(57)【要約】  本発明は、膵線維症の処置に使用する医薬の調製のための、一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１は、ＣＨ３基またはＣＨ２ＯＨを示し、Ｒ２は、Ｈまたは１〜５個の炭素原子を有するアルキル基を示すか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、先に述べた式（Ｉ）の（ａ）の位置の炭素および窒素と一緒になって式（ＩＩ）を有する基を形成している）から選択されるグリコシダーゼ阻害剤の使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
嚢胞性線維症の処置用医薬の調製のためのグルコシダーゼ阻害剤の使用。
【請求項２】
嚢胞性線維症の処置用医薬の調製のための、以下の一般式（Ｉ）：
【化１】
2007510699.tif 000017
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨ基を示し、
Ｒ２は、Ｈまたは１〜５個の炭素原子を有するアルキル基を示すか、
あるいは、Ｒ１およびＲ２は、上記式（Ｉ）の（ａ）の位置の炭素および窒素と一緒になって、式：
【化２】
2007510699.tif 000018
で示される基を形成している）
で示される化合物から選択される、請求項１に記載のグルコシダーゼ阻害剤の使用。
【請求項３】
以下の一般式（ＩＩ）：
【化３】
2007510699.tif 000019
（式中、Ｒ２は、Ｈまたは１〜５個の炭素原子を有するアルキル基を示す）
で示される化合物から選択される、請求項１または２に記載のグルコシダーゼ阻害剤の使用。
【請求項４】
以下の一般式（ＩＩａ）：
【化４】
2007510699.tif 000020
（式中、Ｒ２は、Ｈまたは１〜５個の炭素原子を有するアルキル基を示す）
で示される化合物から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコシダーゼ阻害剤の使用。
【請求項５】
以下の一般式（ＩＩ．１）または（ＩＩ．２）：
【化５】
2007510699.tif 000021
（式中、Ｒ２は、Ｈまたは１〜５個の炭素原子を有するアルキル基を示す）
で示される化合物から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルコシダーゼ阻害剤の使用。
【請求項６】
以下の式：
【化６】
2007510699.tif 000022
で示される、式（ＩＩ．１）または（ＩＩ．２）（式中、Ｒ２が、ＨまたはＮ−ブチル基を示している）の化合物の、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
化合物ＮＢ−ＤＮＪまたはＮＢ−ＤＭＪの、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
化合物ＮＢ−ＤＮＪの、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
経口（シロップ剤、懸濁剤、ゼラチンカプセル剤、錠剤、散剤、または顆粒剤）、直腸（坐剤）もしくは鼻腔経路（吸入によるエアゾール剤、または滴剤）により、特に、成人については１日当り約１ｍｇ〜２ｇの有効成分の割合で、または小児および乳児については１日当り１ｍｇ〜１ｇの割合で、１回以上の用量で投与できる医薬の調製のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１０】
ＣＦＴＲチャネル活性化化合物と組み合わせた、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
以下の式：
【化７】
2007510699.tif 000023
で示されるゲニステインまたは以下の式（ＩＩ）：
【化８】
2007510699.tif 000024
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、水素原子を示すか、またはＣ１およびＣ２との組合せで６個の炭素原子を有する芳香族環を形成し、
Ｒ５は、水素原子、または、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは置換アルキル基、特にブチル基、あるいは式ＣＯＯＲ’（Ｒ’は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖または置換アルキル基、特にエチル基を示す）で示されるエステルを示し、
Ｙは、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、または−ＮＨＣＯＣＨ３基を示し、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は水素原子を示すか、あるいは、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、またはＲ１０の少なくとも１つは、ハロゲン原子、特に、塩素、臭素、もしくはフッ素原子を示し、
Ｘは、アニオン形態のハロゲン原子、特に臭素Ｂｒ−もしくは塩素Ｃｌ−原子、またはアニオン形態の原子基を示す）
で示されるベンゾ［ｃ］キノリジニウムの誘導体と組み合わせた請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物の、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
以下の化合物：
【化９】
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2007510699.tif 000026
2007510699.tif 000027
2007510699.tif 000028
から選択される式（ＩＩ）のベンゾ［ｃ］キノリジニウムの誘導体と組み合わせた請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物の、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１３】
嚢胞性線維症の治療において、同時にもしくは別々に使用するかまたは時間をかけて使用するための組合せ製品としての、請求項１〜８のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の少なくとも１種類と請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＣＦＴＲチャネル活性化化合物の少なくとも１種類とを含む製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、嚢胞性線維症の処置用医薬の調製のためのグルコシダーゼ阻害剤の使用である。
【０００２】
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、欧州および北米の人口集団において最も広まっている致死性の常染色体劣性遺伝性疾患である。ＣＦ遺伝子（遺伝子座７ｑ３１）は、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通調節因子（Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator））と呼ばれる膜貫通タンパク質をコードしている（Tsuiら、1985；Riordanら、1989）。ＣＦ遺伝子の変異により、肺、汗腺、腸、および膵外分泌部などの様々な器官の細胞膜を通る水および電解質の輸送に異常が生じる。ＣＦＴＲタンパク質の１０００を超える変異が存在するが、最も頻繁に起こる変異（患者の７０％）は、ＮＢＦ１ドメインの５０８位のフェニルアラニンの欠失である（ｄｅｌＦ５０８）。ＣＦ患者の主な死亡原因はこの欠失に関連しており、粘液の粘性上昇により引き起こされる感染または肺不全が生じる。この粘性により気道が閉塞し、日和見細菌による感染のリスクが高まる。更に消化管系、特に膵臓系（膵不全の患者）に増悪が認められる。ＣＦＴＲタンパク質は、ＡＢＣ膜輸送体スーパーファミリーに属する１４８０アミノ酸の糖タンパク質である。ＣＦＴＲは、健康個体の肺上皮細胞の先端形質膜に位置する塩素チャネルである。ＣＦＴＲは、水および電解質の経上皮輸送に関与し、これにより健康個体における肺気道の水和が可能となる。ＣＦ患者では、小胞体（ＥＲ）に留まるこのタンパク質が正しくアドレッシングされないため、このタンパク質は形質膜に存在しない。この場合、肺気道の水和はもはや機能していない。ｄｅｌＦ５０８欠失によりＮＢＦ１ドメインの折りたたみがむちゃくちゃになり、核タンパク質の完全な成熟が妨げられ、その結果、その生合成中の極く早い時期に分解される。しかし、ｄｅｌＦ５０８タンパク質は膜に到達すると、クロライドチャネルとして機能する。それ故、この疾患の処置における鍵の１つは、細胞膜に向かうようにｄｅｌＦ５０８を再度アドレッシングすることである。一旦膜に到達すると、ｄｅｌＦ５０８の輸送活性は、内因性または外因性の生理的アゴニストにより刺激され得る。
【０００３】
ＣＦＴＲタンパク質をアドレッシングする機序は、以下のように遂行される。その新合成後、ＣＦＴＲタンパク質は小胞体腔に見出されるが、そこにおいてグリコシルトランスフェラーゼにより様々なグリコシル化を受ける。該タンパク質は、とりわけ３個のＮ−結合グルコースおよび１個のＮ−結合マンノースを伴なって見出される。該グルコース２個が、グルコシダーゼＩおよびＩＩにより除去される。従属的なカルシウムを有するシャペロンであるカルネキシンまたはカルレティキュリンが、モノグリコシル化タンパク質を認識し、Ｎ−結合グルコースを介して該モノグリコシル化タンパク質に結合する。これらのシャペロンは、ＥＲに存在する種々のＣＦＴＲタンパク質が互いに凝集するのを防ぎ、ＥＲｐ５７などの他のシャペロンが結合できるようにする。このようにして形成されたＣＦＴＲ／カルネキシン／ＥＲｐ５７複合体により、ＣＦＴＲの折りたたみが可能となる。その後、グルコシダーゼＩＩが残りのグルコースを除去し、これによりシャペロンからＣＦＴＲが放出される。折りたたみが正しくなければ、グルコシルトランスフェラーゼによりグルコースがＣＦＴＲに付加され、良好に折りたたまれるまで再度１回以上のサイクルを受けることができる。折りたたみが依然として正しくなければ、マンノシダーゼによりＮ−結合マンノースが除去され、その後、該タンパク質はトランスロコンチャネル複合体を介してサイトゾルへと輸送され、ここで分解されることができる（Ellgard & Helenius、2003）。この現象は、ＣＦＴＲ−ＷＴの８０％に、ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲの９９％に観察される。一旦サイトゾルに入ると、該タンパク質は、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、またはＨｄｊ−２などの種々のシャペロンにより助けられる。これらのシャペロンにより、ユビキチンはＣＦＴＲに結合できるようになる。このように標識されているのでＣＦＴＲは認識され、ＡＴＰ依存性である２６Ｓプロテアソーム複合体により分解される（Gelmanら、2002）。ＣＦＴＲの折りたたみが、小胞体制御機序により正しいと判断された場合、該タンパク質はゴルジ装置へと到達することができる。このタンパク質は、マンノースを介してＣＦＴＲに結合している「積み荷」タンパク質ＥＲＧＩＣ−５３（レクチンファミリーに属する）により助けられる。ＥＲＧＩＣの通過は、ＣＯＰＩ因子により形成される小胞を介して起こる（Ellgard & Helenium、2003）。該タンパク質は、正しく折りたたまれていない場合、ゴルジ装置のエンドグリコシダーゼＨに感受性であり（Chengら、1990）、その後、小胞体へと戻され、そこで分解されるようである。一方、正しく折りたたまれたタンパク質は、エンドグリコシダーゼＨに抵抗性であり、ＶＩＰ３６因子（ＥＲＧＩＣ−５３の相同体）により助けられ、先端膜へと運ばれる（Fiedler & Simons、1995）。
【０００４】
グルコシダーゼ阻害剤のカスタノスペルミンは、肺上皮細胞表面上でのｄｅｌＦ５０８の存在の回復に対して効果を及ぼすことがすでに観察されているが（Weiら、1996）、他方で、この化合物が、膜のｄｅｌＦ５０８のアドレッシングを回復できるだけでなく、ｄｅｌＦ５０８をイオン輸送体として機能させることができることまでは記載されていない。それ故、この文献の著者は、嚢胞性線維症の処置の枠組み内での、この化合物の可能性ある使用に関する仮説は提唱していない。
【０００５】
本発明者らは、このグルコシダーゼ阻害剤が、ｄｅｌＦ５０８のイオン輸送活性または細胞生存度に影響を及ぼすことなく、ｄｅｌＦ５０８の正しくかつ特異的なアドレッシングを確実に行なうことができるかどうかを判断するために、このグルコシダーゼ阻害剤を厳密に研究した。
【０００６】
Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）は、小胞体のグルコシダーゼＩおよびＩＩ阻害剤であり、これは最初ヒトの抗ウイルス分子として開発された。これらの酵素の阻害により、ＨＩＶウイルス（ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus））のエンベロープの糖タンパク質の折りたたみが改変され、結果として、ウイルスサイクルが遮断されることが判明している（Plattら、2001）。ＮＢ−ＤＮＪを使用した治療は、後天性免疫不全症候群をかかえている患者で評価されており、この分子は十分に耐容性があり、高濃度（２ｍＭ）でさえ培養液中の組織に対して細胞毒性ではない。更に、これらの臨床治験により、ＮＢ−ＤＮＪはまた、グリコシルトランスフェラーゼに対しても阻害効果を有することが判明した。これが、この分子（ＯＧＴ９１８とも命名されている）がゴーシェ病の処置においても研究されている理由である（Dwekら、2000、Coxら、2000）。この遺伝病は、リソソーム酵素のβ−グルコセレブロシダーゼの欠乏により引き起こされ、これによりグルコセレブロシド（酵素の基質）が蓄積する。したがって、グルコセレブロシドの生合成に関与するグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤であるＮＢ−ＤＮＪは、その合成および蓄積を妨げる（Dwekら、2000、Coxら、2000）。ＮＢ−ＤＮＪは、２００２年に、ザベスカ（Zavesca（登録商標））の名称でゴーシェ病の医薬として販売の許可を得た。
【０００７】
本発明は、ＮＢ−ＤＮＪおよび他のグルコシダーゼ阻害剤全般が、他のクロライドチャネルを変化させることなく、膜のｄｅｌＦ５０８のアドレッシングを回復させることができ、ｄｅｌＦ５０８をイオン輸送体として機能させることができるという事実の、本発明者らによる実証からもたらされている。
【０００８】
本発明の主題は、嚢胞性線維症の処置用医薬の調製のためのグルコシダーゼ阻害化合物の使用である。
【０００９】
「グルコシダーゼ阻害剤」の表現は、あらゆるグルコシダーゼＩおよび／またはＩＩ阻害剤を意味し、これらのグルコシダーゼの阻害は、特にPlattら、1994に記載の方法に従って測定することができる。
【００１０】
本発明の主題は、より特定すると、特に欠失ｄｅｌＦ５０８についてヒトのホモ接合型肺上皮ＣＦ１５細胞で行なった本明細書で後記した実験の枠組み内でのグルコシダーゼ阻害化合物の先に述べた使用であり、上記化合物は、他のクロライドチャネルを変化させることなく、膜のｄｅｌＦ５０８のアドレッシングを回復させることができ、ｄｅｌＦ５０８をイオン輸送体として機能させることのできる化合物から選択される。
【００１１】
より特定すると、本発明の主題は、以下の一般式（Ｉ）：
【化１０】
2007510699.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨ基を示し、
Ｒ２は、Ｈまたは１〜５個の炭素原子を有するアルキル基を示すか、
あるいは、Ｒ１およびＲ２は、上記式（Ｉ）の（ａ）の位置の炭素および窒素と一緒になって、式：
【化１１】
2007510699.tif 000004
で示される基を形成している）
で示される化合物から選択される、グルコシダーゼ阻害化合物の先に述べた使用である。
【００１２】
より特定すると、本発明は、以下の式：
【化１２】
2007510699.tif 000005
で示される式（Ｉ）の化合物の先に述べた使用に関する。
【００１３】
より特定すると、本発明は、以下の一般式（ＩＩ）：
【化１３】
2007510699.tif 000006
（式中、Ｒ２は、Ｈまたは１〜５個の炭素原子を有するアルキル基を示す）
で示される化合物から選択されるグルコシダーゼ阻害剤の先に述べた使用に関する。
【００１４】
より特定すると、本発明の主題は、以下の一般式（ＩＩａ）：
【化１４】
2007510699.tif 000007
（式中、Ｒ２は、Ｈまたは１〜５個の炭素原子を有するアルキル基を示す）
で示される化合物から選択される、先に定義したグルコシダーゼ阻害剤の先に述べた使用である。
【００１５】
本発明の主題はまた、以下の一般式（ＩＩ．１）または（ＩＩ．２）：
【化１５】
2007510699.tif 000008
（式中、Ｒ２は、Ｈまたは１〜５個の炭素原子を有するアルキル基を示す）
で示される化合物から選択される、請求項１〜４の一項に記載のグルコシダーゼ阻害剤の先に述べた使用である。
【００１６】
より特定すると、本発明は、以下の式： 
【化１６】
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で示される、先に定義した式（ＩＩ．１）または（ＩＩ．２）（式中、Ｒ２が、ＨまたはＮ−ブチル基を示している）の化合物の先に述べた使用に関する。
【００１７】
好ましくは、本発明の枠組み内で使用される化合物は、ＮＢ−ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＭＪである。
【００１８】
また好ましくは、本発明の枠組み内で使用される化合物は、ＮＢ−ＤＮＪである。
【００１９】
本発明の主題はまた、経口（シロップ剤、懸濁剤、ゼラチンカプセル剤、錠剤、散剤、または顆粒剤）、直腸（坐剤）、鼻腔経路（吸入によるエアゾール剤、または滴剤）により、特に、成人については１日当り約１ｍｇ〜２ｇの有効成分の割合で、または小児および乳児については１日当り１ｍｇ〜１ｇの割合で、１回以上の用量で投与できる医薬の調製のための、先に定義したグルコシダーゼ阻害化合物の先に述べた使用である。
【００２０】
本発明はまた、ＣＦＴＲチャネル活性化化合物と組み合わせた先に定義したグルコシダーゼ阻害化合物の先に述べた使用に関する。
【００２１】
それ故、本発明の主題は、より特定すると、以下の式：
【化１７】
2007510699.tif 000010
で示されるゲニステインまたは以下の式（ＩＩ）：
【化１８】
2007510699.tif 000011
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、水素原子を示すか、またはＣ１およびＣ２との組合せで６個の炭素原子を有する芳香族環を形成し、
Ｒ５は、水素原子、または、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは置換アルキル基、特にブチル基、あるいは式ＣＯＯＲ’（Ｒ’は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖または置換アルキル基、特にエチル基を示す）で示されるエステルを示し、
Ｙは、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、または−ＮＨＣＯＣＨ３基を示し、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は水素原子を示すか、あるいは、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、またはＲ１０の少なくとも１つは、ハロゲン原子、特に、塩素、臭素、もしくはフッ素原子を示し、
Ｘは、アニオン形態のハロゲン原子、特に臭素Ｂｒ−もしくは塩素Ｃｌ−原子、またはアニオン形態の原子基を示す）
で示されるベンゾ［ｃ］キノリジニウムの誘導体から選択されるＣＦＴＲチャネル活性化化合物と組み合わせた、先に定義したグルコシダーゼ阻害化合物の先に述べた使用である。
【００２２】
より特定すると、本発明の主題は、以下の化合物：
【化１９】
2007510699.tif 000012
2007510699.tif 000013
2007510699.tif 000014
2007510699.tif 000015
から選択される式（ＩＩ）のベンゾ［ｃ］キノリジニウムの誘導体と組み合わせた先に定義したグルコシダーゼ阻害化合物の先に述べた使用である。
【００２３】
本発明の主題はまた、嚢胞性線維症の治療において、同時にもしくは別々に使用するかまたは時間をかけて使用するための組合せ製品としての、少なくとも１種類のグルコシダーゼ阻害化合物、特に先に定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物と先に定義したＣＦＴＲチャネル活性化化合物の少なくとも１種類とを含む製品である。
【００２４】
本発明は更に、ＭＢ−ＤＮＪがｄｅｌＦ５０８のイオン輸送活性または細胞生存度に影響を及ぼすことなく、ＭＢ−ＤＮＪによりｄｅｌＦ５０８が正しくかつ特異的にアドレッシングされる効果についての実験的証明に関する以下の詳細な記述により説明される。
【００２５】
Ｉ）材料および方法
Ｍ１．細胞培養
ＣＨＯ−ＷＴ細胞：ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞は、野生型ＣＦＴＲ遺伝子（ＣＦＴＲ−ＷＴ）でトランスフェクトされた線維芽細胞である。それ故、この細胞は、ＣＦＴＲタンパク質を過剰発現する。
【００２６】
培養培地：ＭＥＭα培地（ギブコ）＋７％ウシ胎児血清＋０．５％ペニシリン／ストレプトマイシン＋１００μＭのメトトレキサート（アメトプテリン、シグマ製）。
【００２７】
ＣＦ１５細胞：ＣＦ１５細胞は、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ遺伝子を発現する鼻から得られたヒト上皮細胞である。
【００２８】
培養培地：ＤＭＥＭ培地＋ＨＡＭ  Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋０．６％ペニシリン／ストレプトマイシン＋成長因子（インスリン５μｇ／ｍｌ、トランスフェリン５μｇ／ｍｌ、エピネフリン５．５μＭ、アデニン０．１８ｍＭ、ＥＧＦ１０ｎｇ／ｍｌ、Ｔ３  ２ｎＭ、ヒドロコルチゾン１．１μＭ）。
【００２９】
Ｃａｌｕ−３細胞：Ｃａｌｕ−３細胞は、野生型ＣＦＴＲ遺伝子を発現する肺から得られたヒト上皮細胞である。
【００３０】
培養培地：ＤＭＥＭ培地／グルタマックスを含むＦ１２＋７％ウシ胎児血清＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン。
【００３１】
Ｍ２．免疫標識
抗ＣＦＴＲ一次抗体（Ａｂ）、次いでＣｙ３フルオロフォアで標識した一次抗抗体二次抗体による免疫標識により、細胞におけるＣＦＴＲタンパク質の位置が視覚化できるようになされた。細胞は、前もって、適切な培養培地中の薄層に播種した。各回５分間３回のＴＢＳ（ＮａＣｌ：１５７ｍＭ、トリス塩基：２０μＭ、ｐＨ７．４）での洗浄を行なった。その後、細胞を、ＴＢＳ−パラホルムアルデヒド（３％）の添加により２０分間かけて固定した。ＴＢＳで３回（５分間）洗浄した後、細胞を、細胞膜における穴の形成を可能とする０．１％ＴＢＳ−トリトンと共にインキュベートし（１０分間）、その後、ＴＢＳでの３回の洗浄をもう一度行ない、その後、細胞を、０．５％ＴＢＳ−ＢＳＡ−０．０５％サポニンと１時間一緒にした。その後、細胞を、ＣＦＴＲ抗Ｃ末端一次抗体（２μｇ／ｍｌ）と共に１時間インキュベートした。各回５分間３回のＴＢＳ−ＢＳＡ−サポニンでの洗浄を行ない、その後、ＧＡＭ−ｃｙ３二次抗体（１／４００）と共に１時間インキュベートした。５分間の２回のＴＢＳでの洗浄の後、核を、Ｔｏｐｒｏ３（１／１０００）と共に５分間インキュベートすることにより標識した。最後に、薄層を、最後の５分間３回のＴＢＳでの洗浄後、スライド上に乗せることができた。スライドを、適切な波長のレーザーを用いた励起により共焦点顕微鏡（バイオ・ラッド製）で観察した。Ｃｙ３標識とＴｏｐｒｏ３標識を区別するために、Ｔｏｐｒｏ３の蛍光色を青色（核の色）に変えておいた。
【００３２】
Ｍ３．放射性トレーサエフラックス
細胞中のクロライドイオン輸送の測定は、放射性ヨウ化物エフラックス技術（Becqら、1999；Dormerら、2001）を使用して行なった。トレーサ（１２５Ｉ）を、細胞内媒体に取り込ませた。その後、細胞を出る放射性トレーサの量を、種々の薬理学的試薬の添加後に計測した。ヨウ化物は、クロライドイオン輸送のトレーサとして使用した。２種類の放射性トレーサ１２５Ｉおよび３６Ｃｌは、クロライドチャネルの活性を測定する上での等価体と考えることができる（Venglarickら、1990）。１２５Ｉは、更に、３５Ｃｌと比べて寿命が短いという利点がある（それぞれの半減期：３０日間および３００，０００年間）。細胞を、２４ウェルプレートの適切な培地中で培養した。エフラックス培地（ＮａＣｌ：１３６．６ｍＭ、ＫＣｌ：５．４ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４：０．３ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４：０．３ｍＭ、ＮａＨＣＯ３：４．２ｍＭ、ＣａＣｌ２：１．３ｍＭ、ＭｇＣｌ２：０．５ｍＭ、ＭｇＳＯ４：０．４ｍＭ、ＨＥＰＥＳ：１０ｍＭ、Ｄ−グルコース：５．６ｍＭ）で２回濯ぎ、無秩序に放射能を放出する死滅細胞を除去した。その後、細胞を、５００μｌの投入物（１μＣｉ／ｍｌの１２５ＩＮａ）と共にＣＨＯ−ＷＴでは３０分間、または、ＣＦ１５およびＣａｌｕ−３では１時間インキュベートした。ヨウ化物は、細胞膜の両側において平衡状態にあった。ロボット（MultiPROBE、パッカード製）により以下の段階を行なった：投入培地をエフラックス培地で濯ぎ、細胞外放射能を除去した。上澄みを、溶血チューブ中に１分毎に収集し、培地を等容量（５００μｌ）で置き換えた。最初の３分間に採取した試料には薬物は添加せず、これにより受動的なＩ−イオンの排出を特徴づける安定なベースラインを得ることが可能となった。以下の７つの試料は、試験する分子の存在下で得られた。実験終了時に、細胞を、５００μｌのＮａＯＨ（０．１Ｎ）／０．１％ＳＤＳの添加により溶解する（３０分間）ことで、細胞内に残存する放射能を測定することができた。溶血チューブに存在する放射能は、ガンマカウンター（Cobra II、パッカード製）を使用して１分当りのカウント数（ｃｐｍ）で計測した。ｃｐｍで示した結果は、以下の式に従って、放射性ヨウ化物（Ｒ）の排出速度の形で表わした：Ｒ（分−１）＝［ｌｎ（１２５Ｉ  ｔ１）−ｌｎ（１２５Ｉ  ｔ２）］／（ｔ１−ｔ２）、ここで、１２５Ｉ  ｔ１：時間ｔ１におけるｃｐｍ；１２５Ｉ  ｔ２：時間ｔ２におけるｃｐｍ。このヨウ化物の流量は、曲線の形で示した。試験する分子の投与に起因するヨウ化物の排出を定量するために、以下の相対流量を計算し、これによりベース流量を除外できた：相対速度（分−１）＝Ｒピーク−Ｒベース。最後に、これらの結果は、様々な薬物の効果を互いに比較できるようにするために標準化した。結果は、平均＋／−ＳＥＭの形で示した。スチューデントの統計検定を使用して、薬物の効果を対照物と比較した（Ｐ＜０．０１に相当する数値を、統計学的有意と判断した）。
【００３３】
Ｍ４．細胞毒性試験
ＭＴＴ毒性試験は、ＭＴＴ（黄色のテトラゾリウム塩）からホルマザン（紫色）へのミトコンドリアデヒドロゲナーゼの代謝能に基づいた比色試験である。それで、変換された色素の濃度に比例する吸光度を分光計により測定することができた。細胞を、試験する試剤の存在下で９６ウェルプレート中で２時間インキュベートした。３つの対照試験を行なった：１００％生存細胞：試剤を含まない細胞；０％生存細胞：開放された空気中に放置された細胞；ブランク：細胞を含まない培地。培地の色が吸光度測定を妨害しないように、細胞をフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ培地で濯いだ。その後、それらを、ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ溶液１００μｌと共に４時間インキュベートした。その後、培地を除去し、１００μｌのＤＭＳＯの添加により、変換された色素（ホルマザン）を可溶化することができた。吸光度を、５７０ｎｍ（紫色）；６３０ｎｍ（バックグラウンドノイズ）で分光計により測定した。バックグラウンドノイズを取り除くために、以下の計算を行なった：ＯＤ真の＝ＯＤ５７０ｎｍ−ＯＤ６３０ｎｍ。その後、結果を、対照（１００％および０％生存細胞）に対して標準化し、平均＋／−ＳＥＭの形で示した。
【００３４】
ＩＩ）結果
Ｒ１．ＣＦ１５細胞におけるｄｅｌＦ５０８のアドレッシングに対するＮＢ−ＤＮＪの効果
ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲタンパク質のアドレッシングに関する研究を、実験室において、欠失ｄｅｌＦ５０８についてのホモ接合型肺ヒト上皮ＣＦ１５細胞に関する薬理学、細胞イメージング、生化学的および電気生理学的試験のアプローチを組み合わせることにより行なった。ＣＦＴＲのアドレッシングに関与する特定の因子に干渉できる種々の分子が存在する。これは、グルコシダーゼＩおよびＩＩ阻害剤であるＮ−ブチル−デオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）の場合であり、これが試験された。
【００３５】
各実験において、カクテル（フォルスコリン１０μＭ、ゲニステイン３０μＭ）の添加により、ＣＦＴＲが膜上にある場合にはＣＦＴＲを活性化することができた。したがって、ｄｅｌＦ５０８のアドレッシングが回復された場合、ヨウ化物エフラックスを観察できた。ヒストグラムの形で示した結果は、１００％ＣＦＴＲ活性があると判断されている基準となる処理（２５０μＭのＭＰＢ−９１で２時間かけて細胞を処理）に対して標準化した。本発明者らは、グルコシダーゼ阻害剤であるＮ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）（構造は以下に示した）を用いて３７℃で２時間かけてＣＦ１５細胞を処理すると、ｄｅｌＦ５０８タンパク質のアドレッシングが回復し、ｄｅｌＦ５０８タンパク質はイオン輸送体として機能することができるようになることを本発明書に示した（図１）。
【００３６】
細胞を処理しなければ、ｄｅｌＦ５０８タンパク質は膜状ではなく、カクテル（フォルスコリン１０μＭ、ゲニステイン３０μＭ）により刺激されるヨウ化物エフラックスはなかった。ＮＢ−ＤＮＪのＥＣ５０（最大効果の５０％をもたらす分子の濃度）は、１２３μｍｏｌにおいて測定された（図２）。細胞イメージングにより、本発明者らは、ＮＢ−ＤＮＪでの処理後に形質膜区画におけるｄｅｌＦ５０８タンパク質の位置を決定した。
【００３７】
Ｒ２．Ｃａｌｕ−３細胞におけるＣＦＴＲ活性に対するＮＢ−ＤＮＪの効果
ＮＢ−ＤＮＪの効果がｄｅｌＦ５０８のアドレッシングに特異的であり、他のクロライドチャネルを変化させないことを示すために、ＮＢ−ＤＮＪを、Ｃａｌｕ−３細胞における可能性ある活性化物質として試験した。図３に示した結果は、Ｃａｌｕ−３細胞におけるヨウ化物エフラックスで得られた。対照物は、フォルスコリン（５μＭ、ｎ＝８）およびＭＰＢ−９１（２５０μＭ、ｎ＝８）であった。ＮＢ−ＤＮＪ（ｎ＝８）は、ＮＢ−ＤＮＪを含む効果と含まない効果（ベース）との間に有意差がなかったことから、野生型ＣＦＴＲの活性化物質でもなく、この細胞の他のアニオン輸送体の活性化物質でもない。
【００３８】
Ｒ３．Ｃａｌｕ−３細胞におけるＣＦＴＲのアドレッシングに対するＮＢ−ＤＮＪの効果
ＮＢ−ＤＮＪの効果が、ｄｅｌＦ５０８のアドレッシングに特異的であることを示すために、ＮＢ−ＤＮＪを、Ｃａｌｕ−３細胞における野生型ＣＦＴＲのアドレッシングのモジュレーターとして試験した。図４に示した結果は、ＮＢ−ＤＮＪ（５００μＭ）で２時間処理したＣａｌｕ−３細胞におけるヨウ化物エフラックスで得られた。図４では、ベースは、処理せずＭＰＢ−９１により刺激しなかった細胞に相当する。ヨウ化物のエフラックスは全く刺激されなかった。第二の対照は、処理しないが２５０μＭのＭＰＢ−９１で刺激した細胞に相当する。この場合、ＣＦＴＲは活性化され、ヨウ化物エフラックスを測定した。第三の対照は、ＭＰＢ−９１で３７℃で２時間処理し、その後、２５０μＭのＭＰＢ−９１で刺激した細胞に相当する。この実験条件下でのＣＦＴＲ活性は、２つの他の実験状況と比べて有意差がなかった。最後に、Ｃａｌｕ−３細胞を、５００μＭのＮＢ−ＤＮＪで３７℃で２時間処理し、２５０μＭのＭＰＢ−９１で刺激した場合、ＣＦＴＲ活性のレベルは影響を受けなかった。これらの結果により、ＮＢ−ＤＮＪは、野生型ＣＦＴＲアドレッシング経路または他のクロライドチャネルには影響を及ぼさず、また、ヒト非ＣＦ肺上皮細胞におけるＣＦＴＲ活性も変化させないことが実証された。
【００３９】
Ｒ４．アドレッシング経路の種々の阻害剤の細胞毒性
ＮＢ−ＤＮＪの細胞毒性を試験する目的で、ＣＨＯ−ＷＴ細胞を、種々の濃度の阻害剤と共に２時間インキュベートし、その後、ＭＴＴを用いた細胞生存度試験に付した。図５には、結果の要約を示した。結果は、細胞が、ＮＢ−ＤＮＪの全ての濃度において生存可能であることを示した。それ故、この分子は、細胞毒性を全く示さない。
【００４０】
Ｒ５．ＣＦ１５細胞におけるｄｅｌＦ５０８のアドレッシングに対するＮＢ−ＤＮＪ類似体の効果
本発明者らは、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシンファミリー（ＮＢ−ＤＮＪまたはｎＢ−ＤＮＪ）の種々の化合物の効果を比較した。製品を、図６に示した。各実験において、カクテル（フォルスコリン１０μＭ、ゲニステイン３０μＭ）の添加により、ＣＦＴＲが膜上にある場合にはＣＦＴＲを活性化することができた。図７に示した結果により、ＣＦ１５細胞を１００μＭのＤＮＪ、ｎＢ−ＤＮＪまたはＤＭＪで３７℃で２時間処理すると、ｄｅｌＦ５０８タンパク質のアドレッシングが回復し、ｄｅｌＦ５０８タンパク質はイオン輸送体として機能することができるようになった（図７）。これに対し、ＤＧＪ、ｎＢ−ＤＧＪ、ＤＦＪ、およびｎＢ−ＤＦＪの化合物は、ｄｅｌＦ５０８のアドレッシングに対して有意な効果を及ぼさなかった（図７）。各化合物（ＤＮＪ、ＤＭＪおよびｎＢ−ＤＭＪ）に関して、ＥＣ５０（最大効果の５０％をもたらす分子の濃度）を、＞２５０μＭ、１３４μＭ、および１１３μＭでそれぞれ決定した。
【００４１】
ＩＩＩ）結論
エフラックス試験により、小胞体におけるｄｅｌＦ５０８の蓄積を引き起こすＮＢ−ＤＮＪが、このタンパク質の膜中の再配置を可能とし、その結果、ヒト肺上皮細胞におけるｄｅｌＦ５０８の再アドレッシングのための重要な薬理学的手段を具現化することが明らかになった。ＮＢ−ＤＮＪは、このタンパク質のイオン輸送活性に影響を及ぼすことなく、膜のｄｅｌＦ５０８の特異的なアドレッシングを可能とし、他のクロライドチャネルに対しても、または細胞生存度に対しても影響を及ぼさなかった。
【００４２】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ｄｅｌＦ５０８のアドレッシングに対するＮＢ−ＤＮＪの効果。  ＣＦ１５細胞を、ＮＢ−ＤＮＪ（５００μＭ）で２時間前処理した。ＭＰＢ−９１（２５０μＭ）の効果が、この試験における１００％を表すとみなした。ＣＦＴＲ活性を、ｆｓｋ１０μＭ＋Ｇｓｔ３０μＭによる刺激後のヨウ化物エフラックス（各条件に関しｎ＝８）で測定した。Ｎｓ：有意差なし。＊＊＊：有意差ｐ＜０．００１。
【図２】ｄｅｌＦ５０８のアドレッシングに対するＮＢ−ＤＮＪの効果を示すグラフ。  ＣＦ１５細胞を、種々の濃度のＮＢ−ＤＮＪで２時間前処理した。ＣＦＴＲ活性を、ｆｓｋ１０μＭ＋Ｇｓｔ３０μＭによる刺激後のヨウ化物エフラックス（各濃度に関しｎ＝４）で測定した。
【図３】Ｃａｌｕ−３細胞のアニオン輸送に対するＮＢ−ＤＮＪの効果。  ＣＦＴＲ活性を、フォルスコリン（ｆｓｋ）５μＭ、ＭＰＢ−９１  ２５０μＭ、ＮＢ−ＤＮＪ  ５００μＭによる刺激後のヨウ化物エフラックス（各条件に関しｎ＝８）で測定した。ｆｓｋおよび化合物ＭＰＢ−９１は、この細胞におけるヨウ化物エフラックスを活性化するが、ＮＢ−ＤＮＪは全く効果がないことが特筆される。Ｎｓ：有意差なし。＊＊＊：有意差ｐ＜０．００１。
【図４】Ｃａｌｕ−３細胞をＮＢ−ＤＮＪで処理した効果。  Ｃａｌｕ−３細胞を、５００μＭのＮＢ−ＤＮＪ、ＭＰＢ−９１  ２５０μＭと共に３７℃で２時間前もってインキュベートした。処理しなかった細胞：処理せず。ベースは、細胞を処理もせず刺激もしなかったことを示す。ＣＦＴＲ活性は、ＭＰＢ−９１  ２５０μＭによる刺激後のヨウ化物エフラックス（各条件に関しｎ＝８）で測定した。エフラックス刺激レベルは３つの条件で同じであるので、ＮＢ−ＤＮＪでの処理は全く効果がないことが特筆される。Ｎｓ：有意差なし。
【図５】ＣＨＯ細胞の細胞毒性に対するＮＢ−ＤＮＪの効果。  ５および５０μＭにおいては細胞毒性は測定できるほどではないことが特筆される。低毒性が５００μＭで出現している。細胞を２時間処理。Ｎｓ：有意差なし。＊＊＊：有意差ｐ＜０．００１。
【図６】Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪまたはｎＢ−ＤＮＪ）の構造およびＮＢ−ＤＮＪファミリーの種々の化合物。
【図７】ＣＦ１５細胞におけるｄｅｌＦ５０８のアドレッシングに対するＮＢ−ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪの類似体の効果。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【国際調査報告】
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