(57)【要約】新規のピキアメタノリカ(Pichia methanolica)分泌シグナルポリペプチド、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに関連した組成物および使用方法が開示される。新規のピキアメタノリカ分泌シグナル配列の前に配置された対象とするポリペプチドを有するDNA構築体を用いることによって、大量の組換えタンパク質を産生する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:2と少なくとも95パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ピキアメタノリカ(Pichia methanolica)の分泌シグナル配列であるポリペプチド。
【請求項２】
SEQ ID NO:2を含む、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
SEQ ID NO:2である、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:1またはその相補体のヌクレオチド配列を含む、単離されたDNA分子。
【請求項６】
約50℃から約65℃までにおける0.015 M NaCl/0.0015 Mクエン酸ナトリウム(SSC)および約0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)のハイブリダイゼーション条件の下で、SEQ ID NO:1またはその相補体にハイブリダイズできる単離されたDNA分子であって、ピキアメタノリカの分泌シグナル配列であるポリペプチドをコードするDNA分子。
【請求項７】
コードされるポリペプチドがSEQ ID NO:2の少なくとも20個の連続アミノ酸を有する、請求項6記載の単離されたDNA分子。
【請求項８】
コードされるポリペプチドがSEQ ID NO:2である、請求項6記載の単離されたDNA分子。
【請求項９】
ポリペプチドをコードする単離されたDNA分子であって、そのコードされるポリペプチドがSEQ ID NO:2に対し少なくとも95パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、そのコードされるポリペプチドがピキアメタノリカの分泌シグナル配列であるDNA分子。
【請求項１０】
コードされるポリペプチドがSEQ ID NO:2を含む、請求項9記載の単離されたDNA分子。
【請求項１１】
コードされるポリペプチドがSEQ ID NO:2である、請求項9記載の単離されたDNA分子。
【請求項１２】
ペプチド結合によって連結された第一の部分と第二の部分とを含む融合タンパク質であって、第一の部分がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含んでおり、かつ第二の部分が別のポリペプチドを含んでいる融合タンパク質。
【請求項１３】
第一の部分、第二の部分および第三の部分を含む融合タンパク質であって、第一の部分がペプチド結合によって第二の部分に連結されており、かつ第二の部分がペプチド結合によって第三の部分に連結されており、第一の部分がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含んでおり、第二の部分が別のポリペプチドを含んでおり、かつ第三の部分がアフィニティータグ、治療薬または検出可能な標識を含んでいる融合タンパク質。
【請求項１４】
第一の部分、第二の部分および第三の部分を含む融合タンパク質であって、第一の部分がペプチド結合によって第二の部分に連結されており、かつ第二の部分がペプチド結合によって第三の部分に連結されており、第一の部分がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含んでおり、第二の部分が別のポリペプチドを含んでおり、かつ第三の部分が少なくとも一つの定常領域を含む免疫グロブリン成分を含んでいる融合タンパク質。
【請求項１５】
第三の部分がヒト免疫グロブリンFc断片である、請求項14記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
核酸分子が請求項12記載の融合タンパク質をコードする、単離されたDNA分子。
【請求項１７】
核酸分子が請求項13記載の融合タンパク質をコードする、単離されたDNA分子。
【請求項１８】
核酸分子が請求項14記載の融合タンパク質をコードする、単離されたDNA分子。
【請求項１９】
以下の機能的に連結されたエレメントを含むDNA構築体:
ピキアメタノリカの転写プロモーターを含む第一のDNAセグメント;
SEQ ID NO:2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第二のDNAセグメント;
対象とする異種タンパク質をコードする第三のDNAセグメント; および
ピキアメタノリカの転写ターミネーター含む第四のDNAセグメント。
【請求項２０】
第一のDNAセグメントがグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素1(GAP1)、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素2(GAP2)、アルコール利用遺伝子1(alcohol utilization gene 1(AUG1))およびアルコール利用遺伝子2(AUG2)からなる群より選択されるピキアメタノリカ転写プロモーターである、請求項19記載のDNA構築体。
【請求項２１】
第二のDNAセグメントがSEQ ID NO:1を含む、請求項19記載のDNA構築体。
【請求項２２】
第二のDNAセグメントがSEQ ID NO:1である、請求項19記載のDNA構築体。
【請求項２３】
第四のDNAセグメントがGAP1、GAP2、AUG1およびAUG2からなる遺伝子の群より選択されるピキアメタノリカ転写ターミネーターを含む、請求項19記載のDNA構築体。
【請求項２４】
選択可能マーカーをさらに含む、請求項19記載のDNA構築体。
【請求項２５】
選択可能マーカーがADE2遺伝子である、請求項24記載のDNA構築体。
【請求項２６】
ピキアメタノリカの複製起点をさらに含む、請求項19記載のDNA構築体。
【請求項２７】
機能的に連結された第五のDNAセグメントであって、アフィニティータグ、治療薬または検出可能な標識を含む第五のDNAセグメントをさらに含む、請求項19記載のDNA構築体。
【請求項２８】
機能的に連結された第五のDNAセグメントであって、少なくとも一つの定常領域を含む免疫グロブリン成分を含んだ第五のDNAセグメントをさらに含む、請求項19記載のDNA構築体。
【請求項２９】
第五のDNAセグメントがヒト免疫グロブリンFc断片である、請求項28記載のDNA構築体。
【請求項３０】
請求項19記載のDNA構築体を含有するピキアメタノリカ細胞。
【請求項３１】
DNA構築体がゲノムに挿入される、請求項30記載のピキアメタノリカ細胞。
【請求項３２】
DNA構築体が複数コピーでゲノムに挿入される、請求項31記載のピキアメタノリカ細胞。
【請求項３３】
液胞プロテイナーゼAが機能的に欠損している、請求項30記載のピキアメタノリカ細胞。
【請求項３４】
液胞プロテイナーゼBが機能的に欠損している、請求項30記載のピキアメタノリカ細胞。
【請求項３５】
液胞プロテアーゼAおよび液胞プロテアーゼBが機能的に欠損している、請求項30記載のピキアメタノリカ細胞。
【請求項３６】
機能的に欠損したAUG1遺伝子を含む、請求項30記載のピキアメタノリカ細胞。
【請求項３７】
機能的に欠損したAUG2遺伝子を含む、請求項30記載のピキアメタノリカ細胞。
【請求項３８】
機能的に欠損したAUG1遺伝子およびAUG2遺伝子を含む、請求項30記載のピキアメタノリカ細胞。
【請求項３９】
以下の段階を含む、対象とするタンパク質の産生方法:
第三のDNAセグメントを発現させ、かつ対象とするタンパク質が産生される請求項30記載の細胞を培養する段階; および
対象とするタンパク質を回収する段階。
【請求項４０】
請求項1記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片。
【請求項４１】
ポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、抗体断片およびヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項40記載の抗体。
【請求項４２】
F(ab')、F(ab)、Fab'、Fab、Fv、scFvおよび最小認識単位からなる群より選択される、請求項40記載の抗体断片。
【請求項４３】
請求項40記載の抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を含む、抗イディオタイプ抗体。
【請求項４４】
請求項19記載のDNA構築体を含む、キット。
【請求項４５】
請求項19記載のDNA構築体を含有するピキアメタノリカ細胞を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
メチロトローフ酵母は、メタノールを唯一の炭素源およびエネルギー源として利用できる酵母である。メタノールの利用に必要な生化学的経路を有する酵母の種は4種属、つまりハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属およびトルロプシス(Torulopsis)属に分類されている。これらの種属は細胞形態および増殖特性を基礎としているので、いささか人為的であって、密接な遺伝的関係を反映していない(Billon-Grand, Mycotaxon 35:201-204, 1989; Kurtzman, Mycologia 84:72-76, 1992)。さらに、これらの種属内の全ての種がメタノールを炭素源およびエネルギー源として利用できるというわけではない。この分類の結果として、種属のなかの個々の種間で生理機能および代謝が大きく異なる。
【０００２】
メチロトローフ酵母はいくつかの理由で、組換えタンパク質の産生系で用いるのに魅力的な候補である。第一に、いくつかのメチロトローフ酵母は最少限定培地で高生物体量まで急増することが示されている。第二に、組換え発現カセットがゲノムに挿入されるので、有糸分裂期では安定である。第三に、これらの酵母は大量の組換えタンパク質を分泌することができる。例えば、Faber et al., Yeast 11:1331, 1995; Romanos et al., Yeast 8:423, 1992; Cregg et al., Bio/Technology 11:905, 1993; 米国特許第4,855,242号; 米国特許第4,857,467号; 米国特許第4,879,231号; および米国特許第4,929,555号; ならびにRaymond, 米国特許第5,716,808号、同第5,736,383号、同第5,854,039号および同第5,888,768号を参照されたい。
【０００３】
組換えDNA技術によるタンパク質の量産では、対象とする所望のタンパク質が増殖培地中に分泌されることが都合のよい場合が多い。細胞からのタンパク質の分泌は、通常、翻訳産物のアミノ末端を構成する疎水性アミノ酸の短いストレッチの存在によって達成される。この疎水性のストレッチは「分泌シグナル配列」と呼ばれており、異種タンパク質の分泌をもたらすためにシグナル配列を用いることが可能である。これは一般的に、分泌シグナル配列をコードするDNA配列を含むDNA構築体であって、所望の異種タンパク質をコードする遺伝子が挿入されているDNA構築体の構築によって達成される。そのようなプラスミドを宿主細胞に形質転換すると、その宿主細胞は所望のタンパク質を増殖培地中に発現かつ分泌すると考えられる。
【０００４】
現在のところ、ピキアメタノリカ(Pichia methanolica)において異種タンパク質産物の分泌を達成する唯一の方法は、外来性の分泌シグナルペプチドを介したものである。外来遺伝子のものはピキアメタノリカに固有のものではないので、異種タンパク質の発現のレベルは、ピキアメタノリカに固有の分泌シグナル配列を取り込んだDNA構築体と比べて最適以下である可能性が高い。
【発明の開示】
【０００５】
このように、工業用酵素および医薬用タンパク質を含めて、経済的に重要なポリペプチドの産生にメチロトローフ酵母の利用を可能とするピキアメタノリカ固有の分泌シグナル配列を同定する必要性が当技術分野において依然として存在する。本発明はそのような材料および方法、ならびにその他の関連する利点を提供する。
【０００６】
発明の詳細な説明
以下に続く説明のなかで、いくつかの用語が広く使用される。以下の定義は本発明の理解を容易にするために提供される。
【０００７】
特別の定めのない限り、「一つの(a)」、「一つの(an)」、「その(the)」および「少なくとも一つの(at least one)」は同じ意味で使用されており、一つまたは複数を意味する。
【０００８】
「対立遺伝子変異体」という用語は、遺伝子のもう一方の型を指すように本明細書において用いられる。対立遺伝子変異は個体群に存在することが知られており、変異から生ずる。
【０００９】
「DNA構築体」とは、天然には存在しない配置で組み合わされ、かつ並べられているDNAのセグメントを含むように人の介入によって改変されている、一本鎖または二本鎖のDNA分子のことである。
【００１０】
「DNAセグメント」とは特定の属性を有する、より大きなDNA分子の一部分のことである。例えば、特定のポリペプチドをコードするDNAセグメントは、5'から3'の方向に解読される場合に、特定のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする、プラスミドまたはプラスミド断片などの、より長いDNA分子の一部分である。
【００１１】
「機能的に欠損した」という用語は、野生型の対応物におけるその活性のレベルと比較して活性が10%未満の細胞における発現のことを指す。その発現レベルは適切なアッセイ法によって測定した場合に、野生型の対応物における活性の1%未満、より好ましくは0.01%未満であることが好ましい。その活性は本質的に検出不可能である(すなわち、バックグラウンドを有意に超えていない)ことが最も好ましい。遺伝子の機能的な欠損は、コード領域または非コード領域のいずれかでの変異によってもたらすことができる。
【００１２】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードするDNAセグメントを指すように本明細書において用いられる。文脈が許せば、この用語はゲノムDNA(介在配列の有無にかかわらず)、cDNAおよび合成DNAを含む。遺伝子はプロモーターエレメントを含めて、非コード配列を含んでもよい。
【００１３】
「単離された」という用語は、ポリヌクレオチドに適用する場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から取り除かれており、したがって、その他の外因性のまたは不必要なコード配列がなく、遺伝子操作されたタンパク質産生系のなかで用いるのに適した形態で存在することを意味する。そのような単離された分子は、その天然環境から分離されているものであり、cDNAクローンおよびゲノムクローンを含む。
【００１４】
「機能的に連結される」とは、DNAセグメントに言及した場合、そのセグメントは、それらがその意図する目的に対し協調的に機能する、例えば、転写がプロモーターで始まり、コード部分(segment)を経由してターミネーターまで進むように配置されることを示す。
【００１５】
「ポリヌクレオチド」とは、5'から3'末端の方向に解読されるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖の重合体のことである。ポリヌクレオチドはRNAおよびDNAを含み、これは天然源から単離されても、インビトロで合成されても、または天然分子および合成分子の組み合わせから調製されてもよい。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対(「bp」と略される)、ヌクレオチド(「nt」)またはキロベース(「kb」)として表される。文脈が許せば、後者の二つの用語は、一本鎖または二本鎖であるポリヌクレオチドを表現することができる。これらの用語が二本鎖分子に適用される場合、それらは全長を指すように用いられており、「塩基対」という用語に等価であると理解されると思われる。当業者であれば、二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さがわずかに異なっていてもよく、またはの末端は酵素的切断の結果として互い違いであってよく、したがって、二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対となっていなくてもよいことを認識すると思われる。そのような対になっていない末端は一般に、長さが20 ntを超えないと考えられる。
【００１６】
「ポリペプチド」とは、天然によりまたは合成により産生されたかを問わず、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の重合体のことである。約10アミノ酸残基に満たないポリペプチドは、一般に「ペプチド」と呼ばれる。
【００１７】
「プロモーター」という用語は、RNAポリメラーゼの結合および転写の開始を与えるDNA配列を含んだ遺伝子の一部分を示すために、その分野で認識されている意味で本明細書において用いられる。プロモーター配列は遺伝子の5'非コード領域に見られることが多いが、必ずしもそうとは限らない。転写の開始で機能するプロモーター内の配列は、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴づけられることが多い。これらのプロモーターエレメントとしては、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列および転写因子結合部位が挙げられる。一般的には、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed., The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA, 1987を参照されたい。
【００１８】
「プロ配列」とは、分泌タンパク質をコードする遺伝子の成熟したコード配列のすぐ5'側に通常は存在するDNA配列のことである。プロ配列は、タンパク質が分泌経路を移動する場合、シス作用性のシャペロンとして働くプロペプチドをコードする。
【００１９】
「タンパク質」とは、一つまたは複数のポリペプチド鎖を含む巨大分子のことである。タンパク質は糖質基（carbohydrate group）などの、非ペプチド成分を含んでもよい。糖質およびその他の非ペプチド置換基は、タンパク質を産生する細胞によってタンパク質に付加されることができ、それらは細胞の種類によって異なると考えられる。タンパク質は、一般にそのアミノ酸の骨格構造によって定義され、糖質基などの置換基は一般的に特定されないが、それでもなお存在してもよい。
【００２０】
「分泌シグナル配列」という用語は、ポリペプチドを合成する細胞の分泌経路を通って、より大きいポリペプチドの一成分として、より大きいポリペプチドを方向づけるポリペプチド(「分泌ペプチド」)をコードするDNA配列のことを示す。このより大きいポリペプチドは、通常、分泌経路を通る移行時に切断されて、分泌ペプチドが取り除かれる。分泌ペプチドおよびプロペプチドは、まとめてプレプロペプチドと呼ばれてもよい。
【００２１】
本明細書において用いられる「治療薬」とは、治療に有用な複合体をもたらすように抗体成分に結合される分子または原子のことである。治療薬の例としては、薬物、毒素、免疫賦活剤、キレート剤、ホウ素化合物、光活動性の薬剤または色素、および放射性同位体が挙げられる。
【００２２】
「検出可能な標識」とは、診断に有用な分子をもたらすように抗体成分に結合できる分子または原子のことである。検出可能な標識の例としては、キレート剤、光活動性の薬剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオンまたはその他のマーカー成分が挙げられる。
【００２３】
「アフィニティータグ」という用語は、第二のポリペプチドの精製もしくは検出を可能とするようにまたは基質との第二のポリペプチドの付着を可能とするように、第二のポリペプチドに付着されることができるポリペプチドセグメントを指すように本明細書において用いられる。原則的に、抗体またはその他の特異的な結合剤を使用できる任意のペプチドまたはタンパク質をアフィニティータグとして用いることができる。アフィニティータグとしては、ポリヒスチジン領域（tract）、プロテインA(Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991))、グルタチオンSトランスフェラーゼ(Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988))、Glu-Gluアフィニティータグ(Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985))、サブスタンスP、FLAGペプチド(Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988))、ストレプトアビジン結合ペプチド、あるいはその他の抗原エピトープまたは結合ドメインが挙げられる。一般的には、Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991)を参照されたい。アフィニティータグをコードする核酸分子は、商業的供給者(例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)から入手可能である。
【００２４】
本明細書において引用される全ての参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。
【００２５】
現在のところ、ピキアメタノリカにおいて異種タンパク質産物の分泌を達成する唯一の方法は、外来性の分泌シグナルペプチドを介したものである。外来遺伝子のものはピキアメタノリカに固有のものではないので、異種タンパク質の発現のレベルは、ピキアメタノリカに固有の分泌シグナル配列を取り込んだDNA構築体と比べて最適以下である可能性が高い。理論に限定するわけではないが、天然のピキアメタノリカ分泌シグナルペプチドは、その標的膜への異種タンパク質の輸送をより効果的に方向づけることで、および異種タンパク質が膜を通過する際に膜上のピキアメタノリカ・ペプチダーゼによってより効果的に切断されることで、異種タンパク質の産生を増大させるものと思われる。
【００２６】
本発明は、エキソ-1,3-β-グルカナーゼ遺伝子と称した、以下「β-グルカナーゼ」というピキアメタノリカ分泌シグナル配列を含む単離されたDNA分子を提供する。そのDNA分子はSEQ ID NO:1に示されており、そのコードするポリペプチドはSEQ ID NO:2に示されており、およびSEQ ID NO:2のポリペプチドをコードする縮重DNA分子はSEQ ID NO:3に示されている。当業者であれば、SEQ ID NO:1はP.メタノリカβ-グルカナーゼ遺伝子の単一の対立遺伝子であることおよびその他の機能的な対立遺伝子(対立遺伝子変異体)が存在する可能性が高いこと、ならびに対立遺伝子変異にはヌクレオチド変化が含まれてもよいことを理解すると思われる。β-グルカナーゼのDNA配列はDNA構築体に含まれてもよい。例えば、DNA構築体は機能的に連結された次のエレメントを含むことができ、そのエレメントとしてはピキアメタノリカ・プロモーター配列、β-グルカナーゼDNA配列、異種DNA配列およびピキアメタノリカ・ターミネーターが挙げられる。
【００２７】
ピキアメタノリカ分泌シグナル配列β-グルカナーゼをコードする発現ベクターを含む大腸菌(E. coli) DH10B細胞培養物が2003年8月1日付けでAmerican Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)に寄託されており、特許寄託による指定番号PTA-5369が割り当てられている。この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従って維持されると考えられる。この寄託は単に当業者に対する利便性を考えてなされたに過ぎず、寄託が米国特許法第112条の下で必要とされることの承認ではない。
【００２８】
本発明はDNAおよびRNA分子を含めて、本明細書において開示されるβ-グルカナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を提供する。当業者であれば、遺伝暗号の縮重という観点から、かなりの配列変異がこれらのポリヌクレオチド分子のなかで可能であることを容易に認識すると思われる。SEQ ID NO:3は、SEQ ID NO:2のβ-グルカナーゼポリペプチドおよびその断片をコードする全てのDNAを包含する縮重DNA配列である。当業者であれば、SEQ ID NO:3の縮重配列がまたTの代わりにUを用いることで、SEQ ID NO:2をコードする全てのRNA配列を提供することを認識すると思われる。すなわち、SEQ ID NO:3のヌクレオチド1位からヌクレオチド84位を含む、β-グルカナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびそのRNA等価物が本発明によって企図される。表1には縮重ヌクレオチドの位置を示すためにSEQ ID NO:3のなかで用いられている1文字コードが記載されている。「分解(Resolution)」とは、コード文字により示されるヌクレオチドのことである。「相補体」とは、相補的なヌクレオチドに対するコードを示す。例えば、コードYはCまたはTのいずれかを示し、その相補体RはAまたはGを示しており、AがTに相補的であって、GがCに相補的である。
【００２９】
【表１】
2007519392.tif 000002
【００３０】
所定のアミノ酸に対して可能な全てのコドンを含む、SEQ ID NO:3に使用の縮重コドンは、表2に記載されている。
【００３１】
【表２】
2007519392.tif 000003
【００３２】
当業者であれば、各アミノ酸をコードする可能な全てのコドンを表す、縮重コドンを決定する際にいくらかのあいまいさが導入されることを認識すると思われる。例えば、セリンに対する縮重コドン(WSN)は、ある状況では、アルギニン(AGR)をコードすることができ、アルギニンに対する縮重コドン(MGN)は、ある状況では、セリン(AGY)をコードすることができる。同様の関係がフェニルアラニンをコードするコドンとロイシンをコードするコドンとの間に存在する。このように、縮重配列によって網羅される一部のポリヌクレオチドは変異アミノ酸配列をコードする可能性があるが、当業者はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を参照することによりそのような変異配列を容易に同定することができる。本明細書において記述されるように、変異配列を機能性について容易に試験することができる。
【００３３】
β-グルカナーゼをコードする完全長のクローンは、従来のクローニング手順により得ることができる。相補DNA(cDNA)クローンが好ましいが、使用目的(例えば、トランスジェニック動物での発現)によっては、ゲノムクローンを使用すること、または少なくとも一つのゲノムイントロンを含むようにcDNAクローンを改変することが好ましいこともある。cDNAクローンおよびゲノムクローンを調製する方法は周知であって、当業者のレベルの範囲内であり、ライブラリーをプロービングするかまたはプライミングするために、本明細書において開示される配列、またはその一部分の使用を含む。グルカナーゼ断片に対する抗体、またはその他の特異的な結合パートナーを用いて、発現ライブラリーをプロービングすることができる。
【００３４】
本発明はSEQ ID NO:1のヌクレオチド配列またはその相補体を含む単離されたDNA分子を提供する。当業者であれば、SEQ ID NO:1に開示される配列はヒトβ-グルカナーゼの単一の対立遺伝子であること、および対立遺伝子変異および選択的スプライシングが起こると期待されることを認識すると思われる。この配列の対立遺伝子変異体は標準的な手順にしたがって、異なる個体由来のcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをプロービングすることによりクローニングすることができる。サイレント変異を含有するものおよび変異がアミノ酸配列の変化をもたらすものを含めて、SEQ ID NO:1に示されるDNA配列の対立遺伝子変異体は本発明の範囲内であり、SEQ ID NO:2の対立遺伝子変異体であるタンパク質も同様に本発明の範囲内である。選択的にスプライシングされたmRNAから作製されたcDNAであって、β-グルカナーゼポリペプチドの特性を保持しているものは、本発明の範囲内に含まれ、そのようなcDNAおよびmRNAによりコードされるポリペプチドも同様に本発明の範囲内に含まれる。これらの配列の対立遺伝子変異体およびスプライス変異体は当技術分野において知られる標準的な手順にしたがって、異なる個体または組織由来のcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをプロービングすることによりクローニングすることができる。
【００３５】
本発明は同様に、ポリペプチドをコードするDNA分子であって、そのコードされるポリペプチドはSEQ ID NO:2に対し少なくとも95パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、そのコードされるポリペプチドはピキアメタノリカの分泌シグナル配列であるDNA分子を提供する。そのポリペプチドはSEQ ID NO:2を含んでも、SEQ ID NO:2で本質的に構成されてもまたはSEQ ID NO:2で構成されてもよい。
【００３６】
本発明は同様に、SEQ ID NO:2と少なくとも95パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ピキアメタノリカの分泌シグナル配列であるポリペプチドを提供する。そのポリペプチドはSEQ ID NO:2を含んでも、SEQ ID NO:2で本質的に構成されてもまたはSEQ ID NO:2で構成されてもよい。
【００３７】
本発明は同様に、SEQ ID NO:2のポリペプチド、またはその相同分子種に対し実質的に類似の配列同一性を有する単離されたβ-グルカナーゼポリペプチドを提供する。「実質的に類似の配列同一性」という用語は、SEQ ID NO:2に示される配列、またはその相同分子種に対し少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の、または99%を超える配列同一性を含むポリペプチドを指すように本明細書において用いられる。本発明は同様に、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基番号1から28の配列に対し少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の、または99%を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含んだポリペプチドを含む。本発明は、そのようなポリペプチドをコードするDNA分子をさらに含む。同一性の割合を決定する方法は以下に記述されている。
【００３８】
本発明は同様に、ペプチド結合によって連結された第一の部分と第二の部分とを含む融合タンパク質であって、第一の部分はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含んでおり、第二の部分は別のポリペプチドを含んでいる融合タンパク質を提供する。第二の部分はピキアメタノリカにとって異種のタンパク質であってよい。任意で、本発明の融合タンパク質は第三の部分をさらに含んでよく、その部分としては、例えば、少なくとも一つの定常領域、例えば、ヒト免疫グロブリンFc断片を含む免疫グロブリン成分、アフィニティータグ、治療薬、検出可能な標識および同様のものを挙げることができる。
【００３９】
本発明は同様に、約50℃から約65℃で0.015 M NaCl/0.0015 Mクエン酸ナトリウム(SSC)および約0.1パーセントのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)のハイブリダイゼーション条件の下で、SEQ ID NO:1またはその相補体にハイブリダイズできる単離されたDNA分子を提供する。この核酸分子はピキアメタノリカの機能的なβ-グルカナーゼなどの、ポリペプチドの少なくとも一部分をコードしてもよい。
【００４０】
本発明は同様に二つの判定基準、つまり既述のように、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するコードポリペプチドとの間の類似性の判定および/またはハイブリダイゼーションアッセイ法を用いて同定できる変異β-グルカナーゼDNA分子を企図する。そのようなβ-グルカナーゼ変異体は、(1) 洗浄のストリンジェンシーが55〜65℃で0.1% SDS入りの0.5×SSC〜2×SSCに相当するストリンジェントな洗浄条件の下で、SEQ ID NO:1(またはその相補体)のヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズする核酸分子、または(2) SEQ ID NO:2のアミノ酸配列に対し少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の、または99%を超える同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。または、β-グルカナーゼ変異体は、(1)洗浄のストリンジェンシーが55〜65℃で0.1% SDS入りの0.1×SSC〜0.2×SSCに相当する高度にストリンジェントな洗浄条件の下で、SEQ ID NO:1(またはその相補体)のヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズする核酸分子、および(2) SEQ ID NO:2のアミノ酸配列に対し少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の、または99%を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけることができる。
【００４１】
配列同一性の割合は従来の方法により決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)、およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照されたい。手短に言えば、10のギャップ開始ペナルティ、1のギャップ伸張ペナルティおよび表3(アミノ酸は標準的な1文字コードにより示されている)に記載のHenikoff and Henikoff(同章)の「BLOSUM62」スコアリングマトリックスを用い、アライメントスコアを最適化するように二つのアミノ酸配列を整列させる。
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【００４２】
【表３】
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【００４３】
当業者は二つのアミノ酸配列を整列するのに利用できる確立された多くのアルゴリズムが存在することを理解している。PearsonとLipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、本明細書において開示されるアミノ酸配列と推定上の変異β-グルカナーゼのアミノ酸配列によって共有される同一性のレベルを調べるのに適したタンパク質アライメント法である。FASTAアルゴリズムはPearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)により、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)により記述されている。
【００４４】
手短に言えば、FASTAは最初に、保存的アミノ酸置換、挿入または欠失を考慮せず、問合せ配列(例えば、SEQ ID NO:2)と同一性(ktup値が1である場合)または同一性の対(ktup = 2の場合)の密度が最も高い試験配列により共有される領域を同定することによって配列類似性を特徴づける。次いで、アミノ酸置換マトリックスを用いて全ての対合アミノ酸の類似性を比較することによって、同一性の密度が最も高い10箇所の領域を再計算し、これらの領域の端部を「トリミング」して最高スコアに寄与するアミノ酸残基だけが含まれるようにする。「カットオフ」値(配列の長さとktup値に基づいた所定の公式で計算した)よりも大きなスコアを有する領域がいくつか存在している場合には、トリミングされた初期の領域を調べて、その領域を加えることでギャップを伴うだいたいのアラインメントが形成されるかどうかを確認する。最後に、アミノ酸の挿入と欠失を可能にするNeedleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974))の変法を用いて、二つのアミノ酸配列のスコアの最も高い領域を整列させる。FASTAに好ましいパラメーターは、ktup = 1、ギャップ開始ペナルティ = 10、ギャップ伸張ペナルティ = 1、および置換マトリックス = BLOSUM62である。これらのパラメーターは、Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)の付録2に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル(「SMATRIX」)を変更することによってFASTAプログラムに導入することができる。
【００４５】
上記の比を用い、FASTAを利用して核酸分子の配列同一性を決定することもできる。ヌクレオチド配列の比較の場合、ktup 値は1から6の範囲、好ましくは3から6まで、最も好ましくは3とし、その他のパラメーターはデフォルトとして設定することができる。
【００４６】
変異β-グルカナーゼポリペプチドまたは実質的に類似の配列同一性を有するポリペプチドは、一つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するとして特徴づけられる。これらの変化は経度のもの、すなわち保存的アミノ酸置換(下記表4に示される)およびポリペプチドの折り畳みまたは活性に実質的に影響を与えないその他の置換; 小規模の欠失、典型的には1アミノ酸から約10アミノ酸、好ましくは1アミノ酸から約5アミノ酸の欠失; ならびに、例えば、アミノ末端のメチオニン残基、約5〜20残基までの小さなリンカーペプチド、治療薬、検出可能な標識またはアフィニティータグなどの、アミノ末端またはカルボキシル末端の伸長であることが好ましい。本発明はしたがって、SEQ ID NO:2の対応領域に対し少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または99%を超えて同一である配列を含んだ約15〜100アミノ酸残基のポリペプチドを含む。アフィニティータグを含んだポリペプチドは、β-グルカナーゼポリペプチドとアフィニティータグとの間にタンパク質分解切断部位をさらに含むことができる。好ましいそのような部位としては、トロンビン切断部位および第Xa因子切断部位が挙げられる。本発明のポリペプチドは組換えポリペプチドであることが好ましい。別の局面では、本発明のβ-グルカナーゼポリペプチドは少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個または少なくとも25個の連続アミノ酸を有する。例えば、本発明のβ-グルカナーゼポリペプチドは、SEQ ID NO:2の少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個または少なくとも25個の連続アミノ酸を有するポリペプチドに関する。
【００４７】
【表４】
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【００４８】
構造的完全性を維持するのに重大な意味を持つ領域またはドメインを含むアミノ酸残基を決定することができる。これらの領域内で、程度の差こそあれ変化に寛容であると考えられる特定の残基および分子全体の三次構造を維持すると考えられる特定の残基を決定することができる。配列構造を解析する方法としては、アミノ酸またはヌクレオチドの高い同一性を有する複数配列のアライメント、二次構造性質、ビット列（binary pattern）、相補的パッキングおよび埋もれた極性の相互作用が挙げられるが、これらに限定されることはない(Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5:372-376, 1995およびCordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6:3-10, 1996)。一般に、分子に対する修飾をデザインするかまたは特定の断片を同定する場合、構造の決定には修飾分子の活性を評価することを伴うと考えられる。
【００４９】
アミノ酸配列の変化は、生物学的活性に必須な高次構造の破壊を最小限に抑えるようにしてβ-グルカナーゼポリペプチドに加えられる。アミノ酸配列の変化の影響は、例えば、上記のコンピューターモデリングによって予測することができ、または結晶構造の解析によって判定することができる(例えば、Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol. 2:266-268, 1995を参照されたい)。当技術分野において周知であるその他の方法では、標準分子(例えば、天然タンパク質)と変異タンパク質の折り畳みを比較する。例えば、変異分子および標準分子におけるシステインパターンの比較を行うことができる。質量分析ならびに還元およびアルキル化を用いた化学修飾によって、ジスルフィド結合と関連するまたはそのような関連のないシステイン残基を判定する方法が提供される(Bean et al., Anal. Biochem. 201:216-226, 1992; Gray, Protein Sci. 2:1732-1748, 1993; およびPatterson et al., Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994)。修飾分子が標準分子と同じシステインパターンを持っていない場合、折り畳みに影響が出ると一般的に考えられている。他のよく知られているおよび一般に受け入れられている折り畳みの測定方法は円二色性(CD)である。修飾分子および標準分子がもたらすCDスペクトルを測定し比較することは日常業務である(Johnson, Proteins 7:205-214, 1990)。結晶学は折り畳みおよび構造を解析するための他の周知の方法である。核磁気共鳴(NMR)、消化ペプチドマッピングおよびエピトープマッピングは同様に、タンパク質とポリペプチドとの間の折り畳みおよび構造的類似性を解析するための公知の方法である(Schaanan et al., Science 257:961-964, 1992)。
【００５０】
SEQ ID NO:2に示されるβ-グルカナーゼタンパク質配列のHopp/Woods疎水性プロファイルを作成することができる(Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986およびTriquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998)。このプロファイルはスライド式の6残基ウィンドウに基づいている。埋込まれていたG残基、S残基およびT残基ならびに露出されていたH残基、Y残基およびW残基は無視した。
【００５１】
当業者であれば、β-グルカナーゼポリペプチドのアミノ酸配列の修飾をデザインする場合には、全体の構造的および生物学的プロファイルに支障を来さないように、親水性または疎水性が考慮されるということを認識していると思われる。置換に対し特に興味深いのは、Val、LeuおよびIleからなる群またはMet、Gly、Ser、Ala、TyrおよびTrpからなる群より選択されるより選択される疎水性残基である。例えば、置換に寛容である残基としてはSEQ ID NO:2に示されるように、Val残基、Leu残基およびIle残基またはMet残基、Gly残基、Ser残基、Ala残基、Tyr残基およびTrp残基からなる群を挙げることができる。SEQ ID NO:2のなかにある各位置の保存されたシステイン残基は、置換に比較的寛容であるものと思われる。
【００５２】
前述の「FASTA」解析などの方法を用いて、類似性の高い領域をタンパク質のファミリー内で同定し、保存領域のアミノ酸配列を解析するために使用する。構造に基づいて変異β-グルカナーゼポリヌクレオチドを同定する代替的アプローチは、前述のように、候補となる変異β-グルカナーゼ遺伝子をコードする核酸分子がSEQ ID NO:1のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズできるかどうかを判定することである。
【００５３】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸を同定する他の方法は、部位特異的変異誘発法またはアラニンスキャニング変異誘発法(Cunningham and Wells, Science 244:1081 (1989), Bass et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:4498 (1991), Proteins: Analysis and Design, Angeletti (編), 259-311頁 (Academic Press, Inc. 1998)中のCoombs and Corey, 「Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering」)などの、当技術分野において公知の手順である。後者の方法では、単一のアラニン変異を分子中の残基ごとに導入し、得られた変異分子を以下に開示される生物学的または生化学的活性について試験し、分子の活性にとって重大な意味を持つアミノ酸残基を同定する。同様にHilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996)を参照されたい。
【００５４】
本発明は同様に、第一の部分と第二の部分とを含む融合タンパク質であって、第一の部分と第二の部分はペプチド結合によって連結されており、第一の部分はSEQ ID NO:2と少なくとも95パーセントの配列同一性を有するポリペプチドまたはSEQ ID NO:2を含むポリペプチドなどの、機能的なβ-グルカナーゼを含んでおり、第二の部分は異種タンパク質などの、対象とするタンパク質を含んでいる融合タンパク質を提供する。この融合タンパク質は任意で、アフィニティータグ、治療薬、検出可能な標識および同様のものなどの、第三の部分を含んでもよい。本発明は同様に、本発明の融合タンパク質をコードするDNA分子を提供する。
【００５５】
本発明は同様に、機能的に連結された次のエレメントを含むDNA構築体を提供する: ピキアメタノリカの転写プロモーターを含む第一のDNAセグメント、SEQ ID NO:2のポリペプチドまたはSEQ ID NO:2と95パーセントの配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第二のDNAセグメント、対象とするタンパク質をコードする第三のDNAセグメント、およびピキアメタノリカの転写ターミネーターを含む第四のDNAセグメント。第一のDNAセグメントは、例えば、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素1(GAP1)、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素2(GAP2)、アルコール利用遺伝子1(alcohol utilization gene 1(AUG1))、アルコール利用遺伝子2 (AUG2)およびその他のピキアメタノリカ・プロモーターなどの転写プロモーターであってよい。第二のDNAセグメントは機能的なピキアメタノリカβ-グルカナーゼ遺伝子、例えば、SEQ ID NO:1である。第三のDNAセグメントは異種タンパク質をコードすることが好ましい。第四のDNAセグメントは、例えば、GAP1、GAP2、AUG1、AUG2およびその他のピキアメタノリカ・ターミネーターなどのピキアメタノリカ転写ターミネーターを含む。
【００５６】
本発明のDNA構築体は選択可能なマーカー、例えば、ADE2遺伝子をさらに含んでよい。加えて、本発明のDNA構築体は、ピキアメタノリカの複製起点または他の生物、例えば、大腸菌、チャイニーズハムスター卵母(CHO)細胞、仔ハムスター腎(BHK)細胞および同様のもの由来のさらなる複製起点をさらに含んでよい。例えば、本発明のDNA構築体は、例えば、大腸菌の中で増幅させることができ、次いでこれをタンパク質の発現用に、CHO細胞などの宿主細胞に移動させることができる。
【００５７】
本発明のDNA構築体は、機能的に連結された第五のDNAセグメントであって、少なくとも一つの定常領域、例えば、ヒト免疫グロブリンFc断片を含む免疫グロブリン成分、アフィニティータグ、治療薬および/または検出可能な標識を含む第五のDNAセグメントをさらに含んでよい。
【００５８】
培養哺乳類細胞は本発明のDNA構築に適した宿主である。外因性DNAを哺乳類宿主細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション(Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973)、エレクトロポレーション(Neumann et al., EMBO J. 1:841-5, 1982)、DEAE-デキストランを介したトランスフェクション(Ausubel et al., 同章)およびリポソームを介したトランスフェクション(Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993 ; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993)、ならびにウイルスベクター(Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-90, 1989; Wang and Finer, Nature Med. 2:714-6, 1996)が挙げられる。培養哺乳類細胞での組換えポリペプチドの産生は、例えば、Levinson et al., 米国特許第4,713,339号; Hagen et al., 米国特許第4,784,950号; Palmiter et al., 米国特許第4,579,821号; およびRingold, 米国特許第4,656,134号により開示されている。適当な培養哺乳類細胞としては、COS-1 (ATCC番号CRL 1650)、COS-7 (ATCC番号CRL 1651)、BHK (ATCC番号CRL 1632)、BHK 570 (ATCC番号CRL 10314)、293 (ATCC番号CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977)およびチャイニーズハムスター卵母(例えば、CHO-K1; ATCC番号CCL 61)細胞系が挙げられる。適当なさらなる細胞系は当技術分野において公知であり、American Type Culture Collection, Manassas, VAなどの公的寄託機関から入手可能である。一般に、SV-40またはサイトメガロウイルス由来のプロモーターなどの、強力な転写プロモーターが好ましい。例えば、米国特許第4,956,288号を参照されたい。適当なその他のプロモーターとしては、メタロチオネイン遺伝子由来のもの(米国特許第4,579,821号および同第4,601,978号)およびアデノウイルス主要後期プロモーターが挙げられる。
【００５９】
一般的に、薬剤選択を用いて、外来DNAが挿入されている培養哺乳類細胞を選択する。そのような細胞は一般に、「トランスフェクタント」といわれる。選択薬剤の存在下で培養された細胞であって、対象とする遺伝子をその子孫に継代することができる細胞は「安定的なトランスフェクタント」といわれる。好ましい選択可能マーカーは、抗生物質のネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択はG-418または同様のものなどの、ネオマイシン型の薬剤の存在下で行われる。選択系を用いて対象とする遺伝子の発現レベルを増加させることも可能であり、このプロセスは「増幅」といわれる。低レベルの選択薬剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、その後、選択薬剤の量を増加させて、導入した遺伝子の産物を高いレベルで産生する細胞を選択することにより、増幅は行われる。好ましい増幅可能な選択可能マーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼであり、これはメトトレキセートに対する耐性を与える。その他の薬剤耐性遺伝子(例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)を使用することもできる。緑色蛍光タンパク質、またはCD4、CD8、クラスI MHCなどの細胞表面タンパク質、胎盤由来アルカリホスファターゼなどの、表現型の変化を導入する他のマーカーを用いて、FACSソーティングまたは磁気ビーズによる分離技術のような手段により、非トランスフェクト細胞からトランスフェクト細胞を選別してもよい。
【００６０】
植物細胞、昆虫細胞および鳥類細胞を含めて、その他の高等真核細胞を宿主として使用することもできる。植物細胞で遺伝子を発現させるためにベクターとしてアグロバクテリウムリゾジェネス(Agrobacterium rhizogenes)を使用することは、Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987により概説されている。昆虫細胞の形質転換およびその細胞中での外来ポリペプチドの産生は、Guarino et al., 米国特許第5,162,222号および国際公開公報第94/06463号により開示されている。一般にオートグラファカリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)に由来する、組換えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させることができる。King, L.A. and Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; およびRichardson, C.D(編)., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995を参照されたい。組換えバキュロウイルスを作製する第二の方法では、Luckow (Luckow, VA, et al., J. Virol 67:4566−79, 1993)が記述しているトランスポゾンに基づく系を用いる。この系はBac-to-Bacキット(Life Technologies, Rockville, MD)として市販されている。この系では、「バックミド（bacmid）」と呼ばれる大型のプラスミドとして大腸菌の中で保持されるバキュロウイルスゲノムの中にβ-グルカナーゼ融合タンパク質をコードするDNAを移動させるTn7トランスポゾンを含んだ、トランスファーベクターpFastBac1(商標) (Life Technologies)を用いる。このpFastBac1(商標)トランスファーベクターには、対象とする遺伝子の発現を推進するためにAcNPVポリヘドリンプロモーターが使われている。しかしながら、pFastBac1(商標)は大いに改変することができる。ポリヘドリンプロモーターを除去し、バキュロウイルス感染の初期に発現させ、かつ分泌タンパク質を発現させるのに好都合であることが明らかにされているバキュロウイルス塩基性タンパク質プロモーター(Pcor、p6.9またはMPプロモーターとしても知られる)で置換することができる。Hill-Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71:971-6, 1990; Bonning, B.C. et al., J. Gen. Virol. 75:1551-6, 1994; およびChazenbalk, G.D., and Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270:1543-9, 1995を参照されたい。このようなトランスファーベクターの構築では、短いまたは長い種類の塩基性タンパク質プロモーターを使用することができる。
【００６１】
当技術分野において公知の技術を用いて、β-グルカナーゼ融合タンパク質を含んだトランスファーベクターを大腸菌に形質転換し、組換えバキュロウイルスを示す、分断化されたlacZ遺伝子を含むバックミドについてスクリーニングする。一般的な技術を用いて、組換えバキュロウイルスゲノムを含んだバックミドDNAを単離し、これを使ってスポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞、例えば、Sf9 細胞をトランスフェクトする。β-グルカナーゼ融合タンパク質を発現する組換えウイルスを次に産生させる。当技術分野において一般的に用いられる方法により、組換えウイルスのストックを作製する。
【００６２】
この組換えウイルスは宿主細胞、典型的にはヨトウガのスポドプテラフルギペルダ由来の細胞系に感染させるのに使われる。一般的には、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Application of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994を参照されたい。別の適当な細胞系はトリコプルシアニ(Trichoplusia ni) (米国特許第5,300,435号)由来のHigh FiveO(商標)細胞系(Invitrogen)である。
【００６３】
酵母細胞を含めて、菌類細胞を本発明中で使用することもできる。この点で具体的に対象とされる酵母菌種としては、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキアパストリス(Pichia pastoris)およびピキアメタノリカが挙げられる。S.セレビシエ細胞を外因性DNAで形質転換し、組換えポリペプチドをその細胞から産生させる方法は、例えば、Kawasaki, 米国特許第4,599,311号; Kawasaki et al., 米国特許第4,931,373号; Brake, 米国特許第4,870,008号; Welch et al., 米国特許第5,037,743号; およびMurray et al., 米国特許第4,845,075号により開示されている。形質転換細胞は選択可能マーカー、一般に薬剤耐性または特定の栄養素(例えば、ロイシン)の非存在下で増殖する能力により判定される表現型によって選択される。サッカロマイセスセレビシエで用いるのに好ましいベクター系は、Kawasaki et al(米国特許第4,931,373号)により開示されているPOT1ベクター系であり、この系は形質転換細胞をグルコース含有培地中での増殖によって選択可能とする。酵母で用いるのに適したプロモーターおよびターミネーターとしては、糖分解酵素遺伝子(例えば、Kawasaki, 米国特許第4,599,311号; Kingsman et al., 米国特許第4,615,974号; およびBitter, 米国特許第4,977,092号を参照されたい)およびアルコール脱水素酵素遺伝子由来のものが挙げられる。同様に、米国特許第4,990,446号; 同第5,063,154号; 同第5,139,936号および同第4,661,454号を参照されたい。ハンセヌラポリモルファ(Hansenula polymorpha)、シゾサッカロマイセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロマイセスラクチス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロマイセスフラギリス(Kluyveromyces fragilis)、ウスチラゴメイデス(Ustilago maydis)、ピキアパストリス、ピキアギラーモンジイ(Pichia guillermondii)およびカンジダマルトサ(Candida maltosa)を含めて、その他の酵母用の形質転換系が当技術分野において公知である。例えば、Gleeson et al., J. Gen. Microbiol 132:3459-65, 1986およびCregg, 米国特許第4,882,279号を参照されたい。アスペルギルス(Aspergillus)細胞をMcKnight et al., 米国特許第4,935,349号の方法にしたがって用いてもよい。アクレモニウムクリソゲナム(Acremonium chrysogenum)を形質転換する方法は、Sumino et al., 米国特許第5,162,228号により開示されている。ニューロスポラ(Neurospora)を形質転換する方法はLambowitz, 米国特許第4,486,533号により開示されている。
【００６４】
リチウム形質転換(Hiep et al., Yeast 9:1189-1197, 1993; Tarutina and Tolstorukov, Abst. of the 15th International Specialized Symposium on Yeasts, Riga (USSR), 1991, 137; Ito et al., J. Bacteriol. 153:163, 1983; Bogdanova et al., Yeast 11:343, 1995)、スフェロプラスト形質転換(Beggs, Nature 275:104, 1978; Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978; Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5:3376, 1985)、凍結融解ポリエチレングリコール形質転換(Pichia Expression Kit Instruction Manual, Invitrogen Corp., San Diego, CA, Cat. No. K1710-01)またはエレクトロポレーションを含めた、いくつかの公知の方法のいずれかによって、他の有用な酵母宿主細胞のP.メタノリカ細胞の中に異種または外因性DNAを導入することもできるが、後者のものが好ましい。エレクトロポレーションは、パルス電場を用いて細胞膜を一過性に透過化処理し、DNAなどの巨大分子を細胞中に移行させるプロセスである。エレクトロポレーションは哺乳類(例えば、Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982)および菌類(例えば、Meilhoc et al., Bio/Technology 8:223-227, 1990)宿主細胞で用いるための記述がある。しかしながら、DNAが細胞中に移入される実際の機構は十分に理解されていない。P.メタノリカの形質転換の場合、指数関数的に減衰する、2.5 kV/cmから4.5 kV/cmの電界強度および1ミリ秒から40ミリ秒の時定数(τ)を有するパルス電場にその細胞をさらすと、エレクトロポレーションが驚くほどに効率的であるということが分かっている。時定数τは初期ピーク電圧V0がV0/eの値にまで減衰するのに必要とされる時間と定義される。時定数はパルス回路の全抵抗値と電気容量の積、すなわちτ = R×Cとして計算することができる。典型的には、抵抗値および電気容量はいずれも予め設定されても、または選択のエレクトロポレーション装置に応じて、使用者により選択されてもよい。いずれにしても、製造元の使用説明書にしたがって装置を設定し、上記の電界強度および減衰パラメーターを実現する。エレクトロポレーション装置は商業的供給者(例えば、BioRad Laboratories, Hercules, CA)から入手できる。
【００６５】
形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主細胞は、栄養素および選択の宿主細胞の増殖に必要とされるその他の成分を含有する培地中で従来の方法にしたがって培養される。限定培地および複合培地を含めて、さまざまな適当な培地が当技術分野において知られており、これらには一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルが含まれる。培地には必要に応じて、増殖因子または血清のような成分が含まれてもよい。増殖培地によって一般に、例えば、発現ベクターに載せられているまたは宿主細胞に同時にトランスフェクトされる選択可能マーカーにより補完される必須栄養素の欠乏または薬剤選択によって、外因的に付加されたDNAを含む細胞が選択されると考えられる。例えば、P.メタノリカ細胞は十分な炭素源、窒素源および微量栄養素源を含有する培地中で、約25℃から35℃の温度で培養される。液体培養では小フラスコの振盪または発酵槽のスパージング（sparging）などの、従来の手段によって十分な通気を与える。P.メタノリカに好ましい培地はYEPD(2% D-グルコース、2% Bacto(商標)ペプトン(Difco Laboratories, Detroit, MI)、1% Bacto(商標)酵母抽出物(Difco Laboratories)、0.004%アデニンおよび0.006% L-ロイシン)である。
【００６６】
P.メタノリカを形質転換するのに用いるDNA分子は一般に、二本鎖の環状プラスミドとして調製されると考えられ、これは形質転換の前に線状化されることが好ましい。ポリペプチドまたはタンパク質の産生の場合、このDNA分子は本明細書において開示される選択可能マーカーに加えて、転写プロモーター、機能的なグルカナーゼ遺伝子、対象とするポリペプチドまたはタンパク質をコードするDNAセグメント(例えば、cDNA)および転写ターミネーターを含んだ発現カセットを含むと考えられる。これらのエレメントは機能的に連結されて、対象とするDNAセグメントの転写をもたらす。プロモーターおよびターミネーターはP.メタノリカ遺伝子のものであることが好ましい。有用なプロモーターとしては、構成的プロモーターおよびメタノール誘導性プロモーター由来のものが挙げられる。プロモーター配列は一般に、遺伝子のコード配列の1.5 kb上流の範囲内に、多くの場合には1 kbまたはそれ以下の範囲内に含まれる。一般に、調節プロモーターは調節領域の存在によって、構成的プロモーターよりも大きい。正および負両方の調節領域を含んだメタノール誘導性プロモーターは、開始ATGから1 kbを超えて上流に及んでいることもある。プロモーターは機能によって識別されており、公知の方法にしたがってクローニングすることができる。
【００６７】
使用できるメタノール誘導性プロモーターは、P.メタノリカのアルコール利用遺伝子のものである。そのような一つの遺伝子の代表的なコード鎖の配列はAUG1 (Raymond et al., 米国特許第6,153,424号)である。P.メタノリカは第二のアルコール利用遺伝子AUG2を含んでおり、そのプロモーターを本発明中で使うことができる(Raymond et al., 米国特許第6,153,424号)。その他の有用なプロモーターとしてはジヒドロキシアセトンシンターゼ(DHAS)、ギ酸脱水素酵素(FMD)およびカタラーゼ(CAT)遺伝子のものが挙げられる。他の種由来のこれらの酵素をコードする遺伝子が報告されており、その配列を用いることができる(例えば、Janowicz et al., Nuc. Acids Res. 13:2043, 1985; Hollenberg and Janowicz, EPO特許公報番号0 299 108; Didion and Roggenkamp, FEBS Lett. 303:113, 1992)。これらのタンパク質をコードする遺伝子は、公知の配列をプローブとして用いることにより、または公知の配列をアライメント(整列)し、このアライメントに基づいてプライマーをデザインし、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってP.メタノリカのDNAを増幅することによりクローニングすることができる。
【００６８】
構成的プロモーターは環境条件によって活性化または不活性化されることのないものであり、すなわちそれらは常に転写が活性である。本発明中で用いるのに好ましい構成的プロモーターとしては、P.メタノリカのグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(本明細書において記載される)、トリオースリン酸イソメラーゼおよびホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子由来のものが挙げられる。これらの遺伝子は上記のように、または対応遺伝子の変異を有する、サッカロマイセスセレビシエ細胞などの、宿主細胞での補完によってクローニングすることができる。この種の変異体は当技術分野において周知である。例えば、Kawasaki and Fraenkel, Biochem. Biophys. Res. Comm. 108:1107-1112, 1982; McKnight et al., Cell 46:143-147, 1986; Aguilera and Zimmermann, Mol. Gen. Genet. 202:83-89, 1986を参照されたい。
【００６９】
本発明のDNA分子はピキア・メタノリカのグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素1(GAPDH-1)のプロモーターおよびターミネーター(SEQ ID NO:5) (Raymond et al., 国際公開公報第00/78978号)、ならびにP.メタノリカのグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素2(GAPDH-2)のプロモーターおよびターミネーター(SEQ ID NO:6) (Raymond, 米国特許第6,348,331号および同第6,440,720号)を含むことができる。メタノールの使用を最小限に抑えることが望まれる大規模の産業プロセスの場合、メタノール利用に必要な遺伝子に遺伝的欠損がある宿主細胞が使われてもよい。そのような遺伝子としては、アルコールオキシダーゼ遺伝子AUG1およびAUG2 (Zamost, B., 米国特許第6,258,559号)、ならびにカタラーゼ、ホルムアルデヒド脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、ジヒドロキシアセトンシンターゼ、ジヒドロキシアセトンキナーゼ、フルクトース1,6-二リン酸アルドラーゼおよびフルクトース1,6-ビスホスファターゼをコードする遺伝子が挙げられる。両アルコールオキシダーゼ(AUG1およびAUG2)遺伝子が欠損されている細胞を使うことが特に好都合である。AUG1遺伝子、AUG2遺伝子またはAUG1とAUG2の両遺伝子に欠損があるピキアメタノリカ菌株を作り出す方法はRaymond et al., Yeast 14:11 (1998)により、Raymond, 米国特許第5,716,808号により、およびRaymond et al., 米国特許第5,736,383号により記述されている。
【００７０】
P.メタノリカのグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素-1(GAPDH-1)遺伝子プロモーター、コード領域およびターミネーターを含んだDNA分子の配列がSEQ ID NO:5に示されている。この遺伝子をGAP1と称した。当業者であれば、SEQ ID NO:5はP.メタノリカGAP1遺伝子の単一の対立遺伝子であることおよびその他の機能的な対立遺伝子(対立遺伝子変異体)が存在する可能性が高いこと、ならびに対立遺伝子変異にはプロモーター領域、コード領域またはターミネーター領域のヌクレオチド変化が含まれてもよいことを認識すると考えられる。
【００７１】
SEQ ID NO:5のなかで、GAP1の読み取り枠はヌクレオチド1733〜1735位のメチオニンコドン(ATG)から始まる。転写プロモーターはATGの上流に位置している。遺伝子発現実験によって、機能的プロモーターはGAP1遺伝子の5'-フランキング領域の約900ヌクレオチド以内に含まれていることが示された。このプロモーター配列の解析から、サッカロマイセスセレビシエのプロモーターエレメントに相同ないくつかの配列の存在が明らかとなった。これらの配列にはヌクレオチド1584位から1591位のコンセンサスTATAAAボックス、ヌクレオチド1355位から1367位のコンセンサスRap1p結合部位(Graham and Chambers, Nuc. Acids Res. 22:124-130, 1994)、ならびにヌクレオチド1225位から1229位、1286位から1290位、1295位から1299位、1313位から1317位、1351位から1354位、1370位から1374位、1389位から1393位および1457位から1461位の候補となるGcr1p結合部位(Shore, Trends Genet. 10:408-412, 1994)が含まれる。理論によって束縛されることを望むわけではないが、これらの配列はS.セレビシエのプロモーターTDH3プロモーター(Bitter et al., Mol. Gen. Genet. 231:22-32, 1991)におけるその対応配列のものに類似の機能を果たす可能性がある、すなわち、それらは異種の転写調節領域を結合する可能性があると考えられる。P.メタノリカGAP1プロモーター中のコンセンサスGcr1p結合部位の周辺領域の変異は、プロモーター活性を破壊することが分かっている。
【００７２】
転写プロモーターとして本発明中で用いるのに好ましいSEQ ID NO:5に示した配列の部分には、SEQ ID NO:5の5'非コード領域の少なくとも900個の連続ヌクレオチドを含むセグメント、および好ましくはSEQ ID NO:5に示した配列のヌクレオチド810位からヌクレオチド1724位を含むセグメントが含まれる。当業者であれば、P.メタノリカGAP1遺伝子の5'非コード領域のもっと長い部分を使うこともできることを認識すると思われる。本発明のプロモーター配列はしたがって、3'方向のヌクレオチド1732位までのSEQ ID NO:5の配列を含んでもよく、5'方向のヌクレオチド232位までまたはそれを超えて伸びていてもよい。操作の便宜性および簡便性のため、発現用DNA構築体のなかで使われるプロモーターは、一般には長さが1.5 kbを超えないと考えられ、多くの場合には長さが1.0 kbを超えないと考えられる。
【００７３】
以降に続く例のなかでさらに詳細に開示されるように、ヌクレオチド810位から1724位までのSEQ ID NO:5の配列は、機能的な転写プロモーターを与える。しかしながら、さらなるヌクレオチドをこの配列の片端または両端から除去することができ、得られた配列をタンパク質、好ましくは好都合なアッセイ法を容易に使用できるタンパク質をコードする配列に連結することによって、その配列をプロモーター機能について試験することができる。
【００７４】
本発明中では、GAP1プロモーターには、SEQ ID NO:1のヌクレオチド1733位から始まるGAP1遺伝子のコード配列が実質的にないことが好ましい。本明細書において用いられる「GAP1遺伝子のコード配列が実質的にない」という用語は、プロモーターDNAがGAP1コード配列の15またはそれ以下のヌクレオチド、好ましくは10またはそれ以下のヌクレオチド、およびより好ましくは3またはそれ以下のヌクレオチドを含むことを意味する。本発明の一つの態様中では、GAP1プロモーターはP.メタノリカのGAP1遺伝子のコード配列がない状態で供与される。しかしながら、当業者であれば、GAP1のATGが異種配列の翻訳の開始を与えるようにして、SEQ ID NO:5の開始ATG(ヌクレオチド1733位から1735位)を含むGAP1遺伝子断片をATGがない異種のコード配列に機能的に連結できることを認識すると思われる。当業者であればさらに、GAP1と異種アミノ酸配列とを含む融合タンパク質が産生されるように、さらなるGAP1コード配列が含まれてもよいことを認識すると思われる。そのような融合タンパク質には翻訳の後で、GAP1と異種配列の分離を容易とする切断部位が含まれてもよい。
【００７５】
GAP1プロモーター配列に加えて、本発明は同様に、P.メタノリカGAP1遺伝子の3'非コード領域に由来する転写ターミネーター配列を提供する。コンセンサス転写ターミネーター配列(Chen and Moore, Mol. Cell. Biol. 12:3470-3481, 1992)はSEQ ID NO:5のヌクレオチド2774位から2787位に存在する。本発明中では、したがって、長さが少なくとも約60 bpの転写ターミネーター遺伝子セグメントが提供される。例えば、長さが少なくとも90 bpまたは長さが約200 bpのもっと長いセグメントが使われることが多い。これらのセグメントは上記の終結配列を含み、その5'末端としてSEQ ID NO:5のヌクレオチド2735位を有してもよい。しかしながら、当業者であれば、DNA構築体の中に供与される転写ターミネーターセグメントは終結コドンがないコード配列の挿入を可能とするように、SEQ ID NO:5のヌクレオチド2732〜2734位のTAA翻訳終結コドンをその5'末端に含むことができることを認識すると思われる。
【００７６】
本発明は同様に、SEQ ID NO:6に示されるピキアメタノリカのグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素-2(GAPDH-2)遺伝子プロモーター、コード領域およびターミネーターを含んだDNA分子を提供する。この遺伝子をGAP2と称した。当業者であれば、SEQ ID NO:6はP.メタノリカGAP2遺伝子の単一の対立遺伝子であることおよびその他の機能的な対立遺伝子(対立遺伝子変異体)が存在する可能性が高いこと、ならびに対立遺伝子変異にはプロモーター領域、コード領域またはターミネーター領域のヌクレオチド変化が含まれてもよいことを認識すると思われる。
【００７７】
SEQ ID NO:6のなかで、GAP2の読み取り枠はヌクレオチド1093〜1095位のメチオニンコドン(ATG)から始まる。転写プロモーターはATGの上流に位置している。遺伝子発現実験によって、機能的プロモーターはGAP2遺伝子の5'-フランキング領域の約1000ヌクレオチド以内に含まれていることが示された。
【００７８】
転写プロモーターとして本発明中で用いるのに好ましいSEQ ID NO:6に示した配列の部分には、SEQ ID NO:6の5'非コード領域の少なくとも900連続ヌクレオチドを含むセグメント、および好ましくはSEQ ID NO:6に示した配列のヌクレオチド93位からヌクレオチド1080位を含むセグメントが含まれる。当業者であれば、P.メタノリカGAP2遺伝子の5'非コード領域のもっと長い部分を使うこともできることを認識すると思われる。本発明のプロモーター配列はしたがって、3'方向のヌクレオチド1092位までのSEQ ID NO:6の配列を含んでもよく、5'方向のヌクレオチド1位までまたはそれを超えて伸びていてもよい。一般に、発現用DNA構築体のなかで使われるプロモーターは、長さが1.5 kbを超えず、好ましくは長さが1.0 kbを超えない。これらのプロモーター断片に加えて、本発明は同様に、約3300 bpまでの単離DNA分子、ならびに5000 bpまでの単離DNA分子であって、P.メタノリカのGAP2プロモーター配列を含む前記分子を提供する。
【００７９】
本発明中では、GAP2プロモーターには、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1093位から始まるGAP2遺伝子のコード配列が実質的にないことが好ましい。本明細書において用いられるGAP2遺伝子のコード配列が「実質的にない」という用語は、プロモーターDNAがGAP2コード配列の15またはそれ以下のヌクレオチド、好ましくは10またはそれ以下のヌクレオチド、およびより好ましくは3またはそれ以下のヌクレオチドを含むことを意味する。本発明の好ましい態様中では、GAP2プロモーターはP.メタノリカのGAP2遺伝子のコード配列がない状態で供与される。しかしながら、当業者であれば、GAP2のATGが異種配列の翻訳の開始を与えるようにして、SEQ ID NO:6の開始ATG(ヌクレオチド1093位から1095位)を含むGAP2遺伝子断片をATGがない異種のコード配列に機能的に連結できることを認識すると思われる。当業者であればさらに、GAP2と異種アミノ酸配列とを含む融合タンパク質が産生されるように、さらなるGAP2コード配列が含まれてもよいことを認識すると思われる。そのような融合タンパク質には翻訳の後で、GAP2と異種配列の分離を容易とする切断部位が含まれてもよい。
【００８０】
GAP2プロモーター配列に加えて、本発明は同様に、P.メタノリカGAP2遺伝子の3'非コード領域に由来する転写ターミネーター配列を提供する。コンセンサス転写ターミネーター配列(Chen and Moore, Mol. Cell. Biol. 12:3470-3481, 1992)はSEQ ID NO:6のヌクレオチド2136位から2145位に存在する。本発明中では、したがって、少なくとも約50 bp長、好ましくは少なくとも60 bp長、より好ましくは少なくとも90 bp長、さらにより好ましくは約200 bp長の転写ターミネーター遺伝子セグメントが提供される。本発明のターミネーターセグメントはSEQ ID NO:6の3'非コード領域の500〜1000ヌクレオチドを含んでもよい。これらのセグメントは上記の終結配列を含み、好ましくはその5'末端としてSEQ ID NO:6のヌクレオチド2095位を有する。しかしながら、当業者であれば、発現ベクターの中に供与される転写ターミネーターセグメントは終結コドンがないコード配列の挿入を可能とするように、SEQ ID NO:6のヌクレオチド2092〜2094位のTAA翻訳終結コドンをその5'末端に含むことができることを認識すると思われる。
【００８１】
本発明のDNA構築体は、選択可能マーカーをさらに含んでよい。本発明の発現ベクターまたはDNA構築体は、ベクターを含んだP.メタノリカ細胞の同定および選択を可能とする選択可能マーカーをさらに含む。選択可能マーカーはそれらを含んだ細胞に有利な増殖をもたらす。選択の一般的原理は当技術分野において周知である。選択可能マーカーはP.メタノリカ遺伝子であることが好ましい。よく使われる選択可能マーカーは、アミノ酸またはヌクレオチドの合成に必要とされる酵素をコードする遺伝子である。これらの遺伝子に変異がある細胞は、この変異が選択可能マーカーによって補完されなければ、特定のアミノ酸またはヌクレオチドを欠いた培地の中で増殖することができない。このような「選択可能」培地を使用することで、宿主細胞内での異種DNAの安定的な維持が確実になる。P.メタノリカで用いる本発明の選択可能マーカーとしては、例えば、ホスホリボシル-5-アミノイミダゾールカルボキシラーゼ(AIRC; EC 4.1.1.21)をコードするP.メタノリカADE2遺伝子を挙げることができる。Raymond, 米国特許第5,736,383号を参照されたい。このADE2遺伝子は、ade2宿主細胞に形質転換されると、細胞がアデニンの非存在下で増殖することを可能にする。代表的なP.メタノリカADE2遺伝子配列のコード鎖がSEQ ID NO:4に示されている。図解の配列には、ヌクレオチド1007〜1009位の開始ATGコドンとともに、1006ヌクレオチドの5'非コード配列および442ヌクレオチドの3'非コード配列が含まれる。本発明の好ましい態様中では、ヌクレオチド407〜2851位を含むDNAセグメントが選択可能マーカーとして使われるが、コード部分がプロモーターおよびターミネーター配列に機能的に連結される限りもっと長いまたはもっと短いセグメントを使うことができる。別の方法では、野生型細胞に有利な増殖をもたらす、優性の選択可能マーカーが使われてもよい。典型的な優性の選択可能マーカーは、ネオマイシン型の抗生物質(例えば、G418)、ハイグロマイシンBおよびブレオマイシン/フレオマイシン型の抗生物質(例えば、ゼオシン(商標); Invitrogen Corporation, San Diego, CAから入手できる)などの、抗生物質に対する耐性を与える遺伝子である。P.メタノリカで用いるのに好ましい優性の選択可能マーカーは、ゼオシン(商標)の活性を阻害するSh bla遺伝子である。
【００８２】
本発明は同様に、本明細書において記述されるDNA構築体を含んだピキアメタノリカ細胞を提供する。このDNA構築体は一つまたは複数のコピーとして、ピキアメタノリカのゲノムにゲノムにより挿入されてもよい。ピキアメタノリカ細胞は機能性を欠く液胞プロテイナーゼAおよび/または液胞プロテイナーゼBを有してもよい。ピキアメタノリカ細胞は機能性を欠くAUG1および/またはAUG2遺伝子を有してもよい。
【００８３】
本発明は同様に、第三のDNAセグメントを発現させ、かつ対象とするタンパク質が産生される本発明のDNA構築体を含んだ本発明の細胞を培養する段階、および対象とするタンパク質を回収する段階を含む、対象とするタンパク質の産生方法を提供する。対象とするタンパク質は、ピキアメタノリカにとって異種性または外来性であることが好ましい。
【００８４】
クローニングしたDNA分子を操作しさまざまな宿主細胞に外因性DNAを導入する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Murray, ed., Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press, Clifton, NJ, 1991; Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D. C., 1994; Ausubel et al. (編), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1995; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, New York, 1997により開示されている。発現ベクターを含めて、DNAベクターは一般に、選択可能マーカーならびに細菌宿主(例えば、大腸菌)内で機能して、原核生物宿主内でのベクターの複製および増幅を可能とする複製起点を含む。必要に応じて、これらの原核生物のエレメントは、これを別の宿主に導入する前にベクターから取り除くことができる。例えば、そのような原核生物の配列は、P.メタノリカ宿主細胞へのその導入前のベクターの線状化によって取り除くことができる。
【００８５】
本発明のその他の態様中では、本発明の機能的なβ-グルカナーゼ遺伝子に機能的に連結された機能的な転写ターミネーターであるSEQ ID NO:6の一部分を含むDNAセグメント、および対象とするタンパク質をコードするさらなるDNAセグメントを含んだDNA構築体が提供される。一つの態様中では、本発明のGAP2プロモーターおよびターミネーター配列を組み合わせて使用し、その際にDNA構築体のなかでその双方を機能的なβ-グルカナーゼ遺伝子および対象とするタンパク質をコードするDNAセグメントに機能的に連結する。
【００８６】
組換えタンパク質の産生のために宿主としてP.メタノリカ細胞を使用することは、米国特許第5,955,349号、同第5,888,768号、同第6,001,597号、同第5,965,389号、同第5,736,383号、同第5,854,039号、同第5,716,808号、同第5,736,383号、同第5,854,039号および同第5,736,383号に開示されている。P.メタノリカを形質転換するのに用いるDNA構築体、例えば、発現ベクターは一般に、二本鎖の環状プラスミドとして調製されると考えられ、これは形質転換の前に線状化されることが好ましい。宿主染色体への発現ベクターDNAの組み込みを容易にするため、宿主DNA配列(例えば、AUG1 3'配列)がプラスミドの発現セグメント全体にこの両末端で隣接していることが好ましい。対象とするポリペプチドをコードするDNAを含んだプラスミドのP.メタノリカ細胞への導入を容易にするため、エレクトロポレーションが使われる。指数関数的に減衰する、2.5kV/cmから4.5 kV/cm、好ましくは約3.75 kV/cmの電界強度および1ミリ秒から40ミリ秒、最も好ましくは約20ミリ秒の時定数(τ)を有するパルス電場を用いたエレクトロポレーションによって、P.メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。
【００８７】
組み込み形質転換体はタンパク質の産生プロセスで用いるのに好ましい。そのような細胞は、DNAがゲノムからめったに失われないので、持続的な選択圧なしに増殖させることができる。宿主染色体へのDNAの組み込みはサザンブロット解析により確認することができる。手短に言えば、形質転換されたおよび形質転換されていない宿主DNAを制限エンドヌクレアーゼで消化し、電気泳動により分離し、支持メンブレンにブロッティングし、適切な宿主DNAセグメントでプロービングする。非形質転換細胞および形質転換細胞で見られる断片のパターンの相違は、組み込み形質転換体を示唆するものである。制限酵素およびプローブを選択して、ゲノム断片の中から、形質転換しているDNAセグメント(例えば、プロモーター、ターミネーター、異種DNAおよび選択可能マーカー配列)を同定することができる。
【００８８】
異種タンパク質の発現レベルの相違が、個々の分離株のなかでの組み込み部位および発現カセットのコピー数などの要因から生じる可能性がある。したがって、産生株を選択する前に、いくつかの分離株を発現レベルについてスクリーニングすることが好都合である。高い発現レベルを示す分離株は、通常、所望の発現カセットの組み込まれたコピーを複数含むと考えられる。種々の適当なスクリーニング方法を用いることができる。例えば、タンパク質を結合するメンブレン(例えば、ニトロセルロース)で重層されたプレート上で、形質転換体のコロニーを増殖させる。分泌またはその後の溶解により、タンパク質が細胞から放出されて、メンブレンに結合する。次いで、イムノアッセイ法を含めて、公知の方法を用い、結合したタンパク質をアッセイすることができる。発現レベルのさらに正確な解析は、細胞を液体培地中で培養し、必要に応じて馴化培地または細胞溶解物を解析することで得られる。培地および溶解物からタンパク質を濃縮し精製する方法は、ある程度、対象とするタンパク質によって決まると考えられる。そのような方法は、当業者によって容易に選択されて行われる。
【００８９】
分泌タンパク質の産生の場合、誤ったタンパク質分解を最小限に抑えるために、液胞プロテアーゼ、つまりPEP4遺伝子によりコードされるプロテイナーゼAおよびPRB1遺伝子によりコードされるプロテイナーゼBに機能欠損がある宿主細胞が好ましい(Raymond et al., 米国特許第6,153,424号)。液胞プロテアーゼの活性(およびしたがって液胞プロテアーゼの欠損)は、いくつかの公知のアッセイ法のいずれかにより測定される。好ましいアッセイ法はサッカロマイセスセレビシエ用に開発されたものであり、Jones, Methods Enzymol. 194:428-453, 1991により開示されている。好ましいそのようなアッセイ法はAPNE重層アッセイ法であり、これによってカルボキシペプチダーゼY(CpY)の活性が検出される。Wolf and Fink, J. Bact. 123:1150-1156, 1975を参照されたい。酵素前駆体(プロ)CpYはプロテイナーゼAおよびプロテイナーゼBにより活性化されるので、APNEアッセイ法は一般に液胞プロテアーゼの活性を示唆する。APNE重層アッセイ法はカルボキシペプチダーゼYを介したN-アセチル-フェニルアラニン-β-ナフチル-エステル(APNE)からのβ-ナフトールの放出を検出するものであり、ジアゾニウム塩Fast Garnet GBCとのβ-ナフトールの反応によって不溶性の赤色色素の形成が起こる。室温でアッセイプレート(YEPDプレートが好ましい)上にて増殖している細胞にRxM 8 mlを重層する。RxMは、寒天0.175 g、H2O 17.5 mlおよび1 M Tris-HCl pH 7.4 5 mlを混合し、この混合物をレンジにより加熱して寒天を溶解し、約55℃まで冷却し、調製したてのAPNE (ジメチルホルムアミド中で2 mg/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 2.5 ml、およびアッセイ直前に、Fast Garnet GBC塩 (Sigma Chemical Co.) 20 mgを添加することにより調製される。重層を凝固させて、着色を観察する。野生型コロニーは赤色となり、その一方でCPY欠損菌株は白色となる。カルボキシペプチダーゼY活性は同様にウェル試験により検出することもでき、この試験では細胞をマイクロタイター試験プレートのウェル中に分布させて、N-ベンゾイル-L-チロシンp-ニトロアニリド(BTPNA)およびジメチルホルムアミドの存在下でインキュベートする。細胞をジメチルホルムアミドにより透過化処理すると、細胞中のCpYがBTPNA内のアミド結合を切断して、黄色の生成物p-ニトロアニリンを生ずる。CpYアッセイ法はプロテアーゼ活性を低下させるどんな変異も、その活性が最終的にCpY活性の低下をもたらす限り検出すると考えられる。
【００９０】
P.メタノリカ細胞は十分な炭素源、窒素源および微量栄養素源を含有する培地中で、約25℃から35℃の温度で培養される。液体培養では小フラスコの振盪または発酵槽のスパージングなどの、従来の手段によって十分な通気を与える。P.メタノリカに好ましい培地はYEPD(2% D-グルコース、2% Bacto(商標)ペプトン(Difco Laboratories, Detroit, MI)、1% Bacto(商標)酵母抽出物(Difco Laboratories)、0.004%アデニン、0.006% L-ロイシン)である。
【００９１】
大量培養の場合、1個から2個のP.メタノリカ菌株のコロニーを新鮮な寒天プレート(例えば、YEPD寒天)からピック（pick）し、2リットルのバッフル付き振盪フラスコ中に含まれるYEPDブロス250 ml中に懸濁させることができる。この培養物を30℃および振盪速度250 rpmで16時間から24時間増殖させる。発酵槽開始容量1リットルにつき、およそ50ミリリットルから80ミリリットルの植菌材料(5〜8% v/v植菌材料)を使用する。
【００９２】
好ましい発酵培地は炭素源としてグルコース、無機アンモニア、カリウム、リン酸塩、イオンおよびクエン酸を含んだ水溶性の培地である。本明細書で用いる「水溶性の培地」とは、目に見える沈殿物を含んでいない培地である。この培地にはリン酸塩ガラス(ヘキサメタリン酸ナトリウム)が含まれないことが好ましい。好ましい培地は脱イオン水中で調製され、硫酸カルシウムを含まない。最少培地として、培地には酵母抽出物などの、ポリペプチドまたはペプチドが含まれないことが好ましい。しかしながら、必要に応じて、酸で加水分解されたカゼイン(例えば、カザミノ酸またはアミカーゼ(amicase))を培地に添加することができる。発酵培地の例は次の化合物を混合することによって調製される: (NH4)2SO4 (11.5グラム/リットル)、K2HPO4 (2.60グラム/リットル)、KH2PO4 (9.50グラム/リットル)、FeSO4・7H2O (0.40グラム/リットル)およびクエン酸(1.00グラム/リットル)。蒸留し、脱イオン化した水を1リットルまで添加した後、この溶液をオートクレーブによって滅菌し、冷却させて、それから以下を添加する: 60% (w/v)グルコース溶液(47.5ミリリットル/リットル)、10×微量金属溶液(20.0ミリリットル/リットル)、1 M MgSO4 (20.0ミリリットル/リットル)およびビタミン原液(2.00ミリリットル/リットル)。10×微量金属溶液にはFeSO4・7H2O (100 mM)、CuSO4・5H2O (2 mM)、ZnSO4・7H2O (8 mM)、MnSO4・H2O (8 mM)、CoCl2・6H2O (2 mM)、Na2MoO4・2H2O (1 mM)、H3BO3 (8 mM)、KI (0.5 mM)、NiSO4・6H2O (1 mM)、チアミン(0.50グラム/リットル)およびビオチン(5.00ミリグラム/リットル)が含まれる。ビタミン原液にはイノシトール(47.00グラム/リットル)、パントテン酸(23.00グラム/リットル)、ピロドキシン(1.20グラム/リットル)、チアミン(5.00グラム/リットル)およびビオチン(0.10グラム/リットル)が含まれる。当業者はこれらの特定の成分および量を変化させることができる。例えば、硫酸アンモニウムを塩化アンモニウムと置き換えることができ、または硫酸アンモニウムの量を、例えば、約11グラム/リットルから約22グラム/リットルまで変化させることができる。
【００９３】
微量金属およびビタミンの添加後、培地のpHを通常は、10% H3PO4の添加によってpH 4.5に調整する。一般に、およそ1リットルあたり約10ミリリットルを添加すれば、さらに酸を添加する必要はないと考えれる。発酵の間に、pHを5 N NH4OHの添加により、産生されるタンパク質に応じて、約3.5から約5.5または約4.0から約5.0の間に維持する。
【００９４】
発酵槽の例はBIOFLO 3000発酵槽システム(New Brunswick Scientific Company, Inc.; Edison, NJ)である。この発酵槽システムでは6リットルまたは14リットルの発酵槽容器を取り扱うことができる。6リットルの容器で行われる発酵は培地3リットルで調製され、その一方、14リットルの容器で行われる発酵は培地6リットルで調製される。温度を操作する発酵槽容器は通常、発酵の経過の間には30℃に設定されるが、この温度は発現されるタンパク質に応じて、27〜31℃に及んでもよい。発酵はバッチモードで実施される。最初に存在しているグルコースはおよそ10時間の経過発酵時間(EFT)までに使用されることが多く、この時点でグルコースの供給を開始して、細胞集団を増加させることができる。グルコースの供給例としては、60% (w/v)グルコース900ミリリットル、50% (w/v) (NH4)2SO4 60ミリリットル、10×微量金属溶液60ミリリットルおよび1 M MgSO4 30ミリリットルが挙げられる。ピキアメタノリカの発酵は骨の折れるものであり、30%を超える溶解酸素飽和度を維持するために高度の撹拌、通気および酸素スパージングが必要になる。至適な発現および増殖のためには、溶解酸素度は15%を下回るべきではない。生物体量は通常、48時間のEFTで1リットルあたり細胞乾燥重量およそ30グラムからおよそ80グラムに到達する。
【００９５】
本発明により産生されるタンパク質は、従来の方法を用いて宿主細胞から回収される。分泌タンパク質は標準的な方法を用いて馴化培地から回収され、同様に特定のタンパク質かどうか選別される。一般に、Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1994を参照されたい。
【００９６】
本発明の材料および方法を用いて、研究、産業または製薬対象のタンパク質を産生させることができる。そのようなタンパク質としてはリパーゼ、セルラーゼおよびプロテアーゼなどの酵素; 抗体およびその断片; プロテアーゼ阻害剤を含めて酵素阻害剤; 血小板由来増殖因子(PDGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)などの増殖因子; グルタミン酸脱炭酸酵素(GAD); エリスロポイエチン、トロンボポエチン、コロニー刺激因子、インターロイキンおよびインターロイキンアンタゴニストなどのサイトカイン; インシュリン、プロインシュリン、レプチンおよびグルカゴンなどのホルモン; zsig37、zsig39、zacrp8および同様のものなどの脂肪細胞補体関連タンパク質; ならびに切断型(「可溶性受容体」)でまたは、例えば、免疫グロブリン定常領域配列との融合タンパク質として発現できる、増殖因子受容体を含めて、受容体が挙げられる。これらのおよびその他のタンパク質をコードするDNAは、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第4,889,919号; 同第5,219,759号; 同第4,868,119号; 同第4,968,607号; 同第4,599,311号; 同第4,784,950号; 同第5,792,850号; 同第5,827,734号; 同第4,703,008号; 同第4,431,740号; 同第4,762,791号; 同第6,265,544号; 同第6,566,499号; 同第6,197,930号;同第6,482,612号; ならびに国際公開公報第95/21920号および国際公開公報第96/22308号を参照されたい。
【００９７】
グリコシル化されていない医薬用タンパク質を産生するために本発明を使うことが特に好ましい。P.メタノリカ細胞を含めて、酵母細胞は、哺乳類のものとは異なる糖鎖の付いた糖タンパク質を産生する。酵母細胞で産生された哺乳類の糖タンパク質はしたがって、哺乳類に導入した場合に「異質」と見なされる可能性があり、例えば、天然にグリコシル化されたものとは異なる薬物動態を示す可能性がある。
【００９８】
本発明は同様に、本発明のポリペプチドに対する抗体を提供する。β-グルカナーゼに対する抗体は、例えば、抗原としてβ-グルカナーゼ発現ベクターの産物または天然源から単離されたβ-グルカナーゼを用いて得ることができる。特に有用な抗β-グルカナーゼ抗体はβ-グルカナーゼと「特異的に結合する」。抗体が以下の二つ性質の少なくとも一つを示す場合、抗体は特異的に結合するものと考えられる: (1) 抗体が結合活性の閾値レベルでβ-グルカナーゼに結合する、および(2) 抗体がβ-グルカナーゼに関連するポリペプチドと有意に交差反応しない。
【００９９】
第1の特徴に関しては、抗体がβ-グルカナーゼのポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに106 M-1またはそれ以上、好ましくは107 M-1またはそれ以上、より好ましくは108 M-1またはそれ以上および最も好ましくは109 M-1またはそれ以上の結合親和性(Ka)で結合する場合、抗体は特異的に結合する。当業者は、例えば、スキャッチャード解析(Scatchard, Ann. AT Acad. Sci. 51:660 (1949))により、抗体の結合親和性を容易に決定することができる。第2の特徴に関しては、例えば、標準的なウエスタンブロット解析を用い、抗体によってβ-グルカナーゼが検出されるが、しかし公知の関連ポリペプチドが検出されない場合、抗体は関連ポリペプチド分子と有意に交差反応しない。公知の関連ポリペプチドの例は相同分子種およびタンパク質ファミリーの一員である同じ種由来のタンパク質である。
【０１００】
抗原性のβ-グルカナーゼエピトープを持つペプチドおよびポリペプチドを用いて、抗β-グルカナーゼ抗体を産生させることができる。本発明の抗原性のエピトープを持つペプチドおよびポリペプチドは、SEQ ID NO:2のなかに含まれる少なくとも9、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも18、少なくとも21または少なくとも24から約28アミノ酸の配列を含む。エピトープを持つペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中で十分な溶解性を与えるように選択されることが望ましい(すなわち、その配列は比較的親水性の残基を含んでおり、その上、疎水性の残基は回避されることが好ましい)。さらに、プロリン残基を含むアミノ酸配列はまた、抗体の産生に望ましい場合がある。
【０１０１】
例として、β-グルカナーゼ内の候補となる抗原部位は、LASERGENE (DNASTAR; Madison, WI)のPROTEANプログラム(バージョン3.14)により実行されるような、Jameson-Wolf法、Jameson and Wolf, CABIOS 4:181, (1988)を用いて同定することができる。この解析にはデフォルトパラメーターが使用されている。
【０１０２】
Jameson-Wolf法ではタンパク質構造予測に対する6つの主要なサブルーチンを組み合わせることにより、候補となる抗原決定基を予測する。手短に言えば、Hopp-Woods法, Hopp et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824 (1981)を初めに用いて、局部親水性の最も大きい領域に相当するアミノ酸配列を同定する(パラメーター: 7残基平均)。第二段階では、Eminiの方法, Emini et al., J. Virology 55:836 (1985)を用いて、表面確率(surface probability)を計算する(パラメーター: 表面識別閾値(0.6) = 1)。第三に、Karplus-Schultz法, Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72:212 (1985)を用いて、骨格鎖の柔軟性を予測する(パラメーター: 柔軟性閾値(0.2) = 1)。解析の第四および第五の段階では、Chou- Fasmanの方法、Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (編), 549-586頁 (Plenum Press 1990)中のChou,「Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition」およびGarnier-Robson, Garnier et al., J. Mol. Biol. 120:97 (1978) (Chou-Fasmanパラメーター: 立体配座表 = 64タンパク質; α領域閾値 = 103; β領域閾値 = 105; Garnier-Robsonパラメーター: αおよびβ判定定数 = 0)を使用して、二次構造予測をデータに適用する。第六のサブルーチンでは、柔軟性パラメーターおよび疎水性親水性指標/溶媒到達性因子を組み合わせて、「抗原性指標」として表される表面等高線数値を決定する。最後に、ピーク拡大機能を抗原性指標に適用する。これは各ピーク値の20%、40%、60%または80%を付加することにより主要な表面ピークを広げて、内部領域と比べて表面領域の可動性から生じるさらなる自由エネルギーに相当する。しかしながら、ヘリックス領域は柔軟性に劣る傾向があるため、この計算はヘリックス領域に存在するどの主要なピークにも適用されない。
【０１０３】
組換えβ-グルカナーゼタンパク質に対するまたは天然源から単離されたβ-グルカナーゼに対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて調製することができる。抗体はβ-グルカナーゼ-グルタチオントランスフェラーゼ融合タンパク質を用いて作製することも可能であり、これはBurrus and McMahon, Exp. Cell. Res. 220:363 (1995)により記述されている方法に類似している。ポリクローナル抗体の一般的な産生方法は、例えば、Immunochemical Protocols (Manson(編)), 1-5頁 (Humana Press 1992)中のGreen et al.,「Production of Polyclonal Antisera」、およびDNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (編), 15頁 (Oxford University Press 1995)中のWilliams et al.,「Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies」により記述されている。
【０１０４】
β-グルカナーゼポリペプチドの免疫原性はミョウバン(水酸化アルミニウム)またはフロインドの完全もしくは不完全アジュバントなどのアジュバントを用いて増加させることができる。免疫付与に有用なポリペプチドには同様に、免疫グロブリンポリペプチドとのまたはマルトース結合タンパク質とのβ-グルカナーゼまたはその一部分の融合体などの、融合ポリペプチドが含まれる。ポリペプチド免疫原は完全長の分子またはその一部分とすることができる。ポリペプチド部分が「ハプテン様」である場合、そのような部分を免疫付与のために高分子担体(キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)または破傷風トキソイドなどの)に結合するかまたは連結することが好都合である場合がある。
【０１０５】
ポリクローナル抗体は通常、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモットまたはヒツジなどの動物で産生されるが、本発明の抗β-グルカナーゼ抗体は類人猿抗体に由来してもよい。診断上および治療上有用な抗体をヒヒで産生するための一般的な技術は、例えば、Goldenberg et al., 国際公開公報第91/11465号のなかで、およびLosman et al., lnt. J. Cancer 46:310 (1990)のなかで見出すことができる。
【０１０６】
または、モノクローナル抗β-グルカナーゼ抗体、例えば、β-グルカナーゼ活性をなくす無力化モノクローナル抗体を作製することができる。特定の抗原に対する齧歯類モノクローナル抗体を当業者に公知の方法により得ることができる(例えば、Kohler et al., Nature 256:495 (1975), Coligan et al.(編), Current Protocols in Immunology, Vol.1, 2.5.1-2.6.7頁 (John Wiley & Sons 1991) [「Coligan」], DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (編), 93頁 (Oxford University Press 1995)中のPicksley et al.,「Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli」を参照されたい)。
【０１０７】
手短に言えば、β-グルカナーゼ遺伝子産物を含む組成物をマウスに注射し、血清試料を取り出すことで抗体産生が有ることを検証し、Bリンパ球を得るために脾臓を取り出し、ハイブリドーマを産生するためにBリンパ球をミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、抗体をハイブリドーマ培養物から単離することによって、モノクローナル抗体を得ることができる。
【０１０８】
さまざまな十分に確立された技術によって、モノクローナル抗体をハイブリドーマ培養物から単離し精製することができる。そのような単離技術としては、プロテイン-Aセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる(例えば、2.7.1-2.7.12頁および2.9.1-2.9.3頁のColigan; Methods in Molecular Biology, Vol. 10, 79-104頁 (The Humana Press, Inc. 1992)中のBaines et al.,「Purification of Immunoglobulin G (IgG)」を参照されたい)。
【０１０９】
特定の用途の場合、抗β-グルカナーゼ抗体の断片を調製することが望ましいこともある。例えば、抗体のタンパク質分解性の加水分解によって、そのような抗体断片を得ることができる。従来の方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって、抗体断片を得ることができる。例として、ペプシンによる抗体の酵素的切断によってF(ab')2と示される5S断片をもたらすことで、抗体断片を産生させることができる。3.5S Fab'一価断片を産生させるチオール還元剤を用いて、この断片をさらに切断することができる。任意で、ジスルフィド結合の切断から生ずるスルフヒドリル基に対する保護基を用いて、切断反応を行うことができる。別の方法として、ペプシンを用いた酵素的切断によって2本の一価Fab断片とFc断片を直接的に産生させる。これらの方法は、例えば、Goldenberg, 米国特許第4,331,647号, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960), Porter, Biochem. J. 73:119 (1959), Edelman et al., Methods in Enzymology Vol.1, 422頁 (Academic Press 1967)中により、ならびに2.8.1-2.8.10頁および2.10.-2.10.4頁のColiganにより記述されている。
【０１１０】
無傷の抗体によって認識される抗原に断片が結合する限り、一価の軽鎖-重鎖断片を形成させる重鎖の分離、断片のさらなる切断、またはその他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的技術などの、その他の抗体切断方法を使うこともできる。
【０１１１】
例えば、Fv断片はVH鎖およびVL鎖の結合を含む。Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659 (1972)により記述されているように、この結合は非共有結合性とすることができる。あるいは、可変鎖を分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋することができる(例えば、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)を参照されたい)。
【０１１２】
Fv断片はペプチドリンカーによって連結されているVH鎖およびVL鎖を含んでもよい。これらの一本鎖抗原結合タンパク質(scFv)は、オリゴヌクレオチドによって連結されたVHおよびVLドメインをコードするDNA配列を含んだ構造遺伝子を構築することで調製される。この構造遺伝子を発現ベクター中に挿入し、これを引き続いて大腸菌などの宿主細胞中に導入する。この組換え宿主細胞によって、2本のVドメインを架橋しているリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖が合成される。ScFvの産生方法は、例えば、Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 97 (1991)により記述されている(同様に、Bird et al., Science 242: 423(1988), Ladner et al., 米国特許第4,946,778号, Pack et al., Bio/Technology 11:1271 (1993)およびSandhu、前記を参照されたい)。
【０１１３】
例として、インビトロでリンパ球をβ-グルカナーゼポリペプチドにさらし、ファージまたは類似ベクターの抗体ディスプレイライブラリーを選択する(例えば、固定化されたまたは標識されたβ-グルカナーゼのタンパク質またはペプチドを用いて)ことにより、scFVを得ることができる。候補となるβ-グルカナーゼポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージにディスプレイされた(ファージディスプレイ)または大腸菌などの細菌にディスプレイされたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム変異導入法およびランダムポリヌクレオチド合成法を介するなど、いくつかの方法で得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを用いて、リガンドもしくは受容体などのタンパク質もしくはポリペプチド、生体高分子もしくは合成高分子、または有機物質もしくは無機物質とできる公知の標的と相互作用するペプチドをスクリーニングすることができる。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作製しスクリーニングする方法は、当技術分野において公知であり(Ladner et al., 米国特許第5,223,409号, Ladner et al., 米国特許第4,946,778号, Ladner et al., 米国特許第5,403,484号, Ladner et al., 米国特許第5,571,698号およびKay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996))、ランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびそのようなライブラリーをスクリーニングするキットは、例えば、CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA)、Invitrogen Inc. (San Diego, CA)、New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA)およびPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ)から市販されている。本明細書において開示されるβ-グルカナーゼ配列を用いてランダムペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングし、β-グルカナーゼに結合するタンパク質を同定することができる。
【０１１４】
抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。対象とする抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって、CDRペプチド(「最小認識単位」)を得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成するポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製される(例えば、Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991), Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al.(編), 166頁 (Cambridge University Press 1995)中のCourtenay-Luck, 「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies」およびMonoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (編), 137頁 (Wiley-Liss, Inc. 1995)中のWard et al.,「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」を参照されたい)。
【０１１５】
ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、標準的な方法を用いて、動物に抗β-グルカナーゼ抗体または抗体断片を免疫することによって調製することができる。例えば、Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (編), 1-12頁 (Humana Press 1992)中のGreen et al.,「Production of Polyclonal Antisera」を参照されたい。同様に、2.4.1-2.4.7頁のColiganを参照されたい。あるいは、上記の方法とともに抗β-グルカナーゼ抗体または抗体断片を免疫原として用い、モノクローナル抗イディオタイプ抗体を調製することができる。
【０１１６】
抗イディオタイプβ-グルカナーゼ抗体、ならびにβ-グルカナーゼポリペプチドを用いて、β-グルカナーゼの基質および阻害剤を同定することおよび単離することができる。例えば、本発明のタンパク質およびペプチドをカラムに固定化して用いて、カラムに流される生体試料から基質および阻害タンパク質を結合させることができる(Hermanson et al.(編), Immobilized Affinity Ligand Techniques, 195-202頁 (Academic Press 1992))。放射能標識されたまたはアフィニティー標識されたβ-グルカナーゼポリペプチドを用いて、生体試料中のβ-グルカナーゼの基質および阻害剤を同定することまたは局在化させることもできる(例えば、Deutscher(編), Methods in Enzymol., vol. 182, 721-37頁 (Academic Press 1990); Brunner et al., Ann. Rev. Biochem. 62:483 (1993); Fedan et al., Biochem. Pharmacol. 33:1167 (1984)を参照されたい)。
【０１１７】
本発明は同様に、機能的なβ-グルカナーゼ遺伝子を含んだDNA構築体などの、DNA分子をキットとして提供する。あるいは、そのようなキットにはAUG1および/またはAUG2プロモーターならびに液胞プロテイナーゼAおよび/または液胞プロテイナーゼBの欠失体などの、ピキアメタノリカ細胞が含まれてもよい。さらに、キットには対象とするタンパク質をコードする遺伝子をDNA構築体中に挿入する方法に関する使用説明書ならびに提供のピキアメタノリカ細胞を形質転換し、対象とするタンパク質を発現、産生および回収する方法に関する使用説明書が含まれてもよい。
【０１１８】
本発明を以下の限定するものではない例によってさらに説明する。
【０１１９】
実施例
実施例1
エキソ-1,3-β-グルカナーゼの同定
P.メタノリカβ-グルカナーゼ遺伝子をクローニングするため、45kDaの分泌タンパク質を発酵条件の下で増殖させたPMAD16菌株のブロスから単離した。N末端配列決定による検証から、単離されたタンパク質は30アミノ酸の重複部分のなかで対応するH.ポリモルファ(H. polymorpha)エキソ-1,3-β-グルカナーゼタンパク質配列に対し76.7%の相同性および対応するS.オシデンタリス(S. occidentalis)エキソ-1,3-β-グルカナーゼタンパク質配列に対し74.1%の相同性を有することが分かった。縮重センス(ZC18,176; SEQ ID NO:7およびZC18,177; SEQ ID NO:8)およびアンチセンス(ZC16,562; SEQ ID NO:9およびZC16,567; SEQ ID NO:10ならびにZC18,180; SEQ ID NO:11およびZC18,181; SEQ ID NO:12)PCRプライマーをH.ポリモルファおよびS.オシデンタリスのエキソ-1,3-β-グルカナーゼ遺伝子のコード領域のアライメントからデザインした。次に、これらのプライマーを用いて、P.メタノリカゲノムDNAを増幅させた。1280bp長の増幅配列を回収し、これが対応するH.ポリモルファ・エキソ-1,3-β-グルカナーゼタンパク質配列に対し65.0%の相同性を有することが分かった。
【０１２０】
P.メタノリカゲノムライブラリーをベクターpRS426 (Christianson et al., Gene 110:119-122, 1992)、つまりS.セレビシエ中で増殖することを可能にする2μおよびS.セレビシエURA3配列を含んだシャトルベクターの中に構築した。標準的な手順にしたがって、ゲノムDNAを菌株CBS6515から調製した。手短に言えば、細胞を富栄養培地中で一晩培養し、ザイモリエース(酵母細胞壁溶解酵素)でスフェロプラストとし、SDSで溶解した。DNAを溶菌液からエタノールで沈殿させて、フェノール/クロロホルム混合液で抽出し、次いで酢酸アンモニウムおよびエタノールで沈殿させた。DNA調製物のゲル電気泳動から、損なわれていない高分子量のDNAおよび相当な量のRNAの存在が示された。酵素の希釈系列の存在下でDNAをインキュベートすることにより、DNAをSau 3Aで部分的に消化した。消化物の試料を電気泳動により解析して、断片のサイズ分布を確認した。4 kbから12 kbの間に移動したDNAをゲルから切り出し、このゲル切片から抽出した。次に、サイズ分画したDNAを、予めBam HIで消化し、アルカリホスファターゼで処理しておいたpRS426に連結した。エレクトロポレーター(Gene Pulser(商標); BioRad Laboratories, Hercules, CA)を製造元の推奨にしたがって用い、反応混合液の分割量を大腸菌MC1061細胞の中にエレクトロポレーションを行った。
【０１２１】
P.メタノリカのエキソ-1,3-β-グルカナーゼ遺伝子断片の配列決定領域からデザインされたセンスおよびアンチセンスプライマーを用いたPCRによって、このライブラリーをスクリーニングした。PCR反応混合液を94℃で1分間インキュベートし、続けて94℃、1分、52℃、1分、72℃、11分を34サイクル行った。43ライブラリーのプールから始めて、陽性のプールを同定し、個々のコロニーに分解していった。P.メタノリカのエキソ-1,3-β-グルカナーゼ遺伝子をその挿入断片として含んだpRS426プラスミドを有する単一コロニーを単離した。エキソ-1,3-β-グルカナーゼ遺伝子の方向ならびに挿入断片中の5'および3'フランキング配列の長さをDNA配列決定によって推定した(SEQ ID NO:1)。この遺伝子をエキソ-1,3-β-グルカナーゼと称した。
【０１２２】
実施例2 
異種性のS.セレビシエリーダーと内因性のP.メタノリカリーダーとを用いるZACRP3タグなし酵母発現ベクターの構築および特徴づけ
ピキアメタノリカでのzacrp3 (Piddington et al., 米国特許第6,521,233号)の発現では、Raymond, 米国特許第5,888,768号; Raymond, 米国特許第5,955,349号; およびRaymond, 米国特許第6,001,597号に記載の発現系を用いる。zacrp3をコードするポリヌクレオチドの全部または一部を含んだ発現プラスミドは相同組換えを介して構築される(Raymond et al., 米国特許第5,854,039号)。タグなしzacrp3ポリペプチドを発現させるためにpVRM51から発現ベクターを構築した。PVRM51はpCZR204発現ベクターの誘導体であり、これはKex2p切断を促進させるためにα因子プレプロ(αFpp)配列内の1アミノ酸(D83→Y83)だけがpCZR204と異なる。pVRM51ベクターはAUG1プロモーターを含んでおり、その後にαFpp(D83→Y83)リーダー配列およびアミノ末端ペプチドタグ(Glu-Glu)が続き、その後に平滑末端化Sma I制限部位、カルボキシ末端ペプチドタグ(Glu-Glu)、翻訳停止コドンが続き、その後にAUG1ターミネーター、ADE2選択可能マーカーおよび最後にAUG1 3'非翻訳領域が続いている。同様にこのベクターに含まれるのは、S.セレビシエ中での選択および複製に必要とされるURA3およびCEN-ARS配列、ならびに大腸菌中での選択および複製に必要とされるAmpRおよびcolE1 ori配列である。タグなしzacrp3ポリペプチドを発現させるためにzCZR204から第二の発現ベクターを構築した。zCZR204発現ベクターは上記の通りであり、唯一の相違は、この発現プラスミドにはαFppリーダーが通常挿入されている場所にβ-グルカナーゼリーダーが挿入されているということである。これらのベクターに挿入されたzacrp3配列はzacrp3アミノ酸配列の残基番号23(Gln)で始まる。zacrp3のヌクレオチド配列はSEQ ID NO:13に示されており、zacrp3のポリペプチド配列はSEQ ID NO:14に示されている。
【０１２３】
各構築体に対し、特異的な組換えプライマーをデザインした。αFppD→Y::zacrp3構築体の場合、これらのプライマーはZG37,475 (SEQID NO:15)およびZG37,474 (SEQ ID NO:16)である。β-グルカナーゼ::zacrp3構築体の場合、プライマーZG39,207 (SEQ ID NO:17)およびZG39,209 (SEQ ID NO:18)を用いてβ-グルカナーゼリーダーを増幅し、その一方で、プライマーZG39,208 (SEQ ID NO:19)およびZG37,474 (SEQ ID NO:16)を用いてzacrp3を増幅した。得られたPCR断片を上記の酵母発現ベクター中に相同的に組換えた。αFppD→Y::zacrp3構築体の場合、N末端プライマー(ZG37,475) (SEQ ID NO:15)は一端にα因子プレプロ(αFpp)コード配列の39塩基対が伸び、もう一端に成熟zacrp3配列のアミノ末端コード配列の26塩基対が続く。C末端プライマー(ZG37,474) (SEQ ID NO:16)は一端にzacrp3のカルボキシ末端コード配列の約28塩基対が伸び、AUG1ターミネーター配列の40塩基対をともなう。
【０１２４】
β-グルカナーゼ::zacrp3構築体の場合、N末端β-グルカナーゼプライマー(ZG39,207) (SEQ ID NO:17)はβ-グルカナーゼリーダー配列の27塩基対に先行して、AUG1p配列の40塩基対に及ぶ。β-グルカナーゼを増幅するC末端プライマー(ZG39,209) (SEQ ID NO:18)には、Glu-Gluタグのアミノ末端コード配列の33塩基対に先行してβ-グルカナーゼのカルボキシ末端コード配列の30塩基対が含まれる。N末端zacrp3プライマー(ZG39,208) (SEQ ID NO:19)は成熟zacrp3配列の26塩基対に先行して、β-グルカナーゼ配列の39塩基対に及ぶ。zacrp3を増幅するC末端プライマー(ZG37,474) (SEQ ID NO:16)は、一端にzacrp3のカルボキシ末端コード配列の約28塩基対が伸び、AUG1ターミネーター配列の40塩基対をともなう。
【０１２５】
αFppリーダーを用いるタグなしzacrp3プラスミドの構築
タグなしzacrp3プラスミドはS.セレビシエSF838-9Dα中で、SmaI消化されたpVRM51アクセプターベクター100 ngおよびPCR増幅されたzacrp3 cDNAドナー断片1 μgを相同的に組換えることによって作製された。
【０１２６】
zacrp3 PCR断片をPCR反応により合成した。100 μlの最終反応容量に、プライマーZG37,474 (SEQ ID NO:16)およびZG37,475 (SEQ ID NO:15)を各100 pmol、10×PCR緩衝液(Boehringer Mannheim) 10 μl、Pwoポリメラーゼ(Boehringer Mannheim) 1 μl、0.25 mMヌクレオチド三リン酸ミックス(Perkin Elmer) 10 μlおよびdH2Oを添加した。PCR反応は94℃で2分を1サイクル、続けて94℃で30秒、50℃で1分および72℃で1分を25サイクル、続けて72℃で7分伸長を行い、4℃に一晩保持で完結させた。得られた754 bpの二本鎖zacrp3断片はSEQ ID NO:20に開示されている。
【０１２７】
β-グルカナーゼリーダーを用いるタグなしzacrp3プラスミドの構築
タグなしzacrp3プラスミドはS.セレビシエSF838-9Dα中で、SmaI消化されたpCZR204アクセプターベクター100 ngならびにPCR増幅されたβ-グルカナーゼリーダードナー断片各1 μgおよびzacrp3 cDNAドナー断片1 μgを相同的に組換えることによって作製された。zacrp3 PCR断片は、まず初めにβ-グルカナーゼリーダーおよびzacrp3をそれぞれ含む二つの断片を別の反応で増幅させることによって合成された。
【０１２８】
β-グルカナーゼリーダーは次のようにPCR反応で増幅させた。100 μlの最終反応容量に、プライマーZG39,207 (SEQ ID NO:17)およびZG39,209 (SEQ ID NO:18)を各100 pmol、10×PCR緩衝液(Boehringer Mannheim) 10 μl、Pwoポリメラーゼ(Boehringer Mannheim) 1 μl、0.25 mMヌクレオチド三リン酸ミックス(Perkin Elmer) 10 μlおよびdH2Oを添加した。PCR反応は94℃で2分を1サイクル、続けて94℃で30秒、50℃で1分および72℃で30秒を25サイクル、続けて72℃で7分伸長を行い、4℃に一晩保持で完結させた。得られた157 bpの二本鎖β-グルカナーゼリーダー断片はSEQ ID NO:21に開示されている。
【０１２９】
Zacrp3は次のようにさらなるPCR反応で増幅させた。100 μlの最終反応容量に、プライマーZG39,208 (SEQ ID NO:19)およびZG37,474 (SEQ ID NO:16)を各100 pmol、10×PCR緩衝液(Boehringer Mannheim) 10 μl、Pwoポリメラーゼ(Boehringer Mannheim) 1 μl、0.25 mMヌクレオチド三リン酸ミックス(Perkin Elmer) 10 μlおよびdH2Oを添加した。PCR反応は94℃で2分を1サイクル、続けて94℃で30秒、50℃で1分および72℃で30秒を25サイクル、続けて72℃で7分伸長を行い、4℃に一晩保持で完結させた。得られた754 bpの断片は二本鎖であり、zacrp3 PCR断片はSEQ ID NO:22に開示されている。
【０１３０】
コンピテントな酵母細胞(S.セレビシエ菌株SF838-9Dα) 100マイクロリットルを上記由来の種々のDNA混合物と個別に混合し、これを0.2 cmエレクトロポレーションキュベットに移した。この酵母/DNA混合物を0.75 kV (5 kV/cm)、無限大Ω、25 μFでエレクトロパルス処理した。次いで、この酵母/DNA混合物を1.2 Mソルビトール1 mlに添加し、30℃で1時間インキュベートした。次いで、この酵母を2枚のURA DSプレート上に500 μlずつの2つの分割量でプレーティングし、30℃でインキュベートした。
【０１３１】
約48時間後、単一プレート由来のUra+酵母形質転換体をH2O 1 ml中に再懸濁し、これを短時間遠心分離させて酵母細胞を沈殿とした。この細胞沈殿物をQiagen P1溶解用緩衝液300 μl中に再懸濁して、酸洗浄ガラスビーズ(Sigma) 100〜200 μlを含んだ新しいチューブに移した。試料を1分間隔で2回または3回激しく撹拌して、細胞を溶解させた。試料を沈殿させて、溶菌液250 μlを新しいチューブに移し、Qiagen Spin Miniprep Kitの残りの部分を製造元の使用説明書にしたがって行った。
【０１３２】
エレクトロコンピテントな大腸菌DH10B細胞(Invitrogen)の形質転換は、酵母DNAプレップ2 μlおよびDH10B細胞 40 μlで行った。この細胞を0.1 cmキュベット中で2.0 kV、25 μFおよび100 Ωにてエレクトロパルス処理した。エレクトロポレーション後、SOC (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit, MI)、0.5%酵母抽出物(Difco)、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mMグルコース) 250 μlをLB AMPプレート(LBブロス(Lennox)、1.8% Bacto Agar (Difco)、100 mg/Lアンピシリン)上に1つの分割量でプレーティングした。プレートを37℃で一晩インキュベートした。
【０１３３】
タグなしzacrp3に対する正しい発現構築体を持った個々のクローンを制限消化により同定して、zacrp3挿入断片の存在を検証し、各種のDNA配列が相互に正しく連結されていることを確認した。陽性クローンの挿入断片を配列解析に供した。αFppD→Yリーダー::zacrp3プラスミドをpSDH147と称し、β-グルカナーゼリーダー::zacrp3プラスミドをpSDH149と称した。Qiagen Maxiキット(Qiagen)を製造元の使用説明書にしたがって用い、両プラスミドについてさらに大量のプラスミドDNAを単離し、そのDNAをNot Iで消化して、ベクター骨格からピキア-zacrp3発現カセットを分離させた。次に、Not Iで制限消化したDNA断片をピキアメタノリカ発現宿主PMAD16およびPMAD18に形質転換した。これは別の形質転換として、調製済みのコンピテントなPMAD16またはPMAD18細胞100 μlをNot Iで制限消化したpSDH147またはpSDH149 10 μgと混合し、これを0.2 cmエレクトロポレーションキュベットに移すことによって行った。この酵母/DNA混合物を0.75 kV、25 μF、無限大Ωでエレクトロパルス処理した。このキュベットに1.2 Mソルビトール800 μlを添加し、選択を目的に400 μl分割量を2枚のADE DS (0.056% -Ade-Trp-Thrパウダー、0.67%アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース、2% D-グルコース、0.5% 200×トリプトファン、トレオニン溶液および18.22% D-ソルビトール)プレート上にプレーティングし、30℃でインキュベートした。
【０１３４】
P.メタノリカ宿主PMAD16およびPMAD18中でのZacrp3発現-クローンの選択および特徴づけ
各菌株/プラスミド(計400クローンに対し) 100クローンを単離した。これらのうち、それぞれの10クローンのみを高レベルのzacrp3発現がないかウエスタンブロットによってスクリーニングした。40クローン全てを次の方法で増殖させた。各25 ml培養物には各菌株の1コロニーを用いBMY.1 pH6.0培地(1リットルあたり: アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース(Becton Dickinson) 13.4 g、酵母抽出物(Difco) 10.0 g、トリプトン(Difco) 10.0 g、カザミノ酸(Difco) 10.0 g、K2HPO4 (EM Science) 6.7 g、クエン酸(EM Science) 4.2 gおよび水) + 2%グルコース中に植菌した。BMY.1培地にFXIIIビタミン溶液(0.05 g/Lビオチン、0.8 g/Lチアミン塩酸塩、0.8 g/LピロキシジンHCL、15.0 g/Lイノシトール、15.0 g/Lパントテン酸カルシウム、0.6 g/Lナイアシンアミド、0.1 g/L葉酸、0.2 g/Lリボフラビン、1.0 g/L塩化コリン)を培地1リットルあたり10 ml添加した。培養物を250 rpmに設定したプラットフォームシェーカーに載せた125 mlのバッフル付きフラスコ中で30℃にて一晩増殖させた。
【０１３５】
翌日、各終夜植菌培養物1 mlを、上記のFXIIIビタミン+ 1%メタノールを添加した作りたてのBMY.1培地24 ml中に希釈してAUG1プロモーターを誘導した(グルコースは添加しなかった)。培養物を250 rpmに設定したプラットフォームシェーカーに載せた125 mlのバッフル付きフラスコ中で30℃にて24時間増殖させた。増殖および誘導の24時間後、培養物をBeckman遠心分離機(JA-20ローター)中において5000rpmで10分間集菌して、細胞を沈殿させた。zacrp3を含有する上清300 μlをNuPAGE 4×サンプルバッファー(Invitrogen) 100 μlと混合した。各試料400 μlを2つの200 μl試料に分割し、一方の試料のセットを2% β-メルカプトエタノール(Sigma)で処理して還元試料としたのに対し、もう一方のセットは未還元試料とした。
【０１３６】
SDS-PAGE解析を下記のように行った。全ての還元試料を100℃で10分間加熱し、その一方、全ての未還元試料を65℃で10分間加熱した。各試料15 μLをポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に適用した。タンパク質の分離は4〜12%勾配のNuPAGEポリアクリルアミド分離ゲル(Invitrogen)での電気泳動により、1×MESランニングバッファー(Invitrogen)を用いた変性条件(SDS-PAGE)の下で行った。130 Vの電圧を全泳動の間中、印加した。その後、電気的転写を0.2 μnニトロセルロースメンブレン(Invitrogen)に400 mA (定電流)で1時間行った。次いで、メンブレンの無タンパク質領域をブロッキングするために、このブロットをブロッキング溶液[ウエスタンA + 10%脱脂粉乳(NFDM)(Carnation)]中、40 rpmで撹拌しながら25℃で30分間インキュベートした。
【０１３７】
一次抗体として、ウサギで産生された抗zacrp3アフィニティー精製抗体E1834(自家製)をウエスタンA + 2.5% NFDM中にて10,000倍希釈で使用した。インキュベーションは25℃で2時間とした。その後、ウエスタンBを用い適度な撹拌で5分の洗浄を2回行い、続けてウエスタンAを用い適度な撹拌で5分の洗浄を1回行った。二次抗体として、ヤギで産生されたウサギ抗IgG (Amersham)をウエスタンA + 2.5% NFDM中にて2000倍希釈で使用した。ブロットを室温で1時間インキュベートし、ウエスタンBを用い適度に撹拌しながら5分間3回洗浄し、続けてdH2O中で短時間すすいだ。Enhanced Chemiluminescentの両基質(Amersham) 2 mlを1:1の比率で混合し、ブロットを現像前にこの溶液中で5秒間インキュベートした。次いで、曝露済みのブロットを時間指定された露光によってX線フィルム(Kodak)に現像し、次にこのフィルムを現像してデータを可視化した。
【０１３８】
pSDH149 (β-グルカナーゼリーダー)およびpSDH147 (S.セレビシエα因子プレプロ配列)に相当するP.メタノリカクローン由来の培地のポリアクリルアミドゲルでの電気泳動解析から、両宿主菌由来の培地中において、約28kDa (還元条件下)のバンドがzacrp3に相当するものと思われるが、誘導なしの細胞培地ではバンドが存在しないことが示された。挿入された異種遺伝子の発現がないか解析された組換えクローンの約90パーセントが組換えzacrp3を産生し分泌していた。得られたzacrp3プラスミド含有酵母菌株から、内因性のP.メタノリカβ-グルカナーゼリーダー構築体pSDH149はPMAD16宿主菌株のバックグラウンドでは異種のS.セレビシエαFppリーダーpSDH147と比較して同水準のzacrp3を分泌することが明らかである。興味深いことに、プラスミド含有酵母菌株から、内因性のP.メタノリカβ-グルカナーゼリーダー構築体pSDH149はPMAD18宿主菌株のバックグラウンドでは異種のS.セレビシエαFppリーダーpSDH147と比較して約2〜3倍高い水準のzacrp3を分泌することが明らかである。各αFpp::zacrp3菌株の1分離株(isolet)を引き続き用いるためにピックした。得られたクローンをそれぞれ、PMAD16::pSDH147.4.2、PMAD18::pSDH147.4.8と称した。各β-グルカナーゼ::zacrp3菌株の2分離株を引き続き用いるためにピックした。得られたクローンをそれぞれ、PMAD16::pSDH149.4.4、PMAD16::pSDH149.4.9、PMAD18::pSDH149.4.5およびPMAD18::pSDH149.4.8と称した。
【０１３９】
実施例3
異種性のS.セレビシエリーダーと内因性のP.メタノリカリーダーとを用いるZsig37タグなし酵母発現ベクターの構築および特徴づけ
ピキアメタノリカでのzsig37の発現では、Raymond, 米国特許第5,888,768号; Raymond, 米国特許第5,955,349号; およびRaymond, 米国特許第6,001,597号に記載の発現系を用いる。zsig37をコードするポリヌクレオチドの全部または一部を含んだ発現プラスミドは相同組換えを介して構築される(Raymond et al., 米国特許第5,854,039号)。Zsig37をベクターpCZR204中に組換えた。zsig37を増幅するのに使われたオリゴによって、Kex2p切断を促進させるためにα因子プレプロ(αFpp)配列内に1アミノ酸変異(D83→Y83)が導入された。この変異は組換えが起こる際にベクターpCZR204中に導入された。pCZR204ベクターはAUG1プロモーターを含んでおり、その後にαFppリーダー配列およびアミノ末端ペプチドタグ(Glu-Glu)が続き、その後に平滑末端化Sma I制限部位、カルボキシ末端ペプチドタグ(Glu-Glu)、翻訳停止コドンが続き、その後にAUG1ターミネーター、ADE2選択可能マーカーおよび最後にAUG1 3'非翻訳領域が続いている。同様にこのベクターに含まれるのは、S.セレビシエ中での選択および複製に必要とされるURA3およびCEN-ARS配列、ならびに大腸菌中での選択および複製に必要とされるAmpRおよびcolE1 ori配列である。タグなしzsig37ポリペプチドを発現させるためにzCZR204から第二の発現ベクターを構築した。zCZR204発現ベクターは上記の通りであり、唯一の相違は、この発現プラスミドにはαFppリーダーが通常挿入されている場所にβ-グルカナーゼリーダーが挿入されているということである。これらのベクターに挿入されたzsig37配列はzsig37アミノ酸配列の残基番号86(Arg)で始まる。zsig37の完全長のヌクレオチド配列はSEQ ID NO:27に示されており、zsig37の完全長のポリペプチド配列はSEQ ID NO:28に示されている(米国特許第6,265,544号、同第6,566,499号、同第6,518,403号、同第6,448,221号および同第6,544,946号を参照されたい)。
【０１４０】
各構築体に対し、特異的な組換えプライマーをデザインした。αFppD83→Y83::zsig37構築体の場合、これらのプライマーはZG42,210 (SEQ ID NO:29)およびZG42,206 (SEQ ID NO:30)である。β-グルカナーゼ::zsig37構築体の場合、ZG42,209 (SEQ ID NO:31)およびZG42,211 (SEQ ID NO:32)を用いてβ-グルカナーゼリーダーを増幅し、その一方で、プライマーZG42,273 (SEQ ID NO:33)およびZG42,206 (SEQ ID NO:30)を用いてzsig37を増幅した。得られたPCR断片を上記の酵母発現ベクター中に相同的に組換えた。αFppD83→Y83::zsig37構築体の場合、N末端プライマー(ZG42,210) (SEQID NO:29)は一端にα因子プレプロ(αFpp)コード配列の39塩基対が伸び、αFpp配列内にD83→Y83変異が導入されており、もう一端に成熟zsig37配列のアミノ末端コード配列の25塩基対が続く。C末端プライマー(ZG42,206) (SEQ ID NO:30)は一端にzsig37のカルボキシ末端コード配列の約21塩基対が伸び、AUG1ターミネーター配列の40塩基対をともなう。
【０１４１】
β-グルカナーゼ::zsig37構築体の場合、N末端β-グルカナーゼプライマー(ZG42,209) (SEQ ID NO:31)はβ-グルカナーゼリーダー配列の27塩基対に先行して、AUG1p配列の40塩基対に及ぶ。β-グルカナーゼを増幅するC末端プライマー(ZG42,211) (SEQ ID NO:32)には、成熟zsig37配列のアミノ末端コード配列の25塩基対に先行してβ-グルカナーゼのカルボキシ末端コード配列の39塩基対が含まれる。N末端zsig37プライマー(ZG42,273) (SEQ ID NO:33)は成熟zsig37配列の25塩基対に先行して、β-グルカナーゼ配列の39塩基対に及ぶ。zsig37を増幅するC末端プライマー(ZG42,206) (SEQ ID NO:30)は、一端にzsig37のカルボキシ末端コード配列の約21塩基対が伸び、AUG1ターミネーター配列の40塩基対をともなう。
【０１４２】
αFppD→Yリーダーを用いるタグなしzsig37プラスミドの構築
タグなしzsig37プラスミドはS.セレビシエSF838-9Dα中で、SmaI消化されたpCZR204アクセプターベクター100 ngおよびPCR増幅されたzsig37 cDNAドナー断片1 μgを相同的に組換えることによって作製された。
【０１４３】
zsig37 PCR断片をPCR反応により合成した。100 μlの最終反応容量に、プライマーZG42,210 (SEQ ID NO:29)およびZG42,206 (SEQ ID NO:30)を各100 pmol、10×PCR緩衝液(Boehringer Mannheim) 10 μl、Pwoポリメラーゼ(Boehringer Mannheim) 1 μl、0.25 mMヌクレオチド三リン酸ミックス(Perkin Elmer) 10 μlおよびdH2Oを添加した。PCR反応は94℃で2分を1サイクル、続けて94℃で30秒、50℃で1分および72℃で1分を30サイクル、続けて72℃で7分伸長を行い、4℃に一晩保持で完結させた。得られた846 bpの二本鎖zsig37断片はSEQ ID NO:34に開示されている。αFpp::zsig37の完全長のヌクレオチド(pSDH156)はSEQ ID NO:35に示されており、対応するそのコードタンパク質はSEQ ID NO:36に示されている。
【０１４４】
β-グルカナーゼリーダーを用いるタグなしzsig37プラスミドの構築
タグなしzsig37プラスミドはS.セレビシエSF838-9Dα中で、SmaI消化されたpCZR204アクセプターベクター100 ngならびにPCR増幅されたβ-グルカナーゼリーダードナー断片各1 μgおよびzsig37 cDNAドナー断片1 μgを相同的に組換えることによって作製された。zsig37 PCR断片は、まず初めにβ-グルカナーゼリーダーおよびzsig37をそれぞれ含む二つの断片を別の反応で増幅させることによって合成された。
【０１４５】
β-グルカナーゼリーダーは次のようにPCR反応で増幅させた。100 μlの最終反応容量に、プライマーZG42,209 (SEQ ID NO:31)およびZG42,211 (SEQ ID NO:32)を各100 pmol、10×PCR緩衝液(Boehringer Mannheim) 10 μl、Pwoポリメラーゼ(Boehringer Mannheim) 1 μl、0.25 mMヌクレオチド三リン酸ミックス(Perkin Elmer) 10 μlおよびdH2Oを添加した。PCR反応は94℃で2分を1サイクル、続けて94℃で30秒、50℃で1分および72℃で1分を30サイクル、続けて72℃で7分伸長を行い、4℃に一晩保持で完結させた。得られた148 bpの二本鎖β-グルカナーゼリーダー断片はSEQ ID NO:37に開示されている。
【０１４６】
Zsig37は次のようにさらなるPCR反応で増幅させた。100 μlの最終反応容量に、プライマーZG42,273 (SEQ ID NO:33)およびZG42,206 (SEQ ID NO:30)を各100 pmol、10×PCR緩衝液(Boehringer Mannheim) 10 μl、Pwoポリメラーゼ(Boehringer Mannheim) 1 μl、0.25 mMヌクレオチド三リン酸ミックス(Perkin Elmer) 10 μlおよびdH2Oを添加した。PCR反応は94℃で2分を1サイクル、続けて94℃で30秒、50℃で1分および72℃で1分を30サイクル、続けて72℃で7分伸長を行い、4℃に一晩保持で完結させた。得られた846 bpの断片は二本鎖であり、zsig37 PCR断片はSEQ ID NO:38に開示されている。
【０１４７】
コンピテントな酵母細胞(S.セレビシエ菌株SF838-9Dα) 100マイクロリットルを上記由来の種々のDNA混合物と個別に混合し、これを0.2 cmエレクトロポレーションキュベットに移した。この酵母/DNA混合物を0.75 kV (5 kV/cm)、無限大Ω、25 μFでエレクトロパルス処理した。次いで、この酵母/DNA混合物を1.2 Mソルビトール1 mlに添加し、30℃で1時間インキュベートした。次いで、この酵母を2枚のURA DSプレート上に500 μlずつの2つの分割量でプレーティングし、30℃でインキュベートした。
【０１４８】
約48時間後、単一プレート由来のUra+酵母形質転換体をH2O 1 ml中に再懸濁し、これを短時間遠心分離させて酵母細胞を沈殿とした。この細胞沈殿物をQiagen P1溶解用緩衝液300 μl中に再懸濁して、酸洗浄ガラスビーズ(Sigma) 100〜200 μlを含んだ新しいチューブに移した。試料を1分間隔で2回または3回激しく撹拌して、細胞を溶解させた。試料を沈殿させて、溶菌液250 μlを新しいチューブに移し、Qiagen Spin Miniprep Kitの残りの部分を製造元の使用説明書にしたがって行った。
【０１４９】
エレクトロコンピテントな大腸菌DH10B細胞(Invitrogen)の形質転換は、酵母DNAプレップ2 μlおよびDH10B細胞 40 μlで行った。この細胞を0.1 cmキュベット中で2.0 kV、25 μFおよび100 Ωにてエレクトロパルス処理した。エレクトロポレーション後、SOC (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit, MI)、0.5%酵母抽出物(Difco)、10 mM NaCl (J.T. Baker)、2.5 mM KCl (Mallinkrodt)、10 mM MgCl2 (Mallinkrodt)、10 mM MgSO4 (J.T. Baker)、20 mMグルコース(Difco)および水) 250 μlをLB AMPプレート(LBブロス(Lennox)、1.8% Bacto Agar (Difco)、100 mg/Lアンピシリン(Sigma))上に1つの分割量でプレーティングした。プレートを37℃で一晩インキュベートした。
【０１５０】
タグなしzsig37に対する正しい発現構築体を持った個々のクローンを制限消化により同定して、zsig37挿入断片の存在を検証し、さまざまなDNA配列が相互に正しく連結されていることを確認した。陽性クローンの挿入断片を配列解析に供した。αFppD83→Y83リーダー::zsig37プラスミドをpSDH156と称し、β-グルカナーゼリーダー::zsig37プラスミドをpSDH160と称した。Qiagen Maxiキット(Qiagen)を製造元の使用説明書にしたがって用い、両プラスミドについてさらに大量のプラスミドDNAを単離し、そのDNAをNot Iで消化して、ベクター骨格からピキア-zsig37発現カセットを分離させた。次に、Not Iで制限消化したDNA断片をピキアメタノリカ発現宿主PMAD16およびPMAD18に形質転換した。これは別の形質転換として、調製済みのコンピテントなPMAD16またはPMAD18細胞100 μlをNot Iで制限消化したpSDH156またはpSDH160 1.0 μgおよび2.5 μgと混合し、これを0.2 cmエレクトロポレーションキュベットに移すことによって行った。この酵母/DNA混合物を0.75 kV、25 μF、無限大Ωでエレクトロパルス処理した。このキュベットに1.2 Mソルビトール800 μlを添加した。形質転換体を選択用プレート上にプレーティングする前に、試験管中で30℃にて2時間増殖させた。選択を目的に400 μl分割量を2枚のADE DS (0.056% -Ade-Trp-Thrパウダー(TCI America, Alfa Aesar, and Calbiochem)、0.67%アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース(Becton Dickinson)、2% D-グルコース(Difco)、0.5% 200×トリプトファン、トレオニン溶液(ICNおよびAlfa Aesar)および18.22% D-ソルビトール)プレート上にプレーティングし、30℃でインキュベートした。β-グルカナーゼ::zsig37の完全長のヌクレオチド配列(pSDH160)はSEQ ID NO:39に示されており、対応するそのコードタンパク質はSEQ ID NO:40に示されている。
【０１５１】
P.メタノリカ宿主PMAD16およびPMAD18中でのZsig37発現-クローンの選択および特徴づけ
250クローンのPMAD16::pSDH156および300クローンのPMAD18::pSDH156を単離した。さらに、55クローンのPMAD16::pSDH160および68クローンのPMAD18::pSDH160を単離した。全てのクローンを高レベルのzsig37発現がないかコロニーブロット解析によってスクリーニングした。クローンを次のようにコロニーブロットによってスクリーニングした。各形質転換体を2枚の作りたての1%メタノールプレート(1リットルあたり: アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース(Becton Dickinson) 6.8 g、-ade-trp-thrパウダー(TCI America, Alfa Aesar, Calbiochem) 0.6 g、Bacto agar (Difco) 18.0 g、200×トリプトファン/トレオニン溶液(Alfa AesarおよびICN) 5 ml、メタノール(J.T. Baker) 10 ml、飽和ビオチン(ICN) 2 mlおよび水)に貼付した。各プレートをニトロセルロースフィルター(Schleicher & Schuell)で重層し、30℃で3日間インキュベートした。その後、ニトロセルロースフィルターを除去した。一方のフィルターセットは次の条件下で変性し還元した。フィルターをハイブリダイゼーション用チューブの中に入れて、25 mlの25 mM Tris (Millipore)、25 mMグリシン (J.T. Baker)、5 mM β-ME (Sigma) pH9.0を各チューブに添加した。フィルターを65℃で10分間インキュベートした。変性/還元後、フィルターを取り出し、ウエスタン用のブロッキング溶液(50 mM Tris (Millipore) pH7.4、5 mM EDTA (J.T. Baker) pH8.0、0.05% Igepal CA-630 (Sigma)、150 mM NaCl (J.T. Baker)、2.5%ゼラチン (Mallinkrodt)、水および10%脱脂粉乳(NFDM)(Carnation))の中に直接入れた。もう一方の同一のフィルターセットは未変性で未還元のフィルターセットとした。これらのフィルターをプレートから取り出し、ウエスタン用のブロッキング溶液の中に直接入れた。全てのフィルターをブロッキング溶液中で25℃にて30分間インキュベートした。
【０１５２】
次に、0.2 μg/ml zsig37一次抗体E1489を含有するウエスタンA(50 mM Tris (Millipore) pH7.4、5 mM EDTA (J.T. Baker) pH8.0、0.05% Igepal CA-630 (Sigma)、150 mM NaCl (J.T. Baker)、2.5%ゼラチン (Mallinkrodt)、水) + 2.5% NFDM (Carnation)中にて、フィルターを25℃で1〜2時間インキュベートした。次いで、ブロットにウエスタンB (1M NaCl (J.T. Baker)、50 mM Tris (Millipore) pH7.4、5 mM EDTA (J.T. Baker)、0.05% Igepal (Sigma)、0.25%ゼラチン(Mallinkrodt)および水)中で25℃にて各7分間の3回洗浄を行い、続けてウエスタンA中で25℃にて7分間の1回洗浄を行った。次に、5000倍希釈のロバ抗ウサギ二次抗体(Life Technologies)を含有するウエスタンA + 2.5% NFDM中で、フィルターを25℃で1時間インキュベートした。次いで、ブロットに25℃のウエスタンB (1M NaCl (J.T. Baker)、50 mM Tris (Millipore) pH7.4、5 mM EDTA (J.T. Baker)、0.05% Igepal (Sigma)、0.25%ゼラチン(Mallinkrodt)および水)中で25℃にて各7分間の4回洗浄を行った。その後、Lumi-Light Plus ECL基質(Roche)を用いて現像する前に、全てのブロットを脱イオン水で短時間すすいだ。Lumi-Lightの両基質 2 mlを1:1の比率で混合し、ブロットを現像前にこの溶液中で5秒間インキュベートした。次いで、曝露済みのブロットを時間指定された露光によってX線フィルム(Kodak)に現像し、次にこのフィルムを現像してデータを可視化した。
【０１５３】
10クローンのPMAD16::pSDH156、12クローンのPMAD18::pSDH156、6クローンのPMAD16::pSDH160および6クローンのPMAD18::pSDH160を引き続き行うウエスタン解析用にピックした。クローンは全て次の方法で増殖させた。各5 ml培養物には各菌株の1コロニーを用いYEPD培地(1リットルあたり: 20.0 g D-グルコース(J.T. Baker)、20.0 g Bacto Peptone (Difco)、10.0 g酵母抽出物(Difco)、0.04 gアデニン(Alfa Aesar)、0.06g L-ロイシン(TCI America)および水)中に植菌した。培養物を試験管中で増殖させて、30℃で一晩、ローラードラム上に置いた。翌日、各終夜植菌培養物0.5 mlを、FXIIIビタミン溶液(0.05 g/Lビオチン、0.8 g/Lチアミン塩酸塩、0.8 g/LピロキシジンHCL、15.0 g/Lイノシトール、15.0 g/Lパントテン酸カルシウム、0.6 g/Lナイアシンアミド、0.1 g/L葉酸、0.2 g/Lリボフラビン、1.0 g/L塩化コリン)を培地1リットルあたり10 mlおよび1%のメタノール終濃度とするためにメタノール(J.T. Baker)を1リットルあたり10 ml添加したBMY.1培地(1リットルあたり: アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース(Becton Dickinson) 13.4 g、酵母抽出物(Difco) 10.0 g、トリプトン(Difco) 10.0 g、カザミノ酸(Difco) 10.0 g、K2HPO4 (EM Science) 6.7 g、クエン酸(EM Science) 4.2 gおよび水) 24.5 ml中に希釈した。培養物を250 rpmに設定したプラットフォームシェーカーに載せた125 mlのバッフル付きフラスコ中で30℃にて48時間増殖させた。24時間後、ウエスタン解析用に試料を採取し、1%メタノール用量を各培養物に添加した。
【０１５４】
増殖および誘導の48時間後、培養物をBeckman遠心分離機(JA-20ローター)中において10,000rpmで10分間集菌して、細胞を沈殿させた。zsig37を含有する上清250 μlを2×Laemmli Sample Buffer (125 mM Tris (Millipore)、20%グリセロール(EM Science)、4% SDS (ICN)、0.01%ブロモフェノールブルー(EM Science)および水) 250 μlと混合した。各試料500 μlを2つの250 μl試料に分割し、一方の試料のセットを2% β-メルカプトエタノール(Sigma)で処理して還元試料としたのに対し、もう一方のセットは未還元試料とした。
【０１５５】
SDS-PAGE解析を下記のように行った。還元試料は全て65℃で10分間加熱したのに対し、未還元試料は全て加熱しなかった。各試料15 μLをポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に適用した。タンパク質の分離は4〜12%勾配のTris-Glyポリアクリルアミド分離ゲル(Invitrogen)での電気泳動により、1×グリシンランニングバッファー(Invitrogen)を用いた変性条件(SDS-PAGE)の下で行った。80 Vの電圧を最初の30分間印加し、その後、電圧を泳動の間に130 Vまで上昇させた。その後、電気的転写を0.2 μmニトロセルロースメンブレン(Invitrogen)に200 mA (定電流)で2時間行った。次いで、ブロットを上記のように現像した。
【０１５６】
pSDH156 (S.セレビシエα因子D→Yプレプロ配列)およびpSDH160 (β-グルカナーゼリーダー)に相当するP.メタノリカクローン由来の培地のポリアクリルアミドゲルでの電気泳動解析から、両宿主菌由来の培地中において、ある環境では種々のzsig37形に相当するものと思われるが、誘導なしの細胞培地ではバンドが存在しないことが示された。挿入された異種遺伝子の発現がないか解析された組換えクローンの約90パーセントが組換えzsig37を産生し分泌していた。得られたzsig37プラスミド含有酵母菌株から、異種のS.セレビシエαFpp構築体pSDH156はPMAD16宿主菌株のバックグラウンドでは内因性のP.メタノリカβ-グルカナーゼリーダーpSDH160と比較して同水準のzsig37を分泌することが明らかである。興味深いことに、プラスミド含有酵母菌株から、内因性のP.メタノリカβ-グルカナーゼリーダー構築体pSDH160はPMAD18宿主菌株のバックグラウンドと比較してPMAD16において約2〜3倍高い水準のzsig37を分泌することが明らかである。各αFpp::zsig37菌株のすべての分離株を引き続き用いるためにピックした。得られたクローンをそれぞれ、PMAD16::pSDH156分離株＃40、56、58、84、92、149、167、169、230、231、およびPMAD18::pSDH156分離株＃23、29、35、144、149、161、191、202、206、217、224、269と称した。さらに、各β-グルカナーゼ::zsig37菌株のすべての分離株を引き続き用いるためにピックした。得られたクローンをそれぞれ、PMAD16::pSDH160分離株＃1、2、26、30、44、およびPMAD18::pSDH160分離株＃1、10、21、43、48、62と称した。
【０１５７】
本明細書において引用される全ての特許、特許出願および刊行物、ならびに電気的に利用可能な材料(例えば、GenBankアミノ酸およびヌクレオチド配列の寄託)の完全な開示は参照により組み入れられる。先の詳細な説明および例は、理解を明確にするためにのみ与えられている。本明細書から不必要な限定が理解されるべきではない。当業者には明らかな変形が特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に含まれるので、本発明は、示されているおよび記述されている全くの細部に限定されることはない。
【配列表】
2007519392000001.app
【国際調査報告】
2007519392.tif 000007
2007519392.tif 000008
2007519392.tif 000009