(57)【要約】  バイオプロセッシングシステムにおける低剪断環境の維持法を開示する。本発明の方法はバイオプロセッシングシステムが操作できる時間を延長するために有用であり、これにより生産時間およびシステムから回収できる生成物の量を最大とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞のバイオプロセッシングシステムにおいて低剪断環境を維持する方法であって：
（ａ）細胞懸濁液を容器中で培養し；
（ｂ）ぜん動性ポンプの作動により容器から懸濁液の一部を取り出し；
（ｃ）懸濁液を透過流（ｐｅｒｍｅａｔｅ  ｓｔｒｅａｍ）と貯留流（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ  ｓｔｒｅａｍ）とに分ける外部細胞貯留デバイス（ＣＲＤ）に懸濁液の一部を送達し、ここで外部ＣＲＤ中の剪断速度は３０００秒−１未満であり；そして
（ｄ）貯留流を容器に戻す、
工程を含んでなる上記システム。
【請求項２】
ＣＲＤがスピンフィルターである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞懸濁液が動物由来の細胞保護物質の不存在下で培養される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
容器が２０秒−１未満の剪断速度を生じる細胞懸濁液を生成するための手段を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣＲＤ剪断速度が２０００秒−１未満である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＣＲＤ剪断速度が１５００秒−１未満である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
操作細胞密度が最高約２５×１０６細胞／ｍｌに維持される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
操作細胞密度が少なくとも約３０日間維持される請求項６に記載の方法。
【請求項９】
真核細胞懸濁液がポリペプチドを分泌する細胞を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが抗体または抗体に由来する結合タンパク質である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞懸濁液が骨髄腫細胞である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
骨髄腫細胞がＮＳ０細胞である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
バイオプロセッシングシステムが適切に（ｉｎ  ｐｌａｃｅ）滅菌可能である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
バイオプロセッシングシステムにおいて最高約２５×１０６細胞／ｍｌの操作細胞密度を少なくとも２０日間維持するための方法であって；
（ａ）ポリペプチドを分泌することができる骨髄腫細胞懸濁液を容器中で少なくとも５０リットルの容量で培養し；
（ｂ）ぜん動性ポンプの作動により容器から懸濁液の一部を取り出し；
（ｃ）懸濁液を外部スピンフィルターに送達して中の懸濁液を透過流と貯留流とに分けるようにし、ここで外部スピンフィルターは１５００秒−１未満の剪断速度を生成し；そして
（ｄ）貯留流を容器に戻す、
工程を含んでなる上記方法。
【請求項１５】
ポリペプチドが抗体または抗体に由来する結合タンパク質である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
骨髄腫細胞がＮＳ０細胞である請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、連続潅流バイオプロセッシングシステムにおいて、低剪断環境の維持に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
現代の生物薬剤は、所望する最終産物を最終的な形態で生産し、そして分泌させるために、成長およびエネルギー源として可溶性の栄養物質を使用する生物工学的に作られた完全に生きている細胞により生産される。原核および真核系の両方が知られている。
【０００３】
単細胞バクテリア、酵母および糸状菌の大規模培養が高度に開発され、そしてこれらの細胞はそれらの丈夫な細胞壁により有意な損傷を受けることなく激しく撹拌される大容量の液体培地中で成長することができる。逆に真核細胞は一般に細胞膜を有し、これは細胞が損傷を受けずに過大な乱流作用には耐えることができず、そして成長を支持するために複雑な栄養培地が連続的に提供されなければならない。
【０００４】
成長する真核細胞用の連続潅流バイオリアクターでは、外部培地が最終産物を回収するための根本材料（ｓｏｕｒｃｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ）、ならびに連続する細胞成長のための栄養源となる。細胞懸濁液から可溶性産物を取り出すために、可溶性産物を含有する栄養培地は細胞から連続的に取り出されなければならない。しかし内部の移動部分を持つバイオリアクター容器および細胞分離部品は真核細胞を傷つけ、そして細胞を高い流体剪断応力に供する恐れがある。細胞の損傷および剪断応力は細胞死をもたらし、そして細胞の成長阻害は細胞密度および産物の収量を減少させる。
【０００５】
幾らかの流体剪断応力は定量することができ、そしてｓ−１の単位で剪断速度として測定される。剪断速度は剪断流れ応力（ｓｈｅａｒ  ｆｌｏｗ  ｓｔｒｅｓｓ）および粘度に関連し、ここで剪断速度（γ）＝剪断流れ応力（ｔ）／粘度（μ）である。剪断流れ応力は、液体を静止セルに通して移動させること、セルを静止液体に通して移動させること、または液体およびセルを同時に移動させることにより生成することができ、そして一般にダイン／ｃｍ２で定量される。粘度はポイズで測定され、ここで１ポイズ＝１ダイン秒ｃｍ−２＝１００センチポイズ（ｃｐ）である。最も粘度が低い流体の１つである水の粘度は０．０１ｃｐである。培地中の典型的な真核細胞懸濁液の粘度は、２５℃の温度で１．０から１．１ｃｐの間である。流体の密度または温度の変化もこの粘度の一因となり得る。
【０００６】
他の流体剪断応力は、フレキシブルチューブ、導管またはパイプのような管中の乱流から生じるものである。直径（ｄ）の真っすぐな管を通るニュートン流体の層流の発生では、壁での剪断速度は平均流速に依存する。液体には移動に抵抗する傾向があり、そして固体表面に最も近い流体は移動に対してより大きく抵抗し、これにより境界層および固体表面からの距離に対する速度勾配を作る。速度勾配の傾斜は液体が移動している速度およびその粘度の関数である。容器を通る、またはそれを囲む液体の流速が加速する時、幾つかの点で層流速度は液体の粘度に打ち勝ち、そして滑らかな粘度勾配が壊れ、乱流が生じる。非特許文献１は、細胞の溶解（ｌｙｓｉｓ）は剪断応力のみに比べて乱流条件下での全体的な剪断応力に一層緊密に関係することを示した。
【０００７】
連続潅流システムに不可欠であるのは、生きている細胞を培養基から分離し、そして新たな培地を含む細胞を反応容器に戻すための手段を提供する細胞貯留デバイス（ｃｅｌｌ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ：ＣＲＤ）である。ＣＲＤはフィルターまたは膜のような機械的（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ）デバイス、および重力沈降タンク、遠心機、超音波フィルターおよび誘電泳動装置のような非機械的（ｎｏｎ−ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ）デバイスを含む。
【０００８】
細胞および回収産物を分離するために特に効果的な方法は、スピンフィルターデバイスを用いた培地からの細胞の遠心分離である。内部スピンフィルターは、バイオプロセッシングシステムに基づく大規模な潅流培養バイオリアクターに低剪断系として使用されてきた。内部スピンフィルター潅流バイオリアクター細胞培養装置は、例えば特許文献１および２に記載されている。しかし潅流バイオリアクターの操作中に内部スピンフィルターの詰まりが、バイオプロセッシングシステムに基づく潅流細胞培養を操作できる日数を制限する。
【０００９】
また外部スピンフィルターは（ＥＳＦ）は、バイオプロセッシングシステムに基づく潅流細胞培養から生成物を回収するためにも使用することができる。ＥＳＦ技術により潅流培養中にＥＳＦフィルター材料の交換が可能となり、これによりバイオプロセッシングシステムに基づく潅流細胞培養を操作できる日数を延ばす。多くはバイオプロセッシングシステムに基づく潅流細胞培養からのタンパク質生産のスケールアップにＥＳＦを使用することは、再循環用のローブポンプ（ｌｏｂｅ  ｐｕｍｐ）を使用して行われてきた。しかしＥＳＦは、ポンプおよびフィルターユニットを通過する培地中に保持されているこれらの細胞に有意な剪断応力を与える。
【００１０】
剪断応力のこれらの主な要因はすべて、バイオプロセッシングシステムに基づく潅流細胞培養におけるタンパク質生産に負の影響を及ぼす恐れがある。すなわちそのようなシステムにおいて剪断応力の主な要因を制御することにより、真核細胞培養のバイオプロセッシングシステムにおいて細胞密度を維持することができる方法の必要性が存在する。
【特許文献１】米国特許第５，１２６，２６９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６３７，４９６号明細書
【非特許文献１】Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：３２９−３３５，１９９４
【発明の開示】
【００１１】
発明の要約
本発明は、細胞懸濁液を容器中で培養し；ぜん動性（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ）ポンプの作動により容器から懸濁液の一部を取り出し；懸濁液を透過流と貯留流とに分ける外部細胞貯留デバイスに懸濁液の一部を送達し、ここで外部細胞貯留デバイス中の剪断速度は３０００秒−１未満であり；そして貯留流を容器に戻す工程を含んでなる、真核細胞のバイオプロセッシングシステムにおいて低剪断環境を維持する方法を提供する。
発明の詳細な説明
本明細書に引用するすべての刊行物（限定するわけではないが特許および特許出願を含む）は、完全な説明を通して参照により本明細書に編入する。
【００１２】
本明細書および特許請求の範囲で使用する用語「抗体」は広い意味であり、そしてマウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体および抗体フラグメントを初めとするポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を含め、免疫グロブリンまたは抗体分子を含む。
【００１３】
用語「抗体に由来する結合タンパク質（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、第２の分子に結合することができる抗体の一部を含んでなる分子を意味する。一般に抗体のそのような部分は、抗原に結合する完全な抗体の可変領域、またはＣＨ１、ＣＨ２もしくはＣＨ３領域のような抗体の定常領域の少なくとも一部であることができる。抗体に由来する結合タンパク質の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、単鎖抗体分子および少なくとも２つの完全な抗体から形成された多重特異性抗体を含む。他の例には、式
（Ｖ１（ｎ）−Ｐｅｐ（ｎ）−Ｆｌｅｘ（ｎ）−Ｖ２（ｎ）−ｐＨｉｎｇｅ（ｎ）
−ＣＨ２（ｎ）−ＣＨ３（ｎ））（ｍ）
［式中、Ｖ１は免疫グロブリン可変領域のＮ−末端の少なくとも１つの部分であり、Ｐｅｐは第２の分子に結合する少なくとも１つの生物活性ペプチドであり、Ｆｌｅｘはミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）が選択的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）方向性および結合特性を有することを可能にすることにより構造的柔軟性を提供するポリペプチドであり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ−末端の少なくとも１つの部分であり、ｐＨｉｎｇｅは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部であり、ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２定常領域の少なくとも一部であり、そしてＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３定常領域の少なくとも一部であり、ここでｎおよびｍは１から１０の間の整数である］を有するミメティボディを含む。ミメティボディはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のような種々の型の免疫グロブリン分子の特性および機能を模する。
【００１４】
本明細書で使用する用語「バイオプロセッシングシステム」は、哺乳動物または昆虫細胞のような真核細胞に由来するポリペプチドのような生物起源の分子を生産するための本質的には閉鎖系を意味する。本発明の方法に使用することができる代表的なバイオプロセッシングシステムの形態を図１に示し、これはバイオリアクター容器１、再循環ポンプ２および外部スピンフィルター（ＥＳＦ）３のような外部細胞貯留デバイス（ＣＲＤ）との間の関係を示す。典型的にはバイオリアクターは反応空間を封じ込める５０リットルから２００リットル容量の容器であり、細胞培養物を混合そして懸濁し、そして適切に完全に滅菌することができる手段を備えている。
【００１５】
典型的には、容器は硬質ステンレス鋼タンクであるが、容器は例えば細胞バックのような柔軟なポリマー性容器を含んでなることができる。バイオリアクターは新しい培地用の供給ラインおよび細胞懸濁液の一部を引き抜く取り出しラインを有する。取り出しラインはポンプを通り、そして適切に滅菌できる連結を通ってＥＳＦに連続する。ＥＳＦ３はまた回収した本質的に細胞を含まない培地用のライン、およびある細胞濃度の点で内部出口から導かれ、そしてバイオリアクターに戻る第２ラインを連結するコネクターを有する。バルブは流れを制御するためにシステム中の様々な点に存在し、そしてシステムの種々の部品の滅菌を可能とする。
【００１６】
本明細書で使用する用語「操作細胞密度」とは、生物起源の分子の生産を得るためにバイオプロセッシングシステムが操作され得る細胞密度を意味する。そのような細胞密度は、バイオプロセッシングシステムに供給されるアミノ酸、酸素または他の代謝産物のような栄養が細胞の生存能を維持するために十分である密度である。あるいはそのような細胞密度は、細胞の生存能を維持するために十分な速度でバイオプロセッシングシステムから廃棄産物が除去され得る密度である。そのような細胞密度は当業者により容易に決定することができる。典型的なバイオプロセッシングシステムでは、細胞密度は約０．５×１０６細胞／ｍｌから約２５×１０６細胞／ｍｌの間である。
【００１７】
本明細書で使用する用語「透過流（ｐｅｒｍｅａｔｅ  ｓｔｒｅａｍ）」とは、培地および懸濁細胞の一部が貯留バリアを通ることにより外部ＣＲＤを出ることを意味する。
【００１８】
本明細書で使用する用語「貯留流（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ  ｓｔｒｅａｍ）」とは、培地および懸濁細胞の一部が貯留バリアを通らずに外部ＣＲＤを出ることを意味する。典型的には細胞の大部分が貯留流に存在する。
【００１９】
本発明は低剪断環境を維持する方法を提供し、これにより流体剪断応力を最小とすることによりバイオプロセッシングシステムにおける操作細胞密度を維持する。抗体または抗体に由来する結合タンパク質または別の目的タンパク質のようなポリペプチドを発現する真核細胞は、バイオプロセッシングシステム中で成長させることができる。本発明の方法は、バイオプロセッシングシステムに関する操作時間を延長するために有用であり、これにより生産時間およびシステムから回収され得る生成物の量を最大とする。さらにバイオプロセッシングシステム全体を適切に滅菌することができ、これによりバイオプロセッシング操作間の時間を最小にする。
【００２０】
特に本発明は、細胞懸濁液を容器中で培養し、ぜん動性ポンプの作動により容器から懸濁液の一部を取り出し、懸濁液を透過流と貯留流とに分けるＣＲＤに懸濁液の一部を送達し、ここでＣＲＤ中の剪断速度は３０００秒−１未満であり，そして貯留流を容器に戻すことにより真核細胞のバイオプロセッシングシステムにおいて低剪断環境を維持する方法を提供する。
【００２１】
連続潅流システムには、細胞の懸濁を提供し、新しい栄養物質を供給し、そして生成物を含有する画分を得ることを可能にするバイオリアクター容器中の撹拌または可動部を要する。細胞懸濁液を得るために、バイオリアクター容器の多くは剪断応力の潜在的原因である１もしくは複数の可動性の機械的撹拌デバイスを使用する。
【００２２】
細胞懸濁液を生成するための手段の例には、プロペラのような羽根車、または他の機械的手段、内袋（ｂｌａｄｄｅｒ）、流体またはガス流に基づく手段、超音波定常波生成機、揺動プラットホームまたは細胞懸濁液を生成するそれらの組み合わせを含む。本発明の方法では、プロペラが培地中の細胞を懸濁し、そして２０ｓ−１未満の剪断速度を生成するための例示的手段である。プロペラは回転速度（ｒｐｍ）で移動し、そして直径（Ｄ）を有する。プロペラの羽の接線に沿って、しかもその先端で生じる最大剪断力（Ｖｔ）の簡略化した計算式は、
Ｖｔ＝半径 ｘ 回転速度＝Ｄ／２ ｘ ２Π ｘ ｒｐｍ
のような羽の半径と回転速度の積である。
【００２３】
本発明の方法に有用な羽根車撹拌機／バイオリアクター形態により生成される最大剪断速度の例を表１に示す。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
当業者は、本発明の方法に適合する容器内で、真核細胞懸濁液を生成するためのさらなる容器および手段を直ちに知ることができるだろう。
【００２６】
本発明では、バイオリアクターからＣＲＤに細胞懸濁液を移動させるために使用するポンプの種類が、剪断速度に大きな影響を及ぼすことが測定された。本発明の方法では、ぜん動性ポンプの作動によりバイオリアクター容器から真核細胞懸濁液の一部を取り出すことにより剪断速度が最小とされる。そのようなポンプの例には、Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ（ファルモス（Ｆａｌｍｏｕｔｈ）、英国）６００シリーズポンプのぜん動性ポンプ、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  Ｌ／Ｓシリーズ（コール−パルマー（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）、バリングトン、イリノイ州）、または他のぜん動性ポンプモデルを含む。
【００２７】
多くの異なる種類のポンプが当該技術分野では知られ、そして往復ポンプ、ロータリーポンプ、ローブポンプ、遠心ポンプ、ダイヤフラムポンプおよびぜん動性ポンプを含む。典型的にはローブポンプは、連続潅流バイオプロセッシングシステムに使用されてきた。ローブポンプは液体を押すためにローブ要素（ｌｏｂｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔ）またはローターを使用する。一般には２もしくは３のローブが各ローターに存在する。２つのローブ要素が回転し、１つは電源により直接駆動され、他方は時限ギアを介して駆動される。要素が回転すると、液体が各ローターの２つのローブとポンプチャンバーの壁との間にトラップされ、そしてポンプの吸引側から排出側へ運ばれる。液体が吸引チャンバーから出ると、吸引チャンバー中の圧は下がり、そしてさらなる液体がリザーバーからチャンバーへと向けられる。ローブはポンプの中心で出会う点で連続的な密閉が存在するように構成される。ポンプのローブには時々、ポンプの密閉性を向上させるために、外縁に小さい羽が付けられている。羽はそれらのスロットに機械的に保持されているが、幾らか移動の自由もある。遠心力はチャンバーおよび他の回転部材に対して羽がきちんと張るように（ｓｎｕｇ）保つ。
【００２８】
ローブポンプの構造は、その回転中に特定の点でポンプチャンバーの壁とローブ要素との間にギャップを提供し、ポンプを通る細胞を含む培養基に剪断応力を生じる。例えば６．４６ｃｍのポンプチャンバー直径、および６．３５ｃｍのローブ直径を用いると、細胞が通過しなければならないギャップは、ローブが回転する時に０から０．１１ｃｍの間で変動する。３０００秒−１を越える剪断速度は典型的には細胞を損傷し、特にプリマトン（ｐｒｉｍａｔｏｎｅ）および／または血清のような動物の産物に由来する細胞保護物質の不存在下ではそうである。
【００２９】
ぜん動性ポンプは、導管の長さに沿って液体を移動させるために、導管のシャフトまたは部分の直径が順次狭くなる原理に基づき作動する。流体は全部がチューブまたはホース中に含まれ、そしてポンプとは接触しない。これらのポンプにはシール、グランドまたはバルブが無く、そして衛生または滅菌操作に理想的である。ぜん動性ポンプはその直線的な流路により、スラリーおよびスラッジを詰まりや封鎖無しにポンプで等しく成功裏に送液する。容量形ポンプでもそうであるように、スリップまたは逆流がない。
【００３０】
ぜん動性ポンプは、複合材料で作られた導管を連結することができる。そのようなチューブの１例は、シリコンポリマーおよびポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ；Ｔｅｆｌｏｎ（商標）としても知られている）を含んでなる複合材料で作られたＳｔａ−Ｐｕｒｅ（商標）ポンプチューブ（ミトステクノロジー社（Ｍｉｔｏｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、フェニックスヴィレ、ペンシルバニア州）である。本発明の方法で使用するために適当な複合チューブの他の例は、繊維強化ポリマー性チューブを含む。これらの形態は完全なバイオプロセッシングシステムの適切に滅菌を提供する。当業者は本発明の方法に適合する他のぜん動性ポンプおよびチューブを認識している。
【００３１】
また剪断応力はバイオプロセッシングシステムのＣＲＤユニット中でも生成し得る。例えばＥＳＦで、デバイスは所定の内径（ｄ）を収容するタンクおよびスクリーンを保持する第２の直径を持つスピンフィルターバスケットを含んでなる（図２を参照にされたい）。タンクの内壁とスピンフィルターバスケット／スクリーンとの間には距離のギャップ距離があり、そしてタンクの内壁とバスケット／スクリーンとの間の直径の比率はカッパ（κ）と定める。ＥＳＦ構成物品に関する剪断速度の計算は、バスケット（Ｖｔ）とキャップに沿った距離（Ｌ）の回転速度に基づき、そしてＡｔｓｕｍｉの相関に基づき算出され得る。Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｅｒ．Ｓｃｉ．１５７，１７７−１８７（１９９９）を参照にされたい。
【００３２】
典型的にはＥＳＦ直径は、乱流を保つためにＥＳＦタンクとスピンフィルターとの間のギャップが最小となるように設計される。乱流はフィルターの詰まりを防止するために必須であると考えられてきた。しかしギャップサイズの減少を介することにより寄与する剪断速度の減少によりＥＳＦシステムの剪断速度を低下させることができる。出願人は予期せずに、ギャップサイズは維持しながらバスケットの回転速度を減少させることにより、フィルターの詰まりを上昇させることなく剪断が低下することを見いだした。
【００３３】
ギャップから剪断を低下させる別の取り組みは、ＥＳＦ直径を下げることである。そのような目的に役立てるために様々な減少させた直径を形成することができる。表２は種々のバイオリアクター形状に関するＥＳＦギャップからの有意な剪断応力寄与率およびＥＳＦバスケット速度を示す。
【００３４】
【表２】
2007510416.tif 000004
【００３５】
本発明の方法では、バイオリアクターから取り出された真核細胞懸濁液の一部は、懸濁液を透過流と貯留流とに分けるために外部スピンフィルターに送達される。次いで貯留流はさらに培養するためにバイオプロセッシングシステムの容器に戻される。
【００３６】
本発明の方法では、ＣＲＤにより生成する剪断速度が３０００ｓ−１未満、２０００秒−１未満または１５００秒−１未満である。バイオプロセッシングシステムの生産操作中の例示的なＥＳＦ剪断速度範囲は、約１２３５ｓ−１から約７００ｓ−１の間である。ＥＳＦ剪断速度をこの範囲に維持するために、ＥＳＦ回転速度は典型的には約２５〜約３００ｒｐｍであり、直径は約５〜約３０ｃｍであり、そしてギャップは約０．５〜約５ｃｍである。
【００３７】
本発明の方法で培養する真核細胞は、連続潅流培養条件下で成長することができる任意の細胞株でよい。これらの細胞には例えばＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、Ａｇ６５３細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション寄託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）のような骨髄腫に由来する細胞、または当業者に知られている他の骨髄腫に由来する細胞株およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を含む。
【００３８】
また本発明の方法は、２０日から４０日以上の範囲の期間、バイオプロセッシングシステム中で低剪断環境を維持するためにも使用することができる。例示的な操作時間は、少なくとも約３０日である。維持できる操作細胞密度は、少なくとも約０．５×１０６細胞／ｍｌである。典型的なバイオプロセッシングシステムの操作細胞密度は、約０．５×１０６／ｍｌから約２５×１０６／ｍｌの間であり得る。例示密度は、約２．５×１０６／ｍｌから約２２×１０６／ｍｌの間であり得る。本発明の方法では、細胞の生存能は典型的には約４０％から約１００％の間である。他のバイオプロセッシングシステムの操作細胞密度および得られる細胞の生存能のレベルは当業者に認識され、そして当業者に周知な技法により測定することができる。
【００３９】
本発明を以下の具体的な非限定的実施例を参照にしてこれから説明する。
【実施例】
【００４０】
実施例１
バイオプロセッシングシステムにおける剪断を減少させるための大規模ぜん動性ポンプの使用
抗−ＣＤ３抗体を発現する剪断感受性のＮＳＯ細胞株（米国特許第６，４９１，９１６号明細書に記載されている）は、ローブポンプ再循環機を使用して連続潅流バイオリアクター中で血清の存在下にて成長させた。これらの細胞は、細胞懸濁液の再循環およびＥＳＦへの送達のためにローブポンプを使用した時、バイオプロセッシングシステムにより損傷した。結果はバイオプロセッシングシステム操作の１２日後に、２０％の許容できない低い生存能であった（図３）。
【００４１】
結果として、潅流バイオリアクター中で細胞懸濁液を生成するために使用するプロペラは、１０ｓ−１から２０ｓ−１の間の剪断速度が維持されるように操作された。さらにローブポンプはＷａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ（ファルマウス、英国）６００シリーズぜん動性ポンプに置き換えて、剪断を減少させた。ローブポンプをぜん動性ポンプに置き換えた後、図４の結果は、細胞の成長および生存能がＥＳＦフィルター材料を交換せずに少なくとも４０日間、バイオプロセッシングシステム中で維持できたことを示す。
実施例２
ＥＳＦ回転速度の減少
大規模生産に使用するＥＳＦの典型的な操作条件は、剪断速度に寄与する。表３に示す結果は、小規模至適化実験では、７８ｃｍ  ｓ−１の先端スピードが１２２９ｓ−１の許容し得る剪断速度を生じることを示す。この先端スピードを１００リットルにスケールアップしたバイオリアクターの形態で７８ｃｍ  ｓ−１の一定に維持すると、ＥＳＦの回転スピードは約２５％減少し、そして対応する剪断速度は７３５秒−１である。
【００４２】
【表３】
2007510416.tif 000005
【００４３】
本発明を完全に説明しているが、当業者には添付する特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく多くの変更および修飾を行えることが明白である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】バイオプロセッシングシステムの概略を示す。
【図２】外部スピンフィルターデバイスの詳細を示す。
【図３】バイオプロセッシングシステムにおいて、細胞の生存能および密度に及ぼすローブポンプにより生成される剪断の効果を示す。
【図４】低剪断バイオプロセッシングシステムにおいて、ぜん動性ポンプの使用により生じる改善された細胞の成長および生存能を示す。
【図１】
2007510416.tif 000006
【図２】
2007510416.tif 000007
【図３】
2007510416.tif 000008
【図４】
2007510416.tif 000009
【国際調査報告】
2007510416.tif 000010
2007510416.tif 000011