(57)【要約】  トリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）発現に直接又は間接的に影響を与える分析物の同定方法について記載する。本方法はＴＰＨ２の発現を調節する能力を調べることにより、グルココルチコイド受容体モジュレーターとβ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型（β−ＨＳＤ１）阻害剤の中枢神経系浸透及び活性をスクリーニングすることができる。本方法は脳における中枢セロトニン作動性神経伝達のグルココルチコイド妨害を抑制する分析物を同定するために特に有用である。
2007510406.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の脳におけるグルココルチコイド受容体の活性を直接又は間接的に調節する分析物の同定方法であって、
（ａ）グルココルチコイドを第１の動物に投与し、第１の動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素（ＴＰＨ２）の量を測定する段階と；
（ｂ）グルココルチコイドと分析物を第２の動物に投与し、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定し、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量が第１の動物のＴＰＨ２の量に比較して変化した場合には、分析物が動物の脳におけるグルココルチコイド受容体の活性を調節すると判定する段階とを含む前記方法。
【請求項２】
ＴＰＨ２がＴＰＨ２  ｍＲＮＡであり、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＴＰＨ２  ｍＲＮＡを測定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＴ−ＰＣＲがＴＰＨ２  ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＴＰＨ２がＴＰＨ２  ＲＮＡであり、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＴＰＨ２  ｍＲＮＡを測定する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）の量に対する分析物の効果の測定方法であって、
（ａ）分析物を動物に投与する段階と；
（ｂ）動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定し、動物の脳におけるＴＰＨ２の量が分析物を投与しない動物の脳におけるＴＰＨ２の量に比較して変化した場合には、分析物が動物の脳におけるＴＰＨ２の量に対して効果をもつと判定する段階を含む前記方法。
【請求項６】
ＴＰＨ２がＴＰＨ２  ｍＲＮＡであり、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＴＰＨ２  ｍＲＮＡを測定する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＲＴ−ＰＣＲがＴＰＨ２  ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＴＰＨ２がＴＰＨ２  ＲＮＡであり、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＴＰＨ２  ｍＲＮＡを測定する請求項５に記載の方法。
【請求項９】
分析物が慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）の量に直接又は間接的に影響を与えるか否かを調べる方法であって、
（ａ）慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物を提供する段階と；
（ｂ）慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物に分析物を投与する段階と；
（ｃ）動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定し、動物の脳におけるＴＰＨ２の量が分析物を投与しない動物の脳におけるＴＰＨ２の量に比較して増加した場合には、分析物が慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物におけるＴＰＨ２の量に対して効果をもつと判定する段階とを含む前記方法。
【請求項１０】
ＴＰＨ２がＴＰＨ２  ｍＲＮＡであり、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＴＰＨ２  ｍＲＮＡを測定する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＲＴ−ＰＣＲがＴＰＨ２  ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＴＰＨ２がＴＰＨ２  ＲＮＡであり、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＴＰＨ２  ｍＲＮＡを測定する請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物におけるグルココルチコイドレベルを直接又は間接的に抑制する分析物の同定方法であって、
（ａ）慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物を提供する段階と；
（ｂ）慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物に分析物を投与する段階と；
（ｃ）動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）の量を測定し、動物の脳におけるＴＰＨ２の量が分析物を投与しない動物の脳におけるＴＰＨ２の量に比較して増加した場合には、分析物が慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物におけるグルココルチコイドレベルを抑制すると判定する段階とを含む前記方法。
【請求項１４】
ＴＰＨ２がＴＰＨ２  ｍＲＮＡであり、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＴＰＨ２  ｍＲＮＡを測定する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＴ−ＰＣＲがＴＰＨ２  ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＴＰＨ２がＴＰＨ２  ＲＮＡであり、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＴＰＨ２  ｍＲＮＡを測定する請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
分析物が動物の脳における完全グルココルチコイドアゴニストもしくはアンタゴニストであるか又は部分グルココルチコイドアゴニストであるかを判定する方法であって、
（ａ）分析物を第１の動物に投与し、第１の動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）の量を測定する段階と；
（ｂ）グルココルチコイドを第２の動物に投与し、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定する段階と；
（ｃ）グルココルチコイドと分析物を第３の動物に投与し、第３の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定する段階と；
（ｄ）第１、第２及び第３の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を比較し、（１）第１の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少と第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少が第３の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少以下である場合には、分析物が完全アゴニストであると判定し、（２）第２の動物の脳におけるＴＰＨ２に比較して第１の動物の脳におけるＴＰＨ２が増加すると共に第３の動物の脳におけるＴＰＨ２が増加した場合には、分析物が完全アンタゴニストであると判定し、（３）第１の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少と第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少が第３の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少よりも大きい場合には、分析物が部分アゴニストであると判定する段階とを含む前記方法。
【請求項１８】
ＴＰＨ２がＴＰＨ２  ｍＲＮＡであり、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＴＰＨ２  ｍＲＮＡを測定する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＲＴ−ＰＣＲがＴＰＨ２  ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＴＰＨ２がＴＰＨ２  ＲＮＡであり、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＴＰＨ２  ｍＲＮＡを測定する請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
動物の脳における中枢セロトニン作動性神経伝達のグルココルチコイド妨害を直接又は間接的に抑制する分析物の同定方法であって、
（ａ）グルココルチコイドを第１の動物に投与し、第１の動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素（ＴＰＨ２）の量を測定する段階と；
（ｂ）グルココルチコイドと分析物を第２の動物に投与し、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定し、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量が第１の動物のＴＰＨ２の量に比較して変化した場合には、分析物が動物の脳における中枢セロトニン作動性神経伝達のグルココルチコイド妨害を抑制すると判定する段階とを含む前記方法。
【請求項２２】
ＴＰＨ２がＴＰＨ２  ｍＲＮＡであり、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＴＰＨ２  ｍＲＮＡを測定する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＲＴ−ＰＣＲがＴＰＨ２  ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲである請求項２３に記載の方法。
【請求項２４】
ＴＰＨ２がＴＰＨ２  ＲＮＡであり、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＴＰＨ２  ｍＲＮＡを測定する請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
動物の脳における中枢セロトニン作動性神経伝達のグルココルチコイド妨害を抑制する分析物の同定用キットであって、
（ａ）トリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）をコードするｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列をもつ少なくとも１個のオリゴヌクレオチドプローブと；
（ｂ）キットの使用説明書とを含む前記キット。
【請求項２６】
キットが更にオリゴヌクレオチドプローブに相補的なｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列の領域を挟むプライマー対を含む請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
キットが更に逆転写酵素バッファー、逆転写酵素、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）バッファー、ｄＮＴＰ、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼから構成される群から選択される１種以上の成分を含む請求項２５又は２６に記載のキット。
【請求項２８】
キットが更に１種以上のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試薬を含む請求項２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）発現に直接又は間接的に影響を与える分析物の同定方法に関する。本方法はＴＰＨ２の発現を調節する能力を調べることにより、グルココルチコイド受容体モジュレーターと１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型（β−ＨＳＤ１）阻害剤の中枢神経系浸透及び活性をスクリーニングすることができる。本方法は脳における中枢セロトニン作動性神経伝達のグルココルチコイド妨害を抑制する分析物を同定するために特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
セロトニン系は気分調節や、睡眠覚醒サイクル、摂食、体温調節、生殖、覚醒、不安、アルコール中毒、薬物乱用の調節における多数の中枢神経面を媒介する（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２３：１５３７−１５５１（１９８４）；Ｊａｃｏｂｓ  ａｎｄ  Ａｚｍｉｔａ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７２：１６５−２２９（１９９２））。末梢組織において、セロトニンは血管緊張、腸運動、一次止血、及び細胞性免疫応答を調節する。（Ｖｅｅｎｓｔｒａ−ＶａｎｄｅｒＷｅｅｌｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１０：１６５−（２０００））。セロトニンは中枢神経系における主要な神経伝達物質であるので、セロトニン作動性経路の調節異常は鬱病、精神分裂症、強迫性障害、及び自殺等の多数の複雑な精神障害に関係があるとされている。
【０００３】
トリプトファン水酸化酵素（ＴＰＨ）は  神経伝達物質であるセロトニン（５−ヒドロキシトリプトアミン（５−ＨＴ））の合成における律速酵素である。また、神経ホルモンであるメラトニンの合成において非律速的な第１段階を触媒する。ＴＰＨはフェニルアラニン水酸化酵素とチロシン水酸化酵素を含むプテリン依存性芳香族アミノ酸モノオキシゲナーゼファミリーのメンバーである。哺乳動物中枢神経系では、背側縫線核（ＤＲＮ）と正中縫線核（ＭＲＮ）の細胞にＴＰＨ  ｍＲＮＡ発現が認められる。これらの領域はいずれも脳にセロトニンを上行性に投射する（Ｊａｃｏｂｓ  ａｎｄ  Ａｚｍｉｔｉａ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：５０４１−５０５５（１９９２））。ＴＰＨ  ｍＲＮＡ発現はホルモンメラトニンの合成における非律速酵素として松果腺にも認められ、更に、網膜、腸の腸神経細胞の周辺、肥満細胞、血小板、及び甲状腺細胞にも認められる（Ｋｕｈｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．３３：１５−２１（１９７９）；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：２２７−２７２（１９８１）；Ｃｈａｍｐｉｅｒら，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６０：２１９１−２１９７（１９９７）；Ｋｖｅｔｎａｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｓａｂｂａｎ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５１：３４２−３５６（１９９８））。
【０００４】
Ｂｅｔｈｅａら（Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．４７：５６２−５７６（２０００））はマカクザル及びモルモットＤＲＮにおける１７β−エストラジオール投与によるＴＰＨ  ｍＲＮＡ及び蛋白質レベルの調節を報告している（Ｂｅｔｈｅａ，前出；Ｌｕら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  １１：２５７−２６７（１９９９）；Ｐｅｃｉｎｓ−Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：７０２１−７０２９（１９９６））。１７β−エストラジオール投与に伴うＴＰＨ  ｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの変化はラットでは報告されていないが、グルココルチコイドによるＴＰＨ蛋白質、ＴＰＨ酵素活性、及びＴＰＨ  ｍＲＮＡ発現の調節がラットＤＲＮで示されている（Ａｚｍｉｔｉａ  ａｎｄ．ＭｃＥｗｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６６：１２７４−１２７６（１９６９）；Ａｚｍｉｔｉａ  ａｎｄ  ＭｃＥｗｅｎ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７８：２９１−３０２（１９７４）；Ｓｚｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２６：１６９−１７３（１９７６）；Ｒａｓｔｏｇｉ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ．４２：６３−７１（１９７８）；Ｐａｒｋら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．７，７６−８０（１９８９）；Ａｚｍｉｔｉａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：５０４１−５０５５（１９９３）；Ｃｌａｒｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｏ，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４８：３４６−３５４（１９９７））。
【０００５】
最近、Ｗａｌｔｈｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：７６（２００３））はマウス、ラット、及びヒトゲノムにＴＰＨの２種のアイソフォームが存在することを報告している。ＴＰＨの第２のアイソフォームはＴＰＨ２であり、当分野で公知の最初のＴＰＨは現在ではＴＰＨ１と呼ばれる。各ＴＰＨアイソフォームに特異的なＲＮＡ保護試験によると、ＴＰＨ１  ｍＲＮＡは十二指腸に存在するが、脳には存在しないことが判明した。他方、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡは脳のみで検出された。ＳｕｇｄｅｎはＪ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８６：１３０８−１３１１（２００３）においてラット松果腺におけるＴＰＨ１及びＴＰＨ２  ｍＲＮＡの発現を比較した。ＳｕｇｄｅｎはＴＰＨ１  ｍＲＮＡがＴＰＨ２  ｍＲＮＡの約１００，０００倍であり、ＴＰＨ１  ｍＲＮＡ発現が明暗サイクルと共に変動するのに対してＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現は有意変動を示さないことを見出した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記に鑑み、脳における異常なセロトニン作動性機能を検出及び測定すると共に、脳におけるＴＰＨ２発現を直接又は間接的に調節することができる化合物を評価するにはＴＰＨ２  ｍＲＮレベルを特異的に測定する方法が重要であり、鬱病、精神分裂症、強迫性障害、及び自殺防止等の精神病の治療につながると思われる。
【０００７】
本発明はトリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）発現に直接又は間接的に影響を与える分析物の同定方法を提供する。本方法はＴＰＨ２の発現を調節する能力、特にＴＰＨ２発現のグルココルチコイド抑制を妨害するか及び／又はＴＰＨ２発現を刺激するモジュレーターとアンタゴニストを調べることにより、グルココルチコイド受容体モジュレーターと１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型（β−ＨＳＤ１）阻害剤の中枢神経系浸透及び活性をスクリーニングすることができる。従って、１側面では、本方法は脳における中枢セロトニン作動性神経伝達のグルココルチコイド妨害を抑制する分析物を同定するために特に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、１態様では、本発明は動物の脳におけるグルココルチコイド受容体の活性を直接又は間接的に調節する分析物の同定方法として、（ａ）グルココルチコイドを第１の動物に投与し、第１の動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素（ＴＰＨ２）の量を測定する段階と；（ｂ）グルココルチコイドと分析物を第２の動物に投与し、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定し、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量が第１の動物のＴＰＨ２の量に比較して変化した場合には、分析物が動物の脳におけるグルココルチコイド受容体の活性を調節すると判定する段階とを含む方法を提供する。
【０００９】
上記態様の特定側面において、グルココルチコイドはデキサメタゾン、プレドニソロン、及びミフェプレストンから構成される群から選択される。
【００１０】
上記態様の他の側面において、分析物はグルココルチコイドアゴニスト活性をもつ分析物、グルココルチコイドアンタゴニスト活性をもつ分析物、及びアゴニストとアンタゴニストの混合活性をもつ分析物から構成される群から選択される。
【００１１】
上記態様の更に他の側面において、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の変化はＴＰＨ２  ｍＲＮＡ量の増加である。
【００１２】
別の態様において、本発明は動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）の量に対する分析物の効果の測定方法として、（ａ）分析物を動物に投与する段階と；（ｂ）動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定し、動物の脳におけるＴＰＨ２の量が分析物を投与しない動物の脳におけるＴＰＨ２の量に比較して変化した場合には、分析物が動物の脳におけるＴＰＨ２に量に対して効果をもつと判定する段階とを含む方法を提供する。
【００１３】
上記態様の特定側面において、脳におけるＴＰＨ２の量の変化はＴＰＨ２  ｍＲＮＡの量の増加又はＴＰＨ２  ｍＲＮＡの量の減少である。
【００１４】
更に別の態様において、本発明は分析物が慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）の量に直接又は間接的に影響を与えるか否かを調べる方法として、（ａ）慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物を提供する段階と；（ｂ）慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物に分析物を投与する段階と；（ｃ）動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定し、動物の脳におけるＴＰＨ２の量が分析物を投与しない動物の脳におけるＴＰＨ２の量に比較して増加した場合には、分析物が慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物におけるＴＰＨ２の量に対して効果をもつと判定する段階とを含む方法を提供する。
【００１５】
上記態様の特定側面において、動物における慢性的に高いグルココルチコイドレベルは動物がストレス誘導条件下におかれた結果である。特定側面では、ストレス誘導条件は慢性拘束ストレス又は飼料による肥満症である。
【００１６】
上記態様の他の側面において、方法は１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型活性の阻害剤である分析物をスクリーニングする。
【００１７】
上記態様の更に他の側面において、分析物の効果は動物の脳におけるＴＰＨ２の量の増加である。
【００１８】
更に別の態様において、本発明は慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物におけるグルココルチコイドレベルを直接又は間接的に抑制する分析物の同定方法として、（ａ）慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物を提供する段階と；（ｂ）慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物に分析物を投与する段階と；（ｃ）動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）の量を測定し、動物の脳におけるＴＰＨ２の量が分析物を投与しない動物の脳におけるＴＰＨ２の量に比較して増加した場合には、分析物が慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物におけるグルココルチコイドレベルを抑制すると判定する段階とを含む方法を提供する。
【００１９】
上記態様の特定側面において、動物における慢性的に高いグルココルチコイドレベルは動物がストレス誘導条件下におかれた結果である。特定側面では、ストレス誘導条件は慢性拘束ストレス又は飼料による肥満症である。
【００２０】
上記態様の他の側面において、方法は１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型活性の阻害剤である分析物をスクリーニングする。
【００２１】
更に別の態様において、本発明は分析物が動物の脳における完全グルココルチコイドアゴニストもしくはアンタゴニストであるか又は部分グルココルチコイドアゴニストであるかを判定する方法として、（ａ）分析物を第１の動物に投与し、第１の動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）の量を測定する段階と；（ｂ）グルココルチコイドを第２の動物に投与し、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定する段階と；（ｃ）グルココルチコイドと分析物を第３の動物に投与し、第３の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定する段階と；（ｄ）第１、第２及び第３の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を比較し、（１）第１の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少と第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少が第３の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少以下である場合には、分析物が完全アゴニストであると判定し、（２）第２の動物の脳におけるＴＰＨ２に比較して第１の動物の脳におけるＴＰＨ２が増加すると共に第３の動物の脳におけるＴＰＨ２が増加した場合には、分析物が完全アンタゴニストであると判定し、（３）第１の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少と第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少が第３の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少より大きいも場合には、分析物が部分アゴニストであると判定する段階とを含む方法を提供する。
【００２２】
上記態様の特定側面において、グルココルチコイドはデキサメタゾン、プレドニソロン、及びミフェプレストンから構成される群から選択される。
【００２３】
別の態様において、本発明は動物の脳における中枢セロトニン作動性神経伝達のグルココルチコイド妨害を直接又は間接的に抑制する分析物の同定方法として、（ａ）グルココルチコイドを第１の動物に投与し、第１の動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素（ＴＰＨ２）の量を測定する段階と；（ｂ）グルココルチコイドと分析物を第２の動物に投与し、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定し、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量が第１の動物のＴＰＨ２の量に比較して変化した場合には、分析物が動物の脳における中枢セロトニン作動性神経伝達のグルココルチコイド妨害を抑制すると判定する段階とを含む方法を提供する。
【００２４】
上記態様の特定側面において、グルココルチコイドはデキサメタゾン、プレドニソロン、及びミフェプレストンから構成される群から選択される。
【００２５】
上記態様の他の側面において、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の変化はＴＰＨ２  ｍＲＮＡ量の増加である。
【００２６】
上記態様の更に他の側面において、分析物はグルココルチコイドアゴニスト活性をもつ分析物、グルココルチコイドアンタゴニスト活性をもつ分析物、アゴニストとアンタゴニストの混合活性をもつ分析物、及び１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型活性を阻害する分析物から構成される群から選択される。
【００２７】
本発明の上記態様及び側面のいずれかにおいて、動物はマウス、モルモット、ラット、及び霊長類から構成される群から選択され、更に他の側面において、ＴＰＨ２の発現は脳から採取された縫線スライス標本、特に脳の背側縫線核における発現である。
【００２８】
上記態様の特定側面において、ＴＰＨ２はＴＰＨ２  ｍＲＮＡである。
【００２９】
上記態様のいずれかの他の側面において、ＴＰＨ２はＴＰＨ２  ｍＲＮＡであり、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡは逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定される。更に別の測定において、ＲＴ−ＰＣＲはＴＰＨ２  ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲである。更に他の側面において、オリゴヌクレオチドプローブは配列番号１１及び配列番号１２から構成される群から選択され、プローブはリボプローブとすることができる。
【００３０】
上記態様のいずれかの更に他の側面において、ＴＰＨ２はＴＰＨ２  ＲＮＡであり、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡはＴＰＨ２  ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより測定される。更に他の側面において、オリゴヌクレオチドプローブは配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から構成される群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
上記態様のいずれかの更に他の側面において、ＴＰＨ２はＴＰＨ２に特異的な抗体を使用して測定される。
【００３２】
別の態様において、本発明は動物の脳における中枢セロトニン作動性神経伝達のグルココルチコイド妨害を抑制する分析物の同定用キットとして、（ａ）トリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）をコードするｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列をもつ少なくとも１個のオリゴヌクレオチドプローブと；（ｂ）キットの使用説明書とを含むキットを提供する。
【００３３】
キットの特定側面において、キットは更にオリゴヌクレオチドプローブに相補的なｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列の領域を挟むプライマー対を含む。
【００３４】
上記態様の他の側面において、キットは更に逆転写酵素バッファー、逆転写酵素、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）バッファー、ｄＮＴＰ、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼから構成される群から選択される１種以上の成分を含む。
【００３５】
上記態様の更に他の側面において、キットは更に１種以上のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試薬を含み、キットの更に他の側面において、オリゴヌクレオチドプローブはリボプローブである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明は動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）発現又はレベルに直接又は間接的に影響を与える分析物の同定方法及びキットを提供する。本方法及びキットは動物の脳におけるＴＰＨ２の発現を調節する能力を調べることにより、グルココルチコイド受容体モジュレーターと１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型（β−ＨＳＤ１）サプレサッー又はインヒビターの中枢神経系浸透及び活性をスクリーニングすることができる。本方法は脳における中枢セロトニン作動性神経伝達のグルココルチコイド妨害を直接又は間接的に抑制する分析物を同定し、鬱病（精神病性鬱病を含む）、精神分裂症、強迫性障害等の神経精神疾患又は障害に加え、睡眠障害、肥満症、Ｉ型糖尿病及び食欲障害等の他の障害；ストレス（慢性ストレスを含む）、Ｉ型糖尿病、各種心臓血管病、もしくは肥満症等の代謝不均衡に伴うストレスに起因又は誘導される神経精神障害、自殺行動；並びに中枢セロトニン作動性神経伝達のグルココルチコイド妨害を伴う鬱病に相関する症状をもつ他の疾患の治療用プロトコールをデザインするために特に有用である。
【００３７】
最近、Ｗａｌｔｈｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：７６（２００３））はマウス、ラット、及びヒトゲノムにＴＰＨの２種のアイソフォームが存在することを報告している。第１のアイソフォーム（ＴＰＨ１）は十二指腸に存在するが、脳には存在せず、第２のアイソフォーム（ＴＰＨ２）は脳のみに存在する。２種のアイソフォームの場所の相違は２種のセロトニン系が存在し、一方はＴＰＨ１を使用し、末梢組織に局在し、他方はＴＰＨ２を使用し、脳に局在することを示唆している。二重セロトニン系は中枢又は末梢セロトニン作用の一方のみに作用する特異的治療薬を開発できる可能性を示唆している。これは鬱病、精神分裂症、強迫性障害、及び自殺等の精神病患者の末梢セロトニンレベル及びその代謝と中枢神経系におけるセロトニン機能の有用な相関を見出すために重要である。しかし、ＴＰＨ１をＴＰＨ２から区別するには問題がある。市販のＴＰＨ抗体は両方のＴＰＨアイソフォームを認識するので、ウェスタンブロット分析又は免疫細胞化学分析によりアイソフォームを区別することができない。更に、ＴＰＨ蛋白質又は酵素活性の変化が報告されている場合にどのＴＰＨアイソフォームが調節されるのかを調べることは困難である。更に、背側縫線組織標本には両方の活性が存在しており、区別できないため、ＴＰＨ活性レベルによりアイソフォームを識別することは実現不可能である。
【００３８】
本発明者らはＴＰＨ２  ｍＲＮＡをＴＰＨ１  ｍＲＮＡから区別するために使用することが可能なオリゴヌクレオチドプローブと、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡを優先的に増幅するためにＲＴ−ＰＣＲ反応で使用することができるＰＣＲプライマーをデザインした。本明細書で使用する「ｍＲＮＡ」なる用語はｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、又は両者を含む。
【００３９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを使用し、本発明者らはＴＰＨ１が脳で発現されることを発見し（図２Ａ、３Ａ、及び６参照）、ＴＰＨ２が脳で発現されることを確認した（図２Ｂ及び３Ｂ参照）。Ｗａｌｔｈｅｒら（前出）はＲＮＡ保護試験によりＴＰＨ１が脳で発現されないと報告していたので、この結果は予想外であった。即ち、本発明者らはＴＰＨ２がＤＲＮで強く発現されるが、ＴＰＨ１もｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより検出可能な程度にＤＲＮで発現されることを見出した。
【００４０】
ＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現を検出するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを使用し、本発明者らはＴＰＨ１とＴＰＨ２が特定ホルモンに応答して差別的に調節されることも発見した。例えば、本発明者らはマウス背側縫線核（ＤＲＮ）におけるＴＰＨ１及びＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現が１７β−エストラジオールにより差別的に調節されることを発見した。ＴＡＱＭＡＮ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲとｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学法のいずれでも、１７β−エストラジオールはエストロゲン受容体βを介してマウスＤＲＮにおけるＴＰＨ１  ｍＲＮＡレベルを増加するが、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルは変わらない（図５Ａ及び５Ｂ（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）；図４Ｂ及び４Ｃ（ＲＴ−ＰＣＲ）参照）。
【００４１】
本発明者らはマウスＤＲＮにおけるＴＰＨアイソフォームのｍＲＮＡ発現がグルココルチコイドにより差別的に調節されることも発見した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによると、マウス縫線スライス標本におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルはデキサメタゾン、プレドニソロン、又はミフェプレストン（ＲＵ４８６）投与に応答して低下した（図７及び８参照）が、ＴＰＨ１  ｍＲＮＡレベルはこれらの投与により検出可能な変化を示さなかった（図６参照）。これらの結果はＴＰＨ１及びＴＰＨ２  ｍＲＮＡがマウスＤＲＮで各種ホルモンにより差別的に調節されることを示している。最後に、図９に示すように、本発明者らはデキサメタゾンとＲＵ４８６のどちらも別々に投与した場合にはＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現が低下するが、併用投与すると、ＲＵ４８６はデキサメタゾンの効果を阻害することを見出した。ＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現に対するグルココルチコイド効果は卵巣切除雌マウス（上記参照）と雄マウス（図１０及び１１参照）の両者で認められたので、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現に対して観察されたグルココルチコイドの効果は雌雄非依存的であると思われる。
【００４２】
従って、本発明はＴＰＨ２をコードするヌクレオチド配列と優先的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを提供する。オリゴヌクレオチドプローブは天然又は修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はその混合物を含むことができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブはＴＰＨ２をコードするｍＲＮＡ又はＴＰＨ２をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的又はアンチセンスである。特定態様において、ＴＰＨ２をコードするヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブは配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１１、及び配列番号１２から構成される群から選択することができる。ＴＰＨ２をコードする核酸に特異的な他のオリゴヌクレオチドプローブはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ１７３３５３に記載のヒトＴＰＨ２又はＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ１７３３９１に記載のマウスＴＰＨ２をコードする核酸配列から容易に確認することができる。当業者に自明の通り、このプローブは一般にハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じてこのプローブ配列と完全な相補性をもたないターゲット配列と実質的に結合する。このプローブは放射性同位体等のラベルで直接標識するか又はビオチン等のラベルで間接的に標識し、後からストレプトアビジン複合体を結合させることが好ましい。このプローブの有無をアッセイすることにより、ＴＰＨ２をコードするｍＲＮＡの有無を検出することができる。このプローブは放射性標識、蛍光標識等の当分野で公知の任意標準技術により標識することができる。ラベルとしては放射性同位体、ＦＩＴＣ又は他の蛍光色素マーカー、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光クエンチャー−ドナー色素、又は他の検出可能な分子が挙げられる。このプローブはｉｎ  ｓｉｔｕ法又はノーザンハイブリダイゼーションを使用して脳組織、例えばＤＲＮでＴＰＨ２をコードするｍＲＮＡを検出するために特に有用である。リボプローブを含むオリゴヌクレオチドプローブの作製方法と、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びノーザンハイブリダイゼーションの実施方法はＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）又はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（２００１）に記載されている。
【００４３】
本発明は更にＴＰＨ２をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅又はＴＰＨ２をコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを提供する。特定態様において、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ用フォワードオリゴヌクレオチドプライマーとしては配列番号７と配列番号８から構成される群から選択されるプライマーが挙げられ、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ用リバースオリゴヌクレオチドプライマーとしては配列番号９と配列番号１０から構成される群から選択されるプライマーが挙げられる。ＴＰＨ２をコードする核酸に特異的な他のＰＣＲプライマーはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ１７３３５３に記載のヒトＴＰＨ２又はＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ１７３３９１に記載のマウスＴＰＨ２をコードする核酸配列から容易に確認することができる。別の態様では、ＴＰＨ２をコードするｍＲＮＡを検出するためにＰＣＲプライマーをＲＴ−ＰＣＲ反応で使用する。ｃＤＮＡの作製方法とＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ反応はＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）又はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（２００１）に開示されている。
【００４４】
特に好ましい態様では、ＴＡＱＭＡＮ法等のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法でＰＣＲプライマーを使用する。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法はＴＰＨ２をコードするｍＲＮＡを検出し、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡの量又はレベルを定量することができる。ＴＡＱＭＡＮ法は当分野で周知である。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法では、反応のＰＣＲ成分はフォワード及びリバースＰＣＲプライマーと、プライマーに相補的な配列間に配置された配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブのセットを含む。プローブは一端をレポーター色素で標識し、他端をクエンチャー色素で標識し、ポリメラーゼにより伸長しないように３’末端をブロックする。レポーター色素の例としてはＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、又はＭＡＸが挙げられ、クエンチャー色素の例としてはＴＡＭＲＡ又はＭＧＢが挙げられる。無傷プローブでは、クエンチャー色素はレポーター色素の蛍光を抑制する。しかし、ＰＣＲ増幅中にポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性はプローブを消化し、レポーター色素をクエンチャー色素との近傍から放出させ、レポーター色素に蛍光発光させる。レポーター色素の蛍光は鋳型量に比例するので、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡの量を定量することができる。従って、本発明は動物の脳におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡの発現を直接又は間接的に調節する分析物の同定方法として、脳におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕ検出するために上記オリゴヌクレオチドプローブを使用する方法と、脳におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲにより検出するための方法を提供する。ＲＴ−ＰＣＲ法は更に脳におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡの発現を定量するため、即ち経時的に産生されたＴＰＨ２  ｍＲＮＡの量又はレベルを測定するためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を含む。本明細書に開示する方法はグルココルチコイド受容体モジュレーターと１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型（β−ＨＳＤ１）阻害剤であり、脳に侵入してＴＰＨ２をコードするｍＲＮＡの発現又は量又はレベルを増加させることができる分析物を同定するための一次及び二次スクリーニングレジメンで使用することができる。このような分析物は中枢セロトニン作動性経路のグルココルチコイド妨害の結果である精神障害を治療するために有用である。本明細書で使用する「分析物」なる用語は分子、化合物、組成物、薬剤、及び製剤を含む。
【００４５】
従って、１態様では、動物の脳におけるグルココルチコイド受容体の活性を直接又は間接的に調節する分析物の同定方法として、グルココルチコイドを第１の動物に投与し、第１の動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素（ＴＰＨ２）の量を測定する段階と；グルココルチコイドと分析物を第２の動物に投与し、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定する段階とを含む方法が提供される。第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量が第１の動物のＴＰＨ２の量に比較して変化した場合、特に変化がＴＰＨ２量の増加である場合には、分析物が動物の脳におけるグルココルチコイド受容体の活性を調節すると判定する。
【００４６】
別の態様では、動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）の量に対する分析物の効果の測定方法として、分析物を動物に投与する段階と；動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定する段階とを含む方法が提供される。動物の脳におけるＴＰＨ２の量が分析物を投与しない動物の脳におけるＴＰＨ２の量に比較して変化した場合、特に変化がＴＰＨ２量の増加である場合には、分析物が動物の脳におけるＴＰＨ２に量に対して効果をもつと判定する。
【００４７】
図９に示す結果によると、本発明は更に分析物が動物の脳における完全グルココルチコイドアゴニストもしくはアンタゴニストであるか又は部分グルココルチコイドアゴニストであるかを判定する方法として、（１）分析物を第１の動物に投与し、第１の動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）の量を測定する段階と；（２）グルココルチコイドを第２の動物に投与し、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定する段階と；（３）グルココルチコイドと分析物を第３の動物に投与し、第３の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定する段階とを含む方法を提供する。第１、第２及び第３の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を比較する。第１の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少と第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少が第３の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少以下である場合には、分析物は完全アゴニストであると判定する。第２の動物の脳におけるＴＰＨ２に比較して第１の動物の脳におけるＴＰＨ２が増加すると共に第３の動物の脳におけるＴＰＨ２が増加した場合には、分析物は完全アンタゴニストであると判定する。第１の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少と第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少が第３の動物の脳におけるＴＰＨ２の減少より大きいも場合には、分析物は部分アゴニストであると判定する。
【００４８】
更に別の態様では、動物の脳における中枢セロトニン作動性神経伝達のグルココルチコイド妨害を直接又は間接的に抑制する分析物の同定方法として、グルココルチコイドを第１の動物に投与し、第１の動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素（ＴＰＨ２）の量を測定する段階と；グルココルチコイドと分析物を第２の動物に投与し、第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定する段階とを含む方法が提供される。第２の動物の脳におけるＴＰＨ２の量が第１の動物のＴＰＨ２の量に比較して変化した場合、特に変化がＴＰＨ２量の増加である場合には、分析物が動物の脳における中枢セロトニン作動性神経伝達のグルココルチコイド妨害を抑制すると判定する。
【００４９】
上記方法の典型的プロトコールでは、卵巣切除した雌マウス又は雄マウスにビークル対照、通常は約３〜２０ｍｐｋのデキサメタゾン等のグルココルチコイド、デキサメタゾンと分析物の混合物、又は分析物を少なくとも１日１回皮下投与する。典型的アッセイでは、マウスに約４日間投与する。４回目の投与から約６時間後にマウスに深麻酔し、頭蓋から脳を摘出し、すぐに腹側を上にして分析時までドライアイスで凍結する。所定態様では、グルココルチコイドと分析物の混合物をマウスに投与する前に分析物をマウスに１日以上投与し、他の態様では、マウスにグルココルチコイドを投与してから１日以上後に分析物をグルココルチコイドとの混合物としてマウスに投与する。本明細書に開示する本発明の態様のいずれか１種を実施する際にはビークル対照を含むことが好ましい。
【００５０】
測定されるＴＰＨ２はＴＰＨ２に特異的な抗体を使用して検出されるＴＰＨ２蛋白質、又はＴＰＨ２  ｍＲＮＡを選択的に増幅するＴＰＨ２  ｍＲＮＡもしくはＲＴ−ＰＣＲプライマー／プローブ組み合わせに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出されるＴＰＨ２  ｍＲＮＡとすることができる。
【００５１】
ＴＰＨ２  ｍＲＮＡはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション化学法又はＲＴ−ＰＣＲ、特にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して検出することが好ましい。実施例１はマウスの背側縫線におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡを検出するために各種プローブとｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を使用する１例を示す。実施例２及び３は背側縫線から抽出したＲＮＡにおけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡを検出するためのプライマーとプローブの組み合わせの例とリアルタイムＰＣＲ法を示す。
【００５２】
上記態様の変形例では、分析物が慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物の脳におけるトリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）の量に直接又は間接的に影響を与えるか否かを調べる方法として、慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物を提供する段階と；慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物に分析物を投与する段階を含む方法が提供される。その後、動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定する。動物の脳におけるＴＰＨ２の量が分析物を投与しない動物の脳におけるＴＰＨ２の量に比較して増加した場合には、分析物が慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物におけるＴＰＨ２の量に対して効果をもつと判定する。
【００５３】
別の変形例では、慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物におけるグルココルチコイドレベルを直接又は間接的に抑制する分析物の同定方法として、慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物を提供する段階と；慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物に分析物を投与する段階とを含む方法が提供される。その後、動物の脳におけるＴＰＨ２の量を測定する。動物の脳におけるＴＰＨ２の量が分析物を投与しない動物の脳におけるＴＰＨ２の量に比較して増加した場合には、分析物が慢性的にグルココルチコイドレベルの高い動物におけるグルココルチコイドレベルを抑制すると判定する。
【００５４】
先述の態様ではグルココルチコイドを外因的に投与することによりグルココルチコイドレベルを増加させることが、上記変形例はグルココルチコイドが内在性であり、動物にストレッサーを与えることによりグルココルチコイドレベルを自然増加させる点が先述の態様と相違する。上記変形例の典型的プロトコールでは、卵巣切除した雌動物（ラット、霊長類、マウス、モルモット）、又は雄動物（ラット、霊長類、マウス、モルモット）にストレッサーを与えることによりストレスを誘導する。例えば、ストレスは慢性拘束ストレス、多重ストレス、飼料による肥満ストレス、糖尿病に伴うストレス等とすることができる。Ｍａｇａｒｉｎｏｓ  ａｎｄ  ＭｃＥｗｅｎ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６９：８３−８８（１９９５）；Ｍａｇａｒｉｎｏｓ  ａｎｄ  ＭｃＥｗｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１１５６−１１０６１（２０００）は動物にストレスを誘導する方法を開示している。その後、ビークル対照、又は分析物をマウスに少なくとも１日１回皮下投与する。典型的アッセイでは、マウスに約４日間投与する。４回目の投与から約６時間後にマウスに深麻酔し、頭蓋から脳を摘出し、すぐに腹側を上にして本明細書に開示するような分析時までドライアイスで凍結する。上記変形例は動物の脳におけるＴＰＨ２レベルを増加するように内在グルココルチコイドレベルを調節するβ−ＨＳＤ１阻害剤である分析物を同定するのに特に適している。β−ＨＳＤ１とグルココルチコイド作用の組織特異的増幅剤としてのその役割はＳｅｃｋｌ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４２：１３７１−１３７６（２００１）に記載されている。
【００５５】
ＴＰＨ２蛋白質の検出により、ＴＰＨ２又はそのエピトープに対して特異的親和性をもつ抗体が提供される。これらの抗体はＴＰＨ２をｉｎ  ｓｉｔｕ同定するために有用である。「抗体」なる用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、ラクダもしくはラマ抗体又はラクダ化抗体のライブラリーから得られる抗体等の１本鎖ＶＨ抗体（Ｎｕｔｔａｌｌら，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１：２５３−２６３（２０００）；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２（２００１））、及び組換え抗体を含む総称を意味する。「組換え抗体」なる用語は完全Ｈ鎖抗体のポリペプチド配列又は１本鎖Ｈ鎖抗体のアミノ末端可変ドメインのみを含む１本鎖ポリペプチド（ＶＨ鎖ポリペプチド）と、抗体分子のＦｖ領域を含む１本鎖組換えポリペプチドを提供するように可変Ｈ鎖ドメイン（ＶＨ）に連結した可変Ｌ鎖ドメイン（ＶＬ）を含む１本鎖ポリペプチド（ｓｃＦｖポリペプチド）を含む総称を意味する（Ｓｃｈｍｉｅｄｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２４２：１０１−１１４（２０００）；Ｓｃｈｕｌｔｚら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６６６３−６６６９（２０００）；Ｄｕｂｅｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７８：２０１−２０９）１９９５）；及び米国特許第６，２０７，８０４号，Ｈｕｓｔｏｎら参照）。分析物に対して特異的な組換え１本鎖ＶＨ又はｓｃＦｖポリペプチドの構築はファージディスプレイ（ｄｅ  Ｈａａｒｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８２１８−１８２３０（１９９９）；Ｓａｖｉｒａｎｔａｏ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：３９４９−３９５５（２０００））又はポリペプチド合成等の現在利用可能な分子技術を使用して実施することができる。他の態様では、組換え抗体としては特定アミノ酸残基や、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ｆｌｕｏｒ等のリガンドないしラベルをもつポリペプチド等の修飾抗体が挙げられる。更に他の態様としては、プロテインＡ又はＧを含むポリペプチド等の第２のポリペプチドと融合した上記ポリペプチドを含む融合ポリペプチドが挙げられる。
【００５６】
ＴＰＨ２に特異的な抗体は当分野で公知の方法により作製することができる。例えば、ポリクローナル及びモノクローナル抗体は、例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）に記載されているような当分野で周知の方法により作製することができる。このような抗体を作製するための免疫原としてはＴＰＨ２又はそのフラグメントを使用することができる。あるいは、（市販合成器を使用して）合成ペプチドを作製し、免疫原として使用することもできる。当分野で周知の方法によりアミノ酸配列を合成し、対応するポリペプチドの疎水性又は親水性ドメインのどちらをコードするかを決定することができる。キメラ、ヒト化、ラクダ化、ＣＤＲグラフト、又は二価抗体等の改変抗体も当分野で周知の方法により作製することができる。このような抗体も例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，前出や、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，前出に記載されているハイブリドーマ、化学合成又は組換え法により作製することができる。抗ペプチド及び抗融合蛋白質抗体のいずれも使用することができる。（例えば、Ｂａｈｏｕｔｈら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２：３３８（１９９１）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）参照）。
【００５７】
本発明の方法は脳におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡの量又はレベルを増加させるグルココルチコイド受容体モジュレーター（アンタゴニスト）又はβ−ＨＳＤ１阻害剤である分析物を同定するために分析物の高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）に使用することができる。あるいは、高スループットスクリーニング法の補助法として本発明の方法を使用することもでき、高スループットスクリーニング法によりグルココルチコイド受容体モジュレーター又はβ−ＨＳＤ１阻害剤であるとして同定された分析物を本発明の方法により分析し、脳におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡの量又はレベルを増加させる分析物を同定する。いずれの場合も、本発明の方法は中枢神経系に浸透する（即ち血液脳関門を通過することが可能な）グルココルチコイド受容体モジュレーター又はβ−ＨＳＤ１阻害剤である分析物を同定する。多くの場合に、有用な性質をもつ化学物質は所定の望ましい性質又は活性をもつ化合物（「リード化合物」と言う）を同定し、リード化合物の変異体を作製し、これらの変異体化合物の性質と活性を評価することにより作製される。薬剤発見の全側面で時間スケールを短縮することが最新の傾向である。多数を迅速且つ効率的に試験できることから、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）法が従来のリード化合物同定法に取って代わりつつある。
【００５８】
１側面では、高スループットスクリーニング法は脳におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現を増加する多数の潜在的グルココルチコイドモジュレーター又はβ−ＨＳＤ１阻害剤（候補化合物）を含むライブラリーを提供する。次に、このような「組み合わせ化学ライブラリー」を１種以上のアッセイでスクリーニングし、所望の特徴的活性を示すライブラリーメンバーの特定化学種又はサブクラスを同定する。こうして同定された化合物を従来の「リード化合物」として使用することもできるし、それ自体を潜在的グルココルチコイドモジュレーター又はβ−ＨＳＤ１阻害剤として使用することもできる。
【００５９】
組み合わせライブラリーの作製装置は市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ，３９０  ＭＰＳ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ；Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ；４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ；９０５０  Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ参照）。溶液相化学反応用に多数の周知ロボットシステムも開発されている。これらのシステムとしては武田薬品工業株式会社（大阪）により開発された自動合成装置や、化学者により実施される手動合成作業を真似たロボットアームを使用する多数のロボットシステム（Ｚｙｍａｔｅ  ＩＩ，Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；Ｏｒｃａ，Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）等の自動ワークステーションが挙げられる。上記装置のいずれも本発明で使用するのに適している。本発明に記載に合わせたこれらの装置の改造（が存在する場合にはその）種類と実施も当業者に自明てある。更に、多数の組み合わせライブラリー自体が市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ；Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．；ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ；３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ；Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ参照）。
【００６０】
本明細書に記載する任意アッセイはＴＰＨ２リボプローブハイブリダイゼーションとＴＰＨ２−プライマーＲＴ−ＰＣＲ法を含む高スループットスクリーニングに利用することができる。上述のように、本明細書に開示する方法によりグルココルチコイドモジュレーター又はβ−ＨＳＤ１阻害剤を同定することが好ましい。このようなスクリーニング用の高スループットシステムは当業者に周知である。例えば、米国特許第５，５５９，４１０号は蛋白質結合の高スループットスクリーニング法を開示しており、米国特許第５，５５９，４１０号は蛋白質結合の高スループットスクリーニング法を開示しており、米国特許第５，５７６，２２０号及び５，５４１，０６１号はリガンド／抗体結合の高スループットスクリーニング法を開示している。
【００６１】
更に、高スループットスクリーニングは市販されている（例えば、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；Ａｉｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ参照）。これらのシステムは一般に全サンプル及び試薬ピペッティング、液体分配、定時インキュベーション、及びアッセイに適した検出器によるマイクロプレートの最終読み取りを含む全手順を自動化する。これらの構造化可能なシステムは高スループットで迅速な始動と高度なフレキシビリティとオーダーメイドを可能にする。このようなシステムの製造業者は詳細なプロトコールを提供している。例えば、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．は遺伝子転写、リガンド結合等の調節を検出するためのスクリーニングシステムについて記載した技術報告書を公開している。
【００６２】
上記に鑑み、本発明は更に動物の脳における中枢セロトニン作動性神経伝達のグルココルチコイド妨害を抑制する分析物の同定用キットとして、トリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２（ＴＰＨ２）をコードするｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列をもつ少なくとも１個のオリゴヌクレオチドプローブと；キットの使用説明書を含むキットを提供する。キットの特定側面において、キットは更にオリゴヌクレオチドプローブに相補的なｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列の領域を挟むプライマー対を含む。上記態様の他の側面において、キットは更に逆転写酵素バッファー、逆転写酵素、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）バッファー、ｄＮＴＰ、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼから構成される群から選択される１種以上の成分を含む。上記態様の更に他の側面において、キットは更に１種以上のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用試薬を含み、キットの更に他の側面において、オリゴヌクレオチドプローブはリボプローブである。キットに含むことができるプローブとプライマーの例は実施例１〜３に記載する。
【００６３】
以下の実施例は更に本発明の理解を深めることを目的とする。
【実施例１】
【００６４】
本実施例では、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学法を使用してＤＲＮにおけるＴＰＨ１及びＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現を測定した。本実施例は１７β−エストラジオールがＤＲＮにおけるＴＰＨ１  ｍＲＮＡ発現に阻害効果を生じたが、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現には無効であったことも示す。
【００６５】
動物及び投与群は以下のように構成した。雌マウス（１３〜１６週齢）の卵巣を切除した（Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒのＣ５７ＢＬ／６）。大豆を含まない齧歯類用飼料で飼育し、外科処置と出荷から最低１週間回復させた。ビークル（ゴマ油）０．１ｃｃ又は化合物（指定に応じてデキサメタゾン、ＲＵ４８６、もしくはプレドニソロン３、１０、もしくは２０ｍｇ／ｋｇ体重（ｍｐｋ）又は指定に応じて１７β−エストラジオール０．２ｍｐｋ）を午前中に（１日１回４日間）マウスに皮下（ｓ．ｃ．）投与した。４回目の投与から約６時間後にマウスにケタミン／キシラジンで深麻酔し、頭蓋から脳を摘出し、すぐに腹側を上にしてドライアイスで凍結した。
【００６６】
分子生物学法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）又はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（２００１）の方法が挙げられる。
【００６７】
クリオスタットで切断した１６μｍ厚冠状マウス脳切片で３種のＴＰＨ２リボプローブを使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。ＴＰＨ２リボプローブ鋳型の２種（ＴＰＨ２ａリボプローブ及びＴＰＨ２ｂリボプローブ）はオーバーラップしないようにし、ＴＰＨ２をコードするヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＹ０９０５６５参照）の夫々ヌクレオチド１３４−３４９と３５９−５７７を含むｃＤＮＡ鋳型から作製した。第３のＴＰＨ２リボプローブ（ＴＰＨ２ｃリボプローブ）鋳型はＴＰＨ２をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド１３４−９５２を含むｃＤＮＡ鋳型から作製した。ＴＰＨ１  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｊ０４７５８）のヌクレオチド５９５−１４３７を含むｃＤＮＡ鋳型から作製したＴＰＨ１リボプローブ（ＴＰＨ１−８９２）も使用した。ｃＲＮＡに取込まれた３３Ｐ標識ＵＴＰ（ＮＥＮ−Ｄｕｐｏｎｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して各プローブのセンス鎖とアンチセンス鎖を合成した。Ｔ７（アンチセンス）とＴ３（センス）のＲＮＡポリメラーゼ配列伸長部を含むｃＤＮＡ鋳型を使用してプローブを転写した。取込まれなかったヌクレオチドを除去するためにＮＵＣＴＲＡＰプッシュカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用した。マウス配列に対するプライマーを使用してマウス縫線スライスｃＤＮＡからリボプローブ鋳型を増幅した。
【００６８】
ＴＰＨ２ａリボプローブ鋳型配列は
【００６９】
【化１】
2007510406.tif 000003
であった。
【００７０】
ＴＰＨ２ｂリボプローブ鋳型配列は
【００７１】
【化２】
2007510406.tif 000004
であった。
【００７２】
ＴＰＨ２ｃリボプローブ鋳型配列は
【００７３】
【化３】
2007510406.tif 000005
であった。
【００７４】
ＴＰＨ２−８９２リボプローブ鋳型配列は
【００７５】
【化４】
2007510406.tif 000006
2007510406.tif 000007
であった。
【００７６】
以下のようにｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。マウス脳の１６μｍ厚冠状背側縫線切片（図４Ａ参照）を含むスライドを１×ＰＢＳバッファー（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）中４％ホルムアルデヒドで素早く後固定し、１×ＰＢＳでリンスし、０．１Ｍトリエタノールアミン中０．２５％無水酢酸でアセチル化し、２×塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）（２×ＳＳＣ：０．３Ｍ  ＮａＣｌ，０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）でリンスした。数回のリンスとエタノール脱水後に切片を一晩５５℃でプローブ５×１０４ｃｐｍ／μＬとハイブリダイズさせた。翌朝、切片を室温にて２×ＳＳＣで２回洗浄し、３７℃にて３０分間リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ  Ａ）で処理し、室温にて２×ＳＳＣで１回、１×ＳＳＣで１回、指定に応じて４５℃又は６５℃にて０．２×ＳＳＣで２回洗浄した。エタノールを使用して切片を脱水し、β感光フィルム（ＢＩＯＭＡＸ  ＭＲ，ＮＥＮ−Ｄｕｐｏｎｔ）に１〜３時間室温で密着させた。ＮＩＫＯＮレンズ（Ｎｉｋｏｎ  Ｃａｎａｄａ，Ｉｎｃ．）を搭載したＣＣＤビデオカメラ（Ｄａｇｅ−ＭＴＩ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｃｉｔｙ，ＩＮ）とＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍを使用して中脳切片のオートラジオグラフ画像を撮影した。
【００７７】
図２Ａ及び２Ｂに示すように、ｍＲＮＡに対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含むＴＰＨ１及びＴＰＨ２リボプローブは１７β−エストラジオールを投与した卵巣切除マウスに由来するＤＲＮスライスで夫々ＴＰＨ１及びＴＰＨ２をコードするｍＲＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出するのに特異的であった。ＴＰＨ２ｂリボプローブとＴＰＨ１メッセージの交差反応性を試験するために、ｐｃＤＮＡ−３．１にサブクローニングしたＴＰＨ１又はＴＰＨ２のコーディング配列をＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。ＴＰＨ２ｂリボプローブはＴＰＨ２  ｍＲＮＡを過剰発現するＣＯＳ−７細胞とハイブリダイズしたが、ＴＰＨ１  ｍＲＮＡを過剰発現するＣＯＳ−７細胞でハイブリダイゼーションは検出されなかった。ＴＰＨ１−８９２リボプローブとＴＰＨ２メッセージの交差反応性を試験するために、ｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングしたＴＰＨ１又はＴＰＨ２のコーディング配列をＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。ＴＰＨ１−８９２リボプローブはＴＰＨ１  ｍＲＮＡを過剰発現するＣＯＳ−７細胞とハイブリダイズしたが、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡを過剰発現するＣＯＳ−７細胞でハイブリダイゼーションは検出されなかった。
【００７８】
図３Ａ及び３Ｂに示すように、卵巣切除マウスのＤＲＮにおけるＴＰＨ１及びＴＰＨ２  ｍＲＮＡの量と分布は区別可能である。図３Ａ及び３ＢはＴＰＨ１−８９２（図３Ａ）又はＴＰＨ２ｃアンチセンスリボプローブ（図３Ｂ）とハイブリダイズした卵巣切除マウスのＤＲＮの吻側端から尾側端まで移動する冠状中脳スライス標本のオートラジオグラフである。図３Ａ及び３Ｂに示すように、ＤＲＮにおけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡの発現はＤＲＮにおけるＴＰＨ１  ｍＲＮＡの発現よりも有意に多かった（ＴＰＨ１−８９２アンチセンスリボプローブとハイブリダイズしたＤＲＮスライスの３日間露光をＴＰＨ２ｃアンチセンスリボプローブとハイブリダイズしたＤＲＮスライスの１．５時間と比較）。
【００７９】
図５Ａ及び５Ｂに示すように、１７β−エストラジオールは卵巣切除マウスのＤＲＮにおけるＴＰＨ１  ｍＲＮＡレベルを増加するが、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルには明白な効果がない。これは、１７β−エストラジオールを投与した卵巣切除マウスに由来し、ＴＰＨ１−８９２アンチセンスリボプローブとハイブリダイズしたＤＲＮスライスと、１７β−エストラジオールを投与した卵巣切除マウスに由来し、ＴＰＨ２ｃアンチセンスリボプローブとハイブリダイズしたＤＲＮスライスのオートラジオグラフを比較することにより確認することができる。
【実施例２】
【００８０】
本実施例では、リアルタイム定量的ＰＣＲ法を使用してマウスＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現に及ぼすデキサメタゾン、ＲＵ４８６、エストラジオール、プレドニソロン、又はビークルの効果を測定した。一般に、リアルタイムＰＣＲは実施例１に記載したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法よりもｍＲＮＡ発現の検出感度が高い。本実施例はデキサメタゾン、ＲＵ４８６、１７β−エストラジオール、及びプレドニソロンが各々縫線スライス標本におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現に阻害効果を生じたが、ＴＰＨ１  ｍＲＮＡ発現には無効であったことを示す。本実施例は更に１７β−エストラジオールがＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現に検出可能な効果を生じなかったことも示す。更に、本実施例はＲＵ４８６が単独で混合又は部分アゴニストである場合にはＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現を阻害したが、デキサメタゾンと混合すると、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現のデキサメタゾン阻害を阻止することも示す。
【００８１】
雌マウス（１３〜１６週齢）の卵巣を切除した（Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒのＣ５７ＢＬ／６；ＴａｃｏｎｉｃのＥＲノックアウト動物）。大豆を含まない齧歯類用飼料で飼育し、外科処置と出荷から最低１週間回復させた。ビークル（ゴマ油）０．１ｃｃ又は化合物（指定に応じてデキサメタゾン、ＲＵ４８６、エストラジオール、又はプレドニソロン３、１０、又は２０ｍｐｋ）を午前中に（１日１回４日間）マウスに皮下投与した。４回目の投与から約６時間後にマウスにケタミン／キシラジンで深麻酔し、頭蓋から脳を摘出し、マウス脳ブロックの腹側を上にして氷上に置き、氷冷レザーブレードを１ｍｍ間隔でブロックに挿入した。視床下部の尾側端を第１のレザーブレードの配置用解剖マーカーとして使用し、ブレード４枚を尾側から順次挿入した。切片４枚を試験し、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を加えた試験管に背側縫線の最大部分を含む２枚を入れ、４℃で一晩おいた。２４時間後にＲＮＡＬＡＴＥＲから脳スライスを取り出し、別の試験管に入れて−８０℃で保存した。
【００８２】
分子生物学法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）又はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（２００１）の方法が挙げられる。
【００８３】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＴＰＨ２検出用としてＴＰＨ２プライマーとプローブのセットを２組作製した。マウスＴＰＨ２フォワードプライマーはｍＴＰＨ２−５１４Ｆ及びｍＴＰＨ２−１２７０Ｆとし、その対応する配列は夫々５’−ＧＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＴ−３’（配列番号７；ＴＰＨ２をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド５１４−５３５に対応）と５’−ＴＴＣＧＴＣＣＡＴＣＧＧＡＧＡＡＴＴＧＡＡ−３’（配列番号８；ＴＰＨ２をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド１２７０−１２９０に対応）である。マウスＴＰＨ２リバースプライマーはｍＴＰＨ２−５８５Ｒ及びｍＴＰＨ２−１３４４Ｒとし、その対応する配列は夫々５’−ＧＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＴ−３’（配列番号９；ＴＰＨ２をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド５６７−５８５に対応）と５’−ＣＡＧＧＴＣＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＣＡＡＡＧ−３’（配列番号１０；ＴＰＨ２をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド１３２４−１３４４に対応）である。マウスＴＰＨ２プローブはｍＴＰＨ２−５６５Ｔ及びｍＴＰＨ２−１２９２Ｔとし、その対応する配列は夫々５’−ＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１１；ＴＰＨ２をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド５３９−５６５に対応）と５’−ＣＡＴＧＣＴＣＴＴＴＣＣＧＡＣＡＡＧＧＣＧＴＧＴＧＴ−３’（配列番号１２；ＴＰＨ２をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド１２９２−１３１７に対応）である。プローブは５’末端をＦＡＭで標識し、３’末端をＴＡＭＲＡで標識した。
【００８４】
ＴＡＱＭＡＮ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＳ  ７７００  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡを使用するリアルタイムＰＣＲ分析のために、マウス縫線スライスからの全ＲＮＡ単離を以下のように実施した。サンプルを４℃のＲＮＡＬＡＴＥＲ中で一晩保存した後にＲＮＡＬＡＴＥＲを除去し、全ＲＮＡの単離まで−８０℃で保存した（重量２５〜５０ｍｇスライス２枚）。スライスを−８０℃から取り出し、ＦＡＳＴＰＲＥＰ処理用試験管に入れたＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ  １．０ｍＬに加えた。全サンプルが処理された後にビーズマトリックスを充填したＬＹＳＩＮＧ  ＭＡＴＲＩＸ  Ｄ管を使用してＦＡＳＴＰＲＥＰ  １２０ホモジナイザーに入れ、設定６で３０秒後に設定６で２０秒間１回スライスをホモジナイズした。サンプルを室温で５分間放置して核蛋白質複合体を完全に解離させた後にサンプルを１２，０００×ｇで５分間４℃にて遠心した。ホモジネートを１．５ｍＬマイクロ遠心管に移し、ＢＣＰ（ブロモ−３−クロロプロバン）１００μＬを加えた。サンプルを１５秒間ボルテックスし、室温で２〜３分間放置した。サンプルを１２，０００×ｇで１５分間４℃にて遠心した。水層を取り出し、別のＲＮＡｓｅ不添加滅菌１．５ｍＬマイクロ遠心管に入れた。５ｍｇ／ｍＬグリコーゲン５μＬを各サンプルに加え、サンプルをボルテックスした。イソプロパノール５００μＬを各サンプルに加えた。サンプルを１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間放置した後、１２，０００×ｇで１５分間４℃にて遠心した。上清をデカントし、ペレットを氷冷７５％エタノール５００μＬで洗浄した。サンプルを１２，０００×ｇで１５分間４℃にて遠心し、エタノールをデカントし、ペレットを１０分間風乾した。ペレットを予め暖めておいたＲＮＡＳＥＣＵＲＥ（６０℃）３０μＬに再懸濁し、６０℃に１０分間加熱した。ＤＮＡｓｅ処理とｃＤＮＡ分析までサンプルを−８０℃で保存した。
【００８５】
ＴＡＱＭＡＮ分析のための野生型マウス縫線スライス全ＲＮＡのＤＮａｓｅ処理とｃＤＮＡ調製。ＤＮＡフリーキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用するＤＮａｓｅ処理。全ＲＮＡサンプル５μｇを９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。１×ＤＮａｓｅ  Ｉ溶液を各サンプルに加えた（ＤＮａｓｅ  Ｉバッファー，ＤＮａｓｅ  Ｉ，Ｈ２Ｏ）。反応液を混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＮａｓｅ不活化試薬ビーズを加えて反応液を不活化し、室温で３分間十分に混合し、２，５００ＲＰＭで１分間４℃にて遠心した（反応液２５μＬを試験し、不活化試薬１／１０容量で不活化した）。
【００８６】
逆転写。ＤＮａｓｅ  Ｉで処理した全ＲＮＡ１０μＬを１×逆転写反応混合物（ＤＥＰＣで処理したＨ２Ｏ，ＲＴバッファー，ＭｇＣｌ２，ｄＮＴＰミックス，ランダムヘキサマー，ＲＮａｓｅインヒビター，及びＭＵＬＴＩＳＣＲＩＢＥ  ＲＴ）４０μＬに加え、２５℃で１０分間、４８℃で３０分間、９５℃で５分間インキュベートした。ＥＤＴＡを加えて逆転写を停止した。サンプルを保存用プレートに移し、−２０℃で保存した。
【００８７】
マウスＴＰＨ  ｍＲＮＡの相対レベルを測定するために縫線スライスｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析を以下のように実施した。ＴＡＱＭＡＮ反応ミックス（１×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ）；２０ｎＭフォワード及びリバース１８Ｓ  ｒＲＮＡ対照プライマーと１００ｎＭ  １８Ｓ  ｒＲＮＡ対照プローブ並びに（ａ）３００ｎＭ  ｍＴＰＨ２−５１４Ｆ及びｍＴＰＨ２−５８５Ｒプライマーと２００ｎＭ  ｍＴＰＨ２−５６５Ｔプローブ（ＴＰＨ２−５１４プライマー／プローブセット）又は（ｂ）３００ｎＭ  ｍＴＰＨ２−１２７０Ｆ及びｍＴＰＨ２−１３４４Ｒプライマーと２００ｎＭ  ｍＴＰＨ２−１２９２Ｔプローブ（ＴＰＨ２−１２７０プライマー／プローブセット））２２．５μＬを加えた９６ウェルプレートの各ウェルにｃＤＮＡ２．５μＬを加えた。サンプルをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で試験し、収集したデータをＭｅｒｃｋ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＴＡＱＭＡＮ  ＰＬＵＳプログラムで分析した。
【００８８】
実施例１の結果から、１７β−エストラジオールはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより測定した場合に卵巣切除マウスのＤＲＮにおけるＴＰＨ１  ｍＲＮＡ発現を誘導したが、ＴＰＨ２発現には無効であることが示唆された。実施例１で観察された１７β−エストラジオールの差別効果はリアルタイムＰＣＲ法により確認された。図４Ｂに示すように、１７β−エストラジオール０．０１〜０．２ｍｋｐを１日１回ｓ．ｃ．投与した処、卵巣切除マウスのＤＲＮに約１．４〜１．６倍のＴＰＨ１  ｍＲＮＡレベルの有意誘導を生じた（０．０２５〜０．１ｍｐｋ  １７β−エストラジオールでｐ＜０．０１及び０．２ｍｐｋ  １７β−エストラジオールでｐ＜０．００１）。他方、図４Ｃに示すように、同一濃度範囲で１７β−エストラジオールを投与してもＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルには効果がなかった。図１２は子宮重量測定値が１７β−エストラジオールにより劇的に誘導されることを示す。
【００８９】
図６はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合にグルココルチコイドが卵巣切除マウスのＤＲＮにおけるＴＰＨ１  ｍＲＮＡレベルに影響を与えなかったことを示す。同図に示すように、１７β−エストラジオール０．２ｍｐｋはＴＰＨ１  ｍＲＮＡレベルの１．８倍の有意誘導を生じた（ｐ＜０．００１）が、３ｍｐｋデキサメタゾンも１０ｍｐｋプレドニソロンもＴＰＨ１  ｍＲＮＡレベルに効果がなかった。
【００９０】
他方、図７に示すように、ＴＰＨ２−５１４又はＴＰＨ２−１２７０プライマー／プローブセットを使用すると、１０ｍｐｋのミフェプレストン（ＲＵ４８６）は３ｍｐｋのデキサメタゾン及び１０ｍｐｋのプレドニソロンと同様に、卵巣切除マウスのＤＲＮにおけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルを低下させた。一般に、デキサメタゾンとプレドニソロンは完全なグルココルチコイド受容体アゴニストであるが、ＲＵ４８６は多少のアゴニスト活性をもつグルココルチコイド受容体アンタゴニストである（混合ないし部分グルココルチコイド受容体アゴニスト）。図８の結果はＲＵ４８６のアゴニスト活性を明白に示している。
【００９１】
図８はＲＵ４８６濃度を１０ｍｐｋから２０ｍｐｋに増加することによりＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルの更なる低下が観察されたことを示す。デキサメタゾンの量を３ｍｐｋから１０ｍｐｋに増加した場合にもは同様の更なる低下が観察された。
【００９２】
図９はＲＵ４８６とデキサメタゾンの同時投与により、ＲＵ４８６のグルココルチコイドアンタゴニスト活性を発現できることを示す。同図に示すように、デキサメタゾン又はＲＵ４８６はＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルの有意低下を生じた（夫々４０％と２８％）。しかし、デキサメタゾンをＲＵ４８６と併用投与すると、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルは１７％しか低下しなかった。ＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルに及ぼすこの効果はデキサメタゾン効果と統計的差があるが、ビークル対照値とは統計的差がない。この結果は混合ないし部分アゴニストを同定するために上記方法を使用できることを示している。即ち、デキサメタゾンの共存下の完全アゴニストはデキサメタゾンによるＴＰＨ２  ＭＲＮＡ発現の低下を増進するが、混合ないし部分アゴニストはデキサメタゾンによるＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現の低下を阻害する。従って、本発明の方法はＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現に影響を与える分析物と混合ないし部分アゴニストである分析物の両者を同定することができる。
【実施例３】
【００９３】
本実施例は卵巣切除雌マウスで観察されるＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現に及ぼすグルココルチコイド効果が慢性コルチコステロン投与下の雄マウスでも観察されることを実証する。
【００９４】
実験開始時体重２５ｇの雄ＢＫＴＯマウス（Ｂａｎｔｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｍａｎ，Ｈｕｌｌ  ＵＫ）にイソフルオランで素早く麻酔した。コルチコステロンペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，カタログ番号Ｇ−１１１，２１日放出製剤）４×５ｍｇ又はコルチコステロン４０ｍｇ／ｋｇ／日に等量の４×プラセボペレット（カタログ番号ＮＣ−１１１）を動物に移植した。１匹当たり１回の切開で済むようにトロカール１個にペレット４個を保持できるように同梱のトロカールを改造したものを使用してペレットを移植した。ペレットの移植に最も理想的な場所は皮膚と筋肉の間に最大スペースがとれるような場所であり、例えば耳と肩の間の首の側面であり、この技術を使用すると縫合又は創傷クリップは不要であった。動物を飼育ケージに戻し、回復させた。１４日後に動物を安楽死させ、ＥＤＴＡ被覆管に胴体から採血し、１０分間３０００ｒｐｍで遠心し、血漿を取り出し、分析の準備ができるまでドライアイスで凍結した。脳を摘出し、イソペンタン中で凍結し、分析の準備ができるまで−８０℃で保存した。背側縫線の２５０μｍ厚冠状切片３〜４枚を切り取り、皮質を切片から除去し、切片を４℃のＲＮＡＬＡＴＥＲに加えた。実施例２のＴＰＨ２−５１４プライマー／プローブセットとＰＣＲ条件を使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析（ＴＡＱＭＡＮ）用に背側縫線スライスを処理した。ＣＯＡＴ−Ａ−ＣＯＵＮＴラットコルチコステロンラジオイムノアッセイキット（ＤＰＣ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ−Ｏｒｄｅｒ  ｎｏ  ＴＫＲＣ１）を使用して血漿コルチコステロンを分析した。サンプルの分析は製造業者の指示に従って実施した。
【００９５】
図１０は１４日間コルチゾン投与後に雄マウスの血漿中コルチゾンレベルが有意に増加したことを示す（ｐ＝０．００４）。図１１は同一マウスの縫線スライス標本でＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルが有意に低下したことを示す（ｐ＝０．０１）。これらの結果はＴＰＨ２発現に及ぼすグルココルチコイド効果が卵巣切除雌マウスに限定されないことを示している。従って、本発明の方法は雄雌両方のマウスにおけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルに影響を与える分析物を同定するために使用できると考えられる。
【実施例４】
【００９６】
本実施例はデキサメタゾンが卵巣切除雌マウスと無傷雄マウスの両者のＤＲＮにおけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルを低下させることを示す。デキサメタゾンによるＤＲＮ中のＴＰＨ２  ｍＲＮＡの低下はミフェプレストンの同時投与により阻止される。
【００９７】
卵巣切除Ｃ５７／ＢＬ６雌マウス（１３〜１６週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、無傷Ｃ５７／ＢＬ６雄マウス（１３〜１６週齢）をＴａｃｏｎｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。大豆を含まない齧歯類用飼料で飼育し、外科処置と出荷から最低１週間回復させた。ビークル（ゴマ油）０．１ｃｃ又は化合物（用量は実験毎に指定）を午前中に（１日１回４日間）マウスに皮下投与した。４回目の投与から約６時間後にマウスにケタミン／キシラジンで深麻酔した。
【００９８】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析用として頭蓋から脳を摘出し、マウス脳ブロックの腹側を上にして氷上に置き、氷冷レザーブレードを１ｍｍ間隔でブロックに挿入した。視床下部の尾側端を第１のレザーブレードの配置用解剖マーカーとして使用し、ブレード４枚を尾側から順次挿入した。切片４枚を試験し、ＲＮＡ−ｌａｔｅｒを加えた試験管に背側縫線の最大部分を含む２枚を入れ、４℃で一晩おいた。２４時間後にＲＮＡＬＡＴＥＲ（Ａｍｂｉｏｎ）から脳スライスを取り出し、別の試験管に入れて−８０℃で保存した。投与群当たりｎ＝７匹をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試験に使用した。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学分析用として頭蓋から脳を摘出し、腹側を上にして粉末ドライアイス上に置き、凍結した脳を切片作製時まで−８０℃で保存した。投与群当たりｎ＝５〜６匹をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学分析に使用した。
【００９９】
マウスＴＰＨ２プライマーはｍＴＰＨ２−５１４Ｆ及びｍＴＰＨ２−５８５Ｒとし、マウスＴＰＨ２プローブはｍＴＰＨ２−５６５Ｔとした。ｍＴＰＨ２−５６５Ｔは蛍光色素ＦＡＭとキエンチャーＴＡＭＲＡで標識した。
【０１００】
ＴＡＱＭＡＮ分析のためのマウス縫線スライスからの全ＲＮＡ単離は実施例２に記載した通りである。ＤＮＡフリーキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して全ＲＮＡサンプルからゲノムＤＮＡを取り出し、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ  ＲＴとＴａｑＭａｎ  Ｇｏｌｄ  ＲＴ試薬（ＡＢＩ）を使用してｃＤＮＡ合成を実施した。ＥＤＴＡを加えて逆転写を停止した。サンプルを保存用プレートに移し、−２０℃で保存した。
【０１０１】
ＴＡＱＭＡＮを使用してリアルタイムＰＣＲ分析を以下のように実施した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応ミックス（１×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ）；２０ｎＭフォワード及びリバース１８Ｓ  ｒＲＮＡ対照プライマーと１００ｎＭ  １８Ｓ  ｒＲＮＡ対照プローブ並びに３００ｎＭ  ｍＴＰＨ２−５１４Ｆ及びｍＴＰＨ２−５８５Ｒプライマーと２００ｎＭ  ｍＴＰＨ２−５６５Ｔプローブ）２２．５μＬを加えた９６ウェルプレートの各ウェルにｃＤＮＡ２．５μＬを加えた。サンプルをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ），Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で試験し、収集したデータをＭｅｒｃｋ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＴＡＱＭＡＮ  Ｐｌｕｓプログラムで分析し、一元配置ＡＮＯＶＡ（ＣＭＧ，Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して統計的有意差を検定した。
【０１０２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学分析を以下のように実施した。オーバーラップしないＴＰＨ２リボプローブ鋳型ＴＰＨ２ａ及びＴＰＨ２ｂを実施例１に記載したように作製した。ｃＲＮＡに取込まれた３３Ｐ又は３５Ｓ標識ＵＴＰを使用し、センスプローブにはＴ７ポリメラーゼ、アンチセンスプローブにはＴ３ポリメラーゼを使用してＰｒｏｍｅｇａ  Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍによりアンチセンス及びセンス両者のリボプローブを合成した。
【０１０３】
冠状切片（Ｃｒｙｏｔｏｎ，１６ｍｍ厚）をマウスＴＰＨ２リボプローブＴＰＨ２ａ又はＴＰＨ２ｂとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたスライドをＫｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘ  ＭＲフィルム（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に室温で３〜１６時間露光した。中脳切片のオートラジオグラフィー画像を動物間で解剖学的にマッチさせ、Ｎｉｋｏｎレンズ（Ｎｉｋｏｎ  Ｃａｎａｄａ，Ｉｎｃ．）を搭載したＣＣＤビデオカメラ（Ｄａｇｅ−ＭＴＩ  Ｉｎｃ）とＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍを使用してデンシトメトリーを実施した。ＤＲＮのＯ．Ｄ．から対象領域の外側のバックグラウンド読み値を差し引くことにより平均グレースケール光学密度を得た。ＤＲＮの吻側端から尾側端までに相当する冠状切片５〜６枚で分析を実施した。各動物からのＯ．Ｄ．値を平均した後、各群の平均を計算し、平均±ＳＥＭとして報告した。一元配置ＡＮＯＶＡにより投与群平均を比較した（ＣＭＧ，Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ）。
【０１０４】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学試験からのオートラジオグラフィー画像のデンシトメトリー分析により測定した場合、デキサメタゾンを１日１回４日間投与した卵巣切除雌マウスはＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルが３ｍｇ／ｋｇで２８％低下し、１０ｍｇ／ｋｇで３６％低下する（図１３Ａ及び１３Ｂ；ｐ＜０．００１，ｎ＝５〜６）。
【０１０５】
グルココルチコイドにより生じるＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルの変化を定量するためにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。ＤＲＮを含むブレグマレベル８．００（図４Ａ参照）でマウス脳の１ｍｍ冠状切片を切り取り、皮質を除去し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析のための全ＲＮＡ単離とｃＤＮＡ合成に切片を使用した。卵巣切除雌マウスにデキサメタゾン０．１〜３ｍｇ／ｋｇを１日１回４日間投与すると、縫線スライス標本におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルは０．１ｍｇ／ｋｇで２３％から３ｍｇ／ｋｇで４４％まで低下した（図１４）。これらのデータから、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学法で観察された結果が確認され、０．１ｍｇ／ｋｇといった低いデキサメタゾン用量でＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルの統計的に有意な低下がマウスＤＲＮで検出された。
【０１０６】
ＴＰＨ２メッセージレベルのグルココルチコイド調節の雌雄特異性を試験するために、１ｍｐｋデキサメタゾンを１日１回４日間無傷雄Ｃ５７／Ｂ１６マウスに投与した。デキサメタゾンを投与すると、マウス縫線スライス標本におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルは２６％低下し（図１５）、図１４に示すように１ｍｇ／ｋｇ投与時に卵巣切除雌Ｃ５７／Ｂ１６マウスで検出されたＴＰＨ２メッセージレベルの３０％低下とほぼ同等であった。ミフェプレストンを単独投与してもＴＰＨ２メッセージレベルには効果がない。同様に、１７β−エストラジオール投与もＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルに効果がない。
【０１０７】
デキサメタゾンはグルココルチコイド及びミネラロコルチコイド受容体の両者に高い親和性をもつので、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡに及ぼすグルココルチコイド効果の特異性を試験するために、有意アンタゴニスト性をもつグルココルチコイド受容体モジュレーターであるミフェプレストン（ＲＵ４８６）と共にデキサメタゾンを同時投与した。図９に示すように、デキサメタゾン３ｍｇ／ｋｇを投与した卵巣切除雌マウスではＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルが４０％低下したが、この低下はミフェプレストンの同時投与により阻止することができた。同様に、無傷雄マウスにデキサメタゾン１ｍｇ／ｋｇを投与すると、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルは２６％低下した。卵巣切除雌マウスの場合と同様に、ミフェプレストンの同時投与によりｍＲＮＡレベルの低下を阻止することができた（図１５参照）。２０ｍｇ／ｋｇを投与した卵巣切除雌マウスではミフェプレストンの部分アゴニスト活性が検出された（ＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルの２８％低下（図９参照））が、無傷雄マウスに３０ｍｇ／ｋｇ投与した場合には検出されなかった（図１５）。デキサメタゾンによるＴＰＨ２メッセージレベルの変化がミフェプレストンにより阻止されたことから、デキサメタゾンはグルココルチコイド受容体を介して作用していると予想された。
【０１０８】
実施例１〜４に示した結果から明らかなように、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡはマウス背側縫線核において各種ホルモンにより差別的に調節され、（１）グルココルチコイド投与の結果、４日間毎日投与後にＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルは有意に低下し；（２）グルココルチコイドによるＴＰＨ２メッセージレベルの低下はグルココルチコイド受容体アンタゴニストであるミフェプレストンにより阻止され；（３）ＴＰＨ２メッセージレベルに及ぼすグルココルチコイドの効果は雌雄特異的ではなく、卵巣切除雌及び無傷雄Ｃ５７／Ｂ１６マウスの両者で認められた。
【０１０９】
他方、１７β−エストラジオールは卵巣切除雌又は無傷雄Ｃ５７／Ｂ１６マウスに４日間投与レジメン後に背側縫線核におけるＴＰＨ２メッセージレベルに測定可能な効果がなかった。１７β−エストラジオールはマカクザルとモルモットの両者の背側縫線でＴＰＨメッセージ及び蛋白質レベルを調節することが示されている（Ｂｅｔｈｅａら，Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．４７：５６２−５７６（２０００）；Ｌｕら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  １１：２５７−２６７（１９９９）；Ｐｅｃｉｎｓ−Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：７０２１−７０２９（１９９６））。１７β−エストラジオールに応答するＴＰＨ２  ｍＲＮＡの変化は検出されなかったので、上記Ｂｅｔｈｅａら，Ｌｕら及びＰｅｃｉｎｓ−Ｔｈｏｍｐｓｏｎらで測定された変化はＴＰＨ１アイソフォームの発現の変化に対応するものであると思われる。
【０１１０】
新生児と成体の両者のラット脳におけるＴＰＨ活性及び蛋白質の副腎皮質影響とグルココルチコイド調節については文献に多くの報告があるが、マウス中脳又は脳幹におけるＴＰＨ発現に及ぼすグルココルチコイドの効果について記載している刊行物はほとんどない。両側の副腎を摘出すると成体ラット中脳のＴＰＨ活性が低下するが、コルチコステロンを投与することにより基線レベルまで回復できることが示されている（Ａｚｍｉｔｉａ  ａｎｄ  ＭｃＥｗｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６６：１２７４−１２７６（１９６９）；Ｒａｓｔｏｇｉ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｓｍ．４２：６３−７１（１９７８）。更に、血漿コルチコステロンを増加することが知られている電気脚ショックや低温暴露等のストレッサーの結果、成体ラット中脳におけるＴＰＨ活性が増加することも示されている（Ａｚｍｉｔｉａ  ａｎｄ  ＭｃＥｗｅｎ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７８：２９１−３０２（１９７４））。両側副腎摘出はストレッサーで認められるＴＰＨ活性の変化を阻止し、コルチコステロンの投与はストレスが副腎摘出動物でＴＰＨ活性レベルに与える影響を復元する（Ａｚｍｉｔｉａ  ａｎｄ  ＭｃＥｗｅｎ，前出）。ＴＰＨ活性の変化がＴＰＨ蛋白質の変化と正の相関があることも示されている（Ａｚｍｉｔｉａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：５０４１−５０５５（１９９３））。コルチコトロフィン放出因子（ＣＲＦ）のｉｃｖ注射によりＴＰＨ酵素活性の間接的調節が行われており、その結果、成体ラットにおけるＴＰＨ活性が増加し、これは両側副腎摘出とミフェプレストンにより阻止することができ、デキサメタゾンの投与により復元することができる（Ｓｉｎｇｈら，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２０：８１−９２（１９９２））。これらの研究では、扁桃体中心核の病変もＴＰＨ活性に及ぼす視床下部−下垂体−副腎（ＨＰＡ）軸活性化の効果を阻止しており、この脳領域がセロトニン合成の副腎皮質調節において特に重要な役割を果たすことを示唆している。（Ｓｉｎｇｈら，前出）。
【０１１１】
しかし、マウス脳におけるＴＰＨ活性又は蛋白質のグルココルチコイド調節については情報が不足している。ある研究では、ＴＰＨ活性は成体マウス脳で副腎摘出又は慢性コルチコステロン投与の影響を受けないことが示されている（Ｓｚｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２６：１６９−１７３（１９７６））。他方、成体マウス脳幹で観察されたレセルピンによるＴＰＨ活性増加が副腎摘出により阻止され、副腎摘出マウスでレセルピンによるＴＰＨ活性増加がコルチコステロンにより復元されたという報告もある（Ｓｚｅら，前出）。齧歯類研究をまとめると、グルココルチコイドによりセロトニン生合成を調節できることが明白であり、ＴＰＨ活性は辺緑系のセロトニン作動性緊張に関連していると思われる。しかし、これらの研究は活性変化に関与するＴＰＨアイソフォームも同定していないし、マウス脳におけるＴＰＨ活性に及ぼす副腎皮質調節の効果についても検討していない。
【０１１２】
最近まで、セロトニンの生合成には単一のＴＰＨアイソフォームが関与していると考えられていた。ＴＰＨを発現しないマウスを作製した処、中脳と脳幹で依然としてセロトニン生合成を示したことから、第２のＴＰＨアイソフォームの存在が判明した（Ｗａｌｔｈｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：７６（２００３））。ゲノムデータベースのシリコスクリーニングの結果、公知ＴＰＨに対して相同性をもつ別の遺伝子が同定された（Ｗａｌｔｈｅｒら，前出）。従って、ＴＰＨ２のヒト、マウス及びラットクローンが同定され、  ＣＯＳ細胞で異種発現させた場合にＴＰＨ活性を示すことが判明した（Ｗａｌｔｈｅｒら，前出）。ＷａｌｔｈｅｒらはＴＰＨ２が脳で高度に発現されることを示すためにＲＮＡ保護アッセイを使用し、このデータからＴＰＨ２が脳における主要なＴＰＨアイソフォームであり、ＴＰＨ１が末梢で発現される主要ＴＰＨアイソフォームであると推論した。ＴＰＨ２が齧歯類脳における主要ＴＰＨアイソフォームであることはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学法を使用して確認され、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡは脳幹と中脳の組織学的に規定された縫線核全体に強く発現されるが、これに対してＴＰＨ１  ｍＲＮＡは齧歯類背側縫線核では発現レベルが非常に低いが、松果腺では強く発現されることが分かった（本明細書；Ｐａｔｅｌら，Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５５：４２８−３３（２００４））。ＴＰＨ２が同定されたことにより、縫線核で報告されている弱いＴＰＨ（ＴＰＨ１）メッセージレベルと両者ＴＰＨアイソフォームに共通のエピトープに対して作製された抗体を使用して検出された強いＴＰＨ免疫反応性の間に存在していた明白な矛盾を解明し易くなった。ＣＮＳにおけるＴＰＨ  ｍＲＮＡの調節を再検討し、ｍＲＮＡ調節をセロトニン生合成と相関させることが可能になったので、ＴＰＨ２の同定は有意義であった。
【０１１３】
本発明の実施例はＴＰＨ２  ｍＲＮＡがＤＲＮで各種ホルモンにより差別的に調節されることを実証する。デキサメタゾンを投与すると、雄雌両方のマウスでＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルが有意に低下したが、１７β−エストラジオールを投与してもＤＲＮにおけるＴＰＨ２メッセージレベルは変わらなかった。ＴＰＨ１  ｍＲＮＡも雄雌両方のマウスのＤＲＮで各種ホルモンにより差別的に調節されるようである。１７β−エストラジオールは背側縫線核におけるＴＰＨ１メッセージレベルを誘導する（データは示さず）。エストラジオールはＥＲ−βノックアウトマウスにおけるＴＰＨ１メッセージレベルに効果がないので、エストラジオールによるＴＰＨ１メッセージの変化はＥＲ−βの活性化により媒介されると思われる。他方、デキサメタゾンは雄雌両方のマウスのＤＲＮでＴＰＨ１  ｍＲＮＡに検出可能な効果がなかった（データは示さず）。本明細書に記載する結果によると、エストロゲンとグルココルチコイドは５−ＨＴ生合成のレベルでマウスセロトニン作動系を差別的に調節するらしい。
【０１１４】
セロトニン神経伝達は行動、感情及び認知プロセスで主要な役割を果たしており、このため、精神医学分野ではＴＰＨの多形の研究に大きな関心が寄せられてきた。ＴＰＨ多形へのこの大きな関心の結果、数件のＳＮＰ分析データが最近発表され、ＴＰＨ２遺伝子に感情障害関連ハプロタイプが存在することが示唆されている（Ｚｉｌｌら，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １−７，（２００４年５月４日事前オンライン発表）；Ｈａｒｖｅｙら，事前オンライン発表（２００４年７月２０日）；Ｌｕｃａら，事前オンライン発表（２００４年６月１５日））。この遺伝データはＴＰＨ２の発現及び／又は機能の変化が精神病に関係があることを示唆しており、機能と調節に関してＴＰＨアイソフォームを区別するものを解明する必要が重視される。グルココルチコイドによるＴＰＨ２メッセージの低下はグルココルチコイド増加が疾病の１つの特徴である大鬱病、特に精神病性大鬱病の病因に関係があるらしい（Ｂｅｌａｎｏｆｆら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １５８：１６１２−１６１６（２００１））。
【実施例５】
【０１１５】
本実施例はＴＰＨ２に特異的なポリクローナル抗体の作製方法について記載する。
【０１１６】
ＴＰＨ１のアミノ酸配列と殆ど一致しないアミノ酸配列をもつＴＰＨ２のエピトープに対応するペプチド（例えばＴＰＨ２ａ又はＴＰＨ２ｂプローブにより取り囲まれる領域内のアミノ酸配列に対応するペプチド）。１０週齢を過ぎたニュージーランドシロウサギで抗体を産生させる。ペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の蛋白質と結合し、等容量のフロイント完全アジュバントと混合することにより乳化し、免疫毎に合計０．１ｍｇのペプチドを３カ所の背側皮下部位に注入することが好ましい。等容量のフロイント不完全アジュバントに乳化したペプチド約０．１ｍｇを含有するブースターを２週間後に皮下投与する。関節動脈から採血する。血液を凝固させ、遠心により血清を採取する。血清を−２０℃で保存する。
【０１１７】
精製のために、ＴＰＨ２又はペプチドを活性化支持体に固定化する。抗血清を血清カラムに通した後に洗浄する。特異抗体をｐＨ勾配により溶出させ、採取し、硼酸バッファー（０．１２５Ｍ合計硼酸）中に−０．２５ｍｇ／ｍＬで保存する。遊離ＴＰＨ２又は固相に結合したペプチド（１ｐｇ／ウェル）を使用してＥＬＩＳＡ法により抗ＴＰＨ２抗体力価を測定する。ビオチン化抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ−ＳＡコンジュゲート、及びＡＢＴＳを使用して検出する。
【実施例６】
【０１１８】
本実施例はＴＰＨ２に特異的なモノクローナル抗体の作製方法について記載する。
【０１１９】
実施例４に記載したような精製ペプチド約１μｇ／匹をフロイント完全アジュバントと１：１で混合してＢＡＬＢ／ｃマウスに初期注射により免疫する。２週間後に、アジュバントを加えずに抗原約１μｇを各マウスの静脈内にブースター注射する。ブースター注射から３日後に各マウスからの血清がＴＰＨ２に特異的な抗体であるかどうかを確認する。
【０１２０】
ｃＤｋｋ−４蛋白質に特異的な抗体に陽性のマウスから脾臓を摘出し、無血清ＤＭＥＭで３回洗浄し、２０％ウシ胎仔血清、１ｍＭピルビン酸、ペニシリン１００単位、及びストレプトマイシン１００単位を添加したＤＭＥＭ約２０ｍＬを入れた滅菌ペトリ皿に加える。細胞を２３ゲージ針で潅流により放出させる。その後、細胞を低速遠心によりペレット化し、細胞ペレットを０．１７Ｍ塩化アンモニウム５ｍＬに再懸濁し、氷上に数分間置く。次に２０％ウシ胎仔血清５ｍＬを加え、細胞を低速遠心によりペレット化する。次に細胞をＤＭＥＭ１０ｍＬに再懸濁し、無血清ＤＭＥＭ中で中期対数期骨髄腫細胞と３：１比で混合する。細胞混合物を低速遠心によりペレット化し、上清フラクションを除去し、ペレットを５分間放置する。次に、１分間かけて０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ  ８．１，３７℃中の５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１ｍＬを加える。１分間３７℃でインキュベーション後、ＤＭＥＭ１ｍＬを更に１分間加えた後、３回目のＤＭＥＭを更に１分間加える。最後に、ＤＭＥＭ１０ｍＬを２分間かけて加える。その後、細胞を低速遠心によりペレット化し、２０％ウシ胎仔血清、０．０１６ｍＭチミジン、０．１ヒポキサンチン、０．５μＭアミノプテリン、及び１０％ハイブリドーマクローニングファクター（ＨＡＴ培地）を加えたＤＭＥＭにペレットを再懸濁する。次に細胞を９６ウェルプレートにプレーティングする。
【０１２１】
３、５、及び７日後に、プレート中の培地の２分の１を捨て、ＨＡＴ培地に交換する。１１日後に、ハイブリドーマ細胞上清をＥＬＩＳＡアッセイによりスクリーニングする。このアッセイでは、９６ウェルプレートをＴＰＨ２又はペプチドでコーティングする。各ウェルからの上清１００μＬをスクリーニングプレート上の対応するウェルに加え、１時間室温でインキュベートする。インキュベーション後、各ウェルを３回水洗し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ａ、Ｍの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（１：１，５００倍希釈液）１００μＬを各ウェルに加え、１時間室温でインキュベートする。その後、ウェルを３回水洗し、基質ＯＰＤ／過酸化水素を加え、約１５分間室温で反応を進行させる。次に１Ｍ  ＨＣｌ１００μＬを加えて反応を停止させ、ウェルの吸光度を４９０ｎｍで測定する。対照ウェルよりも吸光度の高い培養液を２ｃｍ２培養皿に移し、ＨＡＴ培地中の正常マウス脾細胞を加える。更に３日後に、培養液を上記のように再スクリーニングし、陽性の培養液を制限希釈によりクローニングする。各２ｃｍ２培養皿の細胞をカウントし、細胞密度を１×１０５個／ｍＬに調整する。細胞を完全培地で希釈し、正常マウス脾細胞を加える。細胞を希釈毎に９６ウェルプレートにプレーティングする。１０日後に、細胞の増殖をスクリーニングする。増殖陽性ウェルを抗体産生についてスクリーニングし、陽性ウェルを２ｃｍ２培養に拡張し、正常マウス脾細胞を加える。安定な抗体産生ハイブリドーマが得られるまでこのクローニング手順を繰返す。安定なハイブリドーマをより大きな培養皿に累進的に拡張し、細胞のストックを得る。
【０１２２】
プリスタン０．５ｍＬを雌マウスに腹腔内注射してマウスに腹水産生を誘導することにより腹水産生を実施する。１０〜６０日後に、細胞４．５×１０６個を各マウスに腹腔内注射し、７〜１４日後に腹水を回収する。
【０１２３】
本明細書では例証態様に関して本発明を記載するが、当然のことながら、本発明はこれらの態様に限定されない。当業者と本明細書の教示を閲覧する者は本発明の範囲内でその他の変形や態様に想到しよう。従って、本発明は特許請求の範囲のみにより限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】ＴＰＨ１とＴＰＨ２のアミノ酸配列である夫々配列番号１及び配列番号２のアラインメントを示す。更に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲプローブとｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション生化学プローブのアラインメントも示す。
【図２Ａ】図２Ａはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学法に対するＴＰＨ１リボプローブの特異性を示す。同図に示すように、ＴＰＨ１アンチセンスリボプローブはエストラジオールを投与したマウスに由来するマウスＤＲＮとハイブリダイズしたが、センスリボプローブはハイブリダイズしなかった。
【図２Ｂ】図２Ｂはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学法に対するＴＰＨ２リボプローブの特異性を示す。同図に示すように、オーバーラップしないＴＰＨ２ａ及びＴＰＨ２ｂアンチセンスリボプローブはエストラジオールを投与したマウスに由来するマウスＤＲＮとハイブリダイズしたが、ＴＰＨ２ｂセンスリボプローブはハイブリダイズしなかった。
【図３Ａ】図３ＡはＤＲＮの吻側端から尾側端まで移動する未処置マウスに由来するマウスＤＲＮの冠状スライス標本におけるＴＰＨ１  ｍＲＮＡの分布を示す。ハイブリダイゼーションプローブはＴＰＨ１−８９２アンチセンスリボプローブとした。
【図３Ｂ】図３ＢはＤＲＮの吻側端から尾側端まで移動する未処置マウスに由来するマウスＤＲＮの冠状スライス標本におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡの分布を示す。ハイブリダイゼーションプローブはＴＰＨ２ｃアンチセンスリボプローブとした。
【図４Ａ】図４ＡはリアルタイムＰＣＲ分析用縫線スライス標本を作製するために使用した解剖を示す背側縫線のレベルにおけるマウス脳の冠状スライスを示す（Ｐａｘｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ，１９９７から転載）。円内の脳組織をＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した（縫線スライス標本）。ＰＡＧは中脳中心灰白質であり、ＤＲは背側縫線であり、ｓｃｐは上小脳脚であり、ＭＲは正中縫線である。
【図４Ｂ】図４ＢはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合に１７β−エストラジオールがマウス縫線スライス標本におけるＴＰＨ１  ｍＲＮＡの発現を調節することを示す。１７β−エストラジオール（０．０２５〜０．２ｍｇ／ｋｇ体重（ｍｐｋ），皮下（ｓ．ｃ．））を１日１回４日間投与した卵巣切除マウスに由来する縫線スライスでは１．４〜１．６倍のＴＰＨ１  ｍＲＮＡが誘導された。
【図４Ｃ】図４ＣはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合に如何なる用量の１７β−エストラジオールも卵巣切除マウスに由来するマウス背側縫線スライス標本におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡの発現に明白な効果がなかったことを示す。１７β−エストラジオール（０．０２５〜０．２ｍｐｋ，ｓ．ｃ．）を１日１回４日間マウスに投与した。
【図５Ａ】図５ＡはＴＰＨ１−８９２アンチセンスリボプローブを使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学法により測定した場合に１７β−エストラジオールがマウスＤＲＮにおけるＴＰＨ１  ｍＲＮＡの発現を調節することを示す。１７β−エストラジオール（０．２ｍｐｋ，ｓ．ｃ．）を１日１回４日間投与した卵巣切除マウスに由来するＤＲＮでは３倍のＴＰＨ１  ｍＲＮＡが誘導された。
【図５Ｂ】図５ＢはＴＰＨ２ｃアンチセンスリボプローブを使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学法により測定した場合に１７β−エストラジオール（０．２ｍｐｋ，ｓ．ｃ．）が卵巣切除マウスに由来するマウスＤＲＮにおけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡの発現に明白な効果がなかったことを示す。１７β−エストラジオール（０．２ｍｐｋ，ｓ．ｃ．）を１日１回４日間マウスに投与した。
【図６】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合にグルココルチコイドがマウス縫線スライス標本におけるＴＰＨ１  ｍＲＮＡレベルに影響を与えないことを示す。１７β−エストラジオール（０．２ｍｐｋ，ｓ．ｃ．）を１日１回４日間投与した卵巣切除マウスの背側縫線では１．８倍のＴＰＨ１  ｍＲＮＡが誘導された。同一実験でデキサメタゾン又はプレドニソロンを皮下投与した処、ＴＰＨ１メッセージレベルに効果がなかった。
【図７】マウス縫線スライス標本におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルに及ぼす１７β−エストラジオールとデキサメタゾン、プレドニソロン、ミフェプレストン（ＲＵ４８６）の各グルココルチコイドの効果の比較を示す。０．２ｍｐｋ１７β−エストラジオール、３ｍｐｋデキサメタゾン、１０ｍｐｋＲＵ４８６、１０ｍｐｋプレドニソロン、又はビークル対照を１日１回マウスに投与した。ｍＴＰＨ２−５１４Ｆ及びｍＴＰＨ２−５８５ＲとｍＴＰＨ２−５６５Ｔプローブ（ＴＰＨ２−５１４プライマー／プローブセット）又はｍＴＰＨ２−１２７０Ｆ及びｍＴＰＨ２−１３４４ＲとｍＴＰＨ２−１２９２Ｔプローブ（ＴＰＨ２−１２７０プライマー／プローブセット）を使用してリアルタイムＰＣＲを実施した。１７β−エストラジオールはビークルに比較してＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現に関して統計的有意効果がなかったが、各グルココルチコイドはビークル対照に比較してＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現の有意低下を生じた。
【図８】ＴＰＨ２−５１４プライマー／プローブセットを使用してリアルタイムＰＣＲにより測定した場合のマウス縫線スライス標本におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルに及ぼす１７β−エストラジオールとデキサメタゾン、プレドニソロン、ミフェプレストン（ＲＵ４８６）の各グルココルチコイドの効果の比較を示す。ＲＵ４８６の量を２０ｍｐｋとした以外は上記と同様にマウスに投与した。１７β−エストラジオールはビークルに比較してＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現に統計的有意効果がなかったが、各グルココルチコイドはビークル対照に比較してＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現の有意低下を生じた。
【図９】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合にミフェプレストン（ＲＵ４８６）が縫線スライス標本におけるマウスＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルに対するデキサメタゾンの効果を阻害することを示す。デキサメタゾンを１日１回４日間投与すると、マウス縫線スライスにおけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルは４０％低下した（ｐ＜０．００１）。デキサメタゾンとミフェプレストンを同時投与するとＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルは１７％低下し、デキサメタゾン効果に比較して統計的差がある（ｐ＜０．０５）が、ビークル対照値とは統計的差がない。ミフェプレストンを単独投与すると、ＴＰＨ２メッセージレベルは２８％低下した（ｐ＜０．０１）。
【図１０】コルチコステロンを１４日間投与した雄ＢＫＴＯマウスにおける血漿コルチコステロン濃度を示す。
【図１１】図１２でコルチコステロンを１４日間投与した雄ＢＫＴＯラットの縫線スライス標本においてＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルが有意に低下したことを示す。
【図１２】１７β−エストラジオール（０．２ｍｇ／ｋｇ，ｓ．ｃ．）を１日１回４日間投与した卵巣切除雌マウスからの子宮重量測定値が１７β−エストラジオール投与に応じて約３．２〜３．７倍増加したことを示す（＊ｐ＜０．００１）。これは４ｂ及び４ｃに示す同一実験の子宮重量データである。
【図１３Ａ】図１３Ａは３及び１０ｍｇ／ｋｇデキサメタゾンを１日１回４日間投与した卵巣切除雌マウスのマウスＤＲＮにおけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学法を使用して検出した場合の代表的オートラジオグラフィー画像を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは３又は１０ｍｇ／ｋｇデキサメタゾンを皮下投与した卵巣切除雌マウスのＤＲＮにおけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルのオートラジオグラフィー画像のデンシトメトリー分析を示す。Ｖはデキサメタゾンのビークルである。デキサメタゾンを皮下投与すると、マウスＤＲＮにおけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルは低下する（３ｍｇ／ｋｇで２８％，１０ｍｇ／ｋｇで３６％）（＊ｐ＜０．００１）。
【図１４】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合にデキサメタゾンが卵巣切除雌マウスに由来するマウス縫線スライス標本におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現を調節することを示す。デキサメタゾン０．１〜３ｍｇ／ｋｇを１日１回４日間皮下投与すると、マウス縫線スライス標本におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルは０．１ｍｇ／ｋｇで２３％から３ｍｇ／ｋｇで４４％まで低下した（＆ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００５；＊ｐ≦０．００１）。
【図１５】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合にミフェプレストンが無傷雄マウスに由来する縫線スライス標本におけるマウスＴＰＨ２  ｍＲＮＡ発現に対するデキサメタゾンの効果を阻害することを示す。デキサメタゾンを無傷雄マウスに１日１回４日間投与すると、マウス縫線スライスにおけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルは２６％低下した（＊ｐ＜０．００１）。デキサメタゾンとミフェプレストンを同時投与すると、ＴＰＨ２  ｍＲＮＡレベルはビークルに比較して変わらなかったが、デキサメタゾン効果とは有意差があった（＆ｐ＜０．０５）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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