(57)【要約】本発明は、細胞（例えば、Ａ５４９細胞）を適応させて、無血清および無動物材料培地懸濁培養において成長させるための方法を提供する。本発明は、無血清および無動物材料培地懸濁培養における成長のために適応化された上記Ａ５４９細胞由来であるウイルス（例えば、アデノウイルス）を調製するための方法を提供する。上記適応化Ａ５４９細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）登録番号第ＰＴＡ−５７０８号として識別される細胞株の特徴を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清および無動物材料培地懸濁培養において安定である、適応化Ａ５４９細胞株。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞株であって、ここで、前記適応化Ａ５４９細胞株は、ＡＴＣＣ登録番号第ＰＴＡ−５７０８号として識別される細胞株である、細胞株。
【請求項３】
Ａ５４９細胞を無血清および無動物材料培地懸濁培養に適応させるための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）接着培養において、該細胞を、血清含有培地から２．５％〜１．２５％未満の最終血清濃度を有する培地へと離脱させる工程；
（ｂ）該細胞を、懸濁培養に導入する工程；
（ｃ）細胞凝集をモニタリングする工程；
（ｄ）細胞凝集体を取り除く工程；および
（ｅ）懸濁培養において、血清を有しない培地への該細胞の離脱を継続する工程
を包含する、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、ここで、前記Ａ５４９細胞は、ＡＴＣＣ株ＣＣＬ−１８５である、方法。
【請求項５】
無血清および無動物材料培地懸濁培養において安定である、適応化Ａ５４９細胞株を生成するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）請求項３に記載の方法によって、Ａ５４９細胞を適応させる工程；および
（ｂ）該細胞を、無血清および無動物材料培地懸濁培養において培養する工程
を包含する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、０℃以下の温度で前記細胞を保存する工程をさらに包含する、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、前記細胞を低温保存する工程をさらに包含する、方法。
【請求項８】
ウイルスを生成するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）請求項１に記載の適応化Ａ５４９細胞株のＡ５４９細胞を、無血清および無動物材料培地懸濁培養において培養する工程；
（ｂ）該細胞に、該ウイルスを接種する工程；および
（ｃ）該接種された細胞をインキュベートする工程
を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記細胞を、工程（ｃ）の後に凍結させる工程をさらに包含する、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、前記ウイルスを、工程（ｃ）の後に収集する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記ウイルスは、前記細胞および前記培地から収集される、方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の方法であって、ここで、前記ウイルスは、アデノウイルスである、方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の方法であって、ここで、前記ウイルスは、組み換えウイルスである、方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の方法であって、ここで、前記ウイルスは、異種の遺伝子を保有する、方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記アデノウイルスは、条件的複製アデノウイルスである、方法。
【請求項１６】
請求項８に記載の方法であって、工程（ｂ）の後に、前記培養物へ塩化カルシウムを添加する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１７】
請求項８に記載の方法であって、ここで、前記ウイルスの接種時の前記Ａ５４９細胞濃度は、１．８×１０６細胞／ｍｌ〜２．４×１０６細胞／ｍｌである、方法。
【請求項１８】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、接種されたアデノウイルスの量は、培地１ｍｌあたり１×１０８ウイルス粒子である、方法。
【請求項１９】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、接種時のウイルス：細胞の比は、（４０〜６０）：１である、方法。
【請求項２０】
請求項８に記載の方法であって、工程（ａ）の後および工程（ｂ）の前に、前記培養培地を新鮮な培地に交換する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２１】
請求項８に記載の方法であって、工程（ｃ）の後に
（ｄ）培養培地を、新鮮な培地に交換する工程；および
（ｅ）前記細胞をインキュベーションする工程
をさらに包含する、方法。
【請求項２２】
請求項８に記載の方法であって、工程（ａ）の後および工程（ｂ）の前；ならびに工程（ｃ）の後に、前記培養培地を新鮮な培地に交換する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２３】
請求項８に記載の方法であって、ここで、前記Ａ５４９細胞は、低温保存された細胞株由来である、方法。
【請求項２４】
請求項８に記載の方法であって、ここで、前記Ａ５４９細胞は、無血清および無動物材料培地懸濁培養に対して適応化された細胞株由来である、方法。
【請求項２５】
アデノウイルスを生成するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）接着培養において、Ａ５４９細胞を、血清含有培地から２．５％〜１．２５％未満の最終血清濃度を有する培地へと離脱させる工程；
（ｂ）該細胞を、懸濁培養に導入する工程；
（ｃ）細胞凝集をモニタリングする工程；
（ｄ）該細胞凝集体を取り除く工程；  
（ｅ）懸濁培養において、血清を有しない培地への該細胞の離脱を継続する工程；
（ｆ）該細胞を、成長の後期対数期まで増殖させる工程；
（ｇ）該培養培地を、新鮮な培地に交換する工程；
（ｈ）該細胞に、該アデノウイルスを接種する工程；
（ｉ）該培養物に、塩化カルシウムを添加する工程；
（ｊ）該接種された細胞を、インキュベートする工程；
（ｋ）該培養培地を、新鮮な培地に交換する工程；
（ｌ）該細胞をインキュベートする工程；
（ｍ）該培養物に、塩化カルシウムを添加する工程；
（ｎ）該細胞をインキュベートする工程；および
（ｏ）該アデノウイルスを収集する工程
を包含する、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、工程（ｅ）の後、しかし工程（ｆ）の前において、以下の工程：
（ｉ）前記細胞を濃縮する工程；
（ｉｉ）前記培地を、凍結保護物質が補充された培地に交換する工程；
（ｉｉｉ）前記細胞を凍結する工程；
（ｉｖ）０℃以下の温度で、前記細胞を保存する工程；ならびに
（ｖ）前記細胞を、無血清および無動物材料培地懸濁培養へと戻す工程
をさらに包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、培養物中で細胞を成長させるための方法およびこの細胞を使用したウイルスの生成に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ウイルスベクターの生成のための懸濁処理の開発において、２つの主要な障壁がある。第一は、細胞接種物の長期培養の維持が困難なことである。第二は、一旦生成細胞が懸濁環境に保たれると、ウイルス生産性が顕著に減少する傾向に向かうことである。
【０００３】
定常培養における無血清培地に対するＡ５４９細胞の適応のための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄら（非特許文献１）において、上記Ａ５４９細胞株は、定常培養において、無血清培地に適応させられた。この方法において、Ａ５４９細胞は最初に、１％ウシ胎仔血清を含む基礎イーグル培地に対して、１ヶ月の期間にわたって適応させられた。これらＡ５４９細胞のコンフルエントに近い単一層は、生理食塩水で洗浄され、そしてＲＯ培地と呼ばれる無血清倍地（フェノールレッドを含まない、セレン（３０ｎＭ）およびグルタミン（２ｍＭ）を補充されたＲＰＭＩ  １６４０）中におかれた。ＲＯ培地への適応の間（これは約１ヶ月間を要した）に、血清無しで生存したコロニーが出現し、そして最終的に、付着した細胞およびクラスター状に浮遊した細胞の混合物を形成した。無血清および無成長因子培地に適応された細胞は、Ａ５４９−ＲＯと命名された。上記Ａ５４９−ＲＯ細胞は、あらゆる血清または添加成長因子の非存在下で、２年間を超えて増殖した。上記Ａ５４９−ＲＯ細胞は、高細胞密度（５×１０５細胞／ｍｌ）で維持され、そして１４日間毎に１：２で継代培養された。上記Ａ５４９−ＲＯ細胞は、８日間〜１０日間の倍加時間を有し、そして親のＡ５４９細胞は、３０時間の倍加時間を有した。上記Ａ５４９−ＲＯ細胞は、大きな細胞凝集塊または細胞クラスターで、付着した細胞および親のＡ５４９細胞に比べて非常にゆっくりとした速度で成長し、浮遊した細胞の混合物として存在し、定常培養において成長し、そして最適な成長のために高細胞密度を必要とした。
【非特許文献１】Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４年、第２６９巻、第１１号：８５９６−８６０３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記Ａ５４９細胞株は、歴史的に、ウイルスベクターの生成のための接着培養物または定常培養物として増殖されてきた。本発明は、Ａ５４９懸濁培養において、ウイルスベクターを生成するための新規の方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、無血清および無動物材料培地懸濁培養において安定である、適応化Ａ５４９細胞株を提供する。本発明の１つの実施形態において、上記適応化Ａ５４９細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）登録番号第ＰＴＡ−５７０８号として識別される細胞株の特徴を有する。本発明の別の実施形態において、上記適応化Ａ５４９細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）登録番号第ＰＴＡ−５７０８号として識別される、細胞株である。
【０００６】
本発明はまた、Ａ５４９細胞を無血清および無動物材料培地懸濁培養に適応させるための方法を提供し、この方法は、以下の工程
（ａ）接着培養において、上記細胞を、血清含有培地から２．５％〜１．２５％未満（例えば、１．２５％〜０％）の最終血清濃度を有する培地へと離脱させる工程；
（ｂ）上記細胞を、懸濁培養に導入する工程；
（ｃ）細胞凝集（例えば、凝集体あたりの細胞の数；細胞凝集の程度；この細胞凝集体のサイズの分布）をモニタリングする工程；
（ｄ）細胞凝集体を取り除く工程；および
（ｅ）懸濁培養において、血清および／または他のあらゆる動物起源の成分を有さない培地への、上記細胞の離脱を継続する工程
を包含する。適応方法のために使用される上記Ａ５４９細胞（すなわち、親の細胞）は、ＡＴＣＣ株ＣＣＬ−１８５であり得る。
【０００７】
本発明は、無血清および無動物材料培地懸濁培養において安定な適応化Ａ５４９細胞株を生成するための方法を包含し、この方法は、以下の工程
（ａ）接着培養において、血清含有培地から２．５％〜１．２５％未満（例えば、１．２５％〜０％）の最終血清濃度を有する培地へと、上記細胞を離脱させる工程；
（ｂ）上記細胞を、懸濁培養に導入する工程；
（ｃ）細胞凝集（例えば、凝集体あたりの細胞の数；細胞凝集の程度；この細胞凝集体のサイズの分布）をモニタリングする工程；
（ｄ）細胞凝集体を取り除く工程；  
（ｅ）懸濁培養において、血清を有さない培地への上記細胞の離脱を継続する工程；および
（ｆ）無血清および無動物材料培地懸濁培養において、上記細胞を培養する工程
を包含する。さらに、上記方法は、工程（ｅ）の後か、または工程（ｆ）の後かのいずれかに、上記細胞を低温保存する工程を含み得る。さらに別の実施形態において、この低温保存された細胞株は、無血清および無動物材料培地条件下か、または血清含有培地条件下かのいずれかで凍結される。上記方法はまた、０℃以下の温度で上記細胞を保存する工程を包含し得る。
【０００８】
本発明はまた、ウイルスを生成するための方法を提供し、この方法は、以下の工程
（ａ）無血清および無動物材料培地懸濁培養において安定である適応化Ａ５４９細胞株のＡ５４９細胞を培養する工程；
（ｂ）上記細胞に、ウイルス（例えば、ＣＲＡＶのようなアデノウイルス）を接種する工程；および
（ｃ）上記接種された細胞をインキュベートする工程
を包含する。上記方法はまた、工程（ａ）の後および工程（ｂ）の前に、上記培養培地を新鮮な培地に交換する工程を含み得る。上記方法はまた、工程（ｂ）の後に、上記培養物に塩化カルシウムを添加する工程および／または上記培養培地を、さらなる塩化カルシウムを有するか、または有さない新鮮な培地に（例えば、灌流により）交換する工程を含み得る。上記方法はまた、工程（ｃ）の後に、上記細胞を凍結させる工程を含み得る。さらに、上記方法は、工程（ｃ）の後に上記ウイルスを収集する工程を含み得る。上記方法は、上記細胞および上記培地から、上記ウイルスを収集する工程を含み得る。
【０００９】
本発明の１つの実施形態において、上記適応化Ａ５４９細胞株は、無血清および無動物材料培地懸濁培養において、少なくとも１３７世代にわたり持続的な成長および安定したウイルス生産性を示す。本発明の別の実施形態において、上記適応化Ａ５４９細胞株は、無血清および無動物材料培地懸濁培養において、少なくとも６ヶ月間にわたり持続的な成長および安定したウイルス生産性を有する。
【００１０】
本発明の１つの実施形態において、上記ウイルスはアデノウイルスである。別の実施形態において、上記アデノウイルスは条件的複製アデノウイルスである。さらに別の実施形態において、上記ウイルスは、組み換えウイルスである。別の実施形態において、上記組み換えウイルスは、異種遺伝子を保有する。
【００１１】
本発明の１つの実施形態において、上記アデノウイルスの接種のとき、無血清および無動物材料培地懸濁培養において安定な適応化Ａ５４９細胞株のＡ５４９細胞濃度は、１．８×１０６細胞／ｍｌ〜２．４×１０６細胞／ｍｌである。別の実施形態において、無血清および無動物材料培地懸濁培養において安定なＡ５４９細胞株のＡ５４９細胞は、上記アデノウイルスの接種のときに成長の後期対数期にある培養物由来である。別の実施形態において、接種されたアデノウイルスの量は、培養物１ｍｌあたり１×１０８ウイルス粒子である。本発明のさらに別の実施形態において、接種のときのアデノウイルス粒子：Ａ５４９細胞株の比は、（４０〜６０）：１である。
【００１２】
本発明の１つの実施形態において、ウイルスを生成するための方法のための、無血清および無動物材料培地懸濁培養において安定な適応化Ａ５４９細胞のＡ５４９細胞は、低温保存された細胞株由来である。さらに別の実施形態において、上記凍結保存された細胞株は、無血清および無動物材料培地条件下か、または血清含有培地条件下かのいずれかで凍結される。
【００１３】
本発明の範囲はまた、アデノウイルスを生成するための方法を提供し、この方法は、以下の工程
（ａ）接着培養において、Ａ５４９細胞を、血清含有培地（例えば、１０％血清（例えば、ウシ胎仔血清）を含む）から２．５％〜１．２５％未満（例えば、１．２５％〜０％）の最終血清濃度を有する培地へと離脱させる工程；
（ｂ）上記細胞を、懸濁培養に導入する工程；
（ｃ）上記培養物中における細胞凝集（例えば、凝集体あたりの細胞の数；この凝集体のサイズ；細胞凝集の程度；この細胞凝集体のサイズの分布）をモニタリングする工程；
（ｄ）細胞凝集体を取り除く工程；  
（ｅ）懸濁培養において、血清および／または任意の動物起源の成分を有さない培地へと、上記細胞をさらに離脱させる工程；
（ｆ）上記細胞を濃縮する工程；
（ｇ）上記培地を、凍結保護物質が補充された培地に交換する工程；
（ｈ）上記細胞を凍結する（例えば、上記細胞を低温保存する）工程；
（ｉ）上記細胞を、０℃以下の温度で保存する工程；
（ｊ）上記細胞を、無血清および無動物材料培地懸濁培養に戻す工程；
（ｋ）上記細胞を、成長の後期指数期にまで増殖させる工程；
（ｌ）上記培養培地を、新鮮な培地（例えば、無血清培地および無動物材料培地）に交換する工程；
（ｍ）上記細胞を、アデノウイルスで接種する工程；
（ｎ）上記培養物に、塩化カルシウムを添加する工程；
（ｏ）上記接種された細胞を、インキュベートする工程；
（ｐ）上記培養培地を、新鮮な培地（例えば、無血清培地および無動物材料培地）に交換する工程；
（ｑ）上記培養物に、塩化カルシウムを添加する工程；
（ｒ）上記細胞をインキュベートする工程；ならびに
（ｓ）上記アデノウイルスを収集する工程
を包含する。工程（ｆ）〜工程（ｊ）、工程（ｌ）、工程（ｎ）、工程（ｐ）、工程（ｑ）および工程（ｓ）は、任意である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、血清または他の動物起源の培地成分の存在下で、感染細胞の成長に関連した問題無しに、（例えば、懸濁Ａ５４９細胞中で）アデノウイルスを生成するための経済的かつ簡便な方法を提供する。
【００１５】
（適応化Ａ５４９細胞株の生成）
本発明は、血清および動物起源の成分由来である物質の非存在下での成長に対してＡ５４９細胞株を適応させて、懸濁培養における持続的な成長およびアデノウイルスを接種させた場合に安定したウイルス生成速度を示す細胞株を生成するための方法を包含する。一般に、上記Ａ５４９細胞は、
（ａ）接着培養または定常培養において、上記細胞を、血清含有培地（例えば、１０％血清を含む培地）から、２．５％〜１．２５％、または２．５％〜０．６％、または２．５％〜０．５％、または２．５％〜０．４％、または２．５％〜０．３％、または２．５％〜０．２％、または２．５％〜０．１％、または２．５％〜０．０５％、または２．５％〜０の最終血清濃度を有する培地へと、次第に離脱させる工程；
（ｂ）上記細胞を、懸濁培養のために、振とう容器、振動（ｒｏｃｋｅｄ）容器、強い攪拌（ａｇｉｔａｔｅｄ）容器または攪拌（ｓｔｉｒｒｅｄ）容器中におく工程；
（ｃ）上記培養において、細胞凝集を測定する工程、または細胞凝集の程度をモニタリングする工程；
（ｄ）細胞凝集体を（当該分野において公知の任意の方法により）取り除く工程；および
（ｅ）懸濁培養において、血清または任意の他の動物起源の培地成分を有さない培地への、上記細胞の離脱を継続する工程
によって適応される。好ましくは、上記細胞は、工程（ｂ）、工程（ｃ）、および工程（ｅ）を通じて持続的に振とう、振動、強い攪拌または攪拌される。通常、上記適応処理は、完了するまでに３週間〜６週間を要する。
【００１６】
代表的に、上記適応化細胞は、無血清および無動物材料培地懸濁培養において、少なくとも１３７世代または６ヶ月の間安定である（すなわち、上記細胞は、無血清および無動物材料培地懸濁培養における持続的な成長、および安定したウイルス生成速度を示す）。また、上記適応化細胞は、無血清および無動物材料培地懸濁培養において、血清含有培地中での定常の培養における親のＡ５４９細胞の倍加時間の０．８倍〜２．９倍の範囲の倍加時間を有する。例えば、代表的には、無血清および無動物材料培地における適応化Ａ５４９細胞に関する倍加時間は、２４時間〜８８時間の範囲であり、血清含有培地中および定常培養における親のＡ５４９細胞に関する倍加時間は、３０時間である。無血清および無動物材料培地懸濁培養の適応化Ａ５４９細胞株において、総細胞集合は、懸濁液中にある。１つの実施形態において、９９％を超える適応化Ａ５４９細胞が懸濁液中にある（例えば、上記細胞の１００％は懸濁液中にあり、この細胞の１００％が表面に付着せず、この細胞の１００％が液体培地中に懸濁されている）。
【００１７】
本発明の１つの実施形態において、上記適応化Ａ５４９細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）登録番号第ＰＴＡ−５７０８号として識別される細胞株の特徴を有し、これはまた、Ａ５４９Ｓ細胞株と呼ばれる。このＡ５４９Ｓの細胞株の細胞は、無血清および無動物材料培地懸濁培養において、少なくとも１３７世代または６ヶ月の間安定である（すなわち、上記細胞は、無血清および無動物材料培地懸濁培養における持続的な成長、および安定したウイルス生成速度を示す）。無血清および無動物材料培地懸濁培養における上記Ａ５４９Ｓ細胞株の細胞の倍加時間は、約２４時間〜８８時間の範囲である。上記Ａ５４９Ｓ細胞株の無血清および無動物材料培地懸濁培養において、全Ａ５４９Ｓ細胞集団は、懸濁液中にある。１つの実施形態において、９９％を超えるＡ５４９Ｓ細胞は、懸濁液中にある（例えば、上記細胞の１００％は懸濁液中にあり、この細胞の１００％が表面に付着せず、この細胞の１００％が液体培地中に懸濁されている）。
【００１８】
本発明の１つの実施形態において、上記適応化Ａ５４９細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）登録番号第ＰＴＡ−５７０８号として同定される細胞株であり、これはまた、Ａ５４９Ｓ細胞株と呼ばれる。
【００１９】
「Ａ５４９」は、当該分野において一般に知られる肺癌細胞株である。１つの実施形態において、適応方法のために使用される上記Ａ５４９の親細胞株は、ＡＴＣＣ株ＣＣＬ−１８５である。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「コンフルエント」は、細胞が成長表面上で、全ての細胞が他の細胞と接触している密集した層を形成し、ゆえに実質的に利用可能な全表面が使用されていることを示す。例えば、「コンフルエント」は、（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８７、ｐ．３６３で）「全ての細胞が、それらの全外周で他の細胞と接触しており、そして、覆われていない、利用可能な基質が残っていない」状況として定義されている。本発明の目的のため、用語「実質的にコンフルエント」は、たとえ隙間が残り得るとしても、細胞がほぼ表面上に接触し、その結果７０％を超える、好ましくは９０％を超える、利用可能な表面が使用されていることを示す。ここで、「利用可能な表面」は、細胞を適応させるのに十分な表面領域を意味する。したがって、さらなる細胞を適応し得ない隣接した細胞間の小さな隙間は、「利用可能な表面」をなさない。
【００２１】
哺乳動物細胞は、その細胞を血清から徐々に離脱させることによってか、または直接適応によって、血清条件中での増殖から無血清条件中に適応され得る。この段階的離脱方法は、培養物にとってはより少ないストレスであり得、そしてより少ない成長遅延を引き起こし得る。直接適応方法はより早いが、これは相対的に過酷であり、そして最初の細胞密度および生存度は、多くの場合低下する。
【００２２】
多くの細胞株は、血清含有培地から無血清培地へ直接的に継代培養され得る。例えば、成長の中間対数期において少なくとも９０％の生存度で、血清の存在下で培養物が成長した場合、それは１：２または１：３の比で無血清倍地中に希釈される。この処理は、一貫した成長が得られるまで、毎週２回繰り返される。最初は、培養物は、血清補充培地から無血清培地へ直接的に播種された場合の顕著な細胞の減少のために、継代培養のために通常使用される播種密度と比較してより高い播種密度で播種される。この細胞成長速度は、無血清培地において、血清補充培地における細胞に関して観察される速度まで回復する前の最初の数回の継代の間、通常はより緩徐である。この手順が成功しない場合、上記系時的な方法、または離脱方法が使用されるべきである。
【００２３】
血清および血清タンパク質含有培地から無血清および無動物材料培地への細胞の「離脱」または「系時的適応」とは、上記培地の血清濃度の漸進的な低下、段階的な低下をいう。この漸進的低下は、当該分野において周知の方法によってなされ得る。例えば、高濃度の血清を含む第１の培地は、わずかに少ない血清を含む第２の培地に播種するために使用され得る。一旦第２の培地中の細胞が所定の細胞密度まで成長すると、それらは、次に、さらにより少ない血清を含む第３の培地を播種するために使用され得る。この処理は、所望の量の血清を含む培地において細胞が成長するまで繰り返され得る。
【００２４】
細胞を離脱する別の工程の別の例において、上記細胞は、この細胞が成長の線形対数期のピークに到達するまで、１０％血清を補充された基礎培地において成長する。次いで、上記細胞は、５％血清を補充された無血清培地ベース中へ継代培養される。上記細胞は、飽和密度に到達するまで、１％血清を補充された無血清培地ベース中に継代培養される。引き続き、各々の継代培養物において、血清濃度が０．０６％を下回るまで５０％ずつ血清を減少させる。次いで、無血清倍地中において、上記細胞を維持および培養する。適用の間の任意の点で細胞成長が減退する場合、細胞成長を促進する血清濃度まで回復させる。血清低下スケジュールを開始する前に、その血清濃度で細胞成長を安定化させる。一旦上記細胞が無血清条件に適応化されると、培地タンパク質低下スケジュールが開始される（例えば、各々の継代培養物は、無血清培地条件下および無動物材料培地条件下において、その培養物が増殖するまで、等しい量の無血清および無動物材料培地が添加される）。この方法の改変において、上記細胞は、中間的無血清培養工程を使用せずに、無血清および無動物材料培地条件に直接的に適応され得る。
【００２５】
細胞を離脱する工程の他の例は、血清含有培地（例えば、５％血清〜１０％血清を含む基礎培地）において、細胞を９０％飽和密度まで増殖させることである。５０％血清含有培地および５０％無血清培地を使用して、１：１の比で継代培養する。その次の日に、上記細胞を同様の方法で継代培養する。ある点において、この細胞倍加は低下し、そして細胞培養の間の時間間隔は増加する。この細胞が１日１回の（ｄａｉｌｙ）基準で継代培養されるような時期まで、必要に応じて上記細胞を１：１で継代培養し続けた。一旦上記細胞が無血清条件に対して適応されると、培地タンパク質低下スケジュールが開始される（例えば、この細胞が１日１回の基準で継代培養されるような時期までの、５０％無血清培地ならびに５０％無血清および無動物材料培地を使用した、各々１：１の継代培養で）。この点において、上記細胞は、１：１よりも大きい比での継代培養プログラムへと調整され得る。この方法の変更において、上記細胞は、中間的無血清培地工程を使用せずに、無血清および無動物材料培地条件に直接的に適応され得る。
【００２６】
細胞を離脱する工程の別の例において、各々の継代で、培養物は血清含有培地および無血清培地の混合物中に希釈される。初めに、１：１の血清含有培地：無血清培地の比が使用され得る。その後の各々の継代で、上記無血清培地の相対量は、完全な血清の非依存性が達成されるまで増加される。各々の継代で、その培養は、成長の中間線形対数期にあるべきであり、そして培地中への希釈は、おおよそ１：２〜１：３の比とするべきである。細胞は、１週間あたり２回で継代培養されるべきである。各々の継代で、新しい培地条件が成功しなかった場合、細胞生存度を維持するために適切であると知られている血清濃度で予備のフラスコへ播種されるべきである。
【００２７】
細胞株（例えば、血清の存在下で接着性であるＡ５４９）に関して、無血清培地または無血清および無動物材料培地への適応はしばしば、結果として、培養物は緩く接着性となり、おそらく凝集塊化し、そして大きな細胞凝集体を有する。
【００２８】
細胞の懸濁培養への導入は、当該分野において周知の方法によってなされ得る。例えば、接着培養の細胞は、細胞スクレーパーを使用して成長表面から剥離され得、次いで容器（例えば、振とうフラスコまたはスピナーフラスコ）中へ置かれ得、この中でその培養物は常に攪拌される。別の例において、培養物の細胞は、トリプシン処理によってその成長表面から剥離され得、その後このトリプシンの不活性化、または上記細胞の洗浄による上記トリプシンの除去が続き、次いで容器中の懸濁培養液中に置かれる。あるいは、接着培養において培養された細胞は、非酵素的手順（例えば、培養容器の緩やかな叩打または二価イオンキレート剤を含む溶液を用いた処理による）によって、基層から取り外され得る。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）のような二価イオンキレート剤が使用され得る。この懸濁培養は、懸濁液中において上記細胞を維持するために、振とう、振動、強い攪拌、回転または攪拌され得る。
【００２９】
多くの細胞型は、懸濁培養において、細胞凝集塊として成長する傾向がある（特に、付着細胞株または接着細胞株にもとは由来する培養物）。種々のレベルの細胞凝集体を有する培養物は、異なる成長動態を表示し得る。凝集体サイズの制御は、重要な問題である。細胞死および細胞壊死は、凝集体内において起こり得る。激しい凝集は、スペースおよび代謝拡散の制限の結果として、乏しい細胞成長をもたらす。さらに、この細胞がウイルス生成処理のための宿主細胞である場合、極度な細胞凝集は、上記凝集体の内側の細胞の感染を妨げ、その結果、得られる全体的なウイルス力価が減少することによって感染効率にネガティブに影響し得る。生物体量測定および凝集定量化の両方は、凝集性懸濁培養物中の細胞の成長および挙動を決定する上で重要である。懸濁培養における細胞凝集の程度の評価は、懸濁処理をモニタリングするために重要である。
【００３０】
培養における細胞凝集体または細胞凝集塊の存在は、当該分野において公知の任意の方法によって決定され得る。例えば、凝集体の存在は、顕微鏡的にまたは細胞サイズ測定装置（例えば、ＣＯＵＬＴＥＲ  ＣＯＵＮＴＥＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、１９５０  Ｗｅｓｔ  ８ｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ、３３０１０、ＵＳＡ）またはＡｃｃｕＳｉｚｅｒ  ７８０／ＳＰＯＳ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｉｚｅｒ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、６６８  Ｗｏｏｄｂｏｕｒｎｅ  Ｒｏａｄ、Ｓｕｉｔｅ  １０４、Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ、ＰＡ、１９０４７、ＵＳＡ））によって可視化され得る。細胞凝集を定量化するために自動化された他の方法は、当該分野において公知である（Ｎｅｅｌａｍｅｇｈａｍら、Ａｎｎ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２５（１）：１８０−９（１９９７）；Ｔｓａｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６：８０９−８１４（２０００））。本発明の１つの実施形態において、Ｔａｓｏら（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｐｒｏｇ．１６：８０９−８１４（２０００））の方法は、細胞凝集および細胞生物体量を定量的にモニターするために使用され得る。
【００３１】
適応化Ａ５４９細胞は、小さな凝集体と単一懸濁細胞との混合物（すなわち、単分散である細胞および直径４００ミクロン〜直径２０ミクロンのサイズの凝集体中の細胞）中で、無血清および懸濁培養において成長する懸濁適格性（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）の細胞である。上記適応化Ａ５４９細胞は、接着依存性細胞の無血清および無動物材料培地懸濁培養の条件への漸進的な適応によって、無血清および無動物材料培地懸濁培養における成長に適格であるように作られる。細胞凝集塊の量はまた、培養物中に脂質混合物を添加することによって減少し得る。化学的に限定された脂質混合物の添加は、培養物への動物生成物の導入を回避し得る。
【００３２】
Ａ５４９細胞の懸濁適応の間、大きな細胞凝集塊に関連しない細胞は、選択的に保持され得る。この大きな細胞凝集塊に関連しない細胞の選択的保持は、当該分野において周知の方法によって行われ得る。例えば、懸濁培養物の攪拌は１分間〜２分間の間停止され、大きな細胞凝集体が培養容器の底に沈むことを可能にする。個々の細胞および小さな凝集体中の細胞を含むその培養物の容量の９０％が取り出され（ｄｒａｗ  ｏｆｆ）、新しい容器中に継代培養される。大きな細胞凝集体を含む最初の培養物の容量の１０％の残りの培養量は、廃棄される。別の例において、懸濁培養物の攪拌は、１分間〜２分間の間停止され、大きな細胞凝集体が培養容器の底に沈むことを可能にする。大きな細胞凝集体を含むこの培養物の容量の１０％は、上記容器の底からピペットを用いて取り出され、そして廃棄される。個々の細胞および小さな凝集体中の細胞を含む最初の培養物の容量の９０％の残りの培養量は、継代培養される。２５０ｍｌ、５００ｍｌおよび１Ｌのサイズの振とうフラスコの培養容器は、それぞれ、３０ｍｌ〜４０ｍｌ、１００ｍｌ、および２４０ｍｌの培養容量が好ましい。
【００３３】
このように、数百個以上の細胞からなる凝集体は、培養物（例えば、細胞集団）から除去される。所望される細胞集団は、多回数の選択工程（例えば、上記手順の繰り返しによる）によって濃縮され得る。その結果、細胞は、同様の懸濁培養培地中の非適応化細胞に比べて、より小さな凝集塊またはより少ない程度の細胞凝集を示す。
【００３４】
培養の間における培養物の凝集塊化または凝集化の程度は、ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７８０／ＳＰＯＳ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｉｚｅｒを使用した粒子（すなわち、細胞凝集体）サイズ測定によってモニターされ得る。この機器において、個々の粒子はレーザー光のそばを通過し、そして各々の粒子によってブロックされた光の量が測定される。ブロックされた光の量は、上記粒子の交差断面積に相当し、したがって細胞凝集塊サイズまたは細胞凝集体サイズの交差断面積に相当する。上記光学サイズ測定器は、個々の細胞（例えば、直径１０ミクロン〜直径１５ミクロン）から直径４００ミクロンまでの細胞凝集体にわたる粒子のサイズを検出し得る。例えば、好ましいプローブは、直径０．５ミクロン〜直径４００ミクロンの範囲のサイズの粒子を検出する機器とともに使用される。
【００３５】
１つの実施形態において、細胞凝集または細胞凝集の程度のモニタリングは、Ｔｓａｏら、（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６：８０９−８１４（２０００））において開示される方法によって実施される。
【００３６】
適応化Ａ５４９細胞株の細胞は、無血清および無動物材料培地懸濁培養において、小さな細胞凝集体を有する単一細胞の混合物として存在し得る。これは、大きな細胞凝集塊または大きな細胞凝集体を選択的に除去することによって部分的に達成される。より大きな凝集体を形成する細胞集合は、適応化の過程の間に取り除かれたと考えられる。取り除かれた細胞凝集体または細胞凝集塊は、直径４００ミクロンより巨大であり得る。残りの細胞凝集体および培養された細胞凝集体は、小さい（１００ミクロン〜２０ミクロンの範囲の大きさ）ことが好ましい。その単一細胞サイズは、直径１０ミクロン〜直径１５ミクロンの範囲である。
【００３７】
無血清および無動物材料懸濁培養において安定な適応化Ａ５４９（Ａ５４９Ｓとも名付けられる）培養物中に存在する細胞凝集体または細胞凝集塊は、直径４００ミクロン未満（例えば、３５０ミクロン）であり得、一般に、少なくとも直径３００ミクロン未満（例えば、直径２５０ミクロン）、少なくとも直径２００ミクロン未満（例えば、直径１５０ミクロン）、少なくとも直径１００ミクロン未満（例えば、直径９０ミクロン、直径８０ミクロン、直径７０ミクロン、直径６０ミクロン）、少なくとも直径５０ミクロン未満（例えば、直径４０ミクロン、直径３０ミクロン）、および少なくとも直径２５ミクロン未満であり得る。単一の細胞は、１０ミクロン〜１５ミクロンの範囲の直径を有する。
【００３８】
粒子サイズの分布は、培養物の凝集状態についての情報を提供すると同時に、累積細胞容量を提供する。ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ  ７８０／ＳＰＯＳ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｉｚｅｒを使用した凝集状態の定量化は、以下の方法により記載される。１つの方法は、全粒子（すなわち、細胞および細胞凝集体）の累積容量の分布をまとめるヒストグラムである。細胞凝集塊形成の程度は、累積性凝集プロット（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｐｌｏｔ）（例えば、累積細胞容量プロフィール）によって表され得る。凝集の分布もまた、数値的様式において示され得る。このパーセントポイントは、ヒストグラム上またはチャート上の２５％、５０％および７５％水準と交差する累積曲線において選択される。その結果の数値的提示（例えば、５０％水準）は、試料間での凝集の程度の簡便かつ一貫した比較を提供する。
【００３９】
適応化Ａ５４９細胞株は、ブダペスト条約の下で、２００３年１２月２３日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０−２２０９、ＵＳＡに寄託された。表示名および登録番号は以下の通りである；寄託名：「Ａ５４９Ｓ」；ＡＴＣＣ登録番号：ＰＴＡ−５７０８。ＡＴＣＣに寄託された上記細胞株の入手に対する全ての制約は、特許の付与に無関係である。
【００４０】
「懸濁培養」は、培養容器中の細胞の大多数または全てが懸濁液中に存在する（例えば、いかなる基層または表面、容器表面、もしくは容器内の別の表面にも付着しない）細胞培養を意味する。この懸濁培養は、懸濁液中で細胞を維持するために振とう、振動、強く攪拌、回転、または攪拌され得る。
【００４１】
「血清含有培地」は、任意の生物由来である血清を含む任意の成長培地を含む。例えば、血清含有培地は、ウシ胎仔血清、仔ウシ新生仔血清、仔ウシ血清、ヒト血清、ウマ血清、トリ血清、ヤギ血清、ブタ血清、ウサギ血清、および／またはヒツジ血清を含有する培地を含む。血清は、熱で不活性化されるか、透析されるか、γ−照射されるか、脱脂されるかまたは脱線維素され得る。この血清はまた、例えば、鉄または成長因子を補充され得る。
【００４２】
「無血清培地」は、血清を欠くあらゆる培地を含む。当該分野において、無血清培地は、細胞成長を示すための血清の補充を必要としない培地の分類を説明し得る。無血清培地は、個々の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）タンパク質画分またはバルクの（ｂｕｌｋ）タンパク質画分を含み得る。このタンパク質は、動物由来であり得る。市販されている好ましい無血清培地処方物の例は、ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、１３８０４  Ｗ．１０７ｔｈ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ、６６２１５、ＵＳＡ提供の、ＥＸ−ＣＥＬＬＴＭ５２０およびＥＸ−ＣＥＬＬＴＭ３０１である。
【００４３】
「無血清および無動物材料」培養培地とは、動物由来成分を含まない培養培地をいう。当該分野において、無血清培地および無血清および無動物材料培地の細胞培養培地製造者の定義は異なり得る。無血清培地または無血清および無動物材料培地はまた、無血清、化学的限定培地とも記載され得る。これらの培地は、無血清培地の下位分類であり、未知組成物の成分を含まない。これらの培地は、動物由来成分を含まず、そして全ての成分は、既知の化学構造を有している。無タンパク質培地は、無血清培地の下位分類であり、全てのタンパク質を含まないが、植物加水分解産物または酵母加水分解産物を含み得る。
【００４４】
「無血清および無動物材料培地懸濁培養」または「無血清および無動物材料懸濁培養」は、無血清および無動物材料培地中で増殖される懸濁培養を意味する。この無血清および無動物材料培地懸濁培養は、細胞および培地を含む。この培養物は、培地中で成長または培養した細胞によって分泌されるか、この細胞に由来するか、またはこの細胞に生成されたタンパク質を含む。ウイルスが増殖された場合、上記培養物は細胞、ウイルスおよび培地を含む。ウイルスを生成する培養は、細胞およびウイルス由来であるタンパク質を含む。
【００４５】
市販されている無動物材料合成的細胞培養培地は、無血清および無動物材料培地として使用され得る。好ましい無血清および無動物材料培地の例としては、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２５１１  Ｄａｉｍｌｅｒ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ、９２７０５、ＵＳＡ提供のＩＳ２９３−ＶＴＭが挙げられる。
【００４６】
市販されている無血清培地は、無血清培地としての適合性に関してスクリーニングされ得る。例えば、市販されている培地は、振とうフラスコ中においてＡ５４９細胞成長を支持するそれらの能力に関して、スクリーニングされ得る。例えば、接着培養由来の細胞は、目的の培地を使用した懸濁液中に移され得る。別の例において、すでに樹立された懸濁培養由来の細胞は、それらの現在の培地から目的の培地へと切り換えられ得る。細胞成長は、血球計計数によってモニターされる。細胞凝集塊形成の程度は、顕微鏡検査によって評価される。例えば、このスクリーニング方法の結果として、ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、（１３８０４  Ｗ．１０７ｔｈ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ、６６２１５、ＵＳＡ）提供の培地ＥＸ−ＣＥＬＬＴＭ５２０およびＥＸ−ＣＥＬＬＴＭ３０１が、大きな凝集を伴わずにＡ５４９細胞成長を支持することを見出した。これらの培地は、無血清培地としてさらに開発し得る。上記スクリーニング方法のさらなる結果として、例えば、無血清および無動物材料培地は、Ｃｏｎｄｏｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９：１３７−１４３（２００３））において開示される、ＨＥＫ２９３細胞の懸濁培養（例えば、０．１％  ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８（ＧＩＢＣＯ）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＊ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、１×微量元素（Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）Ａ、１×微量元素Ｂ、および１×微量元素Ｃ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、ならびに１３．４ｍｇ／Ｌグルコン酸第１鉄（Ｆｌｕｋａ）を補充した、ＩＳ  ２９３−Ｖ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に関する無血清および無動物材料培地は、大きな凝集を伴わずにＡ５４９細胞成長を支持する。この培地は、無血清および無動物材料培地としてさらに開発され得る。
【００４７】
また、例えば、以下の市販されている培地は、上記スクリーニング方法においてＡ５４９細胞成長を支持しない；ＣＤ  ２９３（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）；ＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）；２９３  ＳＦＭ  ＩＩ（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｄｉｕｍ  ３  ｆｏｒ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １４５０８、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、６３１７８、ＵＳＡ）；およびＣＨＯ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＰＦ−ＡＣＦ−ＣＨＯ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。これらの培地は、さらに開発されない。さらに、例えば、培養したＡ５４９細胞は、以下の市販されている培地において大きな凝集体を形成する；ＵＬＴＲＡＣＨＯＴＭ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｏｎｅ  Ｍｅａｄｏｗｌａｎｄ  Ｐｌａｚａ、Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ、０７０７３、ＵＳＡ）；ＵＬＴＲＡＣＵＬＴＵＲＥＴＭ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐ．）；およびＩＳ−ＣＨＯ−ＶＴＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。これらの培地は、さらに開発されない。
【００４８】
上記無血清および無動物材料培地は、鉄輸送のためにトランスフェリンを置換するように設計された鉄補充物を補充される。市販されている鉄補充物の例は、２２２〜３３４百万分率（ｐｐｍ）の鉄および鉄結合のための合成輸送分子を含む、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １４５０８、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、６３１７８、ＵＳＡ提供のＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ−Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｉｒｏｎ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（製品番号Ｉ３１５３）である。これは、２２２〜３３４ｐｐｍの鉄および鉄が結合する合成輸送分子を含む。この複合体は細胞の中に輸送され、この鉄はそこで放出され、そしてその細胞にとって有用なものとなる。Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ−Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｉｒｏｎ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔは、培地１リットルあたり１ｍｌの希釈率で使用される。市販されている鉄補充物の好ましい例は、培地１リットルあたり１ｍｌ〜３ｍｌ、好ましくは培地１リットルあたり３ｍｌの希釈率で使用されるＩｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２５１１  Ｄａｉｍｌｅｒ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ、９２７０５、ＵＳＡ）Ｉｒｏｎ  Ｃｈｅｌａｔｅ（製品番号９３４３）であり、市販されている鉄補充物の別の好ましい例は、培地１リットルあたり１３ｍｇの濃度でのグルコン酸第１鉄である。
【００４９】
細胞の成長を促進するために、培地は、脂質および脂質前駆体（例えば、コリン、オレイン酸、リノール酸、エタノールアミン、またはホスホエタノールアミン）を補充される。上記培地に補充するために利用され得る、市販されている濃縮脂質混合物がある。市販されている脂質混合濃縮物の１つの例は、培地１リットルあたり１０ｍｌの希釈率で使用されるＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １４５０８、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、６３１７８、ＵＳＡ）のＬｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）（製品番号Ｌ２２７３）である。Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＬｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）の処方は、以下の通りである：１００ｍｌ／ＬのＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＬｉｐｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（製品番号Ｌ  ５１４６）、および１００ｇ／Ｌ  ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−２８（製品番号Ｐ  １３００）。Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）を作るために使用されるＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＬｉｐｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（製品番号Ｌ  ５１４６）の処方は、以下の通りである：コレステロール（４．５ｇ／Ｌ）；タラ肝油脂肪酸、メチルエステル（１０ｇ／Ｌ）；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２５ｇ／Ｌ）；およびＤ−α−酢酸トコフェノール（２ｇ／Ｌ）。市販されている脂質混合物濃縮物の好ましい例は、培地１リットルあたり１ｍｌ〜１０ｍｌ（例えば、０．１％  ｖ／ｖ〜１％ｖ／ｖ）、好ましくは培地１リットルあたり１ｍｌ（例えば、０．１％  ｖ／ｖ）の希釈率での使用、より好ましくは培地１リットルあたり４ｍｌ（例えば、０．４％  ｖ／ｖ）の希釈率での使用、およびさらなお好ましくは培地１リットル１０ｍｌ（例えば、１％  ｖ／ｖ）の希釈率で使用されるＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１６００  Ｆａｒａｄａｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、９２００８、ＵＳＡ）のＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（製品番号１１９０５−０３１）である。ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（製品番号１１９０５−０３１）のための処方は、以下の通りである：ＰＬＵＲＯＮＩＣＦ−６８（１００，０００ｍｇ／Ｌ）；エチルアルコール（１００，０００ｍｇ／Ｌ）；コレステロール（２２０ｍｇ／Ｌ）；Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとも呼ばれる）（２，２００ｍｇ／Ｌ）；ＤＬ−α−酢酸トコフェノール（７０ｍｇ／Ｌ）；ステアリン酸（１０ｍｇ／Ｌ）；ミリスチン酸（１０ｍｇ／Ｌ）；オレイン酸（１０ｍｇ／Ｌ）；リノール酸（１０ｍｇ／Ｌ）；パルミチン酸（１０  ｍｇ／Ｌ）；パルミトレイン酸（１０ｍｇ／Ｌ）；アラキドン酸（２ｍｇ／Ｌ）；およびリノレン酸（１０ｍｇ／Ｌ）。
【００５０】
上記無血清および無動物材料培地には、非イオン性界面活性因子（ｓｕｒｆａｃｅ−ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）または非イオン性界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ６８）が補充される。上記ＰＬＵＲＯＮＩＣは、一般構造ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ）ｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｃＨ（ここで、ｂは少なくとも１５であり、そして（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ＋ｃは、２０重量％〜９０重量％で変化する）を有する非イオン性界面活性剤の一系列である。上記ＰＬＵＲＯＮＩＣはまた、例えば、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）；メチルオキシランポリマー（オキシランを有するポリマー）；およびポリエチレンポリプロピレングリコール、ポリマーとして公知である。特に好ましいい非イオン性界面活性剤は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ６８である。非イオン性界面活性剤（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ６８）の量は、培地中において、０．０５％と０．４％との間の範囲（特に好ましくは、０．１％と０．０５％との間であり、より特に好ましくは、０．１％）で使用され得る。この因子は、一般に、細胞を攪拌および曝気のネガティブな効果から保護するために使用される（ＭｕｒｈａｍｍｅｒおよびＧｏｏｃｈｅｅ、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．６：１４２−１４８；Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ、１９９１、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：３１６−３２４）。
【００５１】
さらに、上記培地には、細胞の成長を亢進させるために、無機微量元素（例えば、セレン、グルタミン、硫酸銅、クエン酸酸化鉄、亜セレン酸ナトリウム、硫酸亜鉛、モリブデン酸アンモニウム、バナジン酸アンモニウム、硫酸マンガン、硫酸ニッケル、ケイ酸ナトリウム、塩化第一スズ、塩化アルミニウム、酢酸バリウム、塩化カドミウム、塩化クロム、二塩化コバルト、二酸化ゲルマニウム、臭化カリウム、硝酸銀、フッ化ナトリウムおよびオキシ塩化ジルコニウム）が補充される。
【００５２】
例えば、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈの微量元素Ａ：１，０００×溶液（製品番号９９−１８２−ＣＩ）；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈの微量元素Ｂ：１，０００×溶液（製品番号９９−１７５−ＣＩ）；およびＭｅｄｉａｔｅｃｈの微量元素Ｃ：１，０００×溶液、製品番号９９−１７６−ＣＩ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、１３８８４  Ｐａｒｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｒｏａｄ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ、２０１７１、ＵＳＡ）のような、市販されている微量元素の濃縮化混合物がある。Ｍｅｄｉａｔｅｃｈの微量元素  Ａ溶液、微量元素  Ｂ溶液、および微量元素Ｃ溶液の各々は、培地１リットルあたり１ｍｌの希釈率で使用される。Ｍｅｄｉａｔｅｃｈの微量元素Ａ：１，０００×溶液（製品番号９９−１８２−ＣＩ）の処方は、以下の通りである：ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１．６ｍｇ／Ｌ）；ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（８６３ｍｇ／Ｌ）；亜セレン酸＊２Ｎａ（１７．３ｍｇ／Ｌ）；およびクエン酸第一鉄（１１５５．１ｍｇ／Ｌ）。Ｍｅｄｉａｔｅｃｈの微量元素Ｂ：１，０００×溶液（製品番号９９−１７５−ＣＩ）の処方は、以下の通りである：ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（０．１７ｍｇ／Ｌ）；Ｎａ２ＳｉＯ３＊９Ｈ２Ｏ（１４０ｍｇ／Ｌ）；モリブデン酸、アンモニウム塩（１．２４ｍｇ／Ｌ）；ＮＨ４ＶＯ３（０．６５ｍｇ／Ｌ）；ＮｉＳＯ４＊６Ｈ２Ｏ（０．１３ｍｇ／Ｌ）；およびＳｎＣｌ２（無水物）（０．１２ｍｇ／Ｌ）。Ｍｅｄｉａｔｅｃｈの微量元素Ｃ：１，０００×溶液（製品番号９９−１７６−ＣＩ）の処方は、以下の通りである：ＡｌＣｌ３＊６Ｈ２Ｏ（１．２ｍｇ／Ｌ）；ＡｇＮＯ３（０．１７ｍｇ／Ｌ）；Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２（２．５５ｍｇ／Ｌ）；ＫＢｒ（０．１２ｍｇ／Ｌ）；ＣｄＣ１２（２．２８ｍｇ／Ｌ）；ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（２．３８ｍｇ／Ｌ）；ＣｒＣｌ３（無水物）（０．３２ｍｇ／Ｌ）；ＮａＦ（４．２ｍｇ／Ｌ）；ＧｅＯ２（０．５３ｍｇ／Ｌ）；ＫＩ（０．１７ｍｇ／Ｌ）；ＲｂＣｌ（１．２１ｍｇ／Ｌ）；およびＺｒＯＣｌ２＊８Ｈ２Ｏ（３．２２ｍｇ／Ｌ）。
【００５３】
さらに、上記無血清および無動物材料培地には、細胞培養のｐＨレベルの制御に役立つ緩衝液が補充される。例えば、緩衝液は、炭酸水素ナトリウム、一塩基リン酸塩および二塩基リン酸塩、ＨＥＰＥＳ（（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸（ｅｎｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））；４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）；およびその塩））、ならびにトリス（（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；トリス（２−アミノエチル）アミン；さらにその塩））を含む。
【００５４】
さらに、上記無血清および無動物材料培地には、培地中に、アミノ酸（Ｌ−グルタミン）が２ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で、好ましくは、少なくとも２ｍＭ（例えば、１ｍＭまたは３ｍＭ）の濃度で、より好ましくは、少なくとも４ｍＭ（例えば、５ｍＭ、６ｍＭ、または７ｍＭ）の濃度で、より好ましくは、少なくとも８ｍＭ（例えば、９ｍＭまたは１０ｍＭ）の濃度で補充される。
【００５５】
必要に応じて、上記無血清培地および無動物材料培地には、培地１リットルあたり０．１グラム〜１０グラム（例えば、少なくとも培地１リットルあたり２グラム）の濃度で、炭水化物（例えば、Ｄ−グルコース）が補充され得る。
【００５６】
１つの実施形態において、上記無血清および無動物材料培地、０．１％  ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１６００  Ｆａｒａｄａｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、９２００８、ＵＳＡ）、Ｉｒｖｉｎｅ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＩｒｏｎ  Ｃｈｅｌａｔｅ（培地１リットルあたり３ｍｌ）、１５ｍＭ  トリス緩衝液、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈの（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、１３８８４  Ｐａｒｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｒｏａｄ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ、２０１７１、ＵＳＡ）の微量元素Ａ（培地１リットルあたり１ｍｌ）、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈの微量元素Ｂ（培地１リットルあたり１ｍｌ）、およびＭｅｄｉａｔｅｃｈの微量元素Ｃ（培地１リットルあたり１ｍｌ）、８ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ならびにＧＩＢＣＯ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（１％  ｖ／ｖ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が補充された、Ｉｒｖｉｎｅ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＩＳ  ２９３−ＶＴＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２５１１  Ｄａｉｍｌｅｒ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ、９２７０５、ＵＳＡ）である。
【００５７】
別の実施形態において、上記無血清および無動物材料培地は、０．１％  ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、グルコン酸第一鉄（培地１リットルあたり１３ｍｇ）、１５ｍＭ  トリス緩衝液、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈの微量元素  Ａ（培地１リットルあたり１ｍｌ）、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈの微量元素  Ｂ（培地１リットルあたり１ｍｌ）、およびＭｅｄｉａｔｅｃｈの微量元素  Ｃ（培地１リットルあたり１ｍｌ）、８ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ならびにＧＩＢＣＯ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（１％  ｖ／ｖ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が補充された、Ｉｒｖｉｎｅ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＩＳ  ２９３−ＶＴＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）である。
【００５８】
（細胞培養およびウイルス生成）
本発明の適応化Ａ５４９細胞株は、適切な培地（例えば、無血清および無動物材料培地）中で、好ましくは懸濁培養において細胞を培養することによって簡単に増殖され得る。
【００５９】
一旦上記細胞が適応化されると、それらは低温保存され得、そして将来の使用のために保存され得る。好ましくは、適応化Ａ５４９細胞を成長の後期対数期にまで増殖させ；その細胞を濃縮し；成長培地から、例えば、凍結保護物質および安定剤を補充した無血清および無動物材料培地のような培地または血清含有培地へと交換し；細胞を凍結し；そして０℃以下の温度で細胞を保存することによって、上記細胞は低温保存される。
【００６０】
好ましくは、上記細胞は、−７０℃以下（例えば、−８０℃）で、または液体窒素中で、もしくは液体窒素の気相中で保存される。
【００６１】
上記細胞は、当該分野において公知であるあらゆる方法によって濃縮され得る。例えば、上記細胞は、遠心、沈降、灌流デバイス（例えば、ふるい）を使用した濃縮または濾過によって濃縮され得る。好ましくは、上記細胞は、少なくとも１×１０７細胞／ｍｌにまで濃縮される。
【００６２】
上記細胞は、当該分野において公知であるあらゆる凍結保護物質中で保存され得る。例えば、この凍結保護物質は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはグリセロールであり得る。上記細胞は、当該分野において公知である安定剤中で保存され得る。例えば、この安定剤は、メチルセルロースまたは血清であり得る。
【００６３】
凍結するより前に、濃縮された細胞は、細胞バンクを作製するために数個の別の容器中に分けられ得る。上記細胞は、例えば、ガラス製またはプラスチック製のバイアル中またはチューブ中に、もしくは細胞培養バッグ中に保存され得る。将来の使用のために上記細胞が必要となった場合、上記細胞バンクから低温保存された細胞の一部が（１つの容器から）選択され得、解凍され得、そして無血清および無動物材料培地懸濁培養において適応化を伴わずに使用され得る。
【００６４】
適応化Ａ５４９細胞は、当該分野において公知である哺乳動物細胞の懸濁培養のための任意の方法によって増殖または成長し得る。この適応化Ａ５４９細胞は、無血清および無動物材料培地懸濁培養において適応化を伴わずに成長し得る。増殖は、単一工程手順または複数の工程手順によって実施され得る。単一工程の増殖手順において、上記適応化Ａ５４９細胞は保存庫から取り出され、そしてウイルスの生成を行う予定である培養容器中へ直接播種される。複数の工程の増殖手順において上記適応化Ａ５４９細胞は保存庫から取り出され、そしてウイルスの生成を行う予定である最終培養容器に到達するまで次第にサイズを大きくたいくつかの培養容器を経て増殖される。この増殖工程の間、上記細胞は、成長のために至適化された条件下で成長する。例えば、温度、ｐＨ、溶存酸素レベルなどの培養条件は、特定の細胞株にとって至適であると知られており、そしてこの分野の当業者に明らかである条件である（例えば、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  第２版、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照のこと）。
【００６５】
適応化Ａ５４９細胞、またはその細胞中でウイルス（例えば、アデノウイルス）を生成する適応化Ａ５４９細胞を増殖させる場合、この細胞は、最初のバイアルから生物体量にまで無血清培地中または無血清および無動物材料培地中で成長し得る。高い細胞密度を有する生物体量は、ウイルス増殖およびウイルス生成処理の間、無血清培地中または無血清および無動物材料培地中で維持され得る。
【００６６】
適応化Ａ５４９細胞は成長し得、そしてこのウイルスを生成する適応化Ａ５４９細胞は、当該分野において公知であるあらゆる適切な容器中で培養され得る。例えば、細胞は成長し得、そして感染した細胞は、バイオジェネレーター（ｂｉｏｇｅｎｅｒａｔｏｒ）中またはバイオリアクター（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）中で培養され得る。一般に、「バイオジェネレーター」または「バイオリアクター」は、一般にステンレス金属製またはガラス製であり、０．５リットル以上の容量を有し、攪拌システム、ＣＯ２ガスの気流を注入するためのデバイスおよび酸素添加デバイスを装備する培養タンクを意味する。代表的に、それはバイオジェネレーターの内部パラメーター（例えば、培養物のｐＨ、溶存酸素、温度、タンク圧または特定の物理化学的なパラメーター（例えば、グルコースの消費もしくはグルタミンの消費または乳酸およびアンモニウムイオンの生成））を測定する探針（ｐｒｏｂｅ）を備える。ｐＨ探針、酸素探針、および温度探針は、これらのパラメーターを持続的に調節するバイオプロセッサに連絡する。他の実施形態において、上記容器は、スピナーフラスコ、回転瓶、振とうフラスコまたは機械的攪拌を提供する攪拌棒を有するフラスコである。別の実施形態において、１つの上記容器はＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）である。懸濁培養は、懸濁液中で細胞を維持するために振とう、振動、強い攪拌、回転または攪拌され得る。
【００６７】
ある適応化Ａ５４９培養における細胞密度は、当該分野において公知であるあらゆる方法によって決定され得る。例えば、細胞密度は、顕微鏡的（例えば、血球計）、または電子細胞計数デバイス（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）（例えば、ＣＯＵＬＴＥＲ  ＣＯＵＮＴＥＲ；ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ  ７８０／ＳＰＯＳ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｉｚｅｒ）によって決定され得る。
【００６８】
用語「世代数」とは、細胞培養が起こした集団倍加の数をいう。集団倍加の計算は、当該分野において周知である（例えば、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、編者ＪａｋｏｂｙおよびＰａｓｔａｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、５８：１５０−１５１（１９７９）を参照のこと）。１つの実施形態において、インビトロ細胞齢（ｃｅｌｌ  ａｇｅ）または培養の世代数は、培養期間の間の細胞分裂の数を、以下の式、ｌｎ（細胞質量の増加倍数（ｆｏｌｄ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅａｓｅ））／ｌｎ２で計算することによって決定される。１つの実施形態において、細胞質量における増加は、Ｔｓａｏら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６：８０９−８１４（２０００））において開示される方法によって測定される。
【００６９】
用語「組み換え」とは、慣習的な組み換えＤＮＡ技術を介して改変されたゲノムをいう。
【００７０】
用語「ウイルス」は、本明細書中で使用する場合、天然に存在するウイルスのみならず、組み換えウイルス、弱毒化ウイルス、ワクチン株などもまた含む。組み換えウイルスとしては、異種遺伝子を含むウイルスベクターが挙げられるが、これに限定されない。用語組み換えウイルスは、キメラの（または多量体も同様）ウイルス（すなわち、１種より多い（ｍｏｒｅ  ｔｈａｔ  ｏｎｅ）ウイルスサブタイプ由来の相補的コード配列を使用して構築されたベクター）を含む。例えば、Ｆｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：８６６−８７０（１９９７）を参照のこと。いくつかの実施形態において、ウイルス複製のためのヘルパー機能（ｈｅｌｐｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）は、宿主細胞、ヘルパーウイルス、またはヘルパープラスミドによって提供される。代表的なベクターとしては、哺乳動物細胞（特に、ヒト細胞）に感染し、かつウイルス由来（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、疱疹ウイルス、およびアビポックスウイルス）であり得るベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
本発明の細胞培養物中において、あらゆるウイルスも増殖され得る。１つの実施形態において、このウイルスはアデノウイルスである。用語「アデノウイルス」は、用語「アデノウイルスベクター」と同義語であり、そしてアデノウイルス属のウイルスをいう。用語アデノウイルスとは、集合的に、マストアデノウイルス属の動物アデノウイルスをいい、ヒトアデノウイルス亜属、ウシアデノウイルス亜属、ヒツジアデノウイルス亜属、ウマアデノウイルス亜属、イヌアデノウイルス亜属、ブタアデノウイルス亜属、マウスアデノウイルス亜属およびサルアデノウイルス亜属が挙げられるが、これらに限定されない。特に、ヒトアデノウイルスとしては、Ａ亜属〜Ｆ亜属ならびにその個々の血清型が挙げられる。例えば、１、２、３、４、４ａ、５、６、７、７ａ、７ｄ、８、９、１０、１１（Ａｄ１１ＡおよびＡｄ１１Ｐ）、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３４ａ、３５、３５ｐ、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、および９１のアデノウイルス型のいずれもが、本発明の細胞培養物中において生成され得る。本発明の好ましい実施において、上記アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型２もしくはヒトアデノウイルス血清型５であるか、またはヒトアデノウイルス血清型２由来もしくはヒトアデノウイルス血清型５由来である。
【００７２】
本発明の１つの実施形態において、上記アデノウイルスは、野生型遺伝子、変異型遺伝子を含む。別の実施形態において、上記ウイルスは、変異型遺伝子を含む；例えば、改変遺伝子はセグメントを欠き得るか、または１つ以上のさらなる異種遺伝子を含み得る。別の実施形態において、上記ウイルスは、選択的複製組み換えウイルスまたは条件的複製ウイルス（すなわち、正常細胞において弱毒化されたウイルスであると同時に、腫瘍細胞におけるウイルス複製を維持するウイルス（例えば、Ｋｉｒｎ，Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：７８１−７８７（２００１）；Ａｌｅｍａｎｙ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：７２３−７２７（２０００）；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａ，Ｍ．ら、Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３２１−３４３頁（２００３）を参照のこと））である。
【００７３】
本発明の１つの実施形態において、上記選択的複製組み換えベクターは、選択的複製組み換えアデノウイルスまたはアデノウイルスベクター（例えば、公開された国際出願番号ＷＯ  ００／２２１３６およびＷＯ  ００／２２１３７；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１０３５−１０４１（２００１）；Ｈｏｗｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２（５）：４８５−９５（２０００）；ならびにＤｅｍｅｒｓ，Ｇ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：４００３−４００８（２００３）において記載された選択的複製組み換えアデノウイルスまたはアデノウイルスベクター）である。
【００７４】
選択的複製組み換えアデノウイルスはまた、「腫瘍崩壊性アデノウイルス」、「腫瘍崩壊性複製アデノウイルス」、「複製アデノウイルスベクター」、「条件的複製アデノウイルスベクター」または「ＣＲＡＶ」として記載され得るが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明の別の実施形態において、上記アデノウイルスは、０１／ＰＥＭＥ（ｃＫ９ＴＢまたはＫ９ＴＢとしても公知）であり、それは、Ｅ１ａ遺伝子およびＥ３領域における欠失、Ｅ２Ｆアンタゴニスト（Ｅ２Ｆ−Ｒｂ）をドライブするｐ５３応答性プロモーターの挿入、およびＥ３−１１．６Ｋ遺伝子を調節する主要な後期プロモーター（ｌａｔｅｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の挿入によって、正常細胞において複製を減弱化されるように改変されており、そして例えば、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１０３５−１０４１（２００１）；米国特許出願公開第ＵＳ２００２／０１５０５５７号；およびＤｅｍｅｒｓ，Ｇ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：４００３−４００８（２００３）において記載される。
【００７６】
用語「感染させる」は、ウイルスによる細胞の感染を促進させる条件下において、適応化Ａ５４９細胞にウイルスを曝すことを意味する。所与のウイルスの多数のコピーによって感染した細胞において、ウイルス複製のために必要な活性およびビリオンパッケージングのために必要な活性は協働的である。したがって、上記適応化Ａ５４９細胞が上記ウイルスに高い確率で複数回感染するように条件が調整されることが好ましい。適応化Ａ５４９細胞においてウイルスの生成を亢進させる条件の一例は、感染相において細胞濃度と比較してウイルス濃度を増大させることである。しかしながら、細胞あたりの総感染数が高くなりすぎ得ることは可能であり、その結果細胞に対して毒性効果をもたらす。したがって、ウイルス粒子：Ａ５４９細胞の比は、感染のときに（４０〜６０）：１に維持されることが好ましい。
【００７７】
用語「ウイルスゲノムの複製を許容する条件下における培養」は、感染したＡ５４９についての条件を、ウイルスが増殖できるように維持することを意味する。ウイルスを含む細胞は、ウイルスによって感染した細胞およびウイルスを生成する細胞を含む。培養条件を、各々の細胞によって生成されるウイルス粒子の数を最大化できるように制御することが所望される。培養条件（例えば、当業者において周知である他のパラメーターの中でも温度、溶存酸素、ｐＨ、攪拌）を、モニターまたはコントロールすることが所望される。市販されているバイオリアクター（例えば、バイオリアクター類のＢＩＯＳＴＡＴ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ、ＵＳＡ））は、このようなパラメーターを測定および維持するための条件を有する。感染条件および培養条件の至適化はいくらか変化するが、しかしながら、効率的なウイルスの複製および生成のための条件は、例えば、公知の細胞株の性質、ウイルスの性質およびバイオリアクターの型を当業者が考慮することによって達成され得る。
【００７８】
ウイルス（例えば、アデノウイルス）は、本発明の適応化Ａ５４９細胞または懸濁Ａ５４９細胞において生成され得る。ウイルスは、上記適応化Ａ５４９細胞を培養すること；必要に応じて、新鮮な成長培地を上記細胞に添加すること；この細胞をウイルスとともに播種する；必要に応じて、細胞培養物に塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を補充すること；播種された上記細胞を（任意の時間）インキュベートすること；必要に応じて新鮮な成長培地を上記播種された細胞に添加すること；必要に応じて細胞培養物に塩化カルシウムを補充すること；そして必要に応じて上記細胞およびその培地からウイルスを収集することによって生成され得る。代表的に、慣習的な方法（例えば、Ｓｈａｂｒａｍら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ８：４５３−４６５（１９９７）において記載されるような、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムを使用した高速液体クロマトグラフィー）によって決定されるようなウイルス粒子の濃度がプラトーになり始めた場合、収集が実施される。
【００７９】
代表的に、感染した適応化Ａ５４９細胞は、培養において、少なくとも１３７世代または少なくとも６ヶ月の間、上記ＣＲＡＶアデノウイルスの生成を３６×１０９ｖｐ／ｍｌ〜１４４×１０９ｖｐ／ｍｌの範囲内で維持可能である。
【００８０】
新鮮な培地は、ウイルス接種の後および／または前に上記細胞に供給され得る。例えば、この新鮮な培地は灌流によって添加され得る。培地交換は、上記適応化Ａ５４９細胞または上記適応化Ａ５４９培養物においてウイルス生成のレベルを増大させる。本発明の１つの実施形態において、感染した適応化Ａ５４９細胞の培地は２回の連続した交換に供され、１回目の交換は感染時であり、そして２回目の交換は感染の１日後である。新鮮な培地は、さらなるカルシウムの添加有りまたは添加無しで細胞に供給され得る。
【００８１】
カルシウムは、ウイルス感染後の上記適応化Ａ５４９細胞に供給され得る。このカルシウムは、可溶形態（例えば、塩化カルシウムまたは硫酸カルシウム）で上記培養物に添加される。カルシウム添加は、上記適応化Ａ５４９細胞または上記適応化Ａ５４９培養物においてウイルス生成のレベルを増大させる。本発明の１つの実施形態において、塩化カルシウムは、ウイルス感染後に培養物中に添加される。別の実施形態において、塩化カルシウムは、ウイルス播種の２時間後に添加される。別の実施形態において、塩化カルシウムは、ウイルス感染の２時間後〜８時間後の範囲において上記培養物中に添加される。別の実施形態において、塩化カルシウムは、ウイルス感染の２０時間後〜２４時間後の範囲において上記培養物中に添加される。新鮮な培地中または細胞培養物中において使用されるさらなる付加的な塩化カルシウム濃度の範囲は、０．２ｍＭ〜１．６ｍＭである。本発明の１つの実施形態において、感染した適応化Ａ５４９細胞または感染した適応化Ａ５４９細胞培養物は、さらに１．６ｍＭ  塩化カルシウムを添加された新鮮な培地の２回の連続した交換に供され、１回目の交換は感染時であり、２回目の交換は感染の１日後である。
【００８２】
ウイルスを生成するために使用される上記適応化Ａ５４９細胞は、無血清および無動物材料培地条件下で凍結された細胞株由来、または血清含有培地条件下で凍結された細胞株由来（例えば、凍結された細胞バンク由来）であり得る。
【００８３】
上記培養物中のウイルスの存在を同定する（すなわち、培養物中のウイルスタンパク質の存在を実証する）ための適切な方法としては、ウイルスタンパク質のうちの１つに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用し得る免疫蛍光試験（Ｖｏｎ  Ｂｕｅｌｏｗら、Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ、第１０版、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ（Ｓｏｉｎｅら、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３７：４６７−４７６（１９９３））、ＥＬＩＳＡ（Ｖｏｎ  Ｂｕｅｌｏｗら、Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ、第１０版、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ））、フローサイトメトリーによるヘキソン発現分析（Ｍｕｓｃｏら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３３：２９０−２９６（１９９８））、ウイルス中和反応、または特定のウイルスタンパク質を同定するための任意の通常の組織化学的方法が挙げられる。
【００８４】
培養物中のウイルスの量の力価は、Ｖｉｌｌｅｇａｓら「Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ」：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第３版、Ｐｕｒｃｈａｓｅら編、Ｋｅｎｄａｌｌ／Ｈｕｎｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｄｕｂｕｑｕｅ、Ｉｏｗａ（１９８９）において記載される当該分野において公知である技術によって実施され得る。特定の実施形態において、ウイルス粒子の濃度は、Ｓｈａｂｒａｍら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：４５３−４６５（１９９７）によって記載されるＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑアッセイによって決定される。本明細書中で使用する場合、用語「溶解」とは、ウイルスを含む細胞の破裂をいう。溶解は、当該分野において周知である種々の方法によって達成され得る。例えば、哺乳動物細胞は、均質化によって、微細流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によって、または慣習的な凍結−融解方法によって、低い圧力（差圧１００ｐｓｉ〜２００ｐｓｉ）条件下において溶解され得る。
【００８５】
ウイルスを含む細胞は、凍結され得る。ウイルスは、このウイルスを含む細胞およびその培地から収集され得る。１つの実施形態において、ウイルスは、ウイルスを含む細胞およびその培地の両方から同時に収集され得る。特定の実施形態において、ウイルス生成細胞および培地は、ウイルスを含む細胞の溶解および、ウイルス精製を（浄化していなければ）干渉する細胞破片の培地からの浄化を両方に行う条件下において、米国特許第６，１４６，８９１号に記載されるようなクロスフロー精密濾過（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ  ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に供される。
【００８６】
ウイルスは、ウイルスを含む細胞および培地から別々に収集され得る。このウイルスを含む細胞は、慣習的な方法（例えば、分画遠心法）によって、その培地から分離して集められ得る。収集された細胞は、凍結保存され得るか、またはウイルスを遊離させるための溶解によって、さらに処理され得る。ウイルスは、クロマトグラフ的な手段によって上記培地から収集され得る。エキソジナーゼ（ｅｘｏｇｅｎａｓｅ）を含まないＤＮＡ／ＲＮＡは、ＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅ（例えば、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．））を使用した分解によって除去され得る。
【００８７】
ウイルス収集は、例えば、米国特許第６，１４６，８９１号および同第６，５４４，７６９号において記載されるような、限外濾過または接線フロー濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）のような方法によって、ウイルスを濃縮するためにさらに処理され得る。
【００８８】
本発明の細胞培養物中で生成されたウイルス粒子は、当該分野において一般に知られているあらゆる方法によって、単離および精製され得る。例えば、上記ウイルス粒子は、塩化セシウム勾配精製、カラムクロマトグラフィーまたはバッチクロマトグラフィー、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）クロマトグラフィー（Ｈａｒｕｎａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３：２６４−２６７（１９６１）；Ｋｌｅｍｐｅｒｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９：５３６−５４５（１９５９）；Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １０：４５９−４６５（１９６０））、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（米国特許出願公開第ＵＳ２００２／００６４８６０号）および他の樹脂（例えば、軟質ゲル（例えば、アガロース）を含む、均質な架橋多糖類、大きな「通過細孔（ｔｈｒｏｕｇｈｐｏｒｅ）」を有する灌流クロマトグラフィー樹脂を含む、合成ポリマーを基礎としたマクロ細孔ポリマー、タンパク質を使用したとのより早い相互作用のために設計されたテンタクル（ｔｅｎｔａｃｌｅ）を有する「テンタクラー（ｔｅｎｔａｃｕｌａｒ）」吸着剤（例えば、フラクトゲル（ｆｒａｃｔｏｇｅｌ））、ならびに軟質ゲルの高い能力および複合材料の強剛性を利用した、強固なシェル中の軟質ゲルを基礎とした材料（例えば、Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）Ｆ）（Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．６５８：２０７（１９９４）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．６９９：４７−６１（１９９７））を使用したクロマトグラフィーによって精製され得る。特定の実施形態において、（例えば、Ｈｕｙｇｈｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１４０３−１４１６（１９９５）；米国特許第５，８３７，５２０号；および同第６，２６１，８２３号において記載されるように）カラムクロマトグラフィーによって、上記ウイルスは精製され得る。
【００８９】
（タンパク質精製）
本発明の適応化Ａ５４９細胞中で成長したアデノウイルス（好ましくは、目的のポリペプチドをコードする異種遺伝子を含むアデノウイルス）によって生成されたタンパク質もまた、単離および精製され得る。
【００９０】
上記タンパク質（本発明のポリペプチドおよび抗原性フラグメント）は、標準の方法によって精製され得、その方法としては、塩析またはアルコール沈殿、親和性、分離用ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、陽イオン交換および陰イオン交換クロマトグラフィー、ならびに分配クロマトグラフィー、さらに向流分配が挙げられるが、これらに限定されない。このような精製方法は、当該分野において周知であり、かつ、例えば、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８２巻，Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹにおいて開示されている。
【実施例】
【００９１】
以下の実施例は本発明をより明白に説明するために提供され、そして決して本発明の範囲を限定するようには解釈されるべきではない。
表１は、実施例において使用された種々の培地を収載する。
【００９２】
【表１】
2007515172.tif 000002
（実施例１：接着Ａ５４９細胞の無血清および無動物材料培地懸濁培養への適応化）
トリプシン処理によって接着細胞を培養するための下記の標準の手順に続いて、Ａ５４９細胞を解凍し、そしてＴ−７５培養フラスコ中の培地１（表１）中に継代した。適応化処理は、３週間〜６週間をかけて完了する。懸濁適応の上記処理を開始するために、漸次的に低いレベルの血清を含む培地を介する上記細胞の連続的な継代によって、付着細胞を徐々に血清から離脱させた。これを、各々の細胞培養継代で、無血清および無動物材料懸濁培地（培地２（表１を参照のこと））の容量を増加させることによる、培地１（表１を参照のこと）の希釈によって行った。結果として、最終ＦＢＳ濃度が０．３％を下回るまで、最初の１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）レベルから各々の継代ごとに５０％ずつ段階的に血清レベルを減少させた。各々の継代を、３日間〜５日間行った。上記細胞を、いくつかの細胞が非接着（例えば、細胞が培養容器の表面に付着していない）となるまで継代した。
【００９３】
０．３％  ＦＢＳ含有培地における１回の継代の後、上記細胞をＴ７５フラスコからトリプシン処理し、２５０ｍｌ振とうフラスコ（４０ｍｌ培養容量）中の同じ０．３％  ＦＢＳ含有培地中に再度播種し、そして振とうインキュベーター中で、３７℃の温度で、５％  ＣＯ２の雰囲気下で、８５ｒｐｍで振とうさせながら成長させた。
【００９４】
懸濁培養へと移行する際、血清からの離脱を完了させるために、その後の継代培養の全てを無血清および無動物材料培地（培地２（表１を参照のこと））を用いて実施した。細胞を、約２×１０６細胞／ｍｌ〜２．５×１０６細胞／ｍｌまで成長させた。次いでこの培養物を、５００ｍｌ振とうフラスコ（１００ｍｌ培養容量）中へ、培養物：培地２（表１を参照のこと）について１：２で分配（ｓｐｌｉｔ）した。１Ｌ振とうフラスコ（２４０ｍｌ培養容量）中へ１：２で分配する前に、細胞を、約２×１０６細胞／ｍｌ〜２．５×１０６細胞／ｍｌまで再び成長させた。トリパンブルーを用いて染色することによって決定されるような、この培養物の生存度を、９０％より高く維持した。
【００９５】
細胞の成長および凝集を、粒子サイズ測定器（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅｒ）（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ  ７８０／ＳＰＯＳ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｉｚｅｒ）を使用して毎日モニターした。この培養物の凝集プロフィールについて、５０％の読み取り値（ｒｅａｄｉｎｇ）が１００細胞／凝集塊以下であることが、最高の成長率を示す。トリパンブルー色素排除および血球計を使用して、培養物生存度を測定した。細胞凝集サイズをモニタリングすることは、細胞凝集の制御を介した至適細胞成長のための培養条件（例えば、培地改変および攪拌速度の効果）の決定を可能にする。２つの培養物を作製し、そしてこの複製培養物の１つの培養条件に対する１つのパラメーター（例えば、攪拌速度）を変更し、そして粒子サイズ測定器を使用して時間をかけて凝集の程度をモニターした。さらに、継代培養スケジュールを決定するために、粒子サイズ測定を持続的に実施した。上記粒子サイズ測定器は、細胞密度と等価である細胞質量、および所望されるパラメーター内での凝集の維持の読み取り値を示す。上記細胞質量読み取り値を、いつ培養物を分配するのか、ならびにその分配比を決定するために使用した。上記凝集プロフィールについて、５０％の測定値が１００細胞／凝集塊以下であることの維持が、最高の成長率をもたらした。
【００９６】
１Ｌフラスコ中の上記培養物の連続的な増殖のために、細胞を、上記粒子サイズ測定器を使用して継続的にモニターし、そして上述のように継代培養した。粒子サイズ測定器分析は、懸濁培養において最初の数回の継代の間にＡ５４９細胞が大きな凝集体を形成する傾向があることを示した。継代培養前に１分間〜２分間攪拌を中止することによって大きな凝集体を振とうフラスコの底に沈ませ、それによってピペッティングを介してその凝集体を集団から除去し得た。凝集体が所望されるレベルにまで減少するまで、培養物をこの様式で継代培養した。望ましいレベルは、１分後〜２分後に培養フラスコの底に大きな凝集塊が沈んでおらず、かつ上記粒子サイズ測定器を使用した５０％の細胞読み取り値が１００細胞／凝集塊以下であるレベルである。この培養成長速度を維持した。観察された成長速度は、少なくとも０．３／日である。無血清および無動物材料培地における懸濁成長に適応化された細胞は、「懸濁Ａ５４９細胞」もしくは「適応化Ａ５４９細胞」または「Ａ５４９Ｓ」あるいは「ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−５７０８」と呼ばれ得る。
【００９７】
【表２】
2007515172.tif 000003
【００９８】
【表３−１】
2007515172.tif 000004
。
【００９９】
（実施例２：懸濁培養における、種々の細胞株由来であるＡ５４９細胞の細胞凝集の量の比較）
適応化Ａ５４９懸濁細胞株を作製するためのＡ５４９細胞の無血清および無動物材料培地懸濁適応化の間、大きな細胞凝集塊に関連しない細胞を選択的に保持した。表面に付着しない細胞株の細胞または亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を選択し、そして無血清および無動物材料培地懸濁培養において増殖させた。複数回の選択（この培養物の攪拌を停止し、そして大きな細胞凝集体をフラスコの底に沈めて懸濁液中に留まる細胞を継代培養することによる）によって、望ましい細胞集団を濃縮した。結果として生じた適応化Ａ５４９細胞株は、同じ懸濁培地において、非適応化Ａ５４９細胞と比較してより凝集の程度が低かった（例えば、表３を参照のこと）。
【０１００】
上記Ａ５４９接着細胞をトリプシン処理し、培地１（表１を参照のこと）で１回洗浄し、次いで１２５ｍｌ振とうフラスコ中の培地１または培地２（表１を参照のこと）のいずれか（２０ｍｌ容量）の中に播種した。５％ＣＯ２雰囲気、３７℃の温度、および８５ｒｐｍの振とう速度で、振とうインキュベーター中で細胞を６日間成長させた。
【０１０１】
【表３−２】
2007515172.tif 000005
。
【０１０２】
（実施例３：無血清および無動物材料培地懸濁培養における、Ａ５４９Ｓ細胞によるＣＲＡＶの生成）
軌道振とう器上のエルレンマイアーフラスコと攪拌型タンクバイオリアクターとの両方において、Ａ５４９Ｓ細胞によるウイルス生成を実施した。両方の場合において、ウイルス接種物で培養物を感染させることによって、生成物を得た。
【０１０３】
振とうフラスコにおけるウイルス生成のために、振とう器を組織培養インキュベーター中に設置することにより温度（３７℃）、ＣＯ２レベル（５％）および湿度を維持した。無血清および無動物材料培地（培地２、表１を参照のこと）中で、バッチモード（ｂａｔｃｈ  ｍｏｄｅ）で感染に先立って約１．８×１０６細胞／ｍｌ〜２．４×１０６細胞／ｍｌの密度まで懸濁Ａ５４９細胞を成長させた。ウイルス接種の前に、無血清および無動物材料培地（培地２、表１を参照のこと）で最初の培養容量の約９０％の培地交換を遠沈によって実施した。約（４０〜５０）：１のウイルス粒子：細胞の比と等価である、１×１０８ウイルス粒子／ｍｌの最終濃度でウイルスを接種した。ウイルス接種の２時間後、上記培地にさらなる１．６ｍＭ  塩化カルシウムを供給するために、その培地に塩化カルシウムを添加した。感染の約２０時間後、さらに１．６ｍＭ  ＣａＣｌ２が補充された無血清および無動物材料培地（培地２（表１を参照のこと））で別の９０％培地交換を遠沈によって実施した。生成されたウイルスの量を定量化するために、感染の２４時間後、４８時間後および７２時間後に各々の培養物から３ｍｌの培養試料を収集した。ウイルス生成の量は、１００×１０９ｖｐ／ｍｌ〜１５０×１０９ｖｐ／ｍｌまたは３×１０４ｖｐ／細胞〜４×１０４ｖｐ／細胞であった。
【０１０４】
バイオリアクターにおける生成のために、攪拌型タンクバイオリアクターに内部スピンフィルター（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｐｉｎ  ｆｉｌｔｅｒ）を取り付け、そしてピッチブレードインペラー（ｐｉｔｃｈ  ｂｌａｄｅ  ｉｍｐｅｌｌｅｒ）を備え付けた。培養温度を加熱ブランケット（ｈｅａｔｉｎｇ  ｂｌａｎｋｅｔ）を用いて３７℃で維持した。溶存酸素を、飽和空気の４０％で維持した。ヘッドスペース（ｈｅａｄｓｐａｃｅ）における空気の流量を、０．１Ｌ／分間で維持した。このバイオリアクタータンクに、無血清および無動物材料培地（培地２、表１を参照のこと）中に０．５×１０６細胞／ｍｌの初期播種密度で振とうフラスコ由来から細胞を播種した。攪拌速度を、全実験の間１２０ｒｐｍで維持した。この細胞密度が約１．８×１０６細胞／ｍｌ〜２．４×１０６細胞／ｍｌに達した場合、３．８Ｌの無血清および無動物材料培地（培地２、表１を参照のこと）を用いた灌流を実施した。次いで、上記灌流の直後に、１ｍｌあたり１×１０８ウイルス粒子の最終濃度でウイルスを接種した。振とうフラスコの場合と同様に、感染の２時間後に上記タンク中の培養物にさらなるＣａＣｌ２（１．６ｍＭ）を添加した。感染の約２０時間後、３．８リットルの無血清および無動物材料培地（培地２（表１を参照のこと））を用いたさらなる灌流を実施した。感染後、５％  Ｎａ２ＣＯ３溶液でｐＨを６．９以上に保った。このウイルス力価を、Ｓｈａｂｒａｍら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：４５３−４６５（１９９７）において記載されるようなＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムを使用して測定した。
【０１０５】
（実施例４．無血清および無動物材料培地懸濁培養における、適応化Ａ５４９細胞株の安定性）
Ａ５４９Ｓ細胞を、試験期間の間（６ヶ月の間）持続的に継代し、そして予定した間隔で、ＣＲＡＶ生産性の評価のために培養物アリコートに感染させた。上記培養物の生涯全体にわたって同じ様式でこれらの感染実験を繰り返し実施した。細胞世代数として表されるインビトロ培養齢（ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｇｅ）にわたって、生産性を評価した。
【０１０６】
一般に、生成宿主細胞株は、測定可能な（ｓｃａｌａｂｌｅ）処理を保証するために有意な世代数（例えば、最低６０世代）にわたって安定であるべきである。第一に、長期の間、上記細胞培養は選択された培養環境においてその成長を維持できなくてはならない。第二に、生成のレベルは限定された培養齢の終末で有意な様式で変わる（ｄｒｉｆｔ）べきではない。第三に、種々の培養齢で産生された生成物の質は比較可能でなくてはならない。上記適応化Ａ５４９細胞株の安定性を評価するために、成長速度における変化およびウイルス生成速度をモニターした。上記成長速度を、世代数（または細胞分裂数）を成長に要した日数で割ることによって導き出した（表４を参照のこと）。これはまた、ｌｎ（細胞質量における増加の倍数）／（培養の開始のときの培養時間の終わりの時（日における））として表され得る。
【０１０７】
データは、成長曲線の第一のデータポイントにおいて示されるように、上記適応化Ａ５４９細胞が冷凍ストックから無血清および無動物材料懸濁培養へ復活させられた後にすぐに成長できる状態にあることを示す。これは、１日あたり４０％の細胞成長であると言い換えられる。この後、成長速度において約６０世代での明白なプラトーに達するまで漸進的な増加が続く。成長速度における初期増加は、低温学的に保存された条件から培養が開始された場合、多くの細胞株の間で共通である。
【０１０８】
表４のデータにおけるＡ５４９Ｓ細胞についての平均成長速度の範囲は、０．１９（／日）〜０．６９（／日）であり、２２データポイントの平均で０．４２（／日）であった。これは、式（０．６９３×２４）／平均成長速度（２４時間〜８８時間）および４０時間の平均倍加時間を用いて平均成長速度（／日）から算出される倍加時間（時間）における範囲に一致する。
【０１０９】
この成長速度の測定のために上記培養を継続する一方で、ウイルス生成の評価のために衛星培養物（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を分配し、そしてそれらをアデノウイルスベクターを用いて感染させた。上記衛星培養物について、そのＡ５４９Ｓ細胞を、感染に先立って約１．８×１０６細胞／ｍｌ〜２．４×１０６細胞／ｍｌまで成長させた。ウイルス接種の前に、新鮮な培養培地（培地２、表１を参照のこと）で最初の培養容量の約９０％の培地交換を実施した。１×１０８ｖｐ／ｍｌの最終濃度でウイルスを接種した。ウイルス接種の約２時間後、上記培養物に塩化カルシウム（８００μＭ）を添加した。感染の約２０時間後、さらに８００μＭ  塩化カルシウムを補充し成長培地（培地２（表１を参照のこと））で、別の９０％培地交換を実施した。ウイルス生成の定量化のために、感染の２４時間後、４８時間後および７２時間後に感染培養試料を収集した。このウイルス力価を、Ｓｈａｂｒａｍら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：４５３−４６５（１９９７）において記載されるようなＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムを使用して測定した。その最大ウイルス力価は、全ての場合において、感染の約４８時間後に達成された。このウイルス生産性は、表４において容量生産性として示される。表４における容量ウイルス生産性の範囲は、３．６３×１０１０（ｖｐ／ｍｌ）〜１．４４×１０１１（ｖｐ／ｍｌ）であった。表４における２１データポイントについての平均容量ウイルス生産性は、８．２１×１０１０（ｖｐ／ｍｌ）であった。
【０１１０】
【表４】
2007515172.tif 000006
。
【０１１１】
（実施例５：Ａ５４９懸濁細胞の低温保存）
血清含有凍結培地（培地５、表１を参照のこと）と無動物材料凍結培地（培地４、表１を参照のこと）との両方を使用してＡ５４９懸濁細胞バンクの低温保存を実施した。実施例１に記載されるように、細胞を培養した。「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、ＮＹ、２０００、２９７−３０８頁に記載される標準的プロトコールに従って、凍結細胞バンクを調製した。無動物材料バンクの場合、その凍結培地には培地４（表１を参照のこと）を使用した。血清含有バンクについては、培地５（表１を参照のこと）を使用した。
【０１１２】
両方のバンク由来である解凍された細胞は、再適応化の必要性無しで懸濁液中で容易に成長した。両方のバンクについての解凍後の成長速度は、きわめて類似していた（例えば、表５を参照のこと）。その後の２つのバンクによるウイルス生産性はまた、無血清低温保存によって影響されなかった（例えば、表６を参照のこと）。細胞バンクからのバイアルを３７℃の水槽で解凍し、遠沈によって培地２（表１を参照のこと）で１回洗浄し、次いで２０ｍｌの培地２（表１を参照のこと）を使用して１２５ｍｌ振とうフラスコ中に播種した。実施例４において示されるように、成長速度を算出した。上記衛星培養物について、実施例４において記載されるように感染を実施した。
【０１１３】
【表５】
2007515172.tif 000007
【０１１４】
【表６】
2007515172.tif 000008
。
【０１１５】
（実施例６．Ａ５４９細胞の懸濁適応前および懸濁適応後のＣＲＡＶ生成の比較）
適応化Ａ５４９細胞株（Ａ５４９Ｓ）または接着培養物由来であるＡ５４９細胞のいずれかのＡ５４９細胞を使用して、同じ条件下で、血清含有培地（培地１、表１を参照のこと）および定常培養皿において感染を実施した。感染培養を、二重に実施した。
【０１１６】
培地２（表１を参照のこと）中で成長させた無血清および無動物材料培地懸濁培養物由来である適応化Ａ５４９細胞を、数個のＴ−２５培養フラスコ中の培地１（表１を参照のこと）中に８０％〜１００％コンフルエントで播種し、そして上記フラスコ表面に対して２４時間付着させた。接着培養（非適応化）として完全に成長させたＡ５４９細胞を、感染の４日間前に数個のＴ−２５フラスコ中に播種し、そして培地１（表１を参照のこと）中において８０％〜１００％コンフルエントまで成長させた。感染のとき、両方の細胞株由来の培養物に、培地１（表１を参照のこと）を使用して培地の交換を施し、そしてそれらをＣＲＡＶを使用して１×１０８ｖｐ／ｍｌまたは４×１０８ｖｐ／ｍｌのいずれかで感染させた。感染の２４時間後、このウイルス接種材料を取り除き、そして新鮮な培地１（表１を参照のこと）で置き換えた。さらに、感染の２４時間後、各々の細胞株について１つの代表的なフラスコを取り、トリプシン処理し、そして血球計計数およびトリパンブルー染色によってフラスコあたりの細胞の数を決定した。感染の２日後および３日後に、各々の細胞株由来であるフラスコを−８０℃で凍結させ、そしてＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ  ＨＰＬＣ分析のために処理した。上記２つの細胞株に関する特異的生産性を決定するために、この培養物により生成されたウイルスの全量を感染の２４時間後に存在する細胞の数で割った。１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（表１を参照のこと、培地１（付着培養のために使用した処方物））を使用した定常培養皿において、懸濁適応化細胞（Ａ５４９Ｓ）に対して感染を実施した。上記Ａ５４９細胞は、１細胞あたりの基準で、非適応化、対照Ａ５４９細胞と比較してウイルス生成のレベルにおいて減少を示さなかった（例えば、表７を参照のこと）。
【０１１７】
【表７】
2007515172.tif 000009
。
【０１１８】
（実施例７．無血清および無動物材料懸濁培養における、Ａ５４９Ｓ細胞におけるＣＲＡＶ生成に対する塩化カルシウム添加の効果）
ＣＲＡＶ生成に対する塩化カルシウム添加の効果を、振とうフラスコ中で評価した。振とうフラスコにおけるウイルス生成のため、温度（３７℃）、ＣＯ２レベル（５％）および湿度レベルを、組織培養インキュベーター中に振とう器を置くことによって維持した。この懸濁Ａ５４９Ｓ細胞を、無血清および無動物材料培地（培地２、表１を参照のこと）中で、バッチモードで約１．８×１０６細胞／ｍｌ〜２．４×１０６細胞／ｍｌの程度にまで成長させた。ウイルス接種の前に、無血清および無動物材料培地（培地２、表１を参照のこと）で最初の培養容量の約９０％の培地交換を遠沈によって実施した。約（４０〜５０）：１のウイルス粒子：細胞の比と等価である、１×１０８ウイルス粒子／ｍｌの最終濃度でウイルスを接種した。
【０１１９】
ウイルス接種（ウイルス感染）の約２時間後に、２００μＭ〜１６００μＭの濃度（特に、２００μＭ、４００μＭ、８００μＭおよび１６００μＭの塩化カルシウム濃度）の標的塩化カルシウム濃度を（培養培地中にすでに含まれているカルシウムの量に加えて）達成するために、その培養物に塩化カルシウム溶液を添加した。次に、感染の約２０時間後に、感染の２時間後に実施した塩化カルシウム添加によって行ったのと同量のさらなる塩化カルシウムを含む新鮮な培地２を用いた遠沈により、培地灌流を実施した。対照培養は、感染の２時間後にも、または感染の２０時間後における新鮮な培地２（表１を参照のこと）を用いた灌流と一緒にも塩化カルシウムが添加されない。ウイルス生成の量を定量化するために、感染の４８時間後に各々の培養物から３ｍｌの培養試料を収集した。ウイルス生成の量を、Ｓｈａｂｒａｍら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：４５３−４６５（１９９７）において記載されるようなＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ  ＨＰＬＣによって測定した。この結果は、表８を参照のこと。
【０１２０】
【表８】
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。
【０１２１】
（実施例８：ＣＲＡＶ生成に対するウイルス接種材料濃度の効果）
Ａ５４９Ｓ細胞を使用したＣＲＡＶ生成に対するウイルス接種材料濃度の効果を、振とうフラスコ中において試験した。凍結バンク由来であるＡ５４９Ｓ細胞を解凍し、そして培地２（表１を参照のこと）中にそれらが安定した成長を示すまで継代した。２個の１リットル振とうフラスコ培養物を約２．７×１０６細胞／ｍｌの濃度まで成長させ、そしてその培養物を混ぜ合わせた。最初の培養容量の約８５％の培地交換を遠沈によって実施し、そして上記細胞を約３．６×１０６細胞／ｍｌの最終細胞密度になるように再度懸濁し、そして１４個の１２５ｍｌ振とうフラスコ中に等分した。次いで上記細胞に０．１２５×１０８ｖｐ／ｍｌ〜８×１０８ｖｐ／ｍｌの濃度範囲でＣＲＡＶウイルスを接種し（表９を参照のこと）；各々の濃度について二重に感染を実施した。接種した細胞を、組織培養インキュベーター中で３７℃、５％  ＣＯ２、および高湿度で成長させた。感染の２時間後、その培養物にさらに１．６ｍＭ  塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を供給するために、各々の培養物に塩化カルシウムを添加した。感染の約２０時間後、１．６ｍＭ  ＣａＣｌ２を補充した培地２（表１を参照のこと）を使用して別の８５％培地交換を実施した。ＣＲＡＶウイルス生成の定量化のために、感染の２４時間後、４８時間後、７２時間後、および９６時間後に各々の培養物から３ｍｌの試料を収集した。表９は、０．５×１０８ｖｐ／ｍｌ〜８×１０８ｖｐ／ｍｌの範囲で感染させられた培養物からのウイルス力価において、感染の３日後または４日後までにほとんど差異が無かったことを示す。
【０１２２】
【表９】
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【０１２３】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態によって範囲を限定されるべきではない。実際に、本明細書中に記載される本発明の種々の改変は、前述の説明から当業者に対して明白となる。このような改変は、添付された特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
【０１２４】
特許、特許出願、刊行物、製品文書および手順書は本出願を通して引用され、それらの開示は、本明細書中に参考としてその全体が援用される。
【国際調査報告】
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