(57)【要約】発現カセットは、Cre融合遺伝子に隣接するターゲティング部位およびイントロンにより分断されたCreコード配列を含む。このカセットは、Cre/loxP コンストラクトの作成および標的細胞におけるCreの過剰発現によってもたらされる毒性の低減に用いることが出来る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Cre 融合遺伝子を挟むターゲティング部位およびイントロンにより分断されたCreコード配列を含む発現カセット。 
【請求項２】
さらにレポーター遺伝子を含み、それによって例えば蛍光顕微鏡によりCre 活性が可視化できる、請求項 1のカセット。
【請求項３】
ターゲティング部位がloxPを含む、請求項 1または請求項 2のカセット。
【請求項４】
大腸菌において翻訳開始をもたらす部分が不活性化されている請求項1〜3のいずれかのカセット。
【請求項５】
シャインダルガノ配列に対して機能的および/または構造的相同性を有する部分が不活性化されている請求項1〜4のいずれかのカセット。
【請求項６】
哺乳類プロモーターを含む、請求項1〜5のいずれかのカセット。
【請求項７】
Cre/loxP コンストラクトの作成および、標的細胞におけるCreの過剰発現に起因する毒性の低減のための請求項1〜6のいずれかのカセットの使用。
【請求項８】
請求項1〜6のいずれかのカセットにより形質転換された宿主。
【請求項９】
大腸菌である請求項 8の宿主。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は発現カセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Creおよびλ-インテグラーゼファミリーのその他のリコンビナーゼは、植物および脊椎動物ゲノムの操作のための強力なツールであることが判明している。各酵素は特定の標的配列にてDNAを切断し、新たに生じた末端を第二の標的配列にて切断されたDNAと連結させることが出来る。Creに基づく組換えには２つの成分が必要である: 1) loxP、34 bp コンセンサス配列、および2) Cre リコンビナーゼ、バクテリオファージ P1 Cre 遺伝子の38 kDa 産物。Creにより起こる組換え事象の性質は、２つのLoxP部位の相対的配向に依存する。同じ配向であるloxP部位に挟まれているDNAは組換えの際に環状化するが(circulated)、逆方向に配向しているloxP部位に挟まれているDNAは反転する(inverted)。Cre-lox システムは、US4959317に記載されている。
【０００３】
Cre リコンビナーゼの過剰発現は哺乳類細胞に対して毒性であることが判明している。Creは少なくともいくつかのヒト細胞株(腎臓細胞株 293および骨肉腫細胞株 U2OS)に対して、そしてショウジョウバエ細胞に対して毒性であり、植物においては表現型異常を引き起こすことが報告されている。これらの観察のすべてに対する合理的な説明は、少なくともヒト、マウス、酵母および大腸菌ゲノムが、Creの標的であり得る多数の内因性配列を含むということである。
【０００４】
Creの毒性はその鎖切断活性に依存する。これはSilver et al、Mol. Cell 8、233-243 (2001)によって証明されており、その文献において、DNA-切断活性を欠損しているCre 突然変異体は、野生型 Creと比較して毒性が低かったこと; Creがそれ自身の合成を導く遺伝子を切り出す方法では、切り出しに必要な発現の臨界レベルに達成すると、毒性の回避において有効であったことが報告されている。より具体的には、Silver et alによって、293xLac 細胞(ヒト胚性腎臓細胞株 293の誘導体)を、Cre リコンビナーゼ-GFP 融合タンパク質をコードするレトロウイルスにより感染すると、ウイルスは細胞毒性をもたらすが、GFPのみを発現するウイルスではかかる変化が起こらなかったことが観察された。Silver et alは、レトロウイルスベクターにおいてのみ機能的な自己切り出しシステムを作った。このシステムはウイルスゲノムの3' LTR U3 領域に１つのlox 511部位を含む。このloxP部位はウイルス産生の際に複製され、Cre/GFP 融合遺伝子を挟むことにより、Cre 発現の負のフィードバックの発生を可能とする。
【０００５】
真核細胞においてのみ活性であると考えられているプロモーターの下にある遺伝子は大腸菌における遺伝子発現も引き起こしうる。ヒトサイトメガロウイルス即時(immediately)-初期遺伝子領域1 プロモーター-エンハンサー (HCMV-IE)とともにあるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ (CAT)はHB101 大腸菌株において発現することが示され、トリ腫瘍ウイルスプロモーターの下にある遺伝子は細菌において発現することが示された; Sauer、Nucleic Acids Res 24、4608-4613 (1996)、and Mitsialis et al、Gene 16、217-225 (1981)参照。
【０００６】
細菌において用いられた場合、漏出性の発現が、毒性産物の問題だけでなく、Cre/loxPコンストラクトのクローニングについての重大な問題をもたらしうる。細菌はイントロンを切り出すことが出来ないので、大腸菌における漏出性の発現を止める一つの戦略は、 Cre 遺伝子のコード領域にイントロンを挿入することである; Zuo et al、Nat. Biotechnol. 19、157-161 (2001)、Kaczmarczyk & Green、Nucleic Acids Res 29、E56 (2001)、および Bunting et al、Genes Dev. 13、1524-1528 (1999)参照。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本発明は、ニワトリβ-アクチンプロモーター (CAG)の下にあるCreが大腸菌にて発現した場合、Cre/loxP コンストラクトのクローニングに重大な問題があったという観察に部分的には基づく。これら問題を回避するため、本発明は、サイレント自己不活性化Cre (SSi-Cre)と本明細書において称する一体型の Cre 発現システムを提供する。これはまた、ターゲティング部位に挟まれたλ-インテグラーゼファミリーのその他のリコンビナーゼにも適用できる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書に記載し、本発明を説明する特定のシステムにおいて、非毒性 Cre 発現は真核細胞に限定される。突然変異 loxP 配列の使用により、SSi-Cre システムは二重 loxP ターゲティング戦略に完全に適応可能である。このシステムは、蛍光顕微鏡により哺乳類細胞においてCre 活性を可視化するためのレポーターシステムを含んでいてもよい。SSi-Cre システムはしたがって、Cre/loxP システムの使用に伴う重大な技術的問題の有用な解決手段を提供する。
【０００９】
図面の簡単な説明
図 1はpSSi-Cre 発現カセットの構築を示す。Cre-コード配列はイントロンにより分断した。cre/int 融合遺伝子をpDsRed2-N1にサブクローニングし、pCreIntを形成した。cre/int/DsRed 融合遺伝子を２つの突然変異体loxP部位の間にクローニングし、pSSi-Creを形成した。
【００１０】
図 2は、Cre 遺伝子の上流のシャインダルガノ-様配列によって大腸菌において漏出性のCre 発現が可能であることを示す。
A)漏出性のCre 産生のレベルはアガロースゲル図において、2,300 bpバンドの存在により示される。
B) pCre配列と大腸菌のシャインダルガノ配列の比較。リボゾームは開始コドン (ATG)の前のpCreのシャインダルガノ様配列を認識できる。
C) pCreにおけるXho I 部位の欠失により、漏出性の転写が減少した。
【００１１】
図 3は、pSSi-Cre 戦略によりトランスフェクション細胞における非毒性 Cre-発現が可能となることを示す。トランスフェクトされた 293 T 細胞の蛍光顕微鏡分析。
A-B; 赤色蛍光タンパク質発現は毒性が無いことを示す。
C-D; Cre/Dsred 融合タンパク質の過剰発現は細胞に対して毒性である。
E-G; 制御された(Controlled)発現は、Cre/DsRedの過剰発現に伴う毒性の問題を解決する。
H-J; 赤色蛍光は、Cre/Dsredの自己不活性化により時間と共に消失する。
K-M; 偽トランスフェクション細胞。元の拡大率はx 200であった。
【００１２】
図 4は、pSSi-CreがCHO 細胞における遺伝子発現を活性化することを示す。
A)サイレンシングされた VEGF 発現はSTOP カセットのCre-媒介切除により活性化される。
B)発現したVEGFをヒト VEGF ELISA アッセイによって検出した。
【００１３】
好適な態様の説明
以下により詳細に示すように、実験により示されるように、持続的な高レベルのCre-発現により293T 細胞において引き起こされる細胞毒性は、Cre リコンビナーゼ 発現の持続時間と強度の制御により排除することが出来た。哺乳類 CAG プロモーター下の大腸菌におけるCre 遺伝子の発現は、Cre/loxP コンストラクトのクローニングについての重要な問題を引き起こしたことも注目された。かかる問題は一般的に Cre/loxP-実験に適合できるSSi-Cre カセットの構築によって解決された。 
【００１４】
クローニング手順の際、哺乳類プロモーター下にCre リコンビナーゼを含み、そのDNA領域が loxP 組換え部位に挟まれているプラスミドの構築は不可能であった。アガロースゲル電気泳動において、強い2,300 bpバンドが常に検出され、これはコンストラクトの分解を示す(図2a)。いかなる理論にも拘束される意図はないが、これはおそらく大腸菌におけるCre リコンビナーゼのバックグラウンド発現に起因しうる。ニワトリ CAGなどのプロモーターが大腸菌において遺伝子発現を駆動したことは驚くべきである。原核および真核細胞の間では翻訳開始において根本的な相違があるため、Cre 翻訳が起こって、タンパク質合成を促進することはないはずである。pCreの配列とシャインダルガノ配列とをより厳密に比較すると (Kozak、Gene 234、187-208 (1999)参照)、シャインダルガノ配列は大腸菌における翻訳開始を駆動するが、pCreはCre リコンビナーゼの開始コドンの直前にシャインダルガノ様領域を含んでいることが示され、これによって、Cre リコンビナーゼの漏出性の発現が説明され得る(図2b)。この仮説を試験するために、XhoI 制限部位をpCreから欠失させた(図2c)。この欠失により、Cre 翻訳は大幅に低下した (図2c)。漏出性発現のレベルは大幅に低下したが、プラスミドの一部は破壊され、中間コンストラクトの混合集団が生じた。この問題を解決するために、Cre コード配列を短いマウスのプロタミンイントロンにより分断し、Creの細菌による発現を阻害した (図1)。この改変により図2aに示すように大腸菌におけるCreの漏出性の発現は消失した。これらの知見は明らかにあまりよく認識されていなかった、一般的な哺乳類プロモーターが細菌において遺伝子発現を駆動することができる能力を支持する。
【００１５】
Cre リコンビナーゼの発現により細胞毒性が生じた。Cre-DsRed 融合タンパク質を発現する293T 細胞は丸くなり、異常な外見であり、トランスフェクションの48時間後にはウェルのそこから剥離し始めた (図3)。かかる変化は赤色蛍光タンパク質をコードするプラスミド(pDsRed2-N1)によりトランスフェクションされた細胞または偽処理細胞においては観察されなかった。したがって、細胞においてみられる毒性作用はCre-依存的であったようである。SSi-Cre システムはCre 産生の後、できるだけ速くCre 発現を自己不活性化し、Cre 発現の強度と持続時間を最小にする。Cre リコンビナーゼは、切除に必要な臨界レベルの発現に達したら、融合遺伝子を切除する。Silver et alにより記載されたCre 発現の自己不活性化の考えとは異なり、SSi-Creは本質的に両方のloxP部位を含み、それゆえあらゆるベクターと適合性である。
【００１６】
SSi-Cre システムの毒性を試験するために、293T 細胞をpSSi-Creでトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、cre/int/DsRed 融合遺伝子の発現がトランスフェクション細胞におけるかすかな赤色として観察された(図3F)。しかしながら、自己不活性化の結果、発現は培養中に徐々に消失した。トランスフェクションの5日後、赤色はほとんど検出できず(図3I)、これは、cre/int/Dsred 融合遺伝子が切除されたことを示す。トランスフェクション細胞を検出するために、pSSi-Cre コンストラクトには切除不可能なEGFP 発現ユニットをSSi-Cre カセットに加えて含めた(図1)。pSSi-Creにてトランスフェクトされた細胞は緑色を発現し、毒性の徴候はなく、正常に見えた(図3Gおよび3J)。これは、 SSi-Cre カセットからのCre 発現のための戦略が実行可能であって非毒性であることを示した。
【００１７】
二重-loxP 実験とのpSSi-Creの機能性および適合性を調べるために、pSSi-Creを、野生型 loxP-切除可能 STOP カセットを含むpFlox プラスミドとともにCHO 細胞に共トランスフェクトした。STOP カセットの切除はVEGF 発現を活性化し、それは ELISA アッセイによって検出できた(図4a)。Cre 発現のレベルはDNAの組換えを効率的に触媒するのに十分であった(図4b)。このSSi-Cre カセットはいかなる干渉もなく、野生型 loxP部位とともに同じプラスミドにおいて用いることが出来た。これらの結果により、イントロン-含有Cre/DsRed リコンビナーゼは二重-lox アプローチにおいて機能性であり、適合性であることが判明した。 
【００１８】
新規発現カセットはしたがって、標的細胞におけるCreの非毒性発現を可能にする。 SSi-Cre カセットはCre 発現を真核細胞にのみ制限し、大腸菌における単一のベクターにCre リコンビナーゼ 遺伝子とloxP 組換え部位との両方がクローニングされる戦略を可能とする。自己不活性化が改変loxP部位により媒介されているため、多重lox標的化実験を行うことが出来る。SSi-Creはしたがって、はじめて、Cre/loxP システムにともなう主な実践上の問題に解決を与えるものであり、システムのあらゆる望ましい目的に、便利で、単一の発現カセットとして利用することが出来る。
【００１９】
以下の実施例により本発明を説明する。 
発現カセットのクローニング
Cre コード配列をマウスプロタミンイントロンにより分断した。この cre/int 融合遺伝子は一連のPCRによって作成した(図1)。pBS185 プラスミド (Life Technologies) からの5’部分 (ヌクレオチド1-432)を以下を用いて増幅した： オリゴP1 (5'-GTTACGAATTCGCCACCATGTCCAATTTACT GACCGT-3')およびオリゴ P2 (5'-CAGCCCTCTACTTACCTGGTCGAAATCAGTGCGTT-3')。Cre の3’部分 (ヌクレオチド 4331029)を以下を用いて増幅した：オリゴP3 (5'-TTCTTACCTTTCTAGGTTCGTTCACTCATGGAAAA-3')およびオリゴ P4  (5'-TAAGCAGATCTCCATCGCCATCTTCCAGCAGGC-3')。マウスプロタミンイントロン (テンプレートとしてのpAIV-11)を以下を用いて増幅した：オリゴP5 (5'-AC TGATTTCGACCAGGTAAGTAGAGGGCTGGGCTG-3')およびオリゴ P6 (5'-CATG AGTGAACGAACCTAGAAAGGTAAGAAAAGTG-3')。cre/int 融合遺伝子を３つの増幅されたPCR 断片をPCRのためのテンプレートとして用い、オリゴ P1およびオリゴ P4を使用して作成した。このcre/int 融合遺伝子をpDsRed2-N1 (BD Biosciences Clontech)のEcoRI/ BamHI 部位にサブクローニングし、pCreIntを形成した。pCre プラスミドにおいて、イントロンは除いた(図1)。 
【００２０】
改変した２つのLoxP部位(Siegel et al、FEBSD Lett. 505、467-473 (2001)参照)をpCAGGSのEcoRI 部位にクローニングし、これら部位の間に、cre/int/DsRed 融合遺伝子をクローニングした。このSSi-Cre カセット (図1)とEGFP 発現ユニットとをともにpEvoのAvrII 部位にクローニングし、pSSi-Creを形成した。結果として得られたプラスミドをDNA配列決定により確認した。
【００２１】
Xho I 部位の欠失
pSSi-CreをXhoIにより消化し、一本鎖の伸長部を製造業者の指示に従って、リョクトウ(Mung Bean)ヌクレアーゼ (New England BioLabs、Inc.、USA)を用いて除いた。得られた平滑末端を T4 DNA リガーゼ (New England BioLabs、Inc.、USA)を用いて標準的プロトコールによりライゲーションした。
【００２２】
細胞培養およびDNA トランスフェクション
pSSi-Cre プラスミドは細胞培養において特徴づけた。接着性 293 T 細胞をウェル当たり200,000 細胞の密度で播種した。プラスミド/リポソームトランスフェクションを製造業者の指示に従って行った(Fugene（商標）、Roche、Basel、Switzerland)。トランスフェクション細胞は蛍光顕微鏡により調べた。
【００２３】
ELISA 分析
Cre リコンビナーゼの機能性を、pSSi-Cre プラスミドとVEGFのためのloxP-不活性化発現カセットを含むpFloxとの共トランスフェクションによりCHO 細胞において試験した。CMV プロモーター下にサイレンシングされていない VEGF 遺伝子を含むプラスミドを陽性対照として用いた。 CHO 細胞をウェル当たり200,000 細胞にて播種し、Fugene 6プラスミド/リポソームトランスフェクションを製造業者の指示に従って行った(Fugene(商標)、Roche、Basel、Switzerland)。ヒト VEGF ELISA 分析 (R&D Systems、Minneapolis、USA)のためのサンプルを培養の48時間後に回収した。
【００２４】
結果は、図面に示し、上記の報告の通りである。 
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図 1はpSSi-Cre 発現カセットの構築を示す。
【図２】図 2は、Cre 遺伝子の上流のシャインダルガノ-様配列によって大腸菌において漏出性のCre 発現が可能であることを示す。
【図３】図 3は、pSSi-Cre 戦略によりトランスフェクション細胞における非毒性 Cre-発現が可能となることを示す。
【図４】図 4は、pSSi-CreがCHO 細胞における遺伝子発現を活性化することを示す。
【図１】
2007537747.tif 000002
【図２】
2007537747.tif 000003
【図３】
2007537747.tif 000004
【図４】
2007537747.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月16日(2007.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Cre 融合遺伝子を挟むターゲティング部位およびイントロンにより分断されたCreコード配列を含む発現カセット。 
【請求項２】
さらにレポーター遺伝子を含み、それによってCre 活性が可視化できる、請求項 1のカセット。
【請求項３】
蛍光顕微鏡によりCre 活性が可視化できる、請求項2のカセット。
【請求項４】
ターゲティング部位がloxPを含む、請求項 1〜3のいずれかのカセット。
【請求項５】
大腸菌において翻訳開始をもたらす部分が不活性化されている請求項1〜4のいずれかのカセット。
【請求項６】
シャインダルガノ配列に対して機能的および/または構造的相同性を有する部分が不活性化されている請求項1〜5のいずれかのカセット。
【請求項７】
哺乳類プロモーターを含む、請求項1〜6のいずれかのカセット。
【請求項８】
Cre/loxP コンストラクトの作成および、標的細胞におけるCreの過剰発現に起因する毒性の低減のための請求項1〜7のいずれかのカセットの使用。
【請求項９】
請求項1〜7のいずれかのカセットにより形質転換された宿主。
【請求項１０】
大腸菌である請求項 9の宿主。 
【国際調査報告】
2007537747.tif 000006
2007537747.tif 000007