(57)【要約】  混合物中の各コンジュゲートが、ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーと結合したカルシトニン薬を含む、コンジュゲート混合物が開示される。混合物は被験者の血清カルシウム濃度を１０、１５または更に２０パーセント以上減少させ得る。その上、混合物は、コンジュゲートされていないカルシトニンよりも、腸分解のインビトロ・モデルでは、効率よく生存し得る。更に、混合物はコンジュゲートされていないカルシトニンより高いバイオアベイラビリティを示し得る。本発明の組成物は種々の骨疾患および疼痛の治療に有用である。
2007521268.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その治療を必要とする被験者の末梢疼痛を治療する方法であって、実質的に単分散のコンジュゲート混合物の有効量を前記被験者に投与するステップを含み、前記コンジュゲートが第一オリゴマーおよび第二オリゴマーを含み、各オリゴマーがサケ・カルシトニンと結合し、ならびに第一オリゴマーが前記サケ・カルシトニンのＬｙｓ11のアミン官能基と共有結合し、第二オリゴマーが前記サケ・カルシトニンのＬｙｓ18のアミン官能基と共有結合する、方法。
【請求項２】
その治療を必要とする被験者の末梢疼痛を治療する方法であって、実質的に単分散のコンジュゲート混合物の有効量を前記被験者に投与するステップを含み、各コンジュゲートがポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーと結合したカルシトニン薬を含み、前記オリゴマーが非加水分解結合により前記カルシトニン薬と共有結合した第一ポリエチレングリコール部分と、加水分解結合により前記第一ポリエチレングリコール部分と共有結合した第二ポリエチレングリコール部分とを含む、方法。
【請求項３】
その治療を必要とする被験者の末梢疼痛を治療する方法であって、実質的に単分散のコンジュゲート混合物の有効量を前記被験者に投与するステップを含み、それぞれがサケ・カルシトニンのＬｙｓ11でカルボン酸（カルボン酸部分より遠位の末端で、少なくとも７つのポリエチレングリコール・サブユニットを有するメチル末端ポリエチレングリコール部分と共有結合する）のカルボン酸部分と共有結合し、サケ・カルシトニンのＬｙｓ18でカルボン酸（カルボン酸部分より遠位の末端で、少なくとも７つのポリエチレングリコール・サブユニットを有するメチル末端ポリエチレングリコール部分と共有結合する）のカルボン酸部分と共有結合するサケ・カルシトニンを含む、方法。
【請求項４】
その治療を必要とする被験者の末梢疼痛を治療する方法であって、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するコンジュゲート混合物の有効量を前記被験者に投与するステップを含み、混合物中の各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合するサケ・カルシトニンを含み、かつ前記第一オリゴマーおよび前記第二オリゴマーがそれぞれ次式：
【化１】
2007521268.tif 000043
を有する、方法。
【請求項５】
その治療を必要とする被験者の末梢疼痛を治療する方法であって、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するコンジュゲート混合物の有効量を前記被験者に投与するステップを含み、混合物中の各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合するサケ・カルシトニンを含み、前記第一オリゴマーおよび前記第二オリゴマーがそれぞれ次式：
【化２】
2007521268.tif 000044
を有する、方法。
【請求項６】
その治療を必要とする被験者の末梢疼痛を治療する方法であって、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するコンジュゲート混合物の有効量を前記被験者に投与するステップを含み、混合物中の各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11またはＬｙｓ18で次式：
【化３】
2007521268.tif 000045
を有するオリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含む、方法。
【請求項７】
その治療を必要とする被験者の末梢疼痛を治療する方法であって、
【数１】
2007521268.tif 000046
（式中：
ｎは試料中の異なる分子の数であり、
Ｎiは試料のｉ番目分子の数であり、
Ｍiはｉ番目分子の質量である）において、１０，０００を超える分散係数（ＤＣ）を有するコンジュゲート混合物の有効量を前記被験者に投与するステップを含み、
混合物中の各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含み、前記第一オリゴマーおよび前記第二オリゴマーがそれぞれ次式：
【化４】
2007521268.tif 000047
を有する、方法。
【請求項８】
その治療を必要とする被験者の末梢疼痛を治療する方法であって、
【数２】
2007521268.tif 000048
（式中：
ｎは試料中の異なる分子の数であり、
Ｎiは試料のｉ番目分子の数であり、
Ｍiはｉ番目分子の質量である）において、１０，０００を超える分散係数（ＤＣ）を有するコンジュゲート混合物の有効量を前記被験者に投与するステップを含み、
混合物中の各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含み、前記第一オリゴマーおよび前記第二オリゴマーがそれぞれ次式：
【化５】
2007521268.tif 000049
を有する、方法。
【請求項９】
その治療を必要とする被験者の末梢疼痛を治療する方法であって、
【数３】
2007521268.tif 000050
（式中：
ｎは試料中の異なる分子の数であり、
Ｎiは試料のｉ番目分子の数であり、
Ｍiはｉ番目分子の質量である）において、１０，０００を超える分散係数（ＤＣ）を有するコンジュゲート混合物の有効量を前記被験者に投与するステップを含み、
混合物中の各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11またはＬｙｓ18で次式：
【化６】
2007521268.tif 000051
を有するオリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含む、方法。
【請求項１０】
その治療を必要とする被験者の末梢疼痛を治療する方法であって、コンジュゲート混合物の有効量を前記被験者に投与するステップを含み、各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含み、前記第一オリゴマーおよび前記第二オリゴマーがそれぞれ次式：
【化７】
2007521268.tif 000052
を有する、方法。
【請求項１１】
その治療を必要とする被験者の末梢疼痛を治療する方法であって、コンジュゲート混合物の有効量を前記被験者に投与するステップを含み、各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含み、前記第一オリゴマーおよび前記第二オリゴマーがそれぞれ次式：
【化８】
2007521268.tif 000053
を有する、方法。
【請求項１２】
その治療を必要とする被験者の末梢疼痛を治療する方法であって、有効量のコンジュゲート混合物を前記被験者に投与するステップを含み、各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11またはＬｙｓ18で次式：
【化９】
2007521268.tif 000054
を有するオリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含む、方法。
【請求項１３】
その治療を必要とする被験者の末梢疼痛を治療する方法であって、有効量のコンジュゲート混合物を前記被験者に投与するステップを含み、各コンジュゲートが、同じ分子量を有し、かつカルシトニン薬−オリゴマー構造を有し、前記オリゴマーが次式：
【化１０】
2007521268.tif 000055
（式中：
Ｂは結合部分であり、
Ｌはリンカー部分であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は個々に選択されるスペーサー部分であり、
Ｒは親油性部分であり且つＲ’はポリアルキレングリコール部分であるか、またはＲ’は親油性部分であり且つＲはポリアルキレングリコール部分であり、
Ｔはメトキシであり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは個々に０または１であり、
ｐは１からカルシトニン薬の求核性残基数までの整数である）を有し、前記カルシトニン薬がＬｙｓ11およびＬｙｓ18で前記オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下に、全体の内容を参照して本明細書に組み込まれる、２００３年６月２４日に出願された米国仮出願番号第６０／４８２，１３０号の恩典を請求する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、薬物−オリゴマーコンジュゲートに関し、より具体的にはカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートおよび種々の障害を治療するためのこれらのコンジュゲートの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
カルシトニンは、破骨細胞に（カルシトニンに対する細胞表面の受容体を介して）直接作用すると考えられ、半減期の短い、自然に存在するホルモンである。この作用は破骨細胞骨吸収を直接阻害し得る。該骨吸収は低カルシウム血症性および／または低リン酸血症性の血清効果を生じ得る。カルシトニンは、骨粗しょう症およびパジェット病を含むが、これらに限定はされない種々の骨障害を治療する際に役立ち得る。
【０００４】
骨粗しょう症は骨組織が通常石化する骨疾患であるが、骨の量が減少し、柱骨の構造的完全性が損なわれる。皮質骨は、より多孔性で薄くなる。これは骨をより弱くさせ骨折しやすくさせる。合衆国では、閉経後の女性の約２１％は骨粗しょう症（低い骨密度）であり、約１６％は骨折したことがある。８０歳を超える女性においては、約４０％が腰、脊椎、腕、または骨盤の骨折を経験したことがある。高齢者の人口は増加してきたため、骨粗しょう症を患う人口数は増加している。
【０００５】
皮下注射として施されるカルシトニンは骨密度に有意な改善を示すが、注射部位の疼痛、紅潮および嘔気を含む、高頻度の副作用が報告されており、該薬物の使用を制限し得る。
【０００６】
骨のパジェット病は通常高齢者を冒す原因不明の代謝性骨障害である。該疾患は骨細胞としての骨の増加した不規則な形成を惹起し制御不能になる。骨細胞は身体の老骨を溶解し新生骨と交換する責任を担う。ある期間にわたって、変形した新生骨はより大きく弱くなり、正常な骨より多い血管を有する。正常な骨と違って、構造は不規則であり、必然的に弱くなり、軽傷後でさえ骨折しやすくさせる。
【０００７】
その最も軽度の形態において、該疾患は無症状である。より重症な場合において、疼痛が激しくなり得る。該疾患の過酷な進行は骨の湾曲を惹起し得る。頭蓋骨は大きさが増加し脊柱は曲がり得る。骨が増大するにつれ、近隣の神経に圧迫を招き、筋脱力をもたらし得る。重症の頭蓋骨増大の場合において、この圧迫は、難聴、視覚障害（ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ  ｖｉｓｉｏｎ）、目まい、および耳鳴りを招き得る。
【０００８】
カルシトニンは、パジェット病などの増大した骨格再構築の障害を治療するのに有効であり得る。パジェット病を治療する際に、カルシトニンの常用は症状の長期減退を生じ得るが、カルシトニン投与の副作用は嘔気、手の腫脹、じんましん、および腸けいれんを含み得る。
【０００９】
ポリエチレングリコールの多分散混合物またはポリエチレングリコールを含むポリマーとカルシトニンなどの抱合ポリペプチドについて、様々な参照文献が提示されている。例えば、Ｅｋｗｕｒｉｂｅの米国特許第５，３５９，０３０号は、ポリエチレングリコール修飾糖脂質ポリマーの多分散混合物およびポリエチレングリコール修飾脂肪酸ポリマーの多分散混合物とカルシトニンなどの抱合ポリペプチドを提示する。各組み合わせから得られるポリマーの数平均分子量は約５００から約１０，０００ダルトンの範囲にあることが好ましい。
【００１０】
Ｅｋｗｕｒｉｂｅに記載されるポリマー混合物およびコンジュゲートの多分散性はポリマー合成における多分散ポリエチレングリコールの使用の結果であるらしい。ＰＥＧは通常エチレンオキシドの塩基触媒開環重合により生産される。該反応は触媒として水酸化カリウムを用いてエチレングリコールにエチレンオキシドを付加することにより開始する。この過程は、分子量の所与範囲内の数平均分子量を有するポリエチレングリコールポリマーの多分散混合物を生じる。例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｏｆ  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎにより販売されるＰＥＧ製品は、ＰＥＧ  ４００（Ｍn  ３８０〜４２０）、ＰＥＧ  １，０００（Ｍn  ９５０〜１，０５０）、ＰＥＧ  １，５００（Ｍn  １，４００〜１，６００）およびＰＥＧ  ２，０００（Ｍn  １，９００〜２，２００）などの多分散混合物で提供される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
オリゴマーがポリエチレングリコールを含むカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの非多分散混合物を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の実施形態によるポリエチレングリコールを含むカルシトニン−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、１０、１５または更に２０パーセント以上まで血清カルシウム濃度を下げ得ることが予想外に発見された。さらに、本発明の実施形態によるポリエチレングリコールを含むカルシトニン−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、コンジュゲートされていないカルシトニンより腸内消化のインビトロ・モデルを切り抜けるのに有効であり得る。その上、本発明の実施形態によるポリエチレングリコールを含むカルシトニン−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、コンジュゲートされていないカルシトニンより高いバイオアベイラビリティを示し得る。
【００１３】
本発明の実施形態により、ポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーと結合したカルシトニン薬をそれぞれ含む実質的に単分散のコンジュゲート混合物が提供される。ポリエチレングリコール部分は、少なくとも２、３、または４つのポリエチレングリコール・サブユニットを有することが好ましく、少なくとも７つのポリエチレングリコール・サブユニットを有することが最も好ましい。オリゴマーは更に親油性部分を含むことが好ましい。カルシトニン薬はサケ・カルシトニンであることが好ましい。オリゴマーはサケ・カルシトニンのＬｙｓ11およびＬｙｓ18で結合することが好ましい。コンジュゲートは、コンジュゲートが水溶性であり且つ生体膜を貫通できるように、両親媒性平衡であることが好ましい。
【００１４】
本発明の他の実施形態により、実質的に単分散のコンジュゲート混合物が提供され、それぞれのコンジュゲートは、サケ・カルシトニンのＬｙｓ11で第一オリゴマー（カルボン酸部分より遠位の末端で少なくとも７つのポリエチレングリコール・サブユニットを有するメチル末端ポリエチレングリコール部分と共有結合したオクタン酸を含む）のカルボン酸部分と共有結合し、サケ・カルシトニンのＬｙｓ18で第二オリゴマー（カルボン酸部分より遠位の末端で少なくとも７つのポリエチレングリコール・サブユニットを有するメチル末端ポリエチレングリコール部分と共有結合したオクタン酸を含む）のカルボン酸部分と共有結合するサケ・カルシトニンを含む。
【００１５】
本発明の更なる他の実施形態により、実質的に単分散のコンジュゲート混合物が提供され、それぞれのコンジュゲートがポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーと結合したカルシトニン薬を含み、該混合物は被験者の血清カルシウム濃度を少なくとも５パーセントまで下げることができる。
【００１６】
本発明の更なる他の実施形態により、実質的に単分散のコンジュゲート混合物が提供され、それぞれのコンジュゲートはポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーと結合したカルシトニン薬を含み、該混合物は、該オリゴマーと結合していないカルシトニン薬のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性と比較した場合、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性が増す。
【００１７】
本発明の他の実施形態により、実質的に単分散のコンジュゲート混合物が提供され、それぞれのコンジュゲートはポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーと結合したカルシトニン薬を含み、該混合物は該オリゴマーと結合していないカルシトニン薬の生物有効性より高い生物有効性を有する。
【００１８】
本発明の更なる他の実施形態により、コンジュゲートの混合物が提供され、それぞれのコンジュゲートはポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーと結合したカルシトニン薬を含み、該混合物は標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する。
【００１９】
本発明の更なる他の実施形態により、コンジュゲートの混合物が提供され、それぞれのコンジュゲートはポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーと結合したカルシトニン薬を含み、該混合物は、
【数１】
2007521268.tif 000003
において、１０，０００を上回る分散係数（ＤＣ）を有し、
式中：
ｎは試料中の異なる分子の数であり、
Ｎiは試料中のｉ番目分子の数であり、
Ｍiはｉ番目分子の質量である。
【００２０】
本発明の他の実施形態により、コンジュゲートの混合物が提供され、それぞれのコンジュゲートはオリゴマーと結合したカルシトニン薬を含み且つ同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有する。
【００２１】
本発明の更なる他の実施形態により、コンジュゲートの混合物が提供され、それぞれのコンジュゲートは、同じ分子量を有し、次式：
【化１】
2007521268.tif 000004
（式中：
Ｂは結合部分であり、
Ｌは結合基であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は個々に選択されるスペーサー基であり、
Ｒは親油性基であり且つＲ’はポリアルキレングリコール基であるか、またはＲ’は親油性基であり且つＲはポリアルキレンオキシド基であり、
Ｔは末端基であり；
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは個々に０または１であり、
ｐは１からカルシトニン薬の求核性残基数までの整数である）を有する。
【００２２】
本発明のコンジュゲート混合物を含む薬学的組成物、ならびに有効量のそのような薬学的組成物を投与することによりそのような治療の必要性がある被験者の骨粗しょう症を治療する方法も提供される。さらに、このようなコンジュゲート混合物を合成する方法が提供される。
【００２３】
本発明の実施形態によるカルシトニン−オリゴマーコンジュゲート混合物は２０パーセント以上まで血清カルシウム濃度を下げ得る。さらに、このようなコンジュゲートは、コンジュゲートされていないカルシトニンと比較した場合、腸内酵素による分解を減少させ、ならびに／またはバイオアベイラビリティを高め得る。
【００２４】
本発明は、さらに、有効量の本発明組成物を被験者に投与するステップを含む、その治療を必要とする被験者の疼痛（例えば、末梢疼痛；中枢疼痛）を治療する方法を提供する。本発明は下記の１つ以上を含み得る。
【００２５】
１．実質的に単分散のコンジュゲート混合物。但し、該コンジュゲートが第一オリゴマーおよび第二オリゴマーを含み、各オリゴマーがサケ・カルシトニンと結合し、該第一オリゴマーがサケ・カルシトニンのＬｙｓ11のアミン官能基と共有結合し、該第二オリゴマーがサケ・カルシトニンのＬｙｓ18のアミン官能基と共有結合する。
【００２６】
２．実質的に単分散のコンジュゲート混合物。但し、それぞれのコンジュゲートがポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーと結合したカルシトニン薬を含み、該オリゴマーが非加水分解性結合によりカルシトニン薬と共有結合した第一ポリエチレングリコール部分および加水分解性結合により該第一ポリエチレングリコール部分と共有結合した第二ポリエチレングリコール部分を含む。
【００２７】
３．実質的に単分散のコンジュゲート混合物。但し、それぞれがサケ・カルシトニンのＬｙｓ11でカルボン酸（該カルボン酸部分より遠位の末端で少なくとも７つのポリエチレングリコール・サブユニットを有するメチル末端ポリエチレングリコール部分と共有結合する）のカルボン酸部分と共有結合し、サケ・カルシトニンのＬｙｓ18でカルボン酸（該カルボン酸部分より遠位の末端で少なくとも７つのポリエチレングリコール・サブユニットを有するメチル末端ポリエチレングリコール部分と共有結合する）のカルボン酸部分と共有結合するサケ・カルシトニンを含む。
【００２８】
４．標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するコンジュゲート混合物。但し、混合物中の各コンジュゲートがＬｙｓ11で第一オリゴマーと結合し、Ｌｙｓ18で第二オリゴマーと結合するサケ・カルシトニンを含み、該第一オリゴマーおよび該第二オリゴマーがそれぞれ次式：
【化２】
2007521268.tif 000005
を有する。
【００２９】
５．その治療を必要とする被験者の末梢疼痛を治療する方法。但し、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するコンジュゲート混合物の有効量を該被験者に投与するステップを含み、混合物中の各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合し、Ｌｙｓ18で第二オリゴマーと結合するサケ・カルシトニンを含み、該第一オリゴマーおよび該第二オリゴマーがそれぞれ次式：
【化３】
2007521268.tif 000006
を有する。
【００３０】
６．標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するコンジュゲート混合物。但し、混合物中の各コンジュゲートがＬｙｓ11またはＬｙｓ18で次式：
【化４】
2007521268.tif 000007
を有するオリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含む。
【００３１】
７．１０，０００を超える分散係数（ＤＣ）を有するコンジュゲート混合物。但し、ＤＣは、次式：
【数２】
2007521268.tif 000008
（式中：
ｎは試料中の異なる分子の数であり、
Ｎiは試料中のｉ番目分子の数であり、
Ｍiはｉ番目分子の質量である）で示され、混合物中の各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含み、該第一オリゴマーおよび該第二オリゴマーがそれぞれ次式：
【化５】
2007521268.tif 000009
を有する。
【００３２】
８．１０，０００を超える分散係数（ＤＣ）を有するコンジュゲート混合物。但し、ＤＣは、次式：
【数３】
2007521268.tif 000010
（式中：
ｎは試料中の異なる分子の数であり、
Ｎiは試料中のｉ番目分子の数であり、
Ｍiはｉ番目分子の質量である）で示され、混合物中の各コンジュゲートがＬｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含み、該第一オリゴマーおよび該第二オリゴマーがそれぞれ次式：
【化６】
2007521268.tif 000011
を有する。
【００３３】
９．１０，０００を超える分散係数（ＤＣ）を有するコンジュゲート混合物。但し、ＤＣは、次式：
【数４】
2007521268.tif 000012
（式中：
ｎは試料中の異なる分子の数であり、
Ｎiは試料中のｉ番目分子の数であり、
Ｍiはｉ番目分子の質量である）で示され、混合物中の各コンジュゲートがＬｙｓ11またはＬｙｓ18で次式：
【化７】
2007521268.tif 000013
を有するオリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含む。
【００３４】
１０．それぞれのコンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含み、該第一オリゴマーおよび該第二オリゴマーがそれぞれ次式：
【化８】
2007521268.tif 000014
を有するコンジュゲート混合物。
【００３５】
１１．それぞれのコンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含み、該第一オリゴマーおよび該第二オリゴマーがそれぞれ次式：
【化９】
2007521268.tif 000015
を有するコンジュゲート混合物。
【００３６】
１２．それぞれのコンジュゲートが、Ｌｙｓ11またはＬｙｓ18で次式：
【化１０】
2007521268.tif 000016
を有するオリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含むコンジュゲート混合物。
【００３７】
１３．それぞれのコンジュゲートが同じ分子量を有し、かつカルシトニン薬−オリゴマー構造を有するコンジュゲート混合物。但し、該オリゴマーが次式：
【化１１】
2007521268.tif 000017
（式中：
Ｂは結合部分であり、
Ｌはリンカー部分であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は個々に選択されるスペーサー部分であり、
Ｒは親油性部分であり且つＲ’はポリアルキレングリコール部分であるか、またはＲ’は親油性部分であり且つＲはポリアルキレングリコール部分であり、
Ｔはメトキシであり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは個々に０または１であり、
ｐは１からカルシトニン薬の求核性残基数までの整数である）を有し、該カルシトニン薬はＬｙｓ11およびＬｙｓ18で該オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明は本明細書に記載される好ましい実施形態に関して記載される。しかしながら、これらの実施形態は本発明を説明するためのものであり、特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでないと理解されるはずである。
【００３９】
本明細書で用いられるように、「非多分散の」という用語は、Ｅｋｗｕｒｉｂｅの米国特許第５，３５９，０３０号に記載される多分散混合物と対照をなす分散度を有する化合物の混合物を記載するために用いられる。
【００４０】
本明細書で用いられるように、「実質的に単分散の」という用語は、混合物中の少なくとも約９５パーセントの化合物が同じ分子量を有する化合物の混合物を記載するために用いられる。
【００４１】
本明細書で用いられるように、「単分散の」という用語は、混合物中の約１００パーセントの化合物が同じ分子量を有する化合物の混合物を記載するために用いられる。
【００４２】
本明細書で用いられるように、「実質的に純粋な単分散の」という用語は、混合物中の少なくとも約９５パーセントの化合物が同じ分子量を有し且つ同じ分子構造を有する化合物の混合物を記載するために用いられる。従って、実質的に純粋な単分散の混合物は実質的に単分散の混合物であるが、実質的に単分散の混合物は必ずしも実質的に純粋な単分散の混合物ではない。
【００４３】
本明細書で用いられるように、「純粋な単分散の」という用語は、混合物中の約１００パーセントの化合物が同じ分子量を有し且つ同じ分子構造を有する化合物の混合物を記載するために用いられる。従って、純粋な単分散の混合物は単分散の混合物であるが、単分散の混合物は必ずしも純粋な単分散の混合物ではない。
【００４４】
本明細書で用いられるように、「重量平均分子量」という用語は、混合物中の所与分子についての重量分率と混合物中の各分子についての分子質量の積和として定義される。「重量平均分子量」はＭwの記号により表される。
【００４５】
本明細書で用いられるように、「数平均分子量」という用語は、混合物の全重量÷混合物中の分子数として定義され、Ｍnの記号により表される。
【００４６】
本明細書で用いられるように、「分散係数」（ＤＣ）という用語は、次式：
【数５】
2007521268.tif 000018
により定義され、
式中：
ｎは試料中の異なる分子の数であり、
Ｎiは試料中のｉ番目分子の数であり、
Ｍiはｉ番目分子の質量である。
【００４７】
本明細書で用いられるように、「被験者内変動（ｉｎｔｒａ−ｓｕｂｊｅｃｔ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）」という用語は、被験者が異なる時間に同じ用量の薬物または薬学的組成物を投与される場合に、同じ被験者内で生じる活性の変動を意味する。
【００４８】
本明細書で用いられるように、「被験者間変動（ｉｎｔｅｒ−ｓｕｂｊｅｃｔ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）」という用語は、それぞれの被験者が同じ用量の所与の薬物または薬学的組成物を投与される場合に、二以上の被験者間での活性の変動を意味する。
【００４９】
本明細書で用いられるように、「生物有効性（ｂｉｏｅｆｆｉｃａｃｙ）」という用語は、インビボで１つ以上の所望の受容体と相互作用する薬物または薬物コンジュゲートの能力を意味する。
【００５０】
本明細書で用いられるように、「カルシトニン薬」という用語は、カルシトニンの生物活性の全てまたは幾つかを保有する薬物を意味する。
【００５１】
本明細書で用いられるように、「カルシトニン」という用語は、天然、合成、または遺伝子操作の起源により提供されるニワトリ・カルシトニン、ウナギ・カルシトニン、ヒト・カルシトニン、ブタ・カルシトニン、ラット・カルシトニンまたはサケ・カルシトニンを意味する。
【００５２】
本明細書で用いられるように、「カルシトニン類似体」という用語は、１つ以上のアミノ酸が置換されているが、カルシトニンの活性の幾つかまたは全てを保持するカルシトニンを意味する。該類似体は、置換の位置を上付き文字として添えた置換アミノ酸を言及した後カルシトニンを記述することにより記載される。例えば、「Ｐｒｏ2カルシトニン、ヒト」は、ヒトのカルシトニン分子の２番目の位置で通常見出されるグリシンがプロリンと置換したことを意味する。
【００５３】
カルシトニン類似体は、当業者に理解されるように、種々の手段により得られ得る。例えば、ある種のアミノ酸は、相互作用結合能をかなり喪失することなく、例えば抗体の抗原結合領域または基質分子の結合部位などの構造を備えたカルシトニン構造において、他のアミノ酸と置換され得る。カルシトニンの相互作用能および性質はその生体機能活性を規定するため、ある種のアミノ酸配列の置換がアミノ酸配列で為され得るにも関わらず、依然として同様の性質を有するポリペプチドのままである。
【００５４】
このような置換を作製する際に、アミノ酸のハイドロパシー指標が検討され得る。ポリペプチドに相互作用的生体機能を付与する際のアミノ酸のハイドロパシー指標の重要性は一般に当分野で理解されている。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性は、得られるポリペプチドの二次構造に寄与し、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等とポリペプチドとの相互作用を順次規定する。それぞれのアミノ酸はその疎水性および下記の電荷特性に基づいてハイドロパシー指標が指定される。イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。当業者に理解されるように、ある種のアミノ酸は同様なハイドロパシー指標または点数を有する他のアミノ酸と置換されてもよく、依然として同様な生物活性を有するポリペプチドを生じ、即ち、依然として生体機能的に等価なポリペプチドを得る。このような変化を生成する際に、ハイドロパシー指標が相互の±２内であるアミノ酸の置換が好ましく、相互の±１内であるものが特に好ましく、相互の±０．５内であるものが更により特に好ましい。
【００５５】
類似アミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的に為され得ることも当分野で理解される。米国特許第４，５５４，１０１号は、タンパク質の最大局所平均親水性（ｇｒｅａｔｅｓｔ  ｌｏｃａｌ  ａｖｅｒａｇｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）が、その隣接アミノ酸の親水性に支配されるので、タンパク質の生物学的特性に相関することを規定する。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、下記の親水性値がアミノ酸残基に指定されている。アルギニン（＋３．０）；リシン（±３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（ｓｅｉｎｅ）（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。当業者に理解されるように、アミノ酸は同様な親水性値を有する他と置換でき、生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なポリペプチドを依然得ることができる。このような変化において、親水性値が相互の±２内であるアミノ酸の置換が好ましく、相互の±１内であるものが特に好ましく、相互の±０．５内であるものが更により特に好ましい。
【００５６】
上記で概説したように、アミノ酸の置換は、従って、一般にアミノ酸側鎖置換の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基づくものである。種々の前記特性を考慮に入れる典型的な置換（即ち、ポリペプチドの生物活性を著しく変えることなく交換され得るアミノ酸）は、当業者に周知であり、例えば、アルギニンおよびリシン；グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【００５７】
本明細書で用いられるように、「カルシトニン断片」という用語は、カルシトニンの活性の幾つかまたは全てを保持する、カルシトニンで見られるアミノ酸配列のセグメントを意味する。
【００５８】
本明細書で用いられるように、「カルシトニン断片類似体」という用語は、セグメントの１つ以上のアミノ酸が置換されているが、カルシトニンの活性の幾つかまたは全てを保持する、カルシトニン分子に見られるアミノ酸配列のセグメントを意味する。
【００５９】
本明細書で用いられるように、「ＰＥＧ」という用語は直鎖または分岐のポリエチレングリコールポリマーを指し、ポリエチレングリコールのモノメチルエーテル（ｍＰＥＧ）を含む。「ＰＥＧサブユニット」、即ちポリエチレングリコール・サブユニットという用語は、一つのポリエチレングリコール単位、即ち？（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）？を指す。
【００６０】
本明細書で用いられるように、「親油性（ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ）」という用語は、脂質への溶解能ならびに／または生体膜を貫通、相互作用および／もしくは横断する能力を意味し、「親油性部分」または「脂肪親和性（ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ）」という用語は、親油性である部分、および／または他の化学物質に結合するとこのような化学物質の親油性を増す部分を意味する。親油性部分の例は、アルキル、脂肪酸、脂肪酸のエステル、コレステリル、アダマンチルなどを含むが、これらに限定されない。
【００６１】
本明細書で用いられるように、「低級アルキル」という用語は１から５の炭素原子を有する置換または非置換のアルキル部分を指す。
【００６２】
本明細書で用いられるように、「高級アルキル」という用語は６以上の炭素原子を有する置換または非置換のアルキル部分を指す。
【００６３】
本発明の実施形態において、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの実質的に単分散の混合物が提供される。単分散混合物におけるそれぞれのカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートは、ポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーと結合したカルシトニン薬を含む。好ましくは、混合物の少なくとも約９６、９７、９８または９９パーセントのコンジュゲートが同じ分子量を有する。より好ましくは、混合物は単分散混合物である。更により好ましくは、混合物は実質的に純粋な単分散混合物である。更により好ましくは、混合物の少なくとも約９６、９７、９８または９９パーセントのコンジュゲートが同じ分子量及び同じ分子構造を有する。最も好ましくは、混合物は純粋な単分散混合物である。
【００６４】
カルシトニン薬はカルシトニンであることが好ましい。より好ましくは、カルシトニン薬はサケ・カルシトニンである。しかしながら、カルシトニン薬は、例えば、カルシトニン前駆ペプチド、カルシトニン、カルシトニン類似体、カルシトニン断片、およびカルシトニン断片類似体を含む、当業者に知られる種々のカルシトニン薬から選択され得ることが理解されるべきである。カルシトニン前駆ペプチドは、カタカルシン（ＰＤＮ−２１）（Ｃ−プロカルシトニン）、およびＮ−ｐｒｏＣＴ（アミノ末端プロカルシトニン切断ペプチド）、ヒトを含むが、これらに限定されない。カルシトニン類似体は上述のカルシトニンにおける１つ以上のアミノ酸の置換により提供され得る。カルシトニン断片は、カルシトニン１−７、ヒト；およびカルシトニン８−３２、サケを含むが、これらに限定されない。カルシトニン断片類似体は上述のカルシトニン断片中の１つ以上のアミノ酸の置換により提供され得る。
【００６５】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、ポリエチレングリコール部分を含む種々のオリゴマーであり得る。好ましくは、オリゴマーのポリエチレングリコール部分は少なくとも２、３または４のポリエチレングリコール・サブユニットを有する。より好ましくは、ポリエチレングリコール部分は少なくとも５または６のポリエチレングリコール・サブユニットを有し、最も好ましくは、ポリエチレングリコール部分は少なくとも７のポリエチレングリコール・サブユニットを有する。
【００６６】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、追加の親水性部分、親油性部分、スペーサー部分、リンカー部分、および末端部分を含むが、これらに限定されない、１つ以上の他の部分を含み得る。オリゴマーの種々の部分は加水分解性結合または非加水分解性結合のいずれかにより互いに共有結合する。
【００６７】
オリゴマーは、糖、ポリアルキレンオキシド、およびポリアミン／ＰＥＧ共ポリマーを含むが、これらに限定されない１つ以上の追加の親水性部分（即ち、ポリエチレングリコール部分に加えた部分）をさらに含み得る。ポリエチレングリコールはポリアルキレンオキシドであるため、追加の親水性部分はポリエチレングリコール部分であってもよい。隣接のポリエチレングリコール部分は、エーテル結合により結合する場合、同じ部分であると考えられる。例えば、
【化１２】
2007521268.tif 000019
の部分は６つのポリエチレングリコール・サブユニットを有する一つのポリエチレングリコール部分である。この部分がオリゴマーにおける唯一つの親水性部分である場合、オリゴマーは追加の親水性部分を含まない。隣接のポリエチレングリコール部分は、エーテル結合以外の結合により結合する場合、異なる部分であると考えられる。例えば、
【化１３】
2007521268.tif 000020
の部分は、４つのポリエチレングリコール・サブユニットを有するポリエチレングリコール部分および２つのポリエチレングリコール・サブユニットを有する追加の親水性部分である。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーは、ポリエチレングリコール部分を含むが、追加の親水性部分を含まない。
【００６８】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、１つ以上の親油性部分をさらに含み得る。親油性部分は、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐のアルキル部分、または飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐の脂肪酸部分であることが好ましい。親油性部分がアルキル部分である場合、１から２８の炭素原子を有する直鎖の飽和または不飽和のアルキル部分であることが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２から１２の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合、２から１８の炭素原子を有する直鎖の飽和または不飽和である天然脂肪酸部分であることが好ましい。より好ましくは、脂肪酸部分は３から１４の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４、５または６の炭素原子を有する。
【００６９】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、１つ以上のスペーサー部分を更に含み得る。スペーサー部分は、例えば、親油性部分から親水性部分を分離するため、カルシトニン薬から親油性部分もしくは親水性部分を分離するため、第二の親水性もしくは親油性の部分から第一の親水性もしくは親油性の部分を分離するため、またはリンカー部分から親水性部分もしくは親油性部分を分離するために用いられ得る。スペーサー部分は、糖、コレステロールおよびグリセリンの部分からなる群より選択されることが好ましい。
【００７０】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、カルシトニン薬とオリゴマーとを結合するために用いられる１つ以上のリンカー部分をさらに含み得る。リンカー部分はアルキル部分および脂肪酸部分からなる群より選択されることが好ましい。
【００７１】
オリゴマーはカルシトニン薬に結合しないオリゴマーの１つ以上の端部に１つ以上の末端部分をさらに含んでよい。末端部分はアルキルまたはアルコキシの部分であることが好ましく、低級アルキルまたは低級アルコキシの部分であることがより好ましい。最も好ましくは、末端部分はメチルまたはメトキシである。末端部分はアルキルまたはアルコキシの部分であることが好ましいが、当業者に理解されるように、末端部分は糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸を含むが、これらに限定されない種々の部分であってよいと理解されねばならない。
【００７２】
オリゴマーはカルシトニン薬に共有結合することが好ましい。ある実施形態において、カルシトニン薬は加水分解性結合（例えばエステル結合またはカーボネート結合）を利用してオリゴマーと結合する。加水分解性結合はプロドラッグとして作用するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートを提供することができる。１例において、例えばカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートが不活性である場合（即ち、該コンジュゲートがカルシトニン薬の一次作用機構を通じて身体に影響を及ぼす能力を欠失する）、１つ以上のオリゴマーがそれらの個別のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートから開裂し、活性薬物を提供するので、加水分解性結合は、所定の期間にわたってカルシトニン薬を投与する、徐放性または制御放出の効果を提供することができる。他の実施形態において、カルシトニン薬は非加水分解性結合（例えば、カルバメート結合、アミド結合、またはエーテル結合）を利用してオリゴマーと結合する。非加水分解性結合の使用は、長期間、好ましくは少なくとも２時間、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートが血流で循環できることが望ましい場合に、好ましいかもしれない。オリゴマーがカルシトニン薬と共有結合する場合、オリゴマーは、当業者に理解されるように、カルシトニン薬とオリゴマーとを共有結合するために用いられる１つ以上の結合部分をさらに含む。結合部分は、共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分および第二級アミン部分からなる群より選択されることが好ましい。オリゴマーの１より多い部分がカルシトニン薬と共有結合し得る。
【００７３】
オリゴマーがカルシトニン薬と共有結合することが好ましいが、オリゴマーがカルシトニン薬と非共有結合して非共有結合のカルシトニン薬−オリゴマー錯体を形成し得ることが理解されるべきである。当業者に理解されるように、非共有結合は、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、およびミセル封入またはリポソーム封入を含むが、これらに限定されない。本発明の実施形態により、オリゴマーは、当業者に理解されるように、選択様式で非共有結合能を付与するため（例えば、水素結合能を付与するため）、好適に構築、修飾および／または適切に官能化され得る。本発明の他の実施形態により、オリゴマーは、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、およびアミノサリチル酸誘導体を含むが、これらに限定されない種々の化合物で誘導体化され得る。生じるオリゴマーは、薬物分子、医薬品、および／または製剤賦形剤と非共有結合（錯体形成）し得る。生じる錯体は均衡のとれた親油性および親水性を有することが好ましい。本発明の更に他の実施形態により、オリゴマーはアミンおよび／またはアルキルアミンで誘導体化され得る。適切な酸性条件下で、生じたオリゴマーは薬物分子、医薬品および／または製剤賦形剤と非共有結合した錯体を形成し得る。このような錯化から得られる生成物は均衡のとれた親油性・親水性を有することが好ましい。
【００７４】
１より多いオリゴマー（即ち、複数のオリゴマー）がカルシトニン薬と結合し得る。複数のオリゴマーは同じであることが好ましい。しかしながら、複数のオリゴマーが互いに異なり得る又は複数のオリゴマーの幾つかは同じで幾つかは異なり得ることが理解されるべきである。複数のオリゴマーがカルシトニン薬と結合する場合、１つ以上のオリゴマーが加水分解性結合でカルシトニン薬と結合し、また１つ以上のオリゴマーが非加水分解性結合でカルシトニン薬と結合することが好ましいこともある。または、複数のオリゴマーをカルシトニン薬と結び付ける全ての結合は加水分解性であってよいが、例えば、１つ以上のオリゴマーが体内での加水分解によりカルシトニン薬から速やかに取り外され、かつ１つ以上のオリゴマーが体内での加水分解によりカルシトニン薬から徐々に取り外されるような、様々な程度の加水分解性を有する。
【００７５】
オリゴマーは、求核性のヒドロキシル官能基および／またはアミノ官能基を含むがこれらに限定されないカルシトニン薬の様々な求核性残基でカルシトニン薬と結合し得る。カルシトニン薬がポリペプチドである場合、求核性ヒドロキシル官能基は例えばセリンおよび／またはチロシン残基で見出され、求核性アミノ官能基は例えばヒスチジンおよび／もしくはリシン残基で、ならびに／またはポリペプチドのＮ末端１つ以上で見出され得る。オリゴマーがカルシトニン・ポリペプチドのＮ末端１つ以上に結合すると、結合は第二級アミンを形成することが好ましい。カルシトニン薬がサケ・カルシトニンである場合、例えば、オリゴマーは、Ｌｙｓ11、Ｌｙｓ18および／またはＮ末端のアミノ官能基を含む、サケ・カルシトニンのアミノ官能基に結合し得る。１つ以上のオリゴマーはサケ・カルシトニンに結合し得るが、オリゴマーがＬｙｓ11およびＬｙｓ18のアミノ官能基に結合する場合、血清カルシウム低減能の向上など、より高い生物有効性がジコンジュゲート・サケ・カルシトニンで観察される。
【００７６】
本発明の実質的に単分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物は種々の方法により合成され得る。例えば、カルボン酸およびポリエチレングリコールからなる実質的に単分散のオリゴマー混合物は、実質的に単分散のオリゴマー混合物を提供するのに十分な条件の下で、実質的に単分散のカルボン酸混合物を実質的に単分散のポリエチレングリコール混合物と接触させることにより合成される。実質的に単分散の混合物のオリゴマーは次いでカルシトニン薬と反応できるように活性化されカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートを提供する。実質的に単分散のオリゴマー混合物を提供するための合成経路の１実施形態は図３に図示され下記の実施例１１〜１８に記載される。実質的に単分散のオリゴマー混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図４に図示され下記の実施例１９〜２４に記載される。実質的に単分散のオリゴマー混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図５に図示され下記の実施例２５〜２９に記載される。実質的に単分散のオリゴマー混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図６に図示され下記の実施例３０〜３１に記載される。実質的に単分散のオリゴマー混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図７に図示され下記の実施例３２〜３７に記載される。実質的に単分散のオリゴマー混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図８に図示され下記の実施例３８に記載される。実質的に単分散のオリゴマー混合物を提供するための更なる他の合成経路の実施形態は図９に図示され下記の実施例３９に記載される。実質的に単分散のオリゴマー混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図１０に図示され下記の実施例４０に記載される。
【００７７】
実質的に単分散の活性オリゴマー混合物は、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供するのに十分な条件の下で、実質的に単分散のカルシトニン薬混合物と反応し得る。好ましい合成は下記の実施例４１に記載される。当業者に理解されるように、反応条件（例えば、選択されるモル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、実質的に単分散の活性オリゴマー混合物と実質的に単分散のカルシトニン薬混合物との反応から生じるカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物が、実質的に単分散の混合物であるように制御され得る。例えば、リシンのアミノ官能基での結合は反応溶液のｐＨをリシンのｐＫaより下に維持することにより抑制できる。または、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、例えばＨＰＬＣを利用して分離および単離され、実質的に単分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物、例えばモノ−、ジ−、またはトリ−コンジュゲート混合物を提供できる。特定の単離コンジュゲートのコンジュゲーションの程度（例えば、単離分子がモノ−、ジ−、またはトリ−コンジュゲートであるか否か）は、当業者に理解されるように、質量分析を含むがこれに限定されない種々の技法を利用して、測定および／または確認できる。特定のコンジュゲート構造（例えば、オリゴマーがサケ・カルシトニンモノコンジュゲートのＬｙｓ11、Ｌｙｓ18またはＮ末端にあるか否か）は、当業者に理解されるように、配列解析、ペプチド・マッピング、選択的酵素切断、および／またはエンドペプチダーゼ切断を含むが、これらに限定されない種々の技法を利用して、測定および／または確認することができる。
【００７８】
当業者に理解されるように、カルシトニン薬の１つ以上の反応部位は、例えば、カルシトニン薬をＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）またはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）などの適切な遮断試薬と反応させることにより、遮断され得る。この過程は、例えばカルシトニン薬がポリペプチドであり、該ポリペプチドのＮ末端にオリゴマーを有する不飽和コンジュゲート（即ち、全ての求核性残基が結合するとは限らないコンジュゲート）を形成することが望ましい場合に好ましいかもしれない。このような遮断後、実質的に単分散の遮断カルシトニン薬混合物は実質的に単分散の活性オリゴマー混合物と反応し、１つ以上の求核性残基と結合するオリゴマーを有し且つ他の求核性残基と結合する遮断部分を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供できる。コンジュゲーション反応後、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートは、当業者に理解されるように、脱遮断され得る。必要ならば、次にカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は上述したように分離され実質的に単分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供できる。または、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は脱遮断前に分離できる。
【００７９】
本発明の実施形態による実質的に単分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物は、従来の混合物の性質と比較すると、向上した性質を有することが好ましい。例えば、実質的に単分散のカルシトニン−オリゴマーコンジュゲート混合物は少なくとも５パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができる。好ましくは、該コンジュゲートの混合物は少なくとも１０、１１、１２、１３または１４パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができる。より好ましくは、該コンジュゲートの混合物は、少なくとも１５、１６、１７、１８または１９パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができ、最も好ましくは、該コンジュゲートの混合物は少なくとも２０パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができる。
【００８０】
他の例として、実質的に単分散のカルシトニン−オリゴマーコンジュゲート混合物は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性とそれぞれ比較すると、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性が増すことが好ましい。キモトリプシンまたはトリプシンに対する耐性は、試験される分子が下記の実施例５１で概説される手法を用いて適用酵素で分解される際に残存する百分率に相当する。好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーとコンジュゲートしないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約１０パーセント高い。より好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーとコンジュゲートしないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約１５パーセント高く、最も好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーとコンジュゲートしないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約２０パーセント高い。好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーとコンジュゲートしないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約１０パーセント高い。より好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーとコンジュゲートしないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約２０パーセント高い。最も好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーとコンジュゲートしないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約３０パーセント高い。
【００８１】
更なる他の例として、実質的に単分散のカルシトニン−オリゴマーコンジュゲート混合物は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より高い生物有効性を有することが好ましい。特定化合物の生物有効性はその曲線下面積（ＡＵＣ）値に相当する。好ましくは、該混合物の生物有効性はオリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より約５パーセント高い。より好ましくは、該混合物の生物有効性はオリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より約１０パーセント高い。
【００８２】
更なる他の例として、実質的に単分散のカルシトニン−オリゴマーコンジュゲート混合物は、実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のインビボ活性より高いインビボ活性を有することが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、例えばＨ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ  ＆  Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ３９４−４０２（２ｄ．ｅｄ．，１９９１）に記載されるゲル透過クロマトグラフィーなどのサイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【００８３】
他の例として、実質的に単分散のカルシトニン−オリゴマーコンジュゲート混合物は、実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のインビトロ活性より高いインビトロ活性を有することが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【００８４】
更なる他の例として、実質的に単分散のカルシトニン−オリゴマーコンジュゲート混合物は、実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性と比べると、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性が増すことが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【００８５】
更なる他の例として、実質的に単分散のカルシトニン−オリゴマーコンジュゲート混合物は、実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物の被験者間変動より低い被験者間変動を有することが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。被験者間変動は、当業者に理解されるように、種々の方法により測定することができる。被験者間変動は下記の通りに計算されるのが好ましい。用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）（即ち、用量反応曲線と基線値との間の面積）は個々の被験者について測定される。全被験者の平均ＡＵＣは、各被験者のＡＵＣを合計し、その和を被験者数で割ることにより決定される。次に、被験者のＡＵＣと平均ＡＵＣとの差の絶対値が各被験者について決定される。次いで、得られた差の絶対値は合計され、被験者間変動を表す数値が得られる。低い値は低い被験者間変動を表し、高い値は高い被験者間変動を表す。
【００８６】
本発明の実施形態による実質的に単分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物は上述の向上した性質２つ以上を有することが好ましい。より好ましくは、本発明の実施形態による実質的に単分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物は上述の向上した性質３つ以上を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による実質的に単分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物は上述の向上した性質４つ以上を有する。
【００８７】
本発明の更なる他の実施形態において、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するコンジュゲート混合物が提供される。該混合物中の各コンジュゲートはポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーと結合したカルシトニン薬を含む。標準偏差は約１４ダルトン未満であることが好ましく、約１１ダルトン未満であることがより好ましい。分子量分布は、例えばＨ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ  ＆  Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ３９４−４０２（２ｄ．ｅｄ．，１９９１）に記載されるゲル透過クロマトグラフィーなどのサイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない、当業者に公知の方法により測定することができる。次いで、分子量分布の標準偏差は、当業者に理解されるように、統計学的方法により決定することができる。
【００８８】
カルシトニン薬は、好ましくはカルシトニンであろう。より好ましくは、カルシトニン薬はサケ・カルシトニンである。しかしながら、カルシトニン薬は、例えば、カルシトニン前駆ペプチド、カルシトニン、カルシトニン類似体、カルシトニン断片、およびカルシトニン断片類似体を含む、当業者に公知の様々なカルシトニン薬から選択できることが理解されるべきである。カルシトニン前駆ペプチドは、カタカルシン（ＰＤＮ−２１）（Ｃ−プロカルシトニン）、およびＮ−ｐｒｏＣＴ（アミノ末端プロカルシトニン切断ペプチド）、ヒトを含むが、これらに限定されない。カルシトニン類似体は上述のカルシトニンにおける１つ以上のアミノ酸の置換により提供され得る。カルシトニン断片は、カルシトニン１−７、ヒト；およびカルシトニン８−３２、サケを含むが、これらに限定されない。カルシトニン断片類似体は上述のカルシトニン断片中の１つ以上のアミノ酸の置換により提供され得る。
【００８９】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、ポリエチレングリコール部分を含む種々のオリゴマーであってよい。好ましくは、オリゴマーのポリエチレングリコール部分は少なくとも２、３または４のポリエチレングリコール・サブユニットを有する。より好ましくは、ポリエチレングリコール部分は少なくとも５または６のポリエチレングリコール・サブユニットを有し、最も好ましくは、ポリエチレングリコール部分は少なくとも７のポリエチレングリコール・サブユニットを有する。
【００９０】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、追加の親水性部分、親油性部分、スペーサー部分、リンカー部分、および末端部分を含むが、これらに限定されない、１つ以上の他の部分を含んでよい。オリゴマーの種々の部分は加水分解性結合または非加水分解性結合のいずれかにより互いに共有結合する。
【００９１】
オリゴマーは、糖、ポリアルキレンオキシド、およびポリアミン／ＰＥＧ共ポリマーを含むが、これらに限定されない１つ以上の追加の親水性部分（即ち、ポリエチレングリコール部分に加えた部分）をさらに含み得る。ポリエチレングリコールはポリアルキレンオキシドであるため、追加の親水性部分はポリエチレングリコール部分であってもよい。隣接のポリエチレングリコール部分は、エーテル結合により結合する場合、同じ部分であると考えられる。例えば、
【化１４】
2007521268.tif 000021
の部分は６つのポリエチレングリコール・サブユニットを有する一つのポリエチレングリコール部分である。この部分がオリゴマーにおける唯一つの親水性部分である場合、オリゴマーは追加の親水性部分を含まない。隣接のポリエチレングリコール部分は、エーテル結合以外の結合により結合する場合、異なる部分であると考えられる。例えば、
【化１５】
2007521268.tif 000022
の部分は、４つのポリエチレングリコール・サブユニットを有するポリエチレングリコール部分および２つのポリエチレングリコール・サブユニットを有する追加の親水性部分である。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーは、ポリエチレングリコール部分を含むが、追加の親水性部分を含まない。
【００９２】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、１つ以上の親油性部分をさらに含み得る。親油性部分は、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐のアルキル部分、または飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐の脂肪酸部分であることが好ましい。親油性部分がアルキル部分である場合、１から２８の炭素原子を有する直鎖の飽和または不飽和のアルキル部分であることが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２から１２の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合、２から１８の炭素原子を有する直鎖の飽和または不飽和である天然脂肪酸部分であることが好ましい。より好ましくは、脂肪酸部分は３から１４の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４、５または６の炭素原子を有する。
【００９３】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、１つ以上のスペーサー部分を更に含み得る。スペーサー部分は、例えば、親油性部分から親水性部分を分離するため、カルシトニン薬から親油性部分もしくは親水性部分を分離するため、第二の親水性もしくは親油性の部分から第一の親水性もしくは親油性の部分を分離するため、またはリンカー部分から親水性部分もしくは親油性部分を分離するために用いられ得る。スペーサー部分は、糖、コレステロールおよびグリセリンの部分からなる群より選択されることが好ましい。
【００９４】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、カルシトニン薬とオリゴマーとを結合するために用いられるリンカー部分１つ以上をさらに含み得る。リンカー部分は、好ましくは、アルキル部分および脂肪酸部分からなる群より選択される。
【００９５】
オリゴマーはカルシトニン薬に結合しないオリゴマーの１つ以上の端部に１つ以上の末端部分をさらに含んでよい。末端部分はアルキルまたはアルコキシの部分であることが好ましく、低級アルキルまたは低級アルコキシの部分であることがより好ましい。最も好ましくは、末端部分はメチルまたはメトキシである。末端部分はアルキルまたはアルコキシの部分であることが好ましいが、当業者に理解されるように、末端部分は糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸を含むが、これらに限定されない種々の部分であってよいと理解されねばならない。
【００９６】
オリゴマーはカルシトニン薬に共有結合することが好ましい。ある実施形態において、カルシトニン薬は加水分解性結合（例えばエステル結合またはカーボネート結合）を利用してオリゴマーと結合する。加水分解性結合はプロドラッグとして作用するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートを提供することができる。１例において、例えばカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートが不活性である場合（即ち、該コンジュゲートがカルシトニン薬の一次作用機構を通じて身体に影響を及ぼす能力を欠失する）、１つ以上のオリゴマーがそれらの個別のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートから開裂し、活性薬物を提供するので、加水分解性結合は、所定の期間にわたってカルシトニン薬を投与する徐放性または制御放出の効果を提供することができる。他の実施形態において、カルシトニン薬は非加水分解性結合（例えば、カルバメート結合、アミド結合、またはエーテル結合）を利用してオリゴマーと結合する。非加水分解性結合の使用は、長期間、好ましくは少なくとも２時間、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートが血流で循環できることが望ましい場合に、好ましいかもしれない。オリゴマーがカルシトニン薬と共有結合する場合、オリゴマーは、当業者に理解されるように、カルシトニン薬とオリゴマーとを共有結合するために用いられる１つ以上の結合部分をさらに含む。結合部分は、共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分および第二級アミン部分からなる群より選択されることが好ましい。オリゴマーの１より多い部分がカルシトニン薬と共有結合し得る。
【００９７】
オリゴマーがカルシトニン薬と共有結合することが好ましいが、オリゴマーがカルシトニン薬と非共有結合して非共有結合のカルシトニン薬−オリゴマー錯体を形成できることが理解されるべきである。当業者に理解されるように、非共有結合は、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、およびミセル封入またはリポソーム封入を含むが、これらに限定されない。本発明の実施形態により、オリゴマーは、当業者に理解されるように、選択様式で非共有結合能を付与するため（例えば、水素結合能を付与するため）、好適に構築、修飾および／または適切に官能化され得る。本発明の他の実施形態により、オリゴマーは、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、およびアミノサリチル酸誘導体を含むが、これらに限定されない種々の化合物で誘導体化され得る。得られるオリゴマーは、薬物分子、医薬品、および／または製剤賦形剤と非共有結合（錯体形成）し得る。得られる錯体は、好ましくは、均衡のとれた親油性および親水性を有する。本発明の更に他の実施形態により、オリゴマーはアミンおよび／またはアルキルアミンで誘導体化され得る。適切な酸性条件下で、生じたオリゴマーは薬物分子、医薬品および／または製剤賦形剤と非共有結合した錯体を形成し得る。このような錯化から生じる生成物は、好ましくは、均衡のとれた親油性および親水性を有する。
【００９８】
１より多いオリゴマー（即ち、複数のオリゴマー）がカルシトニン薬と結合し得る。複数のオリゴマーは同じであることが好ましい。しかしながら、複数のオリゴマーが互いに異なり得る又は複数のオリゴマーの幾つかは同じで幾つかは異なり得ることが理解されるべきである。複数のオリゴマーがカルシトニン薬と結合する場合、１つ以上のオリゴマーが加水分解性結合でカルシトニン薬と結合し、また１つ以上のオリゴマーが非加水分解性結合でカルシトニン薬と結合することが好ましいこともある。または、複数のオリゴマーをカルシトニン薬と結び付ける全ての結合は加水分解性であってよいが、例えば、１つ以上のオリゴマーが体内での加水分解によりカルシトニン薬から速やかに取り外され、かつ１つ以上のオリゴマーが体内での加水分解によりカルシトニン薬から徐々に取り外されるような、様々な程度の加水分解性を有する。
【００９９】
オリゴマーは、求核性のヒドロキシル官能基および／またはアミノ官能基を含むがこれらに限定されないカルシトニン薬の様々な求核性残基でカルシトニン薬と結合し得る。カルシトニン薬がポリペプチドである場合、求核性ヒドロキシル官能基は例えばセリンおよび／またはチロシン残基で見出され、求核性アミノ官能基は例えばヒスチジンおよび／もしくはリシン残基で、ならびに／または１つ以上のポリペプチドのＮ末端で見出され得る。オリゴマーがカルシトニン・ポリペプチドの１つ以上のＮ末端に結合すると、好ましくは、結合は第二級アミンを形成する。カルシトニン薬がサケ・カルシトニンである場合、例えば、オリゴマーは、Ｌｙｓ11、Ｌｙｓ18および／またはＮ末端のアミノ官能基を含む、サケ・カルシトニンのアミノ官能基に結合し得る。１つ以上のオリゴマーはサケ・カルシトニンに結合し得るが、オリゴマーがＬｙｓ11およびＬｙｓ18のアミノ官能基に結合する場合、血清カルシウム低減能の向上など、より高い生物有効性がジコンジュゲートサケ・カルシトニンで観察される。
【０１００】
標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は種々の方法により合成され得る。例えば、カルボン酸およびポリエチレングリコールからなり標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するオリゴマーの混合物は、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するオリゴマーの混合物を提供するのに十分な条件の下で、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルボン酸の混合物を標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するポリエチレングリコール混合物と接触させることにより合成される。次いで、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する混合物のオリゴマーはカルシトニン薬と反応できるように活性化され、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートを提供する。標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の１実施形態は図３に図示され下記の実施例１１〜１８に記載される。標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図４に図示され下記の実施例１９〜２４に記載される。標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図５に図示され下記の実施例２５〜２９に記載される。標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図６に図示され下記の実施例３０〜３１に記載される。標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図７に図示され下記の実施例３２〜３７に記載される。標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図８に図示され下記の実施例３８に記載される。標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための更なる他の合成経路の実施形態は図９に図示され下記の実施例３９に記載される。標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図１０に図示され下記の実施例４０に記載される。
【０１０１】
標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する活性オリゴマーの混合物は、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供するのに十分な条件の下で、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬の混合物と反応する。好ましい合成は下記の実施例４１に記載される。当業者に理解されるように、反応条件（例えば、選択されるモル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する活性オリゴマーの混合物と、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬の混合物との反応から生じるカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物が、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する混合物であるように制御することができる。例えば、リシンのアミノ官能基でのコンジュゲーションは反応溶液のｐＨをリシンのｐＫaより下に維持することにより抑制できる。または、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、例えばＨＰＬＣを利用して分離および単離でき、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物、例えばモノ−、ジ−、またはトリ−コンジュゲートの混合物を提供し得る。特定の単離コンジュゲートのコンジュゲーションの程度（例えば、単離分子がモノ−、ジ−、またはトリ−コンジュゲートであるか否か）は、質量分析を含むがこれに限定されない、当業者に理解される種々の技法を利用して、測定および／または確認され得る。特定のコンジュゲート構造（例えば、オリゴマーがサケ・カルシトニンモノコンジュゲートのＬｙｓ１１、Ｌｙｓ１８またはＮ末端にあるか否か）は、配列解析、ペプチド・マッピング、選択的酵素切断、および／またはエンドペプチダーゼ切断を含むが、これらに限定されない、当業者に理解される種々の技法を利用して、測定および／または確認され得る。
【０１０２】
当業者に理解されるように、カルシトニン薬の１つ以上の反応部位は、例えば、カルシトニン薬をＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）またはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）などの適切な遮断試薬と反応させることにより、遮断できる。この過程は、例えばカルシトニン薬がポリペプチドであり、該ポリペプチドのＮ末端にオリゴマーを有する不飽和コンジュゲート（即ち、全ての求核性残基が結合するとは限らないコンジュゲート）を形成するのが望ましい場合に好ましいかもしれない。このような遮断後、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する遮断カルシトニン薬の混合物は、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有する活性オリゴマーの混合物と反応し、１つ以上の求核性残基と結合するオリゴマーを有し且つ他の求核性残基と結合する遮断部分を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供できる。コンジュゲーション反応後、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートは、当業者に理解されるように、脱遮断することができる。必要ならば、次にカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は上述したように分離し、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供できる。または、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は脱遮断前に分離することができる。
【０１０３】
本発明の実施形態による標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、従来の混合物の性質と比較すると、改良された性質を有することが好ましい。例えば、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は少なくとも５パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができる。好ましくは、該コンジュゲートの混合物は少なくとも１０、１１、１２、１３または１４パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができる。より好ましくは、該コンジュゲートの混合物は、少なくとも１５、１６、１７、１８または１９パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができ、最も好ましくは、該コンジュゲートの混合物は少なくとも２０パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができる。
【０１０４】
他の例として、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性とそれぞれ比較すると、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性が増すことが好ましい。キモトリプシンまたはトリプシンに対する耐性は、試験される分子が下記の実施例５１で概説される手法に類似する手法を用いて適用酵素で分解される際に残存する百分率に相当する。好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約１０パーセント高い。より好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約１５パーセント高く、最も好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約２０パーセント高い。好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約１０パーセント高い。より好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約２０パーセント高い。最も好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約３０パーセント高い。
【０１０５】
更なる他の例として、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より高い生物有効性を有するのが好ましい。特定化合物の生物有効性はその曲線下面積（ＡＵＣ）値に相当する。好ましくは、該混合物の生物有効性はオリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より約５パーセント高い。より好ましくは、該混合物の生物有効性はオリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より約１０パーセント高い。
【０１０６】
更なる他の例として、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のインビボ活性より高いインビボ活性を有することが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、例えばＨ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ  ＆  Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ３９４−４０２（２ｄ．ｅｄ．，１９９１）に記載されるゲル透過クロマトグラフィーなどのサイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【０１０７】
他の例として、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のインビトロ活性より高いインビトロ活性を有することが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【０１０８】
更なる他の例として、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性と比べると、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性が増すことが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【０１０９】
更なる他の例として、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物の被験者間変動より低い被験者間変動を有することが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。被験者間変動は、当業者に理解されるように、種々の方法により測定することができる。被験者間変動は下記の通りに計算されることが好ましい。用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）（即ち、用量反応曲線と基線値との間の面積）は個々の被験者について測定される。全被験者の平均ＡＵＣは、各被験者のＡＵＣを合計し、その和を被験者数で割ることにより決定される。次に、被験者のＡＵＣと平均ＡＵＣとの差の絶対値が各被験者について決定される。次いで、得られた差の絶対値は合計され、被験者間変動を表す数値が得られる。低い値は低い被験者間変動を表し、高い値は高い被験者間変動を表す。
【０１１０】
本発明の実施形態による標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は上述の向上した性質２つ以上を有することが好ましい。より好ましくは、本発明の実施形態による標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は上述の向上した性質３つ以上を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は上述の向上した性質４つ以上を有する。
【０１１１】
本発明の更なる他の実施形態により、コンジュゲートの混合物が提供され、それぞれのコンジュゲートはポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーと結合したカルシトニン薬を含み、該混合物は、
【数６】
2007521268.tif 000023
において、１０，０００を上回る分散係数（ＤＣ）を有し、
式中：
ｎは試料中の異なる分子の数であり、
Ｎiは試料中のｉ番目分子の数であり、
Ｍiはｉ番目分子の質量である。
【０１１２】
コンジュゲートの混合物は１００，０００を上回る分散係数を有することが好ましい。より好ましくは、コンジュゲート混合物の分散係数は５００，０００を超え、最も好ましくは、分散係数は１０，０００，０００を超える。変数ｎ、Ｎi、およびＭiは、実施例４９で後述される方法を含むがこれに限定されない、当業者に理解される種々の方法により測定することができる。
【０１１３】
カルシトニン薬はカルシトニンであることが好ましい。より好ましくは、カルシトニン薬はサケ・カルシトニンである。しかしながら、カルシトニン薬は、例えば、カルシトニン前駆ペプチド、カルシトニン、カルシトニン類似体、カルシトニン断片、およびカルシトニン断片類似体を含む、当業者に公知の種々のカルシトニン薬から選択され得ることが理解されるべきである。カルシトニン前駆ペプチドは、カタカルシン（ＰＤＮ−２１）（Ｃ−プロカルシトニン）、およびＮ−ｐｒｏＣＴ（アミノ末端プロカルシトニン切断ペプチド）、ヒトを含むが、これらに限定されない。カルシトニン類似体は上述のカルシトニンにおける１つ以上のアミノ酸の置換により提供され得る。カルシトニン断片は、カルシトニン１−７、ヒト；およびカルシトニン８−３２、サケを含むが、これらに限定されない。カルシトニン断片類似体は上述のカルシトニン断片中の１つ以上のアミノ酸の置換により提供され得る。
【０１１４】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、ポリエチレングリコール部分を含む種々のオリゴマーであってよい。好ましくは、オリゴマーのポリエチレングリコール部分は少なくとも２、３または４のポリエチレングリコール・サブユニットを有する。より好ましくは、ポリエチレングリコール部分は少なくとも５または６のポリエチレングリコール・サブユニットを有し、最も好ましくは、ポリエチレングリコール部分は少なくとも７のポリエチレングリコール・サブユニットを有する。
【０１１５】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、追加の親水性部分、親油性部分、スペーサー部分、リンカー部分、および末端部分を含むが、これらに限定されない、１つ以上の他の部分を含み得る。オリゴマーの種々の部分は加水分解性結合または非加水分解性結合のいずれかにより互いに共有結合する。
【０１１６】
オリゴマーは、糖、ポリアルキレンオキシド、およびポリアミン／ＰＥＧ共ポリマーを含むが、これらに限定されない１つ以上の追加の親水性部分（即ち、ポリエチレングリコール部分に加えた部分）をさらに含み得る。ポリエチレングリコールはポリアルキレンオキシドであるため、追加の親水性部分はポリエチレングリコール部分であってもよい。隣接のポリエチレングリコール部分は、エーテル結合により結合する場合、同じ部分であると考えられる。例えば、
【化１６】
2007521268.tif 000024
の部分は６つのポリエチレングリコール・サブユニットを有する一つのポリエチレングリコール部分である。この部分がオリゴマーにおける唯一つの親水性部分である場合、オリゴマーは追加の親水性部分を含まない。隣接のポリエチレングリコール部分は、エーテル結合以外の結合により結合する場合、異なる部分であると考えられる。例えば、
【化１７】
2007521268.tif 000025
の部分は、４つのポリエチレングリコール・サブユニットを有するポリエチレングリコール部分および２つのポリエチレングリコール・サブユニットを有する追加の親水性部分である。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーは、ポリエチレングリコール部分を含むが、追加の親水性部分を含まない。
【０１１７】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、１つ以上の親油性部分をさらに含み得る。親油性部分は、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐のアルキル部分、または飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐の脂肪酸部分であることが好ましい。親油性部分がアルキル部分である場合、１から２８の炭素原子を有する直鎖の飽和または不飽和のアルキル部分であることが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２から１２の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合、２から１８の炭素原子を有する直鎖の飽和または不飽和である天然脂肪酸部分であることが好ましい。より好ましくは、脂肪酸部分は３から１４の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４、５または６の炭素原子を有する。
【０１１８】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、１つ以上のスペーサー部分を更に含み得る。スペーサー部分は、例えば、親油性部分から親水性部分を分離するため、カルシトニン薬から親油性部分もしくは親水性部分を分離するため、第二の親水性もしくは親油性の部分から第一の親水性もしくは親油性の部分を分離するため、またはリンカー部分から親水性部分もしくは親油性部分を分離するために用いられ得る。スペーサー部分は、糖、コレステロールおよびグリセリンの部分からなる群より選択されることが好ましい。
【０１１９】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、カルシトニン薬とオリゴマーとを結合するために用いられるリンカー部分１つ以上をさらに含み得る。リンカー部分は、好ましくは、アルキル部分および脂肪酸部分からなる群より選択される。
【０１２０】
オリゴマーはカルシトニン薬に結合しないオリゴマーの１つ以上の端部に１つ以上の末端部分をさらに含んでよい。末端部分はアルキルまたはアルコキシの部分であることが好ましく、低級アルキルまたは低級アルコキシの部分であることがより好ましい。最も好ましくは、末端部分はメチルまたはメトキシである。末端部分はアルキルまたはアルコキシの部分であることが好ましいが、当業者に理解されるように、末端部分は、糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸を含むが、これらに限定されない種々の部分であってよいと理解されねばならない。
【０１２１】
オリゴマーはカルシトニン薬に共有結合することが好ましい。ある実施形態において、カルシトニン薬は加水分解性結合（例えばエステル結合またはカーボネート結合）を利用してオリゴマーと結合する。加水分解性結合はプロドラッグとして作用するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートを提供することができる。１例において、例えばカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートが不活性である場合（即ち、該コンジュゲートがカルシトニン薬の一次作用機構を通じて身体に影響を及ぼす能力を欠失する）、１つ以上のオリゴマーがそれらの個別のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートから開裂し、活性薬物を提供するので、加水分解性結合は、所定の期間にわたってカルシトニン薬を投与する徐放性または制御放出の効果を提供することができる。他の実施形態において、カルシトニン薬は非加水分解性結合（例えば、カルバメート結合、アミド結合、またはエーテル結合）を利用してオリゴマーと結合する。非加水分解性結合の使用は、長期間、好ましくは少なくとも２時間、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートが血流で循環できることが望ましい場合に、好ましいかもしれない。オリゴマーがカルシトニン薬と共有結合する場合、オリゴマーは、当業者に理解されるように、カルシトニン薬とオリゴマーとを共有結合するために用いられる１つ以上の結合部分をさらに含む。結合部分は、共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分および第二級アミン部分からなる群より選択されることが好ましい。オリゴマーの１より多い部分がカルシトニン薬と共有結合し得る。
【０１２２】
オリゴマーがカルシトニン薬と共有結合することが好ましいが、オリゴマーがカルシトニン薬と非共有結合して非共有結合のカルシトニン薬−オリゴマー錯体を形成できることが理解されるべきである。当業者に理解されるように、非共有結合は、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、およびミセル封入またはリポソーム封入を含むが、これらに限定されない。本発明の実施形態により、オリゴマーは、当業者に理解されるように、選択様式で非共有結合能を付与するため（例えば、水素結合能を付与するため）、好適に構築、修飾および／または適切に官能化され得る。本発明の他の実施形態により、オリゴマーは、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、およびアミノサリチル酸誘導体を含むが、これらに限定されない種々の化合物で誘導体化され得る。得られるオリゴマーは、薬物分子、医薬品、および／または製剤賦形剤と非共有結合（錯体形成）し得る。得られる錯体は、好ましくは、均衡のとれた親油性および親水性を有する。本発明の更に他の実施形態により、オリゴマーはアミンおよび／またはアルキルアミンで誘導体化され得る。適切な酸性条件下で、生じたオリゴマーは薬物分子、医薬品および／または製剤賦形剤と非共有結合した錯体を形成し得る。このような錯化から生じる生成物は、好ましくは、均衡のとれた親油性および親水性を有する。
【０１２３】
１より多いオリゴマー（即ち、複数のオリゴマー）がカルシトニン薬と結合し得る。複数のオリゴマーは同じであることが好ましい。しかしながら、複数のオリゴマーが互いに異なり得る又は複数のオリゴマーの幾つかは同じで幾つかは異なり得ることが理解されるべきである。複数のオリゴマーがカルシトニン薬と結合する場合、１つ以上のオリゴマーが加水分解性結合でカルシトニン薬と結合し、また１つ以上のオリゴマーが非加水分解性結合でカルシトニン薬と結合することが好ましいこともある。または、複数のオリゴマーをカルシトニン薬と結び付ける全ての結合は加水分解性であってよいが、例えば、１つ以上のオリゴマーが体内での加水分解によりカルシトニン薬から速やかに取り外され、かつ１つ以上のオリゴマーが体内での加水分解によりカルシトニン薬から徐々に取り外されるような、様々な程度の加水分解性を有する。
【０１２４】
オリゴマーは、求核性のヒドロキシル官能基および／またはアミノ官能基を含むがこれらに限定されないカルシトニン薬の様々な求核性残基でカルシトニン薬と結合し得る。カルシトニン薬がポリペプチドである場合、求核性ヒドロキシル官能基は例えばセリンおよび／またはチロシン残基で見出され、求核性アミノ官能基は例えばヒスチジンおよび／もしくはリシン残基で、ならびに／または１つ以上のポリペプチドのＮ末端で見出され得る。オリゴマーがカルシトニン・ポリペプチドの１つ以上のＮ末端に結合すると、好ましくは、結合は第二級アミンを形成する。カルシトニン薬がサケ・カルシトニンである場合、例えば、オリゴマーは、Ｌｙｓ11、Ｌｙｓ18および／またはＮ末端のアミノ官能基を含む、サケ・カルシトニンのアミノ官能基に結合し得る。１つ以上のオリゴマーはサケ・カルシトニンに結合し得るが、オリゴマーがＬｙｓ11およびＬｙｓ18のアミノ官能基に結合する場合、血清カルシウム低減能の向上など、より高い生物有効性がジコンジュゲートサケ・カルシトニンで観察される。
【０１２５】
１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は種々の方法により合成され得る。例えば、カルボン酸およびポリエチレングリコールからなり１０，０００を超える分散係数を有するオリゴマーの混合物は、１０，０００を超える分散係数を有するオリゴマーの混合物を提供するのに十分な条件の下で、１０，０００を超える分散係数を有するカルボン酸混合物を、１０，０００を超える分散係数を有するポリエチレングリコール混合物と接触させることにより合成される。次いで１０，０００を超える分散係数を有する混合物のオリゴマーはカルシトニン薬と反応できるように活性化され、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートを提供する。１０，０００を超える分散係数を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の１実施形態は図３に図示され下記の実施例１１〜１８に記載される。１０，０００を超える分散係数を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図４に図示され下記の実施例１９〜２４に記載される。１０，０００を超える分散係数を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図５に図示され下記の実施例２５〜２９に記載される。１０，０００を超える分散係数を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図６に図示され下記の実施例３０〜３１に記載される。１０，０００を超える分散係数を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図７に図示され下記の実施例３２〜３７に記載される。１０，０００を超える分散係数を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図８に図示され下記の実施例３８に記載される。１０，０００を超える分散係数を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための更なる他の合成経路の実施形態は図９に図示され下記の実施例３９に記載される。１０，０００を超える分散係数を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図１０に図示され下記の実施例４０に記載される。
【０１２６】
１０，０００を超える分散係数を有する活性オリゴマーの混合物は、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供するのに十分な条件の下で、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬の混合物と反応する。好ましい合成は下記の実施例４１に記載される。当業者に理解されるように、反応条件（例えば、選択されるモル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、１０，０００を超える分散係数を有する活性オリゴマーの混合物と、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬の混合物との反応から生じるカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物が、１０，０００を超える分散係数を有する混合物であるように制御することができる。例えば、リシンのアミノ官能基でのコンジュゲーションは反応溶液のｐＨをリシンのｐＫaより下に維持することにより抑制できる。または、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、例えばＨＰＬＣを利用して分離および単離でき、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物、例えばモノ−、ジ−、またはトリ−コンジュゲートの混合物を提供し得る。特定の単離コンジュゲートのコンジュゲーションの程度（例えば、単離分子がモノ−、ジ−、またはトリ−コンジュゲートであるか否か）は、質量分析を含むがこれに限定されない、当業者に理解される種々の技法を利用して、測定および／または確認され得る。特定のコンジュゲート構造（例えば、オリゴマーがサケ・カルシトニンモノコンジュゲートのＬｙｓ１１、Ｌｙｓ１８またはＮ末端にあるか否か）は、配列解析、ペプチド・マッピング、選択的酵素切断、および／またはエンドペプチダーゼ切断を含むが、これらに限定されない、当業者に理解される種々の技法を利用して、測定および／または確認され得る。
【０１２７】
当業者に理解されるように、カルシトニン薬の１つ以上の反応部位は、例えば、カルシトニン薬をＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）またはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）などの適切な遮断試薬と反応させることにより、遮断できる。この過程は、例えばカルシトニン薬がポリペプチドであり、該ポリペプチドのＮ末端にオリゴマーを有する不飽和コンジュゲート（即ち、全ての求核性残基が結合するとは限らないコンジュゲート）を形成するのが望ましい場合に好ましいかもしれない。このような遮断後、１０，０００を超える分散係数を有する遮断済みカルシトニン薬の混合物は、１０，０００を超える分散係数を有する活性オリゴマーの混合物と反応し、１つ以上の求核性残基と結合するオリゴマーを有し且つ他の求核性残基と結合する遮断部分を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供できる。コンジュゲーション反応後、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートは、当業者に理解されるように、脱遮断することができる。必要ならば、次にカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は上述したように分離し、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供できる。または、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は脱遮断前に分離することができる。
【０１２８】
本発明の実施形態による１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、従来の混合物の性質と比較すると、改良された性質を有することが好ましい。例えば、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は少なくとも５パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができる。好ましくは、該コンジュゲートの混合物は少なくとも１０、１１、１２、１３または１４パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができる。より好ましくは、該コンジュゲートの混合物は、少なくとも１５、１６、１７、１８または１９パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができ、最も好ましくは、該コンジュゲートの混合物は少なくとも２０パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができる。
【０１２９】
他の例として、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性とそれぞれ比較すると、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性が増すことが好ましい。キモトリプシンまたはトリプシンに対する耐性は、試験される分子が下記の実施例５１で概説される手法と類似した手法を用いて適用酵素で分解される際に残存する百分率に相当する。好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約１０パーセント高い。より好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約１５パーセント高く、最も好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約２０パーセント高い。好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約１０パーセント高い。より好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約２０パーセント高い。最も好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約３０パーセント高い。
【０１３０】
更なる他の例として、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より高い生物有効性を有することが好ましい。特定化合物の生物有効性はその曲線下面積（ＡＵＣ）値に相当する。好ましくは、該混合物の生物有効性はオリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より約５パーセント高い。より好ましくは、該混合物の生物有効性はオリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より約１０パーセント高い。
【０１３１】
更なる他の例として、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のインビボ活性より高いインビボ活性を有するのが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、例えばＨ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ  ＆  Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ３９４−４０２（２ｄ．ｅｄ．，１９９１）に記載されるゲル透過クロマトグラフィーなどのサイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【０１３２】
他の例として、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のインビトロ活性より高いインビトロ活性を有することが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【０１３３】
更なる他の例として、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性と比べると、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性が増すことが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【０１３４】
更なる他の例として、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物の被験者間変動より低い被験者間変動を有することが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。被験者間変動は、当業者に理解されるように、種々の方法により測定することができる。被験者間変動は下記の通りに計算されることが好ましい。用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）（即ち、用量反応曲線と基線値との間の面積）は個々の被験者について測定される。全被験者の平均ＡＵＣは、各被験者のＡＵＣを合計し、その和を被験者数で割ることにより決定される。次に、被験者のＡＵＣと平均ＡＵＣとの差の絶対値が各被験者について決定される。次いで、得られた差の絶対値は合計され、被験者間変動を表す数値が得られる。低い値は低い被験者間変動を表し、高い値は高い被験者間変動を表す。
【０１３５】
本発明の実施形態による１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は上述の向上した性質２つ以上を有することが好ましい。より好ましくは、本発明の実施形態による１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は上述の向上した性質３つ以上を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による１０，０００を超える分散係数を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は上述の向上した性質４つ以上を有する。
【０１３６】
本発明の他の実施形態により、それぞれのコンジュゲートが、オリゴマーと結合したカルシトニン薬を含み且つ同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有する、コンジュゲートの混合物が提供される。
【０１３７】
カルシトニン薬はカルシトニンであることが好ましい。より好ましくは、カルシトニン薬はサケ・カルシトニンである。しかしながら、カルシトニン薬は、例えば、カルシトニン前駆ペプチド、カルシトニン、カルシトニン類似体、カルシトニン断片、およびカルシトニン断片類似体を含む、当業者に公知の種々のカルシトニン薬から選択され得ることが理解されるべきである。カルシトニン前駆ペプチドは、カタカルシン（ＰＤＮ−２１）（Ｃ−プロカルシトニン）、およびＮ−ｐｒｏＣＴ（アミノ末端プロカルシトニン切断ペプチド）、ヒトを含むが、これらに限定されない。カルシトニン類似体は上述のカルシトニンにおける１つ以上のアミノ酸の置換により提供され得る。カルシトニン断片は、カルシトニン１−７、ヒト；およびカルシトニン８−３２、サケを含むが、これらに限定されない。カルシトニン断片類似体は上述のカルシトニン断片中の１つ以上のアミノ酸の置換により提供され得る。
【０１３８】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、ポリエチレングリコール部分を含む種々のオリゴマーであってよい。好ましくは、オリゴマーのポリエチレングリコール部分は少なくとも２、３または４のポリエチレングリコール・サブユニットを有する。より好ましくは、ポリエチレングリコール部分は少なくとも５または６のポリエチレングリコール・サブユニットを有し、最も好ましくは、ポリエチレングリコール部分は少なくとも７のポリエチレングリコール・サブユニットを有する。
【０１３９】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、追加の親水性部分、親油性部分、スペーサー部分、リンカー部分、および末端部分を含むが、これらに限定されない、１つ以上の他の部分を含み得る。オリゴマーの種々の部分は加水分解性結合または非加水分解性結合のいずれかにより互いに共有結合する。
【０１４０】
オリゴマーは、糖、ポリアルキレンオキシド、およびポリアミン／ＰＥＧ共ポリマーを含むが、これらに限定されない１つ以上の追加の親水性部分（即ち、ポリエチレングリコール部分に加えた部分）をさらに含み得る。ポリエチレングリコールはポリアルキレンオキシドであるため、追加の親水性部分はポリエチレングリコール部分であってもよい。隣接のポリエチレングリコール部分は、エーテル結合により結合する場合、同じ部分であると考えられる。例えば、
【化１８】
2007521268.tif 000026
の部分は６つのポリエチレングリコール・サブユニットを有する一つのポリエチレングリコール部分である。この部分がオリゴマーにおける唯一つの親水性部分である場合、オリゴマーは追加の親水性部分を含まない。隣接のポリエチレングリコール部分は、エーテル結合以外の結合により結合する場合、異なる部分であると考えられる。例えば、
【化１９】
2007521268.tif 000027
の部分は、４つのポリエチレングリコール・サブユニットを有するポリエチレングリコール部分および２つのポリエチレングリコール・サブユニットを有する追加の親水性部分である。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーは、ポリエチレングリコール部分を含むが、追加の親水性部分を含まない。
【０１４１】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、１つ以上の親油性部分をさらに含み得る。親油性部分は、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐のアルキル部分、または飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐の脂肪酸部分であることが好ましい。親油性部分がアルキル部分である場合、１から２８の炭素原子を有する直鎖の飽和または不飽和のアルキル部分であることが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２から１２の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合、２から１８の炭素原子を有する直鎖の飽和または不飽和である天然脂肪酸部分であることが好ましい。より好ましくは、脂肪酸部分は３から１４の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４、５または６の炭素原子を有する。
【０１４２】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、１つ以上のスペーサー部分を更に含み得る。スペーサー部分は、例えば、親油性部分から親水性部分を分離するため、カルシトニン薬から親油性部分もしくは親水性部分を分離するため、第二の親水性もしくは親油性の部分から第一の親水性もしくは親油性の部分を分離するため、またはリンカー部分から親水性部分もしくは親油性部分を分離するために用いられ得る。スペーサー部分は、糖、コレステロールおよびグリセリンの部分からなる群より選択されることが好ましい。
【０１４３】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、カルシトニン薬とオリゴマーとを結合するために用いられるリンカー部分１つ以上をさらに含み得る。リンカー部分はアルキル部分および脂肪酸部分からなる群より選択されるのが好ましい。
【０１４４】
オリゴマーはカルシトニン薬に結合しないオリゴマーの１つ以上の端部に１つ以上の末端部分をさらに含んでよい。末端部分はアルキルまたはアルコキシの部分であることが好ましく、低級アルキルまたは低級アルコキシの部分であることがより好ましい。最も好ましくは、末端部分はメチルまたはメトキシである。末端部分はアルキルまたはアルコキシの部分であることが好ましいが、当業者に理解されるように、末端部分は糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸を含むが、これらに限定されない種々の部分であってよいと理解されねばならない。
【０１４５】
オリゴマーはカルシトニン薬に共有結合することが好ましい。ある実施形態において、カルシトニン薬は加水分解性結合（例えばエステル結合またはカーボネート結合）を利用してオリゴマーと結合する。加水分解性結合はプロドラッグとして作用するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートを提供することができる。１例において、例えばカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートが不活性である場合（即ち、該コンジュゲートがカルシトニン薬の一次作用機構を通じて身体に影響を及ぼす能力を欠失する）、１つ以上のオリゴマーがそれらの個別のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートから開裂し、活性薬物を提供するので、加水分解性結合は、所定の期間にわたってカルシトニン薬を投与する徐放性または制御放出の効果を提供することができる。他の実施形態において、カルシトニン薬は非加水分解性結合（例えば、カルバメート結合、アミド結合、またはエーテル結合）を利用してオリゴマーと結合する。非加水分解性結合の使用は、長期間、好ましくは少なくとも２時間、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートが血流で循環できることが望ましい場合に、好ましいかもしれない。オリゴマーがカルシトニン薬と共有結合する場合、オリゴマーは、当業者に理解されるように、カルシトニン薬とオリゴマーとを共有結合するために用いられる１つ以上の結合部分をさらに含む。結合部分は、共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分および第二級アミン部分からなる群より選択されることが好ましい。オリゴマーの１より多い部分がカルシトニン薬と共有結合し得る。
【０１４６】
オリゴマーがカルシトニン薬と共有結合することが好ましいが、オリゴマーがカルシトニン薬と非共有結合して非共有結合のカルシトニン薬−オリゴマー錯体を形成できることが理解されるべきである。当業者に理解されるように、非共有結合は、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、およびミセル封入またはリポソーム封入を含むが、これらに限定されない。本発明の実施形態により、オリゴマーは、当業者に理解されるように、選択様式で非共有結合能を付与するため（例えば、水素結合能を付与するため）、好適に構築、修飾および／または適切に官能化され得る。本発明の他の実施形態により、オリゴマーは、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、およびアミノサリチル酸誘導体を含むが、これらに限定されない種々の化合物で誘導体化され得る。得られるオリゴマーは、薬物分子、医薬品、および／または製剤賦形剤と非共有結合（錯体形成）し得る。得られる錯体は、好ましくは、均衡のとれた親油性および親水性を有する。本発明の更に他の実施形態により、オリゴマーはアミンおよび／またはアルキルアミンで誘導体化され得る。適切な酸性条件下で、得られるオリゴマーは薬物分子、医薬品および／または製剤賦形剤と非共有結合した錯体を形成し得る。このような錯化から得られる生成物は、好ましくは、均衡のとれた親油性および親水性を有する。
【０１４７】
１より多いオリゴマー（即ち、複数のオリゴマー）がカルシトニン薬と結合し得る。複数のオリゴマーは同じであることが好ましい。しかしながら、複数のオリゴマーが互いに異なり得る又は複数のオリゴマーの幾つかは同じで幾つかは異なり得ることが理解されるべきである。複数のオリゴマーがカルシトニン薬と結合する場合、１つ以上のオリゴマーが加水分解性結合でカルシトニン薬と結合し、また１つ以上のオリゴマーが非加水分解性結合でカルシトニン薬と結合することが好ましいこともある。または、複数のオリゴマーをカルシトニン薬と結び付ける全ての結合は加水分解性であってよいが、例えば、１つ以上のオリゴマーが体内での加水分解によりカルシトニン薬から速やかに取り外され、かつ１つ以上のオリゴマーが体内での加水分解によりカルシトニン薬から徐々に取り外されるような、様々な程度の加水分解性を有する。
【０１４８】
オリゴマーは、求核性のヒドロキシル官能基および／またはアミノ官能基を含むがこれらに限定されないカルシトニン薬の様々な求核性残基でカルシトニン薬と結合し得る。カルシトニン薬がポリペプチドである場合、求核性ヒドロキシル官能基は例えばセリンおよび／またはチロシン残基で見出され、求核性アミノ官能基は例えばヒスチジンおよび／もしくはリシン残基で、ならびに／または１つ以上のポリペプチドのＮ末端で見出され得る。オリゴマーがカルシトニン・ポリペプチドの１つ以上のＮ末端に結合すると、結合は、好ましくは、第二級アミンを形成する。カルシトニン薬がサケ・カルシトニンである場合、例えば、オリゴマーは、Ｌｙｓ11、Ｌｙｓ18および／またはＮ末端のアミノ官能基を含む、サケ・カルシトニンのアミノ官能基に結合し得る。１つ以上のオリゴマーはサケ・カルシトニンに結合し得るが、オリゴマーがＬｙｓ11およびＬｙｓ18のアミノ官能基に結合する場合、血清カルシウム低減能の向上など、より高い生物有効性がジコンジュゲート・サケ・カルシトニンで観察される。
【０１４９】
混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は種々の方法により合成され得る。例えば、カルボン酸およびポリエチレングリコールからなり且つ混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するオリゴマーの混合物は、混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するオリゴマー混合物を提供するのに十分な条件の下で、混合物中のそれぞれのポリエチレングリコール分子が同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するポリエチレングリコール混合物とカルボン酸混合物とを接触させることにより合成される。次いで混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有する混合物のオリゴマーはカルシトニン薬と反応できるように活性化され、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートを提供する。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の１実施形態は図３に図示され下記の実施例１１〜１８に記載される。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図４に図示され下記の実施例１９〜２４に記載される。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図５に図示され下記の実施例２５〜２９に記載される。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図６に図示され下記の実施例３０〜３１に記載される。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図７に図示され下記の実施例３２〜３７に記載される。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図８に図示され下記の実施例３８に記載される。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有する活性オリゴマーの混合物を提供するための更なる他の合成経路の実施形態は図９に図示され下記の実施例３９に記載される。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図１０に図示され下記の実施例４０に記載される。
【０１５０】
混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有する活性オリゴマーの混合物は、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供するのに十分な条件の下で、カルシトニン薬の混合物と反応する。好ましい合成は下記の実施例４１に記載される。当業者に理解されるように、反応条件（例えば、選択されるモル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有する活性オリゴマー混合物とカルシトニン薬混合物との反応から生じるカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物が、混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するコンジュゲート混合物であるように制御され得る。例えば、リシンのアミノ官能基での結合は反応溶液のｐＨをリシンのｐＫaより下に維持することにより抑制され得る。または、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、例えばＨＰＬＣを利用して分離および単離でき、混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物、例えばモノ−、ジ−、またはトリ−コンジュゲート混合物を提供し得る。特定の単離コンジュゲートのコンジュゲーションの程度（例えば、単離分子がモノ−、ジ−、またはトリ−コンジュゲートであるか否か）は、当業者に理解されるように、質量分析を含むがこれに限定されない種々の技法を利用して、測定および／または確認され得る。特定のコンジュゲート構造（例えば、オリゴマーがサケ・カルシトニンモノコンジュゲートのＬｙｓ１１、Ｌｙｓ１８またはＮ末端にあるか否か）は、当業者に理解されるように、配列解析、ペプチド・マッピング、選択的酵素切断、および／またはエンドペプチダーゼ切断を含むが、これらに限定されない種々の技法を利用して、測定および／または確認され得る。
【０１５１】
当業者に理解されるように、カルシトニン薬の１つ以上の反応部位は、例えば、カルシトニン薬をＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）またはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）などの好適な遮断試薬と反応させることにより、遮断され得る。この過程は、例えばカルシトニン薬がポリペプチドであり、該ポリペプチドのＮ末端にオリゴマーを有する不飽和コンジュゲート（即ち、全ての求核性残基が結合するとは限らないコンジュゲート）を形成するのが望ましい場合に好ましいこともある。このような遮断後、遮断カルシトニン薬の混合物は、混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有する活性オリゴマー混合物と反応し、１つ以上の求核性残基と結合するオリゴマーを有し且つ他の求核性残基と結合する遮断部分を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供し得る。コンジュゲーション反応後、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートは、当業者に理解されるように、脱遮断され得る。必要ならば、次にカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は上述したように分離され、混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供し得る。または、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は脱遮断前に分離することができる。
【０１５２】
本発明の実施形態による混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、従来の混合物の性質と比較すると、向上した性質を有するのが好ましい。例えば、混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、好ましくは、少なくとも５パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができる。好ましくは、該コンジュゲートの混合物は少なくとも１０、１１、１２、１３または１４パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができる。より好ましくは、該コンジュゲートの混合物は、少なくとも１５、１６、１７、１８または１９パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができ、最も好ましくは、該コンジュゲートの混合物は少なくとも２０パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができる。
【０１５３】
他の例として、混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性とそれぞれ比較すると、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性が増すことが好ましい。キモトリプシンまたはトリプシンに対する耐性は、試験される分子が下記の実施例５１で概説される手法と類似した手法を用いて適用酵素で分解される際に残存する百分率に相当する。好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約１０パーセント高い。より好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約１５パーセント高く、最も好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約２０パーセント高い。好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約１０パーセント高い。より好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約２０パーセント高い。最も好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約３０パーセント高い。
【０１５４】
更なる他の例として、混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より高い生物有効性を有することが好ましい。特定化合物の生物有効性はその曲線下面積（ＡＵＣ）値に相当する。好ましくは、該混合物の生物有効性はオリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より約５パーセント高い。より好ましくは、該混合物の生物有効性はオリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より約１０パーセント高い。
【０１５５】
更なる他の例として、混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のインビボ活性より高いインビボ活性を有することが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、例えばＨ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ  ＆  Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ３９４−４０２（２ｄ．ｅｄ．，１９９１）に記載されるゲル透過クロマトグラフィーなどのサイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【０１５６】
他の例として、混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のインビトロ活性より高いインビトロ活性を有することが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【０１５７】
更なる他の例として、混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性と比べると、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性が増すことが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【０１５８】
更なる他の例として、混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物の被験者間変動より低い被験者間変動を有することが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。被験者間変動は、当業者に理解されるように、種々の方法により測定することができる。被験者間変動は下記の通りに計算されることが好ましい。用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）（即ち、用量反応曲線と基線値との間の面積）は個々の被験者について測定される。全被験者の平均ＡＵＣは、各被験者のＡＵＣを合計し、その和を被験者数で割ることにより決定される。次に、被験者のＡＵＣと平均ＡＵＣとの差の絶対値が各被験者について決定される。次いで、得られた差の絶対値は合計され、被験者間変動を表す数値が得られる。低い値は低い被験者間変動を表し、高い値は高い被験者間変動を表す。
【０１５９】
本発明の実施形態による混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、上述の向上した性質２つ以上を有することが好ましい。より好ましくは、本発明の実施形態による混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は上述の向上した性質３つ以上を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による混合物中の各コンジュゲートが同数のポリエチレングリコール・サブユニットを有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は上述の向上した性質４つ以上を有する。
【０１６０】
本発明の更なる他の実施形態により、コンジュゲートの混合物が提供され、それぞれのコンジュゲートは、同じ分子量を有し、式Ａ：
【化２０】
2007521268.tif 000028
の構造を有し、式中：
Ｂは結合部分であり、
Ｌはリンカー部分であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は個々に選択されるスペーサー部分であり、
Ｒは親油性部分であり且つＲ’はポリアルキレングリコール部分であるか、またはＲ’は親油性部分であり且つＲはポリアルキレングリコール部分であり、
Ｔは末端部分であり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは個々に０または１であり、
ｐは１からカルシトニン薬の求核性残基数までの整数である。
【０１６１】
カルシトニン薬はカルシトニンであることが好ましい。より好ましくは、カルシトニン薬はサケ・カルシトニンである。しかしながら、カルシトニン薬は、例えば、カルシトニン前駆ペプチド、カルシトニン、カルシトニン類似体、カルシトニン断片、およびカルシトニン断片類似体を含む、当業者に知られる種々のカルシトニン薬から選択され得ることが理解されるべきである。カルシトニン前駆ペプチドは、カタカルシン（ＰＤＮ−２１）（Ｃ−プロカルシトニン）、およびＮ−ｐｒｏＣＴ（アミノ末端プロカルシトニン切断ペプチド）、ヒトを含むが、これらに限定されない。カルシトニン類似体は上述のカルシトニンにおける１つ以上のアミノ酸の置換により提供され得る。カルシトニン断片は、カルシトニン１−７、ヒト；およびカルシトニン８−３２、サケを含むが、これらに限定されない。カルシトニン断片類似体は上述のカルシトニン断片中の１つ以上のアミノ酸の置換により提供され得る。
【０１６２】
本発明のこれらの実施形態により、オリゴマーのポリアルキレングリコール部分は少なくとも２、３または４のポリアルキレングリコール・サブユニットを有することが好ましい。より好ましくは、ポリアルキレングリコール部分は少なくとも５または６のポリアルキレングリコール・サブユニットを有し、最も好ましくは、ポリエチレングリコール部分は少なくとも７のポリアルキレングリコール・サブユニットを有する。ポリアルキレン・グリコール部分は、ポリエチレン・グリコール部分、ポリプロピレングリコール部分、またはポリブチレン・グリコール部分などの低級ポリアルキレン・グリコール部分であることが好ましい。より好ましくは、ポリアルキレン・グリコール部分はポリエチレン・グリコール部分またはポリプロピレングリコール部分である。最も好ましくは、ポリアルキレン・グリコール部分はポリエチレン・グリコール部分である。ポリアルキレン・グリコール部分がポリプロピレングリコール部分である場合、該部分は均一の（即ち、ランダムでない）構造を有することが好ましい。均一の構造を有する典型的なポリプロピレングリコール部分は下記：
【化２１】
2007521268.tif 000029
の通りである。
【０１６３】
この均一のポリプロピレングリコール構造はポリプロピレングリコール鎖において各酸素原子に隣接した唯一つのメチル置換炭素原子を有するものとして記載され得る。このような均一のポリプロピレングリコール部分は親油性および親水性の両特性を示し得るため、親油性ポリマー部分を用いることなく両親媒性カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートを提供するのに役立つ。更に、ポリプロピレングリコール部分の第二級アルコール部分とカルシトニン薬との結合は、例えば腸に見出されるトリプシンおよびキモトリプシンなどの酵素により惹起される分解に対する耐性が向上したカルシトニン薬（例えば、サケ・カルシトニン）を提供し得る。
【０１６４】
本発明の実施形態による均一のポリプロピレングリコールは、これから記述するつもりの図１１から１３に図示されるように合成されることが好ましい。図１１に図示されるように、１，２−プロパンジオール５３は第一級アルコール遮断試薬と反応して第二級アルコール伸長モノマー５４を提供する。第一級アルコール遮断試薬は、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドおよびｔ−ブチルジメチルシリルクロリドなどの塩化シリル化合物、ならびにＡｃ2Ｏなどのエステル化試薬を含むが、これらに限定されない、当業者に理解される、様々な第一級アルコール遮断試薬であってよい。好ましくは、第一級アルコール遮断試薬は、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドまたはｔ−ブチルジメチルシリルクロリドなど、実質的に第二級アルコールと反応しない第一級アルコール遮断試薬である。第二級アルコール伸長モノマー（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｍｏｎｏｍｅｒ）（５４）は塩化メタンスルホニル（ＭｅＳＯ2Ｃｌ）と反応して第一級伸長アルコールモノマーのメシラート５５を生じ得る。
【０１６５】
または、第二級アルコール伸長モノマー５４は第二級アルコール遮断試薬と反応して化合物５６を提供し得る。第二級アルコール遮断試薬は、塩化ベンジルを含むが、これに限定されない、当業者に理解される様々な第二級アルコール遮断試薬であってよい。化合物５６はＢ1脱遮断試薬と反応して遮断部分Ｂ1を除去し第一級アルコール伸長モノマー５７を提供し得る。Ｂ1脱遮断試薬は、当業者に理解される様々な脱遮断試薬から選択され得る。第一級アルコールがエステルを形成することにより遮断された場合、Ｂ1脱遮断試薬は塩基（例えば、炭酸カリウム）などの脱エステル化試薬である。第一級アルコールが塩化シリルを用いて遮断された場合、Ｂ1脱遮断試薬はフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）であるのが好ましい。第一級アルコール伸長モノマー５７は塩化メタンスルホニルと反応して第二級アルコール伸長モノマーのメシラート５８を生じ得る。
【０１６６】
第一級アルコール伸長モノマー５４および第二級アルコール伸長モノマー５７は下記の通りにキャッピングされ得る。第二級アルコール伸長モノマー５４はキャッピング試薬と反応して化合物５９を生じ得る。キャッピング試薬は、塩化メチルなどのハロゲン化アルキルを含むが、これに限定されない、当業者に理解される種々のキャッピング試薬であってよい。化合物５９は上述のＢ1脱遮断試薬と反応し第一級アルコール・キャッピングモノマー６０を生じ得る。第一級アルコール・キャッピングモノマー６０は塩化メタンスルホニルと反応して第二級アルコール・キャッピングモノマーのメシラート６１を生じ得る。第一級アルコール伸長モノマー５７はキャッピング試薬と反応して化合物６２を生じ得る。キャッピング試薬は上述のような種々のキャッピング試薬であってよい。化合物６２はＢ2脱遮断試薬と反応して遮断部分Ｂ2を除去し第二級アルコール・キャッピングモノマー６３を提供し得る。Ｂ2脱遮断試薬は、パラジウム／活性炭触媒の存在下でのＨ2を含むが、これに限定されない、当業者に理解される種々の脱遮断試薬であってよい。第二級アルコール・キャッピングモノマーは塩化メタンスルホニルと反応し第一級アルコール・キャッピングモノマーのメシラート６４を生じ得る。図１１で図示される実施形態はキャッピングモノマーの合成を示すが、同様の反応が実施されキャッピングポリマーを提供できることは理解されるべきである。
【０１６７】
一般に、鎖の伸長は、第一級アルコール伸長モノマー５７などの第一級アルコール伸長モノマーまたはポリマーと、例えば第一級アルコール伸長モノマーのメシラート５５などの第一級アルコール伸長モノマーまたはポリマーメシラートとを反応させることにより、または例えば第二級アルコール伸長モノマー５４などの第二級アルコール伸長モノマーまたはポリマーと、例えば第二級アルコール伸長モノマーのメシラート５８などの第二級アルコール伸長モノマーまたはポリマーメシラートとを反応させることにより行われ、種々の均一なポリプロピレン鎖を生じることができる。
【０１６８】
例えば、図１３において、第一級アルコール伸長モノマーのメシラート５５は第一級アルコール伸長モノマー５７と反応してダイマー化合物６５を生じる。または、第二級アルコール伸長モノマーのメシラート５８は第二級アルコール伸長モノマー５４と反応してダイマー化合物６５を生じる。ダイマー化合物６５のＢ1遮断部分は上述のＢ1脱遮断試薬を用いて除去され、第一級アルコール伸長ダイマー６６を生じ得る。第一級アルコール伸長ダイマー６６は塩化メタンスルホニルと反応して第二級アルコール伸長ダイマーのメシラート６７を生じ得る。または、ダイマー化合物６５のＢ2遮断部分は上述のＢ2脱遮断試薬を用いて除去され、第二級アルコール伸長ダイマー６９を生じ得る。第二級アルコール伸長ダイマー６９は塩化メタンスルホニルと反応して第一級アルコール伸長ダイマーのメシラート７０を生じ得る。
【０１６９】
当業者に理解されるように、鎖の伸長過程は、様々な他の鎖の長さに到達するまで反復され得る。例えば、図１３に図示されるように、第一級アルコール伸長ダイマー６６は第一級アルコール伸長ダイマーのメシラート７０と反応し、テトラマー化合物７２を生じ得る。図１３で更に図示されるように、一般的な鎖伸長反応スキームは、第一級アルコール伸長モノマーまたはポリマーの７３を第一級アルコール伸長モノマーまたはポリマーのメシラート７４と反応して、均一なポリプロピレンポリマー７５を生じる工程を含む。ｍおよびｎの値はそれぞれ０から１０００以上の範囲に及ぶ。ｍおよびｎはそれぞれ０から５０までであることが好ましい。図１３に図示される実施形態は、第一級アルコール伸長モノマーおよび／またはポリマーのメシラートと反応する第一級アルコール伸長モノマーおよび／またはポリマーを示すが、同様な反応が第二級アルコール伸長モノマーおよび／またはポリマーならびに第二級アルコール伸長モノマーおよび／またはポリマーのメシラートを用いて実施できることは理解されるべきである。
【０１７０】
第一級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーの末端または第一級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーのメシラートの末端は、第一級アルコール・キャッピングモノマーもしくはポリマーのメシラートまたは第一級アルコール・キャッピングモノマーもしくはポリマーとそれぞれ反応し、キャッピングされた均一のポリプロピレン鎖を生じ得る。例えば、図１２に図示されるように、第一級アルコール伸長ダイマーのメシラート７０は第一級アルコール・キャッピングモノマー６０と反応し、キャッピング／遮断された第一級アルコール伸長トリマー７１を生じる。当業者に理解されるように、Ｂ1遮断部分は除去され、生じたキャッピングされた第一級アルコール伸長トリマーは第一級アルコール伸長モノマーまたはポリマーのメシラートと反応し、キャッピングされたトリマー７１の鎖を伸長し得る。
【０１７１】
第二級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーの末端または第二級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーのメシラートの末端は、第二級アルコール・キャッピングモノマーもしくはポリマーのメシラートまたは第二級アルコール・キャッピングモノマーもしくはポリマーとそれぞれ反応し、キャッピングされた均一のポリプロピレン鎖を生じ得る。例えば、図１２に図示されるように、第二級アルコール伸長ダイマーのメシラート６７は第二級アルコール・キャッピングモノマー６３と反応し、キャッピング／遮断された第一級アルコール伸長トリマー６８を生じる。Ｂ2遮断部分は上述したように除去され、生じたキャッピングされた第二級アルコール伸長トリマーは第二級アルコール伸長量体（ｍｅｒ）のメシラートと反応し、キャッピングされたトリマー６８の鎖を伸長し得る。図１２で図示される合成はダイマーとキャッピングモノマーとの反応を示しトリマーを提供するが、キャッピング過程は均一のポリプロピレングリコール部分の合成におけるどの時点でも実施できること、または、キャッピングされていない均一のポリプロピレングリコール部分が生じ得ることが理解されるべきである。図１２で図示される実施形態はキャッピングモノマーを用いた合成によるポリブチレンオリゴマーのキャッピングを示すが、本発明のポリブチレンオリゴマーが、図１１で上述したキャッピング試薬を用いて直接（即ち、キャッピングモノマーを付加せずに）キャッピングされ得ることが理解されるべきである。
【０１７２】
本発明の実施形態による均一のポリプロピレングリコール部分は、ポリエチレングリコール部分に関して本明細書に記載される方法を含むが、これらに限定されない、当業者に理解される種々の方法により、カルシトニン薬、カルボン酸などの親油性部分、および／または様々な他の部分と結合し得る。
【０１７３】
本発明のこれらの実施形態により、親油性部分は当業者に理解される親油性部分である。親油性部分は、飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐のアルキル部分、または飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐の脂肪酸部分であることが好ましい。親油性部分がアルキル部分である場合、１から２８の炭素原子を有する直鎖の飽和または不飽和のアルキル部分であることが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２から１２の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合、２から１８の炭素原子を有する直鎖の飽和または不飽和の天然脂肪酸部分であることが好ましい。より好ましくは、脂肪酸部分は３から１４の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４、５または６の炭素原子を有する。
【０１７４】
本発明のこれらの実施形態により、スペーサー部分のＧ、Ｇ’およびＧ’’は、当業者に理解されるようなスペーサー部分である。スペーサー部分は、糖、コレステロールおよびグリセリンの部分からなる群より選択されることが好ましい。好ましくは、これらの実施形態のオリゴマーはスペーサー部分を含まない（即ち、ｋ、ｍおよびｎは０であることが好ましい）。
【０１７５】
本発明のこれらの実施形態により、リンカー部分Ｌは、当業者に理解されるように、該薬と該オリゴマーを結合するために用いられる。リンカー部分はアルキル部分および脂肪酸部分からなる群より選択されることが好ましい。
【０１７６】
本発明のこれらの実施形態により、末端部分は、好ましくはアルキルまたはアルコキシの部分であり、より好ましくは低級アルキルまたは低級アルコキシの部分である。最も好ましくは、末端部分はメチルまたはメトキシである。末端部分はアルキルまたはアルコキシの部分であることが好ましいが、末端部分は、糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸を含むが、これらに限定されない、当業者に理解される種々の部分であってよいことが理解されるべきである。
【０１７７】
本発明のこれらの実施形態により、式Ａの構造の括弧で囲まれた部分により表されるオリゴマーは、カルシトニン薬に共有結合する。ある実施形態において、カルシトニン薬は加水分解性結合（例えばエステル結合またはカーボネート結合）を利用してオリゴマーと結合する。加水分解性結合はプロドラッグとして作用するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートを提供することができる。１例において、例えばカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートが不活性である場合（即ち、該コンジュゲートがカルシトニン薬の一次作用機構を通じて身体に影響を及ぼす能力を欠失する）、１つ以上のオリゴマーがそれらの個別のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートから開裂し、活性薬物を提供するので、加水分解性結合は、所定の期間にわたってカルシトニン薬を投与する徐放性効果または制御放出の効果を提供することができる。他の実施形態において、カルシトニン薬は非加水分解性結合（例えば、カルバメート結合、アミド結合、またはエーテル結合）を利用してオリゴマーと結合する。非加水分解性結合の使用は、長期間、好ましくは少なくとも２時間、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートが血流で循環できることが望ましい場合に、好ましいこともある。結合部分Ｂは、当業者に理解されるように、カルシトニン薬とオリゴマーとを共有結合するために用いられる様々な結合部分であってよい。結合部分は、共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分および第二級アミン部分からなる群より選択されることが好ましい。
【０１７８】
変数ｐは１からカルシトニン薬の求核性残基の数までの整数である。ｐが１を超える場合、１より多いオリゴマー（即ち、複数のオリゴマー）が該薬と結合する。本発明のこれらの実施形態により、複数のオリゴマーは同じである。複数のオリゴマーが該薬と結合する場合、１つ以上のオリゴマーが加水分解性結合で該薬と結合すること並びに１つ以上のオリゴマーが非加水分解性結合で該薬と結合することが好ましいかもしれない。または、複数のオリゴマーを該薬と結び付ける全ての結合は加水分解性であってよいが、例えば、１つ以上のオリゴマーが体内での加水分解により該薬から速やかに取り外され、かつ１つ以上のオリゴマーが体内での加水分解により該薬から徐々に取り外されるような、様々な程度の加水分解性を有する。カルシトニン薬がサケ・カルシトニンである場合、ｐは、好ましくは１または２であり、より好ましくは２である。
【０１７９】
オリゴマーは、求核性のヒドロキシル官能基および／またはアミノ官能基を含むがこれらに限定されないカルシトニン薬の様々な求核性残基でカルシトニン薬と結合し得る。カルシトニン薬がポリペプチドである場合、求核性ヒドロキシル官能基は例えばセリンおよび／またはチロシン残基で見出され、求核性アミノ官能基は例えばヒスチジンおよび／もしくはリシン残基で、ならびに／または１つ以上のポリペプチドのＮ末端で見出され得る。オリゴマーがカルシトニン・ポリペプチドの１つ以上のＮ末端に結合すると、結合は、好ましくは第二級アミンを形成する。カルシトニン薬がサケ・カルシトニンである場合、例えば、オリゴマーは、Ｌｙｓ11、Ｌｙｓ18および／またはＮ末端のアミノ官能基を含む、サケ・カルシトニンのアミノ官能基に結合し得る。１つ以上のオリゴマーはサケ・カルシトニンに結合し得るが、オリゴマーがＬｙｓ11およびＬｙｓ18のアミノ官能基に結合する場合、血清カルシウム低減能の向上など、より高い生物有効性がジコンジュゲート・サケ・カルシトニンで観察される。
【０１８０】
混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物は、種々の方法により合成され得る。例えば、カルボン酸およびポリエチレングリコールからなるオリゴマーの混合物は、オリゴマーの混合物を提供するのに十分な条件の下で、カルボン酸混合物をポリエチレングリコール混合物と接触させることにより合成される。次いで混合物のオリゴマーはカルシトニン薬と反応できるように活性化され、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートを提供する。各オリゴマーが同じ分子量を有し且つ式Ａのオリゴマーの構造を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の１実施形態は、図３に図示され下記の実施例１１〜１８に記載される。各オリゴマーが同じ分子量を有し且つ式Ａのオリゴマーの構造を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図４に図示され下記の実施例１９〜２４に記載される。各オリゴマーが同じ分子量を有し且つ式Ａのオリゴマーの構造を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図５に図示され下記の実施例２５〜２９に記載される。各オリゴマーが同じ分子量を有し且つ式Ａのオリゴマーの構造を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図６に図示され下記の実施例３０〜３１に記載される。各オリゴマーが同じ分子量を有し且つ式Ａのオリゴマーの構造を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図７に図示され下記の実施例３２〜３７に記載される。各オリゴマーが同じ分子量を有し且つ式Ａのオリゴマーの構造を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更なる他の実施形態は図８に図示され下記の実施例３８に記載される。各オリゴマーが同じ分子量を有し且つ式Ａのオリゴマーの構造を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための更なる他の合成経路の実施形態は図９に図示され下記の実施例３９に記載される。各オリゴマーが同じ分子量を有し且つ式Ａのオリゴマーの構造を有する活性オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の他の実施形態は図１０に図示され下記の実施例４０に記載される。
【０１８１】
各オリゴマーが同じ分子量を有し且つ式Ａのオリゴマーの構造を有する活性オリゴマー混合物は、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供するのに十分な条件の下で、混合物中のそれぞれの薬物が同じ分子量を有するカルシトニン薬の混合物と反応する。好ましい合成は下記の実施例４１に記載される。当業者に理解されるように、反応条件（例えば、選択されるモル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、カルシトニン薬の混合物と、各オリゴマーが同じ分子量を有し且つ式Ａのオリゴマーの構造を有する活性オリゴマーの混合物との反応から得られるカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物が、それぞれのコンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するコンジュゲートの混合物であるように制御できる。例えば、リシンのアミノ官能基でのコンジュゲーションは反応溶液のｐＨをリシンのｐＫaより下に維持することにより抑制できる。または、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、例えばＨＰＬＣを利用して分離および単離でき、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物、例えばモノ−、ジ−、またはトリ−コンジュゲート混合物を提供し得る。特定の単離コンジュゲートのコンジュゲーションの程度（例えば、単離分子がモノ−、ジ−、またはトリ−コンジュゲートであるか否か）は、質量分析を含むがこれに限定されない、当業者に理解される種々の技法を利用して、測定および／または確認され得る。特定のコンジュゲート構造（例えば、オリゴマーがサケ・カルシトニンモノコンジュゲートのＬｙｓ１１、Ｌｙｓ１８またはＮ末端にあるか否か）は、配列解析、ペプチド・マッピング、選択的酵素切断、および／またはエンドペプチダーゼ切断を含むが、これらに限定されない、当業者に理解される種々の技法を利用して、測定および／または確認され得る。
【０１８２】
当業者に理解されるように、カルシトニン薬の１つ以上の反応部位は、例えば、カルシトニン薬をＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）またはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）などの適切な遮断試薬と反応させることにより、遮断できる。この過程は、例えばカルシトニン薬がポリペプチドであり、該ポリペプチドのＮ末端にオリゴマーを有する不飽和コンジュゲート（即ち、全ての求核性残基が結合するとは限らないコンジュゲート）を形成するのが望ましい場合に好ましいかもしれない。このような遮断後、遮断カルシトニン薬の混合物は混合物中の各オリゴマーが同じ分子量を有し且つ式Ａのオリゴマーの構造を有する活性オリゴマーの混合物と反応し、１つ以上の求核性残基と結合するオリゴマーを有し且つ他の求核性残基と結合する遮断部分を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供できる。コンジュゲーション反応後、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートは、当業者に理解されるように、脱遮断され得る。必要ならば、次にカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は上述したように分離し、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を提供できる。または、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は脱遮断前に分離することができる。
【０１８３】
本発明の実施形態により、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、従来の混合物の性質と比較すると、改良された性質を有することが好ましい。例えば、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は少なくとも５パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができることが好ましい。好ましくは、該コンジュゲートの混合物は少なくとも１０、１１、１２、１３または１４パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができる。より好ましくは、該コンジュゲートの混合物は、少なくとも１５、１６、１７、１８または１９パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができ、最も好ましくは、該コンジュゲートの混合物は少なくとも２０パーセントまで血清カルシウム濃度を下げることができる。
【０１８４】
他の例として、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性とそれぞれ比較すると、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性が増すことが好ましい。キモトリプシンまたはトリプシンに対する耐性は、試験される分子が下記の実施例５１で概説される手法と類似する手法を用いて適用酵素で分解される際に残存する百分率に相当する。好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約１０パーセント高い。より好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約１５パーセント高く、最も好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性より約２０パーセント高い。好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約１０パーセント高い。より好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約２０パーセント高い。最も好ましくは、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のトリプシンによる分解に対する耐性は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬混合物のトリプシンによる分解に対する耐性より約３０パーセント高い。
【０１８５】
更なる他の例として、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン−オリゴマーコンジュゲート混合物は、オリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より高い生物有効性を有することが好ましい。特定化合物の生物有効性はその曲線下面積（ＡＵＣ）値に相当する。好ましくは、該混合物の生物有効性はオリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より約５パーセント高い。より好ましくは、該混合物の生物有効性はオリゴマーと結合しないカルシトニン薬の生物有効性より約１０パーセント高い。
【０１８６】
更なる他の例として、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物は、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のインビボ活性より高いインビボ活性を有することが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、例えばＨ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ  ＆  Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ３９４−４０２（２ｄ．ｅｄ．，１９９１）に記載されるゲル透過クロマトグラフィーなどのサイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【０１８７】
他の例として、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のインビトロ活性より高いインビトロ活性を有することが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【０１８８】
更なる他の例として、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性と比べると、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する耐性が増すことが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【０１８９】
更なる他の例として、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と同じ数平均分子量を有する多分散のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物の被験者間変動より低い被験者間変動を有することが好ましい。当業者に理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。被験者間変動は、当業者に理解されるように、種々の方法により測定することができる。被験者間変動は下記の通りに計算されることが好ましい。用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）（即ち、用量反応曲線と基線値との間の面積）は個々の被験者について測定される。全被験者の平均ＡＵＣは、各被験者のＡＵＣを合計し、その和を被験者数で割ることにより決定される。次に、被験者のＡＵＣと平均ＡＵＣとの差の絶対値が各被験者について決定される。次いで、得られた差の絶対値は合計され、被験者間変動を表す数値が得られる。低い値は低い被験者間変動を表し、高い値は高い被験者間変動を表す。
【０１９０】
本発明の実施形態による、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、上述の向上した性質２つ以上を有することが好ましい。より好ましくは、本発明の実施形態による、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、上述の向上した性質３つ以上を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による、混合物中の各コンジュゲートが同じ分子量を有し且つ式Ａの構造を有するカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、上述の向上した性質４つ以上を有する。
【０１９１】
本発明の実施形態によるコンジュゲート混合物を含む薬学的組成物も提供される。上述したカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、既知の技法に従って、薬学的担体中の投与用に製剤され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（９th  Ｅｄ．１９９５）を参照のこと。本発明の実施形態による薬学的組成物の製造において、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、通常、特に薬学的に許容し得る担体と混合される。担体は、無論、薬学的組成物の任意の他成分と適合できる意味で許容されるべきであり、患者に有害であるべきでない。担体は固体または液体または両方であってよく、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物と共に、単位投与剤形、例えば錠剤として製剤されることが好ましい。該剤形は約０．０１または０．５重量％から約９５または９９重量％のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物を含み得る。薬学的組成物は、１つ以上の副成分を任意に含む該構成要素を混合するステップを含むが、これに限定されない薬学の周知技法のいずれかにより調製され得る。
【０１９２】
本発明の実施形態による薬学的組成物は、経口、直腸、局所、吸入（例えば、エアロゾルで）、口内（例えば、舌下）、膣、非経口（例えば、皮下、筋内、皮内、関節内、胸膜腔内、腹腔内、大脳内、動脈内、または静脈内）、局所（即ち、気道面を含む皮膚および粘膜の両面）および経皮投与に適した組成物を含むが、所与の任意の事例で最も適切な経路は、治療される状態の性質および重症度ならびに使用される特定のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物の性質に依存するだろう。
【０１９３】
経口投与に適した薬学的組成物は、カプセル、カシェ剤、ロゼンジ、または錠剤などの個別単位で提示され得る。該単位のそれぞれは、粉末もしくは顆粒として；水性もしくは非水性の液体の溶液もしくは懸濁液として；または水中油乳剤もしくは油中水乳剤として、規定量のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を含む。このような製剤は、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物と適切な担体（上記の１つ以上の副成分を含み得る）とを結び付けるステップを含む任意の適切な薬学方法により調製され得る。一般に、本発明の実施形態による薬学的組成物は、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物を液体担体または微細に分割された固体担体または両方と均一に且つ密に混合した後、必要な場合は、生じた混合物を成形することにより調製される。例えば、錠剤は、任意には１つ以上の副成分とともに、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物を含む粉末または顆粒を圧縮または成形することにより調製され得る。圧縮錠剤は、任意には結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、および／または表面活性／分散剤と混合した粉末または顆粒など、フリーフロー剤形の混合物を適切な機械で圧縮することにより調製され得る。成形錠剤は不活性液体結合剤で湿した粉末化合物を適切な機械で成形することにより作製され得る。
【０１９４】
口内（舌下）投与に適した薬学的組成物は、風味付けされた基剤、通常、ショ糖およびアカシアまたはトラガカントにカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を含むロゼンジ、ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアカシアなどの不活性基剤にカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を含むトローチを含む。
【０１９５】
非経口投与に適した本発明の実施形態による薬学的組成物は、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物の水性および非水性の滅菌注射溶液を含む。この調製物は対象とするレシピエントの血液と等張であることが好ましい。これらの調製物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および該組成物を対象レシピエントの血液と等張にさせる溶質を含み得る。水性および非水性の滅菌懸濁液は懸濁剤および増粘剤を含み得る。該組成物は、単回投薬（ｕｎｉｔ／ｄｏｓｅ）または複数回投薬（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ）の容器で、例えば密閉されたアンプルおよび水薬瓶で提示され得る。該組成物は、使用直前に、滅菌液体担体、例えば生理食塩水または注射用水の添加だけが必要なフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即席の注射溶液および懸濁液は、前述した種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。例えば、密閉容器に単位投与剤形のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物を含む、注射可能な安定した滅菌組成物が提供され得る。カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、被験者への注射に適した液体組成物を形成するために、薬学的に許容し得る適切な担体を用いて再構成できる凍結乾燥の剤形で提供される。単位投与剤形は通常約１０ｍｇから約１０ｇのカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を含む。カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物は実質的に水に不溶性である場合、生理学的に許容される十分な量の乳化剤が、水性担体にカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物を乳化するのに十分な量で使用され得る。このような有用な乳化剤の１つはホスファチジル・コリンである。
【０１９６】
直腸投与に適した薬学的組成物は単位投与座薬として提示されるのが好ましい。これらは、１つ以上の従来の固体担体と、例えばココアバターと、カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物とを混合した後、生じた混合物を成形することにより調製され得る。
【０１９７】
皮膚への局所適用に適した薬学的組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ジェル、スプレー、エアロゾル、または油の剤形をとることが好ましい。使用され得る単体は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮エンハンサー、およびそれらの二つ以上の組み合わせを含む。
【０１９８】
経皮投与に適した薬学的組成物は、レシピエントの表皮と長時間密に接触したままであるように適応された個別パッチとして提示され得る。経皮投与に適した組成物はイオン泳動法（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３（６）：３１８（１９８６）参照）によっても送達され得る。該組成物は通常カルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物の任意に緩衝された水性溶液の剤形をとる。適切な製剤はクエン酸塩またはビス／トリス緩衝液（ｐＨ６）またはエタノール／水を含み、０．１Ｍから０．２Ｍの活性成分を含む。
【０１９９】
有効量の該薬学的組成物を投与することにより該治療の必要性がある被験者の骨障害を治療する方法も提供される。骨障害は、好ましくは過剰な破骨細胞骨吸収および／または高カルシウム血清効果を特徴とする。本発明の方法により治療および／または予防され得る骨障害は、骨粗しょう症、パジェット病、および高カルシウム血症を含むが、これらに限定されない。
【０２００】
本発明はさらに本発明のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲートの有効量を投与することにより該治療の必要性がある被験者の疼痛を治療する方法を提供する。本明細書で用いられるように、「疼痛を治療する」とは、痛覚に悩むもしくは経験する被験者、または疼痛もしくは痛覚を経験する危険性のある被験者に鎮痛効果を与える任意の種類の作用または機構を指し、痛覚もしくは疼痛の申告を減少させるステップまたは痛覚の進行もしくは疼痛の申告を遅らせるステップを含む。疼痛は、本明細書に記載の方法により、本発明の組成物を投与することにより治療され（例えば疼痛症状の完全なまたは部分的な撲滅により）、そのことは、痛覚または疼痛の申告もしくは知覚を定量的にまたは定性的に測定するよう設計された当分野で公知のアッセイにより測定することができる。痛覚または疼痛の申告は、本発明が属する分野の当業者に理解されるプロトコルにより評価できる。例えば、疼痛は、一方の端を「無疼痛」とし他方の端を「想像できる最悪の疼痛」とした１０ｃｍの直線を含む視覚的アナログ評価スケール（ＶＡＳ）を用いて定量的に評価され得る。または、機械的なＶＡＳ装置（計算尺型装置）が疼痛を評価するために使用できる。術後の疼痛は該直線または機械的ＶＡＳのいずれかを用いて評価できる。「疼痛を治療する」という語句は、痛覚または疼痛の申告の発症を予防するための被験者の予防的治療をさらに含む。従って、疼痛の治療は、痛覚または疼痛の申告の完全および／または部分的な撲滅を含み得る。例えば、治療は、感知される疼痛の強度および／または不快感を減少させることを含む痛覚および／または疼痛の症状のあらゆる減少を含み得る。
【０２０１】
本明細書で用いられるように、「疼痛」はあらゆる種類の疼痛を指し、本発明の方法および組成物は特定の種類の疼痛または本明細書に記載される二種類以上の疼痛の感覚および／または申告を緩和および／または軽減するために被験者を治療することを対象とする。疼痛は急性または慢性の疼痛であり得る。本明細書に記載される疼痛は、不快、過敏、火傷様痛（ｂｕｒｎｉｎｇ）、圧迫感（ｐｉｎｃｈｉｎｇ）、刺痛（ｓｔｉｎｇｉｎｇ）などの感覚を含み得る。本発明により治療できる種類の疼痛例は、炎症、内臓痛、神経因性疼痛、腰痛、切開痛（切開による疼痛または切開により惹起される疼痛）、術後の疼痛、末梢性疼痛（即ち、筋、腱など、または末梢神経自体に起因する疼痛）、中枢性疼痛および脊椎痛（即ち、中枢神経系の病理から生じる疼痛）、および術後の切開痛、ならびに文献に記載されるように現在知られる又は後に同定される他の種類の疼痛を含むが、これらに限定されない。さらに、「疼痛」という用語は侵害受容性疼痛または痛覚も指す。
【０２０２】
本明細書で用いられる「有効量」は、所望する治療効果を生じるのに十分な本発明の化合物または組成物の量を指す。有効量は、被験者の年齢および生理的状態、該障害の重症度、治療期間、任意の併用療法の性質、使用される薬学的に許容し得る担体、ならびに当業者の知識および技能の範囲内にある同様の因子に応じて変化するであろう。任意の個別事例における適切な「有効量」は、適切な教科書および文献を参照することにより並びに／またはルーティーンの実験を用いることにより、当業者によって決定され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（９th  Ｅｄ．１９９５）を参照）。
【０２０３】
その使用が本発明の範囲内にある任意のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物の有効量は、混合物毎に、患者毎に、若干変化し、患者の年齢および状態ならびに送達経路などの因子に応じて変化するであろう。このような用量は当業者に公知の常套的な薬学的手法に従って決定できる。一般命題として、約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの用量が治療効力を有するであろう。全ての重量はカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物の重量に基づいて計算される。高濃度での毒性の懸念は、約１０ｍｇ／ｋｇまで等の低レベルまで静脈投与を限定し得る。全ての重量は活性基剤の重量に基づいて計算される。約１０ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの用量は経口投与に用いられ得る。通常、約０．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇの用量は筋内注射に使用され得る。投与頻度は通常１日当たり１、２、もしくは３回であるか又は該状態を調節するのに必要な回数である。または、該薬−オリゴマーコンジュゲートは持続注入により投与され得る。治療期間は治療される骨障害の種類に応じて変化し、患者の寿命と同じ長さのこともある。
【０２０４】
本発明の実施形態によるコンジュゲート混合物を合成する方法も提供される。下記の合成経路の実施形態は単分散混合物の合成を対象とするものであるが、同様な合成経路が本発明の実施形態による他のカルシトニン薬−オリゴマーコンジュゲート混合物を合成するために利用することができる。
【０２０５】
ポリエチレングリコール部分を含むポリマーの実質的に単分散の混合物は反応１：
【化２２】
2007521268.tif 000030
で図示されるように提供される。
【０２０６】
Ｒ1はＨまたは親油性部分である。Ｒ1は、好ましくは、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、芳香族部分、脂肪酸部分、脂肪酸部分のエステル、コレステリル、またはアダマンチルである。Ｒ1は、より好ましくは、Ｈ、低級アルキル、または芳香族部分である。Ｒ1はＨ、メチル、またはベンジルであることが最も好ましい。
【０２０７】
式Ｉにおいて、ｎは１から２５である。好ましくはｎは１から６である。
【０２０８】
Ｘ+は陽イオンである。好ましくは、Ｘ+は、強塩基など、ＰＥＧのヒドロキシル部分をイオン化できる化合物中の任意の陽イオンである。陽イオンの例は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオンおよびタリウムイオンを含むが、これらに限定されない。
【０２０９】
Ｒ2はＨまたは親油性部分である。Ｒ2は直鎖または分岐のアルキル、アリールアルキル、芳香族部分、脂肪酸部分、または脂肪酸部分のエステルであることが好ましい。Ｒ2は、低級アルキル、ベンジル、１から２４の炭素原子を有する脂肪酸部分、または１から２４の炭素原子を有する脂肪酸部分のエステルであることがより好ましい。Ｒ2は、メチル、１から１８の炭素原子を有する脂肪酸部分、または１から１８の炭素原子を有する脂肪酸部分のエチルエステルであることが最も好ましい。
【０２１０】
式ＩＩにおいて、ｍは１から２５である。好ましくは、ｍは１から６である。
【０２１１】
Ｍｓはメシラート部分（即ち、ＣＨ3Ｓ（Ｏ2）−）である。
【０２１２】
反応１で図示するように、式Ｉの構造を有する化合物の混合物は、式ＩＩの構造を有する化合物の混合物と反応し、ポリエチレングリコール部分を含み且つ式ＩＩＩの構造を有するポリマーの混合物を提供する。式Ｉの構造を有する化合物の混合物は実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式Ｉの化合物の混合物において少なくとも約９６、９７、９８または９９パーセントの化合物が同じ分子量を有し、より好ましくは、式Ｉの化合物の混合物は単分散の混合物である。式ＩＩの化合物の混合物は実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式ＩＩの化合物の混合物において少なくとも約９６、９７、９８または９９パーセントの化合物が同じ分子量を有し、より好ましくは、式ＩＩの化合物の混合物は単分散の混合物である。式ＩＩＩの化合物の混合物は実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式ＩＩＩの化合物の混合物において少なくとも約９６、９７、９８または９９パーセントの化合物が同じ分子量を有する。より好ましくは、式ＩＩＩの化合物の混合物は単分散の混合物である。
【０２１３】
反応１は約０℃から約４０℃の間で実施されることが好ましく、より好ましくは約１５℃から約３５℃の間で実施され、最も好ましくは室温（約２５℃）で実施される。
【０２１４】
反応１は、当業者に理解されるように、様々な期間実施され得る。反応１は、約０．２５、０．５または０．７５時間から約２、４または８時間の期間、実施されることが好ましい。
【０２１５】
反応１は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジエチルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、ペンタン、Ｎ−メチルピロリジノン、テトラヒドロナフタレン、デカヒドロナフタレン、１，２−ジクロロベンゼン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、またはこれらの混合物など（これらに限定されない）の非プロトン溶媒中で実施されることが好ましい。より好ましくは、溶媒はＤＭＦ、ＤＭＡまたはトルエンである。
【０２１６】
式ＩＩの化合物に対する式Ｉの化合物のモル比は約１：１を上回ることが好ましい。モル比は少なくとも約２：１であることがより好ましい。過剰の式Ｉの化合物を供給することにより、式ＩＩの化合物の実質的に全てが反応することを保証でき、以下に論じるように式ＩＩＩの化合物の回収に役立ち得る。
【０２１７】
式Ｉの化合物は反応２：
【化２３】
2007521268.tif 000031
で図示するように調製されることが好ましい。
【０２１８】
Ｒ1およびＸ+は上述する通りであり、式ＩＶの化合物の混合物は実質的に単分散であり、好ましくは、式ＩＶの化合物の混合物において少なくとも約９６、９７、９８または９９パーセントの化合物が同じ分子量を有し、より好ましくは、式ＩＶの化合物の混合物は単分散の混合物である。
【０２１９】
式ＩＶの化合物のＰＥＧ部分のヒドロキシル部分をイオン化できる種々の化合物は、当業者に理解されるであろう。ヒドロキシル部分をイオン化できる化合物は、好ましくは強塩基である。より好ましくは、ヒドロキシル部分をイオン化できる化合物は、水素化ナトリウム、水素化カリウム、ナトリウムｔ−ブトキシド、カリウムｔ−ブトキシド、ブチルリチウム（ＢｕＬｉ）、およびリチウムジイソプロピルアミンからなる群より選択される。ヒドロキシル部分をイオン化できる化合物は、より好ましくは水素化ナトリウムである。
【０２２０】
式ＩＶの化合物に対する式ＩＶの化合物のＰＥＧ部分のヒドロキシル部分をイオン化できる化合物のモル比は少なくとも約１：１であるのが好ましく、少なくとも約２：１であることがより好ましい。過剰の該ヒドロキシル部分をイオン化できる化合物を供給することにより、式ＩＶの化合物の実質的に全てが反応して式Ｉの化合物を提供することを保証する。従って、式ＩＶの化合物および式Ｉの化合物の両方が反応生成物の混合物に存在する場合に生じ得る分離困難が回避できる。
【０２２１】
反応２は約０℃から約４０℃の間で実施されることが好ましく、より好ましくは約０℃から約３５℃の間で実施され、最も好ましくは約０℃から室温（約２５℃）の間で実施される。
【０２２２】
反応２は、当業者に理解されるように、様々な期間実施され得る。反応２は、約０．２５、０．５または０．７５時間から約２、４または８時間の期間、実施されることが好ましい。
【０２２３】
反応２は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジエチルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、ペンタン、Ｎ−メチルピロリジノン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロナフタレン、デカヒドロナフタレン、１，２−ジクロロベンゼン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、またはこれらの混合物など（これらに限定されない）の非プロトン溶媒中で実施されることが好ましい。より好ましくは、溶媒はＤＭＦ、ジクロロメタンまたはトルエンである。
【０２２４】
式ＩＩの化合物は反応３に図示されるように調製されることが好ましい。
【化２４】
2007521268.tif 000032
【０２２５】
Ｒ2およびＭｓは上述の通りであり、式Ｖの化合物は式Ｖの化合物の実質的に単分散の混合物として提示され、好ましくは、式Ｖの化合物の混合物において少なくとも約９６、９７、９８または９９パーセントの化合物が同じ分子量を有し、より好ましくは、式Ｖの化合物の混合物は単分散の混合物である。
【０２２６】
Ｑはハロゲン化物であり、好ましくは塩素またはフッ素である。
【０２２７】
ＣＨ3Ｓ（Ｏ2）Ｑはハロゲン化メタンスルホニルである。ハロゲン化メタンスルホニルは塩化メタンスルホニルまたはフッ化メタンスルホニルであることが好ましい。より好ましくは、ハロゲン化メタンスルホニルは塩化メタンスルホニルである。
【０２２８】
式Ｖの化合物に対するハロゲン化メタンスルホニルのモル比は約１：１を超えることが好ましく、少なくとも約２：１であることがより好ましい。過剰のハロゲン化メタンスルホニルを供給することにより、式Ｖの化合物の実質的に全てが反応して式ＩＩの化合物を提供することを保証する。従って、式Ｖの化合物および式ＩＩの化合物の両方が反応生成物の混合物に存在する場合に生じ得る分離困難が回避できる。
【０２２９】
反応３は約−１０℃から約４０℃の間で実施されることが好ましく、より好ましくは約０℃から約３５℃の間で実施され、最も好ましくは約０℃から室温（約２５℃）の間で実施される。
【０２３０】
反応３は、当業者に理解されるように、様々な期間実施され得る。反応３は、約０．２５、０．５または０．７５時間から約２、４または８時間の期間、実施されることが好ましい。
【０２３１】
反応３は、モノメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、モノイソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、モノ−ｎ−ブチルアミン、ジ−ｎ−ブチルアミン、トリ−ｎ−ブチルアミン、モノシクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、またはこれらの混合物を含むが、これらに限定されない脂肪族アミンの存在下で実施されることが好ましい。より好ましくは、脂肪族アミンはトリエチルアミンなどの第三アミンである。
【０２３２】
当業者に理解されるように、式Ｖの化合物の実質的に単分散の様々な混合物が市販されている。例えば、Ｒ2がＨまたはメチルである場合、式Ｖの化合物はＰＥＧまたはｍＰＥＧの化合物であり、それぞれＡｌｄｒｉｃｈ  ｏｆ  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ；Ｆｌｕｋａ  ｏｆ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、および／またはＴＣｌ  Ａｍｅｒｉｃａ  ｏｆ  Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎから市販されている。
【０２３３】
Ｒ2が例えば高級アルキル、脂肪酸、脂肪酸のエステル、コレステリル、またはアダマンチルなどの親油性部分である場合、式Ｖの化合物は当業者に理解されるような種々の方法により提供され得る。式Ｖの化合物は下記：
【化２５】
2007521268.tif 000033
の通りに提供されることが好ましい。
【０２３４】
Ｒ2は親油性部分であり、好ましくは高級アルキル、脂肪酸エステル、コレステリル、またはアダマンチルであり、より好ましくは脂肪酸の低級アルキルエステルであり、最も好ましくは１から１８の炭素原子を有する脂肪酸のエチルエステルである。
【０２３５】
Ｒ3は、Ｈ、ベンジル、トリチル、テトラヒドロピラン、または当業者に理解されるような他のアルコール保護基である。
【０２３６】
Ｘ2+はＸ+に関して上述する陽イオンである。
【０２３７】
ｍの値は上述する通りである。
【０２３８】
反応４に関して、式ＶＩの化合物の混合物は、反応１に関して上述する反応条件と同様な条件下で式ＶＩＩの化合物の混合物と反応する。式ＶＩの化合物の混合物は実質的に単分散の混合物である。式ＶＩの化合物の混合物における少なくとも約９６、９７、９８または９９パーセントの化合物が同じ分子量を有する。より好ましくは、式ＶＩの化合物の混合物は単分散の混合物である。式ＶＩＩの化合物の混合物は実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式ＶＩＩの化合物の混合物における少なくとも約９６、９７、９８または９９パーセントの化合物が同じ分子量を有する。より好ましくは、式ＶＩＩの化合物の混合物は単分散の混合物である。
【０２３９】
反応５に関して、式ＶＩＩＩの化合物は、当業者に理解されるような種々の方法により、加水分解されてＲ3部分をアルコールに変換し得る。Ｒ3がベンジルまたはトリチルである場合、該加水分解は当業者に知られるように、パラジウム炭触媒の存在下でＨ2を用いて実施されることが好ましい。無論、Ｒ3がＨである場合、反応５は不必要である。
【０２４０】
式ＶＩの化合物は市販されているか又は反応３に関して上述されるようにして提供することができる。式ＶＩＩの化合物は反応２に関して上述されるようにして提供することができる。
【０２４１】
ＰＥＧ部分を含み且つ上記の式ＩＩＩの構造を有するポリマーの実質的に単分散の混合物は、ＰＥＧ鎖を伸長するために、ＰＥＧ部分を含む実質的に単分散の他のポリマーとさらに反応し得る。例えば、下記のスキーム：
【化２６】
2007521268.tif 000034
が用いられ得る。
【０２４２】
Ｍｓ、ｍおよびｎは反応１に関して上述する通りであり；ｐはｎおよびｍと同様であり、Ｘ2+は反応１に関して上述されたＸ+と同様である。Ｑは反応３に関して上述される通りである。Ｒ2は反応１に関して上述する通りであり、好ましくは低級アルキルである。Ｒ1はＨである。反応６は反応３に関して上述されたのと同様な様式で実施されることが好ましい。反応７は反応１に関して上述されたのと同様な様式で実施されることが好ましい。式ＩＩＩの化合物の混合物における少なくとも約９６、９７、９８または９９パーセントの化合物が同じ分子量を有し、より好ましくは、式ＩＩＩの化合物の混合物は単分散の混合物である。式Ｘの化合物の混合物は実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式Ｘの化合物の混合物における少なくとも約９６、９７、９８または９９パーセントの化合物が同じ分子量を有し、より好ましくは、式Ｘの化合物の混合物は単分散の混合物である。
【０２４３】
本発明の実施形態による工程は、これから記載する図１に示すスキームにより図示される。実質的に単分散のポリエチレングリコールを含むオリゴマーの合成は、実質的に単分散のポリエチレングリコールのモノベンジルエーテル（１）の調製により開始する。過剰の、市販の実質的に単分散のポリエチレングリコールは、Ｃｏｕｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１６（１）：１９−２６（１９８６）により記載されるように、水性水酸化ナトリウムの存在下で塩化ベンジルと反応する。次に、１のナトリウム塩はＮａＨの添加により調製され、このナトリウム塩はヒドロキシアルカン酸のエステル（２）から合成されるメシラートと反応する。メシラートの置換の生成物（３）は接触水素化により脱ベンジル化されアルコール（４）を得る。このアルコールのメシラート（５）は、塩化メタンスルホニルの添加により調製され、実質的に単分散のポリエチレングリコール誘導体のモノメチルエーテルのナトリウム塩との反応において求電子試薬として使用され得ることにより、該オリゴマーのポリエチレングリコール部分を所望の長さまで伸長し、長いエステル（６）を得る。該エステルは、水性塩基中で該酸（７）に加水分解され、カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により活性エステル（８）に変換され得る。図１に図示されるオリゴマーはＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性化されるが、本発明のオリゴマーを活性化するために、パラ−ニトロフェニルクロロホルメート、フェニルクロロホルメート、３，４−フェニルジクロロホルメート、および３，４−フェニルジクロロホルメートなどの活性フェニルクロロホルメート；トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｉｏｎ）；およびアセタール形成を含むが、これらに限定されない種々の他の試薬を使用できることは理解されるべきである。
【０２４４】
さらに図１に言及すると、ｑは１から２４である。好ましくは、ｑは１から１８であり、ｑは４から１６であることがより好ましい。Ｒ4は加水分解を受けることができる部分であり、カルボン酸を提供する。Ｒ4は好ましくは低級アルキルであり、より好ましくはエチルである。変数のｎおよびｍは反応１に関して上述したものである。
【０２４５】
本明細書に記載の手法で使用される全ての出発物質は市販されているか又は市販の出発物質を用いて当分野で公知の方法により調製可能である。
【０２４６】
本発明はこれから下記の実施例に関して記載する。これらの実施例は本発明の態様を例証する目的のものであり、特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を制限するものでないことが理解されるべきである。
【０２４７】
［実施例］
［実施例１から実施例１０］
実施例１から１０の反応は、他に明記しない限り、マグネチックスターラーを使用して窒素下で実施した。「ワークアップ（ｗｏｒｋ−ｕｐ）」は、有機溶媒での抽出、飽和ＮａＣｌ溶液を用いた有機相の洗浄、乾燥（ＭｇＳＯ4）、および蒸発（回転式蒸発器）を意味する。薄層クロマトグラフィーはシリカゲル６０°Ｆ−２５４で事前に塗布したＭｅｒｃｋガラスプレートで実施し、スポットをヨード蒸気により可視化した。全ての質量スペクトルは、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＣＯにより測定され、ｍ／ｚ（相対強度）の大きさで報告される。元素分析および融点はＧａｌｂｒａｉｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮにより実施された。実施例１から１０は図２で図示されるスキームについて言及する。
【実施例１】
【０２４８】
８−メトキシ−１−（メチルスルホニル）オキシ−３，６−ジオキサオクタン（９）
非多分散のトリエチレングリコールモノメチルエーテル分子（４．００ｍｌ，４．１９ｇ，２５．５ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（４．２６ｍｌ，３．０９ｇ，３０．６ｍｍｏｌ）とを含む乾燥ジクロロメタン（５０ｍｌ）溶液は氷浴で冷やし窒素雰囲気下においた。塩化メタンスルホニル（２．３７ｍｌ，３．５１ｇ，３０．６ｍｍｏｌ）を含む乾燥ジクロロメタン（２０ｍｌ）溶液を添加漏斗から滴下した。該塩化物の添加完了の１０分後、反応混合物は氷浴から取り出し室温にもどした。混合物はさらに１時間撹拌し、その時点でＴＬＣ（溶離剤（ｅｌｕｔａｎｔ）としての１５％  ＭｅＯＨを含むＣＨＣｌ3）は残存するトリエチレングリコールモノメチルエーテルは無いことを示した。
【０２４９】
反応混合物は別の７５ｍｌのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3、水およびブラインで逐次洗浄した。有機物はＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、真空濃縮し、透明油として化合物９の非多分散混合物を得た（５．３１ｇ、８６％）。
【実施例２】
【０２５０】
エチレングリコールモノメチルエーテル（１０）（ｍ＝４、５、６）
非多分散の化合物１１（３５．７ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＤＭＦ（２５．７ｍｌ）の撹拌溶液に、Ｎ2下で、ＮａＨを含む鉱油の６０％分散液を少しずつ添加し、混合物は室温で１時間撹拌した。この塩１２に、非多分散のメシラート９（２３．３６）を含む乾燥ＤＭＦ（４ｍｌ）溶液を１度に添加し、混合物を室温で３．５時間撹拌した。反応の進行はＴＬＣ（１２％  ＣＨ3ＯＨ−ＣＨＣｌ3）により監視した。反応混合物は等量の１Ｎ  ＨＣｌで希釈し、酢酸エチル（２×２０ｍｌ）で抽出し、廃棄した。水性溶液の抽出およびワークアップにより、非多分散のポリマー１０を得た（収率８２〜８４％）。
【実施例３】
【０２５１】
３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサドコサノール（１０）（ｍ＝４）
油；Ｒｆ  ０．４６（メタノール：クロロホルム＝３：２２）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ15Ｈ32Ｏ8に対する計算値３４０．２１（Ｍ+＋１）、測定値３４１．２。
【実施例４】
【０２５２】
３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサペンタコサノール（１０）（ｍ＝５）
油；Ｒｆ  ０．４３（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ17Ｈ36Ｏ9に対する計算値３８４．２４（Ｍ+＋１）、測定値３８５．３。
【実施例５】
【０２５３】
３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサオクタコサノール（１０）（ｍ＝６）
油；Ｒｆ  ０．４２（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ19Ｈ40Ｏ10に対する計算値４２８．２６（Ｍ+＋１）、測定値４２９．３。
【実施例６】
【０２５４】
２０−メトキシ−１−（メチルスルホニル）オキシ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサエイコサン（１４）
非多分散の化合物１４は、９について記載するようにアルコール１３（ｍ＝４）および塩化メタンスルホニルから油として定量的収率で得られた；Ｒｆ  ０．４（酢酸エチル：アセトニトリル＝１：５）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ17Ｈ37Ｏ10に対する計算値４３３．２１（Ｍ+＋１）、測定値４３３．４６９。
【実施例７】
【０２５５】
エチレングリコールモノメチルエーテル（１５）（ｍ＝３，４，５）
非多分散化合物１５は化合物１０について上述した手法を用いてジオールから調製した。
【実施例８】
【０２５６】
３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０−デカオキサヘンエイコサノール（１５）（ｍ＝３）
油；Ｒｆ  ０．４１（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ21Ｈ44Ｏ11に対する計算値４７２．２９（Ｍ+＋１）、測定値４７２．２９。
【実施例９】
【０２５７】
３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−ウンエカオキサテトラトリコサノール（１５）（ｍ＝４）
油；Ｒｆ  ０．４１（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ23Ｈ48Ｏ12に対する計算値５１６．３１（Ｍ+＋１）、測定値５１６．３１。
【実施例１０】
【０２５８】
３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサヘプタトリコサノール（１５）（ｍ＝５）
油；Ｒｆ  ０．４１（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ25Ｈ52Ｏ13に対する計算値５６０．６７（Ｍ+＋１）、測定値５６０．６７。
【０２５９】
実施例１１から１８は図３で図示されるスキームについて言及する。
【実施例１１】
【０２６０】
ヘキサエチレングリコールモノベンジルエーテル（１６）
３．９９ｇ（１００ｍｍｏｌ）ＮａＯＨを４ｍｌの水に溶解することにより調製される水酸化ナトリウム水溶液は、非多分散のヘキサエチレングリコール（２８．１７５ｇ，２５ｍｌ，１００ｍｍｏｌ）に徐々に添加した。塩化ベンジル（３．９ｇ，３０．８ｍｍｏｌ，３．５４ｍｌ）を添加し、反応混合物は撹拌しながら１００℃まで１８時間加熱した。次いで反応混合物を冷却し、ブライン（２５０ｍｌ）で希釈し、塩化メチレン（２００ｍｌ×２）で抽出した。合わせた有機層はブラインで一度洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、真空濃縮して濃褐色の油を得た。粗生成物の混合物はフラッシュ・クロマトグラフィー（シリカゲル、勾配溶離：酢酸エチルから９／１  酢酸エチル／メタノール）により精製し、黄色油として、非多分散の１６を８．０９９ｇ（７０％）得た。
【実施例１２】
【０２６１】
エチル６−メチルスルホニルオキシヘキサノエート（１７）
非多分散のエチル６−ヒドロキシヘキサノエート（５０．７６ｍｌ，５０．４１ｇ，２２７ｍｍｏｌ）を含む乾燥ジクロロメタン（７５ｍｌ）溶液は氷浴で冷やし、窒素雰囲気下においた。トリエチルアミン（３４．４３ｍｌ，２４．９９ｇ，２４７ｍｍｏｌ）を添加した。塩化メタンスルホニル（１９．１５ｍｌ，２８．３ｇ，２４７ｍｍｏｌ）を含む乾燥ジクロロメタン（７５ｍｌ）溶液は添加漏斗から滴下した。混合物は３．５時間撹拌し、氷浴が融解するにつれ徐々に室温に達した。混合物はシリカゲルを通して濾過し、濾過物は、水、飽和ＮａＨＣＯ3、水およびブラインで逐次洗浄した。有機物はＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、真空濃縮して淡黄色の油を得た。粗生成物の最終精製はフラッシュ・クロマトグラフィー（シリカゲル、１／１  ヘキサン／酢酸エチル）により行い、無色透明の油としての非多分散生成物（４６．１３ｇ，８５％）を得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ２３９（Ｍ＋Ｈ），１９３（Ｍ−Ｃ2Ｈ5Ｏ）。
【実施例１３】
【０２６２】
６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ベンジルオキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（１８）
水素化ナトリウム（３．２２５ｇまたは６０％油分散液、８０．６ｍｍｏｌ）は８０ｍｌの無水トルエンに懸濁させ、窒素雰囲気下におき、氷浴で冷やした。非分散アルコール１６（２７．３ｇ，７３．３ｍｍｏｌ）を含む８０ｍｌの乾燥トルエン溶液をＮａＨ懸濁液に添加した。混合物は０℃で３０分間撹拌し、室温になるままにし、さらに５時間撹拌し、その時間中に、混合物は透明の茶色溶液になった。非多分散のメシラート１７（１９．２１ｇ，８０．６ｍｍｏｌ）を含む８０ｍｌの乾燥トルエンを、ＮａＨ／アルコール混合物に添加し、合わせた溶液は室温で３日間撹拌した。反応混合物は５０ｍｌのメタノールで急冷し、塩基性アルミナを通して濾過した。濾液は真空濃縮し、フラッシュ・クロマトグラフィー（シリカゲル、勾配溶離：３／１  酢酸エチル／ヘキサンから酢酸エチル）により精製し、淡黄色の油として非多分散生成物（１６．５２ｇ，４４％）を得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５１５（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例１４】
【０２６３】
６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（１９）
非多分散のベンジルエーテル１８（１．０３ｇ，２．０ｍｍｏｌ）を２５ｍｌのエタノールに溶解した。この溶液に、２７０ｍｇの１０％  Ｐｄ／Ｃを添加し、混合物は水素雰囲気下におき、４時間撹拌し、その時点でＴＬＣは出発物質の完全な消失を示した。反応混合物はＣｅｌｉｔｅ  ５４５を通して濾過して触媒を取り除き、濾液は真空濃縮し、透明油として非多分散の表題化合物（０．６７ｇ，７９％）を得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４２５（Ｍ＋Ｈ），４４７（Ｍ＋Ｎａ）。
【実施例１５】
【０２６４】
６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メチルスルホニルエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（２０）
非多分散のアルコール１９（０．８３５ｇ，１．９７ｍｍｏｌ）を３．５ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解し、窒素雰囲気下においた。トリエチルアミン（０．３０１ｍｌ，０．２１９ｇ，２．１６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物は氷浴で冷却した。２分後、塩化メタンスルホニル（０．１６ｍｌ，０．２４８ｇ，２．１６ｍｍｏｌ）を添加した。該混合物は、０℃で１５分間、次いで室温で２時間、撹拌した。反応混合物は、シリカゲルを通して濾過し、塩化トリエチルアンモニウムを取り除き、濾液は、水、飽和ＮａＨＣＯ3、水およびブラインで逐次洗浄した。有機物はＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過し、ならびに真空濃縮した。残渣はカラム・クロマトグラフィー（シリカゲル、９／１  酢酸エチル／メタノール）により精製し、非多分散化合物２０（０．８１９ｇ，８３％）を透明な油として得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５０３（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例１６】
【０２６５】
６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸エチルエステル（２１）
ＮａＨ（８８ｍｇの６０％油中分散液、２．２ｍｍｏｌ）は無水トルエン（３ｍｌ）にＮ2下で懸濁し０℃まで冷却した。トルエンとの共沸蒸留により乾燥した非多分散のジエチレングリコールモノメチルエーテル（０．２６ｍｌ，０．２６ｇ，２．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物は室温まで温め、４時間撹拌し、その時間中、濁った灰色の懸濁液は透明の黄色になり次いで茶色になった。メシラート２０（０．５０ｇ，１．０ｍｍｏｌ）を含む２．５ｍｌの乾燥トルエンを添加した。室温で一晩撹拌した後、反応は２ｍｌのメタノールの添加により急冷し、得られる溶液はシリカゲルを通して濾過した。濾液は真空濃縮した。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４９９（Ｍ＋Ｈ），５２１（Ｍ＋Ｎａ）。分取クロマトグラフィー（シリカゲル、１９／３  クロロホルム／メタノール）で更に精製して、透明な黄色油として非多分散の生成物（０．３０２ｇ  ５７％）が得られた。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５２７（Ｍ＋Ｈ），５４９（Ｍ＋Ｎａ）。
【実施例１７】
【０２６６】
６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸（２２）
非多分散のエステル２１（０．２５ｇ，０．４６ｍｍｏｌ）は０．７１ｍｌの１  Ｎ  ＮａＯＨ中で１８時間撹拌した。１８時間後、該混合物は真空濃縮してアルコールを除去し、残渣はさらに１０ｍｌの水に溶解した。水溶液は２  Ｎ  ＨＣｌでｐＨ  ２に酸性化し、生成物はジクロロメタン（３０ｍｌ×２）中に抽出した。合わせた有機物は次いでブライン（２５ｍｌ×２）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過し、真空濃縮して黄色油として非多分散の表題化合物（０．１４７ｇ，６２％）を得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４９９（Ｍ＋Ｈ），５２１（Ｍ＋Ｎａ）。
【実施例１８】
【０２６７】
６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（２３）
非多分散の酸２３（０．２０９ｇ，０．４２ｍｍｏｌ）は、４ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解させ、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）（５７．８ｍｇ，０．５０２ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド）（９８．０ｍｇ，０．５０２ｍｍｏｌ）を既に含む乾燥したフラスコに、Ｎ2雰囲気下で添加した。溶液は室温で一晩撹拌し、シリカゲルを通して濾過し、過剰の試薬およびＥＤＣから形成された尿素を取り除いた。濾液は真空濃縮し、暗黄色の油として非多分散の生成物（０．２３５ｇ，９４％）を得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５９６（Ｍ＋Ｈ），６１８（Ｍ＋Ｎａ）。
【０２６８】
実施例１９から２４は図４で図示されるスキームについて言及する。
【実施例１９】
【０２６９】
トリエチレングリコールモノメチルエーテルのメシラート（２４）
氷浴で０℃まで冷却したＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）溶液に、非多分散のトリエチレングリコールモノメチルエーテル（２５ｇ，０．１５ｍｏｌ）を添加した。次に、トリエチルアミン（２９．５ｍｌ，０．２２ｍｏｌ）を添加し、溶液は０(Ｃで１５分間撹拌し、続いて塩化メタンスルホニル（１３．８ｍｌ，０．１８ｍｏｌ，２０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解）を滴加した。反応混合物は０(Ｃで３０分間撹拌し、室温まで温めた後、２時間撹拌した。粗反応混合物はＣｅｌｉｔｅ（洗浄したＣＨ2Ｃｌ2約２００ｍｌ）を通して濾過した後、Ｈ2Ｏ（３００ｍｌ）、５％  ＮａＨＣＯ3（３００ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（３００ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ（３００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発乾固した。該油は次いで乾燥を確実にするため真空ラインに約２時間おかれ、黄色の油として非多分散の表題化合物（２９．１５ｇ，収率８０％）を得た。
【実施例２０】
【０２７０】
へプタエチレングリコールモノメチルエーテル（２５）
非多分散のテトラエチレングリコール（５１．５ｇ，０．２７ｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１Ｌ）溶液に、カリウムｔ−ブトキシド（１４．８ｇ，０．１３ｍｏｌ，約３０分にわたって少量宛て）を添加した。反応混合物は次いで１時間撹拌した後、ＴＨＦ（９０ｍｌ）に溶解した２４（２９．１５ｇ，０．１２ｍｏｌ）が滴加され、反応混合物は一晩撹拌した。粗反応混合物はＣｅｌｉｔｅ（洗浄したＣＨ2Ｃｌ2，約２００ｍｌ）を通して濾過し、蒸発乾固した。油は次にＨＣｌ（２５０ｍｌ，１  Ｎ）に溶解し、酢酸エチル（２５０ｍｌ）で洗浄し、過剰な２４を取り除いた。残存する２４を取り除くために、さらなる酢酸エチル（１２５ｍｌ）の洗浄が必要なこともある。水相は、２５の大半が水相から除去されるまで、ＣＨ2Ｃｌ2（１２５ｍｌ体積）で繰り返し洗浄した。最初の抽出は、２４、２５、および二結合（ｄｉｃｏｕｐｌｅｄ）の副生成物を含み、ＨＣｌ（１２５ｍｌ，１Ｎ）で逆抽出するべきである。有機層を合わせて蒸発乾固した。得られる油は次いでＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）に溶解し、２５が除去されるまで、Ｈ2Ｏ（５０ｍｌ  ｖｏｌｕｍｅｓ）で繰り返し洗浄した。水性画分を合わせて全体積を５００ｍｌにし、ＮａＣｌは該溶液が濁るまで添加した後、ＣＨ2Ｃｌ2（２×５００ｍｌ）で洗浄した。有機層は合わせて、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発乾固し、非多分散の表題化合物（１６．９ｇ，収率４１％）を油として得た。高い純度を保証するために精製手法の段階１つ以上を繰り返すことが望ましいこともある。
【実施例２１】
【０２７１】
８−ブロモオクトアネート（２６）
８−ブロモオクタン酸（５．０ｇ，２２ｍｍｏｌ）を含むエタノール（１００ｍｌ）溶液に、Ｈ2ＳＯ4（０．３６ｍｌ，７．５ｍｍｏｌ）を添加し、該反応は３時間撹拌しながら加熱還流させた。粗反応混合物は室温まで冷却し、Ｈ2Ｏ（１００ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ3（２×１００ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発乾固し、透明な油（５．５ｇ，収率９８％）を得た。
【実施例２２】
【０２７２】
ＭＰＥＧ７−Ｃ８エステル（２７）の合成
非多分散の化合物２５（３．０ｇ，８．８ｍｍｏｌ）を含むエーテル（９０ｍｌ）溶液に、カリウムｔ−ブトキシド（１．２ｇ，９．６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１時間撹拌した。次に、エーテル（１０ｍｌ）に溶解した非多分散の化合物２６（２．４ｇ，９．６ｍｍｏｌ）を滴加し、反応混合物を一晩撹拌した。粗反応混合物はＣｅｌｉｔｅ（洗浄したＣＨ2Ｃｌ2，約２００ｍｌ）を通して濾過し、蒸発乾固した。得られる油は酢酸エチルに溶解し、Ｈ2Ｏ（２×２００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発乾固した。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル対酢酸エチル／メタノール、１０：１）を行い、非多分散の表題化合物を透明油として得た（０．８４３ｇ，収率１９％）。
【実施例２３】
【０２７３】
ＭＰＥＧ７−Ｃ８酸（２８）
非多分散化合物２７（０．７０ｇ，１．４ｍｍｏｌ）の油に、１Ｎ  ＮａＯＨ（２．０ｍｌ）を添加し、反応混合物を４時間撹拌した。粗反応混合物は濃縮し、酸性化し（ｐＨ〜２）、ＮａＣｌで飽和させ、ＣＨ2Ｃｌ2（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層は合わせて、飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発乾固し、非多分散の表題化合物を透明な油として得た（０．３５ｇ，収率５３％）。
【実施例２４】
【０２７４】
ＭＰＥＧ７−Ｃ８酸（２９）の活性化
非多分散のｍＰＥＧ７−Ｃ８−酸２８（０．３１ｇ，０．６４ｍｍｏｌ）を３ｍｌの無水塩化メチレンに溶解した後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０７９ｇ，０．６９ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ・ＨＣｌ（１３５．６ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）とを含む無水塩化メチレン溶液を添加した。反応物を数時間撹拌した後、１Ｎ  ＨＣｌ、水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗生成物はカラムクロマトグラフィーで精製し、濃縮して、非多分散の表題化合物を透明油として得た。これは、真空乾燥させた。
【０２７５】
実施例２５から２９は図５に図示されるスキームについて言及する。
【実施例２５】
【０２７６】
１０−ヒドロキシデカノエート（３０）
非多分散のｌ０−ヒドロキシデカン酸（５．０ｇ，２６．５ｍｍｏｌ）を含むエタノール（１００ｍｌ）溶液に、Ｈ2Ｓ０4（０．４３ｍｌ，８．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応は撹拌しながら３時間還流加熱した。粗反応混合物は室温まで冷却し、Ｈ2Ｏ（１００ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ3（２×１００ｍｌ）、Ｈ2０（１００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発乾固し、非多分散の表題化合物を透明油として得た（６．９ｇ，収率９８％）。
【実施例２６】
【０２７７】
１０−ヒドロキシデカノエートのメシラート（３１）
ＣＨ2Ｃｌ2（２７ｍｌ）溶液に、非多分散の１０−ヒドロキシデカノエート３０（５．６ｇ，２６ｍｍｏｌ）を添加し、氷浴で０℃まで冷却した。次いで、トリエチルアミン（５ｍｌ，３７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物は０℃で１５分間撹拌した。ＣＨ2Ｃｌ2（３ｍｌ）に溶解した塩化メタンスルホニル（２．７ｍｌ，２４ｍｍｏｌ）を添加し、該反応混合物は０℃で３０分間撹拌し、氷浴を外し、反応物は室温で更に２時間撹拌した。粗反応混合物はＣｅｌｉｔｅ（洗浄したＣＨ2Ｃ１2，８０ｍｌ）を通して濾過し、濾液はＨ2Ｏ（１００ｍｌ）、５％  ＮａＨＣＯ3（２×１００ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ（１００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発乾固し、非多分散の表題化合物を帯黄色の油として得た（７．４２ｇ，収率９７％）。
【実施例２７】
【０２７８】
ＭＰＥＧ7−Ｃ10エステル（３２）
非多分散のヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル２５（２．５ｇ，７．３ｍｍｏｌ）を含むテトラヒドロフラン（１００ｍｌ）溶液に、水素化ナトリウム（０．１９４ｇ，８．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物は１時間撹拌した。次いで、テトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に滴加して溶解した非多分散の１０−ヒドロキシデカノエート３１（２．４ｇ，８．１ｍｍｏｌ）のメシラートを添加し、反応混合物は一晩撹拌した。粗反応混合物はＣｅｌｉｔｅ（洗浄したＣＨ2Ｃ１2，〜２００ｍｌ）を通して濾過し、蒸発乾固した。得られる油は酢酸エチルに溶解し、Ｈ2Ｏ（２×２００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発乾固し、クロマトグラフ（シリカ、酢酸エチル／メタノール、１０：１）にかけ、かつクロマトグラフ（シリカ、酢酸エチル）にかけて、非多分散の表題化合物を透明油として得た（０．５７０ｇ，収率１５％）。
【実施例２８】
【０２７９】
ＭＰＥＧ7−Ｃ10酸（３３）
非多分散のｍＰＥＧ7−Ｃ10エステル３２（０．５７０ｇ，１．１ｍｍｏｌ）の油に、１Ｎ  ＮａＯＨ（１．６ｍｌ）を添加し、反応混合物は一晩撹拌した。粗反応混合物は濃縮し、酸性化（ｐＨ〜２）し、ＮａＣｌで飽和させ、ＣＨ2Ｃｌ2(２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を合わせて、飽和ＮａＣｌ（２×５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発乾固し、非多分散の表題化合物を透明油として得た（０．３４０ｇ，収率６２％）。
【実施例２９】
【０２８０】
ＭＰＥＧ7−Ｃ10酸（３４）の活性化
非多分散の酸３３は、実施例２４で上述した手法と類似する手法を用いて活性化した。
実施例３０および実施例３１は図６に図示されるスキームについて言及する。
【実施例３０】
【０２８１】
Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマー（３６）の合成
非多分散の塩化ステアロイル３５（０．７ｇ，２．３１ｍｍｏｌ）は、ＰＥＧ６（５ｇ，１７．７ｍｍｏｌ）とピリジン（０．９７ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）とを含むベンゼンの混合物に徐々に添加した。反応混合物は数時間（〜５）撹拌した。反応後に展開溶媒として酢酸エチル／メタノールを用いたＴＬＣを行った。次いで、反応混合物は水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、濃縮し、真空乾燥した。精製された非多分散化合物３６はＦＡＢＭＳにより分析した：ｍ／ｅ  ５４９／  Ｍ+Ｈ。
【実施例３１】
【０２８２】
Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマーの活性化
非多分散のＣ１８（ＰＥＧ６）オリゴマーの活性化は２段階で完遂した：
１）非多分散のステアロイル−ＰＥＧ３６（０．８ｇ，１．４６ｍｍｏｌ）をトルエンに溶解し、氷浴で冷却したホスゲン溶液（１０ｍｌ，トルエン中２０％）に添加した。反応混合物は０℃で１時間次いで室温で３時間撹拌した。次に、ホスゲンおよびトルエンを留去し、残存する非多分散のステアロイルＰＥＧ６クロロホルメート３７をＰ2Ｏ5で一晩乾燥させた。
２）非多分散のステアロイルＰＥＧ６クロロホルメート３６（０．７８ｇ，１．２７ｍｍｏｌ）とＴＥＡ（１２８ｍｇ，１．２７ｍｍｏｌ）とを含む無水塩化メチレン溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む塩化メチレン溶液を添加した。反応混合物を１６時間撹拌した後、水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、濃縮し、真空乾燥させて非多分散の活性化Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマー３８を得た。
【０２８３】
実施例３２から３７は図７に図示されるスキームについて言及する。
【実施例３２】
【０２８４】
テトラエチレングリコールモノベンジルエーテル（３９）
非多分散のテトラエチレングリコール（１９．４ｇ，０．１０ｍｏｌ）の油に、ＮａＯＨ（４．０ｍｌ中４．０ｇ）溶液を添加し、反応物を１５分間撹拌した。次いで、塩化ベンジル（３．５４ｍｌ，３０．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物は１００℃まで加熱し、一晩撹拌した。反応混合物は室温まで冷却し、飽和ＮａＣｌ（２５０ｍｌ）で希釈し、ＣＨ2Ｃｌ2（２×２００ｍｌ）で洗浄した。有機層を合わせて、飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、クロマトグラフ（シリカ、酢酸エチル）にかけて、非多分散の表題化合物を黄色の油として得た（６．２１ｇ，収率７１％）。
【実施例３３】
【０２８５】
テトラエチレングリコールモノベンジルエーテルのメシラート（４０）
ＣＨ2ＣＩ2（２０ｍｌ）溶液に、非多分散のテトラエチレングリコールモノベンジルエーテル３９（６．２１ｇ，２２ｍｍｏｌ）を添加し、氷浴で０℃まで冷却した。次いで、トリエチルアミン（３．２ｍｌ，２４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物は０℃で１５分間撹拌した。次に、ＣＨ2ＣＩ2（２ｍｌ）に溶解した塩化メタンスルホニル（１．７ｍｌ，２４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物は０℃で３０分間撹拌し、氷浴は除去し、反応物を室温で更に２時間撹拌した。粗反応混合物はＣｅｌｉｔｅ（洗浄したＣＨ2ＣＩ2，８０ｍｌ）を通して濾過し、濾液はＨ2Ｏ（１００ｍｌ）、５％  ＮａＨＣＯ3（２×１００ｍｌ）、Ｈ2０（１００ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ（１００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。生じた黄色の油は活性炭（１０ｇ）を含むシリカのパッドでクロマトグラフにかけて、非多分散の表題化合物を透明油として得た（７．１０ｇ，収率８９％）。
【実施例３４】
【０２８６】
オクタエチレングリコールモノベンジルエーテル（４１）
水素化ナトリウム（０．４３ｇ，１８ｍｍｏｌ）を含むテトラヒドロフラン（１４０ｍｌ）溶液に、非多分散のテトラエチレングリコール（３．５ｇ，１８ｍｍｏｌ）を含むテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）溶液を滴加し、反応混合物は１時間撹拌した。次いでテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に溶解した非多分散のテトラエチレングリコールモノベンジルエーテル４０（６．０ｇ，１６．５ｍｍｏｌ）のメシラートを滴加し、反応混合物は一晩撹拌した。粗反応混合物はＣｅｌｉｔｅ（洗浄済み、ＣＨ2Ｃｌ2，２５０ｍｌ）を通して濾過し、濾液はＨ2Ｏで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、蒸発乾固した。生じた油はクロマトグラフ（シリカ、酢酸エチル／メタノール、１０：１）にかけ、かつクロマトグラフ（シリカ、クロロホルム／メタノール、２５：１）にかけて、非多分散の表題化合物を透明な油として得た（２．６２ｇ，３４％の収率）。
【実施例３５】
【０２８７】
ステアリン酸ＰＥＧ８−ベンジル（４３）の合成
非多分散のオクタエチレングリコールモノベンジルエーテル４１（０．９９８ｇ，２．０７ｍｍｏｌ）およびピリジン（１６３．９ｍｇ，２．０７ｍｍｏｌ）の撹拌冷却溶液に、非多分散の塩化ステアロイル４２（６２７．７ｍｇ，２．０７ｍｍｏｌ）を含むベンゼンを添加した。反応混合物は一晩（１８時間）撹拌した。翌日、反応混合物は水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、濃縮し、真空乾燥した。次いで、粗生成物は１０％メタノール／９０％クロロホルムを用いてフラッシュシリカゲルカラムのクロマトグラフにかけた。生成物を含む画分を合わせて、濃縮し、真空乾燥して、非多分散の表題化合物を得た。
【実施例３６】
【０２８８】
ステアレート−ＰＥＧ８−ベンジルの水素化分解
非多分散ステアレート−ＰＥＧ８−Ｂｚｌ４３（０．８５４ｇ  １．１３８ｍｍｏｌ）のメタノール溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１０％）（パラジウム、活性炭上１０重量％）を添加した。反応混合物は一晩（１８時間）水素下で撹拌した。次いで、該溶液は濾過し、濃縮し、１０％メタノール／９０％クロロホルムを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、Ｒt＝０．６の画分を回収し、濃縮し、乾燥して、非多分散の酸４４を得た。
【実施例３７】
【０２８９】
Ｃ１８（ＰＥＧ８）オリゴマーの活性化
非多分散ステアレート−ＰＥＧ８オリゴマーの２段階活性化は、上記の実施例３１でステアレート−ＰＥＧ６について記載したように実施し、非多分散の活性化Ｃ１８（ＰＥＧ８）オリゴマー４５を得た。
【実施例３８】
【０２９０】
活性化トリエチレングリコールモノメチルオリゴマーの合成
下記の記載は図８に図示されるスキームについて言及する。２０％ホスゲン（１００ｍｌ，約１８．７ｇ，１８９ｍｍｏｌ  ホスゲン）を含むトルエン溶液はＮ2雰囲気下で０℃まで冷却した。非多分散のｍＴＥＧ（トリエチレングリコールモノメチルエーテル、７．８ｇ，４７．５ｍｍｏｌ）は２５ｍｌの無水酢酸エチルに溶解し、冷却したホスゲン溶液に添加した。該混合物は０℃で１時間撹拌した後、室温まで温め、更に２．５時間撹拌した。残存するホスゲン、酢酸エチルおよびトルエンは真空蒸留により取り除き、透明な油性残渣として非多分散のｍＴＥＧクロロホルメート４６が残った。
【０２９１】
非多分散の残渣４６は５０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解し、それにＴＥＡ（トリエチルアミン、６．６２ｍｌ，４７．５ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、５．８ｇ，５０．４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物は乾燥大気下に室温で２０時間撹拌し、その期間に大量の白色沈殿が出現した。混合物は濾過してこの沈殿物を除去し、真空で濃縮した。得られる油４７はジクロロメタン中から取り出され、冷脱イオン水で２回、１Ｎ  ＨＣｌで２回、ならびにブラインで１回洗浄した。有機物はＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、濃縮して、非多分散の表題化合物を透明な淡黄色の油として得た。必要ならば、溶離液としてＥｔＯＡｃを用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、ＮＨＳエステルを更に精製することができる。
【実施例３９】
【０２９２】
活性化パルミテート−ＴＥＧオリゴマーの合成
以下の記載は図９に記載されるスキームについて言及する。非多分散の無水パルミチン酸（５ｇ；１０ｍｍｏｌ）は乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解し室温で撹拌する。撹拌溶液に、３ｍｏｌ超過のピリジン、続いて非多分散のトリエチレングリコール（１．４ｍｌ）を添加した。反応混合物は１時間撹拌した（反応の進行はＴＬＣにより監視した；酢酸エチル−クロロホルム；３：７）。反応の終わりに、ＴＨＦは除去され、生成物は１０％  Ｈ2ＳＯ4酸と混合し、酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽出した。合わせた抽出物は水、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発させ、非多分散の生成物４８を得た。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（〜１０ｍｌ）溶液は、撹拌しながら、非多分散生成物４８（１ｍｍｏｌ）を含む１０ｍｌの無水ＤＭＦ溶液に添加した。水素化ナトリウム（３ｍｍｏｌ）は該反応混合物に徐々に添加する。反応混合物は数時間（例えば５時間）撹拌する。ジエチルエーテルを添加して、活性化オリゴマーを沈殿させる。この工程は３回反復し、生成物は最終的に乾燥させる。
【実施例４０】
【０２９３】
活性化ヘキサエチレングリコールモノメチルオリゴマーの合成
以下の記載は図１０に図示されるスキームについて言及する。非多分散の活性化ヘキサエチレングリコールモノメチルエーテルは上記の実施例３９における非多分散トリエチレングリコールのものと同様にして調製した。２０％ホスゲンを含むトルエン溶液（３５ｍｌ，６．６６ｇ，６７．４ｍｍｏｌ  ホスゲン）は氷／塩水浴のＮ2雰囲気下で冷却した。非多分散のヘキサエチレングリコール５０（１．８５ｍｌ，２．０ｇ，６．７４ｍｍｏｌ）は、５ｍｌ  無水ＥｔＯＡｃに溶解し、注射器でホスゲン溶液に添加した。反応混合物は氷浴中で１時間撹拌し続け、取り出し、室温で更に２．５時間撹拌した。ホスゲン、ＥｔＯＡｃ、およびトルエンは真空蒸留により除去され、透明な油性残渣として非多分散化合物５１が残った。
【０２９４】
非多分散残渣５１は、乾燥ジクロロメタン２０ｍｌに溶解し、乾燥した不活性雰囲気下に置いた。トリエチルアミン（０．９４ｍｌ、０．６８ｇ、６．７ｍｍｏｌ）、次いで、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、０．８２ｇ、７．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１８時間撹拌した。混合物をシリカゲルで濾過し、白色沈殿物を除去し、真空濃縮した。残渣は、ジクロロメタン中から取り出し、冷水で２回、１Ｎ  ＨＣｌで２回、ブラインで１回洗浄した。有機物は、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。最終精製は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ）により行い、ＵＶ活性非多分散ＮＨＳエステル５２を得た。
【実施例４１】
【０２９５】
サケ・カルシトニン（ＭＷ３４３２，０．０４３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ３０ｍｌ中に溶解した。次いで、ＴＥＡ（３５μｌ）及び無水ＴＨＦ（２ｍｌ）中の実施例２４の活性化オリゴマー（４２ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を１時間撹拌し、次いで０．１％ＴＦＡ水溶液２ｍｌで急冷した。反応後、ＨＰＬＣを行った。次いで、反応混合物を濃縮し、分取ＨＰＬＣ（ＲＣ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ；１×２５カラム、水／０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル、２８０ｎｍで検出）により精製した。モノ−及びジ−コンジュゲートに対応する２個のピークを単離した。試料は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析した。ＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴ、モノコンジュゲートのＭＳ：３８９７。ＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴ、ジコンジュゲートのＭＳ：４３６１。
【実施例４２】
【０２９６】
実施例４１の手法は実施例２９の活性化オリゴマーとサケ・カルシトニンをコンジュゲートするために用いられた。ＰＥＧ７−デシル−ｓＣＴ、モノコンジュゲートのＭＳ：３９２６。ＰＥＧ７−デシル−ｓＣＴ、ジコンジュゲートのＭＳ：４４２０。
【実施例４３】
【０２９７】
実施例４１の手法は実施例３１の活性化オリゴマーとサケ・カルシトニンをコンジュゲートするために用いられた。ステアレート−ＰＥＧ６−ｓＣＴ、モノコンジュゲートのＭＳ：４００６。ステアレート−ＰＥＧ６−ｓＣＴ、ジコンジュゲートのＭＳ：４５８２。
【実施例４４】
【０２９８】
実施例４１の手法は実施例３７の活性化オリゴマーとサケ・カルシトニンをコンジュゲートするために用いられた。ステアレート−ＰＥＧ８−ｓＣＴ、モノコンジュゲートのＭＳ：４０９５。
【実施例４５】
【０２９９】
実施例４１の手法は実施例１８の活性化オリゴマーとサケ・カルシトニンをコンジュゲートするために用いられる。
【実施例４６】
【０３００】
実施例４１の手法は実施例３８の活性化オリゴマーとサケ・カルシトニンをコンジュゲートするために用いられる。
【実施例４７】
【０３０１】
実施例４１の手法は実施例３９の活性化オリゴマーとサケ・カルシトニンをコンジュゲートするために用いられる。
【実施例４８】
【０３０２】
実施例４１の手法は実施例４０の活性化オリゴマーとサケ・カルシトニンをコンジュゲートするために用いられる。
【実施例４９】
【０３０３】
サケ・カルシトニン−オリゴマーコンジュゲートの混合物についての分散係数の決定
サケ・カルシトニン−オリゴマーコンジュゲート混合物の分散係数は下記の通りに決定される。サケ・カルシトニン−オリゴマーコンジュゲートの混合物は、例えば実施例４１で上述されるように提供される。該混合物の第一試料はＨＰＬＣにより精製され、試料中の様々なサケ・カルシトニン−オリゴマーコンジュゲートを分離および単離する。それぞれの単離画分が純粋に単分散のコンジュゲート混合物を含むとすれば、「ｎ」は回収される画分の数に等しい。混合物は下記のコンジュゲート１つ以上を含み得る。コンジュゲートは、コンジュゲーション部位の記載、続いてコンジュゲーションの程度が記載される。Ｌｙｓ11モノコンジュゲート；Ｌｙｓ18モノコンジュゲート；Ｎ−末端モノコンジュゲート；Ｌｙｓ11,18  ジコンジュゲート；Ｌｙｓ11、Ｎ−末端ジコンジュゲート；Ｌｙｓ18、Ｎ−末端ジコンジュゲート；および／またはＬｙｓ11,18、Ｎ−末端トリコンジュゲート。混合物のそれぞれの単離画分は質量分析により解析され画分の質量を決定する。これにより、それぞれの単離画分はモノ−、ジ−、またはトリ−コンジュゲートとして分類でき、試料中のそれぞれのコンジュゲートについての変数「Ｍi」の値を提供する。
【０３０４】
混合物の第二試料はＨＰＬＣにより分析し、ＨＰＬＣトレースを提供する。モル吸光係数がコンジュゲーションの結果として変化しないとすれば、混合物の特定コンジュゲートの重量パーセントは、ＨＰＬＣトレースの全ピーク下全面積の百分率として、特定コンジュゲートに対応するＨＰＬＣトレースのピーク下面積により提供される。試料を回収し、凍結乾燥して、試料の無水グラム重量を決定する。試料のグラム重量は試料中のそれぞれの構成要素の重量パーセントを乗じて試料中のそれぞれのコンジュゲートのグラム重量を決定する。変数「Ｎi」は、試料中の特定コンジュゲートのグラム重量を特定コンジュゲートの質量で割り、商にアボガドロ数（６．０２２０５×１０23ｍｏｌｅ-1）、上記で決定されたＭiを乗じることにより、特定コンジュゲート（ｉ番目コンジュゲート）について決定され、試料中の特定コンジュゲートの分子数Ｎiを得る。次に、分散係数はそれぞれのコンジュゲートについて決定されたｎ、Ｍi、Ｎiを用いて計算される。
【実施例５０】
【０３０５】
サイトセンサー（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ：登録商標）試験
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得られるＴ−４７Ｄ細胞（乳腺管癌細胞系）は、ランニング緩衝液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｏｆ  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販の低緩衝、無血清、重炭酸塩を含まないＲＰＭＩ１６４０培地）中１×１０7  ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で懸濁した。約１００，０００個の細胞は次に１０μｌの小滴のアガロース細胞捕捉培地中に固定し、サイトセンサー・カプセル・カップ内の２枚の３μｍポリカーボネート膜間に挟んだ。サイトセンサーマイクロフィジオメーター（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）のセンサー室に置いたサイトセンサー・カプセル・カップを次いでｐＨ感知検出器に非常に密接して保持した。次に、ランニング緩衝液は、流れが停止する３０秒の間隔を除いて、１００μｌ／分の速度で細胞にいきわたる様にポンプで送り込み、センサー室のランニング緩衝液の酸性化を測定した。酸性化率は２分毎に測定した。センサー室の温度は３７℃であった。細胞は実験開始前の２〜３時間センサー室で平衡にさせ、その期間中、基本的な酸性化率を監視した。次いで、細胞は、種々のｎＭ濃度でランニング緩衝液に希釈された試験化合物（サケ・カルシトニンまたはオクチル−ジ−カルシトニン）に露出させた。試験化合物への細胞の露出は、合計２０分間の反復様式において毎２分のポンプ周期の最初の４０秒間に行なった。これは、試験化合物への細胞の十分な露出を可能にし、細胞代謝の受容体媒介性反応を誘起した。続いて化合物を含まないランニング緩衝液を約５０秒流した。この手法により酸性化率の測定前にセンサー室から試験溶液（ランニング緩衝液単独より僅かに低いｐＨを有した）を洗い流した。従って、酸性化率は完全に細胞活性の尺度であった。同様な手法は、ＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴ、モノコンジュゲート（オクチル−モノ）；ＰＥＧ７−デシル−ｓＣＴ、モノコンジュゲート（デシル−モノ）；ＰＥＧ７−デシル−ｓＣＴ、ジコンジュゲート（デシル−ジ）；ステアレート−ＰＥＧ６−ｓＣＴ、モノコンジュゲート（ＰＥＧ６  Ｓｔ．モノ）；およびステアレート−ＰＥＧ８−ｓＣＴ、モノコンジュゲート（ＰＥＧ８  Ｓｔ．モノ）についてのデータを得るために用いた。データは、各サイトセンサー室の酸性化率のグラフについて曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することにより、化合物の相対的活性を解析し、かつ同じ実験条件下で実施される複数の実験からとられた平均ＡＵＣ測定値を示す図１４に図示される棒グラフとしてプロットした。
【実施例５１】
【０３０６】
酵素安定性
凍結乾燥粉末として供給される化合物は、１０ｍＭ  リン酸緩衝液  ｐＨ  ７．４に再懸濁させた後、ＨＰＬＣによる濃度測定にかける。リン酸緩衝液を用いて、それぞれの特定の腸酵素の活性について最適なｐＨを有する溶液を作製する。このように調製された化合物のアリコートは１．７ｍｌのミクロ遠心管に移し、３７℃の水浴中で１５分間振盪して化合物を温度に平衡させる。１５分後、２μｌの適切な濃縮腸酵素をそれぞれの管に添加し、望ましい最終濃度に到達させる。キモトリプシンおよびトリプシンは１ｍＭ  ＨＣｌに再懸濁する。また、対照として、化合物を２μｌの１ｍＭ  ＨＣｌで処理する。添加直後に、１００μｌの試料は対照管から取り出し、２５μｌのキモトリプシン／トリプシン急冷溶液（１：１  １％  ＴＦＡ：イソプロパノール）のいずれかで急冷する。この試料はＴ＝０分として使用する。試料採取手法は使用する腸酵素に応じて様々な時間間隔で繰り返す。キモトリプシンは１５分、３０分および６０分の試料を有する。トリプシンは３０分、６０分、１２０分および１８０分の試料を有する。全時点が得られると、最終試料は対照管から取り出し、観察される分解が温度または緩衝液に関連しないことを確認する。キモトリプシンおよびトリプシンの試料はＨＰＬＣバイアルに直接に採取してよい。ＲＰ−ＨＰＬＣ（アセトニトリル勾配）を用いて各試料のＡＵＣを決定し、分解率（％）はＴ＝０分の対照に基づいて計算する。結果は以下の表１〜表４に示す。
【０３０７】
【表１】
2007521268.tif 000035
【０３０８】
【表２】
2007521268.tif 000036
【０３０９】
【表３】
2007521268.tif 000037
【０３１０】
【表４】
2007521268.tif 000038
【実施例５２】
【０３１１】
活性および被験者間変動
２０−２５ｇ重量の雄のＣＦ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）は、光（１２：１２の明暗周期、午前６時に点灯）、温度（２１〜２３℃）、および湿度（４０〜６０％相対湿度）が制御された室内において、ノベックス（Ｎｏｂｅｘ）動物飼育器で飼育した。動物は実験動物用飼料（ＰＭＩ栄養）および水道水を自由に摂取できた。マウスは実験日前の４８〜７２時間、飼育条件に順応させた。
【０３１２】
投薬前に、マウスは一晩絶食させ、水は無制限に摂取させた。マウスは時点毎に５匹の動物群に無作為に分配し、本発明のＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴ、ジコンジュゲート（Ｏｃｔｙｌ  Ｄｉ）、または比較目的用のサケ・カルシトニン（ｓＣＴまたはカルシトニン）の単回経口用量を投与した。経口用量は、下記の０．２μｇ／ｍｌ  リン酸塩緩衝ＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴ、ジコンジュゲート、製剤において１０ｍｌ／ｋｇで、胃菅栄養（ｇａｖａｇｉｎｇ）針（Ｐｏｐｐｅｒ  ＃１８、ハブから斜端まで５ｃｍ）を用いて投与した。
【０３１３】
【表５】
2007521268.tif 000039
【０３１４】
緩衝製剤は、自重を計測した清潔なガラスビーカーに８０ｍｌのリン酸緩衝液を添加することにより調製した。コール酸ナトリウムは溶解するまで撹拌しながらリン酸緩衝液に徐々に添加した。次いで、デオキシコール酸塩を添加し、溶解するまで撹拌し続けた。２０μｇに相当するＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴ、ジコンジュゲート溶液を添加した。最後に、１００ｇの最終重量にするために、残存するリン酸緩衝液を添加した。賦形剤−対照マウスを全実験で使用した。用量−反応曲線は薬物投与の６０分後の単一時点を用いて構築した。これらの曲線は図１５〜１８に図示する。
【０３１５】
適切な時点で、マウスにエーテル麻酔をかけ、大動脈を露出し、２５−ゲージ針を備えたシリンジにより血液試料を得た。血液アリコートは２２℃で１時間凝固させ、血清を得て清潔な容器にピペットで移した。校正済みビトロス（Ｖｉｔｒｏｓ）ＤＴ６０  ＩＩ分析器を用いて、各動物について全血清カルシウムを測定した。
【０３１６】
血清カルシウム・データをプロットし、シグマプロット（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ）・ソフトウェア（４．１版）を用いてカーブフィッティングにより薬物動態パラメータを決定した。平均値および標準偏差（または標準誤差）を計算し、プロットして、投薬群間の作用差を決定した。様々なコンジュゲートについての平均血清カルシウム・データを以下の表５に提供する。
【０３１７】
【表６】
2007521268.tif 000040
【０３１８】
ＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴおよびＰＥＧ７−デシル−ｓＣＴのモノコンジュゲートおよびジコンジュゲートのインビトロ活性と匹敵しえない上記の実施例５０で測定されたインビトロ活性にもかかわらず、ステアレート−ＰＥＧ６−ｓＣＴ、ジコンジュゲート、およびステアレート−ＰＥＧ８−ｓＣＴ、ジコンジュゲートは、ＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴおよびＰＥＧ７−デシル−ｓＣＴ、モノコンジュゲートおよびジコンジュゲートについて観察されるインビボ活性に匹敵する（上記の表５から基線からのカルシウム低下（％）により証明されるように）インビボ活性を有するように思われる。特定の理論に縛られることは望まないが、コンジュゲートを含むステアレートの向上したインビボ活性は、これらのコンジュゲートがインビボで加水分解を受けて活性なサケ・カルシトニンまたは活性なサケ・カルシトニン−ＰＥＧコンジュゲートを提供することを示し得る。
【実施例５３】
【０３１９】
ＣＴ−０２５の経口投与後のげっ歯類の無痛覚の評価
本研究の目的は、ＣＴ−０２５の反復経口投与後のげっ歯類における中枢、脊髄および末梢の無痛覚を評価することである。
【０３２０】
１７５−２００ｇ重量の成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）ラットを、中枢および脊髄の無痛覚の研究に用いた。研究には合計２３匹の動物が存在し、食物および水が適宜供給された。動物は個別のケージで飼育され、１２：１２の明暗周期（午前６：００に点灯）の室内で維持した。
【０３２１】
投薬前に、ラットは体重を量り、それぞれの投薬群がほぼ同じ重量であるように、体重により投薬群に分配した。２つの群（１群あたり１０動物）は経口ＣＴ−０２５および薬物賦形剤を受容した。対照群（Ｎ＝３）は硫酸モルフィネを受容した（２．５ｍｇ／ｋｇ；筋内）。
【０３２２】
雄のＣＦ−１（〜３０ｇ）マウスを末梢性無痛覚の研究に用いた。動物はケージで飼育され（５／ケージ）、１２：１２の明暗周期（午前６：００に点灯）の室内で維持した。食物および水は適宜供給された。合計４５匹のマウスを研究に用いた。ラットは１日２回（朝と午後）１００μｇ／ｋｇの用量で９日間（週末を除く）２．０ｍｌ／ｋｇの投薬容積で経口投与することによりＣＴ−０２５を受容した。動物が受容した合計用量は１８００μｇ／ｋｇであった。
【０３２３】
マウスは１日２回（朝と午後）２０μｇ／ｋｇの用量で１０日間（週末を除く）１０ｍｌ／ｋｇの投薬容積で経口投与することによりＣＴ−０２５を受容した。動物の受容した合計用量は４００μｇ／ｋｇであった。Ｎｏｂｅｘ−ＣＴ−０２５−［２５９］の保存溶液は薬物賦形剤で希釈し、２．０μｇ／ｍｌの最終投薬濃度にした。ラットおよびマウスへの投薬製剤の組成は表６および表７に列挙する。
【０３２４】
【表７】
2007521268.tif 000041
【０３２５】
【表８】
2007521268.tif 000042
【０３２６】
ラットは２．０ｍｌ／ｋｇの投薬容積を用いて胃管栄養針（Ｐｏｐｐｅｒ胃管栄養針＃１６）でＣＴ−０２５または薬物賦形剤のいずれかを服用した。動物は週末を除く９日間１日２回（朝と午後）経口用量を与えられた。経口ＣＴ−０２５の１日の用量は２００μｇ／ｋｇであり、動物が受容したＣＴ−０２５の全用量は１８００μｇ／ｋｇであった。対照群（３ラット）は研究の最終日に２．５ｍｇ／ｋｇの用量で硫酸モルフィネを含む食塩水の単回筋内（ｉ．ｍ．）注射を受けた。
【０３２７】
マウスは１日２回（朝と午後）１０日間（週末を除く）１０．０ｍｌ／ｋｇの投薬容積を用いて胃管栄養針（Ｐｏｐｐｅｒ胃管栄養針＃２０）で経口ＣＴ−０２５または薬物賦形剤のいずれかを与えられた。経口ＣＴ−０２５の１日用量は４０μｇ／ｋｇであった。動物が実験中に受容した合計用量は４００μｇ／ｋｇであった。
【０３２８】
中枢および脊髄の無痛覚はラットの足−ホットプレート検定およびラットのテールフリック検定でそれぞれ潜時を測定することにより評価した。末梢性無痛覚はマウス酢酸ライジング試験を用いて評価した。
【０３２９】
中枢および脊髄の無痛覚
ラットは円筒型制約器（ｒｅｓｔｒａｉｎｅｒ）内に置かれ、尾が制約器の開口部を抜けて伸びるテールフリック潜時を測定した。尾の腹面（先端から４〜５ｃｍ）は、直径０．５ｃｍの穴上の試験装置測定面の上に置かれ、穴の下にハロゲン投光電球が固定された。電球の強度は約３〜４秒の基線潜時を生成するために調整された。光線は尾への損傷を防ぐために８秒で自動的に中止する。
【０３３０】
テールフリックのデータ収集前に、全てのラットは１日３セッション動物制約器に慣らさせた後、１日おきに試験した。各試験日に、ラットは経口用量の薬物賦形剤またはＣＴ−０２５のいずれかを与えられ、４時間後、下記の順の２回の行動試験を連続して試験した：テールフリックおよびホットプレート検定。ホットプレート試験は潜在的に混乱させるストレスが誘発する影響を避けるため二番目に行った。正式なデータ収集は９日間実施した。
【０３３１】
ホットプレート潜時は５２℃まで加熱した試験装置面上にラットを置くことにより測定した。加熱刺激に対する潜時は、配置から動物が跳躍する又は後足をなめるまでの時間であるように測定した。
【０３３２】
末梢の無痛覚
酢酸ライジング試験はマウスの末梢無痛覚を判定するために用いた。マウスは、２％酢酸溶液の腹腔内注射を受け、腹筋の収縮の波により特徴付けられる典型的なライジング反応を生じ、続いて後肢が伸びた。ライジング試験は実験開始時（基線）および処置の５および１０日後に行った。ライジング試験の各日に、マウスは酢酸投与の９０分前に経口用量の薬物賦形剤又はＣＴ−０２５のいずれかを与えられた。酢酸投与後、マウスは個別の透明な容器に入れ、５分後に、よじる回数を１０分の期間計数した。それぞれのマウスは研究期間に１度だけ用いた。
【０３３３】
平均値および標準誤差はシグマプロット（８版）・ソフトウェアを用いて動物間の変動を測定するために計算した。統計学的分析はシグマプロット（２．０３版）・ソフトウェアを用いて実施した。
【０３３４】
図１９はテールフリック検定およびホットプレート検定においてＣＴ−０２５および薬物賦形剤の経口投与後に得られた潜時結果を図示する。テールフリック試験およびホットプレート試験における薬物賦形剤およびＣＴ−０２５群の平均基線潜時はそれぞれ〜３．７秒および７．７秒であった。ＣＴ−０２５の反復経口投与はテールフリック検定およびホットプレート検定のいずれかで無痛覚反応を誘起しなかった。ＣＴ−０２５の経口投与後に生じる潜時は、両試験で薬物賦形剤群により影響される潜時と同様であり、基線値に近いままであった。他方で、モルフィネ（２．５ｍｇ／ｋｇ、筋内）の単回注射（１０日目）は両試験の潜時に有意な増加を生じた。モルフィネ対照群についてのテールフリックおよびホットプレートの潜時（平均値および標準誤差）はそれぞれ７．３±０．７および１４．５±２．６であった。
【０３３５】
図２０は酢酸ライジング試験中の無痛覚反応の測定としての伸長回数を図示する。研究の初日、ならびに処理の１および２週間後での薬物賦形剤群における酢酸注射により誘起される伸長の回数はそれぞれ３１．０±１．２、３１．０±１．７、および３０．０±１．４であった。対照的に、ＣＴ−０２５の経口投与は処理の１および２週間後に伸長回数の減少を誘起した。処理の２週後の伸長回数は、薬物賦形剤群についての３０．０±１．４と比べて、１９．３±１．５であった。差異は統計学的に有意であった（ｐ＜０．００１）が、処理の１週間後の治療群間で差異は見出されなかった。
【０３３６】
これらのデータは連続２週間にわたるＣＴ−０２５の反復経口投与が酢酸ライジング試験モデルで末梢の無痛覚を誘起したことを示すが、ＣＴ−０２５はこの研究の条件下で中枢および脊髄が媒介する無痛覚として無効であった。
【０３３７】
本明細書において、本発明の典型的な好ましい実施実施形態が開示されてきた。特定の用語が用いられるが、それらは一般的且つ説明的な意味だけで用いられ、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定することは目的としない。
【図面の簡単な説明】
【０３３８】
【図１】本発明の実施形態によるポリエチレングリコール部分および脂肪酸部分を含む活性ポリマーの混合物を合成するための一般スキームを図示する。
【図２】本発明の実施形態によるｍＰＥＧの混合物を合成するためのスキームを図示する。
【図３】本発明の実施形態による活性化ｍＰＥＧ７−ヘキシルオリゴマーの混合物を合成するためのスキームを図示する。
【図４】本発明の実施形態による活性化ｍＰＥＧ７−オクチルオリゴマーの混合物を合成するためのスキームを図示する。
【図５】本発明の実施形態による活性化ｍＰＥＧ７−デシルオリゴマーの混合物を合成するためのスキームを図示する。
【図６】本発明の実施形態による活性化ステアラート−ＰＥＧ６オリゴマーの混合物を合成するためのスキームを図示する。
【図７】本発明の実施形態による活性化ステアラート−ＰＥＧ８オリゴマーの混合物を合成するためのスキームを図示する。
【図８】本発明の実施形態による活性化ＰＥＧ３オリゴマーの混合物を合成するためのスキームを図示する。
【図９】本発明の実施形態による活性化パルミタート−ＰＥＧ３オリゴマーの混合物を合成するためのスキームを図示する。
【図１０】本発明の実施形態による活性化ＰＥＧ６オリゴマーの混合物を合成するためのスキームを図示する。
【図１１】本発明の実施形態による種々のプロピレングリコールモノマーを合成するためのスキームを図示する。
【図１２】本発明の実施形態による種々のプロピレングリコールポリマーを合成するためのスキームを図示する。
【図１３】本発明の実施形態による種々のプロピレングリコールポリマーを合成するためのスキームを図示する。
【図１４】コンジュゲートされていないカルシトニンと、本発明の実施形態によるカルシトニン−オリゴマーコンジュゲートの種々の混合物との平均ＡＵＣの比較を図示する。これは比較目的のみで提供され、本発明の一部を形成しない。
【図１５】カルシトニンの用量反応曲線と比較して、本発明の実施形態によるｍＰＥＧ７−オクチル−カルシトニンジコンジュゲート混合物の用量反応曲線を図示する。これは比較目的で提供され、本発明の一部ではない。
【図１６】本発明の実施形態によるｍＰＥＧ７−オクチル−カルシトニンジコンジュゲート混合物の経口投与後の用量反応曲線を図示する。
【図１７】本発明の実施形態によるｍＰＥＧ７−オクチル−カルシトニンジコンジュゲート混合物の皮下投与後の用量反応曲線を図示する。
【図１８】サケ・カルシトニンの皮下投与後の用量反応曲線を図示する。これは比較目的で提供され、本発明の一部ではない。
【図１９】テールフリック検定およびホットプレート検定においてＣＴ−０２５および薬物賦形剤の経口投与後に得られる潜時結果を示す。
【図２０】酢酸ライジング試験中の鎮痛反応の測定としての伸びの回数を示す。
【図１】
2007521268.tif 000056
【図２】
2007521268.tif 000057
【図３】
2007521268.tif 000058
【図４】
2007521268.tif 000059
【図５】
2007521268.tif 000060
【図６】
2007521268.tif 000061
【図７】
2007521268.tif 000062
【図８】
2007521268.tif 000063
【図９】
2007521268.tif 000064
【図１０】
2007521268.tif 000065
【図１１】
2007521268.tif 000066
【図１２】
2007521268.tif 000067
【図１３】
2007521268.tif 000068
【図１４】
2007521268.tif 000069
【図１５】
2007521268.tif 000070
【図１６】
2007521268.tif 000071
【図１７】
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【図１８】
2007521268.tif 000073
【図１９】
2007521268.tif 000074
【図２０】
2007521268.tif 000075
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月27日(2007.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に単分散のコンジュゲート混合物の有効量を含んでなり、前記コンジュゲートが第一オリゴマーおよび第二オリゴマーを含み、各オリゴマーがサケ・カルシトニンと結合し、ならびに第一オリゴマーが前記サケ・カルシトニンのＬｙｓ11のアミン官能基と共有結合し、第二オリゴマーが前記サケ・カルシトニンのＬｙｓ18のアミン官能基と共有結合した、末梢疼痛の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
実質的に単分散のコンジュゲート混合物の有効量を含んでなり、各コンジュゲートがポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーと結合したカルシトニン薬を含み、前記オリゴマーが非加水分解結合により前記カルシトニン薬と共有結合した第一ポリエチレングリコール部分と、加水分解結合により前記第一ポリエチレングリコール部分と共有結合した第二ポリエチレングリコール部分とを含む、末梢疼痛の治療のための医薬組成物。
【請求項３】
実質的に単分散のコンジュゲート混合物の有効量を含んでなり、それぞれがサケ・カルシトニンのＬｙｓ11でカルボン酸（カルボン酸部分より遠位の末端で、少なくとも７つのポリエチレングリコール・サブユニットを有するメチル末端ポリエチレングリコール部分と共有結合する）のカルボン酸部分と共有結合し、サケ・カルシトニンのＬｙｓ18でカルボン酸（カルボン酸部分より遠位の末端で、少なくとも７つのポリエチレングリコール・サブユニットを有するメチル末端ポリエチレングリコール部分と共有結合する）のカルボン酸部分と共有結合したサケ・カルシトニンを含む、末梢疼痛の治療のための医薬組成物。
【請求項４】
標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するコンジュゲート混合物の有効量を含んでなり、混合物中の各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含み、かつ前記第一オリゴマーおよび前記第二オリゴマーがそれぞれ下記式：
【化１】
2007521268.tif 000076
を有する、末梢疼痛の治療のための医薬組成物。
【請求項５】
標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するコンジュゲート混合物の有効量を含んでなり、混合物中の各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含み、前記第一オリゴマーおよび前記第二オリゴマーがそれぞれ下記式：
【化２】
2007521268.tif 000077
を有する、末梢疼痛の治療のための医薬組成物。
【請求項６】
標準偏差約２２ダルトン未満の分子量分布を有するコンジュゲート混合物の有効量を含んでなり、混合物中の各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11またはＬｙｓ18で下記式：
【化３】
2007521268.tif 000078
を有するオリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含む、末梢疼痛の治療のための医薬組成物。
【請求項７】
下記式：
【数１】
2007521268.tif 000079
（式中：
ｎは試料中の異なる分子の数であり、
Ｎiは試料のｉ番目分子の数であり、
Ｍiはｉ番目分子の質量である。）
において、１０，０００を超える分散係数（ＤＣ）を有するコンジュゲート混合物の有効量を含んでなる末梢疼痛の治療のための医薬組成物であって、
混合物中の各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含み、前記第一オリゴマーおよび前記第二オリゴマーがそれぞれ下記式：
【化４】
2007521268.tif 000080
を有する、末梢疼痛の治療のための医薬組成物。
【請求項８】
下記式：
【数２】
2007521268.tif 000081
（式中：
ｎは試料中の異なる分子の数であり、
Ｎiは試料のｉ番目分子の数であり、
Ｍiはｉ番目分子の質量である。）
において、１０，０００を超える分散係数（ＤＣ）を有するコンジュゲート混合物の有効量を含んでなる末梢疼痛の治療のための医薬組成物であって、
混合物中の各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オ
リゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含み、前記第一オリゴマーおよび前記第二オリ
ゴマーがそれぞれ下記式：
【化５】
2007521268.tif 000082
を有する、末梢疼痛の治療のための医薬組成物。
【請求項９】
下記式：
【数３】
2007521268.tif 000083
（式中：
ｎは試料中の異なる分子の数であり、
Ｎiは試料のｉ番目分子の数であり、
Ｍiはｉ番目分子の質量である。）
において、１０，０００を超える分散係数（ＤＣ）を有するコンジュゲート混合物の有効量を含んでなる末梢疼痛の治療のための医薬組成物であって、
混合物中の各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11またはＬｙｓ18で下記式：
【化６】
2007521268.tif 000084
を有するオリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含む、末梢疼痛の治療のための医薬組成物。
【請求項１０】
コンジュゲート混合物の有効量を含んでなり、各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含み、前記第一オリゴマーおよび前記第二オリゴマーがそれぞれ下記式：
【化７】
2007521268.tif 000085
を有する、末梢疼痛の治療のための医薬組成物。
【請求項１１】
コンジュゲート混合物の有効量を含んでなり、各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11で第一オリゴマーと結合しＬｙｓ18で第二オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含み、前記第一オリゴマーおよび前記第二オリゴマーがそれぞれ下記式：
【化８】
2007521268.tif 000086
を有する、末梢疼痛の治療のための医薬組成物。
【請求項１２】
有効量のコンジュゲート混合物を含んでなり、各コンジュゲートが、Ｌｙｓ11またはＬｙｓ18で下記式：
【化９】
2007521268.tif 000087
を有するオリゴマーと結合したサケ・カルシトニンを含む、末梢疼痛の治療のための医薬組成物。
【請求項１３】
有効量のコンジュゲート混合物を含んでなり、各コンジュゲートが、同じ分子量を有し、かつカルシトニン薬−オリゴマー構造を有し、前記オリゴマーが下記式：
【化１０】
2007521268.tif 000088
（式中：
Ｂは結合部分であり、
Ｌはリンカー部分であり、
Ｇ、Ｇ'およびＧ''は個々に選択されるスペーサー部分であり、
Ｒは親油性部分であり且つＲ'はポリアルキレングリコール部分であるか、またはＲ'は親油性部分であり且つＲはポリアルキレングリコール部分であり、
Ｔはメトキシであり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは個々に０または１であり、
ｐは１からカルシトニン薬の求核性残基数までの整数である。）
を有し、前記カルシトニン薬がＬｙｓ11およびＬｙｓ18で前記オリゴマーと結合したサケ・カルシトニンである、末梢疼痛の治療のための医薬組成物。
【国際調査報告】
2007521268.tif 000089
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