(57)【要約】  本発明者等は、エクスパンシンポリペプチドをコードする核酸分子で遺伝子的に改変されたトランスジェニック植物細胞と植物、植物細胞壁の組成を変化させる方法、及び上記トランスジェニック植物に由来する植物組織を含む製品に関して記載した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック植物細胞であって、以下の：
ｉ）図６ａ、図６ｂ又は図６ｃに表されるような核酸配列を含む核酸分子、
ｉｉ）（ｉ）で定義されるような前記核酸分子にハイブリダイズし、且つエクスパンシンに関連する比活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、
ｉｉｉ）アミノ酸配列モチーフＡＳＳＩＳＧＧＧを特徴とするエクスパンシンをコードする核酸分子、
ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で定義される配列に対する遺伝コードの結果として縮重している核酸配列を含む核酸分子
から成る群から選択される核酸分子による形質転換により遺伝子的に改変される植物細胞。
【請求項２】
前記細胞は、前記核酸分子の過剰発現に適応される、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記核酸分子は、図６ａ、図６ｂ又は図６ｃに表されるような核酸分子に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
前記核酸分子は、図６ａ、図６ｂ又は図６ｃに表される核酸配列から構成される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
前記核酸分子は、図６ａ、図６ｂ又は図６ｃに表される核酸配列に対して少なくとも６０％相同性を有する核酸配列を含む、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞は、エクスパンシンポリペプチドをコードする核酸分子で形質転換され、該核酸分子は、テマリカタヒバのゲノムから単離される、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
前記テマリカタヒバは、クラテロスチグマ種(Craterostigma spp)である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記核酸分子は、基礎レベル発現と比較した場合に、少なくとも２倍過剰発現される、請求項２ないし７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞は、前記核酸分子を少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍又は少なくとも５０倍過剰発現する、請求項２ないし７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞は、前記核酸分子を少なくとも１００倍過剰発現する、請求項２ないし７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞は、以下の：
ｉ）図６ａ、図６ｂ又は図６ｃに表されるような核酸配列を含む核酸分子、
ｉｉ）（ｉ）で定義されるような前記核酸分子にハイブリダイズし、且つエクスパンシンに関連する比活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、
ｉｉｉ）アミノ酸配列モチーフＡＳＳＩＳＧＧＧを特徴とするエクスパンシンをコードする核酸分子、
ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で定義される配列に対する遺伝コードの結果として縮重している核酸配列を含む核酸分子
から成る群から選択される核酸分子を含むベクターでトランスフェクトされる、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載する細胞。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の細胞を含む植物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の植物に由来する植物細胞又は植物組織を含む製品。
【請求項１４】
前記製品は食料品である、請求項１３に記載する製品。
【請求項１５】
前記製品は紙である、請求項１３に記載の製品。
【請求項１６】
植物細胞壁の機械的特性を変更させる方法であって、以下の：
ｉ）本発明による細胞を供給する工程、及び
ｉｉ）該細胞から植物を栽培する工程
を含む方法。
【請求項１７】
前記植物又はその一部は脱水される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞壁抽出物を調製する方法であって、以下の：
ｉ）本発明による細胞を供給する工程、
ｉｉ）該細胞を植物へと栽培する工程、及び
ｉｉｉ）該植物から細胞壁抽出物を調製する工程
を含み、該細胞壁は変更された機械的特性を有する、前記方法。
【請求項１９】
前記抽出物は脱水される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載の方法により調製される細胞壁抽出物。
【請求項２１】
以下の：
ｉ）図６ａ及び／又は図６ｂ及び／又は図６ｃに表されるような核酸配列を含む核酸分子、
ｉｉ）（ｉ）で定義されるような前記核酸分子にハイブリダイズし、且つエクスパンシンに関連する比活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、
ｉｉｉ）アミノ酸配列モチーフＡＳＳＩＳＧＧＧを特徴とするエクスパンシンをコードする核酸分子、
ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で定義される配列に対する遺伝コードの結果として縮重している核酸配列を含む核酸分子
から成る群から選択される核酸分子によりコードされるポリペプチドを含む組成物。
【請求項２２】
脱水された植物材料の再水和のための作用物質としての請求項２１に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エクスパンシンポリペプチドをコードする核酸分子で遺伝子的に改変されたトランスジェニック植物細胞に関し、植物細胞壁の組成を変更させる方法、及び該トランスジェニック植物に由来する植物組織を含む製品（例えば、食品及び紙）を包含する。
【背景技術】
【０００２】
植物細胞壁は、多くの工業及び商品製品の基礎を成す。セルロースは、天然に見出される最も豊富なポリマーであり、製紙産業で使用され、また食料品において凝結防止剤、乳化剤、安定剤、分散剤及び増粘／ゲル化剤として使用される。セルロースはまた、セルロースを軟化及び可動化させる水の吸収に対して優れた特性を有する。
【０００３】
植物の主要な細胞壁は、他の分子構造要素（例えば、ペクチン）と相互作用するヘミセルロース多糖マトリックス中に包埋されたセルロースミクロフィブリルのネットワークである。細胞壁は、細胞形状を決定し、また主として不浸透性であり（例えば、植物病原体に対して）、且つ多様な強度及び剛性を有する構造を形成するように互いに細胞を付着するように機能する構造である。成長中の植物細胞壁の多糖は、細胞壁に対してある程度の構造的可動性を付与する非共有結合のネットワークを形成する別個の長鎖ポリマーである。この可動性により、植物細胞が、例えば細胞内の膨圧の結果として生じる相当な機械的応力に抵抗することを可能となる。この万能性は主として、マトリックスポリマーの移動又は転位に起因する。この再構築に関わる細胞壁タンパク質の種類がエクスパンシンである。
【０００４】
植物細胞は、茎及び根のような成長領域に見られる成長点と称される分裂細胞の小集合体から生じる。成長点細胞は、非常に小さく、およそ５μｍである。成長由来の細胞は、水及び他の溶質のシンクとして機能する液胞の形成に主として起因する細胞容積の増加をもたらす広範囲な成長期を引き起こす。上記形質転換を引き起こす植物細胞の特性は、細胞壁の順応性が一つの要因となっている。エクスパンシンが上記プロセスにおいて密接に関与している。
【０００５】
エクスパンシンは、およそ２６ｋＤａの分子量を有するタンパク質群であり、最初はキュウリの苗から単離された。エクスパンシンは、細胞外酵素の大きな群として存在し、続いて広範囲の植物種において同定されている（Lee他、２００１年）。エクスパンシンは、現在一般的に、α−エクスパンシン及びβ−エクスパンシンと称される２つの主要な群に分けられる（Cosgrove他、２００２年）が、第３の少数群であるγ−エクスパンシンもまた、シロイヌナズナ(Arabidopsis)で現在同定されている（Li他、２００２年）。ほとんどの研究は、α−エクスパンシンが最初に特性化されたことからα−エクスパンシンに焦点を当てており、α−エクスパンシンは、群Ｉ植物花粉アレルゲンとも称されるβ−エクスパンシンに対して、弱いが重要な配列類似性を示す（Darley他、２００１年）。これらの２つの群のエクスパンシンの正確な生化学的性質及び役割は、依然として完全に解明されていないが、異なる基質特異性が十分に重要な因子であり得る。
【０００６】
ｐＨ依存性細胞壁伸長の媒介による細胞成長におけるα−エクスパンシンの役割は、現在堅固に確立されている。エクスパンシン活性の初期の同定は、熱失活させた細胞壁に対してｐＨ依存性細胞壁伸長性を回復させるエクスパンシンの能力を実証した（McQueen-Mason他、１９９２年）。より最近では、多数の研究により、成長とエクスパンシン発現との相関が確証されている（Cho及びCosgrove、２０００年、Ｉｍ他、２０００年、Ｌｅｅ他、２００３年）。エクスパンシン作用のメカニズムは、細胞壁多糖、すなわちセルロース及びキシログルカン間の非共有結合の崩壊に関与すると考えられ（whitney他、２０００年）、ポリマーが別々にスライドして、伸長が起きることを可能にする。成長におけるエクスパンシンの役割のほかに、形態形成（Cleland、２００１年、Pien他、２００１年、Reinhardt他、１９９８年）、発芽（Chen及びBradford）及び果実軟化（Brummell他、１９９９年）に関与していることが示されている。
【０００７】
エクスパンシン発現はまた、発達的、ホルモン的及び環境的要因において差次的に調節される（Cho及びCosgrove、２００２年）。エクスパンシンの差次的発現に影響を及ぼす１つの環境的態様は、水の有効利用である。例えば、水没することを回避するために、半水生植物は、多くの場合生存の手段として水中に沈むと急速に成長するように誘導される。深水イネ（Cho及びKende、１９９７年）及び冠水耐性ルメックス・パルストリス(Rumex palustris)（Vriezen他、２０００年）の両方では、浸水もまた、幾つかのエクスパンシン遺伝子の発現の増加をもたらし、このことは、観察される成長の増加と直接的に関連がある。対照的に、水が制限されている条件下では、低い水ポテンシャルが主流である環境に適応した根は、それらの細胞壁の伸長性を増加させることにより成長を継続することが可能である（Wu他、１９９６年）。この亢進された伸長性は、エクスパンシン活性の増加及び転写物蓄積と関連がある（Wu他、２００１年）。
【０００８】
テマリカタヒバは、それらの植物性組織全体にわたって乾燥に対して相当レベルの耐性を示す維管束植物の小さいが特有の群である（Scott、２０００年）。テマリカタヒバ植物であるクラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)は、乾燥耐性の分子的研究用のモデル種として役割を果たしている（Ingram及びＢａｒｔｅｌｓ、１９９６年、Ramanjulu及びBartels、２００２年）。テマリカタヒバは通常、それらの本来の含水量の９５％が欠乏しても生き延び、続いて散水の数時間以内に完全に再水和して、完全な生理学的活性が復活する。
【０００９】
干ばつストレスは概して、代謝に対する悪影響、膜及びタンパク質構造並びに細胞内組織に対する修復不可能な損傷の結果として植物の健康状態に対して有害である。したがって、いずれの前記障害は、テマリカタヒバにおいて防御され、或いは修復される。これらのメカニズムの例としては、糖（例えば、ショ糖）及び抗体（例えば、ＬＥＡ(late emboryogenesis-abundant)タンパク質）の蓄積が挙げられ、脱水中に高分子の構造的完全性を安定化すると考えられる（Bartels及びSalamini、２００１年、Hoekstra他、２００１年）。葉の形状の物理的変化（例えば、萎縮）、アントシアニン生合成及びクロロフィルの可逆的損失による光合成装置の防御もまた起こり得る（Alpert、２０００年）。
【００１０】
クラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)を含む少数のテマリタカヒバはまた、脱水中に広範囲の細胞壁フォールディング(folding)を示す（Hartung他、１９９８年、Farrant、２０００年）。細胞壁のフォールディングプロセスは、張力及び潜在的損傷を軽減すると考えられ、原形質連絡を介して細胞壁へ付着された状態のまま、細胞が脱水中に収縮する場合に原形質膜収縮の結果ととして生じる。細胞壁と原形質膜との間の密接な結合を維持することはまた、再水和及び水の取り込み中に不可欠であると予想される。従来の研究により、クラテロスチグマ属(Craterostigma)における細胞壁フォールディングのこのメカニズムは、壁構造及び組成における変化を伴うことが示唆されている（Vicre他、１９９９年）。
【００１１】
幾つかのテマリカタヒバの、脱水及び再水和中に明らかな増大された伸長性並びに可動性を可能とするそれらの細胞壁の機械的特性を変更する能力は、特有の特徴であり、それらの生存に不可欠である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者等は、クラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)における乾燥耐性のこの態様に関して、エクスパンシンに関する潜在的役割を検査してきた。本発明者等は、Ｃ．プランタギネウム(C. plantagineum)由来の３つのエクスパンシン遺伝子の単離について記載し、エクスパンシン遺伝子の発現と、乾燥耐性を可能にする脱水及び再水和現象との間の明瞭な関連性を実証する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一態様によれば、トランスジェニック植物細胞であって、以下の：
ｉ）図６に表されるような核酸配列を含む核酸分子、
ｉｉ）（ｉ）で定義されるような前記核酸分子にハイブリダイズし、且つエクスパンシンに関連する比活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、
ｉｉｉ）アミノ酸配列モチーフＡＳＳＩＳＧＧＧを特徴とするエクスパンシンをコードする核酸分子、
ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として縮重している核酸配列を含む核酸分子
から成る群から選択される核酸分子とともに形質転換により遺伝子的に改変された前記植物細胞。
【００１４】
本発明の好ましい一実施形態では、前記細胞は、前記核酸分子の過剰発現に適応される。
【００１５】
本発明の好ましい一実施形態では、前記核酸分子は、図６ａ、図６ｂ又は図６ｃに表されるような核酸分子に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、請求項１又は２に記載の細胞。
さらに好ましくは、前記核酸分子は、図６ａ、図６ｂ又は図６ｃに表される核酸配列から構成される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の細胞。
【００１６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション／洗浄条件は、当該技術分野で既知である。例えば、核酸は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６０℃での洗浄後に安定な核酸ハイブリッド。最適なハイブリダイゼーション条件は、核酸の配列が既知である場合に算出可能であることは、当該技術分野で既知である。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションに用いる核酸のＧＣ含有量により決定することができる。Sambrook et al (1989) Molecular Cloning; A Laboratory Approachを参照されたい。特定化された相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するのに必要とされるストリンジェントな条件を算出するための一般式は、以下である：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１［％Ｇ＋Ｃ］−０．６３（％ホルムアミド）。
【００１７】
通常、ハイブリダイゼーション条件は、４〜６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥは、１リットルに溶解させたＮａＣｌ  １７５．３ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏ  ８８．２ｇ及びＥＤＴＡ  ７．４ｇを含有する、ｐＨは、７．４に調節）、５〜１０×デンハルト溶液（５０×デンハルト溶液は、フィコール４００  ５ｇを含有する、Pharmacia）、ポリビニルピロリドン５ｇ及びウシ血清アルブミン５ｇ、超音波処理したサケ／ニシンＤＮＡ１００μｇ〜１．０ｍｇ／ｍｌ、０．１〜１．０％  ドデシル硫酸ナトリウム、任意に４０〜６０％脱イオンホルムアミドを使用する。ハイブリダイゼーション温度は、核酸標的配列のＧＣ含有量に応じて様々であるが、通常４２℃〜６５℃である。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、上記核酸分子は、図６ａ、図６ｂ又は図６ｃに表される核酸配列に対して少なくとも６０％相同性を有する核酸配列を含む。好ましくは、上記相同性は、図６ａ、図６ｂ又は図６ｃに表される核酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％又は少なくとも９９％同一性である。
【００１９】
本発明のさらに好ましい実施形態では、上記細胞は、図７ａ、図７ｂ又は図７ｃにおけるアミノ酸配列により表されるようなポリペプチド、或いは変異ポリペプチドをコードする核酸分子で形質転換され、ここで上記変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換により修飾される。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物細胞は、エクスパンシンポリペプチドをコードする核酸分子で形質転換され、ここで上記核酸分子は、テマリカタヒバ植物のゲノムから単離される。好ましくは、上記テマリカタヒバ植物は、クラテロスチグマ種(Craterostigma spp)、好ましくはＣ．プランタギネウム(C. plantagineum)である。
【００２１】
本発明のさらに好ましい実施形態では、上記核酸分子は、基本レベル発現と比較した場合に、少なくとも２倍過剰発現される。
【００２２】
「基本レベル発現」は、同じ種の非トランスジェニック対照細胞、或いは所定の遺伝子又はｃＤＮＡの非機能的コピーを含有するトランスジェニック対照細胞により示される発現のレベルとして解釈され得る。
【００２３】
本発明のかなり好ましい一実施形態では、前記細胞は、前記核酸分子を少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍過剰発現する。
前記細胞は、前記核酸分子を少なくとも１００倍過剰発現する。
【００２４】
核酸分子によりコードされるポリペプチドの活性を増大させるための手段は、当業者に既知であることが明らかである。例えば、且つ限定されないが、細胞に上記遺伝子の多重コピーを供給することにより遺伝子投与量を増大させること。あるいは、又はさらに、遺伝子（複数可）は、上記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡの発現を上げるために、強力なプロモーター配列又は誘導性プロモーター配列の制御下に配置可能である。ｍＲＮＡ安定性の調節はまた、通常ｍＲＮＡの５’側又は３’側の非翻訳領域に対する変化により、ｍＲＮＡ分子の定常状態レベルを変化させるのに使用されるメカニズムである。
【００２５】
本発明のさらに好ましい一実施形態では、前記細胞は、以下の：
ｉ）図６ａ、図６ｂ又は図６ｃに表されるような核酸配列を含む核酸分子、
ｉｉ）（ｉ）で定義されるような前記核酸分子にハイブリダイズし、且つエクスパンシンに関連する比活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、
ｉｉｉ）アミノ酸配列モチーフＡＳＳＩＳＧＧＧを特徴とするエクスパンシンをコードする核酸分子、
ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）で定義される配列に対する遺伝コードの結果として縮重している核酸配列を含む核酸分子
から成る群から選択される核酸分子を含むベクターでトランスフェクトされる。
【００２６】
好ましくは、ベクター中の核酸は、原核（例えば細菌）又は植物細胞のような宿主細胞における転写用の適切なプロモーター又は他の調節エレメントへ操作可能に連結される。ベクターは、多重宿主において機能する二官能性発現ベクターであってもよい。本発明によるポリペプチドをコードする核酸の例では、これは、その自然プロモーター又は他の調節要素を含有してもよく、ｃＤＮＡの場合では、これは、宿主細胞における発現のための適切なプロモーター又は他の調節エレメントの制御下であってもよい。
【００２７】
「プロモーター」とは、転写開始部位の上流にあり、且つ転写に必要とされる調節領域すべてを含有するヌクレオチド配列を意味する。適切なプロモーターとしては、設計に応じて植物体に含まれる植物細胞における発現のための構成的、組織特異的、誘導性、発生的又は他のプロモーターが挙げられる。上記プロモーターとしては、植物細胞で機能可能なウイルス、真菌、細菌、動物及び植物由来のプロモーターが挙げられる。
【００２８】
構成プロモーターとしては、例えば、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター(Odell et al (1985) Nature 313, 9810-812)、イネアクチン(McElroy et al (1990) Plant Cell 2: 163-171)、ユビキチン(Christian et al. (1989) Plant Mol. Biol. 18(675-689)、ｐＥＭＵ(Last et al (1991) Theor Appl. Genet. 81: 581-588)、ＭＡＳ(Velten et al (1984) EMBO J. 3. 2723-2730)、ＡＬＳプロモーター（米国特許出願第０８／４０９，２９７号明細書）等が挙げられる。他の構成的プロモーターとしては、米国特許第５，６０８，１４９号明細書、同第５，６０８，１４４号明細書、同第５，６０４，１２１号明細書、同第５，５６９，５９７号明細書、同第５，４６６，７８５号明細書、同第５，３９９，６８０号明細書、同第５，２６８，４６３号明細書及び同第５，６０８，１４２号明細書におけるものが挙げられる。
【００２９】
化学物質調節プロモーターを使用して、外因性化学物質調節因子の適用により植物における遺伝子の発現を調節することができる。目的に応じて、プロモーターは、化学物質誘導性プロモーター（ここでは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導）又は化学物質抑制性プロモーター（ここでは、化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する）であり得る。化学物質誘導性プロモーターは、当該技術分野で既知であり、トウモロコシＩｎ２−２プロモーター（これは、ベンゼンスルホンアミド除草剤ｓａｆｅｎｅｒにより活性化される）、トウモロコシＧＳＴプロモーター（これは、発芽前除草剤として使用される疎水性求電子性化合物により活性化される）及びタバコＰＲ−１ａプロモーター（これは、サリチル酸により活性化される）が挙げられるが、これらに限定されない。所定の他の化学物質調節プロモーターとしては、ステロイド応答性プロモーター（例えば、Schena et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421-10425及びMcNellie et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257におけるグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照）並びにテトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制プロモーター（例えば、Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229-237、並びに米国特許第５，８１４，６１８号明細書及び同第５，７８９，１５６号明細書（参照されて本明細書中に援用される）を参照）が挙げられる。
【００３０】
特定の組織において亢進発現が望ましい場合、組織特異的プロモーターを利用することができる。組織特異的プロモーターとしては、Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2): 255-265、Kawamata et al (1997) Plant Cell Physiol. 38(7): 792-803、Hansen et al (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3): 337-343、Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341、Van Camp et al (1996) Plant Physiol. 112(2): 525-535、Canevascni et al (1996) Plant Physiol. 112(2): 513-524、Yamamoto et al (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773-778、Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196、Orozco et al (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138、Mutsuoka et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20): 9586-9590及びGuevara-Garcia et al (1993) Plant J. 4(3): 495-50により記載されるものが挙げられる。
【００３１】
「操作可能に連結される」は、同じ核酸分子の一部として結合され、適切に位置されて、転写がプロモーターから開始されるように配向されることを意味する。プロモーターへ操作可能に連結されるＤＮＡは、プロモーターの「転写開始調節下」にある。
【００３２】
好ましい実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター又は発生的調節プロモーターである。
【００３３】
植物に関して幅広い成功とともに従来使用されている特定の手順及びベクターは、Guerineau and Mullineaux (1993)（植物形質転換及び発現ベクター(Plant transformation and expression vectors)）. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148により記載されている。適切なベクターとしては、植物ウイルス由来のベクターが挙げられ得る（例えば、ＥＰ−Ａ−１９４８０９号を参照）。
【００３４】
ベクターはまた、除草剤に対する耐性のような選択可能な表現型を付与するような選択可能な遺伝マーカー（例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキサート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノン及びグリホセート）を包含してもよい。
【００３５】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による細胞を含む植物が提供される。
【００３６】
本発明の好ましい一実施形態において、上記植物は、以下の：トウモロコシ（Zea mays）、アブラナ（Brassica napus, Brassica rapa ssp.）、アマ（Linum usitatissimum）、アルファルファ（Medicago sativa）、イネ（Oryza sativa）、ライムギ（Secale cerale）、モロコシ（Sorghum bicolor, Sorghum vulgare）、ヒマワリ（Helianthus annus）、コムギ（Tritium aestivum）、ダイズ（Glycine max）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、落花生（Arachis hypogaea）、綿（Gossypium hirsutum）、サツマイモ（Iopmoea batatus）、キャッサバ（Manihot esculenta）、コーヒー（Cofea spp.）、ココナッツ（Cocos nucifera）、パイナップル（Anana comosus）、柑橘類の木（Citrus spp.）、カカオ（Theobroma cacao）、茶（Camellia senensis）、バナナ（Musa spp.）、アボカド（Persea americana）、イチジク（Ficus casica）、グアバ（Psidium guajava）、マンゴー（Mangifer indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイア（Carica papaya）、カシュー（Anacardium occidnetale）、マカダミア（Macadamia intergrifolia）、アーモンド（Prunus amygdalus）、テンサイ（Beta vulgaris）、カラスムギ、オオムギ、野菜及び観賞用植物から選択される。
【００３７】
本発明の植物は、好ましくは、作物(例えば、穀物（cereals）及び豆類（pulses）、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、イネ、モロコシ、キビ、キャッサバ、オオムギ及びエンドウマメ）、その他の根菜類、塊茎又は種子（seed crop）である。重要な種子は、採油用ナタネ種子（oil-seed rape）、テンサイ、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、モロコシ及びアマ（アマニ）である。本発明を適用し得る園芸植物には、レタス、エンダイブ及びアブラナ科の野菜（キャベツ、ブロッコリ及びカリフラワーを含む）が挙げられる。本発明は、タバコ、ウリ類、ニンジン、イチゴ、ヒマワリ、トマト及びトウガラシに適用し得る。
【００３８】
当該目的の種子を作る穀類植物には、採油用種子の植物及びマメ科植物が挙げられる。当該目的の種子には、穀類の種子、例えばトウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、モロコシ及びライムギ等が挙げられる。採油用種子の植物には、綿、ダイズ、サフラワー、ヒマワリ、アブラナ属、トウモロコシ、アルファルファ、ヤシ及びココナッツ等が挙げられる。マメ科植物には、豆類（beans）及びエンドウマメが挙げられる。豆類には、グアー、ローカストビーン、コロハ、ダイズ、インゲンマメ（garden beans）、ササゲ、リョクトウ、リママメ、ソラマメ、レンズマメ及びヒヨコマメ等が挙げられる。
【００３９】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による植物に由来する植物細胞又は植物組織を含む製品である。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記製品は食料品である。
【００４１】
多くの食品は、使用前に再水和される乾燥形態（例えば、乾燥スープ及び果実）で保管及び販売される。食品が口当たりを良くなるように食品の品質／質感を高めるように改善された再水和特性を有する食料品の提供は、消費者によって明らかな有益性を有する。
【００４２】
本発明の代替的な好ましい実施形態では、上記製品は紙である。
【００４３】
紙の再生利用は、特定の問題を提示する。再生利用されるべき紙からのパルプ生産は、化学的変性剤及び酵素を利用する。化学的な方法は、例えばリグニンをパルプから除去するための効率的な手段であるが、化学的処理は、多糖の分解をもたらし、且つ高価であることが既知されている。さらに、パルプから残留リグニンを除去するために、パルプが紙に加工される前に、除去を要する強力な漂白剤を使用する必要がある。これらの媒介物はまた、環境に対して害を与える。リグニンを除去するための生物学的手法が既知されている。しかしながら、かかる方法に付随する不利点が存在する。例えば、セルロース繊維に影響を及ぼさないリグニン分解(ligninolytic)酵素を唯一分泌する微生物（例えば、細菌及び／又は真菌）を提供することが重要である。この手法はまた、非常に時間がかかり（３−４週間要する）、バイオリアクタを提供する必要性に起因して高価である。生物学的処理はまた、木材チップをさらなる生物学的又は化学的パルプ化をより受け易くさせるための木材チップの前処理を包含し得る。
【００４４】
変化された機械的特性を有するセルロースを含有する本明細書中に開示するトランスジェニック植物に由来する紙製品は、リグニン抽出を容易とし、化学的／生物学的作用物質の使用が低減されるという事実に起因して、より高い品質の紙製品を提供する。
【００４５】
本発明の一態様によれば、植物細胞壁の機械的特性を変化させる方法であって、以下の：
ｉ）本発明による細胞を供給する工程、及び
ｉｉ）前記細胞から植物を栽培する工程
を含む方法。
【００４６】
本発明の好ましい方法では、前記植物又はその一部は脱水される。
【００４７】
本発明の一態様によれば、細胞壁抽出物を調製する方法であって、以下の：
ｉ）本発明による細胞を供給する工程、
ｉｉ）前記細胞を植物へと栽培する工程、及び
ｉｉｉ）前記植物から細胞壁抽出物を調製する工程
を含み、ここで前記細胞壁は変更された機械的特性を有する。
【００４８】
本発明の好ましい方法では、上記抽出物は脱水される。
【００４９】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による方法により調製される細胞壁抽出物が提供される。
【００５０】
本発明の一態様によれば、以下の：
ｉ）図６ａ及び／又は図６ｂ及び／又は図６ｃに表されるような核酸配列を含む核酸分子、
ｉｉ）（ｉ）で定義されるような前記核酸分子にハイブリダイズし、且つエクスパンシンに関連する比活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、
ｉｉｉ）アミノ酸配列モチーフＡＳＳＩＳＧＧＧを特徴とするエクスパンシンをコードする核酸分子、
ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で定義される配列に対する遺伝コードの結果として縮重している核酸配列を含む核酸分子
から成る群から選択される核酸分子によりコードされるポリペプチドを含む組成物である。
【００５１】
本発明の好ましい一実施形態では、脱水された植物材料の再水和のための作用物質としての組成物の使用である。
【００５２】
本発明の実施形態は、ここでは単なる例として、及び以下の図面を参照して記載される：
【実施例】
【００５３】
材料及び方法
植物材料
クラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)植物は、１６時間の日照時間で２０℃に設定した成長部屋中で成長させた。脱水及び再水和実験は、成長部屋条件下で、およそ１０週齢の成熟植物から切り取った葉で実施した。
【００５４】
顕微鏡法
未処理の葉組織（およそ５ｍｍ２の切片）、４８時間脱水した葉材料及び２４時間再水和させた葉組織（４８時間の脱水後に）を、０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドで真空浸潤させて、固定液中で一晩インキュベートした。続いて、葉材料を０．１Ｍリン酸緩衝液中で洗浄して、段階的に一連のエタノールで脱水させ、最終的にＬＲホワイトレジン(Agar scientific)中に包埋した。半薄０．５μｍ切片をＬｅｉｃａ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  ＵＣＴで切断して、０．３％炭酸ナトリウム中の０．６％トルイジンブルーで染色した。
【００５５】
エクスパンシン活性アッセイ
切り取った葉を０、３、８、２４時間脱水した後、さらに３、５及び２４時間再水和させた。葉を液体窒素中で凍結させて、−８０℃で保管した。凍結させた葉材料５ｇを、１５０ｍｌのカップを用いて家庭用食品ホモジナイザー(Philips Cucina)中で、均質化緩衝液（２５ｍＭ  ヘペス、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  メタ重亜硫酸ナトリウム、３ｍＭ  ジチオスレイトール、ｐＨ  ６．８）５０ｍｌ中で全出力で１分間混ぜ合わせることにより崩壊させた。葉フラグメントは、５０μｍ孔径のナイロン膜上に捕捉され、液体は廃棄した。続いて、膜において圧搾乾燥させる前に、フラグメントを均質化緩衝液５０ｍｌ中で３回洗浄した。洗浄した葉フラグメントを、１Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ヘペス、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  メタ重亜硫酸ナトリウム、３ｍＭ  ジチオスレイトール、ｐＨ６．８  １０ｍｌ中に懸濁させて、室温で１時間穏やかに振動させた。抽出物をナイロンメッシュに通して、浄化した抽出物中に０．３９ｇ／ｍｌの固形硫酸アンモニウムを徐々に溶解させることにより、タンパク質を沈降させた。１０，０００ｇで４℃にて１０分間遠心分離することにより、沈降物を収集して、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）１ｍｌ中に再懸濁させて、セファデックスＧ２５(Amersham Pharmacia Biotech)の５ｍｌカラム上で脱塩した。タンパク質濃度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉ  Ｐｌｕｓタンパク質アッセイ試薬(Pierce)を使用して、製造業者の指示書に従って算出した。
【００５６】
タンパク質抽出物は、Whitney他（２０００年）に記載されているように、エクスパンシン活性に関してアッセイした。簡潔に述べると、アセトバクター・キシリヌス(Acetobacter xylinus)の培養物により生産されるセルロース／キシログルカン複合体の２ｍｍの幅広い片を切断して、クランプ間に材料３ｍｍを載せる特注の伸び計の２つのクランプ間に保持した。複合体を５０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中に浸し、５ｇの印加力下で１５分間伸長させた。１５分後、浴用溶液を、同じ緩衝用溶液中の脱塩抽出タンパク質を含有するものと取り換えた。伸長をさらに１５分間モニタリングした。エクスパンシン活性は、タンパク質添加後の１０分間における複合体の伸長速度からタンパク質添加前の１０分間における伸長の速度を減算したものとして算出した。
【００５７】
ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡは、標準的なプロトコルに従って、３時間脱水したクラテロスチグマ属(Craterostigma)の葉組織から抽出した。逆転写（ＲＴ）は、製造業者の指示書に沿って、総ＲＮＡ  １μｇ、オリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマー(Invitrogen)及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＮアーゼ  Ｈ−逆転写酵素(Invitogen)を用いて、最終容量２０μｌ中で４２℃にて１時間実施した。対照反応は、逆転写酵素の非存在下で実施した。
【００５８】
ＰＣＲは、合成したｃＤＮＡ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(Invitrogen)及びコンセンサスエクスパンシンプライマーを用いて実施した。使用したプライマー配列は、５’−ＧＳＮＣＡＹＧＣＮＡＣＮＴＴＹＴＡＹＧＧＮＧ−３’（順方向プライマー）及び５’−ＹＴＧＣＣＡＲＴＴＹＴＧＮＣＣＣＣＡＲＴＴ−３’（逆方向プライマー）であった。ＰＣＲサイクリングパラメータは、以下の通りであった：９２℃で２分間、続いて９２℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル、最終的に７２℃で５分間。
【００５９】
ＰＣＲ産物は、製造業者の指示書に従って、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)へクローニングし、シーケンシングした。
【００６０】
３’及び５’  ＲＡＣＥ
ＣｐｌＥｘｐ１に関する完全長コード配列は、ｃＤＮＡ末端の３’及び５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）により得られた。３’ＲＡＣＥに関して、逆転写は、アダプターオリゴ（ｄＴ）３’プライマー（５’−ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３’）を使用して上述のように実施した。続いて、ＰＣＲは、遺伝子特異的５’プライマー（５’−ＧＴＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＴＣＣＡＡＣＡＣ−３’）、アダプタープライマー及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(Invitrogen)を使用して実施した。さらなるＰＣＲ増幅は、ネステッド５’遺伝子特異的プライマー（５’−ＡＣＴＡＡＣＧＴＧＧＧＣＧＧＴＧＣＴ−３’）を使用して実施した。続いて、最終的な生成物を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへクローニングして、シーケンシングした。
【００６１】
５’ＲＡＣＥに関して、逆転写は、３’遺伝子特異的プライマー（５’−ＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＡＣＧＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣ−３’）及び５’アダプターオリゴヌクレオチド（５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＡＴＧＧＣＣＧＧＧ−３’）を用いて実施された。ＰＣＲは、同じ３’遺伝子特異的プライマー及び５’アダプター（５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ−３’）を用いて実施した。特異性を改善するために、さらなるラウンドのＰＣＲを、ネステッド３’遺伝子特異的プライマー（５'-ＣＴＧＴＡＡＧＡＡＡＣＧＧＧＣＡＣＡＡＴＣＣＣＡＧＣ−３’）を用いて実施された。上述のように、生成物をクローニングして、シーケンシングした。
【００６２】
リアルタイムＰＣＲ
逆転写（ＲＴ）反応は、０、１、３、８、２４及び４８時間脱水させた後、さらみ１、３、８及び２４時間再水和させたクラテロスチグマ(Craterostigma)の葉組織から抽出したＲＮＡ  ２μｇを用いて、上述のように実施した。ＲＮＡサンプルはすべて、ｃＤＮＡ合成前にＤＮＡ分解酵素処理した。逆転写後に、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて各反応物を精製した。
【００６３】
リアルタイムＰＣＲは、内因性対照、この場合ｔｋｔ３（トランスケトラーゼ３）に対して大量に発現されるように、標準曲線法に基づいた相対定量化を用いて実施した。プライマー対は、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ(Applied Biosystems)を用いて、各エクスパンシン配列及びｔｋｔ３遺伝子に対して設計された。ＰＣＲ反応それぞれで使用されるプライマー配列及び最適化した濃度は以下の通りであった：ＣｐｌＥｘｐ１Ｆｏｗａｒｄ（１００ｎＭ）５’−ＧＣＴＣＡＧＴＡＴＡＣＡＧＣＴＧＧＧＡＴＴＧＴＧ−３’、ＣｐｌＥｘｐ１Ｒｅｖｅｒｓｅ（２００ｎＭ）５’−ＴＴＧＡＡＧＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＴＴＴＡＴＴＧＴＧ−３’、ＣｐｌＥｘｐ２Ｆｏｒｗａｒｄ（３００ｎＭ）５'−ＧＴＧＣＣＴＣＴＣＧＧＧＡＡＣＣＡＴＡＡＴ−３’、ＣｐｌＥｘｐ２Ｒｅｖｅｒｓｅ（３００ｎＭ）５’−ＴＴＧＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡ−３’、ＣｐｌＥｘｐ３Ｆｏｒｗａｒｄ（３００ｎＭ）５'−ＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＡＡＣＧＣＴＧＴＴＣＡ−３’、ＣｐｌＥｘｐ３Ｒｅｖｅｒｓｅ（５０ｎＭ）５’−ＧＴＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧ−３’、ｔｋｔ３Ｆｏｒｗａｒｄ（３００ｎＭ）５’−ＣＡＴＣＴＧＧＧＴＴＡＡＧＡＡＣＧＧＡＡＡＣＡ−３’及びｔｋｔ３Ｒｅｖｅｒｓｅ（５０ｎＭ）５’−ＣＡＡＡＡＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＧＧＴＡＡＴＣ−３’。
【００６４】
２５μｌのＰＣＲ反応は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００配列検出システムにより光学９６ウェル反応プレート(Applied Biosystems)においてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス(Appled Biosystems)を用いて実施した。サイクリングパラメータは、以下の通りであった：５０℃を２分間、９５℃を１０分間、続いて９５℃を１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル。反応はすべて、三重反復又はそれ以上で行った。
【００６５】
［実施例］
脱水中の形態学的変化
脱水中のクラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)の葉の細胞構造で観察される劇的な変化は、図１で明らかに実証される。典型的な水和された葉における葉肉及び維管束細胞の正常な外観（図１ａ、図１ｂ）は、４８時間の脱水後に大幅に崩壊された（図１ｃ、図１ｄ）。予想通り、水の損失は、葉肉細胞の著しい収縮をもたらし、広範囲の細胞壁フォールディングを伴った。木部導管もまた、脱水により影響を受けたが、この細胞型に特徴的な二次細胞壁肥厚の存在に起因して、接平面ではなく縦断面において主に収縮を示した（図１ｄ）。二次肥厚が単独で、開口状態で導管を維持するようであった。しかしながら、細胞壁フォールディングは、木部内、及び導管と葉肉細胞との間の接合点で特に顕著であった。４８時間の脱水後の葉組織の再水和は、完全な回復、及び葉内で正常な細胞形態への復帰をもたらした。
【００６６】
脱水及び再水和中のエクスパンシン活性
エクスパンシン活性は、０、３、８、２４及び４８時間脱水させ、続いて３、５及び２４時間再水和させたクラテロスチグマ属(Craterostigma)の葉材料から単離した粗製細胞壁タンパク質抽出物において測定した。活性は、一定荷重下で、セルロース／キシログルカン複合体へのタンパク質の添加後の伸長速度の増加により測定した。
【００６７】
特定時間の長さで脱水及び再水和させたクラテロスチグマ属(Craterostigma)の切り取った葉におけるエクスパンシン活性の結果は、活性が組織の含水量に応じて著しく変化することを示した（図２）。また、エクスパンシン活性のアッセイに使用したものと同じ特定時点での切り取った葉の代表的な画像が、この図中に示される。
【００６８】
このデータにより、エクスパンシン活性は、脱水の初期の間に確実に増加して、８時間後に対照水和葉に対しておよそ３倍増加のピークに到達することが実証された。続いて、活性のレベルは、脱水の後期段階にわたって減少し、活性は、２４時間までに新鮮な水和葉で検出される活性レベルと同様のレベルにまで低減した。続く水なしでの４８時間では、エクスパンシン活性は、対照のレベル以下のレベルにまで低減した。この脱水期間中の切り取った葉の形態学的変化の検査は、８時間までの水欠乏の初期段階が、葉形状の比較的わずかな変化をもたらすが、葉のサイズに関しては、減少が顕著に観られた。大きさの減少が明白であることを明らかにした。水なしでの２４時間後に、葉は、サイズが著しく収縮し、４８時間までに、葉はさらに小さくなり、広範囲の萎縮を受けた。
【００６９】
エクスパンシン活性はまた、脱水の４８時間後に葉を再水和させる際にも測定した（図２）。これらの測定は、水取り込みの最初の５時間の間にエクスパンシンの顕著な増加を実証した。水の添加のわずか３時間後に、活性レベルは、水和葉に対して４倍を上回って増加した。対照と比較して５倍を上回る増加である活性の最高レベルは、再水和の５時間後に検出された。続いて、活性は低下して、最水和の２４時間後には新鮮な葉で観察されるレベルと同様のレベルにまで戻った。再水和中の葉形状変化は、相当なアンフォールディングを伴って迅速に起こり、水の添加後の最初の３時間のうちに起きた。上記エクスパンシンとアンファーリング(furling)は、５時間までにさらに増加して、再水和の２４時間後に、葉は、それらの本来の形態学的状態に戻った。
【００７０】
クラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)由来のエクスパンシンｃＤＮＡの単離
エクスパンシン配列は、シロイヌナズナ(Arabidopsis)エクスパンシンのα亜群に対して設計されたコンセンサスプライマーを使用して、３時間脱水した葉材料から抽出したＣ．プランタギネウム(C. plantagineum)ＲＮＡに由来するｃＤＮＡから、ＰＣＲにより増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングし、シーケンシングして、エクスパンシンｃＤＮＡ配列の数を同定した。さらなる分析により、これらの配列が、３つの別個の群へ分類され、クラテロスチグマ属(Craterostigma)の葉を脱水する際に３つの別個のエクスパンシンｃＤＮＡの存在を実証した。これらの遺伝子は、ＣｐｌＥｘｐ１、ＣｐｌＥｘｐ２及びＣｐｌＥｘｐ３と称した。
【００７１】
完全長コード配列は、ｃＤＮＡの５’及び３’末端迅速増幅により、これらの遺伝子の１つであるＣｐｌＥｘｐ１に関して得られ、α−エクスパンシンに特有の特徴的なシグナルペプチド及びモチーフを保有する２６１個のアミノ酸から構成されるタンパク質を示した（図３）。コンセンサスプライマーを用いて増幅した配列の他に、３’末端のみが、ＣｐｌＥｘｐ２（２１６個のアミノ酸）及びＣｐｌＥｘｐ３（２２４個のアミノ酸）に関して得られた。このため、これらの配列は、５’末端にあるシグナルペプチドを欠如するが、α−エクスパンシンモチーフを識別する他のすべては存在している。ヌクレオチドレベルで、３つのクラテロスチグマ属(Craterostigma)α−エクスパンシンは、およそ７０％の配列同一性を共有する。シロイヌナズナ(Arabidopsis)由来の３つの代表的なα−エクスパンシン（ＡｔｈＥｘｐα１．２、GenBankアクセッション番号ＡＡＧ６００９５、ＡｔｈＥｘｐα１．５、GenBankアクセッション番号ＢＡＢ１１２５９及びＡｔｈＥｘｐα１．６、GenBankアクセッション番号ＡＡＢ９７１２５）並びにトウモロコシ由来の１つの代表的なα−エクスパンシン（ＺｍａＥｘｐ２、GenBankアクセッション番号ＡＡＫ５６１２０）とのこれらの配列のアラインメントを図３に示す。このデータは、本発明で単離したＣ．プランタギネウム(C. plantagineum)エクスパンシンと他の従来規定されたα−エクスパンシンとの間に相同の有意性を明らかに実証する。上述のように、大きな度合いの異種性が、これらのタンパク質に関するシグナルペプチドをコードするこれらの配列の５’末端に存在する。これらのα−エクスパンシンの他のすべてのドメインは、高度に保存される。１つの顕著な例外が、２つの高度に保存されるシステイン間の短領域に存在し、ここでは、ＣｐｌＥｘｐ１は、短い３個又は４個のアミノ酸挿入を示す（図３において配列上のアステリスクにより示される）。典型的なα−エクスパンシンでは、この領域は、およそ６アミノ酸長であり、概して一連の２〜５個の荷電アミノアシル残基及び保存トリプトファンを特徴とする。しかしながら、ＣｐｌＥｘｐ１では、タンパク質配列のこの伸長は、１０アミノ酸長であり、主として非荷電アミノ酸から構成される（ＣＡＳＳＩＳＧＧＧＫＷＣ）。この領域は、ＣｐｌＥｘｐ２又はＣｐｌＥｘｐ３のいずれにも存在せず、配列アラインメントは、唯一の他の既知のエクスパンシン配列、すなわちトウモロコシ由来のエクスパンシン２の配列がこの位置で間接的に類似したモチーフを含有することを示す。
【００７２】
シロイヌナズナ(Arabidopsis)及びイネのものと一緒のクラテロスチグマ属(Craterostigma)α−エクスパンシンの系統学的分析は、３つのすべての配列が、シロイヌナズナ(Arabidopsis)及びイネエクスパンシンファミリーから従来規定されたサブファミリー及びサブグループへ分類されることを実証した。３つのタンパク質配列のうち、ＣｐｌＥｘｐ２のみが、種のいずれかにおける直接的なオルソログであるＡｔｈＥｘｐα１．１１を有するようであった。ＣｐｌＥｘｐ３は、主にイネα−エクスパンシンにより密接に関連されたのに対して、ＣｐｌＥｘｐ１は、主としてシロイヌナズナ(Arabidopsis)α−エクスパンシンとともに分類された。また、ＣｐｌＥｘｐ１は、ＣｐｌＥｘｐ２及びＣｐｌＥｘｐ３と比較して別個の亜群内に存在することにも注目すべきである。
【００７３】
脱水及び再水和中のエクスパンシン発現
脱水及び再水和のプロセス全体にわたって同定される３つのα−エクスパンシン転写物それぞれの存在量を測定するために、特定の時点で、Ｃ．プランタギネウム(C. plantagineum)の切り取った葉からＲＮＡを単離した。リアルタイムＰＣＲは、各エクスパンシン及びトランスケトラーゼ３（ｔｋｔ３）遺伝子に対して設計された特定のプライマーを使用して実施した。相対定量は、各プライマー対に関して標準曲線を作成することにより実施され、相対量は、内因性対照に対して表された。ｔｋｔ３遺伝子（GenBankアクセッション番号Ｚ４６６４６）は、この遺伝子が常時発現され、且つ脱水又は再水和現象により影響を受けないことがこれまでに示されている（Bernacchia他、１９９５年）ことから、内因性対照として使用した。脱水及び再水和全体にわたる各エクスパンシンの転写物レベルは、水和（０時間の脱水）組織に関して示される。
【００７４】
リアルタイムＰＣＲ実験からのデータを図５に示し、３つのエクスパンシンのうち２つ（ＣｐｌＥｘｐ１及びＣｐｌＥｘｐ３）が、４８時間の脱水全体にわたって、発現の有意な変化を受けたことを明らかとにする。ＣｐｌＥｘｐ１、及びより程度は低いが、ＣｐｌＥｘｐ３は、脱水の初期段階中にｔｋｔ３に対して存在量が増加し、ともに８時間でピークに達した（図５ａ）。続いて、水なしでの４８時間の最終時点まで、レベルは着実に低下した。再水和の２４時間全体にわたって、ＣｐｌＥｘｐ３の発現は、大部分が変化されないままであったのに対して、ＣｐｌＥｘｐ１は、大量に増加して、再水和の３時間後には、収穫したての葉に対してほぼ３００倍のピークに達した（図５ｂ）。ＣｐｌＥｘｐ１に関する転写物レベルは、続く８時間の再水和の時点までに激しく減少した後、再水和の２４時間後に、再度およそ３０倍に増加した。対して、ＣｐｌＥｘｐ２発現レベルは、脱水又は再水和現象のいずれにおいても大規模な影響を受けなかった。
【００７５】
テマリカタヒバのクラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)は、その植物性組織の脱水中に、広範囲であるが可逆的な細胞壁フォールディングを受ける。４８時間脱水した切り取った葉において、形態学的変化は著しく、葉の萎縮を伴う葉の大きさのかなりの減少を伴った。細胞レベルでは、細胞収縮及び壁フォールディングは、葉肉及び維管束細胞の両方全体にわたって明白であった。壁フォールディングは、木部内で特に顕著であったが、これらの細胞の崩壊は、二次肥厚(secondary thickenings)の存在により妨げられた。壁フォールディングのこのメカニズムは、脱水中に細胞が収縮した後、再水和全体にわたって膨張する際に被るストレスの幾つかを軽減する可能性が高い。したがって、これらの事象は、Ｃ．プランタギネウム(C. plantagineum)の、乾燥を生き延びる能力において有意な役割を果たすと考えられる。
【００７６】
細胞壁フォールディングのこのメカニズムは、テマリカタヒバ植物の中では稀であるが、それは、クラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)に限られず、かなりの細胞壁可動性を示唆する。このことが、特有の細胞壁組成、すなわち脱水及び再水和中の細胞壁構造の変化に起因するか、又はこのことは、新たな壁構成成分の合成及び他の代謝回転を包含する動的プロセスであるかどうかは、依然として確立されていない。しかしながら、従来の研究により、クラテロスチグマ・ウィルムシイ(Craterostigma wilmsii)における細胞壁フォールディングのメカニズムは、壁構造及び組成の変化を伴うことが示唆されている（Vicre他、１９９９年）。これらの変化は、脱水中に細胞壁においてキシログルカン及び非エステル化ペクチンの増加し、レベルは再水和中に下降することを伴うことを示した。
【００７７】
本発明者等は、クラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)の葉の脱水及び再水和中に細胞壁フォールディングのこのプロセスにおけるエクスパンシンに関する潜在的な役割を検査した。切り取った葉が乾燥を生き延び、且つ再水和後に生理学的活性を再開させることが可能であり、このことから全植物生理学の正確な描写として受け入れられる（Bartels他、１９９０年）ため、切り取った葉を使用することで実験を行った。エクスパンシン活性に関するアッセイにより、脱水及び再水和の両方の初期段階で起きる活性の増加に伴い、活性が組織の含水量に依存して著しく変化することが示された。Ｃ．プランタギネウム(C. plantagineum)由来の３つのα−エクスパンシンの引き続く単離により、リアルタイムＰＣＲによる脱水及び再水和のプロセス全体にわたるこれらの遺伝子それぞれに関する転写物レベルの変化の分析が可能となった。これらの遺伝子の１つであるＣｐｌＥｘｐ１は、脱水の初期段階中に、及び再水和全体にわたって、発現レベルの有意な変化を受けた。ＣｐｌＥｘｐ３は、唯一脱水の準備段階中に転写物レベルのわずかな変化を示したのに対して、ＣｐｌＥｘｐ２の発現は、ほんとんど影響を受けなかった。総括すると、これらの総合データは、エクスパンシン活性と発現と脱水及び再水和のプロセスとの間に明確な相関を示唆する。エクスパンシン活性と発現との間の関連性における１つの顕著な例外は、再水和の初期段階中のＣｐｌＥｘｐ１に関する転写物レベルの増加及び相当するエクスパンシン活性の増加における明らかな相違がある。これは、これらの代替的アプローチに対する感受性の差異を反映し得る。しかしながら、より有望な説明は、干ばつストレスにより引き起こされる代謝に対する悪影響が、回復中に翻訳現象を決定的に弱めることであり得る。
【００７８】
エクスパンシンは、多数の発生プロセスに関与していることが示されており、発生プロセスでは、これらの酵素の作用により、例えば成長中の細胞壁伸長、又は細胞壁の崩壊若しくは軟化（例えば、果実熟成中）が可能となる。したがって、脱水及び再水和中のクラテロスチグマ属(Craterostigma)における細胞壁の修復におけるエクスパンシンに関する役割を予想することは困難ではない。これは、脱水中の壁構成成分の除去、及び細胞が再水和し、且つ膨張する際の新たなポリマーの合成を包含する動的役割であり得る。これは、細胞壁の崩壊及び細胞壁伸長の両方の態様を併用している。あるいは、乾燥耐性におけるエクスパンシンの役割は、潜在的にセルロース／キシログルカンネットワーク間の結合を崩壊することによるものであり得る。したがって、このことは、細胞壁の構造的完全性に影響を及ぼし、壁内のポリマーにより大きな運動の自由度を可能にすることにより可動性を増加させ得る。
【００７９】
従来の研究により、多数の脱水誘導性（Neale他、２０００年、Kirch他、２００１年）及び再水和誘導性（Oono他、２００３年）遺伝子が同定されており、それらのうちの幾つかは、細胞壁関連性であり、他の種における乾燥耐性及びストレス防御を改善するための優れた候補物を提供している。Sunkar他（２００３年）は、脱水誘導性であるとしてＣ．プランタギネウム(C. plantagineum)において同定されたシロイヌナズナ(Aradbidopsis)におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の過剰発現が、脱水、塩、重金属、パラコート及び過酸化水素に対する耐性を改善することを示している。明白なオルソログは、シロイヌナズナ(Arabidopsis)又はイネにおいてＣｐｌＥｘｐ１又はＣｐｌＥｘｐ３に関して存在しないが、主として非荷電性アミノ酸から構成されるＣｐｌＥｘｐ１に対して特有の小挿入は、興味深いモチーフであり、さらなる研究を必要とする。
【００８０】
食品の脱水及び再水和に対するエクスパンシン処理の効果
乾燥果実及び野菜製品の再水和を妨害する主要な要因の１つは、細胞壁の硬化であり、これは、広範囲に水素結合された細胞壁のポリマー系を再水和することの困難性に幾分起因する可能性が高い。したがって、再水和は、水の可塑化効果に大いに依存する。エクスパンシンは、細胞壁ポリマー間の水素結合を崩壊し、本質的に細胞壁可塑化剤として機能すると考えられる。Ｃ．プランタギネウム(C. plantagineum)の脱水応答におけるエクスパンシンの明白な役割、及び細胞壁に対するそれらの可塑化効果を考慮すると、これらのタンパク質は、植物材料の、効率的に脱水及び再水和する能力を増強するのに有用であり得る。
【００８１】
本発明者等は、再水和アッセイにおけるＣ．プランタギネウム(C. plantagineum)由来のエクスパンシン及びタンパク質抽出物の有用性を検査するために初期実験を実施して、これらの試験からの実例結果を図８に提示する。本発明者等は、組換えキュウリエクスパンシン及びＣ．プランタギネウム(C. plantagineum)細胞壁タンパク質がともに、ジャガイモ及びニンジンの脱水円筒体による水の取り込みを有効に増加させることを見出した。これらの効果は、テマリカタヒバを研究することから得られる洞察が、特に乾燥食品の領域における産業上の利用において有用であり得るという本発明者等の仮説を強力に支持する。興味深いことに、Ｃ．プランタギネウム(C. plantagineum)由来の細胞壁抽出物は、この粗製抽出物において見られるような組み換えキュウリエクスパンシンよりも効果的であるようであった。Ｃ．プランタギネウム(C. plantagineum)エクスパンシンは、この粗製抽出物のほんのわずかな割合を示す可能性が高く、これは、Ｃ．プランタギネウム(C. plantagineum)エクスパンシンはいずれも、キュウリエクスパンシンよりもこれらのアッセイではより効果的であることを示唆し得る。
【００８２】
参考文献
【表１】
2007535300.tif 000002
【００８３】
【表２】
2007535300.tif 000003
【００８４】
【表３】
2007535300.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】０時間の脱水（ａ、ｂ）及び４８時間の脱水（ｃ、ｄ）後の樹脂に包埋したクラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)の葉組織の０．５μｍのトルイジンブルー染色した切片。ｍｃ、葉肉細胞、ｖｃ、維管束細胞、ｘｙ、木部。広範囲の細胞壁フォールディングを示す領域を示す（＊）。
【図２】（ａ）クラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)の葉の脱水及び再水和におけるエクスパンシン活性。粗製細胞壁タンパク質抽出物は、脱水したクラテロスチグマ属(Craterostigma)の葉材料から単離され、続いて、特定の期間再水和させた。活性は、一定荷重下でセルロース／キシログルカン複合体へのエクスパンシン添加後に、伸長速度の増加に従って測定した。測定値は、標準化したタンパク質濃度に関連して表される。データは、６つのそれぞれにおける測定値からの平均値及び標準誤差である。実験全体は、３回繰り返され、同様の結果が得られた。（ｂ）脱水及び再水和の様々な段階でのＣ．プランタギネウム(C. plantagineum)の葉の全体的な葉形態を表す画像。タイムポイントは、エクスパンシン活性をアッセイするのに使用したものと同じである。
【図３】クラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)（ＣｐｌＥｘｐ１、ＣｐｌＥｘｐ２及びＣｐｌＥｘｐ３）、シロイヌナズナ(Arabidopsis)（ＡｔｈＥｘｐα１．２、GenBankアクセッション番号ＡＡＧ６００９５、ＡｔｈＥｘｐα１．５、GenBankアクセッション番号ＢＡＢ１１２５９、ＡｔｈＥｘｐα１．６、GenBankアクセッション番号ＡＡＢ９７１２５）及びトウモロコシ（ＺｍａＥｘｐ２、GenBankアクセッション番号ＡＡＫ５６１２０）由来のα−エクスパンシンのタンパク質配列アラインメント。網掛け領域は、配列が整列する領域を表し、配色は、保存残基（黒）及び類似残基（灰色）を表す。
【図４】切り取ったクラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)の葉の脱水及び再水和中のエクスパンシン活性を示す図である。
【図５】リアルタイムＰＣＲにより決定される場合の脱水及び再水和の特定段階でのクラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)由来の３つのα−エクスパンシン遺伝子の発現。転写物レベルは、標準物質又は内因性対照、この場合はトランスケトラーゼ３遺伝子に対して表される。この遺伝子の発現は、脱水又は再水和現象により影響を受けないことがこれまでに知られている。
【図６】図６ａ、図６ｂ及び図６ｃは、クラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)エクスパンシンの核酸配列である。
【図７】図７ａ、図７ｂ及び図７ｃは、クラテロスチグマ・プランタギネウム(Craterostigma plantagineum)エクスパンシンのアミノ酸配列である。
【図８】乾燥植物材料の再水和に対するエクスパンシンの影響を示す図である。
【図１】
2007535300.tif 000005
【図２】
2007535300.tif 000006
【図３】
2007535300.tif 000007
【図４】
2007535300.tif 000008
【図５】
2007535300.tif 000009
【図６】
2007535300.tif 000010
【図７】
2007535300.tif 000011
【図８】
2007535300.tif 000012
【国際調査報告】
2007535300.tif 000013
2007535300.tif 000014
2007535300.tif 000015
2007535300.tif 000016
2007535300.tif 000017
2007535300.tif 000018