(57)【要約】  本発明は、ＳＡＲＳウイルスを含むコロナウイルスの複数アレルＲＴ−リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイに関する。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ，Ｅ，ＭおよびＮ遺伝子中の複数標的配列が同定された。４つの異なった標的の使用は、ウイルスの基礎的な遺伝的浮動が擬陰性の結果に導かないであろう見込みを増幅する。アッセイの多重アッセイ形式が構想される。よって、本発明はＳＡＲＳ感染の早期診断を可能にする。本アッセイは、治療計画のモニタリング、可能性のある抗ＳＡＲＳ剤のスクリーニング、並びに定量的および定性的決定を必要とする類似の応用との関連で有用であろう。
2007503213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）が、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、およびヌクレオキャップシド（Ｎ）からなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子に特異的な検出物質（ｄｅｔｅｃｔａｎｔ）を含んでなる、コロナウイルスのアッセイ。
【請求項２】
コロナウイルスがＳＡＲＳウイルスである、請求項１のアッセイ。
【請求項３】
ＳＡＲＳウイルスがＳＡＲＳ−ＣｏＶである、請求項２のアッセイ。
【請求項４】
アッセイが、分子ビーコンに基づくマルチアレルＲＴリアルタイムＰＣＲアッセイ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｂｅａｃｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉ−ａｌｌｅｌｉｃ  ＲＴ−ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙ）である、請求項１のアッセイ。
【請求項５】
検出物質が分子ビーコンである、請求項４のアッセイ。
【請求項６】
分子ビーコンがミスマッチ寛容分子ビーコンである、請求項５のアッセイ。
【請求項７】
ＰＣＲアッセイである、請求項１のアッセイ。
【請求項８】
４つの異なったウイルス遺伝子のための４つのセットのＰＣＲプライマー、および４つの異なった分子ビーコンがある、請求項７のアッセイ。
【請求項９】
各分子ビーコンが同じ蛍光体で標識されている、請求項８のアッセイ。
【請求項１０】
各分子ビーコンが異なったＳＡＲＳ−ＣｏＶ遺伝子に特異的である、請求項８のアッセイ。
【請求項１１】
改善が、逆転写可能でありそしてプライマーセットの１つにより増幅可能である、試料に添加される外因性ＲＮＡ標準物質をさらに含んでなる、請求項７のアッセイ。
【請求項１２】
改善が、外因ＲＮＡ標準物質に特異的である異なった蛍光体で標識された第五分子ビーコンの内包物をさらに含んでなる、請求項１１のアッセイ。
【請求項１３】
改善が、臨床試料からＲＮＡの単離をさらに含んでなる、請求項１のアッセイ。
【請求項１４】
試料が、血液、組織、唾液、または鼻咽頭吸引試料を含む、請求項１３のアッセイ。
【請求項１５】
改善が、逆転写、ＰＣＲ増幅、および各熱サイクルのアニール期の間、各色の蛍光強度を測定する分光蛍光熱サイクラー中での、同時自動アンプリコン検出をさらに含む、請求項１または１２のアッセイ。
【請求項１６】
改善が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶを独自に同定する４つの標的配列の選択および検出をさらに含んでなる、請求項１のアッセイ。
【請求項１７】
改善が、各遺伝子の検出物質と共に、特定のアンプリコン、プライマーおよびＩＰＣ標準物質を含むことをさらに含んでなる、請求項１のアッセイ。
【請求項１８】
プライマー、アンプリコンおよび検出物質が、各遺伝子について図３，７，１１および１５に示される式を有するもの、並びに図１７に示されたものから選択されたＩＰＣ標準物質を含む、請求項１７のアッセイ。
【請求項１９】
プライマー、アンプリコンおよび検出物質が、各遺伝子について図４，８，１２および１６に示される式を有するもの、並びに図１８に示されたものから選択されたＩＰＣ標準物質を含む、請求項１７のアッセイ。
【請求項２０】
改善が、ＰＣＲ多重形式をさらに含んでなる、請求項１のアッセイ。
【請求項２１】
請求項１−２０のいずれか１つのアッセイを実行するための、キット。
【請求項２２】
試薬が、個々の容器に中に含有される、請求項２１のキット。
【請求項２３】
試薬が、単一試料のアッセイを実行するために十分な量である、請求項２２のキット。
【請求項２４】
キットが、取扱説明書を含む、請求項２１のキット。
【請求項２５】
以下の試薬群のうち１つまたはそれより多くを含んでなる、試薬組成物
【化１】
2007503213.tif 000019
【化２】
2007503213.tif 000020
【化３】
2007503213.tif 000021
【請求項２６】
請求項２５の試薬組成物を含有する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、ＳＡＲＳウイルスの検出および／または定量化のための方法、並びに該方法に使用するための試薬および該試薬を含有する試験キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）は、最も近々に出現した感染疾患の１つである。ＳＡＲＳの原因は、新しいコロナウイルス、即ちコロナヴィリディー（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリー内のウイルスとして同定されており、サルの接種を含むコッホ仮説による原因の評価が続いて［３］、世界保健機関により「ＳＡＲＳコロナウイルス」（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）として指定された［１，２］。コロナウイルスは、長さでおよそ３０ｋｂのゲノムを有する、エンベロープを有する正の一本鎖ＲＮＡウイルスであり、ＲＮＡウイルスのなかで最も大きく、ＤＮＡ中間体を介することなく宿主細胞の細胞質中で複製する。コロナウイルスは、ヒトにおける風邪の原因となり、そして動物における呼吸器官の疾患、腸の疾患、および神経系の疾患、並びに肝炎の原因となることが報告されている。ヒトコロナウイルスは、通常はインビトロで培養することが困難であるが、一方多くの動物のコロナウイルスおよびＳＡＲＳ−ＣｏＶは、Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞中で容易に培養可能である［４］。３群のコロナウイルスがある：群１および２は、哺乳動物のウイルスを包含し、一方、群３は、鳥類のウイルスを包含する。各群内で、コロナウイルスは、宿主域、抗原性関係、およびゲノム構成により、異なった種に分類される。ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）は、以前に群１（ＨＣｏＶ−２２９Ｅ）および群２（ＨＣｏＶ−ＯＣ４３）に属すると報告され、そして穏やかな呼吸器官の疾病に関与する。
【０００３】
最近、２つの独立のグループ（１つ目は、カナダのＢｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｃｙ（ＢＣＣＡ）［５］（Ｔｏｒ２単離株）、および他は、米国のＣｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣＰ）［６］（Ｕｒｂａｎｉ単離株））が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの全長ゲノム配列を最初に得た。ゲノム配列に基づく系統発生解析により、両単離株は、２つの以前に単離された非病原性のヒトコロナウイルス株である、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３およびＨＣｏＶ−２２９Ｅを含む、以前に特性付けられたコロナウイルス（群）と、遠い関係にあることが明らかとなった。Ｔｏｒ２  ＣｏＶ単離株のゲノムは、２９，７５１ヌクレオチド長であり、そしてＵｒｂａｎｉ  ＣｏＶ単離株のゲノムは、２９，７２７ヌクレオチド長であり、それらの配列は２４ヌクレオチド位置のみで異なっている。両単離株のゲノム構成は、以下の典型的な遺伝子順序を有するコロナウイルスの特性を示す：５’レプリカーゼ（ｒｅｐ）、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）およびヌクレオキャップシド（Ｎ）。およそ２０，０００ヌクレオチド長であるＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ｒｅｐ遺伝子は、タンパク質分解過程を受け、いくつかの非構造タンパク質を生じる、２つのポリタンパク質（ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂ）をコードすると予測される。ｒｅｐの下流には４つの遺伝子があり、それは構造タンパク質Ｓ，Ｅ，ＭおよびＮをコードする。
【０００４】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶのゲノムは、他のコロナウイルス単離株から区別され、そして生物学的重要性となりうる、いくつかの異なったゲノム特性を有する。群２のコロナウイルス（およびいくつかの群３のコロナウイルスにおいて）において、ＯＲＦ１ａとＳの間に存在する赤血球凝血素エステラーゼをコードする遺伝子がなく、そしてＳタンパク質の短いアンカーもない。さらに、Ｓタンパク質の短いアンカー、特定の数および位置の小さいＯＲＦ、並びにたった１つのコピーＰＬＰＰＲＯの存在が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ単離株の以前に記載されたコロナウイルスからの容易に区別する、遺伝的特徴の組み合わせを提供する［５，６］。ＳＡＲＳ−ＣｏＶの検出のために、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ（ＲＴ−ＰＣＲアッセイ）を記載するいくつかの文献がある。
【０００５】
Ｐｅｒｒｉｓら［２］は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染した患者から得られた鼻咽頭吸引試料から、ウイルスを同定するＲＴ−ＰＣＲアッセイを開発した。臨床試料からの全ＲＮＡを、ランダムヘキサマーの存在下で逆転写し、そして生じたｃＤＮＡを、プライマー５’−ＴＡＣＡＣＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧ−３’および５’−ＣＡＣＧＡＡＣＧＴＧＡＣＧＡＡＴ−３’で増幅する。未知のＲＮＡウイルスの遺伝配列を決定するために、彼らはランダムＲＴ−ＰＣＲアッセイを実行する。ウイルス感染したおよびウイルス感染していないアカゲザル胎児腎臓細胞由来の全ＲＮＡを単離し、プライマー５’−ＧＣＣＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＮＮＮＮＮＮ−３’で逆転写し、そして生じたｃＤＮＡをプライマー５‘−ＧＣＣＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣ−３’で増幅した。
【０００６】
Ｋｓｉａｚｅｋら［１］は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶを同定するために、逆転写およびリアルタイムＰＣＲアッセイを開発した。ＳＡＲＳ関連コロナウイルスの増幅および配列決定のために使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは、コロナウイルスポリメラーゼ遺伝子配列の読み枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）１ｂにおけるアラインメントから設計された。彼らは、コロナウイルス／属で広い反応性を達成するために、読み枠１ｂ（ＯＲＦ１ｂ）の保存された領域とハイブリダイズするために以前に設計された、プライマー対ＩＮ−２（＋）５’−ＧＧＧＴＴＧＧＧＡＣＴＡＴＣＣＴＡＡＧＴＧＴＧＡ−３’およびＩＮ−４（−）５’−ＴＡＡＣＡＣＡＣＡＡＣＩＣＣＡＴＣＡＴＣＡ−３’を使用した。これらのプライマーは、ＳＡＲＳ単離株からＤＮＡを増幅するために使用され、そして得られたアンプリコン配列をＳＡＲＳ特異的プライマーＣｏｒ−ｐ−Ｆ２（＋）５’−ＣＴＡＡＣＡＴＧＣＴＴＡＧＧＡＴＡＡＴＧＧ−３’、Ｃｏｒ−ｐ−Ｆ３（＋）５’−ＧＣＣＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＣ−３’、およびＣｏｒ−ｐ−Ｒ１（−）５’−ＣＡＧＧＴＡＡＧＣＧＴＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣ−３’を設計するために使用し、今度はこれを患者検体を試験するために使用した。Ｄｒｏｓｔｅｎら［４］は、３００ヌクレオチド長ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノム部分を遺伝的に特性付けるために、ＰＣＲに基づくランダム増幅手法を使用した。得られた配列に基づいて、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ＯＲＦ１ｂの特異的検出のために、慣用ＰＣＲアッセイのおよびリアルタイムのＰＣＲアッセイを確立した。Ｐｏｏｎら［７］は、ＲＴ−リアルタイム−ＰＣＲアッセイを開発した。ＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染した個体からの排泄物検体から単離した全ＲＮＡを、ランダムヘキサマーで逆転写し、そして生じたｃＤＮＡを、ウイルスポリメラーゼ遺伝子の領域を認識するプライマーｃｏｒｏ３  ５’−ＴＡＣＡＣＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧ−３’およびｃｏｒｏ４  ５’−ＣＡＣＧＡＡＣＧＴＧＡＣＧＡＡＴ−３’で増幅する。これらの著者が文献において、彼らがアッセイに使用したプライマーが、非病原性ヒトコロナウイルス株ＨＣｏＶ−ＯＣ４３と交差反応しうることを認めたことに留意することは重要である。
【０００７】
ＳＡＲＳ特異的ＰＣＲプライマーおよび診断手法が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶポリメラーゼ遺伝子配列の読み枠１ｂ（ＯＲＦ１ｂ）の領域の増幅のために、いくつかの世界保健機関のネットワーク研究所において開発された［８］。これらのプライマーは、異なった時間に疾病の経過に渡って得られた異なった検体で、その相対的能力および感度を決定するために現在評価されている。ＬｉｐｋｉｎとＢｒｉｅｓｅは、多コピーに存在するＳＡＲＳ−ＣｏＶ遺伝子を検出するＰＣＲに基づくＳＡＲＳ診断を開発することを発表したが、印刷物によるさらなる情報は得られていない。
【０００８】
本発明が解決するよう設計された先行技術の課題。現在の分子診断アッセイの有する主要な課題は以下のことである：ａ）Ｔｏｒ２およびＵｒｂａｎｉ単離株から生じた現在のＳＡＲＳ−ＣｏＶ株を含むコロナウイルスの本質的に多様な性質（個体に感染している期間の間、および水平伝播の間のウイルスの突然変異および組換えをする能力）を考慮できないこと；並びに、（ｂ）ヒト集団への遺伝的に同一でないＳＡＲＳ−ＣｏＶ株の継続的および／または複数の導入の可能性を説明できないこと。
【０００９】
ＲＮＡウイルスの特性は、高比率な遺伝子突然変異であり、それは新たなウイルス株の進化に導き、そしてウイルスが免疫システムから逃れるよく確立された機構である。ＳＡＲＳ−ＣｏＶを含むコロナウイルスは、その遺伝材料を複製するときにきわめてずさんであり、それらがコピーする１０，０００ヌクレオチドごとに１つのエラーを生じ、それはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）の複製の間に生じるエラー率とおよそ同じである。コロナウイルスＲＮＡポリメラーゼは、ときどき感染細胞中に存在するウイルスゲノムの多コピー間にジャンプする。したがって、各新たなゲノムは実際にいくつかの鋳型からコピーされ、いずれかの所与の突然変異がウイルス集団中でよく確立されたものになる機会を減じる。さらに、これらのジャンプの１つが正確でない場合、ゲノム全体がスキップをすることが可能であり、重要な遺伝子の一部の欠失を生じる。特に、もし変化が、ウイルスが宿主細胞の表面への結合を可能にするタンパク質スパイクに影響する場合、結果は劇的であり得る。例えば、１９８４年に、新たな呼吸器官の疾病がヨーロッパのブタ牧場に現れた。それは、以前に子ブタの胃に感染したコロナウイルスの欠失突然変異体であることが明らかとなった［９］。それは、ウイルスが異なった細胞型に感染することを可能にする改変したスパイクタンパク質を所持していた。新たな疾患は一般的には致死性ではなかったが、世界中に広がったので、内臓疾患の診断が複雑となった。もう１つの例は、ヒト集団へのＳＡＲＳ−ＣｏＶの最近の導入である。遺伝子の欠失が、ＳＡＲＳウイルスの動物保有宿主からヒトへの移行することの手助けとなったかもしれない可能性がある。中国南部の市場で売られていた動物中に発見されたウイルス株の遺伝子の解析は、これらのＳＡＲＳウイルス株は未知の機能のタンパク質をコードする遺伝子中に２９ヌクレオチドを欠くことを示唆し、そしてこの遺伝子のタンパク質産物は、ウイルスコートタンパク質の内部に結合する。さらに、最近の文献において、シンガポール、トロント、中国および香港のＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染患者由来の１４単離株の全ゲノム配列を比較し、そして１４の突然変異が明らかとなった［１０］。１つの点において、この発見はＳＡＲＳウイルスは突然変異できないことを示唆するとして見ることが可能である；しかし、このウイルスはこれまでのところ、新たなヒト宿主からの抵抗にほとんどあっておらず、そしてしたがって、保持しようとする新たな突然変異を引き起こす選択圧をほとんど有さなかった。ＳＡＲＳ−ＣｏＶはおそらく、これまでそうであったようなものと同じ安定性を残していないであろう。我々の免疫システムは、頻繁にインフルエンザウイルスの生じる変化に類似した変化を強いることが可能である。要するに、ＳＡＲＳ−ＣｏＶを含むコロナウイルスの遺伝的に多様な性質を説明する新たなＳＡＲＳ−ＣｏＶ診断アッセイを慎重に開発することを考慮した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
本発明は、臨床試料中のＳＡＲＳ関連単離株および他のコロナウイルス単離株の検出、並びにそれらの区別のための、分子ビーコンに基づくマルチアレルＲＴリアルタイムＰＣＲアッセイ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｂｅａｃｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉ−ａｌｌｅｌｉｃ  ＲＴ−ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙ）を含む。アッセイ設計の主要な要素は：ａ）ミスマッチ寛容分子ビーコン；ｂ）４つの異なったウイルス遺伝子のための４つのＰＣＲプライマーのセット、および４つの異なった分子ビーコン（それぞれは同じ蛍光体で標識され、そしてそれぞれは異なったＳＡＲＳ−ＣｏＶ遺伝子に特異的である）；ｃ）逆転写され、そしてプライマーセットの１つにより増幅可能である、試料に追加される外因性ＲＮＡ標準物質；並びに、ｄ）外因ＲＮＡ標準物質に特異的な異なった蛍光体で標識される第五分子ビーコンである。該アッセイは、臨床試料（血液、組織、唾液、鼻咽頭吸引試料など）からのＲＮＡの単離、逆転写、ＰＣＲ増幅、および各熱サイクルのアニール期の間、各色の蛍光強度を測定する分光蛍光熱サイクラー中での、同時自動アンプリコン検出をさらに含む。
【００１１】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ，Ｅ，ＭおよびＮ遺伝子（Ｕｒｂａｎｉ株およびＴｏｒ２株）内の複数の標的配列を同定した。Ｓ，ＭおよびＥ遺伝子は、ウイルスの外側に存在する構造遺伝子をコードし、一方Ｎ遺伝子は、ビリオンの内側のウイルスＲＮＡパッケージングに必要な構造遺伝子をコードする。（たった１つの標的配列よりむしろ）ＳＡＲＳ−ＣｏＶを独自に同定する４つの標的配列の選択の根底にある原理は、４つの異なった標的の使用がウイルスの基礎的な遺伝的浮動が擬陰性の結果に導かないであろう見込みを増進することであり、即ち、ライフルでよりもショットガンでの方が移動する標的をヒットする機会が高いということである。したがって、同じアッセイチューブ中の４つの異なった標的アレルを検出することにより、そして単一の蛍光体検出システムを使用することにより、アッセイの設計は、ウイルス配列の連続的なウイルス進化のために、臨床試料におけるＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を見逃す見込みを有意に最小限度にする。さらに、同じアッセイチューブ中で４つの異なった標的配列を同時に検出することにより、アッセイの本質的な感受性が増進される。
【００１２】
他の非病原性のヒトおよび動物のコロナウイルス株からＳＡＲＳ−Ｕｒｂａｎｉ株およびＳＡＲＳ−Ｔｏｒ２株を区別する各ウイルス遺伝子内の最良の標的配列を同定するために、本発明者らは、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている利用可能なコロナウイルス遺伝子配列のＤＮＡアラインメントおよび系統発生学的解析を使用した。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ遺伝子のＤＮＡ配列を、コロナウイルスの公知の３つの群［群１（Ｇ１）：ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ−２２９Ｅ）、ａｆ３０４４６０；ブタ感染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ａｆ３５３５１１；伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、ａｊ２７１９６５；イヌコロナウイルス（ＣＣｏＶ）、ｄ１３０９６；ネココロナウイルス（ＦＣｏＶ）、ａｙ２０４７０４；ブタ呼吸器官コロナウイルス（ＰＲＣｏＶ）、ｚ２４６７５；−群２（Ｇ２）：ウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ）、ａｆ２２０２９５；マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ａｆ２０１９２９；ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ−ＯＣ４３）、ｍ７６３７３；ブタ血球凝集性脳脊椎炎ウイルス（ＨＥＶ）、ａｙ０７８４１７；ラットコロナウイルス（ＲｔＣｏＶ）、ａｆ２０７５５１；および−群３（Ｇ３）：感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ｍ９５１６９］における、それぞれの種を代表する参考ウイルスに由来するものと比較した。配列アラインメントをバイオインフォマティクスの分野で共通して使用される複数配列アラインメントツールである、ＣＬＵＳＴＡＬＷにより実行した。それは、３つの主要な段階（ａ．対アラインメント、ｂ．ガイド樹構築体、および、ｃ．複数アラインメント）を通じて広範囲な複数配列アラインメントを実現する。ＣＬＵＳＴＡＬＷにより作成されたガイド樹は、系統発生樹により示されるものにそっくりの配列間関係の見積もりである。
【００１３】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ遺伝子特異的ＰＣＲプライマーの選択基準は、以下に基づく、ａ）配列アラインメントの検討の結果として、ＳＡＲＳ−ＣｏＶと他のコロナウイルス株間で最も高い遺伝距離を示した、ＳＡＲＳ−ＣｏＶにおけるゲノム領域の同定；ｂ）たとえヌクレオチド置換が存在しても、理論上の融解温度がプライマーの標的へ結合する能力を最大にするプライマー−標的ハイブリッドを形成し（ミスマッチ寛容）、そしてさらに全てのプライマーが、多重アッセイにおいて同じ温度（Ｔｍ  およそ６０℃）でその標的にハイブリダイズ可能である、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ標的を増幅するためのプライマー配列の選択；および、ｃ）４つの標的配列の各々を含有するアンプリコンが、およそ同じ（比較的短い）長さ（およそ１００ヌクレオチド長）であることが可能な、プライマー配列の選択。
【００１４】
分子ビーコンプローブ配列、およびそれらのアーム配列を選択するための基準は以下に基づく：ａ）配列アラインメントの検討の結果として、ＳＡＲＳ−ＣｏＶと他のコロナウイルス株間で最も高い遺伝距離（他のコロナウイルスの配列と比較してＳＡＲＳ−ＣｏＶ配列にギャップまたは欠失を包含するプローブ標的配列に特に重点を置いて）を示した、ＳＡＲＳ−ＣｏＶにおけるおよそ３０ヌクレオチド長領域（生成しようとするアンプリコン内）の同定；ｂ）たとえヌクレオチド置換が存在しても、理論上の融解温度がプローブの標的配列へ結合する能力を最大にするプローブ−標的ハイブリッドを形成し（ミスマッチ寛容）、そしてさらに全てのプローブが、多重アッセイにおいて同じ温度（Ｔｍ  およそ６３℃）でその標的にハイブリダイズ可能である、プローブ配列の選択；および、ｃ）全ての分子ビーコンプローブの基幹（ｓｔｅｍ）ハイブリッドの同程度の安定性を提供するアーム配列の選択（およそ７０℃の基幹Ｔｍ）。
【００１５】
本明細書に記載されるアッセイは、異種のまたは同種の形式のいずれかで実行可能である。アッセイの実行に必要な試薬は、キット形式において供給されうる。キットは、２つまたはそれより多くのコロナウイルス遺伝子Ｓ，Ｅ，ＭおよびＮを測定するために必要な検出物質を含有する。キットは、内部標準物質ＩＰＣもまた含有することが推薦される。検出物質を含む試薬は、個々の容器に別個にパッケージすることが可能である。キットは、所与の試料のアッセイを実行するための反応チューブを含む基質もまた含有してもよい。キットは、ＰＣＲを含む増幅反応を実行するための、そしてコロナウイルスを遊離しそして／または精製するために必要な試薬を含む試料の前処理のための、さらなる試薬もまた含有してよい。
【００１６】
同じ試料、単一容器中での多くの時間、およびおよそ同じ時間について、２つまたはそれ以上の異なったアッセイを実行する必要がある場合、多重形式が利用可能である。そのような形式は当該技術分野で公知である。多重アッセイは、解析しようとする試料中の１分子以上の存在または濃縮、あるいは単一分子のいくつかの特性を同時に決定するために、典型的には使用される。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の詳細な説明
アッセイの一般的な工程は、以下の工程の実行を包含する：
工程１．  逆転写され、そしてプライマーセットの１つにより増幅可能であるＲＮＡ標準物質を、試料からＲＮＡを単離する前に各試料に添加する。次いで、ＲＮＡを各臨床試料（ＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染したと思われる患者から得られた鼻咽頭吸引物、排泄物試料、または全血）から抽出する。次いで、製造業者の説明書にしたがってＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州ヴァレンシア）を使用してＲＮＡを精製する。
【００１８】
工程２．  次いで、各臨床試料から得られた単離ＲＮＡを、４つの標的特異的プライマー（Ｓ遺伝子、Ｓ−ＲＴ  ５’−ＡＧＧＣＴＧＴＡＡＧＡＡ−３’；Ｅ遺伝子、Ｅ−ＲＴ  ５’−ＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＡＣ−３’；Ｍ遺伝子、Ｍ−ＲＴ  ５’−ＡＡＧＣＡＡＣＧＡＡＧＴＡＧ−３’；Ｎ遺伝子、Ｎ−ＲＴ  ５’−ＧＣＣＴＴＣＴＴＴＧＴＴＡＧ−３’；内部正対照、Ｅ−ＲＴ  ５’−ＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＡＣ−３’）で逆転写する。患者の試料に由来するＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルスＲＮＡの逆転写を、０．１２５μＭの（各）遺伝子特異的プライマーの混合物に２０μＬのウイルスＲＮＡを添加し、そして８０℃で５分間インキュベートして二次構造を変性することにより実行する。次いで、チューブをすぐに少なくとも２分間氷上に置く。逆転写反応物は、４０μＬの最終体積中、ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  （各）ｄＮＴＰ、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、２０ユニットのリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）、および８０ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩリボヌクレアーゼＨ−逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）からなる。次いで、反応物を４２℃で５０分間インキュベートし、続いて７０℃で１５分間不活性化する。
【００１９】
工程３．  ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ増幅を、同一の反応において４つのプライマー対および５つの分子ビーコンを使用して実行し、ここで１つのプライマー対は各ウイルス遺伝子に対する（内部正対照の増幅は、ウイルス遺伝子標的の１つの増幅を可能にするように設計されたプライマー対の１つにより可能である）。各ＰＣＲ反応物は、最終体積５０μＬ中、２０μＬのｃＤＮＡ産物、１ｘＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  （各）ｄＮＴＰ、０．４μＭの各プライマー、および２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からなる。５０サイクルの増幅（９４℃で１５秒間、５３℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間）を、７７００Ｐｒｉｓｍ分光蛍光熱サイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で実行した。定量的な測定のために、ＲＮＡ標準物質の６倍連続希釈（１０６から１０コピー）の重複物を、所与の実験運転について試験される試料とともに定量的対照として使用する。各臨床試料のウイルスＲＮＡコピー数を、対照ＲＮＡ標準物質から得られる標準回帰曲線（臨床試料中に存在するゲノムコピーの数の対数は、観察された限界サイクルに反比例する）上への、試験検体の実験的に決定された限界サイクルを差し挟むことにより計算する。
【００２０】
本発明が先行技術の課題をどのように解決するかの説明。
【００２１】
先行技術の主要な課題は、コロナウイルスの本質的に多様な性質を考慮できず、そしてヒト集団への遺伝的同一でないＳＡＲＳ−ＣｏＶの継続的なおよび／または複数の導入の可能性を説明できないことである。本発明は、標的（Ｓ，Ｅ，Ｍ，およびＮ遺伝子）として複数の遺伝子配列を使用することによりこれらの課題を解決する。ＳＡＲＳ−ＣｏＶを同定するために４つの異なる遺伝子標的を使用する第一の原理は、ウイルスの基礎的な遺伝的浮動を逃れることである。よって、各々が異なって増幅したＳＡＲＳ−ＣｏＶ標的に特異的で、そして各々が同じ色の蛍光体で標識されている４つの分子ビーコンを使用することによって、ウイルスの継続的進化的変化のためにＳＡＲＳ−ＣｏＶを検出できない見込みを最小限にする。さらに、アッセイの設計は、異なった色のシグナルを生成する内部正対照ＲＮＡ、逆転写およびＰＣＲ増幅の存在を含み、よってＲＮＡ単離、逆転写、または標的増幅で予期しない問題があるならば、対照シグナルがないことが問題が生じたことを示唆するであろうことを保証する。
【００２２】
他のＳＡＲＳ核酸アッセイの特徴の概要、およびこれらのアッセイと本発明の差異の記載。前の項目で概説されたように、５つのＳＡＲＳ核酸アッセイがある：Ｐｅｒｒｉｓらにより発表されたＲＴ−ＰＣＲアッセイ［２］、Ｋｓｉａｚｅｋらにより発表されたＲＴリアルタイムＰＣＲアッセイ［１］、Ｄｒｏｓｔｅｎらにより発表された類似のＲＴリアルタイムＰＣＲアッセイ［４］、Ｐｏｏｎらにより発表されたもう１つのＲＴリアルタイムＰＣＲアッセイ［７］、およびＬｉｐｋｉｎおよびＢｒｉｅｓｅにより開発されたＰＣＲに基づくＳＡＲＳ診断アッセイ（本アッセイを記載する文献は利用可能でない）。全ての発表されたアッセイは、臨床試料から抽出されたＲＮＡを使用する。さらに、全ての発表されたアッセイはランダムプライマーでＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡの逆転写を開始し、そして全ての発表されたアッセイはコロナウイルス属で広い反応性を達成するために、読み枠１ｂ（ＯＲＦ１ｂ）の保存された領域の増幅を可能にするように以前に設計されたプライマーでｃＤＮＡを生成する。本発明は、多くの異なった方法においてこれらの発明と異なる。本アッセイは１つの代わりに４つの異なった標的を使用し、そしてウイルス遺伝子のために設計されたプライマーで逆転写しそして増幅可能な、内部正ＲＮＡ対照（人工ＲＮＡ分子）（独自の分子ビーコンによる検出のための独自の標的認識配列を有する）を有する。このＲＮＡ分子は、ＲＮＡ単離、逆転写、およびＰＣＲ増幅について対照として役立つ。本発明は、核酸増幅のためのリアルタイムＰＣＲおよびリアルタイム検出のための分子ビーコンを使用する。本発明は、４つ全てのＳＡＲＳ−ＣｏＶ標的のための黄色シグナル（テトラクロロフルオレセイン）および内部正対照が単離され、逆転写され、そしてＰＣＲ増幅されたことを示唆する緑色シグナル（フルオレセイン）の、二重色検出スキームを採用する。
【００２３】
発表されているアッセイの側面ではない、本発明のもう１つの重要な側面は、その３’末端に組み込まれた遺伝子特異的逆転写配列を含有する４つのウイルスＲＮＡ標的の構築体である。集合的に、これらの分子はＳＡＲＳ特異的正対照として役立つ。全ての本発明の設計は、５つのアンプリコン多重アッセイにおいて共に働くことに、熱力学的に適合可能である。
【００２４】
また、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ｍＰＣＲ）が構想される。それは、２つ以上の異なった配列に同時にＰＣＲを実行するための手法である。ｍＰＣＲ反応は以下を含む：前記抽出されたＤＮＡを処理し一本鎖相補鎖を形成し、複数の標識された対になったオリゴヌクレオチドプライマー、異なった短いタンデムリピート配列に特異的な各対になったプライマー、センス鎖における配列の一部に実質的に相補的な各対の１つのプライマー、および相補的アンチセンス鎖における同じ配列の異なった部分に実質的に相補的な各対の他のプライマーを添加し、複数の対になったプライマーをその相補配列にアニールし、同時に各プライマーの３’末端から前記複数の対になったプライマーを伸長し、各プライマーにアニールした鎖に相補的な伸長産物を合成し、前記伸長産物をその相補鎖からの分離の後、各対の他のプライマーの伸長産物の合成のための鋳型として役立て、前記鋳型から前記伸長産物を分離し、一本鎖分子を生産し、少なくとも１回前記アニール工程、伸長工程および分離工程を繰り返すことによって前記一本鎖分子を増幅する。
【００２５】
核酸配列の変異体を含有する複数の標的配列の捕捉を提供するために、低いストリンジェント条件が日常的に使用される。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を供給する（ｐｏｗｅｒｉｎｇ）、または緩衝液の修飾のいずれかにより減少する。ストリンジェント条件が減少し、そして標的核酸配列が他の属の核酸配列に非常に類似する場合、標的の属のための捕捉プローブの特異性が失われうる。
【００２６】
複数の捕捉プローブが使用され、そして標的核酸配列における変異体に適合するように選択された場合、高いストリンジェントな条件下での特異性が回復可能である。複数プローブの混合は、標的生物の群の存在への単一の正の反応を可能にする。
【００２７】
多重アッセイにおいて、目的とする種々の条件が同時に検討される。多重解析は、アッセイの間若しくは終わったその後の、試料成分若しくはそれと共に関連するデータを分類する能力に依存する。
【実施例】
【００２８】
実施例１  ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的分子ビーコン、並びに逆転写およびＰＣＲのためのプライマーの設計
目的：本発明のＳＡＲＳアッセイのための分子ビーコンおよびオリゴヌクレオチドの設計における総合的原理は、５つのアンプリコン多重アッセイにおいて働くために熱力学的に適合可能なミスマッチ寛容分子ビーコンを構築することである。
【００２９】
設計：分子ビーコンを、ＰＣＲのアニーリング温度でその標的にハイブリダイズするが、非結合分子ビーコンは閉じた構造で残ることができるように設計した。これらの基本的側面を、コロナウイルス遺伝子特異的複数アラインメント、並びに標的配列、ＰＣＲプライマーの同一性および長さ、プローブ配列（標的認識配列）の同一性および長さ、およびアーム配列の長さを選択するための熱力学的考察を使用することにより達成した。
【００３０】
材料：ＰＣＲプライマーおよびプローブ−標的ハイブリッドの融解温度を理論的に計算するために、インターネット上で利用可能なＯｌｉｇｏ  Ｔｏｏｌｋｉｔを使用した。分子ビーコンの融解温度および二次構造予測を、インターネット上で利用可能なＭｉｃｈａｅｌ  Ｚｕｋｅｒにより開発されたＤＮＡ折りたたみプログラムを使用して計算した。
【００３１】
結果：ＰＣＲプライマーの理論的融解温度はおよそ６０℃であり；逆転写プライマーのＴｍは４７℃であり；プローブ−標的ハイブリッドのＴｍはおよそ６３℃であり；そして分子ビーコンの基幹ハイブリッドのＴｍはおよそ７０℃であった。
【００３２】
結論：熱力学的に適合可能なミスマッチ寛容分子ビーコンを、最終的な５つのアンプリコン多重ＳＡＲＳ−ＣｏＶアッセイで働くために設計した。
【００３３】
以下の図を参照：ＳＡＲＳ−ＣｏＶアッセイのＳ遺伝子標的への分子設計は、図１−４に詳細に記載され；Ｅ遺伝子標的への分子設計は図５−８を参照し；Ｍ遺伝子標的への分子設計は図９−１２を参照し；Ｎ遺伝子標的への分子設計は図１３−１６を参照し；そして、内部正対照（ＩＰＣ）への分子設計は図１７および１８を参照されたい。
【００３４】
実施例２  分子ビーコンおよび分子ビーコン−標的複合体の実験的特性
目的：これらの実験の総合的原理は、リアルタイムＰＣＲ実験を実行する前に、構築された分子ビーコンの熱力学的特性を評価することである。
【００３５】
設計：各分子ビーコンについて、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００分光蛍光熱サイクラーを使用することにより、２つの融解曲線を決定した（１つはビーコンだけで、もう１つはビーコン−標的複合体）
材料：各分子ビーコンについて、５０μＬの３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した２００ｎＭの分子ビーコンを含有する２つのチューブを用意し、そして４００ｎＭの最終濃度で１つのチューブに相補的なオリゴヌクレオチド標的を添加することによって、融解曲線を得た。
【００３６】
各溶液の蛍光体を、蛍光体をモニターする能力を有する熱サイクラーを使用して、温度の関数として決定した。温度を、（１分間続く各保持時間を有して）８０℃から１０℃へ１℃ずつ直線的に減少させ、そして蛍光強度を各保持の間測定した。
【００３７】
結果：ＰＣＲプライマーの理論上の融解温度は、６０℃±２℃であり；逆転写プライマーの理論上のＴｍは、４７±２℃であり；プローブ標的−ハイブリッドの理論上のＴｍは、およそ６３±３℃であり；そして、分子ビーコンの基幹ハイブリッドの理論上のＴｍは７０±２℃であった。
【００３８】
結論：設計されたミスマッチ寛容分子ビーコンが、そのＤＮＡ標的を正しく認識し、    そして５つのアンプリコン多重ＳＡＲＳ−ＣｏＶアッセイにおいて共に働くことに熱力学的に適合可能であることを決定した。
【００３９】
図：分子ビーコンおよび分子ビーコン−標的ハイブリッドの融解曲線は図１９に示される。
【００４０】
実施例３  アンプリコンを検出するためのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを使用する、一重ＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルスおよびＩＰＣのＰＣＲ増幅
目的：これらの実験の総合的原理は、ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲ条件を評価することである。
【００４１】
設計：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ遺伝子特異的増幅およびＩＰＣ増幅のために、合成標的ＤＮＡを使用した。ＰＣＲ反応を、分光蛍光熱サイクラー（Ｃｅｐｈｅｉｄ）を使用して実行した。
【００４２】
材料：ＰＣＲプロトコルは、以下の表示に示される。
【００４３】
Ｓ遺伝子について：
【００４４】
【化１】
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【００４５】
【化２】
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【００４６】
【化３】
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【００４７】
【化４】
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【００４８】
【化５】
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【００４９】
【化６】
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【００５０】
【化７】
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【００５１】
【化８】
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【００５２】
【化９】
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【００５３】
【化１０】
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【００５４】
【化１１】
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【００５５】
【化１２】
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【００５６】
【化１３】
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【００５７】
【化１４】
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【００５８】
【化１５】
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結果：リアルタイムＰＣＲ増幅曲線は標的ＤＮＡの存在または非存在と一致し、そしてＰＣＲ反応で合成されたアンプリコンは正しい長さを有した。
【００５９】
結論：合成プライマーは、一定のＰＣＲ条件下で十分に働く。
【００６０】
実施例４  遺伝子特異的分子ビーコンを使用する、一重ＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルスおよびＩＰＣのＰＣＲ増幅
目的：これらの実験の総合的原理は、ＰＣＲプライマーを伴う試験において確立された一定のＰＣＲ条件を使用して、分子ビーコンを評価することである。
【００６１】
設計：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ遺伝子特異的増幅およびＩＰＣ増幅のために、合成標的ＤＮＡおよび分子ビーコンを使用する。ＰＣＲ反応を、分光蛍光熱サイクラー（Ｃｅｐｈｅｉｄ）を使用して実行した。各アッセイのために、利用された標的希釈物を、分子ビーコンに基づくリアルタイムＰＣＲアッセイの直線性およびダイナミックレンジを確立するために実行する。
【００６２】
材料：ＰＣＲプロトコルは、Ｓ遺伝子、Ｅ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｎ遺伝子および内部正対照（ＩＰＣ）について実施例３で上述される。
【００６３】
結果：リアルタイムＰＣＲ増幅曲線は、標的ＤＮＡの存在または非存在と一致した。
【００６４】
結論：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的およびＩＰＣ特異的分子ビーコンは、一定のＰＣＲ条件下で十分に働く。図２０（表示２５）を参照されたい。
【００６５】
実施例５  バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写標的ＰＣＲプライマーを使用する、一重ＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルスおよびＩＰＣのＰＣＲ増幅
目的：これらの実験の総合的原理は、５つのアンプリコン（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ，Ｅ，Ｍ，およびＮ遺伝子およびＩＰＣ）のそれぞれについて、その５’末端にバクテリオファージＴ７プロモーター標的認識配列、およびその３’末端に遺伝子特異的逆転写酵素プライマー結合部位を含有するｄｓＤＮＡ分子を生産することである。合成アンプリコンをインビトロＲＮＡ生産のために使用する。合成ＲＮＡ分子は、その３’末端に特異的逆転写酵素プライマー結合部位を有する。
【００６６】
設計：各ＳＡＲＳ−ＣｏＶ遺伝子特異的増幅およびＩＰＣ増幅のために、合成標的ＤＮＡおよびバクテリオファージＴ７−ＲＴ−ＰＣＲプライマーを使用する。ＰＣＲ反応を、アンプリコンを検出するためにＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎを使用する、分光蛍光熱サイクラー（Ｃｅｐｈｅｉｄ）を使用して実行した。
【００６７】
材料：ＰＣＲプロトコルは、実施例３に示される。
【００６８】
結果：リアルタイムＰＣＲ増幅曲線は、標的ＤＮＡの存在または非存在と一致し、そしてＰＣＲ反応において合成されたアンプリコンは正しい長さを有した。
【００６９】
結論：ＰＣＲアッセイを適格とするために使用されるであろう標的ＲＮＡを生産するために、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的バクテリオファージＴ７−ＲＴアンプリコンを、インビトロＲＮＡ転写の鋳型として使用するために生成した。図２０を参照されたい。
【００７０】
実施例６  ＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＩＰＣ特異的ＲＮＡ分子のインビトロＲＮＡ転写
目的：これらの実験の総合的原理は、その３’末端に特異的逆転写プライマー−結合部位を含有するＲＮＡ分子を生産することである。
【００７１】
設計：各ＳＡＲＳ−ＣｏＶ遺伝子特異的増幅およびＩＰＣ増幅のために、Ｔ７−ＲＴ−ＰＣＲ  ｄｓＤＮＡアンプリコン（実験５から生成される）を使用する。
【００７２】
材料：４つのＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的アレルおよびＩＰＣアレルに対応するＲＮＡ転写物を、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ，テキサス州ヒューストン）を使用することにより、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含有するＰＣＲ産物のインビトロ転写物により調製した。
【００７３】
結果：産物鎖の８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動解析に基づき、ＲＮＡ分子は正しい長さを有した。
【００７４】
結論：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的Ｔ７−ＲＴアンプリコンを、インビトロＲＮＡ転写に使用するために生成した。
【００７５】
実施例７  一重ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的およびＩＰＣ特異的ＲＮＡ逆転写、並びに分子ビーコンに基づくリアルタイムＰＣＲ
目的：これらの実験の総合的原理は、その３’末端に特異的逆転写プライマー結合部位を含有するＲＮＡ分子が逆転写可能であり、そして生成したｃＤＮＡがリアルタイムＰＣＲにより増幅可能でありそして検出可能であるかを試験することである。
【００７６】
設計：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ遺伝子特異的増幅およびＩＰＣ増幅のために、Ｔ７−ＲＴ−ＰＣＲ  ｄｓＤＮＡアンプリコン（実験５から生成された）を使用する。
【００７７】
材料：ウイルスＲＮＡおよびＩＰＣ  ＲＮＡとの逆転写を、０．１２５μＭのＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的プライマーおよびＩＰＣ特異的プライマーに、２０μＬのＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的ＲＮＡおよびＩＰＣ特異的ＲＮＡを添加することにより実行し、そして８０℃で５分間インキュベートした。次いで、ＰＣＲチューブをすぐに氷上に少なくとも２分間置いた。逆転写反応物は、４０μＬの最終体積中に、ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、２０ユニット  リボヌクレアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）および８０ユニット  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含有する。反応物を、４２℃で５０分間インキュベートし、続いて７０℃で１５分間不活性化した。ｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲは以下を使用した、５０μＬの最終体積中に、１０μＬ  ｃＤＮＡ、１ｘＰＣＲ緩衝液、３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．４μＭの各分子ビーコン、０．４μＭの各ＰＣＲプライマー、および２．５ユニット  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ。３５サイクルの増幅（９４℃で１５秒、５３℃で３０秒、および７２℃で３０秒）を、７７００Ｐｒｉｓｍ分光蛍光熱サイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で実行した。
【００７８】
結果：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的ＲＮＡ分子およびＩＰＣ特異的ＲＮＡ分子が転写可能であり、そして生成したｃＤＮＡが増幅可能であり、そしてリアルタイムＰＣＲアッセイにおいてＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的分子ビーコンおよびＩＰＣ特異的分子ビーコンにより検出可能ある。
【００７９】
結論：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的ＲＮＡ分子を、最終アッセイにおける対照として使用可能である。
【００８０】
実施例８  多重ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的およびＩＰＣ特異的ＲＮＡ逆転写、並びに分子ビーコンに基づくリアルタイムＰＣＲ
目的：これらの実験の総合的原理は、多重ＲＴ−ＰＣＲ反応において一重ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的ＲＴ−ＰＣＲ反応およびＩＰＣ特異的ＲＴ−ＰＣＲ反応を多重化することである。
【００８１】
設計：５つ全てのＲＴ−ＰＣＲ反応を１つに組み込む。
【００８２】
材料：５つ全てのＲＴプライマー、４セットのＰＣＲプライマー、および５つの分子ビーコンを単一のＲＴ−ＰＣＲ反応において使用すること以外は、実験７と同一である。
【００８３】
結果：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的ＲＮＡ分子およびＩＰＣ特異的ＲＮＡ分子は逆転写可能であり、そしてｃＤＮＡを生成し、そして次いで増幅可能であり、そしてリアルタイムＰＣＲアッセイ中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的分子ビーコンおよびＩＰＣ特異的分子ビーコンにより検出可能である。
【００８４】
結論：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的ＲＮＡ分子は、多重アッセイにおいて対照として使用可能である。
【００８５】
実施例９  臨床試料を使用する完全ＳＡＲＳ−ＣｏＶアッセイの評価
目的：これらの実験の総合的原理は、実際の試料（培養物、唾液由来の主要な患者単離株、並びに全血および排泄物検体に由来する分離ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）を使用してＳＡＲＳ−ＣｏＶアッセイを評価することである。
【００８６】
設計：実験８と同一である。
【００８７】
材料：実験８と同一である。
【００８８】
結果：ＳＡＲＳ−ＣｏＶアッセイはＳＡＲＳ−ＣｏＶを検出し、そしてＳＡＲＳ−ＣｏＶと他の非病原性コロナウイルスを区別する。
【００８９】
結論：ＳＡＲＳ−ＣｏＶアッセイは、培養ＳＡＲＳ株および主要な単離株から抽出されたＳＡＲＳ  ＲＮＡ分子を検出する。
【００９０】
実施例１０  臨床評価
６４の試料を、ＣＤＣ、ＷＨＯおよびカナダ保健省の事例定義に基づきＳＡＲＳを有すると臨床的に診断された２３人の個人から集めた。
【００９１】
試料の型は以下のものを含んだ：気管支洗浄および唾液（死亡前の試料）、並びに肺、肝臓、小腸および大腸、および脾臓組織（死亡後）。
【００９２】
１５人の患者由来の６５の試料は対照として役立てた。２６は、経路病原体スクリーニングのために送られた骨髄試料であった。３９は、発生している間に死んだ１０人の患者由来の死後の器官試料であったが、死は、鬱血性心不全、脳血管障害、アテローム性心臓疾患、慢性閉塞性肺疾患、侵入性Ａ群ストレプトコッカス感染、アミオダロン肺毒性、および肺線維症を含む、その他の原因に起因する。
【００９３】
全ての試料を開発されたアッセイ（Ｓ，Ｅ，Ｍ，Ｎの４つ全ての遺伝子を使用する）を使用することによりブラインドアッセイをし、そして特異性は１００％であった。
【００９４】
【化１６】
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上記の各文献および明細書中で引用した各文献の内容は、明確に本明細書に参照により援用される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１−１】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−２】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−３】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−４】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−５】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−６】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−７】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−８】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−９】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−１０】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−１１】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−１２】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−１３】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−１４】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−１５】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−１６】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−１７】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−１８】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１−１９】図１は、異なった種から単離されたコロナウイルスＳ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図２】図２は、Ｓ遺伝子の系統発生解析を示す。
【図３−１】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−２】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−３】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−４】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−５】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−６】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−７】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−８】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−９】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−１０】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−１１】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−１２】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−１３】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−１４】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−１５】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−１６】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−１７】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−１８】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−１９】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図３−２０】図３は、ＳＡＲＳ関連Ｓ遺伝子の分子設計を示す。
【図４】図４は、Ｓ遺伝子の分子設計をリストアップする。
【図５−１】図５は、異なった種から単離されたコロナウイルスＥ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図５−２】図５は、異なった種から単離されたコロナウイルスＥ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図６】図６は、Ｅ遺伝子の系統発生解析を示す。
【図７−１】図７は、ＳＡＲＳ関連Ｅ遺伝子の分子設計を示す。
【図７−２】図７は、ＳＡＲＳ関連Ｅ遺伝子の分子設計を示す。
【図７−３】図７は、ＳＡＲＳ関連Ｅ遺伝子の分子設計を示す。
【図８】図８は、ＳＡＲＳ関連Ｅ遺伝子の分子設計を示す。
【図９−１】図９は、異なった種から単離されたコロナウイルスＭ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図９−２】図９は、異なった種から単離されたコロナウイルスＭ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図９−３】図９は、異なった種から単離されたコロナウイルスＭ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図９−４】図９は、異なった種から単離されたコロナウイルスＭ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１０】図１０は、Ｍ遺伝子の系統発生解析を示す。
【図１１−１】図１１は、ＳＡＲＳ関連Ｍ遺伝子の分子設計を示す。
【図１１−２】図１１は、ＳＡＲＳ関連Ｍ遺伝子の分子設計を示す。
【図１１−３】図１１は、ＳＡＲＳ関連Ｍ遺伝子の分子設計を示す。
【図１１−４】図１１は、ＳＡＲＳ関連Ｍ遺伝子の分子設計を示す。
【図１１−５】図１１は、ＳＡＲＳ関連Ｍ遺伝子の分子設計を示す。
【図１２】図１２は、Ｍ遺伝子の分子設計をリストアップする。
【図１３−１】図１３は、異なった種から単離されたコロナウイルスＮ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１３−２】図１３は、異なった種から単離されたコロナウイルスＮ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１３−３】図１３は、異なった種から単離されたコロナウイルスＮ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１３−４】図１３は、異なった種から単離されたコロナウイルスＮ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１３−５】図１３は、異なった種から単離されたコロナウイルスＮ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１３−６】図１３は、異なった種から単離されたコロナウイルスＮ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１３−７】図１３は、異なった種から単離されたコロナウイルスＮ遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１４】図１４は、Ｎ遺伝子の系統発生解析を示す。
【図１５−１】図１５は、ＳＡＲＳ関連Ｎ遺伝子の分子設計を示す。
【図１５−２】図１５は、ＳＡＲＳ関連Ｎ遺伝子の分子設計を示す。
【図１５−３】図１５は、ＳＡＲＳ関連Ｎ遺伝子の分子設計を示す。
【図１５−４】図１５は、ＳＡＲＳ関連Ｎ遺伝子の分子設計を示す。
【図１５−５】図１５は、ＳＡＲＳ関連Ｎ遺伝子の分子設計を示す。
【図１５−６】図１５は、ＳＡＲＳ関連Ｎ遺伝子の分子設計を示す。
【図１５−７】図１５は、ＳＡＲＳ関連Ｎ遺伝子の分子設計を示す。
【図１５−８】図１５は、ＳＡＲＳ関連Ｎ遺伝子の分子設計を示す。
【図１５−９】図１５は、ＳＡＲＳ関連Ｎ遺伝子の分子設計を示す。
【図１６】図１６は、Ｎ遺伝子の分子設計をリストアップする。
【図１７−１】図１７は、内部正対照（ＩＰＣ）の分子設計を示す。
【図１７−２】図１７は、内部正対照（ＩＰＣ）の分子設計を示す。
【図１８】図１８は、ＩＰＣの分子設計を示す。
【図１９】図１９は、分子ビーコン融解曲線を示す。
【図２０】図２０は、一重リアルタイムＰＣＲ増幅（連続希釈−ダイナミックレンジ）を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図３−１１】
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【図３−１２】
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【図３−１３】
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【図３−１４】
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【図３−１５】
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【図３−１６】
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【図３−１７】
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【図３−１８】
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【図３−１９】
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【図３−２０】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１５−８】
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【図１５−９】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007503213.tif 000146
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