグラフィー（Ｌ．Ｈｏｆｆｅｒらの「J. of Chromatography B」）からの非結合タンパク質を、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦアニオン交換カラムに加える。カラムを少なくとも３カラム体積の０．００５Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）により洗浄した後、ＩαＩ／ＰαＩ含有画分を、０．５５Ｍの塩化ナトリウムを含有する０．００５Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）（溶出緩衝液）により溶出した。溶出液は約３０〜４０％のＩαＩ／ＰαＩを含有する。０．００５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対する透析又は限外ろ過／透析ろ過（ＵＦ／ＤＦ）の後、ＤＥＡＥセファロースＦＦからの溶出液をヒドロキシルアパタイトカラムに加えた。ＩαＩ／ＰαＩはカラムに結合せず、ＩαＩ／ＰαＩを素通り画分として集める。混入しているタンパク質（主に、ＦＩＩ及びＦＸ）を、リン酸ナトリウム緩衝液の増大する濃度によるグラジエントを使用して溶出させることができる。精製されたＩαＩ／ＰαＩ画分は、９０％を超える標的タンパク質を含有する。
【実施例５】
【０１１４】
ＤＥＡＥ−セファデックスＡ５０（L. Hoffer et al., J. of Chromatography B）又はＱ−セファデックスＡ５０（D. Josic et al., Thrombosis Research、上記参照）でのクリオプア血漿の固相抽出からの溶出液を、８０ｍＬのカラム体積を有するＤＥＡＥ−ＣＩＭチューブモノリスに加えた（K. Branovic et al., J of Chromatography A, 903 (2000) 21-32 を参照のこと）。非結合画分（素通り）を集めた。続いて、カラムを３カラム体積の０．０２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）（平衡緩衝液）により洗浄した。結合したタンパク質を、０．３５Ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含有する０．０２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いた最初の工程で溶出し（溶出液１）、そして、０．５５Ｍの塩化ナトリウムを含有する０．０２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いた第２の工程で溶出した（溶出液２）。ＩαＩ／ＰαＩが素通り画分及び溶出液１に見出される。素通り画分は約３５〜４５％のＩαＩ／ＰαＩを含有する。溶出液１におけるこれらの標的タンパク質の量は、２０〜３０％である。ＩαＩ／ＰαＩを含有する分画物を、０．００５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）に対する透析又は限外ろ過／透析ろ過（ＵＦ／ＤＦ）に供し、そして、ヒドロキシルアパタイトカラムに加えた。ＩαＩｐはカラムに結合せず、ＩαＩｐを素通り画分として集める。素通り画分は９０％を超えるＩαＩ／ＰαＩを含有する。
図８ａ及び図８ｂは、実施例３〜５によって表されるように、ＩαＩｐの例示的な精製スキームを流れ図で記述する。
【実施例６】
【０１１５】
（動物検討における高度に精製されたＩαＩｐの有益な効果）
多菌性の敗血症を、オスのスプラーグドーリーラットにおいて盲腸の結紮・穿刺（ＣＬＰ）によって誘導した。動物を、ＣＬＰを行う前に水を自由に摂取させる以外は一晩絶食させた。実験のとき、ラットをメチルフルラン吸入によって麻酔し、２ｃｍの腹部中線切開を行った。盲腸を露出させ、腸閉塞を避けるために回盲弁の丁度末端で結紮し、１８ゲージのニードルにより２回穿刺し、少量の糞便が押し出されるように穏やかに圧迫し、その後、腹腔に戻した。腹部切開を層状に閉じ、動物に３０ｍＬ／ｋｇ体重の規定食塩水溶液を蘇生液としてＣＬＰ後直ちに皮下に与えた。２群のラット（ｎ＝１２／群）をこの実験に使用した。治療群には、高度に精製されたＩαＩｐを、３０ｍｇ／ｋｇ体重で、ＣＬＰ後の１０時間及び２０時間にて与えた。対照群には、生理的食塩水を与えた。ＣＬＰ後２０時間で、壊死した盲腸を切除し、腹腔を、４０ｍｌの暖かい滅菌された規定食塩水溶液を使用することによって２回洗浄した。その後、腹部切開を層状に閉じた。ＣＬＰ動物における盲腸切除の手法は、敗血症病巣が除去される臨床的状況を模倣するために行った。実験動物には食物を自由に取らせ、そして、動物を、非生存体について死亡時間を記録するために１０日間モニターした。対数順位検定(log-rank test)を、異なる動物群の間での死亡率の比較のために用い、ｐ値をカプラン・マイヤー法によって求めた。生存における著しい増大が、生理的食塩水のコントロール群と比較して、治療群で観測された（対照群の４４％に対して、治療群において動物の８１．３％が生存した（ｐ値＝０．０２９３））。このことは、高度に精製されたＩαＩｐが生物学的に活性（有効）であり、かつ、敗血症動物において敗血症関連死を減少させることにおいて効果的であることを示唆している。結果を図９に示す。
【０１１６】
【表１】
2007515397.tif 000002
【０１１７】
高度に精製されたＩαＩｐ（クリオプア血漿由来）の阻害の比活性を計算し、低温沈降物（ｆＶＩＩＩ製造の副分画物）から精製されたＩαＩｐと比較した。ＩαＩｐの生物学的活性を、発色性基質のＬ−ＢＡＰＡ（Ｎ（α）−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロアニリド塩酸塩：Fluka Chemicals）を使用するトリプシン阻害アッセイで測定した。このアッセイは、Ｌ−ＢＡＰＡの加水分解を阻害するＩαＩｐの能力に基づく。阻害を、４１０ｎｍでのΔ吸光度／分の速度における減少によってモニターすることができる。総タンパク質濃度をＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイによって定量測定し、ＩαＩｐ濃度を、Ｌｉｍら（J. of Infectious Diseases (2003)）に記載されるようにＭＡｂ６９．３１を使用する競合的ＥＬＩＳＡによって測定した。クリオプア血漿と低温沈降物から精製されたＩαＩｐ調製物との間には、トリプシン阻害の比活性の著しい違いは、存在しなかった（ｐ値＝０．９３９）。このことは、両方の分画物におけるＩαＩｐは匹敵し得る生物学的活性を有していることを示唆している。
【実施例７】
【０１１８】
（ＦＩＸ精製からの副分画物）
ＤＥＡＥ−セファロースＦＦでの凝固因子ＦＩＸのクロマトグラフィー精製からの「洗浄画分」（Josic et al, Journal of Chromatography、上記にて引用）。この画分は、０．２５Ｍの塩化ナトリウムを含有する０．０１〜０．１Ｍのクエン酸ナトリウム／０．００５〜０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて溶出させることができる。ＩαＩ及びＰαＩがこの画分における主成分である。ＦＩＸ含有画分は、次の工程において、０．３〜０．６Ｍの塩化ナトリウムを含有する０．０１〜０．１Ｍのクエン酸ナトリウム／０．００５〜０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、ＤＥＡＥセファロースＦＦカラムから溶出させることができる。この分画物もまた、残存量のＩαＩｐと一緒に、凝固因子ＩＩ（ＦＩＩ）、凝固因子Ｘ（ＦＸ）、より少ない量の凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）のような他のビタミンＫ依存性凝固因子を含有する。モル浸透圧濃度及び塩濃度を低下させるために透析を行った後、ＦＩＸ画分における残留ＩαＩｐを、固定化ヘパリンでのアフィニティクロマトグラフィー、そして、塩濃度及びモル浸透圧濃度が増大する緩衝液での段階的溶出によって回収することができる。洗浄緩衝液での初期の溶出段階から得られる画分は、８０％を超えるＩαＩｐを含有し、ＦＩＸの混入が非常に低い。後の工程の塩濃度及びモル浸透圧濃度が高い緩衝液では、ＦＩＸの溶出が生じる。ヘパリンに結合しない素通り画分もまた存在し、これはＦＩＸを含まず、ＩαＩｐ（３０〜４０％）、ビタミンＫ依存性凝固因子、及びウイルス不活性化のために使用された溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）の混合物、を含有する。Ｓ／Ｄは、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦの追加のロマトグラフィー工程で除くことができる。
【０１１９】
ＤＥＡＥ−セファロース、固定化ヘパリン、又はヘパリンからの素通りから集められたＩαＩｐ含有画分は、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーによって個々に、又はまとめて精製することができる。いずれかの方法を使用しても、最終的な調製物は９０％を超えるＩＴＩを含有する。
【０１２０】
これらのプロトコルを用いて精製された濃縮物は、９０％を超えるＩαＩ／ＰαＩを含有する。これは溶媒／界面活性剤処理によってウイルス不活性化されている。安定化剤の使用を伴うか、又は伴わないで、３０分を超える最終容器での最終的な加熱、又は安定化剤の存在下で５５〜６５℃にて低温殺菌を、活性の著しい喪失を伴うことなく、第２のウイルス不活性化工程として導入することができる。
【０１２１】
９０％を超えるＩαＩ／ＰαＩを含有する得られた濃縮物は、Ｓ／Ｄ処理を用いてウイルス不活性化すること、又は第２のウイルス不活性化工程として、安定化剤を伴うか、又は伴わないで、３０分間の精製タンパク質の最終的な加熱、又代わりに、安定化剤の存在下で５５℃〜６５℃にて低温殺菌を用いてウイルス不活性化することができる。
【０１２２】
（強アニオン交換の分画物）
弱アニオン交換体ＤＥＡＥセファデックスＡ５０による固相抽出後の溶出液の代わりに、強アニオン交換体ＱセファデックスＡ５０による固相抽出後の溶出液を使用することができる。溶出条件がドイツ国特許ＤＥ４３４２１３２Ｃ１号に記載される。ＩαＩ及びＰαＩの混合物は、このモノリシックアニオン交換支持体ＤＥＡＥ−ＣＩＭに結合しないか、又は弱く結合するだけである。凝固因子のＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸ、凝固阻害剤のＰＣ、ＰＳ及びＰＺ、接着タンパク質のビトロネクチン、並びにプロテアーゼＦＳＡＰのような、他のタンパク質は別個の画分に溶出される。残留する混入物のさらなる分離を、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーを使用して次の工程で達成することができる。
【０１２３】
（モノリスクロマトグラフィーの分画物）
ＤＥＡＥ  ＣＩＭモノリス（膜）を、ＤＥＡＥセファロースＦＦ又は他の粒子型アニオン交換体の代わりに、ＦＩＸ精製におけるクロマトグラフィー分離のために使用することができる（ドイツ国特許ＤＥ４３４２１３２Ｃ１号を参照のこと）。驚くべきことに、ＩαＩ及びＰαＩは、このモノリシック支持体に結合しないか、又は弱く結合しただけであった。ＦＩＸ、ビトロネクチン、並びにＦＩＩ、ＦＶＩＩ（少量）及びＦＸのような、他のタンパク質、が別個の画分として溶出した。第ＶＩＩ因子活性化プロテアーゼ（ＦＳＡＰ）（J. Roemisch, Biological Chemistry, 383 (2002) 1119-1124）に主に由来するタンパク質分解活性もまた、この精製工程で完全に分離された。ＩαＩ／ＰαＩ含有画分からの残留する混入物、すなわち、微量のビタミンＫ依存性凝固因子ＦＩＩ、ＦＶＩＩ及びＦＸのさらなる分離が、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーを使用して次の工程で達成された。
【０１２４】
本願明細書で引用されるすべての刊行物及び特許文書は、個々の刊行物又は特許文書にそれぞれ示されているように、参照してその全てを本明細書に取り込む。別途定義されない限り、本明細書中で使用されているすべての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有する。下記の参考文献は、当業者に、本発明において使用される多くの用語の一般的な定義を提供するものである；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎらの「Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)」；「The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed. 1988)」；Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇの「The Glossary of Genetics, 5th Ed.(1991)」 ；及び、Ｈａｌｅ及びＭａｒｈａｍの「The Harper Collins Dictionary of Bilogy(1991)」。
【０１２５】
（参照による取り込み）
本出願明細書全体を通して引用されるすべての参考文献（文献、発行された特許、公開された特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む）の内容は、参照して特にその全てを本明細書に取り込む。
【０１２６】
（均等物）
当業者であれば、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、又は通常の実験により確認することができるものである。そのような均等物は、上記の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１は、脾臓の組織病理を示す。正常な周囲の白脾髄及びわずかに細胞過多の赤脾髄を有するＩαＩｐで治療された動物（Ｂ）に対する対照動物（Ａ）における赤脾髄細胞エレメントの広範囲にわたる喪失を伴って白脾髄によって囲まれた筆毛動脈（Ｈ＆Ｅ染色、倍率２０倍）。
【図２】図２は、Ｈ４のアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、盲腸結紮・穿刺（ＣＬＰ）又は偽手術（Ｓｈａｍ）後の５時間及び２０時間での肝臓におけるビクニンのｍＲＮＡ発現の変化を示す。データは、平均値±ＳＥ（ｎ＝８／群）として表され、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びチューキー検定によって比較される：＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ。図３Ａは、増幅され、ゲルでサイズにより分離されたｍＲＮＡを示し、図３Ｂは、ビクニンレベルがＧ３ＰＤＨの発現に対して正規化されている結果をグラフにより示す。
【図４】図４は、盲腸結紮・穿刺（ＣＬＰ）又は偽手術（Ｓｈａｍ）後の５時間及び２０時間での１２５Ｉ−ＩαＩのｔ１／２の変化を示す。データは平均値±ＳＥ（ｎ＝５／群）として表され、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びチューキー検定によって比較される。
【図５】図５は、媒体治療を伴う盲腸結紮・穿刺及び盲腸切除（ＣＬＰ＋媒体）の後、並びに、インターα阻害剤治療を伴う盲腸結紮・穿刺（ＣＬＰ＋ＩαＩｐ）後の１０日間での生存率の変化を示す。各群には１２匹の動物が存在した。生存率をカプラン・マイヤー法によって評価し、対数順位検定を使用することによって比較した：＊Ｐ＜０．０５対ＣＬＰ＋媒体。
【図６】図６は、媒体治療を伴う盲腸結紮・穿刺及び盲腸切除（ＣＬＰ＋媒体）の後、並びに、インターα阻害剤治療を伴う盲腸結紮・穿刺（ＣＬＰ＋ＩαＩｐ）後の１０日間での生存率の変化を示す。各群には１１から１２匹の動物が存在した。生存率をカプラン・マイヤー法によって評価し、対数順位検定を使用することによって比較した：＊Ｐ＜０．０５対ＣＬＰ＋媒体。
【図７】図７は、媒体治療を伴う盲腸結紮・穿刺及び盲腸切除（ＣＬＰ＋媒体）の後、ならびに、インターα阻害剤治療を伴う盲腸結紮・穿刺（ＣＬＰ＋ＩαＩｐ）後の１０日間での生存率の変化を示す。各群には１６匹の動物が存在した。生存率をカプラン・マイヤー法によって評価し、対数順位検定を使用することによって比較した：＊Ｐ＜０．０５対ＣＬＰ＋媒体。
【図８ａ】図８ａは、本発明による、ヒト血漿からのＩαＩｐの精製スキームを記載する。
【図８ｂ】図８ｂは、本発明による、ヒト血漿からのＩαＩｐの精製スキームを記載する。
【図９】図９は、動物による敗血症の研究における、高度に精製されたＩαＩｐの有益な効果をグラフにより示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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