(57)【要約】  本発明は、神経外科の分野での硬膜欠陥用のプロテーゼとして使用される硬膜代用品及びそれを作製する工程に関するものである。本発明は、必要な強度特性、適合性、及び物理的特性を有するように処理された微生物由来多糖類のシートを含む人工硬膜材料を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
硬膜代用品を作製する方法であって：
ａ．多糖類シートを作製する工程と；
ｂ．前記シート中の汚染物質を除去する工程と；
ｃ．前記シートを脱水する工程と；
を含む方法。
【請求項２】
前記多糖類シートが発酵により作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多糖類シートがAcetobacter xylinumにより作製される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
発酵工程を静的条件下で行い、約５日〜約３０日間続ける、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記汚染物質の除去により多糖類を非発熱性にする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記汚染物質を化学洗浄により除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
化学洗浄が約１重量％〜約２０重量％の濃度の水酸化ナトリウム溶液を用いる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
水酸化ナトリウムの濃度が約３重量％〜約５重量％である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記シートを部分脱水する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記部分脱水が熱及び／又は機械変性により実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
熱変性を、多糖類を、氷結温度以上に上昇させる前の所定の期間、０℃未満の温度にすることにより実施する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
硬膜欠陥を処置する方法であって、硬膜欠陥を包囲する天然硬膜を、微生物由来セルロースを含む硬膜代用品に縫合する工程を含む方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法により作製された、非発熱性である微生物由来セルロースを含む硬膜代用品。
【請求項１４】
前記セルロースが硬膜欠陥用プロテーゼとして用いるための所望の強度特性を有する、請求項１３に記載の硬膜代用品。
【請求項１５】
前記セルロースが約０．６ＭＰａ〜約１６ＭＰａの引張破断強度を有する、請求項１３に記載の硬膜代用品。
【請求項１６】
引張破断強度が約１ＭＰａ〜７ＭＰａである、請求項１５に記載の硬膜代用品。
【請求項１７】
約９％の破断時伸長を示す、請求項１３に記載の硬膜代用品。
【請求項１８】
約０．０８ＭＰａを超える縫合強度を有する請求項１３に記載の硬膜代用品。
【請求項１９】
縫合強度が約０．６ＭＰａである、請求項１８に記載の硬膜代用品。
【請求項２０】
硬膜代用品を作製する方法であって：
ａ．セルロースシートを発酵により微生物により作製する工程と；
ｂ．細胞及び過剰な培地を除去するためにシートを化学洗浄する工程と；
ｃ．熱及び／又は機械変性を用いてフィルムを部分脱水する工程と；
を含む方法。
【請求項２１】
前記セルロースシートがAcetobacter xylinumにより作製される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
発酵工程を静的条件下で行い、約５日〜約３０日間続ける、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
化学洗浄でセルロースを非発熱性にする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
化学洗浄で約１重量％〜約２０重量％の濃度の水酸化ナトリウム溶液を用いる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
熱変性を、多糖類を、氷結温度以上に上昇させる前の所定の期間、０℃未満の温度にすることにより実施する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
硬膜代用品が：
ａ．セルロース中に残存する液体を有機溶媒と交換する工程と；
ｂ．有機溶媒を超臨界流体と交換する工程と；
ｃ．超臨界流体をガスとして除去する工程と；
により、さらに、乾燥体にする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
有機溶媒がメタノールもしくはエタノール、イソプロパノール、アセトン又はその混合物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
交換を約0.25時間〜約60日で行う、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
交換を約0.5日〜約7日で行う、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
超臨界流体が二酸化炭素である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
超臨界流体が約1000psi〜約4000psiの圧力下で除去される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
圧力が約1500psi〜約2500psiである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
所望の圧力は約30分〜約7日間維持される、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2003年8月22日に提出された米国仮出願番号60/497,019の継続であり、その内容は参照により本明細書に組み入れられている。
【０００２】
本発明の本実施形態は、硬膜代用品、特に神経外科分野における硬膜欠陥でプロテーゼとして使用される硬膜代用品及びその作製方法に関する。さらに、本発明の実施形態は、必要な強度特性を有する微生物由来多糖類のシートを含む人工硬膜及び発酵により多糖類シートを作製することと、化学洗浄によりシート中の汚染物質を除去することと、生じたシートを最終包装の前に脱水することとを特徴とする、人工硬膜を作製する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
硬膜は、頭蓋骨と脳との間の髄膜を構成する最も外側の膜である。その機能は、脳を保護し、脳脊髄液の漏出を防止することである。硬膜は脊髄も被覆し、同様の機能を提供する。神経外科分野では、いかなる硬膜の欠陥及び痙縮も修復しなければならない。様々な材料がこの目的に用いられてきた。
【０００４】
ドナーからのヒト由来硬膜同種移植片が、硬膜を修復するために最も利用される材料であった。しかしながら、ヒト死体硬膜の使用を介したクロイツフェルトヤコブ病（CJD）の原因となる病原体への感染によりその使用は大幅に減少された。加えて、ヒト硬膜同種移植片は、相同性が低い、及び供給が制限されるなどを含む複数の欠点がある。
【０００５】
硬膜代用品として用いられてきた他の材料としては、シリコーン又はePTFE（延伸ポリテトラフルオロエチレン）等の合成ポリマー、及びコラーゲン等の天然型ポリマーがあげられる。これらの材料には各々独自の欠点がある。例えばシリコーンは患者に髄膜出血を起こす傾向があることが報告されている。シリコーンは、周囲組織への慢性刺激物として作用し、肉芽組織の肥大をおこす。ePTFE等の同様の非生分解性合成材料が開発されたが、その使用に伴う同様の慢性異物反応が発現し、その取扱特性が低いために普及していない。米国特許第5,861,034号に記載されたポリラクチド及びポリグリコリド（PLA/PGA）等の生体吸収性縫合糸で使用される他の合成材料が開発されている。しかしながら、これらの材料は、以前の不成功に終わった先行合成物より臨床性能が改善されていない。
【０００６】
様々な天然型生分解性材料が研究されてきた。例えばゼラチンは、最も早期に研究された生体材料の１つであった。ゼラチンには内硬膜と一体化して用いるのに十分な縫合強度がないために許容されなかった。同様に、他の必要な縫合強度がないコラーゲン生体材料が米国特許第5,997,895号に記載されている。これらの材料は市販され、アンレー材料として幅広く使用されている。しかし、これらの材料は水和すると、構造完全性がないゼラチン状塊に変換される。それゆえ強度及び適合性、そしてある場合には縫合性等の所望の物理的特性を有し、異物反応が最低限である、硬膜代用品の要望がなお存在する。
【０００７】
微生物セルロースは、いくつかの医療用途に提案されてきた。例えば液体装填パッド（米国特許第4,788,146号）、創傷被覆材（米国特許第5,846,213号）及び他の局所適用（米国特許第4,912,049号）としての、医療業界での微生物由来セルロース。Melloら（Mello, L. R., et al., Duraplasty with Biosynthetic Cellulose:An Experimental Study. Journal of Neurosurgery, V.86, 143-150（1997））は、（米国特許第4,912,049号）に記載されたものと同様の生合成セルロースを、実験動物試験で硬膜形成材料として用いたことを発表した。その結果は、微生物由来セルロースの乾燥体が硬膜代用物に適することを示した。しかしながら、Melloらが記載した材料は、発熱物質除去工程を受けず、材料は米国特許第4,912,049号で記載されたように延伸されながら十分に乾燥される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これに対して、本発明は非発熱性埋込型材料を提供し、外科用メッシュを乾燥させずに部分的に脱水するために機械的又は熱的脱水のどちらも用いて、独自の特性を有する２つの材料が得られる。さらにこれらの材料は、超臨界二酸化炭素技術を用いて乾燥して乾燥製品をもたらすことができる。本方法により本発明に、Melloらの空気乾燥セルロースを含む、以前記載されたセルロース性材料では得られない、優れた適合性及び吸収特性が付与される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の実施形態は、機械的及び／又は熱的脱水法を用いる部分水分除去あるいは同方法を用いたほぼ完全な水分除去の固有の方法と、その後の超臨界流体乾燥とを用いて作製した微生物由来セルロースを提供する。これら部分脱水及び乾燥の新規な方法により、理想的な硬膜代用品として所望の水分レベルを得るために再構成しうるセルロースシートの脱水がおこる。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、非漏出、適合性、縫合強度等の物理的特性が改良された微生物由来セルロース、及びそれを作製する方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の実施形態は、所望の強度及び適合特性を有し、非発熱性である微生物由来多糖類を含む人工硬膜を提供する。本発明に記載された多糖類は、Acetobacter xylinumにより生成したセルロースである。本発明の他の実施形態は、静的条件下で起こり、約５日〜約３０日間続く発酵により多糖類を生成する工程を含む、人工硬膜を作製する方法を開示する。次に、腐食性化学洗浄により汚染物質を除去する工程と、その後の水ですすぐ工程とを含む。１つの実施形態において、本方法は所望の最終組成を得るために、生じた微生物セルロースを部分脱水する工程を含み、部分脱水は、機械変性又は熱変性により特定期間０℃未満で維持した後、氷点以上に上昇させる熱変性により行う。他の実施形態では、材料は、超臨界二酸化炭素法を用いてさらに乾燥しうる。
【００１２】
アンレー硬膜代用品の所望の代表的なセルロース含有率は約2％〜約10％であり、好ましい含有率は約2％〜約3％である。縫合可能な硬膜代用品のセルロース含有率は約5％〜約21％が好ましく、完全脱水材料の場合、95％を超えたセルロース含有率が適用しうる。
【００１３】
さらに、本発明の実施形態は、硬膜欠陥部分を被覆するために残存する天然硬膜と人工硬膜を共に縫合すること、又は人工硬膜を脳にアンレーとして配置することを含む、硬膜欠陥を治療する方法を提供する。
【００１４】
本発明で具現される人工硬膜は硬膜欠陥プロテーゼとして機能し、引張強度が約0.6MPa〜約16MPaの所望の強度特性がある。本発明の好ましい実施形態は、アンレー材料の引張強度は約1MPa〜約4MPa、本発明の縫合可能な材料としては約2MPa〜約16MPaである。
【００１５】
加えて、これらの特定の材料の伸長は約17％〜約40％である。この伸長値は、張力下での縫合を受けるときに十分な伸張性をもたらすと思われる。材料に圧力が印加されたときに流体の漏出は最小限であることが見出されている。これらのインプラントの平均破裂強度値はまた、約20N〜約30Nであることが示されている。
【００１６】
縫合強度は、約0.1MPaより大きく、好ましくは約0.6MPaである。
【００１７】
本発明の人工硬膜の平均硬度値は約0.8N〜約2.7Nで、脳表面を損傷しないように人工硬膜の剛性を低下させる。人工硬膜はフレキシブルで取扱い容易であることも見出された。
【００１８】
上記の本発明の実施形態では、漏出及び縫合強度等の品質が改良された人工硬膜及びその作製方法を提供しうる。
【００１９】
以下の詳細な説明は、本発明の特定の実施形態を例示するが、請求項により特定される本発明の範囲を制限することを意味するものではない。
【００２０】
別途特定しない限り、「a」又は「an」という用語は本明細書で用いるように、「１つ又はそれ以上」を意味する。
【００２１】
（発酵を介した硬膜代用品の原材料製造）
本発明の微生物セルロースの作製では、Acetobacter xylium等の微生物を、30℃で初期pH約3〜約6の液体栄養培地を含有する生物反応器内で培養する。培地はスクロース又は他の炭化水素をベースとする。好ましくは、効率的なセルロース製造は、炭素源としてのスクロースと、窒素源としてのアンモニウム塩と、栄養源としてのコーンスティープリカーを用いて実現される。
【００２２】
蒸発を最小限にし、十分な酸素制限条件を提供する適切な生物反応器を選択する。生物反応器は、気密又は限定した気体透過性カバーを装着した清潔で乾燥したプラスチック箱で構成される。酸素制限条件を調節するために通気ポートを加える。生物反応器の寸法は、生成するセルロースフィルムの所望の形状、大きさ及び厚さに応じた形態で変化させうる。静的条件下の発酵工程を約５日〜約３０日間行い、培地中の細菌により微生物を含む無傷のセルロースシートが生成する。単位面積当たりのあるセルロース含有率に該当する所望の厚さに応じて、発酵が停止し、シートを生物反応器から除去する。次に薄膜を含有する過剰培地を、化学洗浄前に圧縮又は遠心分離等の標準分離技法により除去する。
【００２３】
（細胞及び過剰培地の除去）
化学処理は、微生物セルロースを非発熱性にして、以下の方法で実施される。セルロースシートは、原セルロースフィルムを医療グレードの非発熱性材料に変換するために、一連の腐食性化学洗浄工程と、それに続く濾過水により洗浄する工程とを受ける。
【００２４】
様々な暴露時間、濃度、及び温度を用いる精製方法を、原発酵生成物に対して行った。約1〜約4時間の処理時間を、約30℃〜約100℃の温度変化と併せて検討し、工程を最適化した。各種の動作条件の各々から生じたフィルムを、その各発熱物質レベル及び物理的特性について試験した。最も短時間かつ、化学物質が最低濃度の条件で非発熱性生成物を生じるように、最適化を行った。この方法に含まれる時間は、約50〜約90℃で4時間になりうる；好ましくは、含まれる時間は約60℃〜約80℃で約１〜約２時間である。処理後にセルロースパッドに残った細胞破片の量は、米国食品医薬品局（FDA）の21 CFR10.90で概説されている、リムラス変形細胞溶解液（LAL）試験で測定した。上で概説した本洗浄方法は、FDAで硬膜代用品材料に必要な非発熱性セルロースパッド（<0.06EU/ml）を与えた。
【００２５】
（機械的手段による部分脱水）
上記洗浄方法後、セルロース薄膜を、硬膜代用品として、形成し、適合し、機能する望ましい規定重量まで機械的に圧縮する。元の充填体積及び圧縮工程は、本発明の一部を構成し、セルロースの強度、完全性、及び機能に影響を及ぼす所望の密度が達成される。部分脱水試料は、滅菌のための調製において単一又は複合パウチシステムで包装される。試料をセルロース含有率、エンドトキシン、及び機械強度について試験する。
【００２６】
（熱変性を用いる部分脱水工程）
本発明の他の処理は、セルロースを密閉コンテナに入れて、温度を０℃未満に低下して保持する。一定期間後、温度を氷点より高くし、セルロースから放出される過剰な水分を除去する。これにより部分脱水セルロースが生じる。１つの理論に縛られることなく、０℃未満では、水の結晶が形成され、セルロースメッシュの表面にもたらされると考えられる。氷結温度以上では、除去された液体は外科用メッシュを再水和することができず、それにより各種の外科処置での埋込型医療デバイスとして用いるときに引張強度、伸長（伸び）、適合性、及び縫合保持力が向上した生成物が生じる。所望の脱水レベルに応じて、フィルムを１回又はそれ以上の温度変化サイクルに暴露する。過剰な液体を、注入、拭取り、又は真空吸引で除去する。部分脱水材料を、滅菌準備のためにシングル又はダブルパウチシステムで包装する。試料をセルロース含有率、エンドトキシン（LAL）、及び機械強度について試験する。
【００２７】
（超臨界二酸化炭素を用いる乾燥）
上記部分脱水後に、セルロース薄膜を、パッド中の液体を有機溶媒と交換し、その後超臨界二酸化炭素充填チャンバ内で圧力下に薄膜を配置することにより、さらに乾燥する。有機溶媒が全て除去されると、液体CO2温度が上昇するので、CO2はガスを形成した後、放出される。結果物は、切断、包装、及び滅菌を行うことができる乾燥製品である。
【００２８】
以下の実施例は、本発明を例示する。実施例は本発明を限定しないことが理解される。
【実施例１】
【００２９】
アンレー硬膜代用品としての埋込型微生物由来セルロースの製造
本実施例は、生物負荷（微生物汚染）を最小限にする制御環境内でA.xylinumにより生成される標準機械変性微生物由来セルロースフィルムの作製に関する。培養容器から滅菌培地にA.xylinumを接種し、生物反応器トレーに充填して、薄膜の最適増殖が観察されるまで培養した。薄膜をトレーから除去した後、タンク内で約１時間腐食性化学処理（発熱物質除去）を行った。次に薄膜に濾過水による連続洗浄を行った。フィルムを空気圧縮機で圧縮して、重量が概ね4〜10gの薄膜を得た。単位毎に小袋に入れ、密封、滅菌して、セルロース含有率、エンドトキシン（LAL）、及び機械強度を含む各種試験に用いた。
【実施例２】
【００３０】
縫合可能な硬膜代用品としての埋込型微生物由来セルロースの製造
本実施例は、実施例1の初期工程による標準熱変性微生物セルロースフィルムの作製に関する。化学処理後、フィルムを空気圧縮機で圧縮して、重量が概ね9〜13ｇの薄膜を得た。各単位を密封コンテナに入れて、温度を0℃未満に降下させた。少なくとも24時間後に、温度を氷点より高くし、放出された過剰な水分を注いで、セルロースを部分脱水した。部分脱水材料を小袋に入れ、密封、滅菌して、セルロース含有率、エンドトキシン（LAL）、及び機械強度を含む各種試験に用いた。
【実施例３】
【００３１】
硬膜代用品の物理的試験
上記実施例のセルロースを以下の手順で試験した：
【００３２】
（１）セルロース含有率
実施例１及び２で作製した材料のセルロース含有率を評価して、セルロース含有率を決定した。試料を特定の寸法に切断して化学天秤で秤量した。次にそれを60℃のオーブンで24時間乾燥させて、その後に再度秤量した。乾燥重量は湿潤重量のパーセントとして表し、セルロース含有率を得た。図１は、MMMC及びTMMC硬膜代替材料のセルロース含有率の比較を示す。
【００３３】
（２）縫合強度試験
本発明の試料の人工縫合可能硬膜代用品を大きさが各々1cm x 4cmの試験片に切断した。試験片は、5-0ナイロンモノフィラメント縫合糸を1/2サークルテーパーポイントを用いて、端から3mmのところに貫入させた。縫合強度は、ギャップ距離6cm及びクロスヘッド速度300mm/分の条件下で引張試験を実施して測定した。熱変性セルロースの平均縫合保持強度は、インプラントに適切かつ十分な1.48N（0.56MPa）であった。
【００３４】
（３）引張強度試験
本発明の試料の人工アンレー縫合可能な硬膜代用品を大きさが各々1cm x 4cmの試験片に切断した。引張強度及び伸長%を、ギャップ距離2.5cm及びクロスヘッド速度300mm/分の条件下でUnited Mechanical Testing Machineで標準引張試験を実施して測定した。結果を表１ならびに図２及び３に示す。予想通り、縫合可能代用品は引張強度がより高いが、これに対してアンレーは伸長より大きいことが示される。
【表１】
2007503227.tif 000003
【００３５】
（３）厚さ
本発明の試料の人工硬膜は、誤差0.03mmのカリパスを用いて初期厚を測定した。試料の平均厚を表２に示す。予想通り、縫合可能代用品は熱変性の効果のため、より薄い。
【表２】
2007503227.tif 000004
【実施例４】
【００３６】
ウサギでの硬膜代用品の評価
オハイオ州ノースウッドのNorth American Science Associates（NAmSA）にて、硬膜及び脳組織と接触した硬膜代用品試験品の局所組織反応を評価するための実験的試験を実施した。この試験では２つの微生物セルロース材料である、熱変性（TMMC）及び機械変性（MMMC）を調査した。どちらの材料も硬膜代用品用であり、TMMCは縫合可能材料、MMMCはアンレーとすることを目的とする。
【００３７】
２群に分けたウサギ8匹で試験した。ウサギに麻酔をかけて、眼窩に対して概ね2cm尾側の、矢状稜と正中線上の点との間の頭部皮膚に背側正中切開を行った。筋膜及び筋肉を露出させて、適切なバーの付いた高速外科用ハンドピースを用いて頭蓋に1.5cm x 1.5cmを欠損させた。欠損部を適正に洗浄して、その部位から骨破片を除去した後、概ね1cm x 1cmの硬膜切除を行った。適切な試験品を動物の設計した硬膜欠陥境界の下に挿入した。動物4匹に熱変性硬膜代用品を与え、4匹に機械変性硬膜代用品を与えた。組織を接合し、適切な縫合糸で縫合し、監視及び術後ケアのために動物をケージに戻した。
【００３８】
動物は術後１４日に殺処分して、接着、脳脊髄液（CSF）漏出、インプラント固定、デバイス血管新生、感染、水頭、及び出血について評価した。異物反応を判定するために、顕微鏡評価を実施した。NAmSAで実施したこれらの移植試験の結果は、本発明に記載した２つの材料が硬膜代用品として良好に機能することを示した。インプラントは、動物で良好に許容され、最小限の接着が見られた。加えて、インプラント部位での感染の発生、水頭、又は出血はなかった。硬膜代用品は、アンレー及び縫合可能代用品の両方でＣＳＦの漏出もなかった。
【実施例５】
【００３９】
材料特性の医師による評価
神経外科医のグループが集まって、本発明の硬膜代用品材料を評価した。グループは最初に、彼らが好結果の硬膜置換材料にとって最も重要であると感じる当該製品の特性を決定するために、インタビューを受けた。
これらの特性は、以下のように格付けされた：
１−異物反応がないこと
２−潜在的な疾病伝播がないこと
２−取扱の容易さ−輪郭線に対して良好に垂れて適合する；弾性
３−使用準備ができている、最小限の準備時間
４−膨潤しないこと
４−流体バランスを維持する能力
５−接着しないこと
５−アンレー、自己封着能力
６−細胞マトリクス発現：硬膜再生を促進する
７−細胞マトリクス発現：細胞閉塞
８−再吸収性
【００４０】
神経外科医は次に、硬膜代用品材料の種々のプロトタイプを与えられ、以下の基準に従って各プロトタイプを評価するよう依頼された。以下に関して評価される各プロトタイプに、実践ワークステーションが提供された；
ａ）縫合可能性
ｂ）柔軟性／適合性
ｃ）弾性
ｄ）厚さ
ｅ）包装／使用準備
【００４１】
外科医評価者により各プロトタイプに割当てられた主観的スコアに基づいて、その第１の選択は、本発明の記載の２つの材料、すなわち１）部分熱変性微生物セルロース及び２）機械的手段により部分脱水された微生物セルロースであった。
【００４２】
本発明は、決して限定されるわけではないが、以下の番号付けされた実施形態によりさらに説明される。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の方法及び組成に各種の改良及び変形が行えることは、当業者に明らかとなる。それゆえ、本発明は、本発明の改良及び変形が添付の請求項及びその同等物の範囲内に含まれるという条件で、対象にするということが意図される。本明細書で引用されたすべての特許、刊行物、及び参考文献は、参照により個々に組み入れられるのと同程度に、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】機械変性微生物セルロース（MMMC）と比較した熱変性微生物由来セルロース（TMMC）のセルロース含有率の相違を示す。
【図２】機械変性微生物セルロース（MMMC）と比較した熱変性微生物由来セルロース（TMMC）の機械強度（力（Ｎ）を示す。
【図３】機械変性微生物セルロース（MMMC）と比較した熱変性微生物由来セルロース（TMMC）の伸長を示す。
【図１】
2007503227.tif 000005
【図２】
2007503227.tif 000006
【図３】
2007503227.tif 000007
【国際調査報告】
2007503227.tif 000008