(57)【要約】  本発明は、マトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）に対する阻害能及びダウンレギュレーション能を有する新規な物質、該新規物質を含む医薬組成物、癌細胞に対するリポソームのターゲッティングを向上させる方法、新規なマトリックスメタロプロティナーゼ阻害性物質を包含する医薬用及び研究用の製剤、in vivoまたはin vitroにおいてＭＭＰ依存性の病態を阻害及びダウンレギュレートする方法、マトリックスメタロプロティナーゼの触媒活性及び非触媒活性のみならずマトリックスメタロプロティナーゼの活性化及び／又は機能を阻害する方法、並びにＭＭＰ阻害能及びダウンレギュレーション能を有する該新規物質を用いた、マトリックスメタロプロティナーゼを生化学的に単離及び精製する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のペプチドモチーフ：
ＣＧ（Ａｒ）ＧＲ（Ａｒ）（Ｓ／Ｑ）ＰＰＣ
（式中、ＡｒはＰｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒからなる群より選ばれる任意の芳香族アミノ酸残基を表す。）、
又は下記のペプチドモチーフ：
ＣＲＸＹＧＰＸＸＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。）
を有するペプチドを含む、マトリックスメタロプロティナーゼの触媒活性及び非触媒活性に対する阻害能及びダウンレギュレーション能を有する物質。
【請求項２】
該ペプチドモチーフがＣＧＹＧＲＦＳＰＰＣであることを特徴とする、請求項１に記載の物質。
【請求項３】
該ペプチドモチーフがＣＲＶＹＧＰＹＬＬＣであることを特徴とする、請求項１に記載の物質。
【請求項４】
マトリックスメタロプロティナーゼに対する阻害能及びダウンレギュレーション能を有する請求項１〜３のいずれかの物質と、薬学的に許容される担体とを包含する医薬組成物。
【請求項５】
マトリックスメタロプロティナーゼに対する阻害能及びダウンレギュレーション能を有する請求項１〜３のいずれかの物質を包含する、マトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）依存性の病態に対する治療用医薬組成物。
【請求項６】
該ＭＭＰ依存性の病態が、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９からなる群より選ばれる少なくとも１種のＭＭＰに依存性の病態であることを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
メリフィールド固相ペプチド合成法によるペプチド合成工程を含む、マトリックスメタロプロティナーゼに対する阻害能及びダウンレギュレーション能を有する請求項１の物質の製造方法。
【請求項８】
哺乳動物におけるマトリックスメタロプロティナーゼ依存性の病態を治療または予防する方法であって、哺乳動物に対して請求項１〜３のいずれかの物質を、ＭＭＰの活性化、ＭＭＰの発現及びＭＭＰの機能からなる群より選ばれる少なくとも１種を該哺乳動物において阻害もしくはダウンレギュレートするのに有効な量で投与することを含む方法。
【請求項９】
該マトリックスメタロプロティナーゼ依存性の病態が、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９からなる群より選ばれる少なくとも１種に依存性の病態であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物におけるマトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）の活性化、ＭＭＰの発現、ＭＭＰの機能及びＭＭＰの作用の阻害方法であって、哺乳動物に対して請求項１〜３のいずれかの物質を、ＭＭＰの活性、ＭＭＰの活性化及びＭＭＰの作用を妨げるのに有効な量で投与することを含む方法。
【請求項１１】
該マトリックスメタロプロティナーゼが、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９からなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
マトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）をin vitroで阻害又はダウンレギュレートする方法であって、ＭＭＰの活性を阻害もしくはダウンレギュレートするのに有効な量の請求項１〜３のいずれかの物質を、in vitroの系に加えることを含む方法。
【請求項１３】
阻害又はダウンレギュレートするマトリックスメタロプロティナーゼが、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
マトリックスメタロプロティナーゼに対する阻害能及びダウンレギュレーション能を有する請求項１〜３のいずれかの物質を用いた、マトリックスメタロプロティナーゼを生化学的に単離及び精製する方法。
【請求項１５】
マトリックスメタロプロティナーゼに対する阻害能及びダウンレギュレーション能を有する請求項１〜３のいずれかの物質を用いた、腫瘍細胞に対するリポソームのターゲッティングを向上させる方法。
【請求項１６】
該腫瘍細胞がマトリックスメタロプロティナーゼを発現する腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）の活性に対する阻害能を有する新規な物質、このような阻害性物質を含む医薬組成物、新規なマトリックスメタロプロティナーゼ阻害性物質を包含する医薬用及び研究用の製剤、in vivoまたはin vitroにおいてＭＭＰ依存性の病態を阻害及びダウンレギュレートする方法、マトリックスメタロプロティナーゼの触媒活性及び非触媒活性を阻害する方法、並びに新規なＭＭＰ阻害性物質を用いた、マトリックスメタロプロティナーゼを生化学的に単離及び精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロティナーゼ（matrix metalloproteinase）（ＭＭＰ）は、細胞の動きを制限する細胞外マトリックス及び基底膜の構成成分のほぼ全てを分解することができる、遺伝学的に密接に関連したタンパク質加水分解酵素のスーパーファミリーを構成する。ＭＭＰは更に、セルピン、サイトカイン及び増殖因子のみならず、ある種の細胞表面成分のプロセシングを行う。ＭＭＰは、形態形成並びに創傷治療、栄養膜細胞の移植、及び子宮内膜性の月経困難症などの生理的局面における組織の再構築及び細胞遊走の仲介において重要な役割を果たすと考えられている。ＭＭＰはさらに、組織の再構築、血管新生、並びにサイトカイン、増殖因子、インテグリンやそれらの受容体のプロセシングといった分子現象の調整及び修飾に関与する。ＭＭＰはまた、細菌毒性因子誘導性の単核細胞による腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）の放出と膜結合性タンパク質分解プロセシングを仲介する。この現象は、膜結合性のメタロプロティナーゼＴＡＣＥ（ＴＮＦ−α活性化酵素）によって仲介される。このようにＭＭＰ阻害性物質、例えば本発明で提供する新規ペプチドは、この種の活性化酵素をブロックすることによって関節内（i.a.）でＴＮＦ−αの活性化を防ぐことができる（例えば、米国特許第6,624,144号（Koivunen et al）を参照）。
【０００３】
ゼラチナーゼとしても知られるマトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）−２及び−９は、発生のみならず、炎症や癌等の病態においても細胞遊走や組織の再構築に重要な役割を果たす（１）。我々がゼラチナーゼに対して高い選択性を示すペプチド阻害剤であるＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（ＣＴＴ）をファージディスプレイ法によって同定した（２）のに対し、他の研究者たちは上記酵素を特異的にターゲッティングするためのゼラチナーゼ選択性低分子阻害剤を開発した（３）。
【０００４】
ゼラチナーゼに特有の構造的特徴は触媒ドメイン内に存在するコラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）である（４）。ＣＢＤは３つのフィブロネクチンII型繰り返し配列からなり、ゼラチナーゼ特異的な化合物を開発する際の興味深いターゲットである。大部分のＭＭＰのように、ゼラチナーゼもＣ末端ヘモペキシン/ビトロネクチン様ドメイン（C-terminal-hemopexin/vitronectin-like domain）（Ｃドメイン又はＰＥＸ）を含有し、このドメインは、マトリックスメタロプロティナーゼに対する組織性の阻害性物質（tissue inhibitors for matrix metalloproteinases）（ＴＩＭＰ）の結合部位を含み、ＭＭＰ−９の二量体化を司るものである（５）。
【０００５】
ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９は密接に関連した酵素であるが、発現、活性化及びグリコシル化の調節と基質選択性において異なっている（１、４）。これら２種の酵素のうち、ＭＭＰ−２のほうがより詳細に研究されている。例えば、ｐｒｏ−ＭＭＰ−２の活性化は詳細に特徴付けられており、ＴＩＭＰ−２、ＭＴ１−ＭＭＰ及びαvβ3インテグリンの細胞表面における相互作用が関与することもわかっている（６、７）。ＭＭＰ−９は同様のメカニズムでは活性化されないことが知られており、プラスミン/ＭＭＰ−３カスケード（８）やトリプシン−２（９）を含む数種のプロティナーゼがin vitroでＭＭＰ−９を活性化することができる。
【０００６】
細胞表面で生じるＭＭＰ−９の相互作用に関与する分子の詳細や、このような相互作用が細胞遊走をどのように調節するかについては、比較的少しのことしか知られていない。ＭＭＰ−９は、α5β1インテグリン、IV型コラーゲンのα2鎖及びヒアルロナン受容体ＣＣ４４と相互作用することが知られている（１０、１１）。我々は、ｐｒｏ−ＭＭＰ−９の結合相手として白血球特異的なβ2-インテグリンを最近同定した。ファージディスプレイペプチドであるＡＤＧＡＣＩＬＷＭＤＤＧＷＣＧＡＡＧ（ＤＤＧＷ）は、αMインテグリンサブユニットのリガンド結合性Ｉドメインに対して結合するｐｒｏ−ＭＭＰ−９と競合し、白血球の遊走を阻害した（１２）。本発明において我々は、基質の結合又は酵素前駆体の活性化を阻害し、その結果として細胞の遊走と浸潤を阻害する、ＭＭＰ−９結合ペプチドを単離した。これらのペプチドを用いて、我々はフィブロネクチン、ビトロネクチン及びαvβ5インテグリンのＭＭＰ−９相互作用部位を同定した。
【０００７】
癌、転移性癌、慢性間接リウマチ、多発性硬化症、歯周炎、骨粗鬆症、骨肉腫、骨髄炎、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患、皮膚病、眼病などの多様な疾患においては、ＭＭＰの発現と活性が身体の内因性抗プロティナーゼ保護機構を超えて病理学的に上昇していることが数件の研究によって示されている。タンパク質分解酵素、特にＭＭＰはこれらの病態に関連した組織破壊による損傷に寄与すると考えられている。
【０００８】
この他にも、細胞外タンパク質の分解や破壊が顕著な役割を果たしている疾患が多数存在する。このような疾患の例としては、関節炎疹、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、熱傷、褥瘡や静脈瘤性潰瘍などの創傷、骨折、外傷、炎症、胃潰瘍、座瘡や乾癬などの皮膚病、苔癬様病変、表皮水疱症、アフタ（反応性口内潰瘍）が挙げられ、その他にも歯周病、インプラント周囲炎、顎骨や他の嚢胞や歯根管の治療又は歯内治療などに関連する疾患、外因性や内因性の歯根吸収、齲食などの歯科疾患も挙げられる。
【０００９】
数種のＭＭＰ阻害性物質が存在し研究されているが（詳細については、米国特許第6,624,144号（Koivunen et al）を参照）、試験はもっぱら実験段階であり、潜在的にＭＭＰと関連している病態や疾患に対する治療薬や予防薬として臨床において許容されるＭＭＰ阻害性物質は存在しない。さらにＭＭＰ阻害性物質に対して検出された有害な副作用としては、例えば、毒性（合成ペプチド）や抗菌活性（テトラサイクリン）等が挙げられる。従って、この分野においては、新規治療剤として有望なＭＭＰ阻害性化合物の候補が常に求められている。
【００１０】
発明の詳細な説明 
本明細書で用いる略号の意味は以下の通りである：ＭＭＰ、マトリックスメタロプロティナーゼ（matrix metalloproteinase）；ＣＢＤ、コラーゲン結合ドメイン（collagen binding domain）;Ｃドメイン、Ｃ末端ヘモペクシン様ドメイン；ｐｒｏ−ＭＭＰ−９−ΔＨＣ、ヒンジ領域とＣドメインを欠いたｐｒｏ−ＭＭＰ−９；ＴＩＭＰ、ＭＭＰに対する組織性阻害物質；ｕＰＡ、ウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性化因子；ｕＰＡＲ、ｕＰＡ受容体；ＣＴＴ、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチド；ＣＲＶ、ＣＲＶＹＧＰＹＬＬＣペプチド；ＰＰＣ、ＡＤＧＡＣＧＹＧＲＦＳＰＰＣＧＡＡＧペプチド；ＤＤＧＷ、ＡＤＧＡＣＩＬＷＭＤＤＧＷＣＧＡＡＧペプチド；ＰＤＢｕ、ホルボールエステル；ＶＮ、ビトロネクチン；ＦＮ、フィブロネクチン。
【００１１】
侵襲細胞の遊走は、インテグリンを介して細胞表面に結合したマトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）に依存するようである。我々は、以前、インテグリンα−サブユニットのＩドメインとＭＭＰ−９触媒ドメインとの間に相互作用が存在することを証明した。今回、我々は、インテグリンβ−サブユニットとＭＭＰ−９との間にも相互作用が存在することを証明する。我々は、ファージディスプレイ法を用いて、ＭＭＰ−９触媒ドメイン、コラーゲン結合ドメイン又はＣ末端ヘモペクシン様ドメインに結合する、ＭＭＰ−９阻害性物質を開発した。Ｃ末端ヘモペクシン様ドメインに結合するペプチド（Ｃ末端ドメイン結合性ペプチド）はインテグリンβ鎖のストーク領域（stalk）に存在する活性化エピトープを模倣して、ＭＭＰ−９Ｃ末端ドメインとαvβ5インテグリンとの結合を阻害する。他のＭＭＰ−９結合性ペプチドとは異なり、上記Ｃ末端ドメイン結合性ペプチドは、直接ＭＭＰ−９の触媒活性を阻害しないが、in vitroにおける酵素前駆体の活性化及び細胞遊走、更にはin vivoにおける腫瘍異種移植片の成長を防止する。また、我々は、ＭＭＰ−９とウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）とが結合すること、そしてＭＭＰ−９がｕＰＡＲを開裂させることを発見した。上記のことを纏めると、我々は、異なる種々のＭＭＰ−９ドメインが仲介する幾つかの相互作用に関して、関与分子の詳細を特定したのである。
【００１２】
従って、本発明の目的は、下記のペプチドモチーフ（配列表の配列番号１及び２に示す配列に対応）：
ＣＧ（Ａｒ）ＧＲ（Ａｒ）（Ｓ／Ｑ）ＰＰＣ
（式中、ＡｒはＰｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒからなる群より選ばれる任意の芳香族アミノ酸残基を表す。）、
又は下記のペプチドモチーフ（配列表の配列番号３に示す配列に対応）：
ＣＲＸＹＧＰＸＸＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。）
を有するペプチドを含む、マトリックスメタロプロティナーゼに対する阻害性物質及び結合リガンドとして機能する新規な物質を提供することである。
【００１３】
本発明は、また、少なくとも１種のＭＭＰ（特にＭＭＰ−２及び／又はＭＭＰ−９）の活性、該ＭＭＰの活性化、該ＭＭＰの機能及び該ＭＭＰの発現からなる群より選ばれる少なくとも１種を阻害もしくはダウンレギュレートするのに有効な量の該新規物質（マトリックスメタロプロティナーゼに対する阻害能及びダウンレギュレーション能を有する新規な物質（以下屡々単に「ＭＭＰ阻害性物質／ダウンレギュレーター」（ＭＭＰ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）と称す））と薬学的及び生物学的に許容される担体とを包含する医薬組成物に関する。本発明のＭＭＰ阻害性物質／ダウンレギュレーターを含む医薬組成物は、全身的、局所的及び／又は局部的に使用することができる。該医薬組成物には、他のＭＭＰ阻害剤、他の薬剤、及び腫瘍ホーミング薬品又は分子などと新規なＭＭＰ阻害性物質を可能な全ての組み合わせで組み合わせたもの（混合薬）も含まれる。
【００１４】
また、本発明は、上記した新規なＭＭＰ阻害性物質を包含する、ＭＭＰ依存性の病態に対する治療用医薬製剤、及び該医薬製剤を、例えばＭＭＰに対する親和性リガンドとして用いて、ＭＭＰを生化学的に単離及び精製する方法にも関する。上記のＭＭＰ依存性の病態としては、創傷、熱傷、骨折、外傷、炎症、潰瘍、癌、結合組織及び骨における癌及び癌転移の進行、歯周炎、歯肉炎、インプラント周囲炎、嚢胞、歯根管の治療、外因性や内因性の歯根吸収、齲食、ＡＩＤＳ、角膜潰瘍、胃潰瘍、アフタ、外傷、座瘡、乾癬、骨内における人工股関節のゆるみ、骨髄炎、骨粗鬆症、組織再編成、血管新生、関節炎疹（リウマチ、反応性及び変形性の関節症など）、肺病（気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
また、本発明は、標準的なメリフィールド固相ペプチド合成法によるペプチド合成工程を含む、上記した新規なＭＭＰ阻害性物質／ダウンレギュレーターの製造方法に関する。
【００１６】
本発明において特に好ましいＭＭＰ剤は、以下のペプチド阻害性物質：ＣＧＹＧＲＦＳＰＰＣ及びＣＲＶＹＧＰＹＬＬＣであり、これらは後述する実験において示すようにｐｒｏ-ＭＭＰ-９の活性を阻害する。
【００１７】
我々が開発した、新規なペプチド阻害性物質は、ＭＭＰ及び細胞遊走を阻害するペプチドミメティックスをデザインする際の先導化合物（lead compounds）として有用である。上記のペプチドモチーフは、ＭＭＰファミリーの個々の酵素に対するより選択的な阻害性物質の開発に使用することもできる。更には、ＭＭＰを標的とする上記ペプチドが低分子であることを利用して、薬剤を腫瘍に移送するために上記ペプチドを用いることもできる。また、腫瘍脈管構造に存在する受容体を標的とするファージライブラリー由来のペプチドは、マウス体内の腫瘍に対して細胞傷害性薬剤の有用なキャリアーであることを見出した。ＭＭＰは、通常、正常組織と比較して腫瘍において過剰に発現されており、また、血管形成の過程に関与していると思われるため、ターゲット化学療法における潜在的な受容体である。
【００１８】
即ち、本発明は、ペプチドモチーフＣＧ（Ａｒ）ＧＲ（Ａｒ）（Ｓ／Ｑ）ＰＰＣ（Ａｒは任意の芳香族アミノ酸残基）、又はペプチドモチーフＣＲＸＹＧＰＸＸＣ（Ｘは任意のアミノ酸残基）を用いて、腫瘍細胞に対するリポソームのターゲッティングを向上させる方法、又は腫瘍細胞によるリポソームの取り込みを増加させる方法に関する（そのような方法の詳細については、ＷＯ０２０７６４９１参照）。
【００１９】
上記のように、本発明においては、該新規なＭＭＰ阻害性物質を単独で、又は本発明で問題にしている疾患及び障害に関連して通常用いられている他の薬剤と組み合わせて使用することによってＭＭＰ依存性の病態の治療及び予防が可能になった。上記の他の薬剤の例としては、インテグリン結合ペプチドなどの腫瘍部位に対するホーミング分子又はキャリアー分子（Arap et al., 1998）のみならず、テトラサイクリン、化学変性されたテトラサイクリン（Golub et al., 1992）、ビスホスホネートなどが挙げられる。本発明の医薬組成物における上記の新規なＭＭＰ阻害性物質の使用量は、投与方法のみならず阻害性物質の種類、患者、治療する疾患などにより異なる。
【００２０】
本発明の新規なＭＭＰ阻害性物質は、動物に注射した際に毒性を示さず、細胞数及び細胞生存率に影響を与えない。
【００２１】
上記のように、本発明は、該新規なＭＭＰ阻害性物質／ダウンレギュレーターを、哺乳動物におけるＭＭＰの生成、活性化及び作用を阻害するのに有効な量を投与することにより、該哺乳動物におけるＭＭＰの生成、合成や発現、ＭＭＰの活性化、及びＭＭＰの機能や作用を阻害する方法のみならず、哺乳動物に、該新規なＭＭＰ阻害性物質を有効量投与することにより、該哺乳動物のＭＭＰ依存性の病態を治療又は予防する方法にも関する。
【００２２】
更に、本発明は、該新規なＭＭＰ阻害性物質／ダウンレギュレーターを、哺乳動物におけるＴＨＰ−１細胞の活性化及びＴＨＰ−１細胞活性を阻害するのに有効な量投与することにより、哺乳動物におけるＴＨＰ−１細胞の活性化、機能及び作用を阻害する方法のみならず、哺乳動物に、本発明の該新規なＭＭＰ阻害性物質を有効量投与することにより、ＴＨＰ−１依存性の病態（炎症など）を治療及び予防する方法に関する。
【００２３】
更に、本発明は、ＭＭＰをin vitroで阻害する方法であって、ＭＭＰの活性を阻害するのに有効な量の該新規なＭＭＰ阻害性物質を、in vitroの系に加えることを含む方法に関する。
【００２４】
本発明の更なる目的は、該新規なＭＭＰ阻害性物質を用いて、ＭＭＰを単離及び精製する方法を提供することである。
【００２５】
なお本明細書中、発明の背景技術を説明するため、また、特に本発明の実施態様に関する詳細を補うために言及又は使用する各種刊行物及びその他の文献は、言及したことにより本明細書中に組み込まれたものとする。以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例】
【００２６】
ファージディスプレイ  ファージディスプレイによる選択を、ランダムペプチドライブラリーであるＣＸ7-10ＣとＸ9-10（１３）を用いて行った。精製したヒトｐｒｏ−ＭＭＰ−９（９）又は組み換えＭＭＰ−９ Ｃドメイン（２μｇ／ｍｌ）をマイクロタイターウェルに固定し、ウェルをＢＳＡでブロックした。ファージを、５０ｍＭ Hepes（ｐＨ７．５）／５ｍＭ ＣａＣｌ2／１μＭ ＺｎＣｌ2／１５０ ｍＭ ＮａＣｌ／２％ ＢＳＡに加えた。選択工程を３回行った後に、ファージの配列を決定した（１４）。ファージの結合特異性はｐｒｏ−ＭＭＰ又は組み換えドメイン（２０ｎｇ／ウェル）を用いて試験した。ファージ（１０8形質導入単位／ウェル）を、競合ペプチド（２０μＭ）、ゼラチン（２．５μｇ／ｍｌ）又はＴＩＭＰ−１（２．５μｇ／ｍｌ、Calbiochem製）の存在下又は非存在下で結合せしめ、その後、ＰＢＳ／０．０５％ Tween20（ＰＢＳＴ）で洗浄した。ファージは、ペルオキシダーゼ標識抗ファージ抗体（Amersham Bioscience製）を用いて検出した。
【００２７】
ペプチド合成  ファージペプチドは、初めにインテイン融合体を用いた組み換えペプチドとして作製した（１２、１５）。化学的なペプチド合成はＦｍｏｃ化学を用いて行い、ペプチドの純度と完全性は質量分析で検証した（１５）。ＣＲＶペプチドとＤＤＧＷペプチド以外のペプチドは水に溶解し、ＣＲＶペプチドとＤＤＧＷペプチドは１０ｍＭの濃度になるように５０ｍＭ ＮａＯＨに溶解した後にｐＨを中性にするためにＰＢＳで希釈した。ＴＴＰＮＳＬＬＶＳＷＱＰＰＲＡＲＩＴペプチドとＡＤＩＭＩＮＦＧＲＷＥＨＧＤＧＹＰＦペプチドはセルロースメンブラン上で合成した。セルロースメンブランは３％ ＢＳＡのＴＢＳ／０．０５％ Tween20溶液でブロックし、０．２μｇ／ｍｌのビオチン化ＣＢＤとインキュベートした。結合したＣＢＤは、ペルオキシターゼ標識ストレプトアビジン（１：１００００希釈、Pierce製）と化学ルミネセンスを用いた検出方法て検出した。
【００２８】
ＭＭＰ及びインテグリンドメインの発現  ＣＢＤ（アミノ酸 Gly204-Gly373）は、NdeI制限部位とPstI制限部位を導入するオリゴヌクレオチドである５’−ＧＧＣＧＧＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＡＡＣＧＣＡＧＡＴＧＧＣＧＣＧ−３’と５’−ＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＣＣＴＴＧＧＴＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＧ−３’を用いて、ＭＭＰ−９のｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物は、ｐＴＷＩＮベクター（New England Biolabs製）に連結した。ＣＢＤを大腸菌で発現させ、ゼラチン−セファロース（Amersham Biosciences製）を用いて精製した。数件の実験においては、ＣＢＤをスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを用いてビオチン化した（Pierce）。ＭＭＰ−２のＣ末端ドメイン（Glu438-Cys631）及びＭＭＰ−９のＣ末端ドメイン（Asp494-Asp688）を文献（１６）の記載に従って発現させた。Ｐｒｏ−ＭＭＰ−９−ΔＨＣ（Ala1-Gly424）は、オリゴヌクレオチドである５’−ＧＧＣＧＧＣＣＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧ−３’と５’−ＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＣＣＡＴＡＧＡＧＧＴＧＣＣＧＧＡＴＧＣ−３’を用いてクローニングし、ＮｄｅＩとＰｓｔＩを用いて消化し、ｐＴＷＩＮベクターに連結した。タンパク質は、尿素で可溶化することによって封入体から精製し、アルギニンの存在下でリフォールディングし、ゼラチン−セファロースを用いて精製した。インテグリンβ5Ｉ−ＥＧＦ２＋３断片（Glu476-Asn563）は、オリゴヌクレオチドである５’−ＧＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧ−３’と５’−ＧＧＴＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＧＣＧＴＴＡＣＡＧＴＴＧＴＣＣＣＣＧ−３’を用いてβ5インテグリンｃＤＮＡからクローニングし、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで消化し、ｐＨＡＴ２ベクターに連結した。Ｎ末端にＨｉｓ６タグを有するタンパク質を大腸菌で発現させ、可溶型タンパク質をＮｉ2+アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。Ｋ５４２ＡとＹ５４４Ａ変異体であるβ5Ｉ−ＥＧＦ２＋３構築物は部位特異的突然変異で作製した。全ての構築物の完全性をＤＮＡシークエンシングで検証した。
【００２９】
ゼラチナーゼ阻害アッセイ  アミノフェニル水銀アセテート（ＡＰＭＡ）活性化ＭＭＰ−２とトリプシン活性化ＭＭＰ−９の阻害を、ビオチン化ゼラチンを基質に用いて行った（１５）。
【００３０】
ゼラチン結合アッセイとＣＢＤ結合アッセイ  組み換えＣＢＤ又はヒト血漿フィブロネクチン（Calbiochem製）（０．２μｇ／ｍｌのＴＢＳ溶液）をマイクロタイターウェルに固定した。ウェルを１％ ＢＳＡ−ＰＢＳＴで飽和した。ビオチン化ゼラチン（０．２μｇ／ｍｌの１％ ＢＳＡ−ＰＢＳＴ溶液）は、記載した濃度のペプチドと共に又はペプチドなしで添加するか、あるいは過剰量の非標識ゼラチン（１０μｇ／ｍｌ）と共に添加し、１時間結合せしめた。結合したゼラチンはストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて検出した。固定したフィブロネクチン、フィブロネクチンの１１０−ｋＤａ断片（Upstate Biotechnology製）又は尿素変性したヒト血漿ビトロネクチン（１７）（１μｇ／ウェル）に対するＣＢＤの結合を、ビオチン化ＣＢＤ（５μｇ／ｍｌ）の１％ ＢＳＡ−ＰＢＳＴ溶液を用い、２０μＭのペプチドの存在下又は非存在下で検討した。
【００３１】
ＭＭＰ−９のＣドメインの二量体化  組み換えＣドメイン又はＣＢＤのＰＢＳ溶液（濃度：５μｇ／ｍｌ）をマイクロタイターウェルにコートし、次いで１％ ＢＳＡ−ＰＢＳＴでブロックした。125Ｉ標識Ｃドメインを１％ ＢＳＡ−ＰＢＳＴ中でペプチドと共に３０分間プレインキュベートし、その後ウェルに加えた。２時間インキュベートした後、ウェルを洗浄した。結合した放射能を１％ ＳＤＳで溶出し、ガンマ線測定器で計測した。
【００３２】
細胞培養  ヒトＨＴ１０８０繊維肉腫、単球細胞ＴＨＰ−１及びＨＳＣ−３舌部扁平上皮腫瘍細胞を文献（２、１４、１８）の記載に従って維持した。野生型及びβ5インテグリンでトランスフェクトしたＣＳ−１ハムスター黒色腫細胞は、スクリップス研究所（Scripps Research Institute）のデビッド チェレッシュ（David Cheresh）博士の好意により提供されたものであり、文献（１９）の記載に従って維持した。細胞生存率はＭＴＴ（臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニールテトラゾリウム）アッセイ（Roche製）を用いて計測した。
【００３３】
細胞接着  ＨＴ１０８０細胞を、ペプチド（２００μＭ）、タンパク質（４０μｇ／ｍｌ）又は抗αvβ5インテグリンモノクローナル抗体であるＰ１Ｆ６（Chemicon製）、あるいは対照抗体（２５μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、ビトロネクチン又はフィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ）に接着せしめた。細胞接着は文献（１４）の記載に従って定量した。固定したＫＩＭ１２７抗体又は対照モノクローナル抗体（２μｇ／ｍｌ）へのＴＨＰ−１細胞の接着は、可溶性タンパク質（５０μｇ／ｍｌ）または抗体（２５μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で行った。
【００３４】
細胞遊走及び浸潤  細胞遊走アッセイは、トランスウェル遊走チャンバー（transwell migration chamber）（ポアサイズ：８μｍ、Costar製）を用いて、１０％血清含有培地中で行った（２、１４）。簡単に説明すると、メンブランの両面を４０μｇ／ｍｌのＧＳＴ又はβ2インテグリンリガンドペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣ−ＧＳＴ融合ペプチド（ＧＳＴ−ＬＬＧ−Ｃ４）でコートし、完全培地でブロックした。ＴＨＰ−１細胞（５０，０００細胞／１００μｌ）をペプチドと共に血清含有培地中で１時間プレインキュベートした。細胞を１６時間にわたって遊走せしめ、クリスタルバイオレットで染色して計数した（１４）。ＨＴ１０８０（２０，０００細胞／１００μｌ）による浸潤アッセイは、マトリゲル（Matrigel）でコートしたトランスウェル（BD Biosciences製）を使用する以外は、上記のＴＨＰ−１遊走アッセイと同様に行った。
【００３５】
細胞周囲のタンパク質分解  マイクロタイターウェルをフィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ標識ゼラチン（１００μｇ／ｍｌ）の混合物でコートした後、１％ ＢＳＡのＰＢＳ溶液で飽和した。ＨＴ１０８０細胞（１００μｌの０．１％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭ中に５０，０００細胞）を、２０ｎＭ ＰＤＢｕ（４β-ホルボール−１２，１３−ジブチレート、Sigma Aldrich製）とペプチド又はＭＭＰ−２／ＭＭＰ−９選択的阻害剤ＩｎｈＩ（Calbiochem製）の存在下でインキュベートした。対照としては、活性化されていない細胞及び細胞が存在しない培地を使用した。４８時間後のゼラチン分解を、調整培地から得た５０μｌの部分標本における蛍光強度の増加として、Wallac Victor2リーダーを用いて計測した。
【００３６】
白血球αMインテグリンへのｐｒｏ−ＭＭＰ−９及びゼラチンの結合  ペプチド存在下におけるαMＩドメインへのｐｒｏ−ＭＭＰ−９の結合を、文献（１２）の記載に従って検討した。ＴＢＳ／１ｍＭ ＣａＣｌ2／１ｍＭ ＭｇＣｌ2溶液であるインテグリンαMβ2（１２）又は対照となるαIIbβ3（インディアナ州、サウスベンド、Enzyme Research Laboratories製）を固定し（１μｇ／ウェル）、次いで１％ ＢＳＡのＰＢＳＴ溶液でウェルを飽和することで、Ｐｒｏ−ＭＭＰ−９／αMβ2インテグリン複合体へのゼラチンの結合を検討した。Ｐｒｏ−ＭＭＰ−９（１００ｎｇ／ウェル）は２時間インキュベートし、結合していないｐｒｏ−ＭＭＰ−９は洗浄して除去した。ビオチン化ゼラチン（２．５μｇ／ｍｌ）を室温で３０分間結合せしめた。結合したゼラチンは、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて検出した。
【００３７】
ＭＭＰ−９の活性化  ＴＨＰ−１細胞（４０，０００／１００μｌ）又はコンフルエントなＨＴ１０８０細胞を、特に記載のある場合を除き、２．５μｇ／ｍｌ プラスミノーゲン、０．５μｇ／ｍｌ ｐｒｏ−ＭＭＰ−３（Oncogene Research Products製）、４０ｎＭ ＰＤＢｕと終濃度２００μＭのペプチドの存在下又は非存在下で１６時間インキュベートした。調整培地の部分標本をゼラチンザイモグラフィー（９）で分析した。ＭＭＰ−９をＭＭＰ−３（酵素対基質比が１：５）によってin vitroで活性化した。活性化は、２００μＭのＣＲＶ又はスクランブルペプチドの存在下または非存在下で、５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ７．５）／５ｍＭ ＣａＣｌ2／１μＭ ＺｎＣｌ2／０．０２％ ＮａＮ3／０．０１％ Tween20溶液中で、＋３７°Ｃで１時間行った。サンプルはゼラチンザイモグラフィーで分析した。
【００３８】
免疫沈降とウエスタンブロッティング  ＨＴ１０８０細胞を５０ｎＭのＰＤＢｕを用いて無血清培地中で３時間活性化し、ＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ８．０）／１４０ｍＭ ＮａＣｌ／１％ Triton X-100／１ｍＭ ＰＭＳＦ中で溶解した。１ｍｇのタンパク質を、４μｇの抗ｕＰＡＲ（３９９Ｒ、コネティカット州、グリニッジ、American Diagnostica製）、抗ＭＭＰ−９（Ｈ−１２９、SantaCruz Biotechnology製）又は対照ＩｇＧを用いた免疫沈降に付した。インテグリンは、２μｌの抗インテグリン細胞質ドメイン抗血清（２０）を用いた免疫沈降に付した。免疫沈降物は８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で展開し、次いでブロッティングを行い、抗ＭＭＰ−９抗体で検出した。
【００３９】
免疫蛍光分析  ＨＴ１０８０細胞を無血清のＤＭＥＭ中でビトロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）に接着せしめた。０．５％アガロースを含むＤＭＥＭを重層し、ウェルの一端からＰＤＢｕと共に５μｌのＦＢＳ（終濃度２０ｎＭ）を加えることによって、細胞による指向的遊走を刺激した。１晩培養した細胞をＰＢＳで洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定し、細胞を透過性にし、抗ｕＰＡＲモノクローナル抗体（Ａｂ３９３７、American Diagnostica製、２μｇ／ｍｌ）か抗β５インテグリンＩＡ９（２μｇ／ｍｌ、（２１））及びＭＭＰ−９ポリクローナル抗体（Ｈ−１２９、１０μｇ／ｍｌ）で染色した。一次抗体の検出は、抗マウスAlexa Fluor 488抗体（anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody）及び抗ウサギAlexa Fluor 555抗体（anti-rabbit Alexa Fluor 555 antibody）を用いて行った。
【００４０】
ｕＰＡＲの開裂  ０．５μｇの組み換え溶解性ヒトｕＰＡＲ（ｓｕＰＡＲ、R & D Systems製）を、１０ｍＭのＥＤＴＡを添加又は未添加の５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ７．５）／５ｍＭ ＣａＣｌ2／１μＭ ＺｎＣｌ2／０．０２％ ＮａＮ3／１０μｇ／ｍｌ アプロチニン中で、５０ｎｇのトリプシンで活性化したＭＭＰ−９を用いて消化した。キモトリプシンの開裂はアプロチニンを用いずに行った。サンプルを３７℃で１６時間インキュベートし、非還元型の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、その後、抗ｕＰＡＲ抗体（３９９Ｒ、１：１，０００希釈）を用いてウエスタンブロッティングを行った。ＨＴ１０８０細胞又はＴＨＰ−１細胞の細胞表面で生じるｕＰＡＲの開裂は、２０ｎＭのＰＤＢｕを添加又は未添加の無血清培地中で、２０μＭ ＩｎｈＩ、２００μＭ ＣＴＴかＷ→Ａ ＣＴＴ対照ペプチド、２５μｇ／ｍｌ アプロチニン又は２０μＭ ベンズアミジンのいずれかの存在下又は非存在下で４８時間行った。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、５０ｍＭ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）／１００ｍＭ ＮａＣｌと共にインキュベートして細胞表面に結合したウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）とＭＭＰを抽出し、５００ｍＭ Hepes（ｐＨ７．５）／１００ｍＭ ＮａＣｌで中和した。膜タンパク質をTriton X-114による抽出で濃縮し（２２）、３０μｇ（ＨＴ１０８０細胞）又は１０μｇ（ＴＨＰ−１細胞）のタンパク質を１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ｕＰＡＲの存在を上記のように分析した。ゼラチナーゼは、酸溶出液をゼラチンザイモグラフィーに付して分析し、ｕＰＡはプラスミノーゲン／粉乳ザイモグラフィーで分析した（２３）。
【００４１】
β5 Ｉ−ＥＧＦ２＋３結合アッセイ  ＭＭＰ−９のＣドメイン、ＭＭＰ−２のＣドメイン、ＣＢＤ、β5 Ｉ−ＥＧＦ２＋３又はビトロネクチン（２μｇ／ｍｌ）をマイクロタイターウェルに固定した。ビオチン化β5 Ｉ−ＥＧＦ２＋３断片（２．５μｇ／ｍｌ）を、競合ペプチドと共に３０分間１％ ＢＳＡ−ＰＢＳＴ中でプレインキュベートしておいたウェルに加え、その後さらに１時間インキュベートした。結合したビオチン化タンパク質はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて検出した。
【００４２】
細胞に結合する125Ｉ−Ｃドメイン  ＭＭＰ−９のＣドメインを比活性が０．０６μＣｉ／ｐｍｏｌとなるように125Ｉで標識した。標識したドメインは、ファージの結合アッセイで観察されたＣＲＶペプチド結合活性の４０％を保持した。ＣＳ−１細胞を２．５ｍＭ ＥＤＴＡのＰＢＳ溶液で洗浄し、２０ｍＭ Hepes（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＭｎＣｌ2／０．２ｍＭ ＣａＣｌ2／０．５％ ＢＳＡに懸濁した。２００μｌ容量で１．５×１０6個の細胞を氷上で３０分間競合ペプチドと共にプレインキュベートした後、125Ｉ標識Ｃドメイン（１×１０6ｃｐｍ）を加え、氷上で３時間インキュベートした。２００μｌのジブチルフタレート／シクロヘキサン混合液（２３：２容量比）を含むチューブに細胞を移し、７５００×ｇで１０分間遠心分離に付し、瞬間的に凍結した（２４）。細胞の入ったチューブの底を切断し、ガンマ線測定器で分析した。
【００４３】
In vivoにおける細胞成長  動物実験は、ヘルシンキ大学の倫理委員会の承認の上で行った。ＨＳＣ−３腫瘍は、５×１０6個の腫瘍細胞（１００μｌのＰＢＳ溶液）をＨｓｄ無胸腺ヌードマウス（HSD:Athymic Nude-nu mice）の両脇腹に投与することで形成した。３日後から、１日に０．８μｇ／ｍｌのＣＲＶ、スクランブルペプチド又はベヒクル（ＰＢＳ）の尾部静脈注射（容量２００μｌ）を５回行った。３次元カリパスによる測定を週に２回行い、腫瘍の体積を計算した。腫瘍体積が１，０００ｍｍ3に達したらマウスを屠殺した。腫瘍血管系を染色するために、抗ＣＤ３１抗体（ＭＥＣ １３．３、BD Biosciences製）と抗マウス Alexa Fluor 488抗体を用いて７μｍの凍結組織切片を染色した。
【００４４】
統計分析  統計学的有意差は、ｔ検定又はカプラン−マイヤー生存分析（Kaplan-Meier survival analysis）に伴う対数順位検定（Log-Rank test）を用いて計算した。
【００４５】
結果
ＭＭＰ−９の様々なドメインに対するペプチドプローブの同定  ゼラチナーゼが仲介する細胞遊走を詳しく理解するために、我々はファージディスプレイしたランダムペプチドライブラリーから、ＭＭＰ−９に結合するタンパク質の候補を探索した。活性ＭＭＰ−９は主としてＷＧＦモチーフを有するペプチドに結合するので、バイオパニングにはｐｒｏＭＭＰ−９とその組み換えドメインを用いた（２）。２種類のグループのｐｒｏ−ＭＭＰ−９結合ペプチドが見出された（表１）。グループＩのペプチドは、ＣＧ（Ａｒ）ＧＲ（Ａｒ）（Ｓ／Ｑ）ＰＰＣ（式中Ａｒは芳香族アミノ酸を表す）モチーフを有していた。これらのペプチドは、ゼラチナーゼの基質であるフィブロネクチンやビトロネクチンの配列と類似性を示した（４）。グループＩＩのペプチドは、ＣＲＸＹＧＰＸＸＸＣモチーフを有していた。このグループにおいては、ＣＲＶＹＧＰＹＬＬＣペプチドをｐｒｏ−ＭＭＰ−９を用いたバイオパニングで得、その一方、他の配列は組み換えＣ末端ドメインを用いて得られた。ＣＧＹＧＲＦＳＰＰＣ（ＰＰＣ）ペプチドとＣＲＶＹＧＰＹＬＬＣ（ＣＲＶ）ペプチドを２種類のグループの代表として選び、さらに研究を行った。
【００４６】
これらペプチドモチーフの結合部位を同定するために、我々はファージ結合実験を行った。ＰＰＣペプチドを有するファージのｐｒｏ−ＭＭＰ−９への結合は、可溶性の組み換えＡＤＧＡＣＧＹＧＲＦＳＰＰＣＧＡＡＧ（ＰＰＣ）１８量体ペプチドとゼラチンによって阻害されたが、ＣＴＴや組み換えＡＤＧＡＣＲＶＹＧＰＹＬＬＣＧＡＡＧ（ＣＲＶ）ペプチドでは阻害されなかった（図１Ａ）。逆に、ＣＲＶ−ファージの結合は、ＣＲＶによって阻害されたものの、ＰＰＣ、ＣＴＴやゼラチンでは阻害されず、このことは、ＰＰＣペプチドとＣＲＶペプチドのそれぞれの結合部位には重複がないことを示している。ゼラチンによるＰＰＣファージの結合阻害は、ＰＰＣがＭＭＰ−９のコラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）に結合したことを意味している。さらにＭＭＰ−２のＣＢＤを用いたファージ選択によっても、ＰＰＣ様のペプチドであるＡＣＧＹＴＹＨＰＰＣＡＲＬＴが得られた（２５）。ＣＴＴペプチドやＣＲＶペプチドではなく、ＰＰＣペプチドが固定化ＣＢＤに対するゼラチンの結合を容量依存的に阻害した（図１Ｂ）。しかし、ＰＰＣペプチドはフィブロネクチンに対するゼラチンの結合には全く効果がなく（データは記載しない）、この結果はＰＰＣがゼラチナーゼのフィブロネクチンＩＩ型繰返し配列に対して特異的であることを示唆している。ゼラチン分解アッセイにおいては、ＰＰＣはＭＭＰ−９とＭＭＰ−２の活性を阻害し（図１Ｃ）、スクランブル対照ペプチドであるＡＤＧＡＣＰＳＹＧＰＲＦＧＣＧＡＡＧ（ｓｃｒ．ＰＰＣ）は全く効果がなかった。ＣＲＶペプチドはゼラチナーゼ活性を阻害しないが、これはゼラチンがＣＲＶとは競合しないという結果と一致している。ＰＰＣペプチドは、このアッセイにおいて１００μＭ濃度でゼラチンの分解を完全に阻害するＣＴＴよりも弱いゼラチナーゼ阻害性物質である（１５）。
【００４７】
フィブロネクチンとビトロネクチンのＰＰＣ様配列のＭＭＰ−９への結合を検討するために、我々は固相結合アッセイでこれらペプチドに対するＣＢＤの結合を試験した。ＣＢＤはフィブロネクチンとビトロネクチンの両方に結合したが、ゼラチン結合部位と考えられたＣ末端のヘパリン結合ドメインを欠失した、フィブロネクチンの１１０ｋ−Ｄａ断片には結合しなかった（図１Ｄ）。ＰＰＣはＣＢＤの結合を阻害したものの、スクランブルペプチドは阻害しなかった。同様の結果がＰｅｐＳｐｏｔメンブランアッセイ（PepSpot membrane assay）で得られ、ここではビオチン化ＣＢＤはＰＰＣ様のフィブロネクチンペプチドであるＴＴＰＮＳＬＬＶＳＷＱＰＰＲＡＲＩＴに結合したが、１８量体である対照ペプチドには結合しなかった（図１Ｄ、挿入図）。
【００４８】
種々のＭＭＰを比較すると、ＣＲＶファージはｐｒｏ−ＭＭＰ−９に対してのみペプチドで阻害されうる結合を示し、ｐｒｏ−ＭＭＰ−２やｐｒｏ−ＭＭＰ−３に対しては結合を示さなかった（図２Ａ）。ＭＭＰ−９に対する選択性は、組み換えＭＭＰ−９ Ｃドメインと組み換えＭＭＰ−２ Ｃドメインに対しても観察された。ＣＲＶファージは、ＭＭＰ−２ Ｃドメインと比較してＭＭＰ−９ Ｃドメインをより強く認識した（図２Ｂ）。ＣＲＶファージのＭＭＰ−９ Ｃドメインへの結合（図２Ｃ）やｐｒｏ−ＭＭＰ−９への結合（図示しない）に対して、ＴＩＭＰ−１は競合することができなかった。ＣＲＶファージは、ＣＢＤ（図２Ｃ）やヒンジ領域とＣ末端ドメインを欠失したｐｒｏ−ＭＭＰ−９（ｐｒｏ−ＭＭＰ−９−ΔＨＣ、図示しない）には結合しなかった。次に我々は、ＭＭＰ−９ Ｃドメインの二量体化に関するＣＲＶの効果を調べた。125Ｉ標識ＣドメインをＣＲＶ又はスクランブルペプチドと共にプレインキュベートし、その後に非標識Ｃドメインでコートしたウェルに加えた。Ｃドメインの二量体化はＣＲＶによって阻害されたものの、スクランブルペプチドでは阻害されなかった（図２Ｄ）。
【００４９】
細胞の遊走と浸潤の、ゼラチナーゼのドメイン特異的相互作用をブロックすることによる阻害  我々は、ＣＴＴペプチド、ＰＰＣペプチド及びＣＲＶペプチドを用いて、細胞遊走と浸潤におけるゼラチナーゼドメインの役割を検討した。ＣＴＴの結合部位は、ＣＢＤにではなく、触媒ドメインに存在する（図１Ｂ、（１２）及び我々の未発表データ）。上述したように、ＰＰＣはＣＢＤに対するプローブであり、ＣＲＶはＣドメインに対するプローブである。３種のペプチドの全てが、マトリゲルにおいてＨＴ１０８０繊維肉腫への浸潤を阻害した。２００μＭ濃度のＣＲＶ又はＣＴＴで、５０％阻害が観察された。ＰＰＣペプチドの場合は、同じ効果を得るには５００μＭの濃度が必要であった（図３Ａ）。スクランブル対照ペプチドは非活性であった。同様の結果が、β2インテグリン及びゼラチン依存性の形で、合成ＧＳＴ−ＬＬＧ−Ｃ４基質（１４）の上で遊走したＴＨＰ−１単球細胞に関しても得られた。スクランブルペプチドではなく、ＰＰＣ、ＣＲＶ及びＣＴＴが阻害効果を示した（図３Ｂ）。細胞を５００μＭ濃度のペプチドと共に４８時間培養しても細胞生存率には何ら影響はなかったので（図示しない）、細胞遊走の阻害は毒性によるものではない。調整培地への蛍光性ゼラチン断片の放出による測定が示すように、驚くべきことに、ＣＴＴとＰＰＣが細胞周囲のゼラチン分解を阻害した（図３Ｃ）のと同様に、ＣＲＶも細胞周囲のゼラチン分解を阻害した。このアッセイでは、フィブロネクチン／ＦＩＴＣ標識ゼラチンのコーティング上で、ＨＴ１０８０細胞をホルボールエステル（ＰＤＢｕ）の存在下で４８時間培養した。ゼラチナーゼ選択性低分子阻害剤（gelatinase-selective small molecule inhibitor）（Ｉｎｈ１）もまたゼラチン分解を阻害したが、スクランブルペプチドは阻害しなかった。これらの結果は、ＭＭＰに対する直接的な酵素阻害剤のみならず、ＣＲＶもまた細胞遊走や細胞周囲のタンパク質分解に影響を与えることを示した。我々は、ＤＤＧＷによってブロックされる、ＭＭＰ−９と白血球αMインテグリンのＩドメインとの相互作用（図３Ｄ）に、ＣＲＶペプチドとＰＰＣペプチドは影響を与えないことを試験した。実際に、ＰＰＣの存在によって典型的な例では２０〜５０％も高い結合が見られ、このことから明らかなように、ＰＰＣはＩドメインへのｐｒｏ−ＭＭＰ−９の結合を安定化した。Ｉドメインの非存在下における抗体のｐｒｏ−ＭＭＰ−９への結合はＰＰＣの影響を受けなかった（図示しない）。これらのデータが示すように、αMβ2インテグリン結合ＭＭＰ−９は、インテグリン、ＭＭＰ−９とリガンド／基質の間で三分子複合体（triple molecular complex）を形成するために、ＣＢＤを用いて基質を結合することができる。直接これを試験するために、固定化したαMβ2インテグリンにｐｒｏ−ＭＭＰ−９を結合せしめ、そこへのビオチン化ゼラチンとＭＭＰ−９基質の結合を調査した。ゼラチンはｐｒｏ−ＭＭＰ−９／αMβ2インテグリン複合体には結合したが、αMβ2インテグリン単独には結合しなかった。血小板インテグリンのαIIbβ3はｐｒｏＭＭＰ−９／ゼラチン−結合を支持しなかった（図３Ｅ）。
【００５０】
ＭＭＰ−９はウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性化因子受容体と結合する  次に我々は、ＰＤＢｕで活性化したＨＴ１０８０細胞とＴＨＰ−１細胞における、プラスミン／ＭＭＰ−３の仲介するｐｒｏ−ＭＭＰ−９の活性化に対するペプチドの影響を調査した。ペプチドの存在下で細胞をインキュベートして得た調整培地をゼラチンザイモグラフィーで分析した。３種類のペプチドの中で、ＣＲＶのみがｐｒｏ−ＭＭＰ−９を阻害することができた。ＨＴ１０８０細胞では、ＣＲＶペプチドはｐｒｏ−ＭＭＰ−９の活性化を強く阻害し、ｐｒｏ−ＭＭＰ−２の活性化を部分的に阻害した（図３Ｆ）。プラスミノーゲンの添加がＨＴ１０８０細胞におけるｐｒｏ−ＭＭＰ−９の活性化には十分であり、ｐｒｏ−ＭＭＰ−３がさらに活性化を促進することはなかった。ＴＨＰ−１細胞においては、ｐｒｏ−ＭＭＰ−９の活性化にはｐｒｏ−ＭＭＰ−３とプラスミノーゲンを共に添加することが必要であり、活性化はＣＲＶによって阻害されたが、それ以外のペプチドでは阻害されなかった（図３Ｇ）。実際、ｐｒｏ−ＭＭＰ−９の活性化はＰＰＣやＤＤＧＷの存在下で増加し、以前にＤＤＧＷに関して観察したような（１２）、ＭＭＰ−９のより高濃度の放出があった。ＣＲＶはin vitroにおける精製ｐｒｏ−ＭＭＰ−９のＭＭＰ−３による活性化を阻害しなかった（図３Ｈ）。
【００５１】
プラスミノーゲン活性化カスケードがｐｒｏ−ＭＭＰ−９の活性化に関与しているので、我々はウロキナーゼ受容体とＭＭＰ−９とが結合する可能性について検討した。ＰＤＢｕ活性化ＨＴ１０８０細胞の免疫沈降は、ｐｒｏ−ＭＭＰ−９が抗ｕＰＡＲ抗体と共沈するが、対照抗体とは共沈しないことを示した（図４Ａ）。ｕＰＡＲとｐｒｏ−ＭＭＰ−９の結合はＴＨＰ−１細胞においても同様に見られ、この結合も事前のＰＤＢｕによる活性化の影響を受けなかった（図４Ａ）。ｕＰＡＲを開裂するプロティナーゼは数種類存在するので（２６、２７）、我々はＭＭＰ−９が更にｕＰＡＲを開裂するかどうか疑問に思った。そこで精製したタンパク質を用いて、キモトリプシンが開裂するのと同様に、ＭＭＰ−９はｕＰＡＲからドメイン１（Ｄ１）を開裂することを観察した（図４Ｂ）。ＭＭＰ−９によるｕＰＡＲの開裂はアプロチニンの存在下でも起こり、メタロプロティナーゼ阻害剤であるＥＤＴＡによって阻害された。ｕＰＡＲの開裂はホルボールエステルで活性化された細胞の表面で起こった（２６）。ゼラチナーゼがこの過程にいかに寄与しているかを検討するために、我々はＨＴ１０８０細胞をプロティナーゼ阻害剤と共にインキュベートし、膜タンパク質濃縮溶解物をｕＰＡＲに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングで分析した。ゼラチナーゼの選択的阻害剤であるＩｎｈＩはｕＰＡＲの開裂を阻害したが、セリンプロテイナーゼ阻害剤であるアプロチニンやベンズアミジンは阻害しなかった（図４Ｃ）。ｕＰＡＲの開裂阻害は、調整培地中及び細胞表面のゼラチナーゼ濃度の低下を伴った。調整培地中ではＭＭＰ−２よりも高濃度でＭＭＰ−９が存在し、細胞表面においてはこの逆だった。細胞表面結合ＭＭＰ−９は、以前に観察されたように潜在型だった（２８）。加えて、ＩｎｈＩの存在下では、細胞表面結合性ｕＰＡの濃度が低下した。ＴＨＰ−１細胞上でのｕＰＡＲの開裂は、同様にＩｎｈＩとＣＴＴによって阻害されたが、Ｗ→Ａ ＣＴＴの変異体ペプチド（１５）やアプロチニン（図４Ｄ）によっては阻害されなかった。ＰＤＢｕの非存在下では、無血清培地で培養したＴＨＰ−１細胞はほとんど検出することのできないレベルのｕＰＡＲしか発現しなかった。
【００５２】
ＣＲＶペプチドはインテグリンβ鎖エピトープの模倣物である  非白血球細胞では、ｕＰＡＲはβ1インテグリン、β3インテグリン及びβ5インテグリンと結合することができる（２９〜３２）。そこで我々は、ＨＴ１０８０細胞においてＭＭＰ−９がどのインテグリンと相互作用しうるのかを検討した。α2インテグリン、α3インテグリン、α5インテグリン、β3インテグリン及びβ5インテグリンのそれぞれに対する抗体を用いて免疫沈降を行った。ｐｒｏ−ＭＭＰ−９はα5インテグリンとβ5インテグリンと結合し、このことはα5β1インテグリンとαVβ5インテグリンが、培養組織処理済みプラスチック（tissue culture-treated plastic）上で成長したＨＴ１０８０細胞におけるｐｒｏ−ＭＭＰ−９の結合に関与する主要なインテグリンであることを示している（図５Ａ）。ＭＭＰ−１とＭＭＰ−２は各々のＣ末端ドメインを通じてインテグリンと相互作用することができる（６、３３）。興味深いことに、データベースサーチによって、ＣＲＶペプチドとインテグリンβ鎖（特にβ5鎖）のストーク領域に存在する配列との類似性が明らかになった。ＣＲＶの７個のアミノ酸残基がβ5配列内のアミノ酸残基と一致するか又は類似していた（図５Ｂ）。これらの配列は、システインに富んだ、インテグリンの表皮成長因子様のドメイン２（Ｉ−ＥＧＦ２）に位置し、活性型に特異的な抗体の反応性によって示されるように、インテグリンの活性化によって露出される（３４、３５）。実際に、ＫＩＭ１２７抗体のエピトープは、β2インテグリン鎖の中のＣＲＶ様配列に位置付けられている（３４）。ＭＭＰ−９のこのインテグリン活性化エピトープに対する結合を研究するために、我々は、ビトロネクチンやフィブロネクチンへの細胞接着におけるＭＭＰ−９ Ｃドメインの影響を初めに検討した。Ｃドメイン、ｐｒｏ−ＭＭＰ−９−ΔＨＣ（４０μｇ／ｍｌ）やＣＲＶペプチド（２００μＭ）は、ＨＴ１０８０細胞のビトロネクチンやフィブロネクチンに対する接着を阻害しなかった（図５Ｃ）。αVβ5インテグリン−ブロッキング抗体であるＰ１Ｆ６（２５μ／ｇｍｌ）による阻害から明らかなように、ビトロネクチンに対する接着はαVβ5依存性の形で生じた。固定化Ｃドメインに対するＨＴ１０８０細胞の特異的な接着は観察されなかった（図示しない）。これらの結果が示すように、主要なＲＧＤリガンド結合部位や細胞接着決定基は、α5β1インテグリンとαVβ5インテグリンにおけるＭＭＰ−９ Ｃドメイン相互作用部位の候補ではない。この結果は、β5インテグリンからＩ−ＥＧＦドメイン２とＩ−ＥＧＦドメイン３（３６）を発現することを後押しした。興味深いことに、ビオチン化β5Ｉ−ＥＧＦ２＋３タンパク質は、ＣＲＶペプチドを阻害するような形態でＭＭＰ−９ Ｃドメインに特異的に結合した（図５Ｄ）。β5Ｉ−ＥＧＦ２＋３断片は、ＭＭＰ−９ ＣＢＤ、ビトロネクチン又はそれ自身には結合せず（図５Ｄ）、ＭＭＰ−２のＣドメインにも結合しなかった（図示しない）。結合は陽イオン非依存性で（図示しない）、未標識のβ5Ｉ−ＥＧＦ２＋３で阻害することができた。我々は次にＣＲＶ様の配列の重要性を研究するために、β5Ｉ−ＥＧＦ２＋３のＫ５４２残基とＹ５４４残基をアラニンに変異した。変異体の活性は減少し、ＭＭＰ−９ ��ドメインに対するビオチン化β5Ｉ−ＥＧＦ２＋３の結合における競合については、Ｋ５４２Ａタンパク質とＹ５４４Ａタンパク質の効果は低かった（図５Ｅ）。Ｙ５４４Ａ変異もまた、β5Ｉ−ＥＧＦ２＋３がマトリゲルを介したＨＴ１０８０の浸潤を阻害する能力を低下させた（図５Ｆ）。β5Ｉ−ＥＧＦ２＋３、ＭＭＰ−９ Ｃドメイン及びＭＭＰ−２ Ｃドメインは各々が同様の効力でＨＴ１０８０の浸潤を阻害したが、ＧＳＴは効果を示さなかった。
【００５３】
ＭＭＰ−β5とインテグリンとの相互作用に関する証拠をさらに見出すために、我々は、αVβ5発現細胞に対するＭＭＰ−９ Ｃドメインの結合を研究した。125ヨウ素で標識したＭＭＰ−９ Ｃドメインは、β5インテグリンをトランスフェクトしたＣＳ−１黒色腫細胞に対して特異的な結合を示したが、トランスフェクトしていないＣＳ−１黒色腫細胞には結合しなかった（図６Ａ）。この結合は、非標識ＭＭＰ−９ Ｃドメインとβ5Ｉ−ＥＧＦ２＋３断片と競合したが、β5Ｉ−ＥＧＦ２＋３ Ｙ５４４Ａ変異体との競合の程度は低かった。ＭＭＰ−２ ＣドメインやＧＲＧＤＳＰペプチドとの競合は見られなかった。
【００５４】
ＭＭＰ−９ Ｃドメインによるβ2インテグリンのＣＲＶ様部位への結合を試験するために、我々はＴＨＰ−１細胞の固定化ＫＩＭ１２７抗体に対する結合について検討した。ＴＨＰ−１細胞はＫＩＭ１２７抗体に結合したが、抗Ｈｉｓ６標識抗体には結合しなかった（図５Ｆ）。Ｃドメイン（５０μｇ／ｍｌ）は細胞結合を４０％阻害したが、ＣＢＤは阻害しなかった（図５Ｆ）。結合の特異性は、可溶性ＫＩＭ１２７とは競合するが、対照抗体とは競合しないことによって示された。Ｃドメインは、別のβ2インテグリン−活性化抗体であるＲ３Ｆ９ＣへのＴＨＰ−１の結合に対しては全く効果がなかった（図示しない）。
【００５５】
ビトロネクチン上のＨＴ１０８０細胞を二重免疫蛍光染色したところ、ｕＰＡＲ、ＭＭＰ−９及びβ5インテグリンに関して部分的な共局在化（colocalization）が観察された。ＭＭＰ−９は、インテグリンとｕＰＡＲの共局在が顕著な細胞の先導端に集中していた（図７）。無関係の対照抗体に関してのみ非特異的な核染色が見られた。ｕＰＡＲとＭＭＰ−９との共局在はＴＨＰ−１細胞の表面にも見られた（図示しない）。
【００５６】
ＣＲＶペプチドの反応性に関する最後の試験として、in vivoにおける腫瘍成長に対するその効果を調べた。ＨＳＣ−３舌部扁平上皮腫瘍細胞異種移植片を有するマウスの皮下腫瘍が初期の目視不可の段階で、マウスをペプチドで処置した。ＣＲＶ、スクランブルペプチド又はＰＢＳを５回静脈注射した。３１日目には、スクランブルペプチドやＰＢＳと比較して、統計的に有意な腫瘍成長阻害がＣＲＶについて観察された（図８Ａ）。ＣＲＶはマウスの生存率を向上し、２ヵ月後には、５回のＣＲＶ注射を受けたマウスの全てが生存していたが、その一方で、スクランブルペプチドやＰＢＳを投与したマウスは大型腫瘍のために安楽死させた（図８Ｂ）。ＣＲＶの効果の少なくとも一部は、血管新生の阻害によるものである。内皮マーカーであるＣＤ３１による免疫染色が示すように、ＣＲＶ処置マウスに存在する腫瘍血管系は発達が遅れていた（図８Ｃ）
【００５７】
考察
我々は、ゼラチナーゼに対するドメイン特異的なペプチドプローブを開発し、ゼラチナーゼにとって重要な分子間相互作用について検討した。ドメイン特異的なペプチドはいずれも細胞遊走を阻害し、これはＭＭＰ−９の主な３つのドメイン、即ち、触媒ドメイン、ＣＢＤとＣドメイン、がそれぞれ個別の役割を果たすことを示している。既に白血球においては、ｐｒｏ−ＭＭＰ−９がその触媒ドメインを介してαMインテグリンＩドメインやαLインテグリンＩドメインと相互作用することを我々は報告している（１２）。本願では、ＭＭＰ−９のＣドメインとインテグリンβサブユニットとの結合という、ＭＭＰ−９の別のインテグリン相互作用を見出した。カルシウムの存在下で起こり、ｐｒｏ−ＭＭＰ−９を非活性の状態で維持すると考えられるＩドメインの相互作用と比較して、Ｃドメイン／βサブユニット相互作用は活性化されたインテグリンを必要とし、ＭＭＰ−９の活性化と細胞周囲のゼラチン分解を仲介するための機能的な役割を担うものと考えられる。
【００５８】
本発明に係る研究において同定したＭＭＰ−９結合性ペプチドの中では、ＣＢＤ結合性ペプチドであるＰＰＣは、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の非活性部位特異的阻害剤（exosite inhibitor）としてゼラチンの結合と分解を阻害したが、ＭＭＰ−９とインテグリンとの相互作用に対しては阻害効果を示さなかった。我々は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメイン内でＣＢＤ認識部位としてＰＰＣ様配列を同定した。ビトロネクチンは類似しているものの、明らかに親和性の低いＣＢＤ結合部位を有していた。ＰＰＣはフィブロネクチンのフィブロネクチンＩＩ型繰返し配列に結合しないので、高い特異性を示すゼラチナーゼ阻害剤を開発するための先導化合物として用いることができるであろう。
【００５９】
Ｃ末端ドメイン結合性のＣＲＶペプチドはＭＭＰ−９の酵素活性に影響を与えないが、ＭＭＰ−９ Ｃドメインの二量体化、プラスミノーゲン／ＭＭＰ−３依存性経路によるｐｒｏ−ＭＭＰ−９の活性化、及び細胞周囲のゼラチン分解を阻害した。ＣＲＶはインテグリンβサブユニット（好ましくはβ5サブユニット）の活性化エピトープの模倣物であることをいくつかの所見が示している。ＭＭＰ−９のＣドメインは、β2インテグリンのＣＲＶ相同部位を認識するＫＩＭ１２７抗体に対する白血球の接着を阻害した。組み換えβ5インテグリンＩ−ＥＧＦ２＋３断片はＣＲＶ依存性の形でＣドメインに特異的に結合し、β5Ｉ−ＲＧＦ２＋３における542Ｋ残基と544Ｙ残基の単一アラニン変異は活性を減少させた。β5インテグリンをトランスフェクトした細胞はＭＭＰ−９ Ｃドメインに結合したが、トランスフェクトしていない細胞は結合しなかった。ＨＴ１０８０細胞においては、β5インテグリンに対する抗体とｐｒｏ−ＭＭＰ−９を共沈し、β5Ｉ−ＥＧＦ２＋３断片とＣドメインの両方がこの細胞系の浸潤能を阻害した。ＭＭＰ−９とβ5インテグリンは同様にＨＴ１０８０細胞の先導端に局在した。しかし、我々は、ＣＲＶペプチドがＣドメインが仲介する他の相互作用も阻害する可能性を排除することはできない。
【００６０】
我々は、ＨＴ１０８０細胞におけるＭＭＰ−９とαVβ3の結合を観察することはできなかったが、ＭＭＰ−９と活性αVβ3インテグリンとの間の機能的な結合が見出された（３７）。これは、ＨＴ１０８０細胞がビトロネクチンとの接着の際にαVβ5インテグリンを利用するという事実を反映していると考えられる。αVβ5とＭＭＰ−９の発現は類似した転写調節を受けるので（３、３８）、ＭＭＰ−９とαVβ5の結合の方が生理学的により適切な反応なのかもしれない。代わりに、αVβ3とＭＭＰ−２は一緒に調節されていると考えられる（３９）。我々の研究においては、ＣＲＶペプチドはｐｒｏ−ＭＭＰ−２の活性化を弱く阻害したのみで、結合アッセイにおいてＭＭＰ−２のＣドメインとＭＭＰ−９のＣドメインは競合しなかった。
【００６１】
ＣＲＶがインテグリン活性化エピトープを模倣するという発見は、ｐｒｏ−ＭＭＰ−９の活性化にリガンド結合性のインテグリンが必要な理由を説明する（３７、４０）。我々はまた、ＭＭＰ−９の活性化に必要であるｕＰＡＲがＨＴ１０８０細胞やＴＨＰ−１細胞においてｐｒｏ−ＭＭＰ−９と結合することを示した。ｕＰＡＲはin vitroのＭＭＰ−９の基質であり、ｕＰＡＲの細胞性開裂はゼラチナーゼ依存性であった。ＭＭＰ−９による開裂はｕＰＡＲのＤ１ドメインの放出をもたらし、この現象は、ＭＭＰ−１２などの他のＭＭＰに関しても観察されている（２７）。機能的には、ｕＰＡＲの開裂はｕＰＡ結合能の喪失と、ｕＰＡＲとインテグリンとの分離を生じる（４１）。このようにＭＭＰ−９は自らの活性化を調節するだけではなく、ｕＰＡＲの機能も調節する。興味深いことに、ＭＭＰ−９とｕＰＡＲの協力が腫瘍細胞の血管内浸潤に必要不可欠であることが示された（４２）。ｕＰＡ／ｕＰＡＲとゼラチナーゼは、遊走細胞の輸送ベヒクル（transport vehicle）に共存する（４３、４４）。
【００６２】
ＣＲＶによる腫瘍成長の阻害は、原発腫瘍の成長及び／又は血管新生におけるＭＭＰ−９／αVβ5の重要な機能を示唆している。しかしβ3インテグリンノックアウトマウスとβ5インテグリンノックアウトマウス（４５）や、ＭＭＰ−９の血漿濃度が低いマウス（４６）において、腫瘍細胞の阻害よりもむしろ増加が観察された。ＭＭＰ−９のアンジオスタチンやツムスタチン（tumstatin）を生成する能力（４７）が、これらの矛盾する発見の説明となるかもしれず、αVβ5−結合ＭＭＰ−９がアンジオスタチンの生成に用いられているとも考えられる。さらにＭＭＰ−９によるｕＰＡＲの開裂は、腫瘍の拡散も阻害できる。ＭＭＰの活性を直接阻害することを目的とした腫瘍治療法は成功しているとは言えないので、ＭＭＰを阻害するための非触媒的な手段はより魅力的かもしれない（６）。我々がファージディスプレイ法によって開発したペプチドが、多様なインテグリン仲介相互作用に干渉してＭＭＰの触媒ドメインやＣ末端ドメインの結合をブロックするということは研究の励みとなり、これはゼラチナーゼの機能を局所的に防ぐが酵素活性には影響しない特定の薬剤の開発が可能であることを示唆している。この考えを支持するように、αMβ2インテグリン／ｐｒｏ−ＭＭＰ−９複合体をブロックするβ2インテグリンのリガンドであるＤＤＧＷペプチドもまた、マウスの急性炎症モデルにおける好中球動員を阻害するというin vivoにおける活性を示した（４８）。
【００６３】
ＭＭＰ−９とインテグリンの相互作用に関する我々のモデルは、ファージディスプレイペプチドを用いて得られた「ペプチド観測的」観点（“petidoscopic”view）に基づくものであり、ｐｒｏ−ＭＭＰ−９が２種類の方法でインテグリンと相互作用することを示唆している。白血球においては、インテグリンＩドメインとＭＭＰ−９触媒ドメインとの相互作用が優勢であり、明らかにｐｒｏ−ＭＭＰ−９が非活性の状態に保たれている。リガンドの結合はインテグリンを活性化し、ＭＭＰ−９ Ｃドメインの結合部位として機能する、β鎖の活性化エピトープを露出する。次にＭＭＰ−９はプロティナーゼで活性化されるか、又は基質に直接結合することによって触媒作用を有するようになる（４９）。αサブユニットのＩドメインを欠失するインテグリンにおいては、ＭＭＰ−９ Ｃドメイン特異的相互作用が主要な相互作用部位であると考えられる。
【００６４】
【表１】
2007537162.tif 000002
【００６５】
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【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ＭＭＰ−９と結合するペプチドリガンドの特徴付け。（Ａ）図示したペプチド（２０μＭ）又はゼラチン（２．５μＭ）が競合物質として存在する条件下で、ＰＰＣ、ＣＲＶ又は対照ペプチド（ＣＰＥＥＬＷＷＬＣ）を提示したファージをＰｒｏ−ＭＭＰ−９に結合せしめた。結合したファージを抗ファージ抗体を用いて定量した。結果は、特に断りがない限り、他の図においても３回の実験の平均±ＳＤで示す。＊＊は、他の図においても、スチューデントのｔ検定における統計学的有意差（ｐ＜０．００１）があることを示す。（Ｂ）ＣＴＴやＣＲＶとは異なり、ＰＰＣは、固定化したＣＢＤに対するゼラチンの結合を阻害する。ビオチン化ゼラチンは、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて検出した。（Ｃ）ゼラチン分解アッセイにおいて、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の酵素活性はＰＰＣペプチドによって阻害されたが、ＣＲＶペプチドやスクランブルペプチドによっては阻害されなかった。（Ｄ）完全なフィブロネクチン、フィブロネクチンの断片（１１０ｋＤａの細胞結合性断片）、ビトロネクチン（１μｇ／ウェル）又はＢＳＡに対するビオチン化ＣＢＤの結合を、２０μＭペプチドの存在下又は非存在下で測定した。（１Ｄ内の挿入図）Pepspotメンブラン上のフィブロネクチン由来ペプチドＴＴＰＮＳＬＬＶＳＷＱＰＰＲＡＲＩＴ又は対照ペプチドに対するビオチン化ＣＢＤの結合。ＣＢＤの結合は、高感度化学ルミネセンスにより検出した。
【図２】ＣＲＶペプチドは、ＭＭＰ−９のＣドメインに選択的に結合し、ＭＭＰ−９のホモダイマリゼーション（ＭＭＰ−９同士の二量体化）を阻害する。（Ａ）ＣＲＶファージのｐｒｏ−ＭＭＰに対する結合（Ａ）、並びにＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の組み換えＣドメインに対する結合（Ｂ）を、２０μＭ可溶性ペプチドの存在下又は非存在下において検討した。（Ｃ）組み換えＣドメイン、ＭＭＰ−９又はＣＢＤに対するファージの結合を、ペプチド（２０μＭ）又はＴＩＭＰ−１（２．５μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で分析した。（Ｄ）125Ｉ標識Ｃドメインの非標識Ｃドメイン、ＣＢＤ又はＢＳＡに対する結合を、ＣＲＶ又はスクランブルＣＲＶペプチドの存在下又は非存在下で検討した。結合した放射能をガンマ線測定器で測定した。＊＊は、スチューデントのｔ検定における統計学的有意差（ｐ＜０．００１）があることを示し、n.s.は有意差がないことを示す。
【図３】ＭＭＰ−９のドメインに特異的な細胞遊走と浸潤の阻害。（Ａ）ペプチドの存在下又は非存在下における、マトリゲルでコートされた浸潤チャンバーに対するＨＴ１０８０繊維肉腫の浸潤。全てのサンプルを３回の独立した実験によって３回分析した。（Ｂ）トランスウェルをＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ又は対照となるＧＳＴでコートした。ペプチドの存在下で、ＴＨＰ−１細胞を一晩遊走させた。（Ｃ）２０ｎＭ ＰＤＢｕの存在下又は非存在下でペプチドと４８時間インキュベートした後のＨＴ１０８０細胞のゼラチン分解。データは、６つのサンプルの平均±ＳＥＭで示す。（Ｄ）ペプチドの存在下又は非存在下でのαMインテグリンＩドメインに対するｐｒｏ−ＭＭＰ−９の結合。結合したＭＭＰ−９は、抗ＭＭＰ−９モノクローナル抗体によって検出した。スチューデントのｔ検定における統計学的有意差はアスタリスク（＊）を用いて以下のように示す：＊はｐ＜０．０５であることを示し、＊＊はｐ＜０．００１であることを示す。（Ｅ）Ｐｒｏ−ＭＭＰ−９／インテグリン複合体へのゼラチンの結合。ビオチン化ゼラチンは、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて検出した。ＨＴ１０８０細胞におけるＭＭＰ−９の活性化（Ｆ）及びＴＨＰ−１細胞におけるＭＭＰ−９の活性化（Ｇ）。これらの細胞を、ホルボールエステルの存在下で、無血清培地中でインキュベートすることによりＭＭＰ−９の発現を刺激した。プラスミノーゲン（２．５μｇ／ｍｌ）及びｐｒｏ−ＭＭＰ−３（０．５μｇ／ｍｌ）を加えてＭＭＰ−９の活性化を促進した。ペプチドは、２００μＭ又は図に示す濃度で使用した。サンプルはゼラチンザイモグラフィーによって分析した。（Ｈ）ＣＲＶ及びスクランブルペプチド（２００μＭ）の存在下における、in vitroのＭＭＰ−３によるｐｒｏ−ＭＭＰの活性化。
【図４】ＭＭＰ−９は、ｕＰＡＲと相互作用し、これを開裂する。（Ａ）ｕＰＡＲに対する抗体（３９９Ｒ）及びＭＭＰ−９に対する抗体（Ｈ−１２９）による免疫沈降を、ＢＤＢｕ活性化ＨＴ１０８０細胞並びに非活性化及び活性化ＴＨＰ−１細胞を用いて行った。Ｐｒｏ−ＭＭＰ−９はウェスタンブロッティングによって検出した。（Ｂ）ＭＭＰ−９は、in vitroの可溶性ｕＰＡＲを開裂した。開裂は、１０ｍＭのＥＤＴＡにより阻害される。Ｄ２Ｄ３断片を産生するキモトリプシンによる開裂を対照として示す。（Ｃ）ＨＴ１０８０細胞上の化学的ゼラチナーゼ阻害剤ＩｎｈＩ（２０μＭ）によるｕＰＡＲ開裂の阻害。ＤＭＳＯをＩｎｈＩのベヒクルとして用いた。アプロチニン（２５μｇ／ｍｌ）とベンズアミジン（２０μＭ）を対照として用いた。等量の細胞膜画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ｕＰＡＲに対する抗体を用いて分析した。調整培地はゼラチンザイモグラフィーによって分析した。細胞表面ゼラチナーゼ及びｕＰＡＲに関しては、酸抽出物を分析した。（Ｄ）ＴＨＰ−１細胞上でのｕＰＡＲの開裂も同様にゼラチナーゼ阻害剤であるＩｎｈＩ（２０μＭ）及びＣＴＴ（２００μＭ）によって阻害された。
【図５】ＭＭＰ−９ Ｃドメインに対する結合部位としてのインテグリンβ5鎖の同定。（Ａ）インテグリン細胞質ドメインに対するウサギ抗血清を用いて免疫沈降を行い、引き続いて図４に示す抗ＭＭＰ−９抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。（Ｂ）インテグリンβ鎖の構造を示す概略図。各々のβ鎖におけるＣＲＶペプチドに類似した配列を示す。β2インテグリンにおけるＫＩＭ１２７抗体エピトープは下線で示す。（Ｃ）ＣＲＶペプチド又はＭＭＰ−９ドメインは、ＨＴ１０８０細胞のフィブロネクチン又はビトロネクチンへの接着を阻害しない。（Ｄ）β5インテグリンのビオチン化Ｉ−ＥＧＦ２＋３断片の、ＭＭＰ−９のＣドメイン又はＣＢＤ、ＢＳＡ、Ｉ−ＥＧＦ２＋３断片又はビトロネクチンに対する結合を、ペプチド又は非標識ＥＧＦ２＋３の存在下又は非存在下で評価した。＊＊は、スチューデントのｔ検定において、ｐ＜０．００１であることを示す。（Ｅ）β5Ｉ−ＥＧＦ２＋３断片の結合に対する、β5Ｉ−ＥＧＦ２＋３のアラニン変異体による競合。（Ｆ）β5インテグリン及びＭＭＰドメイン（５０μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下での、ＨＴ１０８０細胞のマトリゲルへの浸潤。データは、４つのサンプルに関する数値の平均±ＳＤで示す。スチューデントのｔ検定における統計学的有意差はアスタリスク（＊）を用いて以下のように示す：＊はｐ＜０．０５であることを示し、＊＊はｐ＜０．００１であることを示す。
【図６】ＭＭＰ−９ Ｃドメインとインテグリンβ5鎖の細胞表面相互作用。（Ａ）非標識タンパク質（５０μｇ／ｍｌ）又はペプチド（５０μＭ）が競合物質として存在又は不在の条件下での、野生型ＣＳ−１細胞及びβ5インテグリンをトランスフェクトしたＣＳ−１細胞に対する125Ｉ標識Ｃドメインの結合。データは、５〜８個の測定点で得た数値の平均±ＳＥＭで示す。（Ｂ）固定化したＫＩＭ１２７へのＴＨＰ−１細胞の接着を、ＭＭＰ−９ドメイン又は抗体の存在下又は非在下で試験した。統計学的な差はｔ検定で求めた。
【図７】ＭＭＰ−９、ｕＰＡＲ及びβ5インテグリンは、ＨＴ１０８０細胞の先導端に共局在した。ビトロネクチンでコートしたカバーガラスに接着した細胞を、血清濃度勾配中、ＰＤＢｕの存在下で一晩インキュベートすることにより遊走を刺激した。細胞を、それぞれ対応する抗体によって染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。図中の棒は２５μｍを表す。
【図８】ＣＲＶペプチドは、in vivoのＨＳＣ−３ヒト腫瘍異種移植片の成長を阻害する。（Ａ）ＣＲＶ、スクランブルＣＲＶ又はＰＢＳを注射したマウスにおける腫瘍体積（それぞれ１０個、８個、１０個の腫瘍片に基づく）を、３１日後又は腫瘍の大きさが終点である１０００ｍｍ3（点線）に達した時点で測定した。図中、棒はそれぞれの実験条件における腫瘍体積の平均値を意味する。統計学的有意差はｔ検定によって計算した。（Ｂ）ＣＲＶ及びＰＢＳ（各グループはそれぞれマウス５匹で構成される）及びスクランブルＣＲＶ（各グループはそれぞれマウス４匹で構成される）のカプラン−マイヤー生存分析（Kaplan-Meier survival analysis）（ＣＲＶ vs. スクランブルＣＲＶ； Log-Rank検定で求めたｐ＝０．００３、ＣＲＶ vs. ＰＢＳ；ｐ＝０．００２、ＰＢＳ vs. スクランブルＣＲＶ；ｐ＝０．１１）。（Ｃ）腫瘍脈管構造を抗ＣＤ３１抗体で染色した。ＣＲＶ、スクランブルＣＲＶ又はＰＢＳで処理したマウスの代表的なサンプルを示す。図中の棒は２００μｍを表す。
【配列表フリーテキスト】
【００６７】
配列番号１：合成ペプチド
３位のXaaは芳香族アミノ酸であるPhe、Trp又はTyr
６位のXaaは芳香族アミノ酸であるPhe、Trp又はTyr
配列番号２：合成ペプチド
３位のXaaは芳香族アミノ酸であるPhe、Trp又はTyr
６位のXaaは芳香族アミノ酸であるPhe、Trp又はTyr
配列番号３：合成ペプチド
３位のXaaはいかなるアミノ酸でもよい
７位〜９位のXaaはいかなるアミノ酸でもよい
配列番号４：合成ペプチド
配列番号５：合成ペプチド
配列番号６：合成ペプチド
配列番号７：合成ペプチド
配列番号８：合成ペプチド
配列番号９：合成ペプチド
配列番号１０：合成ペプチド
配列番号１１：合成ペプチド
配列番号１２：合成ペプチド
配列番号１３：合成ペプチド
配列番号１４：合成ペプチド
配列番号１５：合成ペプチド
配列番号１６：合成ペプチド
配列番号１７：合成ペプチド
配列番号１８：合成ペプチド
【図１】
2007537162.tif 000003
【図２】
2007537162.tif 000004
【図３】
2007537162.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007537162.tif 000009
【図８】
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【配列表】
2007537162000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月26日(2006.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のペプチドモチーフ：
ＣＲＸＹＧＰＸＸＸＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。）
を有するペプチドを含む、マトリックスメタロプロティナーゼに対する阻害能及びダウンレギュレーション能を有する物質。
【請求項２】
該ペプチドモチーフがＣＲＶＹＧＰＹＬＬＣであることを特徴とする、請求項１の物質。
【請求項３】
マトリックスメタロプロティナーゼに対する阻害能及びダウンレギュレーション能を有する請求項１又は２の物質と、薬学的に許容される担体とを包含する医薬組成物。
【請求項４】
マトリックスメタロプロティナーゼに対する阻害能及びダウンレギュレーション能を有する請求項１又は２の物質を包含する、マトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）依存性の病態に対する治療用医薬組成物。
【請求項５】
該ＭＭＰ依存性の病態が、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９からなる群より選ばれる少なくとも１種のＭＭＰに依存性の病態であることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
メリフィールド固相ペプチド合成法によるペプチド合成工程を含む、マトリックスメタロプロティナーゼに対する阻害能及びダウンレギュレーション能を有する請求項１の物質の製造方法。
【請求項７】
哺乳動物におけるマトリックスメタロプロティナーゼ依存性の病態を治療または予防する方法であって、哺乳動物に対して請求項１又は２の物質を、ＭＭＰの活性化、ＭＭＰの発現及びＭＭＰの機能からなる群より選ばれる少なくとも１種を該哺乳動物において阻害もしくはダウンレギュレートするのに有効な量で投与することを含む方法。
【請求項８】
該マトリックスメタロプロティナーゼ依存性の病態が、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９からなる群より選ばれる少なくとも１種に依存性の病態であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物におけるマトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）の活性化、ＭＭＰの発現、ＭＭＰの機能及びＭＭＰの作用の阻害方法であって、哺乳動物に対して請求項１又は２の物質を、ＭＭＰの活性、ＭＭＰの活性化及びＭＭＰの作用を妨げるのに有効な量で投与することを含む方法。
【請求項１０】
該マトリックスメタロプロティナーゼが、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９からなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
マトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）をin vitroで阻害又はダウンレギュレートする方法であって、ＭＭＰの活性を阻害もしくはダウンレギュレートするのに有効な量の請求項１又は２の物質を、in vitroの系に加えることを含む方法。
【請求項１２】
阻害又はダウンレギュレートするマトリックスメタロプロティナーゼが、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
マトリックスメタロプロティナーゼに対する阻害能及びダウンレギュレーション能を有する請求項１又は２の物質を用いた、マトリックスメタロプロティナーゼを生化学的に単離及び精製する方法。
【請求項１４】
マトリックスメタロプロティナーゼに対する阻害能及びダウンレギュレーション能を有する請求項１又は２の物質を用いた、腫瘍細胞に対するリポソームのターゲッティングを向上させる方法。
【請求項１５】
該腫瘍細胞がマトリックスメタロプロティナーゼを発現する腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【国際調査報告】
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