(57)【要約】  本発明は飲料中に生成する濁りの抑制または減少方法を提供する。シラン処理シリカフィルター媒体を合成した。飲料をこのシラン処理シリカフィルターと接触することによって、１以上の濁り生成性がシラン処理シリカフィルター媒体へ結合し、濾過によって除去される。さらに、飲料中の微粒子成分もまた濾過によって除去される。保存中および／または冷蔵下において濁りを生成する飲料として例えば、アルコール、果実および野菜飲料が本発明で好適に処理される。この飲料中の濁りは主にポリフェノールおよびタンパク質に起因する。本発明はポリフェノールおよびタンパク質両方のレベルを減少させることのできる方法を提供する。本発明の方法に有用なシリカフィルター媒体としてはもみ殻灰、カラスムギ殻灰、および珪藻土が含まれる。
2007533325.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
濁りの生成を防止するための方法および／または飲料中の濁りを減らす方法であって：
ａ  飲料サンプルを表面の活性基が１以上のシランと反応されているシリカフィルター媒体で濾過する、
ｂ  １以上の濁り生成性物質をシリカフィルター媒体へ結合させる、および
ｃ  濾過された飲料サンプルを回収する
工程を含む方法。
【請求項２】
濁り生成性物質がポリフェノールおよび濁り生成性タンパク質からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記飲料サンプルが濾過工程に先だって前記シリカフィルター媒体と混合される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記飲料サンプルがアルコール、果物または野菜飲料である、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記アルコール飲料がビールである請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記１以上の濁り生成性物質がシリカフィルター媒体上へ、静電、疎水性、または親水性相互作用により結合される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
粒子成分が物理的取り込みおよび／または結合によってシリカフィルター媒体へ捕捉され、濾過工程により飲料サンプルから除去される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記粒子成分が微生物、沈殿物、封入体または結晶である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記シリカフィルター媒体がもみ殻灰、カラスムギ殻灰、または珪藻土である、請求項１〜８いずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記シランがアルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、アリールオキシ、アミノ、アミド、メタクリレート、メルカプト、カルボニル、ウレタン、ピロール、カルボキシ、シアノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルキルエステル、アリールエステルからなる群から選択され、シリカフィルター媒体の活性基と反応する加水分解性部分を有する、請求項１〜９いずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記加水分解性部分がアルコキシ基である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記シランがモノ−、ジ−、またはトリアルコキシシランである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記シランがｎ−オクタデシルトリエトキシシラン、フェニルトリエトキシシランまたはｎ−オクチルトリエトキシシランである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記シランがさらに、４級アンモニウム、アリール、エポキシ、アミノ、尿素、メタクリレート、イミダゾール、カルボニル、イソチオリウム、スルホネート、ホスホネート、ウレタン、ウレイド、イソシアノ、スルフヒドリル、カルボキシレート、カルボニル、アミド、カルボニル、ウレタン、ピロール、およびイオン性部分からなる群から選択される部分を有している、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記４級アンモニウム部分を有するシランが３−(トリメトキシシリル)プロピルオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド、Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、または３−(Ｎ−スチリルメチル−２−アミノエチルアミノ)−プロピルトリメトキシシランハイドロクロライドである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記アリール部分を有するシランが、３−(トリメトキシシリル)−２−(ｐ，ｍ−クロロメチル)−フェニルエタン、２−ヒドロキシ−４−(３−トリエトキシシリルプロポキシ)−ジフェニルケトン、((クロロメチル)フェニルエチル)トリメトキシシランまたはフェニルジメチルエトキシシランである、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記エポキシ部分を有するシランが３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランまたは２−(３，４−エポキシシクロヘキシル)エチルトリメトキシシランである、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記アミノ部分を有するシランが、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−(２−アミノエチル)−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、トリメトキシシリルプロピルジエチレントリアミン、２−(トリメトキシシリルエチル)ピリジン、Ｎ−(３−トリメトキシシリルプロピル)ピロール、トリメトキシシリルプロピルポリエチレンイミン、ビス−(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシランまたはビス(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシランである、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
前記尿素部分を有するシランがＮ−(トリエトキシシリルプロピル)尿素またはＮ−１−フェニルエチル−Ｎ’−トリエトキシシリルプロピルウレアである、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
前記メタクリレート部分を有するシランが３−(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレートである、請求項１４記載の方法。
【請求項２１】
前記イミダゾール部分を有するシランがＮ−［３−(トリエトキシシリル)プロピル］イミダゾールまたはＮ−(３−トリエトキシシリルプロピル)−４，５−ジヒドロイミダゾールである、請求項１４記載の方法。
【請求項２２】
前記イソシアノ部分を有するシランがトリス−(３−トリメトキシシリルプロピル)イソシアヌレートまたは３−イソシアナトプロピルトリエトキシシランである、請求項１４記載の方法。
【請求項２３】
前記スルフヒドリル部分を有するシランが３−メルカプトプロピルトリエトキシシランである、請求項１４記載の方法。
【請求項２４】
前記エーテル部分を有するシランがビス［(３−メチルジメトキシシリル)プロピル］−ポリプロピレンオキシドおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタンである、請求項１４記載の方法。
【請求項２５】
前記カルボニル部分を有するシランが３−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物である、請求項１４記載の方法。
【請求項２６】
前記スルホネート部分を有するシランが２−(４−クロロスルホニルフェニル)−エチルトリクロロシランである、請求項１４記載の方法。
【請求項２７】
前記イソチオウリウム(ｉｓｏｔｈｉｏｕｒｉｕｍ)部分を有するシランがトリメトキシシリルプロピルイソチオウロニウムクロライドである、請求項１４記載の方法。
【請求項２８】
前記アミド部分を有するシランがトリエトキシシリルプロピルエチル−カルバメート、Ｎ−(３−トリエトキシシリルプロピル)−グルコンアミドまたはＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−４−ヒドロキシブチルアミドである、請求項１４記載の方法。
【請求項２９】
前記ウレタン部分を有するシランがＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタンまたはＯ−(プロパルギルオキシ)−Ｎ−(トリエトキシシリルプロピル)ウレタンである、請求項１４記載の方法。
【請求項３０】
前記イオン性部分を有するシランが３−(トリメトキシシリル)プロピル−エチレンジアミントリ酢酸トリナトリウム塩；または３−(トリヒドロキシシリル)プロピルメチルリン酸ナトリウム塩である、請求項１４記載の方法。
【請求項３１】
前記１以上のシランがＮ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドおよびビス(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシランである、請求項１〜９いずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記１以上のシランが３−アミノプロピルトリメトキシシランおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；３−トリヒドロシリルプロピルメチルリン酸ナトリウム塩およびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−Ｃｌ、トリメチルアンモニウムクロリドおよび(３−グリシドキシプロピル)トリメトキシシラン；３−トリヒドロシリルプロピルメチルリン酸ナトリウム塩およびビス−(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシラン；３−(Ｎ−スチリルメチル−２−アミノエチルアミノ)−プロピルトリメトキシシランハイドロクロライドおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；２−(トリメトキシシリルエチル)ピリジンおよびＮ−(３−トリエトキシシリルプロピル)−グルコンアミド；Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−Ｃｌ、トリメチルアンモニウムクロリドおよびＮ−(３−トリエトキシシリルプロピル)−グルコンアミド；Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−Ｃｌ、トリメチルアンモニウムクロリドおよび２−ヒドロキシ−４−(３−トリエトキシシリルプロポキシ)−ジフェニルケトン；３−メルカプトプロピルトリエトキシシランおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；３−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物およびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；トリメトキシシリルプロピル−エチレンジアミン、トリ酢酸トリナトリウム塩およびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；２−(４−クロロスルホニルフェニル)−エチルトリクロロシランおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；および２−(４−クロロスルホニルフェニル)−エチルトリクロロシランおよびビス−(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシランからなる群から選択される、請求項１〜９いずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記シラン反応シリカフィルター媒体が下記一般式：
【化１】
2007533325.tif 000035
［式中、Ｒ１はアルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、アリールオキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、アミノアシル、またはアシルアミノ、アルキルエステル、もしくはアリールエステル；
Ｒ２およびＲ８は独立して置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、またはアリールアルカリル；
Ｒ３は水素、アルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、アリールａｋアリール、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルエステル、アリールエステル、カルボキシ、スルホネート、シアノ、アミノアシル、アシルアミノ、エポキシ、ホスホネート、イソチオウロニウム、チオウロニウム、アルキルアミノ、４級アンモニウム、トリアルキルアンノミウム、アルキルエポキシ、アルキル尿素、アルキルイミダゾール、またはアルキルイソチオウロニウム；ここで前記アルキル、アルケニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、および複素環上の水素は任意にハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、またはシアノで置換されていてもよい；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８は独立して水素、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、エーテル、エステルまたはアリールアルカリル；
Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９は置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、またはアリールアルカリル基であって、二つの共有結合を形成可能な基である］
からなる群から選択される、請求項１〜９いずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアルコール、果実、野菜飲料中に生じる濁りを抑制又は減少させる方法に関する。より詳細には、本発明はもみ殻灰などのシラン処理シリカフィルター媒体を、ビールなどの飲料由来の１又は複数の濁り成分の除去へ使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコールおよびフルーツ飲料における濁りは古くから問題とされていた。飲料中の濁りは製品の美しさや目への訴えの点からも好ましくない。さらに濁りの生成は製品の色や味が落ちる結果を招く。この問題の解決のため、種々のアプローチからの試みが行われてきた。よく採用される方法のひとつは、飲料製品の温度を２０-３０°Ｆへと下げ、濁りを生成させることである。この冷却操作の間、濁りの前駆体が「ヘイズ」として分離され、公知の方法、たとえばろ過によって分離される。多くの場合、このような冷却処理は完全に有効というわけではなく、繰り返しの冷却、沈殿化処理が必要となる。冷却処理の代替処理としては、特定の飲料の製造に用いられる穀物に含まれる濁りの前駆体の量を測定する試み、たとえばビールの製造に用いられる麦芽を抽出すること、がなされている。かかる測定の結果、濁り原因物質含量の少ない穀物を原料に用いることにより、飲料がにごる可能性を減じることが可能となる。かかる方法はコストおよび時間がかかる。このアプローチは濁り問題の改善につながりはするが、濁り問題を解決することはほとんどなかった。
古くから、パックされたビールの濁りの原因の最も頻度の高いものがタンパク質-ポリフェノール相互作用によるものであることは知られていた(Compton,J.beer Quality and taste methodology.In the Practical Brewer、２nd Ed.H.M.Broderick、Ed.Master Brewers Assoc.Am.Madison、WI、pp.２８８-３０８、１９７７)。ビールの安定化、又は少なくとも濁りの生成を遅らせる２つの方法が開発されている：(a)濁り-生成タンパク質の濃度を減らす,または(b)濁り生成性ポリフェノールの濃度を減らす。濁り生成性ポリフェノールはポリアミドまたはポリビニルポリピロリドン(PVPP)への吸着,または清澄化によって除去することができる。濁り生成性タンパク質,であって飲料中に泡を生成する泡生成性タンパク質でないものはシリカゲルへ吸着して除去することができる。グラスについだビールやその他の飲料中に泡ができることが、望ましいビールのような飲料の品質であるとかんがえられている。シリカゲルの濁り生成性タンパク質ｓに対する特異性は、シリカゲルがタンパク質のプロリン残基、ポリフェノールｓが結合して濁りを生じる部位である、に結合することに起因する。(Siebert,et al.,J.Am.Soc.Brew.Chem.５５：７３-３８(１９９７)).
【０００３】
果実飲料において、濁り問題は、酵素の使用によって果実製品のフェノール成分と共に濁りを生じるタンパク質を加水分解することによって処理されてきた。
【０００４】
米国特許第３,９５８,０２３は１以上の野菜または果物から誘導された液体を処理し、該液体中の冷蔵濁りの生成傾向を減少させる方法を開示する。前記方法には濾過工程および１以上の冷蔵濁り制御成分の添加工程を含み、改善点は濾過工程に用いられるフィルター媒体のプレコート層内またはプレコート層下に少なくとも１の冷蔵濁り制御剤を福間サルこと、および少なくとも１の冷蔵濁り制御剤を添加剤として濾過工程前に液体へ添加することを含む。前記冷蔵濁り制御剤はヘクトライト、酸活性化ベントナイト、酸処理酸活性化ベントナイト、ポリビニルピロリドン、ポリビニルポリピロリドン、天然マグネシウムシリケート、合成金属シリケート、および１４重量％以下のMgOを含有する酸処理合成マグネシウムシリケートからなる群から選択される。
【０００５】
米国特許第４,２８２,２６１は不安定な飲料から濁り前駆体を取り除く工程を開示する。該工程は前記飲料を濁りの無い条件で室温にて微粒子の正荷電修飾多孔性媒体と接触させる方法である。電荷はポリアミノ-ポリアミンエピクロロヒドリンカチオン性樹脂で修飾されており、沈殿を生成させ、室温にてこの沈殿を前記飲料から除く。
【０００６】
米国特許第６,０１１,４０６は濁り生成性成分を含む飲料を安定化させる方法を開示する。この方法は：(a)清澄化した飲料を、濁り生成性タンパク質およびフェノール性化合物の両方を吸着可能な交換性基が共有結合されている水不溶性多孔性親水性親水性マトリックスと接触させ、全部ではないが一部の濁り生成性タンパク質および／またはフェノール性化合物を除去する；および(b)マトリックスより飲料を回収する工程を含む方法である。
【０００７】
飲料中の濁りの抑制または減少に適切な改善された抵コストの工程が望まれている。望まれているのは、低コストの原材料が用いられ、大規模製造に適切に用いられ、サンプルの前処理が不要な方法である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は濁りの生成を防止するための方法および／または飲料中の濁りを減らす方法に関する。放置および／または冷却すると濁りを生ずる飲料が本発明によって好適に扱われる。かかる飲料にはアルコール、果実および野菜飲料が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の方法は(a)飲料サンプルを表面活性基を１以上の以上のシランと反応させたシリカフィルター媒体で濾過する；(b)１以上の濁り生成性物質をシリカフィルター媒体へ結合させる、および(c)濾過された飲料サンプルを回収する工程を有する。本発明の方法に有用なシリカフィルター媒体にはもみ殻灰、オート麦殻灰または珪藻土が挙げられる。シリカフィルター媒体を処理するのに有用なシラン類としては、一般に例えば、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、アリールオキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルキルエステル、アリールエステルなどの加水分解可能でシリカフィルター媒体上の活性基と反応する部分を有するものが含まれる。
【００１０】
ポリフェノール類のような濁り生成性物質および濁り生成性タンパク質類はシラン処理された媒体へ結合し、飲料より１段階の濾過作業にて除去される。さらに、微生物、酵母およびその他の残骸の粒子も該方法にて飲料より除去される。
【００１１】
本発明は飲料中の濁りの生成を抑制または減少する方法を提供する。シラン処理シリカフィルター媒体を調製する。飲料をシラン処理シリカフィルターへ接触させることによって、１以上の濁り生成性成分がシラン処理シリカフィルター媒体へ結合し、濾過によって除去される。さらに、飲料飲料中の粒子もまた濾過によって除去される。
【００１２】
保存中および／または冷蔵中に濁りを生じやすい飲料が本発明にて好適に処理される。かかる飲料にはアルコール、果実および野菜飲料が含まれる。アルコール飲料にはホップを入れた麦芽汁の発酵により得られる、例えば、ビール、エール、ラガー、スタウトおよび発泡酒が含まれる。アルコール飲料にはまた、果実の発酵により得られるもの、例えば、ワイン、ウイスキー、強化ワイン製品(シェリー、ブランデーおよびコニャック)、ラム、リキュール類およびコーディアル類が含まれる。果実飲料には果実より得られたものが含まれ、例えば、リンゴ、クランベリー、葡萄、柑橘類、桃、梨、プラム、アプリコットおよびネクタリンジュースが例示される。野菜飲料には野菜起源の飲料が含まれ、例えば、野菜ジュース例えば、トマト、人参、セロリ、パセリ、ほうれん草、ウィートグラス、ケール、きゅうり、松葉、ロクベンシモツケ、ヨモギ、ビート、ラディッシュ、アロールートジュースが例示される。本発明の方法は特にビール中の濁りを減少させるのに有用である。
【００１３】
この飲料中の濁りは主にポリフェノール類とタンパク質類に起因するものであり、これらは反応して水素結合を昭二、大きな分子となる。濁り生成性タンパク質類は一般に３０-６０kDaの範囲の分子量を有している、ただしこの範囲は原料によって変化する。濁り生成性ポリフェノール類にはタンニンおよびアントシアノゲンが含まれる。(米国特許第６,００１,４０６)飲料中の濁りを減少させるためには、ポリフェノール類、タンパク質類または両方を部分的に除去することが有用である。本発明はポリフェノール類およびタンパク質類の両方のレベルを減少させるすることができる方法を提供するが、知られている方法においては、タンパク質類またはポリフェノール類のいずれかを除去することしかできない。
【００１４】
本発明の方法は飲料中にすでに生じてしまった濁りと粒子状物を除去するのに有用である。。本発明の方法はまた、濁り生成性物質となる可能性のある物質、例えば、濁り生成性タンパク質およびポリフェノールを除去して濁り形成がより困難となるようにするためにも有用である。さらに本発明の方法は濁りの原因となりうる混入した微生物の除去や微生物活性低下のためにも有用である。
濁り生成性物質の量およびその濁り形成性傾向はいくつかの要因に依存する。例えば、ビールは醸造所で採用される製法やホップ、オオムギの種類などによってそれぞれ組成がことなる。このことは、ビールの種類および／または醸造所によって、受け入れ可能な一般的に用いられる方法により測定される濁りの量が変わり得ることを意味する。本発明においても、濁り量の上限を特定することはそれ故に難しい。一般的なガイドラインとして、本発明の方法を採用した結果、濁り生成性タンパク質および／またはポリフェノール(単独で、または組み合わせて)が少なくとも１０%、好ましくは１５%、より好ましくは２０%減少した場合に、濁りのレベルが下がったとする。飲料中の総タンパク質には例えば好ましい泡生成性タンパク質類と好ましくない濁り-生成性タンパク質の全てを含む。飲料中の総タンパク質濃度はBCA(ビシンコニン酸)アッセイによって測定することができる。(Smith,Anal.Biochem.１５０,７６-８５(１９８５))。BCA アッセイでは全タンパク質量を、サンプル中のペプチド結合の量を定量することによって測定する。ペプチド結合はアルカリ条件下でCu+２をCu+へと還元する。各Cu+は次いでBCAの２分子をキレートし、着色錯体を生成するので、その吸光度は総タンパク質濃度と相関する。BCA アッセイは１２５μg/ml から２０００μg/ml濃度範囲のタンパク質量の測定が可能である。
【００１５】
泡生成性タンパク質はほとんどが疎水性タンパク質であり、その濃度はブラッドフォードアッセイにより測定可能である(Siebert,et al.J.Am.Soc.Brew.Chem.５５：７３-７８(１９９７))。この方法は疎水性タンパク質を選択的に測定する方法である。タンパク質が結合すると、酸性条件下でのクーマッシー(Coomassie登録商標)ブルーＧ−２５０の吸光度が４６５nm から５９５nm へとシフトする。クーマッシー染料は主に疎水性で正荷電のタンパク質、例えば、アルギニン、ヒスチジン、およびリシンに結合する。これらの疎水性で正荷電のタンパク質はビールの泡生成性タンパク質である。ブラッドフォードアッセイでは４０μg/ml から２５０μg/mlの範囲の濃度のタンパク質を検出できる。
濁り生成性タンパク質の濃度は一般に、泡生成性タンパク質濃度を総タンパク質タンパク質濃度から引くことによって得られる。飲料中の泡生成性タンパク質と濁り生成性タンパク質の量は、個別の飲料によって変わる。ビールでは、泡生成性タンパク質ｓが総タンパク質の約５-５０%を、濁り生成性タンパク質が総タンパク質の約５０-９５%を占める。例えば泡生成性タンパク質は総タンパク質の約２０%であり、濁り生成性タンパク質は総タンパク質の約８０%である。飲料中の濁りの生成の抑制または減少のゴールは全てのタンパク質、特に泡生成性タンパク質の除去ではない。すなわち、タンパク質の除去は特定の飲料の例えば風味、香織、および起泡性に影響する。濁りの抑制または減少のゴールは濁り生成性タンパク質またはポリフェノールを少なくとも１０%、好ましくは１５%、より好ましくは２０%減少させるところにある。
【００１６】
飲料の濁りは当業者に知られた種々の方法により測定することができる。例えばシャポーンクーリング(Chapon cooling)方法は濾過ビールの冷蔵濁りを予測するのに用いられる。飲料の温度を特定時間下げた後に濁りを測定する。濁りの増加がほとんどあるいは全く無い場合には良好な濁り安定性が、一方急激に濁りが増加する場合には低い濁り安定性が認定される。
【００１７】
本方法を用い、飲料サンプルの濁度をまず最初に室温にて測定する。該飲料サンプルの温度を次いで０℃までプロピレングリコール入りのウォーターバス内で下げる。サンプルのアリコートを一定のインターバル、例えば、１、２、１２、および２４時間後に採取し、濁度を測定する。あるアリコートの濁度は０℃のウォーターバスから取り出した直後に測定する。濁度はEBC単位(European Brewing Convention)で示す。最初の室温においた時と比較した濁度の有意な上昇は物理的安定性が低いことを示し、サンプルが冷蔵濁りを生じやすい傾向があることを示す。
【００１８】
飲料の濁りを測定する他の方法としては強制-濁り安定性法がある。本方法では飲料サンプルを加熱／冷却温度サイクルに付した後に生じた濁りを測定する。短時間高温で保存された飲料サンプルは室温にて長期間保存された場合と同様の冷蔵濁りを生じる。本方法はシャポーンクーリング法より、より時間がかかるがより高い確度で予測可能である。
【００１９】
この強制-濁り安定性方法、を用いる場合、飲料サンプルの濁度をまず最初に室温にて測定する。サンプルを次いで０℃の氷冷ウォーターバスへ投入し、２４時間インキュベートする。濁度を２４時間後に測定して、「冷蔵後の総濁り」として記録する。サンプルを次いで５０℃で３日間インキュベートし、次いで０℃で２４時間置き、サンプルの濁度を測定する。
この５０℃/０℃サイクルを繰り返し、濁度を再度測定する。３および６日後に濁度の有意な上昇が認められた場合には物理的安定性が低いことを示す。３および６日後にほんの少ししか濁度が上がらない場合には、物理的安定性が高いことを示す。
本発明はシラン処理シリカフィルター媒体を用いて濾過することにより濁りを減少させる方法を提供する。濾過は仕込んだ流体を多孔性媒体を通過させることによって粒子を除去するものである。粒子は物理的トラップおよび媒体への結合を含む種々の機構によってフィルター媒体に捕捉される。
フィルター媒体はフィルターエイドとしても知られ、遊離粒子であっても構造体であってもよい。フィルター媒体は濾過される液体に溶解しない粒子状の固体であってよく。粒子は液体に添加されても、フィルター上もしくはフィルター支持体を被覆してもよい。フィルター媒体を用いる理由は、濾過のスピードを上げる、フィルター表面の付着物を減少させる、減少させる、フィルター層の割れを減少させる、その他濾過を改善するというものである。フィルター媒体はしばしば、その物理的形状によって説明される。一部のフィルター媒体は本質的に不連続な膜であり、汚染物質を膜表面上に保持することによって機能する(表面フィルタ)。これらのフィルター媒体はそもそも機械的な張力によって機能し、フィルター媒体の孔のサイズが液体から除去しようとする粒子サイズより小さいことが重要である。かかるフィルター媒体は通常低い流速およびすぐに詰まってしまう傾向がある。
【００２０】
他のフィルター媒体としては多孔性支持体もしくは基板上に形成した微細な繊維状または粒子状物質の多孔性ケーキもしくは層が例示される。濾過される溶液は微細な物質の隙間に形成された孔の通り道を通って流れ、粒子状の汚染物質がフィルター媒体に保持される。フィルター媒体の深さのために、係るフィルターは深型フィルターと呼ばれる(表面フィルターの反対の意)。かなり大きな孔の大きさを有するフィルター媒体を用いて要求された懸濁粒子状汚染物質の除去が達成できれば、より速い流速で行うことができ、魅力である。さらに、より高い粒子保持能を有するフィルターであれば、詰まる傾向が減る。
【００２１】
本発明ではシラン処理シリカ媒体を用いて、種々の濁り生成性物質および粒子状物質をアルコール、果実および野菜飲料から除去する。
【００２２】
「粒子状物質」の後は肉眼で見える不溶性物質もしくは微細な粒子状物質を意味する。粒子状物質は飲料においてはしばしば望ましくなく、また粒子状物質は濁りの原因ともなる。肉眼で見える粒子はヒトの目で見えるものをいい、限定するものではないが沈殿物、封入体および結晶が含まれる。封入体は細胞内コンパートメントで不溶性で不正に折りたたまれたタンパク質である。結晶は過飽和溶液より規則的かつ繰り返し生じる分子の凝集によっ形成される。沈殿はランダム凝集の非晶質である。肉眼で見える粒子は有機物起源であっても無機物起源であってもよく、タンパク質とタンパク質、塩とタンパク質、塩と塩、タンパク質とポリマー、などの相互作用によって生成される。微細な粒子は顕微鏡下でのみ視認できる粒子である。微細粒子の例としては、微生物を含む。微生物が飲料内で過増殖すると、肉眼で見える粒子を形成することもある。本発明の方法により好適に捕捉され、飲料より除くことができる微生物としてはグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、菌、酵母、カビ、ウイルス等ガレイ時される。
【００２３】
醸造所、ワイナリー、ジュースその他の飲料の工場における問題の一つが、微生物汚染である。微生物汚染の除去のために最も良く用いられている方法は熱滅菌および粒径による濾過である。熱滅菌の最も大きな欠点はその適用が高温によって損なわれない製品に限られることである。粒径による濾過はコストと時間がかかることが問題である。さらに、この濾過方法は細菌と同じ寸法の成分を含む製品には用いることができない。本発明は濁り生成性物質(例えば、濁り生成性タンパク質およびポリフェノール)および粒子(例えば、微生物)を１段階の濾過ステップにて除去することができる有利な方法である。それ故、本発明の方法はそれぞれ別個の成分を含む種々の飲料において濁りを防止もしくは減少させるのに有用である。
【００２４】
本発明の特徴は濾過工程において処理されたシリカフィルター媒体を用い、可溶性物質をシリカフィルター媒体へ結合させ、粒子状物質を濾過によって捕捉するところにある。本発明は前濾過工程が不要である。可溶性濁り生成性物質はシラン処理シリカフィルター媒体上へいくつかのメカニズム例えば、親水性、疎水性、親和性および／または静電相互作用、によって結合する。本発明の方法に用いられるシリカフィルター媒体は、その表面がシラン類に処理されるのに適しており、工業的濾過に用いるのに適した構造特性を有している。シリカフィルター媒体としては、これらに限定されるわけではないが、もみ殻灰、カラスムギ殻灰、珪藻土、パーライト、タルク、および粘土が例示される。
もみ殻灰は稲作農の副産物である。米の穀粒は外殻に守られており、これは収穫重量のおよそ１７-２４%を占める。籾殻は７１-８７%(w/w)の有機成分、例えば、セルロースおよび１３-２９%(w/w)の無機成分からなる。この無機分画のかなりの部分、８７-９７%(w/w)はシリカ(SiO２)である。現在、食べられない籾殻は燃料、燃料、肥料、および詰め物として用いられる。籾殻を焼くと、構成されるシリカ成分(通常９０%以上)が副成分として生成する。もみ殻灰(ＲＨＡ)は他の遊離シリカフィルター媒体と比してより大きな表面領域およびより孔の多い構造を有している。これらの性質によりＲＨＡは本発明において好ましい処理されたフィルター物質である。
【００２５】
珪藻土(珪藻岩Diatomite)はシリカ沈殿物が堆積したものであり、珪藻、即ち海水もしくは真水環境下に蓄積する単細胞藻類様植物の化石化した骨格から構成される。そのハニカム状のシリカ構造のおかげで珪藻岩は例えば、吸収性、表面面積、化学的安定性および低い嵩密度等の有用な性質を有している。珪藻岩は９０%のSiO２＋Al、Fe、Ca およびMg 酸化物を有している。
パーライトは天然の薄片状火山岩の総称であり、熱処理により膨張させることができるものである。膨張パーライトとしては２ポンド／立方フィート(３２kg/m３)もの軽量のものを製造することができる。パーライトは天然ガラスの一形態であり、化学的に不活性として分類され、おおよそ７のｐＨを有する。パーライトはシリカ、アルミニウム、酸化カリウム、酸化ナトリウム、鉄、酸化カルシウム、およびマグネシウムオキシドを含有する。加工された後、液体から微粒子を濾過して除去するのに好適な多孔質構造を有するパーライトは、深型濾過に好適に用いられる。
【００２６】
タルク(タルカム)は天然の水和マグネシウムシリケート、３MgO ４SiO２ H２Oである。粘土は水和アルミニウムシリケート、Al２O３ SiO２xH２Oである。上記のシリカフィルター媒体物質の混合物を最適な濾過とコストパフォーマンスを達成するために用いるてもよい。もみ殻灰または珪藻土は任意に種々の精製および／または洗浄処理に付した後に表面シラン処理に付してもよい。
【００２７】
シリカフィルター媒体を予め定めた量の機能性シラン(またはシラン類)をその表面へ結合させることによって処理する。処理されたシリカフィルター媒体は液体中の成分を、例えば静電、親水性、疎水性、親和性相互作用、および／または物理的捕獲により捕捉する。静電相互作用によって、荷電したシリカフィルター媒体はサンプル中にある反対の電荷を有する成分吐血号する。親水性相互作用によって、シリカフィルター媒体中の水への強い親和性を有する部分がファンデルワールス相互作用により成分の極性基を引きつける。疎水性相互作用によって、シリカフィルター媒体の炭化水素長鎖を有する部分が成分の非極性基を引きつける。
【００２８】
シラン処理シリカフィルター媒体は好適には非処理シリカフィルター媒体と比して同等もしくはよりすぐれた流速を示すものである。シリカゲルが濁り生成性タンパク質には結合するがポリフェノールには結合しないことが知られている。シラン処理シリカフィルター媒体は濁り生成性タンパク質だけでなくポリフェノールにも結合する。それ故に、本発明は濁りの原因が濁り生成性タンパク質であるかポリフェノールであるかを問わず、種々の飲料において濁りを減少させるのに好適に用いられる。
【００２９】
シリカフィルター媒体の基材物質の形状は適用可能であればどのようなものでもよく球、繊維、フィラメント、シート、厚板、ディスク、ブロック、フィルム等が例示される。シリカフィルター基材物質はカートリッジ、ディスク、プレート、膜、織物、スクリーン等に形成されてもよい。例えば、醸造所の大量濾過においてはプレートおよびフレームフィルタープレスが用いられる(Fermented Beverage Production,２nd Ed.by LeaおよびPiggott,P.368-373)。未処理シリカフィルター媒体の比表面積は好ましくは１m２/gより大きく、より好ましくは１０m２/gより大きいものである。より大きな表面積を有するシリカフィルター媒体が好ましいというのは、より広い範囲の表面処理が可能だからである。さらに大きな孔を有する媒体であれば、流速が速くなる。しかしながら、孔大きい物質は比較的低い表面積となる。大きな表面積と大きな孔サイズのバランスにより、表面処理と流速を達成する。これらの基材の表面の性質は例えば、NMR(核磁気共鳴その他の技術)、SEM(走査電子顕微鏡)、BET(Brunauer-Emmett-Teller)表面積測定技術などで分析でき、炭素-水素-窒素含量は当業者に良く知られた燃焼法で測定することができる。
【００３０】
シリカフィルター媒体の表面処理に有用なシランとしては、いかなるタイプの有機シランであってもよく、イオン型非イオン型いずれでもよい。好適なシランは一般式(Ｒ１)ｘＳｉ(Ｒ２)３−ｘＲ３で示される：
［式中、Ｒ１は典型的にはシリカフィルター媒体表面上の活性基と反応する加水分解性部分(例えば、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、アリールオキシ、アミノ、アミド、メタクリレート、メルカプト、カルボニル、ウレタン、ピロール、カルボキシ、シアノ、アミノアシル、またはアシルアミノ、アルキルエステル、もしくはアリールエステル)であり、好ましい加水分解性部分はアルコキシ基、例えばメトキシまたはエトキシ基である；
１＜Ｘ  ＜３、１より多いシロキサン結合はフィルター粒子とシランの間に形成される；
Ｒ２は処理工程においてフィルター表面と反応しない炭素含有部分であり、例えば、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルキルシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、またはアリールアルカリルである、
Ｒ３は表面の反応が終了した後にシリコン原子に化学的に結合して残る有機部分であり、好ましくは濾過課程において目的成分と相互作用しうるものである；例えばＲ３は水素、アルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、アリールアルカリル、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、アリールオキシ、アミノ、アミド、メタクリレート、メルカプト、カルボニル、ウレタン、ピロール、アルキルエステル、アリールエステル、カルボキシ、スルホネート、シアノ、アミノアシル、アシルアミノ、エポキシ、ホスホネート、イソチオウロニウム、チオウロニウム、アルキルアミノ、４級アンモニウム、トリアルキルアンノミウム、アルキルエポキシ、アルキル尿素、アルキルイミダゾール、またはアルキルイソチオウロニウムであってよい；
ここで、前記アルキル、アルケニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、および複素環基上の水素はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、またはシアノと置換されていてもよい。
【００３１】
１以上のシランがヒドロキシル基を有する多孔性シリカフィルター媒体の表面に共有結合することができる。シリカフィルター媒体の表面積によりシランの結合量が決まる。.
【００３２】
本発明においてシリカを処理するのに有用なシランは好ましくは下記アルコキシ、４級アンモニウム、アリール、エポキシ、アミノ、尿素、メタクリレート、イミダゾール、カルボキシ、カルボニル、イソシアノ、イソチオリウム、エーテル、ホスホネート、スルホネート、ウレタン、ウレイド、スルフヒドリル、カルボキシレート、アミド、カルボニル、ピロール、およびイオン性からなる群から選択される部分を有するものである。アルコキシ部分を有するシランとしてはモノ−、ジ−、またはトリアルコキシシラン、例えば、ｎ−オクタデシルトリエトキシシラン、ｎ−オクチルトリエトキシシランおよびフェニルトリエトキシシランが例示される。
【００３３】
４級アンモニウム部分を有するシランとしては３−(トリメトキシシリル)プロピルオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド、Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、または３−(Ｎ−スチリルメチル−２−アミノエチルアミノ)−プロピルトリメトキシシランハイドロクロライドが例示される。アリール部分を有するシランとしては３−(トリメトキシシリル)−２−(ｐ，ｍ−クロロおよびメチル)−フェニルエタン、２−ヒドロキシ−４−(３−トリエトキシシリルプロポキシ)−ジフェニルケトン、((クロロメチル)フェニルエチル)トリメトキシシランおよびフェニルジメチルエトキシシランが例示される。エポキシ部分を有するシランとしては３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランおよび２−(３，４−エポキシシクロヘキシル)エチルトリメトキシシランが例示される。アミノ部分を有するシランとしては３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−(２−アミノエチル)−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、トリメトキシシリルプロピルジエチレントリアミン、２−(トリメトキシシリルエチル)ピリジン、Ｎ−(３−トリメトキシシリルプロピル)ピロール、トリメトキシシリルプロピルポリエチレンイミン、ビス−(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシラン、およびビス(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシランが例示される。
【００３４】
尿素部分を有するシランとしてはＮ−(トリエトキシシリルプロピル)ウレアおよびＮ−１−フェニルエチル−Ｎ'−トリエトキシシリルプロピルウレアが例示される。メタクリレート部分を有するシランとしては３−(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレートが例示される。スルフヒドリル部分を有するシランとしては３−メルカプトプロピルトリエトキシシランが例示される。イミダゾール部分を有するシランとしてはＮ−［３−(トリエトキシシリル)プロピル］イミダゾールおよびＮ−(３−トリエトキシシリルプロピル)−４，５−ジヒドロイミダゾールが例示される。イオン性シランとしては３−(トリメトキシシリル)プロピル−エチレンジアミントリ酢酸トリナトリウム塩；および３−(トリヒドロキシシリル)プロピルメチルリン酸ナトリウム塩が例示される。カルボニル部分を有するシランとしては３−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物が例示される。イソシアノ部分を有するシランとしてはトリス−(３−トリメトキシシリルプロピル)イソシアヌレートおよび３−イソシアナ−トプロピルトリエトキシシランが例示される。エーテル部分を有するシランとしてはビス［(３−メチルジメトキシシリル)プロピル］−ポリプロピレンオキシドおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタンが例示される。
【００３５】
スルホネート部分を有するシランとしては２-(４-クロロスルホニルフェニル)-エチルトリクロロシランが例示される。イソチオウロニウム部分を有するシランとしてはトリメトキシシリルプロピルイソチオウロニウムクロライド。アミド部分を有するシランとしてはトリエトキシシリルプロピルエチル-カルバメート、N-(３-トリエトキシシリルプロピル)-グルコンアミド、およびN-(トリエトキシシリルプロピル)-４-ヒドロキシブチルアミドが例示される。ウレタン部分を有するシランとしてはN-(トリエトキシシリルプロピル)-O-ポリエチレンオキシドウレタンおよびO-(プロパルギルオキシ)-N-(トリエトキシシリルプロピル)ウレタンが例示される。
【００３６】
シリカフィルター媒体さらに１以上のシランにて処理してもよく、例えば、Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドとビス(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシラン；３−アミノプロピルトリメトキシシランとＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；３−トリヒドロシリルプロピルメチルリン酸、ナトリウム塩およびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−Ｃｌ、トリメチルアンモニウムクロリドおよび(３−グリシドキシプロピル)トリメトキシシラン；３−トリヒドロシリルプロピルメチルリン酸、ナトリウム塩およびビス−(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシラン；３−(Ｎ−スチリルメチル−２−アミノエチルアミノ)−プロピルトリメトキシシランハイドロクロライドおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；２−(トリメトキシシリルエチル)ピリジンおよびＮ−(３−トリエトキシシリルプロピル)−グルコンアミド；Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−Ｃｌ、トリメチルアンモニウムクロリドおよびＮ−(３−トリエトキシシリルプロピル)−グルコンアミド；Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−Ｃｌ、トリメチルアンモニウムクロリドおよび２−ヒドロキシ−４−(３−トリエトキシシリルプロポキシ)−ジフェニルケトン；３−メルカプトプロピルトリエトキシシランおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；３−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物およびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；トリメトキシシリルプロピル−エチレンジアミン、トリ酢酸、トリナトリウム塩およびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；２−(４−クロロスルホニルフェニル)−エチルトリクロロシランおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；および２−(４−クロロスルホニルフェニル)−エチルトリクロロシランおよびビス−(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシランのような組合せにより処理してもよい。
【００３７】
シラン処理シリカフィルター媒体は一般式
【化１】
2007533325.tif 000003
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびｘはシリコン(Ｓｉ)に直接結合する基が４以下である限り、上記と同意；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８は独立して水素、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、エーテル、エステルまたはアリールアルカリル；
Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９は置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、またはアリールアルカリル基であって、２つの共有結合を形成できる基である。］
【００３８】
シリカフィルター媒体表面のシラノール基は下記一般反応式に沿って処理される：
【化２】
2007533325.tif 000004
【００３９】
［式中、粒子−ＯＨは表面に活性部位を有するフィルター粒子である。Ｒ１は例えばメトキシ(ＣＨ３Ｏ−)またはエトキシ(ＣＨ３ＣＨ２Ｏ−)などの不安定なシランの脱離基であって、粒子表面のヒドロキシ基、または表面に結合していない他の加水分解されたシラン分子の反応性基と相互作用する。１＜ｘ＜３；ｎは反応したＲ１基の数、そして  ｎ＜ｘ］
【００４０】
過剰量の反応性シランを長時間無水条件下で反応させると、多孔性物質の総活性部位の２５％から５０％のみの反応という結果となる、というのは、さらなる反応は固定化された残基間の立体障害により阻まれ、さらに奥深く埋め込まれた粒子−ＯＨ基へのアクセスもまた阻まれているからである。本発明の目的のため、かかる立体的事情より用いることができる部位を「飽和範囲」と名付けるが、この「飽和範囲」は特定の残基の立体的な要求によって決まる。この飽和範囲の名は１以上の不安定な脱離基を有する反応性シランにつけられるものである。無水条件下では、かかるシランはモノレイヤーを形成し不定飽和度の複数層を形成することはない。しかしながら、水性条件下においては、複数層が多官能シランを有する表面上に形成される。
【００４１】
シリカフィルター媒体表面のシラン処理は本質的に「ウエット」あるいは本質的に「ドライ」な工程のいずれで行ってもよい。本質的にウエットな工程においては溶媒(有機溶媒または水))中のシリカフィルター媒体表面上へシラン基を、所望により加熱して反応させる。加熱または溶媒の添加は反応に不要である。しかしながら、加熱または溶媒により反応速度が改善され、均一な表面被覆が達成される。本質的にドライな工程はシリカフィルター媒体上へシラン基を蒸気相または高度に攪拌した液体相中で、シランとシリカフィルター媒体を直接混合し、次に加熱することによって反応させる。
【００４２】
シリカフィルター媒体をシランで処理する好ましい方法は、反応させるシランを徐々に、直接多孔性シリカフィルター媒体に接触している溶媒を激しく攪拌しているところへ添加するというものである。他の好適な方法は、処理を蒸気相で行うこと、即ち反応性シランの上記がシリカフェイルター媒体へ接触および反応するようにすることである。例えば、多孔性物質を吸引反応槽に置き、吸引下で乾燥する。すばやく反応するシランを次いで、該吸引槽へ蒸気として投入し、該多孔性物質に接触させる；一定の接触時間の後、反応の副生成物を減圧下で除去する。次いで吸引を解消し、多孔性物質を反応槽より取り出す。
【００４３】
実際の処理工程は１分から２４時間の間に行われる。一般に、本発明の目的のためには処理を約３０分から６時間かけて行い、フィルター補助材の表面の均一な処理を確実とすることが好ましい。処理は０〜４００℃の温度範囲で行うことが好ましい。好ましい処理温度は室温(２２〜２８℃)から２００°の範囲内の温度である。
【００４４】
本発明で用いられる反応させるシランの量は表面の反応させようとするヒドロキシル基の数およびシランの分子量によって決まる。典型的には、副反応の可能性を見越して利用可能な表面のヒドロキシル基の化学量論の当量プラス多少の過剰量の反応性シランを表面ヒドロキシル基の処理に用いる。より厚く外側表面処理を行うことが望ましい場合には、さらなる反応性シランを用いればよい。典型的には０から１０(好適)、０から２０、または１ｔｏ  ５０倍過剰量の反応性シランが用いられる。しかしながら、１から５００倍過剰を用いることもあり得、この場合には粒子上のより多い処理となる。
【００４５】
加水分解性基を有するシランは粒子−ＯＨ基と縮合してこれらの基材の有機基と共有結合を形成する。例えばシランのアルコキシ基は粒子表面上の粒子−ＯＨ基と反応する。表面−シラン相互作用は速くそして効率的である。例えば４級アンモニウム部分を有するシランが用いられる場合、プロトン化された正荷電シランは静電力により粒子の脱プロトン化された基に効率よく引きつけられ、速くそして効率の良い反応を達成する。
シラン反応シリカフィルター媒体は好ましくは目的とする成分と反応する官能性部分を有している。官能性部分としては４級アンモニウム、エポキシ、アミノ、尿素、メタクリレート、イミダゾール、スルホネートおよびその他の生物分子と反応することが知られている基が例示される。さらに該官能性部分はさらに良く知られた方法によってさらなる新しい官能基を生成して他の相互作用を起こすべく、反応されていてもよい。４級アンモニウムまたはスルホネート基を官能基として有するシラン反応粒子フィルター媒体を得るための一般的な反応式を下記に示す。
【００４６】
４級アンモニウム基を有するシラン反応粒子フィルター媒体は１段階で調製することができる。所望により、２段階または３段階の工程を採用してもよい。例えば、２段階方法の第１段階で粒子表面をアミノ−官能基を有するシラン、(Ｒ１)ＸＳｉ(Ｒ２)３−ＸＲ４Ｎ(Ｒ５)２、と反応させる。これは以前に記述した方法にて行う。次のステップで二級アミンはグリシジルトリメチルアンモニウムクロリドのエポキシド基と容易に反応する。(スキーム１参照)
スキーム１  ４級アンモニウム官能性フィルターエイドの合成
【００４７】
【化３】
2007533325.tif 000005
【００４８】
スルホネート官能基を有するシラン反応シリカフィルター媒体も２段階で調製することができる。第一段階では粒子表面を先に説明した方法にてエポキシ−官能基を有するシランと反応させる。次の段階では、エポキシ官能基は容易に重硫酸ナトリウムと反応してスルホネート−官能基を有するシリカフィルター媒体が得られる。(スキーム２参照)。メタ重亜硫酸ナトリウム(Ｎａ２Ｓ２Ｏ５)は水で分解して重硫酸ナトリウム(ＮａＨＳＯ３)となる。
【００４９】
スキーム1  スルホネート−官能性シリカフィルター媒体の合成
【化４】
2007533325.tif 000006
【００５０】
シラン−処理された粒子は分離工程において可溶性物質を静電、および／または疎水性、および／または親水性相互作用機能によって捕捉する一方、粒子を除去する。処理されたシリカフィルター媒体の利点はこの分離工程を、濾過と固相抽出を単一ステップにまとめることによって、手続きを単純化したことにある。望ましい処理されたシリカフィルター媒体の質は、非処理シリカフィルター媒体と比して同等または改善された流速(濾過性能)を示し、１回の操作で収着により可溶性物質を捕捉することが可能なものである。
【００５１】
本発明の１の実施形態においては、シリカ粒子の表面に特別な荷電基を共有結合させ、これによって静電力によって物質を捕捉する。反対の電荷を有する物資が多孔性処理表面上に結合する。静電力による引力に加えて、疎水性または親水性相互作用により疎水性または親水性リガンドを、結合および／または放出性能を改善するために配してもよい。
【００５２】
処理されたシリカフィルター媒体の性質は、表面積、孔体積および孔のサイズを当業者に公知の方法、例えば、マイクロメトリクス(登録商標Micrometrics)アナライザーを用いる方法にて解析される。例えば、表面積はBET 法にて特徴付けられる。孔の体積および孔の直径はバレット―ジョイナー―ヘレンダ(BarrettJoynerHalenda)分析にて実施可能である。特定の官能基および分子構造はNMR分光分析によって決定される。炭素-水素-窒素含量は燃焼法にて決定される；この分析情報から粒子表面の処理レベルを計算することができる。
【００５３】
本発明に有用なシラン処理シリカフィルター媒体は一般に(限定されるわけではないが)下記一般式：
【化５】
2007533325.tif 000007
［式中、Ｒ１はアルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシル、アリールオキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、アミノアシル、またはアシルアミノ、アルキルエステル、またはアリールエステル；
Ｒ２は独立して置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、またはアリールアルカリル；
Ｒ３は水素、アルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、アリールａｋアリール、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシル、アリールオキシ、アミノ、アルキルエステル、アリールエステル、カルボキシ、スルホネート、シアノ、アミノアシル、アシルアミノ、エポキシ、ホスホネート、イソチオウロニウム、チオウロニウム、アルキルアミノ、４級アンモニウム、トリアルキルアンノミウム、アルキルエポキシ、アルキル尿素、アルキルイミダゾール、またはアルキルイソチオウロニウム；(ここで前記アルキル、アルケニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、および複素環上の水素は任意にハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシ、またはシアノで置換されていてもよい)；
Ｒ５、Ｒ６およびＲ８は独立して水素、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、またはアリールアルカリル；
Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９は置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、またはアリールアルカリル基であって、２つの共有結合を形成可能な基である；
(ここで前記粒子はもみ殻灰、カラスムギ殻灰、珪藻土、パーライト、，タルク、または粘土である)
からなる群から選択される。
【００５４】
本発明の方法に用いられるシラン反応シリカフィルター媒体は好ましくは目的とする成分と反応可能な官能性部分を有している。この官能性部分はアルコキシル、４級アンモニウム、エポキシ、アミノ、尿素、メタクリレート、イミダゾール、スルホネート、カルボキシル、シアノ、スルフヒドリル、カルボニル、イソチオリウム、ホスホネート、および生物学的分子と反応することが知られている他の有機部分からなる群から選択される。
【００５５】
飲料サンプルを本発明のシラン処理シリカフィルター媒体へ適用する前に、粒子状物質を除去するための前濾過処理をしてもしなくともよい。本発明の方法では前濾過処理工程がいらないというのが、本発明の有利な点のひとつである。さらに、飲料サンプルをシラン処理シリカフィルター媒体へ適用するに際して、濾過工程に先だっての該飲料とフィルター媒体との前混合を行っても行わなくともよい。１の実施形態においては、サンプルを処理されたシリカフィルター媒体と機械的混合のためのいずれかの方法(例えば、かきまぜ、攪拌、ボルテックスなど)によって、処理されたシリカフィルター媒体の表面に成分が結合するのに十分な時間、混合する。当業者であれば結合のための好適な時間は媒体の孔の特性、タンパク質またはポリフェノールの性質、飲料の粘度、およびその他の速度論的な原理によって変化することを理解するであろう。一般に、結合が生じる時間は約数分から数時間まで変化し得、そして１−３日間続き得る。処理されたシリカフィルター媒体に成分を結合させた後、混合物を濾過装置にかけ、サンプルをフィルター媒体で濾過する。
【００５６】
他の実施形態においては、飲料サンプルとフィルター媒体を先に混合することなく飲料サンプルをシラン処理シリカフィルター媒体を含有する濾過ユニットで直接濾過する。処理されたシリカフィルター媒体は粒子を捕捉し、特定の可溶性成分例えば、タンパク質およびポリフェノールを結合する一方結合しない可溶性物質、例えば泡生成性タンパク質、を通り抜けさせる。濾過された飲料サンプルを回収する。
【００５７】
本発明の１の適用態様としてはシラン処理シリカフィルター媒体を微生物を飲料より除去するための適用が挙げられる。微生物汚染は醸造所、ワイナリー、ジュース及び他の飲料工業において共通した問題である。出願人は本発明のシラン処理シリカフィルター媒体が抗微生物活性を有することを見いだした。細菌をこのシラン処理シリカフィルター媒体へ接触させることによって、総生細菌カウントが有意に減少する。微生物はまたシラン処理シリカフィルター媒体に捕捉される。即ち、濾過ステップにより製品よりさらに微生物汚染を除去することが可能なのである。
【００５８】
下記実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は単に本発明の説明のために用いられることを意図しており、制限的解釈に用いられるべきではない。実施例１から５はシリカフィルター媒体の表面処理を示す。実施例６−１３はシラン処理シリカフィルター媒体の殺菌活性および濾過の結果を示す。実施例１４−１９はビールをシラン−処理媒体で処理したものである。
【００５９】
米国特許公開公報第２００４−０２１１７２４Ａ１号では、実施例５から１４にシラン処理フィルター媒体を粒子状物質と可溶性成分を含むサンプルから１以上の目的タンパク質成分を分離するのに用いることを開示している。米国特許公開公報第２００４−０２１１７２４Ａ１、その全体、特に実施例５−１４は参照により本明細書の一部を成すものとする。
【００６０】
実施例１
バッチ工程における、トリアルコキシシランを用いたもみ殻灰媒体(ｔＲＨＡ)の処理
処理はテフロン（登録商標）シャフトの機械式かくはん器、温度計、温度計を備えた三首の丸底反応フラスコおよびフラスコ周囲の加熱マントルを有する器具を用いて行った。反応フラスコに挽いていないＲＨＡ  シリカフィルター媒体(表面積：〜３０ｍ２／ｇ)、および溶媒混合物を投入した。表１に各実施例の反応条件を示した。混合物は数分間、室温で攪拌し、次いで正確な量のシランを直接混合物にゆっくりした投入速度で添加する一方、混合作業を続けることを含む表面改質工程を行った。計算上シランが複数層カバー(高レベル処理)を達成するのに必要な２５０％、または計算上シランが単層カバー(低レベル処理)を達成するのに必要な８５％を正確に添加した。シランの量はその純度によって補正した。投入した濃度を表１に示す。次に、主に安全のために用いられ、生成物に他の影響を及ぼさないＮ２ブランケット下で混合物を加熱および還流した。なお、加熱は特に必要はない。２時間攪拌および還流した後、処理したスラリー状の混合物を放置して冷却させた。次いでワットマン濾紙を敷いた磁器製のブフナー漏斗へ写し、真空フィルターフラッシュにつなげた。処理されたフィルタースラリーを濾過しトルエンで二回およびＩＰＡで二回洗浄した。その後、サンプルをフード内で約２４時間乾燥した。処理したフィルター媒体をパイレックス（登録商標）容器へ移し、シリンジ針でいくつも穴を空けたパラフィンフィルムで覆った。次いで、サンプルを真空オーブン内で６０℃にて２−４時間乾燥した。乾燥したサンプルの表面積、孔の構造および炭素−水素−窒素含量を調べた。
【００６１】
表1：処理用組成物および条件のまとめ
【表１Ａ】
2007533325.tif 000008
【表１Ｂ】
2007533325.tif 000009
【００６２】
実施例２
別のタイプの処理ずみシリカフィルター媒体の調製
さらなる基材として特に、高炭素もみ殻灰、複数種類の超純度珪藻土(Celpure P１０００、Celpure P６５)、Celite ５４５(標準的珪藻土フィルターエイド)、パーライト、およびLRA II(非-シリカベースの脂質吸収剤)を用いた。表２にこれらのサンプルの処理条件および組成を示す。
【００６３】
表２：種々の基材の処理条件及び組成
【表２】
2007533325.tif 000010
【００６４】
Z-６０３２：３-(N-スチリルメチル-２-アミノエチルアミノ)-プロピルトリメトキシシランハイドロクロライド
AEAPTMS：N-(２-アミノエチル)-３-アミノプロピルトリメトキシシラン
【００６５】
実施例３
親水性４級アンモニウム官能性フィルターエイド(フィルター媒体サンプル４０および４２)製造のための二段階法
処理はテフロン（登録商標）シャフトの機械式かくはん器、温度計、温度計を備えた５００ミリリットルの三首丸底反応フラスコおよびフラスコ周囲の加熱マントルを有する器具を用いて行った。反応フラスコへ５０gのアミノ-官能性基を有する前処理ＲＨＡ(サンプル１７または１９)シリカフィルター媒体、および２００ml IPA溶媒を投入した。混合物を数分間室温で攪拌し、次いで表面処理工程正確な量のグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド(２.４６g サンプル１７、または２.０２g サンプル１９)を直接混合物へ混合物にゆっくりした投入速度で添加する一方、混合作業を続けることを含む表面改質工程を行った。N２ブランケット下で反応混合物を加熱および還流した。４時間攪拌および還流した後、処理したスラリー状の混合物を放置して冷却させた。次いでWhatman濾紙を敷いた磁器製のブフナー漏斗へ写し、真空フィルターフフラスコにつなげた。処理されたフィルターケーキを濾過し、それぞれ約１５０ｍｌのD１水で４回洗浄した。その後、サンプルをフード内で約２４時間乾燥した。次いで処理したシリカフィルター媒体をパイレックス（登録商標）容器へ移し、シリンジ針でいくつも穴を空けたパラフィンフィルムで覆った。次いで、サンプルを真空オーブン内で６０℃にて２-４時間乾燥した。乾燥したサンプルの表面積、孔の構造、炭素-水素-窒素含量および２９Si NMRを調べた。
【００６６】
実施例４
親水性スルホネート-官能性フィルターエイド(フィルター媒体サンプル４１)
製造のための二段階法
処理はテフロン（登録商標）シャフトの機械式かくはん器、温度計、温度計を備えた５００ミリリットルの三首丸底反応フラスコおよびフラスコ周囲の加熱マントルを有する器具を用いて行った。反応フラスコへ５０gのエポキシ-官能性基を有する前処理ＲＨＡ(サンプル１５)シリカフィルター媒体、および２００ml のIPA：H２O(５：１)溶媒を投入した。混合物を数分間室温で攪拌し、次いでN２ブランケット下で７０℃まで加熱した。０.５５g のメタ重亜硫酸ナトリウム、０.０７の亜硫酸ナトリウム触媒、および５gの水を添加漏斗より混合物へゆっくりした速度で１-２時間かけて添加する一方で混合作業を続けることを含む表面改質工程を行った。温度をその後およそ８０℃まで加熱し、反応が完了するまで維持した。反応は残存するNaHSO３のヨウ素還元滴定にて行った。おおよそ２２時間攪拌および還流した後、処理したスラリー混合物を放置して冷却させた。次いでWhatman濾紙を敷いた磁器製のブフナー漏斗へ写し、真空フィルターフフラスコにつなげた。処理されたフィルターケーキを濾過し、それぞれ約１５０ｍｌのD１水で４回洗浄した。その後、サンプルをフード内で約２４時間乾燥した。次いで処理したシリカフィルターエイドをパイレックス（登録商標）容器へ移し、シリンジ針でいくつも穴を空けたパラフィンフィルムで覆った。次いで、サンプルを真空オーブン内で６０℃にて２-４時間乾燥した。乾燥したサンプルの表面積、孔の構造、炭素-水素-窒素含量および２９Si NMRを調べた。表３に２段階法の組成および条件をまとめた。
【００６７】
表３：２段階法の処理条件および組成
【表３】
2007533325.tif 000011
.  処理されたシリカフィルター媒体の解析：BET 表面積、孔体積および孔直径
【００６８】
表面積および多孔度はマイクロメトリクス(Micrometrics、登録商標)ASAP ２０１０アナライザーを用いて行った。分析の前にサンプルを吸引下、１５０℃で圧力が一定になるまで脱気した。分析工程において、N２ガスを７７°Kにてサンプルに吸着させ表面積を吸着したガスの体積から計算した。BETパラメーターはBET等式をASAP-２０１０ソフトウエアを用いて積分して求めた。表面積は０.０５＜P/Po ＜０.３の範囲で等温線の吸着ブランチより計算した。BarrettJoynerHalenda 分析を用いて孔体積および孔直径を計算した。
NMR 
【００６９】
特定の官能基および分子構造の同定は２９Si 固体NMR分光分析をUnity Plus ４００MHz 分光分析機でバリアンVT CPMASプローブおよび７mmのモーターを用いて行った。
炭素-水素-窒素(CHN)
CHN含量はロバートソン・マイクロライト・ラボラトリーズによて燃焼分析法を用いて測定した。この分析で得られる情報から、表面上の処理レベルを計算した。
表４  処理されたシリカサンプルの分析データ
【００７０】
表４：処理されたシリカサンプルの分析結果
【表４】
2007533325.tif 000012
【００７１】
実施例５
シリカフィルターの組成および各種処理条件並びにその特徴分析
表５A-５D はもみ殻灰の各種処理条件および組成、並びにその特性を示す。
【００７２】
【表５Ａ−１】
2007533325.tif 000013
【表５Ａ−２】
2007533325.tif 000014
【表５Ａ−３】
2007533325.tif 000015
【００７３】
【表５Ｂ】
2007533325.tif 000016
【００７４】
【表５Ｃ−１】
2007533325.tif 000017
【表５Ｃ−２】
2007533325.tif 000018
【表５Ｃ−３】
2007533325.tif 000019
【表５Ｃ−４】
2007533325.tif 000020
【００７５】
【表５Ｄ】
2007533325.tif 000021
【００７６】
リガンド密度は元来のもみ殻灰上の炭素により０.４３%Cの補正をした。。混合シランサンプルリガンド密度は最初のシランに基づく。
【００７７】
実施例６
殺菌性活性試験(Bacillus subtilis)
試験微生物：Bacillus subtilis
被検フィルター媒体：フィルター媒体サンプル４３、４４、４およびFW１２(未処理珪藻土)
【００７８】
手順：
Bacillus subtilis の培養液を滅菌ＰＢＳで希釈して〜１０４ＣＦＵ／ｍＬとした。(１ＯＤ  ≒５＊１０８ＣＦＵ／ｍＬを用いて培養液中のＣＦＵ／ｍＬを測定した)
０．５ｇのフィルター媒体／５ｍＬ液体(１０％固体)を用いた
１．  サンプルの培養液を連続的希釈したもの(滅菌０．９％ｗ／ｖ  ＮａＣｌ)をＬＡプレートに播き、実際に用いるＣＦＵ／ｍＬを決定した。プレートを一晩３４℃にてインキュベートした。
２．  フィルター媒体および希釈細菌サンプル(またはＰＢＳコントロール)を滅菌した１２５ｍＬ  バッフルフラスコ内で２時間半、３０℃、２００ｒｐｍにて攪拌した。
３．  処理したサンプルの液体部分(２)をＬＡプレート上に播き(各サンプルにつき５プレート、１のプレートをコントロールとする)一晩３４℃にてインキュベートした。
４．  プレート上の細菌を計数した。
結果：
表６に結果をまとめた。細菌をサンプル４および４４のフィルターと混合することによって、ＣＦＵは減少したが、これはフィルター媒体サンプル４および４４が抗微生物活性を有し、接触することにより細菌を殺したことを意味する。
【００７９】
【表６】
2007533325.tif 000022
【００８０】
凡例：
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水(細胞が浸透圧ショックによって溶菌されるのを防止)
ＣＦＵ：コロニー形成ユニット(生細胞数)
ＴＦＴＣ：少なすぎてカウント不能
ＣＦＵ／ｍＬ  は：平均±差(プレート数)で示す［差は平均と平均から最も遠い値との差である］．
２０３００コロニーのプレートのみ計数した。
【００８１】
実施例７
殺菌性活性試験(Bacillus subtilis)
【００８２】
試験微生物：Bacillus subtilis
被検フィルター媒体：フィルター媒体サンプル１、４、６、４４、および４５.
【００８３】
手順：
Bacillus subtilis の培養液を滅菌PBSで希釈して〜１０４CFU/mLとした。
０.５g フィルター媒体/５mL 液体(１０%固体)を用いた。
１.  サンプルの培養液を連続的希釈したもの(滅菌０.９%w/v NaCl)をLAプレートに播き、実際に用いるCFU/mLを決定した。プレートを一晩３４℃にてインキュベートした。
２.  フィルター媒体および希釈細菌サンプル(１５mL 液体)を滅菌した２５０mL バッフルフラスコ内で混合した。各フィルター媒体それぞれにつき２つのフラスコを用いた。
(細菌サンプルではなくPBSを投入したサンプルもまた下記フィルター媒体サンプルに含まれる：サンプル１、６および４５)
３.  上記を２時間、３０℃、２５０rpmにて混合した。
４.  処理サンプル(液体部分)をLAプレート上に播いた(各サンプル４または５プレート)。プレートを一晩、３４℃にてインキュベートした。
５.  プレート上の細菌数を計数した。
【００８４】
結果：
結果を表７にまとめた。細菌とフィルター媒体サンプル１、４、６、４４、および４５とを混合することによってCFUは有意に減少した。
【００８５】
【表７】
2007533325.tif 000023
【００８６】
実施例８
殺菌活性および濾過試験(Lactobacillus brevis)
試験微生物：Lactobacillus brevis
試験フィルター媒体：サンプル４、４３、４５およびＦＷ１２。
【００８７】
０.５ｇのフィルター媒体／５ｍＬ培養物(１０％固体)を用いた。
【００８８】
手順：
１.  Lactobacillus brevis の一晩培養物を２段階で希釈して〜１０５CFU/mLとした(１OD６００≒２.７*１０８CFU/mLを基準)―第１段の希釈は滅菌ラクトバチルスMRS培地にて行い、第２段の希釈を滅菌PBSにて行った。
２.  培養物の段階的希釈物(０.９%w/v NaCl内)を調製した(第２段の希釈).
３.  希釈されたサンプルをラクトバチルスMRS培地プレート上に播き、実際の開始CFU/ｍLを決定した。
４.  フィルター媒体および希釈した細菌サンプル(１０mL 液体)を滅菌１２５mL バッフルフラスコ内へ投入し、パラフィルム(登録商標)で密封し、２時間１５分間室温にてオービットシェイカー上で混合した(〜６０rpm).
５.  処理サンプルの段階希釈物(０.９%w/v NaCl内)を調製し、ラクトバチルスMRS培地プレート上に播いた。
６.  選択されたサンプル/サンプル４、４３および４５の希釈物を５μm フィルターで濾過した。
７.  濾過したサンプルをLactobacillus brevis 培地プレート上に置き、キャンドルジャー内で３０℃にて２日間培養した。
８.  プレートを計数した。
【００８９】
結果：
結果を表１５にまとめた。CFUはサンプル４、４３、および４５と細菌を混合することによって減少した。５μｍのフィルターで濾過することにより、CFUはさらに減少した。
【００９０】
【表８】
2007533325.tif 000024
【００９１】
実施例９
抗菌活性試験(E.coli)
試験微生物：E.coli(MG１６５５)
試験フィルター媒体：FW１２、サンプル４３、１、４、６、４４および４５。
【００９２】
手順：
０.５g フィルター媒体/５mL フィード(=１０%固体)。
１.  E.coli 培養物(未だ定常期に至らず)を２段階で希釈して〜１０５CFU/mL(１OD６００≒５*１０８CFU/mLを基準)とした第１段の希釈はthe first滅菌LB培地を用い、第２段の希釈は滅菌PBS(これがフィード)にて行った。
２.  フィードの段階希釈物(０.９%w/v NaCl)を調製した。
３.  １００μLの希釈フィードサンプルをLAプレート上に播き、実際の開始CFU/mLを決定した。
４.  フィルター媒体および１０mLフィードを滅菌１２５mL バッフルフラスコ内へ投入し２時間、２５℃、２００rpm(４分の３インチストローク)にて混合した。
５.  混合サンプルの段階的希釈物(０.９%w/v NaCl内)を調製し、それぞれ１００μl をLAプレートに播き、３０℃で一晩培養した。
６.  プレートの計数を行った。.
【００９３】
結果：
結果を表９にまとめた。
【００９４】
【表９】
2007533325.tif 000025
【００９５】
実施例１０
殺菌活性および濾過試験(Lactobacillus brevis)
試験した微生物：：Lactobacillus brevis タイプの株(ATCC番号１４８６９)
試験したフィルター媒体：サンプル４３、４、および４４
手順：
０.５g フィルター媒体/５mL フィード(=１０%固体)
１.  Lactobacillus brevis 培養物を~１０５CFU/mL(１OD６００≒２.７*１０８CFU/mLを基準)へと２段階で希釈した第１段階の希釈は滅菌Lactobacillus MRS培地にて、第２段階の希釈は滅菌PBS(これがフィード)にて行った。
２.  フィードの段階的希釈物(０.９%w/v NaCl内)を調製した。
３.  希釈したサンプル１００μLLactobacillus MRS培地プレート上へ播き、実際の開始CFU/mLを決定した。
４.  フィルター媒体および５mLフィードを滅菌した１５mL円錐チューブへ投入し、２時間、２５℃、２５０rpm(２分の１インチストローク)混合した。
５.  混合サンプルの段階的希釈物(０.９%w/v NaCl内)を調製し、Lactobacillus MRS 培地プレート上へ播いた(それぞれ１００μl).
６.  全サンプルを５μmシリンジフィルターで濾過した。
７.  濾過サンプルの段階的希釈物(０.９%w/v NaCl内)を調製し、Lactobacillus MRS 培地プレート上へ播いた。
８.  プレートをキャンドルジャー内で３０℃にて２日間インキュベートした。
９.  プレートの計数を行った。.
【００９６】
結果：
結果を表１７にまとめた。CFUはサンプル４、４３、および４４と細菌を混合することによって減少した。５μｍのフィルターで濾過することにより、CFUはさらに減少した。
【００９７】
【表１０】
2007533325.tif 000026
【００９８】
実施例１１
抗菌活性試験(Lactobacillus brevis)
試験した微生物：：Lactobacillus brevis
試験したフィルター媒体：サンプル４８、５０、５１、および５２。
【００９９】
手順：
１.  Lactobacillus brevis(グラム陽性)培養物をMRS寒天培地上に画線し、好気条件下２６℃にて十分に増殖するまでインキュベートした。
２.  ＭＲＳプレートから取ったコロニーを０.１%ペプトンで希釈して５x １０４cfu/mLとなるようにして作業用種菌菌液を調製した。
３.  ０.５gフィルター媒体を３０ｍＬガラス管中の接種菌液へ添加した。(５%).
４.  ガラス管を密封し、室温にて３０分間、混合(８反転/分).しながらインキュベートした。
５.  １：１０の段階的希釈物を０.９%NaClにて調製し、細菌集団を数えるためにMRS寒天と共に流し平板法にてプレートを作成した。
６.  プレートを２６℃、好気条件下(GasPak)にて十分な数へと増殖するまでインキュベートした。
７.  ２０-２００コロニーを有するプレートの計数を行った。結果を表１１にまとめた。
【０１００】
実施例１２
抗菌活性試験(Acetobacter pasteurianus(グラム陰性))
試験した微生物：：Acetobacter pasteurianus(グラム陰性)
試験したフィルター媒体：サンプル４８、５０、５１、および５２。
【０１０１】
手順：
１.  Acetobacter pasteurianus(グラム陰性)培養物をMRS寒天上に画線し、好気条件下２７℃十分に増殖するまでインキュベートした。
２.  寒天培地上のコロニー１ｍｌループを９９ｍｌｎｏＭＲＳ培地へ添加し、２７℃でインキュベートして培養物をストックした。
３.  作業用接種菌液をMRS ストック培養物のアリコートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)または０.１%ペプトンにて希釈して調製した。
４.  ０.５ｇのフィルター媒体を１０mL 接種菌液へ３０mLのガラス管中で添加した。
５.  ガラス管を密封し、室温にて３０分間、混合(８反転/分).しながらインキュベートした。
６.  １：１０の段階的希釈物を０.１%ペプトンにて調製し、細菌集団を数えるためにMRS寒天と共に流し平板法にてプレートを作成した。
７.  プレートを２７℃、好気条件下(GasPak)にて十分な数へと増殖するまでインキュベートした。
８．  ２０-２００コロニーを有するプレートの計数を行った。結果を表１１にまとめた
【０１０２】
実施例１３
抗菌活性試験(Saccharomyces diastaticus(酵母))
試験した微生物：：Saccharomyces diastaticus(酵母)
試験したフィルター媒体：サンプルs ４８、５０、および５１。
【０１０３】
手順：
１.  Saccharomyces diastaticus(酵母)培養物をＹM寒天培地上へ画線し、好気条件、３０℃にて十分に増殖するまでインキュベートした。
２.  作業用接種菌液をＹＭプレート上のコロニーをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて３x １０４cfu/mLを目標として希釈し、調製した。
３.  ０.５ｇのフィルター媒体を１０mL 接種菌液へ３０mLのガラス管中で添加した。
４.  ガラス管を密封し、室温にて３０分間、混合(８反転/分).しながらインキュベートした。
５.  １：１０の段階的希釈物を０.９%NaClにて調製し、細菌集団を数えるためにMRS寒天と共に流し平板法にてプレートを作成した。
６.プレートを３０℃、好気条件下(GasPak)にて十分な数へと増殖するまでインキュベートした。
７.            ２０-２００コロニーを有するプレートの計数を行った。結果を表１１にまとめた。
【０１０４】
【表１１】
2007533325.tif 000027
【０１０５】
実施例１４
ビールの処理
シラン処理シリカサンプルを１回洗浄して不純物を除去した。各被検サンプル(０.３g)を秤量し、５０mL ポリプロピレン遠心分離用チューブへ投入した。１０mLのMilliQ 水を各チューブへ添加し、サンプルとゲルシェイカーを用い、５０rpmにて１５分間室温にて攪拌した。チューブを次いで卓上型遠心分離装置にて１５分間、３０００rpm にて遠心分離を行った。液体を次いで注意深くデカンテーションにより除き、チューブを５０℃吸引オーブン内に投入し、２０in Hgで一晩置いて過剰の水分を除去した。
【０１０６】
ビール(Anderson Valley Brewing Company製、脱炭酸Belk's ESBエール)へ８%(v/v)トリブチルリン酸塩を添加してASBCMethod,Beer １Dに則って脱炭酸した。それぞれ３０mlずつ脱炭酸ビールを分注して５０mL ポリプロピレンシラン処理シリカサンプルを含有する遠心分離チューブに投入した。遠心分離チューブを反転させ、ついで３時間室温にてゲルシェーカーセット上、５０rpmで撹拌した。インキュベーションに続き、チューブを１５分間、３０００rpm にて卓上型遠心分離機を用いて遠心分離し、懸濁している物質をペレットとした。各処理されたビールサンプルをついで５μm シリンジフィルター(Sartoris、Minisart、番号１７５９４)にてろ過してさらなる懸濁物を除去した。
【０１０７】
実施例１５
総ポリフェノール量の測定方法
１.  材料
カルボキシメチルセルロース(CMC/EDTA)試薬の調製
２.５g CMC(１%低粘度カルボキシメチルセルロースナトリウム塩)をビーカー中のおよそ１００mL のミリQ水(MilliQ H２O )へ投入した。
０.５g EDTAを添加し、混合物を室温にて約１-３時間撹拌CMCが完全に溶解するまで撹拌する；必要であれば遠心分離をする。
第二鉄試薬：３.５%グリーンクエン酸第二鉄アンモニウム
アンモニア試薬：希釈強アンモニア溶液(J.T.Baker)２倍体積のH２O.
【０１０８】
２.  飲料サンプル処理手順
２mL 飲料サンプル(１%w/v)および１.６mL CMC/EDTA 試薬をピペットで１３x１００mm のガラス管内へ投入
【０１０９】
１００μL 鉄試薬添加およびボルテックス混合
１００μL アンモニア試薬添加およびボルテックス混合
１.２mL MilliQ H２O添加およびボルテックス混合
混合物を室温にて１０分間放置
６００nmの吸光度を測定
総ポリフェノール(mg/L)を６００nm吸光度に８２０を掛けることによって計算する。総ポリフェノールを全部のサンプルについて記録する。
【０１１０】
３.ブランクコントロール
２mLの飲料サンプルおよび１.６mLのCMC/EDTA試薬をピペットで測り、管へ投入。
１００μLのアンモニア試薬を添加しおよび完全に混ぜる。
１.３mLのMilliQ H２Oを添加し、ボルテックスする。
混合物を室温にて１０分間置く。
吸光度を測定し、サンプルに対するブランクコントロールとして用いる。
【０１１１】
実施例１６
総タンパク質測定の手順
総タンパク質濃度はBCAで測定する。ペプチド結合はアルカリ条件下でCu２+をCu+へと還元する。ついでCu+はそれぞれ２分子のバイココニック酸(bichoninic acid)(BCA)へ配位する。
【０１１２】
本アッセイはタンパク質が変わっても変化は少ない。というのは、銅はタンパク質へペプチド結合を介して反応するのであって、たんぱく質毎に相違する特定のアミノ酸鎖とではない。それ故に、BCA アッセイはビールの総タンパク質の測定に用いられる。
【０１１３】
BCA アッセイは任意のサンプルクリーンアップをコンパタブル（登録商標）タンパク質アッセイ用試薬セット(ピアスカタログ番号２３２１５)を、製品と共に提供される説明書に従って行った後に行う。このサンプルクリーンアップでは干渉してくる非タンパク質サンプル成分を、選択的にタンパク質を沈殿させ、干渉成分を上澄として除去するものである。精製されたタンパク質ペレットを再溶解し、標準的BCA アッセイ方法(BCA タンパク質アッセイキット、ピアスカタログ番号２３２２７)にてアッセイする。
【０１１４】
実施例１７
手順疎水性タンパク質測定の手順
疎水性タンパク質はタンパク質を用いるブラッドフォードアッセイにて行った。
染料試薬濃縮物(Bio-Radカタログ番号５００-０００６)を製品とともに提供される説明書にしたがって用いた。酸性条件下でタンパク質に結合すると、クーマッシー(登録商標)ブルーG-２５０の吸光度は４６５nm から５９５nm へとシフトする。クーマッシー(登録商標)染料は主に疎水性および正荷電タンパク質へと結合する。
【０１１５】
実施例１８
処理されたビール中の総ポリフェノール、総タンパク質、および疎水性タンパク質量。
【０１１６】
実施例１４の各処理ビールの総ポリフェノール、総タンパク質、および疎水性(泡生成性)タンパク質を、実施例１５−１７のプロトコールにしたがって測定した。測定された総ポリフェノール、総タンパク質、および疎水性タンパク質の処理されたビール中の濃度を表１２に示す。さらに、総ポリフェノール、総タンパク質、および疎水性タンパク質の処理されたビール中の減少量(％)を表１２に示した。
【０１１７】
【表１２−１】
2007533325.tif 000028
【表１２−２】
2007533325.tif 000029
【表１２−３】
2007533325.tif 000030
【表１２−４】
2007533325.tif 000031
【０１１８】
*ESB ビールの値は２５サンプルの平均値
*０%は本発明の処理の後の変化が本質的になかったことを示す。
【０１１９】
実施例１９
未処理シリカフィルター媒体、市販の安定剤、およびシラン-処理フィルターサンプルのビール濁りに対する効果
材料
コントロールフィルター媒体：
湯でリンスした未処理のRiceLand もみ殻灰(ＲＨＡ)
湯でリンスした未処理のRiceSil １００ＲＨＡ
Divergan F PVPP、BASF
Daraclar ９２０シリカヒドロゲル、グレースディビジョンコード番号１００００１５８６０
Clarcel CBR３珪藻土(DE)
Celite Hyflo SuperCel DE
Celite Standard SuperCel DE
【０１２０】
シラン処理シリカフィルター媒体(表５C参照)
サンプル番号７１、３-(N-スチリルメチル-２-アミノエチルアミノ)-プロピルトリメトキシシランハイドロクロライド、RiceSil １００へ配位
サンプル番号７１、３-(N-スチリルメチル-２-アミノエチルアミノ)-プロピルトリメトキシシランハイドロクロライド、RiceSil １００へ配位
サンプル番号７６、N-(３-トリエトキシシリルプロピル)-４,５-ジヒドロイミダゾール、RiceSil１００へ配位
サンプル番号７８、３-アミノプロピルトリメトキシシラン次いで N-(トリエトキシシリルプロピル)-O-ポリエチレンオキシドウレタン、RiceSil １００へ配位
サンプル番号８７、N-トリメトキシシリルプロピル-N,N,N-Cl、トリメチルアンモニウムクロリド次いで N-(３-トリエトキシシリルプロピル)-グルコンアミド、RiceSil １００へ配位
サンプル番号８８、N-(トリエトキシシリルプロピル)-４-ヒドロキシブチルアミド、RiceSil １００へ配位
サンプル番号９３、ウレイドプロピルトリメトキシシラン、RiceSil １００へ配位
サンプル番号９９、N-(３-トリメトキシシリルプロピル)ピロール、RiceSil １００へ配位
【０１２１】
他の材料：
Belk's ESB エール、(Anderson Valley Brewing Company)
トリブチルリン酸塩
５０mL ポリプロピレン遠心管
卓上型遠心分離機
Hach ２１００AN 乾燥剤を含むユニットに結合したサンプルセルを有する濁度計(濃縮によって濃度数値が変化するのを防ぐ)
シリコーンオイルと共に調製した濁度測定のためのガラスセル
氷冷ウォーターバス０℃
５μm シリンジフィルター
３０mL シリンジ
【０１２２】
方法
シラン処理フィルター媒体の洗浄処理
コントロールのフィルター媒体およびシラン処理フィルター媒体サンプルを全ての不純物を除去するために１回洗浄した。各サンプル０.３gを秤量し、５０mL ポリプロピレン遠心管へ投入した。１０mLのMilliQ 水を添加し、サンプルを１００rpmで１５分間、ゲルシェイカー上で室温にて混合した。遠心管を次いで３０００rpm にてバッチトップ遠心機にて１５分間遠心した。上清をそっとデカンテーションした後、各遠心管をホイルで覆った。ホイルへ複数の孔を空け、サンプルを真空オーブンにて５０℃で一晩、２４インチHgにて乾燥した。
【０１２３】
未処理ＲＨＡの洗浄処理
各４０g の未処理RiceLand ＲＨＡおよびRiceSil １００ＲＨＡへ、２００mL の９５℃MilliQ 水を添加し、攪拌プレート上で１０分間攪拌した。各スラリーを次いでワットマンの４番濾紙を敷いたブフナー漏斗で濾過し、乾燥ケーキを得た。全部で６００mLの９５℃の熱湯をケーキ上へ注ぎ、熱湯はすぐに吸引にて除いた。各ＲＨＡケーキをガラスビーカーへ投入し、ホイルで蓋をし、真空オーブン内で一晩、５０℃、２４インチHgにて乾燥した。
【０１２４】
ビールの処理
ビールへ０.００８%トリブチルリン酸塩を添加して、ASBC Method “Beer,１D”に記載されたように脱炭酸した。各コントロール(未処理ＲＨＡまたはDE)、市販の安定剤(PVPPまたはシリカゲル)、もしくはシラン処理シリカサンプルを表１３に記載のごとく秤量して５０mLの管に投入したものを２連作成した。最初の低濃度試験には、０.１%の各フィルター媒体、０.１%のシリカヒドロゲル、および０.０３%PVPP、これらは市販品に使用されている濃度である、を用いて、その冷蔵濁りに対する効果を調べた。２番目の高濃度実験では、１%の各フィルター媒体、１%のシリカハイドロゲル、および０.３%のPVPPを用いて、冷蔵濁り形成に対する効果を調べた。
【０１２５】
【表１３】
2007533325.tif 000032
【０１２６】
サンプルを秤量してチューブへ投入した後、３０ｍＬの脱炭酸ビールをコントロール、市販の安定剤、またはシラン処理サンプルを含有する各チューブへ添加した。各チューブを数回反転させ、コントロール、市販の安定剤、またはシラン処理サンプルが完全に濡れたのを確認した。混合物をゲルシェイカー上で１００ｒｐｍ  にて３時間攪拌した。次いでチューブを３０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し、ビール上清を濾過５μｍ  シリンジフィルターで濾過した。
【０１２７】
濁り分析
「ＡＳＢＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  『ビール２７、物理的安定性』に記載のシャポンの冷却方法(Ｃｈａｐｏｎ  ｃｏｏｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ)を冷蔵濁りを誘導するのに用いた、各ビール濾過物を室温とした後、濁りをハッチ濁度計で測定した。濾過物を次いで０℃の氷冷ウォーターバス中でインキュベートし、濁りを２および１５または１６時間に再度測定した。濁りはＥＢＣユニットで示した。未処理ビール、および処理ビールの(ａ)ゼロ時間、室温、(ｂ)２時間、０℃で放置後、および(ｃ)１５時間０℃で放置後の濁りを表１４および図１に示した(低濃度試験)。濁りはＥＢＣユニットで示した。未処理ビール、および処理ビールの(ａ)時間ゼロ、室温、(ｂ)２時間、０℃で放置後、および(ｃ)１６時間０℃で放置後の濁りを表１５および図２に示した(高濃度試験)。累積的濁り増加は１５または１６時間０℃にて放置した後のＥＢＣユニットで示される濁り値(ｃ)から室温、ゼロ時間のＥＢＣユニット値を引いて得た。非処理ビールと比べた各処理ビールの濁り減少パーセントは未処理ビールの値にて正規化して計算した。
【０１２８】
表１４：低濃度
【表１４】
2007533325.tif 000033
【０１２９】
表１５：高濃度
【表１５】
2007533325.tif 000034
【０１３０】
我々の結果は結果シラン処理フィルター媒体サンプル７１、７８、８８、および９９の濃度t １%で処理したもの、およびシラン処理フィルター媒体サンプル７１の濃度０.１０%で処理したものは、非処理ビールと比して濁りをそれぞれ９９、１５、５０、６６、および２４%改善した。
【０１３１】
発明の好ましい実施形態と共に発明を説明したが、発明の範囲内でさまざまな改変をし得ることを確認されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は０.０３または０.１%濃度における未処理ＲＨＡ、市販の安定剤、およびシラン処理シリカフィルター媒体のビール濁りに対する効果を示す。
【図２】図２は０.３または１%濃度における未処理ＲＨＡ、市販の安定剤、およびシラン処理シリカフィルター媒体のビール濁りに対する効果を示す。
【図１】
2007533325.tif 000036
【図２】
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【国際調査報告】
2007533325.tif 000038