(57)【要約】  本発明は、低酸素誘導性因子水酸化酵素の不活化による低酸素誘導性遺伝子発現の活性化における、内因性２−オキソ酸分子およびその誘導体の特有の分子的特徴の解明に関する。本発明は、組織血管新生を誘導し、貧血を治療し、卒中および心臓発作に対する耐性を誘導し、組織治癒を向上させ、臓器移植を向上させるために使用できる物質を同定する。【選択図】  図１
2007510734.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞においてＨＩＦ−１介在性遺伝子発現を活性化する方法であって、前記細胞に、ピルビン酸、オキサロ酢酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケトイソカプロン酸、α−ケト−β−メチル吉草酸、ならびにそれらのメチルエステル、それらのエチルエステルおよびそれらのグリセロールエステルからなる群から選択される、少なくとも１つの２−オキソ酸を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記哺乳類がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＩＦ−１介在性遺伝子発現が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、グルコース輸送体アイソフォーム３（Ｇｌｕｔ−３）、アルドラーゼＡ（ａｌｄｏＡ）およびエリスロポエチンをコードする遺伝子からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子の発現の活性化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記２−オキソ酸が、前記細胞においてＨＩＦ−１の水酸化を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記水酸化が、プロリルヒドロキシラーゼまたはアスパラギンヒドロキシラーゼによって介在される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
低酸素適応を必要とする哺乳類において、そのような適応を誘導する方法であって、前記哺乳類に、ピルビン酸、オキサロ酢酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケトイソカプロン酸、α−ケト−β−メチル吉草酸、ならびにそれらのメチルエステル、それらのエチルエステルおよびそれらのグリセロールエステルからなる群から選択される、少なくとも１つの２−オキソ酸を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項７】
前記哺乳類がヒトである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒトが心臓発作、卒中または妊娠子癇を起こす恐れがある、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒトが喘息、糖尿病、癲癇、貧血または心不整脈に罹患している、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒトが高高度または煙吸入に曝露されていた、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳類において組織の新血管新生を促進する方法であって、前記患者に、ピルビン酸、オキサロ酢酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケトイソカプロン酸、α−ケト−β−メチル吉草酸、ならびにそれらのメチルエステル、それらのエチルエステルおよびそれらのグリセロールエステルからなる群から選択される、少なくとも１つの２−オキソ酸を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記哺乳類がヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒトがアテローム性動脈硬化症、脈管炎、静脈炎および血栓症からなる群から選択される末梢血管疾患を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒトが創傷または熱傷の治癒を必要としている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物を局所適用する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
胎児において適切な酸素ホメオスタシスの発達を促進する方法であって、妊娠しているヒトに、ピルビン酸、オキサロ酢酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケトイソカプロン酸、α−ケト−β−メチル吉草酸、ならびにそれらのメチルエステル、それらのエチルエステルおよびそれらのグリセロールエステルからなる群から選択される、少なくとも１つの２−オキソ酸を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項１７】
前記の妊娠しているヒトに早産の恐れがある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳類を放射線から保護する方法であって、前記哺乳類に、ピルビン酸、オキサロ酢酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケトイソカプロン酸、α−ケト−β−メチル吉草酸、ならびにそれらのメチルエステル、それらのエチルエステルおよびそれらのグリセロールエステルからなる群から選択される、少なくとも１つの２−オキソ酸を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項１９】
放射線への曝露の前に、放射線への曝露の際に、または放射線への曝露の後に前記組成物を投与する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
放射線への曝露の１時間後に前記組成物を投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
放射線への曝露の４時間後に前記組成物を投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
放射線への曝露の２４時間後に前記組成物を投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳類がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物の前記哺乳類への前記投与が、経口投与、粘膜投与、経眼投与、皮下注射、経皮投与およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも１つの方法によって達成される、請求項１、６、１１、１６または１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記粘膜投与が、口腔内、気管内、鼻腔内、咽頭内、直腸内、舌下、膣内およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記口腔内、気管内、鼻腔内、咽頭内、舌下およびそれらの組合せ投与用に、前記組成物がエマルション、ガム、トローチ剤、スプレー、錠剤および包接複合体からなる群から選択される物理的な形である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記直腸および前記膣内投与用に、前記組成物がクリーム剤、潅注液、浣腸剤および坐剤からなる群から選択される物理的な形である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記鼻腔内投与用の前記組成物が、吸入用粉末および鼻腔用スプレーからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記経口投与用の前記組成物が、食品に混入したもの、栄養補助食品に混入したもの、飲料または水もしくはその他の液体と混合される粉末に混入したもの、チュアブルの錠剤もしくはカプセル剤、飲み込める錠剤、カプセル剤、カプレット剤もしくはソフトゲル、キューメルトストリップ（Ｑ−ｍｅｌｔ  ｓｔｒｉｐ）、棒状剤、トローチ剤およびガムからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記経眼投与用の前記組成物が、懸濁液、溶液およびスプレーから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記皮下投与用の前記組成物が、医薬学的に許容される注射可能な担体に混入したものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
経皮投与用の前記組成物が、外用クリームの物理的な形、または接着性パッチの物理的形である親油性担体に混入したものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
約１時間〜約４８時間の範囲の時間間隔で前記組成物を反復投与する、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（政府支援）
ＮＩＨがＮＳ３７８１４を付与し、国防総省がＭＤＡ９０５−９２−Ｚ−０００３を付与している。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、概して、血流および酸素供給が減少した条件において生存を向上させる、ヒト組織における遺伝子発現の変化に関する。本発明は、具体的には、２−オキソ酸およびその誘導体による低酸素誘導性遺伝子発現の薬理学的活性化に関する。本願は、参照によりその全文を本明細書に援用する、米国仮出願第６０／５１７，９１８号に関する。
【背景技術】
【０００３】
高所適応との関連で最も知られているであろう、低酸素レベルに適応する能力は、生存にとって重要なことである。細胞は、新しい赤血球合成（赤血球新生）および新しい血管の発達（脈管形成）を介して、より良い酸素送達を促進するタンパク質をコードする遺伝子のスイッチを入れることによって低酸素に適応する。その他の低酸素刺激性遺伝子産物は、グルコース取り込みを刺激し、嫌気性グルコース代謝を増強し、いくつかの細胞生存機構を誘導する（表１）。アスリートは、その生理学的能力を向上させるために、長い間このような低酸素適応を十分に利用してきた。さらに、亜致死の低酸素に対する細胞の周到な適応はまた、卒中および心臓発作からの組織損傷を減少させることがわかっている。このような設定における低酸素負荷は、低酸素プレコンディショニングと呼ばれ、多数の動物研究で、虚血性傷害を減少させる最も強力な戦略の１つを構成することがわかっている。虚血性傷害に対する、低酸素プレコンディショニング介在性保護は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、心臓、脳、脊髄、網膜、肝臓、肺および骨格筋をはじめ種々の臓器系で起こるとわかっている（Hawaleshkaら（1998）Can. J. Anaesth. 45、670〜82頁）。虚血性または低酸素プレコンディショニングはまた、移植に用いられる提供された組織の生存延長および移植効率において有用である。
【０００４】
低酸素が生存促進遺伝子の発現を誘導する機構は急速に明らかになってきつつある。低酸素（酸素レベル５％未満）は遺伝子発現を、主に転写因子ＨＩＦ−１（低酸素誘導性因子−１）を介して調節する（Semenza（2001）Trends Mol. Med. 7、345〜350頁）。ＨＩＦ−１α（ＨＩＦ−ｌａ）およびＨＩＦ−１β（ＨＩＦ−ｌｂ）と呼ばれる、２種の異なるタンパク質が、この転写因子を構成し、ＨＩＦ−ｌａ成分のレベルは酸素圧によって特異的に調節される。ＨＩＦ−ｌａレベルの調節はＨＩＦ−ｌａタンパク質の分解を直接的に制御する新規酸素感受性機構に関連する（図１）。ＨＩＦ−ｌａとＨＩＦ−ｌｂの双方とも身体のほとんどの細胞で構成的に合成される。しかし、ＨＩＦ−１ａタンパク質は酸素の存在下で連続的に分解される。ＨＩＦ−１−α−プロリルヒドロキシラーゼとして知られる、新しく発見された酵素ファミリーは、ＨＩＦ−１ａの酸素依存性分解を調節する。これらの酵素は、ＨＩＦ−１ａタンパク質中の重要なプロリン残基の酸素依存性水酸化を触媒する。この修飾が、次には、ＨＩＦ−１タンパク質のユビキチン化およびプロテアソーム分解を対象とする。もう１つの最近同定されたＨＩＦ−１ａアスパラギンヒドロキシラーゼ酵素活性も、正常な酸素圧下でのＨＩＦ−１の転写活性化能力の阻害に関与していると思われる。ＨＩＦ−１ａアスパラギンヒドロキシラーゼは、他の研究者らからはＨＩＦまたはＦＩＨ−１を阻害する因子と呼ばれてきた。ＨＰＨおよびＦＩＨ−１はすべて、その活性のためにいくつかの補因子：酸素、鉄、アスコルビン酸および２−オキソグルタル酸を必要とする（図２）。したがって、酸素の不在下では、ＨＩＦ−１は水酸化または分解されず、結果として、その濃度が劇的に増加する（Semenza（2001）Trends Mol. Med. 7、345〜350頁）。これによってＨＩＦ−１ａおよびβサブユニットが二量化し、核に転位し、低酸素レベル下での生存を促進するいくつかの遺伝子の転写を活性化することが可能となる（図１）。また、ＨＰＨ酵素機構の発見によって、デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）などの鉄キレート剤が、何故、ＨＩＦ−１を活性化し、低酸素によって誘導されるものと同様の遺伝子のスイッチを入れることができるのかが説明される。ＨＰＨ中の鉄部位について恐らく競合するであろうコバルトおよびニッケル塩も、ＨＩＦ−１および低酸素遺伝子発現の調節において低酸素に似た状態を呈する。ＤＦＯとコバルトは双方とも、疾病の動物モデルにおいて低酸素プレコンディショニング介在性細胞保護を実施するために効果的に用いられてきた（Jonesら、（2001）J. Cereb. Blood Flow Metab. 21、1105〜1114頁）。これらの薬剤の毒性によりヒトにおけるその使用は不可能となっているが、低酸素で見られるものと同様の保護的プレコンディショニングを誘導するその能力は、低酸素以外の手段によるＨＩＦ−１ａレベルの薬理学的処置は強力な治療戦略であるということを実証する。最近、その他の補因子部位での分子間相互作用も、ＨＰＨ活性、ＨＩＦ−１ａレベル、および低酸素誘導性遺伝子の発現を調節するとわかった。したがって、２−オキソグルタル酸の人工類似体、例えばＮ−オキサリルグリシン（ＮＯＧ）または細胞透過性ジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ）は、ＨＰＨ���よびＦＩＨ−１の活性をブロックし、その結果、ＨＩＦ介在性遺伝子発現の活性化が可能になることがわかった（Warneckeら（2003）FASEB J. 17、1186〜1188頁）。しかし、これらの人工的な２−オキソグルタル酸類似体は、当初コラーゲン合成に関与する酵素であるプロコラーゲンプロリンヒドロキシラーゼを阻害するよう意図されたものであるため、ＨＰＨまたはＦＩＨ−１の阻害に特異的ではない。
【０００５】
ＨＰＨ、ＦＩＨ−１およびプロコラーゲンプロリンヒドロキシラーゼはすべて、鉄および２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼとして知られる、酵素の大きな部類に属している。これらの酵素は自然界に広く生じ、有益な生物学的水酸化を行っている（Hanauske-Abelら（2003）Curr. Med. Chem. 10、1005〜1019頁）。これらの酵素の反応サイクルを図２に表す。これらの酵素の１つの特性は、それらは同時に触媒能がなくなることである。このことは、鉄介在性酸化を触媒する結果として、これらの酵素が重要なアミノ酸残基で酸化されるか、鉄のレドックス状態が、継続した反応サイクルを実施する間に役に立たないものになる、のいずれかを意味する。同時に触媒能がなくなることは、アスコルビン酸によって防ぐか戻すことができる（図２）。最近、多数の細胞株が顕著なタンパク質レベルのＨＩＦ−１ａを発現し、低酸素でない状態でＨＩＦ介在性遺伝子の発現を示し、これがアスコルビン酸によって戻せることがわかった（Knowlesら（2003）Cancer Res. 63、1764〜1768頁）。このことは、多数の細胞では、ＨＰＨおよびＦＩＨ−１は、不活性型で存在する場合もあるし、またはアスコルビン酸によって戻せるいくつかの機構によって不活性にされる場合もあるということを示唆する。これまでのところ、この現象の明確な理解はなされておらず、ＨＰＨおよびＦＩＨ−１不活化機構の可能性を活用する薬学的アプローチは全く開発されていない。
【０００６】
特定の薬理作用のある物質、例えば鉄キレート剤、鉄置換金属、または２−オキソグルタル酸アンタゴニスト、例えばＮＯＧもしくはＤＭＯＧが、２−オキソグルタル酸依存性酵素の一般的な阻害剤である。このファミリーの酵素はまた、様々な天然２−オキソ酸およびその誘導体に対する感受性が異なっている（Hanauske-Abelら（2003）Curr. Med. Chem. 10、1005〜1019頁、Sze-Fong Ngら（1991）J. Biol. Chem. 266、1526〜1533頁、Kauleら（1998）Matrix Biol. 17、205〜212頁）。したがって、ピルビン酸はヒトではコラーゲン合成酵素を阻害しないが（Cerbon-Ambrizら（1987）Lab Invest. 57、392〜396頁）、特定の水面下に生息する虫ではこのような酵素を阻害する（Kauleら（1998）Matrix Biol. 17、205〜212頁）。コラーゲン合成の阻害のために開発された、２−オキソグルタル酸由来阻害剤は、ＨＰＨおよびＦＩＨ−１を阻害するが、ＨＰＨおよびＦＩＨ−１を阻害する２−オキソ酸分子の具体的な化学的必要条件はまだ解明されていない。グルコース代謝により２−オキソ酸、例えばピルビン酸およびオキサロ酢酸が生じるが、これらは２−オキソグルタル酸と構造的に関連がある（図３）。また、アミノ酸代謝によって２−オキソグルタル酸と構造的に類似する分枝鎖２−オキソ酸が生じる。これらの天然２−オキソ酸はＨＰＨおよびＦＩＨ−１の生体調節因子である可能性がある。これらの物質およびその誘導体を用いて、低酸素遺伝子発現を調節する新しい薬剤物質を開発することも可能である。
【発明の開示】
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、低酸素誘導性因子水酸化酵素を不活化することによる低酸素誘導性遺伝子発現を活性化するための、内因性２−オキソ酸分子およびその誘導体の特有の分子の特徴の解明に関する。本発明は、組織の血管新生を誘導し、貧血を治療し、卒中および心臓発作に対する耐性を誘導し、組織治癒を向上させ、放射線傷害に対して保護し、免疫機能を向上させ、臓器移植を向上させるために使用できる物質を同定する。
【０００８】
本発明の一実施形態は、細胞においてＨＩＦ−１ａ介在性遺伝子発現を活性化する方法に関し、これは前記細胞に、α−ケトイソ吉草酸、α−ケトイソカプロン酸、α−ケト−β−メチル吉草酸、オキサロ酢酸、ならびにそれらのメチルエステル、それらのエチルエステル、それらのグリセロールエステルおよびブタンジオールジピルベートからなる群から選択される、少なくとも１つの２−オキソ酸を含む組成物を投与することを含む。一実施形態では、前記ＨＩＦ−１ａ介在性遺伝子発現は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、グルコース輸送体アイソフォーム３（Ｇｌｕｔ−３）、アルドラーゼＡ（ａｌｄｏＡ）およびエリスロポエチンをコードする遺伝子からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子の発現の活性化を含む。もう１つの実施形態では、前記２−オキソ酸は前記細胞においてＨＩＦ−１ａの水酸化を阻害する。さらなる実施形態では、前記水酸化はプロリルヒドロキシラーゼまたはアスパラギンヒドロキシラーゼによって介在される。
【０００９】
本発明のもう１つの実施形態は、低酸素適応を必要とする哺乳類においてそのような適応を誘発する方法に関し、これは前記哺乳類に、ピルビン酸、オキサロ酢酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケトイソカプロン酸、α−ケト−β−メチル吉草酸、ならびにそれらのメチルエステル、それらのエチルエステルおよびそれらのグリセロールエステルからなる群から選択される、少なくとも１つの２−オキソ酸を含む組成物を投与することを含む。本発明のもう１つの実施形態では、心臓発作、卒中または妊娠子癇を起こす恐れがあるヒトにおいて前記低酸素適応を誘発する。さらなる実施形態では、喘息、糖尿病、癲癇、貧血または心不整脈に罹患しているヒトにおいて前記低酸素適応を誘発する。もう１つの実施形態では、高高度または煙吸入に曝露されていたヒトにおいて前記低酸素適応を誘発する。
【００１０】
本発明のさらなる一実施形態は、哺乳類において組織の新血管新生を促進する方法に関し、これは前記患者に、ピルビン酸、オキサロ酢酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケトイソカプロン酸、α−ケト−β−メチル吉草酸、オキサロ酢酸、ならびにそれらのメチルエステル、それらのエチルエステルおよびそれらのグリセロールエステルからなる群から選択される、少なくとも１つの２−オキソ酸を含む組成物を投与することを含む。本発明の一実施形態では、アテローム性動脈硬化症、脈管炎、静脈炎および血栓症からなる群から選択される末梢血管疾患を有するヒトにおいて前記の組織の血管新生を促進する。本発明のもう１つの実施形態では、創傷治癒または熱傷治癒を必要とするヒトにおいて前記の組織の血管新生を促進する。
【００１１】
本発明のもう１つの実施形態は、胎児において適切な酸素ホメオスタシスの発達を促進する方法に関し、これは妊娠しているヒトに、ピルビン酸、オキサロ酢酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケトイソカプロン酸、α−ケト−β−メチル吉草酸、オキサロ酢酸、ならびにそれらのメチルエステル、それらのエチルエステルおよびそのグリセロールエステからなる群から選択される、少なくとも１つの２−オキソ酸を含む組成物を投与することを含む。本発明の一実施形態では、早産の恐れがある前記の妊娠しているヒトにおいて、胎児の適切な酸素ホメオスタシスの発達を促進する。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態は、哺乳類を放射線傷害から保護する方法に関し、これは前記哺乳類に、ピルビン酸、オキサロ酢酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケトイソカプロン酸、α−ケト−β−メチル吉草酸、ならびにそれらのメチルエステル、それらのエチルエステル、およびそれらのグリセロールエステルからなる群から選択される、少なくとも１つの２−オキソ酸を含む組成物を投与することを含む。本発明の一実施形態では、前記組成物を、放射線への曝露の前、放射線への曝露の際、または放射線への曝露の後に予防的に投与する。
【００１３】
前記の本発明のすべての実施形態において、前記組成物は経口投与、粘膜投与、経眼投与、皮下注射、経皮投与およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも１つの方法によって投与する。一般に、前記組成物の投与は、約１時間〜約４８時間の範囲の時間間隔で反復する。
（詳細な説明）
【００１４】
本発明は、特定の内因性２−オキソ酸が正常酸素圧（２０〜２１％酸素）条件下のＨＩＦ−１レベルの調節に関与しているという発見に由来するものである。具体的には、内因性２−オキソ酸、ピルビン酸およびオキサロ酢酸が、ＨＩＦ水酸化酵素中の２−オキソグルタル酸結合部位について競合し、その結果その不活化をもたらす。これによって、酸素の存在下でさえ、長期間持続するＨＩＦ−１ａ蓄積およびＨＩＦ−１ａ介在性遺伝子発現の活性化がもたらされる。
【００１５】
定義
別段の定義のない限り、本明細書に用いたすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または同等の方法および材料はいずれも、本発明の実施または試験に使用できるが、好ましい方法および材料が記載されている。
【００１６】
本明細書において、用語「結合」とは、分子相互の、例えば、それだけには限らないが、酵素と基質、タンパク質とタンパク質、転写因子タンパク質とＤＮＡおよびＤＮＡまたはＲＮＡ鎖とその相補鎖の付着を指す。分子表面の一部の形および化学的性質が相補的であるために結合が生じる。よく使われる比喩として、酵素がどのようにその基質と相互作用するかを説明するために用いられる「鍵と鍵穴」がある。
【００１７】
本明細書において、用語「転写因子」とは、ＤＮＡの特定の調節領域に結合し、遺伝子発現を刺激するいずれかのタンパク質またはタンパク質複合体を指す。例としては、それだけには限らないが、ＨＩＦ−１ａタンパク質が挙げられる。
【００１８】
本明細書において、用語「遺伝子発現」とは、最終的に、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の増加およびタンパク質機能の増強をもたらす、ＤＮＡからのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の産生の増強を指す。
【００１９】
本明細書において、用語「ＨＩＦ−１」または「ＨＩＦ−１タンパク質」とは、先に記載されたように（Wangら（1995）J. Biol. Chem. 270、1230〜1237頁、米国特許第６，５６２，７９９号および同６，２２２，０１８号）ＨＩＦ−１α（ＨＩＦ−１ａ）およびＨＩＦ−１β（ＨＩＦ−ｌｂ）と呼ばれる２種の異なるタンパク質を含む転写因子を指し、すべての既知のアイソフォーム、例えば哺乳類のもの、特に、ヒトＨＩＦ−１を含む。
【００２０】
本明細書において、用語「低酸素」とは５パーセント（％）より低い酸素圧を指す。正常空気は２０〜２１パーセントの酸素、当技術分野で「正常酸素圧」と呼ばれる状態からなる。
【００２１】
本明細書において、用語「治療薬」とは、ＨＩＦ−１ａ水酸化酵素への結合に必要である、２−オキソ酸、例えばピルビン酸およびオキサロ酢酸のコア化学構造を組込むいずれかの組成物を指す。例としては、それだけには限らないが、ピルビン酸およびオキサロ酢酸のメチルエステル、エチルエステルおよびグリセロールエステル、α−ケトイソ吉草酸、α−ケトイソカプロン酸、α−ケト−β−メチル吉草酸、オキサロ酢酸、ならびにそれらのメチルエステル、それらのエチルエステルおよびそれらのグリセロールエステルが挙げられる。その他の例としては、その分解を抑えることによって、ピルビン酸およびオキサロ酢酸組織レベルを上昇させる物質が挙げられる。
【００２２】
使用方法
心臓発作または卒中を起こしやすいものまたは心臓発作後および卒中後の罹病者における低酸素適応の誘導。これら２つの状態は、我々の社会の死亡および身体障害の主要原因に含まれている。今日、心臓発作および卒中を防ぐために利用できる少数の医薬としては、抗高血圧薬、アスピリンおよびその他の抗血小板物質およびコレステロール低下薬が挙げられる。動物実験では、低酸素または虚血プレコンディショニングは、心臓発作および卒中に対して、これらの他のアプローチのすべてよりもはるかに予防的な保護を提供する。さらに、低酸素によって活性化された遺伝子の薬理学的誘導は、それに対して競合品のない、虚血性傷害に対する保護を提供するための新規アプローチおよび別個の機構に相当するため、このようなアプローチは、すべての既存のアプローチを補完する。本発明者らのアプローチはまた、このような傷害からの回復を向上させるためにも必要である。したがって、本発明は、心臓発作もしくは卒中を起こしやすいものまたは心臓発作後および卒中後の罹病者における低酸素適応の誘導方法を包含し、これは本明細書に記載された１つ以上の治療薬を単独または組合せて投与することを含む。
【００２３】
予測可能な卒中の状況における危険を減少させるための予防的治療：心臓バイパス術、脛動脈の動脈内膜切除術、深海ダイビング。卒中再発または心臓発作に対する保護における、２−オキソ酸およびその誘導体の予防的使用に加え、本発明はまた、卒中を起こす相当な危険がある状況において、予防的神経保護の誘導のために利用できる。このように、今日、最もよくある外科手術のうちの２つである、心臓バイパス術または脛動脈の動脈内膜切除術を受けたものは、虚血性脳傷害の相当な発生に見舞われる。したがって、本発明は、これらの患者に、低酸素によって調節される遺伝子を誘導する、２−オキソ酸およびその誘導体を前投与する方法を包含し、有意な保護を提供する。
【００２４】
糖尿病におけるグルコース代謝の改善。糖尿病もまた、我々の社会が直面する主要な医学的問題の１つであり続けている。２型糖尿病は発生率が増加し続けている。高血糖はまた、多数のその他の疾病の危険因子でもある。これまでにＨＩＦ−１ａによって調節されるとわかった十数個程の遺伝子が、グルコース代謝の増強に関与している。これにはグルコースの取り込みだけでなく、重要な調節酵素によるその代謝も含まれる。現在、糖尿病患者においてグルコース代謝を向上させる有効な臨床上の戦略はなく、治療は、インスリン分泌を増強するか、インスリン受容体感受性を高める、のいずれかの物質の使用に限定されている。したがって、本発明は、糖尿病患者においてグルコース輸送体および糖分解酵素の発現をアップレギュレートするための、２−オキソ酸およびその誘導体の使用を包含する。このようなアプローチもまた、すべての既存のアプローチを補完し、したがって、既存の糖尿病治療と併用できる。
【００２５】
何らかの形の血管疾患における虚血組織の新血管新生。卒中および心臓発作からの回復には、組織の新血管新生が必要である場合がある。これは、多数の末梢血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症、脈管炎、静脈炎または血栓症の症例であり得る。現在、組織を薬理学的に再血管新生させる慣例のアプローチはない。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）または繊維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）の組織レベルを高めることを目標とする遺伝子治療アプローチは、主要な競合技術であるが、これらはまだ効果的に実現されてはいない。実際、増強された解糖代謝、詳しくは、乳酸およびピルビン酸の、脈管形成因子の生成を誘導する能力および脈管形成を増強する能力は、１５年以上にわたって知られている（Jensenら（1986）Lab Invest. 54、574〜578頁）。２−オキソ酸の、突出した新血管新生を起こすこの強力な作用は、動物モデルにおいて最近わかった（Leeら（2001）Cancer Res. 61、3290〜3293頁）。こういった長期にわたる観察結果にもかかわらず、この現象の基礎をなす機構を、ＶＥＧＦの発現ならびにＶＥＧＦ受容体がＨＩＦ−１によって調節されると解明したのは本発明者らが最初であった（表１、図１８Ｃ）。
【００２６】
創傷治癒および熱傷治癒の向上。組織の新血管新生および組織増殖は、創傷および熱傷の治癒には不可欠である。２−オキソ酸の局所塗布により、ＨＩＦ−１ａを活性化することによって、脈管形成を促進し、結合組織エレメントおよび上皮細胞の増殖を増強する遺伝子の発現を誘導できた。実際、低酸素によって調節される遺伝子発現は、胎児では突出した創傷再生および成体では創傷修復を果たす（Albinaら（2001）Am. J. Physiol. Cell Physiol.281、C1971〜1977頁、Scheidら（2000）Pediatr. Surg. Int. 16、232〜236頁）。ＨＩＦ−１ａの活性化は、これらの遺伝子のスイッチを入れる際の重要な事象に相当する。したがって、本発明は、ＨＩＦ−１ａ活性化を介して創傷および熱傷治癒を促進するために、絆創膏に混入した、および局所塗布された、２−オキソ酸、例えばピルビン酸、オキサロ酢酸、またはその誘導体の使用を包含する。
【００２７】
貧血の治療。ＨＩＦ−１ａは、最初、エリスロポエチン遺伝子の発現を調節する転写因子として発見された。エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、低酸素に応じて腎臓および肝臓組織によって産生されるとわかっている。ＥＰＯは、骨髄中の赤血球前駆体上のＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）に作用し、赤血球細胞の増殖をもたらす。ＥＰＯは、臨床貧血を改善することにおいてこのように有効であり、今では臨床設定で見られる種々の貧血の治療で慣例的に用いられている。ＨＩＦ−１ａはまた、内因性ＥＰＯ産生の誘導に加え、赤血球前駆体が、酸素を運搬できる成熟赤血球に変わるのを可能にする、トランスフェリンおよびトランスフェリン受容体遺伝子の発現も誘導する。したがって、本発明は、２−オキソ酸、ピルビン酸およびオキサロ酢酸ならびにその誘導体などの治療薬を投与し、ＨＩＦ−１ａ活性化を介して貧血を改善する方法を包含する（図１８Ｄおよび２０Ｅ参照）。２−オキソ酸であるピルビン酸またはオキサロ酢酸の経口摂取は、ヒトには無害であるので、このアプローチはヒトに容易に使用できる。さらに、これらの薬剤の有効性は、投与後に血液ヘマトクリットレベルを測定することによって調べることができる。
【００２８】
高所適応。高高度の空気には、低い高度と同一の酸素のパーセント組成が含まれている。しかし、気圧が低いために、高高度の空気には全体的に少ないガス分子、したがって低い酸素レベルしか含まれていない。頭痛、過換気、倦怠感および死亡などの高所病の症状は、組織への不十分な酸素送達によるものである。したがって、高高度での不十分な酸素には、哺乳類が生存するためにその生理機能を適応させることが必要となる。哺乳類の高所適応は、換気の急激な増加ならびにＨＩＦ−１ａ介在性遺伝子発現の持続的な増加によって主に支配されている（Semenza（2001）Trends Mol. Med. 7、345〜350頁）。このような遺伝子は、同時に身体の細胞の酸素依存性グルコース代謝を改善しながら、血液酸素運搬能および組織酸素送達を向上させることによって、高高度での哺乳類の生理機能を亢進する。低酸素へのヒトの適応を効果的に増強する現在利用できる主要なアプローチは、高度を上げることであり、これによってＨＩＦ−１ａ介在性遺伝子発現を確実することが可能となる。本発明は、高所適応を改善し、促進するための、本明細書で規定される治療薬（すなわち、ピルビン酸またはオキサロ酢酸およびその誘導）の予防的使用を包含するという点で、このアプローチの代替法を提供する。この適用は、高高度を訪れる旅行者または軍人または低い酸素レベルの地域に急速に上がる必要があり得る人物の間でかなり有用である。
【００２９】
煙吸入の予防。消防士は高高度に日常的に入るわけではないが、彼らは、煙吸入および一酸化炭素毒性による予期しない低酸素の急性発作の危険にさらされている。ピルビン酸またはオキサロ酢酸またはその誘導体での予防により、このような個人が低酸素障害を受ける機会を著しく低下させることができ、したがって、これも本発明に包含される。また、このアプローチを用いて、慢性喫煙に伴われる症状（例えば、肺気腫および関連疾患）を示している患者を治療することもできる。
【００３０】
喘息、痙攣および心不整脈の予防。心臓発作または卒中における低酸素適応の誘導と同様に、喘息、癲癇または心不整脈の患者は、組織低酸素の急性発作の危険にさらされている。こういった状態は、重大な低酸素障害または酸素欠乏障害をもたらす可能性がある。したがって、本発明は、このような個体が低酸素障害を受ける機会を減少させるための、ピルビン酸またはオキサロ酢酸またはその誘導体での予防を包含する。
【００３１】
運動能力改善。極めて過酷な有酸素スポーツで競技するアスリートほどＨＩＦ−１ａ介在性遺伝子発現を十分に利用してきた集団はない。実際、どの国のオリンピックトレーニングセンターも、低酸素によって誘導される生理機能の向上を利用するために高高度に位置している。先に記載した、低酸素によって誘導される生理学的変化によって酸素のより有効な利用が可能となり、また運動している身体が無酸素燃料をより効率的に利用することが可能となる。この結果、過酷な有酸素運動または競技の間の持久力が高まる。ピルビン酸は代謝燃料をより多く提供し、能力を増強できるという考えで、長い間これが有酸素運動の際にアスリートによって用いられてきた。しかし、本発明者らの発見によって提示される、これまで知られていなかった見識（図８参照）は、この戦略には欠点があるということを示唆する。高度に有酸素的な運動は、供給が変わらないにもかかわらず酸素に対する要求が増大することによる急性の組織低酸素をもたらす。実際、ピルビン酸および乳酸は、酸素を必要とする反応によるその不十分な代謝のために運動の間に相当蓄積する。したがって、高度に過酷な運動の急性発作の間に多くのピルビン酸が蓄積する。しかし、このような個体では、ピルビン酸ではなく酸素が再び補給されることが必要である。あるいは、慢性の低酸素によって誘導される、細胞代謝の変化および組織機能の改善は、実際に酸素の組織要求を低下させる。さらに、低酸素によって誘発される、血液の酸素運搬能の改善および組織の毛細血管密度の改善が、運動能力の改善の重要な因子であり得る。これらの生理学的変化は、それ自体を発現するのに、およびＨＩＦ−１ａによって調節される遺伝子発現を介して開始されるのに何日もまたは何週間もかかる（Semenza（2001）Trends Mol. Med. 7、345〜350頁）。したがって、運動能力を改善するためのピルビン酸および、またはオキサロ酢酸の効果的利用は、燃料源としてのその明白な役割ではなく、ＨＩＦ−１ａ活性化因子としてのその明白でない役割という本発明者らの発見に焦点を当てなくてはならない。したがって、本発明は、アスリートによる、ＨＩＦ−１ａ介在性遺伝子発現の長期の変化を最大にするための、トレーニングの間のおよび競技の前の、ピルビン酸、オキサロ酢酸、またはその誘導体の慢性的な経口摂取の調節を包含する。その運動能力を改善したいと思うアスリートによるＥＰＯの秘密使用の増加は、運動能力を改善するための、より安全な２−オキソ酸誘導体の使用に対して大きな需要がある可能性を示唆する。
【００３２】
未熟で出生した幼児の生存の向上。早産は、その後成人してから多数の疾病と高度に関連がある。生きるためには適切な酸素ホメオスタシスの発達が不可欠であり、これが起こるにはＨＩＦ−１ａの活性化が不可欠である（Hawaleshkaら（1998）Can. J. Anaesth. 45、670〜82頁）。実際、ＨＩＦ−１ａノックアウトマウスは子宮内で死亡する。したがって、本発明は、早産の危険性が高い妊婦へ、胎児組織においてＨＩＦ−１ａを誘導し、適切な酸素ホメオスタシスの発達を促進し得る、ピルビン酸、オキサロ酢酸またはその誘導体を投与することを包含する。このアプローチはまた、妊娠子癇からくる卒中様エピソードの予防においても有益である。
【００３３】
移植前のドナー臓器の保存。本発明は、採取前の組織ドナーの臓器においてＨＩＦ−１ａを誘導するための、ピルビン酸、オキサロ酢酸またはその誘導体の使用ならびに適切に灌流されない時間の間の臓器の低酸素生存を向上させるための、提供される臓器の保存液へのこれらの物質の添加を包含する。
【００３４】
免疫機能の改善。最近、ＨＩＦ−１ａ遺伝子のノックアウトで免疫活性が劇的に低下することが分かった（Cramerら（2003）Cell Cycle 2、192〜193頁）。したがって、本発明は、それだけには限らないが、ＡＩＤＳおよび電離放射線に対する曝露をはじめとする種々の免疫不全病からの転帰を改善するために、免疫不全個体にピルビン酸およびオキサロ酢酸を投与することを包含する。
【００３５】
放射線照射後のＨＩＦ−１ａ活性化の阻害は、血管破壊の増強の結果として腫瘍の放射線感受性を有意に高める。したがって、本発明は、被験体の放射線傷害に対する予防的保護または治療的治療のための組成物の投与に関する。本発明の一実施形態では、被験体に、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＩＦ−１ａ活性化を増強する化合物からなる治療用組成物を投与する。脈管形成調節因子の分泌増強の結果として、血管放射線が、それだけには限らないが、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をはじめとするサイトカインの分泌のために、減少する。このような化合物は本明細書に記載した２−オキソ酸の種類であることが好ましい。
【００３６】
投与経路は、製剤の投与のために一般に是認されている慣行であればいずれであってもよく、これとしては、それだけには限らないが、粘膜投与、経口消費、経眼投与、皮下注射、経皮投与などが挙げられる。通常、経口投与が好ましい。
【００３７】
組成物の粘膜投与としては、口腔内、気管内、鼻腔内、咽頭、直腸、舌下、膣内などといった経路が挙げられる。口腔内/気管内/咽頭/舌下粘膜を介する投与用に、組成物をエマルション、ガム、トローチ剤、スプレー、錠剤またはシクロデキストリン包接複合体などの包接複合体として製剤できる。鼻腔内投与は、吸入用粉末または鼻腔用スプレーの使用によって実施することが好都合である。直腸および膣内投与には、組成物をクリーム剤、潅注液、浣腸剤または坐剤として製剤してもよい。
【００３８】
組成物の経口消費は組成物を食品または飲料に混入すること、または組成物をチュアブルのもしくは飲み込める錠剤もしくはカプセル剤に製剤することによって達成できる。経眼投与は、組成物を眼への適用に適応した溶液または懸濁液、例えば液滴またはスプレーに混入することによって達成できる。皮下投与は、組成物を医薬学的に許容される注射可能な担体に混入することを含む。経皮投与には、組成物を親油性担体に混入し、外用クリームまたは接着性パッチとして製剤できることが好都合である。自己溶解性である縫合糸に見られるものなどの、ポリラクチドファイバーは、乳酸を生じ、これはまた、その後組織によって代謝され、ピルビン酸を形成し得る。この縫合糸またはその他の縫合糸製造を、２−オキソ酸の長期の局所送達のために使用できる。
【００３９】
放射線傷害に対する所望の保護を達成するのに有効な投与量および用量率の範囲は、標準的な業界の慣行にしたがって決定できる。好ましい用量および用量率とは、１日１回投与される（すなわち、毎朝）、１日２回投与される（すなわち、毎朝および毎夕）または１日３回投与される（すなわち、毎食と共に）、１日あたり約１０〜３，０００ｍｇの２−オキソ酸を提供するのに十分な組成物である。
【００４０】
ＨＩＦ−１結合パートナーを同定する方法
本発明のもう１つの実施形態は、ＨＩＦ−１ａまたはＨＩＦ−１ｂの結合パートナーの単離および同定に用いる方法を提供する。一般に、ＨＩＦ−１ａまたはＨＩＦ−１ｂタンパク質を、可能性ある結合パートナーとＨＩＦ−１ａタンパク質との結合を可能にする条件下で、可能性ある結合パートナーまたは細胞の抽出物もしくは画分と混合する。混合後、本発明のタンパク質と結合した、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはその他の分子（例えば、システインまたはヒスチジン）を混合物から分離する。次いで、本発明のタンパク質に結合している結合パートナーを回収し、さらに分析することができる。結合パートナーを同定および単離するには、ＨＩＦ−１ａ全タンパク質を用いてもよい。あるいは、タンパク質の断片を用いてもよい。
【００４１】
本明細書において、細胞抽出物とは、溶解したか、破壊した細胞から作製した調製物または画分を指す。細胞抽出物の好ましい供給源としては、アレルギー性過敏症を患う患者の、ヒト皮膚組織もしくはヒト気道に由来する細胞またはヒト肺組織の生体サンプルに由来する細胞がある。あるいは、細胞抽出物は、正常組織または入手可能な細胞株、特に、神経膠腫細胞株をはじめとする癌細胞株から調製してもよい。
【００４２】
種々の方法を用いて細胞の抽出物を得ることができる。細胞を、物理的または化学的破壊方法のいずれかを用いて破壊してもよい。物理的破壊方法の例としては、それだけには限らないが、超音波処理および機械的剪断が挙げられる。化学的溶解方法の例としては、それだけには限らないが、界面活性剤溶解および酵素溶解が挙げられる。当業者ならば、細胞抽出物を調製する方法を、本方法に用いる抽出物を得るために容易に適応させることができる。
【００４３】
細胞の抽出物を調製すると、抽出物を、ＨＩＦ−１ａタンパク質と結合パートナーとの結合が起こり得る条件下で、本発明のタンパク質と混合する。種々の条件を使用できるが、ヒト細胞の細胞質中に見られる条件とよく似ている条件が最も好ましい。浸透圧、ｐＨ、温度および用いる細胞抽出物の濃度などの特徴は、タンパク質と結合パートナーとの結合を最適化するよう変更できる。
【００４４】
適切な条件下で混合した後、結合している複合体を混合物から分離する。混合物を分離するには種々の技術を利用できる。例えば、本発明のタンパク質に特異的な抗体を用いて、結合パートナー複合体を免疫沈降させることができる。あるいは、標準的な化学的分離技術、例えばクロマトグラフィーおよび密度／沈降遠心分離を使用できる。
【００４５】
抽出物中に存在する結合していない細胞構成要素を除去した後、従来法を用いて結合パートナーを複合体から分離することができる。分離は、例えば、混合物の塩濃度またはｐＨを変更することによって達成できる。結合している結合パートナー対を混合抽出物から分離するのを補助するために、本発明のタンパク質を固体支持体上に固定化してもよい。例えば、タンパク質をニトロセルロースマトリックスまたはアクリルビーズに付着させることができる。タンパク質の固体支持体への付着により、ペプチド／結合パートナー対の、抽出物中に見られるその他の構成要素からの分離が補助される。同定される結合パートナーは、単一のタンパク質か、２種以上のタンパク質から構成される複合体のいずれかであり得る。あるいは、結合パートナーは、Takayamaら、（1997）Methods Mol. Biol. 69、171〜184頁またはSauderら（1996）J. Gen. Virol. 77、991〜996頁の手順にしたがってファーウェスタンアッセイを用いて同定でき、あるいは、エピトープタグをつけたタンパク質またはＧＳＴ融合タンパク質の使用によって同定できる。
【００４６】
あるいは、酵母ツーハイブリッドシステムにおいてＨＩＦ−１をコードする核酸分子を用いてもよい。酵母ツーハイブリッドシステムはその他のタンパク質パートナー対を同定するために用いられており、本明細書に記載した核酸分子を用いるよう容易に適応させることができる。
【００４７】
ＨＩＦ−１発現を調節する物質の同定方法
本発明の一実施形態では、ＨＩＦ−１ａまたはＨＩＦ−１ｂタンパク質をコードする核酸の発現を調節する物質を同定する方法を提供する。このようなアッセイは、本発明の核酸の発現レベルの変化をモニターする入手可能な手段はいずれも利用できる。本明細書において、物質は、細胞において核酸の発現をアップまたはダウンレギュレートできる場合に、本発明の核酸の発現を調節するとされる。ＨＩＦ−１ａタンパク質の発現をアップレギュレートする物質の例としては、それだけには限らないが、２−オキソ酸、例えばピルビン酸、オキサロ酢酸およびその誘導体が挙げられる。
【００４８】
１つのアッセイ形式では、ＨＩＦ−１ａ遺伝子のオープンリーディングフレーム、または５’および／もしくは３’調節エレメントといずれかのアッセイ可能な融合パートナーの間にレポーター遺伝子融合物を含む細胞株を調製できる。ホタルルシフェラーゼ遺伝子およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をはじめ、多数のアッセイ可能な融合パートナーが知られており、容易に入手できる（Alamら（1990）Anal. Biochem. 188、245〜254頁）。次いで、リポーター遺伝子融合物を含む細胞株を、適切な条件および時間のもと、調べようとする物質に曝露する。物質に対して曝露されたサンプルと対照サンプルの間のレポーター遺伝子の発現の差により、ＨＩＦ−１ａタンパク質をコードする核酸の発現を調節する物質を同定する。
【００４９】
物質の、ＨＩＦ−１ａタンパク質をコードする核酸の発現を調節する能力をモニターするために、さらなるアッセイ形式を使用できる。例えば、ｍＲＮＡ発現を、本発明の核酸とのハイブリダイゼーションによって直接モニターできる。細胞株を、適切な条件および時間のもと、調べようとする物質に対して曝露し、Sambrookら（2001）Molecular Clonig-A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に開示されるものなどの標準的な手順によって全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離する。
【００５０】
物質に曝露された細胞と対照細胞との間の、ｍＲＮＡ発現レベルの差を検出するためのプローブは、ＨＩＦ−１ａタンパク質をコードする核酸から調製できる。必要ではないが、ハイストリンジェンシー条件下で、標的核酸とのみ特異的にハイブリダイズするプローブを設計することが好ましい。ハイストリンジェンシー条件下では、高度に相補的な核酸のみがハイブリッドを形成する。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーにより、ハイブリッドを形成するために、２種の核酸鎖間に存在するはずである相補性の量が定まる。ストリンジェンシーは、プローブ：標的ハイブリッドとプローブ：非標的ハイブリッド間の安定性の差を最大とするよう選択しなければならない。
【００５１】
プローブは、当技術分野で公知の方法によって、ＨＩＦ−１ａタンパク質をコードする核酸から設計できる。例えば、プローブのＧ＋Ｃ含量およびプローブの長さが、プローブのその標的配列との結合に影響を及ぼし得る。プローブの特異性を最適化する方法は、Sambrookら（2001）Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPressまたはAusubelら（1995）Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishingにおいて一般に入手可能である。
【００５２】
ハイブリダイゼーション条件は、公知の方法、例えばSambrookらおよびAusubelらによって記載されたものを用いて、各プローブに必要なように改変する。全細胞ＲＮＡまたはポリＡ  ＲＮＡについて濃縮されたＲＮＡのハイブリダイゼーションは、いずれかの入手可能な形式で達成できる。例えば、全細胞ＲＮＡまたはポリＡ  ＲＮＡについて濃縮されたＲＮＡを固体支持体に取り付け、この固体支持体を、プローブが特異的にハイブリダイズする条件下で、少なくとも１つの本発明の配列、または１つの本発明の配列の一部を含む、少なくとも１つのプローブに対して曝露する。あるいは、少なくとも１つの本発明の配列、または１つの本発明の配列の一部を含む、核酸断片を固体支持体、例えばシリコンチップまたは多孔質ガラスウエハーに取り付けてもよい。次いで、このガラスウエハーを、取り付けられた配列が特異的にハイブリダイズする条件下、サンプルから得た全細胞ＲＮＡまたはポリＡ  ＲＮＡに対して曝露すればよい。このような固体支持体およびハイブリダイゼーション法は、広く入手可能である、例えば国際公開第９５／１１７５５号パンフレットに開示されたもの。所与のプローブの、未処理の細胞集団から得た、および物質に対して曝露された細胞集団から得たＲＮＡサンプルと特異的にハイブリダイズする能力について調べることによって、ＨＩＦ−１ａタンパク質をコードする核酸の発現をアップまたはダウンレギュレートする物質を同定する。
【００５３】
ｍＲＮＡの質的および量的分析のためのハイブリダイゼーションもＲＮアーゼ保護アッセイを用いることによって実施できる（すなわち、ＲＰＡ、Maら（1996）Methods 10、273〜238頁参照）。要するに、遺伝子産物をコードするｃＤＮＡとファージ特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）とを含む発現媒体を、ｃＤＮＡ分子の３’末端、ファージプロモーターの下流で直線化し、続いて、このような直線化した分子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によるｃＤＮＡの標識アンチセンス転写物の合成のための鋳型として用いる。次いで、８０％ホルムアミド、４０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ（ｐＨ６．４）、０．４Ｍ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むバッファー中で、４５℃で一晩インキュベートすることによって、標識転写物を単離したＲＮＡの混合物（すなわち、全または分画ｍＲＮＡ）とハイブリダイズする。次いで、得られたハイブリッドを、４０μｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡと２μｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＨとを含むバッファー中で消化する。外来タンパク質を非活性化および抽出した後、サンプルを分析のために尿素／ポリアクリルアミドゲル上にロードする。
【００５４】
もう１つのアッセイ形式では、まず、ＨＩＦ−１ａ遺伝子産物を発現する細胞または細胞株を生理学的に同定する。このように同定した細胞および／または細胞株は、物質の、適当な表面形質導入機構および／またはサイトゾルのカスケードとの外因性接触に関して転写装置の調節の忠実度が維持されるように、必要な細胞機構を含むと予想される。さらに、このような細胞または細胞株を、本遺伝子産物に特有である１つ以上の抗原断片と融合している、本遺伝子産物をコードする構造遺伝子の末端を含む、機能し得る非翻訳５’プロモーターを含む発現媒体（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）構築物を用いて形質導入するかトランスフェクトし、ここで前記断片は前記プロモーターの転写制御下にあり、分子量が天然ポリペプチドとは区別できるポリペプチドとして発現されるか、免疫学的に識別できるタグもしくはその他の検出可能マーカーをさらに含むこともできる。このようなプロセスは当技術分野では周知である（Sambrookら（2001）Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress参照）。
【００５５】
次いで、前記で概説したように形質導入またはトランスフェクトされた細胞または細胞株を、適当な条件下で物質（例えば、２−オキソ酸またはその誘導体）と接触させる。例えば、医薬学的に許容される賦形剤中の物質を、水性生理学的バッファー、例えば生理学的ｐＨのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理学的ｐＨのイーグル平衡塩類溶液（ＢＳＳ）、血清を含むＰＢＳもしくはＢＳＳまたは３７℃でインキュベートされたＰＢＳもしくはＢＳＳおよび／もしくは血清を含む条件培地中で、細胞と接触させる。前記条件は、当業者によって必要であると考えられるように調節できる。細胞を物質と接触させた後、前記細胞を破壊し、溶解物のポリペプチドを、ポリペプチド画分がプールされ、免疫学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降またはウエスタンブロット）によってさらに処理されるよう抗体と接触するよう分画する。「物質を接触させた」サンプルから単離されたタンパク質のプールを、賦形剤のみか対照物質（シスチン、システインまたはヒスチジン）を細胞と接触させる対照サンプルと比較し、物質を接触させたサンプルから得た免疫学的に生じたシグナルの、対照と比較した増加または減少を用いて物質の有効性を見分ける。
【００５６】
ＨＩＦ−１活性を調節する物質の同定方法
本発明は、ＨＩＦ−１ａタンパク質の少なくとも１つの活性を調節する物質を同定する方法を提供する。このような方法またはアッセイでは、所望の活性をモニターまたは検出する手段はいずれも利用できる。
【００５７】
１つの形式では、調べようとする物質に曝露されていない対照細胞集団に比べて、曝露された細胞集団の間で標準単位に標準化された、ＨＩＦ−１ａタンパク質の特定の活性をアッセイできる。細胞株または細胞集団を、適当な条件および時間のもと、調べようとする物質に曝露する。細胞溶解物は曝露された細胞株または細胞集団および対照の曝露されていない細胞株または細胞集団から調製できる。次いで、細胞溶解物をプローブを用いて分析する。
【００５８】
抗体プローブは、適した哺乳類宿主を適当な免疫化プロトコールを用い、本発明のタンパク質またはその抗原含有断片を用いて免疫することによって調製できる。免疫原性を増強するために、これらのタンパク質または断片を、適した担体とコンジュゲートさせることもできる。ＢＳＡ、ＫＬＨまたはその他の担体タンパク質などの担体を含む免疫原性コンジュゲートを調製する方法は当技術分野では周知である。状況次第で、例えば、カルボジイミド試薬を用いる直接コンジュゲーションが有効である場合もあるし、他の場合では、ハプテンへの到達しやすさを提供するには、結合試薬、例えばPierce Chemical Co.によって供給されるものが望ましい場合もある。ハプテンペプチドは、例えば、担体への結合を容易にするために、システイン残基でアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれでも延長でき、またはシステイン残基を散在させることもできる。免疫原の投与は、当技術分野で一般的に理解されているように、概ね、適したアジュバントを使用し、適した期間にわたる注射によって実施する。免疫化スケジュールの間、抗体形成の妥当性を決定するために抗体の力価をとる。
【００５９】
このようにして産生されたポリクローナル抗血清はいくつかの適用には十分であり得るが、薬剤組成物にはモノクローナル調製物の使用が好ましい。標準的な方法（例えば、Kohler & Milstein（1992）Biotechnology 24、524〜526頁参照）または一般的に知られているように、リンパ球もしくは脾臓細胞の不死化を達成する修飾を用いて、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株を調製できる。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原がペプチドハプテン、ポリペプチドまたはタンパク質である免疫アッセイによってスクリーニングできる。所望の抗体を分泌する適当な不死化細胞培養物が同定されれば、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または腹水における産生によって培養できる。
【００６０】
所望のモノクローナル抗体は、培養上清から、または腹水上清から回収できる。免疫学的に重要な部分を含む、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清の断片、ならびに無傷の抗体をアンタゴニストとして使用できる。特に、治療の関係では、免疫学的反応性断片、例えばＦａｂまたはＦａｂ’断片の使用が好ましいことが多いが、これは、一般的に、これらの断片が全免疫グロブリンよりも免疫原性が低いためである。
【００６１】
抗体または断片はまた、現在の技術を用いて、遺伝子組換え手段によって作製できる。タンパク質の所望の領域と特異的に結合する抗体領域も、多重種起源のキメラとの関連で作製できる。
【００６２】
タンパク質の所望の領域と特異的に結合する抗体領域も、多重種起源のキメラ、例えばヒト化抗体との関連で作製できる。したがって、抗体は、米国特許第５，５８５，０８９号またはRiechmannら（1988）Nature 332、323〜327頁に記載されるような、ヒト化抗体またはヒトの一抗体であり得る。
【００６３】
前記の方法においてアッセイされる物質は無作為に選択してもよいし、合理的に選択もしくは設計してもよい。本明細書において、物質は、ＨＩＦ−１ａタンパク質単独の、またはその関連基質、結合パートナーなどの関連性に関わる特定の配列を考慮することなく無作為に選ばれる場合に、無作為に選択されると言われる。無作為に選択される物質の例としては、化学ライブラリーまたはペプチドコンビナトリアルライブラリー、または生物の増殖培養液の使用がある。
【００６４】
本明細書において、物質は、物質の作用に関連して、標的部位の配列またはそのコンホメーションを考慮する無作為でない基準で選ばれる場合に、合理的に選択もしくは設計される。これらの部位から構成されるペプチド配列を利用することによって物質を合理的に選択できるか、合理的に設計できる。例えば、合理的に選択されたペプチド物質は、そのアミノ酸配列がいずれかの機能的コンセンサス部位と同一であるか、その誘導体であるペプチドであり得る。合理的に選択された物質の例としては、それだけには限らないが、システイン、ヒスチジンおよびその誘導体が挙げられる。
【００６５】
本発明の方法でスクリーニングされる物質は、例として、２−オキソ酸、ペプチド、ペプチドミメティクス、抗体、抗体断片、小分子、ビタミン誘導体、ならびにカルボヒドレートなどの小分子であり得る。本発明のペプチド物質は、当技術分野で知られている標準的な固相（または液相）ペプチド合成法を用いて調製できる。さらに、これらのペプチドをコードするＤＮＡは、市販のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成でき、また標準的な遺伝子組換え作製システムを用いて遺伝子組換えによって作製できる。非遺伝子によってコードされるアミノ酸が含まれる場合には、固相ペプチド合成を用いる作製が必要とされる。
【００６６】
本発明の物質のもう１つの種類は、ＨＩＦ−１タンパク質水酸化酵素またはＨＩＦ−１ｂに結合し、その活性を阻害し、ひいてはＨＩＦ−１ａの活性を誘導する抗体またはその断片である。抗体物質は、適した哺乳類被験体を、本明細書に記載した抗原性領域を含み、タンパク質のその部分が抗体によって標的とされることを目的とするペプチドで免疫化することによって得ることができる。
【００６７】
本明細書において、「抗体」とは、抗原と特異的に結合し、認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片に由来するフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεとして分類され、これらは順に免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ規定する。
【００６８】
例示的免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は、２つの同一なポリペプチド鎖対から構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を含む。各鎖のＮ末端は、約１００〜１１０以上のアミノ酸からなる可変領域を規定し、これは主に抗原認識に関与している。用語可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）とは、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。
【００６９】
抗体は無傷の免疫グロブリンとして、種々のペプチダーゼでの消化によって生じる断片として、または遺伝子組換え変異体、例えばヒト化抗体または一本鎖抗体として生じる。したがって、例えば、ペプシンによって抗体が、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で消化されると、それ自体が、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨＩと結合している軽鎖である、Ｆ（ａｂ）’２またはＦａｂの二量体が生じる。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件下で還元され、ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、それによってＦ（ａｂ）’２二量体がＦａｂ’単量体に変換することがある。Ｆａｂ’単量体は、ヒンジ領域の一部を含む、実質的にＦａｂである。
【００７０】
１以上の重鎖を含む抗体断片では、重鎖は、無傷の抗体の非Ｆｃ領域に見られるいずれかの定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧアイソタイプ中のＣＨ１）を含む場合があり、および／または無傷の抗体中に見られるいずれかのヒンジ領域配列を含む場合があり、および／または重鎖のヒンジ領域配列もしくは定常ドメイン配列と融合しているか、その中にあるロイシンジッパー配列を含む場合がある。適したロイシンジッパー配列としては、ｊｕｎおよびｆｏｓロイシンジッパーおよびＧＣＮ４ロイシンジッパーが挙げられる（Kostelneyら（1992）J. Immunol. 148、1547〜1553頁、米国特許第６，１３３，４２６号）。
【００７１】
種々の抗体断片が無傷の抗体の消化という意味で定義されるが、当業者ならば、このような断片は、化学的にか、遺伝子組換え手法を用いることによってのいずれかでデノボ合成できることは理解されよう。したがって、本明細書において、抗体用語はまた、全抗体の修飾によって生じた抗体断片、または遺伝子組換え手法を用いてデノボ合成されたもの、例えば遺伝子組換えＩｇＧ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号および同４，６４２，３３４号、Queenら（1989）Proc. Natl Acad. Sci. USA 86、10029〜10033頁）、一本鎖抗体、またはファージディスプレイによって獲得した抗体、およびハイブリドーマ法によって作製されたモノクローナル抗体（Kohlerら（1975）Nature 256、495頁）も含む。
【００７２】
一般鎖抗体の合成は米国特許第４，９４６，７７８号に記載されており、単鎖抗体はConrathら（2001）J. Biol. Chem. 276、7346〜7350頁およびDesmyterら（2001）J. Biol. Chem. 276、26285〜26290頁によって記載されている。抗体はまた、ファージディスプレイ技術によって作製できる（Barbasら（2001）Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress、Kayら（1996）Phage Display of Peptidesand Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press）。一本鎖抗体を作製する技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、ＨＩＦ−１ｂおよびＨＩＦ−１水酸化酵素に対する抗体を作製するために適応させることができる。また、トランスジェニックマウス、またはその他の哺乳類などのその他の生物を用いてヒト化抗体を発現させることもできる。
【００７３】
本明細書において、「キメラ抗体」とは、定常領域の一部またはすべてが置換または交換によって変わっており、その結果、抗原結合部位が、異なる種類または抗体の定常領域と、または酵素、ホルモン、タンパク質、毒素（米国特許第６，０５１，４０５号）、成長因子、または薬物と結合している抗体分子である。
【００７４】
さらに説明しなくとも、当業者は、前記の説明および以下の例示的実施例を用いて、本発明を製造し、利用することができ、特許請求される方法を実施できると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に示すものであって、決して本開示内容の残りの部分を制限すると解釈するべきではない。
【実施例】
【００７５】
最近、ヒト細胞株が正常酸素圧条件下（２０％酸素）でさえＨＩＦ−１ａレベルの基礎的上昇を示すことがわかった（Luら（2002）J. Biol. Chem. 277、23111〜23115頁）。この基礎的ＨＩＦ−１ａ発現レベルは調べる特定の細胞株によって異なる。さらなる調査によって、ＨＩＦ−１の基礎的発現の差は、具体的な細胞株を増殖させるために用いられた異なる培養培地の関数であると示された。高グルコースを含有するかピルビン酸を添加した培地で増殖した細胞は、正常酸素圧下でさえ検出可能なレベルのＨＩＦ−１ａを有すると思われた。この現象の基礎をなす生化学的機構を解明するために、本発明者らはヒト神経膠腫細胞株Ｕ−８７を、注意深く規定した培養培地条件下で調べた。したがって、本発明者らは、そのすべての成分が本発明者らにわかっている、新しく調製したクレブスバッファーでこれらの細胞を培養しながら調べた。本発明者らは、これらの細胞において、培地を新しいクレブスバッファーに変えた際にＨＩＦ−１ａレベルの時間依存性の上昇を見出した（図４）。クレブスバッファーの各成分の系統的な除去によって、ＨＩＦ−１ａタンパク質の蓄積をもたらす重要な成分はグルコースであることが明らかになった。したがって、グルコース不含クレブスではＨＩＦ−１レベルの増加は見られず、ＨＩＦ−１ａレベルはグルコース用量依存的に増加した。さらに、非代謝性グルコース類似体２−デオキシグルコースでは、グルコースのＨＩＦ−１ａを刺激する能力は模倣できなかった。したがって、グルコースの代謝産物がＨＩＦ−１ａの蓄積に関与していた。しかし、低酸素およびＤＦＯ、２種の公知のＨＩＦ−１のアクチベーターは、グルコースの不在下でさえ、依然としてＨＩＦ−１ａタンパク質をアップレギュレートすることができ、これらの結果から、グルコース介在性作用はこれまでに認識されていたものとは異なる新規機構に相当することが実証された。
【００７６】
グルコース代謝産物介在性ＨＩＦ−１ａ蓄積を正確に規定するために、本発明者らは、解糖の薬理学的阻害剤ならびに種々のグルコース代謝産物の細胞への直接添加を用いた（図４）。ヨードアセトアミド、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の阻害剤は、クレブスバッファーのＨＩＦ−１ａ蓄積を刺激する能力を完全に阻止した。シンナメート、ミトコンドリア膜および原形質膜を越えるピルビン酸および乳酸輸送の阻害剤は、クレブスバッファーのＨＩＦ−１ａ蓄積に対する作用を妨げなかった。これらの結果により、ＧＡＰＤＨ後のステップに関与するグルコース代謝産物に絞られた。次いで、グルコース不含クレブス中へのピルビン酸および乳酸の添加はＨＩＦ−１ａを直接活性化し、数種のピルビン酸代謝産物、例えばクエン酸、２−オキソグルタル酸、コハク酸およびアラニンは作用がないことがわかった。乳酸およびピルビン酸は、本発明者らが主に研究したＵ８７神経膠腫細胞などのヒト細胞株によって豊富に産生される（図５）。乳酸およびピルビン酸はまた、酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を介して相互変換可能である。グルコースのピルビン酸への代謝は、細胞のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を高め、他方、ピルビン酸の乳酸への変換はこの比を低下させる。ＮＡＤＨまたはＮＡＤレベルの変化がＨＩＦ−１ａタンパク質の増加に関わっていた可能性を除外するために、本発明者らは、穏やかな界面活性剤（ジギトニン）処理で透過性にした細胞を用いた。これらの調製物は、すべての既知の介在物によってＨＩＦ−１ａを誘導できた。３ｍＭ  ＮＡＤまたはＮＡＤＨの直接添加はＨＩＦ−１ａレベルに対して全く影響がなく、このことによりＮＡＤＨ／ＮＡＤ比が、グルコース代謝によるＨＩＦ−１ａ活性化に関わっていなかったことが実証される。本発明者らは、ＨＩＦ−１ａ活性化においてピルビン酸をより詳しく関係させるためにＬＤＨ阻害剤、オキサマートを用いた。オキサマートは乳酸のＨＩＦ−１ａ蓄積を刺激する能力を阻止し、他方でピルビン酸の作用を増強した。これらの結果により、乳酸はＨＩＦ−１ａ蓄積を刺激できるが、まずピルビン酸に変換されなければならないということが実証された。したがって、ピルビン酸が、ＨＩＦ−１ａ蓄積の刺激に関与する、主要なグルコース代謝産物であった。ピルビン酸は、ＨＩＦ−１ａの蓄積を、ＨＰＨ酵素の不活化に似た方法でその分解を阻害することによって増強すると思われた。このことは図５で、ピルビン酸が、タンパク質合成せずにＨＩＦ−１ａレベルの上昇を維持したという観察によって実証された。通常、ＨＩＦ−１ａは極めて短い半減期を有し、酸素および鉄の存在下で合成されて数分で分解される。
【００７７】
本発明者らは、その他の細胞代謝産物の評価で、ＨＩＦ−１活性化代謝産物の構造的必要条件は極めて特異的であることを見出した。本発明者らは、オキサロ酢酸、ピルビン酸の主要な代謝産物、クレブス回路中間体もまた、ＨＩＦ−１ａタンパク質の強力かつ効果的な誘導物質であることを見出した（図６）。オキサロ酢酸とピルビン酸は、いくつかの代謝経路を介して相互変換できる。これにもかかわらず、これらのグルコース代謝産物は双方とも、多数の細胞種においてＨＩＦ−１ａレベルを強力に誘導するのに十分であると思われる。
【００７８】
図７の構造ダイアグラムはまた、２−オキソ酸に基づく将来の薬剤開発の観点から表している。本発明者らは、オキサロ酢酸はＨＩＦ−１を活性化できるがコハク酸および２−オキソグルタル酸はできないことを示した。このことはＨＩＦ−１活性化の介在における２−オキソ基の重要性を指摘するものであるがまた、４および５位の適切に位置した基の重要性も示すものでもある。そのピルビン酸はＨＩＦ−１を活性化できるということは、本発明者らが決定した、ＨＩＦ−１を活性化するのにこれまでのところ必要である最小の特徴は、２−オキソ基と３位のメチル基であるということを示す。３位にカルボキシル基を有するクエン酸は、リンゴ酸同様有効でない。前記で本発明者らが実証したとおり正確に、グルコース不含培地で、ピルビン酸および酢酸の単純な生化学的誘導体を、ＨＩＦ−１の活性化についてスクリーニングできる。これによって、低酸素遺伝子発現を調節するのにピルビン酸よりも遥かに強力で安定な簡単な薬剤の開発が可能となり得る。したがって、小さな２−オキソ酸によるＨＩＦ−１の調節について本発明者らが解明したことを利用して、低酸素下での生存率を向上する生理学的応答を誘導する薬剤を開発することができる。ここで留意すべきは、本発明者らがＨＩＦ−１活性化因子として同定したエチル−およびメチルピルビン酸誘導体は、その他の臨床適用に使用するために既に提案されているということである（Changら（2003）Diabetologia. 46、1220〜1227頁、Fink（2003）Crit. CareMed.31（付録）、S51〜56）。
【００７９】
本発明者らが同定した２−オキソ酸ＨＩＦ誘導物質の作用機構を調べるために、本発明者らはまず、細胞ＡＴＰレベルに対するその作用を調べた。図８Ａに示したように、本発明者らの研究に用いた４〜８時間培養期間の間、グルコースまたはグルコース代謝産物の、本発明者らのグルコース不含バッファーへの添加には、細胞ＡＴＰレベルに対して有意な作用がなかった。ここで留意すべきは、グルコース、ピルビン酸およびオキサロ酢酸の、ＡＴＰレベルに対する作用は、２−オキソグルタル酸およびコハク酸のものと、それらのＨＩＦ−１ａ誘導に対する劇的に異なる作用にもかかわらず有意差があるとはいえないということである。さらに、ＡＴＰの、透過処理細胞への直接添加は基礎ＨＩＦ−１ａレベルを上昇させなかった（図８Ｂ）。これらのデータは、細胞リン酸化能の変化とは異なるＨＩＦ誘導機構を示す。図１のスキームに示されるように、ＨＩＦ−１ａの細胞レベルは、プロテアソーム活性、ユビキチン化、またはプロリル水酸化の遮断によって上がり得る。ラクタシスチンβ−ラクトン（Ｌｂｌ）によるプロテアソームの阻害は、ポリユビキチン化型のＨＩＦ−１ａの蓄積をもたらし、これはウエスタンブロットで通常、高分子量種のスメアとして現れる。このポリユビキチン型は核に転位せず、遺伝子転写を活性化しない。図９Ａは、クレブスバッファー中で処理したＵ８７細胞の全細胞抽出物では、グルコースまたはピルビン酸によって誘導されたＨＩＦ−１ａは、ＨＰＨ阻害剤低酸素およびデスフェリオキサミン（ＤＦＯ）による誘導で見られるものと同様の分子量を有することを示す。ポリユビキチン化ＨＩＦ−１ａの特徴的な高分子量スメアはラクタシスチン処理でしか見られない。ＨＩＦ−１ａの細胞蓄積および核転位はまた、免疫組織化学によって調べることができる。この目的のために、本発明者らは、細胞培養皿に対してＵ８７細胞よりも付着性であるＵ２５１細胞を用いた。図９Ｂに示されるように、グルコース、ピルビン酸およびオキサロ酢酸は、低酸素およびＤＦＯと同様に核ＨＩＦ−１ａ蓄積を促進するが、細胞質ＨＩＦ−１ａの増加しか促進しないラクタシスチンとは異なる。コハク酸はＨＩＦ−１ａ蓄積に影響を及ぼさない。このアッセイをＵ２５１細胞で用いて、本発明者らは、内因性分枝鎖２−オキソ酸はＨＩＦ−１ａ蓄積を促進できると判断した（図１０）。
【００８０】
これらのデータは、図７に示される構造プロフィールと共に、内因性２−オキソ酸ＨＩＦ−１ａ誘導物質は、ＮＯＧまたはＤＭＯＧと同様の方法でＨＰＨ中の２−ＯＧ結合部位について競合することによって働くことができるということを強力に示唆した（図２参照）。本発明者らは、３種の既知のヒトＨＰＨ相同体のすべてが、本発明者らが研究していた細胞内に発現されたと判断した（図１１Ａ）。本発明者らは、ピルビン酸またはオキサロ酢酸が、ＨＰＨ上の２−ＯＧ結合部位について競合できるかどうかを調べるために、セファロースビーズ上に２−ＯＧを固定化したアフィニティーカラムを調製した。本発明者らはまた、ウサギ網状赤血球培養システムを用いて発現プラスミドから３５Ｓ標識ＨＰＨ相同体も調製した（Bruickら（2001）Science 294、1337〜1340頁）。２−ＯＧカラムによって、本発明者らが３５Ｓ標識ＨＰＨの結合ならびに結合の可能性ある競合物を調べることが可能となった。図２中のステップＢをモニターするこのアプローチはこれまでに用いられている（Anzellottiら（2000）Arch. Biochem. Biophys. 382、161〜172頁）。図１１Ｂに示されるように、３種の３５Ｓ標識ＨＰＨ相同体のすべてが固定化した２−ＯＧと結合し、結合の半量より多くが鉄の必要性を示した。本発明者らは、３５Ｓ標識ＨＰＨ−１を用いて、その基質２−ＯＧはこの結合を置換することができるが、最終産物コハク酸はできないことも示した（図１１Ｃ）。本発明者らは、３５Ｓ標識ＨＰＨの鉄依存性結合を用いて、ピルビン酸とオキサロ酢酸は双方とも２−ＯＧ結合部位について実際に競合し得ることを示した（図１１Ｄ）。
【００８１】
ＨＰＨ活性に対するピルビン酸およびオキサロ酢酸の作用（図２中ステップＤ）を直接評価するために、本発明者らは、よく使われる３５Ｓ−ｐＶＨＬプルダウンアッセイを用いた。このアッセイはＨＰＨ相同体の、３５Ｓ−ｐＶＨＬ結合活性を、ＨＩＦ−１ａＯＤＤの重要なプロリン５６４残基を含むビオチン化した１９マーのペプチドに付与する能力をモニターする（図１参照）。１μｇ量のペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳したＨＰＨおよび指示試薬と共にインキュベートした後、３５Ｓ−ｐＶＨＬを加え、続いてストレプトアビジンコートしたビーズを加えてＨＩＦ−１ａペプチドをプルダウンした。反応物をペレット化し、ペレットを洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために可溶化し、続いて、オートラジオグラフィーに付して捕獲された３５Ｓ−ｐＶＨＬを明らかにした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳された各ＨＰＨ相同体を用いて、本発明者らはまずアッセイ条件を、必要なＨＰＨ基質および補因子に関して最適化した。この最適化はＨＰＨ−１について図１２Ａ〜Ｃに示されている。２−ＯＧと鉄は双方とも、活性にとって確実に必要であったが、それがなくてもある程度の活性は見られ、またアスコルビン酸も用量依存的に活性を増強するとわかった。（Ｄ）すべての他の試薬を一定に維持した条件下（アスコルビン酸＝２００μＭ、硫酸第一鉄＝１００μＭ）、１ｍＭ量のＰｙｒまたはＯＡＡは、３種のＨＰＨ相同体のいずれによっても、ＨＩＦ−１ａペプチドのプロリン水酸化を触媒することにおいて１００μＭの２−ＯＧの代わりになることはできなかった。
【００８２】
ピルビン酸およびオキサロ酢酸の、２−ＯＧ結合部位について競合する能力は、ＨＩＦ−１ａプロリル水酸化を触媒できないことと共に、それらの、２−ＯＧアンタゴニストとしての役割の可能性を支持した。したがって、本発明者らは、それらの２−ＯＧによって触媒されるＨＩＦ−１ａ水酸化を阻害する能力を、３５Ｓ−ｐＶＨＬプルダウンアッセイを用いて調べた。しかし、周知のＨＰＨ阻害剤であるＮ−オキサリルグリシン（ＮＯＧ）と比べ、ピルビン酸による阻害は全く見られず、オキサロ酢酸による阻害はほとんど見られなかった（図１３）。本発明者らがこのアッセイに用いたアッセイ条件は、理想のＨＰＨ活性が得られるよう文献を最適化したものであった。これには、先に記載した同時に触媒能がなくなることを避けるために２ｍＭレベルのアスコルビン酸の使用が含まれる。一方では、培養細胞は、通常、その培地に余分のアスコルビン酸を添加されることはない。本発明者らは、ピルビン酸およびオキサロ酢酸の、ＨＩＦ−１ａ蓄積を誘導する強い能力と、ＨＰＨ活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害するには能力に乏しいことの間で本発明者らが観察した矛盾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにアスコルビン酸を含めたことに起因すると疑った。本発明者らは実際、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてアスコルビン酸の量を変更することによって、ピルビン酸のＨＰＨ−１およびＨＰＨ−２活性に対する阻害作用を明らかにし、それらはアスコルビン酸感受性であると思われた（図１４）。
【００８３】
興味深いことに、ＨＰＨ３活性はピルビン酸またはオキサロ酢酸に非感受性であると思われた。ＨＰＨ−２は、ほとんどの細胞の主要なＨＰＨ活性の構成要素であると報告されている。したがって、本発明者らは、生細胞において、アスコルビン酸の、ピルビン酸およびオキサロ酢酸によるＨＩＦ−１ａ蓄積を妨げる能力について評価した。図１５に示されるように、培養細胞実験に１００μＭのアスコルビン酸を含めることによって、ピルビン酸およびアスコルビン酸によるＨＩＦ−１ａ蓄積の完全な阻害がもたらされるが、低酸素によるものは阻害しない。アスコルビン酸は、同時に触媒能がなくなった後、２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼに対して反応性であることが分かっているので（図２ＥおよびＦ）、本発明者らの結果は、ピルビン酸およびオキサロ酢酸は、ＨＰＨと結合し、次いで、それらをアスコルビン酸可逆的に不活化するということを示唆した。アスコルビン酸感受性不活化は、２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼのファミリーのメンバーの間で高度に可変性であり、実験データなしには予測できない。本発明者らは、この可能性を調べるために、低酸素かピルビン酸またはオキサロ酢酸のいずれかを用いて誘導した後のＨＩＦ−１ａ蓄積の可逆性を比較した。これらの実験の論理的根拠は、よく知られている、低酸素によるＨＰＨ活性の可逆的阻害に起因する（図１参照）。したがって、低酸素の間のＨＩＦ−１ａ蓄積およびＨＩＦ活性化は、再酸素化すると迅速に逆戻りする。図１６Ａは、Ｕ２５１細胞において低酸素によって誘導されたＨＩＦ−１ａ蓄積は、実際、再酸素化すると迅速に崩壊し、酸素再導入の３０分後には核タンパク質は検出可能できなくなることを示す。他方、ピルビン酸によって誘導されたＨＩＦ−１ａ蓄積は、ピルビン酸を洗浄除去した４０分後も十分に持続する。核抽出物のウエスタンブロット分析によって、オキサロ酢酸を用いて同様の結果がＵ８７細胞において見られた（図１６Ｂ）。本発明者らは、２−オキソ酸によって誘導されたＨＩＦ−１ａ蓄積の持続がＨＰＨ不活化によるものであるかどうかを調べるために、この実験を、洗浄バッファーに１００μＭのアスコルビン酸を加えて反復した。図１６Ｃに見られるように、アスコルビン酸はＨＩＦ−１ａの崩壊速度を著しく増強した。
【００８４】
本発明者らは、ピルビン酸またはオキサロ酢酸処理によって、ＨＰＨ活性が不活化されたかどうかを直接調べるために、ピルビン酸またはオキサロ酢酸処理した細胞から得たＵ２５１細胞抽出物の、ＨＩＦ−１ａペプチドを水酸化する能力を、３５Ｓ−ｐＶＨＬプルダウンアッセイを用いて評価した（Ivanら（2002）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99、13459〜13466頁）。これらの実験では、アスコルビン酸は、アッセイのｉｎ  ｖｉｔｒｏ部分から省いた。図１７に示されるように、細胞のピルビン酸およびオキサロ酢酸前処理は、明らかに、細胞抽出物のＨＰＨ活性を低下させ、細胞インキュベーション期間にアスコルビン酸が存在することでこの阻害が妨げられた。このような前処理誘導された阻害は低酸素またはＤＭＯＧでは見られなかった（図１７Ｂ）。
【００８５】
ＨＩＦによる効果的な遺伝子発現は、ＨＰＨ酵素の阻害によるＨＩＦタンパク質安定化だけでなく、ＨＩＦ−１のＤＮＡとの結合、ＦＩＨ−１活性の阻害および遺伝子転写にも関与している。本発明者らが、その研究のほとんどに用いたヒト神経膠腫はすべて、ＦＩＨ−１のｍＲＮＡを発現する（図１８Ａ）。さらに、正常酸素圧下で、Ｕ８７細胞をピルビン酸と共に４〜６時間インキュベートすると、ＨＩＦ調節エレメントＤＮＡ結合活性の蓄積がもたらされ（図１８Ｂ）、いくつかのＨＩＦ調節されるｍＲＮＡの発現が増強される（図１８Ｃ）。さらに、周知の、ＨＩＦによって調節される遺伝子エリスロポエチン（Ｅｐｏ）を産生する、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞のピルビン酸処理は、Ｅｐｏレベルの用量依存性増加をもたらした（図１８Ｄ）。これらのデータは、ピルビン酸および恐らくはその他の２−オキソ酸はまた、ＦＩＨ−１も阻害でき、図１に示されるＨＩＦシグナル伝達経路を完全に活性化することを意味する。本発明者らは、グルコース代謝産物ピルビン酸およびオキサロ酢酸によってＨＲＥにより調節されるプロモーターを含む遺伝子の活性化を直接評価するために、細胞蛍光の増強によって示されるように、ＨＩＦ活性化、低酸素、ＤＦＯおよびピルビン酸のすべてによって活性化されるＨＲＥ−ＧＦＰ発現に応答する、ＨＲＥ緑色蛍光（ＨＲＥ−ＧＦＰ）構築物を用いてトランスフェクトしたＵ３７３神経膠腫細胞を用いた（図１８Ｅ）。さらに、ＨＲＥ−ルシフェラーゼ構築物を用いて安定にトランスフェクトされたＵ２５１細胞も、低酸素、ピルビン酸、オキサロ酢酸ならびにエチル−およびメチルピルビン酸誘導体によってルシフェラーゼ遺伝子発現の顕著な活性化を示した（図１８Ｆ）。本発明者らはまた、同じＨＲＥ−ルシフェラーゼ発現性Ｕ２５１細胞を用いて、ピルビン酸およびオキサロ酢酸によるＨＩＦ−依存性遺伝子発現の活性化が低酸素またはＤＭＯＧによるものとは、そのアスコルビン酸での可逆性によって異なることを示すことができた（図１９）。
【００８６】
本明細書に示したデータのほとんどは、ヒト癌細胞株を用いて実施した実験から得たものであったので、本発明者らは、ピルビン酸またはオキサロ酢酸が、正常細胞および組織においてＨＩＦ経路を活性化できるかどうかを調べようとした。したがって、本発明者らは、ラット大脳皮質ニューロンおよび星状細胞の初代培養物を調製し、これらの細胞を、先に記載した細胞株についてのものと同様の解析に付した。図２０Ａに示されるように、ラットニューロンは、１％酸素か３ｍＭピルビン酸のいずれかに４時間曝露するとＨＩＦ−１ａ核免疫反応性を蓄積する。同様に、ラット大脳皮質星状細胞の初代培養も、低酸素またはピルビン酸で処理するとＨＩＦ−１ａを誘導するとわかった（図２０Ｂ）。本発明者らは、ピルビン酸またはオキサロ酢酸の、ＨＩＦ−１ａをｉｎ  ｖｉｖｏで活性化する能力を調べるために、１０日齢のラットに５００ｍｇ／ｋｇ用量のピルビン酸またはオキサロ酢酸のいずれかを腹腔内注射した。本発明者らはまた、同腹子を、空気中８％酸素または０．１％一酸化炭素のいずれかを用いて全身低酸素に付した。これらのパラダイムは双方とも、相当な低酸素およびＨＩＦ−１活性化が生じると示された。本発明者らは、個別の処理各々の４時間後、動物の脳を回収し、ＨＩＦ−１ウェスタンブロト分析のために核抽出物を調製した。
【００８７】
本発明者らは、エリスロポエチンｍＲＮＡ発現の分析のために腎臓も回収した。図２０ＣおよびＤに示されるように、ラット脳は、低酸素、ピルビン酸注射またはオキサロ酢酸注射後にＨＩＦ−１ａ免疫反応性の増加を示した。図２０Ｅは、腎臓のエリスロポエチン遺伝子発現も、低酸素またはオキサロ酢酸処理のいずれかによって刺激されたことを示す。これらの結果は、ＨＰＨ（および恐らくはＦＩＨ−１）不活化２−オキソ酸を用いてＨＩＦ介在性遺伝子発現を調節することの有用性を実証する。
【００８８】
本発明者らはまた、２−オキソ酸によって誘導された遺伝子発現から得られる有益な生理学的結果を実証することを目的とする研究を完了した。こういった試みの１つは、低酸素プレコンディショニングのための２−オキソ酸の使用を含む。２−オキソ酸、例えば、ピルビン酸およびオキサロ酢酸は、細胞保護性ＨＩＦ活性化遺伝子を誘導することによって、選択的心臓手術または脛動脈手術における卒中の危険を低下させ、胃腸の手術後の虚血性の腸損傷を減少させ、また、移植された臓器の移植効率を高めることもできる場合がある。本発明者らは、このようなアプローチの実現可能性を実証するために、虚血プレコンディショニングのニューロン細胞培養モデルを用いた。このモデルでは、初代ラットニューロン培養物を致死量以下の期間の酸素およびグルコース欠乏（ＯＧＤ）に曝露し、それによって虚血を模倣した。この短時間のＯＧＤ期間の後、細胞をその定型的な培養条件に戻す。次いで、その後致死期間のＯＧＤを適用し、ＯＧＤでプレコンディショニングしたもの対未処置の細胞の生存を、通常用いられるＭＭＴ還元アッセイをはじめとする種々の細胞生存アッセイによって評価する（Sawyer（1995）Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22、295〜296頁）。最近、個体を致死量以下の虚血または低酸素に曝露する危険を避けるために虚血または低酸素プレコンディショニングを誘導するための薬学的試みが探求された。このような最近の試みの１つでは、ＨＩＦによって誘導される遺伝子産物、エリスロポエチンを利用し、これでの前処理は、顕著なＯＧＤ神経保護を示す（Ruscherら（2002）J.Neurosci. 22、10291〜10301頁）。本発明者らは、オキサロ酢酸前処理が、ＯＧＤの間のニューロンの生存を向上させられるかどうか調べるために、このエリスロポエチン研究に用いた前処理パラダイムを利用した。基礎パラダイムを図２１Ａに示す。ラット大脳皮質ニューロンをニューロンベーサル培地（Ｎ／Ｂ２７）で８日間培養した。その時点で、培養培地にオキサロ酢酸（ＯＡＡ）またはビヒクルを加え、細胞をさらに２日間培養した。この処理期間の後、培地をグルコースを欠く等張塩溶液で置換してニューロンに２時間の酸素−グルコース欠乏を受けさせた。また、ニューロンを１％酸素環境中に入れた。このＯＧＤパラダイムは、１日後、ニューロンの死滅の有意な遅延をもたらす。図２１Ｂに示されるように、３ｍＭ  ＯＡＡでのニューロンの前処理は、このパラダイムにおける生存を向上させる。これらの結果から、ＨＰＨを不活化することによってＨＩＦを誘導できる、ピルビン酸およびＯＡＡなどの２−オキソ酸を用いて治療目的で低酸素遺伝子発現を誘導できるということが示唆される。
【００８９】
本発明を前記の実施例に関連して詳細に説明したが、本発明の趣旨から逸脱することなく、種々の改変を行うことができると理解される。したがって、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ制限される。本願において、引用した特許、特許出願および参照した出版物はすべて、参照によりその全文を本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ＨＩＦ−１ａヒドロキシラーゼおよび低酸素による遺伝子発現の調節。（Ａ）ＨＩＦ−１ａタンパク質ヒドロキシラーゼは、今日まで、多細胞生物における酸素センサーの最良の候補である。これらの酵素は２−オキソグルタル酸、アスコルビン酸、酸素および鉄を必要とし、そのように、低酸素下での、またはデスフェリオキサミン（ＤＦＯ）などの鉄キレート剤およびコバルトなどの競合金属によるその阻害を説明している。その他の示される補因子部位での分子間相互作用が、これらの酵素の活性を調節できるかどうかはわかっていない。（Ｂ）低酸素によるＨＩＦ−１ａタンパク質ヒドロキシラーゼ活性を介する遺伝子発現の調節。２つの別個の活性が、ＨＩＦ−１ａを、別個のプロリンとアスパラギン残基で水酸化し、ＨＩＦ−１のタンパク質分解およびトランス活性化活性をそれぞれ調節する。これらの活性は、低酸素下で阻害され、それによりＨＩＦ−１ａが蓄積することが可能となり、ＨＩＦ−１複合体が遺伝子発現を活性化することが可能となる（破線）。略語：ＤＦＯ＝デスフェリオキシミン、２−ＯＧ＝２−オキソグルタル酸、Ａｓｃ＝アスコルビン酸、ｂＨＬＨ＝β−ヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン、ＰＡＳ＝Ｐｅｒ−Ａｒｎｔ−Ｓｉｍドメイン、Ｃ−ＴＡＤ＝Ｃ末端トランス活性化ドメイン、ＯＤＤ＝酸素依存性分解ドメイン、ｐＶＨＬ＝フォン−ヒッペル−リンドウ（ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ）タンパク質、ＨＩＦ−ｂ＝ＨＩＦのβサブユニット、ＨＲＥ＝ＨＩＦ調節エレメント。
【図２】ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼの推定酵素サイクル。ＨＰＨとＦＩＨ−１は、２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ酵素ファミリーのメンバーである。これらの酵素は、生物学的水酸化を実施するのに鉄と、２−オキソグルタル酸と、酸素とを必要とする。この図は、この酵素ファミリーの多数のメンバーに対して提案されている推定上の一連の事象を表す（Hanauske-Abelら（２００３） Curr. Med. Chem. 10、1005〜1019頁）。（Ａ）ＨＰＨ（灰色のＣ形構造）は鉄（Ｆｅ）と結合する。（Ｂ）ＨＰＨ−鉄複合体は２−オキソグルタル酸と結合する。２−オキソ基が鉄と配位し、分子の５−炭素末端が異なる部位と相互作用する。（Ｃ）この複合体により、分子酸素の一原子が２−オキソグルタレート分子中に挿入されることが可能となり、コハク酸と二酸化炭素が生じ、もう一方の酸素原子は酵素が結合している鉄と複合体を形成する。（Ｄ）鉄錯体形成している酸素を用い、ＨＩＦ−１ａ酸素依存性分解ドメイン内のプロリン５６４を水酸化する。ＨＰＨはまた、同様の水酸化をプロリン４０２で実施し、ＦＩＨ−１酵素はアスパラギン８０３を水酸化する。（Ｅ）この水酸化機構を利用するほとんどの酵素は、経時的に、同時に触媒能がなくなる。この不活化は、酸素と、鉄と、酵素との間のレドックス反応に関与している場合があり、偽基質の存在などの特定の条件が揃っている場合がある。（Ｆ）このようにして不活化された酵素は、アスコルビン酸を用いて再活性化することができるが、これは２−オキソグルタル酸と同様の方法でこれらの酵素と結合すると思われる。
【図３】グルコース代謝およびＨＩＦ−１調節。（Ａ）解糖およびＨＩＦ−１ａアップレギュレーションに関与する重要なグルコース代謝産物を決定するための戦略の概略スキーム。解糖の間に、グルコースは順次代謝されてピルビン酸となり、次いで、これはさらなる代謝のためにミトコンドリアに入ることができ、または乳酸に変換され得る。複合体相互変換はまた、ピルビン酸およびオキサロ酢酸（ＯＡＡ）レベルと関連している。グルコース類似体２−デオキシグルコース（２ＤＧ）は、２−デオキシグルコース６リン酸にしか進むことができず、さらには代謝され得ない。グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は、解糖における重要な酵素であり、ヨード酢酸（ＩＡＡ）によって選択的に阻害され得る。ピルビン酸および乳酸の細胞膜を通過する輸送は、特異的担体によって起こり、これは４−ヒドロキシシンナメート（４−ＣＩＮ）によって阻止される。このようにして、４−ＣＩＮはピルビン酸がミトコンドリアに入るのを防ぐ。乳酸のピルビン酸への相互変換は乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）によって介在され、これはオキサマートによって選択的に阻止される。本明細書に示される、種々の阻害剤および中間体の使用によって、どの重要な代謝産物がＨＩＦ−１ａ活性化に関与しているかを決定することが可能となった。（Ｂ）２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）、コハク酸（Ｓｕｃｃ）、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）およびピルビン酸（Ｐｙｒ）の構造比較。２−ＯＧ、ＯＡＡおよびＰｙｒはすべて、２位のケト基に基づく２−オキソ酸であるが、コハク酸はそうではない。
【図４】グルコース代謝によるＨＩＦ−１ａレベルの調節。Ｕ８７神経膠腫細胞の核抽出物をＨＩＦ−１ａタンパク質を認識する特異的モノクローナル抗体でプローブした、ウエスタンブロットを示す。（Ａ）ＤＭＥＭで培養したＵ８７神経膠腫細胞を、５．５ｍＭグルコース（Ｇｌｃ）を含有するクレブスバッファーに変え、次いで、種々の時点でウエスタンブロット分析によって核ＨＩＦ−１ａレベルを評価した。（Ｂ）細胞を、示したグルコース濃度を含有するか、またはグルコースを５．５ｍＭの２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）で置き換えたクレブスバッファー中で４時間インキュベートした後、ＨＩＦ−１ａレベルを測定した。（Ｃ）正常酸素圧（２１％酸素）低酸素（１％酸素）下で、または１５０μＭデスフェリオキサミン（ＤＦＯ）で４時間処理した後、グルコース不含クレブスバッファー中で培養したＵ８７細胞において、ＨＩＦ−１ａレベルを測定した。（Ｄ）５０μＭのＩＡＡまたは１ｍＭの４−ＣＩＮの存在下でのグルコースによるＨＩＦ−１ａの誘導をモニターした。（Ｅ）グルコースを３ｍＭ濃度の乳酸（Ｌａｃ）、ピルビン酸（Ｐｙｒ）、クエン酸（Ｃｉｔ）、２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）、コハク酸（Ｓｕｃｃ）またはアラニン（Ａｌａ）と置き換えたクレブス中で４時間培養したＵ８７細胞において、ＨＩＦ−１ａレベルを測定した。結果は少なくとも３回反復した実験を代表するものである。この図はＨＩＦ−１ａレベルは解糖代謝によって調節され得ること、および関与する機構は明らかではなく低酸素に関するものとは異なっていることを実証する。
【図５】乳酸およびピルビン酸によるＨＩＦ−１ａタンパク質レベルの調節。Ｕ８７細胞をＭＥＭ中で一晩維持した。（Ａ）ＭＥＭから５．５ｍＭグルコース含有クレブスバッファーに変更した後、培養バッファー中の乳酸の産生を経時的に測定した。５０μＭのＩＡＡの存在下またはグルコース不含クレブスバッファー中で同様の測定を行った。（Ｂ）５．５ｍＭグルコース含有クレブスバッファー単独（白抜きバー）または１０ｍＭオキサマートの存在下（黒塗りバー）で４時間培養した後、バッファーの乳酸およびピルビン酸レベルを測定した。（Ｃ）細胞をＭＥＭ（対照、ＣＴ）から０．５５ｍＭグルコースを含有するか、またはグルコースを示した濃度の乳酸またはピルビン酸で置き換えた、のいずれかのクレブスに切り替えた４時間後に、核ＨＩＦ−１ａタンパク質レベルを求めた。（Ｄ）細胞をＭＥＭから２ｍＭ乳酸またはピルビン酸を含有するグルコース不含クレブスに切り替えた後に、ＨＩＦ−１ａレベルを測定した。５．５ｍＭグルコースを含有するクレブス（Ｇｌｃ）で４時間処理することによるＨＩＦ−１ａ誘導を比較のために示す。（Ｅ）ジギトニン透過処理細胞を、５０μＭのＩＡＡの存在下、１％酸素または５．５ｍＭグルコースもしくは２ｍＭピルビン酸のいずれかを含有するクレブスで処理した。レーン５および６の透過処理細胞はそれぞれ、グルコース不含クレブス中３ｍＭのＮＡＤまたはＮＡＤＨで処理した。４時間後、核ＨＩＦ−１ａレベルを求めた。（Ｆ）細胞を、グルコース不含クレブス（レーン１）または５．５ｍＭグルコースを含有するクレブスで４時間処理した後、ＨＩＦ−１ａレベルを求めた。グルコースは透過処理または無傷の細胞の双方でＨＩＦ−１ａを誘導し、ＮＡＤまたはＮＡＤＨ（各３ｍＭ）のどちらもこの誘導に何の影響も及ぼさなかった。カタラーゼ（１０００および２０００ユニット／ｍｌ）も何の影響も及ぼさなかった。（Ｇ）２ｍＭ乳酸またはピルビン酸を含有し、１０ｍＭオキサマートを含有するかしないグルコース不含クレブス中で４時間処理した後、ＨＩＦ−１ａレベルを求めた。（Ｈ）ＨＩＦ−１ａタンパク質の崩壊を測定するために、低酸素下で４時間処理した後に（レーン１）、４時間の低酸素と、それに続く３０分間の正常酸素圧後（レーン２）、４時間の１５０μＭのＤＦＯ処理後（レーン３）、４時間のＤＦＯと、それに続く１時間の１００μＭのＣＨＸの添加後（レーン４）、４時間の２ｍＭピルビン酸での処理後（レーン５）および４時間のピルビン酸と、それに続く１時間の１００μＭのＣＨＸの添加後に（レーン６）、ＨＩＦ−１ａ測定を行った。（Ｈ）グルコース不含（レーン１）、１ｍＭピルビン酸を含有する（レーン２）、１ｍＭピルビン酸と１０ｍＭ  ２−ＯＧを含有する（レーン３）クレブスで４時間処理したジギトニン透過処理細胞において、ＨＩＦ−１ａレベルを求めた。示した場合を除き、すべての実験は正常酸素圧下で実施し、少なくとも３回反復し、同様の結果を得た。図３と共にこの図も、グルコース代謝の間に起こるすべての重要な変化のうちで、ＨＩＦ−１ａ蓄積を促進するものはピルビン酸の蓄積であるということを実証する。さらに、ピルビン酸はＨＩＦ−１ａタンパク質レベルを安定化することによってその作用を介在すると思われる。
【図６】ピルビン酸類似体およびオキサロ酢酸は、ＨＩＦ−１ａタンパク質レベルを効率的に高める。ヒトＵ８７神経膠腫細胞（パネルＡ〜Ｃ）およびその他の細胞株（Ｄ）を解糖およびクレブス回路中間体ならびにピルビン酸のエチルおよびメチルエステルで処理し、核抽出物中のＨＩＦ−１ａ蓄積について分析した。前記で論じたような乳酸を除き、解糖中間体にはピルビン酸の他に、ＨＩＦ−１ａ蓄積を活性化するとわかったものはない。すべてのクレブス回路のうち、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）のみがＨＩＦ−１ａ蓄積を刺激できた。（Ｂ）ピルビン酸およびＯＡＡの作用は、ピルビン酸のエチルおよびメチルエステルによって模倣され、既知の２−オキソグルタル酸アンタゴニスト、ジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ）のものと同程度に明白であった。（Ｃ）ＯＡＡの作用はピルビン酸と同程度に強力であり、（Ｄ）はＵ２５１ヒト神経膠腫細胞、Ｈｅｐ３Ｂヒト肝細胞腫細胞およびＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞を含むいくつかの他の細胞株で見られた。Ｈｅｌａヒト子宮頸癌細胞、正常ヒト星状細胞および正常ヒト前立腺上皮細胞も、ピルビン酸およびオキサロ酢酸に対して同様の応答を示した（データ示さず）。
【図７】ＨＩＦ−１ａレベルを上昇させる２−オキソ酸の構造活性必要条件。ＨＩＦ−１ａタンパク質レベルは、低酸素、鉄除去またはＮ−オキサリルグリシンもしくはジメチルオキサリルグリシンなどの人工類似体による２−オキソグルタル酸の競合アンタゴニズムのいずれかの結果としてＨＰＨ活性が阻害されることによって蓄積する。本発明者らは、天然に存在する２−オキソ酸はＨＩＦ−１ａ蓄積を促進することができるということを見出し、この活性のためのその構造上の必要条件をこの図に示す。本発明者らは、ジギトニン透過処理ヒト神経膠腫細胞（Ｕ８７、Ｕ２５１）を１ｍＭ用量に対して曝露することによって、示した構造各々のＨＩＦを誘導する能力を調べた。Ｎ−オキサリルグリシンおよびそのエステル化前駆体ジメチルオキサリルグリシンは、一貫してＨＩＦ−１ａレベルを高めた。示したその他の化合物すべてのうち、ピルビン酸、オキサロ酢酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケトイソカプロン酸およびα−ケト−β−メチル吉草酸（囲んだもの）だけが、ＨＩＦ−１ａ蓄積を刺激できる物質であった。乳酸も、そのピルビン酸への変換後に、ＨＩＦ−１ａを刺激できる（図５参照）。これらのデータは、α−ケト基の必要性を証明するものである。しかし、α−ケト酪酸およびα−ケトアジピン酸は効果がないということはまた、その他の構造上の特徴が重要であるという実験データを提供するものである。
【図８】２−オキソ酸によるＨＩＦ活性化は、エネルギー代謝から独立している。（Ａ）Ｕ２５１神経膠腫細胞を、グルコース不含か、または各２ｍＭの示した添加物を含む、クレブスバッファー中で培養した。４時間の時点で、ルシフェラーゼ法を用いて細胞抽出物中のＡＴＰレベルを測定した。種々の処理で、ＡＴＰのわずかな変動が観察されたものの、これらの物質それぞれのＨＩＦ−１ａ蓄積に対する作用とは相関はなかった。（Ｂ）ジギトニン透過処理細胞への１ｍＭ  ＡＴＰの直接添加もまた、ＨＩＦ−１ａレベルに対して全く影響を及ぼさなかった。
【図９】ピルビン酸は、ユビキチン化の前のステップで作用することによってＨＩＦ−１ａを安定化する。（Ａ）Ｕ８７神経膠腫細胞を、グルコース不含クレブスバッファー単独（レーン１）または示した処理を含めて（ＤＦＯ＝１００μＭ、ＤＭＯＧ＝１ｍＭ、グルコース＝２ｍＭ、ピルビン酸＝２ｍＭ、ラクタシスチン−βラクトン（Ｌｂｌ）＝２０μＭ）４時間培養した。１％酸素以外のすべての処理は２０％酸素下で実施した。次いで、全細胞抽出物を調製し、ＨＩＦ−１ａタンパク質レベルについてプローブした。プロテアソーム阻害剤Ｌｂｌで処理した細胞のみが、ユビキチン化ＨＩＦ−１ａの特徴的な大きな分子量のスメアとＨＩＦ免疫反応性を示した。（Ｂ）Ｕ３７３神経膠腫細胞を、（Ａ）におけるものと同様の条件下で処理した。オキサロ酢酸およびコハク酸は２ｍＭで用いた。ここで留意すべきは、Ｌｂｌ処理によって生じたユビキチン化ＨＩＦ−１ａは核に転位しないということである。また、コハク酸は効果がないということも留意すべきである。
【図１０】分枝鎖２−オキソ酸によるＨＩＦ−１ａ活性化の実証。Ｕ２５１細胞を、グルコース不含クレブスバッファー中、２ｍＭ用量の示した２−オキソ酸で４時間処理した。次いで、細胞を洗浄し、固定し、ＨＩＦ−１ａタンパク質について染色した。
【図１１】ピルビン酸およびオキサロ酢酸は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼへの２−オキソグルタル酸結合について競合する。（Ａ）ヒト神経膠腫細胞はＨＰＨ相同体１、２および３を発現する。ＲＴ−ＰＣＲを、特異的プライマーを用いて実施し、本発明者らのデータのほとんどを集めるために用いた神経膠腫細胞株中のＨＰＨ相同体の存在を実証した。見られる発現パターンは正常ヒト組織のものと同様である。（Ｂ）ＨＰＨは、固定化した２−オキソグルタル酸と結合する。このアッセイは、図２中ステップＢの尺度である。２−オキソグルタル酸と共有結合しているエポキシ活性化セファロースビーズを、２５０ｍＭの硫酸鉄の存在下または不在下、室温でｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳した３５Ｓ標識ＨＰＨ相同体と共にインキュベートし、次いで、遠心分離によってペレット化した。４回さらに洗浄した後、ペレットと結合している放射標識を、シンチレーションカウンターによって測定した。結合している放射標識の５０％より多くが鉄依存性であった。（Ｃ）ＨＰＨの２−オキソグルタル酸カラムへの全結合のほぼ半量を、２０ｍＭ  ２−オキソグルタル酸で置換できたが、２０ｍＭコハク酸ではできなかった。（Ｄ）固定化した２−オキソグルタル酸への鉄依存性ＨＰＨ結合は、ピルビン酸（２０ｍＭ）およびオキサロ酢酸（２０ｍＭ）によって置換される。
【図１２】ピルビン酸およびオキサロ酢酸は、ＨＩＦ−１ａＯＤＤペプチドの水酸化を支持しない。本発明者らは、ＨＰＨ相同体の３５Ｓ−ｐＶＨＬ結合活性を、ＨＩＦ−１ａＯＤＤの重要なプロリン５６４残基を含むビオチン化１９マーペプチドに付与する能力をモニターすることによって、ピルビン酸またはオキサロ酢酸がＨＩＦ−１ａのプロリル水酸化に影響を及ぼすかどうかを調べた（図１参照）。ペプチドを、ＨＰＨおよび示した試薬と共にインキュベートした後、３５Ｓ−ｐＶＨＬを加え、続いて、ストレプトアビジンでコートしたビーズを加えてＨＩＦ−１ａペプチドをプルダウンした。反応物をペレット化し、そのペレットを洗浄し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために可溶化し、続いて、オートラジオグラフィーに付して捕獲された３５Ｓ−ｐＶＨＬを明らかにした。本発明者らはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳されたＨＰＨ相同体を用いて、まずアッセイ条件を、必要なＨＰＨ基質および補因子に関して最適化した。（Ａ）この用量曲線によって示されるように、２−ＯＧは確実に活性化が必要であった。その他の試薬の条件：アスコルビン酸＝２ｍＭ、硫酸鉄＝２５０μＭ、ＤＴＴ＝１ｍＭ。（Ｂ）鉄も、最大約１００μＭまで確実に必要であった。条件：アスコルビン酸＝２ｍＭ、２−ＯＧ＝２ｍＭ、ＤＴＴ＝１ｍＭ。（Ｃ）アスコルビン酸はその不在下でいくらかの活性が見られたが、用量依存的に活性を高めた。条件：２−ＯＧ＝１２５μＭ、硫酸鉄＝２５０μＭ、ＤＴＴ＝１ｍＭ。（Ｄ）すべての他の試薬を前記のように一定に維持した条件下では、３種のＨＰＨ相同体のいずれによってＨＩＦ−１ａペプチドのプロリン水酸化を触媒することでは、ＰｙｒまたはＯＡＡの１ｍＭ量を１００μＭ  ２−ＯＧと置換することはできなかった。すべてのアッセイで５μｌ（約２０ｎｇ）の酵素および１μｇのペプチドを用いた。
【図１３】２−ＯＧ類似体の、遺伝子組換えＨＰＨ活性に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用。ＨＰＨ活性を、図１１におけるような３５Ｓ−ｐＶＨＬプルダウンアッセイによって評価した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳されたＨＰＨ相同体の活性を、１ｍＭの２−ＯＧ類似体Ｎ−オキサリルグリシン（ＮＯＧ）、ピルビン酸またはＯＡＡの不在下および存在下で調べた。ＮＯＧによる阻害は全く明らかであるが、ピルビン酸およびオキサロ酢酸の作用は５ｍＭまたは２５ｍＭ［２−ＯＧ］のいずれかであまり一貫性がない。
【図１４】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子組換えＨＰＨ活性のアスコルビン酸可逆的阻害。図１１において用いた３５Ｓ−ｐＶＨＬ捕獲アッセイを用いて、ＯＡＡまたはＰｙｒがＨＰＨ活性の阻害剤として作用できるかどうかを調べた。用いた条件：２−ＯＧ＝１００ｍＭ、硫酸鉄＝２０ｍＭ、ＤＴＴ＝１ｍＭ。アスコルビン酸濃度は示したように変え、ＯＡＡまたはＰｙｒを、示した場合には１ｍＭで加えた。ＯＡＡおよびＰｙｒの双方ともＨＰＨ−１およびＨＰＨ−２活性を阻害すると思われ、その作用は、低いアスコルビン酸用量でより明らかであった。ＨＰＨ−３はＯＡＡまたはＰｙｒに対して感受性でないと思われた。
【図１５】ピルビン酸またはオキサロ酢酸誘導性ＨＩＦ−１ａ蓄積は、アスコルビン酸によって阻止される。Ｕ８７およびＵ２５１神経膠腫細胞を、示した条件下、グルコース不含クレブスバッファー中で４時間処理した。ピルビン酸およびＯＡＡを、示した場合には１ｍＭで含めた。（Ａ）Ｕ８７細胞におけるＨＩＦ−１ａの核蓄積を、核抽出物においてウエスタンブロッティングによって評価した。（Ｂ）Ｕ２５１細胞におけるＨＩＦ−１ａの核蓄積を、免疫組織化学によって分析した。ここで留意すべきは、低酸素下ではなく、ピルビン酸およびオキサロ酢酸処理下の、アスコルビン酸（１００μＭ）によるＨＩＦ−１蓄積の阻害ということである。また、２−オキソグルタル酸（１０ｍＭ）はいずれの誘導物質も逆転させることができないことも留意すべきである。刺激されていないＵ８７細胞はこの図では示していない。
【図１６】アスコルビン酸は長期のＨＩＦ−１ａ蓄積を逆転させる。（Ａ）Ｕ２５１における、低酸素またはピルビン酸のいずれかで誘導した後のＨＩＦ−１ａ崩壊の比較。Ｕ２５１細胞を、低酸素下または正常酸素圧中１ｍＭピルビン酸と共にグルコース不含クレブス中で４時間培養した。この細胞を、正常酸素圧中、グルコース不含クレブスに切り替えた後、示した時間に、ホルムアルデヒド中で固定した。次いで、細胞をＨＩＦ−１ａ免疫反応性について染色した。ここで留意すべきは、ピルビン酸に対し、低酸素によって誘導された後の核ＨＩＦ−１ａ染色の急速な崩壊である。（Ｂ）低酸素下で４時間処理したＵ８７細胞は、顕著なＨＩＦ−１ａ誘導を示すが、これは再酸素化３０分までに完全に分解される。Ｕ８７細胞を、１ｍＭピルビン酸またはオキサロ酢酸を含むか含まない、グルコース不含クレブスバッファー中で処理した。４時間後、細胞を、グルコース不含クレブスで種々の時間、１００μＭアスコルビン酸を洗浄液に含めるか含めずに洗浄した。ここで留意すべきは、ピルビン酸およびオキサロ酢酸誘導性ＨＩＦ−１ａ蓄積は、誘導物質が洗浄され除去された後、長時間持続するということである。洗浄液にアスコルビン酸を含めることにより、ＨＩＦ−１ａ崩壊速度が高まった。
【図１７】ピルビン酸およびオキサロ酢酸による細胞のＨＰＨ活性の不活化。Ｕ２５１細胞を、示した添加剤を含むか含まない、グルコース不含クレブスバッファー中で４時間培養した。次いで、全細胞抽出物を調製し、ＨＰＨ酵素の供給源として用い、プロリン５６４を含む、ＨＩＦ−１ａＯＤＤに由来するビオチン化ペプチドを水酸化した。プロリン水酸化を、図１２〜１４におけるように、ストレプトアビジンでコートしたビーズのヒドロキシプロリン３５Ｓ−ｐＶＨＬ複合体をプルダウンする能力によって測定した。（Ａ）細胞を１ｍＭピルビン酸またはオキサロ酢酸で処理すると、Ｕ２５１抽出物のＨＰＨ活性が著しく減少した。細胞インキュベーションの際に、１００μＭのアスコルビン酸を含めることによって、この活性の損失が防がれた。（Ｂ）低酸素またはＤＭＯＧを用いた同様の実験からはＨＰＨ活性のこのような損失は示されなかった。
【図１８】２−オキソ酸は、ヒト細胞株においてＨＩＦ介在性遺伝子発現を活性化する。ＨＩＦによる効果的な遺伝子発現は、ＨＰＨ酵素の阻害によるＨＩＦタンパク質安定化だけでなく、ＨＩＦ−１のＤＮＡとの結合、ＦＩＨ−１活性の阻害および遺伝子転写にも関連している（図１参照）。（Ａ）本発明者らの研究に用いた神経膠腫細胞はＦＩＨ−１を発現することがＲＴ−ＰＣＲを用いて評価された。（Ｂ）ピルビン酸処理したＵ８７細胞から得た核抽出物は、ＨＲＥ  ＤＮＡに対して結合活性を表す。（Ｃ）Ｕ８７細胞はまた、ＨＩＦによって調節されると分かっているいくつかの遺伝子、例えば血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、グルコース輸送体アイソフォーム３（Ｇｌｕｔ−３）およびアルドラーゼＡ（ＡｌｄｏＡ）のｍＲＮＡレベルをアップレギュレートする。ＨＩＦ調節下にないβアクチン、ハウスキーピング遺伝子の発現はピルビン酸によって影響を受けない。（Ｄ）ヒトＨｅｐ３Ｂ肝細胞腫細胞はエリスロポエチン（ｅｐｏ）ｍＲＮＡを発現し、この発現はピルビン酸によって用量依存的に増加する。（Ｅ）Ｕ３７３細胞を、プロモーターを含むＨＩＦ調節エレメント（ＨＲＥ）の制御下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）構築物を用いてトランスフェクトし、次いで、示した条件下、グルコース不含培地で８時間培養した。細胞を１％酸素またはＤＦＯで処理すると、ＧＦＰ（緑色蛍光）が発現された。ピルビン酸はまた、ＧＦＰ発現も増強した。（Ｆ）ＨＲＥ調節されるルシフェラーゼを用いて、２−オキソ酸およびその類似体による、ＨＩＦ調節される遺伝子の活性化を実証した。プロモーターを含むＨＲＥの制御下のルシフェラーゼ構築物を用いて安定にトランスフェクトされたＵ２５１細胞を、グルコース不含クレブスで以下の条件を用いて６時間培養した：１＝対照、２＝１％酸素、３＝ピルビン酸（２ｍＭ）、４＝ＯＡＡ（２ｍＭ）、５＝エチルピルビン酸（２ｍＭ）、６＝グルコース（５．５ｍＭ）、７＝ＤＭＯＧ（０．５ｍＭ）、８＝ラクタシスチン−βラクトン（２０ｍＭ）。ここで留意すべきは、ラクタシスチンによってではなく、低酸素、ＤＦＯおよび２−オキソ酸によって増強されたＨＲＥ−ルシフェラーゼ発現ということである。
【図１９】ＨＩＦ介在性遺伝子発現は、アスコルビン酸によって選択的に逆転される。ＨＲＥ−ルシフェラーゼを安定に発現するＵ２５１細胞を、グルコース不含クレブスバッファー中で、示した条件を用いて８時間培養した。ピルビン酸、オキサロ酢酸およびＤＭＯＧは、各々１ｍＭで加えた。ピルビン酸またはオキサロ酢酸によるＨＲＥ−ルシフェラーゼの活性化は、アスコルビン酸によるその選択的逆転によって低酸素またはＤＭＯＧによるものと区別される。１０ｍＭの２−オキソグルタル酸では逆転は見られなかった。
【図２０】２−オキソ酸は脳細胞においてＨＩＦを活性化する  （Ａ）ニューロベーサル（Neurobasal）培地で増殖させたラット大脳皮質ニューロンの初代培養を、１％酸素または３ｍＭピルビン酸のいずれかで４時間処理し、次いで、ＨＩＦ−１ａ免疫反応性についてアッセイした。ここで留意すべきは、低酸素とピルビン酸双方によるＨＩＦ−１ａの核蓄積の増加である。（Ｂ）核抽出物を調製し、ウエスタンブロッティングによってＨＩＦ−１ａについてアッセイした点を除いて同様の実験を、ラット星状細胞の初代培養を用いて実施した。（Ｃ）１０日齢のラットを低酸素（８％酸素）に付し、または２ｇ／ｋｇピルビン酸を腹腔内注射した。４時間後、ラットを屠殺し、その脳を回収し、核抽出物を調製した。ＨＩＦ−１ａレベルをウエスタンブロッティングによって調べた。（Ｄ）同様の実験で、１０日齢のラットを０．１％一酸化炭素に曝露し、全身性低酸素症を引き起こすか、または２ｇ／ｋｇのＯＡＡを腹腔内注射した。
【図２１】オキサロ酢酸プレコンディショニングはニューロンを酸素グルコース欠乏から保護することができる。ＯＡＡプレコンディショニングには、酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）の４８時間前に、培地に直接添加する種々の濃度のＯＡＡの添加を含めた。ＯＧＤを開始する直前、ニューロベーサル培地（Ｎ／Ｂ２７）を除去し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。その後、グルコース不含クレブスバッファーを用いてＯＧＤを誘発し、細胞を低酸素チャンバー（１％酸素）中に２時間入れた。対照実験では、培地を標準のグルコースを含有するクレブスバッファーに置き換え、細胞を２０〜２１％酸素の正常酸素圧中でインキュベートした。ＯＧＤの直後、種々の処理群からバッファーを除去し、新鮮培地と置き換え、細胞をＭＴＴ還元での侵襲の２４時間後の細胞生存率についてアッセイした。ＯＡＡは、１ｍＭの濃度で保護作用を示し、この作用は統計的に有意であった（３ｍＭオキサロ酢酸処理で＊ｐ＜０．０５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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