(57)【要約】  本発明は、軟骨細胞の生体外立体培養のための、ｐＨの関数として自己架橋結合する、シラン化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）又はシラン化ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）ヒドロゲルの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨細胞の立体生体外培養のための、ｐＨの関数として自己架橋結合する、シラン化ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）又はシラン化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）ヒドロゲルの使用。
【請求項２】
前記ヒドロゲルが、ＨＥＣ又はＨＰＭＣと：以下の一般式（Ｉ）：
ＸＳｉ（ＯＺ）3                （Ｉ）
｛式中、Ｘは、ハロゲン原子：又はエポキシ官能基を有する炭化水素基、特にＣ2-20を表し、そしてＺは、水素原子、アルカリ金属、及びアルキル基、特にＣ1-5から選択される。｝で表される化合物との、反応により得られる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＨＥＣ又は前記ＨＰＭＣが、シラノレート側基又はアルカリ金属又はアンモニウムシラノレート前駆体であって、前記ＨＥＣ前記ＨＰＭＣの総乾燥重量の０．５〜５％に相当するものを担持する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記ヒドロゲルが、以下の単純式：
【化１】
2007510410.tif 000011
を有するポリマーからなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
ヒドロゲル内に一体化される細胞複合体の生体外製造方法であって、前記複合体は、軟骨性部位に注入されることを意図され、ここで当該方法は、軟骨細胞とシラン化ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）又はシラン化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）ヒドロゲルとの生体外混合、ｐＨの関数としての架橋結合を、前記ヒドロゲルの架橋結合のために適切なｐＨでの生理緩衝液中において、前記ヒドロゲル中での軟骨細胞の一体化及び前記立体培養のために適した条件下及び適した期間にわたり、実施することを含む、前記製造方法。
【請求項６】
ヒドロゲル内に一体化される細胞複合体の生体外製造方法であって、前記複合体は、軟骨性部位に注入することを目的とするものであり、ここで当該方法は、軟骨細胞に分化し得る未分化細胞とシラン化ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）又はシラン化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）ヒドロゲルとの生体外混合、ｐＨの関数としての自己架橋結合を、前記ヒドロゲルの架橋結合のために適切なｐＨを有する生理緩衝液中で、前記ヒドロゲル中での前記未分化細胞の分化に由来する軟骨細胞の一体化及び前記立体培養のために適した条件下及び適した期間中にわたり、実施することを含む、前記製造方法。
【請求項７】
以下の生体外ステップ：
固体支持体上の軟骨細胞の単層増殖；
上記単層増殖を通して脱分化した、前記増殖した軟骨細胞の収穫；
前記ヒドロゲルの架橋結合のために適したｐＨで、生理緩衝液中、前記脱分化増殖軟骨細胞と前記ヒドロゲルとの混合、その結果としての前記ヒドロゲル中での軟骨細胞の一体化及びその再分化の達成；
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒドロゲルが、ＨＥＣ又はＨＰＭＣと：以下の一般式（Ｉ）：
ＸＳｉ（ＯＺ）3                （Ｉ）
｛式中、Ｘは、ハロゲン原子又はエポキシ官能基を有する炭化水素基、特にＣ2-20を表し、そしてＺは、水素原子、アルカリ金属、及びアルキル基、特にＣ1-5から選択される。｝である化合物との、反応により得られる、請求項５〜７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＥＣ又は前記ＨＰＭＣが、シラノレート側基又はアルカリ金属又はアンモニウムシラノレート前駆体であって、前記ＨＥＣ又は前記ＨＰＭＣの総乾燥重量の０．５〜５％に相当するものを担持する、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒドロゲルが、以下の単純式：
【化２】
2007510410.tif 000012
を有するポリマーからなる、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨性部位におけるその移植のための、軟骨細胞の立体培養のためのセルロース・ヒドロゲルの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨組織は、特殊な、非血管の、非神経支配の、強く及び弾力のある結合支持組織である。それは、肋骨内、胸骨内、鼻や耳、また関節内に存在する。軟骨組織は、軟骨細胞として知られる特異的細胞、及び基本的にコラーゲン繊維とプロテオグリカンからなる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む。
【０００３】
関節軟骨細胞は、炎症起源（関節リウマチ、変形性関節症）、外傷学上の起源又は老化（関節）に関する多くの変化の中枢となり得る。これらの軟骨細胞の病変の確立は、大体長期間にわたって、細胞外マトリックスの分解及び細胞質内の減少をもたらす。血管形成及び軟骨細胞増殖の欠如は、組織低修復能を与え、そしてそれは、分解的反応を不可逆的に提供する。高齢化を考えれば、これらの変形性病状は、今や人口のかなりの割合に影響を与え、その結果、主要な公衆衛生問題である。このような状況において、科学界は、長年の間、機能的軟骨組織の再生手段に興味を抱いている。
【０００４】
研磨軟骨形成術、微少破壊又は細胞網外科手術は、軟骨の僅かな自発修復能を刺激するために提案される（Ｈｕｎｚｉｋｅｒ，２００２）。これらの技術であって、軟骨下起源の血液凝固の形成の余地があるものは、繊維状のまま及び一過性のままである軟骨組織の形成をもたらす（Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。同時に、軟骨形成特性を有する組織の移植のための技術もまた研究されている。骨膜の又は軟骨膜の自己移植の使用、及び骨軟骨組織の使用（モザイク形成術）は、移植後の軟骨型組織の新形成を可能とする（Ｈｕｎｚｉｋｅｒ，２００２）。これらの技術の多くの限定（移植片の不安定度、石灰化、臨床結果の低再現性）及び局所的病変の修復のための適応制限は、昨今、軟骨の外傷学上病変に適用される新しい再生医療技術の開発を導いている。
【０００５】
Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．は、自己軟骨細胞の移植に基づく修復方法を提案した最初の人物であった（Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。この方法は、３つのステージ：最初に、軟骨細胞を単離するために軟骨断片を無耐荷重領域から除去し、次いで、試験管内で単層として増殖させ、次いで、病変の骨膜弁の下に再移植する、にわたって行われる。この結果は、軟骨性欠陥の修復を明らかとしたが、しかし当該患者は２つの激しい外科手術に耐える必要がある。さらに、その単層増殖後の細胞表現型が未だ決定されなければならない。
【０００６】
植物又は動物起源の多くの三次元マトリクス、例えば、コラーゲンスポンジ、フィブリン、ヒアルロン酸又はアルギン酸塩も開発されている（Ｃａｎｃｅｄｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。これらの生物由来物質の使用に関連するウイルス伝染のリスク、及び前臨床試験間に観察される炎症反応は、完全合成生体材料の開発に対する最新の研究に通ずる（Ｈｕｎｚｉｋｅｒ，２００２）。ポリマーであって、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、カーボン・ファイバー、ポリエステルウレタン、ダクロン（登録商標）（Ｄａｃｒｏｎ）、及びテフロン（登録商標）（Ｔｅｆｌｏｎ）が提案され、そして軟骨細胞又は間充織細胞の立体培養に試験管内で使用されている。これらの合成ポリマーの内のいくつかは、軟骨性部位におけるその移植後、免疫応答又は炎症を引き起こしている（Ｃａｎｃｅｄｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０００７】
注入可能なヒドロゲル組成物は、特に米国特許第６，１２９，７６１号において、記載される。
【発明の開示】
【０００８】
本発明者らは、今般、軟骨性部位における移植のため、ｐＨの関数として自己架橋結合するヒドロゲル中での軟骨細胞の立体培養の有益性を明らかにした。
【０００９】
使用されるヒドロゲルは、ｐＨの関数として自己架橋結合し、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）又はヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）水溶液からなるヒドロゲルであって、その上に当該ＨＥＣ又はＨＰＭＣの鎖の間に共有結合の形成を可能とするシラン基をグラフトさせたものである。
【００１０】
この型のポリマー材料は、国際特許出願ＷＯ９７／０５９１１における無機充填剤とともに記載される。
【００１１】
この材料は、好ましくは、以下の単純式：
（ＨＥＣ又はＨＰＭＣ）−Ｏ−Ｘ−Ｓｉ（ＯＺ）3
を有するポリマーからなり、ここで、当該式は、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）又はヒドロキシプロピルメチルセルロースと：以下の一般式（Ｉ）：
ＸＳｉ（ＯＺ）3                （Ｉ）
｛式中、Ｘは、ハロゲン原子：又はエポキシ官能基を有する炭化水素基であって、特にＣ2-20を表し、そしてＺは、水素原子、アルカリ金属、及びアルキル基、特にＣ1-5から選択される。｝で表される化合物との、反応により得られる。
【００１２】
一般式（Ｉ）の化合物は、例えば、（３−グリシドキシプロピル）トリメトキシシラン：
【化１】
2007510410.tif 000002
であり得る。
【００１３】
塩基性培地中、ＨＥＣ又はＨＰＭＣ上に一体化させた当該有機ケイ素化合物であって当該エポキシドを切断している当該化合物、及びメトキシシラン基は、加水分解され、以下の単純式：
【化２】
2007510410.tif 000003
を有するポリマーを生成する。
【００１４】
当該ポリマーは、好ましくは、シラン化ＨＰＭＣポリマーである。
【００１５】
このポリマーは、ｐＨが約１２．４超又は同等での水溶液中において安定である。当該溶液の酸性化は、粘性の段階的増加及びヒドロゲルの形成を引き起こす。この物理現象は、（ｉ）シラノレート基のシラノール基への転換：
【化３】
2007510410.tif 000004
によるポリマーの架橋結合、次いで、
【００１６】
（ｉｉ）他のシラノールに接触する、あるシラノールの縮合：
【化４】
2007510410.tif 000005
及び／又は
【００１７】
（ｉｉｉ）当該セルロースエーテル又はその置換基の循環におけるヒドロキシル基に接触するシラノールの縮合：
【化５】
2007510410.tif 000006
による三次元網目構造の形成、と対応する。
【００１８】
この共有型架橋結合であって、当該ポリマー水溶液のｐＨの低減により引き起こされる当該結合は、可逆的であり、そして当該ヒドロゲルは、当該媒質のｐＨが高くなると再溶解する。それ故、使用前、合成されたポリマーは、粉末状であって、アルカリ性の水酸化ナトリウム溶液中に溶解され得るものを形成し得る。当該ゲル化ｐＨは、所望の架橋結合比率に依存し、７〜１２の間である。
【００１９】
得られたゲルは、オートクレーブ法により滅菌され得る（例えば、１２１℃で、２０分間）。
【００２０】
塩基性水溶液中の当該ポリマーは、架橋結合前、その生物学的使用に先立って、生理緩衝液とも混合され得る。当該最終混合物のｐＨは、それ故、全体的混合物の架橋結合に先立って、所望の処理時間に適合される。この架橋結合時間は、振動レオメトリーにより測定され、この混合物のパラメータの機能である、主に、そのｐＨ及び温度として、５分間から５日間まで変化し得る（Ｂｏｕｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｂｏｕｒｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２」ｂ）。
【００２１】
対象用途のための好適な架橋結合比率を提供するために、ケイ素担体側基であって、シラノレート又はアルカリ金属又はアンモニウムシラノレート前駆体型の当該付随基は、当該ポリマーの総乾燥重量の０．５〜５％に相当することが望まれる。
【００２２】
本発明は、ｐＨの関数として自己架橋結合する、この型のシラン化ＨＥＣ又はシラン化ＨＰＭＣヒドロゲルの使用に関し、ここで当該ゲルは、軟骨細胞の立体生体外培養のためのものである。
【００２３】
使用される当該ヒドロゲルは、特に、以下の利点：
当該ヒドロゲルは、当該ヒドロゲル中で一体化される軟骨細胞と生体適合性であること；
当該軟骨細胞は、当該ヒドロゲル中で密接して一体化されること；
単層増殖により脱分化された当該軟骨細胞が、当該ヒドロゲル中で再分化し、そして軟骨細胞特性を維持すること；
当該架橋形成は、ヒドロゲルと軟骨細胞との混合物に加える生理緩衝液のｐＨにより制御可能であること、
を有する。
【００２４】
当該ヒドロゲルにおいて培養される細胞は、好ましくは、ヒト又は動物の軟骨細胞であり、好ましくは、自己の軟骨細胞であって、当該軟骨組織の病変を有する患者のものである。これらの細胞は、例えば、軟骨組織から除去され、例えば、関節軟骨の一部から又は鼻軟骨から除去され得る。
【００２５】
当該ヒドロゲル内において培養される細胞は、軟骨形成の分化能を有する未分化細胞でもあり得る。間葉性幹細胞又は脂肪組織起源の幹細胞は、それ故、含まれる。前者は、特に、骨髄を移すこと（典型的には、吸引により、当該吸引は、シリンジを使用し、骨梁であって、例えば長骨、腸骨稜から実施する。）により、後者は、脂肪吸引術（典型的には、脂肪塊から真空下の吸引である）により入手され得る。
【００２６】
これらの未分化細胞は、次いで、軟骨細胞表現型の誘導を可能とする条件下、当該ヒドロゲルの存在下において培養される。これらの条件は、好ましくは、従来の培地（ＤＭＥＭ又はＭＥＭ）における培養であって、必要であれば、グルタミン及び抗生物質、及び好ましくは、自系の、動物又はヒトの血清又は血清代替物、及び軟骨形成の添加物もまた加える。例としては、特に、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ＴＧＦ−ベータ、ＩＧＦ−１、ＢＭＰ（骨形成蛋白質）、デキサメタゾン、リノール酸、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）又はピルビン酸塩を含む。他の添加物は、当該細胞の軟骨細胞分化を誘導するためにも使用され得る。当該培養物は、好ましくは、３７℃の湿潤条件下、所望により変化し得る酸素濃度存在下において生成される。低酸素状態（Ｈｙｐｏｘｉａ）は、軟骨細胞表現型の発達に重要な因子であることがわかっている。
【００２７】
本発明は、ヒドロゲル内に一体化される細胞の複合体の生体外製造方法にも関し、当該複合体は、軟骨性部位に注入することを目的とされ、ここで当該製造方法は、軟骨細胞又は軟骨細胞分化の可能性のある未分化細胞と、シラン化ＨＥＣ又はＨＰＭＣヒドロゲルとの生体外混合、ｐＨの関数としての架橋結合を含み、当該ヒドロゲルの架橋結合のために適切なｐＨでの生理緩衝液において、ヒドロゲル中での、軟骨細胞であって、場合により当該未分化細胞の分化由来のものの、一体化及び立体培養のために適した条件下及び適した期間で実施することを含む。
【００２８】
いわゆる当業者は、いずれの生理緩衝液を使用し得る。例としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ又はＴＲＩＳバッファーを含む。いずれの生体培地であって、いわゆる当業者によく知られるもの、例えば、ＤＭＥＭ培地又はアルファ−ＭＥＭ培地（アルファ  ミニマム  エッセンシャル培地）もまた使用され得る。
【００２９】
好ましくは、当該方法は、以下の生体外ステップ：
固定支持体、例えば培養プレート、の上での軟骨細胞の単層増殖；
当該単層増殖を通じて脱分化した、当該増殖した軟骨細胞の収穫；
当該ヒドロゲルの架橋結合のために適したｐＨで、生理緩衝液中、当該脱分化増殖軟骨細胞とヒドロゲルとの混合、その結果としての、当該ヒドロゲル中での軟骨細胞の一体化及びその再分化の達成、
を含む。
【００３０】
シラン化ＨＥＣ又はＨＰＭＣからなるヒドロゲルのレオロジー特性は、それが移植部位に注入されることを可能とし、それ故、非侵襲性の手術により当該軟骨細胞の運び込みを促進する。
【００３１】
内部で軟骨細胞が培養される当該ヒドロゲルは、通常、軟骨組織により占有される病変部分に移植され得る。
【００３２】
目的病変は、局所性軟骨物質の損失であって、外傷性続発症又は、さらに一般的には、いずれかの骨関節の又は形成の軟骨性の病変又は損失に関する。
【００３３】
本発明は、軟骨組織、すなわち、以下の型：
ヒアリン（鼻隔、喉頭、気管軟骨、関節、又は肋骨の胸骨端に存在する。）；
繊維軟骨（椎間板、特定の関節軟骨、及び恥骨結合に存在する。）；
弾力組織（耳介、外耳道、喉頭蓋、エウスタキオ管、及び喉頭軟骨内に存在する。）
の全ての工学技術に適用され得る。
【００３４】
椎間板の修復は特に望まれる。腰痛の原因は知られていないが、椎間板及び不可避の及び加齢のその劣化に因るものかもしれない。椎間板は、隣接脊椎体との間に配置される４つの同心性組織からなる繊維軟骨性構造である。外層は、外側の繊維輪であって、目に見えて配向されるコラーゲン繊維からなっている。内側の繊維輪は、外側より低いコラーゲン密度を有し、そして、外輪より組織化されていない。推移帯は、内側の輪を髄核から分離している繊維組織の細い領域であり、ここで当該髄核は、核小体を形成するゼラチン状の中心帯である。当該椎間板は、欠乏血管化されており、そして限定された神経支配を有する。
【００３５】
成人において、当該椎間板は、滋養物及び代謝物の拡散により養われる。当該椎間板は、豊富な細胞外マトリクスにおいて埋め込まれた相対的にわずかな細胞を含み、ここで当該細胞外マトリクスは、主に、水、プロテオグリカン、コラーゲン、及び非コラーゲン性蛋白質からなる。当該椎間板の細胞は、これらの高分子を合成し、そして維持し、そしてこの細胞外マトリクスを修復する。成人において、軟骨細胞は、細胞核の細胞だけである。内側の繊維輪、推移帯、及び隣接脊椎体の軟骨板は、軟骨細胞も含むが、一方、外側の繊維輪は、ほとんどを繊維芽細胞型の細胞を含む。椎間板変性の固有の度合いは、個々人の全ての場合に生ずる。はっきりした関連性は、年齢と椎間板の変性において明らかとされている。変性は１０代前から観察される。症候性椎間板を有する人は、通常の老化作用の促進を後天性因子及び遺伝因子に因り、経験する。
【００３６】
したがって、本発明は、ヒト又は動物の治療方法であって、ヒドロゲルの注入による投与を含む当該治療方法にも関し、ここで当該ヒドロゲルは、上記定義の通りであり、そして、前もって生体外で軟骨細胞により移植され、例えば、上記方法を使用して実施される。
【００３７】
当該注入は、滅菌されたシリンジ、及び使い捨てのプランジャーで提供される結合片を含むシステムを使用して実施され得、例えば、当該システムは、ＨＡＷＥＮＥＯＳ  ＤＥＮＴＡＬより購入し、オートクレーブにより滅菌されたシリンジ（ＮＯ．４４０，Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｈａｗｅ−Ｃｅｎｔｒｉｘ  Ｃ−ＲR，ＭａｒｋＩＩＩを参照のこと。）、及び結合片（Ｎｏ．４４５を参照のこと。）を含む。
【００３８】
以下の図及び実施例は、本発明を例証するものであり、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３９】
実施例１：ヒドロゲルの製造
原料：
・ＨＰＭＣ  Ｅ４Ｍ（登録商標）（Ｃｏｌｏｒｃｏｎ−Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｆｒａｎｃｅ）
・グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＳ）（Ａｃｒｏｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）
・ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）
・ＮａＯＨ（ＶＷＲ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｆｏｎｔｅｎａｙ−ｓｏｕｓ−Ｂｏｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）
・ＮａＣｌ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）
・ＨＣｌ  ０．１Ｍ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）
・ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ  Ｄｕｓｔｓｃｈｅｒ，Ｂｒｕｍａｔｈ，Ｆｒａｎｃｅ）
【００４０】
ａ）シラン化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｓｉ−ＨＰＭＣ）粉末の合成
当該合成を、ＨＰＭＣ２４０グラムの量で実施した。ポリサッカリド（多糖）は、Ｅ４Ｍ（登録商標）を選択した。当該合成を、有機溶媒中の不均質溶質における、６リットル・フラスコ中のグリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＳ）を使用して実施した（Ｂｏｕｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。当該合成を、３時間沸騰させながら実施した。当該シラン化ＨＰＭＣ粉末を、最初に、一晩オーブン乾燥させ、次いで、凍結乾燥させた（Ｃｈｒｉｓｔ  Ａｌｐｈａ  １−４ＳＴ）。
【００４１】
ｂ）シラン化ヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液の製造
Ｓｉ−ＨＰＭＣ粉末の６グラムを、０．２Ｍ  ＮａＯＨ溶液２００ｍｌ中に溶解した。この混合物を４８時間撹拌した。次いで、当該Ｓｉ−ＨＰＭＣ溶液を、０．０９Ｍ  ＮａＯＨ溶液中において、１６時間透析した。次いで、２回目の透析を０．０９Ｍ  ＮａＯＨ溶液中において、２時間実施した。次いで、この３％Ｓｉ−ＨＰＭＣ溶液を等分し、そして蒸気滅菌した（１２１℃、３０分間）。
【００４２】
ｃ）当該ヒドロゲルの架橋結合の誘導
細胞培養のために使用されるヒドロゲルを、層流フード下、ＨＥＰＥＳバッファーの７．５ｍｌとＳｉ−ＨＰＭＣ溶液の７．５ｍｌを、添加されたＦＣＳの１０％と共に混合することにより、即座に製造した。当該ＨＥＰＥＳバッファーを、ＨＥＰＥＳの３．１ｇ及びＮａＣｌの０．８ｇを０．０３ＭのＨＣｌ溶液中に溶解することにより製造した。次いで、この溶液を、等分し、蒸気滅菌した（１２１℃、３０分間）。
【００４３】
このＨＥＰＥＳ／Ｓｉ−ＨＰＭＣ混合物を、１５秒間、ボルテックス撹拌し、次いで、１２００ｒｐｍで２分間遠心した。この混合物を、培養プレートに移した。培地を１時間後に加えた。
【００４４】
ｄ）レオロジーによるヒドロゲルの物理的特性
器具及び方法
ヒドロゲルの架橋結合を特徴付けるために、本発明者らは、２つのレオロジー的なパラメータ：分散モジュールＧ’’（液体の特性）及び保存モジュールＧ’（固体の特性）を測定した。この測定をレオメーター（Ｒｈｅｏｓｔｒｅｓｓ  ３００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈａａｋｅ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）であって、直径６０ｍｍ及び角度１°を有する平面コーン（Ｃ６０／１チタン、ｐｌａｎａｒ  ｃｏｎｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈａａｋｅ）で提供される当該レオメーターを使用して実施した。先端（トランケーション）とプレートとの間は、０．０５３ｍｍだった。測定を、３振動数（１Ｈｚ、３．２Ｈｚ、及び１０Ｈｚ）、及び負担圧力１の振動モードにおいて、パスカル３７℃で、そして１，２００，０００秒間（１３．８日間）実施した。当該結果をＰａで表示した。
【００４５】
結果
当該ヒドロゲルは、その製造の間、粘稠液の特性を有する。架橋結合の間、その物理的特性は、ゲル特性に向けて発達する。好ましい態様に従って製造されたヒドロゲルであって、実施例１に示している当該ヒドロゲルは、一旦架橋結合過程を完了しており（１０日間）、１．５％の乾燥ポリマー及び９８．５％の水からなり、ここで含水量は、軟骨組織におけるものに相当する。当該ヒドロゲルの計算されたメッシュ・サイズ（０．２２μｍ）は、細胞のサイズより小さいように思えた。
【００４６】
ヒドロゲルの物理的特性、例えば、架橋結合過程の始まりに対応するゲル点、架橋結合時間、及びヒドロゲルのメッシュ・サイズといった当該特性を確立するために、時間の関数としての、液体成分（Ｇ’’）及び跳ね返り成分（Ｇ’）の発達を、３つの異なる振動数で測定した。一組のＧ’／Ｇ’’は、その結果、各振動数に対応した。各ペアのｔａｎΔを追跡すると、これらの３つは曲線を描きある点：ゲル点に集まっていた。当該ヒドロゲルの架橋結合は、その製造後３３分間で始まり、そして２４４時間後（１０日後）完遂され、跳ね返り成分（Ｇ’’）が、３１０Ｐａ値で安定期に達した時であった。この跳ね返り成分の値により、当該ヒドロゲルのメッシュ・サイズを計算することができた。
【数１】
2007510410.tif 000007
【００４７】
上記製造条件下、当該ヒドロゲル（Ｘｉ）の平均統計メッシュ・サイズは、０，０２３μｍであった。
【表１】
2007510410.tif 000008
【００４８】
実施例２：当該ヒドロゲルの細胞毒性試験
原料及び方法
２．１  細胞培養
ａ）軟骨細胞株
原料：
・ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）
・Ｈａｍ’ｓＦ１２培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
・ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
・Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
・トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
【００４９】
本発明者らは、ヒト軟骨細胞株  ＳＷ１３５３及びＣ２８／Ｉ２を使用し、当該細胞株は、ヒト軟骨肉腫由来（Ｍｅｎｇｓｈｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、及びシミアン・ウイルス４０のＴ抗原により不死化されたヒト肋軟骨由来（Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）であった。これらの細胞を、ＤＭＥＭ及びＨａｍ’ｓＦ１２の質量／質量  混合物であって、ＦＣＳ１０％、ペニシリン／ストレプトマイシン１％、及びＬ−グルタミン１％を添加した当該混合物（完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２）において、３７℃及び５％ＣＯ2含有での湿潤空気下、培養した。
【００５０】
当該培地を、一日おきに全て新しくした。一旦、細胞が集密（コンフルエンス）の８０〜９０％に達したら、当該細胞をトリプシン（０．０２５％）／ＥＤＴＡ（０．０１％）の２ｍｌで処理した。３分間、３７℃でインキュベートした後、当該トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を集め、そして、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地８ｍｌの存在下、遠心（８分間、１２００ｒｐｍ）した。上清の除去後、細胞ペレットを完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地１０ｍｌで再構成させた。次いで、当該細胞をカウントし、１０，０００細胞数／ｃｍ2の密度となるように２５ｃｍ2フラスコに蒔いた。
【００５１】
ｂ）主要な軟骨細胞
ヒト鼻軟骨細胞の単離
原料：
・ハンクス液（ＨＢＳＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
・プロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
・ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
【００５２】
ヒト鼻軟骨組織を除去した、ここで当該除去は、再生鼻形成術を受ける患者のインフォームド・コンセントを得て実施した。当該鼻軟骨組織をハンクス液（ＨＢＳＳ）で５回洗浄し、そして層流フードの下で細かく切断し、小片とした。次いで、当該軟骨組織小片を１ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼを含むＨＢＳＳ中で、３７℃で、３０分間、インキュベートした。次いで、当該小片をＨＢＳＳで３回濯ぎ、次いで、４時間、撹拌しながら、０．６２５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼを含む完全ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１％Ｌ−グルタミン）中で、インキュベートした。当該上清を５分間、１４００ｒｐｍで遠心した。当該ペレットをＨＢＳＳで１回洗浄し、遠心（８分間、１２００ｒｐｍ）し、そして、１０ｍｌ完全ＤＭＥＭ中に再懸濁した。当該細胞をカウント、１０，０００細胞数／ｃｍ2の密度で２５ｃｍ2フラスコに移した。当該細胞を、５％ＣＯ2を含む３７℃での湿潤空気下、培養した。当該培地を一日おきに新しくした。一旦、細胞が集密（コンフルエンス）の８０〜９０％に達したら、それらを、上記のように、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して処理した。
【００５３】
ラビット関節軟骨細胞の単離
原料：
・ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
・トリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
・ヒストリチクス菌  ＩＩ型コラゲナーゼ（２９０Ｕ／ｍｇ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
・セルスクリーン（Ｃｅｌｌ  ｓｃｒｅｅｎ）（Ｆａｌｃｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＵＳＡ）
【００５４】
Ｇｈａｙｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００により以前に記載された通り、生まれたばかりのラビット、年齢１２又は１３日、を麻酔後、頚椎脱臼により処理した。層流フードの下、前足及び後ろ足を取り外し、それらの軟組織をはぎ取った。次いで、膝及び肩の関節を外した。当該関節軟骨を、外科用メスを使用して微細な薄片に切り、そして、入手した当該小片をＨＢＳＳ中に置いた。これらの小片を、最初は、０．０５％ヒアルロニダーゼを含むＨＢＳＳの１２ｍｌ中において、３７℃で、１０分間、次いで、０．２％トリプシンを含むＨＢＳＳの６ｍｌ中において、３７℃で、１５分間、インキュベートした。ＨＢＳＳで２回濯いだ後、当該小片を０．２％のコラゲナーゼを含むＨＢＳＳ中に移し、３７℃で、３０分間インキュベートした。
【００５５】
当該小片を、０．０３％のコラゲナーゼで強化された完全ＤＭＥＭ溶液中において、１５時間のインキュベーションにより、温浸の最後のステップに供した。当該温浸生成物をセルスクリーンを通してろ過し、収集し、遠心（８分間、１２００ｒｐｍ）した。当該細胞ペレットを完全ＤＭＥＭの２０ｍｌ中に再懸濁した。当該細胞をカウントし、１０，０００細胞数／ｃｍ2の密度で２５ｃｍ2フラスコに移した。最後に、当該細胞を、５％ＣＯ2を含む３７℃での湿潤空気下、培養した。当該培地を一日おきに新しくした。一旦、細胞が集密（コンフルエンス）の８０〜９０％に達したら、それらを、上記のように、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して処理した。
【００５６】
２．２  当該ヒドロゲルの細胞毒性試験
ａ）実験条件
原料：
・Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ  ２４穴培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＢＶ，Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）
・アクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
・ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
・メチル・テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  ＭＴＳ，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）
・フェニル・メチル・スルホキシド（ＰＭＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
・リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
【００５７】
当該ヒドロゲルの細胞毒性を測定するために、当該ヒト主要軟骨細胞、ＳＷ１３５３及びＣ２８／Ｉ２を、２４穴プレートに１０，０００細胞個／ｃｍ2で配置した。５％ＣＯ2を含む３７℃での湿潤空気下、２４時間インキュベーション後、当該細胞を、ヒドロゲル存在下（５００μｌのＳｉ−ＨＰＭＣ／穴）又は不存在下（完全培地の５００μｌ）で、２４、４８、及び７２時間培養した。ヒドロゲル不存在下において培養された細胞を、アクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍｌ）又はその賦形剤（ＤＭＳＯ）でも処理し、細胞毒性ポジティブコントロールを得た。
【００５８】
ｂ）ＭＴＳ試験
この比色試験は、ホルマザン中のテトラゾリウム塩ＭＴＳを酸化するための生細胞のミトコンドリアの能力を測定する。形成された色のついた生成物は、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性に比例する。それ故、吸光度測定は、当該細胞生存能力を定量化することを可能とする。上記条件下で２４、４８、及び７２時間培養後、当該細胞を完全培地で洗浄し、そして、４８μｇ／ｍｌのＰＭＳ及び２ｍｇ／ｍｌのＭＴＳを含むＭＴＳ試薬１００μｌの存在下において、３７℃で、１時間、培養した。４９０nｍでの吸光度測定をマイクロプレートリーダー（ＭＲＸ，Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で実施した。当該結果を、対照条件（ヒドロゲル非存在下で培養した細胞）と比較したＭＴＳ活性のパーセンテージとして示した。
【００５９】
ｃ）細胞計数
上記特定の条件の下、２４、４８、及び７２時間インキュベーション後、ヒドロゲル存在下又は非存在下の培地を引き上げ、そして２００μｌのトリプシン／ＥＤＴＡにより置き換えた。当該細胞を、５％ＣＯ2含有３７℃の湿潤空気下、２分間インキュベートした。次いで、当該細胞を集め、２ｍｌの完全培地存在下、遠心（８分間、１２００ｒｐｍ）した。当該ペレットを２ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして当該細胞を、マラッセ細胞に対するトリパンブルー溶液（ＰＢＳ中０．０４％）での生体染色後、カウントした。当該結果を、総細胞数／穴において示した。
【００６０】
結論
２．３  ヒト鼻軟骨細胞の特性
単離されたヒト鼻軟骨細胞の表現型を特徴付けるために、本発明者らは、ＲＴ／ＰＣＲ方により、単離後及び単層培養の間の軟骨細胞表現型の特異的マーカーの発現を試験した。この試験により、新鮮に単離された鼻軟骨細胞（Ｐ０）は、コラーゲンＩＩ、アグリカン、及びコラーゲンＸを発現し、またコラーゲンＩも発現していることが明らかとなった。様々な段階の間、本発明者らは、様々な遺伝子の発現の変異を観察した。ＩＩ型コラーゲンの発現は、Ｐ０とＰ３の間で、減少した。アグリカンの発現は、Ｐ０とＰ１の間で、落ち込んだ。コラーゲンＸは、僅かに、新鮮に単離された軟骨細胞により発現させられ、その発現は、Ｐ３で、もはや検出されなかった。Ｉ型コラーゲンの発現は、逆に、Ｐ２とＰ３の間で、著しく高まった。
【００６１】
これらの結果により、当該新鮮に単離された鼻軟骨細胞は、コラーゲンＩＩ、アグリカン、及びコラーゲンＸを発現することが明らかとなった。これらの軟骨細胞マーカーの発現は、単層培養において低減し、そして、Ｉ型コラーゲンの発現における著しい高まりと関連した。
【００６２】
２．４  当該ヒドロゲルの細胞毒性
ａ）当該ゲルを介して培養された軟骨細胞のＭＴＳ活性の測定
軟骨細胞に対するヒドロゲルの細胞毒性を測定するために、本発明者らは、ＳＷ１３５３及びＣ２８／Ｉ２細胞株に対する、及びヒト鼻軟骨細胞に対する、Ｓｉ−ＨＰＭＣヒドロゲルを介する培養の２４、４８、及び７２時間後のＭＴＳ活性を分析した。
【００６３】
当該結果により、ＭＴＳ活性は、ヒドロゲルの存在により変化しない：ＳＷ１３５３、Ｃ２８／Ｉ２軟骨細胞、及びヒト鼻軟骨細胞について、当該対照培養条件とヒドロゲルを介して生成される培養との間で、著しい変化は観察されなかったことが明らかとなった。一方、アクチノマイシンＤは、この場合において細胞毒性ポジティブコントロールとして使用された転写阻害剤であるが、２４時間後からＭＴＳ活性における著しい低減を起こした。アクチノマイシンＤ存在下の２４時間後、ＳＷ１３５３、Ｃ２８／Ｉ２軟骨細胞、及びヒト鼻軟骨組織から単離された細胞のＭＴＳ活性は、それぞれ７２％、６９％、及び８６％低減した（図１Ａ〜１Ｃ）。
【００６４】
これらの結果により、当該ヒドロゲルは、ＳＷ１３５３及びＣ２８／Ｉ２軟骨細胞のＭＴＳ活性に影響を与えず、そしてまた、ヒト鼻軟骨細胞のＭＴＳ活性にも与えないことが明らかとなった。
【００６５】
ｂ）トリパンブルー計数
細胞増殖に対するヒドロゲルの影響を測定するために、本発明者らは、トリパンブルー染色による細胞計数を実施した。この染色は、死細胞（青）と生細胞（白）を区別することができる。当該計数を、ＳＷ１３５３及びＣ２８／Ｉ２軟骨細胞株、及びヒト鼻軟骨細胞について、ヒドロゲルを介する培養の２４、４８、及び７２時間後に実施した（図２Ａ〜２Ｃ）。
【００６６】
ＳＷ１３５３とＣ２８／Ｉ２軟骨細胞とヒト鼻軟骨細胞との間の細胞数について、当該対照培養条件下で、及びＳｉ−ＨＰＭＣヒドロゲルを介して生成された培養の間に培養された場合に著しい変化は観察されなかった。一方、アクチノマイシンＤは、２４時間後からの細胞数における著しい低減を生じた。アクチノマイシンＤ存在下における培養の２４時間後、ＳＷ１３５３軟骨細胞の数は８８％低減し、そして、Ｃ２８／Ｉ２軟骨細胞の数は８１％低減した。ヒト鼻軟骨細胞は、アクチノマイシンＤでの処理の２４時間後、４３％低減した。
【００６７】
これらの結果より、当該ヒドロゲルは、当該ＳＷ１３５３軟骨細胞、当該Ｃ２８／Ｉ２軟骨細胞又は当該ヒト鼻軟骨細胞の増殖に変化を与えないことが明らかとなった。
【００６８】
実施例３：ヒドロゲル内における軟骨細胞の培養
３．１  立体培養における軟骨細胞の観察
原料及び方法
実験条件
原料：
・セル・トラッカー・グリーン（ＣＴＧ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）
・エチジウム・ホモ二量体−１（ＥｔｈＤ−１）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）
【００６９】
当該ラビット関節軟骨細胞、当該ＳＷ１３５３、及びＣ２８／Ｉ２細胞を、１００万細胞数／１ｍｌヒドロゲルの比率において、ヒドロゲル中に懸濁した。この混合物の５００μｌを、２４穴培養プレート中の穴に挿入した。次いで、当該細胞を完全培地存在下、４８時間、９６時間、１週間、及び２週間培養した。同時に、ポジティブ細胞死対照（コントロール）を、５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ含有溶液を添加することにより実施した。当該ヒドロゲル内で培養した細胞を、セル・トラッカー・グリーン（ＣＴＧ）及びエチジウム・ホモ二量体１（ＥｔｈＤ−１）を使用して観察した。ＣＴＧは、無色製品であって、細胞膜を通して自由に拡散する。次いで、それは、細胞質内において、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼにより、細胞を脱離できない蛍光生成物に転換される。ＣＴＧは、生細胞においてグリーン蛍光を発する。ＥｔｈＤ−１は、ＤＮＡ挿入剤であって、その蛍光は、核酸結合後４０倍まで高まる。それは、膜損傷を有する細胞のみ染み込む。これらの２つの染料の併用使用は、生細胞（グリーン染色）及び死細胞（レッド染色）の共局在化を可能とする（Ｍａｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。当該培地を引き上げ、そして、完全培地中における５μＭのＣＴＧ溶液４００μｌにより置き換えた。当該細胞を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、当該ＣＴＧ溶液を完全培地により置き換え、そして、当該細胞を３７℃で３０分間、再度インキュベートした。ＰＢＳで濯いだ後、次いで、当該細胞を、１時間、周囲温度で、暗闇の中、ＦＣＳなしの完全培地中における１μＭのＥｔｈＤ−１溶液４００μｌで処理した。当該培地を最終的に除去し、当該ヒドロゲルを引き上げ、スライドとカバーグラスの間に置いた。画像を、落射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ，Ｚｅｉｓｓ，Ｉｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により入手し、ＤＣ３０デジタルカメラ（Ｋａｐｐａ  ｏｐｔｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｇｍｂｈ，Ｇｌｅｉｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して記録した。
【００７０】
当該ゲル中の細胞を、上記特定のように２４、４８、及び７２時間培養後、レーザー走査倒立型共焦点顕微鏡（ＩＦＲ２６，Ｃａｒｏｌｉｎｅ  Ｖｉｇｎｅｓ−Ｃｏｌｏｍｂｅｉｘ）によっても表示した。当該共焦点顕微鏡は、焦点面に対して無関係なシグナルを削除することにより、鮮明な画像を製造する。当該顕微鏡は、Ｚ軸に沿って動く被写体台を有し、焦点面を変化させることができ、そして、それ故、サンプルの様々な面を表示できる。当該ＣＴＧの蛍光をフルオレセインイソチオシアネート検出器（ＦＩＴＣ：λｅｘ＝４８８ｎｍ；吸収λｅｍ＝４９０〜５６０ｎｍ）を使用して追跡した。当該ＥｔｈＤ−１をローダミン検出器（ＴＲＩＴＣ：λｅｘ＝５６８ｎｍ；吸収λｅｍ＝５７０〜７００ｎｍ）により表示した。
【００７１】
結論
当該ヒドロゲル中での立体培養の間、当該軟骨細胞の発達を観察するために、本発明者らは、ＳＷ１３５３及びＣ２８／Ｉ２軟骨細胞に対して、及びラビット関節軟骨細胞に対して、染色（ＣＴＧ及びＥｔｈＤ−１）を実施した。次いで、蛍光顕微鏡により観察した。当該ヒドロゲル内で、当該ＳＷ１３５３及びＣ２８／Ｉ２軟骨細胞又はラビット関節軟骨細胞は、丸形を有し、そして、セル・トラッカー・グリーンにより、鮮やかにグリーンに染められていた。細胞は、ほとんど赤に染色されなかった。当該ＳＷ１３５３、Ｃ２８／Ｉ２、及びラビット関節軟骨細胞は、当該ヒドロゲル内で３次元に、小塊を形成しながら、発達し、その数及び大きさは、培養時間に応じて増えた。
【００７２】
当該ヒドロゲル内において培養された細胞の３次元の観測結果を提示するために、本発明者らは、共焦点顕微鏡によるそれらの観測結果を補足した。この試験において、Ｃ２８／Ｉ２細胞の観測結果のみを公表した。共焦点顕微鏡は、慣習的蛍光顕微鏡で前もって得ていた結果と同様の結果であることを明らかにした。当該細胞は、小塊を形成し発達した。アクチノマイシンＤで４８時間処理した細胞は、著しいレッド染色を表示した。グリーン染色された細胞はほとんど維持されていなかった。これらの結果から、本発明における培養条件下、当該セル・トラッカー・グリーン／エチジウム・ホモ二量体−１の二重染色法は、生細胞と死細胞をはっきりと区別できることが示唆された。当該ＳＷ１３５３軟骨細胞、当該ヒト鼻軟骨細胞、及びラビット関節軟骨細胞の観測結果を現在分析している。
【００７３】
これらの全結果より、当該ＳＷ１３５３及びＣ２８／Ｉ２軟骨細胞、及びラビット関節軟骨細胞は、当該ヒドロゲル中での立体培養において、それらの生存を維持することが明らかとなった。
【００７４】
３．２．軟骨細胞表現型の分析
軟骨細胞表現型を分析するために、特異的軟骨細胞マーカーをコードするメッセンジャーの発現をＲＴ−ＰＣＲ法により調査した。
【００７５】
（ａ）実験条件
原料：
・トリゾール（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
【００７６】
ヒト鼻軟骨組織から単離された細胞の表現型を特徴付けるために、新鮮に単離した細胞画分をトリゾール（登録商標）存在下、凍結した（段階０，Ｐ０）。他の細胞画分を、１０，０００／ｃｍ2の比率で、２５ｃｍ2フラスコに配置した。当該細胞を、上記条件下（ａ章）、毎週継代培養した。１、２、及び３段階後、当該細胞をトリゾール（登録商標）存在下、-８０℃で凍結した（段階１（Ｐ１）、２（Ｐ２）、３（Ｐ３））。
【００７７】
ラビット関節軟骨組織から新鮮に単離した軟骨細胞を、１００万細胞数／ヒドロゲル１ｍｌの比率において分配し、そしてこの混合物の２ｍｌを、６穴培養プレートの穴に挿入した。次いで、当該細胞を、トリゾール（登録商標）存在下、凍結するのに先立ち、３週間培養した。
【００７８】
（ｂ）総ＲＮＡｓの抽出
原料：
・クロロホルム（ＶＷＲ）
・イソプロパノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）
・エタノール（ＶＷＲ）
・アガロース（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
・エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
・トリスボラートＥＤＴＡ（ＴＢＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
【００７９】
当該細胞を氷上で解凍し削り：次いで、当該トリゾール（登録商標）溶液を集め、そして、４℃、１２，０００ｒｐｍで、１０分間、遠心した。当該上層を除去し；クロロホルム２００μｌを加え、そして、当該混合物を１５秒間、激しく撹拌（ボルテックス）した。周囲温度で１０分間インキュベート後、当該サンプルを４℃、１２，０００ｒｐｍで、１５分間、遠心した。当該水相を除去し、そして、総ＲＮＡｓを、イソプロパノール５００μｌ存在下において、遠心（１２，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）することにより、沈殿させた。当該上清を除去し、そして、当該ペレットを７５％エタノールで洗浄し、次いで乾燥させた。当該総ＲＮＡｓを水２０μｌに溶かした。次いで、当該単離したＲＮＡｓ量を、２６０ｎｍで吸光度を測定することにより算定した。最終的に、当該ＲＮＡ濃度を１μｇ／μｌに調整した。抽出したＲＮＡｓの完全性を確認するために、総ＲＮＡｓの５００ｎｇを、ＥｔＢｒを含むＴＢＥバッファー中の１％アガロースゲル上電気泳動法により分離した。移動（マイグレーション）は、１００Ｖで３０分間行った。当該総ＲＮＡｓをＵＶ徹照法の使用により表示した。
【００８０】
（ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ法による転写分析
ＤＮアーゼ処理
原料：
・デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮアーゼＩ）５Ｕ／μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
・１０×ＤＮアーゼＩバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
・エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）２５ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
【００８１】
ＲＮＡ２μｇを移動し；１０×ＤＮアーゼＩバッファーの１μｌ及びＤＮアーゼＩ（５Ｕ／μｌ）の１μｌを加え、そして、当該量を滅菌水の使用により１０μｌに調整した。次いで、当該サンプルを、周囲温度で１５分間インキュベートした。当該反応を２５ｍＭ  ＥＤＴＡの１μｌを添加することにより止め、そして、当該反応生成物を６５℃で１０分間置いた。
【００８２】
逆転写（ＲＴ）
原料：
・デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）１０ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
・０．５μｇ／μｌのヘキサヌクレオチド  プライマー（Ｒａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｌａｔｉｏｎ  Ｈｅｘａｐｒｉｍｅｒ  Ｃ１１８１）
・トリ骨髄芽球ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）１０Ｕ／μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
・５×ＡＭＶ−ＲＴバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
・ＲＮアーゼ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）４００Ｕ／μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
【００８３】
各サンプルに、ＤＮアーゼでの処理に先立ち、１０ｍＭのｄＮＴＰの３μｌ、ヘキサヌクレオチド・プライマーの３μｌ、ＡＭＶ−ＲＴバッファーの６μｌ、ＡＭＶ−ＲＴの１μｌ、及びＲＮＡｓｉｎの１μｌを加え；当該量を滅菌水の使用により３０μｌに調整した。逆転写を、以下の条件：２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、９５℃で１０分間の下、サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ，ＶＷＲ）を使用して実施した。このように入手した当該一本鎖相補ＤＮＡ溶液（ｃＤＮＡ）を、次いで、ＰＣＲ反応に使用するまで、-２０℃で保存した。
【００８４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
原料：
・特異的オリゴマー・プライマー（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）
・１０×Ｔａｑポリメラーゼバッファー  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
・Ｔａｑポリメラーゼ  ５Ｕ／μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
・ＭｇＣｌ2  ５０ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
【００８５】
ＰＣＲをｃＤＮＡ溶液の２μｌであって、１００ｎｇ／μｌにおけるセンスプライマー０．５μｌ及びアンチセンスプライマー０．５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼバッファーの５μｌ、ＭｇＣｌ2の１．５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼの０．５μｌ、及び水の４０μｌを加えた溶液を使用して行った。当該ＰＣＲ反応を、以下の条件：９４℃で変性の３分間、その後、９４℃で２０秒間（変性）、６０℃で２０秒間（ハイブリダイゼーション）、及び７２℃で伸長の２０秒間の３０サイクルの下、サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）を使用して行った。当該ＰＣＲを、７２℃で伸長の１０分間により完結させた。この試験結果により、ＰＣＲ産物は指数増幅段階において得られることが明らかとなった。当該プライマーの配列、当該ハイブリダイゼーション温度、及び当該増幅単位（アンプリコン）の長さを、表２（以下の表）において、特定した。
【００８６】
【表２】
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【００８７】
（ｄ）アガロースゲル上での分離
当該ＰＣＲ増幅産物を、１×トリス・ボラートＥＤＴＡバッファー（ＴＢＥ）中における２％アガロースゲル上での電気泳動で分離した。当該バンドを、ＵＶ徹照法を用いて、エチジウムブロマイドにより明らかとした。アンプリコンの長さを表２に示す。
【００８８】
（ｅ）当該アガロースゲルの半定量濃度分析
当該２％アガロースゲル上で得られた当該バンドの明暗度（関連遺伝子及び参考遺伝子）を、Ｌｅｉｃａ  Ｑ５００  ソフトウエア（Ｌｅｉｃａ  Ｉｍａｇｉｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）の使用により評価し、様々な実験条件の下、増幅された転写の半定量濃度分析が可能となる。当該結果を、当該関連遺伝子／参考遺伝子の比として任意の単位で示した。
【００８９】
結論
ヒドロゲル中での立体培養におけるラビット関節軟骨細胞の表現型の維持を確認するため、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＩＩ型コラーゲン、アグリカン、及びコラーゲンＸをコードする転写産物の発現を評価した。Ｉ型コラーゲンの発現をも同時に評価した。
【００９０】
単層培養の間、本発明者らは、ＩＩ型コラーゲン、アグリカン、及びＸ型コラーゲンの発現における低減を観察した。３週間の培養後、当該ＩＩ型コラーゲンは未だ僅かに発現しており、一方、Ｘ型コラーゲン及びアグリカンは、もはや検出できなかった。同時に、本結果により、Ｉ型コラーゲンの発現は、単層培養３週間後、増えていたことが明らかとなった。
【００９１】
反対に、当該細胞を３週間のヒドロゲル中での立体培養したところ、ＩＩ型コラーゲン、アグリカン、及びＸ型コラーゲンの発現は維持された。Ｉ型コラーゲンの発現は、促進されるようには見えなかった。
【００９２】
これらの結果は、ラビット関節軟骨細胞の立体培養は、軟骨細胞マーカー（コラーゲンＩＩ、アグリカン、及びコラーゲンＸ）の発現を可能とし維持し得ることを示唆した。
【００９３】
実施例４：立体培養における当該軟骨細胞の再分化試験
培養
実施例１において製造されたヒドロゲル中での立体培養における当該軟骨細胞の再分化試験のために、新鮮に単離されたヒト及びラビット、鼻及び関節軟骨細胞を、単層で４週間、次いで、ヒドロゲル内３次元で、及び同時に単層で、４週間培養した。
【００９４】
総ＲＮＡｓを、単層培養及び当該立体培養の２、３、及び４週間後の間の各段階で抽出した。軟骨細胞表現型の特異的マーカーである、ＩＩ型コラーゲン及びアグリカンの発現を、軟骨細胞の脱分化のマーカーである、Ｉ型コラーゲンとともに、ＲＴ−ＰＣＲ法により試験した。
【００９５】
当該結果により、新鮮に単離された軟骨細胞は、ＩＩ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、及びアグリカンを発現していることが明らかとなった。これらのマーカーの発現は、単層培養の間に変化し；ＩＩ型コラーゲン及びアグリカンの発現は、様々な段階で、３段階の最後で消失するまで低減し、一方、Ｉ型コラーゲンの発現は、最初の段階からずっと、著しく増え、様々な段階の間、著しく発現したままであった。その結果、当該軟骨細胞は、単層培養における３段階の最後で、脱分化したように見えた。次いで、ヒドロゲル中での当該軟骨細胞の立体培養の間、当該結果により、ＩＩ型コラーゲン、及びアグリカンの発現が増え、Ｉ型コラーゲンの発現が低減することが明らかとなった。これらの結果は、当該細胞は、ヒドロゲル内において、軟骨細胞表現型を回復したことを提示した。
【００９６】
これらの結果より、使用されたヒドロゲルは、前もって脱分化した軟骨細胞の再分化を可能とすることを示唆した。
【００９７】
統計的試験法
全試験を３通り実施した。各試験を２回実施した。当該結果を平均＋／−標準偏差により表示した。平均の対照試験を、差異分析法試験（Ａｎｏｖａ試験）を使用して実施した。当該結果について、ｐ＜０．０５を有意差があると考えた。
【００９８】
実施例５：鼻軟骨細胞の皮下移植
ヒドロゲルを、先の実施例に記載の通り製造し、鼻軟骨組織（ＨＮＣ）由来のヒト軟骨細胞と一体化した。次いで、それらを、ヌードマウスにおいて皮下移植し、そして３週間放置した。
【００９９】
当該試験を以下の５条件：
（１）ヒト鼻軟骨細胞を、移植に先立つ１５日間、当該ヒドロゲル内において、立体培養した。
（２）ヒト鼻軟骨細胞を、当該ヒドロゲル経由の移植に先立ち、単層において１５日間培養した。
（３）ヒト鼻軟骨細胞を、新鮮に単離し、そして当該ヒドロゲルを経由して移植した。
（４）ヒト包皮繊維芽細胞を、当該ヒドロゲルを経由する移植に先立ち、単層において、１５日間培養した。
（５）単なるヒドロゲル
の下、実施した。
【０１００】
当該移植の回復の間、本発明者らは、当該移植が移植後３週間でもまだはっきりと見えるように留意した。その結果、当該ヒドロゲルはこれらの３週間の間、再吸収されることはなかった。当該組織学的分析により、ＨＮＣを含む３つの条件（条件１、２、及び３）について、当該ヒドロゲル内にアリシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ）染色としてのポジティブ軟骨細胞小塊の存在が明らかとなった。その結果、これらの全結果により、我々は、当該Ｓｉ−ＨＰＭＣヒドロゲルが、生体内における３週間後の軟骨型組織の新形成を可能としたことを示した。
【０１０１】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、軟骨細胞のＭＴＳ活性を示し、ここで、当該軟骨細胞は、２４時間、４８時間、及び７２時間培養され、以下の条件、対照条件（ヒドロゲルなし）、ｓｉ−ＨＰＭＣヒドロゲルと接触下、又はアクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍｌ）の存在下、における培養である。ＳＷ１３５３（図１Ａ）、Ｃ２８／１２（図１Ｂ）及びヒト鼻軟骨細胞（図１Ｃ）である。*ｐ＜０．００１は、各段階で対照（コントロール）と比較した。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、軟骨細胞数を示し、ここで、当該軟骨細胞は、２４時間、４８時間、及び７２時間培養され、以下の条件、対照条件（ヒドロゲルなし）、ｓｉ−ＨＰＭＣヒドロゲルと接触下、又はアクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍｌ）の存在下、における培養である。ＳＷ１３５３（図２Ａ）、Ｃ２８／１２（図２Ｂ）及びヒト鼻軟骨細胞（図２Ｃ）である。*ｐ＜０．００１は、各段階で対照（コントロール）と比較した。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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