(57)【要約】生体組織のイオン移行チャンネルでの化合物効果研究に役立つ、パッチクランプ技法の急速灌流を実行するためのシステムを開示する。本発明は、さらに、少量の試験される材料および少量の液状キャリアの利用が可能で、よって、複数の試験を短期間で達成することができる、微小灌流チャンバーアセンブリを含む。本発明は、大量処理および低用量の溶液およびサンプルを提供すると同時に、より広範囲に、薬物などの化学製品のスクリーニングに使用される、電子生理学的薬物取扱いおよび適用に関係する。る。
2007535931.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェースチャンバーを備え、前記インターフェースチャンバーは、細胞を懸濁可能なインターフェースバスを提供するものである、システム。
【請求項２】
前記細胞と結合される電極を含有するピペットをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記インターフェースチャンバーが、電極である、請求項３に記載のシステム。
【請求項４】
インターフェースチャンバーを備え、細胞はギガシールインターフェースでキャピラリーと結合されており、前記インターフェースチャンバーおよびキャピラリーは、前記キャピラリーが前記インターフェースチャンバーを通ってスライドできるよう、相対的に移動可能であり、前記インターフェースチャンバーは、液体の懸濁に適しているものである、インターフェースシステム。
【請求項５】
前記マイクロピペットは電極を含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記インターフェースチャンバーが電極である、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
ロッドが、前記インターフェースチャンバーと連結されている、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記インターフェースチャンバーは実質的に円筒形である、請求項６に記載のシステム。
【請求項９】
前記インターフェースチャンバーはコイルである、請求項６に記載のシステム。
【請求項１０】
前記インターフェースチャンバーは、１００ｕＬを超えない用量の液体を懸濁するのに適している、請求項６に記載のシステム。
【請求項１１】
前記細胞は、哺乳類細胞である、請求項６に記載のシステム。
【請求項１２】
前記電極間の電流および電圧の少なくとも一つを測定するための装置をさらに備える、請求項６に記載のシステム。
【請求項１３】
インターフェースチャンバー電極およびキャピラリー電極の少なくとも一つによって測定される、電圧および電流の少なくとも一つの記録のための記録手段をさらに備える、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
パッチクランプシステムであって、
ａ）電極を備えるキャピラリーと、
ｂ）前記キャピラリーと連結される細胞であって、前記キャピラリーおよび前記細胞の細胞膜間でギガシールを形成するのに十分なように連結されている細胞と、
ｃ）電極を備えるインターフェースチャンバーであって、前記インターフェースチャンバーおよびキャピラリーは、前記キャピラリーが前記インターフェースを通ってスライドできるよう相対的に移動可能であり、前記インターフェースチャンバーは、液体を含有および懸濁するのに適した形状である、インターフェースチャンバーと、
ｄ）前記電極間の電流および電圧の少なくとも一つを測定するための装置と、
ｅ）複数の貯蔵槽を備えるプレートであって、少なくとも一つの貯蔵槽は、試験化合物を含む、プレートと、
を備えるパッチクランプシステム。
【請求項１５】
細胞の特性を測定する方法であって、
ａ）インターフェースチャンバーに細胞を置くステップであって、前記インターフェースチャンバーは、インターフェースバスで前記細胞を懸濁し、前記細胞は、キャピラリーに固定される、ステップと、
ｂ）前記細胞の一つまたはそれ以上の特性を測定するステップと、
を含む方法。
【請求項１６】
細胞の特性を測定する方法であって、
ａ）インターフェースチャンバーに細胞を置くステップであって、前記細胞は、ギガシールによりキャピラリーに固定され、前記インターフェースチャンバーおよびキャピラリーは、前記キャピラリーがインターフェースチャンバーを通ってスライドできるよう相対的に移動可能である、ステップと、
ｂ）前記細胞の一つまたはそれ以上の特性を測定するステップと、
を含む方法。
【請求項１７】
前記インターフェースチャンバーは電極である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記インターフェースチャンバー電極およびマイクロピペット電極は、細胞膜を横切って電流を測定するように構成されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記インターフェースチャンバーはロッドと連結されており、さらに、前記キャピラリーの軸に沿って前記インターフェースチャンバーを移動するために、ロッドを使用するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞は哺乳類細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ａ）前記インターフェースシステムを貯蔵槽へ移動するステップであって、前記貯蔵槽は試験化合物の溶液を含むステップと、
ｂ）細胞膜を横切って流れる電流を測定するステップと、をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記試験化合物の溶液は、３５０ｕＬ未満の用量である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記貯蔵槽は、プレートに配置された複数の貯蔵槽の一つである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の貯蔵槽は、一つまたはそれ以上の異なる試験化合物を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数の貯蔵槽に対して、前記移動するステップおよび測定するステップを反復するステップをさらに含み、前記インターフェースシステムは、各測定するステップの前に異なる貯蔵槽へ移動される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記インターフェースシステムは、少なくとも一つの移動ステップの前に洗浄される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
一つまたはそれ以上のステップが自動化された、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞膜の一つまたはそれ以上のリガンド依存型チャンネルを横切る電流を測定するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記リガンド依存型チャンネルは、グルタミン、ＧＡＢＡおよびアセチルコリンからなるグループから選択される化合物に反応する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞膜の一つまたはそれ以上の電位依存型チャンネルを測定するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
細胞の特性を測定する方法であって、
ａ）インターフェースチャンバーを含むインターフェースシステムを確立するステップであって、細胞は、キャピラリーおよび細胞間でシールを形成するのに十分となるよう前記キャピラリーと結合され、前記インターフェースチャンバーおよびキャピラリーは、前記キャピラリーが前記インターフェースチャンバーを通ってスライドできるよう相対的に移動可能であり、前記インターフェースチャンバーは、液体を含有および懸濁するのに適した形状である、ステップと、
ｂ）前記電極間の電流および電圧の少なくとも一つを測定するための手段を確立するステップと、
ｃ）前記インターフェースシステムを、試験化合物を含む第一の貯蔵槽へ移動するステップと、
ｄ）細胞膜を横切って流れる電流を測定するステップと、
を含む方法。
【請求項３２】
一つまたはそれ以上の異なる貯蔵槽に対して、移動するステップと測定するステップを反復するステップをさらに含み、前記インターフェースシステムは各測定するステップの前に異なる貯蔵槽へ移動される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記インターフェースチャンバーが一つの貯蔵槽から他の貯蔵槽へ移動される間、前記キャピラリー電極の非補償型電気容量がほぼ同じである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞をキャピラリーに付着させる方法であって、
ａ）前記キャピラリー内に陽圧をかけるステップと、
ｂ）前記キャピラリーを細胞のち密層に挿入するステップであって、前記キャピラリーは、前記キャピラリーの端を破損せずに前記細胞を前記キャピラリーに付着させるのに適切な深度で挿入される、ステップと、
ｃ）前記キャピラリーおよび細胞間にギガシールを形成するために、前記キャピラリーの圧力を減少させるステップと、
を含む方法。
【請求項３５】
ａ）細胞層から前記キャピラリーを除去するステップと、
ｂ）前記細胞の全細胞構成を確立するために、さらにキャピラリー内の圧力を減少させるステップと、をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
細胞をキャピラリーに付着させる方法であって、
ａ）前記キャピラリー内に約９００〜１０００ｍｍＨｇ（絶対）の陽圧をかけるステップと、
ｂ）前記キャピラリーを前記細胞のち密層へ挿入するステップと、
ｃ）前記キャピラリーおよび細胞間のギガシールを形成するために、前記キャピラリー内の圧力を約７００ｍｍＨｇへ減少させるステップと、
ｄ）前記細胞層から前記キャピラリーを除去するステップと、
ｅ）前記細胞の全体細胞構成を確立するために、さらに前記キャピラリー内の圧力を６００〜６５０ｍｍＨｇに減少させるステップと、
を含む方法。
【請求項３７】
細胞の特性を測定する方法であって、
ａ）インターフェースチャンバーに細胞を置くステップであって、前記インターフェースチャンバーは、前記細胞を前記インターフェースチャンバーのインターフェースバスに浸し、前記細胞は、請求項３４または３５に記載の方法によりキャピラリーに固定されるステップと、
ｂ）前記細胞の一つまたはそれ以上の特性を測定するステップと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急速灌流の実行、および生体膜およびそれらの内在性膜タンパク質の研究のために「ブラインドパッチ」手段で記録される、パッチクランプの獲得のためのシステムに関連する。さらに特定すると、本発明は、薬物などの化学製品のスクリーニングに使用させる、電子生理学的薬物取扱いおよび適用に役立つ、大量処理および低容量条件をもつパッチクランプ灌流システムに関連する。本発明は、大量処理スクリーニングのための装置およびその装置の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
多くの細胞工程は、キャリアタンパク質およびイオンチャンネルのため、細胞膜電位の変化により制御される。キャリアタンパク質は、特定の溶質を結合し、一つの膜、そして次の膜に順次に溶質結合部位をさらす構造変化を生じることにより、それらを生体細胞膜の脂質二重層を渡って移動する。あるキャリアタンパク質は、単に、単一溶質「ダウンヒル」、つまり、溶質の濃度および／または電気化学的勾配に沿って移動する。他のキャリアタンパク質は、ＡＴＰの加水分解、または必要な一連の構造変化（Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓら，１９９４年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．Ｉｎｃ．第３版，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙで概評）を生じさせるための他の溶質（ナトリウムなど）の「ダウンヒル」の流れにより供給されたエネルギーを使用して、溶質の濃度および／または電気化学的勾配に対して溶質「アップヒル」を移動するために、ポンプのように働くことができる。ＡＢＣトランスポーターのスーパーファミリーのような複数のキャリアタンパク質は、特に臨床的に重要である。これらのタンパク質は、癌細胞およびマラリアの原因である寄生体だけでなく、嚢胞性線維症の原因として知られる。
【０００３】
キャリアタンパク質と異なり、イオンチャンネルタンパク質は、イオンおよび他の分子を一つの場所から他へ通過させる、生体膜に細孔を形成する膜貫通タンパク質である。イオンチャンネルには様々なタイプがある。例えば、「漏出チャンネル」は、全ての生理学的膜状態で、開放的である。「電位依存型チャンネル」は、膜の電位に応じて開く。「リガンド依存型チャンネル」は、細胞外の媒介物（例えば、神経伝達物質）または細胞内媒介物（例えば、イオンまたはヌクレオチド）のような特定の分子の結合に反応する。また、他のイオンチャンネルは、Ｇタンパク質のようなタンパク質との相互作用により調節される。
【０００４】
イオンチャンネルタンパク質は、主に特定のイオンの浸透を媒介する。例えば、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、クロライド（Ｃｌ−）、カルシウム（Ｃａ２＋）チャンネルが、確認されている。イオンチャンネルは、細胞膜の反対側の電荷の相違である、細胞膜電位を引き起こす大きな原因である（前記Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓら）。動物細胞において、Ｎａ＋、Ｋ＋およびＡＴＰａｓｅｓは、Ｎａ＋の細胞内濃度を低く、そしてＫ＋の細胞内濃度を高く維持する。これらのＡＴＰａｓｅｓに反して、Ｋ＋漏出チャンネルは、Ｋ＋イオンに、Ｋ＋濃度勾配を移動させ、細胞の外へ移動させることを可能にする。これにより、複数のイオンチャンネルが、細胞膜電位の形成に寄与する。
【０００５】
電位依存型およびリガンド依存型イオンチャンネルは、ほとんどの筋肉および神経細胞を含む電気的興奮性細胞で、細胞膜活動電位を発生させる原因である（前記Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓら）。例えば、活動電位が、電位依存型Ｎａ＋チャンネルを介してＮａ＋の流入により生じる、細胞膜脱分極により誘発される。活動電位は、分泌細胞および神経でホルモンおよび神経伝達物質の放出を引き起こす。これらは、筋肉細胞の収縮を引き起こし、生化学的事象および遺伝子発現のレベルに影響を与える。しかし、イオンチャンネルは、興奮性細胞に限られるものではないことを記述する。事実、電位依存型Ｎａ＋、Ｋ＋またはＣａ２＋チャンネルは、多様な非興奮性細胞タイプに存在する（前記Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓら）。
【０００６】
多様なキャリアタンパク質およびイオンチャンネルは、製薬用薬剤の新しい標的の豊富な収集を表す。多くの化学物、化合物およびリガンドは、キャリアタンパク質および／またはイオンチャンネル活動に影響することで知られる。さらに、キャリアタンパク質およびイオンチャンネルを調整する薬剤は、多様な疾患、障害または状態の治療に使用されうる、薬用組成物に調合されることが可能である（Ｓ．Ａ．Ｎ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９９６、Ｎｅｕｒｏｎ  １６：９１３〜９１９）。例えば、ＡＢＣトランスポーターの活動を調節する薬剤は、嚢胞性線維症および／または癌の治療に使用される。Ｃａ２＋チャンネルの活動を調節する薬剤は、てんかん、不安症およびアルツハイマー病の治療に使用される。さらに、Ｎａ＋チャンネルの活動を調節する薬剤は、筋痙攣、斜けい、振せん、学習障害、脳腫瘍、痛みおよびアルツハイマー病の治療に使用されうる。Ｎａ＋チャンネルを阻止する薬剤は、局部麻酔に使用されうる。上皮Ｎａ＋チャンネルを調節する薬剤は、嚢胞性線維症、ぜんそくおよび高血圧の治療に使用される。さらに、Ｋ＋チャンネルの活動を調節する薬剤は、無酸素性および虚血性疾患の損傷作用の反作用、およびマラリアおよび鎌状血球症の損傷に対して赤血球を保護するのに使用される（Ｊ．Ｒ．Ｅｎｆｅｉｌｄら、１９９５、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎｅｗｓ  ２：２３〜２７）。
【０００７】
イオンチャンネル活動は、パッチクランプ分析の技法を使用して測定することができる。マイクロピペットを使用して膜のパッチを電気的に隔離し、電位固定状態下でそのパッチのチャンネルタンパク質を研究するという一般的な考えは、Ｎｅｈｅｒ、ＳａｋｍａｎｎおよびＳｔｅｉｎｂａｃｋにより、「Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｃｈ  Ｃｌａｍｐ，Ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  Ｃｕｒｒｅｎｔｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｏｐｅｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｃｅ」（Ｐｆｕｌｕｅｇｅｒ  Ａｒｃｈ、３７５；２１９〜２７８、１９７８）で要約されている。彼らは、筋肉細胞膜の表面に対してアセチルコリン（ＡＣＨ）を含むピペットを押し付けることにより、ＡＣＨ活性されたイオンチャンネルの開閉に起因する電流で、個々のジャンプを観察できることを発見した。しかし、ピペットのガラスおよび膜間の耐性（１０〜１５メガオーム）は、チャンネルの耐性（約１０ギガオーム）に対して、とても小さいという事実により、彼らの研究は制限された。
【０００８】
ピペットの先端熱加工およびピペットの内部への軽い吸引の適用により、ピペットが細胞の表面に接触されると、非常に高耐性のシール（１〜１００ギガオーム）が得られることが発見された。この技法は、生体問題の多くのチャンネルが研究される干渉を大幅に減少する。この改善されたシールは、「ギガシール」と名付けられ、ピペットは、「パッチピペット」と表示される。パッチクランプ技法の改善における彼らの研究に対して、ＮｅｈｅｒおよびＳａｋｍａｎｎは、１９９１年生理医学ノーベル賞を受賞した。
【０００９】
パッチクランプ技法は、生物学および医学で大きな進展を示す。例えば、本技法は、単一イオンチャンネルタンパク質を介して流れるイオンの測定を可能にし、薬剤に反応する単一イオンチャンネルの研究を可能にする。つまり、一般的なパッチクランプ技法において、高ガラスピペット（基本的に、先端の直径が約１μｍ）は、細胞膜の表面に対して押し付けられる。ピペット先端は、細胞に固くシールされ、膜の極小のパッチにいくつかのイオンチャンネルタンパク質を隔離する。これらのチャンネルの活動は、電気的（単一チャンネル記録）に測定、または代替的に、膜のパッチは、破断され、全細胞膜のチャンネル活動の測定（全細胞記録）を可能にする。
【００１０】
単一チャンネル記録および全細胞記録の双方の間、個々のチャンネル亜型が、膜に「電位固定」を課すことにより、さらに分解される。フィードバックループの使用により、「電位固定」は、膜に電位勾配を課し、全体的なチャンネルの活動を制限および制御し、個々のチャンネル亜型の分離を可能にする。
【００１１】
このような実験での時間分解および電位制御は、印象的で、しばしばミリ秒またはμ秒範囲でさえある。しかし、薬剤的なスクリーニングでの一般的な方法としてのパッチクランプ技法の主な大きな障害は、１日に試験できる化合物の数が限られていることである。さらに、一般的な技法は、サンプル化合物変化の遅い速度およびパッチクランプピペットに必要とされる厳密な位置により、さらに制限される。
【００１２】
各パッチクランプ技法の処理量を考えたときの主な制限は、溶解された試験化合物を細胞およびパッチへ送る、灌流システムの特質である。既存のパッチクランプ設定において、細胞は生理的食塩液で継続的に灌流される、大型の実験チャンバー（０．２〜２ｍＬウェル）に置かれる。そして、化合物は、少数の溶液ボトルに接続された弁の注入口を変えることにより適用される。しかし、この技法は、複数の欠点がある。まず、一回に接続されうる異なる化合物の数は、ボトルの数により制限される。二番目に、試験に必要な支持液および／またはサンプルの用量は、時間および供給コストによる律速工程を残す。三番目に、細胞およびパッチの周りの溶質組成物を変える時間は、長いままである。よって、パッチクランプ記録の処理量を増加する複数の試みがあった。
【００１３】
Ｕキャピラリーおよび他のシステムのように、神経伝達物質調節されたチャンネルを活性する化合物の部分的適用のための複雑なシステムの改善は、効率的な適用時間を削減する。しかし、これらの急速適用システムにより交換された浴溶液の用量は、かなり大きく、１日の多重化合物のスクリーニングの量を制限する結果となる。これは多大な数の化合物または異なる濃度の試験に必要とされる時間で、高い試薬コストのため、医療産業でのこれらの工程の使用を制限する。主な原因は、従来のパッチクランプの実験で使用されるシステムと実質的に同一である、Ｕキャピラリーを満たす供給システムに柔軟性がないことと、その容量が低いことである。
【００１４】
Ｏｌｅｓｅｎら（集合的に、以下「Ｏｌｅｓｅｎ」）の米国特許第６，０６３，２６０号、６，１１７，２９１号および６，４７０，２２６号は、パッチピペット自動的に細胞浴から選択された細胞をパッチさせる、コンピュータ化されたモータ制御システムを開示した。次に、ピペット先端および細胞は、パッチクランプ測定のために、一つまたはそれ以上の化学液および洗浄溶液を含む灌流チャンバーに固定されたままである。自動サンプラーは、代替的に多様な源から灌流チャンバーに液体を導く弁を制御する。灌流チャンバーの管は、使用済み液体をチャンバーの外へ吸引する。細胞が、試験溶液に浸されたら、パッチクランプ測定が行われてよい。Ｏｌｅｓｅｎにおいて、灌流チャンバーは、移動しない。むしろ、複雑な一連のチューブおよびポンプが、試験化学物質および洗浄浴槽をインターフェースチャンバーの内外へ送るために使用される。よって、細胞（およびピペット）を異なる試験および洗浄溶液に移動する代わりに、溶液が自動サンプラーを介して固定された細胞に運ばれてくる。自動サンプラーにより生じる電気的干渉（および振動）を最小限にするため、パッチクランプ測定を実行するときに、特別な注意が払われる。
【００１５】
Ｆａｒｂら（以下、「Ｆａｒｂ」）の米国特許第６，０４８，７２２号は、複数の試験および洗浄溶液でパッチされた細胞を灌流する、自動パッチクランプ灌流システムを開示した。試験および洗浄溶液は、複数の貯蔵槽から多重バレル多岐管を介して、パッチされた細胞を含む記録チャンバーに排出される。弁は、一定の時間で、どの溶液が細胞を灌流するかを制御する。Ｏｌｅｓｅｎシステムのように、Ｆａｒｂシステムは、細胞を溶液に移動させるより、溶液を細胞に移動させる。
【００１６】
Ｗｅａｖｅｒら（以下、「Ｗｅａｖｅｒ」）により、２００１年７月６日にファイルされた、米国特許第０９／９００，６２７号は、細胞膜に固定するために、ピペット先端を使用せずに細胞の電気性質を測定できるシステムを開示した。むしろ、複数の多孔面の細孔が、複数の細胞膜に固定されシールされた。多孔面の一面は外側電極に結合され、もう一面は測定電極に結合される。多孔面がマイクロチップである、一実施例において、各細胞は、細胞特性の測定ができるように、それ自身が接地、測定電極である電極に接合されている。試験溶液は、一つまたはそれ以上の多孔面に適用されると、パッチクランプ記録は、結合された細胞を測定する。複数の多孔面がマルチウェルプレートで同時に試験されるために、システムは自動化されえる。
【００１７】
Ｎｏｒｗｏｏｄら（以下、「Ｎｏｒｗｏｏｄ」）により、２００１年３月２１日にファイルされた、米国特許出願第１０／２３９，０４６号（公開番号ＵＳ２００３／０１３９３３６Ａｌ）は、パッチピペットが、キャピラリーチューブの底から懸濁された液滴のような、懸濁液の液体空気界面に位置する、細胞に固定されるシステムを提供する。チューブ内の圧力の増加（または減少）が、円形凸部の液体空気海面に外側（または内側）にふくれさせる。細胞が円形凸部に位置するため、細胞の位置は内部チューブ圧力の調節により制御される。凸部を外側にふくれさせると、細胞は、チューブのちょうど下に位置するパッチピペットに接触し、凸部の上方向に向かう。細胞が、パッチピペットに触れると、ピペットは、ギガシール（ギガオームシール）を形成し、パッチクランプ測定の準備のため、細胞を「パッチ」する。Ｎｏｒｗｏｏｄシステムにおいて、細胞は、パッチ前はパッチピペットの外側である。また、空気圧力システムは、細胞液体を保持し、懸濁する第二チューブに適用される。空気圧力はパッチピペット自体には適用されない。
【００１８】
高処理スクリーニングを実行するための急速で、低コストおよび／またはより実用的は方法の必要がある。そのような高処理スクリーンは、イオンチャンネル活動調整する薬剤の研究および特定のために、貴重である。よって、そのような薬剤は、癌、心臓疾患、嚢胞性線維症、てんかん、痛み、視覚消失および聴覚消失などの多様な疾患の治療に役立つ。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は自動薬物取扱いおよび適用のためのシステムを提供し、薬物などの化学製品のスクリーニングのためのシステムに利用する。特に、方法およびシステムは、高処理および低液体用量条件を提供しながら、イオンチャンネル移動の効果を測定するために使用される。本発明の目的において、「イオンチャンネル」は、漏出チャンネル、電位依存型チャンネル、機械依存型、リガンド依存型チャンネルおよびいかなる他のクラスのチャンネルタンパク質を意味する。
【００２０】
本発明の一実施例は、試験に必要な化学化合物量の削減である。他の実施例は、数多くのスクリーニングが単一細胞に用いることができ、この結果、スクリーニングの率を増加するという、方法を提供する。
【００２１】
他の実施例は、スクリーニング工程中、細胞を液体に浸漬しておくシステムを使用するシステムおよび方法を提供する。他の実施例は、急速脱感作リガンド依存型イオンチャンネル研究に必要な、パッチクランプ制御下の細胞膜を囲む灌流液の平均時間を最小化する。
【００２２】
本発明の一実施例は、インターフェースチャンバーからなるシステムを提供する。ここで、インターフェースチャンバーは、細胞を懸濁することができるインターフェースバスを提供する。本システムは、パッチクランプ技法を実行する方法に特に適している。
【００２３】
他の実施例は、インターフェースチャンバーを備え、細胞はギガシールを介してキャピラリーと結合され、前記インターフェースチャンバーおよびキャピラリーは、前記キャピラリーが前記インターフェースチャンバーを通ってスライドできるよう、相対的に移動可能であり、前記インターフェースチャンバーは、液体の懸濁に適している、インターフェースシステムを提供する。
【００２４】
他の実施例は、パッチクランプシステムであって、電極を備えるキャピラリーと、前記キャピラリーと連結される細胞であって、前記キャピラリーおよび前記細胞の細胞膜間でギガシールを形成するのに十分なように連結される細胞と、電極を備えるインターフェースチャンバーであって、前記インターフェースチャンバーおよびキャピラリーは、前記キャピラリーが前記インターフェースを通ってスライドできるよう相対的に移動可能であり、前記インターフェースチャンバーは、液体を含有および懸濁するのに適した形状である、インターフェースチャンバーと、前記電極間の電流および電圧の少なくとも一つを測定するための装置と、複数の貯蔵槽を備えるプレートであって、少なくとも一つの貯蔵槽は、試験化合物を含む、プレートと、を備えるパッチクランプシステムを提供する。
【００２５】
一実施例において、本発明は、細胞の特性を測定する方法であって、インターフェースチャンバーに細胞を置くステップを含み、前記インターフェースチャンバーは、インターフェースバスで前記細胞を懸濁し、前記細胞は、キャピラリーに固定される方法を提供する。それから前記細胞の一つまたはそれ以上の特性が測定されてもよい。
【００２６】
他の実施例において、本発明は、細胞の特性を測定する方法であって、インターフェースチャンバーに細胞を置くステップを含み、前記細胞は、ギガシールによりキャピラリーに固定され、前記インターフェースチャンバーおよびキャピラリーは、前記キャピラリーがインターフェースチャンバーを通ってスライドできるよう相対的に移動可能である、方法を提供する。それから前記細胞の一つまたはそれ以上の特性が測定されてもよい。
【００２７】
また、他の実施例は、細胞の特性を測定する方法であって、インターフェースチャンバーを含むインターフェースシステムを確立するステップであって、細胞は、キャピラリーおよび細胞間でシールを形成するのに十分となるよう前記キャピラリーと結合され、前記インターフェースチャンバーおよびキャピラリーは、前記キャピラリーが前記インターフェースチャンバーを通ってスライドできるよう相対的に移動可能であり、前記インターフェースチャンバーは、液体を含有および懸濁するのに適した形状である、ステップと、前記電極間の電流および電圧の少なくとも一つを測定するための手段を確立するステップと、前記インターフェースシステムを、試験化合物を含む第一の貯蔵槽へ移動するステップと、細胞膜を横切って流れる電流を測定するステップと、を含む方法を提供する。
【００２８】
本発明の前述および他の目的、利点および特徴となる性質は、以下の例示的な実施例の説明と添付の図面から明らかとなるが、図面において、同様の参照番号は、多様な図を通して同様の要素を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
図１Ａ〜１Ｃは、本発明の一実施例によるとフィンターフェースシステム７を示す。インターフェースシステム７は、細胞１０、細胞膜１０ａと結合することができるキャピラリー２、キャピラリー先端２ａを入れるのに移動可能なインターフェースチャンバー６、インターフェースチャンバー６と連結するロッド８およびキャピラリー先端２ａを浸すことができる液体１２からなる。
【００３０】
図１Ａに示すように、パッチクランプ技法の全細胞構成は、例えば、マイクロスコープ下で確立することができる。図１Ｂにおいて、コイル型のインターフェースチャンバー６は、電極先端を覆うことができ、細胞は、溶液に浸すことができるものであり、インターフェースシステム７を形成する。図１Ｃにおいて、インターフェースシステム７は、溶液から除去することができる。
【００３１】
図１Ｂ、１Ｃおよび３に示すように、「インターフェースシステム」７は、キャピラリー２、キャピラリー２および細胞膜１０ａ間にシールを形成するために十分な方法でキャピラリー先端２ａに固定する細胞１０、およびキャピラリー先端２ａ、細胞１０、および毛管力および／または液体の表面張力によりインターフェースチャンバー６に懸濁される少量の液体２６を入れたインターフェースチャンバー６からなる。液体２６は、インターフェースチャンバー６の内側で懸濁することができる。
【００３２】
キャピラリー２は、一つまたは両端が空洞でもよく、好ましくは形状がほぼ円筒状である。キャピラリー２は、その先端２ａに開口部を含んでよい。キャピラリー２は、ほぼ円錐状の形状でもよい。キャピラリー先端２ａは、哺乳類、昆虫類、両生類、または他の細胞のような、細胞１０に固定できるサイズおよび形でよい。例えば、キャピラリー先端２ａの開口部は、直径、約０．１から１０ミクロンである。
【００３３】
キャピラリー２は、またはいかなる管状装置または形状が管状の装置の一部を含んでいてもよい。好ましくは、キャピラリー２は、パッチピペットを含む。本明細書で使用されているように、「パッチピペット」という用語は、細胞１０に固定し、ギガシールを形成するパッチクランプ技法で使用される一切のチューブを意味する。さらに好ましくは、キャピラリー２は、キャピラリー先端２ａをもつ円錐状で終わるチューブからなり、「マイクロピペット」と称する。マイクロピペット先端２ａの開口部は、哺乳類細胞のような、動物細胞１０の細胞膜１０ａに固定される構成でもよい。
【００３４】
図２Ａ〜２Ｃは、本発明の実施例によると、高細胞密度ブラインドパッチクランプを示す。本高細胞密度ブラインドパッチクランプは、細胞１０をキャピラリー２に固定するのに使用することができる。一実施例において、安定したｈＥＲＧチャンネルを発現する細胞は、チューブに収集され、遠心分離される、従来の方法により酵素的に分離されてよい。細胞は、他のチューブに順次収集され、ち密細胞層１１、例えば、１〜１０ｍｍの深度、好ましくは２〜７ｍｍの深度、さらに好ましくは３〜５ｍｍの深度の層に沈下することを可能にさせる。上述の細胞層１１の性質は、ピペット先端２ａを破損せずにパッチピペット２の細胞への挿入を可能にする。例えば、パッチピペット先端２ａは、細胞層１１の１〜４ｍｍの深度に挿入されてもよい。これは、パッチピペットのブラインド操作およびキャピラリー細胞１０の細胞膜およびパッチピペット２間の高耐性密接電気結合（ギガシール）のブラインド形成を可能にする。これを達成する一方法は、以下に記述される。
【００３５】
最初に図２Ａを参照すると、陽圧は、パッチピペット２内に適用することができる。陽圧は、例えば、９００〜１０００ｍｍＨｇ（絶対）でよい。ピペット２は、細胞層１１の表面の上、例えば表面の上１０ｍｍ、のチューブ内に位置づけられてよい。
【００３６】
二番目に、図２Ｂを参照に、パッチピペット２は、細胞層１１に挿入されてよい。挿入の深度は、ミリメータおよびマイクロメータの任意の範囲間で変更されてよい。図２Ｂに示される例において、深度は、例えば、１および５ｍｍの間で変更されてよい。圧力の変更（例えば、７００ｍｍＨｇ）は、ピペット２および特定の細胞１０間のギガシールの自発的形成を生じるものである。ギガシールの形成後、ピペット先端２ａに固定されたパッチピペット２および細胞１０は、細胞層１１から除去することができる。それから、ピペット２および細胞１０は、細胞層１１の上、例えば層１１の上１０〜１５ｍｍに位置づけられてもよい。
【００３７】
三番目に、図２Ｃを参照すると、全細胞構成は、パッチピペット内の圧力を、例えば、６００〜６５０ｍｍＨｇに変更することにより確立されてよい。その後、圧力は、パッチクランプ記録の安定を確保するために、異なる圧力、例えば、７００〜７４０ｍｍＨｇのような、より高い圧力で保持されてよい。
【００３８】
インターフェースチャンバー６は、図２Ａ〜２Ｃに示すように工程中どの点においても細胞１０および／または液体１２を含有するのに使用されてもよいことに、注意すべきである。例えば、ピペット２が図２Ｂに示される位置にあるとき、インターフェースチャンバー６は、図２Ｃに示すように、液体１２の表面上にあるピペット２の軸の位置から、インターフェースチャンバー６が細胞１０を含む、液体１２の表面下の位置に、移動することができる。これは、ピペット２が細胞１０とギガシールを形成した後（または前）に実行することができる。好ましい実施例において、潜在的に細胞を損傷し、順次不成功率を増加させるかもしれないので、インターフェースチャンバー６は、細胞層１１に挿入されない（図２Ｂ）。
【００３９】
細胞１０がパッチピペット２に固定されると、細胞層１１の外へ移動され（図２Ｃ）る。この際、インターフェースチャンバー６は、パッチされた細胞１０を覆うように位置づけられる。インターフェースチャンバー６およびピペット２は、部品が一体として移動することができる。つまり、インターフェースシステム７では、細胞１０、ピペット２およびインターフェースチャンバー６は、相対的な位置を確保する。所望するなら、インターフェースシステム７は、現時点で、安全に、空気を介してチューブから一つまたはそれ以上の異なる貯蔵槽１８に移動することができる。インターフェースチャンバー６が細胞１０を囲む液体浴を懸濁できるように、細胞１０を空気に露出することを避けることが所望されるとき、本方法または関連する方法が好ましい。
【００４０】
本発明の他の実施例は、細胞１０の特性を測定するために、本発明のインターフェースシステム７を使用する方法、例えば図１Ｂ、１Ｃおよび３、を示す。インターフェースシステム７は、キャピラリー２、キャピラリー２および細胞１０の細胞膜１０ａ間のシールを形成するのに十分な方法でキャピラリー先端２ａに固定された細胞１０、およびインターフェースチャンバー６を含んでいる。インターフェースチャンバー６は、キャピラリー先端２ａ、細胞１０および毛管力および／または液体の表面張力によって懸濁された少量の液体２６を封入している。
【００４１】
図３は、インターフェースシステムおよびマルチウェルプレートを備えている、典型的なパッチクランプシステムを示す。パッチクランプシステムは、一つまたはそれ以上の貯蔵槽１８を含むマルチウェルプレート１６を備えている。本明細書で使用されるように、「貯蔵槽」という用語は、少量の液体を含有できる任意の表面を意味する。これは、ウェルおよびくぼみ、および少量の液体が、液体の表面張力によってまとまっている、明瞭な小滴を形成する平面、を含む。好ましくは、貯蔵槽１８は、１ｕＬ、５ｕＬ、１０ｕＬ、５０ｕＬ、１００ｕＬ、２００ｕＬまたは５００ｕＬの最小量を保持することができる。貯蔵槽１８は、好ましくは、１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬまたは１０ｍＬの最大量を保持することができる。貯蔵槽は、また、これらの最小および最大量のいかなる組み合わせを保持するものでもよい。例えば、貯蔵槽１８は、増加分の間の増加分だけでなく、５ｕＬから２ｍＬまたは１００ｕＬから１ｍＬ間において、液体の増加量を保持するものでもよい。さらに好ましくは、貯蔵槽１８は、１０ｕＬから２ｍＬ間の液体を保持することができる。さらにより好ましくは、貯蔵槽１８は、２０ｕＬから１ｍＬ間の液体を保持することができる。各貯蔵槽１８は、一つまたはそれ以上の試験化合物２０を含むものでもよいし、または中性溶液を含むものでもよい。試験化合物２０は、薬物、または代替的に、不活性水溶液または塩水などの不活性液体を含んでよい。
【００４２】
好ましくは、インターフェースチャンバー６は、電極を含み、好ましくは、キャピラリー先端２ａは細胞膜１０ａにシールされる。一実施例において、インターフェースシステム７は、試験化合物２０を含む溶液を含んでいる貯蔵槽１８に移動される。電極４は、好ましくは、電極４により電流を測定する装置、および／または、電極４およびインターフェースチャンバー６のような他の基準の電圧を測定する装置、に固定される。外部電流を、所望の値の基準電圧または電流を確立するために、前記電極に印加してもよい。さらに、試験化合物２０を含む溶液にインターフェースシステム７を導入する前および／または後に、細胞膜１０ａ（および／またはインターフェースチャンバー６および電極４の電圧）を流れる電流は、インターフェースチャンバー６および電極４間を接続する回路からなる電気測定手段で測定される。
【００４３】
好ましい実施例において、一つまたはそれ以上の以下のパラメータ（例えば、電気性質）は、細胞で測定される。パラメータは、電圧クランプの電流、電極を横切る電圧および／または細胞または細胞膜を横切る電圧、電気抵抗、インピーダンス、電気容量、光学蛍光、プラスモン共鳴、機械共鳴、流動性および／または強剛性である。
【００４４】
本発明の他の側面において、さらなる試験が同じ細胞１０で実行されてよい。本発明のこの側面は、インターフェースシステム７を貯蔵槽１８から移動し、試験化合物なしにインターフェースシステム７を溶液２０へ入れることにより洗浄してもよい。好ましい洗浄は、２から５回実行され、インターフェースチャンバー６に含まれる液状に残る一切の試験化合物は、細胞１０の活動レベル以下に稀釈される。インターフェースシステム７は、それから、他の試験化合物２０（または洗浄溶液）を含む溶液からなる、他の貯蔵槽１８に移動される。代替的に、もし細胞１０が、同じ試験化合物の低濃度から高濃度に移動するときには、洗浄工程は、一般的な試験実施では、省略することができる。細胞、細胞膜またはシステムの電気性質は、上記のように測定される。本プロセスは、所望するだけ繰り返される。
【００４５】
貯蔵槽１８は、好ましくはマルチウェルまたはマイクロタイタープレート１６により提供される。本発明の目的において、貯蔵槽１８は、インターフェースチャンバー６を貯蔵槽１８へ挿入するのに十分な試験サンプルの癒着を、可能にする十分な表面張力を提供する平面アレイと同様に、液体を入れるウェルおよびくぼみを意味する。貯蔵槽１８は、一つまたはそれ以上の異なる化合物を含んでよい。本発明の一側面において、試験化合物２０は、化学物質または移動阻止または活性剤などの薬剤候補または活動薬剤を含む。例えば、貯蔵槽１８は、癌を治療する薬物の溶液を含んでよい。試験化合物２０は、不活性水溶液または塩水などの不活性液体も含む。
【００４６】
好ましくは、細胞１０の特性を測定することを必要とする試験化合物２０の溶液は、５ミリリッタ未満の用量である。必要とされる最小量は、１０ｕＬ、２０ｕＬ、３０ｕＬ、５０ｕＬおよび８０ｕＬ、およびこれらの用量間の増加分でよい。必要とされる最大量は、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬおよび５ｍＬ、およびこれらの用量間の増加分でよい。試験溶液の用量は、これらの最小および最大量のいかなる組み合わせでもよい。例えば，用量は、液体の増分量、例えば、３０ｕＬから０．５ｍＬの間、または５０ｕＬから５ｍＬの間でよい。さらに好ましくは、用量は、２０ｕＬから１ｍＬの間である。例えば、各ウェルが０．３〜０．３５ｍＬの溶液を入れるよう造られた９６ウェルプレートでよい。
【００４７】
本発明の利点は、標的細胞１０を一つの貯蔵槽１８から他にすぐに移動できることである。インターフェースシステム７は、単に一つの貯蔵槽１８から移動され、他に挿入される。化合物稀釈および灌流システム調節の操作に時間を要する必要がない。重要にも、灌流による遅い細胞１０を含むバスチャンバーの内容物の入れ替え工程は、たいてい、インターフェースシステム７を一つの貯蔵槽１８から次へ移動するのにかかる時間を削減させる。さらに、本発明は、追加のチューブまたは付属品の必要なしで済ます。これは、コストの低下および灌流システム内に存在するかもしれない残留物との不慮の汚染を著しく削減する。試験化合物２０は、たいてい、チューブの洗浄および入れ替えを必要とする、灌流システムに使用されるチューブに付着できる。この問題は、本発明の試験システムにより排除される。
【００４８】
本発明の他の利点は、細胞１０がインターフェースシステム７の中にある間、細胞１０を囲む小さいインターフェースバス２６の容量を提供することである。インターフェースバス２６は、細胞１０を一つの貯蔵槽１８から他へ移動する間、小さい稀釈容量を確保するものである。例えば、好ましい実施例において、インターフェースバス２６の容量は、貯蔵槽１８の溶液の容量の５０分の１から１０分の３の間と同様に、これらの容量の間のいかなる増加分である。さらに好ましくは、インターフェースバス２６の容量は、貯蔵槽１８の溶液の容量の１０分の２未満である。
【００４９】
好ましくは、インターフェースバス２６は、増分量の液体、例えば、最小容量である０．０２ｕＬ、０．１ｕＬ、０．２ｕＬ、１ｕＬ、２ｕＬ、５ｕＬ、１０ｕＬまたは２０ｕＬと同様に、これらの容量の間の任意の増加分を保持することができる。インターフェースバス２６は、好ましくは、最大溶液量である０．０３ｍＬ、０．０５ｍＬ、０．１ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬまたは５ｍＬと同様に、これらの容量の間の任意の増加分を保持することができる。インターフェースバス２６は、これらの最小および最大容量のいかなる組み合わせを保持することもできる。例えば、インターフェースバス２６は、２ｕＬから０．５ｍＬ、または１０ｕＬから０、０５ｍＬの間で保持することができる。さらに好ましくは、インターフェースバス２６は、１０ｕＬから０．５ｍＬの間の液体を保持することができる。またさらに好ましくは、インターフェースバス２６は、０．０２ｍＬから０．０３ｍＬの間の液体を保持することができる。例えば、インターフェースバス２６は、０．０２〜０．０３ｍＬの容量をもち、貯蔵槽溶液の容量は、０．３〜０．３５ｍＬでよい。インターフェースバス２６の稀釈は、化合物２０により素早く生じるため、小さいインターフェースバス２６の容量は、さらに改善された平均時間を提供する。また、小さいインターフェースバス２６の容量は、より小さいバス容量が使用されうるため、試験化合物２０を節約するのを可能にする。
【００５０】
他の利点は、試験の急速適用時間および洗浄溶液のため、本発明のある実施例は、リガンド依存型チャンネルの測定に受け入れられる。この利点は、イオン電流が脱感作の前（つまり、ベースラインレベル以下に減少する前）に感知されるため、脱感作リガンド依存型チャンネルの場合、より明らかであろう。本適用において、適切なリガンド依存型チャンネルを発現する細胞からの記録が、上述のように得られる。可溶性のリガンドは、プレートのウェルに置かれ、細胞のウェルへの移動により、電流が誘発される。ウェルは、試験化合物（リガンドに加え）も含み、よって、リガンド依存型チャンネルに作用する化合物が、検査される。
【００５１】
本発明の別の側面において、細胞１０の特性を測定するために、図１および３のインターフェースシステム７を使用する一切の方法は、コンピュータにより制御される一般的なロボットおよび機械的装置により、任意で自動化される。例えば、機械的システムは、キャピラリー２およびロッド８と結合し、インターフェースシステム７を一つの貯蔵槽１８から他移動させうる。また、複数のキャピラリー２は、それぞれキャピラリー先端２ａに密封された細胞をもち、お互い結合されうる。複数のキャピラリー２およびロッド８は、複数の貯蔵槽１８に挿入されることができる。これは、同時に複数の細胞１０の試験を可能にする。
【００５２】
図４は、本発明の実施例によると、キャピラリー２および細胞１０の一般的な実施例を示す。
【００５３】
細胞１０で適切なシール、好ましくはギガオームシールを得ることができるキャピラリー先端２ａの形成を可能できれば、キャピラリー２の長さは、本発明において重要ではない。好ましくは、キャピラリー２は、プラスチック（例えば、ポリスチレン）またはガラスのような異なる非伝導性の材料から作られる。さらに好ましくは、キャピラリー２は、生体膜に密着して結合する任意の材料から作られ、良い誘電性をもち、多様な化学物質に不活性で、容易に洗浄できる。例えば、キャピラリー２はガラスからなる。
【００５４】
電極４は、キャピラリー先端２ａの内部にあり、電子アンプに固定される。電極４は、細胞膜１０ａの電流を測定するために構成される。本説明書で使用されるように、「電極」という用語は、電気信号をキャピラリー溶液２５（または細胞１０）から電子アンプに伝える、または通過する物理的なトランスミッターまたは伝導体を意味する。キャピラリー溶液２５は、細胞１０および電極４の間で電気を伝える。ここで、電極４は、キャピラリー２の内部（または一部内部）でよい。電極４が、キャピラリー２内部のキャピラリー溶液２５に接触しているとき、キャピラリー２は、パッチ電極のように働く。本明細書で使用されるように、「パッチ電極」という用語は、全てが細胞１０につながっている、さらに電極４を含むパッチピペット２を意味する。よって、「パッチ電極」および「キャピラリー電極」は本発明の目的により、互換性がある。
【００５５】
本適用の目的により、電極４は、キャピラリー２（つまり、「パッチ電極」）内から細胞の電気性質を測定（または影響）するために使用される構造を意味する。本構造は、電極４と同様、溶液２５を含んでよい。本構造４は、キャピラリー２外の電気性質を測定（または影響）するために使用される基準電極２８と異なる。キャピラリー２ａのギガオームシールは、二つの電極４、２８の影響の範囲で電気バリアを生み出す。
【００５６】
好ましい実施例において、パッチ電極２は、マイクロ電極である。本明細書で使用されるように、「マイクロ電極」という用語は、個々の細胞からの信号を記録するために適切なサイズのパッチ電極２を意味する。
【００５７】
本発明の実施例によると、パッチ電極２の先端は、パッチクランプ記録を形成するために細胞１０と接触しうる。本明細書に使用されるように、「パッチクランプ」は、パッチ電極を細胞膜の小面積に接触させることによって、生体膜からの信号の記録を可能にする、パッチ電極構造を意味する。パッチクランプは、パッチ電極を細胞膜の小面積に接触させ、次に細胞膜（パッチ）の小面積を破断することによって、細胞の全膜からの信号の記録を可能にする、パッチ電極構造を意味する「全細胞パッチクランプ」でもよい。
【００５８】
キャピラリー先端２ａが、細胞１０ａの細胞膜に接触すると、キャピラリー先端２ａおよび細胞１０の間にシールを形成することができる。好ましくは、シールは、十分に密着し、１ギガオーム、好ましくは１０ギガオームを超える耐性が、細胞膜１０ａおよびキャピラリー先端２ａの間で得られる。ギガオームシールの形成の方法は、当該分野において周知である。
【００５９】
電極４は、電極４、および、インターフェースチャンバー６または基準電極２８のような他の基準、の電流および／または電圧を測定する測定装置に接続することができる。電極４は、キャピラリー先端２ａに接触している細胞１０の膜１０ａの電圧および／または電流を測定するために構成することができる。上記細胞１０およびキャピラリー先端２ａは、電極を含むインターフェースチャンバー６に囲まれた状態にある。
【００６０】
図１Ａ〜１Ｃおよび３を参照に、本発明のインターフェースチャンバー６は、空洞部を含むように形状されてよい。空洞は、液体２６が、インターフェースチャンバー６内に付着するように、表面張力および／または毛管力が十分であるような、好ましいサイズおよび形状である。好ましくは、インターフェースチャンバー６は、１ｕＬほどの少量および１ｍＬほどの量を懸濁できる。よって、インターフェースチャンバー６は、増分量の液体、例えば、１ｕＬ、５ｕＬ、１０ｕＬ、２０ｕＬ、５０ｕＬ、１００ｕＬ、２００ｕＬ、５００ｕＬ、７５０または１ｍＬの液体と同様に、増加分の間の増加分を懸濁できる。本明細書に使用されるように、「懸濁」は、液体を含有または保有する能力を意味する。
【００６１】
ある実施例において、インターフェースチャンバー６の空洞は、キャピラリー先端２ａが完全にインターフェースチャンバー６内に入るように、キャピラリー先端２ａの幅より広い。好ましくは、インターフェースチャンバー６は、図１Ａで例示されるように、基本的に、形状が円筒である。インターフェースチャンバー６は、いかなる個体材料からなってよい。好ましくは、インターフェースチャンバー６は、金属のような、伝導性材料からなる。ある実施例において、インターフェースチャンバー６は、基準電極２８のように働く能力をもつ。
【００６２】
好ましい実施例において、インターフェースチャンバー６は、図１および３に示すように金属コイルのような電極２８からなる。よって、インターフェースチャンバー６は、液体２６を含有するためのインターフェースチャンバー６として、またパッチクランプ測定の基準電極２８としての、二つの機能を持つ。好ましくは、コイル６、２８は、直径１ミリメートルから１０ミリメートルである。好ましくは、コイルのリング間の距離は、０．０１ミリメートルから２ミリメートルの間である。
【００６３】
コイル状のインターフェースチャンバー／電極６、２８の利点の一つは、最大の液体表面積を提供し、これにより、インターフェースチャンバー６内の液体２６を保持するための毛管力および／または表面張力の最大効果を可能にすることである。よって、これは、正確なパッチクランプ測定を得るのに役立つ、液体２６（基準電極２８により一部保持される）の安定した基準電圧測定を提供する。
【００６４】
図５は、インターフェースチャンバー６の他の実施例を示す。本実施例において、インターフェースチャンバー６は、チューブを含む。チューブ６は、プラスチックまたは他の材料（他の非伝導材料のような）から作られる。基準電極２８は、チューブ６の外側でよい。基準電極２８は、チューブ６と結合される。キャピラリー２は、キャピラリー２をチューブ６（またはチューブ６がキャピラリー２に）にスライドさせることによって、チューブ６と結合できるようになるため、チューブ６は、キャピラリー２の半径とほぼ等しい（しかしわずかにおおきい）半径をもってよい。チューブ６およびキャピラリー２の間の摩擦は、挿入により、ペンがペンのふたと結合するのに類似した方法で、これらの結合を生じる。
【００６５】
好ましい実施例において、ロッド８は、図１および２に示すように、インターフェースチャンバー６と結合されうる。代替実施例において、ロッド８およびインターフェースチャンバー６は、一緒に硬い構成機器を構成する。ロッド８は、任意の硬い材料からなる。好ましくは、装置が、ロッド８を動かすことによってインターフェースチャンバー６の動作を制御できるように、ロッド８は、装置に結合するのに適切なものになっている。好ましくは、ロッド８の表面は、人または機械がロッドの表面に触っても、インターフェースチャンバー６の電気性質に影響を与えないように、プラスチックまたはセラミックなどの非伝導性材料からなる。
【００６６】
ある実施例において、ロッド８は、基準電極２８または基準電極２８に接続される伝導体からなる内部コアをもつ。（よって、インターフェースチャンバー６、ロッド８のいずれか、または、インターフェースチャンバー６およびロッド８の双方が基準電極２８を含む。）ロッド８は、一端をインターフェースチャンバー６に、そして他の端を電気測定装置に結合することができる。
【００６７】
電気測定装置、電極４および基準電極２８が閉回路の一部となるように、電気測定装置も、電極４に結合することができる。閉回路は、また、インターフェースチャンバー６内の細胞１０および液体２６を含むことができる。ロッド８の内部コアは、よって、電気測定装置が、電流の細胞膜１０ａの通過、または、電圧の基準電極２８および電極４のような他の装置の横断などの、インターフェースチャンバー６の電気性質を、制御および／また監視することを可能にする。
【００６８】
ロッド８は、インターフェースチャンバー６を移動するのに使用することができる。好ましい実施例において、ロッド８は、キャピラリー２の軸に沿ってインターフェースチャンバー６を移動するのに使用されている。これにより、キャピラリー２およびインターフェースチャンバー６の相対移動は、キャピラリー先端２ａをインターフェースチャンバー６内で移動することを可能にする。一実施例において、ロッド８は、ロッド８の長さに沿った前後動作で、インターフェースチャンバー６を移動するのに使用されうる。例えば、人または機械は、ロッド８を動かし、従って、ロッドに結合したインターフェースチャンバー６を動かすことができる。
【００６９】
ロッド８は、ファスナー２２（図１Ｃに示す）によりキャピラリー２に結合されうる。これにより、双方は、ほとんどまたは相対移動なしに一緒に容易に移動することができる。ファスナー２２は、キャピラリー２に接続されるか、またはロッド８に接続される。ファスナー２２はキャピラリー２をロッド８に結合するための任意の結合手段からなる。これにより、キャピラリー先端２ａは、インターフェースチャンバー６に相対的な固定された位置にとどまる。好ましい実施例において、ロッド８、インターフェースチャンバー６およびファスナー２２は、ほとんどまたは構成部品の相対的な移動なしに移動される、硬直した装置を構成する。また、好ましい実施例において、キャピラリー先端２ａの固定された位置インターフェースシステム７の近くまたは中心に位置してよい。
【００７０】
代替的に、ファスナー２２は、キャピラリー２を直接インターフェースチャンバー６に結合してよい。この場合、ファスナー２２は、好ましくは、インターフェースチャンバー６の電気性質の影響を避けるために、非伝導性の材料からなる。
【００７１】
液体２６が、インターフェースチャンバー６内で懸濁されたら、キャピラリー先端２ａは、液体２６内に移動してよい。代替的に、キャピラリー先端２ａは、すでに液体バス１２にあるため、インターフェースチャンバー６は、キャピラリー先端２ａおよび／または液体バス１２の全てまたは一部を囲むために、インターフェースチャンバー６は、バス１２に移動されうる。インターフェースチャンバー６が、液体バス１２から除去されると、液体バス１２からの液体の全てまたは一部は、液体の表面張力および／または毛管力の結果により、インターフェースチャンバー６の空洞に収容される。インターフェースチャンバー６の空洞に収容された液体２６の容量は、以下「インターフェースバス」２６とする。
【００７２】
多様な細胞タイプが、本システムで検査できる。検査できるいくつかの細胞の非網羅的なリストは、Ｊｕｒｋａｔリンパ腫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、細胞株を含む、イオンチャンネル／移動タンパク質）、海馬、神経節、神経内分泌細胞などの神経組織からの一次細胞、骨格筋、平滑筋、心筋、免疫細胞、血液細胞、上皮、内皮、植物細胞、および遺伝子操作された細胞を含む。本発明の好ましい実施例において、動物細胞１０が、キャピラリー２に密封され、試験される。さらに好ましくは、細胞が、細胞膜１０ａに自発的または周知の分子生物学技法により人口的に導入されたイオンチャンネルまたは移動タンパク質を含む。一実施例において、細胞１０は、哺乳類、昆虫類または両生類の細胞である。さらに好ましくは、細胞はヒト細胞である。
【００７３】
図６は、本発明の実施例により図１および３のインターフェースシステム７で使用した好ましい方法を示した工程図である。
【００７４】
ステップ１０１において、図１Ａに示されているように、キャピラリー先端２ａは、細胞１０の細胞膜１０ａに結合される。細胞１０は、結合時に液体バス１２の中かもしれない。結合は、キャピラリーが細胞に結合されるあらゆる状態で生じる。これは、キャピラリー先端２ａを細胞１０に密封するために、わずかな吸引および電圧を伴うかもしれない。キャピラリー２は、好ましくは、キャピラリー先端２ａが細胞膜１０ａの一つまたはそれ以上のタンパク質イオンチャンネルを覆うという状態で、細胞１０に固定される。さらに好ましくは、キャピラリー先端２ａ内の細胞膜１０ａのパッチは、全細胞膜１０ａの全細胞パッチ記録を形成するための強い吸引および／または電圧により破断される。キャピラリー２は、好ましくは、電極４を含んでいる。インターフェースチャンバー６は、好ましくは、コイル状電極からなる。本ステップ中、インターフェースチャンバー６は、キャピラリー先端２ａから離れた位置でキャピラリー２を囲む。
【００７５】
ステップ１０２において、キャピラリー２およびインターフェースチャンバー６は、インターフェースチャンバー６が、先端に固定されたキャピラリー先端２ａおよび細胞１０を取り囲むため、相対的に互いに移動される。これは、インターフェースチャンバー６がキャピラリー先端２ａ方向へキャピラリー２の軸に沿って移動することによりインターフェースチャンバー６と結合したロッド８の移動、またはキャピラリー先端２ａおよび細胞がインターフェースチャンバー６により取り囲まれることよるキャピラリー２の移動により達成される。本インターフェースシステム７は、インターフェースチャンバー６がキャピラリー先端２ａおよび細胞１０を取り囲むときに、形成される。
【００７６】
任意ステップ１０３において、キャピラリー２（またはキャピラリーホルダー）およびインターフェースチャンバー６は、ほとんどまたは相対移動なしに一緒に容易に移動ができるため、ファスナー２２で一緒に固定される。代替的に、このステップ１０３で、ファスナー２２は、キャピラリー２を直接インターフェースチャンバー６に結合するために使用されてよい。これにより、ファスナー２２は、好ましくは、インターフェースチャンバー６の電気性質への影響を避けるために非伝導性材料からなる。
【００７７】
ステップ１０４において、インターフェースシステム７は、液体バス１２から除去され、本ステップで、好ましくは、液体バスの一部を除去し、懸濁する。インターフェースシステム７は、部品が一体として移動されることに注意する。本システム７の部品は、システム７（任意ステップ１０３で記述されたように）として部品を動かすのを円滑にするために一緒に固定されるか、部品がシステム７として部品を移動するために同時に一緒に移動されることができる。インターフェースチャンバー６の空洞に収容された少量の液体２６は、インターフェースバス２６であり、細胞１０を絶えず取り囲む。インターフェースバス２６の毛管力および／また表面張力は、好ましくはインターフェースチャンバー６のいかなるギャップまたは穴から液体が漏れを防ぐ。例えば、インターフェースチャンバー６がコイル状なら、インターフェースバス２６の表面張力は、コイルの尖った先から液体の漏れを防ぐだろう。好ましい実施例において、キャピラリー２および細胞１０は、バス１２から除去されるため、キャピラリー先端２ａは、インターフェースチャンバー６およびインターフェースバス２６に対して、固定された位置に留まるだろう。
【００７８】
任意のステップ１０５において、細胞１０は、洗浄される。本ステップはインターフェースシステム７を中性水溶液のような洗浄液へ挿入することからなる。洗浄液は、好ましくは、いかなる活性材料または試験薬剤を含まない。むしろ、洗浄液は、細胞１０を濯ぐ。洗浄液は、インターフェースチャンバー６で懸濁された液体をゆすぐ、または取りかえる。本洗浄ステップは、プロセスが必要とするなら、細胞１０の洗浄が必要なときに実行してよい。例えば、細胞１０は、試験化合物２０を含む溶液に浸された後に洗浄される。好ましくは、洗浄液は、プレート１６の貯蔵槽１８に位置する。
【００７９】
ステップ１０６において、細胞１０は、貯蔵槽１８に挿入される。貯蔵槽１８は、好ましくは、試験溶液、例えば候補薬物２０を含む。
【００８０】
ステップ１０７において、電極４および細胞膜１０ａを横切る電流および／または電圧が測定される。
【００８１】
任意ステップ１０８において、インターフェースシステム７は、ステップ１０５で記述されるように、貯蔵槽１８から取り除かれ、任意に洗浄される。
【００８２】
任意ステップ１０９において、インターフェースシステム７は、他の貯蔵槽１８に挿入され、測定プロセスが貯蔵槽１８の数だけ（任意で洗浄ステップ１０５で）繰り返される。好ましくは、各貯蔵槽１８は同等または異なる濃度の異なる薬剤を含んでよい。電極を含むインターフェースチャンバー６の使用の利点の一つは、インターフェースチャンバー６に含まれる溶液の小容量のため、細胞膜１０ａへの薬剤拡散の効果を最大にする。
【実施例】
【００８３】
例１．図７は、本発明の例の一つによると、ＤＲＧ神経の外向きカリウム電流での９つの４−ＡＰの作用を示す。電極および細胞対時間を測定するパッチクランプを横切る電流を示す。全細胞記録測定が、従来の方法により得られた。インターフェースチャンバーは、上のステップ１０１〜１０３のように、細胞を囲むために移動された。電流の測定は、細胞が通常の塩水（制御）を含むウェルにある間に記録された。細胞は、それから、通常の塩水から、Ｋ＋チャンネルブロッカー４−ＡＰの濃度の増加（増加した間隔で０から１０ｍＭ）を含むウェルに移動された。各測定用に、細胞の電位は、−５０ｍＶから、プレパルスによって４００ｍｓ、−１００ｍＶにステップ状に変えられ、その後、テスト用に＋４０ｍＶにステップ状に変えられる。試験パルスの後、細胞は、−６０ｍＶに再分極された。曲線を１０秒ごとに得、５つの曲線をウェルごとに得た。インターフェースは、一つのウェルから次へと、２秒のような短時間で移動された。
【００８４】
細胞からのＫ＋フローによる外向き電流が示される。試験された最高濃度で、不活性電流は保たれず、有意な非不活性活動（持続的）電流が持続する。示されるように、Ｋ＋チャンネルブロッカー４−ＡＰの濃度の増加は、細胞膜の電流を減少した。低電流が、４−ＡＰに影響された予測された遮断で持続する。ピーク電流（各測定のグラフの左の棘波）およびエンド電流（各測定の電流の最終値）の双方が、４−ＡＰの濃度が増加すると減少した。
【００８５】
例２．図８は、本発明の例の一つによる、分画阻止のピーク電流対試験物質の濃度を示すグラフを示す。図８において、例１（図７）からのピーク電流が、分画阻止対試験物質４−ＡＰの濃度として表される。示されるように、ピーク電流は、４−ＡＰの濃度が増加すると、予測通り、減少した。示された用量反応曲線は、的確に試験物質の多濃度を測定するための本システムの能力を示す。
【００８６】
例３．図９は、本発明の例の一つによる、電極対時間を測定するパッチクランプの電圧変化の測定を示す。記録は、全細胞構成のＣＨＯ細胞から得られた。インターフェースチャンバーは、細胞の周りに移動され、電極に固定される（ステップ１０２および１０３）。細胞は、記録中、５ｍＭＫＣＩから２０ｍＭＫＣＩに移動された。この行動は、カリウム勾配ジャンプにより膜の電圧を変化させた。示されるように、電圧は、およそ０．２秒内に安定した状態に達した。これは、スクリーニング用にデザインされた当該分野の従来のシステムおよび方法より、より早い反応時間（つまり、溶液交換）である。
【００８７】
例４．図１０Ａ〜１０Ｂは、本発明の実施例を使用して得られたイオンチャンネル電流測定を示すグラフを示す。この例において、図２Ａ〜２Ｃに示した方法により、細胞は、ピペットへ結合された。図１０Ａにおいて、例示的記録は、安定したｈＥＲＧチャンネルを発現するＨＥＫ２９３細胞から得られたイオン電流を示す。細胞は、−８０ｍＶに保持された。外向きカリウム電流は、２０ｍＶのステップで−６０から８０ｍＶの範囲で１秒長テスト電圧、次に、−１００ｍＶまでの１秒長過分極パルスによって、生じた。間隔時間を描く曲線は、１０秒である。図１０Ｂにおいて、Ｇ／Ｇｍａｘ（伝導性／最大伝導性）曲線は、ｈＥＲＧで示される。データは、サンプル測定の数が７であるとき、基準±ＳＤを表す。
【００８８】
例５．図１１Ａ〜１１Ｂは、安定したｈＥＲＧチャンネルを発現するＨＥＫ２９３細胞から得られたイオン電流を示すグラフを示す。この例において、細胞は、図２Ａ〜２Ｃで示される方法により、ピペットに結合される。図１１Ａにおいて、電流跡を示す。図１１Ｂにおいて、対応するテール電流電圧曲線を示す。これらの得られた測定において、細胞は、−８０ｍＶで保たれた。外向けカリウム電流は、＋４０ｍＶまでの１秒長テスト電圧、次に１０ｍＶのステップで−１００ｍＶおよび−２０ｍＶの間の範囲で２秒長分極パルスによって、生じた。これらの測定の間隔時間を描く曲線は、１０秒である。
【００８９】
例６．図１２Ａ〜１２Ｂは、安定したｈＥＲＧチャンネルを発現するＨＥＫ２９３細胞のカリウム電流のＥ４０３１の作用を示すグラフを示す。この例において、細胞は、図２Ａ〜２Ｃで示される方法により、ピペットに結合される。図１２Ａにおいて、電流跡は、制御細胞を示す。図１２Ｂにおいて、電流跡は、Ｅ４０３１の５マイクロモル溶液の適用後の細胞を示す。細胞は、−８０ｍＶに保たれた。外向けカリウム電流は、＋４０ｍＶまでの１秒長テスト電圧で、次に０．１Ｈｚで適用された−１００ｍＶまでの２秒長分極パルスによって、生じた。
【００９０】
例７．データは、上述に類似した方法で、リガンド依存型チャンネルから当該分野に精通した者により得られる。研究の下、チャンネルを開くのに十分なリガンド濃度をウェルに添加し、ウェルに細胞を挿入することによりイオンチャンネルが得られる。データ跡は、急速ゲート運動学のチャンネルの例３のそれと非常に類似している。本技法は、グルタミン、ＧＡＢＡおよびアセチルコリンに要因のあるチャンネルを含む、あらゆるリガンド依存型チャンネルに適用される。
【００９１】
本明細書で示され、記述された本発明の特定の実施例は、具体例にすぎないことを理解する。多くの変形、変更、代替および等価物が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく当該分野に精通した者において実行されるだろう。特に、本明細書で使用された用語は、関連する仕様で使用される類似した用語の下で幅広く読まれるべきである。さらに、一つの記述された実施例からの多様な形態を他の実施例からの形態への使用は、当該分野に精通した者の技術内であることを理解するものとする。よってい、本明細書に記載および添付の図で示される全ての主題内容は、例示的であり、制限されるものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲により独立して定義されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１Ａ】コイル型のインターフェースチャンバーが、細胞に対してインターフェースシステムを形成するための位置である、典型的なパッチクランプシステムを示す。
【図１Ｂ】コイル型のインターフェースチャンバーが、細胞に対してインターフェースシステムを形成するための位置である、典型的なパッチクランプシステムを示す。
【図１Ｃ】コイル型のインターフェースチャンバーが、細胞に対してインターフェースシステムを形成するための位置である、典型的なパッチクランプシステムを示す。
【図２Ａ】本発明の実施例による、高細胞密度ブラインドパッチクランプを示す。
【図２Ｂ】本発明の実施例による、高細胞密度ブラインドパッチクランプを示す。
【図２Ｃ】本発明の実施例による、高細胞密度ブラインドパッチクランプを示す。
【図３】インターフェースシステムおよびマルチウェルプレートを含む、典型的なパッチクランプシステムを示す。
【図４】キャピラリーおよび細胞の典型的な実施例を示す。
【図５】典型的なインターフェースシステムを示す。
【図６】図１Ａ〜１Ｃのシステムを使用する方法を示す、工程図である。
【図７】細胞膜を横切った電圧対時間を表すグラフを示す。
【図８】ピーク電圧および分画阻止対試験物質の濃度を表したグラフを示す。
【図９】細胞膜を横切った電圧対時間を表すグラフを示す。
【図１０Ａ】本発明の実施例を使用して得られた、イオンチャンネル電圧測定を表すグラフを示す。
【図１０Ｂ】本発明の実施例を使用して得られた、イオンチャンネル電圧測定を表すグラフを示す。
【図１１Ａ】安定したｈＥＲＧチャンネルを発現するＨＥＫ２９３細胞から得られたイオン電圧を表すグラフを示す。
【図１１Ｂ】安定したｈＥＲＧチャンネルを発現するＨＥＫ２９３細胞から得られたイオン電圧を表すグラフを示す。
【図１２Ａ】安定したｈＥＲＧチャンネルを発現するＨＥＫ２９３細胞でナトリウム電流でのＥ４０３１の効果を表すグラフを示す。
【図１２Ｂ】安定したｈＥＲＧチャンネルを発現するＨＥＫ２９３細胞でナトリウム電流でのＥ４０３１の効果を表すグラフを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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