(57)【要約】  細胞外マトリックスタンパク質、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン又はラミニンを精子サンプルに添加し、精子を低運動性非受精能獲得状態にするか、又は既存の非受精能獲得状態を維持する。続いて、イン・ビトロ受精研究又はイン・ビボ受精法における適切なタイミングで、アンギオテンシンII又は関連ペプチドをその精子サンプルに添加して運動性を強化し、かつ精子に受精能を獲得させる。細胞外マトリックスタンパク質は望ましくない早期の自然受精能獲得を妨げ、精子を厳密に正しい時期に移送のための正しい受精能獲得状態にすることができるため、人工授精法をより厳密にすることができる。アンギオテンシンIIでの処理をペプチドＲＧＤの使用と組み合わせ、細胞外マトリックスタンパク質の結合と競合させてその効果を抑制することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリックスタンパク質を含み、それにより低運動性非受精能獲得状態にある精子サンプルを提供し、並びにアンギオテンシンII又は関連ペプチドを添加して運動性を刺激し、及び該精子に受精能を獲得させることを含む精子調節方法。
【請求項２】
細胞外マトリックスタンパク質を含有する精子サンプルが細胞外マトリックスタンパク質を精子サンプルに添加して該精子を非受精能獲得状態にすることによって調製されている、請求項１による方法。
【請求項３】
細胞外マトリックスタンパク質を含有する精子サンプルが細胞外マトリックスタンパク質を天然に含有するサンプルである、請求項１による方法。
【請求項４】
細胞外マトリックスタンパク質を含有する精子サンプルがアンギオテンシンII又は関連ペプチドを添加して該精子に受精能を獲得させる前に保存されている、請求項１、２又は３による方法。
【請求項５】
細胞外マトリックスタンパク質を含有する精子サンプルが保存のために凍結又は冷却されており、かつアンギオテンシンII又は関連ペプチドを添加して該精子に受精能を獲得させる前に解凍されている、請求項４による方法。
【請求項６】
細胞外マトリックスタンパク質が、保存のために凍結又は冷却される前に精子試料に添加され、かつアンギオテンシンII又は関連ペプチドを添加して該精子に受精能を獲得させる前に解凍される、請求項４による方法。
【請求項７】
イン・ビトロで実施される、請求項１ないし６のいずれか１項による方法。
【請求項８】
少なくとも部分的にイン・ビボで実施される、請求項１ないし６のいずれか１項による方法。
【請求項９】
細胞外マトリックスタンパク質がフィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンから選択される、請求項１ないし８のいずれか１項による方法。
【請求項１０】
受精能付与剤がアンギオテンシンIIもしくはアンギオテンシンIIアミド又はトリペプチドＲＧＤを含むペプチドである、請求項１ないし９のいずれか１項による方法。
【請求項１１】
精子を低運動性非受精能獲得状態で保存する薬剤としての１種類以上の細胞外マトリックスタンパク質の使用。
【請求項１２】
細胞外マトリックスタンパク質含有精子が液体形態で保存される請求項１１による使用。
【請求項１３】
細胞外マトリックスタンパク質含有精子が凍結形態で保存される請求項１１による使用。
【請求項１４】
細胞外マトリックスタンパク質の存在によって低運動性非受精能獲得状態で保存されている精子サンプルの運動性及び受精能獲得を刺激する薬剤としてのアンギオテンシンII又は関連ペプチドの使用。
【請求項１５】
非受精能獲得状態で保存されている精子サンプルが細胞外マトリックスタンパク質含有凍結精子の解凍によって得られる、請求項１４による使用。
【請求項１６】
非受精能獲得状態で保存されている精子サンプルが液体形態で保存されている細胞外マトリックスタンパク質含有精子サンプルである、請求項１４による使用。
【請求項１７】
非受精能獲得状態で保存されている精子サンプルが細胞外マトリックスタンパク質を天然に含有するサンプルである、請求項１４による使用。
【請求項１８】
非受精能獲得状態で保存されている精子サンプルが使用の準備が整うまで受精能獲得が抑制されている新鮮な精子である、請求項１４による使用。
【請求項１９】
細胞外マトリックスタンパク質がフィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンから選択される、請求項１４ないし１８のいずれか１項による使用。
【請求項２０】
受精能付与剤がアンギオテンシンIIもしくはアンギオテンシンIIアミド又はトリペプチドＲＧＤを含むペプチドである、請求項１４ないし１９のいずれか１項による使用。
【請求項２１】
精子を非受精能獲得状態で保存する薬剤として１種類以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む生殖細胞培地。
【請求項２２】
細胞外マトリックスタンパク質がフィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンから選択される、請求項２１による生殖細胞培地。
【請求項２３】
非受精能獲得状態で保存されている精子サンプルの受精能獲得のための薬剤としてアンギオテンシンII又は関連ペプチドを含む生殖細胞培地。
【請求項２４】
受精能付与剤がアンギオテンシンIIもしくはアンギオテンシンIIアミド又はトリペプチドＲＧＤを含むペプチドである、請求項２３による生殖細胞培地。
【請求項２５】
１種類以上の細胞外マトリックスタンパク質を含有する精子阻害組成物。
【請求項２６】
アンギオテンシンII又は関連ペプチドを含有する精子強化組成物。
【請求項２７】
活性物質がペッサリー基体中に分散されている請求項２５又は２６による組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は精子機能の調節に関する。特には、本発明は特定のタンパク質、例えば、フィブロネクチン及びアンギオテンシンIIの、それぞれ、非受精能獲得及び非活性化状態での精子の保存並びに非受精能獲得／非活性化精子の受精能獲得／活性化状態への変換への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の精子の成熟及び運動性を誘導及び維持する生理学的要素は、幾つかの薬剤が関与することは知られているものの、一般には不明瞭のままである。例えば、ボランティア及び不妊治療病院を訪れる患者からの刺激又は非刺激精子に関する運動性データは、アンギオテンシンIIが運動性精子のパーセンテージ及びそれらの直線速度の両者を増加させることができ、それに対して特異的ＡＴＩ受容体アンタゴニスト・ロサルタンは運動性精子のパーセンテージに対するアンギオテンシンIIの作用を阻害することを示した。アンギオテンシンIIは、曲線速度、直線速度、及び外側頭運動（lateral  head  movement）の振幅を含む特定の運動パラメータに対する作用を有することが示されている。これらの運動性の変化は精子の受精能獲得、すなわち、最終的に卵子を受精させる能力に特徴的に関連する。これらの知見はＷＯ  ９５／３２７２５「受精能促進へのアンギオテンシンIIの使用（Use  of  angiotensin  II  to  promote  fertility）」の基礎である。
【０００３】
同時に、精子と、特にはフィブロネクチンを含む、細胞外マトリックスタンパク質との相互作用に興味が引かれている。フィブロネクチンは精子表面の様々な位置で見出されており、精子上でのその存在は不妊に関連する可能性がある。
【０００４】
他の研究において、精子凍結に関連する問題が考察されている。精子凍結は家畜及びヒトの両者における人工授精のための精子保存及びイン・ビトロ受精における必須のツールである。しかしながら、種及び個体に依存して、精子凍結及び解凍に関連する様々な程度の損傷が存在し、新鮮な非凍結精子と比較して受精が損なわれる。部分的には、これは、凍結及び解凍が受精能獲得を反映する変化を誘発するものと思われるためである。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、フィブロネクチンを、運動性を低下させることによる非受精能獲得状態での静止の保存に添加物として用いることができ、かつアンギオテンシンII及びその類似体並びにＲＧＤトリペプチドを含む小ペプチドを、受精能獲得が細胞外マトリックスタンパク質の存在によって抑制されているサンプルの運動性の強化による受精能獲得に用いることができるという知見に基づく。
【０００６】
したがって、本発明は、細胞外マトリックスタンパク質を含み、それにより非受精能獲得状態にある精子サンプルを提供し、及びアンギオテンシンII又は関連ペプチドを添加して該精子に受精能を獲得させることを含む精子調節方法を提供する。
【０００７】
典型的には、細胞外マトリックスタンパク質を含む精子サンプルは、細胞外マトリックスタンパク質を精子サンプルに添加し、運動性を低下させることによって非受精能獲得状態とするか、又は既存の非受精能獲得状態を維持することによって調製する。この低運動性、非受精能獲得状態での精子の保存へのマトリックスタンパク質の使用は本発明のさらなる側面である。しかしながら、本発明の調節方法は、細胞外マトリックスタンパク質を天然に含む精子サンプルと共に用いることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
天然に非受精能獲得状態にある精子は、刺激されようとされまいと、最終的に受精能獲得に至る固有の潜在能力を有する。しかしながら、精子の凍結及び解凍はそれらに多大な損傷を与えるが、解凍後の、又は冷凍（しかしながら凍結ではない）保存からサンプルを取り出した後の、生存可能な条件で回復されたものはしばしば急速に受精能獲得に至り、これが解凍後又は冷凍後のそれらの有用性を頻繁に制限する。本発明の特徴は、例えば、受精研究において、又はヒトの不妊治療病院における患者サンプルの治療において、又は動物の人工治療において、技術者の制御の下で精子を用いるプロセス全体にわたって幾らかの制御を提供し、事実上、「ブレーキ及びアクセル」を提供するのに添加された細胞外マトリックスタンパク質及びアンギオテンシンIIを利用することである。本発明によるマトリックスタンパク質の使用により、精子サンプルの利用可能寿命を３−４倍延長可能であることが見出されている。
【０００９】
好ましい側面において、本発明は、細胞外マトリックスタンパク質を精子サンプルに添加して精子を非受精能獲得状態にするか、又は既存の非受精能獲得状態を維持し、及び、実質的に、イン・ビトロ受精研究又はイン・ビボ受精手順における適切な時期に、アンギオテンシンII又は関連ペプチドを精子サンプルに添加して精子に受精能を獲得させることを含む。
【００１０】
一側面において、本発明は、運動性を低下させることによって精子を非受精能獲得／非活性状態で保存する薬剤としての１種類以上の細胞外マトリックスタンパク質の使用を含む。有効量は、定型的な試験法により、下記実施例を手引きとして用いて見出すことができる。例えば、マトリックスタンパク質は約１μｇ／ｍｌないし５０μｇ／ｍｌ、典型的には、２μｇ／ｍｌないし２０μｇ／ｍｌのレベルでサンプルに添加することができる。
【００１１】
細胞外マトリックスタンパク質は、適切には通常の増量剤培地中で、冷蔵のために、又は凍結精子として低温保存するための凍結の前に、新鮮な精子に添加することができる。
【００１２】
あるいは、細胞外マトリックスタンパク質は精子サンプルに、そのサンプルが即時使用のままであるとき、解凍後又は冷蔵後に添加することができる。解凍されたサンプルは、典型的には、供給者による独自開発培地中に懸濁されている。ＩＶＦ法又は受精研究の実施に責任を持つ技術者は、解凍された精子を洗浄し、遠心によって精虫を濃縮した後、それらの研究又はＩＶＦに適する培地に精子を再懸濁させることが好都合であることを見出すことができる。
【００１３】
別の側面において、本発明は、サンプルが細胞外マトリックスの存在によって低運動性の非受精能獲得状態で保存されているとき、運動性を強化することによって精子サンプルに受精能を獲得させるための薬剤としてのアンギオテンシンII又は関連ペプチドの使用を含む。有効量は、定型的な試験法により、下記実施例を手引きとして用いて見出すことができる。例えば、アンギオテンシンII又は類似体を処理組成物中に０．１ｎＭないし１００ｎＭ、典型的には、１ｎＭないし１０ｎＭの量で提供することが適切であり得る。
【００１４】
非受精能獲得精子を提供する細胞外マトリックスタンパク質含有精子サンプルは、細胞外マトリックスタンパク質含有凍結精子の解凍から得られるものであっても、凍結せずに保存されている細胞外マトリックスタンパク質含有精子サンプルから得られるものであっても、細胞外マトリックスタンパク質を天然に含有する精子サンプルから得られるものであってもよい。
【００１５】
あるいは、受精能獲得がアンギオテンシンIIを用いて誘導されるとき、使用の必要が生じるまで技術者が精子を低運動性の非受精能獲得状態に保持することができるように、細胞外マトリックスタンパク質を解凍後もしくは保存後の精子サンプル又は新鮮なサンプルに添加した後、アンギオテンシンIIもしくは関連ペプチドを使用することができる。
【００１６】
細胞外マトリックスタンパク質は細胞表面に結合することができ、これは、実際の機構は未だに不明ではあるが、本発明に従って精子を低運動性の非受精能獲得状態に維持することに関与するものと信じられる。本発明における使用に適する細胞外マトリックスタンパク質には、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンが含まれる。
【００１７】
受精能付与剤（capacitating agent）として、アンギオテンシンIIを関連ペプチド、例えば、ＷＯ  ９５／３２７２５（その開示全体は参照によりここに組み込まれる）において言及される塩及び類似体に置き換えることができる。適切な類似体はアンギオテンシンIIアミドである。
【００１８】
あるいは、トリペプチドモチーフＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を含むペプチドを受精能獲得のための薬剤として用いることができる。このモチーフはトリペプチドＲＧＤそれ自体によって、又は他の小ペプチド、例えば、商業的に入手可能なテトラペプチドＲＧＤＳ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ）によってもたらされるものであり得る。ＲＧＤは細胞膜中のインテグリンが結合するすべての細胞外マトリックスタンパク質において見出されるトリペプチドモチーフである。したがって、フリーのＲＧＤ、又はモチーフＲＧＤを含有する他のペプチドの使用は細胞外マトリックスタンパク質と競合し、これらのタンパク質による細胞結合を阻害する。有効量は、定型的な試験法により、下記実施例を手引きとして用いて見出すことができる。
【００１９】
ＲＧＤはアンギオテンシンIIとの組み合わせで適切に用いられ、これは、ＲＧＤが細胞外マトリックスタンパク質の結合を阻害し、運動性、したがって、受精能獲得／活性化の刺激における添加されたアンギオテンシンIIの有効性を高めるためである。しかしながら、ＲＧＤペプチドの不在下であっても、アンギオテンシンIIは依然として有効な受精能付与剤である。
【００２０】
保存については、新鮮な精子を、好ましくは、精子増量剤培地又は他の生殖細胞培地に添加する。
【００２１】
したがって、本発明のさらなる側面は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン又はラミニンを含有し、それ故に添加された精子が非受精能獲得状態に維持される、精子増量剤培地である。精子増量剤培地は商業的に入手可能であり、典型的には、緩衝水溶液を含む。
【００２２】
精子増量剤培地はしばしば使用時に、固体、典型的には、粉末化増量組成物を水に添加することによって調製される。したがって、本発明は、細胞外マトリックスタンパク質を含有する、精子増量剤組成物、典型的には、水で戻すための粉末も提供する。
【００２３】
さらなる側面において、本発明は、精子を非受精能獲得状態に変換するための薬剤の調製への、又は精子を非受精能獲得状態に変換するための精子増量剤培地の調製への１種類以上の細胞外マトリックスタンパク質の使用を提供する。
【００２４】
増量培地を精子の凍結保存に用いるとき、増量剤培地は、好ましくは、１種類以上の凍結防止剤、例えば、グリセロールも含有する。
【００２５】
同様に、精子に受精能を獲得させるため、受精能付与剤を含有する増量剤培地に精子サンプルを添加することができ、その逆も同様である。
【００２６】
したがって、本発明は、アンギオテンシンIIもしくは類似体及び／又はＲＧＤ含有ペプチドを含む精子増量剤培地又は組成物も提供する。
【００２７】
さらなる側面において、本発明は、精子に受精能を獲得させるための薬剤の調製への、又は精子に受精能を獲得させるための精子増量剤培地もしくは組成物の調製へのアンギオテンシンIIもしくは類似体及び／又はＲＧＤ含有ペプチドの使用も提供する。
【００２８】
精子増量組成物は本発明の分野に従事する熟練者に公知であり、一般には、緩衝剤、例えば、クエン酸もしくはクエン酸ナトリウム及び重炭酸ナトリウム、及び／又は栄養素、例えば、グルコースのような糖を含有する。精子を凍結保存しようとするとき、これも公知のように、凍結防止剤、例えば、グリセロール又は卵もしくは乳タンパク質を添加することができる。抗生物質を添加することもできる。培地のｐＨは、一般には、約７−８である。
【００２９】
一般には、本発明の手順は、商業的に入手可能であるか、又は当該技術分野において公知である生殖細胞用の培地を利用する  −  例えば、ＷＯ  ０３／０７２７０７（その開示全体は参照によりここに組み込まれる）に列挙される物質を参照のこと。
【００３０】
本発明は、主として、哺乳動物の精子、特には、不妊治療病院において用いるためのヒト精子及び人工授精による家畜繁殖において用いるための動物精子に関する。
【００３１】
ヒト及び家畜の両者の人工授精法に関する主な問題は排卵に対する精子受精能獲得のタイミングである。部分的にはこのために、成功率はしばしば非常に低い。本発明による「ブレーキ及びアクセル」剤を用いることにより、人工授精法をより厳密にすることができる。適切な増量剤培地中で、精子を受精能獲得の正しい状態で厳密に正しい時期に移すことができる。ある環境においては、細胞外マトリックスタンパク質「ブレーキ」の使用が十分な処置であり得、精子は排卵に伴って生じるアンギオテンシンIIの自然放出によって受精能を獲得することができる。これは、排卵のタイミングのための治療処置を回避することにより、本発明の用途を拡張する。
【００３２】
本発明のさらなる発展は、性交直前に体内適用される、細胞外マトリックスタンパク質（例えば、フィブロネクチン）又はアンギオテンシンII（もしくは類似体）を含有するペッサリーの使用による、イン・ビボでの精子強化及び阻害（受精能強化及び避妊）の両者を提供する。
【００３３】
したがって、本発明は、さらなる側面において：
好ましくはペッサリー基体中に分散されている、１種類以上の細胞外マトリックスタンパク質を含有する精子阻害組成物；
好ましくはベッサリー基体中に分散されている、アンギオテンシンII又は関連ペプチドを含有する精子強化組成物、
を提供する。
【００３４】
ヒト及び動物の使用に適するペッサリー基体は商業的に入手可能であり、当該技術分野において公知である。典型的には、それらは体内使用に適する温度で溶融する脂肪又はワックスを含有する。フォームペッサリーも活性物質の分散の補助に使用可能である。クリーム及びゲルをビヒクルとして用いることもできる。
【００３５】
以下の実施例において、例としてのみ、本発明を説明する。
材料
雄ウシ精子サンプル（Semex）
フィブロネクチン（２５０μｇ／ｍｌ、Sigma）
ビトロネクチン（２５０μｇ／ｍｌ、Sigma）
ラミニン（２５０μｇ／ｍｌ、Sigma）
ＲＧＤＳ（１５０μｌ／ｍｌ）（ＲＧＤの源として）
アンギオテンシンII（１０−９モル／Ｌ）
Ｓｐ−ＴＡＬＰ（Tyrodeアルブミンラクテートピルベート）培地（ＴＬ、ＢＳＡ、Fract V、ピルベート、ゲンタマイシン）  −  生殖細胞培地
Thermoplate  −  加熱された顕微鏡ステージ
【００３６】
精子調製及び分離：
各々の精子サンプルを０．２５ｍｌプラスチックストローに充填し、凍結した。この凍結精虫ストロー（０．２５ｍｌ）を、３７℃水浴に投入することによって急速に解凍した。サンプルが解凍されたとき、ストローをティッシュで乾燥させて水平に保ち、両端を切断して予め暖めたＴＡＬＰ培地に投入した。
【００３７】
受精能獲得
精虫をＴＡＬＰ培地で２回洗浄し、６００×ｇで１０分間遠心した後、予め３７℃に暖めたＴＡＬＰに再懸濁させた。凍結−解凍した精虫の運動性をサーマルプレートを用いて３７℃で評価した。精子の運動性及び形態を暖かい３７℃ステージ上での顕微鏡観察によって見積もった。精液（１０μｌ）をカバーグラス（１８ｍｍ×１８ｍｍ）で覆い、少なくとも５顕微鏡視野分を検査した。運動性はサンプル中の直線前進運動をする運動性精虫のパーセンテージとして表した（Vinson, G.P., Puddefoot, J.R.,  Ho,  M.M.,  Barker,  S.,  Mehta,  J.,  Saridogan,  E.  and  Djahanbakhch,  O.  (1995).  "Type  1  angiotensin  II  (ATI)  receptors  in  sperm",  Journal  Of  Endocrinology,  144,  369-378を参照のこと）。調製した精子サンプルを、各例において説明されるように、添加物と共に３７℃で水浴においてインキュベートし、前述のように運動性についてアッセイした。
【００３８】
（実施例１）
解凍した精子のサンプルを以下のように添加物と共にインキュベートした：
１．精子をフィブロネクチン（２μｇ／ｌ）と共に１０分間インキュベートした。
２．精子をフィブロネクチン（２μｇ／ｌ）＋ＲＧＤＳ（５×１０−６モル／Ｌ）と共に１０分間インキュベートした。
３．アンギオテンシンII（１０−９モル／Ｌ）をフィブロネクチン＋ＲＧＤＳサンプルに添加し、さらに１０、２０、３０及び４０分間インキュベートした。
【００３９】
すべてのインキュベーションは、水浴及び加熱ステージを用いて、３７℃で行った。精液サンプル（１０μｌ）を予備加熱（３７℃）スライドに塗布し、顕微鏡の加熱ステージに載せて検査した。運動性精子の数を、対照サンプルにおいてゼロ時間で、及び指示されたインキュベーション時間後の処理サンプルにおいてカウントした。
【００４０】
それらの結果は図１に示され、図１において柱は、
１．対照  ０時間；
２．フィブロネクチン  １０分；
３．フィブロネクチン＋ＲＧＤ  １０分；
４．フィブロネクチン＋ＲＧＤ＋アンギオテンシンII  １０分；
５．フィブロネクチン＋ＲＧＤ＋アンギオテンシンII  ２０分；
６．フィブロネクチン＋ＲＧＤ＋アンギオテンシンII  ３０分；
７．フィブロネクチン＋ＲＧＤ＋アンギオテンシンII  ４０分；
８．対照  ４０分後；
の運動値を示し、ここから以下のことを見てとることができる：
ａ）対照サンプルはゼロ時間で７０％の運動性を示した。
ｂ）精子に対するフィブロネクチン濃度の効果は総精子運動性の非常に著しい変化を示した。５−１０分のインキュベーションの後、サンプルは僅かに１４％の精子運動性しか示さなかった。
ｃ）１０分後のフィブロネクチン＋ＲＧＤＳの効果は、１０分間のフィブロネクチン単独と比較したとき、有意の鎖を示さなかった（２３％）。
ｄ）サンプルにアンギオテンシンIIを添加することにより、精神運動性が有意に変化した。アンギオテンシンIIとのインキュベーションの増加は精子運動性の増加を示した。１０、２０、及び３０−４０分のインキュベーションの後、運動性は、フィブロネクチン単独と比較して、それぞれ４３％、６４％及び７１％増加した。ＲＧＤ＋フィブロネクチンサンプルと比較して、増加はそれぞれ３４％、５５％、及び６２％であった。
ｅ）対照サンプルは、水浴中での４０分のインキュベーションの後、僅かに２８％の運動性を示すだけであった。
【００４１】
（実施例２）
解凍した精子のサンプルを以下のように添加物と共にインキュベートした：
１．精子をフィブロネクチン（２μｇ／ｌ）と共に１０分間インキュベートした。
２．アンギオテンシンII（１０−９モル／Ｌ）をフィブロネクチンサンプルに添加し、さらに１０、２０、及び３０分間インキュベートした。
【００４２】
これらの結果は図２に示され、図２において柱は、
１）対照  １０分；
２）フィブロネクチン  １０分；
３）フィブロネクチン＋アンギオテンシンII  １０分；
４）フィブロネクチン＋アンギオテンシンII  ２０分；
５）フィブロネクチン＋アンギオテンシンII  ３０分；
６）対照  ３０分後；
の運動値を示し、ここから以下のことを見てとることができる：
ａ）対照サンプルは時間ゼロで７９％の運動性を示した。
ｂ）精子に対するフィブロネクチン濃度の効果は総精子運動性の非常に著しい変化を示した。５−１０分のインキュベーションの後、精子運動性は８％のみであった。
ｂ）サンプルにアンギオテンシンIIを添加することにより、精子運動性が有意に変化した。インキュベーションの開始から１０、２０、及び３０−４０分で、フィブロネクチン単独と比較して、運動性はそれぞれ６４％、６２％及び６２％に増加した。
ｃ）対照サンプルは、水浴中での３０分のインキュベーションの後、僅かに２０％の運動性を示すだけであった。
【００４３】
（実施例３）
解凍した精子のサンプルを以下のように添加物と共にインキュベートした：
１．精子をＲＧＤＳ（５×１０−６モル／Ｌ）と共に５分間インキュベートした。
２．フィブロネクチン（２μｇ／ｌ）をＲＧＤＳサンプルに添加し、さらに５分間インキュベートした。
３．アンギオテンシンII（１０−９モル／Ｌ）をフィブロネクチン＋ＲＧＤＳサンプルに添加し、さらに１０、２０、及び３０分間インキュベートした。
【００４４】
これらの結果は図３に示され、図３において柱は
１）対照  ０分；
２）ＲＧＤと共に予備インキュベーション  ５分；
３）ＲＧＤ＋フィブロネクチン  ５分；
４）フィブロネクチン＋ＲＧＤ＋アンギオテンシンII  １０分；
５）フィブロネクチン＋ＲＧＤ＋アンギオテンシンII  ２０分；
６）フィブロネクチン＋ＲＧＤ＋アンギオテンシンII  ３０分；
７）対照  ３０分；
の運動値を示し、ここから以下のことを見てとることができる：
ａ）対照サンプルは時間ゼロで６２％の運動性を示した。
ｂ）精子とのＲＧＤＳの予備インキュベーションは精子運動性の１９％の低下を示した。
ｃ）精子と予備インキュベートしたＲＧＤＳに対するフィブロネクチン濃度の効果は総精子運動性の非常に著しい変化を示した。５−１０分のインキュベーションの後、対照及びＲＧＤ処理サンプルと比較して、運動性がそれぞれ４７％及び２８％低下した。
ｄ）アンギオテンシンIIをサンプルに添加することにより、精子運動性が有意に変化した。アンギオテンシンIIとのインキュベーションが長いほど、精子運動性の増加が示された。１０、２０、及び３０−４０分のインキュベーションの後、２０％フィブロネクチン及びＲＧＤＳと比較して、運動性はそれぞれ４３％、５４％及び５４％増加した。
ｅ）対照サンプルは、水浴中で３０分のインキュベーションの後、僅かに３８％の運動性を示すのみであった。
【００４５】
実施例１ないし３の反復
実施例１ないし３の手順を、マトリックスタンパク質・フィブロネクチンを２μｇ／ｌで用いて行った。２０μｇ／ｌのフィブロネクチンで同じ手順を実施したところ、同様の結果が達成された。
【００４６】
（実施例４）
解凍した精子のサンプルを以下のように添加物と共にインキュベートした：
１．精子をビトロネクチン（２μｇ／ｌ）と共に３７℃、水浴内で５分間インキュベートした。
２．アンギオテンシンII（１０−９モル／Ｌ）をビトロネクチンサンプルに添加し、さらに５、１５、１５及び３５分間インキュベートした。
【００４７】
これらの結果は図４に示され、図４において柱は、
１）対照  １０分；
２）ビトロネクチン  ５分；
３）ビトロネクチン＋アンギオテンシンII  ５分；
４）ビトロネクチン＋アンギオテンシンII  １５分；
５）ビトロネクチン＋アンギオテンシンII  １５分；
６）ビトロネクチン＋アンギオテンシンII  ３５分；
の運動値を示し、ここから：
精子に対するビトロネクチン濃度の効果は総精子運動性の非常に著しい低下を示し；及び、サンプルにアンギオテンシンIIを添加することにより、精子運動性が著しく増加したことを見てとることができる。
【００４８】
（実施例５）
解凍した精子のサンプルを以下のように添加物と共にインキュベートした：
１．精子をラミニン（２μｇ／ｌ）と共に３７℃、水浴内で１０分間インキュベートした。
２．アンギオテンシンII（１０−９モル／Ｌ）をラミニンサンプルに添加し、さらに１０、２０、３０及び４０分間インキュベートした。
これらの結果は図５に示され、図５において柱は、
１）対照  １０分；
２）ラミニン  ５分；
３）ラミニン＋アンギオテンシンII  １０分；
４）ラミニン＋アンギオテンシンII  ２０分；
５）ラミニン＋アンギオテンシンII  ３０分；
６）ラミニン＋アンギオテンシンII  ４０分；
の運動値を示し、ここから、精子に対するラミニン濃度の効果は総精子運動性の著しい低下を示し；サンプルにアンギオテンシンIIを添加することにより、精子運動性が著しく増加したことを見てとることができる。
【００４９】
運動性及び受精能獲得
受精能獲得は、基本的には、卵子に受精する精子の能力である。運動不能の精子は卵子に受精することができず、通常は、過剰活性化の開始が受精能獲得と同時に生じるものと思われる。上記実施例におけるデータはすべて運動性パーセンテージを示す。アンギオテンシンIIの刺激効果は精子の運動性を高め、過剰活性化に関連する曲線速度、側頭置換（lateral head displacement）、及びビート・クロス頻度（beat  cross  frequency）も高める（Vinson,  GP,  Mehta,  J,  Evans,  S,  Matthews,  S,  Puddefoot,
JR, Saridogan, E, Holt, WV, and Djahanbakhch, O (1996) Angiotensin ii stimulates
sperm motility. Regulatory Peptides 67 131-135）。
【００５０】
受精能獲得を評価する代わりの方法は、ＣＴＣアッセイ（DasGupta  S,  Mills  CL,  Fraser  LR.  Ca(2+)-related  changes  in  the  capacitation  state  of  human
spermatozoa  assessed  by  a  chlortetracycline  fluorescence  assay.  J  Reprod  Fertil.  1993  Sep;99(1):  135-43.:  Fraser  LR,  Herod  JE.  Expression  of  capacitation-dependent  changes  in  chlortetracyeline  fluorescence  patterns  in  mouse  spermatozoa  requires  a  suitable  glycolysable  substrate.  J
Reprod Fertil. 1990 Mar;88(2):611-21)を用いることによるものである。下記実施例６において用いられるこの方法においては、染色のパートナーが非受精能獲得、受精能獲得及びアクロソーム反応精子を区別する。
【００５１】
（実施例６）
材料：
クロロテトラサイクリン（ＣＴＣ）溶液：ＣＴＣ（トリス（２０ｍＭ）−ＮａＣｌ（１３０ｍＭ）中７５０μＭのＣＴＣ、ＤＬ−システイン（５ｍＭ）、緩衝剤（２０ｍＭトリス／１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．８）
アンギオテンシンII  リットルあたり（１０−９）モル
フィブロネクチン（５−５０μｇ／ｍｌ）
精虫サンプルは健常雄ウシから入手した（Semex、ＵＫ）。この研究において用いたすべての精液サンプルは凍結及び解凍されていた。各々のサンプルを０．２５ｍｌプラスチックストローに充填した。
【００５２】
精子調製及び分離：
凍結した精虫ストロー（０．２５ｍｌ）を３７℃水浴に投入することによって急速に解凍した。サンプルが解凍されたとき、ストローをティッシュで乾燥させて水平に保ち、両端を切断して予め暖められたＴＡＬＰ培地に投入した。
【００５３】
受精能獲得
精虫をＴＡＬＰ培地で２回洗浄し、６００ｇで１０分間遠心した後、予め３７℃に暖めたＴＡＬＰに再懸濁させた。精虫を添加物無しで、又はアンギオテンシンII（リットルあたり１０−９モル）、フィブロネクチン（５−５０μｇ／ｍｌ）のいずれか、もしくはその両者と共にインキュベートした。光学顕微鏡で見る前に、処理したサンプル（４５μｌ）をＣＴＣ溶液（４５μｌ）と共にホイルを巻き付けたエッペンドルフ管に等分し、１２．５％パラホルムアルデヒドで固定した。
【００５４】
３パターンのクロロテトラサイクリン蛍光染色を雄ウシ精虫上で観察することができる：
Ｆ（非受精能獲得）−パターン、明るい蛍光が精子頭部の全領域にわたって検出された；Ｂ（受精能獲得）−パターン、精子頭部では蛍光が検出されたが、アクロソーム後領域では検出されなかった；  ＡＲ（アクロソーム反応）−パターン、精子頭部全体で弱い蛍光が観察され、明るいバンドが赤道領域に時折観察された。
【００５５】
結果
対照（非処理）群においては約６０％の精子が非受精能獲得パターンを示し、３０分でこれは５５％に低下した。受精能獲得及びアクロソーム反応精子においては有意の変化はなかった（図６を参照）。フィブロネクチン（５μｇ／ｍｌ）処理サンプルは非処理対照に非常に類似する精子染色パターンを示した（図６及び図７を比較）。対照的に、アンギオテンシンIIのみとの６０分インキュベーション、受精能獲得精子が増加し（４５％）、かつ非受精能獲得精子は約（１８％）に低下した（図８を参照）。これらのデータは、アンギオテンシンIIが非受精能獲得（Ｆパターン）から受精能獲得（Ｂパターン）への移行を促進することを示唆する。これには急速なアクロソーム・エキソサイトーシスが続く。フィブロネクチン（５μｇ／ｍｌ）及びアンギオテンシンII（１０−９）の両者で処理したサンプルにおいても非受精能獲得精子が顕著に減少し、３０分以内では僅かに２５％の細胞のみが非受精能獲得パターンを示し、６０分でこれは１５％に低下した。これには受精能獲得及びアクロソーム反応精子全体の増加が伴っていた（図９を参照）。これらの結果は、Ａｎｇ  II（１０−９）がフィブロネクチンの存在下でさえ受精能獲得を増加させ、かつ、前期実施例において示されるデータとの比較から、運動性及び受精能獲得のアンギオテンシンII刺激が同時に生じることを示す。
【００５６】
（実施例７）
精子生存可能性に対するフィブロネクチンの作用
貯蔵溶液：カルボキシフルオレセインジアセテート（ジメチルスルホキシド中０．４６ｍｇ／ｍｌ）、ヨウ化プロピジウム（０．５ｍｇ／等張性生理食塩水ｍｌ）、ホルムアルデヒド（１５０μｌ蒸留水に対して１０μｌホルマリン）。蛍光染料：２ｍｌの精子増量剤に対して５０μｌのカルボキシフルオレセイン及び５０μｌのヨウ化プロピジウム、それに加えて１００μｌのホルムアルデヒド。精液を染料（１：１）希釈駅で希釈し、室温、３７℃で１５分間インキュベートした。サンプルを増量剤で洗浄し、生存及び死亡精子について検査した。
【００５７】
非処理対照サンプルにおいては、室温で３日間保存したとき、生存精子のパーセンテージが７５％から１８％に低下したことが示された。同一条件に保持されていたがフィブロネクチン（５μｇ／ｍｌ）のさらなる存在下にある精子は、３日後に４８％が生存可能のままであることを示した。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、実施例１の手順からの運動性測定の図である。
【図２】図２は、実施例２の手順からの運動性測定の図である。
【図３】図３は、実施例３の手順からの運動性測定の図である。
【図４】図４は、実施例４の手順からの運動性測定の図である。
【図５】図５は、実施例５の手順からの運動精読邸の図である。
【図６】図６は、実施例６の手順からの受精能獲得測定の図である。
【図７】図７は、実施例６の手順からの受精能獲得測定の図である。
【図８】図８は、実施例６の手順からの受精能獲得測定の図である。
【図９】図９は、実施例６の手順からの受精能獲得測定の図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年12月15日(2006.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリックスタンパク質を精子サンプルに添加して該精子を非受精能獲得状態とし、続いてアンギオテンシンII又は関連ペプチドを添加して運動性を刺激し、かつ該精子に受精能を獲得させることを含む精子調節方法。
【請求項２】
細胞外マトリックスタンパク質を含有する精子サンプルが、アンギオテンシンII又は塩もしくは類似体を添加して該精子に受精能を獲得させる前に保存されている、請求項１による方法。
【請求項３】
細胞外マトリックスタンパク質を含有する精子サンプルが保存のために凍結又は冷却されており、かつアンギオテンシンII又は塩もしくは類似体を添加して該精子に受精能を獲得させる前に解凍される、請求項２による方法。
【請求項４】
イン・ビトロで実施される、請求項１ないし３のいずれか１項による方法。
【請求項５】
少なくとも部分的にイン・ビボで実施される、請求項１ないし３のいずれか１項による方法。
【請求項６】
細胞外マトリックスタンパク質がフィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンから選択される、請求項１ないし５のいずれか１項による方法。
【請求項７】
受精能付与剤がアンギオテンシンIIもしくはアンギオテンシンIIアミドである、請求項１ないし６のいずれか１項による方法。
【請求項８】
精子を低運動性非受精能獲得状態で保存する薬剤としての１種類以上の細胞外マトリックスタンパク質の使用。
【請求項９】
細胞外マトリックスタンパク質含有精子が液体形態で保存される請求項８による使用。
【請求項１０】
細胞外マトリックスタンパク質含有精子が凍結形態で保存される請求項９による使用。
【請求項１１】
細胞外マトリックスタンパク質の添加によって低運動性非受精能獲得状態で保存されている精子サンプルの運動性及び受精能獲得を刺激するための薬剤としてのアンギオテンシンII又は関連ペプチドの使用。
【請求項１２】
非受精能獲得状態で保存されている精子サンプルが細胞外マトリックスタンパク質含有凍結精子の解凍によって得られる、請求項１１による使用。
【請求項１３】
非受精能獲得状態で保存されている精子サンプルが液体形態で保存されている細胞外マトリックスタンパク質含有精子サンプルである、請求項１２による使用。
【請求項１４】
非受精能獲得状態で保存されている精子サンプルが使用の準備が整うまで受精能獲得が抑制されている新鮮な精子である、請求項１３による使用。
【請求項１５】
細胞外マトリックスタンパク質がフィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンから選択される、請求項１１ないし１４のいずれか１項による使用。
【請求項１６】
受精能付与剤がアンギオテンシンIIもしくはアンギオテンシンIIアミドである、請求項１１ないし１５のいずれか１項による使用。
【請求項１７】
１種類以上の細胞外マトリックスタンパク質を、精子を非受精能獲得状態で保存する薬剤として水性バッファ中に含む生殖細胞培地。
【請求項１８】
細胞外マトリックスタンパク質がフィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンから選択される、請求項１７による生殖細胞培地。
【請求項１９】
ゲル、クリーム又はペッサリー基体に分散されている１種類以上の細胞外マトリックスタンパク質を含有する精子阻害組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
あるいは、トリペプチドモチーフＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を含むペプチドを受精能獲得のための薬剤として用いることができる。このモチーフはトリペプチドＲＧＤそれ自体によって、又は他の小ペプチド、例えば、商業的に入手可能なテトラペプチドＲＧＤＳ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ）によってもたらされるものであり得る。ＲＧＤはすべての細胞外マトリックスタンパク質が結合する細胞膜中のインテグリンにおいて見出されるトリペプチドモチーフである。したがって、フリーのＲＧＤ、又はモチーフＲＧＤを含有する他のペプチドの使用は細胞外マトリックスタンパク質と競合し、これらのタンパク質による細胞結合を阻害する。有効量は、定型的な試験法により、下記実施例を手引きとして用いて見出すことができる。
【国際調査報告】
2007511594.tif 000011
2007511594.tif 000012
2007511594.tif 000013
2007511594.tif 000014