(57)【要約】  本発明は、分子あるいは分子集合体の酵素修飾による生体活性表面を製造する方法に関するものであり、特に、コラーゲン、ガラス表面、金属、金属酸化物、プラスチック、バイオポリマーあるいは他の材料、細胞培養においてはアモルファス二酸化珪素（シリカ）またはシリコーンと共に、シリカテインα、シリカテインβドメインを含む酵素修飾に用いられるポリペプチドによる、組織工学、あるいは医療用インプラントによる方法に関する。本発明の方法は、細胞／細胞培養物の成長、活性および／または石灰化を促進する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アモルファス二酸化珪素（シリカ）および／あるいはシリコーンを有する表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾により、生体活性表面を製造する方法であって、ポリペプチドによる酵素修飾からなり、当該ポリペプチドは、配列番号１あるいは配列番号３に示された配列と２５％以上の配列同一性を示す動物、細菌、植物あるいは真菌由来のシリカテイン(silicatein)αあるいはシリカテインβドメイン、あるいは配列番号５に示された配列と２５％以上の配列同一性を示す動物、細菌、植物あるいは真菌由来のシリカーゼ（silicase）ドメインからなる方法。
【請求項２】
珪酸、モノアルコキシシラントリオール（monoalkoxysilanetriol）、ジアルコキシシランジオール（dialkoxysilanediol）、トリアルコキシシラノール（trialkoxysilanol）、あるいはテトラアルコキシシラン（tetraalkoxysilane）が酵素修飾基質として用いられることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
モノアルコキシシランジオール（monoalkoxysilanediol）、モノアルコキシシラノール（monoalkoxysilanol）、ジアルコキシシラノール（dialkoxysilanol）、アルキルシラントリオール（alkylsilanetriol）、アリールシラントリオール（arylsilanetriol）あるいはメタロシラントリオール（metallosilanetriol）、アルキルシランジオール（alkylsilanediol）、アリールシランジオール（arylsilanediol）あるいはメタロシランジオール（metallosilanediol）、アルキルシラノール（alkylsilanol）、アリールシラノール（arylsilanol）あるいはメタロシラノール（metallosilanol）、アルキルモノアルコキシシランジオール（alkylmonoalkoxysilanediol）、アリールモノアルコキシシランジオール（arylmonoalkoxysilanediol）あるいはメタロモノアルコキシシランジオール（metallomonoalkoxysilanediol）、アルキルモノアルコキシシラノール（alkylmonoalkoxysilanol）、アリールモノアルコキシシラノール（arylmonoalkoxysilanol）あるいはメタロモノアルコキシシラノール（metallomonoalkoxysilanol）、アルキルジアルコキシシラノール（alkyldialkoxysilanol）、アリールジアルコキシシラノール（aryldialkoxysilanol）あるいはメタロジアルコキシシラノール（metallodialkoxysilanol）、アルキルトリアルコキシシラン（alkyltrialkoxysilane）、アリールトリアルコキシシラン（aryltrialkoxysilane）あるいはメタロトリアルコキシシラン（metallotrialkoxysilane）が酵素修飾基質として用いられることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾により、生体活性表面を製造する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法において、当該表面は、ガラス、金属、金属酸化物、プラスチック、バイオポリマーあるいはその他の材料である方法。
【請求項５】
表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾により、生体活性表面を製造する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法において、当該分子あるいは分子集合体は、バイオポリマーである方法。
【請求項６】
表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾により、生体活性表面を製造する請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法において、当該分子あるいは分子集合体は、コラーゲンである方法。
【請求項７】
表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾により、生体活性表面を製造する請求項６に記載の方法において、当該分子あるいは分子集合体は、海洋性カイメン由来のコラーゲンである方法。
【請求項８】
表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾により、生体活性表面を製造する請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、配列番号１あるいは配列番号３によるスベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）由来のシリカテインαあるいはシリカテインβのポリペプチド、あるいはシリカテインαあるいはシリカテインβドメインのアミノ酸配列が配列番号１あるいは配列番号３に示された配列と２５％以上の配列同一性を示すシリカテインαあるいはシリカテインβに相同性のあるポリペプチドが、in vivo、細胞抽出物あるいは細胞溶解物あるいは精製形状において得られる方法。
【請求項９】
表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾により、生体活性表面を製造する請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、配列番号５によるスベリテス・ドムンクラSuberites domuncula由来シリカーゼ（silicase）のポリペプチド、あるいはシリカーゼ（silicase）ドメインのアミノ酸配列が配列番号５に示された配列と２５％以上の配列同一性を示すシリカーゼ（silicase）に相同性のあるポリペプチドが、in vivo、細胞抽出物あるいは細胞溶解物あるいは精製形状において得られる方法。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載された方法により得られた珪酸含有構造物あるいは表面。
【請求項１１】
細胞および／あるいは細胞培養物の成長、活性および／あるいは石灰化を促す方法であって、ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を実施すること、およびｂ）得られた生体活性表面に細胞および／あるいは細胞培養物を接触させること、から成る方法。
【請求項１２】
細胞および／あるいは細胞培養物の成長、活性および／あるいは石灰化を促す請求項１１に記載の方法において、当該細胞は、骨芽細胞あるいは骨芽細胞類似の細胞から選択される方法。
【請求項１３】
細胞培養、組織工学、あるいは医療用インプラント製造における、請求項１〜９あるいは請求項１１あるいは１２のいずれか１項に記載の方法の利用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
１．従来技術
二酸化珪素、珪酸塩およびシリコーンは、産業上広く利用され、経済的に重要な材料である。また、ハイテク製品（光学およびマイクロエレクトロニクス機器、ナノ粒子製造など）の製造に用いられる主要な材料の１つでもある。二酸化珪素（SiO2）は、結晶およびアモルファス形状中に存在する。アモルファスSiO2は、とりわけ、分子篩として、触媒、充てん剤、増白剤として、吸収剤として、担体、安定剤あるいは触媒担体として使用されている。また、アモルファスSiO2（「バイオシリカ」）は、その骨格構造が、珪藻（diatom）の殻および珪質カイメンの針（骨針）など、多くの単細胞および多細胞有機体から成り、バイオミネラリゼーションにより形成された材料でもある。
【０００２】
重合珪酸塩の化学合成には、通常、高圧や高温などの極端な条件を要する。それとは対照的に、珪酸含有カイメンは、温和な条件下、すなわち比較的低温かつ低圧においても、特異的な酵素の助けを借りて珪酸塩骨格を形成する能力を有する。これらの有機体におけるSiO2合成は、高い特異性、制御され得る点、および明確なナノ構造を合成することができる点において際立っている。
【０００３】
生体起源シリカ形成に関与するメカニズムに関しては、ここ数年間で最初の洞察が得られた。驚いたことに、珪酸含有カイメンはそのシリカ骨格を酵素的に合成する能力を有することが判明した。これは、二酸化珪素形成に関与する最初の遺伝子およびタンパク質の単離により明らかになった。
【０００４】
普通海綿綱（Ｄｅｍｏｓｐｏｎｇｅｓ）における骨針形成は、タンパク質（「シリカテイン」）から成る軸フィラメント周囲から始まり、酵素活性を有し、アモルファス二酸化珪素合成を媒介する（Cha et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:361-365; Krasko et al. (2000) Europ. J. Biochem. 267:4878-4887）。海洋性珪酸含有カイメンであるスベリテス・ドムンクラSuberites domunculaから酵素がクローン化され（Krasko et al. (2000) Europ. J. Biochem 267:4878-4887）、その際用いられた技術が記載された；最初に記載された酵素はシリカテインα（単にシリカテインとも呼ばれる）である（PTC/US 30601. Methods, compositions, and biomimetic catalysts, such as silicateins and block copolypeptides, used to catalyze and spatially direct the polycondensation of silicon alkoxides, metal alkoxides, and their organic conjugates to make silica, polysiloxanes, polymetallo-oxanes, and mixed poly(silicon/metallo)oxane materials under environmentally benign conditions. 発明者／出願人: DE Morse, GD Stucky, TD Deming, J Cha, K Shimizu, Y Zhou; DE 10037270 A1. Silicatein-vermittelte Synthese von amorphen Silicaten und Siloxanen und ihre Verwendung. ドイツ特許庁２０００年、 出願人および発明者: WEG Mueller, B Lorenz, A Krasko, HC Schroeder; PCT/EP01/08423. Silicatein-mediated synthesis of amorphous silicates and siloxanes and use thereof. 発明者／出願人: WEG Mueller, B Lorenz, A Krasko, HC Schroeder）。有機珪素化合物（アルコキシシラン（alkoxysilane））からバイオシリカを合成することができる。
【０００５】
また、シリカテインαに加え、シリカテインβもクローン化された（DE 103 52 433.9. Enzymatische Snthese, Modifikation und Abbau von Silicium(IV)- und anderer Metall(IV)-Verbindungen. ドイツ特許庁２００３年、出願人: Johannes Gutenberg University Mainz; 発明者: WEG Mueller, H Schwertner, HC Schroeder）。
【０００６】
シリカテインは、カテプシンファミリーの代表的なものである。例えば高度な脊椎動物におけるカテプシンの場合など、Cys、HisおよびAsnのアミノ酸は、システインプロテアーゼの触媒３残基（CT）を形成するが、カイメンカテプシン（カイメンジオジア・シドニウム（Geodia cydonium）およびSドムンクラ（S. domuncula）のカテプシンL-cDNA由来のアミノ酸配列）中に存在する。しかしながら、シリカテインαおよびシリカテインβ（Sドムンクラ（S. domuncula））においては、システイン基がセリンに置換されている（Krasko et al. (2000) Europ. J. Biochem. 267:4878-4887）。
【０００７】
組換えシリカテインの酵素活性を測定するために、従来、基質としてテトラエトキシシラン（tetraethoxysilane）が用いられるが、その際、酵素介在によるエタノールの脱離後に産生されたシラノールが重合する（図３）。重合二酸化珪素の量は、モリブデ-ト検定により測定することができる（Cha et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:361-365; Krasko et al. (2000) Europ. J. Biochem. 267:4878-4887）。
【０００８】
また、Sドムンクラ（S. domuncula）から、アモルファス二酸化珪素の溶解能を有する酵素をクローン化することも可能である（HC Schroeder, A Krasko, G Le Pennec, T Adell, M Wiens, H Hassanein, IM Mueller, WEG Mueller (2003) Silicase, an enzyme which degrades biogenous amorphous silica: Contribution to the metabolism of silica deposition in the demosponge Suberites domuncula. Prog. Molec. Subcell. Biol. 33:250-268; DE 102 46 186.4. Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms. ドイツ特許庁２００２年、出願人: Johannes Gutenberg University Mainz; 発明者: WEG Mueller, A Krasko, HC Schroeder）。シリカ分解酵素であるシリカーゼ（silicase）は、mRNAの差次的発現技術を用いて同定された。シリカーゼ（silicase）は、その１つの炭酸脱水酵素様酵素をコードする。組換えシリカーゼ（silicase）は、遊離珪酸形成下において、二酸化珪素の溶解を引き起こす。しかしながら、同酵素はまた、可逆反応においてその合成能をも有する。ノーザンブロット実験により、Sドムンクラ（S. domuncula）において、培地中の珪素濃度が上昇すると、シリカ同化酵素であるシリカテインの発現は、シリカ異化酵素であるシリカーゼ（silicase）同様、上昇することが示された。
【０００９】
１．１．骨芽細胞
骨芽細胞は、骨形成細胞である。1型コラーゲンおよび非コラーゲンタンパク質など、骨基質タンパク質のほとんどを合成し、分泌する。また、石灰化に関与するアルカリホスファターゼを多く含有する。骨芽細胞は、１α２５‐ジヒドロキシビタミンＤ３（1α25-dihydroxyvitamin D3）［1.25(OH)2D3］、グルココルチコイドおよび成長因子に反応する。1.25(OH)2D3は、骨再吸収の刺激因子であり、成熟した骨芽細胞中において、石灰化プロセスに関わるオステオカルシンなどの遺伝子発現を増加させる。
【００１０】
骨芽細胞表現型の典型的なマーカーとしては、中でもアルカリホスファターゼ、オステオカルシン、1型コラーゲン、フィブロネクチン、オステオネクチン、シアロタンパク質、プロテオグリカン類およびコラゲナーゼなどが挙げられる。アルカリホスファターゼは、グリコシルホスファチジルイノシトール（glycosylphosphatidylinositol:GPI）アンカ‐を通して膜に結合するエクトエンザイム（細胞から外部へと向けられている酵素）である。
【００１１】
骨芽細胞には、多くの細胞系がある。SaOS-2細胞は、骨芽細胞の機能を研究するために、実験モデルとして用いられる確立されたヒト骨肉腫細胞系である。おそらく、入手可能なヒト細胞系の中で、最も分化した骨芽細胞様細胞である（Rifas et al. (1994) Endocrinology 134:213-221）。SaOS-2細胞は、高いアルカリホスファターゼ活性を有し、パラトモン（parathomone）および1.25(OH)2D3受容体と同時にオステオネクチンを含有し、石灰化能を有する（Rodan et al. (1987) Cancer Res. 47:4961-4966; McQuillan et al. (1995) Bone 16: 415-426）。マトリックスを構築するために合成されるコラーゲンは、主に1型およびＶ型コラーゲンより構成される。
【００１２】
SaOS-2などの骨芽細胞培養物の石灰化は、β‐グリセロリン酸塩の添加により促進される。β‐グリセロリン酸塩は、外部へと向けられたアルカリホスファターゼにより分裂され、無機リン酸塩（Pi）が放出される。また、石灰化の際に、ヒドロキシルアパタイト結晶が定着できるコラーゲンマトリックス形成を促すために、アスコルビン酸もしばしば添加される（McQuillan et al. (1995) Bone 16:415-426）。石灰化は、刺激されたSaOS-2細胞の密集後６〜７日で容易に示され得る。
【００１３】
骨の細胞外マトリックスへの骨芽細胞接着のメカニズムは、複雑である。コラーゲン基質への接着が、骨芽細胞分化および骨芽細胞機能を制御しているように思われる。例えば、Arg-Gly-Asp(RGD)を含むペプチドの誘導性は、ラット骨芽細胞において、石灰化およびそれに続く破骨細胞成長を阻む原因となるが、これらの細胞によるコラーゲン合成に対しては、影響を及ぼさない（Gronowicz and Derome (1994) J. Bone Miner. Res. 9:193-201）。一方、RGDトリペプチドを含む表面は、骨芽細胞活性を促進することが示されてきた（El-Ghannam et al. (2004) J. Biomed. Mater. Res. 68A:615-627）。
【００１４】
インテグリンと細胞外マトリックスタンパク質との相互作用は、接着メカニズムおよびそれに続く細胞プロセスに決定的に関与する。ヒト骨芽細胞は、複数のインテグリンを発現する。一部のインテグリンは、ヒトＭＧ‐６３骨肉腫細胞において、インターロイキン‐１によるアルカリホスファターゼ発現誘導に関わることが示されてきた（Dedhar (1989) Exp. Cell. Res. 183: 207-204）。その他のインテグリンは、コラーゲン接着受容体として同定された（Hynes (1992) Cell 69:11-25）。このように、1型コラーゲンに含まれるテトラペプチド誘導Asp-Gly-Glu-Ala（DGEA）（Staatz et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:7363-7367）は、ヒト骨芽細胞により発現されたインテグリンにより認識される（Clover et al. (1992) J. Cell Sci. 103:267-271）。また、DGEAペプチドは、SaOS-2細胞におけるCa2+の上昇を引き起こす（McCann et al. (1997) Matrix Biol. 16:271-280）。
【特許文献１】PTC/US30601
【特許文献２】DE10037270A1
【特許文献３】PCT/EP01/08423
【特許文献４】DE10352433.9
【特許文献５】DE10246186.4
【特許文献６】PCT/US99/0601
【特許文献７】PCT/EP03/10983
【特許文献８】DE10010113 A 1
【非特許文献１】Cha at al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:361-365
【非特許文献２】Krasko et al. (2000) Europ. J. Biochem 267:4878-4887
【非特許文献３】HC Schroeder, A Krasko, G Le Pennec, T Adell, M Wiens, H Hassanein, IM Mueller, WEG Mueller (2003) Silicase, an enzyme which degrades biogenous amorphous silica: Contribution to the metabolism of silica deposition in the demosponge Suberites domuncula. Prog. Molec. Subcell. Biol. 33:250-268
【非特許文献４】Rodan et al. (1987) Cancer Res. 47:4961-4966
【非特許文献５】McQuillan et al. (1995) Bone 16: 415-426
【非特許文献６】Gronowicz and Derome (1994) J. Bone Miner. Res. 9:193-201
【非特許文献７】El-Ghannam et al. (2004) J. Biomed. Mater. Res. 68A:615-627
【非特許文献８】Dedhar (1989) Exp. Cell. Res. 183: 207-204
【非特許文献９】Hynes (1992) Cell 69:11-25
【非特許文献１０】Staatz et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:7363-7367
【非特許文献１１】Clover et al. (1992) J. Cell Sci. 103:267-271
【非特許文献１２】McCann et al. (1997) Matrix Biol. 16:271-280
【非特許文献１３】Hench et al. (1991) J. Amer. Cerm. Soc. 74:1487
【非特許文献１４】Gao et al. (2001) Biomaterials 22:1475-1483; Bosetti et al. (2003) J. Biomed. Mater. Res. 64A:189-95
【非特許文献１５】Reffitt et al. (2003) Bone 32:127-135
【非特許文献１６】Gross et al. (1988) CRC Critical Reviews in Biocompatibility 4:2; Yamamuro et al. (編者), Handbook on Bioactive Ceramics, vol. I: Bioactive Glasses and Glass-Ceramics, vol. II. CRC Press, Boca Raton, FL, 1990; Hench and Wilson (1984) Science 226:630
【非特許文献１７】Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York
【非特許文献１８】Swatschek et al. (2002) Eur. J. Pharm. Biopharm. 53:107-113
【非特許文献１９】Hochuli et al. (1987) J. Chromatogr. 411: 177-184
【非特許文献２０】Stanford et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:9420-9428
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
２．発明の主題
診療所において、骨修復および骨置換に好んで優先的に用いられる自家移植には不都合があるため、代替骨置換材の需要は高い。整形外科においては、ポリラクチド（PLA）、ポリグリコリド（PGA）およびそのコポリマー（PLAGA）などの生分解性ポリマーは、しばしば利用されている。近年、４５Ｓ５生体活性ガラスなど、表面のリン酸カルシウム層を通して、新骨形成を促し、骨への連結を築く、いわゆる生体活性材料が開発されてきた（Hench et al. (1991) J. Amer. Cerm. Soc. 74:1487）。しかしながら、これにより非生理的表面マトリックス（ガラス表面）が手に入るわけではない。
【００１６】
そのため、本発明における課題は、従来用いられてきた材料より優れた性質を持つ適切な生理的表面を手に入れることとなる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題は、本発明の第一の態様により、生理学的分子／分子集合体（コラーゲン）から構成され、酵素的に作られたバイオシリカにより修飾された本発明に記載の表面マトリックスにより解決される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の枠組み内において、ある材料の表面上に、当該材料と組織（新骨形成など）との間に最終的に（安定した）結合を形成する特異的な生物反応が実現された場合、その材料は「生体活性を有する」ものとされる。かように、「生体活性を有する」材料は、細胞成長および／あるいは細胞分化および／あるいは特異的な細胞機能調節の促進（骨芽細胞による石灰化促進あるいは線維芽細胞によるコラーゲン形成の促進および／あるいは細胞機能促進など）に寄与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
1型コラーゲン、アルカリホスファターゼの発現は、骨形成タンパク質‐２（BMP‐2）の発現と同様、表面活性ガラス（生体活性ガラス）により、in vitroにおいて上昇することが示されている（Gao et al. (2001) Biomaterials 22:1475-1483; Bosetti et al. (2003) J. Biomed. Mater. Res. 64A:189-95）。
【００２０】
珪酸は、骨形成において重要な役割を担う。そのため、オルト珪酸は、in vitroにおいて、ヒト骨芽細胞における1型コラーゲン合成および分化を促すことが知られている（Reffitt et al. (2003) Bone 32:127-135）。同様に、アルカリリン酸塩活性およびオステオカルシンも有意に上昇する。
【００２１】
以下は、生体活性ガラスおよびガラスセラミックスの臨床応用に関する調査論文として示されている：Gross et al. (1988) CRC Critical Reviews in Biocompatibility 4:2; Yamamuro et al. (編者), Handbook on Bioactive Ceramics, vol. I: Bioactive Glasses and Glass-Ceramics, vol. II. CRC Press, Boca Raton, FL, 1990; Hench and Wilson (1984) Science 226:630。
【００２２】
このような骨置換材の要件は、生体適合性、生分解性および骨伝導性（骨成長を促進できる）を有する、すなわち生体活性を有する（その表面にリン酸カルシウム層を形成できる、上記参照）ことである。
【００２３】
そのため、本発明の更なる態様に従い、アモルファス二酸化珪素（シリカ）を有する表面上の分子あるいは分子集合体を酵素修飾することにより、生体活性表面を作り出す方法が記載される。酵素修飾にはポリペプチドが用いられ、当該ポリペプチドは、配列番号１あるいは配列番号３に示された配列と、２５％以上、好ましくは５０％以上、更に好ましくは７５％以上、そして最も好ましくは９５％以上の配列同一性を示す動物、細菌、植物あるいは真菌由来のシリカテインα、シリカテインβドメインを含むことを特徴とする。
【００２４】
アモルファス二酸化珪素（シリカ）を有する表面上の分子あるいは分子集合体を酵素修飾することにより、生体活性表面を得ることが可能であることは、これまでの技術水準においては知られておらず、また認知され得なかった。
【００２５】
そのため、珪酸、モノアルコキシシラントリオール（monoalkoxysilanetriol）、ジアルコキシシランジオール（dialkoxysilanediol）、トリアルコキシシラノール（trialkoxysilanol）あるいはテトラアルコキシシラン（tetraalkoxysilane）などの化合物を酵素修飾の基質として用いた本発明による方法も提供される。
【００２６】
本発明の更なる態様によれば、当該方法は、シリコーンを有する表面上の分子あるいは分子集合体を酵素修飾することにより、生体活性表面を作り出す際にも有用である。酵素修飾にはポリペプチドもまた用いられ、当該ポリペプチドは、配列番号１あるいは配列番号３に示された配列と、２５％以上、好ましくは５０％以上、更に好ましくは７５％以上、そして最も好ましくは９５％以上の配列同一性を示す動物、細菌、植物あるいは真菌由来のシリカテインα、あるいはシリカテインβドメインを含むことを特徴とする。
【００２７】
モノアルコキシシランジオール（monoalkoxysilanediol）、モノアルコキシシラノール（monoalkoxysilanol）、ジアルコキシシラノール（dialkoxysilanol）、アルキルシラントリオール（alkylsilanetriol）、アリールシラントリオール（arylsilanetriol）あるいはメタロシラントリオール（metallosilanetriol）、アルキルシランジオール（alkylsilanediol）、アリールシランジオール（arylsilanediol）あるいはメタロシランジオール（metallosilanediol）、アルキルシラノール（alkylsilanol）、アリールシラノール（arylsilanol）あるいはメタロシラノール（metallosilanol）、アルキルモノアルコキシシランジオール（alkylmonoalkoxysilanediol）、アリールモノアルコキシシランジオール（arylmonoalkoxysilanediol）あるいはメタロモノアルコキシシランジオール（metallomonoalkoxysilanediol）、アルキルモノアルコキシシラノール（alkylmonoalkoxysilanol）、アリールモノアルコキシシラノール（arylmonoalkoxysilanol）あるいはメタロモノアルコキシシラノール（metallomonoalkoxysilanol）、アルキルジアルコキシシラノール（alkyldialkoxysilanol）、アリールジアルコキシシラノール（aryldialkoxysilanol）あるいはメタロジアルコキシシラノール（metallodialkoxysilanol）、アルキルトリアルコキシシラン（alkyltrialkoxysilane）、アリールトリアルコキシシラン（aryltrialkoxysilane）あるいはメタロトリアルコキシシラン（metallotrialkoxysilane）などの化合物は、末述の態様（シリコーンを有する表面上の分子あるいは分子集合体を酵素修飾することにより、生体活性表面を作り出す態様）において、酵素修飾の基質として用いることができる。
【００２８】
更に本発明の別の態様によれば、当該方法は、アモルファス二酸化珪素（シリカ）を有する表面上の分子あるいは分子集合体を酵素修飾することにより、生体活性表面を作り出す際にも有用である。酵素修飾にはポリペプチドもまた用いられ、当該ポリペプチドは、配列番号５に示された配列と、２５％以上、好ましくは５０％以上、更に好ましくは７５％以上、そして最も好ましくは９５％以上の配列同一性を示す動物、細菌、植物あるいは真菌由来のシリカテインα、あるいはシリカテインβドメインを含むことを特徴とする。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、ガラス、金属、金属酸化物、プラスチック、バイオポリマーあるいはその他の材料の表面上における分子あるいは分子集合体の酵素修飾による生体活性表面の製造は、本発明に記載の方法によって行い得る。
【００３０】
更に本発明の別の態様によれば、表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾による生体活性表面の製造方法が提供され、この場合の分子あるいは分子集合体は、バイオポリマー、特にコラーゲン、好ましくは海洋性カイメン由来のコラーゲンである。
【００３１】
更に、細胞／細胞培養物、特に骨芽細胞の成長、活性および／あるいは石灰化を促すための本発明に記載の方法は、以下において提供される。ａ）アモルファス二酸化珪素（シリカ）を有する表面上の分子あるいは分子集合体が酵素的に修飾される、またｂ）酵素修飾にはポリペプチドが用いられ、当該ポリペプチドは、配列番号１あるいは配列番号３に示された配列と、２５％以上、好ましくは５０％以上、更に好ましくは７５％以上、そして最も好ましくは９５％以上の配列同一性を示す動物、細菌、植物あるいは真菌由来のシリカテインαあるいはシリカテインβドメインを含むことを特徴とする。
【００３２】
また、ポリペプチドは、アモルファス二酸化珪素（シリカ）を有する表面の成長、活性および／あるいは石灰化を促進する本発明による方法にも用いることができる。当該ポリペプチドは、配列番号５に示された配列と、２５％以上、好ましくは５０％以上、更に好ましくは７５％以上、そして最も好ましくは９５％以上の配列同一性を示す動物、細菌、植物あるいは真菌由来のシリカーゼ（silicase）ドメインを含むことを特徴とする。
【００３３】
本発明による前述の方法は、細胞培養、組織工学、あるいは医療用インプラント製造に利用される。
【００３４】
本発明の更なる態様は、本発明記載の方法により得られた珪酸を含有する構造あるいは表面に関わる。
【００３５】
本発明により用いられるポリペプチド（配列番号１あるいは配列番号３によるスベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）由来のシリカテインαあるいはシリカテインβ、あるいはシリカテインαあるいはシリカテインβのアミノ酸配列において、配列番号１あるいは配列番号３に示された配列と、２５％以上、好ましくは５０％以上、更に好ましくは７５％以上、そして最も好ましくは９５％以上の配列同一性を示すシリカテインαあるいはシリカテインβに相同性のあるポリペプチド）は、天然型に加え、合成により製造され、あるいは当該ポリペプチドが原核生物あるいは真核生物の細胞抽出物あるいは細胞溶解物中に存在するという特徴を更に有し得る。細胞抽出物あるいは溶解物は、ex vivoあるいはex vitroにて、例えば組換え細菌細胞あるいは海洋性カイメンからなど、細胞から得ることができる。本発明により用いられるポリペプチドの場合、配列番号５によるスベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）由来のシリカーゼ（silicase）、あるいはシリカーゼ（silicase）ドメインのアミノ酸配列において、配列番号５に示された配列と、２５％以上、好ましくは５０％以上、更に好ましくは７５％以上、そして最も好ましくは９５％以上の配列同一性を示すシリカーゼ（silicase）に相同性のあるポリペプチドでもあり得る。
【００３６】
本発明により用いられるポリペプチドは、当分野の技術水準において知られている従来の方法に従い精製することができ、従って他のタンパク質を実質的に含有しない状態で存在し得る。
【００３７】
ヌクレオチド配列由来のポリペプチド同様、Sドムンクラ（S. domuncula）由来のシリカテインαポリペプチドおよびシリカテインβポリペプチドをコードするcDNAの特性が開示されている（PCT/US99/0601; DE 10037270 A 1; PCT/EP01/08423; DE 103 52 433.9）。組換えシリカテインαポリペプチドの分子量は、２８．５ｋＤＡ以下（シリカテイン２６ｋＤＡ以下に加えてベクター２ｋＤＡ）であり、等電点ｐｌは約６．１６である。
【００３８】
ヌクレオチド配列由来のポリペプチド同様、Sドムンクラ（S. domuncula）由来シリカーゼ（silicase）をコードするcDNAの特性もまた開示されている（DE 102 46 186.4）。
【００３９】
以降、本発明は以下の実施例により更に詳細に説明されるが、それに限るものではない。
添付図面および配列番号は、以下の通りである。
【００４０】
配列番号１：本発明により用いられるSドムンクラ（S. domuncula）由来のシリカテインαポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号２：本発明により用いられるSドムンクラ（S. domuncula）由来のシリカテインαポリペプチドの核酸配列。
配列番号３：本発明により用いられるSドムンクラ（S. domuncula）（SIA_SUBDO）由来のシリカテインβのアミノ酸配列。
配列番号４：本発明により用いられるSドムンクラ（S. domuncula）由来のシリカテインβの核酸配列。
配列番号５：本発明により用いられるSドムンクラ（S. domuncula）由来のシリカーゼ（silicase）のアミノ酸配列。
配列番号６：本発明により用いられるSドムンクラ（S. domuncula）由来のシリカーゼ（silicase）のcDNAの核酸配列。
配列番号７：本発明により用いられるSドムンクラ（S. domuncula）（SIA_SUBDO）由来のコラーゲン３のアミノ酸配列。
配列番号８：本発明により用いられるSドムンクラ（S. domuncula）由来のコラーゲン３の核酸配列。
【実施例１】
【００４１】
２．１．酵素的に修飾された表面上におけるSaOS-2細胞の石灰化
以下の試験には、ヒト骨芽細胞（SaOS-2細胞）が用いられた。SaOS-2細胞は、骨原性肉腫から生じる（McQuillan et al. (1995) Bone 16:415-426）。全ての培養物に関して、細胞成長および石灰化が測定された。石灰化に加え、アルカリホスファターゼ発現もまた、更なる分化マーカーとして測定された。
【００４２】
SaOS-2細胞は、細胞変換（実験培養の開始）後７日目に１０ｍＭ  β‐グリセロリン酸塩を加え、１２日間まで培養された。その後、リン酸カルシウム沈降物の量は、バッチに分けてアリザリンレッドSにより測定された。結果は、総DNAと関係付けられた。
【００４３】
SaOS-2細胞の石灰化は、コラーゲンによる培養皿のコーティングにより強く促進される（図４）。この例においては、組換え３型カイメンコラーゲン（Sドムンクラ（S. domuncula））は、１型ウシコラーゲン（Sigma製）より効果的であった（いずれもインキュベーション時間は２日間、測定値がバッチ当たりのDNA（μｇ）へ関連付けられた場合には１２日間）。β‐グリセロリン酸塩を加えたバッチにおける石灰化促進程度は、更に長時間のインキュベーション期間（１２日間）後に１型ウシコラーゲンでコーティングしたウエルとほぼ同等に過ぎなかった。しかしながら、この時点においても、他の全バッチに比べ、組換えカイメンコラーゲンでコーティングしたウエルにおいて、石灰化の程度が大きかった。
【００４４】
しかし、コラーゲン（１型ウシコラーゲンおよび組換え３型カイメンコラーゲン）による培養皿（ウエル）のコーティングは、長時間のインキュベーション期間において（１２日間；図４）、SaOS-2細胞の成長（バッチ当たりのDNA（μｇ）で示される）に対し、負の影響を及ぼした。
【００４５】
細胞密度（１ｃｍ2当たりの細胞数）測定においても、類似の結果が得られた（図５）。短時間のインキュベーション期間（１〜４日間）においては、コラーゲン（１型ウシコラーゲンあるいは組換え３型カイメンコラーゲン）によりコーティングされたウエル（バッチ）において、細胞成長が顕著に促進された。しかし長時間のインキュベーション期間（８日間）においては、成長はコントロール値（コラーゲンでコーティングされていないウエル）より低かった。
【００４６】
上記とは対照的に、コントロールより細胞密度が高い、すなわち成長が良好な例は、本発明による方法（コラーゲン、および酵素的に‐すなわちシリカテインおよびTEOSにより‐作られたコラーゲンによる表面修飾）により表面処理されたウエルに見られた（図５）。
【００４７】
また、DNA濃度の測定においても、本発明による方法により表面処理されたウエルには、細胞成長（培養物当たりの総DNA値に基づく）の低下は見られなかった。処理された（修飾された）ウエルの４日目における総DNAは、コントロールよりかなり高かった（図６）。
【００４８】
SaOS-2細胞の石灰化（リン酸カルシウムの沈降）測定において、修飾されていないコントロール表面に比べ、本発明により酵素的に修飾された骨芽細胞を促進する表面においては、大幅な差異が見られるのは明らかであった。図７は、１２日目にアリザリンレッドSにより表れた石灰化を示す。修飾されていないコントロールウエル表面において、β‐グリセロリン酸塩が添加されたが（７日目）、β‐グリセロリン酸塩を加えないコントロール（ウエル番号１Ｂおよび１Ｃ）に比べ、比較的わずかな石灰化の上昇しか見られなかった（ウエル番号１Ａ）。対照的に、組換えカイメンコラーゲン３型、および酵素的に‐すなわちシリカテインαおよびTEOSにより‐合成されたバイオシリカでのコーティングにより修飾された表面で培養されたSaOS-2細胞（ウエル番号２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）の場合、ウシ１型コラーゲンおよび酵素的に‐すなわちシリカテインαおよびTEOSにより‐合成されたバイオシリカでのコーティングにより修飾された表面で培養されたSaOS-2細胞（ウエル番号３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）と同様、石灰化の急激な上昇が見られた。
【００４９】
本発明（コラーゲン、シリカテインαおよびTEOSによる処理）により酵素的に修飾された表面上に培養されたSaOS-2細胞の石灰化は、コラーゲンのみで修飾された表面上に培養されたSaOS-2細胞に比べ、大幅に上昇した（図8）。図に示された通り、１２日目において、１型コラーゲンとシリカテインαおよびTEOS（バイオシリカ修飾ウシコラーゲンの合成）によるコーティング後、あるいは組換え３型コラーゲンとシリカテインαおよびTEOS（バイオシリカ修飾カイメンコラーゲンの合成）によるコーティング後、培養皿中の石灰化程度（アリザリンレッド(nmol)／総DNA（μｇ）で示される）は、特定のコラーゲンのみによりコーティングされた培養皿に比べ顕著に高かった。
【００５０】
本発明による酵素修飾の生理活性は、石灰化したSaOS-2細胞におけるアルカリホスファターゼ活性の測定によっても示すことができる。
【実施例２】
【００５１】
２．２シリカテインポリペプチドの製造
コラーゲン修飾に必要なシリカテインポリペプチドは、組織あるいは細胞の精製あるいは組換えにより製造することができる。
【００５２】
２．２．１．天然資源からのシリカテインポリペプチド精製
シリカテインαおよびシリカテインβの精製は、単離されたカイメン骨針から行うことができる。
【００５３】
２．２．２．組換えシリカテインポリペプチドの製造
組換えタンパク質（シリカテインα：配列番号１；シリカテインβ：配列番号３）の製造は、大腸菌（E.coli）中にて行うことができる。酵母や哺乳類細胞における製造も可能である。この目的のために、特定のcDNAが、pQE-30などの発現ベクター中にクローン化される。E.coli形質転換の後、IPTG（イソプロピル‐β‐チオガラクトピラノシド（isopropyl-β-thiogalactopyranoside））により、タンパク質の発現が誘導される（Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York）。Ni-NTAマトリックス上において、ヒスチジン標識による組換えタンパク質の精製が行われる。
【００５４】
オリゴヒスチジンとシリカテイン間に、エンテロキナーゼ切断部位に対応する配列を導入することもできる。その後、融合タンパク質はエンテロキナーゼにより切断される。
【００５５】
代わりに、例えば「GST（グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（glutathione S transferase））融合」系（Amersham Company製）を組換えタンパク質の発現に用いることもできる。発現中にシグナルペプチドの影響を受ける可能性を排除するために、２つの挿入片を用いることができる。１つの挿入片は完全型誘導タンパク質から成り（長鎖型）、もう１つの挿入片は活性域のみから構成される（短鎖型）。相当するクローンは、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）のGST遺伝子を含むプラスミドpGEX-4T-2中にクローン化される。E.coliの形質転換後、IPTGによりタンパク質の発現が誘導される。得られたGTS融合タンパク質は、グルタチオンセファロース4B上において、アフィニティークロマトグラフィーにより精製される。グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼを分離するために、融合タンパク質がトロンビンにより切断される。
【００５６】
別の好ましい代替法（本項に記載される実験に用いられる）としては、遺伝子ＩＩＩシグナル配列により細胞質周囲の空間内に組換えタンパク質が分泌されるオリゴヒスチジン発現ベクターpBAD/gIIIA（Invitrogen製）を用いて、E.coli中に組換えシリカテインαを試作する方法が挙げられる（図１）。シリカテインαをコードするcDNA配列（配列番号２）は、以下のプライマー（シリカテインαの短鎖型）を用いて、PCR法により増幅される：フォワードプライマー：TAT CC ATG GAC TAC CCT GAA GCT GTA GAC TGG AGA ACC（配列番号９）およびリバースプライマー：TAT T CTA GA A TTA TAG GGT GGG ATA AGA TGC ATC GGT AGC（配列番号１０）。その後、pBAD/gIIIA（発現ベクター中への挿入に用いられる制限ヌクレアーゼ：Nco1およびXba1）中にクローン化される。E.coli XL1-blue株の形質転換後、L-アラビノースにより融合タンパク質の発現が誘導される。
【００５７】
組換えカイメンシリカテインポリペプチド（短鎖型）の分子量は、２８．５ｋＤＡ以下（シリカテイン２６ｋＤＡ以下に加えてベクター２ｋＤＡ）であり、等電点ｐＩは約６．１６である。
【００５８】
同様に、完全型誘導シリカテインαタンパク質（長鎖型）を含む挿入片を用いることもできる。
【００５９】
類似の方法により、シリカテインβ（cDNA： 配列番号４；それに由来するアミノ酸配列：配列番号３）の短鎖型および長鎖型を発現させることもできる。
【実施例３】
【００６０】
２．３．シリカテイン活性の測定
（組換え）シリカテインの酵素活性を測定するために、テトラエトキシシラン（TEOS）を加水分解し、続いて重合した後、重合および沈降したシリカの測定に基づいた検定を用いることができる（図３）。同検定において、酵素は、通常１ｍｍのMOPS緩衝液（pH6.8）に溶解され、１〜４．５ｍＭテトラエトキシシラン溶液１ミリリットルと化合される。通常、室温において、反応時間を変えて酵素反応が行われる。シリカ製造物を実証するために、材料が遠心分離され、エタノールで洗浄され、空気乾燥される。その後、沈殿物は１ＭのNaOHにより加水分解される。放出された珪酸塩は、モリブデート支援実証法（Merck社の珪素検定）により、製造された溶液中で定量される。
【００６１】
（組換え）シリカテインによるアルコキシシランの加水分解もまた、結合光学試験を用いて測定することができる。この試験は、放出されたアルコールの測定に基づくものである。この目的のために、リン酸カリウム緩衝剤ｐＨ７．５（O2飽和）にABTS［アジノビス（３‐エチルベンゾチアゾリン‐６‐スルホン酸）[azino‐bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)）］を加えた溶液と同時に、ペルオキシダーゼ溶液およびアルコールオキシダーゼ溶液が、キュベット内にピペットで添加される。混合後、H2O2が加えられる。更に混合した後、基質溶液（例えばMOPS緩衝液中にテトラエトキシシラン［TEOS］を配合）あるいは基質溶液に配合された酵素（シリカテイン）が添加され、その後、光度計により４０５ｎｍにおける吸光度が測定される。較正直線を作成するために、様々なアルコール（エタノールなど）濃度が利用される。
【実施例４】
【００６２】
２．４．天然資源からのシリカーゼ（silicase）および組換え酵素の製造
天然資源（組織あるいは細胞など）からのシリカーゼ（silicase）精製および酵素（配列番号５）の組換え製造は、技術水準である（DE 102 46 186.4; PCT/EP03/10983）。
【実施例５】
【００６３】
２．５．シリカーゼ（silicase）活性の測定
（市販の）炭酸脱水酵素製剤（例えばウシ赤血球由来；Calbiochem company製など）あるいは組換えカイメンシリカーゼ（silicase）のシリカーゼ（silicase）活性を示す方法が開示された（DE 102 46 186.4; PCT/EP03/10983）。
【実施例６】
【００６４】
２．６．カイメンコラーゲンの製造
天然コラーゲン（ウシコラーゲンなど脊椎動物由来、および海洋性デモカイメンなど無脊椎動物由来）および組換えコラーゲン（特に海洋性カイメンSドムンクラ（S. domuncula）由来）のいずれも、鋳型として用いることができる。その調整に関して、以下に２、３の方法を記載する。
【００６５】
２．６．１．天然カイメンコラーゲンの単離
様々な海洋性カイメンからコラーゲンを単離する簡単な方法が開示された（DE 100 10 113 A 1. Verfahren zur Isolierung von Schwammkollagen sowie Herstellung von nanopartikulaerem Kollagen. 出願人: W Schatton. 発明者: J Kreuter, WEG Mueller, W Schatton, D Swatschek, M Schatton; Swatschek et al. (2002) Eur. J. Pharm. Biopharm. 53:107-113）。高収率（＞３０％）でカイメンコラーゲンが得られる。
【００６６】
２．６．２．組換えカイメンコラーゲンの製造
組換えコラーゲン（配列番号７）を製造するために、Sドムンクラ（S. domuncula）由来の非線維性コラーゲン（コラーゲン３）をコードするクローンを用いることができる。
【００６７】
Sドムンクラ（S. domuncula）由来３型コラーゲン（配列番号８）をコードするcDNA配列は、適切なプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅し、適切な発現ベクターにサブクローン化することができる。中でも、細菌オリゴヒスチジン発現ベクターpBAD/gIIIA（Invitrogen製）およびpQTK_1（Qiagen製）を用いた場合、発現がうまくいった（図２）。ＰＣＲ法には、以下のプライマーを用いることができる（続けてpBAD/gIIIAを使用する）；フォワードプライマー：TAT cc atg gTG GCA ATA TCA GGT CAG GCT ATA GGA CCT C（配列番号１１）およびリバースプライマー：TAT AA GC TT CGC TTT GTG CAG ACA ACA CAG TTC AGT TC（配列番号１２）；発現ベクター中への挿入に用いられる制限ヌクレアーゼ：Nco1およびHindIII。大腸菌（Escherichia coli）XL1-blue株をプラスミド（発現ベクター）により形質転換した後、L-アラビノース（pBAD/gIIIAにおいて）、あるいはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）（IPTG；pQTK_1において）により融合タンパク質の発現が誘導される。発現ベクターpBAD/gIIIAは、遺伝子ＩＩＩシグナル配列により組換えタンパク質が細胞質周囲の空間内に分泌されるという利点を有する。膜通過後、シグナル配列が取り除かれる。pQTK-1を用いる際には、PBS/8 M尿素を用いて細菌が抽出される。懸濁液は、超音波処理後、遠心分離される。上清からの融合タンパク質の精製は、HochuliらJ. Chromatogr. 411: 177-184; 1987に記された通り、Ni-NTAアガロースマトリックス（Qiagen製）を用いて、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより行われる。抽出物は、カラムに乗せられ、続いてPBS／尿素により洗浄され、PBS／尿素中に配合された１５０ｍＭイミダゾールにより、融合タンパク質がカラムから溶出される。
【００６８】
上記のプライマーを用いて増幅されたcDNAの発現後に採取された組換え３型コラーゲン（Sドムンクラ（S. domuncula））の分子量は、２８．５ｋＤＡ以下である。配列番号８に示されたcDNA由来のペプチド（配列番号７参照）の等電点（IEP）は、８．１８５である。ｐＨ７．０における電荷は、４．９４６である。
【実施例７】
【００６９】
２．７．細胞培養
ヒト骨肉腫細胞（SaOS-2；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）は、１５％ウシ胎児血清（FBS）に１％グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたマッコイ培地（Invitrogen製）を用いて、３７℃、相対湿度９８〜１００％、および５％CO2雰囲気下において培養される。培地は２日間ごとに交換される。実験用培養物を製造するために、コンフルエント細胞は、Ca2+およびMg2+を含まないハンクス平衡塩溶液（HBSS）（Sigma製）により短時間洗浄され、その後トリプシン消化される。すなわち、Ca2+およびMg2+を含まないPBS（137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4, pH 7.40）中において、０．１重量％のトリプシン／０／０４重量％EDTAにより処理される。細胞懸濁液が形成された後、血球計により細胞数が計測され、１０００個（細胞数）／ｍｍ２の密度において、２４ウエルプレート（190 mm2）に植えつけられた。その後培養物は、成長培地中にて１４日間までインキュベーションされる。培地は２日間ごとに交換され、１週間後以降は毎日交換された。７日目に、１０ｍＭのβ‐グリセロリン酸塩（Sigma製）１Ｍ原液が添加された。β‐グリセロリン酸塩により、石灰化が促進される。
【実施例８】
【００７０】
２．８．培養皿の処理および検定の実施
培養皿は、PBSのみ（コントロール）、あるいは以下のタンパク質をPBS中に配合した溶液によりコーティングされる。
ａ）  １型コラーゲン（Sigma製；10 μg/cm2）＋シリカテイン（1 μg/cm2）＋TEOS（5 mM）
ｂ）  ３型コラーゲン（10 μg/cm2）＋シリカテイン（1 μg/cm2）＋TEOS（5 mM）
【００７１】
この目的のために、マイクロタイタープレートは、コラーゲン、シリカテインおよびTEOSを加えた後、３７℃にて１時間インキュベーションされる。その後、プレートはPBSで１度洗浄され、細胞が挿入される。
【００７２】
上記以外のタンパク質および基質の濃度、および上記以外のインキュベーション時間もまた、適切であることが判明した。
【００７３】
原液（PBS、濾過処理）中の組換え３型コラーゲン（Sドムンクラ（S. domuncula））濃度は、４００μｇ／ｍｌである。同溶液は、コーティング（10 μg/cm2）のために、PBSを用いて１：１０の割合で希釈された。
【００７４】
原液（0.1 N酢酸、NaOH pH 7.0により中和；濾過処理）中のSigma製１型コラーゲンの濃度は、４００μｇ／ｍｌである。同溶液は、コーティング（10 μg/cm2）のために、PBSを用いて１：１０の割合で希釈された。
【００７５】
上記以外のコラーゲン濃度、および上記以外の型のコラーゲンもまた、適切であることが判明した。
【００７６】
原液（PBS；濾過処理）中の組換えシリカテイン（シリカテインα；Sドムンクラ（S. domuncula））濃度は、４０μｇ／ｍｌである。同溶液は、コーティング（10 μg/cm2）のために、PBSを用いて１：１０の割合で希釈される。
【００７７】
上記以外のシリカテイン濃度もまた、適切であることが判明した。また、シリカテインαと同様に、シリカテインβを修飾用酵素として用いることもできる。
【００７８】
テトラエチルオルト珪酸塩（テトラエトキシシラン（tetraethoxysilane）、TEOS；Aldrich製）原液の濃度は、５ｍＭであった。通常５００ｍＭの原液中において、TEOSがジメチルスルホキシドに溶解され、その後目的とする終濃度になるまで希釈される。
【００７９】
上記以外のTEOS濃度、および上記以外の基質（シリカ製造のための珪酸、モノアルコキシシラントリオール（monoalkoxysilanetriol）、ジアルコキシシランジオール（dialkoxysilanediol）、トリアルコキシシラノール（trialkoxysilanol）あるいはテトラアルコキシシラン（tetraalkoxysilane）、およびシリコーン製造のためのモノアルコキシシランジオール（monoalkoxysilanediol）、モノアルコキシシラノール（monoalkoxysilanol）、ジアルコキシシラノール（dialkoxysilanol）、アルキルシラントリオール（alkylsilanetriol）、アリールシラントリオール（arylsilanetriol）あるいはメタロシラントリオール（metallosilanetriol）、アルキルシランジオール（alkylsilanediol）、アリールシランジオール（arylsilanediol）あるいはメタロシランジオール（metallosilanediol）、アルキルシラノール（alkylsilanol）、アリールシラノール（arylsilanol）あるいはメタロシラノール（metallosilanol）、アルキルモノアルコキシシランジオール（alkylmonoalkoxysilanediol）、アリールモノアルコキシシランジオール（arylmonoalkoxysilanediol）あるいはメタロモノアルコキシシランジオール（metallomonoalkoxysilanediol）、アルキルモノアルコキシシラノール（alkylmonoalkoxysilanol）、アリールモノアルコキシシラノール（arylmonoalkoxysilanol）あるいはメタロモノアルコキシシラノール（metallomonoalkoxysilanol）、アルキルジアルコキシシラノール（alkyldialkoxysilanol）、アリールジアルコキシシラノール（aryldialkoxysilanol）あるいはメタロジアルコキシシラノール（metallodialkoxysilanol）、アルキルトリアルコキシシラン（alkyltrialkoxysilane）、アリールトリアルコキシシラン（aryltrialkoxysilane）あるいはメタロトリアルコキシシラン（metallotrialkoxysilane））もまた、適切であることが判明した。
【実施例９】
【００８０】
２．９．DNA濃度の測定
ピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）検定などの技術水準である手法により、総DNAをバッチに分けて測定することができる。この目的のために、ピコグリーンdsDNA定量試薬（分子プローブ）は、TE緩衝液（10 mM トリス/HCl pH 7.4, 1 mM EDTA）中に１：２００の割合で希釈される。その後、ピコグリーン溶液は、サンプル（TE緩衝液中に懸濁された細胞）と、１：１（100μl:100μl）の割合で混合される。各バッチは、暗所にて５分間静置され、その後、蛍光ELISAプレートリーダー（Fluoroskan  バージョン4.0など）を用いて、励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５３５ｎｍにおいて測定される。仔ウシ胸腺DNAによる校正曲線が比較標準として記録された。
【実施例１０】
【００８１】
２．１０．アリザリンレッドSによる石灰化の実証
SaOS-2細胞などの骨芽細胞によるリン酸カルシウム形成は、Stanfordらの手法（J. Biol. Chem. 270:9420-9428, 1995）、あるいは技術水準であるその他の手法により測定することができる。細胞は、４℃にて１時間、１００％エタノール中に固定され、その後短時間、蒸留H2Oにより洗浄され、４０ｍＭアリザリンレッドS溶液（pH 4.2；Sigma製）により、１０分間室温にて軽く攪拌しながら染色される。その後細胞は、蒸留H2Oおよび１倍PBS（DULBECCO製）により数回洗浄される。その後、細胞は１０重量％  塩化セチルピリジニウム（cetylpyridinium chloride）（CPC）１００μｌ／ｃｍ２、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（pH 7.0）中において、１５分間室温にて軽く攪拌しながらインキュベーションされる。上清のアリコートが、１０％  ＣＰＣ、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（pH 7.0）により１０倍に希釈され、５６２ｎｍにおける吸光度が測定される。結合したアリザリンレッドSのモル数は、校正曲線を用いて測定することができる。得られた値は、並行培養により測定された総DNA量と関連付けられる。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
３．利用
本発明の更なる態様としては、表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾による生体活性表面製造のために、シリカテインα、シリカテインβあるいは関連ポリペプチド、を用いたアモルファス二酸化珪素（シリカ）を利用した後述の方法、および得られたその製造物の利用が挙げられる。
【００８３】
１．表面アモルファス二酸化珪素（シリカ）上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾による生体活性表面製造方法、および得られたその製造物の細胞培養、組織工学、あるいは医療用インプラントにおける利用。
【００８４】
２．（一般に細胞および細胞培養物、また特に線維芽細胞および骨形成細胞／骨芽細胞の）成長促進、また（骨形成細胞／骨芽細胞の）石灰化促進における当該方法およびそこから得られた製造物の利用。
【００８５】
３．リン酸カルシウムあるいはアパタイトの沈降を助長し、あるいは促進するマトリックスを製造における当該方法およびそこから得られた製造物の利用。
【００８６】
４．特に骨とインプラント間の安定結合製造における当該方法およびそこから得られた製造物の利用において、以下が生じる：ａ）溶液、培地、あるいは体液から、あるいは細胞から放出された、あるいは細胞酵素（例えば、骨芽細胞膜に関与するアルカリホスファターゼによるβ‐グリセロリン酸塩からのリン酸塩放出など）の関与により形成されたCa2+およびPO43-群の表面SiO2層への遊走。これには、リン酸カルシウム沈殿を伴う。（ｂ）溶解性の高いカルシウムおよびリン酸塩を含有することにより作られたアモルファスリン酸カルシウム層の成長（ｃ）ヒドロキシルアパタイト、炭酸アパタイト、およびフッ化アパタイトから成る混合アパタイト材料形成下における水酸化物アニオン、炭酸アニオン、およびフッ化物アニオン（例えば、体液中に、および体液由来物に含まれる）を含有することによるアモルファスリン酸カルシウム層の結晶化。
【００８７】
５．医療用インプラントの生体適合性改善における当該方法およびそこから得られた製造物の利用。
【００８８】
６．インプラント表面との組織融合の要件としての、生体材料、プラスチック、金属、金属酸化物およびその他の材料に対する細胞接着を促進するコーティング製造における当該方法の利用。
【００８９】
７．抗原抗体反応、あるいは補体系成分のインプラント表面への結合など、受け側有機体における免疫反応を軽減するための、インプラントの表面結合分子あるいは分子集合体上のSiO2層製造における当該方法の利用。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１−１】Sドムンクラ（S. domuncula）由来シリカテインαの発現。シリカテインαクローン（Sドムンクラ（S. domuncula））のヌクレオチド配列、また発現ベクターpBAD/gIIIA中へクローン化するための短鎖型シリカテインαをコードするcDNAの増幅に用いられるフォワードプライマーおよびリバースプライマー、およびアミノ酸配列がヌクレオチド配列由来である組換えタンパク質（シリカテインα短鎖型）のアミノ酸配列。
【図１−２】Sドムンクラ（S. domuncula）由来シリカテインαの発現。シリカテインαクローン（Sドムンクラ（S. domuncula））のヌクレオチド配列、また発現ベクターpBAD/gIIIA中へクローン化するための短鎖型シリカテインαをコードするcDNAの増幅に用いられるフォワードプライマーおよびリバースプライマー、およびアミノ酸配列がヌクレオチド配列由来である組換えタンパク質（シリカテインα短鎖型）のアミノ酸配列。
【図２】Sドムンクラ（S. domuncula）由来の非線維性３型コラーゲンの発現。３型コラーゲンクローン（Sドムンクラ（S. domuncula））のヌクレオチド配列、また発現ベクターpBAD/gIIIA（Nco1およびHindIII制限酵素部位は下線で示されている）中へクローン化するための３型コラーゲンをコードするcDNAの増幅に用いられるフォワードプライマーCol3_fおよびリバースプライマーCol3_r、およびアミノ酸配列がヌクレオチド配列由来である組換えタンパク質のアミノ酸配列。
【図３】シリカテイン活性の測定。通常、テトラエトキシシラン（TEOS）が基質として用いられる。
【図４】培養皿を組換え非線維性カイメンコラーゲン（3型；Sドムンクラ（S. domuncula））によりコーティングした後のSaOS-2細胞の石灰化促進を線維性１型ウシコラーゲン（Sigma製）によりコーティングした場合と比較したもの。培養皿（24ウエルプレート）は、組換え３型コラーゲン（Sドムンクラ（S. domuncula））あるいは１型コラーゲン（ウシ；Sigma製）のいずれかで異なる量（10μg/mlあるいは30μg/ml）を用いてコーティングされた。その後、培養皿にSaOS-2細胞が植え付けられ、標準条件下において、２日間および１２日間培養された。７日目に、当該バッチにβ‐グリセロリン酸塩（β-GP;10 mM）が添加された。その後、アリザリンレッドS（AR-S;A）および総DNA(B)で石灰化が測定された。（Ｃ）はアリザリンレッド（nmol)／総DNA（μg）での石灰化の測定を示している。
【図５】本発明により酵素的に修飾された骨芽細胞刺激表面におけるSaOS-2細胞の成長をコントロールの表面と比較したもの（細胞密度）。表面が修飾されていないウエル内で培養されたSaOS-2細胞により得られた結果（＝コントロール）（○）、および以下の方法により修飾された表面に培養されたSaOS-2細胞の結果が示されている：（ａ）組換え３型コラーゲン（Sドムンクラ（S. domuncula））および酵素的に合成されたバイオシリカ（シリカテインαおよびTEOSを用いたもの）を用いたコーティングにより修飾されたもの（■）、（ｂ）組換えウシ１型コラーゲンおよび酵素的に合成されたバイオシリカ（シリカテインαおよびTEOSを用いたもの）を用いたコーティングにより修飾されたもの（▲）、（ｃ）組換え３型コラーゲンのみ（Sドムンクラ（S. domuncula））により修飾されたもの（△）、（ｄ）組換えウシ１型コラーゲンのみにより修飾されたもの（◇）、（ｅ）シリカテインのみにより修飾されたもの（●）、および（ｆ）タンパク質（コラーゲンあるいはシリカテイン）を加えずにTEOS処理により修飾されたもの（□）。７日目に、当該バッチにβ-グリセロリン酸塩（10 mM）が添加された。細胞変換後１、２、３、４、６および８日目の細胞密度（1 cm2当たりの細胞数）が示されている。
【図６】本発明により酵素的に修飾された骨芽細胞刺激表面におけるSaOS-2細胞培養物の総DNA量を修飾されていないコントロール表面と比較したもの。組換え３型コラーゲン（Sドムンクラ（S. domuncula））あるいは１型コラーゲン（Sigma製）のいずれかにより表面を修飾され、それぞれ酵素的に合成されたバイオシリカ（シリカテインα[Si]および[TEOS]による）でコーティングされたウエルとコーティングされないウエルにおいて、細胞が培養された。７日目に、当該バッチにβ‐グリセロリン酸塩（10 mM）が添加された。細胞変換後１、２、３、４、６および８日目の培養物（ウエル）当たりの総DNA量が示されている。
【図７】本発明により酵素的に修飾された骨芽細胞刺激表面におけるSaOS-2細胞の石灰化を修飾されていないコントロール表面と比較したもの。１２日目に、アリザリンレッドＳにより石灰化が示された。７日目に、当該バッチにβ‐グリセロリン酸塩（10 mM）が添加された。１Ａ：修飾されていない表面において、７日目以降β‐グリセロリン酸塩を加えて培養されたSaOS-2細胞（石灰化の相対強度：++）。１Ｂ、１Ｃ：修飾されていない表面において、β‐グリセロリン酸塩を加えないで培養されたSaOS-2細胞（コントロール；石灰化の相対強度：+）。２Ａ、２Ｂ、２Ｃ：修飾された（組換えカイメン3型コラーゲン、および酵素的に‐すなわちシリカテインαおよびTEOSを用いて‐合成されたバイオシリカを用いたコーティングにより修飾された）表面において、β‐グリセロリン酸塩を加えて培養されたSaOS-2細胞（石灰化の相対強度：+++）。３Ａ、３Ｂ、３Ｃ：修飾された（ウシ１型コラーゲン、および酵素的に‐すなわちシリカテインαおよびTEOSを用いて‐合成されたバイオシリカを用いたコーティングにより修飾された）表面において、β‐グリセロリン酸塩を加えて培養されたSaOS-2細胞（石灰化の相対強度：+++）。
【図８】本発明により酵素的に修飾された表面において培養されたSaOS-2細胞の石灰化促進を、コラーゲンのみによりコーティングされた表面におけるSaOS-2細胞およびコントロール（コーティングされていない培養皿において、β‐グリセロリン酸塩を添加した、あるいは添加しないもの）と比較したもの。培養皿のコーティングには、１型コラーゲン（ウシ；Sigma製）のみ、あるいは組換え非線維性３型コラーゲン（Sドムンクラ（S. domuncula））のみ、あるいは１型コラーゲン＋シリカテインα+TEOS（バイオシリカ修飾ウシコラーゲンの合成）、あるいは組換え３型コラーゲン＋シリカテインα+TEOS（バイオシリカ修飾カイメンコラーゲンの合成）が用いられた。その後、培養皿にSaOS-2細胞が植え付けられ、標準条件下において、２日間および１２日間培養された。７日目に、当該バッチにβ‐グリセロリン酸塩（β-GP; 10 mM）が添加された。石灰化は、アリザリンレッド（nmol）／総DNA（μg）で示される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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