(57)【要約】本発明は、その発現が癌、特に乳癌の診断および／または予後診断に重要な遺伝子セットを提供する。本発明は、そのセット中のすべてのマーカーをアッセイするために、保管されているパラフィン包埋生検材料を使用することに対応しており、そのため、最も広範に利用可能なタイプの生検材料に適合する。また、例えば針生検または細針吸引などによる、いくつかの異なった腫瘍組織回収法にも適合する。さらに、遺伝子セットの各メンバーについて、本発明は、検査に使用できるオリゴヌクレオチド配列を特定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者が癌を再発せずに長期間生存する可能性を予測する方法であって、該患者から採取した癌細胞における１種類以上の予後ＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の発現レベルを、該癌細胞におけるすべてのＲＮＡ転写産物またはそれらの産物の発現レベル、あるいはＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の参照用セットの発現レベルに対して正規化して決定する工程を含み、該予後ＲＮＡ転写産物が、Ｂ＿カテニン；ＢＡＧ１；ＢＩＮ１；ＢＵＢ１；Ｃ２０＿ｏｒｆｌ；ＣＣＮＢ１；ＣＣＮＥ２；ＣＤＣ２０；ＣＤＨ１；ＣＥＧＰ１；ＣＩＡＰ１；ｃＭＹＣ；ＣＴＳＬ２；ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７；ＤＲ５；ＥｐＣＡＭ；ＥｓｔＲ１；ＦＯＸＭ１；ＧＲＢ７；ＧＳＴＭ１；ＧＳＴＭ３；ＨＥＲ２；ＨＮＲＰＡＢ；ＩＤ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＴＧＡ７；Ｋｉ＿６７；ＫＮＳＬ２；ＬＭＮＢ１；ＭＣＭ２；ＭＥＬＫ；ＭＭＰ１２；ＭＭＰ９；ＭＹＢＬ２；ＮＥＫ２；ＮＭＥ１；ＮＰＤ００９；ＰＣＮＡ；ＰＲ；ＰＲＥＰ；ＰＴＴＧ１；ＲＰＬＰＯ；Ｓｒｃ；ＳＴＫ１５；ＳＴＭＹ３；ＳＵＲＶ；ＴＦＲＣ；ＴＯＰ２Ａ；およびＴＳからなる群より選択される１つ以上の遺伝子の転写産物であり、
ここで、ＢＵＢ１；Ｃ２０＿ｏｒｆｌ；ＣＣＮＢ１；ＣＣＮＥ２；ＣＤＣ２０；ＣＤＨ１；ＣＴＳＬ２；ＥｐＣＡＭ；ＦＯＸＭ１；ＧＲＢ７；ＨＥＲ２；ＨＮＲＰＡＢ；Ｋｉ＿６７；ＫＮＳＬ２；ＬＭＮＢ１；ＭＣＭ２；ＭＥＬＫ；ＭＭＰ１２；ＭＭＰ９；ＭＹＢＬ２；ＮＥＫ２；ＮＭＥ１；ＰＣＮＡ；ＰＲＥＰ；ＰＴＴＧ１；Ｓｒｃ；ＳＴＫ１５；ＳＴＭＹ３；ＳＵＲＶ；ＴＦＲＣ；ＴＯＰ２Ａ；およびＴＳの１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が低いことを示し、そして
ＢＡＧ１；Ｂカテニン；ＢＩＮ１；ＣＥＧＰ１；ＣＩＡＰ１；ｃＭＹＣ；ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７；ＤＲ５；ＥｓｔＲ１；ＧＳＴＭ１；ＧＳＴＭ３；ＩＤ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＴＧＡ７；ＮＰＤ００９；ＰＲ；およびＲＰＬＰＯの１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項２】
少なくとも２つの前記予後ＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の発現レベルを決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも５つの前記予後ＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の発現レベルを決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１０の前記予後ＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の発現レベルを決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１５の予後ＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の発現レベルを決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記癌が乳癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が、リンパ節陰性かつＥＲ陽性の乳癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が卵巣癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
１つ以上の予後ＲＮＡ転写産物の発現レベルが決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡがイントロンＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、ＭＭＰ９、ＧＳＴＭ１、ＭＥＬＫ、ＰＲ、ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７、ＧＳＴＭ３、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＢ１、ＳＴＭＹ３、ＧＲＢ７、ＭＹＢＬ２、ＣＥＧＰ１、ＳＵＲＶ、ＬＭＮＢ１、ＣＴＳＬ２、ＰＴＴＧ１、ＢＡＧ１、ＫＮＳＬ２、ＣＩＡＰ１、ＰＲＥＰ、ＮＥＫ２、ＥｐＣＡＭ、ＰＣＮＡ、Ｃ２０＿ｏｒｆｌ、ＩＴＧＡ７、ＩＤ１  Ｂ＿カテニン、ＥｓｔＲｌ、ＣＤＨ１、ＴＳ  ＨＥＲ２、およびｃＭＹＣからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の、１つ以上の予後ＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の発現レベルを決定する工程を含み、
ここで、Ｃ２０＿ｏｒｆｌ；ＣＣＮＢ１；ＣＤＣ２０；ＣＤＨ１；ＣＴＳＬ２；ＥｐＣＡＭ；ＧＲＢ７；ＨＥＲ２；ＫＮＳＬ２；ＬＭＮＢ１；ＭＣＭ２；ＭＭＰ９；ＭＹＢＬ２；ＮＥＫ２；ＰＣＮＡ；ＰＲＥＰ；ＰＴＴＧ１；ＳＴＭＹ３；ＳＵＲＶ；ＴＳ；およびＭＥＬＫの１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が低いことを示し、そして
ＢＡＧ１；Ｂカテニン；ＣＥＧＰ１；ＣＩＡＰ１；ｃＭＹＣ；ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７；ＥｓｔＲ１；ＧＳＴＭ１；ＧＳＴＭ３；ＩＤ１；ＩＴＧＡ７；およびＰＲの１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、ＧＲＢ７、ＳＵＲＶ、ＰＲ、ＬＭＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＨＥＲ２、ＧＳＴＭ１、ＭＥＬＫ、Ｓ２０＿ｏｒｆｌ、ＰＴＴＧ１、ＢＵＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＢ１、ＳＴＭＹ３、ＫＮＳＬ２、ＣＴＳＬ２、ＭＣＭ２、ＮＥＫ２、ＤＲ５、Ｋｉ＿６７、ＣＣＮＥ２、ＴＯＰ２Ａ、ＰＣＮＡ、ＰＲＥＰ、ＦＯＸＭ１、ＮＭＥ１、ＣＥＧＰ１、ＢＡＧ１、ＳＴＫ１５、ＨＮＲＰＡＢ、ＥｓｔＲ１、ＭＭＰ９、ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７、ＴＳ、Ｓｒｃ、ＢＩＮ１、ＮＰ００９、ＲＰＬＰＯ、ＧＳＴＭ３、ＭＭＰ１２、ＴＦＲＣ、およびＩＧＦ１Ｒからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の、１つ以上の予後ＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の発現レベルを決定する工程を含み、
ここで、ＧＲＢ７；ＳＵＲＶ；ＬＭＮＢ１；ＭＹＢＬ２；ＨＥＲ２；ＭＥＬＫ；Ｃ２０＿ｏｒｆｌ；ＰＴＴＧ１；ＢＵＢ１；ＣＤＣ２０；ＣＣＮＢ１；ＳＴＭＹ３；ＫＮＳＬ２；ＣＴＳＬ２；ＭＣＭ２；ＮＥＫ２；Ｋｉ＿６７；ＣＣＮＥ２；ＴＯＰ２Ａ＿４；ＰＣＮＡ；ＰＲＥＰ；ＦＯＸＭ１；ＮＭＥ１；ＳＴＫ１５；ＨＮＲＰＡＢ；ＭＭＰ９；ＴＳ；Ｓｒｃ；ＭＭＰ１２；およびＴＦＲＣの１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が低いことを示し、そして
ＰＲ；ＧＳＴＭ１；ＤＲ５；ＣＥＧＰ１；ＢＡＧ１；ＥｓｔＲｌ；ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７；ＢＩＮ１；ＮＰ００９；ＲＰＬＰＯ；ＧＳＴＭ３；ＩＧＦ１Ｒの１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項１３】
癌患者が癌を再発せずに長期間生存する可能性を予測する方法であって、患者から採取した癌細胞における１種類以上の予後ＲＮＡ転写産物または発現産物の発現レベルを、該癌細胞におけるすべてのＲＮＡ転写産物またはそれらの産物の発現レベル、あるいはＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の参照用セットの発現レベルに対して正規化して決定する工程を含み、該予後ＲＮＡ転写産物が、ＧＲＢ７；ＬＭＮＢ１；ＥＲ；ＳＴＭＹ３；ＫＬＫ１０；ＰＲ；ＫＲＴ５；ＦＧＦＲ１；ＭＣＭ６；ＳＮＲＰＦからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の転写産物であり、
ここで、ＧＲＢ７；ＬＭＮＢ１；ＳＴＭＹ３；ＫＬＫ１０；ＦＧＦＲ１およびＳＮＲＰＦの１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が低いことを示し、そしてＥＲ；ＰＲ；ＫＲＴ５およびＭＣＭ６の１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項１４】
前記ＲＮＡが、前記患者の固定したろう包埋乳癌組織標本から単離される、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡが、針生検組織または細針吸引細胞から単離される、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
固体表面に固定された以下の遺伝子：Ｂ＿カテニン；ＢＡＧ１；ＢＩＮ１；ＢＵＢ１；Ｃ２０＿ｏｒｆｌ；ＣＣＮＢ１；ＣＣＮＥ２；ＣＤＣ２０；ＣＤＨ１；ＣＥＧＰ１；ＣＩＡＰ１；ｃＭＹＣ；ＣＴＳＬ２；ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７；ＤＲ５；ＥｐＣＡＭ；ＥｓｔＲ１；ＦＯＸＭ１；ＧＲＢ７；ＧＳＴＭ１；ＧＳＴＭ３；ＨＥＲ２；ＨＮＲＰＡＢ；ＩＤ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＴＧＡ７；Ｋｉ＿６７；ＫＮＳＬ２；ＬＭＮＢ１；ＭＣＭ２；ＭＥＬＫ；ＭＭＰ１２；ＭＭＰ９；ＭＹＢＬ２；ＮＥＫ２；ＮＭＥ１；ＮＰＤ００９；ＰＣＮＡ；ＰＲ；ＰＲＥＰ；ＰＴＴＧ１；ＲＰＬＰＯ；Ｓｒｃ；ＳＴＫ１５；ＳＴＭＹ３；ＳＵＲＶ；ＴＦＲＣ；ＴＯＰ２Ａ；およびＴＳの２つ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、アレイ。
【請求項１７】
以下の遺伝子：ＭＭＰ９、ＧＳＴＭ１、ＭＥＬＫ、ＰＲ、ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７、ＧＳＴＭ３、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＢ１、ＳＴＭＹ３、ＧＲＢ７、ＭＹＢＬ２、ＣＥＧＰ１、ＳＵＲＶ、ＬＭＮＢ１、ＣＴＳＬ２、ＰＴＴＧ１、ＢＡＧ１、ＫＮＳＬ２、ＣＩＡＰ１、ＰＲＥＰ、ＮＥＫ２、ＥｐＣＡＭ、ＰＣＮＡ、Ｃ２０＿ｏｒｆｌ、ＩＴＧＡ７、ＩＤ１  Ｂ＿カテニン、ＥｓｔＲｌ、ＣＤＨ１、ＴＳ  ＨＥＲ２、およびｃＭＹＣの２つ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項１８】
以下の遺伝子：ＧＲＢ７、ＳＵＲＶ、ＰＲ、ＬＭＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＨＥＲ２、ＧＳＴＭ１、ＭＥＬＫ、Ｓ２０＿ｏｒｆｌ、ＰＴＴＧ１、ＢＵＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＢ１、ＳＴＭＹ３、ＫＮＳＬ２、ＣＴＳＬ２、ＭＣＭ２、ＮＥＫ２、ＤＲ５、Ｋｉ＿６７、ＣＣＮＥ２、ＴＯＰ２Ａ、ＰＣＮＡ、ＰＲＥＰ、ＦＯＸＭ１、ＮＭＥ１、ＣＥＧＰ１、ＢＡＧ１、ＳＴＫ１５、ＨＮＲＰＡＢ、ＥｓｔＲ１、ＭＭＰ９、ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７、ＴＳ、Ｓｒｃ、ＢＩＮ１、ＮＰ００９、ＲＰＬＰＯ、ＧＳＴＭ３、ＭＭＰ１２、ＴＦＲＣ、およびＩＧＦ１Ｒの２つ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項１９】
前記遺伝子の少なくとも３つにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項２０】
前記遺伝子の少なくとも５つにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項２１】
前記遺伝子の少なくとも１０にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項２２】
前記遺伝子のすべてにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項２３】
同一の遺伝子にハイブリダイズする１つより多くのポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項２５】
前記ｃＤＮＡが、約５００から５０００塩基長である、請求項２４に記載のアレイ。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドである、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドが約２０から８０塩基長である、請求項２６に記載のアレイ。
【請求項２８】
前記固体表面がガラスである、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項２９】
約３３０，０００個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項３０】
前記アレイが、イントロンベースのポリヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
浸潤性乳癌と診断された患者が乳癌を再発せずに長期間生存する可能性を予測する方法であって、
（ａ）該患者から採取した乳癌細胞における、Ｂ＿カテニン；ＢＡＧ１；ＢＩＮ１；ＢＵＢ１；Ｃ２０＿ｏｒｆｌ；ＣＣＮＢ１；ＣＣＮＥ２；ＣＤＣ２０；ＣＤＨ１；ＣＥＧＰ１；ＣＩＡＰ１；ｃＭＹＣ；ＣＴＳＬ２；ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７；ＤＲ５；ＥｐＣＡＭ；ＥｓｔＲ１；ＦＯＸＭ１；ＧＲＢ７；ＧＳＴＭ１；ＧＳＴＭ３；ＨＥＲ２；ＨＮＲＰＡＢ；ＩＤ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＴＧＡ７；Ｋｉ＿６７；ＫＮＳＬ２；ＬＭＮＢ１；ＭＣＭ２；ＭＥＬＫ；ＭＭＰ１２；ＭＭＰ９；ＭＹＢＬ２；ＮＥＫ２；ＮＭＥ１；ＮＰＤ００９；ＰＣＮＡ；ＰＲ；ＰＲＥＰ；ＰＴＴＧ１；ＲＰＬＰＯ；Ｓｒｃ；ＳＴＫ１５；ＳＴＭＹ３；ＳＵＲＶ；ＴＦＲＣ；ＴＯＰ２Ａ；およびＴＳからなる群より選択される遺伝子セットの、遺伝子のＲＮＡ転写産物または発現産物の発現レベルを、該乳癌細胞におけるすべてのＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の発現レベル、あるいはＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の参照用セットの発現レベルに対して正規化して決定する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたデータを統計分析に供する工程；ならびに
（ｃ）該長期間生存する可能性が高いかまたは低いかを決定する工程
を含む、方法。
【請求項３２】
患者に対して個別のゲノムプロフィールを作成する方法であって、
（ａ）該患者から採取した乳房組織から抽出されたＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程；
（ｂ）表１および２のいずれかに列挙されている乳癌遺伝子セットから選択された１つ以上の遺伝子の組織における発現レベルを決定する工程であって、該発現レベルが、コントロール遺伝子に対して正規化され、必要に応じて、乳癌参照用組織セットに見られる量と比較される、工程；ならびに
（ｃ）該遺伝子発現分析によって得られるデータをまとめた報告を作成する工程
を含む方法。
【請求項３３】
前記乳房組織が乳癌細胞を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記乳房組織が、固定したパラフィン包埋生検サンプルから採取される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＲＮＡが断片化している、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記報告が、前記患者の長期間生存の可能性の予測を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記報告が、前記患者の治療様式についての提言を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
表１および２に列挙される遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅するための方法であって、表３に列挙される単位複製配列および表４Ａ−４Ｄに列挙されるプライマー−プローブのセットを用いて該ＰＣＲを行う工程を含む、方法。
【請求項３９】
表４Ａ−４Ｄに列挙される、ＰＣＲプライマー−プローブのセット。
【請求項４０】
表３に列挙される、ＰＣＲ単位複製配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、その発現が癌の診断および／または予後診断に重要な遺伝子セットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野の説明）
癌の専門医には、「医療の標準」という性格をもつ化学療法薬のさまざまな組み合わせなど、彼らに利用可能な治療の選択肢が数多くあり、また、特定の癌に対してラベル表示されていないが、有効であるとの証拠がある数多くの薬剤もある。良好な治療成果をもたらす可能性を最も高くするには、患者に利用できる最適な癌治療を割り当てる必要があり、また、この割り当てが、診断後できるだけ早く行われる必要がある。
【０００３】
現在、臨床診療において使用されている診断用検査は単一検体（ｓｉｎｇｌｅ  ａｎａｌｙｔｅ）であるため、何十もの異なったマーカーの間の関係を知ることの潜在的な価値を捕捉できていない。さらに、診断用検査はしばしば非定量的で、免疫組織化学法に頼っている。この方法は、試薬が正規化されていないせいもあり、また、解釈が主観的で簡単には数値化できないせいもあって、しばしば、研究室が変わると結果も変わってしまう。ＲＮＡによる検査は、時間とともにＲＮＡが分解するという問題があり、また、解析のために患者から新鮮な組織サンプルを得ることが難しいという事実があるために、あまり利用されていない。固定パラフィン包埋組織の方が容易に利用できるため、固定組織中のＲＮＡを検出するための方法が確立されている。しかしながら、これらの方法では、一般的に、少量の材料から多数の遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を研究することはできない。したがって、伝統的な固定組織は、蛋白質の免疫組織化学的検出以外のために使用されることはほとんどない。
【０００４】
過去数年間で、いくつかの群が、マイクロアレイ遺伝子発現分析法によって、さまざまな癌型の分類に関する研究を発表している（Ｇｏｌｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：５３１−５３７（１９９９）；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：１３７９０−１３７９５（２００１）；Ｃｈｅｎ−Ｈｓｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７  （Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ３１６−Ｓ３２２  （２００１）；Ｒａｍａｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１５１４９−１５１５４（２００１））。遺伝子発現パターンに基づいたヒト乳癌のいくつかの分類も報告されている（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：２２３２−２２３８（２０００）；Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１１４６２−１１４６７（２００１）；Ｓｏｒｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１０８６９−１０８７４（２００１）；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：８３７５−８３８０（２００１））。しかし、これらの研究は、乳癌など、さまざまなタイプの癌の既に確立している分類を充実および絞り込むことに主眼を置いているため、一般的には、示差的に発現される遺伝子の関係を新たに洞察するものではなく、それらの発見を、癌治療法の臨床成果を向上させるために、治療戦略と結びつけるものでもない。
【０００５】
最新の分子生物学および生化学によって、活性が、腫瘍細胞の挙動、分化状態、および一定の治療薬に対する感受性または耐性に影響を与える何百もの遺伝子が明らかにされているにもかかわらず、いくつか例外があるものの、そのような遺伝子の状況を、薬剤治療に関する日常的な臨床判断を行う目的で利用してはいない。顕著な例外は、タモキシフェンなどの抗エストロゲン薬で治療する患者を選ぶために、乳癌におけるエストロゲンレセプター（ＥＲ）蛋白質の発現が利用されていることである。もう１つの例外的な実例は、Ｈｅｒ２の拮抗薬である登録商標Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）による患者を選択するために、乳癌におけるＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）蛋白質の発現が利用されていることである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
最近の進歩にもかかわらず、相変わらず癌治療で困難なのは、病理学的に別個の腫瘍型に対する具体的な治療計画を対象とし、転帰を最大にするために腫瘍治療を個別化することである。したがって、さまざまな治療選択肢に対する患者の反応に関する予測情報を同時に提供する検査法に対する需要が存在している。これは、その生物学がよく分かっていない乳癌に特に言えることである。乳癌を、ＥｒｂＢ２＋下位群などのいくつかの下位群、および、エストロゲンレセプター（ＥＲ）およびいくつか別の転写因子（Ｐｅｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：７４７−７５２（２０００））の遺伝子発現が低下ないし欠如するという特徴をもつ下位群に分類できることが、乳癌の細胞および分子的な多様性を反映しているわけではなく、また、患者の反応を最大にする治療法を計画できるわけではないことは明らかである。
【０００７】
特に、乳癌や卵巣癌などの癌であると一旦診断されると、癌が再発する可能性や患者が長期間生存する可能性など、病気の予測される経路を医師が予測して、それに従って、最も適当な治療選択肢を選ぶことができる方法に対する需要が生じる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、特に無病生存に関し、その発現が予後的に有意義な遺伝子のセットを提供する。
【０００９】
本発明は、該セット中のすべてのマーカーをアッセイするために、保管されているパラフィン包埋生検材料を使用することに対応しており、そのため、最も広範に利用可能なタイプの生検材料に適合する。また、例えば針生検（ｃｏｒｅ  ｂｉｏｐｓｙ）または細針吸引などによる、いくつかの異なった腫瘍組織回収法にも適合する。さらに、遺伝子セットの各メンバーについて、本発明は、検査に使用できるオリゴヌクレオチド配列を特定する。
【００１０】
１つの態様において、本発明は、患者が癌を再発させることなく長期間生存する可能性を予測する方法であって、患者から採取した癌細胞における１種類以上の予後ＲＮＡ転写産物の発現レベルまたは発現産物を、該癌細胞におけるすべてのＲＮＡ転写産物またはそれらの産物の発現レベル、または、ＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の参照用セットの発現レベルに対して正規化して決定することを含む方法において、該予後ＲＮＡ転写産物が、Ｂ＿カテニン；ＢＡＧ１；ＢＩＮ１；ＢＵＢ１；Ｃ２０＿ｏｒｆｌ；ＣＣＮＢ１；ＣＣＮＥ２；ＣＤＣ２０；ＣＤＨ１；ＣＥＧＰ１；ＣＩＡＰ１；ｃＭＹＣ；ＣＴＳＬ２；ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７；ＤＲ５；ＥｐＣＡＭ；ＥｓｔＲ１；ＦＯＸＭ１；ＧＲＢ７；ＧＳＴＭ１；ＧＳＴＭ３；ＨＥＲ２；ＨＮＲＰＡＢ；ＩＤ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＴＧＡ７；Ｋｉ＿６７；ＫＮＳＬ２；ＬＭＮＢ１；ＭＣＭ２；ＭＥＬＫ；ＭＭＰ１２；ＭＭＰ９；ＭＹＢＬ２；ＮＥＫ２；ＮＭＥ１；ＮＰＤ００９；ＰＣＮＡ；ＰＲ；ＰＲＥＰ；ＰＴＴＧ１；ＲＰＬＰＯ；Ｓｒｃ；ＳＴＫ１５；ＳＴＭＹ３；ＳＵＲＶ；ＴＦＲＣ；ＴＯＰ２Ａ；およびＴＳからなる群より選択される１つ以上の遺伝子の転写産物であり、
ここで、ＢＵＢ１；Ｃ２０＿ｏｒｆｌ；ＣＣＮＢ１；ＣＣＮＥ２；ＣＤＣ２０；ＣＤＨ１；ＣＴＳＬ２；ＥｐＣＡＭ；ＦＯＸＭ１；ＧＲＢ７；ＨＥＲ２；ＨＮＲＰＡＢ；Ｋｉ＿６７；ＫＮＳＬ２；ＬＭＮＢ１；ＭＣＭ２；ＭＥＬＫ；ＭＭＰ１２；ＭＭＰ９；ＭＹＢＬ２；ＮＥＫ２；ＮＭＥ１；ＰＣＮＡ；ＰＲＥＰ；ＰＴＴＧ１；Ｓｒｃ；ＳＴＫ１５；ＳＴＭＹ３；ＳＵＲＶ；ＴＦＲＣ；ＴＯＰ２Ａ；およびＴＳの１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が低いことを示し、また、
ＢＡＧ１；Ｂカテニン；ＢＩＮ１；ＣＥＧＰ１；ＣＩＡＰ１；ｃＭＹＣ；ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７；ＤＲ５；ＥｓｔＲ１；ＧＳＴＭ１；ＧＳＴＭ３；ＩＤ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＴＧＡ７；ＮＰＤ００９；ＰＲ；およびＲＰＬＰＯの１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が高いことを示す方法に関する。
【００１１】
さまざまな実施態様において、２つ以上、または５つ以上、または１０以上、または１５以上、または２０以上、または２５以上の予後ＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の発現レベルを決定する。
【００１２】
別の実施態様において、癌は乳癌または卵巣癌である。
【００１３】
さらに別の実施態様において、癌はリンパ節陰性かつＥＲ陽性の乳癌である。
【００１４】
さらなる実施態様において、ＲＮＡはイントロンＲＮＡを含む。
【００１５】
なおさらなる実施態様において、ＭＭＰ９、ＧＳＴＭ１、ＭＥＬＫ、ＰＲ、ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７、ＧＳＴＭ３、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＢ１、ＳＴＭＹ３、ＧＲＢ７、ＭＹＢＬ２、ＣＥＧＰ１、ＳＵＲＶ、ＬＭＮＢ１、ＣＴＳＬ２、ＰＴＴＧ１、ＢＡＧ１、ＫＮＳＬ２、ＣＩＡＰ１、ＰＲＥＰ、ＮＥＫ２、ＥｐＣＡＭ、ＰＣＮＡ、Ｃ２０＿ｏｒｆｌ、ＩＴＧＡ７、ＩＤ１  Ｂ＿カテニン、ＥｓｔＲｌ、ＣＤＨ１、ＴＳ  ＨＥＲ２、およびｃＭＹＣからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の１つ以上の予後ＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の発現レベルを決定するが、
ここで、Ｃ２０＿ｏｒｆｌ；ＣＣＮＢ１；ＣＤＣ２０；ＣＤＨ１；ＣＴＳＬ２；ＥｐＣＡＭ；ＧＲＢ７；ＨＥＲ２；ＫＮＳＬ２；ＬＭＮＢ１；ＭＣＭ２；ＭＭＰ９；ＭＹＢＬ２；ＮＥＫ２；ＰＣＮＡ；ＰＲＥＰ；ＰＴＴＧ１；ＳＴＭＹ３；ＳＵＥＶ；ＴＳ；およびＭＥＬＫの１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が低いことを示し、また、
ＢＡＧ１；Ｂカテニン；ＣＥＧＰ１；ＣＩＡＰ１；ｃＭＹＣ；ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７；ＥｓｔＲ１；ＧＳＴＭ１；ＧＳＴＭ３；ＩＤ１；ＩＴＧＡ７；およびＰＲの１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が高いことを示す。
【００１６】
別の実施態様において、ＧＲＢ７、ＳＵＲＶ、ＰＲ、ＬＭＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＨＥＲ２、ＧＳＴＭ１、ＭＥＬＫ、Ｓ２０＿ｏｒｆｌ、ＰＴＴＧ１、ＢＵＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＢ１、ＳＴＭＹ３、ＫＮＳＬ２、ＣＴＳＬ２、ＭＣＭ２、ＮＥＫ２、ＤＲ５、Ｋｉ＿６７、ＣＣＮＥ２、ＴＯＰ２Ａ、ＰＣＮＡ、ＰＲＥＰ、ＦＯＸＭ１、ＮＭＥ１、ＣＥＧＰ１、ＢＡＧ１、ＳＴＫ１５、ＨＮＲＰＡＢ、ＥｓｔＲ１、ＭＭＰ９、ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７、ＴＳ、Ｓｒｃ、ＢＩＮ１、ＮＰ００９、ＲＰＬＰＯ、ＧＳＴＭ３、ＭＭＰ１２、ＴＦＲＣ、およびＩＧＦ１Ｒからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の１つ以上の予後ＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の発現レベルを決定するが、
ここで、ＧＲＢ７；ＳＵＲＶ；ＬＭＮＢ１；ＭＹＢＬ２；ＨＥＲ２；ＭＥＬＫ；Ｃ２０＿ｏｒｆｌ；ＰＴＴＧ１；ＢＵＢ１；ＣＤＣ２０；ＣＣＮＢ１；ＳＴＭＹ３；ＫＮＳＬ２；ＣＴＳＬ２；ＭＣＭ２；ＮＥＫ２；Ｋｉ＿６７；ＣＣＮＥ２；ＴＯＰ２Ａ＿４；ＰＣＮＡ；ＰＲＥＰ；ＦＯＸＭ１；ＮＭＥ１；ＳＴＫ１５；ＨＮＲＰＡＢ；ＭＭＰ９；ＴＳ；Ｓｒｃ；ＭＭＰ１２；およびＴＦＲＣの１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が低いことを示し、また、
ＰＲ；ＧＳＴＭＩ；ＤＲ５；ＣＥＧＰ１；ＢＡＧ１；ＥｓｔＲｌ；ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７；ＢＩＮ１；ＮＰ００９；ＲＰＬＰＯ；ＧＳＴＭ３；ＩＧＦ１Ｒの１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が高いことを示す。
【００１７】
別の態様において、本発明は、患者が癌を再発させることなく長期間生存する可能性を予測する方法であって、患者から採取した癌細胞における１種類以上の予後ＲＮＡ転写産物の発現レベルまたは発現産物を、該癌細胞におけるすべてのＲＮＡ転写産物またはそれらの産物の発現レベル、または、ＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の参照用セットの発現レベルに対して正規化して決定することを含む方法において、該予後ＲＮＡ転写産物が、ＧＲＢ７；ＬＭＮＢ１；ＥＲ；ＳＴＭＹ３；ＫＬＫ１０；ＰＲ；ＫＲＴ５；ＦＧＦＲ１；ＭＣＭ６；ＳＮＲＰＦからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の１つ以上の予後ＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の発現レベルを決定するが、
ここで、ＧＲＢ７；ＬＭＮＢ１；ＳＴＭＹ３；ＫＬＫ１０；ＦＧＦＲ１およびＳＮＲＰＦの１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が低いことを示し、また、
ＥＲ；ＰＲ；ＫＲＴ５およびＭＣＭ６；ＥＲ；ＰＲ；ＫＲＴ５およびＭＣＭ６の１つ以上の発現が、癌を再発せずに長期間生存する可能性が高いことを示す。
【００１８】
この方法の１つの実施態様において、ＲＮＡは、患者の固定ワックス包埋乳癌組織標本から単離される。
【００１９】
別の実施態様において、ＲＮＡは針生検組織または細針吸引細胞から単離される。
【００２０】
別の態様において、本発明は、固体表面に固定されている以下の遺伝子の２つ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイに関する：Ｂ＿カテニン：ＢＡＧ１；ＢＩＮ１；ＢＵＢ１；Ｃ２０＿ｏｒｆｌ；ＣＣＮＢ１；ＣＣＮＥ２；ＣＤＣ２０；ＣＤＨ１；ＣＥＧＰ１；ＣＩＡＰ１；ｃＭＹＣ；ＣＴＳＬ２；ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７；ＤＲ５；ＥｐＣＡＭ；ＥｓｔＲ１；ＦＯＸＭ１；ＧＲＢ７；ＧＳＴＭ１；ＧＳＴＭ３；ＨＥＲ２；ＨＮＲＰＡＢ；ＩＤ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＴＧＡ７；Ｋｉ＿６７；ＫＮＳＬ２；ＬＭＮＢ１；ＭＣＭ２；ＭＥＬＫ；ＭＭＰ１２；ＭＭＰ９；ＭＹＢＬ２；ＮＥＫ２；ＮＭＥ１；ＮＰＤ００９；ＰＣＮＡ；ＰＲ；ＰＲＥＰ；ＰＴＴＧ１；ＲＰＬＰＯ；Ｓｒｃ；ＳＴＫ１５；ＳＴＭＹ３；ＳＵＲＶ；ＴＦＲＣ；ＴＯＰ２Ａ；およびＴＳ。
【００２１】
１つの実施態様において、このアレイは、以下の遺伝子の２つ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む：ＭＭＰ９、ＧＳＴＭ１、ＭＥＬＫ、ＰＲ、ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７、ＧＳＴＭ３、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＢ１、ＳＴＭＹ３、ＧＲＢ７、ＭＹＢＬ２、ＣＥＧＰ１、ＳＵＲＶ、ＬＭＮＢ１、ＣＴＳＬ２、ＰＴＴＧ１、ＢＡＧ１、ＫＮＳＬ２、ＣＩＡＰ１、ＰＲＥＰ、ＮＥＫ２、ＥｐＣＡＭ、ＰＣＮＡ、Ｃ２０＿ｏｒｆｌ、ＩＴＧＡ７、ＩＤ１  Ｂ＿カテニン、ＥｓｔＲｌ、ＣＤＨ１、ＴＳ  ＨＥＲ２、およびｃＭＹＣ。
【００２２】
別の実施態様において、このアレイは、以下の遺伝子の２つ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む：ＧＲＢ７、ＳＵＲＶ、ＰＲ、ＬＭＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＨＥＲ２、ＧＳＴＭ１、ＭＥＬＫ、Ｓ２０＿ｏｒｆｌ、ＰＴＴＧ１、ＢＵＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＢ１、ＳＴＭＹ３、ＫＮＳＬ２、ＣＴＳＬ２、ＭＣＭ２、ＮＥＫ２、ＤＲ５、Ｋｉ＿６７、ＣＣＮＥ２、ＴＯＰ２Ａ、ＰＣＮＡ、ＰＲＥＰ、ＦＯＸＭ１、ＮＭＥ１、ＣＥＧＰ１、ＢＡＧ１、ＳＴＫ１５、ＨＮＲＰＡＢ、ＥｓｔＲ１、ＭＭＰ９、ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７、ＴＳ、Ｓｒｃ、ＢＩＮ１、ＮＰ００９、ＲＰＬＰＯ、ＧＳＴＭ３、ＭＭＰ１２、ＴＦＲＣ、およびＩＧＦ１Ｒ。
【００２３】
さらなる実施態様において、上記遺伝子の３つ以上、または５つ以上、または１０以上、または１５以上、または２０以上、または２５以上にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【００２４】
なおさらなる実施態様において、本アレイは、上記遺伝子のすべてにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【００２５】
さらに別の実施態様においては、本アレイは、同一の遺伝子にハイブリダイズする複数のポリヌクレオチドを含む。
【００２６】
付加的な実施態様において、本アレイは、イントロンベースの配列を含む。
【００２７】
別の実施態様において、これらのポリヌクレオチドはｃＤＮＡであって、例えば、約５００から５０００塩基長でありうる。
【００２８】
さらに別の実施態様において、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドであって、例えば、約２０から８０塩基長程度である。
【００２９】
本アレイは、例えば、ガラスに固定することができ、数十万個、例えば３３０，０００個のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、浸潤性乳癌と診断された患者が乳癌を再発させることなく長期間生存する可能性を予測する方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
（ａ）患者から採取した乳癌細胞におけるＢ＿カテニン；ＢＡＧ１；ＢＩＮ１；ＢＵＢ１；Ｃ２０＿ｏｒｆｌ；ＣＣＮＢ１；ＣＣＮＥ２；ＣＤＣ２０；ＣＤＨ１；ＣＥＧＰ１；ＣＩＡＰ１；ｃＭＹＣ；ＣＴＳＬ２；ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７；ＤＲ５；ＥｐＣＡＭ；ＥｓｔＲ１；ＦＯＸＭ１；ＧＲＢ７；ＧＳＴＭ１；ＧＳＴＭ３；ＨＥＲ２；ＨＮＲＰＡＢ；ＩＤ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＴＧＡ７；Ｋｉ＿６７；ＫＮＳＬ２；ＬＭＮＢ１；ＭＣＭ２；ＭＥＬＫ；ＭＭＰ１２；ＭＭＰ９；ＭＹＢＬ２；ＮＥＫ２；ＮＭＥ１；ＮＰＤ００９；ＰＣＮＡ；ＰＲ；ＰＲＥＰ；ＰＴＴＧ１；ＲＰＬＰＯ；Ｓｒｃ；ＳＴＫ１５；ＳＴＭＹ３；ＳＵＲＶ；ＴＦＲＣ；ＴＯＰ２Ａ；およびＴＳからなる群より選択される遺伝子セットの遺伝子のＲＮＡ転写産物または発現産物の発現レベルを、該癌細胞におけるすべてのＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の発現レベル、または、ＲＮＡ転写産物またはそれらの発現産物の参照用セットの発現レベルに対して正規化して決定する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたデータを統計分析に供する工程；および
（ｃ）該長期間生存の可能性が高くなったか低くなったかを決定する工程。
【００３１】
なおさらなる態様において、本発明は、患者に個別のゲノムプロフィールを作成する方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
（ａ）患者から採取した乳房組織から抽出されたＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程；
（ｂ）表１および２のいずれかに列挙されている乳癌遺伝子セットから選択された１つ以上の遺伝子の組織における発現レベルを決定する工程であって、該発現レベルが、参照用遺伝子に対して正規化されるか、選択的には、乳癌参照用組織セットに存在する量と比較される工程；および
（ｃ）該遺伝子発現分析によって得られるデータをまとめた報告を作成する工程。
【００３２】
乳房組織は、乳癌細胞を含む可能性がある。
【００３３】
別の実施態様において、乳房組織は、固定されたパラフィン包埋生検サンプルから採取されるが、その中では、ＲＮＡが断片化している可能性がある。
【００３４】
上記報告は、患者の長期間生存の可能性、および／または、該患者の治療様式についての提言を含む。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、表１および２に列挙されている遺伝子のｍＲＮＡ産物のレベルを、表に列挙されている単位複製配列および表４Ａ−４Ｄに列挙されているプライマー−プローブのセットを用いて、リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって決定する方法に関する。
【００３６】
なおさらなる態様において、本発明は、表４Ａ−４Ｄに列挙されているプライマー−プローブのセット、および表３に列挙されているＰＣＲ単位複製配列に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
別段の記載がない限り、本明細書において使用される科学技術用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）、およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｉｍａ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４ｔｈ  ｅｄ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９２）は、当業者にとって、本願で使用されている多くの用語に対する一般的な手引きとなる。
【００３８】
当業者は、本明細書に記載されているのと同様または同等の多くの方法および材料があることを認識するであろうが、それらも、本発明を実施するときに使用することができよう。実際、本発明は、決して、記載されている方法および材料に限定されるものではない。本発明の目的にとって、以下の用語を下記のとおり定義する。
【００３９】
「マイクロアレイ」という用語は、基質上に規則正しく並べられたハイブリダイズ可能なアレイ要素、好ましくはポリヌクレオチドプローブを意味する。
【００４０】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数形で用いられても複数形で用いられても、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドであって、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡを意味する。したがって、例えば、本明細書で定義されているポリヌクレオチドには、１本鎖および２本鎖のＤＮＡ、１本鎖および２本鎖の領域を含むＤＮＡ、１本鎖および２本鎖のＲＮＡ、ならびに１本鎖および２本鎖の領域を含むＲＮＡ、１本鎖もしくは、より一般的には２本鎖であるか、または、１本鎖および２本鎖の領域を含むＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子などがあるが、これらに限定されるものではない。さらに、本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三重鎖領域を意味する。このような領域にある鎖は、同一の分子または異なった分子に由来するものでもよい。該領域は、１つ以上の該分子のすべてを含んでいてもよいが、より一般的には、いくつかの分子の一領域のみを含む。三重鎖領域の分子の１つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的にはｃＤＮＡを含む。この用語は、修飾された塩基を１つ以上含むＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを包含する。したがって、安定性のため、またはそれ以外の理由で修飾されている骨格をもつＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書において意図されている用語としての「ポリヌクレオチド」である。さらに、ＤＮＡまたはＲＮＡは、イノシンなどの例外的塩基、または、トリチウム化された塩基などの修飾塩基が、本明細書において定義されている「ポリヌクレオチド」という用語の範囲に含まれる。一般的に、「ポリヌクレオチド」という用語は、未修飾ポリヌクレオチドの化学的、酵素的および／は代謝的に修飾された形態のすべてを包含するとともに、ウイルス、ならびに単純細胞および複雑型細胞などの細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態も包含する。
【００４１】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、比較的短いポリヌクレオチドを意味し、１本鎖デオキシリボヌクレオチド、１本鎖または２本鎖のリボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および２本鎖ＤＮＡを意味する。１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、例えば、市販されている自動式オリゴヌクレオチド合成装置を用いる化学合成法によってよく合成される。しかし、オリゴヌクレオチドは、これ以外に、インビトロ組換えＤＮＡによる技術や、細胞および生物の中でＤＮＡを発現させるなど、さまざまな方法によって作成できる。
【００４２】
「示差的に発現される遺伝子」、「示差的遺伝子発現」およびこれらの同義語は、互換的に使用され、乳癌など、具体的には癌などの病気を患う被験者において、その発現が、正常または対照となる被験者における発現と比較して、より高いレベルかより低いレベルに活性化される遺伝子を意味する。この用語は、同じ病気の異なる段階で、その発現がより高いレベルまたはより低いレベルに活性化される遺伝子も包含する。また、示差的に発現される遺伝子は、核酸レベルまたは蛋白質レベルで活性化または抑制されてもよく、あるいは、異なったポリペプチド産物をもたらす選択的スプライシングを受けることもあると理解される。このような違いは、例えば、ポリペプチドのｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌またはその他の分配における変化によって証明することができる。示差的遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物の間で発現を比較すること、または、２つ以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物の間における発現比率を比較すること、または、さらに、同じ遺伝子が異なってプロセッシングされた２つの産物であって、正常な被験者と、具体的には癌という病気を患う被験者の間で異なっているか、または、同じ病気のさまざまな段階で異なっている産物を比較することを包含しうる。示差的発現は、例えば、正常および病気の細胞間における、または、異なった病気が発症したか、異なった病気の段階にある細胞間における、遺伝子またはその発現産物の時間的または細胞内での発現パターンの定量的、および定性的な違いを含む。本発明の目的にとって、正常な被験者と病気の被験者において、または、病気の被験者の病気発症のさまざまな段階において、ある遺伝子の発現に約２倍以上、好ましくは約４倍以上、より好ましくは約６倍以上、最も好ましくは約１０倍以上の違いがあるときに、「示差的遺伝子発現」が存在するとみなされる。
【００４３】
ＲＮＡ転写産物について「過剰発現」という用語は、標本中で決定されたＲＮＡのすべてまたは特定の参照用ｍＲＮＡセットであるかもしれない参照用ｍＲＮＡのレベルに対して正規化することによって決定された転写産物のレベルを意味するために用いられる。
【００４４】
「遺伝子増幅」という用語は、特定の細胞または細胞株において遺伝子または遺伝子断片のコピーを多数形成させる処理を意味する。複製領域（増幅されたＤＮＡの鎖）は、しばしば「単位複製配列（アンプリコン）」と呼ばれる。通常、産生されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、すなわち遺伝子発現のレベルも、発現された特定の遺伝子から作られてコピーの数に比例して増加する。
【００４５】
「予後」という用語は、本明細書において、乳癌などの腫瘍性疾患の再発、転移拡散、および薬剤耐性など、癌に起因する死または進行が起こる可能性を予測することを意味する。「予測」という用語は、本明細書において、患者が。薬剤または薬剤のセットに芳しくまたは芳しくなく反応する可能性、および、そのような反応の程度、または、原発性腫瘍の手術による除去および／または化学療法の後一定期間再発なしに生存する可能性のいずれかを意味する。本発明に係る予測法を臨床的に利用して、特定の患者に対して最も適切な治療法を選択することによって治療法を決定することができる。本発明に係る予測法は、ある患者が、外科的介入、所定の薬剤または薬剤の併用による化学療法、および／または放射線療法などの治療計画に対して良好な反応を示す可能性があるか否か、または、手術および／または化学療法の終了、またはその他の治療法の後に長期間生存する可能性があるか否かを予測するのに有益な手段である。
【００４６】
「長期」生存という用語は、本明細書では、手術またはその他の治療の後３年以上、より好ましくは８年以上、最も好ましくは１０年以上生存することを意味する。
【００４７】
「腫瘍」という用語は、本明細書において使用される場合、悪性または良性のすべての腫瘍細胞の成長および増殖、および前癌および癌の細胞および組織を意味する。
【００４８】
「癌」および「癌性」という用語は、一般的には無秩序な細胞増殖という特徴をもつ、哺乳動物における生理学的状態を意味または記述するものである。癌の例には、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、メラノーマ、および脳腫瘍などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
癌の「病理」には、患者の健康を危うくする現象のすべてが含まれる。これに限定はないが、異常または制御不能な細胞増殖、転移、隣接した細胞の正常な機能による介入、サイトカインまたはその他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症反応または免疫反応の抑制または悪化、新生組織形成、前癌状態、悪性腫瘍、周辺組織またはリンパ節など離れた組織または器官への浸潤などが含まれる。
【００５０】
ハイブリダイゼーション反応の「厳密性」は、当業者によって容易に決定することができ、通常は、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する実験的計算である。一般的に、プローブが長くなるほど、適当なアニーリングを行うための温度が高くなる一方で、プローブが短くなるほど低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、通常、変性したＤＮＡが、融解温度よりも低い温度で環境中に相補鎖が存在する場合に再アニールできることにかかっている。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなるほど、利用できる相対的な温度は高くなる。その結果、相対温度が高くなるほど、反応条件の厳密性が高くなり、温度が低くなるほど厳密性は低くなることになる。ハイブリダイゼーション反応の厳密性のさらなる詳細と説明については、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照。
【００５１】
「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェントな条件」は、本明細書で定義されているように、一般的には、（１）例えば５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムというような低イオン強度および高温を洗浄に用い、（２）ハイブリダイゼーションの間、ホルムアミドなどの変性剤、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）などを、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムとともに４２℃で用い、または、（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波破砕済みサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で用い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃での５０％ホルムアミド中、４２℃で洗浄した後、５５℃でＥＤＴＡ入り０．１×ＳＳＣによることからなる高厳密性洗浄を行う。
【００５２】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている条件とされ、上記の洗浄用溶液およびハイブリダイゼーション条件よりも厳密性の低い溶液および条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）を使用することを含む。中程度にストリンジェントな条件の一例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃で一晩インキュベートした後、１×ＳＳＣ中、約３７〜５０℃でフィルターを洗浄することである。当業者は、プローブの長さなどの要素を取り入れる必要に応じて、温度、イオン強度などをどのように調整すべきかを理解していよう。
【００５３】
本発明との関連において、特定の遺伝子セットに列挙されている遺伝子を「１つ以上」、「２つ以上」「５つ以上」などと言うのは、列挙されている遺伝子のいずれか１つ、またはそれらのいずれか、およびすべての組み合わせを意味する。
【００５４】
「リンパ節陰性」乳癌など、「リンパ節陰性」の癌という用語は、本明細書において、リンパ節にまで拡散していない癌を意味するために使用される。
【００５５】
「スプライシング」および「ＲＮＡスプライシング」という用語は互換的に使用され、連続したコード配列をもち、真核細胞の細胞質に移行して行く成熟ｍＲＮＡを産生するためにイントロンを除去しエクソンを連結させるＲＮＡプロセッシングを意味する。
【００５６】
理論上、「エクソン」という用語は、成熟ＲＮＡ産物に現れる、断続的した遺伝子の分節を意味する（Ｂ．Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．１９９０）。理論上、「イントロン」という用語は、転写されるが、その両側にあるエクソンをスプライシングしてつなげることにより転写産物内から除去されるＤＮＡ分節を意味する。実施面において、エクソン配列は、配列番号によって定義されている遺伝子のｍＲＮＡ配列の中に存在する。実施面において、イントロン配列は、遺伝子のゲノムＤＮＡの中に存在する介在配列であって、エクソン配列によって挟まれ、５’側および３’側の境界にＧＴおよびＡＧというスプライス共通配列を有する。
【００５７】
（Ｂ．詳細な説明）
本発明を実施するに当たって、別途記載がない限り、分子生物学（組換え技術など）、微生物学、細胞生物学、および生化学の常法を用いるが、それらは、当技術分野の範囲内である。そのような技術は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，  １９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，第４版（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，ＢｌａｃｋＷｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，１９８７）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｆ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；および「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）などの文献で十分に説明されている。
【００５８】
（１．遺伝子発現プロファイリング）
遺伝子発現プロファイリングの方法には、ポリヌクレオチド解析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、およびプロテオミクスによる方法などがある。最も一般的に用いられる方法で、サンプル中のｍＲＮＡ発現を定量するために当技術分野において知られている方法には、ノザンブロッティングおよびインサイツハイブリダイゼーション（（Ｐａｒｋｅｒ  ＆  Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６：２４７−２８３（１９９９））；ＲＮＡｓｅプロテクション・アッセイ法（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：８５２−８５４（１９９２））；および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）などのＰＣＲ法（Ｗｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：２６３−２６４（１９９２））などがある。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの二重鎖またはＤＮＡ−蛋白質二重鎖などの特定の二重鎖を識別できる抗体を用いることもできる。配列決定による遺伝子発現分析法の代表的な方法には、遺伝子発現連続解析法（ＳＡＧＥ）、および大規模並列シグネチャー配列決定法（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析法などがある。
【００５９】
（２．ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリング法）
（ａ  逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））
上記技術の中で、最も感度が高く、最も融通がきく定量法はＲＴ−ＰＣＲであって、異なったサンプル集団、正常組織と腫瘍組織、薬物治療の有無などにおけるｍＲＮＡレベルを比較したり、遺伝子発現のパターンの特徴を調べたり、密接に関係したｍＲＮＡを区別したり、また、ＲＮＡの構造を解析するために利用できる。
【００６０】
最初の工程は、標的サンプルからｍＲＮＡを単離することである。出発物質は、一般的には、ヒトの腫瘍または腫瘍細胞株、およびそれぞれに対応する正常な組織または細胞株から単離された全ＲＮＡである。このように、ＲＮＡは、乳房、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮などの腫瘍など、さまざまな原発性腫瘍、または腫瘍細胞株から、健康なドナーからプールしたＤＮＡを用いて単離することができる。ｍＲＮＡが原発性腫瘍に由来するものであれば、凍結されたか、または保管されているパラフィン包埋され固定（ホルマリン固定）された組織サンプルからｍＲＮＡを抽出することができる。
【００６１】
ｍＲＮＡを抽出するための一般的な方法が、当技術分野において周知されており、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９７）など、分子生物学の標準的な教科書に開示されている。パラフィン包埋された組織からＲＮＡを抽出する方法は、例えば、Ｒｕｐｐ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋｅｒ，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．５６：Ａ６７（１９８７）、およびＤｅ  Ａｎｄｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４（１９９５）に開示されている。具体的には、Ｑｉａｇｅｎなどの製造業者から入手した精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼを用いて、製造業者の指示に従ってＲＮＡ単離を行うことができる。例えば、培養されている細胞の全ＲＮＡは、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて単離することができる。これ以外の市販されているＲＮＡ単離用キットには、商標ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ全ＤＮＡおよびＲＮＡ精製キット（登録商標ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、およびパラフィンブロックＲＮＡ単離用キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）などがある。組織サンプルからの全ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を用いて単離することができる。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム濃度勾配遠心法によって単離することができる。
【００６２】
ＲＮＡは、ＰＣＲの鋳型としては利用できないため、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの第一の工程は、ＲＮＡ鋳型を逆転写させてｃＤＮＡとした後、ＰＣＲ反応でそれを指数的に増幅させることである。２つの最も広く使用されている逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写工程は、一般的には、環境および発現プロファイリングの目的に応じて、特異的プライマー、ランダムなヘキサマー、またはオリゴ−ｄＴプライマーを用いて開始される。例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて製造業者の指示に従って、抽出されたＲＮＡを逆転写することができる。そして、得られたｃＤＮＡを、次のＰＣＲ反応における鋳型として用いることができる。
【００６３】
ＰＣＲの工程では、さまざまな熱安定的ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼを使用するが、一般的には、５’−３’ヌクレアーゼ活性をもつが、３’−５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性をもたないＴａｑＤＮＡポリメラーゼが用いられる。すなわち、商標ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲは、一般的には、ＴａｑポリメラーゼまたはＴｔｈポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的単位複製配列に結合しているハイブリダイゼーション用プローブを加水分解するが、同じ５’ヌクレアーゼ活性をもつ酵素を使用することもできる。２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応に特有の単位複製配列を生成させる。この２つのプライマーの間に存在する塩基配列を検出するために別のオリゴヌクレオチド、すなわちプローブを設計する。このプローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長することはできず、レポーター用の蛍光色素およびクエンチャー用の蛍光色素で標識されている。これら２種類の色素がプローブ上にあって互いに近くにあるときには、レポーター用色素からレーザーによって発生する光は、クエンチャー用の色素で消光されている。増幅反応の過程で、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素が、鋳型依存的にプローブを切断する。その結果得られたプローブ断片は溶液中に解離して、放出されたレポーター用色素からのシグナルが、第２のフルオロフォアの消光作用から解放される。レポーター用色素の一分子は、新しい分子が合成される度に放出されるため、消光されないレポーター用色素の検出に基づいて、データを定量的に解釈することが可能となる。
【００６４】
商標ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、登録商標ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）など市販の装置を用いて行うことができる。好適な実施態様において、５’ヌクレアーゼ法は、登録商標ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出キットなどのリアルタイム定量用ＰＣＲ装置上で行う。この装置は、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよびコンピュータからなる。この装置は、サーモサイクラー上の９６ウェルのフォーマットの中にあるサンプルを増幅する。増幅過程で、レーザーによって発生させた蛍光シグナルを、９６ウェルすべてについて、光ファイバーケーブルを通じてリアルタイムで集めて、ＣＣＤで検出する。この装置は、器具を作動させるため、およびデータを解析するためのソフトウエアを含む。
【００６５】
５’−ヌクレアーゼ・アッセイのデータは、まず、Ｃｔすなわち限界サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）として表現される。上記したように、蛍光値は、サイクル毎に記録され、増幅反応のその時点までに増幅された産物の量を示す。蛍光シグナルが統計的に有意であると最初に記録された時点が限界サイクル（Ｃｔ）である。
【００６６】
誤差とサンプル対サンプルにおける変動作用を最小にするために、通常、内部標準を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施する。理想的な内部標準は、さまざまな組織の中で一定のレベルで発現され、実験処理によって影響されないものである。遺伝子発現のパターンを正規化するためにもっとも頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンのｍＲＮＡである。
【００６７】
ＲＴ−ＰＣＲ技術のより新しい変法は、リアルタイム定量的ＰＣＲであって、二重標識された蛍光発生プローブ（すなわち商標Ｔａｑｍａｎプローブ）によってＰＣＲ産物の蓄積を決定する。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列に対する内部競合分子を正規化するために利用する定量的な競合ＰＣＲにも、サンプル中に含まれる正規化用遺伝子、またはＲＴ−ＰＣＲ用のハウスキーピング遺伝子を用いる定量的な比較ＰＣＲにも適合する。更なる詳細については、例えば、Ｈｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４（１９９６）を参照されたい。
【００６８】
ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長、および増幅など、固定されたパラフィン包埋組織をＲＮＡの由来源として使用する遺伝子発現プロファイリングの典型的プロトコールの各工程は、さまざまな発行済みの雑誌記事に記載されている｛例えば、Ｔ．Ｅ．Ｇｏｄｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２：８４−９１［２０００］；Ｋ．Ｓｐｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−２９［２００１］｝。端的には、典型的な方法は、パラフィン包埋された腫瘍組織サンプルの約１０μｍ厚の切片を切り出すことから始まる。そして、ＲＮＡを抽出して、蛋白質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析した後に、必要があれば、ＲＮＡの修復および／または増幅の工程を行うこともでき、遺伝子特異的プローブを用いてＲＮＡを逆転写した後、ＲＴ−ＰＣＲを行う。
【００６９】
（ｂ．マスアレイ装置）
Ｓｅｑｕｅｎｏｍ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって開発されたマスアレイによる遺伝子発現プロファイリング法において、ＲＮＡを単離し逆転写した後、得られたｃＤＮＡを、一塩基を除くすべての位置で標的となるｃＤＮＡ領域に一致する合成ＤＮＡ分子（競合分子）で固定して、内部標準として使用する。このｃＤＮＡ／競合分子の混合液をＰＣＲで増幅してから、エビ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素によるＰＣＲ後処理を行ない、その結果、残ったヌクレオチドを脱リン酸化する。アルカリホスファターゼを不活性化させた後、競合分子およびｃＤＮＡのＰＣＲ産物にプライマー伸長処理を行って、競合分子およびｃＤＮＡに由来するＰＣＲ産物に対し異なった質量シグナルを生じさせる。これらの生成物は、精製された後、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）による解析に必要な成分を予め搭載しているチップアレイに分注される。そして、作成された質量スペクトルのピーク領域の比率を解析することによって反応液中に存在するｃＤＮＡを定量する。更なる詳細については、例えば、Ｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｎｔｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：３０５９−３０６４（２００３）を参照されたい。
【００７０】
（ｃ．その他のＰＣＲ法）
さらなるＰＣＲによる技術には、例えば、ディファレンシャルディスプレイ法（Ｌｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：９６７−９７１（１９９２））；増幅断片長多型法（ｉＡＦＬＰ）（Ｋａｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２：１３０５−１３１２（１９９９））；登録商標ビーズアレイ技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｏｌｉｐｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），Ｊｕｎｅ  ２００２；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７２：５６１８（２０００））；遺伝子発現の迅速アッセイ法において、市販されているＬｕｍｉｎｅｘ１００ＬａｂＭＡＰ装置と複数に色分けされたミクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いた遺伝子発現検出用ビーズアレイ（ＢＡＤＧＥ）（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１：１８８８−１８９８（２００１））；および高カバー率遺伝子発現プロフィール（ＨｉＣＥＰ）解析法（Ｆｕｋｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３１（１６）ｅ９４（２００３））などがある。
【００７１】
（３．マイクロアレイ）
示差的遺伝子発現は、マイクロアレイ技術を用いても同定または確認することができる。すなわち、新鮮な腫瘍組織またはパラフィン包埋された腫瘍組織のいずれにおいても、マイクロアレイ技術を用いて、乳癌関連遺伝子の発現プロフィールを決定することができる。この方法においては、目的とするポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドなど）をマイクロチップ基板上にプレートするか、整列させる。そして、整列させた配列を、目的とする細胞または組織由来の特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。ＲＴ−ＰＣＲのときとちょうど同じように、ｍＲＮＡの由来源は、腫瘍または腫瘍細胞株、および対応する正常組織または細胞株から単離した全ＲＮＡである。このように、さまざまな原発性腫瘍または腫瘍細胞株からＲＮＡを単離することができる。ｍＲＮＡの由来源が原発性腫瘍の場合には、例えばｍＲＮＡが原発性腫瘍に由来するものであれば、凍結されたか、または保管されているパラフィン包埋され固定（ホルマリン固定）された組織サンプルからｍＲＮＡを抽出することができ、日常の医療業務において、ごく普通に調製して保存することができる。
【００７２】
マイクロアレイ技術の具体的な実施態様において、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅された挿入配列を高密度で基板に乗せる。好ましくは、１０，０００ヌクレオチド以上の配列を基板に適用する。マイクロアレイ上の遺伝子は、各１０，０００成分ずつマイクロアレイに固定されるが、高ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションに適している。目的とする組織から抽出されたＲＮＡの逆転写によって蛍光標識を取り込むことにより、蛍光標識されたｃＤＮＡプローブを作成することができる。チップに適用された標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡスポットに特異性をもってハイブリダイズする。非特異的結合プローブを除去するための高厳密性洗浄の後、共焦点レーザー顕微鏡、またはＣＣＤカメラなど、別の検出法によってチップを走査する。各アレイ上成分のハイブリダイゼーションを定量すると、対応するｍＲＮＡの豊富さを見積もることが可能になる。二色蛍光法によって、２種類のＲＮＡ由来源から作成され、別々に標識されたｃＤＮＡプローブを対毎にアレイにハイブリダイズさせる。こうして、これら２種類の由来源からの各特定遺伝子に対応する転写産物の相対的な豊富さが同時に決定される。ハイブリダイゼーションを小規模化させたことによって、多数の遺伝子の発現パターンの簡便で迅速な評価が利用可能になる。このような方法は、細胞当り数コピーしか発現されない希少な転写産物を検出するのに必要とされる感度をもつことが示されており、少なくとも約２倍の発現レベルの違いを再現性をもって検出することが示されている（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（２）：１０６−１４９（１９９６）。マイクロアレイ解析法は、製造業者の指示に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎＣｈｉｐ技術、またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いるなどして、市販されている装置によって実施することができる。
【００７３】
遺伝子発現の大規模解析を行うためのマイクロアレイ法の開発によって、癌分類の分子マーカーおよびさまざまな腫瘍型の転帰予測を体系的に検索することが可能になった。
【００７４】
（４．遺伝子発現連続解析法（ＳＡＧＥ））
遺伝子発現連続解析法（ＳＡＧＥ）は、各転写産物に対するハイブリダイゼーション・プローブを用意する必要なしに、多数の遺伝子転写産物を同時かつ定量的に解析できる方法である。まず、短い配列タグ（約１０〜１４塩基対）を各転写産物内部のユニークな位置から得る場合には、各転写産物を個別に同定するのに十分な情報を含むタグを作成する。そして、多数の転写産物を一緒に連結させて、長い連続した分子を形成させると、配列決定することができ、多数のタグの同一性を同時に明らかにすることができる。転写産物の集団の発現パターンを、各タグの量を決定し、各タグに対応する遺伝子を同定することによって定量的に評価することができる。さらなる詳細については、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４−４８７  （１９９５）；およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８８：２４３−５１（１９９７）を参照されたい。
【００７５】
（５．大規模並列シグネチャー配列決定法（ＭＰＳＳ））
この方法は、Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：６３０−６３４（２０００）に記載されているが、ゲルによらないシグネチャー配列決定法を、個別の直径５μｍのマイクロビーズ上の何百万もの鋳型のインビトロにおけるクローニングと組み合わせる配列決定法である。まず、インビトロ・クローニングによって、ＤＮＡ鋳型のマイクロビーズライブラリーを構築する。その後、フロー・セルにおいて高密度（一般的には３×１０６マイクロビーズ／ｃｍ２よりも大きい）で、鋳型を含むマイクロビーズの平らなアレイを組み立てる。各マイクロビーズ上のクローニングされた鋳型の遊離末端を、ＤＮＡ断片の分離を必要としない蛍光によるシグネチャー配列決定法を用いて同時に解析する。この方法は、１回の操作で、酵母ｃＤＮＡライブラリーから何十万もの遺伝子のシグネチャー配列を同時かつ正確に提供できることが分かっている。
【００７６】
（６．免疫組織化学法）
免疫組織化学法も、本発明に係る予後マーカーの発現レベルを検出するのに適している。すなわち、抗体または抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、もっとも好ましくは、各マーカーに対して特異的なモノクローナル抗体を用いて発現を検出する。これらの抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチン、またはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどのハプテン標識によって抗体そのものを直接標識して検出することができる。あるいは、非標識一次抗体を、抗血清、ポリクローナル抗血清、または一次抗体に特異的なモノクローナル抗体を含む、標識された二次抗体とともに用いる。免疫組織化学法のプロトコールおよびキットは、当技術分野において周知されていて市販されている。
【００７７】
（７．プロテオミクス）
「プロテオミクス」という用語は、一定の時点でサンプル（例、組織、生物、または細胞培養物）の中に存在する蛋白質の全部と定義されている。とりわけ、プロテオミクスは、あるサンプルにおける蛋白質発現の全体的な変化を調べること（「発現プロテオミクス」とも呼ばれる）を含む。プロテオミクスは、一般的に以下の工程を含む：（１）２−Ｄゲル電気泳動（２−Ｄ  ＰＡＧＥ）によるサンプル中の各蛋白質の分離、（２）このゲルから回収された各蛋白質の同定、例えば、ｍｙ質量分析またはＮ−末端配列決定法、および（３）バイオインフォマティクスを用いたデータ解析。プロテオミクス法は、他の遺伝子発現プロファイリング法の有用な補助法であり、本発明に係る予後マーカーの産物を検出するために単独または他の方法と組み合わせて使用することができる。
【００７８】
（８．ｍＲＮＡの単離、精製、および増幅の一般的な説明）
固定されたパラフィン包埋組織をＲＮＡの由来源として使用する遺伝子発現プロファイリングの典型的プロトコールの各工程は、ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長、および増幅を含み、さまざまな発行済みの雑誌記事に記載されている（例えば、Ｔ．Ｅ．Ｇｏｄｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２：８４−９１［２０００］；Ｋ．Ｓｐｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−２９［２００１］）。端的には、典型的な方法は、パラフィン包埋された腫瘍組織サンプルの約１０μｍ厚の切片を切り出すことから始まる。そして、ＲＮＡを抽出して、蛋白質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析した後に、必要があれば、ＲＮＡの修復および／または増幅の工程を行うこともでき、遺伝子特異的プローブを用いてＲＮＡを逆転写した後、ＲＴ−ＰＣＲを行う。最後に、データを解析して、調べた腫瘍サンプルで同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づき、癌再発の予測された可能性に応じて、患者に利用できる最良の治療選択肢を同定する。
【００７９】
（９．乳癌遺伝子セット、アッセイされた遺伝子の結果、および遺伝子発現データの臨床への応用）
本発明の重要な態様は、乳癌組織による一定の遺伝子の測定された発現を用いて、予後情報を提供することである。そのためには、測定されたＲＮＡの量の差異と、用いたＲＮＡの品質のばらつきの両方を補正（正規化）する必要がある。そのため、このアッセイ法は、一般的には、ＧＡＰＤＨおよびＣｙｐ１のような周知のハウスキーピング遺伝子など、一定の正規化遺伝子の発現を測定して取り込む。あるいは、正規化は、測定した遺伝子のすべて、またはそれらの大きなサブセットのシグナルの平均値または中央値（Ｃｔ）に基づくことも可能である。患者の腫瘍ｍＲＮＡの測定・正規化された量を、乳癌組織の参照用セットで見られる量と遺伝子毎に比較する。この参照用セットにおける乳癌組織の数（Ｎ）は十分に大きいので、別の参照用セットが（全体として）、本質的には同一の挙動をとることは確実である。この条件に合えば、具体的なセットにおける各乳癌組織の同一性は、測定される遺伝子の相対量に対して有意な影響を与えないはずである。通常、乳癌組織の参照用セットは、約３０以上、好ましくは約４０以上の異なったＦＰＥ乳癌組織標本からなる。別途記載がない限り、各ｍＲＮＡ／検査される腫瘍／患者毎に正規化された発現レベルは、参照用セットにおいて測定された発現レベルに対するパーセントで表示される。より具体的には、腫瘍の数が十分に多い（例えば４０個の）参照用セットから、各ｍＲＮＡ分子種の正規化されたレベル分布を得ることができる。解析すべき特定の腫瘍サンプルで測定されたレベルは、この範囲内にあるパーセント値になるが、これは、当技術分野において周知されている方法によって決定することができる。以下、別途記載がない限り、遺伝子の発現レベルと言うときには、必ずしも明示されていないが、参照用セットに対して正規化された発現をいうものとする。
【００８０】
（１０．イントロンに基づくＰＣＲ用のプライマーおよびプローブの設計）
本発明の一つの態様によれば、ＰＣＲ用のプライマーおよびプローブは、増幅する遺伝子に存在するイントロン配列に基づいて設計される。したがって、プライマー／プローブ設計における最初の工程は、該遺伝子内のイントロン配列を明らかにすることである。これは、Ｋｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．，Ｇｅｎｍｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２（４）：６５６−６４（２０００）によって開発されたＤＮＡ  ＢＬＡＳＴのような公開されているソフトウエアによって、または、その変法を含むＢＬＡＳＴソフトウエアによって行うことができる。その次の工程は、ＰＣＲ用のプライマーおよびプローブを設計する十分に確立した方法を行う。
【００８１】
非特異的なシグナルを防止するためには、プライマーおよびプローブを設計するときに、イントロンに含まれる反復配列をマスクすることが重要である。これは、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ経由でオンラインにて利用可能なＲｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラムを用いて簡単に行うことができ、このプログラムは、反復因子のライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングして、反復因子をマスクしたクエリ配列を返して来る。次に、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＭＧＢ  ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｓｔｅｖｅ  Ｒｏｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎ  Ｊ．Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ（２０００）ｏｎ  ｔｈｅ  ＷＷＷ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｕｓｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ．Ｋｒａｗｅｔｚ  Ｓ，Ｍｉｓｅｎｅｒ  Ｓ（ｅｄｓ）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｐｐ．３６５−３８６より）など、市販されているか、さもなければ公開されているプライマー／プローブ設計用パッケージを用いて、マスクされたイントロン配列を、プライマーおよびプローブを設計するために使用することができる。
【００８２】
ＰＣＲプライマーの設計において考慮される最も重要な要素は、プライマーの長さ、融解温度（Ｔｍ）、およびＧ／Ｃ含有量、特異性、相補的プライマー配列、および３’−末端の配列などである。一般的に、最適なＰＣＲプライマーは、通常１７〜３０塩基の長さであって、例えば、約５０〜６０％など、約２０〜８０％のＧ＋Ｃ塩基を含む。Ｔｍは、５０から８０℃の間であり、例えば約５０から７０℃が一般的には好適である。
【００８３】
ＰＣＲ用のプライマーおよびプローブの設計に関するさらなる手引きについては、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，  Ｃ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ．」  ｉｎ：  ＰＣＲ  ＰＹｉｔｎｅｒ，  Ａ  ．ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １Ｖｌａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．１３３−１５５；Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲｓ」  ｉｎ：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４，ｐｐ．５−１１；およびＰｌａｓｔｅｒｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ：Ｐｒｉｍｅｒ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｅ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．７０：５２０−５２７（１９９７）などを参照されたい。また、これらの開示内容はその全体が、参照することによって明示的に本明細書に組み込まれる。
【００８４】
本発明のさらなる詳細を、以下の非制限的な実施例において説明する。
【実施例】
【００８５】
（２４２人の悪性乳癌における遺伝子発現の第２相試験）
浸潤性乳腺癌腫のパラフィン包埋固定組織サンプルにおける遺伝子発現を分子的に特徴づけて、そのような分子的特徴と無病生存率の相関関係を明らかにすることを主な目的として、遺伝子発現試験を設計して実施した。
【００８６】
（試験計画）
浸潤性乳癌と診断された２５２人の各患者から採取されたパラフィン包埋されホルマリン固定された原発性乳癌組織に対して分子的アッセイ法を行った。患者はすべてリンパ節転移陰性、ＥＲ陽性で、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）による治療を受けていた。平均年齢は５２歳で、平均の臨床腫瘍サイズは２ｃｍであった。追跡調査の中央値は１０．９年であった。２００３年１月１日現在、４１人の患者が局所的または遠位での病気の再発を起こしているか、死亡している。材料および方法の節に記載したようにして行われた組織病理学的評価が、十分な量の腫瘍組織と均一な病理を示した場合にのみ、患者を試験に組み込んだ。
【００８７】
（材料および方法）
標準的な組織病理学法によって、診断、腫瘍量の半定量的評価、および腫瘍の悪性度を調べるために各代表的腫瘍塊の特徴を調べた。腫瘍の面積が切片の７０％よりも小さい場合には、腫瘍領域を肉眼で見て切除して、６つの（１０ミクロンの）切片から組織を取り出した。それ以外の場合は、全部で３つの切片を（これらも、それぞれ１０ミクロンの厚さに）調製した。切片を２つのＣｏｓｔａｒ印の微量遠心用チューブ（ポリプロピレン製、１．７ｍＬチューブ、透明）に入れた。外科手術の一環として２個以上の腫瘍塊が得られた場合には、その病理を最も顕著に示す塊を解析に用いた。
【００８８】
（遺伝子発現分析）
固定パラフィン包埋組織サンプルからｍＲＮＡを抽出して精製し、上記第６章に記載した遺伝子発現分析を行うために調製した。
【００８９】
定量的な遺伝子発現の分子的アッセイは、登録商標ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００配列検出キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＲＴ−ＰＣＲにより実施した。登録商標ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００は、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよびコンピュータからなる。この装置は、サーモサイクラー上の３８４ウェルのフォーマットの中にあるサンプルを増幅する。増幅過程で、レーザーによって発生させた蛍光シグナルを、３８４ウェルのすべてについて、光ファイバーケーブルを通じてリアルタイムで集め、ＣＣＤで検出する。この装置は、器具を作動させるため、およびデータを解析するためのソフトウエアを含む。
【００９０】
（解析と結果）
１８７個の癌関連遺伝子および５個の参照用遺伝子について腫瘍組織を解析した。十分なＲＴ−ＰＣＲプロフィールが、２５２人の患者のうち２４２人から得られた。各患者あたり平均して７つの参照用遺伝子に基づいて、その患者ごとに限界サイクル（ＣＴ）値を正規化した。登録データおよび選択された患者のチャートを検討することから、すべての患者について臨床転帰データを利用することができた。転帰を以下のように分類した：
発症あり：局所的、部分的、または遠位において乳癌を再発させつつ生存しているか、乳癌が原因で死亡した。
【００９１】
発症なし：局所的、部分的、または遠位における乳癌を再発せずに生存しているか、反対側に乳癌を再発して生存しているか、乳癌ではない二次原発性癌を患いつつ生存しているか、または、乳癌を再発する前に死亡した。
【００９２】
解析は、
Ａ．正規化された遺伝子発現と、０または１という２進法的転帰との関係を判定すること、
Ｂ．乳癌を再発せずに生存している患者、または、乳癌以外の原因で死亡した患者が検閲された場合には、正規化された遺伝子発現と、転帰するまでの時間（上記したように０または１）との関係を解析することによって実施した。この方法を用いて、各遺伝子、また複数の遺伝子セットの予後への影響を評価した。
【００９３】
（２進法的アプローチによる浸潤性乳癌患者の解析）
最初の（２進法的）方法において、２４２人の浸潤性乳癌患者のすべてについて解析を行った。１０年後に再発なしおよび乳癌と無関係な死亡と分類されたか、または、１０年後に再発もしくは乳癌に関係して死亡と分類された患者群に対してｔ検定を行ない、各遺伝子に対する群間の違いについてｐ値を計算した。
【００９４】
表Ｉは、群間の差異に関するｐ値が０．０５未満であった３３の遺伝子を列挙したものである。平均発現値の１列目は、乳癌の転移によって再発したか、または乳癌によって死亡した患者に関する。平均発現値の２列目は、乳癌の転移による再発もなく、乳癌によって死亡したのでもない患者に関する。
【００９５】
【表１】
2007521005.tif 000002
上記表Ｉにおいて、マイナスのｔ値は、より高い発現を示していて、良好な転帰と関係があり、逆に、より高い（プラスの）ｔ値は、不良な転帰と関係した発現が高い事を示している。したがって、例えば、ＣＣＮＢ１遺伝子の発現が上昇すること（ｔ−値＝３．０２；ＣＴ平均生存率＜ＣＴ平均死亡率）は、無病生存の可能性が低くなることを示している。同様に、ＧＳＴＭ１遺伝子の発現が上昇すること（ｔ−値＝−３．５６；ＣＴ平均生存率＞ＣＴ平均死亡率）は、無病生存の可能性が高くなることを示している。
【００９６】
このように、表１に示したデータによれば、乳癌における以下の遺伝子のいずれかの発現は、癌を再発せずに生存する可能性が低いことを示している：Ｃ２０＿ｏｒｆｌ；ＣＣＮＢ１；ＣＤＣ２０；ＣＤＨ１；ＣＴＳＬ２；ＥｐＣＡＭ；ＧＲＢ７；ＨＥＲ２；ＫＮＳＬ２；ＬＭＮＢ１；ＭＣＭ２；ＭＭＰ９；ＭＹＢＬ２；ＮＥＫ２；ＰＣＮＡ；ＰＲＥＰ；ＰＴＴＧ１；ＳＴＭＹ３；ＳＵＲＶ；ＴＳ；ＭＥＬＫ。
【００９７】
表１に示したデータによれば、乳癌における以下の遺伝子のいずれかの発現は、癌を再発せずに生存する良好な予後を示している：ＢＡＧ１；Ｂカテニン；ＣＥＧＰ１；ＣＩＡＰ１；ｃＭＹＣ；ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７；ＥｓｔＲ１；ＧＳＴＭ１；ＧＳＴＭ３；ＩＤ１；ＩＴＧＡ７；およびＰＲ。
【００９８】
（複数の遺伝子の解析および転帰の指標）
複数の遺伝子を用いることで、転帰をよりよく区別できるか否かを判断するために２つの方法を採り上げた。まず、変数増加工程ワイズ法を用いて判別分析を行った。どの単一遺伝子単独で得られたよりも高い判別を示す転帰を分類したモデルを作成した。第２の方法（時間−発症法）によって、各遺伝子について、Ｃｏｘの比例ハザード（Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓ）モデル（例えば、Ｃｏｘ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｏａｋｅｓ，Ｄ．（１９８４），Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｄａｔｅ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）を、再発または死亡までの時間によって従属変数として、また、該遺伝子の発現レベルを独立変数として定義した。Ｃｏｘモデルにおいてｐ−値が０．０５未満である遺伝子を同定した。各遺伝子について、Ｃｏｘモデルは、該遺伝子の発現の単位変化（ｕｎｉｔ  ｃｈａｎｇｅ）について、再発または死亡の相対的リスク（ＲＲ）を提供する。測定された発現の閾値で（ＣＴ目盛りによって）、患者を選択して下位群に分配することができるが、その場合、その遺伝子が不良な予後（ＲＲ＞１．０１）または良好な予後（ＲＲ＜１．０１）のいずれの指標であるかによって、閾値よりも高い発現値をもつ患者はすべてリスクが高くなり、閾値よりも低い発現値をもつ患者はすべてリスクが低くなるか、または、その逆である。したがって、どの閾値によっても、それぞれ高いリスクか低いリスクをもつ患者の下位群を規定できる。結果を表２にまとめてあるが、表は、群間の差異に対するｐ値が０．０５未満であった４２の遺伝子を列挙している。
【００９９】
【表２】
2007521005.tif 000003
表２に示したデータによれば、乳癌における以下の遺伝子のいずれかの発現は、癌を再発せずに生存する可能性が低いことを示している：ＧＲＢ７；ＳＵＲＶ；ＬＭＮＢ１；ＭＹＢＬ２；ＨＥＲ２；ＭＥＬＫ；Ｃ２０＿ｏｒｆｌ；ＰＴＴＧ１；ＢＵＢ１；ＣＤＣ２０；ＣＣＮＢ１；ＳＴＭＹ３；ＫＮＳＬ２；ＣＴＳＬ２；ＭＣＭ２；ＮＥＫ２；Ｋｉ＿６７；ＣＣＮＥ２；ＴＯＰ２Ａ＿４；ＰＣＮＡ；ＰＲＥＰ；ＦＯＸＭ１；ＮＭＥ１；ＳＴＫ１５；ＨＮＲＰＡＢ；ＭＭＰ９；ＴＳ；Ｓｒｃ；ＭＭＰ１２；ＴＦＲＣ。
【０１００】
表２に示したデータによれば、乳癌における以下の遺伝子のいずれかの発現は、癌を再発せずに生存する良好な予後を示している：ＰＲ；ＧＳＴＭＩ；ＤＲ５；ＣＥＧＰ１；ＢＡＧ１；ＥｓｔＲｌ；ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ０７；ＢＩＮ１；ＮＰ００９；ＲＰＬＰＯ；ＧＳＴＭ３；ＩＧＦ１Ｒ。
【０１０１】
２進法的解析法および時間−発症解析法は、いくつか例外はあるが、同じ遺伝子を予後マーカーとして同定した。例えば、表１および２を比較すると、１０個の遺伝子が、両方の表で上位１５の遺伝子に現れている。さらに、両方の解析法で、同じ遺伝子が［ｐ＜０．１０］で同定された場合（２６の遺伝子で同定されている）、それらは常に、生存／再発との相関関係の方向性（プラスのサインかマイナスのサインか）についても一致していた。全体的に、これらの結果は、同定されたマーカーが、重要な予後的価値を有するという結論を強めている。
【０１０２】
（浸潤性乳癌患者２４２人の多変量遺伝子解析法）
２つ以上の遺伝子を含むＣｏｘモデル（多変量モデル）のために、各個別の遺伝子を段階的にモデルの中に組み込ませることを行ったが、ここで、最初に入れた遺伝子は、有意な一変量ｐ−値をもつ遺伝子の中から予め選択されており、各後続工程においてモデルに入れ込むために選ばれた遺伝子は、そのモデルのデータへの適合性をもっとも高める遺伝子である。この解析は、どのような遺伝子総数であっても行うことができる。結果を以下に示す解析法において、段階的入力は、最大１０遺伝子についてまで行った。
【０１０３】
以下の等式を用いて多変量解析を行った；ＲＲ＝ｅｘｐ［ｃｏｅｆ（Ａ遺伝子）×Ｃｔ（Ａ遺伝子）＋ｃｏｅｆ（Ｂ遺伝子）×Ｃｔ（Ｂ遺伝子）＋ｃｏｅｆ（Ｃ遺伝子）×Ｃｔ（Ｃ遺伝子）＋．．．．．．．．．．．．］。
【０１０４】
この等式において、良好な転帰を予測する因子となる遺伝子の係数は正の数であり、不良な転帰を予測する因子となる遺伝子の係数は負の数である。この等式における「Ｃｔ」値はΔＣｔｓであって、すなわち、ある集団に対する正規化されたＣｔ値の平均と、問題となっている患者について測定した正規化Ｃｔとの間の差異を反映している。本解析法で用いられる規則は、集団の平均値よりも低いΔＣｔｓと高いΔＣｔｓが、それぞれ、（ｍＲＮＡの量の多寡を反映して）正のサインと負のサインを示すということであった。この等式を解いて計算された相対的リスク（ＲＲ）は、患者が、癌を再発せずに長期間生存する機会が大きくなるか低くなるかを示す。
【０１０５】
Ｃｏｘの比例ハザードモデルを用いた多変量段階解析法を、浸潤性乳癌の患者２４２人すべてについて得られた遺伝子発現データに対して行った。以下の１０遺伝子セットが、この解析法によって、患者の生存について特に強い予測的価値をもつと同定されている：ＧＲＢ７；ＬＭＮＢ１；ＥＲ；ＳＴＭＹ３；ＫＬＫ１０；ＰＲ；ＫＲＴ５；ＦＧＦＲ１；ＭＣＭ６；ＳＮＲＰＦ。この遺伝子セットにおいて、ＥＲ；ＰＲ；ＫＲＴ５およびＭＣＭ６は良好な予後に寄与するが、ＧＲＢ７；ＬＭＮＢ１；ＳＴＭＹ３；ＫＬＫ１０；ＦＧＦＲ１およびＳＮＲＰＦは不良な予後に寄与する。
【０１０６】
何が具体的な実施態様であるとみなされるかに言及しながら、本発明を説明してきたが、本発明が、そのような実施態様に限定されるものでないことは当然である。逆に、本発明は、添付の請求項の精神と範囲に含まれるさまざまな改変や同等なものを含むものである。例えば、開示は、さまざまな乳癌関連遺伝子および遺伝子セットと、乳癌の個人別の予後に焦点を絞っているが、他の型の癌に関する遺伝子、遺伝子セットおよび方法も、具体的に本明細書の範囲に含まれる。特に、本発明の遺伝子セットまたはそれらの変異体を、卵巣癌の症例において長期間生存または再発の可能性を予測するための予後マーカーとして利用することもできる。
【０１０７】
本開示全体にわたって引用された文献はすべて、参照することにより明らかに本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
【表３−１】
2007521005.tif 000004
【０１０９】
【表３−２】
2007521005.tif 000005
【０１１０】
【表４−１】
2007521005.tif 000006
【０１１１】
【表４−２】
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【０１１２】
【表４−３】
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【０１１３】
【表４−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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