(57)【要約】  本発明は、デカルピス ハミルトニーの塊状根から抗酸化活性の豊かな抽出物を調製する方法、および該抽出物の抗酸化剤、フリーラジカル除去剤としての使用に関する。該抽出物は4〜47％の範囲で抗酸化活性を有しており、また、１種類のフリーラジカルのみ除去する他の合成抗酸化剤と異なり、２種類以上のフリーラジカルを除去することができるため、より優れた抗酸化剤を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デカルピス ハミルトニーのジクロロメタン抽出物の抗酸化剤としての使用であって、該抽出物は薬理的に許容される医薬用添加物または食用物と混合される。
【請求項２】
抗酸化特性は、好ましくはフリーラジカル除去活性である、請求項1記載の使用。
【請求項３】
フリーラジカル除去活性は、ヒドロキシルラジカル除去活性である、請求項２記載の使用。 
【請求項４】
抽出物は、塊状根から得られる、請求項１記載の使用。
【請求項５】
抗酸化活性は、4〜47％の範囲である、請求項１記載の使用。
【請求項６】
抽出物は、100〜1000ppmの範囲で適用される、請求項１記載の使用。
【請求項７】
抽出物は、塊茎の髄と塊茎の皮とから得られる、請求項４記載の使用。
【請求項８】
髄から得られる抽出物の抗酸化活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、30〜45％の範囲である、請求項７記載の使用。
【請求項９】
髄から得られる抽出物の抗ラジカル活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、35〜46％の範囲である、請求項７記載の使用。
【請求項１０】
髄から得られる抽出物のヒドロキシル除去活性は、100〜200ppmの濃度範囲で適用される場合、36〜47％の範囲である、請求項７記載の使用。
【請求項１１】
皮から得られる抽出物の抗酸化活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、36〜47％の範囲である、請求項７記載の使用。
【請求項１２】
皮から得られる抽出物の抗ラジカル活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、32〜48％の範囲である、請求項７記載の使用。
【請求項１３】
髄から得られる抽出物のヒドロキシル除去活性は、100〜200ppmの濃度範囲で適用される場合、43〜49％の範囲である、請求項７記載の使用。
【請求項１４】
デカルピス ハミルトニー Wight & Arn.の塊状根から得られるジクロロメタン抽出物を有効量含む抗酸化組成物であって、１以上の薬理的に許容される添加物と共に任意的に用いられる。
【請求項１５】
デカルピス ハミルトニー Wight & Arn.の塊状根から抗酸化活性の豊かな抽出物を調製する方法であって、該方法は以下のステップを含む。
a) デカルピス ハミルトニーの塊状根をジクロロメタンで抽出して、第１の抽出物を得、
b) 上記ステップ(a)で得られた第１の抽出物を濃縮して、抗酸化活性の豊かな抽出物を得る。
【請求項１６】
上記ステップ(a)において、塊状根を70％のアルコールで洗浄し、表面を殺菌する、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
上記ステップ(a)において、ジクロロメタンと塊状根との重量比は、およそ2：1である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
デカルピス ハミルトニーの塊状根から抗酸化剤として得られるジクロロメタン抽出物の抗酸化活性は、4〜47％の範囲である、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
抗酸化特性は、好ましくはフリーラジカル除去活性である、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
フリーラジカル除去活性は、ヒドロキシルラジカル除去活性である、請求項15記載の方法。
【請求項２１】
抽出物は、塊茎の髄と塊茎の皮とから得られる、請求項15記載の方法。
【請求項２２】
髄から得られる抽出物の抗酸化活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、30〜45％の範囲である、請求項15記載の方法。
【請求項２３】
髄から得られる抽出物の抗ラジカル活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、35〜46％の範囲である、請求項15記載の方法。
【請求項２４】
髄から得られる抽出物のヒドロキシル除去活性は、100〜200ppmの濃度範囲で適用される場合、36〜47％の範囲である、請求項15記載の方法。
【請求項２５】
皮から得られる抽出物の抗酸化活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、36〜47％の範囲である、請求項15記載の方法。
【請求項２６】
皮から得られる抽出物の抗ラジカル活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、32〜48％の範囲である、請求項12記載の方法。
【請求項２７】
髄から得られる抽出物のヒドロキシル除去活性は、100〜200ppmの濃度範囲で適用される場合、43〜49％の範囲である、請求項12記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デカルピス ハミルトニー（Decalepis hamiltonii Wight & Arn.）の塊状根から抗酸化活性の豊かな抽出物を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、デカルピス ハミルトニー（Decalepis hamiltonii Wight & Arn.）の塊状根から抗酸化活性の豊かな抽出物を調製する方法の開発を目的とするものである。デカルピス ハミルトニー(swallow root)は、ガガイモ科（Asclepidaceae）に属し、インドのデカン半島および西ガーツの森林地帯に自生するmonogenericなつる性の低木である。根が非常に香り高いため、料理用香料として使用される。根はとても多肉質で、筒状（直径1-6 cm）であり、Wealth of India 1952 (Wealth of India 1952, A dictionary of raw materials, CSIR, New Delhi 3: 24)で述べられているように、舌にヒリヒリする感じを伴う味覚のような、sarasaparillaによって特徴づけられる。デカルピス ハミルトニーの根は、香味成分(Wealth of India, 1990)、アペタイザー(Murthi, P.B.R. and Seshadri, T.R. Proc. Ind. Acad. Sci. 1947; 13A, 221)、血液浄化(Jacob, K.C. Madras Agric. Journal. An unrecorded economic product Decalepis hamiltonii W & Arn., Family Asclepidaceae 1937; 25; 176)、および保存剤(Phadke, N.Y., Gholap A.S., Ramakrishnan K, Subbulakshmi G., J. Food Sci. Sechnol. 1994; 31, 472)として使用される。同様に、この分類の根が、Nayar et al.(1978) (Nayar RC, Shetty JKP, Mary Z and Yoganrasimhan 1978. Pharmacological studies of root of Decalepis hamiltonii W & Arn and comparison with Hemidesmus indicus (L.) R. Br. Proc. Indian Acad. Sciences 87(B): 37-48)で述べられ、アーユルヴェーダで"Sariva Bheda"として考慮され、Amnutamalalca taila、Drakshadi churna、shatavari rasayana、およびyeshtimadhu tailaのようないくつかの薬草を調合するときに、Hemidesmus indicusの根の代用物としての利用が述べられている。根は、92％の肉質部と8％の木のコア部を含んでいる。最近、この植物の生存を危険にさらした乱獲によって、この非常に香り高い根が過度の利用に供された。George et al.(George, J., Perira, J., Divakar, S., Udayasanlcar, K and Ravishanlcar, G.A. Current Science, 1999; 77, 501-502)による最近の報告によると、デカルピス ハミルトニーの芳香性の根が、害虫に対し致死性およびサブリーサルなレベルの強力な殺虫作用を持つことがわかった(Indian Patent No.1301/Del/98)。また、これらの根の超臨界抽出物は、強力な抗菌剤であることがわかった (George, J., Udayasanlcar, K., Keshava, N and Ravishankar, G.A. Fitoterapia 1999; 70,172-174)。George, J., Bais, H.P.およびRavishankar, G.A.は、葉のカルスからデカルピス ハミルトニー個体を再生することができた(Current Science, 2000; 79: 894-898)。同様に、植え替えのためのデカルピス ハミルトニーの根付け方法が以前報告された(Bais HP, Sudha G, Suresh B &. Ravishankar G.A, Cure. Sci, 2000,79: 408-410; Obul Reddy, B., Giridhar, P and Ravishankar G.A, Current Science 81 (11), 2001,1479-1482)。デカルピス ハミルトニーの塊状根抽出物は、主要化合物(97％)として香気化合物2-ヒドロキシ-4-メトキシベンズアルデヒドを含有しており、これは水蒸気蒸留法とジクロロメタンを用いて抽出可能である(Nagarajan, S., Jaganmohana Rao L., and Gurudutt, K.N., Chemical composition of the volatiles of Decalepis hamiltonii (Wight & A.,) Flavour and Fragrance Journal. 16: 27,2001)。
【０００３】
抗酸化剤は、食品、特に脂質および脂質含有食品に加えられると、加工および保存中の食品劣化の主原因の1つである脂質の過酸化プロセスを遅らせることによって、保存期間を高めることができる化合物である。ブチルヒドロキシアニソール(BHT)やbutylated hydroxytoulene(BHT)のような合成抗酸化剤は、発がん性が疑われているため、食物への使用が制限されてきた(Mahavi D.L., Salunkhe D.K., Toxicological aspects of food antioxidants. In: Food Antioxidants : Madhavi, DL., Deshpande SS, Salunkhe DK, eds.; Dekker : New York, 1995; p267)。一般に、代謝過程の酸化は、本質的な細胞活動に必要なエネルギーの生産を導く。しかし、生細胞における酸素の代謝はまた、relative oxygen species(ROS)として一般に知られる酸素由来フリーラジカルの不可避的な生産を導く(Mccord J.M., Free radicals and pro-oxidants in health and nutrition. Food Technol. 48: 106-110., 1994; Adegoke G.O, Kumar M.N, Gopalkrishna AG, Vardaraj M.C., Sambaiah K., Lokesh B.R, Antioxidants and lipid oxidation in foods-a critical appraisal. J. Food Sci. Technol.35: 283-298,1998)。そして、これらは多くの疾病の発症に関与する。これらのフリーラジカル類は、生体膜の不飽和脂肪酸を攻撃し、脂質の過酸化とタンパク質およびDNAの破壊をもたらし、さらに生物システムにおける一連の劣化的変化を引き起こし、細胞の不活化を導く。したがって、フリーラジカル連鎖反応の惹起を防ぐことによって脂質の過酸化プロセスを遅らせることができる抗酸化剤の同定は、近年重要さを増してきた。生物システムでは、各種の抗酸化機構が、ROSと戦う際に重要な役割を果たす(Aruoma OI, Nutrition and health aspects of free radicals and antioxidants. Food Chem, 32: 671-683.,1994)。抗酸化剤は、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、カタラーゼまたはグルタチオンペルオキシダーゼなどの酵素をコードする遺伝子発現をアップレギュレートすることによって、内因性の防御レベルの容易化に作用するのかもしれない(Halliwell B, Gutteridge JMC. Free Radicals in Biology and Medicine, 2nd Edition, Japan Scientific Societies Press: Tokyo, Japan, 1989)。
【本発明の目的】
【０００４】
本発明の主たる目的は、上述の問題点を解決するため、デカルピス ハミルトニー（Decalepis hamiltonii Wight & Arn.）の塊状根から抗酸化活性の豊かな抽出物を調製する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、デカルピス ハミルトニーの塊状根抽出物の抗酸化活性を評価することである。
【本発明の要旨】
【０００５】
本発明は、デカルピス ハミルトニーの塊状根から抗酸化活性の豊かな抽出物を調製する方法、および該抽出物の抗酸化剤、フリーラジカル除去剤としての使用に関する。該抽出物は4〜47％の範囲で抗酸化活性を有しており、また、１種類のフリーラジカルのみ除去する他の合成抗酸化剤と異なり、２種類以上のフリーラジカルを除去することができるため、より優れた抗酸化剤を提供することができる。
【本発明の詳細な説明】
【０００６】
このように、本発明が提供する方法は、
1) デカルピス ハミルトニー Wight & Arn.の塊状根から抗酸化活性の豊かな抽出物を調製する方法であって、該方法は以下のステップを含む。
a) まず70-75％アルコール200 mlにデカルピス ハミルトニーの塊茎（tubers）を５〜１０秒間浸して表面の汚れを取り除き、次に滅菌水で３回洗浄することによって、デカルピス ハミルトニーの塊茎を洗浄し、
b) 塊茎全体または塊茎の異なる部分（皮つきの塊茎、皮なしの塊茎、中央のコア部または髄（ずい）の部分のみ、あるいは肉質の部分のみ）をミキサーでペースト状にし、
c) 比率(1:3)のジクロロメタンの根抽出物を回収し、
d) ジクロロメタンの根抽出物の抗酸化活性を決定、評価する。
本発明の一実施形態においては、デカルピス ハミルトニーの塊茎のジクロロメタン抽出物の回収方法が標準化されている。
本発明の他の実施形態においては、デカルピス ハミルトニーの塊状根抽出物の抗酸化活性をアッセイするため、ジクロロメタン抽出物が解析された。
本発明の他の実施形態においては、デカルピス ハミルトニー Wight & Arn.の塊状根の塊茎全体または塊茎の異なる部分をまずミキサーでペースト状にし、次にこれら塊茎のジクロロメタン画分が回収され、香気代謝物2-ヒドロキシ-4-メトキシベンズアルデヒドがガスクロマトグラフ（GC）によって定量された。その後、エタノール中のこれらジクロロメタン画分の抗酸化活性が決定された。 
本発明の他の実施形態においては、デカルピス ハミルトニーのジクロロメタン抽出物の抗酸化剤としての使用であり、前記抽出物は薬理的に許容される医薬用添加物または食用物と混合される。
本発明のさらに他の実施形態においては、抗酸化特性は、好ましくはフリーラジカル除去活性である。 
本発明のさらに他の実施形態においては、フリーラジカル除去活性は、ヒドロキシルラジカル除去活性である。 
本発明のさらに他の実施形態においては、抽出物は、塊状根から得られる。
本発明の他の実施形態においては、抗酸化活性は、4〜47％の範囲である。
本発明のさらに他の実施形態においては、抽出物は、100〜1000 ppmの範囲で適用される。
本発明のさらに他の実施形態においては、抽出物は、塊茎の髄と塊茎の皮とから得られる。
本発明の他の実施形態においては、髄から得られる抽出物の抗酸化活性は、500〜1000 ppmの濃度範囲で適用される場合、30〜45％の範囲である。
本発明の他の実施形態においては、髄から得られる抽出物の抗ラジカル活性は、500〜1000 ppmの濃度範囲で適用される場合、35〜46％の範囲である。
本発明のさらに他の実施形態においては、髄から得られる抽出物のヒドロキシル除去活性は、100〜200 ppmの濃度範囲で適用される場合、36〜47％の範囲である。
本発明のさらに他の実施形態においては、皮から得られる抽出物の抗酸化活性は、500〜1000 ppmの濃度範囲で適用される場合、36〜47％の範囲である。
本発明の他の実施形態においては、皮から得られる抽出物の抗ラジカル活性は、500〜1000 ppmの濃度範囲で適用される場合、32〜48％の範囲である。
本発明のさらに他の実施形態においては、髄から得られる抽出物のヒドロキシル除去活性は、100〜200 ppmの濃度範囲で適用される場合、43〜49％の範囲である。
本発明のさらに他の実施形態は、デカルピス ハミルトニー Wight & Arn.の塊状根から得られるジクロロメタン抽出物を有効量含む抗酸化組成物であり、１以上の薬理的に許容される添加物と共に用いられてもよい。
【表の簡単な説明】
【０００７】
表１：デカルピス ハミルトニーの種々の根抽出物の抗酸化活性を標準のBHAと比較したもの
表２：デカルピス ハミルトニーの種々の根抽出物の抗酸化活性を標準のD.P.P.Hと比較したもの
表３：デカルピス ハミルトニーの種々の根抽出物のヒドロキシラジカル除去活性を比較したもの
【実施例】
【０００８】
本発明の実施例について、以下説明する。
実施例１
デカルピス ハミルトニーの新鮮な塊茎を、地方の市場から集め、必要な大きさにした（およそ長さ10.0±1.0 cmと直径2.0±0.5 cm）。塊茎1000グラム当たり2-4リットルの冷水(15±2℃)を用いて塊茎を洗い、余分な物質と土を取り除いた。次に、70％アルコール200 mlで５秒間、塊茎の表面を滅菌し、その後３回滅菌水で洗浄した。塊茎の表面は、滅菌吸取紙で拭き取られた。塊茎（塊茎全体(A) 606.35グラム： 皮なしの塊茎(B) 185グラム： 中央のコア部又は髄部(C) 72.40グラム： 皮部分(D) 110グラム）は、ミキサーでペースト状にされた。塊茎全体、および塊茎の異なる部分における水分量は、以下のように記録された（塊茎全体(A) 74％： 皮なしの塊茎(B) 75％： 中央のコア部又は髄部(C) 40.23％： 皮部分(D) 53.21％）。
【０００９】
ジクロロメタンを(各試料の重量の二倍)上記ペースト状の根に添加し、暗所に一晩置いた。その後、分液漏斗を用いて、ジクロロメタン抽出物を分離した。同じ操作を、ジクロロメタンを用いて３回繰り返した。その後、すべてのジクロロメタン画分がプールされた。同様に、塊茎の異なった部分も、(塊茎全体について)上述したように、粉末の抽出物を調製した後、ジクロロメタンで分離抽出された。これらは、風乾され、最終的に1 mlのエタノールに溶解され、更なる分析のために低温暗所で保存された。混合した抽出物は、水分含量を取り除くために無水硫酸ナトリウムを含む漏斗を通過させ、フラッシュエバポレーターで濃縮され、l mlエタノールに溶解され、閉じたバイアルに保存された。香味化合物の定量は、水素炎イオン化検出器(FID)を使用して、ガスクロマトグラフ分析(GC)で決定された。すべてのアルコール抽出物は最終的に、香味成分2-ヒドロキシ-4-メトキシベンズアルデヒドについて、GC-MS法で分析された。
【００１０】
2-ヒドロキシ-4-メトキシベンズアルデヒド(2H4MB)の分析は、標準品と共にTLCプレート(Fluka Chemicals、スイス)に根抽出物をスポットし、ヘキサン：ベンゼン(1:1)を含む溶媒系を用いることによって行った。標準品(2H4MB) (0.47)と一致するRf値のスポットが溶剤で溶出され、UVスペクトルを、Perken-Elmer UV-Vis recording spectrophotometer UV-160で測定した。278nmで最大の吸光が得られた。定量検出はGCで行われた。成分は標準試料のGC保持時間と比較して確認された。
【００１１】
濃縮した揮発物は、GC、キャピラリーカラムを用いた水素炎イオン化検出器(FID)、および島津製作所のGC-14BとQP 5000 MS systemとを用いたGC-MS分析によって分離された。条件は次のとおりである。SPB-1カラム（Supelco、米国、30 m x 0.32 mm、膜厚0.25μM）；オーブン温度プログラム（60℃で２分、250℃まで２℃/分ずつ上昇させ、５分間保持；注入口温度225℃；検出温度250℃；キャリヤーガスヘリウム、流速1 ml/分。分析用の注入溶液量は1μlであった。
【００１２】
GC分析によって、抽出物の2-ヒドロキシ-4メトキシベンズアルデヒド含量は、代謝物として次のとおりであることが示された。
塊茎全体(A) 110 mg/g FW-1皮なしの塊茎(B) 274 mg/g FW-1; 中央のコア部又は髄部(C) 72.4 mg/g FW-1皮部分(D) 53.0 mg/g FW-1
【００１３】
ジクロロメタン画分の食品応用への適合性
ジクロロメタンは、国際がん研究機関によって評価された（IARC. 1986. Monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans : Some halogenated hydrocarbons and pesticide exposures. Lyon, 41: 43-85）。天然香味材料からの香りづけで調製された、抽出溶液(ジクロロメタン)の使用による食料品中の最大残渣限界値は、0.02 mg/kgである（www. docs. justice. gov. mt./lom/ legislation）。
【００１４】
β-カロチン リノール酸塩モデル系を用いた抗酸化活性分析(β CLAMS) (Hidalgo et al., 1994)
これは、抗酸化剤をスクリーニングする迅速な方法の1つであり、酸素水によって生成される“活性酸素”(ROS)によって、不飽和脂肪酸であるリノール酸が酸化させられる原理に主に基づいている。形成された産物はβ-カロチンの酸化を開始し、変色する。これは、抗酸化剤によって防止されるので、変色の程度が低くなるほど活性があることを示す。即ち、変色が多ければ抗酸化活性は低く、逆もまた同様である。
【００１５】
β-カロチンは水に不溶のため、最初はエマルジョンにした。β-カロチンをクロロホルムに溶かし、界面活性剤としてTween-40（Polyoxyethylene sorbotan manonitrate）を用いて、リノール酸と混合し、エマルジョンを形成した。生じた混合物は、３回蒸留した水(1パート)で希釈され、よく混合された。さらにこのエマルジョンに酸素水(4パート)を加えると、酸化反応をすぐに開始する。これを、サンプルを含む試験管に移し、初期値(ゼロ分)が読み取られた後、15分間隔で470 nmにおける吸光度が記録された。すべての試験管は実験中50℃のウォーターバスに置かれた。
【００１６】
材料：
・β-カロチン リノール酸エマルジョン混合物-100 ml (Jayaprakash et al., 2000)
エマルジョンの組成
クロロホルム1 ml中、0.4 mgβ-カロチン、40 mg リノール酸、400 mg tween-40。クロロホルムは、（40℃で）rotavapourを使用して真空下除去された。このエマルジョンは20 mlの水および80 mlの酸素水と混合された。
・抽出溶液の調製：エタノール中の4.5 mg/ml溶液が実験に使用された。
・BHA溶液：エタノール1 mlに4.5 mg溶解した。
【００１７】
方法：
抽出溶液0.025, 0.05および0.1 mlとBHA溶液0.05 mlとが濃度（100 ppm、50 ppm、25 ppm）に応じて異なる試験管に加えられ、エタノールで容量0.5 mlとした。4 mlのβ-カロチン リノール酸エマルジョンが各試験管に加えられ、ゼロ時にすべてのサンプルの470 nmの吸光度を測定後、試験管を50℃のウォーターバスの中に置いた。吸光度の測定は、15分間隔で、β-カロチンの色がコントロール反応において消えるまで(t=180分)続けられた。上述のように調製された混合物でβ-カロチンエマルジョンのないものはブランクとして使用され、抽出物のない混合物はコントロールとして使用された。種々の抽出物の抗酸化活性が、異なる濃度で用量反応的に決定された。
【００１８】
抽出物の抗酸化活性(％ AA)は、以下の式を使用してβ-カロチンの脱色から評価された(Hidalgo et al., 1994)。
各実験は３回行われ、吸光度の偏差は10％未満であった。
％ AA = 100[1-(A0-At)/A00-A0t)]
ここで、％ AA =  抗酸化活性
A0 =  サンプルのゼロ時での吸光度
At =  180分間インキュベーション後のサンプルの吸光度
A00 =  コントロールのゼロ時での吸光度
At0 =  180分間インキュベーション後のコントロールの吸光度
結果は、％抗酸化活性として表された。
【表１】
2007537129.tif 000002
【００１９】
塊茎の皮部の抽出物は、(fresh weightに基づいた) 塊茎全体と比べて、良好な抗酸化活性を示した。中央のコア（髄）部の抽出物も、塊茎の皮部の抽出物と同様に、ほぼ等しい量の抗酸化活性を示した。
【００２０】
実施例２
デカルピス ハミルトニーの新鮮な塊茎を、地方の市場から集め、必要な大きさにした（およそ長さ10.0±1.0 cmと直径2.0±0.5 cm）。塊茎1000グラム当たり2-4リットルの冷水(15±2℃)を用いて塊茎を洗い、余分な物質と土を取り除いた。次に、70％アルコール200 mlで５秒間、塊茎の表面を滅菌し、その後３回滅菌水で洗浄した。塊茎の表面は、滅菌吸取紙で拭き取られた。塊茎（塊茎全体(A) 606.35グラム： 皮なしの塊茎(B) 185グラム： 中央のコア部又は髄部(C) 72.40グラム： 皮部分(D) 110グラム）は、ミキサーでペースト状にされた。塊茎全体、および塊茎の異なる部分における水分量は、以下のように記録された（塊茎全体(A) 74％： 皮なしの塊茎(B) 75％： 中央のコア部又は髄部(C) 40.23％： 皮部分(D) 53.21％）。
【００２１】
ジクロロメタンを(各試料の重量の二倍)上記ペースト状の根に添加し、暗所に一晩置いた。その後、分液漏斗を用いて、ジクロロメタン抽出物を分離した。同じ操作を、ジクロロメタンを用いて３回繰り返した。その後、すべてのジクロロメタン画分がプールされた。同様に、塊茎の異なった部分も、(塊茎全体について)上述したように、粉末の抽出物を調製した後、ジクロロメタンで分離抽出された。これらは、風乾され、最終的に1 mlのエタノールに溶解され、更なる分析のために低温暗所で保存された。混合した抽出物は、水分含量を取り除くために無水硫酸ナトリウムを含む漏斗を通過させ、フラッシュエバポレーターで濃縮され、l mlエタノールに溶解され、閉じたバイアルに保存された。香味化合物の定量は、水素炎イオン化検出器(FID)を使用して、ガスクロマトグラフ分析(GC)で決定された。すべてのアルコール抽出物は最終的に、香味成分2-ヒドロキシ-4-メトキシベンズアルデヒドについて、GC-MS法で分析された。
【００２２】
2-ヒドロキシ-4-メトキシベンズアルデヒド(2H4MB)の分析は、標準品と共にTLCプレート(Fluka Chemicals、スイス)に根抽出物をスポットし、ヘキサン：ベンゼン(1:1)を含む溶媒系を用いることによって行った。標準品(2H4MB) (0.47)と一致するRf値のスポットが溶剤で溶出され、UVスペクトルを、Perken-Elmer UV-Vis recording spectrophotometer UV-160で測定した。278nmで最大の吸光が得られた。定量検出はGCで行われた。成分は標準試料のGC保持時間と比較して確認された。
【００２３】
濃縮した揮発物は、GC、キャピラリーカラムを用いた水素炎イオン化検出器(FID)、および島津製作所のGC-14BとQP 5000 MS systemとを用いたGC-MS分析によって分離された。条件は次のとおりである。SPB-1カラム（Supelco、米国、30 m x 0.32 mm、膜厚0.25μM）；オーブン温度プログラム（60℃で２分、250℃まで２℃/分ずつ上昇させ、５分間保持；注入口温度225℃；検出温度250℃；キャリヤーガスヘリウム、流速1 ml/分。分析用の注入溶液量は1μlであった。
【００２４】
GC分析によって、抽出物の2-ヒドロキシ-4メトキシベンズアルデヒド含量は、代謝物として次のとおりであることが示された。
塊茎全体(A) 110 mg/g FW-1皮なしの塊茎(B) 274 mg/g FW-1; 中央のコア部又は髄部(C) 72.4 mg/g FW-1皮部分(D) 53.0 mg/g FW-1
【００２５】
ジクロロメタン画分の食品応用への適合性
ジクロロメタンは、国際がん研究機関によって評価された（IARC. 1986. Monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans : Some halogenated hydrocarbons and pesticide exposures. Lyon, 41: 43-85）。天然香味材料からの香りづけで調製された、抽出溶液(ジクロロメタン)の使用による食料品中の最大残渣限界値は、0.02 mg/kgである（www. docs. justice. gov. mt./lom/ legislation）。
【００２６】
安定フリーラジカルとしてD.P.P.Hを使用した化学的に安定したラジカル除去活性の概略図：(Blios、1958) 
【化１】
2007537129.tif 000003
抽出物のフリーラジカル除去活性は、α,αジフェニル-β-ピクリルヒドラジル（D.P.P.H）のメタノール溶液に対してテストされた。抗酸化剤は、D.P.P.H.と反応し、これをα,αジフェニル-β-ピクリルヒドラジンへ変換する。変色の程度は、抗酸化抽出物の除去活性を示す。517 nmで生じる吸光度の変化が抗酸化活性の測定値として使用された。
【００２７】
材料：
・D.P.P.H（100μM）のメタノール溶液：39.4 mgのD.P.P.Hが分析用メタノール１リットルに溶解された。
・抽出溶液の調製：55 mgの抽出物が10 mlのメタノールに溶解され、ろ過された。ろ液が実験に使用された。
【００２８】
方法：
抽出溶液0.025, 0.05および0.1 mlと標準品とが異なる試験管に入れられた。これに、5 mlのD.P.P.Hメタノール溶液が加えられ、よく振った後、混合物を20分間室温に静置した。ブランクは、抽出物なしで上述のように調製された。517 nmの測定値に着目し、まず517 nmでのブランクの吸光度に着目し、サンプルの吸光度の変化が測定された。
除去活性は、次の式を用いて算出された阻害割合として表された。
【数１】
2007537129.tif 000004
【表２】
2007537129.tif 000005
【００２９】
塊茎の皮部の抽出物は、(fresh weightに基づいた) 塊茎全体と比べて、良好な抗酸化活性を示した。中央のコア（髄）部の抽出物も、塊茎の皮部の抽出物と同様に、ほぼ等しい量の抗酸化活性を示した。
【００３０】
実施例３
デカルピス ハミルトニーの新鮮な塊茎を、地方の市場から集め、必要な大きさにした（およそ長さ10.0±1.0 cmと直径2.0±0.5 cm）。塊茎1000グラム当たり2-4リットルの冷水(15±2℃)を用いて塊茎を洗い、余分な物質と土を取り除いた。次に、70％アルコール200 mlで５秒間、塊茎の表面を滅菌し、その後３回滅菌水で洗浄した。塊茎の表面は、滅菌吸取紙で拭き取られた。塊茎（塊茎全体(A) 606.35グラム： 皮なしの塊茎(B) 185グラム： 中央のコア部又は髄部(C) 72.40グラム： 皮部分(D) 110グラム）は、ミキサーでペースト状にされた。塊茎全体、および塊茎の異なる部分における水分量は、以下のように記録された（塊茎全体(A) 74％： 皮なしの塊茎(B) 75％： 中央のコア部又は髄部(C) 40.23％： 皮部分(D) 53.21％）。
【００３１】
ジクロロメタンを(各試料の重量の二倍)上記ペースト状の根に添加し、暗所に一晩置いた。その後、分液漏斗を用いて、ジクロロメタン抽出物を分離した。同じ操作を、ジクロロメタンを用いて３回繰り返した。その後、すべてのジクロロメタン画分がプールされた。同様に、塊茎の異なった部分も、(塊茎全体について)上述したように、粉末の抽出物を調製した後、ジクロロメタンで分離抽出された。これらは、風乾され、最終的に1 mlのエタノールに溶解され、更なる分析のために低温暗所で保存された。混合した抽出物は、水分含量を取り除くために無水硫酸ナトリウムを含む漏斗を通過させ、フラッシュエバポレーターで濃縮され、l mlエタノールに溶解され、閉じたバイアルに保存された。香味化合物の定量は、水素炎イオン化検出器(FID)を使用して、ガスクロマトグラフ分析(GC)で決定された。すべてのアルコール抽出物は最終的に、香味成分2-ヒドロキシ-4-メトキシベンズアルデヒドについて、GC-MS法で分析された。
【００３２】
2-ヒドロキシ-4-メトキシベンズアルデヒド(2H4MB)の分析は、標準品と共にTLCプレート(Fluka Chemicals、スイス)に根抽出物をスポットし、ヘキサン：ベンゼン(1:1)を含む溶媒系を用いることによって行った。標準品(2H4MB) (0.47)と一致するRf値のスポットが溶剤で溶出され、UVスペクトルを、Perken-Elmer UV-Vis recording spectrophotometer UV-160で測定した。278nmで最大の吸光が得られた。定量検出はGCで行われた。成分は標準試料のGC保持時間と比較して確認された。
【００３３】
濃縮した揮発物は、GC、キャピラリーカラムを用いた水素炎イオン化検出器(FID)、および島津製作所のGC-14BとQP 5000 MS systemとを用いたGC-MS分析によって分離された。条件は次のとおりである。SPB-1カラム（Supelco、米国、30 m x 0.32 mm、膜厚0.25μM）；オーブン温度プログラム（60℃で２分、250℃まで２℃/分ずつ上昇させ、５分間保持；注入口温度225℃；検出温度250℃；キャリヤーガスヘリウム、流速1 ml/分。分析用の注入溶液量は1μlであった。
【００３４】
GC分析によって、抽出物の2-ヒドロキシ-4メトキシベンズアルデヒド含量は、代謝物として次のとおりであることが示された。
塊茎全体(A) 110 mg/g FW-1皮なしの塊茎(B) 274 mg/g FW-1; 中央のコア部又は髄部(C) 72.4 mg/g FW-1皮部分(D) 53.0 mg/g FW-1
【００３５】
ジクロロメタン画分の食品応用への適合性
ジクロロメタンは、国際がん研究機関によって評価された（IARC. 1986. Monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans : Some halogenated hydrocarbons and pesticide exposures. Lyon, 41: 43-85）。天然香味材料からの香りづけで調製された、抽出溶液(ジクロロメタン)の使用による食料品中の最大残渣限界値は、0.02 mg/kgである（www. docs. justice. gov. mt./lom/ legislation）。
【００３６】
ヒドロキシルラジカル除去活性（Singh, R. P., Chidambara Murthy, K. N., Jayaprakasha, G. K., Studies on the antioxidant activity of Pomegranate (Punica grantum) peel and seed extracts using in vitro models. J. of Agri. Food Chem., 2002,50: 81-86）
ヒドロキシルラジカルは、フリーラジカル病理学で強い損傷種とされてきた。このラジカルは、DNAのヌクレオチドと結合する能力があり、ら旋構造を破壊し、発がん、突然変異および細胞障害の原因となる。さらに、この種は、脂質過酸化プロセスのイニシエーターの1つと考えられている。したがって、本方法では選択された天然産物のヒドロキシルラジカル除去活性が、アスコルビン酸-鉄EDTAをモデルとして使用しヒドロキシルラジカルを生成することによって、評価された。
【００３７】
酸化によって形成されたヒドロキシルラジカルは、DMSOと反応し、ホルムアルデヒドを生成する。DMSOからのホルムアルデヒドの生成は、Fe3+/アスコルビン酸系によるDMSO酸化中に形成されたヒドロキシルラジカルの検出に便利な方法を提供し、ヒドロキシルラジカルの検出に使用された。
【００３８】
材料：
・鉄-EDTA（1:2）混合物：水100 ml中、0.013gのアンモニウム硫酸鉄と0.26gのEDTA
・アスコルビン酸溶液：100 mlの蒸留水中、0.22g
・200 mlのリン酸バッファー（pH 7.4）中、1.70 mlのジメチルスルフォキサイド
・17.5％のトリクロロ酢酸
・EDTA溶液：100 mlの蒸留水中、0.018g
・ナッシュ試薬：１リットルの蒸留水中、２Ｍ又は750グラムの酢酸アンモニウム + 0.05 M又は3 mlの酢酸 + 0.02 M又は2 mlのアセチルアセトン
以前の結果に基づいて、ブドウ搾り粕、ブドウの種、および、ざくろ皮のメタノール抽出物で強い活性を示した３つの抽出物が、このモデルのために選択された。 
【００３９】
方法：
0.025, 0.05, 0.1 m1の抽出物が2％アルコールで調製され、異なった試験管に入れられ、ウォーターバスで気化させた。これらに、鉄-EDTA溶液1 ml、EDTA 0.5 ml、およびDMSO l mlを加えた後、各試験管に0.5 mlのアスコルビン酸を加えることによって反応を開始させた。試験管はしっかりふたをし、80-90℃のウォーターバスで15分間加熱された。その後、すべての試験管に氷冷TCA（17.5％ w/v)１mlを加えて反応を停止させ、２分間置いた後、ナッシュ試薬3 mlを加えて発色のため10-15分間置き、形成されたホルムアルデヒドを決定した。形成された黄色の強度は、試薬なしに対し、412 nmでスペクトル光学的に測定された。
ヒドロキシルラジカルの除去割合は、テスト化合物の結果をブランク（試薬なし）のものと比較して算出された。
【数２】
2007537129.tif 000006
テスト化合物の吸光度については必要な補正がなされた。％ヒドロキシルラジカル除去は、次の式で算出された。
【表３】
2007537129.tif 000007
【００４０】
塊茎の皮部の抽出物は、(fresh weightに基づいた) 塊茎全体と比べて、良好な抗酸化活性を示した。中央のコア（髄）部の抽出物も、塊茎の皮部の抽出物と同様に、ほぼ等しい量の抗酸化活性を示した。
【００４１】
本発明の新規性は、はじめて、デカルピス ハミルトニーの塊状根抽出物の抗酸化活性を決定し、解明した点である。また、１種類のラジカルのみ除去する他の合成抗酸化剤と異なり、（２種類以上のフリーラジカルを除去することができるため）より優れた抗酸化剤を提供することができる。
【００４２】
本発明の主な利点は、以下のとおりである。
1. デカルピス ハミルトニーの塊茎のジクロロメタン抽出物の抗酸化活性の同定および報告。
2. 本研究に基づき、スーパーオキシドのような様々なフリーラジカル類、およびヒドロキシルラジカルに対する抗酸化剤としての性質から、デカルピス ハミルトニーの塊状根の抽出物を様々な製薬目的に利用可能である。また、１種類のラジカルのみ除去する他の合成抗酸化剤と異なり、（２種類以上のフリーラジカルを除去することができるため）より優れた抗酸化剤を提供することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月10日(2004.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デカルピス ハミルトニーのジクロロメタン抽出物の抗酸化剤としての使用であって、該抽出物は薬理的に許容される医薬用添加物または食用物と混合される。
【請求項２】
抗酸化特性は、好ましくはフリーラジカル除去活性である、請求項1記載の使用。
【請求項３】
フリーラジカル除去活性は、ヒドロキシルラジカル除去活性である、請求項２記載の使用。 
【請求項４】
抽出物は、塊状根から得られる、請求項１記載の使用。
【請求項５】
抗酸化活性は、4〜47％の範囲である、請求項１記載の使用。
【請求項６】
抽出物は、100〜1000ppmの範囲で適用される、請求項１記載の使用。
【請求項７】
抽出物は、塊茎の髄と塊茎の皮とから得られる、請求項４記載の使用。
【請求項８】
髄から得られる抽出物の抗酸化活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、30〜45％の範囲である、請求項７記載の使用。
【請求項９】
髄から得られる抽出物の抗ラジカル活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、35〜46％の範囲である、請求項７記載の使用。
【請求項１０】
髄から得られる抽出物のヒドロキシル除去活性は、100〜200ppmの濃度範囲で適用される場合、36〜47％の範囲である、請求項７記載の使用。
【請求項１１】
皮から得られる抽出物の抗酸化活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、36〜47％の範囲である、請求項７記載の使用。
【請求項１２】
皮から得られる抽出物の抗ラジカル活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、32〜48％の範囲である、請求項７記載の使用。
【請求項１３】
髄から得られる抽出物のヒドロキシル除去活性は、100〜200ppmの濃度範囲で適用される場合、43〜49％の範囲である、請求項７記載の使用。
【請求項１４】
デカルピス ハミルトニー Wight & Arn.の塊状根の髄および皮から得られるジクロロメタン抽出物を有効量含む抗酸化組成物であって、１以上の薬理的に許容される添加物と共に任意的に用いられる。
【請求項１５】
デカルピス ハミルトニー Wight & Arn.の塊状根から抗酸化活性の豊かな抽出物を調製する方法であって、該方法は以下のステップを含む。
a) デカルピス ハミルトニーの塊状根をジクロロメタンで抽出して、第１の抽出物を得、
b) 上記ステップ(a)で得られた第１の抽出物を濃縮して、抗酸化活性の豊かな抽出物を得る。
【請求項１６】
上記ステップ(a)において、塊状根を70％のアルコールで洗浄し、表面を殺菌する、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
上記ステップ(a)において、ジクロロメタンと塊状根との重量比は、およそ2：1である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
デカルピス ハミルトニーの塊状根から抗酸化剤として得られるジクロロメタン抽出物の抗酸化活性は、4〜47％の範囲である、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
抗酸化特性は、好ましくはフリーラジカル除去活性である、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
フリーラジカル除去活性は、ヒドロキシルラジカル除去活性である、請求項15記載の方法。
【請求項２１】
抽出物は、塊茎の髄と塊茎の皮とから得られる、請求項15記載の方法。
【請求項２２】
髄から得られる抽出物の抗酸化活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、30〜45％の範囲である、請求項15記載の方法。
【請求項２３】
髄から得られる抽出物の抗ラジカル活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、35〜46％の範囲である、請求項15記載の方法。
【請求項２４】
髄から得られる抽出物のヒドロキシル除去活性は、100〜200ppmの濃度範囲で適用される場合、36〜47％の範囲である、請求項15記載の方法。
【請求項２５】
皮から得られる抽出物の抗酸化活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、36〜47％の範囲である、請求項15記載の方法。
【請求項２６】
皮から得られる抽出物の抗ラジカル活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、32〜48％の範囲である、請求項15記載の方法。
【請求項２７】
髄から得られる抽出物のヒドロキシル除去活性は、100〜200ppmの濃度範囲で適用される場合、43〜49％の範囲である、請求項15記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月3日(2006.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デカルピス ハミルトニーの塊状根の髄および皮のジクロロメタン抽出物の抗酸化剤としての使用であって、該抽出物は薬理的に許容される医薬用添加物または食用物と混合される。
【請求項２】
抗酸化特性は、好ましくはフリーラジカル除去活性である、請求項1記載の使用。
【請求項３】
フリーラジカル除去活性は、ヒドロキシルラジカル除去活性である、請求項２記載の使用。 
【請求項４】
抗酸化活性は、4〜47％の範囲である、請求項１記載の使用。
【請求項５】
抽出物は、100〜1000ppmの範囲で適用される、請求項１記載の使用。
【請求項６】
髄から得られる抽出物の抗酸化活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、30〜45％の範囲である、請求項１記載の使用。
【請求項７】
髄から得られる抽出物の抗ラジカル活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、35〜46％の範囲である、請求項１記載の使用。
【請求項８】
髄から得られる抽出物のヒドロキシル除去活性は、100〜200ppmの濃度範囲で適用される場合、36〜47％の範囲である、請求項１記載の使用。
【請求項９】
皮から得られる抽出物の抗酸化活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、36〜47％の範囲である、請求項１記載の使用。
【請求項１０】
皮から得られる抽出物の抗ラジカル活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、32〜48％の範囲である、請求項１記載の使用。
【請求項１１】
髄から得られる抽出物のヒドロキシル除去活性は、100〜200ppmの濃度範囲で適用される場合、43〜49％の範囲である、請求項１記載の使用。
【請求項１２】
デカルピス ハミルトニー Wight & Arn.の塊状根の髄および皮から得られるジクロロメタン抽出物を有効量含む抗酸化剤として有用な組成物であって、１以上の薬理的に許容される添加物と共に任意的に用いられる。
【請求項１３】
デカルピス ハミルトニー Wight & Arn.の塊状根の髄および皮部分から抗酸化活性の豊かな抽出物を調製する方法であって、該方法は以下のステップを含む。
a) デカルピス ハミルトニーの塊状根をジクロロメタンで抽出して、第１の抽出物を得、
b) 上記ステップ(a)で得られた第１の抽出物を濃縮して、抗酸化活性の豊かな抽出物を得る。
【請求項１４】
上記ステップ(a)において、塊状根を70％のアルコールで洗浄し、表面を殺菌する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
上記ステップ(a)において、ジクロロメタンと塊状根との重量比は、およそ2：1である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
デカルピス ハミルトニーの塊状根から抗酸化剤として得られるジクロロメタン抽出物の抗酸化活性は、4〜47％の範囲である、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
抗酸化特性は、好ましくはフリーラジカル除去活性である、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
フリーラジカル除去活性は、ヒドロキシルラジカル除去活性である、請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
髄から得られる抽出物の抗酸化活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、30〜45％の範囲である、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
髄から得られる抽出物の抗ラジカル活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、35〜46％の範囲である、請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
髄から得られる抽出物のヒドロキシル除去活性は、100〜200ppmの濃度範囲で適用される場合、36〜47％の範囲である、請求項１３記載の方法。
【請求項２２】
皮から得られる抽出物の抗酸化活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、36〜47％の範囲である、請求項１３記載の方法。
【請求項２３】
皮から得られる抽出物の抗ラジカル活性は、500〜1000ppmの濃度範囲で適用される場合、32〜48％の範囲である、請求項１３記載の方法。
【請求項２４】
髄から得られる抽出物のヒドロキシル除去活性は、100〜200ppmの濃度範囲で適用される場合、43〜49％の範囲である、請求項１３記載の方法。
【国際調査報告】
2007537129.tif 000008
2007537129.tif 000009