(57)【要約】  本発明は、モノクローナル抗体Ｈ３３、又はそのフラグメント若しくは誘導体である血管形成阻害分子、癌の治療、特に固形腫瘍の治療におけるその使用、及びこれらを含む治療用及び診断用の組成物に関する。本発明は特に、Ｈ３３のヒト化誘導体、又はＨ３３の特異性を有するヒトモノクローナル抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託アクセッションＤＳＭ  ＡＣＣ２６２２として２００３年１０月２２日に寄託されたハイブリドーマ１３Ｈ３３により産生される抗体Ｈ３３、そのフラグメント、及び誘導体からなる群から選択される、薬物として使用するための血管形成阻害分子。
【請求項２】
癌の治療又は診断で使用するための、請求項１に記載の血管形成阻害分子。
【請求項３】
固形腫瘍の治療又は診断で使用するための、請求項２に記載の血管形成阻害分子。
【請求項４】
Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単一領域抗原結合性フラグメント、ｓｃＦｖ及びその集合体、ＶＨＨｓから選択されるＨ３３のフラグメントである、請求項１から３までのいずれか一項に記載の血管形成阻害分子。
【請求項５】
抗体Ｈ３３の誘導体が、Ｈ３３と同じ特異性を有するヒトモノクローナル抗体である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の血管形成阻害分子。
【請求項６】
ヒトモノクローナル抗体がトランスジェニックマウスで産生される、請求項５に記載の血管形成阻害分子。
【請求項７】
抗体Ｈ３３と同じ特異性を有する組換え抗体、抗体Ｈ３３をベースにしたヒト化抗体、及び抗体Ｈ３３をベースにしたキメラ抗体から選択される誘導体である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の血管形成阻害分子。
【請求項８】
癌を治療するための治療用又は診断用組成物を調製するための、請求項１から７までのいずれか一項に記載の血管形成阻害分子の使用。
【請求項９】
固形腫瘍を治療するための治療用又は診断用組成物を調製するための、請求項１から７までのいずれか一項に記載の血管形成阻害分子の使用。
【請求項１０】
治療上有効な量の請求項１から７までのいずれか一項に記載の１つ又は複数の血管形成阻害分子、及び賦形剤、担体、又は希釈剤を含む、癌を治療するための、特に固形腫瘍を治療するための治療用組成物。
【請求項１１】
診断上有効な量の請求項１から７までのいずれか一項に記載の１つ又は複数の血管形成阻害分子、及び賦形剤、担体、又は希釈剤を含む、癌を診断するための、特に固形腫瘍を診断するための診断用組成物。
【請求項１２】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託アクセッションＤＳＭ  ＡＣＣ２６２２として２００３年１０月２２日に寄託されたハイブリドーマ１３Ｈ３３により産生される抗体Ｈ３３の、固形腫瘍の治療又は診断のための薬剤組成物を調製するための使用。
【請求項１３】
治療上有効な量のＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託アクセッションＤＳＭ  ＡＣＣ２６２２として２００３年１０月２２日に寄託されたハイブリドーマ１３Ｈ３３により産生される抗体Ｈ３３、及び賦形剤、担体、又は希釈剤を含む、癌を治療するための、特に固形腫瘍を治療するための治療用組成物。
【請求項１４】
診断上有効な量のＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託アクセッションＤＳＭ  ＡＣＣ２６２２として２００３年１０月２２日に寄託されたハイブリドーマ１３Ｈ３３により産生される抗体Ｈ３３、そのフラグメント又は誘導体、及び賦形剤、担体、又は希釈剤を含む、ヒト又は動物の身体において癌を診断するための、特に固形腫瘍を検出するための診断用組成物。
【請求項１５】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託アクセッションＤＳＭ  ＡＣＣ２６２２として２００３年１０月２２日に寄託されたハイブリドーマ１３Ｈ３３により産生される、Ｈ３３の特異性を有するＨ３３抗体のフラグメント。
【請求項１６】
Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単一領域抗原結合性フラグメント、ｓｃＦｖ及びその集合体、ＶＨＨｓから選択される、請求項１５に記載のフラグメント。
【請求項１７】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託アクセッションＤＳＭ  ＡＣＣ２６２２として２００３年１０月２２日に寄託されたハイブリドーマ１３Ｈ３３により産生される、Ｈ３３の特異性を有する抗体Ｈ３３抗体の誘導体。
【請求項１８】
Ｈ３３と同じ特異性を有するヒトモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の誘導体。
【請求項１９】
ヒトモノクローナル抗体がトランスジェニックマウスで産生される、請求項１８に記載の誘導体。
【請求項２０】
抗体Ｈ３３と同じ特異性を有する組換え抗体、抗体Ｈ３３をベースにしたヒト化抗体、及び抗体Ｈ３３をベースにしたキメラ抗体から選択される、請求項１７に記載の誘導体。
【請求項２１】
薬物として使用するための、請求項１５から２０までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体Ｈ３３のフラグメント又は誘導体。
【請求項２２】
癌の治療又は診断に使用するための、請求項１５から２０までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体Ｈ３３のフラグメント又は誘導体。
【請求項２３】
固形腫瘍の治療又は診断に使用するための、請求項１５から２０までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体Ｈ３３のフラグメント又は誘導体。
【請求項２４】
癌の治療又は診断のための薬剤組成物を調製するための、請求項１５から２０までのいずれか一項に記載の抗体Ｈ３３のフラグメント又は誘導体の使用。
【請求項２５】
固形腫瘍の治療又は診断のための薬剤組成物を調製するための、請求項１５から２０までのいずれか一項に記載の抗体Ｈ３３のフラグメント又は誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管形成を阻害することができる分子、１つ又は複数の該分子を含む治療用又は診断用組成物、及び医療における、特に癌、特に固形腫瘍の治療又は診断におけるそのような分子の使用に関する。更に、そのような分子を提供する方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
既存の脈管構造から新しい血管を形成する血管形成は、傷の治癒、生殖、及び胚の発生に必須である。血管形成はまた、腫瘍の発生にも不可欠である。新しい血管は、腫瘍で栄養を供給し、細胞が非制御に有糸分裂を行うのを可能にする。
【０００３】
血管形成の間、内皮細胞は増殖し、新組織中に移動し、内皮細胞間接合部を形成して、管の形成をもたらす。このプロセスは、血管形成因子によって始まり進められる。ＶＥＧＦ及びアンジオポエチンのシグナル伝達により血管周囲細胞と内皮細胞の接触が弱められ、インテグリンが媒介する新しい内皮細胞と細胞外マトリックスの増殖及び相互作用が可能になる。αｖβ３及びαｖβ５インテグリンが、血管形成因子とのシグナル伝達のクロストークを介して血管の発生及び血管形成に関与すると記載されている。
【０００４】
内皮細胞と細胞外マトリックスの相互作用に加えて、内皮細胞間の接触を調節することが管の形成に重要である。例えば、接着分子のＶＥ−カドヘリンは、血管リモデリングで役割を果たし、血管の統合性を維持している。
【０００５】
本発明をもたらした研究で、接合部の接着分子であるＪＡＭ−Ｂ及びＪＡＭ−Ｃが発見された。これらの分子は、血管の細胞間の接触面で見られ、白血球の経内皮性の遊走に関わる。現在では、ＪＡＭ−ＢとＪＡＭ−Ｃの相互作用も、血管形成で重要な役割を果たすことがわかっている。
【０００６】
この知見をもとに、本発明者らは、血管形成を阻害することのできる新規の分子を見出そうとした。このために本発明者らは、
ａ）ある範囲の分子を提供するステップと、
ｂ）これらの分子がＪＡＭ−ＢとＪＡＭ−Ｃの相互作用を妨げることができるか否かを試験するステップと、
ｃ）陽性の分子がｉｎ  ｖｉｖｏで血管形成を阻止する能力を試験するステップと、
ｄ）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験で血管形成阻害分子として陽性である分子を選択するステップと
を含む方法を用いた。
【０００７】
この分子がｉｎ  ｖｉｖｏで血管形成を阻止する能力の試験は、実施例４に記載される網膜テストにより行うことができる。
【０００８】
本発明により、ＪＡＭ−ＢとＪＡＭ−Ｃの相互作用を妨げることができる分子が全て、血管形成も阻害できるわけではないことが見出された。したがって、所望の分子を見つけるために、上記ステップｄ）のさらなる試験が必要である。
【０００９】
本発明による特に適切な分子を見つけるために、この方法は、陽性の分子がｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の増殖を阻害する能力を試験するステップを更に含むことができる。ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の増殖を阻害する試験は、例えば、実施例５に記載した試験である。
【００１０】
血管形成阻害分子を分離し又は産生するステップにより、所望の分子を実際に得られるようになる。
【００１１】
この方法で試験することのできる分子の範囲は、多様である可能性がある。分子の範囲は、例えば、ＪＡＭ−Ｂ又はＪＡＭ−Ｃに対する抗体の集団が適切であり得る。抗体の調製は発明による技術を必要としない複雑ではない技術であり、例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５〜４９７頁、（１９７５年）に記載されている。したがって、当業者であれば、過度の負担とせずにそのような範囲を提供することができる。
【００１２】
分子がＪＡＭ−ＢとＪＡＭ−Ｃの相互作用を妨げることができるか否かの試験は、例えば、表面にＪＡＭ−Ｂ又はＪＡＭ−Ｃのいずれかを発現する細胞を、ラベルした可溶性のＪＡＭ−Ｃ又はＪＡＭ−Ｂそれぞれと分子の存在下でインキュベートし、分子の存在しない対照のインキュベートと比べた細胞のラベルの減少を記録することにより行う。ラベルの量の減少を引き起こした分子を、ＪＡＭ−Ｃ又はＪＡＭ−Ｂを発現しＪＡＭ−Ｂ又はＪＡＭ−Ｃをラベルした対照の細胞と比較して可視化したが、試験して表面に結合していた分子に、陽性の分子として選択されたものはなかった。
【００１３】
適切なラベルは、当技術分野でよく知られている蛍光、放射線、又はビオチンをベースとするラベルである。ラベル、及びその消失又は減少を可視化するのに適した技術にはフローサイトメトリー、生化学、又は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）がある。
【００１４】
次いで、ＪＡＭ−Ｂ及びＪＡＭ−Ｃの相互作用を阻害することが見出されている分子が、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管形成を阻害する能力を更に試験する。これには様々な選択肢が可能である。しかし、脈管のリモデリングは内皮細胞に本質的に依存し微小環境因子に依存しないので、実施例４に記載した網膜テストが大変適している。代替の試験には、漿尿膜アッセイ、虚血再灌流、又は血管形成因子を添加したマトリゲルの移植片が誘発する血管形成がある。これらの試験は、当技術分野ではよく知られている。
【００１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管形成を阻害する能力の試験に加え、又は試験の代わりに、ｉｎ  ｖｉｖｏで分子が腫瘍の増殖を阻害する能力を試験してもよい。このような試験の適切な例には、実施例５に記載したものがある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の方法により、本発明の血管形成阻害分子としてＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託アクセッションＤＳＭ  ＡＣＣ２６２２として２００３年１０月２２日に寄託されたハイブリドーマ１３Ｈ３３により産生される抗体Ｈ３３の同定が最終的にもたらされた。ＪＡＭ−Ｃに対する抗体Ｈ３３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで血管形成を阻止しｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の増殖を妨げることができることが示された。抗体Ｈ３３は、マクロファージの腫瘍中への動員を減少させる。抗体Ｈ３３は、ＪＡＭ−ＣとＪＡＭ−Ｂの相互作用を阻止することもできる。Ｈ３３は、増殖にもアポトーシスにも影響を及ぼさない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
したがって、本発明は、薬物として使用するための、特に癌を治療するための、より詳しくは固形腫瘍を治療するための抗体Ｈ３３に関する。更に、本発明は、薬物として使用するための、Ｈ３３と同じ特異性を有するＨ３３のフラグメント及び誘導体に関する。このようなフラグメント及び誘導体は特に、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単一領域抗原結合性フラグメント、Ｈ３３の特異性を有する組換え抗体、ｓｃＦｖ及びその集合体、ＶＨＨｓ、Ｈ３３のヒト化誘導体、少なくともＨ３３の特異性を備えるキメラ抗体、又はＨ３３の特異性を有するヒトモノクローナル抗体である。後者は、下記に説明するようにトランスジェニックマウス又は他の動物で適切に産生される。
【００１８】
本発明は、全抗体そのものの抗原結合性の能力を保持する抗体フラグメント及び抗体の誘導体に更に関する。このようなＨ３３のフラグメント及び誘導体は、従来技術には記載されておらず、したがって新規である。
【００１９】
機能的抗原結合性抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解（パパイン消化、ペプシン消化、又は他の酵素的手法）により操作して、Ｆａｂ、Ｆｖ、又は単一領域を得ることができる。
【００２０】
或いは、フラグメントを組換えにより産生することができる。Ｆａｂフラグメント（「抗原結合性フラグメント」）は、抗体分子の抗原結合性領域であり、ＶＨ＋ＣＨ１及びＣＬ＋ＶＬを含む。ＣＬとＣＨ１の間には、鎖間ジスルフィド結合が存在する。ヘテロ二量体の分子量は、通常約５０ｋＤａである。Ｆａｂフラグメントは、全抗体をパパイン消化して調製することができる。
【００２１】
ＩｇＧ抗体全体の抗原結合性部位全体を依然として含む最小のフラグメント（−約３０ｋＤａ）は、可変重鎖（ＶＨ）領域及び可変軽鎖（ＶＬ）領域の両者からなる。このヘテロ二量体はＦｖフラグメント（「可変フラグメント」）と呼ばれ、依然として抗原に結合することができる。
【００２２】
別のフラグメントは、単一領域抗原結合性フラグメント（ｄＡｂｓ）又はＶＨｓである。
【００２３】
単鎖Ｆｖフラグメントを組換えにより作成することができる。ｓｃＦｖフラグメントでは、ＶＨ領域とＶＬ領域は、親水性で可動性のペプチドリンカーで結合している。ｓｃＦｖｓは複合体を形成してダイマー（ダイアボディーズ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ））、トリマー（トリアボディーズ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ））、又はそのモノマー単位が同一若しくは異なる特異性を有することがある、より大きな集合体になることがある。
【００２４】
さらなるタイプの抗体フラグメントは、可能な限り小型の完全な抗原結合性フラグメントを含むＶＨＨｓである。ＶＨＨｓは、免疫化したラクダ科動物の抗体の重鎖をタンパク質分解して、又は組換え技術により産生することができる。
【００２５】
組換えＤＮＡ技術を用いる場合は、基本的に、Ｈ３３抗体のＨ鎖又はＬ鎖のＶ領域をコードするポリヌクレオチドを、好ましくはヒトＨ鎖又はＬ鎖の定常領域をコードするポリヌクレオチドと融合してもよい。この方法で得られるＨ鎖及びＬ鎖を完全に発現させる目的で、タンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードする配列を加えることもできる。
【００２６】
本発明の血管形成阻害分子を産生するために、本発明の融合ポリヌクレオチドが適切なコントロール配列と結合して選択された宿主細胞での転写及び翻訳の調節を可能にする発現カセット、及びポリヌクレオチド又はそのような発現カセットを備える組換えベクターが用いられる。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチド、即ちＨ３３に特異性のある血管形成阻害分子を、このように組換えＤＮＡ技術のよく知られた方法によって容易に得ることができるだけではなく、化学的なＤＮＡ合成によっても得ることができる。
【００２８】
組換えＤＮＡの構築物を、組換えＤＮＡ及び遺伝子操作のよく知られた技術により得ることができ、宿主細胞に導入することができる。
【００２９】
本発明の枠内での有用な宿主細胞は、原核生物又は真核生物の細胞であってよい。適切な真核生物の細胞の中では、例として、植物細胞、酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの酵母細胞、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）又はスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）などの昆虫の細胞、及びＨｅＬａ、ＣＨＯ、３Ｔ３、Ｃ１２７、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの哺乳類の細胞などが挙げられる。
【００３０】
キメラのＩｇ鎖をコードする核酸構築物を含むベクターで、原核生物又は真核生物の細胞をトランスフェクションする方法がいくつかある。ベクターをリンパ球中に導入する好ましい方法は、スフェロプラスト融合によるものである（例えば、Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８９年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７巻、７９８〜８０４頁を参照されたい）。代替の方法には、エレクトロポレーション、又はリン酸カルシウム沈殿法が含まれる。免疫複合体を産生する他の有用な方法には、適当なｉｎ  ｖｉｖｏ系又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で構築物及びその翻訳物をコードするＲＮＡ配列を調製することが含まれる。
【００３１】
発現後、標準のタンパク質精製手順により本発明のタンパク質を回収することができる（例えば、米国特許第５，６５０，１５０号を参照されたい）。
【００３２】
本発明の分子で重鎖と軽鎖を結合させる場合、抗体の可変領域の重鎖が、対応する軽鎖と同じ細胞で共発現されることが好ましい。複数のポリペプチド鎖を含む融合タンパク質に対し、１つを超える発現ベクターを用いることができる。例えば２つの発現ベクターを用いるコトランスフェクション方法では、多くの場合両方のベクターが標的細胞に誘導されることになる。或いは、同じ細胞で共発現させるために複数のポリペプチドをコードする単一のベクターを用いると有用なことがある。
【００３３】
更に、本発明のタンパク質を単鎖分子として発現させると好都合であることがある。例えば、抗体の可変領域は、非免疫グロブリンタンパク質と場合により融合した単鎖抗体又はｓＦｖとして発現されることがある。他の一実施形態では、ある重鎖（融合サイトカインと共に又はそれなしで）がある軽鎖（又は重鎖）の相手と（融合サイトカインと共に又はそれなしで）結合して、１価及び２価の免疫複合体を形成する。
【００３４】
ＶＬ領域及びＶＨ領域の核酸配列の構築方法に応じて、ＶＬ領域とＶＨ領域をジスルフィド結合又はペプチド結合で結合させることができる。一般的に、Ｖ領域の配列を別々のＤＮＡ構築物上にコードすると、Ｖ領域はジスルフィド結合で結合する。これとは対照的に、Ｖ領域の配列を単鎖のＤＮＡ構築物上にコードすると、Ｖ領域は通常ペプチド結合により結合する。
【００３５】
本発明のある実施形態では、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域はそれぞれ、免疫グロブリンの軽鎖の定常領域及び重鎖の定常領域と結合することができる。免疫グロブリンの軽鎖の定常領域のκ鎖又はλ鎖のいずれかを用いることができる。
【００３６】
本発明の発現ベクターの構築、及び宿主細胞の形質転換は、分子生物学の標準技術により行うことができる。
【００３７】
このような原核生物又は真核生物の細胞により産生された本発明の血管形成阻害分子を、タンパク質Ａセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより細胞又は培養上清から精製し、マイクロタイタープレートにコーティングした可溶性のＪＡＭ−Ｃに対するＨ３３の結合に対する阻害活性を、よく知られた競合ＥＬＩＳＡ技術により測定してＪＡＭ−Ｃ結合性活性を評価することができる。
【００３８】
残りのラットの可変領域は、依然としてヒトに免疫原性であることがあり、したがって抗体をベースとした治療法の効力を損なうことがある。特許ＷＯ２００４０５５０５６号に記載されたようにアミノ酸置換基の導入を伴う「ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」及び「ヒト化」など、免疫原性を低下させるよく知られた手法を適用することができる。引き続き、Ｈ３３に対する阻害活性により、上記に記載したような結合親和性の引き続いてのスクリーニングを行うことができる。
【００３９】
或いは、非ヒトＴ細胞抗原決定基を、ヒト抗体に存在するヒト自己抗原決定基に対応するように変異させる（例えば、米国特許第５７１２１２０号を参照されたい）。Ｈ３３抗体は、少なくとも１つのヒト化配列を含むＶＬ領域及びＶＨ領域を有する本発明の一部であり、その結果ヒトに投与する場合に免疫原性が低下する。
【００４０】
上記に記載したように、宿主細胞で引き続き抗体の産生、及び精製を行うことができる。
【００４１】
本発明の別の一態様によると、Ｈ３３又は類似の分子の抗体の可変領域を、Ｆｃ部分を介入し又はそれなしに非免疫グロブリン部分に結合することができる。特に、非免疫グロブリン部分は、インターロイキン、造血因子、リンフォカイン、インターフェロン、又はケモカインなどのサイトカインであることができる。インターロイキンは、例えば、インターロイキン−２又はインターロイキン−１２であることができる。造血因子及びリンフォカインは、例えば、それぞれ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びリンフォトキシンであることができる。インターフェロンは、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、又はインターフェロン−γであることができる。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、第２のサイトカインなどの第２の非免疫グロブリン部分を含む。
【００４３】
本発明は、患者におけるＪＡＭ−Ｂ／ＪＡＭ−Ｃの相互作用を妨げるための薬物を調製するための、Ｈ３３抗体、又はそのフラグメント若しくは誘導体の使用も提供する。
【００４４】
相互作用の妨害には、本発明の可変領域を有する抗体を患者に投与することにより、その表面上にＪＡＭ−Ｃを有する細胞を標的にすることが含まれることがある。一実施形態では、標的とされる細胞は腫瘍細胞である。
【００４５】
本発明のさらなる態様によると、ＪＡＭ−Ｃ／ＪＡＭ−Ｂの相互作用の妨害は、抗体の可変領域をコードする核酸、又はこの核酸を含む細胞を用いることによりもたらすことができ、いずれも患者に投与することができる。
【００４６】
ヒトにおける臨床上の使用には、ラット由来の抗体Ｈ３３を修飾することが抗体の免疫原性を低下させ又は最小にするのに有用なことがある。ネズミ科動物の抗原の免疫原性を低下させる方法として、様々な方法が文献に報告されている。このような方法には、ネズミ科動物又はラットの可変領域及びヒトの定常領域を含むキメラ抗体の産生、ネズミ科動物又はラットの抗体に由来する可変の結合性配列を含む単鎖抗体の産生、より小型であるため免疫原性がより低い可能性があるネズミ科動物又はラットの抗体の抗原結合性フラグメントの産生、ヒトモノクローナル抗体の産生及び「ヒト化」抗体の産生が含まれる。
【００４７】
ヒト化により、非免疫原性である抗体を、親の非ヒト抗体分子の抗原結合性特性を完全に保持して提供することが理想的である。非免疫原性であれば、有害免疫反応を生じないで複数回投与の投与ができるようになる。ヒト化抗体を産生するための様々な方法が文献に報告されている。例えば、ヒト化抗体は、（ａ）非ヒトＣＤＲのみをヒトのフレームワーク及び定常領域上に移植することにより（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、５２２〜２５頁（１９８６年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻、１５３４〜１５３６頁（１９８８年））、又は（ｂ）非ヒト可変領域全てを（リガンド結合性特性を保持するために）移植するだけではなく、免疫原性を低下させるために曝された残基を置換することによりヒト様の表面で「覆い隠す（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」ことにより（「ベニヤード（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」抗体とも呼ばれる）（Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．、２８巻、４８９〜４９８頁（１９９１年）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１巻（３）、１６９〜２１７号（１９９４年））産生することが潜在的に可能である。
【００４８】
ヒトの可変領域のフレームワーク領域内に非ヒト（ネズミ科動物又はラット）残基を保持すると、得られたヒト化抗体の適当な結合性の機能を維持するのに役立つことが報告されている。ヒト化抗体は、宿主受容者の抗体の免疫原性を潜在的に低下させ又は除去し、その結果バイオアベイラビリティを上昇させ、有害免疫反応の可能性を低下させ、したがって複数回の抗体投与を潜在的に可能にすることが報告されている。また、所望の結合性特性を有する抗体由来の、上記に記載したｓｃＦｖ、並びにＦｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ）’２フラグメントなどの抗体フラグメントの合成には、完全な抗体よりも免疫原性の低い標的とする部分を産生する別の既知の方法が含まれている。本来、単鎖抗体及び抗体フラグメントは完全な抗体よりも小型であるので、完全な抗体よりも免疫原性が低い可能性がある。
【００４９】
組換えタンパク質、例えば抗体は、発現に用いられる様々な宿主細胞で様々にグリコシル化されることも知られている。Ｈ３３抗体を臨床上で使用する場合は、グリコシル化によりその半減期が延長し且つ／又は免疫原性が低下することがある。
【００５０】
抗体Ｈ３３を競合スクリーニングで用いて、Ｈ３３と同じ又は類似の特異性を有する「ヒトモノクローナル抗体」又は「組換えヒト抗体」を分離することもできる。基本的に、このようにして分離されたヒト抗体は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え及びアイソタイプスイッチングを行うことにより、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）、又はＪＡＭ−Ｃに対するヒトモノクローナル抗体の複数のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及び／又はＩｇＥ）を産生することができる非ヒトトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスで産生することができる（例えば、欧州特許第１４７１９３８号及び米国特許第２００４２０８８７３号）。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第２００３／００１７５３４号に開示されたようなポリクローナル抗体を産生するトランスジェニックウサギであってもよい。
【００５１】
「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する単一の結合特異性を表す抗体を意味する。一実施形態では、Ｈ３３と同じ特異性を有するヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含む遺伝子を有するトランスジェニックの非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
【００５２】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系は、ネズミ系である。マウスにおけるハイブリドーマの産生は、大変よく確立された手順である。融合のために免疫化した脾細胞を分離するための免疫化プロトコール及び技術は、当技術分野で知られている。融合パートナー（例えば、ネズミ科動物ミエローマ細胞）及び融合の手順も知られている。
【００５３】
好ましい一実施形態では、ＪＡＭ−Ｃに対するものでＨ３３の特異性を有するヒトモノクローナル抗体を、「ＨｕＭＡｂ」マウスとして知られるマウス系ではなくヒト免疫系の部分を有するトランスジェニックマウスを用いて産生することができる（Ｌｏｎｂｅｒｇら、（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻（６４７４）、８５６〜８５９号）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭ又は［κ］軽鎖の発現の低下を示し、免疫化に対する反応で、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子はクラススイッチ及び体細胞突然変異を経て高親和性のヒトＩｇＧ［κ］モノクローナル抗体を生じる（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎら、（１９９４年）、上記；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ、（１９９４年）、「実験的薬理学のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍａｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、１１３巻、４９〜１０１頁における再考；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．及びＨｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５年）、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻、６５〜９３頁；並びにＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ、（１９９５年）、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４巻、５３６〜５４６頁）。ＨｕＭＡｂマウスの調製は、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ら、（１９９２年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０巻、６２８７〜６２９５頁；Ｃｈｅｎ，Ｊら、（１９９３年）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５巻、６４７〜６５６頁；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、３７２０〜３７２４頁；Ｃｈｏｉら、（１９９３年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４巻、１１７〜１２３頁；Ｃｈｅｎ，Ｊら、（１９９３年）、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２巻、８２１〜８３０頁；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、（１９９４年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２巻、２９１２〜２９２０頁；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら、（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻（６４７４）８５６〜８５９頁；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．、（１９９４年）「実験的薬理学のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍａｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、１１３巻、４９〜１０１頁；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ら、（１９９４年）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６巻、５７９〜５９１頁；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．及びＨｕｓｚａｒ，Ｄ．、（１９９５年）、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３巻、６５〜９３頁；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．、（１９９５年）、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、７６４巻、５３６〜５４６頁；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ら、（１９９６年）、Ｎａｔｕｒｅ  ＢＩｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４巻、８４５〜８５１頁に詳しく記載されている。更に、全てＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．及びＫａｙ，Ｒ．Ｍ．並びにＧｅｎＰｈａｒｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌへの、米国特許第５５４５８０６号、第５５６９８２５号、第５６２５１２６号、第５６３３４２５号、第５７８９６５０号、第５８７７３９７号、第５６６１０１６号、第５８１４３１８号、第５８７４２９９号、及び第５７７０４２９号；Ｓｕｒａｎｉらへの米国特許第５５４５８０７号；１９９８���１月１１日発行のＷＯ９８／２４８８４号、１９９４年１１月１０日発行のＷＯ９４／２５５８５号、１９９３年６月２４日発行のＷＯ９３／１２２７号、１９９２年１２月２３日発行のＷＯ９２／２２６４５号、及び１９９２年３月１９日発行のＷＯ９２／０３９１８号を参照されたい。
【００５４】
好ましいＨｕＭＡｂマウスは、内生の軽鎖（κ）遺伝子にＪＫＤ破壊があり（Ｃｈｅｎら、（１９９３年）、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２巻、８２１〜８３０頁に記載されている通り）、内生の重鎖遺伝子にＣＭＤ破壊があり（ＫｏｒｍａｎらによるＷＯ０１／１４４２４号の実施例１に記載されている通り）、ＫＣｏ５ヒトκ軽鎖導入遺伝子を有し（Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、（１９９６年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４巻、８４５〜８５１頁に記載されている通り）、ＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を有し（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．及びＫａｙ，Ｒ．Ｍ．による米国特許第５７７０４２９号に記載されている通り）且つ／又はＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子を有する（ＫｏｒｍａｎらによるＷＯ０１／１４４２４号の実施例２に記載されている通り）。
【００５５】
或いは、染色体を導入したフラグメント上にヒト免疫グロブリン遺伝子を有するマウスを用いて、Ｈ３３の特異性を有する抗ＪＡＭ−Ｃ抗体を生じることができる。このような染色体を導入したマウスの調製は、ＴｏｍｉｚｕｋａらによるＷＯ９７／０７６７１号に記載されている。好ましいマウスは、ある種のヒト免疫グロブリン遺伝子が導入遺伝子上にあり他の遺伝子が導入染色体上にあるものであり、例えば、ＩｓｈｉｄａらによるＷＯ０２／４３４７８号に詳しく記載されているようなヒト軽鎖導入遺伝子（例えば、ＫＣｏ５κ鎖導入遺伝子）、及びヒト重鎖導入染色体（例えば、ＳＣ２０導入染色体）を有するマウスである。
【００５６】
Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら、（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻（６４７４）、８５６〜８５９頁、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ら、（１９９６年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４巻、８４５〜８５１頁、及びＷＯ９８／２４８８４号に記載されているように、Ｈ３３の特異性を有するＪＡＭ−Ｃに対するヒトモノクローナル抗体を完全に生み出すために、ＨｕＭＡｂマウスを、ＪＡＭ−Ｃ抗原、並びに／又は、ＪＡＭ−Ｃ及び／若しくは組換えＪＡＭ−Ｃを産生する細胞の、精製し又は濃縮した調製物で免疫化してもよい。マウスは最初の注入時に６〜１６週齢であることが好ましい。例えば、組換えＪＡＭ−Ｃを用いて、ＨｕＭＡｂマウスを腹腔内にて免疫化することができる。
【００５７】
ＪＡＭ−Ｃに対するヒトモノクローナル抗体を産生するために、標準プロトコールに基づいてマウスの脾細胞を分離し、ＰＥＧを用いてマウスミエローマ細胞系と融合することができる。次いで、得られたハイブリドーマを、よく知られた技術により、抗原に特異性のある抗体の産生のためスクリーニングする。
【００５８】
Ｈ３３の特異性を有する本発明のヒト抗体も、当技術分野でよく知られているように、例えば、組換えＤＮＡ技術と遺伝子移入法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマで産生することもできる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．、（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、１２０２頁）。
【００５９】
ＪＡＭ−ＢとＪＡＭ−Ｃの相互作用を妨げ、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管形成を阻害する能力のある、Ｈ３３、そのフラグメント又は誘導体を、本発明に用いることができる。抗体フラグメント及び抗体融合タンパク質の産生については、Ｊｏｏｓｔｅｎ，Ｖら、Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．、２巻（１）、１頁（２００３年）に再考がある。抗体フラグメント及び誘導体を調製するための技術は広く知られており、当分野の技術者であれば過度の負担なく行うことができる。
【００６０】
例えば、Ｈ３３抗体、又はその抗体フラグメントを発現させるために、軽鎖及び重鎖の、部分又は全長をコードするＤＮＡを標準の分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅、部位特異的突然変異誘発）により得ることができ、遺伝子が転写及び翻訳のコントロール配列に作動可能に結合するように発現ベクター中に挿入することができる。この文脈で「作動可能に結合する」とは、抗体遺伝子がベクター中に結合しその結果ベクター内の転写及び翻訳のコントロール配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすことを意味するものとされる。発現ベクター及び発現のコントロール配列は、宿主細胞が用いた発現と適合するように選択される。
【００６１】
抗体の軽鎖遺伝子及び抗体の重鎖遺伝子を別々のベクター中に挿入することができ、又はより典型的には、両遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入する。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体の遺伝子フラグメント及びベクターの相補的な制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）により発現ベクター中に挿入される。
【００６２】
本明細書に記載される抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域を用いて、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に結合し、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に結合するように、所望のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクター中に挿入することにより、あらゆる抗体のアイソタイプの全長の抗体遺伝子を作り出すことができる。
【００６３】
更に、又は或いは、組換えの発現ベクターは、宿主細胞から抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで結合するように、抗体鎖遺伝子をクローンしてベクターを作ることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であることができる。
【００６４】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換えの発現ベクターは、宿主細胞の抗体鎖遺伝子の発現をコントロールする制御配列を有する。「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳をコントロールする他の発現コントロール要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとされる。このような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ著「遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」１８５巻、カリフォルニア州、サンディエゴ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ出版（１９９０年）に記載されている。
【００６５】
制御配列の選択を含む、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存することがあることを、当業者であれば理解するであろう。
【００６６】
哺乳動物の宿主細胞の発現に対する好ましい制御配列には、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、シミアンウィルス４０（Ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０）（ＳＶ４０）、アデノウィルス（例えば、アデノウィルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなど、哺乳動物細胞で高レベルのタンパク質発現を指示するウィルス要素が含まれる。或いは、ユビキチンプロモーター又はβ−グロブリンプロモーターなど、非ウィルス性の制御配列を用いてもよい。
【００６７】
抗体鎖遺伝子及び制御配列に加えて、本発明の血管形成阻害分子を発現させるための組換えの発現ベクターは、宿主細胞でベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）及び選択可能なマーカー遺伝子などのさらなる配列を有することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、その中にベクターが導入される宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌらによる、米国特許第４３９９２１６号、第４６３４６６５号、及び第５１７９０１７号を参照されたい）。例えば、通常、選択可能なマーカー遺伝子は、その中にベクターが導入される宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択可能なマーカー遺伝子には、（ｄｈｆｒ−宿主細胞でメトトレキサートの選択／増幅に使用するための）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、及び（Ｇ４１８を選択するための）ｎｅｏ遺伝子が含まれる。
【００６８】
軽鎖及び重鎖を発現させるために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを、標準の技術により宿主細胞中にトランスフェクションする。様々な形態の「トランスフェクション」は、外因性のＤＮＡを原核生物又は真核生物の宿主細胞中に導入するために通常用いられる広範囲の技術、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。本発明の分子を原核生物又は真核生物のどちらかの宿主細胞で発現させることは理論的に可能であるが、真核生物細胞における発現が最も好ましく、哺乳動物の宿主細胞が最も好ましい、というのは、このような真核生物の細胞、特に哺乳動物の細胞は原核生物の細胞よりも集合し、適当に折りたたまれ免疫学的に活性の抗体、フラグメント、又はこれらの誘導体を分泌し易いからである。
【００６９】
本発明の組換えの抗体を発現させるのに好ましい哺乳動物の宿主細胞には、ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含み、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、（１９８０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻、４２１６〜４２２０頁に記載され、例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ及びＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ、（１９８２年）、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９巻、６０１〜６２１頁に記載されたような、ＤＨＦＲを分泌することのできるマーカーと共に用いられる）、ＮＳ／０ミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、及びＳＰ２．０細胞が含まれる。特に、ＮＳ／０ミエローマ細胞と共に用いるための別の好ましい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２号、ＷＯ８９／０１０３６号、及び欧州特許第３３８  ８４１号で開示されたＧＳ（グルタミン合成）遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物の宿主細胞中に導入する場合、宿主細胞で産物を発現させるのに十分な時間、或いは、より好ましくは宿主細胞が増殖した培地中に産物を分泌させるのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより、発現産物が産生される。発現産物は、標準のタンパク質精製方法を用いて培地から回収することができる。
【００７０】
或いは、クローンされた抗体遺伝子を、微生物、例えばｓｃＦｖ抗体を産生させるための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、藻類、及び昆虫細胞などの原核生物細胞を含む他の発現系で発現させることができる。更に、抗体はトランスジェニックの非ヒト動物で、例えば、ヒツジ及びウサギからのミルク、若しくは雌鳥からの卵、又はトランスジェニック植物で産生され得る。例えば、Ｖｅｒｍａ，Ｒ．ら、（１９９８年）、抗体の操作（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）：「細菌、イースト菌、昆虫及び哺乳動物の発現システムの比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ，ｙｅａｓｔ，ｉｎｓｅｃｔ  ａｎｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２１６巻、１６５〜１８１頁；Ｐｏｌｌｏｃｋら、（１９９９年）、「組換え抗体を産生する方法としてのトランスジェニックミルク（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｌｋ  ａｓ  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、２３１巻、１４７〜１５７頁；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．ら、（１９９９年）、「植物における組換え抗体の分子農業（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆａｒｍｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ）」、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、３８０巻、８２５〜８３９頁を参照されたい。
【００７１】
抗体は、６個の重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を優先的に介して標的の抗原と相互作用をする。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個々の抗体間ではＣＤＲの外部の配列よりも多様性に富む。ＣＤＲ配列は殆どの抗体−抗原相互作用に関与するので、天然に存在する特異的な抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、天然に存在する特異的な抗体の特性を模倣する組換え抗体、この場合は特に様々な特性を有する様々な抗体からのフレームワーク配列上に移植されたＨ３３を発現させることができる（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２７頁；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、５２２〜５２５頁；Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６巻、１００２９〜１００３３頁を参照されたい）。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公共のＤＮＡデータベースから得ることができる。これらにはＢ細胞の成熟の間Ｖ（Ｄ）Ｊの結合によって形成される完全に集合した可変遺伝子が含まれないので、これらの生殖細胞系配列は、成熟した抗体遺伝子配列とは異なる。生殖細胞系遺伝子の配列は、可変遺伝子のいたるところの変異を含むが通常はＣＤＲ内で密集する、親和性の高い２次レパートリー抗体の配列とも異なる。例えば、体細胞突然変異は、フレームワーク領域１のアミノ末端部分及びフレームワーク領域４のカルボキシ末端部分では比較的珍しい。更に、多くの体細胞突然変異は、抗体の結合性特性を大幅に変更することはない。
【００７２】
この理由から、最初の抗体（ＷＯ９９／４５９６２号を参照されたい）の結合性特性と類似の結合性特性を有する完全な組換え抗体を再生するために、特別な抗体のＤＮＡ配列を全て得る必要はない。ＣＤＲ領域に及ぶ、部分的な重鎖及び軽鎖の配列は、通常、この目的に十分間に合う。部分的な配列を用いて、どの生殖細胞系列の可変及び結合性遺伝子セグメントが、再結合した抗体の可変遺伝子に関与するかを決定する。次いで、生殖細胞系配列を用いて、可変領域の失われた部分を埋め合わせる。重鎖及び軽鎖のリーダー配列は、タンパク質の成熟の間に切断され、最終の抗体の特性に関与しない。失われた配列を加えるために、クローンしたｃＤＮＡ配列を、ライゲーション又はＰＣＲ増幅により合成オリゴヌクレオチドと結合させてもよい。或いは、可変領域全体を、１セットの短い重複するオリゴヌクレオチドとして合成してもよく、ＰＣＲ増幅により結合させて完全に合成の可変領域のクローンを作り出してもよい。このプロセスには、例えば、特定の制限部位を除くか若しくは含み、又は特定のコドンを最適化するなどの、ある長所がある。
【００７３】
本出願において、「血管形成阻害分子」は、Ｈ３３、並びに、本明細書に記載されるのと同じ又は類似の特異性を保持するＨ３３の全ての可能なフラグメント及び誘導体を意味する。
【００７４】
本発明は、癌、特に固形腫瘍の治療又は診断のための治療用組成物又は診断用組成物を調製するための、Ｈ３３、そのフラグメント及び誘導体などの血管形成阻害分子の使用にも関する。
【００７５】
本発明は、治療上又は診断上有効な量の１つ又は複数の本発明の血管形成阻害分子、及び適切な賦形剤、担体、希釈剤、又は他の添加剤を含む、癌、特に固形腫瘍を治療し又は診断するための治療用組成物又は診断用組成物にも関する。癌治療の分野の技術者であれば、治療上又は診断上有効な量を確立することができる。
【００７６】
この組成物は、複数の（例えば、２つ又はそれを超える）本発明の血管形成阻害分子の組合せも含むことができる。
【００７７】
本発明の薬剤組成物は、併用療法で、即ち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの化学療法薬、少なくとも１つの抗炎症薬、又は少なくとも１つの免疫抑制薬を含むことができる。
【００７８】
別の一実施形態では、本発明の血管形成阻害分子を、放射線療法と組み合わせて投与することができる。
【００７９】
別の一実施形態では、本発明の血管形成阻害分子を、１つ又は複数の他の抗体、例えば１つ又は複数のヒト抗体、例えば抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせて投与することができる。
【００８０】
投与レジメンは最適の所望の反応（例えば、治療的反応）をもたらすように調節される。例えば、単回ボーラスを投与することができ、投与量をいくつかに分割して時間をかけて投与することができ、或いは治療状態の緊急性に従って、投与量を比例的に減少又は増加することができる。投与を容易にし投与量を均一にするために、単位投与形態で非経口の組成物を調合することは特に有利である。本明細書で用いられる単位投与形態は、治療する対象に対する単位投与量として適合された物理的に別個の単位を意味し、各単位は、必要とされる製薬上の担体と共同して所望の治療効果を生じるよう計算された、予め決定された量の有効成分を含む。本発明の単位投与形態を詳しく述べると、（ａ）有効化合物の独特の特性、及び達成すべき特定の治療効果、並びに（ｂ）個体の感受性を処置するためのそのような有効化合物を配合する、当技術分野に固有の制限ということにより表され、これらに直接依存する。
【００８１】
本明細書で用いられる「非経口投与」及び「非経口に投与された」は、経腸投与及び局所投与以外の投与方法を意味し、通常は注射又は注入により、且つ静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、関節内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）、皮膜下、くも膜下（ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ）、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内の注射及び注入を含むがそれだけには限定されない。
【００８２】
本発明の血管形成阻害分子は、適切な賦形剤、担体、又は希釈剤と共に薬剤組成物に含まれてもよい。
【００８３】
本発明の薬剤組成物に使用することができる適切な水性及び非水性の担体の例には、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。
【００８４】
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などの添加剤も含むことができる。滅菌を行い、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの様々な抗細菌剤及び抗真菌剤を含むことにより、確実に微生物の存在を防ぐことができる。糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含むことが望ましいこともある。更に、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる物質を含むことにより、注射可能な薬剤形態の吸収の延長をもたらすことができる。
【００８５】
本発明の化合物を、薬剤としてヒト及び動物に投与する場合、単独で、又は、例えば、０．０１〜９９．５％（より好ましくは０．１〜９０％）の有効成分を、薬剤として許容される担体と組み合わせて含む薬剤組成物として投与することができる。
【００８６】
選択された投与経路とは無関係に、適切な水和した形態で用いることのできる、本発明の血管形成阻害分子、及び／又は本発明の薬剤組成物を、当業者には周知の従来の方法により、薬剤として許容される投与形態に調合する。
【００８７】
本発明の薬剤組成物における有効成分の実際の投与量レベルを、患者に有毒とならずに、特定の患者、組成、及び投与方法に対する所望の治療上の反応を達成するのに効果的である有効成分の量を得るために変化させることができる。選択された投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物又はそのエステル、塩、若しくはアミドの活性；投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、治療期間；他の薬物、化合物、及び／又は使用される特定の化合物と組み合わせて用いられる材料；治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態、及び以前の病歴；並びに医学技術分野でよく知られている同様の因子を含む、様々な薬物動態学的因子に依存する。当技術分野の通常の技術を有する医師又は獣医師であれば、必要とされる薬剤組成物の有効な量を容易に決定し処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、薬剤組成物に使用する本発明の化合物の投与量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで開始し、所望の治療効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させることができる。一般に、本発明の組成物の適切な１日量は、治療効果をもたらすのに効果的な最低の投与量である化合物の量である。このような有効投与量は、一般的に上記に記載した因子に依存する。
【００８８】
適切には、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下に投与することができ、好ましくは標的部位に近接して投与する。所望により、治療用組成物の有効１日投与量を、２、３、４、５、６、又はそれを超える、１日を通して適当な間隔で別々に投与される小用量として、場合により単位投与形態で投与することができる。本発明の化合物を単独で投与することができるが、化合物を医薬製剤（組成物）として投与することが好ましい。
【００８９】
例えば、血管形成阻害分子としてＨ３３を用いる場合、生物学的サンプルでの投与に続いて、様々な時間点で循環しているＨ３３抗体の量を、Ｈ３３抗体を標的にする抗イディオタイプ抗体を使用することにより、又はＨ３３抗体を検出するための他の特定の方法（例えば、コーティングとしてＪＡＭ−Ｃを用いたＥＬＩＳＡアッセイ）を使用することにより、測定して投与量を決定し又は調節することができる。
【００９０】
治療用組成物を、当技術分野で周知の医療機器により投与することもできる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の治療用組成物を、米国特許第５３９９１６３号、第５３８３８５１号、第５３１２３３５号、第５０６４４１３号、第４９４１８８０号、第４７９０８２４号、又は第４５９６５５６号に開示されている機器などの、針なし皮下注射用装置を用いて投与することができる。本発明に有用なよく知られている埋め込み物及びモジュールの例には、制御された速度で薬物を分配するための埋め込み可能な微量注入ポンプを開示している米国特許第４４８７６０３号、皮膚を通して薬物を投与するための治療用機器を開示している米国特許第４４８６１９４号、正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示している米国特許第４４４７２３３号、薬物を継続して送達するための流速可変の埋め込み可能な注入装置を開示している米国特許第４４４７２２４号、複数のチャンバーの区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示している米国特許第４４３９１９６号、並びに浸透圧性の薬物送達システムを開示している米国特許第４４７５１９６号が含まれる。他のこのような埋め込み、送達システム、及びモジュールの多くは、当業者に知られている。
【００９１】
ある実施形態では、本発明の血管形成阻害分子はｉｎ  ｖｉｖｏで確実に適切な分配がなされるように調合することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの親水性の高い化合物を排除する。確実に（所望により）本発明の治療用化合物がＢＢＢを通過できるために、例えば、リポソーム中に調合することができる。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４５２２８１１号、第５３７４５４８号、及び第５３９９３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞又は器官内に選択的に運搬される１つ又は複数の部分を含むことができ、したがって標的とされる薬物の送達を向上させる（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ、（１９８９年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２９巻、６８５頁を参照されたい）。例示的な標的とする部分には、葉酸又はビオチン（例えば、Ｌｏｗらへの米国特許第５４１６０１６号を参照されたい）、マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら、（１９８８年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１５３巻、１０３８頁）、抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら、（１９９５年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３５７巻、１４０頁；Ｍ．Ｏｗａｉｓら、（１９９５年）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、３９巻、１８０頁）、界面活性剤タンパク質Ａ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら、（１９９５年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２３３巻、１３４頁）、本発明の製剤を含むことができる様々な種類及び本発明の分子の構成要素、ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら、（１９９４年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻、９０９０頁）が含まれ、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ、（１９９４年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６巻、１２３頁；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ、（１９９４年）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４巻、２７３頁も参照されたい。
【００９２】
本発明の一実施形態では、本発明の血管形成阻害分子をリポソーム中に調合し、より好ましい実施形態では、このリポソームは標的とする部分を含む。最も好ましい実施形態では、リポソーム中の治療用化合物は、所望の領域に近接する部位、例えば腫瘍の部位へのボーラス注射により送達される。組成物は容易に注射できる程度まで流動性でなければならない。組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対抗して保存されなければならない。
【００９３】
本発明の血管形成阻害分子の有効な投与量及び投与レジメンは、治療する疾患又は病状に依存し、当業者が決定することができる。
【００９４】
腫瘍の治療で「治療上有効な投与量」は、完全でも部分的でもよい目的とする腫瘍の反応により測定することができる。完全寛解（ＣＲ）は、疾患の臨床的、放射線医学的、又は他の徴候のないものと定義される。部分寛解（ＰＲ）は、５０％を超える腫瘍集塊のサイズの減少による。腫瘍の進展までの平均期間は、目的の腫瘍反応の持続性を特徴づける基準である。
【００９５】
腫瘍の治療法で「治療上有効な投与量」は、疾患の進行を安定化させる能力により測定することもできる。化合物が癌を阻止する能力は、ヒトの腫瘍における有効性を予測できる動物モデル系で評価することができる。治療上有効な量の治療用化合物は、腫瘍の大きさを減少させることができ、さもなければ対象の症状を改善することができる。当業者の一人であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、及び特定の組成物又は選択された投与経路などの因子に基づいてそのような量を決定することができる。
【００９６】
したがって、本発明の組成物で治療する患者に、本発明の分子の治療効果を増強又は増大する別の治療用物質を、（本発明の分子を投与する前に、投与と同時に、又は投与後に）更に投与することができる。
【００９７】
本発明は、更に本発明の化合物の診断における使用にも関する。ラベルした抗体を、例えば、身体における腫瘍の場所を特定するために用いることができる。放射性の、常磁性の、又はその他で抗体をラベルすることは、当技術分野でよく知られた技術である。
【００９８】
特定の実施形態では、本発明は、例えば組織サンプル、体液サンプル、又は細胞サンプルなどのサンプル中のＪＡＭ−Ｃをｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出することにより、ＪＡＭ−Ｃに関連する疾患を診断するための方法を提供する。これは、例えば、試験するサンプルを、場合によっては対照サンプルと一緒に、Ｈ３３とＪＡＭ−Ｃの複合体が形成できる条件下で、Ｈ３３抗体又はその誘導体若しくはフラグメントと接触させることにより実現される。次いで、複合体の形成を（例えばＥＬＩＳＡを用いて）検出することができる。対照サンプルを試験サンプルと共に用いる場合、両サンプル中で複合体を検出することができ、サンプル間の複合体の形成にいかなる統計学的な有意差もあれば試験サンプル中にＪＡＭ−Ｃが存在することが示唆される。
【００９９】
本発明を、以下の実施例で更に説明する。これらの実施例は、例示を目的とするにすぎず、いかなる方法でも本発明を制限しようとするものではない。実施例では、以下の図を参照とする。
【実施例】
【０１００】
（実施例１）
ＪＡＭ−Ｂ又はＪＡＭ−Ｃに対する抗体群の調製
本発明の方法で試験する抗体群を、Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５〜４９７頁、（１９７５年）に従って調製する。このような抗体群を得るための抗原の供給源は、実施例３に記載するように調製した組換えの可溶性ＪＡＭ−Ｂ又はＪＡＭ−Ｃにある。
【０１０１】
（実施例２）
可溶性ＪＡＭ−Ｂ及びＪＡＭ−Ｃの調製
本発明により、ＪＡＭ−ＣはそのＶ領域を介して異種親和性にＪＡＭ−Ｂと相互作用をし、可溶性のＪＡＭ−ＣのＶ領域はＪＡＭ−Ｂと結合するのに十分であることが見出された。
【０１０２】
同様のクローニング方法を用いて、ＰＣＲにより可溶性ＪＡＭ−Ｂ及び可溶性ＪＡＭ−ＣのＶ領域が得られた。プライマーは、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（スイス、Ｂａｌｇａｃｈ、ＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈＧｍｂＨ）から入手し、クローニング方法のために加えられた制限部位に下線が引いてある。ＪＡＭ−Ｃの細胞外Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを、ネズミ科動物のＪＡＭ−Ｃの配列の全長をコードするプラスミド、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｔ７、並びに順方向及び逆方向のプライマーとして（５’−ｇｃｔｃｔａｇａｃａｇｔｇｔｔｇｃｃｇｔｃｔｔｇｃｃｔａｃａｇ−３’）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化してから、ＦＬＡＧ−ｔａｇ配列を含むｐｃＤＮＡ３でクローニングした。
【０１０３】
可溶性ＪＡＭ−Ｂは以下のように調製する。順方向及び逆方向のプライマーとして（５’−ｔｃａｇｃｔａｇｇｃａｇｃｃａｇｃｔ−３’）及び（５’−ｇｃｔｃｔａｇａａｔｃｔａｃｔｔｇｃａｔｔｃｇｃｔｔｃｃ−３’）を用いてＰＣＲにより、可溶性ＪＡＭ−ＢをコードするｃＤＮＡを得た。ＸｂａＩで消化したＰＣＲ産物を、次いで、ＥｃｏＲＩ／ｂｌｕｎｔ及びＸｂａＩ部位を用いてｐｃＤＮＡ３におけるＦＬＡＧ  Ｔａｇ配列でインフレームでクローンした。
【０１０４】
（実施例３）
ＪＡＭ−ＢとＪＡＭ−Ｃの相互作用を妨げる能力の試験
表面にＪＡＭ−Ｂ又はＪＡＭ−Ｃのいずれかを発現する細胞を、Ａｕｒｒａｎｄ−Ｌｉｏｎｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７６巻、２７３３〜４１頁、（２００１年ａ）；Ａｕｒｒａｎｄ−Ｌｉｏｎｓら、Ｂｌｏｏｄ、９８巻、３６９９〜７０７頁、（２００１年ｂ）；Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｌｅｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、１００巻、２４７９〜２４８６頁、（２００２年）に記載された通りにして得る。
【０１０５】
実施例２に記載した通りに得られた可溶性ＪＡＭ−Ｂ及びＪＡＭ−Ｃを、Ａｌｅｘａ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）のスルホサクシンイミジルエステル、又はスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）で、製造元の手順に従ってラベルする。
【０１０６】
ＪＡＭ−Ｂ又はＪＡＭ−Ｃを発現する細胞を、試験する分子の存在下で、ラベルした可溶性のＪＡＭ−Ｃ又はＪＡＭ−Ｂとそれぞれ接触させる。フローサイトメトリーで蛍光をモニターし、非処置の対照と比べて蛍光強度が低下したら、可溶性ＪＡＭ−Ｃ又は可溶性のＪＡＭ−Ｂの結合が減少したことを示している。
【０１０７】
（実施例４）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血管形成を阻止する能力の試験
生後７日（Ｐ７）のマウスを７５％酸素中に５日間置き、網膜の中央無血管化を生じさせる（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８巻、２７〜３４頁、（２００２年）。このインキュベーションの後、マウスをさらなる５日間（Ｐ１７まで）正常酸素条件下で飼育する。Ｐ１２、Ｐ１４、及びＰ１６に、マウスにモノクローナル抗体５０μｇを腹腔内注射する。非拡散性蛍光デキストラン溶液で脈管構造全体を灌流することにより、新血管形成を検出する。フラットマウントした網膜に、新血管形成及び血管性糸球体の領域が検出される。血管性糸球体は、血管形成刺激に反応して生成され、内境界膜を通して突出する、増殖性の高い蛇行状の血管の群れである。糸球体の数を計測して、試験する分子で処置したマウスと対照マウスにおける網膜の新血管形成を比較する。
【０１０８】
試験した分子の１つは、新血管形成の減少を引き起こしたモノクローナル抗体Ｈ３３である。
【０１０９】
（実施例５）
ＪＡＭ−Ｃに対するモノクローナル抗体Ｈ３３は、血管形成及び腫瘍増殖の阻害物質である
１．材料と方法
抗体
ヒト及びマウスのＪＡＭ−Ｃ（Ｈ３３、Ｈ３６、及びＤ３３）に対するラットモノクローナル抗体（ＣＲＡＭ）、並びにマウスＰＥＣＡＭ−１／ＣＤ３１（ＧＣ５１）及びＬｓｅｌｅｃｔｉｎ／ＣＤ６２Ｌ（Ｍｅ１１４）に対するラットモノクローナル抗体は、以前に記載がある（Ａｕｒｒａｎｄ−Ｌｉｏｎｓら、２００１年ａ、上記；Ｇａｌｌａｔｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３０巻、３０〜３４頁、（１９８３年）；Ｐｉａｌｉら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻、２４６４〜７１頁、（１９９３年）；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻、３０１頁、（１９７９年））。無関係の抗体の対照ラットＩｇＧ２ａとして用いた抗ヒトＣＤ４４（９Ｂ５）は、Ｂ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ博士より快く提供された（Ｌａｓｃｈｉｎｇｅｒ及びＥｎｇｅｌｈａｒｄｔ、２０００年）。あらゆる他の無関係の抗体を、陰性対照として用いることができる。ヒトＪＡＭ−Ｂに対するポリクローナル抗体は、Ｐａｌｍｅｒｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２７５巻、１９１３９〜４５頁（２０００年）に従って調製した。モノクローナルマウス抗ヒトインテグリンαｖβ３（ＬＭ６０９）は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（カリフォルニア州、テメキュラ）から入手した。
【０１１０】
内皮細胞
臍静脈のコラゲナーゼ処理により、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を分離した（Ｗａｌｌ  ＲＴら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９６巻、２０３〜２１３頁（１９７８年））。ＨＵＶＥＣを、２０％ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、内皮細胞増殖サプリメント（ＥＣＧＳ、１５μｇ／ｍＬ；ニューヨーク州レイクプラシッド、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びヘパリン（４μｇ／ｍｌ；スイス、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｉｇｍａ）を追加したＭ１９９中に保存した。細胞は、パッセージ３〜５の間を使用した。
【０１１１】
ＶＥＧＦ刺激
グロースファクターレデューストマトリゲル（米国、マサチューセッツ州、ベッドフォード、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で１．１０５ＨＵＶＥＣを培養した。４８時間後、細胞を１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＶＥＧＦ−１６５（英国、ロンドン、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｈｏｕｓｅ）と、１５分間（免疫細胞化学用）又は１５分〜２４時間（フローサイトメトリー用）インキュベートした。
【０１１２】
フローサイトメトリー
ＨＵＶＥＣを、Ｈ３６抗ＪＡＭ−Ｃモノクローナル抗体と氷中でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、Ｈ３６抗体の０．２％ＢＳＡ結合を、フィコエリトリン結合した抗ラット抗体（米国、ペンシルバニア州、ウェストグローブ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて検出した。対照として、一次抗体を除外した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ及びＣｅｌｌｑｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（米国、カリフォルニア州、マウンテンビュー、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析を行った。
【０１１３】
免疫染色
モノクローナル抗体抗ＪＡＭ−Ｃ（Ｈ３６）及びＪＡＭ−Ｂ／ＶＥ−ＪＡＭに対するポリクローナル抗体で免疫組織化学試験を行うために、アセトン／メタノール１：１で凍結サンプルを−２０℃で５分間固定し、乾燥し、ＰＢＳ、０．２％ゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０中で再水和した。免疫細胞化学試験用に、細胞を、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液中で１５分間固定してから、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００のＰＢＳ溶液で１０分間透過化処理をした。細胞をＰＢＳ、０．２％ＢＳＡで洗浄し、一次抗体で１時間インキュベートし、洗浄し、その後Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＦＩＴＣ又はパーオキシダーゼ（米国、ペンシルバニア州、ウェストグローブ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と結合させた二次抗体と更にインキュベートした。共焦点顕微鏡Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０を用いて写真を得た。過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）で腎臓を染色して、糸球体腎炎を検出した。
【０１１４】
ｅｘ  ｖｉｖｏの大動脈リングアッセイ
記載された通りに、（Ｎｉｃｏｓｉａ，Ｒ．Ｆ．及びＯｔｔｉｎｅｔｔｉ、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．、２６巻（２）、１１９〜２８頁、（１９９０年））、マウスの大動脈リングアッセイを行った。要約すると、１ｍｍの胸部大動脈リングを、場合により試験する抗体を含む、増殖因子を減少させたマトリゲル（米国、マサチューセッツ州、ベッドフォード、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）５０μｌの２つの層の間に置き、ヘパリン（米国、ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）２０Ｕ／ｍｌ及びＥＣＧＳ（米国、ニューヨーク州、レークプラシッド、Ｕｐｓｔａｔｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加したＤＭＥＭ１００μｌを上乗せした。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡を用いて位相差顕微鏡により、微小血管の増殖を可視化した。
【０１１５】
腫瘍移植
８〜１０週齢のＣ５６ＢＬ６／Ｊ雌マウス（フランス、Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ研究所）に、ネズミ科Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞（ＬＬＣ１）１ｘ１０６を皮下接種した。次いで、１日おきに、マウスに１５０μｇのモノクローナル抗体Ｈ３３、アイソタイプにマッチした対照の抗体Ｍｅ１１４、又はＰＢＳを腹腔内注射した。対照の腫瘍（ＰＢＳを注射したマウス）が１〜１．５ｃｍ３に達したら、動物を屠殺し、腫瘍を摘出し分析した。
【０１１６】
血管の定量
腫瘍の凍結切片を、免疫染色の章で記載したように、モノクローナル抗ＰＥＣＡＭ−１抗体で染色した。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡を用いて、凍結切片全体の写真を撮影した（腫瘍ごとに４つの凍結切片）。Ｚｅｉｓｓ  ＫＳ４００ソフトウェアを用いて、ＰＥＣＡＭ−１染色、及び腫瘍の全領域を定量した。
【０１１７】
エバンスブルー透過性アッセイ
麻酔したマウスの眼窩後静脈中に、抗ＪＡＭ−Ｃ又はアイソタイプにマッチした対照抗体１５０μｇを注射した。１５分後、エバンスブルー色素（米国、ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）３０ｍｇ／ｋｇ生理食塩水溶液の１００μｌを、抗体と同じ方法で注射し、１時間循環させた。次いで、マウスを３７℃の１％パラホルムアルデヒドのクエン酸バッファー溶液ｐＨ４．２で潅流し、血管管腔から色素を除去した。潅流した直後に、器官（腎臓、肺、心臓、及び脳）を解剖した。組織を乾燥（高速真空）した後、乾燥重量を測定した。引き続き組織を、７０℃で１８時間、ホルムアルデヒド５００μｌ中でインキュベートして、エバンスブルーを抽出した。抽出物を遠心分離し、上清の６２０ｎｍの吸光度を分光光度計で測定した。抽出物の色素濃度を、エバンスブルーのホルムアミド溶液の検量線から計算し、乾燥組織重量に標準化した。
【０１１８】
統計学的分析
血管密度数、腫瘍体積、及び腫瘍重量を、マンホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）検定を用いて分析した。統計用ソフトウェアであるＳｔａｔＶｉｅｗ（米国、カリフォルニア州、バークレイ、Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社）を用いて、分析結果を計算した。
【０１１９】
結果
ＪＡＭ−Ｃは腫瘍血管により発現され、血管形成刺激に感受性である
ヒト肝臓の血管形成性腫瘍では、抗ＪＡＭ−Ｃ抗体Ｈ３６は血管を染色する（図１）。それとは対照的に、ＪＡＭ−Ｃをコードする転写物は、正常の肝臓には存在しない。ＶＥＧＦでＨＵＶＥＣを処理すると、１５分以内に内皮の細胞間接触部に、即座に大量のＪＡＭ−Ｃの蓄積がもたらされる（図２Ａ）。この突然の出現は、ＪＡＭ−Ｃの再局在化の結果であり、発現レベルがこの処理によって変更されることはない（図２Ｂ）。ＨＵＶＥＣをＴＮＦ−α又はトロンビンで刺激すると、同様の結果が観察された。
【０１２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの血管の生長は、抗ＪＡＭ−Ｃモノクローナル抗体により阻害されるｅｘ  ｖｉｖｏの大動脈リングアッセイを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの新血管形成を行った。新たに解剖したマウスの大動脈を小さなリングに切り、これらを、抗ＪＡＭ−Ｃ抗体の存在下又は存在なしにマトリゲル中に埋め込んだ。大動脈リングからの内皮血管の生長を、１２日間にわたって評価した。対照の抗ＪＡＭ−Ｃ又はアイソタイプにマッチした抗体が存在しても大動脈の出芽に影響を及ぼさないが、Ｈ３３抗ＪＡＭ−Ｃ抗体は新血管形成を完全に阻止する（図３）。
【０１２１】
抗ＪＡＭ−Ｃモノクローナル抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の増殖及び血管形成を低下させる
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの血管形成がＨ３３抗ＪＡＭ−Ｃ抗体で阻止され得ることを仮定して、我々はこの抗体が腫瘍の血管形成及び腫瘍の増殖に作用があるか否かを調べた。マウスに、Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞を皮下注射した。次いで、抗ＪＡＭ−Ｃ抗体及び対照の抗体を、１日おきに腹腔内注射した。対照の腫瘍が１〜１．５ｃｍ３に達したら動物を屠殺し、腫瘍を摘出した。マウスをＨ３３抗ＪＡＭ−Ｃ抗体で処理すると、対照のアイソタイプにマッチした抗体又はＰＢＳと比べて、腫瘍の大きさ（図４Ａ）、体積（図４Ｂ）、及び重量（図４Ｃ）は有意に減少した。
【０１２２】
摘出した腫瘍の代表的な例を図４Ａに示す。Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞は、ＪＡＭ−Ｃを発現しない（データは示さず）。Ｈ３３抗体の腫瘍の増殖に対する作用は、血管形成の阻害によるものである。腫瘍の脈管構造を可視化するために、凍結切片を、内皮のマーカーであるＰＥＣＡＭ−１に対する抗体で免疫染色した（図４Ｄ）。腫瘍の領域全域のＰＥＣＡＭ−１染色の％値を測ることにより血管の密度を定量した（図４Ｅ）。対照に比べると、Ｈ３３抗体は腫瘍における血管の数を低下させた。
【０１２３】
Ｈ３３抗ＪＡＭ−Ｃモノクローナル抗体はｉｎ  ｖｉｖｏで毒性がない
ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体を注射すると、毒性があり得ることは知られている。Ｈ３３抗ＪＡＭ−Ｃ抗体に見られた作用はマウスにおける全身の毒性作用によるものではないことを照らし合わせるために、抗体を注射した動物が病状を発症するか否かを調べた。ＪＡＭ−Ｃは腎臓の内皮により発現されるので、抗体が糸球体腎炎を作り出すか否かを最初に分析した。このために、処置した動物の腎臓切片は、過ヨウ素酸−シッフで染色された。糸球体に、タンパク質の異常な蓄積は検出されなかった（図５Ａ）。
【０１２４】
ＪＡＭ−Ｃは血管透過性の制御に関与するので、抗体が血管の漏れ易さを引き起こすか否かも試験した。幸いなことに、これは心臓、肺、腎臓、又は脳、分析を行った代表的臓器にはなかった（図５Ｂ）。
【０１２５】
対照のマウス（ｃｔｒｌ）又はアイソタイプにマッチした対照の抗体で処置したマウスに比べて、Ｈ３３で処置した網膜に糸球体の数の低下が見られた。これから、Ｈ３３で処置した動物では網膜の新血管形成が低下することが指摘される（図６）。
【０１２６】
（実施例６）
抗ＪＡＭ−Ｃ抗体Ｈ３３は腫瘍中のマクロファージの数を低下させるが、増殖にも内皮細胞のアポトーシスにも影響を及ぼさない
材料と方法
血管の密度、アポトーシス細胞、及び腫瘍中へのマクロファージ含量の組織学的検査及び定量
モノクローナル抗体抗ＰＥＣＡＭ−１（ＧＣ５１）を有する腫瘍凍結切片に対する免疫組織化学検査用に、切片を−２０℃で５分間、アセトン／メタノール１：１で固定し、乾燥し、ＰＢＳ／０．２％ゼラチン／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で水和させた。切片を、室温で１時間抗体とインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄後、パーオキシダーゼ（米国、ペンシルバニア州、ウェストグローブ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と結合させた２次抗体とインキュベートした。
【０１２７】
パラホルムアルデヒドで固定しパラフィン包埋した、ＰＥＣＡＭ−１及びＪＡＭ−Ｃに対するポリクローナル抗体を有する眼の切片に対する免疫組織化学検査用に、切片を脱ロウし、従来の手順を続けた。組織切片を、次いで、０．３％Ｈ２Ｏ２のメタノール溶液で１０分間処理し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３０分間ブロックした。切片を、室温で１時間、ポリクローナル抗体とインキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄した後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）システムと３０分インキュベートした（スイス、Ｚｇ、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  ＡＧ）。
【０１２８】
以前に記載された（Ｋｉｎｄｌｅｒ，Ｖ．ら、Ｃｅｌｌ、５６巻、７３１〜７４０頁、１９８９年）方法を用いて、腫瘍凍結切片で酸ホスファターゼ活性を検出した。腫瘍凍結切片のアポトーシス細胞の検出は、ＤＮＡ鎖切片をラベルすることに基づき（ＴＵＮＥＬ蛍光法）、ターミナルトランスフェラーゼ及びビオチン−１６−ｄＵＴＰを用い、製造者の指示（スイス、ロートクロイツ、Ｒｏｓｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ株式会社）に従って行った。
【０１２９】
結合したビオチン−１６−ｄＵＴＰを、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  Ｄｙｅ（米国、ペンシルバニア州、ウェストグローブ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に結合したストレプトアビジンで検出した。
【０１３０】
ＡｘｉｏｃａｍカラーＣＣＤカメラを装着したＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡又はＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ  １顕微鏡を用いて写真を得た。画像は、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ（登録商標）ソフトウェア（ドイツ、オーベルコッヘン、Ｚｅｉｓｓ）を用いて記録し処理した。
【０１３１】
酸ホスファターゼ陽性細胞（マクロファージ）の数及び腫瘍中へのＴＵＮＥＬ陽性細胞（アポトーシス細胞）の数を定量するために、Ｚｅｉｓｓ  ＫＳ４００又はＯｐｅｎｌａｂソフトウェア（ドイツ、オーベルコッヘン、Ｚｅｉｓｓ）を用いて、凍結切片全体（腫瘍あたり凍結切片４個）の写真を分析した。
【０１３２】
細胞の増殖を決定するためのＭＴＴアッセイ
ネズミ原発性内皮細胞（ＬＭＥＣ）及び腫瘍細胞（ＬＬＣＩ）の増殖の指標を、Ｈａｎｓｅｎ，ＭＢら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１１９巻、２０３〜２１０頁、１９８９年に記載されているように、ＭＴＴ（３，（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリン臭化物）法を用いて決定した。簡単に述べると、細胞を１ウェルあたり１．２５ｘ１０４〜１ｘ１０５個の範囲の密度で９６ウェルプレートに３組ずつ接種し、５０ｍｇ／ｍｌの抗ＪＡＭ−Ｃ抗体Ｈ３３又は対照の抗体である９Ｂ５の存在下又は存在なしで完全培地中で培養した。培養２４時間後、ＭＴＴ溶液（滅菌ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ）２５ｍｌを各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした後、抽出バッファー（２０％ｗ／ｖのＳＤＳをＤＭＦ溶液及び脱塩水それぞれに溶解し、８０％酢酸と２．５％１Ｎ  ＨＣｌの２．５％を加えてｐＨを４．７に調節したもの）１００ｍｌを加えた。３７℃で一夜インキュベート後、マイクロプレートリーダー（米国、カリフォルニア州、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１３３】
結果
Ｈ３３抗ＪＡＭ−Ｃ抗体は、マクロファージの腫瘍中への動員を減少させる
腫瘍の血管形成には炎症が伴うことが多く、マクロファージは顕著な腫瘍関連の炎症細胞を代表している（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｍら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ、７０巻、４７８〜４９０頁、２００１年）。実際、マクロファージは、大抵は低酸素の条件下で、ＶＥＧＦなどの血管形成因子を分泌することにより血管形成に関与する（Ｍｕｒｄｏｃｈ，Ｃら、Ｂｌｏｏｄ、１０４巻（８）、２２２４〜３４頁、２００４年）。ＪＡＭ−Ｃは、白血球の接着、並びに内皮細胞及び上皮細胞を介した遊出に関係している（Ｚｅｎ，Ｋら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、１５巻、３９２６〜３９３７頁、２００４年；Ｃｈａｖａｋｉｓ，Ｔら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００４年；Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｌｅｇｅｒ，ＣＡら、Ｂｌｏｏｄ、１００巻、２４７９〜２４８６頁、２００２年；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，ＳＡら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７５巻、３４７５０〜３４７５６頁、２０００年）。
【０１３４】
そこで、マクロファージの腫瘍中への動員にＨ３３抗体が影響を及ぼすことがあるか否かを調べた。図７Ｂ及び７Ｄに示すように、Ｈ３３抗体で処置したマウスは、対照のマウスに比べてマクロファージ含量の減少を示した。これにより、血管形成に対するＨ３３の作用は、一部分はマクロファージの動員に及ぼす働きによって媒介されることが指摘される。
【０１３５】
Ｈ３３抗ＪＡＭ−Ｃ抗体は、内皮細胞の増殖又はアポトーシスに対する作用がない
血管形成は、血管形成の刺激の際の内皮細胞の増殖及び構築的な再編成により調整された、複雑なプロセスである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮細胞の増殖を阻害することによりＨ３３抗体が血管形成を阻止するか否かが最初に試験され、作用がないことが見出された（図８Ａ）。Ｈ３３処置が腫瘍細胞の増殖に与えるあらゆる直接の結果を避けるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの腫瘍細胞でも実験を行い、作用は検出できなかった（図８Ｂ）。
【０１３６】
これらの結果により、Ｈ３３の投与後に観察された血管形成の低下は、脈管細胞又は腫瘍細胞の増殖を妨げたことによってもたらされたのではないことが示された。アポトーシスの刺激は、Ｈ３３処置によって引き起こされた血管形成の低下に対する別の説明でもある。この仮説は、アポトーシス細胞の標準のラベリングプロトコール（ＴＵＮＥＬ）によりアポトーシスを同定することにより、腫瘍切片上で試験された。結果は、Ｈ３３抗体が、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮細胞のアポトーシスに関係がないことを示していた（図８Ｃ、データを示さず）。しかし、腫瘍細胞はｉｎ  ｖｉｖｏでＴＵＮＥＬラベルの上昇を示し、抗体が媒介する血管形成が低下した結果としてアポトーシスが起こったことを示唆している（図８Ｃ及びＤ）。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】ヒト肝臓腫瘍でＪＡＭ−Ｃが血管により発現されることを示す図である。ＪＡＭ−Ｃの発現は、血管形成腫瘍のパネルで分析した。ヒトＪＡＭ−Ｃをコードする転写物は、正常な肝臓には存在しない。抗ＪＡＭ−Ｃ抗体で凍結切片を免疫染色すると、血管の分集団による発現が示される（矢印）。ＰＥＣＡＭ−１に対するポリクローナル抗体で染色して血管の構造を可視化したものを右のパネルに示すが、腫瘍の血管形成特性はαｖβ３染色（挿入）により制御された。
【図２】ＶＥＧＦ刺激時に、ＪＡＭ−ＣがＨＵＶＥＣの内皮細胞間接合部で動員されることを示す図である。（Ａ）ＨＵＶＥＣを組換えＶＥＧＦ−１６５で刺激し、ホルムアルデヒドで固定し、抗ＪＡＭ−Ｃモノクローナル抗体でＪＡＭ−Ｃの局在を可視化した。対照として、ＪＡＭ−Ａ染色を行った。ＪＡＭ−Ｃ分子は、ＶＥＧＦ−１６５刺激時に細胞間接触部で強化されたが、ＪＡＭ−Ａでは効果が見られなかった。（Ｂ）ＦＡＣＳ分析により、ＶＥＧＦ処置後も発現レベルは変化がない（細線は陰性対照、点線は非処置細胞、太線はＶＥＧＦ処置細胞）ことから、細胞間接触時のＪＡＭ−Ｃの強化は分子の局在によることが示された。
【図３】抗ＪＡＭ−Ｃモノクローナル抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血管形成を消失させることを示す図である。抗ＪＡＭ−Ｃ抗体（５０μｇ／ｍｌ）の存在下又は存在なしで、マウスからの大動脈リングが２層のマトリゲルの間に成長し、１２日後に新血管形成が可視化された。写真は、代表的な非処置（Ａ、ｎ＝１１）、又は抗ＪＡＭ−Ｃモノクローナル抗体Ｈ３３（Ｂ、ｎ＝１１）及びＤ３３（Ｃ、ｎ＝６）若しくはアイソタイプにマッチした対照の抗体Ｍｅ１１４（Ｄ、ｎ＝６）で処置した大動脈リング微小血管の光学顕微鏡写真である。Ｈ３３のみが脈菅形成の出芽を阻止した。
【図４】抗ＪＡＭ−Ｃ抗体Ｈ３３が、腫瘍の増殖及び腫瘍の血管形成を低下させることを示す図である。マウスにＬＬＣ１腫瘍細胞を皮下注射し、１日おきに抗ＪＡＭ−Ｃ抗体又はアイソタイプにマッチした対照の抗体（１５０μｇ）で処置した。（Ａ）対照のマウス（ＰＢＳ及びアイソタイプにマッチした対照の抗体）又はＨ３３抗ＪＡＭ−Ｃ抗体で処置したマウスに増殖した１２日目のＬＬＣ１腫瘍の肉眼的外観である。Ｈ３３抗ＪＡＭ−Ｃ抗体で処置したマウスは、腫瘍の体積（Ｂ）及び腫瘍の重量（Ｃ）の測定により示されるように腫瘍増殖が低下したことが示される。ＰＥＣＡＭ−１免疫染色（Ｄ）及びコンピュータ分析による定量（Ｅ）により、微小血管が検出された。＊ｐ＜０．０１。バーはそれぞれ１０匹の試験動物の平均値±標準誤差を表す。
【図５】Ｈ３３抗ＪＡＭ−Ｃ抗体はｉｎ  ｖｉｖｏでは毒性がないことを示す図である。Ｈ３３抗ＪＡＭ−Ｃ抗体が腫瘍の増殖をもたらすのは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける全身の毒性作用によるのではないことを確かめるために、図４に記載したようにマウスを処置し、器官を解剖し分析した。（Ａ）これらのマウスからの腎臓を過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）で染色したものは、糸球体腎炎の発症のいかなる徴候も示していなかった。対照として、自己免疫疾患ＮＺＢｘＢＳＸＢマウスからの腎臓の切片を比較した（Ｍｅｒｉｎｏ  Ｒ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．９４巻（２）、５２１〜５頁（１９９４年））。（Ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管透過性を、エバンスブルー透過アッセイを用いて評価した。Ｈ３３抗体は、代表的な臓器の心臓、肺、腎臓、及び脳における血管の透過性に対し作用がなかった。バーはそれぞれ、試験した７匹の動物の平均値±標準誤差を表す。
【図６】網膜の脈管再成の間の糸球体の定量化を示す図である。Ｈ３３処置及び対照の抗体処置のマウスにおける網膜の新血管形成を比べるために糸球体の数を計測した。Ｈ３３処置（１３Ｈ３３）マウスでは、対照マウス（ｃｔｒｌ）又はアイソタイプにマッチした対照の抗体（９Ｂ５）で処置したマウスに比べると、糸球体の数の低下が見られた。これにより、Ｈ３３で処置した動物で、網膜の新血管形成が低下することが指摘される。
【図７】抗ＪＡＭ−Ｃ抗体Ｈ３３が、腫瘍におけるマクロファージの数を低下させることを示す図である。ＰＢＳ、対照の抗体、又はＨ３３で処置したマウスからのＬＬＣ１腫瘍凍結切片を、酸ホスファターゼ染色してマクロファージを検出した（Ａ、矢印）。腫瘍内の１ｍｍ２あたりのラベルしたマクロファージの数を計測することにより、微小血管の密度を定量した（Ｂ）。Ｈ３３処置動物からの腫瘍では、対照の動物に比べてマクロファージの浸潤が低下することが示された。バーはそれぞれ、グループあたりｎ匹（ＰＢＳはｎ＝６、対照の抗体はｎ＝６、Ｈ３３はｎ＝９）のマウスの４つの切片から得られた平均値±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１。バーのスケール、（Ａ）１６０ｍｍ、（Ｂ）２０ｍｍ。
【図８】Ｈ３３抗体は、内皮細胞の増殖にもアポトーシスにも影響を及ぼさないことを示す図である。内皮細胞（Ａ）又はＬＬＣ１腫瘍細胞（Ｂ）に、１ウェルあたり１．２５ｘ１０４〜５ｘ１０４個の範囲の細胞を接種し、Ｈ３３抗体若しくは対照の抗体のいずれかの存在下又は存在なしで培養した。ＭＴＴアッセイを用いて増殖速度を決定した。Ｈ３３抗体は、内皮細胞及び腫瘍細胞の増殖に影響を及ぼさない。（Ｃ）アイソタイプにマッチした対照又はＨ３３処置マウスからのＬＬＣ１腫瘍凍結切片を、ＰＥＣＡＭ−１に免疫染色し（緑色）、アポトーシス細胞にはＴＵＮＥＬ染色した（赤色、矢印）。マウスをＨ３３抗体で処置した場合、対照に比べて、内皮細胞はアポトーシスの増加を示さなかった。対照的に、腫瘍内のアポトーシス細胞を定量することによって示されるように、腫瘍細胞ではアポトーシスの増加が示される（Ｄ）。
【図１】
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【図６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月20日(2006.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託アクセッションＤＳＭ  ＡＣＣ２６２２として寄託されたハイブリドーマ１３Ｈ３３により産生される抗体Ｈ３３、Ｈ３３と同じ特異性を有するそのフラグメント及びＨ３３と同じ特異性を有するその誘導体からなる群から選択される血管形成阻害分子。
【請求項２】
当該分子が、
ａ）  抗体Ｈ３３と同じ特異性を有するＨ３３をベースにしたヒト化抗体、
ｂ）  抗体Ｈ３３と同じ特異性を有するＨ３３をベースにしたキメラ抗体
ｃ）（ｉ）  Ｆａｂ  フラグメント、
（ｉｉ）  Ｆｖフラグメント、
（ｉｉｉ）  単一領域抗原結合性フラグメント、
（ｉｖ）  ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及びｓｃＦｖのより大
きな集合体、並びに
（ｖ）  ＶＨＨ、
から選択されるＨ３３のフラグメント、
ｄ）  Ｈ３３の特異性を有する組換え抗体、及び
ｅ）  Ｈ３３としての特異性を有するヒトモノクローナル抗体
からなる群から選択される、請求項１に記載の血管形成阻害分子。
【請求項３】
当該分子が、
ａ）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの血管形成を阻害する、
ｂ）  ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍形成を阻害する、
ｃ）  腫瘍中へのマクロファージの動員を減少させる、
ｄ）  ＪＡＭ−ＣのＪＡＭ−Ｂとの相互作用を阻害する、
請求項１又は２に記載の血管形成阻害分子。
【請求項４】
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の血管形成阻害分子及び（ｂ）１又は２の非免疫グロブリン部分を含む融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の血管形成阻害分子を含む医薬。
【請求項６】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託アクセッションＤＳＭ  ＡＣＣ２６２２として寄託されたハイブリドーマ１３Ｈ３３。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の血管形成阻害因子をコードするポリペプチド。
【請求項８】
選択された宿主細胞中で、その転写及び翻訳の制御を可能にする適切な調節配列に結合した請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項９】
請求項８に記載の発現カセットを含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の血管形成阻害因子を生産する方法であって、
ａ）  当該血管形成阻害因子をコードする組換え発現ベクターを真核及び原核宿主細胞中に導入し、
ｂ）  宿主細胞中において生産物の発現を可能にするのに十分な時間当該宿主細胞を培養することを含む、上記方法。
【請求項１２】
当該宿主細胞が哺乳類細胞である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
当該宿主細胞がＣＨＯ、ＮＳ／０ミエローマ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３又はＳＰ２．０細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の血管形成阻害分子を含む、癌の治療又は診断のための治療用又は診断用組成物。
【請求項１５】
癌が固形腫瘍である、請求項１４に記載の治療用又は診断用組成物。
【請求項１６】
患者におけるＪＡＭ−Ｂ／ＪＡＭ−Ｃ相互作用を阻害するための請求項５に記載の医薬。
【請求項１７】
適切な賦形剤、担体又は希釈剤を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の血管形成阻害分子を含む医薬組成物。
【請求項１８】
適切な賦形剤、担体又は希釈剤を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の血管形成阻害分子を含む診断用組成物。
【請求項１９】
当該血管形成阻害分子が標識されている請求項１８に記載の診断用組成物。
【請求項２０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の血管形成阻害分子或いは請求項１８又は１９に記載の診断用組成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける診断的使用。
【国際調査報告】
2007515159.tif 000010
2007515159.tif 000011
2007515159.tif 000012
2007515159.tif 000013