(57)【要約】  本発明により、異種タンパク質を製造する方法であって、（ａ）シャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている遺伝子と、異種タンパク質をコードしている遺伝子とを含む２μｍ系プラスミドを含む宿主細胞を準備すること；（ｂ）その宿主細胞を、培養培地中、シャペロンタンパク質をコードしている遺伝子と、異種タンパク質をコードしている遺伝子の発現を可能とする条件下で培養すること；および（ｃ）発現した異種タンパク質を培養宿主細胞または培養培地から精製することを含んでなる方法が提供される。
2007515962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非２μｍ系プラスミドタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）シャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている遺伝子と、非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている遺伝子とを含む２μｍ系プラスミドを含んでなる宿主細胞を準備すること、
（ｂ）該宿主細胞を、培養培地中、シャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている遺伝子と、非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている遺伝子の発現を可能とする条件下で培養すること、および
（ｃ）発現した非２μｍ系プラスミドタンパク質を培養宿主細胞または培養培地から精製すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
精製された非２μｍ系プラスミドタンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化する工程、および、所望により、このようにして製剤化されたタンパク質を単位投与形で提供する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
真菌（好ましくは、酵母）または脊椎動物の非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている遺伝子とシャペロンタンパク質をコードしている遺伝子とを同じ２μｍ系プラスミド上に提供することにより、前記非２μｍ系プラスミドタンパク質の生産を増強するための発現ベクターとしての、２μｍ系プラスミドの使用。
【請求項４】
シャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている遺伝子と非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている遺伝子とを含んでなる２μｍ系プラスミドであって、このプラスミドが２μｍプラスミドに基づく場合には、非組込みベクターである、プラスミド。
【請求項５】
シャペロンが真菌シャペロン（好ましくは、酵母シャペロン）または哺乳類シャペロン（好ましくは、ヒトシャペロン）の配列を有するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項６】
シャペロンが、ＡＨＡ１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５、ＣＣＴ６、ＣＣＴ７、ＣＣＴ８、ＣＮＳ１、ＣＰＲ３、ＣＰＲ６、ＥＰＳ１、ＥＲＯ１、ＥＵＧ１、ＦＭＯ１、ＨＣＨ１、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ３０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ８２、ＪＥＭ１、ＭＤＪ１、ＭＤＪ２、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＰＤＩ１、ＰＦＤ１、ＡＢＣ１、ＡＰＪ１、ＡＴＰ１１、ＡＴＰ１２、ＢＴＴ１、ＣＤＣ３７、ＣＰＲ７、ＨＳＣ８２、ＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ１１、ＮＯＢ１、ＥＣＭ１０、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、ＳＳＥ２、ＳＩＬ１、ＳＬＳ１、ＵＢＩ４、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、ＰＥＲ１、ＰＴＣ２、ＰＳＥ１およびＨＡＣ１または末端切断型イントロンレスＨＡＣ１のいずれか１つによりコードされているタンパク質の配列を含むものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項７】
シャペロンがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼであるか、またはＰＳＥ１、ＯＲＭ２もしくはＳＳＡ１によりコードされているタンパク質またはその変異体もしくは断片の配列を含むものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項８】
宿主細胞が、前記プラスミドによりコードされている第一のシャペロンとは異なるシャペロンをコードしている第二の組換え遺伝子も発現する、請求項１、２、５、６または７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
シャペロンをコードしている第二の組換え遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
プラスミドが、異なるシャペロンをコードしている２つの異なる遺伝子を含み、その遺伝子の１つが請求項８により定義されたシャペロンをコードしている第二の組換え遺伝子である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１１】
前記シャペロンの１つがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１２】
前記シャペロンの１つがＯＲＭ２である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１３】
前記２つのシャペロンがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとＯＲＭ２である、請求項８または９に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１４】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、酵母において分泌を引き起こすのに有効なリーダー配列を含むものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１５】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、真核生物タンパク質、またはその断片もしくは変異体、好ましくは脊椎動物または真菌（例えば、酵母）タンパク質である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１６】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が商業上有用なタンパク質である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１７】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、アルブミン、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば、血液凝固因子）、アンチスタシン、ｔｉｃｋ抗凝固ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンギオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンに基づく分子またはいずれかの断片（例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ断片）、Ｋｕｎｉｔｚドメインタンパク質、インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ２、インターフェロンα種および亜種、インターフェロンβ種および亜種、インターフェロンγ種および亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＡＸ１５（Ａｘｏｋｉｎ（商標））、ＩＬ１−受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびＥＰＯ模倣体、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびＴＰＯ模倣体、プロサプチド、シアノビリン−Ｎ，５−ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルディン、血小板由来増殖因子、副甲状腺ホルモン、プロインスリン、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、インスリン様増殖因子、カルシトニン、成長ホルモン、トランスフォーミング増殖因子β、腫瘍壊死因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、プレ型および活性型双方の凝固因子（限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ウィルブランド因子、α１アンチトリプシン、プラスミノーゲンアクチベーター、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Ｘおよび因子XIIIを含む）、神経増殖因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターαトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、Ｃタンパク質、Ｓタンパク質、または上記のいずれかの変異体もしくは断片から選択される配列を含むものである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１８】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、アルブミンまたはその変異体もしくは断片の配列を含むものである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１９】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、トランスフェリンファミリーメンバー、好ましくはトランスフェリンもしくはラクトフェリンまたはその変異体もしくは断片の配列を含むものである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項２０】
非２μｍ系プラスミドタンパク質が、融合タンパク質、例えば、アルブミンもしくはトランスフェリンファミリーメンバーまたはいずれかの変異体もしくは断片が別のタンパク質配列と直接的または間接的に融合された融合タンパク質を含むものである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項で定義されたプラスミドを含んでなる、宿主細胞。
【請求項２２】
プラスミドによりコードされているシャペロンが必須遺伝子である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
プラスミドの不在下では、前記シャペロンを産生しない、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
酵母細胞である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
プラスミドがｐＳＲ１、ｐＳＢ３もしくはｐＳＢ４に基づくものであって、酵母細胞がチゴサッカロミセス・ルクシーであるか、プラスミドがｐＳＢ１もしくはｐＳＢ２に基づくものであって、酵母細胞がチゴサッカロミセス・バイリーであるか、プラスミドがｐＳＭ１に基づくものであって、酵母細胞がチゴサッカロミセス・フェルメンタチであるか、プラスミドがｐＫＤ１に基づくものであって、酵母細胞がクルイベロミセス・ドロソフィラルムであるか、プラスミドがｐＰＭ１に基づくものであって、酵母細胞がピキア・メンブラネファシエンスであるか、またはプラスミドが２μｍプラスミドに基づくものであって、酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエもしくはサッカロミセス・カルルスベルゲネシスである、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
プラスミドが２μｍプラスミドに基づくものであって、酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエまたはサッカロミセス・カルルスベルゲネシスである、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
宿主細胞が、請求項２１〜２６のいずれか一項で定義された宿主細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
宿主細胞が、請求項２３またはそれに従属する他のいずれかの請求項で定義された宿主細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｂ）が、宿主細胞を富栄養培地などの非選択培地中で培養することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
非２μｍ系プラスミドタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）第一のシャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子、第二のシャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子、および非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている第三の組換え遺伝子を含む宿主細胞であって、第一のシャペロンと第二のシャペロンが異なるものである、宿主細胞を準備すること、
（ｂ）該宿主細胞を、培養培地中、第一、第二および第三の遺伝子の発現を可能とする条件下で培養すること、および
（ｃ）所望により、発現した非２μｍ系プラスミドタンパク質を培養宿主細胞または培養培地から精製すること、および
（ｄ）所望により、精製されたタンパク質を凍結乾燥すること
を含んでなる、方法。
【請求項３１】
精製された非２μｍ系プラスミドタンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化する工程、および、所望により、このようにして製剤化されたタンパク質を単位投与形で提供する工程をさらに含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
第一および第二のシャペロンが、ＡＨＡ１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５、ＣＣＴ６、ＣＣＴ７、ＣＣＴ８、ＣＮＳ１、ＣＰＲ３、ＣＰＲ６、ＥＰＳ１、ＥＲＯ１、ＥＵＧ１、ＦＭＯ１、ＨＣＨ１、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ３０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ８２、ＪＥＭ１、ＭＤＪ１、ＭＤＪ２、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＰＤＩ１、ＰＦＤ１、ＡＢＣ１、ＡＰＪ１、ＡＴＰ１１、ＡＴＰ１２、ＢＴＴ１、ＣＤＣ３７、ＣＰＲ７、ＨＳＣ８２、ＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ１１、ＮＯＢ１、ＥＣＭ１０、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、ＳＳＥ２、ＳＩＬ１、ＳＬＳ１、ＵＢＩ４、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、ＰＥＲ１、ＰＴＣ２、ＰＳＥ１およびＨＡＣ１または末端切断型イントロンレスＨＡＣ１のいずれか１つによりコードされているタンパク質の配列を含むものである、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
第一のシャペロンがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼである、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
第二のシャペロンがＯＲＭ２である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
第一または第二のシャペロンの少なくとも１つが、染色体に組み込まれた組換え遺伝子によりコードされている、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
第一または第二のシャペロンの少なくとも１つが、プラスミド上の遺伝子によりコードされている、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記プラスミドが請求項１〜２６のいずれか一項で定義されたプラスミドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子と、トランスフェリンに基づくタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子とを含んでなる、宿主細胞。
【請求項３９】
トランスフェリンに基づくタンパク質の発現を増強するための、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の配列を含むタンパク質をコードしている組換え遺伝子の使用。
【請求項４０】
トランスフェリンに基づくタンパク質が、トランスフェリンまたはトランスフェリンファミリーの他のメンバー（例えば、ラクトフェリン）、その変異体もしくは断片、またはトランスフェリン、その変異体もしくは断片を含む融合タンパク質の配列を含むものである、請求項３８に記載の宿主細胞または請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子がプラスミド上に提供される、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４２】
前記プラスミドが２μｍ系プラスミドである、請求項４１に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４３】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子が染色体に組み込まれる、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４４】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子が、内因的にコードされているＰＤＩ遺伝子の遺伝子座で、好ましくは内因性ＰＤＩ遺伝子の発現を妨げることなく、染色体に組み込まれる、請求項４３に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４５】
トランスフェリンに基づくタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子がプラスミド上に提供される、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４６】
前記プラスミドが２μｍ系プラスミドである、請求項４５に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４７】
トランスフェリンに基づくタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子が染色体に組み込まれる、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４８】
トランスフェリンに基づくタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子が、内因的にコードされているＰＤＩ遺伝子の遺伝子座で、好ましくは内因性ＰＤＩ遺伝子の発現を妨げることなく、染色体に組み込まれる、請求項４７に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４９】
非２μｍ系プラスミドタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）ＯＲＭ２またはその変異体もしくは断片の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子と、非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子とを含む宿主細胞を準備すること、および
（ｂ）該宿主細胞を、培養培地中、第一および第二の遺伝子の発現を可能とする条件下で培養すること
を含んでなる、方法。
【請求項５０】
精製された非２μｍ系プラスミドタンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化する工程、および、所望により、このようにして製剤化されたタンパク質を単位投与形で提供する工程をさらに含んでなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＯＲＭ２またはその変異体もしくは断片の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子が、宿主細胞の染色体に組み込まれている、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＯＲＭ２またはその変異体もしくは断片の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子がプラスミド上に存在する、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５３】
ＯＲＭ２またはその変異体もしくは断片の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子と、非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子とを含んでなる、宿主細胞。
【請求項５４】
宿主細胞中における非２μｍ系プラスミドタンパク質の発現を増強するための、ＯＲＭ２またはその変異体もしくは断片の配列を含むタンパク質をコードしている組換え遺伝子の使用。
【請求項５５】
ＯＲＭ２またはその変異体もしくは断片の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子と、非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子とを含んでなる、プラスミド。
【請求項５６】
２μｍ系プラスミドである、請求項５５に記載のプラスミド。
【請求項５７】
非２μｍ系プラスミドタンパク質が請求項１４〜２０のいずれか一項で定義されたものである、請求項４９〜５６のいずれか一項に記載の方法、使用、宿主細胞またはプラスミド。
【請求項５８】
必須シャペロンをコードしている遺伝子を含むプラスミドを含んでなり、該プラスミドの不在下ではシャペロンを産生できない宿主細胞であって、該プラスミドが、請求項１４〜２０のいずれか一項で定義された非２μｍ系プラスミドタンパク質などの非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている組換え遺伝子をさらに含むものである、宿主細胞。
【請求項５９】
前記プラスミドの不在下では生存力のない、請求項５８に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
前記シャペロンがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼである、請求項５８または５９に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
必須シャペロンをコードしている遺伝子を単独の選択マーカーとして含んでなる、プラスミド。
【請求項６２】
請求項１４〜２０のいずれか一項で定義された非２μｍ系プラスミドタンパク質などの非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている遺伝子をさらに含んでなる、請求項６１に記載のプラスミド。
【請求項６３】
２μｍ系プラスミドである、請求項６１または６２に記載のプラスミド。
【請求項６４】
非２μｍ系プラスミドタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）請求項５８〜６０のいずれか一項で定義された宿主細胞を準備する工程、および
（ｂ）該宿主細胞を、培養培地中、必須シャペロンおよび非２μｍ系プラスミドタンパク質の発現を可能とする条件下で培養する工程
を含んでなる、方法。
【請求項６５】
宿主細胞が請求項６１〜６３のいずれか一項で定義されたプラスミドを含むものである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
工程（ｂ）が、宿主細胞を、富化栄養培地または複合培地などの非選択培地で培養することにより実施される、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
宿主細胞を最小培地などの選択培地中で培養し、その宿主細胞内でタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現させることにより、宿主細胞における非２μｍ系プラスミドタンパク質の発現を増強するための、前記ヌクレオチド配列の使用であって、このタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードしているヌクレオチド配列が次の特徴：
（ａ）そのヌクレオチド配列が、天然ＰＤＩプロモーターまたはその機能的変異体の配列を有するプロモーターを含み、かつ、一連の１４回の「ＴＡ」反復を含むこと；
（ｂ）コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼが、アミノ酸ＥＡＤＡＥＡＥＡまたはその保存的に置換された変異体を、一般に、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ３８４０２に関して定義されている５０６〜５１３番の位置に含むこと；
（ｃ）コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの残基Ｓｅｒ４１がコドンＴＣＴによりコードされていること；
（ｄ）コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの残基Ｇｌｕ４４がコドンＧＡＡによりコードされていること；
（ｅ）コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの残基Ｌｅｕ２６２がコドンＴＴＧによりコードされていること；
（ｆ）コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの残基Ａｓｐ５１４がコドンＧＡＣによりコードされていること；または
（ｇ）そのヌクレオチド配列が、天然ＰＤＩターミネーターまたはその機能的変異体の配列を有するターミネーター配列を含み、かつ、１９１９番の位置（天然ＳＫＱ２ｎターミネーター配列に関して１９１９番と定義されたもの）に一連の連続する８個の塩基「Ａ」、および／または塩基「Ｃ」を含むこと
のうち少なくとも１つを有することを特徴とする、使用。
【請求項６８】
非２μｍ系プラスミドタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードしている組換え遺伝子を含み、かつ、請求項６７で定義された核酸配列の配列を有し、さらに非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている組換え遺伝子を含む宿主細胞を準備する工程、および
（ｂ）該宿主細胞を、最小培養培地中、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび非２μｍ系プラスミドタンパク質の発現を可能とする条件下で培養する工程
を含んでなる、方法。
【請求項６９】
宿主細胞内でシャペロンをコードしているコード配列に作動可能なように連結されたプロモーターの配列を含むポリヌクレオチド配列を発現させることにより宿主細胞における非２μｍ系プラスミドタンパク質の発現を増強するための、該ポリヌクレオチドの使用であって、前記プロモーターが、そのコード配列がその天然プロモーターに作動可能なように連結されていた場合に達成されるであろうレベルよりも低いレベルのシャペロン発現を果たすことを特徴とするものである、使用。
【請求項７０】
非２μｍ系プラスミドタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）シャペロンをコードしているコード配列に作動可能なように連結されたプロモーター（このプロモーターは、そのコード配列がその天然プロモーターに作動可能なように連結されていた場合に達成されるであろうレベルよりも低いレベルのシャペロン発現を果たすことを特徴とする）の配列を含む組換え遺伝子を含み、かつ、非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている組換え遺伝子をさらに含む宿主細胞を準備する工程、および
（ｂ）該宿主細胞を、シャペロンおよび非２μｍ系プラスミドタンパク質の発現を可能とする条件下で培養する工程
を含んでなる、方法。
【請求項７１】
精製されたタンパク質を凍結乾燥する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７２】
発現した非２μｍ系プラスミドタンパク質を培養宿主細胞または培養培地から精製する工程をさらに含んでなる、請求項４９、６４、６８または７０に記載の方法。
【請求項７３】
精製されたタンパク質を凍結乾燥する工程をさらに含んでなる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
精製または凍結乾燥された非２μｍ系プラスミドタンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化する工程をさらに含んでなる、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
製剤化されたタンパク質を単位投与形で提供する工程をさらに含んでなる、請求項７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本願は、遺伝子発現法に関する。
【０００２】
発明の背景
シャペロンとして知られるタンパク質種は、Hartl (1996, Nature, 381, 571-580)によれば、別のタンパク質の不安定な立体配座異性体と結合して安定化させ、そして、結合と遊離の制御により、in vivoでのその適切な運命、すなわち、フォールディング、オリゴマーアセンブリ、特定の細胞内コンパートメントへの輸送、または分解による除去を助長するタンパク質として定義されている。
【０００３】
ＢｉＰ（酵母におけるＧＲＰ７８、Ｉｇ重鎖結合タンパク質およびＫａｒ２ｐとしても知られる）は、ｈｓｐ７０ファミリーの豊富な約７０ｋＤａのシャペロンであり、小胞体（ＥＲ）に常在し、とりわけ、分泌系の輸送を助け、タンパク質を折りたたむ働きをする。
【０００４】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、タンパク質の翻訳後プロセシングの際にジスルフィド結合の形成の触媒に関与する、ＥＲに常在するシャペロンタンパク質である。
【０００５】
天然タンパク質および外来タンパク質の双方の分泌の研究から、ＥＲからゴルジ体への輸送が律速段階であることが示されている。ＢｉＰと正常タンパク質の一時的会合、およびこれよりも安定な突然変異型またはミスフォールド型のタンパク質との相互作用を示す証拠がある。結果として、ＢｉＰは、フォールディング前駆体を可溶化し、さらには、折りたたみも組み立てもされていないタンパク質の輸送を防ぐという二重の役割を果たす可能性がある。Robinson and Wittrup, 1995, Biotechnol. Prog. 11, 171-177では、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)におけるＢｉＰ（Ｋａｒ２ｐ）およびＰＤＩタンパク質レベルに対する外来タンパク質の分泌の影響が調べられており、外来分泌タンパク質の長期にわたる構成的発現が、ウエスタン分析では検出できないレベルにまで可溶性ＢｉＰおよびＰＤＩを低下させることが見出されている。異種タンパク質分泌の結果としてのＥＲシャペロンおよびフォールダーゼレベルの低下は、酵母発現／分泌系を改良するために重要な意味を持っている。
【０００６】
シャペロンの発現は、折り畳み異常タンパク質応答（ＵＰＲ）をはじめとするいくつかのメカニズムによって調節される。
【０００７】
組換え技術を用いると、複数のＰＤＩ遺伝子コピーにより、宿主細胞におけるＰＤＩタンパク質レベルが増加することが示されている(Farquhar et al, 1991, Gene, 108, 81-89)。
【０００８】
ＰＤＩをコードしている遺伝子と異種ジスルフィド結合タンパク質をコードしている遺伝子の同時発現は、最初に、１９９３年１２月２３日公開のＷＯ９３／２５６７６において、異種タンパク質の産生を高める手段として示された。ＷＯ９３／２５６７６には、アンチスタシンとｔｉｃｋ抗凝固タンパク質の組換え発現がＰＤＩとの同時発現により増強可能であることが報告されている。
【０００９】
この戦略は、他のタンパク質種の組換え発現を増強するためにも用いられている。
【００１０】
Robinson et al, 1994, Bio/Technology, 12, 381-384には、サッカロミセス・セレビシエにおける付加的組換えＰＤＩ遺伝子コピーを用いて、ヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）Ｂホモ二量体の組換え発現を１０倍増強でき、また、シゾサッカロミセス・ポムベ(Schizosacharomyces pombe)の酸性ホスファターゼの組換え発現を４倍増強できたことが報告されている。
【００１１】
Hayano et al, 1995, FEBS Letters, 377, 505-511には、酵母におけるヒトリゾチームとＰＤＩの同時発現について記載されている。機能的リゾチームの産生および分泌に３０〜６０％前後の増強が見られた。
【００１２】
Shusta et al, 1998, Nature Biotechnology, 16, 773-777には、宿主細胞内でＰＤＩを過剰発現させることにより、サッカロミセス・セレビシエにおける単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）の組換え発現を２〜８倍増強できたことが報告されている。
【００１３】
Bao & Fukuhara, 2001, Gene, 272, 103-110には、酵母ＰＤＩ遺伝子の付加的組換えコピー（ＫｌＰＤＩ１）との同時発現により、酵母クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)における組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の発現および分泌を１５倍以上増強できたことが報告されている。
【００１４】
ＰＤＩ遺伝子と異種タンパク質の遺伝子を含む同時形質転換酵母を作出するために、ＷＯ９３／２５６７６には、この２つの遺伝子を染色体に組み込むことができるか；１つを染色体に組み込み、もう１つをプラスミド上に存在させることができるか；各遺伝子を異なるプラスミドに導入することができるか；または両遺伝子を同じプラスミドに導入することができることが教示されている。ＷＯ９３／２５６７６には、染色体に組み込まれたＰＤＩ遺伝子の付加的コピーを有する酵母のプラスミドｐＫＨ４α２からのアンチスタシンの発現（実施例１６および１７）；ＹＥｐ２４(Botstein et al, 1979, Gene, 8, 17-24)と呼ばれるマルチコピー酵母シャトルベクター上に存在している付加的なＰＤＩ遺伝子コピーを有するベクターＫ９９１からのアンチスタシンの発現（実施例２０）；およびそれぞれＧＡＬ１０およびＧＡＬ１プロモーターの制御下、酵母シャトルベクターｐＣ１／１(Rosenberg et al, 1984, Nature, 312, 77-80)からのアンチスタシンとＰＤＩ遺伝子の双方の発現が例示されている。実際に、Robinson and Wittrup, 1995（前掲）ではまた、エリスロポエチンを発現させるためにＧＡＬ１ｌ−ＧＡＬ１０遺伝子間領域が用いられ、異種タンパク質の分泌のための生産酵母株は、厳格な抑制および誘導プロモーターを用いて構築すべきであり、そうでなければ、大規模な発酵槽をいっぱいにするのに必要な多世代の細胞増殖の後には、持続的分泌の負の影響（すなわち、検出可能なＢｉＰおよびＰＤＩの低下）が優勢になる、と結論づけられている。
【００１５】
当技術分野の次なる研究では、組換えタンパク質生産を最大とするための鍵は導入遺伝子の染色体組込みであると認識された。
【００１６】
Robinson et al, 1994（前掲）では、付加的な染色体組込み型のＰＤＩ遺伝子コピーを用いることにより、ＰＤＧＦおよびＳ．ポムベ(S. pombe)酸性ホスファターゼの発現の増強が認められた。Robinsonは、マルチコピー２μｍ発現ベクターを用いてＰＤＩタンパク質レベルを増強させる試みが異種タンパク質分泌に悪影響を及ぼしたことを報告している。
【００１７】
Hayano et al, 1995（前掲）には、ヒトリゾチームおよびＰＤＩの遺伝子を、酵母の、各々別個の線状化組込みベクター上へ導入することにより、染色体組込みがもたらされることが記載されている。
【００１８】
Shusta et al, 1998, Nature Biotechnology, 16, 773-777には、サッカロミセス・セレビシエにおける単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）の組換え発現が記載されている。Shustaは、酵母系において、宿主染色体への導入遺伝子の組込みとエピソーム発現ベクターの使用との間の選択が分泌に大きな影響を及ぼし得ることを報告しており、Parekh & Wittrup, 1997, Biotechnol. Prog., 13, 117-122によれば、δ組込みベクターを用いた宿主染色体へのｓｃＦｖ遺伝子の安定組込みは、２μｍ系発現プラスミドを使用するよりも優れていた。Parelkh & Wittrup（前掲）は、これまでに、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）の発現が、２μｍ系発現プラスミドよりも、δ組込みベクターを用いることにより大幅に増強されたことを教示している。この２μｍ系発現プラスミドは、異種分泌タンパク質の産生に関しては逆効果であるとされていた。
【００１９】
Bao & Fukuhara, 2001（前掲）には、「ＫｌＰＤＩ１遺伝子は、ｒＨＳＡ発現カセットを有するマルチコピーベクターへ直接導入可能であると初めて考えられた。しかし、このような構築物は酵母の増殖とプラスミドの安定性に著しい影響を及ぼすことが分かった。これにより、マルチコピーベクター上のＫｌＰＤＩ１遺伝子がＫ．ラクチス細胞の増殖に有害なであったという我々のこれまでの知見が確認された(Bao et al, 2000)」と報告されている。 Bao et al, 2000, Yeast, 16, 329-341には、Bao & Fukuharaの前述の頁に述べたように、ＫｌＰＤＩ１遺伝子をＫ．ラクチスのマルチコピープラスミドｐＫａｎ７０７に導入したこと、そして、このプラスミドの存在がこの株に低い増殖をもたらしたことが報告されている。Bao et alは、ＫｌＰＤＩ１遺伝子の過剰発現がＫ．ラクチス細胞に有毒であったと結論づけている。これらのBao et alにおける初期の知見に鑑み、Bao & Fukuuharaは、宿主染色体上にＫｌＰＤＩ１の１回の重複を導入することを選択した。
【００２０】
こういったことを背景に、本発明者らは、驚くべきことに、先行技術による示唆に反して、シャペロンタンパク質および異種タンパク質の遺伝子を酵母の２μｍ系マルチコピープラスミド上で同時発現させると、異種タンパク質の産生が実質的に高まることを実証した。
【発明の開示】
【００２１】
本発明の第一の態様によれば、異種タンパク質を製造する方法が提供され、該方法は、
（ａ）シャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている遺伝子と、異種タンパク質をコードしている遺伝子とを含む２μｍ系プラスミドを含んでなる宿主細胞を準備すること；
（ｂ）該宿主細胞を、培養培地中、シャペロンタンパク質をコードしている遺伝子と、異種タンパク質をコードしている遺伝子の発現を可能とする条件下で培養すること；
（ｃ）発現した異種タンパク質を培養培地から精製すること；および
（ｄ）所望により、精製されたタンパク質を凍結乾燥すること
を含んでなる。
【００２２】
一つの実施態様では、工程（ｃ）において、発現した異種タンパク質を商業上許容されるレベルの純度または医薬上許容されるレベルの純度にまで精製する。
【００２３】
好ましくは、この方法は、精製された異種タンパク質を担体または希釈剤、例えば、医薬上許容される担体または希釈剤とともに製剤化する工程、および、所望により、製剤化されたタンパク質を単位投与形で提供する工程をさらに含んでなる。
【００２４】
本発明の第二の態様によれば、真菌（好ましくは、酵母）または脊椎動物の異種タンパク質をコードしている遺伝子とシャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている遺伝子とを同じ２μｍ系プラスミド上に提供することにより、前記異種タンパク質の生産を増強するための発現ベクターとしての、２μｍ系プラスミドの使用が提供される。
【００２５】
本発明の第三の態様によれば、シャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている遺伝子と異種タンパク質をコードしている遺伝子とを含んでなる２μｍ系プラスミド（このプラスミドが２μｍプラスミドに基づく場合には、それは非組込みベクターである）が提供される。
【００２６】
本発明の第四の態様によれば、上記で定義したプラスミドを含んでなる宿主細胞が提供される。
【００２７】
本発明は、組換え改変型の２μｍ系プラスミドに関する。
【００２８】
発芽酵母のある近縁種は天然の環状二本鎖ＤＮＡプラスミドを含むことが示されている。これらのプラスミドは２μｍ系プラスミドと総称され、チゴサッカロミセス・ルクシー(Zygosaccharomyces rouxii)（以前はチゴサッカロミセス・ビスポルス(Zygosaccharomyces bisporus) として分類されていた）由来のｐＳＲ１、ｐＳＢ３およびｐＳＢ４、チゴサッカロミセス・バイリー(Zygosaccharomyces bailii)由来のプラスミドｐＳＢ１およびｐＳＢ２、チゴサッカロミセス・フェルメンタチ(Zygosaccharomyces fermentati)由来のプラスミドｐＳＭ１、クルイベロミセス・ドロソフィラルム(Kluyveromyces drosphilarum)由来のプラスミドｐＫＤ１、ピキア・メンブラネファシエンス(Pichia membranaefaciens)由来の命名されていないプラスミド（以下「ｐＰＭ１」）、ならびにサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来の２μｍプラスミドおよび変異体（例えば、Ｓｃｐ１、Ｓｃｐ２およびＳｃｐ３）が挙げられる(Volkert, et al., 1989, Microbiological Reviews, 53, 299; Murray et al., 1988, J. Mol. Biol. 200, 601; Painting, et al., 1984, J. Applied Bacteriology, 56, 331)。
【００２９】
１つのプラスミドファミリーとして、これらの分子は、一般にプラスミドの反対側に２つの逆方向反復を有し、６ｋｂｐ前後（４７５７〜６６１５ｂｐの範囲）の類似の大きさ、３つのオープンリーディングフレーム（そのうちの１つは部位特異的レコンビナーゼ（ＦＬＰ）をコードしている）、および逆方向反復の１つの末端付近に位置する、複製起点（ｏｒｉ）としても知られる自立複製配列（ＡＲＳ）を有するという一連の共通の特徴を持っている(Futcher, 1988, Yeast, 4, 27; Murray et al., 前掲およびToh-e et al., 1986, Basic Life Sci. 40, 425)。はっきりとしたＤＮＡ配列の相同性は認められないが、それらの共有の分子構造およびオープンリーディングフレームの機能の保存はこれらのファミリーメンバー間の一般的な先祖伝来の連関を証明している。
【００３０】
上記の天然２μｍ系プラスミドはいずれも本発明において使用可能であるが、本発明は天然２μｍ系プラスミドの使用に限定されない。本発明の目的によれば、２μｍ系プラスミドは下記の通りとされる。
【００３１】
２μｍ系プラスミドは環状二本鎖ＤＮＡプラスミドである。これは一般に、組換え挿入された配列を除いて、３，０００〜１０，０００ｂｐ、好ましくは４，５００〜７，０００ｂｐといった小さなものである。
【００３２】
２μｍ系プラスミドは一般に、少なくとも３つのオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を含み、その各々はマルチコピープラスミドとしての２μｍ系プラスミドの安定な維持において機能を持つタンパク質をコードしている。この３つのＯＲＦによりコードされているタンパク質は、ＦＬＰ、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２と呼ばれている。２μｍ系プラスミドは、ＦＬＰ、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２をコードする３つ総てのＯＲＦを含んでない場合には、不足しているタンパク質をコードするＯＲＦが、別のプラスミド上か、または染色体組込みによりトランスで提供されなければならない。
【００３３】
「ＦＬＰ」タンパク質は、ＦＬＰにより認識される逆方向反復配列の間での部位特異的組換えを触媒することができるタンパク質である。これらの逆方向反復配列はＦＬＰ組換え標的（ＦＲＴ）部位と呼ばれ、各々、一般に、さらに大きな逆方向反復の一部として存在する（下記参照）。好ましいＦＬＰタンパク質は、プラスミドｐＳＲ１、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２、ｐＳＢ３、ｐＳＢ４、ｐＳＭ１、ｐＫＤ１、ｐＰＭ１、および、例えば、Volkert et al（前掲）、Murray et al（前掲）およびPainting et al（前掲）に記載の２μｍプラスミドの１つによりコードされているＦＬＰタンパク質の配列を含んでいる。これらのＦＬＰタンパク質の変異体および断片もまた本発明に含まれる。「断片」および「変異体」は、同じＦＲＴ配列の間の部位特異的組換えを触媒する天然タンパク質の能力を保持するものである。このような変異体および断片は通常、プラスミドｐＳＲ１、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２、ｐＳＢ３、ｐＳＭ１、ｐＫＤ１および２μｍプラスミドの１つによりコードされているＦＬＰタンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を有する。異なるＦＬＰタンパク質は異なるＦＲＴ配列特異性を有する可能性がある。典型的なＦＲＴ部位は逆方向反復配列によりフランキングされたコアヌクレオチド配列を含み得る。２μｍプラスミドでは、ＦＲＴコア配列は８ヌクレオチド長であり、フランキングしている逆方向反復配列は１３ヌクレオチド長である(Volkert et al, 前掲)。しかしながら、所定のＦＬＰタンパク質により認識されるＦＲＴ部位は、２μｍプラスミドＦＲＴ部位とは異なるものであり得る。
【００３４】
ＲＥＰ１およびＲＥＰ２は、細胞分裂の際のプラスミドコピーの分割に関与するタンパク質であり、また、ＦＬＰ発現の調節にも役割を果たし得る。異なる２μｍ系プラスミドに由来するＲＥＰ１タンパク質間で著しい配列の多様性が見られたが、異なる２μｍ系プラスミドに由来するＲＥＰ２タンパク質間では、アライメントが可能な配列はない。好ましいＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質は、プラスミドｐＳＲ１、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２、ｐＳＢ３、ｐＳＢ４、ｐＳＭ１、ｐＫＤ１、ｐＰＭ１、および、例えば、Volkert et al（前掲）、Murray et al（前掲）およびPinting et al（前掲）に記載の２μｍプラスミドの１つによりコードされているＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質の配列を含む。また、これらのＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質の変異体および断片も本発明に含まれる。ＲＥＰ１およびＲＥＰ２の「断片」および「変異体」は、天然ＯＲＦの代わりにプラスミドによってコードされている場合、好適な酵母集団内でプラスミドの安定なマルチコピー維持を実質的に妨げないものである。このようなＲＥＰ１およびＲＥＰ２の変異体および断片は通常、プラスミドｐＳＲ１、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２、ｐＳＢ３、ｐＳＢ４、ｐＳＭ１、ｐＫＤ１、ｐＰＭ１および２μｍプラスミドの１つによりコードされているＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質と、それぞれ、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を有する。
【００３５】
プラスミド上のＯＲＦによりコードされているＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質は適合するものでなければならない。ＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質は、ｐＳＲ１、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２、ｐＳＢ３、ｐＳＢ４、ｐＳＭ１、ｐＫＤ１、ｐＰＭ１および２μｍプラスミドなど、同じ天然の２μｍ系プラスミドによりコードされているＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質、またはその変異体もしくは断片の配列を有するのが好ましい。
【００３６】
２μｍ系プラスミドは、一般に２つの逆方向反復配列を含む。これらの逆方向反復は、それらが各々ＦＲＴ部位（上記参照）を含んでいる限り、どんな大きさであってもよい。これらの逆方向反復は  一般に相同性が高い。それらは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上の配列同一性を持ち得る。好ましい実施態様では、それらは同一である。一般に、これらの逆方向反復は各々２００〜１０００ｂｐの長さである。好ましい逆方向反復配列は、各々、２００〜３００ｂｐ、３００〜４００ｂｐ、４００〜５００ｂｐ、５００〜６００ｂｐ、６００〜７００ｂｐ、７００〜８００ｂｐ、８００〜９００ｂｐ、または９００〜１０００ｂｐの長さを持ち得る。特に好ましい逆方向反復は、プラスミドｐＳＲ１（９５９ｂｐ）、ｐＳＢ１（６７５ｂｐ）、ｐＳＢ２（４７７ｂｐ）、ｐＳＢ３（３９１ｂｐ）、ｐＳＭ１（３５２ｂｐ）、ｐＫＤ１（３４６ｂｐ）、２μｍプラスミド（５９９ｂｐ）、ｐＳＢ４およびｐＰＭ１のものである。
【００３７】
逆方向反復の配列は可変である。しかしながら、各逆方向反復のＦＲＴ部位の配列は、プラスミドによりコードされているＦＬＰタンパク質の特異性と適合し、それにより、コードされているＦＬＰタンパク質がプラスミドの逆方向反復配列間の部位特異的組換えを触媒する働きをすることができるものでなければならない。逆方向反復配列の組換え（つまり、ＦＬＰタンパク質が、そのプラスミドでＦＲＴ部位を認識する能力）は、当技術分野で公知の方法によって判定することができる。例えば、ＦＬＰの発現に有利な条件下の酵母細胞内のプラスミドを、プラスミドのある領域の別の領域に対する方向の変化によってもたらされる該プラスミドの制限プロフィールの変化に関してアッセイすることができる。制限プロフィールの変化の検出は、そのＦＬＰタンパク質がプラスミドのＦＲＴ部位を認識できること、従って、各逆方向反復のＦＲＴ部位がプラスミドによりコードされているＦＬＰタンパク質の特異性と適合することを示す。
【００３８】
特に好ましい実施態様では、ＦＲＴ部位をはじめとする、逆方向反復配列は、ｐＳＲ１、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２、ｐＳＢ３、ｐＳＢ４、ｐＳＭ１、ｐＫＤ１、ｐＰＭ１または２μｍプラスミドなどの、ＦＬＰタンパク質をコードするＯＲＦと同じ２μｍ系プラスミドに由来するものである。
【００３９】
これらの逆方向反復は一般に、逆方向反復間に定義された２領域（例えば、２μｍプラスミドのＵＬおよびＵＳとして定義されるもの）が、導入遺伝子などの外から導入される配列を除いてほぼ同じ大きさとなるように２μｍ系プラスミド内に配置する。例えば、この２領域の一方は、他方の領域の長さの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上、１００％までに相当する長さであり得る。
【００４０】
２μｍ系プラスミドは、一般に、ＦＬＰをコードするＯＲＦと一方の逆方向反復（次の段落で述べる他の逆方向反復と区別するために、本明細書では「ＩＲ１」と呼ぶ）とを、例えば２μｍプラスミドに見られるような介在コード配列なしで、ＦＬＰ  ＯＲＦの遠位末端にＩＲ１が来るように並列して含む。ここで「遠位末端」とは、プロモーターが転写を開始する末端とは反対側のＦＬＰ  ＯＲＦ末端を意味する。好ましい実施態様では、ＦＬＰ  ＯＲＦの遠位末端はＩＲ１と重複する。
【００４１】
２μｍ系プラスミドは、一般に、ＲＥＰ２をコードするＯＲＦと他方の逆方向反復（前の段落で述べたＩＲ１と区別するために、本明細書では「ＩＲ２」と呼ぶ）とを、例えば２μｍプラスミドに見られるような介在コード配列なしで、ＲＥＰ２  ＯＲＦの遠位末端にＩＲ２が来るように並列して含む。ここで「遠位末端」とは、プロモーターがその転写を開始する末端とは反対側のＲＥＰ２  ＯＲＦ末端を意味する。
【００４２】
一つの実施態様では、このＲＥＰ２およびＦＬＰをコードするＯＲＦは、２μｍ系プラスミドの逆方向反復間で定義された２領域のうち同じ領域に存在してもよく、この領域は大きい方の領域であっても小さい方の領域であってもよい（２領域の大きさが不等である場合）。
【００４３】
一つの実施態様では、このＲＥＰ２およびＦＬＰをコードするＯＲＦは互いに異なるプロモーターから転写され得る。
【００４４】
一般に、２μｍ系プラスミドの逆方向反復間に定義された領域（例えば、２μｍプラスミドのＵＬおよびＵＳとして定義されるもの）は、マルチコピープラスミドとして２μｍ系プラスミドの安定な維持において機能を果たすタンパク質をコードする多くとも２つの内因性遺伝子を含み得る。よって、好ましい実施態様では、逆方向反復に定義されたプラスミドの一方の領域は、内因性コード配列として、多くともＦＬＰとＲＥＰ２；ＦＬＰとＲＥＰ１；またはＲＥＰ１とＲＥＰ２をコードするＯＲＦを含み得る。
【００４５】
２μｍ系プラスミドは、一般に、複製起点（自立複製配列「ＡＲＳ」としても知られる）を含み、これは一般に双方向性である。適当なＡＲＳ配列のいずれが存在してもよい。酵母染色体複製起点に典型的なコンセンサス配列が適当であり得る(Broach et al, 1982, Cold Spning Harbor Symp. Quant. Biol., 47, 1165-1174; Williamson, Yeast, 1985, 1, 1-14)。好ましいＡＲＳとしては、ｐＳＲ１、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２，ｐＳＢ３、ｐＳＢ４、ｐＳＭ１、ｐＫＤ１、ｐＰＭ１および２μｍプラスミドから単離されたものが挙げられる。
【００４６】
よって、好ましい２μｍ系プラスミドは、ＦＬＰ、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２をコードしているＯＲＦ、２つの逆方向反復配列（各々、コードされているＦＬＰタンパク質に適合するＦＲＴ部位を含む逆方向反復）、およびＡＲＳ配列を含み得る。好ましくは、ＦＲＴ部位は、コードされているＦＬＰタンパク質の配列と同じ２μｍ系プラスミドに由来するものとされる。より好ましくは、コードされているＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質の配列は、互いに同じ２μｍ系プラスミドに由来するものとされる。さらに好ましくは、ＦＲＴ部位は、コードされているＦＬＰ、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質の配列と同じ２μｍ系プラスミドに由来するものとされる。さらに好ましくは、ＦＬＰ、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２をコードしているＯＲＦの配列ならびに逆方向反復の配列（ＦＲＴ部位を含む）は同じ２μｍ系プラスミドに由来するものとされる。さらに好ましくは、ＡＲＳ部位は、ＦＬＰ、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２のＯＲＦの１以上のもの、ならびに逆方向反復の配列（ＦＲＴ部位を含む）と同じ２μｍ系プラスミドに由来するものとされる。
【００４７】
「〜に由来する」とは、それらが由来する配列と同一の配列を有する配列を含む。しかしながら、上記で定義したように、その変異体および断片も含まれる。例えば、２μｍプラスミドのＦＬＰ遺伝子に由来する配列を有するＦＬＰ遺伝子は、改変型プロモーターまたは天然遺伝子のものに匹敵する他の調節配列を有してもよい。
【００４８】
それに加えて、またはその代わりに、２μｍプラスミドのＦＬＰ遺伝子に由来する配列を有するＦＬＰ遺伝子は、天然遺伝子と同じタンパク質をコードし得るか、または改変ＦＬＰタンパク質をコードし得るオープンリーディングフレーム内に、改変されたヌクレオチド配列を有していてもよい。同じ考え方が、特定の供給源に由来する配列を有する２μｍ系プラスミド上の他の配列にも当てはまる。
【００４９】
場合によっては、２μｍ系プラスミドは、Volkert et al（前掲）に記載のような２μｍプラスミドのＳＴＢ領域（ＲＥＰＳとしても知られる）に相当する領域を含み得る。本発明による２μｍ系プラスミドにおけるこのＳＴＢ領域は、２以上の、例えば、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のタンデム反復配列を含み得る。あるいは、タンデム反復配列は存在しなくてもよい。これらのタンデム反復はどんな大きさでもよく、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｂｐまたはそれ以上の長さである。２μｍプラスミドのＳＴＢ領域におけるタンデム反復は６２ｂｐの長さである。タンデム反復の配列は必ずしも同じでなくてもよい。若干の配列バリエーションは許容される。ＲＥＰ１およびＲＥＰ２  ＯＲＦのいずれかまたは双方と同じプラスミド由来のＳＴＢ領域を選択するのが好ましい場合がある。ＳＴＢ領域はシス作用エレメントであると考えられ、好ましくは転写されない。
【００５０】
場合によっては、２μｍ系プラスミドは、マルチコピープラスミドとしての２μｍ系プラスミドの安定な維持において機能を果たすタンパク質をコードする付加的ＯＲＦを含んでもよい。この付加的タンパク質はＲＡＦまたはＤと呼ばれる。ＲＡＦまたはＤ遺伝子をコードするＯＲＦは、例えば、２μｍプラスミドおよびｐＳＭ１に見られる。よって、ＲＡＦまたはＤ  ＯＲＦは、２μｍプラスミドまたはｐＳＭ１によりコードされているＲＡＦまたはＤ遺伝子ＯＲＦのタンパク質産物、またはその変異体および断片をコードするのに好適な配列を含み得る。よって、２μｍプラスミドまたはｐＳＭ１のＲＡＦまたはＤ遺伝子のタンパク質産物の変異体および断片もまた本発明に含まれる。２μｍプラスミドまたはｐＳＭ１のＲＡＦまたはＤ遺伝子のタンパク質産物の「断片」および「変異体」は、天然ＯＲＦの代わりに２μｍプラスミドまたはｐＳＭ１によりコードされていても、好適な酵母集団内でのプラスミドの安定なマルチコピー維持を妨げないものである。このような変異体および断片は、通常、２μｍプラスミドまたはｐＳＭ１によりコードされているＲＡＦまたはＤ遺伝子ＯＲＦのタンパク質産物と少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を有する。
【００５１】
天然２μｍ系プラスミドが好ましいこともある。天然２μｍ系プラスミドは、上記で定義した特徴を有するいずれのプラスミドであってもよく、このプラスミドは酵母に天然に存在することが分かっており、すなわち、異種配列を含むよう組換え改変されていない。好ましくは、天然２μｍ系プラスミドは、チゴサッカロミセス・ルクシーから得られるようなｐＳＲ１（受託番号Ｘ０２３９８）、ｐＳＢ３（受託番号Ｘ０２６０８）またはｐＳＢ４、双方ともチゴサッカロミセス・バイリーから得られるようなｐＳＢ１またはｐＳＢ２（受託番号ＮＣ＿００２０５５またはＭ１８２７４）、チゴサッカロミセス・フェルメンタチから得られるようなｐＳＭ１（受託番号ＮＣ＿００２０５４）、クルイベロミセス・ドロソフィラルムから得られるようなｐＫＤ１（受託番号Ｘ０３９６１）、ピキア・メンブラネファシエンス由来のｐＰＭ１、または最も好ましくは、サッカロミセス・セレビシエから得られるような２μｍプラスミド（受託番号ＮＣ＿００１３９８またはＪ０１３４７）から選択される。この段落の受託番号はＮＣＢＩ寄託物を参照したものである。
【００５２】
２μｍプラスミド（図１）は、ほとんどのサッカロミセス・セレビシエ株に半数性ゲノム当たり６０〜１００コピーで内在する６，３１８ｂｐの二本鎖ＤＮＡプラスミドである。この２μｍプラスミドは、２つの５９９ｂｐ逆方向反復配列によって隔てられたスモールユニーク（ＵＳ）領域とラージユニーク（ＵＬ）領域を含む。この逆方向反復配列の部位特異的組換えの結果、in vivoにおいてこのプラスミドのＡ型およびＢ型の間で相互変換が生じる(Volkert & Broach, 1986, Cell, 46, 541)。２μｍのこの２つの形態は、それらのユニーク領域の相対的方向だけが異なる。
【００５３】
サッカロミセス・セレビシエからクローニングした２μｍプラスミド（Ｓｃｐ１としても知られる）のＤＮＡ配列決定から６，３１８ｂｐの大きさが得られたが(Hartley and Donelson, 1980, Nature, 286, 860)、ＳＴＢとして知られる領域における、それぞれ１２５ｂｐおよび２２０ｂｐの小さな欠失の結果として、他の若干小さい２μｍの変異体Ｓｃｐ２およびＳｃｐ３が存在することが知られている(Cameron et al., 1977, Nucl. Acids Res., 4, 1429; Kikuchi, 1983, Cell, 35, 487およびLivingston & Hahne, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3727)。世界中の天然サッカロミセス株の８０％についてのある研究では、２μｍと相同なＤＮＡを含んでいた（サザンブロット解析による）(Hollenberg, 1982, Current Topics in Microbiology and Immunobiology, 96, 119)。さらにまた、Ｓ．セレビシエおよびＳ．カルルスベルゲネシスに見られる天然の２μｍプラスミド集団内にはバリエーション（遺伝多型）が存在し、ＮＣＢＩ配列（受託番号ＮＣ＿００１３９８）がその一例である。
【００５４】
２μｍプラスミドは核局在性を有し、高レベルの有糸分裂安定性を示す(Mead et al, 1986, Molecular & General Genetics, 205, 417)。２μｍプラスミドの遺伝安定性はプラスミドによりコードされているコピー数の増幅および分割機構に起因するものであり、これはキメラベクターの開発の際に簡単に損なわれる(Futcher & Cox, 1984, J. Bacteriol., 157, 283; Bachmair & Ruis, 1984, Monatshefte fur Chemie, 115, 1229)。２μｍプラスミドを含む酵母株は［ｃｉｒ＋］として知られ、一方、２μｍプラスミドを含まない酵母株は［ｃｉｒ０］として知られる。
【００５５】
２μｍプラスミドのＵＳ領域はＲＥＰ２およびＦＬＰ遺伝子を含み、ＵＬ領域はＲＥＰ１およびＤ（ＲＡＦとしても知られる）遺伝子、ＳＴＢ遺伝子座および複製起点を含む(Broach & Hicks, 1980, Cell, 21, 501; Sutton & Broach, 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 2770)。Ｆｌｐレコンビナーゼは、逆方向反復内のＦＲＴ部位（Ｆｌｐ認識標的）と結合し、部位特異的組換えを媒介するが、これはin vivoにおける天然プラスミド増幅とプラスミドコピー数の制御に不可欠なものである(Senecoff et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 82, 7270; Jayaram, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A., 82, 5875)。２μｍ系プラスミドのコピー数は、Ｆｌｐレコンビナーゼ活性の変化によって有意に影響を受け得る(Sleep et al, 2001, Yeast, 18, 403; Rose & Broach, 1990, Methods Enzymol., 185, 234)。Ｒｅｐ１およびＲｅｐ２タンパク質はプラスミドの分離を媒介するが、それらの作用様式は明らかでない(Sengupta et al, 2001, J. Bacteriol., 183, 2306)。それらはまた、ＦＬＰ遺伝子の転写を抑制する(Reynolds et al, 1987, Mol. Cell. Biol., 7, 3566)。
【００５６】
２μｍプラスミドのＦＬＰおよびＲＥＰ２遺伝子は互いに異なるプロモーターから転写され、それらの間で介在配列は明らかに定義されていない。ＦＬＰおよびＲＥＰ２転写物は両者とも、それらの翻訳終結コドンの後のそれぞれ２４ｂｐおよび１７８ｂｐにおいて、逆方向反復配列内の同じ配列モチーフで終わる(Sutton & Broach, 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 2770)。
【００５７】
ＦＬＰの場合、Ｃ末端コード配列もまた逆方向反復配列内にある。さらに、この２つの逆方向反復配列は５９９ｂｐにわたって高度に保存されており、この特徴はin vivoにおいて効率的なプラスミド複製および増幅に有利であると考えられるが、in vitro部位特異的組換えに不可欠なのはＦＲＴ部位（６５ｂｐ未満）のみである(Senecoff et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 7270; Jayaram, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 5875; Meyer-Leon et al, 1984, Cold Spring Harbor Symposia On Quantitative Biology, 49, 797)。Ｆｌｐの重要な触媒残基はアルギニン−３０８とチロシン−３４３（必須）であり、鎖の切断はヒスチジン−３０９およびヒスチジン−３４５により容易となる(Prasad et al, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 2189; Chen et al, 1992, Cell, 69, 647; Grainge et al, 2001, J MoL BioL, 314, 717)。
【００５８】
Ｒｅｐ２については２つの機能的ドメインが報告されている。残基１５〜５８はＲｅｐ１結合ドメインを形成し、残基５９〜２９６は自己会合およびＳＴＢ結合領域を含む(Sengupta et al, 2001, J. Bacteriol., 183, 2306)。
【００５９】
２μｍプラスミドの必須の機能的領域の多くを欠損しているが、機能的なシスエレメントＡＲＳおよびＳＴＢを保持している２μｍのキメラまたは欠失の大きな変異誘導体は、細胞分裂時に母細胞と娘細胞との間で有効な分割ができない。このようなプラスミドは、これらの機能が、例えば宿主内に機能的２μｍプラスミドを提供することによりトランスで提供されれば有効に分割しうる（いわゆる、［ｃｉｒ＋］宿主）。
【００６０】
目的の遺伝子はこれまで、２μｍプラスミドのＵＬ領域に挿入されてきた。例えば、ＥＰ０２８６４２４のプラスミドｐＳＡＣ３Ｕ１、および図２に示す、β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性のため）、ＬＥＵ２選択マーカーおよびオリゴヌクレオチドリンカー（最後の２つのものは２μｍ様非組込みベクターｐＳＡＣ３（ＥＰ０２８６４２４参照）のＵＬ領域内のユニークなＳｎａＢＩ部位に挿入されている）を含むプラスミドを参照。酵母に形質転換した後、図２に示すプラスミドから、ＸｂａＩ部位間の、アンピシリン耐性遺伝子を含む大腸菌ＤＮＡが欠失される。このことはChinery & Hinchliffe, 1989, Curr. Genet, 16, 21およびＥＰ０２８６４２４に記載されており、これらのタイプのベクターは「非組込みベクター」と呼ばれる。リンカー内のＮｏｔＩ部位でさらなるポリヌクレオチド挿入を行うこともできる(Sleep et al, 1991, Biotechnology (NY), 9,183)。
【００６１】
２μｍプラスミドにおける別の挿入部位も当技術分野で公知であり、Rose & Broach (1990, Methods Enzymol., 185, 234-279)に記載されているもの、例えば、ＦＬＰのＥｃｏＲＩにおける挿入を用いるプラスミドｐＣＶ１９、ｐＣＶ２０、ＣＶｎｅｏ；ＤのＥｃｏＲＩを挿入部位として用いるプラスミドｐＣＶ２１、ｐＧＴ４１およびｐＹＥ；ＤのＰｓｔＩを挿入部位として用いるプラスミドｐＨＫＢ５２；ＤのＰｓｔＩおよびＤのＥｃｏＲＩにおける挿入を用いるプラスミドｐＪＤＢ２４８；ＤのＰｓｔＩおよびＦＬＰのＥｃｏＲＩを挿入部位として用いるプラスミドｐＪＤＢ２１９；プラスミドＧ１８；ＦＬＰのＣｌａＩにおける挿入を用いるプラスミドｐＡＢ１８；プラスミドｐＧＴ３９およびｐＡ３；ＤのＰｓｔＩを挿入部位として用いるプラスミドｐＹＴ１１、ｐＹＴ１４およびｐＹＴ１１−ＬＥＵ；ならびにＦＬＰのＥｃｏＲＩを挿入部位として用いるプラスミドＰＴＹ３９が挙げられる。
【００６２】
他の２μｍプラスミドとしては、ｐＳＡＣ３、ｐＳＡＣ３Ｕ１、ｐＳＡＣ３Ｕ２、ｐＳＡＣ３００、ｐＳＡＣ３１０、ｐＳＡＣ３Ｃ１、ｐＳＡＣ３ＰＬ１、ｐＳＡＣ３ＳＬ４、およびｐＳＡＣ３ＳＣ１が挙げられ、ＥＰ０２８６４２４およびChinery & Hinchliffe (1989, Curr, Genet., 16, 21-25)に記載されており、これにはまた適当な２μｍ挿入部位としてＰｓｔＩ、ＥａｇＩまたはＳｎａＢＩが記載されている。２μｍプラスミドとしては、さらに、ｐＡＹＥ２５５、ｐＡＹＥ３１６、ｐＡＹＥ４４３、ｐＡＹＥ５２２(Kerry-Williams et al, 1998, Yeast, 14, 161-169)、ｐＤＢ２２４４（ＷＯ００／４４７７２）およびｐＡＹＥ３２９(Sleep et al, 2001, Yeast, 18, 403-421)が挙げられる。
【００６３】
１つの好ましい実施態様では、１以上の遺伝子が、２μｍ系プラスミドのＡＲＳ配列の前後の非転写領域内へ挿入される。例えば、Ｓ．セレビシエから得られる２μｍプラスミドでは、このＡＲＳ配列前後の非転写領域はＤ遺伝子の末端からＡＲＳ配列の開始部にまで及ぶ。ＳｎａＢＩ（配列ＡＲＳの複製起点付近）への挿入はChinery & Hinchliffe, 1989, Curr. Genet., 16, 21-25に記載されている。当業者ならば、Chinery & Hinchliffeにより記載されている非転写領域内のＳｎａＢＩ部位付近の位置にも遺伝子挿入を行えることが分かるであろう。
【００６４】
もう１つの好ましい実施態様では、２μｍ系プラスミド内のＲＥＰ２およびＦＬＰ遺伝子は各々、それらに隣接する逆方向反復を有し、２μｍ系プラスミドの、ＲＥＰ２遺伝子またはＦＬＰ遺伝子のいずれかの最後の機能的コドンの１つ後の塩基と、該遺伝子に隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間の領域に１以上の遺伝子が挿入される。ＲＥＰ２遺伝子またはＦＬＰ遺伝子のいずれかの最後の機能的コドンとは、そのコドンを停止コドンで置換すると、プラスミドのマルチコピー安定性に許容されない低下が起こるという遺伝子のプロモーターから最下流にある遺伝子のオープンリーディングフレームのコドンである。従って、ポリヌクレオチド配列挿入、欠失または置換による、いずれかの遺伝子の最後の機能的コドンの下流にあるいずれかの点でのＲＥＰ２またはＦＬＰ遺伝子の分断は、プラスミドのマルチコピー安定性に許容されない低下をもたらすことはない。
【００６５】
例えば、２μｍプラスミドのＲＥＰ２遺伝子はコドン５９の後で分断可能であり、２μｍプラスミドのＦＬＰ遺伝子はコドン３４４の後で分断可能であり、各々、プラスミドのマルチコピー安定性を低下させない。他の２μｍ系プラスミド内の等価遺伝子の最後の機能的コドンは、通常、ＦＬＰまたはＲＥＰ２遺伝子のいずれかにおいてプラスミド突然変異を作出した後、本明細書に示されている試験により、そのプラスミドがマルチコピー安定性を保持しているかどうかを判定することで判定することができる。
【００６６】
プラスミドがマルチコピー安定性を保持しているかどうかは、Chinery & Hinchliffe (1989, Cuir. Genet., 16, 21-25)で定義されるような試験を用いて判定することができる。Chinery & Hinchliffe (1989, Curr. Geneet., 16, 21-25)で定義されている非選択培地（ＹＰＤ、ＹＥＰＤとも呼ばれる）で増殖しない酵母には、他の非選択培地を用いてもよい。プラスミドの安定性は、所定の世代数の後の、選択マーカーに対して原栄養性を残している細胞のパーセンテージとして定義することができる。世代数は好ましくは、ｐＳＡＣ３５またはｐＳＡＣ３１０などの対照プラスミドとの違いを示すのに十分なものであるか、またはこのような対照プラスミドに匹敵する安定性を示すのに十分なものである。世代数は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上であってよい。世代数は多いほうが好ましい。許容されるプラスミド安定性は１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または実質的に１００％とすることができる。パーセンテージが高いほうが好ましい。当業者ならば、プラスミドが非選択培地で増殖させた際に１００％に満たない安定性を有するとしても、選択培地で培養する場合には有用であることが分かるであろう。例えば実施例に記載されているプラスミドｐＤＢ２７１１は、実施例１に従って安定性を判定した場合には１０％に過ぎなかったが、選択増殖条件下での振盪フラスコ培養では組換えトランスフェリン生産性に１５倍の増強をもたらす。
【００６７】
従って、ＲＥＰ２遺伝子の最後の機能的コドンの１つ後の塩基と該遺伝子に隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間、より好ましくは逆方向反復の最初の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間、さらに好ましくはＲＥＰ２遺伝子の翻訳終結コドンの後、ＦＲＴ部位の１つ前の塩基までの位置で１以上の遺伝子挿入を行うことができる。
【００６８】
それに加えて、またはその代わりに、ＦＬＰ遺伝子の最後の機能的コドンの１つ後の塩基と該遺伝子に隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間、好ましくは逆方向反復の最初の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間、より好ましくはＦＬＰコード配列の末端の１つ後の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間、例えば、ＦＬＰコード配列の終末端の１つ後の塩基で１以上の遺伝子挿入を行うことができる。
【００６９】
１つの好ましい実施態様では、２μｍ系プラスミドがＳ．セレビシエの２μｍプラスミドに基づく場合、それは当技術分野で公知のような（例えば、その内容が引用することにより本明細書の一部とされるＥＰ２８６４２４参照）非組込みベクターである。非組込みベクターは、組換えによる欠失を意図したＤＮＡ配列、３つの２μｍＦＲＴ部位（その１対の部位が正方向であり、他の２対が逆方向である）および目的のＤＮＡ配列（大腸菌複製起点および細菌選択マーカーなど）を含む２μｍプラスミドベクターであってよく、消失を意図するこの配列は、正方向の上記部位の間に位置する。
【００７０】
従って、この欠失される配列は、選択マーカーＤＮＡ配列を含むことができる。
【００７１】
好ましい非組込みベクターは、（ｉ）細菌宿主内でのベクターの増殖に必要な細菌プラスミドＤＮＡ配列；（ii）余分な２μｍＦＲＴ部位；および酵母の形質転換のための選択マーカーＤＮＡ配列をさらに有する完全な２μｍプラスミドを含み、２μｍプラスミドの２つの逆方向反復配列の１つにある制限部位、例えばＸｂａＩに、上記細菌プラスミドＤＮＡ配列が存在し、余分なＦＲＴ部位が作出され、この余分なＦＲＴ部位は上記の反復配列の１つの内在的ＦＲＴ部位に対して正方向にあり、この細菌プラスミドＤＮＡ配列は、余分なＦＲＴ部位と上記の反復配列の１つの内在的ＦＲＴ部位の間に挟み込まれている。好ましい非組込みベクターでは、細菌プラスミドＤＮＡ配列は総て上記のように挟み込まれている。特に好ましい２μｍプラスミドベクターは、実質的に、ＥＰ２８６４２４に示されているようなｐＳＡＣ３の配置を有している。
【００７２】
本明細書において「非組込みベクター」はまた、その内容が引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第６，４５１，５５９号に定義されているようなプラスミドを含む。従って、非組込みベクターは、非酵母ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列以外に、細菌（特に、大腸菌）複製起点を含まない、またはより好ましくは、細菌（特に、大腸菌）配列を含まない２μｍベクターであってよく、好ましくは、非酵母ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列以外の、該ベクター中の総てのＤＮＡは酵母由来のＤＮＡである。
【００７３】
本明細書において「シャペロン」とは、別のタンパク質の不安定な立体配座異性体と結合して安定化させ、そして、結合と遊離の制御により、in vivoでのその適切な運命、すなわち、フォールディング、オリゴマーアセンブリ、特定の細胞内コンパートメントへの輸送、または分解による除去を助長する。よって、シャペロンはまた、タンパク質フォールディングに関与するか、またはシャペロン活性を有するか、または折り畳み異常タンパク質応答に関与するタンパク質でもある。この種のシャペロンタンパク質は当技術分野で公知であり、例えば、スタンフォードゲノムデータベース（ＳＧＤ）、http:://db.yeastgenome.org）において公知となっている。好ましいシャペロンは真核生物シャペロンであり、特に好ましいシャペロンは酵母シャペロンであり、ＡＨＡ１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５、ＣＣＴ６、ＣＣＴ７、ＣＣＴ８、ＣＮＳ１、ＣＰＲ３、ＣＰＲ６、ＥＲＯ１、ＥＵＧ１、ＦＭＯ１、ＨＣＨ１、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ３０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ８２、ＪＥＭ１、ＭＤＪ１、ＭＤＪ２、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＰＤＩ１、ＰＦＤ１、ＡＢＣ１、ＡＰＪ１、ＡＴＰ１１、ＡＴＰ１２、ＢＴＴ１、ＣＤＣ３７、ＣＰＲ７、ＨＳＣ８２、ＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ１１、ＮＯＢ１、ＥＣＭ１０、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、ＳＳＥ２、ＳＩＬ１、ＳＬＳ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、ＰＥＲ１、ＰＴＣ２、ＰＳＥ１、ＵＢ１４およびＨＡＣ１または末端切断型イントロンレスＨＡＣ１(Valkonen et al. 2003, Applied Environ. Micro. 69, 2065)が挙げられる。
【００７４】
本発明の実施において有用なシャペロンとしては次のものが挙げられる。
・熱ショックタンパク質、例えば、ｈｓｐ７０ファミリータンパク質のメンバーであるタンパク質（Ｋａｒ２ｐ、ＳＳＡおよびＳＳＢタンパク質、例えば、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＢ１およびＳＳＢ２タンパク質によりコードされているタンパク質を含む）、ＨＳＰ９０ファミリーのメンバーであるタンパク質、またはＨＳＰ４０ファミリーのメンバーであるタンパク質もしくはそれらの調節に関与するタンパク質（例えば、Ｓｉｌｌｐ）（ＤＮＡ−ＪおよびＤＮＡ−Ｊ様タンパク質（例えば、Ｊｅｍ１ｐ、Ｍｄｊ２ｐを含む）。
・カリオフェリン／インポーチンファミリータンパク質のメンバーであるタンパク質、例えば、カリオフェリン／インポーチンタンパク質のαまたはＢファミリー、例えば、ＰＳＥ１によりコードされているカリオフェリンβタンパク質。
・Hjelmqvist et al, 2002, Genome Biology, 3(6), research0027.1-0027.16が記載しているＯＲＭＤＬファミリーのメンバーであるタンパク質、例えばＯｒｍ２ｐ。
・小胞体または分泌経路の他所、例えばゴルジ体に本来存在するタンパク質。例えば、小胞体（ＥＲ）の管腔、特にＰＤＩなどの分泌細胞で本来働くタンパク質。
・ＥＲに固定されているトランスメンブランタンパク質であるタンパク質、例えば、Hjelmqvist et al, 2002, 前掲が記載しているＯＲＭＤＬファミリーのメンバー（例えば、Ｏｒｍ２ｐ）。
・サイトゾルで働くタンパク質、例えば、ｈｓｐ７０タンパク質（ＳＳＡおよびＳＳＢタンパク質、例えば、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＢ１およびＳＳＢ２タンパク質産物を含む）。
・核、核エンベロープおよび／または細胞質で働くタンパク質、例えば、Ｐｓｅ１ｐ。
・細胞の生存力に必須のタンパク質、例えば、ＰＤＩまたは必須カリオフェリンタンパク質、例えば、Ｐｓｅ１ｐ。
・スルヒドリル酸化またはジスルフィド結合の形成、切断または異性化に関与するタンパク質、または特に分離タンパク質および細胞表面タンパク質の生合成中にタンパク質のチオール：ジスルフィド交換反応を触媒するタンパク質、例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（例えば、Ｐｄｉ１ｐ、Ｍｐｄ１ｐ）、ホモログ（例えば、Ｅｕｇ１ｐ）および／または関連タンパク質（例えば、Ｍｐｄ２ｐ、Ｆｍｏ１ｐ、Ｅｒｏ１ｐ）。
・タンパク質合成、アセンブリまたはフォールディングに関与するタンパク質、例えば、ＰＤＩおよびＳｓａ１ｐ。
・成熟タンパク質よりも折り畳まれていないタンパク質に優先的または排他的に結合するタンパク質、例えば、ｈｓｐ７０タンパク質（ＳＳＡおよびＳＳＢタンパク質、例えば、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＢ１およびＳＳＢ２によりコードされているタンパク質）。
・サイトゾルにおいて前駆体タンパク質の凝集を防ぐタンパク質、例えば、ｈｓｐ７０タンパク質（ＳＳＡおよびＳＳＢタンパク質、例えば、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＢ１およびＳＳＢ２によりコードされているタンパク質）。
・損傷したタンパク質に結合して安定化させるタンパク質、例えば、Ｓｓａ１ｐ。
・折り畳み異常タンパク質応答に関与するか、または折り畳み異常タンパク質応答を誘導する薬剤（例えば、ツニカマイシンおよびジチオトレイトール）に対する耐性の増強をもたらすタンパク質、例えば、Hjelmqvist et al, 2002, 前掲が記載しているＯＲＭＤＬファミリーの（例えば、Ｏｒｍ２ｐ）またはストレス応答に関与する（例えば、Ｕｂｉ４ｐ）。
・コシャペロンであるタンパク質、ならびに／または  タンパク質フォールディングおよび／もしくは折り畳み異常タンパク質応答に間接的に関与するタンパク質（例えば、ｈｓｐ１０４ｐ、Ｍｄｊ１ｐ）。
・巨大分子の核−細胞質間輸送に関与するタンパク質、例えば、Ｐｓｅ１ｐ。
・核局在配列と核輸出配列を認識し、核膜孔複合体と相互作用することにより、核膜を通過する巨大分子の輸送を媒介するタンパク質、例えば、Ｐｓｅ１ｐ。
・ＥＰ０７４６６１１およびHillson et al, 1984, Methods Enzymol., 107, 281-292に記載されているようなスクランブルリボヌクレアーゼのＤＮＡに対してリボヌクレアーゼ活性を復活させ得るタンパク質、例えば、ＰＤＩ。
・酸性ｐＩ（例えば、４．０〜４．５）を有するタンパク質、例えば、ＰＤＩ；
・Ｈｓｐ７０ファミリーのメンバーであり、好ましくは、Ｎ末端ＡＴＰ結合ドメインとＣ末端ペプチド結合ドメインを有するタンパク質、例えば、Ｓｓａ１ｐ。
・ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼであるタンパク質（例えば、Ｃｐｒ３ｐ、Ｃｐｒ６ｐ）。
・既知シャペロンのホモログであるタンパク質（例えば、Ｈｓｐ１０ｐ）。
・ミトコンドリアシャペロンであるタンパク質（例えば、Ｃｐｒ３ｐ）。
・細胞質または核シャペロンであるタンパク質（例えば、Ｃｎｓ１ｐ）。
・膜結合シャペロンであるタンパク質（例えば、Ｏｒｍ２ｐ、Ｆｍｏ１ｐ）。
・シャペロンアクチベーター活性またはシャペロンレギュレーター活性を有するタンパク質（例えば、Ａｈａ１ｐ、Ｈａｃ１ｐ、Ｈｃｈ１ｐ）。
・未熟型のタンパク質と一時的に結合して適切なフォールディング輸送、および／または分泌誘導するタンパク質、例えば、小胞体への効率的な輸送に必要なタンパク質（例えば、Ｌｈｓ１ｐ）またはそれらの細胞内の作用部位に必要なタンパク質（例えば、ＰｓｅＩｐ）。
・タンパク質複合体アセンブリおよび／またはリボソームアセンブリに関与するタンパク質（例えば、Ａｔｐ１１ｐ、ＰｓｅＩｐ、Ｎｏｂ１ｐ）。
・シャペロニンＴ複合体のタンパク質（例えば、Ｃｃｔ２ｐ）。または
・プレフォールディング複合体のタンパク質（例えば、Ｐｆｄ１ｐ）。
【００７５】
好ましいシャペロンは、小胞体（ＥＲ）の管腔内でジスルフィド結合の形成を触媒することのできる等価物を有するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）またはその断片もしくは変異体である。「ＰＤＩ」とは、ＥＰ０７４６６１１およびHillson et al, 1984, Methods Enzymol., 107, 281-292に記載されているようなスクランブルリボヌクレアーゼのＲＮＡに対するリボヌクレアーゼ活性を復活させる能力を有するいずれのタンパク質も含む。
【００７６】
ＰＤＩは、一般にチオール：ジスルフィド交換反応を触媒する酵素であり、分泌細胞のＥ．Ｒ．管腔の主要な常在タンパク質成分である。一連の証拠は、それが分泌タンパク質の生合成において役割を果たすことを示唆し(Freedman, 1984, Trends Biochem. Sci., 9, 438-41)、これはin situにおける直接的架橋研究によっても裏付けられている(Roth and Pierce, 1987, Biochemistry, 26,4179-82)。ＰＤＩが欠損しているミクロソーム膜が同時翻訳タンパク質のジスルフィド形成に特異的な欠陥を示すという知見(Bulleid and Freedman, 1988, Nature, 335, 649-51)は、この酵素が、分泌タンパク質および細胞表面タンパク質の生合成の際に本来のジスルフィド結合形成の触媒として働くことを意味する。この役割はin vitroにおいてこの酵素の触媒特性に関して知られているものと一致し、チオール：ジスルフィド交換反応を触媒し、正味のタンパク質ジスルフィド、切断または異性化をもたらし、また、一般に、多様な還元型の折り畳まれていないタンパク質基質におけるタンパク質フォールディングおよび本来のジスルフィド結合の形成を触媒することができる(Freedman et al., 1989, Biochem. Soc. Symp., 55, 167-192)。また、ＰＤＩは、イソメラーゼ活性を欠いた変異型ＰＤＩがタンパク質フォールディングを加速させるので、シャペロンとしても働く(Hayano et al, 1995, FEBS Letters, 377, 505-511)。最近、ジスルフィドの異性化ではなく、スルヒドリルの酸化がＳ．セレビシエにおいてタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの主要な機能であることが報告された(Solovyov et al., 2004, J. Biol. Chem., 279 (33) 34095-34100)。酵素のＤＮＡおよびアミノ酸配列はいくつかの種では既知であり(Scherens et al, 1991, Yeast, 7, 185-193; Farquhar et al, 1991, Gene, 108, 81-89；ＥＰ０７４６６１；ＥＰ０２９３７９３；ＥＰ０５０９８４１)、哺乳類肝臓から均一となるまで精製された酵素の作用機序に関する情報が増えつつある(Creighton et al, 1980, J Mol. Biol., 142, 43-62; Freedman et al, 1988, Biochem. Soc. Trans., 16, 96-9; Gilbert, 1989, Biochemistry, 28, 7298-7305; Lundstrom and Holmgren, 1990, J. Biol. Chem., 265, 9114-9120; Hawkins and Freedman, 1990, Biochem. J., 275, 335-339)。これまでに細胞においてタンパク質フォールディング、アセンブリおよび輸送のメディエーターとして含められている多くのタンパク質因子(Rothman, 1989, Cell, 59, 591-601)のうち、ＰＤＩは十分適宜された触媒活性を有する。
【００７７】
宿主における内在性ＰＤＩ遺伝子の欠失または不活性化の結果、生存力のない宿主が生じる。言い換えれば、この内在性ＰＤＩ遺伝子は「必須」遺伝子である。
【００７８】
ＰＤＩは哺乳類組織から容易に単離され、この均一な酵素は、特徴的な酸性ＰＩ（４．０〜４．５）を伴うホモ二量体（２×５７ｋＤ）である(Hillson et al, 1984, Meyhods Enzymol., 107, 281-292)。また、この酵素はコムギおよび藻類クラミドモナス・レインハルジー(Chlamydomonas reinhardii)(Kaska et al, 1990, Biochem. J., 268, 63-68)、ラット(Edman et al, 1985, Nature, 317, 267-270)、ウシ(Yamauchi et al, 1987, Biochem. Biophys. Res. Comm., 146, 1485-1492)、ヒト(Pihlajaniemi et al, 1987, EMBO J., 6, 643-9)、酵母(Scherens et al, 前掲; Farquhar et al, 前掲)および雛鳥(Parkkonen et al, 1988, Biochem. J., 256, 1005-1011)からも精製されている。これらの脊椎動物種由来のタンパク質は高度の配列保存性を示し、総てラットＰＤＩ配列で最初に示された全体的な特徴を示す(Edman et al., 1985, 前掲)。
【００７９】
好ましいＰＤＩ配列としては、ヒト由来のものおよびＳ．セレビシエなどの酵母種由来のものが挙げられる。
【００８０】
酵母タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ前駆体ＰＤＩ１は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ４２３７３またはＢＡＡ００７２３として見出すことができる。それは次の５２２アミノ酸の配列を有する。
【００８１】
【化１】
2007515962.tif 000003
【００８２】
別の酵母タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ３８４０２として見出すことができる。それは次の５３０アミノ酸の配列を有する。
【００８３】
【化２】
2007515962.tif 000004
【００８４】
これらの配列の次のアライメント（第一の配列としてＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ４２３７３またはＢＡＡ００７２３、第二の配列としてＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ３８４０２）は、これらの２つの配列間の違いは、１１４番の１つのアミノ酸の違い（太字で強調）であり、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ３８４０２で定義された配列は、５０６〜５１３番に付加的アミノ酸ＥＡＤＡＥＡＥＡを含む。
【００８５】
【化３】
2007515962.tif 000005
【００８６】
上記のＰＤＩ配列の変異体および断片、ならびに他の天然ＰＤＩ配列の変異体も本発明に含まれる。ＰＤＩに関して「変異体」とは、１以上の位置においてアミノ酸挿入、欠失または置換（保存的または非保存的）を持ったタンパク質を意味し、ただしここで、このような変化は、基本的特性、例えば、酵素活性（典型的活性および比活性）、あるｐＨ範囲における熱安定性（ｐＨ安定性）が有意に変化していないタンパク質を生じる。これに関して「有意」とは、当業者が、その変異体の特性が異なり得るが、元のタンパク質と比べて明瞭ではないなととする場合を意味する。
【００８７】
「保存的置換」とは、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｉｐなどの組合せを意図する。好ましい保存的置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒが挙げられる。
【００８８】
「変異体」は、一般に、それが由来するポリペプチドと少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。
【００８９】
２つのポリペプチド間の配列同一性％は、後述のように、好適なコンピュータープログラムを用いて判定することができる。このような変異体は天然のものであっても、当業者に周知のようなタンパク質工学および部位特異的突然変異誘発を用いて作出されたものであってもよい。
【００９０】
ＰＤＩに関して「断片」とは、１以上の位置に欠失が存在しているタンパク質を意味する。よって、断片は完全成熟ＰＤＩタンパク質の全配列の多くて５、１０、２０、３０、４０または５０％、一般に６０％まで、より一般には７０％まで、好ましくは８０％まで、より好ましくは９０％まで、さらに好ましくは９５％まで、さらに好ましくは９９％までを含み得る。ＰＤＩタンパク質の特に好ましい断片は目的タンパク質の１以上のドメイン全体を含む。
【００９１】
ＰＤＩの断片または変異体は、宿主細胞において組換え発現させた場合に、Ｓ．セレビシエなどの宿主細胞において内因的にコードされているＰＤＩ遺伝子の欠失を補うことができるタンパク質であってもよく、例えば、別の生物、例えば、別の酵母もしくは他の真菌、または別の真核生物、例えば、ヒトもしくは他の脊椎動物、または動物により、あるいは植物によりコードされているホモログのようなＰＤＩの天然ホモログであってもよい。
【００９２】
別の好ましいシャペロンとしては、ＳＳＡ１、または同等のシャペロン様活性を有するその断片または変異体がある。ＳＳＡ１は、ＹＧ１００としても知られ、Ｓ．セレビシエゲノムの第Ｉ染色体上にあり、１．９３kｂｐの大きさである。
【００９３】
公開されているＳＳＡ１のタンパク質配列の１つは次の通りである。
【００９４】
【化４】
2007515962.tif 000006
【００９５】
公開されているＳＳＡ１のコード配列は次の通りであるが、この配列は、同一のタンパク質産物をコードする別のヌクレオチド配列を得るための縮重置換により改変することができると考えられる。
【００９６】
【化５】
2007515962.tif 000007
2007515962.tif 000008
【００９７】
タンパク質Ｓｓａ１ｐはＨｓｐ７０ファミリーのタンパク質に属し、サイトゾルに常在している。Ｈｓｐ７０はいくつかのシャペロン活性を遂行する能力を持ち；タンパク質の合成、アセンブリおよびフォールディングを助け；種々の細胞内の場所へにポリペプチドの輸送およびタンパク質凝集塊の溶解を媒介する(Becker & Craig, 1994, Eur.J: Biochem. 219, 11-23)。Ｈｓｐ７０遺伝子は高度に保存され、Ｎ末端ＡＴＰ結合ドメインとＣ末端ペプチド結合ドメインを有する。Ｈｓｐ７０タンパク質は、主として折り畳まれていないタンパク質のペプチド主鎖と相互作用する。ｈｓｐ７０タンパク質による結合およびペプチドの放出はＡＴＰ依存的なプロセスであり、ｈｓｐ７０のコンホメーション変化を伴う(Becker & Craig, 1994, 前掲)。
【００９８】
サイトゾルｈｓｐ７０タンパク質は、特に、タンパク質の合成、フォールディングおよび分泌に関与する(Becker & Craig, 1994, 前掲)。Ｓ．セレビシエでは、サイトゾルｈｓｐ７０タンパク質は、機能的に互いに異なるＳＳＡ（ＳＳＡ１〜４）とＳＳＢ（ＳＳＢ１および２）の２つの群に分けられている。ＳＳＡファミリーは、その群のタンパク質の少なくとも１つが細胞の生存力を維持するために活性でなければならないという意味で必須である(Becker & Craig, 1994, 前掲)。サイトゾルｈｓｐ７０タンパク質は、好ましくは、フォールディングされていない、非成熟タンパク質と結合する。このことは、それらが、サイトゾルにおいて巨大分子複合体へと組み立てられるまで、それらを非フォールディング状態に維持し、かつ／または種々のオルガネラへのそれらの輸送を促進することにより、前駆体タンパク質の凝集を防ぐということを示唆している(Becker & Craig, 1994, 前掲)。ＳＳＡタンパク質は特に、小胞体およびミトコンドリアへ輸送するための前駆体の翻訳後生合成および維持に関与する(Kim et al., 1998, Proe. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 12860-12865; Ngosuwan et al., 2003, J. Biol. Chem. 278(9), 7034-7042)。Ｓｓａ１ｐは損傷を受けたタンパク質に結合し、それらを部分的非フォールディング型で安定化させ、再フォールディングまたは分解を生じさせることが示されている(Becker & Craig, 1994, 前掲; Glover & Lindquist, 1998, Cell. 94, 73-82)。
【００９９】
Demolder et al, 1994, J. Biotechnol., 32, 179-189は、酵母におけるＳＳＡ１の過剰発現が、ヒトインターフェロン−βをコードしている組換え染色体に組込み型遺伝子の発現の増強をもたらしたことを報告している。ＳＳＡ１およびヒトインターフェロン−βが同じプラスミド上の組換え遺伝子によりコードされていた場合に異種遺伝子発現の増強が達成できるという示唆はない。実際に、酵母におけるシャペロンの過剰発現の分野でのより最近の発展を鑑みれば（例えば、Robinson et al, 1994, 前掲; Hayano et al, 1995, 前掲; Shusta et al, 1998, 前掲; Parekh & Wittrup, 1997, 前掲; Bao & Fukuhara, 2001, 前掲;およびBao et al, 2000, 前掲）、当業者は、異種タンパク質の発現レベルを増強させるために、２μｍ系プラスミドからＳＳＡ１を発現させる気には全くならなかったであろうし、２μｍ系プラスミドからのＳＳＡ１および異種タンパク質の双方を発現させることはなおのことである。
【０１００】
ＳＳＡ１の変異体および断片も本発明含まれる。ＳＳＡ１に関して「変異体」とは、アミノ酸挿入、欠失または置換（保存的または非保存的）を有している１以上の位置以外に関しては天然ＳＳＡ１の配列を有するタンパク質を意味する（ただし、このような変化は、塩基の特性、例えば、酵素活性（典型的活性および比活性）、熱安定性、あるｐＨ範囲における活性（ｐＨ安定性）が有意に変化していないタンパク質をもたらす）。これに関して「有意に」とは、当業者が、その変異体の特性が異なり得るが、元のタンパク質と比べて不明瞭なものではないとする場合を意味する。
【０１０１】
「保存的置換」とは、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐなどの組合せを意図する。好ましい保存的置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒが挙げられる。
【０１０２】
ＳＳＡ１の「変異体」は、一般に、天然ＳＳＡ１の配列と少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくはなくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。
【０１０３】
２つのポリペプチド間の配列同一性％は、後述のように、好適なコンピュータープログラムを用いて判定することができる。このような変異体は天然のものであっても、当業者に周知のようなタンパク質工学および部位特異的突然変異誘発の方法を用いて作出されたものであってもよい。
【０１０４】
ＳＳＡ１に関して「断片」とは、欠失が存在している１以上の位置以外は天然ＳＳＡ１の配列を有するタンパク質を意味する。よって、断片は完全成熟ＳＳＡ１タンパク質の全配列の多くて５、１０、２０、３０、４０または５０％、一般に６０％まで、より一般には７０％まで、好ましくは８０％まで、より好ましくは９０％まで、さらに好ましくは９５％まで、さらに好ましくは９９％までを含み得る。ＳＳＡ１タンパク質の特に好ましい断片は目的タンパク質の１以上のドメイン全体を含む。
【０１０５】
ＳＳＡ１の断片または変異体は、Ｓ．セレビシエなどの宿主細胞において組換え発現させた場合に宿主細胞において内因的にコードされているＳＳＡ１遺伝子（またはそのホモログ）の欠失を補うことができるタンパク質であってもよく、例えば、別の生物、例えば、別の酵母もしくは他の真菌、または別の真核生物、例えば、ヒトもしくは他の脊椎動物、または動物により、あるいは植物によりコードされているホモログのようなＳＳＡ１の天然ホモログであってもよい。
【０１０６】
別の好ましいシャペロンとしては、ＰＳＥ１または同等のシャペロン様活性を有するその断片もしくは変異体がある。
【０１０７】
ＰＳＥＩはＫＡＰ１２１としても知られ、第XIII染色体上にある必須遺伝子である。
【０１０８】
公開されているタンパク質ｐｓｅ１pのタンパク質配列は次の通りである。
【０１０９】
【化６】
2007515962.tif 000009
2007515962.tif 000010
【０１１０】
公開されているＰＳＥ１のコード配列は次の通りであるが、この配列は、同一のタンパク質産物をコードする別のヌクレオチド配列を得るための縮重置換により改変することができると考えられる。
【０１１１】
【化７】
2007515962.tif 000011
2007515962.tif 000012
【０１１２】
ＰＳＥ１遺伝子は３．２５ｋｂｐの大きさである。Ｐｓｅ１ｐは巨大分子の核−細胞質間輸送に関与する(Seedorf & Silver, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 8590-8595)。このプロセスは、核エンベロープに埋め込まれた核膜孔複合体（ＮＰＣ）を介して起こり、ヌクレオポリンからなる(Ryan & Wente, 2000, Curr. Opin. Cell Biol. 12, 361-371)。タンパク質は、核輸入、核局在配列（ＮＬＳ）および輸出、核輸出配列（ＮＥＳ）に必要な情報を含む特異的配列を有する(Pemberton et al., 1998, Cunr. Opin. Cell Biol. 10, 392-399)。Ｐｓｅ１ｐは一タンパク質群のカリオフェリン／インポルチンであり、αおよびβファミリーに分類されている。カリオフェリンは  、ＮＬＳおよびＮＥＳを認識し、ＮＰＣと相互作用することで、核膜を通過する巨大分子の輸送を媒介する可溶性輸送因子である。(Seedorf & Silver, 1997, 前掲; Pemberton et al., 1998, 前掲; Ryan & Wente, 2000, 前掲)。核孔を経た輸送は、小ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｎによって触媒されるＧＴＰ加水分解により駆動される(Seedorf & Silver, 1997, 前掲)。Ｐｓｅ１Ｐはカリオフェリンβと同定されている。Ｓ．セレビシエでは１４のカリオフェリンβタンパク質が同定されているが、そのうち４つのみが必須である。これはおそらく、複数のカリオフェリンが単一の巨大分子の輸送を媒介する可能性があるためである(Isoyama et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(24), 21863-21869)。Ｐｓｅ１ｐは核の核エンベロープおよび細胞質のある範囲に局在する。このことは、このタンパク質がその輸送機能の一部として核内外を移動することを示唆している(Seedorf & Silver, 1997, 前掲)。Ｐｓｅ１ｐは転写因子(Isoyama et al., 2001, 前掲; Ueta et al., 2003, J. Biol. Chem. 278(50), 50120-50127)、ヒストン(Mosammaparast et al., 2002, J. Biol. Chem. 277(1), 862-868)、およびリボソームへのアセンブリ前のリボゾームタンパク質(Pemberton et al., 1998, 前掲)の核輸入に関与している。また、それは核からｍＲＮＡの輸出を媒介する。カリオフェリンはＲＮＡ結合タンパク質に見られる異なるＮＥＳを認識し、それと結合し、それが核から輸出される前にＲＮＡをコーティングする(Seedorf & Silver, 1997, Pemberton et al., 1998, 前掲)。
【０１１３】
巨大分子の核−細胞質間輸送は、細胞周期の適切な進行に必須なので、ｐｓｅ１ｐなどの核輸送因子は細胞増殖の新規な候補標的である(Seedorf & Silver, 1997, 前掲)。
【０１１４】
Ｓ．セレビシエにおけるＰｓｅ１ｐ（タンパク質分泌エンハンサー）の過剰発現もまた、生物活性タンパク質のレパートリーの内因的タンパク質分泌レベルを増強することが示されている(Chow et al., 1992; J. Cell. Sci. 101(3), 709-719)。ＰＳＥ１および異種タンパク質が双方とも同じプラスミド上の組換え遺伝子によりコードされていた場合に異種遺伝子発現の増強が達成できるという示唆はない。実際に、酵母におけるシャペロンの過剰発現におけるより最近の発展を鑑みれば（例えば、Robinson et al, 1994, 前掲; Hayano et al, 1995, 前掲; Shusta et al, 1998, 前掲; Parekh & Wittrup, 1997, 前掲; Bao & Fukuhara, 2001, 前掲;およびBao et al, 2000, 前掲）、当業者は、異種タンパク質の発現レベルを増強させるために、２μｍ系プラスミドからＰＳＥ１を過剰発現させることは全く試みなかったであろうし、２μｍ系プラスミドからのＰＳＥ１および異種タンパク質の双方を発現させることはなおのことである。
【０１１５】
ＰＳＥ１の変異体および断片も本発明に含まれる。ＰＳＥ１に関して「変異体」とは、アミノ酸挿入、欠失または置換（保存的または非保存的）を有している１以上の位置以外に関しては天然ＰＳＥ１の配列を有するタンパク質を意味する（ただし、このような変化は、塩基の特性、例えば、酵素活性（典型的活性および比活性）、熱安定性、あるｐＨ範囲における活性（ｐＨ安定性）が有意に変化していないタンパク質をもたらす）。これに関して「有意に」とは、当業者が、その変異体の特性が異なり得るが、元のタンパク質と比べて不明瞭なものではないとする場合を意味する。
【０１１６】
「保存的置換」とは、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐなどの組合せを意図する。好ましい保存的置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒが挙げられる。
【０１１７】
ＰＳＥ１の「変異体」は、一般に、天然ＰＳＥ１の配列と少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくはなくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。
【０１１８】
２つのポリペプチド間の配列同一性％は、後述のように、好適なコンピュータープログラムを用いて判定することができる。このような変異体は天然のものであっても、当業者に周知のようなタンパク質工学および部位特異的突然変異誘発の方法を用いて作出されたものであってもよい。
【０１１９】
ＰＳＥ１に関して「断片」とは、欠失が存在している１以上の位置以外は天然ＰＳＥ１の配列を有するタンパク質を意味する。よって、断片は完全成熟ＰＳＥ１タンパク質の全配列の多くて５、１０、２０、３０、４０または５０％、一般に６０％まで、より一般には７０％まで、好ましくは８０％まで、より好ましくは９０％まで、さらに好ましくは９５％まで、さらに好ましくは９９％までを含み得る。ＰＳＥ１タンパク質の特に好ましい断片は目的タンパク質の１以上のドメイン全体を含む。
【０１２０】
ＰＳＥ１の断片または変異体は、Ｓ．セレビシエなどの宿主細胞において組換え発現させた場合に宿主細胞において内因的なＰＳＥ１遺伝子の欠失を補うことができるタンパク質であってもよく、例えば、別の生物、例えば、別の酵母もしくは他の真菌、または別の真核生物、例えば、ヒトもしくは他の脊椎動物、または動物により、あるいは植物によりコードされているホモログのようなＰＳＥ１の天然ホモログであってもよい。  
【０１２１】
別の好ましいシャペロンとしては、ＯＲＭ２または同等のシャペロン様活性を有するその断片もしくは変異体がある。
【０１２２】
ＯＲＭ２はＹＬＲ３５０Ｗとしても知られ、Ｓ．セレビシエゲノムの第XII染色体上にあり（８２８７２９〜８２９３７９番）、酵母タンパク質Ｏｒｍ１ｐと類似性を有する進化的に保存されているタンパク質をコードしている。Hjelmqvist et al, 2002, Genome Biology, 3(6), research 0027.1-0027.16は、ＯＲＭ２が３つのヒト遺伝子（ＯＲＭＤＬ１、ＯＲＭＤＬ２およびＯＲＭＤＬ３）ならびに微胞子虫、植物、ショウジョウバエ(Drosophila)、尾索類および脊椎動物におけるホモログを含む遺伝子ファミリーに属することを報告している。ＯＲＭＤＬ遺伝子は、タンパク質小胞体（ＥＲ）において固定されているトランスメンブランタンパク質をコードしていることが報告されている。
【０１２３】
タンパク質Ｏｒｍ２ｐは折り畳み異常タンパク質応答を誘導する薬剤に対する耐性に必要とされる。Hjelmqvist et al, 2002（前掲）は、２つのＳ．セレビシエＯＲＭＤＬホモログ（ＯＲＭ１およびＯＲＭ２）の二重ノックアウトが増殖速度の低下ならびにツニカマイシンおよびジチオトレイトールに対するより大きな感受性をもたらすことを報告している。
【０１２４】
公開されているＯrm２ｐ配列の１つは次の通りである。
【０１２５】
【化８】
2007515962.tif 000013
【０１２６】
上記のタンパク質はＳ．セレビシエにおいて以下のコードヌクレオチドによりコードされているが、この配列は、同一のタンパク質産物をコードする別のヌクレオチド配列を得るための縮重置換により改変することができると考えられる。
【０１２７】
【化９】
2007515962.tif 000014
2007515962.tif 000015
【０１２８】
ＯＲＭ２の変異体および断片も本発明含まれる。ＯＲＭ２に関して「変異体」とは、アミノ酸挿入、欠失または置換（保存的または非保存的）を有している１以上の位置以外に関しては天然ＯＲＭ２の配列を有するタンパク質を意味する（ただし、このような変化は、塩基の特性、例えば、酵素活性（典型的活性および比活性）、熱安定性、あるｐＨ範囲における活性（ｐＨ安定性）が有意に変化していないタンパク質をもたらす）。これに関して「有意に」とは、当業者が、その変異体の特性が異なり得るが、元のタンパク質と比べて不明瞭なものではないとする場合を意味する。
【０１２９】
「保存的置換」とは、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐなどの組合せを意図する。好ましい保存的置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒが挙げられる。
【０１３０】
ＯＲＭ２の「変異体」は、一般に、天然ＯＲＭ２の配列と少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくはなくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。
【０１３１】
２つのポリペプチド間の配列同一性％は、後述のように、好適なコンピュータープログラムを用いて判定することができる。このような変異体は天然のものであっても、当業者に周知のようなタンパク質工学および部位特異的突然変異誘発の方法を用いて作出されたものであってもよい。
【０１３２】
ＯＲＭ２に関して「断片」とは、欠失が存在している１以上の位置以外は天然ＯＲＭ２の配列を有するタンパク質を意味する。よって、断片は完全成熟ＯＲＭ２タンパク質の全配列の多くて５、１０、２０、３０、４０または５０％、一般に６０％まで、より一般には７０％まで、好ましくは８０％まで、より好ましくは９０％まで、さらに好ましくは９５％まで、さらに好ましくは９９％までを含み得る。ＯＲＭ２タンパク質の特に好ましい断片は目的タンパク質の１以上のドメイン全体を含む。
【０１３３】
ＯＲＭ２の断片または変異体は、Ｓ．セレビシエなどの宿主細胞において組換え発現させた場合に宿主細胞において内因的なＯＲＭ２遺伝子の欠失を補うことができるタンパク質であってもよく、例えば、別の生物、例えば、別の酵母もしくは他の真菌、または別の真核生物、例えば、ヒトもしくは他の脊椎動物、または動物により、あるいは植物によりコードされているホモログのようなＯＲＭ２の天然ホモログであってもよい。
【０１３４】
シャペロンの配列を含むタンパク質をコードしている遺伝子は、異種タンパク質をコードしている遺伝子に関して、ＯＲＦと調節領域の組合せを特に強調して後述するような様式で形成することができる。
【０１３５】
本明細書において「タンパク質」とは、天然および非天然のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドのあらゆるものを含む。「異種タンパク質」は、２μｍ系プラスミドにより天然にはコードされていないタンパク質であり、「非２μｍ系プラスミドタンパク質」と呼ぶこともできる。便宜上、「異種タンパク質」および「非２μｍ系プラスミドタンパク質」は、本願を通じて同義で用いる。よって、好ましくは、異種タンパク質は、Ｚ．ルクシーから得られるようなｐＳＲ１、ｐＳＢ３またはｐＳＢ４；双方ともＺ．バイリーから得られるようなｐＳＢ１またはｐＳＢ２；Ｚ．フェルメンタチから得られるようなｐＳＭ１；Ｋ．ドロソフィラルムから得られるようなｐＫＤ１；Ｐ．メンブラネファシエンスから得られるようなｐＰＭ１；およびＳ．セレビシエから得られるような２μｍプラスミドのいずれか１つによりコードされているＦＬＰ、ＲＥＰ１、ＲＥＰ２、またはａＲＡＦ／Ｄタンパク質ではない。
【０１３６】
異種タンパク質をコードしている遺伝子は、異種タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列（一般に、ある生物の標準的なコドン使用に従う）を含み、これはオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）と呼ばれる。この遺伝子は、オープンリーディングフレームをコードしてないポリヌクレオチド配列（「非コード領域」と呼ばれる）もいくらかさらに含んでもよい。
【０１３７】
その遺伝子中の非コード領域は、ＯＲＦに作動可能なように連結された１以上の調節配列を含んでよく、これにより、オープンリーディングフレームの転写および／またはその結果生じた転写物の翻訳が可能となる。
【０１３８】
「調節配列」とは、それが作動可能なように連結されたオープンリーディングフレームの発現（すなわち、転写および／または翻訳）を調節する（すなわち、促進する、または低下させる）配列を意味する。調節領域は一般に、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位などを含む。当業者ならば、調節領域の選択が意図する発現系によって異なることが分かるであろう。例えば、プロモーターは構成型であっても誘導型であってもよく、細胞種または組織種特異的であっても非特異的であってもよい。
【０１３９】
好適な調節領域は５ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ，１００ｂｐ、１２０ｂｐ、１４０ｂｐ、１６０ｂｐ、１８０ｂｐ、２００ｂｐ、２２０ｂｐ、２４０ｂｐ、２６０ｂｐ、２８０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、８５０ｂｐ、９００ｂｐ、９５０ｂｐ，１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐまたはそれ以上の長さであり得る。
【０１４０】
当業者ならば、シャペロン、例えばＰＤＩをコードしている遺伝子が非コード領域および／または調節領域をさらに含み得ることが分かるであろう。このような非コード領域および調節領域は、シャペロンＯＲＦに本来会合している天然非コード領域および／または調節領域に限定されるものではない。
【０１４１】
発現系がサッカロミセス・セレビシエなどの酵母である場合、Ｓ．セレビシエの好適なプロモーターとしては、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＰＹＫ１、ＰＭＡ１、ＣＹＣ１、ＰＨＯ５、ＴＲＰ１、４ＤＨ１、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、α−接合因子フェロモン、ａ−接合因子フェロモン、ＰＲＢ１プロモーター、ＰＲＡ１プロモーター、ＧＰＤ１プロモーター、および５’調節領域の部分と他のプロモーターの５’調節領域の部分との、または上流活性化部位とのハイブリッドを含むハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ−Ａ−２５８０６７のプロモーター）と会合するものが挙げられる。
【０１４２】
好適な転写終結シグナルは当技術分野で周知のものである。宿主細胞が真核生物である場合、転写終結シグナルは好ましくは、転写終結およびポリアデニル化に適切なシグナルを含む真核生物遺伝子の３’フランキング配列に由来するものである。好適な３’フランキング配列は、例えば、用いる発現制御配列に本来会合している遺伝子のものであってよく、すなわち、そのプロモーターに相当し得る。あるいは、それらは異なってもよい。その場合、宿主が酵母、好ましくは、Ｓ．セレビシエであれば、Ｓ．セレビシエＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＣＹＣ１、またはＰＧＫ１遺伝子の終結シグナルが好ましい。
【０１４３】
２μｍ遺伝子などの隣接する遺伝子への転写の読み過ごしを防ぐためには、シャペロンＰＤＩ１のものなど、異種遺伝子のプロモーターおよびオープンリーディングフレームは転写終結配列がフランキングしていて、転写終結配列がプロモーターおよびオープンリーディングフレームの上流および下流の双方に配置されていることが有利であり得る（また、その逆の場合もある）。
【０１４４】
一つの実施態様では、サッカロミセス・セレビシエなどの酵母において有利な調節配列としては、ＥＰ４３１８８０で教示されているような酵母プロモーター（例えば、サッカロミセス・セレビシエＰＲＢ１プロモーター）；および転写ターミネーター、好ましくは、ＥＰ６００５７で教示されているようなサッカロミセスＡＤＨ１由来のターミネーターが挙げられる。好ましくは、このベクターは少なくとも２つの翻訳終結コドンを組み込んでいる。
【０１４５】
翻訳の読み過ごしを最小限とし、ひいては、延長した非天然融合タンパク質の生産を避けるためには、非コード領域には、ＵＡＡ、ＵＡＧまたはＵＧＡなどの翻訳停止コドンをコードしている１を超えるＤＮＡ配列を組み込むことが有利であり得る。翻訳停止コドンＵＡＡが好ましい。
【０１４６】
「作動可能なように連結される」とは、その意味の範囲内に、調節配列が、その調節領域が意図した様式でＯＲＦに作用を発揮できるＯＲＦとの関係を形成するように遺伝子の非コード領域内に配置されることを含む。このように、ＯＲＦに「作動可能なように連結されたる」調節領域は、その調節領域が、調節配列に適合した条件下、意図した様式でＯＲＦの転写および／または翻訳に影響を及ぼし得るように配置される。
【０１４７】
１つの好ましい実施態様では、この異種タンパク質は分泌される。この場合、例えば天然ＨＳＡ分泌リーダーの大部分を、ＷＯ９０／０１０６３に教示されているようなＳ．セレビシエα−接合因子分泌リーダーの小部分とともに含む分泌リーダー配列をコードしている配列をオープンリーディングフレームに含められる。
【０１４８】
あるいは、この異種タンパク質は細胞内のものであってもよい。
【０１４９】
もう１つの好ましい実施態様では、この異種タンパク質は真核生物タンパク質の配列、またはその断片もしくは変異体を含む。好適な真核生物としては、真菌、植物および動物が揚げられる。１つの好ましい実施態様では、この異種タンパク質は真菌タンパク質、例えば、酵母タンパク質である。もう１つの好ましい実施態様では、この異種タンパク質は動物タンパク質である。動物の例としては、脊椎動物および無脊椎動物が挙げられる。脊椎動物の例としては、哺乳類、例えば、ヒトおよび非ヒト哺乳類が挙げられる。
【０１５０】
従って、この異種タンパク質は、酵母タンパク質の配列を含んでいてもよい。それは、例えば、２μｍ系プラスミドが由来する同じ宿主からの酵母タンパク質の配列を含んでもよい。当業者ならば、本発明の第一、第二または第三の態様の方法、使用またはプラスミドが、１を超える異種タンパク質、１を超えるシャペロン、または１を超える異種タンパク質と１を超えるシャペロンをコードしているＤＮＡ配列を含んでもよいことが分かるであろう。
【０１５１】
もう１つの好ましい実施態様では、この異種タンパク質は、アルブミン、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば、血液凝固因子）、アンチスタシン、ｔｉｃｋ抗凝固ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンギオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンに基づく分子またはいずれかの断片（例えば、Small Modular ImmunoPharmaceutical（商標）（「ＳＭＩＰ」）またはｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ断片）、Ｋｕｎｉｔｚドメインタンパク質（例えば、ＷＯ０３／０６６８２４に記載のもの、アルブミン融合物を含む、または含まないもの）、インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ２、インターフェロンα種および亜種、インターフェロンβ種および亜種、インターフェロンγ種および亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＡＸ１５、ＩＬ１−受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびＥＰＯ模倣体、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびＴＰＯ模倣体、プロサプチド、シアノビリン−Ｎ，５−ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶ  ｇｐ４１、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルディン、血小板由来増殖因子、副甲状腺ホルモン、プロインスリン、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、インスリン様増殖因子、カルシトニン、成長ホルモン、トランスフォーミング増殖因子β、腫瘍壊死因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、プレ型および活性型双方の凝固因子（限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ウィルブランド因子、α１アンチトリプシン、プラスミノーゲンアクチベーター、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Ｘおよび因子XIIIを含む）、神経増殖因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターαトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、Ｃタンパク質、Ｓタンパク質、または前記のいずれかの変異体もしくは断片の配列を含んでもよい。
【０１５２】
上記のタンパク質に関して「変異体」とは、１以上の位置においてアミノ酸挿入、欠失または置換（保存的または非保存的）を持ったタンパク質を意味し、ここで、このような変化は、基本的特性、例えば、酵素活性または受容体結合（典型的活性および比活性）、熱安定性、あるｐＨ範囲における活性（ｐＨ安定性）が有意に変化していないタンパク質を生じる。これに関して「有意に」とは、当業者が、その変異体の特性が異なり得るが、元のタンパク質と比べて不明瞭なものではないとする場合を意味する。
【０１５３】
「保存的置換」とは、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐなどの組合せを意図する。好ましい保存的置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒが挙げられる。
【０１５４】
「変異体」は、一般に、それが由来するポリペプチドと少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。
【０１５５】
２つのポリペプチド間の配列同一性％は、例えば、ウィスコンシン州立大学Genetic Computing GroupのＧＡＰプログラムなどの好適なコンピュータープログラムを用いて判定することができ、同一性％は、配列が最適にアラインされたポリペプチドに関して算出されると考えられる。
【０１５６】
あるいは、アライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム(Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res., 22(22), 4673-80)を用いて行ってもよい。これらのパラメーターは次の通ようなものであり得る。
・ＦＡＳＴペアワイズ・アライメント・パラメーター：Ｋ−タップル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップ・ペナルティー；３、トップダイアゴナル数；５。スコアリング法；ｘ％。
・マルチプル・アライメント・パラメーター：ギャップ・オープン・ペナルティー；１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー；０．０５。
・スコアリング・マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【０１５７】
このような変異体は天然のものであっても、当技術分野で周知のようなタンパク質工学および部位特異的突然変異誘発の方法を用いて作出されたものであってもよい。
【０１５８】
上記のタンパク質に関して「断片」とは、１以上の位置に欠失を有するタンパク質を意味する。よって、断片は完全成熟ポリペプチドの全配列の多くて５、１０、２０、３０、４０または５０％を含み得る。一般に、断片は、目的の完全タンパク質の全配列の６０％まで、より一般には７０％まで、好ましくは８０％まで、より好ましくは９０％まで、さらに好ましくは９５％まで、さらに好ましくは９９％までを含む。目的タンパク質の特定の好ましい断片は、目的タンパク質の１以上のドメイン全体を含む。
【０１５９】
特に好ましい一つの実施態様では、この異種タンパク質はアルブミンの配列またはその変異体もしくは断片を含む。
【０１６０】
「アルブミン」とは、いずれの供給源から得られるアルブミンタンパク質配列を含むタンパク質も含む。一般に、この供給源は哺乳類である。１つの好ましい実施態様では、血清アルブミンはヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）である。「ヒト血清アルブミン」とは、ヒトにおいて天然に存在するアミノ酸配列を有する血清アルブミンおよびその変異体という意味を含む。好ましくは、このアルブミンはＷＯ９０／１３６５３またはその変異体に開示されているアミノ酸配列を有する。このＨＳＡコード配列は、ヒト遺伝子に対応するｃＤＮＡを単離するための既知の方法によって得ることができる、例えば、ＥＰ７３６４６およびＥＰ２８６４２４にも開示されている。
【０１６１】
もう１つの好ましい実施態様では、「アルブミン」は、ウシ血清アルブミンの配列を含む。「ウシ血清アルブミン」としては、例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６９から取得されるような、ウシに天然に存在するアミノ酸配列および下記に定義するようなその変異体を有する血清アルブミンという意味を含む。「ウシ血清アルブミン」とは、また、以下に定義するような全長ウシ血清アルブミンの断片またはその変異体という意味も含む。
【０１６２】
もう１つの好ましい実施態様では、アルブミンは、イヌ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ４９８２２参照）、ブタ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ０８８３５参照）、ヤギ（例えば、Ｓｉｇｍａから製品番号Ａ２５１４またはＡ４１６４として入手できる）、シチメンチョウ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号０７３８６０参照）、ヒヒ（例えば、Ｓｉｇｍａから製品番号Ａ１５１６として入手できる）、ネコ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ４９０６４参照）、ニワトリ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ１９１２１参照）、オボアルブミン（例えば、ニワトリアルブミン）（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１２参照）、ロバ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ３９０９０参照）、モルモット（例えば、Ｓｉｇｍａから製品番号Ａ３０６０、Ａ２６３９、Ｏ５４８３またはＡ６５３９として入手できる）、ハムスター（例えば、Ｓｉｇｍａから製品番号Ａ５４０９として入手できる）、ウマ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ３５７４７参照）、アカゲザル（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｑ２８５２２参照）、マウス（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｏ８９０２０参照）、ハト（例えば、Khan et al, 2002, Int. J. Biol. Macromol., 30(3-4), 171-8により定義されている）、ウサギ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ４９０６５参照）、ラット（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ３６９５３参照）およびヒツジ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ１４６３９参照）由来の血清アルブミンの１つに由来するアルブミン配列を含み、下記に定義するようなその変異体および断片を含む。
【０１６３】
アルブミンの天然変異型としては多くのものが知られている。その多くはPeters (1996, All About Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical Applications, Academic Press, Inc., SanDiego, California, p. 170-181)に記載されている。上記で定義したような変異体はこれらの天然変異体の１つであり得る。
【０１６４】
「変異体アルブミン」とは、１以上の位置においてアミノ酸挿入、欠失または置換（保存的または非保存的）を持ったアルブミンタンパク質を意味し、ただしここで、このような変化は、基本的特性、例えば、酵素活性（典型的活性および比活性、例えば、ビリルビンとの結合）、浸透圧（膠質浸透圧、コロイド浸透圧）、あるｐＨ範囲における挙動（ｐＨ安定性）が有意に変化していないアルブミンタンパク質を生じる。これに関して「有意に」とは、当業者が、その変異体の特性が異なり得るが、元のタンパク質と比べて不明瞭なものではないとする場合を意味する。
【０１６５】
「保存的置換」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せを意図する。このような変異体は、引用することにより本明細書の一部とされるStevensに対して１９８１年１１月２４日に発行された米国特許第４，３０２，３８６号に開示されているような部位特異的突然変異誘発によるなど、当技術分野で周知の技術によって作出することができる。
【０１６６】
一般に、アルブミン変異体は、天然アルブミンと４０％を超える、通常には少なくとも５０％、より一般には少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％またはそれ以上の配列同一性を有する。２つのポリペプチド間の配列同一性％は好適なコンピュータープログラム、例えば、ウィスコンシン州立大学Genetic Computing GroupのＧＡＰプログラムを用いて判定することができ、同一性％は、その配列が最適にアラインされたポリペプチドに関して算出されると考えられる。あるいは、このアライメントはClustal Wプログラム(Thompson et al., 1994)を用いて行うこともできる。用いるパラメーターは次の通りである。
【０１６７】
ＦＡＳＴペアワイズ・アライメント・パラメーター：Ｋ−タップル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップ・ペナルティー；３、トップダイアゴナル数；５。スコアリング法；ｘ％。マルチプル・アライメント・パラメーター：ギャップ・オープン・ペナルティー；１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー；０．０５。スコアリング・マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【０１６８】
上記で用いる「断片」とは、少なくとも１つの基本特性、例えば、結合活性（典型的活性および比活性、例えば、ビリルビンに対する結合）、浸透圧（膠質浸透圧、コロイド浸透圧）、あるｐＨ範囲における挙動（ｐＨ安定性）が有意に変化していない限り、全長アルブミンのいずれの断片またはその変異体も含む。これに関して「有意に」とは、当業者が、その変異体の特性が異なり得るが、元のタンパク質と比べて不明瞭なものではないとする場合を意味する。断片は一般に少なくとも５０アミノ酸の長さである。断片はアルブミンの少なくとも１つのサブドメイン全体を含み得る。ＨＳＡのドメインは組換えタンパク質として発現されている(Dockal, M. et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 29303-29310)、ここでは、ドメインＩはアミノ酸１〜１９７からなると定義され、ドメインIIはアミノ酸１８９〜３８５からなると定義され、組成物IIIはアミノ酸３８１〜５８５からなると定義されている。ドメインＩとIIの間、およびドメインIIの間に存在するα−ヘリックス構造の延長部（ｈ１０−ｈ１）のためにドメインの部分的重複が存在する(Peters, 1996, 前掲, 表２〜４)。ＨＳＡはまた、６つのサブドメイン（サブドメインＩＡ、ＩＢ、IIＡ、IIＢ、IIIＡおよびIIIＢ）を含む。サブドメインＩＡはアミノ酸６〜１０５を含み、サブドメインＩＢはアミノ酸１２０〜１７７を含み、サブドメインIIＡはアミノ酸２００〜２９１を含み、サブドメインIIＢはアミノ酸３１６〜３６９を含み、サブドメインIIIＡはアミノ酸３９２〜４９１を含み、サブドメインIIIＢはアミノ酸５１２−５８３を含む。断片は上記で定義したような１以上のドメインもしくはサブドメインの全体もしくは一部、またはそれらのドメインおよび／もしくはサブドメインの任意の組合せを含み得る。
【０１６９】
別の特に好ましい実施態様では、異種タンパク質はトランスフェリンまたはその変異体もしくはその断片の配列を含む。本明細書において「トランスフェリン」とは、トランスフェリンファミリーの総てのメンバー(Testa, Proteins of iron metabolism, CRC Press, 2002; Harris & Aisen, Iron carriers and iron proteins, Vol. 5, Physical Bioinorganic Chemistry, VCH, 1991)およびそれらの誘導体、例えば、トランスフェリン、変異株トランスフェリン(Mason et al, 1993, Biochemistry, 32, 5472; Mason et al, 1998, Biochem. J., 330(1), 35)、末端切断型トランスフェリン、トランスフェリンローブ(Mason et al, 1996, Protein Expr. Purif, 8, 119; Mason et al, 1991, Protein Expr. Purif., 2, 214)、ラクトフェリン、変異型ラクトフェリン、末端切断型ラクトフェリン、ラクトフェリンローブまたは上記のいずれかのものと他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質との融合物を含む(Shin et al, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2820; Ali et al, 1999, J Biol. Chem., 274, 24066; Mason et al, 2002, Biochemistry, 41, 9448)。
【０１７０】
トランスフェリンはヒトトランスフェリンであってもよい。本発明では、「ヒトトランスフェリン」は、ヒト由来のトランスフェリンと識別できない、またはその変異体もしくは断片である材料を表すのに用いる。「変異体」には、挿入、欠失および置換（保存的または非保存的）を含み、ここで、このような変化はトランスフェリンの有用なリガンド結合または免疫原性を実質的に変化させない。
【０１７１】
トランスフェリンの突然変異体も本発明に含まれる。このような突然変異体は免疫原性を変化させ得る。例えば、トランスフェリン突然変異体はグリコシル化の改変（例えば、低下）を示し得る。トランスフェリン分子のＮ結合グリコシル化パターンは、Ｎ、ＸまたはＳ／Ｔの位置のいずれか、または総てで、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔなどのアミノ酸グリコシル化コンセンサス配列を付加／除去することによって改変することができる。トランスフェリン突然変異体は、金属イオンおよび／またはトランスフェリン受容体などの他のタンパク質とのそれらの自然結合を変化させ得る。この様式で改変されたトランスフェリン突然変異体の例を下記に挙げる。
【０１７２】
本発明者らは、また、ヒトトランスフェリンまたはヒトトランスフェリン類似体の天然多型変異体も含む。一般に、ヒトトランスフェリンの変異体または断片は少なくとも５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％または５０重量％（好ましくは少なくとも８０重量％、９０重量％または９５重量％）のヒトトランスフェリンのリガンド結合活性（例えば、鉄結合活性）を有する。トランスフェリンまたは試験サンプルの鉄結合活性は、それらの鉄不含状態および完全に鉄が付加した状態のタンパク質の４７０ｎｍ：２８０ｎｍ吸光度比によって分光光度的に測定することができる。特に断りのない限り、試薬は鉄不含でなければならない。鉄は、０．１Ｍクエン酸塩、０．１Ｍ酢酸塩、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ４．５に対する透析によってトランスフェリンまたは試験サンプルから除去することができる。タンパク質は、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．０中、約２０ｍｇ／ｍＬでなければならない。２８０ｎｍでの吸光度が分光光度的に正確に測定できるように水に希釈したアポトランスフェリン(Calbiochem, CN Biosciences, Nottingham, UK)の４７０ｎｍ：２８０ｎｍ吸光度比を測定する（０％鉄結合）。２ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨに１９１ｍｇのニトロ三酢酸を溶解した後、２ｍＬの０．５Ｍ塩化鉄（III）を加えることで、２０ｍＭ鉄−ニトリロトリアセテート（ＦｅＮＴＡ）溶液を作製する。脱イオン水で５０ｍＬに希釈する。新しく作製した２０ｍＭ  ＦｅＮＴＡの十分な過剰量を加えた後、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．０に対してホロトランスフェリン調製物を完全に透析して残留するＦｅＮＴＡを除去することで、アポトランスフェリンに完全に鉄を付加し（１００％鉄結合）、その後、４７０ｎｍ：２８０ｎｍの吸光度比を測定する。この手順を、試験サンプルを用いて繰り返し、まず、鉄フリーとしなければならず、最終比を対照と比べる。
【０１７３】
その上、上記のいずれかのものを含む単一もしくは複数の異種融合物；またはアルブミン、トランスフェリンもしくは免疫グロビンまたはこれらのいずれかの変異体もしくは断片との単一もしくは複数の異種融合物が使用できる。このような融合物としては、ＷＯ０１／７９２７１で例示されるような、アルブミンＮ末端融合物、アルブミンＣ末端融合物およびコ−Ｎ末端およびＣ末端アルブミン融合物、ならびにトランスフェリンＮ末端融合物、トランスフェリンＣ末端融合物、およびコ−Ｎ末端およびＣ末端トランスフェリン融合物が挙げられる。
【０１７４】
トランスフェリン融合物の例は、米国特許出願ＵＳ２００３／０２２１２０１およびＵＳ２００３／０２２６１５５、Shin, et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A, 92, 2820, Ali, et al., 1999, J Biol Chem, 274, 24066, Mason, et al., 2002, Biochemistry, 41, 9448に示されており、これらの内容は引用することにより本明細書の一部とする。
【０１７５】
当業者ならば、また、本発明とともに用いるオープンリーディングフレームとして、他のいずれかの遺伝子もしくは変異体、または一部もしくはいずれかのオープンリーディングフレームが利用可能であることも分かるであろう。例えば、このオープンリーディングフレームは、天然タンパク質（チモーゲンを含む）、または天然タンパク質の変異体もしくは断片（例えば、一ドメインであってもよい）；または完全に合成されたタンパク質；または種々のタンパク質（天然または合成）単一もしくは複数の融合物であるいずれかの配列を含むタンパク質をコードし得る。このようなタンパク質は、限定されるものではないが、ＷＯ０１／７９２５８、ＷＯ０１／７９２７１、ＷＯ０１／７９４４２、ＷＯ０１／７９４４３、ＷＯ０１／７９４４４およびＷＯ０１／７９４８０に示されているリスト、またはその変異体もしくは断片から入手することができ、これらの開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる。これらの特許出願はアルブミンの融合相手に関してタンパク質のリストを示しているが、本発明はそれに限定されるものでなく、本発明の目的では、そこに挙げられているタンパク質のいずれのものを単独で供してもよいし、あるいはまた、アルブミン、免疫グロブリンのＦｃ領域、トランスフェリン、ラクトフェリンもしくは他のいずれかのタンパク質、または上記のうちいずれかの断片もしくは変異体の融合相手として、目的ポリペプチドとして供してもよい。
【０１７６】
この異種タンパク質は治療上活性なタンパク質であってもよい。言い換えれば、それはヒトなどの個体において認識される医療効果を有し得る。当技術分野では、多くの異なる種類の治療上活性なタンパク質が周知である。
【０１７７】
この異種タンパク質は酵母において分泌を引き起こすのに有効なリーダー配列を含んでいてもよい。
【０１７８】
宿主細胞からタンパク質を分泌させるため、多くの天然または人工ポリペプチドシグナル配列（分泌プレ領域とも呼ばれる）が使用または開発されている。このシグナル配列は、細胞から周辺の培地へ、あるいはある場合には、原形質周辺空間へタンパク質を輸出する細胞機構に未完成タンパク質を向ける。このシグナル配列は、必ずというわけではないが、通常、一次翻訳産物のＮ末端に位置し、必ずというわけではないが、通常、分泌過程でそのタンパク質を切断して「成熟」タンパク質とする。
【０１７９】
ある種のタンパク質の場合、シグナル配列の除去後、最初に分泌されるものは、「プロ」配列と呼ばれる、そのＮ末端における付加的アミノ酸を含み、この中間的なものは「プロタンパク質」と呼ばれる。これらのプロ配列は、最終的なタンパク質を折りたたみ、機能的となるよう助け、通常、その後に切断されると考えられる。他の場合では、このプロ領域は、単に、酵素がプレ−プロ領域を切断するための切断部位を提供し、別の機能を持つことは知られていない。
【０１８０】
プロ配列は細胞からのタンパク質の分泌の際か、または細胞から周辺培地または原形質周辺空間への輸出の後かのいずれかに除去され得る。
【０１８１】
タンパク質の分泌を命令するポリペプチド配列は、それらがシグナル（すなわち、プレ）配列に似ていようがプレプロ分泌配列に似ていようが、リーダー配列と呼ばれる。タンパク質の分泌は、翻訳、移動および翻訳後プロセシングを含む動的プロセスであり、これらの段階の１以上は、必ずしも別の段階が開始または完了する前に完了しない場合がある。
【０１８２】
酵母サッカロミセス・セレビシエ、チゴサッカロミセス種、クルイベロミセス・ラクチスおよびピキア・パストリスなどの真核生物種におけるタンパク質の生産では、既知のリーダー配列としては、Ｓ．セレビシエ酸性ホスファターゼタンパク質（Ｐｈｏ５ｐ）（ＥＰ３６６４００参照）、インベルターゼタンパク質（Ｓｕｃ２ｐ）（Smith et al. (1985) Science, 229, 1219-1224参照）および熱ショックタンパク質−１５０（Ｈｓｐ１５０ｐ）（ＷＯ９５／３３８３３参照）由来のものが挙げられる。さらに、Ｓ．セレビシエ接合因子α−１タンパク質（ＭＦα−１）由来、ならびにヒトリゾチームおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）タンパク質由来のリーダー配列が使用されており、ヒトアルブミン分泌のためには後者のものが特に使用されているが、他を排除するものではない。ＷＯ９０／０１０６３は、ＭＦα−１とＨＳＡリーダー配列の融合を記載しており、これはＭＦα−１リーダー配列を使用するよりも、混入するヒトアルブミン断片の生産を有利に減じる。改変型リーダー配列も本願の実施例で開示され、読者はこれらのリーダー配列がトランスフェリン以外のタンパク質とともに使用できることが分かるであろう。さらに、天然トランスフェリンリーダー配列を用いて、トランスフェリンおよび他の異種タンパク質の分泌を指示してもよい。
【０１８３】
シャペロンがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼであれば、好ましくは、この異種タンパク質は成熟型のジスルフィド結合を含む。このジスルフィド結合は分子内および／または分子間に存在し得る。
【０１８４】
異種タンパク質は商業上有用なタンパク質であってもよい。数種の異種により発現されるタンパク質は、細胞の活動に有益な作用をもたらすために、それらが発現される細胞と相互作用させようとするものである。これらのタンパク質はそれら自体、商業上有用なものではない。商業上有用なタンパク質は、それらが発現される細胞のex vivoでの有用性を有するタンパク質である。しかしながらやはり、当業者ならば、商業上有用なタンパク質もまた、それを異種タンパク質として発現する宿主細胞に対して生物学的作用を有し得るが、その作用はそこでタンパク質を発現するための主な理由または唯一の理由ではないことが分かるであろう。
【０１８５】
一つの実施態様では、異種タンパク質がβ−ラクタマーゼでないことが好ましい。もう１つの実施態様では、異種タンパク質がアンチスタシンでないことが好ましい。しかしながら、これらのタンパク質の中に、本発明による２μｍ系プラスミドに由来しているβ−ラクタマーゼまたはアンチスタシンのいずれかをコードする遺伝子以外に、本発明による２μｍ系プラスミド上に存在するものはないこと、および単に、異種タンパク質をコードしている遺伝子は、β「−ラクタマーゼおよび／またはアンチスタシン以外のタンパク質をコードすることが分かるであろう。
【０１８６】
プラスミドは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001, 3rd edition（それらの内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているものなど当技術分野で周知の技術を用いて、シャペロンをコードしている遺伝子を挿入し、さらに異種タンパク質をコードしている遺伝子を挿入することで、当技術分野で公知の２μｍ系プラスミドを改変することにより作製することができる。例えば、このような方法の１つは、付着末端による連結を含む。適合する付着末端は、好適な制限酵素により、挿入用のＤＮＡ断片およびプラスミド上に作製することができる。これらの末端は相補的塩基対の形成によってすぐにアニーリングし、残ったニックはＤＮＡリガーゼの作用によって閉じることができる。
【０１８７】
別の方法では、合成二本鎖オリゴヌクレオチドリンカーおよびアダプターを用いる。平滑末端を有するＤＮＡ断片は、凸部３’末端を除去し、凹部３’末端を埋めるバクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩによって作製される。所定の制限酵素に対する認識配列を含む合成リンカーおよび平滑末端化二本鎖ＤＮＡは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより平滑末端化ＤＮＡ断片に連結することができる。次に、それらを適当な制限酵素で消化して付着末端を作出し、適合する末端を有する発現ベクターに連結する。アダプターはまた、連結に用いられる平滑末端を１つ含むが、予め作製された付着末端も有する、化学的に合成されたＤＮＡ断片でもある。あるいは、ＤＮＡ断片は、１以上の合成二本鎖オリゴヌクレオチド（場合によって、付着末端を含んでもよい）の存在下または不在下でＤＮＡリガーゼの作用によりともに連結することができる。
【０１８８】
多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーが、Sigma-Genosys Ltd, London Road, Pampisford, Cambridge, United Kingdomをはじめとする多くの供給者から市販されている。
【０１８９】
２μｍ系プラスミドにおける適当な挿入部位としては、限定されるものではないが、上述のものが挙げられる。
【０１９０】
本発明によれば、上記のようなプラスミドを含む宿主細胞も提供される。宿主細胞はいずれの細胞種でもよい。細菌および酵母の宿主細胞が好ましい。細菌宿主細胞は、クローニング目的で有用であり得る。酵母宿主細胞は、プラスミドに存在する遺伝子の発現に有用であり得る。
【０１９１】
一つの実施態様では、宿主細胞は、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、またはピキア属のメンバー、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、クルイベロミセス・ラクチス、ピキア・パストリスおよびピキア・メンブラネファシエンスなどの酵母細胞であり、あるいは、チゴサッカロミセス・ルクシー、チゴサッカロミセス・バイリー、チゴサッカロミセス・フェルメンタチ、またはクルイベロミセス・ドロソフィラルムが好ましい。
【０１９２】
宿主細胞種は用いるプラスミド種との適合性に関して選択すればよい。１つの酵母種から得られたプラスミドは、他の酵母種で維持可能である(Irie et al, 1991, Gene, 108(1), 139-144; Irie et al, 1991, Mol. Gen. Genet., 225(2), 257-265)。例えば、チゴサッカロミセス・ルクシー由来のｐＳＲ１は、サッカロミセス・セレビシエで維持可能である。好ましくは、この宿主細胞は用いる２μｍ系プラスミドと適合する（次のプラスミドについて詳しくは下記を参照）。例えば、プラスミドがｐＳＲ１、ｐＳＢ３またはｐＳＢ４に基づく場合、好適な酵母細胞はチゴサッカロミセス・ルクシーであり、プラスミドがｐＳＢ１またはｐＳＢ２に基づく場合、好適な酵母細胞はチゴサッカロミセス・バイリーであり、プラスミドがｐＳＭ１に基づく場合、好適な酵母細胞はチゴサッカロミセス・フェルメンタチであり、プラスミドがｐＫＤ１に基づく場合、好適な酵母細胞はクルイベロミセス・ドロソフィラルムであり、プラスミドがｐＰＭ１に基づく場合、好適な酵母細胞はピキア・メンブラネファシエンスであり、プラスミドが２μｍプラスミドに基づく場合、好適な酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエまたはサッカロミセス・カルルスベルゲネシスである。プラスミドが２μｍプラスミドに基づき、酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエであるのが特に好ましい。
【０１９３】
本発明による２μｍ系プラスミドは、それが天然プラスミドに由来する配列を有する遺伝子ＦＬＰ、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２の１つ、２つまたは好ましくは３つを含んでいるならば、天然プラスミドに基づくと言える。
【０１９４】
例えば、遺伝子コード配列の分断により、タンパク質のＯ−グリコシル化に関与する１以上のタンパク質マンノシルトランスフェラーゼに欠損のある酵母を用いることが特に有利であり得る。
【０１９５】
組換え発現したタンパク質は、生産宿主細胞により望ましくない翻訳後修飾を受けることがある。例えば、アルブミンタンパク質配列はＮ結合型グリコシル化の部位を含まず、自然状態でＯ結合型グリコシル化により修飾されるとの報告はない。しかしながら、多くの酵母種で産生される組換えヒトアルブミン（「ｒＨＡ」）は、一般にマンノースを巻き込むＯ結合型グリコシル化により修飾可能であることが判明した。マンノシル化されたアルブミンはレクチンコンカナバリンＡと結合し得る。酵母により産生されたマンノシル化アルブミンの量は、１以上のＰＭＴ遺伝子を欠いた酵母株を用いて減少させることができる（ＷＯ９４／０４６８７）。これを達成する最も便宜な方法は、そのゲノムに、Ｐｍｔタンパク質のうちの１つを低レベルでしか産生しないような欠陥を有する酵母を作出することである。例えば、Ｐｍｔタンパク質をわずかしか、または全く産生しないような、コード配列または調節領域における（またはＰＭＴ遺伝子の１つの発現を調節する別の遺伝子における）欠失、挿入または転位があり得る。あるいは、この酵母は、抗Ｐｍｔ抗体などの抗Ｐｍｔ剤を産生するように形質転換させることもできる。
【０１９６】
Ｓ．セレビシエ以外の酵母を用いる場合、例えば、ピキア・パストリスまたはクルイベロミセス・ラクチスにおいて、Ｓ．セレビシエのＰＭＴ遺伝子に相当する１以上の遺伝子を分断することも有益である。Ｓ．セレビシエから単離されたＰＭＴ１（または他のいずれかのＰＭＴ遺伝子）の配列を、他の真菌種における同等の酵素活性をコードしている遺伝子の同定または分断に用いてもよい。クルイベロミセス・ラクチスのＰＭＴ１ホモログのクローニングはＷＯ９４／０４６８７に記載されている。
【０１９７】
酵母は、それぞれＷＯ９５／３３８３３およびＷＯ９５／２３８５７に教示されているように、ＨＳＰ１５０および／またはＹＡＰ３遺伝子の欠失を有していることが有利である。
【０１９８】
上記で定義したプラスミドは標準的な技術によって宿主に導入することができる。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad Sci. USA 69, 2110およびSambrook et al (2001)  Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY参照。酵母細胞の形質転換は、Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。Beggs (1978) Nature 275, 104-109の方法も有用である。Ｓ．セレビシエの形質転換方法は一般に、ＥＰ２５１７４４、ＥＰ２５８０６７およびＷＯ９０／０１０６３で教示されている（これらは総て、引用することにより本明細書の一部とされる）。脊椎動物細胞に関しては、このような細胞の形質転換に有用な試薬、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤がStratagene Cloning SystemsまたはLife Technologies Inc.,  Gaithersburg, MD 20877, USAから入手できる。
【０１９９】
細胞の形質転換にはまた、エレクトロポレーションも有用であり、エレクトロポレーションは酵母細胞、細菌細胞および脊椎動物細胞を形質転換するためのものとして当技術分野で周知のものである。エレクトロポレーションによる酵母の形質転換法は、Becker & Guarente (1990) Methods Eszymol. 194, 182に開示されている。
【０２００】
一般に、プラスミドは、総ての宿主を形質転換するわけではないので、形質転換宿主細胞を選択する必要がある。よって、プラスミドは、限定されるものではないが、細菌選択マーカーおよび／または酵母選択マーカーをはじめとする選択マーカーを含み得る。典型的な細菌選択マーカーはβ−ラクタマーゼ遺伝子であるが、その他多くのものが当技術分野で公知である。典型的な好適な酵母選択マーカーとしては、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＳＦＡ１、ＡＤＥ２、ＭＥＴ１５、ＬＹＳ５、ＬＹＳ２、ＩＬＶ２、ＦＢＡ１、ＰＳＥ１、ＰＤＩ１およびＰＧＫ１が挙げられる。当業者ならば、ｐｇｋ１酵母株のＰＧＫ１で実証されているように(Piper and Curran, 1990, Curr. Genet. 17, 119)、プラスミド上に機能的遺伝子が提供されている場合には、その染色体欠失または不活性化が生存力のない宿主を作り出すいずれかの遺伝子、いわゆる必須遺伝子を選択マーカーとして使用できることが分かるであろう。好適な必須遺伝子はStanfordゲノムデータベース（ＳＧＤ）、http:://db.yeastgenome.orgに見出せる。欠失または不活性化した際に栄養（生合成）要求とならない必須遺伝子産物（例えば、ＰＤＩ１、ＰＳＥ１、ＰＧＫ１またはＦＢＡ１）は、プラスミドの不在下で、特定の選択条件下で細胞を培養する必要があるという不都合なく、プラスミドの安定性の増強を達成するためにその遺伝子産物を産生できない宿主細胞のプラスミドにおいて、選択マーカーとして使用できる。「栄養（生合成）要求性」とは、増殖培地に対する添加または改変によって補償できる欠陥を含む。よって、本発明において好ましい「必須マーカー遺伝子」は、宿主細胞で欠失または不活性化した際に、増殖培地に対する添加または改変によっては補償できない欠陥をもたらすものである。
【０２０１】
さらに、本発明の第一、第二または第三の態様のいずれか１つに従うプラスミドは、１を超える選択マーカーを含み得る。
【０２０２】
１つの選択技術としては、形質転換細胞において選択形質をコードしているＤＮＡ配列マーカーを必要な制御エレメントとともに発現ベクターに組み込むことを含む。これらのマーカーとしては、真核細胞培養に関してはジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８またはネオマイシン耐性、および大腸菌およびその他の細菌の培養に関してはテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン（すなわち、β−ラクタマーゼ）耐性遺伝子が挙げられる。あるいは、このような選択形質の遺伝子は、目的の宿主細胞と同時形質転換するのに用いる別のベクター上にあってもよい。
【０２０３】
首尾よく形質転換した細胞を同定する別法としては、本発明によるプラスミドの導入から得られた細胞を増殖させ、場合によって、組換えポリペプチド（すなわち、プラスミド上のポリヌクレオチド配列によりコードされており、かつ、そのポリペプチドがその宿主により自然には産生されないという意味で、宿主細胞にとっては異種であるポリペプチド）を発現させる。細胞を採集し、溶解し、Southern (1975) J Mol. Biol. 98, 503またはBerent et al (1985) Biotech. 3, 208が記載しているものなどの方法、または当技術分野で一般的なＤＮＡおよびＲＮＡ分析の他の方法を用い、ＤＮＡまたはＲＮＡ内容物を組換え配列が存在しているかどうか調べることができる。あるいは、形質転換細胞の培養物の上清中のポリペプチドの存在を、抗体を用いて検出することもできる。
【０２０４】
組換えＤＮＡの存在に関して直接アッセイすることに加え、形質転換の成功は、組換えＤＮＡがタンパク質の発現を命令し得る場合は、周知の免疫学的方法により確認することができる。例えば、発現ベクターで首尾よく形質転換した細胞は、適当な抗原性を示すタンパク質を産生する。形質転換されたと考えられる細胞のサンプルを採集し、好適な抗体を用いてそのタンパク質に関してアッセイする。
【０２０５】
このように、形質転換宿主細胞それら自体に加え、本発明はまた、栄養培地中でのこれらの細胞の培養、好ましくは、モノクローナル（クローン的均一）培養、またはモノクローナル培養由来の培養も意図する。あるいは、形質転換細胞は、工業上／商業上または医薬上有用な産物であり得、さらなる精製なしに使用することもでき、あるいは、培養培地から精製し、所望により、それらの意図する工業上／商業上または医薬上の使用に適当な様式で担体または希釈剤とともに製剤化し、また、所望により、その使用に適した様式でパッケージングおよび提供することができる。例えば、全細胞を埋植するか、または細胞培養物を工程、作物またはその他の目的の標的上／中へ直接噴霧するのに使用できる。同様に、酵母細胞などの全細胞を、フラグランス、フレーバーおよび医薬など、極めて多様な適用でカプセルとして使用することもできる。
【０２０６】
次に、形質転換宿主細胞を十分な時間、当業者に公知であり、また、本明細書に開示されている技術の点から適当な条件下で培養し、そのプラスミドによりコードされているシャペロンおよび異種タンパク質を発現させることができる。
【０２０７】
培養培地は非選択性であっても、またはプラスミドの維持に対して選択圧をかけてもよい。
【０２０８】
このようにして生産された異種タンパク質は細胞内に存在するか、または分泌される場合には、培養培地中および／または宿主細胞の原形質周辺の空間に存在し得る。
【０２０９】
「発現した異種タンパク質を培養宿主細胞または培養培地から精製する」工程は、所望により、細胞の固定化、細胞の分離および／または細胞の破砕を含むが、細胞の固定化、分離および／または破砕の工程とは異なる、少なくとも１つの他の精製工程を常に含む。
【０２１０】
細胞の固定化技術、例えば、アルギン酸カルシウムビーズを用いて細胞を封入することなどは当技術分野で周知のものである。同様に、細胞分離技術、例えば、遠心分離、濾過（例えば、クロスフロー濾過、流動床クロマトグラフィーなど）も当技術分野で周知のものである。同様に、細胞破砕法、例えば、ビーズミリング、音波処理、酵素処理なども当技術分野で周知のものである。
【０２１１】
少なくとも１つの他の精製工程は、当技術分野で公知のタンパク質精製に好適な他のいずれの工程であってもよい。例えば、組換え発現したアルブミンの回収のための精製技術はＷＯ９２／０４３６７（マトリックス由来色素の除去）、ＥＰ４６４５９０（酵母由来着色物質の除去）、ＥＰ３１９０６７（アルカリ沈殿とそれに続く、親油相に対するアルブミンの適用）、ならびにＷＯ９６／３７５１５、米国特許第５７２８５５３号およびＷＯ００／４４７７２（完全精製工程を記載）に開示されており、これらは総て、引用することにより本明細書の一部とされる。
【０２１２】
アルブミン以外のタンパク質は、培養培地から、そのようなタンパク質を精製するのに有用であることが分かっているいずれかの技術によって精製することができる。
【０２１３】
好適な方法としては、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿法、酸または溶媒抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、濃縮、希釈、ｐＨ調整、ダイアフィルトレーション、限外濾過、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ、伝導性調整などが挙げられる。
【０２１４】
一つの実施態様では、上述の技術のうちいずれか１以上を用い、このようにして単離されたタンパク質を商業上または工業上許容されるレベルの純度にまでさらに精製してもよい。商業上または工業上許容されるレベルの純度に、本発明者らは、少なくとも０．０１ｇ．Ｌ−１、０．０２ｇ．Ｌ−１、０．０３ｇ．Ｌ−１、０．０４ｇ．Ｌ−１、０．０５ｇ．Ｌ−１、０．０６ｇ．Ｌ−１、０．０７ｇ．Ｌ−１、０．０８ｇ．Ｌ−１、０．０９ｇ．Ｌ−１、０．１ｇ．Ｌ−１、０．２ｇ．Ｌ−１、０．３ｇ．Ｌ−１、０．４ｇ．Ｌ−１、０．５ｇ．Ｌ−１、０．６ｇ．Ｌ−１、０．７ｇ．Ｌ−１、０．８ｇ．Ｌ−１、０．９ｇ．Ｌ−１、１ｇ．Ｌ−１、２ｇ．Ｌ−１、３ｇ．Ｌ−１、４ｇ．Ｌ−１、５ｇ．Ｌ−１、６ｇ．Ｌ−１、７ｇ．Ｌ−１、８ｇ．Ｌ−１、９ｇ．Ｌ−１、１０ｇ．Ｌ−１、１５ｇ．Ｌ−１、２０ｇ．Ｌ−１、２５ｇ．Ｌ−１、３０ｇ．Ｌ−１、４０ｇ．Ｌ−１、５０ｇ．Ｌ−１、６０ｇ．Ｌ−１、７０ｇ．Ｌ−１、７０ｇ．Ｌ−１、９０ｇ．Ｌ−１、１００ｇ．Ｌ−１、１５０ｇ．Ｌ−１、２００ｇ．Ｌ−１、２５０ｇ．Ｌ−１、３００ｇ．Ｌ−１、３５０ｇ．Ｌ−１、４００ｇ．Ｌ−１、５００ｇ．Ｌ−１、６００ｇ．Ｌ−１、７００ｇ．Ｌ−１、８００ｇ．Ｌ−１、９００ｇ．Ｌ−１、１０００ｇ．Ｌ−１、またはそれ以上の濃度でのタンパク質の提供を含める。
【０２１５】
この異種タンパク質は医薬上許容されるレベルの純度を達成するために精製されるのが好ましい。タンパク質は、パイロジェンフリーであり、そのタンパク質の活性に関連のない医学的作用を引き起こさずに医薬上有効な量で投与可能であるならば、医薬上許容されるレベルの純度を有する。
【０２１６】
得られた異種タンパク質は、その既知の有用性のいずれを目的に使用してもよく、アルブミンの場合には、火傷、ショックおよび血液損失を処置するための患者へのｉ．ｖ．投与、培養培地への補給、および他のタンパク質処方物における賦形剤としての使用が挙げられる。
【０２１７】
本発明によるプロセスによって得られた治療上有用な異種タンパク質は単独で投与することもできるが、１以上の許容される担体または希釈剤とともに医薬製剤として提供することが好ましい。担体または希釈剤は、目的タンパク質と適合し、かつ、そのレシピエントに害がないという意味において「許容」されるものでなければならない。一般に、担体または希釈剤は、無菌かつパイロジェンフリーの水または生理食塩水である。
【０２１８】
所望により、製剤化されたタンパク質を錠剤、カプセル剤、注射溶液などのような形態で単位投与形にて提供する。
【０２１９】
本発明のさらなる実施態様は、ＰＤＩおよびトランスフェリンに基づくタンパク質の配列を含むタンパク質を組換え的にコードしている宿主細胞を提供する。「トランスフェリンに基づくタンパク質」とは、トランスフェリンまたはトランスフェリンファミリーの他のいずれかのメンバー（例えば、ラクトフェリン）、その変異体もしくは断片、または上記の種類を含むトランスフェリン、その変異体もしくは断片を含む融合タンパク質を意味する。よって、本発明はまた、トランスフェリンに基づくタンパク質の発現を増強するための組換えＰＤＩ遺伝子の使用も提供する。
【０２２０】
このＰＤＩ遺伝子は、上記の２μｍ系プラスミドなどのプラスミド上に提供してもよい。あるいは、ＰＤＩ遺伝子は、染色体に組み込んでもよい。好ましい実施態様では、ＰＤＩ遺伝子は内因的にコードされているＰＤＩ遺伝子の遺伝子座において、好ましくは内因的ＰＤＩ遺伝子の発現を妨害することなく、染色体に組み込まれる。これに関して、「内因的ＰＤＩ遺伝子の発現を妨害することなく」とは、組込みの結果として内因的ＰＤＩ遺伝子からのタンパク質産生のいくらかの低下が許容されるものである（好ましくは、低下がない）ことを意味し、内因的ＰＤＩ遺伝子と組み込まれたＰＤＩ遺伝子からの発現を合わせた作用の結果としての、改変宿主細胞におけるＰＤＩタンパク質産生の総レベルが、組込み前の宿主細胞によるＰＤＩタンパク質産生レベルよりも高くなっている。
【０２２１】
トランスフェリンに基づくタンパク質をコードしている遺伝子は、上記の２μｍ系プラスミドなどのプラスミド上に提供してもよいし、または、内因的にコードされているＰＤＩ遺伝子の遺伝子座などに、好ましくは、内因的ＰＤＩ遺伝子の発現を妨害することなく、染色体に組み込んでもよい。
【０２２２】
一つの実施態様では、ＰＤＩ遺伝子は染色体に組み込まれ、トランスフェリンに基づくタンパク質をコードしている遺伝子はプラスミド上に提供される。もう１つの実施態様では、ＰＤＩ遺伝子はプラスミド上に提供され、トランスフェリンに基づくタンパク質をコードしている遺伝子は染色体に組み込まれる。さらに別の実施態様では、ＰＤＩ遺伝子とトランスフェリンに基づくタンパク質をコードしている遺伝子の双方が染色体に組み込まれる。さらに別の実施態様では、ＰＤＩ遺伝子とトランスフェリンに基づくタンパク質をコードしている遺伝子の双方がプラスミド上に提供される。
【０２２３】
上述のように、Bao et al, 2000, Yeast, 16, 329-341は、Ｋ．ラクチス  ＰＤＩ遺伝子ＫｌＰＤＩ１の過剰発現はＫ．ラクチス細胞に有害であったことを報告している。こういったことを背景に、本発明者らは、驚くことに、Bao et alが報告している悪影響なく、ＰＤＩおよび他のシャペロンを過剰発現させることができるだけでなく、同じ細胞で２つの異なるシャペロンを組換え的に過剰発現させることができ、毒性というよりむしろ、いずれかのシャペロンの個々の発現により得られるレベルよりも高いレベルまで異種タンパク質の発現を高めることができる。これは予期されたことではなかった。これに対し、Bao et alの教示に照らせば、２つのシャペロンの過剰発現は一方の過剰発現よりもいっそう毒性が高いと思われるところである。さらに、本発明による初期の知見に照らせば、単一のシャペロンとの同時発現によって得られる異種タンパク質発現の増強は、用いる細胞系に可能な最大レベルであると予測された。従って、２つの異なるシャペロンと異種タンパク質との同時発現により、異種タンパク質発現のいっそうさらなる増強を得ることができるとの知見は特に驚くべきことである。
【０２２４】
よって、本発明の第五の態様によれば、異種タンパク質を製造する方法が提供され、該方法は、第一のシャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子、第二のシャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子、および異種タンパク質をコードしている第三の組換え遺伝子を含む宿主細胞（上記のものなど）を準備すること（なお、この第一のシャペロンと第二のシャペロンは異なっている）；その宿主細胞を、培養培地中、第一、第二および第三の遺伝子の発現を可能とする条件下で培養すること；および、所望により、発現した異種タンパク質を培養宿主細胞または培養培地から精製すること；さらには、所望により、精製されたタンパク質を凍結乾燥することを含んでなる。
【０２２５】
この方法は、精製された異種タンパク質を担体または希釈剤ともに製剤化し、所望により、このようにして製剤化されたタンパク質を上述のような方法にて単位投与形で提供する工程をさらに含んでもよい。
【０２２６】
「組換え遺伝子」とは、「独立した」発現可能な配列として独立して作動し、コードされているタンパク質を産生する核酸配列、あるいはまた、標的タンパク質の高い発現を生じさせるように宿主内で内在配列と一緒に作動する、導入された（例えば、内在配列とは異なる核酸配列を産生するように内在配列に組み込むことによる）核酸配列を含む。
【０２２７】
第一および第二のシャペロンは上述のようなシャペロンであってよく、同じ宿主細胞で同時発現させた際に異種タンパク質の発現の増強に相加作用をもたらすシャペロンの組合せである。「相加作用」とは、宿主細胞における異種タンパク質の発現レベルが、同じ系の（ｉ）第一の組換え遺伝子を、第二の組換え遺伝子の発現の不在下で、第三の組換え遺伝子と同時発現させる場合、および（ii）第二の組換え遺伝子を、第一の組換え遺伝子の発現の不在下で、第三の組換え遺伝子と同時発現させる場合と比べ、第一および第二の組換え遺伝子を第三の組換え遺伝子と同時発現させるほうが高いという意味を含む。
【０２２８】
１つの好ましいシャペロンは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼである。別の好ましいシャペロンはＯＲＭ２またはその断片もしくは変異体である。特に好ましい実施態様では、第一および第二のシャペロンはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびＯＲＭ２またはその断片もしくは変異体である。
【０２２９】
第一、第二および第三の組換え遺伝子は各々独立に宿主細胞内のプラスミド（例えば、上述のような２μｍ系プラスミド）上に存在してもよいし、あるいは、宿主細胞のゲノム内の染色体に組み込んでもよい。プラスミドと染色体に組み込まれる第一、第二および第三の組換え遺伝子のいずれの組合せを用いてもよいと考えられる。例えば、第一、第二および第三の組換え遺伝子は各々独立にプラスミド上に存在してもよく、これは同じプラスミドであっても異なるプラスミドであってもよい。あるいは、第一の組換え遺伝子がプラスミド上に存在し、第二および第三の組換え遺伝子が宿主細胞のゲノム内の染色体に組み込まれてもよい。あるいは、第一および第二の組換え遺伝子がプラスミド上に存在し、第三の組換え遺伝子が宿主細胞のゲノム内の染色体に組み込まれてもよい。あるいは、第一および第三の組換え遺伝子がプラスミド上に存在し、第二の組換え遺伝子が宿主細胞のゲノム内の染色体に組み込まれてもよい。あるいは、第一および第二の組換え遺伝子が宿主細胞のゲノム内の染色体に組み込まれ、第三の組換え遺伝子がプラスミド上に存在してもよい。あるいは、第一、第二および第三の  組換え遺伝子が各々独立に宿主細胞のゲノム内の染色体に組み込まれてもよい。
【０２３０】
特に好ましいプラスミド、本発明の上述の態様に関して上記で定義されたものである。従って、本発明はまた、異なるシャペロンをコードしている２つの異なる遺伝子（第一および第二の組換え遺伝子）を含む上記で定義したようなプラスミドも提供する。１つの好ましい実施態様では、このプラスミドは、上記のような異種タンパク質などの異種タンパク質（第三の組換え遺伝子）をコードしている遺伝子をさらに含み得る。
【０２３１】
本発明の第六の態様では、本発明の上述の態様に関して上記で定義された異種タンパク質などの異種タンパク質を製造する方法が提供され、該方法は、ＯＲＭ２の配列またはその変異体を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子と、異種タンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子とを含む宿主細胞を準備すること；その宿主細胞を、培養培地中、第一および第二の遺伝子の発現を可能とする条件下で培養すること；発現した異種タンパク質を培養宿主細胞または培養培地から精製すること；および、所望により、精製されたタンパク質を凍結乾燥すること；および、所望により、精製された異種タンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化すること；および、所望により、製剤化されたタンパク質を単位投与形で提供することを含んでなる。
【０２３２】
上述の様式では、宿主細胞は、ＯＲＭ２に代わるシャペロンの配列またはその変異体を含むタンパク質をコードしているさらなる組換え遺伝子をさらに含んでもよい。
【０２３３】
第一および第二の組換え遺伝子のいずれか、または双方はプラスミドから、好ましくは同じプラスミドから発現させることができる。また、ＯＲＭ２に代わるシャペロンの配列またはその変異体を含むタンパク質をコードしているさらなる組換え遺伝子も、プラスミドから、好ましくは第一および第二の組換え遺伝子の一方または双方と同じプラスミドから発現させることができる。このプラスミドは、２μｍプラスミドなどの２μｍ系プラスミドであり得る。
【０２３４】
本発明の第七の態様によれば、宿主細胞内での核酸配列および組換え遺伝子の同時発現により、宿主細胞の組換え遺伝子によりコードされている異種タンパク質の、宿主細胞における生産を高めることを目的とした、タンパク質ＯＲＭ２またはその変異体をコードしている核酸配列の使用も提供される。核酸配列および異種タンパク質をコードしている組換え遺伝子のいずれか一方または双方を宿主細胞内のプラスミド、好ましくは同じプラスミドから発現させてもよい。上述の様式では、宿主細胞は、ＯＲＭ２に代わるシャペロンまたはその変異体をコードしている組換え遺伝子をさらに含んでもよく、これは宿主細胞内のプラスミド、好ましくは前記核酸配列および異種タンパク質をコードしている組換え遺伝子のいずれか一方または双方と同じプラスミド上に位置していてよい。好適なプラスミドとしては、上述のような２μｍプラスミドなどの２μｍ系プラスミドが挙げられる。
【０２３５】
本発明の第八の態様によれば、異種タンパク質をコードしている組換え遺伝子とＯＲＭ２またはその変異体をコードしている遺伝子を同じプラスミド上に提供することによって異種タンパク質の生産を高めることを目的とした、発現ベクターとしてのプラスミドの使用も提供される。このプラスミドは、上述の様式においてＯＲＭ２に代わるシャペロンまたはその変異体をコードしている遺伝子をさらに含み得る。好適なプラスミドとしては、上述のような２μｍプラスミドなどの２μｍ系プラスミドが挙げられる。
【０２３６】
よって、本発明の第九の態様によれば、上述のように、タンパク質ＯＲＭ２またはその変異体もしくは断片をコードしている第一の遺伝子と異種タンパク質をコードしている第二の遺伝子を含むプラスミド、好ましくは発現プラスミド、も提供される。このプラスミドは、ＯＲＭ２に代わるシャペロンまたはその変異体をコードしている第三の遺伝子をさらに含んでもよい。好ましい実施態様では、この第三の遺伝子は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼの配列を含むタンパク質をコードしている。
【０２３７】
発明者らはまた、ＰＤＩのような「必須」シャペロンの配列を含むタンパク質をコードしているプラスミド保持遺伝子が、プラスミドの不在下ではシャペロンを産生しない宿主細胞内でプラスミドを安定維持するのに使用でき、同時に、宿主細胞内の組換え遺伝子によりコードされている異種タンパク質の発現を高めるということも実証した。この系は、使用者が、プラスミドが保持する必要のある組換え遺伝子の数を最小限とできることから有利である。例えば、典型的な先行技術のプラスミドは、宿主細胞培養工程中にプラスミドの安定維持を可能とするマーカー遺伝子（上記のものなど）を有する。このようなマーカー遺伝子は、目的の作用を達成するのに必要ないずれかのさらなる遺伝子に加えて、プラスミド上に保持される必要がある。しかしながら、外因的ＤＮＡ配列を組み込むプラスミドの能力には限りがあるので、目的の効果を達成するために必要な配列挿入の数を最小限とすることが有利である。さらに、いくつかのマーカー遺伝子（栄養要求性マーカー遺伝子など）は、そのマーカー遺伝子の効果を得るために、培養工程を特定の条件下で行う必要がある。このような特定条件は細胞増殖またはタンパク質産生にとっては最適なものでない場合もあり、あるいは非効率もしくは過度に費用のかかる増殖系が必要な場合もある。
【０２３８】
異種遺伝子発現を増強する目的で、本発明者らは、宿主細胞での異種タンパク質の産生の増強と、プラスミドの不在下ではシャペロンを産生できない細胞内にプラスミドが存在する場合にそのプラスミド上の選択マーカーの役割という二重の目的で、「必須」シャペロンの配列を含むタンパク質を組換え的にコードしている遺伝子を使用できることを見出した。この系には、プラスミドに保持する必要のある組換え遺伝子の数を最小限とするという利点がある。この系にはまた、プラスミド安定性が失われることなく、いずれの特定のマーカー遺伝子にも適合させる必要のない条件下で宿主細胞を培養することができるという利点がある。例えば、この系を用いて作製した宿主細胞は富栄養培地で培養することができ、これは栄養要求性マーカー遺伝子にそれらの効果を与えるべく一般的に用いられる最小培地よりも経済的であると考えられる。
【０２３９】
よって、本発明の第十の態様によれば、プラスミドを含む宿主細胞が提供され、このプラスミドは、このプラスミドの不在下では宿主細胞がシャペロンを産生できない必須シャペロンをコードしている遺伝子を含んでなる。好ましくは、プラスミドの不在下では、宿主細胞は生存力を有さない。この宿主細胞は、本発明の上述の態様に関して上記したものなどの異種タンパク質をコードしている組換え遺伝子をさらに含んでもよい。
【０２４０】
本発明の第十一の態様によれば、単独の選択マーカーとして、必須シャペロンをコードしている遺伝子を含むプラスミドも提供される。このプラスミドは、異種タンパク質をコードしている遺伝子をさらに含んでいてもよい。このプラスミドは２μｍ系プラスミドであってもよい。
【０２４１】
本発明の第十二の態様によれば、プラスミドを含む宿主細胞を準備する工程（このプラスミドは、そのプラスミドの不在下では宿主細胞がシャペロンを産生できない、必須シャペロンをコードしている遺伝子を含み、この宿主細胞は異種タンパク質をコードしている組換え遺伝子さらに含んでもよい）；その宿主細胞を、培養培地中、必須シャペロンおよび異種タンパク質の発現を可能とする条件下で培養する工程；および、所望により、発現した異種タンパク質を培養宿主細胞または培養培地から精製する工程；および、所望により、精製されたタンパク質をさらに凍結乾燥する工程を含んでなる、異種タンパク質の生産方法も提供される。
【０２４２】
この方法は、精製された異種タンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化する工程、および、所望により、製剤化されたタンパク質を上述の様式で単位投与形で提供する工程をさらに含んでもよい。好ましい一つの実施態様では、この方法は、宿主細胞を富栄養培地などの非選択培地で培養することを含む。
【０２４３】
本発明者らは、また、驚くべきことに、異なるＰＤＩ遺伝子が、特定の培養条件下で異なる量で異種タンパク質の発現を高める能力を有していることを見出した。特に、実施例８で述べるように、本発明者らは、ＳＫＱ２ｎ  ＰＤＩ１遺伝子が、宿主細胞を最小培地で培養した際に、Ｓ２８８ｃ  ＰＤＩ１遺伝子よりも高い異種タンパク質発現をもたらすことを示した。
【０２４４】
ＳＫＱ２ｎ  ＰＤＩ１遺伝子とＳ２８８ｃ  ＰＤＩ１遺伝子のコードされているタンパク質の唯一の違いは、ＳＫＱ２ｎが５０６〜５１３番（上記に示すＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ３８４０２に関して定義されている位置）に付加的なアミノ酸ＥＡＤＡＥＡＥＡを含むことである。
【０２４５】
用いた遺伝子間の違いは図９４に示される配列アラインメントで示され、次のように要約することができる。
・ＳＫＱ２ｎのプロモーターは、一連の１４回の「ＴＡ」反復を含むが、Ｓ２８８のプロモーターは１２回の「ＴＡ」反復しか含まない。
・Ｓｅｒ４１は、ＳＫＱ２ｎではＴＣＴによりコードされているが、Ｓ２８８ｃではＴＣＣによりコードされている。
・Ｇｌｕ４４は、ＳＫＱ２ｎではＧＡＡによりコードされているが、Ｓ２８８ｃではＧＡＧによりコードされている。
・Ｌｅｕ２６２は、ＳＫＱ２ｎではＴＴＧによりコードされているが、Ｓ２８８ｃではＴＴＡによりコードされている。
・Ａｓｐ５１４は、ＳＫＱ２ｎではＧＡＣによりコードされているが、Ｓ２８８ｃでは類似体Ａｓｐ５０６がＧＡＴによりコードされている。
・ＳＫＱ２ｎのターミネーター配列は一連の８個の連続する「Ａ」塩基を含むが、Ｓ２８８ｃのターミネーター配列は一連の７個の連続する「Ａ」塩基を含み、ＳＫＱ２ｎ遺伝子の１８８０番に相当する位置に「Ａ」塩基を含まない。
・ＳＫＱ２ｎのターミネーター配列は１９１９番に「Ｃ」を有するが、Ｓ２８８ｃのターミネーター配列は相当する位置に「Ｔ」を有する。
【０２４６】
宿主細胞を最小培地で培養した際に異種タンパク質発現において観察される増強を達成するためには、選択されたＰＤＩ遺伝子に、ＳＫＱ２ｎ遺伝子の上記特徴のいずれか、または総てを含めることが有利である。
【０２４７】
よって、第十三の態様によれば、宿主細胞を最小培地で培養した際に、宿主細胞内のヌクレオチド配列の発現により、宿主細胞内で異種タンパク質の発現を高めるのに用いるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードしているヌクレオチド配列も提供され、このタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードしているヌクレオチド配列は、次の特徴のうちの少なくとも１つを有することを特徴とする。
・ヌクレオチド配列は、ＰＤＩプロモーターまたはその機能的変異体の配列を有するプロモーターを含み、一連の１４回の「ＴＡ」反復を含む；または
・コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼはアミノ酸ＥＡＤＡＥＡＥＡまたはその保存的に置換された変異体を、一般には、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ３８４０２に関して定義されている５０６〜５１３番に含む；または
・コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの残基Ｓｅｒ４１はコドンＴＣＴによりコードされている；
・コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの残基Ｇｌｕ４４はコドンＧＡＡによりコードされている；
・コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの残基Ｌｅｕ２６２はコドンＴＴＧによりコードされている；または
・コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの残基Ａｓｐ５１４はコドンＧＡＣによりコードされている；または
・そのヌクレオチド配列は天然ＰＤＩターミネーターまたはその機能的変異体の配列を有するターミネーター配列を含み、いずれかは１９１９番に一連の８個の連続する「Ａ」塩基および／または塩基「Ｃ」を含む（天然ＳＫＱ２ｎターミネーター配列の１９１９番に関して定義されている通り）。
【０２４８】
本発明の第十四の態様によれば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードしている組換え遺伝子を含み、かつ、上記定義の核酸配列の配列を有する宿主細胞を準備する工程（この宿主細胞は異種タンパク質をコードしている組換え遺伝子をさらに含む）；この宿主細胞を、最小培養培地中、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと異種タンパク質の発現を可能とする条件下で培養する工程；および、所望により、発現した異種タンパク質を培養宿主細胞または培養培地から精製する工程；さらに、所望により、精製されたタンパク質を凍結乾燥する工程；さらには、所望により、精製された異種タンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化する工程；および、所望により、製剤化されたタンパク質を上述の様式にて単位投与形で提供する工程を含んでなる、異種タンパク質の製造方法も提供される。
【０２４９】
ＰＤＩおよび異種タンパク質をコードしている遺伝子は、本発明の他の実施態様に関して上記した様式で提供することができる。
【０２５０】
本発明者らはまた、本発明の他の実施態様に従う組換え提供されるシャペロンの作用が、そのシャペロンの発現レベルを制御するプロモーターを改変することにより調整できることも見出した。驚くことに、本発明者らは、いくつかの場合で、短いプロモーターが異種タンパク質発現の増強をもたらすことを見出した。特定の理論に縛られるものではないが、本発明者らは、これがすでに高レベルで異種タンパク質を発現する宿主細胞における組換えシャペロンの発現が、細胞にそれら自体、異種により発現されるタンパク質を過負荷させ、それにより異種タンパク質の生産に全体的な増強がほとんど、または全く達成されないためであると考えている。このような場合、組換えシャペロン遺伝子を末端切断型プロモーターとともに提供すると有益な場合がある。
【０２５１】
よって、本発明の第十五の態様によれば、宿主細胞（上記で定義したようなもの）内でのポリヌクレオチド配列の発現により、宿主細胞内での異種タンパク質（上記のようなもの）の発現を高めるために用いる、シャペロン（上記のようなもの）をコードしているコード配列に作動可能なように連結されたプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（上記で定義したプラスミドなど）が提供され、ここで、このプロモーターは、そのコード配列がその天然プロモーターに作動可能なように連結されていた場合に達成されるであろうものから改変されている、例えば、それより高い、または低いシャペロン発現レベルを果たすことを特徴とする。
【０２５２】
本発明の第十六の態様によれば、シャペロンをコードしているコード配列に作動可能なように連結されたプロモーター（このプロモーターは、そのコード配列がその天然プロモーターに作動可能なように連結されていた場合に達成されるであろうものよりも低いレベルのシャペロン発現を果たすことを特徴とする）の配列を含む組換え遺伝子を含み、かつ、異種タンパク質をコードしている組換え遺伝子をさらに含む宿主細胞を準備する工程；その宿主細胞をシャペロンおよび異種タンパク質の発現を可能とする条件下で培養する工程；および、所望により、発現した異種タンパク質を培養宿主細胞または培養培地から精製する工程；さらに、所望により、精製されたタンパク質を凍結乾燥する工程；さらに、所望により、精製された異種タンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化する工程；および、所望により、製剤化されたタンパク質を上述の様式にて単位投与形で提供する工程を含んでなる、異種タンパク質の製造方法も提供される。
【０２５３】
本明細書に記載の実施例から明らかなように、組換え発現したＰＤＩとトランスフェリンに基づくタンパク質の組合せは、驚くほど高いレベルのトランスフェリン発現をもたらす。例えば、染色体にコードされている組換えＰＤＩ遺伝子を含む系におけるトランスフェリン発現は２倍の増強をもたらした（染色体にコードされている組換えＰＤＩ遺伝子を含まない対照と比較）。この増強は、組換えトランスフェリン遺伝子の代わりにヒトアルブミンをコードしている組換え遺伝子を含む同等の系よりも５倍高かった。
【０２５４】
宿主は原核細胞（例えば、大腸菌などの細菌細胞）または真核細胞など、いずれの細胞種でもよい。好ましい真核細胞としては、酵母細胞などの真菌細胞、および哺乳類細胞が挙げられる。酵母細胞の例は上記で述べられている。哺乳類細胞の例としては、ヒト細胞が挙げられる。
【０２５５】
上記のような宿主細胞を培養して組換えトランスフェリンに基づくタンパク質を生産することができる。このようにして生産されたトランスフェリンに基づくタンパク質を培養物から単離し、例えば、当技術分野で公知であり、かつ／または上記で示したような技術を用い、好ましくは、医薬上許容されるレベルの純度にまで精製することができる。精製されたトランスフェリンに基づくタンパク質は、医薬上許容される担体または希釈剤とともに製剤化してもよく、単位投与形で提供してもよい。
【０２５６】
以下、本発明を非限定的な実施例および図面を参照して例示する。
【実施例】
【０２５７】
Ｓ．セレビシエ由来の組換えヒトトランスフェリン突然変異体（Ｎ４１３Ｑ、Ｎ６１１Ｑ）の分泌を例示するため、２つのタイプの発現カセットが用いられてきた。１つのタイプは改変型ＨＳＡ（プレ）／ＭＦα１（プロ）リーダー配列（「改変型融合リーダー配列」と呼称）を用いたものである。もう１つのタイプの発現カセットは改変型ＨＳＡ（プレ）リーダー配列を用いたものである。
【０２５８】
「改変型融合リーダー」の２４個のアミノ酸は、ＭＫＷＶＦＩＶＳＩＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＤＫＲである。
【０２５９】
改変型ＨＳＡ（プレ）リーダー配列の１８個のアミノ酸配列は、ＭＫＷＶＦＩＶＳＩＬＦＬＦＳＳＡＹＳである。
【０２６０】
これら２つのカセットを用いたトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）の発現が、Ｓ．セレビシエＰＤＩ遺伝子、ＰＤＩ１の付加的コピーを含む、および含まない２μｍ発現ベクターを用い、Ｓ．セレビシエで研究されてきた。
【０２６１】
実施例１
発現プラスミドの構築
オリゴヌクレオチドＣＦ８６とＣＦ８７（下記参照）の０．５ｍＭ溶液をアニーリングすることによって作製した５２ｂｐのリンカーを２μｍプラスミドｐＳＡＣ３５のＵＳ領域の、５９９ｂｐ逆方向反復内のＸｃｍＩ部位に導入した。逆方向反復と重複するため、一方のＸｃｍＩ部位はＲＥＰ２翻訳終結コドンの後で５１ｂｐを切断し、他方のＸｃｍＩ部位はＦＬＰコード配列の末端の前で１２７ｂｐを切断する（図３参照）。このＤＮＡリンカーは、ｐＳＡＣ３５には存在しない制限部位をコードしているコア領域「ＳｎａＢＩ−ＰａｃＩ−ＦｓｅＩ／ＳｆｉＩ−ＳｍａＩ−ＳｎａＢＩ」を含んでいた。
【０２６２】
【化１０】
2007515962.tif 000016
【０２６３】
プラスミドｐＳＡＣ３５をＸｃｍＩで部分的に消化し、線状１１ｋｂ断片を０．７％（ｗ／ｖ）アガロースゲルから単離し、ＣＦ８６／ＣＦ８７  ＸｃＭＩリンカー（原液、１０−１および１０−２希釈）と連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を選択し、ＳｍａＩ消化により線状化可能なプラスミドの存在に関してスクリーニングした。制限酵素分析により、ＲＥＰ２の後のＸｃｍＩ部位にリンカーがクローニングされているｐＤＢ２６８８（図４）が確認された。オリゴヌクレオチドプライマーＣＦ８８、ＣＦ９８およびＣＦ９９（表１）を用いたＤＮＡシーケンシングにより、挿入が適正なリンカー配列を含んでいることが確認された。
【０２６４】
【表１】
2007515962.tif 000017
【０２６５】
この酵母株を、改良型の酢酸リチウム法(Sigma酵母形質転換キット、ＹＥＡＳＴ−１、プロトコール２; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18))を用いて形質転換し、ロイシン原栄養性とした。ＢＭＭＤ寒天プレート上で形質転換体を選択し、その後、ＢＭＭＤ寒天プレート上に貼付した。１０ｍＬ  ＢＭＭＤ振盪フラスコ培養（２４時間、３０℃、２００ｒｐｍ）から、同量の無菌４０％（ｗ／ｖ）トレハロースを添加することで低温保存トレハロース原液を調製した。
【０２６６】
ＹＥＰＤおよびＢＭＭＤの組成は、Sleep et al., 2002, Yeast 18, 403により記載されている。ＹＥＰＳおよびＢＭＭＳの組成は、単独の初期炭素源として２％（ｗ／ｖ）グルコースの代わりに２％（ｗ／ｖ）スクロースを用いること以外はＹＥＰＤおよびＢＭＭＤと同じであった。
【０２６７】
Ｓ．セレビシエ  ＰＤＩ１遺伝子をｐＤＢ２６８８のＸｃｍＩリンカーにクローニングした。このＰＤＩ１遺伝子（図５）を、ＰＤＩ１遺伝子を含む大きなＳ．セレビシエゲノムＳＫＱ２ｎＤＮＡ断片（米国特許第６，２９１，２０５号に記載され、また、Crouzet & Tuite, 1987, Mol. Gen. Genet., 210, 581-583およびFarquhar et al, 1991, 前掲にもクローンＣ７として記載されているプラスミドｐＭＡ３ａ：Ｃ７において提供されているもの）（これは、ＹＩｐｌａｃ２１１(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)にクローニングされたものであり、ＰＤＩ１遺伝子の３’非翻訳領域内のユニークなＢｓｕ３６Ｉ部位に挿入されたＳａｃＩ制限部位を含む合成ＤＮＡリンカーを有していた）に由来の１．９ｋｂ  ＳａｃＩ−ＳｐｅＩ断片にクローニングした。この１．９ｋｂ  ＳａｃＩ−ＳｐｅＩ断片をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理してＳｐｅＩ  ５’−オーバーハングを埋め、ＳａｃＩ  ３’−オーバーハングを除去した。このＰＤＩ１断片は、翻訳開始コドンの上流に２１２ｂｐのＰＤＩ１プロモーターと、翻訳終結コドンの下流に１４８ｂｐを含んでいた。これを、ＳｍａＩ線状化／ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで処理したｐＤＢ２６８８に連結し、ＲＥＰ２と同じ方向で転写されるＰＤＩ１遺伝子を有するプラスミドｐＤＢ２６９０（図６）を作出した。Ｓ．セレビシエ株をｐＤＢ２６９０で形質転換してロイシン原栄養性とした。
【０２６８】
次に、ヒトトランスフェリン突然変異体（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）の発現カセットをｐＤＢ２６９０のＮｏｔＩ部位にクローニングし、ｐＤＢ２７１１（図７）を作出した。このｐＤＢ２７１１中の発現カセットはＳ．セレビシエＰＲＢ１プロモーター、ＨＳＡ／ＭＦα融合リーダー配列（ＥＰ３８７３１９； Sleep et al, 1990, Biotechnology (N.Y.), 8, 42）、その後にヒトトランスフェリン突然変異体（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）のコード配列とＳ．セレビシエ  ＡＤＨ１ターミネーターを含んでいる。プラスミドｐＤＢ２５３６は、同じ発現カセットをｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位に挿入することにより構築した。
【０２６９】
ｐＤＢ２５３６およびｐＤＢ２７１１で用いた「改変型融合リーダー」配列は、改変型ＨＳＡ−プレ配列とＭＦαｌ−プロ配列を含んでいる。用いた代わりのリーダー配列は、ＭＦα１−プロ配列の６つの残基を除去することにより改変型融合リーダー配列から得た改変型ＨＳＡ−プレ配列であった。
【０２７０】
ｐＤＢ２５１５（図８）の改変型融合リーダー配列を、ＭＦα１−プロ領域の６つの残基（ＲＳＬＤＫＲ）のコード配列を欠失させるように、オリゴヌクレオチドＣＦ１５４およびＣＦ１５５で突然変異させた。これは、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発キットの取扱説明書に従って行った。ｐＤＢ２５１５は、ＰｓｐＯＭＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に連結されたｐＤＢ２５２９（下記参照）の２９４０ｂｐ  ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（部分的）ＤＮＡ断片を含んでいる大腸菌クローニングベクターｐＧＥＭ−７Ｚ（−）(Promega)である。
【０２７１】
【化１１】
2007515962.tif 000018
【０２７２】
コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞を突然変異プラスミドで形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選択した。これらのコロニー由来のプラスミドＤＮＡを、ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩでの二重消化によりスクリーニングした。次に、改変型ＨＳＡ−プレリーダーに関して適正なＤＮＡ配列であるかどうかを、ｐＤＢ２９２１（図９）の、リーダー配列の各側で、ＡｆｌＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間の３８６ｂｐの領域にわたって確認した。この３８６ｂｐのＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を単離し、ＢａｍＨＩでの部分的消化とＡｆｌＩＩおよびウシ腸管アルカリ性ホスファターゼでの完全消化によって作製したｐＤＢ２５２９（図１０）の６，０８１ｂｐ  ＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片と連結した。ｐＤＢ２５２９は、ユニークなＮｏｔＩ部位にクローニングされたｐＤＢ２５３６のトランスフェリン発現カセットを含んでいる大腸菌クローニングベクターｐＢＳＴ（＋）(Sleep et al, 2001, Yeast, 18, 403-441)である。これによりｐＤＢ２９２８（図１１）が得られ、これを、連結産物で形質転換したアンピシリン耐性大腸菌ＤＨ５α細胞から単離した。
【０２７３】
３，２５６ｂｐのＮｏｔＩ発現カセットをｐＤＢ２９２８から単離した。これはＰＲＢ１プロモーター、改変型ＨＳＡ−プレリーダー配列のコード領域、その後にトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）、およびＡＤＨ１ターミネーターを含んでいた。これを２μｍ系ベクターｐＳＡＣ３５とｐＤＢ２６９０のＮｏｔＩ部位に連結し、発現プラスミドｐＤＢ２９２９、ｐＤＢ２９３０、ｐＤＢ２９３１およびｐＤＢ２９３２（図１２〜１５）を作製した。ｐＤＢ２９２９およびｐＤＢ２９３１においては、トランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）配列はＬＥＵ２と同じ向きで転写されるが、ｐＤＢ２９３０およびｐＤＢ２９３２では、転写は逆向きである。
【０２７４】
実施例２
トランスフェリンの発現
Ｓ．セレビシエ対照株を総てのトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）発現プラスミドで形質転換してロイシン原栄養性とし、低温保存原株を調製した。
【０２７５】
株を、５０ｍＬ三角フラスコ中、２００ｒｐｍで振盪した１０ｍＬ  ＢＭＭＤ培養中、３０℃で４日間増殖した。培養上清中に分泌した組換えトランスフェリンの力価をロケット免疫電気泳動（ＲＩＥは、Weeke, B., 1976,”Rocket immunoelectrophoresis”In N. H. Azelsen, J. KrollおよびB. Weeke [eds.], A manual of quantitative immunoelectrophoresis. Methods and applications. Universitetsforlaget, Oslo, Norwayに記載されている）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）（表２）、およびコロイドクーマシーブルー染色液で染色する非還元ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって比較した。Ｓ．セレビシエＰＤＩ１が過剰発現した際に分泌された組換えトランスフェリンの増強は１０倍を超えるものと推定された。
【０２７６】
【表２】
2007515962.tif 000019
【０２７７】
ＲＩＥ分析は、ＰＤＩ１の付加的コピーの存在下でのトランスフェリン分泌の増強がおよそ１５倍であることを示している（図１６）。ＲＩＥ分析によれば、改変型ＨＳＡ−プレリーダー配列に関する増強は、改変型融合リーダー配列の場合よりも若干大きいと思われた（図１７）。
【０２７８】
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によれば、トランスフェリン分泌の増強は、改変型融合リーダー配列では１８倍、そして、改変型ＨＳＡ−プレリーダー配列では１５倍であることが示された（表２）。
【０２７９】
図１８は、付加的なＰＤＩ１発現を伴う、および伴わないＳ．セレビシエ株によって分泌された組換えトランスフェリンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ比較を示す。
【０２８０】
トランスフェリン発現を測定するためのＲＰ−ＨＰＬＣ法
カラム：５０×４．６ｍｍ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４  ３００Å、５μｍカラム温度：４５℃
流速：１ｍＬ．分−１
ピーク検出：２１４ｎｍでのＵＶ吸光度
ＨＰＬＣ移動相  Ａ：０．１％ＴＦＡ、５％アセトニトリル
ＨＰＬＣ移動相  Ｂ：０．１％ＴＦＡ、９５％アセトニトリル
勾配：０〜３分  ３０％Ｂ
３〜１３分  ３０〜５５％Ｂの直線勾配
１３〜１４分  ５５％Ｂ
１４〜１５分  ５５〜３０％Ｂの直線勾配
１５〜２０分  ３０％Ｂ
注入：通常サンプル１００μＬであるが、任意の容量を注入可能
標準曲線：示された結果に用いた０．１〜１０μｇのヒトトランスフェリン注入に対するピーク面積の標準曲線は１０μｇまで直線であった。
【０２８１】
ｙ＝５３０８８８．ｘ＋１０５２６．７
（式中、ｙ＝ピーク面積、かつ、ｘ＝μｇ量）（ｒ
２）：０．９９９９５３（ここで、相関係数＝ｒ）
【０２８２】
実施例３
ＰＤＩの染色体過剰発現
プラスミドｐＤＢ２５０６からの組換えグリコシル化トランスフェリン発現とプラスミドｐＤＢ２５３６からの組換え非グリコシル化トランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）の分泌を検討するため、Ｓ．セレビシエ株Ａを選択した。株Ａは次のような特徴を有する。
・染色体組込み型の付加的ＰＤＩ１遺伝子が宿主のＰＤＩ１染色体の位置に組み込まれている。
・ＵＰＡ３遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子を含んだ細菌ＤＮＡ配列もまた、Ｓ．セレビシエゲノムの、上記遺伝子の挿入部位に組み込まれている。
【０２８３】
対照株には上記の挿入はない。
【０２８４】
対照株［ｃｉｒ０］および株Ａ［ｃｉｒ０］をｐＤＢ２５０６（組換えトランスフェリン）、ｐＤＢ２５３６（組換え非グリコシル化トランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ））またはｐＳＡＣ３５（対照）で形質転換してロイシン原栄養性とした。形質転換体をＢＭＭＤ−寒天上で選択した。
【０２８５】
ＢＭＭＤ振盪フラスコ培養物中のトランスフェリン分泌の相対的レベルを、ロケット免疫電気泳動（ＲＩＥ）により株／プラスミドの組合せに関して調べた。図１９は、両株と、もグリコシル化および非グリコシル化組換えトランスフェリンの双方を培養上清へ分泌したことを示している。
【０２８６】
株Ａ［ｐＤＢ２５０６］および株Ａ［ｐＤＢ２５３６］から分泌されたグリコシル化および非グリコシル化トランスフェリンの双方のレベルはそれぞれ、対照株から分泌されたレベルよりも高いことが分かった。ゆえに、少なくとも振盪フラスコ培養では、株Ａにおいて宿主ゲノムのＰＤＩ１遺伝子座に組み込まれたＰＤＩ１はトランスフェリン分泌を促進した。
【０２８７】
さらに、対照株［ｐＤＢ２５３６］と株Ａ［ｐＤＢ２５３６］の間で見られたトランスフェリン分泌の増強は、ＲＩＥによれば、少なくとも１００％の増強であることが分かった。これに対し、対照株［ｐＤＢ２３０５］と株Ａ［ｐＤＢ２３０５］の間のｒＨＡモノマー分泌の増強はおよそ２０％であった（データは示されていない）よって、株ＡにおけるＰＤＩ１の付加的コピーによるトランスフェリン分泌の増強は、１７個のジスルフィド結合を有するｒＨＡに比べ、トランスフェリンが１９個のジスルフィド結合を持っていることを考慮すれば、驚くほど大きかった。ＰＤＩ１遺伝子の付加的コピーは、Ｓ．セレビシエからの、トランスフェリンファミリー、およびそれらの誘導体に由来するタンパク質の分泌に特に有益であり得る。
【０２８８】
株Ａ［ｐＤＢ２５３６］および株Ａ［ｐＤＢ２５０６］から分泌されたトランスフェリンのレベルを、ＢＭＭＤおよびＹＥＰＤ中で増殖させた形質転換体に対して、ＲＩＥにより比較した（図２０）。結果は、ＢＭＭＤ（２〜５ｍｇ．Ｌ−１血清トランスフェリン相当）に比べ、ＹＥＰＤ（１０〜２０ｍｇ．Ｌ−１血清トランスフェリン相当）中で増殖させることにより、非グリコシル化組換えトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）およびグリコシル化組換えトランスフェリンの双方の力価２倍を超える増強が達成されたことを示した。このＹＥＰＤ中で見られたグリコシル化および非グリコシル化トランスフェリン力価双方の増強は、両トランスフェリン発現プラスミドが、非選択的増殖条件下で、ＹＥＰＤ中での増殖から通常得られると予測される高いバイオマスを高いグリコシル化および非グリコシル化トランスフェリン生産性へと解釈可能とするに十分安定であったことを示唆した。
【０２８９】
ＢＭＭＤ振盪フラスコ培養で増殖させた場合の株Ａ［ｐＤＢ２５３６］から分泌された非グリコシル化トランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）および株Ａ［ｐＤＢ２５０６］から分泌されたグリコシル化トランスフェリンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図２１に示す。株Ａ［ｐＤＢ２５３６］サンプルは、株Ａ［ｐＳＡＣ３５］対照に比べて付加的なタンパク質バンドを明らかに示した。この余分なバンドは、対照株［ｐＤＢ２５３６］から分泌された組換えトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）の予測された位置に移動した。株Ａ［ｐＤＢ２５０６］の培養上清は、トランスフェリンの予測された位置に拡散したタンパク質バンドを含むことが分かった。このことは、分泌した組換えトランスフェリンが、おそらくはＡｓｐ４１３および／またはＡｓｐ６１１における過剰なマンノシル化のために不均質であることを示唆した。
【０２９０】
実施例４
Ｓ．セレビシエ株Ａからのトランスフェリン分泌と、ｐＤＢ２７１１を含むＳ．セレビシエ対照株からのトランスフェリン分泌との比較
プラスミドｐＤＢ２７１１は上記の通りである。プラスミドｐＤＢ２７１２（図２２）もまた、ｐＤＢ２７１１と逆向きにＮｏｔＩカセットを用いて作製した。
【０２９１】
対照株Ｓ．セレビシエ［ｃｉｒ０］をｐＤＢ２７１１およびｐＤＢ２７１２で形質転換させてロイシン原栄養性とした。形質転換体をＢＭＭＤ寒天上で選択し、対照株［ｐＤＢ２７１１］の低温保存トレハロース原株を調製した。
【０２９２】
対照株［ｐＤＢ２７１１］、対照株［ｐＤＢ２７１２］、株Ａ［ｐＤＢ２５３６］、対照株［ｐＤＢ２５３６］およびもう１つの対照株［ｐＤＢ２５３６］による組換えトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）の分泌を、ＢＭＭＤおよびＹＥＰＤ振盪フラスコ培養の双方で比較した。ＲＩＥは、ＰＤＩ１の染色体コピーを２つ有する株Ａ［ｐＤＢ２５３６］、およびＰＤＩ１遺伝子の染色体コピーを１つ有する対照株［ｐＤＢ２５３６］に比べ、多数のエピソームＰＤＩ１コピーを有する対照株［ｐＤＢ２７１１］から、組換えトランスフェリン分泌における有意な増強が達成されたことを示した（図２３）。対照株［ｐＤＢ２７１１］および対照株［ｐＤＢ２７１２］は、同等レベルのｒＴｆ（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）を培養培地中に分泌することが分かった。ＢＭＭＤおよびＹＥＰＤ培地の双方において、対照株［ｐＤＢ２７１１］形質転換体と対照株［ｐＤＢ２７１２］形質転換体の間で分泌のレベルは比較的一致していたが、このことは、プラスミド安定性が非選択条件下であっても高レベルトランスフェリン分泌にとって十分なものであったことを示唆している。これは、ＰＤＩ１のマルチコピー２μｍプラスミドへの導入が宿主に有害であることが示された組換えＰＤＧＦ−ＢＢおよびＨＳＡに関するこれまでの公開データとは対照的である。
【０２９３】
【表３】
2007515962.tif 000020
【０２９４】
ＢＭＭＤ振盪フラスコ培養において対照株［ｐＤＢ２７１１］、対照株［ｐＤＢ２７１２］、株Ａ［ｐＤＢ２５３６］、対照株［ｐＤＢ２５３６］およびもう１つの対照株［ｐＤＢ２５３６］から分泌されたトランスフェリンの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図２４に示す。これによれば、対照株［ｐＤＢ２７１１］および対照株［ｐＤＢ２７１２］由来の総てのサンプルにおいて、トランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）の予測される位置に豊富なタンパク質バンドが示される。種々の株からのトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）バンドの相対的染色強度は株Ａ［ｐＤＢ２５３６］は対照株［ｐＤＢ２５３６］およびもう１つの対照株［ｐＤＢ２５３６］よりも多く生産したが、対照株［ｐＤＢ２７１１］および対照株［ｐＤＢ２７１２］からの分泌にいっそう劇的な増強が見られたことを示唆した。見られた高い組換えトランスフェリン分泌には、これらの株の高いＰＤＩ１コピー数が伴っていた。このことは、Ｐｄｉ１ｐレベルは対照株、株Ａおよびもう１つの対照株のトランスフェリン分泌を制限していること、および高いＰＤＩ１コピー数が高いトランスフェリン分泌の一因であることを示唆した。高いＰＤＩ１コピー数はＰＤＩ１の定常状態の発現レベルを高め、従って、Ｐｄｉ１ｐ活性の量を高め得る。これをＰＤＩ１遺伝子のコピー数を高めずに達成することができる別法がいくつかあり、例えば、定常状態のＰＤＩ１  ｍＲＮＡレベルを、いわゆる高効率プロモーターの使用によって転写速度を高めるか、またはＰＤＩ１  ｍＲＮＡのクリアランス速度を引き下げるかのいずれかによって高めることができる。あるいは、タンパク質工学を用いて、Ｐｄｉ１ｐタンパク質の比活性またはターンオーバー数を高めることもできる。
【０２９５】
高細胞密度発酵において、対照株［ｐＤＢ２７１１］組換えトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）の生産は、ＧＰ−ＨＰＬＣ分析とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、およそ３ｇ．Ｌ−１であると測定された（表３）。この生産レベルは、対照株、もう１つの対照株またはｐＤＢ２５３６を含む株Ａよりも数倍高いものである。さらに、ヒトでの治療用途のタンパク質の生産に関しては、対照株［ｐＤＢ２７１１］などの発現系は、細菌のＤＮＡ配列を含まないので、株Ａを用いるものより有利である。
【０２９６】
結論
マルチコピー発現プラスミド（ｐＤＢ２５３６）からの組換えトランスフェリンの分泌を、酵母ゲノムに組み込まれたＰＤＩ１遺伝子の付加的コピーを含むＳ．セレビシエ株で検討した。また、ＰＤＩ１遺伝子がマルチコピーエピソームトランスフェリン発現プラスミド（ｐＤＢ２７１１）に挿入されたマルチコピー発現プラスミドで形質転換したＳ．セレビシエにおいてもトランスフェリン分泌を検討した。
【０２９７】
ゲノムの内在するＰＤＩ１遺伝子座にＰＤＩ１遺伝子の付加的コピーが組み込まれたＳ．セレビシエ株は、１コピーのＰＤＩ１しか含まない株と比べ、高いレベルで組換えトランスフェリンおよび非グリコシル化組換えトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）を分泌した。ｐＤＢ２７１１を用いると、ＰＤＩ１コピー数にさらなる上昇が達せられた。ｐＤＢ２７１１で形質転換した株の高細胞密度発酵では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＧＰ−ＨＰＬＣ分析で測定した場合、組換えトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）はおよそ３ｇ．Ｌ−１で分泌された。従って、ＰＤＩ１遺伝子のコピー数が多いと、Ｓ．セレビシエから分泌される組換えトランスフェリンの量に多大な増加がもたらされた。
【０２９８】
次のような結論が導き出される。
１．ｐＤＢ２５３６（非グリコシル化トランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ））およびｐＤＢ２５０６（グリコシル化トランスフェリン）からの組換えトランスフェリン発現の振盪フラスコ分析では、Ｓ．セレビシエ株の株Ａは、対照株よりも高いレベルの両組換えトランスフェリンを培養上清中に分泌した。これはＰＤＩ１遺伝子座に組み込まれたＰＤＩ１の余分なコピーのためであった。
２．マルチコピー発現プラスミド上にＰＤＩ１遺伝子を含んだ対照株［ｐＤＢ２７１１］は、株Ａ［ｐＤＢ２５３６］に比べ、振盪フラスコ培養および高細胞密度発酵の双方で、組換えトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）分泌に数倍高い分泌をもたらした。３．Ｓ．セレビシエなどの酵母においてＰＤＩ１コピー数の増加は、トランスフェリンファミリー由来のものなど、異種タンパク質の生産の際に有利である。
４．ＰＤＩ１遺伝子の付加的コピーをを含むｐＳＡＣ３５系プラスミドは、トランスフェリンファミリー由来のタンパク質、およびそれらの誘導体、例えば、融合物、突然変異体、ドメインおよび末端切断型の生産に利点を有する。
【０２９９】
実施例５
２μｍ様プラスミドへのＰＤＩ１遺伝子の挿入は、種々の異なるＳ．セレビシエ株からの組換えトランスフェリンの分泌を増強した
Ｓ．セレビシエ株ＪＲＹ１８８  ｃｉｒ＋(National Collection of Yeast Cultures)およびＭＴ３０２／２８Ｂ  ｃｉｒ＋(Finnis et al., 1993, Eur. J. Biochem., 212, 201-210)を、天然２μｍプラスミドを、Rose and Broach (1990, Meth. Enzymol., 185, 234-279)に記載のように、ガラクトースにより誘導されるＹｅｐ３５１−ＧＡＬ−ＦＬＰ１からのＦＬＰの過剰発現により矯正し、それぞれＳ．セレビシエ株ＪＲＹ１８８  ｃｉｒ０およびＭＴ３０２／２８Ｂ  ｃｉｒ０を作出した。
【０３００】
Ｓ．セレビシエ株ＪＲＹ１８８  ｃｉｒ０、ＭＴ３０２／２８Ｂ  ｃｉｒ０、Ｓ１５０−２Ｂ  ｃｉｒ０(Cashmore et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 203, 154-162)、ＣＢ１１−６３  ｃｉｒ０(Zealey et al., 1988, Mol. Gen. Genet., 211, 155-159)を総てｐＤＢ２９３１（図１４）およびｐＤＢ２９２９（図１２）で形質転換してロイシン原栄養性とした。形質転換体を、適宜添加を行った、ロイシンを含まない最小培地上で選択した。各株の形質転換体を５０ｍＬ振盪フラスコ内の１０ｍＬ  ＹＥＰＤ中に接種し、回転振盪機にて３０℃、２００ｒｐｍで４日間インキュベートした。培養上清を採取し、組換えトランスフェリン力価をロケット免疫電気泳動によって比較した（図２６）。これらの結果は、総ての酵母株からの上清中のトランスフェリン力価が、２μｍプラスミド内にＰＤＩ１が存在している場合（ｐＤＢ２９２９）のほうが、存在してない場合（ｐＤＢ２９３１）よりも高かったことを示した。
【０３０１】
実施例６
同じ２μｍ様プラスミド上に種々のＰＤＩ１遺伝子と種々の異種タンパク質の発現カセットを含む発現ベクターの構築
ＰＤＩ１遺伝子のＰＣＲ増幅およびＹＩｐｌａｃ２１１へのクローニング
Ｓ．セレビシエＳ２８８ｃおよびＳ．セレビシエＳＫＱ２ｎ由来のＰＤＩ１遺伝子をＰＣＲ増幅し、プロモーター配列を含む５’非翻訳領域の長さが様々に異なるＤＮＡ断片を作製した。ＹＩｐｌａｃ２１１(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位へのＰＣＲ産物のクローニングが可能となるようにＰＣＲプライマーを設計した。後のクローニングを容易にするため、付加的な制限エンドヌクレアーゼ部位もＰＣＲプライマーに組み込んだ。表４に構築されたプラスミドを記載し、表５にＰＤＩ１遺伝子を増幅するために用いたＰＣＲプライマー配列を示す。これらのＹＩｐｌａｃ２１１系プラスミド内のＰＤＩ１プロモーターの長さの違いは表４に記載されている。
【０３０２】
オリゴヌクレオチドプライマーＤＳ２４８およびＤＳ２５０（表５）を用いて、Ｓ．セレビシエＳ２８８ｃゲノムＤＮＡ由来のＰＤＩ１遺伝子をＰＣＲ増幅した後、そのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そのおよそ１．９８ｋｂの断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断したＹＩｐｌａｃ２１１(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)にクローニングすることによりｐＤＢ２９３９（図２７）を作出した。ｐＤＢ２９３９のＤＮＡシーケンシングにより、表５において太字で示されているＤＳ２４８配列内からの「Ｇ」の欠失を確認した。ＰＤＩ１遺伝子のシーケンシングに用いたオリゴヌクレオチドプライマーを表６に示すが、これらは公開されているＳ２８８ｃ  ＰＤＩ１遺伝子配列（ＰＤＩ１／ＹＣＬ０４３Ｃ、第III染色体上の座標５０２２１〜４８６５３＋１０００塩基対の上流配列および１０００塩基対の下流配列(http://www.yeastgenome.org/Genebank Accession number NC001135)）から設計したものである。
【０３０３】
【表４】
2007515962.tif 000021
【０３０４】
【表５】
2007515962.tif 000022
2007515962.tif 000023
【０３０５】
【表６】
2007515962.tif 000024
【０３０６】
同様に、プラスミドｐＤＢ２９４１（図２８）およびｐＤＢ２９４２（図２９）も表４および５に記載されているＰＣＲプライマーを用い、それぞれおよそ１．９０ｋｂおよび１．８５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＹＩｐｌａｃ２１１にクローニングすることにより構築した。ｐＤＢ２９４１およびｐＤＢ２９４２内のＰＤＩ１遺伝子に関して適正なＤＮＡ配列を確認した。
【０３０７】
このＳ．セレビシエＳＫＱ２ｎ  ＰＤＩ１遺伝子配列を、クローンＣ７(Crouzet & Tuite, 1987, 前掲; Farquhar et al., 1991, 前掲)としても知られるｐＭＡ３ａ：Ｃ７（米国特許第６，２９１，２０５号）由来のＰＤＩ１遺伝子を含むプラスミドＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＳＫＱ２ｎ  ＰＤＩ１遺伝子を、オリゴヌクレオチドプライマーＤＳ２４８およびＤＳ２５０（表４および５）を用いて増幅した。およそ２．０１ｋｂのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断したＹＩｐｌａｃ２１１(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)に連結し、プラスミドｐＤＢ２９４３（図３０）を作出した。このＳＫＱ２ｎ  ＰＤＩ１配列の５’末端は、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＳｎａＢＩ、ＰａｃＩ、ＦｓｅＩ、ＳｆｉＩおよびＳｍａＩ部位を含めるべく延長した平滑末端ＳｐｅＩ部位と類似しており、３’末端はＳｍａＩ、ＳｎａＢＩおよびＢａｍＨＩ部位を含めるべく延長した平滑末端Ｂｓｕ３６Ｉ部位と類似する部位までにわたる。このＰＤＩ１プロモーターの長さはおよそ２１０ｂｐである。このＰＤＩ１断片に関して、表６に示されているオリゴヌクレオチドプライマーを用いて全ＤＮＡ配列を決定した。これにより、Ｓ．セレビシエ株ＳＫＱ２ｎ（ＮＣＢＩ受託番号ＣＡＡ３８４０２）のＰＤＩタンパク質のコード配列が存在するが、１１４番にセリン残基を有する（これまでに公開されているようなアルギニン残基ではない）ことが確認された。ｐＤＢ２９３９におけるＳ．セレビシエＳ２８８ｃ配列と同様に、ｐＤＢ２９４３も、表５において太字で示されているＤＳ２４８配列内から「Ｇ」が欠失していた。
【０３０８】
同様に、プラスミドｐＤＢ２９６３（図３１）およびｐＤＢ２９４５（図３２）も表４および５に記載されているＰＣＲプライマーを用い、それぞれおよそ１．９４ｋｂおよび１．８７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＹＩｐｌａｃ２１１にクローニングすることにより構築した。１１４番のアミノ酸にセリンコドンを有するｐＤＢ２９６３およびｐＤＢ２９４５内のＰＤＩ１遺伝子に関して、予測されたＤＮＡ配列を確認した。
【０３０９】
ＲＥＰ２の後のＸｃｍＩ部位に種々のＰＤＩ１遺伝子が挿入されたｐＳＡＣ３５系ｒＨＡ発現プラスミドの構築
ｒＨＡを種々のＰＤＩ１遺伝子と同時発現させるためのｐＳＡＣ３５系プラスミドを構築した（表７）。
【０３１０】
【表７】
2007515962.tif 000025
【０３１１】
まず、ｐＤＢ２２４３（図３３、ＷＯ００／４４７７２に記載）由来のｒＨＡ発現カセットを２，９９２ｂｐのＮｏｔＩ断片上で単離し、次にこれをｐＤＢ２６８８（図４）のＮｏｔＩ部位にクローニングしてｐＤＢ２６９３（図３４）を作出した。ｐＤＢ２６９３をＳｎａＢＩで消化し、ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで処理し、ｐＤＢ２９４３、ｐＤＢ２９６３、ｐＤＢ２９４５、ｐＤＢ２９３９、ｐＤＢ２９４１およびｐＤＢ２９４２由来のＰＤＩ１遺伝子を含むＳｎａＢＩ断片と連結した。これによりプラスミドｐＤＢ２９７６〜ｐＤＢ２９８７（図３５〜４６）を作出した。ＲＥＰ２と同じ方向に転写されるＰＤＩ１を「方向Ａ」で示し、ＲＥＰ２と逆向きに転写されるＰＤＩ１を「方向Ｂ」で示した（表７）。
【０３１２】
ＲＥＰ２の後のＸｃｍＩ部位に種々のＰＤＩ１遺伝子が挿入されたｐＳＡＣ３５系トランスフェリン発現プラスミドの構築
組換えトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）を種々のＰＤＩ１遺伝子と同時発現させるためのｐＳＡＣ３５系プラスミドを構築した（表８）。
【０３１３】
【表８】
2007515962.tif 000026
【０３１４】
これを達成するために、まず、ｒＨＡ発現のためのＮｏｔＩ発現カセットを、ＮｏｔＩ消化およびベクター骨格の環化によってｐＤＢ２９７６、ｐＤＢ２９７８、およびｐＤＢ２９８０から欠失させた。これにより、表９に示されるようなプラスミドｐＤＢ３０８１（図４７）、ｐＤＢ３０８３（図４８）およびｐＤＢ３０８４（図４９）を作出した。
【０３１５】
【表９】
2007515962.tif 000027
【０３１６】
ｐＤＢ２９２８（図１１）由来の３，２５６ｂｐのＮｏｔＩ断片を、トランスフェリン遺伝子からの転写がＬＥＵ２と同じ方向となるように、ｐＤＢ３０８１、ｐＤＢ３０８３およびｐＤＢ３０８４のＮｏｔＩ部位にクローニングした。これにより、表８に示されるようなプラスミドｐＤＢ３０８５（図５０）、ｐＤＢ３０８６（図５１）およびｐＤＢ３０８７（図５２）を作出した。
【０３１７】
実施例７
２μｍ様プラスミドにおけるＰＤＩ１遺伝子の挿入および至適化は、種々の異なるＳ．セレビシエ株による組換えヒト血清アルブミンの分泌を増強した
Ｓ．セレビシエ株ＪＲＹ１８８  ｃｉｒ０、ＭＴ３０２／２８Ｂ  ｃｉｒ０、Ｓ１５０−２Ｂ  ｃｉｒ０、ＣＢ１１−６３  ｃｉｒ０（総て上記）、ＡＨ２２  ｃｉｒ０(Mead et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 205, 417-421)およびＤＳ５６９  ｃｉｒ０(Sleep et al., 1991, Bio/Technology, 9, 183-187)を、改良型の酢酸リチウム法(Sigma酵母形質転換キット、ＹＥＡＳＴ−１、プロトコール２; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18))を用い、ｐＤＢ２２４４（ＷＯ００／４４７７２）、ｐＤＢ２９７６（図３５）、ｐＤＢ２９７８（図３７）またはｐＤＢ２９８０（図３９）のいずれかで形質転換し、ロイシン原栄養性とした。形質転換体を、適宜添加を行ったＢＭＭＤ寒天プレート上で選択した後、適宜添加を行ったＢＭＭＤ寒天プレートに貼付した。
【０３１８】
各株の形質転換体を５０ｍＬ振盪フラスコ中、１０ｍＬのＹＥＰＤに接種し、回転振盪機にて３０℃、２００ｒｐｍで４日間インキュベートした。培養上清を採取し、組換えアルブミン力価をロケット免疫電気泳動により比較した（図５３および５４）。これらの結果は、総ての酵母株からの培養上清中のアルブミン力価が、２μｍプラスミド内にＰＤＩ１が存在している場合のほうが、存在してない場合（ｐＤＢ２９３１）よりも高かったことを示した。プラスミド上にＰＤＩ１が存在していない場合の培養上清のアルブミン力価は、発現宿主としてどの酵母株を選択したかということによるが、試験したほとんどの例では、２μｍプラスミド内に長いプロモーター（〜２１０ｂｐ）を有するＰＤＩ１が存在した場合（ｐＤＢ２９７６）に発現の最大増強が見られた。ＰＤＩ１プロモーターを、例えば調節部位を削除するように短くすることで改変すると、その改善の制御に影響があった。高ｒＨＡ産生株として知られるある酵母株（ＤＳ５６９）では、最適な発現のために短いプロモーターのほうが好ましかった。
【０３１９】
実施例８
２μｍ系プラスミド上で同時発現させた場合、種々のＰＤＩ１遺伝子が組換えトランスフェリンの分泌を増強した
長いプロモーター（〜２１０ｂｐ）を有するＳ．セレビシエＳＫＱ２ｎ  ＰＤＩ１遺伝子、および長い、中間、および短いプロモーター（それぞれ〜２１０ｂｐ、〜１４０ｂｐおよび〜８０ｂｐ）を有するＳ．セレビシエＳ２８８ｃ  ＰＤＩ１の同時発現を伴う場合の、組換えトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）の分泌を検討した。
【０３２０】
これまでの実施例（例えば、実施例２）で用いたものと同じ対照株をｐＤＢ２９３１（ＰＤＩ１を持たない陰性対照プラスミド）およびｐＤＢ２９２９、ｐＤＢ３０８５、ｐＤＢ３０８６およびｐＤＢ３０８７（表８）で形質転換してロイシン原栄養性とした。形質転換体をＢＭＭＤ寒天プレート上で選択し、分析のために５個のコロニーを選択した。株を１０ｍＬ  ＢＭＭＤおよび１０ｍＬ  ＹＥＰＤ振盪フラスコ培養中、３０℃、２００ｒｐｍで４日間増殖させ、ロケット免疫電気泳動（ＲＩＥ）による分析のため、培養上清を採取した。
【０３２１】
図５５は、最小培地（ＢＭＭＤ）において、長いプロモーターを有するＳ．セレビシエＳＫＱ２ｎ  ＰＤＩ１遺伝子が最高のｒＴＦ（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）力価をもたらしたことを示す。Ｓ．セレビシエＳ２８８ｃ  ＰＤＩ１遺伝子は、低いｒＴＦ（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）力価をもたらし、これは、ＰＤＩ１プロモーター長を短くするとさらに低下した。
【０３２２】
図５６は、富栄養培地（ＹＥＰＤ）においては、長いプロモーターを有する、Ｓ．セレビシエＳＫＱ２ｎ  ＰＤＩ１およびＳ．セレビシエＳ２８８ｃ  ＰＤＩ１遺伝子は同等のｒＴＦ（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）産生レベルを示した。また、Ｓ．セレビシエＳ２８８ｃ  ＰＤＩ１遺伝子のプロモーター長を短くするほど、ｒＴＦ（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）の生産レベルは低くなった。
【０３２３】
実施例９
２μｍ系プラスミド上のＰＤＩ１は、組換えアルブミン融合物の分泌を増強した
組換えアルブミン融合物の発現に対する、長いプロモーター（〜２１０ｂｐ）を有するＳ．セレビシエＳＫＱ２ｎ  ＰＤＩ１遺伝子の同時発現の影響を検討した。
【０３２４】
ＮｏｔＩ  Ｎ末端エンドスタチン−アルブミン発現カセット（ｐＤＢ２５５６）の構築はこれまでに記載されている（ＷＯ０３／０６６０８５）。適当な酵母ベクター配列を、ＥＰ−Ａ−２８６４２４で全般的に開示され、Sleep, D., etal., 1991, Bio/Technology, 9, 183-187に記載されている「非組込み」プラスミドｐＳＡＣ３５により提供した。３．５４ｋｂの  ＮｏｔＩ  Ｎ末端エンドスタチン−アルブミン発現カセットをｐＤＢ２５５６から単離し、精製し、ＮｏｔＩで消化した上にウシ腸管ホスファターゼで処理したｐＳＡＣ３５に連結し、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ方向でＮｏｔＩ発現カセットを含むプラスミドｐＤＢ３０９９を作出した（図５７）。適当な酵母ＰＤＩ１ベクター配列を、「非組込み」プラスミドｐＤＢ２６９０（図６）により提供した。３．５４ｋｂのＮｏｔＩ  Ｎ末端エンドスタチン−アルブミン発現カセットをｐＤＢ２５５６から単離し、精製し、ＮｏｔＩで消化した上にウシ腸管ホスファターゼで処理したｐＤＢ２６９０に連結し、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ方向でＮｏｔＩ発現カセットを含むプラスミドｐＤＢ３１００を作出した（図５８）。
【０３２５】
ＮｏｔＩ  Ｎ末端アンギオスタチン−アルブミン発現カセット（ｐＤＢ２５５６）の構築は、ｐＳＡＣ３５系酵母発現ベクターｐＤＢ２７６５（図５９）の構築と同様、これまでに記載されている（ＷＯ０３／０６６０８５）。３．７７ｋｂのＮｏｔＩ  Ｎ末端アンギオスタチン−アルブミン発現カセットをｐＤＢ２５５６から単離し、精製し、適当な酵母ＰＤＩ１発現ベクターｐＤＢ２６９０をＮｏｔＩで消化し、ウシ腸管ホスファターゼで処理したものに連結し、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ方向でＮｏｔＩ発現カセットを含むプラスミドｐＤＢ３１０７を作出した（図６０）。
【０３２６】
ＮｏｔＩ  Ｎ末端Ｋｒｉｎｇｌｅ５−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン発現カセット（ｐＤＢ２７７１）の構築は、ｐＳＡＣ３５系酵母発現ベクターｐＤＢ２７７３（図６１）の構築と同様、これまでに記載されている（ＷＯ０３／０６６０８５）。３．２７ｋｂのＮｏｔＩ  Ｎ末端Ｋｒｉｎｇｌｅ５−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン発現カセットをｐＤＢ２７７１から単離し、精製し、適当な酵母ＰＤＩ１発現ベクターｐＤＢ２６９０をＮｏｔＩで消化し、ウシ腸管ホスファターゼで処理したものに連結し、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ方向でＮｏｔＩ発現カセットを含むプラスミドｐＤＢ３１０４を作出した（図６２）。
【０３２７】
ＮｏｔＩ  Ｎ末端ＤＸ−８９０−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン発現カセット（ｐＤＢ２６８３）の構築はこれまでに記載されている（ＷＯ０３／０６６８２４）。適当な酵母ベクター配列を、「非組込み」プラスミドｐＳＡＣ３５により提供した。３．２０ｋｂのＮｏｔＩ  Ｎ末端ＤＸ−８９０−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン発現カセットをｐＤＢ２６８３から単離し、精製し、ｐＳＡＣ３５をＮｏｔＩで消化し、ウシ腸管ホスファターゼで処理したものに連結し、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ方向でＮｏｔＩ発現カセットを含むプラスミドｐＤＢ３１０１を作出した（図６３）。適当な酵母ＰＤＩ１ベクター配列を、「非組込み」プラスミドｐＤＢ２６９０（図６）により提供した。３．２０ｋｂのＮｏｔＩ  Ｎ末端ＤＸ−８９０−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン発現カセットをｐＤＢ２６８３から単離し、精製し、ｐＤＢ２６９０をＮｏｔＩで消化し、ウシ腸管ホスファターゼで処理したものに連結し、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ方向でＮｏｔＩ発現カセットを含むプラスミドｐＤＢ３１０２を作出した（図６４）。
【０３２８】
ＮｏｔＩ  Ｎ末端ＤＰＩ−１４−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン発現カセット（ｐＤＢ２６６６）の構築は、ｐＳＡＣ３５系酵母発現ベクターｐＤＢ２６７９（図６５）の構築と同様、これまでに記載されている（ＷＯ０３／０６６８２４）。
【０３２９】
３．２１ｋｂのＮｏｔＩ  Ｎ末端ＤＰＩ−１４−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン発現カセットをｐＤＢ２６６６から単離し、精製し、適当な酵母ＰＤＩ１発現ベクターｐＤＢ２６９０をＮｏｔＩで消化し、ウシ腸管ホスファターゼで処理したものに連結し、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ方向でＮｏｔＩ発現カセットを含むプラスミドｐＤＢ３１０３を作出した（図６６）。
【０３３０】
ヒトゲノムＤＮＡから、標準的な条件を使用し、エキソン１およびエキソン２としてそれぞれ次のプライマーを用いた２エキソンの増幅によりＣＮＴＦをクローニングした。
【０３３１】
【化１２】
2007515962.tif 000028
【０３３２】
【化１３】
2007515962.tif 000029
【０３３３】
両断片を標準的な条件下で連結し、その後、プライマー５’−ＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＣＴＧＡＣＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧ−３’および５’−ＣＴＣＴＣＴＡＧＡＡＧＣＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＣ−３’を用い、ＰＣＲにより再び増幅し、ベクターｐＣＲ４(Invitrogen)にクローニングした。Ａｘｏｋｉｎｅ（商標）(Lambert et al, 2001, PNAS, 98, 4652-4657に開示)を作製するため、部位特異的突然変異誘発を用いてＣ１７Ａ（ＴＧＴ→ＧＣＴ）およびＱ６３Ｒ（ＣＡＧ→ＡＧＡ）突然変異を導入した。ＤＮＡシーケンシングもまた、ＷＯ２００４／０１５１１３に記載のようなサイレントＴ→Ｃ置換Ｖ８５Ｖ（ＧＴＴ→ＧＴＣ）の存在を明らかにした。
【０３３４】
このＡｘｏｋｉｎｅ（商標）ｃＤＮＡを一本鎖オリゴヌクレオチドＭＨ３３およびＭＨ３６を用いてＰＣＲにより増幅し、およそ０．５８ｋｂｐのＰＣＲ断片を作出した。
【０３３５】
【化１４】
2007515962.tif 000030
【０３３６】
これは５０ｍＬ反応液中、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(Roche)を用いて行い、９５℃で４分のインキュベーションにより開始し、その後、２５サイクルのＰＣＲ（９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒）を行った。１０ｍＬのサンプルにおいて、臭化エチジウムで染色した１％アガロースゲルでの電気泳動の後、、予測された大きさのＰＣＲ産物が見られた。残りのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット(Qiagen)を用いて精製し、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで完全に消化した。およその予測された大きさのＤＮＡを、臭化エチジウム染色１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルから切り出し、精製した。
【０３３７】
プラスミドｐＤＢ２５７３Ｘは、好適な転写プロモーターおよびターミネーターを、好適な分泌リーダー配列、およびヒトアルブミンのＮ末端と融合した（ＧＧＳ）４ＧＧペプチドリンカーの部分をコードしているＤＮＡ配列とともに提供した。ｐＤＢ２５７３Ｘｓの構築はこれまでに記載されている（ＷＯ０３／０６６８２４）。
【０３３８】
０．５７ｋｂのＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ消化ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩおよびウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで消化したｐＤＢ２５７３Ｘと連結し、プラスミドｐＤＢ２６１７（図９５）を作出し、このＰＣＲ作製断片および隣接する配列に関して、オリゴヌクレオチドプライマーＣＦ８４、ＣＦ８５、ＰＲＢおよびＤＳ２２９を用い、適正なＤＮＡ配列を確認した。
【０３３９】
【化１５】
2007515962.tif 000031
2007515962.tif 000032
【０３４０】
プラスミドｐＤＢ２６１７をＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、Ａｘｏｋｉｎｅ（商標）−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン分泌のための３．５８６ｋｂのＮｏｔＩ発現カセットをアガロースゲルから精製した。
【０３４１】
適当な酵母ベクター配列を、「非組込み」プラスミドｐＳＡＣ３５により提供した。３．５８６ｋｂのＮｏｔＩ  Ｎ末端Ａｘｏｋｉｎｅ（商標）−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン発現カセットをｐＤＢ２６１７から単離し、精製、ｐＳＡＣ３５をＮｏｔＩで消化し、ウシ腸管ホスファターゼで処理したものに連結し、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ方向でＮｏｔＩ発現カセットを含むプラスミドｐＤＢ２６１８を作出した（図９６）。適当な酵母ＰＤＩ１ベクター配列を、「非組込み」プラスミドｐＤＢ２６９０（図６）により提供した。３．５８６ｋｂのＮｏｔＩ  Ｎ末端Ａｘｏｋｉｎｅ（商標）−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン発現カセットをｐＤＢ２６１７から単離し、精製し、ｐＤＢ２６９０をＮｏｔＩで消化し、ウシ腸管ホスファターゼで処理したものに連結し、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ方向でＮｏｔＩ発現カセットを含むプラスミドｐＤＢ３１０６を作出した（図６８）。
【０３４２】
ヒトＩＬ１０ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ受託番号（ＮＭ＿０００５７２）を、一本鎖オリゴヌクレオチドＣＦ６８およびＣＦ６９を用い、ＰＣＲ増幅した。
【０３４３】
【化１６】
2007515962.tif 000033
2007515962.tif 000034
【０３４４】
０．４３ｋｂのＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで完全に消化し、ＢｇｌＩＩで部分的に消化し、０．４２ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片を単離した。
【０３４５】
プラスミドｐＤＢ２５７３Ｘは、好適な転写プロモーターおよびターミネーターを、好適な分泌リーダー配列、およびヒトアルブミンのＮ末端と融合した（ＧＧＳ）４ＧＧペプチドリンカーの部分をコードしているＤＮＡ配列とともに提供した。ｐＤＢ２５７３Ｘの構築はこれまでに記載されている（ＷＯ０３／０６６８２４）。
【０３４６】
プラスミドｐＤＢ２５７３ＸをＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで完全に消化し、６．２１ｋｂのＤＮＡ断片を単離し、ウシ腸管ホスファターゼで処理した後、０．４２ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ  Ｎ末端  ＩＬ１０  ｃＤＮＡと連結し、ｐＤＢ２６２０（図６９）を作出した。適当な酵母ベクター配列を、「非組込み」プラスミドｐＳＡＣ３５により提供した。３．５１ｋｂのＮｏｔＩ  Ｎ末端ＩＬ１０−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン発現カセットをｐＤＢ２６２０から単離し、精製し、ｐＳＡＣ３５をＮｏｔＩで消化し、ウシ腸管ホスファターゼで処理したものに連結し、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ方向でＮｏｔＩ発現カセットを含むプラスミドｐＤＢ２６２１を作出した（図７０）。適当な酵母ＰＤＩ１ベクター配列を、「非組込み」プラスミドｐＤＢ２６９０（図６）により提供した。３．５１ｋｂのＮｏｔＩ  Ｎ末端ＩＬ１０−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン発現カセットをｐＤＢ２６２０から単離し、精製し、ｐＤＢ２６９０をＮｏｔＩで消化し、ウシ腸管ホスファターゼで処理したものに連結し、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ方向でＮｏｔＩ発現カセットを含むプラスミドｐＤＢ３１０５を作出した（図７１）。
【０３４７】
これまでの実施例で用いたものと同じ対照酵母株を、改良型酢酸リチウム法(Sigma酵母形質転換キット、ＹＥＡＳＴ−１、プロトコール２; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18))を用いて形質転換し、ロイシン原栄養性とした。形質転換体をＢＭＭＤ寒天プレート上で選択し、その後、ＢＭＭＤ寒天プレート上に貼付した。  １０ｍＬのＢＭＭＤ振盪フラスコ培養（２４時間、３０℃、２００ｒｐｍ）から低温保存トレハロース原液を調製した。
【０３４８】
各株の形質転換体を５０ｍＬ振盪フラスコ内の１０ｍＬ  ＢＭＭＤ中に接種し、回転振盪機にて３０℃、２００ｒｐｍで４日間インキュベートした。培養上清を採取し、組換えアルブミン融合物力価をロケット免疫電気泳動によって比較した（図７２）。これらの結果は、酵母株からの培養上清中のアルブミン融合物力価が、２μｍプラスミド内にＰＤＩ１が存在している場合のほうが、存在してない場合よりも高かったことを示した。
【０３４９】
ロケット免疫電気泳動により検出された、このアルブミン融合物の発現の増強を、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって研究した。種々のアルブミン融合物を発現するＹＢＸ７のＢＭＭＤ振盪フラスコ培養を回転振盪機にて３０℃、２００ｒｐｍで４日間増殖させた。培養上清のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図７３）。研究下のアルブミン融合物の予測される大きさを有するタンパク質バンドには、存在量の増加が見られた。
【０３５０】
実施例１０
２μｍ系プラスミド上でのＳ．セレビシエ  ＯＲＭ２と組換えトランスフェリンの同時発現
Ｓ．セレビシエＳ２８８ｃ由来のＯＲＭ２遺伝子を、ＵＬ領域内のＮｏｔＩＩ部位にｒＴｆ（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）の発現カセットを含むｐＳＡＣ３５系プラスミド上のＲＥＰ２の後のＸｃｍＩ部位にクローニングした。
【０３５１】
ｐＤＢ２９２８（図１１）由来のｒＴｆ（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）発現カセットを含む３，２５６ｂｐのＮｏｔＩ断片をｐＤＢ２６８８（図４）のＮｏｔＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＤＢ２９６５（図７４）を構築した。ｐＤＢ２６８８をＮｏｔＩ消化により線状化し、アルカリ性ホスファターゼで処理した。ｐＤＢ２９２８由来のｒＴｆ発現カセットをｐＤＢ２６８８のＮｏｔＩ部位にクローニングし、ＬＥＵ２と同じ方向で転写されるトランスフェリン遺伝子を有するｐＤＢ２９６５を作出した。
【０３５２】
ＯＲＭ２遺伝子をＳセレビシエＳ２８８ｃゲノムＤＮＡから、Expand High Fidelity PLUS PCR System (Roche)を用い、オリゴヌクレオチドプライマーＧＳ１１およびＧＳ１２（表１０）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０３５３】
【表１０】
2007515962.tif 000035
【０３５４】
ベクターｐＤＢ２９６５のＸｃｍＩ部位のリンカーにクローニングするため、フォワードプライマーの５’末端にＳｎａＢＩおよびＰａｃＩ制限認識部位を、そして、リバースプライマーの５’末端にＳｎａＢＩおよびＦｓｅＩ制限認識部位を組込むようにプライマーを設計した。ＰＣＲは次の条件下で行った：２００μＭ  ｄＮＴＰミックス、２．５ＵのＥｘｐａｎｄ  ＨｉＦｉ酵素ブレンド、１×Ｅｘｐａｎｄ  ＨｉＦｉ反応バッファー、０．８μｇゲノムＤＮＡ；９４℃２分を１サイクル、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル、および７２℃７分を１サイクル。各プライマー０．４μＭを用いた。必要な１，１９５ｂｐのＰＣＲ産物およびｐＤＢ２９６５ベクターをＰａｃＩおよびＦｓｅＩで消化し、ともに連結し、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を選択した。ＯＲＭ２含有構築物をアンピシリン耐性クローンから単離したプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により確認した。４つのプラスミドクローンｐＤＢ３０９０、ｐＤＢ３０９１、ｐＤＢ３０９２およびｐＢＤ３０９３を作製したが、それらは総て、制限分析の際に予測されたＤＮＡ断片パターンを持っていた（図７５）。
【０３５５】
トランスフェリンおよびＯＲＭ２遺伝子を２μｍ系プラスミドから同時発現させた場合のトランスフェリン分泌に対する影響を検討するため、Ｓ．セレビシエ対照株および株Ａ（実施例３に記載の通り）を選択した。対照株および株Ａを、プラスミドｐＤＢ３０９０、ｐＤＢ３０９２およびｐＢＤ３０９３、ならびにＯＲＭ２を含まないｒＴｆ（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）発現カセットを含む対照プラスミドｐＤＢ２９３１（図１４）で形質転換してロイシン原栄養性とした。形質転換体をＢＭＭＤ寒天上で選択し、その後の分析のためＢＭＭＤ寒天に貼付した。
【０３５６】
トランスフェリン分泌に対するＯＲＭ２同時発現の影響を検討するため、１０ｍＬ選択（ＢＭＭＤ）および非選択（ＹＥＰＤ）液体培地にＯＲＭ２／トランスフェリン同時発現プラスミドを含む株を接種した。次に、この振盪フラスコ培養物を３０℃で振盪しながら（２００ｒｐｍ）４日間、インキュベートした。トランスフェリン分泌の相対的レベルをロケットゲル免疫電気泳動（ＲＩＥ）により測定した（図７６）。
【０３５７】
対照株［ｐＤＢ３０９０］および対照株［ｐＤＢ３０９２］から分泌されたトランスフェリンのレベルは、ＢＭＭＤおよびＹＥＰＳの両培地とも、対照株［ｐＤＢ２９３１］から得られたレベルよりも高かった。同様に、株Ａ［ｐＤＢ３０９０］および株Ａ［ｐＤＢ３０９３］の双方から分泌されたトランスフェリンのレベル、ＢＭＭＤおよびＹＥＰＳの両培地とも、株Ａ［ｐＤＢ２９３１］から得られたレベルよりも高かった。総ての株Ａの形質転換体からのトランスフェリン分泌は、同じ培地で増殖させた対照株の形質転換体の場合よりも高かった。株Ａはゲノム内にＰＤＩ１の付加的コピーを含み、これがトランスフェリン分泌を増強した。従って、株Ａにおいては、ＯＲＭ２とＰＤＩ１の発現の増強がトランスフェリンの分泌に累積作用を有していた。
【０３５８】
実施例１１
２μｍ系プラスミド上でのＳ．セレビシエＰＳＥＩとトランスフェリンの同時発現
Ｓ．セレビシエＳ２８８ｃからのＰＳＥ１遺伝子を、ＵＬ領域内のＮｏｔＩ部位にｒＴｆ（Ｎ４１３Ｑ、Ｎ６１１Ｑ）の発現カセットを含むｐＳＡＣ３５系プラスミド上のＲＥＰ２の後のＸｃｍＩ部位にクローニングした。
【０３５９】
３．２５ｋｐの野生型ＰＳＥ１遺伝子を、Ｓ．セレビシエＳ２８８ｃゲノムＤＮＡから、Expand High Fidelity PCR Kit (Roche)を用い、オリゴヌクレオチドプライマーＣＥＤ００９およびＣＥＤ０１０（表１０）を用いてＰＣＲ増幅した。ベクターｐＵＣ１９へのクローニングを容易にするため、５’末端にＢａｍＨＩ制限認識部位を組込むようプライマーを設計した。ＰＣＲは次の条件下で行った：９４℃２分を１サイクル、９４℃１５秒、４５℃３０秒、６８℃４分３０秒を１０サイクル；９４℃１５秒、４５℃３０秒、６８℃４分３０秒（１サイクルごとに５秒延長）を２０サイクル；および６８℃１０分を１サイクル。必要なＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化した後、ＢａｍＨＩで消化した上にアルカリ性ホスファターゼで処理したｐＵＣ１９に連結し、構築物ｐＤＢ２８４８（図７７）を作出した。ｐＤＢ２８４８のシーケンシングにより、増幅された配列は、第XIII染色体上の座標８９２２２０〜８８８９５１＋１０００塩基対の上流配列および１０００塩基対の下流配列（サッカロミセスゲノムデータベースhttp://www.yeastgenome.org/）のＰＳＥ１／ＹＭＲ３０８Ｃ由来の配列と比較した場合に、Ｓ．セレビシエＳ２８８ｃ  ＰＳＥ１に関して予測された通りであったことを確認された。次に、ＰＳＥ１遺伝子をＢａｍＨＩ消化によりｐＤＢ２８４８から切り出し、得られた４，０９６ｂｐの断片をフェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させ、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片で処理して５’−オーバーハングを埋めた。プラスミドｐＤＢ２９６５（図７４）をＳｎａＢＩ消化により線状化し、アルカリ性ホスファターゼで処理した。この線状化ｐＤＢ２９６５ベクターとＰＳＥ１挿入部を連結し、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を選択した。これらのアンピシリン耐性クローンから単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、プラスミドｐＤＢ３０９７（図７８）およびｐＤＢ３０９８（図７９）がＰＳＥ１遺伝子を含んでいることが確認された。ｐＤＢ３０９７においては、ＰＳＥ１遺伝子はＲＥＰ２と同じ方向で転写されるが、ｐＤＢ３０９７においては、ＰＳＥ１遺伝子はＲＥＰ２と逆の方向で転写される。
【０３６０】
Ｓ．セレビシエ対照株を、プラスミドｐＤＢ３０９７およびｐＢＤ３０９８、ならびにＰＳＥ１を含まないｒＴｆ（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）発現カセットを含む対照プラスミドｐＤＢ２９３１（図１４）で形質転換してロイシン原栄養性とした。形質転換体をＢＭＭＤ寒天上で選択し、その後の分析のためＢＭＭＤ寒天に貼付した。
【０３６１】
トランスフェリン分泌に対するＰＳＥ１発現の影響を検討するため、１０ｍＬの選択（ＢＭＭＤ）液体培地が入ったフラスコにＰＳＥ１／トランスフェリン同時発現プラスミドを含む株を接種した。次に、この振盪フラスコ培養物を３０℃で振盪しながら（２００ｒｐｍ）４日間インキュベートした。トランスフェリン分泌の相対的レベルをロケットゲル免疫電気泳動（ＲＩＥ）により測定した（図８０）。
【０３６２】
対照株［ｐＤＢ３０９７］および対照株［ｐＤＢ３０９８］から分泌されたトランスフェリンのレベルは、ＢＭＭＤ培地において、対照株［ｐＤＢ２９３１］から得られたレベルより高かった。従って、２μｍ系プラスミドからのＰＳＥ１の発現はＳ．セレビシエからのトランスフェリン分泌を増強した。トランスフェリン分泌はｐＤＢ３０９７およびｐＤＢ３０９８において、ＲＥＰ２遺伝子に対していずれかの方向で転写されるＰＳＥ１遺伝子によって向上した。
【０３６３】
実施例１２
２μｍ系プラスミド上でのＳ．セレビシエＳＳＡ１と組換えトランスフェリンの同時発現
Ｓ．セレビシエＳ２８８ｃ由来のＳＳＡ１遺伝子を、ＵＬ領域内のＮｏｔＩ部位にｒＴｆ（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）のための発現カセットを含むｐＳＡＣ３５系プラスミド上のＲＥＰ２の後のＸｃｍＩ部位にクローニングした。
【０３６４】
１．９３ｋｂのＳＳＡ１遺伝子をＳ．セレビシエＳ２８８ｃゲノムＤＮＡから、Expand High Fidelity PCR Kit (Roche)を用い、オリゴヌクレオチドプライマーＣＥＤ０３７およびＣＥＤ０３８（表１０）を用いてＰＣＲ増幅した。ベクターｐＵＣ１９へのクローニングを容易にするため、５’末端にＳｐｈＩ制限認識部位を組込むようプライマーを設計した。ＰＣＲは次の条件下で行った：９４℃１０分を１サイクル、９４℃１分、５５℃１分、７２℃５分を３５サイクル；および７２℃１０分を１サイクル。必要なＰＣＲ産物をＳｐｈＩで消化した後、ＳｐｈＩで消化した上にアルカリ性ホスファターゼで処理したｐＵＣ１９に連結し、構築物ｐＤＢ２８５０（図８１）を作出した。ｐＤＢ２８５０のシーケンシングにより、サッカロミセスゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）で公開されている第Ｉ染色体上の座標１４１４３３〜１３９５０５＋１０００塩基対の上流配列および１０００塩基対の下流配列のＳ．セレビシエＳ２８８ｃ  ＳＳＡ１／ＹＡＬ００５Ｃの予測された配列が確認された。
【０３６５】
ＳＳＡ１遺伝子をＳｐｈＩ消化によりｐＤＢ２８５０から切り出し、得られた２，７４８ｂｐの断片をフェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理して３’−オーバーハングを除去した。プラスミドｐＤＢ２９６５をＳｎａＢＩ消化により線状化し、アルカリ性ホスファターゼで処理した。この線状化ｐＤＢ２９６５ベクターとＳＳＡ１挿入部を連結し、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を選択した。これらのアンピシリン耐性クローンから単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、ＳＳＡ１構築物ｐＤＢ３０９４（図８２）およびｐＤＢ３０９５（図８３）が確認された。ｐＤＢ３０９４においては、ＳＳＡ１遺伝子はＲＥＰ２と同じ方向で転写されるが、ｐＤＢ３０９５においては、ＳＳＡ１遺伝子はＲＥＰ２と逆の方向で転写される。
【０３６６】
Ｓ．セレビシエ対照株を、プラスミドｐＤＢ３０９４およびｐＢＤ３０９５、ならびにＳＳＡ１を含まないｒＴｆ（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）発現カセットを含む対照プラスミドｐＤＢ２９３１（図１４）で形質転換してロイシン原栄養性とした。形質転換体をＢＭＭＤ寒天上で選択し、その後の分析のためＢＭＭＤ寒天に貼付した。
【０３６７】
トランスフェリン分泌に対するＳＳＡ１発現の影響を検討するため、１０ｍＬの選択（ＢＭＭＤ）液体培地が入ったフラスコにＳＳＡ１／トランスフェリン同時発現プラスミドを含む株を接種した。これらの振盪フラスコ培養物を３０℃で振盪しながら（２００ｒｐｍ）４日間インキュベートした。トランスフェリン分泌の相対的レベルをロケットゲル免疫電気泳動（ＲＩＥ）により測定した（図８４）。
【０３６８】
対照株［ｐＤＢ３０９５］から分泌されたトランスフェリンのレベルは、ＢＭＭＤ培地において、対照株［ｐＤＢ２９３１］および対照株［ｐＤＢ３０９４］から得られたレベルより高かった。従って、２μｍ系プラスミドからＳＳＡ１の発現はＳ．セレビシエからのトランスフェリン分泌を増強した。トランスフェリン分泌はｐＤＢ３０９４において、ＲＥＰ２遺伝子に対して逆方向で転写されるＳＳＡ１遺伝子によって向上した。
【０３６９】
実施例１３
ＰＤＩ１遺伝子分断を２μｍ系プラスミド上のＰＤＩ１遺伝子と組み合わせると組換えアルブミンの分泌およびプラスミドの安定性を高めた
表１１に挙げられている一本鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーは、酵母ＰＤＩ１コード領域の上流の領域と酵母ＰＤＩ１コード領域の下流の別の領域を増幅するように設計されたものである。
【０３７０】
【表１１】
2007515962.tif 000036
【０３７１】
プライマーＤＳ２９９およびＤＳ３００は、ゲノムＤＮＡ由来のＳ２８８ｃを鋳型として用いて、ＰＤＩ１の５’領域をＰＣＲ増幅し、プライマーＤＳ３０１およびＤＳ３０２は、ＰＤＩ１の３’領域を増幅した。ＰＣＲ条件は次の通りとした：１μＬ  Ｓ２８８ｃ鋳型ＤＮＡ（０．０１ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬおよび１００ｎｇ／μＬ）、５μＬ  １０×バッファー(Fast Start Taq+Mg, (Roche))、１μＬ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５μＬ  各プライマー（２μＭ）、０．４μＬ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＴａｑをＨ２Ｏで５０μＬとした。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９７００を用いて行った。条件は、変性９５℃で４分［ＨＯＬＤ］、その後、［ＣＹＣＬＥ］変性９５℃で３０秒、アニーリング４５℃で３０秒、伸張７２℃で４５秒の２０サイクルの後、［ＨＯＬＤ］７２℃１０分、その後、［ＨＯＬＤ］４℃とした。０．２２ｋｂｐのＰＤＩ１  ５’ＰＣＲ産物はＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、０．３４１ｋｂｐのＰＤＩ１  ３’ＰＣＲ産物はＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで切断した。
【０３７２】
プラスミドｐＭＣＳ５(Hoheisel, 1994, Biotechniques 17, 456-460)（図８５）をＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで平滑末端化し、再連結してｐＤＢ２９６４（図８６）を作出した。
【０３７３】
プラスミドｐＤＢ２９６４をＨｉｎｄＩＩＩ消化し、ウシ腸管ホスファターゼで処理し、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した０．２ｋｂｐのＰＤＩ１  ５’ＰＣＲ産物ならびにＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化した０．３４ｋｂｐのＰＤＩ１  ３’ＰＣＲ産物と連結してｐＤＢ３０６９（図８７）を作出し、これを、フォワードおよびリバース万能プライマーならびにＤＮＡシーケンシングプライマーＤＳ３０３、ＤＳ３０４、ＤＳ３０５およびＤＳ３０６（表１１）を用いて配列決定した。
【０３７４】
プライマーＤＳ２３４およびＤＳ２３５（表１２）を用いて、ＹＩｐｌａｃ２０４(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)から、ＰＣＲ産物の各末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を組み込んだ改変ＴＲＰ１マーカー遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は次の通りとした：１μＬ  鋳型ＹＩｐｌａｃ２０４（０．０１ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬおよび１００ｎｇ／μＬ）、５μＬ  １０×バッファー(Fast Start Taq+Mg, (Roche))、１μＬ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５μＬ  各プライマー（２μＭ）、０．４μＬ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＴａｑをＨ２Ｏで５０μＬとした。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６００を用いて行った。条件は、変性９５℃で４分［ＨＯＬＤ］、その後、［ＣＹＣＬＥ］変性９５℃で３０秒、アニーリング４５℃で４５秒、伸張７２℃で９０秒の２０サイクルの後、［ＨＯＬＤ］７２℃１０分、その後、［ＨＯＬＤ］４℃とした。０．８６ｋｂｐのＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＭＣＳ５のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ｐＤＢ２７７８（図８８）を作出した。制限酵素消化と、万能フォワードおよびリバースプライマーならびにＤＳ２３６、ＤＳ２３７、ＤＳ２３８およびＤＳ２３９（表１２）を用いたシーケンシグにより、改変されたＴＲＰ１遺伝子の配列が適正であったことを確認した。
【０３７５】
【表１２】
2007515962.tif 000037
【０３７６】
０．８６ｋｂｐのＴＲＰ１遺伝子をｐＤＢ２７７８から、ＨｉｎｄＩＩＩ消化により単離し、ｐＤＢ３０６９のＨｉｎｄＩＩＩ部位へクローニングしてｐＤＢ３０７８（図８９）およびｐＤＢ３０７９（図９０）を作出した。１．４１ｋｂのｐｄｉ１：：ＴＲＰ１分断ＤＮＡ断片をｐＤＢ３０７８またはｐＤＢ３０７９から、ＮｏｔＩ／ＰｓｔＩ消化により単離した。
【０３７７】
ＴＰＰ１欠失（ｔｒｐ１Δ）を組み込んだ酵母株は、ひと度ｔｒｐ１Δが作出されたならばゲノム内にＴＲＰ１マーカー遺伝子（ｐＤＢ２７７８）との相同性が残らないように、従って、将来のＴＲＰ１を含む構築物とＴＲＰ１遺伝子座との間の相同組換えが起こらないように構築されたはずであった。選択された宿主株のゲノムから天然ＴＲＰ１配列の全体的な除去を達成するため、組込みベクターＹＩｐｌａｃ２０４(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)上に存在するＴＲＰＩマーカー遺伝子の外側のＴＲＰ１遺伝子の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの領域を増幅するようにオリゴヌクレオチドを設計した。このＹＩｐｌａｃ２０４  ＴＲＰ１マーカー遺伝子は、内部ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩおよびＸａＩ部位が部位特異的突然変異誘発により除去されているという点で天然／染色体ＴＲＰ１遺伝子とは異なる(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)。ＹＩｐｌａｃ２０４改変型ＴＲＰ１マーカー遺伝子を１．４５３ｋｂｐの平滑末端化ゲノム断片ＥｃｏＲＩ断片から構築し、これはＴＲＰ１遺伝子と１０２ｂｐのみのＴＲＰ１プロモーターを含んでいた(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)。これは比較的短いプロモーター配列であったが、ｔｒｐ１栄養要求性突然変異を補償するには明らかに十分なものであった(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)。５’〜ＴＲＰ１  ＯＲＦの開始部までの１０２ｂｐに存在する、ＥｃｏＲＩ部位の上流のＤＮＡ配列のみを用いて５’ＴＥＰ１  ＵＴＲを作出した。機能的に改変されたＴＲＰ１マーカーの３’末端の外側にある限り３’ＵＴＲの選択はあまり重要でなく、翻訳停止コドンの８５ｂｐ下流となるように選択した。
【０３７８】
ＰＣＲ増幅の際に制限酵素部位が、その後のクローニング工程で用いられるＰＣＲ産物の末端に付加されるように、ＴＲＰ１遺伝子の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ領域を増幅するために一本鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを設計および構築した。Ｓ２８８ｃゲノムＤＮＡを鋳型として用い、プライマーＤＳ２３０およびＤＳ２３１（表１２）はＰＣＲによりＴＲＰ１の５’領域を増幅し、プライマーＤＳ２３２およびＤＳ２３３（表１２）はＴＲＰ１の３’領域を増幅した。ＰＣＲ条件は次の通りとした：１μＬ鋳型Ｓ２８８ｃゲノムＤＮＡ（０．０１ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬおよび１００ｎｇ／μＬ）、５μＬ  １０×バッファー(Fast Start Taq+Mg, (Roche))、１μＬ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５μＬ  各プライマー（２μＭ）、０．４μＬ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＴａｑをＨ２Ｏで５０μＬとした。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６００を用いて行った。条件は、変性９５℃で４分［ＨＯＬＤ］、その後、［ＣＹＣＬＥ］変性９５℃で３０秒、アニーリング４５℃で４５秒、伸張７２℃で９０秒の２０サイクルの後、［ＨＯＬＤ］７２℃１０分、その後、［ＨＯＬＤ］４℃とした。
【０３７９】
この０．１９ｋｂｐのＴＲＰ１  ５’ＵＴＲ  ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、０．２ｋｂｐのＴＲＰ１  ３’ＵＴＲ  ＰＣＲ産物はＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで線状化したｐＡＹＥ５０５に連結し、プラスミドｐＤＢ２７７７（図９１）を作出した。ｐＡＹＥ５０５の構築についてはＷＯ９５／３３８３３に記載されている。プラスミド骨格およびクローニングされた挿入部の配列からプライミングするように設計されたフォワードおよびリバースプライマーを用いたＤＮＡシーケンシングにより、両場合において、クローニングされたＴＲＰ１遺伝子の５’および３’ＵＴＲ配列が予測されるＤＮＡ配列を持っていたことを確認した。プラスミドｐＤＢ２７７７は、ＴＲＰ１の５’および３’ＵＴＲに由来する配列の融合物を含んでなるＴＲＰ１分断断片を含んでいた。この０．３８３ｋｂｐのＴＲＰ１分断断片を、ＥｃｏＲＩでの完全消化により、ｐＤＢ２７７７から切り出した。
【０３８０】
酵母株ＤＸＹ１(Kerry-Williams et al., 1998, Yeast, 14, 161-169)を、改良型の酢酸リチウム法(Sigma酵母形質転換キット、ＹＥＡＳＴ−１、プロトコール２; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18))を用い、アルブミン発現プラスミドｐＤＢ２２４４で形質転換してロイシン原栄養性とし、酵母株ＤＸＹ１［ｐＤＢ２２４４］を作出した。このアルブミン発現プラスミドｐＤＢ２２４４の構築についてはＷＯ００／４４７７２に記載されている。形質転換体をＢＭＭＤ寒天プレート上で選択した後、ＢＭＭＤ寒天プレート上に貼付した。１０ｍＬ  ＢＭＭＤ振盪フラスコ培養（２４時間、３０℃、２００ｒｐｍ）から低温保存トレハロース原液を調製した。
【０３８１】
ＤＸＹ１［ｐＤＢ２２４４］を、Toyn et al., (2000 Yeast 16, 553-560)が記載しているように、対選択トリプトファン類似体、５−フルオロアントラニル酸（５−ＦＡＡ）を配合した栄養寒天を用い、ｐＤＢ２７７７由来の０．３８３ｋｂｐのＥｃｏＲＩ  ＴＲＰ１分断ＤＮＡ断片で形質転換し、トリプトファン独立栄養性とした。５−ＦＡＡの有毒作用に耐性のあるコロニーを採取し、もう一度５−ＦＡＡプレートに線条接種し、それらが本当に５−ＦＡＡ耐性であることを確認し、バックグラウンド増殖から選択した。次に、増殖させたコロニーをＢＭＭＤおよびＢＭＭＤ＋トリプトファン上に再貼付し、どれがトリプトファン栄養要求株であるか確認した。
【０３８２】
次に、トリプトファン栄養要求株であることが示されたコロニーを、どの単離物がｔｒｐ１であるかを確認すべく、ＹＣｐｌａｃ２２(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)での形質転換によるさらなる分析のために選択した。
【０３８３】
ＴＲＰ１遺伝子座にわたるＰＣＲ増幅を用い、ｔｒｐ−表現型がこの領域の欠損によるものであったことを確認した。５−ＦＡＡ耐性であって、トリプトファンを添加しない最小培地では増殖できないことが確認された単離物からゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムＴＲＰ１遺伝子座の、プライマーＣＥＤ００５およびＣＥＤ００６（表１２）を用いたＰＣＲ増幅を次のようにして行った：１μＬ鋳型ゲノムＤＮＡ、５μＬ  １０×バッファー(Fast Start Taq+Mg, (Roche))、１μＬ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５μＬ  各プライマー（２μＭ）、０．４μＬ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＴａｑをＨ２Ｏで５０μＬとした。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６００を用いて行った。条件は、変性９４℃で１０分［ＨＯＬＤ］、その後、［ＣＹＣＬＥ］変性９４℃で３０秒、アニーリング５５℃で３０秒、伸張７２℃で１２０秒の４０サイクルの後、［ＨＯＬＤ］７２℃１０分、その後、［ＨＯＬＤ］４℃とした。野生型ＴＲＰ１遺伝子座のＰＣＲ増幅では、１．３４ｋｂｐの大きさのＰＣＲ産物が生じたが、欠失ＴＲＰ１領域にわたる増幅では、０．５０ｋｂｐ小さい０．８４ｋｂｐのＰＣＲ産物が生じた。ＰＣＲ分析により、ＤＸＹ１由来ｔｒｐ−株（ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ［ｐＤＢ２２４４］）が予測された欠失を有することを確認した。
【０３８４】
Sleep et al., (1991, Bio/Technology, 9, 183-187)が記載しているように、この酵母株ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ［ｐＤＢ２２４４］の発現プラスミドｐＤＢ２２４４は回復した。ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ ｃｉｒ０を、改良型の酢酸リチウム法(Sigma酵母形質転換キット、ＹＥＡＳＴ−１、プロトコール２; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18))を用い、ｐＤＢ２２４４、ｐＤＢ２９７６、ｐＤＢ２９７７、ｐＤＢ２９７８、ｐＤＢ２９７９、ｐＤＢ２９８０またはｐＤＢ２９８１のいずれかで再形質転換し、ロイシン原栄養性とした。トリプトファンを添加したＢＭＭＤ寒天プレート上で形質転換体を選択した後、トリプトファンを添加したＢＭＭＤ寒天プレート上に貼付した。トリプトファンを添加した１０ｍＬ  ＢＭＭＤ振盪フラスコ培養（２４時間、３０℃、２００ｒｐｍ）から低温保存トレハロース原液を調製した。
【０３８５】
酵母株ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９７６］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９７７］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ３０７８］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ３０７９］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９８０］またはＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９８１］を、改良型の酢酸リチウム法(Sigma酵母形質転換キット、ＹＥＡＳＴ−１、プロトコール２; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18))を用い、ｐＤＢ３０７８からＮｏｔＩ／ＰｓｔＩ消化により単離した１．４１ｋｂ  ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１分断ＤＮＡ断片で形質転換し、トリプトファン原栄養性とした。ＢＭＭＤ寒天プレート上で形質転換体を選択した後、ＢＭＭＤ寒天プレートに貼付した。
【０３８６】
各株６個の形質転換体を、５０ｍＬ振盪フラスコ中、１０ｍＬのＹＥＰＤに接種し、回転振盪機にて３０℃、２００ｒｐｍで４日間インキュベートした。培養上清および細胞バイオマスを採集した。これらのトリプトファン原栄養株およびＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２２４４］からゲノムＤＮＡを調製した(Lee, 1992, Biotechniques, 12, 677)。プライマーＤＳ２３６およびＤＳ３０３（表１１および１２）を用いたゲノムＰＤＩ１遺伝子座のＰＣＲ増幅は次のようにして行った：１μＬ鋳型ゲノムＤＮＡ、５μＬ  １０×バッファー(Fast Start Taq+Mg, (Roche))、１μＬ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５μＬ  各プライマー（２μＭ）、０．４μＬ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＴａｑをＨ２Ｏで５０μＬとした。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９７００を用いて行った。条件は、変性９４℃で４分［ＨＯＬＤ］、その後、［ＣＹＣＬＥ］変性９４℃で３０秒、アニーリング５０℃で３０秒、伸張７２℃で６０秒の３０サイクルの後、［ＨＯＬＤ］７２℃１０分、その後、［ＨＯＬＤ］４℃とした。野生型ＰＤＩ１遺伝子座のＰＣＲ増幅ではＰＣＲ産物は生じなかったが、欠失ＰＤＩ１領域にわたる増幅では、０．６５ｋｂｐのＰＣＲ産物が生じた。ＰＣＲ分析により、試験した３６の可能性のあるｐｄｉ１：：ＴＲＰ１株の総てが予測されたｄｐｄｉ１：：ＴＲＰ１欠失を持っていたことを確認した。
【０３８７】
これらの組換えアルブミンの力価をロケット免疫電気泳動により比較した（図９２）。各群の中で、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９７６］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９７８］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９８０］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９７７］およびＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９７９］の６つのｐｄｉ１：：ＴＲＰ１分断物は総て、極めて類似したｒＨＡ生産性を有していた。ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９８１］の６つのｐｄｉ１：：ＴＲＰ１分断物だけがｒＨＡ発現力価に変動を示した。図９２に示したこれら６つのｐｄｉ１：：ＴＲＰ１分断物をＹＥＰＤ寒天上に拡げ、単一コロニーを単離し、その後、ＢＭＭＤ寒天上に再貼付した。
【０３８８】
３つの、単一細胞由来単離物ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１  ［ｐＤＢ２９７６］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１  ［ｐＤＢ２９７８］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１  ［ｐＤＢ２９８０］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１  ［ｐＤＢ２９７７］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１  ［ｐＤＢ２９７９］およびＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１  ［ｐＤＢ２９８１］を、ＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２２４４］、ＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２９７６］、ＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２９７８］、ＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２９８０］、ＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２９７７］、ＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２９７９］およびＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２９８１］とともに、５０ｍＬ振盪フラスコ中、１０ｍＬのＹＥＰＤに接種し、回転振盪機にて３０℃、２００ｒｐｍで４日間インキュベートした。培養上清を採取し、組換えアルブミン力価をロケット免疫電気泳動により比較した（図９３）。図９３で示されている１３の野生型ＰＤＩ１およびｐｄｉ１：：ＴＲＰ１分断物をＹＥＰＤ寒天上に拡げ、単一コロニーを単離した。次に、各株から１００の単一細胞由来コロニーをＢＭＭＤ寒天または組換えアルブミンの発現を検出するためのヤギ抗ＨＳＡ抗体(Sleep et al., 1991, Bio/Technology, 9, 183-187)を含むＹＥＰＤ寒天上に再貼付し、各コロニーのＬｅｕ＋／ｒＨＡ＋、Ｌｅｕ＋／ｒＨＡ−、Ｌｅｕ−／ｒＨＡ＋またはＬｅｕ−／ｒＨＡ−の表現型をスコアリングした（表１３）。
【０３８９】
【表１３】
2007515962.tif 000038
【０３９０】
これらのデータは、染色体にコードされているＰＤＩを持たない宿主株においてプラスミドに対する選択マーカーとしてＰＤＩ１遺伝子を用いる場合には、この例の富栄養培地などの非選択培地であってもプラスミドの保持が高まることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０３９１】
【図１】種々のプラスミドマップを示す。
【図２】種々のプラスミドマップを示す。
【図３】プラスミド挿入部位を示す。
【図４】種々のプラスミドマップを示す。
【図５】ＰＤＩコード配列を含むＤＮＡ断片の制限地図を示す。
【図６】種々のプラスミドマップを示す。
【図７】種々のプラスミドマップを示す。
【図８】種々のプラスミドマップを示す。
【図９】種々のプラスミドマップを示す。
【図１０】種々のプラスミドマップを示す。
【図１１】種々のプラスミドマップを示す。
【図１２】種々のプラスミドマップを示す。
【図１３】種々のプラスミドマップを示す。
【図１４】種々のプラスミドマップを示す。
【図１５】種々のプラスミドマップを示す。
【図１６】ＰＤＩ１の過剰発現を伴う組換えトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）分泌の増強のロケット免疫電気泳動（ＲＩＥ）測定結果を示す。低温保存酵母原株を１０ｍＬ  ＢＭＭＤ振盪フラスコ培養にて４日間増殖させ、上清を５μＬ／ウェルで添加した。ヤギポリクローナル抗トランスフェリン（ヒト）抗血清(Calbiochem)を、４０μＬ／ロケット免疫電気泳動ゲル（５０ｍＬ）で用いた。Ａ＝対照株［ｐＳＡＣ３５］、フラスコ２本；Ｂ＝対照株［ｐＤＢ２５３６］、フラスコ２本；Ｃ＝対照株［ｐＤＢ２７１１］、原液〜４０倍希釈水溶液；Ｄ＝対照株［ｐＤＢ２９３１］、フラスコ２本；Ｅ＝対照株［ｐＤＢ２９２９］、原液〜４０倍希釈水溶液。
【図１７】ＰＤＩ１の過剰発現を伴う、および伴わない組換えトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）分泌のＲＩＥ分析の結果を示す。低温保存酵母原株を１０ｍＬ  ＢＭＭＤ振盪フラスコ培養にて４日間増殖させ、上清を５μＬ／ウェルで添加した。各株の個々の２つの培養物からの上清からなる二反復の添加とした。ヤギポリクローナル抗トランスフェリン（ヒト）抗血清(Calbiochem)を、４０μＬ／ロケット免疫電気泳動ゲル（５０ｍＬ）で用いた。Ａ＝対照株［ｐＳＡＣ３５］；Ｂ＝対照株［ｐＤＢ２５３６］；Ｃ＝対照株［ｐＤＢ２７１１］；Ｄ＝対照株［ｐＤＢ２９３１］；Ｅ＝対照株［ｐＤＢ２９２９］。
【図１８】ＰＤＩ１過剰発現を伴う、および伴わない組換えトランスフェリン分泌のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。ＢＭＭＤ振盪フラスコ培養物を４日間増殖させ、１０μＬの上清をＧｅｌｃｏｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ試薬(Pierce)を用いた非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）、ＭＯＰＳバッファー、InVitrogen）で分析した。ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２マーカー(InVitrogen)。１＝ｐＤＢ２５３６；２＝ｐＤＢ２５３６；３＝ｐＤＢ２７１１；４＝ｐＤＢ２７１１；５＝ｐＤＢ２９３１；６＝ｐＤＢ２９３１；７＝ｐＤＢ２９２９；８＝ｐＤＢ２９２９；９＝ｐＳＡＣ３５対照。
【図１９】ＰＤＩ１の付加的組込みコピーを有するＳ．セレビシエ株からの組換えトランスフェリン分泌のＲＩＥ分析を示す。５日目のＢＭＭＤ振盪フラスコ培養上清を５ｍＬ／ウェルで添加した。株は、１）ｐＳＡＣ３５（陰性対照）；２）ｐＤＢ２５３６（組換え非グリコシル化トランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ））または３）ｐＤＢ２５０６（このトランスフェリンＯＲＦが４１３番と６１１番のＮ→Ｑ突然変異を含まないトランスフェリンをコードしていること以外はプラスミドｐＤＢ２５３６と同じ、すなわち、組換えグリコシル化トランスフェリン）を含んでいた。各ウェルには個々の形質転換体に由来するサンプルを含んだ。標品はヒト血漿ホロ−トランスフェリン(Calbiochem)１００、５０、２０、１０、５および２ｍｇ．Ｌ−１とした。
【図２０】振盪フラスコ培養で増殖させた株Ａ［ｐＤＢ２５３６］および株Ａ［ｐＤＢ２５０６］からの組換えトランスフェリン分泌のＲＩＥ分析を示す。５日目のＢＭＭＤまたはＹＥＰＤ振盪フラスコ培養上清を５ｍＬ／ウェルで二反復として添加した。
【図２１】振盪フラスコ培養で増殖させた株Ａ［ｐＤＢ２５３６］および株Ａ［ｐＤＢ２５０６］からの組換えトランスフェリン分泌のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。培養物をＢＭＭＤ中で５日間増殖させ、上清３０ｍＬを、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ試薬(Pierce)で染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（商標）、ＭＯＰＳバッファー、InVitrogen）で分析した。１）株Ａ［ｐＤＢ２５３６］形質転換体１；２）株Ａ［ｐＤＢ２５３６］形質転換体２；３）株Ａ［ｐＳＡＣ３５］対照；４）株Ａ［ｐＤＢ２５０６］形質転換体１；５）ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２プロテインスタンダード（およその分子量のみ）。
【図２２】種々のプラスミドマップを示す。
【図２３】ＰＤＩ１コピー数の異なるＳ．セレビシエ株から分泌された組換えトランスフェリンのＲＩＥを示す。３日目のＢＭＭＤ振盪フラスコ培養上清を５ｍＬ／ウェルで添加した。ヤギポリクローナル抗トランスフェリン（ヒト）抗血清(Calbiochem)を３０ｍＬ／ロケット免疫電気泳動ゲル（５０ｍＬ）で用いた。（Ａ）Ｓ．セレビシエ対照株［ｐＤＢ２７１１］または［ｐＤＢ２７１２］からの上清；（Ｂ）株Ａ［ｐＤＢ２５３６］からの上清；（Ｃ）対照株［ｐＤＢ２５３６］からの上清。
【図２４】ＰＤＩ１コピー数の異なるＳ．セレビシエ株から分泌された組換えトランスフェリンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ還元ゲルを、１レーン当たり３０ｍＬの３日目ＢＭＭＤ振盪フラスコ培養上清とともに添加した後、ＭＯＰＳバッファー(InVitrogen)で泳動させる；（レーン１）対照株［ｐＤＢ２５３６］からの上清；（レーン２）株Ａ［ｐＤＢ２５３６］からの上清；（レーン３〜６）対照株［ｐＤＢ２７１１］または［ｐＤＢ２７１２］からの上清；（レーン７）分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２、InVitrogen）。
【図２５】種々のプラスミドマップを示す。
【図２６】付加的なＰＤＩ１遺伝子の同時発現を伴う、および伴わない種々のＳ．セレビシエ株から分泌された組換えトランスフェリンのＲＩＥを示す。１０ｍＬ  ＹＥＰＤ振盪フラスコに酵母を接種し、３０℃で４日間インキュベートした。ロケット免疫電気泳動ゲルの１ウェル当たり５μＬ培養上清を添加した。血漿Ｔｆ標準濃度はμｇ／ｍＬである。２０μＬヤギ抗Ｔｆ／５０ｍＬアガロース。プレシピンをクーマシーブルーで染色した。
【図２７】種々のプラスミドマップを示す。
【図２８】種々のプラスミドマップを示す。
【図２９】種々のプラスミドマップを示す。
【図３０】種々のプラスミドマップを示す。
【図３１】種々のプラスミドマップを示す。
【図３２】種々のプラスミドマップを示す。
【図３３】種々のプラスミドマップを示す。
【図３４】種々のプラスミドマップを示す。
【図３５】種々のプラスミドマップを示す。
【図３６】種々のプラスミドマップを示す。
【図３７】種々のプラスミドマップを示す。
【図３８】種々のプラスミドマップを示す。
【図３９】種々のプラスミドマップを示す。
【図４０】種々のプラスミドマップを示す。
【図４１】種々のプラスミドマップを示す。
【図４２】種々のプラスミドマップを示す。
【図４３】種々のプラスミドマップを示す。
【図４４】種々のプラスミドマップを示す。
【図４５】種々のプラスミドマップを示す。
【図４６】種々のプラスミドマップを示す。
【図４７】種々のプラスミドマップを示す。
【図４８】種々のプラスミドマップを示す。
【図４９】種々のプラスミドマップを示す。
【図５０】種々のプラスミドマップを示す。
【図５１】種々のプラスミドマップを示す。
【図５２】種々のプラスミドマップを示す。
【図５３】種々の長さのプロモーターを有するＰＤＩ１遺伝子と同時発現させた場合の種々のＳ．セレビシエ株におけるｒＨＡ発現のＲＩＥ分析を示す。１０ｍＬ  ＹＥＰＤ振盪フラスコに酵母を接種し、３０℃で４日間インキュベートした。ロケット免疫電気泳動ゲルの１ウェル当たり４μＬ培養上清を添加した。ｒＨＡ標準濃度はμｇ／ｍＬである。４００μＬヤギ抗ＨＡ（Sigma製品Ａ−１１５１を水５ｍＬに再懸濁）５０ｍＬアガロース。プレシピンをクーマシーブルーで染色した。
【図５４】種々の長さのプロモーターを有するＰＤＩ１遺伝子と同時発現させた場合の種々のＳ．セレビシエ株におけるｒＨＡ発現のＲＩＥ分析を示す。１０ｍＬ  ＹＥＰＤ振盪フラスコに酵母を接種し、３０℃で４日間インキュベートした。ロケット免疫電気泳動ゲルの１ウェル当たり４μＬ培養上清を添加した。ｒＨＡ標準濃度はμｇ／ｍＬである。４００μＬヤギ抗ＨＡ（Sigma製品Ａ−１１５１を水５ｍＬに再懸濁）５０ｍＬアガロース。プレシピンをクーマシーブルーで染色した。
【図５５】種々のＰＤＩ１構築物と同時発現させた場合のｒＴＦ発現のＲＩＥ分析を示す。１０ｍＬ  ＢＭＭＤ振盪フラスコに酵母を接種し、３０℃で４日間インキュベートした。２５μＬのヤギ抗Ｔｆ／５０ｍＬを含んだロケット免疫電気泳動ゲルの１ウェル当たり５μＬ培養上清を添加した。血漿Ｔｆ標準濃度はμｇ／ｍＬである。プレシピンをクーマシーブルーで染色した。
【図５６】種々のＰＤＩ１構築物と同時発現させた場合のｒＴＦ発現のＲＩＥ分析を示す。１０ｍＬ  ＹＥＰＤ振盪フラスコに酵母を接種し、３０℃で４日間インキュベートした。２５μＬのヤギ抗Ｔｆ／５０ｍＬを含んだロケット免疫電気泳動ゲルの１ウェル当たり５μＬ培養上清を添加した。血漿Ｔｆ標準濃度はμｇ／ｍＬである。プレシピンをクーマシーブルーで染色した。
【図５７】種々のプラスミドマップを示す。
【図５８】種々のプラスミドマップを示す。
【図５９】種々のプラスミドマップを示す。
【図６０】種々のプラスミドマップを示す。
【図６１】種々のプラスミドマップを示す。
【図６２】種々のプラスミドマップを示す。
【図６３】種々のプラスミドマップを示す。
【図６４】種々のプラスミドマップを示す。
【図６５】種々のプラスミドマップを示す。
【図６６】種々のプラスミドマップを示す。
【図６７】種々のプラスミドマップを示す。
【図６８】種々のプラスミドマップを示す。
【図６９】種々のプラスミドマップを示す。
【図７０】種々のプラスミドマップを示す。
【図７１】種々のプラスミドマップを示す。
【図７２】組換えＰＤＩ１と同時発現させた場合、およびさせない場合のｒＨＡ融合タンパク質のＲＩＥ分析を示す。１０ｍＬ  ＢＭＭＤ振盪フラスコに、アルブミン融合発現プラスミドで形質転換したＹＢＸ７を接種し、３０℃で４日間インキュベートした。ロケット免疫電気泳動ゲルの１ウェル当たり４μＬ培養上清を添加した。ｒＨＡ標準濃度はμｇ／ｍＬである。２００μＬヤギ抗ＨＡ（Sigma製品Ａ−１１５１を水５ｍＬに再懸濁）／５０ｍＬアガロース。プレシピンをクーマシーブルーで染色した。
【図７３】発現プラスミド上にＰＤＩ１が存在する場合、および存在しない場合の組換えアルブミン融合物の分泌のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。１０ｍＬ  ＢＭＭＤ振盪フラスコに酵母を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４日間インキュベートした。３０μＬ上清を、ＧｅｌＣｏｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ試薬(Pierce)を用いた非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）、ＭＥＳバッファー、InVitrogen）で分析した。１＝ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２マーカー(InVitrogen)；２＝１μｇ  ｒＨＡ；３＝アンギオスタチン−ｒＨＡ；４＝アンギオスタチン−ｒＨＡ＋ＰＤＩ１；５＝エンドスタチン−ｒＨＡ；６＝エンドスタチン−ｒＨＡ＋ＰＤＩ１；７＝ＤＸ−８９０−（ＧＧＳ）４ＧＧ−ｒＨＡ；８＝ＤＸ−８９０−（ＧＧＳ）４ＧＧ−ｒＨＡ＋ＰＤＩ１；９＝ＤＰＩ−１４−（ＧＧＳ）４ＧＧ−ｒＨＡ；１０＝ＤＰＩ−１４−（ＧＧＳ）４ＧＧ−ｒＨＡ＋ＰＤＩ１；１１＝Ａｘｏｋｉｎｅ（商標）（ＣＮＴＦＡｘ１５）−（ＧＧＳ）４ＧＧ−ｒＨＡ(Lambert et al, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 4652-4657)；１２＝Ａｘｏｋｉｎｅ（商標）（ＣＮＴＦＡｘ１５）−（ＧＧＳ）４ＧＧ−ｒＨＡ＋ＰＤＩ１。
【図７４】種々のプラスミドマップを示す。
【図７５】種々のプラスミドマップを示す。
【図７６】２μｍ系プラスミドからのＯＲＭ２同時発現を伴うＳ．セレビシエからのトランスフェリン分泌の増強を示すＲＩＥ分析を示す。４日目の振盪フラスコ培養上清を５μＬ／ウェルで添加した。標品はヒト血漿ホロ−トランスフェリン(Calbiochem)２５、２０、１５、１０、５μｇ／ｍｌとし、５μｌ／ウェルを添加した。ヤギポリクローナル抗トランスフェリン（ヒト）抗血清(Calbiochem)を２０μｌ／ロケット免疫電気泳動ゲル（５０ｍｌ）で用いた。
【図７７】種々のプラスミドマップを示す。
【図７８】種々のプラスミドマップを示す。
【図７９】種々のプラスミドマップを示す。
【図８０】２μｍ系プラスミドからのＰＳＥ１同時発現を伴うＳ．セレビシエからのトランスフェリン分泌の増強を示すＲＩＥ分析を示す。４日目の振盪フラスコ培養上清を５μＬ／ウェルで添加した。標品はヒト血漿ホロ−トランスフェリン(Calbiochem)２５、２０、１５、１０、５μｇ／ｍｌとし、５μｌ／ウェルを添加した。ヤギポリクローナル抗トランスフェリン（ヒト）抗血清(Calbiochem)を２０μｌ／ロケット免疫電気泳動ゲル（５０ｍｌ）で用いた。
【図８１】種々のプラスミドマップを示す。
【図８２】種々のプラスミドマップを示す。
【図８３】種々のプラスミドマップを示す。
【図８４】２μｍ系プラスミドからのＳＳＡ１同時発現を伴うＳ．セレビシエからのトランスフェリン分泌の増強を示すＲＩＥ分析を示す。４日目の振盪フラスコ培養上清を５μＬ／ウェルで添加した。標品はヒト血漿ホロ−トランスフェリン(Calbiochem)２５、２０、１５、１０、５μｇ／ｍｌとし、５μｌ／ウェルを添加した。ヤギポリクローナル抗トランスフェリン（ヒト）抗血清(Calbiochem)を２０μｌ／ロケット免疫電気泳動ゲル（５０ｍｌ）で用いた。
【図８５】種々のプラスミドマップを示す。
【図８６】種々のプラスミドマップを示す。
【図８７】種々のプラスミドマップを示す。
【図８８】種々のプラスミドマップを示す。
【図８９】種々のプラスミドマップを示す。
【図９０】種々のプラスミドマップを示す。
【図９１】種々のプラスミドマップを示す。
【図９２】ＲＩＥの結果を示す。１０ｍＬ  ＹＥＰＤ振盪フラスコに、ｐＤＢ３０７８から単離した１．４１ｋｂのＮｏｔＩ／ＰｓｔＩ  ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１分断ＤＮＡ断片で形質転換してトリプトファン原栄養性としたＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９７６］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９７７］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９７８］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９７９］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９８０］またはＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ［ｐＤＢ２９８１］を接種した。形質転換体を３０℃、２００ｒｐｍで４日間増殖させた。ロケット免疫電気泳動ゲルの１ウェル当たり４μＬの培養上清を添加した。ｒＨＡ標準濃度はμｇ／ｍＬである。７００μＬヤギ抗ＨＡ（Sigma製品Ａ−１１５１を水５ｍＬに再懸濁）／５０ｍＬアガロース。プレシピンをクーマシーブルーで染色した。さらなる分析のために選択した単離物を（＊）で示す。
【図９３】ＲＩＥの結果を示す。１０ｍＬ  ＹＥＰＤ振盪フラスコに、ＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２２４４］、ＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２９７６］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１  ［ｐＤＢ２９７６］、ＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２９７８］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１  ［ｐＤＢ２９７８］、ＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２９８０］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１  ［ｐＤＢ２９８０］、ＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２９７７］、ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１  ［ｐＤＢ２９７７］、ＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２９７９］  ＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１  ［ｐＤＢ２９７９］、ＤＸＹ１  ［ｐＤＢ２９８１］およびＤＸＹ１  ｔｒｐ１Δ  ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１  ［ｐＤＢ２９８１］を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４日間増殖させた。ロケット免疫電気泳動ゲルの１ウェル当たり４μＬの培養上清を添加した。ｒＨＡ標準濃度はμｇ／ｍＬである。８００μＬヤギ抗ＨＡ（Sigma製品Ａ−１１５１を水５ｍＬに再懸濁）／５０ｍＬアガロース。プレシピンをクーマシーブルーで染色した。さらなる分析のために選択した単離物を（＊）で示す。
【図９４】実施例６に記載されているように長いプロモーターを有するＳＫＱ２ｎおよびＳ２８８ｃの遺伝子配列の配列アラインメントを示す。
【図９５】種々のプラスミドマップを示す。
【図９６】種々のプラスミドマップを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４Ａ】
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【図９４Ｂ】
2007515962.tif 000133
【図９４Ｃ】
2007515962.tif 000134
【図９５】
2007515962.tif 000135
【図９６】
2007515962.tif 000136
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月24日(2006.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非２μｍ系プラスミドタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）シャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている遺伝子と、非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている遺伝子とを含む２μｍ系プラスミドを含んでなる宿主細胞を準備すること、
（ｂ）該宿主細胞を、培養培地中、シャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている遺伝子と、非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている遺伝子の同時発現を可能とする条件下で培養すること、および
（ｃ）発現した非２μｍ系プラスミドタンパク質を培養宿主細胞または培養培地から精製すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
精製された非２μｍ系プラスミドタンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化する工程、および、所望により、このようにして製剤化されたタンパク質を単位投与形で提供する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
真菌（好ましくは、酵母）または脊椎動物の非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている遺伝子とシャペロンタンパク質をコードしている遺伝子とを同じ２μｍ系プラスミド上に提供することにより、前記非２μｍ系プラスミドタンパク質の生産を増強するための発現ベクターとしての、２μｍ系プラスミドの使用。
【請求項４】
シャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている遺伝子と非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている遺伝子とを含んでなる２μｍ系プラスミドであって、このプラスミドが２μｍプラスミドに基づく場合には、非組込みベクターである、プラスミド。
【請求項５】
シャペロンが真菌シャペロン（好ましくは、酵母シャペロン）または哺乳類シャペロン（好ましくは、ヒトシャペロン）の配列を有するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項６】
シャペロンが、ＡＨＡ１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５、ＣＣＴ６、ＣＣＴ７、ＣＣＴ８、ＣＮＳ１、ＣＰＲ３、ＣＰＲ６、ＥＰＳ１、ＥＲＯ１、ＥＵＧ１、ＦＭＯ１、ＨＣＨ１、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ３０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ８２、ＪＥＭ１、ＭＤＪ１、ＭＤＪ２、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＰＤＩ１、ＰＦＤ１、ＡＢＣ１、ＡＰＪ１、ＡＴＰ１１、ＡＴＰ１２、ＢＴＴ１、ＣＤＣ３７、ＣＰＲ７、ＨＳＣ８２、ＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ１１、ＮＯＢ１、ＥＣＭ１０、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、ＳＳＥ２、ＳＩＬ１、ＳＬＳ１、ＵＢＩ４、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、ＰＥＲ１、ＰＴＣ２、ＰＳＥ１およびＨＡＣ１または末端切断型イントロンレスＨＡＣ１のいずれか１つによりコードされているタンパク質の配列を含むものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項７】
シャペロンがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼであるか、またはＰＳＥ１、ＯＲＭ２もしくはＳＳＡ１によりコードされているタンパク質またはその変異体もしくは断片の配列を含むものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項８】
宿主細胞が、前記プラスミドによりコードされている第一のシャペロンとは異なるシャペロンをコードしている第二の組換え遺伝子も発現する、請求項１、２、５、６または７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
シャペロンをコードしている第二の組換え遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
プラスミドが、異なるシャペロンをコードしている２つの異なる遺伝子を含み、その遺伝子の１つが請求項８により定義されたシャペロンをコードしている第二の組換え遺伝子である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１１】
前記シャペロンの１つがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１２】
前記シャペロンの１つがＯＲＭ２である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１３】
前記２つのシャペロンがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとＯＲＭ２である、請求項８または９に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１４】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、酵母において分泌を引き起こすのに有効なリーダー配列を含むものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１５】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、真核生物タンパク質、またはその断片もしくは変異体、好ましくは脊椎動物または真菌（例えば、酵母）タンパク質である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１６】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が商業上有用なタンパク質である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１７】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、アルブミン、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば、血液凝固因子）、アンチスタシン、ｔｉｃｋ抗凝固ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンギオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンに基づく分子またはいずれかの断片（例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ断片）、Ｋｕｎｉｔｚドメインタンパク質、インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ２、インターフェロンα種および亜種、インターフェロンβ種および亜種、インターフェロンγ種および亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＡＸ１５（Ａｘｏｋｉｎ（商標））、ＩＬ１−受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびＥＰＯ模倣体、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびＴＰＯ模倣体、プロサプチド、シアノビリン−Ｎ，５−ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルディン、血小板由来増殖因子、副甲状腺ホルモン、プロインスリン、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、インスリン様増殖因子、カルシトニン、成長ホルモン、トランスフォーミング増殖因子β、腫瘍壊死因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、プレ型および活性型双方の凝固因子（限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ウィルブランド因子、α１アンチトリプシン、プラスミノーゲンアクチベーター、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Ｘおよび因子XIIIを含む）、神経増殖因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターαトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、Ｃタンパク質、Ｓタンパク質、または上記のいずれかの変異体もしくは断片から選択される配列を含むものである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１８】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、アルブミンまたはその変異体もしくは断片の配列を含むものである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項１９】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、トランスフェリンファミリーメンバー、好ましくはトランスフェリンもしくはラクトフェリンまたはその変異体もしくは断片の配列を含むものである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項２０】
非２μｍ系プラスミドタンパク質が、融合タンパク質、例えば、アルブミンもしくはトランスフェリンファミリーメンバーまたはいずれかの変異体もしくは断片が別のタンパク質配列と直接的または間接的に融合された融合タンパク質を含むものである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法、使用またはプラスミド。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項で定義されたプラスミドを含んでなる、宿主細胞。
【請求項２２】
プラスミドによりコードされているシャペロンが必須遺伝子である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
プラスミドの不在下では、前記シャペロンを産生しない、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
酵母細胞である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
プラスミドがｐＳＲ１、ｐＳＢ３もしくはｐＳＢ４に基づくものであって、酵母細胞がチゴサッカロミセス・ルクシーであるか、プラスミドがｐＳＢ１もしくはｐＳＢ２に基づくものであって、酵母細胞がチゴサッカロミセス・バイリーであるか、プラスミドがｐＳＭ１に基づくものであって、酵母細胞がチゴサッカロミセス・フェルメンタチであるか、プラスミドがｐＫＤ１に基づくものであって、酵母細胞がクルイベロミセス・ドロソフィラルムであるか、プラスミドがｐＰＭ１に基づくものであって、酵母細胞がピキア・メンブラネファシエンスであるか、またはプラスミドが２μｍプラスミドに基づくものであって、酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエもしくはサッカロミセス・カルルスベルゲネシスである、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
プラスミドが２μｍプラスミドに基づくものであって、酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエまたはサッカロミセス・カルルスベルゲネシスである、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
宿主細胞が、請求項２１〜２６のいずれか一項で定義された宿主細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
宿主細胞が、請求項２３またはそれに従属する他のいずれかの請求項で定義された宿主細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｂ）が、宿主細胞を富栄養培地などの非選択培地中で培養することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
非２μｍ系プラスミドタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）第一のシャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子、第二のシャペロンタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子、および非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている第三の組換え遺伝子を含む宿主細胞であって、第一のシャペロンと第二のシャペロンが異なるものである、宿主細胞を準備すること、
（ｂ）該宿主細胞を、培養培地中、第一、第二および第三の遺伝子の発現を可能とする条件下で培養すること、および
（ｃ）所望により、発現した非２μｍ系プラスミドタンパク質を培養宿主細胞または培養培地から精製すること、および
（ｄ）所望により、精製されたタンパク質を凍結乾燥すること
を含んでなる、方法。
【請求項３１】
精製された非２μｍ系プラスミドタンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化する工程、および、所望により、このようにして製剤化されたタンパク質を単位投与形で提供する工程をさらに含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
第一および第二のシャペロンが、ＡＨＡ１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５、ＣＣＴ６、ＣＣＴ７、ＣＣＴ８、ＣＮＳ１、ＣＰＲ３、ＣＰＲ６、ＥＰＳ１、ＥＲＯ１、ＥＵＧ１、ＦＭＯ１、ＨＣＨ１、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ３０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ８２、ＪＥＭ１、ＭＤＪ１、ＭＤＪ２、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＰＤＩ１、ＰＦＤ１、ＡＢＣ１、ＡＰＪ１、ＡＴＰ１１、ＡＴＰ１２、ＢＴＴ１、ＣＤＣ３７、ＣＰＲ７、ＨＳＣ８２、ＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ１１、ＮＯＢ１、ＥＣＭ１０、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、ＳＳＥ２、ＳＩＬ１、ＳＬＳ１、ＵＢＩ４、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、ＰＥＲ１、ＰＴＣ２、ＰＳＥ１およびＨＡＣ１または末端切断型イントロンレスＨＡＣ１のいずれか１つによりコードされているタンパク質の配列を含むものである、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
第一のシャペロンがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼである、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
第二のシャペロンがＯＲＭ２である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
第一または第二のシャペロンの少なくとも１つが、染色体に組み込まれた組換え遺伝子によりコードされている、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
第一または第二のシャペロンの少なくとも１つが、プラスミド上の遺伝子によりコードされている、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記プラスミドが請求項１〜２６のいずれか一項で定義されたプラスミドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子と、トランスフェリンに基づくタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子とを含んでなる、宿主細胞。
【請求項３９】
トランスフェリンに基づくタンパク質の発現を増強するための、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の配列を含むタンパク質をコードしている組換え遺伝子の使用。
【請求項４０】
トランスフェリンに基づくタンパク質が、トランスフェリンまたはトランスフェリンファミリーの他のメンバー（例えば、ラクトフェリン）、その変異体もしくは断片、またはトランスフェリン、その変異体もしくは断片を含む融合タンパク質の配列を含むものである、請求項３８に記載の宿主細胞または請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子がプラスミド上に提供される、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４２】
前記プラスミドが２μｍ系プラスミドである、請求項４１に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４３】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子が染色体に組み込まれる、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４４】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子が、内因的にコードされているＰＤＩ遺伝子の遺伝子座で、好ましくは内因性ＰＤＩ遺伝子の発現を妨げることなく、染色体に組み込まれる、請求項４３に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４５】
トランスフェリンに基づくタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子がプラスミド上に提供される、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４６】
前記プラスミドが２μｍ系プラスミドである、請求項４５に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４７】
トランスフェリンに基づくタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子が染色体に組み込まれる、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４８】
トランスフェリンに基づくタンパク質の配列を含むタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子が、内因的にコードされているＰＤＩ遺伝子の遺伝子座で、好ましくは内因性ＰＤＩ遺伝子の発現を妨げることなく、染色体に組み込まれる、請求項４７に記載の宿主細胞または使用。
【請求項４９】
非２μｍ系プラスミドタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）ＯＲＭ２またはその変異体もしくは断片の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子と、非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子とを含む宿主細胞を準備すること、および
（ｂ）該宿主細胞を、培養培地中、第一および第二の遺伝子の発現を可能とする条件下で培養すること
を含んでなる、方法。
【請求項５０】
精製された非２μｍ系プラスミドタンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化する工程、および、所望により、このようにして製剤化されたタンパク質を単位投与形で提供する工程をさらに含んでなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＯＲＭ２またはその変異体もしくは断片の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子が、宿主細胞の染色体に組み込まれている、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＯＲＭ２またはその変異体もしくは断片の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子がプラスミド上に存在する、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５３】
ＯＲＭ２またはその変異体もしくは断片の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子と、非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子とを含んでなる、宿主細胞。
【請求項５４】
宿主細胞中における非２μｍ系プラスミドタンパク質の発現を増強するための、ＯＲＭ２またはその変異体もしくは断片の配列を含むタンパク質をコードしている組換え遺伝子の使用。
【請求項５５】
ＯＲＭ２またはその変異体もしくは断片の配列を含むタンパク質をコードしている第一の組換え遺伝子と、非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている第二の組換え遺伝子とを含んでなる、プラスミド。
【請求項５６】
２μｍ系プラスミドである、請求項５５に記載のプラスミド。
【請求項５７】
非２μｍ系プラスミドタンパク質が請求項１４〜２０のいずれか一項で定義されたものである、請求項４９〜５６のいずれか一項に記載の方法、使用、宿主細胞またはプラスミド。
【請求項５８】
必須シャペロンをコードしている遺伝子を含むプラスミドを含んでなり、該プラスミドの不在下ではシャペロンを産生できない宿主細胞であって、該プラスミドが、請求項１４〜２０のいずれか一項で定義された非２μｍ系プラスミドタンパク質などの非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている組換え遺伝子をさらに含むものである、宿主細胞。
【請求項５９】
前記プラスミドの不在下では生存力のない、請求項５８に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
前記シャペロンがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼである、請求項５８または５９に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
必須シャペロンをコードしている遺伝子を単独の選択マーカーとして含んでなる、プラスミド。
【請求項６２】
請求項１４〜２０のいずれか一項で定義された非２μｍ系プラスミドタンパク質などの非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている遺伝子をさらに含んでなる、請求項６１に記載のプラスミド。
【請求項６３】
２μｍ系プラスミドである、請求項６１または６２に記載のプラスミド。
【請求項６４】
非２μｍ系プラスミドタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）請求項５８〜６０のいずれか一項で定義された宿主細胞を準備する工程、および
（ｂ）該宿主細胞を、培養培地中、必須シャペロンおよび非２μｍ系プラスミドタンパク質の発現を可能とする条件下で培養する工程
を含んでなる、方法。
【請求項６５】
宿主細胞が請求項６１〜６３のいずれか一項で定義されたプラスミドを含むものである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
工程（ｂ）が、宿主細胞を、富化栄養培地または複合培地などの非選択培地で培養することにより実施される、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
宿主細胞を最小培地などの選択培地中で培養し、その宿主細胞内でタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現させることにより、宿主細胞における非２μｍ系プラスミドタンパク質の発現を増強するための、前記ヌクレオチド配列の使用であって、このタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードしているヌクレオチド配列が次の特徴：
（ａ）そのヌクレオチド配列が、天然ＰＤＩプロモーターまたはその機能的変異体の配列を有するプロモーターを含み、かつ、一連の１４回の「ＴＡ」反復を含むこと；
（ｂ）コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼが、アミノ酸ＥＡＤＡＥＡＥＡまたはその保存的に置換された変異体を、一般に、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ３８４０２に関して定義されている５０６〜５１３番の位置に含むこと；
（ｃ）コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの残基Ｓｅｒ４１がコドンＴＣＴによりコードされていること；
（ｄ）コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの残基Ｇｌｕ４４がコドンＧＡＡによりコードされていること；
（ｅ）コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの残基Ｌｅｕ２６２がコドンＴＴＧによりコードされていること；
（ｆ）コードされているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの残基Ａｓｐ５１４がコドンＧＡＣによりコードされていること；または
（ｇ）そのヌクレオチド配列が、天然ＰＤＩターミネーターまたはその機能的変異体の配列を有するターミネーター配列を含み、かつ、１９１９番の位置（天然ＳＫＱ２ｎターミネーター配列に関して１９１９番と定義されたもの）に一連の連続する８個の塩基「Ａ」、および／または塩基「Ｃ」を含むこと
のうち少なくとも１つを有することを特徴とする、使用。
【請求項６８】
非２μｍ系プラスミドタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードしている組換え遺伝子を含み、かつ、請求項６７で定義された核酸配列の配列を有し、さらに非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている組換え遺伝子を含む宿主細胞を準備する工程、および
（ｂ）該宿主細胞を、最小培養培地中、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび非２μｍ系プラスミドタンパク質の発現を可能とする条件下で培養する工程
を含んでなる、方法。
【請求項６９】
宿主細胞内でシャペロンをコードしているコード配列に作動可能なように連結されたプロモーターの配列を含むポリヌクレオチド配列を発現させることにより宿主細胞における非２μｍ系プラスミドタンパク質の発現を増強するための、該ポリヌクレオチドの使用であって、前記プロモーターが、そのコード配列がその天然プロモーターに作動可能なように連結されていた場合に達成されるであろうレベルよりも低いレベルのシャペロン発現を果たすことを特徴とするものである、使用。
【請求項７０】
非２μｍ系プラスミドタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）シャペロンをコードしているコード配列に作動可能なように連結されたプロモーター（このプロモーターは、そのコード配列がその天然プロモーターに作動可能なように連結されていた場合に達成されるであろうレベルよりも低いレベルのシャペロン発現を果たすことを特徴とする）の配列を含む組換え遺伝子を含み、かつ、非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードしている組換え遺伝子をさらに含む宿主細胞を準備する工程、および
（ｂ）該宿主細胞を、シャペロンおよび非２μｍ系プラスミドタンパク質の発現を可能とする条件下で培養する工程
を含んでなる、方法。
【請求項７１】
精製されたタンパク質を凍結乾燥する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７２】
発現した非２μｍ系プラスミドタンパク質を培養宿主細胞または培養培地から精製する工程をさらに含んでなる、請求項４９、６４、６８または７０に記載の方法。
【請求項７３】
精製されたタンパク質を凍結乾燥する工程をさらに含んでなる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
精製または凍結乾燥された非２μｍ系プラスミドタンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化する工程をさらに含んでなる、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
製剤化されたタンパク質を単位投与形で提供する工程をさらに含んでなる、請求項７４に記載の方法。
【国際調査報告】
2007515962.tif 000137
2007515962.tif 000138