(57)【要約】  本発明は、ＧＦＡＴ配列と精製マーカーの少なくとも一つの配列とを含む、酵素活性を有するタンパク質に関するものであって、精製マーカーの配列は、ＧＦＡＴ配列の二つの連続するアミノ酸の間に挿入されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＦＡＴ配列および該ＧＦＡＴ配列の二つの連続するアミノ酸の間に挿入されている少なくとも一つの精製タグ配列、または
該タンパク質が酵素活性を有するならば、少なくとも一つのアミノ酸の抑制、挿入、または突然変異によって該ＧＦＡＴ配列から得られる配列、または
該タンパク質が酵素活性を有するならば、該ＧＦＡＴ配列の一つと少なくとも３５％の配列同一性および／または少なくとも４４％の配列類似性を有する配列
を含む、酵素的に活性なタンパク質。
【請求項２】
ＧＦＡＴ配列が、細菌あるいは真核生物；特に植物、真菌、または動物；特に昆虫もしくは哺乳動物；さらに詳しくはヒトのＧＦＡＴ配列に対応する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
精製タグ配列が、ＧＦＡＴ配列の二つの連続するアミノ酸の間に挿入されており、該アミノ酸が、
大腸菌（Escherichia coli）ＧＦＡＴのアミノ酸約３０〜８０の間に伸長する配列に対応し、かつ／またはそれに相同なＧＦＡＴ配列の部分、または
大腸菌ＧＦＡＴのアミノ酸約２２０〜２３０の間に伸長する配列に対応し、かつ／またはそれに相同なＧＦＡＴ配列の部分、または
大腸菌ＧＦＡＴのアミノ酸約２３５〜２５０の間に伸長する配列に対応し、かつ／またはそれに相同なＧＦＡＴ配列の部分
に含まれる、請求項１または２記載のタンパク質。
【請求項４】
精製タグ配列が、ヒトＧＦＡＴ配列の二つの連続するアミノ酸の間に挿入されており、該アミノ酸が、該ヒトＧＦＡＴ配列のアミノ酸４０〜５０、２９０〜３３０、および／または３４０〜３７０の間に含まれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
ＧＦＡＴ配列が、
ヒトＧＦＡＴ１の配列に対応する配列番号：２、
ヒトＧＦＡＴ２の配列に対応する配列番号：４、
ヒトＧＦＡＴ１Ａｌｔの配列に対応する配列番号：６
に対応する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
精製タグ配列が二つの連続するアミノ酸の間に挿入されており、該アミノ酸が以下のアミノ酸の間：
配列番号：２の４３〜４７、２９８〜３０６、および／または３４２〜３４７、
配列番号：４の４２〜４５、２９９〜３０７、および／または３４３〜３４８、
配列番号：６の４３〜４７、３１６〜３２４、および／または３６０〜３６５
に含まれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
精製タグ配列が以下のアミノ酸の間：
配列番号：２の２９９および３００、
配列番号：４の３００および３０１、
配列番号：６の３１７および３１８
に挿入されている、請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】
精製タグが、約２〜約１０個のアミノ酸、特に約４〜約８個のアミノ酸の配列に対応する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
精製タグがヘキサヒスチジンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
以下の配列：
ヘキサヒスチジンがアミノ酸２９９と３００との間に挿入されている、配列番号：２の配列に対応する配列番号：８、
ヘキサヒスチジンがアミノ酸３００と３０１との間に挿入されている、配列番号：４の配列に対応する配列番号：１０、および
ヘキサヒスチジンがアミノ酸３１７と３１８との間に挿入されている、配列番号：６の配列に対応する配列番号：１２
に対応する、請求項７および９記載のタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする配列を含むか、またはそれによって構成される核酸。
【請求項１２】
以下のヌクレオチド配列：
配列番号：８のタンパク質をコードする配列番号：７、もしくは
配列番号：１０のタンパク質をコードする配列番号：９、もしくは
配列番号：１２のタンパク質をコードする配列番号：１１
もしくはその相補的配列を含むか、またはそれによって構成されるか、あるいは該ヌクレオチド配列が酵素的に活性なタンパク質をコードするならば少なくとも一つのヌクレオチドの突然変異、挿入、または欠失によって該配列から得られる核酸。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の核酸を含む真核生物または原核生物ベクター。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質を含む溶液からの該タンパク質のための精製方法であって、該タンパク質の精製タグに特異的に結合する化合物の存在下に該溶液を置く工程、および該化合物への該タンパク質の結合によって形成された複合体を該溶液の他の構成要素から分離する工程を含む方法。
【請求項１５】
Ｎｉ２＋またはＣｏ２＋、特にＮｉ２＋のような二価金属陽イオンを含む化合物の存在下に請求項１０記載のタンパク質を含む溶液を置く工程、および該化合物への該タンパク質の結合によって形成された複合体を該溶液の他の構成要素から分離する工程を含む、請求項１４記載の精製方法。
【請求項１６】
酵素的に活性な形態の請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質のための、特に−８０℃または４℃での精製方法であって、
約１mM〜約１０mMの、特に約１mMのフルクトース−６−リン酸、
約１mM〜約５mMの、特に約１mMのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、
約５％〜約２０％の、特に約１０％のグリセロール
を含む溶液に該タンパク質を添加することを含む方法。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質のような、適切ならば精製タグに結合した活性ＧＦＡＴタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、２℃〜１０℃の温度で、特に約４℃で少なくとも８日間、および−１００℃〜−２０℃の温度で、特に約−８０℃で少なくとも１２か月間酵素的に活性な形態で保存されうるものであり、該タンパク質が、
約１mM〜約１０mMの、特に約１mMのフルクトース−６−リン酸、
約１mM〜約５mMの、特に約１mMのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、
約５％〜約２０％の、特に約１０％のグリセロール
と組み合わされている組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質の活性を修飾する化合物のスクリーニングのための、特に該タンパク質の阻害剤のスクリーニングのための該タンパク質の使用。
【請求項１９】
糖尿病、特にＩＩ型糖尿病、肥満、アシドーシス、ケトーシス、関節炎、癌、もしくは骨粗鬆症の治療または予防の枠内で有用な化合物のスクリーニングのための、請求項１８記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素活性を修飾する化合物のスクリーニングに十分な量で迅速に精製できる修飾されたグルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グルコサミン−６−リン酸シンターゼまたは２−デオキシグルコース−６−リン酸ケトールイソメラーゼとも呼ばれるグルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）ＥＣ２．６．１．１６は、ヘキソサミンの生合成経路に関与する。ＧＦＡＴは、Ｌ−グルタミンからフルクトース−６−リン酸のケトン官能基にアミド性窒素を転移させることによって、反応：
Ｌ−グルタミン＋フルクトース−６−リン酸→Ｌ−グルタミン酸＋グルコサミン−６−リン酸
に従い生合成経路の最初の律速段階を触媒する。 したがってＧＦＡＴは、フルクトース−６−リン酸を介してヘキソサミン経路におけるグルコースの流れと、結果として産生するヘキソサミンの形成とを調節している。
【０００３】
組換え細菌形のＧＦＡＴである大腸菌（Escherichia coli）のグルコサミン−６−リン酸シンターゼが均質に精製され、徹底的に研究された。アミド転移の性質および酵素メカニズムが特に広く記載された（Teplyakovら、Nat. Prod. Rep. (2002) 19:60の論文）。特に、結晶構造が解明されたこの酵素（Teplyakovら、J. Mol. Biol. (2001) 313:1093）は、一つがヒドロラーゼ（グルタミナーゼ）活性を有し、もう一つがイソメラーゼ活性を有する二つのドメインにより形成されている。
【０００４】
さらに、特にラット肝のＧＦＡＴ(Huynhら、Arch. Biochem. Biophys. (2000) 379:307)および酵母カンジダアルビカンス（Candida albicans）のＧＦＡＴ（Milewskyら、J. Biol. Chem. (1999) 274:4000）を含めた真核生物ＧＦＡＴがキャラクタリゼーションされた。
【０００５】
ヒトにおいて予備研究は、肝臓にＧＦＡＴ活性が存在することを示した（Ghoshら、J. Biol. Chem. (1960) 235:1265）。いくつかのＧＦＡＴが現在公知である。主要な形であるＧＦＡＴ１、中枢神経系に選択的に発現するＧＦＡＴ２、および横紋筋に本質的に発現するＧＦＡＴ１のアイソフォームである ＧＦＡＴ１Ａｌｔである。ＧＦＡＴ１およびＧＦＡＴ２のペプチド配列は、互いに７５％の配列同一性を有し、ＧＦＡＴ１およびＧＦＡＴ１Ａｌｔのペプチド配列は、ＧＦＡＴ１Ａｌｔの配列に１８個のアミノ酸が挿入されていることを除き同一である。よってＧＦＡＴの配列は、ヒトにおいてよく保存されており、またヒトＧＦＡＴ１と、大腸菌ＧＦＡＴまたはマウスＧＦＡＴ１とのペプチド配列がそれぞれ３５％および９９％の同一性を有することから、種間でもよく保存されている。
【０００６】
ヒトＧＦＡＴ１遺伝子は、１９９２年にクローニングされた（McKnightら、J. Biol. Chem. (1992) 267:25208）。この酵素は、二つの別個のドメインによって形成される７７ｋＤａのタンパク質をコードする（Teplyakovら、Nat. Prod. Rep. (2002) 19:60）。
【０００７】
ヘキソサミンの生合成経路の最終産物であるＵＤＰ−ＮＡｃ−ＧｌｃＮＨ２の産生の増加および組織へのその蓄積は、最近インスリン抵抗性の発現に関与していた（Marshallら、FASEB J. (1991) 5:3031、Yki-Jarvinenら、Diabetes (1996) 45:302、Thompsonら、J. Biol. Chem. (1997) 272: 7759、Hawkinsら、J Clin. Invest. (1997) 99:2173、Robinsonら、Diabetes (1993) 42: 1333、Danielsら、J. Clin. Invest. (1995) 96:1235、Baronら、J. Clin. Invest. (1995) 96:2792）。
【０００８】
このように、ＧＦＡＴ１の僅かな過剰発現または外因性グルコサミンの供給によるＵＤＰ−ＮＡｃ−ＧｌｃＮＨ２の細胞レベルにおける増加は、インビボおよび培養脂肪細胞の両方においてインスリン抵抗性を誘導しうることが示された（Robinsonら、Diabetes (1993) 42:1333；Danielsら、J. Clin. Invest. (1995) 96:1235；Baronら、J. Clin. Invest. (1995) 96:2792；Hebertら、J. Clin. Invest. (1996) 98:930）。
【０００９】
実際にインスリンは、その受容体に結合することによって形質導入経路を活性化し、その経路は細胞に貯蔵されたＧＬＵＴ４受容体のようなグルコース輸送体の膜への移行を誘導し、グルコースの流入を増加させる。このようにグルコースは解糖系に入り、グルコース−６−リン酸に転換されてからフルクトース−６−リン酸に変換される。グルコースの流入が過剰のとき、フルクトース−６−リン酸がヘキソサミンの生合成経路に入り、ＧＦＡＴによってグルコサミン−６−リン酸に変換される。いくつかの観察から、グルコサミン−６−リン酸の代謝物が細胞膜へのグルコース受容体の移行を妨害し、それによって細胞へのグルコースの流入を低減させることが示された（Marshallら、FASEB J. (1991) 5:3031、Giacarriら、Diabetologia (1995) 38:518、Marshallら、J. Biol. Chem. (1991) 266:4706、Patersonら、Endocrinology (1995) 136:2809）。
【００１０】
グルコサミン−６−リン酸の代謝物がその生理学的効果を及ぼすメカニズムは明らかではない。しかし、高サイトゾル濃度のＵＤＰ−ＮＡｃ−ＧｌｃＮＨ２は、ＳｅｒまたはＴｈｒのリン酸化部位の高グリコシル化を誘導することによって、インスリンシグナル伝達経路の停止を誘導するという一つの仮説が提唱された（Comerら、J. Biol. Chem. (2000) 275:29179）。
【００１１】
したがってＧＦＡＴ活性は、高レベルの血液グルコースの原因の一つとしてみなされており、さらに非インスリン依存型糖尿病またはＩＩ型糖尿病を患う患者において高いことが公知である（Yki-Jarvinenら、Diabetes (1996) 45:302）。
【００１２】
ＧＦＡＴ阻害剤を得ることは、特に例えばＩＩ型糖尿病、アシドーシスおよび／または糖尿病性ケトーシスのような高血糖症につながる病理を患う個体における血糖症を軽減することを可能にするであろう。
【００１３】
真菌または植物ＧＦＡＴの阻害剤は、それぞれ殺真菌剤および除草剤を得ることも可能にしうるであろう。
【００１４】
しかし、組換え形のＧＦＡＴを得たにもかかわらず、得られた酵素調製物が不安定であること、それらが少量であること、およびそれらの精製レベルが不十分であることは、効果的なＧＦＡＴ阻害剤を得ることを可能にしていない。
【００１５】
したがって本発明の主題は、活性が安定であり、大量に得ることができ、高レベルの精製度および活性を有する修飾ＧＦＡＴを提供することである。
【００１６】
本発明は、以下：
−  ＧＦＡＴ配列、およびＧＦＡＴ配列の二つの連続するアミノ酸の間に挿入されている精製タグ配列の少なくとも一つ、または
−  該タンパク質が酵素活性を有するならば、少なくとも一つのアミノ酸の抑制、挿入または突然変異によって該ＧＦＡＴ配列から誘導される配列、または
−  該タンパク質が酵素活性を有するならば、該ＧＦＡＴ配列の一つと少なくとも３５％、特に少なくとも９０％の配列同一性および／もしくは少なくとも４４％、特に少なくとも９５％の配列類似性を有する配列
を含む、酵素的に活性なタンパク質に関する。
【００１７】
ＧＦＡＴという用語は、特に以下の実施例またはBroschatら、J. Biol. Chem. (2002) 277:14764に記載されている実験条件で、以下の反応を触媒するＥ．Ｃ．２．６．１．１６酵素のクラスのことを呼ぶ：
Ｌ−グルタミン＋フルクトース−６−リン酸→Ｌ−グルタミン酸＋グルコサミン−６−リン酸
【００１８】
ＧＦＡＴは、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼの名で、またグルコサミン−６−リン酸シンターゼもしくは２−デオキシグルコース−６−リン酸ケトールイソメラーゼの名でも呼ばれる。
【００１９】
「酵素的に活性なタンパク質」という用語は、触媒作用を有するタンパク質のことを呼ぶ。
【００２０】
好都合には酵素的に活性なタンパク質は、ＧＦＡＴ活性を有する。
【００２１】
「精製タグ」という用語は、所定のリガンドに特異的に結合できるペプチド配列のことを呼ぶ。好都合には精製タグへの該リガンドの結合は、精製タグを有するタンパク質と該リガンドとの間で複合体を形成することを可能にし、該複合体を特異的に単離できるようにする。
【００２２】
好都合には、本発明による精製タグは、ペプチド鎖の末端に、すなわちＮ末端にもＣ末端にも配置されず、ペプチド鎖内部に配置される。
【００２３】
「配列同一性」という用語は、特に例えばAltschulら、Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389によって定義されるアルゴリズムを用いた、２つの整列された配列間の同一のアミノ酸のパーセントのことを呼ぶ。
【００２４】
「配列類似性」という用語は、特に例えばAltschulら、Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389によって定義されるアルゴリズムを用いた、２つの整列された配列間の類似したアミノ酸の、すなわち側鎖が類似した物理化学特性を有するアミノ酸のパーセントのことを呼ぶ。
【００２５】
本発明は、ＧＦＡＴ配列が細菌、あるいは真核生物；特に植物、真菌、または動物；特に昆虫もしくは哺乳動物；さらに詳しくはヒトのＧＦＡＴ配列に対応する、上に定義されるタンパク質に特に関する。
【００２６】
本発明はさらに詳しくは、ＧＦＡＴ配列の二つの連続するアミノ酸の間に精製タグ配列が挿入されている上に定義されるタンパク質に関するものであって、該アミノ酸は、
−  大腸菌ＧＦＡＴのβ２シートとβ３シートとの間に伸長する配列に対応し、かつ／もしくは相同であるＧＦＡＴ配列の部分、または
−  大腸菌ＧＦＡＴのβ１３シートとβ１４シートとの間に伸長する配列に対応し、かつ／もしくは相同であるＧＦＡＴ配列の部分、または
−  大腸菌ＧＦＡＴのβ１５シートとα６ヘリックスとの間に伸長する配列に対応し、かつ／もしくは相同であるＧＦＡＴ配列の部分
に含まれる。
【００２７】
大腸菌ＧＦＡＴの構造は、特にTeplyakovら、J. Mol. Biol. (2001) 313:1093（総タンパク質）、Isupovら、Structure (1996) 4:801（グルタミナーゼドメイン）およびTeplyakovら、Structure (1998) 6:1047（イソメラーゼドメイン）に記載されている。完全タンパク質の構造は、Protein Data Bankのファイルを有する１ＪＸＡ原子座標ファイル(http://www.pdb.org)を用いて特に調べることができる。
【００２８】
配列番号：１３に大腸菌ＧＦＡＴのペプチド配列を定義する。
【００２９】
β２シートとβ３シートとの間に伸長する配列は、グルタミナーゼドメインに位置する、大腸菌ＧＦＡＴのアミノ酸約３０〜８０の間に伸長する配列に対応する。
【００３０】
β１３シートとβ１４シートとの間に伸長する配列は、グルタミナーゼドメインに位置する、大腸菌ＧＦＡＴのアミノ酸約２２０〜２３０の間に伸長する配列に対応する。
【００３１】
β１５シートとα６ヘリックスとの間に伸長する配列は、イソメラーゼドメインに位置する、大腸菌ＧＦＡＴのアミノ酸約２３５〜２５０の間に伸長する配列に対応する。
【００３２】
したがって特定の態様によれば、本発明は、精製タグ配列がＧＦＡＴ配列の二つの連続するアミノ酸の間に挿入されている上に定義されるタンパク質に関するものであって、該アミノ酸は、
−  大腸菌ＧＦＡＴのアミノ酸約３０〜８０の間に伸長する配列に対応し、かつ／もしくは相同であるＧＦＡＴ配列の部分、または
−  大腸菌ＧＦＡＴのアミノ酸約２２０〜２３０の間に伸長する配列に対応し、かつ／もしくは相同であるＧＦＡＴ配列の部分、または
−  大腸菌ＧＦＡＴのアミノ酸約２３５〜２５０の間に伸長する配列に対応し、かつ／もしくは相同であるＧＦＡＴ配列の部分
に含まれる。
【００３３】
特に例えばAltschulら、Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389によって定義されるアルゴリズムを用いて、または当業者に周知でありThompsonら、Nucleic Acids Res. (1994) 22: 4673-4680に記載されたＣｌｕｓｔａｌ  Ｗソフトウェアを用いて、該ＧＦＡＴの配列を大腸菌ＧＦＡＴの配列と整列させることによって、大腸菌ＧＦＡＴの二次構造に対応し、かつ／もしくは相同であるＧＦＡＴ配列の部分の確認を得られる。
【００３４】
特に、二つの配列もしくは配列の部分の間の同一性のパーセントが約３５％を超え、かつ／またはこれら二つの配列もしくは配列部分の間の類似性のパーセントが約４４％を超えるならば、これらの二つの配列もしくは配列部分は相同であると呼ぶ。
【００３５】
さらに詳しくは二つの配列または配列部分が、以下の条件のようなストリンジェントな条件でハイブリダイズできるならば、それらは相同であると呼ぶ：ホルムアミド：５０％、ＮａＣｌ：０．７５mol/l、クエン酸ナトリウム：０．７５mmol/l、ドデシル硫酸ナトリウム：１％、ｐＨ７、４２℃。
【００３６】
別の好ましい態様によれば、本発明は、精製タグ配列がヒトＧＦＡＴ配列の二つの連続するアミノ酸の間に挿入されている、上に定義されるタンパク質に関するものであって、該アミノ酸は、該ヒトＧＦＡＴ配列のアミノ酸４０〜５０、２９０〜３３０、および／または３４０〜３７０の間に含まれる。
【００３７】
該ヒトＧＦＡＴ配列のアミノ酸４０〜５０は、β２シートとβ３シートとの間に伸長する、大腸菌ＧＦＡＴ配列の部分に、すなわち大腸菌ＧＦＡＴのアミノ酸約３０〜８０の間に伸長する配列に対応し、かつ／または相同である。
【００３８】
該ヒトＧＦＡＴ配列のアミノ酸２９０〜３３０は、β１３シートとβ１４シートとの間に伸長する、大腸菌ＧＦＡＴ配列の部分に、すなわち大腸菌ＧＦＡＴのアミノ酸約２２０〜２３０の間に伸長する配列に対応し、かつ／または相同である。
【００３９】
該ヒトＧＦＡＴ配列のアミノ酸３４０〜３７０は、β１５シートとα６ヘリックスとの間に伸長する、大腸菌ＧＦＡＴ配列の部分に、すなわち大腸菌ＧＦＡＴのアミノ酸約２３５〜２５０の間に伸長する配列に対応し、かつ／または相同である。
【００４０】
本発明は、特に上に定義されるタンパク質に関するものであって、そのタンパク質におけるＧＦＡＴ配列は、
−  ヒトＧＦＡＴ１配列に対応する配列番号：２、
−  ヒトＧＦＡＴ２配列に対応する配列番号：４、
−  ヒトＧＦＡＴ１Ａｌｔ配列に対応する配列番号：６
に対応する。
【００４１】
ヒトＧＦＡＴ１配列は、特にMcKnightら、J. Biol. Chem. (1992) 267:25208に記載され、配列番号：１のヌクレオチド配列に対応する。
【００４２】
ヒトＧＦＡＴ２配列は、特にOkiら、Genomics (1999) 57:227に記載され、配列番号：３のヌクレオチド配列に対応する。
【００４３】
ヒトＧＦＡＴ１Ａｌｔ配列は、特にDeHavenら、Diabetes (2001) 50:2419に記載され、配列番号：５のヌクレオチド配列に対応する。
【００４４】
本発明は、特に精製タグ配列が二つの連続するアミノ酸の間に挿入されている、上に定義されるタンパク質に関するものであって、該アミノ酸は以下のアミノ酸の間：
−  配列番号：２の４３〜４７、２９８〜３０６、および／または３４２〜３４７、
−  配列番号：４の４２〜４５、２９９〜３０７、および／または３４３〜３４８、
−  配列番号：６の４３〜４７、３１６〜３２４、および／または３６０〜３６５
に含まれる。
【００４５】
配列番号：２のアミノ酸４３〜４７、配列番号：４のアミノ酸４２〜４５、および配列番号：６のアミノ酸４３〜４７は、β２シートとβ３シートとの間に伸長する大腸菌ＧＦＡＴ配列の部分、すなわち大腸菌ＧＦＡＴのアミノ酸約３０〜８０の間に伸長する配列に対応し、すなわちそれに相同である。
【００４６】
配列番号：２のアミノ酸２９８〜３０６、配列番号：４のアミノ酸２９９〜３０７、および配列番号：６のアミノ酸３２５〜３３０は、β１３シートとβ１４シートとの間に伸長する大腸菌ＧＦＡＴ配列の部分、すなわち大腸菌ＧＦＡＴのアミノ酸約２２０〜２３０の間に伸長する配列に対応し、すなわちそれに相同である。
【００４７】
配列番号：２のアミノ酸３４２〜３４７、配列番号：４のアミノ酸３４３〜３４８、および配列番号：６のアミノ酸３６０〜３６５は、β１５シートとα６ヘリックスとの間に伸長する大腸菌ＧＦＡＴ配列の部分、すなわち大腸菌ＧＦＡＴのアミノ酸約２３５〜２５０の間に伸長する配列に対応し、すなわちそれに相同である。
【００４８】
別の特定の実施形態によれば、本発明は、さらに詳しくは精製タグ配列がＧＦＡＴ配列の二つの連続するアミノ酸の間に挿入されている、上に定義されるタンパク質に関するものであって、該アミノ酸は、
−  ヒトＧＦＡＴ１のアミノ酸約４３〜４７の間に伸長する配列に対応し、かつ／またはそれに相同であるＧＦＡＴ配列の部分、
−  ヒトＧＦＡＴ１のアミノ酸約２９８〜３０６の間、特に２９９〜３００の間に伸長する配列に対応し、かつ／またはそれに相同であるＧＦＡＴ配列の部分、
−  ヒトＧＦＡＴ１のアミノ酸約３４２〜３４７の間に伸長する配列に対応し、かつ／またはそれに相同であるＧＦＡＴ配列の部分
に含まれる。
【００４９】
本発明は、さらに詳しくは精製タグ配列が以下のアミノ酸の間：
−  配列番号：２の２９９および３００、
−  配列番号：４の３００および３０１、
−  配列番号：６の３１７および３１８
に挿入されている上記のタンパク質に関する。
【００５０】
本発明は、精製タグがアミノ酸約２〜約１０個、特にアミノ酸約４〜約８個の配列に対応する上記のタンパク質に関する。
【００５１】
本発明による好ましい精製タグは、特にいわゆるＦＬＡＧタグ（Sigma-Aldrich、フランス）に関する。これらのタグは、所定のパラトープに特異的に結合し、該パラトープは、例えば抗体または抗体断片に属することが可能である。ＦＬＡＧタグの特定の例は、例えばペプチド配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号：１８）によって構成される。
【００５２】
本発明による他の好ましいタグは、数個のヒスチジンによって形成されるタグである。これらのタグは、例えばＮｉ２＋またはＣｏ２＋のような二価金属陽イオンと複合体を形成しうる。
【００５３】
本発明は、精製タグがヘキサヒスチジンである上に定義されるタンパク質に特に関する。
【００５４】
配列Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号：19）は、ヘキサヒスチジンと呼ばれる。
【００５５】
本発明は、さらに詳しくは以下の配列：
−  ヘキサヒスチジンがアミノ酸２９９と３００との間に挿入されている配列番号：２に対応する配列番号：８、
−  ヘキサヒスチジンがアミノ酸３００と３０１との間に挿入されている配列番号：４に対応する配列番号：１０、および
−  ヘキサヒスチジンがアミノ酸３１７と３１８との間に挿入されている配列番号：６に対応する配列番号：１２
に対応する上に定義されるタンパク質に関する。
【００５６】
本発明は、上に定義されるタンパク質をコードする配列を含むか、またはそれによって構成される核酸にも関する。
【００５７】
本発明は、さらに詳しくは以下のヌクレオチド配列：
−  配列番号：８のタンパク質をコードする配列番号：７、もしくは
−  配列番号：１０のタンパク質をコードする配列番号：９、もしくは
−  配列番号：１２のタンパク質をコードする配列番号：１１
もしくはその相補的配列を含むか、またはそれによって構成される核酸、あるいは該ヌクレオチド配列が酵素的に活性なタンパク質をコードするならば、少なくとも一つのヌクレオチドの突然変異、挿入または欠失によって該配列から得られる核酸に関する。
【００５８】
別の態様によれば、本発明は、上に定義される核酸を含む真核生物または原核生物ベクターにも関する。
【００５９】
これらのベクターは、真核生物または原核生物において本発明によるタンパク質を特に合成することを可能にする。
【００６０】
好都合には本発明は、昆虫細胞において本発明によるタンパク質の合成を可能にするバキュロウイルス型発現ベクターに関する。
【００６１】
本発明は、該タンパク質を含む溶液から上に定義されるタンパク質を精製するための方法にも関し、その方法は、該タンパク質の精製タグに特異的に結合する化合物の存在下に該溶液を置く工程、および該化合物への該タンパク質の結合によって形成した複合体を溶液の他の構成要素から分離する工程を含む。
【００６２】
化合物を固体支持体に固定して、該化合物と該タンパク質との間に形成した複合体を遠心分離またはろ過によって回収できるようにできる。場合により支持体に固定された該化合物をカラムに配置して、該溶液がカラムを通過して溶出するようにできる。
【００６３】
好都合には上記の方法は、精製タンパク質を回収するために該化合物に対する該タンパク質の結合によって形成する複合体を解離させる工程も含みうる。
【００６４】
本発明は、さらに詳しくは上に定義される精製方法に関し、その方法は、上に定義されるタンパク質を含む溶液をＮｉ２＋またはＣｏ２＋、特にＮｉ２＋のような二価金属陽イオンを含む化合物の存在下に置く工程、および該化合物へのタンパク質の結合によって形成する複合体を溶液の他の構成要素から分離する工程を含む。
【００６５】
好都合には上記の方法は、精製タンパク質を回収するために、二価金属陽イオンを含む該化合物への該タンパク質の結合によって形成する複合体を、特にイミダゾールを使用して解離する工程も含みうる。
【００６６】
別の態様によれば、本発明は、酵素的に活性な形態の上に定義されるタンパク質を特に−８０℃または４℃で保存するための方法に関し、その方法は、以下：
−  約１mM〜約１０mMの、特に約１mMのフルクトース−６−リン酸、
−  約１mM〜約５mMの、特に約１mMのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン
−  約５〜約２０％、特に約１０％のグリセロール
を含む溶液に該タンパク質を添加することを含む。
【００６７】
フルクトース−６−リン酸は、該タンパク質の基質である。
【００６８】
トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンは、Ｎｉ２＋またはＣｏ２＋イオンを担持する樹脂の性質を維持することを都合よく可能にする還元化合物である。
【００６９】
グリセロールは、好都合には凍結保護剤である。
【００７０】
したがって本発明は、適切ならば上に定義されるタンパク質のような精製タグに結合した活性ＧＦＡＴタンパク質を含む組成物にも関するものであって、該タンパク質は、酵素的に活性な形態で温度２〜１０℃、特に約４℃で少なくとも８日間、および温度−１００〜−２０℃、特に約−８０℃で少なくとも１２か月間保存されうるものであり、該タンパク質は以下のもの：
−  約１ｍＭ〜約１０ｍＭの、特に約１ｍＭのフルクトース−６−リン酸、
−  約１ｍＭ〜約５ｍＭの、特に約１ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン
−  約５〜約２０％、特に約１０％のグリセロール
と組み合わされる。
【００７１】
本発明は、該タンパク質の活性を修飾する化合物のスクリーニング、特に該タンパク質の阻害剤のスクリーニングのための、上に定義されるタンパク質の使用にも関する。
【００７２】
以下の方法：
−  Broschatら、Analytical Biochem. (2002) 305:10-15に記載される放射分析法、
−  Nakataら、J. Antibio. (2001) 54:737-743に記載されたいわゆるニトロブルーテトラゾリウム法、
−  Ghoshら、Method. Enzymol. (1960) 5:414に記載され、下記の実施例に詳細に記載されるモーガンエルソン法、
−  Badetら、Biochemistry (1987) 26:1940に記載され、下記の実施例に詳細に記載されるＡＰＡＤ法
を用いて本発明によるタンパク質の活性を特に測定できる。
【００７３】
好都合にはこれらの方法は、本発明によるタンパク質の活性を修飾する化合物の、特に高流速でのスクリーニングに使用できる。
【００７４】
本発明は、糖尿病、特にＩＩ形糖尿病、肥満、アシドーシス、ケトーシスもしく、癌、または骨粗鬆症の治療または予防の枠内で有用な化合物のスクリーニングのための上に定義される使用に特に関する。
【００７５】
実施例１
１．ｇｆａｔ１−Ｈｉｓ６遺伝子の合成およびクローニング
プラスミドｐＣＲＩＩ−ｇｆａｔ１を形成させるために、ヒトｇｆａｔ１遺伝子に対応するｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片をｐＣＲＩＩベクター（Invitrogen）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。プラチナｐｆｘポリメラーゼ（Roche）および以下の適当なプライマー対を用いたＰＣＲによって、ｐＣＲＩＩにクローニングされたｇｆａｔ１遺伝子配列の位置８９８に、ヒスチジン残基６個からなる内部精製タグのヌクレオチド配列を導入した：
−  開始ＡａｔＩＩ−Ｈｉｓ６：
【００７６】
【表１】
2007515931.tif 000002
【００７７】
−  終了ＨｉｎｃＩＩ：
【００７８】
【表２】
2007515931.tif 000003
【００７９】
ＰＣＲは、以下のプロトコルによる：９４℃、２分間の後、３０サイクル（９４℃４５秒間、５５℃１分間、７２℃５分間）、その後に７２℃での重合を５分間、４℃に戻る。
【００８０】
ＡａｔＩＩおよびＨｉｎｃＩＩによる消化の次に１．５％Seaplaqueアガロースゲル（Tebu）で精製した後に、対応する制限部位のレベルでアンプリコン（１７０bp）をｐＣＲＩＩ−ｇｆａｔ１構築体に挿入した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｂｓ）の存在下でこの１７０bpの挿入体をこの構築体に３：１の比率で１６℃で一晩ライゲーションによって導入した。このように得られたライゲーション混合物（２０μl）は、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を可能にした。次に、組換えプラスミドｐＣＲＩＩ−ｇｆａｔ１−Ｈｉｓ６のＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をドナープラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１（Life Technologies Ltd）にクローニングした。このように発生させたプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ−ｇｆａｔ−Ｈｉｓ６（図１）を複数消化（ＳｍａＩ、ＡｃｃＩ／ＤｒａＩ、ＰｓｔＥＩ／ＸｂａＩ）および配列決定によって検証した。構築体を改良する目的で、ｇｆａｔ１遺伝子上流の二つのオープンリーディングフレームを除去するために以下のプライマー対を用いたＰＣＲによって開始コドン上流の配列を二つの位置で突然変異させた：
−  開始ＸｂａＩ
【００８１】
【表３】
2007515931.tif 000004
【００８２】
−  終了ＡｆｅＩ
【００８３】
【表４】
2007515931.tif 000005
【００８４】
ＰＣＲは、以下のプロトコルによる：９４℃、２分間の後、３０サイクル（９４℃１５秒間、５５℃３０秒間、６８℃１分間）、その後に６８℃での重合を１分間、４℃に戻る。
【００８５】
ＤＨ１０Ｂａｃ細胞への転位のために使用するドナープラスミドｐＦａｓｔＢａｃ−ｇｆａｔ−Ｈｉｓ６−２ｏｒｆを製造するためにｐＦａｓｔＢａｃ−ｇｆａｔ−Ｈｉｓ６におけるホモログと交換するために、二つの突然変異を含む得られたＰＣＲ断片を０．７％TSeaPlaqueゲル（Tebu）で精製してから、ＸｂａＩおよびＡｆｅＩで消化した。
【００８６】
ＤＨ１０Ｂａｃ細胞に転位させた後で組換えバクミド（bacmid）を単離し、リポフェクチン（Life Technologies Ltd）の存在下でＳｆ９昆虫細胞にトランスフェクトするために使用した。得られたバキュロウイルスをＳｆ９細胞中で増幅させ、５・１０７pfu/mlのウイルス力価が測定された。
【００８７】
２．ＧＦＡＴ１−Ｈｉｓ６タンパク質の製造
用量５lのフラスコに入ったＳＦ９００ＩＩ培地（Life Technologies Ltd）の存在下で１００rpmで撹拌しながらＳｆ９昆虫細胞を２８℃で培養した。２・１０９細胞/mlの密度の細胞に上で得られた組換えバキュロウイルスを感染多重度２（pfu/細胞）で感染させ、７２時間培養した。
【００８８】
細胞および上清を遠心分離（２５００g、４℃で１０分間）によって分離した。細胞を２０mMトリス塩酸緩衝液（pH７）の存在下で洗浄し、遠心分離（４０００g、４℃で４５分間）し、ー８０℃で凍結させた。
【００８９】
ＧＦＡＴ１−Ｈｉｓ６タンパク質の精製
細胞ペレット（２０g）を溶解緩衝液（５０mMのＮａＰＯ４、ｐＨ７．５、３００mMのＮａＣｌ、１０mMイミダゾール、１mMフルクトース−６−リン酸（フルクトース−６Ｐ）、１mMのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、１mMのＰＭＳＦ（フェニルメチルスフホニルフルオリド）、１０％グリセロール、およびＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Roche Applied Sciences）１個）５０mlに入れ、直径０．２mmのマイクロビーズ４０gの存在下で４５００rpm（３０秒間４サイクル）でダイノミル（DynoMill）を用いた粉砕に供した。−１５℃に調整したエチレングリコール／水を循環させることによって混合物を冷却した。得られた粗抽出物（１００ml、総タンパク質４４５mg）を４℃で２０分間、１２０００rpmで遠心分離した。上清を４℃で超遠心分離（３５００００rpm、１時間）に供した。このように得られた上清を５０％Ｎｉ−ＮＴＡマトリックス（Qiagen）５mlと共に４℃で２時間混合した。混合物を空のカラムに注いでから、洗浄用緩衝液（５０mMのＮａＰＯ４（ｐＨ７．５）、300mMのＮａＣｌ、40mMイミダゾール、1mMフルクトース−６Ｐ、1mMのＴＣＥＰ、1mMのＰＭＳＦおよＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Roche Applied Sciences）１個）４０mlで洗った。前と同じ緩衝液に溶かした１２５および５００mMイミダゾールによる連続段階によって溶出を実施した。このようにして、１２mgの機能的ＧＦＡＴ１−Ｈｉｓ６（ブラッドフォード法によるタンパク質アッセイ）が得られた。
【００９０】
４．ＧＦＡＴ１−Ｈｉｓ６酵素の保存
次に、１mMフルクトース−６Ｐ、１mMのＴＣＥＰおよび１０％グリセロールの存在下の１００μl分画にして酵素を−８０℃で貯蔵した。酵素の安定性は、−８０℃で数か月間であり、４℃で８日間を超える。
【００９１】
５．ＧＦＡＴ１−Ｈｉｓ６酵素活性のアッセイ
ＧＦＡＴ１−Ｈｉｓ６の酵素活性の種々のアッセイテストを使用した。ＧＦＡＴ１−Ｈｉｓ６の活性を修飾する、特に阻害する化合物をスクリーニングするためにもこれらのテストを使用できる。高流速でのスクリーニングにもこれらを容易に適合させることができる。
【００９２】
モーガンエルソンアッセイ：
この場合、以下の原理の比色テストによって酵素活性をモニターする：酵素によって放出されるＤ−グルコサミン−６Ｐは、アルカリ性媒質中で無水酢酸によってＮ−アセチル化され（Ghoshら、Method. Enzymol. (1962) 5:414）、次に濃厚酸性媒質中でエールリッヒ試薬（パラ−ジメチルアミノベンズアルデヒド；ＰＤＡＢ）で溶液を処理する。形成したピンク色の化合物は５８５nmで吸収を示す。
【００９３】
以下の化合物の存在下で３７℃で３０分間酵素反応を行う：
−  １００mMのフルクトース−６Ｐ、０．２ml
−  ６０mMのＬ−グルタミン、０．２５ml
−  １５０mMのＫＰＯ４（ｐＨ７）、０．２５ml
−  ２５mMのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）（ｐＨ７）、０．１ml
−  試料２００μl（必要ならばＨ２Ｏで仕上げる）
【００９４】
温度１００℃の湯浴に４分間浸すことによって反応を停止させてから、遠心分離する。上清０．８mlを以下のプロトコルによるグルコサミン−６Ｐのアッセイのためにサンプリングする：
−  飽和ＮａＨＣＯ３、０．１mlの添加、
−  即時調製した５％無水酢酸溶液０．１mlの添加、
−  周囲温度での５分間の撹拌およびインキュベーション、
−  １００℃の浴中で５分間インキュベーション、
−  ０．８Mホウ酸カリウム、ｐＨ９．１（１０NのＫＯＨで調整）０．２mlの添加、
−  １００℃の浴中で７分間の撹拌およびインキュベーション、
−  エールリッヒ試薬を酢酸で１０倍希釈したものを即時調製し、その３mlを氷冷した溶液に添加、
−  ３７℃で２０分間インキュベーション。
【００９５】
濃度範囲０〜２００nmolの標準としてＤ−グルコサミンを用いて確立した標準曲線と比較することによってＧＦＡＴの活性を決定した。このように得られたＧＦＡＴ１−Ｈｉｓ６の比活性は、１．７U/mgと測定された。これは、組換えヒトＧＦＡＴ１の精製物についてBroschatら、J Biol. Chem. (2002) 277:14764によって得られた値０．４U/mgよりも大きい。これは、ＧＦＡＴ１−Ｈｉｓ６の方が活性が高く、かつ／または本発明による酵素調製物の方が純度が高いことを反映している。
【００９６】
ＧＦＡＴ１−Ｈｉｓ６の反応速度パラメータは、ＡＰＡＤテストによるグルタミン酸デヒドロゲナーゼと連結した分光光度アッセイによってグルタミン（ＫｍＧｌｎ＝０．２mM）およびフルクトース−６Ｐ（Ｆ６Ｐ）（ＫｍＦ６Ｐ＝０．００６mM）に関してキャラクタリゼーションされた。これは、従来技術において引用された値に従う（Broschatら、J. Biol. Chem. (2002) 277:14764に対してＫｍＧｌｎ＝０．２６mMおよびＫｍＦ６Ｐ＝０．００７mM）。
【００９７】
ＡＰＡＤアッセイ
これは、ＧＦＡＴ活性の紫外部分光光度アッセイである。これは、以下の（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）によって触媒される）反応に従って、ＧＦＡＴと、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）のアナログであるＡＰＡＤ（３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド）とを用いて形成するＬ−グルタミン酸塩の量を連続測定することに基づく：
【００９８】
【化１】
2007515931.tif 000006
【００９９】
測定は３７℃で、３６５nmで実施される。これらの条件で１吸光単位は形成したＡＰＡＤＨ０．１１μmolに対応する。
【０１００】
このテストは、以下のものを含む：
−  ３mMのＡＰＡＤ（２mg/ml）１００μl、
−  ２MのＫＣｌ、２５μl、
−  １MのＫＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）１００μl、
−  １００mMフルクトース−６Ｐ（３０．４１mg/ml）１００μl、
−  ６０mM精製Ｌ−グルタミン（８．７７mg/ml）１００μl
−  Ｈ２Ｏ適量で１mlとする（以後に加える体積を考慮）、
−  ＧＤＨ、５０μl、
−  アッセイする試料０．５μg。
【０１０１】
Broschatら、Analytical Biochem. (2002) 305:10-15に記載される放射アッセイまたはNakataら、J. Antibio. (2001) 54:737-743に記載されるいわゆるニトロブルーテトラゾリウムアッセイのような他のアッセイ法も使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】分子量６．８９kbを有するプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ−ｇｆａｔ−Ｈｉｓ６を示す図である。カセット「Ａｍｐｒ」は、アンピシリン耐性遺伝子を表し、カセット「ｏｒｉ」は、細菌複製起点を表し、カセット「Ｇｍｒ」は、ゲンタマイシン耐性遺伝子を表し、カセット「Ｐｏｌｈ  Ｐｒ」は、ポリヘドリンプロモーターを表し、カセットｇｆａｔ−ｈｉｓ６は、ヘキサヒスチジンタグをコードする配列の挿入によって修飾されたｇｆａｔ１遺伝子を表す。位置４．１１kbのＸｂａＩ制限部位および位置４．５６kbおよび６．６０kbのＥｃｏＲＩも示す。
【図１】
2007515931.tif 000007
【配列表】
2007515931000001.xml
【国際調査報告】
2007515931.tif 000047
2007515931.tif 000048
2007515931.tif 000049
2007515931.tif 000050
2007515931.tif 000051
2007515931.tif 000052