(57)【要約】  単純ヘルペスウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）をコードする核酸を含むことを特徴とする単純ヘルペスウイルスを開示する。開示される単純ヘルペスウイルスは、遺伝子運搬酵素プロドラッグ治療法を行う癌の治療に有効であることが示されている。【選択図】  図３１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）をコードする核酸を含むことを特徴とする単純ヘルペスウイルス。
【請求項２】
前記ＮＴＲが大腸菌ＮＴＲである、請求項１記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項３】
前記核酸が、配列番号２又は配列番号１のポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項２記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項４】
前記核酸が、配列番号２又は配列番号１のポリペプチドをコードする核酸に対し少なくとも６０％の配列同一性を有する、請求項１記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項５】
前記配列同一性の程度が少なくとも７０％である、請求項４記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項６】
前記核酸が、配列番号２の核酸、その相補配列、又は配列番号１のポリペプチドをコードする核酸に対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、請求項１記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項７】
単純ヘルペスウイルスのゲノムが上記ＮＴＲをコードする核酸と機能的に連結された調節性ヌクレオチド配列をさらに含み、該調節性ヌクレオチド配列は該ＮＴＲの転写制御機能を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項８】
前記核酸が、単純ヘルペスウイルスのゲノムの少なくとも１つのＲＬ１遺伝子座内に位置する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項９】
前記核酸が、単純ヘルペスウイルスのゲノムの少なくとも１つのＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列の内に位置する又はそれと重複する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１０】
単純ヘルペスウイルスがＨＳＶ−１ １７株若しくはＦ株、又はＨＳＶ−２ ＨＧ５２株のうち１つの変異株である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１１】
単純ヘルペスウイルスがＨＳＶ−１ １７株の変異株１７１６の変異株である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１２】
遺伝子特異的ヌル変異株である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１３】
ＩＣＰ３４．５ヌル変異株である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１４】
少なくとも１つの発現可能なＩＣＰ３４．５遺伝子を欠損する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１５】
わずかに１つの発現可能なＩＣＰ３４．５遺伝子を欠損する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１６】
神経毒性がない、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１７】
異種ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）をコードする核酸が単純ヘルペスウイルスのゲノムに組み込まれる核酸カセットの一部を形成するものであり、該カセットは、以下：
（ａ）上記ＮＴＲをコードする核酸、及びコードする核酸
（ｂ）リボソーム結合部位、並びに
（ｃ）マーカー
をコードし、該ＮＴＲをコードする核酸は該リボソーム結合部位の上流（５’）に配置され、該リボソーム結合部位は該マーカーの上流（５’）に配置される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１８】
調節性ヌクレオチド配列がＮＴＲをコードする核酸の上流（５’）に位置し、該調節性ヌクレオチド配列は該ＮＴＲをコードする核酸の転写調節機能を有する、請求項１７記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１９】
前記カセットがタンパク質コード配列を破壊し、各遺伝子産物の不活性化をもたらす、請求項１７又は１８記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項２０】
前記カセットの転写産物が、ＮＴＲをコードする第１シストロン及びマーカーをコードする第２シストロンを含むバイシストロン又はポリシストロン転写産物であり、リボソーム結合部位が第１シストロンと第２シストロンの間に位置する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項２１】
リボソーム結合部位が内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項２２】
マーカーがポリペプチドをコードする規定のヌクレオチド配列である、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項２３】
マーカーが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のタンパク質コード配列又は強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のタンパク質コード配列を含む、請求項２２記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項２４】
マーカーが、対応する標識核酸プローブを用いた高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションによって検出可能な規定のヌクレオチド配列を含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項２５】
カセットが、マーカーをコードする核酸の下流（３’）に位置するポリアデニル化配列をコードする核酸をさらに含む、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項２６】
ポリアデニル化配列がシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化配列を含む、請求項２５記載の単純ヘルペスウイルス
【請求項２７】
医学的治療の方法に使用するための、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項２８】
癌の治療に使用するための、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項２９】
腫瘍の腫瘍溶解療法に使用するための、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項３０】
癌の治療のための医薬の製造における、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルスの使用。
【請求項３１】
治療が必要な患者に、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルスを投与するステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を溶解又は死滅させる方法。
【請求項３２】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の単純ヘルペスウイルスを含むことを特徴とする医薬、医薬組成物又はワクチン。
【請求項３３】
薬学的に許容される担体、アジュバント又は希釈剤をさらに含む、請求項３２記載の医薬、医薬組成物又はワクチン。
【請求項３４】
ウイルスのゲノムが少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）をコードする核酸配列を含むことを特徴とする単純ヘルペスウイルス。
【請求項３５】
ウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）をコードする核酸配列を含み、神経毒性がないことを特徴とする単純ヘルペスウイルス。
【請求項３６】
請求項３４又は３５記載の単純ヘルペスウイルス及びＮＴＲプロドラッグを含むことを特徴とする組成物。
【請求項３７】
ＮＴＲプロドラッグがＣＢ１９５４である、請求項３６記載の組成物。
【請求項３８】
腫瘍の治療に使用するための単純ヘルペスウイルスであって、該ウイルスのゲノムが少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含むことを特徴とする単純ヘルペスウイルス。
【請求項３９】
腫瘍の治療に使用するための単純ヘルペスウイルスであって、該ウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、神経毒性がないことを特徴とする単純ヘルペスウイルス。
【請求項４０】
腫瘍の治療においてＮＴＲプロドラッグと併用するための単純ヘルペスウイルスであって、該ウイルスのゲノムが少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含むことを特徴とする単純ヘルペスウイルス。
【請求項４１】
腫瘍の治療においてＮＴＲプロドラッグと併用するための単純ヘルペスウイルスであって、該ウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、神経毒性がないことを特徴とする単純ヘルペスウイルス。
【請求項４２】
ある量の請求項１〜２６、３４又は３５記載の単純ヘルペスウイルスを含有する第１容器と、ある量のＮＴＲプロドラッグを含有する第２容器とを含むキットオブパーツ。
【請求項４３】
腫瘍の治療のための医薬の製造における単純ヘルペスウイルスの使用であって、該ウイルスのゲノムが少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含む、上記使用。
【請求項４４】
腫瘍の治療のための医薬の製造における単純ヘルペスウイルスの使用であって、該ウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、該単純ヘルペスウイルスは神経毒性がない、上記使用。
【請求項４５】
腫瘍の治療のための医薬の製造における単純ヘルペスウイルス及びＮＴＲプロドラッグの使用であって、該ウイルスのゲノムが少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含む、上記使用。
【請求項４６】
腫瘍の治療のための医薬の製造における単純ヘルペスウイルス及びＮＴＲプロドラッグの使用であって、該ウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、該単純ヘルペスウイルスは神経毒性がない、上記使用。
【請求項４７】
腫瘍の治療においてＮＴＲプロドラッグを含む第２医薬と連続的に又は同時に投与するための第１医薬の製造における単純ヘルペスウイルスの使用であって、該ウイルスのゲノムが少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含む、上記使用。
【請求項４８】
腫瘍の治療において単純ヘルペスウイルスを含む第２医薬と連続的に又は同時に投与するための第１医薬の製造におけるＮＴＲプロドラッグの使用であって、該ウイルスのゲノムが少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含む、上記使用。
【請求項４９】
腫瘍の治療において単純ヘルペスウイルスを含む第２医薬と連続的に又は同時に投与するための第１医薬の製造におけるＮＴＲプロドラッグの使用であって、該ウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、該単純ヘルペスウイルスは神経毒性がない、上記使用。
【請求項５０】
腫瘍の治療においてＮＴＲプロドラッグを含む第２医薬と連続的に又は同時に投与するための第１医薬の製造における単純ヘルペスウイルスの使用であって、該ウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、該単純ヘルペスウイルスは神経毒性がない、上記使用。
【請求項５１】
腫瘍の治療方法であって、以下のステップ：
（ｉ）治療が必要な患者に、治療上有効な量の単純ヘルペスウイルスを投与するステップであって、該ウイルスのゲノムが少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内にニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含む、上記ステップ、
（ｉｉ）上記患者に治療上有効な量のＮＴＲプロドラッグを投与するステップ
を含む方法。
【請求項５２】
腫瘍の治療方法であって、以下のステップ：
（ｉ）治療が必要な患者に、治療上有効な量の単純ヘルペスウイルスを投与するステップであって、該ウイルスのゲノムがニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、該単純ヘルペスウイルスは神経毒性がない、上記ステップ、
（ｉｉ）上記患者に治療上有効な量のＮＴＲプロドラッグを投与するステップ
を含む方法。
【請求項５３】
単純ヘルペスウイルスが腫瘍細胞を死滅可能である、請求項５１又は５２記載の方法。
【請求項５４】
ＮＴＲプロドラッグがＣＢ１９５４である、請求項３８〜５３のいずれか１項に記載のウイルス、キット、使用又は方法。
【請求項５５】
ニトロレダクターゼをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで発現させる方法であって、少なくとも１つの対象の細胞又は組織に単純ヘルペスウイルスを感染させるステップを含み、該ウイルスのゲノムは少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、該ニトロレダクターゼは転写調節配列に機能的に連結されている、上記方法。
【請求項５６】
ニトロレダクターゼをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで発現させる方法であって、少なくとも１つの対象の細胞又は組織に神経毒性がない単純ヘルペスウイルスを感染させるステップを含み、該ウイルスのゲノムは異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、該ニトロレダクターゼは転写調節配列に機能的に連結されている、上記方法。
【請求項５７】
ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ（ＥＣＡＣＣ受託番号０３１１０５０１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単純ヘルペスウイルスのゲノムがニトロレダクターゼをコードする核酸を含むことを特徴とする単純ヘルペスウイルス変異株に関する。
【背景技術】
【０００２】
単純ヘルペスウイルス
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムは、共有結合した長い（Ｌ）セグメントと短い（Ｓ）セグメントと称する２つのセグメントを含む。それぞれのセグメントは、一対の逆方向末端反復配列と隣接する特有の配列を含有する。長い反復配列（ＲＬ又はＲＬ）と短い反復配列（ＲＳ又はＲＳ）は異なるものである。
【０００３】
広範囲にわたり研究１，６，７，８されているＨＳＶのＩＣＰ３４．５（γ３４．５とも呼ばれる）遺伝子は、ＨＳＶ−１のＦ株９及びｓｙｎ１７＋株３並びにＨＳＶ−２のＨＧ５２株４において配列が決定されている。ＩＣＰ３４．５遺伝子の１コピーがそれぞれのＲＬ反復領域内に位置する。ＩＣＰ３４．５遺伝子の両方のコピーを不活性化する変異株（すなわち、ヌル変異株）、例えばＨＳＶ−１  １７株の１７１６変異株２（ＨＳＶ１７１６）又はＦ株５の変異株Ｒ３６１６若しくはＲ４００９は神経毒性を欠く、すなわち無毒性であるので、遺伝子送達ベクターとして又は腫瘍溶解（腫瘍崩壊；oncolysis）による腫瘍の治療の両方に利用できることは公知である。ＨＳＶ−１ １７株の１７１６変異株は、それぞれのＲＬ反復配列のＢａｍＨＩ（ｓ）制限断片内に位置するＩＣＰ３４．５遺伝子のそれぞれのコピー中に７５９ｂｐの欠失を有する。
【０００４】
ＨＳＶ１７１６などのＩＣＰ３４．５ヌル変異株は、事実上、第一世代の腫瘍溶解性ウイルスである。ほとんどの腫瘍はそれぞれに特徴があるので、第１世代の腫瘍溶解性ウイルスの能力が全ての腫瘍型において複製する又はそれらに有効な治療を提供する広いスペクトルをもつことは保証されていない。
【０００５】
ＨＳＶ１７１６は、ＥＰ ０５７１４１０号及びＷＯ ９２／１３９４３号に記載され、１９９２年１月２８日に、欧州動物細胞培養コレクション（the European Collection of Animal Cell Cultures, Vaccine Research and Production Laboratories, Public Health Laboratory Services, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, United Kingdom）に受託番号Ｖ９２０１２８０３のもとで、ブダペスト条約（The Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure、本明細書では「ブダペスト条約」と呼ぶ）の条項に従って寄託されている。
【０００６】
ニトロレダクターゼプロドラッグ活性化
酵素プロドラッグ療法は、無毒又は低毒性プロドラッグをより顕著な細胞傷害性のある形態へ酵素的に活性化することに基づく。活性化にはプロドラッグの細胞傷害性還元形態への酵素還元が関わりうる。
【０００７】
大腸菌ニトロレダクターゼ酵素（ＮＴＲ）は、遺伝子運搬酵素プロドラッグ治療法（gene-dircted enzyme prodrug therapy；ＧＤＥＰＴ）において、ジニトロベンズアミドクラスのニトロ芳香族プロドラッグを活性化する酵素としての使用が提案されている１６。大腸菌ＮＴＲは２つの活性化部位をもつホモ二量体酵素であって、大腸菌由来の酸素非感受性酵素（ｎｆｓＢ遺伝子産物）である。大腸菌ＮＴＲは、ニトロフラゾンなどの広範囲のニトロ含有化合物を（ヒドロキシルアミン類へ）及びメナジオンなどのキノン類を（キノール類へ）還元する能力を有する。この能力は不可逆性阻害剤であるジクマロールにより特異的に抑制される。
【０００８】
芳香族ニトロ基を対応するヒドロキシルアミン（及び恐らくはアミン）誘導体へ還元するＮＴＲの能力は、主にジニトロベンズアミドクラスのプロドラッグを用いる癌化学療法において提案されている。５−アジリジン−１−イル−２，４−ジニトロベンズアミドＣＢ１９５４（ＣＡＳ登録番号２１９１９−０５−１）は、かかるＮＴＲを用いるＧＤＥＰＴ用のプロドラッグとして研究されているプロドラッグの１つである１６。
【０００９】
環状及び非環状ニトロアリールホスホロアミドマスタード類似体も、大腸菌ＮＴＲにより活性化されることが示されている１７。非環状４−ニトロベンジルホスホルアミドマスタードは、ニトロレダクターゼを発現するＶ７９細胞に対して１６７，５００倍の選択的細胞傷害性を示しＩＣ５０が０．４ｎＭと低く、ＣＢ１９５４より活性が約１００倍高くかつ選択性が２７倍高い。
【００１０】
ニトロレダクターゼを発現する組換えアデノウイルス及び組換えレトロウイルス１０が、プロドラッグＣＢ１９５４とともに、癌の治療に提供する意図で使用するために構築されている。該組換えウイルスは腫瘍溶解性でなく、遺伝子運搬酵素プロドラッグ治療法に依って腫瘍細胞死滅を達成する。
【発明の開示】
【００１１】
本発明者らは、ＲＬ１遺伝子座に不活性化を起こす突然変異、さらに具体的には、機能性ＩＣＰ３４．５遺伝子産物を産生せず、神経毒性がないようにＩＣＰ３４．５遺伝子産物の機能を不活性化する突然変異を有する単純ヘルペスウイルスは、腫瘍標的化療法に有用な遺伝子産物をコードする遺伝子を細胞へ送達するために使用できることを確認した。
【００１２】
本発明者らは新規の第二世代の腫瘍溶解性ＨＳＶ変異株を提供する。このＨＳＶ変異株のゲノムは、１つ又はそれぞれのＩＣＰ３４．５遺伝子座に挿入された異種（すなわち、非ＨＳＶ由来である）大腸菌ニトロレダクターゼタンパク質コード配列を含み、該配列はＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列を破壊してＩＣＰ３４．５遺伝子を非機能化して機能性ＩＣＰ３４．５遺伝子産物を発現できないようにする。作製されたＨＳＶは、挿入されたプロモーターの制御下で大腸菌ニトロレダクターゼ遺伝子産物を発現することができる。従って、このウイルスはＨＳＶ  １７株の１７１６変異株の腫瘍溶解活性を有し、遺伝子運搬酵素プロドラッグ治療法（ＧＤＥＰＴ）に利用することができ、そしてプロドラッグＣＢ１９５４と共に用いるとｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞死滅の有意な増大を示す。本ウイルス変異株をＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ（ＨＳＶ１７９０とも呼ぶ）と名付けた。
【００１３】
ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰは、遺伝子操作で作製した、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）遺伝子を発現する単純ヘルペスウイルスＩＣＰ３４.５ヌル変異株である。このウイルスは強化されたウイルス誘導腫瘍細胞傷害性を提供する。このウイルスはＮＴＲトランスジーン送達及びＣＢ１９５４プロドラッグ治療を、ＨＳＶ１７１６の増殖特異的溶解能と組み合わせるものである。
【００１４】
本発明の単純ヘルペスウイルスにより発現される異種ニトロレダクターゼポリペプチドは、ＮＴＲプロドラッグのニトロレダクターゼ依存性活性化により誘導される活性な医薬を組織特異的に送達するための遺伝子運搬酵素−プロドラッグターゲティング技法に有用でありうる。
【００１５】
本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでニトロレダクターゼ遺伝子をＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰによりマウス神経膠腫異種移植片モデル（mouse gliomal xenograft model）中に導入すると、プロドラッグＣＢ１９５４との併用で腫瘍増殖の遅延及び腫瘍溶解がもたらされることを実証した。ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰウイルスとＣＢ１９５４プロドラッグの両方を併用して投与すると、ウイルス又はプロドラッグを単独で用いるときより大きい効果をもたらす、すなわち、併用は相乗効果を示すことを観察した。
【００１６】
この結果は、腫瘍溶解性ＨＳＶ療法とニトロレダクターゼ／プロドラッグ処置に関する遺伝子療法との組み合わせが、腫瘍細胞死滅及び腫瘍増殖低減そしてそれによる腫瘍治療の有効な手段を提供することを実証する。
【００１７】
単純ヘルペスウイルスＨＳＶ１７１６が媒介する腫瘍溶解とニトロレダクターゼ遺伝子導入との組み合わせは、驚くべき相乗作用を示す結果をもたらし、全種類の腫瘍を治療するための新規な治療方法を提供する。
【００１８】
ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰは、Crusade Laboratories Limited（住所：Department of Neurology Southern General Hospital 1345 Govan Road Govan Glasgow G51 5TF Scotland）の名前で、２００３年１１月５日、欧州細胞培養コレクション（the European Collection of Cell Cultures (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, United Kingdom）に受託番号０３１１０５０１としてブダペスト条約（The Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure、本明細書ではブダペスト条約と呼ぶ）の条項に従って寄託されている。
【００１９】
従って、本発明は、単純ヘルペスウイルスのゲノムがニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含むことを特徴とする単純ヘルペスウイルスに関する。該単純ヘルペスウイルスはまた、非神経毒性でありうる。
【００２０】
その最も一般的な形では、本発明は、単純ヘルペスウイルスのゲノムがニトロレダクターゼをコードする核酸を含むことを特徴とする単純ヘルペスウイルスに関する。
【００２１】
本発明の一態様によると、本発明は、単純ヘルペスウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）をコードする核酸を含むことを特徴とする単純ヘルペスウイルスを提供する。
【００２２】
上記核酸は、大腸菌ＮＴＲをコードしてもよいし、配列番号２の核酸配列を含むものであっても、それからなるものであってもよいし、又はそれを例示することができる。あるいは、該核酸は配列番号２に対し少なくとも６０％の配列同一性を有してもよい。あるいは、上記配列同一性の程度は、かかる核酸によりコードされるポリペプチド又はタンパク質がニトロレダクターゼ機能を有することを条件として、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の１つであってもよい。配列の同一性は所与のヌクレオチド配列の全長にわたって決定する。配列が異なる長さである場合、短い方の配列の配列同一性を長い方の配列の全長にわたって決定する。
【００２３】
ＮＴＲをコードする上記核酸は、配列番号２の核酸又はその相補配列に対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする能力により選択することができる。
【００２４】
上記単純ヘルペスウイルスのゲノムは、上記ＮＴＲをコードする核酸と機能的に連結された調節配列をさらに含んでもよく、ここで上記調節配列は上記核酸の転写制御機能を有する。
【００２５】
ＮＴＲをコードする核酸は、単純ヘルペスウイルスのゲノムの少なくとも１つのＲＬ１遺伝子座内に位置しうる。好適には、該核酸は単純ヘルペスウイルスのゲノムの少なくともの１つのＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列の内に位置するか又はそれと重複することができる。該核酸は、ＲＬ１遺伝子座又はＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列の両方（通常はこれで全てであろう）のコピー内に位置してもよい。
【００２６】
単純ヘルペスウイルスは、好ましくは変異株であり、そしてＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２の変異株、さらに好ましくはＨＳＶ−１ １７株、ＨＳＶ−１ Ｆ株、又はＨＳＶ−２ ＨＧ５２株の１つの変異株である。単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１ １７株の１７１６変異株のさらなる変異株であってもよい。
【００２７】
ある特定の実施形態においては、単純ヘルペスウイルスは遺伝子特異的ヌル変異株、例えばＩＣＰ３４．５ヌル変異株であってもよい。
【００２８】
他の実施形態においては、単純ヘルペスウイルスは少なくとも1つの発現可能なＩＣＰ３４．５遺伝子を欠損してもよい。
【００２９】
さらに他の実施形態においては、単純ヘルペスウイルスはわずかに１つの発現可能なＩＣＰ３４．５遺伝子を欠損してもよい。
【００３０】
さらに他の実施形態においては、単純ヘルペスウイルスは神経毒性がないものでありうる。
【００３１】
本発明の単純ヘルペスウイルスにおいて、ＮＴＲをコードする核酸は単純ヘルペスウイルスのゲノム中に永久に組み込まれる核酸カセットの一部を形成するものであり、上記カセットは、以下：
（ａ）ＮＴＲをコードする核酸；
（ｂ）リボソーム結合部位；及び
（ｃ）マーカーをコードする核酸
を含み、ここでＮＴＲをコードする核酸はリボソーム結合部位の上流（５’）に配置され、そしてリボソーム結合部位はマーカーをコードする核酸の上流（５’）に配置され、そして上記リボソーム結合部位は上記マーカーの転写制御機能を有する。
【００３２】
調節性ヌクレオチド配列はＮＴＲをコードする核酸の上流（５’）に位置し、ここで調節性ヌクレオチド配列はＮＴＲをコードする核酸の転写、従って得られる転写産物及びポリペプチドの発現を制御及び調節する機能を有してもよい。調節配列は、当業者に公知の選択されたプロモーター又はエンハンサーエレメント、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含みうる。適宜、調節配列は構成的であってもよいし又は誘導的であってもよい。
【００３３】
カセットの構成要素は、好ましくは、予め定めた順序で配置される。
【００３４】
好ましい一実施形態においては、ＮＴＲをコードする核酸をリボソーム結合部位の上流（すなわち、５’）に配置し、そしてリボソーム結合部位をマーカーの上流（すなわち、５’）に配置する。転写時に、ＮＴＲをコードする核酸を含む第１シストロン及びマーカーをコードする核酸を含む第２シストロンを含み、これらのシストロンの間にリボソーム結合部位が位置するカセットから、単一転写産物（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）を産生させることができる。
【００３５】
このカセットの転写産物は、ＮＴＲをコードする核酸によりコードされた第１シストロン及びマーカー核酸をコードする第２シストロンを含み、リボソーム結合部位が第１シストロンと第２シストロンの間に位置するバイシストロン又はポリシストロン転写産物であってもよい。
【００３６】
他の実施形態においては、ＮＴＲをコードする核酸を第１調節性ヌクレオチド配列の上流（すなわち、５’）に配置し、そして第１調節性ヌクレオチド配列をマーカーの上流（すなわち、５’）に配置する。
【００３７】
上記カセットは、単純ヘルペスウイルスゲノムのタンパク質コード配列を破壊して各遺伝子産物の不活性化をもたらすことができる。
【００３８】
１つの好適なリボソーム結合部位はリボソーム侵入部位を含み、カセットの核酸によりコードされる転写ｍＲＮＡへのリボソームの侵入を可能にして、リボソームを翻訳開始シグナルと結合させる。好ましくは、リボソーム侵入部位は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、さらに好ましくは脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳであって、ｃａｐ依存性の翻訳開始を可能にする。ＩＲＥＳは従って、単一転写産物上の、バイシストロン又はポリシストロンｍＲＮＡの内部に位置するコード配列（すなわち、隣接シストロンの下流に位置するシストロン）の翻訳を可能にする。
【００３９】
好ましくは、マーカーは、組換えによりカセットが組み込まれた単純ヘルペスウイルス変異株に感染した細胞株（例えば、ＢＨＫ細胞）において発現することができるポリペプチドをコードする規定のヌクレオチド配列である。マーカーの機能は、カセットを用いて形質転換したウイルス変異株を含有するウイルスプラークの同定を可能にすることである。
【００４０】
マーカーは、好ましくは検出可能なマーカー、さらに好ましくは発現可能なマーカーポリペプチド若しくはタンパク質であり、少なくとも選択したポリペプチド又はタンパク質をコードする配列を含む。マーカーをコードする核酸はさらに、コード配列の上流及び／又は下流に、マーカーｍＲＮＡの転写制御機能を有する調節配列を含んでもよい。好ましいマーカーとしては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のタンパク質コード配列又は遺伝子、好ましくは強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のタンパク質コード配列又は遺伝子が挙げられる。
【００４１】
他の実施形態においては、マーカーは、例えば蛍光又は放射性標識を用いて標識した対応する核酸プローブを用いた高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションによって検出可能な、規定のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００４２】
カセットはまた、ポリアデニル化（「ポリＡ」）配列をコードする核酸を含んでもよく、上記配列は好ましくはマーカーをコードする核酸の下流（３’）に配置する。１つの好ましいポリＡ配列はシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化配列である。カセット内のポリＡ配列の好ましい位置は、マーカーの直ぐ下流（すなわち、３’）である。
【００４３】
本発明の単純ヘルペスウイルス変異株は、核酸カセットのウイルスゲノム中への位置指定挿入により、さらに好ましくは、相同組換えにより作製することができる。しかし、本発明のウイルスはこのように得られる単純ヘルペスウイルスに限定されるものでない。
【００４４】
本発明の他の態様においては、本発明に係る単純ヘルペスウイルスを医学的治療の方法に使用するために提供する。適宜、上記単純ヘルペスウイルスを疾患の治療に使用するために提供する。好ましくは、上記単純ヘルペスウイルスを癌の治療に使用するために提供する。適宜、上記単純ヘルペスウイルスを癌／腫瘍の腫瘍溶解治療に使用するために提供することができる。本発明に係る単純ヘルペスウイルスの、癌の治療のための医薬の製造における使用も提供する。
【００４５】
本発明の他の態様においては、腫瘍療法に使用するための本発明に係る単純ヘルペスウイルス変異株を含有する医薬、及び治療が必要な患者にＨＳＶ変異株又はかかるＨＳＶを含むか若しくはそれにから誘導される医薬の有効量を投与するステップを含む腫瘍の治療方法も提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を溶解又は死滅させる方法であって、治療が必要な患者に本発明に係る単純ヘルペスウイルスのある量を投与するステップを含む方法も提供する。
【００４６】
本発明に係る単純ヘルペスウイルスを含有する医薬、医薬組成物又はワクチンも提供する。医薬、医薬組成物又はワクチンはさらに薬学的に許容される担体、アジュバント又は希釈剤を含んでもよい。医薬組成物又はワクチンはさらにＮＴＲプロドラッグを含んでもよい。
【００４７】
本発明にはまた、記載した他の態様及び特性のいずれかと組み合わせて提供することができる次の態様が含まれうる。
【００４８】
本発明の他の態様によると、ウイルスのゲノムが少なくとも1つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）をコードする核酸配列を含むことを特徴とする単純ヘルペスウイルスを提供する。
【００４９】
本発明の他の態様によると、ウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）をコードする核酸配列を含み、神経毒性がないことを特徴とする単純ヘルペスウイルスを提供する。
【００５０】
本発明の単純ヘルペスウイルスを含む組成物は、ＮＴＲプロドラッグと組み合わせて提供することができる。ＮＴＲプロドラッグはＣＢ１９５４でありうる。
【００５１】
本発明の他の態様によると、腫瘍の治療に使用するための単純ヘルペスウイルスであって、該ウイルスのゲノムが少なくとも1つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含むことを特徴とする単純ヘルペスウイルスを提供する。
【００５２】
本発明の他の態様によると、腫瘍の治療に使用するための単純ヘルペスウイルスであって、該ウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、神経毒性がないことを特徴とする単純ヘルペスウイルスを提供する。
【００５３】
本発明の他の態様によると、腫瘍の治療においてＮＴＲプロドラッグと併用するための単純ヘルペスウイルスであって、該ウイルスのゲノムが少なくとも1つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含むことを特徴とする単純ヘルペスウイルスを提供する。
【００５４】
本発明の他の態様によると、腫瘍の治療においてＮＴＲプロドラッグと併用するための単純ヘルペスウイルスであって、該ウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、神経毒性がないことを特徴とする単純ヘルペスウイルスを提供する。
【００５５】
本発明の他の態様によると、ある量の本発明の単純ヘルペスウイルスを含有する第１容器とある量のＮＴＲプロドラッグを含有する第２容器とを含むキットオブパーツを提供する。
【００５６】
他の態様においては、腫瘍を治療するための医薬の製造における単純ヘルペスウイルスの使用であって、該ウイルスのゲノムが少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含む、上記使用も提供する。
【００５７】
他の態様においては、腫瘍を治療するための医薬の製造における単純ヘルペスウイルスの使用であって、該ウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、該単純ヘルペスウイルスは神経毒性がない、上記使用も提供する。
【００５８】
他の態様においては、腫瘍を治療するための医薬の製造における単純ヘルペスウイルス及びＮＴＲプロドラッグの使用であって、該ウイルスのゲノムが少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含む、上記使用も提供する。
【００５９】
他の態様においては、腫瘍を治療するための医薬の製造における単純ヘルペスウイルス及びＮＴＲプロドラッグの使用であって、該ウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、該単純ヘルペスウイルスは神経毒性がない、上記使用も提供する。
【００６０】
他の態様においては、腫瘍の治療においてＮＴＲプロドラッグを含む第２医薬と連続的に又は同時に投与するための第１医薬の製造における単純ヘルペスウイルスの使用であって、該ウイルスのゲノムが少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含む、上記使用も提供する。
【００６１】
他の態様においては、腫瘍の治療において単純ヘルペスウイルスを含む第２医薬と連続的に又は同時に投与するための第１医薬の製造におけるＮＴＲプロドラッグの使用であって、該ウイルスのゲノムが少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含む、上記使用も提供する。
【００６２】
他の態様においては、腫瘍の治療において単純ヘルペスウイルスを含む第２医薬と連続的に又は同時に投与するための第１医薬の製造におけるＮＴＲプロドラッグの使用であって、該ウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、該単純ヘルペスウイルスは神経毒性がない、上記使用も提供する。
【００６３】
他の態様においては、腫瘍の治療においてＮＴＲプロドラッグを含む第２医薬と連続的に又は同時に投与するための第１医薬の製造における単純ヘルペスウイルスの使用であって、該ウイルスのゲノムが異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、該単純ヘルペスウイルスは神経毒性がない、上記使用も提供する。
【００６４】
連続投与の間の時間間隔は、単純ヘルペスウイルスとＮＴＲプロドラッグが体内で相互作用して活性医薬成分をｉｎ  ｓｉｔｕで産生できるようにする時間である。好ましい時間間隔は１５分間未満、１時間未満、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、１週間、２週間である。該単純ヘルペスウイルス又はＮＴＲプロドラッグのいずれを最初に投与してもよい。
【００６５】
他の態様においては、腫瘍の治療方法であって、以下のステップ：
（ｉ）治療が必要な患者に単純ヘルペスウイルスを投与するステップであって、上記ウイルスのゲノムが少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内にニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含む、上記ステップ；及び
（ｉｉ）上記患者に治療上有効な量のＮＴＲプロドラッグを投与するステップ
を含む方法を提供する。
【００６６】
他の態様においては、腫瘍の治療方法であって、以下のステップ：
（ｉ）治療が必要な患者に単純ヘルペスウイルスを投与するステップであって、上記ウイルスのゲノムがニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、該単純ヘルペスウイルスは神経毒性がない、上記ステップ；及び
（ｉｉ）上記患者に治療上有効な量のＮＴＲプロドラッグを投与するステップ
を含む上記方法を提供する。
【００６７】
上記治療方法において、上記単純ヘルペスウイルスは腫瘍細胞を、例えば腫瘍溶解によって、死滅可能であることが好ましい。
【００６８】
ＮＴＲプロドラッグに関する本発明の態様において、好ましいプロドラッグの１つはＣＢ１９５４である。
【００６９】
他の態様においては、ニトロレダクターゼをｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで発現させる方法であって、少なくとも１つの対象の細胞又は組織に単純ヘルペスウイルスを感染させるステップを含み、上記ウイルスのゲノムは少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、上記ニトロレダクターゼは転写調節配列に機能的に連結されている、上記方法を提供する。
【００７０】
他の態様においては、ニトロレダクターゼをｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで発現させる方法であって、少なくとも１つの対象の細胞又は組織に神経毒性がない単純ヘルペスウイルスを感染させるステップを含み、上記ウイルスのゲノムは異種ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を含み、上記ニトロレダクターゼは転写調節配列に機能的に連結されている、上記方法を提供する。
【００７１】
ＨＳＶゲノムの少なくとも１つの長い反復領域（ＲＬ）内に異種ニトロレダクターゼをコードする核酸を有する本発明の単純ヘルペスウイルスは、好ましくは上記核酸をＨＳＶゲノムの複数の長い反復領域のそれぞれの内に有する。２つの長い反復領域が通常ＨＳＶゲノム内に存在する。
【００７２】
ＮＴＲヌクレオチド配列は全長転写産物又はポリペプチドをコードしうる（すなわち、完全なＮＴＲタンパク質コード配列を含む）。あるいは、ＮＴＲヌクレオチド配列は、ポリペプチド産物がニトロレダクターゼ活性を保持するという条件で、全長転写産物の断片又は末端切断されたポリペプチドをそれぞれコードする全長配列の１以上の断片を含んでよい。
【００７３】
断片は、対応する全長配列の少なくとも１０％をコードするヌクレオチド配列を含むことができ、さらに好ましくは、該断片は対応する全長配列の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％を含む。好ましくは該断片は、少なくとも、すなわち最小長さが２０ヌクレオチド、さらに好ましくは、少なくとも３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００  ２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００又は４０００ヌクレオチドを含む。該断片は、最大長さが、すなわち、２０ヌクレオチド以下、さらに好ましくは、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００  ２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００又は４０００ヌクレオチド以下でありうる。断片の長さは上記最小長さと最大長さの間のいずれの長さであってよい。
【００７４】
１つの好ましい実施形態においては、ＨＳＶ変異株はＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰであり、該ＨＳＶ変異株は、Crusade Laboratories Limited（住所：Department of Neurology Southern General Hospital 1345 Govan Road Govan Glasgow G51 5TF Scotland）の名前で、２００３年１１月５日、欧州細胞培養コレクション（the European Collection of Cell Cultures (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, OJG, United Kingdom）に受託番号０３１１０５０１としてブダペスト条約の条項に従って寄託されている。
【００７５】
適宜、上記単純ヘルペスウイルス及び／又は上記ＮＴＲプロドラッグの投与は非経口投与であってもよい。好ましくは、単純ヘルペスウイルスの投与は、注入、さらに好ましくは治療対象の腫瘍への注入による。ＮＴＲプロドラッグも注入により投与することができ、腫瘍部位への直接注入であってもよい。あるいは、注入を静脈内に行ってもよい。
【００７６】
単純ヘルペスウイルスとＮＴＲプロドラッグの投与は、例えば、ウイルスとプロドラッグを単一組成物中で混合することにより同時であってもよいし、又は、例えば、片方を投与した直後に他方を投与することにより実質的に同時であってもよい。あるいは、予め定めた時間間隔を単純ヘルペスウイルスとＮＴＲプロドラッグの投与の間に置いてもよい。本発明は投与順序により限定されるものでない。
【００７７】
本発明のさらなる態様においては、ニトロレダクターゼをコードする核酸を少なくとも１つの対象の細胞又は組織に送達するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの方法であって、上記細胞又は組織を本発明に係る単純ヘルペスウイルスに感染させるステップを含む上記方法を提供する。
【００７８】
本発明の他の態様においては、ある量の本発明の単純ヘルペスウイルスを提供する第１容器とある量のＮＴＲプロドラッグを提供する第２容器とを含むキットオブパーツを提供する。場合によっては単純ヘルペスウイルス及び／又はＮＴＲプロドラッグの好適な投与量についての情報を含む、投与のための指示書を該キットとともに提供することもできる。
【００７９】
本発明の他の態様においては、本発明の改変した単純ヘルペスウイルスを作製又は産生する方法であって、ニトロレダクターゼをコードする核酸配列を、選択した単純ヘルペスウイルスのゲノム内の選択した及び／又は所定の挿入部位に導入するステップを含む、上記方法を提供する。
【００８０】
記載した通り、ニトロレダクターゼをコードする核酸配列が一部分を構成する核酸カセットを、選択した単純ヘルペスウイルスのゲノム内に相同組換えにより挿入することができる。カセットの一部分であるか否かを問わず、挿入の部位はいずれかの選択したゲノム位置であってよい。好ましい挿入部位の１つは長い反復領域（ＲＬ）の１つ又は両方であり、１コピーのカセットを好ましくは反復領域（ＲＬ）のそれぞれのコピー内に挿入する。さらに好ましくは、挿入部位は少なくとも１つの（好ましくは両方の）ＲＬ１遺伝子座内であり、そして最も好ましくは少なくとも１つの（好ましくは両方の）ＨＳＶゲノムＤＮＡのＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列内に挿入する。その挿入は２つの反復領域、ＲＬ１遺伝子座又はＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列のそれぞれにおける同一又は実質的に類似した位置に起こることが好ましい。
【００８１】
挿入により、神経毒性のない変異株であって、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞中へのｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション時に、コードされたニトロレダクターゼポリペプチドをＮＴＲプロドラッグの取込み及び／又は活性化を促進する機能を有する形態で発現する能力のある改変型ウイルスを作ることができる。神経毒性のない変異株は、ＩＣＰ３４．５ヌル変異株でありうる。
【００８２】
核酸カセットは、いずれのサイズであってもよく、例えば、長さが５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ｋｂｐ以下である。
【００８３】
好ましくは、単純ヘルペスウイルスは少なくとも１コピーのニトロレダクターゼをコードする核酸を、それぞれの長い反復領域（ＲＬ）、すなわち、末端及び内部の長い反復（ＴＲＬ及びＩＲＬ）領域内に含有する。好ましい実施形態において、それぞれの外因性配列又はカセットは、単純ヘルペスウイルスゲノムのＲＬ１遺伝子座内に、より好ましくはＩＣＰ３４．５遺伝子若しくはタンパク質コード配列をコードする単純ヘルペスウイルスゲノムのＤＮＡ内に位置する。従って、単純ヘルペスウイルスは神経毒性を有しない。
【００８４】
本発明のウイルスが由来する親単純ヘルペスウイルスは、いずれの種であってもよく、例えば、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２である。ある好ましい実施形態においては、単純ヘルペスウイルスはＨＳＶ−１  １７株の変異株であって１７株ゲノムＤＮＡの改変により得ることができる。好適な改変としては、外来性ニトロレダクターゼ核酸配列又は該配列を含む外来性／異種カセットの単純ヘルペスウイルスゲノムＤＮＡ中への挿入が挙げられる。挿入は、外来性核酸配列の選択した単純ヘルペスウイルスのゲノム中への相同組換えによって実施することができる。
【００８５】
本発明の単純ヘルペスウイルスの神経毒性なしの表現型は、外来性核酸配列のＲＬ１遺伝子座における挿入の結果であってもよいが、本発明に係る単純ヘルペスウイルスは神経毒性のない親株、例えば、ブダペスト条約（the Budapest Treaty at the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, United Kingdom）に基づいて受託番号Ｖ９２０１２８０３として寄託されているＨＳＶ１７１６を利用して、ゲノムの他の位置に外来性核酸配列を、標準の遺伝子操作技法、例えば、相同組換えによって挿入することにより取得することができる。この態様においては、ニトロレダクターゼ核酸配列又は上記配列を含有するカセットの挿入のために選択される単純ヘルペスウイルスゲノムの位置は中立の位置でありうる。
【００８６】
本発明の単純ヘルペスウイルスは、本発明の単純ヘルペスウイルスが由来する公知の「親」株の変異株であってもよい。特に好ましい親株はＨＳＶ−１ １７株である。他の親株としては、ＨＳＶ−１ Ｆ株又はＨＳＶ−１ ＨＧ５２株が挙げられる。変異株としては、実質的に親のゲノムに類似し、ニトロレダクターゼ核酸配列又は上記配列を含有するカセットを含み、そして導入されると単純ヘルペスウイルスの病原特性を無能化することができる限られた数の他の改変、例えば、１つ、２つ若しくは３つの他の特定の突然変異、例えば、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）遺伝子、６５Ｋトランス誘導因子（ＴＩＦ）における突然変異、及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複製・選択中に自然に組み込まれうる自然の変化からもたらされる少数の突然変異を含有するＨＳＶが含まれる。あるいは、変異株のゲノムは親株のゲノムであってもよい。
【００８７】
本発明の単純ヘルペスウイルスは、単独で、又はＮＴＲプロドラッグと併用して医学的治療の方法に使用することができる。これは、細胞増殖に関連する若しくは関わる疾患、又はいずれかの種類の癌若しくは腫瘍の治療を含みうる。治療は分裂細胞の選択的溶解に関わりうる。治療は腫瘍溶解、すなわち腫瘍細胞の溶解であってもよい。治療対象の腫瘍はいずれの種類であってもよく、癌、新生物又は新生物組織が含まれかつ動物又はヒト患者のいずれのものであってもよい。
【００８８】
治療することができる癌／腫瘍の種類は原発性又は二次性（転移性）腫瘍であってもよい。治療する腫瘍は、中枢神経系若しくは末梢神経系に由来する神経系腫瘍、例えば、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経繊維腫、上衣細胞腫、シュワン腫、神経繊維腫、星細胞腫及び欠突起膠腫であってもよいし、あるいは非神経系組織に由来する非神経系腫瘍、例えば、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、肝細胞腫、類表皮癌、前立腺癌、乳癌細胞、肺癌細胞又は大腸癌細胞であってもよい。本発明のＨＳＶ変異株を用いて非神経系組織に由来する中枢神経系又は末梢神経系の転移性腫瘍を治療することができる。
【００８９】
本発明の単純ヘルペスウイルスはｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏの「遺伝子送達」方法に用いることができる。本発明の神経毒性のない単純ヘルペスウイルスは発現ベクターであって、単純ヘルペスウイルスゲノムによりコードされるニトロレダクターゼを発現させる目的で、選択した細胞若しくは組織に感染させるために使用することができる。
【００９０】
ある実施形態においては、細胞を患者、ドナー、又は他のいずれかの供給源から採取し、本発明の単純ヘルペスウイルスに感染させ、場合によっては、コードされたニトロレダクターゼの発現及び／又は機能についてスクリーニングし、そして場合によっては患者の体内に、例えば注入により、戻す及び／又は導入することができる。
【００９１】
本発明の単純ヘルペスウイルスの選択した細胞への送達は、裸のウイルスを用いて又はウイルスを担体、例えば、ナノ粒子、リポソーム若しくは他の小胞内に封入して実施することができる。
【００９２】
本発明のウイルスを用いて形質転換されかつ好ましくはニトロレダクターゼタンパク質を発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞、好ましくはヒト又は哺乳動物細胞、並びにかかる細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで上記ウイルスを用いて形質転換する方法は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００９３】
本明細書において、単純ヘルペスウイルス変異株は非野生型単純ヘルペスウイルスであり、そして組換え単純ヘルペスウイルスであってもよい。単純ヘルペスウイルス変異株は野生型と比較して改変を含有するゲノムを含んでもよい。改変は少なくとも１つの欠失、挿入、付加又は置換を含みうる。
【００９４】
本発明の態様による医薬及び医薬組成物は、いくつかの経路による投与用に製剤化することができ、上記経路としては、限定されるものでないが、非経口、静脈内、筋肉内、腫瘍内、経口及び経鼻が挙げられる。医薬及び組成物は液状又は固形（例えば、錠剤）で製剤化することができる。液状製剤は、ヒト又は動物の身体の選択した領域への注入による投与用に製剤化することができる。
【００９５】
本明細書においては、神経毒性が無いというのは、高力価のウイルス（ほぼ１０６プラーク形成ユニット（ｐｆｕ））を動物又は患者に導入しても２２、２３、致死性脳炎を引き起こすことがなく、動物、例えばマウス又はヒト患者におけるＬＤ５０がほぼ≧１０６ｐｆｕの範囲にある２１ことによって定義する。
【００９６】
単純ヘルペスウイルスゲノム内に存在するＩＣＰ３４．５遺伝子の全コピー（２コピーが通常存在する）を破壊して、単純ヘルペスウイルスが機能的なＩＣＰ３４．５遺伝子産物を産生できないようにした場合、該ウイルスはＩＣＰ３４．５ヌル変異株であると考えられる。
【００９７】
ヌクレオチド配列と機能的に連結された調節配列（例えば、プロモーター）を該配列に隣接して又は近接して配置して、調節配列が上記ヌクレオチド配列の産物の発現を実施及び／又は制御できるようにすることができる。従って、ヌクレオチド配列にコードされた産物は該調節配列から発現可能である。
【００９８】
ＮＴＲプロドラッグ
本明細書において、「ＮＴＲプロドラッグ」は、選択したヒト若しくは動物の身体に対して又はヒト若しくは動物の身体の選択した細胞若しくは組織に対して毒性がないか又は低毒性である化学化合物又は薬剤であって、かつニトロレダクターゼ酵素によりヒト若しくは動物の身体又はそれらの選択した細胞に対して細胞傷害性である化学化合物又は薬剤に活性化されうる任意の化学化合物又は薬剤を意味する。
【００９９】
「活性化」とは毒性のない（又は低毒性の）プロドラッグの細胞傷害性の活性型への変換を意味しうる。この変換はプロドラッグのＮＴＲによる酵素的還元を意味しうる。酵素的還元反応はＮＴＲの基質としてのプロドラッグを必要とし、そして他の補因子を必要としうる。
【０１００】
ＮＴＲプロドラッグの例としては、次のクラスの分子から誘導される化合物を挙げることができる：
１．ジニトロベンズアミド類;
２．ジニトロアジリジニルベンズアミド類（例えば、ＣＢ１９５４）；
３．ジニトロベンズアミドマスタード誘導体（例えば、ＳＮ２３８６２）；
４．４−ニトロベンジルカルバメート類；
５．ニトロインドリン類；
６．ＮＴＲの基質でありかつＮＴＲ還元時に活性化されて細胞傷害性ホスホルアミドマスタード又は同様の反応性化学種を遊離するニトロ芳香族（ニトロアリールホスホルアミド類とも呼ばれる）１７；
７．ジニトロベンズアミドクラスのニトロ芳香族プロドラッグ。
【０１０１】
ＮＴＲプロドラッグの例は参考文献１６及び１７に開示されていて、これらは本明細書にその全文が参照により組み入れられる。
【０１０２】
ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）
ニトロレダクターゼ酵素は共通してニトロ化合物、キノン類、及び色素の還元を触媒する。酵素的還元には補因子ＮＡＤＰＨが必要でありうる。
【０１０３】
本明細書においてニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）は、ＮＴＲプロドラッグを活性のある細胞傷害型に活性化することができる酵素を意味する。
【０１０４】
好ましいＮＴＲは、ニトロフラゾンなどの広範囲のニトロ含有化合物を（ヒドロキシルアミン類へ）及びメナジオンなどのキノン類を（キノール類へ）還元する能力を有しうる。
【０１０５】
好ましいＮＴＲは、不可逆性阻害剤であるジクマロールによって特異的に抑制されうる。
【０１０６】
好ましいＮＴＲの１つは大腸菌酸素非感受性ニトロレダクターゼ酵素（ｎｆｓＢ遺伝子産物）である。大腸菌ＮＴＲの配列情報は、ＮＣＢＩデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）においてアクセッション番号ＢＡ０００００７（ＧＩ：４７１１８３０１）（大腸菌完全ゲノム配列）及びＢＡＢ３４０３９（ＧＩ：１３３６００７４）（ニトロレダクターゼ配列情報）として見出すことができる。
【０１０７】
大腸菌ＮＴＲタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）及び大腸菌ＮＴＲ遺伝子のポリヌクレオチド配列（配列番号２）を図３２（Ａ）及び（Ｂ）にそれぞれ複写した。
【０１０８】
好適なニトロレダクターゼ酵素のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ヒト、非ヒト哺乳動物及び細菌を含む動物、昆虫又は微生物から誘導するか又は得ることができ、かつ公的に利用しうる配列から選択することができる。その他のニトロレダクターゼ遺伝子の多数の配列が公的に利用しうる。本発明に係る単純ヘルペスウイルスの一部分を形成しうるその他のニトロレダクターゼ核酸配列の例としては、ＮＣＢＩデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov）のアクセッション番号により参照して、次が挙げられる：
−ＢＡＢ３４０３９（ＧＩ：１３３６００７４）−大腸菌
−ＢＡＡ３５２１８．１（ＧＩ：１６５１２４０）−大腸菌
−ＡＡＢ７２０５３．１（ＧＩ：２４１５３８５）−枯草菌。
【０１０９】
ハイブリダイゼーションストリンジェンシー
本発明において、核酸配列はハイブリダイゼーションと適当なストリンジェンシーの洗浄条件を用いることにより同定することができる。
【０１１０】
相補的核酸配列はワットソン−クリック結合相互作用を介して互いにハイブリダイズしうる。１００％相補的でない配列もハイブリダイズするが、ハイブリダイゼーションの強度は相補性の低下とともに通常低下しうる。従って、ハイブリダイゼーションの強度を利用して互いに結合しうる配列の相補性の程度を識別することができる。
【０１１１】
当業者はハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」を容易に決定することができる。
【０１１２】
所与の反応のストリンジェンシーは、プローブ長さ、洗浄温度、及び塩濃度などの因子に依存しうる。一般的に長いプローブの適当なアニーリングにはより高い温度を必要とする一方、より短いプローブはより低い温度でアニーリングすることができる。プローブとハイブリダイズしうる配列の間の所望の相補性の程度が高いほど、利用しうる相対温度は高い。結果として、より高い相対温度は反応条件をよりストリンジェントにする一方、より低い温度はストリンジェンシーをより低くする。
【０１１３】
例えば、ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に従って、５Ｘ ＳＳＣ、５Ｘデンハルト試薬、０.５〜１.０％ＳＤＳ、１００μｇ/ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０.０５％ピロリン酸ナトリウムおよ５０％以下のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を用いて実施することができる。ハイブリダイゼーションは３７〜４２℃にて少なくとも６時間実施する。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを次の通り洗浄する：（１）室温にて２Ｘ ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中で、５分間；（２）室温にて２Ｘ ＳＳＣ及び０.１％ＳＤＳ中で、１５分間；（３）３７℃にて１Ｘ ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中で、３０分間〜１時間；（４）４２〜６５℃にて１Ｘ ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中で、溶液を３０分間毎に変えて、２時間。
【０１１４】
核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要なストリンジェンシー条件を計算する一般式の１つは、融点Ｔｍを計算するものである（Sambrookら, 1989）：
Ｔｍ＝８１.５℃＋１６.６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０.４１（％Ｇ＋Ｃ）−０.６３（％ホルムアミド）−６００/ｎ
（式中、ｎはオリゴヌクレオチド中の塩基数である）。
【０１１５】
上記式の一例として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミド、ＧＣ含量４２％及び平均プローブサイズ２００塩基を用いると、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ２本鎖のＴｍは配列相補性の１％低下毎に１〜１．５℃だけ低下する。
【０１１６】
従って、ヌクレオチド配列は、上記式を用いて選択することができる種々のハイブリダイゼーション及び洗浄ストリンジェンシー条件のもとで標的配列とハイブリダイズする能力により分類することができる。Ｔｍをハイブリダイゼーション強度の指標を与えるために利用することができる。
【０１１７】
条件のストリンジェンシーに基づいて配列を識別する概念は、当業者に周知であり、容易に応用することができる。
【０１１８】
９５〜１００％配列相補性を示す配列は、非常に高いストリンジェンシー条件のもとでハイブリダイズすると考えることができ、８５〜９５％相補性を示す配列は、高いストリンジェンシー条件のもとでハイブリダイズすると考えることができ、７０〜８５％相補性を示す配列は、中程度のストリンジェンシー条件のもとでハイブリダイズすると考えることができ、６０〜７０％相補性を示す配列は、低いストリンジェンシー条件のもとでハイブリダイズすると考えることができ、５０〜６０％相補性を示す配列は、非常に低いストリンジェンシー条件のもとでハイブリダイズすると考えることができる。
【０１１９】
本発明は、その組み合わせが容認されないか又は明らかに無効である場合を除き、記載した態様及び好ましい特徴の組み合わせを含むものである。
【０１２０】
本発明の態様及び実施形態を、これから例示として添付する図面を参照して説明する。さらなる態様及び実施形態は当業者にとって明白であろう。本明細書に記述した全文書は本明細書に参照により組み入れられる。
【０１２１】
図面の簡単な説明
図１：プラスミドｐＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びＲＬ１.ｄｅｌからのプラスミドＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰの作製を示す。
【０１２２】
図２：ＨｐａＩ消化し、ＣＩＰ処理したＲＬ１.ｄｅｌのアガロースゲル電気泳動を示す。ＲＬ１.ｄｅｌをＨｐａＩを用いて消化した。消化したＤＮＡを次いで、次のライゲーション反応でベクター自体の再アニーリングを防止するために仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）を用いて処理した。消化／ＣＩＰ処理したＤＮＡのサンプルを、１ＫｂｐのＤＮＡラダー（Promega）と共に、１％アガロースゲル上で電気泳動した。ＨｐａＩはベクターを８.６Ｋｂｐにおいて直鎖化した。
【０１２３】
図３：ＮｓｉＩ／ＳｓｐＩ消化したｐＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ａ）及び精製／平滑末端ｐＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＰｏｌｙＡ（Ｂ）のアガロースゲル電気泳動を示す。ｐＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの４つのＮｓｉＩ／ＳｓｐＩ消化断片を、１ＫｂｐのＤＮＡラダー（Promega）と共に１％アガロースゲル上で電気泳動した。５.４Ｋｂｐ断片（ｐＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＰｏｌｙＡ）をゲルから精製した。精製したＤＮＡをクレノウポリメラーゼを用いて平滑末端化し、サンプルをアガロース上で電気泳動してその濃度を確認した。
【０１２４】
図４：ｐＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＰｏｌｙＡインサートを含有するＲＬ１.ｄｅｌクローンの同定を示す。精製して末端平滑化したｐＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＰｏｌｙＡ断片とＨｐａＩ消化してＣＩＰ処理したＲＬ１.ｄｅｌとを用いてライゲーション反応を実施した。細菌を、ライゲーション反応物から得たサンプルを用いて形質転換し、ＬＢＡ（Ａｍｐｒ）プレート上にまいた。コロニーを拾い、プラスミドＤＮＡを抽出し、ＡｆｌＩＩを用いて消化した。消化したサンプルを、１ＫｂｐのＤＮＡラダー（Ｌ）（Promega）と共に１％アガロースゲル上で電気泳動した。＊クローン５と８は、ＡｆｌＩＩ消化により予想サイズ（４.８Ｋｂｐ及び９.２Ｋｂｐ）の２つの断片が作製されたので、ｐＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＰｏｌｙＡインサートを含有する。インサート無しのクローンは、ＲＬ１.ｄｅｌ内にＡｆｌＩＩ部位がないので、ＡｆｌＩＩによって消化されないであろう。注：両方向のインサートが受け入れられば、インサートは二方向にクローニングされうる。
【０１２５】
図５：クローン５（ＲＬ１.ｄＣＭＶ−ＮＡＴ−ＧＦＰｂ）中のｐＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＰｏｌｙＡの方向の決定を示す。ｐＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＰｏｌｙＡ（平滑末端）は、ＲＬ１.ｄｅｌのＨｐａＩ部位中に二方向でクローニングされうる。クローン５内のインサートの方向を決定するために、プラスミドをＸｈｏＩを用いて消化しそして消化したＤＮＡを１ＫｂｐのＤＮＡラダー（Promega）と共に１％アガロースゲル上で電気泳動した。もしインサートがＡに示した方向にクローニングされていれば、１０.２Ｋｂｐと３.８Ｋｂｐの２つの断片がＸｈｏＩ消化から作製されうる。もしインサートが逆方向にクローニングされていれば（Ｂ）、１２.４Ｋｂｐと１.６Ｋｂｐの２つの断片が作製されうる。１０.２Ｋｂｐ及び３.８Ｋｂｐの２つの断片のゲル中の存在により、インサートがＡに示した方向にクローニングされていることを確認した。
【０１２６】
＊このＸｈｏＩ部位は、最初のクローニングベクター（ＲＬ１.ｄｅｌ）中のＨｐａＩ部位の上流に存在し、この中にｐＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＰｏｌｙＡがクローニングされている。
【０１２７】
図６：クローン５（Ａ）からのｐＣＭＶ−ＮＡＴの除去とＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｂ）の大規模プラスミド調製を示す。４つのクローン５のサンプルをＸｈｏＩを用いて消化し、１ＫｂｐのＤＮＡラダー（Ｌ）（Promega）と共に１％アガロースゲル上で電気泳動した（Ａ）。この消化から作製されたＤＮＡの大きい方の断片（１０．２Ｋｂｐ）をゲルから精製し、ＸｈｏＩ部位に戻しライゲーションを行い、新しいプラスミドにおいて単一ＸｈｏＩを形成させ、ＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰと名付けた。大規模プラスミド調製物を増殖させ、該調製物をＸｈｏＩを用いて消化することにより確認した。１μｌ及び４μｌの消化したＤＮＡを１ＫｂｐのＤＮＡラダー（Ｌ）（Promega）と共に１％アガロースゲル上で電気泳動した（Ｂ）。該ＤＮＡは、ＸｈｏＩを用いて消化すると１０.２Ｋｂｐの単一断片を産生するはずである。ＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰのＣｌａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｒｕＩ及びＸｈｏＩ部位は全て特有のものである。
【０１２８】
＊クローン５は、ＲＬ１.ｄｅｌ プラスミド中に、ｐＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰからの５.４Ｋｂｐ ｐＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＰｏｌｙＡ断片がクローニングされたものである。
【０１２９】
図７：目的遺伝子産物を発現するＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶ−１の作製、検出及び精製を示す。
【０１３０】
図８：ｐＰＳ９４９からのｐＣＭＶ−ＮＴＲをＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰ中にクローニングするために用いた手法を示す。（１）ｐＰＳ９４９をＢａｍＨ１を用いて消化し、１.６ＫｂｐのｐＣＭＶ−ＮＴＲ断片を精製する；（２）ＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰをＢｇｌＩＩを用いて消化し、仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）を用いて処理する；（３）ｐＣＭＶ−ＮＴＲ断片（ＢａｍＨＩ末端）をＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰのＢｇｌＩＩ部位中にクローニングする。
【０１３１】
＊ｐＰＳ９４９プラスミドは、Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｙｏｕｎｇ教授（University of Birmingham）から供与を受けたものであり、ｐＬＮＣＸ（Clontech）中のＣＭＶ−ＩＥプロモーター（ｐＣＭＶ）の下流に大腸菌ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）遺伝子を含有する。
【０１３２】
図９：ＢａｍＨＩ消化したｐＰＳ９４９（Ａ）及び精製したｐＣＭＶ−ＮＴＲ断片（Ｂ）のアガロースゲル電気泳動を示す。ｐＰＳ９４９の４つのサンプルをＢａｍＨＩを用いて消化し、１ＫｂｐのＤＮＡラダー（Ｌ）（New England Biolabs）と共に、１％アガロースゲル上で電気泳動した。ＣＭＶ ＩＥプロモーター（ｐＣＭＶ）と下流の大腸菌ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）遺伝子から成る１.６Ｋｂｐの断片をゲルから精製し、精製したＤＮＡのサンプルをアガロースゲル上で電気泳動してその濃度を確認した。
【０１３３】
図１０：ＢｇｌＩＩで消化し、ＣＩＰで処理したＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰのアガロースゲル電気泳動を示す。ＲＬ１.ｄＩＲＥＳ.ＧＦＰをＢｇｌＩＩを用いて消化した。消化したプラスミドを次いで、次のライゲーション反応でベクター自体の再アニーリングを防止するために仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）を用いて処理した。消化／ＣＩＰ処理したＤＮＡのサンプルを、１ＫｂｐのＤＮＡラダー（Promega）と共に１％アガロースゲル上で電気泳動してその濃度を確認した。ｐＰＳ９４９からのｐＣＭＶ−ＮＴＲを、その後に、消化／ＣＩＰ処理したベクター中にクローニングした。
【０１３４】
図１１：クローン４中のｐＣＭＶ−ＮＴＲの方向の決定を示す。ｐＣＭＶ−ＮＴＲ（ＢａｍＨＩ末端）はＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰのＢｇｌＩＩ部位中に二方向にクローニングされうる。その方向を決定するために、クローン４をＢｇｌＩＩとＸｈｏＩを用いて消化し、消化したＤＮＡを１ＫｂｐのＤＮＡラダー（Promega）と共に１％アガロースゲル上で電気泳動した。もしインサートが所望の方向（Ａ）にあれば、２つの断片（１１.５Ｋｂｐと３００ｂｐ）が作製されうる。もし逆方向にあれば、１０.５Ｋｂｐと１.３Ｋｂｐの２つの断片が作製されうる。３００ｂｐ程度のバンドの存在（及び１.３Ｋｂｐのバンドの不在）により、ｐＣＭＶ−ＮＴＲ断片がベクター中に所望の方向でクローニングされていることを確認した。
【０１３５】
図１２：ＳｃａＩで消化したクローン４（Ａ）のアガロースゲル電気泳動及びＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰウイルスの力価（Ｂ）を示す。クローン４（ＲＬ１.ｄＣＭＶ−ＮＴＲ−ＧＦＰ）をＳｃａＩを用いて消化し、消化したＤＮＡを精製し、そして５μｌを１ＫｂｐのＤＮＡラダー（Promega）と共に１％アガロースゲル上で電気泳動してその濃度を確認した。８０％コンフルエントのＢＨＫ細胞を次いで１０μｌのＨＳＶ１７＋ＤＮＡ及び適当な容積の残りの消化したクローン４を用いて共トランスフェクトした。細胞を３７℃にて３日間、ｃｐｅが明白になるまでインキュベートした。組換えウイルスのプラークを蛍光顕微鏡下で拾い、精製し、そしてウイルスストックをＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰと名づけて増殖させた。ウイルスストックの細胞結合画分及び細胞遊離画分をＢＨＫ細胞上で力価測定した。
【０１３６】
図１３：コンフルエントＢＨＫ及び３Ｔ６細胞中のＨＳＶ１７＋、ＨＳＶ１７１６及びＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰの増殖動力学を示す。コンフルエントＢＨＫ及び３Ｔ６細胞を０.１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩにて感染させた。感染した細胞を感染後０、４、２４、４８及び７２時間に回収し、音波処理し、そして子孫ウイルスをＢＨＫ細胞単層上で力価測定した。ＢＨＫ細胞において、全てのウイルスが類似した動力学で複製した（Ａ）；コンフルエント３Ｔ６細胞において、ＨＳＶ１７１６及びＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰは両方とも、効率的に複製しなかった（Ｂ）。
【０１３７】
図１４：ＨＳＶ１７＋及びＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰに感染したＢＨＫ細胞内のＩＣＰ３４．５発現についてのウェスタンブロット分析を示す。ＢＨＫ細胞をＨＳＶ１７＋及びＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰに１０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩにて感染させた。感染後１６時間に細胞を回収し、タンパク質抽出物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてウェスタンブロットでポリクローナル抗ＩＣＰ３４．５抗体を利用して分析した。ＩＣＰ３４．５は、ＨＳＶ１７＋感染細胞で強く発現したが、ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ感染細胞では発現しなかった。
【０１３８】
図１５：ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ感染細胞株におけるＮＴＲ発現についてのウェスタンブロット分析を示す。ＢＨＫ、Ｃ８１６１、ＶＭ及び３Ｔ６細胞を１０ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ、ＨＳＶ１７＋に感染させるか、又は感染させなかった（mock）。感染後１６時間に、細胞を回収し、タンパク質抽出物をウェスタンブロットでポリクローナルＮＴＲ特異的抗体を利用して分析した。全てのＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ感染細胞において有意なＮＴＲ発現を検出した。感染なし（mock）又はＨＳＶ１７＋感染細胞においてＮＴＲ発現は検出されなかった。
【０１３９】
図１６：ＣＢ１９５４（５０μＭ）の存在下又は不在下における、ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ及びＨＳＶ１７１６−ＧＦＰのコンフルエント３Ｔ６細胞に対する影響を示す。９６ウエルプレートの３ウエル内のコンフルエント３Ｔ６細胞を、非感染（mock）、１若しくは１０ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ、又は１ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６−ＧＦＰに感染させた。４５分後、感染細胞に５０μＭ ＣＢ１９５４を含有する培地又は単独の培地を積層して３７℃にてインキュベートした。２４、４８、７２、９６、及び１２０時間後、細胞生存％を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Promega）を用いて、プロドラッグの不在下における非感染（mock）細胞の細胞生存％と比較して決定した。示した図は３回の測定値の平均＋／−標準誤差を示す。
【０１４０】
図１７：ＣＢ１９５４（５０μＭ）の存在下又は不在下における、ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ及びＨＳＶ１７１６−ＧＦＰのコンフルエントＣ８１６１細胞に対する影響を示す。９６ウエルプレートの３ウエル内のコンフルエントＣ８１６１細胞を、非感染（mock）、１若しくは１０ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ、又は１ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６−ＧＦＰに感染させた。４５分後、感染細胞に５０μＭ ＣＢ１９５４を含有する培地又は単独の培地を積層して３７℃にてインキュベートした。２４、４８、７２、９６、及び１２０時間後、細胞生存％を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Promega）を用いて、プロドラッグの不在下における非感染（mock）細胞の細胞生存％と比較して決定した。示した図は３回の測定値の平均＋／−標準誤差を示す。
【０１４１】
図１８：１０ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰを用いて（Ａ）又は５０μＭ ＣＢ１９５４の存在下の１０ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰを用いて（Ｂ）処置し、７２時間後のコンフルエント３Ｔ６細胞を示す。５０μＭ ＣＢ１９５４を含有する培地を積層したＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ感染細胞における細胞死の程度は、通常培地を積層したＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ感染細胞における細胞死の程度より有意に顕著である。これらの細胞の、ＣＢ１９５４の存在下又は不在下の１０ｐｆｕ／細胞 ＨＳＶ１７１６に感染させた後の細胞死の程度は、Ａで観察されたものに匹敵し得るものである（データは示してない）。５０μＭ ＣＢ１９５４単独による処理はこれらの細胞に影響を与えない。
【０１４２】
図１９：１０ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ（Ａ）、又は５０μＭ ＣＢ１９５４と共に１０ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ（Ｂ）を用いて処置した後、７２時間のコンフルエントＣ８１６１細胞を示す。５０μＭ ＣＢ１９５４を含有する培地を積層したＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ感染細胞における細胞死の程度は、通常培地を積層したＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ感染細胞における細胞死の程度より有意に顕著である。これらの細胞の、ＣＢ１９５４の存在下又は不在下の１０ｐｆｕ／細胞 ＨＳＶ１７１６に感染させた後の細胞死の程度は、Ａで観察されたものに匹敵し得るものである（データは示してない）。５０μＭ ＣＢ１９５４単独はこれらの細胞に影響を与えない。
【０１４３】
図２０：腫瘍内にＨＳＶ１７９０を注入した皮下Ａ２７８０（異種移植片）腫瘍をもつ胸腺欠損ヌードマウスの体重変化（健康の目安として）を示す。グループサイズ＝１投与当たり３匹のマウス。腫瘍内注入の日（第０日）におけるＡ２７８０異種移植片は直径０.５〜１ｍｍである。異種移植片は、雌性胸腺欠損ヌードマウスの側部皮下に１０×１０６ Ａ２７８０細胞を注入した１２日後にこのサイズに達した。
【０１４４】
図２１：Ａ２７８０異種移植片をもつ胸腺欠損ヌードマウスにおける、ＨＳＶ１７９０の腫瘍内注入後の腫瘍体積の経時変化を示す。
【０１４５】
図２２：マウスの開始腫瘍サイズを示す。
【０１４６】
図２３：ＣＭＶ−ｎｔｒ、ＣＢ１９５４又は両方の併用による処置後の体重の変化を示す。
【０１４７】
図２４：ＣＭＶ−ｎｔｒ、ＣＢ１９５４又は両方の併用による処置後の腫瘍体積の変化を示す。
【０１４８】
図２５：それぞれの処置グループの開始腫瘍体積を示す（表２を参照）。
【０１４９】
図２６：ＨＳＶ１７９０、ＨＳＶ１７１６、ＣＢ１９５４又はそれらの併用により処置したＡ２７８０異種移植片をもつ胸腺欠損ヌードマウスの体重（健康の目安として）を示す。
【０１５０】
図２７：プロドラッグＣＢ１９５４を用いて処置した異種移植片の腫瘍体積の変化を示す。
【０１５１】
図２８：１０５ＰＦＵ ＨＳＶ１７９０及びＣＢ１９５４を用いて処置した異種移植片の腫瘍体積の変化を示す。
【０１５２】
図２９：１０６ＰＦＵ ＨＳＶ１７９０及びＣＢ１９５４を用いて処置した異種移植片の腫瘍体積の変化を示す。
【０１５３】
図３０：１０５ＰＦＵ ＨＳＶ１７１６及びＣＢ１９５４を用いて処置した異種移植片の腫瘍体積の変化を示す。
【０１５４】
図３１：１０５ＰＦＵ、１０６ＰＦＵ ＨＳＶ１７９０及び１０５ＰＦＵ ＨＳＶ１７１６の比較を示す。
【０１５５】
図３２：大腸菌ＮＴＲの配列情報、（Ａ）ＮＴＲポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）;（Ｂ）ＮＴＲ遺伝子のポリヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【０１５６】
図３３：２つのＮＴＲプロドラッグ、（Ａ）ＣＢ１９５４；（Ｂ）ＳＮ２３８６２の構造を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５７】
本発明者らが意図する本発明を実施するための最良の形態の具体的な詳細を、以下に例として説明する。当業者には、本発明がこれらの具体的な詳細に限定されることなく実施できることは明白であろう。
【０１５８】
単純ヘルペスウイルス変異株を作製するために有用なベクター
本発明の単純ヘルペスウイルス変異株は、核酸ベクターを利用して作製することができる。
【０１５９】
本発明に係る単純ヘルペスウイルス変異株を作製するために有用なベクターの１つは、
選択した単純ヘルペスウイルスのゲノム内の挿入部位に隣接するヌクレオチド配列に対応する第１及び第２ヌクレオチド配列；並びに
上記第１及び第２ヌクレオチド配列の間に位置して
ａ）１つ又は複数の挿入部位；及び
ｂ）リボソーム結合部位；及び
ｃ）マーカー
をコードする核酸を含むカセット
を含むか、から成るか、又は本質的にから成る核酸ベクターである。
【０１６０】
本発明に係る単純ヘルペスウイルス変異株を作製するために有用な他のベクターは、
選択した単純ヘルペスウイルスのゲノム内の挿入部位に隣接するヌクレオチド配列に対応する第１及び第２ヌクレオチド配列；並びに
上記第１及び第２ヌクレオチド配列の間に位置して、
ａ）１つ又は複数の挿入部位；及び
ｂ）第１の調節性ヌクレオチド配列；及び
ｃ）マーカー
をコードする核酸を含むカセット
を含むか、から成るか又は本質的にから成る核酸ベクターである。
【０１６１】
第１及び第２ヌクレオチド配列は、選択した単純ヘルペスウイルスのゲノムのＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列内に形成される挿入部位に隣接するか、又はそれらの全て若しくは一部を含むヌクレオチド配列に対応してもよい。
【０１６２】
カセットは複数の挿入部位を含んでもよく、それぞれの挿入部位は好ましくは特定の制限エンドヌクレアーゼ部位（「制限部位」）をコードする核酸により形成される。制限部位は一緒になって、一連のオーバーラップした又は異なる制限部位を含むマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を形成してもよく、好ましくは一連の別個の制限部位は１以上のＣｌａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｒｕＩ、ＸｈｏＩ制限部位を含む。
【０１６３】
カセットのコードされる構成要素は、予め定めた順に配置することができる。ある実施形態においては、１つ又は複数の挿入部位をリボソーム結合部位／第１の調節配列の上流（すなわち、５’）に配置し、そしてリボソーム結合部位／第１の調節配列をマーカーの上流（すなわち、５’）に配置する。
【０１６４】
第１及び第２ヌクレオチド配列は、選択した単純ヘルペスウイルス内の挿入部位（「ウイルスの挿入部位」）周囲のゲノムの領域と同一性を有するヌクレオチド配列を含むものでありうる。これらの配列は、第１及び第２ヌクレオチド配列とウイルスのゲノム内のそれぞれの対応する配列との間の相同組換えによって、カセットをウイルスの挿入部位に組み込むことを可能にする。
【０１６５】
従って、第１及び第２ヌクレオチド配列は、選択したウイルスゲノムの対応する配列との相同組換えのためのフランキング配列であり、かかる相同組換えはウイルスの挿入部位にカセットの挿入をもたらす。
【０１６６】
第１及び第２ヌクレオチド配列は、ＨＳＶゲノムのＲＬ１遺伝子座内の、さらに好ましくはＨＳＶゲノムのＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列内の挿入部位に隣接するヌクレオチド配列に対応してもよい。
【０１６７】
第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれ、長さが少なくとも５０ｂｐ、さらに好ましくは、長さが少なくとも１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００ ２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００又は４０００ｂｐであってもよい。第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれ、ウイルスゲノム内の対応する配列と少なくとも５０％配列同一性、さらに好ましくは少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有してもよい。配列の同一性は所与のヌクレオチド配列の全長にわたって決定する。配列が異なる長さである場合、短い方の配列の配列同一性を長い方の配列の全長全体にわたって決定する。
【０１６８】
第１及び第２ヌクレオチド配列は、所与の配列の１本鎖がＨＳＶゲノムの対応する１本鎖相補配列と様々なハイブリダイゼーションストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする能力により特徴付けることができる。適宜、第１及び第２ヌクレオチド配列は、それらの対応する相補配列と非常に低い、低い又は中程度のストリンジェンシー条件下で、より好ましくは高い又は非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうる。
【０１６９】
ウイルスの挿入部位は、ベクターの第１及び第２ヌクレオチド配列に対応するゲノムヌクレオチド配列（それぞれ「ベクターフランキング配列」及び「ゲノムフランキング配列」と呼ぶ）の間の相同組換えが起こりうる位置であり、ベクターフランキング配列の選択により予め決定することができる。ゲノムフランキング配列が直接隣接する場合、挿入部位は２つのゲノムフランキング配列の周囲の直接隣接する塩基の間の位置であって、カセットの挿入によりゲノムフランキング配列が分離される。ゲノムフランキング配列がウイルスゲノム内で１つ又は複数の塩基により分離されている場合、挿入部位は相同組換え事象によりゲノムから切除される上記１つ又は複数の塩基により形成される。
【０１７０】
ウイルス挿入部位の位置は、ベクターフランキング配列の注意深い選択と構築により正確に選定することができる。従って、ベクターは、カセットの相同的挿入によって、選んだタンパク質コード配列が破壊されかつそれぞれの遺伝子産物が不活性化されるように、又はカセットがウイルスゲノムの非タンパク質コード領域に挿入されるように構築することができる。いくつかの単純ヘルペスウイルス株の完全なゲノム配列は報じられており、公的に利用しうる。ＨＳＶ−１ １７ｓｙｎ＋株の完全ゲノム配列はＤｏｌａｎら3（本明細書に参照により組み入れられる）により、そしてＨＳＶ−１ ＨＧ５２株の完全ゲノム配列はＤｏｌａｎら4（本明細書に参照により組み入れられる）により報じられていて、ＥＭＢＬデータベースからアクセッションコードＺ８６０９９として利用することができる。この情報を利用して、ＨＳＶ−１（例えば、１７又はＦ株）変異株又はＨＳＶ-２（例えば、ＨＧ５２株）変異株を作製するのに使用するための本発明のベクターを設計することが好ましい。
【０１７１】
第１及び第２ヌクレオチド配列（ベクターフランキング配列）はそれぞれ、選択したＨＳＶ（例えば、ＨＳＶ−１ １７株若しくはＦ株又はＨＳＶ−１ ＨＧ５２株）のゲノムのＲＬ末端反復領域に対応する配列を含んでもよい。ベクターフランキング配列は、ＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列に隣接するＲＬ末端反復領域のヌクレオチド配列を含む、から成る又は本質的にから成ってもよい。ＩＣＰ３４．５コード配列に隣接する、選択した配列の片方若しくは両方は、対応するＨＳＶゲノムにおいてＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列と重複、すなわち該配列中に伸張するように選択してもよいし、あるいは片方若しくは両方の配列がＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列と重複しないように選択してもよい。同様に、選択した配列は、完全に若しくは部分的に、コードされた他の重要なシグナル、例えば、転写開始射部位、ポリアデニル化部位、規定のプロモーター又はエンハンサーと重複するように選んでもよい。この好ましい実施形態において、挿入部位は、従って、ＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列の全て又は一部を含んでもよいし及び／又は挿入されたカセットはＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列を破壊するものでありうる。
【０１７２】
ＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列に隣接及び／又は重複するＲＬ反復領域の領域に対応する第１及び第２ヌクレオチド配列を含む記載したベクターを、ＩＣＰ３４．５ヌル変異株の作製に使用して、ＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列の全て又は一部を相同組換え事象中に切除しかつ置き換えてＩＣＰ３４．５コード配列の両方のコピーが破壊されるようにすることができる。この組換えにより、ＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列内に核酸の挿入が行われて、それにより該配列を破壊することができる。従って、この事例において首尾よく形質転換されたウイルスは、ＩＣＰ３４．５遺伝子の少なくとも1つのコピーから、そして好ましくは両方のコピーからＩＣＰ３４．５活性のある遺伝子産物を作製することができない。
【０１７３】
首尾よく形質転換されたウイルスは、従って、ＩＣＰ３４．５活性のある遺伝子産物を作製することができない。
【０１７４】
カセットのそれぞれの構成要素は、目的ヌクレオチド配列、リボソーム結合部位及びマーカーをコードするｍＲＮＡを含む又はから本質的に成る単一のバイシストロン転写産物が得られるように、隣の構成要素と実質的に隣接して配置することができる。
【０１７５】
記載したベクターはさらに、抗生物質耐性、例えば、カナマイシン耐性又はアンピシリン耐性を付与するポリペプチド若しくはタンパク質などの選択マーカーをコードする核酸を含んでも、から成っても、又はから本質的に成ってもよい。
【０１７６】
記載したベクターは好ましくはＤＮＡベクター、特にｄｓＤＮＡベクターである。ベクターは、直鎖状又は環状（プラスミド）ＤＮＡベクターとして提供することができる。ベクターは、好ましくは、ヌクレオチド配列、例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、ＤＮＡライゲーション及び制限材料（例えば、酵素）並びに当業者に公知の技法を利用することにより、２つの型の間の移行を可能にする。選択したＨＳＶによる相同組換えを達成するために、ベクターが好ましくは直鎖で提供される。
【０１７７】
本発明者らが提供するかかるベクターの１つはプラスミドＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰであり、該プラスミドは、Crusade Laboratories Limited（住所：Department of Neurology Southern General Hospital 1345 Govan Road Govan Glasgow G51 5TF Scotland）の名前で、２００３年９月３日、欧州細胞培養コレクション（the European Collection of Cell Cultures (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, OJG, United Kingdom）に受託番号０３０９０３０３としてブダペスト条約（The Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure、本明細書ではブダペスト条約と呼ぶ）の条項に従って寄託されている。
【０１７８】
ＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰは、（選択したプロモーターの下流の）目的ヌクレオチド配列をＨＳＶ−１の無能化ＲＬ１遺伝子座中に導入する相同組換えの方法に利用することができる多数の「シャトルベクター」を作製するための、そして目的ヌクレオチド配列、例えばＲＮＡ転写産物の産物、又はポリペプチド、及びＧＦＰを発現し、容易に同定しうる腫瘍溶解性ＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶ−１変異株を作製するためのプラットフォームを提供することができる。ＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰは、従って、ＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶの容易な作製と精製を提供する。
【０１７９】
ＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰは、選択された遺伝子の産物を発現することができ、そして投与したウイルスの細胞溶解能力及び／又は治療効果を強化することができる第２世代の腫瘍溶解性ウイルスを作製するための有用なベクターである。
【０１８０】
ＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドは、マルチクローニング配列（ＭＣＳ）、その下流の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ＧＦＰ遺伝子、及びＳＶ４０ポリアデニル化配列、並びにフランキングＨＳＶ−１ ＲＬ１配列（複数）を組み込んでいる。脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ）の組み込みにより、単一転写ｍＲＮＡからの２つのオープンリーディングフレームの翻訳が可能になる。
【０１８１】
目的ヌクレオチド配列（及び選択したプロモーター）のＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰ中へのクローニングによる特定のシャトルベクターを作製した後、所望の核酸転写産物又はタンパク質を発現する組換えＨＳＶ−１を、２週間以内に作製して精製することができる。これは従来の技術のプロトコルを用いる２〜３ヶ月の作業に匹敵する。
【０１８２】
本発明者らが提供するＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドを用いて作製したＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶにおいて、目的ヌクレオチド配列とＧＦＰの両方の単一転写産物としての転写は、目的ヌクレオチド配列の上流の同じプロモーターより制御され、転写されたＩＲＥＳがＧＦＰのｃａｐ依存性翻訳を指令する。作製されるＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶは神経毒性がない。ＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドを改変してカセット周囲の適当なフランキング配列を組み込むことにより、ＧＦＰを発現する他の遺伝子特異的ＨＳＶヌル変異株を作製することができる。
【０１８３】
ＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰはプロモーターがないので、選択したプロモーターを相同組換えシャトルベクターに組み込んで、挿入したカセットからの目的ヌクレオチド配列の発現を制御することができる。
【０１８４】
目的の核酸転写産物若しくはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含むプラスミドＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰ、又はその改変型プラスミドシャトルベクターは、単離した又は精製した形態で提供することができる。
【０１８５】
ベクターはプラスミドＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰの変異体であってもよい。
【０１８６】
プラスミドＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰは、目的配列及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするマーカー遺伝子を直列発現するように設計されている。目的配列並びにそのプロモーター（例えば、ＣＭＶ）をＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰ中にクローニングして、プロモーターに目的配列に対するｍＲＮＡ並びにＩＲＥＳ−ＧＦＰの転写を駆動させる。翻訳は、内部リボソーム侵入部位からＧＦＰの発現をもたらすので、目的遺伝子及びプロモーターはこれを達成する正しい方向でＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰ中にクローニングされる必要がある。この直列発現の配置が不適当でありうる場合及び該カセット設計の変法が好都合である場合などの色々な事例がある。
【０１８７】
１つの例は、Ｈ１又はＵ６などのＲＮＡ ｐｏｌＩＩＩプロモーターを用いるｓｉＲＮＡのショートヘアピンＲＮＡとしての発現である。これらのプロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌＩＩＩ発現カセットが短い転写産物を産生するためだけに設計されるので、ＩＲＥＳ−ＧＦＰのさらなる直列発現を駆動することができない。さらに、その３'非翻訳領域に強いｍＲＮＡシャットオフシグナルをもつゲノムＤＮＡから誘導される目的配列はＩＲＥＳ−ＧＦＰ発現を支持することができない。
【０１８８】
従って、いくつかの事例においては、目的の配列とマーカーを独立したプロモーターから別々に発現させるカセットを提供することができる。
【０１８９】
ある変異体は、プラスミドＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰのカセットのリボソーム結合部位が調節性ヌクレオチド配列、好ましくは、ホスホグリセロキナーゼプロモーターなどの強い構成的プロモーターにより置き換えられたカセットを含有する。マーカーはそれにより、この（「第１」）調節配列の制御下で発現される。目的のヌクレオチド配列（例えば、ＮＴＲ、アンチセンス又はｓｉＲＮＡ）は、目的のヌクレオチド配列の上流（５'）の第２調節配列、例えばＣＭＶプロモーターの制御下で発現される。このベクター変異体は、ｓｉＲＮＡ分子の発現に弱いプロモーターを用いる場合ｓｉＲＮＡを発現するために又はＮＴＲをコードする核酸が強い終結シグナルを有して、ＮＴＲ及びマーカー配列をコードする単一のバイ又はポリシストロン転写産物を転写若しくは翻訳することが困難である場合に特に好適である。この実施形態において、ウイルスゲノムに組み込まれたカセットを含有する形質転換されたウイルスは、第１及び第２プロモーターの制御下で２つの別々の転写産物を産生する。
【０１９０】
かかるカセットの１つを次の方法で構築した。ＰＧＫプロモーター／ＧＦＰ遺伝子を含有する１.３ｋｂｐの平滑末端ＥｃｏＲＩ／ＡｆｌＩＩ断片を、ベクターｐＳＮＲＧから制限酵素消化と次いでクレノウ処理により得て、ＲＬ１−ｄｅｌベクター中にクローニングし、平滑末端を作製する制限酵素ＮｒｕＩを用いて切断した。ＰＧＫ／ＧＦＰ ＤＮＡの挿入の成功を、ＢａｍＨＩ消化により確認し、挿入したＤＮＡの方向をＲＬ１−ｄｅｌの特有のＸｈｏＩ部位及びＰＧＫ／ＧＦＰの３'末端のＢｓｒＧＩ部位を用いて同定した。順方向及び逆方向の両方の方向にＰＧＫ／ＧＦＰをもつプラスミドを得て、そのプラスミドをＲＬ１−ｄＰＧＫ／ＧＦＰｆｏｒ及びＲＬ１−ｄＰＧＫ／ＧＦＰｒｅｖと名づけた。ＧＦＰの発現を、順方向及び逆方向のプラスミドを用いてトランスフェクトしたＢＨＫ細胞において確認した。
【０１９１】
従って、目的配列並びにそれら自身のプロモーター（ＰＧＫプロモーターをこの目的にも使わないことが好ましいが）を次いでＲＬ１−ｄＰＧＫ／ＧＦＰｆｏｒ又はＲＬ１−ｄＰＧＫ／ＧＦＰｒｅｖ中に、いずれかの方向で、残りの特有のＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ又はＨｐａＩ制限部位を用いてクローニングすることができる。得られるプラスミドを用いて、マーカーＧＦＰ遺伝子及び目的の遺伝子が独立してそれら自身のプロモーターから発現される、組換えＨＳＶを誘導することができる。
【０１９２】
記載したベクターを構築してこれを利用し、カセットのフランキングヌクレオチド配列と選択した単純ヘルペスウイルスゲノムの対応する配列との間の相同組換えの機構を介した核酸カセットの挿入により、遺伝子操作したＨＳＶ−１又はＨＳＶ-２を作製することができる。
【０１９３】
記載したベクターは、次を含むものでありかつ次に利用するものである：
ｉ）選択したヌクレオチド配列、例えばＮＴＲをＨＳＶゲノムのある特定の遺伝子座に送達するための遺伝子送達（遺伝子療法）ベクター；及び／又は
ｉｉ）選択した調節エレメントの制御下で、ＨＳＶゲノムから送達されたｉ）のヌクレオチド配列を発現するための発現ベクター；及び／又は
ｉｉｉ）ＨＳＶ遺伝子特異的ヌル変異株を作製するためのベクターであって、カセットを選択したゲノム位置に挿入して選択したＨＳＶ遺伝子のタンパク質コード配列を破壊し、得られるウイルス変異株の遺伝子産物を不活性化するベクター。
【０１９４】
記載したベクターは、遺伝子操作した遺伝子特異的ＨＳＶヌル変異株、すなわち、選択した遺伝子の活性遺伝子産物を発現することができないＨＳＶ変異株の製造に利用することができる。これらのベクターは、唯１つの遺伝子コピーからの選択したタンパク質を発現し、その他の遺伝子コピーは破壊又は改変されていて、その結果、機能的遺伝子産物を発現することができない、遺伝子操作したウイルスの製造に利用することができる。かかるベクターはまた、好ましくは上記遺伝子特異的ＨＳＶヌル変異株を含み、好ましくは腫瘍の腫瘍溶解治療により癌及び腫瘍を治療するために用いる医薬の製造に利用することもできる。
【０１９５】
記載したベクターはまた、遺伝子操作したＨＳＶ変異株の製造に利用することもでき、ここで、ＨＳＶ変異株のゲノムはカセットの相同組換えによりＨＳＶゲノムに挿入しておくことができる外来性又は異種遺伝子を含有するものである。好ましくは、外来性／異種遺伝子は、その発現を挿入したカセットの一部分を形成する調節エレメント（例えば、プロモーター）により調節することができるＨＳＶ変異株において発現される。かかるベクターは、好ましくは腫瘍の腫瘍溶解治療を含む疾患の治療に使用するための遺伝子操作したＨＳＶ変異株を含む医薬の製造に使用することができる。
【０１９６】
記載したベクターはまた、遺伝子操作したＨＳＶ変異株の製造に使用することもでき、ここで、ＨＳＶ変異株のゲノムは外来性／異種遺伝子（すなわち、非ＨＳＶ由来の遺伝子）を含み、上記外来性／異種遺伝子はカセットの相同組換えによりＨＳＶゲノムのタンパク質コード配列内に挿入しておくことができ、その結果、ＨＳＶ変異株は上記タンパク質コード配列によりコードされる活性遺伝子を発現することができないこと、及び外来性／異種遺伝子産物は調節エレメントの制御下で発現される。好ましくは、調節エレメントはカセットの一部を形成する。かかるベクターは、好ましくは、腫瘍の腫瘍溶解治療を含む疾患の治療において使用するための遺伝子操作したＨＳＶ変異株を含む医薬の製造に使用することができる。
【０１９７】
記載したベクターはまた、遺伝子操作したＨＳＶ変異株の製造に使用することもでき、ここで、ＨＳＶ変異株のゲノムはカセットの相同組換えによりＨＳＶゲノムのタンパク質コード配列内に挿入しておいたヌクレオチド配列を含み、その結果、ＨＳＶ変異株は上記タンパク質コード配列によりコードされる活性遺伝子を発現することができないこと、及び挿入されたヌクレオチド配列は調節エレメントの制御下で発現されて所望の転写産物を産生する。好ましくは、調節エレメントはカセットの一部を形成する。かかるベクターは、好ましくは、腫瘍の腫瘍溶解治療を含む疾患の治療において使用するための遺伝子操作したＨＳＶ変異株を含む医薬の製造に使用することができる。
【０１９８】
記載したベクターを用いて、カセットを選択したＨＳＶのゲノム中に挿入することによりＨＳＶ変異株を作製することができ、その作製の方法は、プラスミドである上記ベクターを提供し、ベクターを直鎖化し、そして細胞培養物に直鎖化したベクター及び上記ＨＳＶからのゲノムＤＮＡを共トランスフェクトすることを含みうる。
【０１９９】
共トランスフェクションは、上記カセットのウイルスゲノムの挿入部位中への相同組換えにとって効果的な条件下で実施することができる。
【０２００】
本方法はさらに、次の１以上のステップを含みうる：
１）上記共トランスフェクトした細胞培養物を上記マーカーを発現するＨＳＶ変異株を検出するためにスクリーニングするステップ；
及び／又は
２）上記ＨＳＶ変異株を単離するステップ；及び／又は
３）上記ＨＳＶ変異株を、目的ヌクレオチド配列若しくはＲＮＡ又はそれによりコードされるポリペプチドの発現についてスクリーニングするステップ；及び／又は
４）上記ＨＳＶ変異株を、活性遺伝子産物の欠損についてスクリーニングするステップ；及び／又は
５）腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで死滅させる、上記ＨＳＶ変異株の腫瘍溶解能力を試験するステップ。
【実施例１】
【０２０１】
プラスミドＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰの構築
一般的手法
プラスミドＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰを、図１に図解した３段階で作製した。
【０２０２】
１．ＣＭＶ ＩＥプロモーター（ｐＣＭＶ）、ＮＡＴ遺伝子、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ＧＦＰレポーター遺伝子及びＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有するＤＮＡ配列を、ｐＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰからＮｓｉＩ及びＳｓｐＩを用いて切り出し、精製した。
【０２０３】
２．精製したｐＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＰｏｌｙＡ ＤＮＡ断片をＲＬ１.ｄｅｌ中にクローニングして、ＲＬ１.ｄＣＭＶ−ＮＡＴ−ＧＦＰと名づけた新しいプラスミドを形成させた。
【０２０４】
３．ＲＬ１.ｄＣＭＶ−ＮＡＴ−ＧＦＰのｐＣＭＶ−ＮＡＴ ＤＮＡ配列をＸｈｏＩを用いて切り出し、プラスミドの残りを再度ライゲーションしてＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰと名づけた新規プラスミドを形成させた。この新規プラスミドは、マルチクローニングサイト（示した全てのサイトは特有のものである）、その下流にＩＲＥＳ、ＧＦＰ遺伝子及びＳＶ４０ポリＡ配列、（全て、ＨＳＶ−１ ＲＬ１フランキング配列内にある）を含有した。ＲＬ１遺伝子座において目的遺伝子を発現する組換えＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶ−１は、目的遺伝子（好適なプロモーターの下流）をマルチクローンサイト中にクローニングしかつＢＨＫ細胞にプラスミドとＨＳＶ−１ ＤＮＡを共トランスフェクトすることにより作製することができる。標的遺伝子を発現する組換えウイルスは、ＧＦＰ蛍光を用いて同定することができる。
【０２０５】
ＲＬ１.ｄＣＭＶ−ＮＡＴ−ＧＦＰからＣＭＶプロモーター及びノルアドレナリントランスポーター遺伝子（ｐＣＭＶ−ＮＡＴ）を除去し、次いでプラスミドの残りを再度ライゲーションして、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、その下流の脳心筋炎ウイルス内部リボソーム侵入部位（ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ）、ＧＦＰレポーター遺伝子及びＳＶ４０ポリＡ配列の全てをＲＬ１フランキング配列内に含有する新規プラスミド（ＲＬ１．ｄＩＲＥＳ-ＧＦＰ）を得た。この新規のＤＮＡ配列の配置、すなわち「スマートカセット」によって、単に所望のトランスジーンをＭＣＳ中に（好適なプロモーターの下流に）挿入してＢＨＫ細胞を該プラスミドとＨＳＶ−１ ＤＮＡを用いて共トランスフェクトすることにより、ＲＬ１遺伝子座において目的遺伝子を発現するＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶ−１を容易に作製することが可能になる。ＧＦＰ遺伝子とＭＣＳの間に位置するＩＲＥＳは同じプロモーターから２つの遺伝子の発現ができるようにし、従って目的遺伝子を発現する組換えウイルスもＧＦＰを発現し、それ故に蛍光顕微鏡下で容易に同定しかつ精製することができる。
【０２０６】
材料と方法
１μｇのＲＬ１.ｄｅｌ*を、１０ユニットＨｐａＩ（Promega）を含有する好適な容積の１０ｘバッファー（Promega）とヌクレアーゼを含まない水（Promega）を用いて３７℃にて１６時間消化した。次いで消化したプラスミドを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて精製し、１０ユニットの仔ウシ腸ホスファターゼ（Promega）を含有する好適な容積の１０ｘＣＩＰバッファーとヌクレアーゼを含まない水（Promega）を用いて４時間３７℃にて処理し、その後、再びＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。５μｌの精製したＤＮＡを１％アガロースゲル上で電気泳動した、その濃度を確認した（図２）。
【０２０７】
４ｘ１μｇのｐＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ＊＊を、１０ユニットのＮｓｉＩ及び１０ユニットのＳｓｐＩを含有する好適な容積の１０ｘバッファー（Promega）及びヌクレアーゼを含まない水（Promega）を用いて３７℃にて１６時間消化した。反応混合物を１％アガロースゲル中で１時間、１１０ボルトにて電気泳動した。ＣＭＶ ＩＥプロモーター（ｐＣＭＶ）、その下流のノルアドレナリントランスポーター遺伝子（ＮＡＴ）、脳心筋炎ウイルス内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子、及びＳＶ４０ポリアデニル化配列（ＳＶ４０ＰｏｌｙＡ）から構成される５.４ＫｂｐのＤＮＡ断片を、滅菌メスを用いてゲルから切り出し、そしてＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen）を用いて精製した。溶離したＤＮＡを３ユニットのクレノウポリメラーゼ（Promega）を製造業者の指示に従って用いて平滑末端化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いてＤＮＡを精製した。５μｌの精製したＤＮＡ断片を１％アガロースゲル上で電気泳動してその濃度を確認した（図３）。
【０２０８】
ライゲーション反応を、５ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Promega）、好適な容積の１０Ｘ ＤＮＡリガーゼバッファー（Promega）、ヌクレアーゼを含まない水（Promega）並びに様々な容積のＨｐａＩで消化し／ＣＩＰで処理したＲＬ１.ｄｅｌ及び平滑末端化したｐＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＳＶ４０ Ｐｏｌｙ Ａ ＤＮＡを含有する小エッペンドルフチューブ中で、１６℃にて一夜実施した。次いでコンピテントＪＭ１０９細菌細胞（Promega）を様々なライゲーション反応のアリコートを用いて形質転換した＊＊＊。プレート上に形成されたコロニーを拾い、それらのプラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎプラスミド・ミニキットを用いて抽出し、そしてインサートについてＡｆｌＩＩ（New England Biolabs）制限酵素分析を用いてスクリーニングした。インサートを含有するプラスミドＤＮＡは、ＡｆｌＩＩによる消化後に４.８Ｋｂｐ及び９.２Ｋｂｐの２つの断片を生じうる。２つのクローン（クローン５及び８）はインサートを含有した（図４）。クローン５（ＲＬ１.ｄＣＭＶ−ＮＡＴ−ＧＦＰ）中のインサートの方向を、ＸｈｏＩ制限酵素分析を用いて決定した（図５）。
【０２０９】
クローン５からＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰを作製するために、４ｘ５００ｎｇのクローン５を、１０ユニットのＸｈｏＩを含有する好適な容積のバッファーと水（Promega）を用いて一夜３７℃にて消化することにより、ＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＳＶ４０ＰｏｌｙＡインサートのＣＭＶ−ＮＡＴ部分を除去した。消化したＤＮＡを１％アガロースゲル上で１１０ボルトにて１時間電気泳動した（図６Ａ）。ｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）（Promega）骨格中のＩＲＥＳ、ＧＦＰ遺伝子、ＳＶ４０ポリＡ配列及びＲＬ１フランキング配列から成る１０.２Ｋｂｐの断片を、滅菌メスを用いて切り出し、そしてＤＮＡをゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製した。
【０２１０】
ライゲーション反応は、１００ｎｇ〜５００ｎｇの精製ＤＮＡ、３ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Promega）、好適な容積の１０Ｘ ＤＮＡリガーゼバッファー（Promega）及びヌクレアーゼを含まない水（Promega）を含有する小エッペンドルフチューブ中で一夜１６℃にて実施した。次いでコンピテントＪＭ１０９細菌細胞（Promega）を様々なライゲーション反応のアリコートを用いて形質転換した＊＊＊。プレート上に形成されたコロニーを拾い、それらのプラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎプラスミド・ミニキットを用いて抽出し、そしてＸｈｏＩ（Promega）制限酵素分析を用いてスクリーニングした。ＣＭＶ−ＮＡＴが除去されたプラスミドＤＮＡを含有するコロニーはＸｈｏＩを用いて消化すると１０.２Ｋｂｐの１断片を生じうる。いくつかのポジティブクローンを見出し、１つを単離し、そして大規模プラスミド調製をPromegaのＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉｐｒｅｐｓキットを用いて行った。大規模プラスミド調製物をＸｈｏＩを用いて消化して確認した（図６Ｂ）。このプラスミドをその後「ＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰ」と名付けた。
【０２１１】
プラスミドＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰは、Crusade Laboratories Limited（住所：Department of Neurology Southern General Hospital 1345 Govan Road Govan Glasgow G51 5TF Scotland）の名前で、２００３年９月３日、欧州細胞培養コレクション（the European Collection of Cell Cultures (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, OJG, United Kingdom）に受託番号０３０９０３０３としてブダペスト条約の条項に従って寄託されている。
【０２１２】
ＲＬ１.ｄｅｌ
＊ＲＬ１.ｄｅｌはＤｒ.Ｅ.ＭｃＫｉｅより提供を受けたものであって、ＲＬ１遺伝子及びそのフランキング配列から成るＨＳＶ−１断片（１２３４５９−１２９４０３）がクローニングされているｐＧＥＭ−３Ｚｆ（−）プラスミド（Promega）である。ＲＬ１遺伝子の４７７ｂｐのＰｆｌＭＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片（１２５２９２−１２５７６９）が除去されてマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）により置き換えられ、ＲＬ１.ｄｅｌを形成する。
【０２１３】
ｐＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ
＊＊ｐＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰはＤｒ. Ｍａｒｉｅ Ｂｏｙｄ（CRUK Beatson Laboratories）より提供を受けたものであって、ウシノルアドレナリントランスポーター（ＮＡＴ）遺伝子（３.２Ｋｂｐ）がＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングされているｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰプラスミド（BD Biosciences Clontech）である。
【０２１４】
＊＊＊細菌細胞の形質転換
１０μｌのグリセロール大腸菌ストックを、１０ｍｌの２ＹＴ培地の入った２０ｍｌグリーナーチューブ（griener tube）に加えた。これを３７℃の振盪培養器において１６〜２４時間、飽和培養が得られるまでおいた。１ｍｌのこの培養物を次いで１００ｍｌの２ＹＴの入った５００ｍｌ滅菌ガラスボトルに加え、３７℃の振盪培養器に３時間おいた。細菌細胞を、２,０００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離（Beckman）によりペレット化した。次いで細胞を、１／１０容積の形質転換及び貯蔵バッファー（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｍｇ（ＳＯ）４、１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ３,５００、５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ）に再懸濁した。細胞を１０分〜２時間、氷上に置いて、その後、これらの細胞は形質転換にコンピテントであるとみなした。
【０２１５】
ＤＮＡ １〜１０μｌをコンピテントな細菌１００μｌとエッペンドルフチューブ内で混合し、チューブを氷上に３０分間置いた。この後、チューブを４２℃水浴中で正確に４５秒間インキュベートすることによりサンプルに「熱ショック」を与え、その後、サンプルを氷上にさらに２分間置いた。１ｍＬのＬ−ブロスを加え、チューブを２〜３回反転し、そして細菌を１時間、３７℃にてインキュベートした。形質転換した細菌１００μＬを、好適な抗生物質（通常はアンピシリン又はカナマイシン）を１００μｇ/ｍｌ含有するＬ−ブロス寒天プレート上にまいた。プレートを室温にて乾燥した後、倒置位置で３７℃にて一夜インキュベートした。
【実施例２】
【０２１６】
プラスミドＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰを用いて、目的遺伝子産物とＧＦＰを発現するＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶ−１の作製
一般的手法
目的遺伝子産物を発現するＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶ−１の作製には、目的遺伝子産物（ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列、及び多くの場合には所望のプロモーターをＲＬ１.ｄＩＲＥＳ.ＧＦＰのＭＣＳに挿入すること、次いで、目的遺伝子を含有する直鎖化プラスミドとＨＳＶ ＤＮＡによりＢＨＫ細胞を共トランスフェクトすることが必要である。相同組換え後、ＧＦＰを発現するウイルスプラークを同定する。図７は、含まれる本方法のステップを例示する。
【０２１７】
図７Ａについては、目的遺伝子と所望のプロモーター（Ｘ）を含有するプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、プロモーター／遺伝子断片を遊離させる。
【０２１８】
プロモーター／遺伝子断片を精製し、ＲＬ１.ｄＩＲＥＳ.ＧＦＰのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）中にクローニングして腫瘍溶解性ＨＳＶ−１を作製するのに好適なシャトルベクターを形成する（図７Ｂ）。このベクターは、本質的なＲＬ１遺伝子にフランキングするＨＳＶ−１配列を含有するがＲＬ１遺伝子を含有しない。プラスミドはまた、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の下流に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子も含有する。ＩＲＥＳは、目的遺伝子とＧＦＰ遺伝子の両方の発現を同じ上流のプロモーターからできるようにする。
【０２１９】
次いでＢＨＫ細胞を、このようにして目的遺伝子を含有させた直鎖化ＲＬ１.ｄＩＲＥＳ.ＧＦＰとＨＳＶ−１ ＤＮＡを用いて共トランスフェクトする（図７Ｃ）。相同組換えの後に、目的遺伝子とＧＦＰを発現するデザイナーウイルスが作製されて、野生型ウイルス（同様に作製されるがＧＦＰを発現しない）から蛍光顕微鏡下で識別することができる。
【０２２０】
ＧＦＰを（従って目的遺伝子も）発現するウイルスプラークを蛍光顕微鏡下で拾い、そして全ての野生型ＨＳＶ−１が除去されるまで精製する。組換えＨＳＶ−１は、全てのウイルスプラークがＧＦＰを発現するときに１００％純粋であるとみなす（図７Ｄ）。
【０２２１】
組換えウイルスが完全に純粋になると、単離したプラークを拾い、高度に濃縮されたストックを増殖させて力価測定する（図７Ｅ）。選択したプロモーターから目的遺伝子産物を発現する腫瘍溶解性ＨＳＶ−１は、次いで特性決定、及び腫瘍死滅能力のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行う。
【０２２２】
材料と方法
目的遺伝子とＧＦＰを発現するＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶ−１組換え体を作製するためには、目的遺伝子、及び、多くの場合には好適なプロモーターをＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰのＭＣＳ中に、このプラスミドのＧＦＰ遺伝子に対して順方向にクローニングすることが必要である。これが達成されていると、プラスミドを無関係な領域で直鎖化する（すなわち、１回だけ切断する制限酵素、通常はＳｓｐＩ又はＳｃａＩを用いて消化する）。６０ｍｍペトリディッシュ中の８０％コンフルエントＢＨＫ細胞を、次に、ＨＳＶ−１ ＤＮＡ及び直鎖化したプラスミドＤＮＡを用いて下記のように共トランスフェクトする。
【０２２３】
目的遺伝子及びＧＦＰを発現する複製制限のあるＨＳＶ−１を作製するためには、目的遺伝子を好適なプロモーター（例えば、ＣＭＶ ＩＥ）の下流でＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰ中にクローニングしなければならない。プロモーターは、二シストロン性のｍＲＮＡ転写産物を産生するために目的遺伝子の上流に必要である。転写産物中の２つのオープンリーディングフレームの間のＩＲＥＳ配列は、効率的なｃａｐ依存性翻訳の内部開始のためのリボソーム結合部位として機能する。本設計によって、目的遺伝子及びＧＦＰの両方の共役転写、次いで第１遺伝子（目的遺伝子）のｃａｐ依存性の翻訳開始、及びＧＦＰのＩＲＥＳが指令するｃａｐ依存性の翻訳ができるようになる。こうして共役的な遺伝子発現がこの配置において確保される。
【０２２４】
ＣａＰＯ４及びＤＭＳＯブーストによる、ウイルス及びプラスミドＤＮＡの共トランスフェクション
ＨＳＶ−１（１７＋）ＤＮＡ及び目的遺伝子とプロモーターを含有する０.１〜１μｇの直鎖化スマートカセットを、１μｌの仔ウシ胸腺ＤＮＡ（１０μｇ/ｍｌ）及び最終容積１６５μｌを与える適当な容積の蒸留水を含有する１.５ｍｌエッペンドルフチューブ中にピペッティングする。その溶液を２００μｌピペットチップを用いて非常に穏やかに混合する。次いで、３８８μｌのＨＥＢＳ、ｐＨ ７.５（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、４.９ｍＭ ＫＣｌ、１.６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、５.５ｍＭ Ｄ−グルコース、２１ｍＭ ＨＥＰＥＳ）を加え、溶液を混合した後に、２６.５μｌの２Ｍ ＣａＣｌ２を滴下し、そしてエッペンドルフチューブを２〜３回指先ではじく。サンプルを室温で１０〜１５分間放置し、次いで、６０ｍｍペトリディッシュ中の培地を除去しておいた８０％コンフルエントＢＨＫ細胞へ滴下する。４５分間の３７℃におけるインキュベーション後に、細胞に５ｍｌのＥＴＣ１０を積層し、そして３７℃にてインキュベートした。３〜４時間後、培地を除去してプレートをＥＴＣ１０を用いて洗浄する。正確に４分間後、細胞に室温にて１ｍｌの２５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含むＨＥＢＳを積層する。４分間後、細胞を５ｍｌ ＥＴＣ１０を用いて３回すぐに洗浄し、その後、５ｍｌのＥＴＣ１０を積層し、そしてインキュベーターに戻す。翌日、新鮮な培地を細胞に加える。２日後、ｃｐｅが明白であれば、細胞を培地中にかき集め、小さいビジュー（bijoux）へ移して十分に音波処理を行う。次いでサンプルを−７０℃にて必要なときまで保存する（以下のプラーク精製の節を参照）。
【０２２５】
注意：  加えるウイルスＤＮＡの容積は、上記の操作をプラスミドＤＮＡなしで一連のウイルスＤＮＡ容積を用いて実施し、そして２〜３日後、ＢＨＫ単層上に最大ウイルスプラーク数を与える容積を選ぶことによって決定する。
【０２２６】
プラーク精製
音波処理した共トランスフェクションプレートからのサンプルを解凍し、ＥＴＣ１０で連続１０倍希釈する。無希釈〜１０５希釈したサンプルからの１００μｌを、６０ｍｍペトリディッシュ中の培地を除去しておいたコンフルエントＢＨＫ細胞上にプレーティングする。４５分間の３７℃におけるインキュベーション後に、細胞に５ｍｌのＥＴＣ１０を積層し、３７℃にて４８時間インキュベートする。次いでプレートをウイルスプラークの存在について確認し、最小の、最も分離されたプラークをもつディッシュを蛍光立体顕微鏡下に置く。目的遺伝子に加えて緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するように設計した組換えウイルスは、ＧＦＰフィルターを利用すると野生型ウイルスと明確に識別することができる。蛍光プラークを、２０μｌピペットを用いて拾い、１ｍｌのＥＴＣ１０を含有するエッペンドルフチューブ中に移す。そのサンプルを十分に音波処理した後、ＥＴＣ１０で連続１０倍希釈を行い、そして上記精製手順を繰り返す。この方法を典型的には３〜４回、ＢＨＫ単層上の全てのプラークが蛍光色になるまで繰返す。これを達成した後、このサンプル５０μｌを用いて、ローラーボトル中で５０ｍｌのＥＴＣ１０中にてＢＨＫ細胞に感染させ、そしてウイルスストックを増殖させる。
【０２２７】
組織培養培地
ＢＨＫ２１／Ｃ１３細胞を、１０％新生仔ウシ血清（Gibco）及び１０％（ｖ／ｖ）トリプトースホスフェートブロスを添加したＥａｇｌｅ培地（Gibco）中で増殖させる。これをＥＴＣ１０と呼ぶ。ウイルス力価測定及びプラーク精製のために、ＥＭＣ１０（１.５％メチルセルロース及び１０％新生仔ウシ血清を含有するＥａｇｌｅ培地）を細胞に積層する。
【実施例３】
【０２２８】
ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰの構築
一般的手法
ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰは、ＣＭＶ ＩＥプロモーター（ｐＣＭＶ）とその下流の大腸菌ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）遺伝子から成るｐＰＳ９４９10から得
.た１.６ＫｂｐのＢａｍＨＩ断片を、ＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰスマートカセットのＭＣＳ中に、ＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰ中のＧＦＰ遺伝子に対して順方向にクローニングすることにより作製した（図８）。得られるプラスミドをＲＬ１.ｄＣＭＶ−ＮＴＲ−ＧＦＰと名付け、次いで、直鎖化して組換えウイルスを作製し、上記の通り精製した。ｐＬＮＣＸ（Clontech）骨格中にＣＭＶ ＩＥプロモーター（ｐＣＭＶ−ＮＴＲ）の下流にＮＴＲ遺伝子を含有するプラスミドｐＰＳ９４９（参考文献１０において「ｐｘＬＮＣ−ｎｔｒ」と称される）は、Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｙｏｕｎｇ（University of Birmingham, UK）より供与を受けたものである。
【０２２９】
材料と方法
４×１μｇのｐＰＳ９４９を、１０ユニットのＢａｍＨＩ（Promega）を用いて、好適な容積の１０ｘバッファー（Promega）及びヌクレアーゼを含まない水（Promega）中で、３７℃にて１６時間かけて消化した。反応混合物を、１％アガロースゲル中で１時間、１１０ボルトにて電気泳動した。ＣＭＶプロモーターとその下流のＮＴＲ遺伝子（ｐＣＭＶ−ＮＴＲ）から成る１.６ＫｂｐのＤＮＡ断片を、滅菌メスを用いて切り出し、ゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen）を用いてＤＮＡを精製した。５μｌの精製したＤＮＡ断片を１％アガロースゲル上で電気泳動してその濃度を確認した（図９）。
【０２３０】
次いで２μｇのＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰスマートカセットを、好適な容積の１０ｘバッファー（Promega）及びヌクレアーゼを含まない水（Promega）、３７℃にて１６時間かけて１５ユニットのＢｇｌＩＩ（Promega）を用いて消化した。消化したプラスミドを次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて精製し、１０ユニットの仔ウシ腸ホスファターゼ（Promega）を用いて、好適な容積の１０ｘＣＩＰバッファー及びヌクレアーゼを含まない水中で、３７℃にて４時間処理し、その後、再びＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて精製した。５μｌの精製したＤＮＡを１％アガロースゲル上で電気泳動してその濃度を確認した（図１０）。
【０２３１】
ライゲーション反応を、５ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Promega）、好適な容積の１０Ｘ ＤＮＡリガーゼバッファー（Promega）、ヌクレアーゼを含まない水（Promega）並びに様々な容積のＢｇｌＩＩ消化／ＣＩＰ処理したＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰスマートカセット及びｐＣＭＶ−ＮＴＲ（ＢａｍＨＩ末端）を含有する小さなエッペンドルフチューブ中で、１６℃にて一夜行った。コンピテントＪＭ１０９細菌細胞（Promega）を次いで、ライゲーション反応物の様々なアリコートを用いて形質転換した。プレート上に形成されたコロニーを拾い、それらのプラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ プラスミドミニキットを用いて抽出し、そしてインサートについてＢｇｌＩＩ/ＸｈｏＩ（Promega）制限酵素分析を用いてスクリーニングした。ｐＣＭＶ−ＮＴＲインサートを正しい方向で含有するＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドＤＮＡは、ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩによる消化後に１１.５Ｋｂｐ及び３００ｂｐの２つの断片を産生し得た。１つのクローン（クローン４）はインサートを正しい方向に含有することがわかった（図１１）。このプラスミドを「ＲＬ１.ｄＣＭＶ−ＮＴＲ−ＧＦＰ」と名付けた。
【０２３２】
０.１〜１μｇのＲＬ１.ｄＣＭＶ−ＮＴＲ−ＧＦＰを、１０ユニットのＳｃａＩ（Promega）を用いて、好適な容積の１０ｘバッファー（Promega）及びヌクレアーゼを含まない水（Promega）中で、３７℃にて１６時間かけて消化することにより直鎖化した。消化したＤＮＡのサンプル（５μｌ）を１％アガロースゲル上で１時間１１０ボルトにて電気泳動してそれが直鎖化されていることを確認した。８０％コンフルエントＢＨＫ細胞を次いで、好適な容積の残りの直鎖化ＤＮＡ及びＨＳＶ−１ ＤＮＡを用いて共トランスフェクトした。ＧＦＰ（及び従ってＮＴＲ）を発現する組換えＨＳＶ−１を同定し、そして蛍光顕微鏡を用いて精製し、ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰと名付けたウイルスストックをＢＨＫ細胞上で増殖させて力価測定した（図１２）。
【０２３３】
ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰは、Crusade Laboratories Limited（住所：Department of Neurology Southern General Hospital 1345 Govan Road Govan Glasgow G51 5TF Scotland）の名前で、２００３年１１月５日、欧州細胞培養コレクション（the European Collection of Cell Cultures (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, United Kingdom）に受託番号０３１１０５０１としてブダペスト条約の条項に従って寄託されている。
【０２３４】
ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰによる細胞死滅
ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰは、ＢＨＫ細胞及び３Ｔ６細胞中のＨＳＶ１７１６とほとんど同一の動力学で複製する。ＢＨＫ細胞はＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶの複製を支持するが、コンフルエント３Ｔ６細胞はこれを支持しない。図１３は、ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰが許容しうる細胞株中でＨＳＶ１７１６と同じように複製しうること、及び外来遺伝子、例えば、ＮＴＲ及びＧＦＰの導入はＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶの腫瘍溶解能力を低減しないことを示す。ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰが３Ｔ６細胞において複製しない事実も、この組換えＨＳＶがＩＣＰ３４．５ヌル変異株であることを示す。
【０２３５】
図１４は、ＩＣＰ３４．５ポリペプチドがＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰから発現されず、従ってこのウイルスが遺伝子療法ベクターとして有用であることを実証するウェスタンブロットである。
【０２３６】
図１５は、ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰに感染させた様々な細胞株におけるＮＴＲの発現を実証する別のウェスタンブロットであり、これにはヒト悪性黒色腫細胞株（Ｃ８１６１）及びＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶを複製しないコンフルエント３Ｔ６細胞が含まれる。ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰによる感染後のコンフルエント３Ｔ６細胞におけるＮＴＲの発現は、このＩＣＰ３４．５ヌル変異株の複製がプロドラッグ活性化遺伝子（すなわち、ＮＴＲ）の発現に必要でないことを実証するので、期待が持てるものである。いくつかの腫瘍細胞はｉｎ ｖｉｖｏでＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶの複製を支持しないので、ＨＳＶ１７１６では死滅しないであろう。
【０２３７】
図１６は、コンフルエント３Ｔ６細胞において実施した細胞傷害性アッセイの結果を示す。コンフルエント３Ｔ６細胞の、ＩＣＰ３４．５ヌル変異株（ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ）による１プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）での感染は、有意な細胞死を生じず、また５０μＭ ＣＢ１９５４によって該細胞のインキュベーションを分離することもない。しかし５０μＭ ＣＢ１９５４が増殖培地に含まれると、１ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰによる感染後７２時間に有意な細胞死が明白に起こる。これは、明らかにウイルスの複製がないときでも、ウイルス運搬酵素プロドラッグ治療法（ＶＤＥＰＴ）から実質的な細胞死が起こりうることを実証する。
【０２３８】
コンフルエント３Ｔ６細胞のＩＣＰ３４．５ヌル変異株による１０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでの感染は、「ウイルス抗原過負荷」として知られる機構による細胞死を生じうる。しかし、５０μＭ ＣＢ１９５４が増殖培地に含まれる場合、細胞死滅のレベルはさらに顕著である（ほぼ２０％さらに大きい）。
【０２３９】
類似の細胞傷害性アッセイをヒトＣ８１６１黒色腫細胞で実施したが、その結果を図１７に示す。コンフルエント３Ｔ６細胞と異なり、Ｃ８１６１細胞はＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶの複製を支持する。従って、細胞のＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶによる１ｐｆｕ／細胞での感染後に、細胞死が起こりうる。しかし、ＣＢ１９５４がＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ感染細胞の重層に含まれると、細胞はより効率的にかつより迅速に死滅する。ＣＢ１９５４がＨＳＶ１７１６−ＧＦＰに感染した細胞の重層に含まれる場合、細胞死滅の増強は明らかでない。これらの結果は、細胞死滅の増強がヒト腫瘍細胞において可能であることを実証する。
【０２４０】
コンフルエント３Ｔ６及びヒトＣ８１６１黒色腫細胞において実施した細胞傷害性アッセイの細胞培養写真を図１８及び１９に示す。
【実施例４】
【０２４１】
酵素プロドラッグ治療法を併用した、選択的複製コンピテント単純ヘルペスウイルスの抗腫瘍活性のｉｎ ｖｉｖｏ評価
酵素プロドラッグ治療法を併用した、選択的複製コンピテント単純ヘルペスウイルスの抗腫瘍活性を、適当な動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで研究した。
【０２４２】
親ウイルスであるＨＳＶ１７１６は、タンパク質ＩＣＰ３４.５をコードするＲＬ１遺伝子の両方のコピーを欠損する単純ヘルペスウイルス1（ＨＳＶ １）の選択的複製コンピテント変異株である。このタンパク質は病原性の特異的決定因子である。このタンパク質の機能は色々な文献に詳しく記載されている12。本ウイルスは高レベルの機能的ＰＣＮＡを有する細胞においてのみ増殖することができる。高レベルのＰＣＮＡは、腫瘍細胞などの分裂中の細胞においてのみ見出され、正常な分化細胞では見出されない。
【０２４３】
ＨＳＶ１７１６は、いくつかの動物モデルにおいて最小限の毒性で選択的腫瘍細胞死滅及び生存期間の改善を達成できることが既に示されている13。患者におけるＨＳＶ１７１６ウイルスを用いた最初のフェーズ１臨床試験もいくつかが成功を収めている14,15。
【０２４４】
ＨＳＶ１７１６は腫瘍において選択的に複製し細胞溶解により腫瘍バルクを低減するが、本発明者らは、細胞型及び増殖状態は不均一であるために、ＨＳＶ１７１６が腫瘍の全細胞において細胞を溶解して複製することは予測しなかった。
【０２４５】
腫瘍細胞死滅の有効性を増強するために、従って、全腫瘍を死滅させるために、本発明者らは、ＣＭＶ初期プロモーター（上記実施例３を参照）の制御下で大腸菌ニトロレダクターゼ遺伝子（ｎｔｒ）を発現するＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰと称するＨＳＶ１７１６の誘導体を構築した。本実施例及び図面において参照しているＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰをＨＳＶ１７９０と呼ぶこととする。
【０２４６】
酵素ｎｔｒは、不活性なプロドラッグＣＢ１９５４を、分裂及び非分裂細胞をアポトーシスにより死滅させる機能性細胞傷害性アルキル化剤に変換する。この活性薬剤は拡散性及び膜透過性があるので、効率的なバイスタンダー効果をもたらす、すなわち、活性薬剤は周囲の細胞に影響を与えうることを特徴とする。
【０２４７】
プロドラッグは、ｎｔｒを発現するウイルスに感染している腫瘍においてのみその活性型に変換されるので、正常な細胞に対する毒性は避けられ、従ってこの化合物の全身送達後の治療指数が改善される。
【０２４８】
この組み合わせを用いた最初のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験は、このウイルスとＣＢ１９５４との併用による細胞死滅の増強をいくつかの細胞株において、既に示している。
【０２４９】
本実施例は、さらにこの併用手法を適当な動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価するものである。
【０２５０】
結果
１〜３ヶ月
１〜３ヶ月は主にｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で実施した。この期間中に、異種移植モデルにおいて使用するための高力価の滅菌ウイルスストックを作製した。
【０２５１】
異種移植モデルはまた、最初に無処置患者から得た腫瘍サンプルから誘導されたヒト卵巣上皮癌細胞株である細胞株Ａ２７８０（European Collection of Cell Cultures (ECACC) CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdom, 受託番号９３１１２５２０）を用いて、胸腺欠損ヌードマウスにおいて作製した。
【０２５２】
神経膠腫異種移植モデルは、自家利用できる２種の神経膠腫細胞株であるＬＮ−１８及びＵ３７３ＭＧを用いて作製した。文献では、両方の株が胸腺欠損マウス中の異種移植片として増殖に成功したことが報じられている。しかし、以下の表に示す通り、本発明者らは、５００万細胞を皮下注入した後２８日までの異種移植片の増殖を観察することができなかった。
【表１】
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【０２５３】
Ａ２７８０腫瘍取込み
先に報じられた通り、Ａ２７８０はほぼ５０％の取込率を有する、すなわち、側部皮下に５００万細胞を注入したマウスの５０％が異種移植片を発生する。注入細胞数を１０００万以上に増加すると、ほぼ１５〜２５％の取込率の増加が見られ、６５〜７５％の全取込率が達成された。
【０２５４】
従って、注入神経膠腫細胞数の増加はこれらの細胞株の取込率を増加しうる。
【０２５５】
ＨＳＶ１７９０ウイルスに対する用量反応
マウスをウイルスとプロドラッグの併用で処置する前に、最初に、投与するウイルスとプロドラッグの量について、十分な情報に基づいて決定するための実験を行わなければならない。
【０２５６】
用量反応実験によって、本実験に使用すべきウイルスの最適用量及びウイルスの最高許容用量（ＭＴＤ）、すなわち、有害な副作用なしに１匹のマウスに投与しうるウイルスの最大用量を見出すことができる。腫瘍をもつマウスの小グループに小用量のウイルスを与える。これらのマウスに有害な影響がなければ、他のグループにさらに高用量のウイルスを与える。マウスに病的な影響が現れ始めるか又は最大用量に到達するまでこれを続ける。
【０２５７】
腫瘍内に注入することができるウイルスの最大量は１００μｌであるので、本発明者らの現在のストックからの最大用量は１注入当たり１０９ＰＦＵである。
【０２５８】
図２０は、様々な用量のウイルスを注入した後のマウスの体重変化を示す。体重は動物の全健康の良い指標である。なんらかの体重減少は治療に十分耐えられないことを意味する。初期体重の２０％を超える体重減少があれば、その動物を直ちに犠牲にした。
【０２５９】
１０９ＰＦＵのＨＳＶ１７９０ウイルスの用量にこれらのマウスは耐えられず、急速に体重を減少したので、注入後３日に犠牲にした。マウスは１０８ＰＦＵ以下の用量によく耐え、最初は注射後に体重が低下したものの、急速に回復してほぼ最初の体重を回復した。
【０２６０】
実験の進行とともに、動物が体重が増加すると思われることに留意すべきである。これは、測定するのが全体重であるので形成中の腫瘍の重量を含むという事実のためであることはほとんど間違いない。
【０２６１】
ＨＳＶ１７９０処置に対する腫瘍の応答
腫瘍体積を、毎日、ＨＳＶ１７９０ウイルスの腫瘍内注入後に測定して、腫瘍の増殖遅延又は腫瘍の退行を調べた。
【０２６２】
図２１は、１００日間にわたって測定した腫瘍体積の変化を示す。腫瘍をＰＢＳだけを対照として注入すると、腫瘍はサイズが急速に増加し、注入後ほぼ第１３日に腫瘍はあまりにも大きくなるので動物を犠牲にせざるを得なかった。
【０２６３】
全ての用量のウイルスによる処置は、腫瘍の増殖をある程度遅延させるようであった。１０５ＰＦＵの用量はマウスの寿命をほぼ１２日間延長する一方、１０６ＰＦＵウイルス腫瘍を注射したマウスは対照グループと比較してさらに２３日間長く生存し、その後、腫瘍は著しく大きくなった。恐らく意外なことに、１０８ＰＦＵのウイルスを注入したマウスのグループは対照グループよりほんの僅かに長く生存したにすぎなかった。大多数の非感染性粒子又はその非常に多くの粒子が、ウイルスが増殖したであろう細胞を死滅させる原因となった可能性がある。
【０２６４】
１０７ＰＦＵのウイルスにより処置したマウスグループは、最も永く生存し、実にマウス３匹のうちの２匹は１００日後に犠牲にしたときに腫瘍の徴候が観察されなかった。
【０２６５】
裸のＤＮＡ実験
腫瘍増殖の変化が、ウイルス自体に因るものであって、ＨＳＶ１７１６ウイルスに導入されているＣＭＶ−ｎｔｒプラスミドＤＮＡの結果でないことを確認するために、ＣＭＶ−ｎｔｒプラスミドＤＮＡ単独及びプロドラッグＣＢ１９５４との併用の効果を調べる実験を実施した。
【０２６６】
マウスを、腫瘍直径がほぼ５ｍｍになった時に、ランダムにそれぞれ６匹の動物の治療グループに分けた（これを第０日とする）。図２２は、本実験に用いたマウスの開始時の腫瘍直径を示す。マウスの２グループにＣＭＶ−ｎｔｒプラスミドを直接、腫瘍内注入により１注入当たり０.２ｍｇのＤＮＡの用量にて投与した。これらのグループの１つに次いで、８０ｍｇ／ｋｇのＣＢ１９５４の単一用量を第２日に腹膜内注入により投与した。マウスの第３グループは、第０日における生理食塩水対照の腫瘍内注入の後、ＣＢ１９５４（８０ｍｇ／ｋｇ）を第２日に腹膜内注入により単一投与した。動物を毎日体重測定し（図２３）かつ毎日カリパス測定を実施して、腫瘍サイズが２０ｍｍ×（by）２０ｍｍの領域になるまで続けた。腫瘍体積をこれらの測定値から見積もった（体積＝ｄ３×６）（図２４）。さらに、これらの投与した薬剤の毒性を決定した。これらの実験に基づいて、本発明者らは、ＣＭＶ−ｎｔｒ単独、ＣＢ１９５４単独又はＣＭＶ−ｎｔｒとＣＢ１９５４両方の併用のいずれも、このモデル系において、腫瘍退行により測定した抗腫瘍活性を有しないことを確認した（図２４）。
【０２６７】
スケジュール実験
前の用量反応実験は、１マウス当たり１０８ＰＦＵウイルス未満の用量は動物の健康に有害な影響を及ぼさないと考えられることを示した。
【０２６８】
１マウス当たり１０７ＰＦＵウイルスの用量は、腫瘍増殖の大きい低減をもたらし、実に１００日後にグループのマウス３匹のうちの２匹は観察しうる腫瘍を有しなかった。これは非常に期待できる結果であり、ウイルス単独で増殖を遅延させるか又は腫瘍退行を引き起こすのに十分高い用量である。
【０２６９】
しかし、ウイルスとプロドラッグＣＢ１９５４の併用の効果を調べるために、より低い容量のウイルスを研究した（もしウイルス単独の処置がかかる長期間にわたり増殖遅延をもたらせば、プロドラッグの相加又は相乗効果を確認できないであろう）。
【０２７０】
本発明者らはＣＢ１９５４との併用で２つの用量のウイルスの研究を実施した。選択した用量は１０５ＰＦＵ及び１０６ＰＦＵであった。これら両方の用量は、初期の実験においていくらかの腫瘍増殖遅延を引き起こした。
【０２７１】
プロドラッグは、粉末形態を１０％アセトンに溶解し、ピーナッツオイルを用いて容積を調製した後に、８０ｍｇ／ｋｇを腹膜内注入として投与した。
【０２７２】
薬物が巧く作用しうるか（従ってどれだけの腫瘍増殖遅延又は退行が見られるか）を決定する他の要因は、薬物を実際にいつ投与するかにある。プロドラッグは、ＮＴＲの存在下においてのみ活性基質に変換されうるので、ＮＴＲを含有するウイルスを最初に投与しておく必要があると考えた。また、もしウイルスに複製しかつより多くのＮＴＲを産生する時間が与えられれば、その場合、プロドラッグはより顕著な効果を与えることができることも考えた。
【０２７３】
ウイルスと薬物両方の最適用量及びこれらの処置の最適時間を見出すために、スケジュール実験を実施した。
【０２７４】
腫瘍直径がほぼ５ｍｍ（腫瘍体積０．５〜１．５ｍｍ３）となった時に、マウスをランダムに３匹の動物の処置グループに分けた（表２に示した処置計画）。図２５はそれぞれのグループの開始腫瘍体積を示す。
【表２】
2007511215.tif 000004
【０２７５】
処置グループに、ウイルス及びそのグループに対する所定用量を単一直接腫瘍内注入により投与した。ウイルスはＰＢＳ＋１０％血清で希釈した。「ウイルスなし」対照グループには１００μｌのＰＢＳ＋１０％血清の腫瘍内注入を投与した。この日を実験第１日と定めた。
【０２７６】
腫瘍内注入はマウスに有害な効果を与えるないように見えた。いくつかの腫瘍は注入後に僅かに出血するが大したことはなかった。動物の体重は低下しなかった（図２６）し、動物の挙動に変化は見られなかった。僅かに出血する全腫瘍において、翌日、治癒プロセスが始まり、３〜５日間にいずれの腫瘍にも穿刺傷の証拠はほとんどなかった。
【０２７７】
ＣＢ１９５４の注入を第２日、第１０日及び第１５日に適当なグループに与えた。８０ｍｇ／ｋｇの１用量（１マウス当たりほぼ２ｍｇの等量）を与えた。粉末型のＣＢ１９５４薬剤（Sigma製）をアセトンに溶解して最終容積の１０％とした（１０μｌ／２ｍｇ）。その容積を次いでピーナッツオイルを用いて２ｍｇのＣＢ１９５４を含有する１００μｌに調合した。ピーナッツオイルは粘稠であるので、シリンジを用いて薬剤を混合した。薬剤は毎回新しく調合した。
【０２７８】
適当なグループに次いでこの溶液を腫瘍内注入した。薬剤を投与しなかった対照グループには、１０％アセトンを含有するピーナッツオイルの１００μｌを腹膜内注入した。
【０２７９】
注入時又はその後の時点において、いずれのマウスにも注入部位に腫脹又は刺激は認められなかった。マウスは、注入後に短時間、わずかに嗜眠性が見られたが、体重の低下はなく（図２６）、又は、翌日に嗜眠性の徴候は示さなかった。
【０２８０】
ウイルスなし＋ＣＢ１９５４プロドラッグ
グループ５、６、７、８、１３及び１４は、プロドラッグ単独の腫瘍増殖に対する効果を調べた。図２７は、ＣＢ１９５４を単独で与えると腫瘍増殖に対して僅かしか効果のないことを示す。
【０２８１】
１０５ＰＦＵウイルス＋／−ＣＢ１９５４プロドラッグ
１０５ＰＦＵウイルスを第０日に与え、プロドラッグ又はビヒクルを第２日及び第１０日に与えた。
【０２８２】
図２８のグラフから見られる通り、ウイルス単独、又はウイルス及びプロドラッグを用いて処置した腫瘍は、無処置腫瘍ほど大きく増殖しなかった。ウイルスを用いて処置した腫瘍は無処置対照のほぼ半分のサイズまで増殖した。
【０２８３】
ウイルス及びプロドラッグを用いた処置は、体積でほぼ２〜３ｍｍ３までしか増殖しない腫瘍を生じた。これは、ほぼ２０ｍｍ３のサイズまで増殖する無処置腫瘍より有意に低い。
【０２８４】
１０６ＰＦＵウイルス＋／−ＣＢ１９５４プロドラッグ
図２９は、表２に記載した通り、高用量のウイルス（１注入当たり１０６ ＰＦＵ）とプロドラッグとの併用による処置後の、経時的な腫瘍体積の変化を示す。低用量のウイルスによるのと同じように、ウイルス単独、又はＣＢ１９５４との併用による処置は、無処置対照と比較して有意に小さい腫瘍を生じる。
【０２８５】
ＨＳＶ１７１６ウイルスとＣＢ１９５４プロドラッグの併用
ＣＭＶ−ｎｔｒ ＤＮＡを含有する遺伝子操作を行ってないウイルスの親株を、腫瘍増殖遅延に対する効果について試験した。このウイルスは腫瘍溶解効果を有するが、しかし、不活性なプロドラッグをその活性型代謝産物に変換するのに必要なＮＴＲ遺伝子を含有しない。従って、プロドラッグをウイルスと組み合わせて加えても相加的又は相乗的効果を予想しえない。図３０はこの実験の結果を示す。
【０２８６】
ウイルスとプロドラッグの組み合わせは、無処置対照腫瘍と比較して、腫瘍増殖の若干の低下を生じると思われる。
【０２８７】
これらの結果を得るために用いたグループは、僅かに２〜３匹の動物を含んだ。用いた動物はまた、前の実験に用いた動物より加齢していて、増殖により長い時間を要した。従って、もっと多数のマウスを用いて、より若いマウス又はより速く形成する腫瘍を用いて実験を繰り返すことによって、ＨＳＶ１７１６ウイルスによる処置後にさらに顕著な増殖遅延を得る可能性はある。
【０２８８】
ＣＢ１９５４プロドラッグと併用したＨＳＶ１７９０（１０５及び１０６における）及びＨＳＶ１７１６の比較
図３１は、プロドラッグと併用した２つの用量のＨＳＶ１７９０ウイルス、及びプロドラッグと併用したＨＳＶ１７１６との比較を示す。親ウイルスＨＳＶ１７１６は無処置対照と比較して若干の増殖遅延を示す。この増殖遅延は、不活性なプロドラッグをその活性型に変えるＮＴＲ遺伝子が存在しないので、ウイルスの腫瘍溶解効果に因るものであると考えられる。
【０２８９】
腫瘍をＮＴＲ遺伝子を含有するＨＳＶ１７９０ウイルスを用いて処置すると、腫瘍増殖はさらに低下する。この低下は用量依存性であり、より高用量のウイルスはより低用量のウイルスよりも大きい増殖遅延をもたらすと思われる。
【０２９０】
結論として、これらの結果から、実際にプロドラッグＣＢ１９５４と併用したＨＳＶ１７９０ウイルスは、試験したモデル系において増殖遅延をもたらすと考えられる。ウイルスと薬剤の両方を併用すれば、それぞれ単独で得られるより大きい効果が得られる。
【０２９１】
ウイルス処置後にプロドラッグを与えるタイミングが重要であると思われる。ＣＢ１９５４を、ウイルス注入後まもなく（ウイルス注入後、第２日）与えた時、腫瘍増殖は、該薬剤をさらに後日に（第１０日）与えた時ほど大きい遅延を起こさない。第２日に与えると、薬剤はウイルス増殖及び複製を支持する細胞を死滅させ、ウイルスの腫瘍溶解効果を事実上低減するからであろう。
【０２９２】
第１０日になると、ウイルスが複製されていて腫瘍溶解により可能な限り多数の細胞を死滅させ得る。細胞型及び増殖状態が一様ではないので、腫瘍内の全細胞がウイルスによる溶解に感受性でないと予想される。そこで薬剤が侵入して、ウイルス増殖を支持するが腫瘍溶解に感受性ではない細胞（従ってＮＴＲ遺伝子を含有する）を死滅させることにより「完全に死滅させる（mop up）」。活性薬剤は拡散性かつ膜透過性であるので、バイスタンダー効果（ウイルスに感染した細胞だけでなくその近傍の細胞を死滅させる効果）を有しうる。
【０２９３】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０２９４】
【図１】プラスミドｐＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びＲＬ１.ｄｅｌからのプラスミドＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰの作製を示す。
【図２】ＨｐａＩ消化し、ＣＩＰ処理したＲＬ１.ｄｅｌのアガロースゲル電気泳動を示す。
【図３】ＮｓｉＩ／ＳｓｐＩ消化したｐＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ａ）及び精製／平滑末端ｐＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＰｏｌｙＡ（Ｂ）のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図４】ｐＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＰｏｌｙＡインサートを含有するＲＬ１.ｄｅｌクローンの同定を示す。
【図５】クローン５（ＲＬ１.ｄＣＭＶ−ＮＡＴ−ＧＦＰｂ）中のｐＣＭＶ−ＮＡＴ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＰｏｌｙＡの方向の決定を示す。
【図６】クローン５（Ａ）からのｐＣＭＶ−ＮＡＴの除去とＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｂ）の大規模プラスミド調製を示す。
【図７】目的遺伝子産物を発現するＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶ−１の作製、検出及び精製を示す。
【図８】ｐＰＳ９４９からのｐＣＭＶ−ＮＴＲをＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰ中にクローニングするために用いた手法を示す。
【図９】ＢａｍＨＩ消化したｐＰＳ９４９（Ａ）及び精製したｐＣＭＶ−ＮＴＲ断片（Ｂ）のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図１０】ＢｇｌＩＩで消化し、ＣＩＰで処理したＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰのアガロースゲル電気泳動を示す。
【図１１】クローン４中のｐＣＭＶ−ＮＴＲの方向の決定を示す。
【図１２】ＳｃａＩで消化したクローン４（Ａ）のアガロースゲル電気泳動及びＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰウイルスの力価（Ｂ）を示す。
【図１３】コンフルエントＢＨＫ及び３Ｔ６細胞中のＨＳＶ１７＋、ＨＳＶ１７１６及びＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰの増殖動力学を示す。
【図１４】ＨＳＶ１７＋及びＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰに感染したＢＨＫ細胞内のＩＣＰ３４．５発現についてのウェスタンブロット分析を示す。
【図１５】ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ感染細胞株におけるＮＴＲ発現についてのウェスタンブロット分析を示す。
【図１６】ＣＢ１９５４（５０μＭ）の存在下又は不在下における、ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ及びＨＳＶ１７１６−ＧＦＰのコンフルエント３Ｔ６細胞に対する影響を示す。
【図１７】ＣＢ１９５４（５０μＭ）の存在下又は不在下における、ＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ及びＨＳＶ１７１６−ＧＦＰのコンフルエントＣ８１６１細胞に対する影響を示す。
【図１８】１０ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰを用いて（Ａ）又は５０μＭ ＣＢ１９５４の存在下の１０ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰを用いて（Ｂ）処置し、７２時間後のコンフルエント３Ｔ６細胞を示す。
【図１９】１０ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ（Ａ）、又は５０μＭ ＣＢ１９５４と共に１０ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６／ＣＭＶ−ＮＴＲ／ＧＦＰ（Ｂ）を用いて処置した後、７２時間のコンフルエントＣ８１６１細胞を示す。
【図２０】腫瘍内にＨＳＶ１７９０を注入した皮下Ａ２７８０（異種移植片）腫瘍をもつ胸腺欠損ヌードマウスの体重変化（健康の目安として）を示す。
【図２１】Ａ２７８０異種移植片をもつ胸腺欠損ヌードマウスにおける、ＨＳＶ１７９０の腫瘍内注入後の腫瘍体積の経時変化を示す。
【図２２】マウスの開始腫瘍サイズを示す。
【図２３】ＣＭＶ−ｎｔｒ、ＣＢ１９５４又は両方の併用による処置後の体重の変化を示す。
【図２４】ＣＭＶ−ｎｔｒ、ＣＢ１９５４又は両方の併用による処置後の腫瘍体積の変化を示す。
【図２５】それぞれの処置グループの開始腫瘍体積を示す（表２を参照）。
【図２６】ＨＳＶ１７９０、ＨＳＶ１７１６、ＣＢ１９５４又はそれらの併用により処置したＡ２７８０異種移植片をもつ胸腺欠損ヌードマウスの体重（健康の目安として）を示す。
【図２７】プロドラッグＣＢ１９５４を用いて処置した異種移植片の腫瘍体積の変化を示す。
【図２８】１０５ＰＦＵ ＨＳＶ１７９０及びＣＢ１９５４を用いて処置した異種移植片の腫瘍体積の変化を示す。
【図２９】１０６ＰＦＵ ＨＳＶ１７９０及びＣＢ１９５４を用いて処置した異種移植片の腫瘍体積の変化を示す。
【図３０】１０５ＰＦＵ ＨＳＶ１７１６及びＣＢ１９５４を用いて処置した異種移植片の腫瘍体積の変化を示す。
【図３１】１０５ＰＦＵ、１０６ＰＦＵ ＨＳＶ１７９０及び１０５ＰＦＵ ＨＳＶ１７１６の比較を示す。
【図３２】大腸菌ＮＴＲの配列情報、（Ａ）ＮＴＲポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）;（Ｂ）ＮＴＲ遺伝子のポリヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図３３】２つのＮＴＲプロドラッグ、（Ａ）ＣＢ１９５４；（Ｂ）ＳＮ２３８６２の構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
2007511215.tif 000036
【図３３】
2007511215.tif 000037
【国際調査報告】
2007511215.tif 000038
2007511215.tif 000039
2007511215.tif 000040
2007511215.tif 000041
2007511215.tif 000042