(57)【要約】  本発明は、種々の疾患と関連する染色体性又は遺伝的異常性、又は種々の疾病に対する傾向を検出及びマッピングする方法、又は大きいスケールのコピー数変異の現象を検出する方法を提供する。特に、本発明は、試料の間の再現性を可能とし、試験試料及び参照試料核酸の両方について、同一の検出可能な標識を用いることによって感度を向上させる、アレイに基づく比較ハイブリダイゼーションを実施するための進歩した方法を提供する。本発明の方法は、癌等の特定の病状を検出又は診断し、染色体性又は遺伝的異常性及び遺伝子発現レベルの検出に基づいて癌の傾向を検出するのに有用である。本発明の方法は、また、特に出生前の試料の遺伝的障害又はそれらに対する傾向の検出又は診断に有用である。更に、本発明の方法は、また、出生後の発育の異常性に関連する新規な遺伝的異常性の検出又は診断に有用である。
2007537762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
比較ハイブリダイゼーションを実施する方法であって、核酸アレイにハイブリダイズした、試験核酸及び参照核酸の量を比較することを含み、ハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の前記量は、同一の検出可能な標識で標識されたハイブリダイズした核酸からのシグナルを検出することにより決定される、ことを含む前記方法。
【請求項２】
前記検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションの前に、試験核酸及び参照核酸に結合される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションの後に、試験核酸及び参照核酸に結合される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記検出可能な標識は、リガンド−レセプター相互作用により、又は相補的なヌクレオチド配列の間のハイブリダイゼーションにより、試験核酸及び参照核酸に結合される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記試験核酸又は参照核酸の一方は、ハイブリダイゼーションの間、検出可能な標識に結合しており、ハイブリダイゼーションの後、検出可能な標識は前記試験核酸又は参照核酸の他方に結合される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の量は、
ａ）ハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の総量を表す、アレイにハイブリダイズした検出可能な標識のシグナルを測定し；
ｂ）ハイブリダイズした核酸を処理して、前記試験核酸又は参照核酸の一方から前記検出可能な標識を選択的に除去し、ここで、前記検出可能な標識は、第一及び第二の化学結合を通じてそれぞれ試験核酸及び参照核酸に結合しており、前記第一の結合又は前記の第二結合の一方は処理工程に対して感受性であり；
ｃ）工程ｂ）の後に、アレイにハイブリダイズした検出可能な標識のための、前記ハイブリダイズした試験核酸又は参照核酸の一方を表わすシグナルを検出し；そして
ｄ）ｃ）及びｂ）からのシグナルを用いることにより、ハイブリダイズした試験又は参照の他方のシグナルを検出する
ことにより決定される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションの前に、試験核酸及び参照核酸に結合される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションの後に、試験核酸及び参照核酸に結合される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記検出可能な標識は、リガンド−レセプター相互作用により、又は相補的なヌクレオチド配列の間のハイブリダイゼーションにより、試験核酸及び参照核酸に結合される、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記試験核酸又は参照核酸の一方は、ハイブリダイゼーションの間、検出可能な標識に結合しており、ハイブリダイゼーションの後、検出可能な標識は前記試験核酸又は参照核酸の他方に結合される、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
ハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の量は、
ａ）ハイブリダイズしたアレイを、検出可能な標識及び第一の構成要素を含む第一の複合体と接触させることにより、アレイにハイブリダイズした試験核酸又は参照核酸の一方を表わすシグナルを測定し、ここで、前記第一の複合体は、前記試験核酸又は参照核酸と結合している第一のタグを介して前記試験核酸又は参照核酸の一方と選択的に反応し、前記第一の構成要素及びタグは特異的結合ペアのメンバーであり；
ｂ）工程ａ）のハイブリダイズしたアレイを、検出可能な標識及び第二の構成要素を含む第二の複合体と接触させることにより、ハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の総量を表すシグナルを測定し、ここで、前記第二の複合体は、工程ｂ）で検出された前記試験核酸又は参照核酸の他方と結合している第二のタグを介して、前記試験核酸又は参照核酸の他方と選択的に反応し、前記第二の構成要素及び第二のタグは特異的結合ペアのメンバーであり；そして
ｃ）a）及びｂ）からのシグナルを用いて、ａ）で検出されない、前記ハイブリダイズした試験核酸又は参照核酸の他方のシグナルを得る
ことにより決定される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ハイブリダイズした、試験核酸及び参照核酸の量は、
ａ）ハイブリダイズしたアレイを、検出可能な標識及び第一の構成要素を含む第一の複合体と接触させることにより、アレイにハイブリダイズした試験核酸又は参照核酸の一方を表わすシグナルを測定し、ここで、前記第一の複合体は、前記試験核酸又は参照核酸と結合している第一のタグを介して、前記試験核酸又は参照核酸の一方と選択的に反応し；
ｂ）ａ）で用いたハイブリダイズしたアレイの複製物を、検出可能な標識及び第二の構成要素を含む第二の複合体と接触させることにより、ａ）で検出されない、前記試験核酸又は参照核酸の他方を表すシグナルを測定し、ここで、前記第二の複合体は、前記試験核酸又は参照核酸の前記他方と結合している第二のタグを介して、前記試験核酸又は参照核酸の他方と選択的に結合している、
ことにより決定される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ハイブリダイズした、試験核酸及び参照核酸の量は、
ａ）アレイにハイブリダイズした、試験核酸又は参照核酸の一方を表わすシグナルを測定し、ここで、前記検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションの前に結合されており；
ｂ）ハイブリダイズしたアレイを、検出可能な標識及び構成要素を含む第一の複合体と接触させることによって、ハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の総量を表すシグナルを測定し、ここで、前記第一の複合体は、前記試験核酸又は参照核酸の前記他方と結合したタグを介して、前記試験核酸又は参照核酸の他方と選択的に反応し；そして
ｃ）a）及びｂ）からのシグナルを用いて、ａ）で検出されない、前記ハイブリダイズした試験核酸又は参照核酸の他方のシグナルを得る
ことにより決定される、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ハイブリダイズした、試験核酸及び参照核酸の量は、
ａ）アレイを読み取ることにより、アレイにハイブリダイズした試験核酸又は参照核酸の一方を表わすシグナルを測定し、ここで、前記検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションの前に、前記試験核酸及び参照核酸の一方と結合されており；
ｂ）ａ）で用いたハイブリダイズしたアレイの複製物を、検出可能な標識及び構成要素を含む複合体と接触させることにより、ａ）で検出されない、前記試験核酸又は参照核酸の他方を表すシグナルを測定し、ここで、前記複合体は、前記試験核酸又は参照核酸の前記他方と結合したタグを介して、前記試験核酸又は参照核酸の他方と選択的に反応し、前記アレイ複製物は、ハイブリダイズする核酸に検出可能な標識が結合されていない点で、第一のアレイと異なる、
ことにより決定される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記第一のタグ及び前記第二のタグは、それぞれ、ユニークなオリゴヌクレオチド捕獲配列を含む、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１６】
前記第一の複合体及び前記第二の複合体は、それぞれ、前記ユニークなオリゴヌクレオチド捕獲配列の一方に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記第一の複合体及び前記第二の複合体は、それぞれ、デンドリマーコンストラクト中の前記ユニークなオリゴヌクレオチド捕獲配列の一方に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記第一の構成要素及び前記第一のタグは、それぞれ、第一の特異的結合ペアのメンバーと結合しており、前記第二の構成要素及び第二のタグは、それぞれ、第二の特異的結合ペアのメンバーと結合しており、ここで、前記第一及び第二の結合ペアのメンバーは交差反応しない、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記試験核酸又は参照核酸が、細胞の核酸のサブセットを表す、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸アレイが、それぞれ人工染色体中に含まれる複数の核酸断片を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記人工染色体が、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記人工染色体が、Ｐ−１由来の人工染色体（ＰＡＣ）である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸アレイが複数の核酸断片を含み、前記複数の核酸断片はそれぞれ、約１，０００〜約１，０００，０００ヌクレオチド長である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸アレイが複数の核酸断片を含み、前記複数の核酸断片はそれぞれ、約１００，０００〜約３００，０００ヌクレオチド長である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸アレイが、少なくとも１つの染色体の核酸配列を集合的に含む、複数の核酸断片を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数の核酸断片が、約３〜４メガベース長の染色体配列の断片を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の核酸断片が、約２〜３メガベース長の染色体配列の断片を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記複数の核酸断片が、約１〜２メガベース長の染色体配列の断片を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の核酸断片が、細胞の全ての染色体の核酸配列を集合的に含む、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の核酸断片が、約３〜４メガベース長の染色体配列の断片を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
前記複数の核酸断片が、約２〜３メガベース長の染色体配列の断片を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の核酸断片が、約１〜２メガベース長の染色体配列の断片を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸アレイが、興味のある少なくとも５０のゲノム領域を集合的に含む複数の核酸断片を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸アレイが、複数の核酸断片の核酸が存在する少なくとも約３００の個別の部位を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸アレイが、複数の核酸断片の核酸が存在する少なくとも約５００の個別の部位を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記検出可能な標識が、光学的手段によって検出される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出可能な標識が蛍光団である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第一の結合及び前記第二の結合が、温度に対する感受性において異なるものである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第一の結合及び前記第二の結合が、両方とも、異なる融点（Ｔｍ）を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記第一の結合及び第二の結合が、ｐＨ加水分解に対する感受性において異なるものである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記第一の結合及び前記第二の結合が、両方ともペプチドを含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記第一の結合及び前記第二の結合が、放射線に対する感受性において異なるものである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第一の結合及び前記第二の結合が、両方とも、紫外線に対する感受性が異なるヌクレオチドストレッチを含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記第一の結合及び前記第二の結合が、酸化的条件中の変化に対する感受性において異なるものである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記第一の結合及び前記第二の結合が、大気条件の変化に対する感受性において異なるものである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
大気条件の前記変化が、前記表面をオゾンに曝露することを含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記第一の結合及び前記第二の結合のいずれかが、加水分解を引き起こす試薬と接触させることにより加水分解される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記第一の結合及び前記第二の結合のいずれかが、酵素と接触させることにより加水分解される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記第一の結合及び前記第二の結合のいずれかが、制限エンドヌクレアーゼ又はホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位を含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記第一の結合及び前記第二の結合のいずれかが、レアカットヌクレアーゼにより切断され、切断によって、前記試験試料の核酸又は前記参照試料の核酸のいずれかから検出可能な標識が選択的に除去される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
制限酵素又はホーミングエンドヌクレアーゼに対する認識部位を含む前記オリゴヌクレオチドが、デンドリマーコンストラクトである、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
前記第一の結合及び前記第二の結合が、バッファー条件の変化に対する感受性において異なるものである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記試験試料が患者から得られる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
患者から得られた前記試験試料が、癌性細胞を含むと疑われるものである、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記試験試料が胎児標本から得られる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記試験試料が、胚又は胎児から得られる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記試験試料が個人から得られ、方法が遺伝的異常を検出するために用いられる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記試験試料が個人から得られ、方法が遺伝的異常を診断するために用いられる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記試験核酸及び参照核酸がゲノム核酸である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
試験試料中の遺伝子発現と参照試料中の遺伝子発現とを比較する方法であって、
核酸アレイにハイブリダイズした、試験試料のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡと、参照試料のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡとの量を比較し、ハイブリダイズした試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡの前記量は、同一の検出可能な標識で標識された、ハイブリダイズされたｃＤＮＡからのシグナルを検出することにより決定される、前記方法。
【請求項６１】
前記検出可能な標識が、ハイブリダイゼーション前に試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡと結合される、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
前記検出可能な標識が、ハイブリダイゼーション後に試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡと結合される、請求項６０記載の方法。
【請求項６３】
前記検出可能な標識が、リガンド−レセプター相互作用により、又は相補的なヌクレオチド配列の間のハイブリダイゼーションにより、試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡに結合される、請求項６０記載の方法。
【請求項６４】
ハイブリダイズした、試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡの量は、
ａ）ハイブリダイズした、試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡの総量を表す、アレイにハイブリダイズした検出可能な標識のシグナルを測定し；
ｂ）ハイブリダイズした核酸を処理して、試験ｃＤＮＡ又は参照ｃＤＮＡの一方から前記検出可能な標識を選択的に除去し、ここで、前記検出可能な標識は、第一及び第二の化学結合を通じて、それぞれ試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡに結合されており、前記第一の結合又は前記第二の結合は、処理工程に対して感受性であり；
ｃ）工程ｂ）の後に、アレイにハイブリダイズした検出可能な標識のシグナルを測定し、これは前記ハイブリダイズした試験ｃＤＮＡ又は参照ｃＤＮＡの一方を表わし；そして
ｄ）ｂ）からｃ）を引くことにより、ｂ）で選択的に除去された検出可能な標識のシグナルを決定し、ここで、ｃ）及びｄ）からの前記シグナルは、核酸アレイにハイブリダイズした、前記試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡの一方のシグナルを表す、
ことにより決定される、請求項６０記載の方法。
【請求項６５】
前記検出可能な標識が、ハイブリダイゼーションの前に、前記試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡに結合される、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記検出可能な標識が、ハイブリダイゼーションの後に、前記試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡに結合される、請求項６４記載の方法。
【請求項６７】
前記検出可能な標識が、リガンド−レセプター相互作用により、又は相補的なヌクレオチド配列の間のハイブリダイゼーションにより、試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡに結合される、請求項６４記載の方法。
【請求項６８】
ハイブリダイズした、試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡの量は、
ａ）ハイブリダイズしたアレイを、検出可能な標識及び第一の構成要素を含む第一の複合体と接触させることにより、アレイにハイブリダイズした試験ｃＤＮＡ又は参照ｃＤＮＡの一方を表わすシグナルを測定し、ここで、前記第一の複合体は、前記試験ｃＤＮＡ又は参照ｃＤＮＡと結合されている第一のタグを介して、前記試験ｃＤＮＡ又は参照ｃＤＮＡの一方と選択的に反応し、前記第一の構成要素及びタグは特異的結合ペアのメンバーであり；
ｂ）工程ａ）のハイブリダイズしたアレイを、検出可能な標識及び第二の構成要素を含む第二の複合体と接触させることにより、ハイブリダイズした試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡの総量を表すシグナルを測定し、ここで、前記第二の複合体は、工程ｂ）で検出された前記試験ｃＤＮＡ又は参照ｃＤＮＡの他方と結合されている第二のタグを介して、前記試験核酸又は参照核酸の他方と選択的に反応し、前記第二の構成要素及び第二のタグは特異的結合ペアのメンバーであり；そして
ｃ）ｂ）からａ）を引いて、ａ）で検出されない、前記ハイブリダイズした試験ｃＤＮＡ又は参照ｃＤＮＡの他方のシグナルを得る
ことにより決定される、請求項６０記載の方法。
【請求項６９】
ハイブリダイズした、試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡの量は、
ａ）ハイブリダイズしたアレイを、検出可能な標識及び第一の構成要素を含む第一の複合体と接触させることにより、アレイにハイブリダイズした試験ｃＤＮＡ又は参照ｃＤＮＡの一方を表わすシグナルを測定し、ここで、前記第一の複合体は、前記試験ｃＤＮＡ又は参照ｃＤＮＡと結合されている第一のタグを介して、前記試験ｃＤＮＡ又は参照ｃＤＮＡの一方と選択的に反応し；
ｂ）ａ）で用いたハイブリダイズしたアレイの複製物を、検出可能な標識及び第二の構成要素を含む第二の複合体と接触させることにより、ａ）で検出されない、前記試験ｃＤＮＡ又は参照ｃＤＮＡの他方を表すシグナルを測定し、ここで、前記第二の複合体は、前記試験ｃＤＮＡ又は参照ｃＤＮＡの前記他方と結合されている第二のタグを介して、前記試験ｃＤＮＡ又は参照ｃＤＮＡの他方と選択的に結合する
ことにより決定される、請求項６０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の疾患又は種々の疾患にかかりやすい傾向に関する、染色体性又は遺伝的異常性の検出及びマッピングに関する。特定の態様においては、本発明は、比較ハイブリダイゼーションにおける核酸の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の記述は、読者の理解を補助するために提供される。提供された情報又は引用された文献は、本発明に対する先行技術であると認めるものではない。
【０００３】
比較ハイブリダイゼーション法は、第三の標的核酸と相互作用する、２種の核酸の能力を検出する。特に、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は、染色体異常を検出するための方法である。ＣＧＨは、本来は、腫瘍中に普通に見られる欠失、重複又は増幅等のＤＮＡ配列の過剰又は減少の部位を検出及び同定するために開発された（Kallioniemiら、Science 258:818-821, 1992）。例えば、１以上の染色体の数異常を引き起こす遺伝的障害（異数性）は、ヒトの疾患の有用な診断上の指標、特に癌マーカーとしての指標を提供する。染色体のコピー数の変化は、大半の主要なヒトの癌の型において見出される。レビューとして、Mittelmanらの、CANCER, Vol.2（Wiley-Liss, 1994）中の「染色体異常の目録」を参照されたい。
【０００４】
更に、異数体細胞の存在は、また、遺伝子の染色体異常のマーカーとして使用されてきた。種々の染色体異常は、全ての生児出生の０．５％に生じ得ると推定されている。例えば、生児出生の８００分の１の発生率であるダウン症候群又は１８トリソミーは、種々の出生前スクリーニング又は診断技術の主題である。染色体１３、１８、２１、Ｘ及びＹを含む染色体異数性は、全ての先天性異常を引き起こす染色体異常の９５％までを占め（Whitemanら、Am. J. Hum, Genet. 49:A127-129, 1991）、平衡転座を含む全ての染色体異数性の６７％までを占める（Klingerら、Am. J. Hum. Genet. 51:52-65, 1992）。
【０００５】
ＣＧＨは、配列の従前の知識なしで、種々のコピー数を有するゲノム配列の位置を発見し、マッピングするのに有用である。ＣＧＨのために、公知の変異に対するオリゴヌクレオチドプローブは必要でない。初期のＣＧＨ技術は、それぞれ異なる色で標識され、分裂中期の染色体の広がりを有する、試験されるＤＮＡと正常な参照ＤＮＡとの間の競合的インサイチューハイブリダイゼーションを用いている。正常な参照ＤＮＡと比較し、コピー数が増加又は減少している、試験されるＤＮＡ中の染色体領域は、２種の異なる色からのシグナル比が変化する領域を検出することによって迅速に確認することができる。例えば、試験細胞中のコピー数が減少する、それらのゲノム領域は、参照よりも試験されるＤＮＡからの相対的に低いシグナルを示すであろう（ゲノムの他の領域と比較し（例えば、欠失））。しかし、一方で、試験細胞中のコピー数が増加する領域は、試験ＤＮＡからの相対的に高いシグナルを示すであろう（例えば、重複）。コピー数が減少又は増加する部位は、配列の１コピーの欠失又は過剰に限定され、ＣＧＨ法は、通常、約５〜１０メガベース（Ｍｂ）である。
【０００６】
ＣＧＨは、最近、分裂中期の染色体の広がりよりも、個々のゲノム核酸配列を解析するために適応されている。個々の核酸配列が固体担体に配列され、この配列は１以上の染色体又は全ゲノムの全体を表わすことができる。アレイの標的に対する標識核酸のハイブリダイゼーションは、種々の標識、例えば２色の蛍光を用いて検出される。従って、複数の個々の核酸配列を有する、アレイをベースとするＣＧＨは、染色体の広がりよりも更に特異的な情報を得ることを可能とし、潜在的に更に感受性であり、試料の解析を促進する。
【０００７】
例えば、通常のアレイをベースとするＣＧＨにおいては、試験試料及び正常な参照試料の細胞由来の同量の全ゲノム核酸を、異なる２色の蛍光色素で標識し、細胞のゲノムを集合的に包含する、クローニングされた核酸フラグメントを含むＢＡＣのアレイに共ハイブリダイゼーションする。得られた共ハイブリダイゼーションは、蛍光的に標識されたアレイ、配列されたＢＡＣ中の相同的な配列に対する試験ゲノムＤＮＡ及び基準ゲノムＤＮＡ中の配列の競合的ハイブリダイゼーションを反映する呈色を引き起こす。理論的に、試験及び参照ゲノム核酸中の相同的配列のコピー数比は、アレイ中の個々のＢＡＣにおけるそれぞれの着色された蛍光シグナルの比と直接比例するべきである。例えば、分裂中期の染色体の広がりの代わりに固体担体上に固定化された標的核酸を用いる、アレイをベースとするＣＧＨは、米国特許第5,830,645号及び6,562,565号明細書に記載されている。
【０００８】
ハイブリダイゼーション混合物中に、１以上の色又はタイプの核酸を併用した場合、相対的濃度及び／又は標識密度は、種々の目的のために調節される。調節は、適切な検出試薬（アビジン、抗体等）を選択するか、又は他のパラメーターの間の顕微鏡フィルターを設計することよって行われる。定量的画像解析を用いる場合、数学的ノーマライゼーションが、異なる色の染色強度中の一般的な相違について補正するために用いられる。従って、伝統的なＣＧＨにおける参照ゲノム核酸から試験核酸を区別するための異なる標識の使用は、試料の処理、試料の全域における標準化、及び得られた結果の評価を複雑にする、付加的な精製又は調節を伴う。例えば、目視観察、又は結果の写真を用いる場合、個々の色強度は、それらの相対的な強度における、変化の最適な可観測性を調節する必要がある。
【０００９】
後述するように、ＣＧＨを含む、比較ハイブリダイゼーション法における改良が提供される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、比較ハイブリダイゼーション、特に、比較ゲノムハイブリダイゼーション法における異なる標識を用いることの限界（例えば、２種の異なる波長において読まれるべき、異なる蛍光色）を克服することである。従って、核酸アレイにハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の量を比較することによって比較ハイブリダイゼーションを実施する方法であって、前記量が、同一の検出可能な標識で標識された、ハイブリダイズされた核酸からのシグナルを検出することによって決定される方法が提供される。この方法は、一般に、比較ハイブリダイゼーション法に、特にＣＧＨに適用される。従って、試験核酸及び参照核酸がゲノム核酸であるＣＧＨへの言及は、試験核酸及び参照核酸がゲノム核酸以外である方法を含むと理解すべきである。同様に、用いられる標識のタイプは重要ではないことが理解されよう。本明細書に開示される、当該技術分野で公知である、及びまだ発見されてない種々の標識が本発明において用いられ、本発明に開示される発明の実施態様のいずれかにおける単一のタイプの標識（例えば、蛍光標識）への言及は、このような他のタイプの標識を含むと理解すべきである。
【００１１】
好ましい実施態様においては、ＣＧＨは、ゲノム核酸の２種の試料；すなわちゲノム核酸を含む試験試料、及び未知の染色体又はゲノムの異常性を伴うゲノム核酸を含む参照又はコントロール試料を用いて実施される。前記試験試料及び参照試料は、個々の位置における表面（例えばスライドガラス）にスポットされた、複数の核酸又は核酸断片を含む核酸アレイに共ハイブリダイズされる。前記アレイは、特定の公知の遺伝子変異又は病状についての標的核酸マーカーを含むか、又は染色体分析と同様の遺伝子プロフィールを得るための染色体全体（集合的に）、又は完全な染色体対を表わす。これらのアプローチにおいては、検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションの前又はハイブリダイゼーションの後に、試験核酸及び参照核酸に結合させることができる。他のアプローチにおいては、検出可能な標識は、ハイブリダイゼーション前に試験核酸又は参照核酸の一方に結合させ、ハイブリダイゼーション後に試験核酸又は参照核酸の他方に結合させてもよい。検出可能な標識は、リガンド−レセプター相互作用によるか、又は相補的なヌクレオチド配列の間にハイブリダイゼーションすることによる等の共有結合又は非共有結合で結合してもよい。
【００１２】
本発明の中心は、アレイにハイブリダイズする試験核酸及び参照核酸の相対量を決定するために、同一の標識を用いる能力である。本発明は、種々のアプローチによってこの目的を達成する。「減法的な」方法を意味することにおいて、検出可能な標識を、試験核酸及び参照核酸に結合するために用いられる結合は異なり、一方の結合を他の結合と区別して選択的に切断又は除去することを可能とする。第一の工程として、アレイにハイブリダイズした試験試料核酸及び参照試料核酸の両方に結合した標識を表すアレイ上の全ての検出可能なシグナルが、最初に位置的に定量される。次いで、アレイは、ハイブリダイズした試験核酸又は参照核酸のいずれか感受性の結合を有するものから標識が除かれるように、結合の選択的な切断を引き起こす条件又は処理を受ける。次いで、感受性のリンカーと結合していない核酸である残留シグナルが位置的に定量される。次の工程は、２つの読み取りの結果を用いて、感受性の結合によって標識に結合した、ハイブリダイズした核酸の量を定量することを含む。好ましいアプローチにおいては、感受性のリンカーによって標識と結合した核酸を表すシグナルは、選択的除去の後に、全シグナルから残りのシグナルを引くことによって決定される。このように定量された２つの試料からのシグナルは、試験試料核酸と関連する、染色体性又はゲノム異常性を検出するために、試験試料ゲノム核酸及び参照試料ゲノム核酸の間の相違を確認するために用いることができる。
【００１３】
本発明はまた、「付加的」なアプローチと称することができる別のアプローチによって、同一の検出可能な標識を用いた比較ハイブリダイゼーションを達成する。このアプローチによれば、試験試料核酸は、第一のタグを含み、参照試料核酸は第二のタグを含む。ハイブリダイゼーションに続いて、第一の複合体が第一のタグと選択的に結合するように、表面を検出可能な標識及び第一の構成要素を含む第一の複合体と接触させる。次の工程は、アレイの表面に結合した検出可能な標識の位置及び量を決定すること（すなわち、アレイを「読みとる」こと）を含む。一旦、アレイを読み取って、第一のタグを含む核酸と関連する検出可能な標識の量を定量すると、次いで、第二の複合体が第二のタグと選択的に結合するように、表面を、第一の複合体中に存在するものと同一の検出可能な標識を含み、第二の構成要素を含む第二の複合体と接触させる。次いで、アレイを読み取り、表面にハイブリダイズした両方の核酸を表わす全ての検出可能な標識の位置及び量を決定する。最後の工程は、第二のタグと関連する、ハイブリダイズした核酸の量を決定するために、２つの読み取りの結果を用いることを含む。好ましいアプローチにおいては、第一の読み取りを第二の読み取りから引いて、第二のタグと結合している核酸を表わすシグナルを得る。このようにして決定された２つの試料からのシグナルは、試験試料核酸と関連する染色体性又は遺伝的異常性のいずれかを検出するために、試験試料ゲノム核酸及び参照試料ゲノム核酸の間の相違を同定するために用いることができる。
【００１４】
このアプローチの変形においては、第二のタグと関連しているハイブリダイズした核酸の量を、第一の複合体と接触していない、ハイブリダイズしたアレイの複製物を用いて定量することができる。すなわち、複製物アレイは、第二の複合体と接触するが、第一の複合体と接触しない。この第二のアレイ由来のシグナルは、第二のタグを有するハイブリダイズした核酸の量を表わし、第一の複合体とのみ接触し、第一のタグと関連するハイブリダイズした核酸の量を表わす第一のアレイ由来のシグナルの量と比較することができる。２つの分析法は互いに独立的であるため、各アレイは、いずれの順番でも、又は同時に処理されてもよい。
【００１５】
他のアプローチにおいては、試験核酸及び参照核酸の一方が既に標識されており（例えば、ランダムプライミングによって）、アレイを試験核酸及び参照核酸とハイブリダイズさせてもよい。次いで、ハイブリダイゼーション後に、アレイを読み取り、特定の標識化された核酸試料に対応するシグナルを測定する。次いで、アレイを、検出可能な標識及び構成要素を含む複合体と接触させ、ここで、複合体は、試験核酸又は参照核酸の他方と接触したタグによって、試験核酸又は参照核酸の前記他方と選択的に反応する。アッセイを再度読み取り、両方のハイブリダイズした核酸についての全シグナルを測定する。次の工程は、２つの読み取りの結果を用いて、タグと関連する、ハイブリダイズした核酸の量を測定することを含む。好ましいアプローチにおいては、第一の読み取りが、第二の読み取りから引かれ、タグと結合している核酸を表わすシグナルを得る。このようにして定量された２つの試料由来のシグナルは、試験試料核酸と関連する染色体性及び遺伝的異常性を検出するために、試験試料ゲノム核酸及び参照試料ゲノム核酸の相違を確認するために用いることができる。
【００１６】
このアプローチの変形においては、第二のタグと関連するハイブリダイズした核酸の量は、複製物が検出可能な標識を含まない試験核酸及び参照核酸にハイブリダイズすることによって調製されることを除き、ハイブリダイズしたアレイの複製物を用いて定量することができる。このケースにおいては、複製物アレイを、検出可能な標識及び構成要素を含む複合体と接触させ、ここで、前記複合体は、他方の試験核酸又は参照核酸と結合しているタグによって他方の試験核酸又は参照核酸と選択的に反応する。この第二のアレイ由来のシグナルは、第二のタグを有するハイブリダイズした核酸の量を直接表わし、これを、第一の複合体とのみ接触し、第一のタグと関連するハイブリダイズした核酸の量を表わす第一のアレイ由来のシグナル量と比較することができる。２つの分析法は互いに独立的であるため、各アレイは、いずれの順番でも、又は同時に処理されてもよい。
【００１７】
本発明書で用いられるように、「タグ」なる用語は、試料の実質的に全ての個々の核酸断片が、同一のタグによって標識され、精製され、又は捕獲されることのできるような、試料の核酸と直接又は間接的に関連する物理的分子を意味する。前記タグは、リガンド−レセプター、又は相補的配列を有するオリゴヌクレオチド対のような特異的結合対であってもよい。本明細書で言及されるタグ／構成要素相互作用は、リガンド／レセプター結合対、又は相補的配列を有するオリゴヌクレオチド対のような特異的結合対であると理解される。タグ／構成要素の組み合わせは、比較ハイブリダイゼーションにおいて一緒に用いられる他のタグ／構成要素の組み合わせと認め得るほどに相互作用しないように選択すべきである。
【００１８】
好ましい実施態様においては、タグは、アッセイに対して基本的にユニークであるヌクレオチド配列を意味する、ユニークなオリゴヌクレオチド「捕獲配列」を含む。このケースにおいては、反応性構成要素は、核酸断片の１つの試料と関連するユニークなオリゴヌクレオチド捕獲配列と相補的なオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、反応性構成要素の相補的オリゴヌクレオチドはデンドリマーコンストラクト中に存在し、多数の検出可能な標識を提供する。
【００１９】
本明細書において用いる場合、特異的結合対のメンバーは、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−レセプター、レセプター−リガンド、酵素−基質、ＩｇＧ−プロテインＡ等を含む。
【００２０】
本明細書において用いる場合、「核酸」は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び／又はＲＮＡの断片又は一部分を意味する。核酸は、いずれかの起源（例えば、試料ＤＮＡ又はＲＮＡから分離、精製、増幅、クローニング、逆転写）に由来する最初に分離された核酸から由来するか又は得てもよく、又はデノボで合成されてもよい。核酸は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド、及びそれらの断片又は一部分、一本鎖又は二本鎖であり、センス又はアンチセンスストランドを表わす、ゲノム又は合成起源のＤＮＡ又はＲＮＡを含む。
【００２１】
「ゲノム核酸」は、細胞の核由来の一部又は全てのＤＮＡを意味する。いくつかの実施態様においては、ゲノムＤＮＡは、単一の遺伝子の全て又は一部、又は複数の遺伝子由来の配列、１以上の染色体由来の配列、又は細胞の全ての染色体由来の配列を含む。一方、「全てのゲノム核酸」なる用語は、本明細書において、細胞のゲノム中に含まれるＤＮＡの全ての相補体を意味する。よく知られているように、ゲノム核酸は、遺伝子のコード領域、イントロン、５’及び３’の非翻訳領域、５’及び３’フランキングＤＮＡ、及びテロメア及び動原体性ＤＮＡ、複製開始点、及び遺伝子間ＤＮＡ等の構造断片を含む。ゲノム核酸は、細胞の核から得てもよく、組換え的に製造してもよい。ゲノムＤＮＡは、また、細胞核から直接に分離されたＤＮＡ又はＲＮＡから転写されてもよい。また、ＰＣＲ増幅を用いてもよい。種々の試料由来のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを製造する方法は当該技術分野において公知である。
【００２２】
本明細書において用いる場合、「ｃＤＮＡ」は、ＲＮＡから複製されたＤＮＡを意味する。ｍＲＮＡから複製されたｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの種々の非コード配列特性を含まない。
【００２３】
本明細書において用いる場合、「染色体異常性」は、野生型又は正常細胞由来のＤＮＡ配列中の任意の相違を意味する。染色体異常性は、前記生物中の全ての染色体の正常な完全な遺伝的相補体と比較した時に、生物中に含まれる全ての染色体の完全な遺伝的相補体、又はそれらの任意の部分の間の相違を反映するかもしれない。例えば、染色体異常性は、コピー数（例えば、異数性）、又はそれらの一部（例えば、欠失、増幅）、又は染色体構造の変化（例えば、転座、変異）を含むかもしれない。本明細書において用いる場合、「異数体細胞」又は「異数性」は、間期において少なくとも１つの染色体の異常な数を有する細胞を意味する。例えば、正常ヒト細胞は、間期において４６本の染色体の全て、又は各染色体１〜２２の２コピー及び２本の性染色体（ＸＸ又はＸＹ）を含む。異常な染色体コピー数は、染色体１〜２２の２コピーの正常な染色体相補体の２以外のいずれかの数であり、性生殖対Ｘ及びＹの２以外のいずれかの組み合わせである。
【００２４】
本明細書において用いる場合、「遺伝的異常性」は、特定の病状と関連するとして知られている染色体異常性（例えば、病状を直接引き起こす機能障害性タンパク質を引き起こす特定の遺伝的変異）を意味する。染色体性又は遺伝的異常性は遺伝的であり、すなわち世代から世代へ移っていく。
【００２５】
本明細書において用いる場合、「試料」は、基本的に病気の又は健康な、ヒト、動物及び植物、及び細胞培養、組換え細胞、細胞構成成分及び環境要因生物から取得することができる。試料は、例えば、ヒト、犬、猫、ヒツジ、ウシ及びブタ等を含むいずれかの動物由来であってもよいが、これらに限定されない。試料は、生物学的組織、体液又は組織から得られる。試料は、羊水、血液、血液細胞、髄液、細針生検試料、試料、腹水、血漿、胸膜液、唾液、精液、血清、痰、組織又は組織ホモジネート、組織培養培養液、尿等を含むが、これらに限定されない。試料は、また、組織の薄切り、分画、精製、又は細胞小器官の分離などで処理されてもよい。
【００２６】
「試験試料」は、一般には患者又は疑わしい細胞集団由来、又は、染色体又は遺伝的異常性を含む核酸についてスクリーニングされたゲノム核酸を含む。「参照試料」は、一般には正常個体、又は正常な遺伝的プロフィールを有する野生型細胞集団由来のゲノム核酸を含む。「試験試料」は、また、ｃＤＮＡを製造することのできるｍＲＮＡを含む。
【００２７】
試験試料及び参照試料由来のゲノム核酸を、表面の個々の部位において固定化された多数の核酸断片を含む表面と、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる。本明細書において用いる場合、「ハイブリダイゼーション」なる用語は、相補的塩基対の間の水素結合の形成によって二重鎖又はヘテロ二重鎖を形成するための、実質的に相補的なヌクレオチド配列の対形成（核酸のストランド）を意味する。それは特異的であり、すなわち、２つの相補的ポリヌクレオチドの間のランダムでない相互作用である。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸の間の関連性の強度）は、核酸の間の相補性の程度、要求される条件の厳密さ、及び形成されるハイブリッドのＴmに影響される。
【００２８】
試験試料のゲノム核酸は、第一の結合によって検出可能な標識と結合する。参照試料のゲノム核酸は、第二の結合によって同一の検出可能な標識と結合する。
【００２９】
本明細書において用いる場合、「検出可能な標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電磁気的、放射化学的、又は蛍光、化学的蛍光、又は化学発光等の化学的手段によって検出可能なシグナルを生成する任意の部分を意味する。好ましい、検出可能な標識は、フルオレセイン、フィコエリトリン、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、アロフィコシアニン、テキサスレッド、ペリデニンクロロフィル、シアニン、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ等の蛍光色素分子又は蛍光団、フィコエリトリン−Ｃｙ５（登録商標）等のタンデム型の複合体を含む。Ｃｙ３（登録商標）、及びＣｙ５（登録商標）は、一般に２色検出システムにおいて一緒に用いられている。単一標識ＣＨＧにおいては、Ｃｙ３（登録商標）は、Ｃｙ５（登録商標）より好ましい。検出可能な標識は、共有結合的又は非共有結合的に核酸と結合していてもよい。また、検出可能な標識は、リガンド−レセプター結合対配列又は他の特異的認識分子によって、他の核酸との結合を達成する分子を直接標識することによって結合していてもよい。
【００３０】
本明細書において用いる場合、「結合」は、標識が、試料中でゲノム核酸と物理的に関連することを意味する。１つの実施態様においては、第一の結合又は第二の結合のいずれかが選択的な除去に対して感受性である。すなわち、一方の標識の結合が、標識が核酸から分離されることを可能とする切断又は分離に対して感受性であるが、他方はそうではない。結合の対（すなわち、対の一方のリンカーが選択的な除去に対して感受性である差異結合）の具体例は、２個の異なる化学リンカー、２個の異なるオリゴヌクレオチド、又は２個の異なるペプチド配列を含み、化学リンカー、オリゴヌクレオチド又はペプチド配列が、温度、ｐＨ加水分解、照射（例えば、紫外線照射に対するヌクレオチドストレッチ又は化学物質感受性、例えば光分解構成要素）、酸化条件、大気条件（例えば、オゾンに対する暴露）、バッファー条件、外部物質（例えば、制限酵素又はホーミングエンドヌクレアーゼ等の酵素）による加水分解、又は化学分解（例えば、Fidelity System, Inc. Gaithersburg, MDから市販されているような、飽和ＮａＩＯ4水溶液を用いて３０〜４０分間で選択的に切断することのできるジオールを含むリンカー、ジチオスレイトール又は他の適当な還元剤で切断することのできるジスルフィドを含むリンカー）に対する感受性の点で異なる。
【００３１】
「感受性」とは、感受性のある結合を含む核酸と関連している検出可能な標識がその試料の核酸のメンバーの約８０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上から物理的に分離されていることを意味する。除去における欠陥を計算して最終結果に組み込むことができる場合には特に、９５％未満が除去される処理が許容される。他の差異結合には、標識工程における標識と試験試料又は参照試料のいずれかの核酸との、異なる化学結合又は物理的相互作用が含まれる。試料の核酸は、アレイにハイブリダイゼーションする前、又はアレイにハイブリダイゼーションした後に標識することができる。これらの全ての具体例において、感受性のある結合を作成して、ハイブリダイゼーションの最初の読み取りの後、一方の試料の核酸をそのサンプルの核酸と関連する標識が選択的に除去されるようにする。従って、同一の標識を２つの時点で読み取り、(i)アレイにハイブリダイズした、試験核酸及び参照核酸の両方の検出可能な標識からのシグナルを検出し；及び(ii)アレイにハイブリダイズした、処理に対して感受性を有するリンカーによって結合した標識を有する核酸からのシグナルを検出する。これら２つの読み取りの減算は、除去処理に対して耐性である結合によって標識された、ハイブリダイズした核酸を表わす値を与える。
【００３２】
１つのアプローチにおいては、標識は試料又は参照核酸と非共有結合的に関連していてもよく、従って、標識を結合する前に、核酸を最初に標的とハイブリダイズさせることができる。このケースにおいては、第一のユニークなオリゴヌクレオチドを、試験試料核酸又は参照試料核酸のいずれかに結合させることができ、ここで、このオリゴヌクレオチドは、ユニークなハイブリダイゼーション配列、及び当該技術分野で公知であり、例えばFermentas Life Sciences（例えば、I-SceI）から市販されているような、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、又はレアカットエンドヌクレアーゼの認識部位を含む。他方の核酸は、好ましくは、異なるユニークなハイブリダイゼーション配列を含むがこの認識部位を含まない第二のオリゴヌクレオチドに結合している。結合したオリゴヌクレオチドを有する両方の核酸は、一方又は他方のハイブリダイゼーション配列に相補的である、他の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを用いて、別々に検出される。このような検出可能に標識された相補的なオリゴヌクレオチドはデンドリマー複合体であってもよい。この実施態様を用いて、ハイブリダイズされたアレイに両方の標識されたオリゴヌクレオチドを適用した後、次いで、第一のユニークなオリゴヌクレオチド中の認識部位に特異的なエンドヌクレアーゼと接触させることにより、第一のユニークなオリゴヌクレオチドと関連する標識を選択的に除去する。
【００３３】
本明細書において用いる場合、「デンドリマー」は、モノマーと呼ばれている分岐された単位から構築された、人工的に製造された、又は合成された重合体分子である。好ましい実施態様においては、モノマーは、塩基対形成によって結合して組み立てられたＤＮＡ分子である（例えば、米国特許第5,175,270；5,484,904；及び5,487,973号明細書を参照）。他のモノマーは、一級アミン（例えば、米国特許第5,530,092号明細書を参照）、ポリアミドアミン、ポリエチレンイミン、及びポリプロピレンイミン（例えば、米国特許第5,393,797；5,393,795、5,560,929；及び5,387,617号明細書を参照）；ペプチド；及び他の核酸を含むが、これらに限定されない。種々のタグ（例えば、オリゴヌクレオチド）は、デンドリマーポリマーの末端に結合させるか、デンドリマーの内部構造に組み入れてもよい。結合は、共有結合（例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端が、デンドリマーの分岐の末端に共有結合的に結合する）、ならびに非共有的相互作用（例えば、核酸ハイブリダイゼーション配列）を含む。デンドリマーに複数の標識を組み入れることによって、ハイブリダイゼーションシグナル強度は劇的に向上する。
【００３４】
本発明の更なる実施態様によれば、参照試料中の遺伝子発現に対する試験試料中の遺伝子発現を比較する方法が提供される。該方法の最初の工程は、試験試料のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡおよび参照試料のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを、ハイブリダイゼーション条件下で、表面上の個々の位置にそれぞれ固定化した複数の核酸断片を含む表面と接触させることを含む。このケースにおいては、試験試料ｃＤＮＡ及び参照試料ｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションの前又は後に同一の検出可能な標識で標識され、この標識は、第一の結合によって試験試料のｃＤＮＡに、及び第二の結合によって参照試料のｃＤＮＡに結合している。第一の結合又は第二の結合のいずれかが、選択的な除去に感受性を有しており、表面にハイブリダイズした核酸と結合している検出可能な標識が測定される。担体表面にハイブリダイズした核酸に結合した検出可能な標識の位置及び量が測定される。次いで、標識は、ハイブリダイズした試験試料ｃＤＮＡ又はハイブリダイズした参照試料ｃＤＮＡのいずれかから選択的に除去される。次いで、担体上に残存する検出可能な標識の位置及び量が測定され、これは試料の一方を表わす。除去の後に残存する位置及び量と、除去前の位置及び量との相違は、他方の試料を表わす。アレイにハイブリダイズした各試料核酸の相対量は、参照試料と比較した試験試料中の遺伝子の発現を反映する。
【００３５】
「発現アレイ」なる用語は、特定の時点における細胞中に存在するｍＲＮＡの相補体を表すｃＤＮＡ配列の集合を意味する。ｃＤＮＡ発現アレイは、オリゴｄＴプライミング又はヘキソマーを用いるランダムプライミングによって調製することができる。ランダムプライマーオリゴは、５’側に連結可能な末端を有していてもよい。プライミング及び伸張してｃＤＮＡを製造した後、ｃＤＮＡの連結可能な末端を、架橋オリゴによって捕獲配列に連結する。次いで、捕獲配列を有するｃＤＮＡは、固定化された核酸プローブ配列を含む固相にハイブリダイズされる。捕獲配列は、捕獲配列用の単一の標準断片（テールとしても知られる）を有する適当な標識化試薬（例えば、標識されたデンドリマー核酸）を用いて検出される。発現アレイを調製するための例示的な供給品及びプロトコールは、例えばGenisphere, Incの製造業者から入手可能である。
【００３６】
単一標識化された比較ゲノムハイブリダイゼーションについて本明細書で開示された実施態様のいずれも、成人、子供および新生児等の患者の染色体異常性又は遺伝的異常性を検出するために用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
図面の簡単な説明
図１は、本発明の例示的な実施態様を示す。試験ゲノムＤＮＡ断片及び基準ゲノムＤＮＡ断片を、同じ蛍光標識で標識し、ここで、標識は酵素的切断によって、試験ＤＮＡ断片から選択的に除去される。マイクロアレイを標識の選択的除去の前及び後の２つの時点でスキャンする。すなわち、ＣＧＨ比較のため同一の均一な標識の使用を可能とする減法アプローチが提供される。
【００３８】
図２は、本発明の他の例示的な実施態様を示す。試験ゲノムＤＮＡ断片及び基準ゲノムＤＮＡ断片を、同じ蛍光標識で連続的に標識化する。参照ゲノムＤＮＡ断片中への標識の取り込みの後、及び試験ゲノムＤＮＡ断片中への標識の取り込みの後、マイクロアレイを２つの時点でスキャンする。すなわち、ＣＧＨ比較についての同一の均一な標識の使用を可能とする別のアプローチが提供される。
【００３９】
図３は、本発明の他の例示的な実施態様を示す。識別可能なタグ配列で標識された、試験ゲノムＤＮＡ断片及び基準ゲノムＤＮＡ断片（三重ハッシュマーク）を、標識されていない状態で、単一のカバーガラスの下で、アレイの２枚セットに一晩ハイブリダイズさせる。一方のアレイを、試験試料タグに特異的な構成要素を有する標識されたデンドリマーと、別々にハイブリダイズさせる。洗浄及びスキャンニングの後、両方のアレイを、同時に、参照核酸タグに特異的な構成要素を有する第二の標識されたデンドリマーとハイブリダイズさせる。洗浄後、第二のスキャンを得る。２つのスキャンを示されているように用いて、ハイブリダイズした試験ゲノムＤＮＡ及び基準ゲノムＤＮＡの相対量を決定する。すなわち、染色体性又は遺伝的異常性を検出するためのアプローチが提供される。
【００４０】
図４は、本発明の他の例示的な実施態様を示す。識別可能なタグ配列で標識された、試験ゲノムＤＮＡ断片及び基準ゲノムＤＮＡ断片を、標識されていない状態で、単一のカバーガラスの下で、試験核酸に特異的な構成要素を含む標識されたデンドリマーと一緒に、アレイの２枚セットに一晩ハイブリダイズさせる。洗浄及びスキャンニング後、両方のアレイを、参照試料タグに特異的な構成要素を有する標識されたデンドリマーと共ハイブリダイズさせる。アレイを洗浄し、再びスキャンする。２つのスキャンを示されているように用いて、ハイブリダイズした試験ゲノムＤＮＡ及び基準ゲノムＤＮＡの相対量を決定する。すなわち、染色体性又は遺伝的異常性を検出するためのアプローチが提供される。
【００４１】
発明の詳細な説明
本発明によれば、試験試料中の染色体異常性を検出するか、又は個人における遺伝的異常性を診断するための、アレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を実施する方法が提供される。ＣＧＨは、量的変化、例えば、配列又はコピー数の欠失又は過剰が起こっているゲノム中の領域を検出するために用いることのできる、分子細胞遺伝学的アプローチである。ＣＧＨは、癌の解析及び診断、及び出生前診断等の遺伝病の解析及び診断に特に有用である。ＣＧＨ反応は、典型的には、未知の試験試料の遺伝的構成物を、既知の正常な参照試料と比較するために用いられる。
【００４２】
（ゲノム核酸の供給源）
１つの実施態様においては、本発明の方法は試験試料中の染色体異常性を検出するために用いることができる。好ましい実施態様においては、試験試料は患者から得られる。他の好ましい実施態様においては、試験試料は、染色体又は遺伝的異常性と関連する症状又は病状を有すると思われる患者から得られた細胞、組織又は体液を含む。症状又は病状の因果関係、診断又は予後は、遺伝的欠陥、例えば、ゲノム核酸塩基置換、増幅、欠失及び／又は転座と関連する。試験試料は、このような細胞由来の癌細胞又は核を含んでいると思われる。試料は、羊水、生検、血液、血液細胞、骨髄、髄液、糞試料、細針生検試料、腹水、血漿、胸水、唾液、精液、血清、痰、涙、組織又は組織ホモジネート、組織培養液、尿等を含んでいてもよいが、これらに限定されない。試料は、組織の薄切り、分画、精製又は細胞小器官分離等の処理をされてもよい。
【００４３】
細胞、組織又は体液試料の分離方法は当該技術分野で公知であり、吸引、組織切片作成、血液又は他の体液の採取、外科手術又は針生検等を含むが、これらに限定されない。患者由来の試料は、組織学的目的のために採取した凍結切片又はパラフィン切片を含んでもよい。試料はまた、染色体異常性及びコピー数等のモザイクのレベルを検出することが望まれている上清（細胞培養の）、細胞の可溶化液、組織培養由来の細胞から得ることができる。
【００４４】
好ましい実施態様においては、癌細胞を含むと思われる試料がヒト患者から得られる。試料は、静脈穿刺、腰部穿刺、唾液又は尿等の体液試料、組織又は針生検等の公知の技術を用いて患者から得ることができる。癌細胞を含む腫瘍を有すると思われる患者においては、試料は、腫瘍の生検又は外科的検体を含み、例えば、腫瘍生検、細針生検又は切除された腫瘍からの切片を含む。洗浄検体は、生理食塩水で洗浄した興味のある領域、例えば頚部、気管支、膀胱等から調製してもよい。患者試料は、またアルコール検出器を用いて、又は咳又はくしゃみから採取した呼気試料を含んでもよい。生物学的試料は、また、組織及び／又は血液が保存されている細胞又は血液バンクから、又は細胞の培養物等のインビトロ供給源から得てもよい。試料供給源として用いられる細胞の培養を確立するための技術は当業者に周知である。
【００４５】
他の実施態様においては、本発明の方法は、胎児の染色体又は遺伝的異常性を検出するために用いることができる。胎児の出生前診断は、染色体又は遺伝的異常性を有する胎児を保持することの危険性の増大について女性に示すことができる。危険因子は当該技術分野に公知であり、例えば、高齢の母性年齢、出生前スクリーニングにおける異常な母体血清マーカー、以前の子供における染色体異常、身体的異常及び未知の染色体状態、親の染色体異常、及び再発する自然に発生する流産を含む。
【００４６】
本発明の方法は、全てのタイプの胚又は胎児細胞を用いて出生前診断を実施するために用いることができる。胎児細胞は、妊娠している女性、又は胚の試料から得ることができる。従って、胎児細胞は、羊水穿刺、シリンジによって吸引された絨毛膜絨毛、経皮的臍帯血、胎児皮膚生検、四分割〜八分割期の胚由来の割球（着床前）、又は胚盤胞由来の栄養外胚葉試料（着床前又は子宮内洗浄）によって得られた羊水中に存在する。十分量のゲノム核酸を有する体液も用いられる。
【００４７】
本発明の方法は、試験試料から得られるゲノム核酸の第一の集団、及び参照試料から得られるゲノム核酸の第二の集団を利用する。参照試料は、遺伝的異常性を含んでいない、すなわち、全ての染色体の正常な遺伝的相補性を有する個体、細胞培養又は組織培養のいずれかから得られる、本明細書で提供される任意の細胞、組織又は体液であってもよい。
【００４８】
標識とゲノム核酸との結合
試験試料及び参照試料の両方のゲノム核酸は、ハイブリダイゼーションの前又は後のいずれかで、同一の検出可能な標識と結合させる。好ましい実施態様においては、標識は光学的手段によって検出可能であり、最も好ましくは蛍光標識又は蛍光団である。検出可能な標識は、核酸に取り込ませてもよく、結合させてもよく、コンジュゲートさせてもよい。核酸及び検出可能な標識の間の結合は共有結合であっても非共有結合であってもよい。本発明の方法によれば、同一の検出可能な標識を、試験試料のゲノム核酸及び参照試料のゲノム核酸の両方を標識するために用いる。標識は、潜在的な立体障害又は他の有用な又は所望の特性に対する影響を減少するために、種々の長さのスペーサーアームによって結合させることができる。Mansfield, Mol. Cell. Probes 9: 145-156, 1995を参照。
【００４９】
有用な標識は、例えば、蛍光色素（例えば、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光団、テキサスレッド）、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉ、131Ｉ、電子密度の高い試薬（例えば、金）、ＥＬＩＳＡにおいて通常に用いられるような酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、比色分析標識（例えば、金コロイド）、磁気標識（例えば、Dynabeads（登録商標））、ビオチン、ジオキシゲニン、又は抗血清又はモノクローナル抗体が利用できるハプテン及びタンパク質を含む。標識は、検出すべき核酸に直接組み入れてもよく、又は検出すべき核酸にハイブリダイズするか又は結合するプローブ（例えば、オリゴヌクレオチド）又は抗体に結合してもよい。
【００５０】
好ましい実施態様においては、検出可能な標識は蛍光団である。本明細書において用いる場合、「蛍光団」なる用語は、１つの波長において電磁照射の量子を吸収し、それに応じて、異なる、通常はより長い波長において１以上の光子を照射する分子を意味する。適当な蛍光成分は、当該技術分野において公知の以下の蛍光団を含む。
４−アセトアミド−４’−イソチオシアナートスチルベン−２，２’ジスルホン酸
アクリジン及び誘導体：
アクリジン
アクリジンイソチオシアネート
Alexa Fluor（登録商標）350、Alexa Fluor（登録商標）488、Alexa Fluor（登録商標）566、Alexa Fluor（登録商標）555、Alexa Fluor（登録商標）568、Alexa Fluor（登録商標）594、Alexa Fluor（登録商標）647（モレキュラープローブス）
５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）
４−アミノ−Ｎ−〔３−ビニルスルホニル）フェニル〕ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（Lucifer Yellow VS）
Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド
アントラニルアミド
Black Hole Quencher（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））色素（biosearch Technologies）
BODIPY（登録商標）R-6G、BOPIPY（登録商標）530/550、BODIPY（登録商標）FL
ブリリアントイエロー
クマリン及び誘導体
クマリン
７−アミノ−４−メチルクマリン（AMC、クマリン１２０）
７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）
Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３，５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５，５（登録商標）
シアノシン
４’６−ジアミニジド−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）
５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）
７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナートフェニル）−４−メチルクマリン
ジエチレントリアミンペンタアセテート
４，４’−ジイソチオシアナートジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸
４，４’−ジイソチオシアナートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸
５−〔ジメチルアミノ〕ナフタレン−１−スルホニルクロライド（ＤＮＳ、ダンシルクロライド）
４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）
４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）
Eclipse（登録商標）（Epoch Biosciences Inc.）
エオシン及び誘導体：
エオシン
エオシンイソチオシアネート
エリトロシン及び誘導体：
エリトロシンＢ
エリトロシンイソチオシアネート
エチジウム
フルオレセイン及び誘導体：
５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）
５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）
２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）
フルオレセイン
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）
ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）
ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）
テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）
フルオレスカミン
ＩＲ１４４
ＩＲ１４４６
マラカイトグリーンイソチオシアネート
４−メチルウンベリフェロン
オルトクレゾールフタレイン
ニトロチロシン
パラロザニリン
フェノールレッド
Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン
ｏ−フタルジアルデヒド
オレゴングリーン（登録商標）
プロピジウムヨーダイド
ピレン及び誘導体
ピレン
ピレンブチレート
スクシニミジル１−ピレンブチレート
ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５（モレキュラープローブス）
リアクティブレッド４（Cibacron（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−４）
ローダミン及び誘導体
６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）
６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）
リザミンローダミンＢスルホニルクロライド
ローダミン（Ｒｈｏｄ）
ローダミンＢ
ローダミン１２３
ローダミングリーン
ローダミンＸイソチオシアネート
スルホローダミンＢ
スルホローダミン１０１
スルホローダミン１０１のスルホニルクロライド誘導体（テキサスレッド）
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）
テトラメチルローダミン
テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）
リボフラビン
ロゾール酸
テルビウムキレート誘導体
【００５１】
他の蛍光性ヌクレオチド類似体を用いることができる。例えば、Jameson, Meth. Enzymol.278; 363-390,1997、Zhu, Nucl. Acids Res. 22: 3418-3422, 1994を参照。米国特許第5,652,099及び6,268,132号明細書は、また核酸、例えばＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチドに組み入れるための、酵素的又は化学合成によって蛍光性オリゴヌクレオチドを製造させるヌクレオシド類似体を開示している。米国特許第5,135,717号明細書は、蛍光性標識として用いられるフタロシアニン及びテトラベンズトリアザポルフィリン試薬を開示している。
【００５２】
検出可能な標識は、共有結合又は非共有結合手段、例えば、当該技術分野において公知のクレノウポリメラーゼを用いたランダム−プライマー標識等の転写、ニックトランスレーション、又は増幅、又は等価等によって核酸に組み入れることができる。例えば、１つの実施態様においては、ヌクレオシド塩基は、Ｃｙ３（登録商標）又はＣｙ５（登録商標）等の蛍光色素等の検出可能な部分に結合し、次いで、ゲノム核酸に組み入れられる。核酸は、標識されていないｄＣＴＰと混合して、Ｃｙｓ３（登録商標）又はＣｙ５（登録商標）−ｄＣＴＰに組み入れることができる。
【００５３】
他の実施態様においては、核酸を標識するためにＰＣＲ又はニックトランスレーションを用いた場合、蛍光色素又はハプテン（ビオチン又はジゴキシゲニン）のスクシニミジル−エステル誘導体にアリルアミン−ｄＵＴＰをカップリングすることによって合成された修飾されたヌクレオチドを用いることができる。この方法は、最も一般的な蛍光ヌクレオチドの慣習的な調製を可能とする。例えば、Henegariu, Nat. Biotechnol. 18:345-348, 2000を参照。
【００５４】
標識の他の非共有結合的組み入れは、当該技術分野において公知の他の方法を用いて達成することができる。例えば、白金属が、グアノシンのＮ７位に結合することによって、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はヌクレオチドと共配位的結合を形成するKreatech Biotechnology's Universal Linkage System（登録商標）（ＵＬＳ（登録商標））は、非酵素的標識技術を提供する。この技術は、また、アミノ酸の側鎖を含む窒素及び硫黄に結合することによってタンパク質を標識するために用いられる。例えば、米国特許第5,580,990、5,714,327及び5,985,566号明細書、及び欧州特許第0539466号を参照。従って、このシステムは、核酸集団のメンバーに検出可能な標識を、核酸、又はそれが結合するペプチド分子に直接に、又は、相補的な核酸分子又はそのパートナー分子に、間接的に結合する方法を提供する。
【００５５】
また、検出可能な標識を用いた標識は、核酸、例えば、オリゴヌクレオチド、又は「分子指標」又は「アプタマー指標」としてのステムループ構造の形態における核酸等の他の生物学的分子に結合した核酸を含み得る。検出可能な部分としての分子指標は当該技術分野において公知である。例えば、Sokol (Proc. Natl.Acad. Sci. USA 95: 11538-11543, 1998)は、５’及び３’末端に、適合した蛍光供与体及び受容体発色団を有する「分子指標」レセプターオリゴデオキシヌクレオチドを合成した。相補的核酸ストランドがないと、分子指標は、蛍光共鳴エネルギー移動がシグナル放出を起こらないようにするステムループ構造を残存する。相補的配列を用いたハイブリダイゼーションにおいて、ステムループ構造は、供与体及び受容体の間の物理的距離を増大させ、その結果、蛍光共鳴エネルギー移動を減少させ、指標が適当な波長の光によって励起された時に検出可能なシグナルが放出することを可能とする。例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチドを形成する、Ｇが豊富な１８量体三重らせんが開示されている、Antony (Biochemistry 40: 9387-9395, 2001)を参照。また、米国特許第6,277,581及び6,235,504号明細書を参照。
【００５６】
アプタマー指標は分子指標と同じである。例えば、Hamaguchi, Anal. Biochem. 294: 126-131, 2001; Poddar, Mol. Cell. Probes 15: 161-167, 2000; Kaboev, Nucl. Acids Res. 28: E94, 2000を参照。アプタマー指標は、２以上の構造をとることができ、そのうちの１つがリガンド結合を可能とする。蛍光−消光対が、リガンド結合によって誘導された構造中の変化を報告するために用いられる。例えば、Yamamoto, Genes Cells 5:389-396, 2000; Smimov, Biochemistry 39: 1462-1468, 2000を参照。
【００５７】
好ましい実施態様においては、ゲノム核酸は、オリゴヌクレオチド結合を用いて標識される。ゲノム核酸は、最初に、制限酵素（例えば、ＡｌｕＩ）を用いて断片に消化される。次いで、断片を架橋オリゴヌクレオチドを用いて、ユニークな捕獲配列と結合する。適切に消化された場合、ユニークな断片は、共有結合を得るために用いられることができるように、直接核酸の末端に隣接して配置される。次いで、各断片は、各断片と結合するユニークな捕獲配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むデンドリマーコンストラクトによって標識することができる。核酸の２以上の試料の断片は、各試料と結合するユニークな捕獲配列によって標識することができる。特に好ましい実施態様においては、検出可能な標識の複数のコピーがデンドリマーに結合し、シグナルの増幅を達成する。好ましくは、本発明の方法におけるデンドリマーの使用は、１０、２０、５０、１００又は２００以上の蛍光団分子がゲノム核酸に結合することを可能とする。断片の標識は、２以上の核酸試料のハイブリダイゼーション前であることができ、又はシグナル強度を最大にするために、好ましくはハイブリダイゼーション後であることができる。
【００５８】
また、ゲノム核酸はペプチドによって標識されてもよい。ペプチドは、第二のレポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、第二の抗体についての結合部位、転写性活性化因子ポリペプチド、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される、所定のポリペプチドエピトープに組み入れることによって検出可能とされ得る。標識は、また、第一のペプチドと相互作用する第二のペプチド（上述したようなデンドリマーコンストラクト）によって結合してもよい（例えば、Ｓ−Ｓ結合）。
【００５９】
他の実施態様においては、ゲノム核酸は、ペプチド核酸によって標識してもよい。本明細書において用いる場合、「ペプチド核酸（又はＰＮＡ）」なる用語は、天然の核酸に見られるような、塩基又は塩基類似体を含む分子であるが、核酸の通常の糖−リン酸骨格よりも、ペプチド骨格と結合する分子を意味する。ペプチドに対する塩基の結合は、例えば、オリゴヌクレオチドと同様の方法で、核酸の相補的塩基により塩基と塩基対を可能とすることである。これらの小分子は、また、抗遺伝子試薬を設計し、核酸の相補的ストランドへの結合によって転写伸長を停止する（Nielsenら、Anticancer Drug Des. 8: 53 63 1993）。
【００６０】
シグナル強度を最大にするために、ハイブリダイゼーションの前又は好ましくは後に、間接的な標識を実施してもよい。好ましい実施態様においては、ハイブリダイズした表面を、検出可能な標識及び第一の構成要素を含む第一の複合体（第一の複合体は、試験試料又は参照試料のいずれかの核酸と選択的に反応する）と接触させ、同時又は後に、同じ検出可能な標識及び第二の構成要素を含む第二の複合体（第二の複合体は、他の試料の核酸と選択的に反応する）と接触させる。１つの実施態様においては、第一の複合体又は第二の複合体は、一方の試料が検出可能な標識から選択的に除去されるように、検出可能な標識の異なる結合を含んでいてもよい（すなわち、減法的アプローチ）。また、他の実施態様においては、第一の複合体及び第二の複合体は、検出可能な標識の異なる結合を含まないが、代わりに、一方を加え、次に他方を加える（すなわち、付加的アプローチ）。
【００６１】
特定の実施態様においては、単離された、又は精製された分子が好ましい。本明細書において用いる場合、「単離された」、「精製された」又は「実質的に精製された」なる用語は、それらの自然環境から取り除かれ、単離され、又は分離されて、それらが自然に結合する他の成分から、少なくとも６０％フリー、好ましくは７５％フリー、最も好ましくは９０％フリーである、核酸又はアミノ酸配列のいずれかの分子を意味する。従って、単離された分子は、実質的に精製された分子である。
【００６２】
ハイブリダイゼーション
本発明の方法は、比較ゲノムハイブリダイゼーションを実施するための全ての公知の方法及び手段、及びそれらの変形を組み入れることができる。例えば、米国特許第6,197,501号；6,159,685号；5,976,790号；5,965,362号；5,856,097号；5,830,645号；5,721,098号；5,665,549号；5,635,351号明細書；Diago, Am. J. Pathol. 158: 1623-1631, 2001; Theillet, Bull. Cancer 88: 261-268, 2001; Werner Pharmacogenomics 2: 25-26, 2001; Jain, Pharmacogenomics 1: 289-307, 2000を参照。
【００６３】
一般に、核酸のハイブリダイゼーションは以下の工程を含む：（１）標的核酸の固定化；（２）標的ＤＮＡの接近性を増大し、非特異的結合を減少するためのプレハイブリダイゼーション処理；（３）個体表面上の核酸への核酸混合物のハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイゼーション中の結合しない核酸断片を除去するためのポストハイブリダイゼーション洗浄；（５）ハイブリダイゼーション核酸断片の検出。間接的な検出を用いる場合、標識された試薬（例えば、デンドリマー）を用いたハイブリダイゼーションの付加的工程及び洗浄が必要である。これらの工程において用いられる試薬及び用いられるそれらの条件は、特定の応用に依存して変化する。
【００６４】
いくつかの適用において、反復配列のハイブリダイゼーション能力を遮断する必要がある。反復配列のハイブリダイゼーション能力を除去し、及び／又は無能にするための多くの方法が知られている（例えば、WO 93/18186を参照）。例えば、大量製法（bulk procedures）を用いることができる。ヒトゲノムを含む多くのゲノムにおいて、共有反復ＤＮＡの大部分は、Alu等の高度反復配列のいくつかのファミリー中に含まれる。これらの方法は、相補的配列のハイブリダイゼーション速度が、それらの濃度の上昇につれて上昇するという事実を利用する。従って、通常高濃度で存在する反復配列は、ハイブリダイゼーション条件の下で、以下の変性する他のものよりも、急速に二本鎖になるだろう。次いで、二本鎖核酸は除去され、残部がハイブリダイゼーションに用いられる。二本鎖配列から一本鎖を分離する方法は、ヒドロキシアパタイト、又は固相担体に結合した固定化相補的核酸を用いることを含む。また、部分的にハイブリダイズした混合物を用いることができ、二本鎖配列は標的にハイブリダイズすることができないだろう。
【００６５】
ハイブリダイゼーション能力が阻害される配列に対して相補的である、標識されていない配列を、ハイブリダイゼーション混合物に加えることができる。この方法は、反復配列及び他の配列のハイブリダイゼーションを阻害するために用いられる。例えば、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡは、試料中の反復配列のハイブリダイゼーションを選択的に阻害するために用いられる。Ｃｏｔ−１  ＤＮＡを調製するために、ＤＮＡを抽出し、切断し、変性し、再生する。高度反復配列は急速にリアニールするので、得られるハイブリッドは、これらの配列について非常に豊富である。残存する一本鎖は、Ｓ１ヌクレアーゼで消化され、二本鎖Ｃｏｔ−１  ＤＮＡが精製され、試料中の反復配列のハイブリダイゼーションを遮断するために用いられる。Ｃｏｔ−１  ＤＮＡは上述のように調製することができるが、商業的に得ることもできる（ＢＲＬ）。
【００６６】
本発明の方法における核酸のためのハイブリダイゼーション条件は当該技術分野で周知である。ハイブリダイゼーション条件は、高度、中程度又は低度のストリンジェンシーの条件であることができる。理想的には、核酸は、試料中の相補的な核酸とのみハイブリダイズし、他の非相補的な核酸とはハイブリダイズしない。当該技術分野で公知なように、ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーの程度を変えてバックグラウンドのシグナルを減少するために、ハイブリダイゼーション条件を変化させることができる。例えば、ハイブリダイゼーション条件が高度なストリンジェント条件である場合、核酸は、非常に高度の相補性を有する核酸標的配列とのみ結合するだろう。低度のストリンジェントな条件は、ある程度の配列の相違を有する配列のハイブリダイゼーションを可能とするだろう。ハイブリダイゼーション条件は、生物学的試料、及び核酸のタイプ及び配列に依存して変化するだろう。当業者は、本発明の方法を実施するためのハイブリダイゼーション条件を最適化する方法を知っているだろう。
【００６７】
本明細書において用いる場合、「ストリンジェンシー」なる用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる温度、イオン強度の条件、及び他の化合物の存在に関して用いられる。高度なストリンジェント条件を用いると、高頻度の相補的な塩基配列を有する十分に長い断片を有する核酸の間にのみ、核酸の塩基対形成が生じるだろう。
【００６８】
例示的なハイブリダイゼーション条件は以下の通りである。高度なストリンジェント条件は、一般に、６５℃で０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみハイブリダイゼーションを可能とする条件を意味する。例えば、高度なストリンジェントな条件は、４２℃で、５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＣ（生理的クエン酸ナトリウム）、０．２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中におけるハイブリダイゼーション、それに続く、６５℃での０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中での洗浄によって供給される。中程度のストリンジェントな条件は、４２℃で、５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中におけるハイブリダイゼーション、それに続く、６５℃での０．２×ＳＳＣ及び０．２％ＳＤＳ中での洗浄と等しい条件を意味する。低度なストリンジェントな条件は、１０％ホルムアミド、５×デンハート液、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中におけるハイブリダイゼーション、それに続く、５０℃での１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中での洗浄と等しい条件を意味する。
【００６９】
本明細書において用いる場合、「相補的」又は「相補性」なる用語は、塩基対形成規則に関連するポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチド又は標的核酸等のヌクレオチドの配列）に関して用いられる。本明細書で用いられるような核酸の相補体は、１つの配列の５’末端が他方の３’末端と対を形成するような核酸配列に配列した時、オリゴヌクレオチドは「逆平行結合」であることを意味する。例えば、配列“5'-A-G-T-3'”は、配列“3'-T-C-A-5”と相補的である。天然の核酸に通常に見られない特定の塩基が、本発明の核酸中に含まれるかもしれず、例えば、イノシン及び７−デアザグアニンを含む。相補性は完全である必要はなく、安定な二本鎖は、ミスマッチな塩基対又は不適合な塩基を含んでいてもよい。核酸技術における当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの組成及び配列、ミスマッチ塩基対のイオン強度及び頻度を含む多くの変数を考慮して経験的に二本鎖の安定性を決定することができる。
【００７０】
相補性は、核酸塩基のいくつかのみが塩基対規則に従って適合する「部分的」なものであってもよい。また、核酸の間に「完全な」又は「全ての」相補性があってもよい。核酸ストランド間の相補性の程度は、核酸ストランド間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しく影響される。これは、増幅反応ならびに核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。いずれの用語も、特にポリヌクレオチドの文脈では、個々のヌクレオチドに関しても用いることができる。例えば、オリゴヌクレオチド中の特定のヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの残りの部分と核酸ストランドとの間の相補性との対照又は比較において、他の核酸ストランド中のヌクレオチドに対する相補性又はその欠如について記述することができる。
【００７１】
「相同性」及び「相同的な」なる用語は、配列間の同一性の程度を意味する。部分的な相同性又は完全な相同性があってもよい。部分的に相同的な配列は、他の配列と１００％に満たない同一性のものである。好ましくは、相同的な配列は、全体的に見て、少なくとも７０％又は少なくとも７５％、更に好ましくは少なくとも８０％又は少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する。
【００７２】
本明細書において用いる場合、「Ｔｍ」なる用語は、「融解温度」に関して用いられる。融解温度は、二本鎖核酸分子の試料が、一本鎖に半分解離する温度である。核酸のＴｍを計算するためのいくつかの式は当該技術分野で周知である。標準的な参考文献に示されるように、Ｔｍ値の簡単な推定値は、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌの水溶液中にある時、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって計算することができる（例えば、Anderson及びYoung, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization, 1985を参照）。他の参考文献（例えば、Allawi及びSantaLucia, Biochemistry 36: 10581-94, 1997）は、Ｔｍの計算のために、構造及び環境ならびに配列特性を考慮する複雑な計算を含む。
【００７３】
アレイ
本発明の方法において用いられる核酸は、アレイ又は「バイオチップ」に固定化又は塗布され得る。本発明で用いられるように、「アレイ」又は「マイクロアレイ」又は「バイオチップ」又は「チップ」は、基板表面の限定された領域上に配列された複数の成分を意味する。本発明の方法の実施において、例えば、米国特許第6,277,628；6,277,489；6,261,776；6,258,606；6,054,270；6,048,695；6,045,996；6,022,963；6,013,440；5,965,452；5,959,098；5,856,174；5,830,645；5,770,456；5,632,957；5,556,752；5,143,854；5,807,522；5,800,992；5,744,305;5,700,637；5,556,752：5,434,049；等に開示されたような、任意の公知のアレイ及び／又はアレイの製造及び使用方法が、全て又は一部、又はそれらの変形が組み入れられる。また、例えば、WO99/51773；WO99/09217；WO97/46313；WO96/17958を参照。また、例えば、Johnston, Curr. Biol. 8:R171-R174, 1998; Schummer, Biotechniques 23: 1087-1092, 1997; Kern, Biotechniques 23:120-124, 1997; Solinas-Toldo, Genes, Chromosomes & Cancer 20: 399-407, 1997; Bowtell, Nature Genetics Supp. 21: 25-32, 1999を参照。また、公開された、米国特許出願20010018642号；20010019827号；20010016322号；20010014449号；20010014448号；20010012537号；20010008765号を参照。
【００７４】
アレイは、一般的には、複数の「標的要素」又は「スポット」であり、各標的要素は、基板表面上の個々の位置に固定化された、所定量の１以上の生物学的分子、例えば、ポリペプチド、核酸分子、又はプローブを含む。好ましい実施態様においては、複数のスポットは、表面上の、好ましくは少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約３００又は少なくとも約５００の別々の位置に固定化された核酸断片を含む。大部分は、例えば、二重のスポット、三重のスポット、四重のスポット、五重のスポットを製造するための同一の核酸断片の多重反復を含んでいてもよい。
【００７５】
アレイに基づくＣＧＨの解像度は、主として、全体のゲノムに広がり得るアレイ中の核酸の数、サイズ及び地図上の位置に依存する。固定されるべき興味あるそれぞれの核酸は、核酸の大きい挿入物に組み入れられ得る、核酸ベクター（例えば、プラスミド、コスミド等）、又は当該技術分野で公知であるような、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ−１由来人工染色体等の人工染色体中に含まれてもよい。通常、平均約１５０キロベースのクローニングされたゲノムＤＮＡを供給することができる、細菌性人工染色体、又はＢＡＣが、アレイの製造において用いられる。好ましくは、興味ある、各核酸断片は、約１，０００（１ｋＢ）〜約１，０００，０００（１ＭＢ）ヌクレオチド長であり、更に好ましくは約１００，０００（１００ｋＢ）〜３００，０００（ＫＢ）ヌクレオチド長である。興味ある核酸断片は、染色体に沿って約３〜４メガベース（ＭＢ）間隔（すなわち、染色体性配列の断片を含む）で、更に好ましくは染色体に沿って約２〜３メガメース間隔で、最も好ましくは染色体に沿って約１〜２メガベース間隔で、少なくとも１つの染色体の配列に広がるように（すなわち、集団的に表現）選択される。全体のゲノムの相補体を表わすために、核酸断片は、このような間隔で全ての染色体に広がるように選択されてもよい。また、興味ある、選択されたゲノム領域、例えば、公知の変異ホットスポットは、１以上の染色体から選択されてもよい。このような、興味あるゲノム領域は、染色体異常性、隣接遺伝子異常性、遺伝的に関係のある疾患又は症候群と関連する核酸断片であってもよい。
【００７６】
通常、固定化された核酸分子は、試料とアレイとの間の特異的結合、例えばハイブリダイゼーションのために試料と接触させる。固定化された核酸断片は、実質的に全て、又は、ヒトゲノムを含む、染色体又は実質的に全てのゲノムの小区分を含む、特異的なメッセージ（例えば、ｃＤＮＡライブラリー）または遺伝子（例えば、ゲノムライブラリー）からの配列を含むことができる。他の標的要素は、陽性及び陰性コントロール等の参照配列を含むことができる。アレイの標的要素は、異なるサイズ及び異なる密度で、基板表面に配列されていてもよい。アレイの異なる標的要素は、同一の分子種を有するが、量、密度、サイズ、標識又は非標識等は異なる。標的要素のサイズ及び密度は、標識（固定化された分子も、標識され得る）の性質、基板担体（固体、半固体、繊維、毛細管又は多孔性）等の因子の多くの因子に依存するだろう。
【００７７】
各標的要素は、実質的に、同一の核酸配列、又は種々の長さの核酸及び／又は配列の混合物を含んでいてもよい。従って、例えば、標的要素は、ＤＮＡのクローニング断片の２以上のコピーを含み、各コピーは、本明細書で開示されたように、種々の長さの断片に切断される。アレイの表面に固定された核酸の長さ及び複雑さは、本発明にとって重大ではない。アレイは、任意の基板、例えば、固体表面（例えばニトロセルロース、ガラス、石英、石英ガラス、プラスチック等）に固定化された核酸を含む。例えば、蛍光が測定される場合、シクロオレフィンポリマーを含む、複数のウェルを有する基板を開示する、米国特許第6,063,338号明細書を参照。本発明の方法におけて用いられるアレイは、ハイブリダイゼーション及び洗浄反応の間、湿度及び温度を制御するための構成成分を含む筐体を含むことができる。
【００７８】
本発明のＣＧＨ法は、任意のタイプのアレイを用いて実施することができる。市販されているＣＧＨアレイ、又は調製されたアレイプリンティング用スライドは、例えば、
Affymetrix, Santa Clara CalifからのGeneChip（登録商標）；Spectral Chip（登録商標）マウスＢＡＣアレイ及びSpectral Chip（登録商標）ヒトＢＡＣアレイ及びSpectral Genomics, Houston, Tex由来の他の特別注文のＢＡＣアレイ；Amersham Bioscience（GE Healthcare）からのcodelink（登録商標）Human Bioarrays；及びDow Corning, Elizabethtown, KentuckyからのUltraGap（登録商標）。製造業者の提案するプロトコールに従って用いられるUltraGap（登録商標）が好ましい。
【００７９】
好ましい実施態様においては、表面は、BAC Resouce Consortiumによって編集される細菌性人工染色体（ＢＡＣ）の概要中で提供される、１、数個、又は全てのヒトゲノム核酸断片を含むアレイを含有し、当該技術分野でＲＰＩ又はＣＴＢクローン名によって呼ばれている。Cheungら、Nature 409: 953-958, 2001を参照。この概要は、ヒトゲノムのドラフト配列上に、７，６００個の細胞遺伝学的に定義された標識を含んでいる（McPhersonら、Nature, 409: 934-41, 2001）。これらの標識は、生体内ハイブリダイゼーションにおける蛍光による染色体バンドに位置する長い挿入クローンであり、それぞれは、ゲノム配列上に位置する配列タグを含む。これらのクローンは、約１Ｍｂ解像度中の２４人全てのヒト染色体を表わす。ＢＡＣゲノムコレクションの起源は、ＢＡＰＡＣリソールセンター（ＣＨＯＲＩ−小児病院オークランドリサーチセンター）、リスゲン（ResGen、インビトロジェンを通じたリサーチジェネティクス）及びサンガーセンター（ＵＫ）を含む。
【００８０】
種々の固体表面に核酸を固定化する多くの方法は当該技術分野において公知である。例えば、固体表面は、薄膜、ガラス、プラスチック又はビーズであってもよい。所望の成分は、非特異的結合によって結合した、共有結合又は非共有結合であってもよい。固体表面上への核酸の固定化は下記で更に完全に議論する。
【００８１】
多種多様の有機及び無機ポリマー、及び天然及び合成の他の材料が、固体表面のための材料として用いられる。具体例の固体表面は、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ジアゾ化膜（紙又はナイロン）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース及び酢酸セルロースを含む。更に、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等のプラスチックを用いることができる。用いることのできる、他の材料は、紙、セラミック、金属、半金属、半導体材料、サーメット等を含む。更に、ゲルを形成する基板を用いることができる。このような材料は、タンパク質（例えば、ゼラチン）、リポ多糖、ケイ酸塩、アガロース及びポリアクリルアミドを含む。固体表面が多孔質である場合、システムの性質に依存し、種々のポアサイズが、使用可能である。
【００８２】
アレイプリンティングのための固体表面の製造において、種々の性質を得るため、特に積層板として複数の異なる材料を用いてもよい。非特異的結合を回避し、共有結合を簡素化し、シグナル検出を向上するために、例えば、タンパク質（たとえば、ウシ血清アルブミン）又は巨大分子の混合物（たとえば、デンハート液）を用いることができる。
【００８３】
化合物及び表面の間の共有結合が望ましい場合、表面は多機能であるか、又は多機能化することができる。表面に存在し、結合のために用いられる官能基は、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基等を含む。種々の表面に対する多種多様の化合物の結合方法は、公知であり、参考文献に十分に例示されている。例えば、分子に種々の官能基を導入することによって、核酸を固定化する方法は公知である（例えば、Bischoffら、Anal. Biochem. 164: 336-344, 1987; Kremskyら、Nucl. Acids Res. 15: 2891-2910, 1987を参照）。修飾されたヌクレオチドを含むＰＣＲプライマーを用いて、又は修飾されたヌクレオチドを用いた酵素的末端標識によって、修飾されたヌクレオチドを標的の上に配置することができる。
【００８４】
別の表面は、化学的にコーティングされたスライドガラス等の、誘導体化された表面を含む。具体例は、Amersham BiosciencesからのCodeLink（登録商標）活性化スライドである。これらのスライドは、反応を示し、マイクロアレイのアミン修飾ＤＮＡを共有的に固定化する、アミン反応性基を含む長鎖親水性ポリマーからなる、新規な３−Ｄ界面化学でコーティングされている。このポリマーは、それ自身に、及びスライドの表面に共有的に架橋しており、ハイブリダイゼーションを向上するために、スライドの表面から離れて固定されたＤＮＡを正しい方向に置くように設計されている。このような３Ｄスライドの他のものは、Dow Corningにより販売されているUltraGap（登録商標）である。
【００８５】
相対的に高い要素密度（例えば、３０〜４０／ｃｍ2まで）で標的を配列させる、手動及びロボットによる方法を用いる、よく開発された技術のため、本発明の核酸アレイのための膜担体（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ポリプロピレン）を使用することは有利である。更に、このような膜は一般に入手可能であり、膜へのハイブリダイゼーションのためのプロトコール及び装置は周知である。しかし、ハイブリダイゼーションを検出するために蛍光標識が用いられる時、多くの膜材料がかなりの蛍光を照射する。
【００８６】
与えられたアッセイ形式を最適化するため、当業者は、膜タイプ、蛍光団、励起及び照射バンド、スポットサイズ等の種々の組み合わせについて蛍光検出の感度を決定することができる。更に、低い蛍光のバックグラウンドの膜が開示されている（たとえば、Chuら、Electrophoresis 13: 105-114, 1992を参照）。
【００８７】
候補の膜上の種々の直径のスポットの検出のための感度は、例えば、蛍光的に末端標識されたＤＮＡ断片の希釈の連続をスポットすることにより容易に決定することができる。次いで、これらのスポットを、従来の蛍光顕微鏡を用いて映す。従って、蛍光団及び膜の種々の組み合わせから達成することのできる、感度、直線性及びダイナミックレンジを決定することができる。また、既知の相対的割合の蛍光団の対の連続的希釈を分析して、蛍光比率の測定値が検出器及び膜蛍光により許容されるダイナミックレンジにわたって実際の蛍光団の比を反映する精度を決定することができる。
【００８８】
ガラス、石英又は小さいビーズ等の、膜よりも非常に低い蛍光を有する基板上のアレイは、非常によい感度を達成することができる。例えば、約１ｍｍ直径から約１μｍまでの範囲の種々のサイズの要素を、これらの材料として用いることができる。少量の濃縮された標的ＤＮＡを含む、小さいアレイメンバーは、それぞれの要素に結合するために利用できるプローブの全量に限界があるので、複雑度の高い比較ハイブリダイゼーションのために都合よく用いられる。従って、得られるシグナルが非常に局在化され、かつ鮮やかになるように、少量の濃縮された標的ＤＮＡを含む、小さいアレイメンバーを有することが有利である。このような小さいアレイメンバーは、通常は、１０4／ｃｍ2以上の密度でアレイ中で用いられる。１ｃｍ2の領域の蛍光画像を定量することができる、相対的に簡単なアプローチは、簡単な画像中の多くのメンバーからのデータの獲得を可能にすることが開示されている（例えば、Wittrupら、Cytometry 16:206-213, 1994）。
【００８９】
ガラス又は合成石英ガラスに対する標的核酸の共有結合は、多くの公知の技術に従って達成することができる。このような基板は、非常に低い蛍光基板、及び非常に効率的なハイブリダイゼーション環境を与える。
【００９０】
市販されている試薬を使用するガラスに核酸を結合させるための、多くの可能なアプローチがある。例えば、多くの官能基を有するシラン処理されたガラスを製造するための材料は、商業的に入手可能であるか、標準技術を用いて製造することができる。また、ガラスよりも少なくとも１０倍低い自己蛍光を有する、スリップを覆う石英はシラン処理され得る。
【００９１】
また、標的は、市販されている、コーティングされたビーズ又は他の表面に固定することができる。例えば、ビオチン末端標識核酸は、市販されているアビジンコーティングビーズと結合することができる。また、ストレプトアビジン又は抗−ジゴキシゲニン抗体は、例えば、プロテインＡの以下の標準プロトコール（例えば、Smithら、Science 258: 1122-1126, 1992を参照）を用いて、タンパク質が媒介するカップリングによってシラン処理されたスライドガラスと結合することができる。ビオチン又はジゴキシゲニン末端標識核酸は、標準技術に従って製造することができる。
【００９２】
ビーズに結合した核酸に対するハイブリダイゼーションは、それらをハイブリダイゼーション混合物に懸濁し、次いで、洗浄後、それらを、解析のためにガラス基板上に蒸着すさせることによって達成することができる。また、アビジンでコーティングされているか、されていない酸化第二鉄粒子等の常磁性粒子を用いることができる。
【００９３】
アレイに基づくＣＧＨの解釈
１以上の標的核酸断片に対して、試料をハイブリダイズすることにより、試験試料及び参照試料中の特定の核酸配列のコピー数を比較する。各試料と関連する検出可能な標識によって製造された、ハイブリダイゼーションシグナル強度及び強度の比を決定する。一般的には、標的核酸断片上のシグナル強度比が大きければ大きいほど、要素を結合した２個の試料中の配列のコピー数比が大きくなる。従って、標的核酸断片の間のシグナル強度比の比較は、２個の試料のゲノム核酸中の異なる配列のコピー数比の比較を可能にする。
【００９４】
蛍光色素を有する標識核酸に加え、本発明は、試料の核酸を結合した検出可能な標識を検出するための任意の装置又は方法を用いて実施することができ、試料核酸の個々のメンバー、又は核酸断片を固定化したアレイ、又は核酸を検出するための任意の装置又は方法は、相互に特にハイブリダイズする。複数の蛍光団の検出のための装置及び方法は当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第5,539,517；6,049,380；6,054,279：6,055,325；及び6,294,331号明細書を参照。多色の蛍光画像を読み取り、解析する等の、読み込み又は「読み取り」装置を含む、任意の公知の装置又は方法、又はそれらの変形は、本発明の方法を実施するために用いられるか又は適合することができる。例えば、米国特許第6,294,331；6,261,776；6,252,664；6,191,425；6,143,495；6,140,044；6,066,459；5,943,129；5,922,617；5,880,473；5,846,708；5,790,727号明細書；及び本明細書において、アレイの議論において引用される特許を参照。また、米国特許出願第20010018514号、20010007747号；及び国際公開公報WO0146467A；WO9960163A；WO0009650A；WO0026412A；WO0042222A；WO0047600A；及びWO0101144Aを参照。
【００９５】
例えば、分光器が光検出器の二次元アレイ上の発光スペクトルを撮像することができ、それ故、アレイのスペクトル的に十分に分解された画像が得られる。蛍光団の光物理学、例えば、蛍光量子収量及び光破壊の収量及び検出器の感受性は、オリゴヌクレオチドアレイのための読み込まれた時間パラメーターである。より低い光破壊の破壊収量を有する、十分なレーザーパワー及びＣｙ５（登録商標）又はＣｙ３（登録商標）の使用により、アレイは５秒未満で読むことができる。
【００９６】
本発明の方法の実施を含む、電荷結合デバイス又はＣＣＤが、マイクロアレイ走査システム中で用いられる。色の識別は、３色ＣＣＤビデオ画像に基づくことができる。これらは、色相値を測定することによって行なうことができる。色相値は、色を数値的に特定するために導入される。計算は、カメラの個々のチャンネルによって記録された、赤、緑及び青光（ＲＧＢ）の強度に基づく。しかし、ＲＧＢ値を色相値に変えるために用いられる公式はデータを単純化し、光の真の物理的性質に言及しない。また、スペクトルの画像処理を用いることができ；それは、波長に対する強度として光を解析する。それは、光の色を正確に記述するための唯一の数である。更に、画像中に全ての画素についてのスペクトルの情報を含んでいるので、スペクトルの画像処理は、空間データを提供することができる。また、スペクトルの画像処理は、明視野顕微鏡を用いて行なうことができる。例えば、米国特許第6,294,331号を参照。
【００９７】
本発明の方法の特定の利点は、単一の検出可能な標識が用いられることである。これは、複数の着色した蛍光団を読み込んで調整する必要性を除去する。より低い範囲のシグナル強度は均一であり、２以上の蛍光団の間のシグナル強度の相違を考慮することなく、容易に正常化することができる。本発明のアレイに基づくＣＧＨアプローチの他の利点は、各染色体の全体のゲノム配列を超えて広がることによる増大した解像度、及び従来の生体内染色体ハイブリダイゼーションと比較して向上した感度を含む。
【００９８】
本発明の方法は、例えば、蛍光強度を基板の一の関数として定量し、外れ値（所定の統計的な分布から逸脱したデータ）を除去するか、又は残りのデータから標的の相対的結合親和性を計算する工程を含む、データ解析を含む。得られたデータは、標的及びプローブの間の発光又は結合親和性によって異なる、それぞれの領域の色を有する画像として表示することができる。例えば、米国特許第5,324,633；5,863,504；及び6,045,996号明細書を参照。本発明は、また、担体上に位置する試料上の標識化マーカーを検出するための装置を組み入れることができる。例えば、米国特許第5,578,832号明細書参照。
【００９９】
以下の非限定的実施例を参照することにより、本発明を更に詳細に記述する。
【実施例１】
【０１００】
ゲノム核酸アレイの調製
種々のマイクロアレイ装置（例えば、BioRobotics Microgrid等；集団的「アレイ」）が、固体表面の複数の別々の位置に核酸材料を印刷するために利用できる。２個の特定の表面は、大きい挿入物クローンマイクロアレイ製造の特定の応用のためのプロトコールを確立するために、天然のＢＡＣ  ＤＮＡを用いて印刷された（例えば、ＢＡＣｓ、ＰＡＣｓ、コスミド）。
【０１０１】
典型的な先行技術の導入及び検証プロトコールは、色素のみの溶液又は色素−オリゴＤＮＡ溶液のいずれかを用いたアレイヤーの印刷性能を評価する。これらの条件は、大きいクローンアレイの製造に関する流体力学を反映しない。それ故、印刷パラメーターの発生について最適状態には及ばない。本明細書に開示された実施例は、アレイヤーを検証し、大きい挿入物クローンマイクロアレイの製造についての印刷パラメーターを確立するための簡単かつ質的なアプローチを確立する。
【０１０２】
大きい挿入物ＤＮＡクローン（ＢＡＣｓ、ＰＡＣｓ、コスミド）の試料捕集を、７５〜１００ｎｇ／μｌの濃度で、塩を含む印刷バッファー（例えば、５０〜１５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８〜９）に再懸濁した。１００Ａ及び７０Ｗで５秒間、超音波水浴処理装置を用いて、ＤＮＡを簡単に断片化した。５００塩基対以上の範囲に均一に分布する、断片化したＤＮＡのサイズを確認するために、ゲル電気泳動（０．８〜１．０％アガロース）を用いた。超音波処理したＤＮＡの３０μｌの一定量に、最適な蛍光性ヌクレオチド色素−接合体の１μｌを加えた。試料を混合し、印刷表面に移動した。印刷工程が完了すると、用いた蛍光色素の波長にセットして、得られた画像をレーザースキャナー（例えば、Axon4000, 4100,4200）を用いて走査することによって評価した。
【０１０３】
これらの通常のパラメーターに基づいて、２つの表面を試験した。最初の表面は、標準の塩基／酸プロトコールに従って清掃した平らなスライドガラスであった。スライドガラス上の蛍光測定は、約１０，０００のスポット強度、及び約２９０μｍのスポットサイズを有する、約３０００のバックグラウンド読み込みを示した。第二の表面は、CodeLink（登録商標）Activated Slide（Amersham Biosciences）であった。CodeLink （登録商標） Activated Slide上の蛍光測定は、約６５，０００のスポット強度、及び約１８０μｍのスポットサイズを有する、約１５，０００のバックグラウンド読み込みを示した。
【実施例２】
【０１０４】
ゲノム核酸の調製
（標識）
ゲノムＤＮＡは、検出可能な標識を導入するための標準プロトコールによって標識される。蛍光団を用いた例示的なランダムプライミングは以下の通りである。１ｎｇ〜１μｇのＤＮＡを含む１００μｌの反応中に、１×ランダムプライマー溶液（BioPrime DNA Labeling System, Gibco BRL）、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰ、０．１ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．４ｍＭ  Ｃｙ３又はＣｙ５−ｄＣＴＰ（Amersham）及び１６０Ｕのクレノウ断片（BioPrime DNA Labeling System, Gibco BRL）を混合する。他の試薬を加える前に、ＤＮＡ及びランダムプライマー溶液を全体の体積８４μｌ中で１００℃で１０分間インキュベートし、最終的な１００μｌの反応物を３７℃で一晩インキュベートした。取り込まれないヌクレオチドを、セファデックスＧ−５０カラムを用いて除去した。
【０１０５】
（デンドリマー標識）
ゲノムＤＮＡは、デンドリマーコンストラクト中に含まれるタグを含んでいてもよい。デンドリマーは、検出を増幅するための所望の検出可能な標識の複数のコピーを統合するために作成された、高度に分岐した分子である。デンドリマーを標識し、構築するためのキットは市販されている（例えば、Genisphere Inc）。簡単に言うと、ゲノムＤＮＡをAluIで消化し、平均２５６塩基対の消化された断片を得る。次いで、ゲノムＤＮＡフラグメントを、３’ＴｄＴで処理して、各フラグメントのポリ−Ｔテイルに接続する。次いで、(i)ポリ−Ａテイルを有する架橋したオリゴヌクレオチド、(ii)捕獲配列オリゴヌクレオチド（架橋オリゴヌクレオチドに相補的な１つの末端を有する）、及び(iii)Ｔ−テイルを有する断片を含むライゲーションを実施し、その３’末端に、同一のユニークな捕獲配列を有するゲノムＤＮＡ断片を得る。ゲノムＤＮＡ（すなわち、核酸の試験試料及び参照試料）の各試料を、ハイブリダイゼーションの前に、ユニークな捕獲配列に結合させる。ハイブリダイゼーションに続き、次いで、ゲノムＤＮＡ断片を、一方の試料のユニークな捕獲配列に相補的なオリゴヌクレオチド、複数の標識のコピー、通常の蛍光色素分子を含むデンドリマーを用いて標識する。
【０１０６】
また、ユニークな捕獲配列及びｍＲＮＡ分子のポリ−Ａテイルにハイブリダイズするポリ−Ｔテイルを含むプライマーオリゴヌクレオチドを用いて、非標識のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰにより、ゲノムｍＲＮＡの逆転写を行う。次いで、反応を停止し、ｍＲＮＡ分子のポリ−Ａテイルを分解して、ユニークな捕獲配列を含むゲノムｃＤＮＡを得る。次いで、これらのゲノムｃＤＮＡは、ユニークな捕獲配列に相補的なオリゴヌクレオチド、及び複数の標識のコピー、通常の蛍光色素分子を含むデンドリマーを用いて標識することができる。Genisphere, Incは、サイズ及び蛍光強度が変化する種々のデンドリマーを提供する。アレイ９００及び３５０シリーズのキットは、４層のデンドリマーを含む。４層のデンドリマーは、理論的には、外層に、３２４個の一本鎖ＤＮＡアームを有する。４層のデンドリマーの直径は１８２〜１９０ｎｍであり、分子量は１．２×１０7ダルトンである。アレイ５０シリーズキットは、２層のデンドリマーを含む。２層のデンドリマーは、理論的には、外層に、４５個の一本鎖ＤＮＡアームを有する。２層のデンドリマーの直径は７０〜９０ｎｍであり、分子量は１．３×１０6ダルトンである。
【実施例３】
【０１０７】
比較ゲノムハイブリダイゼーション
それぞれ、ユニークな捕獲配列を含む、試験試料及び参照試料から得られたゲノム核酸（それぞれ、約１〜２μｇ）を、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ（８０〜１００μｇ）と一緒にしてエタノールで沈殿させる。沈殿を、遠心によって集め、５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、１０％硫酸デキストラン、４％ＳＤＳ及び５００μｇの酵母ｔＲＮＡを含む、ｐＨ７の５０μｌのハイブリダイゼーション混合物への再溶解の前に、１０分間風乾させる。ハイブリダイゼーション混合物を７０℃で１０〜１５分間インキュベートし、ＤＮＡを変性させ、次いで、３７℃で６０分間インキュベートし、反復配列の遮断を可能とする。アレイに、５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、１０％硫酸デキストラン及び４％ＳＤＳ中の５００μｇのサケの精子のＤＮＡを含む、ｐＨ７の５０μｍのスライドブロッキング溶液を加える。室温で３０分間インキュベーション後、ブロッキング溶液の４分の３を除去し、変性し、リアニーリングしたハイブリダイゼーション混合物を加え、３７℃で１６〜７２時間ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、過剰のハイブリダイゼーション液体を０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１％  ＮＰ４０で洗い流し、次いで、アレイを、５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、ｐＨ７で、４５℃で１５分間、一回洗浄し、最後に０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１％  ＮＰ４０、ｐＨ８で室温で１５分間洗浄する。
【実施例４】
【０１０８】
サブトラクティブ標識を用いた、単一標識ＣＧＨ
例示的な選択的除去は、試験試料から得られるゲノム核酸または参照試料から得られるゲノム核酸のいずれかと結合した、大気のオゾンを用いた除去に感受性の標識を製造することによって、達成することができる。特定の蛍光団（例えば、Ｃｙ５（登録商標）及びAlexa647）は、１０〜３０秒のように短い時間の約５〜１０ｐｐｍのような低いオゾン濃度に感受性である。ハイブリダイゼーション後、アレイを、オゾン発生装置を有する密閉チャンバーに置き、約６０〜８５ｐｐｍの大気オゾン濃度を約１０〜３０分間達成する。一方のゲノム核酸の集団からの標識の選択的除去は、標識化工程の物理的性質を改変することによって、大気オゾンに対する曝露を増加するために、ゲノムＤＮＡからの標識の距離を増加させる等によって達成することができる。
【０１０９】
他の例示的な選択的な除去は、試験試料から得られるゲノム核酸又は参照試料から得られるゲノム核酸のいずれかと結合した、制限酵素又はホーミングエンドヌクレアーゼを用いた切断による除去に感受性の標識を製造することによって達成することができる。この実施例においては、参照試料ゲノム核酸は、第一のユニークな捕獲配列に相補的なオリゴヌクレオチド及び蛍光標識を含むデンドリマーを結合した、第一のユニークな捕獲配列を用いて調製される。試験試料ゲノム核酸は、第二のユニークな捕獲配列に相補的なオリゴヌクレオチド及び第一の試料について用いられるのと同じ蛍光標識を含むデンドリマーを結合した、エンドヌクレアーゼの認識配列を表わすヌクレオチドのストレッチを含むこの第二のユニークな捕獲配列を用いて調製される。複数の固定化された興味のある核酸断片を含むアレイに対する試験ゲノム核酸及び参照ゲノム核酸のハイブリダイゼーションの後に、アレイの蛍光が測定される。
【０１１０】
次いで、アレイは、試験試料核酸から蛍光標識を選択的に取り除くために、ゲノム核酸からデンドリマーコンストラクトの切断を可能とする条件下で、第二のユニークな捕獲配列中に含まれる配列を認識するエンドヌクレアーゼと接触させる。
【０１１１】
他の例示的な選択的な除去は、ＵＶ照射による除去を受けやすい、試験試料から得られるゲノム核酸、又は参照試料から得られるゲノム核酸のいずれかと結合する標識を製造することによって達成することができる。この標識は、２−ニトロベンジル基を含むリンカー等の、光切断性であるリンカーを用いて導入される（例えば、Baiら、Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 409-413, 2003を参照）。ハイブリダイゼーション後、アレイを、水の入ったチャンバーに設置し、３４０ｎｍ（約２０ｍＷ／ｃｍ2の光強度）のＵＶを５〜１０分間照射し、ゲノム核酸の１集団からのみ（すなわち、光切断性リンカーを含む核酸）標識を選択的に除去する。
【０１１２】
従って、これらの選択的除去の実施例においては、読み取られた同一の蛍光団については、アレイからのデータは２つの時点で得られる。結合した核酸試料の蛍光（FTotal）を一部測定するために、比較ゲノムハイブリダイゼーションの後（例えば、試験試料ゲノム核酸からの標識の選択的除去の前）に第一の獲得を行う。参照試料ゲノム核酸の残りの蛍光（FReference）を一部測定するために、標識の選択的除去の後に第二の獲得を行う。試験試料ゲノム核酸の蛍光（Ftest）は、（FTotal-FReference）と等しい。従って、２つのゲノム核酸試料の間、及び異なる試料で実施される試験の間の最大の均一性を達成するために、同一の蛍光団を用いることができる。選択的な除去を、参照ゲノムＤＮＡと結合した核酸を除去するよう設計すると、第二の読み取りは、Ftestであり、FTest及びFTotalの間の相違はFReferenceである。
【０１１３】
単一の標識ＣＧＨの品質管理として、試験標識及び参照標識のための２つのリンカーが切り換えられ、比較ハイブリダイゼーションを繰り返した。
【実施例５】
【０１１４】
追加的標識を用いた単一標識ＣＧＨ
単一標識ＣＧＨのための例示的な追加標識は、第一のユニークなオリゴヌクレオチドタグを含む参照試料から得られるゲノム核酸、及び第二のユニークなオリゴヌクレオチドタグを含む試験試料から得られるゲノム核酸の第一の比較ハイブリダイゼーションを実施することによって達成することができる。試験ゲノム核酸及び参照ゲノム核酸を、複数の興味ある固定化された核酸を含むアレイとハイブリダイゼーションさせた後、アレイを、第一のユニークなオリゴヌクレオチドタグに相補的なオリゴヌクレオチド、及び蛍光標識を含む第一のデンドリマー複合体に曝露する。これは、参照試料ゲノム核酸の選択的標識を提供する。
【０１１５】
デンドリマーハイブリダイゼーションのための好ましい条件は、５０μｇのＣｏｔＩ  ＤＮＡ、及び５０〜１００μｇのＳＳＴ（断片化した（超音波処理した）サケ精巣ＤＮＡ）を含む、Pronto!（登録商標）ハイブリダイゼーションバッファー（Corning, Inc）の使用を含む。CotI  ＤＮＡは、植物ＤＮＡ、魚類ＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、及び非天然のＤＮＡ、例えばデンドリマー性ＤＮＡ等の他のいかなる非ほ乳類ゲノムＤＮＡと置換されてもよい。３０分のハイブリダイゼーションの後、アレイを以下のようにして洗浄する。
１．スライドを、０．０１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ（ｐＨ７．５〜８．０）中で、室温でカバーガラスが解放されるまで浸す（＜３分）。
２．０．０１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ（ｐＨ７．５〜８．０）中で５０℃でゆっくりと撹拌しながら５分間インキュベートする。
３．２×ＳＳＣ（ｐＨ７．５〜８．０）中で室温でゆっくりと撹拌しながら５分間インキュベートする。
４．０．２×ＳＳＣ（ｐＨ７．５〜８．０）中で室温でゆっくりと撹拌しながら５分間インキュベートする。
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（界面活性剤）
１×ＳＳＣ：０．１５モル塩化ナトリウム及び０．０１５モルクエン酸ナトリウム
【０１１６】
次いで、アレイからのデータを得、第一の参照試料ゲノム核酸の蛍光（FReference）を検出する。次いで、アレイを、第二のユニークなオリゴヌクレオチドタグに相補的なオリゴヌクレオチド、及び第一のデンドリマー複合体中で用いられているのと同じ標識を含む第二のデンドリマー複合体に曝露する。次いで、第二の時点についてアレイからのデータを得、結合した核酸の蛍光（FTotal）を部分的に検出する。試験試料ゲノム核酸の蛍光（FTest）は（FTotal-FReference）に等しい。従って、２つのゲノム核酸試料の間、及び異なる試料で実施される試験の間の最大の均一性を達成するために、同一の蛍光団を用いることができる。第一のデンドリマー複合体がFtestと結合すれば、FTest及びFTotalの間の相違はFReferenceである。この方法を、図３に概略的に示す。１つの標識化されたデンドリマーが、ゲノム核酸で標識されたタグとのハイブリダイゼーションの間に一緒にハイブリダイズするこの方法の変形を図４に示す。
【０１１７】
単一の標識化ＣＧＨにおける品質管理として、試験ゲノム核酸及び参照ゲノム核酸に結合するユニークなタグ配列が切り換えられ、比較ハイブリダイゼーションを繰り返した。
【０１１８】
他に定義しない限り、本明細書で用いられる技術及び化学用語は、この発明の属する分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１１９】
本明細書において例示的に記載されている発明は、特に本明細書において開示されていない、いかなる要素、限定がない場合、最適に実施されることができる。従って、例えば、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「含む(containing)」等は、限定なしで拡張的に読むべきである。更に、本明細書で用いられている用語及び表現は、限定的でない、説明の用語として用いられ、示され記載された特徴又はそれらの一部の任意の相当語句を除外する、このような用語及び表現を使用する意思がないが、種々の修飾が権利主張された発明の範囲内で可能であると理解される。
【０１２０】
従って、本発明は、好ましい実施態様及び任意の特徴、修飾によって具体的に開示すべきであるけれど、本明細書で開示される具体化された発明の改良及び変形は当業者に助けを借りるかもしれず、このような修飾、改良及び変形は本発明の範囲内であると判断されることを理解すべきである。本明細書で提供される材料、方法及び実施例は、好ましい実施態様の代表であり、例示であり、本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【０１２１】
本発明は、本明細書に広くかつ一般的に記載された。一般的な開示の範囲内の、より狭い種類及び下位概念の分類のそれぞれも、本発明の一部を形成する。これは、条件を有する本発明、又は削除された材料が特に本願明細書において開示されるか否か、にもかかわらず、属からいかなる内容も取り除いている負の限定の一般的な記述を含む。
【０１２２】
更に、本発明の特徴又は実施態様がマーカッシュグループに関して記載されている所で、当業者は、本発明がまた、このことによりマーカッシュグループのメンバーのいかなる個々の部材又はサブグループに関して記載されていると認識する。
【０１２３】
本明細書で言及されている、全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それぞれが個々に引用したものと同程度に、それらの全部において引用したものとする。矛盾する場合、定義を含む本明細書は制御される。
【０１２４】
他の実施態様は、以下の請求の範囲中で説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、試験ゲノムＤＮＡ断片及び基準ゲノムＤＮＡ断片を同じ蛍光標識で標識する、本発明の例示的な実施態様を示す。
【図２】図２は、試験ゲノムＤＮＡ断片及び基準ゲノムＤＮＡ断片を同じ蛍光標識で連続的に標識化する、本発明の例示的な実施態様を示す。
【図３】図３は、標識されたデンドリマーおよびアレイの２枚セットを用いる、本発明の例示的な実施態様を示す。
【図４】図４は、標識されたデンドリマーおよびアレイの２枚セットを用いる、本発明の例示的な実施態様を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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