(57)【要約】リガンドと被検体との相互作用を測定するための方法およびアッセイが記載される。該アッセイは、問題のリガンドと結合しているコロイダル粒子の懸濁液を含み得る。該コロイダル粒子は、凝縮相から分散相への相転移状態またはその付近に、該懸濁液中に維持される。次いで、試験される被検体が、該懸濁液中に添加される。該被検体が該リガンドに結合すると、相変化が起こり、該結合が成功したことを示す。
2007521494.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の被検体(analyte)を検出するための方法であって、
コロイダル粒子の懸濁液を提供すること（ここで、該粒子は、該被検体へ結合するリガンドと結合しており、そして該コロイダル粒子は、動的相転移状態付近にある）；
該懸濁液と該サンプルとを接触させること；ならびに
該コロイダル粒子が第一相から第二相へ転移するかどうかを測定すること（ここで、このような転移は、該被検体が該サンプル中に存在することの指標である）、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記コロイダル粒子が脂質層を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂質層が脂質二重層を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記脂質二重層が天然細胞膜を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記脂質二重層が人工細胞膜を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記コロイダル粒子が前記リガンドへ共有結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドが前記コロイダル粒子へ非共有的に結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リガンドが、前記コロイダル粒子上の脂質層中に散在している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記コロイダル粒子が、正味の負電荷または正味の中性電荷を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記被検体が、蛋白質、核酸、抗体、抗原、受容体、ウイルス、および細菌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該コロイダル粒子が第一相から第二相へ転移するかどうかを測定することが、前記懸濁液中のコロイダル粒子の中心間の距離を測定することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記コロイダル粒子が１μｍと１０μｍの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一相が凝縮相（condensed phase）であり、そして前記第二相が分散相（dispersed phase）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一相が分散相であり、そして前記第二相が凝縮相である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記コロイダル粒子の懸濁液が、第一集団のコロイダル粒子と第二集団のコロイダル粒子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一集団が、前記第二集団中のコロイダル粒子よりも大きいコロイダル粒子を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第一集団が、前記第二集団中のコロイダル粒子とは異なるように標識されているコロイダル粒子を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
リガンドへの被検体(analyte)の結合を検出するためのアッセイシステムであって、
コロイダル粒子の懸濁液（ここで、該コロイダル粒子は、動的相転移状態付近にある）；
該粒子と結合しておりそして該被検体に特異的なリガンド；ならびに
該被検体によって接触されると、該コロイダル粒子が第一相から第二相へ転移するかどうかを測定するように構成されたデバイス（ここで、このような転移は、該被検体が該リガンドへ結合されることの指標である）
を備える、アッセイシステム。
【請求項１９】
前記コロイダル粒子の懸濁液が、第一集団のコロイダル粒子と第二集団のコロイダル粒子を含む、請求項１８に記載のアッセイシステム。
【請求項２０】
前記第一集団が、前記第二集団中のコロイダル粒子よりも大きいコロイダル粒子を含む、請求項１９に記載のアッセイシステム。
【請求項２１】
前記第一集団が、前記第二集団中のコロイダル粒子とは異なるように標識されているコロイダル粒子を含む、請求項１９に記載のアッセイシステム。
【請求項２２】
前記コロイダル粒子が脂質層を含む、請求項１８に記載のアッセイシステム。
【請求項２３】
前記脂質層が天然細胞膜を含む、請求項２２に記載のアッセイシステム。
【請求項２４】
前記コロイダル粒子が前記リガンドへ共有結合されている、請求項１８に記載のアッセイシステム。
【請求項２５】
前記リガンドが前記コロイダル粒子へ非共有的に結合されている、請求項１８に記載のアッセイシステム。
【請求項２６】
前記第一相が凝縮相（condensed phase）であり、そして前記第二相が分散相（dispersed phase）である、請求項１８に記載のアッセイシステム。
【請求項２７】
前記第一相が分散相であり、そして前記第二相が凝縮相である、請求項１８に記載のアッセイシステム。
【請求項２８】
リガンドへの被検体の結合を検出するためのアッセイシステムであって、
コロイダル粒子の懸濁液（ここで、該粒子は脂質層でコーティングされており、そしてここで、該粒子は、動的相転移状態付近にある）；
該脂質層と結合しているリガンド（ここで、該リガンドは、該被検体について特異的である）；ならびに
該被検体によって接触されると、該コロイダル粒子が第一相から第二相へ転移するかどうかを検出するための手段（ここで、このような転移は、該被検体が該リガンドへ結合されることの指標である）
を備える、アッセイシステム。
【請求項２９】
前記検出手段が顕微鏡を含む、請求項２８に記載のアッセイシステム。
【請求項３０】
前記検出手段が蛍光検出器を含む、請求項２８に記載のアッセイシステム。
【請求項３１】
前記脂質層が天然細胞膜を含む、請求項２８に記載のアッセイシステム。
【請求項３２】
前記リガンドが前記脂質層へ非共有的に結合されている、請求項２８に記載のアッセイシステム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本願は、2003年12月4日に出願された、係属中の米国仮出願番号60/527,209の利益を主張し、その全体が、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
政府支援の記述
本発明は、契約番号DE-AC03-76SF00098で、the U.S. Department of Energy at Lawrence Berkeley National Laboratoryによって支援された研究の間になされた。政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
発明の分野
本発明は、問題の被検体と問題のリガンドとの間の結合相互作用をアッセイするための方法および組成物に関する。より詳細には、本発明は、溶液中のコロイダル粒子の集団的挙動の変化を観察することによって、被検体とリガンドとの相互作用を検出することに関する。
【０００４】
関連技術の説明
大抵の生体分子は、インビボでそれらの作用を行うために、他の生体分子と相互作用する。例えば、細胞プロセスは、しばしば、複数のサブユニット複合体において共に結合された蛋白質を伴う。更に、複数のタイプの生体分子間での相互作用は、細胞骨格および細胞膜のような、細胞構造の多様性を生み出す。更には、多くの病原体、疾患、および生理学的に顕著なコンディションは、生物学的サンプル中の特定の物質の存在によって診断され得る。従って、問題のリガンドと被検体（analyte）との間の結合を検出する感度が高く、低コストな方法について、一般的な要求が存在する。
【０００５】
いくつかのリガンドは、細胞膜中に天然に存在する。この理由のために、細胞膜は、それらのリガンドとインビボでのそれらの機能とのつながりを測定するために広く研究されている。例えば、多くの公知の治療薬物は、細胞膜の表面上に存在する生体分子（例えば、受容体）を標的にしている。膜表面上における生化学反応を研究することにおける重大な課題は、インビトロアッセイ内で、天然に流動性の膜環境を模倣することの困難性である。１つのストラテジーは、インビボでの細胞膜の構造を模倣するために、脂質膜で固体支持体（例えば、シリカまたは特定のポリマー）をコーティングすることを包含する（Sackmann, E., Science 271: 43-48 (1996); Groves, J. T., Curr. Op. Drug Disc. & Dev., 5: 606-612 (2002)）。この技術を使用して、膜は、該固体界面付近に堅く捕捉されるだけでなく、それらの天然の流動性および生物学的な機能性が保持された（Grakoui et al., Science 285: 221-227 (1999)）。
【０００６】
支持される表面（例えば、シリカ）上を流動する脂質膜が、Ｇ蛋白質共役型受容体を含む、種々の治療的に価値のある膜蛋白質を研究するために使用された（Fang et al., J. Am. Chem. Soc, 124: 2394-2395 (2002)）。しかし、それらの膜表面上における分子相互作用の検出は、一般的に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（例えば、Hoffman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 11215- 11220 (2000)）または全内部反射（ＴＩＲ）顕微鏡（Yang et al., Anal. Chem., 73:165-169 (2001)）のような複雑な技術を必要とした。これらの技術は、通常、蛍光ラベルの使用を必要とする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明の実施形態は、コロイダル粒子の集団（population）の集団的挙動（collective behavior）を観察することによって、被検体とリガンドとの結合事象を検出するための方法および組成物に関する。種々の実施形態において、本発明は、被検体とリガンドとの間の結合を検出およびキャラクタライズするための方法、このような結合を検出するために有用なコロイダル粒子、ならびに該コロイダル粒子の製造方法を包含する。他の実施形態は、分子結合相互作用を検出およびキャラクタライズするためのキットを包含する。
【０００８】
１つの実施形態において、問題のリガンドを、コロイダル粒子の表面と直接的にまたは間接的に結合させ、修飾されたコロイドの集団（population）を作製する。次いで、該修飾コロイドを、それらが水溶液中において平衡または近平衡（near-equilibrium）分布を達成することを可能にする条件下でインキュベートする。該コロイドは、好ましくは、フリーな側方拡散（free lateral diffusion）を示し、そして該系は、好ましくは、エルゴード流体（ergodic fluid）の特徴を示す。いくつかの実施形態において、該修飾コロイドは、下層の支持体上へ重力により沈積し（settle）、そして二次元コロイドを形成する。該コロイダル粒子の分布は、好ましくは、コンピュータ支援解析と組み合わせて、直接的な光学画像化を使用して測定される。
【０００９】
問題の被検体が該修飾コロイドへ結合するかどうかを検出するために、該被検体を該コロイド溶液へ添加する。該被検体は、そのフリーの形態で添加され得るか、または他の材料もしくは構造体（例えば、生細胞）と結合され得る。結合は、該被検体の添加時の、平衡でまたは平衡付近の（at or near equilibrium）該修飾コロイダル粒子の分布の変化を観察することによって検出され得る。いくつかの実施形態において、結合は、凝縮相（condensed phase）から分散相（dispersed phase）への粒子間での相転移を誘発する。他の実施形態において、被検体の添加は、分散相から凝縮相への相転移を生じさせる。なお更なる実施形態において、結合は、該コロイダル粒子の分布の変化によって測定され得、該粒子は所定の相転移を受けない。
【００１０】
コロイダル粒子の分布は、直接的な光学画像化（direct optical imaging）を使用して観察され得る。相転移はまた、溶液中の該粒子の空間分布を測定するデバイスまたは肉眼を使用して検出され得る。いくつかの実施形態において、相転移は、該被検体の存在下および非存在下における該修飾コロイダル分布の定量的比較を可能にする、粒子二体分布関数（particle pair distribution functions）の統計分析を行うことによって測定される。他の実施形態において、異なる統計分析が、コロイダル相挙動の差異を示すために使用される。
【００１１】
該コロイダル粒子は、任意のサイズおよび／または組成のものであり得る。いくつかの実施形態において、該コロイダル粒子は、多孔性または非多孔性（nonporous）材料（例えば、シリカ）から形成される実質的に球状のコロイダル粒子である。本発明の１つの局面において、該コロイダル粒子は、脂質膜層で被覆(derivatized)される。該脂質層は、二重層、単層、または他の構造であり得る。該脂質膜層は、修飾粒子（modified particle）を作製するために、被検体に特異的なリガンドでドープ（doped）または被覆（derivatized）され得る。１つの局面において、ドープト脂質層と該粒子表面との間に水層を備える、外側のドープト脂質膜層（outer doped lipid membrane layer）を有する被覆粒子が使用される。１つの実施形態において、該脂質膜は、細胞表面蛋白質（cell-surface protein）または膜結合リガンド（membrane-associated ligand）でドープされる。この実施形態において、被検体が該リガンドを介して該膜表面へ結合することは、該粒子が凝縮された集団から分散された集団への相転移を受ける結果となる。
【００１２】
本発明の実施形態は、リガンドと被検体との間の結合相互作用を同定およびキャラクタライズするために有用である。例えば、１つの実施形態において、膜被覆されたコロイダル粒子は、脂質二重層環境中の細胞表面分子との被検体相互作用を研究するために使用される。別の実施形態において、このような修飾されたコロイダル集団は、疾患、病原体、薬物、または種々の生理学的状態と関連した被検体の存在を検出するための診断ツールとして使用される。例えば、膜を標的にする細菌毒素（例えば、ボツリヌス、コレラ、炭疽、破傷風）およびウイルスは、それらの脂質リガンドへの結合を検出することによって診断され得る。
【００１３】
本発明のこれらおよび他の目的ならびに特徴は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を読めば、より完全に明確になる。
【００１４】
詳細な説明
本発明の実施形態は、リガンドと被検体との結合を検出するためのアッセイに関する。該アッセイにおいて、以下に説明されるように、先ず、コロイドの集団をリガンドと結合させて、修飾コロイドの集団を作製する。次いで、該修飾コロイドを、それらが相転移状態かまたはそれ付近にある条件下で、共にインキュベートする。このような条件下で、該修飾コロイドは、大部分が、凝縮相（condensed phase）にあるが、分散相（dispersed phase）への転移に近い。該コロイダル混合物条件の比較的僅かな摂動（perturbation）が、該修飾コロイドを、大部分が分散された相への転移へ導き得る。
【００１５】
該結合されたリガンドに結合する被検体の添加は、大部分が凝縮された相から大部分が分散された相への該修飾コロイドの相転移を生じさせ得ることが、発見された。この発見を使用して、被検体処理に続く修飾コロイドの集団の相を測定することによって、リガンドへの任意の被検体の結合を検出するための高感度のアッセイを開発することが可能であった。
【００１６】
本発明の実施形態は、凝縮相から分散相への相転移に限定されないことに注意されるべきである。実際に、リガンドへの被検体の結合は、分散相から凝縮相への相転移を測定することによって検出することが出来た。
【００１７】
コロイダル系の挙動は、粒子間の対相互作用ポテンシャル（pair interaction potential）によって駆動される。膜被覆シリカ粒子の場合、該対ポテンシャルは、膜−膜相互作用によって左右される。脂質膜被覆シリカ粒子の二次元分散は、これら膜表面相互作用の詳細によって支配されるコロイダル相転移を示す。集団的相挙動（collective phase behavior）は、膜表面における少数の分子事象から容易に検出可能な応答を生じさせる共同増幅器（cooperative amplifier）として役立つ。
【００１８】
このようなアッセイは、コロイド、被検体、またはリガンドにタグを付ける標識技術の使用を必要としないことが、理解されるべきである。該マイクロスフェアの相転移は、光学的に、例えば顕微鏡を用いて、検出され得る。従って、本発明の実施形態は、被検体−リガンド結合事象を検出するために該成分のいずれも染色または標識する必要がないという利点を提供する。
【００１９】
しかし、該アッセイは、非標識化成分に限定されないことが理解されるべきである。いくつかの状況下において、コロイド、リガンドまたは被検体を標識することが有利であるかもしれない。例えば、１つの実施形態において、マイクロスフェアの異種混合物（heterogeneous mixture）が標識され、そしてその後、それらの分散パターンが、被検体での処理に続いて該標識の位置を測定することによって検出される。別の実施形態において、コロイド粒子の異種性（heterogeneity）は、個々の粒子のサイズの実質的な差異に起因して、識別可能であるかもしれない。
【００２０】
更に、該相転移は、好ましくは、動的相転移（dynamical phase transitions）である。本明細書中で使用される場合、動的相転移は、実質的に全ての集団が１つの相から別のものへ移動するものである。更には、該集団の構成部分もまた、動的に移動しているかもしれない。例えば、コロイド集団の動的相転移は、実質的に全てのコロイダル集団の相が、例えば、凝縮相から分散相へ変化するものである。しかし、該集団中のコロイダル粒子はまた、種々の他のコロイダル粒子と動的に結合する。肉眼での観察から、該コロイド集団は、１つの相から別のものへ、移動しているかもしれないし、または移動していないかもしれない。しかし、該コロイドが相を変化させる自由は、確かに存在する。しかし、粒子レベルで、各特定の粒状コロイダル粒子は、任意の数の他の粒子と、任意の時間数、対を形成しそして対を形成しない。従って、該粒子は、決して不可逆的に互いに結合されない。これは、例えば、凝集（agglutination）のような検出方法とは対照的であり、これは動的相転移の典型ではない。これは、凝集物の構成部分は、転移状態に続いて、互いと動的に相互しないためである。凝集において、該構成成分は、固定された配置で互いに結合されたままである。
【００２１】
下記に議論されるように、本発明の実施形態はまた、該被検体による接触後の、粒子の集団の集団的挙動の統計分析を使用して、被検体の存在を検出する方法を包含する。直接的な光学画像化を使用して、複数の近平衡相（near- equilibrium phases）が観察され、そして被検体が１０−４単層ほど低い密度で粒子表面に結合することが、相転移を誘発し得ることが発見された。統計分析は、異なる系間の定量的比較を可能にし、そして微妙な転移前効果（subtle, pre-transition effects）およびシグネチャー転移後挙動（signature post-transition behavior）を明らかにする。いくつかの実施形態において、粒子分布は、粒子二体分布関数（particle pair distribution functions）を算出することによって測定され、しかし、より高次の相関関数（higher-order correlation functions）を含むがこれに限定されない他の分析が使用されるかもしれない。平衡または平衡付近で相転移を達成する粒子の表面上における結合事象は、以下により詳細に議論されるように、統計分析によって解釈および算出され得る、該粒子のランダム分布に対して認識可能なシグネチャー効果（signature effect）を生じさせると判った。
【００２２】
以下の略語が、本明細書および図面を通して使用される：
ＦＲＡＰ  −  光退色後の蛍光回復（fluorescence recovery after photobleaching）；
ｇ（ｒ）  −  二体分布関数（pair distribution function）；
ＤＭＯＰＣ  −  １，２−ジミリストオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（1,2-Dimyristoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）；
ＤＭＰＳ  −  １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine]）；
ＤＯＥＰＣ  −  １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine）；
ＮＢＤ−ＰＥ  −  １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル（1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3 -Phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)；
Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−ＤＰＰＥ  −  Ｎ−（テキサスレッドスルホニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（N-(Texas red sulfonyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine）；
ＧＴ１Ｂ  −  トリシアロガングリオシド（trisialoganglioside）；
ＧＭ１  −  モノシアロガングリオシド（monosialoganglioside）；
ＴＴ  −  破傷風毒素；
ＣＴＢ  −  コレラ毒素Ｂ−サブユニット；および
ＢＴ  −  α−ブンガロトキシン。
【００２３】
粒子組成物
知られているように、コロイダル粒子は、種々の秩序相（ordered phases）に自己構築し（self-assemble）得る。コロイダル粒子の集団的挙動（collective behavior）は、主として、粒子間の対相互作用ポテンシャル（pair interaction potential）によって決定され、これらは、次に、該粒子の表面化学によって支配される。従って、該コロイダル粒子の特徴は、該アッセイの感度および他の局面を決定することにおいて重要である。
【００２４】
用語“コロイド”および“コロイダル粒子”は、本明細書において交換可能に使用され、そして溶液中で集団的挙動を示すに十分に小さな微視的粒子を意味するように規定される。該コロイダル粒子は、約１０ｎｍ〜５０μｍの直径を有し得、そして好ましくは直径約１μｍ〜６．８μｍ、そしてより好ましくは約５μｍ〜６．８μｍである。該粒子は、任意の形状のものであり得るが、好ましくは本質的に球状である。１つの実施形態において、該コロイダル粒子は、マイクロスフェア（microspheres）である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、コロイダル粒子は不活性であり、該裸の粒子は、該アッセイの条件下で、顕著には互いに相互作用しない。他の実施形態において、該裸の粒子は、互いに対して引力または斥力を発し得る。粒子はまた、シリカおよびシリカ含有化合物、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ジアセチレン、アルケン、チオフェン、ポリチオフェン、グリコポリチオフェン、イミド、アクリルアミド、アクリレート、メタクリルアミド、メタクリレート、ビニルエーテル、無水リンゴ酸、ウレタン、アリルアミン、シロキサン、アニリン、ピロール、およびビニルピリジニウムおよび他のヒドロゲルポリマー材料、マイクロゲルおよびハイドロゲル）、金または他の金属、第ＩＩ−ＶＩ族材料、第ＩＩＩ−Ｖ族材料、分枝および非分枝の組成物（例えば、デンドリマー）、他の無機および有機金属ならびに材料アセチレンのような材料の多孔性および非多孔性（non-porous）形態を含む、種々の材料からも構成され得る。
【００２６】
コロイダル粒子は、広範囲の物質を用いて被覆され得、それらの表面の化学的および生物学的構成を調節し、それによって溶液中でのそれらの挙動を調節する精密な方法を提供する。１つの実施形態において、粒子は、脂質層でコーティングされる。該脂質層は、二重層、単層または他の構造であり得る。該脂質膜の化学的組成は、対相互作用ポテンシャルを調節し、そしてそれによって、該粒子が相転移状態にあるポイントを調節するように、調整され得る。本明細書中で使用される場合、用語“相転移状態”は、該コロイドが、分散相から凝縮相へ（逆の場合も同じ）変化しようとしているコロイダル粒子懸濁液の状態を規定するように意図される。実際の“相転移”は、１つの相から別のものへのコロイダル懸濁液の転移を規定するように意図される。
【００２７】
種々の実施形態において、該脂質コーティングされた粒子は、該脂質層が正味の中性または正味の負電荷を有する場合、凝縮相に入る。同様に、他の実施形態において、該脂質コーティングされた粒子は、該脂質層が正味の正電荷を有する場合、分散相に入る。好ましい実施形態において、該脂質層は、中性および負に帯電した脂質の混合物から構成され、該脂質の約１０％が負に帯電されている。しかし、該アッセイは、任意の表面電荷組成を有する粒子を用いて行われ得る。
【００２８】
脂質膜は、モノリシック支持体（monolithic substrates）上に支持膜を形成するために使用される本質的に同一の小胞融合プロセス（vesicle fusion process）によって、シリカ粒子上に構築される（Bayerl et al., Biophys. J., 58: 357-362 (1990); Buranda et al., Langmuir, 19: 1654-1663 (2003)）。Tanaka et al., J. Am. Chem. Soc, 126; 3257-3260 (2004) によって記載されるものような、任意の他の好適な方法が、同様に使用され得る。該脂質層は、該粒子上に膜を形成するために、精製された成分から再構成され得、あるいは生細胞から剥離された膜が使用され得る。該脂質層は、好ましくは連続的であり、そして好ましくは、側方流動性（lateral fluidity）を維持している。１つの実施形態において、該脂質層は、約１〜５μｍ２／ｓの拡散係数を有する。
【００２９】
図１ａは、膜被覆シリカ粒子の略図である。示されるように、シリカ（ＳｉＯ２）粒子は、約１ｎｍの水層および幅が約５ｎｍである脂質二重層と結合されている。図１ｂは、流動膜のために該粒子表面をコーティングする脂質膜について行われた光退色後の蛍光回復（fluorescence recovery after photobleaching）（ＦＲＡＰ）実験を詳述する３つの写真を示している。写真は、退色前の全イルミネーション（左）、退色中の暴露パターン（中央）、および退色後１分の全イルミネーション（右）を示している。図１ｃは、非流動膜での、同一の蛍光回復を示している。
【００３０】
該脂質層は、一般的に、以下が挙げられるがこれらに限定されない生物学的または合成膜の任意の成分を含み得る：脂質、コレステロール、ステロイド、エルゴステロール、ポリエチレングリコール、蛋白質、ペプチド、または任意の他の分子、例えば、脂肪酸、トリアシルグリセロール、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリン、セレブロシドおよびガングリオシド）、ステロール、コレステロール、界面活性剤、ポリソルベート、オクトキシノール、ドデシル硫酸ナトリウム、両性イオン洗浄剤（zwitterionic detergents）、デシルグルコシド、デオキシコレート、ジアセチレン誘導体、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール（phosphotidylinositol）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルメタノール、カルジオリピン、セラミド、リゾホスファチジルコリン、Ｄ−エリスロスフィンゴシン（D-erythrosphingosine）、スフィンゴミエリン、ドデシルホスホコリン、Ｎ−ビオチニルホスファチジルエタノールアミン、ならびに膜または膜集合体（membrane assemblies）（例えば、リポソームおよびフィルム）と結合し得る細胞膜の他の合成または天然成分。
【００３１】
１つの実施形態において、該膜は、中性のおよび負にまたは正に帯電した脂質モノマー、より好ましくは中性のおよび負に帯電した脂質から構成される。好適な脂質としては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：ホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジン酸、１，２−ジミリストオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（1,2-Dimyristoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）（ＤＭＯＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine] (sodium salt)）（ＤＭＰＳ）、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine）（ＤＯＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン、Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンアンモニウム塩、およびＮ−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミントリエチルアンモニウム塩、Ｌ−ａ−ホスファチジルコリン（Ｅｇｇ  ＰＣ）、コレステロール、Ｎ−ジニトロフェニルアミノカプロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＮＰ−Ｃａｐ  ＰＥ）、セラミド（天然および合成調製物）、Ｎ−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ドデカノイル］−スフィンゴシン−１−ホスホコリン（Ｃ１２−ＮＢＤ  スフィンゴミエリン）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（Ｃａｐ  ビオチニル）、１−パルミトイル（Ｄ３１）−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホイノシトール（および他のホスホイノシトール抽出物）、ならびに種々の長さのポリエチレングリコール。
【００３２】
好ましい実施形態において、該コロイダル粒子は、１，２−ジミリストオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＯＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（ＤＭＰＳ）、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）を含む、脂質膜で被覆されたシリカ粒子であり、そして該膜は、被検体に特異的なリガンドでドープされる。被検体に結合すると、該ポリマー骨格の崩壊が生じ、凝縮相から分散相への検出可能な相転移が生じる。
【００３３】
代替の実施形態において、該粒子は、非脂質ポリマー（例えば、Discher et al., Science 297:967-973 (2002)に開示されるもの）または所望の対相互作用ポテンシャルを達成するに十分な任意の他の材料で被覆されるか、またはこれらから完全に構成され得る。
【００３４】
懸濁液中の粒子は、自由な側方拡散（free lateral diffusion）を示すことが判り、そして該系は、エルゴード流体（ergodic fluid）として振舞った。粒子の希釈コレクションについてのブラウン軌道を、図２ａに示す。粒子拡散係数は、膜組成とは本質的に無関係であり；測定値は、５μｍ直径粒子について、０．０７９〜０．０８６μｍ２／ｓの範囲であった。
【００３５】
これらの値は、純粋に粘性の抵抗についてStokes-Einstein関係によって予想されるものの約８０％であり、下層の支持体上の抵抗からの少ない寄与を示している。該粒子表面上の膜間の相互作用の強度に依存して、該コロイドの分散（ガス）または凝縮（液体または結晶）相が観察された。粒子移動度（particle mobility）が、凝縮相において保持され、粒子は不可逆的に結合していないことがわかった（図２ｂ）。凝縮相および分散相の両方における、個々の粒子の移動度は、系平衡化の速度を規定した。図２ｂにおいて見られる、粒子の凝縮クリスタライトへの凝縮およびそこからのエバポレーション（evaporation）のタイムスケールは、我々の実験のそれと比較して迅速であった（数分ｖｓ．３０分超）。更に、該相の全体的形態学および量的二体分布関数（overall morphology and quantitative pair distribution functions）は、個々の粒子の交換にもかかわらず、一定のままであった。これらの観察は、該系が、少なくとも数粒子直径の長さスケールにわたって、近平衡であることを示唆している。
【００３６】
該脂質膜の化学組成は、対相互作用ポテンシャルを調節するために調整され、そして下記に説明される。凝縮相は、図２ｂにおいて見られるように、該コーティング膜が正味の中性または負に帯電していたかに関わらず、形成された。対照的に、正味正に帯電した膜は、分散相へ至った。複数の相の出現は、対相互作用エネルギーが、該系を相転移付近に釣り合わせることを示した。従って、該膜表面上の微小摂動（perturbation）は、該コロイドの巨視的組織の顕著な変化を誘発した。
【００３７】
リガンド
リガンドは、本明細書において使用される場合、他の化学的エンティティーへ結合してより大きな複合体（complexes）を形成する、イオン、分子、または分子基を含む。リガンドは、可能性のある被検体として下記に記載されるものを含む、広範囲の材料を含み得る。好ましくは、リガンドは、検出される被検体について特異的親和性を有する。好適なリガンドとしては、炭水化物、核酸、ビオチン、ストレプトアビジン、サイトカイン、ペプチド、蛋白質、リポ蛋白質、糖蛋白質、酵素、受容体、チャネル、抗体、小分子薬物（small molecule drugs）、より大きなポリマー薬物（larger polymeric drugs）、発色団（chromophores）、抗原、キレート化合物、ホスフェートおよび反応基、分子認識複合体（molecular recognition complexes）、イオン基、重合性基（polymerizable groups）、ジニトロフェノール、リンカー基、電子供与または受容基、疎水基、親水基、有機または無機分子、あるいは受容体へ結合する任意の分子が挙げられるが、これらに限定されない。更には、複数のリガンドが、単一のコロイドと結合され得る。使用され得る広範囲のリガンドは、被検体の多様なグループとの結合の検出およびキャラクタライゼーションを可能にする。
【００３８】
リガンドは、コロイダル粒子の表面へ、直接的にまたは間接的に結合され得る。本明細書中で使用される場合、２つの分子は、それらが任意の様式で互いに結合される場合、“結合される（associated）”。例えば、２つの分子は、それらが非共有的に結合される場合、結合される。別の実施形態において、２つの分子は、それらが共有結合される場合、結合される。いくつかの実施形態において、リガンドは、コロイダル粒子の外部表面上の脂質層中に散在される（interspersed）。脂質膜のこのタイプのドーピングは、Salafsky et al., Biochemistry, 35: 14773-14781 (1996)、およびGroves at al., Biophys. J., 71: 2716- 2723 (1996)によって記載されており、これらは両方とも、それらの全体が参照により本明細書中に組み込まれる。いくつかの実施形態において、リガンドは、膜中に直接組み込まれ、他のものにおいて、それらは、膜へ間接的に、例えば該膜中に組み込まれたグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）リンカーを介して、結合され、なお他のものにおいて、天然膜抽出物の場合がそうであるように、膜に天然に存在している。リガンドは、約１０−２〜１０−６モル濃度の濃度で、より特には約１０−２〜１０−４モル濃度で、該脂質層中に挿入され得、あるいは、天然の脂質膜における典型的なインビボ濃度で存在し得る。他の実施形態において、リガンドは、該粒子の表面へ直接、共有結合される。例えば、リガンド（例えば、抗体または抗体結合フラグメント）は、シリカ、スチレン、磁気（magnetic）、または半導体ナノ結晶粒子へ直接、カップリングされ得る。抗体フラグメントの非限定的な例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメントおよび単鎖抗体が挙げられる。
【００３９】
被検体
本明細書中で使用される場合、被検体は、分析を受ける物質または化学成分である。被検体は、好ましくは該リガンドへ結合する、無制限の種々の物質から構成され得る。被検体の例としては、毒素、ホルモン、酵素、レクチン、蛋白質、シグナリング分子（signaling molecules）、無機または有機分子、汚染物質（contaminants）、抗体、ウイルス、細菌または他の病原性生物、またはイディオトープまたは他の細胞表面マーカーが挙げられる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、該被検体は、その存在が病原性生物の指標である種々の物質を含み得、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＨＩＶ、クラミジア（Chlamydia）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、連鎖球菌（Streptococcus suis）、サルモネラ（Salmonella）、ムンプス、ニューカッスル、ならびに種々のウイルス（レオウイルス、センダイウイルス、およびミクソウイルスを含む）を検出するためのシアル酸；コロナウイルス、脳脊髄炎ウイルス、およびロタウイルスを検出するための９−ＯＡＣシアル酸；サイトメガロウイルスおよび麻疹ウイルスを検出するための非シアル酸糖蛋白質；炭疽（Anthrax）、ＣＤ４、血管作用性腸管ペプチド（vasoactive intestinal peptide）をハイブリダイズしそしてその存在を同定するためのペプチド配列、およびＨＩＶを検出するためのペプチドＴ；ワクシニアを検出するための上皮増殖因子；狂犬病を検出するためのアセチルコリンレセプター；Epstein-Barrウイルスを検出するためのＣＤ３補体レセプター；レトロウイルスを検出するためのβ−アドレナリン作動性レセプター；ライノウイルスを検出するためのＩＣＡＭ−１、Ｎ−ＣＡＭ、およびミエリン−結合糖蛋白質ＭＡｂ；ポリオウイルスを検出するためのポリオウイルスレセプター；ヘルペスウイルスを検出するための線維芽細胞増殖因子レセプター；大腸菌を検出するためのオリゴマンノース；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）を検出するためのガングリオシドＧＭ１；ならびに、広範囲の病原体（例えば、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、V. vulnificus、V. parahaemolyticus、V. cholerae、およびV. alginolyticus）を検出するための抗体。
【００４１】
該被検体はまた、可能性のあるリガンドとして上記に記載される物質のいずれも含み得る。
【００４２】
検出アッセイ
検出アッセイを、該被検体が該リガンドに結合したかどうかを測定するために使用する。いくつかの実施形態において、該アッセイは、目的のリガンドを保有する粒子を溶液へ添加してコロイダル懸濁液を形成する工程を包含する。次いで、該粒子が相転移状態またはその付近となるように、該粒子に平衡または近平衡分布（equilibrium or near equilibrium distribution）を達成させる。次いで、互いに対する該粒子の分布を、それが該被検体の添加に続いての粒子分布と比較され得るように、その相で測定する。次いで、該被検体を、該コロイダル懸濁液へ添加し、そして該コロイダル粒子は、平衡または近平衡分布を回復される。次いで、該互いに対する粒子相対分布を、再度測定し、該被検体が該リガンドへ結合したかどうかを測定する。該粒子分布が、それらが１つの相から別の相へ（例えば、大部分が凝縮した相から大部分が分散した相へ）転移したことを示した場合、該被検体が該リガンドへ結合したと測定される。
【００４３】
他の実施形態において、該アッセイは、以下の工程を包含する：問題のリガンドを保有するコロイダル粒子を溶液へ添加してコロイドを形成させる工程；該コロイダル粒子が平衡または近平衡分布を達成させる工程；互いに対する該粒子の分布を検出する工程；該コロイダル粒子を単離する工程；該単離された粒子を、該リガンドに結合する被検体を潜在的に含有する第二溶液へ添加する工程；該コロイダル粒子が、平衡または近平衡分布へ回復させる工程；ならびに、互いに対する該粒子の分布を検出し、該被検体が該サンプル中に存在するか否かを測定する工程。
【００４４】
該アッセイの更なる実施形態は、以下の工程を包含し得る：問題のリガンドを保有するコロイダル粒子を溶液へ添加してコロイドを形成する工程；該コロイダル粒子の［動的な］平衡または近平衡分布を達成させる工程；互いに対する該粒子の分布を検出する工程；該コロイダル粒子を単離する工程；該単離したコロイダル粒子を、該リガンドに結合する被検体を潜在的に含有する環境へ添加する工程；該コロイダル粒子を該環境から単離する工程；該コロイダル粒子を溶液へ添加する工程；該コロイダル粒子の平衡または近平衡分布を回復させる工程；ならびに、互いに対する該粒子の分布を検出して、該被検体が該サンプル中に存在するか否かを測定する工程。集団的相挙動（collective phase behavior）は、該膜表面における少数の分子事象から容易に検出可能な応答を生じさせる共同増幅器（cooperative amplifier）として役立つ。
【００４５】
１つの実施形態において、被検体結合は、凝縮相から分散相への転移を観察することによって検出される。結合時に凝縮から分散への相転移を達成するために、該アッセイ条件（例えば、該粒子のサイズおよび表面組成、ならびに該アッセイ溶液の組成）は、該粒子が、該粒子間の引力（例えば、ファンデルワールス相互作用）に起因して該被検体の非存在下で凝縮相を形成するようなものである。該溶液へ添加された被検体が、粒子結合されたリガンドへ結合する場合、該粒子表面とのその相互作用は、２つの粒子間の最接近位置（the closest approach position）を増加させ得、そして従って、それら間の引力の累積的強度（cumulative strength）を減少させる（Wong and Groves, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 99: 14147 (2002)を参照のこと）。このようにして、該被検体の結合は、該粒子の分布を測定することによって結合の検出を可能にする様式で、該コロイダル粒子の凝集、分布および挙動に影響を与え得る。粒子二体分布関数（particle pair distribution functions）の統計分析は、異なる系の間での定量的比較を可能にし、そして、微妙な被検体−リガンド相互作用を明らかにし得る。更には、結合事象は、特定の相互作用と相関し得る、該粒子のランダム分布に対して認識可能なシグネチャー効果（signature effects）を生じさせ得る。
【００４６】
該被検体の検出は二元性の事象（binary event）ではないことがまた認識されるべきである。例えば、該リガンドへの結合の強さまたは弱さは、本アッセイによって正確に測定され得る（図８Ａ〜８Ｃを参照のこと）。該コロイダル粒子が凝縮状態から分散状態へ転移した程度を測定することによって、該被検体と該リガンドとの結合の量を評価することが可能である。凝縮状態から分散状態へ転移するより多数のコロイドは、より強いリガンド結合の指標であり、一方、凝縮状態から分散状態へ転移するより少ない数のコロイドは、該リガンドが該被検体へより弱く結合したことを示している。
【００４７】
図８Ａ〜８Ｃは、膜被覆されたコロイドを使用する結合親和性の測定を示している。膜結合されたＧＭ１を有する膜コーティングされたシリカマイクロビーズへのＣＴＢの結合を、ある範囲のＣＴＢ濃度で測定した。動径分布関数のプロットは、使用した蛋白質濃度範囲に渡るコロイダル分布の定量的比較を可能にした。コロイドアッセイから得られた平衡結合曲線と、従来の蛍光方法を使用して得られた結合曲線との比較は、該コロイド二体分布関数が、蛍光により測定された結合蛋白質濃度でのコロイドアッセイスケールから得られることを明らかにした。従って、該コロイドアッセイは、広範囲の相互作用についての平衡解離定数を正確に測定するために使用され得る、結合親和性のラベル無しアッセイを提供する。
【００４８】
１つの実施形態において、該粒子間での引力は、該系を、該被検体の非存在下において、相転移に近い状態に釣り合わせる。いくつかの実施形態において、アッセイ溶液のイオン強度、温度、または粒子−粒子引力の親和性に影響を与える他の変数の変化に応答しての相転移を観察することによって該系が相転移閾値付近にあることを確かにするために、該アッセイは較正され得る。該アッセイは、一般的に、該系が相転移状態の閾値付近である場合により感度が高く、リガンドおよび被検体間の結合の小さな摂動が、容易に検出可能な相転移を誘発することを可能にする。しかし、本発明のいくつかの実施形態は、該被検体の存在下または非存在下において、粒子の集団が相転移またはその付近にあること無しに、結合を検出する。
【００４９】
該粒子を観察するために、それらは、典型的に、重力に起因して、平衡または近平衡状態にある（settle in）。該粒子は、実質的に平坦な表面な表面上に沈積し（settle on）、“二次元コロイド”を形成し得、これは、通常支持体の表面上のコロイダル粒子の層である（図７ａ）。二次元コロイドは、該粒子の観察および画像化、ならびに該表面上におけるそれらの分布の統計分析を促進する。コロイダル粒子は、該粒子がウエルまたはプレートの底に配置されると、該粒子間またはその周囲の空間とは反対の粒子によって占領される領域の、約０．１〜０．５、またはより好ましくは０．１５〜０．２５のフラクションを生成する濃度で、好ましくは使用される。粒子が多いほど、該アッセイはより感度が高くなる傾向にある。粒子移動度は、平衡および近平衡相において保持され、そして粒子移動度の程度は、系平衡化の速度を規定する。いくつかの実施形態における平衡のタイムスケールは、７分未満である。他の実施形態において、それは約３０分未満である。
【００５０】
該アッセイは、典型的に、外力の適用を必要とせず、しかしむしろ、コロイダル粒子の集団の熱力学的挙動に依存する。該コロイダル溶液は、該系が該被検体の存在下または非存在下の両方において平衡または平衡付近にある場合、好ましくはエルゴード流体（ergodic fluid）の特徴を示す。単一の粒子は、経時で、クラスター、スタンド・アローン・ポジション（stand alone position）へ、そしてまたクラスターへと移る。コロイダル粒子は、該懸濁液中で自由に動き回りそして相対位置を変化させる。この特性は、動的な、可逆的な、および／または“弱い”結合相互作用の検出を可能にし、何故ならば、該アッセイは、固定的な複合体（static complexes）の形成を必要としないからである。これは、結合を検出するための安定な複合体の形成を必要とする、現在の技術（例えば、共沈、アフィニティークロマトグラフィーなど）とは対照的である。個々の粒子移動度は蛋白質結合によって影響を受けず、従って、問題の特定の被検体への暴露は、好適な同種（cognate）リガンドがコロイダル膜へ組み込まれている場合に、相転移を誘発する。
【００５１】
代替の実施形態は、複合体相互作用を検査するために、粒子の異種（heterogeneous）混合物を使用し得る。粒子は、それらが個々に同定可能となるように、標識され得る。このようなラベルとしては、粒子材料へドープされた蛍光分子、脂質層へドープされた蛍光分子、粒子材料へドープされた半導体ナノ結晶などが挙げられるが、これらに限定されない。粒子はまた、サイズに従って区別され得る。例えば、いくつかの実施形態は、異なるサイズの粒子を使用し、各々の粒子は、例えば、粒子表面または材料の修飾により、あるいは粒子サイズ自体により（例えば、相互作用に利用可能な表面積を変化させること）、異なる特性を有する。広範囲の粒子サイズが、該アッセイにおいて使用され得る。１つの実施形態において、約３〜７μｍ直径の粒子が使用され、そして約５０％の直径の変化は、相挙動の検出可能な差異を与える。この実施形態において、検出可能な粒度の差異は、特定の粒子の挙動を同定しそして追跡するための手段を提供する。種々の実施形態において、特定の特性を有する粒子の挙動を追跡することは、複雑な分子間相互作用の検出を可能にする。例えば、異種の組成および官能性の強力に相互作用する粒子は、より複雑な系の分析において使用され得る、複雑な、多官能性の、ナノスケール構造体への構築のためのビルディングブロック（building blocks）として使用され得る。コロイダル粒子はまた、蛍光ラベル、半導体ナノ結晶、ナノスケール検出デバイス、またはカスタム設計されたナノ結晶または分子のような材料を用いて内部で（internally）官能化され得る。
【００５２】
他の実施形態において、粒子は、生細胞と混合され得る。これらの実施形態において、細胞表面蛋白質または他の分子は、リガンドの結合時に粒子分布の検出可能な変化を生じさせる、被検体として役立つ。これは、細胞活性化および増殖事象（例えば、細胞ロゼッテイング（cell rosetting））、細胞相互作用、多重化（multiplexing）、および他の生理学的に関連する事象の検出を可能にする。
【００５３】
コロイダル粒子は、問題の被検体の存在を検出するために、多くの異なる環境、例えば、人体、過激な毒素または腐食剤が存在する領域へ分散され得る。該粒子はまた、高真空設定で使用され得る。これらの実施形態において、結合事象を生じさせ、そして該粒子は次いで回収され、そして該アッセイが行われることを可能にする条件へ供される。結合事象を受けた有限数の粒子のみが回収されるに違いないので、該粒子は、水の流れる集まり（body）、例えば、川、または生物のような環境中に分散され得る。いくつかの実施形態において、該被検体サンプルへ暴露された“センサー”粒子は、該被検体サンプルへ暴露されなかった複数のバックグラウンド粒子を通って移動され得る。これは、該検出工程が、該バックグラウンド粒子に対する該“センサー”粒子の相挙動を観察することにより、少数のサンプル暴露された粒子を用いて行われることを可能にする。
【００５４】
該コロイドアッセイの実施は、自動液体ハンドリングおよび画像化システムを受けることが可能であり、高スループット分析を促進する。例えば、自動流体ハンドリングシステムは、１以上のテストウエルにおいて該アッセイの工程を行うために使用され得る。好ましい実施形態において、該アッセイは、Corning COSTAR 3997ポリスチレンプレート、または同程度の高スループットプレートにおいて行われる。自動流体ハンドリングは、サンプルの均一かつ再現可能な処理を達成することによって、種々の条件下で複数のアッセイが同時に行われることを可能にする。流体ハンドリングデバイス（fluid handling device）は、中でも、アッセイ条件（例えば、温度およびインキュベーション時間）を制御するため、サンプルをテストウエルへ添加しそしてそこから取り出すため、ならびに該アッセイの検出工程を行うために、プログラムされ得る。ロボット流体ハンドリングデバイス（Robotic fluid handling devices）は、例えばTecan AGから市販されている。
【００５５】
いくつかの実施形態において、該アッセイの検出工程は、相転移と相関することが公知の変数を測定することによって行われ得、好ましくは、ここで、該変数は、コロイダル粒子の分布よりも測定するのがより容易である。例えば、分光光度計、スキャンニグプレートリーダー（scanning plate reader）、あるいは光散乱を画像化または計算する類似のデバイスが、被検体の添加前および後の粒子集団の光学密度を測定するために使用され得、そして特定の測定値（readings）は、相転移の発生または不発生に相関し得る。次いで、更なるアッセイが、高スループット様式で行われ得、ここで、リガンドへの被検体の結合が、該プレートをスキャンニングして、相転移の発生または不発生を示す、シグネチャー光学密度測定値（signature optical density reading）が達成されるかどうかを測定することによって、検出される。
【００５６】
変化され得る本発明の他の局面は、該アッセイにおいて使用される材料の水和、コーティング、およびチャージ（charge）を包含する。
【００５７】
検出
粒子の集団の分布は、対相関（pair correlation）で表現され得、そして相転移は、該関数を分析することによってマッピングされ得る。最小集団数（minimum population number）は、２、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは１０００である。
【００５８】
図３は、ｔ＝０ｓでの被検体蛋白質の添加によって誘発される凝縮相から分散相への相転移の時間系列を示している（図３ａ左上パネル）。被検体を含有する溶液の液滴を、ウエルの上部へ添加する秒数内で、該凝縮相の均一な崩壊が認識可能である（図３ａ右上パネル）。約１分の時、該コロイドは、測定可能な分散された分布を達成した（図３ａ下パネル）。個々の粒子移動度は、蛋白質結合によって影響を受けず、従って問題の特定の被検体への暴露は、好適な同種リガンド（cognate ligand）が該コロイド膜へ組み込まれている場合にのみ、相転移を誘発した。膜表面へ結合された被検体の物理的存在は、２つの膜間の最接近位置（the closest approach position）を増加させ、そして従って、粒子間のファンデルワールス引力の累積的強度を減少させ、相転移を可能にさせる。
【００５９】
該コロイド相の定量分析を、二体分布関数ｇ（ｒ）を求めることによって行った。粒子位置を、約１６ｎｍの精度へのオブジェクトロケーティングアルゴリズムにより広視野（約１ｍｍ２）画像から測定した。粒子の大集団の広視野画像は、高解像度カメラ（例えば、電荷結合素子カメラ）で撮影され、そしてイメージングソフトウエア（例えば、METAMORPH（Universal Imaging Corporation, Cranberry Township, PA））で解析されるべきである。このようなソフトウエアを使用して、粒子の中央は、強度を使用することにより非常に正確に判明され得、何故ならば、該粒子は球状のクリアな物体であるからである。各粒子の中央のＸ、Ｙ座標を、各画像について算出し、各粒子の中央と、その最近接粒子、第２最近接物および第３最近接物などの中央との距離を算出する（図７ｂ）。
【００６０】
空間的寸法Ｘ ｂｙ Ｙの有限の長方形ウインドウについて、ｇ（ｒ）は、以下から計算され得る：
【００６１】
【数１】
2007521494.tif 000003
【００６２】
ここで、η（ｒ）は、分離距離（separation distance）ｒ±δｒ／２（ここで示されるデータについてδｒ＝４０ｎｍ）を有する粒子対の数であり、ｒは、使用される粒子の半径であり、そしてＮは、粒子の総数である。
【００６３】
有効な分析のためのｇ（ｒ）プロットについての反復数（number of iterations）は、Ｎ、分析される粒子対の数に依存する。Ｎ＝１である場合、満足いくまでｇ（ｒ）を計算することは、粒子の特定の組成について特定のｇ（ｒ）プロットを示すに十分なデータを集めるために非常に長い時間を必要とし得る。従って、Ｎは、数秒足らずで十分なデータを集めるために、少なくとも１０、好ましくは１０００以上であることが、好ましい。
【００６４】
凝縮相ｇ（ｒ）は、ｔ＝０での該曲線において、１つの粒径（ｒ０）の最近接物分離距離での大きなピーク、ならびにｒ＝√３ｒ０および２ｒ０で生じる第２ピーク（ヘキサゴナル・クリスタライトにおいて次の最近接物に対応する）を特徴とする。ｇ（ｒ）の独立測定は、非常に一致していた。別個のコロイダル調製物から測定された該ｒ０ピークの大きさ（magnitude）の標準偏差は、一般的に、５％未満であった。ランダムな分布および対応してフラットなｇ（ｒ）関数からなる、分散相は、凝縮相と目に見えて区別可能である（時間３０、６０および２４０秒での曲線を参照のこと）。ｇ（ｒ）の定量測定は、更に、中間的な分布の範囲を区別する。これらは一時的であり得、秩序（order）の中間的な程度はまた、近平衡分布においても観察され、膜表面における異なる量の蛋白質結合と一致する。
【００６５】
該コロイダル相の定量分析は、更に、無限のシリーズの分布を求めることによって行われ得る。これは、コロイダル粒子タイプの数が１より大きい場合に使用される。
【００６６】
サンプル間の定量比較のために、ｇ（ｒ）における第１ピークを分離し、これは、粒子直径（５μｍ）で生じる。対応の有効な相互作用エネルギーＥｉ。Ｅｉは、次いで、ｋＢＴエネルギーの概算として算出され、そしてｇ（ｒ）プロットにおける第１ピークの高さの自然ｌｏｇをとり、そしてそれを公知の関数または式を有する曲線に適合させるか、あるいは該曲線下の面積を積分することによって、算出される。これは、等しいエリアフラクション（area fractions）（φ）の粒子を含むサンプル間での正確な比較を可能にし、そしてＥｉは、低カバレージ密度（coverage densities）で純粋な対相互作用エネルギーに収束する。平衡は、Ｅｉが意味のあるユニットのエネルギー（meaningful units of energy）を有するために要求されるが、これは、有効な比較のための要件ではない。各コロイダル系が初期に無相関の状態（initially uncorrelated state）でキャストされる限り、所定時間間隔での非平衡分布測定はまた、定量比較のために使用され得る。
【００６７】
Ｅｉの計算は有用であり得る一方、本明細書で使用される被検体検出の場合においてそれは必要ではないかもしれない。定量ｇ（ｒ）プロットは、粒子を分析することによって被検体が検出および結合される場合、非常に特徴的な第１ピークの消失を示す。
【００６８】
平衡時、ｇ（ｒ）は、平均力のポテンシャル（potential of mean force）、ｗ（ｒ）に物理的に関連している：
【００６９】
【数２】
2007521494.tif 000004
【００７０】
希釈系において、ｗ（ｒ）は、対相互作用ポテンシャルに等しく、そして従って、該相互エネルギーの直接測定を提供する。より濃縮された系において、ｗ（ｒ）は、隣接する粒子に起因する影響を含む。ｗ（ｒ）は、好適な短縮近似（truncating approximation）（例えば、Percus - Yevick等式）と共に、Ornstein - Zernike積分方程式を使用して、真の対ポテンシャルを得るためにデコンボルブされ（deconvolved）得る。
【００７１】
ｇ（ｒ）の独立測定は、高度に一貫しているべきである。同一の出発材料由来の別個のコロイダル調製物から測定されたＥｉ値間の標準偏差は、一般的に、０．１ｋＢＴ未満であった。
【００７２】
ｇ（ｒ）の正確な測定は、異なる膜組成物間の相互作用の微妙さ（subtleties）を探究する手段を提供する。凝縮相から分散相への転移は、該膜の正味の静電荷が負から正へ徐々に調節されるので、検査された。
【００７３】
ファンデルワールス、立体的−水和（steric-hydration）、および静電気を含むいくつかの力は、膜間の相互作用ポテンシャルに寄与する。分子的にフラットな雲母表面上に支持される脂質膜間の力は、表面力装置（surface forces apparatus）（ＳＦＡ）を使用して研究された。コロイド実験のそれらに似ている条件下で、雲母支持される膜間の粘着性相互作用エネルギーは、約０．５〜１ｎｍの最小分離で、約１０−２２Ｊ／ｎｍ２のオーダーのものであった。これは、大部分が斥力的な立体的−水和力（repulsive steric-hydration forces）によって測定される、最小分離距離を除いて、一般的に、Derjaguin-Landau-Verwey- Overbeek（ＤＬＶＯ）理論の予測と一致していた。膜−被覆粒子間のＤＬＶＯ相互作用ポテンシャルは、静電気相互作用のための線形化Derjaguin近似ならびにHamaker定数＝７×１０−２１Ｊを有する２つの球体間の非遅延（non-retarded）ファンデルワールスポテンシャルを使用して算出した。ファンデルワールス引力は、強力であり（１ｎｍ最小分離で３５０ｋＢＴ）、そして静電気反発力によってバランスがとられており、これは、迅速に、マグニチュード≧１４ｍＶ（１ｎｍ最小分離）の表面ポテンシャルで優勢となった。ＤＬＶＯ相互作用の大きな全体的マグニチュードは、ファンデルワールスと静電力との間の正確なバランスが、実験で観察される一貫して弱い接着へ至り得ることは起こりそうもないことを示唆している。
【００７４】
実験結果の１つの説明は、本発明のコロイド粒子が分子的にフラットではないという事実に基づいて構成され得る。２つの粒子は互いに近づくにつれ、相対的により高い表面トポグラフィー（surface topography）の領域ほど、より短い相互作用距離を経験する。ラフな表面間の接触形状（contact geometry）の詳細は、それらが作用する特徴的な長さスケールに基づいて、種々の粒子間力に異なった影響を与える。例えば、ナノメートル長スケールにおける表面トポグラフィーは、これらの実験において、長いDebye長（＞１００ｎｍ）に起因して静電相互作用に対してほとんど影響を有さないと予想される。対照的に、短距離のファンデルワールス相互作用は、ナノメートルスケール表面トポグラフィーによって強力に調節される：大抵の接着性エネルギーは、最接近接点における表面の小さな部分的領域から生じる。同様に短距離の立体的−水和力（steric-hydration forces）は、同様に、これらの近い接点領域に基づいて、２つの粒子間の最小の分離距離を決定する。従って、大きな表面積は、表面トポグラフィーに起因する短距離相互作用力を経験することから除外される。
【００７５】
該膜表面に結合する被検体は、トポグラフィーを生み出し、そして有効な粗さ（roughness）を変化させる。これは、被検体結合誘導されるコロイダル相転移について可能な機構を提案し、ここで、該膜表面上の僅かな蛋白質の存在が、２つの粒子間の最接近位置をシフトさせ、そして従って、ファンデルワールス引力の累積的強度を調整する。膜組成の調節によって相互作用エネルギーを調整する実験的能力は、このタイプのコロイダル相転移に基づく分析システムの設計および最適化に特に重要である。
【００７６】
該被検体の検出アッセイは、検出の低コストおよびスケーラビリティ（scalability）に起因して、高スループット様式で行われ得る。ソフトウエアプログラムを、ｇ（ｒ）の計算を自動化するように書いた。該プログラムは、各画像における各粒子のＸ、Ｙ座標位置を含むテキストファイルを入力する。該ソフトウエアはまた、各画像のピクセル解像度、粒子のサイズ、画像ウインドウのサイズ、およびｇ（ｒ）の所望の解像度のようなパラメータを考慮に入れる。ｇ（ｒ）は高または低解像度で分解され得るが、ｇ（ｒ）は、０．０４のようなより高い解像度で分解されるのが好ましく、何故ならば、これは、許容可能なシグナル対ノイズ比を有するからである。該解像度が低ければ（例えば、０．０１またはそれ以下の解像度で）、多過ぎるノイズが存在する傾向となる。該プログラムは、ｇ（ｒ）プロットを算出しそして出力する。実験を、一般的に、１画像当たり約７０００の個々の粒子に対応する、φ＝約０．１５〜０．２５の粒子エリアフラクション（particle area fractions）で行い、ここで、φは、粒子間および粒子周囲における空の空間とは対照的な、粒子によってカバーされるウインドウの領域である。一般的に、約５〜１０の独立した画像を平均して、＞１０８測定対距離（measured pair distances）からｇ（ｒ）を得た。
【００７７】
該フィールドエリアの画像化は、写真が一貫して撮影される限り、自動化され得、唯一の制限は、自動化カメラの速度、ソフトウエアおよびハードウエアである。ｇ（ｒ）プロットは、十分な数の粒子が十分な時間画像化される限り、かなり迅速に求められ得る。
【００７８】
該アッセイは、高スループット検出を促進するために、全ての波長およびスペクトルにおいて光散乱を画像化および計算する分光光度計またはスキャンニングプレートリーダー（scanning plate reader）のような装置のみで行われ得ることが、更に意図される。該相転移前および各相転移時に特定の粒子集団の光学密度を測定し、シグネチャー光学密度測定値（signature optical density reading）を捕らえる。該被覆粒子への被検体の添加および結合時に、該プレートは、相転移が誘発されたか否かについてスキャンされ得る。
【００７９】
該検出アッセイに影響を与える他のファクターとしては、該アッセイが行われる材料のチャージ（charge）および、水和層（hydration layers）、コーティングが挙げられる。該検出アッセイは、Corning COSTAR 96−ウエル 3997ポリスチレンプレートまたは同程度の高スループットプレートにおいて好ましくは行われることが、現在意図される。該アッセイは、96-、384-または1536-ウエルプレートにおいて実行可能に行われ得る。
【００８０】
該技術の適用
本明細書に記載のコロイダル粒子は、任意の所定の溶液中の被検体を検出する高感度の、低コストな方法を提供する。好ましい実施形態において、リガンドへの結合事象の検出は、病原性生物、疾患、毒素、汚染物質、ホルモンの存在、シグナリング分子、抗体、癌またはメディカルコンディション（medical condition）を検出するために使用される。いくつかの実施形態において、ＨＩＶ、クラミジア（Chlamydia）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、連鎖球菌（Streptococcus suis）、サルモネラ（Salmonella）、ムンプス、ニューカッスル、ならびに種々のウイルス（レオウイルス、センダイウイルス、およびミクソウイルスを含む）を検出するためのシアル酸；コロナウイルス、脳脊髄炎ウイルス、およびロタウイルスを検出するための９−ＯＡＣシアル酸；サイトメガロウイルスおよび麻疹ウイルスを検出するための非シアル酸糖蛋白質；炭疽（Anthrax）、ＣＤ４、血管作用性腸管ペプチド（vasoactive intestinal peptide）をハイブリダイズしそしてその存在を同定するためのペプチド配列、およびＨＩＶを検出するためのペプチドＴ；ワクシニアを検出するための上皮増殖因子；狂犬病を検出するためのアセチルコリンレセプター；Epstein-Barrウイルスを検出するためのＣｄ３補体レセプター；レオウイルスを検出するためのβ−アドレナリン作動性レセプター；ライノウイルスを検出するためのＩＣＡＭ−１、Ｎ−ＣＡＭ、およびミエリン−関連糖蛋白質ＭＡｂ；ポリオウイルスを検出するためのポリオウイルスレセプター；ヘルペスウイルスを検出するための線維芽細胞増殖因子レセプター；大腸菌を検出するためのオリゴマンノース；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）を検出するためのガングリオシドＧＭ１；ならびに、広範囲の病原体（例えば、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、V. vulnificus、V. parahaemolyticus、V. cholerae、およびV. alginolyticus）を検出するための抗体を含むがこれらに限定されないリガンドが、種々の病原性生物を検出するために組み込まれる。
【００８１】
本明細書に記載の膜被覆コロイダルシステムは、細胞膜表面における化学事象に関連する広範囲の問題への潜在的な適用を有する。これらは、多数の細胞表面蛋白質とのリガンド相互作用をマッピングすることから、膜標的化細菌毒素（membrane-targeting bacterial toxins）（例えば、ボツリヌス、コレラ、炭疽、破傷風）およびウイルスの検出へ及ぶ。該コロイドをコーティングするために天然の生物学的膜を使用することは、多種多様の被検体を測定することを可能にすることが、理解されるべきである。天然膜の使用によって、該アッセイは、天然膜上にのみ見られるリガンドへの被検体の結合を検出し得る。公知であるように、多くのタイプの膜結合リガンドは、インンビトロで容易には発現されず、そして従って、天然膜の使用は、多くの利点を提供する。
【００８２】
膜被覆粒子は、異種混合物（heterogeneous mixtures）中でまたは生細胞（例えば、ロゼッティング（rosetting））と混合され得、本明細書で概説される方法論が、膜間レセプター−リガンド相互作用の分析へ適用されることを可能にする。該コロイドアッセイの実施は、自動液体ハンドリングおよび画像化システム（automated liquid handling and imaging systems）に敏感に反応する。本明細書において研究される対分布のような空間分布関数の詳細な分析は、定量的に認識可能な効果を生じさせ得ないものを包含する、微妙な相互作用のキャラクタライゼーションを可能にする。同時に、コロイダル粒子上における膜コーティングの使用は、化学官能性の広範囲なレパートリーを提供し、これは、非生物学的設定において価値があると分かるかもしれない。この研究において脂質膜で示される一般的な原理は、最近開発されたポリマー小胞（polymer vesicles）のような他の材料へ拡大され得ることが理解される。
【００８３】
粒子の異種混合物は、膜および／または膜結合リガンド間の相互作用を検査するために、あるいは多重化（multiplexing）の様式として、使用され得る。この実施において、該粒子は、ラベルで個々に同定可能であり得る。使用され得るラベルとしては、粒子材料にドープされる蛍光分子、膜へドープされる蛍光分子、粒子材料へドープされる半導体ナノ結晶などが挙げられるが、これらに限定されない。異種の組成および官能性の強力に相互作用する粒子は、より複雑なシステムの分析に使用され得る、複雑な、多官能性の、ナノスケール構造への構築のためのビルディングブロック（building blocks）として使用され得る。
【００８４】
粒子は、細胞活性化および増殖（例えば、細胞ロゼッティング）を定量的に観察するために、あるいは細胞様特性を保持する容易に観察可能な、制御可能な界面を作製することによって細胞相互作用および多重化（multiplexing）を検査するために、生細胞と混合され得る。
【００８５】
粒子はまた、蛍光ラベル、半導体ナノ結晶、ナノスケール検出デバイス、またはカスタム設計されたナノ結晶もしくは分子のような材料を用いて内部で官能化され得る。
【００８６】
コロイダル粒子は、例えば汚染物質の存在を検出するために、人体、過激な毒素または腐食剤（caustics）が存在する領域、あるいは高真空設定（hard vacuum settings）のような多くの異なる環境へ分散され得る。結合事象が生じることが可能となり、次いで該粒子は回収され、次いで、本アッセイが行われることを可能にする条件へ供される。該粒子は沈積し、そして該結合事象を受けた有限数の粒子のみが回収されるに違いないので、該粒子は、水の流れる集まり（body）（例えば、川）のような環境においてさえ、分散され得る。例えば、川への暴露後の該粒子の観察可能な挙動および分布は、該川におけるキャスト前の粒子と比較される。
【００８７】
検出下の該媒体へ暴露された、“センサー”粒子は、該媒体へ暴露されなかった複数のバックグラウンド粒子を通って移動され得る。該粒子の挙動に関する相データは、有限な場所における多くの粒子を観察する全体的な空間データを見るよりもむしろ、比較的少ない“センサー”粒子の痕跡を観察することによって、導き出され得る。
【実施例】
【００８８】
実施例１
ガングリオシドドープト膜で被覆されたシリカ粒子を使用する検出アッセイのための方法および材料
材料：脂質をAvanti Polar Lipidsから得た。１，２−ジミリストオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＯＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（ＤＭＰＳ）、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）を、クロロホルム中に受け、そして−２０℃で２週間まで保存した。モノシアロガングリオシドＧＭ１、ウシ−アンモニウム−塩（bovine- ammonium -salt）（ＧＭ１）を、Matreya Inc.から粉末形態で受け取り、そして−２０℃での保存のために、１ｍｇ／ｍＬまで、２：１ クロロホルム／メタノール中に溶解した。トリシアロガングリオシドＧＴ１Ｂ、ウシ脳（ＧＴ１Ｂ）をSigmaから粉末形態で受け取り、そして−２０℃での保存のために、１ｍｇ／ｍＬまで、２：１ クロロホルム／メタノール中に溶解した。蛍光プローブＮ−（テキサスレッドスルホニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（Texas Red登録商標DPPE）をMolecular Probesから粉末形態で購入し、そして使用前にクロロホルム中に溶解した。ＦＩＴＣ標識された、コレラ毒素サブユニットＢ（Cholera toxin subunit B）（ＣＴＢ）、をSigmaから購入し、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度まで０．２×ＰＢＳ中に溶解し、そして４℃で保存した。標識されていないα−ブンガロトキシン（ＢＴ）をSigmaから購入し、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度まで０．２×ＰＢＳ中に溶解し、そして４℃で保存した。蛍光標識された、破傷風毒素、ｃ−フラグメント（ＴＴ）をCalbiochemから購入し、０．１ｍｇ／ｍＬ ＴＴの濃度まで滅菌Ｈ２Ｏおよび１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中において再構成し、そして４℃で保存した。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）をSigmaから購入し、滅菌Ｈ２Ｏ中において再構成し、そして４℃で保存した。標識されていないウサギＩｇＧフラクション抗体  抗−Texas Red（登録商標）を、１ｍｇ／ｍＬの濃度でMolecular Probesから購入し、そして４℃で保存した。５μｍ平均直径シリカガラスマイクロスフェア（silica glass microspheres）をBangs laboratoriesから得、そしてＤＩ Ｈ２Ｏ下４℃で保存した。
【００８９】
支持された膜：支持された二重層を、クリーンなガラスマイクロスフェア上への小単層小胞（small unilamellar vesicles）（ＳＵＶ）の融合により形成した。クロロホルム中の脂質溶液を、小さな丸底フラスコへ蒸発させ、そして約３．３ｍｇ／ｍＬで、１８．２ＭΩ−ｃｍ水中、４℃で１時間水和させた。脂質を、氷水浴中において透明までプローブ−超音波処理し（probe-sonicated）、そして１６０，０００ｇおよび４℃で２時間、超遠心分離した。上澄みを１週間まで４℃で保存した。ガラス表面を、濃硝酸中２５０℃での沸騰、続いての広範囲のリンスによって、堆積のために調製した。１．５ｍＬ遠心分離チューブにおいて等しい量（１００μＬ）のスプレッディング溶液（spreading solution）（１：１  ＳＵＶ／ＰＢＳ）および粒子溶液を共に混合することによって、二重層を該粒子表面上に自己構築（self-assemble）させた。過剰量の小胞を、パルス−遠心分離により該粒子をペレット化することおよび該上澄みの除去によって、除去した。次いで、１ｍＬの１８．２ＭΩ−ｃｍ水を、該ペレット化粒子へ添加し、そして全混合物を撹拌して、再懸濁させた。
【００９０】
コロイド形成：該粒子懸濁液を所望の濃度へ希釈し、そして該懸濁液２００〜３００μＬをCostarナンバー3997 96-ウエルプレート中へピペッティングすることによって、コロイドをキャストした。各ウエルの底への該粒子の平らな沈積（settling）を可能にするために、該96-ウエルプレートを１５分間乱されない状態に放置した。
【００９１】
画像化：支持された二層コーティングされた粒子を、作業濃度（working concentration）まで希釈し、そして観察のためにCorning 96-ウエル細胞培養クラスター上に堆積させた。粒子を、蛍光用の水銀アークランプおよび明視野イルミネーション用の１００Ｗハロゲンランプを備えるNikon TE-300倒立蛍光顕微鏡（Nikon, Japan）を用いて、室温で観察した。画像を、Roper Scientific CoolSnap HQ電荷結合素子カメラ（Roper Scientific CoolSnap HQ, USA）で記録した。画像をSIMPLE PCI（Compix Inc., Cranberry Township, PA）で得て、そしてMETAMORPH（Universal Imaging Corporation, Cranberry Township, PA）で解析した。
【００９２】
データ分析：上記の等式（１）を得るために、二体分布関数は、
ｇ（ｒ）＝ｎ（ｒ）／ｐ（ｒ）
と表され、
式中、ｎ（ｒ）＝２η（ｒ）／（Ｎ（Ｎ−１）δｒ）は、
分離距離ｒを有する粒子対の実際の相対密度（actual relative density）であり、そしてｐ（ｒ）＝２（πＸＹｒ−２（Ｘ＋Ｙ）ｒ２＋ｒ３）／（Ｘ２Ｙ２）は、空間寸法ＸｂｙＹの有限の長方形ウインドウにおいて分離距離ｒを有する粒子対を見出す一般的な確率密度である。ｐ（ｒ）についてのこの式を得るために、我々は、線積分
【００９３】
【数３】
2007521494.tif 000005
【００９４】
を解き、式中、
ｐ（ｒｘ）＝２（Ｘ−ｒｘ）／Ｘ２およびｐ（ｒｙ）＝２（Ｙ−ｒｙ）／Ｙ２は、それぞれ、分離ベクターｒ（separation vector r）のｒｘおよびｒｙ絶対投影（absolute projections）を有する粒子対を見出す確率密度であり、そしてＱは円の全てのポジティブクオーター（all- positive quarter of a circle）である。
【００９５】
平衡時、ｇ（ｒ）は、平均力のポテンシャル（potential of mean force）、ｗ（ｒ）に物理的に関連する：
【００９６】
【数４】
2007521494.tif 000006
【００９７】
希釈系において、ｗ（ｒ）は、対相互作用ポテンシャル（pair interaction potential）に等しく、そして従って、相互作用エネルギーの直接測定を提供する。より濃縮された系において、ｗ（ｒ）は、隣接する粒子に起因する影響を含む。サンプル間の定量比較のために、我々は、粒子直径で生じるｇ（ｒ）における第１ピークを分離し、そして対応の有効な相互作用エネルギー、Ｅｉを計算する。これは、等しいエリアフラクション（area fractions）（φ）の粒子を含むサンプル間の正確な比較を可能にし、そしてＥｉは、低カバレージ密度（low coverage densities）で純粋な対相互作用エネルギーへ収束する。平衡は、Ｅｉが意味のあるユニットのエネルギーを有するために要求されるが、これは、有効な比較のための要件ではなかった。各コロイダル系が初期に無相関の状態（initially uncorrelated state）でキャストされる限り、所定時間間隔での非平衡分布測定はまた、定量比較のために使用され得る。ｇ（ｒ）の独立した測定値は非常に一致した。同一の出発材料由来の別個のコロイダル調製物から測定されたＥｉ値間の標準偏差は、一般的に、０．１ｋＢＴ未満であった。
【００９８】
実施例２
ガングリオシドドープト膜で被覆されたシリカ粒子を使用する検出アッセイ
膜被覆シリカ粒子を、水中で分散し、ここで、それらは、下層の支持体上へ重力により沈積し、そして二次元コロイドを形成する。粒子はフリーな側方拡散（free lateral diffusion）を示し、そして該系は、エルゴード流体（ergodic fluid）として振舞った。粒子の希薄コレクションについてのブラウン軌道（Brownian trajectories）を、図２ａに示す。粒子拡散係数は、膜組成とは本質的に無関係であった；測定値は５μｍ直径粒子について０．０７９〜０．０８６μｍ２／ｓの範囲であった。これらの値は、純粋に粘性の抵抗についてのStokes-Einstein関係によって予想されるものの約８０％であり、下層の支持体上の抵抗からの少ない寄与を示している。該粒子表面上の膜間の相互作用の強度に依存して、該コロイドの分散（ガス）または凝縮（液体または結晶）相が観察された。粒子移動度（particle mobility）は、凝縮相において保持された（図２ｂ）。凝縮相および分散相の両方における、個々の粒子の移動度は、系平衡化の速度を規定した。図２ｂにおいて見られる、粒子の凝縮クリスタライトへの凝縮およびそこからのエバポレーション（evaporation）のタイムスケールは、我々の実験のそれと比較して迅速であった（数分ｖｓ．３０分超）。更に、該相の全体的形態学および量的二体分布関数（overall morphology and quantitative pair distribution functions）は、個々の粒子の交換にもかかわらず、一定のままであった。これらの観察は、該系が、少なくとも数粒子直径の長さスケールにわたって、近平衡であることを示唆している。
【００９９】
該脂質膜の化学組成は、対相互作用ポテンシャルを調節するために調整され、そして下記に記載される。凝縮相は、図２ｂにおいて見られるように、該コーティング膜が正味の中性または負に帯電しているかに関わらず、形成した。対照的に、正味正に帯電した膜は、分散相に至った。複数の相の出現は、対相互作用エネルギーが、該系を相転移付近に釣り合わせることを示した。従って、該膜表面上の微小摂動は、該コロイドの巨視的組織の顕著な変化を誘発すると予想される。我々は、膜結合リガンドへの蛋白質結合の効果を検査することによって、この予測に気づく。
【０１００】
いくつかの蛋白質系を研究した：膜表面抗原へ結合する抗体、ならびにそれらの各々の膜リガンド、モノシアロガングリオシドＧＭ１およびトリシアロガングリオシドＧＴ１Ｂへ結合する細菌毒素、コレラ（ＣＴＢ）および破傷風（ＴＴ）。９％ホスファチジルセリン／９１％ＤＭＯＰＣ膜でコーティングされた粒子を、実施例２に記載されるように調製した。
【０１０１】
このようにして調製した粒子は、研究した全ての膜表面リガンドについて、寿命の短いクリスタライトからなる凝縮相を形成した。全てのケースにおいて、膜表面への蛋白質結合は、凝縮から分散への相転移を誘発した。図３は、ｔ＝０秒での蛋白質の添加により誘発された相転移の時間系列を示す。これらの実験を、９６−ウエルプレートの約５ｍｍラウンドウエルにおいて約３００μｌ溶液で行った。該ウエルの上部へ蛋白質溶液の液滴を添加する３０秒内で、凝縮相の均一な崩壊が認識可能であった。６０秒内で、該コロイドは、分散された分布を達成した。個々の粒子移動度は、蛋白質結合によって影響を受けない。問題の特定の蛋白質への暴露は、好適な同種リガンド（cognate ligand）が該コロイド膜へ組み込まれている場合にのみ、凝縮相から分散相への相転移を誘発した。膜表面へ結合された蛋白質の物理的存在は、２つの膜間の最接近位置（the closest approach position）を増加させ、そして従って、粒子間のファンデルワールス引力の累積的強度を減少させる。
【０１０２】
実施例３
コレラおよび破傷風毒素を検出するための被覆コロイダル粒子を使用する検出
ある範囲の蛋白質およびリガンド濃度に渡る近平衡コロイダル分布の測定を行い、膜表面上における蛋白質結合の読み出しとしての相転移の有用性を探究した。抗体研究を、蛍光膜プローブ、Texas Red-DPPEへ結合するモノクローナルＩｇＧ抗体を使用して、行った。
【０１０３】
抗−Texas Red（登録商標）ウサギＩｇＧフラクション抗体を、室温で暗所中４５分間、該抗体の２０μｇ／ｍＬ溶液を該粒子溶液１ｍＬと共にインキュベートし、５分毎に穏やかに撹拌することによって、Texas Red（登録商標）含有膜へ結合させた。抗体をまた、９６−ウエルプレートにおいて該キャストコロイドへ直接、抗体溶液を添加することによって、Texas Red（登録商標）含有膜へ結合させた。細菌毒素（ＣＴＢ、ＴＴ、ＢＴ）を、連続した穏やかな混合下、室温で、暗所中、５０分間、種々の濃度で該毒素を粒子溶液と共にインキュベートすることによって、膜（ＧＭ１、ＧＴ１Ｂのいずれかを含むか、またはガングリオシド無し）へ結合させた。
【０１０４】
２０μｇ／ｍｌ抗−Texas Red抗体と共にインキュベートされたサンプルは、リガンド表面濃度≧１０−４単層について、凝縮相から分散相への明らかな転移を示した（図４ａ）。これは、膜間分離（intermembrane separations）が＜１０ｎｍ（５μｍ粒子）である接触領域（contact region）内で、各膜において約１０リガンド分子に対応する。細菌毒素結合研究のために、ガングリオシドリガンドＧＴ１ＢまたはＧＭ１を、一定の０．５％で膜へ組み込んだ。ＴＴとのインキュベーションは、ＧＴ１Ｂ含有コロイドにおいて分散相の形成を誘発し、一方、ＧＭ１コロイドにおいて影響は生じなかった（図４ｂ）。同様に、ＣＴＢへの暴露は、ＧＭ１コロイドにおいて分散相への転移を誘発し、ＧＴ１Ｂコロイドにおいて影響を生じさせなかった（図４ｃ）。ブンガロトキシン（１μＭ）への暴露は、いずれのコロイドにおいても影響を生じさせなかった。測定されたｇ（ｒ）におけるｒ０ピークの大きさは、結合された蛋白質の表面濃度をトレースする。
【０１０５】
図４は、膜リーフレット当たり−１．４３×１０４〜７．１５×１０４ｅ／μｍ２の範囲の完全にイオン化された電荷密度を有する膜組成物のパネルからの結果を示し；実際の表面電荷密度は、不完全イオン化に起因して顕著により低いと予想される。最も強い相互作用は、中性膜で被覆された粒子について見られた。これは、中性表面間で予想される静電反発の最小化と一致している。中性から離れて、Ｅｉは、正に帯電した膜について急激に低下し、一方、該膜が負に帯電するにつれて、ほんの僅かな、しかし一定した、減少が観察される。蛋白質結合実験において使用されるＤＭＰＳ膜（完全イオン化で−１．４３×１０５ｅ／μｍ２）は、中性膜のそれと類似したＥｉを示した（約２ｋＢＴ、図３を参照のこと）。
【０１０６】
ＣＴＢ−ＧＭ１およびＴＴ−ＧＴ１Ｂ結合を、平面な支持膜（ＳＵＶをガラスカバースリップへ堆積させることによって形成される）を種々の濃度のＣＴＢおよびＴＴと共にインキュベートし、そしてＦＩＴＣラベル（ＣＴＢから）またはフルオレセインラベル（fluroescein label）（ＴＴから）のいずれかからの蛍光をモニタリングすることによって、キャラクタライズした。結果は、ＣＴＢが、約４１ｎＭの有効な解離定数で、ここで研究される８９％ＤＭＯＰＣ／９％ＤＭＰＳ／１％ＧＭ１／１％Texas Red DPPE膜へ結合することを示している（図５ａを参照のこと）。ＣＴＢ−ＧＭ１結合は一価ではないので、これは、結合親和性のおおよその表示である。結論は、ＴＴが、約６０ｎＭの有効な解離定数で、ここで研究される８９％ＤＭＯＰＣ／９％ＤＭＰＳ／１％ＧＴ１Ｂ／１％Texas Red DPPE膜へ結合することを示している（図５Ｂを参照のこと）。
【０１０７】
実際の検出実験を、約４ｍｇ／ｍＬの有機および無機成分を含有する川の水のサンプル中で、ＦＣＳ（０．１％）およびＣＴＢ（１００ｎＭ濃度で）を混合することによって行った。該混合物を、０．２μｍフィルターで濾過し、そして連続的に穏やかに混合しながら、室温で暗所中５０分間、１ｍＬの該粒子溶液と共にインキュベートした。過剰な可溶性成分を、該コロイドをキャスティングする前に１８．２Ｍ□−ｃｍ水で該混合物をリンスすることによって、除去した。
【０１０８】
サポートする表１および図５ｂ、５ｃ、５ｄおよび５ｅは、該コロイド検出スキームの選択性を試験するように設計された一連の実験についての結果を含む。
【０１０９】
【表１】
2007521494.tif 000007
【０１１０】
表１中の約１未満のＥｉの値（太字で示される）は、強力に陽性のシグナル（毒素検出）を示す。ＧＭ１（図５ｄ）、ＧＴ１Ｂ（図５ｅ）を含有するかまたはガングリオシド無し（図５ｃ）の膜で被覆された粒子を、ＣＴＢ、ＴＴおよびＢＴに対する結合親和性について試験した。得られたコロイダル分布を、有効な相互作用エネルギー、Ｅｉの点で評価した。いずれのタイプの毒素も存在しない場合において、該３つのタイプの膜のいずれかで被覆された粒子は、約２を超えるＥｉ値を有することが、観察された。この値は、凝縮相の典型であり、そして陰性シグナルと考えられる。毒素およびその特異的標的の存在下において（ＧＭ−ＣＴＢ、ＧＴ１Ｂ−ＴＴ）、該コロイドについてのＥｉ値は、約１未満であった。この値は、分散相のコロイドの典型であり、そして陽性シグナルと考えられる。更に、正しくないまたは存在しない標的の存在下における毒素との特異性が、明白に示される。陰性シグナルを、以下の系について得た：ＧＭ１−ＴＴ、ＧＴ１Ｂ−ＣＴＢ、標的を含まないＣＴＢおよびＴＴ、ならびに３つの膜タイプ全てを含むＢＴ。
【０１１１】
このデータ全てについてのＧ（ｒ）プロットは、図５ｃに存在する。広範囲の可能性のある標的に対して感受性ではないこと（insensitivity）が、ＧＭ含有膜の存在下で０．１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）をインキュベートすることによって実証された。得られたコロイダル分布のＥｉ値は、陰性シグナルの指標の、約２超であった。ＣＴＢが存在しそしてＧＭ１含有膜で被覆された粒子へ結合される場合、ｇ（ｒ）プロットにおける第１ピークは顕著に不在であったことに注意のこと。そして検出される毒素が破傷風毒素である場合、ＧＴ１Ｂ含有膜で被覆された粒子についてのｇ（ｒ）プロットにおいて顕著に不在のピーク（noticeably absent peak）が存在した。従って、ｇ（ｒ）プロットは、溶液中の毒素が該被覆粒子によって結合および検出されたことを、質的に示し得る。
【０１１２】
実施例４
コロイダル粒子の異種混合物（Heterogeneous mixtures）を使用する検出
２つのタイプのコロイダル粒子を、実施例１に従って作製した。一方のタイプを、影付き（shaded）として視覚化し、そして他方を白色（white）として視覚化した。ここで図６を参照して、該コロイドは、以下の組成のものであった：影付き粒子（shaded particles）は、流動性脂質二重層膜（組成：９６％ＤＭＯＰＣ、３％ＤＭＰＳ、１％Texas Red（登録商標）ＤＰＰＥ）中にカバーされた６．８μｍ直径のシリカマイクロスフェアである。白色粒子（white particles）は、流動性脂質二重層膜（組成：９８％ＤＭＯＰＣ、２％ＤＯＥＰＣ、１％１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル、またはＮＢＤ−ＰＥ）中にカバーされた６．８μｍ直径の非多孔性シリカマイクロスフェアである。粒子位置分析（particle location analysis）は、実施例２において行われそして概説されるものと同一である。
【０１１３】
コロイドの異種混合物の研究を、所望の割合で異なるコロイドの希釈溶液を一緒に混合することによって達成した。次いで、得られた異種コロイド溶液を、上述されるように、激しく撹拌し、そして９６ウエルプレートのウエルへピペットで取り、該コロイドをキャストした。
【０１１４】
該コロイダル粒子の異種混合物についてのｇ（ｒ）を測定する分析を、下記のように行った。図６ａの二元コロイドについて、異種粒子の全ての系についてφ＝０．２。図６ｂにおけるプロットは、異種ｇ（ｒ）プロットの特徴的表示を示している。
【０１１５】
第一に、４つの‘ヘテロ−粒子（hetero-particle）’のケースについて、ｎ（ｒ）、分離距離ｒを有する粒子対の実際の相対密度の評価：
全ての粒子のｎ（ｒ）
【０１１６】
【数５】
2007521494.tif 000008
【０１１７】
ηＡＬＬ（ｒ）は、分離距離ｒ±（δｒ／２）を有する全ての粒子対の数であり、そしてＮＳおよびＮＷは、それぞれ、影付きおよび白色粒子の総数である。ここでＮＳ＋ＮＷ＝Ｎなので、ｎＡＬＬ（ｒ）は、オリジナルの‘ホモ−粒子（homo-particle）’ｎ（ｒ）に類似する。
【０１１８】
影付き粒子のｎ（ｒ）
【０１１９】
【数６】
2007521494.tif 000009
【０１２０】
ηＳ（ｒ）は、分離距離ｒ±（δｒ／２）を有する影付き−影付き粒子対の数である。我々が白色粒子を無視する場合（これを、我々はここですることが出来る）、ＮＳ＝Ｎであり、そしてｎＳ（ｒ）はまたオリジナルの‘ホモ−粒子’ｎ（ｒ）に類似する。
【０１２１】
白色粒子のｎ（ｒ）
置換Ｓ→Ｗを伴って、ｎＷ（ｒ）は上記ｎＳ（ｒ）に類似する。
【０１２２】
白色粒子に対する影付き粒子のｎ（ｒ）（異種対相関関数）
【０１２３】
【数７】
2007521494.tif 000010
【０１２４】
ηＳＷ（ｒ）は、分離距離ｒ±（δｒ／２）を有する粒子へテロ−対の数である。このｎＳＷ（ｒ）式は、実際に‘ホモ−粒子’ｎ（ｒ）式とは異なる唯一のものである。
【０１２５】
該４つのケースについてのｇ（ｒ）
我々は、オリジナルの一般定義式を使用する：
【０１２６】
【数８】
2007521494.tif 000011
【０１２７】
ここで、ｐ（ｒ）は、分離距離ｒを有する粒子対を見つける確率密度である。ｎ（ｒ）は該４つの議論された‘ヘテロ−粒子’のケースにおいて異なったが、ｐ（ｒ）は、オリジナルの‘ホモ−粒子’ｐ（ｒ）と変わらないままであり、そして以下である：
【０１２８】
【数９】
2007521494.tif 000012
【０１２９】
上記式を組み合わせて、我々は以下を得る：
【０１３０】
【数１０】
2007521494.tif 000013
【０１３１】
ｐ（ｒ）は全てのケースにおいて同一であるので、これら４つのｇ（ｒ）関数間の関係は、それらの相対的ｎ（ｒ）部分の比較から直接生じる。
【０１３２】
図６Ａの写真に示される影付きおよび白色粒子対の相対密度のグラフ表示を、図６Ｂに記載する。異種ｇ（ｒ）のこの特定の表示における第１ピークは非常に鋭く、高く、そして正確に１つのビーズ直径で生じ、互いに接触している影付きおよび白色粒子の存在を示している。これは、影付き粒子および白色粒子の完全にいずれも相互作用しない好ましくないエネルギー領域を示す、該関数の値の鋭い降下によってフォローされる。これは、分離距離ｒを有する影付きおよび白色粒子対の相対密度を示す更なるピークによってフォローされる。該コロイドが存在する溶液のイオン強度を変化させることは、異種ｇ（ｒ）が２つの粒子が相互作用するという好ましくない可能性を示す領域の幅を変化させ得ることが示され得る。この効果は、コロイダル粒子の異種混合物を相転移点へより近くにまたはそこからより遠くへ置くことにおいて利用され得、従って、相挙動の差異をより敏感にする。
【０１３３】
実施例５
コロイダル粒子を使用する検出
実際の検出実験を、約４ｍｇ／ｍＬの有機および無機成分を含有する川の水のサンプル中において、ＦＣＳ（０．１％）およびコレラ毒素（ＣＴＢ）（１００ｎＭ濃度で）を混合することによって行った。該混合物を、０．２μｍフィルターで濾過し、そして連続的に穏やかに混合しながら、室温で暗所中５０分間、１ｍＬの該粒子溶液と共にインキュベートした。過剰な可溶性成分を、該コロイドをキャスティングする前に１８．２ＭＷ−ｃｍ水で該混合物をリンスすることによって、除去した。
【０１３４】
実施例２における統計分析の方法を使用する分析の際に、コレラの検出について該系からの陽性シグナルが観察された。
【０１３５】
代替法は、コレラ毒素リガンドを有する粒子を川へ分散し、十分なインキュベーション時間（即ち、約５０分）を可能にし、該川の水から該粒子を回収および単離し、そして次いで、上記で概説した分析を行うことである。
【０１３６】
実施例６
二体分布関数を算出するための代替法
ｇ（ｒ）を算出する代替法が、計算効率を上げるために使用され得る。典型的なコロイダル分布を観察する場合、観察のフィールドにおいて、多くの粒子対を４０μｍ超で分離する。対分布は４０μｍの十分前で一定となるので、これらの対距離（pair distances）を計算しそしてそれらをヒストグラムに組み込むことは、無駄である。計算される対距離の数はＮ２、画像中の粒子数（１０４〜１０５）のスケールであるので、必要でない対距離は、顕著に該計算の速度を低下させ得る。該粒子は、ある程度、硬いスフェアであるので、所定のビーズの第ｎ最近接物（n-th nearest-neighbors）は、中央ビーズから４０μｍ超離れていることが保証される。６．８４μｍビーズについて、第７順位の最近接物は遠すぎるが、第６順位の最近接物は範囲内にあり得る。従って、第６およびそれよりも低い順位の最近接物対について対距離を計算するだけの方式を見出すことが出来るならば、計算されるがｇ（ｒ）の第一の４０μｍに無関係である対距離の数を最小化することが出来る。
【０１３７】
関連する対を標識するために、Ｎ×Ｎマトリクスを使用する。ビーズｉおよびビーズｊが第６またはそれ以下の順位の最近接物である場合、それらの対距離が計算されそしてヒストグラムへ組み込まれるべきであることを示す１が存在すべきである。それらがより高次の最近接物（higher- nearest neighbors）である場合、ゼロが存在すべきである。上述のアプローチは、１’ｓでこのマトリクスを満たすことに等しい。典型的には、該粒子対の８％未満は、該４０μｍ ｇ（ｒ）に関連する。
【０１３８】
このマトリクスを得るために、第１順位の最近接物対を標識するマトリクスを計算する。便宜上、第１順位の最近接物マトリクスがＧと呼ばれる。このマトリクスＧは、最近接物ビーズの中央を接続するラインセグメントを描くことによって得られる、該ネットワークの数学的表示である。ビーズｉをビーズｊへ接続するラインセグメントが存在する場合、Ｇのセル（ｉ，ｊ）において１が存在する。従って、Ｇは、直接的な幾何学的意味を有する（それは、ドットを接続する方法を教示する）。最近接物ネットワーク（nearest neighbor network）は、デラウニー三角分割（Delaunay Triangulation）と呼ばれる方法を使用して非常に迅速に計算され得る。この方法は、適用計算幾何学に重要である。
【０１３９】
グラフ理論において、マトリクスＧは、同様に、別の意味を有する。Ｇは、高順位の最近接物対を含有するより複雑なネットワークを提供するように、該ネットワークをオペレートし得る。従って、Ｇ２は、第２およびより低い最近接物のネットワークである。Ｇ６は、第６およびより低い最近接物のネットワークである。従って、該アルゴリズムは下記のように機能する：
各ビーズの位置を記載する（ｘ，ｙ）対の所定のセット
１）デラウニー三角分割（Delaunay triangulation）を使用してＧを計算する
２）Ｇ６を計算する
３）Ｇの上部三角部分（upper-triangular part）における各１について
ａ）対距離を計算する
ｂ）対距離をヒストグラムに入れる
４）ヒストグラムを標準化する。
【０１４０】
実施例７
天然細胞膜を使用する蛋白質検出
膜結合された蛋白質の検出を、粒子をコーティングするために天然細胞から直接得た“粗”膜抽出物を使用して行った。詳細には、６．８ｍｍ平均直径シリカマイクロビーズを、ヒト赤血球細胞の天然細胞膜から直接調製した小胞でコーティングした。天然細胞膜は、生細胞から採取される膜である。次いで、該赤血球膜中に存在する該天然膜結合された細胞内蛋白質（Band III）への抗体の結合の作用は、相転移を誘発するに十分であったことが、示された。
【０１４１】
赤血球細胞ゴーストを、Kaufmannらの方法（Kaufmann, S. & Tanaka, M. Cell Adhesion onto Highly Curved Surfaces: One-Step Immobilization of Human Erythrocyte Membranes on Silica Beads. ChemPhysChem 4, 699-704 (2003)）を使用して作製した。得られた細胞を、次いで、氷水浴中、９０秒間（５秒パルス＋１秒インターバル）、２５Ｗで、５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中、プローブ−超音波処理し（probe-sonicated）、小単層小胞（small unilamellar vesicles）（ＳＵＶ）を作製した。緩衝液中のＳＵＶを、２時間、１６０，０００ｇおよび４℃で、超遠心分離した。上澄みを、４℃で、５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中、４８時間まで保存した。１．５ｍＬ遠心分離チューブにおいて等しい量（１００ｍＬ）のスプレッディング溶液（spreading solution）（１：１ＳＵＶ／１×  トリス緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４）とマイクロビーズ懸濁液（脱イオン化水中１０％固体）とを共に混合することによって、二重層を該マイクロビーズ表面上に自己構築させた（self-assemble）。過剰量の小胞を、パルス遠心分離および上澄みの除去によって、除去した。次いで、１ｍＬの５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を該マイクロビーズへ添加し、そして全ての混合物を撹拌して、該マイクロビーズを再懸濁させた。
【０１４２】
抗体染色の前に、該ビーズを、ＢＳＡ（１５ｍｇ／ｍＬ）中１時間インキュベートし、抗体の非特異的吸着を防止した。次いで、細胞内Band IIIドメインを、生理学的緩衝液中においてモノクローナルマウスＩｇＧ抗体を使用して同定した。次いで、該結合されたマウスＩｇＧを、Texas Red標識化ポリクローナルヤギ抗−マウス抗体によって検出した。各抗体についてのインキュベーション時間は３０分であった。ビーズを１８．２ＭΩ−ｃｍ水で徹底的にリンスし、受容可能な作業濃度まで希釈し、９６ウエルプレートへキャストし、そして重力によって沈積させた。該マイクロビーズを、蛍光用の水銀アークランプおよび明視野イルミネーション用の１００Ｗハロゲンランプを備えるNikon TE-300倒立蛍光顕微鏡を用いて、室温で観察した。画像を、Roper Scientific CoolSnap HQ電荷結合素子カメラで記録した。
【０１４３】
この実験の結果は、上述に示されるような、実施例２で行った抗体アッセイの結果と類似していた。このケースにおいて、該抗体の結合は、該コロイドに凝縮相から分散相への相転移を受けさせるに十分であった。
【０１４４】
この実験は、二次抗体または複雑な光検出装置が必要とされないので、現在利用可能なもの（ＥＬＩＳＡなど）と類似しているがよりシンプルなプロテオミック分析を行うように改変され得ることが、理解されるべきである。遺伝的に非常にキャラクタライズされている、ＨＥＫおよびＣＨＯ細胞のようなモデル細胞系は、任意の数の膜−結合された／結合された被検体を提示するように形質転換され得る。更に、天然に生じる被検体を提示する天然細胞もまた使用され得、そしてモデル細胞のエンジニアリングが実行可能でないかあるいは好適でない場合において、より好適でさえあるかもしれない（発現のためにエンジニアリングすることが困難である蛋白質、天然細胞において高濃度で天然に存在するとわかっているものなど）。
【０１４５】
上記の明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするに十分であると考えられる。上記の説明および実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態を詳述し、そして本発明者によって意図されるベストモードを説明する。しかし、上記が文字でどんなに詳細に現れているとしても、本発明は多くの様式で実施され得、そして本発明は添付の特許請求の範囲およびその均等物に従って構成されなければならないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１ａは、膜被覆シリカ粒子の概略図である。図１ｂは、流動膜のために粒子表面をコーティングする脂質膜について行われた光退色後の蛍光回復（ＦＲＡＰ）実験を詳述する３つの写真を示す。写真は、退色前の全イルミネーション（illumination）（左）、退色中の暴露パターン（中央）、および退色後１分の全イルミネーション（右）を示す。図１ｃは、非流動膜を用いての、同一の蛍光回復を示す。
【図２】図２は、膜被覆粒子の移動度を示している。図２ａは、水で満たされた皿の底へ重力で沈積している、膜被覆粒子の二次元ブラウン軌道を示す写真である。図２ｂは、凝縮クリスタライトへのそしてそこからの、個々の粒子の移動度を例示する、該コロイドの凝縮相の画像の時間系列を示す４つの写真のセットである。時間系列は、ｔ＝０、ｔ＝９０秒、ｔ＝１８０秒およびｔ＝２７０秒でとられている。
【図３】図３は、蛋白質結合誘発されるコロイダル相転移を示す。図３ａは、蛋白質の添加によって誘発される、凝縮から分散コロイダル相への転移を示す画像の時間系列を示す４つの写真のセットである。写真は、時間ｔ＝０、ｔ＝３０秒、ｔ＝６０秒およびｔ＝２４０秒で撮影された。図３ｂは、図３ａに示される時間系列についての三次元グラフｇ（ｒ）である。
【図４】図４は、蛋白質結合アッセイの結果を示す一連の三次元グラフである。図４ａは、２０μｇ／ｍｌ抗−Texas RedウサギモノクローナルＩｇＧ抗体と共のインキュベーション後の、Texas Red-DPPEリガンド（Ｎ−（テキサスレッドスルホニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）の異なるモルフラクション（χ）を含む流動膜（９０％ＤＭＯＰＣ、約９％ＤＭＰＳ）で被覆された粒子（エリアフラクションφ＝０．１５）の分散液についての、測定されたｇ（ｒ）関数のプロットである。図４ｂは、種々の濃度の破傷風毒素（ＴＴ）と共にインキュベートされた、ガングリオシドＧＴ１Ｂ（トリシアロガングリオシド）を含有する膜で被覆された６．８μｍ直径粒子（φ＝０．２５）の一連の同一の分散液についてのｇ（ｒ）のプロットである。膜表面ＧＴ１ＢへのＴＴの結合は、該コロイドの直接観察（挿入画像）によってならびにｇ（ｒ）プロットにおいて検出されるように、凝縮相の分散相への転移を誘発する。図４ｃは、ＧＴ１Ｂの代わりに０．５％モノシアロガングリオシド（ＧＭ１）を用いることを除いて、図４ｂにおけるような一連の実験の結果を示すプロットである。ＧＭ１膜へのコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）の結合は、該転移を誘発する。ＧＴ１ＢコロイドとのＣＴＢまたはＧＭ１コロイドとのＴＴのインキュベーションは、影響を生じさせなかった。
【図５】図５は、平面の支持膜上におけるパラレルセットの実験を示す線グラフのセットである。該グラフは、ＣＴＢ−ＧＭ１（図５ａ）およびＴＴ−ＧＴ１Ｂ（図５ｂ）結合についての有効な解離定数が、それぞれ、約６０および約４１ｎＭであると測定されたことを示している。図５ｃ：ＧＭ１およびＧＴ１Ｂを含まない膜で被覆されたビーズへＣＴＢが添加された場合の、結合の不在。図５ｄ：ＧＭ１−含有膜で被覆されたビーズは、ＣＴＢ（その天然リガンド）の結合を検出したが、α−ブンガロトキシン（ＢＴ）またはＴＴの結合は検出しなかった。図５ｅ：ＧＴ１Ｂ含有膜で被覆されたビーズは、ＴＴ（その天然リガンド）の結合を検出したが、ＣＴＢまたはＢＴの結合は検出しなかった。
【図６】図６ａは、溶液中のマイクロスフェアの写真である。影付き粒子は、流動性脂質二重層膜（組成：９６％ＤＭＯＰＣ、３％ＤＭＰＳ、１％Texas Red（登録商標）ＤＰＰＥ）中にカバーされた６．８ｍｍ直径のシリカマイクロスフェアである。白色に着色された粒子は、流動性脂質二重層膜（組成：９８％ＤＭＯＰＣ、２％ＤＯＥＰＣ、１％１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル、またはＮＢＤ−ＰＥ）中にカバーされた６．８ｍｍ直径の非多孔性シリカマクロスフェアである。図６ｂは、サンプル中の影付きおよび白色の粒子対の相対密度を示す、典型的な異種対相関関数（heterogeneous pair correlation function）のグラフを示す。
【図７ａ】図７ａは、直接的な光学画像化によって観察された被覆コロイダル粒子を示す概略図である。
【図７ｂ】図７ｂは、均質（homogeneous）コロイダル粒子のｇ（ｒ）プロット中の異なるピークに対応する最隣接相互作用（nearest-neighbor interactions）の視覚的表示である。
【図８ａ】図８Ａは、１ｎＭ（左）、５０ｎＭ（中央）、および１０００ｎＭ（右）ＣＴＢインキュベーションでの、膜結合ＧＭ１へのＣＴＢの結合時の、膜コーティングされたシリカマイクロビーズの凝集の変化する状態を示す３つの画像の写真である。
【図８ｂ】図８Ｂは、増加する濃度のＣＴＢと共にインキュベートした０．５モル％ＧＭ１膜コーティングされたビーズについての動径分布関数の一連のプロットを示すグラフである。
【図８ｃ】図８Ｃは、コロイドアッセイ（破線）および従来の蛍光読み出し（実線）から得られる平衡結合曲線間の比較を示す線グラフである。
【図９ａ】図９Ａは、ヒト赤血球膜で被覆された６．８μｍ平均直径ビーズ（エリアフラクションφ＝０．１５）の分散液について測定されたｇ（ｒ）のプロットである（左）。対応の画像は、代表的な分布を示す（右）。
【図９ｂ】図９Ｂは、ヒト赤血球膜で被覆されそして過剰量の抗−Band IIIマウスモノクローナル抗体と共にインキュベートされた、６．８μｍ平均直径ビーズ（エリアフラクションφ＝０．１５）の分散液について測定されたｇ（ｒ）のプロットである（左）。対応の画像は、代表的な分布を示す（右）。
【図１】
2007521494.tif 000014
【図２】
2007521494.tif 000015
【図３】
2007521494.tif 000016
【図４】
2007521494.tif 000017
【図５ａ】
2007521494.tif 000018
【図５ｂ】
2007521494.tif 000019
【図５ｃ】
2007521494.tif 000020
【図５ｄ】
2007521494.tif 000021
【図５ｅ】
2007521494.tif 000022
【図６ａ】
2007521494.tif 000023
【図６ｂ】
2007521494.tif 000024
【図７ａ】
2007521494.tif 000025
【図７ｂ】
2007521494.tif 000026
【図８ａ】
2007521494.tif 000027
【図８ｂ】
2007521494.tif 000028
【図８ｃ】
2007521494.tif 000029
【図９】
2007521494.tif 000030
【国際調査報告】
2007521494.tif 000031
2007521494.tif 000032