(57)【要約】  本発明は、哺乳動物のアポトーシス亢進に有用な組成物、及び同様の組成物の使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１に示すヌクレオチド配列（配列番号１）と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含有してなる、単離された核酸分子。
【請求項２】
図１に示すヌクレオチド配列（配列番号１）を含有してなる、単離された核酸分子。
【請求項３】
変異形核酸分子である、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
ストリンジェントな条件下で図１に示すヌクレオチド配列（配列番号１）の相補鎖にハイブリダイズする、単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の核酸を含有してなる発現ベクター。
【請求項６】
ベクターで形質転換した宿主細胞によって認識されるコントロール配列に、前記核酸が作用可能に結合する、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを有する宿主細胞。
【請求項８】
哺乳動物細胞、大腸菌細胞又は酵母細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養すること、及び細胞培養物から前記ポリペプチドを回収することを含む、ポリペプチド製造方法。
【請求項１０】
図１に示すヌクレオチド配列（配列番号１）によってコードされるポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド。
【請求項１１】
（ａ）図２（配列番号２）又は図１４（配列番号６）に示すポリペプチド、
（ｂ）Ｃ末端が切断されている、図２（配列番号２）又は図１４（配列番号６）に示すポリペプチド、
（ｃ）Ｎ末端が切断されている、図２（配列番号２）又は図１４（配列番号６）に示すポリペプチド、
（ｄ）残基１６０〜１７９のＢＩＲドメインが変更されている、図２（配列番号２）又は図１４（配列番号６）に示すポリペプチド、
と、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
図２（配列番号２）又は図１４（配列番号６）に示すＭＬ−ＩＡＰキメラアミノ酸配列を含有してなる、単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
異種ポリペプチドに融合した請求項１０又は１１に記載のポリペプチドを含有してなるキメラポリペプチド。
【請求項１４】
ＩＡＰポリペプチドのカスパーゼ阻害を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）空間群Ｐ４１２１２において、およそ８７×８７×７４Åの単位細胞寸法を有する、図２（配列番号２）又は図１４(配列番号６)に示す分子の結晶構造を、既知のＩＡＰインヒビターに接触させること、
（ｂ）インヒビター候補を（ａ）に示す複合体に浸漬すること、
（ｃ）インヒビター候補が既知のＩＡＰインヒビターを置換するかどうかを決定すること
を含む方法。
【請求項１５】
ＩＡＰポリペプチドのカスパーゼ阻害を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
ａ．化合物を用いてＩＡＰポリペプチドを共結晶化すること、
ｂ．結合分子の構造をＸ線クロマトグラフィーにより分解すること、
ｃ．共結晶化した分子の座標をモデル化すること、
ｄ．（ｃ）で生成された座標を用いて双方向式手順を適用し、ＩＡＰポリペプチドのアゴニスト候補又はアンタゴニスト候補を同定すること、
ｅ．アゴニスト又はアンタゴニストを合成すること、
ｆ．アゴニスト又はアンタゴニストをＩＡＰポリペプチドと接触させ、前記ＩＡＰポリペプチドとのその相互作用能を測定すること
を含む方法。
【請求項１６】
ＭＬ−ＩＡＰキメラのカスパーゼ阻害を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
ａ．前記化合物の存在下でカスパーゼポリペプチドとＩＡＰポリペプチドを接触させること、
ｂ．調節化合物不在下のカスパーゼ活性の量と比較した場合の、カスパーゼ活性の量を検出すること
を含む方法。
【請求項１７】
前記カスパーゼは、カスパーゼ３及びカスパーゼ９からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗体を用いてカスパーゼ活性を検出する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質基質の切断によってカスパーゼ活性を検出する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ＩＡＰポリペプチドが図２（配列番号２）又は図１４（配列番号６）に示すものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＡＰポリペプチドのアンタゴニストのスクリーニング方法であって、
（ａ）図１（配列番号１）に示すＩＡＰキメラを細胞に形質移入すること、
（ｂ）形質移入した細胞をＩＡＰアンタゴニスト候補に接触させること、
（ｃ）前記アンタゴニストが、アンタゴニスト未処理細胞と比較してＩＡＰを発現する細胞のアポトーシスを増大させたかどうかを決定すること
を含む方法。
【請求項２２】
細胞の生存率を向上させる方法であって、細胞中のＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのカスパーゼ阻害活性を変更する化合物に対し、細胞を接触させることを含む方法。
【請求項２３】
カスパーゼとＭＬ−ＩＡＰキメラの特異的結合を変化する化合物の同定方法であって、
（ａ）カスパーゼとＭＬ−ＩＡＰキメラが特異的に結合できる条件下で、カスパーゼ及びＭＬ−ＩＡＰキメラを、カスパーゼ及びＭＬ−ＩＡＰキメラの会合を変化する能力を有すると思われる化合物に接触させること、
（ｂ）カスパーゼとＭＬ−ＩＡＰキメラの会合の変化を検出することにより、カスパーゼとＭＬ−ＩＡＰキメラの会合を変化する化合物を同定すること
を含む方法。
【請求項２４】
接触をインビトロで行う、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
接触を細胞内で起こす、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記カスパーゼは、カスパーゼ３及びカスパーゼ９からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＭＬ−ＩＡＰキメラと化合物を接触させることを含み、分子の結合を蛍光偏光によって測定することができる、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（優先権の主張）
本出願は、米国特許法１１９条の下に、２００３年１１月１３日に出願された米国特許仮出願第６０／５１９，８６３号の優先権を主張し、この仮出願全体を出典明記により本明細書に包含する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、哺乳動物のアポトーシスを亢進する組成物のスクリーニングに有用な組成物、及びスクリーニング方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
アポトーシス又はプログラム細胞死は脊椎動物と同様に無脊椎動物での発達及び恒常性に重要な役割を持つ一般的及び生化学的な調節機能である。未熟な細胞死を引き起こすアポトーシス異常は様々な発育性疾患に関与している。結果的に細胞死欠乏となるアポトーシス欠損は、癌及び慢性ウイルス感染に関与している(Thompson等, (1995) Science 267, 1456-1462)。
アポトーシスにおけるある重要なエフェクター分子にカスパーゼがある（アスパラギン酸特異的プロテアーゼを含むシステイン）。カスパーゼはアスパラギン酸残基後を切断する強力なプロテアーゼであり、活性化されると細胞内から生細胞タンパク質を消化する。カスパーゼは高度に活性なプロテアーゼなので、未熟な細胞死を予防するためにこのタンパク質ファミリーの厳重なコントロールが重要である。一般に、カスパーゼは主として不活性型チモーゲンとして合成され、活性化されるにはタンパク質分解過程を要する。このタンパク質分解過程はカスパーゼ調節の唯一の手段である。調節の二次的機能はカスパーゼに結合して阻害するタンパク質ファミリーが介する。
【０００４】
カスパーゼを阻害する分子ファミリーはアポトーシス阻害因子（ＩＡＰ）である(Deveraux等, J Clin Immunol (1999), 19:388-398)。ＩＡＰは本来そのＰ３５タンパク質を代用する機能的能力によってバキュロウイルスにおいて発見された抗アポトーシス遺伝子である(Crook等. (1993) J Virology 67, 2168-2174)。ＩＡＰはショウジョウバエからヒトにわたる生物体において記述されている。器官に関係なく構造的に、ＩＡＰは１から３のバキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）ドメインを含み、それらのほとんどはカルボキシル末端ＲＩＮＧフィンガーモチーフも有している。ＢＩＲドメイン自体は５つのαヘリックス及び３つのβ鎖を含む約８０残基のｚｉｎｃ結合ドメインであり、ｚｉｎｃイオンを配位するシステインとヒスチジンを有する(Hinds等, (1999) Nat. Struct. Biol. 6, 648-651; Sun等、(1999) Nature 401, 818-22; Sun等、(2000) J. Biol Chem. 275, 33777-81)。
全てのＩＡＰタンパク質は、バキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）の１〜３のコピー、８０のアミノ酸からなる亜鉛結合ドメインを含み、これらは活性化されたカスパーゼ３、７、及び９、並びに成熟Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ及びＨｔｒＡ２／Ｏｍｉなどの天然ＩＡＰタンパク質アンタゴニストを含む多数のサイトゾル標的と相互作用するために必要である。しかしながら、異なるＢＩＲドメインは、これらタンパク質に対して異なる親和性を有し、よってアポトーシスの調節に別個の機能を有する。例えば、Ｘ染色体にリンクするＩＡＰ（ＸＩＡＰ）の第２ＢＩＲドメインは直前のリンカー領域（ＸＩＡＰ−ＢＩＲ２）と共に、カスパーゼ３及び７に結合し、２〜１０ｎＭの阻害定数でそれらを阻害する（Takahashi等、(1998) J Biol Chem 273(14): 7787-90; Sun等、(1999) Nature 401 (6755): 818-22）。一方、ＸＩＡＰの第３ＢＩＲドメイン（ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３）は１０〜２０ｎＭの阻害定数でカスパーゼ９を特異的に阻害する（Deveraux等、(1999) Genes Dev 13: 239-252; Liu等、(2000) Nature 408(6815): 1004-8; Sun等、(2000) J Biol Chem 275(43): 33777-81）。対照的に、アポトーシスの黒色腫インヒビターの単一のＢＩＲドメイン（ＭＬ−ＬＡＰ）は、カスパーゼ３及び９をわずかに阻害するが、カスパーゼ７は阻害しないことが分かっており、但し阻害定数は報告されていない（Vucic等、(2000) Curr Biol 10(21): 1359-66）。
【０００５】
黒色腫ＩＡＰ（ＭＬ−ＩＡＰ）は黒色腫におけるＩＡＰ発現を強く上方制御する(Vucic等, (2000) Current Bio 10:1359-1366)。タンパク質構造の決定により、ヒトＸＩＡＰ、Ｃ−ＩＡＰ１及びＣ−ＩＡＰ２に存在するドメインに対応する顕著な相同性を示すＭＬ−ＩＡＰ  ＢＩＲ及びＲＩＮＧフィンガードメインが明らかにされた。ＭＬ−ＩＡＰのＢＩＲドメインはＸＩＡＰのBIR2及びBIR3、C-IAP1及びC-IAP2に最も類似性があり、欠損解析に示されるようにアポトーシス阻害を担っていると思われる。さらに、Vucic等はＭＬ−ＩＡＰが化学療法剤誘導性アポトーシスを阻害することを明らかにした。アドリアマイシン及び４-第三ブチルフェノール（４−ＴＢＰ）等の薬剤をＭＬ−ＩＡＰを過剰発現する黒色腫の細胞培養系で試験すると、正常メラニン細胞対照と比較して化学療法剤が細胞を死滅する影響が著しく低かった。ＭＬ−ＩＡＰが抗アポトーシス活性を示す機構はカスパーゼ３及び９の阻害によるものである。ＭＬ−ＩＡＰはカスパーゼ１、２、６、７又は８を有効に阻害しなかった。
アポトーシスは多様な相互因子を持つ厳密に制御された経路であるので、ＩＡＰ自体が調節を受けるという発見は特異なことではなかった。ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａでは、Reaper (rpr)、頭部退行欠損（Head Involution Defective）(hid)及びGRIMタンパク質が物理的に相互作用し、ショウジョウバエのＩＡＰファミリーの抗アポトーシス活性を阻害する。哺乳動物では、タンパク質SMAC/DIABLOがＩＡＰを遮断するように働き、アポトーシスが進行する。正常なアポトーシスではＳＭＡＣが活性型になると、ミトコンドリアから細胞質に放出され、物理的にＩＡＰに結合してＩＡＰがカスパーゼに結合するのを阻害することが示された。このＩＡＰの阻害により、カスパーゼは活性化された状態であるためアポトーシスが進行する。
【０００６】
これらＩＡＰタンパク質アンタゴニストのアポトーシス促進機能は、成熟タンパク質のＮ末端に見られる保存された４残基ＩＡＰタンパク質間相互作用モチーフ（Ａ−Ｖ／Ｉ−Ｐ／Ａ−Ｉ／Ｆ／Ｙ）によって決まる（Chai等、(2000) Nature 406:855-862; Srinivasula等、(2001) Nature 410(6824):112-6）。この保存されたモチーフはまた、ショウジョウバエタンパク質のReaper、Hid、Grim、Sickle、及びJafrac2に見られ、これらもＩＡＰタンパク質をアンタゴナイズし、よってＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの機能的相同体をアンタゴナイズする（White等、(1994) Science 264(5159):677-83; Grether等、(1995) Genes Dev 9(14):1694-708; Chen等、(1996) Genes Dev 10(14):1773-82; Goyal等、(2000) Embo J 19(4): 589-97; Christich等、(2002) Curr Biol 12(2):137-40; Srinivasula等、(2002) Curr Biol 12(2):125-30; Tenev等、(2002) Embo J 21(19): 5118-29; Wing等、(2002) Curr Biol 12(2):131-5）。構造研究により、これらＮ末端のペプチドはＢＩＲドメインの表面溝に結合し、この結合は、ペプチドの保存されたＮ末端アラニン残基に関する静電気的相互作用、並びに複数の分子間水素結合及び疎水性相互作用により安定化していることが判明している（Liu等、(2000) Nature 408:1004-1008, Wu等、(2000) Nature 408 1008-1012; Wu等、(2001) Mol. Cell 8, 95-104; Srinivasula等、(2002) Curr. Biol. 12, 125-30; Franklinら、(2003) Biochem. 42 8223-31）。
上述のようなアポトーシス研究の進歩にもかかわらず、癌の進行を抑制するための、哺乳動物におけるアポトーシス亢進能を有する付加的診断及び治療用薬剤の需要が高い。本発明は、特定残基がＸＩＡＰ−ＢＩＲ３に見られる残基に対応しており、残りがＭＬ−ＩＡＰに対応しているキメラＭＬ−ＩＡＰポリペプチドに関する。キメラタンパク質によるカスパーゼ９に対する結合及びその阻害は、天然のＭＬ−ＩＡＰ又はＸＩＡＰと比較して有意に良好であるが、Ｓｍａｃを主成分とするペプチド及び成熟Ｓｍａｃに対するその結合親和性は、天然ＭＬ−ＩＡＰのものと類似していることが判明している。キメラＭＬ−ＩＡＰポリペプチドのカスパーゼ９阻害の向上は、ＭＣＦ７細胞に形質移入されたとき、ドキソルビシン誘発性アポトーシスの阻害が増大することと相関している。したがって、本発明はＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの使用と、ＩＡＰアンタゴニストのスクリーニング方法に関する。
【０００７】
（発明の概要）
一実施形態において、本発明はＭＬ−ＩＡＰキメラを提供する。このようなキメラをスクリーニング法に使用して、ＭＬ−ＩＡＰキメラとカスパーゼの会合を変化させる薬剤を同定することができる。好ましくは、カスパーゼはカスパーゼ３又はカスパーゼ９である。
別の実施形態では、本発明は、ＭＬ−ＩＡＰキメラで細胞を形質移入し、次いで細胞をＩＡＰインヒビターに接触させることにより、細胞集団のアポトーシス特性を変更し、アポトーシスに対する細胞の感受性が増大したかどうかを決定する方法を提供する。好ましい実施形態では、形質移入した細胞を、ＡＰＯ２Ｌ等の２次的なアポトーシス剤でも処理する。
本発明の更に別の実施形態は、ＩＡＰインヒビターを有すると思われる試料中におけるＭＬ−ＩＡＰキメラインヒビターの存在を決定する方法を目的とし、本方法では、ＩＡＰインヒビターに結合するＭＬ−ＩＡＰキメラに試料を曝し、試料中でのＩＡＰインヒビターに対するＭＬ−ＩＡＰキメラの結合を測定し、そのような結合の存在が試料中におけるＩＡＰインヒビターの存在を示す。場合によっては、試料はＩＡＰインヒビターを発現すると思われる細胞を含むことができる。本方法に使用するＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドは、場合によって検出可能に標識したり、固体支持体に付着させたりすることができる。
本発明の更なる他の実施態様は、ＭＬ−ＩＡＰキメラを発現する細胞へのＩＡＰインヒビター結合方法に関し、該方法は、ＭＬ−ＩＡＰキメラの該ＩＡＰインヒビターへの結合に適する条件下で該ＩＡＰインヒビターとＭＬ−ＩＡＰキメラを発現する細胞とを接触させ、それらを結合させることを含む。
【０００８】
本発明の更に別の実施形態は、ＭＬ−ＩＡＰキメラの結晶構造の使用によるＩＡＰインヒビターの同定方法を目的とし、本方法では、前記結晶構造を用いることにより、ＢＩＲドメインとＩＡＰインヒビター候補の間の接触残基を同定する。このような接触残基及び近隣の残基は、本明細書で説明する技術による代替物の候補となる。このような変異体が生成されたら、変異体のパネルを本明細書に開示するようにしてスクリーニングし、１以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有するＩＡＰインヒビターを同定する。
別の実施形態では、本発明は、上記又は後述するポリペプチドのいずれかに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。一態様では、本発明はＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドに結合する単離された抗体に関する。別の態様では、抗体はＭＬ−ＩＡＰキメラの活性を阻害又は中和する（アンタゴニスト抗体）。別の態様では、抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）残基を有する。抗体は標識することができ、及び固体支持体に固定することができる。さらなる態様では、抗体は抗体断片、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、又は抗イデオタイプ抗体である。
また別の実施形態では、本発明は、抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体を製薬的に許容可能な担体と混合して含有してなる組成物に関する。一態様では、組成物は治療的有効量の抗体を含有する。好ましくは、この組成物は無菌である。本組成物は、長期の貯蔵安定性を達成できる液体医薬製剤の形態で投与することができる。あるいは、抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、ヒト化抗体、又は一本鎖抗体である。
【０００９】
更なる実施形態では、本発明は、
(ａ)ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含む組成物； 
(ｂ)前記組成物を収容する容器；並びに
癌の軽減における前記ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの使用を記した前記容器に添付されるラベル、又は前記容器に含まれる包装挿入物
を含んでなる製造品に関する。この組成物は、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド、或いはそのアゴニスト又はアンタゴニストの治療的有効量を含むことができる。
別の実施形態では、本発明は哺乳動物における癌の診断方法に関し、本方法は、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料、並びに（ｂ）同じ細胞型の既知の正常組織細胞のコントロール試料において、ＩＡＰインヒビターをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含んでなり、コントロール試料と比較して試験試料で高い又は低い発現レベルが、試験組織細胞が得られた哺乳動物における癌の存在を示す。
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物における癌の診断方法に関し、本方法は、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料と抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体を接触させ、（ｂ）試験試料中におけるこの抗体とＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド間の複合体の形成を検出することを含んでなり、前記複合体の形成が、前記癌の存在の有無を示す。検出は定性的又は定量的であってよく、同じ細胞型の既知の正常組織細胞のコントロール試料における複合体の形成をモニターし、それと比較して行うことができる。試験試料中に形成された多量の複合体は、試験組織細胞が得られた哺乳動物における癌の有無を示す。抗体は、好ましくは検出可能なラベルを有する。複合体の形成は、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、或いは当該分野で知られている他の技術によってモニターすることができる。試験試料は、通常、癌を有すると思われる個体から得る。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、試料中のＩＡＰポリペプチドの存在を測定する方法を提供し、本方法は、ＩＡＰポリペプチドを含有すると思われる細胞の試験試料を抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体へ曝露し、前記抗体の前記細胞試料への結合を測定することを含む。特定の態様では、この試料はＩＡＰポリペプチドを含有すると思われる細胞を含み、抗体は細胞に結合する。この抗体は、好ましくは検出可能に標識され及び／又は固体支持体へ結合される。
別の実施形態では、本発明は、抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体と担体を適切な包装体に含んでなる、癌関連疾患診断用キットに関する。このキットは、好ましくは、ＩＡＰポリペプチドの検出に抗体を用いるための指示書を含む。好ましくは、この担体は製薬的に許容可能である。
別の実施形態では、本発明は、適切な包装体に抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体を含む診断用キットに関する。このキットは、好ましくは、この抗体をＭＬ−ＩＡＰキメラの検出に用いるための指示書を含む。
【００１１】
その他の実施形態では、本発明は：
（ａ）通常は、ＩＡＰポリペプチドによって誘導される細胞応答の誘導に適した条件下でスクリーニングされる試験化合物と細胞を接触させ；
（ｂ）前記細胞応答の誘導を測定して試験化合物が有効アゴニストであるかどうかを確定することを含み、前記細胞応答の誘導により、前記試験化合物が有効なアゴニストであることが示される、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアゴニストを同定する方法に関する。
別の実施形態では、本発明は、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの活性の阻害能を有する化合物を同定する方法に関し、本方法は、候補化合物とＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの相互作用を可能にするのに十分な条件と時間にわたってこの二つの成分を接触させ、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの活性が阻害されるかどうかを測定することを含む。特定の態様では、候補化合物又はＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのいずれかを固体支持体上に固定する。別の態様では、非固定化成分に検出可能なラベルを付す。好ましい態様では、本方法は：
（ａ）通常は、ＩＡＰポリペプチドによって誘導される細胞応答の誘導に適した条件下において、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの存在で、スクリーニング対象の試験化合物と細胞を接触させる工程；並びに
（ｂ）試験化合物が有効アンタゴニストであるかどうかを決定するために、前記細胞応答の誘導を測定する工程
を含む。
別の実施形態では、本発明は、通常はＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドを発現する細胞において該ポリペプチドの発現を阻害する化合物を同定する方法を提供し、本方法は、細胞を試験化合物に接触させ、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの発現が阻害されるかどうかを決定することを含む。好ましい態様では、この方法は：
（ａ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドを発現させるのに適した条件下でスクリーニング対象の試験化合物と細胞を接触させる工程；並びに
（ｂ）前記ポリペプチドの発現の阻害を測定する工程を
を含む。
【００１２】
更に別の実施形態では、本発明は、罹患している哺乳動物の癌を治療する方法に関し、本方法は、（ａ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド、（ｂ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアンタゴニストのいずれかをコードする核酸分子を哺乳動物へ投与することを含み、ここで、アゴニスト又はアンタゴニストは抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体とすることができる。好ましい実施形態では、この哺乳動物はヒトである。別の好ましい実施形態では、この核酸はエキソビボ遺伝子治療によって投与される。更なる好ましい実施形態では、核酸は、ベクター、より好ましくはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス又はレトロウイルスベクターである。
更に別の態様では、本発明は、プロモーター、（ａ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド、（ｂ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアンタゴニストをコードする核酸、並びにポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるウイルスベクターを含んでなる組換えウイルス粒子を提供し、ここで、ウイルスベクターがウイルス構造タンパク質に関連する。好ましくは、シグナル配列は哺乳動物由来のものである。
更なる実施形態では、本発明は、レトロウイルス構造タンパク質を発現する核酸コンストラクトを含んでなるエキソビボ産生細胞に関し、この核酸コンストラクトは、また、プロモーター、（ａ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド、（ｂ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアンタゴニストをコードする核酸、並びにポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるレトロウイルスベクターを含み、前記産生細胞が構造タンパク質に関連するレトロウイルスベクターを包み込んでおり、組換えレトロウイルス粒子を生産する。
【００１３】
更なる実施形態では、本発明は哺乳動物の細胞増殖を増大させる方法を提供し、本方法は、前記哺乳動物に対し（ａ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド、又は（ｂ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアゴニストを投与することを含み、よって哺乳動物の細胞増殖を増大させる。
更なる実施形態では、本発明は哺乳動物の細胞増殖を低減する方法を提供し、本方法は、前記哺乳動物に対し（ａ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド、又は（ｂ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアンタゴニストを投与することを含み、よって哺乳動物の細胞増殖を低減する。
更なる実施形態では、本発明は哺乳動物の細胞のアポトーシスを低減する方法を提供し、本方法は、前記哺乳動物に対し（ａ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド、又は（ｂ）ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアゴニストを投与することを含み、よって哺乳動物の細胞のアポトーシスを低減する。
更なる実施形態では、本発明は哺乳動物の細胞のアポトーシスを増大する方法を提供し、本方法は、前記哺乳動物に対しＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアンタゴニストを投与することを含み、よって哺乳動物の細胞のアポトーシスを増大させる。
【００１４】
更なる実施形態
本発明の他の実施形態では、本発明は、ここに開示されるポリペプチドのいずれかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。また、そのようなベクターを含む宿主細胞が提供される。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母である。ここに開示されるポリペプチドのいずれかを生産する方法が更に提供され、該方法は、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養物から所望のポリペプチドを回収することを含む。
他の実施形態では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したここに開示されるポリペプチドのいずれかを含むキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例には、免疫グロブリンのＦｃ領域又はエピトープタグ配列に融合したここに開示のポリペプチドのいずれかを含むキメラ分子が含まれる。
別の実施形態では、本発明は上述又は後述のポリペプチドのいずれかに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
また別の実施形態では、本発明は、アンチセンスプローブとして又はゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列の単離に有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは前述又は後述のヌクレオチド配列のいずれかから得られる。
他の実施形態では、本発明は、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【００１５】
一態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示されたアミノ酸配列、又はここに開示された完全長アミノ酸配列のその他の具体的に定義された断片を有するＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、或いは（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示されたＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドｃＤＮＡのコード配列、又はここに開示された完全長アミノ酸配列のその他の具体的に定義された断片のコード配列を含んでなるＤＮＡ分子、或いは（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、（ａ）ここに開示したヒトタンパク質ｃＤＮＡのいずれかによってコードされているのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、或いは（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、更に或いは少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。
別の態様では、本発明は、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのコード化ヌクレオチド配列を含むか、或いはそのようなコード化ヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
【００１７】
他の実施形態は、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのコード配列の断片、又はその相補鎖に関し、それらは、例えば、場合によっては抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのコード化断片のハイブリダイゼーションプローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされ得る。このような核酸断片は、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約３０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約４０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約５０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約６０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約７０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約８０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約９０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１００ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１１０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１３０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１４０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１６０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１７０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１９０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約２００ヌクレオチド長、或いは少なくとも約２５０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約３００ヌクレオチド長、或いは少なくとも約３５０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約４００ヌクレオチド長、或いは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約５００ヌクレオチド長、或いは少なくとも約６００ヌクレオチド長、或いは少なくとも約７００ヌクレオチド長、或いは少なくとも約８００ヌクレオチド長、或いは少なくとも約９００ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１０００ヌクレオチド長であり、ここで「約」という語の内容は参照する長さのプラス又はマイナス１０％のヌクレオチド配列長を指すことを意味する。ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くの良く知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを用いてＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の公知のヌクレオチド配列とを整列させ、いずれのＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより、日常的な手法で同定してもよい。このようなＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の全ては、ここで考慮される。また、これらのヌクレオチド分子断片、好ましくは抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体に対する結合部位を含むＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド断片によってコードされるＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド断片も考慮される。
別の実施形態では、本発明は、上記で特定された単離された核酸配列のいずれかによってコードされる単離されたＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドを提供する。
【００１８】
一態様では、本発明は、ここに開示した完全長アミノ酸配列、ここに開示したシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示したシグナルペプチドを有するか又は有しない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、或いはここに開示した完全長アミノ酸配列のその他の具体的に定義された断片を有するＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドに対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いはは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、或いは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドに関する。
更なる態様では、本発明は、ここに開示したヒトタンパク質ｃＤＮＡのいずれかによってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、或いは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドに関する。
【００１９】
特定の態様では、本発明は、Ｎ-末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを有しない、上記したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる単離されたＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドを提供する。それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は、適したコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞をＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培養物からＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドを回収することを含む。
それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は、適したコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞をＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培養物からＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドを回収することを含む。
更に他の実施形態では、本発明は、ここで定義される天然ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施形態では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体或いは小分子である。
更なる実施形態では、本発明は、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関し、それは、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることを含む。好ましくは、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドは天然ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドである。
また更なる実施形態では、本発明は、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド、或いはここに記載したＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体を、担体と組み合わせて含有する組成物に関する。場合によっては、担体は製薬的に許容される担体である。
本発明のその他の実施形態は、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド、又は上記したようなそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体を、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体に対して反応性である症状の治療に有用な医薬の調製のために用いることに関する。
【００２０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
定義
「ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示されるＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド配列、ここに開示されたＢＩＲドメインを欠くＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド配列、又はここに開示されたＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド配列の他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドを意味する。このようなＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド変異体には、例えば、ＭＬ−ＩＡＰキメラアミノ酸配列のＮ-又はＣ-末端において一つ又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドが含まれる。通常、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド変異体は、ここに開示されたＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド配列、ここに開示されたＢＩＲドメインを欠くＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド配列、又はここに開示されたＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド配列の他の具体的に定義された断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、或いは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＭＬ−ＩＡＰキメラ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、或いは少なくとも約２０アミノ酸長、或いは少なくとも約３０アミノ酸長、或いは少なくとも約４０アミノ酸長、或いは少なくとも約５０アミノ酸長、或いは少なくとも約６０アミノ酸長、或いは少なくとも約７０アミノ酸長、或いは少なくとも約８０アミノ酸長、或いは少なくとも約９０アミノ酸長、或いは少なくとも約１００アミノ酸長、或いは少なくとも約１５０アミノ酸長、或いは少なくとも約２００アミノ酸長、或いは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
ここに定義されるＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較プログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２はジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００２１】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２及び３に、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＭＬ−ＩＡＰキメラ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。「ＭＬ−ＩＡＰキメラ」は対象となる仮説的ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」は対象となる「ＭＬ−ＩＡＰキメラ」ポリペプチドが比較されているポリペプチドのアミノ酸配列を表し、そして「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」の各々は異なった仮説的アミノ酸残基を表している。
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性値は、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。更に、殆どのＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２が用いられた場合には、％アミノ酸配列同一性値は、（ａ）天然ポリペプチドから誘導された配列を有する対象のポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即ち、対象のポリペプチドが比較されるポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）対象のポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが対象の比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが対象のポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００２２】
また、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。ＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
アミノ酸配列比較にＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００２３】
「ＭＬ−ＩＡＰキメラ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＭＬ−ＩＡＰキメラ変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示するＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド配列、又はここに開示するＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する。通常、ＭＬ−ＩＡＰキメラ変異体ポリヌクレオチドは、ここに開示するＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド配列、又はここに開示するＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８１％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、或いは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常は、ＭＬ−ＩＡＰキメラ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約６０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約９０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約３００ヌクレオチド長、或いは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約６００ヌクレオチド長、或いは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【００２４】
ここで同定されるＭＬ−ＩＡＰキメラコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要に応じて間隙を導入した後の、対象の核酸配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較プログラＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２はジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
核酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さがアミノ酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％核酸配列同一性の計算の例として、表４及び５に「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＭＬ−ＩＡＰキメラ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。「ＭＬ−ＩＡＰキメラ-ＤＮＡ」は対象となる仮説的ＭＬ−ＩＡＰキメラコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」は対象となる「ＭＬ−ＩＡＰキメラ-ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸配列を表し、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」の各々は異なった仮説的アミノ酸残基を表している。
【００２５】
特に断らない限り、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性値は、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。更に、殆どのＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２が用いられた場合、％核酸配列同一性値は、（ａ）天然配列ポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象のポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、対象の比較核酸配列（即ち、対象のポリペプチドコード化核酸分子が比較されるポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２によって決定した一致する同一核酸残基の数を、（ｂ）対象のポリペプチドコード化核酸分子のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂに対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、核酸配列Ａが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Ｂが対象とするＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
また、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。ＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
【００２６】
核酸配列比較にＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（或いは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
他の実施態様では、ＭＬ−ＩＡＰキメラ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに開示する完全長ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子である。ＭＬ−ＩＡＰキメラ変異体ポリペプチドは、ＭＬ−ＩＡＰキメラ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００２７】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端或いは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、或いは、（２）クーマシーブルー或いは好ましくは銀染色を用いた非還元或いは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも一つの精製工程により調製される。
「単離された」ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドコード化核酸は、同定され、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態或いは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド核酸分子を含む。
【００２８】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列或いは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター或いはリンカーが使用される。
【００２９】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、多エピトープ特異性を持つ抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体組成物、一本鎖抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体、及び抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体の断片を包含している（下記参照）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー（緊縮性）」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。更に、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリダイゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００３０】
ここで定義される「ストリンジェント条件」又は「高度のストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる、例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム；又は（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストランを用いて、加えて、４２℃で、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、及び５５℃で、５０％ホルムアミド中で洗浄した後、５５℃で、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高緊ストリンジェンシー洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual（New York: Cold Spring Harbor Press, 1989）に記載されているように同定され、上記のストリンジェントより低い洗浄液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃での終夜インキュベーション、次いで１×ＳＳＣ中にて３７〜５０℃でのフィルター洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。
【００３１】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００３２】
ここでの目的に対する「活性な」又は「活性」とは、天然又は天然に生じるＩＡＰキメラの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの形態を意味し、ここで、「生物学的」活性とは、天然又は天然に生じるＩＡＰキメラが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘発する能力以外の、天然又は天然に生じるＩＡＰキメラによって引き起こされる生物機能（阻害又は刺激）を意味し、「免疫」活性とは、天然又は天然に生じるＩＡＰキメラが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘発する能力を意味する。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの生物学的活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＩＡＰキメラポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機小分子、などを含む。ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させ、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドに正常に関連している一又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含んでもよい。
【００３３】
「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し、患者は標的とする病理学的状態又は疾患を防止又は低下（減少）させられる。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００３４】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICS(商品名)を含む。
「抗体断片」は、原型の抗体の一部、好ましくは原型の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００３５】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）２断片を生じ、それは二つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの三つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬに量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な三つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【００３６】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの一つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ’断片と相違する。ここで、Ｆａｂ’-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
【００３７】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合とって望ましい構造の形成を可能にする、ＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
【００３８】
「ダイアボディ(diabodies)」という用語は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ-ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP404,097；WO93/11161；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)に、より十分に記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリー法で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端或いは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、或いは、（３）クーマシーブルー或いは好ましくは銀染色を用いた非還元或いは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００３９】
「特異的に結合する」抗体、又は特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ特異的な抗体とは、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープとは実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ結合するものである。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、「標識」抗体が生成されるように、抗体に直接又は間接的に抱合している検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
【００４０】
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
【００４１】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」と融合したＩＡＰインヒビターを含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有し、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。場合によっては、タグポリペプチドは細胞内へのキメラＩＡＰインヒビターの挿入を容認する担体ポリペプチドである。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜５０のアミノ酸残基(好ましくは、約１０〜２０の残基)を有する。
「ＩＡＰインヒビター（阻害物質）」はアポトーシスタンパク質阻害物質（ＩＡＰ）の抗アポトーシス活性を遮断する分子である。天然に生じるＩＡＰポリペプチドの例として、哺乳動物のＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯタンパク質、及びショウジョウバエのＨＩＤ、ＲＰＲ及びＧＲＩＭタンパク質がある。
ここでの目的に対する「活性インヒビター」とは、天然又は天然に生じるＩＡＰ阻害物質の生物学的活性を保持するＩＡＰインヒビターの形態を意味し、その中で、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＩＡＰが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘導する能力以外の、天然又は天然発生ＩＡＰ阻害物質によって引き起こされる生物機能を意味する。
【００４２】
「ＩＡＰ」又はアポトーシスタンパク質阻害物質は物理的に作用して活性を遮断することにより細胞のアポトーシスを阻害する分子であり、アポトーシス経路内のカスパーゼ分子である。ＩＡＰ分子の例としてＭＬ−ＩＡＰ（登録番号：ＢＩＲ７＿ＨＵＭＡＮ）、ＸＩＡＰ、ＮＡＩＰ、Ｃ−ＩＡＰ１及びＣ−ＩＡＰ２がある。構造的にＩＡＰは一以上のＢＩＲドメインを含み、多くのＩＡＰはカルボキシル末端ＲＩＮＧフィンガードメインを含む。
「カスパーゼ」はアスパラギン酸のＣ末端側でポリペプチド基質を切断するシステインプロテアーゼポリペプチドとして定義する。
「ＢＩＲドメイン」（バキュロウイルスＩＡＰリピート）は、特異的に結合して阻害することのできるタンパク質構造を含むポリペプチド、カスパーゼである。特に、ＭＬ−ＩＡＰのＢＩＲドメインは登録番号：ＢＩＲ７＿ＨＵＭＡＮで示す配列のアミノ酸８７−１６８である。
【００４３】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ＩＡＰポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害、又は中和する任意の分子が含まれる。同じように、「薬剤」という用語は最も広い意味で用いられ、天然のＩＡＰポリペプチド阻害物質の生物学的活性を模倣する任意の分子が含まれる。適切な薬剤又はアンタゴニスト分子には、特にオリゴペプチド及び小有機分子が含まれる。ＩＡＰポリペプチドのアンタゴニストを同定する方法は、ＩＡＰポリペプチドと候補アンタゴニスト分子を接触させ、そして通常はＩＡＰポリペプチドに関連している一又は複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定することが含まれ得る。
「オリゴペプチド」は３〜３０アミノ酸残基の長さの短いアミノ酸配列であり、オリゴペプチドに特定の立体配座の特性又はタンパク質分解耐性等の特定の生物学的活性を与えるために、単独又は天然に生じるアミノ酸残基と組み合わせて用いられる天然に生じるアミノ酸残基及び非天然に生じる残基類似体を包含する。
【００４４】
「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治療上の処置及び予防的療法又は防護的療法の双方を称し、その目的は、標的である病的症状又は疾患を防ぐか又は衰え（小さく）させることである。治療を必要とするものには、疾患に罹りやすいものと同時に疾患に既に罹っているもの、又は疾患が予防されるべきものを含む。本発明の方法に従ってＩＡＰインヒビターの治療量を投与された後に、患者が次の一又は複数のものについて観察可能な及び／又は測定可能な以下のような減少又は消失を示したならば、被検体又は哺乳動物は、ＩＡＰポリペプチド発現癌に関して成功裏に「治療された」ことになる：癌細胞の数の減少、又は癌細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；軟部組織及び骨への癌の広がりを含む、末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度の阻害；及び／又は特定の癌に関連している一又は複数の症状のある程度の緩和；疾病率及び死亡率の減少、及び生活の質問題の改善。ＩＡＰインヒビターが生存癌細胞の成長を防ぐ及び／又は死滅させることができる範囲において、それは、細胞増殖抑制及び／又は細胞毒性であり得る。これらの兆候又は症状の低減は、また、患者が感じることができる。
疾患における成功裏の治療及び改善を評価することに関する上記のパラメーターは、医師にとってよく知られている日常的手法によって容易に測定が可能である。癌治療では、有効性は、例えば、病気の進行までの時間（ＴＴＰ）の算定及び／又は反応速度（ＲＲ）を確かめることによって測定できる。転移は、ステージング試験によって、骨のスキャン及び骨への広がりを確かめるためのカルシウムレベル及び他の酵素に関する試験によって確かめることができる。ＣＴスキャンは、また、領域の骨盤及びリンパ節への広がりを探索することで行うことができる。胸のＸ線、及び既知の方法による肝臓の酵素レベルの測定を、それぞれ肺及び肝臓への転移を探索するために用いる。疾患をモニタリングする他の常套的方法には、経直腸的超音波断層法（ＴＲＵＳ）及び経直腸的針生検（ＴＲＮＢ）が含まれる。
【００４５】
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
癌の治療、症状の緩和又は診断のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００４６】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(登録商標)を含む。
「固相」又は「固体支持体」とは、本発明のＭＬ−ＩＡＰキメラが接着又は付着できる非水性マトリクスを意味する。ここに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、径の調整されたガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る実施形態では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他では精製用カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）を含むことができる。また、この用語は、米国特許第４２７５１４９号に記載されたような別々の粒子の不連続な固相も含む。
【００４７】
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えばＩＡＰインヒビター）輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は細胞膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。
ここで定義されている「小」分子又は「小」有機分子とは、約５００ダルトン未満の分子量である。
【００４８】
ここに開示するＩＡＰインヒビターの「有効量」とは、特に述べた目的を実施するために十分な量のことである。「有効量」は、述べられた目的に関連して、経験的及び常套的な形で決定することができる。
「治療的有効量」という用語は、患者又は哺乳動物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的なＩＡＰインヒビター又は他の薬剤の量を指す。癌の場合、治療的に有効量の薬は癌細胞の数を減じ；腫瘍の大きさを減じ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速及び好ましくは停止）し；腫瘍成長をある程度まで阻害し；及び／又は癌に関連する一又は複数の症状をある程度まで緩和する。「治療する」のここでの定義を参照せよ。薬が存在する癌細胞の成長を妨げ及び／又は死滅させる程度まで、それは、細胞分裂停止及び／又は細胞障害性であり得る。
【００４９】
ＩＡＰインヒビターの「成長阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのＩＡＰインヒビターの「成長阻害量」は、経験的及び常套的な形で決定することができる。
ＩＡＰインヒビターの「細胞障害性量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞をインビトロ又はインビボで破壊できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのＩＡＰインヒビターの「細胞障害性量」は、経験的及び常套的な形で決定することができる。
【００５０】
オリゴペプチドであるＩＡＰインヒビターは、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリをスクリーニングする技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えば、米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号、及びＷＯ８４／０３５６４号；Geysen等、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)； Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)； Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)； Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman, H. B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624；Marks,J.D.等 (1991), J. Mol. Biol., 222:581；Kang, A. S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照）。
ここに記載されるような抗体又はオリゴペプチド以外の有機分子であるＩＡＰインヒビターは、好ましくは、ここに定義されるようなＩＡＰポリペプチド又はＩＡＰキメラに特異的に結合する。有機分子であるＩＡＰインヒビターは、既知の方法（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号及びＷＯ００／３９５８５号参照）を用いて同定され、化学的に合成することができる。小有機分子は通常、約２０００ダルトン未満の大きさであり、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満の大きさであり、ここに記載される様なＩＡＰポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する能力のあるこのような有機分子は、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に結合する能力のある分子の有機分子ライブラリをスクリーニングする技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号及びＷＯ００／３９５８５号参照）。
【００５１】
腫瘍関連ポリペプチド標的等の対象のＩＡＰポリペプチドに「結合する」ＩＡＰインヒビターは、ＩＡＰインヒビターがＩＡＰポリペプチドを発現している細胞又は組織を標的とする診断及び／又は治療剤として有用であり、他のタンパク質と有意には交差反応しないように十分な親和性でＢＩＲドメインと結合するものである。そのような実施形態では、ＩＡＰインヒビターの「非標的」タンパク質との結合の程度は、蛍光偏光法、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析又は放射免疫沈降（ＲＩＡ）によって定量した場合、その特定の標的タンパク質とのＩＡＰインヒビターの結合の約１０％未満である。標的分子へのＩＡＰインヒビターの結合に関して、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープと「特異的に結合」又は「特異的に結合する」、又はそれに対して「特異的である」という表現は、非特異的な相互作用とは測定して異なる結合を意味する。特異的な結合は、例えば、一般に結合活性を持たない類似した構造の分子であるコントロール分子の結合性と比較して、分子の結合性を定量することによって測定することができる。例えば、特異的な結合は、標的、例えば過剰の非標識標的に類似したコントロール分子との競合によって決定することができる。この場合、プローブに対する標識標的の結合が過剰の非標識標的によって競合的に阻害されるならば、特異的結合であることが示される。ここで使用される特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープと「特異的に結合」又は「特異的に結合する」、又はそれに対して「特異的である」という表現は、例えば標的に対して少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ、あるいはそれ以上のＫｄを持つ分子によって示される。一実施形態では、「特異的に結合する」とは、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープへ実質的に結合することなく分子が特定のポリペプチド又は特定のポリペプチドのエピトープに結合するような結合を意味する。
【００５２】
「ＩＡＰポリペプチドを発現する腫瘍細胞の成長を阻害する」ＩＡＰインヒビター、又は「成長阻害」ＩＡＰインヒビターは、適切なＩＡＰポリペプチドを発現又は過剰発現する癌細胞の測定可能な程の成長阻害を引き起こすものである。好ましい成長阻害ＩＡＰインヒビターは、一般的には、適切なコントロール、典型的には試験されたＩＡＰインヒビターで処理されていない腫瘍細胞であるコントロールと比較して、２０％より多く、好ましくは約２０％から約５０％、さらに好ましくは５０％よりも多く（例えば、約５０％から約１００％）で腫瘍細胞に発現したＩＡＰを含有するＢＩＲドメインの成長を阻害する。インビボでの腫瘍細胞の成長阻害は、下記の実験実施例に記載しているような種々の方法で確かめることができる。
「アポトーシスを誘導する」ＩＡＰインヒビターは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス体と呼ばれる)等により決定されるようなプログラムされた細胞死を誘導するものである。好ましくは、細胞は腫瘍細胞、例えば前立腺、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、肺、腎臓、結腸、、黒色腫、又は膀胱細胞である。アポトーシスに伴う細胞イベントを評価するために種々の方法が利用できる。例えば、ホスファチジルセリン(ＰＳ)転位置をアネキシン結合により測定することができ；ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダーリングにより評価することができ；ＤＮＡ断片化に伴う細胞核／クロマチン凝結は低二倍体細胞の何らかの増加により評価することができる。好ましくは、アネキシン結合アッセイにおいて、アポトーシスを誘導するＩＡＰインヒビターは、未処理細胞の約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合を誘導するという結果を生じるものである。
【００５３】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指す又は記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ様悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)(例えば扁平上皮細胞癌)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃(gastric)又は腹部(stomach)癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)又は腎(renal)癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫、脳、並びに頭部及び頸部の癌、及び関連した転移が含まれる。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖を伴う疾患を意味する。一実施形態では、細胞増殖性疾患は癌である。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
【００５４】
「ＩＡＰポリペプチド発現細胞」は、内因性又は形質移入されたＩＡＰポリペプチドを発現する。「ＩＡＰポリペプチド発現癌」は、ＩＡＰポリペプチドを有する細胞を含む癌である。場合によって、「ＩＡＰポリペプチド発現癌」は、その細胞内に十分なレベルのＩＡＰポリペプチドを生成し、ＩＡＰインヒビターはそれへ結合することができ、癌に関して治療的効果を有する。別の実施形態では、選択的に「ＩＡＰポリペプチド発現癌」は、ＩＡＰインヒビターアンタゴニストが結合することができ、癌に対して治療的有効量を有するように十分なレベルのＩＡＰポリペプチドを産生する。ＩＡＰポリペプチドを「過剰発現」する癌は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、その細胞表面に顕著により高いレベルのＩＡＰポリペプチドを有するものである。そのような過剰発現は、遺伝子増幅又は増大した転写又は翻訳によって生じ得る。ＩＡＰポリペプチド過剰発現は、診断又は予後アッセイにおいて、細胞内に存在するＩＡＰタンパク質の増大したレベルを評価することによって定量されうる（例えば、ＩＡＰポリペプチドをコードする単離された核酸から、組み換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる単離されたＩＡＰポリペプチドに対して調製した抗ＩＡＰポリペプチド抗体を用いた免疫組織化学アッセイを介して；ＦＡＣＳ分析など）。あるいは、又は付加的に、例えば、ＩＡＰコード化核酸又はその相補鎖と一致する核酸ベースプローブを使用する蛍光インサイツハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開の国際公開９８／４５４７９を参照せよ）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、又はリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を介して、細胞のＩＡＰポリペプチドコード化核酸又はｍＲＮＡのレベルを測定してもよい。また、例えば、抗体ベースアッセイを用いて、血清のような生物学的体液中に流れている抗原を測定することによって、ＩＡＰポリペプチド過剰発現を研究してもよい（同じく、例えば、１９９０年６月１２日に発行の米国特許第４９３３２９４号；１９９１年４月１８日に公開の国際公開９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に発行の米国特許第５４０１６３８号；Sias等, J. Immunol. Methods 132: 73-80(1990)を参照せよ）。上記のアッセイとは別に、種々のインビボアッセイは、熟練技術者に入手可能である。例えば、患者の体の中にある細胞を、例えば、放射活性アイソトープのような検出可能な標識で選択的に標識した抗体に曝してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば、放射活性の外部スキャンニングによって、又は以前に抗体へ曝した患者から取り出した生検を分析することによって評価することができる。
【００５５】
「標識」という語は、ここで用いられる場合、「標識化」分子を作製するために、推定上のＩＡＰインヒビター又はＭＬ−ＩＡＰキメラに直接的又は間接的に結合させる検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位元素標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００５６】
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にＩＡＰポリペプチド発現癌細胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、成長阻害剤は、Ｓ期でＩＡＰ発現細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘導する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にし、その結果細胞の有糸分裂を阻害する。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフタセンジオンである。
【００５７】
「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１ａ、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインには、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
「パッケージ挿入物」という用語は、効能、用途、服用量、投与、配合禁忌及び／又はその治療薬の用途に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業的包装を慣習的に含めた指示書を指す。
【００５８】
表１
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【００５９】
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【００６０】
（本発明の組成物及び方法）
ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体
一実施態様では、本発明は、ここで治療及び／又は診断薬としての用途が見出され得る抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
【００６１】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質へ、関連する抗原（特に、合成ペプチドが用いられる場合）を結合させるために有用である。例えば、この抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて結合させることができる。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００６２】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞（融合のパートナーとも呼ばれる）の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００６３】
好ましい融合のパートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、融合しない親細胞に対して選択する選択培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１およびＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【００６４】
例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson等, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、例えばマウスへの細胞の腹腔内注射によって、インビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡ又はプロテインＧ-セファロースを用いる）又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等のような常套的な抗体精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
【００６５】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン（ＣＨ及びＣＬ）の配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）のコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾してキメラ又は融合抗体ポリペプチドを生成することができる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００６６】
ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗-ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００６７】
抗体がヒトの治療用途を意図している場合、抗原性及びＨＡＭＡ反応(ヒト抗-マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、その中のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）をヒト化抗体のために受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００６８】
ヒト化抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体は、免疫結合体を生成するために、状況に応じて一又は複数の細胞傷害剤(類)と結合していてもよい抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。また、ヒト化抗体は無傷抗体、例えば無傷ＩｇＧ１抗体であってもよい。
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、同５５６９８２５号、同５５９１６６９号（全てジェンファーム(GenPharm)）；同５５４５８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照されたい。
【００６９】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553[1990])を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
上述したように、ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞により産生することができる(米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号)。
【００７０】
抗体断片
ある状況下では、抗体全体よりも、抗体断片を用いることに利点がある。より小さな大きさの断片によって迅速なクリアランスが可能となり、固形腫瘍への接近の改良につながり得る。
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、すべて大腸菌で発現させ分泌させることができ、従って、大量のこれら断片の産生が容易となった。抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。インビボ半減期が増した、サルベージレセプター結合性エピトープ残基を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２が、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のどちらかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されてもよい。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【００７１】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する結合部位とＭＬ−ＩＡＰキメラ結合部位とが結合しうる。あるいは、抗ＭＬ−ＩＡＰキメラアームは、ＭＬ−ＩＡＰキメラ-発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させ局在させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＭＬ−ＩＡＰキメラを発現する細胞に細胞障害性剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＭＬ−ＩＡＰキメラ結合アーム及び細胞障害性剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公開第９６／１６６７３号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５８３７２３４号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５８２１３３７号は、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＣＤ３抗体を教示するものである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【００７２】
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖の結合にあまり影響がないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【００７３】
米国特許第５７３１１６８号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（国際公開第９１／００３６０号、同９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【００７４】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【００７５】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【００７６】
ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４６７６９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開第９１／００３６０；国際公開第９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
【００７７】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【００７８】
エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の抗原-依存細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存細胞障害性（ＣＤＣ）を向上させることは望ましい。これは、抗体のＦｃ領域で一又は複数のアミノ酸置換を誘導することによりなされうる。あるいは又はさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes,  B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【００７９】
免疫複合体
また、本発明は、化学治療薬、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞障害性剤、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【００８０】
メイタンシン及びメイタンシノイド
好ましい一実施態様では、本発明の抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体(完全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【００８１】
メイタンシノイド-抗体コンジュゲート
治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
【００８２】
抗ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド抗体-メイタンシノイドコンジュゲート(免疫コンジュゲート)
抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体を化学的に結合させることにより調製される。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３-４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【００８３】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【００８４】
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【００８５】
細胞障害性剤
ＩＡＰインヒビターと結合可能な他の抗腫瘍剤には、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、４−三次ブチルフェノールエトポシド、タキソール、カンプトテシン、メトトレキセート、ビンクリスチン又はタモキシフェン、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
【００８６】
腫瘍を選択的に破壊するため、ＩＡＰインヒビターは高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートしたタンパク質を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばＴｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、ＭＲＩとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ＩＰＡインヒビターは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばＴｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【００８７】
ＩＡＰインヒビターと細胞障害性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)がＩＡＰインヒビターに放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害性剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
別法として、ＩＡＰインヒビター及び細胞障害性剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
また別の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)にＩＡＰインヒビターをコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害性剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【００８８】
オリゴペプチド
本発明のＩＡＰインヒビターはここで記載される様なＩＡＰポリペプチドに、好ましくは特異的に、結合するオリゴペプチドである。ＩＡＰインヒビターは、既知のオリゴペプチド合成法を用いて化学的に合成することができ、あるいは組換え技術を用いて調製及び生成することができる。ＩＡＰインヒビターは通常、少なくとも約３のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長以上であり、このようなオリゴペプチドはここに記載される様なＩＡＰポリペプチドに対して好ましくは特異的に結合する能力がある。ＩＡＰインヒビターは、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えば、米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号、及びＷＯ８４／０３５６４号；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman,H.B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624；Marks,J.D.等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581；Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照）。
【００８９】
この点において、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリを検索して、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるこれらライブラリのメンバーを同定することを可能にするよく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、様々なポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として表示されることによる技術である（Scott,J.K.及びSmith G. P. (1990) Science 249:386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体（又はランダムクローンｃＤＮＡ）の大きなライブラリを標的分子に高い親和性で結合するこれらの配列について素早く効果的に分類することができる点にある。ファージでのペプチド（Cwirla,S.E.等 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378）又はタンパク質（Lowman,H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson,T.ら (1991) Nature, 352: 624; Marks,J.D.等 (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363）ライブラーリのディスプレイは、特異的に結合する特性を有するものについて無数のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている（Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668）。ランダム突然変異体のファージライブラリの分類は、多数の変異体を構築して増殖させる方法、標的レセプターを用いた親和性精製の方法、及び結合環境の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、及び同第５６６３１４３号。
【００９０】
ほとんどのファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用していたが、λファージディスプレイシステム（ＷＯ９５／３４６８３；米国特許第５６２７０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ren, Z-J.ら (1998) Gene 215:439; Zhu, Z. (1997) CAN 33:534; Jiang, J.等 (1997) can 128:44380; Ren, Z-J.等 (1997) CAN 127:215644; Ren, Z-J. (1996) Protein Sci. 5:1833; Efimov, V.P.等 (1995) Virus Genes 10:173）及びＴ７ファージディスプレイシステム（Smith,G.P.及びScott,J.K. (1993) Methods in Enzymology,217, 228-257; 米国特許第５７６６９０５号）も知られている。
現在、基礎的なファージディスプレイ構想の多くの他の改良及び変形が開発されている。これらの改良は、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリをスクリーニングするための、及びこれらのタンパク質が所望の特性をスクリーニングする潜在能力で機能性タンパク質をディスプレイするためのディスプレイシステムの能力を増強する。ファージディスプレイ反応のための組み換え反応手段について記載があり（ＷＯ９８／１４２７７）及びファージディスプレイライブラリは二分子相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）及び拘束性へリックスペプチドの特性（ＷＯ９８／２００３６）を分析及び制御するために使用されている。ＷＯ９７／３５１９６は、リガンドが標的分子に結合しうる第一の溶液、及び親和性リガンドが標的分子に結合しない第二の溶液とファージディスプレイライブラリを接触させて結合リガンドを選択的に単離する、親和性リガンドの単離方法を記載する。ＷＯ９７／４６２５１は、親和性精製抗体でランダムファージディスプレイライブラリをバイオパニングし、次いで結合ファージを単離し、続いてマイクロプレートのウェルでマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。黄色ブドウ球菌（Staphlylococcus aureus）タンパク質Ａの親和性タグとしての使用も報告されている（Li等, (1998) Mol Biotech., 9:187）。ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリでもよいコンビナトリアルライブラリを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリの使用を記載している。ファージディスプレイに用いる洗浄剤における使用に適した酵素を選択する方法はＷＯ９７／０９４４６に記載される。特異的に結合するタンパク質を選択する更なる方法は、米国特許第５４９８５３８号、同第５４３２０１８号、及びＷＯ９８／１５８３３に記載されている。
ペプチドライブラリの作製及びこれらのライブラリのスクリーニングの方法は、米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、同第５４９８５３０号、同第５７７０４３４号、同第５７３４０１８号、同第５６９８４２６号、同第５７６３１９２号、及び同第５７２３３２３号に記載される。
【００９１】
また、ここに記載するようにキメラＩＡＰインヒビターを生成するために他のポリペプチド配列と融合したＩＡＰインヒビターも取り込まれる。ショウジョウバエタンパク質ANTENNAPEDIAの研究により三つめの螺旋状ドメインの１６アミノ酸が細胞膜を越えて転座しており細胞質内に挿入していることを発見した (Prochiantz  A., (1996) Curr. Opinion Neurobiol. (5):629-34, Derossi等, (1998) Trends Cell Biol. (8) 84-87)。このペプチドはペネトラチン(Penetratin)(RQIKIWFQNRRMKWKK-NH2 (SEQ ID NO:7))と命名された。細胞膜転座が起こるメカニズムはまだ定義されていないが、分解することなく細胞質からANTENNAPEDIAペプチドが回収されることとその低細胞毒性であることにより、細胞に作用しうるキメラ分子を生成するために他のペプチド配列に融合して、活性を損なうことなく簡単に内部移行しうることが示される。このようなキメラ分子は、化学的結合反応が不要であることに有益性があり、キメラは直接的合成又はプラスミド発現ベクターへの挿入の何れかによる。さらに、ペネトラチン配列は修飾、例としてビオチン化又はリン酸化を加えて融合させ得ることにも有用性がある。さらに、エピトープタグ配列を加えることにより抗体を用いたキメラ分子回収を亢進することができる。ペネトラチン／ＳＭＡＣ融合を合成し、ＩＡＰとの相互作用を成功裏に示す(Arnt等, (2002) Jour. Bio. Chem. 277 (46) 44236-44243)。Arnt等はＳＭＡＣの４〜８アミノ酸をペネトラチン配列に融合し、ビオチン化転位を加えた。３０分のインキュベーション後、ＳＭＡＣ／ペネトラチン融合オリゴペプチドをストレプトアビジン−アガロースにより回収し、結合分子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製し、免疫ブロット法により分析した。この実験によりＳＭＡＣ／ペネトラチン融合ポリペプチドは試験した細胞系のＸＩＡＰ及びｃＩＡＰ１への結合を示した。さらに、この研究班はＳＭＡＣ／ペネトラチン融合オリゴペプチドがカスパーゼ活性が増強するにつれてＩＡＰの効果的阻害剤として働くことを証明した。ペネトラチンはここで明確に記載するように、内部移行することが立証された他のオリゴペプチド、ＴＡＴ転写因子、Ｈｅｒｐｅｓ、ＶＰ２２、ＦＧＦ−２及びラクトフェリンも又、組み込まれる。
【００９２】
小有機分子
ＩＡＰインヒビターは、ここに記載されるようなＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドに対し、好ましくは特異的に結合する、ここに定義されるようなオリゴペプチド以外の有機分子である。ＩＡＰインヒビター小有機分子は既知の方法（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５号参照）を用いて同定され、化学的に合成されうる。有機分子であるＩＡＰインヒビターは、通常、約２０００ダルトンの大きさ未満であり、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトンの大きさであり、ここに記載される様なＩＡＰポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する能力のあるこのような有機分子は、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定されうる。この点において、ポリペプチド標的に結合する能力のある分子の有機分子ライブラリを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５号参照）。ＩＡＰインヒビターは、例えばアルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバミン酸塩、炭酸塩、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホン酸、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアン酸塩、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、酸塩化物等であり得る。
【００９３】
所望の特性を有するＩＡＰインヒビターのスクリーニング
ＩＡＰポリペプチドに結合するオリゴペプチド及び有機分子を生成する技術を、上記にて記載した。所望するような、所定の生物学的特性を有する抗体、オリゴペプチド又は有機分子をさらに選択することができる。
ＩＡＰインヒビターの成長阻害効果を、例えば、内因的に、又はＩＡＰ遺伝子による形質移入後に、ＩＡＰポリペプチドを発現する細胞を用いる当該分野で周知の方法によって評価することができる。好ましくは、このような形質移入はＭＬ−ＩＡＰキメラを用いて行われる。例えば、適切な腫瘍細胞株及びＩＡＰ形質移入細胞は、数日間（例えば、２−７）、種々の濃度のＩＡＰインヒビターで処理し、クリスタル・バイオレット又はＭＴＴで染色、又は幾つかの他の比色アッセイによって分析し得る。増殖を測定する他の方法は、ＩＡＰインヒビターの存在下又は非存在下で処理した細胞の３Ｈ-チミジン取り込みを比較することによる。処理の後、細胞を収集し、ＤＮＡへ取り込まれた放射能をシンチレーションカウンターで定量化した。適切なポジティブコントロールには、細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体、オリゴペプチド又は小有機分子でその選択した細胞株を処理することが含まれる。インビボでの成長阻害は、当該分野で知られている種々の方法で確かめることができる。好ましくは、腫瘍細胞は、ＩＡＰポリペプチドを過剰発現するものである。好ましくは、ＩＡＰインヒビターは、ある実施形態では約０．５から３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、未処理腫瘍細胞と比べて約２５−１００％、より好ましくは約３０−１００％、そしてさらにより好ましくは約５０−１００％又は７０−１００％のＩＡＰポリペプチド発現腫瘍細胞のアポトーシスをインビトロ又はインビボで引き起こす。
【００９４】
細胞死を誘発するＩＡＰインヒビターを選択するために、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー又は７ＡＡＤの取込みにより示される膜インテグリティの損失度合いを対照と比較して求める。ＰＩ取込みアッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の不在下で行われる。ＩＡＰポリペプチド発現腫瘍細胞を、培地のみ、又は適切なＩＡＰインヒビターを含有する培地でインキュベートする。細胞を３日間インキュベートする。各処理に続いて、細胞を洗浄し、細胞凝塊除去のために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２ｘ７５チューブ(チューブ当たり１ｍｌ、処理グループ当り３チューブ)に等分する。次いで、チューブへＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を与える。サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(登録商標）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(登録商標）セルクエスト(CellQuest)ソフトウェア(Becton Dickinson)を使用して分析してもよい。ＰＩ取込みによって測定されるような、統計的に有意なレベルの細胞死を誘発するＩＡＰインヒビターは、細胞死誘発ＩＡＰインヒビターとして選択することができる。
関心のあるＩＡＰポリペプチド上のＢＩＲドメインへ結合するＩＡＰインヒビターを選択するために、AnalystTM HT 96-384 (Molecular Devices Corp.) 等の偏光装置が用いられる。蛍光偏光親和性測定器の試料は、50mM Tris（pH 7.2）、120mM NaCl、1%ウシグロブリン及び0.05%オクチルグルコシド等の偏光緩衝液に５-カルボキシフルオレセイン結合ペプチドを最終濃度３〜５ｎＭになるように添加して調製する。インキュベーション工程の後、９６穴黒色ＨＥ９６プレート(Molecular Devices Corp.)上で反応液を標準的なカットオフフィルタを用いて蛍光性色素(lex = 485 nm; lem = 530 nm)を測定する。見かけのＫｄ値をＥＣ５０値から求めることができる。阻害定数（Ｋｉ）は以前詳述されているように決定することができる(Keating等, (2000) Proceedings of SPIE: In vitro diagnostic instrumentation Cohn, G.E., Ed. p128-137)。
【００９５】
免疫リポソーム
ここで開示されている抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体は、免疫リポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は生物膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号；及び１９９７年１０月２３日に公開の国際公開９７／３８７３１に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
関心のある抗体が結合したＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド上のエピトープに結合する抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを実施することができる。既知の抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体のように、試験抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子が同じ部位又はエピトープと結合するならば、このアッセイを確定するために用いることができる。あるいは、又は付加的に、エピトープマッピングを、当該分野で周知の方法によって行うことができる。例えば、接触残基を同定するために、例えばアラニンスキャンニングによって抗体配列を変異させることができる。この変異体抗体は、適切なフォールディングを確かめるために、最初にポリクローナル抗体との結合について試験される。異なる方法では、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの異なる領域と一致するペプチドを、試験抗体群又は試験抗体及び特徴付けられた又は既知のエピトープを有する抗体による競合アッセイで用いることができる。
【００９６】
抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ)
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開８１／０１１４５を参照)を活性な抗癌剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素へ抗体をコンジュゲートすることによって、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えば国際公開８８／０７３７８及び米国特許第４９７５２７８号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に変換するようにプロドラッグへ作用し得る任意の酵素が含まれる。
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを変換させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(Neuberger等, Nature 312:604-608[1984])。
【００９７】
ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド
本発明は、本出願でＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（部分及び完全長）が同定され単離された。
当業者であれば、本技術分野で常套的な方法を用いて寄託されたクローンの配列決定を行うことにより、これらクローンの実際のヌクレオチド配列を容易に決定することができる。予想されるアミノ酸配列は、常套的な技術を用いてヌクレオチド配列から決定できる。
【００９８】
抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体及びＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド変異体
ここに記載した抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体及びＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドに加えて、抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体及びＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド変異体も調製できると考えられる。抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体及びＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド変異体は、コード化ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することによって、及び／又は所望の抗体又はポリペプチドを合成することによって調製できる。当業者は、アミノ酸変化がグリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などの抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体の翻訳後プロセス又はＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの翻訳後プロセスを変え得るのを理解するであろう。
ここに記載した抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体及びＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号に示す保存的及び非保存的変異に関する技術及び指針のいずれかを用いて作成することができる。変異は、結果として天然配列抗体又はポリペプチドと比較してアミノ酸配列の変化を生じる、抗体又はポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよい。場合によっては、変異は、抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体又はＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの一つ又は複数のドメインにおける、少なくとも一つのアミノ酸の他の任意のアミノ酸との置換による。どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失され得るかを確かめる指針は、抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体又はＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの配列を既知の相同タンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内で生じたアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換すること、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果であるとすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内であり得る。許容され得る変異は、配列にアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、生じた変異体を完全長又は成熟天然配列によって示される活性に関して試験することによって確かめられる。
【００９９】
抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体及びＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド断片がここで提供されている。そのような断片は、例えば完全長天然抗体又はタンパク質と比較した時に、Ｎ末端又はＣ末端で切断しているか、又は内部残基を欠いている可能性がある。具体的には、これら残基は、本明細書に記載するような置換されたＢＩＲドメインを含みうる。ある断片は、抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体又はＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの所望される生物学的活性にとって必修ではないアミノ酸残基を欠く。
抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体及びＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド断片は、多くの従来技術のいずれかによって調製してもよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法には、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基で確定した部位でタンパク質を切断することが知られた酵素によってタンパク質を処理することで、又は適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによって抗体又はポリペプチド断片を生成することが含まれる。さらにその他の好適な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望の抗体又はポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することが含まれる。ＤＮＡ断片の所望の末端を確定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体及びＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド断片は、天然抗ＩＡＰ抗体又はＩＡＰポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【０１００】
特定の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換の項目で表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より実質的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
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【０１０１】
ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの機能の実質的修飾は、（ａ）置換領域のＭＬ−ＩＡＰキメラの骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は分子疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の１つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、又はより好ましくは、残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ変異体ＤＮＡを作成することもできる。
【０１０２】
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
ＭＬ−ＩＡＰキメラの適切なコンフォメーションを維持することに関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐために、概してセリンと置換され得る。逆に、ＭＬ−ＩＡＰキメラの安定性を向上させるために、それにシステイン結合（複数でも）を加えてもよい。
【０１０３】
特に好ましい型の置換変異体は、親ＭＬ−ＩＡＰキメラの一又は複数の残基の置換を含む。一般的に、更なる開発のために得られた変異体は、それらが生成された親ＭＬ−ＩＡＰキメラと比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を生成する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性成熟が含まれる。簡潔に言えば、ＭＬ−ＩＡＰキメラ接触部位を変異させて該部位にアミノ酸置換を生成させる。このように生成されたＭＬ−ＩＡＰキメラ変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として一価形態で表示される。ファージ表示変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変の候補領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、ＭＬ−ＩＡＰキメラ結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。加えて、ＭＬ−ＩＡＰキメラ／ＩＡＰインヒビター複合体の結晶構造を分析して、ＩＡＰインヒビターとＭＬ−ＩＡＰキメラＢＩＲドメインとの接点を同定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここで詳しく記述した技術による置換の候補である。そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つＭＬ−ＩＡＰキメラを更なる開発のために選択することができる。
【０１０４】
宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315(1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【０１０５】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌（E. coli）、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium）、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【０１０６】
ＭＬ−ＩＡＰキメラは、特にグリコシル化が必要ない場合に、細菌で産生させることができる。大腸菌での産生が、より迅速でより費用効率的である。細菌でのタンパク質の発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号（Carter等）、米国特許第５７８９１９９号（Joly等）、及び翻訳開始部位（ＴＩＲ）及び発現と分泌を最適化するシグナル配列を記載している米国特許第５８４０５２３号（Simmons等）を参照のこと。これら特許は、ここに参考文献として取り入れられている。発現の後、ＭＬ−ＩＡＰキメラは、大腸菌細胞ペーストから可溶性分画へ分離し、精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＭＬ−ＩＡＰキメラコード化ベクターの適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９８５年５月２日公開の欧州特許第１３９３８３号）；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)（米国特許第４９４３５２９号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983]）、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ１２４２４）、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ１６０４５）、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４１７８）、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６５００）、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（欧州特許第４０２２２６号）；ピシア・パストリス(Pichia pastoris)（欧州特許第１８３０７０号； Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)（欧州特許第２４４２３４号）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許第３９４５３８号）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日公開の国際公開９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びアスペルギルス・ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【０１０７】
グリコシル化ＭＬ−ＩＡＰキメラの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエＳ２及びヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコ等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々の形質移入用のウィルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ−１変異株、カイコＮＰＶのＢｍ-５株が公に入手でき、このようなウィルスは、本発明に係るウィルスとして、特に、ヨトウガ細胞の形質移入のために使用してもよい。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59 (1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）である。
宿主細胞は、ＭＬ−ＩＡＰキメラの上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
【０１０８】
複製可能なベクターの選択及び使用
ＭＬ−ＩＡＰキメラをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＭＬ−ＩＡＰキメラは直接的に組換え手法によって生成されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生成される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＭＬ−ＩＡＰキメラ−コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２１７９号)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１４６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１０９】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしており、例えばバシリのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子がある。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＩＡＰインヒビター−コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファンで成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【０１１０】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＭＬ−ＩＡＰキメラ−コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, (1978) Nature, 275:615； Goeddel等, (1979) Nature, 281:544］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, (1980) Nucleic Acids Res., 8:4057; 欧州特許第３６，７７６号］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer等, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまた抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体又はＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, (1980) J. Biol. Chem., 255:2073］又は他の糖分解酵素［Hess 等, (1968) J. Adv. Enzyme Reg., 7:149；Holland, (1978) Biochemistry, 17：4900］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【０１１１】
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＭＬ−ＩＡＰキメラ転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開の英国特許第２２１１５０４号)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【０１１２】
より高等の真核生物によるＭＬ−ＩＡＰキメラをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＭＬ−ＩＡＰキメラコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＭＬ−ＩＡＰキメラをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＭＬ−ＩＡＰキメラの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第１１７０６０号；及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
【０１１３】
宿主細胞の培養
本発明のＭＬ−ＩＡＰキメラを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン（商品名）薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１１４】
この発明は、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド（ＩＡＰインヒビター）の影響を防ぐ物質を同定する化合物のスクリーニング方法を含む。アンタゴニスト剤候補のスクリーニングアッセイを設計し、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドと結合又は複合する化合物を同定する。このようなスクリーニングアッセイには、特に小分子剤候補の同定に適したキメラライブラリのハイスループットスクリーニングに従うアッセイを含む。
本アッセイは様々な形態で実行することができ、従来技術において特徴付けの済んでいる、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞に基づくアッセイを含む。
【０１１５】
アンタゴニストのアッセイは全て、候補薬とＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドが相互作用するのに適した条件下で、そのような相互作用に十分な時間に亘り、それら２つの成分を接触させる必要がある点で共通している。
結合アッセイでは、相互作用は結合であり、形成される複合体は反応混合物中で単離又は検出可能である。特定の実施形態では、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド又は候補薬は、共有又は非共有結合性の接着により、固定支持体上、例えばマイクロタイタプレートに固定される。非共有結合性の接着は通常、固体表面をＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド溶液でコーティングし、乾燥させることによって行う。或いは、固定するＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドに特異的な固定抗体、例えばモノクローナル抗体を使用して、それを固体表面に係留することができる。このアッセイは、固定の構成要素、例えば係留した構成要素を含むコーティング表面に、検出可能なラベルで標識した非固定構成要素を追加することによって行う。反応が完了したら、反応しなかった構成要素を例えば洗浄により除去し、固体表面に係留された複合体を検出する。最初から固定されていない構成要素が検出可能なラベルを有している場合、表面上に固定されたラベルが検出されるということは、複合が起こったことを示す。最初から固定されていない構成要素がラベルを有していない場合、例えば固定された複合体に特異的に結合する抗体を標識して用いることにより、複合を検出することができる。
【０１１６】
アンタゴニストのアッセイを行うために、特定の活性についてスクリーニングする化合物と一緒にＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドを細胞に添加することができ、化合物がＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの存在下において対象となる活性を阻害することができる場合、その化合物がＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドに対するアンタゴニストであることが示される。或いは、競合阻害アッセイに適した条件下で、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドとアンタゴニスト候補をＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドと混合することにより、アンタゴニストを検出することができる。ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドは、例えば放射能によって標識することができ、よって競合相手に結合したＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチド分子の数を使用してアゴニスト候補の効果を決定することができる。
アンタゴニストの候補には、ＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドのＢＩＲドメインに結合し、それによりＭＬ−ＩＡＰキメラポリペプチドの正常な生物学的活性を遮断するＭＬ−ＩＡＰキメラインヒビターを含む。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
【０１１７】
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害性薬、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤のようなその機能を高める薬剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【実施例】
【０１１８】
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書全体の中で特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
実施例１：ＭＬ−ＩＡＰキメラ
これまでのＸＩＡＰ−ＢＩＲ３ドメインの構造及び変異原性分析により、Ｓｍａｃ及びカスパーゼ９の結合部位は重なり合ってはいるが、同一ではないことが分かっている（Liu等、(2000) Nature 408(6815):1004-8; Sun等、(2000) J Biol Chem 275(43):33777-81; Wu等、(2000) Nature 408(6815):1008-12）。例えば、３つの突然変異Ｗ３１０Ａ、Ｅ３１４Ｓ、及びＨ３４３Ａはそれぞれカスパーゼ９の活性阻害を無くすことが示されており（Sun等、(2000) J Biol Chem 275(43):33777-81）、これらの残基がカスパーゼ９に直接接触することが示唆されている。一方、これら３の突然変異のうち２つ（Ｗ３１０Ａ及びＥ３１４Ｓ）は、蛍光標識したＳｍａｃペプチドへの結合を有意に低減する（Liu等、(2000) Nature 408(6815):1004-8）。Ｓｍａｃ又はＳｍａｃを主成分とするペプチドとの複合体におけるＸＩＡＰ−ＢＩＲ３ドメインの構造分析により、ＸＩＡＰ残基Ｔｒｐ３１０及びＧｌｕ３１４がＳｍａｃ結合部位の一部を形成する一方、Ｈｉｓ３４３が５番目のα螺旋体のＣ末端に位置してＳｍａｃ結合部位から離れていることが分かっている（Liu等、(2000) Nature 408(6815):1004-8; Wu等、(2000) Nature 408(6815):1008-12）。これと一貫して、Ｈ３４３Ａ突然変異は、野生型親和性を持ち、Ｓｍａｃを主成分とするペプチドに結合する（Liu等、(2000) Nature 408(6815):1004-8）。
ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲとＸＩＡＰ−ＢＩＲ３の間の配列同一性が最も小さい領域（これらＢＩＲドメインの構造部分では、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲの残基Ｇｌｙ７８−Ｓｅｒ１７１）は、ＸＩＡＰのＨｉｓ３４３を含むＣ末端α螺旋体に対応する（図３）。対照的に、Ｓｍａｃペプチド結合部位を規定する残基は、２つのＢＩＲドメインの間で高度に保存されている。それぞれを３次構造のレベルで分解すると、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３は、ペプチド結合部位を含め、非常に類似した構造を示す（Franklin等、(2003) Biochemistry 42:8223-8231）。特に、配列保存を欠くものの、螺旋−５のＢＩＲドメインへの詰め込みは類似している。ＸＩＡＰと比べ、ＭＬ−ＩＡＰによるカスパーゼ９活性の阻害効果が３００分の１である(図４、表７)理由が、２つのタンパク質間で異なる、螺旋−５における残基であるかどうかを確認するため、キメラタンパク質コンストラクトを作製した。
【０１１９】
ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ（受け入れ番号BIR7_HUMANのアミノ酸６３〜１７９）をｐＥＴ１５ｂベクター（Novagen（登録商標））にサブクローニングし、上述のようにして細菌を発現させた（Franklin等、(2003) Biochemistry 42:8223-8231）。次いで、次のベクター、ｐｅｔ１５ｂＭＬＢＩＲを２工程式ＰＣＲに基づく方法で修飾し、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧを生成した。まず、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲのアミノ酸１６０〜１７９をＸＩＡＰ−ＢＩＲ３のアミノ酸３３６〜３４８（受け入れ番号BIR4_HUMAN）で置換し、ｐｅｔ１５ｂＭＬＸＢＩＲ３を作製した。次に、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲのＳｅｒ１５０をＧｌｙに変異導入し、ｐｅｔ１５ｂＭＬＸＢＩＲ３ＳＧを作製した。ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧをコードするＤＮＡ配列を図１に示す（配列番号１）。ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧの翻訳されたアミノ酸配列と、下線で示すＸＩＡＰ−ＢＩＲ３残基を図２に示す（配列番号２）。
また、ｐｅｔ１５ｂＭＬＢＩＲベクターを修飾し、ＭＬＸＢＩＲ３及びＭＬＸＢＩＲ３ＳＧと同数のアミノ酸を有するＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲのＣ末端切断バージョンを製造した。元のＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲコンストラクト（ＭＬＢＩＲ）、本作業で使用するＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲのＣ末端切断変異体（ＭＬＢＩＲ−Ｑ）、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ／ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３キメラタンパク質（ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ）、及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３のアミノ酸配列を整列させたものを図３に示す。ｐｅｔ１５ｂＭＬＸＢＩＲ３ＳＧで形質転換した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）からなる培地１リットルを、１ｍＭのＩＰＴＣを用いて、30℃で４時間に亘り５０μＭの酢酸亜鉛の存在下で導入した。細胞をペレットに取り、緩衝液Ａ（トリス（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、ＮａＣｌ３００ｍＭ、β−メルカプトエタノール５ｍＭ、ＰＭＳＦ０．５ｍＭ、ベンズアミジン２ｍＭ）中においてイミダゾール５ｍＭとともに５０ｍｌ／ｌで再懸濁した。細胞をホモジナイズし、微小流動化し、遠心分離した。可溶化液をＮｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen（登録商標））に通し、３００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ａ中で溶出した。最後に、タンパク質を、トリス（ｐＨ７．６）５０mＭ、ＮａＣｌ２００ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭ、ＰＭＳＦ０．５ｍＭ、ベンズアミジン２ｍＭ、酢酸亜鉛５０μＭを含む緩衝液中でSuperdex（登録商標）７５ゲル濾過（Pharmacia）カラムに通した。タンパク質を濃縮し、−80℃で保存した。ＭＬＢＩＲ−Ｑ及びＭＬＸＢＩＲ３の試料を同様に調製した。このようにして調製したタンパク質を結晶化及び結合実験に使用した。
【０１２０】
実施例２：組換えタンパク質の生成
残基３０４〜３０６のＡｌａ置換を有するΔＣＡＲＤ（カスパーゼ補充ドメイン）ヒトカスパーゼ９（最初の１３８残基を欠く）を上記のようにして作製した（Boatright等、(2003) Mol Cell 11: 529-541）。ＸＩＡＰの第３のＢＩＲ（残基２５２〜３４８）を上記のようにして調製した（Sun等（2000）J Biol Chem 275(43): 33777-81）。
Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯのアミノ酸５６〜２３９を含むＰＣＲ生成物（受け入れ番号SMAC_HUMAN）を、C末端Ｈｉｓ６融合を生成するｐｅｔ２１ｂ＋（Novagen）のＸｂａｌ／Ｘｈｏｌ部位にクローニングした。Ｐｅｔ２１ｂＳｍａｃを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Stratagene）に形質転換した。一晩おいた培養物を１：１００に希釈し、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを有するLB培地中において強く振盪しながらＡ６００が０．８になるまで３７℃で成長させた。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、１ｍＭの最終濃縮物に添加し、培養物を１６℃で一晩成長させた。細胞ペレットを、５ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ａ（トリス（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、ＮａＣｌ３００ｍＭ、ＰＭＳＦ０．５ｍＭ、ベンズアミジン２ｍＭ、β−メルカプトエタノール５ｍＭ）に再懸濁し、氷の上に３０分間置いた。細胞をホモジナイズし、微小流動化し、１５，０００ｒｐｍで４５分間遠心分離した。上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagen（登録商標））に充填し、１０ｍＭのイミダゾールを含む１０カラム容量の緩衝液Ａで洗浄し、３００ｍＭのイミダゾールを含む１０カラム容量の緩衝液Ａで溶出した。Ｓｍａｃタンパク質を含む画分をプールし、濃縮し、Superdex（登録商標）２００サイジングカラムに充填した。タンパク質を、１カラム容量からトリス（ｐＨ７．６）５０ｍＭ、ＮａＣｌ３００ｍＭ、ＰＭＳＦ０．５ｍＭ、ベンズアミジン２ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭに溶出した。Ｓｍａｃタンパク質を含む画分をプールし、トリス（ｐＨ７．６）５０ｍＭ、ＰＭＳＦ０．５ｍＭ、ベンズアミジン２ｍＭ、及びＤＴＴ５ｍＭを含む緩衝液を３回交換して透析した。透析した試料をQ-Sepharose（登録商標）ＦＦカラム（Pharmacia）に充填し、トリス（ｐＨ７．６）５０ｍＭ、ＰＭＳＦ０．５ｍＭ、ベンズアミジン２ｍＭ、及びＤＴＴ５ｍＭの緩衝液中０〜１ＭのＮａＣｌ１０カラム容量勾配に溶出した。完全長ＭＬ−ＩＡＰプラスＮ末端Ｈｉｓ６−タグをコードするｃＤＮＡを、ｐＥＴ１５ｂ（＋）発現ベクター（Novagen）にクローニングした。ＭＬ−ＩＡＰは大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに発現した。ＭＬ−ＩＡＰの発現は、Ａ６００＝０．５で５時間に亘り０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。タンパク質は、ＮｉＳＯ４をチャージしたキレート化Sepharose（登録商標）（Pharmacia）を製造者の指示に従って用いた親和性クロマトグラフィーにより精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判断したところ、溶出されたＭＬ−ＩＡＰタンパク質の精度は９５％よりも大きかった。精製タンパク質のタンパク質濃度は、Edelhochの関係（Edelhoch, (1967) Biochemistry 6:1948-1954）から計算された分子吸収係数に基づいて、２８０ｎｍにおける吸光度から決定した。
【０１２１】
実施例３：カスパーゼ９阻害とペプチド結合
コンストラクトＭＬＸＢＩＲ３によるカスパーゼ９の阻害は、同じ長さの野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ、ＭＬＢＩＲ−Ｑの５倍程良好であるが、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３によるカスパーゼ９の阻害と比べるとその７０分の１に過ぎない。これらのデータは、Ｃ末端螺旋−５の外側のＸＩＡＰ−ＢＩＲ３に、ＭＬ−ＩＡＰに存在しない、他の重要なカスパーゼ９結合決定要因が存在する可能性が高いことを示している。Analyst（登録商標）HT 96-384（Molecular Devices Corp.）で偏光実験を行った。蛍光偏光親和性測定のため、偏光緩衝液（トリス（ｐＨ７．２）５０ｍＭ、ＮａＣｌ１２０ｍＭ、ウシグロブリン１％、ＤＴＴ５ｍＭ、及びオクチルグルコシド０．０５％）中最終濃度５μＭのＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ、ＭＬＢＩＲ−Ｑ、ＭＬＸＢＩＲ３、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ又は１０μＭのＸＩＡＰ−ＢＩＲ３から開始し、最終濃度５ｎＭの５−カルボキシフルオレッセイン抱合型ＡＶＰＦＡＫ（５−ＦＡＭ）Ｋ（Ｈｉｄ−ＦＡＭ）（配列番号３）まで、１：２の段階希釈を加えることにより、試料を調製した。９６ウェルブラックＨＥ９６プレート（Molecular Devices Corp.）におけるフルオレッセインフルオロフォア（λｅｘ＝４８５ｎｍ；λｅｍ＝５３０ｎｍ）用標準カットオフフィルタを用いて室温で１０分間のインキュベーションを行った後で反応を読み取った。タンパク質濃度の関数としてフルオレッセイン偏光値をグラフ化し、Kaleidagraph（登録商標）ソフトウェア（Synergy software, Reading, PA）を用いて４つの変数を含む方程式にデータを当てはめることにより、パラメータＥＣ５０値を得た。ＥＣ５０値から見かけ上のＫｄ値を決定した。
５ｎＭのＨＩＤ−ＦＡＭプローブと、１：３で段階希釈したＳｍａｃ−９ｍｅｒペプチド（ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ）（配列番号４）又は野生型成熟Ｓｍａｃタンパク質アンタゴニストを含むウェルに対し、偏光緩衝液中３００μＭの濃度から、０．２μＭのＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ又はＢＩＲキメラコンストラクト、或いは０．５μＭのＸＩＡＰ−ＢＩＲ３タンパク質を添加することにより、競合実験を行った。１０分間のインキュベーションの後、試料の読み取りを行った。アンタゴニスト濃度の関数として蛍光偏光値をグラフ化し、Kaleidagraph（登録商標）ソフトウェア（Synergy software, Reading, PA）を用いて４変数の方程式にデータを当てはめることによりＩＣ５０値を得た。ＩＣ５０値からアンタゴニストの阻害定数（Ｋｉ）を決定した（Keating et al., (2000) Putting the pieces together: contribution of fluorescence polarization assays to small-molecule lead optimization. Proceedings of SPIE: In-Vitro Diagnostic Instrumentation）。
【０１２２】
カスパーゼ９阻害定数の決定：無塩カスパーゼ緩衝液（ＰＩＰＥＳ２０ｍＭ、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、ＣＨＡＰＳ０．１％及びショ糖１０％（ｗ／ｖ）（ｐＨ７．２））中において、３７℃で１５分間、組換えΔＣＡＲＤカスパーゼ９（アッセイにおける最終濃度：３００ｎＭ）を前もって活性化した。これに続き、酵素を用いて３７℃で２０分間、一定の濃度範囲のインヒビターを前もって活性化した。Ａｃ−ＬＥＨＤ−ＡＦＣ（最終濃度：１００μＭ）の添加によりアッセイを開始し、ｆｍａｘ蛍光プレートリーダー（Molecular Devices）を用いて、励起波長４０５ｎｍ及び発光波長５１０ｎｍで３０分間動力学的に測定した。反応混合物は３７℃にサーモスタット制御した。インヒビター［Ｉ］の各々のＫｉ値を、阻害されなかった基質加水分解率（ｖ０）及び阻害率（ｖｉ）から決定し、よって（ｖ０／ｖｉ）−１対［Ｉ］によりＫｉ（ａｐｐ）、即ち基質の存在下における平衡阻害定数を求めた（Salvesen及びNagase, (1989) Proteolytic enzymes: A practical approach. R. J. Beynon及びJ. S. Bond. Oxford, IRL Press: 83-104）。
ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３とカスパーゼ９の複合体について最近報告された結晶構造（Shiozaki et al., (2003) Mol Cell 11: 519-527）により、螺旋−５とペプチド結合部位からの残基に加えて、ＸＩＡＰ中の螺旋−３のＣ末端とその直後のループからの残基もカスパーゼ９に接触することが分かった。ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３のこの領域に同定される重要な接触のうち、Ｇｌｙ３２６はＭＬ−ＩＡＰにおいて保存されていない（対応する残基はＳｅｒ１５０）。このＧｌｙ残基がＸＩＡＰ−ＢＩＲ３中でＧｌｕに突然変異することにより、おそらくはＸＩＡＰカスパーゼ９界面における立体的衝突の導入により、カスパーゼ９阻害が失われた（Shiozaki等、(2003)Mol Cell 11: 519-527）。Ｓｅｒ１５０の側鎖がカスパーゼ９に対するＭＬＸＢＩＲ３の結合を妨害しているかどうかを決定するために、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３に見られるようにこの残基をＧｌｙ残基で置換した追加的コンストラクトを作製した（図３）。このコンストラクト、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧは、正確に測定するには小さすぎる見かけ上のＫｉを持つカスパーゼ９を阻害することが分かった（＜＜１ｎＭ）。よって、このコンストラクトは、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３（Ｋｉ（ａｐｐ）＝１３ｎＭ）又はＭＬ−ＩＡＰ（Ｋｉ（ａｐｐ）＝３〜５μＭ）よりカスパーゼ９阻害能力が高い（図４、表７）。
表７：  カスパーゼ９阻害とＢＩＲドメインのペプチド結合親和性
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【０１２３】
実施例４：カスパーゼ９の結合
カスパーゼ９及びＦｌａｇでタグを付けたＢＩＲドメインタンパク質又はベクターを用いて、２９３Ｔ細胞を一過性に形質移入した。４０時間後、ＮＰ−４０溶解緩衝液（トリス１２０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍ、１％のＮＰ−４０、ＤＴＴ１ｍＭ及びプロテアーゼインヒビター反応混液）中において細胞を溶解させ、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて可溶化液を免疫沈降（ＩＰ）した。次いで、抗カスパーゼ９及び抗Ｆｌａｇ抗体を用いて試料をウェスタンブロット法を行った。ＭＬＸＢＩＲ３及びＭＬＸＢＩＲ３ＳＧキメラタンパク質がカスパーゼ９を阻害するメカニズムに対する理解を深めるため、細胞中のカスパーゼ９への結合を調査した。過剰発現すると、カスパーゼ９は自己触媒的プロセシングを受け、ＸＩＡＰ及びＭＬ−ＩＡＰ  ＢＩＲドメインと物理的に相互作用するプロセシング型となる。従って、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲはプロセシング型カスパーゼ９を免疫共沈降するが、その酵素原前駆体は免疫共沈降しない。ウェスタンブロット法により、Ｓ１５０Ｇ突然変異並びにＸＩＡＰ−ＢＩＲ３のＣ末端タンパク質を有するＭＬＸＢＩＲ３ＳＧは、Ｓ１５０Ｇ突然変異を含まない野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ又はＭＬＸＢＩＲ３と比べて、カスパーゼ９結合が有意に効率的に行われていることが分かった（図５）。従って、ＭＬＸＢＩＲ３Ｓのカスパーゼ９結合の効率は、この分解レベルにおいて、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３の効率と類似していると思われる。
【０１２４】
実施例５：アポトーシスの抑制
レポータープラスミドｐＣＭＶ−βｇａｌ及びベクターコントロールのみ又はＢＩＲドメインコンストラクトの何れかを用いてＭＣＦ７細胞を一過性に形質移入した。形質移入に続き、細胞をドキソルビシン（アドリアマイシン；０．５μｇ／ｍｌ）に曝し、Ｘ-galで染色し、形質移入した細胞の生存数及び死滅数を数えることによりアポトーシスを評価した。アポトーシスの割合（％）は少なくとも４つの試料点の平均値を表し、３つの独立した実験の代表値である。ＭＬＸＢＩＲ３及びＭＬＸＢＩＲ３ＳＧキメラタンパク質がドキソルビシン誘発性のアポトーシスをブロックすることができるかどうかを判断するため、ＭＣＦ−７細胞にＢＩＲドメインタンパク質を一過性に発現させ、続いて細胞をドキソルビシンで処理した。アポトーシスの分析により、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧが、Ｓ１５０Ｇ突然変異を含まない野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ又はＭＬＸＢＩＲ３よりも、有意に効率的にドキソルビシン誘発性アポトーシスを抑制することが判明した（図６）。野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲよりもＭＬＸＢＩＲ３ＳＧの方がアポトーシスの抑制に効果的であるのは、カスパーゼ９の結合及び阻害が改善されているためである。
【０１２５】
実施例６：Ｓｍａｃの結合
ＭＬＸＢＩＲ３及びＭＬＸＢＩＲ３ＳＧキメラタンパク質は、成熟Ｓｍａｃと物理的に相互作用する。Ｆｌａｇでタグを付けたＳｍａｃ及びＭｙｃでタグを付けたＢＩＲドメインタンパク質又はベクターコントロールを用いて、２９３Ｔ細胞を一過性に形質移入した。４０時間後、ＮＰ−４０溶解緩衝液（トリス１２０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、１％のＮＰ−４０、ＤＴＴ１ｍＭ及びプロテアーゼインヒビター反応混液）中で細胞を溶解させ、抗Ｍｙｃ抗体を用いて可溶化液を免疫沈降（ＩＰ）させた。次いで試料を抗Ｆｌａｇ及び抗Ｍｙｃ抗体でウェスタンブロットした。ＦＬ−Ｓｍａｃは完全長Ｓｍａｃタンパク質を表す。
ＭＬＸＢＩＲ３及びＭＬＸＢＩＲ３ＳＧキメラタンパク質へのＳｍａｃの結合を検討するため、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ、ＭＬＸＢＩＲ３、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３、又はベクターコントロールを用いてＳｍａｃを同時発現させた。過剰発現した時点で、ＳｍａｃはＮ末端５５アミノ酸が切断された成熟形態にプロセシングされた（図７）。ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３、並びにＭＬＸＢＩＲ３及びＭＬＸＢＩＲ３ＳＧキメラタンパク質と成熟Ｓｍａｃとの会合を免疫沈降によって示したところ、図７に示すように相互作用の効率は類似していた。
【０１２６】
実施例７：ＢＩＲドメインへのＳｍａｃの結合の定量化
ＢＩＲドメインへのＳｍａｃの結合を定量化するため、実施例３に記載の蛍光偏光に基づく競合アッセイにより、Ｈｉｄを主成分とする５−カルボキシフルオレッセイン標識したペプチド（Ｈｉｄ−ＦＡＭ）をプローブとして用いて、成熟Ｓｍａｃ（ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ）（配列番号４）のＮ末端の９残基に対応するペプチド及び成熟Ｓｍａｃタンパク質の親和性を決定した。蛍光偏光に基づくアッセイによって決定した、５−カルボキシフルオレッセインで標識したＨｉｄ−Ｆａｍの、ＢＩＲドメイン、ＭＬＢＩＲ、ＭＬＢＩＲ−Ｑ、ＭＬＸＢＩＲ３、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ、及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３への結合のＫｄ値を表７に列挙する。各ＢＩＲドメインに対するＨｉｄ−ＦＡＭプローブの結合親和性を、蛍光偏光に基づくアッセイを用いて直接決定し、その結果を図８のグラフに示す。キメラＢＩＲドメインコンストラクトに結合するＨｉｄを主成分とするペプチドのＫｄ値は、野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲコンストラクト（２０〜３０ｎＭ、表７）に対する結合について求められた値と類似しており、これはキメラ置換によりＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲのペプチド結合部位が乱れていないことを示す。同様に、ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（配列番号４）ペプチド又は成熟Ｓｍａｃに結合するＭＬＸＢＩＲ３ＳＧのＫｉ値は、同じ長さの野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲコンストラクト（ＭＬＢＩＲ−Ｑ）について決定された値と基本的に同じであり、それよりもやや長いＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲコンストラクト（ＭＬＢＩＲ）と比較したとき、実験不確定度の範囲内であった（表７）。これらのデータは更に、キメラＢＩＲドメイン上のＳｍａｃ結合部位が、野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲの同部位と同一であることを示唆するものである。従って、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧがＭＬＢＩＲよりも高い効率でアポトーシスを抑制することが観察されたことは、カスパーゼ９への結合及びカスパーゼ９の阻害が向上していることに起因すると考えることができる。
【０１２７】
実施例９：キメラ／複合体の共結晶化及び浸漬
ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ  ＢＩＲドメインコンストラクト中のＭＬ−ＩＡＰ及びＸＩＡＰ残基のカスパーゼ９結合及び阻害が向上していることの原因を更に理解するために、タンパク質をＳｍａｃ又はＨｉｄを主成分とするペプチドとの複合体に結晶化した。ペプチドＡＶＰＷ（Ｈｉｄ）（配列番号５）又はＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（配列番号４）（Ｓｍａｃ）と複合したＭＬＸＢＩＲ３ＳＧの結晶を結晶化液滴から除去し、Ｂｉｓトリス１００ｍＭ（ｐＨ６）、硫酸リチウム２００ｍＭ、３０％（ｘ／ｖ）のポリエチレングリコール３３５０、及び浸漬させた化合物０．５〜１．０ｍＭを含む安定剤の液滴（通常５μｌ）に移した。１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）又は適切なＤＭＳＯ中で凍結乾燥した粉末から化合物を再構成した。化合物の原液の濃度は３０〜５０ｍＭで、可能なときにＡ２８０により確認した。概して結晶は、蒸発を防ぐために同溶液のリザーバに液滴として、浸漬溶液中に一晩置いたが、化合物インヒビター１（表８）を３時間に亘り浸漬しても良好な結果が得られた。次いで１００ｍＭのＢｉｓ−トリス（ｐＨ６）、硫酸リチウム２００ｍＭ、３０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール３３５０、１５％（ｖ／ｖ）のエチレングリコール、及び浸漬段階に使用したものと同じ化合物０．５〜１．０ｍＭを含む結晶安定剤に結晶を移した。結晶安定剤（cryostabilizer）中で１５〜２０分後、結晶を液体窒素に凍結した。浸漬及び結晶安定剤溶液中のインヒビター化合物を適切なペプチドに置換した点を除き、親複合体の結晶（ＡＶＰＷ（配列番号５）及びＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（配列番号４））を同じようにして調製した。
様々なアンタゴニストの複合体のデータベースがスタンフォード大学のSynchrotron Radiation Laboratory, the Advanced Photon Source（Argonne, IL）、及びコーネル大学のHigh Energy Synchrotron Sourceに集められた。データの統計を表８に示す。野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲの既知の構造（鎖Ｅ、ＰＤＢ受け入れコード１ＯＸＮ）を検索モデルとして用いて、プログラムＡＭｏＲｅによる分子置換により解析対象の構造の１番目（インヒビター１）を解析した。インヒビター１の複合体構造の最初の精製では、モデルの野生型ＭＬ−ＩＡＰ残基をそれらのＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ相当物の置換、アンタゴニストのペプチド結合部位の電子密度への配置、タンパク質側鎖の電子密度内への再建を用いた。続く精製では、位置的アニソトロピックΒ因子の周期、及びプログラムＲｅｆｍａｃ５（Murshudov等、(1997) Acta Crystallogr D53: 240-255）で実行するＴＬＳ（translation-libration-screw）精製、プログラムＡｒｐ／ｗＡｒｐ（Perrakis等、(2001) Acta Crystallogr D57 (Pt 10): 1445-50）を用いた自動水添加及び除去、並びにプログラムＯ（Jones等、(1991) Acta Crystallogr A47: 110-9）を用いた手動モデル調節を用いた。
【０１２８】
１．８Åまで精製したインヒビター１複合体構造を標準として使用し、インヒビター３浸漬複合体で１．３Åになるまでデータを収集した。インヒビター３の構造は、位置的アニソトロピックＢ因子、及びＲｅｆｍａｃを用いたＴＬＳ精製により水素原子をriding位置（riding position）に加えて十分に精製した。順にＢｉｓ−トリス分子、エチレングリコール分子、及びリチウムイオンを多数の追加水分子と共にモデルに加えた。
インヒビター３複合体を他の全てのインヒビター構造の新規標準として使用した。インヒビター３複合体モデルからこれら構造の精製を開始し、１０Åの範囲でアンタゴニストと全ての水分を取り去った。無アンタゴニストモデルの精製の１回目を終了した後、新規アンタゴニストを差異電子密度に構築し、新規水分子を自動的に選択して新規複合体モデル全体を位置的アニソトロピックＢ因子、及びＴＬＳ精製を複数回行った。これまでに判明している全ての複合体の精製統計を表８にまとめる。
【０１２９】
ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧキメラ複合体結晶は空間群Ｐ４１２１２に属し、その単位細胞の寸法は概ね８７×８７×７４Åであり、図１１に示すように、結晶学的な非対象ユニット中にタンパク質−ペプチド複合体の２つのコピーを有する。これら２つのコピーは非常に類似しており、残基１００〜１０１を除いて１．４Åの全ての原子ＲＭＳＤを有し、結晶パッキングのために２つのコピーに異なる高次構造をとっている。何れの場合でも複合体の２つのコピーは異なる結晶パッケージ環境を有しているが、どちらのペプチド結合部位もバルク溶媒に曝されており、結合したペプチド自体又はペプチド結合部位の残基によって結晶パッキング接触はない。ＡＶＰＷ（配列番号５）ペプチドを別の化合物に交換する浸漬実験においては、ペプチドのコピー両方が同等の効率で置換される。
結晶化したＭＬＸＢＩＲ３ＳＧコンストラクトは、１３３の残基、即ち、トロンビン切断部位を有する２３の残基Ｈｉｓ６−タグとその後に続くＭＬ−ＩＡＰの残基６３−１７２を有し、残基１５０及び１６０〜１７２はそれらのＸＩＡＰ−ＢＩＲ３相当物で置換される。Ｈｉｓ６−タグとＭＬ−ＩＡＰの残基６３〜７７は、結晶の非対称ユニット中のＭＬＸＢＩＲ３ＳＧの両コピーにおいて乱れている。コピーＡの残基７８〜１６７及びコピーＢの残基７８〜１７２は、結合したアンタゴニストのようにきれいに並んでおり、電子密度マップにおいてその全ての原子が明瞭に目視できる。ＡＶＰＷ（配列番号５）ペプチドの全ての原子もきれいに整列しており、電子密度マップで可視であるが、野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲに見られるように、Ｓｍａｃを主成分とする９残基のペプチドの最初の４つの残基（ＡＶＰＩ）のみがきれいに整列している。ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧキメラタンパク質の構造は野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲのものと基本的に同一である（図１０）。２つの構造は、全ての残基で１．１Å（ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧのＡ鎖対野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲのＥ鎖）、及び残基１００〜１０１以外で０．６Åの、Ｃ−α原子上のＲＭＳＤで重ね合わされうる。Ｓ１５０Ｇ以外の全キメラ置換を含むＭＬＸＢＩＲ３ＳＧの螺旋５は、螺旋上の殆ど全ての残基がこの時点で野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲと異なっていても、残りのＢＩＲドメインと比較して動いていない。ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲのペプチド結合領域はキメラ置換の影響を受けず（図１１）、結合したペプチドに対して１０Åよりも近いキメラ残基の原子は無い。ペプチド結合部位の類似性を前提に予想されるように、２つの異なるタンパク質に結合した同じペプチド（ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（配列番号４）間の全ての原子ＲＭＳＤは０．２Å未満である。
【０１３０】
野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲと同様に、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧキメラは、他のＢＩＲドメイン、特にＸＩＡＰ−ＢＩＲ３（図８）に類似しており、０．５ÅのＣ−αＲＭＳＤ（ＰＤＢコード１Ｇ７３のＣ鎖対ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ構造のＡ鎖、残基１００〜１０１を除く）でＭＬＸＢＩＲ３ＳＧに重ね合わされうる。ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧのキメラＸＩＡＰ残基は、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３における場合と同様に、同じ側鎖高次構造をとる。螺旋５中の３つの残基が残りのＢＩＲドメインとの界面の大部分を形成しており、これら残基（Ｆ１６２Ｙ、Ｖ１６３Ｉ、Ｖ１６６Ｉ）のＭＬＸＢＩＲ３ＳＧキメラ置換は、界面の周縁に３つの重原子を加えるだけで、それらはいずれもこの螺旋のパッキングに影響しない。このように、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧの螺旋５は対応するＸＩＡＰ−ＢＩＲ３の螺旋と同じように見えるが、野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲのそれに相当する螺旋と全く同じように残りのドメインと集合する。
表８：データ収集及び精製統計
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【０１３１】
実施例１２：競合実験のＴＲ−ＦＲＥＴ分析
時分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）競合実験（Kolb等、(1996) J. Biomol. Screening 1 (4):203-210）をＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｒｅａｄｅｒ（登録商標）（Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc.）で実施した。Ｈｉｓ６でタグを付けたＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ３００ｎＭ、ビオチニン化したＳｍａｃペプチド（ＡＶＰＩＡＱＫ−ビオチン）２００ｎＭ、抗Ｈｉｓ６抗体−アロフィコシアニン（ＸＬ６６５）抱合体（CISBio International）５μｇ／ｍｌ、及びユーロピウム標識したストレプトアビジン（Perkin Elmer）２００ｎｇ／ｍｌを含む試薬反応混液を試薬緩衝液（トリス（ｐＨ７．２）５０ｍＭ、ＮａＣｌ１２０ｍＭ、ウシグロブリン０．１％、ＤＴＴ５ｍＭ及びオクチルグルコシド０．０５％）中で調製した。別の方法では、この反応混液は、抗Ｈｉｓ６抗体−アロフィコシアニン抱合体の代わりに濃度を最適化したユーロピウム標識した抗Ｈｉｓ６抗体（Perkin Elmer）を、及びユーロピウム標識したストレプトアビジンの代わりにストレプトアビジン−アロフィコシアニン抱合体（Perkin Elmer）を用いて作ることができる。試薬反応混液を室温で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、３８４ウェルのブラックＦＩＡプレート（Greiner Bio-One, Inc.）上で、反応混液をアンタゴニストの１：３段階希釈液に加えた（つまり、開始濃度５０μＭのＡＶＰＷ）。９０分間室温でインキュベートした後、ユーロピウムの励起（３４０ｎｍ）、並びにユーロピウム（６１５ｎｍ）及びアロフィコシアニン（６６５ｎｍ）の発光波長のためのフィルターを用いて蛍光を読み取った。データを計算し、６１５ｎｍにおけるユーロピウムの発光シグナルに対する６６５ｎｍにおけるアロフィコシアニンの発光シグナルの率を求めた（これらの率にはデータ操作を容易にするために因数１０，０００を乗じた）。結果として得られた値をアンタゴニスト濃度の関数としてグラフ化し、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（登録商標）ソフトウェア（Synergy Software, Reading, PA）を用いて４変数の方程式に当てはめた。アンタゴニストの効力の指標をＩＣ５０値から決定した。ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧへのＡＶＰＷ及びＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（Ｓｍａｃ  ９−ｍｅｒ）アンタゴニストペプチドの結合を示す例示的グラフを図１２に示す。また、上述したようにビオチニン化したＳｍａｃペプチドの代わりにビオチニン化したペプチドライブラリ又は小分子ライブラリをハイスループットスクリーニングとして用いてＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを使用した。
【０１３２】
実施例１３：ＮＭＲのキメラ
核磁気共鳴(NMR)に基づく方法は、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧに結合する化合物を同定し、薬剤発見過程におけるリード化合物として用いられるより強力なアンタゴニスト開発の助けとなりうる。特に、ＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲ（ＮＭＲによる構造的活性関係(structure-activity relationship by NMR))法及びその変法は薬剤発見ＮＭＲに広く適用されている(Shuker等, (1996) Science 274, 1531-1534)。
そのような方法は、タンパク質の化学変化を利用して、タンパク質上の結合部位を標的とした低親和性のリガンドを同定することに基づく。そのような化学変化マッピング法の必須条件は、二次元異核集積スペクトル（１５Ｎ，１Ｈ−  又は１３Ｃ，１Ｈ−集積スペクトルの何れか）におけるタンパク質共鳴の適度な分解能、及び好ましくは配列特異的な配置である。残念なことに、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧキメラタンパク質ドメインはＮＭＲ分光法に必要な濃度範囲に著しく集積しているため質の悪いＮＭＲスペクトルしか得られず、リガンドを同定するためのタンパク質化学変化マッピング法を行うことができない。
しかし、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲの結晶構造のＸ線分析（Franklin等 (2003) Biochemistry 42, 8223-8231）により既に同定された界面に特定のアミノ酸突然変異を導入することにより、溶液集積を低減することができ、よってＭＬＸＢＩＲ３ＳＧのＮＭＲスペクトルの質を向上させることができる。突然変異Ａｌａ７１Ｇｌｕ、Ａｌａ７３Ｇｌｕ、Ｐｈｅ８１Ｇｌｕ、及びＬｅｕ８９ＡｓｐをＭＬＸＢＩＲ３ＳＧのバックグラウンドに導入することにより、図１３に示すように、タンパク質（図１４、配列番号６）のスペクトルの質が劇的に向上しており、よってＮＭＲに基づくスクリーニングに使用可能である。
【０１３３】
実施例１４：抗体の調製
本実施例は、ＭＬ−ＩＡＰキメラに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製について説明する。
モノクローナル抗体の製造技術は従来技術において既知であり、例えばGoding、上掲に開示されている。使用できる免疫原には、精製したＭＬ−ＩＡＰキメラ、ＭＬ−ＩＡＰキメラを含む融合タンパク質、及び細胞表面上の組換えＭＬ−ＩＡＰキメラが含まれる。免疫原は、過度な実験を要さずに当業者によって選択できる。
Ｂａｌｂ／ｃなどのマウスを、完全なフロイントのアジュバントで乳化し、１〜１００マイクログラムの量を皮下注射又は腹腔内注入したＭＬ−ＩＡＰキメラ免疫原で免疫する。別法では、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT）で乳化し、動物の後ろ足の肉球に注射する。次いで１０〜１２日後に、選択したアジュバント中で乳化した追加的免疫原を用いて追加免疫する。またその後、数週間に亘って免疫化注射を追加してマウスを追加免疫することができる。眼窩の後ろから出血させることにより、マウスから周期的に血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡアッセイでの試験を行って抗ＭＬ−ＩＡＰキメラ抗体を検出する。
【０１３４】
適当な抗体力価が検出されたら、抗体について「陽性」の動物に最終的にＭＬ−ＩＡＰキメラを静脈内注入する。３〜４日後、動物を屠殺して脾臓細胞を回収する。次に脾臓細胞を、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手できるＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１などの選択されたマウス黒色腫細胞系に融合させる（３５％のポリエチレングリコールを使用）。融合により、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに播種し、よって非融合細胞、黒色腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増幅を抑制することができるハイブリドーマ細胞を生成する。
ハイブリドーマ細胞は、ＥＬＩＳＡによりＭＬ−ＩＡＰキメラに対する反応性をスクリーニングすることができる。ＭＬ−ＩＡＰキメラに対して所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」のハイブリドーマ細胞の決定は、従来技術の範囲内である。
陽性のハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入することにより、抗ＭＬ−ＩＡＰキメラモノクローナル抗体を含む腹水を生成することができる。別法では、ハイブリドーマ細胞を組織培養物のフラスコ又は回転ボトル内で成長させることができる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降を用い、その後ゲル排除クロマトグラフィーを行うことにより達成することができる。別法では、抗体のタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇへの結合に基づく親和性クロマトグラフィーを利用することができる。
【０１３５】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した実施物は、本発明の特定の態様の一つの例示として意図されており、機能的に等価なあらゆるコンストラクトがこの発明の範囲内にあるため、寄託されたコンストラクトにより、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の態様の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に請求の範囲を限定するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、特許請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ＭＬ−ＩＡＰキメラ（ＸＬＸＢＩＲ３ＳＧ）の核酸配列を示す。
【図２】ＭＬ−ＩＡＰキメラ（ＸＬＸＢＩＲ３ＳＧ）のアミノ酸配列を示す。ＸＩＡＰ  ＢＩＲドメイン、及びセリン１５０からグリシンへの突然変異を下線で示す。
【図３】ＭＬ−ＢＩＲ（野生型）、ＭＬ−ＢＩＲＱ（Ｃ末端が切断された野生型）、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ（ＭＬ−ＩＡＰキメラ。ＸＩＡＰ  ＢＩＲ３ドメインが挿入され、且つＳ１５０Ｇが変更されたＭＬ−ＩＡＰフレームワーク）、及びＸＩＡＰ（野生型）のアミノ酸配列の整列化を示す。
【図４】Ａ〜Ｆは、完全長ＭＬ−ＩＡＰ（ＭＬＩＡＰ−ＦＬ）、並びにキメラコンストラクトであるＭＬＸＢＩＲ３及びＭＬＸＢＩＲ３ＳＧによるカスパーゼ９の阻害を示す。各インヒビタータンパク質について、カスパーゼ９の加水分解率（ｖｉ；ＲＦＵ／分）をインヒビターの濃度に対してグラフ化した（図４Ａ−Ｃ）。また、（ｖ０／ｖｉ）−１とヒンビター濃度との相関を示すグラフをＭＬＩＡＰ−ＦＬとＭＬＸＢＩＲ３について示し（図４Ｄ−Ｆ）、それによりＫｉ（ａｐｐ）を導く。
【図５】ＭＬＢＩＲ、ＭＬＸＢＩＲ３、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧの免疫沈降を、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３との比較でウェスタンブロットにより示す。
【図６】ＭＬＢＩＲ、ＭＬＸＢＩＲ３、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ又はＸＩＡＰ−ＢＩＲ３を用いた形質移入によるドキソルビシン誘導性アポトーシスに対する抵抗性を示す。
【図７】成熟Ｓｍａｃと物理的に相互作用するときのＭＬＢＩＲ、ＭＬＸＢＩＲ３、及びＭＬＸＢＩＲ３ＳＧキメラタンパク質の免疫沈降を、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３との比較でウェスタンブロットにより示す。
【図８】蛍光偏光に基づくアッセイにより測定した、ＢＩＲドメイン、ＭＬＢＩＲ、ＭＬＢＩＲ−Ｑ、ＭＬＸＢＩＲ３、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３への、５−カルボキシフルオレッセイン標識したＨｉｄを主成分とするペプチド（Ｈｉｄ−ＦＡＭ）の結合を示す。Ｋｄ値を表７に示す。
【図９】ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ−ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ複合体結晶の非対称ユニットを示す。ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧタンパク質の両コピーをリボンで、両コピーのペプチドの順の部位を棒で表す。一複合体を（鎖ＡおよびＣ）左側に、タンパク質を薄い色及びペプチドを濃色で指す。他方の複合体を（鎖ＢとＤ）右側に示す。２つのＭＬＸＢＩＲ３ＳＧタンパク質に結合した亜鉛原子を球体で示す。２つの複合体を関連させている非結晶学的２倍軸を図の中央に示し、ページ面とおよそ直角をなす。
【図１０】３つのＢＩＲドメインペプチド複合体の比較である。図１０Ａには、ＡＶＰＩＡＱＫＳＥペプチドとのＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ複合体を示し、整列したキメラ部分（残基１５０及び１６０〜１６７）を黒いリボンで示す。図１０Ｂには、ＡＶＰＩＡＱＫＳＥペプチド（ＰＤＢ受け入れコード１ＯＸＱのＥ鎖及びＦ鎖）との野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ複合体を同じ方向で示し、図１０Ｃには、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３の同様の複合体（ＰＤＢ受け入れコード１Ｇ７３のＢ鎖の残基１〜４、及びＣ鎖の全て）を示す。
【図１１】キメラタンパク質ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧと野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲのペプチド結合部位を重ね合わせたものの立体図である。ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧキメラの背骨をリボンで示す。ペプチドの３．８Å内にある野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲとＭＬＸＢＩＲ３ＳＧの側鎖を線で示し、両複合体のＡＶＰＩＡＱＫＳＥペプチドのＶＰＩ部分も同様に示す。ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ−ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ複合体は図９の左側の複合体と同様に色付けし、タンパク質側鎖を薄灰色で、ペプチドを黒で示す。野生型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ複合体については、タンパク質とペプチドの両方を中程度の灰色で示し、細線で示す。
【図１２】時分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）競合アッセイにより測定した、ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧへのＡＶＰＷ及びＳｍａｃ  ９−ｍｅｒ（ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ）ペプチドの結合を示す。この実験により決定されるＡＶＰＷ及びＡＶＰＩＡＱＫＳＥのＩＣ５０値は、それぞれ０．１５及び３．４６μＭであった。
【図１３】それぞれＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−５００及びＤＲＸ−６００ＮＭＲ分光計において２５℃で取得された、（Ａ）リン酸カリウム（ｐＨ７．２）５０ｍＭ、塩化ナトリウム１５０ｍＭ中ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧ０．５ｍＭ、及び（Ｂ）Ｂｉｓ−トリスプロパン（ｐＨ７．０）５０ｍＭ中Ａｌａ７１Ｇｌｕ／Ａｌａ７３Ｇｌｕ／Ｐｈｅ８１Ｇｌｕ／Ｌｅｕ８９Ａｓｐ突然変異ＭＬＸＢＩＲ３ＳＧの１５Ｎ，１Ｈ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。
【図１４】ＮＭＲスペクトルを向上させるＭＬ−ＩＡＰキメラ（配列番号６）の配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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