(57)【要約】  本発明は、生体内でＶＰＡＣ２受容体のアゴニストとして機能する新規のペプチドを提供する。それらのインスリン分泌促進性ポリペプチド物質は、生体内でのグルコースのチャレンジに対して血糖を低下することが示される。本発明のポリペプチドは、配合物内で安定でありそして長い半減期を有する。本発明のペプチドは、低い内因性インスリン分泌、例えばＩＩ型糖尿病の患者に対する治療を提供する。本発明は、ペプチドの治療有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる、該哺乳動物内の代謝疾患を処置する方法にも関する。
2007519739.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１４８からなる群から選択されるポリペプチド、ならびにそれらの機能的に等価なフラグメント、誘導体、および変種。
【請求項２】
ポリペプチドが配列番号１、２、３、４、５、１１２、１１３、１１４、１１５、および１１６からなる群から選択される、請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項４】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項３の抗体。
【請求項５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項３の抗体。
【請求項６】
ポリエチレングリコールに特異的に結合する抗体。
【請求項７】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項６の抗体。
【請求項８】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項６の抗体。
【請求項９】
ａ．試料を請求項３または請求項６の抗体と接触させ、
ｂ．該抗体を検出し、そして
ｃ．抗体の検出を試料中のポリペプチドの量と相関させる
ことを含んでなる、試料中の配列番号１〜１４８からなる群から選択されるポリペプチドの検出方法。
【請求項１０】
ａ．試料を請求項３または請求項６の第一の抗体と接触させ、
ｂ．試料を第二の抗体と接触させ、ここで第二の抗体は第一の抗体に結合しており、
ｃ．標識を検出し、そして
ｄ．標識の検出を試料中のポリペプチドの量と相関させる
ことを含んでなる、試料中の配列番号１〜１４８からなる群から選択されるポリペプチドの検出方法。
【請求項１１】
請求項３または請求項６の第一の抗体、および第二の抗体が第一の抗体に結合している第二の抗体を含んでなり、試料中の配列番号１〜１４８からなる群から選択されるポリペプチドを検出するためのキット。
【請求項１２】
請求項１のポリペプチドまたはそれらの機能的に等価なフラグメント、誘導体、および変種の治療有効量を、製薬学的に許容できるキャリヤと組合わせて含んでなる製薬学的組成物。
【請求項１３】
ポリペプチドが配列番号１、２、３、４、５、１１２、１１３、１１４、１１５、および１１６からなる群から選択される、請求項１２の製薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項１のポリペプチド、またはそれらの機能的に等価なフラグメント、誘導体、および変種の治療有効量を、製薬学的に許容できるキャリヤおよび１種もしくはそれ以上の製薬学的有効物質と組合わせて含んでなる、製薬学的組成物。
【請求項１５】
製薬学的有効物質が、ＰＰＡＲリガンド、インスリン分泌促進物質、スルホニル尿素薬、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作物質、肝グルコース分泌低下性化合物、インスリンおよびインスリン誘導体、ビグアニド、タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、１１ベータ−ＨＳＤ阻害剤、抗肥満薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ニコチン酸、脂質低下薬、ＡＣＡＴ阻害剤、胆汁酸金属イオン封鎖剤、胆汁酸再取込み阻害剤、ミクロソームトリグリセリド輸送阻害剤、フィブリック酸誘導体、β−ブロッカー、ＡＣＥ阻害剤、カルシウムチャンネルブロッカー、利尿剤、レニン阻害剤、ＡＴ−１受容体拮抗剤、ＥＴ受容体拮抗剤、中性エンドペプチダーゼ阻害剤、血管ペプチダーゼ阻害剤、およびニトラートからなる群から選択される、請求項１４の製薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１のポリペプチド、またはそれらの機能的に等価なフラグメント、誘導体、および変種の有効量を、不活性キャリヤと組合わせて含んでなる、組成物。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、糖尿病の処置方法。
【請求項１８】
糖尿病が、ＩＩ型糖尿病、若年発症成人型糖尿病、潜伏性自己免疫性成人型糖尿病、および妊娠糖尿病からなる群から選択される、請求項１７の方法。
【請求項１９】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、症候群Ｘの処置方法。
【請求項２０】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、糖尿病関連障害の処置方法。
【請求項２１】
糖尿病関連障害が、高血糖症、高インスリン血症、耐糖能異常、空腹時血糖異常、異常脂質血症、高トリグリセリド血症、およびインスリン抵抗性からなる群から選択される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
請求項１のポリペプチドの治療有効量と一種もしくはそれ以上の製薬学的作用物質とを組合わせて、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、糖尿病の処置方法。
【請求項２３】
製薬学的作用物質が、ＰＰＡＲアゴニスト、スルホニル尿素薬、非スルホニル尿素分泌促進物質、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作物質、インスリン分泌促進物質、肝グルコース分泌低下性化合物、インスリン、および抗肥満作用物質からなる群から選択される、請求項２０の方法。
【請求項２４】
糖尿病が、ＩＩ型糖尿病、若年発症成人型糖尿病、潜伏性自己免疫性成人型糖尿病、および妊娠糖尿病からなる群から選択される、請求項２３の方法。
【請求項２５】
請求項１のポリペプチドの治療有効量と一種もしくはそれ以上の製薬学的作用物質とを組合わせて、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、症候群Ｘの処置方法。
【請求項２６】
製薬学的作用物質が、ＰＰＡＲアゴニスト、スルホニル尿素薬、非スルホニル尿素分泌促進物質、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作物質、インスリン分泌促進物質、肝グルコース分泌低下性化合物、インスリン、および抗肥満作用物質からなる群から選択される、請求項２５の方法。
【請求項２７】
請求項１のポリペプチドの治療有効量と一種もしくはそれ以上の製薬学的作用物質とを組合わせて、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、糖尿病関連障害の処置方法。
【請求項２８】
糖尿病関連障害が、高血糖症、高インスリン血症、耐糖能異常、空腹時血糖異常、異常脂質血症、高トリグリセリド血症、およびインスリン抵抗性からなる群から選択される、請求項２７の方法。
【請求項２９】
製薬学的作用物質が、ＰＰＡＲアゴニスト、スルホニル尿素薬、非スルホニル尿素分泌促進物質、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作物質、インスリン分泌促進物質、肝グルコース分泌低下性化合物、インスリン、および抗肥満作用物質からなる群から選択される、請求項２８の方法。
【請求項３０】
請求項１のポリペプチドの治療有効量と、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ニコチン酸、脂質低下薬、ＡＣＡＴ阻害剤、胆汁酸金属イオン封鎖剤、胆汁酸再取込み阻害剤、ミクロソームトリグリセリド輸送阻害剤。フィブリック酸誘導体、β−ブロッカー、ＡＣＥ阻害剤、カルシウムチャンネルブロッカー、利尿剤、レニン阻害剤、ＡＴ−１受容体拮抗剤、ＥＴ受容体拮抗剤、中性エンドペプチダーゼ阻害剤、血管ペプチダーゼ阻害剤、およびニトラートからなる群から選択される１種もしくはそれ以上の作用物質とを組合わせて、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、糖尿病、症候群Ｘ、または糖尿病関連障害の処置方法。
【請求項３１】
糖尿病関連障害が、高血糖症、高インスリン血症、耐糖能異常、空腹時血糖異常、異常脂質血症、高トリグリセリド血症、およびインスリン抵抗性からなる群から選択される、請求項３０の方法。
【請求項３２】
請求項１のポリペプチドおよび１種もしくはそれ以上の製薬学的作用物質が、単一の製薬学的投与配合物として投与される。請求項２２〜３１のいずれかの方法。
【請求項３３】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、糖尿病の併発病因の処置または防止方法。
【請求項３４】
併発病因が、糖質コルチコイド過剰、成長ホルモン過剰、クロム親和細胞腫、および薬剤誘発糖尿病からなる群から選択される、請求項３３の方法。
【請求項３５】
請求項１のポリペプチドの治療有効量と１種もしくはそれ以上の製薬学的作用物質とを組合わせて、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、糖尿病の併発病因の処置または防止方法。
【請求項３６】
製薬学的作用物質が、ＰＰＡＲアゴニスト、スルホニル尿素薬、非スルホニル尿素分泌促進物質、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作物質、インスリン分泌促進物質、肝グルコース分泌低下性化合物、インスリン、および抗肥満作用物質からなる群から選択される、請求項３５の方法。
【請求項３７】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、呼吸器疾患の処置方法。
【請求項３８】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、肥満の処置方法。
【請求項３９】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、心血管疾患の処置方法。
【請求項４０】
心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、冠動脈疾患、および高血圧から選択される、請求項３９の方法。
【請求項４１】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、脂質および炭水化物代謝の障害の処置方法。
【請求項４２】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、睡眠障害の処置方法。
【請求項４３】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、男性生殖障害の処置方法。
【請求項４４】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、生育障害またはエネルギー・ホメオスタシス障害の処置方法。
【請求項４５】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、免疫疾患の処置方法。
【請求項４６】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、自己免疫疾患の処置方法。
【請求項４７】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、急性および慢性の炎症性疾患の処置方法。
【請求項４８】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象者に投与する段階を含んでなる、敗血症性ショックの処置方法。
【請求項４９】
請求項１のポリペプチドまたは請求項１２の製薬学的組成物を対象者に投与することによる、それを必要とする対象者内でグルコース依存性の様式でインスリン放出を促進する方法。
【請求項５０】
糖尿病および糖尿病関連疾患の処置および／または予防のための請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
請求項１記載の少なくとも１種のポリペプチドを少なくとも１種の製薬学的に許容でき、製薬学的に安全なキャリヤまたは賦形剤と組合わせて含む医薬。
【請求項５２】
糖尿病および糖尿病関連疾患の処置および／または予防のための医薬を製造するための請求項１記載のポリペプチドの使用。
【請求項５３】
糖尿病の処置および／または予防のための請求項５１に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年１月２７日付け出願の米国仮特許出願番号６０／５３９，５５０号および２００４年４月２９日付け出願の米国仮特許出願番号６０／５６６，４９９号（それらの内容は引用することにより本明細書にすべて編入される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、新規に同定されたポリペプチドおよび治療目的のためのかかるポリペプチドの使用に関する。さらに具体的には、本発明のポリペプチドは、グルコース依存性の様式で膵臓β細胞からのインスリン放出の刺激に有用であり、それにより代謝障害、例えば糖尿病または糖尿病前症である耐糖能障害に悩む個体のための治療選択肢を提供する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病は、なかでも糖尿病患者内での上昇した血糖レベルにより現れる糖代謝異常を特徴とする。その基となる欠陥は、糖尿病の２種の主要な群への分類、すなわち、患者のランゲルハンス膵島内でインスリンを生成するβ細胞を患者が欠失する場合に起きるＩ型糖尿病、すなわちインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、およびβ細胞機能障害およびインスリン作用の改変を有する患者内で起きるＩＩ型糖尿病、すなわち非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に分類される。
【０００４】
Ｉ型糖尿病患者は、現在インスリンを用いて処置され、一方ＩＩ型糖尿病患者の大部分はβ細胞機能を刺激する薬剤を用いまたはインスリンに対する患者の組織感作性を増進する薬剤を用いて処置されている。時が経過するとＩＩ型糖尿病対象者のほとんど半分はそれらの薬剤への反応を失い、従ってインスリン治療を受けなければならない。ＩＩ型糖尿病を治療するために現在使用されている医薬を以下に記載する。
【０００５】
アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（例えばプレコース（Ｐｒｅｃｏｓｅ（Ｒ））（Ｂａｙｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ボグリボース（ＶｏｇｌｉｂｏｓｅＴＭ）（Ｔａｋｅｄａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）およびミグリトール（Ｍｉｇｌｉｔｏｌ（Ｒ））（Ｂａｙｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、消化管からのグルコースの吸収を遅延して摂取後のグルコースの移動を低下させる。これらの医薬は安全であり、そして軽度から中程度の症状の糖尿病対象者のための治療を提供する。しかし、胃腸への副作用が文献中に記載されている。
【０００６】
インスリン感作物質は、インスリンへの身体の反応を増強する医薬である。チオゾリジンジオン（ｔｈｉｏｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）、例えばアバンジア（Ａｖａｎｄｉａ（Ｒ））（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、ロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ））およびアクトス（ＡｃｔｏｓＴＭ）（Ｔａｋｅｄａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ））は、ペルオキシソーム増殖剤反応性受容体（ＰＰＡＲ）ガンマサブタイプを活性化しそして十分に記述はされていない一組の遺伝子の活性を調節する。その分類で最初のレズリン（ＲｅｚｕｌｉｎＴＭ）（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ））は、肝臓酵素レベルおよび薬剤誘発肝毒性の上昇のために取り下げられた。これらの肝臓作用は、アバンジア（Ｒ）およびアクトスＴＭを使用する患者では著しい問題とは考えられない。しかしながら、治療の最初の一年間は二ヵ月毎そしてその後は定期的に肝臓酵素検査が推奨されている。アバンジア（Ｒ）およびアクトスＴＭは、体液滞留および水腫と関連するように見える。別の可能性がある副作用は体重増加である。アバンジア（Ｒ）は鬱血性心不全との関連のためにインスリンとの併用は処方されない。
【０００７】
インスリン分泌促進物質（例えばスルホニル尿素（ＳＦＵ）およびＡＴＰ−依存性Ｋ＋
チャンネルにより作用するその他の薬剤）は、ＩＩ型糖尿病を治療するために現在使用されている別の薬剤である。ＳＦＵは軽度ないし中程度の空腹時血糖症を有するＩＩ型糖尿病のための標準的な治療である。ＳＦＵは低血糖、体重増加、および高い一次および二次効力低下率の可能性を含む限界を有する。新たに処置された患者の１０〜２０％が著しい処置効果の欠失を示す（一次効力低下）。二次効力低下は、ＳＦＵ使用の６カ月後の処置効果のさらに２０〜３０％の低下で示される。インスリン処置は、治療の５〜７年後でＳＦＵ反応者の５０％で要求される（非特許文献１）。
【０００８】
グルコファージ（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（Ｒ））（Ｌｉｐｈａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）ＨＣｌ）は、肝臓グルコース産生を低下しそして末梢グルコース取込みおよび利用を増加することにより血糖を低下するビグアニドである。この医薬は、軽度および中程度の罹患患者での血糖低下に有効であり、そして体重増加の副作用または低血糖誘発の可能性を有していない。しかし、グルコファージ（Ｒ）は胃腸障害および乳酸アシドーシスを含む多数の副作用を有する。グルコファージ（Ｒ）は７０歳以上および腎臓または肝臓機能に障害を有する患者での糖尿病には禁忌である。最後に、グルコファージ（Ｒ）はＳＦＵと同様の一次および二次効力低下率を有する。
【０００９】
インスリン処置は、食事療法、運動療法の後に開始され、そして経口薬物治療では血糖を適切に調節できなかった。この処置は注入用という欠点を有し、注入は低血糖を招くことがあり、そしてそれは体重増加を起こす。
【００１０】
現在の処置に関連する問題のために、ＩＩ型糖尿病を処置する新しい治療が要求されている。具体的には、正常（グルコース依存性）インスリン分泌を維持する新規の処置が要求されている。かかる新薬は下記の特性を持たなければならない：インスリン分泌を促進するためのグルコース依存性（すなわち上昇した血糖が存在する時にのみインスリン分泌を行う）；低い一次および二次効力低下率；および膵島細胞機能の維持。本明細書中で開示する新規治療を開発するための戦略は、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）シグナル伝達機構およびインスリン分泌へのその効果に基づいている。
【００１１】
サイクリックＡＭＰは、インスリン分泌プロセスの主要な調節因子である。このシグナル分子の上昇は、タンパク質キナーゼＡ経路の活性化に続くＫ＋チャンネルの閉止を促進する。Ｋ＋チャンネルの閉止は細胞脱分極および引き続くＣａ＋＋チャンネルの開放を起こし、それは一方ではインスリン顆粒のエクサイトーシスに導く。インスリン分泌への作用は、もし存在したとしても、低いグルコース濃度がない場合にはほとんど起きない（非特許文献２）。分泌促進物質、例えばＰＡＣＡＰ（下垂体細胞アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド）、ＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド）、およびＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド１）は、グルコース依存性の様式でインスリン分泌を調節するためにｃＡＭＰシステムを使用する（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。ｃＡＭＰの上昇を介して作動するインスリン分泌促進物質、例えばＧＬＰ−１、ＶＩＰおよびＰＡＣＡＰは、インスリン放出に加えてインスリン合成を促進することもできる（非特許文献６、非特許文献７）。
【００１２】
ＧＬＰ−１は、食事後に腸管Ｌ細胞から放出されそしてインクレチンホルモンとして作用する（すなわち、それは膵臓β細胞からのグルコース誘導インスリン放出を強化する）。それは組織タイプに依存して、グルカゴン遺伝子により種々に発現される３７アミノ酸ペプチドである。β細胞中でｃＡＭＰレベルを上昇する有益な効果を支持する臨床データが、ＧＬＰ−１に関して集められている。コントロールが不良なＩＩ型糖尿病におけるＧＬＰ−１の輸液は、それらの空腹時血液グルコースレベルを正常化し（非特許文献８）、そしてより長期の輸液はβ細胞機能を正常な対象者のものに改善する（非特許文献９）、最近の報告は、ＧＬＰ−１が、耐糖能障害を有する対象者中のグルコースへ反応するβ細胞の能力を改善することを示した（非特許文献１０）。しかし、それらのすべての効果は、該ペプチドの短い半減期のために短命である。
【００１３】
Ａｍｙｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、Ｇｉｌａ  Ｍｏｎｓｔｅｒにより最初に同定された３９アミノ酸ペプチドであるエクセンディン−４（Ｅｘｅｎｄｉｎ−４）（ＡＣ２９９３）を用いて臨床試験を行った。Ａｍｙｌｉｎは、臨床試験が、エクセンディン−４を用いて処置されたＩＩ型糖尿病患者において改善された血糖コントロールを示したと報告している。しかし、悪心および吐き気の症候は有意であった。
【００１４】
ＰＡＣＡＰは、膵臓β細胞からのグルコース依存性インスリン分泌の強力な刺激因子である。３種の異なるＰＡＣＡＰ受容体タイプ（ＰＡＣ１、ＶＰＡＣ１、およびＶＰＡＣ２）が記載されている（非特許文献１１、非特許文献１２）。ＰＡＣＡＰは受容体選択性を示さず、３種すべてに同様の活性および効力を有する。ＰＡＣ１は、ＣＮＳ中に主として位置し、一方ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２はそれより広範に分布する。ＶＰＡＣ１は、ＣＮＳならびに肝臓、肺臓、および腸管内に位置する。ＶＰＡＣ２は、ＣＮＳ、膵臓、骨格筋、心臓、腎臓、脂肪組織、精巣、および胃内に位置する。最近の報告は、ＶＰＡＣ２がβ細胞からのインスリン分泌に責任があると主張している（非特許文献１３、非特許文献１４）。ＰＡＣＡＰのこのインスリン指向性作用は、ＧＴＰ結合性タンパク質Ｇにより媒介される。一方、細胞内ｃＡＭＰの蓄積は、β細胞内の非選択性陽イオンチャンネルを活性化して〔Ｃａ＋＋〕を増加し、そしてインスリン含有分泌顆粒のエクサイトーシスを促進する。
【００１５】
ＰＡＣＡＰは、ｃＡＭＰ媒介シグナル伝達経路を介してそれらの作用を行う代謝性、神経内分泌性、そして神経伝達性ペプチドホルモンのスーパーファミリーの最新の一員である（非特許文献１５）。この生物学的活性ペプチドは、アミド化カルボキシル末端を有する３８アミノ酸ペプチド（ＰＡＣＡＰ−３８）および／または２７アミノ酸ペプチド（ＰＡＣＡＰ−２７）のいずれかの２種の分子形態で生合成前駆体から放出される（上記の非特許文献１５）。
【００１６】
ペプチドの２種の形態の最高濃度は脳および精巣内に見いだされている（上記の非特許文献１５）。ペプチドの短い方の形態、ＰＡＣＡＰ−２７は、血管作用性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）と６８％に構造一致を示す。しかし、中枢神経系内のＰＡＣＡＰおよびＶＩＰの分布は、それらの構造的に関連するペプチドが異なる神経伝達機能を有することを示唆する（非特許文献１６）。
【００１７】
最近の研究は、生殖における役割（非特許文献１７）からインスリン分泌刺激の能力（非特許文献１８）までのＰＡＣＡＰ−３８の種々の生物学的効果を示している。さらにＰＡＣＡＰは、脂質および炭水化物代謝のホルモン性調節（非特許文献１９）、概日機能（非特許文献２０）、および免疫系、成長、エネルギーホメオスタシス、および男性生殖機能（非特許文献２１）、食欲調節（非特許文献２２）、ならびに急性および慢性炎症性疾患、敗血症ショック、および自己免疫疾患（例えば全身性エリトマトーデス）（非特許文献２３）に関係すると考えられる。
【００１８】
血管作用性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）は、最初にブタの上部小腸から単離された２８アミノ酸ペプチドである（非特許文献２４、特許文献１）。このペプチドは、ヘロデルミ
ン（ｈｅｌｏｄｅｒｍｉｎ）、セクレチン（ｓｅｃｒｅｔｉｎ）、ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）、およびグルカゴンを含む構造的に関連した小型ポリペプチドのファミリーに属する。ＶＩＰの生物学的効果は、細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達系に結合した膜結合受容体タンパク質の活性化により媒介される。それらの受容体は、最初はＶＩＰ−Ｒ１およびＶＩＰ−Ｒ２として知られていたが、しかし、それらはＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２と同じ受容体であることがその後判明した。ＶＩＰは、ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２と同様の活性および効力を示す。
【００１９】
ヒトの肺液内でのＶＩＰの安定性を改善するために、ボリンら（非特許文献２５）は、このペプチドのらせん傾向を増加しそしてタンパク質分解性劣化を低下させるように設計された一連のＶＩＰ変種を作製した。置換は、受容体結合には重要でないと考えられた位置８、１２、１７、および２５〜２８に集中した。さらに、らせんをさらに効果的に覆うことを望んで“ＧＧＴ”配列をＶＩＰ変異体のＣ末端上にタグした。最後に、らせんをさらに安定化するために、数種の環状変種を合成した（特許文献２）。これらの効果は受容体選択性に直接には関係しなかったけれども、それらは、より高いＶＰＡＣ２選択性を有する２種の類似体を生成した（非特許文献２６、非特許文献２７）。
【特許文献１】米国特許第３，８７９，３７１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６７７，４１９号明細書
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．６：５３３−５４３，１９８９
【非特許文献２】Ｗｅｉｎｈａｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４７：１４２６−１４３５，１９９８
【非特許文献３】Ｋｏｍａｔｓｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６：１９２８−１９３８，１９９７
【非特許文献４】Ｆｉｌｉｐｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：１９５９−１９６９，２００１
【非特許文献５】Ｄｒｕｃｋｅｒ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２：５２１−５２７，２００１
【非特許文献６】Ｓｔｏｇｌｕｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：１１５６−１１６４，２０００
【非特許文献７】Ｂｏｒｂｏｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：５５３０−５５３７，１９９９
【非特許文献８】Ｇｕｔｎｉａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：１３１６−１３２２，１９９２
【非特許文献９】Ｒａｃｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５：１５２４−１５３０，１９９６
【非特許文献１０】Ｂｙｒｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４７：１２５９−１２６５，１９９８
【非特許文献１１】Ｈａｒｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５０：２６５−２７０，１９９８
【非特許文献１２】Ｖａｕｄｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５２：２６９−３２４，２０００
【非特許文献１３】Ｉｎａｇａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２６７９−２６８３，１９９４
【非特許文献１４】Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１：１４５３−１４６０，２００２
【非特許文献１５】Ａｒｉｍｕｒａ，Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ３７：２８７−３０３，１９９２
【非特許文献１６】Ｋｏｖｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ５４：１５９−１６９，１９９１
【非特許文献１７】ＭｃＡｒｄｌｅ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５：８１５−８１７，１９９４
【非特許文献１８】Ｙａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２９０−１２９３，１９９４
【非特許文献１９】Ｇｒａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５：１７３９−４７，２００１
【非特許文献２０】Ｈａｒｍａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０９：４９７−５０８，２００２
【非特許文献２１】Ａｓｎｉｃａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４３：３９９４−４００６，２００２
【非特許文献２２】Ｔａｃｈｉｂａｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３３９：２０３−２０６，２００３
【非特許文献２３】Ｐｏｚｏ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：２１１−２１７，２００３
【非特許文献２４】Ｓａｉｄ  ａｎｄ  Ｍｕｔｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６９：１２１７−１２１８，１９７０
【非特許文献２５】Ｂｏｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３７：５７−６６，１９９５
【非特許文献２６】Ｇｏｕｌｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １８：４０３−４０８，１９９７
【非特許文献２７】Ｘｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８１：６２９−６３３，１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ＰＡＣＡＰ、ＧＬＰ−１、またはエクセンディン−４のグルコース依存性インスリン分泌促進活性を有するが副作用が少なく、そして好ましくは配合物内で安定でありそして生体内で長い血漿半減期を有する改善されたペプチドへの要求がある。かかる改善された生体内半減期は、クリアランス低下およびタンパク質分解に対する感受性低下の双方を有するペプチドからもたらされる。さらに、血漿グルコースレベルのより狭い制御は、長期の糖尿病性合併症を防止するであろう。従って、新規の糖尿病医薬は、患者の生活の改善された質をもたらすであろう。
【００２１】
発明の要旨
本発明は、生体内でＶＰＡＣ２受容体（以後ＶＰＡＣ２）のアゴニストとして機能しそしてＶＰＡＣ２アゴニスト活性を有する作用物質により改善されることができる疾患および状態の処置に有効である新規のポリペプチドを提供する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＶＰＡＣ１およびＰＡＣ１よりもＶＰＡＣ２に対して高い効力を有する選択的ＶＰＡＣ２アゴニストである。例えば、限定ではないが、それらのポリペプチドは、グルコース依存性の様式でインスリン合成および膵臓β細胞からの放出を刺激しそして引き続いて血漿グルコース低下となる。それらの分泌促進性ポリペプチドは、グルコースチャレンジの際のビヒクル制御より多く血漿内の血糖を低下することが示されている。さらに、本発明のポリペプチドは、配合物内で安定でありそして長い血漿半減期および誘導体化された場合に生体内の長い作用期間を有する。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、ＰＡＣＡＰまたはＶＩＰと比較して、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）によるタンパク質分解に対しておよび血漿内で改善された安定性を有する。ＶＩＰおよびＰＡＣＡＰ２７の両者がＤＰＰ４による切断に抵抗性であると報告されているが（Ｚｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２２４１８−２２４２３，２００３）、図２ａは、それらのペプチドはより後の時点で切断され、一方、本発明のペプチドは試験した時点では切断に抵抗性であることが示された。本発明の誘導体は、生体内で長期間の作用が示され、誘導体化された場合に一日一回以下、一週間に一回またはそれより長期の投与間隔を支援する。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、例えば、代謝障害、例えば低下した内因性インスリン分泌からもたらされる障害、例えばＩＩ型糖尿病を有する患者、または耐糖能障害、すなわちインスリン分泌に軽度の改変を有する前糖尿病状態を有する患者に対する治療を提供する。さらに、本発明のポリペプチドは、妊娠糖尿病、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、潜伏性自己免疫性成人型糖尿病（ＬＡＤＡ）、および関連する糖尿病異常脂質血症およびその他の糖尿病合併症、ならびに高血糖症、高インスリン血症、耐糖能障害、空腹時血糖異常、異常脂質血症、高トリグリセリド血症、症候群Ｘ、およびインスリン抵抗性の予防および／または処置に有用であり得る。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、肥満（例えば食欲および摂食の調節）、アテローム性動脈硬化疾患、高脂血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬレベル、高血圧、心血管疾患（アテローム性動脈硬化、冠性心疾患、冠動脈疾患、および高血圧を含む）、脳血管疾患および末梢血管疾患の予防および／または処置において；および狼瘡、多嚢胞性卵巣症候群、発癌、および過形成、喘息、男性生殖異常、潰瘍、睡眠障害、脂質および炭水化物代謝異常、概日不全、成長障害、エネルギーホメオスタシス異常、自己免疫疾患を含む免疫疾患（例えば全身エリトマトーデス）、ならびに急性および慢性炎症性疾患、敗血症ショック、および本明細書中に指定するその他の病状、または本明細書中に以下に記載するその他の機能の予防および／または処置のためにも有用であり得る。
【００２５】
本発明の一つの局面は、配列番号１〜１４８からなる群から選択されるポリペプチド、および表示した配列番号のポリペプチドと本質的に同様の少なくとも１種の生物学的機能を示すそれらのフラグメント、誘導体、および変種であり（集合的に、「本発明のポリペプチド」）、それらの機能的等価物も含む。本発明の他の態様では、配列番号１〜３７および配列番号１１２〜１４８からなる群から選択されるポリペプチドおよび表示した配列番号のポリペプチドおよび表示した配列番号のポリペプチドと本質的に同様の少なくとも１種の生物学的機能を示すそれらのフラグメント、誘導体、および変種である。本発明の別の態様は、配列番号１〜５および配列番号１１２〜１１５からなる群から選択されるポリペプチドおよび表示した配列番号のポリペプチドと本質的に同様の少なくとも１種の生物学的機能を示すそれらのフラグメント、誘導体、および変種である。本発明のさらなる態様は、配列番号１および１１２および表示した配列番号のポリペプチドと本質的に同様の少なくとも１種の生物学的機能を示すそのフラグメント、誘導体、および変種から成る群から選択されるポリペプチドである。
【００２６】
本発明のポリペプチドを選択的に結合する抗体および抗体フラグメントも提供される。かかる抗体は、本発明のポリペプチドを検出するために有用であり、そして当該技術分野では周知の手順により同定および作製できる。ポリクローナルＮ末端ＩｇＧ抗体およびモノクローナルＣ末端Ｆａｂ抗体が、本発明のポリペプチドを認識するとして作製あれている。
【００２７】
本発明は、本発明のいずれかのポリペプチドまたはＶＰＡＣ２に対して活性のいずれかのポリペプチド、例えば配列番号１〜１４８の治療有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる、糖尿病、糖尿病関連障害および／または本発明のポリペプチドにより作用される他の疾患および状態、例えば哺乳動物内で本発明のポリペプチドのＶＰＡＣ２アゴニスト機能により作用されるものを処置する方法にも関する。本発明のポリペプチドを作製する方法も開示される。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、新規のポリペプチド、および実質的に図１ａ〜１ｄ中のポリペプチドと同様の少なくとも１種の生物学的機能を示すそれらのフラグメント、誘導体、および変種（集合的に、本発明のポリペプチド）を提供する。生体内でＶＰＡＣ２アゴニストとして機能する本発明のポリペプチドは、ＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）（Ｈｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４３：４０，１９９４）、潜伏性自己免疫性成人型糖尿病（ＬＡＤＡ）（Ｚｉｍｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｄ．１１：２９９，１９９４）を含む糖尿病、および関連する糖尿病異常脂質血症およびその他の糖尿病合併症、ならびに高血糖症、高インスリン血症、耐糖能障害、空腹時血糖異常、異常脂質血症、高トリグリセリド血症、症候群Ｘ、およびインスリン抵抗性などの疾患または状態の予防および／または処置に使用できる。
【００２９】
さらに本発明のポリペプチドは、肥満（例えば食欲および摂食の調節）、アテローム性動脈硬化疾患、高脂血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬレベル、高血圧、心血管疾患（アテローム性動脈硬化、冠性心疾患、冠動脈疾患、および高血圧を含む）、脳血管疾患および末梢血管疾患の予防および／または処置のため；および狼瘡、多嚢胞性卵巣症候群、発癌、過形成、喘息、ヒト精子運動性を含む男性生殖異常、潰瘍、睡眠障害、および本明細書中に指定するその他の病状、または本明細書中に以下に記載するその他の機能の予防および／または処置のためにも有用であり得る。
【００３０】
さらに、本発明のポリペプチドは、グルコース依存性の様式で膵臓β細胞からのインスリン放出を促進する。本発明のポリペプチドは、水性および非水性配合物の双方の中でも安定でありそして１時間以上の血漿中半減期を示し、例えば６時間より長い血漿半減期を示す。
【００３１】
本発明のポリペプチドはＶＰＡＣ２アゴニストである。それらは、例えばＶＰＡＣ１および／またはＰＡＣ１よりもＶＰＡＣ２に対して少なくとも１０倍の選択性を有する選択性ＶＰＡＣ２アゴニストである。本発明のポリペプチドは、例えばＩＩ型糖尿病の処置に逆効果である血漿グルコースのレベルの維持または上昇を含むことなく、グルコース依存性の様式で血漿内へのインスリン放出を促進する。さらに、本発明のポリペプチドは、ＶＰＡＣ２受容体の選択性アゴニストであり、それにより、例えば、血漿中へのインスリンの放出増加を起こし、一方では、不快で危険な副作用、例えば消化管内水滞留、および／または望ましくない心血管効果、例えば心拍数または血圧の上昇に関連する他の受容体に対して選択的である。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、水性および非水性配合物中でも安定である。例えば、本発明のポリペプチドは、水（ｐＨ７〜８）または非水性有機溶剤中に溶解された場合に、３７〜４０℃で一週間の期間で１０％未満の分解を示す。さらに、本発明の組成物および配合物は、本発明のポリペプチド、および１種もしくはそれ以上の製薬学的に許容できるキャリヤ、製薬学的に許容できる希釈剤、および製薬学的に許容できる溶剤を含んでなってもよい。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、低い内因性インスリン分泌または耐糖能障害、例えばＩＩ型糖尿病を有する患者に対する治療を提供する。すなわち、本発明のポリペプチドはグルコース刺激性インスリン分泌を維持、改善、および回復するために使用してもよい長期作用型ＶＰＡＣ２アゴニストである。さらに、ＶＰＡＣ２受容体の選択性ペプチドアゴニストは、他のＰＡＣＡＰ受容体の非選択性活性化と関連する副作用を起こすことなく、膵臓内のグルコース依存性インスリン分泌を促進する。
【００３４】
本明細書中を通じて使用されるいくつかの用語をここで定義し、その他は使用の都度定
義する。特定のアミノ酸の一文字略号、その相当するアミノ酸、および三文字略号は下記である：Ａ、アラニン（ａｌａ）；Ｃ、システイン（ｃｙｓ）；Ｄ、アスパラギン酸（ａｓｐ）；Ｅ、グルタミン酸（ｇｌｕ）；Ｆ、フェニルアラニン（ｐｈｅ）；Ｇ、グリシン（ｇｌｙ）；Ｈ、ヒスチジン（ｈｉｓ）；Ｉ、イソロイシン（ｉｌｅ）；Ｋ、リシン（ｌｙｓ）；Ｌ、ロイシン（ｌｅｕ）；Ｍ、メチオニン（ｍｅｔ）；Ｎ，アスパラギン（ａｓｎ）；Ｐ、プロリン（ｐｒｏ）；Ｑ、グルタミン（ｇｌｎ）；Ｒ、アルギニン（ａｒｇ）；Ｓ、セリン（ｓｅｒ）；Ｔ、トレオニン（ｔｈｒ）；Ｖ、バリン（ｖａｌ）；Ｗ、トリプトファン（ｔｒｐ）；およびＹ、チロシン（ｔｙｒ）。
【００３５】
「機能的に等価」または「本質的に同様の生物学的機能または活性」は、それぞれのポリペプチドの生物学的活性が同じ手順で決定された場合に、比較しているポリペプチドにより示される生物学的活性の約３０％以内〜約１００％またはそれ以上の生物学的活性の程度をそれぞれ意味する。例えば、図１のポリペプチドと機能的に等価であるポリペプチドは、実施例９のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）シンチレーションプロキシミティーアッセイにより試験された場合に、ヒトＶＰＡＣ２受容体を発現するＣＨＯ細胞系統内のｃＡＭＰの蓄積を示すものである。
【００３６】
「フラグメント」、「誘導体」および「変種」の用語は、図１のポリペプチドに関する場合には、以下にさらに記載するポリペプチドと本質的に同様の生物学的機能または活性を保持する該ポリペプチドのフラグメント、誘導体、および変種を意味する。
【００３７】
類似体とは、その中に本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を含むプロ−ポリペプチドを含む。本発明の活性ポリペプチドは、本来、生体内プロセス、または当該技術分野では周知の手順、例えば酵素または化学的切断により、プロ−ポリペプチド分子を構成する別のアミノ酸から切断できる。例えば、２８アミノ酸の本来のペプチドＶＩＰは、２８アミノ酸活性成熟ペプチドを放出するように生体内でプロセッシングされるさらに大きいポリペプチドとして元々は発現される。
【００３８】
フラグメントは、本明細書中に開示の生体内モデルに記載のように、本質的に同様の機能活性を保持するポリペプチドの一部分である。
【００３９】
誘導体は、本明細書中に開示される機能を本質的に保持しそして追加の構造および付随的機能（例えば、さらに長い半減期を有するＰＥＧ付加またはアセチル化ポリペプチド）を含むポリペプチド、長い半減期、標的特異性または意図する標的への低い毒性を与えるような追加の活性を与える融合ポリペプチドへのすべての改変物を含み、それらは以下にさらに記載する。
【００４０】
本発明のポリペプチドのフラグメント、誘導体、または変種は、（ｉ）１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基が保存的もしくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されそしてかかる置換アミノ酸残基が遺伝子コードによりコードされるものであってもなくてもよいもの、または（ｉｉ）１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）Ｎ末端アセチル基が最初の３個のアミノ酸の１個もしくはそれ以上において他の置換基で置換されているか、もしくは１個もしくはそれ以上の最初の３個のアミノ酸が保存的もしくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されそしてかかる置換されたアミノ酸酵素がタンパク質分解に対する耐性を与えるために遺伝子コードによりコードされるものであってもそうでなくてもよいもの、または（ｉｖ）成熟ポリペプチドが他の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加する化合物（例えばポリエチレングリコールまたは脂肪酸）と融合しているもの、または（ｖ）追加のアミノ酸が成熟ポリペプチド、例えばリーダーもしくは分泌配列もしくは成熟ポリペプチドもしくはポリペプチド配列の精製に使用される配列と融合されているもの
、または（ｖｉ）ポリペプチド配列がより大きなポリペプチド（例えば、ヒトアルブミン、抗体またはＦｃ、効果の持続期間を延長するため）と融合しているもの、であってもよい。かかるフラグメント、誘導体、および変種および類似体は、本明細書中の教示から、当該技術分野の専門家の範囲内にあると考えられる。
【００４１】
本発明の誘導体は、１個もしくはそれ以上の予測され、好ましくは非必須のアミノ酸残基になされる一定の保存的アミノ酸置換（以下に定義する）を含んでもよい。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を改変することなくタンパク質の野生型配列から改変できる残基であり、一方「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性のために必要である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似のアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。類似のアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。それらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。非保存性置換は、保存されるアミノ酸残基に対してまたは保存されるタンパク質ドメイン内に存在するアミノ酸残基、例えばかかる残基がＶＰＡＣ２活性および／またはＶＰＡＣ２選択性などに対して必須である残基１９および２７に対してなされてはならない。フラグメント、または生物学的活性部分は、医薬として、抗体産生のため、研究用試薬としてなどとしての使用に適するポリペプチドフラグメントを含む。フラグメントは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に十分に類似またはそれから誘導され、そして該ポリペプチドの少なくとも１種の活性を示すが、しかし本明細書中に開示される全長ポリペプチドよりは少ないアミノ酸を含むアミノ酸配列を含んでなるペプチドを含む。典型的には、生物学的活性部分は、ポリペプチドの少なくとも１種の活性を有するドメインまたはモチーフを含んでなる。ポリペプチドの生物学的活性部分は、例えば５個またはそれより多いアミノ酸長さであるペプチドであることができる。かかる生物学的活性部分は、合成的にまたは組換え技術により作製でき、そして本明細書中に開示または当該技術分野では公知の手段により本発明のポリペプチドの機能活性の１種もしくはそれ以上について評価できる。
【００４２】
本発明のポリペプチドの変種は、図１（ａ−ｄ）の配列番号のアミノ酸配列またはそのドメインに十分に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「十分に類似」の用語は、第一および第二アミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するように、第二のアミノ酸配列に関して一致または等価なアミノ酸残基の十分または最小数を含む第一アミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約４５％、約７５％〜約９８％、または一致する共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書中では十分に類似として定義される。例えば、変種は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に十分に類似であってもよい。
【００４３】
変種は、突然変異発生によりアミノ酸配列が相違するポリペプチドを含む。ＶＰＡＣ２アゴニストとして機能する変種は、ＶＰＡＣ２アゴニスト活性について、本発明のポリペプチドの変異体、例えば末端切断変異体、の組合わせライブラリーをスクリーニングして同定できる。
【００４４】
さらに、本発明の誘導体は、他の化合物、例えばポリペプチドの半減期を延長でき、および／またはポリペプチドの潜在的な免疫原性を低下できる化合物（例えばポリエチレングリコール、「ＰＥＧ」または脂肪酸）に融合された成熟ポリペプチドを含む。ＰＥＧ付加の場合に、ＰＥＧへのポリペプチドの融合は、当該技術分野の熟練者には公知のいずれ
かの手段により達成されてもよい。例えば、ＰＥＧ付加は、最初に、ＰＥＧが付着するリンカーを得るためにポリペプチド内にシステイン変異を導入し、次いでＰＥＧ−マレイミドを用いて部位指定誘導体化を行って達成されてもよい。例としては、システインをペプチドのＣ末端に付加してもよい（例えば、Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（１５）：８５４８−５３，２０００、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２：４０５−４１７，２００１、Ｇｏｏｄｓｏｏｎ  ＆  Ｋｒａｔｅ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３４３−３４６，１９９０参照）。マレイミドに加えて、多数のＣｙｓ反応性基がタンパク質架橋の該当技術分野の専門家には公知であり、例えばハロゲン化アルキルおよびビニルスルホンの使用である（例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第二版、１９９３参照）。さらに、ＰＥＧは、Ｃ末端カルボン酸基に対して、Ｃ末端の側鎖に対して、内部アミノ酸、例えばＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕに対して、または類似の反応性側鎖部分を含む非本来性アミノ酸に、直接付加により導入してもよい。
【００４５】
ＰＥＧとペプチド架橋基との間のリンカーは変更してもよい。例えば、市場で入手できるＣｙｓ反応性４０ｋＤａ  ＰＥＧ（ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ；Ｎｅｋｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）は、Ｃｙｓへの結合のためにマレイミド基を使用し、そしてマレイミド基はＬｙｓを含むリンカーを介してＰＥＧに付加する。第二の例として、市場で入手できるＣｙｓ反応性４３ｋＤａ  ＰＥＧ（ＧＬ２−４００ＭＡ、ＮＯＦ、東京、日本）は、Ｃｙｓへの結合のためにマレイミド基を使用し、そしてマレイミド基は二置換アルカンリンカーを介してＰＥＧに付加する。
【００４６】
本発明は、架橋部位としてＣｙｓの使用を例示するが、しかしこれに限定はされない。アミノ酸内に存在する他の部分、例えばＮ末端アミノ基、Ｃ末端カルボン酸基、およびアミノ酸の側鎖、例えばＬｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕは、共有結合修飾およびＰＥＧへの付加に適する部分を提供する反応性基を提供することは周知である。適合する架橋剤の多数の例は、当該技術分野の専門家には公知である（例えばＴ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第二版、１９９３参照）。かかる架橋剤は、例示のように、これらに限定はされないが、例えばＮｅｋｔｅｒおよびＮＯＦにより市販されているアミン、アルデヒド、アセタール、マレイミド、スクシンイミド、およびチオールを含む市場で入手できるＰＥＧ誘導体によりＰＥＧに連結されてもよい（例えばＨａｒｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍｏｋｉｎｅｔ．４０：５３９−５５１，２００１参照）。
【００４７】
本発明は、キメラまたは融合ポリペプチドも提供する。本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または変更ペプチド結合により相互に結合したアミノ酸から成ることができ（例えばペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒ））、そして２０種の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドは、天然のプロセス、例えば翻訳後プロセシングにより、または当該技術分野では周知の化学修飾技術のいずれかにより修飾されてもよい。かかる修飾は、基本的な教科書中およびさらに詳細な論文、ならびに研究報告中に詳細に説明されている。修飾はポリペプチド中のどこでなされてもよく、それにはペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端も含まれる。同じ形式の修飾が、与えられたポリペプチド内のいくつかの部位で同一または変化した程度で存在してもよい。また、与えられたポリペプチドは、多数の形式の修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分枝してもよく、そしてそれらは分枝を有するかまたは有しない環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスからもたらされてもよくまたは合成法により作製されてもよい。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタマートの形成、
製剤、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ付加（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、転移ＲＮＡ媒介のアミノ酸のタンパク質への付加、例えばアルギニン化、およびユビキチン化を含む（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第二版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１〜１２ページ（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６，１９９０；Ｒａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３；４８−６２，１９９２参照）。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、図１ａ−ｄのポリペプチド（配列番号１〜１４８）ならびにそれらからの配列中に非本質的な変更を有する配列を含む。「非本質的変更」とは、本発明のポリペプチドの本質的に少なくとも１種の生物学的機能、例えば本明細書中に記載のＶＰＡＣ２アゴニスト活性、選択的ＶＰＡＣ２アゴニスト活性、またはインスリン分泌活性を本質的に維持するいずれかの配列付加、置換、または欠損変種を含む。それらの機能的等価物は、図１ａ−ｄのポリペプチドに対して少なくとも約９０％一致、少なくとも約９５％一致、または少なくとも約９７％一致を有するポリペプチドを含んでもよく、そして本質的に同一の生物学的活性を有するかかるポリペプチドの部分も含む。しかし、本明細書中にさらに記載する機能的等価性を示す図１ａ−ｄのポリペプチドからのアミノ酸配列中に非本質的な変更を有するいずれのポリペプチドも本発明の記載中に含まれる。
【００４９】
当該技術分野では公知のように、２個のポリペプチド間の「類似性」は、アミノ酸配列および一つのポリペプチドの保存性アミノ酸置換を第二のポリペプチド配列に対して比較して決定される。かかる保存性置換は、上記およびデイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｔｈｅ
Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
５，１９７８）およびアルゴス（Ａｒｇｏｓ，ＡＭＢＯ  Ｊ．８：７７９−７８５，１９８９）に記載されたものを含む。例えば、下記のグループの一つに属するアミノ酸は保存的変化を示す。
−ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
−ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；
−ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；
−ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；
−ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ；および
−ａｓｐ、ｇｌｕ
【００５０】
本発明のポリペプチドは、化学合成方法の産物であってもよく、そのために、本発明の単離もしくは精製されたポリペプチド、またはその生物学的活性部分は、化学的に合成された場合に化学的前駆体もしくはその他の化学製品を本質的に含まないであろう。例えば、本発明の単離されたポリペプチドは、非−ポリペプチド、すなわち汚染性物質約３０％未満（乾燥重量により）を含むであろう。本発明のペプチドが化学合成により調製された場合に、調製物は化学的前駆体または本発明以外の化学製品を乾燥重量で約３０％未満含むであろう。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、下記の特定する実施例に記載のように単離されると好都合である。例えば、精製ポリペプチドの調製物は、少なくとも約７０％純度、または約８５％〜約９９％の純度である。調製物の純度は、当該技術分野で公知のいずれかの技術、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動法および質量分光分析／液体クロマトグラ
フィー法により評価できる。
【００５２】
当該技術分野内の技術者の理解内にある関連ペプチドおよび化合物（例えば小型化合物）、例えば化学的擬似体、有機擬似体、またはペプチド擬似体も提供される。本明細書中に使用する場合に「擬似体」、「ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）」、「ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」、「有機擬似体」および「化学的擬似体」の用語は、本発明のペプチドのものと等価な三次元配置にある原子の配列を有するペプチド誘導体、ペプチド類似体、および化学化合物を包含すると意図する。本明細書中に使用される「に等価」の語句は、本発明のペプチドの生物学的機能を有するように該ペプチド内の一定の原子もしくは化学部分の置換（１個若しくは複数個）を有し、該原子および部分の同様もしくは十分に類似する配列もしくは配向を生成する擬似化合物中の結合長さ、結合角、および配列を有する、ペプチドまたは化合物を包含すると意図すると理解される。本発明のペプチド擬似体において、化学構成の三次元配列は、ペプチド内のペプチド骨格の三次元配列および成分アミノ酸側鎖に構造的および／または機能的に等価な本質的に生物学的活性を有する本発明のペプチドのペプチド−、有機−、および化学的擬似体をもたらす。それらの用語は、当該技術分野内での理解に従って使用され、例えばフオーシャー（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９，１９８６）、ヴェバーとフライディンガー（Ｖｅｂｅｒ  ＆  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ，３９２ページ、１９８５）およびエヴァンズら（Ｅｖａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９，１９８７）により説明されている（それらは引用することにより本明細書に編入される）。
【００５３】
本発明のそれぞれのペプチドの生物学的活性にファーマコフォア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）が存在することは理解されている。ファーマコフォアは、当該技術分野において、生物学的活性に対する構造的要求の理想化された三次元定義を含んでなると理解されている。ペプチド−、有機−および化学的擬似体は、現在の計算機モデル化ソフトウエアを用いてそれぞれのファーマコフォアに適合するように設計されてもよい（計算機支援医薬設計）。該擬似体は、本発明のペプチド内の置換原子からの位置情報に基づいて、構造関数解析により生成されてもよい。
【００５４】
本発明により提供されるペプチドは、当該技術分野では公知のいずれかの化学合成技術、特には固相合成技術、例えば市場で入手できる自動化ペプチド合成装置を用いて合成されると有利である。本発明の擬似体は、慣用的にペプチドの合成に使用されている固相または溶液相法により合成されてもよい（例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４，１９６３；Ｃａｒｐｉｎｏ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．６：１９１−９８，１９７３；Ｂｉｒｒ，Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９７８；Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，２，３，および５巻，（Ｇｒｏｓｓ  ＆  Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ編集），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第二版，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ，１９８４；Ｋｅｎｔ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：９５７−８９，１９８８；およびＧｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．５５：１６１−２１４，１９９０（それらは引用することにより本明細書にその全体が編入される）参照）。
【００５５】
例えば、固相法を使用してもよい。要約すると、Ｎ−保護−Ｃ末端アミノ酸残基を不溶性支持体、例えばジビニルベンゼン架橋ポリスチレン、ポリアクリルアミド樹脂、けいそう土／ポリアミド（ｐｅｐｓｙｎ  Ｋ）、細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒ
ｅ  ｇｌａｓｓ）、セルロース、ポリプロピレン膜、アクリル酸被覆ポリエチレンロッド、などに連結する。順次保護アミノ酸誘導体の脱保護、中和、およびカップリングのサイクルが、アミノ酸配列に従うＣ末端からアミノ酸を連結するために使用される。いくつかの合成ペプチドに対して、酸感受性樹脂を用いるＦＭＯＣ戦略を用いてもよい。これに関する固体支持体は、各種の機能性化された形態で市場で入手できるジビニルベンゼン架橋ポリスチレン樹脂であり、それはクロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、パラアセタミドメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂、オキシム樹脂、４−アルコキシベンジルアルコール樹脂（Ｗａｎｇ樹脂）、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル  アミノメチル）−フェノキシメチル樹脂、２，４−ジメトキシベンズヒドリル−アミン樹脂、および４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ＦＭＯＣ−アミノ−メチル）−フェノキシアセタミドノルロイシル−ＭＢＨＡ樹脂（ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂）が含まれる。さらに希望する場合には、酸感受性樹脂もＣ末端酸を提供する。αアミノ酸のための保護基は、塩基不安定性の９−フルオレニルメトキシ−カルボニル（ＦＭＯＣ）である。
【００５６】
ＢＯＣ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）およびＦＭＯＣ基と化学的に適合するアミノ酸の側鎖官能性の適合する保護基は、当該技術分野では周知である。ＦＭＯＣ化学を使用する場合には、下記の保護されたアミノ酸誘導体が好ましい：ＦＭＯＣ−Ｃｙｓ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）、ＦＭＯＣ−Ａｓｎ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｌｅｕ、ＦＭＯＣ−Ｔｈｒ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｖａｌ、ＦＭＯＣ−Ｇｌｙ、ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、ＦＭＯＣ−Ｇｌｎ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）、ＦＭＯＣ−Ｈｉｓ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）、ＦＭＯＣ−Ａｒｇ（ＰＭＣ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル））、ＦＭＯＣ−Ａｒｇ（ＢＯＣ）２、ＦＭＯＣ−Ｐｒｏ，およびＦＭＯＣ−ｔｒｐ（ＢＯＣ）。アミノ酸残基は当該技術分野では公知の各種のカップリング剤および化学薬品、例えばＤＩＣ（ジイソプロピル−カルボジイミド）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾリル−Ｎ−オキシトリスジメチルアミノホスホニウム  ヘキサフルオロホスファート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスファート）、ＰｙＢｒＯＰ（ブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート）を用いる直接カップリング；予め形成された対称無水物経由；活性エステル、例えばペンタフルオロフェニルエステル経由；または予め形成されたＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）活性エステル経由またはＦＭＯＣ−アミノ酸フルオリドおよびクロリド使用によりまたはＦＭＯＣ−アミノ酸−Ｎ−カルボキシ無水物使用によるもの、を使用してカップリングしてもよい。ＨＯＢｔまたはＨＯＡｔ（７−アザヒドロキシベンズトリアゾール）の存在下でのＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）、１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスファート）またはＨＡＴＵ（２−（１Ｈ−７−アザ−ベンゾトリアゾール−１−イル）、１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスファート）を用いる活性化が好ましい。
【００５７】
固相法は、手操作で行ってもよいが、しかし市場で入手できるペプチド合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａなど；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に基づく自動化合成を用いてもよい。典型的な合成では、第一（Ｃ末端）アミノ酸がクロロトリチル樹脂上に負荷される。ＡＢＩ
ＦａｓｔＭｏｃプロトコール（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従う。順次脱保護（２０％ピペリジン／ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）使用）およびＡＢＩ  Ｆａｓｔ  Ｍｏｃプロトコール（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従うカップリングサイクルをペプチド配列を生成するために使用してもよい。無水酢酸によるキャップ形成を伴う二重および三重カップリングを用いてもよい。
【００５８】
合成擬似ペプチドを樹脂から切断しそして適当な捕捉剤を含むＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で処理して脱保護してもよい。多数のかかる切断試薬、例えばＲｅａｇｅｎｔ  Ｋ（０．７５ｇ結晶フェノール、０．２５ｍＬエタンジチオール、０．５ｍＬチオアニソール、０．５ｍＬ脱イオン水、１０ｍＬ  ＴＦＡ）などを使用してもよい。濾過によりペプチドを樹脂がら分離しそしてエーテル沈降により単離してもよい。さらなる精製は、慣用の方法、例えばゲル濾過および逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により達成してもよい。本発明による合成擬似体は、製薬学的に許容できる塩、特には有機塩基と無機塩基との塩を含む塩基付加塩であってもよい。アミノ酸残基の塩基付加塩は、当該技術分野の専門家には周知の方法に従って、適当な塩基または無機塩基を用いるペプチドの処理により調製するか、または適当な塩基の凍結乾燥により所望の塩を直接得てもよい。
【００５９】
一般に、当該技術分野の専門家は、本明細書中に記載するペプチドが、本質的に非修飾ペプチドと同様の活性を有し、そして場合によりその他の望ましい性質を有するペプチドを生成するための各種の化学的技術により修飾されてもよいことを認めるであろう。例えば、ペプチドのカルボン酸基は、製薬学的に許容できる陽イオンの塩の形態で提供されてもよい。ペプチド内のアミノ基は、製薬学的に許容できる酸付加塩、例えばＨＣｌ、ＨＢｒ、酢酸、安息香酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、酒石酸、およびその他の有機酸の形態であってもよく、またはアミドに変換されてもよい。チオールは、多数の周知の保護基のいずれか一つ、例えばアセトアミド基を用いて保護されてもよい。当該技術分野の専門家は、本来の結合立体配置がさらに良く近似されるように本発明のペプチド内に環状構造を導入する方法も認めるであろう。例えば、カルボキシル末端またはアミノ末端システイン残基をペプチドに付加して、酸化された場合にペプチドがジスルフィド結合を含み、それにより環状ペプチドを生成するようしてもよい。その他のペプチド環状化方法は、チオエーテルおよびカルボキシルおよびアミノ末端アミドおよびエステルの形成を含む。
【００６０】
特定すると、相当するペプチドと同様または類似の所望の生物学的活性を有するが、しかし溶解度、安定性、および加水分解およびタンパク質分解に対する感受性に関してペプチドよりもさらに有利な活性を有するペプチド誘導体および類似体を構築するために、各種の技術が利用できる。かかる誘導体および類似体は、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基における修飾、および／またはペプチド内の１個もしくはそれ以上のアミド結合の非アミド結合への変更がされたペプチドを含む。２個もしくはそれ以上のかかる修飾が一つのペプチド擬似構造内に一緒になってもよいことは理解されるであろう（例えば、Ｃ末端カルボキシル基での修飾およびペプチド内の２個のアミノ酸間の−ＣＨ２−カルバミン酸連結の導入）。
【００６１】
アミノ末端修飾は、アルキル化、アセチル化、カルボベンゾイル基の付加、およびスクシンイミド基の形成を含む。特定すると、Ｎ末端アミノ基は、式ＲＣ（Ｏ）ＮＨ−〔式中、Ｒはアルキル、例えば低級アルキルである〕のアミド基を形成するように反応され、そして酸ハロゲン化物、ＲＣ（Ｏ）Ｃｌまたは酸無水物との反応により付加されてもよい。典型的には、該反応は、ほぼ等モルもしくは過剰量（例えば約５当量）の酸ハロゲン化物を、好ましくは反応中に生成する酸を捕捉するために第三級アミン、例えばジイソプロピルエチルアミンの過剰量（例えば約１０当量）を含む不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）中でペプチドと接触させて行うことができる。その外、反応条件は慣用のものである（例えば室温で３０分間）。上記のように、低級アルキルＮ−置換を得るための末端アミノのアルキル化、引き続く酸ハロゲン化物との反応は、式ＲＣ（Ｏ）ＮＲ−のＮ−アルキルアミド基をもたらす。あるいは、アミノ末端は、無水コハク酸との反応によりスクシンイミド基に共有結合で連結されてもよい。無水コハク酸のほぼ当量もしくは過剰量（例えば約５当量）が使用され、そして末端アミノ基は、ウオレンバーグら（Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６１２，１３２号明細書、その全体を引用することにより本明細書に編入される）に記載のようにして、適合する不溶性溶剤（例えばジクロロメタン）中の第三級アミン、例えばジイソプロピルエチルアミンの過剰量（例えば１０当量）の使用を含む当該技術分野では周知の方法によりスクシンイミドに変換される。コハク酸基は、例えばＣ２〜Ｃ６−アルキルまたは−ＳＲ置換基で置換されてもよく、それらはペプチドのＮ末端で置換スクシンイミドを得るために慣用の様式で調製できることも理解される。かかるアルキル置換基は、上記のウオレンバーグらに記載の方法で、低級オレフィン（Ｃ２〜Ｃ６−アルキル）と無水マレイン酸との反応により調製されてもよく、そして−ＳＲ置換基は、ＲＳＨと無水マレイン酸との反応により調製されてもよい〔式中、Ｒは上記に定義されている〕。別の有利な態様では、アミノ末端は、ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−または置換ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−基を形成するために誘導体化されてもよい。該誘導体は、例えば反応の間に生成する酸を捕捉するための第三級アミンを含む適当な不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）中で、ほぼ当量または過剰のベンジルオキシカルボニル  クロリド（ＣＢＺ−Ｃｌ）、または置換されたＣＢＺ−Ｃｌとの反応により調製してもよい。さらに別の誘導体では、Ｎ末端は、末端アミンをスルホンアミドに変換するために適当な不活性希釈剤（ジクロロメタン）中で、当量または過剰（例えば５当量）のＲ−Ｓ（Ｏ）２Ｃｌとの反応によるスルホンアミド基を含んでなる〔式中、Ｒはアルキル、そして好ましくは低級アルキルである〕。例えば、不活性希釈剤は、反応の間に生成する酸を捕捉するために、過剰の第三級アミン（例えば１０当量）、例えばジイソプロピルエチルアミンを含んでもよい。その外、反応条件は慣用のものである（例えば室温で３０分間）。カルバミン酸基は、末端アミンをカルバマートに変換するために適合する不活��希釈剤（例えばジクロロメタン）中で当量または過剰（例えば５当量）のＲ−ＯＣ（Ｏ）ＣｌまたはＲ−ＯＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｈ４−ｐ−ＮＯ２との反応によりアミノ末端に生成されてもよい〔式中、Ｒはアルキル、好ましくは低級アルキルである〕。例えば、不活性希釈剤は、反応中に生成するいずれかの酸を捕捉するために、過剰（例えば約１０当量）の第三級アミン、例えばジイソプロピルエチルアミンを含んでもよい。その外、反応条件は慣用のものである（例えば室温で３０分間）。尿素基は、末端アミンを尿素（すなわちＲＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）基〔式中、Ｒは上記に定義されている〕に変換するために、適合する不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）中で、当量または過剰（例えば５当量）のＲ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏと反応させてアミノ末端に形成してもよい。例えば、不活性希釈剤は、過剰（例えば約１０当量）の第三級アミン、例えばジイソプロピルエチルアミンを含んでもよい。その外、反応条件は慣用のものである（例えば室温で３０分間）。
【００６２】
Ｃ末端カルボキシル基がエステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ〔式中、Ｒはアルキル、そして好ましくは低級アルキルである〕）により置換されてもよいペプチド擬似体を調製する場合に、ペプチド酸を調製するために使用される樹脂を使用してもよく、そして側鎖を保護されたペプチドは、塩基および適合するアルコール（例えばメタノール）を用いて切断されてもよい。かかる連鎖保護基は、所望のエステルを得るためにフッ化水素を用いる処理により、通常の様式で除去されてもよい。Ｃ末端カルボキシル基がアミド−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４により置換されているペプチド擬似体を調製する場合には、ペプチド合成のための固体支持体としてベンズヒドリルアミン樹脂が使用される。合成が完了すると、支持体からペプチドを解放するためにフッ化水素処理すると遊離ペプチドアミンが直接もたらされる（すなわち、Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である）。あるいは、側鎖保護ペプチドを支持体から切断するためにアンモニアとの反応を伴うペプチド合成の間のクロロメチル化樹脂の使用は、遊離ペプチドアミドを生成し、そしてアルキルアミンまたはジアルキルアミンとの反応は、アルキルアミドまたはジアルキルアミドで保護された側鎖を生成する（すなわち、Ｃ末端は−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ１である〔式中、ＲおよびＲ１はアルキル、そして好ましくは低級アルキルである〕）。次いで側鎖保護は、フッ化水素を用いる通常の様式で除去され、遊離アミド、アルキルアミド、またはジアルキルアミドを生成する。
【００６３】
別の代わりの態様では、Ｃ末端カルボキシル基またはＣ末端エステルは、カルボキシル基またはエステルのそれぞれ−ＯＨまたはエステル（−ＯＲ）をＮ末端アミノ基で置換して環化する環状ペプチドを形成するように誘導されてもよい。ここで。例えば、ペプチド酸を生成する合成および切断の後に、例えば塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、またはそれらの混合物中で、適当なカルボキシル基活性化剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）により、遊離酸を活性化エステルに溶液中で変換する。次いで、環状ペプチドは、活性化エステルをＮ末端アミンで置換して形成される。当該技術分野で周知の方法による大希釈溶液の使用により、重合ではなくむしろ環化が促進されてもよい。
【００６４】
当該技術分野で理解されそして本発明により提供されるペプチド擬似体は、本発明のペプチドと構造的に類似しているが、当該技術分野で公知でありそして下記の引用文献：Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編集），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２６７ページ，１９８３；Ｓｐａｔｏｌａ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  １：３，１９８２；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．４６３−４６８ページ，１９８０；Ｈｕｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−１８５．１９７９：Ｓｐａｔｏｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３８：１２４３−１２４９，１９８６；Ｈａｎｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７−３１４，１９８２；Ａｌｍｑｕｉｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８，１９８０；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２３：２５３３；Ｓｚｅｌｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第０４５６６５Ａ号明細書；Ｈｏｌｌａｎｄｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−４４０４，１９８３；およびＨｒｕｂｙ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３１：１８９−１９９，１９８２（それらはいずれも引用することにより本明細書に編入される）に記載の方法により、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス配置の双方）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される連結により場合により置換された１個もしくはそれ以上のペプチド結合を有する。かかるペプチド擬似体は、例えば生産がさらに経済的、さらに高い化学的安定性または増強された薬理学的性質（例えば半減期、吸収、効能、効力など）を有し、低下した抗原性、およびその他の性質を含み、ポリペプチド態様よりも著しい長所を有するであろう。
【００６５】
本発明のペプチドの擬似類似体は、慣用または合理的な医薬設計の原理を利用して得てもよい（例えばＡｎｄｒｅｗｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｌｆｒｅｄ  Ｂｅｎｚｏｎ
Ｓｙｍｐ．２８：１４５−１６５，１９９０；ＭｅＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：１−２４，１９９０；Ｈｏｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，（Ｒｏｂｅｒｔｓ編集）；Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；８４−９３ページ，１９８９ａ；Ｈｏｌ，Ａｒｚｈｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ．３９：１０１６−１０１８，１９８９ｂ；Ｈｏｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２５：７６７−７７８，１９８６（それらの開示は引用することにより本明細書に編入される）参照）。
【００６６】
慣用の医薬設計の方法に従って、所望の擬似分子は、その構造が「本来」のペプチドの構造に共通の属性を有する分子を無作為に試験して得られてもよい。結合分子の特定の基での変化からもたらされる定量的な寄与は、ペプチドの活性と比較して推定される擬似体の生物学的活性を測定して決定されてもよい。合理的な医薬設計の一つの態様では、擬似体は、ペプチドの最も安定な三次元配置の寄与を共有するように設計される。従って、例
えば、本明細書中に開示される本発明のペプチドにより示されるものと類似したイオン性、疎水性、またはファンデルワールス相互作用を起こすために十分な様式で配向される化学基を有するように擬似体を設計してもよい。
【００６７】
合理的な擬似体設計を実行するための一つの方法は、ペプチドの三次元構造の表現を形成できる計算機システム、例えばＨｏｌ，１９８９ａ、Ｈｏｌ，１９８９ｂ、およびＨｏｌ，１９８６により例示されたものを使用する。本発明のペプチドのペプチド−、有機−、および化学的擬似体の分子構造は、当該技術分野で市場で入手できる計算機支援設計プログラムを用いて作成してもよい。かかるプログラムの例は、ＳＹＢＹＬ  ６．５（Ｒ）、ＨＱＳＡＲＴＭ、およびＡＬＣＨＥＭＹ  ２０００ＴＭ（Ｔｒｉｐｏｓ）；ＧＡＬＡＸＹＴＭおよびＡＭ２０００ＴＭ（ＡＭ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ
Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭおよびＣＥＲＩＵＳＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＣＡＣＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＳＴＭ、ＴＳＡＲＴＭ、ＡＭＢＥＲＴＭ、およびＣＨＥＭ−ＸＴＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＣＡ）およびＣＨＥＭＢＵＩＬＤＥＲ３ＤＴＭ（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む。
【００６８】
例えば当該技術分野で認められた分子モデル化プログラムを使用して本明細書中に開示されたペプチドを用いて調製されたペプチド−、有機−、および化学的擬似体は、慣用の化学合成技術を用いて調製され、そして組合わせ化学法を含む高収量スクリーニングを適合させるように設計されてもよい。本発明のペプチド−、有機−、および化学的擬似体を調製するために有用な組合わせ法は、固相合成および組合わせ化学アレイ、例えばＳＩＤＤＣＯ（Ｔｕｓｃｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ）；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；Ｓｙｍｙｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）；Ｍｅｄｉｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｌｅｍｏｎｔ，ＩＬ）；Ｐｈａｒｍ−Ｅｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，ＰＡ）；またはＮ．Ｖ．Ｏｒｅｇｏｎ（Ｏｓｓ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から提供されるものを含む。本発明のペプチド−、有機−、および化学的擬似体の組合わせ化学的調製は、Ｔｅｒｒｉｔ，（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９８）；Ｇａｌｌｏｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−５１，１９９４；Ｇｏｒｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５−１４０１，１９９４；Ｌｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６：７０７−１２，１９９６；Ｒｕｈｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８；２５３−４，１９９６；Ｇｏｒｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９：１４４−５４，１９９６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＆  Ｅｌｌｍａｎ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：５５５−６００，１９９６；Ｆｒｕｃｈｔｅｌ＆  Ｊｕｎｇ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５：１７−４２，１９９６；Ｐａｖｉａ，“Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ”，Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，ｗｗｗ．ｎｅｔｓｃｉ．ｏｒｇ．１９９５；Ａｄｎａｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｌｅａｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ＳＡＲ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，”Ｉｄ．，１９９５；Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｂｒｉａｎｔ，“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，”Ｉｄ．１９９５；Ｐａｖｉａ，“Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄＦｕｔｕｒｅ，”Ｉｄ．１９９６；および米国特許第５，８８０，９７２号、第５，４６３，５６４号、第５，３３１，５７３号、および第５，５７３，９０５号の各明細書中に開示の技術を含み、それらに限定はされないが、当該技術分野で公知の方法に従って調製されてもよい。
【００６９】
新規に合成されたポリペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィーにより本質的に精製されてもよい（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ
Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ
Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９８３参照）。本発明の合成ポリペプチドの組成は、例えばエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解法（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記）によるアミノ酸解析または配列決定により確認してもよい。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列のいずれの部分も、変種ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドを生成するために直接合成の間に改変されるかおよび／または他のタンパク質からの配列を用いる化学的方法を用いて組合わせてもよい。
【００７０】
また、本発明のポリペプチドを選択的に結合する抗体および抗体フラグメントも本明細書中に含まれる。当該技術分野で公知のいずれの形式の抗体も、当該技術分野で公知の方法を用いて生成されてもよい。例えば、抗体は、本発明のポリペプチドのエピトープに特異的に結合するように生成されてもよい。本明細書中に使用される「抗体」は、不変の免疫グロブリン分子、ならびにそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを含み、それらは本発明のポリペプチドのエピトープを結合できる。典型的には、少なくとも６、８、１０、または１２個の隣接アミノ酸がエピトープを形成するために必要とされる。しかし、非隣接アミノ酸を含むエピトープは、それより多いアミノ酸、例えば少なくとも１５、２５、または５０個のアミノ酸を必要とするであろう。
【００７１】
本発明のポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体は、治療的、ならびに免疫化学アッセイ、例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、免疫皮膚化学アッセイ、免疫沈降法、またはその他の当該技術分野で公知の免疫化学アッセイに使用されてもよい。種々の免疫アッセイが所望の特異性を有する抗体を同定するために使用されてもよい。競合結合または免疫放射アッセイに対する多数のプロトコールが当該技術分野で周知である。かかる免疫アッセイは、典型的には、免疫原と免疫原に特異的に結合する抗体との間の複合体形成の測定を含む。
【００７２】
典型的には、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイに使用された場合に他のタンパク質で与えられる検出シグナルより少なくとも５、１０、または２０倍高い検出シグナルを与える。好ましくは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイにおいて他のタンパク質を検出せず、そして溶液から本発明のポリペプチドを免疫沈降できる。
【００７３】
本発明のポリペプチド、またはそれらのフラグメントは、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ラビット、モルモット、サル、またはヒトを免疫化してポリクローナル抗体を産生するために使用されてもよい。所望の場合には、本発明のポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、キャリヤタンパク質、例えばウシ血清アルブミン、チログロブリン、およびキーホールリンペット（ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニンに結合してもよい。宿主種に依存して、免疫学的反応を増加するために種々のアジュバントが使用できる。かかるアジュバントには、限定ではないが、フロイントアジュバント、無機質ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および界面活性物質（例えばリソレクチン、プルロニク・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール）が含まれる。ヒト内に使用されるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌）およびコリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が特に有用である。
【００７４】
本発明のポリペプチドまたはそれらのフラグメントに特異的に結合するモノクローナル抗体は、培地内の連続細胞株による抗体分子の産生をもたらすいずれの技術を用いてでも調製できる。それらの技術には、限定ではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術が含まれる（Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４５７−９７，１９８５；Ｋｏｔｚｂｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１：３１２４，１９８５；Ｃｏｔｅ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−３０，１９８３；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６２：１０９−２０，１９８４）。
【００７５】
さらに、「キメラ抗体」を産生するための開発された技術、すなわち、適当な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためのヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングを使用してもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−５５，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−０８，１９８４；Ｔａｋｅｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−５４，１９８５）。モノクローナルおよびその他の抗体も、それが治療に使用された場合に抗体に対する免疫反応の付与を患者から防止するために「ヒト化」できる。かかる抗体は、治療に直接使用するためにはヒト抗体と配列が十分に類似していてもよくまたはいくつかの主要残基の改変を必要としてもよい。げっ歯類抗体とヒト配列との間の配列の相違は、個別残基の部位指定突然変異誘発によりまたはすべての相補性決定領域のグレーティング（ｇｒａｔｉｎｇ）によりヒト配列中の残基とは異なるものを置換して最小化してもよい。あるいは、ヒト化抗体は組換え技術を用いて産生してもよい（例えば英国特許第２１８８６３８Ｂ号明細書参照）。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、部分的または完全にヒト化された抗原結合部位を含んでもよく、これは米国特許第５，５６５，３３２号明細書中に開示されている。
【００７６】
あるいは、一本鎖抗体の産生のために記載された技術を、本発明のポリペプチドに特異的に結合する一本鎖抗体を産生するように当該技術分野で公知の方法を用いて適合させてもよい。関連する特異性を有するが然し異なるイディオタイプを有する抗体は、無作為の組合わせ免疫グロブリンライブラリーから連鎖シャッリフリングにより生成できる（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１１１２０−２３，１９９１）。
【００７７】
一本鎖抗体は、ＤＮＡ増幅法、例えば鋳型としてハイブリドーマｃＤＮＡを用いるＰＣＲを用いて構築してもよい（Ｔｈｉｒｉｏｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｐｒｅｖ．５：５０７−１１，１９９６）。一本鎖抗体は、単一または二重特異性であることができ、そして二価または四価であることができる。四価、二重特異性、一本鎖抗体の構築は、コロマおよびモリソン（Ｃｏｌｏｍａ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９−６３，１９９７）中に記載されている。二価、二重特異性一本鎖抗体の構築は、マレンダーおよびフォス（Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ  ＆  Ｖｏｓｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９９−２０６，１９９４）中に記載されている。
【００７８】
一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、手操作または自動ヌクレオチド合成を用い、標準組換えＤＮＡ法を用いて発現構築体内にクローニングし、そしてコード配列を発現するために細胞内に導入して構築してもよく、それは以下に記載される。あるいは、一本鎖抗体は、例えば、繊維状ファージ技術を用いて直接産生できる（Ｖｅｒｈａａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６１：４９７−５０１，１９９５；Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６５：８１−９１，１９９３）。
【００７９】
本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、リンパ球集団中の生体内産生の誘導により、または文献（Ｏｒｌａｎｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３８３３３−３７，１９８９；Ｗｉｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−９９，１９９１）中に開示のように高度に特異性の結合試薬の免疫グロブリンライブラリーまたはパネルをスクリーニングして産生してもよい。
【００８０】
他の形式の抗体を本発明の方法中で構築および治療的に使用してもよい。例えば、キメラ抗体は、国際特許出願公開ＷＯ９３／０３１５１号明細書中に開示のようにして構築してもよい。免疫グロブリンから誘導されそして多価および多重特異性である結合タンパク質、例えば「二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」も調製できる（例えば国際特許出願公開ＷＯ９４／１３８０４号明細書参照）。
【００８１】
本発明のポリペプチドに結合するの能力を有するヒト抗体をＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ（Ｒ）ライブラリーから以下のようにして同定してもよい。本発明のポリペプチドを微量分析用プレート上に被覆し、そしてＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ（Ｒ）Ｆａｂファージライブラリーと共に培養してもよい。本発明のポリペプチドに結合していないそれらのファージ連結Ｆａｂをプレートから洗浄除去し、本発明のポリペプチドに緊密に結合したファージのみを残すことができる。結合したファージは、例えばｐＨ変化によりもしくは大腸菌を用いる溶離により溶離できそして大腸菌宿主の感染により増幅する。この選別法は、本発明のポリペプチドに緊密に結合している抗体の集団を濃縮するために一回または二回反復できる。次いで濃縮プールからのＦａｂを発現、精製、そしてＥＬＩＡアッセイでスクリーニングする。
【００８２】
本発明の抗体は、当該技術分野で周知の方法により精製されてもよい。例えば、抗体は本発明のポリペプチドが結合されるカラム上を通してアフィニティー精製されてもよい。次いで、結合抗体を高塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶離できる。
【００８３】
本明細書中に使用される場合の各種の用語を以下に定義する。
【００８４】
本発明の要素またはその好ましい態様を紹介する場合に、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ（該）」は、１個もしくはそれ以上の要素が存在することを意味すると意図する。「含んでなる」、「含む」および「有する」の用語は、列挙した要素のほかにも追加の要素があり得ることを含みそして意味することを意図する。
【００８５】
本明細書中に使用される場合の「対象者」の用語は、哺乳動物（例えばヒトおよび動物）を含む。
【００８６】
「処置」の用語は、いずれかのプロセス、作用、適用、治療などを含み、ここで、人類を含む対象者は、直接もしくは間接的に対象者の条件を改善、または対象者内の状態もしくは障害の進行を遅延させる目的の医療援助を受ける。
【００８７】
「組合わせ治療」または「共治療」の用語は、状態および／または障害を処置するための２種もしくはそれ以上の治療薬剤の投与を意味する。かかる投与は、本質的に同時の様式、例えば有効成分の固定比率を含む単一カプセルまたはそれぞれの阻害剤について複数の分離したカプセル内での２種もしくはそれ以上の治療薬剤の投与を包含する。さらに、かかる投与は、連続する様式でのそれぞれのタイプの治療薬剤の使用を包含する。
【００８８】
「治療的に有効」の語句は、糖尿病状態または障害重度における改善の目標を達成し、一方、与えられる治療処置に関連する不利な副作用を回避または最小化するそれぞれの投与薬剤の量を意味する。
【００８９】
「製薬学的に許容できる」の用語は、該当物が製薬学的製品中の使用に適当であることを意味する。
【００９０】
本発明のポリペプチドは、イン・ビトロで膵島細胞からのインスリン分泌を促進する能力の結果として、および生体内血糖の低下を起こすことにより、ＩＩ型糖尿病（非インスリン依存型糖尿病）を含む糖尿病の処置に使用されてもよい。かかる処置は、糖尿病および糖尿病合併症の発生も遅延させるであろう。該ポリペプチドは、ＩＩ型糖尿病の進展への進行から耐糖能障害を有する患者を防止するために使用してもよい。本発明の方法により本発明のペプチドを用いて処置もしくは防止されるであろうその他の疾患および状態は、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）（Ｈｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４３：４０，１９９２）；潜伏性自己免疫性成人型糖尿病（ＬＡＤＡ）（Ｚｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｄ．１１：２９９，１９９４）；耐糖能障害（ＩＧＴ）（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２２（Ｓｕｐｐ．１）：Ｓ５，１９９９）；空腹時血糖異常（ＩＦＧ）（Ｃｈａｒｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４０：７９６，１９９１）；妊娠糖尿病（Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４０：１９７，１９９１）；および代謝症候群Ｘを含む。
【００９１】
本発明のポリペプチドは、肥満のような異常、およびアテローム性動脈硬化疾患、高脂血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬレベル、高血圧、心血管疾患（アテローム性動脈硬化、冠性心疾患、冠動脈疾患、および高血圧を含む）、脳血管疾患および末梢血管疾患の処置；および狼瘡、多嚢胞性卵巣症候群、発癌、および過形成、喘息、男性生殖異常、潰瘍、睡眠障害、脂質および炭水化物代謝異常、概日不全、成長障害、エネルギーホメオスタシス異常、自己免疫疾患を含む免疫疾患（例えば全身エリトマトーデス）、ならびに急性および慢性炎症性疾患、および敗血症ショックの治療にも有効である。
【００９２】
本発明のポリペプチドは、例えば脂質蓄積細胞を産生する細胞分化、インスリン感度および血糖レベルの調節に関係する生理学的疾患を処置するためにも有用であり、それらには、例えば、インスリンへの自己抗体、インスリン受容体への自己抗体、膵臓β細胞を刺激する自己抗体による異常膵臓β細胞機能、インスリン分泌腫瘍および／または自己免疫低血糖症、アテローム性斑の形成に導くマクロファージ分化、炎症性反応、発癌、過形成、脂肪細胞遺伝子発現、脂肪細胞分化、膵臓β細胞含質量減少、インスリン分泌、インスリンへの組織感度、脂肪肉腫細胞増殖、多嚢胞性卵巣疾患、慢性無排卵、高アンドロゲン症、プロゲステロン産生、ステロイド産生、細胞内のレドックス電位および酸化性ストレス、酸化窒素合成（ＮＯＳ）産生、増加したガンマグルタミルトランスペプチターゼ、カタラーゼ、血漿トリグリセリド、ＨＤＬ、およびＬＤＬコレステロールレベルなどに含まれる。
【００９３】
本発明のポリペプチドは、糖尿病の二次原因を処置するために本発明の方法に使用されてもよい（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｅｅ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２２（Ｓｕｐｐ．１）：Ｓ５，１９９９）。かかる二次原因は、糖質コルチコイド過剰、成長ホルモン過剰、クロム親和細胞腫、および医薬誘導糖尿病を含む。糖尿病を誘発する医薬は、限定ではないが、ピリミニル（ｐｙｒｉｍｉｎｉｌ）、ニコチン酸、糖質コルチコイド、フェニトイン、サイロイド  ホルモン、β−アドレナリン作動性薬剤、α−インターフェロンおよびＨＩＶ感染を処置する医薬を含む。
【００９４】
さらに、本発明のポリペプチドは、喘息の治療（Ｂｏｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  ３７：５７−６６，１９９５；米国特許第５，６７７，４１９号明細書、
ポリペプチドＲ３Ｐ０がモルモット気管平滑筋の緩和に有効なことを示す）、低血圧誘導（ＶＩＰは喘息患者の低血圧、頻脈、および顔面紅潮を誘発する（Ｍｏｒｉｃｅ，ｅｔ
ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ７：２７９−２８０，１９８６；Ｍｏｒｉｃｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ２：１２２５−１２２７，１９８３））；男性生殖異常（Ｓｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ａｎｄｒｏｌ．４３（１）：６７−７１，１９９９）；抗アポトーシス／ニューロン保護剤として（Ｂｒｅｎｎｅｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：２０７−１２，１９８３）；虚血事象の間の心臓保護（Ｋａｆｆｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１２６８（２）：９５２−８，１９９４；Ｄａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：２９７−３０８，１９９８）；概日時計の操作および関連疾患（Ｈａｍａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０９：４９７−５０８，２００２；Ｓｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：１１５７５−８０，２０００）、および最後に抗潰瘍剤（Ｔｕｎｃｅｌ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：３０９−２２，１９９８）に使用されてもよい。
【００９５】
本発明のポリペプチドは、単独または糖尿病または関連障害の処置に当該技術分野の専門家に公知の別の治療および／または化合物と一緒に使用されてもよい。あるいは、本明細書中に記載の方法およびポリペプチドは、組合わせ治療に部分的にまたは完全に使用されてもよい。
【００９６】
本発明のポリペプチドは、糖尿病の処置のための他の公知の治療と組合わせて投与されてもよく、それには、ＰＰＡＲアゴニスト、スルホニル尿素薬剤、非スルホニル尿素分泌促進物質、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作物質、インスリン分泌促進物質、肝グルコース分泌低下性化合物、インスリンおよび抗肥満薬剤を含む。かかる治療は、本発明のポリペプチドの投与の前、それと同時にまたはその後に投与されてもよい。インスリンは、長期および短期作用性形態およびインスリンの配合物の双方を含む。ＰＰＡＲアゴニストは、いずれのＰＰＡＲサブユニットのアゴニストおよびそれらの組合わせも含む。例えば、ＰＰＡＲアゴニストは、ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γ、ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲのサブユニットの２種もしくは３種のいずれかの組合わせのアゴニストを含んでもよい。ＰＰＡＲアゴニストは、例えばロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、およびピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）を含む。スルホニル尿素薬剤は、例えばグリブリド（ｇｌｙｂｕｒｉｄｅ）、グリメピリド（ｇｌｉｍｅｐｉｒｉｄｅ）、クロロプロパミド（ｃｈｌｏｒｏｐｒｏｐａｍｉｄｅ）、トルブタミド（ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）およびグリピジド（ｇｌｉｐｉｚｉｄｅ）を含む。本発明のポリペプチドと一緒に投与された場合に糖尿病処置に有用であるα−グルコシダーゼ阻害剤は、プレコース（Ｐｒｅｃｏｓｅ（Ｒ））、ミグリトール（Ｍｉｇｌｉｔｏｌ（Ｒ））、およびボグリボース（ＶｏｇｌｏｂｏｓｅＴＭ）を含む。糖尿病処置に有用であるインスリン感作物質は、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、例えばグリタゾン（例えばトログリタゾン、ピオグリタゾン、エングリタゾン（ｅｎｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ＭＣＣ−５５５、ロシグリタゾン、など）を含む；ビグアニド、例えばメトホルミンおよびフェノホルミン；タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）阻害剤；ジペプチジル  ペプチダーゼＩＶ（ＤＰ−ＩＶ）阻害剤；およびチアゾリジンジオンおよび非チアゾリジンジオンを含む。本発明のポリペプチドと一緒に投与されて糖尿病の処置に有用である肝グルコース分泌低下性化合物は、メトホルミン、例えばグルコファージ（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（Ｒ））およびグルコファージＸＲ（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ  ＸＲ（Ｒ））を含む。本発明のポリペプチドと一緒に投与された場合に糖尿病の処置に有用であるインスリン分泌促進物質は、スルホニル尿素および非スルホニル尿素医薬：ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、セクレチン（ｓｅｃｒｅｔｉｎ）、ナテグリニド（ｎａｔｅｇｌｉｎｉｄｏ）、メグリチニド（ｍｅｇｌｉｔｉｎｉｄｅ）、レパグリニド（ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ）、グリベンクラミド（ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ）、グリメピリド（ｇｌｉｍｅｐｉｒｉｄｅ）、クロロプロパミド（ｃｈｌｏｒｏｐｒｏｐａｍｉｄｅ）、グリピジド（ｇｌｉｐｉｚｉｄｅ）を含む。ＧＬＰ−１は、本来のＧＬＰ−１より長い半減期を有するＧＬＰ−１の誘導体、例えば脂肪酸誘導体化ＧＬＰ−１およびエクセンジンを含む。本発明の一つの態様では、本発明のポリペプチドは、インスリン分泌促進物質への膵臓β細胞の感受性を増加するためにインスリン分泌促進物質と組合わせて使用される。
【００９７】
本発明のポリペプチドは、抗肥満薬と組合わせて本発明の方法に使用されてもよい。抗肥満薬は、β−３アゴニスト；ＣＢ−１アンタゴニスト；ニュロペプチドＹ阻害剤；食欲抑制剤、例えばシブトラミン（ｓｉｂｕｔｒａｍｉｎｅ）（Ｍｅｒｉｄｉａ（Ｒ）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；およびリパーゼ阻害剤、例えばオルリスタット（ｏｒｌｉｓｔａｔ）（Ｘｅｎｉｃａ（Ｒ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含む。
【００９８】
本発明のポリペプチドは、糖尿病患者中の脂質異常を処置するために一般的に使用されり医薬と組合わせて本発明の方法に使用されてもよい。かかる医薬は、限定ではないが、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ニコチン酸、脂質低下薬（例えばスタノールエステル、ステロールグリコシド、例えばチケシド（ｔｉｑｕｅｓｉｄｅ）、およびアゼチジノン（ａｚｅｔｉｄｉｎｏｎｅ）、例えばエゼチミブ（ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ））、ＡＣＡＴ阻害剤（例えばアバシミブ（ａｖａｓｉｍｉｂｅ））、胆汁酸金属イオン封鎖剤、胆汁酸再取込阻害剤、ミクロソームトリグリセリド阻害剤輸送、およびフィブリック酸（ｆｉｂｒｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体を含む。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、例えばロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、シムバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）、プラバスタチン（ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）、フルバスタチン（ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）、アトルバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）、リバスタチン（ｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）、イタバスタチン（ｉｔａｖａｓｔａｔｉｎ）、セリバスタチン（ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）、およびＺＤ−４５２２を含む。フィブリック酸誘導体は、例えばクロフィブラート（ｃｌｏｆｉｂｒａｔｅ）、フェノフィブラート（ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ）、ベンザフィブラート（ｂｅｎｚａｆｉｂｒａｔｅ）、シプロフィブラート（ｃｉｐｒｏｆｉｂｒａｔｅ）、ベクロフィブラート（ｂｅｃｌｏｆｉｂｒａｔｅ）、エトフィブラート（ｅｔｏｆｉｂｒａｔｅ）、およびゲムフィブロジル（ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ）を含む。金属イオン封鎖剤は、例えば、コレスチラミン（ｃｈｏｒｅｓｔｙｒａｍｉｎｅ）、コレスチポール（ｃｏｌｅｓｔｉｐｏｌ）、および架橋したデキストランのジアルキルアミノアルキル誘導体を含む。
【００９９】
本発明のポリペプチドは、抗高血圧薬、例えばβブロッカーおよびＡＣＥ阻害剤と組合わせて使用してもよい。本発明のポリペプチドと組合わせて使用される追加の抗高血圧薬の例は、カルシウムチャンネル遮断薬（Ｌ型およびＴ型、例えばジルチアゼム（ｄｉｌｔｉｚｅｍ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、ニフェジピン（ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）、アムロジピン（ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ）およびミベフラジル（ｍｙｂｅｆｒａｄｉｌ））、利尿剤（例えばクロロチアジド（ｃｈｌｏｒｏｔｈｉａｚｉｄｅ）、ヒドロクロロチアジド（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｉａｚｉｄｅ）、フルメチアジド（ｆｌｕｍｅｔｈｉａｚｉｄｅ）、ヒドロフルメチアジド（ｈｙｄｒｏｆｌｕｍｅｔｈｉａｚｉｄｅ）、ベンドロフルメチアジド（ｂｅｎｄｒｏｆｌｕｍｅｔｈｉａｚｉｄｅ）、メチルクロロチアジド（ｍｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｔｈｉａｚｉｄｅ）、トリクロロメチアジド（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｉａｚｉｄｅ）、ポリチアジド（ｐｏｌｙｔｈｉａｚｉｄｅ）、ベンズチアジド（ｂｅｎｚｔｈｉａｚｉｄｅ）、エタクリン酸トリクリナフェン（ｅｔａｃｒｙｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒｉｃｒｙｎａｆｅｎ）、クロルサリドン（ｃｈｌｏｒｔｈａｌｉｄｏｎｅ）、フロセミド（ｆｕｒｏｓｅｍｉｄｅ）、ムソリミン（ｍｕｓｏｌｉｍｉｎｅ）、ブメタニド（ｂｕｍｅｔａｎｉｄｅ）、トリアムトレネン（ｔｒｉａｍｔｒｅｎｅｎｅ）、アミロリド（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ）、スピロノラクトン（ｓｐｉｒｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ））、レニン阻害剤、ＡＣＥ阻害剤（例えばカプトプリル（ｃａｐｔｏｐｒｉｌ、ゾフェノプリル（ｚｏｆｅｎｏｐｒｉｌ）、ホシノプリル（ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ）、エナラプリル（ｅｎａｌａｐｒｉｌ）、セラノプリル（ｃｅｒａｎｏｐｒｉｌ）、シラゾプリル（ｃｉｌａｚｏｐｒｉｌ）、デラプリル（ｄｅｌａｐｒｉｌ）、ペントプリル（ｐｅｎｔｏｐｒｉｌ）、キナプリル（ｑｕｉｎａｐｒｉｌ）、ラミプリル（ｒａｍｉｐｒｉｌ）、リシノプリル（ｌｉｓｉｎｏｐｒｉｌ））、ＡＴ−１受容体拮抗剤（例えばロサルタン（ｌｏｓａｒｔａｎ）、イルベサルタン（ｉｒｂｅｓａｒｔａｎ））、バルサルタン（ｖａｌｓａｒｔａｎ））、ＥＴ受容体拮抗剤（例えばシタキセンタン（ｓｉｔａｘｅｎｔａｎ）、アトルセンタン（ａｔｒｓｅｎｔａｎ）、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害剤、血管ペプシダーゼ阻害剤（二重ＮＥＰ−ＡＣＥ阻害剤）（例えば、オマパトリラート（ｏｍａｐａｔｒｉｌａｔ）およびゲモパトリラート（ｇｅｍｏｐａｔｒｉｌａｔ）およびニトラートを含む。
【０１００】
かかる共治療は、２種またはそれ以上の薬剤のいずれの組合わせで投与してもよい（例えばインスリン感作物質と抗肥満薬と組合わせた本発明のポリペプチド）。かかる共治療は、以上に記載したような製薬学的組成物の形態で投与してもよい。
【０１０１】
哺乳動物内で上記に同定された条件の処置の効力を決定するために使用される周知のアッセイに基づいて、そしてそれらの結果とそれらの状態を処置するために使用される公知の薬剤の結果との比較により、本発明のポリペプチドの有効用量がそれぞれの所望の徴候の処置のために容易に決定できる。それらの状態の一つの処置に投与されるべき有効成分（例えばポリペプチド）の量は、使用される特定のポリペプチドおよび投与単位、投与の方法、処置の期間、処置される患者の年齢および性別、および処置される状態の性質および程度のような考慮事項に従って広範に変化できる。
【０１０２】
投与される有効成分の全量は、一般に一日、体重あたりに、約０．００００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、そして好ましくは約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲であってもよい。単位用量は、有効成分約０．０１ｍｇ〜約２０ｍｇを含み、そして一週間あたりに一回ないし数回投与されてもよい。静脈内、筋肉内、皮下を含む注入、および非経口注入、および輸液技術の使用による投与のための週間用量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇであってもよい。毎日の直腸投与方法では、０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ（全体重）である。経皮濃度は、日容量０．００１〜１ｍｇ／ｋｇを維持するために必要なものであってもよい。
【０１０３】
当然ではあるが、各患者への特定の初回および継続投与方法は、担当診断医師により決定される状態の性質および重症度、使用する特定のポリペプチドの活性、患者の年齢、患者の食事、投与時間、投与経路、医薬の排出速度、医薬の組合わせ、などに従って変動する。処置の所望の方式、本発明のポリペプチドの投与の数は、慣用の処置試験を用いて当該技術分野の熟練者により確認されてもよい。
【０１０４】
本発明のポリペプチドは、適切に配合された製薬学的組成物中でそれを必要とする患者に投与して所望の製薬学的効果を達成するために使用されてもよい。本発明の目的のためには、患者は、特定の状態または疾患の処置を必要とするヒトを含む哺乳動物である。従って、本発明は、製薬学的に許容できるキャリヤおよびポリペプチドの治療有効量を含んでなる製薬学的組成物を含む。製薬学的に許容できるキャリヤは、キャリヤへに帰属されているいずれの副作用も有効成分の有益な効果を損なわないように、有効成分のどの有効な活性とも矛盾しない濃度で比較的無毒性でありそして患者に無害であるいずれかのキャリヤである。ポリペプチドの治療有効量は、処置される特定の条件に対して結果が得られるかまたは影響を及ぼす量である。本明細書中に記載のポリペプチドは、例えば、即時または徐放製剤、経口、非経口、局所などを含むいずれかの有効な慣用の投与単位剤型を用いる製薬学的に許容できるキャリヤと共に投与されてもよい。
【０１０５】
本発明のポリペプチドは、非経口、すなわち静脈内、筋肉内、腹腔内、または好ましくは皮下で、滅菌された液体または液体混合物、例えば水、食塩水、デキストロース水溶液および関連糖類水溶液；アルコール、例えばエタノール、イソプロパノール、もしくはヘキサデシルアルコール；グリコール、例えばプロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール；グリセロールケタール、例えば２，２−ジメチル−１，１−ジオキソラン−４−メタノール、エーテル、例えばポリ（エチレングリコール）４００；油；脂肪酸；脂肪酸エステルもしくはグリセリド；またはアセチル化脂肪酸グリセリドであって、製薬学的に許容できる界面活性剤、例えば石鹸または界面活性剤、懸濁剤、例えばペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはカルボキシメチルセルロース、または乳化剤およびその他の製薬学的アジュバントと共であってもなくてももよい製薬学的キャリヤと共に生理学的に許容できる希釈剤中のポリペプチドの注入可能な調剤として投与されてもよい。
【０１０６】
本発明の非経口配合物内に使用できる油の例は、石油、動物、植物、または合成由来の油であり、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ペトロラタム、および鉱油である。適合する脂肪酸は、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸を含む。適合する脂肪酸エステルは、例えば、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルである。適合する石鹸は、脂肪族アルカリ金属、アンモニウム、およびトリエタノールアミン塩を含みそして適合する界面活性剤は、陽イオン界面活性剤、例えばハロゲン化ジメチルジアルキルアンモニウム、ハロゲン化アルキルピリジニウム、おおび酢酸アルキルアミン、陰イオン界面活性剤、例えばスルホン酸アルキル、アリール、およびオレフィン、硫酸アルキル、オレフィン、エーテル、およびモノグリセリド、およびスルホスクシナート、非イオン界面活性剤、例えば脂肪族アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリオキシエチレンポリプロピレン  コポリマー、および両性界面活性剤、例えばアルキル−ベータ−アミノプロピオナート、および２−アルキルイミダゾリン第四級アンモニウム塩、ならびに混合物を含む。
【０１０７】
本発明の非経口組成物は、典型的には、溶液内に有効成分の約０．５重量％〜約２５重量％を含んでもよい。保存剤および緩衝剤が有利に使用されてもよい。注入の部位での刺激を最小化または回避するために、かかる組成物は、約１２〜約１７の親水親油バランス（ＨＢＬ）を有する非イオン界面活性剤を含んでもよい。かかる配合物中の界面活性剤の量は、５重量％〜約１５重量％の範囲である。界面活性剤は、上記のＨＬＢを有する単一成分であってもまたは所望のＨＬＢを有する２種またはそれ以上の成分の混合物であることもできる。
【０１０８】
非経口配合物中に使用される界面活性剤の例は、ポリエチレンソルビタン−脂肪酸エステルの類、例えば、ソルビタンモノオレアートと、プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合により形成される疎水性塩基とのエチレンオキシドの高分子量付加物である。
【０１０９】
製薬学的組成物は、滅菌された注入可能な水性懸濁液の形態であってもよい。かかる懸濁液は、適合する分散剤、または湿潤剤および懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、およびアラビアガ；天然に存在するホスファチドであってもよい分散剤または湿潤剤、例えばレクチン、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリエチレン、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、脂肪酸とヘキシトールとから誘導された部分エステルとのエチレンオキシドの縮合生成物、例
えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、または脂肪酸と無水ヘキシトールとから誘導された部分エステルとのエチレンオキシドの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートを用いる公知方法に従って配合されてもよい。
【０１１０】
滅菌された注入可能な調剤は、無毒性非経口的に受容できる希釈剤または溶剤中の滅菌注入用溶液または懸濁液であってもよい。使用してもよい希釈剤および溶剤は、例えば水、リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液であってもよい。さらに、滅菌固定油が溶剤または懸濁媒体として慣用的に利用される。この目的で、合成モノまたはジグリセリドを含むいかなる無刺激性固定油でも使用できる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸も注入用製剤中に使用してもよい。
【０１１１】
本発明の組成物は、薬剤の直腸投与のための座薬の剤型で投与されてもよい。それらの組成物は、薬剤（例えばポリペプチド）を、常温では固体であるがしかし直腸の温度では液体であり従って直腸内で溶融して薬剤を放出するめに適合する無刺激性賦形剤と一緒に混合して調製してもよい。かかる材料は、例えばカカオバターおよびポリエチレングリコールである。
【０１１２】
本発明の方法に使用される別の配合物は、経皮送達用具（「貼付剤」）を用いる。かかる経皮貼付剤は、本発明のポリペプチドの制御された量での連続または不連続輸液を提供するために使用されてもよい。薬剤の送達のための経皮貼付剤の構造および使用法は、当該技術分野で周知である（例えば米国特許第５，０２３，２５２号明細書（引用することにより本明細書に編入される）参照）。かかる貼付剤は、薬剤の連続、パルス状、またはオンデマンド送達に合わせて構成されてもよい。
【０１１３】
機械的送達装置を介する患者への製薬学的組成物の導入が望ましいかまたは必要なこともある。薬剤の送達のための機械的送達装置の構造および使用法は、当該技術分野では周知である。例えば、脳への直接薬剤投与のための直接技術は、通常、血液脳関門を避けるために患者の消化器系内に薬剤送達カテーテルの配置を含む。身体の特定の解剖的領域への薬剤輸送のために使用される一つのかかる埋め込み送達システムは、米国特許第５，０１１，４７２号明細書（引用することにより本明細書に編入される）中に記載されている。
【０１１４】
本発明の組成物は、一般にキャリヤまたは希釈剤と呼ばれるその他の慣用の製薬学的に許容できる配合成分を、必要または所望に応じて含んでもよい。本発明のいずれの組成物も、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加により、または適当な保存剤により保存されてもよい。かかる組成物を適切な投与剤型に調剤するための慣用の手順が利用できる。
【０１１５】
意図する投与経路のために組成物を配合するために適切として使用してもよい一般的に使用される製薬学的成分は、酸性化剤、例えば、これらに限定はされないが、酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、硝酸；およびアルカリ化剤、例えばこれらに限定はされないが、アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、水酸化カリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン、トロラミン（ｔｒｏｌａｍｉｎｅ）を含む。
【０１１６】
その他の製薬学的成分は、例えば、これらに限定はされないが、吸着剤（例えば粉末セルロースおよび活性炭）；エアロゾル噴射剤（例えば二酸化炭素、ＣＣｌ２Ｆ２、Ｆ２ＣｌＣ−ＣＣｌＦ２およびＣＣｌＦ３）；空気置換剤（例えば窒素およびアルゴン）；抗菌保存剤（例えば安息香酸、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム）；抗微生物保存剤（例えば塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀およびチメロサール）；抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム）；結合物質（例えばブロックポリマー、天然および合成ゴム、ポリアクリレート、ポリウレタン、シリコンおよびスチレン−ブタジエンコポリマー）；緩衝剤（例えば、メタリン酸カリウム、第一リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、無水クエン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム二水和物）、担持剤（例えばアカシアシロップ、アロマ系シロップ、アロマ系芳香エリキシル、チェリーシロップ、ココアシロップ、オレンジシロップ、シロップ、コーン油、鉱油、ラッカセイ油、ゴマ油、注入用静菌性塩化ナトリウムおよび注入用静菌性水）；キレート化剤（例えばエデト酸二ナトリウムおよびエデト酸）；着色料（例えば、ＦＤ＆Ｃ赤色３号、ＦＤ＆Ｃ赤色２０号、ＦＤ＆Ｃ黄色６号、ＦＤ＆Ｃ青色２号、ＦＤ＆Ｃ緑色５号、ＦＤ＆Ｃオレンジ５号、ＦＤ＆Ｃ赤色８号、カラメルおよび酸化第二鉄赤）、清澄剤（例えばベントナイト）、乳化剤（限定ではないが、アカシア、セトマクロゴル、セチルアルコール、グリセリルモノステアラート、レクチン、ソルビタンモノオレアート、ステアリン酸ポリエチレン５０）；カプセル化剤（ゼラチンおよびフタル酸酢酸セルロース）；調味料（例えば、アニス油、シナモン油、ココア、メントール、オレンジ油、ペパーミント油およびバニリン）；湿潤剤（例えばグリセリン、プロピレングリコールおよびソルビトール）；研和剤（例えば鉱油およびグリセリン）；油（例えばラッカセイ油、鉱油、オリーブ油、ピーナツ油、ゴマ油および植物油）、軟膏基剤（例えばラノリン、親水性軟膏、ポリエチレングリコール軟膏、ペトロラタム、親水性ペトロラタム、白色軟膏、黄色軟膏、およびローズ水軟膏）；浸透促進剤（経皮送達）（例えば、モノヒドロキシもしくはポリヒドロキシアルコール、飽和もしくは不飽和脂肪アルコール、飽和もしくは不飽和脂肪エステル、飽和もしくは不飽和ジカルボン酸、精油、ホスファチジル誘導体、ケファリン、テルペン、アミド、エーテル、ケトンおよび尿素）；可塑剤（例えばフタル酸ジエチルおよびグリセリン）；溶剤（例えばアルコール、コーン油、綿実油、グリセリン、イソプロピルアルコール、鉱油、オレイン酸、ピーナツ油、純水、注入用水、注入用滅菌水および灌流用滅菌水）；剛化剤（例えばセチルアルコール、セチルエステルワックス、ミクロクリスタリンワックス、パラフィン、ステアリルアルコール、白色ワックスおよび黄色ワックス）；座薬基剤（例えばココアバターおよびポリエチレングリコール（混合物））；界面活性剤（例えば塩化ベンザルコニウム、ノノキシノール（ｎｏｎｏｘｙｎｏｌ）１０、オキシトキシノール（ｏｘｔｏｘｙｎｏｌ）９、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウムおよびソルビタンモノパルミタート）；懸濁剤（例えばカンテン、ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カオリン、メチルセルロース、トラガカントおよビー（ｖｅｅ）ガム）；甘味料、例えばアスパラテーム、デキストロース、グリセリン、マンニトール、プロピレングリコール、サッカリンナトリウム、ソルビトールおよびスクロース）；錠剤粘着防止剤（例えばステアリン酸マグネシウムおよびタルク）；錠剤結合剤（例えばアカシア、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、圧縮性糖、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、メチルセルロース、ポビドンおよびゼラチン化デンプン）；錠剤およびカプセル希釈剤（例えば第二リン酸カルシウム、カオリン、ラクトース、マンニトール、ミクロクリスタリンセルロース、粉末セルロース、沈降炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ソルビトールおよびデンプン）；錠剤被覆剤（例えば液体グルコース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、フタル酸酢酸セルロースおよびシェラック）；錠剤直接圧縮賦形剤（例えば、第二リン酸カルシウム）、錠剤崩壊剤（例えばアルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ミクロクリスタリンセルロース、ポラクリリンカリウム、アルギン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウムおよびデンプン）；錠剤滑沢剤（例えばコロイド状シリカ、コーンデンプン、タルク）；錠剤滑り剤（例えばステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、ステアリン酸およびステアリン酸亜鉛）；錠剤／カプセル不透明化剤（例えば二酸化チタン）；錠剤艶出剤（例えばカーナバワックスおよび白色ワックス）；粘度増加剤（例えばハチミツロウ、セチルアルコールおよびパラフィン）；張性剤（例えばデキストロースおよび塩化ナトリウム）；粘度上昇剤（例えばアルギン酸、ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポビドン、アルギン酸ナトリウムおよびトラガカント）；および湿潤化剤（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、レシチン、ポリエチレンソルビトールモノオレアート、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、およびステアリン酸ポリエチレン）を含む。
【０１１７】
本明細書中に記載のポリペプチドは、単独の医薬剤として、または組合わせが受け入れられない不利な作用を起こさない場合に１種もしくはそれ以上の他の医薬剤と組合わせて投与されてもよい。例えば、本発明のポリペプチドは、公知の抗肥満薬、または周知の抗糖尿病薬またはその他の指示薬剤などとならびにそれらの混和物および組合わせとして組合わすことができる。
【０１１８】
本明細書中に記載のポリペプチドは、遊離塩基形態または組成物として、研究および診断、または分析参照標準としてなどに使用されてもよい。従って、本発明は、不活性キャリヤおよび本明細書中に記載の方法で同定されたポリペプチド、またはその塩もしくはエステルの有効量を含んでなる組成物を含む。不活性キャリヤは、担持されるポリペプチドと相互作用せず、そして担持されるポリペプチドに対して支持、運搬手段、増量、追跡可能な物質、などを提供するいずれかの物質である。ポリペプチドの有効量は、実行される特定の手順に関して結果を生むかまたはそれに影響を及ぼす量である。
【０１１９】
ポリペプチドは、水性および非水性環境で、加水分解、脱アミド化、酸化、ラセミ化および異性体化を受けることが知られている。分解、例えば、加水分解、脱アミド化または酸化は、毛管電気泳動、質量分光分析、またはエドマン分解法により容易に検出できる。酵素分解にもかかわらず、長い血漿半減期または生物学的存在時間を有するポリペプチドは、少なくとも水溶液中で安定であろう。ポリペプチドは、体温で一日間に１０％未満の分解を示すことが重要である。ポリペプチドが体温で一日間に５％未満の分解を示すとさらに好ましい。慢性糖尿病患者における生涯処置のために、さらに好ましくは、治療薬剤は、それらの投与が容易であり、さらには非経口経路の場合に頻度が低いものである。体温で数週間の間の安定性（すなわち、数％未満の分解率）は、より頻度の低い投与を可能とさせる。ＤＰＰ４に関しまたは血漿中で数日から数週間の期間でのタンパク質分解による劣化に対する安定性（すなわち、数％未満の分解率）は、さらに頻度の低い投与を可能とさせる。冷凍温度での数カ年の安定性は、液体配合物での提供を製造者に可能とし、従って再構成の不便が避けられる。さらに、有機溶剤中の安定性は、ポリペプチドが埋め込みのような新規の投与剤型で配合されることも提供とする。
【０１２０】
皮下、静脈、筋肉内などに適する配合物、適合する製薬学的キャリヤ、および配合および投与の技術は、当該技術分野で周知のいずれかの方法により準備可能であろう（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．第２０版，２０００参照）。
【０１２１】
当該技術分野の通常の熟練者には、変化および変更が、本明細書中に記載の本発明の精神または範囲から外れることなく、本発明に対して実行できるとは明らかである。
【０１２２】
実施例
本発明をさらに良く理解するために、下記の実施例を記載する。それらの実施例は、説
明のためのみであり、いかなる様式でも本発明の範囲を限定すると考えてはならない。本明細書中に記載したすべての出版物は、その全体を引用することにより編入される。
【実施例１】
【０１２３】
ペプチド合成方法
下記の共通手順を本発明のいくつかのポリペプチドを合成するために採用した。
【０１２４】
ペプチド合成は、Ｒａｐｐ−Ｐｏｌｙｍｅｒｅ  ＰＥＧ−ポリスチレン樹脂（Ｒａｐｐ−Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，ドイツ）を用い、連続流条件でＦＭＯＣ／ｔ−ブチル戦略（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ  ＆  Ｄｕｎｎ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第３５巻、１９９４）により実行した。合成が完了した時点で、ペプチドを樹脂から切断しそしてＴＦＡ／ＤＴＴ／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（８５／５／５／２）を用いて脱保護した。冷ジエチルエーテルを用いて切断カクテルからペプチドを沈降させた。沈降物を冷エーテルを用いて３回洗浄し、次いで、５％酢酸中に溶解し次いで冷凍乾燥した。３％ＴＦＡを含む水／アセトニトリルを０％〜１００％アセトニトリルの勾配として使用するＷａｔｅｒｓ  ＡＬＬＩＡＮＣＥ（Ｒ）システム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上のＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱカラム（ＹＭＣ  Ｉｎｃ．Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）上の逆相クロマトグラフィー、およびＶＯＹＡＧＥＲ  ＤＥ（Ｒ）ＭＡＬＤＩ質量分光分析計（モデル５−２３８６−００、ＰｒｅＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ．ＭＡ）上のＭＡＬＤＩ質量分光分析により、ペプチドを検査した。ペプチド試料をＭａｔｒｉｘ緩衝液（５０／５０ｄＨ２Ｏ／アセトニトリル、３％ＴＦＡ含有）に１／１の比で加えた。純度基準＞９５％を満たさないペプチドは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｒｅｐ４０００ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上の逆相クロマトグラフィーにより精製した。
【実施例２】
【０１２５】
ペプチドアセチル化
ペプチドは当該技術分野で周知の標準方法を用いて合成した。ペプチドは、Ｒｉｎｋアミド樹脂上のＨＢＴＵ活性化を伴うＦＭＯＣ化学を用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａペプチド合成装置を用いて合成し、そして無水酢酸を用いてＮ末端をアセチル化した。８４．６％ＴＦＡ、４．４％フェノール、４．４％水、４．４％チオアニソール、および２．２％エタンジチオールを用いてペプチドを切断した。冷ｔ−ブチルメチルエーテルを用いて切断カクテルからペプチドを沈降させた。沈降物を冷エーテルを用いて洗浄しそしてアルゴン中で乾燥した。０．１％ＴＦＡを含み、線状の水／アセトニトリル勾配を有する逆相Ｃ１８クロマトグラフィーを用いてペプチドを精製した。ペプチド同定は、ＭＡＬＤＩおよびエレクトロスプレイ質量分光分析を用い、そしてアミノ酸分析を用いて確認した。
【実施例３】
【０１２６】
ペプチドＰＥＧ付加
生体内のペプチドの半減期は、ペプチドのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の付加を介して増加され、これにより腎臓によるペプチドのクリアランスを低下しそしてペプチドのプロテアーゼ分解を低下する。ＶＰＡＣ２受容体アゴニストペプチドの使用は、生体内の非常に短い半減期により厳しく制限されるが、しかし、ペプチドへのＰＥＧ部分の付加（ＰＥＧ付加）は、一日一回から一週間一回の処置になるために十分なほどペプチドの半減期を延長する。
【０１２７】
ＰＥＧ付加は、当該技術分野の熟練者に公知のいかなる方法で行ってもよい。しかし、本実施例では、ＰＥＧ付加はペプチド内にユニークシステイン変異を導入し、次いでペプ
チドのスルフヒドリルとメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド試薬（Ｎｅｋｔａｒ（Ｉｎｈａｌｅ／Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ），Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ；ＮＯＦ，東京、日本）のマレイミド基との間の安定なチオエーテル結合を介してシステインをＰＥＧ付加して行った。該ユニークシステインは、ＰＥＧ付加による活性の低下の可能性を低くするためにペプチドのＣ末端に導入してもよい。
【０１２８】
一つの例として、二倍モル過剰のｍＰＥＧ−ｍａｌ（分子量２２ｋＤおよび４３ｋＤ）試薬をペプチド（例えば配列番号１、ペプチドのＣ末端にシステイン変異を有する）１ｍｇに加えそしてｐＨ６の反応緩衝液（０．１Ｍ  リン酸Ｎａ／０．１Ｍ  ＮａＣｌ／０．１Ｍ  ＥＤＴＡ）中に溶解した。室温で３０分後に、ｍＰＥＧ−ｍａｌに対して２倍モル過剰のＤＴＴを用いて反応を停止した。ペプチド−ＰＥＧ−ｍａｌ反応混合物を陽イオン交換カラムに通して残留ＰＥＧ試薬を除き次いでゲル濾過カラムにより残留する遊離ペプチドを除去した。ＰＥＧ付加された部位の純度、質量および数は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析により決定した。２２ｋＤ  ＰＥＧが本発明のペプチドに付加されると、強力なＶＰＡＣ２受容体活性化が保持される。さらに，受容体活性化のＶＰＡＣ２対ＶＰＡＣ１およびＰＡＣ１選択性も保持される。より小さいＰＥＦ（例えば線状２２ｋＤ  ＰＥＧ）を用いるＰＥＧ付加はペプチドの活性を低下する傾向は低い可能性があるが、一方より大きいＰＥＧ（例えば分枝状４３ｋＤ  ＰＥＧ）は、活性を低下しやすい。しかし、より大きいＰＥＧは、血漿半減期をさらに長くして一週間に一回の注入を可能とするであろう（Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４０：５３９−５５１，２００１）。
【実施例４】
【０１２９】
製薬学的組成物−ＩＶおよびＳＣ配合物
滅菌したＩＶ注入可能配合物は、配列番号１のポリペプチド４ｍｇ、または４ｍｇポリペプチド含有量に相当する誘導体化ポリペプチド、および１Ｌの滅菌食塩水を用い、当該技術分野では周知のいずれかの製造技術を用いて調製される。ポリペプチドのより高い濃度をＳＣ配合物に使用してもよい。配列番号１または誘導体化ポリペプチドとして同定されたポリペプチドの場合に、４ｍｇを１００ｍＬの食塩水またはＤＭＳＯ中に溶解しそして無菌濾過の後に滅菌バイアルを組成物と一緒に充填する。
【実施例５】
【０１３０】
ペプチドの質量分光分析
ペプチド４０ｐｍｏｌ／２μｌアリコートを１０μｌとなるまで水を用いて希釈した。製造者の指示に基づいて、試料の５０％（２０ｐｍｏｌ／５μｌ）を条件調整したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃ１８  Ｚｉｐ  Ｔｉｐに適用してＨＥＰＥＳ緩衝液を除去した。マトリックス（１０ｍｇ／ｍｌアルファ−シアノヒドロキシケイ皮酸、５０％ＡＣＮ中、０．１％ＴＦＡ）を用いてＺｉｐ  Ｔｉｐから試料をＭＡＬＤＩプレート中に直接溶離した。レフレクター・イオン・モードで操作するＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ  ＭＡＬＤＩで試料を分析した。５００−４０００Ｄａ範囲でデータを採取しそして得られた質量を手計算で期待値と比較した。
【実施例６】
【０１３１】
ペプチドのエドマン分析
１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、５％ＴＦＡ中の１ｎｍｏｌ／１０μｌにおけるエドマン分解のためにペプチド試料を供給した。エドマン分析の前に、製造者の指示に従ってＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰｒｏＳｏｒｂ試料カートリッジを用いてＨＥＰＥＳ緩衝塩を除去した。要約すると、試料をＰＶＤＦ膜に適用しそして０．１％ＴＦＡを用いて洗浄し、次いで膜を取り除きそしてエドマン分解のためにタンパク質配列決定装置に挿入した。エドマン分解は、製造者の指示に従ってパルス液体法を用いて、Ａｐｐ
ｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９４ＨＴタンパク質配列決定システムで実行した。シーケンスコールは手で行った。
【実施例７】
【０１３２】
ペプチドの安定性
実施例４に記載の配合物を定常安定室内に置いた。ＤＰＰ４の溶液内および血漿内での分解に対する安定性に関してペプチドも分析した。ポリペプチドの分解を検出するための敏感な方法である毛管電気泳動、質量分光分析、エドマン分解、ＥＬＩＳＡ、およびペプチド活性のアッセイによる分析のために試料を定期的に取り出した。種々のピークの面積を集計しそして親ポリペプチドのピークの面積を全ピーク面積で割った。その商が純度％である。新しいポリペプチド内には不純物が存在するので、異なる時点での純度を最初の純度で割って、純度変化を正規化した。ＤＰＰ４および血漿に対する安定性に対して、２０ｐｍｏｌ／μｌのペプチドを３７℃で、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中の３００ｐＭ  ＤＰＰ−ＩＶの存在下でインキュベーションした（図２ａ）。種々の時点で、反応（２μｌアリコート）を１μＭ  ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の添加および冷凍により停止した。ＭＡＬＤＩ質量分光分析のために、Ｔ＝０時間、１時間、５時間、および２４時間の時点で評価した。結果を分解生成物と比較した不変のペプチドまたはペプチド誘導体の百分率としてプロットした。
【実施例８】
【０１３３】
ＰＡＣＡＰ１、ＶＰＡＣ１および２受容体へのペプチドの結合
ＰＡＣ１、ＶＰＡＣ１、およびＶＰＡＣ２受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞を集密となるまで培養し、それらのフラスコからかきだしそして５０ｍｌ管内のおだやかな回転でペレット化した。ペレットをＴｒｉｓに基づくホモジネーション緩衝液中に再懸濁しそして氷上で３０〜４０回の手動操作を用いてＤｏｕｎｃｅ組織グラインダー中でホモジナイズした。懸濁液を超遠心分離で分離すると、膜のペレット化をもたらした。このペレットを少量のホモジネーション緩衝液中に再懸濁しそしてＰｉｅｒｃｅからのＢＣＡキットを用いてタンパク質濃度を決定した。
【０１３４】
１０μｇ膜タンパク質、０．１ｎＭ  １２５Ｉ−ＰＡＣＡＰ２７を含む結合反応物および供試化合物の投与曲線を９６ウエルプレート内、３７℃で２０分間インキュベーションした。プレートを２０分間氷上において反応を停止した。非特異性結合を避けるために、０．１％ＰＥＩを用いて予備インキュベーションしたフィルタープレートに反応物を加え、減圧マニホルド内でプロセシングしそしてＢＳＡに基づく洗浄溶液を用いて数回洗浄した。フィルタープレートを乾燥、シンチラント添加、そしてＭｉｃｒｏＢｅｔａカウンターで読み取った。データを解析しそしてＰｒｉｓｍグラフで示した。
【実施例９】
【０１３５】
ペプチドに反応するｃＡＭＰの上昇
ＶＰＡＣ２ペプチドを発現するＣＨＯ細胞を８ｘ１０４細胞／ウエルで９６ウレルプレート中にプレーティングしそしてαＭＥＭ、ヌクレオシド、グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、５％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬ  Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐ、０．４ｍｇ／ｍＬハイグロマイシン、および１．５ｍｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中、３７℃で２４時間培養した。媒体を除きそしてプレートをＰＢＳで洗浄した。細胞をペプチドと一緒に１５分間、３７℃でインキュベーションした（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ  ７．４）中、１％ＢＳＡおよび１００μＭ  ＩＢＭＸを含む）。細胞抽出物中のサイクリックＡＭＰをｃＡＭＰ  ＳＰＡ直接スクリーニングアッセイシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて定量した。溶解物中に存在するｃＭＡＰの量は、該キットで提供される指示に従って決定された。ペプチドのそれぞれの濃度において産生されたｃＡＭＰの量（ｐｍｏｌで表す）をプロットしそしてＰｒｉｚｍソフトウエアを用いて非線型回帰分析により解析してそれぞれのペプチドについてＥＣ５０を決定した。
【０１３６】
あるいは、受容体活性化に反応するｃＡＭＰの上昇は、レポーター細胞株、例えばＣＨＯ内で測定でき、それは所望の受容体を発現するだけでなく、レポーター、例えばｃＡＭＰ反応要素（ＣＲＥ）に連結したルシフェラーゼも発現する。かかる細胞をウエル当たりに１０４細胞で９６ウエルプレートにプレーティングしそして３７℃で４８時間、αＭＥＭ、ヌクレオシド、グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、５％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬ  Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐ、０．４ｍｇ／ｍＬハイグロマイシン、および１．５ｍｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で培養した。次いで細胞をペプチドと一緒に６時間インキュベーションし、媒体を除き、そしてＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。シグナルは、シンチレーションカウンターを用いて検出した。
【０１３７】
本発明のポリペプチドはＶＩＰに基づいて設計され、それはＰＡＣ１での活性を欠損することにより示される（Ｖａｕｄｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５２：２９６−３２４，２０００）。従って、本発明のポリペプチドはＰＡＣ１に対して感知されるほどの活性を有しないと考えられる。
【０１３８】
本発明の代表的ポリペプチドを用いた本アッセイの結果を図３に示す。配列番号１および１１２として同定されるペプチドは、ＶＰＡＣ２レポーターの強力なアゴニストであり、内因性ペプチドＰＡＣＡＰ−２７により達成される受容体活性化の最高レベルの１００％まで受容体を活性化する。さらに、配列番号１、１１２、１５２および１５４として同定されるペプチドは、選択的ＶＰＡＣ２受容体アゴニストであり、ＶＰＡＣ１に対して非常に弱いアゴニスト活性を有する。ＰＡＣＡＰ−２７はＶＰＡＣ１の強力なアゴニストである。
【実施例１０】
【０１３９】
分散ラット膵島細胞からのインスリン分泌
多数の本発明のペプチドにより媒介された分散ラット膵島のインスリン分泌を以下のようにして測定した。ＳＤラット（２００〜２５０ｇ）から単離したランゲルハンス島をコラゲナーゼを用いて消化した。分散膵島細胞をトリプシンを用いて処理し、９６Ｖ底プレート中に接種し、そしてペレット化した。次いで本発明のペプチドを含むかまたは含まない媒体中で細胞を一晩培養した。媒体を吸引除去し、そして３ｍＭグルコースを含むＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ−ＨＥＰＥＳ緩衝液中で細胞を３０分間、３７℃で予備インキュベーションした。予備インキュベーション緩衝液を除去し、そして、適当な時間、ペプチドを加えるものと加えないもので、適当なグルコース濃度（例えば８ｍＭ）を含むＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ−ＨＥＰＥＳ緩衝液と共に、３７℃で細胞をインキュベーションした。一部の試験では、適当な濃度のＧＬＰ−１も含まれていた。一部分の上清を取り出しそしてそのインスリン含有量をＳＰＡにより測定した。その結果を「折り重ね対照（ｆｏｌｄ  ｏｖｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ）」（ＦＯＣ）として表現した。
【０１４０】
本アッセイにおいて、分散ラット膵島細胞からのインスリン分泌の増加は、少なくとも１．４倍の増加と定められた。本発明のポリペプチドのＶＰＡＣ２受容体アゴニスト成分は、少なくとも１．４倍から約１．７倍で分散膵島細胞からインスリンを産生した。
【実施例１１】
【０１４１】
ペプチド特異生物学的抗体の作製およびＥＬＩＳＡによるペプチド測定
本発明のポリペプチドに特異性のポリクローナル抗体を、ＡＢＩ４３３Ａペプチド合成装置を用いて本発明のポリペプチドの特異性フラグメントを合成して作製した。次いでペプチドを樹脂から切断し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ＨＰＬＣシステムを用いて精製した。Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ＭＡＬＤＩ質量分光分析システムを修正された製品を同定するために使用した。凍結乾燥機を用いてペプチドを乾燥した。次いで、Ｃｙｓ上の遊離スルフィドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）基を介してペプチド（２ｍｇ）をキーホール  リンペット  ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合した。
【０１４２】
雌ニュージーランド白ラビットを０、１４、３５、５６、および７７日目に免疫化した。０日目に、それぞれのラビットを２５０μｇペプチドおよび完全フロイントアジュバントで皮下注入した。その後の免疫化には、ラビットあたりに１２５μｇペプチドを使用した。採血は２１日目から開始しそしてその後２１日間隔で行った。抗ペプチド抗体の精製は、粗血清を特異性ペプチドアフィニティー精製カラムを通して行った。抗体力価はＥＬＩＳＡにより決定した。
【０１４３】
９６ウエルＩｍｍｕｌｏｎ  ４ＨＢＸプレートを本発明のペプチドに対して特異性であるＣ末端Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  Ｆ（ａｂ）抗体を用いて被覆し、そして一晩、４℃でインキュベーションした。次いでプレートをブロックして非特異性結合を防止した。次いで、ペプチド標準（２５００ｎｇ／ｍＬ−１６０ｐｇ／ｍＬ）を３３％血漿中で希釈しそして試料を緩衝液中１：３に希釈し、次いで室温で１．５時間のインキュベーションした。洗浄の後、本発明のペプチドに特異性のポリクローナルＮ末端抗体をプレート上で１時間インキュベーションした。次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ロバ−抗−ラビット抗体を添加しそして試料および標準をさらに１時間インキュベーションした。検出は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液と共にインキュベーションした後に評価し、そしてプレートはＯＤ４５０で読み取った（図４ａ）。
【０１４４】
あるいは、本発明のペプチドの特異性のポリクローナルＮ末端抗体を用いて、９６ウエルＩｍｍｕｌｏｎ  ４ＨＢＸプレートを被覆し、そして一晩、４℃でインキュベーションした。次いで、非特異性結合を防止するためにプレートをブロックした。次いで、ペプチド標準（２５００ｎｇ／ｍＬ−１６０ｐｇ／ｍＬ）を血漿中で５０％に希釈し、そして試料を緩衝液中で１：２に希釈し、それに次いで１．５時間、室温でインキュベーションした。洗浄の後、本発明のペプチドに特異性のモノクローナル抗ＰＥＧ抗体をプレート上で１時間インキュベーションした。次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）−抗−マウス抗体を添加しそして試料および標準をさらに１時間インキュベーションした。検出は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液と共にインキュベーションした後に評価し、そしてプレートはＯＤ４５０で読み取った（図４ｂ）。
【実施例１２】
【０１４５】
ＩＶおよび皮下投与後のペプチドの薬物動態学
血漿試料をミクロ遠心分離管に移しそして当量のアセトニトリルを試料に加えた（５０％最終濃度）。試料を約５分間強く渦動攪拌し、そして氷上に１０分間静置した。試料を再び約１分間渦動攪拌し、次いでミクロ遠心分離機で３０分間（４℃）、最高（約１５，０００ｘｇ）で遠心分離した。
【０１４６】
遠心分離の後、水相を清浄な遠心分離管に注意して移し、ミクロ遠心分離機で約５分間（４℃）、最高速度（約１５，０００ｘｇ）で試料を遠心分離した。中程度の加熱設定をしたＳｐｅｅｄ  Ｖａｃ  ＳＣ１１０（Ｓａｖａｎｔ）を用いて、抽出された試料を減圧下で乾燥するまで乾燥した。適量の滅菌水中に試料を再懸濁しそして４℃に保持した。次いで、分析の前に、試料を音波処理浴中で１０分間、室温で音波処理した。ペプチド濃度
は、実施例９に記載のようにレポーターアッセイを用いて決定した。
【０１４７】
この方法を用いて、配列番号１１２の薬物動態学的性質を配列番号１５４のものと比較した（図５ａ）。配列番号１１２上に存在するペプチドアセチル化は改善された薬物動態学的性質をを示し、それは２４時間および４８時間目に検出されたが、一方非アセチル化ペプチドである配列番号１５４は、６時間目に検出されたのみであった。それら２種のペプチドを比較するさらなる研究は、配列番号１１２がラット中で１０．９時間の半減期を有し、一方アセチル化の配列番号１５４のそれは約６時間であることを示した（図５ｂ）。
【０１４８】
血漿ペプチド濃度もＥＬＩＳＡを用いて測定し、それを実施例１１に記載した。この方法を用いて、配列番号１１２の薬物動態学をさらに検討した（図５ｃ）。イヌ中で、配列番号１１２は一週間の間、検出可能な濃度で存在していた。
【実施例１３】
【０１４９】
ラットにおける腹腔内耐糖性に対するＰＥＧ付加ペプチドの影響
皮下投与された場合の本発明のＰＥＧ付加ペプチドの生体内活性をラット内で試験した。一晩絶食したラットに対照またはＰＥＧ付加ペプチド（１〜１００μｇ／ｋｇ）を皮下注入した。３時間後に、基礎血糖を測定し、そしてラットにグルコース２ｇ／ｋｇを腹腔投与した。血糖を１５、３０、および６０分後に再度測定した。本発明のＰＥＧ付加ペプチドは、ＩＰＧＴＴ（腹腔内耐糖性試験）に従うビヒクルに関して血糖レベルを著しく低下し、グルコースＡＵＣで１７％〜２８％低下であった（図６ａ〜６ｄ）。これは、ＰＥＧ付加ペプチドが生体内で長期の血糖低下活性を有することを示す。本発明のＰＥＧ付加ペプチドの血糖低下活性に加えて、それは生体内での長いペプチド半減期も示した。ＰＡＣＡＰ−２７は、生体内で著しく短い半減期を有する（＜１０分間）。ペプチド投与後２４（図６ｂ）、４１（図６ｃ）、６５（図６ｃ）、および７２（図６ｄ）時間において血糖を低下する本発明のＰＥＧ付加ペプチドの能力は、ペプチドがその時間では循環系内に存在しそのためにＰＡＣＡＰ−２７と比較してより長い半減期を有することを明確に示す（図６ｃ）。さらに、配列番号１５４および配列番号１５５のペプチドと比較して、配列番号１１２のペプチドは、長期間、より大きい効能および効力を示す（図６ｂおよび６ｄ）。
【０１５０】
本発明のポリペプチドの活性の証明は、当該技術分野では周知の試験室内、生体外、および生体内でのアッセイを通じて得られるであろう。例えば、糖尿病および関連障害、例えば症候群Ｘ、耐糖能異常、空腹時血糖異常、および高インスリン血症、アテローム性硬化症および関連障害、例えば高トリグリセリド血症、および高コレステロール血症、および肥満の処置のための薬剤の効力を証明するために、下記のアッセイを用いてもよい。
【０１５１】
血糖レベルの測定方法
ｄｂ／ｄｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥから入手）を採血し（眼または尾血管より）そして等しい平均血糖レベルに従って群分けする。それらに経口（製薬学的に許容できるビヒクル中で強制栄養）で供試ポリペプチドを一日一回、１４日間投与する。この時点で動物を眼または尾血管より再度採血しそして血糖レベルを決定する。それぞれの場合に、血糖レベルはＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒ
Ｅｌｉｔｅ  ＸＬ（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を用いて測定する。
【０１５２】
心血管パラメーターへの効果の測定方法
血管パラメーター（例えば心拍数および血圧）も評価する。ＳＨＲラットは、ビヒクルまたは供試ポリペプチドを一日一回、２週間経口投与される。グリンゼルら（Ｇｒｉｎｓ
ｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１３：３７０−３７５，２０００）に記載のように尾部カフ法により血圧および心拍数を決定する。サルにおいては、血圧および心拍数はシェンら（Ｓｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２７８：１４３５−１４４３，１９９６）に記載のようにして測定する。
【０１５３】
トリグリセリドレベルの測定方法
ｈＡｐｏＡ１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥから入手）を採血し（眼または尾血管より）そして等しい平均血清トリグリセリドレベルに従って群分けした。それらに経口（製薬学的に許容できるビヒクル中で強制栄養）で供試ポリペプチドを一日一回、８日間投与する。次いで、動物を眼または尾血管より再度採血しそして血清トリグリセリドレベルを決定する。それぞれの場合に、トリグリセリドレベルは、Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ  Ａｘｏｎ  Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）を用いて測定する。
【０１５４】
ＨＤＬコレステロールレベルの測定方法
血漿ＨＤＬコレステロールレベルを測定するために、ｈＡｐｏＡ１マウスを採血し、等しい平均血漿ＨＤＬコレステロールレベルで群分けする。マウスは、毎日一回、ビヒクルまたは供試ポリペプチドを７日間投与され、次いで８日目に再度採血する。血漿は、Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＸ−４）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いてＨＤＬコレステロールを測定する。
【０１５５】
全コレステロール、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリド、および血糖レベルの測定方法
別の生体内アッセイでは、肥満サルを採血し、次いで一日一回ビヒクルまたは供試ポリペプチドを４週間経口投与し、次いで再度採血する。血清は、Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＸ−４）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて全コレステロール、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリド、および血糖を測定する。リポタンパク質サブクラス分析は、オリバーら（Ｏｌｉｖｅｒ
ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：５３０６−５３１１，２００１）に記載のようにしてＮＭＲ分析により行う。
【０１５６】
上記の明細中に言及したすべての出版物および特許は、引用することにより本明細書に編入される。記載の本発明の組成物および方法の種々の変更および変化が、本発明の範囲および精神から外れることなく当該技術分野の熟練者には明らかである。本発明は特定の好ましい態様に関連して記載されているが、請求される本発明はかかる特定の態様に不当に限定されるべきではないことを理解するべきである。実際に、生化学または関連分野の当該技術分野の熟練者には明らかな本発明を実施するための上記の態様の種々の変更が、以下の請求範囲内にあると考える。当該技術分野の熟練者は、慣用の範囲内の実験を利用して、本明細書中に記載の本発明の特定の態様に対して多数の等価なものを認め、または確認できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１ａ−１ｄ】配列番号１〜１４８のポリペプチドのアミノ酸配列を記載する。配列番号１１２〜１４８は、マレイミド連結を介するＣ末端システインでＰＥＧ付加されたペプチドを示す。ＰＥＧは、いかなる長さ、例えば２２ｋＤ線状ＰＥＧまたは４３ｋＤ分枝状ＰＥＧまたはそれより大きくてもよい。
【図１ｅ】関連するペプチド標準である。
【図２ａ−２ｂ】ＤＰＰ４によるタンパク質分解切断に対するＶＰＡＣ２類似体の安定性を示す。
【図３】ＶＰＡＣペプチドで処理された細胞のｃＡＭＰ反応を示す。
【図４ａ−４ｂ】ペプチド検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図５ａ−５ｃ】ＶＰＡＣペプチドの薬物動態学的性質を示す。
【図６ａ−６ｄ】生体内効力を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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