(57)【要約】  本発明は、ニトリルヒドラターゼの活性、この酵素を活性化するヘルパータンパク質Ｐ１５Ｋの活性およびコバルトトランスポータの活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するロドコッカスからのポリヌクレオチドクラスタ、前記蛋白質をコードするヌクレオチド配列が増強されて存在する形質転換された微生物およびアミドをニトリルから製造するための形質転換された前記微生物の使用に関する。
2007529231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列のそれぞれ少なくとも９０％が配列番号２〜配列番号５中に含まれているアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する４つのポリペプチドをコードする４つのヌクレオチド配列を有する、ロドコッカス・オパクスから単離されたポリヌクレオチドクラスタであって、この場合ポリペプチドは、α−サブユニットおよびβ−サブユニット、ヘルパータンパク質Ｐ１５Ｋおよびコバルトトランスポータからなるニトリルヒドラターゼの活性を有する、前記ポリヌクレオチドクラスタ。
【請求項２】
次のグループ：
ａ）ヌクレオチド配列  配列番号１またはこの配列に対する相補的ヌクレオチド配列の位置１〜７０８からなるポリヌクレオチド、
ｂ）遺伝子コードの退化範囲内のａ）からの配列に相応する、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
ｃ）ストリンジェントな条件下で相補的配列ａ）またはｂ）とハイブリダイズするポリヌクレオチドおよび
ｄ）機能的に中立の同義突然変異を含む、ａ）、ｂ）またはｃ）からのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドから選択され、この場合このポリヌクレオチドは、ニトリルヒドラターゼのβ−サブユニットをコードする、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
次のグループ：
ａ）ヌクレオチド配列  配列番号１またはこの配列に対する相補的ヌクレオチド配列の位置７１０〜１３２７からなるポリヌクレオチド、
ｂ）遺伝子コードの退化範囲内のａ）からの配列に相応する、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
ｃ）ストリンジェントな条件下で相補的配列ａ）またはｂ）とハイブリダイズするポリヌクレオチドおよび
ｄ）機能的に中立の同義突然変異を含む、ａ）、ｂ）またはｃ）からのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドから選択され、この場合このポリヌクレオチドは、ニトリルヒドラターゼのα−サブユニットをコードする、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
次のグループ：
ａ）ヌクレオチド配列  配列番号１またはこの配列に対する相補的ヌクレオチド配列の位置１３２４〜１７３７からなるポリヌクレオチド、
ｂ）遺伝子コードの退化範囲内のａ）からの配列に相応する、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
ｃ）ストリンジェントな条件下で相補的配列ａ）またはｂ）とハイブリダイズするポリヌクレオチドおよび
ｄ）機能的に中立の同義突然変異を含む、ａ）、ｂ）またはｃ）からのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドから選択され、この場合このポリヌクレオチドは、補助蛋白Ｐ１５Ｋをコード化する、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
次のグループ：
ａ）ヌクレオチド配列  配列番号１またはこの配列に対する相補的ヌクレオチド配列の位置２０７６〜３１４６からなるポリヌクレオチド、
ｂ）遺伝子コードの退化範囲内のａ）からの配列に相応する、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
ｃ）ストリンジェントな条件下で相補的配列ａ）またはｂ）とハイブリダイズするポリヌクレオチドおよび
ｄ）機能的に中立の同義突然変異を含む、ａ）、ｂ）またはｃ）からのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドから選択され、この場合このポリヌクレオチドは、コバルトトランスポータをコードする、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
アミノ酸配列  配列番号２および配列番号３を有し、この場合このポリペプチドは、ニトリルヒドラターゼの活性を有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列  配列番号４を有し、この場合ポリペプチドは、ヘルパータンパク質Ｐ１５Ｋの活性を有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項８】
アミノ酸配列  配列番号５を有し、この場合このポリペプチドは、コバルトトランスポータの活性を有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項９】
ヌクレオチド配列  配列番号１またはその相補形からの位置１〜１３２７内での連続する少なくとも２０個のヌクレオチドを含有するプローブまたはプライマー。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列  配列番号１またはその相補形からの位置１３２４〜１７３７内での連続する少なくとも２０個のヌクレオチドを含有するプローブまたはプライマー。
【請求項１１】
ヌクレオチド配列  配列番号１またはその相補形からの位置２０７６〜３１４６内での連続する少なくとも２０個のヌクレオチドを含有するプローブまたはプライマー。
【請求項１２】
ストリンジェントな条件下で配列番号１からの位置１〜１３２７を有する補体とハイブリダイズし、この場合このストリンジェントな条件は、５０〜６８℃の温度で５×ＳＳＣ中での洗浄を含む、請求項２記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ストリンジェントな条件下で配列番号１からの位置１３２４〜１７３７を有する補体とハイブリダイズし、この場合このストリンジェントな条件は、５０〜６８℃の温度で５×ＳＳＣ中での洗浄を含む、請求項４記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ストリンジェントな条件下で配列番号１からの位置２０７６〜３１４６を有する補体とハイブリダイズし、この場合このストリンジェントな条件は、５０〜６８℃の温度で５×ＳＳＣ中での洗浄を含む、請求項５記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１から５までのいずれか１項および請求項１２から１４までのいずれか１項または請求項２、３または４記載または請求項１記載のものから選択された単数または複数のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
ヌクレオチド配列  配列番号２３からなるベクターｐＵＤ１５。
【請求項１７】
ヌクレオチド配列  配列番号２４からなるベクターｐＵＤ１６。
【請求項１８】
請求項１から５までのいずれか１項または請求項１１から１４までのいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを導入することによって形質転換されたかまたは形質移入された宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１５から１７までのいずれか１項に記載のベクターを導入することによって形質転換された宿主細胞。
【請求項２０】
ベクターｐＵＤ１５およびベクターｐＵＤ１６を導入することによって形質転換された宿主細胞。
【請求項２１】
宿主細胞がエンテロバクテリアケアエ（Enterobacteriaceae）科の細菌類、殊にエシェリキア（Escherichia）である、請求項１８または１９記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２２】
ロドコッカス、殊にロドコッカス・オパクスまたはこの酵素を含有する微生物に由来するニトリルヒドラターゼの製造法において、
ａ）請求項１から５までのいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を有する過剰発現された遺伝子を有する形質転換された微生物を、Ｃｏ2+  ０．１５〜４ｍＭ（mmol/l）の存在で、ニトリルヒドラターゼを形成する条件下で発酵させ、
ｂ）この酵素を微生物中に蓄積させ、
ｃ）この酵素を細胞から単離するかまたは
ｄ）微生物を回収し、酵素を有する休眠細胞として取得することを特徴とする、前記ニトリルヒドラターゼの製造法。
【請求項２３】
請求項１８から２１までのいずれか１項に記載の宿主細胞を使用する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
乾燥生物体量１ｍｇ当たり５０Uを上廻る比活性を有するα−アミノニトリルを変換する、ロドコッカス・オパクスに由来する組換えにより産生されたニトリルヒドラターゼ。
【請求項２５】
ニトリルからアミドを酵素により製造する方法において、次の工程
ａ）ニトリル基を含有する化合物を、少なくとも９０％が配列番号２および配列番号３から公知の配列を同一である、ニトリルヒドラターゼ活性およびアミノ酸配列を有するロドコッカス、殊にロドコッカス・オパクスからの酵素と反応させる工程、および
ｂ）アミドを分離する工程を有することを特徴とする、ニトリルからアミドを酵素により製造する方法。
【請求項２６】
精製された酵素および場合によっては固定された酵素を使用する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
酵素を有する休眠細胞を使用する、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
一般式
【化１】
2007529231.tif 000009
および        Ｒ′′−ＣＮ                （II）
〔式中、
Ｘは、ＯＨ、Ｈ、１〜４個のＣ原子を有するアルキルまたは殊にＮＨ2を表わし、
Ｒは、Ｈ、１〜１２個のＣ原子を有する飽和アルキル基、分枝鎖状または非分枝鎖状の場合によってはＮＨ2で置換された、１〜１２個のＣ原子を有するアルケニル基、３〜６個のＣ原子を有する分枝鎖状または非分枝鎖状のシクロアルキル基、アルキルチオ基で置換されたアルキレン基を表わし、この場合アルキルは、Ｃ1〜Ｃ3基に対応し、アルキレンは、二価のＣ3〜Ｃ8基に対応し、
Ｒ′は、Ｈまたは１〜３個のＣ原子を有するアルキルを表わし、
Ｒ′′は、６〜１２個のＣ原子を有し、場合によっては１または２個のアルキル基（Ｃ1〜Ｃ3）またはＣｌもしくはＦで置換された単核または二核の不飽和環、１〜６個のＣ原子を有するアルキルニトリルを表わす〕で示される化合物を相応するアミドに変換する、請求項２５から２７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
アミドまたはアミド含有溶液からバイオマスの細胞を分離し、アミドを鹸化させて相応する酸に変える、請求項２５から２８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
アミドもしくはアミド含有溶液からバイオマスの細胞を分離し、アミドをアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物により鹸化させて相応するカルボン酸の塩に変える、請求項２５から２８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ＭＨＡ−アミドを水酸化カルシウムで鹸化させ、カルシウム塩を取得する、請求項３０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリルヒドラターゼの活性、この酵素を活性化するヘルパータンパク質Ｐ１５Ｋの活性およびコバルトトランスポータの活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するロドコッカスからのポリヌクレオチドクラスタ、このポリヌクレオチドクラスタで形質転換された、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列が増強された量で存在する微生物およびアミドをニトリルから製造するための形質転換された前記微生物の使用に関する。
【０００２】
数多くのニトリルヒドラターゼは、既に刊行物中に記載されている（Synthetic applications of nitrilr-converting enzymes;Martinkova, Ludmila; Mylerova, Veronika; Current Organic Chemistry (2003), 7(13), 1279-1295）。毎年数千トン規模のアクリルアミドの製造のために、ニトリルヒドラターゼは、既に１９８３年以降使用されている。この生体触媒法は、化学的方法と比較して競争能力を有することが証明された（Enzymic synthesis of acrylamide: a success story not yet over; Kobayashi, Michihiko; Nagasawa, Toru; Yamada, Trends in Biotechnology (1992), 10(11), 402-408）。
【０００３】
アクリルニトリルの変換に使用されてよいニトリルヒドラターゼと共に、例えば特にメタクリルニトリルの変換に好適であるものも記載された（Pseudonocardia thermophilaのニトリルヒドラターゼおよび遺伝子のコード化およびニトリルをアミドに変換するための酵素の製造（欧州特許第７９０３１０号明細書）、３−シアノピリジン（ロドコッカスのニトリルヒドラターゼを用いてのアミドの製造方法）（ＷＯ  ２００２０５５６７０）または２−ヒドロキシニトリル、例えば２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル（ロドコッカスのニトリルヒドラターゼおよびアミドの製造における該酵素の使用）（ＷＯ  ２００２０７０７１７）および相応するα−ヒドロキシアミド、酸または酸塩へのα−ヒドロキシニトリルの酵素変換（ＷＯ  ９８３２８７２））。これに対して、２−アミノニトリルが効果的に変換されうるようなニトリルヒドラターゼは、これまで公知ではなかった。ロドコッカスsp. Ｃｒ４からのニトリルヒドラターゼは、例えば２−ヒドロキシニトリルを高い活性で変換するが、しかし、簡単な２−アミノニトリル、例えばアミノアセトニトリルを変換することはない（ＷＯ  ２００２０７０７１７）。
【０００４】
アミノニトリルの相応するアミドへの酵素変換は、アミノ酸への魅力的な合成法の可能性を与えてくれる。それというのも、２−アミノアミドは、簡単な方法で鹸化されうるからである（ＷＯ  ２００１０６０７８９）。この方法は、温和な条件下で極めて高い選択度で、化学的加水分解の際に生じる塩のような副生成物の形成なしに進行する。
【０００５】
代替的に、アミドとアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物とを反応させて、相応する酸の塩に変えることもできる。この方法は、水酸化カルシウムを使用する場合には、４−メチルチオ−α−ヒドロキシブチルアミド（ＭＨＡ−アミド）の変換のために特に好ましい。それというのも、カルシウム−ＭＨＡはメチオニンの代替生成物形として直接使用できるか、またはＭＨＡは飼料添加物として使用することができるからである。
【０００６】
しかし、汎用製品、例えばＤＬ−メチオニンを製造するためには、高い活性を有する生体触媒を提供することでは十分でない。活性を高めるために、増幅すべき遺伝子のために１つの発現系が確立されなければならない。例えば、なかんずくエシェリキア  コリ（Escherichia coli）, バシルス  シュードモナス（Bacillus Pseudomonas）, ピチア（Pichia）, サカロミケス（Sacharomyces） またはアスペルギルス（Aspergillus）において異質発現が提供される。それというのも、これらの微生物は、急速な成長を示し、極めて高い細胞密度を達成し、極めて高い発現レベルを可能にする有効な分子生物学的ツールであるからである（Lee SY (1996) High cell-density culuture of Escherichia coli. TIBTECH 14; 98-105; Riesenberg D, Guthke R (1999) High-cell-density cultivation of microorganisms Appl Microbiol Biotechnol 51:422-430）。
【０００７】
少なくとも３つの遺伝子は、ニトリルヒドラターゼの異質発現のために同時発現されなければならないことが公知である。更に、２つの構造遺伝子と共に、相応するヘルパー蛋白は、鉄依存性酵素ならびにコバルト依存性酵素のために増幅されなければならない（Nojiri M. et al., (1999) Functional expression of Nitrile hydratase in Escherichia coli. Requirement of a nitrile hydratase activator and a post-translational modification of a ligand cystein. J Biochem 125: 696-7-4およびOver-production of stereoselective nitrile hydratase from Pseudomonas putida 5B in Escherichia coli: activity requires a novel downstream protein, Wu, S.; Falle, R.D., Payne, M.S. Applied Microbiology and Biotechnology (1997), 48(6), 704-708）。
【０００８】
前記の３個の遺伝子と共に、構造遺伝子およびヘルパー蛋白の遺伝子と並んで遺伝子クラスタ中のロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous） Ｊ１において、コバルトトランスポータをコードするもう１つの遺伝子が見出された（A novel transporter involved in cobalt uptake, Komeda, Hidenobu et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1007), 94(1), 36-41）。ロドコッカス中の過剰発現ならびにＥ．ｃｏｌｉ 中の過剰発現は、培地からのＣｏ2+イオンの高められた吸収性を生じる。更に、３個の別のタンパク質と一緒のコバルトトランスポータの同時発現の場合には、構造遺伝子およびヘルパー蛋白の単独発現と比較して、よりいっそう低いＣｏ濃度の際に同じニトリルヒドラターゼ活性を達成しうることが示された。しかし、ロドコッカス中での前記効果は、コメダ他（Komeda et al.）によれば、４２μM未満の場合にのみ起こる。
【０００９】
欧州特許第０３６２８２９号明細書の記載から、コバルト塩の存在でのロドコッカス・ロドクラウスの発酵は、公知である。
【００１０】
本発明の課題は、殊にα−アミノニトリルをアミドに変換する、高い活性を有するニトリルヒドラターゼを入手可能にすることである。
【００１１】
本発明は、次の対象を含む：
１．アミノ酸配列のそれぞれ少なくとも９０％が配列番号２〜５中に含まれているアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する４つのポリペプチドをコードする４つのヌクレオチド配列を有する、ロドコッカス、殊にロドコッカス・ロドクラウスから単離されたポリヌクレオチドクラスタ、この場合ポリペプチドは、α−サブユニットおよびβ−サブユニット、ヘルパータンパク質Ｐ１５Ｋおよびコバルトトランスポータからなるニトリルヒドラターゼの活性を有する。
【００１２】
２．次のグループから選択されたポリヌクレオチド：
ａ）ヌクレオチド配列  配列番号１またはこの配列に対する相補的ヌクレオチド配列の位置１〜７０８からなるポリヌクレオチド、
ｂ）遺伝子コードの退化範囲内のａ）からの配列に相応する、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
ｃ）ストリンジェントな条件下で相補的配列ａ）またはｂ）とハイブリダイズするポリヌクレオチドおよび
ｄ）機能的に中立の同義突然変異を含む、ａ）、ｂ）またはｃ）からのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、この場合このポリヌクレオチドは、ニトリルヒドラターゼのβ−サブユニットをコードする。
【００１３】
３．次のグループから選択されたポリヌクレオチド：
ａ）ヌクレオチド配列  配列番号１またはこの配列に対する相補的ヌクレオチド配列の位置７１０〜１３２７からなるポリヌクレオチド、
ｂ）遺伝子コードの退化範囲内のａ）からの配列に相応する、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
ｃ）ストリンジェントな条件下で相補的配列ａ）またはｂ）とハイブリダイズするポリヌクレオチドおよび
ｄ）機能的に中立の同義突然変異を含む、ａ）、ｂ）またはｃ）からのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、この場合このポリヌクレオチドは、ニトリルヒドラターゼのα−サブユニットをコードする。
【００１４】
４．次のグループから選択されたポリヌクレオチド：
ａ）ヌクレオチド配列  配列番号１またはこの配列に対する相補的ヌクレオチド配列の位置１３２４〜１７３７からなるポリヌクレオチド、
ｂ）遺伝子コードの退化範囲内のａ）からの配列に相応する、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
ｃ）ストリンジェントな条件下で相補的配列ａ）またはｂ）とハイブリダイズするポリヌクレオチドおよび
ｄ）機能的に中立の同義突然変異を含む、ａ）、ｂ）またはｃ）からのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、この場合このポリヌクレオチドは、ヘルパータンパク質Ｐ１５Ｋをコードする。
【００１５】
５．次のグループから選択されたポリヌクレオチド：
ａ）ヌクレオチド配列  配列番号１またはこの配列に対する相補的ヌクレオチド配列の位置２０７６〜３１４６からなるポリヌクレオチド、
ｂ）遺伝子コードの退化範囲内のａ）からの配列に相応する、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
ｃ）ストリンジェントな条件下で相補的配列ａ）またはｂ）とハイブリダイズするポリヌクレオチドおよび
ｄ）機能的に中立の同義突然変異を含む、ａ）、ｂ）またはｃ）からのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、この場合このポリヌクレオチドは、コバルトトランスポータの活性を有するタンパク質をコードする。
【００１６】
６）アミノ酸配列  配列番号２および配列番号３を有する、２）または３）に記載のポリペプチド、この場合このポリペプチドは、ニトリルヒドラターゼの活性を有する。
【００１７】
７）アミノ酸配列  配列番号６を有する４）に記載のポリペプチド、この場合このポリペプチドは、ヘルパータンパク質Ｐ１５Ｋの活性を有する。
【００１８】
８）アミノ酸配列  配列番号５を有する５）に記載のポリペプチド、この場合このポリペプチドは、コバルトトランスポータの活性を有する。
【００１９】
９）ヌクレオチド配列  配列番号１またはその相補形からの位置１〜１３２７内での連続する少なくとも２０個のヌクレオチドを含有するプローブまたはプライマー。
【００２０】
１０）ヌクレオチド配列  配列番号１またはその相補形からの位置１３２４〜１７３７内での連続する少なくとも２０個のヌクレオチドを含有するプローブまたはプライマー。
【００２１】
１１）ヌクレオチド配列  配列番号１またはその相補形からの位置２０７６〜３１４６内での連続する少なくとも２０個のヌクレオチドを含有するプローブまたはプライマー。
【００２２】
１２）ストリンジェントな条件下で配列番号１からの位置１〜１３２７を有する補体とハイブリダイズする、２）および３）に記載の単離されたポリヌクレオチド、この場合このストリンジェントな条件は、５０〜６８℃の温度で５×ＳＳＣ中での洗浄を含む。
【００２３】
１３）ストリンジェントな条件下で配列番号１からの位置１３２４〜１７３７を有する補体とハイブリダイズする、４）に記載の単離されたポリヌクレオチド、この場合このストリンジェントな条件は、５０〜６８℃の温度で５×ＳＳＣ中での洗浄を含む。
【００２４】
１４）ストリンジェントな条件下で配列番号１からの位置２０７６〜３１４６を有する補体とハイブリダイズする、５）に記載の単離されたポリヌクレオチド、この場合このストリンジェントな条件は、５０〜６８℃の温度で５×ＳＳＣ中での洗浄を含む。
【００２５】
１５）１）〜５）および１２）〜１４）から選ばれたかまたは２）、３）および４）または５）に記載された、単数かまたは複数のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【００２６】
１６）配列番号１からの２）、３）および６）に記載の配列を有する、ヌクレオチド配列  配列番号２４からなるベクターｐＵＤ１５、この場合出発コドンｇｔｇは、ａｔｇに変化されている。
【００２７】
１７）５）からの配列を有する、ヌクレオチド配列  配列番号２５からなるベクターｐＵＤ１６、この場合出発コドンtｔｇは、ａｔｇに変化されている。
【００２８】
１８）１）〜５）および１２）〜１４）に記載のポリヌクレオチドを導入することによって形質転換されたかまたは形質移入された宿主細胞。この宿主細胞は、適当な安定性の発現系を有することが公知である真核生物または原核生物であることができる。
【００２９】
１９）１５）〜１７）に記載のベクターを導入することによって形質転換された宿主細胞。
【００３０】
２０）１８）または１９）に記載の形質転換された宿主細胞、この場合この宿主細胞は、エンテロバクテリアケアエ（Enterobacteriaceae）科の細菌類、殊にエシェリキア（Escherichia）である。
【００３１】
ベクターＤＮＡは、真核細胞又は原核細胞中に、公知の形質転換技術または形質移入技術により導入することができる。
【００３２】
"形質転換"、"形質移入"、"接合"及び"遺伝子導入"とは、異種ＤＮＡを導入するための先行技術により知られる処置に関連する。
【００３３】
同様に、本発明の対象は、ロドコッカス・オパクス、その完全な遺伝子または一部を含む相応する遺伝子バンクと、本発明による配列番号１からのポリヌクレオチドまたはその断片を有するプローブとをハイブリダイズさせることによりスクリーニングし、そして挙げられるポリヌクレオチド配列を単離することによって得られるポリヌクレオチド配列から主になっているポリヌクレオチドである。
【００３４】
本発明による配列を有するポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして、本発明によるタンパク質をコードする核酸あるいはポリヌクレオチドまたは遺伝子を全長で単離するかまたは本発明による遺伝子の配列と高い配列相似性を有する核酸あるいはポリヌクレオチドまたは遺伝子を単離するために適している。また該ポリヌクレオチドは、所謂"アレイ"、"マイクロアレイ"または"ＤＮＡチップ"上に適用することができ、そこで相応するポリヌクレオチドまたはそこから導き出される配列、例えばＲＮＡまたはｃＤＮＡの検出および決定がなされる。
【００３５】
更に、本発明による配列を有するポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で本発明によるタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡを作製することができるプライマーとして適している。
【００３６】
プローブまたはプライマーとして使用されるかかるオリゴヌクレオチドは、少なくとも２５または３０、有利には少なくとも２０、殊に有利には少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有する。同様に、少なくとも４０または５０のヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドが適している。場合によっては、少なくとも１００、１５０、２００、２５０または３００のヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドも適している。
【００３７】
"単離された"とは、その自然な環境から切り離されたことを意味する。
【００３８】
"ポリヌクレオチド"は、一般に、改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよいポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドを指す。
【００３９】
本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号１によるポリヌクレオチドまたはそこに含まれる断片ならびに、配列番号１によるポリヌクレオチドまたはそこに含まれる断片と少なくとも９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％同一であるものを包含する。
【００４０】
"ポリペプチド"とは、ペプチド結合を介して結合した２つ又はそれ以上のアミノ酸を有するペプチドまたはタンパク質を表わす。
【００４１】
本発明によるポリペプチドは、配列番号２〜４および配列番号６によるポリペプチドならびに、配列番号２〜４および配列番号６によるポリペプチドと少なくとも９１％、９５％、９７％または９９％同一であるものを包含する。
【００４２】
ポリヌクレオチド  配列番号１は、異なるタンパク質をコードする多数の個々の配列を有する。α−サブユニットのための配列とヘルパータンパク質Ｐ１５Ｋのための配列とは、重なり合っている。
【００４３】
ニトリルヒドラターゼのα−サブユニットおよびβ−サブユニットをコードする遺伝子は、活性のタンパク質を得るために共通に発現されなければならない。
【００４４】
配列番号２は、ニトリルヒドラターゼ活性を示すタンパク質のβ−サブユニットのアミノ酸配列を示し、配列番号３は、ニトリルヒドラターゼ活性を示すタンパク質のα−サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００４５】
配列番号２は、ヌクレオチド配列  配列番号１の位置１〜７０８から導き出され、配列番号３は、ヌクレオチド配列  配列番号１の位置７１０〜１３２７から導き出される。
【００４６】
所謂ヘルパータンパク質Ｐ１５Ｋのアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列  配列番号１中の位置１３２４〜１７３７に相応する配列番号６中に見出される。
【００４７】
ヘルパータンパク質は、ニトリルヒドラターゼを活性化し、前記酵素と一緒にニトリルヒドラターゼを形成する微生物中に存在していなければならない。
【００４８】
配列番号４は、コバルトトランスポータのアミノ酸配列を表わし、ヌクレオチド配列  配列番号１の位置２０７６〜３１４６から導き出される。
【００４９】
配列番号４中の出発コドンtｔｇは、PatentIN  Version3.1によってロイシンとして飜訳され、配列番号６中の出発コドンｇｔｇは、バリンとして飜訳される。正しくは、メチオニンと呼ばなければならない。
【００５０】
Ｅ．ｃｏｌｉ中のニトリルヒドラターゼ活性は、コバルトトランスポータの同時発現によって数倍上昇されることが見出された。これは、培地中の高いコバルト濃度が使用される場合にも当てはまり、この場合この濃度は、自然に発生する濃度を上廻る程度の大きさである。意外なことに、コバルトトランスポータの同時発現は、培地中の高いコバルト濃度に対して微生物の毒作用を生じるのではなく、僅かに上昇する細胞の選択度だけを生じる。
【００５１】
一般に、本発明による遺伝子クラスタを単離するために、最初に前記微生物の遺伝子ライブラリーは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で調製される。遺伝子ライブラリーの調製は、一般に公知の教科書およびマニュアル中に記載されている。例としては、Winnacker: Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutchland, 1990)またはSambrook等の教科書：Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)が挙げられる。極めてよく知られている遺伝子ライブラリーは、Kohara他（Cell 50, 495-508 (1987)）によってλ−ベクター中で調製されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２菌株W3110の遺伝子ライブラリーである。Bathe他（Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996）は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株ＮＭ５５４（Raleigh他, 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575）中でコスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ  Ｉ（Wahl他, 1987, Proceedings of the National Academy of Science USA, 84: 2160-2164）を用いて調製されたＣ． グルタミクム C.glutamicum ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリーを記載している。
【００５２】
Ｅ．ｃｏｌｉ中で遺伝子ライブラリーを製作するために、プラスミド、例えばｐＢＲ３２２（Bolivar, Life Science, 25, 807-818 (1979)）またはｐＵＣ９（Vieira他, 1982, Gene, 19: 259-268）が使用されてもよい。ホストとしては、特に制限欠陥および組換え欠陥を有するようなＥ．ｃｏｌｉ菌株が適している。このための1例は、Grant他（Proceedings of the National Academy of Science USA, 87 (1990) 4645-4649）によって記載された菌株DH5αmcrである。引続き、コスミドを用いてクローニングされた長いＤＮＡ断片は、例えばSanger他（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977）が記載しているように、配列決定に適したコモンベクターにサブクローニングされることができ、引続き配列決定されることができる。
【００５３】
更に、得られたＤＮＡ配列は、公知のアルゴリズム又は配列分析プログラムを用いて、例えばＳｔａｄｅｎ(Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986))、Ｍａｒｃｋ(Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988))によるプログラム、またはＢｕｔｌｅｒ(Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998))によるＧＣＧ−プログラムにより調査されてよい。
【００５４】
配列番号１の配列に含まれる配列の遺伝子コードの縮重によって得られたコーディングＤＮＡ配列も同様に本発明の要素である。同様に、前記の配列又はその一部とハイブリダイズするＤＮＡ配列も本発明の要素である。更に、当業界においては、タンパク質中での保存的アミノ酸置換、例えばグリシンとアラニンの置換またはアスパラギン酸とグルタミン酸の置換は、"同義突然変異"（"sense mutations"）として知られ、この置換は、タンパク質活性の根本的変化をもたらさず、すなわち機能的に中立である。更に、タンパク質のＮ−末端および／またはＣ−末端での変化が、その機能を実質的に損なわずまたはむしろ安定化することができることは、公知である。当業者であれば、これについての記載を、なかんずくBen-Bassat他（Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)）で、O'Regan他（Gene 77:237-251 (1989）で、Sahin-Toth他（Protein Sciences 3:240-247 (1994)）で、Hochuli他（Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)）で、および遺伝学と分子生物学の公知の教科書において見出す。
【００５５】
最後に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、配列番号１から得られるプライマーを使用して作製されるＤＮＡ配列は、本発明の要素である。この種のオリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも１５のヌクレオチドの長さを有する。
【００５６】
当業者は、ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列の同定の手引きを、とりわけベーリンガーマンハイムＧｍｂＨ社のマニュアル"フィルタハイブリダイゼーションのためのＤＩＧシステム利用者手引き（The DIG System Users Guide for Filter Hybridization）"（ドイツ・マンハイム在、１９９３年）において、そしてＬｉｅｂｌ他（International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260）で見出す。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施される、すなわち、プローブと目的配列、即ちそのプローブで処理されるポリヌクレオチドとが少なくとも９０％同一である場合にのみハイブリッドが形成される。洗浄工程を含むハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが、バッファー組成の変更、温度の変更および塩濃度の変更によって影響を及ぼされるかあるいは規定されることは、公知である。ハイブリダイゼーション反応は、洗浄工程と比較して相対的に低いストリンジェンシーで実施することが好ましい（Ｈｙｂａｉｄ社ハイブリダイゼーションガイド（Hybaid Hybridisation Guide）、Hybaid有限会社（Hybaid Limited）、英国・テディントン在、１９９６年）。
【００５７】
ハイブリダイゼーション反応のためには、例えば５×ＳＳＣバッファーは、約５０℃〜６８℃の温度で使用されてよい。この場合に、プローブは、プローブの配列に対して７０％未満の同一性を有するポリヌクレオチドともハイブリダイズすることができる。かかるハイブリッドは、あまり安定ではなく、そしてストリンジェントな条件下で洗浄によって取り除かれる。このことは、例えば塩濃度を２×ＳＳＣにまで低下させ、場合によっては次に０．５×ＳＳＣにまで低下させ、その際に温度を約５０℃〜６８℃に調整することによって達成することができる（フィルタハイブリダイゼーションのためのＤＩＧシステム利用者手引き（The DIG System Users Guide for Filter Hybridization）、ベーリンガーマンハイム社（ドイツ・マンハイム在、１９９５年））。場合によっては、塩濃度を０．１×ＳＳＣにまで低下させることが可能である。ハイブリダイゼーション温度を、約１〜２℃の幅で、５０℃から６８℃に段階的に上昇させることによって、使用されるプローブの配列と例えば少なくとも９０％〜９５％の同一性を有するポリヌクレオチド断片を単離することができる。更に、ハイブリダイゼーションについての手引きは、所謂キットの形で市場から入手することができる（例えばロシュ・ディアグノスティクス Roche Diagnostics ＧｍｂＨ社（ドイツ・マンハイム在）のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ、カタログ番号１６０３５５８）。
【００５８】
当業者によれば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたＤＮＡ配列の増幅のための手引きを、特に、Ｇａｉｔによるマニュアル:Oligonucleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)およびＮｅｗｔｏｎおよびＧｒａｈａｍによる:PCR(Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994)に見出す。
【００５９】
一般的に、良好に発現可能な遺伝子を低コピー数を有するベクター中に、よりいっそう弱い発現能力を有する遺伝子をよりいっそう高いコピー数および／または強力なプロモーターを有するベクター上でクローニングするように行われる。宿主細胞は、前記のベクターで形質転換されており、こうして該細胞は、出発生物と比較して、ニトリルヒドラターゼの形成をコードするヌクレオチド配列またはさらにタンパク質をコードするヌクレオチド配列の付加的なコピーを少なくともそれぞれ有する。
【００６０】
コバルトトランスポータをコードする遺伝子は、僅かな範囲内で、例えばα−サブユニットおよびβ−サブユニットおよびヘルパータンパク質Ｐ１５Ｋをコードするポリヌクレオチド配列よりも少ないコピー数、少なくとも1つのコピーより少ないコピー数のベクターを用いて発現することは、好ましいことが判明した。また、記載された遺伝子の異なる発現は、異なる強さのプロモーターを使用することによって達成されてもよい。
【００６１】
α−サブユニットおよびβ−サブユニットおよびヘルパータンパク質をコードするヌクレオチドは、有利に１つの共通のプロモーターまたは２つの別々のプロモーターと一緒に共通のベクター上にある。
【００６２】
こうして製作された形質転換されたかまたは組換えられた微生物は、同様に本発明の一部である。
【００６３】
ニトリルヒドラターゼ、ヘルパータンパク質Ｐ１５Ｋおよびコバルトトランスポータをコードする遺伝子を微生物において増強することによって、ニトリルヒドラターゼの産生向上がもたらされ、又はニトリルヒドラターゼの活性増大ももたらされることが見い出された。
【００６４】
概念"増強"とは、この関連において、微生物中で相応するＤＮＡによってコードされる１種またはそれ以上の酵素の細胞内活性を、例えば単数あるいは複数の遺伝子のコピー数を高めるか、強力なプロモーターを使用するか、または高い活性を有する相応する酵素をコードする遺伝子を使用し、場合によってはこれらの処置を組み合わせて、高めることを示している。
【００６５】
過剰発現の達成のために、構造遺伝子の上流にあるプロモーター領域および調節領域またはリボソーム結合部位を突然変異させることができる。同様に、前記構造遺伝子の上流に構成される発現カセットが作用する。誘導可能なプロモーターにより、この発現を、発酵によるアミノ酸産生の過程において上昇させることが付加的に可能である。ｍ−ＲＮＡの寿命の延長のための処置により、同様に前記発現は改善される。
【００６６】
更に、この酵素タンパク質の崩壊の防止により、同様に前記酵素活性は増強される。前記遺伝子または遺伝子構築物は、様々なコピー数を有するプラスミド中に存在するかまたは染色体に組み込まれ、増幅されてよい。更に、また、当該遺伝子の過剰発現は、この培地組成および培養操作の変更によって達成されてよい。
【００６７】
増強手段、殊に過剰の発現により、相応するタンパク質の活性または濃度は、一般に野生型タンパク質の活性または濃度あるいは本発明によるヌクレオチド配列で形質転換された微生物中のタンパク質の活性または濃度に対して少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％または５００％、最大１０００％までまたは２０００％まで上昇される。
【００６８】
本発明の別の対象は、互いに適合可能でありかる請求項２、３および４に記載の少なくとも1つのヌクレオチド配列または請求項４に記載のヌクレオチド配列を有する、選択された宿主菌株中で一般に自律的に複製可能なベクターを調製することである。
【００６９】
ベクターＤＮＡは、真核細胞または原核細胞中に、公知の形質転換技術により導入されてよい。
【００７０】
宿主生物としては、発現系のために挙げられる有利な微生物、例えばシュードモナス、ピチア、種々異なる酵母、サッカロマイセス、アスペルギルスまたはストレプトマイセス科、特に大腸菌が用いられる。同様に、ロドコッカス・ロドクラウス属の微生物が適している。
【００７１】
同様に、本発明の対象は、ロドコッカス、殊にロドコッカス・オパクスまたはこの酵素を含有する微生物に由来するニトリルヒドラターゼの製造法であり、この場合には、
ａ）請求項１から４までのいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を有する過剰発現された遺伝子を有する形質転換された微生物を、Ｃｏ2+  ０．１５〜４ｍＭ（mmol/l）、殊に０．３〜４mMの存在で、ニトリルヒドラターゼを形成する条件下で発酵させ、
ｂ）この酵素を微生物中に蓄積させ、
ｃ）この酵素を細胞から単離するかまたは
ｄ）微生物を回収し、酵素を有する休眠細胞として取得する。
【００７２】
組換えにより産生されたニトリルヒドラターゼは、乾燥生物体量１ｍｇ当たり５０Uを上廻る活性を有するα−アミノニトリルを変換する。
【００７３】
好ましくは、有利に可溶性塩として発酵液体培地に添加されるＣｏ2+  ０．５〜３．５mM、殊に０．７〜３mMの存在で発酵が実施される。
【００７４】
本発明により使用される微生物は、連続的にかまたは非連続的に回分法（バッチ培養）または流加回分法（流加法）または反復した流加回分法（反復流加法）において培養されてよい。公知の培養方法に関する概要は、Chmiel(Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))による教本またはStorhasによる教本(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))に記載されている。
【００７５】
使用すべき培地は、適当な方法で、前記のそれぞれの株の要求を満足しなくてはならない。種々の微生物の培地の記載は、American Society for Bacteriologyの教本"Manual of Methods for General Bacteriology"(Washington D.C., USA, 1981)に含まれている。
【００７６】
炭素供給源として、糖及び炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、澱粉およびセルロース、油脂、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびヤシ脂、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセリンおよびエタノール、および有機酸、例えば酢酸が使用されてよい。これらの物質は単独でかまたは混合物として使用されてよい。
【００７７】
窒素供給源として、窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粉および尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが使用されてよい。前記窒素供給源は、単独でかまたは混合物として使用されてよい。
【００７８】
燐供給源として、燐酸、燐酸水素カリウムまたは燐酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩が使用されてよい。更に、前記培地は、金属塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含有しなければならず、これらの金属塩は成長に必要である。最後に、必須栄養成長物質、例えばアミノ酸およびビタミンは、上述の物質と共に使用されてよい。上述の使用物質は、１回のバッチの形で培養物に添加してもよいし、適した方法で、この培養の間に供給されてもよい。
【００７９】
前記培養物のｐＨ調節のために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、またはアンモニア水、または酸性化合物、例えば燐酸または硫酸は、適当な方法で使用される。泡の発生の制御のために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルが使用されてよい。プラスミドの安定性の維持のために、前記溶媒には、適した選択的に作用する物質、例えば抗生物質が添加されてよい。好気的条件を維持するために、酸素または酸素含有混合物、例えば空気が前記培養物に導入される。
【００８０】
前記培養物の温度は通常は、１０℃〜４０℃、有利に１０℃〜３０℃である。この培養は、有利には少なくとも対数増殖期を経過するまで継続される。この目標は通常は、１０〜７０時間の間に達成される。
【００８１】
同様に、本発明の対象は、ニトリルからアミドを酵素により製造する方法であり、この方法は、次の工程を含む：
ａ）ニトリル基を含有する化合物を、ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス、殊にロドコッカス・オパクス反応させる工程、および
ｂ）場合によってはアミドを分離する工程。
【００８２】
１つの変法において、前記細胞は、回収され、洗浄され、緩衝液中に懸濁液としてｐＨ値５〜９、殊に６．８〜７．９で取り込まれる。休眠細胞の細胞濃度は、一般に１〜２５％、殊に１．５〜１５％に達する（湿分質量／ｖ）。前記細胞は、物理的または化学的方法により、例えばトルエンで、例えばWilms et al., J. Biotechnol., 86巻 (2001), 19-30に記載されているように、この変換すべきニトリル化合物がこの細胞壁を透過し、かつ生じたアミドが流出しうるように透過処理されていてよい。
【００８３】
生体触媒（全細胞触媒）は、顕著な安定性を示し、したがって１００ｇ／lを上廻る生成物濃度が達成されうる。
【００８４】
本発明によるニトリルヒドラターゼを細胞から公知方法により分離し、場合によっては精製し、ニトリルの反応に使用することも可能である。
【００８５】
また、本発明の対象は、一般式
【化１】
2007529231.tif 000003
および        Ｒ′′−ＣＮ                （II）
〔式中、
Ｘは、ＯＨ、Ｈ、１〜４個のＣ原子を有するアルキル、アリールまたは殊にＮＨ2を表わし、
Ｒは、Ｈ、１〜１２個のＣ原子を有する飽和アルキル基、分枝鎖状または非分枝鎖状の場合によってはＮＨ2で置換された、１〜１２個のＣ原子を有するアルケニル基、３〜６個のＣ原子を有する分枝鎖状または非分枝鎖状のシクロアルキル基、アルキルチオ基で置換されたアルキレン基を表わし、この場合アルキルは、Ｃ1〜Ｃ3基に対応し、アルキレンは、二価のＣ3〜Ｃ8基に対応し、
Ｒ′は、Ｈまたは１〜３個のＣ原子を有するアルキルを表わし、
Ｒ′′は、６〜１２個のＣ原子を有し、場合によっては１または２個のアルキル基（Ｃ1〜Ｃ3）またはＣｌもしくはＦで置換された単核または二核の芳香環、１〜６個のＣ原子を有するアルキルニトリルを表わす〕で示される化合物を相応するアミドに変換することを特徴とする方法である。
【００８６】
次のニトリルが有利に変換される：
飽和モノニトリル：
アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル、イソバレロニトリル、カプロニトリル、
飽和ジニトリル：
マロニトリル、スクシノニトリル、グルタロニトリル、アジポニトリル、
芳香族の非置換および置換のモノニトリルおよびジニトリル：
ベンゾニトリル、２，６−ジフルオロベンゾニトリル、フタロニトリル、イソフタロニトリル、テレフタロニトリル、
α−アミノニトリル：
α−アミノプロピオニトリル、α−アミノメチルチオブチロニトリル、α−アミノブチロニトリル、アミノアセトニトリル、天然アミノから導き出された全てのニトリル、α−アミノ−３，３−ジメチルプロピオニトリルおよびα−アミノ−２，３−ジメチルプロピオニトリル、
カルボキシル基を有するニトリル：
シアノ酢酸、
β−アミノニトリル：
３−アミノプロピオニトリル、
不飽和ニトリル：
アクリルニトリル、メタクリルニトリル、シアン化アリル、クロトノンニトリル、
α−ヒドロキシニトリル：
α−ヒドロキシ−ｎ−プロピオニトリル、α−ヒドロキシ−ｎ−ブチロニトリル、α−ヒドロキシ−イソブチロニトリル、α−ヒドロキシ−ｎ−ヘキサノニトリル、α−ヒドロキシ−ｎ−ヘプタノニトリル、α−ヒドロキシ−ｎ−オクチロニトリル、α，γ−ジヒドロキシ−β，β−ジメチルブチロニトリル、アクロレインシアノヒドリン、メタクリルアルデヒドシアノヒドリン、３−クロロラクトニトリル、４−メチルチオ−α−ヒドロキシブチロニトリルおよびα−ヒドロキシ−α−フェニルプロピオニル。
【００８７】
変換すべきニトリルの反応溶液中での濃度は、規定の範囲に制限されない。
【００８８】
基質による酵素活性の阻害を回避するために、ニトリルの濃度は、一般には、乾燥細胞質量としての生体触媒の量に対して、０．００１〜１０w/w％、殊に０．１〜２w/w％に維持される。基質は、変換開始時に全体を添加することもできるし、変換の進行中に連続的にかまたは非連続的に添加することもできる。
【００８９】
水性反応系中でニトリル化合物の溶解度が低すぎる場合には、溶解補助剤が添加されてよい。
【００９０】
しかしながら代替的に、この反応は、水／有機溶剤の二相系中で実施されてもよい。
【００９１】
微生物の細胞を酵素活性物質として使用する場合には、使用される細胞の量は、基質量に対して、乾燥細胞質量として有利には０．００１〜８w/w％である。
【００９２】
細胞物質の乾燥質量は、水分分析装置ＭＡ４５（Sartorius）を用いて測定される。
【００９３】
また、単離された酵素を、一般に知られる技術により固定化し、さらにこの形で使用することも可能である。
【００９４】
反応は、一般に、−５℃〜５０℃、特に０℃〜３０℃の温度および０．１〜１００時間の時間で実施される。
【００９５】
反応混合物の維持すべきｐＨ値は、酵素活性が損なわれない限りは一定の範囲に制限されていない。変換の後に、形成されたアミドは、反応溶液から公知の記載と同様に分離されかつ精製されてよい。
【００９６】
また、本発明の対象は、アミドまたはアミドを含有する溶液を、例えばバイオマスの細胞から分離し、このアミドを、鹸化させて相応する酸に変えるか、またはアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物を添加しつつ変換させて、相応の酸の塩に変える方法である。
【００９７】
好ましくは、ＭＨＡ−アミドは水酸化カルシウムで鹸化され、相応するカルシウム塩が単離される。
【００９８】
実施例
実施例１
ロドコッカス・オパクスからのニトリルヒドラターゼのクローニング
ロドコッカス・オパクスの染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｉｎＡＩ、ｐＳｔＩおよびＸｍａＩ（Roche）で消化し、断片を０．８％のアガロースゲル上で分離した。サザンブロット分析を標準法（例えば、Sambrook他, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989）により正電荷のナイロン膜（Hybond-N+, Amersham）上に実施した。ハイブリダイゼーションをＤＩＧマークプローブを用いて製造業者（Roche）の使用説明書に従って行なった。プローブを変性プライマー１Ｆおよび１Ｒを有するＰＣＲによりテンプレートとしてのゲノムＤＮＡを用いて製作した。プライマーは、βーサブユニットの相同領域から導き出されたものであり、この場合この相同領域は、種々のＮＨアーゼの配列を整列させることによって測定された。これらの配列は、データーベースから得られた。検出された約２．２ｋｂの大きさのＰｉｎＡＩ断片を単離するために、ＰｉｎＡＩで切断された、２〜２．５ｋｂのＤＮＡ断片を分取ゲル電気泳動により精製し、ＸｍａＩで切断されたベクターｐＵＣ１８（プロメガ）中に結紮し、この結紮混合物をＥ．ｃｏｌｉ JM109（プロメガ）中に形質転換した。プラスの形質転換体をコロニーハイブリダイゼーションプにより同じプローブで同定した。こうして得られたクローンは、βーサブユニットの遺伝子およびニトリルヒドラターゼのα−サブユニットの遺伝子の大部分を有する２２０６ｎｔのインサートを含有していた。
【００９９】
帰属できなかった配列を得るために、上記方法でプライマー２Ｆおよび２Ｒを用いて新しいプローブを製作し、このプローブをクローン化したＰｉｎＡＩ断片の３′末端でハイブリダイズした。テンプレートとしてｐＵＣ１８中でクローン化したＰｉｎＡＩ断片を使用した。前記プローブでのハイブリダイズ前に、上記膜から製造業者（Roche）の使用説明書に従って最初に色信号を除去し、ならびに第１のプローブを除去した。前記膜上で、第２のプローブを用いて約２ｋｂの大きさのＰｓｔＩバンドを検出した。上記の記載と同様に、相応するＤＮＡ断片をＰｓｔＩで開かれたベクターpUC18中でクローン化し、産生物をＥ．ｃｏｌｉ JM109中で形質転換し、プラスのクローンをコロニーハイブリダイゼーションにより同定した。ＰｓｔＩ断片は、１８８３ｎｔの大きさであり、ニトリルヒドラターゼのα−サブユニットの遺伝子の（３′−）部分、ヘルパータンパク質Ｐ１５Ｋの遺伝子およびコバルトトランスポータの遺伝子の（５′−）部分を含んでいた。
【０１００】
コバルトトランスポータ遺伝子の帰属できなかった配列を有するＤＮＡ断片をクローン化するために、プライマー３Ｆおよび３ＲおよびpUC18中でクローン化した、テンプレートとしてのＰｓｔＩ断片を用いて新しいプローブを製作し、このプローブをクローン化したＰｓｔＩ断片の３′−末端でハイブリダイズした。このプローブを用いて、同様に先に色信号および第２のプローブが除去された同じ膜上で約１．１kbの大きさのＸｍａＩバンドを検出した。相応するＤＮＡ断片をＸｍａＩで開かれたベクターpUC18中でクローン化し、産生物をＥ．ｃｏｌｉ JM109中で形質転換し、プラスのクローンをコロニーハイブリダイゼーションにより同定した。そのために、プライマー４Ｆおよび３Ｒで増幅されたプローブを使用した。ＸｍａＩ断片は、１７４７ｎｔの大きさであり、コバルトトランスポータの遺伝子の（３′−）部分を含んでいた。
【０１０１】
ニトリルヒドラターゼ、ヘルパータンパク質Ｐ１５Ｋおよびコバルトトランスポータのα−サブユニットおよびβーサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子クラスターの連続配列は、配列番号１に記載されている。
【０１０２】
実施例２
発現ベクターの構造
構造遺伝子をＥ．ｃｏｌｉのための公知の発現ベクター中でクローン化し、この場合挿入された遺伝子は、ラムノースプロモーターの制御下にある。付加的に、第２のラムノースプロモーターを挿入した。このために、βーサブユニットのための遺伝子を、制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのための切断個所を挿入するプライマー５Ｆおよび５Ｒで増幅させた。第２のラムノースプロモーターを、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのための切断個所を挿入するプライマー６Ｆおよび６Ｒで増幅させた。α−サブユニットのための遺伝子を、制限酵素ＮｃｏＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのための切断個所を挿入するプライマー７Ｆおよび７Ｒで増幅させた。タンパク質Ｐ１５Ｋのための遺伝子を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのための切断個所を挿入しかつ開始コドンをＧＴＧからＡＴＧに変えるプライマー８Ｆおよび８Ｒで増幅させた。こうして生成された発現ベクターは、ｐＵＤ１５と呼ばれる。
【０１０３】
制限地図は、図１に記載されており、配列は、配列番号２４に記載されている。
【０１０４】
コバルトトランスポータのための遺伝子をＥ．ｃｏｌｉのための別の発現ベクターにクローン化し、この場合挿入された遺伝子は、ラムノースプロモーターの制御下にある。このために、コバルトトランスポータをプライマー９Ｆおよび９Ｒで増幅させ、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのための切断個所を挿入し、開始コドンをＴＴＧからＡＴＧに変えた。こうして得られた発現ベクターは、ｐＵＤ１６と呼ばれる。
【０１０５】
制限地図は、図２に記載されており、配列は、配列番号２５に記載されている。
【０１０６】
発現プラスミドを、ドイツ微生物細胞培養コレクションＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）で寄託されている大腸菌ＤＳＭ１４４５９に形質転換した。
【０１０７】
プライマー
【表１】
2007529231.tif 000004
【０１０８】
遺伝子は、セグメント上に位置している：
ｐＵＤ１５：βーサブユニットの遺伝子：ｎｔ２５〜７３２，
α−サブユニットの遺伝子：ｎｔ９４９〜１５６６、
Ｐ１５Ｋの遺伝子：ｎｔ１５９２〜２００５、
ｐＵＤ１６：コバルトトランスポータの遺伝子：ｎｔ２５〜１０９５。
【０１０９】
実施例３
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳＭ１４５５９でのニトリルヒドラターゼの非相同発現
大腸菌ＤＳＭ１４４５９は、ドイツ連邦共和国特許第１０１５５９２８号明細書との関連で寄託された。
【０１１０】
ｐＤＵ１５で形質転換された細胞を、１ｍＭのＣｏＣｌ2および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地（ＭｉｌｌｅｒによるＬＢブイヨン、ＶＷＲ）中で３７℃で振盪しつつ増殖させた。ｐＵＤ１５およびｐＵＤ１６で形質転換された細胞を同様に成長させるが、しかし、培地は、付加的にクロラムフェニコール５０μg/mlを含有していた。その後に、細胞が少なくとも２のＯＤ６００を達成した後に、細胞をなお３回同じ培地中に接種した。１２〜１６時間後に、かかる量の前培養を主培養中に接種し、そのＯＤ６００を０．１とした。主培養の培養培地は、前培養の培養培地に相当したが、しかし、付加的に２ｇ／ＬのＬ−ラムノースを含有していた。細胞は、２２時間後に取得された。
【０１１１】
実施例４
酵素活性の測定
細胞を、実施例３の記載と同様に増殖させ、遠心分離によって培養培地から分離し、標準的バッファー（５０ｍＭの燐酸カリウムバッファー  ｐＨ７．５）中に再懸濁した。この細胞懸濁液５０μｌを、標準的バッファー７００μｌに添加し、反応の開始のために、ニトリルを標準的バッファー中に溶かした２００ｍＭ溶液２５０μｌと混合した。この場合に、細胞懸濁液中の細胞の濃度は、ニトリルが２０℃で１０分後に、５〜３０％まで変換されるように算定された。２０℃で１０分後に、半分に濃縮された燐酸２０μｌを添加することによって反応を停止させ、細胞を遠心分離によって分離した。
【０１１２】
【表２】
2007529231.tif 000005
【０１１３】
１ユニットの活性を、１マイクロモルのメタクリルニトリルが１分間変換してアミドとなる酵素量として定義した。比活性を乾燥生物体量１ｍｇ当たりのＵで記載する。
【０１１４】
この乾燥生物体量を水分分析装置ＭＡ４５（Sartorius）を用いて測定する。
【０１１５】
実施例５
ニトリルヒドラターゼα−サブユニット、βーサブユニットおよびタンパク質Ｐ１５Ｋをコードする遺伝子の同時発現
発現を実施例３の記載と同様に、プラスミドｐＵＤ１５を含む形質転換された菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳＭ１４４５９を用いて実施した。この細胞の比活性は、２３Ｕ／ｍｇ  BTMであった。
【０１１６】
実施例６
ニトリルヒドラターゼ、α−サブユニット、βーサブユニット、タンパク質Ｐ１５Ｋおよびコバルトトランスポータをコードする遺伝子の同時発現
発現を実施例３の記載と同様に、プラスミドｐＵＤ１５およびｐＵＤ１６を含む形質転換された菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳＭ１４４５９を用いて実施した。この細胞の比活性は、８１Ｕ／ｍｇ  BTMであった。
【０１１７】
実施例７
基質の特異性
種々のニトリルを実施例３の記載と同様にプラスミドｐＵＤ１５を含む形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＤＳＭ  １４４５９休眠細胞と反応させた。Ｎ−ホルミルバリンニトリルを用いて得られた比活性を１００％に等しいものとして設定した。別の活性をこれと比較して記載した。結果は、図３に記載されている。
【０１１８】
実施例８
Ｃｏ+2塩の存在での形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＤＳＭ  １４４５９の成長
プラスミドｐＵＤ１５のみまたはｐＵＤ１５およびｐＵＤ１６を含む形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＤＳＭ  １４４５９を実施例３の記載と同様に培養した。この場合、培地中のコバルト濃度を０．５mMから２mMへ変えた。２４時間後、培地の光学的密度を６００ｎｍで測定した。
【０１１９】
【表３】
2007529231.tif 000006
【０１２０】
高いコバルト濃度の場合にも細胞の成長に対する影響は僅かであることを確認することができることが判明した。
【０１２１】
実施例９
メチオニンニトリルとプラスミドｐＵＤ１５を含む形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＤＳＭ  １４４５９休眠細胞との反応
プラスミドｐＵＤ１５を含むＥ．ｃｏｌｉ ＤＳＭ  １４４５９細胞を実施例３の記載と同様に培養し、遠心分離した。湿量に対して細胞２．８ｇを５０mMの燐酸カルシウム緩衝液ｐＨ７．５  ４７．２ｍｌ中に再懸濁させ、メチオニンニトリルを２０℃で強力に攪拌しながら連続的に、反応中の濃度が如何なる時でも１５ｇ／lを超えないような速度で添加した。ｐＨは、７．５で一定に保持した。反応の追跡は、ＨＰＬＣを用いて、実施例４の記載と同様に実施した。３２０分後、ニトリル９．１ｇは、完全にアミド１０．４ｇに変換されていた。これは、１７６ｇ／lの濃度に相当する。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】プラスミドｐＵＤ１５を示す制限地図である略図。
【図２】プラスミドｐＵＤ１６を示す制限地図である略図。
【図３】Ｎ−ホルミルバリンニトリルの変換の際の活性と比較した種々のニトリルの変換の際の相対的比活性をグラフで示す略図。
【符号の説明】
【０１２３】
ｒｈａＰ  ラムノースプロモーター、  β  ニトリルヒドラターゼのβーサブユニットの遺伝子、  α  ニトリルヒドラターゼのα−サブユニットの遺伝子、  Ｐ１５Ｋ  ヘルパータンパク質Ｐ１５Ｋの遺伝子、  ｏｒｉ  複製の出所、  ｂｌａ  アンピシリンに耐性の遺伝子（βーラクタマーゼ）、  ｒｈａＰ  ラムノースプロモーター、  CoTrans  コバルトトランスポータの遺伝子、  ｏｒｉ  複製の出所、  Ｃｍｒ  クロラムフェニコールに耐性の遺伝子
【０１２４】
2007529231.tif 000007
【０１２５】
2007529231.tif 000008
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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