(57)【要約】本発明は、全般的な遺伝子発現プロファイリングのために、フラグメント化ＲＮＡ（例えば、保管された固定化パラフィン包埋組織材料（ＦＰＥＴ  ＲＮＡ）か、または他の臨床的生検組織標本から得られるＲＮＡ）を使用する方法に関する。本発明は、非常に小さな、または極めてフラグメント化されたＲＮＡ試料であっても、全般的な増幅を可能にする、試料の調製方法を提供する。本発明の方法は、ＲＮＡ分析方法（ＲＴ−ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションアレイを含む）の感度を改善する。
2007515964.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現分析のために非常に多数のＲＮＡ種を含むフラグメント化ＲＮＡを調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）フラグメント化されたＲＮＡをポリアデニル化する、工程、および
（ｂ）工程（ａ）において得られた、ポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換する、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記フラグメント化ＲＮＡ中の前記ＲＮＡ種のサイズが、約２０塩基と約２０００塩基との間である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記フラグメント化ＲＮＡ中の前記ＲＮＡ種の平均サイズが、約５０塩基と約３００塩基との間である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、ポリアデニル化が、Ｅ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼを用いて実施される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、工程（ａ）の前に、脱ブロック化因子を用いて、前記フラグメント化ＲＮＡ種の３’末端を脱ブロック化する工程をさらに包含する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、ここで、前記脱ブロック化因子は、ホスファターゼ酵素である、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記ホスファターゼは、仔ウシアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）、細菌のアルカリホスファターゼ、エビのアルカリホスファターゼ、およびそれらの改変体からなる群より選択される、方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、ここで、前記脱ブロック化因子は、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、またはその改変体である、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、ここで、前記ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４  ＰＮＫ）、またはその改変体である、方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の方法であって、ここで、前記脱ブロック化因子が、前記ポリアデニル化工程（ａ）を実施する前に取り除かれる、方法。
【請求項１１】
請求項５に記載の方法であって、ここで、ポリアデニル化工程（ａ）は、前記脱ブロック化因子の事前の除去を伴わずに実施される、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記脱ブロック化因子は、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）である、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）において得られたポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡが、逆転写酵素およびオリゴ−ｄＴプライマーを用いた処理によってｃＤＮＡに変換される、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記逆転写酵素は、トリ骨髄芽細胞症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）、およびＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた組み換えヘテロダイマー逆転写酵素からなる群より選択される、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記オリゴ−ｄＴプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記プロモーターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである、方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）において得られた前記ポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡは、ｃＤＮＡへの変換の前に固定化される、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記固定化は、ビーズ上で実施される、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記固定化されたポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡは、ｃＤＮＡへの変換の前に濃縮される、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記濃縮は、相補的ｒＲＮＡオリゴヌクレオチドを固定化されたビーズへのハイブリダイゼーションによるｒＲＮＡ配列の除去を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記ＲＮＡは、固定化された、パラフィン包埋された組織試料から得られるｍＲＮＡである、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、ここで、前記組織試料は、腫瘍由来である、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記腫瘍は、癌である、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、ここで、前記癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、頚部の癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、および脳腫瘍からなる群より選択される、方法。
【請求項２５】
請求項１５に記載の方法であって、
（ｃ）工程（ｂ）において得られた前記ｃＤＮＡ中に存在する１つ以上のｃＤＮＡ種を、テンプレートとして使用する、ＰＣＲ増幅工程
をさらに包含する、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、ＰＣＲ増幅は、４０サイクルを含み、そして該４０サイクルの最初の５サイクルは、より低いアニーリング／伸長温度で実施される、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、ここで、ＰＣＲ増幅は、４０サイクルを含み、そして該４０サイクルの最初の２サイクルは、より低いアニーリング／伸長温度で実施される、方法。
【請求項２８】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、ＰＣＲ増幅は、４０サイクルを含み、そして該４０サイクルの最初の２サイクル〜５サイクルは、約４０℃〜５８℃の温度で実施される、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記初期のサイクルは、約５０℃の温度で実施される、方法。
【請求項３０】
請求項１５に記載の方法であって、以下の工程：
（ｄ）工程（ｂ）において得られた前記ｃＤＮＡを、二本鎖ＤＮＡに変換する、工程；および
（ｅ）工程（ｄ）において得られた該二本鎖ＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写に供することによって、前記ＲＮＡを増幅し、増幅された相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を得る、工程
をさらに包含する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、工程（ｄ）において、前記ｃＤＮＡは、ＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼＩを用いて二本鎖ＤＮＡへと変換される、方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、工程（ｅ）由来の前記増幅されたｃＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングアッセイにおいて、テンプレートとして直接的に使用される、方法。
【請求項３３】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、工程（ｅ）は、検出可能な標識を用いて前記増幅されたｃＲＮＡを標識化する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記検出可能な標識は、ビオチン標識または蛍光標識である、方法。
【請求項３５】
請求項３０に記載の方法であって、工程（ｅ）において得られた前記増幅されたｃＲＮＡを、マイクロアレイに対するハイブリダイゼーションに供する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）において得られた前記ポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡは、逆転写酵素および延長された逆方向プライマーを用いた処理によってｃＤＮＡに変換され、そして得られた該ｃＤＮＡは、標的アンプリコンに基づいて設計された、延長されていない順方向ＰＣＲプライマーおよび逆方向ＰＣＲプライマーならびにプローブを使用するＰＣＲによって増幅される、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、ここで、前記延長された逆方向プライマーは、前記アンプリコン中へ、前記遺伝子特異的逆ＰＣＲプライマーよりも、さらに１０塩基延長される、方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載の方法であって、ここで、前記延長された逆方向プライマーは、前記アンプリコン中へ、前記遺伝子特異的逆ＰＣＲプライマーよりも、さらに２０塩基延長される、方法。
【請求項３９】
請求項３６に記載の方法であって、ここで、前記延長された逆方向プライマーは、前記アンプリコン中へ、前記遺伝子特異的逆ＰＣＲプライマーよりも、さらに３０塩基延長される、方法。
【請求項４０】
請求項３６に記載の方法であって、ここで、前記延長された逆方向プライマーは、前記アンプリコンの中に、前記順方向ＰＣＲプライマーの１塩基以内まで延長される、方法。
【請求項４１】
増強されたｃＤＮＡ合成のための方法であって、逆転写酵素および延長されたプライマーを用いた処理によってＲＮＡをｃＤＮＡに変換する工程、そして、得られた該ｃＤＮＡを、標的アンプリコンに基づいて設計された、順方向ＰＣＲプライマーおよび逆方向ＰＣＲプライマーならびにプローブを使用するＰＣＲによって増幅する工程を包含する、方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、ここで、前記ＲＮＡは、フラグメント化されたＲＮＡである、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、ここで、前記フラグメント化ＲＮＡの少なくとも一部は、ポリアデニル化されていない、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、ここで、前記延長された逆方向プライマーは、前記アンプリコン中へ、前記逆ＰＣＲプライマー（ＧＳＰ）よりも、さらに１０塩基延長される、方法。
【請求項４５】
請求項４３に記載の方法であって、ここで、前記延長された逆方向プライマーは、前記アンプリコン中へ、前記逆ＰＣＲプライマー（ＧＳＰ）よりも、さらに２０塩基延長される、方法。
【請求項４６】
請求項４３に記載の方法であって、ここで、前記延長された逆方向プライマーは、前記アンプリコン中へ、前記逆ＰＣＲプライマー（ＧＳＰ）よりも、さらに３０塩基延長される、方法。
【請求項４７】
請求項４３に記載の方法であって、ここで、前記延長された逆方向プライマーは、前記順方向ＰＣＲプライマーの１塩基以内まで延長される、方法。
【請求項４８】
遺伝子発現分析のための非常に多数のＲＮＡ種を含むＲＮＡを調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該ＲＮＡをポリアデニル化する工程；および
（ｂ）逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマーまたはオリゴｄＴ−Ｔ７プライマーによって、該ポリアデニル化されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換する、工程
を包含する、方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法であって、ここで、前記ＲＮＡは、ブロック化された３’末端を伴うＲＮＡ種を含む、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、工程（ａ）の前に、前記ブロック化されたＲＮＡ種を脱ブロック化する工程を包含する、方法。
【請求項５１】
請求項４８に記載の方法であって、遺伝子発現分析のために、前記オリゴｄＴでプライミングされたｃＤＮＡを直接的に使用する工程をさらに包含する、方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、ここで、前記遺伝子発現分析は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）によって実施される、方法。
【請求項５３】
請求項４８に記載の方法であって、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮＡｓｅ  Ｈを用いて前記オリゴｄＴ−Ｔ７でプライミングされたｃＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する工程、ならびに、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびｒＮＴＰを用いて該二本鎖ＤＮＡを増幅する工程をさらに包含する、方法。
【請求項５４】
請求項４８に記載の方法であって、前記オリゴｄＴ−Ｔ７でプライミングされたｃＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する工程、ならびに、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびビオチン化されたｒＮＴＰを用いて該二本鎖ＤＮＡを増幅する工程をさらに包含する、方法。
【請求項５５】
遺伝子発現分析のための非常に多数のＲＮＡ種を含むＲＮＡを調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該ＲＮＡをポリアデニル化する工程；ならびに
（ｂ）逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むオリゴｄＴ−Ｔ７プライマーによって、該ポリアデニル化されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換する、工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）において得られた二本鎖ＤＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写に供し、増幅された相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を得る、工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、種々の方法による遺伝子発現プロファイリングのためにＲＮＡを調製する方法に関する。本発明の方法は、１種以上のＲＮＡ種が、その３’末端でフラグメント化および／またはブロック化されているＲＮＡ（例えば、固定化パラフィン包埋組織（ＦＰＥＴ）から得られるＲＮＡ）を含むＲＮＡの全般的な増幅について、特に有用である。この方法はまた、ポリアデニル化を欠いたＲＮＡ種を検出するために有用である。さらに、遺伝子発現プロファイリングにおいて有用であるように増強されたＲＴ−ＰＣＲ法が、提供される。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
遺伝子発現プロファイリングは、生物学的研究および臨床医療の両方において、ますます重要になりつつある。遺伝子発現プロファイリングは、種々の癌の型を分類するため（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８を参照のこと）、ならびに癌（例えば、乳癌（非特許文献９）、および肺癌（非特許文献１０））の臨床的結果を予測するために、使用されている。
【０００３】
試料中のｍＲＮＡ発現の定量のために、当該分野において公知の最も一般的に使用される方法としては、ノーザンブロッティングならびにインサイチュハイブリダイゼーション（非特許文献１１）；ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（非特許文献１２）；マイクロアレイ（非特許文献１３）、および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（非特許文献１４）が挙げられる。代替的に、抗体は、特定の二重鎖を認識し得るものとして利用され得、特定の二重鎖としては、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖が挙げられる。これらについて、その感度、再現性、およびダイナミックレンジのおかげで、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、高生産性で、正確な発現プロファイリングのための最適な方法になっている。
【０００４】
遺伝子発現プロファイリングが潜在的に有用である多くの局面において、ＲＮＡの事前の増幅無しでは、分析のためには不十分である材料がある。ＲＮＡはＰＣＲのテンプレートとして機能し得ないので、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングにおける第１の工程は、このＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡへの逆転写であり、その後、ＰＣＲ反応におけるその指数関数的増幅が続く。ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換は、逆転写（ＲＴ）酵素の存在下において、そのｍＲＮＡのオリゴｄＴプライミングによって代表的に実施される。しかしながら、この工程は、ｍＲＮＡの供給源が、１０年間〜２０年間もの期間をかけて保管され得ており、かつその中でＲＮＡが深刻に分解されている、固定されたパラフィン包埋組織試料である場合、効率的ではない（非特許文献１５）。
【非特許文献１】Ｇｏｌｕｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、第２８６巻：５３１−５３７頁
【非特許文献２】Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊａｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００１年、第９８巻：１３７９０−１３７９５頁
【非特許文献３】Ｃｈｅｎ−Ｈｓｉａｎｇら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００１年、第１７巻（補遺第１号）：Ｓ３１６−Ｓ３２２頁
【非特許文献４】Ｒａｍａｓｗａｍｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００１年、第９８巻：１５１４９−１５１５４頁
【非特許文献５】Ｍａｒｔｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００年、第６０巻：２２３２−２２３８頁
【非特許文献６】Ｗｅｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００１年、第９８巻：１１４６２−１１４６７頁
【非特許文献７】Ｓｏｒｌｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００１年、第９８巻：１０８６９−１０８７４頁
【非特許文献８】Ｙａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００１年、第６１巻：８３７５−８３８０頁
【非特許文献９】Ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、第４１５巻、５３０−５３６頁
【非特許文献１０】Ｂｅｅｒら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２００２年、第８巻、８１６−２４頁
【非特許文献１１】ＰａｒｋｅｒおよびＢａｒｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９年、第１０６巻、２４７−２８３頁
【非特許文献１２】Ｈｏｄ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９２年、第１３巻、８５２−８５４頁
【非特許文献１３】Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６年、第９３巻、第２号：１０６−１４９頁
【非特許文献１４】Ｗｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９２年、第８巻、２６３−２６４頁
【非特許文献１５】Ｌｅｗｉｓら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、２００１年、第１９５巻：６６−７１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＦＰＥＴ試料は、臨床腫瘍学における遺伝子発現プロファイリングのための最も広く入手可能なＲＮＡの供給源であり、そして保管されたＦＰＥＴ試料は、研究腫瘍学における遺伝子発現プロファイリングのための重要なＲＮＡの供給源であるので、このような組織試料を使用した遺伝子発現プロファイリングを可能にする方法、およびその効率を改善する方法に対する重大な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、非常に小さな、または極めてフラグメント化されたＲＮＡ試料であっても、全般的な増幅を可能にする、試料の調製方法を提供する。本発明の方法は、ＲＮＡ分析方法（ＲＴ−ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションアレイを含む）の感度を改善する。さらに、本発明の方法は、保管されたパラフィン包埋組織試料中の全ての発現した遺伝子（フラグメント化ｍＲＮＡ種および／またはブロック化ｍＲＮＡ種を含む）のｍＲＮＡレベルの測定を可能にする。この方法はまた、非ポリアデニル化ｍＲＮＡ（例えば、ヒストン）および非コードＲＮＡ（例えば、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））の測定を可能にする。本発明は、さらに、フラグメント化ＲＮＡ試料の遺伝子発現プロファイリングのために使用されるＲＴ−ＰＣＲの感度を増大する、増強された逆転写工程および改変されたＰＣＲ工程を包含し得る。
【０００７】
１つの局面において、本発明は、遺伝子発現分析のための、非常に多数（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ）のＲＮＡ種（これは、フラグメント化ＲＮＡ種および／またはブロック化ＲＮＡ種を含み得る）を調製するための方法に関し、この方法は、以下の工程：
（ａ）フラグメント化ＲＮＡをポリアデニル化する工程、および
（ｂ）工程（ａ）において得られた、上記ポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換する、工程
を包含する。
【０００８】
代表的に、上記フラグメント化ＲＮＡ内のＲＮＡ種のサイズは、約２０塩基と約２０００塩基との間であり、より頻繁には、約５０塩基と約３００塩基との間である。
【０００９】
ポリアデニル化は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼを用いて実施され得る。
【００１０】
上記フラグメント化ＲＮＡ内の少なくとも一部のＲＮＡ種は、その３’末端でブロック化され得るので、本発明の方法は、脱ブロック化の工程をさらに包含し得る。脱ブロック化は、慣習的な試薬を使用して（例えば、ホスファターゼ酵素（例えば、仔ウシのアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）、細菌のアルカリホスファターゼ、エビのアルカリホスファターゼ、またはそれらの改変体）を用いてか、あるいはポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４  ＰＮＫ）またはその改変体）を用いて）実施され得る。
【００１１】
１つの実施形態において、上記工程（ａ）において得られたポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡは、逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマー（このオリゴｄＴプライマーは、必要に応じてＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）配列を含み得る）を用いた処理によって、ｃＤＮＡに変換される。
【００１２】
別の実施形態において、上記工程（ａ）において得られたポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する前に、ポリアデニル化因子（例えば、ＣＩＰ、またはＰＮＫ）は、除去される。
【００１３】
さらなる実施形態において、上記ポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡは、ポリアデニル化因子（例えば、ＣＩＰ、またはＰＮＫ）の前除去を伴わずに、ｃＤＮＡに変換される。
【００１４】
よりさらなる実施形態において、上記ポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡは、ｃＤＮＡへの変換の前に濃縮（例えば、ｒＲＮＡ配列の除去によって）され、そして引き続き二本鎖ｃＤＮＡに変換される。
【００１５】
さらに別の実施形態において、上記ポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡは、ｃＤＮＡへの変換の前に固定化される。
【００１６】
特定の実施形態において、上記ポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡは、固相ビーズ型式でハイブリダイゼーションされる。所望される場合、上記固定化されたポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡは、ｃＤＮＡへの変換の前に濃縮される。この濃縮は、相補的なｒＲＮＡオリゴヌクレオチドが固定化されたビーズへのハイブリダイゼーションによるｒＲＮＡ配列の除去を包含し得る。
【００１７】
さらに別の実施形態において、上記ＲＮＡは、固定化されたパラフィン包埋組織試料（例えば、腫瘍試料であって、ここで腫瘍は、例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、頚部の癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、または脳腫瘍の様な癌であり得る）から得られたｍＲＮＡである。
【００１８】
本発明の方法は、以下の工程：
（ｃ）上記工程（ｂ）で得られたｃＤＮＡ中に存在する１つ以上のｃＤＮＡ種をテンプレートとして使用するＰＣＲ増幅の工程
を、さらに包含し得る。
【００１９】
特定の実施形態において、ＰＣＲ増幅は、約４０サイクルを含み、その最初の５サイクル、もしくは最初の２サイクル〜５サイクル、または最初の２サイクルは、より低いアニーリング温度／伸長温度（例えば、約４０℃〜５８℃（例えば、約５０℃））で実施される。
【００２０】
別の実施形態において、本発明の方法は、以下の工程：
（ｄ）工程（ｂ）において得られたｃＤＮＡを、二本鎖ＤＮＡに変換する、工程；および
（ｅ）工程（ｄ）において得られた二本鎖ＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写に供することによって、ＲＮＡを増幅し、増幅された相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を得る、工程
を、さらに包含する。
【００２１】
本発明の方法の別の実施形態において、工程（ａ）において得られたポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡは、逆転写酵素および延長された逆方向プライマーを用いた処理によってｃＤＮＡへと変換され、そして得られたｃＤＮＡは、標的アンプリコンに基づいて設計された順方向ＰＣＲプライマーおよび逆方向ＰＣＲプライマー、ならびにプローブを使用したＰＣＲを用いて増幅される。
【００２２】
別の局面において、本発明は、逆転写酵素および延長されたプライマーを用いた処理によって、ＲＮＡをｃＤＮＡへと変換し、そして、標的アンプリコンに基づいて設計された順方向ＰＣＲプライマーおよび逆方向ＰＣＲプライマー、ならびにプローブを使用したＰＣＲによって、得られたｃＤＮＡを増幅する工程を包含する、増強されたｃＤＮＡ合成のための方法に関する。このＲＮＡはフラグメント化されていてもよく、その少なくとも一部は、ポリアデニル化されていなくてもよい。
【００２３】
さらに別の局面において、本発明は、遺伝子発現分析のために、非常に多数のＲＮＡ種を含むＲＮＡを調製するための方法に関し、この方法は、以下の工程：
（ａ）上記ＲＮＡをポリアデニル化する工程；および
（ｂ）逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマーまたはオリゴｄＴ−Ｔ７プライマーによって、上記ポリアデニル化されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換する工程
を包含する。
【００２４】
よりさらなる局面において、本発明は、遺伝子発現分析のために、非常に多数のＲＮＡ種を含むＲＮＡを調製するための方法に関し、この方法は、以下の工程：
（ａ）上記ＲＮＡをポリアデニル化する工程；ならびに
（ｂ）逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むオリゴｄＴ−Ｔ７プライマーによって、上記ポリアデニル化されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換する、工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）において得られた二本鎖ＤＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写に供し、増幅された相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を得る、工程
を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるような意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ  １９９４）は、当業者に、本出願において使用される多くの用語に対する一般的指針を提供する。
【００２６】
用語「ポリアデニル化」または「ポリＡテーリング」とは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端への一連のアデニル酸分子の（ポリ（Ａ））付加をいう。
【００２７】
「ポリアデニル化の効率」とは、ポリＡ付加が起じることの容易性をいい、そして、ＲＮＡの３’末端リボース部分における遊離３’−ヒドロキシル（３’ＯＨ）基の利用能に依存する。
【００２８】
ＲＮＡの「ポリアデニル化のブロック化」または「ブロック化された３’末端」とは、ポリアデニル化反応に関する、ＲＮＡの３’末端リボース部分の利用能をブロック化することをいう。これは、例えば、ＲＮＡの３’末端は、種々のリン酸エステル（代表的には、２’−３’環状リン酸塩、２’−一リン酸および３’−一リン酸）（これは、上記ＲＮＡの３’末端へのポリＡテイルの付加を可能にするために、除去される必要がある）を含むので、起こり得る。
【００２９】
「脱リン酸化」とは、任意の方法によるリン酸エステル（上述）の除去をいい、その方法としては、酵素学的な技術（例えば、仔ウシ腸のホスファターゼ（ＣＩＰ）またはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）の使用）が挙げられるが、これに限定されない。
【００３０】
「閾値サイクル（Ｃｔ）」とは、ＰＣＲ反応における、核酸増幅の相対収率をいう。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲの間、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出する第３のオリゴヌクレオチドプライマー（これは、Ｔａｑポリメラーゼによって伸長され得ない）上のクエンチされたレポーター色素を切断および放出するために利用される。レポーター色素の１つの分子は、各々の新しく合成された核酸分子に対して遊離され、そしてこのクエンチされていないレポーター色素の検出は、増幅の定量的解釈または増幅反応のある点における増幅された生成物の量（ｍｏｕｎｔ  ｏｆ）のための基礎を提供する。蛍光シグナルが、統計学的に有意であると最初に記録された点が、閾値サイクル（Ｃｔ）である。Ｃｔ値がより低くなるほど、ｍＲＮＡはより大量になり、かつ発現プロファイリングアレイにおける核酸（ｃＤＮＡまたはポリＡ  ｍＲＮＡもしくは分解されたｍＲＮＡ）の性能はより良くなる。
【００３１】
用語「マイクロアレイ」とは、基材上のハイブリダイゼーション可能なアレイ要素（例えば、ポリヌクレオチドプローブ）の規則正しい配列をいう。
【００３２】
用語「ポリヌクレオチド」とは、単数形または複数形で使用する場合、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいい、これは、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。したがって、例えば、ポリヌクレオチドとしては、本明細書中で規定される場合、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域を含むＲＮＡ、ＤＮＡならびにＲＮＡを含むハイブリッド分子（これは、一本鎖であっても、より代表的には二本鎖であってもよく、または一本鎖領域または二本鎖領域を含んでもよい）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書中で使用する場合、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む、三重鎖領域をいう。このような領域中の鎖は、同じ分子に由来しても、異なる分子に由来してもよい。この領域は、１つ以上の分子の全てを含み得るが、より代表的には、一部の分子の領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」は、特に、１つ以上の修飾された塩基を含むＤＮＡおよびＲＮＡを含む。したがって、安定性または他の理由のために修飾された骨格を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、この用語が、本明細書中において意図される通りの「ポリヌクレオチド」である。さらに、異常な塩基（例えば、イノシン）、または修飾された塩基（例えば、トリチウム化された塩基）を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中に定義されるように、用語「ポリヌクレオチド」の範囲内に含まれる。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は、未修飾のポリヌクレオチドの、全ての化学的、酵素的、および／または代謝的に改変された形態、ならびにウイルスおよび細胞（単純細胞および複雑細胞を含む）に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を含む。
【００３３】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、相対的に短いポリヌクレオチドをいい、オリゴヌクレオチドとしては、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖リボヌクレオチドまたは二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチド）は、しばしば、化学的な方法によって（例えば、購入可能な自動化オリゴヌクレオチド合成機）合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、種々の他の方法を用いて作製され得、他の方法としては、インビトロ組み換えＤＮＡ媒介技術ならびに細胞および生物体におけるＤＮＡの発現による方法が挙げられる。
【００３４】
用語「差次的に発現される遺伝子」、「差次的遺伝子発現」およびこれらの同義語は、交換可能に使用され、疾患、特に、癌（例えば、乳癌）に罹患する被験体において、正常被験体または対照被験体と比較して、より高いレベルまたはより低いレベルで、発現が達成される遺伝子をいう。この用語はまた、同じ疾患の異なる段階で、より高いレベルまたはより低いレベルで、発現が達成される遺伝子を含む。また、差次的に発現される遺伝子が核酸レベルまたはタンパク質レベルで、活性化されるかまたは阻害されるかのいずれかであり得るか、あるいは、代替的スプライシングに供されて、結果として異なるポリペプチド生成物が生じ得ると理解されている。このような差異は、例えば、ｍＲＮＡレベル、表面上の発現（ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、分泌、またはポリペプチドの他の群分離における変化によって証拠付けられ得る。差次的遺伝子発現は、正常な被験体および疾患（特に、癌）に罹患した被験体の間で、または同じ疾患の種々の段階の間で、２つ以上の遺伝子の間での発現の比較か、または２つ以上の遺伝子の間での発現の比の比較、または同じ遺伝子の別々にプロセスされた２つの生成物の発現の比較さえも包含し得る。差次的発現は、時間における、または、例えば、正常細胞内および疾患細胞内、または、異なる疾患事象もしくは疾患段階の発生を有する細胞内における、遺伝子もしくはその発現生成物における細胞発現パターンにおける、定量的差異、ならびに定性的差異の両方を含む。本発明の目的のために、「差次的遺伝子発現」は、正常な被験体および罹患した被験体における所与の遺伝子の発現の間で、または罹患した被験体における疾患発生の種々の段階において、少なくとも約２倍の差異、好ましくは、少なくとも約４倍の差異、より好ましくは、少なくとも約６倍の差異、最も好ましくは、少なくとも約１０倍の差異が存在する場合に存在するとみなされる。
【００３５】
語句「遺伝子増幅」とは、特定の細胞または細胞株において、複数コピーの遺伝子または遺伝子フラグメントが形成されるプロセスをいう。複製された領域（１本の増幅されたＤＮＡ）は、しばしば、「アンプリコン」といわれる。通常、生成された伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量（すなわち、遺伝子発現のレベル）はまた、発現される特定の遺伝子から作製されたコピーの数に比例して増加する。
【００３６】
用語「スプライシング」および「ＲＮＡスプライシング」は、交換可能に使用され、かつイントロンを除去し、そしてエキソンを結合して真核細胞の細胞質内に移動する連続したコード配列を有する成熟したｍＲＮＡを生成するＲＮＡプロセッシングをいう。
【００３７】
理論上は、用語「エキソン」とは、成熟したＲＮＡ生成物中に示される断続した遺伝子の任意のセグメントをいう（Ｂ．Ｌｅｗｉｎ．Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．１９９０）。理論上は、用語「イントロン」とは、転写されるが、その両端（ｅｉｔｈｅｒ  ｓｉｄｅ）上のエキソンを一緒にスプライシングすることによって転写物中から除去されるＤＮＡの任意のセグメントをいう。操作的上、エキソン配列は、参照配列ＩＤ番号によって定義される遺伝子のｍＲＮＡ配列中に存在する。操作的に、イントロン配列は、遺伝子のゲノムＤＮＡ内の介在性の配列であり、エキソン配列によってかこまれ（ｂｒａｃｋｅｔ）、そして、その５’境界および３’境界で、ＧＴおよびＡＧスプライシングコンセンサス配列を有する。
【００３８】
用語「腫瘍」とは、本明細書中で使用される場合、悪性であろうと陽性であろうと、全ての新生細胞の成長および増殖、ならびに、全ての前癌性および癌性の細胞および組織をいう。
【００３９】
用語「癌」および「癌性」とは、哺乳動物において、調節されていない細胞の成長によって代表的に特徴付けされる生理的状態をいうか、またはその生理的状態を説明する。癌の例としては、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、頚部の癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、および脳腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
癌の「病理」は、患者の健康を危うくする全ての現象を含む。この病理としては、異常または制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常な機能への干渉、サイトカインまたは他の分泌性生成物の異常なレベルでの放出、炎症性応答または免疫応答の抑制または悪化などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
（Ｂ．詳細な説明）
本発明の実施は、他に指示のない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、および生化学の慣習的な技術を利用し、これらの技術は当該分野の範囲内である。このような技術は、文献（例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第４版（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋ  ｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、１９８７）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；および「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４））において十分に説明される。特定のプロトコールは、以下の実施例の「材料および方法」のセクションにおいて、説明される。
【００４２】
以前に考察したように、遺伝子発現プロファイリングは、生物学的研究および臨床医療の重要な手段となっている。
【００４３】
（リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））
遺伝子発現プロファイリング技術のうちの、最も感受性があり、かつ最も柔軟性のある定量法は、ＲＴ−ＰＣＲであり、これは、正常組織および腫瘍組織において、薬物処理有りまたは無しで、種々の試料集団中のｍＲＮＡレベルを比較して、遺伝子発現のパターンを特徴付け、密接に関連したｍＲＮＡ間の区別をし、そしてＲＮＡ構造を分析するために使用され得る。
【００４４】
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの第１の工程は、ＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡへの逆転写工程であり、この後、ＰＣＲ反応における、その指数関数的な増幅が続く。最も一般に使用される２つの逆転写酵素は、トリ骨髄芽細胞症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写工程は、代表的には、環境および発現プロファイリングの目標に依存して、遺伝子特異的プライマー、ランダムヘキサマー、オリゴｄＴプライマーを使用して開始される（ｐｒｉｍｅ）。例えば、抽出されたＲＮＡは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、製造元の指示書に従って逆転写され得る。次いで、生成されたｃＤＮＡは、引き続いてのＰＣＲ反応において、テンプレートとして使用され得る。
【００４５】
ＰＣＲ工程は、種々の熱安定性ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを使用し得るが、代表的には、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（これは、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠く）を利用する。したがって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、代表的には、その標的アンプリコンに結合するハイブリダイゼーションプローブを加水分解するためにＴａｑポリメラーゼまたはＴｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用するが、等価な５’ヌクレアーゼ活性を有するあらゆる酵素が使用され得る。２つのオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲ反応に代表的なアンプリコンを生成するために使用される。第３のオリゴヌクレオチド、またはプローブは、上記２つのＰＣＲプライマーの間に位置するオリゴヌクレオチド配列を検出するために設計される。このプローブは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できず、そしてレポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素を用いて標識される。レポーター色素からの任意のレーザー誘導放射は、上記２つの色素が上記プローブ上にあって、共に近接した場合、クエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）色素によってクエンチされる。増幅反応の間、上記Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、テンプレートに依存した様式で、上記プローブを切断する。結果生じた溶液中のプローブフラグメント解離物、および放出されたレポーター色素からのシグナルは、第２のフルオロフォアのクエンチング効果からは無関係である。レポーター色素の１つの分子は、合成された各新しい分子に対して遊離され、そしてクエンチされていないレポーター色素の検出は、データの定量的解釈のための基礎を提供する。
【００４６】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ）のような、市販されている機器を使用して実施され得る。好ましい実施形態において、５’ヌクレアーゼ手順は、リアルタイム定量的ＰＣＲデバイス（例えば、上記ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ）で実行される。上記システムは、熱サイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピューターで構成される。このシステムは、熱サイクラー上の９６ウェルフォーマット中で、試料を増幅する。増幅の間、レーザー誘導蛍光シグナルは、全９６ウェルに関して光ファイバーケーブルを介してリアルタイムで収集され、そして上記ＣＣＤにおいて検出される。このシステムは、機器を作動させ、そしてデータを分析するためのソフトウェアを備える。
【００４７】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔ、すなわち閾値サイクルとして表される。上記で考察したように、蛍光値は、毎サイクルの間記録され、そして増幅反応におけるその時点まで増幅された生成物の量を表す。蛍光シグナルが統計学的に有意であるとして最初に記録された時点が、閾値サイクル（Ｃｔ）である。
【００４８】
エラーおよび試料−対−試料の変動の影響を最小化するために、ＲＴ−ＰＣＲは、一般に、内部標準を使用して実施される。理想的な内部標準は、種々の組織間で一定のレベルで発現し、かつ実験処理によって影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸塩−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンに関するｍＲＮＡである。
【００４９】
ＲＴ−ＰＣＴ技術のより最近のバリエーションは、リアルタイム定量ＰＣＲであり、これは、二重標識された蛍光原性プローブ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を介して、ＰＣＲ生成物蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは、各々の標的配列についての内部競合物が正規化のために使用される定量競合ＰＣＲ、および試料内に含まれる正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子内を用いた定量競合ＰＣＲの両方に適合できる。さらなる詳細は、例えば、Ｈｅｌｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４（１９９６）を参照のこと。
【００５０】
（マイクロアレイ分析）
遺伝子発現プロファイリングのための、多くの場合最適な別の方法は、マイクロアレイ技術である。この方法において、目的のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）は、マイクロチップ基材上にまかれる（ｐｌａｔｅ）か、またはアレイ状にされる。次いで、このアレイ状にされた配列は、目的の細胞または組織由来の特異的ＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションされる。上記ＲＴ−ＰＣＲ法とちょうど同じように、ｍＲＮＡの代表的な供給源は、ヒトの腫瘍または腫瘍細胞株、および対応する正常な組織および細胞株から単離された全ＲＮＡである。したがって、ＲＮＡは、種々の原発性腫瘍または腫瘍細胞株から単離され得る。ｍＲＮＡの供給源が原発性腫瘍である場合、ｍＲＮＡは、例えば、凍結された組織試料、または保管されたパラフィン包埋組織試料および固定された（例えば、ホルマリン固定された）組織試料（これらは、毎日の臨床医療において日常的に調製および保存される）から抽出され得る。
【００５１】
上記マイクロアレイ技術の特定の実施形態において、ＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡクローンのインサートは、高密度アレイにおける基材に適用される。好ましくは、少なくとも１０，０００ヌクレオチド配列が基材に適用される。このマイクロアレイ化された遺伝子（マイクロチップ上に、各々、１０，０００要素で固定化された）は、ストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションに適している。蛍光で標識されたｃＤＮＡプローブは、蛍光ヌクレオチドの取り込みを介して、目的の組織から抽出されたＲＮＡの逆転写によって生成され得る。標識されたＤＮＡプローブは、上記アレイ上のＤＮＡの各スポットに対するチップハイブリダイゼーション（ｃｈｉｐ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）に特異性を持って適用される。非特異的結合プローブの除去のためのストリンジェントな洗浄の後、そのチップは、共焦点レーザー顕微鏡によってか、または別の検出方法（例えば、ＣＣＤカメラ）によって走査される。各アレイ要素のハイブリダイゼーションの定量化は、対応するｍＲＮＡ存在量の評価を可能にする。ＲＮＡの２つの供給源から生成された、２色の蛍光を用いて別々に標識されたｃＤＮＡプローブは、対になって上記アレイにハイブリダイゼーションされる。したがって、各々の特定化された遺伝子に対応する２つの供給源由来の転写物の相対存在量は、同時に決定される。小規模のハイブリダイゼーションは、多くの遺伝子に関する発現パターンの簡便かつ迅速な評価を提供する。このような方法は、稀な転写物（１細胞あたり数コピーで発現される）を検出するために要求される感度を有し、かつ発現レベルにおいて少なくとも約２倍の差異を再現性を持って検出することが示されている（Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ  ９３（２）：１０６−１４９（１９９６））。マイクロアレイ分析は、市販の機器によって、製造元の指示書に従って（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎＣｈｉｐ技術、またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いて）、実施され得る。
【００５２】
大規模の遺伝子発現分析のためのマイクロアレイ法の開発は、種々の腫瘍型における癌の分類および結果予測の分子マーカーを系統的に検索することを可能にする。
【００５３】
（遺伝子発現プロファイリングのためのＲＮＡの抽出および増幅）
ＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイ技術による遺伝子発現プロファイリングにおける通常の工程は、生物学的試料からのｍＲＮＡの抽出である。
【００５４】
ｍＲＮＡ抽出に関する一般的な方法は、当該分野で周知であり、そしてそれは分子生物学の標準的な教科書（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９９７）が挙げられる）に開示される。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出に関する方法は、例えば、ＲｕｐｐおよびＬｏｃｋｅｒ、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．５６：Ａ６７（１９８７）、およびＤｅ  Ａｎｄｒｅｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４（１９９５）において開示される。特に、ＲＮＡの単離は、購入可能な製品（例えば、Ｑｉａｇｅｎ）からの精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを使用して、製造業者の指示書に従って実施され得る。例えば、培養物中の細胞からの総ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを使用して単離され得る。他の市販のＲＮＡ単離キットとしては、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＭ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。組織試料からの総ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離され得る。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離され得る。
【００５５】
必要に応じて、ＤＮＡは、ＲＮＡの単離の種々の段階で、ＤＮａｓｅまたは当該分野で周知の他の技術によって除去され得る。精製後、このＲＮＡ濃度を分析した後に、ＲＮＡを任意の公知の発現遺伝子プロファイリング方法に供する前に、ＲＮＡ修復および／またはＲＮＡ増幅の工程が必要となり得る。任意の公知の発現遺伝子プロファイリング方法としては、レポータープローブの５’エキソヌクレアーゼと組み合わせたＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）型アッセイ）、フラップエンドヌクレアーゼアッセイ（ＣｌｅａｖａｓｅおよびＩｎｖａｄｅｒ型アッセイ）、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアレイ、ｃＤＮＡハイブリダイゼーションアレイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、３’単一ヌクレオチド伸長アッセイ、および生物学的試料中の特異的ｍＲＮＡ配列の存在量を評価するために計画された他のアッセイが挙げられる。
【００５６】
市販の製品のアベイラビリティー、および組織からのＲＮＡの単離に関する利用可能な広範な知識にもかかわらず、固定化されたパラフィン包埋組織標本（ＦＰＥＴ）からの核酸（ＲＮＡ）の単離、および遺伝子発現プロファイリングへのその使用は、容易ではない。
【００５７】
ｍＲＮＡは、周知のように、その自然の状態では、抽出および維持するのは困難であり、結果的に、ｍＲＮＡは、種々の生物学的供給源から回収され、そして特に、保存された、固定化パラフィン包埋組織（ＦＰＥＴ）由来のｍＲＮＡは、しばしばフラグメント化および／または分解されている。図２は、１年間〜１７年間保管された、ホルマリン固定されたパラフィン包埋（ＰＦＥ）乳癌試料から単離されたＲＮＡの例を示す。保管貯蔵期間に伴いＲＮＡ分解は進行し、そしてその結果、１７年間の貯蔵の後、ＲＮＡは約１００塩基の平均サイズを有する。比較すると、インタクトなｍＲＮＡは、約１８００塩基〜２０００塩基の平均サイズを有する。
【００５８】
上述のように、ｍＲＮＡの抽出には、代表的には、プライマー依存型酵素である逆転写酵素（ＲＴ）を用いたｃＤＮＡへの変換が後に続く。インタクトなｍＲＮＡのｃＤＮＡへの全般的変換は、ＲＴの存在下において、このｍＲＮＡのオリゴｄＴプライミングによって効率的に実施される。
【００５９】
ＰＣＲ反応の間のオリゴｄＴを用いた効率的なプライミングは、ｍＲＮＡの３’末端でのポリＡトラクトの存在によって可能にされる。図３は、インタクトなｍＲＮＡが、ＲＴおよびオリゴｄＴプライミングにより生成されたｃＤＮＡを使用するＴａｑＭａｎ分析によって、効率的にプロファイリングされ得ることを示す。また図に示されるように、オリゴｄＴプライミングされたｃＤＮＡ合成による、固定化されたパラフィン包埋（ＦＰＥＴ）ＲＮＡまたはランダムに分解されたＲＮＡ（アルカリ加水分解によって得た）のプロファイリングは、インタクトなＲＮＡと比較して、より低いＴａｑＭａｎシグナル（より高いＣｔ）が得られることによって判断されるように、非常に非能率的である。プロファイリングされたこの遺伝子について、インタクトなＲＮＡからのシグナルは、ＦＰＥＴ  ＲＮＡからの対応するシグナルと比較して、平均５００倍〜１０００倍大きい。
【００６０】
本発明者らは、オリゴｄＴプライミングによるＦＰＥＴ  ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの非能率的な変換が、分解されたｍＲＮＡの大部分がポリＡテールを含まないことに起因するであろうと考えた。重要なことに、図３はまた、分解されたＲＮＡは、遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を使用して効率的にプロファイリングされ得ることを示す。これは、発現した遺伝子の大部分の領域が、インタクトなｍＲＮＡに予想される比率で、ランダムにフラグメント化されたＲＮＡ中に存在することを示す。この結果は、フラグメント化された（例えば、ＦＰＥＴの）ｍＲＮＡ抽出物に対する有効な全般的遺伝子発現プロファイリングを実施することが可能であることを示唆する。
【００６１】
この目標のために、第１にＲＮＡをポリアデニル化し、次いでオリゴｄＴプライミングされたＲＴを実施することによる、ＦＰＥＴ  ＲＮＡの全般的逆転写が試みられた。図４に示されるように、オリゴｄＴプライミングに先立つＦＰＥＴ  ＲＮＡのポリアデニル化は、３  ｍＲＮＡのＴａｑＭａｎ分析による判断で、約２倍〜４倍、ＲＮＡのｃＤＮＡへの変換を増加させた。この結果は、ポリアデニル化は、フラグメント化された（例えば、ＦＰＥＴ）ＲＮＡを、全般的逆転写および続く遺伝子発現プロファイリングのために調製するための有用な方法であり得ることを示唆していると解釈される。しかしながら、このシグナル増幅はまだ、ｍＲＮＡの選択された領域をＲＴによってｃＤＮＡへ変換したものでプライミングする最も効率的な現在使用される方法である、遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を用いたプライミングによって得られたもののほんの小さな一部分である。
【００６２】
本発明の根底にある１つの認識は、フラグメント化されたＲＮＡのｃＤＮＡへの制限された変換が、ＲＮＡフラグメントの大部分の３’末端は、ブロック化され、その結果ポリアデニル化にアクセス不可能であるという、フラグメント化されたＲＮＡにおける事実に起因する。
【００６３】
モデル系は、ＲＮＡの３’末端がブロック化されていない場合、フラグメント化された（例えば、ＦＰＥＴ）ＲＮＡのポリアデニル化のレベルをモニタリングし、そして遺伝子発現プロファイリングに対するその効果を決定するために発達した。３つの遺伝子のＲＮＡフラグメント（約１００塩基）は、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって生成され、次いでプールされ、そしてポリアデニル化される。ポリアデニル化は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上でのキャピラリー電気泳動によってモニタリングされる。図５の挿入図は、０．１単位および０．２単位のＥ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼ（ＥＰＡＰ）を用いたＲＮＡのテーリングが、ＲＮＡに２０と２００との間のアデニル酸を付加することを実証する。このポリアデニル化されたＲＮＡは、次いでオリゴｄＴプライミングを使用してｃＤＮＡに逆転写され、そしてＴａｑＭａｎ分析によってアッセイされた（図５）。図に示されるように、ＲＮＡのポリアデニル化（０．２  ＥＰＡＰ／オリゴ−ｄＴ）は、非テーリング化ＲＮＡと比較して、ＴａｑＭａｎシグナルにおいて劇的な増加を生じた。
【００６４】
上記の結果に基づいて、フラグメント化されたＦＰＥＴ  ＲＮＡ中の大部分の３’末端は恐らく、細胞のＲＮＡｓｅ（一般に３’ＰＯ４または環状２’−３’ＰＯ４を生じる）による酵素的加水分解に起因してブロック化されると仮定される。これらの修飾は、ＦＰＥＴ  ＲＮＡのポリアデニル化を効率的にブロック化するであろう。
【００６５】
本発明の方法の種々の形態によれば、フラグメント化されたｍＲＮＡのｃＤＮＡへの効率的な変換は、ＲＮＡの３’末端の非ブロック化を伴って開始する。任意のホスファターゼ（仔ウシのアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）またはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）など）は、２’−３’環状リン酸、２’−一リン酸、および３’−一リン酸代表的に、分解されたＲＮＡの３’末端リボース部分上で生成されるを除去するために使用され得る。これは、上記ＦＰＥＴ  ＲＮＡの３’末端への、ポリＡポリメラーゼによる効率的なポリＡ付加を保証する。ＰＮＫ（３’ホスファターゼでもある）は、デオキシヌクレオシド３’−一リン酸の３’−ホスホリル基，５’二リン酸の３’−ホスホリル基、および３’−ホスホリル−ポリヌクレオチドの３’−ホスホリル基の加水分解を触媒する。細菌のアルカリホスファターゼ、エビのアルカリホスファターゼ、およびそれらの誘導体のような他のホスファターゼもまた、このような脱リン酸反応を行うために使用され得る。３’末端はここで、利用可能な遊離の３’ＯＨを有する。
【００６６】
脱リン酸化のような酵素的反応後のｍＲＮＡまたはＦＰＥＴ  ｍＲＮＡのポリアデニル化または「ポリＡテーリング」は、ＲＮＡの３’ＯＨ末端へのアデニル酸分子またはポリ（Ａ）の付加を包含する。１つの実施形態において、これは、Ｅ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼを使用して行われる。しかしながら、当業者によって理解されるように、他のポリＡポリメラーゼもまた、使用され得る。
【００６７】
（特定の実施形態）
本発明の３つの代表的なプロトコール（Ａ、ＢおよびＣ）が、図１中に例示されている。プロセスＡおよびプロセスＢは、ＦＰＥＴ  ＲＮＡを用いて開始し、以下、１）末端ヌクレオチド上の３’ＯＨの直接的または間接的な非ブロック化、２）上記３’末端のポリＡテーリング、３）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの組込みを伴う、ポリｄＴ−プライミングした二本鎖ｃＤＮＡの合成、および４）インビトロ転写による、ＲＮＡ増幅を包含する。
【００６８】
プロセスＣ（図の中央矢印）は、ＦＰＥＴ  ＲＮＡを用いて開始し、そして、以下、１）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの組込みを伴う、Ｔ７−（Ｎ）１５プライミングされた二本鎖ｃＤＮＡの合成、および２）インビトロ転写による、ＲＮＡ増幅を包含する。
【００６９】
具体的には、プロトコールＡは、ＦＰＥＴ  ｃＤＮＡの末端ヌクレオチド上に遊離の３’ＯＨを有するｃＤＮＡを生成する、ランダムプライミングされた（ヘキサマー）ｃＤＮＡ合成を包含する。次いで、上記ＦＰＥＴ  ｃＤＮＡは、ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）およびｄＡＴＰを用いてテーリングされる。次いで、このポリｄＡ−テーリングされたｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）およびＴ７−（ｄＴ）２４プライマーを用いて、二本鎖ＤＮＡへと変換される。次いで、この材料は、ＦＰＥＴ  ＲＮＡ（＋鎖）を生成するために、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびｒＮＴＰを用いて増幅される。この材料は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）による遺伝子発現分析に適切である。（＋）鎖プローブを含むマイクロアレイのための適切な標的とするために、上記ＦＰＥＴ  ＲＮＡは、ビオチン化ｄＮＴＰ、ランダムプライマーおよびＲＴの存在下において（−）鎖ｃＤＮＡへと変換される必要性がある。ここで、この材料は、全般的遺伝子発現プロファイリングを実施するために、マイクロアレイに対してハイブリダイゼーションさせるために適切である。二本鎖プローブを含むマイクロアレイに関しては、この最終工程は必要ではない。この場合、上記ＩＶＴ工程は、プロトコールＢ（下記）のように、ビオチン−ｒＮＴＰを含むべきである。
【００７０】
プロトコールＢは、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）または［ｐＨ２処理（０．０１Ｍ  ＨＣｌまたはマレイン酸）］、続いて仔ウシ腸のアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）を用いた、ＦＰＥＴ  ＲＮＡの３’末端ヌクレオチドの３’ＯＨの２’ＯＨおよび／または脱ブロック化を包含する。これは、Ｅ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼおよびＡＴＰを用いて、ＲＮＡをその３’末端ヌクレオチドで効率的にポリアデニル化することを可能にする。ポリアデニル化に続き、このＲＮＡは、オリゴｄＴプライマーまたはオリゴｄＴ−Ｔ７プライマーのいずれかを使用した逆転写酵素によってｃＤＮＡへと変換される。オリゴｄＴプライミングされたｃＤＮＡは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析による遺伝子発現分析のために直接的に使用され得る。ＦＰＥＴ  ＲＮＡの量が制限されていない場合、この方法は好ましい。ＦＰＥＴ  ＲＮＡの量が制限されている場合、好ましい方法は、オリゴｄＴ−Ｔ７プライミングされたｃＤＮＡを使用し、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮＡｓｅＨを用いてそれを二本鎖ＤＮＡに変換し、そして引き続いてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびｒＮＴＰを用いてそれを増幅する方法である。試料がマイクロアレイ分析のために使用されるべきであるオリゴｄＴ−Ｔ７プライミングされたｃＤＮＡは上記のように二本鎖ＤＮＡに変換され、そして引き続いてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびビオチン化ｒＮＴＰを用いて増幅される。繰り返すと、このプロトコールは、ＦＰＥＴ  ＲＮＡ（すなわち、より一般的な意味では、任意の供給源のフラグメント化されたＲＮＡ）を使用して全般的な遺伝子発現プロファイリングを可能にする。
【００７１】
本発明のさらなるプロトコールは、図１１中に示される。このプロトコールにおいて、ＲＴ工程は、他の通常のＲＴ条件下で示されるようなより長い逆方向プライマー（１０塩基、２０塩基および３０塩基）の使用によって増強される。より長いプライマーほどフラグメント化されたＲＮＡのプライミングにおける増加を可能にし、ＰＣＲ工程のためのより多くのｃＤＮＡ標的を生じた。さらに、より長いプライマーほど、ホルマリン変性された塩基（この塩基は、他の方法では酵素活性をブロック化する）の架橋によって逆転写を援助し得える。さらなる改変としては、ＰＣＲの最初の２サイクルの５０℃での実行が挙げられる。これは、より低いアニーリング温度に起因して、より多くの標的ｃＤＮＡの増幅を可能にする。上記工程の両方は、結果としてより強固な遺伝子発現シグナルを生じる。
【００７２】
さらなる実施形態は、上述のようなフラグメント化されたＲＮＡの全般的な増幅のプロトコール（ＦＲＡ）に優る、いくつかのさらなる改善を提供する。これらの改善された手順は、自動化可能（ａｕｔｏｍａｔａｂｌｅ）な固相ビーズ型式において、全般的な逆転写およびより少ない量（５０ｎｇ）の高度にフラグメント化されたＦＰＥＴ  ＲＮＡ試料増幅でさえ可能にする。この改善はまた、上述のＦＲＡを包含する酵素工程の間の精製（ｃｌｅａｎｕｐ）の回数を減少させ、より高スループットの手順のプロセスを作製する。さらに、上記改善は、ビーズ上の完全にフラグメント化されたＲＮＡトランスクリプトームの保管を可能にする。フラグメント化されていても、その保管されたＲＮＡは、容易に再増幅され、これによって生検腫瘍組織または切除された腫瘍組織および保存されたパラフィン包埋組織試料中の全発現遺伝子のｍＲＮＡレベルの再現性ある測定を可能にする。最終的に、上記手順はまた、遺伝子発現分析の増幅感を可能にする、ｍＲＮＡの富化工程を容易に組み込み得る。
【００７３】
迅速な全般的ＦＰＥＴ  ＲＮＡ増幅手順は、発現プロファイリングされ得る遺伝子の数を、そして代表的には、限られた量の有益な臨床的試料を用いて実施され得る研究の数を非常に増加させる。
【００７４】
改善されたビーズベースプロトコールを作成するために組み込まれた基本的なプロトコールに対する特定の改善および変更は、以下の通りである：
（ａ）ＰＮＫを用いたＦＰＥＴ  ＲＮＡの３’末端の脱ブロック化工程とＥＰＡＰを用いたＲＮＡのポリアデニル化工程との間の精製工程の除去；
（ｂ）工程（ａ）において得られたポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡの、固相ビーズ形式へのハイブリダイゼーション；（この工程は、工程（ｃ）に先立つ、ハイブリダイゼーションを介したｒＲＮＡ配列の除去によるｍＲＮＡを富化する任意の工程を容易に可能にする。）
（ｃ）工程（ｂ）におけるビーズに固定化されたＲＮＡのｃＤＮＡ変換および続く二本鎖ＤＮＡへの変換；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた上記二本鎖ＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写へ供することによる、上記ＲＮＡの増幅。工程（ｃ）および工程（ｄ）のビーズ上での実施はまた、酵素的工程の間の精製時間を減少させる；
（ｅ）２００ｎｇから５０ｎｇへの開始ＦＰＥＴ  ＲＮＡ試料サイズの減少；
（ｆ）ビーズ−固定化二本鎖ＤＮＡのようなＦＰＥＴ  ＲＮＡライブラリーを保管する能力、およびさらなるＲＮＡを生成するために材料を再増幅する能力。
【００７５】
上記改善は、図１３中に例示される。このプロセスは、一般に、５０ｎｇ〜２００ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡで開始され、そして以下、１）ＰＮＫを用いた、末端ヌクレオチド上の３’ＯＨの非ブロック化、２）ＰＮＫ工程からの精製を伴わない、上記ＦＰＥＴ  ＲＮＡ  ３’の直接的ＥＰＡＰポリＡテーリング、３）ビーズに固定化されたオリゴｄＴ−Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列への、ポリアデニル化されたＦＰＥＴ  ＲＮＡのハイブリダイゼーション、続いて４）ＲＴを用いたｃＤＮＡ合成、５）ＲＮＡｓｅ  Ｈによる部分的ＲＮＡ分解の工程、およびＤＮＡポリメラーゼＩを用いた第２鎖ＤＮＡ合成、ならびに６）インビトロ転写によるＲＮＡ増幅を包含する。ＩＶＴの第２ラウンドについての任意の手順は、工程７（破線矢印）中に示される。工程２’中に示される、別の任意の工程としては、リボソームｒＲＮＡフラグメントの除去を含む（点線矢印）。
【００７６】
核酸ハイブリダイゼーションのために使用されるビーズは、例えば、Ｄｙｎａｌ  ２．８−μｍ磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｍ−２８０）またはＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅＴＭ  ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）のような、市販のマイクロビーズであり得る。ストレプトアビジンビーズは、５’ビオチン化核酸または３’ビオチン化核酸と容易に結合し得る。ビーズベースの固定化オリゴｄＴは、ｍＲＮＡを精製する際（Ｈｏｒｎｅｓ，Ｅ．およびＫｏｒｓｎｅｓ，Ｌ．（１９９０）、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．７：１４５；Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｋ．、Ｂｒｅｉｖｏｌｄ，Ｅ．およびＨｏｒｎｅｓ，Ｅ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３６６９）、およびその後のＲＮＡ増幅の際（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ，Ｊ．（１９９５）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０：５８４）に非常に有用である。
【００７７】
本発明のさらなる詳細としては、フラグメント化されたＲＮＡの３’末端の脱リン酸、ポリアデニル化、延長されたプライマーを使用した引き続く逆転写、および増強されたＰＣＲが挙げられ、これらは以下の非限定的な実施例によって例示される。
【実施例】
【００７８】
（参考実施例１）
後述の実施例１において、以下の方法を使用した。
【００７９】
（ＦＰＥＴ  ＲＮＡ抽出手順）
ＲＮＡを、（各々の患者について）３μｍ〜１０μｍの切片から抽出した。キシレン抽出に続いてエタノール洗浄によってパラフィンを除去した。ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＭ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して切片化組織ブロック化からＲＮＡを単離し、そしてＤＮａｓｅＩ工程に含めた。供給業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）によって記載されるＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮＴＭ  ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ  ３０カラムを介した濾過によって、ＦＰＥＴ  ＲＮＡをさらに精製した。簡単に言えば、５０ｎｇ／μｌ〜３００ｎｇ／μｌ  ＦＰＥＴ  ＲＮＡのうちの３０μｌをカラム（５４１７Ｃ  ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機中で２５００ｒｐｍ（６６４×ｇ）で５分間の予備回転）中に充填し、カラムを介して回転（予備回転と同じ条件）して、そして−８０℃で保存した。図２は、ホルマリン固定化パラフィン包埋（ＦＰＥ）乳癌試料（これは、１年間〜１７年間保管された）から単離したＲＮＡの例を示す。
【００８０】
（ポジティブコントロールの相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）合成）
遺伝子ＨＥＲ２、ＧＡＰＤＨ、およびＣＹＰについてのアンプリコンに対して相補的な小さいＲＮＡフラグメントを、以下の２工程で生成した：
１）これらの遺伝子についてのアンプリコンに対して相補的であり、かつその５’末端上にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ部位を含む一本鎖ＤＮＡフラグメントを合成し（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）、そしてＰＣＲによって増幅した。
２）そのＰＣＲ生成物を、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮＴＭ  ＴＥ−３０カラムを使用して精製し、そしてＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってｃＲＮＡを生成し、そしてＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮＴＭ  ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ  ３０カラムを使用して精製した。
【００８１】
（ＦＰＥＴ  ＲＮＡ  ３’末端の脱リン酸）
ＦＰＥＴ  ＲＮＡの３’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）か、または０．０１Ｍ  ＨＣｌのいずれか、および仔ウシのアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理し、２’−３’環状リン酸、２’−一リン酸、および３’−一リン酸を除去した。これらの種々のリン酸エステルは、代表的には、分解されたＲＮＡの３’末端リボース部分上に見出され、そして上記ＦＰＥＴ  ＲＮＡの３’末端への効率的なポリＡ付加を保証するためには除去される必要がある。
【００８２】
（ＰＮＫ処理）
２０μｌ反応容積において、１００ｎｇ〜５０００ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡを１×ＰＮＫ緩衝液（７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭジチオスレイトール）中の２０単位のＰＮＫ（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）および４０単位のＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とともに、３７℃で１時間インキュベーションする。この反応を、２０μｌのＲＮＡｓｅを含まないＨ２Ｏの添加によって停止し、そして４０μｌのフェノール：ＣＨＣｌ３：ＩＡＡ（２５：２４：１）ｐＨ６．６（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）で抽出する。１４，０００×ｇで１分間〜２分間遠心分離した後、その水相を除去し、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮＴＭ  ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ  ３０カラムに通し、そしてＳａｖａｎｔスピード減圧器を使用して容積を１２．５μＬまで減少させる。
【００８３】
（ＣＩＰ処理）
２０μｌの反応容積において、１００ｎｇ〜５０００ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡを１０ｍＭ  ＨＣｌ中で、２５℃で２時間インキュベーションする。次いで、このＦＰＥＴ  ＲＮＡを、上記のようにＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮＴＭ  ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ  ３０カラムに通し、１×ＮＥ緩衝液３（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．９、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール）中の１０単位のＣＩＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、および４０単位のＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とともに３０分間３７℃で、インキュベーションする。この反応を、２０μｌのＲＮＡｓｅを含まないＨ２Ｏの添加によって停止し、そして４０μｌのフェノール：ＣＨＣｌ３：ＩＡＡ（２５：２４：１）ｐＨ６．６（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）で抽出する。１４，０００×ｇで１分間〜２分間遠心分離した後、その水相を除去し、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮＴＭ  ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ  ３０カラムに通し、そしてＳａｖａｎｔスピード減圧器を使用して容積を１２．５μＬまで減少させる。
【００８４】
（ＦＰＥＴ  ＲＮＡのポリアデニル化）
１００ｎｇ〜５０００ｎｇの脱リン酸ＦＰＥＴ  ＲＮＡを、１×ＥＰＡＰ緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）中の１．０単位のＥ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼ（ＥＰＡＰ）、１ｍＭ  ＡＴＰ、および４０単位のＲＮＡｓｅＯＵＴＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とともに、１５分間３７℃でインキュベーションした（２０μＬの反応容積）。この反応を、２０μｌのＲＮＡｓｅを含まないＨ２Ｏの添加によって停止し、そして４０μｌのフェノール：ＣＨＣｌ３：ＩＡＡ（２５：２４：１）ｐＨ６．６（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）で抽出した。１４，０００×ｇで１分間〜２分間遠心分離した後、その水相を除去し、そしてＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮＴＭ  ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ  ３０カラムに通した。
【００８５】
（ＦＰＥＴ  ＲＮＡ分析）
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ蛍光法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、ＲＮＡを定量した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）を使用したマイクロキャピラリー電気泳動によって、ＲＮＡサイズを分析した。
【００８６】
（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブ）
各遺伝子について、本発明者らは、その遺伝子に関する適切なｍＲＮＡ参照配列（ＲＥＦＳＥＱ）登録番号を同定し、そしてＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅデータベースを介して、その配列にアクセスした。プライマーおよびプローブを、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）およびＰｒｉｍｅｒ  ３プログラム［ＷＷＷ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｕｓｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ、Ｓｔｅｖｅ  ＲｏｚｅｎおよびＨｅｌｅｎ  Ｊ．Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ  （２０００）、Ｐｒｉｍｅｒ３：Ｋｒａｗｅｔｚ  Ｓ、Ｍｉｓｅｎｅｒ  Ｓ（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、３６５−３８６頁］を使用して設計した。オリゴヌクレオチドは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）およびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から供給された。アンプリコンサイズを、８５塩基に制限した。蛍光発生的プローブは、５’−ＦＡＭおよび３’−ＢＨＱ１を用いて二重標識した。
【００８７】
（逆転写）
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、逆転写を行った。総ＦＰＥＴ  ＲＮＡ（３ｎｇ／μＬ〜５０ｎｇ／μＬ）、およびプールされた遺伝子の特異的プライマー（各々１００ｎＭ）か、またはオリゴ（ｄＴ）プライマー（２５ｎｇ／μｌ）またはオリゴ（ｄＴ）−Ｔ７プライマー（０．２５μＭ〜５．０μＭ）のいずれかを用いて、この反応を行った。延長されたプライマーの逆転写に関して、この反応物を、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｆｏｒ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、記載されているように行った。総ＦＰＥＴ  ＲＮＡ（３ｎｇ／μＬ〜５０ｎｇ／μＬ）およびプールされた伸長遺伝子特異的プライマーを、それぞれ、３〜５０ｎｇ／μＬおよび１００ｎＭ（各プライマー）の濃度で使用した。
【００８８】
（第２鎖ＤＮＡ合成）
１００ｎｇ〜５０００ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡに由来する第１鎖ｃＤＮＡ合成生成物を、１×第２鎖緩衝液［２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．９；４．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２；９０ｍＭ  ＫＣｌ；０．１５ｍＭ  β−ＮＡＤ＋；１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４］、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１０単位ＤＮＡリガーゼ、４０単位ＤＮＡポリメラーゼＩ、および２単位ＲＮａｓｅＨ（全試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で、１６℃で２時間インキュベーションした（１５０μＬの反応容積）。次いで、９単位Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ）を添加した；反応混合物を、さらに１５分間インキュベーションした。５Ｍ酢酸アンモニウムおよび１００％エタノールで、５μｇのグリコーゲンをキャリアとして用いて、ＤＮＡを沈殿させた。
【００８９】
（インビトロ転写（ＩＶＴ））
沈殿させたｄｓ−ＤＮＡ（上記より）を、８μＬのヌクレアーゼを含まないＨ２Ｏ中に再懸濁し、そしてＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴＭ  Ｔ７  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）を使用してＩＶＴ反応（総量２０μＬ）を実施し、そして４時間３７℃で進行させた。引き続いて、ヌクレアーゼを含まないＨ２Ｏで反応容積を４０μＬまで増加させ、そしてｃＲＮＡを３Ｍ酢酸ナトリウムおよび１００％エタノールを用いて沈殿させた。沈殿したｃＲＮＡを、２０μＬ〜４０μＬのヌクレアーゼを含まないＨ２Ｏ中に再懸濁した。
【００９０】
（ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現プロファイリング）
ＡＢＩ７９００（登録商標）の実行に関して、ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応を、二つ組で、１×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘおよび１ｎｇの総ＲＮＡの相当物から作製したｃＤＮＡから構成される反応物５μｌ中で実施した。プライマーおよびプローブの最終濃度は、それぞれ、０．９μＭ（各プライマー）および０．２μＭであった。ＰＣＲサイクリングを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００上で、以下のように実施した：９５℃１０分間×１サイクル、（９５℃２０秒間、６０℃４５秒間）×４０サイクル。７７００の実行に関して、ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応を、三つ組で、１×ＰＣＲ緩衝液Ａ、４μＭ  ＭｇＣｌ２、０．２μＭ  ｄＮＴＰ、０．０２５Ｕ／μｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、および２．５ｎｇの総ＲＮＡの相当物から作製したｃＤＮＡから構成される反応物２５μｌ中で実施した。プライマーおよびプローブの最終濃度は、上記の通りである。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００上で、ＰＣＲサイクリングを上記の通り実施した。改変ＰＣＲプライミング実験に関して、ＰＣＲサイクリングを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００上で以下のように実施した：９５℃１０分間×１サイクル、（９５℃２０秒間、５０℃２分間）×２サイクル、（９５℃２０秒間、６０℃４５秒間）×３８サイクル。
【００９１】
（実施例１）
（標準プロトコール）
ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）または仔ウシ腸のアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）（それぞれ、２’−３’環状ホスファターゼ活性および３’ホスファターゼ活性を有する酵素）を用いて、ＲＮＡを処理した。この処理したＦＰＥＴ  ＲＮＡのキャピラリー電気泳動の［Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００］分析は、ＰＮＫまたはＣＩＰを用いたＦＰＥＴ  ＲＮＡの処理が、酵素処理されたＲＮＡの移動度において、処理されていないＲＮＡの移動度と比較して、わずかな減少によって判断されるように、ブロック化リン酸を除去することを示唆した（図６Ａ）。荷電したリン酸基の除去は、上記ＦＰＥＴ  ＲＮＡの電荷／質量の比を減少させたので、電気泳動移動度の減少が予想された。
【００９２】
上記ＦＰＥＴ  ＲＮＡの３’末端からのブロック化リン酸が効率的に除去されている場合、上記ＲＮＡのポリアデニル化は実行可能なはずである。ＰＮＫを用いたＦＰＥＴ  ＲＮＡの処理、その後のＥＰＡＰ処理（＋ＰＮＫ／＋ＥＰＡＰ）の結果、上記ＦＰＥＴ  ＲＮＡの電気泳動の移動度において有意な減少を生じた（図６Ｂ）。この移動度の変化はポリアデニル化に起因しており、そして単純に脱リン酸化のみに起因しているのではないことを確認するため、ＰＮＫ単独処理（＋ＰＮＫ／−ＥＰＡＰ）コントロール、および処理無し（−ＰＮＫ／−ＥＰＡＰ）コントロールを含めた。移動度における有意な減少のみを、ＰＮＫ処理およびＥＰＡＰ処理の両方で認めた。したがって、非ブロック化工程、脱リン酸工程（ＰＮＫ処理またはＣＩＰ処理）に続くＥＰＡＰによるポリアデニル化工程の組み合わせは、上記ＦＰＥＴ  ＲＮＡを、効率的にポリアデニル化形態に変換する可能性が大いにある。このポリアデニル化されたＲＮＡは、オリゴｄＴプライマーおよびＲＴを使用した全般的ｃＤＮＡ合成のために適切なはずである。
【００９３】
全般的なｃＤＮＡ合成に対するポリアデニル化の有効性を試験するために、ＦＰＥＴ  ＲＮＡを、ＰＮＫまたはＣＩＰを用いて、または用いずに処理した後、ＥＰＡＰによってポリアデニル化し、そしてＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡ存在量を測定した。ＰＮＫ処理（図７）またはＣＩＰ処理（図８）に続き、ポリアデニル化およびオリゴｄＴプライミングされたＲＴ−ＰＣＲの結果、非ＰＮＫ処理試料または非ＣＩＰ処理試料と比較して、ｃＤＮＡ収量が有意に増加した（それぞれ、４倍〜３２倍または８倍〜１６倍）。これは、３’末端の非ブロック化が、ポリアデニル化およびオリゴｄＴプライミングされたｃＤＮＡの合成の効率を劇的に上昇させることを示す。予想したように、ポリアデニル化は、ＧＳＰプライミングされたｃＤＮＡの合成に対しては、ほとんど効果を有さなかった。重要なことに、ＧＳＰポジティブコントロールは、この全般的プライミング方法が、現在最も効率的なプライミング方法（ＧＳＰプライミング）の２５％〜５０％の効率でｃＤＮＡを増幅することを示す。
【００９４】
さらなる実験において、オリゴｄＴプライマーか、またはＧＳＰプライマーのいずれかを使用して、それぞれ、（ＰＮＫ処理およびＥＰＡＰ処理された）ポリアデニル化ＦＰＥＴ  ＲＮＡおよび非ポリアデニル化ＦＰＥＴ  ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。この実験において、９６種がプールされたＧＳＰプライマーを使用し、そしてＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲ（１ウェルあたり１ｎｇ  ＦＰＥＴ  ＲＮＡの使用、３８４ウェル；ＡＢＩＰｒｉｓｍ（登録商標）７９００機器）によって９６種の遺伝子発現を分析した。図９に示されたデータは、ＧＳＰ−プライミングされた（ｐＡ＿ＧＳＰ１）ｃＤＮＡに対するＣｔ値における類似性によって判断されるように、ポリアデニル化ＦＰＥＴ  ＲＮＡを、効率的にｃＤＮＡ（ｐＡ−ｄＴ）へと変換したことを実証した。多くの遺伝子に関して、オリゴｄＴプライミングを用いたポリアデニル化ＦＰＥＴ  ＲＮＡは、ＧＳＰプライミングを用いたものと比較して、より良いシグナルを生じた。表１は、図９に由来するデータの統計学的概要を示す。左側のパネルは、オリゴｄＴを用いたＲＴの前にＦＰＥＴ  ＲＮＡのポリアデニル化することの結果として、７７％の遺伝子を検出し（Ｃｔ＜３８）、それに対して、非ポリアデニル化ＲＮＡでは、１６％の検出可能な遺伝子のみが得られたこと示す。さらに、ＧＳＰによって生成されたｃＤＮＡの遺伝子発現プロファイリングとポリアデニル化されたＲＮＡのオリゴｄＴプライミングによって生成されたｃＤＮＡの遺伝子発現プロファイリングとの間には、有意な相関がある（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｒ＝０．７７）。ＧＳＰによって生成されたｃＤＮＡの遺伝子発現プロファイリングとポリアデニル化されず、オリゴｄＴプライミングＲＴによって生成されたｃＤＮＡの遺伝子発現プロファイリングとの間には、相関は無かった（Ｒ＝０．１１）。
【００９５】
この方法に対する別の有用な改善は、上記オリゴｄＴプライマー上への、ＦＰＥＴ  ＲＮＡがポリアデニル化に続いて全般的に増幅され得るようなＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ部位の封入であった。図１０（Ａ〜Ｃ）は、３つの異なるＲＮＡ供給源に由来する４６遺伝子の発現に対する、ポリアデニル化およびインビトロ転写（ＩＶＴ）［Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ増幅（Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ８７（５）：１６６３−７（１９９０）］の効果を実証する。図１０Ａは、高品質のインタクトなＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からの発現プロファイリングを示す。ＧＳＰプライミングされたＲＴによって生成されたｃＤＮＡ（ＧＳＰ；非増幅コントロール）とオリゴｄＴ−Ｔ７プライミングされたＲＴによって生成されたｃＤＮＡ（これは、引き続いてＩＶＴにより増幅した（Ｎｏ  ＥＰＡＰ  ＩＶＴ））とを比較した場合、ＩＶＴは、４６遺伝子全て（挿入図を参照のこと）の平均ＴａｑＭａｎシグナルを、約６倍増加させる。ｃＤＮＡ合成およびＩＶＴに先立つＲＮＡのポリアデニル化は、ＴａｑＭａｎシグナル全体（ＥＰＡＰ  ＩＶＴ−１およびＥＰＡＰ  ＩＶＴ−２）に対して、さらなる効果を有さない。図１０Ｂおよび図１０Ｃは、それぞれ、中程度に分解されたＦＰＥＴ  ＲＮＡ（ＢｉｏＰａｔｈ  Ｐｌａｃｅｎｔａ）の遺伝子発現プロファイリング、および深刻に分解されたＦＰＥＴ  ＲＮＡ（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ  １６８）の遺伝子発現プロファイリングを示す。これらの場合において、ポリアデニル化は、上記ＲＮＡのＩＶＴ増幅のために必要な工程であった。示されるように、二つ組の実験からの平均ＴａｑＭａｎシグナル（ＥＰＡＰ  ＩＶＴ  ａｖｇ）は、非ポリアデニル化ＲＮＡからのＩＶＴにより生成されたシグナル（Ｎｏ  ＥＰＡＰ  ＩＶＴ）よりも、約２．５Ｃｔ（６倍）低かった。重要なことに、この遺伝子プロファイリングは、ピヤリン相関係数（Ｒ＝０．９１〜０．９６）によって示されるように、ＩＶＴの後、維持される。要約すれば、分解されたＦＰＥＴ  ＲＮＡのポリアデニル化は、試料中に存在する各遺伝子に対応するｃＤＮＡの全般的合成のための有用な方法である。このｃＤＮＡは、ＩＶＴによる、遺伝子シグナルの正確かつ再現可能な、さらなる増幅のために使用され得る。
【００９６】
遺伝子発現シグナルの増強のための別の改善は、図１２中に示される。この例において、プライマーを長くするにつれて、６遺伝子の検出を増強した。標準的な逆方向プライマー（ＧＳＰ）の長さを超える、プライマーの長さの２０塩基〜３０塩基への延長は、遺伝子発現シグナルを１０倍〜１５倍増強する。さらに、続くＰＣＲの最初の２サイクルを６０℃ではなくむしろ５０℃で実施した場合、その遺伝子発現プロファイリングは、数倍さらに増強する。
【００９７】
（参考実施例２）
他に示さない限り、以下の実施例２〜実施例５において、次の材料および方法を使用した。
【００９８】
（材料）
ＭｙＯｎｅストレプトアビジン被覆ミクロスフェア：Ｄｙｎａｌ、１０ｍｇ／ｍＬを２ｍＬ。
ビオチン−Ｅｂｅｒｗｉｎｅプライマー：ＩＤＴ、１００ｐｍｏｌ／μＬストック（１００μＭ）。５’−ビオチン−ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’（配列番号１）。
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、１０Ｕ／μＬを２，５００単位（１０×反応緩衝液とともに販売される。）
ＲＮａｓｅインヒビター：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、２０Ｕ／μＬ。
ヌクレアーゼを含まないＨ２Ｏ：Ａｍｂｉｏｎ。
Ｐｏｌｙ（Ａ）  Ｔａｉｌｉｎｇ  Ｋｉｔ：Ａｍｂｉｏｎ。キット中で使用される品目−Ｅ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼ（ＥＰＡＰ）酵素（２Ｕ／μＬ）、５×反応緩衝液、１０ｍＭ  ＡＴＰ。
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ。キット中で使用される品目−１０×ＲＴ緩衝液、０．１Ｍ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液（注意：ｄＮＴＰ混合液はまた、第２鎖合成においても使用される）、２Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅＨ（第２鎖合成において使用される）。
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ酵素：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２００Ｕ／μＬ。５×ＲＴ緩衝液（これは、プレＲＴ洗浄工程のための１×ＲＴ緩衝液を作製するために使用される）とともに販売される。
０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２：Ａｍｂｉｏｎ。１Ｍストックとして販売され、そして引き続いて１：１０に希釈される。
５×Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ。ＤＮＡリガーゼ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０Ｕ／μＬ。
ＤＮＡポリメラーゼＩ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０Ｕ／μＬ。
Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、５Ｕ／μＬ。
グリコーゲン：Ａｍｂｉｏｎ、５ｍｇ／ｍＬ。
５Ｍ酢酸アンモニウム：Ａｍｂｉｏｎ。
１００％エタノール：ＳｉｇｍａＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔ−Ｔ７  ＩＶＴ  Ｋｉｔ：Ａｍｂｉｏｎ。キット中で使用される品目−１０×ＩＶＴ緩衝液、７５ｍＭ  ＮＴＰ、酵素混合液。
３Ｍ酢酸ナトリウム：Ａｍｂｉｏｎ。
【００９９】
（方法）
（ＰＮＫ処理およびＥＰＡＰ処理）
（２００ｎｇ〜３００ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡに対して）：１×ＰＮＫ緩衝液（７０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭジチオスレイトール）、１Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）および１Ｕ／μＬのＰＮＫ（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中で、３７℃で３０分間、２０μｌ反応容積中で、ＦＰＥＴ  ＲＮＡをインキュベーションした。ＰＮＫ処理に続き、最終濃度；１×ＥＰＡＰ緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、１ｍＭ  ＡＴＰ、１．５Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅインヒビターおよび０．０２５Ｕ／μｌ  ＥＰＡＰ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）まで反応混合物に添加することによって、上記ＦＰＥＴ  ＲＮＡを直接的にポリアデニル化した。この混合物を、４０μｌの反応容積中で、３７℃で１５分間、次いで７０℃で５分間インキュベーションした。
【０１００】
（５０ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡに対して）：ＰＮＫ処理およびＥＰＡＰ処理を、反応容積を除いて（反応容積は、それぞれ、５μｌおよび１０μｌまでスケールダウンした（１／４容積））、上記と同じようにした。
【０１０１】
（Ｔ７−オリゴｄＴプライマー−磁性ビーズ複合体を用いたポリアデニル化されたＦＰＥＴ  ＲＮＡの逆転写）
（Ｔ７−オリゴｄＴプライマー−磁性ビーズ複合体の調製）
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅＴＭストレプトアビジン（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）ストックビーズ容器を、４℃貯蔵庫から取り出し、そして完全にビーズが再懸濁されるまで強くボルテックスした。０．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブ中に４０μＬ（４００μｇ）のビーズを取り出し；卓上遠心分離機においてビーズを回転させ（＜５秒間）、チューブの底にある液体物を回収した。ビーズの性能を低下させる、ビーズのペレットおよび凝集体の原因となるので、常磁性ビーズが含まれる、チューブを過剰に遠心分離することを避ける。このチューブヒンジを磁石と向かい合わせ、チューブをＭＰＣ−Ｓ磁性ラック（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）中に置き、そして、ビーズがチューブの側面に対して集合させた（約２分間）。ラックから取り外さずにチューブを開け；そしてピペットで上清を除いた。チューブをラックから取り外し、１００μＬの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液（５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ  ７．３）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ）中で再懸濁することによってビーズを洗浄した。液体を回収するためにチューブを簡単に回転させ、次いで磁性チューブラックに置いた。ビーズをチューブの側面に集合させて、そして上清を上述のようにして除去した；そして合計で２回、１×Ｂ＆Ｗ緩衝液の洗浄を繰り返した。最終の洗浄上清を除去し、次いでビーズを、２５μＭ  Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  Ｔ７オリゴｄＴプライマー（５’−ビオチン−ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’）（配列番号１）を含む、４０μＬの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液中に再懸濁した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサー（８５０ｒｐｍ）上で、室温で１５分間インキュベーションを実施した。磁石上でビーズを懸濁（約２分間）し；上清を除去し、そしてビーズを１００μＬの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液を用いて２回洗浄した。ビーズを、８０μＬのビーズ保存緩衝液（１×ＰＢＳ、７０％エタノール）中に再懸濁し、そして使用する状態になるまで４℃で保存した。
【０１０２】
（ポリアデニル化ＦＰＥＴ  ＲＮＡへのＴ７−オリゴｄＴビーズのハイブリダイゼーション）
（２００ｎｇ〜３００ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡに対して）：ＰＮＫ／ＥＰＡＰのインキュベーションの間、前もって調製したプライマー−ビーズ溶液を、４℃貯蔵庫から取り出した。ビーズを再懸濁させるためにチューブを軽く叩き、そして液体を回収するために簡単に回転させた。２０μＬ（１００μｇ）のビーズを０．５ｍＬチューブ中にアリコートし、そのチューブを磁石上に約２分間置いた。その上清を除去し；１００μＬの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液を用いて２回ビーズを洗浄した。７０℃でのＥＰＡＰ不活性化工程の間に、その最終の洗浄上清を除去した。この７０℃でのインキュベーションを完了した後、ＥＰＡＰ反応物を含む上記チューブを徹底的に回転させて液体を回収し、次いでこの反応内容物を、プライマー−ビーズ複合体を含むチューブ中に移した。このチューブを軽くはじいてビーズを再懸濁させ、そして簡単に遠心分離し；サーモミキサー（８５０ｒｐｍ）上で、５分間、室温でインキュベーションした。このチューブを磁性ラック上に約２分間置き；その上清を除去した。
【０１０３】
（５０ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡに対して）：５μＬ（２５μｇ）のビーズのアリコートを除き、上記と同様である。
【０１０４】
（第１鎖ｃＤＮＡ合成）
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、逆転写を行った。
【０１０５】
（２００ｎｇ〜３００ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡに対して）：１００μＬの１×ＲＴ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ）を用いて、ビーズを１回洗浄した。１×ＲＴ緩衝液、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅインヒビター、および１０Ｕ／μＬ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴで構成される、２０μＬのＲＴ反応混合液中にビーズを再懸濁し、そしてサーモミキサー（８５０ｒｐｍ）上で５０分間、４２℃でインキュベーションした。
【０１０６】
（５０ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡに対して）：ビーズを５μＬの１×ＲＴ緩衝液中に再懸濁したことを除き、上記と同様である。
【０１０７】
（第２鎖ｃＤＮＡ合成）
（２００ｎｇ〜３００ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡに対して）：第１鎖ｃＤＮＡ反応物をサーモミキサーから取出し、そして続いて１３０μＬの第２鎖反応混合物を添加した：１．１５×第２鎖緩衝液、０．２３ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、０．０７７Ｕ／μＬ  ＤＮＡリガーゼ、０．３１Ｕ／μＬ  ＤＮＡポリメラーゼＩおよび０．０１５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅＨ。チューブを軽く叩いて混合し；簡単に回転させた。サーモミキサー（８５０ｒｐｍ）上で、１６℃で２時間インキュベーションした。
【０１０８】
（５０ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡに対して）：３２．５μＬの上記第２鎖反応混合物を添加する点を除き、上記と同様である。
【０１０９】
（第２鎖ＤＮＡ精製／インビトロ転写）
（２００ｎｇ／３００ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡおよび５０ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡの両方に対して）：第２鎖反応チューブをサーモミキサーから取り出し；簡単に遠心分離し、そして磁性ラック上に約２分間置いた。上清を除去し、そしてビーズを１００μＬの１×ＩＶＴ洗浄緩衝液（４００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．３）、７０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭスペルミジン）を用いて２回洗浄した。
【０１１０】
インビトロ転写のために、ＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔ−Ｔ７  ＩＶＴ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）を使用した。２０μＬのＩＶＴマスターミックス（Ａｍｂｉｏｎによって説明されるようにして調製した）中でビーズを再懸濁し、そしてチューブを軽く叩いて混合した。簡単に遠心分離し、そしてサーモミキサー（１０００ｒｐｍ）上で、４時間３７℃でインキュベーションした。
【０１１１】
（ＩＶＴ精製）
上記チューブをサーモミキサーから取り出し；簡単に遠心分離し、そして磁性ラック上に約２分間置いた。その上清を、１．５ｍＬマイクロ遠心分離チューブに移し、そして以下の試薬を順に添加した：
ヌクレアーゼを含まないＨ２Ｏ：              ２０μＬ
５ｍｇ／ｍＬグリコーゲン（Ａｍｂｉｏｎ）：  １μＬ
３Ｍ酢酸ナトリウム（Ａｍｂｉｏｎ）：        ４μＬ
１００％エタノール（Ｓｉｇｍａ）：          １００μＬ。
【０１１２】
このチューブをボルテックスし、そして−２０℃で１時間〜一晩インキュベーションした。上記チューブを、冷却したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機中で１４，０００ｒｐｍで２０分間（４℃）遠沈し、ｃＲＮＡをペレット化した。この上清を除去し、そして５００μＬの７０％エタノール溶液を添加してペレットを洗浄した。上記チューブを、冷却したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機中で１４，０００ｒｐｍで３分間（４℃）遠心分離した。ピペットを用いて、可能な限りの量のアルコールを上記チューブから除去し、次いでそのチューブをヒュームフード中に（蓋を開けて）放置して、残ったアルコールを蒸発させた（５分間〜１０分間）。ｃＲＮＡペレットを、４０μＬのヌクレアーゼを含まないＨ２Ｏ中に再懸濁した。
【０１１３】
（ＦＰＥＴ  ＲＮＡ分析）
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ蛍光法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用し、ＲＮＡを定量した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）を使用したマイクロキャピラリー電気泳動によって、ＲＮＡサイズを分析した。
【０１１４】
（ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現プロファイリング）
１×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘおよび１ｎｇのｃＲＮＡからなる、一連の５μｌの反応物中において、ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応を実施した。プライマーおよびプローブの最終濃度を、それぞれ、０．９μＭ（各プライマー）および０．２μＭにした。ＰＣＲサイクリングを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００上で、以下のようにして行った：９５℃１０分間×１サイクル、（９５℃２０秒間、６０℃４５秒間）×４０サイクル。
【０１１５】
（実施例２）
（ＦＰＥＴ  ＲＮＡ  ３’末端の脱リン酸化とポリアデニル化との間の精製工程の除去）
ＦＰＥＴ  ＲＮＡの３’末端を、２’−３’環状リン酸、２’−一リン酸、および３’−一リン酸を除去するために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を用いて処理する。これらの種々のリン酸エステルは、代表的には、分解されたＲＮＡの３’末端リボース部分上に見られ、そして、上記ＦＰＥＴ  ＲＮＡの３’末端への効率的なポリＡ付加を確実にするためには、除去される必要がある。
【０１１６】
前述のように、ＰＮＫを用いた標準的脱リン酸工程を２０μｌのＲＮＡｓｅを含まないＨ２Ｏの添加によって停止し、そして４０μｌのフェノール：ＣＨＣｌ３：ＩＡＡ（２５：２４：１）ｐＨ６．６（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて抽出する。１分間〜２分間の１４，０００×ｇでの遠心分離の後、その水相を除去し、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮＴＭ  ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ  ３０カラムに通し、そしてＳａｖａｎｔスピード減圧器を使用して１２．５μＬまで容積を減らす。ここで、このＲＮＡは、ＥＰＡＰを用いた２０μｌ容積における、標準的ポリアデニル化反応のための準備ができている。
【０１１７】
この方法を合理化するために、本発明者らは、図２中に示されるような、この手順に対するいくつかの改変を試みた。１０００ｎｇの乳癌ＦＰＥＴ  ＲＮＡ（Ｃｌｉｎｏｍｉｃ）を使用したＰＮＫ反応に続き、ＥＰＡＰを用いたポリアデニル化の前に６つの精製条件を試験した。精製条件１は、基本的には、以前に述べた標準プロトコールと同じであるが、試料容積減少工程（スピード減圧）は省略する。この結果、試料容積がより大きくなり、したがって最終ＥＰＡＰ反応容積における増加（４０μｌ）が必要とされる。この４０μｌ反応容積を、図１４中に示されるような全ての５つの精製条件について一定に保った。５つの改変された精製条件後のポリアデニル化ＲＮＡのマイクロキャピラリー電気泳動分析（図１４、左側パネル）は、開始材料（ＳＭ）に相対して、平均にして、５０〜１４０のアデニル酸（９０ヌクレオチド（ｎｔ）の平均サイズを有する）をＲＮＡに付加することを示した；例えば、条件１については；１５０−９０＝６０アデニル酸である。これらの結果は、全５条件で、受容可能なサイズのポリアデニル化ＦＰＥＴ  ＲＮＡを得たことを示す。興味深いことに、ＥＰＡＰ精製工程の後に回収されたＲＮＡの百分率は、全５つのＰＮＫ精製条件が、標準方法（条件６）と比較して、より良くなったことを示した（図１４、右側下部）。さらに、精製の無い条件（５）では、最も高い収率を得た。この回収率は、投入したＲＮＡに相対的であり、そしていくつかの場合では、回収率は、ポリアデニル化に由来する質量の増加に起因して、１００％よりも大きい。ポリアデニル化ＲＮＡの品質をさらに評価するために、本発明者らの以前の特許出願（３９７４０．０００３ＰＲ）に概説されるように、４つの試料を、標準ＩＶＴプロセスの残りで実施し、そしてＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲによって発現プロファイリングした。図１５は、条件２〜条件５に関して増幅されたＲＮＡの４７遺伝子パネルプロファイリングを示す。非増幅ＲＮＡ（ＳＭ）と標準処理したＲＮＡ（条件６）とに、全プロファイリングで高い一致を示す（Ｒ≧０．９１）。精製無しの条件５は、最も低い平均Ｃｔ（３６．０）および最も高いＩＶＴ収量（９５．８μｇ）を示した。したがって、精製無しの条件５を、ＥＰＡＰ処理のための標準手順として採用した（工程２、図１３）。
【０１１８】
（実施例３）
（Ｔ７プロモーター−オリゴｄＴビーズへのポリアデニル化ＦＰＥＴ  ＲＮＡのハイブリダイゼーション、二本鎖ｃＤＮＡ合成、およびＩＶＴ）
本発明の標準的方法のための別の改善としては、磁性ポリスチレンビーズに結合体化されたＴ７プロモーター−オリゴｄＴプライマーへのポリアデニル化ＦＰＥＴ  ＲＮＡのハイブリダイゼーションが挙げられる。これは、最小の精製工程を伴って、全ての引き続く酵素的工程を固体支持体上で容易に実施することを可能にする。例えば、それは、フェノール−ＣＨＣｌ３抽出、および反応の間のスピンカラムクロマトグラフィーの必要性を排除する。ビーズの使用はまた、それ自身を、スループットを非常に増大させ得る自動化されたプロセスに導く。さらに、保管された、ビーズに結合したｃＤＮＡライブラリーは、さらなるｃＲＮＡを得るために容易に再増幅され得る。図１６は、図１３中で概説される、上記標準溶液（非ビーズベースのＩＶＴ方法（ＩＶＴ無し））によって生成された胎盤のｃＲＮＡについての４７遺伝子発現プロファイリング、固相（ビーズベースのＩＶＴ方法（固相ＩＶＴ））によって生成された胎盤ＲＮＡのｃＲＮＡについての４７遺伝子発現プロファイリングを示す。比較のため、非増幅胎盤ＦＰＥＴ  ＲＮＡもまた示す（ＳＭ）。さらに、両方のＩＶＴプロセスで得たｃＲＮＡは、未処理ＲＮＡと高い一致を示した（Ｒ≧０．９４）しかしながら、慣習的な非ビーズＩＶＴ方法は、ビーズベースのＩＶＴ方法と比較して、１．７４倍、より多くのｃＲＮＡを得、その平均Ｃｔは、０．７４、より高かった。ＲＮＡの量を、開始材料のＲＮＡと同じ平均Ｃｔを得るように調整した場合、その相対収率（Ｃｔ調整）は、ほぼ等しく（２１．６６対２０．７９）なる。したがって、上記ビーズベースのＩＶＴ方法は、上記非ビーズベースほ方法と、増幅および忠実度の面では、ほとんど同じ効率である。両方のＩＶＴ方法は、同じ量のＲＮＡ（１ｎｇ／ウェル）を使用した場合、開始材料と同じレベルのＲＴ−ＰＣＲ感度（平均Ｃｔ／質量ＲＮＡ）を達成できないが、開始材料は依然として、感度の損失に対する調整後、ＲＮＡの１００倍の増幅を達成する。
【０１１９】
（実施例４）
（５０ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡおよび２００ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡを使用した、ＲＮＡ増幅の比較）
病歴を有する保管されたＦＰＥＴ試料は、遡及的な臨床研究のために非常に価値のあるものである。このような場合、研究のための臨床的協力者から、患者あたり１つまたは２つ以上の５ミクロンのＦＰＥＴ切片を得ることは、しばしば、困難である。したがって、１マイクログラム未満のＲＮＡから、好ましくは１００ｎｇ未満のＲＮＡからを発して、ＦＰＥＴ  ＲＮＡのＩＶＴ増幅を至適化する必要がある。図１７は、上記ビーズベースのプロトコールによって増幅された、２００ｎｇ（条件１）および５０ｎｇ（条件２および条件３）のＦＰＥＴ  ＲＮＡに由来する４７遺伝子発現プロファイリングを示す。第１の５０ｎｇのＲＮＡ増幅（条件２）に関して、ＲＮＡ  対  ビーズ質量の比および各工程の反応容積を、標準的２００ｎｇのＲＮＡ増幅と同一であった。第２の５０ｎｇのＲＮＡ増幅（条件３）に関して、ＲＮＡ  対  ビーズ質量の比は同一にしたが、反応容積を比例的に上記容積の１／４にスケールダウンした。両方の５０ｎｇのＲＮＡ増幅は、ほぼ同じ量のｃＲＮＡを生じたが、上記２００ｎｇのＲＮＡ増幅と比較すると、１０分の１未満であった。本発明者らは１／４の量のＦＰＥＴ  ＲＮＡを用いて開始したので、５０ｎｇ反応物からは１／４低い収率を期待する場合、２００ｎｇから５０ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡにスケールダウンした本発明者らの増幅の場合では、依然として本研究者らは、効率について説明できない２．５倍の損失を有する。しかしながら、５０ｎｇの増幅に由来する両方の発現プロファイリングは、さらに、上記２００ｎｇのＲＮＡ増幅と強い相関を示す（Ｒ≧０．９７）。また、５０ｎｇ容積スケールの増幅（条件３）に関する平均Ｃｔは、上記２００ｎｇのＲＮＡ増幅と等価なものであった。したがって、このスケールダウン（１／４容積）のバージョンを、５０ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡ増幅手順に採用した。
【０１２０】
（実施例５）
（５０ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡおよび２００ｎｇのＦＰＥＴ  ＲＮＡを使用した二次増幅の比較）
前述のように、ビーズ上に保管されたｃＤＮＡ  ＦＰＥＴライブラリーを保管することのさらなる利点は、それらが容易に再増幅され得ることである。二次ＩＶＴの例について、上記の実験に由来する結合体化したｃＤＮＡを含む保管されたビーズを、１回洗浄し、ＩＶＴ緩衝液中に再懸濁し、そして本来のＩＶＴプロトコールに従って増幅した。図１７ｂは、この実験の結果を示す。この場合も同様に、両方の５０ｎｇＲＮＡ増幅物は、ほぼ同じ量のｃＲＮＡが得られたが、２００ｎｇのＲＮＡ増幅物の１０分の１未満であった。さらに、３つの二次増幅物全てで、それらの対応する最初の増幅物の、約１／３の量のＲＮＡを生じた。高レベルの忠実度は、３つの二次増幅物の間で維持された（Ｒ≧０．９５）。各々の個別の条件に関する、最初の増幅物および二次増幅物もまた、高レベルの一致を維持した（Ｒ≧０．９７）。条件３（ＦＲＡ−１／４容積：５０ｎｇ／２５μｇ）の最初のＩＶＴおよび二次ＩＶＴに関する発現プロファイリングは、図１７ｃ中に示される。
【０１２１】
本開示全体を通じて引用される全ての参考文献は、参考として本明細書中に明白に援用される。
【０１２２】
当業者は、多くの方法および材料が、本発明の実施において使用され得る本明細書中に記載されるものと類似であるか、または等価であると認識し、実際、本発明は、記載される方法および材料には決して限定されない。本発明の目的のために、次の用語が以下に定義される。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、本発明において、遺伝子発現を測定するために使用される、増幅プロセスの全体的な作業の流れを例示した図表である。この図において、ＦＰＥＴは「固定化パラフィン包埋組織」を意味し、ＰＮＫは「ポリヌクレオチドキナーゼ」を意味し、ＣＩＰは「仔ウシ腸のアルカリホスファターゼ」を意味し、ＥＰＡＰは「Ｅ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼ」を意味し、ＴｄＴは「ターミナルトランスフェラーゼ」を意味し、ＩＶＴは「インビトロ転写」を意味し、「ｒＮＴＰ」は「リボヌクレオシド−５’−三リン酸」を意味し、ｄＮＴＰは「２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸」を意味し、ＡＴＰは「アデノシン−５’−三リン酸」を意味する。Ｔ７−（Ｔ）２４は、逆転写酵素を使用したｃＤＮＡ合成のためのプライマーであり、そしてポリデオキシアデニレートの５’末端に結合したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を意味する。Ｔ７−（Ｎ）１５は、逆転写酵素を使用したｃＤＮＡ合成のためのプライマーであり、そしてランダムデオキシ−ペンタデカマーの５’末端に結合したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を意味する。図１中に、本発明の３つの代表的なプロトコール（Ａ、ＢおよびＣ）がある。プロセスＡおよびプロセスＢは、ＦＰＥＴ  ＲＮＡで始まり、以下、１）末端ヌクレオチド上の３’ＯＨの直接的または間接的な非ブロック化、２）３’末端のポリＡテーリング、３）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの取り込みを伴う、オリゴｄＴプライミングされた二本鎖ｃＤＮＡの合成、および４）インビトロ転写による、ＲＮＡ増幅を包含する。プロセスＣ（図の真ん中）は、ＦＰＥＴ  ＲＮＡで始まり、以下、１）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＴ７−（Ｎ）１５プライマーを使用して、二本鎖ｃＤＮＡを直接的に合成する工程、および２）インビトロ転写による、ＲＮＡ増幅を包含する。
【図２】図２は、１２名の異なる乳がん患者の生検材料から単離されたＦＰＥＴ  ＲＮＡのゲル画像を示す。レーンＭ１およびレーンＭ２は、ＲＮＡマーカーを示し、各バンドのサイズは塩基で示される。レーン１〜レーン４、レーン５〜レーン８、およびレーン９〜レーン１２は、腫瘍生検材料由来であり、それぞれ、１年間、６年間、および１７年間保管されていた。試料を、ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏｃｈｉｐを使用したＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で、キャピラリー電気泳動によって分析した。
【図３】図３は、乳房腫瘍ＦＰＥＴ  ＲＮＡ、ランダムに分解された乳房腫瘍ＲＮＡ、およびインタクトな乳房腫瘍ＲＮＡの、選択された遺伝子の発現分析を示す。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）か、またはオリゴ（ｄＴ）１２〜１８のいずれかを用いて、ｃＤＮＡ合成を開始した（ｐｒｉｍｅ）。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。
【図４】図４は、乳房腫瘍ＦＰＥＴ  ＲＮＡの選択された遺伝子の発現分析を示す。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。ポリアデニル化されていないテンプレートＲＮＡを使用して、ＧＳＰか、またはオリゴ（ｄＴ）１２〜１８のいずれかを用いて、ｃＤＮＡ合成を開始した（ＦＰＥＴ／ＧＳＰおよびＦＰＥＴ／ｄＴ）か、あるいはオリゴ（ｄＴ）１２〜１８を用いて、ポリアデニル化されたテンプレートＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡ合成を開始した（ＦＰＥＴ−ｐＡ／ｄＴ）。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定する。
【図５】図５は、インビトロ転写されたｃＲＮＡの遺伝子発現分析を示す。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。０．２単位のＥＰＡＰを用いてＲＮＡポリアデニル化を実施し、そして図４に示されるようにｃＤＮＡ合成を実施した。テンプレートｃＲＮＡの生成については、材料と方法を参照のこと。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。挿入図：０単位、０．１単位または０．２単位のＥＰＡＰを用いて処理したｃＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００ゲル画像。レーンＭは、ＲＮＡマーカーを示し、各バンドのサイズは塩基で表示される。
【図６】図６Ａは、ＰＮＫ（レーン１）、ＰＮＫ緩衝液対照（レーン２）、ＣＩＰ（レーン３）またはＣＩＰ緩衝液対照（レーン４）で処理されたＦＰＥＴ  ＲＮＡのゲル画像を示す。図６Ｂは、ＰＮＫ緩衝液対照に続きＥＰＡＰ緩衝液対照（レーン１）で処理されたＦＰＥＴ  ＲＮＡ、ＰＮＫに続きＥＰＡＰ緩衝液対照（レーン２）で処理されたＦＰＥＴ  ＲＮＡ、ＰＮＫ緩衝液対照に続きＥＰＡＰで処理されたＦＰＥＴ  ＲＮＡ、またはＰＮＫに続きＥＰＡＰ（レーン４）で処理されたＦＰＥＴ  ＲＮＡのゲル画像を示す。ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏｃｈｉｐを使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００上で、キャピラリー電気泳動によって試料を分析した。レーンＭ１およびレーンＭ２はＲＮＡマーカーを示し、各バンドのサイズは塩基で表示される。
【図７】図７は、乳房腫瘍ＦＰＥＴ  ＲＮＡの選択された遺伝子の発現分析を示す。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。遺伝子発現分析に先立ち、このＲＮＡを、ＰＮＫ（＋ＰＮＫ）または緩衝液対照（−ＰＮＫ）で処理し、続いてＥＰＡＰによってポリアデニル化した。次いで、逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマー（＋ＰＮＫ／オリゴｄＴおよび−ＰＮＫ／オリゴｄＴ）または遺伝子特異的プライマー（＋ＰＮＫ／ＧＳＰおよび−ＰＮＫ／ＧＳＰ）を用いて、このＲＮＡをｃＤＮＡへと変換した。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。挿入図：ＰＮＫまたは緩衝液対照で処理し、続いてＥＰＡＰによって処理した、ＦＰＥＴ  ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００ゲル画像。レーンＭはＲＮＡマーカーを示し、各バンドのサイズは塩基で表示される。
【図８】図８は、乳房腫瘍ＦＰＥＴ  ＲＮＡの選択された遺伝子の発現分析を示す。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。遺伝子発現分析に先立ち、このＲＮＡを、ＣＩＰ（＋ＣＩＰ）または緩衝液対照（−ＣＩＰ）で処理し、続いてＥＰＡＰによってポリアデニル化した。次いで、逆転写酵素、およびオリゴｄＴプライマー（＋ＣＩＰ／オリゴｄＴおよび−ＣＩＰ／オリゴｄＴ）または遺伝子特異的プライマー（＋ＣＩＰ／ＧＳＰおよび−ＣＩＰ／ＧＳＰ）を用いて、このＲＮＡをｃＤＮＡへと変換した。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。挿入図：ＣＩＰまたは緩衝液対照で処理し、続いてＥＰＡＰによって処理した、ＦＰＥＴ  ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００ゲル画像。レーンＭはＲＮＡマーカーを示し、各バンドのサイズは塩基で表示される。
【図９Ａ】図９Ａは、乳房腫瘍ＦＰＥＴ  ＲＮＡの９６遺伝子パネルの発現分析を示す。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。遺伝子発現分析に先立ち、このＲＮＡを、ＰＮＫで処理し、続いてＥＰＡＰによって処理した。次いで、逆転写酵素、およびオリゴｄＴプライマー（ｐＡ＿ｄＴ）または遺伝子特異的プライマー（ｐＡ＿ＧＳＰ１）を用いて、このＲＮＡをｃＤＮＡへと変換した。非ポリアデニル化ＲＮＡもまた、上記のようにｃＤＮＡへと変換した（未処理＿ｄＴおよび未処理＿ＧＳＰ１）。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。結果の統計学的分析を、表１に示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、乳房腫瘍ＦＰＥＴ  ＲＮＡの９６遺伝子パネル発現分析を示す。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。遺伝子発現分析に先立ち、このＲＮＡを、ＰＮＫで処理し、続いてＥＰＡＰによって処理した。次いで、逆転写酵素、およびオリゴｄＴプライマー（ｐＡ＿ｄＴ）または遺伝子特異的プライマー（ｐＡ＿ＧＳＰ１）を用いて、このＲＮＡをｃＤＮＡへと変換した。非ポリアデニル化ＲＮＡもまた、上記のようにｃＤＮＡへと変換した（未処理＿ｄＴおよび未処理＿ＧＳＰ１）。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。結果の統計学的分析を、表１に示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、乳房腫瘍ＦＰＥＴ  ＲＮＡの９６遺伝子パネルの発現分析を示す。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。遺伝子発現分析に先立ち、このＲＮＡを、ＰＮＫで処理し、続いてＥＰＡＰによって処理した。次いで、逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマー（ｐＡ＿ｄＴ）または遺伝子特異的プライマー（ｐＡ＿ＧＳＰ１）を用いて、このＲＮＡをｃＤＮＡへと変換した。非ポリアデニル化ＲＮＡもまた、上記のようにｃＤＮＡへと変換した（未処理＿ｄＴおよび未処理＿ＧＳＰ１）。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。結果の統計学的分析を、表１に示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、乳房腫瘍ＦＰＥＴ  ＲＮＡの９６遺伝子パネル発現分析を示す。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。遺伝子発現分析に先立ち、このＲＮＡを、ＰＮＫで処理し、続いてＥＰＡＰによって処理した。次いで、逆転写酵素、およびオリゴｄＴプライマー（ｐＡ＿ｄＴ）または遺伝子特異的プライマー（ｐＡ＿ＧＳＰ１）を用いて、このＲＮＡをｃＤＮＡへと変換した。非ポリアデニル化ＲＮＡもまた、上記のようにｃＤＮＡへと変換した（未処理＿ｄＴおよび未処理＿ＧＳＰ１）。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。結果の統計学的分析を、表１に示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、増幅されたＦＰＥＴ  ＲＮＡおよび未増幅のＦＰＥＴ  ＲＮＡの４６遺伝子パネルの発現分析を示す。３つの異なるＲＮＡを、プロファイリングした。インタクトな全般的全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）は、図１０Ａに示され、胎盤のＦＰＥＴ  ＲＮＡ（ＢｉｏＰａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによってホルマリンで１．５時間〜２時間処理し、そしてパラフィン包埋された胎盤に由来する）は、図１０Ｂに示され、そして乳房腫瘍ＦＰＥＴ  ＲＮＡ（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ、ＭＡ）は、図１０Ｃに示される。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。遺伝子発現分析の前に、ＲＮＡの２つの別々の試料をＰＮＫを用いて処理し、続いてＥＰＡＰを用いて処理して、次いで逆転写酵素およびオリゴｄＴ−Ｔ７プライマーを用いてｃＤＮＡへと変換した。このｃＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮＡｓｅＨを用いて二本鎖とし、ＩＶＴ［ＩＶＴ（テイル付−１）およびＩＶＴ（テイル付−２）］によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ（登録商標）によって分析した。対照として、非ＰＮＫ／非ＥＰＡＰ処理されたＦＰＥＴ  ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）による分析の前に、上記のように二本鎖ｃＤＮＡへと変換してＩＶＴ［ＩＶＴ（テイル無し）］によって増幅したか、またはＧＳＰ（ＧＳＰ）によってｃＤＮＡへと変換した。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。挿入表は、各ＲＮＡ試料に関してプロファイリングされた４６遺伝子の全体の平均Ｃｔを示す。プロファイリングされた４６遺伝子に関する、非増幅（ＧＳＰ）ＲＮＡ試料と増幅（ＩＶＴ）ＲＮＡ試料との間のピアソン相関係数（Ｒ）もまた示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、増幅されたＦＰＥＴ  ＲＮＡおよび未増幅のＦＰＥＴ  ＲＮＡの４６遺伝子パネルの発現分析を示す。３つの異なるＲＮＡを、プロファイリングした。インタクトな全般的全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）は、図１０Ａに示され、胎盤のＦＰＥＴ  ＲＮＡ（ＢｉｏＰａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによってホルマリンで１．５時間〜２時間処理し、そしてパラフィン包埋された胎盤に由来する）は、図１０Ｂに示され、そして乳房腫瘍ＦＰＥＴ  ＲＮＡ（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ、ＭＡ）は、図１０Ｃに示される。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。遺伝子発現分析の前に、ＲＮＡの２つの別々の試料をＰＮＫを用いて処理し、続いてＥＰＡＰを用いて処理して、次いで逆転写酵素およびオリゴｄＴ−Ｔ７プライマーを用いてｃＤＮＡへと変換した。このｃＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮＡｓｅＨを用いて二本鎖とし、ＩＶＴ［ＩＶＴ（テイル付−１）およびＩＶＴ（テイル付−２）］によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ（登録商標）によって分析した。対照として、非ＰＮＫ／非ＥＰＡＰ処理されたＦＰＥＴ  ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）による分析の前に、上記のように二本鎖ｃＤＮＡへと変換してＩＶＴ［ＩＶＴ（テイル無し）］によって増幅したか、またはＧＳＰ（ＧＳＰ）によってｃＤＮＡへと変換した。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。挿入表は、各ＲＮＡ試料に関してプロファイリングされた４６遺伝子の全体の平均Ｃｔを示す。プロファイリングされた４６遺伝子に関する、非増幅（ＧＳＰ）ＲＮＡ試料と増幅（ＩＶＴ）ＲＮＡ試料との間のピアソン相関係数（Ｒ）もまた示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、増幅されたＦＰＥＴ  ＲＮＡおよび未増幅のＦＰＥＴ  ＲＮＡの４６遺伝子パネルの発現分析を示す。３つの異なるＲＮＡを、プロファイリングした。インタクトな全般的全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）は、図１０Ａに示され、胎盤のＦＰＥＴ  ＲＮＡ（ＢｉｏＰａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによってホルマリンで１．５時間〜２時間処理し、そしてパラフィン包埋された胎盤に由来する）は、図１０Ｂに示され、そして乳房腫瘍ＦＰＥＴ  ＲＮＡ（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ、ＭＡ）は、図１０Ｃに示される。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。遺伝子発現分析の前に、ＲＮＡの２つの別々の試料をＰＮＫを用いて処理し、続いてＥＰＡＰを用いて処理して、次いで逆転写酵素およびオリゴｄＴ−Ｔ７プライマーを用いてｃＤＮＡへと変換した。このｃＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮＡｓｅＨを用いて二本鎖とし、ＩＶＴ［ＩＶＴ（テイル付−１）およびＩＶＴ（テイル付−２）］によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ（登録商標）によって分析した。対照として、非ＰＮＫ／非ＥＰＡＰ処理されたＦＰＥＴ  ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）による分析の前に、上記のように二本鎖ｃＤＮＡへと変換してＩＶＴ［ＩＶＴ（テイル無し）］によって増幅したか、またはＧＳＰ（ＧＳＰ）によってｃＤＮＡへと変換した。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。挿入表は、各ＲＮＡ試料に関してプロファイリングされた４６遺伝子の全体の平均Ｃｔを示す。プロファイリングされた４６遺伝子に関する、非増幅（ＧＳＰ）ＲＮＡ試料と増幅（ＩＶＴ）ＲＡＮ試料との間のピアソン相関係数（Ｒ）もまた示す。
【図１１】図１１は、フラグメント化ＦＰＥＴ  ＲＮＡの遺伝子特異的プライミングを促進させるためのストラテジーを示したスキームである。この図において、ＦＰＥＴは「固定化パラフィン包埋組織」を意味し、ＭｅＧｐｐｐとはｍＲＮＡの５’メチル化グアニル酸ＣＡＰ構造をいい、Ａ１００〜３００とはｍＲＮＡの３’ポリＡトラクトをいい、ＲＴとは逆転写酵素をいい、ＰＣＲとはポリメラーゼ連鎖反応をいい、アンプリコンとはＰＣＲによって増幅されるｍＲＮＡの領域をいい、そしてＧＳＰは遺伝子特異的プライマーを意味する。延長された逆方向プライマー（１０ｂ、２０ｂおよび３０ｂ）は、逆方向プライマーと同一であるが、アンプリコン中へさらに１０塩基、２０塩基および３０塩基延長される。およそ、３０ｂ  ＲＴプライマーの３’末端および順方向プライマーの３’末端は、単一の塩基によって分離される。
【図１２】図１２は、乳房腫瘍ＦＰＥＴ  ＲＮＡ（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ  １６８）の選択された遺伝子発現分析を示す。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。遺伝子特異的プライマー（Ｓｔｄプライマー）か、または延長された逆方向プライマー（１０ｂプライマー、２０ｂプライマーおよび３０ｂプライマー）のいずれかを用いて、ｃＤＮＡ合成を開始した。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。
【図１３】図１３は、遺伝子発現を測定するために使用される、本発明における改善されたビーズベースの増幅プロセスの全体的な作業の流れを例示する模式図である。この図において、ＦＰＥＴは「固定化パラフィン包埋組織」を意味し、ＰＮＫは「ポリヌクレオチドキナーゼ」を意味し、ＥＰＡＰは「Ｅ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼ」を意味し、Ｏ−Ｔ７−（ＴＴＴ）は、ｃＤＮＡ合成のための固相の固定化プライマーであり、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列および磁性ポリスチレンビーズに結合するオリゴデオキシチミジレート配列から構成され、ＲＴは「逆転写酵素」を意味し、ＲＮＡｓｅＨは「リボヌクレアーゼＨ」を意味し、ＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｉは「ＤＮＡポリメラーゼＩ」を意味し、ＩＶＴは「インビトロ転写」を意味し、ｃＲＮＡはＩＶＴによって生成された「相補的ＲＮＡ」を意味し、そしてＯ−（−）ｒＲＮＡとは、相補的リボゾームＲＮＡ配列（短いＤＮＡオリゴとして合成される）を固定化したビーズをいう。改善された、ビーズベースのプロトコールは、図の中心部に示される（実線矢印）。このプロセスは、ＦＰＥＴ  ＲＮＡ（一般に、５０ｎｇ〜２００ｎｇ）で開始され、そして以下、１）ＰＮＫを用いた、末端ヌクレオチド上の３’ＯＨの脱ブロック化、２）ＰＮＫ工程からの精製を伴わない、ＦＰＥＴ  ＲＮＡ３’の直接的ＥＰＡＰポリＡテーリングの工程、３）ビーズに固定化されたオリゴｄＴ−Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列へのポリアデニル化されたＦＰＥＴ  ＲＮＡのハイブリダイゼーション、続いて４）ＲＴを用いたｃＤＮＡ合成の工程、５）ＲＮａｓｅＨによる部分的ＲＮＡ分解およびＤＮＡポリメラーゼＩを用いた第２鎖ＤＮＡ合成、ならびに６）インビトロ転写によるＲＮＡ増幅を包含する。第２ラウンドのＩＶＴのための任意の手順は、工程７（破線矢印）に示される。別の任意の工程は、工程２’に示されるリボソームｒＲＮＡフラグメントの枯渇を含む（点線矢印）。
【図１４】図１４は、種々のＰＮＫ精製とそれに続くＥＰＡＰによるポリアデニル化からの結果を示す。左側のパネルは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用したミクロキャピラリー電気泳動によってＦＰＥＴ  ＲＮＡのサイズを示す。レーンの説明：ラダー、２００塩基（最低値）〜６０００塩基のＲＮＡ分子量マーカー；ＳＭ、未修飾ＦＰＥＴ  ＲＮＡ。１〜６、右側のパネルに記載されたＰＮＫ精製条件。Ｐ／Ｃとは、フェノール／クロロホルムをいう；ＤＥＰＣ−３０カラムとは、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮＴＭ  ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ  ３０カラムをいい、加熱不活性化条件は、６５℃で２０分間であった。ＥＰＡＰ精製後の回収率は、投入ＦＰＥＴ  ＲＮＡ（１０００ｎｇ）に相対化されている。
【図１５】図１５は、増幅された乳房腫瘍ＦＰＥＴ  ＲＮＡ（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ、ＭＡ）の４７遺伝子パネルの発現分析を示す。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。挿入表は、各々の精製条件に関してプロファイリングされた４７遺伝子の全般的平均Ｃｔ、および各ＩＶＴに関するｃＲＮＡ収率を示す。これらの精製条件は、上述の実施例２において記載される。
【図１６】図１６は、実施例３において記載される、非ビーズベース（遊離ＩＶＴ）、およびビーズベース（固相ＩＶＴ）によって増幅された、胎盤のＦＰＥＴ  ＲＮＡの４７遺伝子パネルの発現分析を示す。比較のために、増幅されていない出発物質（ＳＭ）のプロフィールもまた示される。上記胎盤は、ＢｉｏＰａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによってホルマリンで１．５時間〜２時間処理され、そしてパラフィン包埋された。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定する。挿入表は、各々の精製条件に関してプロファイリングされた４７遺伝子の全般的平均Ｃｔ、および各ＩＶＴに関するｃＲＮＡ収率を示す。また、正規化後の収率を示す（収率；Ｃｔ．調整値）。収率を正規化するための方程式は：ｃＲＮＡ収率／２（平均Ｃｔ．−ＳＭ  Ｃｔ．）である。
【図１７Ａ】図１７Ａは、増幅された胎盤ＦＰＥＴ  ＲＮＡの４７遺伝子パネル発現分析を示す。この胎盤は、ＢｉｏＰａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによってホルマリンで１．５時間〜２時間処理され、そしてパラフィン包埋された。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。挿入表は、各々のＦＲＡ条件に関してプロファイリングされた４７遺伝子の全般的平均Ｃｔ、および各ＩＶＴに関するｃＲＮＡ収率を示す。３つのＦＲＡ条件は、上記の実施例４において記載される。図１７Ａおよび図１７Ｂは、それぞれ、最初の増幅および第２の増幅からの結果を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、増幅された胎盤ＦＰＥＴ  ＲＮＡの４７遺伝子パネル発現分析を示す。この胎盤は、ＢｉｏＰａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによってホルマリンで１．５時間〜２時間処理され、そしてパラフィン包埋された。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。挿入表は、各々のＦＲＡ条件に関してプロファイリングされた４７遺伝子の全般的平均Ｃｔ、および各ＩＶＴに関するｃＲＮＡ収率を示す。３つのＦＲＡ条件は、上記の実施例４において記載される。図１７Ａおよび図１７Ｂは、それぞれ、最初の増幅および第２の増幅からの結果を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、増幅された胎盤ＦＰＥＴ  ＲＮＡの４７遺伝子パネル発現分析を示す。この胎盤は、ＢｉｏＰａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによってホルマリンで１．５時間〜２時間処理され、そしてパラフィン包埋された。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００上で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって発現を分析した。相対的収率は、閾値サイクル（Ｃｔ）によって測定される。挿入表は、各々のＦＲＡ条件に関してプロファイリングされた４７遺伝子の全般的平均Ｃｔ、および各ＩＶＴに関するｃＲＮＡ収率を示す。３つのＦＲＡ条件は、上記の実施例４において記載される。図１７Ｃは、第１のＩＶＴと第２のＩＶＴとの比較を示す（条件３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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