(57)【要約】  本発明は、タンパク質機能の阻害剤に関する。特に、本発明は、血管新生、造血および胚形成において極めて重要な役割を果たす分子の阻害剤に関する。血管新生および造血の調節におけるこのような阻害剤の使用を記載する。
2007510625.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＭＯ２のＬＩＭ２ドメインに結合して、ＬＭＯ２の機能活性を阻害することができるＬＩＭ２阻害剤。
【請求項２】
ペプチドであり、コンセンサス配列：
Ｈｉｓ／ＣＸＸＣ
（式中、Ｃは亜鉛結合Ｃｙｓであり、
Ｈｉｓはヒスチジンを示し、
Ｘは任意のアミノ酸である）
を含む、請求項１に記載のＬＩＭ２阻害剤。
【請求項３】
ペプチドであり、コンセンサス配列：
ＨｈＨｉｓ／ＣＸＸ1Ｃｈ
（式中、ｈは疎水性アミノ酸を示し、
Ｈｉｓはヒスチジンを示し、
Ｃはシステインを示し、
Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｘ1は荷電アミノ酸を示す）
を含む、請求項２に記載のＬＩＭ２阻害剤。
【請求項４】
ペプチドアプタマーである、請求項２または３に記載のＬＩＭ２阻害剤。
【請求項５】
ペプチドが足場内に拘束されている、請求項３または４に記載のＬＩＭ２阻害剤。
【請求項６】
ペプチドは、少なくともペプチドのＮ末端で足場内に拘束されている、請求項２〜５のいずれか１項に記載のＬＩＭ２阻害剤。
【請求項７】
ペプチドは、少なくともペプチドのＣ末端で足場内に拘束されている、請求項２〜５のいずれか１項に記載のＬＩＭ２阻害剤。
【請求項８】
ペプチドがチオレドキシンタンパク質（Ｔｒｘ）の足場内に拘束されている、請求項５〜７のいずれか１項に記載のＬＩＭ２阻害剤。
【請求項９】
図２に図示され、配列番号２〜１１にそれぞれ指定されているクローン２０７、クローン２０９、クローン８５、クローン８１、クローン６３、クローン７２、クローン２４７、クローン９０、クローン６９およびクローン２０２からなるペプチドアプタマー群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＬＩＭ２阻害剤。
【請求項１０】
図２に図示され、配列番号２、３、４にそれぞれ指定されているクローン２０７、クローン２０９、クローン８５からなるペプチドアプタマーからなる群から選択される、請求項９に記載のＬＩＭ２阻害剤。
【請求項１１】
抗体である、請求項１に記載のＬＩＭ２阻害剤。
【請求項１２】
図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有するＣＤＲを少なくとも１つ含む、請求項１１に記載のＬＩＭ２抗体阻害剤。
【請求項１３】
図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）にそれぞれ指定されているアミノ酸配列を有するＣＤＲを３つ全て含み、一体として抗原結合部位を形成する、請求項１２に記載の抗ＬＭＯ２抗体。
【請求項１４】
ｓｃＦｖまたはｄＡｂである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の抗ＬＭＯ２抗体（ＬＩＭ２阻害剤）。
【請求項１５】
ｓｃＦｖである、請求項１４に記載の抗ＬＭＯ２抗体（ＬＩＭ２阻害剤）。
【請求項１６】
細胞内抗体（細胞内結合抗体）である、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の抗ＬＭＯ２抗体（ＬＩＭ２阻害剤）。
【請求項１７】
請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の抗ＬＭＯ２抗体（ＬＩＭ２阻害剤）をコードする核酸。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
核局在化シグナルをさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＬＩＭ２阻害剤。
【請求項２１】
細胞膜輸送活性を担当するタンパク質のドメインまたは配列に融合またはコンジュゲートする、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＬＩＭ２阻害剤。
【請求項２２】
細胞膜輸送活性を担当するタンパク質のドメインまたは配列が、ＨＩＶ−１−トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）、ショウジョウバエのアンテナペディアホメオドメインタンパク質および単純ヘルペスウイルス１型ＶＰ２２タンパク質からなる群から選択されるもの１つ以上である、請求項２１に記載のＬＩＭ２阻害剤。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の１つ以上のＬＩＭ２阻害剤および製薬学的に許容されうる担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＬＩＭ２阻害剤または請求項２０に記載の組成物の、ＬＭＯ２の機能活性を阻害するための使用。
【請求項２５】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＬＩＭ２阻害剤または請求項２０に記載の組成物の、ＬＭＯ２の機能活性を阻害するための医薬品の製造への使用。
【請求項２６】
医薬品に使用するための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＬＩＭ２阻害剤または請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
腫瘍形成、腫瘍転移、炎症、ＬＭＯ２介在性Ｔ細胞白血病および糖尿病性網膜症からなる群から選択される状態のうち１つ以上を予防および／または治療するための医薬品を製造する際の、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＬＩＭ２阻害剤１つ以上または請求項２３に記載の組成物の使用。
【請求項２８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＬＩＭ２阻害剤１つ以上を、治療を必要としている患者に投与するステップを含む、腫瘍形成、腫瘍転移、ＬＭＯ２介在性Ｔ細胞白血病、炎症、虚血、糖尿病性網膜症からなる群から選択される任意の状態１つ以上を予防および／または治療するための方法。
【請求項２９】
状態が腫瘍形成および／または腫瘍転移である、請求項２６に記載の使用または請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
状態がＬＭＯ２  Ｔ細胞介在性白血病である、請求項２６に記載の使用または請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質機能の阻害剤に関する。特に、本発明は、血管新生、造血および胚形成において極めて重要な役割を果たす分子の阻害剤に関する。血管新生、造血および胚形成の調節におけるこのような阻害剤の用途が記載されている。
【背景技術】
【０００２】
ＬＭＯ２は胚形成、造血および血管新生におけるいくつかの主要な経路のマスターレギュレーターであり、ＬＩＭドメインに関係するタンパク質−タンパク質相互作用により上記状況においてその機能を実施する。治療的観点からみたＬＭＯ２の最も適切な機能は、血管新生における役割であり、ＬＭＯ２は、例えば、原発性固形腫瘍増殖および転移蓄積の拡大に本質的で、必須であるリモデリング過程を構成する血管内皮分裂および遊走の調節に役割を果たす。タンパク質相互作用においてＬＭＯ２の機能を妨害することができる薬剤の開発は、腫瘍におけるなどの異常な血管新生を防止するために治療的に非常に有用となると思われる。
【０００３】
染色体転座結合および染色体転座に影響される遺伝子のｃＤＮＡコピーの分子クローニングにより、非常に多数の異なる転座が研究された（1に総説が示されている）。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖座が第７染色体、バンドｑ３５にマッピングされたとき白血病における染色体転座の研究がさらに実施され、Ｔ細胞腫瘍における染色体転座は、正常なリンパ球系統の発生において再配列を受けるＴＣＲ遺伝子の本質的な染色体の不安定性によって介在されることが示唆された2。これは、ＴＣＲδおよびＴＣＲαによる染色体転座結合部位のＬＭＯ１およびＬＭＯ２のクローニング3〜6ならびにＴＣＲβによる染色体転座部位のＨＯＸ１１およびＬＭＯ２のクローニング5,7〜10によって確認された。
【０００４】
染色体転座が起きた後の遺伝子構造の早期分析は、遺伝子融合または発癌遺伝子活性化(新たな染色体環境による強制的な発現)が生じたことを示した(1に総説が示されている）。さらに、転写因子は染色体転座の頻繁な標的であるが11,12、明白な区別は慢性および急性白血病の染色体転座の間に引くことができると思われ12、後者のカテゴリーだけが転写因子に関与することが１９９０年代初めに明らかになった。これにより、染色体転座−マスター遺伝子モデルが生じ12、そのモデルでは転写調節因子および発生調節因子が染色体転座の主要な標的であること、ならびにそれらの強制的な発現または遺伝子融合は転写バランスを変更し、それによって罹患細胞における細胞運命の調節に影響を与えることが前提とされた。
【０００５】
急性癌の染色体転座−遺伝子は、上流マスター遺伝子であり、その産物は下流経路を調節する。従って、染色体転座の指向性の主要な部分は、染色体転座後に生じる転写因子相互作用の特異性および転写経路に対して結果として生じる影響による。
【０００６】
Ｔ細胞急性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）のＬＭＯ２遺伝子は、染色体転座−マスター遺伝子のパラダイムである（13に概説されている）。ＬＭＯ２は、小型ＬＩＭオンリータンパク質をコードする４つの遺伝子ファミリーに属し、その２つはＴ−ＡＬＬを生ずる独立染色体転座に関与する。ＬＭＯ２は第１１染色体、バンドｐ１３に位置し、Ｔ細胞において１４ｑ１１または７ｑ３５による染色体転座によって特異的に活性化される。これらの染色体転座のブレークポイントは、天然のＬＭＯ２プロモーターの上流に生じ、転座が生じた細胞のＬＭＯ２タンパク質の強制的な発現を生じる（タンパク質産物自体はこれによって影響されない）。遺伝子は転写され、各々２つのＬＩＭフィンガーを有する２つの亜鉛結合ＬＩＭドメインを含む１５６ααタンパク質に翻訳される（各ＬＩＭフィンガーは、亜鉛原子および約１６〜２０残基のフィンガーに配位する、４つのシステインまたは３つのシステインプラス１つのヒスチジンまたはアスパラギン酸残基の亜鉛結合モチーフを含む、図１）。ＬＩＭドメインはＧＡＴＡ  Ｚｎフィンガーに構造的に関連するが、ＬＩＭドメインの特徴は２つのααだけによる各ＬＩＭ  Ｚｎフィンガーの分離である。ＬＩＭドメインの機能は、染色体転座−マスター遺伝子産物の一定の特徴であるタンパク質−タンパク質相互作用にある14〜16。ＬＭＯ２は、赤血球細胞に見られるＤＮＡ結合複合体のＴＡＬ１／ＳＣＬ（別のＴ−ＡＬＬ転座関連タンパク質）、ＬＤＢ１およびＧＡＴＡ−１に結合することができる17。この複合体は、約１２塩基対によってＧＡＴＡ部位から分離されたＥボックスを含む二連ＤＮＡ部位に結合することができる。本発明者らは、ＬＭＯ２の第２のＬＩＭドメインに特異的に結合し、ＬＭＯ２の細胞機能を阻害することができるペプチドアプタマーセットを単離した。これらの試薬は、腫瘍血管新生を阻害、ＬＭＯ２介在性Ｔ細胞白血病を阻止、虚血、炎症および糖尿病性網膜症などの、血管新生が重要な臨床状態においてＬＭＯ２機能を阻害するのに有用であるはずである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、細菌タンパク質チオレドキシン（Ｔｒｘ）の外部ループに基づいてペプチドアプタマーライブラリーをスクリーニングし、ＬＭＯ２タンパク質の第２のＬＩＭドメイン（ＬＩＭ２）に特異的に結合するペプチドセット（「抗ＬＭＯ２試薬／ＬＩＭ２阻害剤」として本明細書において知られている）を同定した。これらのペプチドアプタマーは、驚くべきことに、転写因子ＬＭＯ２に依存する胚形成および血管新生においてＬＭＯ２の機能を阻害することが見出された。
【０００８】
従って、これらのＬＩＭ２阻害剤／抗ＬＭＯ２試薬は、腫瘍血管新生などの病的状況においてＬＭＯ２機能を防止する、ＬＭＯ２介在性Ｔ細胞白血病を阻止する、ならびに虚血、炎症および糖尿病性網膜症などの、血管新生が重要な臨床状態においてＬＭＯ２機能を阻害する際において治療的にかなり有用であると考えられている。
【０００９】
従って、第一の態様において、本発明は、ＬＭＯ２のＬＩＭドメインに結合し、ＬＭＯ２の機能活性を阻害することができる薬剤（ＬＩＭ２阻害剤／抗ＬＭＯ２試薬）を提供する。
【００１０】
本発明によると、（ＬＭＯ２の機能活性）「を阻害する」という用語は、本発明の範囲において、好適な対照と比較したときのＬＭＯ２の機能活性の有意な阻害を含む。有利には、（ＬＭＯ２の機能活性）「を阻害する」という用語は、好適な対照と比較するとき、機能活性の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％阻害をいう。最も有利には、（ＬＭＯ２の機能活性）「を阻害する」は、好適な対照と比較するとき、ＬＭＯ２の機能活性の９５、９６、９７、９８、９９または１００％阻害をいう。好適な対照は当業者に周知であり、本発明の詳細な説明および実施例にも記載されている。
【００１１】
本発明者らは、驚くべきことに、全てのＬＩＭ２阻害剤ペプチド（ＬＭＯ２の機能活性を実質的に阻害するペプチド）は、以下に記載するコンセンサス配列を有することを見出した。コンセンサス配列は、ＬＭＯ２の機能活性を阻害するのに必須であると本発明者らが考えているある構造的特徴をペプチドに与える。
【００１２】
従って、本発明の上記の態様の好ましい実施態様において、ＬＩＭ２阻害剤はペプチドであり、コンセンサス配列：
Ｈｉｓ／ＣＸＸＣ
（式中、Ｃは亜鉛結合Ｃｙｓであり、
Ｈｉｓはヒスチジンを示し、
Ｘは任意のアミノ酸である）
を含む。
【００１３】
本発明の上記の態様によると、有利には、ＬＩＭ２阻害剤はペプチドであり、コンセンサス配列
ＨｈＨｉｓ／ＣＸＸ1Ｃｈ
（式中、ｈは疎水性アミノ酸を示し、
Ｈｉｓはヒスチジンを示し、
Ｃはシステインを示し、
Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｘ1は荷電アミノ酸を示す）
を含む
【００１４】
有利には、本発明によるペプチドＬＩＭ２阻害剤はアプタマーであり、上記のコンセンサス配列を含む。
【００１５】
さらに有利には、本発明によるＬＩＭ２阻害剤は、図２ｃにクローン２０７、クローン２０９、クローン８５、クローン８１、クローン６３、クローン７２、クローン２４７、クローン９０、クローン６９およびクローン２０２として図示され、配列番号２〜１１にそれぞれ指定されている１０のペプチド配列の任意の１つ以上を含む。
【００１６】
さらに有利には、本発明によるさらに別のＬＩＭ２阻害剤は、図２にクローン２０７、クローン２０９、クローン８５、クローン８１、クローン６３、クローン７２、クローン２４７、クローン９０、クローン６９およびクローン２０２として図示され、配列番号２〜１１にそれぞれ指定されている１０のペプチド配列の任意の１つ以上である。
【００１７】
最も有利には、本発明によるＬＩＭ２阻害剤は、図２にクローン２０７、クローン２０９、クローン８５として図示され、配列番号２、３および４にそれぞれ指定されているペプチド配列の任意の１つ以上である。
【００１８】
本発明によるペプチド阻害剤は、拘束されていない形態またはＣ末端および／またはＮ末端が足場（スキャホールド）内に拘束されている形態で使用することができる。好適な足場は当業者に周知であり、天然型であってもまたは合成されたものであってもよい。好適な天然型足場は本発明の詳細な説明に記載されている。本発明によると、有利には、足場はタンパク質足場およびチオレドキシンタンパク質である。
【００１９】
本発明によると、本発明による阻害剤は、１つ以上の細胞内標的剤を含むことができる。有利には、本発明による細胞内標的剤は核局在化シグナルである。好適な核局在化シグナルは当業者に周知であり、本発明の詳細な説明に記載されている。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、本発明による１つ以上のＬＩＭ２阻害剤／抗ＬＭＯ２試薬および製薬学的に許容されうる担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物を提供する。
【００２１】
本発明の上記の態様の好ましい実施態様において、ＬＩＭ２阻害剤はペプチドであり、コンセンサス配列：
Ｈｉｓ／ＣＸＸＣ
（式中、Ｃは亜鉛結合Ｃｙｓであり、
Ｈｉｓはヒスチジンを示し、
Ｘは任意のアミノ酸である）
を含む。
【００２２】
本発明の上記の態様によると、有利には、ＬＩＭ２阻害剤はペプチドであり、コンセンサス配列：
ＨｈＨｉｓ／ＣＸＸ1Ｃｈ
（式中、ｈは疎水性アミノ酸を示し、
Ｈｉｓはヒスチジンを示し、
Ｃはシステインを示し、
Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｘ1は荷電アミノ酸を示す）
を含む。
【００２３】
有利には、本発明によるペプチドＬＩＭ２阻害剤はアプタマーであり、上記のコンセンサス配列を含む。
【００２４】
有利には、本発明によるペプチドＬＩＭ２阻害剤はアプタマーであり、上記のコンセンサス配列を有する。さらに有利には、本発明によるＬＩＭ２阻害剤は、図２ｃにクローン２０７、クローン２０９、クローン８５、クローン８１、クローン６３、クローン７２、クローン２４７、クローン９０、クローン６９およびクローン２０２として図示され、配列番号２〜１１にそれぞれ指定されている１０のペプチド配列の任意の１つ以上を含む。最も有利には、本発明によるさらに別のＬＩＭ２阻害剤は、図２にクローン２０７、クローン２０９、クローン８５、クローン８１、クローン６３、クローン７２、クローン２４７、クローン９０、クローン６９およびクローン２０２として図示され、配列番号２〜１１にそれぞれ指定されている１０のペプチド配列の任意の１つ以上である。
【００２５】
本発明の上記の態様の別の実施態様において、ＬＩＭ２阻害剤／抗ＬＭＯ２試薬は本明細書に規定する抗体である。
【００２６】
本発明の上記の実施態様によると、有利には、抗体はｓｃＦｖである。本発明の上記の態様の別の実施態様において、抗体は本明細書に規定するｄＡｂである。さらに有利には、本発明による抗体ＬＩＭ２阻害剤は、本明細書に規定する細胞内結合抗体である。最も有利には、それらは細胞内結合ｓｃＦｖ分子、重鎖ドメインｉｄＡｂであってもまたは軽鎖ドメインｉｄＡｂであってもよいｉｄＡｂ（細胞内結合シングルドメイン抗体）である。本発明のこの態様の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む細胞内結合抗体である。本発明のこの態様のさらに別の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む細胞内結合ｉｄＡｂまたはｓｃＦｖである。本発明のこの態様のさらに別の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有する少なくとも２つのＣＤＲを含む細胞内結合ｉｄＡｂまたはｓｃＦｖである。本発明のこの態様のさらに別の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有する３つ全てのＣＤＲを含む細胞内結合ｉｄＡｂまたはｓｃＦｖである。本発明のこの態様の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー以外に、図８に図示され、配列番号１２に指定されているアミノ酸配列を含む細胞内結合ｓｃＦｖである。本発明のこの態様の最も好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２に指定されているアミノ酸配列からなる細胞内結合ｓｃＦｖである。
【００２７】
従って、さらに別の態様において、本発明は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む抗ＬＭＯ２抗体（ＬＩＭ２阻害剤）を提供する。
【００２８】
好ましくは、本発明による抗ＬＭＯ２抗体は、転座活性を担当するタンパク質のドメインまたは配列に融合または結合する。好適な転座ペプチドの詳細は本発明の詳細な説明に提供されている。
【００２９】
有利には、本発明は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）にそれぞれ指定されているアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、一体として抗原結合部位を形成する抗ＬＭＯ２抗体（ＬＩＭ２阻害剤）を提供する。
【００３０】
さらに別の態様において、本発明は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む抗ＬＭＯ２抗体（ＬＩＭ２阻害剤）をコードする核酸を提供する。
【００３１】
有利には、本発明は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）にそれぞれ指定されているアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、一体として抗原結合部位を形成する抗ＬＭＯ２抗体（ＬＩＭ２阻害剤）をコードする核酸を提供する。
【００３２】
本発明のこの態様の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、ｓｅｒ−ｇｌｙリンカー以外に、図８に図示され、配列番号１２に指定されているアミノ酸配列を含む細胞内結合ｓｃＦｖである。さらに別の態様において、本発明は、本発明によるＬＩＭ２阻害剤またはそれを含む組成物の、ＬＭＯ２の機能活性を阻害する際の使用を提供する。
【００３３】
さらに別の態様において、本発明は、ＬＭＯ２の機能活性を阻害するための医薬品を製造する際の本発明によるＬＩＭ２阻害剤の使用を提供する。
【００３４】
ＬＭＯ２は哺乳類において多数の種々の役割を有することを本発明は示した。従って、本明細書に規定するＬＭＯ２の「機能活性」という用語は、哺乳類においてＬＭＯ２によって実施される作用の１つ以上、数種または全てをいう。さらに、「ＬＭＯ２の機能活性の阻害」という用語は、哺乳類においてＬＭＯ２によって実施される機能の１つ以上、数種または全ての、本明細書に記載する実質的な阻害をいう。
【００３５】
本発明者らは、ＬＭＯ２は、血管新生（病的な血管新生および病的でない血管新生）、胚形成および白血病誘発を含む造血からなる群の状態において何らかの作用をすることを示した。
【００３６】
本明細書において言う「血管新生」という用語は、成熟血管系を形成する一次毛細血管リモデリングの過程をいう。一方、「脈管形成」という用語は、一次毛細血管ネットワークが形成される脈管形成の一次過程をいう。重要なことに、ＬＭＯ２は、血管新生過程において重要な作用を果たすが、脈管形成過程には作用しないことを本発明者らは示した。
【００３７】
本明細書において言う「病的な血管新生」という用語は、血管新生が何らかの作用を果たす任意の疾病状態／状況をいう。本発明者らは、「病的な血管新生」は、腫瘍血管新生、腫瘍転移、虚血、炎症および糖尿病性網膜症からなる群から選択される状態に寄与することを示した。従って、本明細書において規定する「病的な血管新生」という用語は、本発明の範囲において、上記にいう状態の全てを含む。有利には、本発明によると、病的な血管新生は腫瘍血管新生および／または腫瘍転移である。
【００３８】
「病的な血管新生」におけるＬＭＯ２の作用以外に、ＬＭＯ２は、創傷治癒および月経などのある事象における「病的でない血管新生」においても作用を果たす。本発明によると、「病的でない血管新生」という用語は、本発明の範囲において、創傷治癒および月経を含む。
【００３９】
本発明の上記の態様によると、使用はインビトロであってもまたはインビボであってもよい。インビボでの使用が有利である。
【００４０】
上記のように、本発明は、ＬＭＯ２は、血管新生、胚形成および造血などの過程においてある役割を果たすことを示した。従って、本発明によるＬＩＭ２阻害剤は、腫瘍形成、腫瘍転移、ＬＭＯ２介在性Ｔ細胞白血病、炎症、虚血、糖尿病性網膜症、創傷治癒の調節および月経の調節を含む状態を予防および／または治療する際に治療的にかなり有用となると本発明者らは考えている。
【００４１】
従って、本発明のさらに別の態様において、医薬品に使用するために、本発明によるＬＩＭ２阻害剤またはこれを含む組成物が提供される。
【００４２】
さらに別の態様において、本発明は、腫瘍形成、腫瘍転移、ＬＭＯ２介在性Ｔ細胞白血病、炎症、虚血、糖尿病性網膜症および創傷治癒からなる群から選択される１つ以上の状態を予防および／または治療するための医薬品を製造する際の本発明による１つ以上のＬＩＭ２阻害剤の使用を提供する。
【００４３】
さらに別の態様において、本発明は、本発明による１つ以上のＬＩＭ２阻害剤を、このような治療を必要としている患者に投与するステップを含む、腫瘍形成、腫瘍転移、ＬＭＯ２介在性Ｔ細胞白血病、炎症、虚血、糖尿病性網膜症および創傷治癒からなる群から選択される任意の１つ以上の状態を予防および／または治療するための方法を提供する。
【００４４】
本発明の上記の態様によると、有利には、状態は腫瘍形成および／または腫瘍転移である。
【００４５】
本発明の上記の態様の好ましい実施態様において、ＬＩＭ２阻害剤はペプチドであり、コンセンサス配列：
Ｈｉｓ／ＣＸＸＣ
（式中、Ｃは亜鉛結合Ｃｙｓであり、
Ｈｉｓはヒスチジンを示し、
Ｘは任意のアミノ酸である）
を含む。
【００４６】
本発明の上記の態様によると、有利には、ＬＩＭ２阻害剤はペプチドであり、コンセンサス配列：
ＨｈＨｉｓ／ＣＸＸ1Ｃｈ
（式中、ｈは疎水性アミノ酸を示し、
Ｈｉｓはヒスチジンを示し、
Ｃはシステインを示し、
Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｘ1は荷電アミノ酸を示す）
を含む。
【００４７】
有利には、本発明によるペプチドＬＩＭ２阻害剤はアプタマーであり、上記に示すコンセンサス配列を含む。
【００４８】
有利には、本発明によるペプチドＬＩＭ２阻害剤はアプタマーであり、上記に示すコンセンサス配列を有する。さらに有利には、本発明によるＬＩＭ２阻害剤は、図２ｃにクローン２０７、クローン２０９、クローン８５、クローン８１、クローン６３、クローン７２、クローン２４７、クローン９０、クローン６９およびクローン２０２として図示され、配列番号２〜１１にそれぞれ指定されている１０のペプチド配列の任意の１つ以上を含む。最も有利には、本発明によるＬＩＭ２阻害剤は、図２ｃにクローン２０７、クローン２０９、クローン８５、クローン８１、クローン６３、クローン７２、クローン２４７、クローン９０、クローン６９およびクローン２０２として図示され、配列番号２〜１１にそれぞれ指定されている１０のペプチド配列の任意の１つ以上である。
【００４９】
本発明の上記の態様の別の実施態様において、抗体はｓｃＦｖである。さらに有利には、本発明による抗体ＬＩＭ２阻害剤は、本明細書に規定される細胞内結合抗体である。最も有利には、それらは細胞内結合ｓｃＦｖ分子、重鎖ドメインｉｄＡｂであってもまたは軽鎖ドメインｉｄＡｂであってもよいｉｄＡｂ（細胞内結合シングルドメイン抗体）である。本発明のこの態様の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有するＣＤＲ少なくとも１つを含む細胞内結合抗体である。本発明のこの態様のさらに別の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有するＣＤＲ少なくとも１つを含む細胞内結合ｉｄＡｂまたはｓｃＦｖである。本発明のこの態様のさらに別の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有するＣＤＲ少なくとも２つを含む細胞内結合ｉｄＡｂまたはｓｃＦｖである。本発明のこの態様のさらに別の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有するＣＤＲ３つ全て（ａｔ）を含む細胞内結合ｉｄＡｂまたはｓｃＦｖである。本発明のこの態様の最も好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２に指定されているアミノ酸配列からなる細胞内結合ｓｃＦｖである。
【００５０】
本発明の用途および方法は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、サル、ウマからなる群から選択されるものを含むが、これらに限定されるわけではない哺乳類個体を治療するのに好適である。有利には、本発明の使用および方法はヒト個体を治療するのに有用である。
【００５１】
本発明は、いかなる場合においても本発明を限定するものと考えるべきではない以下の実施例によって記載される。
【００５２】
定義
「ＬＭＯ２」は転写因子である。重要なことに、ＬＭＯ２は、胚形成、造血および血管新生におけるいくつかの主要経路のマスターレギュレーターであり、ＬＩＭドメインに関係するタンパク質−タンパク質相互作用によりその機能を実行する。
【００５３】
「ペプチド」という用語は、各アミノ酸のＮ末端においてアミド結合によって一体として結合している１０以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、２０以下、２５以下、５０以下のアミノ酸をいう。本発明によると、有利には、本発明による「ペプチド」という用語は、アミド結合によって互いに結合している２５以下のアミノ酸をいう。最も有利には、「ペプチド」という用語は、Ｎ末端において一体として結合している２０以下のアミノ酸をいう。本発明によるペプチドは分岐鎖状であってもまたは直鎖状であってもよい。有利には、本発明によるペプチドは直鎖状である。
【００５４】
「タンパク質」という用語は、１つ以上のポリペプチド鎖の集合体をいう。本明細書において規定する「ポリペプチド鎖」は、各アミノ酸のＮ末端においてアミド結合によって一体として結合して鎖を形成している５１以上のアミノ酸をいう。本発明のポリペプチド鎖は分岐鎖状であってもまたは直鎖状であってもよい。１つ以上のポリペプチド鎖は、二次および三次構造要素を有するタンパク質分子を含む。これらの構造要素は結果として得られるタンパク質の構造および機能を決定する。
【００５５】
「抗ＬＭＯ２試薬／ＬＩＭ２阻害剤」は、ＬＭＯ２のＬＩＭ−２ドメインに結合して、ＬＭＯ２の機能活性を実質的に阻害する薬剤をいう。このような薬剤は天然型であっても合成であってもよい。好適な合成分子は小型分子を含む。好適な天然型分子は、タンパク質、特にモノクローナルまたはポリクローナルであってもよい抗体、ペプチドおよび／または核酸分子を含む。
【００５６】
（ＬＭＯ２の機能活性を）「阻害する」という用語は、好適な対照と比べて、ＬＭＯ２の機能活性の有意な阻害をいう。有利には、（ＬＭＯ２の機能活性を）「阻害する」という用語は、好適な対照と比べて、ＬＭＯ２の機能活性の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％阻害をいう。最も有利には、（ＬＭＯ２の機能活性を）「阻害する」という用語は、好適な対照と比べて、ＬＭＯ２の機能活性の９５、９６、９７、９８、９９または１００％阻害をいう。好適な対照は当業者に周知であり、本発明の詳細な説明および実施例にも記載されている。ＬＭＯ２は哺乳類において多数の種々の役割を有する。従って、本明細書に規定するＬＭＯ２の「機能活性」という用語は、細胞においてＬＭＯ２によって実施される作用の１つ以上、数種または全てをいう。さらに、「ＬＭＯ２の機能活性の阻害」という用語は、哺乳類においてＬＭＯ２によって実施される機能の１つ以上、数種または全ての、本明細書に記載する実質的な阻害をいう。本発明者らは、ＬＭＯ２は、血管新生（病的な血管新生および病的でない血管新生を含む）、ある種の形態のＴ細胞白血病、炎症、創傷治癒、虚血および糖尿病性網膜症からなる群の状態において何らかの作用をすることを示した。
【００５７】
本明細書に使用する抗体は、選択された標的に結合することができる抗体断片または完璧な抗体をいい、かつＦｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体およびヒト化抗体を含む改変抗体、ならびにファージディスプレイまたは別の技法を使用して作製され、人工的に選択された抗体を含む。ＦｖおよびＳｃＦｖなどの小さい断片は、それらの小さいサイズおよび結果として得られる優れた組織分布によって、診断および治療的適用のための有利な特性を有する。好ましくは、本発明によるＬＩＭ２阻害剤抗体は、シングル重鎖ドメイン抗体（重鎖ドメインｄＡｂ）、シングル軽鎖ドメイン抗体（軽鎖ドメインｄＡｂ）またはｓｃＦｖ分子である。さらに好ましくは、本発明によるＬＩＭ２阻害剤抗体は、本明細書に規定する細胞内結合シングルドメイン抗体分子（ｉｄＡｂ）である。本明細書に規定する「抗体」という用語はまた、本発明の範囲において、少なくとも１つの重鎖可変ドメインおよび少なくとも１つの抗体不変領域ドメインを含む抗原結合部分を含む分子を含む。
【００５８】
免疫グロブリン分子重鎖および軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（相補性決定領域）は、フレームワーク領域残基でなく、可変領域の超可変ループ内に含有されるアミノ酸残基をいう。これらの超可変ループは、免疫グロブリンとリガンドの相互作用に直接関与する。これらのループ内の残基は、フレームワーク領域内と比較して保存の程度が低い傾向がある。
【００５９】
細胞内は細胞の内部を意味する。細胞は、原核細胞または真核細胞の任意の細胞であってもよく、好ましくは、細菌細胞、酵母細胞および高等真核細胞からなる群から選択される。酵母細胞および哺乳類細胞が最も好ましい。従って、本明細書において使用する「細胞内」抗体および標的またはリガンドは、細胞（細胞質および核を含む）内に存在する抗体および標的／リガンドである。また、「細胞内」という用語は、細胞内環境に類似しているまたはそれを模倣している環境をいう。従って、「細胞内」は細胞内ではなく、インビトロである環境をいう場合がある。例えば、本発明の方法は、市販品を入手してもまたは天然の系から誘導してもよいインビトロにおける転写および／または翻訳系において実施することができる。従って、本発明による「細胞内結合抗体」は、本明細書において規定する細胞内環境において１つ以上の抗原に特異的に結合することができる、本明細書において規定する抗体である。
【００６０】
「血管新生」という用語は、成熟血管系を形成する一次毛細血管リモデリングの過程をいう。一方、「脈管形成」という用語は、一次毛細血管網が形成される脈管形成の一次過程をいう。重要なことに、ＬＭＯ２は、血管新生過程において重要な作用を果たすが、脈管形成過程には作用しないことを本発明者らは示した。
【００６１】
「病的な血管新生」という用語は、血管新生が何らかの作用を果たす任意の疾病状態／状況をいう。本発明者らは、「病的な血管新生」は、腫瘍血管新生、腫瘍転移、虚血、炎症および糖尿病性網膜症からなる群から選択される状態に寄与することを示した。従って、本明細書において規定する「病的な血管新生」という用語は、本発明の範囲において、上記にいう状態の全てを含む。有利には、本発明によると、病的な血管新生は腫瘍血管新生および／または腫瘍転移である。
【００６２】
ＬＭＯ２はまた、創傷治癒および月経などのある種の事象における「病的でない血管新生」に何らかの作用を果たす。従って、本発明によると、「病的でない血管新生」という用語は、本発明の範囲において、創傷治癒および月経を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
本発明の詳細な説明
一般的な技法
特に規定しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技法および生化学における）当業者に普通に理解されるものと同じ意味を有する。分子、遺伝子および生化学的方法（参照することにより本明細書に組入れられる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９年）第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．を一般に参照）ならびに化学的方法の標準的な技法を使用する。また、標準的な免疫学的技法のためにＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ．，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に言及する。
【００６４】
（Ａ）本発明によるＬＩＭ２阻害剤の特徴
第一の態様において、本発明は、ＬＭＯ２のＬＩＭ２ドメインに結合して、その機能活性を阻害することができる薬剤を提供する。
【００６５】
本発明によると、「ＬＩＭ２阻害剤／抗ＬＭＯ２試薬」は、ＬＭＯ２のＬＩＭ−２ドメインに結合し、ＬＭＯ２の機能活性を実質的に阻害する薬剤をいう。このような薬剤は天然型であってもまたは合成されたものであってもよい。好適な合成分子は小型分子を含む。好適な天然型分子は、タンパク質（特にモノクローナルまたはポリクローナルであってもよい抗体）、ペプチドおよび／または核酸分子を含む。有利には、本発明による抗ＬＭＯ２抗体は本明細書に規定するｓｃＦｖ分子またはｄＡｂ分子である。さらに有利には、本発明による抗体ＬＩＭ２阻害剤は本明細書に規定する細胞内結合抗体（細胞内抗体）である。最も有利には、それらは細胞内結合ｓｃＦｖ分子、重鎖ドメインｉｄＡｂであってもまたは軽鎖ドメインｉｄＡｂであってもよいｉｄＡｂ（細胞内結合シングルドメイン抗体）である。本発明のこの態様の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む細胞内結合抗体である。本発明のこの態様のさらに別の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む細胞内結合ｉｄＡｂまたはｓｃＦｖである。本発明のこの態様のさらに別の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有する少なくとも２つのＣＤＲを含む細胞内結合ｉｄＡｂまたはｓｃＦｖである。本発明のこの態様のさらに別の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２（ａ）、１２（ｂ）および１２（ｃ）に指定されているアミノ酸配列を有する３つ全てのＣＤＲを含む細胞内結合ｉｄＡｂまたはｓｃＦｖである。本発明のこの態様のさらに別の好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー以外に、図８に図示され、配列番号１２に指定されているアミノ酸配列を含む、有利にはそれからなる細胞内結合ｓｃＦｖである。本発明のこの態様の最も好ましい実施態様において、抗体ＬＩＭ２阻害剤は、図８に図示され、配列番号１２に指定されているアミノ酸配列を含む、有利にはそれからなる細胞内結合ｓｃＦｖである。
【００６６】
（ｉ）抗体
抗体作製
ＬＭＯ２のＬＩＭ２ドメインに形成される抗体は、標準的な実験技法を使用して作製することができる。組換えタンパク質または天然起源由来のものを使用して抗体を作製することができる。例えば、サル、ヤギ、ウサギまたはマウスなどの哺乳類をチャレンジするためにタンパク質（すなわち「免疫原」）を投与する。得られた抗体をポリクローナル血清として採取してもよく、またはチャレンジ動物の抗体産生細胞を（例えば、不死化融合パートナーと融合してハイブリドーマを作製することによって）不死化し、次いで細胞にモノクローナル抗体を産生させてもよい。
【００６７】
１ａｉ．ポリクローナル抗体
抗原タンパク質は、単独で使用してもまたは免疫原性を増加するために従来のキャリアに結合してもよく、上記に記載するようにペプチド−キャリアコンジュゲート体に対する抗血清を動物において形成する。キャリアタンパク質へのペプチドの結合および免疫化は記載されているように（Ｄｙｍｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２６７：４８１５）実施することができる。血清は、ＥＬＩＳＡまたは別の方法としてドットもしくはスポットブロッティングによってタンパク質抗原に対する抗体価を測定する（Ｂｏｅｒｓｍａ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ（１９９４）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，５１：  ３１７）。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｃｅｌｌ，２８：４７７の手法によるＥＬＩＳＡによって、血清は適切なペプチドと強く反応することが示される。
【００６８】
１ａｉｉ．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を作製するための技法は周知であり、Ａｒｎｈｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ，２９４，  ２７８によって記載されているように、好ましくは、キャリアに結合した任意の抗原を使用してモノクローナル抗体を作製することができる。モノクローナル抗体は、典型的には、ハイブリドーマ組織培養液またはハイブリドーマ組織を導入した動物から得られる腹水から得られる。にもかかわらず、モノクローナル抗体は、タンパク質「に対して形成される」またはタンパク質「によって誘導される」と記載されていることがある。
【００６９】
モノクローナル抗体は、形成後、数多くの手段のいずれかによって機能および特異性について試験される。同様の手法を使用して、ファージディスプレイまたは他のインビトロ選択技術によって作製される組換え抗体を試験することもできる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（またはポリクローナル血清）も免疫原に対する抗体結合についてスクリーニングすることができる。特に好ましい免疫学的試験には、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、イムノブロッティングおよび免疫沈降（Ｖｏｌｌｅｒ，（１９７８）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ，２：１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ；Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  ３１：  ５０７；米国再発行特許第３１，００６号；英国特許第２，０１９，４０８号；Ｂｕｔｌｅｒ（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：４８２；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編），（１９８０）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ参照）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｂ．，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｍａｒｃｈ  １９８６，  １〜５、４６〜４９および６８〜７８ページ）が挙げられ、免疫原に対する抗体の免疫原との結合を検出する全ては、このような検出を容易にするために標識される必要がある。抗体分子を標識するための技法は当業者に周知である（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１〜７２６ページ参照）。
【００７０】
（１ｂ）ウェスタン（抗体）ブロット法
抗体結合の特異性を試験するためのウェスタンブロット法は当業者に周知の方法を使用して実施することができ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９年）に詳細に記載されている。
【００７１】
細胞内抗体
細胞内抗体（細胞内結合抗体）ＬＩＭ２阻害剤は、ＬＭＯ２の機能活性を阻害する際に特に有用である。細胞内環境においてそれらの機能を可能にするこれらの抗体の構造および特徴はＰＣＴ／ＧＢ２００２／００３５１２、ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００１０７７、ＧＢ  ０２２６７２８．４およびＧＢ００２６７２７．６に記載されている。これらの出願は参照することにより本明細書に組入れられる。有利には、本発明による細胞内抗体（細胞内結合抗体）は、図８に示し、配列番号１２として図示するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるｓｃＦｖである。
【００７２】
（ｉｉ）ＬＩＭ２阻害剤としてのペプチド
本発明によると、「ペプチド」という用語は、アミド結合によって各アミノ酸のＮ末端で結合されている１０以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、２０以下、２５以下、５０以下のアミノ酸をいう。本発明によると、有利には、本発明による「ペプチド」という用語は、アミド結合により互いに結合されている２５以下のアミノ酸をいう。最も有利には、「ペプチド」という用語は、Ｎ末端において一体として結合している２０以下のアミノ酸をいう。本発明によるペプチドは分岐鎖状であってもまたは直鎖状であってもよい。有利には、本発明によるペプチドは直鎖状である。
【００７３】
一方、「タンパク質」という用語は、１つ以上のポリペプチド鎖の集合体をいう。本明細書において規定する「ポリペプチド鎖」は、各アミノ酸のＮ末端においてアミド結合によって一体として結合して鎖を形成している５１以上のアミノ酸をいう。本発明のポリペプチド鎖は分岐鎖状であってもまたは直鎖状であってもよい。１つ以上のポリペプチド鎖は、二次および三次構造要素を有するタンパク質分子を含む。これらの構造要素は結果として得られるタンパク質の構造および機能を決定する。
【００７４】
本発明の好ましい実施態様において、ＬＩＭ２阻害剤はペプチドであり、コンセンサス配列：
Ｈｉｓ／ＣＸＸＣ
（式中、Ｃは亜鉛結合Ｃｙｓであり、
Ｈｉｓはヒスチジンを示し、
Ｘは任意のアミノ酸である）
を含む。
【００７５】
有利には、ＬＩＭ２阻害剤はペプチドであり、コンセンサス配列：
ＨｈＨｉｓ／ＣＸＸ1Ｃｈ
（式中、ｈは疎水性アミノ酸を示し、
Ｈｉｓはヒスチジンを示し、
Ｃはシステインを示し、
Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｘ1は荷電アミノ酸を示す）
を含む。
【００７６】
有利には、本発明によるペプチドＬＩＭ２阻害剤はペプチドアプタマー（２０ｍｅｒ）であり、上記に示すコンセンサス配列を含む。
【００７７】
ＬＩＭドメインはタンパク質相互作用のインターフェースを提供し14〜16、ＬＩＭオンリータンパク質ＬＭＯ２はそのＬＩＭドメインを介していくつかのパートナーに結合することが以前に報告されている。
【００７８】
ＬＭＯ２のＬＩＭドメインタンパク質−タンパク質相互作用を調節することによって、腫瘍血管新生などの内皮リモデリングの重要な特別の段階を調節することができることを本発明者らは示している。
【００７９】
本発明による抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーは、Ｔｒｘタンパク質足場内のペプチドドメインを含む２０のアミノ酸に包埋されているｃｙｓ−ｘ−ｘ−ｃｙｓモチーフを保存している２０７のペプチドによって特徴づけられる。本明細書に記載する抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーはＬＭＯ２  ＬＩＭドメインに特異的に結合し、ＬＭＯオンリータンパク質のいずれにも効率よく結合しない。ＬＭＯ２結合はｃｙｓ／ｈｉｓ−ｘ−ｘ−ｃｙｓモチーフに依存していることならびに隣接する疎水性残基の保存は両側およびその間の荷電残基に依存していることをペプチドアプタマーの分析は示している。赤血球新生アッセイによって例示するように（図４）、２０７ペプチドは特異的な結合（図３）およびＬＭＯ２機能の阻害に有効である。ペプチドアプタマーはＬＭＯ２のＬＩＭ２ドメインに結合し、ペプチド配列の調査は、この任意の明らかな理由だけでなく、ＬＭＯファミリーの他のメンバーを上回るＬＭＯ２の特異性の任意の明らかな理由も明らかにしていない。
【００８０】
アミノ酸の種類
本明細書に記載する荷電、極性無電荷および疎水性（非極性）アミノ酸を以下の表に分類する。アミノ酸の保存的置換の場合には、第２のカラムの同じブロックのアミノ酸、好ましくは、第３のカラムの同じラインのアミノ酸を互いに置換することができる：
【表１】
2007510625.tif 000003
【００８１】
（ｉｉｉ）本発明によるペプチド阻害剤に使用するタンパク質足場
本発明によるペプチドＬＭＯ２阻害剤は拘束されていない形態で使用してもまたは別の方法として足場との１つ以上の結合を介してペプチドのＮおよび／またはＣ末端に拘束されていてもよい。好適な足場は天然型であってもまたは合成されたものであってもよい。有利には、本発明によると、足場はタンパク質足場である。
【００８２】
好適な足場は当業者に周知であり、免疫グロブリンドメインに基づいた足場、ＳｐＡなどの細菌受容体に基づいた足場、フィブロネクチン、リポカリン（ｌｉｐｃａｌｌｉｎ）、ＣＴＬＡ４に基づいたものからなる群から選択されるものが挙げられる。他の好適な足場には、フィブロネクチンおよびアフィボディに基づいたものが挙げられる。他の好適な足場には、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｕｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）３１０，５９１〜６０１に記載されているリポカリンおよびＣＴＬＡ４、ならびに国際公開公報第００６９９０７号（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）に記載されているものなどの足場が挙げられ、これは、例えば、細菌ＧｒｏＥＬの環構造または他のシャペロンポリペプチドの環構造に基づいている。
【００８３】
有利には、本発明によると、足場はＴｒｘタンパク質（細菌タンパク質チオレドキシン）である。
【００８４】
ｌｉｉｉ．核酸抗ＬＭＯ２試薬／ＬＩＭ２阻害剤
本発明によると、ＬＩＭ２阻害剤／抗ＬＯＭ２試薬は核酸分子を含んでもよい。有利には、このようなＬＩＭ２阻害剤はアンチセンスＲＮＡである。このようなＲＮＡを作製する方法およびそれらの使用方法は当業者に周知である。
【００８５】
（Ｃ）本発明によるＬＩＭ２阻害剤／抗ＬＭＯ２試薬を使用するＬＭＯ２の機能活性の阻害
さらに別の態様において、本発明は、ＬＭＯ２の機能活性を阻害する際における、本発明によるＬＩＭ２阻害剤またはそれを含む組成物の使用を提供する。
【００８６】
ＬＭＯ２は哺乳類において多数の種々の役割を有することを本発明は示している。従って、本明細書に規定するＬＭＯ２の「機能活性」という用語は、哺乳類においてＬＭＯ２によって実施され、本明細書に記載する作用の１つ以上、数種または全てをいう。さらに、「ＬＭＯ２の機能活性の阻害」という用語は、本明細書に記載する実質的な阻害をいうか、または哺乳類においてＬＭＯ２によって実施される機能の１つ以上、数種または全てをいう。
【００８７】
本発明により、（ＬＭＯ２の機能活性）「を阻害する」という用語は、本発明の範囲において、好適な対照と比較した時の、ＬＭＯ２の機能活性の有意な阻害を含む。有利には、（ＬＭＯ２の機能活性）「を阻害する」という用語は、好適な対照と比較して、ＬＭＯ２の機能活性の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％阻害をいう。最も有利には、（ＬＭＯ２の機能活性）「を阻害する」という用語は、好適な対照と比較して、ＬＭＯ２の機能活性の９５、９６、９７、９８、９９または１００％阻害をいう。好適な対照は当業者に周知であり、本発明の詳細な説明およびまた実施例に記載されている。
【００８８】
本発明者らは、ＬＭＯ２は、血管新生（病的な血管新生および病的でない血管新生を含む）、胚形成および白血病誘発を含む造血からなる群の状態に何らかの作用をすることを示した。
【００８９】
さらに具体的には、ＬＭＯ２は、腫瘍形成、腫瘍転移、ＬＭＯ２介在性Ｔ細胞白血病、炎症、虚血、糖尿病性網膜症、創傷治癒および月経からなる群から選択される状態の任意の１つ以上において何らかの影響を及ぼすと本発明者らは考えている。
【００９０】
（ｃｉ）哺乳類におけるＬＭＯ２の作用：
（ｃｉａ）造血細胞運命におけるＬＭＯ２の作用
ＬＭＯ２機能獲得遺伝子導入マウスモデルにおいて生じるＴ細胞腫瘍を検討することによって、本発明者らは、この場合には、タンデムＥボックスを含む二連配列に結合する類似のＬＭＯ２関連複合体を検出することができた18。これらの観察により２つの結論に至った。第一に、ＬＭＯ２は赤血球細胞において検出されるタンパク質複合体の架橋要素であると思われるので、ＬＭＯ２複合体の要素は造血分化全体を変更する可能性があり、遺伝子セットを調節することによって種々の発生段階依存的な機能を調節することができると思われる。ＬＭＯ２は造血細胞の運命を調節する際に明確な作用を有するということに帰結する。第二に、Ｔ−ＡＬＬにおけるＬＭＯ２の作用は、おそらく、タンパク質複合体の強制的な形成による（染色体転座後の強制的なＬＭＯ２発現の直接の結果）。従って、ＬＭＯ２複合体を介する遺伝子調節に影響を及ぼすことができる。これは、直接的なＤＮＡ結合複合体または通常の作用からのタンパク質の隔絶によって生じうる13。
【００９１】
正常な造血において細胞運命を調節する際のＬＭＯ２の作用は主に遺伝子ターゲティング実験によって証明されている。相同組換えによって胚性幹細胞（ＥＳ細胞）においてヌル突然変異を作製し、ヘテロ接合体マウスを作製した。これらのマウスの繁殖によって、卵黄嚢赤血球新生の失敗によりＥ９〜１０期において胚が死亡し19、ＬＭＯ２はマウス胚形成の原始赤血球新生に必要であることを示している。成体（最終的な）造血におけるＬＭＯ２の可能な作用に関しての検討は、キメラマウスを用いて実施され20、ＬＭＯ２遺伝子が存在しない場合には造血は生じないことを明らかにした。従って、ＬＭＯ２は最終的な造血の早期段階において細胞内で自律的に機能する。この重要な機能は、多能性幹細胞のレベルであっても、前多能性子孫（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｍｕｌｔｉ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｙ）レベルであってもまたは場合によっては、中胚葉がこれらの前駆体を生じさせる、その前であってもよい。
【００９２】
（ｃｉｂ）胚形成におけるＬＭＯ２の作用
本発明者らは、内因性ＬＭＯ２遺伝子のｌａｃＺノックインを使用して、胚形成におけるＬＭＯ２発現のためのリポーターシステムを確立して21、Ｅ８．５から、ＬＭＯ２は内皮細胞および血液前駆細胞においてより特異的な胚体内発現パターンを有することを見出した。Ｅ１０．５では、最終的な造血が大動脈−性腺−中腎（ＡＧＭ）領域において開始すると考えられる場合には、ＬＭＯ２は血管系の内皮細胞および多能性血液前駆細胞において発現される21,22。追加の発現部位は肢芽および海馬において観察された。卵黄嚢および血液前駆細胞におけるＬＭＯ２の発現パターンは原始的および最終的造血における機能と一致している。最初の胚内造血幹細胞活性はほぼＥ１０．５付近のＡＧＭ領域に現れると考えられ、造血幹細胞は、背部大動脈などの大きい動脈の内皮由来である23,24。マウス胚形成では、血管芽細胞（内皮および血液細胞の共通の前駆体であると推定される）は特定されていない後部中胚葉から生じることが提案されており、従って初期毛細血管網はこれらの血管芽細胞から形成される。毛細血管網が形成される脈管構築のこの最初の過程は脈管形成と呼ばれている。さらに成熟した血管系は、血管新生と呼ばれる過程において初期毛細血管網のリモデリングによって形成される25。特に、血管系構築における造血幹細胞の特定前のＬＭＯ２の早期作用は、キメラにおいて無ＬＭＯ２ＥＳ細胞の運命を追跡することによって検討された21。無ＬＭＯ２ＥＳ細胞は、Ｅ９以前のキメラマウスにおける毛細血管網に寄与しうる。しかし、Ｅ１０付近では、内皮における無ＬＭＯ２ＥＳ細胞寄与の失敗により、顕著な血管組織崩壊がキメラマウスにおいて観察される。Ｅ１１以降では、大きい動脈の内皮への無ＬＭＯ２ＥＳ細胞の寄与はない。これらの結果は、ＬＭＯ２は血管新生に必要であるが、脈管形成には必要でないことを示している。ＬＭＯ２は内皮細胞および血液前駆細胞において発現され、造血および血管新生において二重の機能を有する。内皮と血液細胞特定化の密接な関係を考えると、マウス発生のこの臨界的な段階におけるＬＭＯ２の作用は極めて重要である。このタンパク質のこの主要な作用は、ＬＭＯ２のヌル変異によって成体の造血が失敗する理由を順に説明することができる。
【００９３】
（ｃｉｃ）腫瘍血管新生におけるＬＭＯ２の作用
ＬＭＯ２を欠損するＥＳ細胞は腫瘍増殖中に血管新生を支援することができないので、ＬＭＯ２タンパク質は腫瘍血管新生に必須であることも本発明者らは示している26。創傷治癒または月経ならびに腫瘍血管新生、虚血、炎症および糖尿病網膜症などの病的状態などの、血管新生のこのリモデリング過程が必要とされる数多くの状況が成体に存在する27。癌では、血管新生は固形腫瘍増殖および浸潤（転移）の主要な部分である。全ての細胞と同様に、癌細胞は、酸素と二酸化炭素の交換を必要とし、従って、固形腫瘍は増殖を促進するために血液供給を形成する必要がある28,29。これは、腫瘍血管新生過程において局所的な血管内皮を破壊して25,30、腫瘍沈着物への既存の内皮の芽出を可能にすることによって達成される31。
【００９４】
この血管新生スイッチは、血管新生刺激因子が相対的に増加する場合に生じ、腫瘍増殖では、がん細胞は血管新生性となり、必要なリモデリング状態を刺激する。さらに、モザイク状血管の概念は、血管壁の大部分が腫瘍細胞から形成される可能性があり32、これらの細胞は血管内腔内に絶えず脱落しており、従って血液循環が転移集団に寄与することを示すデータによって強く支持されている。また、いわゆる血管芽細胞様内皮前駆体は骨髄から採用されることもあり31、血管壁細胞の別の供給源となっている。血管新生のこれらの特徴は、癌において患者を治療するための主要な標的として提案されている28,29。血管芽出過程を刺激するが、血管リモデリングの転写調節因子についてはほとんど知られていない血管内皮増殖因子34などの、血管新生を調節するいくつかの主要な分子が同定されている。その多くは転写因子である新規遺伝子が同定されている、ヒト白血病における染色体転座の検討から得られた候補もある（1に概説されている)。ＬＭＯ２遺伝子は一例である。この遺伝子はマウス胚の内皮細胞において通常発現され21、その内皮細胞で、この遺伝子が、脈管化が生じた後の血管新生に必要とされる。腫瘍血管新生ではＬＭＯ２の発現が増大される。さらに、ＬＭＯ２が存在しない場合には、ＥＳ細胞腫瘍モデルでは、固形腫瘍における成熟した血管系の発生は妨害される。
【００９５】
（ｃｉｉ）ＬＭＯ２の機能活性を試験するアッセイ
ＬＭＯ２の機能活性を評価するアッセイは当業者に周知である。好適なアッセイは、ＬＭＯ２のヌル変異が赤血球分化経路を不活性化するとき、ＬＭＯ２タンパク質の機能に依存することが周知である、インビトロにおけるＥＳ細胞の赤血球細胞への分化を測定する19,20。ＬＭＯ２のヌル変異によって血管新生も生じない38。
【００９６】
本発明者らは、ＥＳ細胞においてＴｒｘ２０７タンパク質を発現することによって赤血球生成に対する影響を阻害することを観察することができた。阻害レベルはＥＳクローン間で異なり、最大レベルは〜７０％に達した。この不完全な阻害は、選択したＥＳクローンにおけるＴｒｘ２０７タンパク質発現レベルの変動によると本発明者らは考えた。２０ｍｅｒのペプチド（アプタマー）が外側ループに付加されているＴｒｘタンパク質を発現することから生ずる問題もあり（データは示さず）、これは、異なる足場がペプチドを提示する際により有効となりうることを意味する可能性がある。
【００９７】
従って、２０７ペプチドなどの抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーが異なる足場においてさらに有効である可能性がある。実際、拘束されていないペプチドアプタマーが極めて有効である可能性がある。この証拠は、ＧＡＬ４−２０７融合タンパク質は、Ｔｒｘ２０７タンパク質に匹敵するレベルでＬＭＯ２のＬＩＭ２ドメインと相互作用することができたという形態で提供される（図３）。
【００９８】
（ｃｉｉｉ）抗ＬＭＯ２試薬／ＬＩＭ２阻害剤の患者の細胞への送達
一般に、本発明によるＬＩＭ２阻害剤が細胞に送達される。有利には、それは細胞核に送達される。
【００９９】
（Ｃｉｉｉａ）細胞内発現
このような分子を細胞内環境に導入するために、有利には、１つ以上のＬＩＭ２阻害剤をコードする核酸を細胞にトランスフェクションする。
【０１００】
このような阻害剤をコードする核酸を発現のためのベクターに組込むことができる。本明細書において使用するベクター（またはプラスミド）は、発現のために異種ＤＮＡを細胞に導入するために使用される別個の要素をいう。このような搬送体の選択および用途は当業者の技術の範囲内である。多数のベクターが利用可能であり、適当なベクターの選択は、ベクターの意図された用途、ベクターに挿入される核酸のサイズおよびベクターで形質転換する宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能およびそれが適合する宿主細胞に応じて、種々の要素を含有する。ベクター要素は、一般に、複製開始点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、転写終結配列およびシグナル配列のうち、１つ以上を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１０１】
さらに、一般的な操作および核酸増幅目的のために、本発明によるＬＩＭ２阻害剤をコードする核酸をクローニングベクターに組込むことができる。
【０１０２】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、一般に、選択した１つ以上の宿主細胞におけるベクターの複製を可能にする核酸配列を含有する。典型的には、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡから独立したベクターの複製を可能にするものであり、複製開始点または自己複製配列を含む。種々の細菌、酵母およびウイルスのこのような配列が周知である。プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点はほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、２ｍプラスミド開始点は酵母に好適であり、種々のウイルス開始点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス）は哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製開始点要素は、ＣＯＳ細胞などの高レベルＤＮＡ複製に適する哺乳類細胞に使用される場合を除いて、哺乳類発現ベクターには必要とされない。
【０１０３】
ほとんどの発現ベクターはシャトルベクターである、すなわちそれらは少なくとも１つのクラスの生物において複製できるが、発現のために別のクラスの生物にトランスフェクションされることができる。例えば、あるベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にクローニングし、宿主細胞染色体とは独立に複製できないにしても、このベクターを酵母または哺乳類細胞にトランスフェクションする。ＤＮＡは、宿主ゲノムに挿入することによっても複製することができる。しかし、核酸を切断するために制限酵素消化が必要とされるので、ゲノムＤＮＡの回収は外因的に複製されるベクターの回収より複雑である。ＤＮＡはＰＣＲによって増幅することができ、任意の複製能力を持たない宿主細胞に直接トランスフェクションすることができる。
【０１０４】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物に認識され、望ましい核酸に機能的に結合するプロモーターを含有する。このようなプロモーターは誘導的プロモーターであってもまたは構成的プロモーターであってもよい。プロモーターは、起源ＤＮＡからプロモーターを取り出し、単離したプロモーター配列をベクターに挿入することによって核酸に機能的に結合される。ペプチドをコードする核酸の増幅および／または発現を誘導するために未変性のプロモーター配列および多数の異種プロモーターを使用することができる。「機能的に結合する」という用語は、前記要素が、意図されたように機能を果たすことを可能にする関係にある近位をいう。コード配列に「機能的に結合する」調節配列は、調節配列に適合する条件下においてコード配列の発現が実施されるようにライゲーションされる。
【０１０５】
哺乳類宿主におけるベクターからの遺伝子転写は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、伝染性上皮腫、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスゲノム由来、アクチンプロモーターまたは非常に強力なプロモーター、例えば、リボソームタンパク質プロモーターなどの異種哺乳類プロモーター由来、ならびに免疫グロブリン配列に通常関連するプロモーター由来のプロモーターによって調節されうる。
【０１０６】
高等な真核生物による核酸の転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加することができる。エンハンサーは比較的に、方向および位置独立的である。哺乳類遺伝子（例えば、エラスターゼおよびグロビン）由来の多数のエンハンサー配列が周知である。しかし、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例として、複製開始部の後期側（ｂｐ１００〜２７０のＳＶ４０エンハンサーおよびＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは望ましい核酸の５’または３’位置のベクターにスプライシングされうるが、好ましくは、プロモーターの５’部位に位置する。
【０１０７】
有利には、真核生物発現ベクターは遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）を含むことができる。ＬＣＲは、宿主細胞クロマチンに組込まれた導入遺伝子の高レベルの組込み部位独立的な発現を誘導することができ、特にベクターの染色体組込みが生じた永続的にトランスフェクションされた真核細胞系統に関して遺伝子が発現される予定の場合には、これは特に重要である。
【０１０８】
真核生物発現ベクターは、転写終結に必要な配列およびｍＲＮＡを安定化するのに必要な配列も含有する。このような配列は、通常、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および３’未翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、本発明によるＬＩＭ２阻害剤をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。
【０１０９】
哺乳類細胞において核酸の一時的な発現を提供する発現ベクターは、本発明を実施する上で特に有用である。一時的な発現は、通常、宿主細胞が発現ベクターの多数のコピーを蓄積し、次いで、高レベルの望ましい遺伝子産物を合成するように、宿主細胞において効率的に複製することができる発現ベクターの使用に関係する。
【０１１０】
（Ｃｉｉｉｂ）細胞への直接送達
ＬＩＭ２阻害剤は、マイクロインジェクションまたは細胞膜と融合することができるリポソームなどの小胞を使用する送達によって細胞に直接導入することができる。ウイルス膜融合性ペプチドは、有利には、それに続く核への転座のために膜融合および細胞の細胞質への送達を促進するために使用される。
【０１１１】
（Ｃｉｉｉｂ１）核局在化シグナル
核局在化シグナルは、核に抗原を標的化することを担当するシグナルである。このような標的配列は、Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  Ｃａｍｂ  Ｐｈｉｌｏｓ  Ｓｏｃ  ７１，６３７〜７０２に一般的に概説されている。核局在化配列には、ＳＶ４０ラージＴ抗原コンセンサス配列ＰＫＫＫＲＫＶ（Ｄｉｎｇｗａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．１６，４７８〜４８１に概説されている）またはヌクレオプラスミンタンパク質によって例示される二分核定位配列（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）（Ｄｉｎｇｗａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６，６９〜７４；Ｒｏｂｂｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｃｅｌｌ  ６４，６１５〜６２３）が挙げられる。当業者は、細胞核に本発明によるペプチドを標的化する際に使用するのに好適な他の核局在化シグナルについて承知している。
【０１１２】
抗体は、マイクロインジェクションまたは細胞膜に融合することができるリポソームなどの小胞を使用する送達によって細胞に直接導入することができる。ウイルス融合ペプチドは、有利には膜融合および細胞の細胞質への送達を促進するために使用される。
【０１１３】
好ましくは、本発明による抗ＬＭＯ２抗体は、細胞膜輸送活性を担当するタンパク質のドメインまたは配列に融合または結合される。好ましい輸送ドメインおよび配列には、ＨＩＶ−１−トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のアンテナペディアホモドメインタンパク質、および単純ヘルペス−１ウイルスＶＰ２２タンパク質のドメインおよび配列が挙げられる。この手段によって、本発明による抗ＬＭＯ２抗体は、細胞の近くに導入されると、細胞またはその核に進入することができる。
【０１１４】
外から加えられたＨＩＶ−１−トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）は、細胞膜を通過して、核に達し、ウイルスゲノムをトランス活性化することができる。輸送活性は、ＨＩＶ−Ｔａｔのアミノ酸３７〜７２（Ｆａｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  ９１，  ６６４〜６６８）、３７〜６２（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９４，８７６〜８８４）および４９〜５８（塩基配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する）において同定されている。Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，１６０１０−７は、輸送、核局在化および細胞遺伝子のトランス活性化に重要であると思われるアミノ酸４８〜６０（ＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ）からなる配列を同定した。β−ガラクトシダーゼおよびＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質トランスフェクションドメインからなる融合タンパク質を腹腔内注射すると、マウスの全組織に生物学的に活性な融合タンパク質が送達される（Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，  １５６９−７２）。
【０１１５】
ショウジョウバエのアンテナペディアホモドメインタンパク質の第３ヘリックスも同様の特性を有することが示されている（Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ，  Ａ．，  １９９９，  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ８８６，１７２−９に概説されている）。アンテナペディアの輸送を担当するドメインは、配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを有する塩基性アミノ酸に富むアミノ酸１６の長さのペプチドに局在化されている（Ｄｅｒｏｓｓｉ，  ｅｔ  ａｌ．  ，  １９９４，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２６９，１０４４４−５０）。このペプチドは、培養中の細胞の細胞質および核に生物学的に活性な物質を誘導するために使用されている（Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １５，７１５８−７１６７）。アンテナペディアホモドメインの第３ヘリックスの細胞内移行は受容体非依存的であると思われ、輸送過程は膜リン脂質との直接相互作用に関係することが示唆されている（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７１，１８１８８−９３）。
【０１１６】
単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２テグメントタンパク質は細胞間輸送が可能であり、細胞の亜集団において発現されるＶＰ２２タンパク質は集団の他の細胞に広がる（Ｅｌｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，  １９９７，Ｃｅｌｌ  ８８，  ２２３−３３）。ＧＦＰ
（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，  １９９９，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６，１
４９−５１）、チミジンキナーゼタンパク質（Ｄｉｌｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ，  １９９９，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６，１２−２１）またはｐ５３（Ｐｈｅｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ，  １９９８，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６，  ４４０−３）とＶＰ２２とからなる融合タンパク質は、この方法で細胞に標的化（ターゲッティング）されている。
【０１１７】
核および／または細胞膜を通過して輸送することができるタンパク質の特定のドメインまたは配列は突然変異誘発または欠失検討によって同定することができる。または、候補配列を有する合成または発現ペプチドをリポーターに結合し、輸送をアッセイすることができる。例えば、Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７），  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，１６０１０−７に記載されている方法によって、合成ペプチドをフルオレセインに結合し、輸送を蛍光顕微鏡によってモニターすることができる。または、緑色蛍光タンパク質をリポーターとして使用することができる（Ｐｈｅｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ，  １９９８，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６，  ４４０−３）。
【０１１８】
上記に記載するまたは輸送活性を有すると同定されているドメインまたは配列のいずれかを使用して、細胞の細胞質または核に免疫グロブリンを誘導することができる。ペネトラチンとしても周知の上記のアンテナペディアペプチドは、ＨＩＶ  Ｔａｔと同様に好ましい。輸送ペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端を本発明によるシングルドメイン免疫グロブリンに融合することができる。Ｎ末端融合が好ましい。
【０１１９】
ＴＬＭペプチドも細胞への抗体の送達に有用である。ＴＬＭペプチドは、ＨＢＶのＰｒｅ−Ｓ２ポリペプチド由来である。Ｏｅｓｓ  Ｓ，  Ｈｉｌｄｔ  Ｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０００  Ｍａｙ  ７：  ７５０−８参照。抗ＤＮＡ抗体技術も有用である。抗ＤＮＡ抗体ペプチド技術は、Ａｌｅｘａｎｄｒｅ  Ａｖｒａｍｅａｓ  ｅｔ  ａｌ．  ，  ＰＮＡＳ  ｖａｌ  ９５，  ｐｐ  ５６０１−５６０６，  Ｍａｙ  １９９８；  Ｔｈｅｒｅｓｅ  Ｔｅｒｎｙｎｃｋ  ｅｔａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  （１９９８）  １１，５１１−５２１  ；及びＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９９９），  ｖｏｌ  １０  Ｎｕｍｂｅｒ  １，  ｐｐ  ８７−９３に記載されている。
【０１２０】
（Ｄ）本発明によるＬＩＭ２阻害剤／抗ＬＭＯ２試薬の用途．
本発明のさらに別の態様において、医薬品に使用するための本発明によるＬＩＭ２阻害剤またはそれを含む組成物が提供される。
【０１２１】
さらに別の態様において、本発明は、腫瘍形成、腫瘍転移、ＬＭＯ２介在性Ｔ細胞白血病、炎症、虚血、糖尿病性網膜症および創傷治癒からなる群から選択される１つ以上の状態を予防および／または治療するための医薬品を製造する際の、本発明による１つ以上のＬＩＭ２阻害剤の使用を提供する。
【０１２２】
さらに別の態様において、本発明は、本発明による１つ以上のＬＩＭ２阻害剤を、治療を必要としている患者に投与するステップを含む、腫瘍形成、腫瘍転移、ＬＭＯ２介在性Ｔ細胞白血病、炎症、虚血、糖尿病性網膜症および創傷治癒からなる群から選択される１つ以上の状態を予防および／または治療するための方法を提供する。
【０１２３】
本発明による抗ＬＭＯ２試薬／ＬＩＭ２阻害剤は、インビボにおける治療的および予防的適用、インビトロおよびインビボにおける診断的適用、インビトロにおけるアッセイおよび試薬適用、機能的ゲノム学適用等に使用することができる。
【０１２４】
ＬＭＯ２は、造血、血管新生および白血病誘発においてタンパク質相互作用によって機能する。従って、ＬＭＯ２の阻害剤は、前者の検討のため、腫瘍増殖または血管リモデリングが重要である他の状態においておよび特定の白血病を治療する際に血管新生を予防および／または治療するための研究ツールとなる。本明細書に記載する抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーはこれらの種々の状況のいずれかに使用することができる。
【０１２５】
本発明による抗ＬＭＯ２試薬／ＬＩＭ２阻害剤および組成物の治療的および予防的用途は、ヒトなどのレシピエント哺乳類に上記を投与することに関係する。好ましくは、それらは、哺乳類の細胞内環境への投与に関係する。
【０１２６】
少なくとも９０〜９５％の均一性のそれらを含む実質的に純粋なペプチドおよび／または足場分子が哺乳類への投与に好ましく、特に、哺乳類がヒトである場合には、９８〜９９％またはそれ以上の均一性が製薬学的な用途に最も好ましい。部分的にまたは望ましい均一性まで精製されたら、免疫グロブリン分子は診断的もしくは治療的に使用されても（体外的を含む）または当業者に周知の方法を使用してアッセイ手法を開発し、実施する際に使用されてもよい。
【０１２７】
例示的な適用において、「予防」という用語は、疾病の誘発前の防御組成物の投与に関係する。「抑制」は、疾病の誘発事象後であるが、臨床発現の前の組成物の投与をいう。
【０１２８】
本発明の選択した抗ＬＭＯ２／ＬＩＭ２阻害剤はインビボにおいてタンパク質機能を混乱させ、典型的には、炎症状態、腫瘍形成および／または転移、ＬＭＯ２介在性Ｔ細胞白血病、虚血および糖尿病性網膜症を予防、抑制または治療する際に用途を見出している。また、抗ＬＭＯ２試薬／ＬＩＭ２阻害剤は、創傷治癒および／または月経の調節に用途を見出している。
【０１２９】
本発明による抗ＬＭＯ２試薬／ＬＩＭ２阻害剤、特に抗ＬＭＯ２ペプチド／ＬＩＭ２阻害剤ペプチドまたは抗ＬＭＯ２細胞内抗体（拘束されていない形態または本明細書に言及する足場分子によってＮおよび／またはＣ末端が拘束されている）は、有利には、核局在化シグナルをさらに含む。このような分子は、有利には、上記に言及する１つ以上の状態を治療する際の治療薬として使用される。
【０１３０】
疾病から防御するまたは疾病を治療する際に、本発明の選択した免疫グロブリンの有効性をスクリーニングするために使用することができる動物モデル系が利用可能である。  
【０１３１】
一般に、本発明の選択した抗ＬＭＯ２試薬／ＬＩＭ２阻害剤は、純粋な形態で、薬理学的に適当な担体と共に使用される。典型的には、これらの担体として、水性またはアルコール／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられ、いずれも生理食塩液および／または緩衝媒体を含む。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸加リンガーが挙げられる。ポリペプチド複合体を懸濁状態に維持するのに必要である場合には、生理学的に許容される好適な補助剤は、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩などの増粘剤から選択することができる。
【０１３２】
静脈内賦形剤には、リンガーデキストロース系のものなどの流体および栄養補給剤ならびに電解質補給剤が挙げられる。保存剤ならびに抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどの他の添加剤も含有されてもよい（Ｍａｃｋ  （１９８２）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版）。
【０１３３】
本発明の選択した阻害剤は、別個に投与される組成物として使用してもまたは他剤と併用使用してもよい。これらには、シクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシンまたはシスプラチンおよびイムノトキシンなどの種々の免疫療法剤を挙げることができる。医薬組成物には、種々の細胞毒性剤または他の薬剤を本発明による抗ＬＭＯ２試薬／ＬＩＭ２阻害剤または場合によっては、本発明による選択した阻害剤の組み合わせと併用した「カクテル」を挙げることができる。
【０１３４】
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に通常周知のもののいずれであってもよい。治療のためには、本発明による選択した阻害剤組成物は標準的な技法により任意の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺経路または適宜カテーテルを用いる直接注入を含む任意の適当な様式によってもよい。投与量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬剤の併用投与、禁忌（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）および臨床医が考慮べき他のパラメーターに依存する。
【０１３５】
本発明の選択した阻害剤は、保存のために凍結乾燥して、使用時に好適な担体で再構成することができる。周知の凍結乾燥および再構成技法を使用することができる。凍結乾燥および再構成により種々の程度の機能活性の損失が生じることがあることならびに補正のために使用レベルを上方に調節する必要がある場合があることは当業者に理解されている。
【０１３６】
本発明の選択した抗ＬＭＯ２試薬／ＬＩＭ２阻害剤を含有する組成物またはそれらのカクテルは予防的および／または治療的治療のために投与することができる。ある治療適用において、選択した細胞集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅またはいくつかの他の測定可能なパラメーターを実施するのに十分な量は「治療的に有効な量」と規定される。この用量を達成するのに必要な量は、疾病の重症度および患者自身の免疫系の一般的な状態に依存するが、一般に体重１キログラムあたり０．００５〜５．０  ｍｇの選択した免疫グロブリンの範囲であり、さらに一般的には０．０５〜２．０  ｍｇ／ｋｇ／用量の用量が使用される。予防的な適用のためには、本発明の選択した阻害剤分子を含有する組成物またはそれらのカクテルは、ほぼ同じまたはわずかに少ない量を投与することもできる。
【０１３７】
本発明による選択した１つ以上の抗ＬＭＯ２試薬／ＬＩＭ２阻害剤分子を含有する組成物は、哺乳類の選択した標的細胞集団の変更、不活性化、死滅または除去の助けとするために予防的および治療的状況に使用することができる。また、本明細書に記載するポリペプチドの選択したレパートリーは、標的細胞集団を選択的に死滅、欠損させる、または細胞の不均一な収集物から標的細胞集団を効果的に取り出すために体外的にまたはインビトロにおいて使用することができる。
【０１３８】
本発明は、以下の実施例により記載されるが、これは本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１３９】
実施例１：材料と方法
酵母２−ハイブリッドアッセイを使用するＬＭＯ２のペプチドライブラリーのスクリーニング
ライブラリーベクターは酵母選択マーカーとしてＴＲＰ１遺伝子を含有していたので、トリプトファン欠損培地において耐性を示す酵母ＴＲＰ１の選択マーカーがロイシン欠損培地において耐性を示すＬＥＵ遺伝子と交換されているｐＢＴＭ１１６ベクターの改良型のＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインに切断型のマウスＬＭＯ２（ａａ  ２８−１５０）を融合した。このＬｅｘＡ−ＬＭＯ２構築物をベイトとして使用して、Ｌ４０酵母株を使用し、39に記載されているプロトコールにより、２０ｍｅｒペプチドライブラリーの３×１０6の形質転換体35（親切にもＤｒ．  Ｒ．  Ｂｒｅｎｔによる提供を受けた）をスクリーニングした。１０9を超えるメンバーを含むこのライブラリーでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）チオレドキシン（Ｔｒｘ）の活性部位ループを、２０ｍｅｒペプチドを提示する足場として使用する。
【０１４０】
哺乳類２−ハイブリッドアッセイ
酵母Ｔｒｘ−ペプチド配列は、ＶＰ１６活性化ドメインとの融合として哺乳類ＶＰ１６ベクターｐＭＶＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングしたが、ＬＭＯ２ベイトはｐＭベクターのＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合した40。ＬＭＯ２とペプチドの相互作用をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において試験した。１０％ＦＣＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したαＭＥＭにおいてＣＨＯ細胞を増殖させた。トランスフェクションの１６〜２４時間前にＣＨＯ細胞を６つのウェルプレート（ウェルあたり３×１０5細胞）に播種した。トランスフェクションは、ｐｏｌｙｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）１０μｌ、ｐＭおよびｐＶＰ１６ベクター各々５００  ｎｇ、ｐＧ５ルシフェラーゼリポーターベクター５００  ｎｇならびにｐＲＬ−ＣＭＶ（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｐｒｏｍｅｇａ）５０  ｎｇを使用して実施した。トランスフェクションしてから２４〜３６時間後に細胞を回収し、製造業者によりルシフェラーゼ活性アッセイを実施した。良好なペプチド３つを、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインとの融合としてｐＭベイトベクターにサブクローニングし、ＬＭＯ２の異なる部分、他のＬＩＭオンリータンパク質および他のジンクフィンガータンパク質との相互作用を試験した。
【０１４１】
抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーを発現するＥＳ細胞系統の作製
ＫＺ２６およびＨ１６細胞系統は以前に記載されており20、それぞれ、ＬＭＯ２＋／−（ＬＭＯ２の一方の対立遺伝子にｌａｃＺ遺伝子がノックインされている）またはＬＭＯ２−／−である。ＡＦ６およびＢＢ４細胞系統は、野生型ＥＳ細胞系統ＣＣＢのＬＭＯ２の一方の対立遺伝子に、それぞれ、Ｔｒｘ２０７またはＴｒｘをノックインすることによって作製した。６Ｂ２３細胞系統は、ＣＭＶ−Ｔｒｘ２０７発現クローンが安定してトランスフェクションされているＡＦ６のサブクローンであるが、Ｇ１およびＡ５細胞系統は、それぞれ、ＥＦα−Ｔｒｘ２０７およびＥＦα−Ｔｒｘを安定してトランスフェクションすることによってＫＺ２６から作製された。
【０１４２】
胚様体の分化および赤血球新生アッセイ
異なるＥＳクローンの胚様体（ＥＢ）へのインビトロにおける分化は、組換えヒト血管内皮成長因子は１０ｎｇ／ｍｌで使用し、マウスエリスロポイエチンは１単位／ｍｌで使用し、ヒト塩基性線維芽細胞成長因子２は２５ｎｇ／ｍｌで使用し、マウスインターロイキン６は５ｎｇ／ｍｌで使用したことをのぞいて以前に記載されているように41、実施した。１１日間の培養後にＥＢが形成され、回収し、１．５ｍｇのコラゲナーゼを含有する１ｍｌのＤＭＥＭ中で３０分分離し、赤血球マーカーＴｅｒ１１９の発現についてＦＡＣＳによって細胞を分析した。
【０１４３】
実施例２：抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーは、ＬＩＭフィンガーの要素と相同である
ＬＭＯ２がＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合しているＬＭＯ２ベイトを用いて酵母ペプチドアプタマーライブラリー35,36をインビボにおいてスクリーニングした。酵母ペプチドアプタマーライブラリーは、ペプチドと標的タンパク質間の相互作用に好適な細菌チオレドキシン（Ｔｒｘ）タンパク質の外側ループに組込まれているランダムペプチド（２０ｍｅｒ）を発現するさまざまなセットのクローンからなった。２５０のクローンが酵母スクリーニングにおいて同定され、再スクリーニング後にこれらのうちの１５を特異的な結合物と指定した。ＤＮＡをこれらのプラスミドから単離し、配列データを得た（図２）。これらの配列の顕著な特徴は、１５クローンのうち１３クローンにモチーフｃｙｓ−ｘ−ｘ−ｃｙｓまたはｈｉｓ−ｘ−ｘ−ｃｙｓが存在することである（図２Ａ）。哺乳類ルシフェラーゼ２−ハイブリッド転写活性化アッセイを使用してこれらのペプチドアプタマーを再評価したとき（以下参照、図３に示されている）、このモチーフを欠損する２つのクローン由来のタンパク質はこのさらに厳密なアッセイではＬＭＯ２ベイトと相互作用しなかったが、他は２−ハイブリッドアッセイにおいて種々の活性効率を示したことが見出された。各々哺乳類２−ハイブリッドアッセイにおいて得られたレベルのルシフェラーゼリポーター遺伝子の転写活性を有する、これらの誘導されたペプチドアプタマー配列の比較を図２Ｂに示す（ペプチドは、ｃｙｓ／ｈｉｓ−ｘ−ｘ−ｃｙｓモチーフに従って整列されている）。抗ＬＭＯ２ペプチドのｃｙｓ／ｈｉｓ−ｘ−ｘ−ｃｙｓモチーフは、ＬＭＯ２の第２のＬＩＭドメインの第１のＬＩＭフィンガー（すなわち、ｈｉｓ−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｃｙｓ）の一部との相同性が高いことが重要である（図２Ｂ）。
【０１４４】
抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーの相同性はｃｙｓ／ｈｉｓ−ｘ−ｘ−ｃｙｓモチーフの外側に延在する。種々の抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーの比較（図２Ｃ）は、ｃｙｓ／ｈｉｓ−ｘ−ｘ−ｃｙｓモチーフの保存されている領域は、この領域の両側に数残基延在しており、一般にコアモチーフのＮ末端側の２つの疎水性残基、Ｃ末端側の１つの疎水性残基であることを示している。さらにしばしば、荷電アミノ酸はｃｙｓ／ｈｉｓ−ｘ−ｘ−ｃｙｓの中心の２アミノ酸の２番目として存在する（図２Ｃ）ことが重要であり、これはＬＭＯ２  ＬＩＭ２ドメインの相当領域の特徴である（図２Ｂ）。最後に、ＬＭＯ２  ＬＩＭ２ｃｙｓ／ｈｉｓ−ｘ−ｘ−ｃｙｓに隣接するｖａｌ−ｔｙｒジペプチド（ＬＭＯ２  ＬＩＭ２ドメインの完全な要素はｖａｌ−ｔｙｒ−ｈｉｓ−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｃｙｓ−ｐｈｅである）はペプチドアプタマーの２つに保存されているが、ＬＭＯ２と最も大きな相互作用を示す２つでは保存されていない（すなわち、２０７および２０９、図２Ｂ）。概して、抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーの保存領域は疎水性−疎水性−ｃｙｓ−ｘ−荷電−ｃｙｓ−疎水性残基である（図２Ｃ）。
【０１４５】
実施例３：抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーはＬＭＯ２の第２のＬＩＭドメインに特異的に結合する
酵母において発現されるランダムペプチドライブラリーから抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーを単離した。抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーとＣＨＯ細胞において発現されるＬＭＯ２タンパク質ベイトの相互作用後に報告されたルシフェラーゼの活性に基づいた哺乳類アッセイにおいて、ＬＭＯ２との相互作用の活性および特異性をチェックした。活性レベルの結果を図２Ｂに要約し、ＤＢＤ−Ｔｒｘアプタマー融合を発現するクローン（ベイトと命名）およびＶＰ１６転写活性化ドメインに融合したＬＭＯ２を発現するクローン（プレイと命名）の同時トランスフェクション後に観察されるルシフェラーゼ活性の倍増加として表す各ペプチドアプタマーの活性を示す。最も高いレベルの活性を生ずる４つのアプタマーは、クローンＴｒｘ２０７、２０９、８５および８１から作製された。
【０１４６】
Ｔｒｘ−抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマー２０７（図３Ａ）、２０９（図３Ｃ）および８５（図３Ｄ）またはＴｒｘ足場を含まない抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマー２０７が融合されているＧＡＬ４  ＤＢＤを含む種々のベイトが、ＶＰ１６転写トランス活性化ドメインに融合した種々の標的タンパク質と同時発現されている哺乳類リポーターアッセイにおいて抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーによる結合の特異性を評価した。これらの「プレイ」は、ＬＭＯ２、ＬＭＯ２の個々のＬＩＭドメイン（すなわち、ＬＩＭ１またはＬＩＭ２）、関連するＬＩＭオンリータンパク質ＬＭＯ１およびＬＭＯ４、ＬＭＯ相互作用タンパク質ＬＤＢ１およびＧＡＴＡ１を含んだ（図３）。ＬＭＯ２にだけまたはＬＭＯ２の第２のＬＩＭドメイン（ＬＩＭ２）に結合する抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーはこのタンパク質とわずかに相互作用することができるが、Ｔｒｘ２０７はＧＡＴＡ１、Ｔｒｘ２０９および８５との有意な結合を示さないことを本発明者らは観察した。３つ全ての場合において、ＬＭＯ２の単離されたＬＩＭ２ドメインとの結合は、無傷のＬＭＯ２との結合よりはるかに良好であった。さらに、抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーは、エストロゲン受容体α（ジンクフィンガータイプＣ4）またはプロテインキナーゼＴＴＫ（ジンクフィンガータイプＣ2Ｈ2）に見られるジンクフィンガードメインとの結合を示さなかったので、ＬＩＭドメインジンクフィンガーに特異的であった。
【０１４７】
酵母およびＣＨＯ相互作用アッセイを用いて得られたデータは、チオレドキシンタンパク質足場にＮ末端およびＣ末端の両方が拘束されているペプチドアプタマーを使用した。本発明者らは、ＬＭＯ２と結合するための正確な配列要件を知らないので、拘束されていないペプチドの能力はこの分析段階では評価が困難であった。中間試験として、２０７ペプチドのＮ末端にだけＧＡＬ４  ＤＢＤが融合されている融合タンパク質ベイトをデザインした。このタンパク質を、ＶＰ１６に融合されているＬＩＭタンパク質を含むプレイタンパク質アレイと共にＣＨＯリポーターアッセイに使用した（図３Ｂ）。このアッセイにおいて、本発明者らは、拘束されていない２０７ペプチドは、ＬＭＯ２に特異的に結合する際にインビボにおいて同様に効果的であることおよびこのペプチドは、完全なＬＭＯ２タンパク質に結合するよりもさらに効率的にＬＭＯ２のＬＩＭ２ドメインに結合することを見出した。２０７ペプチドは、Ｔｒｘ内の構造的な拘束とは関係のないＬＩＭ２ドメイン領域に特異的に結合する配列を有することをこれらのデータは示している。
【０１４８】
実施例４：抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーはＬＭＯ２タンパク質機能を阻害する。
ＬＭＯ２は、造血、血管新生および白血病誘発37を含む機能的な状況の各々においてタンパク質相互作用によって機能するタンパク質相互作用モジュールである15,17。ＬＭＯ２機能を阻害する抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーの可能な用途を、ＬＭＯ２に依存的であることが周知の、胚性幹（ＥＳ）細胞の赤血球型への分化を使用するＬＭＯ２依存的インビトロ培養アッセイにおいてアッセイした19。野生型ＥＳ細胞が分化するとき（図４Ａ、ＣＣＢ）、約２０〜２５％の細胞が赤血球細胞に分化し（赤血球表面タンパク質Ｔｅｒ１１９の発現によって測定）、ほぼ同じ数字が、ＬＭＯ２＋／−ＥＳ細胞を使用して得られた（図４Ａ、ＥＳクローンＫＺ２６20,26）。一方、以前に記載されているように20、無ＬＭＯ２突然変異体ＥＳ細胞は赤血球新生を受けなかった（図４Ａ、ＥＳクローンＨ１６、ＬＭＯ２−／−）。内因的ＬＭＯ２転写プロモーターの制御下において（ＬＭＯ２遺伝子のノックインとして、図４Ａ、ＥＳクローンＡＦ６）またはＬＭＯ２遺伝子のこのノックインプラスＣＭＶプロモーターのＬＭＯ２を発現する導入遺伝子（図４Ａ、ＥＳクローン６Ｂ２３）またはＥＦαプロモーターのＴｒｘ２０７を発現する導入遺伝子（図４Ａ、ＥＳクローンＧ１）の制御下において、Ｔｒｘ２０７抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーが分化中のＥＳ細胞において発現されるとき、赤血球細胞数の減少が生じた。ペプチド挿入のないＴｒｘを発現する対照ＥＳクローンでは赤血球分化の損失は生じなかった（図４Ａ、ＥＳクローンＢＢ４およびＡ５）。従って、Ｔｒｘ２０７融合を発現するＥＳクローンは、野生型レベルの約５０〜７０％に至る赤血球コロニー形成の阻害を示し（図４Ｂ）、この阻害には、２０７ペプチドアプタマーの存在が必要である。従って、抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマー２０７を発現するＥＳ細胞において特異的に赤血球新生が生じないのは、ＬＭＯ２機能の阻害を示しており、この阻害は２０７ペプチドによって表されるペプチド配列に介在されることを示している（図４）。
【０１４９】
実施例５：抗ＬＭＯ２細胞内抗体（抗ＬＭＯ２  ＃１４と指定されている）はマウス胚を発生する際に血管新生を遮断することができる。
結果および考察
細胞内捕獲方法（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｔｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２ａ；  Ｔｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２ｂ；  Ｖｉｓｉｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）によって、抗ＬＭＯ２細胞内抗体を単離した。１つの細胞内抗体（抗ＬＭＯ２  ＃１４）は、哺乳類細胞リポーターアッセイにおいて複数のＬＭＯ２  ＬＩＭドメインに特異的に結合する（ＣＨＮ  ＆  ＴＨＲ、未発表）。抗ＬＭＯ２  ＃１４はＬＭＯ２の生物学的機能を妨害することができるかどうかを判定することを本発明者らは望んだ。最初に、本発明者らは、培養中におけるＥＳの赤血球または初期内皮細胞への分化を含むインビトロにおけるＥＳ細胞アッセイを使用した。記載されているように（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）、ＥＳ細胞に、抗ＬＭＯ２  ＃１４を発現するクローンをトランスフェクションし、これらの細胞および対照の未トランスフェクションＥＳ細胞に成長因子依存的分化を生じさせた。必要な培養期間後、表面マーカーＴｅｒ１１９（赤血球特異的表面タンパク質）またはＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ，ｐａｎ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌタンパク質）の発現について細胞を調査した。Ｔｅｒ１１９の存在は赤血球分化を示し、ＣＤ３１の存在は血管内皮細胞のデノボ形成（脈管新生）を示す。血管新生はＥＳ細胞培養物において生じない。
【０１５０】
図５は、ＥＳ細胞の赤血球系統へのインビトロにおける分化の結果を示す。Ｌｍｏ２の一方の対立遺伝子にｌａｃＺ遺伝子がノックインされ、Ｌｍｏ２発現についてはその対立遺伝子を無発現にするが、Ｌｍｏ２プロモーターの制御化におけるβ−ガラクトシダーゼ発現を可能にする（Ｌｍｏ２発現のリポーターとして作用する）樹立ＥＳ系統であるサブクローンＫＺ２６及び正常なＥＳ細胞（ＣＣＢ）で、赤血球細胞へのほぼ同じレベルの分化が見られた（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。一方、Ｌｍｏ２のホモ接合型ヌル突然変異を有するＥＳ細胞は赤血球新生を受けず（クローンＨ１６）（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）、抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーを発現するＥＳクローンは、赤血球級新生能力が激しく阻害されている（クローン６Ｂ２３）。ＥＳ細胞において抗ＬＭＯ２細胞内抗体＃１４を発現する影響は、Ｌｍｏ２遺伝子のヌル突然変異と同様の影響を生じることである。ＥＳクローン３Ａは、ｐＥＦ−ＢＯＳプロモーターの制御下で抗ＬＭＯ２＃１４を発現する。成長因子を使用して、培養中に分化するようにこれらの細胞を誘導したとき、非常に低いレベル（対照の〜１０％）のＴｅｒ１１９−赤血球コロニーが見られた。抗ＬＭＯ２＃１４細胞内抗体は赤血球新生においてＬｍｏ２機能を阻害すると本発明者らは結論づける。
【０１５１】
ＥＳ細胞アッセイにおけるＬｍｏ２機能の抗ＬＭＯ２＃１４阻害の特異性の対照として、本発明者らは、ＥＳ分化アッセイにおいてＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ）を発現する細胞の発生を評価した。これらの細胞は、Ｌｍｏ２のヌル突然変異によってあまり影響されないＥＳ細胞の脈管新生過程中に形成する（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）（図６、ＥＳクローン  Ｈ１６）。ＥＳクローンＫＺ２６（Ｌｍｏ２遺伝子のヘテロ接合型）、６Ｂ２３（抗Ｌｍｏ２アプタマーを発現する）または抗ＬＭＯ２＃１４細胞内抗体を発現する３Ａで、同様のレベルのＣＤ３１＋細胞が観察された。従って、図５および図６のデータは、抗ＬＭＯ２＃１４細胞内抗体は赤血球新生においてＬｍｏ２の機能に影響を与えることができるが、デノボ脈管新生に影響を与えないことを示している（ジーンターゲティング検討においてＬｍｏ２機能を規定する結果と同等である（Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。
【０１５２】
Ｌｍｏ２は、既存の血管からの血管内皮のリモデリングにおいて何らかの作用を有するが（血管新生）、毛細血管のデノボ発生においては作用を持たない（脈管新生）（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。従って、ＬＭＯ２のこの機能は、血管新生に関係する臨床的徴候の治療標的である。抗ＬＭＯ２＃１４細胞内抗体が血管新生を遮断できる可能性があることを示すために、マウス胚における血管新生に基づいたアッセイを使用した（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。ドナー胚盤胞に注入され、偽妊娠レシピエントに導入されたＥＳ細胞はキメラ胚を発生し、注入されたＥＳ細胞から実質的な割合の細胞が誘導された。ＫＺ２６  ＥＳ細胞（Ｌｍｏ２−ｌａｃＺノックインについてヘテロ接合型）を胚盤胞に注入し、β−ガラクトシダーゼ活性について胚を染色するとき（Ｌｍｏ２発現細胞において特異的に青色を示す）、本発明者らは発生中の脈管に染色を観察した（Ｙａｍａｄａ  ｅｔａｌ．，  ２０００）。図７は、リモデリング中の血管の内皮細胞が、Ｌｍｏ２遺伝子プロモーター発現により青に染色している胚日齢Ｅ１０．５のキメラ胚標本を示す（左のパネル）。Ｌｍｏ２のヌル突然変異を有するＥＳ細胞を用いて作製されたキメラ胚の同様の分析は、Ｌｍｏ２が存在しない場合の毛細血管網の血管新生（リモデリング）の失敗により青い血管新生を示さなかった（図７、右のパネル）。抗Ｌｍｏ２細胞内抗体を発現するＥＳ細胞を用いてキメラ胚を作製したとき、同じ所見が得られた（図７、中央のパネル）。この細胞内抗体がインビボにおいてＬｍｏ２タンパク質と結合すること（ＣＨＮ  ＆  ＴＨＲ、未発表）およびそれがＥＳ細胞アッセイにおいてＬＭＯ２機能を遮断すること（図５および６）を示したので、抗Ｌｍｏ２細胞内抗体は、Ｌｍｏ２に結合し、そのタンパク質が血管内皮細胞において機能を発揮しないようにすることによって血管新生を防止すると本発明者らは結論づけた。
【０１５３】
抗ＬＭＯ２細胞内抗体（ｓｃＦｖ抗体断片を含む）が血管新生の血管新生セグメントにおいてＬＭＯ２機能を妨害することができるが、デノボ血管内皮細胞形成には影響を与えないことを本発明者らの結果は示す。示したデータは、血管新生におけるＬｍｏ２機能のキメラ胚アッセイを使用し、創傷治癒などの正常な状況または癌などの臨床的徴候などの血管新生が生じる他のインビボ状況に対し推論することができる。この抗ＬＭＯ２細胞内抗体、その誘導体または同様の作用をする他の薬剤（例えば、抗ＬＭＯ２細胞内抗体結合部位の知識に基づいて誘導される小型の化学物質）を使用することは、ヒトおよび動物の疾病において血管新生を管理する重要な方法を示唆している。
【０１５４】
上記の明細書に記載されている全ての刊行物は参照により本明細書に組み入れられる。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、記載されている本発明の方法およびシステムの種々の改良および変更は当業者に明らかである。本発明は具体的な好ましい実施態様に関連して記載されているが、主張されている発明はこのような具体的な実施態様に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、分子生物学または関連する分野の当業者に明らかである、本発明を実施するために記載されている様式の種々の改良は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。
【０１５５】
［文献］
【表２】
2007510625.tif 000004
【表３】
2007510625.tif 000005
【表４】
2007510625.tif 000006
【表５】
2007510625.tif 000007
【表６】
2007510625.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】ＬＩＭドメイン：構造および機能を示す。ＬＭＯ２機能の興味深い態様は、この小さい分子（アミノ酸１５６）がこのような主要な作用を有する可能性があることである。これは、２つのＬＩＭドメイン（Ｂ）を含む5その構造によって部分的に説明され、ＬＩＭドメイン（Ｂ）は、各々自体が２つの亜鉛結合ＬＩＭフィンガーからなり、１つの亜鉛原子がシステイン（ｃｙｓ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）またはアスパラギン酸（ａｓｐ）残基の間に配位されている（Ａ）42〜44。ＬＩＭドメインはタンパク質相互作用モジュールであり14,15、ＬＭＯ２は、正常細胞またはＴ細胞白血病細胞の異なる組成のＤＮＡ結合複合体において結合作用を果たす多用途のタンパク質パートナーであると思われる15〜18,45。
【図２】ＬＭＯ２タンパク質に結合するペプチドの配列を示す。（足場として使用される）Ｔｒｘタンパク質に融合される２０ｍｅｒペプチドを含むペプチドライブラリーを、ＬＭＯ２ベイトを発現するクローンに対してスクリーニングした。ＬＭＯ２相互作用Ｔｒｘ−ペプチドをコードするクローンを単離し、ペプチドの配列を得た。単離したペプチド配列を示す。３×１０6形質転換体から、ＬＭＯ２と相互作用するペプチドアプタマーを発現する１５のプラスミドを単離した。Ａ．酵母２−ハイブリッドアッセイにおいてＬＭＯ２と相互作用する１５のペプチドクローンの配列である。保存されているｃｙｓ（Ｃ）およびｈｉｓ（Ｈ）残基は太字の下線つきで示す。Ｂ．酵母２−ハイブリッドアッセイにおいてＬＭＯ２と相互作用し、ＣＨＯ細胞を使用する哺乳類細胞２−ハイブリッドアッセイにおいても活性な１０のペプチドの配列である。保存されているシステイン（Ｃ）およびヒスチジン（Ｈ）残基は太字の下線つきで示し、保存されている疎水性残基には下線をつけ、ＬＭＯ２  ＬＩＭ２のモチーフと同一の残基は・によって示す。各Ｔｒｘペプチドを用いる哺乳類２−ハイブリッドアッセイにおいて形成されるルシフェラーゼの折りたたみ刺激活性を図のＬＨＳに示す（＋／−標準偏差）。Ｃ．ＬＭＯ２と相互作用する１０のペプチドの配列である。保存されているシステイン（Ｃ）およびヒスチジン（Ｈ）残基は太字の下線つきで示す。保存されている短いアプタマーモチーフはダイアグラムのトップに示し、保存されている疎水性残基には下線をつけている。Ｃはアプタマーモチーフの保存されている荷電残基をいう。
【図３】抗ＬＭＯ２ペプチドアプタマーの哺乳類相互作用アッセイを示す。  ＧＡＬ４  ＤＢＤ−Ｔｒｘ−ペプチド（ｐＭベクター）を発現するクローンをベイトとして使用して、それらの相互作用を、ルシフェラーゼリポータークローンと共にＣＨＯ細胞に同時トランスフェクションしたプレイタンパク質（ＶＰ１６融合ベクター）を発現する種々のクローンに対して試験した。ルシフェラーゼ活性を２４時間後に測定した。示されている値は、空のｐＭベイトベクター単独と比較した折りたたみ刺激である。使用したＶＰ１６プレイクローンはベクターのみ（ｐＶＰ１６＋）、ＬＭＯ２、ＬＭＯ２の個々のＬＭＩドメイン（ＬＩＭ１またはＬＩＭ２）、ＬＭＯ４、ＬＭＯ１、プロテインキナーゼＴＴＫ（ジンクフィンガータイプＣ2Ｈ2）、エストロジェン受容体α（ジンクフィンガータイプＣ4）（ＶＰ１６−ＥＲ）、Ｌｄｂ１またはＧａｔａ１であった。（ＮＢ：Ｇａｌ４−２０７はＴＴＫ、ＥＲα、Ｌｄｂ１およびＧａｔａ１に対して試験しなかった。）Ａ．Ｔｒｘ２０７の哺乳類ツー−ハイブリッドデータＢ．足場内にない２０７のペプチドの哺乳類ツー−ハイブリッドデータＣ．Ｔｒｘ２０９の哺乳類ツー−ハイブリッドデータＤ．Ｔｒｘ８５の哺乳類ツー−ハイブリッドデータ
【図４】ＥＳ細胞由来胚様体の赤血球分化を示す。  胚性幹細胞（ＥＳ）をインビトロにおいて培養して、赤血球分化を生じ、赤血球細胞数を赤血球マーカーＴｅｒ１１９の発現によって測定した。ＥＳクローンは野生型（ＣＣＢ）；ヌルＬＭＯ２細胞（Ｈ１６）；ヘテロ接合型ＬＭＯ２（ｌａｃＺ遺伝子ノックインＬＭＯ２、クローンＫＺ２６）；Ｔｒｘ２０７がＬＭＯ２の一方の対立遺伝子にノックインされているＥＳ細胞（ＡＦ６）またはＣＭＶプロモーター駆動性Ｔｒｘ２０７（６Ｂ２３)が安定にトランスフェクションされた同一クローン；ＴｒｘがＬＭＯ２の一方の対立遺伝子にノックインされているＥＳ細胞（ＢＢ４）；ＥＦαプロモーター駆動性Ｔｒｘ２０７(Ｇ１)が安定にトランスフェクションされているヘテロ接合型ＬＭＯ２（ＫＺ２６）またはＥＦαプロモーター駆動性Ｔｒｘのみ（Ａ５）が安定にトランスフェクションされているヘテロ接合型ＬＭＯ２（ＫＺ２６）であった。Ａ．分離した１１日齢の胚様体においてＴｅｒ１１９を発現する細胞の割合。Ｂ．分離した１１日齢の胚様体においてＴｅｒ１１９を発現する細胞の阻害の割合。
【図５】ＥＳの赤血球系統へのインビトロにおける分化を示す。４０％のメチルセルロース、２０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μg／ｍｌのストレプトマイシン、１００μＭのＭＴＧ、１０μｇ／ｍｌのヒトインスリン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＶＥＧＦ，１Ｕ／ｍｌの組換えマウスＥｐｏ、２５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＦＧＦ及び５ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−６を含有するＩＭＤＭ中で各ＥＳ細胞を１１日間増殖させた。ＦＡＣＳ分析のために胚様体をコラゲナーゼＡで単一のＥＳ細胞に分離した。ビオチン化抗マウス赤血球細胞ｍＡｂ（Ｔｅｒ−１１９）およびストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲート体を用いてＦＡＣＳ分析を実施した。各アッセイはデュープリケートで実施した（黒塗りまたは白抜きの四角で示してある）。
【図６】ＥＳ細胞分化過程における血管内皮細胞のデノボ発生（脈管形成）である。図５に記載するように各ＥＳ細胞を増殖させた。胚様体をコラゲナーゼＡで分離し、ビオチン化抗マウスＣＤ３１ｍＡｂおよびストレプトアビジン−フィコエリスリンコンジュゲート体を用いてＦＡＣＳ分析を実施した。各アッセイはデュープリケートで実施した（黒塗りの四角または白抜きの四角で示してある）。
【図７】血管新生中のＥＳ細胞由来内皮細胞におけるβ−ガラクトシド発現を示す。Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞の内側細胞集団にＥＳ細胞を注入し、雌レシピエントに植え込んだ。１０．５日目に胚を単離し、記載されているように（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）Ｘｇａｌで染色し、全載写真を得た。
【図８】ＬＭＯ２のＬＩＭ２ドメインに結合し、ＬＭＯ２の機能活性を阻害するｓｃＦｖ（抗ＬＭＯ２抗体）のアミノ酸配列を示す。ＶH  ＣＤＲは下線および影をつけ、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）と称する。ＶL  ＣＤＲは影をつけ、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と称する。Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーの配列に下線をつけてある。ｓｃＦｖの配列は配列番号１２と称する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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