(57)【要約】  本発明は、部位Ｉの疎水性が増大した新しいＩＬ−１１ムテインに関する。これらのムテインは、ＩＬ−１１アゴニストまたはハイパーアゴニストとして作用し、血小板減少症治療薬剤として、および放射線または化学療法により、癌の治療中にまたは移植に対して患者を前処理するために引き起こされる有害なインビボの効果に対する生体の抵抗力を改善する薬剤として、特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１１Ｒαに対するエピトープ内の少なくとも２個の非疎水性アミノ酸を疎水性アミノ酸で置換することにより、野生型ＩＬ−１１配列から導出可能なＩＬ−１１ムテインの配列を有するタンパク質を生成する工程を含む、ＩＬ−１１アゴニストを生成する方法。
【請求項２】
ＩＬ−１１ムテインであって、その配列が、野生型ＩＬ−１１の完全な配列から：
−  位置１８２および１８６（完全な野生型の配列を基準にして計算された位置）の親水性アミノ酸をそれぞれ、
○  バリン（記号＝ＶまたはＶａｌ）、
○  アラニン（記号＝ＡまたはＡｌａ）、
○  プロリン（記号＝ＰまたはＰｒｏ）、
○  ロイシン（記号＝ＬまたはＬｅｕ）、
○  イソロイシン（記号＝IまたはＩｌｅ）、
○  フェニルアラニン（記号＝ＦまたはＰｈｅ）、
○  メチオニン（記号＝ＭまたはＭｅｔ）、および、
○  トリプトファン（記号＝ＷまたはＴｒｐ）、
を含む群より選ばれるＸ１およびＸ２により置換すること、
−  ならびに最初の３４個のＮ−末端アミノ酸を超えないＮ末端部分を欠失させること、
により導出可能な配列を含む、ＩＬ−１１ムテイン。
【請求項３】
野生型ＩＬ−１１が、ヒトＩＬ−１１、マカクＩＬ−１１、マウスＩＬ−１１またはラットＩＬ−１１の配列を有することを特徴とする、請求項２記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項４】
請求項２または３記載のＩＬ−１１ムテインであって、その配列が、配列番号９、配列番号２４、配列番号３９、配列番号５４、およびそれらの保存的突然変異配列（前記保存的突然変異配列は、Ｘ１およびＸ２が請求項２で定義される通りであり、ならびに生じるムテインがＩＬ−１１依存性細胞系統の増殖を誘導する能力を保持していることを条件として、配列番号９、配列番号２４、配列番号３９、または配列番号５４のうちの少なくとも１つと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する）を含む群より選ばれる配列を含むＩＬ−１１ムテイン。
【請求項５】
Ｘ１およびＸ２がＶまたはＡであることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項６】
Ｘ１＝ＶおよびＸ２＝Ａであることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項７】
配列番号１０、配列番号２５、配列番号４０、または配列番号５５の配列を含むことを特徴とする、請求項６記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項８】
Ｘ１＝ＡおよびＸ２＝Ｖであることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項９】
配列番号１１、配列番号２６、配列番号４１、または配列番号５６の配列を含むことを特徴とする、請求項８記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項１０】
Ｘ１＝ＶおよびＸ２＝Ｖであることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項１１】
配列番号１２、配列番号２７、配列番号４２、または配列番号５７の配列を含むことを特徴とする、請求項１０記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項１２】
Ｘ１＝ＡおよびＸ２＝Ａであることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項１３】
配列番号１３、配列番号２８、配列番号４３、または配列番号５８の配列を含むことを特徴とする、請求項１２記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項１４】
請求項２〜１３のいずれか１項記載のＩＬ−１１ムテインであって、野生型ＩＬ−１１の完全な配列から：
−  位置１８２および１８６（完全な野生型の配列を基準にして計算された位置）の  親水性アミノ酸をそれぞれＸ１およびＸ２（Ｘ１およびＸ２は請求項２で定義された通り  である）で置換することにより、ならびに
−  最初の２１個のＮ末端アミノ酸を欠失させることにより、
導出可能な配列を含むことを特徴とする、ＩＬ−１１ムテイン。
【請求項１５】
配列番号１４、配列番号２９、配列番号４４、または配列番号５９の配列（配列中、Ｘ１およびＸ２は請求項２で定義されている）を含むことを特徴とする、請求項１４記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項１６】
Ｘ１＝ＶおよびＸ２＝Ａであることを特徴とする、請求項１５記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項１７】
配列番号１５、配列番号３０、配列番号４５、または配列番号６０の配列を含むことを特徴とする、請求項１６記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項１８】
Ｘ１＝ＡおよびＸ２＝Ｖであることを特徴とする、請求項１５記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項１９】
配列番号１６、配列番号３１、配列番号４６、または配列番号６１の配列を含むことを特徴とする、請求項１６記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項２０】
Ｘ１＝ＶおよびＸ２＝Ｖであることを特徴とする、請求項１５記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項２１】
配列番号１７、配列番号３２、配列番号４７、または配列番号６２の配列を含むことを特徴とする、請求項２０記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項２２】
Ｘ１＝ＡおよびＸ２＝Ａであることを特徴とする、請求項１５記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項２３】
配列番号１８、配列番号３３、配列番号４８、または配列番号６３の配列を含むことを特徴とする、請求項２２記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項２４】
請求項２〜２３のいずれか１項記載のＩＬ−１１ムテインであって、野生型ＩＬ−１１の完全な配列から、位置１８２および１８６（完全な野生型の配列を基準にして計算された位置）の親水性アミノ酸をそれぞれＸ１およびＸ２（Ｘ１およびＸ２は、請求項２で定義された通りである）で置換することにより導出可能な配列を含むことを特徴とする、ＩＬ−１１ムテイン。
【請求項２５】
配列番号１９、配列番号３４、配列番号４９または配列番号６４の配列（配列中、Ｘ１およびＸ２は、請求項２で定義された通りである）を含むことを特徴とする、請求項２４記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項２６】
Ｘ１＝ＶおよびＸ２＝Ａであることを特徴とする、請求項２４記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項２７】
配列番号２０、配列番号３５、配列番号５０、または配列番号６５の配列を含むことを特徴とする、請求項２６記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項２８】
Ｘ１＝ＡおよびＸ２＝Ｖであることを特徴とする、請求項２４記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項２９】
配列番号２１、配列番号３６、配列番号５１、または配列番号６６の配列を含むことを特徴とする、請求項２８記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項３０】
Ｘ１＝ＶおよびＸ２＝Ｖであることを特徴とする、請求項２４記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項３１】
配列番号２２、配列番号３７、配列番号５２、または配列番号６７の配列を含むことを特徴とする、請求項３０記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項３２】
Ｘ１＝ＡおよびＸ２＝Ａであることを特徴とする、請求項２４記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項３３】
配列番号２３、配列番号３８、配列番号５３、または配列番号６８の配列を含むことを特徴とする、請求項３２記載のＩＬ−１１ムテイン。
【請求項３４】
核酸であって、その配列が請求項２〜３３のいずれか１項記載のムテインをコードすることを特徴とする核酸。
【請求項３５】
配列番号７２の配列を含むことを特徴とする請求項３４記載の核酸であって、配列中ｎｌｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６の各々が：
○  バリン（記号＝ＶまたはＶａｌ）、
○  アラニン（記号＝ＡまたはＡｌａ）、
○  プロリン（記号＝ＰまたはＰｒｏ）、
○  ロイシン（記号＝ＬまたはＬｅｕ）、
○  イソロイシン（記号＝IまたはＩｌｅ）、
○  フェニルアラニン（記号＝ＦまたはＰｈｅ）、
○  メチオニン（記号＝ＭまたはＭｅｔ）、または
○  トリプトファン（記号＝ＷまたはＴｒｐ）、
をコードする、核酸。
【請求項３６】
配列番号７２の配列を含むことを特徴とする請求項３４〜３５のいずれか１項記載の核酸であって、配列中ｎｌｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６は共に次のコドン：
【表１】
2007521795.tif 000006
を含む群から選ばれる、核酸。
【請求項３７】
配列番号７１または配列番号７０の配列を含むことを特徴とする請求項３４〜３６のいずれか１項記載の核酸であって、配列中、コドンｎｌｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６が請求項３５〜３６のいずれか１項記載の通りに定義されている核酸。
【請求項３８】
配列番号７６または配列番号７４の配列を含むことを特徴とする請求項３４〜３６のいずれか１項記載の核酸であって、配列中、コドンｎｌｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６が請求項３５〜３６のいずれか１項記載の通りに定義されている核酸。
【請求項３９】
配列番号７５のＲＮＡ配列を有することを特徴とする請求項３４〜３５のいずれか１項記載の核酸であって、配列中コドンｎｌｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６が共にコドン：
【表２】
2007521795.tif 000007
を含む群から選ばれる核酸。
【請求項４０】
請求項３４〜３９のいずれか１項記載の核酸を含むことを特徴とする、トランスフェクションベクター。
【請求項４１】
フラグタグをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする、請求項４０記載のトランスフェクションベクター。
【請求項４２】
配列番号７９の配列を含むことを特徴とする請求項４０〜４１のいずれか１項記載のトランスフェクションベクターであって、配列中、ｎｌｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６が請求項３５記載の通りに定義されているトランスフェクションベクター。
【請求項４３】
請求項３４〜３９のいずれか１項記載の核酸を含むこと、および／または請求項４０〜４２のいずれか１項記載のトランスフェクションベクターによりトランスフェクションされたこと、および／または請求項２〜３３のいずれか１項記載のムテインを発現すること、を特徴とする細胞。
【請求項４４】
薬剤であって：
−  治療上有効な量の、請求項２〜３３のいずれか１項記載のＩＬ−１１ムテイン、または請求項３４〜３９のいずれか１項記載の核酸、または請求項４０〜４２のいずれか１項記載のトランスフェクションベクター、または請求項４３記載の細胞、
−  および、場合によっては、薬学的に許容される担体、
を含むことを特徴とする薬剤。
【請求項４５】
炎症性の疾患または症状の予防または治療を意図することを特徴とする、請求項４４記載の薬剤。
【請求項４６】
敗血症性ショックの予防または治療を意図することを特徴とする、請求項４４〜４５のいずれか１項記載の薬剤。
【請求項４７】
糖尿病の予防または治療を意図することを特徴とする、請求項４４〜４５のいずれか１項記載の薬剤。
【請求項４８】
微小血管内皮のアポトーシスの阻止を意図することを特徴とする、請求項４４〜４７のいずれか１項記載の薬剤。
【請求項４９】
抗血小板減少症薬であることを特徴とする、請求項４４記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヒトインターロイキン−１１（ｈＩＬ−１１）は、造血、破骨細胞形成、神経形成および女性の受胎能のような多数の生物学的活性に関係する、多重の能力を有するサイトカインである。それはさらに抗炎症特性を発揮する。ｈＩＬ−１１は、化学療法に起因する血小板減少症を治療するために臨床的に用いられる。
【０００２】
インターロイキン−１１は霊長類間質細胞系統ＰＵ−３４からクローニングされ、最初は造血性のサイトカインと考えられた。その後それは非造血系にも効果があること、および様々な細胞型および組織に作用することが発見された。動物モデルにおける多数の実験、および慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、炎症性肝臓病、粘膜炎および乾癬を含む急性および慢性炎症性疾患に罹患している患者に対する臨床的な試みにより、ＩＬ−１１が抗炎症剤および粘膜保護剤であり、ＩＬ−１１は、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の核内移転を阻害することにより、マクロファージによって分泌されるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１２などの炎症性サイトカインの産生を減少させることができることが明らかになった。その放射線保護活性および敗血症性ショック保護活性も、他の実験によって実証された。このサイトカインの巨核球形成と血小板新生を刺激する能力により、化学療法に起因する血小板減少症の治療に対するｈＩＬ−１１の臨床適用がＦＤＡにより承認された。ＩＬ−１１は健康なマウスだけでなくフォンウイルブランド病マウスモデルにおいてもフォンウイルブランド因子および第VIII因子生産を増加させることができるという事実により、ＩＬ−１１が軽症の血友病Ａまたはフォンウイルブランド病の処置にもう一つの将来性のある治療適用を有することが、最近、立証された。
【０００３】
その作用が広いスペクトルを有するために、ＩＬ−１１拮抗剤はもちろん改良されたＩＬ−１１アゴニストも、多数の生物学的・臨床的応用に対して重要となるであろう。
【０００４】
いくつかのＩＬ−１１分子の構造研究が、ＩＬ−１１の活性化および信号伝達に関係する相互作用を解明するために行なわれた。
【０００５】
Czupryn et al. 1995によるこのような構造研究は、チオレドキシン融合タンパク質として大腸菌からの６１のｈＩＬ−１１の突然変異型の産生を記載している。［Czupryn et al.(1995) Alanine-scanning mutagenesis of human interleukin-11 : identification of regions important for biological activities. Ann. New York Acad. Sci. Jul 21; 762,152-164］。これらの突然変異型の、マウスＴ１０プラズマ細胞腫増殖反応測定による検査により、ｈＩＬ−１１のＣ末端近くのいくつかの位置に起こったＤ１８６Ａ突然変異などの突然変異が、生物活性の実質的な減少を引き起こし（Ｄ１８６Ａ突然変異は、マウスのプラズマ細胞腫細胞系統Ｔ１０における生物活性の５００倍の減少を引き起こした）、またこの領域の多くの他の突然変異がタンパク質の折り畳みまたは安定性のいずれかに影響した、という結論が得られた。
【０００６】
Tacken et al.1999は、ヒトＩＬ−１１の３次元モデルを構築した［Tacken et al.(1999) Definition of receptor binding sites on human interleukin-11 by molecular modelling-guided mutagenesis. Eur. J. Biochem. 265,645-655］。ＩＬ−１１分子内の３つのレセプター結合部位がこのようにして明らかにされた（Tacken et al. 1999の図１Ｂの、部位Ｉ、部位II、および部位IIIを参照のこと）。
【０００７】
Tacken et al. 1999の研究においては、表面に露出している１０個のアミノ酸を部位Ｉ、IIおよびIII内で単一点突然変異原生試験（１つの分子当たり１つのアミノ酸のみを突然変異させた）の候補として選択した。作成された単一点突然変異は、実質的な攪乱をレセプター結合部位に導入するために、疎水性の側鎖を荷電した基（アスパラギン酸）に置換すること、および荷電した側鎖を反対に荷電した残基（リジンまたはグルタミン酸）に置換することからなっていた。このようにして作成された１０個の単一点突然変異体のうちの９個が、単一点突然変異が部位Ｉに属するアミノ酸に存在する４つの突然変異体（Ａ８４Ｄ突然変異；Ｌ８５Ｄ突然変異；Ｒ１９０Ｅ突然変異；Ｌ１９４Ｄ突然変異）を含めて、ＩＬ−１１レセプター複合体に対する親和性の相当な低下、生物活性の欠失または実質的な減少（ＨｅｐＧ２細胞におけるα１−抗キモトリプシン合成の誘導およびＢａ／Ｆ３−１３０−１１α細胞増殖の誘導の喪失または相当な減少）をもたらした。ただ１個の突然変異体即ち、部位IIの親水性アミノ酸を親水性ではあるが反対の電荷を持つアミノ酸により置換した結果であるＲ１３５Ｅだけが、ハイパーアゴニスト的なＩＬ−１１突然変異体である可能性があるように見えた。
【０００８】
したがって、効率的にＩＬ−１１アゴニストを生成し、インビボで活性を有すると証明されるであろうＩＬ−１１アゴニストを得る方法が必要なことに変わりはない。
【０００９】
発明の要約
本発明者らは、少なくとも２個のＩＬ−１１部位Ｉ親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸により置換することにより、部位Ｉの疎水性を実質的に増加させたＩＬ−１１のムテインを設計し、生成した。ムテインを、構造、親和性、特異性、および生物活性について特性決定した。電気泳動解析、ゲルろ過、赤外分光、および円偏光二色性により、これらの新しいタンパク質は、野生型のＩＬ−１１よりもコンパクトであることが明らかである。
【００１０】
本発明のＩＬ−１１ムテインは、ＩＬ−１１Ｒαに増大した親和性（３倍増大した親和性が測定された）をもって結合し、また部位IIを通じてｇｐ１３０を動員する能力を保持している。
【００１１】
有利な特徴として、それらは、様々なＩＬ−１１依存性細胞のインビトロにおける増殖を引き起こす能力を保持している。本発明のムテイン；すなわちＨ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａ  ｈＩＬ−１１ムテインは、７ＴＤ１マウスハイブリドーマ細胞のインビトロの増殖において、野生型のＩＬ−１１より６０〜４００倍活性が高いことがさらに示された。
【００１２】
本発明のムテインはまた、インビボの生物活性を有利に保持している。それらのインビボの生物活性はさらに、野生型ＩＬ−１１よりもはるかに高い可能性がある。Ｈ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａ  ｈＩＬ−１１ムテインを野生型ｈＩＬ−１１より１０倍低い用量を注入することにより、放射線照射されたマウスの死を同じ期間だけ遅らせることが示された。
【００１３】
Ｄ１８６Ａ  ＩＬ−１１ムテインなどの単一点突然変異ＩＬ−１１ムテインと比較して、本発明の二重点突然変異のムテインは、インビトロおよびインビボにおいて予期しない効果および長所を有することが判明している。それらは特に、放射線曝露に対するはるかに高い生存率を引き起こす（即ち、微小血管内皮アポトーシスの阻止において）；下記の実施例３に記載する比較用実例データ、および添付図３５〜３６を参照のこと。
【００１４】
本発明のムテインは、したがって野生型ＩＬ−１１が役に立つすべての生物学的、医学的または臨床的応用に有用であり、またさらに高い効率を示すことさえもできる。本発明のムテインは、放射線防護（例えば、腹部照射中の小腸の放射線防護）に、化学療法の有害作用（例えば、５−フルオロウラシル化学療法中の）の減少に、抗炎症治療において、敗血症性ショックに対する抵抗性において、糖尿病に対して、および造血刺激において、より特別に有用である。
【００１５】
発明の詳細な説明
ＩＬ−１１の信号伝達は、現在、ＩＬ−１１、ＩＬ−１１Ｒαサブユニット（相互作用の特異性を担う）およびｇｐ１３０レセプターβサブユニット（信号伝達を担う）を含むリガンド／レセプター複合体の形成に依存することが知られている。ＩＬ−１１とそのレセプターαサブユニット間の相互作用は最近特定された部位Ｉで生じる（上に引用したTacken et al. 1999、これは参照により本明細書に組み入れられる）。
【００１６】
ＩＬ−１１の活性にとっては、ｇｐ１３０との機能的多量体信号伝達複合体にリガンド特異性を与えるαレセプターサブユニット（ＩＬ−１１Ｒα）への結合が必要である。ｇｐ１３０は、ＩＬ−６、ｖＩＬ−６、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、ＬＩＦ（白血病抑制因子）、ＯＳＭ（オンコスタチンＭ）、ＣＴ−１（カルジオトロフィン）およびＮＮＴ−１／ＢＳＦ−３（新神経栄養因子−１／Ｂ細胞刺激第３因子）を含むサイトカインファミリーの共通のレセプターサブユニットである。ＩＬ−１１はまずＩＬ−１１Ｒαと低い親和性（Ｋｄ＝１０nM）で相互作用し、続いてＩＬ−１１／ＩＬ−１１Ｒα複合体がｇｐ１３０と相互作用して、高親和性（Ｋd＝３００〜８００pM）のシグナル伝達複合体を形成すると信じられている。
【００１７】
レセプターサブユニットとの相互作用を担う３つの部位がＩＬ−１１上に特定された［Grotzinger, J., Kurapkat, G., Wollmer, A., Kalai, M. and Rose-John, S. (1997) The family of the IL-6-type cytokines: specificity and promiscuity of the receptor complexes. Proteins 27, 96-109; Tacken, I., Dahmen, H., Boisteau, O., Minvielle, S., Jacques, Y., Grotzinger, J., Kuster, A., Horsten, U., Blanc, C., Montero- Julian, F. A., Heinrich, P. C. and Muller-Newen, G.(1999) Definition of receptor binding sites on human interleukin-11 by molecular modelling-guided mutagenesis. Eur.J. Biochem. 265,645-655］。
【００１８】
部位Ｉは、基本的にＡＢループの終端およびＤへリックスのＣ末端部分のアミノ酸から成り、ＩＬ−１１Ｒαサブユニットとの相互作用に関与する。基本的にＡおよびＣへリックスからのアミノ酸から成る部位II、および基本的にＤへリックスのＮ末端部分およびＡＢループの始めの残基から成る部位IIIは、ｇｐ１３０（β−サブユニット）の動員に関与する（図２５）。
【００１９】
本発明者らは、ＩＬ−Ｒαに対する親和性が増大し、ｇｐ１３０への親和性を保持し、そしてＩＬ−１１の生物学的活性を保持しまたは改善されたＩＬ−１１ムテインを生成することができることを発見した。
【００２０】
本発明者らは、そのようなアゴニストＩＬ−１１ムテインをＩＬ−１１の部位Ｉの疎水性を実質的に増加させることにより得ることができ、それによってＩＬ−１１分子の構造がよりコンパクトになることを実証する。ＩＬ−１１の部位Ｉの疎水性増加を、ＩＬ−１１の部位Ｉの親水性アミノ酸を疎水性のアミノ酸によって置換することにより達成することができる。さらに、少なくとも２個のそのような親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸により置換するべきであることが、発明者らには明らかであった。
【００２１】
本発明者らは、ヒト野生型ＩＬ−１１の部位Ｉは、２個の親水性アミノ酸（Ｈｉｓ１８２およびＡｓｐ１８６）を含むこと、およびその両方を疎水性の対応物により置換（例えばＨｉｓ１８２およびＡｓｐｌ８６をそれぞれバリンおよびアラニンにより置換）することによって、ＩＬ−１１Ｒαに対する増加した親和性、増加した特異性、および増加したインビトロおよびインビボの生物活性を有するｈＩＬ−１ムテインが得られることを特に証明する。
【００２２】
本発明のムテインがそのような優れた特性および効果を持っているという事実は、これらの２個の親水性アミノ酸のうちの1個だけが置換された場合には反対の特性と効果が得られるため、なおさら驚くべきかつ予期しないことである。
【００２３】
確かに、Czupryn et al. 1995（上に引用）は、Ｄ１８６のＡによる置換（Ｈ１８６の置換無しに）が、野生型のヒト１Ｌ−１１に比較して高度に減少した生物活性を有するヒトＩＬ−１１ムテインをもたらすこと：マウスのプラズマ細胞腫細胞系統Ｔ１０上で生物活性の５００倍の減少が測定されたこと、を記載している。
【００２４】
従ってこの文献は、増加した生物活性を有するムテインを得るためには非常に望ましくない候補突然変異としてＤ／Ａ突然変異を開示した。
【００２５】
実際、本発明者らは、ここでさらに、インビトロで細胞系統から得た結果を直接頼りにして、ある突然変異が、増大した効率を有するムテインを得るための良いかまたは悪い候補であると信頼性を持って考えることはできないことを実証する：同じＤ１８６Ａ突然変異であるが、しかしＦＰΔＩＬ−１１タンパク質（フラグタグ＋Ｎ末端プロリンリッチ領域の欠失、下記の実施例を参照）上で起こったものを、別の細胞系統（細胞系統７ＴＤ１、下記の実施例を参照）上で本発明者が分析し、この細胞系統については生物活性の増加を引き起こすように見える。
【００２６】
実際本発明者らは、インビボで、Ｄ１８６Ａ  ＩＬ−１１ムテインなどの単一点突然変異のＩＬ−１１ムテインと比較して、本発明の二重点突然変異のムテインが、インビボにおける予期しない効果および利点を有することを確認する実験を行った。それらは特に放射線への曝露に対してはるかに高い生存率を誘起する（例えば、微小血管内皮のアポトーシスの抑制において）；下の実施例３に記載した比較用例証データ、および添付図３５〜３６を参照のこと。
【００２７】
Ｈｉｓ１８２およびＡｓｐ１８６の両方を（それぞれＶａｌおよびＡｌａにより）突然変異された本発明のムテインが、驚くべきことにまた予期しないことに、ヒト野生型ＩＬ−１１よりもずっと大きな生物学的活性を有することはさらに注目できる：６０〜４００倍のインビトロにおける細胞増殖の増加が、７ＴＤ１のマウスハイブリドーマ細胞で測定された。
【００２８】
更に、非常に有利なそして実際高度に本質的な特徴として、本発明のムテインは、哺乳動物などの動物においてインビボの生物活性の増加を引き起こす（インビボにおける放射線防護効率の１０倍の増加が、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａを有する照射マウスで測定された。下記の実施例を参照のこと）。
【００２９】
本発明はこのように、ＩＬ−１１Ｒαに対する野生型ＩＬ−１１のエピトープの一部である少なくとも２個の非疎水性アミノ酸を疎水性のアミノ酸によって置換することにより部位Ｉの疎水性を増加させたＩＬ−１１ムテインの生成を含む、ＩＬ−１１アゴニストを生成するための方法を提供する。
【００３０】
前記２個の非疎水性アミノ酸は、ＩＬ−１１Ｒαに対する野生型ＩＬ−１１エピトープの一部であるので、それらはＩＬ−１１の部位Ｉとして知られている部分（＝ＡＢループの終端、およびＤ−へリックスのＣ−末端部）に属する。
【００３１】
前記少なくとも２個の非疎水性アミノ酸は表面に露出されているのが最も好ましい。
【００３２】
ムテイン分子はそれによりさらにコンパクトになる。
【００３３】
それは突然変異された部位Ｉを通じてＩＬ−Ｒαに結合する能力を保持しており、またＩＬ−１１シグナル伝達複合体の他のコンポーネントに、特にｇｐ１３０にムテインの部位IIおよび部位IIIを介して結合する能力をさらに保持していた。
【００３４】
さらに、それはＩＣＬＣ（Interlab Cell Line Collection of the Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro; L. go R. Benzi, 10; 16132 Genova, Italy; see http://www.iclc.it/Lista.html and http://www.biotech.ist.unige.it; ICLC Catalogue accession number = HYL96001）から入手可能な７ＴＤ１マウスハイブリド−マ細胞などのＩＬ−１１依存性細胞のインビトロでの増殖を引き起こす能力を保持していた。
【００３５】
さらに、それは例えば放射線に対して保護する能力などのインビボの生物活性を保持していた。
【００３６】
本発明のムテインは、少なくともＩＬ−１１の親和性および生物活性を保持しているため、それらをＩＬ−１１アゴニストまたはハイパーアゴニストと呼ぶことができる。
【００３７】
あるＩＬ−１１のアミノ酸がＩＬ―１１Ｒαに対するエピトープの一部かどうか、またそれが表面に露出されているかどうかを判断するためには、当業者はTacken et al. 1999（上に引用）の記述に従って進めばよい。それは例えば前記のＩＬ−１１の三次元構造表現を使用して前記の与えられたアミノ酸の位置を決め、それが部位Ｉ（＝ＩＬ−１１Ｒαに対するエピトープ）に属するかどうか、およびそれが表面に露出されているかどうかを決定することを含んでもよい（前記Tacken et al. 1999の図１Ａおよび１Ｂ、およびこの出版物内の"Generation of a molecular model of interleukin-ll and selection of amino acid residues for site-directed mutagenesis"と表題をつけられた章（その内容は参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと）。
【００３８】
野生型ＩＬ−１１Ｒαのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当業者に公知の標準配列データバンクから入手可能である。したがってヒトＩＬ−１１Ｒα配列をＮＣＢＩウェブサイト、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrezから、ヌクレオチドアクセッション番号Ｚ３８１０２の下に、利用可能である（参照によりその内容は本明細書に組み入れられる）。マウスおよびラットなどの非ヒト起源の動物からのＩＬ−１１Ｒα配列もまた、ＮＣＢＩウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrezから利用可能である（マウスおよびラットのＩＬ−１１Ｒα配列に関しては、それぞれのヌクレオチドアクセッション番号Ｘ９８５１９およびＡＦ３４７９３６の下で参照のこと。参照によりその内容は本明細書に組み入れられる）。
【００３９】
ＩＬ−１１Ｒαへの結合を分析するための基質として、可溶性ＩＬ−１１Ｒα、例えばBlanc et al. 2000に記載されているヒトＩＬ−１１Ｒα−ＩＬ−２融合タンパク質を用いることができる（Blanc et al. (2000)  Monoclonal antibodies against the human interleukin-11 receptor α-chain (IL-11Rα) and their use in studies of human mononuclear cells. J. Immunol. Methods 241, 43-59、参照によりその内容は本明細書に組み入れられる）。マウスのＩＬ１１−１１ＲαはＲ＆Ｄ  Ｓｙｔｅｍｓ（http://www.RnDSystems.com）から入手できる。
【００４０】
野生型のＩＬ−１１ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当業者に公知の標準配列データバンクから利用可能である：ヒト野生型のＩＬ−１１配列は、ＮＣＢＩウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrezに、ヌクレオチドアクセッション番号ＡＹ２０７４２９の下に記述されている。参照によりその内容は本明細書に組み入れられる。さらにヒト野生型ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、前記サイトから印刷して添付図１に示す（配列番号７３＝ＡＹ２０７４２９  ＩＬ−１１ヌクレオチド配列；配列番号１＝ヒト野生型ＩＬ−１１アミノ酸配列）。さらに、野生型ｈＩＬ−１１  ｃＤＮＡ配列が、アクセッション番号ＮＭ５７７６５で前述のＮＣＢＩウェブサイトから利用可能である。
【００４１】
非ヒト動物源からの野生型ＩＬ−１１配列、例えばマウスおよびラットＩＬ−１１（それぞれヌクレオチドアクセッション番号ＮＭ  ００８３５０およびＮＭ  １３３５１９）などが、さらに前述のＮＣＢＩウェブサイトから利用可能である。
【００４２】
前記少なくとも２個のアミノ酸の置換は、当業者に公知の任意の標準的手順により達成することができる。その手順には、例えば、Stemmer W. P. and Morris S. K.1992［Stemmer and Morris (1992) Enzymatic inverse PCR: a restriction site independent, single-fragment method for high-efficiency, site-directed mutagenesis. Biotechniques 13, 214-220］に記述されているインバースＰＣＲ増幅による突然変異が含まれよう。参照によりその内容は本明細書に組み入れられる。
【００４３】
適切なプライマーの選択を、ある与えられたＩＬ−１１鋳型配列に対してプライマーの機能を有し、かつその鋳型配列に関してアンプリコンに少なくとも２つの点突然変異を導入する能力を有する配列を有するオリゴヌクレオチドの設計に適用される分野における通常の知識を利用することにより、行なう（上に引用のStemmer and Morris 1992を参照のこと）。
【００４４】
そのようなＩＬ−１１突然変異生成の実例となる手順について下の実施例１に記述する。
【００４５】
ムテインの産生を、タンパク質一般の生成、特に野生型ＩＬ−１１の生成の技術分野における当業者に公知の任意の従来手順により達成することができる。それは、例えばムテインをコードする配列を含むプラスミドの生成を含んでもよく（プラスミドの構築については、Wang, X. M., Wilkin, J. M., Boisteau, O., Harmegnies, D., Blanc, C., Vandenbussche, P., Montero-Julian, F. A., Jacques, Y. and Content, J. (2002) Engineering and use of 32P-labelled human recombinant interleukin-11 for receptor binding studies. Eur. J. Biochem. 269,61-68、を参照のこと。この内容は参照により本明細書に組み入れられる。）、このプラスミドによってE. coliなどの宿主細胞を形質転換し、その結果、形質転換された細胞によってムテインが発現され、それをこの細胞から回収分離することができる。ムテイン産生の実例となる手順を下の実施例１に記述する。
【００４６】
非疎水性アミノ酸（例えば、親水性アミノ酸）は、荷電しているか、荷電していないが極性鎖である側鎖を有する。それらは特に次のものを含む：
−システイン（記号＝ＣまたはＣｙｓ）、
−チロシン（記号＝ＹまたはＴｙｒ）、
−ヒスチジン（記号＝Ｈ、またはＨｉｓ）、
−リシン（記号＝ＫまたはＬｙｓ）、
−アルギニン（記号＝ＲまたはＡｒｇ）、
−グルタミン（記号＝ＱまたはＧｌｎ）、
−アスパラギン（記号＝ＮまたはＡｓｎ）、
−グルタミン酸（記号＝ＥまたはＧｌｕ）、
−アスパラギン酸（記号＝ＤまたはＡｓｐ）、
−セリン（記号＝ＳまたはＳｅｒ）、
−トレオニン（記号＝ＴまたはＴｈｒ）。
【００４７】
疎水性アミノ酸は、無極性で荷電していない側鎖を有する。それらは特に次のものを含む：
−バリン（記号＝ＶまたはＶａｌ）、
−アラニン（記号＝ＡまたはＡｌａ）、
−プロリン（記号＝Ｐ、またはＰｒｏ）、
−ロイシン（記号＝ＬまたはＬｅｕ）、
−イソロイシン（記号＝ＩまたはＩｌｅ）、
−メチオニン（記号＝Ｍ、あるいはＭｅｔ）、
−トリプトファン（記号＝Ｗ、またはＴｒｐ）、
−フェニルアラニン（記号＝ＦまたはＰｈｅ）。
【００４８】
ヒトＩＬ−１１の部位Ｉは、限られた数の親水性アミノ酸を含む疎水性のクラスタからなる：これらの部位Ｉの親水性アミノ酸は、特に位置１８２にＨ、および位置１８６にＤを含む（図１および図２の配列番号１を参照のこと）。
【００４９】
本発明によれば、位置１８２のヒスチジン（Ｈ）および位置１８６のアスパラギン酸（Ｄ）が、疎水性アミノ酸により置換されるべき野生型ｈＩＬ−１１の突然変異の標的として、最も好ましい。
【００５０】
立体障害、構造、および／またはサイズに関する類似性を、前記ＨおよびＤ標的を置換するためにより適切な疎水性アミノ酸を選ぶ際に考慮することになる。ＩＬ−１１部位Ｉ親水性アミノ酸を置換するための最も好ましい疎水性アミノ酸には、バリン（Ｖ）およびアラニン（Ａ）が含まれる。
【００５１】
ＶによるＨ１８２の置換、およびＡによるＤ１８６の置換によって得られるムテインが、ＩＬ−１１ハイパーアゴニストであることが判明した：野生型のｈＩＬ−１１と比較して、それはＩＬ−１１Ｒαへの３倍に増加した親和性を有し、一方ｇｐ１３０を動員する能力を依然として保持する；それは、マウスのハイブリドーマ細胞系統７ＴＤ１の増殖に対して６０〜４００倍活性が強く、また、ムテインは、野生型のＩＬ−１１より１０倍低用量でインビボにおける放射線防護の同一効果に達する（同じインビボの放射線防護結果を達成するために野生型ＩＬ−１１より１０倍少ないムテインしか必要でない）；下記の実施例１および２を参照のこと。
【００５２】
マカク、マウスおよびラットの野生型ＩＬ−１１において、現在部位Ｉに属することが知られている親水性アミノ酸もまた、Ｈ１８２およびＤ１８６である。
【００５３】
野生型ＩＬ−１１タンパク質のＮ末端は２１個のアミノ酸のシグナルペプチドから始まり、１３個のアミノ酸のプロリンリッチ領域が直接その後に続く。これらの最初の３４個のＮ末端アミノ酸はＩＬ−１１生物活性には必要でない：したがって、それらを欠失させることができる。図３は、それらの最初の３４個のＮ末端アミノ酸をそれぞれ欠失させた、野生型のヒト、マカク、マウス、およびラットのＩＬ−１１配列（それぞれ配列番号５〜８）を示す。
【００５４】
本発明はこのようにＩＬ−１１ムテインを提供する。その配列は、野生型ＩＬ−１１から、位置１８２および１８６（完全な野生型配列を基準にして計算された位置）の親水性アミノ酸のそれぞれＸ1およびＸ2による置換であって、Ｘ1およびＸ2は：
−バリン（記号＝ＶまたはＶａｌ）、
−アラニン（記号＝ＡまたはＡｌａ）、
−プロリン（記号＝ＰまたはＰｒｏ）、
−ロイシン（記号＝ＬまたはＬｅｕ）、
−イソロイシン（記号＝ＩまたはＩｌｅ）、
−フェニルアラニン（記号＝ＦまたはＰｈｅ）
−メチオニン（記号＝ＭまたはＭｅｔ）、および
−トリプトファン（記号＝ＷまたはＴｒｐ）、
を含む群より選ばれる置換、および場合によっては、最初の３４個のＮ末端アミノ酸を超えないＮ末端部分の欠失により、導出することのできる配列を含む。
【００５５】
最初の３４個のＮ末端アミノ酸はＩＬ−１１の生物活性に必要ではないため、本発明のムテインの機能を実質的に変更せずに、最初の３４個のＮ末端アミノ酸を超過しないＮ末端部分を欠失させることが実際に可能である。本発明はこのように、図４、７、１０、１３にそれぞれ示した、配列番号９、配列番号２４、配列番号３９、配列番号５４（それぞれ、３４個のアミノ酸を欠失させたヒト、マカク、マウスおよびラット起源の野生型ＩＬ−１１に由来するＩＬ−１１ムテイン）を含む群から選ばれる配列を含む配列のＩＬ−１１ムテインに関する。
【００５６】
本発明はさらに、Ｘ1とＸ2が上に定義した通り（すなわち疎水性アミノ酸）であり、また生じたタンパク質が、野生型ＩＬ−１１が有する、例えば７ＴＤ１マウスのハイブリドーマ細胞系統などのＩＬ−１１依存性細胞系統の増殖を引き起こす能力を保持しているならば、上述の配列番号９、配列番号２４、配列番号３９または配列番号５４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性を備えた配列を含む等価なＩＬ−１１ムテインもまた包含する。
【００５７】
本発明の実例となり有用なムテインは、Ｘ1およびＸ2がＶまたはＡであるムテインを含む。
【００５８】
したがって本発明はより詳細には、生物活性に必要でないＮ−末端のアミノ酸を欠失させた野生型のＩＬ−１１に対応する配列を含み、位置１８２および１８６のアミノ酸がそれぞれ、ＶおよびＡ、ＡおよびＶ、ＶおよびＶ、またはＡおよびＡにより置換されたＩＬ−１１ムテインを包含する。
【００５９】
本発明はこのように、Ｘ1＝ＶおよびＸ2＝Ａである配列番号９、配列番号２４、配列番号３９または配列番号５４の配列を含むＩＬ−１１ムテインに関する；即ち、配列番号１０（ヒトＩＬ−１１由来）、配列番号２５（マカクＩＬ−１１由来）、配列番号４０（マウスＩＬ−１１由来）または配列番号５５（ラットＩＬ−１１由来）の配列を含むＩＬ−１１ムテインに関する。これらの配列番号を、それぞれ図４、７、１０および１３に示す。
【００６０】
本発明はまた、Ｘ1＝ＡおよびＸ2＝Ｖである配列番号９、配列番号２４、配列番号３９または配列番号５４の配列を含むＩＬ−１１ムテインに関する、すなわち、配列番号１１（ヒトＩＬ−１１由来）、配列番号２６（マカクＩＬ−１１由来）、配列番号４１（マウスＩＬ−１１由来）または配列番号５６（ラットＩＬ−１１由来）の配列を含む、ＩＬ−１１ムテインに関する。これらの配列番号を、それぞれ図４、７、１０および１３に示す。
【００６１】
本発明はまた、Ｘ1＝ＶおよびＸ2＝Ｖである配列番号９、配列番号２４、配列番号３９または配列番号５４の配列を含むＩＬ−１１ムテインに関する、すなわち、配列番号１２（ヒトＩＬ−１１由来）、配列番号２７（マカクＩＬ−１１由来）、配列番号Ｎ０４２（マウスＩＬ−１１由来）、または配列番号５７（ラットＩＬ−１１由来）の配列を含む、ＩＬ−１１ムテインに関する。これらの配列番号を、それぞれ図４、７、１０、および１３に示す。
【００６２】
本発明はまた、Ｘ1＝ＡおよびＸ2＝Ａである配列番号９、配列番号２４、配列番号３９または配列番号５４の配列を含むＩＬ−１１ムテインに関する、すなわち、配列番号１３（ヒトＩＬ−１１由来）、配列番号２８（マカクＩＬ−１１由来）、配列番号４３（マウスＩＬ−１１由来）または配列番号５８（ラットＩＬ−１１由来）の配列を含む、ＩＬ−１１ムテインに関する。これらの配列番号を、それぞれ図４、７、１０および１３に示す。
【００６３】
本発明の実例となり有用なＩＬ−１１ムテインは従って、シグナルペプチド（最初の２１個のアミノ酸）を欠失させ、かつ位置１８２および１８６（完全な野生型配列を基準にして計算された位置）のアミノ酸を、上に定義した疎水性のＸ1およびＸ2のアミノ酸によって置換することにより野生型のＩＬ−１１から導出可能なＩＬ−１１ムテインを包む。
【００６４】
本発明はこのように、配列が、配列番号１４、配列番号２９、配列番号４４または配列番号５９の配列（配列中Ｘ1およびＸ2は上に定義されている）を含む、あるいはからなるＩＬ−１１ムテインを包含する。これらの配列番号を、それぞれ図５、８、１１および１４に示す。
【００６５】
配列番号１４の配列は、位置１８２および１８６のアミノ酸がＸ1およびＸ2により置換され、最初の２１個のＮ末端アミノ酸が欠失されたヒトの野生型ＩＬ−１１に対応する（図５を参照）。
【００６６】
配列番号２９の配列は、位置１８２および１８６のアミノ酸がＸ1およびＸ2により置換され、最初の２１個のＮ末端アミノ酸が欠失されたマカクの野生型ＩＬ−１１に対応する（図８を参照）。
【００６７】
配列番号４４の配列は、位置１８２および１８６のアミノ酸がＸ1およびＸ2により置換され、最初の２１個のＮ末端アミノ酸が欠失されたマウスの野生型ＩＬ−１１に対応する（図１１を参照）。
【００６８】
配列番号５９の配列は、位置１８２および１８６のアミノ酸がＸ1およびＸ2により置換され、最初の２１個のＮ末端アミノ酸が欠失されたラットの野生型ＩＬ−１１に対応する（図１４を参照）。
【００６９】
配列番号１４、配列番号２９、配列番号４４、配列番号５９中で、それぞれ、Ｘ1＝ＶおよびＸ2＝Ａであるときは、本発明のムテインは、それぞれ配列番号１５、配列番号３０、配列番号４５、配列番号６０の配列を含む、または、からなる（それぞれ図５、８、１１、１４に示す）。
【００７０】
配列番号１４、配列番号２９、配列番号４４、配列番号５９中で、それぞれ、Ｘ1＝ＡおよびＸ2＝Ｖであるときは、本発明のムテインは、それぞれ配列番号１６、配列番号３１、配列番号４６、配列番号６１の配列を含む、または、からなる（それぞれ図５、８、１１、１４に示す）。
【００７１】
配列番号１４、配列番号２９、配列番号４４、配列番号５９中で、それぞれ、Ｘ1＝ＶおよびＸ2＝Ｖであるときは、本発明のムテインは、それぞれ配列番号１７、配列番号３２、配列番号４７、配列番号６２の配列を含む、または、からなる（それぞれ図５、８、１１、１４に示す）。
【００７２】
配列番号１４、配列番号２９、配列番号４４、配列番号５９中で、それぞれ、Ｘ1＝ＡおよびＸ2＝Ａであるときは、本発明のムテインは、それぞれ配列番号１８、配列番号３３、配列番号４８、配列番号６３の配列を含む、または、からなる（それぞれ図５、８、１１、１４に示す）。
【００７３】
配列番号１５〜１８、配列番号３０〜３３、配列番号４５〜４８、配列番号６０〜６３の配列を含む、または、からなる本発明のムテインは、それぞれ本発明の好ましいムテインである。配列番号１５、配列番号３０、配列番号４５、配列番号６０の配列を含む、または、からなる本発明のムテインが、それぞれ最も好ましい。
【００７４】
本発明の実例となり有用なムテインはまた、位置１８２および１８６のアミノ酸を、上に定義した疎水的なＸ1およびＸ2のアミノ酸によって置換することにより完全な野生型ＩＬ−１１から導出可能な本発明のムテインである。そのような実例となり有用なＩＬ−１１ムテインは、このように、Ｘ1とＸ2が上に定義された、配列番号１９、配列番号３４、配列番号４９または配列番号６４の配列を含む、又はからなるムテインを含む。
【００７５】
配列番号１９の配列は、位置Ｈ１８２およびＤ１８６が共に上に定義されたＸ1およびＸ2によって置換されたヒトの完全な野生型ＩＬ−１１に対応する。それを図６に示す。
【００７６】
配列番号３４の配列は、位置Ｈ１８２およびＤ１８６が共に上に定義されたＸ1およびＸ2によって置換されたマカクの完全な野生型ＩＬ−１１に対応する。それを図９に示す。
【００７７】
配列番号４９の配列は、位置Ｈ１８２およびＤ１８６が共に上に定義されたＸ1およびＸ2によって置換されたマウスの完全な野生型ＩＬ−１１に対応する。それを図１２に示す。
【００７８】
配列番号６４の配列は、位置Ｈ１８２およびＤ１８６が共に上に定義されたＸ1およびＸ2によって置換されたラットの完全な野生型ＩＬ−１１に対応する。それを図１５に示す。
【００７９】
配列番号１９、配列番号３４、配列番号４９、配列番号６４中で、それぞれＸ1＝ＶおよびＸ2＝Ａであるときは、本発明のムテインは、それぞれ配列番号２０、配列番号３５、配列番号５０配列番号６５の配列を含む、または、からなる（それぞれ、図６、９、１２、１５に示す）。
【００８０】
配列番号１９、配列番号３４、配列番号４９、配列番号６４中で、それぞれＸ1＝ＡおよびＸ2＝Ｖであるときは、本発明のムテインは、それぞれ配列番号２１、配列番号３６、配列番号５１、配列番号６６の配列を含む、または、からなる（それぞれ、図６、９、１２、１５に示す）。
【００８１】
配列番号１９、配列番号３４、配列番号４９、配列番号６４中で、それぞれＸ1＝ＶおよびＸ2＝Ｖであるときは、本発明のムテインは、それぞれ配列番号２２、配列番号３７、配列番号５２、配列番号６７の配列を含む、または、からなる（それぞれ、図６、９、１２、１５に示す）。
【００８２】
配列番号１９、配列番号３４、配列番号４９、配列番号６４中で、それぞれ、Ｘ1＝ＡおよびＸ2＝Ａであるときは、本発明のムテインは、それぞれ配列番号２３、配列番号３８、配列番号５３、配列番号６８の配列を含む、または、からなる（それぞれ、図６、９、１２、１５に示す）。
【００８３】
配列番号２０〜２３、配列番号３５〜３８、配列番号５０〜５３、配列番号６５〜６８の配列を含む、または、からなる本発明のムテインは、それぞれ本発明の好ましいムテインである。配列番号２０、配列番号３５、配列番号５０、配列番号６５の配列を含む、または、からなる本発明のムテインが、それぞれ最も好ましい。
【００８４】
本発明は、さらに本発明のムテインをコードするＤＮＡまたはＲＮＡなどの任意の核酸を包含する。
【００８５】
それは特に、本発明に従って適切に突然変異された野生型ＩＬ−１１の連結されたＣＤＳ（コード配列）を含む、ＤＮＡなどの任意の核酸を包含する。
【００８６】
ヒト野生型ＩＬ−１１の連結されたＣＤＳ配列を、図１６Ａに配列番号６９として示す（Ｈ１８２をコードするコドンＣＡＣ、およびＤ１８６をコードするコドンＧＡＣに下線を付す）。
【００８７】
本発明の適切な突然変異は、前記ｃａｃおよびｇａｃの野生型コドンをコドンｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６によりそれぞれ置換することを含む、ここでｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６は共に疎水性アミノ酸、すなわち上に定義したＸ1およびＸ2アミノ酸をコードする。）
【００８８】
従ってｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６は、バリン（記号＝ＶまたはＶａｌ）、アラニン（記号＝ＡまたはＡｌａ）、プロリン（記号＝ＰまたはＰｒｏ）、ロイシン（記号＝ＬまたはＬｅｕ）、イソロイシン（記号＝ＩまたはＩｌｅ）、フェニルアラニン（記号＝ＦまたはＰｈｅ）、メチオニン（記号＝Ｍ、あるいはＭｅｔ）およびトリプトファン（記号＝ＷまたはＴｒｐ）をコードするヌクレオチドコドンを含む群から選ばれる。したがって、遺伝コードの縮重を考慮に入れて、ｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６は共に、次のコドン：
【表３】
2007521795.tif 000002
を含む群から選ばれることになる。
【００８９】
このように、本発明は特に、図１６Ｂに示す配列番号７２の配列を含む任意の核酸（例えばＤＮＡ）を包含する。配列中ｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６は上に定義された通りである。
【００９０】
本発明に従って野生型ＩＬ−１１から、最初の２１個のＮ末端アミノ酸（図５の配列番号１４〜１８を参照）または最初の３４のＮ末端アミノ酸（図４の配列番号９〜１３を参照）を欠失させる場合は、対応する連結されたＣＤＳ配列から対応するコドンを欠失させる。
【００９１】
本発明はしたがって、図１６Ｂおよび１６Ａにそれぞれ示す配列番号７１または配列番号７０の配列を含む任意の核酸（例えばＤＮＡ）を包含する。配列中ｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６は上に定義した通りである
【００９２】
本発明はしたがってより詳細には、図１９および１７にそれぞれ示した配列番号７６または配列番号７４の配列を含む、または、からなる任意の核酸（例えばＤＮＡ）を包含する。配列中コドンｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６は上に定義した通りである。
【００９３】
配列番号７６の配列は、本発明に従って適切に突然変異された、即ち配列中のＨ１８２およびＤ１８６をコードする野生型コドンｃａｃおよびｇａｃが上に定義したｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６により置換された、ヒトＩＬ−１１野生型遺伝子（ＡＹ２０７４２９  ＮＣＢＩアクセッション配列中、位置１５８２から位置７５６６までに定義されている）に対応する。
【００９４】
配列番号７４の配列は、本発明に従って適切に突然変異された、即ち、配列中のＨ１８２およびＤ１８６をコードする野生型コドンｃａｃおよびｇａｃが上に定義したｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６により置換された、配列番号７３（ＡＹ２０７４２９  ＮＣＢＩ配列）のヌクレオチド配列に対応する。
【００９５】
同じ突然変異スキームに従って、マカク、マウスおよびラットの野生型ＩＬ−１１  ＤＮＡなどの、ヒト以外の野生型ＩＬ−１１のＤＮＡから同様に突然変異された配列を得ることができ、またそのような同様に突然変異された配列は本発明に包含される。
【００９６】
本発明はさらに、本発明に従って適切に突然変異された（すなわち、Ｈ１８２とＤ１８６をコードする野生型のコドンＣＡＣおよびＧＡＣが、上に定義したｎ１ｎ２ｎ３とｎ４ｎ５ｎ６によって置換されている）野生型のＩＬ−１１  ＲＮＡ配列に由来するＲＮＡ配列を含む、または、からなる任意の核酸も包含する。
【００９７】
本発明は、したがって詳細には、図１８に示す配列番号７５の配列に関する。配列番号７５の配列は、適切に本発明に従って突然変異されたヒト野生型ＩＬ−１１のｍＲＮＡ配列（ＡＹ２０７４２９  ＮＣＢＩ登録配列に、連結された配列１５８２〜１６５１、３０１４〜３１８６、３３８６〜３４７２、３５８４〜３７４５、５７７８〜７５６６により定義されている）に対応する（ｎ１ｎ２ｎ３とｎ４ｎ５ｎ６に下線を引く）。本発明はまた、マカク、マウス、ラットＩＬ−１１などの野生型のヒト以外のＩＬ−１１  ＲＮＡから同様に得られる任意の突然変異されたＲＮＡ配列に関する。
【００９８】
本発明のさらなる局面によれば、本出願は、例えばプラスミドなどの、本発明の核酸即ち本発明のＩＬ−１１ムテインをコードする核酸を含む、任意のトランスフェクションベクターに関する。
【００９９】
本発明の実例となり有用なトランスフェクションベクターは、位置１８２および１８６の親水性アミノ酸をコードするコドンの上に定義したコドンｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６による置換により；そして恐らくＩＬ−１１型の生物活性に必要でないコドンの欠失により、例えば完全な野生型ＩＬ−１１の中でＮ末端シグナルペプチドをコードするコドンおよび／または、プロリンリッチ領域に対応するＮ末端コドンの欠失などにより；野生型ＩＬ−１１をコードする配列から導出可能な配列を含む、または、からなる配列を挿入配列として含むベクターを含む。
【０１００】
本発明の実例となり有用なトランスフェクションベクターは、位置１８２および１８６の親水性アミノ酸をコードするコドンの上に定義したコドンｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６による置換により；および完全な野生型ＩＬ−１１の最初の２１個のＮ末端アミノ酸、または最初の３１または３４個のＮ末端アミノ酸をコードするコドンの欠失により；野生型ＩＬ−１１をコードする配列から導出可能な配列を含む、または、からなる配列をこのようにして含むことができる。
【０１０１】
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓなどのフラグタグをコードする短いヌクレオチド配列およびそれに続く（ウシ心臓キナーゼによって認識され、セリン残基がリン酸化されるＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａなどの）キナーゼによって認識されリン酸化されることができるコンセンサス配列をコードするもう一つの短いヌクレオチド配列を、ＩＬ−１１ムテインをコードする核酸の一端、例えばその５’端に、完全な野生型ＩＬ−１１中で最初の３１個のＮ末端アミノ酸をコードするコドンの代わりに加えることができる
【０１０２】
そのようなトランスフェクションベクターを下の実施例１に記述する。実例となり有用な、そのようなベクターの挿入配列を図２３の配列番号７９に示す（本発明に従い上に定義されたｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６コドンにより突然変異させ、最初の３１のＮ末端アミノ酸をコードするコドンを欠失させ、フラグタグおよびウシ心臓キナーゼにより認識されるコンセンサス配列をコードするコドンを付加した野生型ヒトＩＬ−１１：図２３中、フラグタグをボックスに入れ、キナーゼ用コンセンサス配列に下線を付す。）
【０１０３】
本発明のさらなる局面によれば、本出願は、本発明の核酸を含む任意の細胞、および／または本発明のトランスフェクションベクターによりトランスフェクションされた任意の細胞、および／または本発明のムテインを発現する任意の細胞に関する。そのような細胞は、例えば本発明のＩＬ−１１ムテインを生成し分離するために用いることができる。当業者にとって適切な宿主細胞として利用可能な任意の細胞は、本発明のトランスフェクションベクターによって形質転換するために用いることができ、その結果生成された形質転換細胞は本発明のムテインを発現することができる。適切な標準宿主細胞には、例えばE. coli細胞、例えばE. coliＢＬ２１（ＤＥ３）株など（Novagenから入手可能）が含まれる。
【０１０４】
本発明はこのように、適当な培地（例えばE. coli形質転換細胞用のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地）中で本発明の細胞を培養することおよび前記細胞から前記ＩＬ−１１ムテインを単離することを含む、本発明のＩＬ−１１ムテインを生成するための方法を包含する。
【０１０５】
本発明はしたがって、前記核酸配列の複製および発現を指令することができる発現制御配列と機能的に共同して働く本発明の核酸配列によって形質転換された任意の細胞を包含する。
【０１０６】
上に示し、下に説明するように、本発明のＩＬ−１１ムテインは少なくともＩＬ−ｌｌＲαおよびｇｐ１３０に結合する能力、ならびに野生型ＩＬ−１１により誘起される型の活性をインビトロおよびインビボにおいて誘起する能力を保持していた。それらは、したがって野生型ＩＬ−１１が有用であると考えられるすべての応用において有用である。
【０１０７】
典型的なＩＬ−１１の生物学的または医学的応用が、US 6,126,933; WO 00/74707; US 5,460,810; US 6,540,993; US 5,215,895; WO 00/53214に記載されており、
その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０８】
Ｈ１８２とＤ１８６がＶａｌとＡｌａによって置換された本発明のＩＬ−１１ムテインは、さらに野生型のＩＬ−１１よりも極めて効率的であると判明し、したがってＩＬ−１１ハイパーアゴニストと呼ぶことができる。例えば、本発明のＨ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａムテイン（すなわち配列番号１０、配列番号２５、配列番号４０または配列番号５５の配列を含むムテイン、またはそれらの保存的突然変異体）が、ＩＬ−ｌｌＲａに野生型のＩＬ−１１と比較して３倍増強された親和性で結合し、７ＴＤ１マウスハイブリド−マ細胞の増殖に対して野生型のＩＬ−１１より６０〜４００倍活性が強く、また野生型のＩＬ−１１と同じインビボの放射線防護イソ−効果を引き起こすために１０倍低い用量しか必要としない（下記の実施例１および２を参照）。
【０１０９】
したがって、本出願はまた、癌の治療のためまたは骨髄移植用に患者を前処理するための放射線治療に対する耐性などの、放射線に対する耐性の改善に役立つ薬剤として本発明のＩＬ−１１ムテインを包含する。
【０１１０】
本出願はまた、癌治療のための化学療法によって引き起こされた有害作用に対する耐性を改善するために役立つ薬剤として本発明のＩＬ−１１ムテインを包含する。
【０１１１】
それは、より詳細には、抗−血小板減少症薬剤としての本発明のＩＬ−１１ムテインに関する。
【０１１２】
本発明のＩＬ−１１ムテインはさらに、抗炎症剤として、および／または造血、神経形成、破骨細胞形成および／または女性の受胎能を誘導または刺激する薬剤として、有用であり得る。
【０１１３】
本発明の抗炎症性局面の詳細に立ち入ると、当業者に知られているように野生型ＩＬ−１１が敗血症性ショック保護および糖尿病保護活性を有することを強調することができる（本明細書の導入部を参照のこと）さらに当業者には、これらのＩＬ−１１の保護活性の基礎となる機構が、ＩＬ−１１が微小血管内皮アポトーシスに及ぼす抑制中に見出されることが知られている（例えば、Sheridan et al. 1999, "Interleukin-11 attenuates pulmonary inflammation and vasomotor dysfunction in endotoxin-induced lung injury", Am.J. Physiol. 277 (Lung Cell. Mol. Physiol. 21: L861-L867); Nicoletti et al. 1999, "Early prophylaxis with recombinant human interleukin-11 prevents spontaneous diabetes in NOD mice", Diabetes, vol. 48, pages 2333-2339、を参照のこと）。
【０１１４】
さらに放射線によって引き起こされる一次病変は微小血管内皮のアポトーシスであることが知られているため（例えば、Paris et al. 2001,"Endothelial apoptosis as the primary lesion initiating intestinal radiation damage in mice", Science vol. 293, pages 293-297参照）、本発明のムテインは微小血管内皮のアポトーシスを阻害するための有用な薬剤である。本発明のムテインは、従って、敗血症性ショックおよび糖尿病（例えば１型糖尿病）などの微小血管内皮アポトーシスの抑制を必要とする疾病または症状の予防および／または症状緩和および／または治療への適用に好都合である。本発明のムテインは強力な抗炎症剤薬であり、初期の免疫性糖尿病誘発経路を下方制御することができる可能性が極めて高い。
【０１１５】
本発明は、したがって本発明の治療上有効な量の、ＩＬ−１１ムテイン、または本発明の核酸、または本発明のベクター、または本発明の細胞を含む任意の薬剤に関する。そのような薬剤はさらに、薬物を製剤する当業者が利用できる、任意の薬学的に許容される担体（例えば等張食塩水）、ならびに当業者が適切であると分かる任意の安定剤、保存剤、緩衝液、酸化防止剤または添加剤を含むことができる。薬剤を、その意図した投与の態様（非経口、静脈内、皮下、局所的等）に適切な任意の形および調質で生成してもよい。本発明の薬剤の投与計画を、担当医は、治療する患者の症状、体重、性別、食事、年齢および他の医学的に重要な特徴を考慮して決定することになる。本発明の有利な特徴として、Ｈ１８２およびＤ１８６がＶａｌとＡｌａにより置換されたムテインを含む薬剤は、通常、野生型ＩＬ−１１の場合よりも低い用量しか必要としない。
【０１１６】
本発明の薬剤は、免疫応答に関与する細胞および造血系の適切な作動に関与する細胞を刺激および／または増強するために役立つ可能性がある。
【０１１７】
それはさらに、炎症性腸疾患（例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、不定性大腸炎および感染性大腸炎）、粘膜炎（例えば口粘膜炎、消化管粘膜炎、鼻粘膜炎、および直腸炎）、壊死性小腸結腸炎、炎症性皮膚病（例えば乾癬、アトピー性皮膚炎、および接触過敏症）、アフタ性潰瘍、咽頭炎、食道炎、消化性潰瘍、歯周炎、歯膜炎および眼の疾病（例えば結膜炎、網膜炎、および葡萄膜炎）を治療するために役立つ可能性がある。
【０１１８】
それはまた、出血性ショックの予防または治療、および出血性ショック中と蘇生中に胃腸系を保護することにも役立つ可能性がある。
【０１１９】
それはまた、移植片対宿主疾患または器官および組織移植の拒絶などの免疫媒介性細胞毒性作用、ならびに血液供給喪失、腐食、炎症、によって引き起こされた局所的組織または細胞障害、または疾病による局部障害などの非免疫媒介的壊死性損傷の、予防または治療にも有用である可能性がある。
【０１２０】
本発明はより詳細には、本発明のムテインを含む任意の血小板減少症治療薬、および癌の化学療法のための治療上有効な量の有効成分に関する。
【０１２１】
本発明の薬はさらに、微小血管アポトーシスの抑制が望ましい任意の疾病または症状の予防、症状緩和または治療のために、および、より詳細には１型糖尿病などの糖尿病、および／または敗血症性ショックの予防、症状緩和または治療にも役立つ。
【０１２２】
次の実施例は、説明用の実施例として挙げるものであり、本発明の範囲を制限するように意図したものでは全くない。より詳細には、ヒトのＩＬ−１１ムテインを有用で特に適切な実例として記載するが、当業者が考慮できるいかなるそれらの保存的突然変異体も本出願に包含される。
【０１２３】
実施例１
ＩＬ−１１ムテインの生成、およびそれらの構造、親和性、特異性および細胞系統生物活性の特性決定。
実験
菌株、酵素および化学薬品
Escherichia coli ＤＨ５αを、Invitrogen Life Technologiesから、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびｐＥＴ―２２ｂ（＋）をNovagenから入手した。E. coli組み換えヒトＩＬ−１１をPepro Tech Inc（London, UK）およびR & D Systems（Wiesbaden-Nordenstadt, Germany）から入手した。突然変異生成用プライマーをGensetから入手した。ＭＡＢ６２８および抗−ｈＩＬ−１１ビオチン化ポリクローナル抗体ＢＡＦ２１８をR & D Systemsから入手した。比放射能〜３０００Ci/mmolの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰをAmersham Pharmacia Biotechから得た。アクリルアミドおよびＮ，Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミドを、Bio-Radから得た。ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、グルタミン、およびＦＣＳをGibco-BRLから入手した。ウシ心筋ｃＡＭＰ非依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット、ストレプトアビジン結合アルカリ性フォスファターゼ、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、および抗−フラグＭ２モノクローナル抗体をSigma（Bornem, Belgium）から得た。
【０１２４】
突然変異誘発
ＦＰΔＩＬ−１１を、図２４に示されたプライマーを用いて以前にWang et al. 2002 に記述されたプラスミドｐＥＴ−ＦＰΔＩＬ−１１のインバースＰＣＲ増幅により突然変異させ、続いてＤｐｎＩ消化によって親のプラスミドを除去した。
【０１２５】
インバースＰＣＲ増幅による突然変異の詳細な記述については、Stemmer, W. P. and Morris, S. K. (1992) Enzymatic inverse PCR: a restriction site independent, single-fragment method for high-efficiency, site-directed mutagenesis. Biotechniques 13,214-220を参照すること。なおその内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２６】
プラスミドｐＥＴ−ＦＰΔＩＬ−１１の構築のためには、Wang, X. M., Wilkin, J. M., Boisteau, O., Harmegnies, D., Blanc, C., Vandenbussche, P., Montero-Julian, F. A., Jacques, Y. and Content, J. (2002) Engineering and use of 32P-labelled human recombinant interleukin-11 for receptor binding studies. Eur. J. Biochem. 269,61-68を参照すること。なおその内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２７】
Wang et al. 2002に従って、図１６Ａの配列番号６９に示したヒトＩＬ−１１の連結されたＣＤＳの最初の３１個のアミノ酸をコードするＮ末端ヌクレオチドを欠失させ（最初の２１のシグナルペプチドアミノ酸＋それに続くプロリンリッチ領域に対応する１０個のアミノ酸）、フラグタグ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）およびそれに続く、ウシ心蔵キナーゼが認識してセリン残基をリン酸化することができるコンセンサスアミノ酸配列（Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ）をコードする配列により置換したことに注意されたい。したがって、ＦＰΔＩＬ−１１は次の配列（上部のイタリック体のヌクレオチド列＝ヒトＩＬ−１１の連結されたＣＤＳ配列配列番号６９；その下のヌクレオチド列＝ＦＰΔＩＬ−１１；下部のアミノ酸列＝ＦＰΔＩＬ−１１タンパク質）を有する：
【０１２８】
【表４】
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【０１２９】
ＦＰΔＩＬ−１１のフラグタグをボックスに入れ；ＦＰΔＩＬ−１１中に作られたウシ心臓タンパク質キナーゼ触媒サブユニットによって認識されるリン酸化部位に下線を引く。
【０１３０】
従って、突然変異していない親のＦＰΔＩＬ−１１のヌクレオチド配列が図２２に示す配列番号７７の配列であり、またそのアミノ酸配列が配列番号７８の配列である。
【０１３１】
また、本発明に従って突然変異されたＦＰΔＩＬ−１１のヌクレオチド配列が、図２３に示す配列番号７９の配列であり、またこの突然変異されたＦＰΔＩＬ−１１のアミノ酸タンパク質配列が、配列番号８０の配列である。
【０１３２】
ゲル精製したＰＣＲ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて終夜１６℃でライゲーションし、次にこれを用いてE. coli ＤＨ５αを形質転換した。ＤＨ５α中で対応するプラスミドを増幅して配列決定し、次にこれを用いてE. coliのＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を形質転換した。
【０１３３】
親および突然変異体のＦＰΔＩＬ−１１の生成および精製
突然変異体のまたは親のＦＰΔＩＬ−１１  ｃＤＮＡを保持しているプラスミドにより形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、１００μg/mlのアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で培養した。組換えタンパク質の発現を、１mMのＩＰＴＧにより２時間３７℃で誘導した。
【０１３４】
E. coliを次に、５０ｍM  Ｈｅｐｅｓ  pH７．４中、０．１％トリトンＸ−１００および１５０μg/mlリゾチーム存在下で、３０分間３７℃のインキュベーション、およびその後のマイクロプローブ（Vibra Cell, Sonics Materials Inc. Danburg, Connecticut, USA）を用いた強度レベル５での５分間の超音波処理により溶解した。溶解物を１３,０００ｇ２５分間４℃で２回遠心し、次に以前に記述したように分析または精製した［上に引用したWang et al. 2002；参照により組み入れられる］。簡潔に述べれば、溶解物を６０％（ＮＨ４）２ＳＯ４で沈殿させて粗タンパク質を濃縮した。５０mM  Ｈｅｐｅｓ  pH７．４緩衝液に対して透析して塩を除去し、続いて５０mM  Ｈｅｐｅｓ緩衝液pH７．４および０〜１MのＮａＣｌ勾配を用いたＭｏｎｏ−Ｓ  ＨＲ５／５カラム（Amersham Pharmacia Biotech）によるクロマトグラフィーを行って試料を精製した。
【０１３５】
親および突然変異体ＦＰΔＩＬ−１１のＥＬＩＳＡによる定量化
ヒトＩＬ−１１に対して生成された２つの抗体、中和しないモノクローナル抗体ＭＡＢ６１８およびビオチン化ポリクローナルＢＡＦ２１８を、組換えヒト親およびムテインのサンドイッチエリザ法による定量化に用いた。９６ウエルプレートを、終夜４℃で１００μlの２μg/ml濃度のモノクローナル抗体ＭＡＢ６１８によりコートした。３％ＢＳＡでブロック後、１００μlの段階希釈試料を加え、１時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液（０．１％トゥイーン２０を含むＰＢＳ緩衝液）で洗浄後、プレートをさらに１時間３７℃で１００μl/ウエルの３０ng/ml濃度のビオチン化ポリクローナル抗体ＢＡＦ２１８とインキュベーションした。ストレプトアビジンを連結させたアルカリ性フォスファターゼ（１／５０００）と３７℃で１時間もう１回インキュベーションする前に、プレートをＴＢＳ緩衝液（１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、１５０mM  ＮａＣＩ（pH７．５））で３回洗浄した。最後に、ＥＬＩＳＡ増幅システム（Gibco BRL）を用いて、そのテストを明らかにした。市販の組換えＩＬ−１１を標準として用いた。感度は２ｐg/mlであった。
【０１３６】
質量分析
ＦＰΔＩＬ−１１およびムテインの正確な分子量を、ナノ−エレクトロスプレー質量分析法により、ハイブリッド四極子飛行時間型Ｑ−ＴＯＦ質量分析計（Micromass, Whytenshawe, UK）を用いて決定した。解析に先立って、１０kDaのカットオフを持つＶｉｖａｓｐｉｎ微小濃縮装置（Millipore, Bedford, MA）を用いて、試料を脱塩した。水で２回洗浄した後に、試料を５０％アセトニトリルおよび０．１％ギ酸水溶液の混合液に溶解し、およそ５pmol/μlの濃度とした。この試料４μlを、ナノ・エレクトロスプレーキャピラリー（MDS Proteomics, Odense, D）に入れ、次にこの装置と共に供給された特別のホルダーに設置した。ニードル・チップをわずかに破壊し、小さな窒素の逆圧を加えることにより、スプレーを開始した。キャピラリー電圧を１２５０Ｖに設定した。ｍ／Ｚ１０００〜２５００、１走査当たり１秒でデータを集め、約５分間スペクトルを蓄積した。データ処理を、装置と共に供給されたＭａｓｓｌｙｎｘおよびＭａｘＥｎｔソフトウェアを用いて行なった。
【０１３７】
赤外分光法
ＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを、室温で液体窒素冷却された水銀カドミウムテルル（ＭＣＴ）検知器を装備したＢｒｕｋｅｒ  ＩＦＳ５５  ＦＴＩＲ分光光度計により、名目上２CM-1の分解能で記録し、１cm-1ごとにコード化した。内部反射エレメント（ＩＲＥ）は、４５°の開口角を有するゲルマニウム・プレート（５０×２０×２mm）であり、２５の内部反射を産み出した。分光光度計を、ＦＴＩＲパージガスジェネレーター７５−６２  Ｂａｌｓｔｏｎ（（Maidstone, England）を用いて乾燥させた空気により、試料区画において１０〜２０l/分、および光学区画において５l/分の流量で連続的に浄化した。試料を窒素気流下で徐々に蒸発させることにより、薄膜がＡＴＲプレートの一側面に得られた［Fringeli and Gunthard (1981). Infrared membrane spectroscopy. Mol. Biol. Biochem. Biophys. 31,270-332、参照により本明細書にその内容が組み入れられる］。その後、ＡＴＲプレートを液体試料ホルダー中に密閉した。２Ｈ２Ｏを飽和させたＮ２を室温で吹きかけることによりＡＴＲプレート上の試料を再水和した。各測定に対して２５６の走査を平均した。二次構造決定を、二次構造に敏感なアミドＩバンド（１６００〜１７００cm-1）の形状に基づいて行った［Goormaghtigh et al. (1990). Secondary structure and dosage of soluble and membrane proteins by attenuated total reflection Fourier-transform infrared spectroscopy on hydrated films. Eur.J.Biochem.193, 409-420、この内容は、参照により本明細書に組み入れられる］。
【０１３８】
水素／重水素交換キネティクス：窒素を、一連の３個の２Ｈ２Ｏを含むバイアル瓶に泡立てて吹き込むことにより２Ｈ２０で飽和した。重水素化を始める前に、試料の１０個のスペクトルを記録して測定値の安定性をテストした。ゼロ時間に、１００ml/分の流量（Ｂｒｏｏｋｓ流量計によって制御した）で、２Ｈ２Ｏ飽和したＮ２流束を試料に連結した。個々のキネティクス時間点に対して、２４の走査を記録し、４cm-1の分解能で平均した。すべてのキネティクスのスペクトルを大気からの吸水および側鎖の寄与について補正した。大気からの水の減算は、減算係数を、試料スペクトルと基準の大気中水スペクトルとの、１５７９〜１５７２cm-1の大気中水バンドの比率［４５〜４９］として計算する自作ソフトウェアにより、自動的に行った。δ（Ｎ−Ｈ）振動に特徴的であるアミドIIの面積を、１５９６〜１５０２cm-1間の積分により得た。各スペクトルについて、アミドIIの面積を対応するアミドＩν（Ｃ＝Ｏ）面積で割算した。百分率で表したこの比率を重水素化時間に対してプロットした。１００％値は重水素化前に得られたアミドII／アミドＩ比で定義される。０％値はアミドII領域におけるゼロ吸収に対応し、タンパク質の完全な重水素化に対して観察される。
【０１３９】
円偏光二色性
ＣＤ測定を、温度制御装置を装備し、Chen and Yang［Chen and Yang (1977). Two-point calibration of circular dichrometer with d-10-camphorsulfonic acid. Anal. Lett. 10,1195-1207、その内容は参照により本明細書に組み込まれる］により較正したＪａｓｃｏ  Ｊ−７２０分光旋光計（日本分光株式会社、Tokyo, Japan）を用いて行なった。スペクトルバンド幅は、それぞれ２nm（＜２５０nm）および１nm（＞２５０nm）であった。測定を温度２０℃で実行し、溶媒はすべてＰＢＳであった。時定数は１〜４sであり、またセル光路長は０．１〜１０mmであった。
【０１４０】
ＦＰΔＩＬ−１１およびそのムテインのラベル
ＦＰΔＩＬ−１１およびＨ／Ｖ−Ｄ／Ａを、ウシ心臓キナーゼ存在下の［γ−３２Ｐ］ＡＴＰによるタンパク質リン酸化により、ラベルした。またリン酸化を、前述のオートラジオグラフィーにより、確認した［Wang et al. (2002)；上に引用、参照により組み入れられる］。
【０１４１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを前述のように実行した［Laemmli (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685。参照により、その内容は本明細書に組み入れられる］。ムテインおよび親のＦＰΔＩＬ−１１を、ゲルからニトロセルロース膜に転写し、ビオチン化ヤギ・ポリクローナル抗体ＢＡＦ２１８（R&D）と、次にストレプトアビジン結合アルカリフォスファターゼとインキュベートして検出し、最後にＮＢＴ／ＢＣＩＰシステム（Sigma）によって明らかにした。あるいは、タンパク質をビオチン化抗−フラグ抗体（SigmaからのＭ２抗体）を用いて検出した。
【０１４２】
３２Ｐ−Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａの細胞への結合
３２Ｐ−Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａの７ＴＤ１細胞への結合を、親の３２Ｐ−ＦＰΔＩＬ−ｌｌのＢ１３Ｒαｌ細胞への結合についてのWangらの記述に従って実施した［Wang et al. (2002)、上に引用、参照により組み入れられる］。７ＴＤ１細胞（５×１０５）を成長因子を欠く培地中で予め２時間インキュベートし、リン酸緩衝食塩水pH７．４（ＰＢＳ）で３回洗浄した。結合の研究のために、放射性ラベルされたＨ／Ｖ−Ｄ／Ａを０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中の指定した濃度の細胞へ加えた。混合物を４℃で適当な時間インキュベートし、結合した放射性ラベルＨ／Ｖ−Ｄ／Ａを、４０％フタル酸ジオクチルおよび６０％フタル酸ジブチル（Janssen Chimica, Beerse, Belgium）混合液の０．２mlの層を通過して３０００ｇ、１分間遠心分離することにより、フリーの放射能から分離した。急速凍結の後、細胞沈殿を含む各チューブの先端を切り離し、Ｂｅｃｋｍａｎ  β−カウンターによって放射能をカウントした。非特異的結合を、２００倍モル過剰のラベルされていないＨ／Ｖ−Ｄ／Ａの存在下で、細胞を放射性ラベルされたＨ／Ｖ−Ｄ／Ａとインキュベートすることにより、測定した。
【０１４３】
表面プラズモン共鳴研究
これらの実験をＢｉａＣｏｒｅ  ２０００光学バイオセンサー（BiaCore, Uppsala, Sweden）を用いて行なった。ヒトのＩＬ−１１ＲとＩＬ−２の融合タンパク質（ＩＬ−１１Ｒ−ＩＬ−２）［Blanc et al. (2000). Monoclonal antibodies against the human interleukin-11 receptor alpha- chain (IL-llRalpha) and their use in studies of human mononuclear cells. J. Immunol. Methods 241,43-59、参照により、その内容は本明細書に組み入れられる］を、第一アミノ基によりカルボキシメチルデキストラン・フローセル（ＣＭ５）に、速度論的結合研究に適した低い固定化レベル（１つのフロー・セル当たり約５００ＲＵ）で、結合させた。続いて親のＦＰΔＩＬ−１１またはムテインの結合を、Ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水（pH７．４）中で１０μl/分の流量、室温で実施した。
【０１４４】
ＩＬ−１１  バイオアッセイ
ＩＬ−１１活性を、７ＴＤ１細胞を用いて測定した。２×１０３細胞／ウエルを平底９６ウエルのマイクロタイタープレートで７日間、精製されたムテインまたは親のＦＰΔＩＬ−１１の段階希釈物、あるいは予め同じタンパク質濃度に調節された種々のムテインを含むE. coli粗溶解物の存在下で、培養した。次に各ウエル中の菌体数を、ヘキソサミニダーゼ比色測定法により測定した［Van Snick et al. (1986). Purification and NH2-terminal amino acid sequence of a T-cell-derived lymphokine with growth factor activity for B-cells hybridomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 9679-9683、参照によりその内容は本明細書に組み入れられる］。生物活性を同様に、１×１０４Ｂ９細胞／ウエルについて約３日間測定し、ＸＴＴ比色測定法によって明らかにした。各試料を、標準として市販の組換えヒトＩＬ−１１（PeproTechより）を用いて、３重にテストした。
【０１４５】
結果
Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａ  ムテインの発現、精製および最初の特性決定
ＦＰΔＩＬ−１１をヒトＩＬ−１１の親分子として用いて、突然変異生成によりＩＬ−１１ムテインを生成した。その理由は、ｉ）野生型ヒト組換えＩＬ−１１と同じ活性を有すること、ii）フラグタグ（Ｆ）、リン酸化部位（Ｐ）の存在およびＩＬ−１１の最初の１０のアミノ酸の欠如（Δ）により、ＩＬ−１１の強い発現、単純な精製および容易な放射性ラベルが可能になること［Wang et al.(2002)、上に引用］である。
【０１４６】
Ｈ１８２およびＤ１８６残基の生物活性およびレセプター結合に関する関与を評価するために、インバースＰＣＲ法を用いる部位特異的突然変異誘発により対応する位置を置換した［上に引用したStemmer and Morris (1992)。参照により組み入れられる］。これらの２個の残基を、バリン（Ｈ１８２／Ｖ）およびアラニン（Ｄ１８６／Ａ）と置換して、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａと名付けたムテインを生成した。
【０１４７】
これらの親および突然変異体ＦＰΔＩＬ−１１のE. coli中における発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した（図２６）。親の分子は、見かけ上約２４kDaの分子量を有し、理論上予期される値（２０．０５０kDa）より高い値であった。この相違は、ＦＰΔＩＬ−１１のＮ末端のフラグタグおよびリン酸化部位に存在する多数の荷電残基（１個のＧｌｕ、５個のＡｓｐ、２個のＡｒｇおよび２個のＬｙｓ）の導入による可能性があった。確かに、ＦＰΔＩＬ−１１の２個の荷電残基Ｈ１８２およびＤ１８６が２個の疎水性アミノ酸と置換されたとき、生じたムテインは親よりゲル中でより速く移動し、その結果、見かけの分子量（１９kDa）は計算値（１９．９kDa）に近かった。この観察によって、荷電残基がＳＤＳ−ＰＡＧＥ中の分子移動度に影響を及ぼし得るという仮説が強化された。しかし、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａの移動度の減少がタンパク質の切断による可能性を除外するために、精製した親と突然変異体のＦＰΔＩＬ−１１を質量分析に付した。ＦＰΔＩＬ−１１およびＨ／Ｖ−Ｄ／Ａがそれぞれ、２０．０１６kDaおよび１９．９３４kDaの質量を有すると判明し、予測された分子量に完全に合致した。
【０１４８】
たとえＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＨ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインの電気泳動度の増加が、電荷の修飾による可能性が最も高いとしても、それが突然変異生成によって引き起こされた分子構造および／または立体構造の変化に、部分的にはよるものである可能性を、我々は除外することができない。そのような変更が、親の分子よりコンパクトなムテインをもたらし、したがってそれを熱変性に対してより耐性にし、ポリアクリルアミドゲル中でより速く移動するようにした可能性があろう。
【０１４９】
赤外分光法（ＩＲ）および円偏光二色性（ＣＤ）による構造解析
突然変異によって立体構造変化が引き起こされた可能性をさらに評価するために、均質となるよう精製された親およびムテインの、減衰全反射フーリエ変換赤外分光分析（ＡＴＲ−ＦＴＩＲ）による特性決定を行った。この技術は可溶性および膜タンパク質の構造を研究するために用いられ、成功を収めた［Goormaghtigh et al. (1990)、上に引用］。その方法は、タンパク質の振動バンド、詳細にはその吸収振動数が二次構造に依存するアミドＩバンド、ｖ（Ｃ＝Ｏ）の解析に基づいている。図２７が、ＡＴＲ−ＦＴＩＲによるpH７．４で記録した２個のタンパク質の重水素化スペクトルを表わす。それらのスペクトルが似ていることから、２個のアミノ酸（Ｈ１８２とＤ１８６）のそれぞれバリンとアラニンによる置換は、タンパク質の二次構造に検知できる影響を及ぼさないことが示唆される。アミドＩ内の主吸収ピークは、α−へリックス構造に関連した領域に位置しており、この構造が両方のＩＬ−１１（親とムテイン）において優勢であることを裏付ける。
【０１５０】
親と突然変異体のＩＬ−１１をさらにＣＤ解析に付した。この技術がα−へリックス構造により敏感であるという理由による。図２８にそれらのＣＤスペクトルを示す。両方のスペクトルは同じ形状を有しているが、それらの強度は異なる。両タンパク質の遠紫外ＣＤスペクトルによる二次構造解析［Kalai et al. (1997). Analysis of the human interleukin-6/human interleukin-6 receptor binding interface at the amino acid level: proposed mechanism of action. Blood 89,1319-1333。この内容は、参照により本明細書に組み入れられる］は、タンパク質のα−へリックス性を反映しており（親ＩＬ−１１：α−ヘリックス４４．８％、β−シート１４．０％、ターン１５％、残り２６．２％；突然変異体ＩＬ−１１：α−ヘリックス３８．８％、β−シート１７．０％、ターン１５．７％、残り２８．５％）、それは４本のα−へリックス束を持つサイトカインに典型的なものである。ＩＬ−１１ムテインの、親のものと比較して少し低いヘリックス含量は、突然変異されたアミノ酸によって導入された構造変化を反映している可能性があろう。
【０１５１】
ＦＰΔＩＬ−１１の突然変異によって起きた構造変化をさらに特徴づけるために、ムテインおよび親タンパク質の重水素化キネティクスを測定した。可溶性タンパク質では、水素／重水素交換の速度は、本質的に、タンパク質構造安定性と関係する（二次構造中の局所的なアンフォールディング動態が交換を決める）。タンパク質の水素交換速度を、アミドII吸光度ピーク［１５９６〜１５０２cm-1領域におけるδ（Ｎ−Ｈ）の最大値］の重水素化による１４６０cm-1領域「アミドII'、δ（Ｎ−Ｄ）］へのシフトにより起こる減少をモニターすることにより追跡した（データを示さず）。実験の項に記述したようにアミドII／アミドＩの比率から計算した交換されていない残基のパーセンテージの経時変化を図２９に示す。ＦＰΔＩＬ−１１は速い交換をしているが、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインは水素／重水素交換に、より耐性があるように見える。これはムテインがオリゴマーを形成する、および／または、親ＦＰΔＩＬ−１１よりコンパクトな構造を有する可能性があることを示唆している。
【０１５２】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラムによるゲルろ過により、親および突然変異タンパク質が共にモノマー型に対応する類似の位置で溶出された（図３０）。これは、突然変異による部位Ｉの疎水性の増加によって二量体またはオリゴマーの形成が起こることはなかったことを示す。
【０１５３】
可溶性ＩＬ−ｌｌＲαとの相互作用
Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａの突然変異生成および関連する構造変化がＩＬ−ｌＩＲａとの相互作用に影響があるかどうかを明らかにするために、親のＩＬ−１１およびＨ／Ｖ−Ｄ／ＡムテインのヒトＩＬ−１１Ｒαへの結合を記述する結合および解離の反応速度定数（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ）を、デキストランに固定された精製ヒトＩＬ−ｌｌＲａ−ＩＬ−２［Blanc et al. (2000)、上に引用］融合タンパク質をマトリックスして用いる表面プラズモン共鳴バイオセンサー解析により測定した。下の表１に表すように、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａの結合（ｋｏｎ）および解離（ｋｏｆｆ）反応速度定数は共に、親ＦＰΔＩＬ−１１のものよりはるかに高く（それぞれ３５倍および１４倍）、その結果、ムテインの平衡解離定数（Ｋｄ）は、ＦＰΔＩＬ−１１のそれより３倍低くなった。
【０１５４】
【表５】
2007521795.tif 000004
【０１５５】
平衡解離定数を相互作用の自由エネルギー（ΔＧ＝−ＲＴ・ln（１／ＫＤ））によって解釈すれば、ＦＰΔＩＬ−１１またはＨ／Ｖ−Ｄ／ＡのＩＬ−１１Ｒ−ＩＬ−２への結合には、それぞれ９．２または９．８ｋｃａｌ／ｍｏｌの自由エネルギー変化が伴う。これは突然変異生成およびそれが引き起こした構造変化は、ＩＬ−１１のＩＬ−１１Ｒαレセプターとの相互作用に有利であることを示す。
【０１５６】
細胞表面ＩＬ−１１レセプターとの相互作用
Ｂ１３Ｒα１および７ＴＤ１細胞を、Ｈ／Ｖ−Ｄ／ＡのヒトおよびマウスのＩＬ−１１レセプターへの結合を検査するために用いた。Ｂ１３Ｒα１は、ヒトｇｐ１３０およびｈＩＬ−ｌｌＲαによって安定にトランスフェクションされたＢａ／Ｆ３細胞である［Lebeau et al. (1997) Reconstitution of two isoforms of the human interleukin-11 receptor and comparaison of their functional properties. FEBS Lett. 407, 141-147、この内容は、参照により本明細書に組み入れられる］。ラベルされていないＨ／Ｖ−Ｄ／Ａを２００倍モル過剰加えて決定された非特異的結合成分は少なかった（全結合の５％未満）。スキャチャード法による特異的結合データの解析により、単一クラスの結合部位の存在が明らかになった（下の表２を参照）。
【０１５７】
【表６】
2007521795.tif 000005
【０１５８】
おそらく、トランスフェクションされた細胞の表面にｇｐ１３０が過剰に発現されたために、我々はこれらの細胞上に高親和性レセプターのみを検出することができた。ムテインに対する解離定数（Ｋｄ＝０．７nM）は、その親に対する解離定数（Ｋｄ＝０．４nM）より高かった。３２ＰＨ／Ｖ−Ｄ／Ａの結合は過剰のＦＰΔＩＬ−１１によって完全に阻害され、またその逆も成立することが分かり、これは２個の分子が互いに、この結合について競合することを示す。
【０１５９】
７ＴＤ１は、マウス骨髄腫細胞系統Ｓｐ２／０−Ａｇｌ４とＣ５７ＢＬ／６マウス由来の脾臓細胞の融合により得られたマウスハイブリドーマ細胞系統である。この細胞系統がピコグラム量のＩＬ−６に応答することは周知である［Van Snick et al.(1986)、上に引用］、しかしナノグラム量のＩＬ−１１に対する増殖応答も有する［Wang et al. (2002)、上に引用］。
【０１６０】
７ＴＤ１細胞を用いて、３２ＰでラベルされたＨ／Ｖ−Ｄ／ＡまたはＦＰΔＩＬ−１１のレセプターへの結合を解析したとき、２つのクラスの結合部位が観察された（上記の表２を参照）：ナノモル範囲のＫｄを有する低親和性レセプターは、ＩＬ−１１またはムテインの孤立したＩＬ−ｌｌＲα鎖への結合に相当する可能性が高く、またピコモル範囲のＫｄを有する高親和性受容体は、ＩＬ−１１／ＩＬ−ｌｌＲαとｇｐ１３０伝達サブユニットとの集合体に相当する可能性が高い。いずれの型のレセプターも、ラベルされたＦＰΔＩＬ−１１およびＨ／Ｖ−Ｄ／Ａについて同程度の数が検出され、２つの分子が共通のレセプターを競合するという上記の観察に合致した。孤立したＩＬ−１１Ｒα鎖への低親和性結合に関して、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａの親和性（Ｋｄ＝２．７nM）が、バイオセンサー実験（上記の表１を参照のこと）に一致して、ＦＰΔＩＬ−１１について測定された親和性（Ｋｄ＝７．２nM）よりおよそ３倍高いことが分かった。高親和性受容体複合体に関しては、しかしながら、Ｈ／Ｖ−Ｄ／ＡとＦＰΔＩＬ−１１の結合間で相違が見出されなかった（Ｋｄ＝０．６０nM対０．６５nM）。
【０１６１】
細胞増殖の誘導
ムテインのＩＬ−１１Ｒαに対する増加した親和性がどの程度までその生物活性に影響を与えることができるか研究するために、細胞増殖分析を種々の細胞系統で行った。
【０１６２】
図３１Ａに示すように、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインは、ＩＬ−１１と同様に、７ＴＤ１の細胞増殖を用量依存的にサポートする。しかしながら、半最大値の増殖（ＥＣ50）を引き起こすのに必要なムテインの濃度は、野生型ＩＬ−１１に必要なそれよりはるかに低かった（４００倍）。（Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａに対するＥＣ５０＝０．０３ng/ml対ＦＰΔＩＬ−１１およびｒｈＩＬ−１１に対する１５ng/ml）。ムテインのこの活性増大は一貫していくつかの実験で見出され、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａ／ＦＰΔＩＬ−１ｌ活性比が６０〜４００の範囲であった。ゲルろ過実験（図３０Ａおよび３０Ｂ）は、親と突然変異体ＩＬ−１１が凝集の兆候なくモノマー分子（約２０kDaの）として行動したこと、および生物活性は完全にこれらのモノマーに関連していたことを示した。
【０１６３】
７ＴＤ１細胞で見出されたこととは際立って対照的に、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインは、別のマウスのハイブリドーマ細胞系統であるＢ９細胞では１０倍活性が弱かった（図３１Ｂ）。これはＩＬ−１１ムテインの作用機序が予想したよりも複雑であることを示している。
【０１６４】
Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａ活性がｇｐ１３０の伝達によって媒介されるかどうかをチェックするために、我々はＩＬ−１１の部位II中に局在するエピトープと反応することが実証された抗−ＩＬ−１１ｍＡｂ（Ｈ２）を用いた［Blanc et al.(2000)、上に引用］。ｇｐ１３０の動員の邪魔をすることにより、この抗体が、ＦＰΔＩＬ−１１のレセプターへの結合を阻害し、従ってＩＬ−１１依存細胞増殖を阻害する［Ｗａｎｇら（２００２）、上に引用］。図３２は、この中和抗体が親と突然変異体ＦＰΔＩＬ−１１によって誘導された７ＴＤ１細胞の増殖を共に阻害することができることを示す。これは、抗体Ｈ２により認識されるエピトープ（部位II）がＨ／Ｖ−Ｄ／Ａムテイン上に保存されていること、およびＨ／Ｖ−Ｄ／Ａは、親ＩＬ−１１と同様に、その生物活性を発揮するためにｇｐ１３０サブユニットが必要であることを表している。抗ヒトｇｐ１３０抗体、ＭＡＢ６２８およびＢ−Ｒ３は、親または突然変異体ＩＬ−１１によるマウス７ＴＤ１細胞の増殖に影響せず、対照として役立った。これらの２つの抗体がヒト細胞の細胞増殖を阻害することがすでに示されているため［Chevalier et al. (1996). Interleukin-6 family of cytokines induced activation of different functional sites expressed by gp130 transducing protein. J. Biol. Chem. 271, 14764-14772］、これらの結果は、これらの抗体により認識されるヒトｇｐ１３０上のエピトープを、マウスｇｐ１３０は共有していないことも示す。
【０１６５】
Ｈ２抗体の阻害作用を表す用量応答曲線（図３２）を解析したところ、半最大値の抑制（ＩＣ50）を引き起こすために必要なＨ２の濃度は、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインの場合には親のＩＬ−１１より約１０倍低かった。これは、部位ＩにおけるＨ／Ｖ−Ｄ／Ａ突然変異が部位IIの立体構造変化を引き起こし、その結果Ｈ２抗体に対する親和性が増加したことを示す。別の実験が、Ｈ／Ｖ−Ｄ／ＡがＩＬ−１１と同様に、ヒトＩＬ−ｌＩＲａおよびヒトｇｐ１３０を共トランスフェクションしたＢａ／Ｆ３細胞の増殖を刺激できることを示した。しかしその一方で、ヒトｇｐ１３０のみをトランスフェクションしたＢａ／Ｆ３細胞はどちらの分子にも応答しなかった。したがって、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａは、親ＩＬ−１１と同様にＩＬ−１１Ｒαがなければｇｐ１３０を活性化することができない。
【０１６６】
Ｈ１８２およびＤ１８６のＨ／Ｖ−Ｄ／Ａの特性における相対的な役割
Ｈ１８２とＤ１８６の相対的重要度を研究するために、これらの残基を別々にまたは組合せて突然変異させ、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａに加えて、Ｈ／Ｖ、Ｄ／Ｖ、Ｄ／Ａ、およびＨ／Ｖ−Ｄ／Ｖムテインを生成した。図３３に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析により、すべての組換え型タンパク質が良好に発現されていることが明らかである。Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａに対して以前に観察されたように、全てのムテインが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の見かけの分子量とそれらの予測値の間で系統的な差異を示した。ムテインＤ／ＶおよびＤ／Ａが、ムテインＨ／Ｖより速く移動した。これは負に帯電した残基（Ｄ）はゲル中の分子移動度に、正に帯電した残基（Ｈ）より多くの影響を及ぼしたことを示唆する。Ｄ／ＶとＤ／Ａの間の移動度の違いはさらに、電荷が移動度の変化に含まれる唯一の因子ではないことを示した。これは、電荷以外に、突然変異に起因する分子のＳＤＳ抵抗性の構造変化もまた、移動度変化に寄与する可能性がある、という我々の以前の仮説を強化する。２つの二重ムテインＨ／Ｖ−Ｄ／ＶおよびＨ／Ｖ−Ｄ／Ａは類似していて、単一ムテインより高い移動度を有していた。これは２つの突然変異の累積効果を示している。
【０１６７】
７ＴＤ１細胞を、様々なＦＰΔＩＬ−１１ムテインの生物活性を測定するために用いた（図３４）。Ｄ／Ａのみの突然変異が、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａの組合せよりもさらに強い、強力な活性の増大をもたらしたようである。Ｄ／Ｖ突然変異もまた活性の増大をもたらしたが、Ｄ／Ａ突然変異よりもはるかに低い程度あった。対照的に、Ｈ／Ｖ突然変異は、常に生物活性の僅かな減少に帰着した：Ｈ／Ｖ、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ｖ、およびＨ／Ｖ−Ｄ／Ａはそれぞれ、野生型、Ｄ／Ｖ、およびＤ／Ａより活性が低かった。
【０１６８】
これらの結果は、Ｄ１８６が部位Ｉの鍵となるアミノ酸であって、ＩＬ−１１の活性に本質的な役割を果たすことを示唆する。注目すべきは、Ｄ１８６をアラニンの代わりにバリンで置換すると、はるかに低い活性の増大がもたらされたが、これは疎水性に加えて位置１８６の側鎖のサイズがこの活性の増強に重要であることを示唆する。Ｈ１８２残基も部位Ｉにおける相互作用に関係しているがしかし役割は小さいようである。
【０１６９】
考察
この研究の目的は、特異的なレセプター鎖（ＩＬ−１１Ｒα）への結合を担う領域（部位Ｉ）内に位置するアミノ酸を変化させることにより、強力なヒトＩＬ−１１アゴニストを作成することであった。ＩＬ−１１のモデル（図２５）を、関連するサイトカインＩＬ−６、ＣＮＴＦおよびＬＩＦの公知のレセプター相互作用部位に基づいたホモロジー考察により構築した［Jacques et al. (1998). The interleukin-11/receptor complex: rational design of agonists/antagonists and immunoassy as potentially useful in human therapy. Res. Immunol. 149,737-740、この内容は参照により本明細書に組み入れられる］。突然変異生成実験に支持されて、モデルは、水素結合および塩橋の形成により相互作用の特異性を保証する周囲の極性残基または荷電残基の骨格によって保護された、少数の無極性側鎖の疎水性相互作用が、レセプターリガンド結合の主要なエネルギーを提供する、と予測する［Kalai et al.(1997)、上に引用］。したがって、ＩＬ−１１とα−レセプターサブユニットとの相互作用を増強するために、我々は部位Ｉの疎水性クラスタの中央にある２個の荷電アミノ酸残基Ｈ１８２およびＤ１８６を、２個の疎水性残基により置換した。我々は、部位Ｉの表面の疎水性を局所的に増加させることが分子の四次構造に影響を及ぼす可能性があると予想した：突然変異生成によって生成された推定上の大きな疎水的相互作用領域が、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａがオリゴマーを形成するために好都合である可能性がある。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５クロマトグラフィーが、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａが実際に、可溶性で機能的なモノマータンパク質として発現されたことを証拠づけた。しかし、赤外の水素／重水素交換キネティクスがＨ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインが１Ｈ／２Ｈ交換に対してより耐性があることを示し、これはムテインが親のＦＰΔＩＬ−１１よりコンパクトな構造を有する可能性があることを示唆した。赤外１Ｈ／２Ｈキネティクス研究では、実験のためにタンパク質がフィルム中で濃縮されたため、実際は、より高いタンパク質濃度で記録された。したがって付加的な相互作用が赤外実験に存在することが考えられる。それでも、Ｈ／Ｖ―Ｄ／Ａ突然変異体で見出されたそのような新しく、より疎水性の領域を包含する局所相互作用によっては、残基のほとんど４０％がより遅い交換を行うという図２９に報告した大きな効果を説明することができず、またそのような差は二次構造の小さな差を考慮したのでは説明できなかった。他方で、突然変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのより速い移動度から、よりコンパクトな構造が導かれ、これはより遅い赤外ｌＨ／２Ｈ交換、およびＣＤのデータと良く一致する。
【０１７０】
Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインの結合特性の解析によって、Ｄヘリックスの終端の残基がＩＬ−１１Ｒαの認識およびこれとの相互作用に、関係していることが確認された。実際に、バイオセンサーによる研究によって、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａ突然変異が、単離したＩＬ−ｌｌＲａ鎖との結合のパラメーターの変更に関係していることが示された。結合定数と解離定数が共に著しく増加した。これは、部位Ｉにおけるサイトカイン・レセプター相互作用に含まれる分子結合の性質が強く修飾されたことを示している。これらの変化にもかかわらず、ＩＬ−１１Ｒαに対するムテインの結合親和性は、親のＩＬ−１１のそれより３倍高いだけであった。細胞表面レセプターの平衡研究によって、この３倍の親和性の増加が確認され、さらに高親和性ＩＬ−ｌｌＲａ／ｇｐ１３０複合体については、ムテインおよび野生型のＩＬ−１１が同程度の親和性を表すことが示された。
【０１７１】
野生型ＩＬ−１１と比較したＨ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインの相対的な生物活性は、２つの分子間の親和性の差との間に相関がなかった。確かに、７ＴＤ１マウスハイブリドーマ細胞系統においては、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａは相当程度（４００倍まで）増大した活性を有していたが、別のマウスハイブリドーマ細胞系統（Ｂ９）においては、その生物活性は約１０倍低くなった。そのような変動は、別のマウスプラズマ細胞腫細胞系統（Ｔ１０）においては、アラニンによるＤ１８６の置換（Ｄ／Ａムテイン）が、サイトカインの活性を野生型より５００倍弱くしたことを示す従来の研究に一致している［上に引用した Czupryn et al.(1995), Ann. New York Acad. Sci. 762,152-16、参照により本明細書に組み入れられる］。
【０１７２】
何がＨ／Ｖ−Ｄ／Ａを、７ＴＤ１細胞においてより活性を高くするのであろうか。７ＴＤ１細胞はＩＬ−６に強く応答しているので、そのような高いＨ／Ｖ−Ｄ／Ａ生物活性は、ＩＬ−６Ｒαを介した信号伝達による刺激に起因する可能性がある。親のＦＰΔＩＬ−１１が、７ＴＤ１細胞への高親和性結合について、３２ＰラベルされたＨ／Ｖ−Ｄ／Ａと完全に競合することがこの研究で明らかになり、またこの放射性ラベルされたタンパク質のＩＬ−６Ｒαへの結合がＲＩＡ分析によって検出できなかったため、この仮説を論駁することができる。Ｈ／Ｖ−Ｄ／ＡによるマウスＩＬ−６の誘導は、我々が、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａの７ＴＤ１に対する生物活性がＩＬ−６中和抗体存在下で変更されなかったことを見出したため、除外することができる。したがって、発現が細胞系統に依存する別の因子が、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインの増強された活性の原因であることを仮定しなければならない。そのような因子は、機能的なＩＬ−１１レセプターの構造に関与しているもう一つの未知のレセプター鎖である可能性がある。ＩＬ−１１リガンドレセプター複合体の化学量論はいまだに未解決問題であり、ｇｐ１３０とは異なる伝達サブユニットが、ＩＬ−１１を介するシグナル伝達に参加している可能性がある。この未知のサブユニットの有力な候補は、最近同定され、活性化された単球上で主に発現されることが見出された、ｇｐ１３０様レセプター（ＧＬＭ−Ｒ）である［Ghilardi et al. (2002). A novel type I cytokine receptor is expressed on monocytes, signals proliferation, and activates STAT-3 and STAT-5. J. Biol. Chem. 277,16831-16836、この内容は参照により本明細書に組み入れられる］。このレセプターは、増殖信号を伝達して、転写因子ＳＴＡＴ−３およびＳＴＡＴ−５の活性化を引き起こすことができる。まだそのリガンドは同定されていないが、ＧＬＭ−Ｒは「それ自身」がＩＬ−１１のレセプターであると分かったわけではなかった。
【０１７３】
そのような仮説（ｇｐ１３０とｇｐ１３０様レセプターとのヘテロ複合体）の枠のなかで、突然変異誘発によって引き起こされた構造変化により、ムテインＨ／Ｖ−Ｄ／Ａが野生型ＩＬ−１１よりも、この未知のｇｐ１３０様因子を動員および／または活性化しやすいようになったと仮定することができる可能性がある。７ＴＤ１細胞に関する我々の研究は、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａおよび野生型ＩＬ−１１が同程度の高親和性結合をすることを示したので、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａのより高い活性は、より高いシグナル伝達効率と関係しているのであろう。したがってｇｐ１３０様因子をｇｐ１３０よりも多く発現する細胞（７ＴＤ１のような）上では、ムテインはより活性が強いであろう、そして反対に、ｇｐ１３０をｇｐ１３０様因子より多く発現する細胞（Ｂ９またはＴ１０のような）上では、ムテインは活性がより弱いであろう。中和抗体阻害実験により、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａの部位IIは、抗体Ｈ２結合に関連して立体構造が修飾されたが、機能的なままであることが示された。部位IIのそのような修飾は、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａによってｇｐ１３０の代わりにｇｐ１３０様分子が動員される結果となる可能性がある。あるいは、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａの部位IIはやはりｇｐ１３０の動員に関与し、部位IIIがｇｐ１３０様因子の動員に関与することも考えられる。
【０１７４】
結論として、我々は７ＴＤ１細胞上のＩＬ−ｌｌＲαに対する増大した親和性および強く増強された活性を有する新規なｈＩＬ−１１ムテインを生成した。したがって、これらのムテインは、ＩＬ−１１が有益であることが示された病状に役立つ可能性のあるアゴニスト分子を構成する。さらに、それはＩＬ−１１レセプターの構造と機能の詳細をさらに解明することを目指す研究にとって価値のある分子であるに違いない。
【０１７５】
実施例２：
インビボにおける放射線防護
マウス
生後８〜１２週のＣ５７Ｂ１／６オス・マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Chatillon sur Chalaronne, France）から購入した。マウスをＮａｎｔｅｓ（France）における、ＩＮＳＥＲＭ  Ｕ４６３の動物中核施設に収容した。この施設はPrefecture of the French Department of Loire-Atlantiqueが承認し、フランス獣医局の規制および基準に従って維持されている。
【０１７６】
放射線およびＩＬ−１１処置
６０Ｃｏ源を操作してＴｅｒａｔｒｏｎ  ７８０（Atomic Energy of Canada limited, Canada）により全身照射を行った。線量率は１．５Ｇｙ／分であった。ヒト組み換えＦＰΔＩL−１１およびＨ／Ｖ−Ｄ／Ａタンパク質（Jean Content, Institut Pasteur, Bruxelles, Belgiumによって合成された）を０．２％のゼラチンを含む無菌のＰＢＳに溶解し、眼窩後静脈内注入により８００ngを照射前３０分ならびに照射後５、６０および１２０分に、与えた。
【０１７７】
生存率の研究
終点での生存率を、プロダクトリミットカプラン・マイヤー法を用いて、処理の時から死亡まで計算した。プロダクトリミットカプラン・マイヤー生存曲線の差を、打ち切りデータのためのマンテルのログランク検定により評価した。統計解析をスチューデントのｔ−テストにより行なった。
【０１７８】
結果
放射線治療医が患者の腹部照射に際して遭遇する大問題の１つは、胃腸管の大きな放射線感受性である。腹部の局部照射は腸の絨毛の破壊をもたらし、患者の脱水、敗血症性ショック、およびそれに続く死亡を引き起こす結果となる。この病状は胃腸症候群（ＧＩ症候群）として知られている。腸陰窩に存在する幹細胞の死が上皮細胞の再生を阻止して絨毛の壊死を引き起こすことが、ずっと以前から証明されている（Potten CS, Merritt A, Hickman J, Hall P, Faranda A: Characterization of radiation-induced apoptosis in the small intestine and its biological implications. Int. J. Radiat. Biol. 65: 71-8.1994）。
【０１７９】
マウスにおいて、我々は１回の１５Gyの線量が腸粘膜の完全な破壊およびそれに続く動物の死を引き起こすことを観察した（Paris F, Fuks Z, Kang A, Capodieci P, Juan G, Ehleiter D, Haimovitz-Friedman A, Cordon-Cardo C, Kolesnick R: Endothelial apoptosis as the primary lesion initiating intestinal radiation damage in mice. Science. 293: 293-7., 2001）。
【０１８０】
したがって我々は、ＦＰΔＩＬ−１１（上記実施例１に記述された）の、γ−線に曝露されて致命的な照射を受けたＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスにおける治療能力を評価し、ＦＰΔＩＬ−１１が動物の死を遅らせることを見出した（ＦＰΔＩＬ−１１によって予め処理されてから１５Ｇｙの照射を受けたマウスの死亡中央値８日に対し、担体のみで処理された後に照射されたマウスの５日間）。結果を図２１に図示する。
【０１８１】
同一の実験条件で、我々は、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインの治療活性を評価した。ＦＰΔＩＬ−１１に使用した用量と比較して１０倍低い用量のＨ／Ｖ−Ｄ／Ａ（全量０．３２μg対３．２μg）による前処理が同一の効果で死亡を遅延させる（８日の死亡中央値）。結果を図２２に図示する。この低用量のＦＰΔＩＬ−１１（０．３２μg）による前処理は、１５Ｇｙで照射された動物の調査では極めて僅かの効果しか有しなかった。
【０１８２】
これらの実験は、本発明のＨ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインが、野生型ＩＬ−１１と比較して機能の増大をもたらし、放射線曝露後の小腸保護を改善したことを示す。
【０１８３】
実施例３
結果の比較［単一点突然変異対二重点突然変異］
血清中のＨ／Ｖ−Ｄ／Ａ  ｈＩＬ−１１ムテインの定量化
Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａ  ＩＬ−１１ムテインを、１５Ｇｙ照射の３０分前、５分、１時間、および２時間後にマウスの眼窩後に注入する。
【０１８４】
第一段階で、我々は眼窩後の注入後に血液中に存在するＨ／Ｖ−Ｄ／Ａ  ＩＬ−１１の量を測定する。
【０１８５】
その目的のために、ＥＬＩＳＡ免疫測定を、８００ngのムテイン注入３０分後に採取した血清中のＨ／Ｖ−Ｄ／Ａ  ＩＬ−１１を測定するように設計する。
【０１８６】
９６ウエルプレートを抗ヒトＩＬ−１１抗体（R&D SystemsからＡＦ−２１８−ＮＡと指定して入手可能なポリクローンヤギＩｇＧ）で予めコートした。その後組換えＨ／Ｖ−Ｄ／Ａ  ＩＬ−１１ムテインを含む標準、または血清を適当なマイクロタイタープレートのウエルに加えてインキュベーションする。
【０１８７】
洗浄して、試料中の結合していないＩＬ−１１および試料の他の成分を除去した後、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａ  ＩＬ−１１ムテインのフラグタグに対する抗−フラグ抗体（Ｍ２、Sigma）およびＭ２抗体に対するビオチン結合ポリクローナル抗体を加えてインキュベーションする。ＩＬ−１１は、もし存在すれば、予めウエル上にコートされた抗体に結合し、それによって固定化され、その後ビオチン結合抗体により「サンドイッチ」される。
【０１８８】
試料中に存在するＩＬ−１１の量を定量的に測定するために、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させたアビジンを各マイクロプレートウエルに加えてインキュベーションする。酵素基質反応を、硫酸溶液を加えて終了させ、カラー変化を分光測光法により波長４５０nmで測定する。
【０１８９】
このＥＬＩＳＡ免疫測定により、我々は血清中のＨ／Ｖ−Ｄ／Ａ  ＩＬ−１１を２．２nMのモル濃度で検出する。これは血液１ml当たり３．３ngのＨ／Ｖ−Ｄ／Ａ  ｈＩＬ−１１濃度を表わす（マウス中の血液の体積は約５mlであり；また、我々はマウスに８００ngのＨ／Ｖ−Ｄ／Ａ  ｈＩＬ−１１（即ち１６０ng／mlの血液）を注入した。）。
【０１９０】
我々のデータは、注入３０分後に２％のムテインが血液中を循環していることを示している。残りは分解されたか、または細胞レセプターに結合した。
【０１９１】
Ｄ／Ａムテインの効力
単一点Ｄ／Ａ突然変異ｈＩＬ−１１ムテインを、Czupryn et al.1995（上に引用）の教示に従って生成し、野生型ＦＰΔＩＬ−１１タンパク質および本発明の二重点突然変異Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａ  ｈＩＬ−１１ムテインと：
−  第１にインビトロでの７ＴＤ１細胞における増殖誘導解析によって、および
−  第２にインビボでの動物の小腸放射線防護および死亡の研究により、
比較した。
【０１９２】
増殖測定は、２×１０３の細胞濃度の７ＴＤ１細胞を、平底９０ウエルプレート中において、野生型ＦＰΔＩＬ−１１またはそのムテインの存在用量を増加させてインキュベーションすることにより行う。７日後に、生存している細胞数をヘキソサミダーゼに対する比色定量法により測定した。
【０１９３】
我々はＤ／ＡおよびＨ／Ｖ−Ｄ／Ａ  ｈＩＬ−１１が細胞増殖に対して同等の用量応答を有しており、一方で野生型組換えＩＬ−１１はそれより弱い活性であることを見出した（図３５参照）。
【０１９４】
１５Ｇｙの照射後にＤ／Ａ  ＩＬ−１１ムテインを眼窩後に注入したマウスの生存率を解析し、野生型のＦＰΔＩＬ−１１および本発明のＨ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインを注入したマウスの生存率と比較する（図３６参照）。
【０１９５】
生後８〜１２週のオスC５７B１／６マウスに、６０Ｃｏ源を操作してＴｅｒａｔｒｏｎ  ７８０（Atomic Energy of Canada limited, Canada）により全身照射を行う。線量率は１．５Ｇｙ／分である。ヒト組換えＦＰΔＩ１−１１、Ｄ／ＡおよびＨ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインを０．２％ゼラチンを含む無菌ＰＢＳに溶解し、眼窩後静脈内に８００ngを、照射前３０分、照射後５、６０および１２０分に注入して与える。
【０１９６】
終点での生存率を、処理の時間から死亡まで、プロダクトリミットカプラン・マイヤー法を用いて計算する。プロダクトリミットカプラン・マイヤー生存曲線の差を、打ち切りデータのためのマンテルのログランク検定により評価する。統計解析をスチューデントのｔ−テストにより行なう。同じ実験条件において、我々は本発明のＨ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインの治療活性をＤ／Ａムテインと比較して評価した。
【０１９７】
我々は既に、ＦＰΔＩＬ−１１に用いる用量と比較して１０倍低用量のＨ／Ｖ−Ｄ／Ａによる前処理（全量０．３２μg対３．２μg）が、死亡を同一のイソ効果で遅延させる（死亡中央値８日）ことを証明した；上記実施例２を参照のこと。
【０１９８】
同じ実験条件で、Ｈ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインの０．３２μgの注入がマウスの死を遅らせるが、しかしＤ／Ａムテインの同用量の注入ではそうでない。０．３２μgを注入され１５Ｇｙで照射されたマウスは、同じ低用量の野生型ＦＰΔＩＬ−１１を注入され同じ線量で照射されたマウスと同じイソ効果で速く死亡した。
【０１９９】
これらの実験は、本発明のＨ／Ｖ−Ｄ／Ａムテインは、野生型ＩＬ−１１と比較して機能の増大をもたらし放射線曝露の後に小腸保護を改善するとしても、Ｄ／Ａムテインは同じ治療効果をもたらさないことを示す。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】図１は、ＮＣＢＩウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez）からの、ＡＹ２０７４２９アクセッションのエントリーの転載であって、野生型ヒトＩＬ−１１（ｈＩＬ−１１）のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列および特性（それぞれ配列番号７３および配列番号１）を示す。
【図２】図２は、完全な野生型のヒト、マカク、マウスおよびラットＩＬ−１１のアミノ酸配列（配列番号１〜４）を示す。
【図３】図３は、最初の３４個のＮ末端アミノ酸を欠失させた野生型のヒト、マカク、マウス、および、ラットＩＬ−１１のアミノ酸配列（配列番号５〜８）を示す。Ｈ１８２およびＤ１８６に下線が引かれている。
【図４】図４は、３４個のアミノ酸を欠失させた野生型ｈＩＬ−１１から、野生型のＨ１８２およびＤ１８６を疎水性アミノ酸（下線で示す）によって置換することにより導出可能な本発明のｈＩＬ−１１ムテイン（配列番号９〜１３）を示す。
【図５】図５は、最初の２１個のアミノ酸を欠失させた野生型ｈＩＬ−１１から、野生型のＨ１８２およびＤ１８６を疎水性アミノ酸（下線で示す）で置換することにより導出可能な本発明のｈＩＬ−１１ムテイン（配列番号１４〜１８）を示す。
【図６】図６は、完全な野生型のｈＩＬ−１１から、野生型のＨ１８２およびＤ１８６を疎水性アミノ酸（下線で示す）で置換することにより導出可能な本発明のｈＩＬ−１１ムテイン（配列番号１９〜２３）を示す。
【図７】図７は、３４個のアミノ酸を欠失させた野生型マカクＩＬ−１１から、野生型のＨ１８２およびＤ１８６を疎水性アミノ酸で置換することにより導出可能な本発明のＩＬ−１１ムテイン（配列番号２４〜２８）を示す。
【図８】図８は、最初の２１個のＮ−末端アミノ酸を欠失させた野生型マカクＩＬ−１１から、野生型のＨ１８２とＤ１８６を疎水性アミノ酸で置換することにより導出可能な本発明のＩＬ−１１ムテイン（配列番号２９〜３３）を示す。
【図９】図９は、完全な野生型のマカクＩＬ−１１から、野生型のＨ１８２およびＤ１８６を疎水性アミノ酸で置換することによって導出可能な本発明のＩＬ−１１ムテイン（配列番号３４〜３８）を示す。
【図１０】図１０は、最初の３４個のＮ−末端アミノ酸を欠失させた野生型マウスＩＬ−１１から、Ｈ１８２とＤ１８６を疎水性アミノ酸で置換（下線で示す）することによって導出された本発明のＩＬ−１１ムテイン（配列番号３９〜４３）を示す。
【図１１】図１１は、最初の２１個のＮ−末端アミノ酸を欠失させた野生型マウスＩＬ−１１から、Ｈ１８２とＤ１８６を疎水性アミノ酸で置換（下線で示す）することによって導出された本発明のＩＬ−１１ムテイン（配列番号４４〜４８）を示す。
【図１２】図１２は、完全な野生型マウスＩＬ−１１から、Ｈ１８２およびＤ１８６を疎水性アミノ酸で置換（下線で示す）することによって導出された本発明のＩＬ−１１ムテイン（配列番号４９〜５３）を示す。
【図１３】図１３は、最初の３４個のＮ−末端アミノ酸を欠失させた野生型ラットＩＬ−１１から、Ｈ１８２とＤ１８６を疎水性アミノ酸で置換（下線で示す）することによって導出された本発明のＩＬ−１１ムテイン（配列番号５４〜５８）を示す。
【図１４】図１４は、最初の２１個のＮ−末端アミノ酸を欠失させた野生型ラットＩＬ−１１から、Ｈ１８２とＤ１８６を疎水性アミノ酸で置換（下線で示す）することによって導出された本発明のＩＬ−１１ムテイン（配列番号５９〜６３）を示す。
【図１５】図１５は、完全な野生型ラットＩＬ−１１から、Ｈ１８２およびＤ１８６を疎水性アミノ酸で置換する（下線で示す）ことによって導出された本発明のＩＬ−１１ムテイン（配列番号６４〜６８）を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＡＹ２０７４２９  ＮＣＢＩヌクレオチドエントリで定義された、ヒトの完全な野生型ＩＬ−１１に対する連結されたＣＤＳ配列（配列番号６９）、および３４個のアミノ酸を欠失させたｈＩＬ−１１由来の本発明のｈＩＬ−１１ムテインに対する連結されたＣＤＳ配列（配列番号７０）を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、２１個のアミノ酸を欠失させたｈＩＬ−１１由来の本発明のｈＩＬ−１１ムテインに対する連結されたＣＤＳ配列（配列番号７１）、および完全なｈＩＬ−１１由来の本発明のｈＩＬ−１１ムテインに対する連結されたＣＤＳ配列（配列番号７２）を示す。
【図１７−１】図１７−１は、本発明に従って突然変異させたＡＹ２０７４２９  ＮＣＢＩエントリーのヌクレオチド配列を示す（野生型ｃａｃおよびｇａｃを置換するコドンｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６に下線を付して示す）。
【図１７−２】図１７−２は、本発明に従って突然変異させたＡＹ２０７４２９  ＮＣＢＩエントリーのヌクレオチド配列を示す（野生型ｃａｃおよびｇａｃを置換するコドンｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６に下線を付して示す）。
【図１７−３】図１７−３は、本発明に従って突然変異させたＡＹ２０７４２９  ＮＣＢＩエントリーのヌクレオチド配列を示す（野生型ｃａｃおよびｇａｃを置換するコドンｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６に下線を付して示す）。
【図１８−１】図１８−１は、ｈＩＬ−１１に由来する本発明のムテインのｍＲＮＡ配列（配列番号７５）を示す（コドンｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６に下線を付して示す）。
【図１８−２】図１８−２は、ｈＩＬ−１１に由来する本発明のムテインのｍＲＮＡ配列（配列番号７５）を示す（コドンｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６に下線を付して示す）。
【図１９−１】図１９−１は、ｈＩＬ−１１に由来する本発明のＩＬ−１１ムテインの遺伝子配列（配列番号７６）を示す（コドンｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６に下線を付して示す）。
【図１９−２】図１９−２は、ｈＩＬ−１１に由来する本発明のＩＬ−１１ムテインの遺伝子配列（配列番号７６）を示す（コドンｎ１ｎ２ｎ３およびｎ４ｎ５ｎ６に下線を付して示す）。
【図２０】図２０は、１５Ｇｙの照射に曝露されたマウスの日数に対する生存％を示す（上の曲線＝組換えられしかし突然変異されなかった３．２μgのＩＬ−１１で処置されたマウス；下の曲線＝処置されていない対照マウス）。
【図２１】図２１は、１５Ｇｙの照射に曝露されたマウスの、日数に対する生存％を示す（上の曲線＝３．２μgの組換えられ突然変異されなかったＩＬ−１１で、または０．３２μgの本発明のＨ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａムテイン「ＨＶＤＡ」−で処置されたマウス；下の曲線＝０．３２μgの組換えられ突然変異されなかったＩＬ−１１で処置されたマウス、または処置されていない対照マウス）。
【図２２】図２２は、親（突然変異されなかった）の組換えＩＬ−１１（ＦＰΔＩＬ−１１）のヌクレオチド配列（配列番号７７）、およびその、親（突然変異されなかった）のアミノ酸配列（配列番号７８）を示す。
【図２３】図２３は、本発明に従って突然変異されたＦＰΔＩＬ−１１のヌクレオチド配列（配列番号７９）、および突然変異された対応するアミノ酸配列（本発明の配列番号８０）を示す。
【図２４】図２４は、ＦＰΔＩＬ−１１のインバースＰＣＲ突然変異生成に用いたプライマーを示す。
【図２５Ａ】図２５Ａおよび２５Ｂはヒト野生型ＩＬ−１１の３Ｄモデルを示す。  図２５Ａに、Tacken et al.［1999］によって記述された、ＣＮＴＦに対して得られた結晶学的データに基づくＩＬ−１１の３Ｄモデルを示す。図２５Ｂは、ＩＬ−１１モデルの部位Ｉの概観を示す。正荷電のアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ）は青色に、負荷電の（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）は赤に、親水性はグレイに、疎水性は黄色に着色されている。
【図２５Ｂ】図２５Ａおよび２５Ｂはヒト野生型ＩＬ−１１の３Ｄモデルを示す。  図２５Ａに、Tacken et al.［1999］によって記述された、ＣＮＴＦに対して得られた結晶学的データに基づくＩＬ−１１の３Ｄモデルを示す。図２５Ｂは、ＩＬ−１１モデルの部位Ｉの概観を示す。正荷電のアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ）は青色に、負荷電の（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）は赤に、親水性はグレイに、疎水性は黄色に着色されている。
【図２６】図２６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した、ＦＰΔＩＬ−１１およびＨ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａムテインの発現を示す。  ＢＬ２１ E. coliを、ＦＰΔＩＬ−１１およびＨ／Ｖ−Ｄ／ＡムテインをコードするｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクターで、または空のベクター（Ｅ）で形質転換した。タンパク質生成の誘導（ｉ、誘導；ｎ、非誘導）の後、実験法に記述するように細菌を溶解した。その後、上清（１レーン当たり全蛋白量１００μg）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、クーマシー青で着色した。
【図２７】図２７は、ＦＰΔＩＬ−１１（上）、およびＨ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａ（下）の１８００〜１４００cm-1周波数範囲における、赤外スペクトルを示す。  吸光度をmODで表す。吸光度スケールは下のスペクトルのためである。上のスペクトルは、明瞭さのためにずらして示した。
【図２８】図２８は、ＦＰΔＩＬ−１１（上）、およびＨ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａ（下）のＣＤスペクトルを示す。
【図２９Ａ】図２９Ａおよび２９Ｂは、ＦＰΔＩＬ−１１（丸）、およびＨ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａ（十字）の、2Ｈ2Ｏに曝した時間の関数としてのアミドIIバンドの積分強度の変化を示す。  カーブフィッティングを３つの減衰指数関数により行なった。パネル２９Ａ：０〜２０分、パネル２９Ｂ：０〜７００分
【図２９Ｂ】図２９Ａおよび２９Ｂは、ＦＰΔＩＬ−１１（丸）、およびＨ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａ（十字）の、2Ｈ2Ｏに曝した時間の関数としてのアミドIIバンドの積分強度の変化を示す。  カーブフィッティングを３つの減衰指数関数により行なった。パネル２９Ａ：０〜２０分、パネル２９Ｂ：０〜７００分
【図３０Ａ】図３０Ａおよび３０Ｂは、親ＦＰΔＩＬ−１１および突然変異体Ｈ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａのゲル濾過クロマトグラフィー、およびクロマトグラフィー中に集められた画分について検査したそれらの生物活性を示す。  図３０Ａにおいては、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラム（Ｋ１６  Pharmacia Biotech）を用い、３つのタンパク質、アルブミン（６７kDa）、卵白アルブミン（４３kDa）およびキモトリプシノーゲンＡ（２５kDa）で較正した後、分析する各３０μgのラベルされていないタンパク質を、トレーサーとして33Ｐでラベルされた５０ngの同一物の存在下でカラムに載せた。集めた各区画の５０μlを放射性計測に付した。図３０Ｂでは、ＩＬ−１１活性を、マウスハイブリドーマ細胞系統７ＴＤ１を用いて測定した。細胞を平底マイクロウェルプレート中で（２×１０3の７ＴＤ１細胞／ウエル）、０．２μlの溶出した各画分存在下で培養した。７日間の培養の後、生存している細胞数をヘキソサミニダーゼの比色測定により決定した。各試料を３重に検査し、平均値を標準偏差と共に表示した。
【図３０Ｂ】図３０Ａおよび３０Ｂは、親ＦＰΔＩＬ−１１および突然変異体Ｈ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａのゲル濾過クロマトグラフィー、およびクロマトグラフィー中に集められた画分について検査したそれらの生物活性を示す。  図３０Ａにおいては、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラム（Ｋ１６  Pharmacia Biotech）を用い、３つのタンパク質、アルブミン（６７kDa）、卵白アルブミン（４３kDa）およびキモトリプシノーゲンＡ（２５kDa）で較正した後、分析する各３０μgのラベルされていないタンパク質を、トレーサーとして33Ｐでラベルされた５０ngの同一物の存在下でカラムに載せた。集めた各区画の５０μlを放射性計測に付した。図３０Ｂでは、ＩＬ−１１活性を、マウスハイブリドーマ細胞系統７ＴＤ１を用いて測定した。細胞を平底マイクロウェルプレート中で（２×１０3の７ＴＤ１細胞／ウエル）、０．２μlの溶出した各画分存在下で培養した。７日間の培養の後、生存している細胞数をヘキソサミニダーゼの比色測定により決定した。各試料を３重に検査し、平均値を標準偏差と共に表示した。
【図３１Ａ】図３１Ａおよび３１Ｂは、７ＴＤ１（図３１Ａ）およびＢ９細胞（図３１Ｂ）でテストされた、親のＦＰΔＩＬ−１１および突然変異体Ｈ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａの生物活性を示す。  細胞を平底マイクロウェルプレート中で（２×１０3の７ＴＤ１細胞／ウエル；１×１０4のＢ９細胞／ウエル）、親のＦＰΔＩＬ−１１、ムテインＨ／Ｖ−Ｄ／Ａ、または市販のｒｈＩＬ−１１（Ｒ＆Ｄ）の段階希釈物の存在下で培養した。７ＴＤ１は培養７日後およびＢ９細胞は培養３日後に、生存している細胞数を、ヘキソサミニダーゼ（７ＴＤ１細胞）、およびＸＴＴの比色測定（Ｂ９細胞）により決定した。各試料を３重に検査し、平均値を標準偏差と共に表示した。
【図３１Ｂ】図３１Ａおよび３１Ｂは、７ＴＤ１（図３１Ａ）およびＢ９細胞（図３１Ｂ）でテストされた、親のＦＰΔＩＬ−１１および突然変異体Ｈ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａの生物活性を示す。  細胞を平底マイクロウェルプレート中で（２×１０3の７ＴＤ１細胞／ウエル；１×１０4のＢ９細胞／ウエル）、親のＦＰΔＩＬ−１１、ムテインＨ／Ｖ−Ｄ／Ａ、または市販のｒｈＩＬ−１１（R&D）の段階希釈物の存在下で培養した。７ＴＤ１は培養７日後およびＢ９細胞は培養３日後に、生存している細胞数を、ヘキソサミニダーゼ（７ＴＤ１細胞）、およびＸＴＴの比色測定（Ｂ９細胞）により決定した。各試料を３重に検査し、平均値を標準偏差と共に表示した。
【図３２】図３２は、ＦＰΔＩＬ−１１または突然変異体Ｈ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａにより刺激された７ＴＤ１細胞増殖の、抗−ｈＩＬ−１１および抗ヒトｇｐ１３０中和抗体による阻害を示す。細胞を、表示した濃度の抗ヒトＩＬ−１１モノクローナル抗体Ｈ２（丸）、ならびに抗ヒトｇｐ１３０モノクローナル抗体ＭＡＢ６２８（四角）およびＢ−Ｒ３（三角）とインキュベーションした。データ点は３回行った測定の平均を表わす。
【図３３】図３３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングによって分析された、親のＦＰΔＩＬ−１１およびそのＨ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａムテインの発現を示す。  ＢＬ２１ E. coliを図に示す空のベクター（対照）、または親のＦＰΔＩＬ−１１またはムテインをコードする発現ベクトルで形質転換した。タンパク質発現を引き起こした後、超音波処理により細胞を溶解し、溶解物（１つのレーン当たり１００μg全蛋白量）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（左）およびＩＬ−１１に対して生成されたポリクローナル抗体（ＢＡＦ  ２１８）を用いるイムノブロッティング（右）により解析した。
【図３４】図３４は、７ＴＤ１細胞のＦＰΔＩＬ−１１およびそのＨ１８２Ｖ＋Ｄ１８６Ａムテインに応答した増殖を示す。  ７ＴＤ１細胞を、対照、ＦＰΔＩＬ−１１またはムテインを含むE. coli溶解物の段階希釈物（始めに２μg／mlに調節）存在下で、インキュベーションした。７日間の培養の後、ヘキソサミニダーゼの比色測定により、細胞数を決定した。
【図３５】図３５は、本発明のムテインの有利な局面のインビトロにおける比較結果を、野生型のＩＬ−１１（四角）、または本発明のＨ／Ｖ−Ｄ／Ａムテイン（三角）もしくはＤ／Ａムテイン（丸）の用量増加に応答して、７ＴＤ１細胞（ＩＣＬＣアクセッション番号＝ＨＹＬ９６００１）によって示されたそれぞれの増殖レベルを示すことにより、表示する。
【図３６】図３６は、本発明のムテインの有利な局面のインビボにおける比較結果のデモンストレーションであって、ＩＬ−１１の３２０ng（四角）または３．２μg（菱形）注入後、本発明のＨ／Ｖ−Ｄ／Ａムテイン３２０ng（丸）の注入後またはＤ／Ａムテイン３２０ng（三角）の注入後の、１．５Ｇｙ／分で照射されたマウスのそれぞれのパーセント生存率を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
2007521795.tif 000055
【図３３】
2007521795.tif 000056
【図３４】
2007521795.tif 000057
【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
2007521795000001.app
【国際調査報告】
2007521795.tif 000060
2007521795.tif 000061