(57)【要約】環状ジ−ＧＭＰまたはその環状ジヌクレオチドは、インビトロおよび患者体内において癌細胞増殖を阻害するために、または癌細胞アポトーシスを増大するために用いられ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞のアポトーシスを増大させる必要のある患者において癌細胞の増殖を阻害するための、または癌細胞のアポトーシスを増大させるための方法であって、その必要のある患者に有効量の環状ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドアナログを投与し、該患者において癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞のアポトーシスを増大させることを含む、方法。
【請求項２】
有効量の環状ジ−ＧＭＰがその必要のある患者に投与される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
有効量の環状ジヌクレオチドアナログがその必要のある患者に投与される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
環状ジヌクレオチドアナログが環状ジヌクレオチド化合物（Ｉ）〜（ＸＸ）からなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
増殖が阻害されるかまたはアポトーシスが増大される癌細胞が大腸癌細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
増殖が阻害されるかまたはアポトーシスが増大される癌細胞が、膵臓、乳房、肺、脳、前立腺、扁平細胞、リンパ球および白血球に由来する癌細胞からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
癌細胞の増殖を阻害するための、または癌細胞のアポトーシスを増大させるための医薬の調製における、環状ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドアナログの使用。
【請求項８】
環状ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログが環状ジヌクレオチド化合物（Ｉ）〜（ＸＸ）からなる群より選択される、請求項７記載の使用。
【請求項９】
増殖が阻害されるかまたはアポトーシスが増大される癌細胞が大腸癌細胞である、請求項７記載の使用。
【請求項１０】
増殖が阻害されるかまたはアポトーシスが増大される癌細胞が、膵臓、乳房、肺、脳、前立腺、扁平細胞、リンパ球および白血球に由来する癌細胞からなる群より選択される、請求項７記載の使用。
【請求項１１】
癌細胞の増殖を阻害するための、または癌細胞のアポトーシスを増大させるための医薬組成物であって、環状ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドアナログおよび医薬上許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
技術分野
本発明は、癌を阻害および処置するための環状ジヌクレオチド、例えば、ｃ−ジ−ＧＭＰおよびそのアナログの使用に関する。特に、環状ジヌクレオチドは、基礎的および成長因子が誘導するヒト癌細胞の増殖を阻害する。
【０００２】
従来技術の記載
実験データは、アポトーシスおよびＤＮＡ修復の調節に作用する体細胞遺伝子の変化の蓄積に関連して、正常な大腸粘膜から腺腫様ポリープないし癌に進行する結果として、ほとんどの大腸癌が生じることを示す（Ｋｉｎｚｌｅｒら，１９９６；およびＪａｓｓら，２００２）。これらの変化は、癌遺伝子、腫瘍抑制因子およびミスマッチ修復遺伝子の突然変異およびメチル化を含む（Ｋｉｎｚｌｅｒら，１９９６；およびＪａｓｓら，２００２）。環境因子（例えば、糞便の胆汁酸濃度）は、この過程を進めるのに重要な役割を果たす（Ｈｉｌｌら，１９７５；Ｒｅｄｄｙら，１９７７；Ｈｉｌｌ，１９９１；およびＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎら，２０００）。
【０００３】
米国癌協会は、２００４年に１０６，３７０症例の大腸癌が診断されることを推定している（ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ）。米国において、大腸癌は２番目に多い癌死因であり、および主な胃腸病による死因である（Ｒｕｓｓｏら，２００４）。該結果は、診断時の癌のステージに強く関連する（Ｂｒｅｓａｌｉｅｒ，２００２）。ステージ０の疾患（粘膜に限定される）を有する患者は、９０％以上が生存する（Ｂｒｅｓａｌｉｅｒ，２００２）。対照的に、大腸の外側の１またはそれ以上のリンパ節へと広がるステージＩＩＩの疾患を有する患者の５年生存率は、たったの約５５％と見積もられる（Ｂｒｅｓａｌｉｅｒ，２００２）。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびレバミソールもしくはロイコボリンを用いる、ステージＩＩもしくはＩＩＩの疾患を有する患者のための補助化学療法は、大腸癌の再発率および死亡率をそれぞれ４２および３３％まで軽減し得る（Ｂｒｅｓａｌｉｅｒ，２００２）。トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、イリノテカン、チミジル酸シンターゼ阻害剤および他の剤と併用される５−ＦＵは有望であるが、進行した疾患（ステージＩＩＩおよびＩＶ）のための処置は依然としてわずかに効果があるのみである（Ｂｒｅｓａｌｉｅｒ，２００２）。最近、臨床試験における有効性に基づいて、イリノテカンに基づく化学療法では効果のない患者において転移性直腸結腸癌を処置するために、イリノテカンと併用して、ＥＧＦＲに特異的である合成キメラモノクローナル抗体、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）がＦＤＡにより認可された。セツキシマブも、イリノテカンに基づく化学療法では効果のない、ＥＧＦＲが発現している転移性直腸結腸癌を有する患者を処置するための単剤として認可されている。
【０００４】
癌が発症するには、細胞成長下にある通常の制約に細胞が打ち勝つ必要がある。最終的に、正常な細胞成長は細胞周期により調節される。細胞周期は、２つの細胞分裂の間に核において生じる事象を含む。該周期は、Ｇ１（初めのギャップ）、Ｓ（ＤＮＡ合成）、Ｇ２（２番目のギャップ）およびＭ（有糸分裂）と呼ばれる４期に分けられる。ＤＮＡ複製のために必要とされるＲＮＡおよび蛋白質はＧ１期の間に合成される。Ｓ期において、ＤＮＡ複製が生じ、そして細胞のＤＮＡ含量は、２倍体の値、２ｎから、完全に複製された４倍体の値、４ｎに倍加する。４倍体細胞は、来るべきＧ２期における有糸分裂に備える。最終的に、Ｍ期において、細胞は、各々２倍体（２ｎ）のＤＮＡ相補鎖を含む２つの娘細胞に分裂する。細胞は、細胞周期から脱出してＧ０と呼ばれる静止状態に入ってもよい。特定条件下では、細胞を刺激して、Ｇ０期から脱出させ、次いで、細胞周期へと再進入させることができる。細胞周期のＧ１からＳ期へのエントリーを制御する主要な調節ポイントは、Ｇ１期後期に存在し、および制御（Ｒ）点と呼ばれる。癌細胞の成長は、癌細胞上の特定の成長因子受容体と相互作用する、上皮成長因子（ＥＧＦ）およびアセチルコリンを含む多数の成長因子により刺激されてもよい。
【０００５】
受容体後シグナル伝達カスケードは、細胞機能に変化をもたらすリガンド−受容体相互作用のために非常に重要である。Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のムスカリン性コリン作動性ファミリーは、Ｍ１〜Ｍ５と呼ばれる５つのムスカリン性受容体サブタイプを含む（Ｂｏｎｎｅｒら，１９８７；およびＢｒａｎｎら，１９９３）。末梢性Ｍ３受容体は、胃腸管においてよく見られ、Ｇ蛋白質に共役する。幾つかの癌細胞がＭ３ムスカリン性受容体を発現し、およびこれらの受容体の活性化が癌細胞増殖の刺激をもたらすことは明かであるが、これらの事象に内在する細胞経路は解明されていない。ＧＰＣＲと対照的に、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、成長因子受容体ファミリーの一員であり、およびこれらの受容体の活性化は癌細胞の増殖をもたらす（Ｍｕｒｐｈｙら，２００１）。ＥＧＦＲは一般的に、多数の上皮悪性腫瘍において過剰発現され、および多くの場合、悪性表現型に関連しており、およびＥＧＦＲは、肺癌、頭頸部扁平細胞癌腫および大腸癌の５０％を超える症例において存在している（Ｊａｎｍａａｔら，２００３）。最近では、ＧＰＣＲの活性化がＥＧＦＲのごとき受容体のトランス活性化をもたらし得ることが見出されている（Ｚｈａｎｇら，１９９９）。
【０００６】
ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのごとき環状ヌクレオチドは、真核生物において、重要な低分子量シグナル伝達分子としてよく認識されている。細菌では、ｃＡＭＰがグルコース異化代謝産物抑制の改善において役割を果たすが（Ｊａｃｋｓｏｎら，２００２；Ｎｏｔｌｅｙ−ＭｃＲｏｂｂら，１９９７）、ｃＧＭＰがシグナル伝達分子として作用することは示されていない。しかし、別のグアノシンヌクレオチド、環状ジヌクレオチドｃ−ジ−ＧＭＰ（３’，５’−環状ジグアニル酸、環状ジグアニル酸、環状ジグアノシン一リン酸、環状ビス（３’→５’）ジグアニル酸、環状ジグアニル酸、ｃＧｐＧｐおよびｃ−ＧｐＧｐとしても知られている）
【化１】
2007529532.tif 000002
【０００７】
［上記構造において、Ｇはグアニンである］は、少数の種において細胞内細菌シグナル伝達分子であることが報告されており、ならびにその構造は知られており、かつｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ結合した２つのｃＧＭＰ分子からなる（Ｊｅｎａｌ，２００４およびＲｏｓｓら，１９９１）。ｃ−ジ−ＧＭＰは初め酢酸菌（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ）（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍと改名されている）において同定され、およびこの種においてセルロース産生を調節することが示されている（Ａｍｉｋａｍら，１９８９；Ｍａｙｅｒら，１９９１；Ｒｏｓｓら，１９９０および１９９１）。正確な分子機序は依然として不明であるが、Ｇ．ｘｙｌｉｕｍにおける調節は、遺伝子発現を活性化する膜蛋白質に対するｃ−ジ−ＧＭＰの結合を含むと考えられる。セルロース産生は、各々細胞中のｃ−ジ−ＧＭＰレベルを制御するＧＧＤＥＦドメインを有する２つの蛋白質、ジグアニル酸シクラーゼ（Ｄｇｃ）およびｃ−ジ−ＧＭＰホスホジエステラーゼ（ＰｄｅＡ）の拮抗作用により調節されると考えられる。故に、ｃ−ジ−ＧＭＰはシグナル伝達分子であると考えられる。ＧＧＤＥＦドメインを含む蛋白質は微生物細胞内に非常に広く分布しており、このことは、それらが多数の微生物により自然に産生されることを示すが、一方で、ヒト蛋白質におけるそれらの分布はずっと低いと考えられる。
【０００８】
癌の処置もしくは予防におけるメチル化されていないオリゴヌクレオチドの使用が既に報告されている。適切なフランキング領域（ＣｐＧモチーフ）を有するＣｐＧを含む合成オリゴヌクレオチドは、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞を活性化して、様々な免疫調節性サイトカイン、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびガンマインターフェロン（Ｋｒｉｅｇ，２００２）を分泌することが見出されている。ＣｐＧＤＮＡも、共刺激分子、例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６を活性化し、および粘膜表面で強力な先天性免疫を誘導することが示されている。ＣｐＧＤＮＡの免疫賦活性は、そのアジュバントの性質により、長期のワクチン様効果をもたらす。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、抗体および細胞が介在する免疫の両方に影響を及ぼし、およびその適用は、アレルギー反応を抑制し、かつモノクローナル抗体および細胞傷害性免疫細胞を増強するワクチンアジュバントを含む。それらは化学療法剤の抗腫瘍効果も高め、および固形腫瘍の外科的切開後の生存を改善する（Ｗｅｉｇｅｌら，２００３）。ＣｐＧオリゴヌクレオチドについては、抗腫瘍効果は、直接的な抗腫瘍効果ではなく宿主免疫系の活性化を介して調節される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、それらの免疫治療的性質に基づいて、様々な癌を処置および予防するために、および癌ワクチンにおいて用いられている（米国特許第６，６５３，２９２号；第６，４２９，１９９号；第６，４０６，７０５号；および第６，１９４，３８８号）。しかし、これらのＣｐＧオリゴヌクレオチドは環状ではない。
【０００９】
環状ジヌクレオチドは細胞周期停止を惹起することが報告されている（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，１９９９）。しかし、癌処置へのそれらの適用は提案されていないし、研究されていない。毎年約６０，０００人の米国人が大腸癌により死亡している（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，１９９９；およびＷｉｎａｗｅｒら，２００３）。外科的処置は初期病変に有効であるが、進行した転移性疾患のための処置は、湿潤性および転移性大腸癌を有する患者にはあまり有効ではなく、生存率は非常に低い。故に、大腸癌の進行を阻害し、かつ癌の萎縮および退化を惹起する安全な治療（抗癌）剤が非常に有益であり得よう。
【００１０】
本明細書中引用される任意の文献は、かかる文献が先行技術に関連していること、または本出願の任意の請求項の特許性のための材料と見なされることを意図するものではない。任意の文献の内容もしくはデータに関する任意の記載は、出願時に出願人が利用できる情報に基づいており、およびかかる記載の正確性を認めるものではない。
【００１１】
発明の概要
本発明は、有効量の環状ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドアナログをその必要のある患者へ投与することにより、癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞のアポトーシスを増大させるための方法を提供する。
【００１２】
本発明は、癌の処置にも関する。本発明の方法により阻害もしくは処置されてもよい癌の例は、乳癌、大腸癌、膵癌、肺癌、脳腫瘍、前立腺癌、白血病、扁平細胞癌腫およびホジキン病を含むが、これらに限定されない。この方法は、悪性形質転換（異形成ないし異常増殖）を阻害するために用いられてもよい。
【００１３】
本発明はさらに、活性成分として環状ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドアナログを含有する医薬組成物を提供する。
【００１４】
図の簡単な説明
図１は、増加濃度のｃ−ジ−ＧＭＰが、基礎的ならびにアセチルコリンおよびＥＧＦが刺激する大腸癌細胞の増殖を阻害することを示すグラフである。水、アセチルコリン（３００μＭ）およびＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）を用いて、Ｈ５０８細胞を５日間、３７℃で処理した。スルホローダミンブルー（ＳＲＢ）比色アッセイ（Ｓｋｅｈａｎら，１９９０）により、細胞増殖を測定した。結果は３つの別個の実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍである。＊および＊＊は、水、アセチルコリンおよびＥＧＦ単独の存在下で観察されたものよりも有意に異なる値を示す（それぞれｐ＜０．０５および０．００５、対応のないスチューデントのｔ−検定）。
【００１５】
図２は、基礎的ならびにアセチルコリンおよびＥＧＦが刺激する大腸癌細胞の増殖に対するｃ−ジ−ＧＭＰおよびＧＭＰアナログの効果を示すグラフである。指示された濃度のｃＧＭＰ、５’−ＧＭＰおよびｃ−ジ−ＧＭＰを単独で用いて、ならびにアセチルコリンおよびＥＧＦの存在下、５日間３７℃でＨ５０８細胞を処理した。スルホローダミンブルー（ＳＲＢ）比色アッセイ（Ｓｋｅｈａｎら，１９９０）により、細胞増殖を測定した。結果は３つの別個の実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍである。＊および＊＊は、水、アセチルコリンおよびＥＧＦ単独の存在下で観察されたものよりも有意に異なる値を示す（それぞれｐ＜０．０５および０．００５、対応のないスチューデントのｔ−検定）。
【００１６】
図３は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞における細胞生存に対するｃ−ジ−ＧＭＰの濃度依存性効果を示すグラフである。ＭＴＳ比色アッセイにより、細胞生存（対照％）を測定した。値は３つの実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
【００１７】
発明の詳細な記載
意外にも、本発明は、環状ジ−ＧＭＰ（ｃ−ジ−ＧＭＰ）が、Ｍ３ムスカリン性（Ｍ３Ｒ）もしくは上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現している大腸癌細胞の増殖を直接阻害し得ること、または大腸癌細胞のアポトーシスを直接増大もしくは誘導し得ることを見出した。異なる器官における細胞成長の新生物調節、すなわち、成長因子が刺激する細胞増殖は同様であるので、大腸癌細胞についての結果は、Ｍ３ムスカリン性および／またはＥＧＦ受容体を発現する他の癌細胞にも適用できると考えられる。ＥＧＦが刺激する癌細胞の増殖を阻害する剤、例えば、環状ジ−ＧＭＰおよびその環状ジヌクレオチドアナログは抗癌剤として用いられ得る。非限定的な例は、膵臓、乳房（Ｂｅｒｑｕｉｎら，２００５；Ｐｅｒｅｚら，１９８４；Ｉｍａｉら，１９８２）、肺、脳（Ｚｈａｎｇら，２００４）、前立腺（Ｄａｖｉｅｓら，１９８８；Ｅａｔｏｎら，１９８８）、扁平細胞（例えば、皮膚の扁平細胞癌腫、口腔粘膜、食道；Ｋａｍａｔａら，１９８６）、リンパ球（例えば、ホジキン病）および白血球（例えば、白血病；Ｏｖａｌら，１９９１；Ｓｐｅｎｇｅｍａｎら，２００５）に由来する癌細胞を含むが、これらに限定されない。さらに、細胞アポトーシスに至る基礎的な細胞増殖の阻害は、癌細胞の多くの型において同様であるとも考えられ得る。
【００１８】
癌細胞の増殖を阻害するための、または癌細胞のアポトーシスを増大／誘導するための方法を提供する本発明に従って、その必要のある患者は、患者において癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞のアポトーシスを増大／誘導することにより癌細胞に直接作用する有効量の環状ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドアナログを投与される。本発明の好ましい一の実施態様は、大腸癌にかかっている患者を処置するために本方法を用いることである。当業者により理解されるように、本発明は、膵癌、乳癌、肺癌、脳腫瘍、前立腺癌、ホジキン病、扁平細胞癌腫および白血病を含むがこれらに限定されない癌にかかっている患者の処置も含む。
【００１９】
本発明は、有効量の環状ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドをその必要のある患者へ投与することにより悪性形質転換（異形成ないし異常増殖）を阻害するための方法も提供する。
【００２０】
本発明のさらなる一の態様は、癌細胞の増殖を阻害するための、または癌細胞のアポトーシスを増大／誘導するための医薬組成物であって、活性成分として環状ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドおよび医薬上許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有する医薬組成物を対象とする。
【００２１】
ビス（３’→５’）−環状ジグアニル酸（ｃ−ジ−ＧＭＰ）、環状ジヌクレオチドは、本発明の方法において用いられる好ましい実施態様である。ｃ−ジ−ＧＭＰの化学構造を以下に示す。
【化２】
2007529532.tif 000003
【００２２】
ｃ−ジ−ＧＭＰの合成方法は、例えば、Ｋａｗａｉら（Ｋａｗａｉ  Ｒ，Ｎａｇａｔａ  Ｒ，Ｈｉｒａｔａ  Ａ，Ｈａｙａｋａｗａ  Ｙ（２００３）Ａ  ｎｅｗ  ｓｙｓｔｈｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｃｙｃｌｉｃ  ｂｉｓ（３’→５’）ｄｉｇｕａｎｙｌｉｃ  ａｃｉｄ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｕｐｐｌ．３：１０３−４；出典明示により本明細書の一部となる）により記載されている。
【００２３】
ｃ−ジ−ＧＭＰに加えて、ｃ−ジ−ＧＭＰアゴニストとして作用する、すなわちｃ−ジ−ＧＭＰと同じ効果を有するその環状ジヌクレオチドアナログも用いられ得る。ｃ−ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログの非限定的な例を、化合物（Ｉ）〜（ＸＸ）として以下に示す：
【化３】
2007529532.tif 000004
【化４】
2007529532.tif 000005
【化５】
2007529532.tif 000006
【００２４】
上記環状ジヌクレオチドは、ｃ−ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログの単なる好ましい実施態様であって、それに限定されるものではない。例えば、グアニン塩基は他の塩基で置換され得る。
【００２５】
環状ジヌクレオチドを修飾して環状ジヌクレオチドアナログを得てもよいので、これらの修飾された環状ジヌクレオチドアナログおよびそれらの使用方法も本発明の態様として含まれる。ｃ−ジ−ＧＭＰは例えば、Ｃ、Ｎ、ＯもしくはＰで修飾されて、ｃ−ジ−ＧＭＰアナログを生じ得る。本発明において用いるためのｃ−ジ−ＧＭＰアナログは、ｃ−ジ−ＧＭＰの活性と同様の活性を有する。ｃ−ジ−ＧＭＰアナログはさらに修飾されて、別のｃ−ジ−ＧＭＰアナログを生じてもよい。さらに修飾されたｃ−ジ−ＧＭＰアナログは、元々のｃ−ジ−ＧＭＰアナログと同様の特性を有し得る。これらのさらなる修飾は所望の特性、例えば、毒性もしくは細胞取り込みの変化をもたらしてもよい。
【００２６】
ＭｅＳａｔｅ−ｃ−ジ−ＧＭＰは、細胞取り込みおよび細胞膜浸透性を増大するために、ｃ−ジ−ＧＭＰよりもさらに高い疎水性および親油性を有する、およびそれ故に、さらに高いバイオアベイラビリティを有する、環状ジ−ＧＭＰの環状ジヌクレオチドアナログである。ホスホジエステルに変換される、ホスホトリエステルによるｃ−ジ−ＧＭＰ中のホスホジエステル結合のいずれか１つもしくはその両方の修飾は、細胞内の酵素的切断を介して生じ得る。この誘導体（アナログ）は、カルボキシエステラーゼに不安定なＳ−アシル−２−チオエチル（ＳＡＴＥ）基で一時的にマスクされたリン酸基の負電荷を有する。一旦、細胞内のかかる誘導体は体内で加水分解されて、環状ジヌクレオチド親分子を放出すると考えられる。本発明は環状ジヌクレオチド（およびオリゴヌクレオチドではない）の使用に関するが、オリゴヌクレオチドの取り込みが悪いという問題に打ち勝つためにＭｅＳａｔｅホスホトリエステル分子が合成されている（Ｖｉｖｅｓら，１９９９）。合成された分子はカルボキシエステラーゼに不安定なＳ−アシル−２−チオエチル（ＳＡＴＥ）基でマスクされ、より高い親油性を獲得する。このＳＡＴＥ基は効果的に細胞膜を通過する。アセチルに相当するアシルを有する、酵素に不安定なＳＡＴＥ基を有する特定のオリゴヌクレオチド分子は、ＭｅＳＡＴＥプロオリゴと名付けられた。ＭｅＳＡＴＥヌクレオチド一リン酸も合成された（Ｐｅｙｒｏｔ  ｔｅｓら，２００４）。
【００２７】
２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ｃ−ジ−ＧＭＰは、環状ジ−ＧＭＰの２’−Ｏ−遮断誘導体（アナログ）であり、天然のｃ−ジ−ＧＭＰのものと同様の化学的性質を有すると考えられているが、天然のｃ−ジ−ＧＭＰのものよりも高い細胞膜浸透性を有すると考えられている。２’−Ｏ−モノピレニルメチル−ｃ−ジ−ＧＭＰ（蛍光標識された）および８−モノトリチウム−標識ｃ−ジ−ＧＭＰ（放射標識された）は検出アッセイのために用いられ得る。
【００２８】
ｃ−ジ−ＧＭＰは治療用途のために十分に適する。それは、４００μＭのＣ−ジ−ＧＭＰに２４時間曝露させた正常ラット腎細胞において非毒性であり、および２００μＭのｃ−ジ−ＧＭＰの５０μｌを投与してから２４時間後のＣＤ１マウスにおいて非致死性である。ｃ−ジ−ＧＭＰは生理的食塩水に可溶であり、かつ生理条件下（ｐＨ１０）で安定である。分子の構造は知られており、およびその大きさは小さく、＜５００Ｄａである。アナログは容易に設計および合成され得る。
【００２９】
多数のｃ−ジ−ＧＭＰアナログが容易に合成され得る。多数のｃ−ジ−ＧＭＰアナログの一群は、ｃ−ジ−ＧＭＰアナログのライブラリーであると考えられ得る。ｃ−ジ−ＧＭＰアナログのライブラリーは本発明の方法において有用である。例えば、ｃ−ジ−ＧＭＰアナログのライブラリーは、癌細胞の増殖を阻害するか、または癌細胞のアポトーシスを増大／誘導するｃ−ジ−ＧＭＰアナログを同定するためにスクリーニングされてもよい。
【００３０】
本発明の方法に従って用いるための、少なくとも１つのｃ−ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドアナログまたはその混合物を含有する医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に許容される担体もしくは賦形剤を用いて、慣用法により処方されてもよい。１もしくは複数の担体は、組成物の他の成分と適合し、かつそのレシピエントに有害でないという意味で「許容される」必要がある。担体は生物学的に許容かつ不活性である必要があり、すなわち、それは細胞の代謝反応の実施を可能とする必要があり、その結果、本発明の化合物がその阻害活性に作用し得る。
【００３１】
以下の担体、投与方法、投与形態などの例は、既知の可能性として記載され、そこから、担体、投与方法、投与形態などが本発明の使用のために選択され得る。しかし、当業者は、選択される任意の特定の処方および投与方法を最初に試験し、それが所望の結果を成し遂げるかを確認する必要があることを理解するだろう。ｃ−ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドは活性成分として単独で、または他の抗癌剤と組み合わせて用いられてもよいことも理解されよう。
【００３２】
用語「担体」は、ｃ−ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤もしくはビヒクルを言う。医薬組成物中の担体は、結合剤、例えば、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドンもしくはポビドン）、トラガカントガム、ゼラチン、デンプン、ラクトースもしくはラクトース一水和物；崩壊剤、例えば、アルギン酸、トウモロコシデンプンなど；滑沢剤もしくは界面活性剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはラウリル硫酸ナトリウム；流動促進剤、例えば、コロイダルシリコンダイオキサイド；甘味料、例えば、スクロースもしくはサッカリン；および／または香料、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジフレイバーを含んでもよい。
【００３３】
投与方法は、非経口、例えば、静脈内、腹膜内、筋内、皮下、粘膜内（例えば、経口、経鼻、頬側、膣内、直腸内、眼内）、髄腔内、局所および皮内経路を含むが、これらに限定されない。投与は全身または局所的であり得る。
【００３４】
経口投与のために、医薬調製物は液体形態、例えば、溶液、シロップもしくは懸濁液であってもよく、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで復元するための薬剤製品として提供されてもよい。かかる液体調製物は、医薬上許容される添加剤、例えば、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体もしくは水素添加された食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンもしくはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステルもしくは分別植物油）；および防腐剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアートもしくはソルビン酸）を用いて慣用法により調製されてもよい。医薬組成物は、医薬上許容される賦形剤、例えば、結合剤（例えば、予めゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて慣用法により調製される、例えば、錠剤もしくはカプセル剤の形態をとってもよい。錠剤は、当該技術分野においてよく知られている方法によりコーティング、すなわち、腸溶コーティングされてもよい。
【００３５】
経口投与用調製物は、活性化合物を制御放出するように適切に処方されてもよい。
【００３６】
局所投与のために、ｃ−ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドアナログは、局所的に適用されるビヒクル、例えば、膏薬もしくは軟膏中に組み込まれる。
【００３７】
頬側投与のために、組成物は、慣用法により処方される錠剤もしくはロゼンジの形態をとってもよい。
【００３８】
組成物は、注入、例えば、ボーラス注入もしくは連続注入による非経口投与のために処方されてもよい。注入用処方は、例えばアンプル中もしくは複数回投与用容器中、防腐剤を添加した単位投与形態で提供されてもよい。組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中、懸濁液、溶液もしくはエマルジョンのごとき形態をとってもよく、および処方用の剤、例えば、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤を含んでもよい。或いは、活性成分は、使用前に適当なビヒクル、例えば、パイロジェン不含滅菌水で復元するための粉末形態であってもよい。
【００３９】
組成物は、例えば、カカオ脂もしくは他のグリセリドのごとき慣用的な坐剤用基剤を含む、坐剤もしくは停留浣腸剤のごとき直腸用組成物中に処方されてもよい。
【００４０】
吸入による投与のために、本発明に従って用いるための組成物は、適当な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適当な気体を用いて、加圧容器もしくはネブライザーから提示されるエアロゾルスプレーの形態で、都合よく送達される。或いは、吸入スプレーのように加圧容器もしくはネブライザーを必要としない経鼻スプレーは、経鼻投与のために用いられ得る。加圧されたエアロゾルの場合、投与単位は、一定用量を送達するためのバルブを備えることにより、決定されてもよい。化合物のパウダーミックスならびにラクトースもしくはデンプンのごとき適当な散剤用基剤を含む、吸入器もしくは粉末吸入器において用いるための、例えばゼラチンでできたカプセル剤およびカートリッジが処方されてもよい。
【００４１】
典型的な処置計画は、数日間、最高１週間〜約６ヶ月間を含む期間にわたって、有効量を投与することを含む。
【００４２】
癌細胞に対する有効量は、マイクロモル範囲、例えば、約４０μＭ〜１ｍＭ、好ましくは、約５０μＭ〜５００μＭ、より好ましくは、約１００μＭ〜３００μＭであると考えられる。投与経路に応じて、癌細胞へかかる有効量を送達するために必要とされ得るｃ−ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドアナログの用量を慣用的な実験を用いて決定することは、医薬技術の当業者の範囲内であろう。所望の用量は、必要に応じて適切な間隔で投与される、１〜６もしくはそれ以上の分割用量（ｓｕｂｄｏｓｅ）として投与されてもよい。化合物は繰り返し投与されてもよく、またはゆっくりと、かつ絶え間なく患者へ注入されてもよい。より高用量およびより低用量で投与されてもよい。
【００４３】
インビボで投与されるｃ−ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドアナログの用量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態および体重、併用処置の種類、もしあれば、処置頻度および所望される医薬効果の性質に依存してもよいことが理解される。本明細書中にて提供される有効量の範囲は、それに限定されるものではなく、好ましい用量範囲を表すことが意図される。しかし、最も好ましい用量は、関連技術分野の当業者により理解および決定されるように、個々の対象に合わせて調節されてもよい。例えば、Ｂｅｒｋｏｗら，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９９２；Ｇｏｏｄｍａｎら，ｅｄｓ．，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，（１９９２）；Ａｖｅｒｙ’ｓ  Ｄｒｕｇ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＤＩＳ  Ｐｒｅｓｓ，ＬＴＤ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９８７），Ｅｂａｄｉ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，（１９８５），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｓｅｖｅｎｔｅｅｎｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８５）を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
【００４４】
上記方法は、環状ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドアナログを単独かまたは他の活性成分と組み合わせて投与することにより実施されてもよい。併用療法において利用される化合物は、個別もしくは複合処方中のいずれかとして同時に、または環状ジ−ＧＭＰもしくはその環状ジヌクレオチドアナログと違う時間に、例えば連続的に投与されてもよく、その結果、複合効果が成し遂げられる。投与量および投与計画は医師により調整され得、例えば、初めにその標準用量を減らし、次いで、得られた結果に応じて漸増することにより調節され得る。本発明の治療効果は、医師により決定されるような他の療法と併用されてもよい。
【００４５】
本発明は、ここで、一般的に記載されているが、それは、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されよう。該実施例は、例示を目的として提供されており、本発明を限定するものではない。
【００４６】
実施例１
本実施例に記載の実験において、ｃ−ジ−ＧＭＰ（≦５０ＡＭ）は、インビトロでの癌細胞増殖の阻害に関して顕著な特性を有することが示される。ｃ−ジ−ＧＭＰは、ヒト大腸癌（Ｈ５０８）細胞の基礎的および成長因子（アセチルコリンおよび上皮成長因子）が誘導する細胞増殖を共に阻害する。毒性研究により、正常ラット腎細胞およびヒト神経芽腫細胞を生体に関連する用量でｃ−ジ−ＧＭＰへ曝露させても全く細胞傷害性を示さないことが、明かとなった。
【００４７】
材料および方法
化学物質および試薬
純粋で高収率のｃ−ジ−ＧＭＰジアンモニウム塩の調製をもたらす最近記載された新規方法を用いて、純粋形態のｃ−ジ−ＧＭＰを合成した（Ｈａｙａｋａｗａら，２００３；およびＨｙｏｄｏら，２００４）。構造的に関連するヌクレオチド（グアノシン３’，５’−環状一リン酸（ｃＧＭＰ）およびグアノシン５’−一リン酸（５’−ＧＭＰ）；共にＳｉｇｍａから））も調べた。ダルベッコ変法イーグル培地、ＭＥＭ非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＧ４１８はＧｉｂｃｏＢＲＬから得た。他の全ての化学物質はＳｉｇｍａまたはＦｉｓｈｅｒから得た。
【００４８】
Ｈ５０８大腸癌細胞培養
１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を加えたＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ）中でＨ５０８ヒト大腸癌細胞を成長させた。トリプシン処理した後、接着培養物を集密以下（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で週に１回継代した。培養物をインキュベーター中、５％のＣＯ２および９５％の空気の雰囲気下、３７℃で維持した。
【００４９】
Ｈ５０８大腸癌細胞の増殖アッセイ
スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）比色アッセイ（Ｓｋｅｈａｎら，１９９０）を用いて、細胞増殖を測定した。細胞を約１０％の集密で９６−ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中に播種し、次いで、２４時間付着させた。成長培地を除去し、次いで、ＦＢＳ不含かつ指示された濃度の試験物質を含む新鮮な培地を加えた。５％のＣＯ２および９５％の空気の雰囲気下、指示された時間の間、３７℃で細胞をインキュベーションした。インキュベーションした後、１％の酢酸中に溶解させた０．４％（ｗ／ｖ）のＳＲＢを用いて細胞を３０分間処理した。緩衝化されていない１０ｍＭのトリス塩基を用いて、蛋白質に結合した色素を抽出した。コンピューターに接続した９６−ウェルマイクロタイタープレートリーダーを用いて、５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５０】
正常ラット腎細胞（ＮＲＫ）における毒性アッセイ
個々の細胞株におけるｃ−ジ−ＧＭＰの毒性を試験した。これらの研究では、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイを用いて、ＮＲＫ５２Ｅ細胞（正常ラット腎細胞）における急性（２４および７２時間）毒性を測定した。ＮＲＫ５２Ｅ細胞は、ＮＲＫと呼ばれる混合培養物から元々クローニングされたラット腎尿細管上皮細胞株である。Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイを細胞株の増殖を測定するために設計し、そしてそれを用いて、様々な化学物質の細胞傷害性を慣例的に測定する。Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ色素は、ＲＥＤＯＸ指標として機能し、および細胞の代謝還元に関する適切な酸化−還元範囲における蛍光および比色の変化の両方を示す。ほとんどの生細胞に対してその毒性は少ない。
【００５１】
正常ラット腎細胞に対する化学毒性
化学毒性を評価するために、９６−ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中にほぼ集密でプレートしたＮＲＫ５２Ｅ細胞を用いて、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイを行った。組織培養フラスコ中、１０％のＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中にて、細胞を維持した。トリプシン処理により細胞を回収し、基本培地中に再懸濁し、次いで、カウントした。ＮＲＫ５２Ｅ細胞を４〜５×１０４細胞／ウェルの密度でプレートした。２４時間の接着／順化期間の後に、その組織培養培地を吸引し、次いで、適切な試験溶液と交換した。ほとんどの実験については、各溶液につき８ウェルを用いた。すなわち、８つの複製ウェルの１つのカラムにて各溶液を試験した。一般に、各実験は以下の設計；プレート用のベースライン対照として用いる１つのカラム（細胞なし，プラスチック表面のみ）、負対照として用いる１つのカラム（血清含有基本培地）、溶媒対照として用いる１つのカラム（ＤＭＥＭ培地，無血清）、細胞死の正対照として用いる１つのカラム（細胞の浸透圧破壊をもたらす滅菌脱イオン水）を利用し、および８つのカラムを用いて様々な濃度のｃ−ジ−ＧＭＰ（２μＭ〜４００μＭ）を試験した。プレートを２４もしくは７２時間インキュベーションし、次いで、位相差顕微鏡で観察した。全ての溶液を吸引し、次いで、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ色素（１０容量％）含有の新鮮なＤＭＥＭと交換した。プレートを３７℃でさらに６時間インキュベーションし、その後、蛍光プレートリーダー（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ）を用いて蛍光を測定した。生の蛍光単位としてデータを集め、そしてそれを、各群につき全８ウェルからの平均値を用いて、溶媒対照のパーセントとして表した（平均蛍光試験／平均蛍光対照×１００＝対照蛍光％）。
【００５２】
正常ラット腎細胞における細胞増殖アッセイ
細胞増殖への潜在的効果を評価するために、ＮＲＫ５２Ｅ細胞を用いてＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイを行った。毒性アッセイについて記載のように細胞を回収し、次いで、９６−ウェル組織培養プレート中に約３×１０３細胞／ウェルの密度で播種し、次いで、９６時間にわたって評価した。血清含有ＤＭＥＭ基本培地中、細胞を３時間付着させた。付着させた後、その培地を吸引し、次いで、毒性アッセイについて記載した設計に従った試験溶液と交換し、各溶液にＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ色素を（１０容量％として）加えた。２４、４８、７２および９６時間目に、蛍光プレートリーダー（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ）でＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ色素の還元を測定した。形態観察も行って、細胞パターンが蛍光データに適合するかを確かめた。データを生の蛍光単位として集め、そしてそれを、各時間枠において、各群につき用いた全８ウェルからの平均値を用いて、溶媒対照のパーセントとして表した（平均蛍光試験／平均蛍光対照×１００＝対照蛍光％）。Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅそれ自体がある種の成長および阻害効果を及ぼさないことを確かめるためのさらなるチェックとして、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅなしの培地中に、より低い密度で細胞をプレートし、７２時間曝露させることによっても、実験を行った。７２時間の成長期間の後、培地を吸引し、次いで、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ（１０容量％）含有の新鮮なＤＭＥＭを全てのウェルに加えた。細胞をＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ溶液中でさらに６時間インキュベーションし、次いで、蛍光を測定し、次いで、データを収集し、次いで、記載のように表した。
【００５３】
ヒト神経芽腫細胞における毒性アッセイ
１０％のＦＢＳ、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびＬ−グルタミン（２ｍＭ）を加えたＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（１：１）培地中でＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞を培養し；その細胞培養培地を２日ごとに交換した。加湿インキュベーター中、３７℃、９５％の空気−５％のＣＯ２中で培養物を維持した。９６ウェルプレートについて約１０００〜７０００細胞／ウェルをアッセイするために、標準曲線の直線範囲を定めた。記載した全てのデータはこの範囲内であった。ＭＴＳアッセイ濃度応答曲線は以下のように行った：１８００細胞／ウェルを９６ウェルプレート中にプレートした。３０時間後、毒物不含（対照）か、または様々な濃度の毒物を含むよう、培地を変えた。次いで、細胞を４８時間曝露させ、培地を除去し、次いで、フェノールレッドなしの１００μｌの最小必須培地および２０μｌのＭＴＳ試薬を加えた。細胞をインキュベーションし、次いで、２時間後、ＥＬｘ８０８マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で、４９０ｎｍにて、プレートを測定した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、非線形回帰により、ＥＣ５０値を決定した。
【００５４】
統計分析
全グラフは、３つの別個の実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。等しい分散をもつ正規分布を仮定する、スチューデントの対応のない両側ｔ−検定を用いて、統計的計算を行った。アスタリスクの数により統計的有意性が示される（＊，ｐ＜０．０５，＊＊，ｐ＜０．００５）。
【００５５】
結果および考察
ｃ−ジ−ＧＭＰはヒト大腸癌細胞の増殖を阻害する
Ｍ３ムスカリン性（Ｍ３Ｒ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体（ＥＧＦＲ）を発現する中程度に分化したヒト盲腸腺癌に由来する細胞（Ｈ５０８細胞）の基礎的および成長因子が刺激する増殖について、ｃ−ジ−ＧＭＰの潜在的治療作用を調べた（Ｃｈｅｎｇら，２００３）。有効なスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）比色アッセイ（Ｓｋｅｈａｎら，１９９０）を用いて、細胞増殖を測定した。単独かまたは増加濃度のｃ−ジ−ＧＭＰ（０．５〜５０μＭ）を加えた成長刺激因子、アセチルコリン（３００μＭ）およびＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）の不在または存在下でＨ５０８細胞をインキュベーションした。５日間インキュベーションした後、試験した最大濃度、５０μＭのｃ−ジ−ＧＭＰは、基礎的なＨ５０８細胞増殖を約１５％だけ減少させた（図１；対照と比較してｐ＜０．０５，スチューデントの対応のないｔ−検定）。顕著には、増加濃度の環状ジヌクレオチドは、漸次、アセチルコリンおよびＥＧＦが誘導する細胞増殖を阻害した（図１；刺激因子単独と比較して，ｐ＜０．０５〜０．０１）。さらに、５０μＭのｃ−ジ−ＧＭＰを用いると、アセチルコリンおよびＥＧＦが誘導する増殖は基礎レベルまで減少した（ｐ＜０．０１）。より低い濃度のｃ−ジ−ＧＭＰは基礎的な増殖を有意には改変しないので、これらのより低い濃度はアポトーシスを誘導しないと考えられる。しかし、５０μＭのｃ−ジ−ＧＭＰでは、基礎的な増殖は阻害され、このことは、細胞の顕微鏡試験により観察されなかったが、アポトーシスが関与しているかもしれないことを示す。
【００５６】
次いで、本発明者の実験室では、構造的に関連するグアノシンヌクレオチドアナログ、グアノシン３’，５’−環状一リン酸（ｃＧＭＰ）およびグアノシン５’−一リン酸（５’−ＧＭＰ）が大腸癌細胞の増殖を阻害するか否かを試験した。これらの実験を行って、癌細胞の増殖の阻害におけるｃ−ジ−ＧＭＰの特異性を試験し、そして癌細胞への効果が一般的な細胞外ヌクレオチドまたはグアノシンヌクレオチドアナログに起因する可能性を除外した。ｃ−ジ−ＧＭＰの構造が３’−５’リン酸ジエステル結合により連結されている２つのｃＧＭＰ分子に若干類似しているため、および５’−ＧＭＰがｃ−ジ−ＧＭＰの分解産物であるために、５’−ＧＭＰおよびｃＧＭＰも選択した。５０μＭの濃度では、試験したグアノシンアナログ、ｃＧＭＰおよび５’−ＧＭＰのいずれもが５日間のインキュベーションの後にＨ５０８細胞の基礎的な増殖を改変しなかった（図２）。しかし、両アナログは、アセチルコリンおよびＥＧＦが刺激する増殖を軽減した。この作用において両アナログはｃ−ジ−ＧＭＰよりも効力が低い。
【００５７】
Ｈ５０８大腸癌細胞において、Ｍ３ＲおよびＥＧＦＲ後のシグナル伝達は、ｐ４４／４２（ＥＲＫ１／２）マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードの活性化を要する（Ｃｈｅｎｇら，２００３）。ｃ−ジ−ＧＭＰは、アセチルコリンおよびＥＧＦが誘導するｐ４４／４２ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードの活性化を改変しなかった（図示せず）。この知見は、環状ジヌクレオチドの作用はリガンド−受容体相互作用の阻害により介されないが、ジャーカット細胞にて観察されるように、細胞周期の調節に対する該剤の核内作用により介される傾向が強いことが示される。
【００５８】
これらの結果は、この大腸癌細胞株に対する作用機序におけるｃ−ジ−ＧＭＰの重要性、新規性および場合により特異性を明らかにする。Ｈ５０８細胞の増殖阻害の基礎をなす正確な分子機序は未だ十分には理解されていないが、研究されている。それにも関わらず、本明細書における知見は、ｃ−ジ−ＧＭＰがヒト大腸癌細胞の基礎的および成長因子が刺激する増殖の両方を阻害することを明確に示す。異なる器官における細胞成長の新生物調節は同様であるので、本明細書における知見は、膵臓、乳房、肺などに由来するものを含むがこれらに限定されない他の癌細胞型に適用できる。より低い濃度のｃ−ジ−ＧＭＰは、基礎的な細胞増殖を改変しない。故に、これらの濃度がアポトーシスを誘導する可能性は低い。５０μＭの環状−ジ−ＧＭＰを用いると、基礎的な増殖は阻害され、従って、細胞の顕微鏡試験により観察されなかったが、アポトーシスの可能性がある。
【００５９】
正常ラット腎細胞における細胞傷害性試験
ＮＲＫ細胞をｃ−ジ−ＧＭＰに２４時間曝露させた場合、細胞傷害性の証拠はほとんどなかった（表１）。曝露期間を７２時間に増大させた場合、２００および４００μＭのｃ−ジ−ＧＭＰで毒性が観察された（表１）。２００μＭのｃ−ジ−ＧＭＰを用いると、７２時間の集密および非集密細胞において、蛍光がそれぞれ３６および１４％減少した。２０、４０、１００μＭの化合物に曝露させた細胞では、溶媒対照と比較して蛍光は減少しなかった。比較のために、正対照（脱イオン水）は、対照に対して蛍光を１００％減少し、最大の細胞傷害性を示した。故に、全ての関連する生物学的濃度では、ｃ−ジ−ＧＭＰは正常ラット腎細胞に対して全く細胞傷害性を示さない。
【表１】
2007529532.tif 000007
【００６０】
ｃ−ジ−ＧＭＰ（２００および４００μＭ）をＮＲＫ細胞増殖について評価した場合、より高用量では常に、９６時間の曝露期間にわたってほとんど成長しない程度まで細胞増殖が阻害された。２００μＭ用量は、細胞増殖の阻害を示したが、これは４００μＭ用量ほど顕著ではない。９６時間までに、前群の蛍光は対照の８５％だった。１００μＭのｃ−ジ−ＧＭＰは、４８および７２時間で増殖の一時的減少を惹起した（それぞれ対照の蛍光の７５および８７％）。しかし、９６時間までに、細胞は溶媒対照と同程度（対照の蛍光の９４％）まで増殖した。５、２５または５０μＭのｃ−ジ−ＧＭＰにより細胞増殖は改変されなかった（データ示さず）。
【００６１】
ヒト神経芽腫細胞における細胞傷害性試験
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）アッセイは、細胞増殖、細胞傷害性および生存を測定するための定量的比色アッセイである。生細胞においてのみ、ＭＴＳをホルマザン産物に変換する。ＭＴＳは、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）に類似しており、細胞傷害性アッセイにおいて広く用いられる。その違いは、ＭＴＳ試薬用のホルマザン産物は培地に可溶であるが、ＭＴＴ試薬は可溶でないということである。
【００６２】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞におけるｃ−ジ−ＧＭＰの細胞傷害性を研究するために、増加濃度（０．０００１〜１０００μＭ）を培養培地へ加え、次いで、ＭＴＳアッセイにより細胞生存を評価した。４８時間後、環状ジヌクレオチドは用量依存的に細胞生存率を減少した（図３）。算出したＥＣ５０は３５０μＭだった。１００μＭまでは、細胞生存率への効果は全くなく；より大きい濃度では、細胞生存率における急激な減少が観察された。これらのデータに基づいて、０．０００１〜１００μＭのｃ−ジ−ＧＭＰの濃度範囲は安全と考えられてもよい。この研究により、ｃ−ジ−ＧＭＰは癌細胞の増殖を阻害する濃度で安全であり、かつ細胞傷害性がないことが示される。
【００６３】
実施例２
環状ジヌクレオチドがヒト大腸癌細胞の増殖を阻害する分子機序の測定
実施例１の結果は、環状−ジ−ＧＭＰが基礎的および成長因子が誘導する大腸癌細胞の増殖を阻害することを示す。本実施例では、Ｈ５０８および他の大腸癌細胞株においてこれらの作用の用量依存性、再現性および機序をさらに探究することが提案される。細胞周期の進行およびアポトーシスに関する細胞シグナル伝達および核変換に対する環状−ジ−ＧＭＰの作用を調べる前に、蛍光および放射標識した環状−ジ−ＧＭＰを用いて、形質膜に結合するか、または大腸癌細胞に入り、および細胞内部位で作用する環状−ジ−ＧＭＰの能力またはその能力がないことを直接測定することが提案される。標識した環状ジヌクレオチドが大腸癌細胞に入るか否かを調べること、およびアフィニティクロマトグラフィーを用いてその分子が形質膜またはサイトゾル中の特定分子と相互作用するか否かを測定することも提案される。
【００６４】
大腸癌細胞株の選択
実施例１の実験で用いた大腸癌細胞株、Ｈ５０８細胞は、中程度に分化したヒト盲腸腺癌に由来し、ならびにＭ３ＲおよびＥＧＦＲを発現する（Ｆｒｕｃｈｔら，１９９９；およびＣｈｅｎｇら，２００３）。実施例１における知見の再現性を確認するため、および他の大腸癌細胞株にそれらを拡大適用するために、本発明者らは、成長因子受容体を様々に発現する他のヒト大腸癌細胞株に対する環状ジヌクレオチドおよびアナログ（例えば、ｃＧＭＰ）の作用を調べることを提案する。特に、Ｍ３ＲおよびＥＧＦＲも発現するＨＴ−２９細胞（Ｆｒｕｃｈｔら，１９９９）、ムスカリン性受容体を発現しないＳＮＵ−Ｃ４（Ｆｒｕｃｈｔら，１９９９）ならびに高レベルのＥＧＦＲ発現を有するがＭ３Ｒを発現しないＳＷ４８０細胞が用いられ得る。これらの成長因子に対する受容体の発現は、刺激に対する細胞応答を決定する。
【００６５】
方法
個別支払い制の供給元、ＡＲＣ，Ｉｎｃから得た放射標識ｃ−ジ−ＧＭＰ（３Ｈ−ｃ−ジ−ＧＭＰ）を用いて、環状ジヌクレオチドが細胞に結合するかまたは細胞に入るか否かを測定する。癌細胞を、振盪水浴中、１００μＭの標識ｃ−ジ−ＧＭＰを含有する培地中でインキュベートし、次いで、様々な時間（０、０．５、１、２、４、６および８時間）にアッセイする。細胞懸濁液を遠心分離し、結合していないｃ−ジ−ＧＭＰを除去し、次いで、細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、強固に結合していないｃ−ジ−ＧＭＰを除去し、次いで、保持する。この「洗液」、全細胞試料のアリコート、超音波処理した溶解物に由来する上清、および超音波処理した溶解物に由来する細胞ペレットをシンチレーションカクテル（Ｓｃｉｎｔｉ−Ｓａｆｅ  Ｅｃｏｎｏｌ）へ加え、次いで、各試料の放射能（３Ｈ−ｃ−ジ−ＧＭＰの量を示す）を液体シンチレーションカウンティングにより測定する。加えて、標識−ｃ−ジ−ＧＭＰの完全性（結合しているまたは結合していない）をＨＰＬＣにより確認する。個々の実験において、特異的結合（または細胞取り込み）は、非特異的結合もしくは取り込みを阻害する高濃度の非標識ｃ−ジ−ＧＭＰの存在下、放射性リガンド結合の量として推定する。特異的結合もしくは取り込みを、全結合もしくは取り込みの値から非特異的なものを差し引くことにより決定する。
【００６６】
環状−ジ−ＧＭＰに結合する形質膜および／またはサイトゾル蛋白質を同定するために、環状−ジ−ＧＭＰでコーティングした臭化シアン−活性化セファロースカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーアプローチを使用する。このアプローチは、細胞中の特異的リガンドに対する受容体を同定するために用いられており、ｃＧＭＰ−依存性受容体およびプロテインキナーゼ（Ｌｉｎｃｏｌｎら，１９７７；およびＤｉｌｌｓら，１９７９）を同定するための固定化したｃＧＭＰの使用も含む。カラムを調製するために、２グラムの臭化シアン−活性化セファロース４Ｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を氷冷蒸留水中で２時間膨潤させ、次いで、１ｍＭの氷冷ＨＣｌで３０分間、２回洗浄した。そのゲルを、ガラス製濾過ビン（ｇｌａｓｓ−ｆｉｌｉｔｅｒｉｎｇ  ｃｒｕｃｉｂｌｅ）から吸引により排出する。次いで、それを、１００ｍｌの氷冷蒸留水で２回、および０．１Ｍの氷冷ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９）で２回洗浄し、次いで、同じ装置を用いて部分的に乾燥させる。２００μＭの環状−ジ−ＧＭＰの溶液（５ｍｌのバッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ３，ｐＨ９）中の０．７２５ｍｇ）を４℃で２ｇのゲルへ加え、次いで、穏やかに振盪しながら一晩放置する。そのゲルを濾過し、次いで、２８０ｎｍにおいて０．０２光学密度（ＯＤ）単位の吸光度が得られるまで、それぞれ１００ｍｌの０．１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ９）、１ＭのＮａＣｌおよび蒸留水で連続して洗浄する。ゲルの遊離アミノ基を遮断するために、３０ｍｌの１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ９）をそのゲルへ加え、次いで、穏やかに攪拌しながら２時間室温で放置する。そのゲルを吸引により排出し、それぞれ１００ｍｌの蒸留水および１ＭのＮａＣｌで連続して洗浄し、次いで、５０ｍｌの溶出バッファー（０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．５）で平衡化する。最後に、そのゲルを、１００ｍｌの結合バッファー（３．８４ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４，６．１６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４，０．１５ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で３回洗浄し、必要時まで４℃で貯蔵する。
【００６７】
結合バッファー中に懸濁させた、固定化した環状−ジ−ＧＭＰを含むゲルを、１０ｍｌのカラム（８０×１５ｍｍ）中に移し、次いで、３０ｍｌの結合バッファーで平衡化する。超音波処理により得られ、および３０ｍｌの結合バッファー中に再懸濁させた大腸癌細胞の全細胞溶解物を、５ｍｌ／時間の流速でカラムに加える。細胞溶解物を加えた後、そのカラムを、１５ｍｌ／時間の流速で、３０ｍｌの洗浄バッファーＡ（５６ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４，１４４ｍＭのＮａ２ＰＯ４，２ＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．２および１％のＴｗｅｅｎ２０）、次いで、洗浄バッファーＢ（５６ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４，１４４ｍＭのＮａ２ＰＯ４，１ＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．２）を用いて洗浄し、界面活性剤を除去する。全洗浄手順にわたって試料を集め、次いで、吸光度（２８０ｎｍ）をモニターする。溶出液の吸光度が約０．００１Ｏ．Ｄ．単位になるまで、３０ｍｌのバッファーＢを用いてカラムを洗浄する。次いで、溶出バッファー（２０ｍｌ）を２０ｍｌ／時間の流速でカラムに加える。受容体フラクション（２ｍｌの溶出液）を集め、次いで、２ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを直ちに７．２に調節する。各フラクション中の全蛋白質を２８０ｎｍでモニターする。溶出したフラクションを集め、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにアプライし、次いで、クーマシーブルーで染色する。環状−ジ−ＧＭＰに対する特異的結合を示すゲル上の蛋白質の分子量を、分子量の標準的基準（Ｓｉｇｍａマーカー）を用いて測定する。対照として、３０ｍｌのＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）を、非特異的結合の対照として使用する。目的の蛋白質バンドを切り取り、次いで、それらの同一性をアミノ酸配列により決定する。蛋白質の一次配列の同定は、ＢＬＡＳＴゲノムデータベースサーチにより行い、遺伝子蛋白質の名称、マッチの同一性パーセントおよび類似性ならびに標的蛋白質とのペアワイズアライメントを明らかにする。
【００６８】
期待される結果および解釈
細胞外環状−ジ−ＧＭＰはＨ５０８細胞増殖を改変するので、本発明者らは、これらの効果が、環状−ジ−ＧＭＰと表面受容体の相互作用およびそれらの結合のいずれかが調節上の変化をもたらすことによってか、細胞へ取り込まれ細胞機能を調節することによってか、またはその両機序により介されると考える。３Ｈ−ｃ−ジ−ＧＭＰシグナルが全細胞溶解物中よりも「洗液」中においてより少ないならば、このことは、ｃ−ジ−ＧＭＰが細胞と関連することを示唆するだろう。シグナルが細胞溶解物の上清中よりも細胞溶解物のペレット中においてより大きいならば、このことは、ｃ−ジ−ＧＭＰが細胞膜に関連することを示唆するだろう。しかし、超音波処理した溶解物に由来する細胞ペレット中よりも超音波処理した溶解物に由来する上清中においてシグナルがより大きいならば、このことは、ｃ−ジ−ＧＭＰが主に細胞内にあることを示唆する。その正確な取り込み機序は知られていないが、例えば、それが特異的または非特異的取り込みであるか否かというような将来の研究において取り組まれよう。このアプローチは、環状−ジ−ＧＭＰの細胞内レベルの測定を可能にする。過去の研究は、環状−ジ−ＧＭＰが真核細胞に入り得ることを示しているが、大腸癌細胞は研究されていない（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，１９９９）。結果が、環状−ジ−ＧＭＰが細胞へ入るが、飽和が生じることを示すならば、このことは、環状−ジ−ＧＭＰが、拡散ではなくむしろ飽和性受容体もしくはチャネルを介して細胞へ入ることを示唆するだろう。環状−ジ−ＧＭＰが分子上の炭素ではなく窒素もしくは酸素を介して水素結合により受容体に結合し得ることが考えられ、故に、用いる標識方法が結合活性を阻害するとは考えられない。概して、これらの研究は、環状−ジ−ＧＭＰ、細胞外分子が細胞表面に結合するかまたは実際に細胞へ入るか否かを確証するために重要である。
【００６９】
環状−ジ−ＧＭＰと膜もしくは細胞質蛋白質の相互作用を測定するためのアフィニティクロマトグラフィー実験において、カラムマトリックスと非特異的に相互作用する蛋白質は、高いイオン強度および高濃度の界面活性剤を有するバッファーを用いて溶出され得ると考えられる。かかる処理は一般的に、大腸癌細胞溶解物蛋白質とカラムマトリックスの間の疎水性および親水性相互作用の強度を軽減する。結果として、カラムに特異的に結合していない高分子が溶出される。これらの条件下では、結合した環状−ジ−ＧＭＰはカラムから解離されない。環状ジヌクレオチドは、低いｐＨにおいて、抗体−抗原反応と同様の様式で、カラムから排除できるはずである。このアフィニティクロマトグラフィー法を用いて、本発明者らは、同質のものを単離し、次いで、幾つかの環状−ジ−ＧＭＰ−結合蛋白質を同定することを期待する。サイトゾル蛋白質から形質膜を分離するための慣用法を使用する。この精製アプローチはこれらの蛋白質についてのさらなる研究を容易にし得る。さらなる研究のための蛋白質は、最優先の蛋白質の特徴に基づいて、未知であるが潜在的な調節機能を有する蛋白質が優先され得る。蛋白質は、蛋白質精製の予想される容易さに基づいて選択され、およびそれは比較的小さいサイズかつ膜貫通ドメイン欠損のものであろう。幾つかの蛋白質は、膜貫通セグメントを含んでもよく、および界面活性剤の存在下での全長蛋白質の精製および／またはこれらの蛋白質の可溶性部分のみの精製を試みる。
【００７０】
代替的アプローチ
放射標識した環状−ジ−ＧＭＰの代替的アプローチとして、蛍光標識した環状−ジ−ＧＭＰ（例えば、２’−Ｏ−ピレニルメチル−環状−ジ−ＧＭＰ）を用いて、蛍光を分光法（３７５ｎｍ）により検出する。対照として、上清中に検出される環状−ジ−ＧＭＰが細胞溶解に起因する可能性を排除するために、（ｉ）ＤＮＡのＤＡＰＩ染色および蛍光分光法もしくは電子分光法、ならびに（ｉｉ）独占的な細胞質蛋白質についてのアッセイ（例えば、ＬＤＨ）（Ｓｉｇｍａキット）を行う前に、細胞懸濁液を試験する。アフィニティクロマトグラフィーについては、カラムをコーティングするために用いる最初の濃度、２００μＭが有効な結合のためには低すぎることが見出される場合には、バッファー中の環状−ジ−ＧＭＰ（３．６２５ｍｇ／５ｍｌ）の１ｍＭ溶液を用いて、実験を繰り返す。
【００７１】
実施例３
頻繁には、哺乳類細胞において、抗増殖剤は、Ｇ１期細胞周期停止を惹起する。増殖の停止は、抗増殖剤の最終結果であるが、細胞周期停止の機序は、細胞型および剤の作用の分子機序に応じて様々である。実施例１の結果は、環状−ジ−ＧＭＰが基礎的および成長因子が誘導する大腸癌細胞の増殖を阻害することを示す。特に、Ｈ５０８ヒト大腸癌細胞を用いた実験は、環状ジヌクレオチドがアセチルコリンおよびＥＧＦが誘導するＨ５０８細胞増殖を阻害することを示す。環状ジヌクレオチドがムスカリン性もしくはＥＧＦ受容体阻害剤として作用すること、または該剤が受容体後のシグナル伝達を遮断することは可能であるが、可能性は低い。例えば、Ｈ５０８大腸癌細胞において、増加濃度の環状−ジ−ＧＭＰは、アセチルコリンもしくはＥＧＦのいずれかが誘導するｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）のリン酸化を阻害しない。故に、本発明者らは、既にジャーカット細胞において示されているように、該剤は、細胞周期停止を誘導することにより、さらに下流に作用する可能性が高いと考える。それにも関わらず、環状ジヌクレオチドの受容体もしくは受容体後の作用を排除するために、Ｍ３ＲおよびＥＧＦＲ活性化の両方に共通のシグナル伝達段階に対するその作用を調べることが提案される。これらの段階は、ｐ４４／４２ＭＡＰＫのリン酸化に加えて、ＥＧＦＲ  Ｔｙｒ９９２および転写因子ｐ９０ＲＳＫのリン酸化を含む。
【００７２】
真核細胞において、Ｇ１／Ｓ期移行の間、細胞周期進行は、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）の逐次的活性化（リン酸化）および不活性化（脱リン酸化）に依存する。Ｃｄｋ活性化は、Ｃｄｋ活性化キナーゼによるサイクリン結合およびスレオニンリン酸化を必要とする。Ｇ１期からＳ期への移行は、Ｃｄｋに結合するおよびこれを活性化するサイクリン（Ｄ、ＥおよびＡ）の蓄積により調節される。Ｃｄｋ阻害剤（特に、ｐ２１、ｐ２７およびｐ５７）の１つのファミリーも、Ｃｄｋ活性化の調節に関与している。さらに、ｐ２１活性の調節は、機能性ｐ５３の存在に依存する（Ｐａｎら，２００２）。大腸癌細胞周期進行およびアポトーシスに対する環状−ジ−ＧＭＰの作用を評価するための幾つかの補足的アプローチが提案される。環状−ジ−ＧＭＰが誘導する細胞周期停止を調べるために、細胞周期分布をフローサイトメトリーにより分析する。環状ジヌクレオチドによるＤＮＡ合成の阻害を調べるために、２時間のインキュベーションの間、ＤＮＡ中への標識した（１２５Ｉまたは蛍光で標識した）デオキシウリジンの組み込みを評価する。環状−ジ−ＧＭＰが誘導するサイクリンＡ、Ｄ１もしくはＥレベルの抑制またはＣｄｋ阻害剤発現における増大を、免疫ブロッティングにより分析する。細胞周期停止後、多数の腫瘍細胞はアポトーシスを受ける。カスパーゼ−３活性化を評価することにより、およびアポトーシスに整合する形態変化（例えば膜の小疱形成（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）または組織培養ディッシュの表面からの剥離）についての組織学的検査により、アポトーシス機序の活性化を測定する。任意の観察された効果について、環状−ジ−ＧＭＰの作用の用量依存性および経時変化を調べる。これらのアプローチにより、本発明者らは、環状−ジ−ＧＭＰが大腸癌細胞の増殖を阻害する機序を明確にする。この機序を同定することにより、環状−ジ−ＧＭＰに関連する分子の効力を開発および研究するためのさらなる研究を促進する。
【００７３】
方法
ｐ９０ＲＳＫ活性化を含む、大腸癌細胞におけるＥＧＦＲおよびｐ４４／４２ＭＡＰＫシグナル伝達の活性化は、これらの蛋白質のリン酸化を測定するための免疫ブロッティングにより行う。フローサイトメトリー細胞分析のために、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、次いで、７０％のエタノール中、１時間、−２０℃で固定する。固定された細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＲＮａｓｅ（０．０５％）およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．５％）を含有するＰＢＳと共に３０分間３７℃でインキュベーションし、次いで、ヨウ化プロピジウムで染色する。染色された細胞を、Ｇｒｅｅｎｅｂａｕｍ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒの中心施設にて利用できるＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて選別する。細胞数をＤＮＡ含量に対してプロットする。１試料あたり少なくとも１０，０００個の細胞をカウントする。細胞周期調節蛋白質の活性化は、サイクリンＡ、サイクリンＥ、サイクリンＤ１、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ４、ｐ２１、ｐ２７およびｐ５３に対する市販の抗体を用いる免疫ブロッティングを利用して調べる。α−チューブリン発現は、蛋白質ローディングを制御するために用いられる。免疫複合体は、化学発光の増強を用いて可視化される。アポトーシスの活性化は、カスパーゼ−３活性化のための市販のアッセイキット（不活性型ｐ３２から活性型ｐ１７の変換の測定）を用いて測定する。
【００７４】
期待される結果および解釈
上記したように、環状−ジ−ＧＭＰでの処理が成長因子とその受容体の相互作用を改変すること、または受容体後の細胞質シグナル伝達に作用することは期待されない。剤が核レベルでさらに下流の成長因子の効果を阻害する可能性が高い。特に、これらの効果は、細胞周期停止およびアポトーシスへの効果を含む可能性がある。前者は、Ｇｏ／Ｇｉ期での環状−ジ−ＧＭＰが誘導する細胞周期停止を含んでもよい。さらに、環状ジ−ＧＭＰの添加は、免疫ブロッティングにより分析されるように、サイクリンＡ、サイクリンＤ１およびサイクリンＥの細胞レベルを抑制してもよい。対照的に、環状−ジ−ＧＭＰの添加は、Ｃｄｋ阻害剤（ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７およびｐ５３）の発現を増大してもよい。
【００７５】
代替的アプローチ
提案された実験を行うに当たっての困難は予期されない。同様に、細胞周期進行もしくはアポトーシスにおける環状−ジ−ＧＭＰが誘導する変化についてのアッセイが一般的に用いられる。大腸癌細胞における細胞周期停止への環状ジヌクレオチドの作用を測定するために用いられてもよい別のアプローチは、インビトロＣｄｋキナーゼ活性アッセイを行うことである（Ｐａｎら，２００２）。このアッセイにおいて、環状−ジ−ＧＭＰが直接Ｃｄｋを阻害するか否かが測定できる。アポトーシスアッセイのための代替的アプローチとして、ＦＩＴＣ−標識アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色の組み合わせを用いて、非アポトーシスの生細胞、早期アポトーシス細胞、および後期アポトーシスもしくはネクローシス細胞を同定してもよい。対照細胞に対する環状−ジ−ＧＭＰ−処理細胞の、赤色（ＰＩ取り込み）から緑色（ＦＩＴＣ）の蛍光を区別するフローサイトメトリー分析は、アポトーシスに対する剤の作用を評価するための別の機序を提供する。（アポトーシス細胞を定義する）アネキシンＶｐｏｓおよびＰＩｎｅｇのパーセンテージを用いて、環状−ジ−ＧＭＰが誘導するアポトーシスについての用量応答および経時変化を測定する。
【００７６】
実施例４
アゾキシメタン（ＡＯＭ）齧歯類大腸癌モデルにおける新生物変化を阻害するための環状ジヌクレオチドの効力の測定
実施例１における結果は、環状−ジ−ＧＭＰがインビトロで大腸癌細胞の増殖を阻害することを示す。大腸の異常増殖の進行を予防もしくは阻害するための環状−ジ−ＧＭＰの使用可能性を調べるための本実施例において、大腸癌の確立された齧歯類モデルである、ＡＯＭが誘導する上皮内異常増殖−異常腺窩巣（ＡＣＦ）およびβ−カテニンが蓄積する腺窩（ＢＣＡＣ）の発達を用いる。ＡＣＦ単独では前癌病変を示すのに不十分であり得るので（Ｐａｕｌｓｅｎら，２００１；およびＹａｍａｄａら，２００３）、ＢＣＡＣも大腸発癌の初期段階を示すために用いる（Ｙａｍａｄａら，２０００および２００３；およびＴａｋａｈａｓｈｉら，２０００）。癌誘発剤（ＡＯＭ）、次いで、経口環状−ジ−ＧＭＰおよびビヒクルを用いてＡ／Ｊマウスを処置した後、（ａ）ＡＣＦおよびＢＣＡＣの発達における減少により測定される環状−ジ−ＧＭＰの抗−新生物作用、ならびに（ｂ）環状ジヌクレオチドでの処置が、細胞増殖（５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）標識）および／またはアポトーシス（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ介在ニック末端標識アッセイ（ＴＵＮＥＬ））の一般的な組織学的指標を変化させるかどうかを測定する。容易に入手可能なこの系統（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）は、ＡＯＭが誘導する発癌に対して非常に感受性であるために（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕら，１９９８；およびＢｏｉｖｉｎら，２００３）、Ａ／Ｊマウスをこれらの研究のために選択した。
【００７７】
短期動物研究において提案される上皮内異常増殖（ＡＣＦおよびＢＣＡＣ）の評価と対照的に、長期研究の主な目的は、ＡＯＭマウス大腸癌モデルにおいて、大腸腺腫および腺癌の発達に対する環状−ジ−ＧＭＰでの長期処置の効果を比較することである。第２の目的は、細胞増殖およびアポトーシスならびにＭ３ＲおよびＥＧＦＲシグナル伝達に関連する遺伝子の発現に対する処置効果を評価することである。ＡＯＭ−処置Ａ／Ｊマウスにおいて、環状−ジ−ＧＭＰでの処置は、上皮内異常増殖および明らかな腫瘍の発達を軽減すると考えられる。
【００７８】
毒性を惹起することなく上皮内異常増殖を軽減する環状−ジ−ＧＭＰの最適な経口用量を決定するための、ＡＯＭ−処置Ａ／Ｊマウスにおける用量範囲の実験
ＡＯＭは、上皮内異常増殖もしくは明らかな腫瘍の発達が評価できる前にマウスに悪影響を与えるかもしれない毒性物質である。血液レベルが１００μＭに達することに基づき、経口環状−ジ−ＧＭＰの適切な開始用量を算出した。これは、インビトロでの有効濃度の２倍である。算出は、環状ジヌクレオチドの推定される経口バイオアベイラビリティに応じて異なる。試験物質を食品へ添加する際に付随する、経口用量の送達における不確実性を回避するために、経口胃カニューレを用いて、毎朝（月曜〜金曜）、環状−ジ−ＧＭＰを送達する。環状−ジ−ＧＭＰが１００％のバイオアベイラビリティであれば、１００μＭの血液レベルに達するために、３０ｇの動物に相当する経口用量は２．２ｍｇである。マウスにおいて毒性を惹起することなく異常増殖を軽減するのに十分な環状−ジ−ＧＭＰの経口投与量を決定するために、本発明者らは、用量範囲研究を提案し、２５、５０および１００％のバイオアベイラビリティを説明する。従って、少数の動物（１０／研究群）を用いる４週間のパイロット研究において、ＰＢＳ中に新たに溶解した、３０ｇの体重のマウス、１日あたり、０、２．２、４．４および８．８ｍｇの経口環状−ジ−ＧＭＰと併用される１０ｍｇ／ｋｇのＡＯＭの効果を調べる。測定されるべき毒性のパラメーターは、体重、外見、直腸出血および生存を含む。４週間後、最後の環状−ジ−ＧＭＰ投与の２時間後に、動物を屠殺する。摘除した大腸を、異常増殖（ＡＣＦおよびＢＣＡＣ）の組織学的徴候について調べる。また、動物を屠殺する場合、環状−ジ−ＧＭＰレベルを測定するために血液を採取する。
【００７９】
胃腸上皮内異常増殖の発達を、ＡＣＦおよびＢＣＡＣの検出について大腸上皮を分析することにより研究する
発癌物質で処置した齧歯類において、ＡＣＦおよびＢＣＡＣは、肉眼で特定できる最も初期の新生物病変である（Ｐａｕｌｓｅｎら，２００１；Ｙａｍａｄａら，２０００および２００３；Ｂｏｉｖｉｎら，２００３；およびＢｉｒｄ，１９８７）。マウスにおいて、ＢＣＡＣは、ＡＣＦよりも信頼性のある異常増殖の指標である（Ｐａｕｌｓｅｎら，２００１；およびＹａｍａｄａら，２０００および２００３）。本明細書中のこれらの研究が異常増殖の有効な組織学的マーカーを確実に利用できるために、摘除した大腸をＡＣＦおよびＢＣＡＣの両方について調べる。初めの一連の実験は、ＡＯＭおよび環状−ジ−ＧＭＰで短期処置した後のマウスと比較した場合に、ＡＣＦおよびＢＣＡＣの発達に差異があるか否かを測定する。異常増殖の発達に対して領域特異的効果があるか否かを測定するために、これらの分析および長期研究のために提案されたものについて、小腸、近位１／２の大腸および遠位１／２の大腸を別々に評価および検討する。
【００８０】
実験アプローチの概要
短期研究
２週間の順化期間の後、標準的な市販の食飼を自由に摂取させた１〜２月齢のＡ／Ｊマウスを、ＡＯＭ［１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、１週間の間隔をあけて２回］を用いて処置し、およびビヒクル［０．１ｍｌのリン酸バッファー生理的食塩水（ＰＢＳ）］もしくは環状−ジ−ＧＭＰのいずれかを月曜〜金曜まで毎日投与（合計＝１０日）する。点滴１時間前に、ＡＯＭを新鮮なＰＢＳ中に溶解する。ＡＯＭの提案される用量は、齧歯類における先の大腸癌研究（Ｏｃｈｉａｉら，２００１；Ｂｉｒｄら，１９８７および１９９７）、および上記のような環状−ジ−ＧＭＰのものから選択した（環状−ジ−ＧＭＰ用量は、用量範囲実験の結果に基づいて変更されてもよいことに留意すること）。２週間の処置期間から４週間後、ＣＯ２窒息によりマウスを安楽死させ、次いで、大腸を摘除し、次いで、１０％のホルマリン中に固定する。固定した組織を、組織学的実験のために染色する（ＡＣＦ用に０．２５％のメチレンブルーおよびＢＣＡＣ用にアビジン−ビオチン免疫ペルオキシダーゼ法）。動物の数は以下に記載の算出により決定したが、ＡＯＭもしくは環状−ジ−ＧＭＰの毒性が早死をもたらすならば、用量範囲研究に基づいて、その数を増大してもよい。
【００８１】
長期研究
２週間の順化の後、１〜２月齢のマウスを、ＡＯＭ（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、注入ごとに１週間の間隔をあけて８回）を用いて処置し、およびビヒクル（ＰＢＳ）もしくは環状−ジ−ＧＭＰ（８週間の間、月曜〜金曜までの毎日）のいずれかを投与する。マウスが肛門出血を発症した場合か、または大腸癌の明らかな証拠を発症しないならば初めのＡＯＭ注入から２５週間後に、マウスを屠殺する。エンドポイントは、このマウス大腸癌モデルを用いた以前の研究（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕら，１９９８）に基づいて選択した。安楽死の２時間前に、マウスにＢｒｄＵｒｄ（５０ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内）を投与し、Ｓ期細胞を標識する（Ｗａｌｉら，２００２）。安楽死させた後、腸を切除し、次いで、短期研究について記載したように処理し、縦方向に切断し、次いで、紙上に横たえ、肉眼的病変をカウントする。処置期間にわたって同じエンドポイントを用いて、摘除した大腸において、ウェスタンおよびノーザンブロットならびにリアルタイムＰＣＲにより、細胞増殖およびアポトーシスに関連する選択された遺伝子の活性化および発現を測定する。
【００８２】
試料サイズ算出
ここで提案する全研究における１群あたりのマウスの数は、０．８の統計的検出能（０．２０の□エラーおよび＜０．０５の□エラー）に基づいて結果の再現性を確実にするために必要とされる数の試料サイズ算出に基づく。ＡＯＭおよび環状−ジ−ＧＭＰを用いたマウスの短期および長期処置の効果を比較するために、各マウスにおけるＡＣＦ、ＢＣＡＣおよび腫瘍の数を結果の判定として用いる。ＡＯＭおよびビヒクル（ＰＢＳ）で処置したマウスを、ＡＯＭおよび環状−ジ−ＧＭＰで処置したマウスと比較する。この比較についてのＡＣＦおよびＢＣＡＣの数の平均の差異を、対応のないｔ−検定を用いて測定する。等しい分散を仮定して、１群あたり２０匹のマウスを用いて、０．０５の（片側）有意レベルで大きな差異（エフェクトサイズ０．８）を検出する約８０％の検出能が提供される（Ｃｏｈｅｎ，１９８８）。例えば、ＡＯＭで処置したマウスにおけるＡＣＦの数の平均が３６．４（ＳＤ＝２．４）であるならば（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕら，１９９８）、ＡＯＭおよび環状−ジ−ＧＭＰで処置したマウスにおけるＡＣＦの平均数において１２％の減少を検出する８０％の検出能を有し得る。これらの算出は、最高１０％の動物が（麻酔、毒性もしくは予期せぬ原因により）未熟に死亡してもよいことを考慮している。ＡＯＭで処置したマウスにおけるＢＣＡＣの発達について、限られた公開データがある（Ｙａｍａｄａら，２０００および２００３；ならびにＴａｋａｈａｓｈｉら，２０００）。上記したように、ＤＣＴを用いる提案された用量範囲研究により、研究群の動物の数が変更されてもよい。
【００８３】
プラセボおよび環状−ジ−ＧＭＰを用いたＡＯＭ−処置マウスの長期処置の効果を比較するために、上記した群間で同じ比較を行う。長期研究における主な目的は、腫瘍発生頻度である。１群あたり３０匹のマウスを用いて、研究は、０．０５の（片側）有意レベルで腫瘍発生頻度において中程度〜より大きな差異（エフェクトサイズ０．７）を検出する約８０％の検出能を有し得る（Ｃｏｈｅｎ，１９８８）。ＡＯＭで処置したマウスの腫瘍発生頻度が５０％ならば、ＡＯＭおよび環状−ジ−ＧＭＰ（６０％）で処置したマウスにおける腫瘍発生頻度において２０％の減少を検出する８０％の検出能を有し得る。これらの算出は、１５〜２０％の動物が（麻酔、毒性もしくは予期せぬ原因により）未熟に死亡するかもしれないことを考慮している。各比較についての増殖およびアポトーシスの指標ならびに腫瘍数における差異を、対応のないｔ−検定により測定する。ＡＯＭに長期曝露させた後のマウスの生存率を、カプラン・マイヤー法により算出する（Ｃｏｌｅｔｔ，１９９４）。差異は、ログランク検定により分析できる（Ｃｏｌｅｔｔ，１９９４）。統計分析は、ＳＡＳソフトウェアを用いて実施する。
【００８４】
特定方法
動物モデルの選択
ＡＯＭは、齧歯類においてＡＣＦ、ＢＣＡＣおよび大腸癌を確実に誘導する合成アルキル化剤および発癌物質である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕら，１９９８；Ｏｃｈｉａｉら，２００１；およびＹａｍａｄａら，２００３）。ＡＯＭ齧歯類モデルは、ヒト大腸癌において観察される病理学的および遺伝学的変化を模倣する（Ｋｉｎｚｌｅｒら，１９９６；Ｗａｎｇら，１９９８；およびＧｕｄａら，２００１）。環状−ジ−ＧＭＰでの処置が、ＡＯＭが誘導するＡＣＦ、ＢＣＡＣ（短期研究）および大腸腫瘍（長期研究）の発達に作用するか否かが測定できるので、マウス大腸癌モデルは特に有用である。細胞増殖およびアポトーシスに関連する遺伝子の発現も調べる。
【００８５】
ＡＣＦおよびＢＣＡＣについての大腸上皮の分析
ＩＡＣＵＣに認可された麻酔剤（ケタミン／キシロシン（ｘｙｌｏｓｉｎｅ））を投与した後、標準的技法を用いて大腸を切除し、次いで、氷冷ＰＢＳを管腔に流し、糞便を除去する。大腸を縦方向に切断し、次いで、顕微鏡用スライド上にセットし、粘膜にスライドアップし、次いで、中和した１０％のホルマリン中で１時間固定し、次いで、７０％のエタノール中、−２０℃で貯蔵する。全スライドに固定したマウス大腸組織を、０．２５％のメチレンブルーを用いて３０秒間染色し、冷ＰＢＳを用いて脱染し、次いで、解剖顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ｓｔｅｍｉ  ＤＶ−４）を２０〜４０×の倍率で用いて透視することによりＡＣＦについて調べる。本出願については、ＡＣＦを、「メチレンブルーでより強く染まる上皮細胞の肥厚層を有し、多くの場合、スリット状の管腔開口部を有し、さらなる腺窩周囲空間を有し、および顕微鏡の焦点面から隆起している、その領域にあるほとんどの腺窩よりも大きな１またはそれ以上の腺窩」と定義する（Ｂｏｉｖｉｎら，２００３）。ＡＣＦについて評価した後、組織をＰＢＳで脱染し、次いで、標準的な技法を用いてβ−カテニンについての免疫組織化学により、ＢＣＡＣを同定する（Ｗａｌｉら，２００２；Ｐａｕｌｓｅｎら，２００１；およびＴａｋａｈａｓｈｉら，２０００）。簡潔に言うと、パラフィン包埋したホルマリン固定セクションを、脱パラフィンし、再水和し、次いで、クエン酸バッファー中、マイクロ波により、抗原回復を行う（Ｗａｌｉら，２００２；およびＴａｋａｈａｓｈｉら，２０００）。モノクローナルβ−カテニン抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ヤギ抗マウス抗体および染色キットは市販されている。ＡＣＦの数、ＡＣＦ中の異常な腺窩の総数およびＢＣＡＣの数を、各マウスに由来する大腸の近位および遠位の半分ずつならびに小腸においてカウントする。スライドを評価する研究者は、処置（すなわち、対照もしくは環状−ジ−ＧＭＰ）について知らされていない。
【００８６】
細胞増殖およびアポトーシスにおける胆汁酸が誘導する変化についての組織学的試験
増殖の指標として、屠殺２時間前に、マウスにＢｒｄＵｒｄ（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入をし、Ｓ期細胞を標識する。抗−ＢｒｄＵｒｄ（Ｓｉｇｍａキット）を用いて免疫染色した後、１０００個の細胞中のＢｒｄＵｒｄ−陽性の核の数をカウントすることにより、ＢｒｄＵｒｄ−標識を測定する（データはＢｒｄＵｒｄ陽性のパーセントとして示される）（Ｗａｌｉら，２００２）。これらの分析では、研究者は処置（すなわち、ＰＢＳもしくは環状−ジ−ＧＭＰ）について知らされていない。アポトーシスの指標として、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ介在ニック末端標識アッセイ（ＴＵＮＥＬ，Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）を用いることが提案される。ＢｒｄＵｒｄおよびＴＵＮＥＬ標識では、粘膜筋層から大腸管腔に及ぶ完全な腺窩のみがカウントされる（Ｗａｌｉら，２００２）。
【００８７】
マウスの体重および生存に対する胆汁酸処置の効果の測定
動物の体重を毎週測定する。生存を、処置開始（２週目）から２７週目までの日において測定し、次いで、カプラン・マイヤー法により分析する。
【００８８】
大腸腺腫および腺癌の誘導およびＢｒｄＵｒｄ標識を、環状−ジ−ＧＭＰ−およびビヒクル−処置マウスにおいて分析および比較する
腺腫および腺癌の組織学的定義は、コンセンサスリコメンデーション（Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒｓ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ；Ｂｏｉｖｉｎら，２００３）に準拠する。腫瘍の数を、各マウスに由来する大腸においてカウントする。肉眼で見える腫瘍を摘除し、次いで、二分する。腫瘍の半分を、室温で一晩、中和した１０％のホルマリン中に固定し、次いで、標準的技法により組織学用に処理する。他の半分は、７０％のエタノール中に固定し、次いで、蛋白質およびＲＮＡを抽出する。腫瘍が肉眼的に検出されない場合、０．２５％のメチレンブルーを用いて組織を染色し、次いで、低倍率で調べる（Ｏｃｈｉａｉら，２００１）。
【００８９】
細胞増殖およびアポトーシスに関連する遺伝子の発現における変化の試験 
ＡＯＭマウス大腸癌モデルを用いて、提案される実験では、腺腫、腺癌および隣接する「正常」組織において、細胞増殖に関与することが知られている遺伝子発現を比較する。特に、この一連の実験において、ウェスタンブロッティングを用いて蛋白質を調べ、ならびにノーザンブロッティングおよびリアルタイム−ＰＣＲを用いて、細胞増殖の調節に関与することが知られているｐ９０ＲＳＫおよび下記の選択されたｐ９０ＲＳＫ活性化の遺伝子標的（Ｆｒｏｄｉｎら，１９９９）：ｃＡＭＰ応答エレメント結合蛋白質（ＣＲＥＢ）（Ｇｉｎｔｙら，１９９４；およびＸｉｎｇら，１９９６）；ＮＦ−κＢ（Ｇｈｏｄａら，１９９７；およびＳｃｈｏｕｔｅｎら，１９９７）；およびｃ−Ｆｏｓ（Ｘｉｎｇら，１９９６）についてのｍＲＮＡを調べる。適切な抗体が入手できるならば、脱パラフィンした組織ブロックについて免疫組織化学を用いる。
【００９０】
これらの研究では、蛋白質およびｍＲＮＡそれぞれの抗原性および構造的完全性を維持するために、大腸組織を、ホルマリンではなく７０％のエタノール中で３０分間固定処理する（Ｂｉｒｄら，１９９７）。直ぐに処理しない組織は、凍結し、かつ−８０℃で貯蔵する。大腸を、氷を充填した滅菌ペトリディッシュのふたにセットし、次いで、解剖顕微鏡（１０〜２０×倍率）で調べる。ＲＮＡ分析（以下を参照のこと）のために、変性溶液を含む微小遠心チューブ中に腫瘍をセットする。ウェスタンブロッティングのために、ＳＤＳ試料バッファー中、組織を１０分間ボイルする。次いで、標準的手法を用いて、試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、エレクトロブロッティング、次いで、目的蛋白質に特異的な抗体を用いるプロービングに付す。これらの研究のための参照（対照）試料は、腫瘍近くの領域から取り出した「正常」組織からなる。ノーザンブロッティングおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲのためのＲＮＡは、新鮮な組織のための標準的手法を用いて抽出する。
【００９１】
遺伝子発現レベルを評価するための定量的ＲＴ−ＰＣＲ
先の技法の限られた出発物質、結果のより大きな直線性（銀粒子は飽和し、およびはるかに狭い直線範囲を有する）およびより大きな感受性を考慮すると、多くの点で、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはノーザンブロッティングより好ましい。ゲノムＤＮＡを混入することによる増幅を防ぐために、フォワードおよびリバースプライマーを異なるエキソンに配置する。得られた物質を標準化するために、ＴａｑｍａｎリボソームＲＮＡコントロール用試薬（ＶＩＣ−標識；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いる。定量的ＲＴ−ＰＣＲをＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ装置で行う。エキソン−エキソン境界の情報は、ＳａｎｇｅｒＣｅｎｔｅｒから得る。ＲＮＡ配列およびエキソン−エキソン境界の情報を、定量的ＰＣＲプライマーデザインソフトウェアに入力する。許容されるプライマーおよびプローブセットは、製造元の推奨条件内（プライマーのＴｍ，５８〜６０℃；プローブのＴｍ，プライマーのものより１０℃以上高いもの）で探索する。５’−末端のレポーターとしてＦＡＭを用いて、および３’−末端のクエンチャーとしてＴＡＭＲＡもしくはＢＨ１を用いて、プローブを標識する。
【００９２】
ランダムヘキサマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて、ｃＤＮＡを合成する。定量的ＲＴ−ＰＣＲのための反応混合液は、２．５μ１のＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、フォワードおよびリバースプライマーの両方（３００ｎＭ）、プローブ（２００ｎＭ）、１０ｎｇの全ＲＮＡに由来するｃＤＮＡと合わせ、次いで、水を加えて、２５μｌにすることにより調製する。サーマルサイクリング条件は、５０℃で２分間の初めのサイクル、９５℃で１０分間、次いで、９５℃で３０秒間および６０℃で１分間の４０サイクルである。各ランにおいて、連続希釈した標準ｃＤＮＡが増幅され、そして未知試料の値が、標準曲線からの相対量として推定される。各試料のＰＣＲ反応は３通りずつ行われ、そして３つの反応の平均を試料についての代表値と規定する。ＴａｑＭａｎリボソームＲＮＡコントロール用試薬（ＶＩＣ色素標識：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびβ−アクチンを内部標準として用い、半定量的データを得る。
【００９３】
環状−ジ−ＧＭＰのアポトーシス作用の試験
細胞増殖の減少（細胞周期停止）、アポトーシスの増大またはその両方のために、大腸腫瘍形成の阻害が生じてもよい。補足的アプローチを用いて、環状−ジ−ＧＭＰが、ＡＯＭマウス大腸癌モデルにおいてアポトーシスを増大するか否かを測定する。ＤＮＡ鎖切断を有する細胞が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ介在ニック末端標識（ＴＵＮＥＬ；Ａｐｏｐｔａｇキット，Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）により、摘除した大腸において同定される。カスパーゼ、特にカスパーゼ−３は、アポトーシス調節において重要な役割を果たす（Ｃｏｈｅｎ，１９９７）。カスパーゼ−３の活性化を、市販の抗血清および試薬を用いる標準的免疫組織化学を利用して、脱パラフィンした組織ブロックにおいて調べる（Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎら，２００３）。ウェスタンおよびノーザンブロッティングならびにＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｐ２１およびｐ５３を含むアポトーシスに関連する蛋白質および遺伝子の発現も調べる。
【００９４】
データ分析
必要に応じて様々な方法を用いて、数値データの有意性を決定する。平均間の有意性は、多重比較のためにボンフェローニ補正を行うスチューデントの対応のないｔ−検定により決定するか、或いは分散分析、次いで、ダネット検定により決定する。ネステッドデザイン用（ｆｏｒ  Ｎｅｓｔｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ）ＡＮＯＶＡを用いて、ＢｒｄＵｒｄ標識に対する処置効果を調べる。チューキーの方法を用いて、多重比較に適合させる。ノンパラメトリッククラスカル−ワリス検定を用いて、正規分布していない変数（例えば、群間のＡＣＦ、ＢＣＡＣおよび腫瘍の数の比較）を分析する。ウェスタンおよびノーザンブロットならびに他の数以外のデータを少なくとも３回繰り返して行い、結果の再現性を検証する。蛋白質または遺伝子発現レベルにおける変化の定量化のために、ブロットの密度測定を行い、次いで、スチューデントの対応のないｔ−検定により比較する。＜０．０５のＰ値は、有意であると見なされる。
【００９５】
代替的アプローチ
環状−ジ−ＧＭＰを用いたこれらの提案される用量範囲研究（Ｄ．２．ａ．ｉを参照のこと）は、毒性を伴うことなく新生物病変の数を軽減する最も適切な用量を決定できる。
【００９６】
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【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】図１は、増加濃度のｃ−ジ−ＧＭＰが基礎的ならびにアセチルコリンおよびＥＧＦが刺激する大腸癌細胞の増殖を阻害することを示すグラフである。
【図２】図２は、基礎的ならびにアセチルコリンおよびＥＧＦが刺激する大腸癌細胞の増殖に対するｃ−ジ−ＧＭＰおよびＧＭＰアナログの効果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞における細胞生存率に対するｃ−ジ−ＧＭＰの濃度依存性効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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