(57)【要約】  骨粗鬆症および他の代謝性骨疾患の処置に使用するための、個体の消化管に沿った任意の部分で骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を投与する方法および製剤を記載する。
2007535546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨誘導性骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または機能的に同等の骨誘導タンパク質と、
腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤と、
所望により、胃ペプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤と、
所望により、腸トリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤と、
所望により、吸収促進剤と
を含む製剤を個体に経口投与することを含む、前記個体における骨量喪失を特徴とする代謝性骨疾患を処置する方法。
【請求項２】
前記骨誘導性ＢＭＰが、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびその組合せから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記骨誘導性ＢＭＰが、精製された天然タンパク質または精製された組換えタンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する前記薬剤が、ｐＨ低下剤、キモトリプシン特異的阻害剤、およびその組合せから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｐＨ低下剤が、酢酸、コハク酸、乳酸、クエン酸、イソクエン酸、アスコルビン酸、オキザロ酢酸、シュウ酸、リンゴ酸、フマル酸、２−ケトグルタル酸、グルタル酸、ピルビン酸、グリセリン酸、およびその組合せから成る群から選択される緩衝剤である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記キモトリプシン特異的阻害剤が、キモスタチン、Ｚ−Ｌ−ｐｈｅクロロメチルケトン、α２抗プラスミン、アプロチニン、６−アミノヘキサン酸、α１アンチトリプシン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、ブロモエノールラクトン、ジイソプロピルフルオロリン酸、エコトイン、Ｎ−アセチル−エグリンＣ、メシル酸ガベキサート、ロイペプチントリフルオロ酢酸塩、Ｎ−ｐ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン、ダイズトリプシン−キモトリプシン阻害剤、およびその組合せから成る群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する前記薬剤が、コムギ、コメ、オートムギ、ダイズ、およびその組合せから調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
胃ペプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する前記薬剤が存在する場合に、前記薬剤が、腸溶コーティング、胃ｐＨ調節剤、ペプシン特異的阻害剤化合物、およびその組合せから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記腸溶コーティングが、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、酢酸トリメリト酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、メタクリル酸コポリマー、アクリル酸エチルコポリマー、およびその組合せから成る群から選択される化合物を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記胃ｐＨ調節剤が、制酸薬、ヒスタミンＨ２受容体を遮断する化合物、プロトンポンプ阻害剤、およびその組合せから成る群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記制酸薬が、炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、炭酸アルミニウムゲル、およびその組合せから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヒスタミンＨ２受容体を遮断する前記化合物が、シメチジン、ファモチジン、ニザチジン、ラニチジン、およびその組合せから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロトンポンプ阻害剤が、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラゾール、アベプラゾール（ａｂｅｐｒａｚｏｌｅ）、およびその組合せから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプシン特異的阻害剤化合物が、ペプスタチンＡ、ペプシノストレプチン、およびその組合せから成る群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
腸トリプシンのタンパク質分解活性を阻害する前記薬剤が存在する場合に、前記薬剤が、アプロチニン、α２抗プラスミン、抗トロンビンＩＩＩ、α１アンチトリプシン、アンチパイン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、ｐ−アミノベンズアミジン二塩酸塩、デリン、ベンズアミジン塩酸塩、ジイソプロピルフルオロリン酸、３，４−ジクロロイソクマリン、エコチン、メシル酸ガベキサート、ロイペプチン、α２マクログロブリン、フェニルメチルスルホニルフルオリド、Ｎ−α−ｐ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン、トリプシン−キモトリプシン阻害剤、およびその組合せから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する前記薬剤が、十二指腸において前記製剤から放出されて、前記骨誘導性ＢＭＰまたは機能的に同等の骨誘導タンパク質が腸から血流中に吸収されるのに十分な時間、腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記吸収促進剤が存在する場合に、前記吸収促進剤が、コレステロール誘導体である陰イオン性薬剤、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、およびその組合せから成る群から選択される界面活性剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
コレステロール誘導体である前記陰イオン性薬剤が胆汁酸である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記胆汁酸が、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、フシジン酸、グリコール酸、デヒドロコール酸、リトコール酸、ウルソコール酸、ウルソデオキシコール酸、およびその組合せから成る群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記陽イオン界面活性剤が、アシルカルニチン、アシルコリン、ラウロイルコリン、塩化セチルピリジニウム、陽イオン性リン脂質、およびその組合せから成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンエーテル、ｐ−ｔ−オクチルフェノールポロキシエチレン、ノニルフェノキシポロキシエチレン、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、およびその組合せから成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記製剤が、口を介して、注射により腸を介して、または直腸的に前記個体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
骨誘導性骨形成タンパク質（ＢＭＰ）と、
腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤と、
所望により、胃ペプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤と、
所望により、腸トリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤と、
所望により、吸収促進剤と
を含む、個体に対する骨誘導性ＢＭＰの経口デリバリーのための製剤。
【請求項２４】
前記骨誘導性ＢＭＰが、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびその組合せから成る群から選択される、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
前記骨誘導性ＢＭＰが、精製された天然タンパク質または精製された組換えタンパク質である、請求項２４に記載の製剤。
【請求項２６】
腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する前記薬剤が、ｐＨ低下剤、キモトリプシン特異的阻害剤、およびその組合せから成る群から選択される、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２７】
前記ｐＨ低下剤が、酢酸、コハク酸、乳酸、クエン酸、イソクエン酸、アスコルビン酸、オキザロ酢酸、シュウ酸、リンゴ酸、フマル酸、２−ケトグルタル酸、グルタル酸、ピルビン酸、グリセリン酸、およびその組合せから成る群から選択される緩衝剤である、請求項２６に記載の製剤。
【請求項２８】
前記キモトリプシン特異的阻害剤が、キモスタチン、Ｚ−Ｌ−ｐｈｅクロロメチルケトン、α２抗プラスミン、アプロチニン、６−アミノヘキサン酸、α１アンチトリプシン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、ブロモエノールラクトン、ジイソプロピルフルオロリン酸、エコトイン、Ｎ−アセチル−エグリンＣ、メシル酸ガベキサート、ロイペプチントリフルオロ酢酸、Ｎ−ｐ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン、ダイズトリプシン−キモトリプシン阻害剤、およびその組合せから成る群から選択される、請求項２６に記載の製剤。
【請求項２９】
腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する前記薬剤が、コムギ、コメ、オートムギ、ダイズ、およびその組合せから調製される、請求項２３に記載の製剤。
【請求項３０】
胃ペプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する前記薬剤が存在する場合に、前記薬剤が、腸溶コーティング、胃ｐＨ調節剤、ペプシン特異的阻害剤化合物、およびその組合せから成る群から選択される、請求項２３に記載の製剤。
【請求項３１】
前記腸溶コーティングが、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、酢酸トリメリト酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、メタクリル酸コポリマー、アクリル酸エチルコポリマー、およびその組合せから成る群から選択される化合物を含む、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３２】
前記胃ｐＨ調節剤が、制酸薬、ヒスタミンＨ２受容体を遮断する化合物、プロトンポンプ阻害剤、およびその組合せから成る群から選択される、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３３】
前記制酸薬が、炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、炭酸アルミニウムゲル、およびその組合せから成る群から選択される、請求項３２に記載の製剤。
【請求項３４】
ヒスタミンＨ２受容体を遮断する前記化合物が、シメチジン、ファモチジン、ニザチジン、ラニチジン、およびその組合せから成る群から選択される、請求項３２に記載の製剤。
【請求項３５】
前記プロトンポンプ阻害剤が、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラゾール、アベプラゾール、およびその組合せから成る群から選択される、請求項３２に記載の製剤。
【請求項３６】
前記ペプシン特異的阻害剤化合物が、ペプスタチンＡ、ペプシノストレプチン、フェニルメチルスルホニルフルオリド、およびその組合せから成る群から選択される、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３７】
前記腸トリプシン特異的阻害剤化合物が存在する場合に、前記化合物が、アプロチニン、α２抗プラスミン、抗トロンビンＩＩＩ、α１アンチトリプシン、アンチパイン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、ｐ−アミノベンズアミジン二塩酸塩、デリン、ベンズアミジン塩酸塩、ジイソプロピルフルオロリン酸、３，４−ジクロロイソクマリン、エコチン、メシル酸ガベキサート、ロイペプチン、α２マクログロブリン、フェニルメチルスルホニルフルオリド、Ｎ−α−ｐ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン、トリプシン−キモトリプシン阻害剤、およびその組合せから成る群から選択される、請求項２３に記載の製剤。
【請求項３８】
前記吸収促進剤が、コレステロール誘導体である陰イオン性薬剤、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、およびその組合せから成る群から選択される界面活性剤である、請求項２３に記載の製剤。
【請求項３９】
コレステロール誘導体である前記陰イオン性薬剤が胆汁酸である、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４０】
前記胆汁酸が、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、フシジン酸、グリコール酸、デヒドロコール酸、リトコール酸、ウルソコール酸、ウルソデオキシコール酸、およびその組合せから成る群から選択される、請求項３９に記載の製剤。
【請求項４１】
前記陽イオン界面活性剤が、アシルカルニチン、アシルコリン、ラウロイルコリン、塩化セチルピリジニウム、陽イオン性リン脂質、およびその組合せから成る群から選択される、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４２】
前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンエーテル、ｐ−ｔ−オクチルフェノールポロキシエチレン、ノニルフェノキシポロキシエチレン、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、およびその組合せから成る群から選択される、請求項３８に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年４月２９日に出願した米国仮出願第６０／５６６２４２号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に治療用タンパク質の経口投与用製剤の分野に属する。詳細には、本発明は、骨粗鬆症および他の代謝性骨疾患のような代謝性疾患の処置に使用するための、骨形成タンパク質を含む製剤を提供する。
【背景技術】
【０００３】
骨粗鬆症は、低い骨量および骨組織の悪化の結果として骨脆弱性および骨折に対する感受性の増加が生じることを特徴とする全身骨格疾患である。骨粗鬆症は、米国で最もよくみられる種類の代謝性骨疾患であり、骨粗鬆症の状態は、米国で２５００万人超を冒している。本疾患は、脊椎骨折５０００００件、股関節骨折２５００００件、および手首骨折２４００００件を含めた毎年１３０万件を超える骨折を引き起こす。股関節骨折は骨粗鬆症の最も重篤な結果であり、５％〜２０％の患者が１年以内に死亡し、生存者の５０％超が無能力になる。
【０００４】
骨粗鬆症は、文字通り「多孔性の骨」を意味する。骨格における健康な骨は、厚い外側の棚と、コラーゲン（タンパク質）、カルシウム塩および他の無機質で満たされた強固な内部の網目とを有する。健康な骨の内部は、蜂巣状または網状の骨の外見を有し、血管および骨髄が骨の網状構造の小孔を満たしている。古い骨は、破骨細胞と呼ばれる細胞によって普通は分解（すなわち吸収）され、骨芽細胞と呼ばれる骨構築細胞に交代する。この更新過程は骨代謝回転と名付けられている。骨粗鬆症は、骨吸収が優勢なことにより内部蜂巣状または網状構造の小孔が大きくなるが、網状構造に新しい骨が同時に復元しない場合、すなわち骨がより多孔性になり、骨が脆弱になって容易に骨折しやすくなる場合に生じる。骨粗鬆症は、骨格全体を普通は冒すが、手首、脊椎、および股関節の骨に破断（骨折）を引き起こすことが最も一般的である。高齢者は、骨粗鬆症になるリスクが最も大きい。したがって、この問題は、人口の高齢化に伴い顕著に増加すると予測されている。世界の骨折の発生率は、今後６０年間で３倍に増加すると予測されている。広く発生している骨粗鬆症以外に、個体での骨成長の喪失を同じく特徴とする骨減少症およびパジェット病のようないくつかの他の代謝性骨疾患が公知である。
【０００５】
骨粗鬆症にはいくつかの原因がある。ホルモン欠乏（女性の場合はエストロゲン、男性の場合はアンドロゲン）は主原因である。女性は男性よりも骨粗鬆症のリスクが大きいことは周知である。女性は、閉経以後５年間に骨喪失の急激な加速を経験する。骨粗鬆症のリスクを増加させる他の要因には、喫煙、アルコール乱用、座りがちなライフスタイル、および低いカルシウム摂取がある。
【０００６】
閉経後骨粗鬆症の処置に現在採用されている最もよくみられる治療法は、ホルモン補充療法（ＨＲＴ）、ビスホスホネート、およびカルシトニンである。これらの三つの処置は骨吸収抑制剤として働く。十分なカルシウム摂取、ビタミンＤ補給、および体重負荷運動を含めた、これらの治療法に対する他の補助手段を推奨することができる。
【０００７】
エストロゲンは骨折を低減することが知られており、骨吸収抑制剤の一例である。さらに、Ｂｌａｃｋら（ＥＰ０６０５１９３Ａ１）は、特に経口服用した場合に、エストロゲンが低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）の血漿中濃度を低下させ、有益な高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の濃度を上昇させ、直腸結腸癌を予防することを報告している。しかし、エストロゲンは、確立した骨粗しょう性骨格において骨を若年成人レベルに回復させることに失敗した。さらに、長期エストロゲン療法は、乳癌、脳卒中、および心臓血管梗塞のリスクの増加を含めた様々な障害に最近関係付けられており、多くの女性がこの処置を避ける原因になっている。エストロゲン補充療法に関連する重大な望ましくない作用は、望ましくない副作用も健康リスクも伴わない、骨粗鬆症のための代替療法を開発する必要性を支えている。
【０００８】
ビスホスホネートは、破骨細胞の骨吸収活性を「スイッチオフ」して、骨芽細胞を新しい骨の生成に、より効率的に働かせることによって作用する、骨粗鬆症の非ホルモン処置の一形態を提供する。アレンドロン酸ナトリウム（例えば、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ニュージャージー州）、エチドロン酸二ナトリウムおよび炭酸カルシウム（例えば、ＤＩＤＲＯＮＥＬ  ＰＭＯ（登録商標）、Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ  Ｃｏ．、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、オハイオ州）、ならびにリセドロン酸ナトリウム（例えば、ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）、Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ニュージャージー州）を含めた、市場で入手できるビスホスホネート化合物がいくつかある。当該化合物は有益な作用をもたらすことができる。例えば、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）ブランドのビスホスホネートで処置された閉経後女性では、脊椎骨折のリスクが５０％近く低減することが研究から示されている（例えば、Ｂｏｎｅら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３５０：  １１８９〜１１９９（２００４）参照）。
【０００９】
カルシウムおよびビタミンＤの補助食品は、高齢者の骨喪失を低減する有効な処置剤である。大多数の者は食事から十分なカルシウムを得ることができるが、これを困難と考える者にとって、栄養補助食品が代替物となる。カルシウム単独は、骨粗鬆症に対する処置として限られた効果しか有さないが、ビタミンＤと併用すると、カルシウムは、自然の太陽光を浴びることができず、粗悪な食事を摂っているおそれのある高齢の外出できない個体に特に有用である。
【００１０】
カルシトリオールは、脊椎に骨粗鬆症を有する閉経後女性に与えられる活性型ビタミンＤである。ビタミンＤなしにカルシウムを吸収することはできないため、カルシトリオールは腸からのカルシウム吸収を改善する。
【００１１】
カルシトニンは、骨を分解する破骨細胞が正しく働くことを抑制することによって、骨構築性骨芽細胞の作用を改善する、甲状腺によって作られるホルモンである。この薬物は、骨喪失速度を下げることによって作用し、骨痛を軽減する。しかし、カルシトニンの欠点は、毎日注射しなければならないこと、吐き気を催すおそれがあること、およびエストロゲン補充療法に比べて高価なことである。
【００１２】
テストステロンは、この男性ホルモンを欠乏した男性のための処置剤であるが、正常なテストステロン濃度を有する骨粗鬆症の男性の骨密度を増加することもできる。テストステロンは注射剤または植込剤として入手できる。
【００１３】
タンパク質同化ステロイドは、骨量および筋量を増加できることから、虚弱な超高齢者および脊椎骨折を有する者にも有用なことがある。副作用があることから、注射が注意深く監視される。
【００１４】
選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）は、骨粗鬆症および心疾患のリスクを低減するが、乳癌または子宮内膜癌のリスクを増加させない合成ホルモン補充分子である。一形態であるラロキシフェンは、閉経後女性における骨粗鬆症の予防および処置に承認されている。
【００１５】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、利用できる唯一のタンパク質同化薬として、閉経後骨粗鬆症を有する女性の処置に承認された。副甲状腺ホルモンを毎日少量注射すると、新しい骨の形成が増加し、骨密度が増加し、骨折の可能性が減少し得る。
【００１６】
特別なサブクラスの形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリータンパク質である骨形成タンパク質（ＢＭＰ、モルフォゲンとも呼ばれる）が、骨および軟骨の形成だけでなく軟部組織の再生（例えば、腎臓、心臓、眼）にも果たす役割を理解するために、および当該理解を臨床的に有効な治療法に発展させるために、これらのタンパク質は３０年以上研究されてきた（例えば、Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５７：  ２９４〜３０８（２００１）；Ｒｅｄｄｉ、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．、８３−Ａ（追補１）：  Ｓ１〜Ｓ６（２００１）米国特許第４９６８５９０号；第５０１１６９１号；第５６７４８４４号；第６３３３３１２号参照）。骨折偽関節の修復を促進するために骨折部に外科的に植込んだ骨形成装置での組換えヒトＢＭＰ−７の使用が報告されている（Ｆｒｉｅｄｌａｅｎｄｅｒら、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．  Ａｍ．  ８３−Ａ：  Ｓ１５１〜Ｓ１５８（２００１））。
【００１７】
数十年の間、ＢＭＰの分野の教示は、ＢＭＰが、大部分のタンパク質とは異なり酸に安定で、プロテアーゼに安定で、したがって、哺乳動物の消化系に存在する消化酵素および酸に分解されない経口投与治療薬としての使用に十分に適するというものであった（例えば、米国特許第４９６８５９０号；第５６７４８４４号；第６３３３３１２号参照）。なお、代謝性骨疾患を処置する方法を含めた、様々な治療的処置のためのＢＭＰの使用を記載している米国特許の発行（例えば、米国特許第５６７４８４４号；第６３３３３１２号）にかかわらず、代謝性疾患を処置するためのＢＭＰ経口製剤を含む臨床治療方式は、実際には全く開発または承認されていないようである。これは、ＢＭＰが特異的消化管酵素による分解に実際は非常に感受性が高いことが原因のおそれがあり、これは、本明細書において最初に実験的に実証された事実である。
【００１８】
骨粗鬆症の処置に進歩がなければ、疾患、骨折、および費用の見積もりは全て増加すると予想される。それは、米国では年齢５０歳超の人口が将来にかけて数十年間増加し続けるからである。
【００１９】
明らかに、骨粗鬆症と、さらに言えば個体における骨喪失を特徴とする他の代謝性骨疾患とのための有効な治療に関して必要性が残ったままである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本明細書に記載した本発明は、個体に骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を有効に経口投与するための方法および組成物を提供することによって、骨粗鬆症および他の代謝性骨疾患を治療するための上記問題を解決する。本発明は、当技術分野における歴史的な許容された教示とは逆に、ＢＭＰ分子がヒトおよび他の哺乳動物の消化系に存在する特異的プロテアーゼによるプロテアーゼ分解に感受性であるという発見に基づく。具体的には、ＢＭＰ−６のようなＢＭＰ分子が、プロテアーゼであるペプシンによって哺乳動物の胃で、およびプロテアーゼであるキモトリプシンによって腸で容易に分解されることが今回見出された。本発明の経口（または「経腸」）投与できる製剤は、個体の胃腸管に沿って投与できる組成物を包含する。したがって、個体の口を経由して投与できる、ＢＭＰを含む本発明の製剤は、胃内での胃ペプシンによる、および腸管での腸キモトリプシンにもよるＢＭＰの分解を抑制しなければならない。当該製剤は、胃ペプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤と、腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤も含む。例えば注射または坐剤により腸に直接投与される製剤は、腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤を含有するが、胃が回避されていることから、胃ペプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤の存在は必要なく、すなわち所望による。本明細書に記載した経口投与できる製剤は、個体の血流中に有効量のＢＭＰが吸収されて、骨塩密度を含めた骨成長を顕著に回復および／または増強させる。骨塩密度は、骨粗鬆症および様々な他の代謝性骨疾患を効果的に処置するのに決定的な、骨成長のパラメータである。本明細書に記載した経口製剤は、代謝性骨疾患以外の疾患または障害を処置するために個体にＢＭＰを経口投与するときにも用途を見出すことができることも認識されている。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、個体における骨量喪失を特徴とする代謝性骨疾患を処置する方法を提供し、その方法は、
骨誘導性骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または機能的に同等の骨誘導タンパク質と、
腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤と、
所望により、胃ペプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤と
を含む製剤をその個体に経口（経腸）投与することを含む。
【００２２】
本明細書に記載した方法および製剤に有用な骨誘導性ＢＭＰには、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびその組合せがあるが、それに限定されるわけではない。
【００２３】
腸キモトリプシンのタンパク質分解活を抑制または阻害するための、本明細書に記載した製剤および方法に有用な薬剤には、ｐＨ低下剤、キモトリプシン特異的阻害剤、およびその組合せがあるが、それに限定されるわけではない。
【００２４】
ｐＨ低下剤は、腸内のｐＨを、または腸管に移行するか、もしくは腸管に投与されたＢＭＰ周囲の少なくとも微小環境のｐＨを効率的に、好ましくはｐＨ５未満に低下させるであろう任意の緩衝薬剤であり得る。
【００２５】
腸キモトリプシンのタンパク質分解活性が本発明によるＢＭＰを分解するのを阻害する薬剤には、キモスタチン、Ｚ−Ｌ−ｐｈｅクロロメチルケトン、α２抗プラスミン、アプロチニン（ウシ膵臓トリプシン阻害剤またはＢＰＴＩとも呼ばれる）、６−アミノヘキサン酸、α１アンチトリプシン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、ブロモエノールラクトン、ジイソプロピルフルオロリン酸、エコトイン（ｅｃｏｔｏｉｎ）、Ｎ−アセチル−エグリンＣ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｅｇｌｉｎ  Ｃ）、メシル酸ガベキサート、ロイペプチントリフルオロ酢酸塩、Ｎ−ｐ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン、ダイズトリプシン−キモトリプシン阻害剤などがあるが、それに限定されるわけではない。
【００２６】
胃ペプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害するための、本明細書に記載した製剤および方法に有用な薬剤には、ペプシン阻害剤、腸溶コーティング、胃ｐＨ調節剤、およびその組合せがあるが、それに限定されるわけではない。
【００２７】
ペプシン阻害剤は、ペプシンと結合してそのタンパク質分解活性を阻害する化合物である。本明細書に記載した方法および組成物に有用なペプシン阻害剤には、ペプスタチンＡ、ペプシノストレプチン（ｐｅｐｓｉｎｏｓｔｒｅｐｔｉｎ）、フェニルメチルスルホニルフルオリドなどがあるが、それに限定されるわけではない。
【００２８】
腸溶コーティングは、胃環境の低ｐＨまたは酵素による溶解または分解に対して安定および抵抗性であるが、腸に存在する高ｐＨ（例えば５よりも大きい）で容易に溶解するコーティング、フィルム、または他の固体性防御被包を提供するために製剤された一つまたは複数の化合物で作られている。このように、本発明に有用な腸溶コーティングは、ＢＭＰのようなコーティングされた治療用化合物が、胃内で胃酵素および酸により分解および／または変性するのを効果的に保護するが、ｐＨがかなり（例えばｐＨ６付近またはそれを超える）アルカリ側の腸に移行すると、血流中に吸収されるために治療用化合物を溶解および放出するであろう。
【００２９】
本発明に有用な胃ｐＨ調節剤は、有効量のＢＭＰまたは機能的に同等の骨誘導タンパク質が、胃ペプシンによる重大な分解を受けずにさらに高い腸のｐＨ環境に移行するのに十分な時間、胃内のｐＨを、またはＢＭＰもしくは機能的に同等の骨誘導タンパク質を含む、胃内に存在する製剤周囲の少なくとも微小環境のｐＨを、典型的なｐＨ３を超えて上昇させる。本発明に有用な胃ｐＨ調節剤には、緩衝薬剤（「制酸薬」）、ヒスタミンＨ２受容体遮断薬（「Ｈ２ブロッカー」）、およびプロトンポンプ阻害剤があり得るが、それに限定されるわけではない。
【００３０】
別の実施形態では、本発明に記載した方法および経口投与できる製剤は、十二指腸および可能性があることには腸管の他の部分においてＢＭＰのタンパク質分解の制限を仲介できるトリプシン阻害剤をさらに含む。トリプシンは十二指腸で活性なことから、上記の薬剤に類似した、十二指腸キモトリプシンを阻害するための薬剤、すなわち一つまたは複数のｐＨ低下剤（緩衝剤）および／またはトリプシン阻害剤も当該製剤に採用できる。
【００３１】
別の実施形態では、本発明の方法および経口投与できる製剤は、腸壁を介した血流中への骨誘導性ＢＭＰ（または機能的に同等の骨誘導タンパク質）の吸収を増強する一つまたは複数の薬剤をさらに含む。吸収促進剤は、様々な界面活性剤のうち任意のものまたは界面活性剤の組合せであり得る。本発明に有用な好ましい吸収促進剤には、コレステロール誘導体である陰イオン性薬剤、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、およびその組合せがあるが、それに限定されるわけではない。
【００３２】
骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、パジェット病、薬物誘発性（例えば、ステロイド誘発性）骨減少症、薬物誘発性骨軟化症、栄養性くる病、胃腸障害に関連する代謝性骨疾患、胆道障害に関連する代謝性骨疾患、腫瘍関連骨喪失、低フォスファターゼ血症、および腎性骨ジストロフィーを非限定的に含める、骨成長の喪失を引き起こす様々な代謝性骨疾患を、本明細書に記載した方法および経口製剤を用いて処置することができる。
【００３３】
（図面の簡単な記載）
図１は、実施例１に記載した骨粗鬆症ラットモデルにおいてＢＭＰ−６の静脈内（ｉ．ｖ．）投与を用いた研究結果のグラフである。このグラフは、偽手術動物を除き卵巣切除（ＯＶＸ）前後に１２週間の処置過程にわたりスキャンしたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雌性ラットの後肢に関する選択された骨塩密度（ＢＭＤ）のデータを示す。処置群１（偽手術、ＯＶＸなし、三角）、処置群２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液（ビヒクル）のみ、ｉ．ｖ．、３回／週、四角）、および処置群５（体重１ｋｇあたりＢＭＰ−６  ５０μｇ（μｇ／ｋｇ）で処置されたＯＶＸ、ｉ．ｖ．、３回／週、菱形）。上下方向の矢印は、ＯＶＸの１２か月後（−４８週間目）での処置の開始（０週目）を示す。星印２個は、群５（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、菱形）のデータ点と、群２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液、四角）の対応する点との間の差が統計的に有意であること（Ｐ＜０．００５）を示す。詳細は本文を参照のこと。
【００３４】
図２は、処置の開始から１２週目での実施例１に記載した研究の全処置群における骨粗鬆症ラットモデルの動物の後肢でのＢＭＤ値を示す棒グラフである。群１（偽手術）、群２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液のみ、３回／週）、群３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、３回／週）、群４（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、２５μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、３回／週）、群５（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、５０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、３回／週）、群６（エストラジオールで処置したＯＶＸ、１７５μｇ／週、３回に分けた投薬５０μｇ、５０μｇ、および７５μｇ／ラットとして各動物に投与、皮下、ｓ．ｃ．）、群７（エストラジオール＋ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ；エストラジオール１７５μｇ／週、３回に分けた投薬５０μｇ、５０μｇ、および７５μｇ／ラットとして各動物に投与、ｓ．ｃ．；ＢＭＰ−６  １０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、３回／週）。処置群３、４、５、または７のいずれかと群２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）とのＢＭＤ値の差（Ｐ＜０．００１）は、群３、４、５、または７と処置群６（エストラジオール単独で処置したＯＶＸ）とのＢＭＤ値の差（Ｐ＜０．００４）と同様に有意である。詳細は本文を参照のこと。
【００３５】
図３は、処置の開始から１２週目での実施例１の研究における動物の腰椎に関するＢＭＤ値を示す棒グラフである。処置群３、４、５、または７のいずれかと、群２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）または群６（エストラジオール単独で処置したＯＶＸ）とのＢＭＤ値の差は有意である（Ｐ＜０．００１）。詳細は本文を参照のこと。
【００３６】
図４は、屠殺後の動物の大腿骨遠位部のｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＥＸＡ分析によりＢＭＤ値を決定した、実施例１における研究結果の棒グラフである。処置群１（偽手術）、３、４、５、６、または７と群２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）とのＢＭＤ値の差は、統計的に有意であった（Ｐ＜０．００１）。処置群３、４、５、および７のＢＭＤ値は、群６（エストラジオール単独で処置したＯＶＸ）とのＢＭＤ値よりもずっと高い。詳細は本文を参照のこと。
【００３７】
図５は、実施例１に記載した研究における選ばれた処置群の動物の大腿骨遠位部における骨塩面積（ＢＭＡ）の棒グラフである。皮質ＢＭＡ値は、ＢＭＰ−６処置した群３、５、および７の方が処置群２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）の動物よりも２５％高かった。詳細は本文を参照のこと。
【００３８】
図６は、実施例１に記載したように処置群１（偽手術）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ）、６（エストラジオールで処置したＯＶＸ）、および７（エストラジオール＋ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ）における動物の大腿骨遠位部に関する骨容量／骨梁容量比（ＢＶ／ＴＶ）に関する棒グラフである。詳細は本文を参照のこと。
【００３９】
図７は、実施例１に記載したように処置群１（偽手術）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ）、６（エストラジオール単独で処置したＯＶＸ）、および７（エストラジオール＋ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ）における動物に関する骨梁幅（ｍｍ）に関する棒グラフである。詳細は本文を参照のこと。
【００４０】
図８は、実施例１に記載した研究の処置群１（偽手術）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、および３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の、動物の大腿骨遠位骨幹端部（ＤＦＭ）の骨髄腔における海綿骨の最大荷重（力、ニュートン単位、「Ｎ」）として表現した押込試験に関する棒グラフである。星印は、群３と群２との間の差が統計的に有意（Ｐ＜０．００１）であることを示す。詳細は本文を参照のこと。
【００４１】
図９は、実施例１に記載した研究の処置群１（偽手術）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、および３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の、動物の仕事（Ｗ、ミリジュール単位、「ｍＪ」）として表現した大腿骨骨幹中央部の３点曲げ試験の吸収エネルギーパラメータに関する棒グラフである。詳細は本文を参照のこと。
【００４２】
図１０は、実施例１に記載した研究の処置群１（偽手術）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、および３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の、動物のミリジュール／ｍ３（ｍＪ／ｍ３）として表現した大腿骨骨幹中央部の３点曲げ試験の靭性（導変数）に関する棒グラフである。詳細は本文を参照のこと。
【００４３】
図１１は、実施例１に記載した研究の処置群１（偽手術）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）、および６（エストラジオール単独で処置したＯＶＸ）の動物の大腿骨遠位部の組織形態分析に基づく骨梁骨容量に対する骨容量の比（ＢＶ／ＴＶ）の棒グラフである。詳細は本文を参照のこと。
【００４４】
図１２は、実施例１に記載した研究の処置群１（偽手術）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）、および６（エストラジオール単独で処置したＯＶＸ）の動物の大腿骨遠位部の石灰化速度（「ＭＡＲ」、μｍ／ｄａｙ）を測定する動的組織形態分析に基づくＢＶ／ＴＶ値の棒グラフである。星印は、ＢＭＰ処置動物（群３）およびエストラジオール＋ＢＭＰ−６で処置した動物（群６）が卵巣切除対照動物（群２）に比べて統計的に有意（Ｐ＜０．００１）であることを示す。詳細は本文を参照のこと。
【００４５】
図１３は、処置群１（偽手術、ＯＶＸなし）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、３回／週）、４（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、１回／週）、５（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、３回／週）に関して実施例２に記載したような高齢（２歳１か月齢）、卵巣切除（ＯＶＸ）ラットの後肢に関するＢＭＤ値の棒グラフである。詳細は本文を参照のこと。
【００４６】
図１４は、処置群１（偽手術、三角）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独、四角）、および５（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、３回／週、菱形）に関して実施例２に記載した研究における処置時間（週）の関数としての動物後肢ＢＭＤ値のグラフである。矢印は処置の開始（０週目）を示す。詳細は本文を参照のこと。
【００４７】
図１５は、実施例３に記載したように、年齢および経路（すなわち経口）の関数としての、経口投与したＢＭＰ−６に対するラットに吸収されたＢＭＰ−６の率のグラフを示す。動物は、口により経口で（群１では３日齢、群２では１５日齢）、または注射器により十二指腸に（群３では４５日齢、群４では７５日齢）、９９ｍテクネチウム標識ＢＭＰ−６の投与を受けた。詳細は本文を参照のこと。
【００４８】
図１６は、実施例３に記載した動物１（酢酸緩衝液中のＢＭＰ−６、ｐＨ３）、動物２（ＢＭＰ−６、酢酸緩衝液、ｐＨ３、タウロデオキシコール酸ナトリウム（１ｍｇ）、およびＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリド（１ｍｇ））、および動物３（ＢＭＰ−６、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７、タウロデオキシコール酸ナトリウム（１ｍｇ）、およびＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリド（１ｍｇ））に吸収された、十二指腸投与したＢＭＰ−６の率の棒グラフである。詳細は本文を参照のこと。
【００４９】
図１７は、実施例５に記載した処置群１（ＢＭＰ−６、ｉ．ｄ．、酢酸緩衝液、ｐＨ４）、２（ＢＭＰ−６、ｉ．ｄ．、酢酸緩衝液、ｐＨ３、タウロデオキシコール酸１ｍｇ、ＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリド１ｍｇ）、３（ＢＭＰ−６、ｉ．ｄ．、酢酸緩衝液、ｐＨ３、タウロデオキシコール酸１ｍｇ、ＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリド１ｍｇ、ジヘプタノイルホスファチジルコリン１．５ｍｇ）、４（ＢＭＰ−６、ｉ．ｄ．、酢酸緩衝液、ｐＨ３、ジヘプタノイルホスファチジルコリン１．５ｍｇ）、および５（ＢＭＰ−６、ｉ．ｖ．、酢酸緩衝液、ｐＨ４）における動物に関する静脈内用量に対する率として表現した、十二指腸内（ｉ．ｄ．）投与したＢＭＰ−６の吸収を示す棒グラフである。詳細は本文を参照のこと。
【００５０】
図１８Ａおよび１８Ｂは、実施例６に記載した、非緩衝性インキュベーション培地１（図１８Ａ）または緩衝性（ｐＨ７．４）インキュベーション培地２（図１８Ｂ）中で０および９０分間インキュベートした、反転腸管系における粘膜（Ｍ、外側）から漿膜（Ｓ、内側）表面への９９ｍＴｃ標識ＢＭＰ−６の輸送研究の（１分間あたり１００万カウント単位の）結果の棒グラフを示す。詳細は本文を参照のこと。
【００５１】
図１９は、以下の様々な反応からの消化生成物をジチオトレイトールで還元して、ＢＭＰ−６モノマーを放出させ、電気泳動し、クマシーブルーで染色したものを示すポリアクリルアミドゲルである：実施例７に記載したように、ペプシン０、１０、５、および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（それぞれレーン１〜４）、ペプシン５および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（それぞれレーン６および７）、ならびにペプシン５および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＳＡ（それぞれレーン８および９）。レーン５は分子量マーカーを含む。ゲルにおけるＢＳＡ、ペプシン、およびＢＭＰ−６モノマーの相対位置を左右方向の矢印で示す。詳細は本文を参照のこと。
【００５２】
図２０は、以下の様々な反応からの消化生成物をジチオトレイトールで還元してＢＭＰ−６モノマーを放出させ、電気泳動し、クマシーブルーで染色したものを示すポリアクリルアミドゲルである：実施例７に記載したように、トリプシン０、１、および０．２μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（それぞれレーン１、２、３）、キモトリプシン０．５および０．２μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（レーン５および６）、トリプシン０．２μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６およびＢＳＡ（レーン７）、キモトリプシン０．２μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６およびＢＳＡ（レーン８）、トリプシン０．２μＬの存在下でインキュベートしたＢＳＡ（レーン９）、ならびにキモトリプシン０．２μＬの存在下でインキュベートしたＢＳＡ（レーン１０）。レーン４は分子量マーカーを含む。ゲルにおけるＢＳＡおよびＢＭＰ−６モノマーの相対位置を左右方向の矢印で示す。詳細は本文を参照のこと。
【００５３】
図２１は、実施例７に記載した様々な反応からの消化生成物を電気泳動し、免疫検出（染色）したものを示すポリアクリルアミドゲルのウェスタン免疫ブロットである。ジチオトレイトールを反応混合物に添加してから電気泳動してＢＭＰ−６モノマーを検出するか、または添加を控えて（ＤＴＴなし）ＢＭＰ−６ダイマーを検出した。動物１由来の胃液１０、１、および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（それぞれレーン２、３、４（ＤＴＴなし））、動物２由来の胃液１０、１、および１μｌの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（それぞれレーン５、６、７（ＤＴＴなし））、熱不活性化胃液１０、１、および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（それぞれレーン８、９、および１０（ＤＴＴなし））。分子量マーカーをレーン１およびレーン１０でも泳動させた。詳細は本文を参照のこと。胃液中のペプシン、ＢＭＰ−６ダイマー、部分消化された「損傷ＢＭＰ−６ダイマー」、およびＢＭＰ−６モノマーの相対位置を左右方向の矢印で示す。詳細は本文を参照のこと。
【００５４】
図２２は、実施例７に記載した様々な反応からの消化生成物を電気泳動して免疫検出（染色）したものを示す、ポリアクリルアミドゲルのウェスタン免疫ブロットである。ジチオトレイトールを反応混合物に添加してから電気泳動してＢＭＰ−６モノマーを検出するか、または添加を控えて（ＤＴＴなし）ＢＭＰ−６ダイマーを検出した。動物１（それぞれレーン１、２、３（ＤＴＴなし））由来および動物２（それぞれレーン４、５、および６（ＤＴＴなし））の胃液１０、１、および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６、ペプシン阻害剤であるペプシノストレプチンと胃液１０、１、および１μＬとの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（それぞれレーン７、８、および９（ＤＴＴなし））、ならびに熱不活性化胃液１０、１、および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（それぞれレーン１１、１２、および１３（ＤＴＴなし））。ＢＭＰ−６モノマーをレーン１４で泳動させた。ＢＭＰ−６ダイマー（ＤＴＴなし）をレーン１５で泳動させた。分子量マーカーをレーン１０で泳動させた。ＢＭＰ−６ダイマーおよびＢＭＰ−６モノマーの相対位置を水平矢印で示す。詳細は本文を参照のこと。
【００５５】
図２３は、実施例７に記載した様々な反応からの消化生成物を電気泳動して免疫検出（染色）したものを示す、ポリアクリルアミドゲルのウェスタン免疫ブロットである。ジチオトレイトールを反応混合物に添加してから電気泳動してＢＭＰ−６モノマーを検出するか、または添加を控えて（ＤＴＴなし）ＢＭＰ−６ダイマーを検出した。動物１（それぞれレーン１および２）由来および動物２（それぞれレーン３および４）の十二指腸液３および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６、酢酸緩衝液（ｐＨ３）と十二指腸液３、１、および１μＬとの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（それぞれレーン６、７、および８（ＤＴＴなし））、ならびに熱不活性化十二指腸液１μｌの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（レーン９）。ＢＭＰ−６モノマーをレーン１０で泳動させた。ＢＭＰ−６ダイマー（ＤＴＴなし）をレーン１１で泳動させた。分子量マーカーをレーン５で泳動させた。ＢＭＰ−６ダイマー、ＢＭＰ−６モノマー、および「短縮ＢＭＰ−６」の相対位置を左右方向の矢印で示す。詳細は本文を参照のこと。
【００５６】
図２４は、実施例７に記載した様々な反応混合物からの消化生成物を電気泳動して免疫検出（染色）したものを示す、ポリアクリルアミドゲルのウェスタン免疫ブロットである。ジチオトレイトールを反応混合物に添加してから、電気泳動してＢＭＰ−６モノマーを検出する（レーン８、９、１０、および１１）か、または添加を控えて（ＤＴＴなし）ＢＭＰ−６ダイマーを検出した（レーン２、３、４、および５）。十二指腸液１μｌの存在下でＢＭＰ−６をインキュベートし（レーン２および８）、十二指腸液１μＬおよびキモトリプシン阻害剤であるキモスタチン１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（レーン３および９）、十二指腸液１μＬおよびダイズトリプシン阻害剤１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（レーン４および１０）、ならびに十二指腸液１μＬおよびアプロチニン１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（レーン５および１１）。ＢＭＰ−６ダイマー（ＤＴＴなし）をレーン１で泳動させた。ＢＭＰ−６モノマーをレーン７で泳動させた。分子量マーカーをレーン６で泳動させた。ＢＭＰ−６ダイマーおよびＢＭＰ−６モノマーの相対位置を水平方向の矢印で示す。詳細は本文を参照のこと。
【００５７】
図２５は、実施例７に記載した様々な反応混合物からの消化生成物を電気泳動して免疫検出（染色）したものを示す、ポリアクリルアミドゲルのウェスタン免疫ブロットである。ジチオトレイトールを反応混合物に添加してから電気泳動してＢＭＰ−６モノマーを検出する（レーン２、３、４、および５）か、または添加を控えて（ＤＴＴなし）ＢＭＰ−６ダイマーを検出した（レーン６、７、８、および９）。十二指腸液１μＬおよびｐＨ７緩衝液の存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（レーン３および７）、十二指腸液１μＬおよびｐＨ４緩衝液の存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（それぞれレーン４および８）、ならびに十二指腸液１μＬおよびｐＨ５緩衝液の存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６（レーン５および９）。ＢＭＰ−６モノマーをレーン２で泳動させた。ＢＭＰ−６ダイマー（ＤＴＴなし）をレーン６で泳動させた。ＢＭＰ−６モノマーおよびＢＭＰ−６ダイマーの相対位置を左右方向の矢印で示す。詳細は本文を参照のこと。
【００５８】
図２６は、実施例８に記載した骨粗鬆症ラットモデルにおけるＢＭＰ−６の経腸投与を用いた研究の結果のグラフである。このグラフは、偽手術動物を除き、卵巣切除（ＯＶＸ）の前後にスキャンした、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雌性ラットの後肢に関する選択された骨塩密度（ＢＭＤ）データを示す。処置群１（偽手術、ＯＶＸなし、ｎ＝１５、黒菱形）、処置群２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独ｐＨ３．５、十二指腸内、ｉ．ｄ．、ｎ＝１０、小四角）、処置群３（５００μｇ／ｋｇ  ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、キモトリプシン２０μｇ、アプロチニン２０μｇ、ｐＨ７．０、ｉ．ｄ．、週１回、ｎ＝１４、三角）、処置群４（５００μｇ／ｋｇ  ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、キモトリプシン２０μｇ、アプロチニン２０μｇ、ｐＨ３．５、ｉ．ｄ．、週１回、ｎ＝１４、大四角）、および処置群５（３００μｇ／ｋｇ  ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、キモトリプシン５０μｇ、アプロチニン５０μｇ、ペプスタチン５０μｇ、ｐＨ３．５、胃管を用いた経口デリバリー、週３回、ｎ＝１４、白菱形）。上下方向の矢印は、ＯＶＸの６か月後に処置を開始したことを示す（時間０）。星印２個は、群３（三角）のデータ点と、群２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液、小四角）の対応する点との間の差が統計的に有意であることを示す（Ｐ＜０．００５）。星印１個は、群４（大四角）のデータ点と対照群２（小四角）の対応するデータ点との間の差が統計的に有意であることを示す（Ｐ＜０．０５）。詳細は本文を参照のこと。
【００５９】
図２７は、図２６（実施例８）関する上記研究の処置群についての３週間処置を受けた後の３週目での、骨粗鬆症のラットモデル動物の後肢におけるＢＭＤ値を示す棒グラフである。処置群１（偽手術）、群２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独ｐＨ３．５、十二指腸内、ｉ．ｄ．）、群３（５００μｇ／ｋｇ体重のＢＭＰ−６、キモトリプシン２０μｇ、アプロチニン２０μｇ、ｐＨ７．０、ｉ．ｄ．、週１回）、および処置群４（５００μｇ／ｋｇ  ＢＭＰ−６、キモトリプシン２０μｇ、アプロチニン２０μｇ、ｐＨ３．５、ｉ．ｄ．、週１回）。星印２個は、処置群３のＢＭＤと、群２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液、四角）のＢＭＤとの間の差が統計的に有意であることを示す（Ｐ＜０．００５）。星印１個は、処置群４または群５のＢＭＤと対照群２のＢＭＤとの間の差が統計的に有意であることを示す（Ｐ＜０．０５）。詳細は本文を参照のこと。
【００６０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、骨粗鬆症および個体における骨成長喪失または骨量喪失を特徴とする他の代謝性骨疾患のための経口投与処置として使用するための、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または機能的に同等の骨誘導タンパク質を含む組成物を提供する。ＢＭＰの当該経口製剤は、胃ペプシンおよび腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害することにより有効量のＢＭＰが胃から腸管内に移行して、最終的に個体の血流中に吸収されることができる一つまたは複数の薬剤を含み得る。
【００６１】
本発明をより明確に理解するために、以下の用語を下記に定義したように使用する。
【００６２】
「骨形成タンパク質」、「ＢＭＰ」、および「モルフォゲン」は同義語であり、特定サブクラスの形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリータンパク質の任意のメンバーを指す（例えば、Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５７：  ２９４〜３０８（２００１）；Ｒｅｄｄｉ、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．、８３−Ａ（追補１）：  Ｓ１〜Ｓ６（２００１）；米国特許第４９６８５９０号；第５０１１６９１号；第５６７４８４４号；第６３３３３１２号参照）。全てのＢＭＰはシグナルペプチド、プロドメイン、およびカルボキシ末端（成熟）ドメインを有する。カルボキシ末端ドメインは、成熟型ＢＭＰモノマーであり、システインノットを形成する７個のシステインを特徴とする高度に保存された領域を含む（Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．、９３：  ８７８〜８８３（１９９６）参照）。
【００６３】
ＢＭＰは、タンパク質精製法（例えば、Ｕｒｉｓｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｓｏｃ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．、１７３：  １９４〜１９９（１９８３）；Ｕｒｉｓｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１：  ３７１〜３７５（１９８４）；Ｓａｍｐａｔｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８４：  ７１０９〜７１１３（１９８７）；米国特許第５４９６５５２号参照）を用いて哺乳動物の骨から本来単離された。しかし、ＢＭＰは、腎臓、肝臓、肺、脳、筋肉、歯、および腸を含めた他の哺乳動物組織および器官からも検出または単離されている。ＢＭＰは、原核または真核細胞培養で発現させるための標準ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法を用いて生産することもできる（例えば、Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７：  ２２２０〜２２２４（１９９０）；Ｗｏｚｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：  １５２８〜１５３４（１９８８）参照）。一部のＢＭＰは、そのうえ局所使用用に商業的に入手でき（例えば、ＢＭＰ−７は、Ｓｔｒｙｋｅｒ−Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、マサチューセッツ州、米国）によって長骨骨折偽関節の処置用に製造販売されており、ＢＭＰ−２はＷｙｅｔｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ニュージャージー州、米国）によって長骨急性骨折用に、およびＭｅｄｔｒｏｎｉｃ，  Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州、米国）によって脊椎固定用にも製造販売されている。
【００６４】
ＢＭＰは、疎水性相互作用および少なくとも一つの鎖間（モノマー間）ジスルフィド結合によって繋がった同一のモノマーポリペプチドのダイマー（ホモダイマー）として普通は存在する。しかし、ＢＭＰはヘテロダイマーを形成することもでき、そのヘテロダイマーは、異なるプロセシング度（長さ）のモノマー（例えば完全長のプロセシングされていないモノマーがプロセシングされた成熟モノマーと会合したもの）または異なるＢＭＰからのモノマー（例えば、ＢＭＰ−６モノマーがＢＭＰ−７モノマーと会合したもの）を組み合わせることによる。プロセシングされていないモノマーのＢＭＰダイマーまたはプロセシングされたＢＭＰモノマー１個とプロセシングされていないＢＭＰモノマー１個とのＢＭＰヘテロダイマーは、水溶液中で概して可溶であるが、二つの完全にプロセシングされた（成熟）モノマーから成るＢＭＰホモダイマーは、低ｐＨの水溶液（例えば、酢酸緩衝液、ｐＨ４．５）中でのみ可溶である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、１１：  ２１５〜２２５（１９９４））。
【００６５】
本発明に有用なＢＭＰは、骨誘導活性、すなわち骨形成を刺激する能力を有するものである。骨誘導（または「骨形成」）活性を、様々な標準アッセイのうち任意のものを用いて検出できる。当該骨誘導アッセイには、異所性骨形成アッセイがあり、そのアッセイでは、コラーゲンおよびＢＭＰを含む担体マトリックスをげっ歯動物の異所性部位に植込み、次に骨形成についてその植込み物を監視する（ＳａｍｐａｔｈおよびＲｅｄｄｉ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７８：  ７５９９〜７６０３（１９８１））。当該アッセイの変形では、マトリックスを異所性部位に植込んで、ＢＭＰをその部位に、例えば静脈内注射によりげっ歯動物に投与できる（下記実施例４および９も参照）。ＢＭＰの骨誘導活性をアッセイする別の方法は、ＢＭＰと共に培養線維芽細胞前駆細胞をインキュベートして、次に軟骨細胞および／または骨芽細胞への分化についてそれらの細胞を監視することである（例えば、Ａｓａｈｉｎａら、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｓ．  ２２２：  ３８〜４７（１９９６）参照）。骨誘導活性を有し、したがって本発明に有用なＢＭＰには、天然起源から精製されたか、組換え生成されたか、または全体もしくは部分的にｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成法により生産されたかのいずれにせよ、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびそのヘテロダイマーがあるが、それに限定されるわけではない。骨誘導活性を有するＢＭＰは、損傷した軟部組織または器官、例えば虚血腎を回復または再生する能力のような、一つまたは複数の他の有益な薬理学的活性も保有することがある（Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１０２：  ２０２〜２１４（１９９８））。
【００６６】
本明細書に記載したＢＭＰを含む組成物および方法は、公知の骨誘導性ＢＭＰ以外のタンパク質が、上記のような標準骨誘導アッセイ（例えば線維芽細胞前駆細胞から軟骨細胞および／または骨芽細胞への分化のアッセイ）によって示される骨誘導活性を有する点で当該タンパク質がＢＭＰに機能的に同等であるという条件で、そのタンパク質を代替的に含み得ることも了解されている。本発明のために、当該代替骨誘導タンパク質は胃腸での分解に対して等しい感受性を表すであろうから、本発明による経口製剤を作成するときに保護剤の存在から利益を得るであろうと推定される。しかし、当該骨誘導タンパク質がそのような酵素分解に対してＢＭＰほど感受性をもたない程度まで酵素中和剤を減少させるか、または除去して、有効な経口製剤を作成するのが可能なことがある。機能的に同等のタンパク質には、種々なＢＭＰホモログ、すなわち公知の骨誘導性ＢＭＰに相同なアミノ酸配列を有するタンパク質と、ペプシンおよびキモトリプシンによる分解に感受性のタンパク質とが含まれ得る。当該ＢＭＰ相同体は、天然であるか、組換え生成されたか、または全体もしくは部分的に合成生産されたものであり得る（例えば、米国特許第５６７４８４４号；第６３３３３１２号参照）。
【００６７】
別に述べない限り、用語「障害」および「疾患」は同義語であり、原因または原因因子にかかわらず、任意の病理学的状態を指す。
【００６８】
「薬物」は、薬理活性を有する任意の化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、有機分子）または組成物を指す。このように、「治療薬」は、疾患の一つまたは複数の症状を改善することを含めて、疾患を処置するために個体に投与して所望の薬理活性を提供できる化合物または組成物である。「予防薬」は、個体に投与して個体における疾患の発現を予防または防御できる化合物または組成物である。薬物は予防的使用も治療的使用も有することがある。例えば、本発明による組成物を経口投与して、個体の骨粗鬆症または他の代謝性骨疾患を処置することは、健康な骨成長を促進し、それは順番に骨折、骨格変形、ならびに進行段階の骨粗鬆症および他の代謝骨疾患に関連する他の合併症に対して高まった感受性を発現することからその個体を防御する。したがって、別に示さない限り、本発明による疾患の「処置」（または「処置すること」）は、個体に本明細書に記載した製剤を経腸投与して、その個体に治療および／または予防有益性を提供することを含む。
【００６９】
用語「組成物」、「処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」、「製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」などは同義語であり、一つまたは複数の化合物から成り得る組成物を指す。骨粗鬆症または他の代謝性骨疾患を処置するための、本明細書に記載したＢＭＰを含む経口製剤は、胃ペプシンおよび／または十二指腸キモトリプシンによるＢＭＰのタンパク質分解を抑制または阻害するために特異的に製剤される。
【００７０】
「代謝性骨疾患（または障害）」は、直接的には身体外傷の結果ではない、骨成長の任意の病理を指す。代謝性骨疾患には、骨粗鬆症、骨減少症、パジェット病（変形性骨炎）、および骨軟化症があるが、それに限定されるわけではない。本発明により処置されうる他の骨障害には、薬物誘導性（例えばステロイド誘導性）骨減少症、栄養性くる病、胃腸障害に関連する代謝性骨疾患、胆道障害に関連する代謝性骨疾患、腫瘍関連骨喪失、低フォスファターゼ血症、薬物誘導性骨軟化症、および腎性骨ジストロフィーがあるが、それに限定されるわけではない。
【００７１】
「骨粗鬆症」は、医学および代謝性骨疾患の分野で公知の意味を有する。上述のように、骨粗鬆症は、低い骨量および骨組織の悪化の結果として骨脆弱性および骨折感受性の増加が生じることを特徴とする全身骨格疾患である。骨粗鬆症は、骨吸収が優勢なことにより正常な骨の内部蜂巣状または網状構造の小孔が大きくなるが、網状構造に新しい骨が同時に復元しないことによって、骨が脆弱になり容易に骨折しやすくなる場合に生じる。骨粗鬆症は、普通は骨格全体を冒すが、手首、脊椎、および股関節の骨に破損（骨折）を起こすことが最も多い。
【００７２】
「薬学的に許容できる」により、生物学的、化学的、または他のいかなる方法でも身体化学的性質および代謝に不適合性ではなく、本発明による障害（例えば、骨粗鬆症または他の代謝性疾患）を処置または予防するために個体に投与できる組成物中の骨形成タンパク質または他の任意の構成要素の所望の有効活性に有害な影響も与えない物質を意味する。
【００７３】
本明細書に記載した製剤を、「経口」、「経口投与できる」、「経腸」、「経腸投与できる」、「非経腸」、「非経腸投与できる」などと称して、消化管に沿ったどこかで個体に有効量のＢＭＰをもたらすためにその製剤を投与する経路または様式を示すことができる。当該「経口」または「経腸」投与経路の例は、経口、例えば固体（例えば、丸剤、錠剤、カプセル剤）または液体（例えばシロップ剤）の化合物または組成物を嚥下すること；舌下（舌下での吸収）；経鼻空腸管または経鼻胃管（胃内）；十二指腸内（ｉ．ｄ．）投与（例えば、個別の注射によるか、またはポンプを介する）；および直腸投与（例えば、吸収のために下部消化管に化合物または組成物を投与するための坐剤）があるが、それに限定されるわけではない。本発明において一つまたは複数の経口（経腸）投与経路を採用できる。個体における代謝性骨障害を処置するために特に好ましいＢＭＰの投与経路は、ＢＭＰと、胃ペプシンおよび十二指腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤とを含む、本明細書に記載した製剤を、個体に嚥下させることである。このように、本明細書に記載した特定の種類の「経口」製剤を特定するか、または状況もしくはその特定の成分の記載により別に示さない限り、「経口」製剤は「経腸」製剤と同じであり、消化管に沿った一つまたは複数の部分で個体に投与することができる製剤を広く包含する。
【００７４】
「非経口」および「非経口的に」のような用語は、消化管に沿った以外に、個体に化合物または組成物を投与する経路または様式を指す。非経口投与経路の例には、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、動脈内（ｉ．ａ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、経皮（皮膚または皮層を介した吸収）、鼻腔内または肺内（例えば、呼吸器粘膜または肺を介して吸収するための吸入または噴霧による）、体腔または器官への直接注射または注入、あるいは身体へ化合物または組成物を能動または受動放出させる任意の様々な装置を体内に植込むことによるものがあるが、それに限定されるわけではない。
【００７５】
アミノ酸残基は、正式名称、または当技術分野で公知の対応する標準３文字もしくは１文字略語で呼ぶことができる。
【００７６】
他の用語の意味は、使用の状況から明らかであろうし、別に示さない限り、医学、代謝性骨障害、および薬理学の分野の技術者に了解される意味に一致する。
【００７７】
３０年間を超える研究、何冊もの参考文献、および骨粗鬆症を処置する方法を含めた、様々な治療的処置のためのＢＭＰの潜在的使用を目的とした米国特許の発行（例えば、米国特許第５６７４８４４号；第６３３３３１２号参照）にかかわらず、代謝性骨疾患を処置するための有効な経口製剤も、ＢＭＰの経口投与を含む有効な臨床治療方式も得られていない。本明細書に最終的に示すように、ＢＭＰが哺乳動物の消化系中の消化酵素および酸による分解に抵抗性であり、したがって、経口製剤および経口治療に容易に従う（同上）という、当技術分野において以前に受け入れられていた教示は、明らかに正しくない。特に、経口投与された有効量のＢＭＰが体内に吸収されて有効な治療結果を生み出すために、腸の特異的タンパク質分解活性、特に胃のペプシンおよび十二指腸のキモトリプシンからＢＭＰを防御しなければならない（例えば、下記実施７および８参照）。ＢＭＰの特異的タンパク質分解感受性が解明されたことから、代謝性疾患および損傷した組織を処置するための、これらの化合物の新しく有用な治療用経口製剤に関する基礎が今回提供される。本明細書に特に記載したように、ＢＭＰを含む経口製剤は、骨粗鬆症および他の代謝性骨疾患のような代謝性疾患を治療するために有用である。
【００７８】
胃ペプシンは、胃の酸性（ｐＨ３）環境でタンパク質分解が活性である。キモトリプシンは、十二指腸および腸管で一般にみられるように、それよりも高いｐＨ範囲（例えばｐＨ７）で活性である。下記にさらに詳細に説明したように、本発明の経口製剤は、ＢＭＰ（または機能的に同等の骨誘導タンパク質）と、ＢＭＰ（または機能的に同等の骨誘導タンパク質）に対する胃ペプシンおよび／もしくは腸キモトリプシンの接触を抑制し、かつ／または哺乳動物消化管（腸）におけるこれらの酵素のタンパク質分解活性を阻害することによって、経口投与したＢＭＰ（または機能的に同等の骨誘導タンパク質）の有効量を、胃を通過して、血流中に吸収されるために腸に移行させる一つまたは複数の薬剤とを含む。
【００７９】
胃ペプシンによるＢＭＰの分解を抑制する薬剤
ペプシンは、（胃内のような）ｐＨ３で活性であり、６を超えるｐＨで不可逆的に不活性化される胃酵素である。ペプシンは、感受性タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのアミノ酸配列におけるフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基のカルボキシル側でそのタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを選択的に開裂する。この酵素は、バリン（Ｖａｌ）、アラニン（Ａｌａ）、またはグリシン（Ｇｌｙ）を含む結合を開裂しない。本発明によるＢＭＰの経口投与用組成物は、ＢＭＰが胃内にある間に胃ペプシンにより分解されるのを抑制する一つまたは複数の薬剤を含むことがある。
【００８０】
ＢＭＰの経口投与用の本発明の製剤は、様々な腸溶コーティングのうち任意のものを用いて包むか、または別なように胃酵素および酸から隔離することができる。当該腸溶コーティングは、低ｐＨまたは胃環境の酵素による溶解または分解に安定および抵抗性であるが、腸に存在するような高い（例えば５よりも大きい）ｐＨで容易に溶解するコーティング、フィルム、または他の固体性防御被包を概して提供する。このように、本発明に有用な腸溶コーティングは、胃でペプシンまたは他の任意の胃酵素により分解されることから有効量のＢＭＰを保護して、ｐＨがかなり高い腸内に移行した場合、腸溶コーティングは溶解して血流中に吸収されるためにＢＭＰを放出するであろう。本発明による経口投与用ＢＭＰを調製するのに有用な腸溶コーティングは、胃の酵素および／または酸による分解または変性から、経口送達された治療剤を防御するのに必要な性質を有する、任意の様々な薬学的に許容できる化合物を含むことがある。非限定的に酢酸フタル酸セルロース（「ＣＡＰ」）、酢酸トリメリト酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、メタクリル酸コポリマー、アクリル酸エチルコポリマー、およびその組合せを非限定的に含めた様々な薬学的に許容できる化合物が、当該腸溶コーティングを調製するために公知である。腸溶コーティングした製剤を、薬学的に許容できる溶解可能な様々な種類のシェルにさらに被包することができる。
【００８１】
胃内のｐＨを、または胃内に存在するＢＭＰ周囲の少なくとも微小環境のｐＨを、ＢＭＰが胃を通過して腸管に移行するのに十分な時間、ペプシンによる重大なタンパク質分解活性に関する至適ｐＨを超えたレベルに上昇させる胃ｐＨ調節剤を用いて、胃ペプシンによる分解からＢＭＰを防御することができる。ペプシン介在性タンパク質分解活性は、ｐＨ４で顕著に低く、５を超えるｐＨでは本質的に不活性である。したがって、本明細書に記載した製剤に有用な胃ｐＨ調節剤は、様々な緩衝薬剤のうち任意のもののことがあり、胃ｐＨを４から７の範囲に一過性に上昇させる胃「制酸薬」とも称される。好ましくは、胃ｐＨ調節剤は胃ｐＨを少なくとも５に上昇させる。本明細書に記載した製剤に胃ｐＨ調節剤として使用できる制酸薬には、炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、炭酸アルミニウムゲルなどがあるが、それに限定されるわけではない。ヒスタミンＨ２受容体を遮断する化合物（「Ｈ２ブロッカー」）も、本明細書に記載した組成物および方法に胃ｐＨ調節剤として使用することができる。当該Ｈ２ブロッカーには、シメチジン、ファモチジン、ニザチジン、ラニチジンなどがあるが、それに限定されるわけではない。本明細書に記載した方法および組成物に胃ｐＨ調節剤として働くことができるなお別の種類の化合物は、プロトンポンプを阻害する化合物である。当該プロトンポンプ阻害剤には、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラゾール、アベプラゾール（ａｂｅｐｒａｚｏｌｅ）などがあるが、それに限定されるわけではない。本明細書に記載した製剤に使用する胃ｐＨ調節剤の適切な量は、胃制酸薬、Ｈ２ブロッカー、またはプロトンポンプ阻害剤を調製するための当業者の常法に従い容易に決定される。ＢＭＰの経口製剤は、一つを超える胃ｐＨ調節剤も含むことができる。
【００８２】
ＢＭＰの胃ペプシン介在性タンパク質分解は、ペプシンに結合して酵素のタンパク質分解活性を阻害する一つまたは複数のペプシン特異的阻害剤化合物を用いて抑制することもできる。当該ペプシン阻害剤には、ペプスタチンＡ、ペプシノストレプチン、フェニルメチルスルホニルフルオリドなどがあるが、それに限定されるわけではない。
【００８３】
ペプシン阻害剤、ｐＨ調節剤、またはその組合せがペプシンのタンパク質分解活性を阻害する有効性は、ペプシン介在性タンパク質分解活性に関する標準ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで最初は試験することができる（例えば、下記実施例７および８参照）。
【００８４】
キモトリプシンによるＢＭＰの分解を抑制する薬剤
キモトリプシンは、ペプチド結合のカルボキシル側で（アミノ酸Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔのように）芳香族または大きな疎水性側鎖を有するペプチド結合を加水分解するセリンプロテアーゼである。キモトリプシンは、タンパク質分解活性に関して至適ｐＨ７．８を有する腸酵素である。本発明によるＢＭＰを経口投与するための組成物は、腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する一つまたは複数の薬剤を含むことがあり、これによって腸管に存在する有効量のＢＭＰが血流中に吸収され得る。
【００８５】
腸キモトリプシンのタンパク質分解活性は、腸内のｐＨを、または腸、例えば十二指腸に存在するＢＭＰ周囲の少なくとも微小環境のｐＨを、ＢＭＰが血流中に吸収されている時間に重大なタンパク質分解活性が生じない程度に低下させることによって阻害できる。様々な薬学的に許容できるｐＨ低下剤（緩衝剤、緩衝薬剤）のうち任意のものを使用して、例えば本発明による製剤が胃から十二指腸に移行するか、または十二指腸内もしくは直腸に注射されたときに、好ましくはｐＨ５未満に、少なくとも腸管の十二指腸でのｐＨ低下に作用させることができる。嚥下された、本発明によるＢＭＰの経口製剤は、好ましくはＢＭＰが十二指腸に移行して初めてｐＨ低下剤を放出する。十二指腸に移行したＢＭＰの少なくとも微小環境のｐＨを低下させるのに有用な緩衝剤には、酢酸、コハク酸、乳酸、クエン酸、イソクエン酸、アスコルビン酸、オキザロ酢酸、シュウ酸、リンゴ酸、フマル酸、２−ケトグルタル酸、グルタル酸、ピルビン酸、グリセリン酸、およびその組合せがあるが、それに限定されるわけではない。酸の塩形態により緩衝剤を参照することは、特定のｐＨで存在し得る対応する酸形態も包含することが了承されている。
【００８６】
腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を阻害する別の手段は、キモトリプシンと結合して阻害する一つまたは複数の化合物を採用することである。本明細書に記載した経口製剤に使用できる当該キモトリプシン阻害剤には、キモスタチン、Ｚ−Ｌ−ｐｈｅクロロメチルケトン、α２抗プラスミン、アプロチニン（「ウシ膵臓トリプシン阻害剤」または「ＢＰＴＩ」とも呼ばれる）、６−アミノヘキサン酸、α１アンチトリプシン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、ブロモエノールラクトン、ジイソプロピルフルオロリン酸、エコトイン、Ｎ−アセチル−エグリンＣ、メシル酸ガベキサート、ロイペプチントリフルオロ酢酸塩、Ｎ−ｐ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン、ダイズトリプシン−キモトリプシン阻害剤、およびその組合せがあるが、それに限定されるわけではない。
【００８７】
キモトリプシンを阻害する薬剤は、様々な食用穀物およびダイズを含めたある種の植物にもみられる。したがって、植物、例えばコメ、ダイズ、オートムギ、およびコムギの抽出物、生成物、または亜画分も、本明細書に記載した製剤に存在することもあるし、また、その製剤と共に投与されることがあり、腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を特異的に抑制または阻害する。
【００８８】
一つもしくは複数のキモトリプシン阻害剤、または一つもしくは複数の緩衝薬剤がキモトリプシンを阻害するの有効性を、キモトリプシン介在性タンパク質分解活性に関する任意の標準ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイで最初は試験できる（例えば、下記実施例７および８参照）。
【００８９】
腸トリプシンによるＢＭＰの分解を抑制する薬剤
トリプシンは、リシン（Ｌｙｓ）およびアルギニン（Ａｒｇ）のカルボキシル結合でペプチド、アミド、およびエステルを特異的に加水分解する。トリプシンは至適ｐＨ７．６を有する腸酵素でもある。十二指腸に存在するトリプシンは、所望の骨誘導薬理活性に大きく影響せずにＢＭＰ−６モノマーポリペプチドのわずかな短縮を引き起こすことができるようである（例えば、下記実施例７および図２０参照）。それにもかかわらず、ＢＭＰを含む経口製剤にトリプシンのタンパク質分解活性を阻害または抑制する薬剤を含ませるのが理想的なことがある。例えば、ＢＭＰの限られた分解でさえも、変性またはさらなる分解に対する感受性がさらに大きくなるリスクを冒すおそれがあることから、ＢＭＰが例えば持続放出製剤または受動ポンプ製剤の形で腸管に比較的ゆっくりと放出され、腸管から吸収される見込みの場合は、腸トリプシンのタンパク質分解活性を阻害または抑制するために一つまたは複数の薬剤を使用するのが好ましいことがある。トリプシンは十二指腸に存在することから、キモトリプシンを阻害するための上記薬剤に類似した薬剤、すなわち一つまたは複数のｐＨ低下剤（緩衝剤）および／またはトリプシン阻害剤も当該製剤に採用できる。
【００９０】
トリプシンタンパク質分解活性を阻害する様々な化合物が公知である。本発明の製剤および方法に使用できる当該トリプシン阻害剤には、アプロチニン（「ウシ膵臓トリプシン阻害剤」または「ＢＰＴＩ」とも呼ばれる）、α２抗プラスミン、抗トロンビンＩＩＩ、α１アンチトリプシン、アンチパイン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、ｐ−アミノベンズアミジン二塩酸塩、デリン、ベンズアミジン塩酸塩、ジイソプロピルフルオロリン酸、３，４−ジクロロイソクマリン、エコチン（ｅｃｏｔｉｎ）、メシル酸ガベキサート、ロイペプチン、α２マクログロブリン、フェニルメチルスルホニルフルオリド、Ｎ−α−ｐ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン、トリプシン−キモトリプシン阻害剤、およびその組合せがあるが、それに限定されるわけではない。
【００９１】
経口（経腸）投与のためのＢＭＰの製剤
ＢＭＰの有効な経口（経腸）投与、すなわち口または消化管に沿った任意の部分による投与を可能にする様々な組成物（製剤）を生産できる。一般に、嚥下される組成物は、胃ペプシンおよび腸キモトリプシンによる分解からＢＭＰを防御する一つまたは複数の薬剤を含有しなければならない。任意の単一の組成物に限定することを意図するわけではないが、本発明に有用な経口製剤の一例は、十二指腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を阻害する薬剤と共に、ＢＭＰを包むか、被包するか、または別なように隔離する腸溶コーティングを採用できる。様々な薬学的に許容できる溶解できるシェルのうち任意のものの中に、腸溶コーティングされた製剤をさらに被包することができる。例として、当該シェルは、ゼラチン、色素、二酸化チタン、アルキルアルコール、水酸化ナトリウム、プロピレングリコール、セラック、およびピリビニルピロリドンのような一つまたは複数の不活性成分を含有することがある。腸溶コーティングされた製剤は、胃を通過する間は無傷なままであり、胃ペプシンおよび酸がＢＭＰを分解または変性するのを抑制する。上記のような特異的ペプシン阻害剤および／または（例えば胃ｐＨを上昇させるための）制酸薬を含ませて胃ペプシンによる分解に対して追加の防御をもたらすことも理想的であり得る。（例えば、満杯の胃、他の薬物療法の作用などが原因で）胃の通過が通常よりも遅いおそれがあるならば、胃ペプシンに対する当該追加の防御は特に好ましいことがある。十二指腸に移行するときに、製剤の腸溶コーティングは腸管のさらに高いｐＨで溶解して、キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する一つまたは複数の薬剤と共にＢＭＰを放出する。上述のように、キモトリプシンのタンパク質分解活性を阻害する薬剤は、ｐＨ低下剤（例えば緩衝剤）、キモトリプシンの特異的阻害剤、キモトリプシンを阻害する植物抽出物もしくは亜画分、またはその組合せであり得る。本明細書に記載した経口製剤に有用なｐＨ低下剤は、酢酸、コハク酸、乳酸、クエン酸、イソクエン酸、アスコルビン酸、オキザロ酢酸、シュウ酸、リンゴ酸、フマル酸、２−ケトグルタル酸、グルタル酸、ピルビン酸、グリセリン酸、およびその組合せから成る群から選択されるもののような緩衝剤であり得る。腸でのＢＭＰの吸収が普通よりも長いと予想される（例えば遅延または長期放出製剤、満杯の腸管、他の薬物療法の作用などの場合であり得る）ならば、ｐＨ低下剤と、一つまたは複数のキモトリプシン特異的阻害剤との両方を含ませることが特に理想的なことがある。さらに、ｐＨ低下剤はトリプシンのような他の腸プロテアーゼを阻害すると予想されるが、特に腸から血流中へのＢＭＰの吸収が異常に長いまたは遅延していると予想されるならば、トリプシン特異的阻害剤も同様に含ませることが理想的なことがある。
【００９２】
製剤が胃を回避する方法で個体に経腸投与されるならば、胃ペプシンタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤は、その製剤の必要構成要素ではない（すなわち所望による構成要素である）ことも了承されている。当該製剤の例には、骨誘導性ＢＭＰ（または機能的に同等の骨誘導タンパク質）を（例えば直腸に挿入したときに）腸に放出する坐剤および十二指腸または結腸に（例えば、単回注射により、またはポンプで連続的に）直接注射できる製剤があるが、それに限定されるわけではない。そのような場合には、懸念は、腸プロテアーゼ、特にキモトリプシンによる分解から骨誘導性ＢＭＰ（または機能的に同等の骨誘導タンパク質）を防御することに関し、血流中への有効量の骨誘導性ＢＭＰの吸収を増強することにも関する。したがって、骨誘導性ＢＭＰ（または機能的に同等の骨誘導タンパク質）に追加して、当該製剤は、腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制または阻害する一つまたは複数の薬剤も好ましくは含み、トリプシンのような他の腸プロテアーゼのタンパク質分解活性を抑制または阻害する一つまたは複数の薬剤も含み得る。
【００９３】
本発明による製剤は、腸壁を介した血流中への骨誘導性ＢＭＰ（または機能的に同等の骨誘導タンパク質）の吸収を増強する一つまたは複数の薬剤も含み得る。吸収促進剤は、様々な界面活性剤のうち任意のものまたは界面活性剤の組合せであり得る。例えば、腸管に直接投与される、本発明の製剤に有用な吸収促進剤には、コレステロール誘導体である陰イオン性薬剤、陽イオン界面活性剤、、非イオン界面活性剤、およびその組合せがあるが、それに限定されるわけではない。コレステロール誘導体である陰イオン性薬剤には、胆汁酸、例えばコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、フシジン酸、グリコール酸、デヒドロコール酸、リトコール酸、ウルソコール酸、ウルソデオキシコール酸などがある。陽イオン界面活性剤には、アシルカルニチン、アシルコリン、ラウロイルコリン、塩化セチルピリジニウム、陽イオン性リン脂質などがある。非イオン界面活性剤には、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ＢＲＩＪ非イオン洗剤）、ｐ−ｔ−オクチルフェノールポロキシエチレン（例えば、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００非イオン洗剤）、ノニルフェノキシポロキシエチレン、ポリオキシエチレンソルビタンエステルなどがある。
【００９４】
消化管に沿った投与部位に応じて、本発明の製剤は、重大な濃度のキモトリプシンがみられる十二指腸を特にその製剤が通過するであろうならば、上記のようなｐＨ低下剤および／または腸プロテアーゼ一つもしくは複数の特異的阻害剤も含み得る。結腸下部（すなわち直腸を介して）に投与された坐剤も、ｐＨ低下剤ならびに／または十二指腸キモトリプシンおよび所望により他のプロテアーゼ（例えばトリプシン）に有効な一つもしくは複数の特異的阻害剤を含む。それは、当該酵素が個体の結腸に移行するか、または別なようにみられることがあるからである。
【００９５】
代謝性骨障害患者の骨の評価
上述のように、骨粗鬆症のような代謝性骨障害の証拠は、骨折、例えば手首、脊椎、または股関節の骨折が臨床的に現れた部分に、障害が進行して初めて認められることが多い。従来のＸ線、放射線吸収法、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および最近開発された二重エネルギーＸ線吸収（ＤＥＸＡ）分析を非限定的に含めた、当技術分野で公知のいくつかの標準法のうち任意のものによって、個体の骨、骨塩密度（ＢＭＤ）、および／または骨塩含量（ＢＭＣ）の状態を評価できる。ＤＥＸＡ分析は、個体の骨のＢＭＤに関する特に精度の高い、非侵襲分析を提供し、したがって骨減少症および骨粗鬆症のような進行性代謝性骨疾患を比較的初期段階でも診断して、本明細書に記載した方法および組成物を用いてＢＭＤの増強または回復を監視する特に好ましい方法である（例えば、下記実施例１および図４参照）。
【００９６】
治療用組成物および方法に関する追加の考察
骨成長喪失を特徴とする代謝性骨疾患を治療する本発明の方法は、胃ペプシンのタンパク質分解活性を抑制もしくは阻害する一つもしくは複数の薬剤および／または十二指腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を抑制もしくは阻害する一つもしくは複数の薬剤と共に、有効量の骨誘導性ＢＭＰを個体に投与することを含み得る。好ましくは、ＢＭＰと、特定の腸酵素のタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤とを含む経口製剤は、個体によって嚥下され、胃を通過して腸管に移行して、そこで血流中に吸収されるために有効量のＢＭＰが放出される。しかし、一部の状況、例えば坐剤または胃もしくは腸管に組成物もしくは薬剤（類）を局所的に注射できる能動もしくは受動ポンプでは、当該薬剤および／またはＢＭＰを消化管に沿った部分に直接投与することができる。本発明の製剤の経口投与は、個体に挿入した経鼻空腸管または胃造ろう管のような機械的装置の助けを借りて投与することもできる。
【００９７】
上述のように、一つまたは複数の腸酵素のタンパク質分解活性を抑制または阻害する薬剤は、ＢＭＰと同じ組成物中に存在することがあるが、腸酵素によるタンパク質分解からのＢＭＰの所望の防御が、有効量のＢＭＰが腸に達して血流中に吸収されるのに十分であるという条件で、当該薬剤を別々の組成物として連続して、または同時に当該薬剤を送達できる可能性もある。
【００９８】
本発明の経口製剤が、その製剤に存在するＢＭＰの骨誘導活性に追加して一つまたは複数の追加の薬理学的有益性または薬理活性を提供する一つまたは複数の追加の治療用化合物をさらに含み得ることも了承されている。当該追加の治療法化合物は、経口投与されたＢＭＰの所望の骨誘導活性を大きく減少させてはならない。
【００９９】
本明細書に記載した製剤に存在する、様々な腸酵素のタンパク質分解活性を阻害または抑制する薬剤の至適量は、薬学的製剤の分野の専門家によって採用される日常的な分析手順によって決定することができる。
【０１００】
骨粗鬆症のような代謝性骨障害を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある特定の個体（患者）のための投薬は、その患者を特徴付ける様々な臨床パラメータ、例えば嚥下能力、年齢、性別、体重、可能性のある遺伝的要因、一つまたは複数の他の疾患の証拠などを考慮して、熟練した担当医療提供者によって決定されるであろう。非限定的な例として、０．５ｍｇ／日から５ｍｇ／日の範囲の用量で、ＢＭＰ−６のようなＢＭＰを個体に経口投与することができる。このように、０．５ｍｇ／日から５ｍｇ／日の用量を本明細書に記載した組成物および方法に使用することができる。処置を開始するために特に有用で、処置過程の間にも維持できる用量は、ＢＭＰ０．５ｍｇ／日である。さらに、定期的または周期的にＢＭＰを個体に投与でき、例えば、ある期間個体に投与し、ある期間停止し、次に再開できる。投薬過程または投薬の繰り返しに関する制限は、概して担当医療提供者が当該投薬もしくは繰り返しが特定の個体にさらなる有益性をもたらすことができるかどうか、および／または特定用量の使用もしくは個体にＢＭＰを経口投与する期間を制限するであろう急性もしくは慢性副作用の証拠が何かあるかどうかに基づくであろう。
【０１０１】
当業者は、質量、例えば、１日に投与される薬物のマイクログラム（μｇ）またはミリグラム（ｍｇ）により、ＢＭＰのような薬理学的活性化合物の用量を表現できるだけでなく、個体の体重または質量１キログラムあたりのＢＭＰの量（例えば、μｇ／ｋｇ、ｍｇ／ｋｇ）、表面積あたりの量（例えば、μｇ／ｍ２、ｍｇ／ｍ２）、製剤の単位容量あたりのｍｇ（例えば、ｍＬあたり）などを非限定的に含めた他の単位でも表現できるのを承知していることも了承されている。本明細書に使用するｍｇ／日による、ヒトに対する投薬量の論考は、個体あたり１日あたりのｍｇを指し、通常使用される標準である７０ｋｇのヒト男性患者に基づく。同様に、体重（質量）１ｋｇあたりの化合物のｍｇによる、ヒトに対する投薬の論考は、７０ｋｇのヒト男性を仮定している。したがって、特定の個体または個体集団に対して用量を修飾しなければならないことがあると了承されている。例えば、これは骨粗鬆症の場合に特に関連する。骨粗鬆症を有すると診断された個体の約８０％が閉経後の女性であり、彼女らの多くが体重７０ｋｇ未満であり、健康な個体（男性または女性）に比べて体重および骨の構造が比較的ひ弱なことがある。よって、７０ｋｇを超えるかまたは７０ｋｇ未満の個体を処置するときは、標準的な薬理学的調整により用量を適切に修飾できることが了承されている。したがって、本明細書に記載した用量の様々な例は、本明細書に記載した、ＢＭＰを含む特定の経口製剤で特異的な個体または個体集団を処置するために必要な様々な他の投薬単位（およびその逆）に当業者によって容易に変換される。
【０１０２】
本発明の本記載にわたり挙げたように、個体の胃に嚥下または別なように投与されるＢＭＰの経口製剤は、胃ペプシンおよび腸キモトリプシンによるＢＭＰのタンパク質分解を抑制する一つまたは複数の薬剤も含まねばならない。当該製剤は、腸トリプシンも同様に阻害する薬剤をさらに含むことができる。製剤が腸、例えば坐剤または腸への注射を介して個体に直接投与されるならば、胃ペプシン活性を阻害する薬剤は必要なく、すなわち所望による構成要素である。
【０１０３】
胃および腸におけるＢＭＰの分解を抑制する、上に挙げた有用な薬剤に追加して、さらに一般には、標準的な薬学のプロトコールおよび教科書（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ペンシルベニア州、１９９０））により、経腸経路により個体に投与するために本発明の組成物を製剤できる。錠剤、ミニ錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、発泡性固体、チュアブル固体錠剤、ソフトゲル剤、カプレット剤、水溶液剤、懸濁剤、乳剤、マイクロエマルション、シロップ剤、またはエリキシル剤を非限定的に含めた様々な投薬剤形のうち任意のものに、骨誘導性ＢＭＰ（または機能的に同等の骨誘導タンパク質）を含む経口（経腸）投与のための本発明の組成物を調製できる。経口使用用の錠剤の場合、通常使用される担体には、乳糖およびコーンスターチがある。ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤も添加できる、カプセル剤、錠剤、丸剤、およびカプレット剤を非限定的に含めた一部の剤形は、個体の腸管へのＢＭＰの遅延、延長、または徐放をもたらす製剤にも特によく適することがある。望むならば、ある種の甘味料および／または着香料および／または着色料を添加することもできる。
【０１０４】
このように、ＢＭＰと胃ペプシンおよび／または十二指腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を阻害または抑制する一つまたは複数の薬剤とを含む組成物は、当技術分野で公知の多数の様々な薬学的に許容できる緩衝剤もしくは担体、賦形剤、または佐剤のうち任意のものも含むことができる。それらは、個体へのさらに効率的であるか、もしくは痛みのない（例えば成分の組合せ、嚥下の容易さ、注射の容易さ、挿入の容易さを増強するための）投与、個体の腸管へのＢＭＰのさらに効率的な、もしくは持続放出デリバリー、および／または組成物をより長く保存するための安定性（例えば保存寿命の延長）を非限定的に含めた一つまたは複数の有益な性質をもたらすことができる。したがって、本発明の医薬組成物は、経腸デリバリー用製剤に採用できるいくつかの化合物のうち任意のものをさらに含むことができる。その化合物には水、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、緩衝化合物（例えば、酢酸、リン酸、グリシン）、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、および塩または他の電解質（例えば、塩化ナトリウム、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸エステル、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、脂肪、およびその組合せがあるが、それに限定されるわけではない。
【０１０５】
本発明の追加の実施形態および特性は、以下の非限定的な実施例から明らかになるであろう。
【０１０６】
（実施例）
下記研究において動物に投与したＢＭＰ−６の用量を、「キログラムあたり」（「／ｋｇ」）の特定量として表示する場合、当該表示は、個別の動物の「体重１キログラムあたり」を意味するものとする。
【０１０７】
実施例１．  高齢卵巣切除ラットに静脈内投与した骨形成タンパク質−６（ＢＭＰ−６）の用量反応および有効性
本研究は、ＢＭＰ−６の静脈内投与が骨粗鬆症ラットモデルにおいて骨成長の促進に有効なことを示す。
【０１０８】
材料および方法
動物および研究プロトコール。  ４月齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雌性ラット１６０匹を本研究に使用した。動物の体重は約３００グラムであった。研究中は、標準条件（２４℃および１２時間／１２時間の明／暗サイクル）で２０×３２×２０ｃｍのケージに入れて、これらのラットを飼育した。全ての動物が、水と、１キログラムあたり１．００％カルシウム、０．６５％リン、および２．４０ＫＩＵビタミンＤ３を含有する市販の固形飼料（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ、Ｂｏｒｃｈｅｎ、ドイツ）とを自由に摂取できるようにした。エストラジオールとしてエストロゲンを投与した。トランスフェクトしたＣＨＯ細胞から標準的な手順に従って組換えＢＭＰ−６を調製した。
【０１０９】
−１４および−４日目に、カルセイングリーン標識方式（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、ｉ．ｐ．）を動物に施行し、それによって活動性の骨形成表面に二重蛍光色素標識の沈着が生じた。
【０１１０】
動物４０匹に偽手術を行い、残りには経腹的到達法により両側の卵巣切除（ＯＶＸ）を行った。卵巣切除の１２か月後に以下のように処置を開始した。
群１．  偽手術  
群２．  ビヒクル（酢酸緩衝液、週３回、ｉ．ｖ．）で処置したＯＶＸ対照
群３．  ＢＭＰ−６（週３回、１０μｇ／ｋｇ、静脈内、ｉ．ｖ．）で処置したＯＶＸ
群４．  ＢＭＰ−６（週３回、２５μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で処置したＯＶＸ
群５．  ＢＭＰ−６（週３回、５０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で処置したＯＶＸ
群６．  エストラジオール−Ｅ２（１７５μｇ／週、週３回、５０、５０、および７５μｇ／ラットの用量で投与、皮下、ｓ．ｃ．）で処置したＯＶＸ
群７．  エストラジオール＋ＢＭＰ−６（エストラジオール：１７５μｇ／週、週３回、５０、５０、および７５μｇ／ラット、ｓ．ｃ．投与。およびＢＭＰ−６を１０μｇ／ｋｇで投与、ｉ．ｖ．）で処置したＯＶＸ
動物を１２週間処置した。
【０１１１】
骨塩のｉｎ  ｖｉｖｏ監視。  卵巣切除前、卵巣切除の３か月後、治療中に２回、処置の６週間後、および処置の１２週間後に、Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌソフトウェアを備える二重エネルギー吸収法（ＤＸＡ、ＨＯＬＯＧＩＣ  ＱＤＲ−４０００、Ｈｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、マサチューセッツ州、米国）を用いて動物をスキャンした。スキャンの前に、チオペンタールバルビツール酸系薬（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ  ＧｍｂＨ、Ｉｓｍａｎｉｎｇ、ドイツ）で動物を麻酔した。
【０１１２】
全身スキャンを行った。腰椎、後肢、全身、および頭を除く全身の骨塩密度（ＢＭＤ）および骨塩含量（ＢＭＣ）を決定した。
【０１１３】
分析のために動物を屠殺する前に採尿した。採尿のために動物を代謝ケージに入れて、一晩１８時間絶食させた。治療開始の１２週間後にエーテル麻酔によって屠殺を開始した。
【０１１４】
ｅｘ  ｖｉｖｏ骨塩測定。  屠殺後に大腿骨、脛骨、および腰椎を摘出して、左大腿骨全体、大腿骨遠位骨幹端部（大腿骨遠位端から０．５ｃｍ）、および大腿骨近位端（大腿骨骨頭、大腿骨頚部、および大転子を含める）のスキャンしたＢＭＤおよびＢＭＣを測定した。
【０１１５】
大腿骨のｐＱＣＴ分析。  コンピュータ断層撮影に基づく精密な定量分析を可能にするｐＱＴＣスキャナー（Ｓｔｒａｔｅｃ−Ｎｏｒｌａｎｄ、Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ、Ｐｆｏｒｚｈｅｉｍ、ドイツ）を用いて、ラットの骨を追加的に分析した。皮質骨の測定にｐＱＣＴ分析を主に使用した。
【０１１６】
大腿骨のマイクロＣＴ分析。  厚さ４μｍのスライスの三次元画像を再構成するマイクロＣＴ機（Ｓｋｙｓｃａｎ、Ａａｒｔｓｃｌａａｒ、ベルギー）で大腿骨をスキャンした。マイクロＣＴ測定は骨梁骨およびその微小構築の分析を可能にする。
【０１１７】
生体工学試験。  大腿骨遠位骨幹端部（ＤＦＭ）の押込試験および大腿骨骨幹の３点曲げ試験により、骨の機械的性質に及ぼすＢＭＰ−６の効果を検討した。ＤＦＭの骨髄腔における海綿骨の機械的性質を決定するために、押込試験を使用した。大腿骨骨幹中央部の機械的性質を決定するために、３点曲げ試験を使用した。
【０１１８】
大腿骨の組織形態計測。  右大腿骨、脛骨、および腰椎を組織形態計測用に摘出した。大腿骨を７０％アルコール中で固定して、メタクリレートに包埋した。大腿骨遠位部（顆部へ４ｍｍの距離）の切片にゴールドナー染色を行った。これらの切片に静的および動的組織形態計測を行った。
【０１１９】
結果
ｉｎ  ｖｉｖｏ骨塩密度（ＢＭＤ）
卵巣切除の１２か月後に、ラットの後肢骨は偽処置動物に比べて約６％のＢＭＤが減少した（図１参照）。全てのＢＭＰ−６用量（すなわち１０、２５、５０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）は減少したＢＭＤの回復に効力があり、５０μｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）のＢＭＰ−６はＢＭＤの最も顕著な回復をもたらした（図１の群５参照）。６週間以内の処置で、ＢＭＰ−６を投与したラットは減少したＢＭＤを取り戻し、処置の１２週間後に群２（未処置の卵巣切除動物）（Ｐ＜０．０００１）および群１（偽手術動物）（Ｐ＜０．０２）の両方に比べて有意に高いＢＭＤを有した（図１参照）。偽処置ラットは、ＢＭＤ−６で治療後に同期間である１２週間以内にＢＭＤが約２％減少した。エストラジオール単独で処置したラット（群６）ではＢＭＤ値が増加したが、卵巣切除した対照動物に比べて有意ではなかった（図２の群６を群２と比較）。エストロゲン処置ラットにＢＭＰ−６を与えた場合（群７）、ＢＭＤ値は６週間後にすでに改善して、治療の１２週間後には有意に高いＢＭＤ値に達したが、その値は、ＢＭＤ−６単独で処置したどの群よりも有意に低かった（図２参照）。
【０１２０】
脊椎レベルでは、全用量のＢＭＰ−６が有効であったが、後肢のように偽手術のＢＭＤ値には達さなかった。用量５０μｇ／ｋｇで投与したＢＭＰ−６は、群２の卵巣切除対照動物に比べて６および１２週間の処置の両方でＢＭＤ値を増加させた（Ｐ＜０．０００１）。１２週間目に、データは、減少したＢＭＤの約５０％が取り戻されたことを示した（図３参照）。椎骨エンベロープで減少した骨を回復するにはより長い処置期間が必要であろう。エストロゲン単独で処置したラット（群６）は、エストロゲンおよびＢＭＰ−６で処置したラット（群７）に類似した範囲の増加したＢＭＤ値を６週間目に示した。１２週間目に、エストロゲン処置ラット（群６）のＢＭＤ値は、ビヒクル（酢酸）緩衝液のみで処置した卵巣切除動物（群２、図３参照）と異ならなかった。これらの結果から、ＢＭＰ−６と組み合わせない限り、エストロゲン単独はＢＭＤの増加を維持できなかったことが示された。
【０１２１】
要約すると、ＢＭＰ−６およびエストロゲンを静脈内投与した治療の３か月目のｉｎ  ｖｉｖｏ後肢ＢＭＤは、３用量全てが有効であり、減少したＢＭＤを取り戻すことができることを示し、最高用量はＢＭＤの最大増加をもたらした（群５、図２）。エストロゲン単独（群６）は、（群７のように）ＢＭＰ−６と組み合わせない限り効果を有さなかった。さらに、ＢＭＰ−６は脊椎では１０μｇ／ｋｇでエストロゲン単独の値と相乗的であった（図３の群７を群６と比較）。研究の終了後にｅｘ  ｖｉｖｏ子宮重量を記録して、ＢＭＰ−６の標的として子宮を除外した。予想通り、エストロゲン単独またはエストロゲンおよびＢＭＰ−６で処置したラットだけが増加した子宮重量を有した。
【０１２２】
ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＢＭＤ。  ラットの脛骨、大腿骨、および脊椎のＢＭＤ値をｅｘ  ｖｉｖｏで決定した。使用した用量とは無関係に、ＢＭＰ−６で処置したラットの大腿骨および脛骨で高度に顕著なＢＭＤ増加が記録され（例えば、図４の大腿骨データを参照）、Ｐ値は１０−６から１０−９の範囲であった。エストロゲン単独の投与（群６）もＢＭＤ値を増加させたが、ＢＭＰ−６処置動物に比べて２分の１から３分の１のレベルであった。
【０１２３】
ｐＱＣＴ分析。  大腿骨のｐＱＣＴ分析は、総ＢＭＤが卵巣切除した対照動物に比べて全てのＢＭＰ−６処置ラットで高かったことを示した。さらに、エストロゲンの投与を受けているラットは、卵巣切除対照（群１、ＯＶＸ）動物に比べて約８％高いＢＭＤ値を有した。ＢＭＰ−６  １０μｇで処置したラット（群３）は、対照動物よりも１３．８％高いＢＭＤを示した。総大腿骨骨塩含量は、ＢＭＰ−６処置ラットで約１８％、エストロゲン処置ラットで１１．５％高かった。これは、厳密なＡＮＯＶＡ／Ｄｕｎｎｅｔｔ検定解析を用いて統計的に有意であった。
【０１２４】
さらなる個別の骨構成要素を細分すると、データは、ＢＭＰ−６が主に骨面積および皮質領域の塩含量に影響したことを示した。皮質骨塩含量は、卵巣切除した対照動物に比べて全ＢＭＰ−６処置ラットで２４％高く（Ｐ＜０．０００１）、皮質骨塩面積（ｍｍ２）は対照値を約２１％上回った（図５参照）。
【０１２５】
マイクロＣＴ分析。  大腿骨のマイクロＣＴ分析から、骨容量／骨梁容量比（ＢＶ／ＴＶ）が、卵巣切除対照動物（群２）、エストロゲン処置ラット（群６）、およびエストロゲン＋ＢＭＰ−６処置ラット（群７）に比べてＢＭＰ−６処置ラット（群３〜５）で有意に高かったことが示された。さらに、ＢＭＰ−６  １０μｇで処置したラット（群３）は、卵巣切除対照動物（群２）に比べてＢＶ／ＴＶ値の８２．３％の増加を、エストロゲンの投与を受けているラット（群６）に比べて４６．９％の増加を有した（図６参照）。骨梁数は、卵巣切除対照ラットよりもＢＭＰ−６処置ラットで３４．８％高く、エストロゲン処置ラットより１４．３％高かった。これは厳密なＡＮＯＶＡ／Ｄｕｎｎｅｔｔ検定解析を用いて統計的に有意であった。骨梁幅は、卵巣切除対照動物（群２）、エストロゲン処置ラット（群６）、およびエストロゲン＋ＢＭＰ−６処置ラット（群７）に比べてＢＭＰ−６処置処置ラット（例えば、群３、ＢＭＰ−６  １０μｇ）の値の統計的に有意な増加を示した。群３のＢＭＰ−６処置動物でさえも、群１の偽手術動物よりも１０．５％高い骨梁幅を有した（図７参照）。
【０１２６】
生体工学試験。  大腿骨遠位骨幹端部（ＤＦＭ）の骨髄腔における海綿骨の機械的性質を決定するために押込試験を使用した。直接パラメータである最大荷重、剛性、および吸収されたエネルギーは、卵巣切除対照動物（群２）に比べてＢＭＰ−６処置ラット（例えば、群３の動物）で３倍増加し、これは統計的に有意であった（図８参照）。極限強度（導変数）は同じ傾向を示した。
【０１２７】
３点曲げ試験を使用して、大腿骨骨幹中央部の機械的性質を決定した。最大荷重および剛性は、卵巣切除対照動物（群２）に比べてＢＭＰ−６処置動物（例えば群３）で有意に高かった。ＢＭＰ−６処置動物からの骨は、偽手術動物（群１）よりも３３．４％大きいエネルギー（すなわち仕事「Ｗ」、ミリジュール単位で表現）を吸収した（Ｐ＜０．０５）（図９参照）。ＢＭＰ−６処置動物の剛性（ミリジュール（ｍＪ）／ｍ３として測定した導変数）は、偽手術動物（群１）に比べて２２．３％増加して統計的な有意性を示した（図１０参照）。
【０１２８】
組織形態計測。  組織形態計測（顕微鏡観察により組織切片における骨パラメータを測定するコンピュータ法）によりｐＱＣＴおよびマイクロＣＴ分析を確認した。大腿骨遠位部の骨容量／骨梁容量（ＢＶ／ＴＶ）は、ビヒクルである緩衝液で処置した卵巣切除ラット（群２、図１１参照）に比べて、ＢＭＰ−６処置動物（例えば、群３）の方が有意に高かった。動的組織形態計測（蛍光顕微鏡を用いて骨へのテトラサイクリンの取込みを測定する方法）は、ＢＭＰ−６処置ラット（例えば群３）またはエストロゲン＋ＢＭＰ−６で処置したラット（群６）で増加した石灰化速度（「ＭＡＲ」、μｍ／日）を示し、これは、ビヒクルである緩衝液で処置した群２卵巣切除対照ラットに比べて統計的に有意であった（Ｐ＜０．００１）（図１２参照）。
【０１２９】
結論
静脈内投与したＢＭＰ−６は、高齢卵巣切除ラットにおいてｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの両方で１２週間にわたりＢＭＤを有意に増加させた。ｐＱＣＴ分析は、皮質骨にＢＭＰ−６が大きな影響を与えたことを示した。さらに、マイクロＣＴ分析は、ＢＭＰ−６処置ラットで偽手術の値に達する骨梁幅の増加を示した。高齢卵巣切除ラットで減少した骨を完全に回復すると以前に報告された公知の薬剤が存在しないことから、これは特に関心深い。骨同化作用を有すると以前に報告された唯一の薬剤は、副甲状腺ホルモンであり、それは骨梁骨および皮質骨の両方に作用するが、皮質に対するその作用は骨吸収トンネルも生み出す。当該吸収トンネルは、骨の機械的特性を弱め、長期間にはその機械的性質に有害作用を及ぼし得るであろう。生体工学試験は、卵巣切除対照動物に比べてＢＭＰ−６処置動物の骨の機械的性質が統計的に有意に改善して、偽手術動物の骨よりも靱性が高くさえあることを示した。
【０１３０】
実施例２．  高齢卵巣切除ラットにおいて骨に及ぼす低用量ＢＭＰ−６の効果
上記のように７か月齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを卵巣切除（ＯＶＸ）し、約２０か月そのままにして骨塩密度（ＢＭＤ）を減少させた。このように、卵巣切除の７２週間後に２年１か月齢で治療を開始し、３か月継続してから分析のために屠殺を行った。動物を以下の群に分けた。
群１  偽手術（ｎ＝８）
群２  ＯＶＸ対照（ｎ＝８）
群３  ＢＭＰ−６、１０μｇ／ｋｇ、週３回で処置したＯＶＸ（ｎ＝８）
群４  ＢＭＰ−６、１０μｇ／ｋｇ、週１回で処置したＯＶＸ（ｎ＝１２）
群５  ＢＭＰ−６、１μｇ／ｋｇ、週３回で処置したＯＶＸ（ｎ＝１２）
【０１３１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＭＤ。  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＭＤを６週間毎に監視した。治療の開始の６週間後に、全てのＢＭＰ−６処置動物はＯＶＸ対照動物に比べて統計的に有意に高い後肢ＢＭＤ値を示し、偽手術動物よりも高いＢＭＤさえ有した。ＢＭＰ−６処置群の間に統計的有意差は存在しなかった。ＢＭＰ−６、用量１μｇ／ｋｇ、週３回（群５）では、ＯＶＸ動物（群２）に比べて後肢のＢＭＤが１１．２％増加したが、ＢＭＰ−６、用量１０μｇ／ｋｇ、週１回（群４）および３回（群３）では、ＢＭＤが７．６％増加した（図１３参照）。治療開始の１２週間後に、ＢＭＰ−６処置動物（群５）は偽手術動物（群１）と比べたときでさえも高いＢＭＤ値を有したが、初期の６週目での測定値に比べて骨が幾分減少した。この現象は動物の加齢により説明できた。それは、実験が終了した時点の２年７か月までは少数の動物しか生存できないからである。（図１４参照）。
【０１３２】
結論
静脈内投与した低用量（例えば、１μｇ／ｋｇ、週３回、ｉ．ｖ．）のＢＭＰ−６は、減少した骨の回復に高用量よりも１２週間にわたりなおさらに有効である。さらに、ＢＭＰ−６、用量１０μｇ／ｋｇ、週１回は、週３回投与したＢＭＰ−６と同様にＢＭＤに対して有効である。
【０１３３】
実施例３．  ９９ｍテクネチウムで標識したＢＭＰ−６の十二指腸での吸収および生体分布
本研究は、個体における骨形成を誘導するために経口投与されたＢＭＰ−６の有効性が個体の年齢に依存し得ることを示す。特に、成体に存在するが、概して幼仔には存在しないことが知られている胃酵素の影響で骨形成タンパク質は分解する。したがって、経口（口を介する）および十二指腸投与したＢＭＰのうち幼仔および成体の個体に吸収された量を比較するために本研究を実施した。具体的には、３日齢、１５日齢、４５日齢、および７５日齢のラットで標識ＢＭＰ−６の吸収を比較した。
【０１３４】
ＢＭＰ−６の標識。  成熟ＢＭＰ−６をメルカプトアセチルグリシルグリシルグリシン（ＭＡＧ３）とキレートさせた。ＢＭＰ−６−ＭＡＧ３複合体を放射性９９ｍテクネチウム−過テクネチウム酸（９９ｍＴｃ）で標識した。クロマトグラフィーから、９７％を超える９９ｍＴｃがその複合体に連結したことが明らかになった。
【０１３５】
動物および治療プロトコール。  動物を以下の処置群に分けた：
群１．  ３日齢。９９ｍＴｃで標識した１００μｇ／ｋｇ  ＢＭＰ−６をピペットで口に直接適用。
群２．  １５日齢。９９ｍＴｃで標識した１００μｇ／ｋｇ  ＢＭＰ−６をピペットで口に直接適用。
群３．  ４５日齢。９９ｍＴｃで標識した１００μｇ／ｋｇ  ＢＭＰ−６を注射器で十二指腸に直接適用。
群４．  ７５日齢。９９ｍＴｃで標識した１００μｇ／ｋｇ  ＢＭＰ−６を注射器で十二指腸に直接適用。
【０１３６】
十二指腸内適用。  動物をチオペンタールで麻酔して腹部手術に供した。腹部臓器を露出させて十二指腸を分離した後で、９９ｍＴｃで標識したＢＭＰ−６を針付き注射器で十二指腸に直接注射した。
【０１３７】
ガンマカウンターを用いた放射能の測定。  手術の６０分後に動物を屠殺した。血液および全ての臓器を測定用に採取した。ガンマカウンターで全ての試料の放射能量を測定し、１分間あたりの計数（ｃｐｍ）として表した。測定放射能を、全適用線量と同じ放射能を有した標準の放射能と比較して、適用した線量の率として結果を表した。半減係数に依存して全ての値を補正した。
【０１３８】
結果
３日齢の動物は適用した用量の９％を吸収したが、１５日齢の動物は適用した用量の０．５％しか吸収しなかった。それよりも高齢の動物、すなわち４５日齢および７５日齢の動物は、適用した用量の０．１％だけを吸収した（図１５）。これらの結果は、胃酵素を発現していない幼仔は、経口適用した場合に成体よりも多量のＢＭＰ−６を吸収できることを示唆している。
【０１３９】
ＢＭＰ−６の十二指腸吸収に及ぼすｐＨ低下剤および促進剤の作用
上記結果に照らして、成ラットおよび胃腸環境を修飾することが公知である薬剤を用いてさらなる研究を行った。ラットは６０日齢で、体重約２００ｇであり、以下の物質の十二指腸内（ｉ．ｄ．）適用に供された。
動物１．  「ｐＨ３」
（ＢＭＰ−６−ＭＡＧ−３）＝１６６μＬ
（酢酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ２．５）＝４９８μＬ
総容量＝６６４μＬ
Ｓｉｇｍａブランド（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）のｐＨ試験ストリップで測定したとき終ｐＨ３、ｐＨ範囲＝０．０〜６．０
動物２．  「ｐＨ３＋促進剤」
（ＢＭＰ−６−ＭＡＧ−３）＝１６６μＬ
（酢酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ２．５）＝４９８μＬ
総容量＝６６４μＬ
ｐＨ試験ストリップで測定したとき終ｐＨ３
促進剤の添加：
タウロデオキシコール酸ナトリウム１ｍｇ
ＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリド１ｍｇ
動物３．  「促進剤」
（ＢＭＰ−６−ＭＡＧ−３）＝１６６μＬ        
（０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７）＝４９８μＬ
総容量＝６６４μＬ
促進剤の添加：
タウロデオキシコール酸ナトリウム１ｍｇ
ＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリド１ｍｇ
【０１４０】
手術の６０分後に動物を屠殺して、放射能の測定のために試料を採取した。
【０１４１】
結果
ＢＭＰ−６への酢酸緩衝液（ｐＨ３）の添加（動物１）は、適用した用量の０．３８％のＢＭＰ−６の吸収、すなわち酢酸緩衝液不在下よりも約４倍高い吸収を招いた。酢酸緩衝液（ｐＨ３）と、吸収促進剤、すなわちタウロデオキシコール酸ナトリウムおよびＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリドとの両方の適用（動物２）により、ＢＭＰ−６の十二指腸吸収が０．９４％増加したが、吸収促進剤単独の添加（動物３）により、適用した用量の０．１６％だけの吸収が可能であった（図１６）。これらの結果は、妥当な条件でＢＭＰ−６が胃腸系を介して吸収され得ることを示唆している。比較的低用量のＢＭＰ−６は、高用量と同程度効果的に骨誘導に作用することから（上記参照）、このデータは、成体の十二指腸を介して通過するＢＭＰ−６の率にわずかでも改善を可能にする投薬製剤が、骨形成に全身作用を及ぼすのに十分であり得ることを示唆している。
【０１４２】
実施例４．  皮下の骨ペレット（マトリックス）での骨形成に及ぼすＢＭＰ−６の十二指腸適用の効果
本研究は、十二指腸に適用し吸収されたＢＭＰ−６が骨形成の誘導に活性であることを示す。脱塩して抽出した骨マトリックスを皮下に植込んだものを骨形成の代理マーカーとして使用する。特定部位（例えば十二指腸）にＢＭＰのような成長因子を投与後の植込骨マトリックスにおける局所骨形成の証拠が、特定製剤の構成要素の存在下でその成長因子がその部位から全身に作用できる一表示としてみなされることが、このアッセイの価値および限界である。
【０１４３】
骨ペレット。  骨ペレット調製のためのドナーは、２０週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットであった。屠殺後に大腿骨および脛骨の骨幹を採取してペレットを作成した。塩素酸および尿素を添加して骨を調製した。皮下に植込んだ骨ペレットでは、新骨は自然形成しない。
【０１４４】
動物および処置プロトコール。  体重約２００ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを手術に供した。骨ペレットを皮下の腋窩領域に植込んだ。動物を以下の処置群に分け、１群あたり４個のペレットを植込んだ。
群１．  対照動物
群２．  用量５μｇ／ｋｇでＢＭＰ−６の十二指腸内（ｉ．ｄ．、上記の通り）投与を受けている動物
群３．  用量５０μｇ／ｋｇでＢＭＰ−６のｉ．ｄ．投与を受けている動物
群４．            用量５００μｇ／ｋｇでＢＭＰ−６のｉ．ｄ．投与を受けている動物
群５．  用量１０００μｇ／ｋｇでＢＭＰ−６のｉ．ｄ．投与を受けている動物
群６．  用量１０μｇ／ｋｇでＢＭＰ−６のｉ．ｖ．投与を受けている動物
【０１４５】
処置群２〜５の動物に、上記の適切な用量のＢＭＰ−６を十二指腸に２回、すなわち骨ペレットの植込みの６時間および２５時間後に直接注射した。静脈内（ｉ．ｖ．）適用を手術の６、１２、２４、および４２時間後に行った。手術の１５日後に動物を屠殺して、組織分析のために骨ペレットを採取した。
【０１４６】
組織分析。  骨ペレットを７０％アルコール中で固定し、脱灰し、パラフィンに包埋した。切片をトルイジンブルーで染色した。新骨の形成の存在下でペレットを陽性とみなした。
【０１４７】
結果
下の表１に結果を示す。ＢＭＰ−６の十二指腸内（ｉ．ｄ．）投与を受けている動物は、皮下骨ペレットに新骨の形成（骨誘導）を示した。これは、妥当な条件でＢＭＰ−６が骨形成に全身作用を及ぼすのに十分な量で胃腸系を通過できることを示唆している。対照動物は骨ペレットに骨誘導の徴候を示さなかった。
【０１４８】
【表１】
2007535546.tif 000003
【０１４９】
実施例５．  静脈内適用したＢＭＰ−６と比較した、９９ｍＴｃで標識したＢＭＰ−６の十二指腸吸収
本研究は、十二指腸および静脈投与の関数としてのＢＭＰ−６の吸収を比較する。
【０１５０】
ＢＭＰ−６の標識。  成熟ＢＭＰ−６をメルカプトアセチル−３−グリシン（ＭＡＧ３）でキレートした。ＢＭＰ−６−ＭＡＧ３複合体を放射性９９ｍテクネチウム−過テクネチウム酸（９９ｍＴｃ）で標識した。クロマトグラフィーから、９７％を超える９９ｍＴｃがその複合体に連結したことが明らかとなった。
【０１５１】
動物および治療プロトコール。体重約２００ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット６匹を実験に参入させた。以下の治療方式を有する処置群に動物を分けた。
群１（ｎ＝１）
容量（ＢＭＰ−６−ＭＡＧ−３）＝２００μＬ
容量（酢酸緩衝液２０ｍＭ、ｐＨ４．０）＝４００μＬ
総容量＝６００μＬ
投与経路：十二指腸内（ｉ．ｄ．）
群２（ｎ＝２）
容量（ＢＭＰ−６−ＭＡＧ−３）＝２００μＬ
容量（酢酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ３．０）＝４００μＬ
総容量＝６００μＬ
促進剤の添加：タウロデオキシコール酸ナトリウム１ｍｇ
ＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリド１ｍｇ
投与経路：ｉ．ｄ．
群３（ｎ＝１）
容量（ＢＭＰ−６−ＭＡＧ−３）＝２００μＬ
容量（酢酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ３．０）＝４００μＬ
総容量＝６００μＬ
促進剤の添加：タウロデオキシコール酸ナトリウム１ｍｇ
ＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリド１ｍｇ
ジヘプタノイルホスファチジルコリン１．５ｍｇ
投与経路：ｉ．ｄ．
群４（ｎ＝１）
容量（ＢＭＰ−６−ＭＡＧ−３）＝２００μＬ
容量（酢酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ３．０）＝４００μＬ
総容量＝６００μＬ
促進剤の添加：ジヘプタノイルホスファチジルコリン１．５ｍｇ
投与経路：ｉ．ｄ．
群５（ｎ＝１）
容量（ＢＭＰ−６−ＭＡＧ−３）＝２００μＬ
容量（酢酸緩衝液２０ｍＭ、ｐＨ４．０）＝４００μＬ
総容量＝６００μＬ
投与経路：静脈内（ｉ．ｖ．）
【０１５２】
群１の動物は、標準酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ４．０）に入れて１００μｇ／ｋｇの用量で十二指腸内（ｉ．ｄ．）注射したＢＭＰ−６の投与を受けた。群２、３、および４の動物は酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ３．０）および種々の組合せの促進剤（例えば、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリド、および／またはジヘプタノイルホスファチジルコリン）に入れて１００μｇ／ｋｇの用量で十二指腸内注射したＢＭＰ−６の投与を受けた。群５の動物は、酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ４．０）に入れて１００μｇ／ｋｇの用量で静脈内（ｉ．ｖ．）注射したＢＭＰ−６の投与を受けた。
【０１５３】
十二指腸内（ｉ．ｄ．）適用。  動物をチオペンタールで麻酔して腹部手術に供した。腹部臓器を露出させて十二指腸を分離した後で、９９ｍＴｃで標識したＢＭＰ−６を針付き注射器で十二指腸に直接注射した。手術の６０分後に動物を屠殺して、血液および全ての臓器を測定のために採取した。
【０１５４】
ガンマカウンターを用いた放射能の測定。  全ての試料の放射能量をガンマカウンターで測定し、１分間あたりの計数（ｃｐｍ）として表した。静脈内注射した動物（群５）の血液から手術後同時に測定した放射能に比べた、十二指腸内注射した動物の血液から測定した放射能の率として結果を表した。全ての値を半減係数に依存して補正した。
【０１５５】
結果
結果を図１７に示す。ｐＨの低下も促進剤の添加もなしにＢＭＰ−６単独の投与を受けた動物１などの動物は、静脈内適用した動物の血液で測定されたＢＭＰ−６の１．６％を血中に有した。酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ３．０）ならびにタウロデオキシコール酸ナトリウム１ｍｇおよびＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリド１ｍｇと共にＢＭＰ−６の投与を受けている動物は、静脈内用量の３５％（群２の動物の平均を図１７に示す）まで増加したＢＭＰ−６の十二指腸吸収を有し、これは、適用したＢＭＰ−６の３５％をこれらの動物が吸収したことを示唆している。酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ３．０）およびジヘプタノイルホスファチジルコリン１．５ｍｇと共に様々な組合せでＢＭＰ−６の投与を受けた動物は、静脈内用量の約６％の吸収を有した（図１７の群３および４参照）。
【０１５６】
実施例６．  反転腸管法による９９ｍＴｃ標識ＢＭＰ−６のｉｎ  ｖｉｔｒｏ十二指腸吸収
ＢＭＰ−６の標識。  成熟ＢＭＰ−６をメルカプトアセチル−３−グリシン（ＭＡＧ３）でキレートした。ＢＭＰ−６−ＭＡＧ３複合体を放射性９９ｍテクネチウム−過テクネチウム酸（９９ｍＴｃ）で標識した。クロマトグラフィーから、９７％を超える９９ｍＴｃがその複合体に連結したことが明らかとなった。
【０１５７】
反転腸管法。  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを屠殺し、幽門弁に対して遠位の腸の最初の１０ｃｍを切離した。等張塩化ナトリウム溶液でこの組織を直ちに洗浄した。洗浄後に多量の腸間膜を切除し、その区域の遠位末端を反転用の棒に結び付けたままで腸を反転させた（粘膜側は外側になり、漿膜側は内側になる）。次に、その腸を幽門弁に対して遠位で結紮糸で結び、前回と同様に洗浄した。次に、その腸の水分を吸い取り、長さ５．５ｃｍに短縮して、鈍針を取り付けた注射器を用いてインキュベーション培地０．５ｍｌを満たした。次に、同インキュベーション培地１０ｍＬを含む２５ｍＬエルレンマイヤーフラスコに腸管を配置して、３７℃で９０分間インキュベートした。実験を通してインキュベーション培地に酸素を連続的に通気させた。
【０１５８】
インキュベーション培地
二つのインキュベーション培地を採用した：
培地１：  １５４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１６．６ｍｍｏｌ／Ｌグルコース
培地２：  １２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭグルコース、３０ｍＭトリス−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．４）、０．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２
【０１５９】
プロトコール
９９ｍＴｃで標識したＢＭＰ−６（８．６４μｇ）を酢酸緩衝液７０μＬ（２０ｍＭ、ｐＨ４．０）に溶解させ、ｉｎ  ｖｉｖｏ吸収が腸の粘膜側から漿膜側に起こることから、腸の外部の粘膜側にインキュベーション用培地１０ｍＬを添加した。腸の粘膜側のインキュベーション培地に酢酸緩衝液（７０μＬ、２０ｍＭ、ｐＨ４．０）単独を添加して、対照として使用した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ反転腸系は以下の通りであった。
１．  ９９ｍＴｃで標識したＢＭＰ−６  ８．６４μｇ＋酢酸緩衝液７０μＬ（２０ｍＭ、ｐＨ４．０）＋培地１  １０ｍｌ
２．  ９９ｍＴｃで標識したＢＭＰ−６  ８．６４μｇ＋２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）７０μＬ＋培地２１０ｍｌ
３．  対照：２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）７０μＬ＋培地１１０ｍｌ
【０１６０】
ガンマカウンターを用いた放射能の測定。  ９０分間インキュベートした後で、外側および内側の培地の放射能量をガンマカウンターで測定して、１分間あたりの計数（ｃｐｍ）として表した。粘膜側の外側培地で測定された放射能に比べた、漿膜側の内側培地で測定された放射能の率としても結果を表現した。半減係数に依存して全ての値を補正した。
【０１６１】
化学パラメータの測定。  比色法によりグルコースおよび乳酸を、市販のキットを使用してＮａ、Ｃｌ、およびＣａを測定した。
【０１６２】
結果
図１８Ａ（培地１のデータ）および１８Ｂ（培地２のデータ）に棒グラフとして結果を示す。培地１（緩衝系なし）に関して、９０分間インキュベーション後に標識ＢＭＰ−６の１７．７％が腸の粘膜側（Ｍ）から漿膜側（Ｓ）表面に移動した（図１８Ａの９０分目のデータ参照）。対照的に、（ｐＨ７．４の緩衝液およびカルシウムを含む）培地２を用いると、標識ＢＭ−６の３２．２％が培地中の腸の粘膜側から漿膜側表面に移動した（図１８Ｂの９０分目のデータ参照）。初発溶液中のグルコースの平均９９．８％が９０分間のインキュベーション時間の間に代謝された。対照系に比べてＢＭＰ−６を含む反転腸系では乳酸生成が４倍増加した。これは、ＢＭＰ−６の移動がより大きいエネルギーの生成を必要としたことを示唆している（下記表２参照）。
【０１６３】
【表２】
2007535546.tif 000004
【０１６４】
実施例７．  特異的胃酵素および腸酵素によるＢＭＰ−６の分解
上記研究は、十二指腸内に存在する場合にＢＭＰ−６が体内に効果的に吸収され得ることを示した。本研究は、胃酵素および腸酵素による分解に対するＢＭＰ−６の感受性を調べた。
【０１６５】
ペプシンのタンパク質分解に対する感受性。  ペプシン０、１、５、または１０μＬ（２５００〜３５００ＩＵ／ｍｇ）と共にＢＭＰ−６（１０μｇ）をインキュベートした。ペプシン分解活性に関する陽性対照としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（５μｇ）を使用した。還元条件（ジチオトレイトール「ＤＴＴ」）でポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により消化反応生成物を調べた。この条件は、ＢＭＰ−６モノマーの追跡を可能にする。可視化するためにクマシーブルーでゲルを染色した。ペプシン０、１０、５、または１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物を、図１９のゲルのそれぞれレーン１〜４に示す。図１９のレーン６および７は、それぞれペプシン５および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６およびＢＳＡの反応生成物を含む。図１９のレーン８および９は、それぞれペプシン５および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＳＡの反応生成物を含む。図１９のレーン５は分子量標準を含む。
【０１６６】
図１９に示すように、ペプシンはＢＳＡおよびＢＭＰ−６の両方を分解した（例えば、図１９のレーン１〜４でのＢＭＰ−６の分解ならびにレーン８および９でのＢＳＡの分解参照）。ＢＳＡの存在下では、反応混合物にＢＭＰ−６のみが存在する場合よりも少量のＢＭＰ−６が分解した（例えば、図１９のレーン６および７を、レーン３および４と比較）。ペプシンによるＢＳＡの分解は、最初に約４７キロダルトン（ｋＤａ）の短いポリペプチドを、最終的にはより小さい断片をもたらすと思われた。結果から、ペプシンが用量特異的にＢＭＰ−６を速やかに分解したことが示された（図１９のレーン１〜４）。
【０１６７】
トリプシンおよびキモトリプシンのタンパク質分解に対する感受性。  上記ペプシンによる分解に対する感受性を試験したのと同様の方法で、腸酵素であるトリプシン（６０００〜１２０００ＩＵ／ｍｇ）またはキモトリプシン（４０〜６０ＩＵ／ｍｇ）と共にＢＭＰ−６（１０μｇ）または陰性対照としてＢＳＡ（５μｇ）をインキュベートした。上記のように還元条件でポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により消化生成物を分析した。図２０のゲルに結果を示す（レーン４は分子量標準）。トリプシン０、１、および０．２μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物を、図２０のゲルのそれぞれレーン１、２、および３に示す。キモトリプシン０．５および０．２μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物を、それぞれレーン５および６に示す。図２０のレーン７は、トリプシン０．２μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６およびＢＳＡの反応生成物を示し、レーン８はキモトリプシン０．２μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６およびＢＳＡの反応生成物を示す。図２０のレーン９は、トリプシン０．２μＬの存在下でインキュベートしたＢＳＡの反応生成物を示し、レーン１０は、キモトリプシン０．２μＬの存在下でインキュベートしたＢＳＡの反応生成物を示す。
【０１６８】
トリプシンは、ＢＭＰ−６モノマーポリペプチドのわずかな短縮を引き起こしただけであった（図２０のレーン２および３参照）が、キモトリプシンは、用量特異的に効果的にＢＭＰ−６を分解できた（図２０のレーン５および６参照）。さらに少量のキモトリプシン（例えば０．２μＬ）は、ＢＭＰ−６モノマーの最初の短縮を示した（図２０のレーン６）。ＢＳＡはトリプシンによる分解（図２０のレーン７および９参照）にも、キモトリプシンによる分解（図２０のレーン８および１０参照）にも抵抗性であった。
【０１６９】
胃液によるＢＭＰ−６の消化。  胃液の別々の試料を絶食Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット２匹から収集した。ＢＭＰ−６（０．５μｇ）を、様々な量（１μＬ、１０μＬ）の胃液試料と共にインキュベートした。還元（＋ＤＴＴ）条件で電気泳動したウェスタン免疫ブロットにより消化生成物を分析して、ＢＭＰ−６モノマーを追跡するか、または非還元（ＤＴＴなし）条件でＢＭＰ−６ダイマーを追跡した。抗ＢＭＰ−６抗体（ＳＶ−１７、ウサギプール血清）を使用してＢＭＰ−６を検出した。図２１のウェスタン免疫ブロットに結果を示す（レーン１および１０は標準分子量マーカーを示す）。動物１の胃液１０、１、および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物を、図２１のそれぞれレーン２、３、および４（ＤＴＴなし）に示し、動物２の胃液１０、１、および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物をそれぞれレーン５、６、および７（ＤＴＴなし）に示す。熱不活性化（９０℃、１分間）胃液１０、１、および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物を、レーン８、９、および１０（ＤＴＴなし、分子量標準を含む）に示す。
【０１７０】
ラット胃液の両試料は、ＢＭＰ−６ダイマー（図２１のレーン４および７参照）またはモノマー（例えば、図２１のレーン２、３、５、および６参照）の減少が示すように、ＢＭＰ−６を分解した。非還元条件では、胃液試料中のペプシンは３５ｋＤａの位置に泳動するが、それはＢＭＰ−６ダイマーの泳動位置に類似している（例えば、図２１のレーン４および７）。タンパク質分解活性を破壊するのに十分な程度、胃液試料を加熱（９０℃、１分）した場合にのみＢＭＰ−６モノマーが検出された（図２１のレーン８および９参照）。特異的抗ＢＭＰ−６抗体（Ｎ−１９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カリフォルニア州）で検出した、約２８ｋＤａに泳動しているわずかに短縮した（すなわち部分分解した）ＢＭＰ−６ダイマー種（図２１のレーン７参照）という、ＢＭＰ−６と動物２の胃液との反応生成物の外観から明らかなように、動物１の胃液試料は動物２の胃液試料よりも活性が高かった。
【０１７１】
ペプシン阻害剤であるペプシノストレプチンの存在下および不在下での胃液による消化。  様々な量（１μＬ、１０μＬ）の上記胃液試料と共にであるが、ペプシン阻害剤であるペプシノストレプチン（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）の存在下および不在下でＢＭＰ−６（０．５μｇ）をインキュベートした。還元条件および非還元（ＤＴＴなし）条件で流したゲルのウェスタン免疫ブロットにより、上記のように反応生成物を分析して、ＢＭＰ−６モノマーおよびダイマーをそれぞれ追跡した。図２２のウェスタン免疫ブロットに結果を示す（レーン１０は標準分子量マーカーを示し、レーン１４はＢＭＰ−６モノマーを含み、レーン１５（ＤＴＴなし）はＢＭＰ−６ダイマーを含む。動物１の胃液１０、１、および１μＬと共にインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物を、図２２のそれぞれレーン１、２、および３（ＤＴＴなし）に示し、動物２の胃液１０、１、および１μＬと共にインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物をレーン４、５、６（ＤＴＴなし）に示す。ペプシン阻害剤であるペプシノストレプチンおよび胃液１０、１、および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物を、それぞれレーン７、８、および９（ＤＴＴなし）に示す。熱不活性化胃液１０、１、１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物を、それぞれレーン１１、１２、および１３に示す。
【０１７２】
ペプシノストレプチンは、還元条件でのＢＭＰ−６モノマー（図２２のレーン７および８参照）または非還元条件でのＢＭＰ−６ダイマー（図２２のレーン９参照）の保存によって示されるように、ＢＭＰ−６に及ぼす胃液のタンパク質分解活性を完全に阻害した（図２２のレーン９参照）。結果は上記のように熱不活性化胃液と共にインキュベートしたＢＭＰ−６を含む陰性対照に類似していた（図２２のレーン１１〜１３参照）。
【０１７３】
上記データは、ペプシンが胃内でのＢＭＰ−６のタンパク質分解の主な原因であることを示す。
【０１７４】
十二指腸液によるＢＭＰ−６の消化。  絶食Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット２匹から十二指腸液の試料を収集した。様々な量（１μＬ、３μＬ）の十二指腸液と共にＢＭＰ−６（０．５μｇ）をインキュベートし、上記のような還元条件および非還元条件（ＤＴＴなし）でポリアクリルアミドゲルのウェスタンブロットにより消化生成物を分析した。結果を図２３のウェスタン免疫ブロットに示す。図２３のレーン１１（ＤＴＴなし）に非還元条件でＢＭＰ−６のダイマーを示し、図２３のレーン１０に還元条件（＋ＤＴＴ）でＢＭＰ−６モノマーを示す。標準分子量マーカーを図２３のレーン５に示す。動物１の十二指腸液３および１μＬと共にインキュベートしたＢＭＰ−６反応生成物を、図２３のそれぞれレーン１および２に示し、動物２の十二指腸液３および１μＬと共にインキュベートしたＢＭＰ−６反応生成物を、それぞれレーン３および４に示す。図２３のレーン６、７、および８（ＤＴＴなし）は、酢酸緩衝液（ｐＨ３）および十二指腸液３、１、および１μＬの存在下でインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物を示す。レーン９は、熱不活性化十二指腸液１μＬと共にインキュベートしたＢＭＰ−６の生成物を示す。
【０１７５】
両動物の十二指腸液は、用量特異的に効果的にＢＭＰ−６を分解した（図２３のレーン１〜４参照）。ｐＨ３酢酸緩衝液の存在下での反応物をインキュベートすることにより、十二指腸液による分解からの部分的防御がもたらされた（図２３のレーン６〜８参照）。加熱によって十二指腸液のタンパク質分解活性を破壊できた（図２３のレーン９参照）。
【０１７６】
十二指腸タンパク質分解活性に及ぼすプロテアーゼ阻害剤の効果。  十二指腸液がＢＭＰ−６を分解する能力にいくつかのプロテアーゼ阻害剤が及ぼす効果を試験した。様々な他のプロテアーゼ阻害剤の存在下および不在下であることを除いては上記のように、十二指腸液と共にＢＭＰ−６をインキュベートした。上記のように、非還元条件（ＤＴＴなし）でポリアクリルアミドゲルを用いて反応生成物を電気泳動してＢＭＰ−６ダイマーを追跡し、還元条件（＋ＤＴＴ）でＢＭＰ−６モノマーを追跡した。次に、ウェスタン免疫ブロットによりゲルを分析した。図２４のウェスタン免疫ブロットに結果を示す（レーン１はＢＭＰ−６ダイマーを示し、レーン７はＢＭＰ−６モノマーを示し、レーン６は標準分子量マーカーを示す）。図２４のレーン１〜５は、非還元条件（ＤＴＴなし）での結果を示し、レーン９〜１１は還元条件（＋ＤＴＴ）での結果を示す。十二指腸液１μＬと共にインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物をそれぞれレーン２および８に示す。十二指腸液１μＬおよびキモスタチン（キモトリプシン特異的阻害剤、１μＬ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州、米国）１μＬと共にインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物を、それぞれレーン３および９に示す。十二指腸液１μＬおよびダイズトリプシン阻害剤１μＬと共にインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物をレーン４および１０に示し、十二指腸液１μＬおよびアプロチニン（ウシ膵臓トリプシン阻害剤またはＢＰＴＩとも呼ばれる、広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）１μＬと共にインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物をレーン５および１１に示す。ＢＭＰ−６ダイマー（レーン３）またはＢＭＰ−６モノマー（レーン９）の保存により示されるように、図２４の結果は、キモスタチンだけがＢＭＰ−６のタンパク質分解を防御したことを示す。
【０１７７】
データは、キモトリプシンが十二指腸におけるＢＭＰ−６のタンパク質分解の主な原因であることを示す。
【０１７８】
十二指腸キモトリプシン介在性のＢＭＰ−６分解に及ぼすｐＨ改変の効果。  上記研究は、キモトリプシンが十二指腸液と共にインキュベートしたときのＢＭＰ−６の分解を主に担う酵素であることを示している。十二指腸キモトリプシンのタンパク質分解活性に及ぼすｐＨの効果も試験した。様々なｐＨ値でインキュベーションを実施したことを除いて上記のように、十二指腸液と共にＢＭＰ−６をインキュベートした。ポリアクリルアミドゲルを用いて反応生成物を電気泳動させ、それを次に上記のようにウェスタン免疫ブロットにより分析した。図２５のウェスタン免疫ブロットに結果を示す（レーン１は分子量標準を示し、レーン２はＢＭＰ−６モノマー単独を示し、レーン６はＢＭＰ−６ダイマー単独を示す）。図２５のレーン２〜５を還元条件（＋ＤＴＴ）で流してＢＭＰ−６モノマーを追跡し、レーン６〜９は非還元条件（ＤＴＴなし）で流してＢＭＰ−６ダイマーを追跡した。ｐＨ７で十二指腸液と共にインキュベートしたＢＭＰ−６の反応生成物を図２５のレーン３および７に示す。ｐＨ４で実施した類似のインキュベーションからの反応生成物をレーン４および８に示し、ｐＨ５で実施したインキュベーションからの反応生成物をレーン５および９に示す。結果は、十二指腸液によるＢＭＰ−６（モノマーおよびダイマー）のタンパク質分解が、ｐＨが７（レーン３および７）から５（レーン５および９）から４（レーン４および８）に減少するにつれ反応混合物中で漸減したことを明らかに示す。これは、十二指腸キモトリプシンの公知のｐＨ感受性と一致する。
【０１７９】
実施例８．  高齢卵巣切除ラットにおける骨に及ぼすＢＭＰ−６および酵素阻害剤の経口および十二指腸適用のｉｎ  ｖｉｖｏ効果
胃ペプシンおよび十二指腸キモトリプシンによる分解から防護した場合に、ラット骨粗鬆症モデルにおいてＢＭＰ−６が消化管に沿って効果的に吸収されて骨塩密度（ＢＭＤ）を回復および改善するかどうかを決定するために、本研究を行った。
【０１８０】
６か月齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを卵巣切除（ＯＶＸ）し、６か月間そのままにして、ＢＭＤを減少させた。十二指腸内（ｉ．ｄ．）投与または胃管により動物にＢＭＰ−６の投与を受けさせた。以下の処置群に従って、卵巣切除の６か月後の１２月齢で治療を開始して３週間継続した。
群：
群１．  偽手術（ｎ＝１５）
群２．  ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液、ｐＨ３．５、ｉ．ｄ．（ｎ＝１０）
群３．  ５００μｇ／ｋｇ  ＢＭＰ−６、キモスタチン２０μｇ、アプロチニン２０μｇ、ｐＨ７．０、ｉ．ｄ．注射、週１回で処置したＯＶＸ（ｎ＝１４）
群４．  ５００μｇ／ｋｇ  ＢＭＰ−６、キモスタチン２０μｇ、アプロチニン２０μｇ、ｐＨ３．５、ｉ．ｄ．注射、週１回で処置したＯＶＸ（ｎ＝１４）
群５．  ３００μｇ／ｋｇ（ｂ．ｗ．）ＢＭＰ−６、キモスタチン５０μｇ、アプロチニン５０μｇ、ペプスタチン５０μｇ、ｐＨ３．５、胃管を用いたｏｓデリバリー、週３回で処置したＯＶＸ（ｎ＝１４）
【０１８１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ骨塩密度（ＢＭＤ）
上記プロテアーゼ阻害研究に基づき、本研究におけるアプロチニンの存在は、胃または十二指腸のタンパク質分解からＢＭＰ−６を防御するのに重大な役割を果たさないとみなされた。治療の開始時および治療後３週間目にｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＭＤを監視した。ＢＭＰ−６で処置した全ての動物が、治療の３週間後にＯＶＸ動物に比べて高い後肢ＢＭＤ値を示した。
【０１８２】
処置群１〜５に関するＢＭＤの変化を図２６および２７に示す。図２６は、３週間の処置期間の過程にわたる結果を示す。図２７は、処置期間の終了までの様々な処置群の動物で達成された最終ＢＭＤ値を比較したものである。処置群３、４、および５で同様の結果が観察された。ｐＨ３．５でプロテアーゼ阻害剤と共にＢＭＰ−６のｉ．ｄ．投与を受けた群４の動物は、酢酸緩衝液単独の投与を受けた群２のＯＶＸ対照動物よりも７．１％高い後肢ＢＭＤ値を有した。群３、４、および５の動物は、群１の偽手術動物よりも幾分高いＢＭＤ値も示した。３週間目に、プロテアーゼ阻害剤と組み合わせてＢＭＰ−６の投与を受けた全ての群（すなわち群３、４、５）は、酢酸緩衝液単独の投与を受けた群２のＯＶＸ動物に比べて後肢のＢＭＤ値に統計的に有意な増加を示し、例えば群３についてはＰ＜０．００５であり、群４および５についてはＰ＜０．０５であった（図２６および２７参照）。
【０１８３】
胃ペプシンおよび十二指腸キモトリプシンのタンパク質分解活性を阻害した場合に、経口投与したＢＭＰ−６が消化管に沿って効果的に吸収され、重大な骨での骨塩密度を顕著に回復させ、増加さえさせて、骨粗鬆症を効果的に処置することをデータは示している。
【０１８４】
実施例９．  皮下骨ペレット（マトリックス）における骨形成に及ぼす他の骨形態形成タンパク質の十二指腸適用の効果
本研究は、上記実施例４の皮下植込み骨ペレット（マトリックス）アッセイを使用して、骨形成に及ぼすＢＭＰ−７および軟骨由来形態形成タンパク質−２（ＣＤＭＰ−２、ＢＭＰ−１３）の十二指腸適用の効果を調べた。本アッセイでは、脱塩および抽出した骨マトリックスを骨形成の代用マーカーとして皮下に植込む。
【０１８５】
骨ペレット。  骨ペレット調製のためのドナーは、２０週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットであった。屠殺後に大腿骨および脛骨の骨幹を採取してペレットを作成した。塩素酸および尿素を添加して骨を調製した。皮下に植込んだ骨ペレットでは、新骨は自然形成しない。
【０１８６】
動物および処置プロトコール。  体重約２００ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを手術に供した。骨ペレットを皮下の腋窩領域に植込んだ。動物を以下の群に分け、１群あたり４個のペレットを植込んだ。
群１．  対照動物（ｎ＝４）
群２．  ＣＤＭＰ−２（ＢＭＰ−１３）、５００μｇ／ｋｇ＋酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ＝３．５）、２０μｇキモスタチン、２０μｇアプロチニン、ｉ．ｄ．（５００μＬ）（ｎ＝３）
群３．  ＢＭＰ−７、５００μｇ／ｋｇ＋酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ＝３．５）、２０μｇキモスタチン、２０μｇアプロチニン、ｉ．ｄ（５００μＬ）（ｎ＝３）
【０１８７】
骨ペレット植込みの６時間（ｈ）および２５ｈ後の２回、動物の十二指腸に直接注射した。手術の１５日後に動物を屠殺して、組織分析用に骨ペレットを採取した。
【０１８８】
組織分析。  骨ペレットを７０％アルコール中で固定し、脱灰し、パラフィンに包埋した。切片をトルイジンブルーで染色した。新骨の形成の存在下でペレットを陽性とみなした。
【０１８９】
結果
下記表３に示すように、ＣＤＭＰ−２（ＢＭＰ−１３）およびＢＭＰ−７のｉ．ｄ．投与を受けている動物は皮下骨ペレットに新骨形成を示した。これは、腸キモトリプシン分解から防御した場合に、両タンパク質が骨形成に全身作用を及ぼすのに十分な量で胃腸系を通過することができることを示唆している。対照動物は骨ペレットにおける骨誘導の徴候を示さなかった。
【０１９０】
【表３】
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【０１９１】
上記本文で引用した全ての特許、出願、および参考文献は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１９２】
本明細書に記載した他の変形形態および実施形態は、本発明の開示または添付の特許請求の範囲から逸脱することなしに、当業者に今や明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】骨粗鬆症ラットモデルにおけるＢＭＰ−６の静脈内（ｉ．ｖ．）投与を用いた研究結果のグラフである。
【図２】処置の開始から１２週目での全処置群における骨粗鬆症ラットモデル動物の後肢でのＢＭＤ値を示す棒グラフである。
【図３】処置の開始から１２週目での動物の腰椎に関するＢＭＤ値を示す棒グラフである。
【図４】屠殺後の動物の大腿骨遠位部のｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＥＸＡ分析によりＢＭＤ値を決定した研究結果の棒グラフである。
【図５】選ばれた処置群の動物の大腿骨遠位部における骨塩面積（ＢＭＡ）の棒グラフである。
【図６】処置群１（偽手術）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ）、６（エストラジオールで処置したＯＶＸ）、および７（エストラジオール＋ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ）における動物の大腿骨遠位部における骨容量／骨梁容量比（ＢＶ／ＴＶ）に関する棒グラフである。
【図７】処置群１（偽手術）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ）、６（エストラジオール単独で処置したＯＶＸ）、および７（エストラジオール＋ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ）における動物に関する骨梁幅（ｍｍ）に関する棒グラフである。
【図８】処置群１（偽手術）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、および３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の、動物の大腿骨遠位骨幹端部（ＤＦＭ）の骨髄腔における海綿骨の最大荷重（「Ｎ」）として表現した押込試験に関する棒グラフである。
【図９】処置群１（偽手術）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、および３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の、動物の仕事（「Ｗ、ミリジュールｍＪ」）として表現した大腿骨骨幹中央部の３点曲げ試験の吸収エネルギーパラメータに関する棒グラフである。
【図１０】処置群１（偽手術）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、および３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の、動物のミリジュール／ｍ３（ｍＪ／ｍ３）として表現した大腿骨骨幹中央部の３点曲げ試験の靭性（導変数）に関する棒グラフである。
【図１１】処置群１（偽手術）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）、および６（エストラジオール単独で処置したＯＶＸ）の動物の大腿骨遠位部の組織形態分析に基づく骨梁容量に対する骨容量の比（ＢＶ／ＴＶ）の棒グラフである。
【図１２】処置群１（偽手術）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）、および６（エストラジオール単独で処置したＯＶＸ）の動物の大腿骨遠位部の石灰化速度（「ＭＡＲ」、μｍ／ｄａｙ）を測定する動的組織形態分析に基づくＢＶ／ＴＶ値の棒グラフである。
【図１３】処置群１（偽手術、ＯＶＸなし）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独）、３（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、３回／週）、４（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、１回／週）、５（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、３回／週）における高齢（２歳１か月齢）、卵巣切除（ＯＶＸ）ラットの後肢に関するＢＭＤ値の棒グラフである。
【図１４】処置群１（偽手術、三角）、２（ＯＶＸ対照、酢酸緩衝液単独、四角）、および５（ＢＭＰ−６で処置したＯＶＸ、１μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、３回／週、菱形）における処置時間（週）の関数としての動物後肢ＢＭＤ値のグラフである。
【図１５】年齢および経路（すなわち経口）の関数としての、経口投与したＢＭＰ−６に対するラットに吸収されたＢＭＰ−６の率を示すグラフである。
【図１６】動物１（酢酸緩衝液中のＢＭＰ−６、ｐＨ３）、動物２（ＢＭＰ−６、酢酸緩衝液、ｐＨ３、タウロデオキシコール酸ナトリウム（１ｍｇ）、およびＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリド（１ｍｇ））、および動物３（ＢＭＰ−６、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７、タウロデオキシコール酸ナトリウム（１ｍｇ）、およびＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリド（１ｍｇ））に吸収された、十二指腸投与したＢＭＰ−６の率の棒グラフである。
【図１７】処置群１（ＢＭＰ−６、ｉ．ｄ．、酢酸緩衝液、ｐＨ４）、２（ＢＭＰ−６、ｉ．ｄ．、酢酸緩衝液、ｐＨ３、タウロデオキシコール酸１ｍｇ、ＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリド１ｍｇ）、３（ＢＭＰ−６、ｉ．ｄ．、酢酸緩衝液、ｐＨ３、タウロデオキシコール酸１ｍｇ、ＤＬ−ラウロイルカルニチンクロリド１ｍｇ、ジヘプタノイルホスファチジルコリン１．５ｍｇ）、４（ＢＭＰ−６、ｉ．ｄ．、酢酸緩衝液、ｐＨ３、ジヘプタノイルホスファチジルコリン１．５ｍｇ）、および５（ＢＭＰ−６、ｉ．ｖ．、酢酸緩衝液、ｐＨ４）における動物に関する静脈内用量に対する率として表現した、十二指腸内（ｉ．ｄ．）投与したＢＭＰ−６の吸収を示す棒グラフである。
【図１８】非緩衝性インキュベーション培地１（図１８Ａ）または緩衝性（ｐＨ７．４）インキュベーション培地２（図１８Ｂ）中で０および９０分間インキュベートした、反転腸管系における粘膜（Ｍ、外側）から漿膜（Ｓ、内側）表面への９９ｍＴｃ標識ＢＭＰ−６の輸送研究の（１分間あたり１００万カウント単位の）結果を示す棒グラフである。
【図１９】様々な反応からの消化生成物をジチオトレイトールで還元して、ＢＭＰ−６モノマーを放出させ、電気泳動し、クマシーブルーで染色したものを示すポリアクリルアミドゲルである。
【図２０】様々な反応からの消化生成物をジチオトレイトールで還元して、ＢＭＰ−６モノマーを放出させ、電気泳動し、クマシーブルーで染色したものを示すポリアクリルアミドゲルである。
【図２１】様々な反応からの消化生成物を電気泳動し、免疫検出（染色）したものを示すポリアクリルアミドゲルのウェスタン免疫ブロットである。
【図２２】様々な反応からの消化生成物を電気泳動して免疫検出（染色）したものを示す、ポリアクリルアミドゲルのウェスタン免疫ブロットである。
【図２３】様々な反応からの消化生成物を電気泳動して免疫検出（染色）したものを示す、ポリアクリルアミドゲルのウェスタン免疫ブロットである。
【図２４】様々な反応混合物からの消化生成物を電気泳動して免疫検出（染色）したものを示す、ポリアクリルアミドゲルのウェスタン免疫ブロットである。
【図２５】様々な反応混合物からの消化生成物を電気泳動して免疫検出（染色）したものを示す、ポリアクリルアミドゲルのウェスタン免疫ブロットである。
【図２６】骨粗鬆症ラットモデルにおけるＢＭＰ−６の経腸投与を用いた研究の結果のグラフである。
【図２７】３週間処置を受けた後の３週目での、骨粗鬆症のラットモデル動物の後肢におけるＢＭＤ値を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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