(57)【要約】  四量体の形態のα−葉酸受容体に特異的に結合しかつ単量体の形態を結合しないモノクローナル抗体が提供される。該抗体は、ある種の癌、とりわけ、卵巣癌のようなα葉酸受容体（「ＦＲ−α」）の増大した細胞表面発現を有する癌の処置で有用である。該モノクローナル抗体、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような抗体誘導体、抗体フラグメントを発現するハイブリドーマ細胞、該モノクローナル抗体、誘導体およびフラグメントを発現する哺乳動物細胞、ならびに該抗体、誘導体およびフラグメントを使用する癌の検出および処置方法もまた提供される。
2007537709.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｍＡｂ  ＬＫ２６のエピトープ以外のエピトープに結合するか；（ｂ）ｍＡｂ  ＬＫ２６よりも大きい親和性で結合するか；若しくは（ｃ）四量体の形態のＦＲ−αへの結合についてｍＡｂ  ＬＫ２６より優れた適性を有する、においてｍＡｂ  ＬＫ２６と識別される、四量体の形態のＦＲ−αに特異的に結合する抗体。
【請求項２】
前記抗体の親和性が最低約１×１０−７Ｍである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体の親和性が最低約１×１０−８Ｍである、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体の親和性が最低約１×１０−９Ｍである、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体の親和性が最低約１×１０−１０Ｍである、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記エピトープがジスルフィド依存性の１エピトープである、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記キメラ抗体がヒト−マウスキメラ抗体である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が完全にヒトの抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体を発現するハイブリドーマ細胞。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを含んでなる発現細胞。
【請求項１５】
請求項１１に記載のハイブリドーマを培養する段階を含んでなる、（ａ）ｍＡｂ  ＬＫ２６のエピトープ以外のエピトープに結合するか；（ｂ）ｍＡｂ  ＬＫ２６よりも大きい親和性で結合するか；若しくは（ｃ）四量体の形態のＦＲ−αへの結合についてｍＡｂ  ＬＫ２６より優れた適性を有する、点においてｍＡｂ  ＬＫ２６と識別される、四量体の形態のＦＲ−αに特異的に結合する抗体の製造方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の発現細胞を培養する段階を含んでなる、（ａ）ｍＡｂ  ＬＫ２６のエピトープ以外のエピトープに結合するか；（ｂ）ｍＡｂ  ＬＫ２６よりも大きい親和性で結合するか；若しくは（ｃ）四量体の形態のＦＲ−αへの結合についてｍＡｂ  ＬＫ２６より優れた適性を有する、点においてｍＡｂ  ＬＫ２６と識別される、四量体の形態のＦＲ−αに特異的に結合する抗体の製造方法。
【請求項１７】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の発現細胞。
【請求項１８】
前記発現細胞が哺乳動物細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）ＬＫ２６のエピトープ以外のエピトープに結合するか、（ｂ）ＬＫ２６よりも大
きい親和性で結合するか；若しくは（ｃ）四量体の形態のＦＲ−αへの結合についてｍＡｂ  ＬＫ２６より優れた適性を有する、点においてＬＫ２６と識別される、四量体の形態のＦＲ−αに特異的に結合する抗体を含んでなる組成物を、異形成細胞を伴う患者に投与することを含んでなる、ＦＲ−αの増大した発現と関連するこうした異形成細胞の増殖の阻害方法。
【請求項２０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記異形成細胞が卵巣癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記患者がヒト患者である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体が化学療法剤とコンジュゲートしている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記化学療法剤が放射性核種である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記放射性核種が、鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７、インジウム−１１１、ホウ素−１０およびアクチニドよりなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化学療法剤が、リシン、改変シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）腸毒素Ａ、カリチェアミシン、アドリアマイシンおよび５−フルオロウラシルよりなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
抗体が化学療法剤に結合されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項２８】
前記化学療法剤が放射性核種である、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
前記放射性核種が、鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７、インジウム−１１１、ホウ素−１０およびアクチニドよりなる群から選択される、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
前記化学療法剤が、リシン、改変シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）腸毒素Ａ、カリチェアミシン、アドリアマイシンおよび５−フルオロウラシルよりなる群から選択される、請求項２７に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との関係
本出願は、２００３年５月２３日出願の米国仮出願第６０／４７２，９４０号（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、四量体の形態のα−葉酸受容体に特異的に結合しかつ単量体の形態を結合しない新規モノクローナル抗体に関する。該抗体は、ある種の癌、とりわけ、卵巣癌のようなα−葉酸受容体（「ＦＲ−α」）の増大した細胞表面発現を有する癌の処置において有用である。本発明はまた、該モノクローナル抗体、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような抗体誘導体、抗体フラグメントを発現するハイブリドーマ細胞、該モノクローナル抗体、誘導体およびフラグメントを発現する哺乳動物細胞、ならびに該抗体、誘導体およびフラグメントを使用する癌の検出および処置方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト膜葉酸結合タンパク質の２種の主要なアイソフォームαおよびβが存在する。該２種のアイソフォームは約７０％のアミノ酸配列相同性を有しかつ数種の葉酸に対するそれらの立体特異性が劇的に異なる。双方のアイソフォームは胎児および成体双方の組織で発現されるとは言え、正常組織は一般に低ないし中程度の量のＦＲ−βを発現する。ＦＲ−αは、しかしながら正常上皮細胞中で発現され、そしてしばしば多様な癌腫中で著しく上昇している（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８。非特許文献９；および非特許文献１０）。ＦＲ−αは卵巣癌の９０％以上で過剰発現されている（非特許文献１１）。
【０００４】
葉酸結合タンパク質に対する抗体の投与が卵巣癌の処置のための一戦略として提案された。
【０００５】
１９８７年に、Ｍｉｏｔｔｉらは、ヒト卵巣癌細胞上の抗原を認識した３種の新たなモノクローナル抗体を記述した（非特許文献９）。これらのうち１種はＭＯｖ１８と称され、絨毛癌細胞の表面上の３８ｋＤａのタンパク質を認識する。ＭＯｖ１８はネズミのＩｇＧ１  κ抗体であり、そして卵巣癌細胞株ＩＧＲＯＶ１の特異的細胞溶解を媒介する。Ａｌｂｅｒｔｉら（非特許文献１２）は、ＭＯｖ１８により認識される抗原がＧＰＩ結合型タンパク質であったことを示した。これはその後、ヒト葉酸結合タンパク質と同定された（非特許文献４）。Ｔｏｍａｓｓｅｔｔｉらは、ＭＯｖ１８がＩＧＲＯＶ１細胞中で可溶性の形態およびＧＰＩアンカー型の形態の葉酸結合タンパク質を認識することを示した（非特許文献１３）。その後の研究はマウスＭＯｖ１８の可変領域をヒトＩｇＧ１（κ）定常領域と組合せてキメラ化ＭＯｖ１８抗体を創製した。該キメラ化抗体は、１０〜１００倍より低い抗体濃度でＩＧＲＯＶ１細胞のより多くかつより特異的な溶解を媒介した（非特許文献１４）。該３８ｋＤａの抗原が単量体の形態のＦＲ−αであるとみられる。
【０００６】
特許文献１は３８ｋＤａのタンパク質（ＦＲ−α）に結合するヒト化抗体を記述している。該抗体は、抗原にちなんで同一名称によりＬＫ２６と命名された。元のマウスモノクローナル抗体は特許文献２（特許文献３として公開されかつ米国で特許文献４として交付された）により記述された。
【０００７】
卵巣癌は婦人科の悪性疾患による死亡の主要原因である。化学療法が推奨される処置でありかつ若干の成功を享受しているとは言え、５年生存期間はなお４０％未満である。
【０００８】
癌における抗体治療の困難な一問題は、しばしば抗体の標的が正常組織ならびに癌性組織により発現されることである。従って、癌細胞を殺すのに使用される抗体は正常細胞に対する有害な影響もまた有する。癌組織中で優先的に発現される独特の標的（１種若しくは複数）を見出すことが多くの癌で困難と判明している。正常組織との反応性の問題を回避する卵巣および他のＦＲ−αをもつ癌に対するより効果的な抗体治療が必要とされる。
【特許文献１】米国特許第５，９５２，４８４号明細書
【特許文献２】欧州特許出願第８６１０４１７０．５号明細書
【特許文献３】欧州特許第ＥＰ０１９７４３５号明細書
【特許文献４】米国特許第４，８５１，３３２号明細書
【非特許文献１】Ｒｏｓｓら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  ７３（９）：２４３２−２４４３
【非特許文献２】Ｒｅｔｔｉｎｇら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３１１０−３１１４
【非特許文献３】Ｃａｍｐｂｅｌｌら（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５３２９−５３３８
【非特許文献４】Ｃｏｎｅｙら（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１（２２）：６１２５−６１３２
【非特許文献５】Ｗｅｉｔｍａｎら（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：３３９６−３４０１
【非特許文献６】Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａら（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４２：５５７−５６７
【非特許文献７】Ｈｏｌｍら（１９９４）ＡＰＭＩＳ  １０２：４１３−４１９
【非特許文献８】Ｆｒａｎｋｌｉｎら（１９９４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８（Ｓｕｐｐｌ．）：８９−９５
【非特許文献９】Ｍｉｏｔｔｉら（１９８７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３９（３）：２９７−３０３
【非特許文献１０】Ｖｅｇｇｌａｎら（１９８９）Ｔｕｍｏｒｉ  ７５：５１０−５１３
【非特許文献１１】ＳｕｄｉｍａｃｋとＬｅｅ（２０００）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４１（２）：１４７−６２
【非特許文献１２】Ａｌｂｅｒｔｉら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７１（３）：１０５１−１０５５
【非特許文献１３】Ｔｏｍａｓｓｅｔｔｉら（１９９３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１７（１−２）：１４３−１４６
【非特許文献１４】Ｃｏｎｅｙら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４（９）：２４４８−２４５５
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
ＦＲ−αを過剰発現する腫瘍が四量体の形態のＦＲ−αの形成に好都合である傾向があることが発見された。いずれかの特定の理論により束縛されることを意図するものではないが、四量体の形態のＦＲ−αの形成が腫瘍細胞の表面上のより大量のＦＲ−αの蓄積による質量効果により駆動されると考えられる。以前、他の研究者らは、それらの疎水性の尾部を介してＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ミセル中に挿入されたＦＲ−αを表した、ゲル濾過アッセイでのより高分子量の種のＦＲ−αを見出したのみであった（Ｈｏｌｍら（１９９７）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  １７（４）：４１５−４２７）。腫瘍の表面上の四量体の形態のＦＲ−αは以前に記述されていない。
【００１０】
本発明は、（ａ）ｍＡｂ  ＬＫ２６のエピトープ以外のエピトープに結合するか；（ｂ）ｍＡｂ  ＬＫ２６よりも大きい親和性で結合するか；若しくは（ｃ）四量体の形態のＦＲ−αへの結合についてｍＡｂ  ＬＫ２６より優れた適性を有する、点においてｍＡｂ  ＬＫ２６と識別される、四量体の形態のＦＲ−αに特異的に結合しかつ単量体の形態を結合しない抗体を提供する。
【００１１】
本発明の抗体は、最低約１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ若しくは１×１０−１２Ｍの親和性を有し、そしてジスルフィド依存性の１エピトープを認識する。
【００１２】
本発明の抗体は、限定されるものでないが、ヒト−マウスキメラ抗体を挙げることができるキメラ抗体でありうる。本発明の抗体はまたヒト化抗体でもありうる。本発明はまた：本発明の抗体を発現するハイブリドーマ細胞；本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド；本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター；および本発明のベクターを含んでなる発現細胞も提供する。
【００１３】
本発明はまた、（ａ）ｍＡｂ  ＬＫ２６のエピトープ以外のエピトープに結合するか；（ｂ）ｍＡｂ  ＬＫ２６よりも大きい親和性で結合するか；若しくは（ｃ）四量体の形態のＦＲ−αへの結合についてｍＡｂ  ＬＫ２６より優れた適性を有する、点においてｍＡｂ  ＬＫ２６と識別される、四量体の形態のＦＲ−αに特異的に結合しかつ単量体の形態を結合しない抗体の製造方法も提供する。本発明の抗体を発現するハイブリドーマ細胞若しくは本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを含んでなる発現細胞を培養する段階を含んでなる方法。本発明の発現細胞は昆虫細胞、および動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞でありうる。
【００１４】
本発明はさらに、（ａ）ＬＫ２６のエピトープ以外のエピトープに結合するか；（ｂ）ＬＫ２６よりも大きい親和性で結合するか；若しくは（ｃ）四量体の形態のＦＲ−αへの結合についてｍＡｂ  ＬＫ２６より優れた適正を有する、点においてＬＫ２６と識別される、四量体の形態のＦＲ−αに特異的に結合する抗体を含んでなる組成物を、異形成細胞（ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）を伴う患者に投与することを含んでなる、ＦＲ−αの増大した発現と関連するこうした異形成細胞の増殖の阻害方法を提供する。該方法は、限定されるものでないが卵巣癌を挙げることができる多様な異形成状態に使用しうる。好ましい態様において、患者はヒト患者である。いくつかの態様において、該抗体は、限定されるものでないが放射性核種、毒素および化学療法剤を挙げることができる免疫毒性剤に結合される。
［発明の詳細な記述］
本明細書に引用されるＧｅｎＢａｎｋデータベース配列への受託番号を包含する参照研究、特許、特許出願および学術論文は、当業者の知識を確立し、そして、これにより、それぞれが引用することにより組込まれることをとりわけおよび個々に示された場合と同一の程度までそっくりそのまま引用することにより組込まれる。本明細書で引用されるいずれかの参考文献と本明細の特定の教示との間のいかなる矛盾も後者に好都合に解決されるべきである。同様に、語若しくは句の技術に理解される定義と本明細でとりわけ教示されるところの該語若しくは句の定義との間のいかなる矛盾も後者に好都合に解決されるべきである。
【００１５】
当業者に既知の組換えＤＮＡ技術の一般原理を示す標準的な参照研究は、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州プレインビュー（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎら編、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボカレイトン（１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード（１９９１）を包含する。
【００１６】
本発明は、四量体の形態の哺乳動物のＦＲ−αに特異的に結合するモノクローナル抗体を使用する癌細胞の増殖および腫瘍性疾患の進行の低下方法を提供する。本発明の方法を使用して、ヒトを包含する哺乳動物における癌細胞の増殖および癌の進行を調節しうる。阻害されうる癌細胞は、正常ヒト組織に関してＦＲ−αの増大した発現を有する全部の癌細胞、とりわけ卵巣癌細胞を包含する。
【００１７】
いずれかの特定の操作理論により束縛されることを願うことなく、癌細胞中でのＦＲ−αの増大した発現は、細胞の表面上で四量体の形態のＦＲ−αを形成する単量体の形態のＦＲ−αの増大した会合をもたらすと考えられる。従って、癌細胞は正常組織に関して四量体の形態のＦＲ−αの増大した発現を有する。従って、四量体の形態のＦＲ−αは癌における抗体治療のための理想的な標的である。
【００１８】
本明細書で使用されるところの「エピトープ」という用語は、モノクローナル抗体が特異的に結合する抗原の部分を指す。
【００１９】
本明細書で使用されるところの「コンホメーションエピトープ」という用語は、間断のない一連のアミノ酸以外の抗原のアミノ酸間の空間的関係により形成される不連続的なエピトープを指す。
【００２０】
本明細書で使用されるところの「四量体の」という用語は、４個の同一の若しくはほぼ同一の単位の一群を指す。
【００２１】
本明細書で使用されるところの「単量体の」という用語は、他の単位と群に集成する成熟タンパク質の単一の単位を指す。
【００２２】
本明細書で使用されるところの「ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの異形成細胞の増殖の阻害」という用語は、培養物中の腫瘍細胞の数の約５％、好ましくは１０％、より好ましくは２０％、より好ましくは３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは９０％、および最も好ましくは１００％の減少を意味している。腫瘍細胞の増殖のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害はＧＥＯ細胞ソフトアガーアッセイのような当該技術分野で既知のアッセイにより測定しうる。
【００２３】
本明細書で使用されるところの「ｉｎ  ｖｉｖｏでの異形成細胞の増殖の阻害」という用語は、動物中の腫瘍細胞の数の約５％、好ましくは１０％、より好ましくは２０％、より好ましくは３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは９０％、および最も好ましくは１００％の減少を意味している。腫瘍細胞の増殖のｉｎ  ｖｉｖｏでの調節は当該技術分野で既知のアッセイにより測定しうる。
【００２４】
本明細書で使用されるところの「異形成細胞」は異常な増殖を表す細胞を指す。異形成細胞は、限定されるものでないが腫瘍、過形成などを挙げることができる。
【００２５】
「予防すること」という用語は、生物体が異常な状態と接触またはそれを発生する確率を低下させることを指す。
【００２６】
「処置すること」という用語は、生物体において治療効果を有することおよび異常な状態を少なくとも部分的に軽減若しくは阻止することを指す。処置することは、阻害された腫瘍増殖の維持および寛解の誘導を包含する。
【００２７】
「治療効果」という用語は異常な状態の阻害を指す。治療効果は異常な状態の症状の１種若しくはそれ以上をなんらかの程度まで緩和する。異常な状態の処置に関して、治療効果は以下、すなわち（ａ）細胞の増殖、成長および／若しくは分化の増大若しくは減少；（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の増殖の阻害（すなわち減速若しくは停止）；（ｃ）細胞死の促進；（ｄ）変性の阻害；（ｅ）異常な状態と関連する症状の１種若しくはそれ以上のなんらかの程度までの緩和；ならびに（ｆ）細胞の集団の機能を高めることの１種もしくはそれ以上を指すことができる。本明細書に記述されるモノクローナル抗体およびそれらの誘導体は、単独でまたは本発明の組成物の複合物若しくは付加的な成分とともに治療効果を達成する。
【００２８】
本明細書で使用されるところの「癌の進行を阻害する」という用語は、未処置の癌細胞の末期疾患への調節に関して腫瘍性疾患の末期癌への調節を遅らせる処置の活性を指す。
【００２９】
本明細書で使用されるところの「約」という用語は、許容できる範囲内の述べられた値の近似値を指す。好ましくは、該範囲は述べられた値の＋／−５％である。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「腫瘍性疾患」という用語は組織の細胞の異常な増殖により示される状態を指す。
抗体
本発明の抗体は四量体の形態のＦＲ−αを特異的に結合しかつ単量体の形態のＦＲ−αを結合しない。いくつかの態様において、該抗体はＬＫ２６と同一のエピトープに結合する。他の態様において、該抗体はＬＫ２６により結合されるもの以外のエピトープに結合する。
【００３１】
好ましい抗体、および本発明の方法での使用に適する抗体は、例えば、完全にヒトの抗体、ヒト抗体ホモログ、ヒト化抗体ホモログ、キメラ抗体ホモログ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）抗体フラグメント、一本鎖抗体、ならびに抗体Ｈ若しくはＬ鎖の単量体若しくは二量体またはそれらの混合物を包含する。
【００３２】
本発明の抗体は、タイプＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそれらのサブタイプ）を包含するいかなるアイソタイプの無傷の免疫グロブリンも包含しうる。免疫グロブリンのＬ鎖はκ若しくはλでありうる。
【００３３】
本発明の抗体は、抗原結合特異性を保持する無傷の抗体の部分、例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、Ｈ鎖単量体若しくは二量体、Ｌ鎖単量体若しくは二量体、１本のＨ鎖および１本のＬ鎖よりなる二量体などを包含する。従って、上述される抗体由来の抗原結合フラグメントならびに完全長の二量体若しくは三量体ポリペプチドはそれら自体有用である。
【００３４】
本発明の発現細胞は、例えばスポドプテラ  フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のような既知のいかなる昆虫発現細胞株も包含する。発現細胞株はまた例えばビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）細胞のような酵母細胞株でもありうる。発現細胞はまた、例えばチャイニーズハムスター卵巣、ベビーハムスター腎細胞、ヒト胎児腎株２９３、正常イヌ腎細胞株、正常ネコ腎細胞株、サル腎細
胞、アフリカミドリザル腎細胞、ＣＯＳ細胞、ならびに非腫瘍原性マウス筋芽細胞Ｇ８細胞、線維芽細胞株、骨髄腫細胞株、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ３１細胞、マウスセルトリ細胞、ヒト子宮頚癌細胞、バッファロー系ラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳腺癌細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ  ５細胞およびＦＳ４細胞のような哺乳動物細胞でもありうる。
【００３５】
「キメラ抗体」は、免疫グロブリンのＬ鎖、Ｈ鎖若しくは双方のヒンジおよび定常領域の全部若しくは一部が別の動物の免疫グロブリンＬ鎖若しくはＨ鎖からの対応する領域の代わりに用いられている組換えＤＮＡ技術により製造される抗体である。こうして、親モノクローナル抗体の抗原結合部分が別の種の抗体のバックボーンにグラフトされる。Ｗｉｎｔｅｒらへの欧州特許第ＥＰ  ０２３９４００号明細書に記述される一アプローチは、ヒトＨおよびＬ鎖免疫グロブリン可変領域ドメインからの相補性決定領域（ＣＤＲ）をマウス可変領域ドメインからのＣＤＲで置換することのような、１種のＣＤＲでの他の種のものの代用を記述している。これらの変えられた抗体をその後、ヒト免疫グロブリン定常領域と組合せて、該抗原に特異的である置換されたネズミのＣＤＲ以外ヒトである抗体を形成しうる。抗体のＣＤＲ領域のグラフト方法は、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６に見出しうる。
【００３６】
キメラ抗体は、キメラ抗体がより少ないネズミのアミノ酸配列を含有するよりも、ヒトにおいて免疫応答を導き出すという問題を回避すると考えられた。ヒト治療薬としてのげっ歯類ＭＡｂの直接使用が、げっ歯類由来抗体で処置した患者のかなりの数で発生したヒト抗げっ歯類抗体（「ＨＡＲＡ」）応答につながったことが見出された（Ｋｈａｚａｅｌｉら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１５：４２−５２）。
【００３７】
制限しない一例として、ＣＤＲグラフトの一実施方法は、標的抗原（例えばＦＲ−α）に結合する目的の抗体のマウスＨおよびＬ鎖を配列決定すること、ならびにＣＤＲ  ＤＮＡ配列を遺伝子的に工作しかつこれらのアミノ酸配列を部位特異的突然変異誘発により対応するヒトＶ領域に置くことにより実施しうる。所望のアイソタイプのヒト定常領域遺伝子セグメントが付加され、そして「ヒト化」ＨおよびＬ鎖遺伝子が哺乳動物細胞中で共発現されて可溶性ヒト化抗体を産生する。典型的な発現細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。キメラ抗体の適する創製方法は例えばＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ
３３２：３２３−３２７；Ｑｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９；およびＯｒｌａｎｄｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３８３３に見出しうる。
【００３８】
ＨＡＲＡ応答の問題を回避するための抗体のさらなる改良は「ヒト化抗体」の開発に至った。ヒト化抗体は組換えＤＮＡ技術により製造され、ここでは抗原結合に必要とされないヒト免疫グロブリンＬ若しくはＨ鎖のアミノ酸の少なくとも１個が、ヒト以外の哺乳動物の免疫グロブリンＬ若しくはＨ鎖からの対応するアミノ酸の代わりに用いられている。例えば、免疫グロブリンがマウスモノクローナル抗体である場合、抗原結合に必要とされない最低１個のアミノ酸を、対応するヒト抗体上でその位置に存在するアミノ酸を使用して置換する。いずれかの特定の操作理論により束縛されることを願うことなく、モノクローナル抗体の「ヒト化」は外来の免疫グロブリン分子に対するヒトの免疫学的反応を阻害すると考えられる。
【００３９】
Ｑｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３および第ＷＯ  ９０／０７８６１号明細書はヒト化抗体の製造法を記述している。ヒトおよびマウスの可変枠組み領域を至適のタンパク質配列相同性のため選んだ。マウスの可変領域の三次構造をコンピュータモデル化し、そしてアミノ酸残基のマウスＣＤＲとの至適の相互作用を示すように相同なヒト枠組みに重ね合わせた。これは抗原に対する改良された結合親和性（ＣＤＲグラフトキメラ抗体の作成に際して典型的には低下する）をもつ抗体の開発につながった。ヒト化抗体の作成への代替のアプローチは当該技術分野で既知であり、かつ、例えばＴｅｍｐｅｓｔ（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１に記述されている。
【００４０】
「一本鎖抗体」は、免疫グロブリンＨおよびＬ鎖フラグメントが工作されたアミノ酸スパンを介してＦｖ領域に結合されている、組換えＤＮＡ技術により形成される抗体を指す。米国特許第４，６９４，７７８号明細書；Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４５４；Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１に記述されるものを包含する多様な一本鎖抗体生成方法が既知である。
【００４１】
本発明の抗体は、単独で若しくは細胞傷害剤との免疫複合物として使用しうる。いくつかの態様において、細胞傷害剤は、限定されるものでないが鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７、インジウム−１１１、およびホウ素−１０若しくはアクチニドのような分裂性核種を挙げることができる放射性同位元素である。他の態様において、細胞傷害剤は、限定されるものでないがリシン、修飾シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）腸毒素Ａ、カリチェアミシン、アドリアマイシンおよび５−フルオロウラシルなどを挙げることができる公知の毒素および細胞傷害性の薬物である。こうした細胞傷害剤への抗体および抗体フラグメントの結合は文献中で公知である。
【００４２】
本発明の抗体は、例えば抗体がそのエピトープに結合することを共有結合が予防しないような、抗体へのいずれかの型の分子の共有結合により改変されている誘導体を包含する。適する誘導体の例は、限定されるものでないが、グリコシル化された抗体およびフラグメント、アセチル化された抗体およびフラグメント、ペギル化された抗体およびフラグメント、リン酸化された抗体およびフラグメント、ならびにアミド化された抗体およびフラグメントを挙げることができる。本発明の抗体およびそれらの誘導体は、既知の保護／封鎖基、タンパク質分解性切断、細胞リガンド若しくは他のタンパク質への結合などによりそれら自身が誘導体化されうる。さらに、本発明の抗体およびそれらの誘導体は、１個若しくはそれ以上の非古典的アミノ酸を含有しうる。
【００４３】
本発明はまた、卵巣癌患者の末梢血単核細胞由来のもののような完全にヒトの抗体も包含する。こうした細胞を例えば骨髄腫細胞に融合してＦＲ−αに対する完全にヒトの抗体を産生するハイブリドーマ細胞を生じうる。
【００４４】
いずれかの特定の操作理論により束縛されることを願うことなく、本発明の抗体は、該抗体の双方の「腕」（Ｆａｂフラグメント）が、四量体を構成する個別のＦＲ−α分子に結合するため、該抗体の増大した親和性により四量体の形態のＦＲ−αを結合するのにとりわけ有用であると考えられる。これは、該抗体の解離（Ｋｄ）の減少および観察される親和性（ＫＤ）の全体的な増大につながる。本発明の抗体は正常組織よりも腫瘍組織により強固に結合することができるため、これは、腫瘍に標的を定めるためのとりわけ良好な特徴である。
ＦＲ−αに対する抗体の製造方法
動物の免疫
本発明はまた、四量体の形態のＦＲ−αに特異的に結合するモノクローナル抗体の製造
方法も提供する。四量体のＦＲ−αは、タンパク質を単離および精製するための多様な公知の技術を使用して細胞若しくは組換え系から精製しうる。例えば、しかし制限としてでなく、四量体のＦＲ−αは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でタンパク質を泳動すること、および該タンパク質をメンブレンにブロッティングすることにより、タンパク質の見かけの分子量に基づいて単離しうる。その後、四量体の形態のＦＲ−αに対応するおよその大きさのバンドをメンブレンから切断し、そして動物で免疫原として直接、若しくはメンブレンからタンパク質を最初に抽出若しくは溶出することにより使用しうる。別法の一例として、該タンパク質は、単独若しくは他の単離および精製手段とともにサイズ排除クロマトグラフィーにより単離しうる。他の精製手段は、Ｚｏｌａ、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＤＥＲＩＶＡＴＩＶＥＳ（ＢＡＳＩＣＳ：ＦＲＯＭ  ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ  ＴＯ  ＢＥＮＣＨ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｌｔｄ．、ニューヨーク、２０００；ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮ、第１１章、“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”、ＨｏｗａｒｄとＢｅｔｈｅｌｌ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２０００；ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（ＳＰＲＩＮＧＥＲ  ＬＡＢ  ＭＡＮＵＡＬ）、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎとＤｕｂｅｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、２００１のような標準的参照教科書で入手可能である。
【００４５】
ＦＲ−αに対する抗体の一生成戦略は、四量体の形態のＦＲ−αで動物を免疫することを必要とする。そのように免疫された動物は該タンパク質に対する抗体を産生することができる。限定されるものでないが、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７を参照されたい）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照されたい）およびヒトモノクローナル抗体を産生させるためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５中、ｐｐ．７７−９６を参照されたい）を挙げることができる、モノクローナル抗体の標準的創製方法が既知である。
抗体特異性についてのスクリーニング
四量体の形態のＦＲ−αに特異的に結合する抗体のスクリーニングは、マイクロタイタープレートを四量体の形態のＦＲ−αで被覆する酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して達成しうる。陽性に反応するクローンからの抗体を、単量体の形態のＦＲ−αで被覆したマイクロタイタープレートを使用する単量体の形態のＦＲ−αに対するＥＬＩＳＡに基づくアッセイにおける反応性についてさらにスクリーニングし得る。単量体の形態のＦＲ−αに対し反応性である抗体を産生するクローンを除外し、そして四量体の形態に対してのみ反応性である抗体を産生するクローンをさらなる拡張および開発のため選択する。
【００４６】
四量体の形態のＦＲ−αに対する抗体の反応性の確認は、例えば、卵巣癌細胞からのタンパク質ならびに精製した四量体および単量体のＦＲ−αを還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、そしてその後メンブレンにブロッティングするウエスタンブロットを使用して達成しうる。メンブレンをその後推定の抗四量体ＦＲ−α抗体でプロービングしうる。非還元条件下での１５２ｋＤａの形態のＦＲ−αとの反応性および３８ｋＤａの形態のＦＲ−αと反応しないこと（還元若しくは非還元条件下で）は、四量体の形態のＦＲ−αに対する反応性の特異性を確認する。
【００４７】
本発明の抗体およびそれらの誘導体は、１×１０−２Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を包含する結合親和性を有する。いくつかの態様において、Ｋｄは１×１０−３未満である。他
の態様において、Ｋｄは１×１０−４未満である。いくつかの態様において、Ｋｄは１×１０−５未満である。なお他の態様において、Ｋｄは１×１０−６未満である。他の態様において、Ｋｄは１×１０−７未満である。他の態様において、Ｋｄは１×１０−８未満である。他の態様において、Ｋｄは１×１０−９未満である。他の態様において、Ｋｄは１×１０−１０未満である。なお他の態様において、Ｋｄは１×１０−１１未満である。いくつかの態様において、Ｋｄは１×１０−１２未満である。他の態様において、Ｋｄは１×１０−１３未満である。他の態様において、Ｋｄは１×１０−１４未満である。なお他の態様において、Ｋｄは１×１０−１５未満である。
抗体の製造
本発明の抗体はｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも製造しうる。ｉｎ  ｖｉｖｏ抗体製造のためには、動物を一般にＦＲ−αの免疫原性の部分（好ましくは四量体のＦＲ−α）で免疫する。抗原は一般に、免疫原性を促進するためにアジュバントと組み合わせる。アジュバントは免疫化に使用する種に従って変動する。アジュバントの例は、限定されるものでないが：フロイントの完全アジュバント（「ＦＣＡ」）、フロイントの不完全アジュバント（「ＦＩＡ」）、鉱物ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン）、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン（「ＫＬＨ」）、ジニトロフェノール（「ＤＮＰ」）、ならびにカルメット−ゲラン桿菌（「ＢＣＧ」）および?瘡菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）のような潜在的に有用なヒトアジュバントを挙げることができる。こうしたアジュバントもまた当該技術分野で公知である。
【００４８】
免疫化は公知の手順を使用して達成しうる。用量および免疫化レジメンは、免疫される哺乳動物の種、その免疫状態、体重および／若しくは計算された表面積などに依存することができる。典型的には、免疫した哺乳動物から血清をサンプリングし、そして例えば下述されるところの適切なスクリーニングアッセイを使用して抗ＦＲ−α抗体についてアッセイする。
【００４９】
免疫した動物からの脾細胞は、（抗体産生Ｂ細胞を含有する）脾細胞を骨髄腫株のような不死細胞系と融合することにより不死化しうる。典型的には、骨髄腫細胞株は脾細胞ドナーと同一種からである。一態様において、不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性である。いくつかの態様において、骨髄腫細胞はエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）感染について陰性である。好ましい態様において、骨髄腫細胞はＨＡＴ感受性、ＥＢＶ陰性かつＩｇ発現陰性である。いかなる適する骨髄腫も使用しうる。マウス骨髄腫細胞株（例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３若しくはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株）を使用してマウスハイブリドーマを生成させうる。これらマウス骨髄腫株はＡＴＣＣから入手可能である。これらの骨髄腫細胞を、ドナー脾細胞ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、好ましくは１５００の分子量のポリエチレングリコール（「ＰＥＧ１５００」）に融合する。該融合から生じるハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地（未融合および非生産的に融合した骨髄腫細胞を殺す）中で選択する。未融合の脾細胞は培養物中で短時間で死ぬ。いくつかの態様において、骨髄腫細胞は免疫グロブリン遺伝子を発現しない。
【００５０】
下述されるもののようなスクリーニングアッセイにより検出される所望の抗体を産生するハイブリドーマを、培養物若しくは動物中で抗体を産生するのに使用しうる。例えば、ハイブリドーマ細胞を、該ハイブリドーマ細胞にモノクローナル抗体を培地中に分泌させるのに十分な条件下かつ時間の間、栄養培地中で培養しうる。これらの技術および培地は当業者により公知である。あるいは、ハイブリドーマ細胞を未免疫の動物の腹腔に注入しうる。細胞が腹腔中で増殖しそして抗体を分泌し、抗体は腹水として蓄積する。腹水を、モノクローナル抗体の豊富な供給源として、シリンジで腹腔から抜き出しうる。
【００５１】
ヒト抗体の別の制限しない製造方法は、それら自身の内因性の免疫グロブリン遺伝子が不活性化されている、別の種（例えばヒト）の抗体を産生するトランスジェニック哺乳動物を記述する米国特許第５，７８９，６５０号明細書に記述されている。異種抗体の遺伝子はヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる。再配列されていない免疫グロブリンをコードする領域を含有する導入遺伝子をヒト以外の動物に導入する。生じるトランスジェニック動物は、導入遺伝子の免疫グロブリン配列を機能的に再配列しかつヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる多様なアイソタイプの抗体のレパートリーを産生することが可能である。その後、トランスジェニック動物からのＢ細胞を、不死化細胞株（例えば骨髄腫細胞）との融合を包含する多様な方法のいずれかにより不死化する。
【００５２】
ＦＲ−αに対する抗体は、当該技術分野で既知の多様な技術を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでもまた製造しうる。例えば、しかし制限としてでなく、ＦＲ−αに対する完全にヒトのモノクローナル抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでプライミングしたヒト脾細胞を使用することにより製造しうる（Ｂｏｅｒｎｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５）。
【００５３】
あるいは、例えば、本発明の抗体は「レパートリークローニング」（Ｐｅｒｓｓｏｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４３２−２４３６；およびＨｕａｎｇとＳｔｏｌｌａｒ（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
１４１：２２７−２３６）により製造しうる。さらに、米国特許第５，７８９，２３０号明細書は、エプスタイン−バーウイルス核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現する、エプスタイン−バーウイルスへの感染により不死化されているヒトＢ抗体産生Ｂ細胞からのヒトモノクローナル抗体の製造を記述している。不死化に必要とされるＥＢＮＡ２をその後不活性化して、増大した抗体力価をもたらす。
【００５４】
別の態様において、ＦＲ−αに対する抗体を末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫化により生じさせる。これは、例えば文献（Ｚａｆｉｒｏｐｏｕｌｏｓら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２００：１８１−１９０）に記述される方法を使用するような、当該技術分野で既知のいずれかの手段により達成しうる。
【００５５】
本発明の一態様において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫化のための手順は、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＭＳ２−１３４、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ３、ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＭＬＨ３、ＭＬＨ４、ＭＬＨ５、ＭＬＨ６、ＰＭＳＬ９、ＭＨＳ１およびＭＳＨ２のようなミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルが脾細胞の融合後にハイブリドーマ細胞に若しくは融合前に骨髄腫細胞に導入されるハイブリドーマ細胞の定方向進化で補足される。ドミナントネガティブな変異体を含有する細胞は超可変となりかつトランスフェクトされていない対照細胞よりも高率で突然変異を蓄積することができる。変異細胞のプールを、より高親和性の抗体を産生する、またはより高力価の抗体を産生する、またはある条件下で単純により速く若しくはより良好に増殖するクローンについてスクリーニングしうる。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを使用する超可変細胞の生成技術は、２０００年１１月１４日交付の米国特許第６，１４６，８９４号明細書に記述されている。あるいは、２００２年７月１８日公開の第ＷＯ  ０２／０５４８５６号明細書、“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ”（ミスマッチ修復の化学的阻害剤）においてＮｉｃｏｌａｉｄｅｓらにより記述されるミスマッチ修復の化学的阻害剤を使用して、ミスマッチ修復を阻害しうる。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレル若しくはミスマッチ修復の化学的阻害剤を使用する抗体の増強方法を、クローン化した免疫グロブリン遺伝子を発現する哺乳動物発現細胞に同様に適用しうる。ドミナントネガティブなアレルを発現する細胞は、該細胞がもう一度遺伝的に安定になりかつもはや異常な高速で突然変異を蓄積しないような、該ドミナントネガティブなアレルのスイッチが切られ得る、誘導可能な場合は細胞から排除され得るなどの点において「治癒」され得る。
腫瘍細胞の増殖の低下方法
本発明の方法は、ＦＲ−αの増大した発現と関連する腫瘍性状態を有すると同定されたヒトおよびヒト以外の動物での使用に適する。本発明から利益を得るヒト以外の動物は、愛玩動物、外来種（例えば動物園の動物）および家畜を包含する。好ましくは、ヒト以外の動物は哺乳動物である。
【００５６】
本発明は、正常細胞に関して新生物中でのＦＲ−αの増大した発現により示される異形成障害を有すると同定されるヒト若しくは動物患者での使用に適する。こうした状態のための処置が必要とこうした患者が一旦同定されれば、本発明の方法を適用して該状態の処置を遂げうる。処置されうる腫瘍は、限定されるものでないが卵巣腫瘍、腎腫瘍、肺腫瘍、ファローピウス管腫瘍、子宮腫瘍およびある種の白血病細胞を挙げることができる。
【００５７】
本発明での使用のための抗体およびそれらの誘導体は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、溶液などのようないずれの許容できる投薬形態物でも経口投与しうる。該抗体およびそれらの誘導体はまた非経口でも投与しうる。それは以下の投与経路、すなわち皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、滑液包内、胸骨内、鼻内、局所で、硬膜下腔内、肝内、病変内および頭蓋内注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）若しくは注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）技術を介する。一般に、該抗体および誘導体は筋肉内若しくは静脈内注入として提供することができる。
【００５８】
本発明の抗体および誘導体は、単独で、若しくは許容できる補助物質、ベヒクルおよび賦形剤を包含する製薬学的に許容できる担体とともに投与しうる。
【００５９】
有効投薬量は多様な因子に依存することができ、また、体重、処置の最終目標、最高耐量、使用される特定の製剤、投与経路などのような多様なパラメータに従って所定の患者について投薬量を調節することは熟練した医師の権限の範囲内に十分にある。一般に、１日あたり約０．００１と約１００ｍｇ／ｋｇ体重の間の抗体若しくはその誘導体の投薬量レベルが適する。いくつかの態様において、用量は１日あたり約０．１ないし約５０ｍｇ／ｋｇ体重の抗体若しくはその誘導体であることができる。他の態様において、用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日ないし約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日であることができる。なお他の態様において、用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日ないし約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日であることができる。投与はボーラスとしてでも注入としてでもよい。投薬量は１日１回若しくは１日に複数回与えてよい。さらに、投薬量は複数回のある時間与えてもよい。いくつかの態様において、用量は１〜１４日ごとに与える。いくつかの態様において、抗体若しくはそれらの誘導体は約．３ないし１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の用量として与える。他の態様において、抗体若しくはそれらの誘導体は約５ないし約１２．５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．で提供する。なお他の態様において、最低１μｇ／ｍｌの血漿レベルが維持されるような抗体若しくはそれらの誘導体が提供される。
【００６０】
有効な処置は多様な方法で評価しうる。一態様において、有効な処置は腫瘍増殖の減速された進行により決定する。他の態様において、有効な処置は腫瘍の縮小（すなわち腫瘍の大きさの減少）により示される。他の態様において、有効な処置は腫瘍の転移の阻害により示される。なお他の態様において、有効な治療は、体重増加、回復した強さ、減少した苦痛、生育、およびより良好な健康状態という患者からの主観的表示のような兆候を包含する患者の増大した満足のいく状態により評価する。
【００６１】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するために提供され、そしてそれを制限すると解釈されるべきでない。
実施例
【実施例１】
【００６２】
四量体の形態のＦＲ−αへのモノクローナル抗体の結合をウエスタンブロットにより示した。簡潔には、ＳＫ−Ｏｖ−３およびＩＧＲＯＶ腫瘍細胞をヌードマウス中で増殖させそして摘出した。腫瘍組織を、２ｍｌ  Ｄｏｕｎｃｅ組織ホモジェナイザー中１５〜２０ストロークでＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。不溶性物質を遠心分離により除去し、そしてＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイを使用して上清の総タンパク質を測定した。異なる実験で、５μｇ若しくは２０μｇいずれかのタンパク質を非還元条件下で４〜１２％ビス−トリスゲル（ＭＥＳ）上で泳動した。電気泳動したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写した。該メンブレンをＢｌｏｔｔｏ（５％乳、０．０５％ＴＢＳ−Ｔ）中でブロッキングした。ＬＫ２６ハイブリドーマ細胞からの培養上清の１００倍希釈および総濃度０．１％のＮａＮ３をＢｌｏｔｔｏブロッキング溶液に一次抗体として直接添加し、そしてメンブレンを一夜インキュベートした。メンブレンを０．０５％ＴＢＳ−Ｔ中で洗浄し、そしてＢｌｏｔｔｏブロッキング溶液中の二次抗体（ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギα−マウスＩｇＧ（ＨおよびＬ鎖））を添加した。メンブレンを、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ＥＣＬ試薬を使用して発色させた。結果を図１に示す（レーン１、ＳＫ−Ｏｖ−３；レーン２、ＩＧＲＯＶ）。該結果は、ＦＲ−αを過剰発現するある種の腫瘍は単量体のＦＲ−αよりも四量体のＦＲ−αの産生のほうを好むことを示す。この知見は、正常組織（一般に単量体の形態のＦＲ−αを発現する）を無傷のままにしつつ腫瘍組織の破壊のため四量体の形態のＦＲ−αを特異的に認識するモノクローナル抗体により活用し得る。
【実施例２】
【００６３】
ＦＲ−αの発現を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）でもまた評価した。簡潔には、ヒスチジン標識とともにＦＲ−αのコーディング配列を含有するプラスミド（ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲ−α）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞にトランスフェクトした。プラスミドｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈ  ＦＲ−αを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養物をＯＤ６００＝１．０まで増殖させた。その後、アラビノースを０．２％の最終濃度まで添加し、そして図２に示される時点でサンプルを採取した。２５ｍｌの４×ＬＤＳサンプル緩衝液を６５ｍｌの培養物に添加することにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートを調製した。１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中でＪＡＲ細胞を繁殖させた。培地を細胞から除去し、そしてＲＩＰＡ緩衝液を培養プレートに直接添加して、ＪＡＲ細胞抽出物対照のため細胞を溶解した。サンプルを４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（ＭＥＳ）上で分離し、そしてＰＶＤＦメンブレンに転写した。ＴＢＳＴ＋５％乳中で一夜ブロッキング後に、メンブレンを、ｍＡｂ  ＬＫ２６の１０００倍希釈で１時間、次いで二次抗体（ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギα−マウスＩｇ）の１００００倍希釈で１時間プロービングした。抗体の検出は、５分の露光後にＰｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  ｆｅｍｔｏを用いて実施した。結果を図２に示す（レーン１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）＋ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲａ、１８０分誘導；レーン２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）＋ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲａ、９０分誘導；レーン３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）＋ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲａ、６０分誘導；レーン４、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）＋ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲａ、３０分誘導；レーン５、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）＋ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲａ、１５分誘導；レーン６、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）＋ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲａ、未誘導；レーン７、ＪＡＲ細胞抽出物）。結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が単量体の形態のＦＲ−αのみを産生しかつ四量体の形態のＦＲ−αを産生しないことを示す。
【実施例３】
【００６４】
四量体のＦＲ−αがＨｏｌｍら（１９９７）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  １７（４
）：４１５−４２７により記述されるところのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ミセル中での凝集のアーチファクトでなかったことを示すために、腫瘍の抽出物を１×ＲＩＰＡ（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ＝７．２）若しくは１×ＰＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ＝７．２）のいずれかで希釈した。全サンプルについて、１μｇ／μｌのストックＩＧＲＯＶ抽出物を使用した。希釈後、４×ＬＤＳサンプル緩衝液を１×の最終濃度まで各サンプルに添加した。サンプルをＭＥＳ泳動緩衝液中で４〜１２％ビス−トリスゲルに負荷した。電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写した。転写されたタンパク質を含有するメンブレンをＢｌｏｔｔｏ（５％脱脂乳、１×ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中室温で４８時間ブロッキングした。一次抗体（１μｇ／ｍｌ  ＬＫ２６抗体）とともにメンブレンをインキュベートすること、次いで洗浄、その後二次抗体（Ｂｌｏｔｔｏ中ＨＲＰ結合ヤギα−マウスＩｇＧ）とのインキュベーションによりメンブレンを発色させた。もう１回の洗浄段階後に、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ＥＣＬ試薬を使用してメンブレンを発色させ、そして１分間露光させた。結果を図３に示す（レーン１、ＰＢＳ中１００倍希釈；レーン２、ＰＢＳ中５０倍希釈；レーン３、ＰＢＳ中２５倍希釈；レーン４、ＰＢＳ中１０倍希釈；レーン５、ＲＩＰＡ中１００倍希釈；レーン６、ＲＩＰＡ中２５倍希釈；レーン７、ＲＩＰＡ中１０倍希釈；Ｍ、分子量マーカー、レーン８、ＲＩＰＡ中１：１希釈）。矢印は単量体（１×）および四量体（４×）を示す。いずれの処理も四量体の形態のＦＲ−αを破壊しなかった。該結果は、ＦＲ−αを過剰発現するある種の腫瘍が、ゲル濾過サンプル調製物のアーチファクトとしてのみ以前に示されていた四量体の形態のＦＲ−αを発現することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】四量体および単量体の形態のＦＲ−αを示す腫瘍細胞のウエスタンブロットを示す。
【図２】大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が発現したＦＲ−αのウエスタンブロットを示す。
【図３】Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在若しくは非存在下で可溶化したＦＲ−αのウエスタンブロットを示す。
【図１】
2007537709.tif 000003
【図２】
2007537709.tif 000004
【図３】
2007537709.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月16日(2007.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｍＡｂ  ＬＫ２６のエピトープ以外のエピトープに結合するか；（ｂ）ｍＡｂ
ＬＫ２６よりも大きい親和性で結合するか；若しくは（ｃ）四量体の形態のＦＲ−αへの結合についてｍＡｂ  ＬＫ２６より優れた適性を有する、においてｍＡｂ  ＬＫ２６と識別される、四量体の形態のＦＲ−αに特異的に結合する抗体。
【請求項２】
前記抗体の親和性が最低約１×１０-7Ｍである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体の親和性が最低約１×１０-8Ｍである、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体の親和性が最低約１×１０-9Ｍである、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体の親和性が最低約１×１０-10Ｍである、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記エピトープがジスルフィド依存性の１エピトープである、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記キメラ抗体がヒト−マウスキメラ抗体である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が完全にヒトの抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体を発現するハイブリドーマ細胞。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを含んでなる発現細胞。
【請求項１５】
請求項１１に記載のハイブリドーマを培養する段階を含んでなる、（ａ）ｍＡｂ  ＬＫ２６のエピトープ以外のエピトープに結合するか；（ｂ）ｍＡｂ  ＬＫ２６よりも大きい親和性で結合するか；若しくは（ｃ）四量体の形態のＦＲ−αへの結合についてｍＡｂ  ＬＫ２６より優れた適性を有する、点においてｍＡｂ  ＬＫ２６と識別される、四量体の形態のＦＲ−αに特異的に結合する抗体の製造方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の発現細胞を培養する段階を含んでなる、（ａ）ｍＡｂ  ＬＫ２６のエピトープ以外のエピトープに結合するか；（ｂ）ｍＡｂ  ＬＫ２６よりも大きい親和性で結合するか；若しくは（ｃ）四量体の形態のＦＲ−αへの結合についてｍＡｂ  ＬＫ２６より優れた適性を有する、点においてｍＡｂ  ＬＫ２６と識別される、四量体の形態のＦＲ−αに特異的に結合する抗体の製造方法。
【請求項１７】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の発現細胞。
【請求項１８】
前記発現細胞が哺乳動物細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）ＬＫ２６のエピトープ以外のエピトープに結合するか、（ｂ）ＬＫ２６よりも大きい親和性で結合するか；若しくは（ｃ）四量体の形態のＦＲ−αへの結合についてｍＡｂ  ＬＫ２６より優れた適性を有する、点においてＬＫ２６と識別される、四量体の形態のＦＲ−αに特異的に結合する抗体を有効成分として含んでなる、異形成細胞を伴う患者におけるＦＲ−αの増大した発現と関連するこうした異形成細胞の増殖を阻害するための医薬製剤。
【請求項２０】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の製剤。
【請求項２１】
異形成細胞が卵巣癌細胞である、請求項１に記載の製剤。
【請求項２２】
患者がヒト患者である、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２３】
抗体が化学療法剤とコンジュゲートしている、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２４】
化学療法剤が放射性核種である、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
放射性核種が、鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７、インジウム−１１１、ホウ素−１０およびアクチニドよりなる群から選択される、請求項２４に記載の製剤。
【請求項２６】
化学療法剤が、リシン、改変シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）腸毒素Ａ、カリチェアミシン、アドリアマイシンおよび５−フルオロウラシルよりなる群から選
択される、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２７】
抗体が化学療法剤に結合されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項２８】
前記化学療法剤が放射性核種である、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
前記放射性核種が、鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７、インジウム−１１１、ホウ素−１０およびアクチニドよりなる群から選択される、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
前記化学療法剤が、リシン、改変シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）腸毒素Ａ、カリチェアミシン、アドリアマイシンおよび５−フルオロウラシルよりなる群から選択される、請求項２７に記載の抗体。
【国際調査報告】
2007537709.tif 000006
2007537709.tif 000007
2007537709.tif 000008
2007537709.tif 000009
2007537709.tif 000010