(57)【要約】【課題】細胞接着及び細胞接着に媒介される疾患を抑制及び予防に使用される新規な化合物及び方法を提供する。【解決手段】本発明に係る化合物及び医薬組成物は、治療薬又は予防薬として使用することができる。特に、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンは、ＶＣＡＭ−１接着機構に媒介される白血球の接着（例えば、単球の内皮細胞への接着）及び移動を抑制する能力を有している。抗炎症性を活性化にするのに加えて、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオン並びにそれらの生理学的に許容される塩及び誘導体は、一般的に、ＶＣＡＭ−１とＶＣＡＭ−１リガンド（例えば、ＶＬＡ−４又はα４β７）との相互作用に基づいている病気、又は、前記相互作用を阻害することによって改善できる病気の治療（すなわち、治療及び予防）に適している。【選択図】なし58【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における細胞接着を抑制する方法であって、
細胞接着を防止、阻害又は抑制するのに有効な量のメチマゾール誘導体又は互変異性環状チオン或いはその混合物を含有する医薬組成物を、前記哺乳類に投与するステップを含む方法。
【請求項２】
哺乳類における、細胞接着に媒介される疾患、疾病、病気又は症状を治療する方法であって、
細胞接着を防止、阻害又は抑制するのに有効な量のメチマゾール誘導体又は互変異性環状チオン或いはその混合物を含有する医薬組成物を、前記哺乳類に投与するステップを含む方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記疾患又は病気は、急性肺損傷、アレルギー性鼻炎、アルツハイマー病、関節炎、ぜんそく、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性糸球体腎炎、ベーチェット氏病、癌、脳梗塞、慢性肝炎、肝硬変、皮膚アナフィラキシー反応、皮膚血管炎、遅延型過敏反応、糖尿病、播種性血管内凝固症候群、肺好酸球性肉芽腫、胃炎、巨細胞性動脈炎、グレーブス病、出血性ショック、高血圧性血管疾患、甲状腺機能低下症、炎症性大腸炎（クローン病、潰瘍性大腸炎）、炎症性皮膚病、腸梗塞、川崎病（粘膜皮膚リンパ節症候群）、リンパ球様間質性肺炎、マラリア、髄膜炎、多発性硬化症、心筋梗塞、臓器移植（ホスト対グラフト、グラフト対ホスト）、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、乾癬、肺梗塞、腎梗塞、虚血後の再かん流傷害、リケッチア脈管炎、サルコイドーシス、敗血症、シェーグレン病、脳梗塞、全身性エリテマトーデス、熱傷（やけど）、閉塞性血栓血管炎（バージャー病）、血栓症、甲状腺炎、結核症、脈管炎、及びヴェーゲナー肉芽腫症の内の１つ以上であることを特徴とする方法。
【請求項４】
哺乳類における、細胞接着を防止、阻害又は抑制する方法であって、
ＶＣＡＭ−１に媒介される細胞接着を防止、阻害又は抑制するのに有効な量のメチマゾール誘導体又は互変異性環状チオン或いはその混合物を含有する医薬組成物、及び薬学的に許容される担体を、前記哺乳類に投与するステップを含む方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
前記細胞接着は、ＶＣＡＭ−１及びＥ−セレクチンに媒介されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記細胞接着は、ＩＲＦ−１依存性のＶＣＡＭ−１に媒介される細胞接着であることを特徴とする方法。
【請求項７】
哺乳類における、サイトカイン誘導性の細胞接着を防止、阻害又は抑制する方法であって、
ＶＣＡＭ−１に媒介される細胞接着を防止、阻害又は抑制するのに有効な量のメチマゾール誘導体又は互変異性環状チオン或いはその混合物を含有する医薬組成物、及び薬学的に許容される担体を、前記哺乳類に投与するステップを含む方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
前記細胞接着は、ＶＣＡＭ−１及びＥ−セレクチンに媒介されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
前記細胞接着は、ＩＲＦ−１依存性のＶＣＡＭ−１に媒介される細胞接着であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法であって、
前記サイトカインは、ＴＮＦ−アルファであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１、４、又は７に記載の方法であって、
細胞接着に関連する炎症を防止、阻害又は抑制するために用いられることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項７に記載の方法であって、
サイトカイン誘導性の細胞接着に関連する炎症を防止、阻害又は抑制するために用いられることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１、４、又は７に記載の方法であって、
免疫又は自己免疫反応に関連する細胞接着を防止、阻害又は抑制するために用いられる
【請求項１４】
請求項４に記載の方法であって、
成人呼吸窮迫症候群、ＡＩＤＳ、アレルギー病、動脈硬化症、関節炎、ぜんそく、アテローム性動脈硬化症、循環器疾患、網膜剥離、有害な血小板凝集、炎症、炎症性大腸炎、多発性硬化症、腫瘍性疾患、眼炎症性疾患、骨関節炎、骨粗しょう症、乾癬、限局性腸炎、移植後の拒絶、血栓溶解後の再閉塞、再かん流傷害、シェーグレン症候群、皮膚炎症性疾患、全身性エリテマトーデス、血栓症、Ｉ型型糖尿病、甲状腺炎、及び、創傷から成る群より選択される１つ以上の病気を治療又は予防するために用いられることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１、４、又は７に記載の方法であって、
前記医薬組成物は、
2007529510.tif 000018
から選択される安全で有効な量の活性化合物、及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする方法。
ただし、
Ｙは、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、ＮＯ２、及びフェニル部分
2007529510.tif 000019
から成る群より選択され、
Ｙの１つだけは前記フェニル部分であり得、
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、及びＣＨ２Ｐｈから成る群より選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｘは、Ｓ及びＯから選択され、
Ｚは、ＳＲ３、ＯＲ３及びＣｌ−Ｃ４アルキルから選択され、
Ｙがフェニル部分でない場合は、Ｒ２及びＲ３の少なくとも２つはＣｌ−Ｃ４アルキルであり、
Ｚがアルキルの場合は、Ｙの少なくとも１つはＮＯ２である。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
Ｚは、ＳＲ３及びＯＲ３から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、
ＺがＳＲ３であり、ＸがＳであることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、
ＹがＨであることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
Ｒ３がＣｌ−Ｃ４アルキルであることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
Ｒ３がメチルであることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、
Ｒ２の少なくとも１つは、メチルであることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法であって、
両方のＲ２がメチルであることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１５に記載の方法であって、
前記活性化合物は、次の化学構造式で表されることを特徴とする方法。
2007529510.tif 000020
【請求項２４】
請求項１５に記載の方法であって、
前記活性化合物は、次の化学構造式で表されることを特徴とする方法。
2007529510.tif 000021
【請求項２５】
請求項１５に記載の方法であって、
前記活性化合物は、次の化学構造式で表されることを特徴とする方法。
2007529510.tif 000022
【請求項２６】
請求項１５に記載の方法であって、
前記活性化合物は、次の化学構造式で表されることを特徴とする方法。
2007529510.tif 000023
【請求項２７】
請求項１５に記載の方法であって、
前記活性化合物は、次の化学構造式で表されることを特徴とする方法。
2007529510.tif 000024
【請求項２８】
請求項１７に記載の方法であって、
Ｙの１つは、フェニル部分であることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２６に記載の方法であって、
Ｒ１及びＲ４がＨであることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２７に記載の方法であって、
Ｒ３がメチルであり、Ｒ２の少なくとも１つがメチルであることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２８に記載の方法であって、
Ｒ３がＨであることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載の方法であって、
両方のＲ２は両方ともメチルであることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項１５に記載の方法であって、
前記活性化合物は、
2007529510.tif 000025
から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項１５に記載の方法であって、
前記医薬組成物は、プロドラッグの形態であることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項１５に記載の方法であって、
前記医薬組成物は、
約０．０１％〜２５％の活性化合物と、
約７５％〜９９．９％の薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項１、４、又は７に記載の方法であって、
前記医薬組成物は、
安全で有効な量の、次の化学構造式で表される活性化合物を含むことを特徴とする方法。
2007529510.tif 000026
ただし、Ｒ２は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択される。
【請求項３７】
請求項３４に記載の方法であって、
Ｒ２は、Ｃｌ−Ｃ４アルキル及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３５に記載の方法であって、
Ｒ２がメチルであることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項１、４、又は７に記載の方法であって、
前記医薬組成物は、安全で有効な量の、
2007529510.tif 000027
から選択される化合物、及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする方法。
ただし、Ｙは、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、ＮＯ２、及びフェニル部分
2007529510.tif 000028
から成る群より選択され、
Ｙの１つだけは前記フェニル部分であり得、
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、Ｃｌ−Ｃ４エステル、及びＣｌ−Ｃ４置換エステルから成る群より選択され、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、及びＣＨ２Ｐｈから成る群より選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｘは、Ｓ及びＯから選択され、
Ｚは、ＳＲ３、ＯＲ３、Ｓ（Ｏ）Ｒ３、及びＣｌ−Ｃ４アルキルから選択され、
Ｙがフェニル部分ではない場合は、Ｒ２及びＲ３の少なくとも２つはＣｌ−Ｃ４アルキルであり、
Ｚがアルキルの場合は、Ｙの少なくとも１つはＮＯ２である。
【請求項４０】
請求項３７に記載の方法であって、
前記活性化合物は、
2007529510.tif 000029
から成る群より選択される
ただし、Ｒ９は、ＯＨ、Ｍ、及びＯＯＣＣＨ２Ｍから成る群より選択され、
Ｍは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから成る群より選択される。
【請求項４１】
請求項３８に記載の方法であって、
前記活性化合物は、
2007529510.tif 000030
から成る群より選択される
ただし、Ｒ１０は、Ｈ、ＮＯ２、Ｐｈ、４−ＨＯＰｈ、及び４−ＭＰから成る群より選択され、
Ｍは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから成る群より選択される。
【請求項４２】
白血球の血管接着に関連する病気の治療方法であって、
（ａ）白血球の血管内への異常な接着に関連する病気の疑いのある患者を特定するステップと、
（ｂ）内皮細胞におけるＶＣＡＭ−１及びＥ−セレクチンの少なくとも１つの細胞表面発現を減少させるのに十分な量のメチマゾール誘導体又は互変異性環状チオン或いはその混合物を含有する医薬組成物を、前記患者に投与するステップとを含み、
それによって白血球細胞の血管内への接着を減少させる方法。
【請求項４３】
請求項４０に記載の方法であって、
１つ以上のさらなる活性成分が本発明に係る化合物と併用され、
（ａ）ＶＣＡＭ−１拮抗薬、
（ｂ）ステロイド、
（ｃ）免疫抑制剤、
（ｄ）抗ヒスタミン剤、
（ｅ）非ステロイド系抗ぜんそく薬、
（ｆ）非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、
（ｇ）シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害薬、
（ｈ）ＩＶ型ホスホジエステラーゼ阻害薬（ＰＤＥ−ＩＶ）、
（ｉ）ケモカイン受容体拮抗薬、
（ｊ）コレステロール降下薬、
（ｋ）抗糖尿病薬、
（ｌ）インターフェロン・ベータ製剤、
（ｍ）抗コリン剤、及び
（ｎ）抗生物質
から選択される医薬組成物と別々に又は一体に投与されることを特徴とする方法。
【請求項４４】
哺乳類における、ＶＣＡＭ−１に媒介される細胞接着を防止、阻害又は抑制する、又は細胞接着に関連する炎症を防止、阻害又は抑制する能力がある化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）前記哺乳類に試験化合物を接触させるステップと、
（ｂ）白血球の接着又は移動或いはその両方における、前記試験化合物の作用を測定するステップと、
（ｃ）前記試験化合物が、前記接着又は移動或いはその両方に対する抑制剤であるかどうかを判断するステップとを含む方法。
【請求項４５】
請求項４２に記載の方法であって、
前記試験化合物の作用の測定は、
ＩＲＦ−１・ＲＮＡ発現レベルの測定、
ＩＲＦ−１・タンパク質発現レベルの測定、
ＩＲＦ−１依存性のＶＣＡＭ−１プロモータ活性化の測定、
サイトカイン誘導性のＩＲＦ−１ＲＮＡ発現レベルの測定、
サイトカイン誘導性のＩＲＦ−１タンパク質発現レベルの測定、
サイトカイン誘導性のＩＲＦ−１依存性ＶＣＡＭ−１プロモータ活性化の測定、
ＴＮＦ−アルファによって増加したＩＲＦ−１・ＲＮＡ発現レベルの測定、
ＴＮＦ−アルファによって増加したＩＲＦ−１タンパク質発現レベルの測定、及び
ＴＮＦ−アルファによって増加したＩＲＦ−１依存性ＶＣＡＭ−１プロモータ活性化の測定、
の１つ以上を含んでいることを特徴とする方法
【請求項４６】
請求項４２に記載の方法であって、
前記試験試験化合物の作用の測定は、
ＶＣＡＭ−１・ＲＮＡの発現レベルの測定、
サイトカイン誘導性のＶＣＡＭ−１タンパク質発現レベルの測定、
サイトカイン誘導性のＶＣＡＭ−１プロモータ活性化の測定、
ＴＮＦ−アルファによって増加したＶＣＡＭ−１・ＲＮＡ発現レベルの測定、
ＴＮＦ−アルファによって増加したＶＣＡＭ−１タンパク質発現レベルの測定、及び
ＴＮＦ−アルファによって増加したＶＣＡＭ−１プロモータ活性化の測定、
の１つ以上を含んでいることを特徴とする方法。
【請求項４７】
ＶＣＡＭ−１発現細胞における細胞接着阻害作用を有する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）前記ＶＣＡＭ−１発現細胞に試験化合物を接触させるステップと、
（ｂ）前記ＶＣＡＭ−１発現細胞を、ＶＣＡＭ−１リガンド発現細胞に接触させるステップと、
（ｃ）前記ＶＣＡＭ−１発現細胞の前記ＶＣＡＭ−１リガンド発現細胞への結合における、前記試験化合物の作用を測定するステップと、
（ｄ）前記試験化合物が、前記ＶＣＡＭ−１発現細胞のＶＣＡＭ−１リガンド発現細胞への結合作用における抑制剤であるかどうかを判断するステップとを含む方法。
【請求項４８】
請求項４５に記載の方法であって、
前記試験化合物の追加前に、追加と同時に、又は追加後に、
ＶＣＡＭ−１発現細胞に、ＶＣＡＭ−１の発現を抑制する能力のあるサイトカインを接触させるステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４６に記載の方法であって、
前記サイトカインは、ＴＮＦ−アルファであることを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４７に記載の方法であって、
前記ＶＣＡＭ−１発現細胞は、
非免疫性標的組織細胞、内皮細胞、及び上皮細胞から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項４７に記載の方法であって、
前記ＶＣＡＭ−１発現細胞は、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）であることを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項４７に記載の方法であって、
前記ＶＣＡＭ−１リガンド発現細胞は、白血球であることを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項４７に記載の方法であって、
前記細胞は、少なくとも３０分間接触を保たれることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞接着及び細胞接着に媒介される疾患を抑制及び予防に使用される新規な化合物及び方法に関するものである。また、本発明は、本発明に係る化合物を含む医薬組成物、及び当該医薬組成物を使用して行う細胞接着及び細胞接着に起因する疾患の抑制及び予防方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞接着は、互いに結合した細胞が特定の標的に向かって移動する又は細胞外マトリクス内に局在するプロセスのことである。つまり、細胞接着は、様々な生物学的現象の基礎を成す基本的機構の１つを構成する。例えば、細胞接着は、造血細胞の内皮細胞への接着、及びその後の前記造血細胞の血管から損傷部位への移動に関与している。細胞接着は、哺乳類における病的炎症及び免疫反応に関与する。
【０００３】
ＶＣＡＭ−１及び他の内皮細胞表面受容体に媒介される接着は、多くの炎症反応に関連する。損傷又は他の炎症刺激部位では、活性化した血管内皮細胞が、白血球に対して接着性を有する分子を発現する。白血球が内皮細胞と接着する仕組みは、一つには、白血球上の細胞表面受容体が、対応する内皮細胞上の細胞表面分子を認識して結合することを含む。結合するとすぐに、白血球は血管壁を通り抜けて損傷部位に入り、感染症と闘う化学伝達物質を放出する。
【０００４】
内皮細胞と白血球の接着機構によって本来健康な脳組織が破壊される中枢神経系障害の例としては、実験的自己免疫性脳脊髄炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis：EAE）、多発性硬化症（Multiple Sclerosis：MS）、及び髄膜炎などの炎症性脳障害がある。これらの炎症性疾患の患者では、大量の白血球が血液脳関門（Blood Brain Barrier：BBB）を通り抜けて移動する。白血球は、広範囲の組織損傷を与え、神経伝導障害及び麻痺をもたらす、有毒な媒介物質を放出する。
【０００５】
他の器官系では、接着機構によって組織損傷も起こり、白血球の移動及び活性化をもたらす。例えば、心筋虚血後における心臓組織の初期の損傷は、損傷組織に入った白血球によってさらに悪化し、さらなる損傷を引き起こすことが分かっている。接着機構に媒介される他の病気としては、例えば、ぜんそく、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、エイズによる認知症、糖尿病、炎症性大腸炎、多発性硬化症、関節リウマチ、組織移植、及び腫瘍転移がある。
【０００６】
血液循環の流体力学環境における白血球の内皮細胞への接着は、病的炎症（例えば、アテローム性動脈硬化症（１）、炎症性大腸炎（２））の中心的な役割を果たす。白血球動員に関与することが知られている内皮細胞接着分子（Endothelial Cell Adhesion Molecule：ＥＣＡＭ３）（例えば、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、及びＩＣＡＭ−１）は、これらの白血球接着における役割によって、そのような環境で上方制御されること、及び病気の進行及び／又は組織損傷の一因となることが分かっている（３）。例えば、ＶＣＡＭ−１は、初期の沫細胞損傷の上にある大動脈内皮細胞上に局所的に存在し（１）、内皮細胞において大腸炎モデルで増加する（４）。そのため、病的炎症を治療するための有望な治療方法は、ＥＣＡＭ発現の抑制によって、白血球の内皮細胞への異常な接着を、減少させることである（５）。
【０００７】
ＥＣＡＭ発現は、内皮細胞が存在するサイトカイン環境に影響される。実際、培養した内皮細胞を炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αで４時間処理することによって、Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１の発現を誘導できる（６）。サイトカイン依存性のＥＣＡＭ誘導は、例えば、核因子ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）、活性化タンパク質−１（ＡＰ−１）、特異性タンパク質（ＳＰ−１）、インターフェロン調節因子−１（ＩＲＦ−１）、及びＧＡＴＡなどの転写因子の活動によって、遺伝子レベルで調節される。例えば、Ｅ−セレクチン・プロモータはＮＦ−ｋＢとの結合部位を有しており（７）、ＶＣＡＭ−１・プロモータはＮＦ−ｋＢ、ＡＰ−１、ＳＰ−１、ＩＲＦ−１、及びＧＡＴＡとの結合部位を有しており（８〜１１）、ＩＣＡＭ−１・プロモータはＮＦ−ｋＢ及びＡＰ−１との機能的結合部位を有している（１２、１３）。これらの転写因子（例えば、ＮＦ−ｋＢ）のいくつかは、刺激されていない内皮細胞内に不活性形態で存在している（１４）。内皮細胞のサイトカイン処理は、これらの転写因子の活性を促進する（１４）、及び、他の転写因子（例えば、ＩＲＦ−１）の発現を誘発する（１０）。活性化又は誘導された転写因子は、各プロモータの結合部位と結合し、遺伝子転写をもたらす。
【０００８】
いくつかの最近の又は有力な病的炎症の治療は、少なくとも部分的には、転写因子の活動を調節することにより行う（１５〜１９）。実際、転写レベルでサイトカイン誘導性のＥＣＡＭ発現を阻止する化合物は、白血球の内皮細胞への接着を抑制すること（１６〜１８、２０）と、動物モデルにおける炎症を軽減させることが分かっている（１５、１７）。メチマゾールは、自己免疫性グレーブス病又は原発性甲状腺機能亢進症の治療に、臨床的に広く使用される（２１）。また、メチマゾールは、ヒトにおける乾癬と、ネズミの実験モデルにおける全身性狼瘡、自己免疫性眼瞼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、甲状腺炎及び糖尿病との両方で、他のいくつかの形態の自己免疫疾患の治療に有効なことが分かっている（２３〜２６）。メチマゾールが、ＭＨＣのクラスＩ及びクラスＩＩ遺伝子発現の異常増加に対する転写阻害物質として作用すること（２６〜２９）、及び、自己免疫疾患の予防におけるクラス１・ノックアウトの作用を模倣することの証拠が蓄積された（３０）。いくつかの観察結果は、メチマゾールはＥＣＡＭの発現にも影響を及ぼし得、そのため潜在的な抗炎症化合物となり得ることを示唆している。特に、（ａ）メチマゾールで治療したグレーブス病患者は、血液中の溶解Ｅ−セレクチン及び溶解ＣＡＭ−１のレベルが減少したこと（３１）、及び、（ｂ）メチマゾールが実験的大腸炎のラットモデルにおける結腸粘膜障害を軽減させることが報告されている（３２）。抗炎症剤又としてより有効な、又はメチマゾールよりも免疫抑制性が高い誘導体化合物を特定しようという試みにより、フェニルメチマゾール（化合物１０、Ｃ−１０）、互変異性環状チオン（tautomeric cyclic thione）は、ＭＨＣ遺伝子の発現の異常増加を抑制する上で５０〜１００倍強力であり、狼瘡（ループス）及び糖尿病の実験モデルにおいて、非常に効果的な薬物であるという観察が導かれた（２６、２８）。これらの観察結果は、メチマゾール、フェニルメチマゾール、又は他の互変異性環状チオンの誘導体が、炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）誘導性のＥＣＡＭ発現、及びその結果として起こる白血球の内皮細胞への接着を減少させることができるという仮説を精査する動機付けとなった。また、ＶＣＡＭ−１依存性細胞接着の阻害物質の必要性も残っている。そのような化合物は、ＶＣＡＭ−１が媒介する細胞接着に関連する様々な病気の治療、予防又は抑制に有用な薬物を提供するであろう。
【０００９】
特定の種類のメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンが、非常に様々な原因の炎症性の症状に対して、望ましくない又は有害な一連の炎症を予防、軽減又は抑制する抗炎症薬として有効であるということが新たに見いだされた。それらは、例えば、関節炎、関節リウマチ、多発性関節炎、炎症性大腸炎（クローン病、潰瘍性大腸炎）、全身性エリテマトーデス、中枢神経系の炎症性疾患（例えば、多発性硬化症）、ぜんそく、又はアレルギー（例えば、遅延型であるＩＶ型アレルギー）の治療に使用される。さらに、本発明に係る化合物は、発作防止又は発作続発防止のための心臓保護、並びに、循環器疾患、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、心筋再梗塞、急性冠症候群、脳梗塞、再狭窄、糖尿病、臓器移植への損傷、免疫疾患、自己免疫疾患、悪性腫瘍の増殖又は天使、マラリア及び他の病気（予防、軽減又は治療のために、ＶＣＡＭ−１発現の異常増加及び／又は白血球の活動による影響を阻害すべきである病気）の治療に適している。好適な使用は、炎症性大腸炎、及び、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病糖尿病の大血管又は微小血管合併症（例えば、心筋梗塞、心筋再梗塞又は腎症）の予防である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、細胞接触及び細胞接触に媒介される病気を抑制及び予防するための、新規な化合物及び方法に関するものである。また、本発明は、細胞接触及び細胞接触に媒介される病気を抑制及び予防するための、医薬組成物及びその使用に関するものである。本発明に係る化合物及び医薬組成物は、治療薬又は予防薬として使用することができる。特に、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンは、ＶＣＡＭ−１接着機構に媒介される白血球の接着（例えば、単球の内皮細胞への接着）及び移動を抑制する能力を有している。抗炎症性を活性化にするのに加えて、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオン並びにそれらの生理学的に許容される塩及び誘導体は、一般的に、ＶＣＡＭ−１とＶＣＡＭ−１リガンド（例えば、ＶＬＡ−４又はα４β７）との相互作用に基づいている病気、又は、前記相互作用を阻害することによって改善できる病気の治療（すなわち、治療及び予防）に適している。特に、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンは、少なくとも部分的には、望ましくない量の白血球接着及び／又は白血球移動によって生じた、又はそれらに関連する病気の治療に適している。また、白血球の接着及び／又は移動を減少させた病気の予防、軽減又は治療に適している。
【００１１】
また、本発明は、白血球の接着及び／又は移動を抑制するための、又はＶＣＡＭ−１発現（例えば、ＴＮＦ−αなどのサイトカインによって誘導されたＶＣＡＭ−１）の異常増加を抑制するための、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオン、及び／又はその薬学的に許容される塩、及び／又は誘導体に関するものである。さらに、本発明は、白血球接着及び／又は白血球移動が望ましくない程度を示す病気を治療するための、又はＶＣＡＭ−１依存性接着プロセスが一因となる病気を治療するための医薬品を作成するための、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオン及び／又はその薬学的に許容される塩及び／又は誘導体の使用に関するものである。また、本発明は、上記した種類の病気の治療に、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオン及び／又はその薬学的に許容される塩及び／又は誘導体を使用することに関するものである。
【００１２】
ある実施形態では、本発明は、病的炎症中の白血球の内皮細胞への異常な接着を、内皮細胞接着分子（Endothelial Cell Adhesion Molecule：ECAM）の転写レベルでの発現を抑制することによって、減少させる方法を提供する。特に、本発明は、ＴＮＦ−α誘導性ＥＣＡＭ（例えば、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１）の発現、及びその結果生じる単球細胞（Ｕ−９３７）のヒト大動脈内皮細胞（Human Aorta Endothelial Cell：HAEC）への接着を、メチマゾール誘導体を使用して調節する方法を提供する。
【００１３】
本発明のある実施形態では、これらの新規な化合物、組成物及び方法は、炎症性及び免疫性疾患の治療に好適に使用される。また、本発明は、本発明に係る化合物を作成する方法、及びその方法に有用な中間体を提供する。
【００１４】
ある実施形態では、本発明は、メチマゾール（１−メチル−２−メルカプトイミダゾール）及びその誘導体の使用を提供する。他の実施形態では、本発明は、カルビマゾール（ネオメルカゾール）及びその誘導体として知られる、プロドラッグ形態のメチマゾールの使用を提供する。
【００１５】
他の実施形態では、本発明は、メチマゾール、メトロニダゾール、メルカプトイミダゾール、メルカプトベンズイミダゾール、２−メルカプト−５−ニトロベンズイミジダゾール、２−メルカプト−５−メチルベンズイミジダゾール、ｓ−メチルメチマゾール、ｎ−メチルメチマゾール、５−メチルメチマゾール、５−フェニルメチマゾール、及び１−メチル−２−チオメチル−５（４）ニトロイミダゾールから成る群より選択される、１つ以上の化合物を含んでいる組成物の使用を提供する。好ましくは、５−フェニルメチマゾールが使用される。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、フェニルメチマゾール（化合物１０；Ｃ−１０）及びその誘導体の使用を提供する。
【００１７】
本発明のある目的は、フェニルメチマゾールを使用してＩＲＦ−１依存性のＶＣＡＭ−１遺伝子発現を抑制することにより、ＴＮＦ−α誘導性の単核白血球のＨＡＥＣへの細胞接着を調節する又は減少させる方法を提供することである。
【００１８】
本発明に係る化合物は、任意の従来技術を使用して合成することができる。好ましくは、本発明に係る化合物は、容易に入手できる出発物質から化学的に合成される。
【００１９】
本発明に係る化合物は、生物学的選択性を高めるための適切な官能基を付加することによって調節される。そのような調節は当該技術分野では公知であり、所定の生物系（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系）への生物学的浸透性を高める、経口有効性を高める、注射投与を可能にすべく溶解度を高める、代謝を変化させる、及び、排出速度を変化させることを含む。
【００２０】
本明細書中では、「患者」という用語は哺乳類を意味し、ヒトを含んでいる。また、「細胞」という用語は哺乳類細胞を意味し、ヒト細胞を含んでいる。
【００２１】
合成されるとすぐに、本発明に係る化合物の活性及びＶＣＡＭ−１特異性は、インビトロ及びインビボ分析によって測定される。
【００２２】
例えば、本発明に係る化合物の細胞接着阻害活性は、ＶＣＡＭ−１発現細胞のＶＣＡＭ−１リガンド（例えば、ＶＬＡ−４）発現細胞（例えば、単球、リンパ球）への結合を阻害するのに必要とされる阻害剤の濃度を測定することによって判断される。この分析では、マイクロタイターウエルは、ＶＣＡＭ−１を発現できる細胞（例えば、内皮細胞）でコーティングされている。前記ウエルがコーティングされるとすぐに、試験化合物の濃度を変化させ、ＶＣＡＭ−１の発現を誘導できるサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）と共に加えられる。または、最初に試験化合物が加えられ、サイトカインを加える前に、内皮細胞を含んでいる前記コーティングされたウエルと共に培養される。前記細胞は、前記ウエル内で少なくとも２時間培養される。培養後、適切に標識化されたＶＣＡＭ−１リガンド発現細胞（例えば、単球、リンパ球）が前記ウエルに加えられ、少なくとも３０分培養される。培養期間後、前記ウエルは洗浄される。結合の抑制は、試験化合物、及び試験化合物を含んでいない対照の様々な濃度のプレート内における、ＶＣＡＭ−１発現細胞の蛍光及び放射能の定量化によって測定される。
【００２３】
この分析に使用できるＶＣＡＭ−１発現細胞としては、非免疫性の標的組織細胞、内皮細胞、及び上皮細胞が挙げられる。この分析で使用されるＶＣＡＭ−１リガンド発現細胞（例えば、単球、リンパ球）は、蛍光又は放射標識される。
【００２４】
また、直接結合分析は、本発明に係る化合物の阻害活性を定量化するために行われる。
【００２５】
ＶＣＡＭ−１特異的阻害剤が特定されるとすぐに、前記阻害剤の特性はインビボ分析によってさらに明らかにされる。そのうちのある分析では、すでに確立された病的炎症のインビボモデルにおける、阻害剤のＶＣＡＭ−１発現及び白血球接着に対する作用を試験する。前記病的炎症のインビボモデルとしては、例えば、慢性炎症（すなわち、大腸炎）のネズミモデルにおける炎症を起こした腸間膜内皮や、アテローム性動脈硬化症が進行したアポリポタンパク質Ｅ欠損（ａｐｏＥ−／−）マウスから摘出した頸動脈がある。
【００２６】
本発明に係る化合物は、無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基から得られる薬学的に許容される塩の形態で使用される。
【００２７】
そのような酸性塩としては、次のものがある。酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホナート、重硫酸塩、ブチラート、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩塩、臭化水素酸塩塩、ヨウ化水素酸塩塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチネート、過硫酸塩、３−フェニル−プロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、チオシアン酸塩、トシレート、及び、ウンデカノエート。
【００２８】
また、そのような塩基塩としては、次のものがある。アンモニウム塩、アルカリ金属塩（ナトリウム及びカリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム及びマグネシウム塩など）、有機塩基を有する塩（ナトリウム及びカリウム塩などジシクロヘキシルアミン塩）、Ｎ−メチル−グルカミン、及び、アミノ酸を有する塩（アルギニン、リジンなど）。
【００２９】
また、塩基性窒素を含んでいる基は、例えば、低アルキル基ハロゲン化合物（メチル、エチル、プロピル、塩化ブチルなど）、臭化物及びヨウ化物、硫酸ジアルキル（ジメチル、ジエチル、ジブチル、及びジアミル硫酸塩など）、長鎖ハロゲン化合物（デシル、ラウリル、ミリスチル、及び塩化ステアリルなど）、ハロゲン化アラルキル（ベンジル及び臭化フェネチル臭化物）などの物質によって四級化することができる。水溶性、油溶性、水分散性又は油分散性の生成物は、そのようにして得られる。
【００３０】
本発明に係る化合物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーを用いて、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、経口腔的に、経膣的に、又は埋め込み型レザバーによって投与される医薬組成物に配合される。「非経口的」という用語は、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、クモ膜下、肝臓内、病巣内、及び頭蓋内への注射又は注入技術を含む。
【００３１】
本発明に係る医薬組成物は、任意の本発明に係る化合物又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体との組み合わせを含む。「担体」という用語は、許容できる補助剤と賦形剤とを含む。本発明に係る医薬組成物に使用できる薬学的に許容される担体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（リン酸塩など）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸におけるグリセリドの部分的混合物、水、塩又は電解質（例えば、硫酸プロタミン）、リン酸水素２ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダル・シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニル・ピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレン・グリコール、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、ポリアクリル酸、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレン・グリコール、及び、ウール脂肪などがある（ただし、これらに限定されるものではない）。これらは、脂質又はポリマー粒子（生分解性高分子を含む）で作られたリポソーム又は薬物担体を含んでおり、標的化遺伝子導入の用途（例えば、抗体への結合）を含んでいる。それらは、最終的な実用的な濃度に希釈する前に、ジメチルスルホキシドによって可溶化することを含んでいる。
【００３２】
本発明によれば、医薬組成物は、例えば注射可能な水溶液又は油性懸濁液などの、無菌性の注射製剤の形態である。この懸濁液は、適切な分散又は湿潤剤と懸濁化剤とを使用して、当該技術分野では公知の技術によって作成される。前記した無菌の注射製剤としては、例えば１，３−ブタンジオール又はジメチルスルホキシド内の水溶液などの、無毒性の薬学的に許容される希釈剤又は溶剤内の無菌の注射可能な水溶液又は懸濁液があり得る。許容可能な担体及び溶液のうちで、使用されるのは水、リンガー溶液、及び生理食塩液である。加えて、殺菌した不揮発性油は、従来、溶剤又は懸濁化剤として使用される。このために、合成モノ又はジグリセリドなどの、任意の無菌性の不揮発性が使用される。脂肪酸（例えば、オレイン酸及びそのグリセリド誘導体）は、薬学的に許容される天然油（オリーブ油又はヒマシ油、特にそれらがポリオキシエチル化されたもの）と同様に、注射製剤の作成に有用である。これらの油又は懸濁液は、直鎖アルコール希釈剤又は分散剤（例えば、Ph. Helv又は同様のアルコール）も含むことができる。
【００３３】
本発明に係る医薬組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液又は溶液などの（ただし、これらに限定されるものではない）、任意の経口投与の形態で経口投与することができる。経口投与用の錠剤の場合は、一般的に使用される担体としては、ラクトースやコーンスターチがある。また、ステアリン酸マグネシウムなどの平滑剤が一般的に加えられる。カプセル形態で経口投与する場合は、ラクトースや乾燥コーンスターチなどの希釈剤が使用できる。経口投与するために水性懸濁液が必要な場合は、活性成分は乳化剤及び懸濁化剤と組み合わされる。必要に応じて、若干の甘味剤、香料添加剤又は着色剤を加えることもできる。
【００３４】
また、本発明に係る医薬組成物は、坐薬の形態で直腸投与される。それらは、前記物質を適切な非刺激性の賦形剤（室温では固形であるが直腸温では液体であり、直腸内では薬物を放出すべく融解するような賦形剤）と混合することによって作成される。そのような物質としては、カカオバター、蜜ろう、及びポリエチレン・グリコールなどがある。
【００３５】
また、特に、治療の標的が容易に局所適用できる領域又は器官を含んでいる場合は（例えば、目、皮膚又は下部腸管の病気を治療する場合は）、本発明に係る医薬組成物を局所的に投与することもできる。適切な局所製剤は、それらの領域又は器官のために容易に作成される。
【００３６】
下部腸管のための局所投与は、肛門坐剤製剤（上記参照）又は適切なかん腸剤によって行うことができる。また、局所的経皮投与パッチを使用して行うこともできる。
【００３７】
局所適用に使用するためには、本発明に係る医薬組成物は、１つ以上の担体に懸濁又は溶解した活性成分を含んでいる、適切な軟膏の形態で作成される。本発明に係る化合物を局所投与するのに用いられる担体としては、鉱物油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレン・グリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレン化合物、乳化ワックス、及び水がある（ただし、これらに限定されるものではない）。また。医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体に懸濁又は溶解した活性成分を含んでいる、適切なローション又はクリームの形態に形成することもできる。適切な担体としては、鉱物油、ソルビタン・モノステアレート、ポリソルベート６０、セチル・エステル・ワックス、セテアリル・アルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジル・アルコール、及び水などがある（ただし、これらに限定されるものではない）。
【００３８】
眼科用に使用するためには、本発明に係る医薬組成物は、等浸透圧のｐＨ調整された無菌食塩水内の微粉化懸濁液の形態に、又は、好ましくは、等浸透圧のｐＨ調整された無菌食塩水内の水溶液の形態に形成される（防腐剤（例えば、塩化ベンジルアルコニウム）を用いて又は用いずに）。或いは、眼科用に使用するためには、本発明に係る医薬組成物は、ワセリンなどの軟膏の形態に形成される。
【００３９】
また、本発明に係る医薬組成物は、噴霧器、ドライパウダー吸入器又は定量吸入器を使用して、鼻エアロゾル又は吸入によって投与することができる。そのような組成物は、医薬組成物の分野では公知の技術によって作成され、ベンジル・アルコール又は他の適切な防腐剤、生体利用効率を高めるための吸収促進剤、過フッ化炭化水素、及び／又は他の通常の可溶化剤又は分散剤を使用して、食塩水中の水溶液として作成される。
【００４０】
単回投与形態を作成すべく担体物質と組み合わされる活性成分の量は、治療するホスト及び投与形態によって異なる。また、当然のことながら、特定の患者への投与薬及び治療計画は、使用する投与薬（化合物）の活性、年齢、体重、健康状態、性別、食生活、投与期間、排出速度、併用する薬、及び、治療する医師の判断及び治療する病気の重症度などの様々な要因によって決定される。また、活性成分の量は、治療薬か予防薬かによって異なる。
【００４１】
本発明に係る化合物の、細胞接着を防止、抑制又は抑止するのに有効な投与量及び投与速度は、抑制剤の性質、患者の体の大きさ、治療目標、治療する病気の性質、使用する医薬組成物、及び、治療する医師の判断などの様々な要因によって決定される。活性成分の投与量レベルが１日当たり約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重１ｋｇ当たり）、好ましくは１日当たり約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇである化合物が有用である。
【００４２】
本発明の他の実施形態では、本発明に係る化合物を含んでいる組成物は、コルチコステロイド、気管支拡張薬、抗ぜんそく薬（マスト細胞安定剤）、抗炎症薬、抗リウマチ剤、免疫抑制剤、代謝拮抗物質、免疫調節剤、乾癬治療薬、抗生物質、及び抗糖尿病薬から成る群より選択されるさらなる物質をさらに含む。また、前記群には、テオフィリン、スルファサラジン及びアミノサリチル酸（抗炎症薬）、シクロスポリン、ＦＫ−５０６及びラパマイシン（免疫抑制剤）、シクロホスファミド及びメトトレキサート（代謝拮抗物質）、及びインターフェロン（免疫賦活剤）などの化合物も含まれる。
【００４３】
他の実施形態では、本発明は、細胞接着に関連する炎症、及び細胞接着に関連する免疫又は自己免疫反応を防止、抑制又は抑止する方法を提供する。ＶＣＡＭ−１に関連する細胞接着は、様々な炎症性、免疫及び自己免疫疾患において中心的役割を果たす。したがって、本発明に係る化合物による細胞接着の抑制は、炎症性、免疫及び自己免疫疾患を治療又は予防する方法に利用することができる。好ましくは、本発明に係る方法によって治療する疾患は、ぜんそく、関節炎、乾癬、移植拒絶、多発性硬化症、糖尿病、炎症性大腸炎、及び、先天性免疫反応の活性化に関連する炎症性／免疫疾患（例えば、内毒素性ショック）から成る群より選択される。
【００４４】
これらの方法は、本発明に係る化合物を使用して、単独投与で、又は抗炎症剤或いは免疫抑制剤と組み合わせて行われる。前記組み合わせによる治療は、単回投与又は複数回投与の形態での、同時に又は異なった時間での投与を含む。
【００４５】
上記した本発明の概要は、本発明の各実施形態又は全ての実施を説明することを目的としたものではない。本発明の利点及び実現は、本発明のより完全な理解と共に、添付された図面を参照しつつ行われる以下の詳細な説明及び特許請求の範囲によって明らかになるであろう。
【００４６】
本明細書中では、温度は全て摂氏で表しており、特に明記しない限りパーセントは重量パーセントである。また、その文献に記載されている本発明に使用可能な組成物及び方法の説明及び開示を目的として言及した本明細書中で記載されている全ての文献は、その参照により本発明に含まれるものとする。前記文献は、単に、本願出願前の従来技術を開示するためのものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明は、ＶＣＡＭ−１の結合を特異的に抑制するメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオン化合物の使用を提供する。これらの化合物は、ＶＣＡＭ−１媒介性の細胞接着及びその細胞接着と関連する病気（炎症や免疫反応など）の抑制、防止及び抑止に有用である。本発明に係る化合物は、単独で使用される、或いは、細胞接着を抑制、防止及び抑止するための他の治療又は予防薬と組み合わせて使用される。また、本発明は、前記したＶＣＡＭ−１媒介性の細胞接着の抑制剤を含んでいる医薬製剤、並びに、本発明に係る化合物及び組成物を使用して細胞接着を抑制する方法を提供する。以下、本明細書中で使用する用語について定義する。
【００４８】
「安全で有効な量」とは、細胞接着及び細胞接着媒介性の疾患を抑制及び防止するための、薬学的活性化合物の十分な量を意味する。医薬活性物資又はその活性物質を含んでいる医薬組成物の必要な投与量は、正常な医学的判断の範囲内で、治療する患者の重症度や、治療する期間、補助治療の性質、患者の年齢及び健康状態、使用する活性化合物の種類などによって異なる。ここで説明する化合物は従来のメチマゾール 化合物よりも低い投与量で薬学的活性をもたらすが、特定の化合物における「安全で有効な量」は、これらのリスクを考慮する必要がある。
【００４９】
「薬学的に許容される」とは、医薬組成物で使用される薬学的活性化合物及び他の成分、並びに、本明細書中で定義された方法が、不適切な毒性、炎症、アレルギー反応などを有することなく、ヒト及び下等動物の組織と接触させるのに適切であり、相応な利益／リスク比に見合うことを意味する。
【００５０】
前記薬学的活性化合物及び本明細書中で定義した医薬組成物の「投与」は、前記化合物及び組成物の局所適用ばかりでなく、前記組成物の注射（特に非経口での注射）、静脈内注射、坐薬、及び経口投与による全身への使用を含む。本発明では、経口投与が特に好ましい。
【００５１】
「改善」又は「改良」という用語は、治療を受ける患者における、有害な影響、又は、細胞接着による疾患の重症度の緩和を意味する。反応の程度は、当該技術分野では公知の手段によって測定される。
【００５２】
「細胞接着による疾患」とは、非定形の細胞接着により導かれる下記の病気である（ただし、これらに限定されるものではない）。虚血後の再かん流傷害、アテローム性動脈硬化症、炎症性大腸炎（クローン病、潰瘍性大腸炎）、熱傷（やけど）、関節炎、ぜんそく、臓器移植（ホスト対グラフト、グラフト対ホスト）、脳梗塞、マラリア、多発性硬化症、糖尿病、出血性ショック、心筋梗塞、肺梗塞、脳梗塞、腸梗塞、腸梗塞、腎梗塞、敗血症、血栓症、遅延型過敏反応、癌、急性肺損傷、自己免疫性又は非自己免疫性糸球体腎炎、結核症、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、シェーグレン病、多発性筋炎／皮膚筋炎、高血圧性血管疾患、脈管炎、結節性多発性動脈炎、巨細胞性動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、川崎病（粘膜皮膚リンパ節症候群）、閉塞性血栓血管炎（バージャー病）、Behoet病、皮膚血管炎、リケッチア脈管炎、播種性血管内凝固症候群、リンパ球様間質性肺炎、肺好酸球性肉芽腫、胃炎、慢性肝炎、肝硬変、グレーブス病、甲状腺炎、甲状腺機能低下症、乾癬、アルツハイマー病、アレルギー性鼻炎、炎症性皮膚病、皮膚アナフィラキシー反応、及び髄膜炎。
【００５３】
「含む」という用語は、定義した薬学的活性化合物及び担体が開示されたように使用される限りは、本発明に係る医薬組成物及び方法で、不活性成分と同様に、様々な他の適合する薬物を併用できることを意味する。したがって、「含む」という用語は、「〜から成る」及び「本質的に〜から成る」というより限定的な用語を包含する。
【００５４】
「患者」という用語は、本発明に係る化合物、組成物及び方法による治療を享受する全ての哺乳類（動物又はヒト）を含む。「治療」という用語は、任意の治癒的治療、予防的治療、及び改善的治療を意味する。
【００５５】
「適合する」とは、本発明に係る組成物の成分を、通常に使用する状態で薬学的活性化合物の効果を実質的に低下させることなく、相互作用を行わずに混合できることを意味する。
【００５６】
本発明に係る医薬組成物は、特別に定義するメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンを、薬学的に許容される担体と共に、安全で有効な量で使用することを含んでいる。
【００５７】
本発明に係る組成物で使用されるメチマゾール誘導体は、次の化学構造式で表される活性化合物である。
2007529510.tif 000002
【００５８】
上記の化学構造式では、Ｙは、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、ＮＯ２、及びフェニル部分
2007529510.tif 000003
から成る群より選択され、
Ｙの１つだけは前記フェニル部分であり得、
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、及びＣＨ２Ｐｈから成る群より選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｘは、Ｓ及びＯから選択され、
Ｚは、ＳＲ３、ＯＲ３及びＣｌ−Ｃ４アルキルから選択され、
Ｙがフェニル部分でない場合は、Ｒ２及びＲ３の少なくとも２つはＣｌ−Ｃ４アルキルであり、
Ｚがアルキルの場合は、少なくとも１つのＹはＮＯ２である。
【００５９】
Ｙは、好ましくは、Ｈ、前記フェニル部分又はＮＯ２であり、最も好ましくは、Ｈ又は前記フェニル部分
2007529510.tif 000004
である。
【００６０】
上記で定義した化合物では、Ｙ基の１つ以下は前記フェニル部分であり得る。
【００６１】
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、Ｃｌ−Ｃ４エステル、及びＣｌ−Ｃ４置換エステルから選択される。Ｒ１は、好ましくは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＯＣＣＨ２Ｍ（ただし、Ｍは、Ｈ又はハロゲンである）であり、最も好ましくは、Ｈである。
【００６２】
Ｒ２は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから選択される。好ましくは、Ｒ２基の一方又は両方はメチルである。
【００６３】
ここでは、「置換アルキル」又は「置換エステル」という用語は、１つ又はそれ以上の個所が、ヒドロキシル又はアルコキシル基、カルボキシル基、ハロゲン、ニトロ基、アミノ又はアシルアミノ基、及びそれらの部分の混合体によって置換された、アルキル、アリル、又はエステル基を含むことを意図している。好ましくは、「置換アルキル」基は、Ｃｌ−Ｃ４ヒドロキシル又はアルコキシル基、或いは、ハロゲンで置換された基である。
【００６４】
Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、及びＣＨ２Ｐｈ（ただし、Ｐｈはフェニルである）から選択される。Ｒ３は、好ましくは、Ｈ又はＣｌ−Ｃ４アルキルであり、最も好ましくは、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、とりわけメチルである。
【００６５】
Ｒ４は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから選択される。Ｒ４は、好ましくは、Ｈである。
【００６６】
Ｘは、Ｓ又はＯであり、好ましくは、Ｓである。
【００６７】
Ｚは、ＳＲ３、ＯＲ３、Ｓ（Ｏ）Ｒ３、及びＣｌ−Ｃ４アルキルから選択される。Ｚは、好ましくは、ＳＲ３、ＯＲ３、及びＳ（Ｏ）Ｒ３であり、最も好ましくはＳＲ３、ＯＲ３であり、とりわけＳＲ３である。
【００６８】
そして、上記の化学構造式では、Ｙがフェニル部分でない場合は、Ｒ２及びＲ３の少なくとも２つのはＣｌ−Ｃ４アルキルである。そして、ＺがＣｌ−Ｃ４アルキルの場合は、Ｙ基の少なくとも１つはＮＯ２である。
【００６９】
本発明に使用できる化合物としては、文献「Kjellin and Sandstrom, Acta Chemica Scandanavica 23: 2879-2887 (1969)」に開示されている（この参照により本発明に含まれるものとする）、次の化学構造式で表される互変異性環状チオンがある。
2007529510.tif 000005
ただし、Ｒ５，Ｒ６＝ＣＨ３，ＣＨ３、Ｐｈ，Ｈ、又はＨ，Ｐｈであり、Ｒ７＝Ｈ又はＣＨ３であり、Ｒ８＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、又はＮＣＨ３である。
【００７０】
本発明に係る組成物に使用するのに好ましい化合物としては、次の化学構造式で表されるものがある。
2007529510.tif 000006
【００７１】
他の好ましい組成物としては、次の化学構造式で表されるものがある。
2007529510.tif 000007
ただし、Ｒ１０は、Ｈ、ＮＯ２、Ｐｈ、４−ＨＯＰｈ、及び４−ｍ−Ｐｈ（ただし、ｍは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである）から選択される。
【００７２】
ここで定義された医薬化合物の特に好ましいサブセットは、Ｙ基の１つが上記に定義したフェニル部分である化合物である。これらの化合物は、次の化学構造式で表される。
2007529510.tif 000008
【００７３】
これらの化合物では、Ｙは、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、ＮＯ２、及びフェニル部分から選択され、好ましくはＨである。
【００７４】
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、Ｃｌ−Ｃ４エステル、及びＣｌ−Ｃ４置換エステルから選択され、好ましくは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＯＣＣＨ２Ｍ（ただし、Ｍは、Ｈ又はハロゲンである）である。好ましくはＨではない。
【００７５】
Ｒ２は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから選択され、好ましくは、Ｒ２基の少なくとも１つはメチルである。
【００７６】
Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、及びＣＨ２Ｐｈ（ただし、Ｐｈはフェニルである）から選択され、好ましくは、Ｈ及びメチルである。
【００７７】
Ｒ４は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから選択され、好ましくは、Ｈである。
【００７８】
Ｘは、Ｓ及びＯから選択され、好ましくは、Ｓである。
【００７９】
Ｚは、ＳＲ３及びＯＲ３から選択され、好ましくは、ＳＲ３である。
【００８０】
特に好ましい化合物は、次の化学構造式で表される化合物である。
2007529510.tif 000009
【００８１】
他の好ましい化合物は、次の化学構造式で表される化合物である。
2007529510.tif 000010
ただし、Ｒ９は、ＯＨ、Ｍ、及びＯＯＣＣＨ２Ｍから成る群より選択され、Ｍは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから成る群より選択される。
【００８２】
最も好ましい化合物は、次の化学構造式で表される化合物である。
2007529510.tif 000011
５−フェニルメチマゾール
【００８３】
また、本明細書中で定義した薬学的活性化合物の混合物も使用できる。上記したメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンは、当該技術分野では公知の技術を用いて合成することができる。例えば、いくつかの互変異性環状チオンの合成については、文献「Kjellin and Sandstrom, Acta Chemica Scandanavica 23: 2879. congruent. 2887 (1969)」に記載されている（この参照により本発明に含まれるものとする）。
【００８４】
代表的なメチマゾール誘導体は、次の方法を用いて合成される。適切に置換されたアセトアルデヒドの類似体は、臭素及び紫外線で処理することによって２位置で臭素化される。その後、無水エタノールを使用して対応するジエチルアセタールを作成する。その後、前記臭素は、密閉されたチューブ内で（約１２０℃、約１６時間）、無水メチルアミン又は他の適切なアミンでの処理によって、この化合物から除去される。結果として生じるアミノアセタールを、塩酸の存在下で、チオシアン酸カリウムと反応させると（スチームバス温度、一晩）、メチマゾール類似体が得られる。
【００８５】
（表：化合物の構造）
2007529510.tif 000012
2007529510.tif 000013
【００８６】
本発明に係る医薬組成物は、安全で有効な量の、１つ以上のメチマゾール誘導体又は互変異性環状チオン（すなわち活性化合物）を含んでいる。好ましい組成物は約０．０１％〜２５％の活性化合物を含んでおり、より好ましい組成物は約０．０１％〜１０％の活性化合物を含んでいる。本発明に係る医薬組成物は、例えば腹腔内、経静脈的、筋肉内又は局所的などの任意の公知な方法で投与することができるが、経口投与することが好ましい。好ましい組成物は、例えば丸薬、錠剤又はアンプルなどの、ユーザが毎回の投与量を測定する必要のない、単回投与に適した固定測定済みの形態で利用可能な、単回投与形態、すなわち医薬組成物である。
【００８７】
本発明に係る医薬組成物は、上記したメチマゾール誘導体又は互変異性環状チオンに適合する薬学的に許容される担体をさらに含む。前記薬学的に許容される担体に加えて、前記医薬組成物は、例えば、付加的な薬学的な活性剤、賦形剤、製剤化の助剤（例えば錠剤化の助剤）、着色剤、着香剤、防腐剤、可溶化剤、分散剤、及び当該技術分野では公知である他の物質などのさらなる適合する成分を、技術的な許容レベルでさらに含むことができる。
【００８８】
本明細書中で使用される「薬学的担体」という用語は、固体又は液体の充填剤、賦形剤又は封入物質を意味する。これらの物質は、薬剤の分野では公知である。薬学的担体として使用できる物質としては、例えば、糖（ラクトース、グルコース、サッカロースなど）、でんぷん（コーンでんぷん、ジャガイモでんぷんなど）、セルロース及びその誘導体（カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、エチル・セルロース、酢酸セルロースなど）、トラガント粉末、モルト、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、硫酸カルシウム、植物油（ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、テオブロマ油など）、ポリオール（プロピレン・グリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレン・グリコール）、寒天、アルギン酸、ピロゲンフリー水、等張食塩水、及び、リン酸緩衝液と、医薬組成物に使用される他の無毒性の適合する物質がある。これらは、脂質又はポリマー粒子（生分解性高分子を含む）を作成するリポソーム又は薬物担体を含んでおり、標的化遺伝子導入の用途（例えば、抗体への結合）を含んでいる。また、湿潤剤及び潤滑油（ラウリル硫酸ナトリウムなど）と、着色剤、着香料、錠剤化薬及び防腐剤を含むこともできる。前記成分の医薬組成物への配合は、公知の技術を用いて行う。
【００８９】
本発明に係る医薬組成物と共に使用される薬学的担体は、投与可能な粒径にするのに十分な濃度にするのに使用される。好ましくは、前記薬学的担体は、医薬組成物の総重量の約７５％〜９９．９９％、より好ましくは約９０％〜９９．９９％含まれることが望ましい。本発明で定義されたメチマゾール誘導体又は互変異性環状チオンは、驚くべきことに、従来の担体物質内にメチマゾールを溶解させる場合よりも溶解性が高い。このことにより、これらのメチマゾール誘導体を含んでいる医薬組成物の作成により柔軟性が向上するので、大きな利益が得られる。また、活性化合物の使用量は著しく少なく済む。
【００９０】
本発明に係るメチマゾール誘導体は、一日当たり、約０．００１〜１００ミリグラム、好ましくは約０．０５〜５０ミリグラムの範囲の用量で投与される。本発明に係る医薬組成物は、血流中で薬学的活性が得られるような適切な量で投与される。所定の場合における必要とされる的確な投与量は、例えば、使用するメチマゾール誘導体の種類、治療する病気の性質、及び患者の体格、体重、年齢及び健康状態に応じて決定される。
【００９１】
「薬学的に許容される塩」という用語は、薬学的に許容される無毒性塩基又は酸（無機又は有機塩基、及び、無機又は有機酸など）から作成される塩を意味する。無機塩基から作成される塩としては、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン塩、マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などがある。特に、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム塩が好ましい。薬学的に許容される無毒性の無機塩基から作成される塩としては、第１、第２及び第３アミン、置換アミン（自然発生的置換アミンを含む）、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂（例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ´−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなど）の塩がある。本発明に係る化合物が塩基性の場合は、塩は薬学的に許容される無毒性の酸（無機酸及び有機酸を含む）から作成される。そのような酸としては、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などがある。特に、クエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸、及び酒石酸が望ましい。当然のことながら、本明細書中では、前記化合物は薬学的に許容される塩を含む。
【００９２】
本発明に係る治療用化合物がＶＣＡＭ−１の活動を抑制する能力は、ＶＣＡＭ−１が様々なリガンド（例えば、ＶＬＡ−４）と結合することによって生じる症状、疾患又は疾病の予防又は回復に役立つ。したがって、これらの化合物は、細胞シグナリング、活性化、移動、拡散及び分化を含む、ローリング（rolling）及び細胞接着プロセスを抑制することができる。そのため、本発明の態様では、ＶＣＡＭ−１結合、細胞接着及び細胞活性化に媒介される疾患、疾病、病気又は症状の治療方法（予防、緩和、改善又は抑制方法を含む）であって、有効量の本発明に係る化合物を哺乳類に投与するステップを含む方法を提供する。前記疾患、疾病、病気又は症状としては、例えば、（１）多発性硬化症、（２）ぜんそく、（３）アレルギー性鼻炎、（４）アレルギー性結膜炎、（５）炎症性肺病、（６）関節リウマチ、（７）敗血症性関節炎、（８）Ｉ型又はＩＩ型糖尿病及びその大血管又は微小血管合併症（例えば、腎症、脳梗塞又は心筋梗塞）、（９）臓器移植拒絶、（１０）再狭窄、（１１）自家骨髄移植、（１２）ウイルス感染の炎症性後遺症、（１３）心筋炎、（１４）炎症性大腸炎（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、（１５）ある種類の毒性及び免疫による腎炎、（１６）接触皮膚過敏症、（１７）乾癬、（１８）腫瘍転移、（１９）甲状腺炎、及び、（２０）アテローム性動脈硬化症がある。
【００９３】
本発明に係る治療用化合物の予防的又は治療的な投与量は、治療する患者の重症度や、本発明に係る化合物の種類及びその投与経路によって異なる。また、投与量は、患者の年齢、体重、応答性によっても異なる。一般に、１日当たりの投与量（１回又は分割しての投与量）の範囲は、哺乳類の体重１ｋｇあたり約０．００１〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１〜５０ｍｇ、最も好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。しかし、場合によっては、前記した範囲外の投与量を用いる必要がある。
【００９４】
静脈内又は腹腔内に投与する場合は、本発明に係る治療用化合物の投与量（体重１ｋｇあたりの１日量）の適切な範囲は約０．００１〜２５ｍｇ（好ましくは、約０．０１〜１ｍｇ）であり、細胞保護を目的とする場合は、本発明に係る治療用化合物の投与量（体重１ｋｇあたりの１日量）の適切な範囲は約０．１〜１００ｍｇ（好ましくは、約１〜１０ｍｇ）である。
【００９５】
経口投与する場合は、本発明に係る治療用化合物の投与量（体重１ｋｇあたりの１日量）の適切な範囲は、約０．０１〜１００ｍｇ（好ましくは、約０．１〜１０ｍｇ）であり、細胞保護を目的とする場合は、本発明に係る治療用化合物の投与量（体重１ｋｇあたりの１日量）の適切な範囲は約０．１〜１００ｍｇ（好ましくは、約１〜１０ｍｇであり、より好ましくは、約１０〜１００ｍｇ）である。
【００９６】
目の病気を治療する場合、眼部に許容可能な形態である、０．００１〜１重量％の本発明に係る治療用化合物の溶液又は懸濁液を含む眼球投与用の点眼薬を使用することができる。
【００９７】
本発明の他の態様は、本発明に係る化合物と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物などにおける「組成物」という用語は、活性成分と、担体を構成する不活性成分（薬学的に許容される賦形剤）とを含む生成物質を包含する。また、任意の２つ以上の成分の結合、錯体化又は凝集から、又は１つ以上の成分の解離から、又は１つ以上の成分の他の種類の反応又は相互作用から直接的又は間接的に生成される他の生成物質を包含する。したがって、本発明に係る医薬組成物は、本発明に係る組成物、付加的な活性成分、及び薬学的に許容される賦形剤を混合して作成した任意の組成物を包含する。
【００９８】
有効な量の本発明に係る化合物は、哺乳類（特にヒト）に、任意の適切な投与経路を用いて投与される。投与経路としては、例えば、経口、経直腸、局所的、非経口、経眼、経肺、経鼻などがある。投与形態としては、例えば、錠剤、トローチ、分散剤、懸濁剤、溶液、カプセル、クリーム、軟膏、エアロゾルなどがある。
【００９９】
本発明に係る医薬組成物は、活性成分としての本発明に係る化合物又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体と、随意的に他の治療成分とを含む。「薬学的に許容される塩」という用語は、薬学的に許容される無毒性塩基又は酸（無機塩基、無機酸、有機塩基、有機酸など）から作成される塩を意味する。
【０１００】
本発明に係る組成物は、経口、経直腸、局所的、非経口（皮下、筋肉内、及び静脈内など）、経眼（眼球）、経肺（エアロゾル吸入）、又は、経鼻投与などに適した組成物を含む。また、もっとも適した投与経路は、治療する症状の性質や重症度、及び活性成分の性質によって異なる。本発明に係る組成物は、製薬学の分野では公知の方法によって、単回投与形態に形成される。
【０１０１】
吸入投与する場合は、本発明に係る化合物は、加圧型パック又はネブライザー（nebuliser）のエアゾールスプレーの形態で使用される。また、本発明に係る化合物は、パウダーの形態で使用され、粉末吸入装置を用いて吸入される。吸入のための好ましい送達システムは、高圧ガス（過フッ化炭化水素又は炭化水素）内に本発明に係る化合物の懸濁液又は溶液として作成される、定量噴霧式吸入剤（Metered Dose Inhalation：MDI）エアゾール、及び、さらなる賦形剤を含んで又は含まない本発明に係る化合物の乾燥パウダーとして作成される乾燥粉末吸入剤（Dry Powder Inhalation：DPI）エアゾールである。
【０１０２】
適切な局所製剤としては、経皮的デバイス、エアゾール、クリーム、軟膏、ローション、粉剤などがある。
【０１０３】
実際の使用では、本発明に係る化合物は、緊密混合における活性成分として、従来の薬学的結合技術によって、薬学的担体と結合される。前記担体は、投与（例えば、非経口（静脈内）を含む）に望ましい製剤形態に応じて、様々な形態を取ることができる。本発明に係る化合物を経口投与形態に製剤する場合は、経口液体製剤（懸濁液、エリキシル剤、溶液など）としては、水、グリコール、油、アルコール、着香料、防腐剤、着色剤などを、経口固形製剤（粉末、カプセル、タブレットなど）としては、でんぷん、糖、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などの担体などの、任意の薬学的媒体を使用することができる。経口液体製剤よりも、経口固形製剤の方が好ましい。錠剤及びカプセルは投与しやすいため、経口での単回投与形態として好適であり、固形の薬学的担体が明らかに使用される。必要に応じて、錠剤は標準的な水性又は非水性技術によってコーティングされる。上述した標準的な投与形態に加えて、本発明に係る治療用化合物は、例えば、米国特許第３，８４５，７７０号、第３，９１６，８９９号、第３，５３６，８０９号、第３，５９８，１２３号、第３，６３０，２００号、及び第４，００８，７１９号に開示されているような、制御放出手段及び／又は送達システムによって投与される。
【０１０４】
経口投与に適した本発明に係る医薬組成物は、所定の量の活性成分を、パウダー又は顆粒として、或いは溶液又は懸濁液として、水性溶液、非水性溶液、水中油型乳剤、又は油中水乳濁液内に含んでいる、カプセルや錠剤などの個々の単位として得られる。そのような組成物は、任意の薬学的方法によって作成されるが、全ての方法は、活性成分を、１つ以上の必須成分を構成する担体と結合させるステップを含む。一般的に、前記組成物は、活性成分と液体担体又は微粉化担体（又はその両方）とを、均一及び緊密に混合させることにより作成される。その後、必要に応じて、生成物を所望する形状に成形にする。例えば、錠剤は、随意的に、１つ以上の副成分と共に、圧縮又は鋳造によって作成される。圧縮錠は、随意的に結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、表面活性剤又は分散剤と結合させた、例えばパウダー又は顆粒などの飲みやすい形態の活性成分を、適切な機械で圧縮することにより作成される。鋳造された錠剤は、不活性液体賦形剤に浸した、粉末化した化合物の混合物を、適切な機械で鋳造することにより作成される。望ましくは、各錠剤は約１〜５００ｍｇの活性成分を含み、各カプセルは約１〜５００ｍｇの活性成分を含む。
【０１０５】
本発明に係る化合物は、本発明に係る化合物が有用な疾患又は疾病の治療、予防、抑制又は改善に用いられる他の薬物と組み合わせて使用される。そのような他の薬物はメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンなどの本発明に係る化合物と同時に又は連続的に、そのために一般的に使用される経路及び量で投与される。本発明に係る化合物を１つ以上の薬物と同時に使用する場合は、本発明に係る化合物に加えて、そのような他の薬物を含んでいる医薬組成物が好ましい。したがって、本発明に係る医薬組成物は、本発明に係る化合物に加えて、１つ以上の他の活性成分を含む医薬組成物を包含する。
本発明に係る化合物Ｉと別々に投与される又は同一の医薬組成物として一体に投与される他の活性成分の例としては、次のものがある（ただし、これらに限定されるものではない）。
（ａ）ＶＣＡＭ−１拮抗薬。
（ｂ）ステロイド：例えば、ベクロメタゾン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、プレドニゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾンなど。
（ｃ）免疫抑制剤：例えば、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、他のＦＫ−５０６型の免疫抑制剤など）。
（ｄ）抗ヒスタミン剤（Ｈ１ヒスタミン拮抗薬）：例えば、ブロモフェニラミン、クロルフェニラミン、デキスクロルフェニルアミン、トリプロリジン、クレマスチン、ジフェンヒドラミン、ジフェニルピラリン、トリペレナミン、ヒドロキシジン、メトジラジン、プロメタジン、トリメプラジン、アザタジン、シプロヘプタジン、アンタゾリン、フェニラミン、ピリラミン、アステミゾール、テルフェナジン、ロラタジン、セチリジン、フェキソフェナジン、デスカルボエトキシロラタジン（ロラタジンの活性代謝物）など。
（ｅ）非ステロイド系抗ぜんそく薬：例えば、β２作動薬（テルブタリン、メタプロテレノール、フェノテロール、イソエタリン、アルブテロール、ビトルテロール、サルメテロール、ピルブテロール）、テオフィリン、クロモグリク酸ナトリウム、アトロピン、臭化イプラトロピウム、ロイコトリエン拮抗薬（ザフィルルカスト、モンテルカスト、プランルカスト、イラルカスト、ポビルカスト、ＳＫＢ−１０６，２０３）、ロイコトリエン生合成阻害剤（ジレウトン、ＢＡＹ−１００５）など。
（ｆ）非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）：例えば、プロピオン酸誘導体（アルミノプロフェン、プロフェンプロフェン、ブクロクス酸、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルビプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸、チオキサプロフェン）、酢酸酸誘導体（インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナック、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロズ酸、フェンチアザク、フロフェナク、イブフェナック、イソキセパク、oxpinac、スリンダク、チオピナク、トルメチン、ジドメタシン、ゾメピラク）、フェナム酸誘導体（フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸、トルフェナム酸）、ビフェニルカルボン酸（ジフルニサル、フルフェニサル）、オキシカム（イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカム）、サリチル酸塩（アセチル・サリチル酸、スルファサラジン）、及び、ピラゾロン（アパゾン、bezpiperylon、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン）など。
（ｇ）シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害薬：例えば、セレコクシブなど。
（ｈ）ＩＶ型ホスホジエステラーゼ阻害薬（ＰＤＥ−ＩＶ）。
（ｉ）ケモカイン受容体拮抗薬：特に、ＣＣＲ−１、ＣＣＲ−２及びＣＣＲ−３。
（ｊ）コレステロール降下薬：例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、及び他のスタチン）、金属イオン封鎖剤（コレスチラミン、コレスチポール）、ニコチン酸、フェノフィブリック酸誘導体（ゲムフィブロジル、クロフィブレート、フェノフィブラート、ベンザフィブラート）、及び、プロブコールなど。
（ｋ）抗糖尿病薬：例えば、インスリン、スルホニル尿素、ビグアニド（メトホルミン）、ａ−グルコシダーゼ阻害剤（アカルボース）、グリタゾン（トログリタゾン、ピオグリタゾン、エングリタゾン、ＭＣＣ−５５５、ＢＲＬ４９６５３）など。
（ｌ）インターフェロン・ベータ製剤：例えば、ベータ・インターフェロン、アルファ・インターフェロンなど。
（ｍ）抗コリン剤：例えば、ムスカリン性拮抗薬（臭化イプラトロピウム）など。
（ｎ）他の化合物：例えば、５−アミノサリチル酸及びそのプロドラッグ、代謝拮抗物質（アザチオプリン、６−メルカプトプリン）、細胞毒性癌化学療法薬。
（ｏ）抗生物質。
【０１０６】
第２の活性成分に対する本発明に係る治療用化合物の重量比は、各成分の有効量によって異なる。一般的に、各成分の有効量が用いられる。したがって、本発明に係る治療用化合物をＮＳＡＩＤと一緒に用いる場合は、本発明に係る治療用化合物のＮＳＡＩＤに対する重量比は、約１０００：１〜１：１０００の範囲、好ましくは約２００：１〜１：２００の範囲となる。また、治療用成分と他の活性成分との組み合わせも、一般的に、上記した範囲内である。ただし、いずれの場合にも、各活性成分の有効な量が用いられる。
【０１０７】
以下の実施例は、本発明に係る薬学的に活性な化合物、医薬組成物、及び治療方法を説明するためのものであり、これらを限定するためのものではない。
【実施例】
【０１０８】
炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）によって誘導される、血管内の内腔表面での内皮細胞接着分子（Endothelial Cell Adhesion Molecule：ECAM）の発現と、その結果生じる白血球接着の増加は、病的炎症の重要な側面である。本発明は、次の（ｉ）〜（ｉｖ）の作用を有するメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンの使用を提供する。
（ｉ）ＴＮＦ−α誘導性の、ヒト大動脈内皮細胞（human aortic endothelial cell：ＨＡＥＣ）におけるＶＣＡＭ−１・ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を大幅に抑制する。そして、ＴＮＦ−α誘導性のＥ−セレクチン発現に対する抑制作用は比較的小さく、ＩＣＡＭ−１発現に対しては影響しない。
（ｉｉ）インビボでの場合と同様のインビトロのフロー条件下で、ＴＮＦ−α誘導性の、単球（Ｕ９３７）のＨＡＥＣへの細胞接着を著しく減少させる。
（ｉｉｉ）ＴＮＦ−α誘導性の、インターフェロン制御因子（Interferon Regulatory Factor-1：IRF-1）のＶＣＡＭ−１・プロモータへの結合を抑制する。
（ｉｖ）ＴＮＦ−α誘導性の、ＨＡＥＣ細胞におけるＩＲＦ−１の発現を減少させる。
組み合わせると、この結果は、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンが、主としてＩＲＦ−１依存性のＶＣＡＭ−１発現を抑制することによって、ＴＮＦ−α誘導性の単球のＨＡＥＣへの細胞接着を減少させることを示す。
【０１０９】
≪材料及び方法≫
【０１１０】
＜材料＞
【０１１１】
培地１９９（Ｍ１９９）、ＲＰＭＩ−１６４０（ＲＰＭＩ）、並びに、Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋を含有するハンクス液（Hanks Balanced Salt Solution：HBSS）（ＨＢＳＳ＋）は、全てBiowhittaker（Walkersville, MD）から入手した。Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋を含有しないダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（Delbecco's Phosphate Buffered Saline）（ＰＢＳ）は、KD Medical（Columbia, MD）から入手した。加熱不活性化した定義済みのウシ胎仔血清（fetal bovine serum：FBS）は、Hyclone Laboratories Inc.（Logan, UT）から入手した。Ｌ−グルタミン、トリプシン・バーゼン液、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び非必須アミノ酸は、全てBiosource International（Camarillo, CA）から入手した。内皮成長因子は、Calbiochem（San Diego, CA）から入手した。ウシ視床下部抽出物は、Pel-Freeze Biological Inc.（Rogers, AR）から入手した。ゼラチン、ヘパリン、ＤＭＳＯ、ＢＳＡ、Ｏ−フェニレンジアミン・ヒドロクロライド（O-phenylenediamine dihydrochloride：OPD）、及び過ホウ酸ナトリウムを有するクエン酸リン酸塩緩衝錠剤は、Sigma Chemical Co.（St. Louis, MO）から入手した。ＨＢＳＳ＋、０．５％のＢＳＡの分析緩衝液を生成すべく、ＨＢＳＳ＋にＢＳＡを加える。組み換え型ヒトＴＮＦ−αは、Calbiochemから入手した。Ｃ−１０は、Ricerca（Cleveland, OH）（２６）で説明されているようにして合成される。Ｃ−１０は、ＤＭＳＯ内に２００ｍＭの原液として作成される。
【０１１２】
＜抗体＞
【０１１３】
機能阻害マウスｍＡｂ ＨＥＬ３／２（抗ヒトＥ−セレクチン；ＩｇＧ１）は、Dr. Raymond T. Camphausen（Wyeth Laboratories; Cambridge, MA）から提供された。機能阻害マウスｍＡｂ ５１−１０Ｃ９（抗ヒトＶＣＡＭ−１；ＩｇＧ１）は、BD Phanningen（San Diego, CA）から入手した。マウスｍＡｂ Ｒ６．５（抗ヒトＩＣＡＭ−１；ＩｇＧ２ａ）は、Dr. Robert Rothlein（Boehr.ingerIngelheim; Ridgefield, CT）から提供された。マウスｍＡｂ ＴＳ１／２２（抗ヒトＬＦＡ−１；ＩｇＧ１）は、Endogen（Woburn, MA）から入手した。ＨＲＰ共役ヤギＦ（ａｂ´）２抗マウスＩｇＧポリクローナル二次抗体（Calbiochem）は、ＥＬＩＳＡにおいて最初のｍＡｂを検出するのに使用される。ｐ５０（ｓｃ−１１９１）、ｐ６５（ｓｃ−１０９）、ｐ５２（ｓｃ−２９８）、ｃ−ｒｅｌ（ｓｃ−７０）、ＲｅｌＢ（ｓｃ−２２６）、ＩＲＦ−１（ｓｃ−１０４１Ｘ）に対するポリクローナル抗体は、Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA）から入手した。
【０１１４】
＜ＨＡＥＣの細胞培養及び処理＞
【０１１５】
ヒト大動脈内皮細胞（Human Aortic Endothelial Cell：HAEC; Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., Walkersville, MD）は、８％のＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのヘパリン、１０ｎｇ／ｍｌの内皮成長因子、１００μｇ／ｍｌの視床下部抽出物、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％の非必須アミノ酸、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが追加されたＭ１９９上で培養される。ＨＡＥＣは、生死判別試験及びＥＬＩＳＡのために、ゼラチンがコートされた９６ウエル組織培養プレート（Corning Incorporated ; Corning, NY）上で継代培養される。また、ＨＡＥＣは、ノーザンブロット分析、ウエスタンブロット分析、及びＥＭＳＡのために、ゼラチンがコートされた１００ｍｍの組織培養皿（BD Falcon; Franklin Lakes, NJ）上で継代培養される。また、ＨＡＥＣは、接着分析のために、ゼラチンがコートされた３５ｍｍの組織培養皿（Corning）上で継代培養される。また、ＨＡＥＣは、ルシフェラーゼ・プロモータ・アッセイ（BD Falcon）のために、ゼラチンがコートされた２４−ウエルの組織培養皿上で継代培養される。全ての実験は、融合性ＨＡＥＣ単層で行われる。他に明記されない限り、ＨＡＥＣは、Ｃ−１０又は０．２５％のＤＭＳＯ（Ｃ−１０に対する担体対照）の存在下又は非存在で、２５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αによって２〜２４時間処理される。ＤＭＳＯの濃度は、全てのＣ−１０条件で、０．２５％で一定に保たれる（他に明記されない限り）。この実験で使用される濃度でのＣ−１０によるＨＡＥＣの処理は、ＨＡＥＣの生存率にほとんど又は全く影響がないことが、ＨＡＥＣ単層のＭＴＳ分析（２０）や目視検査により分かった（データは示さず）。
【０１１６】
Ｕ９３７細胞（American Type Culture Collection; Manassas, VA）は、８％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、及び００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが追加されたＲＰＭＩ上で培養される。接着分析のために、Ｕ９３７細胞は洗浄され、ＲＰＭＩで再懸濁され、フロー接着分析に使用するまで氷上で保持される（＜４時間）。
【０１１７】
＜ＥＬＩＳＡ＞
【０１１８】
ＥＬＩＳＡは、前述した（２０）と同様の方法で、ＨＡＥＣにおけるＥＣＡＭのタンパク質レベルを明らかにするために使用される。ＨＡＥＣは、冷たいＨＢＳＳ＋で洗浄され、１％のホルムアルデヒドで４℃、２０分固定され、冷たいＨＢＳＳ＋で洗浄され、８％のＦＢＳを含有している冷たいＭ１９９で培養される。他に明記されない限り、以降は、全ての抗体の希釈及び洗浄は、８％のＦＢＳを含有しているＭ１９９によって行われる。ＥＣＡＭに対するマウスｍＡｂ（primary mAb）が加えられ（１０ｇ／ｍｌ）、ＨＡＥＣは４℃で２０分培養される。培養後、前記ウエルは洗浄され、マウスＩｇＧに対するペルオキシダーゼ共役ポリクローナル（二次）抗体が加えられる（１：５０で希釈された）。４℃、２０分での培養後、前記ウエルは洗浄され、過ホウ酸ナトリウムを含有するクエン酸リン酸塩緩衝液に溶解しているＯＰＤで処理される。室温、１０分での培養後、マイクロウエルプレート分光光度計（Molecular Devices; Sunnyvale, CA）を使用して、各ウエル内の液体の吸光度を４５０ｎｍで測定する。全ての実験で、各条件は３つのウエルで実施される。
【０１１９】
＜ＲＮＡ単離及びノーザンブロット分析＞
【０１２０】
ノーザンブロット分析は、前述（２７，２９，３３）したのと同様の方法で、ｍＲＮＡレベルを明らかにするために使用される。ＨＡＥＣはＰＢＳで洗浄され、市販のキット（RNeasy Mini Kit; Qiagen Inc.; Valencia, CA）を使用して全てのＲＮＡが抽出される。各レーンの全てのＲＮＡ１２μｇは、０．６６Ｍのホルムアルデヒドを含んでいる１％の変性アガロース・ゲル上で分散される。ゲルは、Nytran膜（Schleicher and Schuell Inc.; Keene, NH）上に毛細血管ブロットされ、ＵＶ交差結合され、ハイブリダイゼーションに使用される。ＩＲＦ−１用のプローブは、前述した（３３）。Ｇ３ＰＤＨ ｃＤＮＡは、Clontech（Palo Alto, CA）から入手した。他のプローブ配列は、次の特異的プライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲ（３３）により合成される。ＶＣＡＭ−１，５´ＧＡＣＴＣＣＧＴＣＴＣＡＴＴＧＡＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧ３´及び５´ＡＴＡＣＴＣＣＣＧＣＡＴＣＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＧＣＣＴＴＴＣＧ３´（１８７６ｂｐ）、Ｅ−セレクチン，５´ＧＴＧＣＡＧＣＣＡＴＴＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＴＴＣ３´及び５´ＧＧＧＣＣＡＧＡＧＡＣＣＣＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＴＣＴＧ３´（９７７ｂｐ）、並びにＩＣＡＭ−１，５´ＣＴＣＡＧＧＴＡＴＣＣＡＴＣＣＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＣＣ３´及び５´ＣＣＣＴＴＧＡＧＴＴＴＴＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＣＴＴＣ３´（１５１４ｂｐ）。ｃＤＮＡは、Ladderman Labeling Kit（Takara Biochemical Inc.; Berkeley, CA）（３３）を使用して、α−３２Ｐ−ｄＣＴＰによって標識される。ノーザンブロット分析は、ＢＡＳ １５００ Bioimaging Analyzer（Fuji Photo Film Co., Ltd. Medical Systems USA Inc.; Stanford, CA）を使用して行われる。各実験は、少なくとも２回は繰り返される。
【０１２１】
＜核抽出物及びＥＭＳＡ＞
【０１２２】
核抽出物は、プロテアーゼ阻害剤混合物（PMSF, Leupeptin, Pepstatin-A）の存在下で、ＮＥ−ＰＥＲ（Ｒ）抽出試薬（Pierce Chemical Co.; Rockford, IL）を使用して、採取したＨＡＥＣから作成される。オリゴヌクレオチド（Biosynthesis Inc.; Lewisville, TX）はアニーリングされており、Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼ酵素を使用して、γ−３２Ｐ−ＡＴＰで標識化された二本鎖オリゴヌクレオチド端を沈殿させる。結合反応（２０分、室温）は、３２Ｐ標識プローブ（活量１００，０００ｃｐｍ）、３〜６μｇのＨＡＥＣ核抽出物、１μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）、１ｍＭのＤＴＴ、１０％のグリセロール、及び１Ｘの結合バッファを含まれる。ＮＦ−ｋＢ ＥＭＳＡ用の結合バッファ（１ＯＸ）は、２００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、３４０ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。ＩＲＦ−１ ＥＭＳＡ用の結合バッファ（１ＯＸ）は、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）である。対照実験では、核抽出物は、標識化していない二本鎖オリゴヌクレオチドの１００倍モル過剰で培養される。スーパーシフト実験では、核抽出物は、２μｇの適切な抗体と培養される。培養後、反応混合物は、１ＸのＴＢＥ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのホウ酸、及び１ｍＭのＥＤＴＡ）内で、５％グリセロールを含んでいる５％の非変性ポリアクリルアミド・ゲル上で電気泳動される（１６０Ｖ、室温）。ゲルは乾燥させられ、オートラジオグラフされる。各実験は、少なくとも２回は繰り返される。
【０１２３】
＜フロー接着分析＞
【０１２４】
McIntire, Smith and colleagues（３４）で説明されているのと類似している平行板型フローチャンバーがこの実験に使用される。我々の特別なセットアップは前述した（２０）。融合性のＨＡＥＣ単層を含んでいる３５−ｍｍ組織培養皿が、フローチャンバーに装填される。簡単に洗浄した後、Ｕ９３７細胞（分析緩衝液中の５＊１０５細胞／ｍｌ）が、１．８ダイン／ｃｍ２の剪断応力で、ＨＡＥＣ単層上にドローされる。Ｕ９３７細胞の蓄積を測定するために、フローの２．５分後、８つの異なる視野で、ＨＡＥＣ単層に付着した（ローリング又は固着した）Ｕ９３７細胞の数が測定され、特に実施するの結果を得るために、前記視野領域で平均化及び正規化された。前記分析は、少なくとも３回行われる。ある実験では、Ｃ−１０の非存在下又は存在下で、ＴＮＦ−αによって活性化されたＨＡＥＣは、ｍＡｂ ＨＥＬ３／２又は５１−１０Ｃ９（１０μｇ／ｍｌ）、或いはＨＥＬ３／２及び５１−１０Ｃ９の組み合わせで処理される。ｍＡｂで処理したＨＡＥＣは、接着分析で使用する前に、３７℃で１５分培養される。
【０１２５】
＜デュアル・ルシフェラーゼ分析＞
【０１２６】
異なる長さ−１６４１／＋１２、−２８８／＋１２、−２２８／＋１２、−８５／＋１２ｂｐからなる、４つのヒトＶＣＡＭ−１・プロモータ欠損構造は、ヒトゲノムＤＮＡからのＰＣＲによって増幅される。各上流側プライマーは、前記プライマーの５´端に位置する制限エンドヌクレアーゼ・Ｍｌｕ Ｉ部位を含んでいる。＋１２端に対応する下流側のプライマーは、５´端に位置するエンドヌクレアーゼ・Ｘｈｏ Ｉを含んでいる。ＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ及びＸｈｏ Ｉ（New England Biolabs Inc., Beverly, MA）により消化され、同様に消化されたｐＧＬ３ベーシック・ルシフェラーゼ・レポーター・ベクター（Promega, Madison, WI）の中に連結される。細胞は、GeneJuiceトランスフェクション試薬（Novagen Inc., Madison, WI）を使用して、４００ｎｇの示される構造又は対照としてのｐＧＬ３ベーシック・ルシフェラーゼ・レポーター・ベクターに２４時間形質移入される。全ての細胞は、「内部」の形質移入対照として野生型のRenilla luciferase（Ｒｌｕｃ）を含んでいる、ｐｈＲＬ−ＴＩＬ（Ｉｎｔ−）ベクター（Promega）に形質移入される。ルシフェラーゼ分析は、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）を使用してＬｕｍａｔ ＬＢ ９５０７チューブ照度計により行われる。全ての実験で、各条件は３つのウエルで行われる。各実験は、少なくとも２回繰り返される。
【０１２７】
＜ウエスタンブロット分析＞
【０１２８】
全細胞溶解液は、溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ ８．０）内で作成される。２０μｇの溶解液は、その後、変性状態下で、NuPAGE Bis-Tris System（Invitrogen; Carlsbad, CA）を使用して、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ ＰＡＧＥゲル上に分散される。タンパク質は、ＩＲＦ−１抗体によって試験されるニトロセルロース膜に移送される。その後のＨＲＰ共役ヤギ抗ウサギＡｂ（sc-2054, Santa Cruz Biotechnology, Inc.）の結合は、Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＳ−３検出試薬（Amersham Pharmacia Biotech.; Piscataway, NJ）を使用して検出される。
【０１２９】
＜統計＞
【０１３０】
単一要素ＡＮＯＶＡは、統計的な差の存在を評価するのに使用される。ＡＮＯＶＡが複数の条件の間に著しい差を示したら、多重対比較のためにボンフェローニ・テスト（Bonferroni test）が使用される。ルシフェラーゼ・プロモータ分析における統計的な差を評価するのに、スチューデントのｔ検定が使用される。Ｐ値が＜０．００１の場合（ＥＬＩＳＡ）と、＜０．０５の場合（接着分析及びルシフェラーゼ・プロモータ分析）は統計的に有意と見なされる。他に明記されない限り、全てのエラーバーは、標準偏差を意味する。
【０１３１】
＜結果＞メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンは、ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１発現を大幅に抑制し、Ｅ−セレクチン発現に対しては少しの影響を及ぼし、ＩＣＡＭ−１発現に対しては影響を及ぼさない。
【０１３２】
メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンのＴＮＦ−α誘導性のＥＣＡＭ発現に対する影響を、動脈内皮細胞（例えば、ＨＡＥＣ）を使用して調べた。ＴＮＦ−α処理を４時間行った内皮細胞と２４時間行った内皮細胞とではＥＣＡＭのプロファイルは大きく異なるので（６）、ＴＮＦ−α処理を４時間行った内皮細胞と２４時間行った内皮細胞とについてのＣ−１０の影響をそれぞれ調べた。最初に、４時間の場合と２４時間の場合の、ＨＡＥＣにおけるＴＮＦ−α誘導性のＥＣＡＭのタンパク質発現に対するＣ−１０の影響を調べた。活性化されていないＨＡＥＣは、Ｅ−セレクチン又はＶＣＡＭ−１を発現するようには見えないが、ＩＣＡＭ−１を発現させた（図１Ａ）。ＴＮＦ−αによる処理を４時間行ったＨＡＥＣは、Ｅ−セレクチン及びＶＣＡＭ−１タンパク質発現を引き起こし、ＩＣＡＭ−１のタンパク質発現を大幅に増加させた（図１Ａ）。ＤＭＳＯ（担体対照）によるＨＡＥＣの処理（４時間）は、ＴＮＦ−α誘導性のＥ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１のタンパク質発現に対してほとんど又は全く影響がなかった（図１Ａ）。対照的に、Ｃ−１０によるＨＡＥＣの処理（４時間）は、ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１のタンパク質発現を著しく減少させた（図１Ａ）。この作用は、Ｃ−１０の濃度が０．２５ｍＭ（図１Ａ）のときに観察された。ＨＡＥＣをメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンで４時間処理した場合は、ＴＮＦ−α誘導性のＥ−セレクチン及びＩＣＡＭ−１のタンパク質発現に対して、ほとんど影響を及ぼさなかった（図１Ａ）。タンパク質レベルでの発現は、ＲＮＡレベルでの発現と同様である。特に、ノーザンブロット分析によって、Ｃ−１０は、投与量に依存して、ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１のｍＲＮＡ発現を減少させ、Ｅ−セレクチンのｍＲＮＡ発現に対してはほとんど影響を及ぼさず、ＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡ発現に対しては全く影響を及ぼさないことが明らかになった（図１Ｂ）。
【０１３３】
２４時間の場合でも、Ｅ−セレクチン発現に対する抑制効果も見られることを除いて、同様の結果が観察された。ＴＮＦ−α処理を２４時間行ったＨＡＥＣにおけるＥ−セレクチン発現レベルは基礎レベルよりも高いが（図２Ａ）、ＴＮＦ−α処理を４時間行った場合よりも明らかに低かった（図１Ａ）。２４時間の場合は、ＴＮＦ−αによって活性化させたＨＡＥＣは、活性化させていないＨＡＥＣと比べると、ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１のレベルの上昇を示した（図２Ａ）。ＤＭＳＯによるＨＡＥＣ処理（２４時間）は、ＴＮＦ−α誘導性のＥ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１の発現に対してはほとんど又は全く影響を及ぼさなかった（図２Ａ）。対照的に、Ｃ−１０によるＨＡＥＣ処理（２４時間）は、ＴＮＦ−α誘導性のＥ−セレクチン及びＶＣＡＭ−１発現を著しく減少させるが、ＩＣＡＭ−１の発現に対しては全く影響を及ぼさなかった（図２Ａ）。この作用は、Ｃ−１０の濃度が≧０．０５ｍＭのときに観察された（図２Ａ）。この場合も、タンパク質レベルでの発現は、ＲＮＡレベルでの発現と同様である。特に、ノーザンブロット分析によって、Ｃ−１０をＴＮＦ−αで２４時間処理した場合は、投与量に依存して、ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１及びＥ−セレクチンのｍＲＮＡ発現を減少させ、ＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡ発現に対してはほとんど又は全く影響を及ぼさないことが明らかになった（図２Ｂ）。
【０１３４】
この作用はＣ−１０の場合に限定されず、他のメチマゾール誘導体又は互変異性環状チオンによっても実証されている。
【０１３５】
（表１）大動脈内皮細胞における、ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１のＲＮＡレベルに対する、異なる濃度のＭＭＩ誘導体又は互変異性環状チオンの作用。
2007529510.tif 000014
数値は、実験を３回繰り返した平均±ＳＤである。
ＮＤは、実施せず（not done）を意味する。
太字の数値は、大幅な抑制（Ｐ＜０．０５又はそれ以上）を示す。
【０１３６】
＜メチマゾール誘導体又は互変異性環状チオン（例えば、Ｃ１０）は、単球がＴＮＦ−αによって活性化されたＨＡＥＣと細胞接着するのを抑制する＞
【０１３７】
ＶＣＡＭ−１は、単核白血球の血管内皮への接着において重要な役割を果たすことが知られている（３５）。この事実は、Ｃ−１０がＶＣＡＭ−１のタンパク質発現を大幅に抑制するという我々の発見（図１Ａ及び２Ａ）と相まって、単球（Ｕ９３７）がＨＡＥＣと細胞接着することにおける、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンの作用（４時間及び２４時間）を調べることを動機付けた。この実験では、インビボでのフロー条件を再現するインビトロ・フローチャンバーを使用した。Ｃ−１０の濃度は、我々のＥＬＩＳＡ分析（図１Ａ及び２Ａ）で最大の効果を示した０．５ｍＭ（４時間の場合）及び０．１ｍＭ（２４時間の場合）とした。
【０１３８】
最初、どのＥＣＡＭがＵ９３７細胞のＴＮＦ−α処理（４時間）によって活性化されたＨＡＥＣへの接着に関与するのかを調べるのに、ｍＡｂ阻害法を使用した。かなりの数のＵ９３７細胞が、ＴＮＦ−α処理（４時間）によって活性化されたＨＡＥＣと接着した（カラム２；図３Ａ）。一方、活性化されていないＨＡＥＣには、Ｕ９３７細胞はほとんど接着しなかった（カラム１；図３Ａ）。ＶＣＡＭ−１に対する機能阻害ｍＡｂである５１−１ＯＣ９による、ＴＮＦ−α処理（４時間）によって活性化されたＨＡＥＣの処理は、Ｕ９３７細胞接着に影響を及ぼさなかった（カラム３対カラム２；図３Ａ）。また、Ｅ−セレクチンに対する機能阻害ｍＡｂであるＨＥＬ３／２による、ＴＮＦ−α処理（４時間）によって活性化されたＨＡＥＣの処理は、Ｕ９３７細胞接着を部分的に減少させた（カラム４対カラム２；図３Ａ）。５１−１ＯＣ９とＨＥＬ３／２の組み合わせによって、ＴＮＦ−α処理（４時間）によって活性化されたＨＡＥＣを処理した場合は、さらなる減少が見られた（カラム５対カラム４；図３Ａ）。これらの結果により、ＴＮＦ−α処理（４時間）によって活性化されたＨＡＥＣへのＵ９３７の細胞接着は、Ｅ−セレクチン及びＶＣＡＭ−１の両方により媒介されることが示唆される。このことは、他の報告（１８）とも一致する。
【０１３９】
Ｃ−１０と、Ｅ−セレクチンに対するｍＡｂ（ＨＥＬ３／２）との組み合わせは、ＴＮＦ−α誘導性のＵ９３７細胞接着（４時間）を大幅に減少させる（カラム６対カラム２；図３Ａ）。さらに、Ｃ−１０と、Ｅ−セレクチンに対するｍＡｂとの組み合わせは、Ｅ−セレクチンに対するｍＡｂ単独で処理した場合と比べて、ＴＮＦ−α誘導性のＵ９３７細胞接着（４時間）を大幅に減少させる（カラム６対カラム４；図３Ａ）。Ｃ−１０単独で処理した場合は、ＤＭＳＯで処理した場合と比べると、ＴＮＦ−α誘導性のＵ９３７細胞接着（４時間）に対してはほとんど影響を及ぼさない（カラム７対カラム８；図３Ａ）。組み合わせると、これらのデータは、ＴＮＦ−α誘導性のＵ９３７のＨＡＥＣへの細胞接着（４時間）に対して、Ｃ−１０が適度な効果を有することを実証する。このことは、ｍＡｂのＥ−セレクチン及びＶＣＡＭ−１に対する抑制を必要とすることを示す上記のｍＡｂデータ、及び、図１に示す４時間の時点では、Ｃ−１０は、ＶＣＡＭ−１のｍＲＮＡ及びタンパク質発現に対して選択的な効果を及ぼすという証拠と一致する。
【０１４０】
ＴＮＦ−αを２４時間活性化した時点では、より大幅な影響が観測される（図３Ｂ）。かなりの数のＵ９３７細胞が、ＴＮＦ−αによって２４時間活性化されたＨＡＥＣに接着する（カラム２；図３Ｂ）。一方、活性化されていないＨＡＥＣに対しては、Ｕ９３７細胞はほとんど接着しない（カラム１；図３Ｂ）。ＴＮＦ−αによって２４時間活性化されたＨＡＥＣに対するＵ９３７細胞接着は、Ｅ−セレクチン及びＶＣＡＭ−１の両方に依存する（カラム５対カラム２、３、４；図３Ｂ）。Ｃ−１０と、Ｅ−セレクチンに対するｍＡｂ（ＨＥＬ３／２）との組み合わせは、ＴＮＦ−α誘導性のＵ９３７の細胞接着（２４時間）を大幅に減少させる（カラム６対カラム２；図３Ｂ）。さらに、Ｃ−１０とＥ−セレクチンに対するｍＡｂとの組み合わせは、ＴＮＦ−α誘導性のＵ９３７の細胞接着（２４時間）を、Ｅ−セレクチンに対するｍＡｂ単独で処理した場合と比べて、大幅に減少させる（カラム６対カラム４；図３Ｂ）。また、Ｃ−１０単独によるＨＡＥＣの処理も、ＴＮＦ−α誘導性のＵ９３７の細胞接着（２４時間）を、ＤＭＳＯで処理した場合と比べると大幅に減少させる（カラム７対カラム８；図３Ｂ）。したがって、上述した結果は、長期間（２４時間）のＴＮＦ−α誘導性のＵ９３７のＨＡＥＣへの細胞接着を、Ｃ−１０が大幅に減少させることを明確に実証する。
【０１４１】
＜メチマゾール誘導体又は互変異性環状チオン（例えばＣ−１０）は、ＶＣＡＭ−１遺伝子転写に影響を及ぼす＞
【０１４２】
上述したことから、実験した両方の条件下で、メチマゾール誘導体が、ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１発現を抑制することは明白である（図１及び２）。メチマゾール誘導体がＴＮＦ−α誘導性を抑制するために転写活性的に作用するかどうかを検査するために、及び、Ｃ−１０抑制作用の分子機構知るために、ＶＣＡＭ−１・プロモータ・レポーター分析を実施した。ＴＮＦ−α誘導性のヒトＶＣＡＭ−１発現に影響を及ぼすことが知られている様々な転写因子であるＮＦ−ｋＢ、ＡＰ−１、ＳＰ−１、ＩＲＦ−１、及びＧＡＴＡとの結合部位の位置は、図４に示すように、−１６４１と＋１２との間に存在する（８〜１１）。それらの活動を大きく分離するために、ＶＣＡＭ−１転写調節要素の４つのトランケーションが作成された（−１６４１／＋１２、−２８８／＋１２、−２２８／＋１２、及び−８５／＋１２ｂｐ作成物）（図４）。これらは、その後、ルシフェラーゼ・レポータ・プラスミドに挿入され、ＨＡＥＣに形質移入される。
【０１４３】
ＴＮＦ−α処理は、前記４つの作成物におけるプロモータ活性の増加を誘導する（図４）。Ｃ−１０処理は、４つの作成物全てにおけるＴＮＦ−α誘導性活性を抑制する（図４）。ＴＮＦ−α誘導性のプロモータ活性の増加は、−２２８／＋１２と−８５／＋１２ ｂｐ作成物との間では減少することに注意されたい（図４）。Ｃ−１０の抑制作用は、−８５／＋１２ ｂｐ作成物で観察される（図４）。これらのデータは、Ｃ−１０がＶＣＡＭ−１遺伝子転写に作用することを明確に実証し、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンがＶＣＡＭ−１・プロモータの−８５／＋１２ ｂｐで生じる転写調節に作用することを示す。
【０１４４】
この作用はＣ−１０の場合に限定されず、他のメチマゾール誘導体又は互変異性環状チオンによっても実証されている。
【０１４５】
（表２）ｈＶＣＡＭ−１（−２２８〜＋１２）ルシフェラーゼ構成活性を使用した、ＴＮＦ−α誘導性ＶＣＡＭ−１プロモータ活性に対する、異なる濃度のＭＭＩ誘導体又は互変異性環状チオンの作用。
2007529510.tif 000015
数値は、実験を３回繰り返した平均±ＳＤである。
ＮＤは、実施せず（not done）を意味する。
太字の数値は、大幅な抑制（Ｐ＜０．０５又はそれ以上）を示す。
【０１４６】
＜メチマゾール誘導体又は互変異性環状チオン（例えばＣ１０）は、ＴＮＦ−α誘導性ＮＦ−ｋＢのＶＣＡＭ−１・プロモータへの結合活性に影響を及ぼさない＞
【０１４７】
ＶＣＡＭ−１プロモータにおけるＮＦ−ｋＢとの結合部位は、−８５／＋１２ ｂｐに位置する（図４）（８、９、１１）。ＴＮＦ−α誘導性ＶＣＡＭ−１発現におけるＣ−１０の抑制作用が、Ｃ−１０のＴＮＦ−α誘導性ＮＦ−ｋＢ活性による結果かどうかを判断するために、ＥＭＳＡを行った。ＥＭＳＡは、３２Ｐ標識されたＮＦ−ｋＢプローブと、ＴＮＦ−αによって処理された又は処理されていないＨＡＥＣから作成された６μｇの核抽出物を用いて、Ｃ−１０の存在下又は非存在下で実施した（結果は示さず）。２時間のＴＮＦ−α処理を行うと、複合体は、ＴＮＦ−α処理を行っていない対照と比べると顕著に誘導された。対照実験では、１００倍モル過剰の未標識のＮＦ−ｋＢプロ−ブにより、ＴＮＦ−α誘導性錯体形成を取り除いた。０．５ｍＭのＣ−１０又はＤＭＳＯの追加は、ＴＮＦ−α依存性の錯体形成に影響を及ぼさなかった（データは示さず）。複合体の成分を特定するために、様々なＮＦ−ｋＢサブユニットに対する抗体を使用して、スーパーシフト実験を行った。ＮＦ−ｋＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットに対する抗体は、ＴＮＦ−α誘導性の錯体をスーパーシフトした。一方、ｐ５２、ｃ−ｒｅｌ及びｒｅｌ−Ｂに対する抗体は、スーパーシフトしなかった（データは示さず）。また、スーパーシフト実験においては、０．５ｍＭのＣ−１０の追加も影響を与えない（データは示さず）。ＤＭＳＯ又はＣ−１０処理だけでは、活性化させていないＨＡＥＣに対して影響を及ぼさないことに注意されたい。理論に制約されることは決して望むものではないが、このデータは、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンがＥＣＡＭ発現を抑制する機構は、ＮＦ−ｋＢ活性及びＶＣＡＭ−１・プロモータへの結合の阻害によるものではないことを強力に示唆している。
【０１４８】
＜メチマゾール誘導体又は互変異性環状チオン（例えばＣ１０）は、ＴＮＦ−α誘導性のＩＲＦ−ＩのＶＣＡＭ−１・プロモータに対する結合活性を抑制する＞
【０１４９】
ルシフェラーゼ・レポーター分析によってメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンがＶＣＡＭ−１・プロモータの−８５／＋１２ ｂｐで生じる転写調節に影響を及ぼすことが示唆されたため、及び、ＥＭＳＡによってＣ−１０がＴＮＦ−αによって誘導されるＮＦ−ｋＢ活性化に影響を及ぼさないことが実証されたため、我々はメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンが異なる下流部位で作用する可能性を考えた。ＩＲＦ−１に対する結合部位は、ＶＣＡＭ−１・プロモータの−８５／＋１２ ｂｐ、−１１〜−１ｂｐのＮＦ−ＫＢ結合部位の下流に位置する。メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンのＴＮＦ−α誘導性ＶＣＡＭ−１発現に対する抑制作用が、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンによるＴＮＦ−α誘導性ＩＲＦ−１活性化の結果であるかどうかを調べるために、我々はＥＭＳＡを行った。ＥＭＳＡは、３２Ｐ標識化されたＩＲＦ−１プローブ（図５Ａ）と、ＴＮＦ−αで処理した又は処理していないＨＡＥＣから作成した３μｇの核抽出物を用いて、Ｃ−１０の存在下又は非存在下（図５Ｂ）で行った。ＴＮＦ−αで２時間処理すると、ＴＮＦ−α処理を行っていない対照（レーン３対レーン２、図５Ｂ）と比較すると非常に顕著である、複合体が生じた（レーン３、図５Ｂ）。０．５ｍＭ及び１ｍＭのＣ−１０を加えると、ＴＮＦ−α誘導性の錯体の形成を抑制する（レーン４及び５対レーン３、図５Ｂ）。ＤＭＳＯは、ＴＮＦ−α依存性の錯体形成に影響を及ぼさないことに留意されたい（レーン６対レーン３、図５Ｂ）。対照実験では、１００倍モル過剰の未標識のＶＣＡＭ−１ ＩＲＦ−１ プローブ（レーン７、図５Ｂ）又は一致するＩＲＦ−１プローブ（レーン９、図５Ｂ）により、ＴＮＦ−α誘導性錯体形成を取り除いた。しかしながら、１００倍モル過剰の未標識のＶＣＡＭ−１ ＩＲＦ−１ プローブ（レーン８、図５Ｂ）又は一致するＩＲＦ−１プローブ（レーン１０、図５Ｂ）による対照実験は、ＴＮＦ−α誘導性錯体形成に影響を与えなかった。スーパーシフト実験によって（図５Ｃ）、ＩＲＦ−１に対する抗体はＴＮＦ−αによって誘導される錯体をスーパーシフトすることが分かった（レーン４対レーン３、図５Ｃ）。組み合わせると、これらのデータは、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンがＶＣＡＭ−１・プロモータに対するＩＲＦ−１結合活性に作用することを実証し、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンがＩＲＦ−１依存性のＶＣＡＭ−１の発現を抑制することを強く示唆する。
【０１５０】
メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンがＴＮＦ−α誘導性のＩＲＦ−１のＶＣＡＭ−１・プロモータへの結合（図５Ｂ）を抑制する機構をさらに検査及び測定するために、我々はＴＮＦ−α誘導性のＩＲＦ−１・タンパク質及びｍＲＮＡの発現におけるメチマゾール誘導体及び互変異性環状の作用を調べた。活性化させていないＨＡＥＣは、ＩＲＦ−１・ｍＲＮＡを発現するようには見えなかった（図６Ａ）。ＴＮＦ−αで２時間処理したＨＡＥＣは、ＩＲＦ−１・ｍＲＮＡを誘導する（図６Ａ）。０．５ｍＭ又は１ｍＭのＣ−１０の追加は、ＨＡＥＣにおける、ＴＮＦ−α誘導性のＩＲＦ−１のｍＲＮＡ発現を減少させる（図６Ａ）。ＲＮＡレベルでの発現は、タンパク質レベルでの発現と同様である。特に、ＨＡＥＣのＣ−１０処理は、ＴＮＦ−αによって誘導されるＩＲＦ−１のタンパク質発現（図６Ｂ）を減少させる。組み合わせると、このセクションのデータは、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンがＴＮＦ−α誘導性のＩＲＦ−１のタンパク質及びｍＲＮＡ発現を減少させることを実証する。
【０１５１】
これらの作用は、Ｃ−１０の場合に限定されず、他のメチマゾール誘導体又は互変異性環状チオンによっても実証されている。
【０１５２】
（表３）ＴＮＦ−アルファ誘導性のＩＲＦ−１のＲＮＡレベルに対する、異なる濃度のＭＭＩ誘導体又は互変異性環状チオンの作用。
2007529510.tif 000016
数値は、実験を２回繰り返した平均±ＳＤである。
太字の数値は、大幅な抑制（Ｐ＜０．０５又はそれ以上）を示す。
【０１５３】
（表４）ＴＮＦ−アルファ誘導性のＩＲＦ−１のタンパク質に対する、異なる濃度のＭＭＩ誘導体又は互変異性環状チオンの作用。
2007529510.tif 000017
数値は、実験を２回繰り返した平均±ＳＤである。
太字の数値は、大幅な抑制（Ｐ＜０．０５又はそれ以上）を示す。
【０１５４】
＜考察＞
【０１５５】
この実験により、我々はメチマゾール（自己免疫疾患（グレーブス病）の治療に通常使用される化合物）のフェニル誘導体であるＣ−１０が新規な抗炎症性を有することを見いだした。特に、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンは、ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１のｍＲＮＡ及びタンパク質発現を劇的に抑制し、Ｅ−セレクチン発現に対して比較的少なく抑制作用を有し、ＩＣＡＭ−１発現に対しては全く作用しない。また、ＶＣＡＭ−１抑制に対する作用は転写的であり、インビボのフロー状態と同様であるインビトロのフロー状態で、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンが、ＴＮＦ−α誘導性の単球のＨＡＥＣへの細胞接着を著しく減少させることが分かった。
【０１５６】
いくつかの現在の及び潜在的な抗炎症剤は、サイトカイン誘導性のＥＣＡＭ発現を転写レベルで抑制することにより、白血球接着を減少させる（５）。これらの化合物の全てが、サイトカイン誘導性ＥＣＡＭ発現に対して同じ効果を示すわけではない。例えば、ラクタシスチン（lactacystin）はイトカイン誘導性のＥ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１発現を減少させることができるが（２０）、他の化合物は、特定のＥＣＡＭ（例えば、ＶＣＡＭ−１）に対して選択的であるように見える（１９，３６）。白血球接着カスケードは、受容体−リガンド機能的重複を有することが実証されているので（例えば、Ｅ−セレクチンとＶＣＡＭ−１は両方とも、リンパ球の連結及びローリングを支えることが分かっている（３７，３８））、いくつかのＥＣＡＭ発現を抑制する化合物は、様々な炎症状況において白血球接着を阻害するのにより効果的である。特に、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンは、Ｅ−セレクチン及びＩＣＡＭ−１に対する作用と比較すると、ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１の発現に対して大きな抑制作用を示し、フロー状態でも単球の内皮への細胞接着を減少させる。
【０１５７】
本発明は、ＮＦ−ｋＢには依存せずに、かつＩＲＦ−１には依存的に、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンによって、ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１の発現を抑制することを提供する。さらに、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンは、遺伝子調節におけるＩＲＦ−１の役割を検査するツールとして使用できる。
【０１５８】
ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１プロモータ活性の増加は、−１６４１と−２８８ ｂｐとの間のＡＰ−１部位の削除によって著しく変化しない（図４）。このことは、前述したプロモータ分析（８）、及びＡＰ−１作用はＮＦ−ｋＢ要素に媒介されることを示している報告と一致する。ＴＮＦ−α誘導性のプロモータ活性の明らかに失うことのない−２８８〜−２２８ ｂｐの欠失は（図４）、他の内皮細胞タイプの特筆すべき従来の研究である（８，４２）。興味深いことに、−８５／＋１２ ｂｐ構造体ではＮＦ−ｋＢ要素は無傷だとという事実にもかかわらず（図４）、プロモータ活性におけるＴＮＦ−α誘導性の増加は、−２２８／＋１２と−８５／＋１２ ｂｐ構造体との間では減少する。
【０１５９】
結論として、本発明により、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンが抗炎症性を示すことが明らかになった。特に、フェニルメチマゾールが、（ｉ）ＨＡＥＣにおいて、ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１発現を劇的に抑制し、Ｅ−セレクチン発現に対しては少しの作用を有し、ＩＣＡＭ−１発現に対しては全く作用しないこと、（ｉｉ）インビボでのフロー条件と同様のインビトロのフロー条件下で、ＴＮＦ−α誘導性の単球（Ｕ９３７）のＨＡＥＣへの細胞接着を著しく減少させること、（ｉｉｉ）ＴＮＦ−α誘導性のＩＲＦ−１のＶＣＡＭ−１プロモータへの結合活性を抑制すること、（ｉｖ）ＨＡＥＣにおけるＴＮＦ−α誘導性のＩＲＦ−１発現を減少させることが明らかになった。したがって、メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンは、病的炎症、特にＶＣＡＭ−１に関連する病気（例えば、アテローム性動脈硬化、及び炎症性大腸炎）の治療に使用することができる。
【０１６０】
＜本発明に係る医薬組成物＞
【０１６１】
細胞接着及び炎症性疾患を治療するために、単位用量形態の医薬組成物は、１日当たり約０．０５〜６０ミリグラム（好ましくは、約０．０５〜２０ミリグラム）の活性化合物を提供する組成物を含んでいる。本発明に係る活性化合物の投与に有用な医薬組成物を以下に示す。これらは、従来の方法を使用して作成される。
【０１６２】
（カプセル剤）
活性成分：０．０５〜２０ｍｇ
ラクトース：２０〜１００ｍｇ
コーンスターチ，Ｕ．Ｓ．Ｐ．：２０〜１００ｍｇ
エアロゾル化されたシリカ・ゲル：２〜４ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム：１〜２ｍｇ
【０１６３】
（錠剤）
活性成分：０．０５〜２０ｍｇ
微結晶性セルロース：５０ｍｇ
コーンスターチ，Ｕ．Ｓ．Ｐ．：８０ｍｇ
ラクトース，Ｕ．Ｓ．Ｐ．：５０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム：１〜２ｍｇ
この錠剤は、従来技術を使用して、糖で被覆することができる。また、着色することもできる。
【０１６４】
（チュアブル錠）
活性成分：０．０５〜２０ｍｇ
マンニトール，Ｎ．Ｆ．：１００ｍｇ
香料：１ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム，Ｕ．Ｓ．Ｐ．：２ｍｇ
【０１６５】
（坐剤）
活性成分：０．０５〜２０ｍｇ
坐剤の基剤：１９００ｍｇ
ジメチルスルホキシド：０．１〜３％
【０１６６】
（液剤）
活性成分：２．０％
ポリエチレン・グリコール３００，Ｎ．Ｆ．：１０．０％
グリセリン：５．０％
亜硫酸水素ナトリウム：０．０２％
ソルビトール溶液７０％，Ｕ．Ｓ．Ｐ．：５０％
メチルパラベン，Ｕ．Ｓ．Ｐ．：０．１％
プロピルパラベン，Ｕ．Ｓ．Ｐ．：０．２％
蒸留水，Ｕ．Ｓ．Ｐ．（ｑ．ｓ．）：１００．０ｃｃ
ジメチルスルホキシド：０．１〜３％
【０１６７】
（注射剤）
活性成分：０．０５〜６０ｍｇ
ポリエチレン・グリコール６００：１．０ｃｃ
亜硫酸水素ナトリウム，Ｕ．Ｓ．Ｐ．：０．４ｍｇ
注射用蒸留水（ｑ．ｓ．）：２．０ｃｃ
ジメチルスルホキシド：０．１〜３％
【０１６８】
以上、本発明の様々な実施形態を説明したが、これらの実施形態は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。従って、本発明の範囲は、特許請求の範囲及びその均等範囲によってのみ規定されるものである。
【０１６９】
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【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】メチマゾール誘導体（Ｃ−１０）は、ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１の発現を短期間で著しく抑制するが、ＴＮＦ−α誘導性のＥ−セレクチン及びＩＣＡＭ−１の発現に対してはほとんど又は全く影響しない。Ｃ−１０の存在下又は１つ以上の存在下で、活性化させてない及び４（ＥＬＩＳＡ）又は２４（ｍＲＮＡ）時間、ＴＮＦ−αで活性化させたＨＡＥＣにおけるＥ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１のタンパク質（Ａ）及びｍＲＮＡ（Ｂ）レベルを、それぞれＥＬＩＳＡ及びノーザンブロット法によって測定した。（Ａ）光学密度（４５０ｎｍ）によって示される吸光レベルは、ＨＡＥＣにおけるＥＣＡＭタンパク質（例えばＥ−セレクチン）のレベルと相関する。全ての値は、実験を少なくとも３回繰り返した実験における平均±ＳＤである。ＴＳ１／２２ｎｉに対するｍＡｂは、陰性対照である。（Ｂ）ＨＡＥＣから単離したＲＮＡは、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１に対する適切なプローブを使用してノーザンブロット法により分析された。ローディング対照として、Ｇ３ＰＤＨプローブが使用された。結果は、３回行った実験の代表例を示している。ＴＮＦ−α活性化は、ＴＮＦ−α（＋）によるＨＡＥＣの活性化、又は分析前の非活性化（−）を示す。処理は、ＴＮＦ−αによる活性化中での、Ｃ−１０、ＤＭＳＯによるＨＡＥＣの処理、又は非処理（−）を示す。＊は、ｐ＜０．００１を示す。
【図２】Ｃ−１０は、２４時間における、ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１及びＥ−セレクチンの発現を短期間で著しく抑制するが、ＩＣＡＭ−１の発現に対してはほとんど又は全く影響しない。Ｃ−１０の存在下又は１つ以上の存在下で、ＴＮＦ−αで２４時間活性化させたＨＡＥＣにおけるＥ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１のタンパク質（Ａ）及びｍＲＮＡ（Ｂ）レベルを、それぞれＥＬＩＳＡ及びノーザンブロット法によって測定した。（Ａ）光学密度（４５０ｎｍ）によって示される吸光レベルは、ＨＡＥＣにおけるＥＣＡＭタンパク質（例えばＥ−セレクチン）のレベルと相関する。全ての値は、３つのウエルの標準偏差の平均±である。結果は、３回行った実験の代表例を示している。ＴＳ１／２２ｎｉに対するｍＡｂは、陰性対照であり、図１（Ａ）と同様の結果を示す。（Ｂ）ＨＡＥＣから単離したＲＮＡは、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１に対する適切なプローブを使用してノーザンブロット法により分析された。ローディング対照として、Ｇ３ＰＤＨプローブが使用された。結果は、３回行った実験の代表例を示している。ＴＮＦ−α活性化は、分析前での、ＴＮＦ−α（＋）によるＨＡＥＣの活性化、又は非活性化（−）を示す。処理は、ＴＮＦ−αによる活性化中での、Ｃ−１０、ＤＭＳＯによるＨＡＥＣの処理、又は非処理（−）を示す。＊は、ｐ＜０．００１を示す。
【図３】Ｃ−１０は、ＴＮＦ−αで４時間活性化させたＨＡＥＣのＵ９３７の細胞接着に対しては少しの作用を示し、ＴＮＦ−αで２４時間活性化させたＨＡＥＣのＵ９３７の細胞接着に対しては劇的な作用を示した。ＨＡＥＣは、Ｃ−１０の存在下又は１つ以上の存在下で、ＴＮＦ−αで４時間（Ａ）又は２４時間（Ｂ）処理された。場合によっては、ＨＡＥＣは、接着分析の前に、ｍＡｂによって前処理される。その後、Ｕ９３７細胞はＨＡＥＣにかん流され、流れの最後の２．５分間での、ＨＡＥＣに接着するＵ９３７細胞の数を測定した。ＴＮＦ−α活性化は、接着分析前の、ＴＮＦ−αによるＨＡＥＣの活性化（＋）、又は非活性化（−）を示す。処理は、ＴＮＦ−αによる活性化の間の、０．５ｍＭ（Ａ）又は０．１ｍＭ（Ｂ）のＣ−１０、ＤＭＳＯによるＨＡＥＣの処理、又は非処理（−）を示す。ｍＡｂは、Ｅ−セレクチンに対するｍＡｂであるＨＥＬ３／２（Ｅ）、ＶＣＡＭ−１に対するｍＡｂである５１−１ＯＣ９（Ｖ）、ＶＣＡＭ−１に対するｍＡｂである５１−１ＯＣ９（Ｖ）とＥ−セレクチンに対するｍＡｂであるＨＥＬ３／２（Ｖ＋Ｅ）との組み合わせによるＨＡＥＣの前処理、又はその他の処理後かつ接着分析前における非処理（−）を示す。剪断応力＝１．８ダイン／ｃｍ２、ｎ≧３、エラーバーはＳＥＭを示す、＃はｐ＜０．０５を示す。
【図４】Ｃ−１０は、ＨＡＥＣにおける、ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１プロモータ活性の増加を抑制する。（左側）様々な、ＴＮＦ−α誘導性のＶＣＡＭ−１発現に関与することが知られている転写要素との結合部位の位置は、−１６４１／＋１２、−２８８／＋１２、−２２８／＋１２、及び−８５／＋１２ ｂｐ 構造を作成するためのテンプレートとして使用される。（右側）ＨＡＥＣは、左側に示される４００ｎｇの構造、又はｐＧＬ３ベーシック・ルシフェラーゼ・レポーター・ベクターに２４時間形質導入される。全てのＨＡＥＣは、「内部」の形質移入対照としてRenilla luciferase（Ｒｌｕｃ）を含んでいる、ｐｈＲＬ−ＴＫ（Ｉｎｔ−）ベクターに形質導入される。ＨＡＥＣは、０．３ｍＭのＣ−１０の存在下又は非存在下で、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αにより６時間処理される。全ての処理条件は、０．３％のＤＭＳＯを含んでいる。分析は、デュアル・ルシフェラーゼ・レポーター分析システムで行われる。発光量（relative light unit：ＲＬＵ）で表されるルシフェラーゼ活性は、プロモータ活性のレベルに関連する。全ての値は、３つのウエルの標準偏差の平均±である。示す結果は、３つの個別の実験の典型例である。バー１は、未処理のＨＡＥＣを示し、バー２は、０．３ｍＭのＣ−１０で処理されたＨＡＥＣを示し、バー３は、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで処理されたＨＡＥＣを示し、バー４は、０．３ｍＭのＣ−１０の存在下で、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで処理されたＨＡＥＣを示す。
【図５】Ｃ−１０は、２時間におけるＴＮＦ−α誘導性のＩＲＦ−１のＶＣＡＭ−１プロモータに対する結合活性の増加を抑制する。（Ａ）ＥＭＳＡで使用されるプローブ配列。上の線は、結合部位を示す。小文字は、突然変異塩基を示す。コンセンサスＮＦ−ｋβプローブ（図示せず）のセンス鎖配列は、５´ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ３´である。（Ｂ）ＥＭＳＡ又は（Ｃ）スーパシフトＥＳＭＡは、３２Ｐ標識化したＩＲＦ−１プローブ、及び、Ｃ−１０の存在下又は非存在下で１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αにより処理されたＨＡＥＣから作成された３μｇの各抽出物により行われる。示す結果は、２つの個別の実験の典型例である。ＴＮＦ−α活性化は、分析前の、ＴＮＦ−αによるＨＡＥＣの活性化（＋）、又は非活性化（−）を示す。処理は、ＴＮＦ−αによる活性化の間の、０．５ｍＭのＨＡＥＣ、１ｍＭのＨＡＥＣ、又はＤＭＳＯによる処理、或いは、非処理（−）を示す。対照実験は、標識化していないＶＣＡＭ−１ ＩＲＦ−１プローブ（ＶＣＡＭ−１ ＩＲＦ野生型）又はＶＣＡＭ−１ ＩＲＦ−１突然変異プローブ（ＶＣＡＭ−１ ＩＲＦ突然変異）又はコンセンサスＩＲＦ−１プローブ（Ｃｏｎｓ．ＩＲＦ）又はコンセンサスＮＦ−ｋβプローブ（Ｃｏｎｓ．ＮＦ−ｋβ）又は２μｇのＩＲＦ−１に対する抗体（ＩＲＦ−１ Ａｂ）の非存在下（−）又は１００倍モル過剰の存在下を示す。
【図６】Ｃ−１０は、ＴＮＦ−α誘導性のＩＲＦ−１発現を減少させる。Ｃ−１０の存在下又は非存在下での、ＴＮＦ−αで活性化させた及び活性化させてないＩＲＦ−１におけるＲＮＡ（Ａ）及びタンパク質（Ｂ）のレベルを、それぞれノーザンブロット分析及びウエスタンブロット分析により測定した。（Ａ）ＨＡＥＣから単離したＲＮＡは、ＩＲＦ−１プローブを用いてノーザンブロット分析した。臭化エチジウム染色されたｒＲＮＡは、ローディング・コントロールされた。（Ｂ）ＨＡＥＣの全ての細胞溶解物は、ＩＲＦ−１抗体を用いて、ウエスタンブロット分析した。転写後のブロットのポンソーＳ染色により、全てのタンパク質のローディングを明らかにした（データは示さず）。ＴＮＦ−α活性化は、分析前での、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（＋）によるＨＡＥＣの活性化、又は非活性化（−）を示す。Ｃ−１０は、ＴＮＦ−αによる活性化の間の、０．５ｍＭのＨＡＥＣ、１ｍＭのＣ−１０、又はＤＭＳＯ（−）による処理を示す。
【配列表】
2007529510000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月2日(2007.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾病を治療するための医薬組成物を製造するための、メチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体或いはその混合物の使用であって、
前記医薬組成物は、細胞接着を防止、阻害又は抑制するのに有効な量の１種以上のメチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体或いはその混合物を含有し、
前記疾病は、急性肺損傷、アレルギー性鼻炎、アルツハイマー病、関節炎、ぜんそく、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性糸球体腎炎、ベーチェット氏病、癌、脳梗塞、慢性肝炎、肝硬変、皮膚アナフィラキシー反応、皮膚血管炎、遅延型過敏反応、糖尿病、播種性血管内凝固症候群、肺好酸球性肉芽腫、胃炎、巨細胞性動脈炎、グレーブス病、出血性ショック、高血圧性血管疾患、甲状腺機能低下症、炎症性大腸炎（クローン病、潰瘍性大腸炎）、炎症性皮膚病、腸梗塞、川崎病（粘膜皮膚リンパ節症候群）、リンパ球様間質性肺炎、マラリア、髄膜炎、多発性硬化症、心筋梗塞、臓器移植（ホスト対グラフト、グラフト対ホスト）、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、乾癬、肺梗塞、腎梗塞、虚血後の再かん流傷害、リケッチア脈管炎、サルコイドーシス、敗血症、シェーグレン病、脳梗塞、全身性エリテマトーデス、熱傷（やけど）、閉塞性血栓血管炎（バージャー病）、血栓症、甲状腺炎、結核症、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、成人呼吸窮迫症候群、ＡＩＤＳ、アレルギー病、動脈硬化症、関節炎、ぜんそく、アテローム性動脈硬化症、循環器疾患、網膜剥離、有害な血小板凝集、炎症、炎症性大腸炎、多発性硬化症、腫瘍性疾患、眼炎症性疾患、骨関節炎、骨粗しょう症、乾癬、限局性腸炎、移植後の拒絶、血栓溶解後の再閉塞、再かん流傷害、シェーグレン症候群、皮膚炎症性疾患、全身性エリテマトーデス、血栓症、Ｉ型型糖尿病、甲状腺炎、及び、創傷から成る群より選択される１つ以上であることを特徴とする使用。
【請求項２】
前記メチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体は、互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記メチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体を含む前記医薬組成物が、互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記医薬組成物が、互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された前記メチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体を、ＶＣＡＭ−１に媒介される細胞接着を防止、阻害又は抑制するのに有効な量含み、かつ薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記細胞接着は、ＶＣＡＭ−１及びＥ−セレクチンに媒介されることを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記細胞接着は、ＩＲＦ−１依存性のＶＣＡＭ−１に媒介される細胞接着であることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記医薬組成物が、互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された前記メチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体を、ＶＣＡＭ−１に媒介される、サイトカイン誘導性の細胞接着を防止、阻害又は抑制するのに有効な量含み、かつ薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記細胞接着は、ＶＣＡＭ−１及びＥ−セレクチンに媒介されることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記細胞接着は、ＩＲＦ−１依存性のＶＣＡＭ−１に媒介される細胞接着であることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記サイトカインは、ＴＮＦ−アルファであることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項１１】
細胞接着に関連する炎症を防止、阻害又は抑制するための使用であることを特徴とする請求項２、４、及び７の何れかに記載の使用。
【請求項１２】
サイトカイン誘導性の細胞接着に関連する炎症を防止、阻害又は抑制するための使用であることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項１３】
免疫又は自己免疫反応に関連する細胞接着を防止、阻害又は抑制するための使用であることを特徴とする請求項２、４、及び７の何れかに記載の使用。
【請求項１４】
前記医薬組成物は、
【化１】
2007529510.tif 000031
から選択される安全で有効な量の互変異性メチマゾール誘導体、及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする請求項２、４、及び７の何れかに記載の使用。
ただし、
Ｙは、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、ＮＯ２、及びフェニル部分
【化２】
2007529510.tif 000032
から成る群より選択され、
Ｙの１つだけは前記フェニル部分であり得、
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキル、フェニル部分から成る群より選択され、
Ｒ３は、Ｈであり、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｚは、ＳＲ３、及びＯＲ３から選択され、
Ｙがフェニル部分でない場合は、Ｒ２はＣｌ−Ｃ４アルキルである。
【請求項１５】
前記医薬組成物は、
【化１】
2007529510.tif 000033
から選択される安全で有効な量の非互変異性メチマゾール誘導体、及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする請求項２、４、及び７の何れかに記載の使用。
ただし、
Ｙは、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、ＮＯ２、及びフェニル部分
【化２】
2007529510.tif 000034
から成る群より選択され、
Ｙの１つだけは前記フェニル部分であり得、
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキル、及びフェニル部分から成る群より選択され、
Ｒ３は、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、及びＣＨ２Ｐｈから成る群より選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｚは、ＳＲ３、Ｓ（Ｏ）Ｒ３、ＯＲ３及びＣｌ−Ｃ４アルキルから選択され、
Ｙがフェニル部分でない場合は、Ｒ２及びＲ３の少なくとも２つはＣｌ−Ｃ４アルキルであり、
Ｚがアルキルの場合は、Ｙの少なくとも１つはＮＯ２である。
【請求項１６】
前記医薬組成物は、
【化３】
2007529510.tif 000035
から選択される安全で有効な量の非互変異性環状チオン誘導体、及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする請求項２、４、及び７の何れかに記載の使用。
ただし、
Ｙは、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、ＮＯ２、及びフェニル部分
【化２】
2007529510.tif 000036
から成る群より選択され、
Ｙの１つだけは前記フェニル部分であり得、
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｒ２は、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、及びフェニル部分から成る群より選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｘは、Ｓである。
【請求項１７】
Ｚは、ＳＲ３であり、ＹがＨであることを特徴とする請求項１４若しくは１５に記載の使用。
【請求項１８】
Ｒ３がＣｌ−Ｃ４アルキルであることを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
Ｒ３がメチルであることを特徴とする請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
Ｒ２の少なくとも１つは、メチルであることを特徴とする請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
両方のＲ２がメチルであることを特徴とする請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
前記活性化合物は、次の化学構造式で表されることを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【化４】
2007529510.tif 000037
【請求項２３】
前記活性化合物は、次の化学構造式で表されることを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【化５】
2007529510.tif 000038
【請求項２４】
前記活性化合物は、次の化学構造式で表されることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【化６】
2007529510.tif 000039
【請求項２５】
前記活性化合物は、次の化学構造式で表されることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【化７】
2007529510.tif 000040
【請求項２６】
前記活性化合物は、次の化学構造式で表されることを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【化８】
2007529510.tif 000041
【請求項２７】
ＺがＳＲ３であり、Ｙの１つは、フェニル部分であることを特徴とする請求項１４若しくは１５に記載の使用。
【請求項２８】
Ｒ１及びＲ４がＨであることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項２９】
ＺがＳＲ３であり、Ｒ３がメチルであり、Ｙの１つはフェニル部分であり、Ｒ１及びＲ４がＨであり、Ｒ２の少なくとも１つがメチルであることを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【請求項３０】
ＺがＳＲ３であり、Ｒ３がＨであり、Ｙの１つはフェニル部分であり、Ｒ１及びＲ４がＨであり、Ｒ２の少なくとも１つがメチルであることを特徴とする請求項１４若しくは１５に記載の使用。
【請求項３１】
Ｙの１つはフェニル部分であり、Ｒ１及びＲ４がＨであり、両方のＲ２はメチルであることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項３２】
前記活性化合物は、
【化９】
2007529510.tif 000042
から成る群より選択されることを特徴とする請求項１４に記載の使用。
【請求項３３】
前記活性化合物は、
【化１０】
2007529510.tif 000043
から成る群より選択されることを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【請求項３４】
前記活性化合物は、
【化１０】
2007529510.tif 000044
から成る群より選択されることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項３５】
前記医薬組成物は、プロドラッグの形態であることを特徴とする請求項１４、１５、及び１６の何れかに記載の使用。
【請求項３６】
前記医薬組成物は、
０．０１％〜２５％の活性化合物と、
７５％〜９９．９％の薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする請求項１４、１５、及び１６の何れかに記載の使用。
【請求項３７】
前記医薬組成物は、
安全で有効な量の、次の化学構造式で表される活性化合物を含むことを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【化１１】
2007529510.tif 000045
【請求項３８】
前記医薬組成物は、安全で有効な量の、
【化１２】
2007529510.tif 000046
から選択される化合物、及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする請求項２、４、及び７の何れかに記載の使用。
ただし、Ｙは、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、ＮＯ２、及びフェニル部分
【化２】
2007529510.tif 000047
から成る群より選択され、
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ４置換アルキル、Ｃｌ−Ｃ４エステル、及びＣｌ−Ｃ４置換エステルから成る群より選択され、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、及びＣｌ−Ｃ４置換アルキルから成る群より選択され、
Ｘは、Ｓであり、
Ｚは、ＳＲ３、ＯＲ３、Ｓ（Ｏ）Ｒ３、及びＣｌ−Ｃ４アルキルから選択され、
Ｙがフェニル部分ではない場合は、Ｒ２はＣｌ−Ｃ４アルキルである。
【請求項３９】
前記活性化合物は、
【化１３】
2007529510.tif 000048
から成る群より選択され、
ただし、Ｒ９は、ＯＨ、Ｍ、及びＯＯＣＣＨ２Ｍから成る群より選択され、
Ｍは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから成る群より選択されることを特徴とする請求項２、４及び７の何れかに記載の使用。
【請求項４０】
前記活性化合物は、
【化１４】
2007529510.tif 000049
から成る群より選択され、
ただし、Ｒ１０は、Ｈ、ＮＯ２、Ｐｈ、４−ＨＯＰｈ、及び４−ＭＰから成る群より選択され、
Ｍは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから成る群より選択されることを特徴とする請求項２、４及び７の何れかに記載の使用。
【請求項４１】
哺乳類（ヒトを除く。）における、ＶＣＡＭ−１に媒介される細胞接着を防止、阻害又は抑制する、又は細胞接着に関連する炎症を防止、阻害又は抑制する能力がある化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）前記哺乳類に試験化合物を接触させるステップと、
（ｂ）白血球の接着又は移動或いはその両方における、前記試験化合物の作用を測定するステップと、
（ｃ）前記試験化合物が、前記接着又は移動或いはその両方に対する抑制剤であるかどうかを判断するステップとを含む方法。
【請求項４２】
前記試験化合物の作用の測定は、
ＩＲＦ−１・ＲＮＡ発現レベルの測定、
ＩＲＦ−１・タンパク質発現レベルの測定、
ＩＲＦ−１依存性のＶＣＡＭ−１プロモータ活性化の測定、
サイトカイン誘導性のＩＲＦ−１ＲＮＡ発現レベルの測定、
サイトカイン誘導性のＩＲＦ−１タンパク質発現レベルの測定、
サイトカイン誘導性のＩＲＦ−１依存性ＶＣＡＭ−１プロモータ活性化の測定、
ＴＮＦ−アルファによって増加したＩＲＦ−１・ＲＮＡ発現レベルの測定、
ＴＮＦ−アルファによって増加したＩＲＦ−１タンパク質発現レベルの測定、及び
ＴＮＦ−アルファによって増加したＩＲＦ−１依存性ＶＣＡＭ−１プロモータ活性化の測定、
の１つ以上を含んでいることを特徴とする請求項４１に記載の方法
【請求項４３】
前記試験試験化合物の作用の測定は、
ＶＣＡＭ−１・ＲＮＡの発現レベルの測定、
サイトカイン誘導性のＶＣＡＭ−１タンパク質発現レベルの測定、
サイトカイン誘導性のＶＣＡＭ−１プロモータ活性化の測定、
ＴＮＦ−アルファによって増加したＶＣＡＭ−１・ＲＮＡ発現レベルの測定、
ＴＮＦ−アルファによって増加したＶＣＡＭ−１タンパク質発現レベルの測定、及び
ＴＮＦ−アルファによって増加したＶＣＡＭ−１プロモータ活性化の測定、
の１つ以上を含んでいることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＶＣＡＭ−１発現細胞における細胞接着阻害作用を有する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）前記ＶＣＡＭ−１発現細胞に試験化合物を接触させるステップと、
（ｂ）前記ＶＣＡＭ−１発現細胞を、ＶＣＡＭ−１リガンド発現細胞に接触させるステップと、
（ｃ）前記ＶＣＡＭ−１発現細胞の前記ＶＣＡＭ−１リガンド発現細胞への結合における、前記試験化合物の作用を測定するステップと、
（ｄ）前記試験化合物が、前記ＶＣＡＭ−１発現細胞のＶＣＡＭ−１リガンド発現細胞への結合作用における抑制剤であるかどうかを判断するステップとを含む方法。
【請求項４５】
前記試験化合物の追加前に、追加と同時に、又は追加後に、
ＶＣＡＭ−１発現細胞に、ＶＣＡＭ−１の発現を抑制する能力のあるサイトカインを接触させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記サイトカインは、ＴＮＦ−アルファであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＶＣＡＭ−１発現細胞は、
非免疫性標的組織細胞、内皮細胞、及び上皮細胞から成る群より選択されることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＶＣＡＭ−１発現細胞は、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）であることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＶＣＡＭ−１リガンド発現細胞は、白血球であることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞は、少なくとも３０分間接触を保たれることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【国際調査報告】
2007529510.tif 000050
2007529510.tif 000051