(57)【要約】  本発明は、レチノイン酸誘導体またはその薬学的に許容される塩、およびセラミド分解阻害剤としてのＤ−トレオ−ＰＰＭＰまたはその薬学的に許容される塩を含むセラミドを産生するレチノイドを投与することを含む過増殖性疾患の処置方法に関し、ここで前記過増殖性疾患は腫瘍であり；そして、セラミドを産生するレチノイドを、腫瘍にネクローシス、アポトーシスまたは両方をもたらすための有効量で投与し、かつセラミド分解阻害剤を、セラミドを産生するレチノイドおよびセラミド分解阻害剤を別々に投与したときの和によりもたらされると予期される以上に、ネクローシス、アポトーシスまたは両方を増すための有効量で投与する。
2007510737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラミドを産生する抗癌剤または処置；および
Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含むセラミド分解阻害剤；
を施すことを含む、腫瘍および／または癌である過増殖性疾患を処置する方法。
【請求項２】
セラミドを産生する抗癌剤または処置が、セラミドを産生するレチノイン酸誘導体またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含むレチノイドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
セラミドを産生するレチノイドが、フェンレチニドまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
セラミドを産生するレチノイドおよびセラミド分解阻害剤を静脈内、経口的または局所的に投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
セラミドを産生するフェンレチニドまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含むレチノイド；および
Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含むセラミド分解阻害剤；
を投与することを含む、腫瘍および／または癌である過増殖性疾患を処置する方法。
【請求項６】
セラミド分解阻害剤が、本質的にＤ−トレオ−ＰＰＭＰまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
セラミドを産生するレチノイドおよびセラミド分解阻害剤を静脈内、経口的または局所的に投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
セラミドを産生する抗癌剤または処置；および
Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含むセラミド分解阻害剤；
を含む、腫瘍および／または癌である過増殖性疾患を処置するための製剤。
【請求項９】
セラミドを産生する抗癌剤または処置が、セラミドを産生するレチノイン酸誘導体またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含むレチノイドを含む、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
セラミドを産生するレチノイドが、フェンレチニドまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含む、請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
セラミドを産生するレチノイドおよびセラミド分解阻害剤を静脈内、経口的、または局所的に投与する、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１２】
セラミドを産生するフェンレチニドまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含むレチノイド；および
Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含むセラミド分解阻害剤；
を含む、腫瘍および／または癌である過増殖性疾患を処置するための製剤。
【請求項１３】
セラミド分解阻害剤が、本質的にＤ−トレオ−ＰＰＭＰまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルからなる、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
該製剤が静脈内、経口的、または局所的に投与される、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１５】
セラミドを産生する抗癌剤または処置；および
本質的にＤ−トレオ−ＰＰＭＰまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルからなるセラミド分解阻害剤；
を投与することを含む、腫瘍および／または癌である過増殖性疾患を処置する方法。
【請求項１６】
セラミドを産生する抗癌剤または処置が、セラミドを産生するレチノイン酸誘導体またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含むレチノイドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
セラミドを産生するレチノイドが、フェンレチニドまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
セラミドを産生する抗癌剤または処置；および
本質的にＤ−トレオ−ＰＰＭＰまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルからなるセラミド分解阻害剤；
を含む、腫瘍および／または癌である過増殖性疾患を処置するための製剤。
【請求項１９】
セラミドを産生する抗癌剤または処置が、セラミドを産生するレチノイン酸誘導体またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含むレチノイドを含む、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２０】
セラミドを産生するレチノイドが、フェンレチニドまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含む、請求項１９に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年１１月１２日に出願された米国特許出願第１０／７１２，７６３号に優先権を主張し、それは本明細書中に完全に記載するのと同程度に図面を含むその全体を参照により本明細書に包含する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する記載
本明細書中に記載した研究のための補助金は、国立衛生研究所の許可の下に、連邦政府により一部提供された。米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【０００３】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般的に、腫瘍などの過増殖性疾患の処置に関する。
【０００４】
背景
米国では毎年約１３０万の小児および成人の癌の新症例があり、結果として５５万人以上の死者をだすことが見積もられている。これらの癌には、生殖系、消化器系、呼吸器系、胸部、泌尿器系、皮膚、口腔および咽頭、内分泌系、脳および神経系の癌、軟組織の癌、骨および関節の癌、眼および眼窩の癌、リンパ腺の癌（例えばリンパ腫など）、ならびに血液の癌（例えば白血病など）が含まれる。故に、癌は米国で２番目に多い死亡原因である。
【０００５】
従って、かかる癌の処置のための改善された治療法が必要とされている。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、多数の癌のための化学療法の改善された有効性のための薬剤および該薬剤の使用方法を提供することである。
【０００７】
本発明のこの局面および下記により当業者に明らかとなり得る本発明の他の局面は、セラミドを産生する抗癌剤または処置、およびセラミド分解阻害剤またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む過増殖性疾患を処置する方法により達成され、ここで前記過増殖性疾患は腫瘍であり、セラミドを産生する抗癌剤または処置は、腫瘍のネクローシス、アポトーシスまたは両方をもたらすための有効量で投与され、そしてセラミド分解阻害剤は、セラミドを産生する抗癌剤または処置およびセラミド分解阻害剤を別々に投与したときの和によりもたらされると予期される以上に腫瘍のネクローシス、アポトーシスまたは両方を増すための有効量で投与される。
【０００８】
本発明のこの局面および他の局面はまた、セラミドを産生する抗癌剤または処置、およびセラミド分解阻害剤またはその薬学的に許容される塩を含む過増殖性疾患を処置するための製剤により達成され、ここで前記過増殖性疾患は腫瘍であり、そしてセラミドを産生するレチノイドは、腫瘍のネクローシス、アポトーシスまたは両方をもたらすための有効量で投与され、そしてセラミド分解阻害剤は、セラミドを産生する抗癌剤または処置およびセラミド分解阻害剤を別々に投与したときの和によりもたらされると予期される以上に腫瘍のネクローシス、アポトーシスまたは両方を増すために有効な量で投与される。
【０００９】
図面の簡単な説明
図１は、セラミドの代謝経路の一部を示す。
【００１０】
図２は、セラミド増加と４−ＨＰＲ（フェンレチニド）の細胞毒性の相関関係を示す。
【００１１】
図３は、４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドが細胞毒性であり、特にデノボのセラミド合成の阻害剤であるＬ−シクロセリンが、４−ＨＰＲおよび４−ＨＰＲ／サフィンゴールの細胞毒性を減少させることを示す。
【００１２】
図４は、４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドが細胞毒性であり、特にグルコシルセラミド合成酵素（ＧＳＣ）の過剰発現が、ＭＣＦ−７乳癌細胞で４−ＨＰＲの細胞毒性を減じ、サフィンゴールの細胞毒性相乗効果を無効にすることを示す。
【００１３】
図５は、ＧＳＣおよび１−Ｏ−ＡＣＳが神経芽腫細胞株および白血病細胞株で発現され、それ故に治療的介入のための標的であることを示す。
【００１４】
図６は、Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰが、耐性神経芽腫細胞株で４−ＨＰＲの細胞毒性に相乗作用することを示す。
【００１５】
図７は、Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰが、多剤耐性神経芽腫細胞株で４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドを増加することを示す。
【００１６】
図８は、Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰが、ＡＬＬ（急性リンパ芽球性白血病）細胞株で４−ＨＰＲの細胞毒性に相乗作用したことを示す。
【００１７】
図９は、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰが、Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰよりもセラミドを増加することを示す。
【００１８】
図１０は、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰが、神経芽腫細胞株で４−ＨＰＲの細胞毒性により強く相乗作用することを示す。
【００１９】
図１１は、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰが、前立腺細胞株で４−ＨＰＲの細胞毒性により強く相乗作用することを示す。
【００２０】
図１２は、可能なＤ−トレオ−ＰＰＭＰの合成方法を示す。
【００２１】
図１３は、ラットでの４−ＨＰＲの連続静脈点滴を示す。
【００２２】
発明の詳しい説明
上記の詳細ならびに本発明の他の利点および目的が得られる方法を完全に理解するために、本発明のより詳しい説明が、その特定の態様を参照することにより提供されるだろう。
【００２３】
現在の臨床に用いる多くの癌化学療法剤は、直接的または間接的にＤＮＡに損傷を与え、ほとんどの細胞にｐ５３依存性のアポトーシスにより死をもたらす。機能的なｐ５３を有しない腫瘍細胞（成人の癌の約１／２、および多くの再発性小児癌）は、ｐ５３依存性の化学療法剤に、最大でもわずかな応答しか示さない。治療が寿命の何年もの延長をもたらし得る、化学療法剤に高応答の小児癌でさえ、現在の化学療法の変異誘発の可能性が、二次的な悪性腫瘍の高いリスクを生じる。故に、ＤＮＡ損傷を引き起こすことなく悪性細胞に細胞毒性であり、かつｐ５３非依存性である化学療法剤の開発は、薬剤耐性の共通機構を回避し、初期および後期の両方の副作用を減じる可能性を提供する。この記載に合う１つの方法は、癌細胞の細胞死を促進する脂質であるセラミドの選択的な過剰産生である。フェンレチニドは、悪性細胞でセラミド産生を刺激するが正常細胞では刺激しない薬剤である。ドキソルビシンは、癌細胞でセラミドを増加し得る化学療法剤のもう１つの例である。かかる方法の重要な要素は、腫瘍細胞がセラミドを無毒化する能力を減少させる薬剤を開発することであり、本発明者らはかかる薬剤の１個が、１−フェニル−２−パルミトイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（ＰＰＭＰ）のＤ−トレオ−立体異性体であることをここで証明する。
【００２４】
ＰＰＭＰはセラミド異化の阻害剤であり、そのようなものとして、細胞毒性レチノイドであるフェンレチニド（４−ＨＰＲ）の抗癌活性を増強することができる。本発明者らは：１）フェンレチニドが、インビトロで投与量および時間依存的に、小児および成人癌の両方の固形癌および急性白血病細胞株でデノボ合成によりセラミドを非常に増加させること；そして、２）セラミド異化の阻害剤、例えばＰＰＭＰが、アルキル化剤耐性および／または機能的ｐ５３欠損を有する細胞株でさえ、４−ＨＰＲ細胞毒性を相乗的に増加させることを発見した。本発明者らの研究は、とりわけ、グリコシルセラミド合成酵素および１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素の両方の阻害剤であるＤ−トレオ−ＰＰＭＰが、４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドの異化を阻止し、その結果、インボトロでの４−ＨＰＲ細胞毒性の相乗的増加をもたらすことを示す。インビボでのデノボセラミドの刺激および操作は、全体的に化学療法の新規な形態を示す。従って、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰは、許容される全身毒性を有する小児および成人癌患者の両方で、４−ＨＰＲ、および他のセラミドを産生する抗癌剤または処置の抗癌効果を増加する可能性が高いであろう。セラミドを産生する抗癌剤または処置は、直接的または間接的にセラミドの増加または産生をもたらす何らかの薬剤または処置である。
【００２５】
本発明の方法には、例えばＤ−トレオ−ＰＰＭＰまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステルなどの可能性のある薬剤の、腫瘍、癌、新生物組織ならびに他の前癌性および非新生物性過増殖疾患または過形成疾患の増殖を阻害または予防することにより細胞毒性レチノイドであるフェンレチニド（４−ＨＰＲ）などの化合物の抗癌活性を増加するために、セラミド異化の阻害剤としての使用が含まれる。前記方法を、一般的には前癌性および非新生物性または非悪性過増殖性疾患を伴う腫瘍、癌および新生物組織を含む過剰増殖性細胞である標的細胞のネクローシスもしくはアポトーシス機構、または両方により増殖を阻害し、および／または細胞毒性を誘導するために用いることができる。
【００２６】
本方法により処置され得る腫瘍、癌および新生物組織の例には、例えば乳癌、骨肉腫、血管肉腫、線維肉腫および他の肉腫、白血病、リンパ腫、洞腫瘍、卵巣癌、尿道癌、膀胱癌、前立腺および他の泌尿生殖器癌、結腸癌、食道癌および胃癌ならびに他の消化管癌、肺癌、骨髄腫、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、内分泌癌、皮膚癌、ならびに神経膠腫および神経芽腫を含む悪性または良性の脳または中枢および末梢神経系腫瘍などの悪性腫瘍が含まれるが、それらに限定されない。
【００２７】
前癌性および非悪性過増殖性疾患の例には、骨髄異形性疾患、子宮頸部上皮内癌、ガードナー症候群のような家族性腸ポリープ、口腔白板症、組織球増殖症、ケロイド、血管腫、過剰増殖性動脈狭窄、炎症性関節炎、角化症および関節炎を含む丘疹落屑性発疹が含まれるが、それらに限定されない。また、疣などのウイルスにより誘導される過増殖性疾患、および感染性単核球症、瘢痕形成などのＥＢＶにより誘導される疾患も含まれる。その方法を、過増殖性疾患を有するかまたは発症する危険があると知られているかまたは予期される何らかの対象に用いることができる。
【００２８】
過増殖性疾患の処置は、過剰増殖性細胞の塊または数の増殖または増加を阻害するかもしくは遅延するか、または他の解剖学的位置に広がるのを阻止し、ならびに過剰増殖性腫瘍の大きさまたは過剰増殖性細胞の数を減ずる、細胞を殺す方法を示す。処置は、過剰増殖性腫瘍の治療または完全な撤廃を意味することを意図される必要はない。処置有効量とは、過剰増殖性細胞の増殖率を低下させ、過剰増殖性細胞の塊の大きさを減少させ、そして／または過剰増殖性細胞の数を減少させる、細胞死をもたらすのに有効な量である。可能性のある薬剤には、２個またはそれ以上の化合物が共に、個々の化合物のみの投与よりも治療的に優れた効果を有するように第一の化合物の活性を増強するのに十分な量で含まれる。
【００２９】
組合せでの２個またはそれ以上の化合物の投与は、２個の化合物が、一方の存在が他方の生物学的効果を変更する十分近い時間内に投与されることを意味する。その２個の化合物は、同時にまたは逐次に投与され得る。同時投与は、投与前に化合物を混合することによるか、または同じ時間点であるが異なる解剖学的位置に、または異なる投与経路の使用で化合物を投与することにより行われ得る。
【００３０】
本化合物の投与は、患者のセラミドレベルに影響を及ぼす。セラミドは、スフィンゴミエリンとスフィンゴ糖脂質のスフィンゴ脂質前駆体である。図１を参照すると、セラミドは、デノボ合成により異なる細胞成分で産生されるか、またはスフィンゴミエリナーゼの作用によるスフィンゴミエリンの分解により産生される。セラミドレベルは、デノボ合成および／またはグルコシルセラミド、１−Ｏ−アシルセラミド、およびスフィンゴミエリンなどの非毒性脂質画分へのセラミドの変換の調節により厳しく制御されている。セラミドはまた、様々なセラミダーゼによりスフィンゴシンに同化される。セラミドは、ＴＮＦ−α、Ｆａｓ、放射線療法、任意の化学療法剤、および熱ショックを含むいくつかの細胞死−シグナル経路におけるセカンドメッセンジャーとして関与している。セラミドに対する細胞応答は、その細胞成分に依存して変化する。細胞死シグナリングでのスフィンゴミエリンにより誘導されるセラミドの役割は明確にされつつあるが、本データはデノボ合成により誘導されるセラミドの細胞毒性機能を支持する。セラミドは、ミトコンドリアの電子伝達を乱し、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成をもたらすことが報告されており、セラミドは、アポトーシス（カスパーゼ）活性化の結果として産生され得る。セラミドは、ｐ５３非依存的に低酸素条件下で細胞死を起こすことが報告されている。セラミドは、カスパーゼ、ＥＲＫ１／２（生存を支持する）、およびＪＮＫ／ＳＡＰＫ（死を支持する）、ホスファターゼの活性化を含む細胞死シグナリング／応答への影響を活性にし、そしてサイクリン依存性キナーゼ、Ｃｄｋ２およびテロメアーゼ活性を不活性にし得る多数のキナーゼを活性化することが示されている。
【００３１】
図１を参照すると、セラミドの代謝経路の一部が記載され、ここでデノボセラミド合成では、Ｌ−シクロセリンにより阻害されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）が、セリンおよびパルミトイル−ＣｏＡのケト−スフィンガニンへの凝縮を触媒し、それがＤ−エリトロ−ジヒドロスフィンゴシン（スフィンガニン）に還元される（１）。スフィンガニンは、フモニシンＢにより阻害される（ジヒドロ）セラミド合成酵素（ＣＳ）によりジヒドロセラミドにアシル化され、その後、セラミドに脱飽和される（２）。あるいは、スフィンゴミエリンが、様々なスフィンゴミエリナーゼによりセラミドに加水分解される（３）。セラミドは、様々なセラミダーゼによりスフィンゴシンに異化される（４）。スフィンゴシンは、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）によりスフィンゴシン−１−リン酸塩（Ｓ−１−Ｐ）にリン酸化される（５）。セラミドは、ゴルジにより誘導されるグリコシルセラミド合成酵素（Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰにより阻害される）によりグルコシルセラミドに異化されるか（６）、または１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素（ヒトレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様リゾホスホリパーゼ）（Ｄ，Ｌ−エリトロ−、およびＤ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰにより阻害される）により１−Ｏ−アシルセラミドに異化される（７）。
【００３２】
セラミドにより仲介される細胞毒性の多くの研究が、セラミドの細胞局在を人工的に侵すことができる外生の、短鎖の、Ｃ２−またはＣ６−セラミドなどの細胞貫通セラミドを用いている。重要なことには、Ｃ２およびＣ６−セラミド、ならびに可能性のあるすべての短鎖セラミドのスフィンゴシン骨格が、セラミダーゼおよび（恐らくゴルジ）セラミド合成酵素の作用により内生の長鎖セラミドおよび他のスフィンゴ脂質に再生されることが証明されている。この発見は、短鎖セラミドを用いて得られたデータの解釈を複雑にするが、デノボ合成されたセラミドの細胞毒性の役割を支持する。
【００３３】
セラミド異化の阻害剤をここに記載する。セラミドは、図１に示されるように様々なセラミダーゼにより分解され、そしてスフィンゴミエリン、グルコシルセラミド、および１−Ｏ−アシルセラミドに異化される。セラミドの細胞毒性は、その分解および異化を減少する阻害剤により増加され得る。かかる阻害剤には、１−フェニル−２−パルミトイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノールの任意の立体異性体（ＰＤＭＰ）およびそのより活性な相同体ＰＰＭＰが含まれ、それらはグルコシルセラミド合成酵素および１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素を阻害する。セラミドを増加させるレチノイドであるフェンレチニド（４−ＨＰＲ）の細胞毒性は、インビトロでの多数の固形癌および白血病細胞株でこれらの薬剤により相乗作用を受ける。グルコシルセラミド形成の阻害はまた、ＭＣＦ７乳癌細胞株のドキソルビシンに対する薬剤耐性を無効にすることも発見され得る。実際に、グルコシルセラミド合成（ＧＣＳ）の阻害、またはセラミドの多数の薬剤による増加は、可能性のある化学療法であり得る。残念なことに、タモキシフェン、シクロスポリン、およびベラパミルなどの、ＧＣＳ活性を阻害することが報告されている臨床的に利用可能な薬剤は、インビトロで小児患者またはほとんどの成人患者で達成不可能なレベルでしか阻害しない。より重大なことには、ＧＣＳおよび１−Ｏ−アシルセラミドを同時に阻害する臨床用途の抗癌剤は知られていない。故に、セラミド異化の阻害剤が、セラミド（例えば４−ＨＰＲなど）を介して作用する癌化学療法剤の効果を増強し得るため、臨床用途のためのセラミド異化を阻害することができる新規の薬剤を開発する必要がある。
【００３４】
ＰＰＭＰは、ＧＣＳおよび１−Ｏ−ＡＣＳ阻害剤である、１−フェニル−２−［デカノイルアミノ］−３−モルホリノ−１−プロパノール（ＰＤＭＰ）の相同体である。ＰＰＭＰは（その前駆化合物であるＰＤＭＰと同様に）、２個の不斉炭素を有し、それ故に４個の立体異性体：Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰ；Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰ；Ｄ−エリトロ−ＰＰＭＰ；および、Ｌ−エリトロ−ＰＰＭＰを有する。ＰＰＭＰは、Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰおよびＤ，Ｌ−エリトロ−ＰＰＭＰのそのラセミ混合物形態で用いられることが多く、これらのラセミ混合物は通常、“ＰＰＭＰ”と称される。ＰＰＭＰは、無傷細胞でＰＤＭＰよりも１０から２０倍活性である。ＰＤＭＰは、元々はゴーシェ病などのスフィンゴ糖脂質蓄積疾患の処置のためのグリコシルセラミド合成酵素（ＧＣＳ）の阻害剤として開発された。しかしながら、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）、ＰＰＰＰ（Ｐ４）、または４’−ヒドロキシ−Ｐ４などの他のグリコシルセラミド合成酵素阻害剤とは異なり、Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰは、処置した細胞の増殖の用量依存的な低下と関係する内生セラミドを増加することが示されている。それにより、Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰは、蓄積疾患の処置のためには望ましくない薬剤であるが、この増殖阻害特性により、マウスのエールリッヒ腫瘍細胞、ラットモデルのＣ６神経膠腫細胞を処置するため、およびマウスルイス肺癌転移を減らすために耐容性の良好な化学療法剤として使用されている。
【００３５】
本発明者らは、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰが、セラミドの分解を阻害し、フェンレチニドなどのセラミドを増加する抗癌剤の抗癌活性を増加するための優れたＰＰＭＰの立体異性体であり、故に本目的のために何らかの他のＰＰＭＰ化合物より好ましいことを明らかにする。Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰは、１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素（レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様リゾホスホリパーゼ）およびグリコシルセラミド合成酵素（ＧＣＳ）を同時に阻害するその能力により、セラミドを増加するその能力を生じ得る。１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素（１−Ｏ−ＡＣＳ）は、最近、１位の炭素でセラミドをアシル化し得る酵素であると特徴付けられ、広範に発現される。アシル基転移は、セラミドストレス下で細胞に同化バッファとして働くと仮定され、セラミドをさらなる同化のために非毒性で貯蔵することを可能とする。Ｄ，Ｌ−エリトロ−ＰＤＭＰはＧＣＳを阻害せず、またセラミド蓄積および増殖阻害を引き起こし、故に１−Ｏ−ＡＣＳを阻害する可能性がある。本発明者らはまた、予期せぬ事に、Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰがグルコシルセラミドの形成を阻害せず、それ故にそのラセミ混合物であるＤ，Ｌ−ＰＰＭＰが、セラミド異化の阻害においてＤ−トレオ−ＰＰＭＰよりも活性が低く、セラミドレベルを増加することを明らかにする。興味深いことには、Ｌ−トレオ−ＰＤＭＰは、ＧＣＳを阻害しないが、むしろスフィンゴ糖脂質生合成を刺激する。
【００３６】
さらに、ＰＤＭＰおよびＰＰＭＰは、ＭＣＦ−７乳癌細胞、ＫＧ１ａおよびＫ５６２白血病細胞、ならびにＫＢ子宮頸癌細胞でのＰ−糖タンパク質により仲介される多剤耐性（ＭＤＲ）表現型を逆戻りさせる。それらはまた、ＭＣＦ−７乳癌およびＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞でドキソルビシンにより誘導されるアポトーシスを増強し、増加したセラミドに伴って、神経芽腫細胞でタキソールおよびビンクリスチン細胞毒性に相乗作用を示す。
【００３７】
本発明者らは、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰが、上記の他の化学療法剤および処置とも相乗作用し得ることを認識し、細胞毒性のセラミドを増加するレチノイドであるフェンレチニド（４−ＨＰＲ）との組合せの使用のためのＧＣＳおよび１−Ｏ−ＡＣＳ阻害剤として有効であることを発見した。
【００３８】
フェンレチニド
合成レチノイド（ビタミンＡ誘導体）、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（フェンレチニド、４−ＨＰＲ）は、１−１２μＭ濃度の４−ＨＰＲで、神経芽腫、結腸直腸癌、頭部および頸部癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、および白血病／リンパ腫を含むインビトロの様々な癌細胞株に細胞毒性であることが示されている。４−ＨＰＲは、アポトーシス、ネクローシス、またはアポトーシス／ネクローシス混合型による細胞死を誘導する。４−ＨＰＲは、白血病／リンパ腫の細胞株、ならびに小細胞および非小細胞性肺癌においてｐ５３非依存的に細胞毒性となることが報告されている。４−ＨＰＲはまた、神経芽腫細胞株においてアポトーシス／ネクローシス混合型によりｐ５３−およびカスパーゼ−非依存的に細胞死を誘導し得る。細胞死は、Ｂｃｌ−２を過剰発現する白血病細胞では遅延されるが、それでもなお起こる。前立腺癌および乳癌細胞株で４−ＨＰＲにより誘導されるアポトーシスは、ＴＧＦ−βにより誘導されるものと同じである。４−ＨＰＲ細胞毒性は、ＰＣ−３前立腺癌細胞で活性化するｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）と関係がある。
【００３９】
臨床的には、低用量の経口４−ＨＰＲ（２００−９００ｍｇ／日；１から３μＭ血漿レベル）は、乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、気管支癌、黒色腫、および口腔癌において、最小の毒性を有する化学予防剤として研究されているが、報告された成功例はわずかである。しかしながら、前癌口腔病変（白斑症）の３０％の減少、および対側性乳癌および卵巣癌の減少が、低用量４−ＨＰＲを用いて報告されている。
【００４０】
成人および小児固形腫瘍における高用量経口４−ＨＰＲのフェーズＩ治験により、下記の結果が得られている。小児にて、７日間３週間毎に投与された経口４−ＨＰＲの最大耐性量（ＭＴＤ）は、２４７５ｍｇ／ｍ２／日であり、それは最小の全身毒性で６から１０μＭの４−ＨＰＲ血漿レベルを達成した。同様の結果が、より低い血漿レベルであるが、１８００ｍｇ／ｍ２／日のフェーズＩＩ治験のために推奨される‘実際的’用量で、成人の高用量経口４−ＨＰＲ治験において観察された。現在利用可能な経口４−ＨＰＲ製剤の低い吸収性が、両治験の主な投与制限であると思われる。
【００４１】
４−ＨＰＲ細胞毒性の機序は複雑である。４−ＨＰＲは、かなりのレチノイド受容体−非依存性細胞毒性を有する。活性酸素種（ＲＯＳ）は、ＨＬ−６０骨髄性白血病細胞株、子宮頸癌および扁平上皮細胞癌細胞での４−ＨＰＲ細胞毒性に寄与し、４−ＨＰＲは、神経芽腫細胞株でＲＯＳを増加する。ＲＯＳは、５種の頭頸部癌細胞株、ならびに５種の肺癌細胞株で検出されたが、抗酸化剤は、これらの細胞株のうち２種でしか４−ＨＰＲにより誘導されるアポトーシスを阻害しなかった。故に、ＲＯＳは、４−ＨＰＲ曝露と関連付けられるが、すべての場合における細胞毒性への正確な寄与は明確にされていない。
【００４２】
さらに、４−ＨＰＲは、デノボ合成の刺激により時間および用量依存的にインビトロで感受性神経芽腫、白血病、およびＰＮＥＴ／ユーイング肉腫細胞株でセラミドの多量の、新規の増加を引き起こし得る。重要なことには、４−ＨＰＲは正常線維芽細胞および末梢血単核細胞で非毒性であり、セラミドの増加がわずかであり、そして骨髄性前駆細胞で非毒性であった。ｐ５３変異および／または高レベルアルキル化剤耐性を有する細胞株を含む、神経芽腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、乳癌および膵臓癌の癌細胞株では、Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰおよびサフィンゴールなどのセラミド異化または活性の調節剤による４−ＨＰＲ細胞毒性の著しい相乗作用がある。グルコシルセラミドおよび１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素の阻害剤であるＤ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰはさらに、６個の急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株のうち４個で４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドレベル、および細胞毒性を増加させる。図面において、Ｄ、Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰは、セラミドレベル、および４−ＨＰＲに曝露された前立腺癌細胞株の細胞毒性をさらに増加することが示される。特記すべき事には、４−ＨＰＲを含む薬剤組合せで見られる細胞毒性は、正常な線維芽細胞および骨髄性前駆細胞に非毒性であった用量レベルで生じた。興味深いことに、４−ＨＰＲは、不死化された（形質転換されていない）急速に増殖するＢ細胞リンパ球芽様細胞株で非毒性であり、かつセラミドの増加はわずかであり、４−ＨＰＲ細胞毒性およびセラミド誘導の明白な悪性特有の特性を支持する。
【００４３】
その新規セラミドを用いる作用機序で４−ＨＰＲを用いる療法は、既存の治療に耐性である多くの固形腫瘍および造血性悪性腫瘍（例えば白血病およびリンパ腫など）に対して効果的であり得、かつ現在の処置レジメンに容易に組み込まれ得る。多くの癌化学療法処置が、身体内での望まれない副作用、とりわけ骨髄中の正常な造血細胞に対する毒性（すなわち、骨髄毒性）により作用が限定される。骨髄毒性は、抗癌効果のために送達され得る抗癌剤（複数可）の量を制限し、赤血球細胞および血小板の輸血を必要とさせ、そして患者に感染を起こしやすくし得る。故に、最小の骨髄毒性である化学療法は、明らかな利点を有する。例えば、フェーズＩ治験により、高用量４−ＨＰＲ、および４−ＨＰＲ＋Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰが最小の骨髄毒性であることが確認された場合、それらは地固め（Consolidation）、または暫定的維持（Interim Maintenance）のフェーズＩＩウインドウ、現在の高リスク急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）プロトコールのフェーズ、および神経芽腫における骨髄破壊的治療後への包含が検討され得る。これは、微小残存病変の再発において、願わくは疾患耐性クローンの拡大より前にセラミドを用いた攻撃を開始することができる。さらに、最小の骨髄毒性の４−ＨＰＲを用いる治療を、現在の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）治療の長期の骨髄回復相の後期に用いることができる。あるいは、４−ＨＰＲを用いた治療が中程度の骨髄毒性作用を有する場合、早期の処置相にそれらを組み込むことはあまり望まれず、それらは、神経芽腫におけるＡＬＬ維持相中もしくは後、または現在のＡＭＬ治療の前回のコースからの骨髄の回復後、または骨髄破壊的治療前に用いられ得る。さらに、かかる毒性のわずかなセラミドを用いる化学療法剤を、多くの固形腫瘍の現在の治療前または後に併用することができる。
【００４４】
さらに、４−ＨＰＲおよびＰＰＭＰは、結腸癌、乳癌、および前立腺癌を含む少なくとも数種の成人悪性腫瘍で抗癌活性を有し得る。
【００４５】
レチノイドおよびセラミド分解阻害剤を用いる過増殖性疾患の処置は、一般にＭａｕｒｅｒらによる米国特許第６，３５２，８４４号および第６，３６８，８３１号に記載され、それらは参照により本明細書中に包含される。
【００４６】
さらに、以下の実施例に記載のように、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰは、予想外に４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドの異化の阻害に最も有効であり、Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰおよびＤ，Ｌ−エリトロ−ＰＰＭＰと比較したとき、および本方法に用いたとき、４−ＨＰＲ細胞毒性に相乗作用することが分かった。さらに、ＰＰＭＰは、ＰＤＭＰよりも１０−２０倍活性であり、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰは予想外にすべてのＰＰＭＰおよびＰＤＭＰ化合物の最も好ましい立体異性体である。
【００４７】
加えて、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰの適用は、純粋である（すなわち、ラセミ混合物ではない）単剤の必要を満たし、ここで薬剤の活性は、２個の分子化合物（molecular entity）の未知の貢献というよりむしろ、単一の分子化合物によるとされ得、故に抗癌効果に影響し得る薬物動態作用および薬理作用を非常に単純化し、ならびに連邦食品医薬品局（U.S. Food and Drug Administration）による規制の検討を非常に簡素化する。さらにＤ−トレオ−ＰＰＭＰは、ＧＣＳおよびＡＣＳの両方に対して同時に阻害活性を示し、結果として多数の癌のための化学療法の改善された有効性に影響し得る。
【００４８】
Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰの合成
図１２を参照すると、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰの合成は、Ｄ−ガーナーアルデヒド（Garner aldehyde）にフェニルクプラートを立体選択的に付加させることによりなされ得る。その合成付加は、主産物としてＤ−トレオイソ型をもたらし得る。微量のＬ−エリトロイソ型（約５％）を、合成の後期にクロロホルムから結晶化することにより除去することができる。合成を、Ｄ−セリンからＤ−ガーナーアルデヒドを生成するための４段階合成法で開始する。本発明者らは、サフィンゴールの産生と同じ方法を用いてキログラムスケールで、Ｌ−セリンからＬ−ガーナーアルデヒドを合成した。ガーナーアルデヒドを、クロマトグラフィーなしに９８＋％ｅｅ純度で２８％全収率で得た。フェニルクプラートを、ヨウ化銅（Ｉ）および臭化フェニルマグネシウムの反応によりインサイチュウで産生することができる。フェニルクプラートのＤ−ガーナーアルデヒドへの付加により、中間体６を産する。中間体６のＨＣｌを用いた脱保護により、Ｄ−トレオ−１−フェニル−２−アミノ−プロパン−１，３−ジオール７を産する。中間体７を活性化パルミチン酸と反応させ、その後、塩基加水分解により中間体８を形成させる。中間体８の第一級ヒドロキシ基をメシラートに変換し、その後、モルホリンで置換し最終産物であるＤ−トレオ−ＰＰＭＰを得ることができる。本発明者らの合成法は、エナンチオマー的に純粋なＰＰＭＰの高効率で、実践的な合成法である。記載された反応のほとんどは、本発明者らの実験室でキログラムスケールで成功裏に行われた。最初の２ｇのバッチが、所望のＰＰＭＰエナンチオマーが同定されてから６から８週間以内に供され得ることが見込まれる。合成の現在の方法の変法およびＤ−トレオ−ＰＰＭＰの他の合成法は、当業者に容易に理解される。
【００４９】
製剤および投与
活性化合物を、様々な状態の処置のために単一の医薬的担体または別個の医薬的担体で投与するために製剤することができる。前記担体は、製剤中のすべての他の成分と混合可能でなければならず、患者に有害であってはならない。担体は、固体または液体または両方であり得、好ましくは、０．５％から９５％重量の活性化合物を含み得る錠剤などの単位用量剤形として化合物と共に製剤される。１個またはそれ以上の活性化合物を、基本的に前記要素を混合すること、および所望により１個またはそれ以上の助剤を包含することからなる薬学の何らかの既知の技術により製造され得る製剤に組み込むことができる。
【００５０】
本発明の製剤は、任意の所定の場合に最も適する経路が、処置される状態の特性および重症度ならびに用いられる特定の活性化合物の特性に依存して変化するかもしれないが、経口、経直腸、口腔内（例えば、舌下）、膣内、非経腸的（例えば、皮下、筋肉内、皮内または静脈内）、局所的（気管表面を含む皮膚および粘膜面の両方）および経皮投与に適する。
【００５１】
経口投与に適する製剤は、粉末または顆粒として、水性もしくは非水性の液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油または油中水エマルジョンもしくはリポソーム製剤として、所定の量の活性化合物（複数可）をそれぞれ含むカプセル、トローチ、または錠剤などの別個の単位で存在し得る。かかる製剤を、活性化合物および適する担体（それは、１個またはそれ以上の助剤を含み得る）を結合させる工程を含む、薬学の任意の適する方法により製造することができる。一般的に、製剤を、液体もしくは微粉化固体担体、または両方と共に活性化合物を均一によく混合し、その後必要であれば、得られた混合物を成形することにより製造することができる。例えば、錠剤を、活性化合物（複数可）を含む粉末または顆粒を、所望により１個またはそれ以上の助剤と共に圧縮または成形することにより製造することができる。他の送達製剤が当業者に示唆され得る。
【００５２】
何らか１個の活性成分の治療的有効投与量は、化合物、患者によっていくらか変化し得、患者の状態および送達経路などの因子に依存して変化し得る。かかる投与量を、本明細書の開示を考慮して既知の薬理学的方法により決定することができる。
【００５３】
全身的処置のためのフェンレチニドに関して、約１、２、または３μＭから１０または２０μＭ、または１００μＭの血漿レベルを達成するための用量；典型的には、１日あたり、１ｍ２体表面積あたり（経口用量で）５０、１００、５００、１０００、２０００、または３０００ｍｇを用いることができる。
【００５４】
広く動物にて試験されているＰＰＭＰの非経腸的薬剤であるＰＤＭＰは、耐容性が良好で、インビボでグルコシルセラミドを減少させることができる。ＰＤＭＰの半減期は約１時間であり、それはＰ−４５０系により同化される。すぐれた活性（１０から２０倍活性）にもかかわらず、同様の研究結果がＰＰＭＰには報告されていない。ＰＤＭＰは、Ｍｙｒｊ５２のような非イオン性界面活性剤の不存在下で水溶液に不和であることが報告されるが、この界面活性剤はげっ歯動物の肝臓に蓄積する。本発明者らは、マウスへの静脈および腹腔内送達のためにＰＰＭＰをＤｉｌｕｅｎｔ−１２に成功裏に可溶化した。さらに、ＬＹＭ−Ｘ−ＳＯＲＢ技術（参照により本明細書中に包含される米国特許第４，８７４，７９５号に記載される）、４−ＨＰＲを含む比較的不溶性の薬剤を溶解することができる非リポソーム性の脂質を用いた経口薬送達系は、経口送達のためにＰＰＭＰを製剤する可能性を有する。ＬＹＭ−Ｘ−ＳＯＲＢベクターは、嚢胞性線維症を有する小児の慢性的な投与で良好な耐容性であることが証明されている。
【００５５】
本発明者らは、マウスに腹腔内投与される高用量の４−ＨＰＲ＋Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰは良好な耐容性であることを確かめた。本発明者らは、４−ＨＰＲおよびＤ−トレオ−ＰＰＭＰの両方をＮＣＩ  Ｄｉｌｕｅｎｔ−１２（５０／５０  Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ／エタノール）に１５ｍｇ／ｍｌで溶解し、ここで注射用にＮＳで１：３に希釈した。本発明者らは、動物に悪影響が観察されない状態で、１０日の休薬期間で隔てたそれぞれ５日の２コースにて、１２５ｍｇ／ｋｇ／日の４−ＨＰＲと、１２５ｍｇ／ｋｇ／日までのＤ−トレオ−ＰＰＭＰを分割用量で腹腔内に共投与した。体重は安定していた。マウスはその後６０日以上生存した。これらの結果は、４−ＨＰＲとＤ−トレオ−ＰＰＭＰが、インビボで良好な耐容性であることを証明した。
【００５６】
経口送達のためのＰＰＭＰの製剤
ＰＰＭＰを、ＬＹＭ−Ｘ−ＳＯＲＢＴＭ技術（LYM-DRUG製品、LLC、AVANTIおよびBioMolecular Products, Inc.の共同出資会社）を用いて経口送達のために製剤することができる。ＬＹＭ−Ｘ−ＳＯＲＢ（ＬＸＳ）マトリックスは、ＦＤＡ  ＧＲＡＳ（一般に安全と見なされている）脂質：リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、モノグリセリド（ＭＧ）、および遊離脂肪酸（ＦＡ）で構成された経口薬剤送達ビヒクルである。ＬＸＳモノマーマトリックスは、１：１のモル比のＬＸＳ／薬剤複合体に薬剤を包含することにより薬剤の溶解性および腸内吸収を改善する。１：４：２から１：２：４の間で変化するＬＰＣ：ＭＧ：ＦＡ比は、溶解される薬剤に依存して変わる。マトリックスは、脂肪酸の不飽和度を変えることにより室温で液体または固体であり得る。ＬＸＳは、例えばレチノイン酸、エストラジオール、シクロスポリンＡ、ジルチアゼム、およびプロゲステロンなどの不溶性の化合物を溶解性とすることができる。ＬＸＳは、生理学的濃度の重炭酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウム（胆汁酸塩）中で安定であり、腸溶液中で小さな粒状物を形成する（７０ｎｍから１０ｎｍ未満）。ＬＸＳマトリックスは、嚢胞性線維症を有する小児の１年の治験で安全であることが証明されている。ＬＸＳを、経口送達用のＰＰＭＰを製剤するために用いることができる。
【００５７】
いくつかの方法が、前もって形成されたＬＸＳ共晶マトリックスに薬剤を組み込むために用いられ得る。ＬＸＳ構成要素のモル組成は、下記の最適化送達物で変化し得る：リゾホスファチジルコリン：モノグリセリド：脂肪酸（１：４：２、１：３、１：２：４）。これらの構成要素のアシル基はまた、室温で固体、半固体、または液体ＬＸＳ組成物に影響を与える飽和：不飽和で変化し得る。ＬＸＳ：薬剤の最終的なモル比は、１：０．５から１：０．９の範囲であり得る。簡単には、ＬＸＳおよび固形薬剤を、必要であれば１００−１２０℃まで熱し、薬剤を溶解させ、透明な粘性溶液を得た。薬剤がすぐに溶解しない場合、薬剤を組み込む第二の方法を検討する。一般に、ＬＸＳ構成要素またはＬＸＳマトリックスを、有機溶媒（例えば、クロロホルム：メタノール、２０：１、ｖ／ｖ）に溶解し、そして原薬剤を溶解するまでわずかに加熱して加える。その後、溶媒を、透明な粘性溶液が得るために真空下で加熱し除去する。ＬＸＳ／薬剤の共晶マトリックスの安定性を、下記のように評価することができる：ＬＸＳ／薬剤マトリックスを室温で一晩放置した結果、安定な製剤を明確に示したままでなければならない。薬剤の結晶が出現する場合、次に他のＬＸＳ組成物、結合水を含むＬＸＳ、および／または他の薬剤を組み込む方法を、低級ＬＸＳ：薬剤モル薬剤で検討する。（１モル以上の水を含むＬＸＳが層状組織を形成し、６−８モルの結合水を含むＬＸＳが逆六面体構造を形成すると認識されるはずである。）ＬＸＳ／薬剤マトリックスが得られたならば、次にＬＸＳ／薬剤マトリックスを重炭酸ナトリウム溶液中で超音波分解し、その後クロマトグラフィーによりサイズ除去を行った。ＬＸＳ／薬剤マトリックス（約７０ｎｍ）が、最初にカラムから溶出され、あるとすれば遊離の薬剤がその後に溶出され得る。一般に安定なＬＸＳ／薬剤製剤は、動物およびヒトで良好／優れた生体利用性を有する。
【００５８】
さらに、ＰＰＭＰは、ＮＣＩ  Ｄｉｌｕｅｎｔ−１２中で４−ＨＰＲと共に共送達用に製剤され得る。
【００５９】
静脈内送達のためのＰＰＭＰの製剤
本発明者らは、４−ＨＰＲのより高い結晶および組織レベルが、経口送達と比較して４−ＨＰＲの静脈内送達で得られることを発見した。４−ＨＰＲの該静脈内投与製剤は、本明細書に記載のとおり最小の全身毒性を保持したまま、現在の経口投与製剤よりも、げっ歯動物およびイヌ科の動物モデルでかなり高い４−ＨＰＲ血漿（５０−１５０μＭ）および組織レベルを得る。
【００６０】
ＰＰＭＰを、Ｄｉｌｕｅｎｔ−１２中で静脈内送達用に製剤することができる。Ｄｉｌｕｅｎｔ−１２（５０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ／５０％エタノール）は、タキソールおよびシクロスポリンＡ用のビヒクルとして臨床的に用いられる。それは、アレルギー反応を緩和するために事前の投薬を必要とし、ヒマシ油を用いることの欠点を有する。しかしながら、必要であれば、この方法を用いることができることが証明されている。しかしながら、ＰＰＭＰは、Ｌｉｐｏｉｄ  Ｅ８０、または他の類似のビヒクルを用いて乳化され得る。
【００６１】
該静脈投与製剤および経口投与製剤は、小型動物の薬物動態モデルおよび腫瘍異種移植モデルを用いて各経路の生体利用性および抗腫瘍活性の前臨床モデル化を可能とし得る。それぞれの製剤はまた、病院対在宅治療設定でそれぞれ別々の利点を有し得る。さらに、本明細書に記載のとおりに開発されたＰＰＭＰの静脈内投与製剤および／または経口投与製剤は、インビトロで４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドの異化を効果的に阻害するインビボでの血漿および組織レベルを達成し得、それは許容できる毒性であることが分かり、そしてインビボで４−ＨＰＲの抗腫瘍活性を増強し得る。
【００６２】
以下の実施例において、ＤＩＭＳＣＡＮ分析は細胞生存分析であって、単なるアポトーシス分析ではなく、故にアポトーシスおよびネクローシスの両方により死に至る癌細胞を示す。ＤＩＭＳＣＡＮは、より従来的なコロニー形成分析と直接的に関連する。さらに、細胞株のＤＩＭＳＣＡＮ薬剤耐性プロファイルは、患者の前の治療と相関する。ＤＩＭＳＣＡＮは、下記の新しい薬剤：１３−シス−レチノイン酸、ＢＳＯ＋Ｌ−ＰＡＭ、およびフェンレチニドについて神経芽腫の危険の高い患者での臨床活性をうまく予測した。細胞毒性分析を、４−５ｌｏｇ以上の細胞死のダイナミックレンジを有する半自動デジタル画像顕微鏡（ＤＩＭＳＣＡＮ）システムを用いて９６ウェルマイクロプレートで行う。簡単には、治験薬でインキュベーション後にフルオレセイン二酢酸［１０μｇ／ｍｌ（生体染色）］をマイクロプレートに加え、２０分間インキュベートした。その後、エオシン−Ｙ（８００μｇ／ｍｌ）を、媒体および死細胞のバックグラウンド蛍光を消光するために加える。その後、そのプレートを、ＤＩＭＳＣＡＮシステム用に設計されたビデオイメージングシステムソフトウェアによりそれぞれのウェルの相対的な蛍光が測定される状態で倒立顕微鏡上で読む。本発明者らは比較研究を行い、ＤＩＭＳＣＡＮにより得られた相対的な蛍光値が、細胞密度（基準をトリパンブルー排除により計算する）およびコロニー形成分析と関連することを示した。本発明を、以下の限定されない実施例でより詳しく説明する。
【００６３】
実施例１
４−ＨＰＲは、インビトロで固形腫瘍および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株に細胞毒性である。
上記のように、４−ＨＰＲは、インビトロで多くの腫瘍細胞型の細胞株に細胞毒性を引き起こし得る。アルキル化剤およびレチノイン酸に耐性の神経芽腫細胞株を処理する４−ＨＰＲの可能性を測定する調査の間、本発明者らは、４−ＨＰＲが、小児神経芽腫およびＰＮＥＴ／ユーイング肉腫、ならびにインビトロの肺癌、乳癌、結腸癌、黒色腫、および膵臓癌を含む多数の成人固形腫瘍の細胞株で１未満から４ｌｏｇの細胞死を引き起こしたことを発見した。神経芽腫細胞株において、４−ＨＰＲ細胞毒性はｐ５３−、および部分的にカスパーゼ−非依存性であって、アポトーシス／ネクローシス混合型による細胞死を誘導した。本発明者らは、４−ＨＰＲが多くの小児ＡＬＬ細胞株に細胞毒性であったことも発見した。
【００６４】
実施例２
４−ＨＰＲは、固形腫瘍およびＡＬＬ白血病細胞株でセラミドを増加した。
４−ＨＰＲは、細胞毒性の機構として、すべてではないが特定のインビトロの固形腫瘍細胞株および白血病細胞株で活性酸素種（ＲＯＳ）を増加することが報告されている。本発明者らは、４−ＨＰＲが２個の神経芽腫細胞株でＲＯＳを増加させることを発見した。しかしながら、抗酸化剤は、神経芽腫細胞株で、特により高い４−ＨＰＲ用量レベルで４−ＨＰＲ細胞毒性をわずかに減じた。これらの結果は、特に高用量レベルで、神経芽腫細胞株の４−ＨＰＲ細胞毒性に部分的ではあるが関与することを示唆する。故に、本発明者らは、４−ＨＰＲ細胞毒性の別の機構を調査した。本発明者らは、神経芽腫の細胞株、ならびにインビトロのＰＮＥＴ／ユーイング肉腫、乳癌および肺癌細胞株で用量および時間依存的に１３倍までかなりセラミドを増加したことを測定した。さらに、本発明者らは、セラミド開始後早期（曝露後２時間以内）の増加が、時間と共に進行し、細胞死の形態的証拠よりもかなり先行して起こることを発見した。本発明者らは、４−ＨＰＲがまた、多発性ＡＬＬ細胞株でセラミドを非常に増加させることを証明した。これらのデータは、４−ＨＰＲ処理により刺激されたセラミドの増加が、結果として後期の細胞死過程をもたらさなかったことを証明し、そしてそのセラミドの増加が、４−ＨＰＲ細胞毒性の一因であり得る可能性を提起した。
【００６５】
実施例３
４−ＨＰＲは、デノボ合成の刺激によりセラミドを増加した。
本発明者らは、インビトロでの固形腫瘍およびＡＬＬ細胞株で、４−ＨＰＲ処理により増加したセラミドがデノボ合成により生じることを測定した。放射性同位元素標識実験により、膜スフィンゴミエリンが、４−ＨＰＲ処理により減少されなかったことが明らかにされた。対照的に、Ｌ−シクロセリンおよびフモニシンＢなどのデノボセラミド合成の阻害剤は、４−ＨＰＲ処理によりもたらされたセラミドの増加を阻害した。さらに、４−ＨＰＲは、デノボセラミド合成の律速酵素であるセリンパルミトイルトランスフェラーゼおよびセラミド合成酵素（図１に示すような）の両方の活性を、酵素活性の直接分析により刺激した。
【００６６】
実施例４
４−ＨＰＲは、正常細胞、および非形質転換細胞株で細胞毒性がわずかであった。
４−ＨＰＲの治療係数を調べるために、耐性神経芽腫を処置するための高用量４−ＨＰＲの能力を確立するため、本発明者らは、インビトロの正常および非悪性細胞株で４−ＨＰＲの細胞毒性を調べた。本発明者らは、インビトロで多くの型の癌細胞株に細胞毒性を引き起こした４−ＨＰＲの用量が、正常な線維芽細胞および正常な骨髄の骨髄性前駆細胞、ならびに正常な末梢血単核細胞、ならびにＥＢＶにより不死化されたが非悪性のリンパ球芽様細胞株に対してわずかな毒性を示したことを測定した。従って、４−ＨＰＲ細胞毒性は、悪性特異的事象である可能性が高く、高用量４−ＨＰＲはインビボでの許容される治療指標を有し得る。
【００６７】
実施例５
４−ＨＰＲは、正常細胞および非形質転換細胞株でセラミドを増加しなかった。
４−ＨＰＲが様々な腫瘍細胞型の細胞株でセラミドを増加し細胞毒性を引き起こしたことを確立するため、本発明者らは、４−ＨＰＲが正常細胞および非形質転換細胞株でセラミドを増加させたかどうかを調べた。本発明者らは、正常な線維芽細胞、ならびに正常な末梢血単核細胞およびＥＢＶにより不死化されたが形質転換されていないリンパ球芽様細胞でセラミドをほんのわずかしか増加させなかったことを測定した。従って、デノボ合成によりセラミドを増加する４−ＨＰＲの能力は、悪性（形質転換された表現型）特異的事象である可能性が高い。さらに、高用量４−ＨＰＲは、インビボの有益な治療指標を有し得る。さらに、セラミド同化を阻害する第二の薬剤はまた、正常組織が４−ＨＰＲに対する反応でセラミドを増加させ得ないため、４−ＨＰＲとの組合せで有益な治療指標を有し得る。
【００６８】
実施例６
４−ＨＰＲ細胞毒性は、セラミドレベルと相関する。
ＲＯＳは、高用量４−ＨＰＲにより誘導された細胞毒性のすべてを説明しなかったため、本発明者らは４−ＨＰＲ細胞毒性でのデノボセラミドの役割と考えた。図２を参照すると、高用量４−ＨＰＲの細胞毒性はセラミドの量の増加と相関していた。正常なヒト線維芽細胞および神経芽腫細胞株を、４−ＨＰＲに曝露した。セラミドレベルを＋２４時間で分析した。細胞毒性を、＋９６から１２０時間でＤＩＭＳＣＡＮにより分析した。図２に示すように、４−ＨＰＲに感受性の細胞株は、＋２４時間、高いセラミドレベルを有した。
【００６９】
実施例７
４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドは細胞毒性を仲介する。
ＲＯＳは、より高用量での４−ＨＰＲの細胞毒性のすべてを説明しなかったため、本発明者らは、細胞毒性の別の機構を調査した。本発明者らは、１）多量の、新規のセラミドの増加（１３倍まで）が時間および用量依存的にデノボ合成により生じたこと、２）セラミドが、細胞死の形態学的証拠のかなり前に増加すること、３）セラミド増加が、４−ＨＰＲが非毒性である正常ヒト細胞および非悪性細胞株でわずかであったこと、そして４）４−ＨＰＲ細胞毒性がセラミド増加の大きさ（図２に示すような）と関係することを観察した。従って、セラミドは、４−ＨＰＲ細胞毒性に寄与する可能性が増す。４−ＨＰＲ細胞毒性でのセラミドの役割をさらに調査するために、本発明者らは、４−ＨＰＲ細胞毒性におけるデノボセラミド合成の阻害剤のみ、および多くの細胞株で４−ＨＰＲ細胞毒性にかなり相乗作用するセラミド調節剤であるサフィンゴール（Ｌ−トレオ−ジヒドロスフィンゴシン）との組合せの効果を試験した。図３を参照すると、Ｌ−シクロセリンおよびフモニシンＢは神経芽腫細胞株に対してそれ自体毒性を示したが、Ｌ−シクロセリンはセラミド増加を抑制し、そしてＭＣＦ−７／ｔｅｔ、ＭＣＦ−７乳癌細胞株での４−ＨＰＲ、および４−ＨＰＲ＋サフィンゴールの細胞毒性をかなり減少させた。さらに、図４を参照すると、グリコシルセラミド合成酵素（ＧＣＳ）の過剰発現が、セラミドを減少させ、４−ＨＰＲ単独の細胞毒性をかなり減少させ、そして４−ＨＰＲ＋サフィンゴールの細胞毒性相乗作用を実質的に無効にし、ＭＣＦ−７／ＧＣＳ細胞でテトラサイクリンを誘導し得るプロモーターを用いてデノボセラミドを非毒性グルコシルセラミドに変える。従って、４−ＨＰＲにより増加されるセラミドプールは、癌細胞に直接的に細胞毒性であり得、また、サフィンゴール合成の機構は、セラミドに直接的に依存する。さらに、これらの結果は、セラミドの非毒性グルコシルセラミドおよび１−Ｏ−アシルセラミドへの変換を阻害する薬剤がさらに、４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドおよび細胞毒性を増加することを示唆する。
【００７０】
図３を参照すると、Ｌ−シクロセリンは、セリンパルミトイル転換酵素（ＳＰＴ）の阻害剤である。ＭＣＦ−７／ｔｅｔ乳癌細胞（対照）をＬ−シクロセリン（２ｍＭ）（＋Ｃ）で前もってインキュベートせずにまたはしてエタノール４−ＨＰＲ（Ｈ）または４−ＨＰＲ＋サフィンゴール（３：１の比）（Ｈ＋Ｓ）に曝露し、そして＋９６時間にＤＩＭＳＣＡＮ分析で分析した。４−ＨＰＲ（●）；４−ＨＰＲ／Ｌ−シクロセリン（Ｏ）；４−ＨＰＲ／サフィンゴール（３：１）（τ）；４−ＨＰＲ／サフィンゴール／Ｌ−シクロセリン（▽）；Ｌ−シクロセリン（２ｍＭ）（□）。Ｌ−シクロセリンは、Ｌ−シクロセリンで処理した対照を標準化したとき４−ＨＰＲおよび４−ＨＰＲ／サフィンゴールの細胞毒性を減じた。従って、デノボセラミドは、単剤の４−ＨＰＲ細胞毒性、およびサフィンゴール細胞毒性相乗効果に寄与する。
【００７１】
図４を参照すると、ＧＣＳをｔｅｔを誘導し得る発現ベクターで形質転換し、３μＭドキシサイクリンで誘導した。４−ＨＰＲによるセラミド生成は、神経芽腫細胞で用量依存性を示した。ＧＣＳの過剰発現は、セラミド（毒性）をグルコシルセラミド（非毒性）に変換し、ドキソルビシン耐性を与える。ＧＣＳの過剰発現は、単剤としてサフィンゴールにわずかに影響を与え、単剤として４−ＨＰＲの細胞毒性を減ずる（ＲＯＳおよびセラミドによる混合型細胞毒性と一致する）が、４−ＨＰＲ＋サフィンゴール（３：１のモル比）の細胞毒性相乗効果が全体としてほとんどなく、４−ＨＰＲ＋サフィンゴール細胞毒性相乗効果がセラミド依存性であることを意味する。統計的分析を、スチューデントの両側ｔ検定で行う：６μＭ  Ｈ＋ＳでＰ＜．０００１；９μＭ  Ｈ＋ＳでＰ＜．０００１；１２μＭ  Ｈ＋ＳでＰ＝．０００２。
【００７２】
実施例８
静脈内投与４−ＨＰＲは、高薬剤レベルを得る。
腫瘍の臨床治療においてセラミドを増加する４−ＨＰＲの能力を最大とするために、４−ＨＰＲの高い維持されたレベルが必要なようである。静脈内投与製剤の利用により、本発明者らは、ラットでの連続的な静脈注射（ｃ．ｉ．ｖ．）を直接試験した。表１に示した結果は、４−ＨＰＲのｃ．ｉ．ｖ．送達が結果として血漿および組織における４−ＨＰＲの高い維持レベルをもたらすことを示す。本発明者らは、ＰＫＣ−ζおよびスフィンゴシンキナーゼの推定阻害剤であるサフィンゴール（Ｌ−トレオ−ジヒドロスフィンガニン）が、ヒト神経芽腫マウス異種移植モデルで４−ＨＰＲの抗腫瘍活性を著しく増加させ得ることも決定した。従って、４−ＨＰＲの抗腫瘍活性は、セラミドの同化を調節する他の薬剤、例えばグリコシルセラミド合成酵素および１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素の阻害剤などにより増加され得る。
【００７３】
実施例９
グルコシルセラミドおよび１−Ｏ−アシルセラミド合成阻害剤。
セラミド細胞毒性を減ずるための１つの細胞機構は、それを（図１に示すように）グルコシルセラミドおよび１−Ｏ−アシルセラミドなどの非毒性形態へ変換することである。グルコシルセラミドの増加レベルは、インビトロにおけるＭＣＦ−７乳癌細胞のドキソルビシン耐性と関係があり、グリコシルセラミド合成酵素（ＧＣＳ）、またはＧＣＳアンチセンス発現の薬理学的阻害剤は、ドキソルビシンにより誘導されるセラミドレベルを回復し、薬剤耐性を無効にする。Ｄ，Ｌ−トレオ−（１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール）（ＰＰＭＰ）は、ＧＣＳおよび１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素の両方を阻害することが報告される。対照的に、Ｄ，Ｌ−エリトロ−ＰＰＭＰは、１−Ｏ−アシルセラミド合成活性のみを阻害し、グルコシルセラミドレベルの減少なしに細胞セラミドを増加する。ＰＰＭＰは、関連化合物であるＰＤＭＰのより活性な同族体であり、それは１２０ｍｇ／ｋｇ／日×１０日の投与量までげっ歯動物で良好な耐性であり、そしてインビボでエールリッヒ腹水腫瘍細胞の異種移植を達成することができる。さらに、本発明者らは、Ｄ，Ｌ−ＰＰＭＰが、固形腫瘍細胞株で４−ＨＰＲおよび４−ＨＰＲ＋サフィンゴール、およびインビトロのＡＬＬ細胞株で４−ＨＰＲの細胞毒性を増加することができることを報告した。
【００７４】
実施例１０
グルコシルセラミド合成酵素（ＧＣＳ）および１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素（１−Ｏ−ＡＣＳ）は、神経芽腫およびＡＬＬおよびＡＭＬ白血病細胞株で広範に発現されている。
阻害のための標的としてＧＣＳおよび１−Ｏ−ＡＣＳを証明するため、本発明者らは、神経芽腫、白血病および正常細胞の細胞株集団で半定量的ＰＣＲ分析によりこれらの酵素のｍＲＮＡ発現レベルを測定した。図５を参照すると、その結果は、ＧＣＳおよび１−Ｏ−ＡＣＳの両方が、これらの癌型の多くの細胞株でｍＲＮＡを発現することを証明する。これらの結果は、これらの酵素が正常組織で広範に発現されるという他の報告を支持する。これらの結果が、これらの酵素が固形腫瘍（神経芽腫）の両方ならびに急性リンパ芽球性（ＡＬＬ）および急性骨髄性（ＡＭＬ）白血病細胞株の両方でよく発現されることを示すため、それらは恐らく他の癌型でも広く発現されるだろう。
【００７５】
図５は、ＧＣＳおよび１−Ｏ−ＡＣＳのｍＲＮＡ発現を示す。Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ分析を、正常細胞（骨髄、末梢血単核細胞（ＰＢＳＣ）および正常な線維芽細胞）、神経芽腫細胞株および急性白血病細胞株でのＧＣＳおよび１−Ｏ−ＡＣＳの定量的ｍＲＮＡレベルに用いた。結果を、骨髄細胞のそれを標準化する。その結果は、これらの酵素がこれらの癌型で発現され、治療標的としてのＧＣＳおよび１−Ｏ−ＡＣＳを証明することを示す。
【００７６】
実施例１１
ＰＰＭＰは、神経芽腫細胞系でセラミドを増加させ、４−ＨＰＲ耐性を無効にした。
４−ＨＰＲは、インビトロで４−ＨＰＲ耐性のＳＫ−Ｎ−ＲＡ神経芽腫のセラミドをわずかに増加したのみであった。Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰは、グリコシルセラミド合成酵素および１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素の両方を阻害するが、一方、Ｄ，Ｌ−エリトロ−ＰＰＭＰは、１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素のみを阻害する。ＳＫ−Ｎ−ＲＡ細胞の４−ＨＰＲ耐性の機構を研究するため、本発明者らは、ＳＫ−Ｎ−ＲＡ細胞を４−ＨＰＲ−のみ、４−ＨＰＲ＋Ｄ，Ｌ−エリトロ−ＰＰＭＰ、または４−ＨＰＲ＋Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰのいずれかに曝露した。本発明者らは、４−ＨＰＲ耐性が、セラミドを非毒性グルコシルセラミドおよびアシルセラミドへ変換する活性によるものであった場合、Ｄ，Ｌ−エリトロ−ＰＰＭＰおよびＤ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰの両方がセラミドおよび４−ＨＰＲ細胞毒性を増加させ得るが、両経路を阻害することによりＤ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰが部分的に相乗作用し得るという仮説を立てた。本発明者らは、Ｄ，Ｌ−エリトロ−ＰＰＭＰが、４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドおよび細胞毒性を増加したが、Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰは、（図６および７に示すような）４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドおよび４−ＨＰＲ細胞毒性をより強力に相乗作用したことを観察した。故に、例えばＰＰＭＰのようなセラミド同化の阻害剤は、４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドを増加させ得、活性グルコシルセラミドおよびアシルセラミド合成酵素経路により癌細胞株での４−ＨＰＲ細胞毒性に相乗効果を与える。
【００７７】
図６は、ＰＰＭＰが耐性神経芽腫細胞株で４−ＨＰＲ細胞毒性に相乗作用したことを示す。生存画分を、デジタル画像蛍光ベースの顕微鏡分析（ＤＩＭＳＣＡＮ）を約５ｌｏｇの感度で用いて測定した。＋９６時間で分析を行った。３個の薬剤すべては、ＳＫ−Ｎ−ＲＡ神経芽腫細胞で個々に最小または非毒性であった。両薬剤は耐性を無効にし、４−ＨＰＲ細胞毒性（Ｃ．Ｉ．＜１）に相乗作用したが、Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰははより強力であった。Ｄ，Ｌ−エリトロ−ＰＰＭＰ（ｅ−ＰＰＭＰ）は、１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素の阻害剤である。Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰ（ｔ−ＰＰＭＰ）は、グリコシルセラミド合成酵素および１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素の両方の阻害剤である。細胞毒性の相乗効果の測定を、組合せ指数（Ｃ．Ｉ．）により行った：相乗作用、Ｃ．Ｉ．＜１；相加作用、Ｃ．Ｉ．＝１；拮抗作用、（Ｃ．Ｉ．）＞１。
【００７８】
図７は、ＰＰＭＰが多剤耐性神経芽腫細胞系での４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドをさらに増加させることを示す。セラミドおよびグルコシルセラミドレベルを、［３Ｈ］−パルミチン酸で標識し、薄層クロマトグラフィーにより測定した。分析を＋２４時間で行った。４−ＨＰＲ（１０μＭ）は、ＳＫ−Ｎ−ＲＡ神経芽腫細胞でのセラミドをやや増加させた。１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素の阻害剤であるＤ，Ｌ−エリトロ−ＰＰＭＰ（ｅ−ＰＰＭＰ）は、４−ＨＰＲにより誘導されるグルコシルセラミドレベルに影響を与えなかったが（Ｐ＝０．２７）、４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドをさらに増加させた（Ｐ＝０．０３）。グリコシルセラミド合成酵素および１−Ｏ−アシルセラミド合成酵素の両方の阻害剤であるＤ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰ（ｔ−ＰＰＭＰ）は、グルコシルセラミド形成を防止し（Ｐ＝０．０１）、さらに４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドレベルをより大きく増加させた（Ｐ＝０．００２）。統計分析をスチューデントのｔ検定により行う。
【００７９】
実施例１２
ＰＰＭＰは、ＡＬＬ細胞株での４−ＨＰＲ細胞毒性に相乗作用した。
本発明者らは、４−ＨＰＲが６個の試験したインビトロのＡＬＬ細胞株すべてで数倍ｌｏｇの細胞毒性をもたらし、時間および用量依存的方法でデノボ合成によりセラミドをかなり増加させたことを発見した。固形腫瘍細胞株でのＰＰＭＰで得られた本発明者らの結果により、本発明者らは、Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰなどのセラミド同化の阻害剤が、ＡＬＬ細胞株で４−ＨＰＲ細胞毒性にも相乗作用し得ることを仮定した。本発明者らは、Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰが、試験した細胞株でグルコシルセラミド形成を減少しセラミドを増加させ、そして６個の小児ＡＬＬ細胞株のうち４個で４−ＨＰＲ細胞毒性に相乗作用することを測定した。
【００８０】
図８は、Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰがＡＬＬ細胞株で４−ＨＰＲ細胞毒性を相乗的に増加させることを示す。Ｄ，Ｌ−ＰＰＭＰは、６個のＡＬＬ細胞株のうち４個で４−ＨＰＲ細胞毒性に相乗作用した。＋９６時間にてＤＩＭＳＣＡＮにより分析した。●＝４−ＨＰＲ；■＝ＰＰＭＰ；□＝４−ＨＰＲ＋ＰＰＭＰ；（１：１のモル比）。細胞毒性相乗作用の測定を、組合せ指数（Ｃ．Ｉ．）により行う：相乗作用、Ｃ．Ｉ．＜１；相加作用、Ｃ．Ｉ．＝１；拮抗作用、Ｃ．Ｉ．＞１；ＣＥＭ，Ｃ．Ｉ．＝１；ＭＯＬＴ−３，Ｃ．Ｉ．＜１；ＭＯＬＴ−４，Ｃ．Ｉ．＜１；ＮＡＬＭ−６，Ｃ．Ｉ．＜１；ＳＭＳ−ＳＢ、３μＭ（Ｃ．Ｉ．＞１）、６μＭ（Ｃ．Ｉ．＞１）、９μＭ（Ｃ．Ｉ．＝１）；ＮＡＬＬ−１、３μＭ（Ｃ．Ｉ．＞１）、６μＭ（Ｃ．Ｉ．＝１）、９μＭ（Ｃ．Ｉ．＜１）。
【００８１】
実施例１３
Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰは、最も活性なＰＰＭＰ立体異性体である。
さらに、本発明者らは、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰが最も活性なＰＰＭＰ立体異性体であることを発見した。本発明者らの初期の研究は、ＰＤＭＰの１０−２０倍の活性となることが報告されているため、ラセミ体Ｄ，Ｌ−ＰＰＭＰを用いて行われた。図６および図７を参照すると、Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰは、Ｄ，Ｌ−エリトロ−ＰＰＭＰよりも活性であった。しかしながら、親化合物の個々のエナンチオマー（すなわち、Ｌ−トレオ−およびＤ−トレオ）であるＰＤＭＰは、個別に用いたとき異なる活性の阻害を有していた。特に、Ｄ−トレオ−ＰＤＭＰは、ＧＣＳおよび１−Ｏ−ＡＣＳ活性を阻害し、グルコシルセラミドを減少させセラミドレベルを減少させたが、一方、Ｌ−トレオ−ＰＤＭＰは、逆にスフィンゴ糖脂質レベルを上昇させた。これらの調査の詳細は、トレオ−ＰＰＭＰのエナンチオマーについては報告されていない。故に、本発明者らは、神経芽腫細胞株、白血病細胞株および前立腺癌細胞株で４−ＨＰＲにより誘導されるグルコシルセラミド、セラミド、および細胞毒性に対するＤ−トレオ−ＰＰＭＰおよびＬ−トレオ−ＰＰＭＰの効果を測定した。
【００８２】
図９を参照すると、ＳＫ−Ｎ−ＲＡ神経芽腫細胞での予備的な結果は、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰがグルコシルセラミド合成を阻害し、Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰよりもセラミドをより多く増加させることを示す。ＳＫ−Ｎ−ＲＡ神経芽腫細胞を、示された時間の間１０μＭ濃度の薬剤に曝露した。脂質を、［３Ｈ］−パルミチン酸で標識し、薄層クロマトグラフィーすることにより分析した。左側のパネルは、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰがＬ−トレオ−ＰＰＭＰよりも４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドを増加させることを示す。右側のパネルは、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰは４−ＨＰＲにより誘導されるグリコシルセラミド増加を防止するが、Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰは防止しないことを示す。まとめて、これは、両エナンチオマーが１−Ｏ−ＡＣＳを阻害し得るが、予期せぬ事に、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰのみがＧＣＳ活性を阻害することを示す。故に、予期せぬ事に単剤としてのＤ−トレオ−ＰＰＭＰが、すべての他のＰＰＭＰ立体異性体よりも４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドレベルを増加させることが分かった。さらに、ＰＰＭＰがＰＤＭＰよりも１０−２０倍活性であるため、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰは予期せぬ事にすべてのＰＰＭＰおよびＰＤＭＰ化合物のうちで最も好ましい立体異性体である。
【００８３】
図１０を参照すると、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰは、相乗作用する４−ＨＰＲ細胞毒性ではＬ−トレオ−ＰＰＭＰよりも活性であった。ＳＫ−Ｎ−ＲＡ神経芽腫細胞を＋９６時間の間、示された薬剤に曝露し、結果をＤＩＭＳＣＡＮにより分析した。Ｈ＝４−ＨＰＲ；Ｌ−トレオ＝Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰ；Ｄ−トレオ＝Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰ。Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰが、Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰよりも４−ＨＰＲ細胞毒性に相乗作用する可能性が高いという結果を示す。これらの結果は、図９に示すセラミドデータの結果と相関した。
【００８４】
同様の結果が、ＢＭ１８５マウスＡＬＬ白血病細胞で観察された。図１１を参照すると、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰがＰＣ−３前立腺癌細胞でセラミドを増加させ、４−ＨＰＲ細胞毒性をより効率よく増加させたという結果も示される。まとめると、これらの結果は、Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰよりもむしろＤ−トレオ−ＰＰＭＰが優れたセラミド分解阻害剤であることを示す。
【００８５】
図１１は、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰが、同用量のＬ−トレオ−ＰＰＭＰよりも前立腺癌細胞株での４−ＨＰＲ細胞毒性により相乗作用し得ることを示す。図１１の左側のパネルは、示された薬剤で処理されたアンドロゲン非依存性の、ＰＴＥＮヌル、前立腺癌細胞系であるＰＣ−３細胞であって、ＤＩＭＳＣＡＮ分析により＋９６ｈで分析される細胞毒性を示す。Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰは、Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰを示した（Ｐ＜０．０４）よりも強く４−ＨＰＲ細胞毒性に相乗作用（Ｃ．Ｉ．＜１）した。図１１の右側のパネルは、示される薬剤（１０μＭ）で処理されたＰＣ−３細胞を示す。脂質を、＋２４時間で［３Ｈ］−パルミチン酸で標識し、薄層クロマトグラフィーにより分析した。Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰは、４−ＨＰＲで処理された細胞でセラミドを増加した（Ｐ＝０．０３５）。相乗作用を、組合せ指数（Ｃ．Ｉ．）により分析した：相乗作用、Ｃ．Ｉ．＜１；相加作用、Ｃ．Ｉ．＝１；拮抗作用、Ｃ．Ｉ．＞１。統計分析をスチューデントのｔ検定により行う。
【００８６】
本発明は、特定の態様および実施例について記載するが、本発明の改変および適応が本発明の精神および範囲から逸脱しないで可能であることは、当業者により容易に理解されるだろう。従って、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、セラミドの代謝経路の一部を示す。
【図２】図２は、セラミド増加と４−ＨＰＲの細胞毒性の相関関係を示す。
【図３】図３は、４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドが細胞毒性であり、特にデノボのセラミド合成の阻害剤であるＬ−シクロセリンが、４−ＨＰＲおよび４−ＨＰＲ／サフィンゴールの細胞毒性を減少させることを示す。
【図４】図４は、４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドが細胞毒性であり、特にグルコシルセラミド合成酵素（ＧＳＣ）の過剰発現が、ＭＣＦ−７乳癌細胞で４−ＨＰＲの細胞毒性を減じ、サフィンゴールの細胞毒性相乗効果を無効にすることを示す。
【図５】図５は、ＧＳＣおよび１−Ｏ−ＡＣＳが神経芽腫および白血病細胞株で発現され、故に治療的介入のための標的であることを示す。
【図６】図６は、Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰが、耐性神経芽腫細胞株で４−ＨＰＲの細胞毒性に相乗作用することを示す。
【図７】図７は、Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰが、多剤耐性神経芽腫細胞株で４−ＨＰＲにより誘導されるセラミドを増加することを示す。
【図８】図８は、Ｄ，Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰが、ＡＬＬ細胞株で４−ＨＰＲの細胞毒性に相乗作用したことを示す。
【図９】図９は、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰが、Ｌ−トレオ−ＰＰＭＰよりもセラミドを増加することを示す。
【図１０】図１０は、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰが、神経芽腫細胞株で４−ＨＰＲの細胞毒性により強く相乗作用することを示す。
【図１１】図１１は、Ｄ−トレオ−ＰＰＭＰが、前立腺細胞株で４−ＨＰＲの細胞毒性により強く相乗作用することを示す。
【図１２】図１２は、可能なＤ−トレオ−ＰＰＭＰの合成方法を示す。
【図１３】図１３は、ラットでの４−ＨＰＲの連続静脈点滴を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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