(57)【要約】37℃での開裂活性が増強されたI-DmoI誘導体、該変異形は、I-DmoIエンドヌクレアーゼの変異形又は第一I-DmoIドメインを少なくとも含むそのキメラ5誘導体の配列を含み、該配列は少なくとも：(i) 上記の第一I-DmoIドメインの位置4、20、49、52、92、94及び／又は95の残基の1つ、及び／又は(ii) I-DmoIのリンカー又は第二ドメインの始めの位置101、102及び／又は109の残基の1つ（存在する場合）の置換を含む。10上記の誘導体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む細胞、動物又は植物及び新規なDNA標的特異性を有するメガヌクレアーゼを単離するためのそれらの使用。【選択図】図６
2007535322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
I-DmoIエンドヌクレアーゼの変異形又は少なくとも第一I-DmoIドメインを含むそのキメラ誘導体の配列を含み、該配列が少なくとも：(i) 前記第一I-DmoIドメインの位置4、20、49、52、92、94及び／又は95の残基の1つ、及び／又は(ii) 存在する場合にI-DmoIのリンカー又は第二ドメインの始めの位置101、102及び／又は109の残基の1つの置換を含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
位置4のアスパラギンがイソロイシンに変更され(N4I)；位置20のグリシンがセリン又はアラニンに変更され(G20S又はG20A)；位置49のリジンがアルギニンに変更され(K49R)；位置52のイソロイシンがフェニルアラニンに変更され(I52F)；位置92のアラニンがスレオニンに変更され(A92T)；位置94のメチオニンがリジンに変更され(M94K)；位置95のロイシンがグルタミンに変更され(L95Q)；（存在する場合に）位置101のフェニルアラニンがシステインに変更され(F101C)；（存在する場合に）位置102のアスパラギンがイソロイシンに変更され(N102I)、及び／又は（存在する場合に）位置109のフェニルアラニンがイソロイシンに変更される(F109I)ことを特徴とする請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
位置49、52、92、95及び／又は101の残基の少なくとも1の置換を含むI-DmoIの変異形であることを特徴とする請求項1又は2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記I-Dmo Iの変異形が、少なくとも：位置52のイソロイシンの好ましくはフェニルアラニンへの置換(I52F)と、位置49、92、95及び／又は101の残基の1又は2のさらなる置換とを含むことを特徴とする請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項５】
a) K49R、I52F及びL95Q、b) I52F及びL95Q、又はc) I52F、A92T及びF101Cからなる群より選択される置換を含むことを特徴とする請求項4に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号1、2又は3の配列に由来することを特徴とする請求項3〜5のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【請求項７】
第一I-Dmo Iドメインの、ダイマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの配列又は別のモノマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼのドメインへの融合からなるキメラDmoエンドヌクレアーゼの変異形であり、該変異形が、少なくとも：(i) 位置4若しくは20及び／又は94の残基の1つ、及び／又は(ii) 存在する場合に位置102又は109の残基の1つの置換を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記第一I-DmoIドメインが、前記キメラDmoエンドヌクレアーゼのNH2-末端にあることを特徴とする請求項7に記載のポリペプチド。
【請求項９】
リンカー、好ましくはI-DmoIのフラグメント96〜104からの少なくとも6の連続する残基からなるI-DmoIリンカーを含むことを特徴とする請求項7又は8に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
a) G20S、b) G20A、c) M94K及びN102I、又はd) N4I及びF109Iからなる群より選択される置換を含むことを特徴とする請求項7〜9のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ダイマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼがI-CreIである請求項7〜10のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号5〜8の配列に由来することを特徴とする請求項11に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
一方のポリペプチドが、位置4、20、49、52、92、94及び／又は95の残基の少なくとも1の置換を含む第一I-DmoIドメインの配列を含み、他方のポリペプチドが、ダイマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの配列又は別のモノマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼのドメインを含むヘテロダイマーDmoエンドヌクレアーゼの変異形であることを特徴とする請求項1又は2に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ダイマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼがI-CreIである請求項13に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
NH2及び／又はCOOH末端にタグを含むことを特徴とする請求項1〜14のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項1〜15のいずれか1つに記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項16に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１８】
請求項16に記載のポリヌクレオチド又は請求項17に記載のベクターで改変されたことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１９】
全て又は一部分の細胞が、請求項16に記載のポリヌクレオチド又は請求項17に記載のベクターで改変されたことを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２０】
全て又は一部分の細胞が、請求項16に記載のポリヌクレオチド又は請求項17に記載のベクターで改変されたことを特徴とするトランスジェニック植物。
【請求項２１】
請求項1〜15のいずれか1つに記載のポリペプチド、請求項16に記載のポリヌクレオチド、請求項17に記載のベクター、請求項18に記載の細胞、請求項19に記載の動物又は請求項20に記載の植物の、新規なDNA標的活性を有するメガヌクレアーゼの選択及び／又はスクリーニングのための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温(＞50℃)において本質的に活性でありかつ37℃ではほとんど又は全く活性を示さないI-DmoIに比べて、37℃での開裂活性が増強されたI-DmoI誘導体に関する。本発明はまた、上記の誘導体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む細胞、動物又は植物、及び新規なDNA標的特異性（target specificity）を有するメガヌクレアーゼを単離するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
メガヌクレアーゼは、大きい(12〜45 bp) DNA標的部位を認識するエンドヌクレアーゼである。野生では（In the wild）、メガヌクレアーゼは、非常に希に切断するエンドヌクレアーゼのファミリーであるホーミングエンドヌクレアーゼで本質的に代表される。これは、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のミトコンドリアグループIイントロンにより元来コードされるI-SceIタンパク質(オメガヌクレアーゼ)の使用(インビボ)により最初に特性決定された。イントロンORF、独立遺伝子又は介在配列(インテイン)によりエンコードされるホーミングエンドヌクレアーゼは、それらを「古典的な」制限酵素（通常、細菌系R/MIIに由来）から区別する、著しい構造的及び機能的な特性を示す。これらは12〜40 bpに及ぶDNAの認識配列を有するが、「古典的な」制限酵素は、より短い範囲である3〜8 bpの範囲(レアカットについては12 bpまで) のDNAを認識する。よって、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ヒトゲノムにおいてさえも非常に低い頻度の切断を示す。
【０００３】
さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼの標的配列の一般的な非対称性は、ほとんどの制限酵素認識部位の特徴的なダイアド対称性と対比される。イントロンORF又はインテインによりコードされるいくつかのホーミングエンドヌクレアーゼは、それらの各遺伝子要素が対立遺伝子のイントロンレス又はインテインレス部位に戻ること(homing)を促進することが示されている。イントロンレス又はインテインレス対立遺伝子中に部位特異的二本鎖破断（break）をつくることにより、これらのヌクレアーゼは、コーディング配列を重複させ、DNAレベルでのイントロン又は介在配列の挿入に導く遺伝子変換プロセスに携わる組換え生成末端(recombinogenic end)を創る。
【０００４】
ホーミングエンドヌクレアーゼは、非常によく保存されたアミノ酸モチーフを基に、4つの別々のファミリーに分類される。Chevalier及びStoddard (Nucleic Acids Research, 2001, 29, 3757〜3774)を参照。それらの1つはドデカペプチドファミリー(ドデカマー、DOD、D1-D2、LAGLI-DADG、P1-P2)である。これは、それらの最も一般的に保存された配列モチーフ：12残基の配列の1又は2のコピー(非常に大多数)：ドデカペプチドにより集められたタンパク質の最大のファミリーである。1つのドデカペプチドをもつホーミングエンドヌクレアーゼ(D)は分子質量が約20 kDaであり、ホモダイマーとして作用する。2つのコピーを有するもの(DD)は、25 kDa (230アミノ酸)〜50 kDa (HO、545アミノ酸)の範囲で、各モチーフの間に70〜150残基を有し、モノマーとして作用する。切断は認識部位の内部であり、3'OHの突出をもつ4 ntのジグザグの(staggered)カットを残す。I-Ceu I及びI-Cre I (166アミノ酸)は、1つのドデカペプチド (モノ-ドデカペプチド)を有するホーミングエンドヌクレアーゼを表す。I-Dmo I(194アミノ酸、SWISSPROTアクセッション番号P21505)、I-Sce I、PI-Pfu I及びPI-Sce Iは、2つのドデカペプチドモチーフを有するホーミングエンドヌクレアーゼを表す。X線結晶解析を用いる構造モデルが、I-Cre I (PDBコード1g9y)、I-Dmo I (PDBコード1b24)、PI-Sce I、PI-Pfu Iについてつくられている。それらのDNA部位に結合したI-Cre I及びPI-SceI (Moureら, Nat Struct Biol, 2002, 9: 764〜70)の構造も明らかになっており、特定のタンパク質-DNA接触についてのいくつかの予見が導かれる。
【０００５】
明らかな配列保存性がないにもかかわらず、ダイマー(I-CreIのように)又は一本鎖タンパク質(I-DmoIのように)のように切断すべきであるLAGLIDADGタンパク質が、類似の活性コンホメーションを採用することが、構造比較により明らかになっている。全ての構造において、LAGLIDADGモチーフは中心であり、2回(2-fold)(擬)対称軸が2つのモノマー又は見かけの(apparent)ドメインを分けている2つの束ねられた(packed)αへリックスを形成する。例えば、LAGLIDADGモチーフは、I-CreIの残基13〜21、並びにI-DmoIの位置12〜20及び109〜117に相当する。LAGLIDADG αへリックスのいずれかの側には、4つのβシートがDNA結合界面を提供し、これがタンパク質と、標的DNA配列の半分の部位(half site)との相互作用を駆動する。I-DmoIは、第一ドメイン(残基1〜95)及び第二ドメイン(残基105〜194)がリンカー(残基96〜104)により分けられている以外は、I-CreIダイマーに類似している(Epinatら, Nucleic Acids Res, 2003, 31: 2952〜62)。
【０００６】
最近、2つのLAGLIDADGヌクレアーゼであるI-DmoIとI-CreIとを融合して、ハイブリッドホーミングエンドヌクレアーゼも開発された。DmoCre (Epinatら, 上記、及びNCBIアクセッション番号CAE85311及びCAE85312)並びにE-DreI (Chevalierら, Mol Cell, 2002, 10: 895〜905)は、2つのI-DmoIドメインのうちの1つのI-CreIへの融合からなる2つの非常に類似したタンパク質である。例えば、DmoCreは、I-CreIの残基13〜166に融合されたI-DmoIの残基1〜109からなる。2つのハイブリッド又はキメラエンドヌクレアーゼは、リンカー領域が異なるだけであり、一方はI-CreI開裂部位から、他方はI-DmoI開裂部位からの2つの部分でできた新規なハイブリッドDNA標的を開裂することができる。
【０００７】
エンドヌクレアーゼは、今日の高度な遺伝子工学技術、特に遺伝子のクローニング及び分析に必須の酵素である。ホーミングエンドヌクレアーゼは、その認識部位のサイズのために、大きいゲノムにおける認識と開裂頻度とが非常に低いので、レアカット(rare-cutter)エンドヌクレアーゼとして非常に興味深い。よって、ホーミングエンドヌクレアーゼは、分子生物学及び遺伝子工学に用いられる
【０００８】
染色体DNAの特異的部位での二本鎖DNA開裂の誘導は、細胞修復機構を誘導し、これは、その遺伝子座における非常に効率的な組換え事象を導く(WO 96/14408；WO 00/46386；US 5,830,729；Choulikaら, Mol Cell Biol, 1995. 15, 1968〜73；Cohen-Tannoudjiら, Mol Cell Biol, 1998. 18, 1444〜8；Donohoら, Mol Cell Biol, 1998, 18, 4070〜8；Rouetら, Mol Cell Biol, 1994, 14, 8096〜106)。
【０００９】
よって、二本鎖破断の導入は、開裂部位の周囲の領域に相同なDNAのターゲティングセグメントの導入を伴い、このことがその遺伝子座へのターゲティング配列の効率的な導入をもたらす(遺伝子損傷を修復するため、又はある特定の方法で染色体DNAを変更するためのいずれか)。あるいは、興味対象部位への二本鎖破断の導入は、遺伝子の別のコピーからの相同染色体DNA配列が、二本鎖破断が誘導された(変異された)配列に正しい配列を提供する遺伝子変換事象を介して遺伝子損傷を修正するために用いられる。この後者のストラテジは、欠陥遺伝子の1つのコピーが疾患表現型を引き起こす(例えば優性変異の場合に起こる)か、又は変異が遺伝子の両方の対立遺伝子の異なる位置で発生する(例えば複合ヘテロ接合変異(compound heterozygous mutations)の場合)かのいずれかの遺伝子疾患の修正を導く。残念なことに、二本鎖破断による相同組換えの導入によるゲノム工学のこの方法は、組換え事象が所望される位置での天然のメガヌクレアーゼの認識及び開裂部位の導入により制限される。ホーミングエンドヌクレアーゼファミリーの多様性にもかかわらず、興味対象の配列で天然の開裂部位を見出すことは非常に困難である。よって、生細胞において新規な特異性を有するメガヌクレアーゼを開発するための多くの努力が、最近なされてきた。
【００１０】
しかし、生細胞における新規な特異性の同定は、メガヌクレアーゼの活性が中温性の温度で検出可能であることを必要とする。よって、このようなアッセイは、30〜37℃で活性なエンドヌクレアーゼ、例えばI-SceIの誘導体を見出すために用いることができるが、37℃において活性が全くないか又は残存活性を示す高温性のエンドヌクレアーゼには用いることができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
よって、生細胞における新規な特異性を有するメガヌクレアーゼを開発するために、37℃において著しい活性を示す新規なメガヌクレアーゼが必要である。
I-DmoIは、超好熱始原菌であるデスルフロコッカス・モビリス(Desulfurococcus mobilis)からのイントロンによりコードされ、高温において本質的に活性であることが示されている(＞50℃；Dalgaardら, Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90: 5414〜7)が、より低い温度でのいくらかの活性も報告されている(Chevalierら, Mol Cell, 2002, 10: 895〜905)。DmoCreは、高温(65℃)で本質的に活性であり、37℃ではほとんど又は全く活性がない(Epinatら, 上記)。
【００１２】
本発明者らは、37℃でのアッセイにより決定される37℃での活性が増強されたI-DmoI及びDmoCreの変異形を単離した。I-DmoIの第一ドメイン、リンカー又は第二ドメインの始めに変異を有するこのような変異形は、新規な開裂部位を有する新規なメガヌクレアーゼを同定する最初の足場として用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
よって、本発明は、I-DmoI ホーミングエンドヌクレアーゼの変異形又は少なくとも第一I-DmoIドメインを含むそのキメラ誘導体の配列を含むポリペプチドに関し、該配列は、少なくとも：(i) 該第一I-DmoIドメインの位置4、20、49、52、92、94及び／又は95の残基の1つ、及び／又は(ii) 存在する場合にI-DmoIのリンカー又は第二ドメインの始めの位置101、102及び／又は109の残基の1つの置換を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明によると、第一I-DmoIドメインは、I-DmoIアミノ酸配列中の位置1〜95に対応し、I-DmoIリンカーは位置96〜104に対応し、第二I-DmoIドメインの始めは位置105〜109に対応する。
【００１５】
本発明において、特に言及しない限りは、残基の番号は、SWISSPROT番号P21505又は構造PDBコード1b24のI-DmoI配列のアミノ酸番号のことをいう。
【００１６】
本発明によるポリペプチド変異形は、高温(＞50℃)にて本質的に活性でありかつ37℃にてほとんど又は全く活性を示さないI-DmoIに比較して、37℃で活性である新規なI-DmoI誘導体を表す。
【００１７】
本発明は、上記で規定する配列を含むか又は該配列から本質的になるポリペプチドを包含する。
特に、本発明は：
a) I-DmoIリンカーにより分けられた上記で規定される第一I-DmoIドメインと第二I-DmoIドメイン(位置105〜194)とからなる、「野生型」I-DmoIの変異形(I-DmoI変異形)、及び
b) 上記で規定される第一I-DmoIドメインの、ダイマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(例えばI-CreI)への融合又は別のモノマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼのドメインへの融合からなる、ハイブリッド又はキメラI-DmoIの変異形(ハイブリッド又はキメラDmo変異形)を包含する。さらに、第一I-DmoIドメイン及びその他のホーミングエンドヌクレアーゼの配列又はドメインは、リンカー、例えばI-DmoIリンカーで分けられていてよい。
【００１８】
上記のa)及びb)で規定されるモノマー変異形の他に、本発明は、一方のポリペプチドが上記で規定される第一I-DmoIドメインの変異形であり、他方のポリペプチドがダイマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(例えばI-CreI)であるか又は別のモノマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼのドメインであるヘテロダイマー変異形(ヘテロダイマーDmo変異形)を含む。
【００１９】
キメラDmo又はヘテロダイマーDmo変異形は、I-Sce I、I-Chu I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Sce I、PI-Tli I、PI-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-Bsu I、PI-Dha I、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I及びPI-Tsp I；好ましくはI-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Csm I、PI-Sce I、PI-Pfu I、PI-Tli I、PI-Mtu I及びI-Ceu I；より好ましくはI-Cre I、PI-Sce I及びPI-Pfu I；さらにより好ましくはI-Cre Iからなる群から選択されるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの配列又はドメインを含み得る。
【００２０】
本発明のポリペプチドは、上記で規定されるその配列に、得られるポリペプチドの37℃での開裂活性を変更しない遺伝子修飾(挿入、欠失、置換、短縮)又は化学修飾を含むことができる。上記の修飾は、上記のポリペプチドの中（within）又は一方若しくは両方の末端に存在し得る。該修飾は、限定されることなく：
- NH2末端及び／又はCOOH末端での1又は複数の残基の挿入、例えば：メチオニン残基をNH2末端に導入する、タグ(エピトープ又はポリヒスチジン配列)をNH2末端及び／又はCOOH末端に導入する。上記のタグは、上記のポリペプチドの検出及び／又は精製に有用である。及び／又は
- 例えばI-DmoIの第一ドメイン、リンカー又は第二度メインの始めの位置1、47、51、55及び／又は107 (M1A、L47A、H51A、L55D、I107L)での1又は複数の残基の置換
を含む。
【００２１】
本発明のI-DmoI誘導体の開裂活性は、レポーターベクターを用いる、酵母又は哺乳動物細胞における37℃でのダイレクトリピート組換えアッセイ（direct repeat recombination assay）(図4)により測定できる。該レポーターベクターは、酵母(図3)又は哺乳動物発現ベクター(図8)にクローニングされた、介在配列内のレポーター遺伝子(LacZ遺伝子)の2つの短縮された非機能性コピーと開裂部位とを含む。開裂部位(図1)は、I-DmoI開裂部位(I-DmoI変異形)、又は一方が上記で規定されるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの開裂部位からであり、他方がI-DmoI開裂部位(ハイブリッドI-DmoI変異形)からの2つの部分でできたハイブリッドDNA標的である。37℃にて活性なメガヌクレアーゼの発現は、レポーターベクターの開裂及び組換えを誘導し、適切なアッセイにより監視できる機能的レポーター遺伝子発現をもたらす。
【００２２】
上記のポリペプチドの有利な実施形態によると：
- 位置4のアスパラギンがイソロイシンに変更され(N4I)、
- 位置20のグリシンがセリン又はアラニンに変更され(G20S又はG20A)、
- 位置49のリジンがアルギニンに変更され(K49R)、
- 位置52のイソロイシンがフェニルアラニンに変更され(I52F)、
- 位置92のアラニンがスレオニンに変更され(A92T)、
- 位置94のメチオニンがリジンに変更され(M94K)、
- 位置95のロイシンがグルタミンに変更され(L95Q)、
- （もし存在するならば）位置101のフェニルアラニンがシステインに変更され(F101C)、
- （もし存在するならば）位置102のアスパラギンがイソロイシンに変更され(N102I)、及び／又は
- （もし存在するならば）位置109のフェニルアラニンがイソロイシンに変更される(F109I)。
【００２３】
上記のポリペプチドの別の有利な実施形態によると、これは、位置49、52、92、95及び／又は101の残基の少なくとも1の置換を含むI-DmoI変異形である。
好ましくは、上記のI-DmoI変異形は、少なくとも：位置52のイソロイシンの好ましくはフェニルアラニンへの置換(I52F)、及び上記で規定される位置49、92、95及び／又は101の残基の1又は2のさらなる置換を含む。より好ましくは、これは、a) K49R、I52F及びL95Q、b) I52F及びL95Q、又はc) I52F、A92T及びF101Cからなる群より選択される置換を含む。
【００２４】
好ましくは、上記のI-DmoI変異形は、配列番号1、2又は3の配列、最も好ましくは配列番号1の配列に由来する。
【００２５】
上記のポリペプチドの別の有利な実施形態によると、これは、第一I-DmoIドメインの、ダイマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの配列への融合、又は別のモノマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼのドメインへの融合からなるキメラDmoエンドヌクレアーゼの変異形であり、該変異形は、少なくとも：(i) 位置4、20及び／又は94の残基の1つ、及び／又は(ii) もし存在するならば位置102又は109の残基の1つの置換を含む。
【００２６】
好ましくは、第一I-DmoIドメインは、キメラDmoエンドヌクレアーゼのNH2末端にある。したがって、その他のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの配列又はドメインは、該キメラDmoエンドヌクレアーゼのCOOH末端にある。
好ましくは、上記のキメラDmo変異形は、リンカー、好ましくは、I-DmoIのフラグメント96〜104からの少なくとも6の連続する残基からなるI-DmoIリンカーを含む。
好ましくは、上記のキメラDmo変異形は、I-CreI (DmoCre)、より好ましくは配列番号5〜8の配列からなる群より選択される配列に由来する。
好ましくは、上記のキメラDmo変異形は、a) G20S、b) G20A、c) M94K及びN102I、又はd) N4I及びF109Iからなる群より選択される置換を含む。
【００２７】
上記のポリペプチドの別の有利な実施形態によると、これは、ヘテロダイマーDmoエンドヌクレアーゼの変異形であり、ここで、一方のポリペプチドは上記で規定される位置4、20、49、52、92、94及び／又は95の残基の少なくとも1の置換を含む第一I-Dmo-Iドメインの配列を含み、他方のポリペプチドはダイマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ又は別のモノマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼのドメインを含む。
好ましくは、上記のダイマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、I-CreIである。
【００２８】
本発明は、上記で規定されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。
【００２９】
本発明は、上記のポリヌクレオチドを含むベクターにも関する。
用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送できる核酸分子のことをいう。好ましいベクターのある種類は、エピソーム、すなわち染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、自律複製及び／又はそれらに連結された核酸の発現が可能なものである。それらに操作可能に連結された遺伝子の発現が可能なベクターは、本明細書において「発現ベクター」という。本発明によるベクターは、限定されないが、YAC (酵母人工染色体)、BAC (バクテリア人工染色体)、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、或いは染色体、非染色体、半合成若しくは合成DNA分子からなっていてよい直線状又は環状DNA若しくはRNA分子を含む。一般的に、組換えDNA技術で用いられる発現ベクターは、しばしば「プラスミド」の形であり、これは、通常、そのベクターの形において、染色体に結合しない環状二本鎖DNAループのことをいう。多数の適切なベクターが当業者に公知である。
【００３０】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルトミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば麻疹ウイルス及びセンダイウイルス)、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えばヘルペス単純ウイルス1型及び2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)及びポックスウイルス(例えばワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス及びカナリア痘ウイルス)を含む二本鎖DNAウイルスを含む。その他のウイルスは、例えばノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス及び肝炎ウイルスを含む。
【００３１】
ベクターは、適切な選択マーカー、例えば：真核細胞培養にはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロフォレートレダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ及びヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；エス・セレビシエにはTRP1；大腸菌にはテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性を含む。
【００３２】
好ましくは、上記のベクターは、本発明のポリペプチドをコードする配列が適切な転写及び翻訳制御要素の制御下におかれ、該タンパク質の産生又は合成を許容する発現ベクターである。よって、上記のポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれる。より具体的には、ベクターは、複製起点、該コードされるポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーター、リボソーム部位、RNAスプライシング部位(ゲノムDNAを用いる場合)、ポリアデニル化部位、及び転写終結部位を含む。これは、エンハンサーを含むこともできる。プロモーターの選択は、ポリペプチドが発現される細胞に依存する。
【００３３】
本発明は、上記で規定されるポリヌクレオチド又はベクター、好ましくは発現ベクターにより改変された原核又は真核の宿主細胞にも関する。
【００３４】
本発明は、全て又は一部分の細胞が、上記で規定されるポリヌクレオチド又はベクターにより改変されたことを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物にも関する。
本明細書において用いられるように、細胞とは、原核細胞、例えば細菌細胞、又は真核細胞、例えば動物、植物又は酵母細胞のことをいう。
【００３５】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、当業者に知られるいずれの方法によっても作製できる。例えば、これは、特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により、cDNA鋳型から増幅される。好ましくは、上記のcDNAのコドンは、所望の発現系における上記のタンパク質の発現に好ましいように選択される。
上記のポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、公知の組換えDNA技術及び遺伝子工学技術により、作製して宿主細胞に導入できる。
【００３６】
本発明のポリペプチドは、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドの発現に適切な条件下で培養し、宿主細胞培養からポリペプチドを回収することにより得ることができる。
【００３７】
本発明は、上記で規定されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、動物又は植物の、新規なDNA標的特異性を有するメガヌクレアーゼを選択及び／又はスクリーニングするための使用にも関する。
例えば、本発明によるポリヌクレオチドに突然変異を誘発でき、得られた突然変異形を適切な発現ベクターにクローニングし、新規なDNA標的を開裂するそれらの能力について選択及び／又はスクリーニングできる。
【００３８】
得られた変異形の開裂活性は、いずれの適切な手段により測定できる。例えば、これは、レポーターベクターを用いる、酵母又は哺乳動物細胞における37℃でのダイレクトリピート組換えアッセイにより測定される。該レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現プラスミドにクローニングされた、介在配列内のレポーター遺伝子(LacZ遺伝子)の2つの短縮された非機能的コピーと新規な開裂部位とを含む。新規なDNA標的を開裂できるメガヌクレアーゼの発現は、レポータープラスミドの開裂及び組換えを誘発し、適切なアッセイにより監視できる機能的レポーター遺伝子発現をもたらす。
【００３９】
本発明は、本発明によるI-Dmo I誘導体を説明する実施例に言及する以下の記載及び図面により、さらに説明される。しかし、これらの実施例は、本発明の説明のためにのみ与えられるものであり、本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。
- 図1は、I-CreI、I-DmoI、並びにハイブリッドC1D2及びC2D2 DNA標的切断部位(配列番号10〜13)を表す。
- 図2は、I-CreI及びDmoCre変異形のスクリーニングに用いられた酵母発現ベクターpCLS0542のマップを示す。
【００４０】
- 図3は、pCLS0050とよばれる酵母レポータープラスミドのマップを示す。これは、CUT8、例えばI-CreI及びI-DmoI開裂部位、並びにLacZ遺伝子の内部（internal）の2つのダイレクトリピートの間にURA3選択マーカーを含む。
- 図4は、酵母又は哺乳動物細胞においてメガヌクレアーゼ誘導組換えを検出する組換えアッセイの原理を示す。組換えは、ほとんどの場合、一本鎖アニーリング(SSA)により起こる。prom：プロモーター。ter：ターミネーター。
【００４１】
- 図5は、I-DmoI配列(配列番号1)のランダム突然変異誘発により得られる変異形の特性決定を示す。I-DmoI及び一連のI-DmoI変異形は、実施例1に記載のようにして、37℃にてI-DmoI標的に対して試験される。DmoCre及びpCL0S542 (空のベクター)もI-DmoI標的に対して試験するが、I-SceIはI-SceI開裂部位を有する標的に対して試験する。A〜V：I-DmoI変異形A：K26N、Δ95；B：N4K、I52F、I60V；C：I52F、L95Q；D、I、J、M、P：wt (= I-DmoI)；E：I19F、I52F、L55Q、F101C；F：Y13C、T76N；G、H、O：I52F；K、U：K49R、I52F、L95Q；L：決定されず（non determined）；N：M94L、L95Q；Q、R：I52F、F101C；S、T：D7V、I52F；V：I52F、A92T、F101C；1：I-SceI；2：pCLS0542；3：I-DmoI野生型；4：DmoCre。
【００４２】
- 図6は、I-DmoI変異形の例を示す。D1変異形のアミノ酸配列(K49R、I52F、L95Q；配列番号4)を、変異形を作製するのに用いた最初の（initial）I-DmoI配列のアミノ酸配列(配列番号1)と整列させる。I-DmoI 1B24 (配列番号2)：PDBタンパク質構造データベースの構造コード1b24に対応する配列。I-DmoI P21505 (配列番号3)：SWISSPROT配列データベースの番号P21505に対応する配列。I-DmoI変異形についての残基番号は、配列SWISSPROT P21505又は構造コードPDB 1b24のアミノ酸番号付けによる。例えば、K49R突然変異は、配列番号4の位置50の残基の変異に対応する。
【００４３】
- 図7は、定方向突然変異誘発により得られる変異形の特性決定を示す。I-DmoI及び定方向突然変異誘発により得られた一連のI-DmoI変異形は、実施例1に記載のようにして、37℃にてI-DmoI標的に対して試験される。DmoCre及びpCLS0542 (空のベクター)もI-DmoI標的に対して試験されるが、I-SceIはI-SceI開裂部位を有する標的に対して試験される。A〜V：I-DmoI変異形；A：G20S；B：K49R；C：I52F；D：A92T；E：L95Q；F：F101C；G：K49R/I52F；H：K49R/A92T；I：K49R/L95Q；J：K49R/F101C；K：I52F/A92T；L：I52F/L95Q；M：I52F/F101C；N：A92T/L95Q；O：A92T/F101C；P：L95Q/F101C；1：I-SceI；2：pCLS0542；3：I-DmoI野生型；4：4：K49R、I52F、L95Q；5：I52F、A92T、F101C；6：DmoCre。
【００４４】
- 図8は、哺乳動物細胞アッセイのためのレポータープラスミドの構造を示す。pCLS0808プラスミドは、LacZ遺伝子内部の2つの小さいダイレクトリピートの間にI-DmoI開裂部位を含む。
- 図9は、DmoCre変異形の例を示す。DC G20S変異形のアミノ酸配列(A1V、G20S；配列番号9)を、変異形の作製に用いた最初のDmoCre配列のアミノ酸配列(DmoCre v1；配列番号5)と整列させる。DmoCre v4 (配列番号6)：上記のEpinatらに記載されるDmoCre構築物に対応する配列。DmoCre変異形についての残基の番号は、配列SWISSPROT P21505又は構造PDB 1b24のアミノ酸番号による。例えば、A1V変異は、配列番号9の位置2の残基の変異に対応する。
【００４５】
- 図10は、酵母における一連の変異形の開裂プロフィールを示す。ここで、CUT8 (I-DmoI＋I-CreI開裂部位)、I-DmoI、C1D2及びC2D2開裂部位がアッセイされる。各パネルにおいて、I-SceIも、ポジティブコントロールとして、I-SceI開裂部位を用いてアッセイされる。全てのその他のタンパク質は、パネルの右に記載される標的を用いてアッセイされる。A：I-SceI；B：空の発現ベクター；C：I-DmoI；D：K49R、I52F、L95Q I-DmoI変異形(実施例1参照)；E：I52F、A92T、F101C I-DmoI変異形(実施例1を参照)；F：DmoCre。1：G20S；2：K49R；3：I52F；4：A92T；5：L95Q；6：F101C；7：K49R/I52F；8：K49R/A92T；9：K49R/L95Q；10：K49R/F101C；11：I52F/A92T；12：I52F/L95Q；13：I52F/F101C；14：A92T/L95Q；15：A92T/F101C；16：L95Q/F101C。
【実施例】
【００４６】
実施例1：37℃での活性が増強されたI-DmoIの特性決定
DNA操作は、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)に記載されるような標準的な手法に従って、従来の方法を用いて行った。
1) 材料及び方法
プラスミド
一連のI-DmoI変異形発現プラスミドを、I-DmoIコーディング配列(配列番号1)のランダム又は定方向突然変異誘発、及び得られた配列の酵母発現プラスミドpCLS0542 (ガラクトース誘導プロモーター、LEU2選択マーカー及び2ミクロン複製起点、図2)へのサブクローニングにより構築した。
レポータープラスミドを、上記のEpinatらに記載されるストラテジに従って構築した。pCLS0050は、URA3選択マーカー及びI-DmoI開裂部位を含む1.3kbにより分けられた825塩基対の2つのダイレクトリピートを有する改変LacZ遺伝子を含む(図3)。
【００４７】
酵母アッセイ
レポータープラスミド及びI-DmoI変異形発現プラスミドでそれぞれ形質転換されたa接合型(FYBL2/7B: a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)の酵母及びα接合型(FYC2/6A: alpha, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)の酵母を、選択培地で一晩増殖させた。次いで、a接合型及びα接合型の酵母の培養物2μlを、最終容量25μlのYPD培地(富培地、グルコース源)と混合し、振とうせずに30℃にて一晩インキュベートした。2μlの懸濁液を、強いメガヌクレアーゼ活性の誘導のために、炭素源としてガラクトースを含む二倍体選択用の選択培地にのせた。プレートを30℃にて24時間、及び37℃にて48時間インキュベートし、その後、X-Gal染色を行った。染色のために、従来の定性X-Galアガロースオーバーレイアッセイを用いた。各プレートを、60℃にて、0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0、0.2% SDS、12%ジメチルホルムアミド(DMF)、14 mM β-メルカプトエタノール、0.4% X-Gal中の1%アガロース2.5 mlで覆った。プレートを37℃にてインキュベートした。
【００４８】
2) 結果
推定される増強された開裂活性を有するI-DmoI変異形を作製し、SSA (一本鎖アニーリング)β-ガラクトシダーゼ標的を含有するレポータープラスミドの特異的組換えを誘導できるそれらの能力について、酵母においてアッセイした。
二倍体において、活性メガヌクレアーゼの発現は、レポータープラスミドの開裂及び組換えを誘導し、X-Gal染色により監視できる機能的LacZ遺伝子をもたらす(図4)。
【００４９】
異なるクローンのプロフィールを図5に示す。15のクローン(B、C、E、G、H、K、L、N、O、Q〜V)は、明るい青色(Q〜T)から暗い青色(C、K、L)までの範囲の青色着色を示す。これらの酵母クローンに形質転換されたプラスミドの配列決定は、陽性のものが、位置49、52、92、95及び／又は101の1又は複数の残基の置換をそれぞれが含む9の異なる配列(1つの配列は回収できなかった)を示すことを示す。結果を、表Iにまとめる。配列番号4の配列に相当する変異形I-DmoIタンパク質の例を、図6に示す。
【００５０】
【表１】
2007535322.tif 000003
【００５１】
変異形は、いくつかの突然変異(例：K49R、I52F、L95Q)をしばしば示したので、各個別の置換の影響を評価するために、単独変異形を作製した。G20S変異形も作製した。この変異形は、37℃においてDmoCreタンパク質に活性の増強を付与し(実施例2を参照)、I-DmoIとDmoCreとは同じNH2末端アミノ酸を共有するので(実施例2を参照)、この変異は、I-DmoIを用いても同様の効果をもたらすことが期待される。
【００５２】
これらの変異形の特性決定を図7に示し、結果を表Iにまとめる。位置52、95、49、92及び／又は101の残基の少なくとも1の置換を含むいくつかの変異形は、37℃にて酵母において活性が実際に増強されたことが示された。興味深いことに、G20S変異形は、37℃にてI-DmoI活性に対して影響を示さない。変異形の活性は、また、上記のEpinatらに記載される方法に従うインビトロ開裂アッセイにおいて37℃にて検出された。
【００５３】
実施例2：37℃にて活性が増強されたキメラDmo (DmoCre)変異形の特性決定
1) 材料及び方法
-  プラスミド
変異形I-DmoIコーディング配列を、哺乳動物細胞での発現用に設計されたベクター(pTriex4-hygro、NOVAGENE)に移した。哺乳動物バージョンのレポータープラスミドを、上記のEpinatらに記載されたものと同様のストラテジを用いて構築した(図8)。酵母プラスミドのプロモーター及び終結配列を、EF1αプロモーター及びBGHポリアデニル化配列で置き換えた。
【００５４】
- 哺乳動物細胞アッセイ
CHO細胞を、レポータープラスミドとI-DmoI変異形発現プラスミドとで、Superfectトランスフェクション試薬を製造業者(Qiagen)のプロトコルに従って用いて、同時トランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後に、細胞をPBS1Xを用いて2回リンスし、溶解バッファー(Tris-HCl 10mM pH7.5、NaCl 150mM、Triton X100、0.1 % BSA、0.1 mg/mlプロテアーゼ阻害剤)中でインキュベートした。溶解物を遠心し、タンパク質濃度測定及びβ-ガラクトシダーゼ液体アッセイのために用いた。典型的には、30μlの抽出物を3μlのMg 100Xバッファー(MgCl2 100mM、β-メルカプトエタノール35%)、33μlのONPG 8 mg/ml及び234μlのリン酸ナトリウム0.1M pH7.5と混合した。37℃でのインキュベーションの後に、反応を、500μlの1M Na2CO3を用いて停止し、ODを415nmで測定した。相対β-ガラクトシダーゼ活性を、このODの関数として決定し、反応時間及びタンパク質全量により標準化した。
【００５５】
2) 結果
DmoCreは、I-DmoIのNH2末端部分がI-CreIドメインに融合されたキメラタンパク質であり、これは半分のI-CreI開裂部位と半分のI-DmoI部位とを有するハイブリッドDNA標的(C1D2、C2D2、図1)を開裂する。DmoCreは、65℃にて本質的に活性であり、37℃ではほとんど又は全く活性を示さない(Epinat, Arnouldら 2003, Nucleic Acids Res 31: 2952〜62)。37℃での推定される増強された活性を有するDmoCre変異形を作製し、5つの異なるレポータープラスミド：CUT8を有するプラスミド(図3)、及びそれぞれI-CreI部位又はI-DmoI部位又はC1D2又はC2D2 (図1)である単独開裂部位を有する4つの類似のプラスミドを用いた以外は実施例1に記載された方法と同様にして、酵母においてアッセイした。さらに、DmoCre変異形を、発現及びレポータープラスミドの両方の哺乳動物バージョンを用いて、哺乳動物細胞においても試験した。
DmoCre変異形を、表IIにまとめる。
【００５６】
【表２】
2007535322.tif 000004
【００５７】
DmoCre変異形タンパク質配列のある例(配列番号9)を、図9に示す。変異形のほとんどはG20S変異を含み、これは、G20S変異形で得られる濃い青色染色で証明されるように、それ自体により最大活性をもたらす(図10)。同様の開裂プロフィールは、酵母及びCHO細胞で観察され、変異形の大多数はC1D2及びC2D2標的を切断可能であった。しかし、これらのいくつかはI-CreI DNA標的をも切断し、このことは、これらの特異的変異形が厳しくない活性（relaxed activity）を有し得ることを示唆する。
【００５８】
図10は、定方向突然変異誘発により得られた変異形、例えばI52F、L95Qをも特徴付ける。このような変異形は、37℃にてI-DmoIに増強された活性をもたらすことが観察された。DmoCreはI-DmoIのNH2末端部分(アミノ酸109まで)を含むので、DmoCreのI52F、L95Q (例えば)バージョンも、37℃での増強された活性を有するであろうことが期待できた。このことは実際には観察されず、これらの変異形は、37℃にてDmoCreの活性に対していずれの影響も有さなかった。これらの結果は、別の分子について得られた結果に基づく酵素の活性を改善できると考えられる変異は、2つのタンパク質が多くの共通する特徴を有していても自明でない（not trivial）ことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】I-CreI、I-DmoI、並びにハイブリッドC1D2及びC2D2 DNA標的切断部位(配列番号10〜13)を表す。
【図２】I-CreI及びDmoCre変異形のスクリーニングに用いられた酵母発現ベクターpCLS0542のマップを示す。
【図３】pCLS0050とよばれる酵母レポータープラスミドのマップを示す。
【図４】酵母又は哺乳動物細胞においてメガヌクレアーゼ誘導組換えを検出する組換えアッセイの原理を示す。
【図５】I-DmoI配列(配列番号1)のランダム突然変異誘発により得られる変異形の特性決定を示す。
【図６】I-DmoI変異形の例を示す。
【図７】定方向突然変異誘発により得られる変異形の特性決定を示す。
【図８】哺乳動物細胞アッセイのためのレポータープラスミドの構造を示す。
【図９】DmoCre変異形の例を示す。
【図１０】酵母における一連の変異形の開裂プロフィールを示す。
【図１】
2007535322.tif 000005
【図２】
2007535322.tif 000006
【図３】
2007535322.tif 000007
【図４】
2007535322.tif 000008
【図５】
2007535322.tif 000009
【図６】
2007535322.tif 000010
【図７】
2007535322.tif 000011
【図８】
2007535322.tif 000012
【図９】
2007535322.tif 000013
【図１０】
2007535322.tif 000014
【配列表】
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【国際調査報告】
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