(57)【要約】  本発明は対象遺伝子の発現を調節するための直交遺伝子スイッチに関する。遺伝子スイッチは内因性リガンドに応答しないキメラ転写因子と、キメラ転写因子を活性化することができるが、内因性転写因子を活性化することができないリガンドを含む。本発明は直交遺伝子スイッチの構築方法にも関する。
2007535906.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列：
【化１】
2007535906.tif 000032
（式中、Ｘ１＝Ｄ又はＡであり；Ｘ２−６は各々独立してＧ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、又はＷであり；Ｘ７＝Ｇ又はＲであり；Ｘ８＝Ｈ又はＶである）を含むポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ２＝Ｌ、Ｍ、又はＶであり；Ｘ３＝Ｆ又はＷであり；Ｘ４＝Ｍ、Ｇ又はＡであり；Ｘ５＝Ｉ、Ｍ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ６＝Ｌである請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ１＝Ｄであり；Ｘ７＝Ｇであり；Ｘ８＝Ｈである請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列を含む請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ｘ４＝Ｇ又はＡである請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３−１５から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｘ１＝Ａであり、Ｘ４＝Ｇ又はＡであり、Ｘ７＝Ｇであり、Ｘ８＝Ｖである請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１６−２８から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ｘ１＝Ｄであり、Ｘ４＝Ｇ又はＡであり、Ｘ７＝Ｒであり、Ｘ８＝Ｈである請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２９−４１から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ＤＮＡ結合ドメインと、
請求項１に記載のポリペプチドを含むリガンド結合ドメインと、
転写調節ドメインを含む転写因子。
【請求項１３】
リガンド結合ドメインが配列番号１６−４１から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１２に記載の転写因子。
【請求項１４】
ＤＮＡ結合ドメインがＧＡＬ４最小ＤＮＡ結合ドメインである請求項１２に記載の転写因子。
【請求項１５】
ＤＮＡ結合ドメインがＨＮＦ−１のＤＮＡ結合ドメインである請求項１２に記載の転写因子。
【請求項１６】
転写調節ドメインがＶＰ１６最小活性化ドメインである請求項１２に記載の転写因子。
【請求項１７】
転写調節ドメインがヒトｐ６５の活性化ドメインの一部である請求項１２に記載の転写因子。
【請求項１８】
配列番号４３を含む請求項１２に記載の転写因子。
【請求項１９】
請求項１２に記載の転写因子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む組成物で形質転換された宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１２に記載の転写因子と結合して前記転写因子を活性化する化合物。
【請求項２２】
ＣＭＰ１及びＣＭＰ４−３８から構成される群から選択される化合物。
【請求項２３】
対象遺伝子の発現を調節するための直交遺伝子スイッチであって、請求項１３に記載の転写因子と；対象遺伝子と対象遺伝子に融合した調節領域を含むベクターを含み、転写因子が調節領域と結合することができる前記遺伝子スイッチ。
【請求項２４】
リガンド結合ドメインと結合して転写因子を活性化する化合物を更に含む請求項２３に記載の遺伝子スイッチ。
【請求項２５】
リガンド結合ドメインが配列番号１６−２８から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含み、化合物がＣＭＰ１、ＣＭＰ４、ＣＭＰ５、及びＣＭＰ１１−３８から構成される群から選択される請求項２４に記載の遺伝子スイッチ。
【請求項２６】
リガンド結合ドメインが配列番号２９−４１から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含み、化合物がＣＭＰ６−１０から構成される群から選択される請求項２３に記載の遺伝子スイッチ。
【請求項２７】
核内ホルモン受容体からリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を選択する段階と；ホルモンの不活性類似体を選択する段階と；選択された不活性類似体の結合を妨害するアミノ酸残基を、結合を助長する各種アミノ酸残基に突然変異させることにより作製される選択されたＬＢＤの修飾変異体を含む転写因子のライブラリーを構築する段階と；選択された不活性類似体でライブラリーをスクリーニングし、不活性類似体により活性化される転写因子を選択する段階を含む直交遺伝子スイッチの作製方法。
【請求項２８】
選択された転写因子の修飾ＬＢＤに突然変異を導入し、ホルモンに対する親和性と転写因子のリガンド非依存的活性を低下させる段階を更に含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
突然変異をもつ転写因子を活性化することができる不活性類似体を作製する段階を更に含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
核内ホルモン受容体がエストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ミネラロコルチコイド受容体（ＭＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ビタミンＤ３受容体（ＶＤＲ）、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）、及びレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）から構成される群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
核内ホルモン受容体がヒトエストロゲン受容体α（ｈＥＲα）である請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
リガンド結合ドメインが配列番号２を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
不活性類似体が核内ホルモン受容体特異的アゴニスト又はアンタゴニストの不活性類似体である請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
不活性類似体がｈＥＲα特異的アゴニスト又はアンタゴニストの不活性類似体である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
不活性類似体がヒトエストロゲン受容体β（ｈＥＲβ）特異的アゴニスト又はアンタゴニストの不活性類似体である請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
不活性類似体がＣＭＰ１である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ライブラリーが酵母１ハイブリッドシステムである請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
転写因子が更にＧＡＬ４最小ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とＶＰ１６最小活性化ドメイン（ＡＤ）を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
転写因子のライブラリーがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐから構成される群から独立して選択されるアミノ酸残基３９１、４０４、４２１、４２４、及び４２８をもつ修飾ＬＢＤを含む請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は内因性核内受容体の正常機能を妨害しない新規遺伝子スイッチに関する。
【背景技術】
【０００２】
核内ホルモン受容体スーパーファミリーは最大の公知真核転写レギュレーターファミリーである。このスーパーファミリーはグルココルチコイド受容体（ＧＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ミネラロコルチコイド受容体（ＭＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）等のステロイドホルモン受容体と、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、及びレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）等の非ステロイドホルモン受容体に加え、リガンドが同定されていないオーファン受容体を含む。ホルモンは対応する受容体との結合を介して、発生、恒常性維持、細胞増殖、分化及び死における主要段階を含む複雑な生理的イベントの調節に重要な役割を果たす。
【０００３】
核内ホルモン受容体作用は脊椎動物系では細胞レベルと分子レベルの両者でかなり詳細に解明されている。リガンドの不在下でステロイドホルモンの核内受容体はＨｓｐ９０、Ｈｓｐ７０及びｐ５９と結合し、不活性な複合体を形成する。エストロゲン受容体複合体は核に存在するが、それ以外の複合体は細胞質に存在する。ホルモンと結合すると、受容体はＨｓｐ９０、Ｈｓｐ７０及びｐ５９分子を遊離し、核に移行する。核内に移行すると、受容体はホモダイマーを形成し、標的遺伝子の調節領域でホルモン応答配列（ＨＲＥ）と結合し、その結果、標的遺伝子を活性化又は抑制する。他方、非ステロイドホルモンの核内受容体はホルモンの不在下でもｈｓｐ蛋白質をもたないヘテロダイマーとしてその応答配列と結合する。核内受容体は非ステロイドホルモンと結合することにより活性化される。
【０００４】
ホルモンは構造的に多様な化合物であるが、その受容体は高度に構造的に関連する蛋白質である。核内ホルモン受容体はアミノ末端領域、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及びリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む構造的及び機能的に規定されたドメインから構成されるモジュラー蛋白質である。リガンド（ホルモン）結合ドメインは約３００アミノ酸長であり、受容体のカルボキシ末端側半分に位置する。リガンド結合ドメインは複雑な構造に折り畳まれ、リガンドを包囲する特異的疎水性ポケットを形成すると思われる。ＬＢＤは更に受容体二量化、ｈｓｐ会合（ステロイドホルモン受容体の場合）、リガンド依存的トランス活性化機能、サイレンシング／リプレッサー機能（ＬＢＤがアンタゴニストと結合する場合）及び核移行シグナルに関与する配列も含む。
【０００５】
遺伝子治療は種々の疾病の治療に大いに期待されるが、その実用化はまだ多数の問題に阻まれており、その１つは患者における導入遺伝子発現を外因性物質の投与により調節する点である。導入遺伝子発現の調節システムは「遺伝子スイッチ」と言うことが多い。
【０００６】
遺伝子スイッチの外因性物質は導入遺伝子の活性のみに作用し、導入遺伝子発現は内因性物質の影響を受けないことが理想的である。
【０００７】
真核遺伝子発現の調節に一般に使用されている多くのシステムは原核又は他の非ヒト成分を含む。これらのシステムとしては大腸菌Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）に由来するテトラサイクリン依存システム、ショウジョウバエＥｃ受容体に由来するエクジソン（Ｅｃ）依存システム、及びラパマイシン依存システムが挙げられる。これらのシステムはその非ヒト成分により、ヒト又は他の免疫適格宿主で免疫原性であると思われる。
【０００８】
核内ホルモン受容体とそのリガンドは遺伝子スイッチの適切な候補である。ある種に由来する核内ホルモン受容体の発現は同一種で免疫原性にならないはずである。例えば、ヒトエストロゲン受容体の発現はヒト宿主で免疫原性にならないはずである。しかし、ホルモン等の外因性リガンドの投与と外因性核内ホルモン受容体の発現は内因性核内ホルモン受容体の正常機能を妨害する恐れがある。他方、外因性核内ホルモン受容体は内因性ホルモンに応答する可能性もある。
【０００９】
相互干渉を減らすために核内ホルモン受容体のリガンド結合ドメインを修飾した例もある。例えば、ヒトプロゲステロン受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）のカルボキシ末端欠失突然変異体をＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインとＶＰ１６活性化ドメインに融合することによりキメラ転写因子が構築された。キメラ転写因子はプロゲステロンに応答しないが、合成プロゲステロンアンタゴニストであるＲＵ４８６により活性化された（Ｗａｎｇ  Ｙ．ら，１９９４，ＰＮＡＳ  ９１：８１８０−８１８４）。しかし、このシステムは対応する核内ホルモン受容体の活性を妨害する外因性リガンドを含んでいる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、内因性核内ホルモン受容体の正常機能に影響を与えないと共に内因性ホルモンにより影響を受けない新規遺伝子スイッチを開発する必要がある。
【００１１】
本明細書の各所に引用する文献は特許請求の範囲に記載する発明の先行技術とは認められない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は以下の配列：
【００１３】
【化２】
2007535906.tif 000003
（式中、Ｘ１＝Ｄ又はＡであり；Ｘ２−６は各々独立してＧ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、又はＷであり；Ｘ７＝Ｇ又はＲであり；Ｘ８＝Ｈ又はＶである）を含むポリペプチドを提供する。
【００１４】
本発明の１態様によると、前記ポリペプチドにおいて、Ｘ２＝Ｌ、Ｍ、又はＶであり；Ｘ３＝Ｆ又はＷであり；Ｘ４＝Ｍ、Ｇ又はＡであり；Ｘ５＝Ｉ、Ｍ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ６＝Ｌである。
【００１５】
本発明の１好適態様によると、前記ポリペプチドにおいて、Ｘ１＝Ｄであり；Ｘ２＝Ｌ、Ｍ、又はＶであり；Ｘ３＝Ｆ又はＷであり；Ｘ４＝Ｍ、Ｇ又はＡであり；Ｘ５＝Ｉ、Ｍ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ６＝Ｌであり；Ｘ７＝Ｇであり；Ｘ８＝Ｈである。
【００１６】
本発明の１態様によると、ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
本発明の１好適態様によると、前記ポリペプチドにおいて、Ｘ１＝Ｄであり；Ｘ２＝Ｌ、Ｍ、又はＶであり；Ｘ３＝Ｆ又はＷであり；Ｘ４＝Ｇ又はＡであり；Ｘ５＝Ｉ、Ｍ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ６＝Ｌであり；Ｘ７＝Ｇであり；Ｘ８＝Ｈである。
【００１８】
本発明の別の好適態様によると、ポリペプチドは配列番号３−１５から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
本発明の１好適態様によると、前記ポリペプチドにおいて、Ｘ１＝Ａであり；Ｘ２＝Ｌ、Ｍ、又はＶであり；Ｘ３＝Ｆ又はＷであり；Ｘ４＝Ｇ又はＡであり；Ｘ５＝Ｉ、Ｍ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ６＝Ｌであり；Ｘ７＝Ｇであり；Ｘ８＝Ｖである。
【００２０】
本発明の別の好適態様によると、ポリペプチドは配列番号１６−２８から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
本発明の１態様によると、前記ポリペプチドにおいて、Ｘ１＝Ｄであり；Ｘ２＝Ｌ、Ｍ、又はＶであり；Ｘ３＝Ｆ又はＷであり；Ｘ４＝Ｇ又はＡであり；Ｘ５＝Ｉ、Ｍ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ６＝Ｌであり；Ｘ７＝Ｒであり；Ｘ８＝Ｈである。
【００２２】
本発明の別の好適態様によると、ポリペプチドは配列番号２９−４１から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本発明は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２４】
本発明はＤＮＡ結合ドメインと、前記ポリペプチドを含むリガンド結合ドメインと、転写調節ドメインを含む転写因子も提供する。
【００２５】
本発明の１態様によると、転写因子のリガンド結合ドメインは配列番号１６−４１から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む
本発明の１態様によると、転写因子のＤＮＡ結合ドメインはＧＡＬ４最小ＤＮＡ結合ドメインである。
【００２６】
本発明の１好適態様によると、転写因子のＤＮＡ結合ドメインはＨＮＦ−１のＤＮＡ結合ドメインである。
【００２７】
本発明の１態様によると、転写因子の転写調節ドメインはＶＰ１６最小活性化ドメインである。
【００２８】
本発明の１代替態様によると、転写因子の転写調節ドメインはヒトｐ６５の活性化ドメインの一部である。
【００２９】
本発明の１好適態様によると、転写因子は配列番号４３を含む。
【００３０】
本発明は前記転写因子をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
本発明は前記転写因子を含む組成物で形質転換された宿主細胞も提供する。
【００３２】
本発明は前記転写因子と結合してこれを活性化する化合物も提供する。
【００３３】
本発明の１好適態様によると、化合物はＣＭＰ１及びＣＭＰ４−３８から構成される群から選択される。
【００３４】
本発明は対象遺伝子の発現を調節するための直交遺伝子スイッチも提供する。遺伝子スイッチは転写因子と；対象遺伝子と対象遺伝子に融合した調節領域を含むベクターを含む。転写因子は調節領域と結合することができる。
【００３５】
本発明の１態様によると、遺伝子スイッチはリガンド結合ドメインと結合して転写因子を活性化する化合物を更に含む。
【００３６】
本発明の１好適態様によると、遺伝子スイッチのリガンド結合ドメインは配列番号１６−２８から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含み、化合物はＣＭＰ１、ＣＭＰ４、ＣＭＰ５、及びＣＭＰ１１−３８から構成される群から選択される。
【００３７】
本発明の１好適態様によると、遺伝子スイッチのリガンド結合ドメインは配列番号２９−４１から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含み、化合物はＣＭＰ６−１０から構成される群から選択される。
【００３８】
本発明は更に直交遺伝子スイッチの作製方法を提供する。前記方法は核内ホルモン受容体からリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を選択する段階と；ホルモンの不活性類似体を選択する段階と；選択された不活性類似体の結合を妨害するアミノ酸残基を、結合を助長する各種アミノ酸残基に突然変異させることにより作製される選択されたＬＢＤの修飾変異体を含む転写因子のライブラリーを構築する段階と；選択された不活性類似体でライブラリーをスクリーニングし、不活性類似体により活性化される転写因子を選択する段階を含む。
【００３９】
本発明の１態様によると、直交遺伝子スイッチの作製方法は選択された転写因子の修飾ＬＢＤに突然変異を導入し、ホルモンに対するその親和性と転写因子のリガンド非依存的活性を低下させる段階を更に含む。
【００４０】
本発明の別の態様によると、前記方法は突然変異をもつ転写因子を活性化することができる不活性類似体を作製する段階を更に含む。
【００４１】
本発明の１態様によると、前記方法で使用される核内ホルモン受容体はエストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ミネラロコルチコイド受容体（ＭＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ビタミンＤ３受容体（ＶＤＲ）、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）、及びレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）から構成される群から選択される。
【００４２】
本発明の１好適態様によると、前記方法で使用される核内ホルモン受容体はヒトエストロゲン受容体α（ｈＥＲα）である。
【００４３】
本発明の別の好適態様によると、前記方法で使用される核内ホルモン受容体は配列番号２を含む。
【００４４】
本発明の１態様によると、前記方法で使用される不活性類似体は核内ホルモン受容体特異的アゴニスト又はアンタゴニストの不活性類似体である。
【００４５】
本発明の１態様によると、前記方法で使用される不活性類似体はｈＥＲα特異的アゴニスト又はアンタゴニストの不活性類似体である。
【００４６】
本発明の１好適態様によると、前記方法で使用される不活性類似体はヒトエストロゲン受容体β（ｈＥＲβ）特異的アゴニスト又はアンタゴニストの不活性類似体である。
【００４７】
本発明の別の好適態様によると、不活性類似体はＣＭＰ１である。
【００４８】
本発明の１好適態様によると、前記方法で使用されるライブラリーは酵母１ハイブリッドシステムである。
【００４９】
本発明の１好適態様によると、前記方法で使用される転写因子は更にＧＡＬ４最小ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とＶＰ１６最小活性化ドメイン（ＡＤ）を含む。
【００５０】
本発明の別の好適態様によると、前記方法で使用される転写因子のライブラリーはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐから構成される群から独立して選択されるアミノ酸残基３９１、４０４、４２１、４２４、及び４２８をもつ修飾ＬＢＤを含む。
【００５１】
本発明の他の特徴と利点は各種実施例を含む以下の付加説明に明示される。後期実施例は本発明の実施に有用な各種要素と手法を例証する。実施例は特許請求の範囲に記載する発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は本発明の実施に有用な他の要素と手法を認識し、利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
本明細書で使用する「核内ホルモン受容体スーパーファミリー」とは相互に関連することがその一次配列から示唆される核内ホルモン受容体のスーパーファミリーを意味する。代表例としてはエストロゲン、プロゲステロン、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、アンドロゲン、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、レチノイドＸ、ビタミンＤ、ＣＯＵＰ−ＴＦ、エクジソン、Ｎｕｒｒ−１、及びオーファン受容体が挙げられる。
【００５３】
核内ホルモン受容体は活性化ドメインと、ＤＮＡ結合ドメインと、リガンド結合ドメインから構成される。ＤＮＡ結合ドメインは特定調節ＤＮＡ配列エレメントを認識してこれと結合し、リガンド結合ドメインは特定生体化合物（リガンド）と結合して受容体を活性化する。
【００５４】
本明細書で使用する「リガンド」とは受容体のリガンド結合ドメインと相互作用（結合）することにより受容体を活性化又は抑制する任意化合物を意味する。
【００５５】
本明細書で使用する「ホルモン」とは核内ホルモン受容体の天然リガンドを意味する。
【００５６】
本明細書で使用する「アゴニスト」とは核内ホルモン受容体と相互作用して転写応答を促進することが可能な化合物である。例えば、エストロゲンはエストロゲン受容体のアゴニストである。エストロゲンと同様の化合物を核内ホルモン受容体アゴニストと定義する。
【００５７】
本明細書で使用する「アンタゴニスト」とは核内ホルモン受容体と相互作用し、受容体アゴニストの活性を阻止することが可能な化合物である。
【００５８】
本明細書で使用する「不活性類似体」とは選択された核内ホルモン受容体のリガンドと構造的に関連するが、受容体のリガンド結合ドメインと結合しない化合物を意味する。不活性類似体は動物又はヒトに通常存在しない。
【００５９】
本明細書で使用する「遺伝子材料」とはＤＮＡ又はＲＮＡの連続フラグメントを意味する。本明細書に記載する方法により標的細胞に導入される遺伝子材料は任意ＤＮＡ又はＲＮＡとすることができる。例えば、核酸は（１）標的細胞に通常存在するもの、（２）標的細胞に通常存在するが、標的細胞で生理的に十分なレベルで発現されないもの、（３）標的細胞に通常存在するが、所定疾患状態では最適レベルで発現されないもの、（４）標的細胞で正常に発現されるか又は発現されない新規遺伝子フラグメント、（５）標的細胞内で発現されるか又は発現されない遺伝子の合成修飾物、（６）標的細胞で発現するように修飾することができる他の任意ＤＮＡ、及び（７）上記の任意組み合わせとすることができる。
【００６０】
本明細書で使用する「核酸カセット」とは細胞に一時的、持続的又はそのエピソームに組込んだ後に蛋白質、又はペプチド、又はＲＮＡを発現することが可能な該当遺伝子材料を意味する。核酸カセットはカセット内の核酸を転写し、必要時に細胞で翻訳できるようにベクター内で他の必要なエレメントと共に位置と順序を決定される。
【００６１】
本明細書で使用する「修飾リガンド結合ドメイン」又は「突然変異体」とは、野生型又は天然配列と相違するように受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の一次配列を改変したリガンド結合ドメインを意味する。改変は点突然変異、挿入、又は欠失とすることができる。
【００６２】
「キメラ」なる用語は本発明の融合蛋白質と転写因子、アクチベーター及びリプレッサーを意味し、異なる起源、特に異なる親蛋白質の成分の組成物を表す。これは特定種間キメラを意味するものではなく、実際に、好適態様では、本発明のキメラ転写因子はヒト蛋白質成分のみから構成される。
【００６３】
本明細書で使用する「プラスミド」とは染色体外遺伝子材料から構成される構築物、通常は染色体ＤＮＡから独立して複製することができるＤＮＡの円形デュプレクスから構成される構築物を意味する。遺伝子導入ではプラスミドをベクターとして使用する。
【００６４】
本明細書で使用する「ベクター」とは標的細胞の形質転換を誘導するようにデザインされた遺伝子材料から構成される構築物を意味する。ベクターは核酸カセット内の核酸を転写し、トランスフェクトした細胞で必要時に翻訳できるように他の必要なエレメントと共に位置と順序を決定された多重遺伝子エレメントを含む。本発明では、好適ベクターは機能的発現を可能にするために十分な距離で順次連結された以下のエレメントを含む：プロモーター；５’ｍＲＮＡリーダー配列；開始部位；発現すべき配列を含む核酸カセット；３’非転写領域；及びポリアデニル化シグナル。
【００６５】
本明細書で使用する「発現ベクター」なる用語は異種細胞で組換え蛋白質を生産するために必要な全情報を含むＤＮＡプラスミドを意味する。
【００６６】
本明細書で使用する「形質転換」とは細胞の特性（発現される表現型）が遺伝子導入メカニズムにより一時的、安定的又は持続的に変化することを意味する。遺伝子材料は特定遺伝子産物を発現するか又は内因性遺伝子産物の発現もしくは効果を改変するような形態で細胞に導入される。当業者に自明の通り、核酸カセットはトランスフェクションや形質導入を含む種々の方法により細胞に導入することができる。
【００６７】
本明細書で使用する「トランスフェクション」とはＤＮＡ発現ベクターを細胞に導入するプロセスを意味する。マイクロインジェクション、ＣａＰＯ４沈殿、リポソーム融合（例えばリポフェクション）又は遺伝子銃の使用等の種々のトランスフェクション法が可能である。
【００６８】
本明細書で使用する「形質導入」とは細胞に組換えウイルスを感染させることにより組換えウイルスを細胞に導入するプロセスを意味する。
【００６９】
本明細書で使用する「一時的」とは特定蛋白質、ペプチド、又はＲＮＡ等を発現させるように遺伝子材料を細胞に導入することを意味する。導入された遺伝子材料は宿主細胞ゲノムに組込まれたり、複製されたりしないので、時間と共に細胞から除去される。
【００７０】
本明細書で使用する「安定的」とは遺伝子材料を標的細胞の染色体に導入し、遺伝子材料が前記細胞に組込まれ、遺伝子材料の持続的成分になることを意味する。安定的形質導入後の遺伝子発現は細胞の特性を持続的に変化させ、安定的な形質転換をもたらすことができる。
【００７１】
本明細書で使用する「持続的」とはエピソーム（染色体外）複製を可能にする遺伝子エレメントと共に遺伝子を細胞に導入することを意味する。この結果、新規遺伝子材料を宿主細胞の染色体に組込まずに細胞の特性の明白な安定的形質転換が得られる。
【００７２】
本明細書で使用する「転写活性」とは特定プロモーターにおけるＲＮＡポリメラーゼ活性の程度の相対尺度である。
【００７３】
本明細書で使用するアミノ酸残基の略語は以下の通りである。
【００７４】
【表１】
2007535906.tif 000004
【００７５】
Ｉ．直交遺伝子スイッチシステムの構築ストラテジー
核内ホルモン受容体とその組換え誘導体が遺伝子スイッチとして使用されている。遺伝子スイッチの主要な問題は遺伝子スイッチと内因性遺伝子調節システムの相互干渉である。また、投与した外因性リガンドが内因性核内ホルモン受容体と結合し、その活性を活性化又は抑制する可能性がある。更に、発現された外因性核内ホルモン受容体が内因性ホルモンと結合し、内部刺激に応答する可能性もある。
【００７６】
従って、遺伝子スイッチの相互干渉をなくすためには、以下の特徴をもつ新規転写因子と外因性リガンドを遺伝子スイッチに加える必要がある。転写因子は外因性リガンドと結合するが、内因性ホルモンと結合せず、外因性リガンドは内因性核内ホルモン受容体と結合しない。外因性リガンドの結合は新規転写因子を活性化又は抑制する。換言するならば、外因性リガンドは新規転写因子の唯一のアゴニスト又はアンタゴニストである。相互干渉のないこのような遺伝子スイッチを直交遺伝子スイッチとも言う。
【００７７】
本明細書で使用する「結合しない」又は「結合することができない」とは結合を検出できないか又は結合が非常に少ないこと、即ち天然リガンドよりも結合親和性が著しく低いことを意味する。親和性は各種濃度の未標識リガンドの存在下で単一濃度の標識リガンドと受容体の結合を測定する競合結合実験で測定することができる。一般に、未標識リガンドの濃度は少なくとも１０６の範囲で変化する。競合結合実験によりＩＣ５０を測定することができる。本明細書で使用する「ＩＣ５０」とは受容体と標識リガンドの会合の５０％阻害に必要な未標識リガンドの濃度を意味する。ＩＣ５０はリガンド−受容体結合親和性の指標である。ＩＣ５０が低いと親和性が高く、ＩＣ５０が高いと親和性が低い。
【００７８】
本願の１態様によると、外因性リガンドとして公知核内ホルモンの不活性類似体を作製し、直交転写因子のために核内ホルモン受容体のリガンド結合ドメインを修飾することにより直交遺伝子スイッチを構築する。不活性類似体は受容体と結合することができない。修飾リガンド結合ドメインは不活性類似体と結合することができるが、その天然形態と結合することはできない。
【００７９】
本願の１好適態様によると、直交転写因子のために修飾されるそのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を提供するように核内ホルモン受容体を選択する。ＬＢＤ及びそのリガンドの構造とそれらの相互作用は十分に認識されていることが好ましい。
【００８０】
構造と相互作用の認識に基づき、リガンドの不活性類似体を合成し、選択する。不活性類似体は選択された核内ホルモン受容体のリガンドと構造的に関連するが、受容体のリガンド結合ドメインと結合しない化合物である。不活性類似体は動物又はヒトに通常存在しない。
【００８１】
次に、選択された不活性類似体と結合して、結合により活性化されるように受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を修飾する。更に、その核内ホルモン結合能とこのＬＢＤをもつ転写因子のリガンド非依存的活性を低下させるようにＬＢＤを修飾する。
【００８２】
本発明の１好適態様によると、ＬＢＤの突然変異体を含む転写因子のライブラリーを構築する。突然変異体は不活性類似体の結合を妨害するアミノ酸残基を、結合を助長する各種アミノ酸残基に突然変異させることにより作製される。次に選択された不活性類似体でライブラリーをスクリーニングし、不活性類似体により活性化することができる転写因子を選択する。選択された転写因子は不活性類似体と結合することができる修飾ＬＢＤを含む。次に、そのホルモン結合とリガンド非依存的転写活性を低下させるように他の突然変異をＬＢＤに導入する。
【００８３】
その後、修飾ＬＢＤを使用して直交遺伝子スイッチシステムの適当な転写因子を構築すると共に、選択された不活性類似体をシステムの外因性リガンドとして使用することができる。修飾ＬＢＤの構造に適合する不活性類似体を作製することによりシステムの新規系列の外因性リガンドを得ることもできる。
【００８４】
本願の１態様によると、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）はエストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ミネラロコルチコイド受容体（ＭＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ビタミンＤ３受容体（ＶＤＲ）、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）、及びレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）から構成される群から選択される核内受容体に由来する。ＬＢＤの構造とそのリガンドとの相互作用はＬＢＤの修飾の指針となるように十分に認識されていることが好ましい。
【００８５】
本願の１好適態様によると、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）はヒトエストロゲン受容体α（ｈＥＲα）に由来する。ｈＥＲα  ＬＢＤのアミノ酸を配列番号１：
【００８６】
【化３】
2007535906.tif 000005
により示す。
【００８７】
リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）はヒトエストロゲン受容体α（ｈＥＲα）のカルボキシ末端側半分に位置しており、受容体のアミノ酸残基２８２〜アミノ酸残基５９５に位置する。本明細書で使用するｈＥＲα  ＬＢＤのアミノ酸残基又は点突然変異は全長ｈＥＲαにおけるその対応位置に従ってナンバリングする。
【００８８】
本願の別の好適態様によると、ｈＥＲα  ＬＢＤはＬｅｕ（３８４）Ｍｅｔ突然変異をもつ。Ｌ３８４Ｍ突然変異はｈＥＲα  ＬＢＤにｈＥＲβ  ＬＢＤの結合特異性をもたせるために必要且つ十分である。Ｌ３８４Ｍ突然変異をもつｈＥＲα  ＬＢＤのアミノ酸配列を配列番号２：
【００８９】
【化４】
2007535906.tif 000006
により示す。
【００９０】
ＩＩ．外因性リガンドの構造とその合成方法
上述のように、そのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を得るように核内ホルモン受容体を選択した後、核内ホルモンの不活性類似体を合成し、直交遺伝子スイッチシステム用にＬＢＤの修飾を誘導するように選択する。修飾ＬＢＤの構造に適合するように新規不活性類似体を合成することもできる。本願の１好適態様によると、そのＬＢＤを得るようにエストロゲン受容体を選択し、エストロゲンの不活性類似体を合成し、選択する。
【００９１】
本願の１好適態様によると、不活性類似体は以下の化学式：
【００９２】
【化５】
2007535906.tif 000007
2007535906.tif 000008
により表される化合物であり、式中、
ＸはＯ、Ｎ−ＯＲａ、Ｎ−ＮＲａＲｂ及びＣ１−６アルキリデンから構成される群から選択され、前記アルキリデン基は置換されていなくてもよいし、ヒドロキシ、アミノ、Ｏ（Ｃ１−４アルキル）、ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、又はＮ（Ｃ１−４アルキル）２から選択される基で置換されていてもよく；
Ｒ１は水素、ＯＲｂ、ＮＲｂＲｃ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、シアノ、及びニトロから構成される群から選択され；
Ｒ２はＣ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、シクロアルキルアルキル、アリールアルキル及びヘテロアリールアルキルから構成される群から選択され、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルアルキル、アリールアルキル及びヘテロアリールアルキル基は場合によりＯＲｂ、ＳＲｂ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、１〜５個のフルオロ、クロロ、ヨード、シアノから選択される基で置換されていてもよく；
Ｒ３は水素、クロロ、ブロモ、ヨード、シアノ、ＮＲａＲｃ、ＯＲａ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ、ＣＯ２Ｒｃ、ＣＯＮＲａＲｃ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、Ｃ３−７シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、及びヘテロアリールアルキルから構成される群から選択され、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は置換されていなくてもよいし、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、シアノ、ＯＲａ、ＮＲａＲｃ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲａＲｃ、ＮＲａ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｃ、ＮＲａ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲｃ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ、ＣＯ２Ｒａ、ＣＯＮＲａＲｃ、ＣＳＮＲａＲｃ、ＳＲａ、Ｓ（Ｏ）Ｒａ、ＳＯ２Ｒａ、ＳＯ２ＮＲａＲｃ、ＹＲｄ、及びＺＹＲｄから選択される１、２又は３個の基で独立して置換されていてもよく；
Ｒ４はＯＲｂ、ＯＲａ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｃ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲｃ、及びＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｃから構成される群から選択され；
Ｒａは水素、Ｃ１−６アルキル、及びフェニルから構成される群から選択され、前記アルキル基は場合によりヒドロキシ、アミノ、Ｏ（Ｃ１−４アルキル）、ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、フェニル、又は１〜５個のフルオロから選択される基で置換されていてもよく；
Ｒｂは水素、Ｃ１−４アルキル、及びフェニルから構成される群から選択され；
Ｒｃは水素及びＣ１−４アルキルから構成される群から選択されるか；
あるいはＲａとＲｃは同一原子上にあるか否かに拘わらず任意の結合した介在原子と共に４〜６員環を形成してもよく；
ＲｄはＮＲｂＲｃ、ＯＲａ、ＣＯ２Ｒａ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ、ＮＲｃ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｂ、ＣＯＮＲａＲｃ、ＳＯ２ＮＲａＲｃ、及び場合によりＯ、Ｓ、ＮＲｃ、又はＣ＝Ｏにより割り込まれていてもよい４〜７員Ｎ−ヘテロシクロアルキル環から構成される群から選択され；
ＹはＣＲｂＲｃ、Ｃ２−６アルキレン及びＣ２−６アルケニレンから構成される群から選択され、前記アルキレン及びアルケニレンリンカーは場合によりＯ、Ｓ、又はＮＲｃにより割り込まれていてもよく；
ＺはＯ、Ｓ、ＮＲｃ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）、（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、ＮＲｃ（Ｃ＝Ｏ）又は（Ｃ＝Ｏ）ＮＲｃから構成される群から選択される。
【００９３】
本発明の化合物において、Ｘは好ましくはＯ及びＮ−ＯＲａから構成される群から選択される。より好ましくは、ＸはＯ、Ｎ−ＯＨ及びＮ−ＯＣＨ３から構成される群から選択される。
【００９４】
本発明の化合物において、Ｒ１は好ましくは水素、ＮＲｂＲｃ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ニトロ及びＣ１−４アルキルから構成される群から選択される。
【００９５】
本発明の化合物において、Ｒ２は好ましくはＣ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ３−６シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリールアルキル及びヘテロアリールアルキルから構成される群から選択され、前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリールアルキル及びヘテロアリールアルキル基は場合によりＯＲｂ、ＳＲｂ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、又は１〜５個のフルオロ、クロロ、ヨード、シアノから選択される基で置換されていてもよい。
【００９６】
本発明の化合物において、Ｒ２はより好ましくはアリールアルキル及びヘテロアリールアルキルから構成される群から選択され、前記アリールアルキル及びヘテロアリールアルキル基は場合によりＯＲｂ、ＳＲｂ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、又は１〜５個のフルオロ、クロロ、ヨード、シアノから選択される基で置換されていてもよい。
【００９７】
本発明の化合物において、Ｒ３は好ましくは水素、クロロ、ブロモ、ヨード、シアノ、ＯＲａ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、シクロアルキルアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、及びヘテロアリールアルキルから構成される群から選択され、前記アルキル、アルケニル、アリール及びヘテロアリール基は置換されていなくてもよいし、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、シアノ、ＯＲａ、ＮＲａＲｃ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲａＲｃ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ、ＣＯ２Ｒｃ、ＣＯＮＲａＲｃ、ＣＳＮＲａＲｃ、ＳＲａ、ＹＲｄ、及びＺＹＲｄから選択される１、２又は３個の基で独立して置換されていてもよい。
【００９８】
本発明の化合物において、Ｒ３はより好ましくは水素、クロロ、ブロモ、ヨード、シアノ、Ｃ１−１０アルキル、アリール、ヘテロアリールから構成される群から選択され、前記アルキル、アリール及びヘテロアリール基は置換されていなくてもよいし、フルオロ、クロロ、ブロモ、シアノ、ＮＲａ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲｃ、ＮＲａＲｃ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲａＲｃ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ、ＣＯ２Ｒｃ、ＣＯＮＲａＲｃ、ＳＲａ、ＹＲｄ、及びＺＹＲｄから選択される１、２又は３個の基で独立して置換されていてもよい。
【００９９】
本発明の化合物において、Ｒ４は好ましくは水素、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｃ、ＯＲａ及びＯ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲｃから構成される群から選択される。
【０１００】
本発明の化合物において、Ｒ４はより好ましくはＯＨである。
【０１０１】
本発明の化合物はキラル中心をもつことができ、ラセミ化合物、ラセミ混合物、ジアステレオマー混合物、及び個々のジアステレオマー、又はエナンチオマーとして存在することができ、全異性形が本発明に含まれる。従って、化合物がキラルである場合には、実質的に他方のエナンチオマーを含まない別々のエナンチオマーが本発明の範囲に含まれ、更に２種のエナンチオマーの全混合物も本発明の範囲に含まれる。
【０１０２】
「アルキル」なる用語は直鎖又は分枝鎖非環式飽和炭化水素から水素原子１個を形式的に除去することにより誘導される一価置換基を意味する（即ち−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）３等）。
【０１０３】
「アルケニル」なる用語は少なくとも１個の二重結合を含む直鎖又は分枝鎖非環式不飽和炭化水素から水素原子１個を形式的に除去することにより誘導される一価置換基を意味する（即ち−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）２等）。
【０１０４】
「アルキニル」なる用語は少なくとも１個の三重結合を含む直鎖又は分枝鎖非環式不飽和炭化水素から水素原子１個を形式的に除去することにより誘導される一価置換基を意味する（即ち−Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨ２Ｃ≡Ｈ、−Ｃ≡ＣＣＨ３、−ＣＨ２Ｃ≡ＣＣＨ２（ＣＨ３）２等）。
【０１０５】
「アルキレン」なる用語は異なる炭素原子から水素原子２個を形式的に除去することにより直鎖又は分枝鎖非環式飽和炭化水素から誘導される二価置換基を意味する（即ち−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−等）。
【０１０６】
「アルキリデン」なる用語は同一炭素原子から水素原子２個を形式的に除去することにより直鎖又は分枝鎖非環式飽和炭化水素から誘導される二価置換基を意味する（即ち＝ＣＨ２、＝ＣＨＣＨ３、＝Ｃ（ＣＨ３）２等）。
【０１０７】
「アルケニレン」なる用語は異なる炭素原子から水素原子２個を形式的に除去することにより直鎖又は分枝鎖非環式不飽和炭化水素から誘導される二価置換基を意味する（即ち−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）＝Ｃ（ＣＨ３）−等）。
【０１０８】
「シクロアルキル」なる用語は飽和単環式炭化水素から水素原子１個を形式的に除去することにより誘導される一価置換基を意味する（即ちシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、又はシクロヘプチル）。
【０１０９】
「シクロアルケニル」なる用語は二重結合を含む不飽和単環式炭化水素から水素原子１個を形式的に除去することにより誘導される一価置換基を意味する（即ちシクロペンテニル又はシクロヘキセニル）。
【０１１０】
「ヘテロシクロアルキル」なる用語はヘテロシクロアルカンから水素原子１個を形式的に除去することにより誘導される一価置換基を意味し、前記ヘテロシクロアルカンは炭素原子１又は２個をＮ、Ｏ又はＳから選択される原子で置換することにより対応する飽和単環式炭化水素から誘導される。ヘテロシクロアルキル基の例としては限定されないが、オキシラニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、及びモルホリニルが挙げられる。
【０１１１】
本明細書で使用する「アリール」なる用語は単環式又は二環式芳香族炭化水素から水素原子１個を形式的に除去することにより誘導される一価置換基を意味する。アリール基の例としてはフェニル、インデニル、及びナフチルが挙げられる。
【０１１２】
本明細書で使用する「ヘテロアリール」なる用語はＮ、Ｏ、又はＳから選択される１、２、３、又は４個のヘテロ原子を含む単環式又は二環式芳香族環系から水素原子１個を形式的に除去することにより誘導される一価置換基を意味する。ヘテロアリール基の例としては限定されないが、ピロリル、フリル、チエニル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ベンズイミダゾリル、インドリル、及びプリニルが挙げられる。
【０１１３】
本明細書で使用する「シクロヘテロアルキル」なる用語はＮ、Ｏ又はＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を含む３〜８員完全飽和複素環を意味する。シクロヘテロアルキル基の例としては限定されないが、ピペリジニル、ピロリジニル、アゼチジニル、モルホリニル、ピペラジニルが挙げられる。
【０１１４】
本明細書で使用する「アルコキシ」なる用語は指定炭素原子数（例えばＣ１−５アルコキシ）、又はこの範囲の任意数（即ちメトキシ、エトキシ等）の直鎖又は分枝鎖アルコキシドを意味する。
【０１１５】
「アルキル」又は「アリール」なる用語又はその接頭辞と語根の組み合わせが置換基の名称に含まれる場合（例えばアリールＣ１−８アルキル）には、「アルキル」及び「アリール」に関する上記定義を含むと解釈すべきである。指定炭素原子数（例えばＣ１−１０）はアルキルもしくは環式アルキル部分における炭素原子数又はアルキルをその接頭辞と語根の組み合わせとして含むより大きな置換基のアルキル部分を独立して意味する。
【０１１６】
「アリールアルキル」及び「アルキルアリール」なる用語はアルキル部分（アルキルは上記に定義した通りである）とアリール部分（アリールは上記に定義した通りである）を含む。アリールアルキルの例としては限定されないが、ベンジル、フルオロベンジル、クロロベンジル、フェニルエチル、フェニルプロピル、フルオロフェニルエチル、クロロフェニルエチル、チエニルメチル、チエニルエチル、及びチエニルプロピルが挙げられる。アルキルアリールの例としては限定されないが、トルエン、エチルベンゼン、プロピルベンゼン、メチルピリジン、エチルピリジン、プロピルピリジン及びブチルピリジンが挙げられる。
【０１１７】
本明細書で使用する「ヘテロアリールアルキル」なる用語はアリールアルキル部分（アリールアルキルは上記に定義した通りである）とＮ、Ｏ又はＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を含む系を意味する。
【０１１８】
本明細書で使用する「シクロアリールアルキル」なる用語は３〜８員完全飽和環部分とアリールアルキル部分（アリールアルキルは上記に定義した通りである）を含むを系意味する。
【０１１９】
本発明の化合物において、Ｒ１とＲ２が同一炭素原子上にあるときにそれらが結合している炭素原子と共に３〜６員環を形成することができる。
【０１２０】
本発明の化合物において、ＲａとＲｂはそれらが結合しているか又はそれらの間の原子の任意のものと共に４〜６員環系を形成することができる。
【０１２１】
本発明の新規化合物は適当な材料を使用して以下のスキーム及び実施例の手順に従って製造することができ、以下の特定例により更に例証する。しかし、実施例に例証する化合物は本発明とみなす唯一の類を形成すると解釈すべきではない。以下の実施例は更に本発明の化合物の製造の詳細を例証する。当業者に自明の通り、以下の製造手順の条件及び工程の公知変形を使用してこれらの化合物を製造することができる。
【０１２２】
本発明の化合物はスキームＩ−ＶＩに要約する一般方法により製造することができる。ＣＨ２ＲＩＩは水素以外のＲ２、又はその前駆体を表し；ＲＩＩＩはＲ３又はその前駆体を表し；ＲＩＩＩａ及びＲＩＩＩｂは水素以外のＲ３、又はその前駆体を表す。ＲＩＶはＯＲａ及びＮＲａＲｂを表す。ＲＯはアセチル等のアシル基を表し；ＲＰはインドール、インダゾール、ベンゾイミダゾール、又はベンゾトリアゾール基のＮ保護基を表す。
【０１２３】
スキームＩ
９ａ置換１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン化合物の基本的製造方法はスキームＩに示す通りであり、Ｃｒａｇｏｅら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２９，８２５−８４１に記載されている化学反応に基づく。スキームＩのインダノン出発材料（１ａ）は市販されている。Ｒ１としてのブロモ（クロロ）置換基は未置換インドナノン（１，Ｒ１＝Ｈ）をＮＢＳ（ＮＣＳ）と反応させることにより導入することができる。２未置換インダノン（１ａ）を塩基性条件下でアルデヒドと反応させることにより２−アルキリデン−１−インダノン（１ｂ）を製造する。二重結合を還元し（ステップ２）、インダノン（１ｃ）を得る。スキームＩのステップ３では、２置換１−インダノン（１ｃ）を塩基の存在下でビニルケトンと反応させる。次に粗生成物を塩基性又は酸性条件下で環化する（ステップ３）。Ｏ脱保護後にテトラヒドロフルオレノン生成物（１ｅ）が得られる。
【０１２４】
【化６】
2007535906.tif 000009
【０１２５】
スキームＩにステップ１−４として示す代表的試薬及び反応条件は以下の通りである。
【０１２６】
ステップ１：ＲＩＩＣＨＯ，ＥｔＯＨ，ＫＯＨ，ｒｔ。
【０１２７】
ステップ２：Ｈ２，１０％Ｐｄ／Ｃ，ＥｔＯＡｃ，ｒｔ。
【０１２８】
ステップ３：ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＲＩＩＩ，ＤＢＮ，ＴＨＦ，ｒｔ→６０℃又は
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＲＩＩＩ，ＮａＯＭｅ，ＭｅＯＨ，ｒｔ→６０℃、
次いでピロリジン，ＨＯＡｃ，ＴＨＦもしくはＰｈＭｅ，６０→８５℃又は
ＨＯＡｃ／６Ｎ  ＨＣｌ，８０℃。
【０１２９】
ステップ４：ＢＢｒ３，ＣＨ２ＣＬ２，−７８℃→ｒｔ。
【０１３０】
スキームＩＩ
ＲＩＩＩが水素である型（２ａ）のテトラヒドロフルオレノン（１ｅ）はスキームＩＩに示す方法により４位を官能化することができる。臭素化（ステップ１）により４−ブロモ中間体（２ｂ）を得る。これらの化合物は公知方法によりＲＩＩＩｂがアリール、ヘテロアリールである各種新規誘導体（２ｃ）に変換することができる（ステップ２）。ＲＩＩＩｂ基が更に修飾可能であるか又は更に修飾可能な官能基を含む場合には、このような修飾を実施し、付加誘導体を生成することができる。例えば、ＲＩＩＩｂが４−ヒドロキシフェニル基である場合には酸素をアルキル化することができる。
【０１３１】
【化７】
2007535906.tif 000010
【０１３２】
スキームＩＩにステップ１及び２として示す代表的試薬及び反応条件は以下の通りである。
【０１３３】
ステップ１：Ｂｒ２，ＮａＨＣＯ３，ＣＨ２Ｃｌ２又はＣＣｌ４，０℃→ｒｔ（ＲＩＩＩａ＝Ｂｒ）。
【０１３４】
ステップ２：ＲＩＩＩｂＳｎＢｕ３，Ｐｄ（ＰＰｈ３）４，ＰｈＭｅ，１００℃または（ＲＩＩＩｂ＝アリール、又はヘテロアリール）。
【０１３５】
スキームＩＩＩ
テトラヒドロフルオレノン誘導体（３ａ）のＣ−３ケトン修飾をスキームＩＩＩに要約する。スキームＩ−ＩＩに従って製造された他のテトラヒドロフルオレノン生成物にもこの方法が適用される。ステップ１でケトンをヒドロキシルアミン又はアルコキシルアミン試薬と反応させると、３−イミノ生成物（３ｂ）が得られる。
【０１３６】
【化８】
2007535906.tif 000011
【０１３７】
スキームＩＩＩにステップ１として示す代表的試薬及び反応条件は以下の通りである。
【０１３８】
ステップ１：ＮＨ２ＯＲａ・ＨＣｌ，ピリジン，ＥｔＯＨ，ｒｔ（ＲＩＶ＝ＯＲａ）。
【０１３９】
スキームＩＶ
本発明の四環式８，９，９ａ，１０−テトラヒドロインデノ［２，１−ｅ］インダゾール−７（３Ｈ）−オン化合物の主要製造方法をスキームＩＶに要約する。４未置換５−（アシルアミノ）−１−インダノン（４ａ）の臭素化（ステップ１）により４−ブロモ化合物（４ｂ）を得、Ｓｔｉｌｌｅ法を使用して４−メチル誘導体（４ｃ）に変換することができる（ステップ２）。アルドール縮合（ステップ３）とその後の還元（ステップ４）により２未置換中間体（４ｃ）を対応する２置換化合物（４ｅ）に変換する。４−メチル−１−インダノン（４ｃ）を塩基性条件下でビニルケトンと反応させてジケトンを得た後、酸性又は塩基性条件下で環化及び脱アシル化し（ステップ５）、７−アミノ−８−メチルテトラヒドロフルオレノン中間体（４ｆ）を得る。ピロリジンと酢酸を使用して環化を行う場合には、アミノ基は保護されたままであり、更に処理後に融合ピラゾール環が形成される。融合ピラゾール環の形成は（４ｆ）をジアゾ化試薬で処理した後にジアゾ中間体をＫＯＡｃとジベンゾ−１８−クラウン−６で環化することにより実施される（ステップ６）。
【０１４０】
【化９】
2007535906.tif 000012
【０１４１】
スキームＩＶでステップ１−６として示す代表的試薬及び反応条件は以下の通りである。
【０１４２】
ステップ１：ＮＢＳ，ＭｅＣＮ又はＤＭＦ，６０℃。
【０１４３】
ステップ２：Ｍｅ４Ｓｎ，ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２，ＰＰｈ３，ＬｉＣｌ，ＤＭＦ，１００℃。
【０１４４】
ステップ３：ＲＩＩＣＨＯ，ＭｅＯＨ，ＮａＯＭｅ，ｒｔ。
【０１４５】
ステップ４：Ｈ２，１０％Ｐｄ／Ｃ，ＥｔＯＡｃ，ｒｔ。
【０１４６】
ステップ５：ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＲＩＩＩ，ＤＢＮ，ＴＨＦ，ｒｔ→６０℃又は
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＲＩＩＩ，ＮａＯＭｅ，ＭｅＯＨ，ｒｔ→６０℃、
次いでピロリジン，ＨＯＡｃ，ＴＨＦもしくはＰｈＭｅ，６０→８５℃又は
ＨＯＡｃ，６Ｎ  ＨＣｌ，１００℃。
【０１４７】
ステップ６：ｉ）ＮＯＢＦ４，ＣＨ２Ｃｌ２，−４５℃→１０℃。
ｉｉ）ＫＯＡｃ，ジベンゾ−１８−クラウン−６，ＣＨ２Ｃｌ２，−４０℃→ｒｔ。
【０１４８】
スキームＶ
スキームＶは予め形成された三環系にＲＩＩＩ置換基を導入するテトラヒドロインデノ［２，１−ｅ］インダゾール−７（３Ｈ）−オン化合物の合成方法を示す。ＲＩＩＩが水素である中間体（４ｃ）の環化（スキームＩＶ，ステップ５参照）によりそれ自体製造される４未置換テトラヒドロフルオレノン中間体（５ａ）を臭素化（ステップ１）し、４−ブロモ中間体（５ｂ）を得る。脱アシル化（ステップ２）後にピラゾール環形成（ステップ３）により６−ブロモテトラヒドロインデノ［２，１−ｅ］インダゾール−７（３Ｈ）−オン生成物（５ｄ）を得る。ピラゾール基をＮ保護（ステップ４）すると、２置換誘導体（５ｅ１）と３置換誘導体（５ｅ２）の混合物が得られ、そのまま使用してもよいし、分離して個々に使用してもよい。Ｎ保護中間体を慣用方法（ステップ５）によりＲＩＩＩｂが特にアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はアリールアルキル基である各種新規誘導体（５ｆ）に変換する。Ｎ保護の除去（ステップ６）により生成物（５ｇ）が得られる。ＲＩＩＩｂ基が更に修飾可能であるか又は更に修飾可能な官能基を含む場合には、このような修飾を実施し、付加誘導体を生成することができる。例えば、４−ヒドロキシ−フェニル基はを酸素をアルキル化することができる。
【０１４９】
【化１０】
2007535906.tif 000013
【０１５０】
スキームＶにステップ１−６として示す代表的試薬及び反応条件は以下の通りである。
【０１５１】
ステップ１：Ｂｒ２，ＮａＨＣＯ３，ＣＨ２Ｃｌ２又はＣＣ１４，０℃→ｒｔ（ＲＩＩＩａ＝Ｂｒ）。
【０１５２】
ステップ２：ＮａＯＭｅ，ＭｅＯＨ及び／又はＥｔＯＨ，ｒｔ→８０℃（ＲＯ＝アセチル）。
【０１５３】
ステップ３：ｉ）ＮＯＢＦ４，ＣＨ２Ｃｌ２，−４５℃→１０℃。
ｉｉ）ＫＯＡｃ，ジベンゾ−１８−クラウン−６，ＣＨ２Ｃｌ２，−４０℃→ｒｔ。
【０１５４】
ステップ４：ＴｓＣｌ，ＤＭＡＰ，ＣＨ２Ｃｌ２，０℃→ｒｔ（ＲＰ＝Ｔｓ）。
【０１５５】
ステップ５：ＲＩＩＩｂＳｎＢｕ３，Ｐｄ（ＰＰｈ３）４，ＰｈＭｅ，１００℃（ＲＩＩＩｂ＝アルケニル、アリール、又はヘテロアリール）。
【０１５６】
ステップ６：ＮａＯＨ，１，４−ジオキサン−ＥｔＯＨ，ｒｔ（ＲＰ＝Ｔｓ）。
【０１５７】
スキームＶＩ
本発明の８，９，９ａ，１０−テトラヒドロフルオレノ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−７（３Ｈ）−オン化合物の主要製造方法をスキームＶＩに要約する。５−アミノインダンのアミノ保護（ステップ１）後に未置換５−（アシルアミノ）−１−インダン（６ｂ）を臭素化（ステップ２）して６−ブロモ化合物（７ｃ）を得、これを酸化（ステップ３）し、インダノン誘導体（６ｄ）を得る。ニトロ化と５−アミノ基の脱保護後に触媒還元（ステップ６）してジアミノ中間体（６ｇ）を得、環化（ステップ７）して７，８−ジヒドロインデノ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−６（３Ｈ）−オン（６ｈ）を形成する。アルドール縮合（ステップ８）とその後の還元（ステップ９）により２未置換中間体（６ｈ）を対応する２置換化合物（６ｊ）に変換する。２置換７，８−ジヒドロインデノ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−６（３Ｈ）−オン（６ｊ）を塩基性条件下でビニルケトンと反応させてジケトンを得た後、酸性又は塩基性条件下で環化（ステップ１０）すると、８，９，９ａ，１０−テトラヒドロフルオレノ−［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−７（３Ｈ）−オン誘導体（６ｋ）が得られる。
【０１５８】
【化１１】
2007535906.tif 000014
【０１５９】
スキームＶＩにステップ１−１０として示す代表的試薬及び反応条件は以下の通りである。
【０１６０】
ステップ１：Ａｃ２Ｏ，ＨＯＡｃ，還流（ＲＯ＝アセチル）。
【０１６１】
ステップ２：Ｂｒ２，ＨＯＡｃ，１０℃。
【０１６２】
ステップ３：ＣｒＯ３，ＨＯＡＣ，１５℃。
【０１６３】
ステップ４：ＨＮＯ３，−４０℃。
【０１６４】
ステップ５：ＭｅＯＨ，ＨＣｌ，還流（ＲＯ＝アセチル）。
【０１６５】
ステップ６：Ｐｄ（Ｃ），Ｈ２，ＥｔＯＡｃ，ＫＯＡｃ。
【０１６６】
ステップ７：ＮａＮＯ２，ＨＣｌ。
【０１６７】
ステップ８：ＲＩＩＣＨＯ，ＭｅＯＨ，ＮａＯＭｅ，ｒｔ。
【０１６８】
ステップ９：Ｈ２，１０％Ｐｄ／Ｃ，ＥｔＯＡｃ−ＥｔＯＨ，ｒｔ。
【０１６９】
ステップ１０：ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＲＩＩＩ，ＤＢＮ，ＴＨＦ，ｒｔ→６０℃又は
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＲＩＩＩ，ＮａＯＭｅ，ＭｅＯＨ，ｒｔ→６０℃、
次いでピロリジン，ＨＯＡｃ，ＴＨＦもしくはＰｈＭｅ，６０→８５℃又は
ＨＯＡｃ，６Ｎ  ＨＣｌ，１００℃。
【０１７０】
スキームＩ−ＶＩにおいて、各種Ｒ基は多くの場合に慣用方法により脱保護される保護官能基を含む。脱保護操作は合成シーケンスの最終段階又は中間段階で実施することができる。例えば、Ｒ４の１個がメトキシル基である場合には、多数の方法の任意のものによりヒドロキシル基に変換することができる。これらの方法としては−７８℃〜室温にてＣＨ２Ｃｌ２中でＢＢｒ３と接触させる方法、ピリジン塩酸塩と共に１９０〜２００℃に加熱する方法、又は０℃〜室温にてＣＨ２Ｃｌ２中でＥｔＳＨとＡｌＣｌ３で処理する方法が挙げられる。別の例はアルコールとフェノールのメトキシメチル（ＭＯＭ）保護の使用である。ＭＯＭ基は水性メタノール中で塩酸と接触させることにより簡便に除去される。他の周知保護−脱保護スキームを使用して各種Ｒ基に含まれる各種官能基の望ましくない反応を防ぐことができる。
【０１７１】
限定するものではないが、特定例Ｉ−ＩＩＩは本発明の１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン化合物の製造方法を例証することができる。限定するものではないが、特定例ＩＶ−Ｖは本発明の８，９，９ａ，１０−テトラヒドロインデノ［２，１−ｅ］インダゾール−７（３Ｈ）−オン化合物の製造方法を例証することができる。限定するものではないが、特定例ＶＩは本発明の８，９，９ａ，１０−テトラヒドロフルオレノ−［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−７（３Ｈ）−オン化合物の製造方法を例証することができる。製造された全化合物はラセミ体であるが、所望により公知方法を使用して分離することができる。
【０１７２】
上記に開示した方法を使用してエストロゲンの各種不活性類似体とエストロゲンの活性類似体が合成され、限定されないが、ＣＭＰ１、ＣＭＰ２、ＣＭＰ３、ＣＭＰ４、ＣＭＰ５（図１Ａ）、ＣＭＰ６、ＣＭＰ７、ＣＭＰ８、ＣＭＰ９、ＣＭＰ１０（図１Ｂ）、及び表１ａ、１ｂ、２及び３に記載の化合物が挙げられる。
【０１７３】
ＩＩＩ．リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の修飾方法及び修飾ＬＢＤの構造と配列
上述のように、核内ホルモン受容体は活性化ドメイン（ＡＤ）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及びリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む構造的及び機能的に規定されたドメインから構成されるモジュラー蛋白質である。モジュラードメインを他の核内ホルモン受容体、又は核内ホルモン受容体以外の蛋白質に由来するその対応ドメインと交換することによりキメラ核内ホルモン受容体を構築することができる。リガンド結合ドメインをキメラ転写因子に配置することにより、ドメインとのリガンド結合を制御することができる。例えば、ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲＬＢＤ／ＶＰ１６  ＡＤをもつキメラ転写因子はエストロゲンと結合すると活性化され、ＧＡＬ４の結合部位と結合し、結合部位に融合した遺伝子の転写を促進する。
【０１７４】
核内ホルモン受容体とキメラ転写因子のどちらもリガンド結合特異性はそのＬＢＤにより決定される。従って、直交遺伝子スイッチシステムを構築しようとする試みはＬＢＤの修飾に主眼を置いている。本願の１態様によると、キメラ転写因子の修飾ＬＢＤは選択された不活性類似体を用いて以下のアプローチにより得ることができる。
【０１７５】
まず、リガンドを包囲する疎水性ポケット領域に突然変異を導入し、ＬＢＤが不活性類似体と結合できるようにする。ＬＢＤ及びそのリガンドと、リガンドと不活性類似体の間の構造差に関する知識を使用して突然変異誘発させ、ＬＢＤの突然変異体を生成する。ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と活性化ドメイン（ＡＤ）に融合した突然変異体を使用して転写因子のライブラリーを構築する。
【０１７６】
第２に、ライブラリーを不活性類似体でスクリーニングし、不活性類似体と結合することができ、これと結合することにより活性化される転写因子を選択する。選択された転写因子は不活性類似体と結合するように修飾されたＬＢＤであるＬＢＤの突然変異体を含む。
【０１７７】
第３に、選択された転写因子の選択された修飾ＬＢＤに付加突然変異を導入し、天然リガンド（ホルモン）に対する親和性と転写因子のリガンド非依存的活性を低下させる。その後、ＬＢＤを使用して直交遺伝子スイッチに適した転写因子を構築することができ、不活性類似体をスイッチの外因性リガンドとして使用することができる。修飾ＬＢＤの構造に基づいて新規系列の不活性類似体を作製することによりスイッチの外因性リガンドを得ることもできる。
【０１７８】
本発明の１好適態様によると、上記に開示したストラテジーを使用してエストロゲン受容体（ＥＲ）のＬＢＤを修飾した。ＬＢＤはヒトエストロゲン受容体α（ｈＥＲα）に由来することがより好ましい。
【０１７９】
本発明の１好適態様によると、Ｌ３８４Ｍ突然変異をｈＥＲα  ＬＢＤに導入する。Ｌ３８４Ｍ突然変異はｈＥＲα  ＬＢＤにｈＥＲβ  ＬＢＤの結合特異性をもたせるために必要且つ十分である。従って、ｈＥＲβリガンドの不活性類似体（例えばＣＭＰ１）と結合するようにＬ３８４Ｍ  ｈＥＲα  ＬＢＤを修飾することができる。Ｌ３８４Ｍ  ｈＥＲα  ＬＢＤのリガンド結合ポケット内の５個の残基（Ｌ３９１、Ｆ４０４、Ｍ４２１、Ｉ４２４、及びＬ４２８）がＣＭＰ１の結合を妨害する可能性の最も高い候補残基として同定された。
【０１８０】
Ｌ３９１、Ｆ４０４、Ｍ４２１、Ｉ４２４、及びＬ４２８を独立してアミノ酸残基Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの１種に突然変異させたＬ３８４Ｍ  ｈＥＲα  ＬＢＤの突然変異体を含む転写因子のライブラリーを構築する。ライブラリー内の各転写因子は更にＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と活性化ドメイン（ＡＤ）を含む。
【０１８１】
次にｈＥＲβリガンドの不活性類似体（例えばＣＭＰ１）でライブラリーをスクリーニングし、不活性類似体により活性化することができる転写因子を選択する。選択された転写因子は不活性類似体と結合することが可能な修飾ＬＢＤを含む。選択されたＬＢＤのアミノ酸配列を配列番号３−１５に示す。
【０１８２】
本発明の１好適態様によると、配列番号３−１５に示すような選択されたＬＢＤにＤ３５１Ａ及びＨ５２４Ｖの突然変異を導入し、そのホルモン結合能とＬＢＤをもつ転写因子のリガンド非依存的活性を低下させる。修飾ｈＥＲα  ＬＢＤのアミノ酸配列を配列番号１６−２８に示す。
【０１８３】
配列番号１６−２８の修飾ＬＢＤはｈＥＲβリガンドの所定の不活性類似体（例えばＣＭＰ１、ＣＭＰ４、ＣＭＰ５、及びＣＭＰ１１−３８（図１Ａ及び表１−３））と結合し、この結合により活性化することができるが、これらのＬＢＤは天然ｈＥＲリガンドとは結合しない。
【０１８４】
あるいは、配列番号３−１５に示すような選択されたＬＢＤにＧ５２１Ｒ突然変異を導入し、その天然ホルモン結合能とＬＢＤをもつ転写因子のリガンド非依存的活性を低下させる。修飾ｈＥＲα  ＬＢＤのアミノ酸配列を配列番号２９−４１に示す。
【０１８５】
Ｇ５２１Ｒ突然変異をもつＬＢＤに適合するようにｈＥＲβリガンドの新規系列不活性類似体（ＣＭＰ６、ＣＭＰ７、ＣＭＰ８、ＣＭＰ９、及びＣＭＰ１０（図１Ｂ）を含む）を合成する。
【０１８６】
配列番号２９−４１の修飾ＬＢＤはｈＥＲβリガンドの所定の不活性類似体（例えばＣＭＰ６、ＣＭＰ７、ＣＭＰ８、ＣＭＰ９、及びＣＭＰ１０）と結合し、この結合により活性化することができるが、天然ｈＥＲリガンドとは結合しない。
【０１８７】
本発明は配列番号１−４１に示すような修飾ｈＥＲα  ＬＢＤをコードするポリヌクレオチドも提供する。
【０１８８】
ＩＶ．修飾ＬＢＤを含むキメラ転写因子
本発明は新規キメラ転写因子を提供する。キメラ転写因子は核内ホルモン受容体の天然リガンドの不活性類似体により活性化又は抑制されるが、リガンド自体には応答しない。
【０１８９】
本発明の１態様によると、キメラ転写因子は核内ホルモン受容体の修飾リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）と、活性化ドメイン（ＡＤ）でも抑制ドメインでもよい転写調節ドメインと、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む。
【０１９０】
なお、リガンド結合依存的転写因子の必須３成分、即ちＤＮＡ結合ドメインとリガンド結合ドメインと転写調節ドメインは本発明のトランスアクチベーター／トランスリプレッサー融合蛋白質において任意順序で配置することができる。
【０１９１】
本発明の１好適態様によると、キメラ転写因子の全ドメインはヒト起源の蛋白質に由来するか又はこのような蛋白質から修飾される。
【０１９２】
多くの場合には非ヒト哺乳動物の細胞における遺伝子発現が望ましい。本発明の代替態様によると、ヒト起源ではなく動物起源のドメインを使用することができる。従って、本発明は更にウサギ、モルモット、ラット、マウスもしくは他の齧歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ又はウマを含むヒト以外の哺乳動物種、あるいは鳥類（例えばニワトリ）のドメインを含む任意キメラ転写因子に関する。
【０１９３】
１．修飾リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）
本発明の１態様によると、キメラ転写因子は核内ホルモン受容体の修飾リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む。修飾リガンド結合ドメインは核内ホルモン受容体の天然リガンドと結合しないが、天然リガンドの不活性類似体とは結合する。不活性類似体が修飾リガンド結合ドメインと結合すると、転写因子が活性化される。不活性類似体は核内ホルモン受容体と結合せず、活性化もしない。
【０１９４】
本願の１好適態様によると、新規転写因子はヒトエストロゲン受容体α（ｈＥＲα）の修飾リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む。
【０１９５】
本願の別の好適態様によると、新規転写因子は配列番号１６−４１から構成される群から選択される配列をもつ修飾リガンド結合ドメインを含む。
【０１９６】
２．転写調節ドメイン
キメラ転写因子の転写調節ドメインは当業者に入手可能な任意のものとすることができる。転写調節ドメインは活性化ドメイン（ＡＤ）とすることができる。真核細胞で転写を活性化するポリペプチドは当分野で周知である。特に、多くのＤＮＡ結合蛋白質の転写活性化ドメインが記載されており、ドメインを異種蛋白質に導入した場合にその活性化機能を維持することが示されている。
【０１９７】
各種蛋白質内に存在する活性化ドメインは類似構造特徴に基づいて分類されている。転写活性化ドメインの種類としては酸性ドメイン、プロリンリッチドメイン、セリン／スレオニンリッチドメイン及びグルタミンリッチドメインが挙げられる。酸性ドメインの例としては既に記載されているＶＰ１６領域とＧＡＬ４のアミノ酸残基７５３−８８１が挙げられる。プロリンリッチドメインの例としてはＣＴＦ／ＮＦ１のアミノ酸残基３９９−４９９とＡＰ２のアミノ酸残基３１−７６が挙げられる。セリン／スレオニンリッチドメインの例としてはＩＴＦ１のアミノ酸残基１−４２７とＩＴＦ２のアミノ酸残基２−４５１が挙げられる。グルタミンリッチドメインの例としてはＯｃｔ１のアミノ酸残基１７５−２６９とＳｐ１のアミノ酸残基１３２−２４３が挙げられる。上記各領域及び他の有用な転写活性化ドメインのアミノ酸配列はＳｅｉｐｅｌ，Ｋ．ら（ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９２  １２：４９６１−４９６８）に記載されている。
【０１９８】
本発明の１好適態様において、活性化ドメインはヒトｐ６５蛋白質の活性化ドメイン（ＡＤ）（Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｂａｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．，１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３８０５−３８１７）、より好ましくはヒトｐ６５のアミノ酸２８５−５５１の領域を含む活性化ドメイン、又はこの領域内に含まれる転写活性化部分である。別の態様では、ｐ６５  ＡＤのマルチマーを使用することができる。別の態様では、ｐ６５  ＡＤの一部のマルチマーを使用することができる。
【０１９９】
本発明の別の好適態様において、活性化ドメインは単純ヘルペスウイルスビリオン蛋白質１６（ＶＰ１６）（Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｊ．ら（１９８８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２：７１８−７２９）を含む。好ましくは、ＶＰ１６のＣ末端アミノ酸約１２７個を使用し、より好ましくは、ＶＰ１６のＣ末端アミノ酸約１１個（アミノ酸４３７−４４７）を使用する。好ましくは、この領域のマルチマー（モノマー２〜４個）を使用し、より好ましくは、この領域の二量体（即ち約２２アミノ酸）を使用する。ＶＰ１６の適切なＣ末端ペプチド部分はＳｅｉｐｅｌ，Ｋ．ら（ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９２  １３：４９６１−４９６８）に記載されている。例えば、アミノ酸配列ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬをもつペプチドの二量体を使用することができる。
【０２００】
本発明の別の態様において、活性化ドメインはＰＰＡＲｙ−１コアクチベーター（ＰＧＣ−１）（Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ  Ｐ．ら，１９９８，Ｃｅｌｌ，９２，８２９）のＡＤを含むか又はこのドメインから構成される。１態様では、ＰＧＣ−１のＮ末端のａａ１−７０の領域を使用する（Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，１３６８−１３７１）。別の態様では、ＰＧＣ−１のＮ末端のａａ１−６５の領域を使用する。別の態様では、ＰＧＣ−１  ＡＤ、又はその一部のマルチマーを使用することができる。
【０２０１】
別の態様では、ＤＢＤと調節ドメインを含む融合蛋白質と相互作用するように転写活性化蛋白質を動員することにより間接メカニズムにより転写を活性化する。これは例えば転写アクチベーター蛋白質（例えば宿主細胞に存在する内因性アクチベーター）との蛋白質−蛋白質相互作用を媒介するポリペプチドドメイン（例えば二量化ドメイン）を介して行うことができる。
【０２０２】
本発明によると、真核細胞で転写活性化能をもつ他のポリペプチドも活性化ドメインで使用することができる。
【０２０３】
更に、転写調節ドメインは抑制ドメインでもよい。他の態様では、転写を抑制することが可能なキメラ転写因子を作製する（転写リプレッサー）。この場合には、転写因子は真核細胞で転写を直接又は間接的に抑制する抑制ドメインを含む。
【０２０４】
真核細胞で転写を抑制するポリペプチドは当分野で周知である。特に、多くのＤＮＡ結合蛋白質の転写抑制ドメインが記載されており、ドメインを異種蛋白質に導入した場合にその活性化機能を維持することが示されている（Ｄｅｕｓｃｈｌｅら，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，１９０７−１９１４；Ｆｒｅｕｎｄｌｉｅｂ  Ｓ．ら，１９９９，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１，１）。
【０２０５】
転写を活性化する代わりに抑制することが可能なこのようなドメインの１例はヒトＫｏｘｌ亜鉛フィンガー蛋白質のＫＲＡＢリプレッサードメインである（Ｍａｒｇｏｌｉｎ  Ｊ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，４５０９−４５１３）。このドメインは単独ドメインとして使用してもよいし、マルチマー形態で使用してもよい。
【０２０６】
３．ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）
キメラ転写因子のＤＮＡ結合ドメインは当業者に入手可能な任意のものとすることができる。真核細胞と原核細胞でＤＮＡと結合するポリペプチドは当分野で周知である。特に、多くのＤＮＡ結合蛋白質のＤＮＡ結合ドメインが記載されており、ドメインを異種蛋白質に導入した場合にそのＤＮＡ結合機能を維持することが示されている。
【０２０７】
各種蛋白質内に存在するＤＮＡ結合ドメインは類似構造特徴に基づいて分類されている。ＤＮＡ結合ドメインの種類としてはヘリックスターンヘリックスモチーフ、亜鉛フィンガーモチーフ（Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：７０−７３）、ロイシンジッパーモチーフ（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８１−１６８８）、又はヘリックスループヘリックスモチーフ（Ｍｕｒｒｅ，Ｃ．ら（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５８：５３７−５４４）をもつものや、高移動度群に由来するものが挙げられる。ヘリックスターンヘリックスモチーフは多数の無脊椎動物と脊椎動物の遺伝子発現レギュレーターで同定されているホメオボックスドメインの成分である。亜鉛フィンガーモチーフはＴＩＩＩＦＡとステロイドホルモン受容体で同定されている。ロイシンジッパーモチーフは癌原遺伝子Ｍｙｃ、Ｆｏｓ及びＪｕｎで検出されている。ヘリックスループヘリックスモチーフはマイトジェン転写因子で検出されている。ＤＮＡ結合に加え、亜鉛フィンガーモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、又はヘリックスループヘリックスモチーフを含むドメインは転写因子の二量化にも役割を果たす。
【０２０８】
本発明の１好適態様によると、ＤＮＡ結合ドメインはキメラ転写因子の発現が所望される組織以外の組織で発現される組織特異的転写因子に由来する。
【０２０９】
本発明の１好適態様によると、ＤＮＡ結合ドメインはヒトＨＮＦ−１のＤＮＡ結合ドメインである。ＤＢＤを含むキメラ転写因子はＨＮＦ−１応答プロモーターにより制御される配列の転写を特異的に活性化（又は抑制）する。ＨＮＦ−１  ＤＢＤを含むキメラ転写因子は内因性ＨＮＦ−１を発現しない組織において、選択されたＨＮＦ−１  ＤＮＡ結合部位に連結された任意標的遺伝子の転写レベルを調節するのに有用である。
【０２１０】
ＨＮＦ−１（ＬＦ−Ｂ１又はＨＮＦ−１αとも言う）は数種の遺伝子の肝細胞特異的転写の主要決定基として暗示されている転写因子である（Ｆｒａｉｎ  Ｍ．１９９０，Ｃｅｌｌ，５９，１４５−１５７）。これらの配列に由来するコンセンサス結合部位はパリンドロームＧＧＴＴＡＡＴ（Ｎ）ＡＴＴＡＡＴＡ（配列番号４２）である（Ｔｒｏｎｃｈｅ  Ｆ．ら，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２６６：２３１−２４５）。この部位の２回対称に一致して、ＨＮＦ−１は二量体としてＤＮＡと結合する。ＤＮＡ結合ドメインはＨＮＦ−１のＮ末端から最初の２８１ａａ（ＤＢＤ＝１−２８１）に位置する。
【０２１１】
肝細胞では天然ＨＮＦ−１ポリペプチドが高レベルで発現される。前記ポリペプチドは肝臓以外の組織（例えば腎臓、腸、胃及び膵臓）でも発現される。しかし、ＨＮＦ−１蛋白質は数種の細胞株及び組織（例えば筋肉）で天然に発現されない。
【０２１２】
ＨＮＦ−１依存的プロモーターの下流にクローニングした導入遺伝子が内因性ＨＮＦ−１をもたない細胞に送達された場合には転写されない（Ｔｏｎｉａｔｔｉ  Ｃ．ら，１９９０，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，４４６７−４４７５）。ＨＮＦ−１は筋肉に存在しないので、ＨＮＦ−１依存的プロモーターの下流にクローニングした導入遺伝子を筋細胞にｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達するとサイレントになると思われる。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られた従来の結果によると、ＨＮＦ−１をコードする発現ベクターを筋肉に同時送達すると、このような導入遺伝子は活性化されることが示されている（Ｔｏｎｉａｔｔｉ  Ｃ．ら，１９９０，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，４４６７−４４７５）。
【０２１３】
本発明の１好適態様において、ＨＮＦ−１  ＤＮＡ結合ドメインはヒトＨＮＦ−１の残基１−２８２（Ｂａｃｈ，ら（１９９０），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，８（１）：１５５−１６４）（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒＰ２０８２３）、又はこれらの残基に含まれるＤＮＡ結合部分を含むか又はこれらから構成される。
【０２１４】
本発明は配列番号４３を含む転写因子を提供する。本発明は更に配列番号４３に示す転写因子をコードするポリヌクレオチドも提供する。
【０２１５】
本発明の代替態様によると、ＤＢＤはＧＡＬ４最小ＤＢＤである。
【０２１６】
本発明によると、真核及び原核細胞でＤＮＡ結合能をもつ他のポリペプチドもＤＮＡ結合ドメインで使用することができる。
【０２１７】
４．キメラ転写因子の他のドメイン
（単独融合蛋白質でもよい）本発明のキメラ転写因子は更に細胞核導入を促進する核移行シグナル（ＮＬＳ）等の１種以上の付加ポリペプチド成分を含むことができる。
【０２１８】
核移行シグナルは一般に塩基性アミノ酸連鎖から構成される。異種蛋白質（例えば本発明の融合蛋白質）と結合すると、核移行シグナルは蛋白質の細胞核導入を促進する。蛋白質表面に露出され、蛋白質の機能を妨害しないように核移行シグナルを異種蛋白質と結合する。蛋白質の一端（例えばＮ末端）にＮＬＳを結合することが好ましい。本発明の融合蛋白質に含むことができるＮＬＳの非限定的な１例のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（配列番号４４）である。核移行シグナルをコードする核酸を標準組換えＤＮＡ技術により融合蛋白質をコードする核酸と（例えば５’末端で）インフレームにスプライシングすることが好ましい。
【０２１９】
Ｖ．キメラ転写因子と不活性類似体を使用する直交遺伝子スイッチ
本発明は更に対象遺伝子の発現を調節するための直交遺伝子スイッチを提供する。遺伝子スイッチは上記のように核内ホルモン受容体の天然リガンドの不活性類似体により活性化又は抑制されるが、天然リガンド自体には応答しない新規キメラ転写因子を含む。
【０２２０】
従って、本発明は有効な外因性リガンドの投与により異種遺伝子又は一連の異種遺伝子の発現を制御することが可能な直交遺伝子スイッチを提供する。本発明の主要な利点の１つは遺伝子スイッチと内因性遺伝子調節システムの相互干渉がないという点にある。換言するならば、外因性インデューサーは内因性遺伝子発現を活性化することができないが、内因性ホルモンは遺伝子スイッチを始動することができない。
【０２２１】
本発明の１態様によると、直交遺伝子スイッチは更に対象遺伝子と対象遺伝子に融合した調節領域を含む構築物を含む。転写因子は調節領域と結合することができる。
【０２２２】
本発明の１好適態様によると、遺伝子スイッチは不活性類似体である外因性リガンドにより調節される。従って、外因性リガンドを使用して内因性核内ホルモン受容体の機能を妨げずに対象遺伝子の発現を制御することができる。
【０２２３】
１．調節対象遺伝子
調節対象遺伝子は遺伝子スイッチにより転写を調節する該当ヌクレオチド配列である。本発明の１態様によると、対象遺伝子はポリペプチド又はペプチド、アンチセンス配列、ｄｓＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ）、又はリボソームをコードする。
【０２２４】
本発明を使用して発現を制御することができるポリペプチドは本発明の実施者の要望と目的に応じて選択することができ、治療用蛋白質でも細胞毒性蛋白質でもよい。治療用蛋白質の種類は治療する疾患により決定される。例えば、癌遺伝子治療で使用される治療用蛋白質はサイトカイン（Ａｇｈａ−Ｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｓ．ａｎｄ  Ｌｏｔｚｅ，Ｍ．Ｔ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５，１１７３−１１７６（２０００））、プロドラッグ活性化酵素（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｊ．ａｎｄ  Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ，Ｉ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５，１１６１−１１６７（２０００））、抗体、及び殺腫瘍遺伝子産物とすることができる。
【０２２５】
アンチセンス調節により発現に作用するのに適した核酸を使用してポリペプチド発現を阻害することができ、アンチセンス配列を本発明による転写制御下に置くことができる。遺伝子発現をダウンレギュレートするためにアンチセンス遺伝子又は部分遺伝子配列を使用することは現在定着している。ＤＮＡの「アンチセンス」鎖の転写により標的遺伝子の「センス」鎖から転写される正常ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡが得られるように２本鎖ＤＮＡを「逆方向」にプロモーターの制御下に置く。この場合、相補的アンチセンスＲＮＡ配列はｍＲＮＡと結合してデュプレクスを形成し、標的遺伝子から蛋白質への内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害すると考えられる。実際の作用機序がこの通りであるか否かはまだ不明である。しかし、この技術を利用できることは周知の事実である。
【０２２６】
あるいは、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）により遺伝子発現を阻害することもでき、ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡをコードする配列を本発明による転写制御下に置くことができる。２本鎖ＲＮＡは植物、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、及びショウジョウバエ等の種々の生物で配列特異的に遺伝子発現を阻害することができる（Ｈｏｍｍｏｎｄ  Ｓ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２，１１０−１１９（２００１））。更に、短いｄｓＲＮＡであるｓｉＲＮＡはＲＮＡｉを生じることにより配列特異的に遺伝子発現を阻止することが示されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４−４９８（２００１）；Ｂａｓｓ，Ｂ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４２８−４２９（２００１））。
【０２２７】
ｓｉＲＮＡはＲＮＡ機序によりｉｎ  ｖｉｖｏプロセシングされてｓｉＲＮＡとなる短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現によりトランスフェクトした哺乳動物細胞で継続的に生産することができる（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  Ｔ．Ｒ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，５５０−５５３（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６，９４８−９５８（２００２）；Ｐａｕｌ，Ｃ．Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，５０５−５０８（２００２））。あるいは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの両者を発現させた後にｉｎ  ｖｉｖｏハイブリダイズしてｓｉＲＮＡを形成することにより哺乳動物でｓｉＲＮＡを生産することもできる（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｔａｉｒａ  Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，４９７−５００（２００２））。短いヘアピンＲＮＡ、又はセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡを本発明のキメラ転写因子に応答性のプロモーターの制御下に置くことができる。
【０２２８】
更に、転写後に特定部位で核酸を切断することが可能なリボザイムを生産し、従って同様に遺伝子発現に作用するのに有用な核酸を使用することも考えられる。リボザイムの背景文献としてはＫａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ  ａｎｄ  Ｓｃａｎｌｏｎ（１９９５）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２，（３）２１３−２２３と、Ｍｅｒｃｏｌａ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ（１９９５）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２，（１）４７−５９が挙げられる。
【０２２９】
２．調節領域
対象遺伝子はキメラ転写因子が結合する少なくとも１個のオリゴヌクレオチド配列を含む調節領域に機能的に連結される。調節領域は通常、転写すべき配列の上流（即ち５’側）に配置され、適宜、最小プロモーターである。調節領域配列は転写すべきヌクレオチド配列の下流（即ち３’側）に機能的に連結してもよい。
【０２３０】
本発明の１態様によると、調節領域はキメラ転写因子の単独又は多重結合部位を含むことができる。本発明の１好適態様によると、調節領域はキメラ転写因子により制御される人工プロモーターである。人工プロモーターはキメラ転写因子の１又は複数の結合部位を含む。
【０２３１】
本発明の１態様によると、キメラ転写因子はＨＮＦ−１のＤＮＡ結合ドメインを含み、転写因子に応答性のプロモーターはＨＮＦ−１の少なくとも１個の結合部位と、１個以上の異なる転写因子の１個以上の結合部位を含むことができる。
【０２３２】
３．外因性リガンド
本発明はキメラ転写因子と結合してこれを活性化することができるが、対応する野生型核内ホルモン受容体とは結合することができない外因性リガンドを提供する。外因性リガンドは好ましくはｗｔ核内ホルモン受容体のアンタゴニスト又はアゴニストの不活性類似体である。
【０２３３】
本発明の１態様によると、外因性リガンドはヒトエストロゲン受容体β（ｈＥＲβ）特異的アゴニスト又はアンタゴニストの不活性類似体である。本発明の１好適態様によると、不活性類似体はＣＭＰ１、ＣＭＰ４、ＣＭＰ５、ＣＭＰ６、ＣＭＰ７、ＣＭＰ８、ＣＭＰ９、ＣＭＰ１０、並びに表１ａ、１ｂ、２及び３に記載の化合物から構成される群から選択される。化合物の構造と合成は上述した通りである。
【０２３４】
本願の１好適態様によると、直交遺伝子スイッチは配列番号１６−４１から構成される群から選択されるアミノ酸配列のＬＢＤをもつキメラ転写因子を含む。
【０２３５】
配列番号１６−２８から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子スイッチでは、外因性リガンドはＣＭＰ１、ＣＭＰ４、ＣＭＰ５、及びＣＭＰ１１−３８から構成される群から選択される。
【０２３６】
配列番号２９−４１から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子スイッチでは、外因性リガンドはＣＭＰ６、ＣＭＰ７、ＣＭＰ８、ＣＭＰ９、及びＣＭＰ１０から構成される群から選択される。
【０２３７】
標的細胞における該当配列の発現は標的宿主細胞に外因性リガンドを投与することにより刺激される。対象の細胞における該当遺伝子の発現を停止するためには、外因性リガンドの投与を停止する。
【０２３８】
抑制ドメインをキメラ転写因子で利用する場合には、標的細胞における該当配列の発現はリガンドの存在下で抑制され、その後、リガンドの投与停止により刺激される。対象の細胞における該当遺伝子の発現を停止するためには、リガンドを再投与する。
【０２３９】
いずれの場合も、患者に投与するリガンドの用量を調節することにより遺伝子発現レベルを調節することができる。従って、宿主細胞では、宿主細胞と接触する外因性リガンドの濃度を変化させること（例えばリガンドを培地に添加するか、又はリガンドを宿主生物に投与する等）により対象遺伝子の転写を制御することができる。
【０２４０】
ＶＩ．直交遺伝子スイッチシステムの適用
酵母細胞や哺乳動物細胞等の遺伝子組換え真核細胞では種々の目的で異種蛋白質を発現される。真核細胞における異種蛋白質の発現を調節するために本発明の遺伝子スイッチを使用することができる。更に、大量の異種蛋白質の蓄積が細胞を損傷させる恐れがある場合や、異種蛋白質が損傷性であるため、細胞の生存性を維持するために短時間の発現が必要である場合に前記スイッチは真核細胞で付加的利点を提供する。
【０２４１】
本発明の直交遺伝子スイッチは宿主細胞（例えば培養真核細胞）における遺伝子発現を調節できることが望ましい種々の状況に広く適用可能である。
【０２４２】
このような誘導システムを遺伝子治療に適用し、治療用蛋白質の発現タイミングを制御することもできる。従って、本発明は形質転換哺乳動物細胞のみならず、哺乳動物自体にも適用可能である。
【０２４３】
宿主細胞における該当遺伝子の発現は外因性リガンドを患者又は細胞に直接投与することにより刺激又は抑制される。該当遺伝子の発現を停止するためには、外因性リガンドの投与を停止する。
【０２４４】
１．遺伝子治療
本発明はヒトにおける遺伝子治療目的及び／又は非ヒト種における研究目的に優先的に利用される。遺伝子治療は特定組換え遺伝子を患者の細胞に導入することにより所定疾患、特に遺伝子異常又は遺伝子欠損に起因する疾患を治療する方法である。遺伝子治療は種々の疾患を治療するために開発されている。遺伝子治療の候補疾患としては癌、心臓血管疾患、嚢胞性線維症、ＡＩＤＳ、ゴーシェ病、家族性高コレステロール血症、関節リウマチ及び鎌状赤血球貧血、並びに筋ジストロフィーが挙げられる。
【０２４５】
多くの場合に遺伝子治療には調節可能な遺伝子発現が不可欠である。本発明の直交遺伝子スイッチにより遺伝子発現の調節を行うことができる。（１）宿主細胞における発現に適した形態のキメラ転写因子をコードする核酸と、（２）キメラ転写因子に応答性のプロモーターに機能的に連結された（例えば治療用の）該当配列を含むように、遺伝子治療を必要とする対象の細胞を改変することができる。
【０２４６】
本発明の代替態様によると、直交遺伝子スイッチを獣医学遺伝子治療に使用する。従って、本発明は更にヒト以外の哺乳動物種における遺伝子治療に関する。非ヒト哺乳動物種はウサギ、モルモット、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ及びウマから構成される群から選択することができる。あるいは、本発明はニワトリ等の鳥類種における遺伝子治療に関する。
【０２４７】
調節可能な遺伝子発現に加え、有効な遺伝子治療には遺伝子スイッチを標的哺乳動物細胞に効率的に送達することが必要である。
【０２４８】
遺伝子治療を他の治療と併用して疾患を治療することもできる（Ｗ．Ｍ．Ｒｉｄｅｏｕｔ  ＩＩＩら，Ｃｅｌｌ  １０９，１７−２７（２００２））。
【０２４９】
転写をｉｎ  ｖｉｖｏ誘導又は抑制するためには、リガンドを生体、又は該当組織に（例えば注射により）投与することができる。リガンドは生体に非毒性でなければならない。治療する生体は動物、特に哺乳動物の生体とすることができ、ヒトでも非ヒトでもよい。適切な投与経路としては経口、腹腔内、筋肉内、ｉ．ｖ．が挙げられる。その後、リガンドを標的細胞に吸収することができる。記載する全ケースにおいて、リガンドの濃度は宿主細胞で発現されるキメラ転写因子の濃度に比例する。
【０２５０】
２．直交遺伝子スイッチの他の用途
上記セクションに概説した遺伝子治療用途以外に、本発明の直交遺伝子スイッチは以下の用途にも使用することができる：
１）細胞を所期機能に利用した後に除去できるように、自殺遺伝子を細胞で条件付き発現させる。例えば、対象に免疫応答を発生させた後に細胞に特定リガンドを投与して自殺遺伝子の発現を誘導することによりワクチン接種に使用した細胞を対象から除去することができる。
２）組換えウイルスベクターに含まれ、産生プロセス中にパッケージング細胞株でウイルスの増殖を妨害する恐れのある遺伝子の発現を調節する。これらの組換えウイルスとしてはアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び当業者に自明の他のウイルスの誘導体が挙げられる。
３）結合部位と結合する内因性活性転写因子を含まない培養細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用して該当毒性蛋白質の大規模生産を行う。培養細胞は細胞における転写因子の発現に適した形態のキメラ転写因子をコードする核酸と、転写因子に応答性のプロモーターに機能的に連結された該当蛋白質をコードする遺伝子を含むように改変しておく。
４）遺伝子の機能を決定する。直交遺伝子スイッチにより内因性遺伝子の発現を変更することができる。例えば、標的遺伝子の発現を抑制するようにＳｉＲＮＡの産生を制御し、抑制により生じる表現型に従って遺伝子の機能を決定するためにキメラ転写因子を使用することができる。
【０２５１】
本発明のポリペプチド又は融合蛋白質を生産する簡便な１つの方法は発現システムで核酸を使用することにより、前記蛋白質をコードする核酸を発現させる方法である。
【０２５２】
従って、本発明は更に各種側面において、コードされる蛋白質を生産するために使用することができる本発明の転写アクチベーター又はリプレッサーをコードする核酸を提供する。
【０２５３】
３．遺伝子スイッチの宿主細胞送達
標的細胞に有効に送達するためには、本発明の遺伝子スイッチを適当なベクターに組込むことができる。本発明のキメラ転写因子に応答性のプロモーター及び／又はエンハンサー配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、マーカー遺伝子、及び適宜他の配列等の適当な調節配列を含む適切なベクターを選択又は構築することができる。更に、ポリペプチド又は融合蛋白質の発現を特定細胞型で優先的に調節するためには、組織特異的調節エレメントもベクターで使用することができる。
【０２５４】
ベクター構築で使用されるＤＮＡ組換え技術のその他の詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ参照。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００３には例えば核酸構築物の作製、突然変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞導入と遺伝子発現、及び蛋白質分析における核酸操作の多数の公知技術及びプロトコールが詳細に記載されている。
【０２５５】
遺伝子治療では、ｉｎ  ｖｉｖｏアプローチ又はｅｘ  ｖｉｖｏアプローチにより本発明の核酸を宿主細胞に導入することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏアプローチでは、治療対象の標的細胞に核酸を直接送達する。ｅｘ  ｖｉｖｏアプローチでは、まず標的細胞を治療対象から取出し、核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクトした後、治療宿主に移植又は他の方法で投与する。
【０２５６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子送達の両者に適したベクターとしてはプラスミド、ウイルスベクター、及びリポソームが挙げられる。本発明の１態様によると、組換え発現ベクターはプラスミドである。
【０２５７】
本発明の１好適態様において、組換え発現ベクターはウイルス核酸に導入した核酸の発現を可能にする改変ウイルス、又はその一部である。例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスを使用することができる。本発明のキメラ転写因子をコード及び発現するが、正常溶解性ウイルス生活環におけるその複製能に関して不活化されるようにウイルス（例えばアデノウイルス）のゲノムを操作することができる。組換えレトロウイルスを作製し、このようなウイルスを細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ感染させるためのプロトコールはＡｕｓｕｂｅｌら（前出）に記載されている。
【０２５８】
多種多様な標的細胞に核酸を導入するためにウイルスベクター等のベクターが使用されている。一般に、対象ポリペプチドの発現から有用な治療又は予防効果を得るために十分な比率の細胞でトランスフェクションが行われるようにベクターを標的細胞と接触させる。
【０２５９】
ウイルスベクターとプラスミドベクターの両者の各種ベクターが当分野で公知である（例えば米国特許第５，２５２，４７９号及びＷＯ  ９３／０７２８２参照）。特に、パポバウイルス（例えばＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ及びＥＢＶを含む）、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス等の多数のベクターが遺伝子導入ベクターとして使用されている。
【０２６０】
細胞内に含まれるか又は細胞に対して識別可能に異種の染色体外ベクターに核酸を配置することができる。染色体外ベクターの１例はアデノウイルスベクターである。アデノウイルスは肺、肝臓、血管及び脳細胞を含む広範なヒト細胞に感染することができるが、宿主細胞のゲノムに組込むことができない。染色体外ベクターを使用する治療は周期的に繰返す必要があると思われる。
【０２６１】
あるいは、トランスフェクトした核酸を各標的細胞のゲノムに持続的に組込み、長期持続効果を得ることもできる。アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス（オンコレトロウイルスとレンチウイルスを含む）も各種ヒト細胞に感染し、宿主細胞のゲノムに組込むことができる。従来技術の多くの遺伝子治療プロトコールは無毒化マウスレトロウイルスを使用しており、より最近ではレンチウイルスを使用している。レンチウイルスベクターはオンコレトロウイルスベクターと同様に、その基本状態で造血幹細胞等の非分裂細胞のゲノムに組込むことができる。従って、これらのウイルスに由来するウイルスベクターを組込みベクターとして構築することができる。
【０２６２】
標準技術によりゲノムとの組換えを促進する配列を加えることにより組込みを促進することもできる。哺乳動物細胞に遺伝子を送達するために最も広く利用されているベクターシステムとしては組換えアデノウイルスが挙げられる。しかし、アデノウイルスは宿主細胞のゲノムに組込むことができないので、組換えアデノウイルスベクターを使用して長期遺伝子発現を達成することは困難である。この問題を解決する１つの方法は「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ」トランスポゾン機構とＦｌｐリコンビナーゼをもつ組換えアデノウイルスである。この組換えウイルスは宿主細胞のゲノムに対象導入遺伝子を組込むことができる（Ｙａｎｔ，Ｓ．Ｒ．，ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，９９９−１００５（２００２））。
【０２６３】
ウイルスベクターの使用の代用として、遺伝子治療で核酸を細胞に導入する他の公知方法としてはリポソームによる導入、直接ＤＮＡ取込み及び受容体によるＤＮＡ導入が挙げられる。受容体による遺伝子導入は標的細胞の表面に存在する受容体に特異的な蛋白質リガンドと核酸をポリリジンにより連結するものであり、核酸を特定細胞に特異的にターゲティングする技術の１例である。
【０２６４】
宿主細胞に送達する必要がある核酸としては、本明細書に開示するようなキメラ転写因子をコードする第１の核酸と、転写単位に機能的に連結された被転写ヌクレオチド配列を含む第２の核酸が挙げられる。
【０２６５】
１態様では、第１の核酸と第２の核酸は別々の分子であり、即ち２種の異なるベクターにある。この場合には、２種のベクターを宿主細胞にコトランスフェクトしてもよいし、ベクターを順次トランスフェクトしてもよい。別の態様では、同一分子、即ち単一ベクターで（即ち共直線的に）核酸を連結する。この場合には、遺伝子治療で好ましい単一核酸分子を宿主細胞にトランスフェクトすることができる。
【０２６６】
あるいは、被転写配列は宿主細胞に内因性でもよい。相同組換えにより内因性配列を適当な転写単位に機能的に連結することができる。例えば、内因性遺伝子の実際のプロモーター領域を排除することにより、本発明のキメラ転写因子に応答性のプロモーター配列と、その３’末端に配置され、内因性遺伝子のコーディング領域に相当する配列と、その’５末端に配置され、内因性遺伝子の上流領域に由来する配列を含む相同組換えベクターを作製することができる。フランキング配列はベクターＤＮＡと内因性遺伝子の相同組換えを成功させるために十分な長さをもつ。好ましくは、数キロベースのフランキングＤＮＡを相同組換えベクターに加える。宿主細胞でベクターＤＮＡと内因性遺伝子の相同組換え後、内因性プロモーターは組換えプロモーターにより置換される。従って、内因性遺伝子の発現はその内因性プロモーターの制御下には置かれなくなり、本発明の転写単位の制御下に置かれる。
【０２６７】
別の態様では、相同組換えにより内因性遺伝子内の任意位置、好ましくは５’又は３’調節領域内にオペレーター配列を挿入し、本明細書に記載する転写アクチベーター又はリプレッサーにより発現を制御することができる内因性遺伝子を作製することができる。例えば、プロモーター又はエンハンサー機能を維持するように本発明のキメラ転写因子の１種以上の結合配列を内因性遺伝子のプロモーター又はエンハンサー領域に挿入することができる。
【０２６８】
筋肉が遺伝子治療の標的組織である場合には、ウイルス又は非ウイルスベクターの直接筋肉内注射が導入遺伝子ｉｎ  ｖｉｖｏ送達の好適方法の１つである。特に、ウイルス又は非ウイルスベクターの直接筋肉内注射は、ｉ）ベクターがウイルス、細菌又は原生動物に由来する抗原をコードする場合には対応する病原体による後期攻撃から保護することができ；ｉｉ）ベクターが腫瘍特異的抗原をコードする場合には対応する抗原を発現する発癌性細胞による攻撃からマウスを保護することができ；ｉｉｉ）ベクターが分泌蛋白質をコードする場合には血流中に送達することができる（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｅｉｄｅｎ，Ｊ．Ｍ．，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，８，３６０−３６５）。
【０２６９】
更に別の側面は核酸を宿主細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ導入する方法を提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ導入は上記ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療及び非遺伝子治療法に使用することができる。導入は限定的ではないが、（特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ導入の場合には）一般に「形質転換」と言うことができ、利用可能な任意技術を使用することができる。真核細胞に適切な技術としてはリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソームによるトランスフェクション及び上記に開示したようなウイルスを使用する形質導入が挙げられる。更に、ワクシニア、及びバキュロウイルス（昆虫細胞の場合）等のウイルスも使用することができる。細菌細胞に適切な技術としては塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びバクテリオファージを使用するトランスフェクションが挙げられる。代法として、核酸の直接注射を利用することもできる。当分野で周知の通り、該当核酸を含むクローンを同定するには、抗生物質耐性及び感受性遺伝子等のマーカー遺伝子を使用することができる。
【０２７０】
４．適切な組成物
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを標的細胞又は治療対象哺乳動物の組織に送達し、外因性リガンドを哺乳動物に投与するためには適切な組成物が必要であると思われる。
【０２７１】
個体に投与する本発明の組成物は場合に応じて個体に効果を示すために十分な「予防有効量」又は「治療有効量」を投与することが好ましい（予防を治療とみなしてもよい）。実際の投与量と投与頻度及び時間コースは治療する疾患の種類と重篤度によって異なる。治療処方（例えば用量の決定等）は一般開業医及び他の医師の裁量に委ねられる。組成物は治療する症状に応じて単独投与してもよいし、他の治療と併用してもよく、同時投与してもよいし、逐次投与してもよい。
【０２７２】
本発明により使用するための本発明の医薬組成物は活性成分に加え、医薬的に許容可能な賦形剤、キャリヤー、緩衝液、安定剤又は当業者に周知の他の材料を加えることができる。このような材料は非毒性でなければならず、活性成分の効力を妨げるものであってはならない。キャリヤー又は他の材料の厳密な種類は投与経路により異なり、経路は経口でも注射（例えば皮膚、皮下又は静脈内）でもよい。
【０２７３】
経口投与用医薬組成物はタブレット、カプセル、散剤又は液体形態とすることができる。タブレットはゼラチン等の固体キャリヤーやアジュバントを加えることができる。液体医薬組成物は一般に水、石油、動物油、植物油、鉱油又は合成油等の液体キャリヤーを加える。生理食塩水、デキストロース又は他の糖類溶液又はグリコール類（例えばエチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール）も加えることができる。
【０２７４】
患部に静脈内、皮膚又は皮下注射するには、パイロジェンフリーで適切なｐＨ、等張性及び安定性をもつ非経口薬として許容可能な水溶液形態に活性成分を処方する。当業者は例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液等の等張ビークルを使用して適切な溶液を容易に調製することができよう。必要に応じて防腐剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤及び／又は他の添加剤を加えてもよい。リポソーム、特にカチオン性リポソームをキャリヤー製剤で使用してもよい。
【０２７５】
上記技術及びプロトコールの例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に記載されている。
【０２７６】
組成物は腫瘍部位又は他の所望部位に局所投与してもよいし、腫瘍又は他の細胞を標的とするような方法で送達してもよい。
【０２７７】
抗体又は細胞特異的リガンド等のターゲティングシステムを使用することにより、標的治療を使用して所定型の細胞により特異的に組成物を送達することができる。例えば薬剤が許容できないほど毒性である場合や、過度に高用量を必要とする場合や、標的細胞に侵入できない場合には、種々の理由からターゲティングが望ましいと思われる。
【０２７８】
組成物は治療する症状（例えば癌、ウイルス感染又は融合蛋白質の活性に媒介される効果を生じることが望ましい他の任意症状）に応じて単独投与してもよいし、他の治療と併用してもよく、同時投与してもよいし、逐次投与してもよい。
【０２７９】
５．宿主細胞
従って、本発明の別の側面は本明細書に開示するような異種核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０２８０】
宿主細胞は例えば哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）、酵母細胞、真菌細胞又は昆虫細胞とすることができる。更に、宿主細胞は非ヒト受精卵でもよく、その場合には転写インヒビター融合蛋白質を発現する細胞をもつトランスジェニック生物を創製するために宿主細胞を使用することができる。
【０２８１】
本発明の１態様によると、哺乳動物宿主細胞はヒト又は非ヒト哺乳動物の細胞である。ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子送達アプローチにより核酸を細胞に導入する。
【０２８２】
従って、本発明は正常哺乳動物細胞（例えば遺伝子治療目的で改変すべき細胞又はトランスジェニックもしくは相同組換え動物を創製するように改変された胚細胞）に適用可能である。遺伝子治療用に特に有用な細胞型の例としては造血幹細胞、筋芽細胞、肝細胞、リンパ球、筋細胞、神経細胞並びに皮膚上皮及び気道上皮が挙げられる。更に、トランスジェニック又は相同組換え動物用には、トランスアクチベーター又はリプレッサー融合蛋白質をコードする核酸を含むように胚性幹細胞と受精卵を改変することができる。
【０２８３】
正常細胞に加え、本発明は細胞株にも適用可能である。本発明の代替態様によると、哺乳動物宿主細胞は培養細胞又は培養株に由来する細胞である。使用することができる哺乳動物細胞株の例としてはＣＨＯ  ３０  ｄｈｆｒ細胞（Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０）、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：ｐｐ  ５９）及びＳＰ２又はＮＳＯ（Ｇａｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（Ｂ）：３−４６）等のミエローマ細胞が挙げられる。
【０２８４】
好ましくは、標的細胞又は組織は結合部位と結合する内因性活性転写因子を含まない。例えば、本発明による遺伝子治療目的ではＨＮＦ−１が筋肉で発現されないことが適切である。１好適態様によると、標的細胞は筋細胞であり、キメラ転写因子のＤＮＡ結合ドメインはＨＮＦ−１に由来する。従って、該当遺伝子は内因性転写因子により刺激されない。
【０２８５】
本発明のキメラ転写因子をコードする核酸を非ヒト動物の受精卵に導入し、１種以上の細胞型で転写因子を発現するトランスジェニック動物を創製することもできる。
【０２８６】
本発明の側面は更に本発明のキメラ転写因子を発現する細胞を含む非ヒトトランスジェニック生物（動物を含む）を提供する（即ちトランスアクチベーター又はリプレッサーをコードする核酸をトランスジェニック生物の細胞の１個以上の染色体に組込む）。
【０２８７】
このようなトランスジェニック細胞の作製方法は本発明に特に密接に関係するものではなく、標的細胞に適した任意方法を使用することができ、このような方法は当分野で公知であり、細胞特異的形質転換が挙げられる。
【実施例】
【０２８８】
（）
以下、実施例により本発明の種々の特徴を更に例証する。以下の実施例は本発明の有用な実施方法も例証する。これらの実施例は特許請求の範囲に記載する発明を限定するものではない。
【０２８９】
材料と方法
プラスミド構築物
酵母発現ベクターｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲαＬＢＤ／ＶＰ１６ＡＤはキメラ転写因子をコードするＤＮＡカセットをｐＥＴ２３ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入した後にカセットをｐＧＢＴ９酵母発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に導入することにより作製した。
【０２９０】
最小ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）のコーディング配列（ａａ１−９３）を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｃＩＩ  ＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＡＳ２−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から切り出し、同一酵素で消化したｐＥＴ２３ｂベクターに挿入し、ｐＥＴ−ＧＡＬ４ＤＢＤを作製した。
【０２９１】
最小ＶＰ１６活性化ドメイン（ＡＤ）のコーディング配列（ａａ４２４−４９０）を含むＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＵＨＤ１７２−１ｎｅｏから切り出し、同一酵素で消化したｐＥＴ−ＧＡＬ４ＤＢＤに挿入し、ｐＥＴ−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＶＰ１６ＡＤを作製した。このプラスミドでは、ＶＰ１６  ＡＤのコーディング配列をＧＡＬ４  ＤＢＤコーディング配列の下流にインフレームに配置し、クローニング中に２アミノ酸リンカー（ＴＥ）を導入した。
【０２９２】
ｈＥＲα  ＬＢＤコーディング配列（ａａ２８２−５９５）は全長ｈＥＲα  ＯＲＦ（１−５９５）を含むプラスミドｐｈＥＲα／ＢＳＫＳ（−）を鋳型とし、以下のＤＮＡプライマー：フォワード，５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴＧＡＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧ−３’（配列番号４５）；リバース，５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＡＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号４６）を使用してＰＣＲ増幅により作製した。得られたＤＮＡフラグメントをＨｉｎｃＩＩとＳａｃＩで消化し、同一酵素で消化したｐＥＴ−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＶＰ１６ＡＤに挿入し、ｐＥＴ−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ｈＥＲαＬＢＤ／ＶＰ１６ＡＤを作製した。この構築物では、２アミノ酸リンカー（ＴＧ）を介してＧＡＬ４  ＤＢＤコーディング配列のＣ末端とインフレームに配置し、ＧＳＧＳＥリンカーを介してＶＰ１６  ＡＤのＮ末端とインフレームに配置するようにｈＥＲα  ＬＢＤコーディング配列をクローニングした。
【０２９３】
構築物ｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲαＬＢＤ／ＶＰ１６ＡＤはＸｈｏＩとＢａｍＨＩを使用してｐＥＴ−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ｈＥＲαＬＢＤ／ＶＰ１６ＡＤからＤＮＡカセットを切り出し、同一酵素で消化したｐＧＢＴ９ベクターにクローニングすることにより作製した。
【０２９４】
ｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｇ（５２１）Ｒ／ＶＰ１６ＡＤはｐＥＴ−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ｈＥＲα  ＬＢＤ／ＶＰ１６ＡＤに含まれるＮｃｏＩ−ＢｓｐＭＩで消化したｗｔＤＮＡフラグメントを同一酵素で消化したｐＧＥＸ−ＥＲα  ＬＢＤ  Ｇ（５２１）Ｒ（下記参照）から得られた突然変異コドンをもつ同一フラグメントで置換することにより作製した。その後、ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｇ（５２１）Ｒ／ＶＰ１６ＡＤ  ＤＮＡカセットを上述のようにＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ消化によりｐＧＢＴ９ベクターに導入した。
【０２９５】
ｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ／ＶＰ１６ＡＤはｗｔ構築物を鋳型とし、以下のＤＮＡプライマー：フォワード（ＥａｇＩ，ｓ），５’−ＧＴＣＣＣＴＧＡＣＧＧＣＣＧＡＣＣＡＧＡＴＧＧ  ＴＣＡＧＴＧＣＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣ−３’（配列番号４７）；リバース［Ｌ（３８４）Ｍ  Ｎｃｏ，ａｓ］，５’−ＧＴＧＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＧＡＧＡＣＣＡＡＴＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号４８）を使用してＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発により作製した。増幅した突然変異ＤＮＡフラグメントをＥａｇＩとＮｃｏｌで消化し、同一酵素で消化したｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ／ＶＰ１６ＡＤに挿入した。
【０２９６】
Ｇ（５２１）Ｒ突然変異をｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ／ＶＰ１６ＡＤとｐＧＢＴ９ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ／ＶＰ１６ＡＤの両者に導入するために、前記突然変異を含むＳｔｕＩ−ＳａｃＩフラグメントをｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｇ（５２１）Ｒ／ＶＰ１６ＡＤから切り出し、同一酵素で消化した対応するレシピエントベクターに挿入した。
【０２９７】
選択した突然変異体ｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ／ＶＰ１６ＡＤのＧ−５２１位とＨ−５２４位に代替突然変異をクローニングするために、ｗｔ構築物を鋳型とし、フォワードプライマーとしてＳｔｕＩ，ｓオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＡＧＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣ−３’）（配列番号４９）を以下の突然変異誘発リバースプライマー：ＧＶ，ＢｓｐＭＩ，ａｓ，５’−ＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＧＧＣＡＣＣＡＣＧＴＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＴＡＣＡＧＡＴＧＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＴＴＧ−３’（配列番号５０）；突然変異誘発三重項を夫々ＣＡＧとＣＡＴとした以外は同一配列をもつＧＬ，ＢｓｐＭＩ，ａｓ及びＧＭ，ＢｓｐＭＩ，ａｓ；ＨＶ，ＢｓｐＭＩ，ａｓ，５’−ＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＧＧＣＡＣＣＡＣＧＴＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＴＴＴ−３’（配列番号５１）の各々と併用してＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発を実施した。各突然変異誘発フラグメントをＳｔｕＩとＢｓｐＭＩで消化し、同一酵素で消化したｐＥＴ−ＧＡＬ４  ＤＢＤ／ｈＥＲαＬＢＤ／ＶＰ１６ＡＤにクローニングした。
【０２９８】
各突然変異ｐＥＴ構築物をＳｔｕＩとＢｓｍＩで消化し、対応する突然変異フラグメントを同一酵素で消化したレシピエントベクターに導入することにより各アミノ酸置換をｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ／ＶＰ１６ＡＤにクローニングした。
【０２９９】
ｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ，Ｈ（５２４）Ｖ／ＶＰ１６ＡＤにＤ（３５１）Ａ突然変異を導入するために、ｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ／ＶＰ１６ＡＤプラスミドを鋳型とし、フォワードプライマー（ＤＡ，Ｈｉｎｄ，ｓ），５’−ＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＡＣＴＧＡＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧ−３’（配列番号５２）とリバースプライマーＬ（３８４）Ｍ  Ｎｃｏ，ａｓ（上記参照）を併用してＰＣＲによる突然変異誘発により適切な突然変異ＤＮＡフラグメントを作製した。得られたフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩとＮｃｏＩで消化し、同一酵素で消化したｐＧＥＸ−ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ（下記参照）に挿入した。この構築物を次にＥａｇＩとＮｃｏＩで消化し、制限フラグメントを同一酵素で消化したｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ，Ｈ（５２４）Ｖ／ＶＰ１６ＡＤにクローニングした。
【０３００】
プラスミドｐＧＥＭ−ｈＥＲα  ＬＢＤ及びｐＧＥＸ−ＥＲα  ＬＢＤはいずれもｐＧＥＸにおいてＧＳＴコーディング配列とインフレームに配置されたｈＥＲα  ＬＢＤをコードするＤＮＡ配列（ａａ３０３−５９５）を含む。構築物ｐＧＥＭ（ＲＩ）−ｈＥＲα  ＬＢＤはｈＥＲα  ＬＢＤコーディング配列の下流のＮｏｔＩ部位とＳａｌＩ部位の間でｐＧＥＭ−ｈＥＲα  ＬＢＤのポリリンカーにＥｃｏＲＩ部位を挿入することにより作製した。ＰＣＲ反応はｐＧＥＭ−ｈＥＲα  ＬＢＤを鋳型とし、以下のプライマー：フォワード，５’−ＣＴＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＧ−３’（配列番号５３）；リバース，５’−ＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣ−３’（配列番号５４）を使用して実施した。ＤＮＡフラグメントをＢｓｐＭＩとＳａｌＩで消化し、同一酵素で消化したｐＧＥＭ−ｈＥＲα  ＬＢＤに挿入した。
【０３０１】
構築物ｐＧＥＭ（ＲＩ）−ｈＥＲα  ＬＢＤ  Ｇ（５２１）ＲはｐＧＥＭ（ＲＩ）−ｈＥＲα  ＬＢＤを鋳型とし、ＳｔｕＩ，ｓをフォワードプライマー（上記参照）とし、ＧＲ，ＢｓｐＭＩ，ａｓ（５’−ＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＧＧＣＡＣＣＡＣＧＴＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＴＡＣＡＧＡＴＧＣＴＣＣＡＴＧＣＧＴＴＴＧ−３’）（配列番号５５）をリバースプライマーとしてＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発により作製した。突然変異ＤＮＡフラグメントをＳｔｕＩとＢｓｐＭＩで消化し、同一酵素で消化したｐＧＥＭ（ＲＩ）−ｈＥＲα  ＬＢＤに挿入した。
【０３０２】
構築物ｐＧＥＸ−ＥＲα  ＬＢＤ  Ｇ（５２１）ＲはｐＧＥＭ−ｈＥＲα  ＬＢＤ  Ｇ（５２１）ＲからのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメントを同一酵素で消化したｐＧＥＸ−ＥＲα  ＬＢＤに導入することにより作製した。
【０３０３】
構築物ｐＧＥＸ−ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）ＭはプラスミドｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ／ＶＰ１６ＡＤをＥａｇＩとＮｃｏＩで消化し、同一酵素で消化したｐＧＥＸ−ＥＲα  ＬＢＤに突然変異コドンを含む制限フラグメントを挿入することにより作製した。
【０３０４】
構築物ｐＧＥＸ−ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）ＩはｐＧＥＸ−ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍを鋳型とし、フォワードプライマーＥａｇＩ，ｓ（上記参照）と以下のリバースプライマー：５’−ＧＴＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＣＣＣＴＣＴＡＣＡＣ−３’（配列番号５６）を使用してＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発により作製した。ＤＮＡフラグメントをＥａｇＩとＢｇｌＩＩで消化し、同一酵素で消化したｐＧＥＸ−ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍに挿入した。
【０３０５】
ＨｉｎｄＩＩＩとＳｔｕＩを使用してＬ（３８４）Ｍ置換と所望選択突然変異の両者をコードするＤＮＡフラグメントを切り出し、同一酵素で消化したｐＧＥＸ−ＥＲα  ＬＢＤの対応するｗｔフラグメントを置換することにより、選択された突然変異組み合わせを対応するｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ／ＶＰ１６ＡＤライブラリーベクターからｐＧＥＸ−ＥＲα  ＬＢＤプラスミドに導入した。
【０３０６】
対応するｐＧＢＴ９構築物をＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化し、同一酵素で消化したｐＭベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に制限フラグメントをクローニングすることにより、ｗｔ及び突然変異ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ／ＶＰ１６ＡＤをコードする哺乳動物発現ベクターを作製した。
【０３０７】
５ＧＡＬ４ＵＡＳ−ｐＳＥＡＰレポーター遺伝子はプラスミドｐＧ５ＣＡＴ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化した後にＫｌｅｎｏｗ酵素でフィルインすることにより構築した。次にＨｉｎｄＩＩＩで消化した後にＫｌｅｎｏｗフィルインしたｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でＳＥＡＰコーディング領域の上流に５個のＧＡＬ４  ＵＡＳ反復配列とＥ１ｂ最小プロモーターを含む制限フラグメントをクローニングした。
【０３０８】
プラスミドｐＶ１ｊ／ＨＥＡｍ４５．２は数回のクローニング段階後に得られた。まずプラスミドｐＨＥＡｗｔ及びｐＢＳ／ＥＲｗｔＬＢＤを作製した。ｐＨＥＡｗｔを得るために、プラスミドｐｈＥＲα／ＢＳＫＳ（−）を鋳型としてプライマー５’−ＧＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＧ−３’（配列番号５７）及び５’−ＡＣＴＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号５８）を使用してＰＣＲ増幅によりｈＥＲαのＬＢＤのａａ３０３−５９５フラグメントを得た。増幅したフラグメントを酵素ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｗｔ  ＬＢＤのａａ３７９−５９５フラグメントを遊離させた。これを従来記載されているプラスミドｐＨＥＡ−１（Ｒｏｓｃｉｌｌｉら，２００２  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．５：６５３−６６３）の対応領域の代わりに使用し、プラスミドｐＨＥＡｗｔを得た。
【０３０９】
プラスミドｐＨＥＡｗｔからｈＥＲα  ｗｔ  ＬＢＤの３０３−５９５領域をＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして切り出し、酵素ＨｉｎｄＩＩＩによる消化、Ｋｌｅｎｏｗによるフィルイン及び再ライゲーションによりＨｉｎｄＩＩＩ部位を除去しておいたプラスミドｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ／ＨｉｎｄＩＩＩ−に導入した。得られたプラスミドをｐＢＳ／ＥＲｗｔＬＢＤと命名した。
【０３１０】
次にプラスミドｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲαＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ／ＶＰ１６ＡＤからのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｔｕＩフラグメントを同一酵素で消化したプラスミドｐＢＳ／ＥＲｗｔＬＢＤに挿入することによりプラスミドｐＢＳ／ＥＲＭ４５を構築した。従って、プラスミドｐＢＳ／ＥＲＭ４５はＬ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ突然変異をもつｈＥＲα  ＬＢＤ（ａａ３０３−ａａ５９５）を含む。次にこの突然変異ＬＢＤをｐＢＳ／Ｅｒｍ４５からＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして切り出し、プラスミドｐＨＥＡｗｔのｗｔ  ＬＢＤの代わりに使用し、プラスミドｐＶ１ｊ／ＨＥＡｍ４５を得た。
【０３１１】
最後に、プラスミドｐＶ１ｊ／ＨＥＡｍ４５をＢｇｌＩＩで消化することによりＨＥＡｍ４５のａａ１−４０６フラグメントを得、同一酵素で消化したプラスミドｐＥＡ１（Ｒｏｓｃｉｌｌｉら，２００２  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．５：６５３−６６３）に導入した。得られたプラスミドをｐＶ１ｊ／ＨＥＡｍ４５．２と命名した。
【０３１２】
全ＤＮＡ構築物は適切なオリゴヌクレオチドを使用して自動シーケンシングにより確認した。
【０３１３】
ＧＳＴ−ＥＲ  ＬＢＤ融合蛋白質の細菌発現及び精製
大腸菌ＢＬ２１細胞（ＣＯＤＯＮＰＬＵＳ（登録商標）ＤＥ  ３−ＲＩＬ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を適切なｐＧＥＸ−ＥＲα  ＬＢＤ発現プラスミドで形質転換した。単一形質転換細菌コロニーに由来する２リットル培養液をＭ９改変最小培地（５ｇ／Ｌグルコース，１ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム，１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７，５μＭビオチン，７μＭチアミン，０．５％カザミノ酸，０．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４，０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２，１３μＭ  ＦｅＳＯ４，５０ｍｇ／Ｌアンピシリン）でＡ６００＝０．８まで３７℃にて増殖させた。次に１８℃まで冷却し、６００μＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−ｂ−チオガラクトピラノシド）で２２時間１８℃にて誘導した。その後の全操作は特に指定しない限り、４℃で実施した。
【０３１４】
細胞を回収し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％グリセロール，０．２Ｍ  ＮａＣｌ，０．４％ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ），５ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，及びＣＯＭＰＬＥＴＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）プロテアーゼインヒビター混合物を含有する緩衝液２００ｍｌ中でＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  １１０−Ｓ）を使用して破砕した。不溶性材料をＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローターで２７，０００×ｇにて３０分間ペレット化した。組換え蛋白質３０％〜５０％を含む清澄化上清をｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイで直接使用するために液体窒素で急速凍結後にアリコートとして−８０℃で保存するか、又は更に精製した。
【０３１５】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８及び０．１％  ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシドを含有する溶解用緩衝液で予め平衡化した５ｍｌ−Ｈｉｇｈ  Ｔｒａｐ  ＧＳＴ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２本を連結し、上清をロードした。１０ｍＭに希釈したグルタチオンを添加した同一緩衝液でＧＳＴ融合蛋白質を溶出させ、０．１％  ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシドを含有する溶解用緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で更に精製した。濃度約２μＭの精製ＧＳＴ−ＥＲ  ＬＢＤホモダイマー形に対応するピークフラクションを液体窒素で急速凍結後に−８０℃で適当なアリコートとして保存した。
【０３１６】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏリガンド結合アッセイ
トリチウム標識エストラジオール（３［Ｈ］Ｅ２）（Ａｍｅｒｓｈａｍ，１５８Ｃｉ／ｍｍｏｌ，５５８ｍＣｉ／ｍｇ）をトレーサーとして使用する競合放射結合アッセイによりＧＳＴ−ＥＲ  ＬＢＤポリペプチドに対するリガンド親和性の測定を実施した。
【０３１７】
濃度５μｇ／ｍｌで抗ＧＳＴ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含有するＰＢＳ１００μｌをマイクロプレート（Ｂａｓｉｃ  Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅｓ，ＮＥＮ）ウェルに１２時間４℃でコーティングした。ＰＢＳ２００μｌで３回洗浄後、１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ２００μｌで３時間４℃で飽和することによりバックグラウンドを低下させた。０．１Ｍ  ＮａＣｌと０．２％ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシドを含有する溶解用緩衝液（アッセイ緩衝液）２００μｌでウェルを３回洗浄した。
【０３１８】
抗ＧＳＴ抗体をコーティングしたウェルにＧＳＴ−ＥＲ  ＬＢＤ蛋白質（２−１０μｌ）又は精製ポリペプチド（８ｎＭ）を含有する粗大腸菌上清適量をアッセイ緩衝液２００μｌ中で持続振盪下に１時間２３℃で結合させた。同一緩衝液２００μｌで更に３回洗浄後、２ｎＭ−１０ｎＭ  ３［Ｈ］Ｅ２とＤＭＳＯ５μｌを含有する同一緩衝液又は試験化合物の適当なＤＭＳＯ希釈液１９５μｌ中でリガンド結合反応をセットアップした。持続振盪下に２時間２３℃でインキュベーション後、マイクロプレートシンチレーションルミネッセンスカウンター（Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ，Ｐａｃｋａｒｄ）を使用してＳＰＡ放射能測定した。Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈソフトウェアを使用して実験データのマルチパラメーターロジスティックフィッティングによりＩＣ５０値を求めた。
【０３１９】
酵母株及び増殖条件
酵母株ＣＧ−１９４５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をライブラリーのディスプレイ及びスクリーニング用レポーター宿主株として使用した。この株はゲノムに組込まれたＧＡＬ４応答性ＵＡＳの制御下にＨＩＳ３及びｌａｃＺレポーター遺伝子の両者を含む。他方、定量的転写β−ガラクトシダーゼアッセイには酵母株Ｙ１８７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した。この株は合成ＵＡＳＧ１７−ｍｅｒ（ｘ３）コンセンサス配列の代わりに天然無傷ＧＡＬ１プロモーターの制御下のほうがＣＧ−１９４５中よりも高レベルで発現されるｌａｃＺレポーター遺伝子（恐らく２コピー存在する）のみを含む。どちらの株もｇａｌ４−且つｇａｌ８０−であり、ＹＰＤ培地中で３０℃にて増殖させた。
【０３２０】
ｐＧＢＴ９プラスミドで形質転換した酵母株を−Ｔｒｐアミノ酸混合物を添加したＳＤ最小培地（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で増殖保存した。−Ｈｉｓ／−Ｔｒｐアミノ酸混合物とＨＩＳ３蛋白質の競合的阻害剤である３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３−ＡＴ）１５−３０ｍＭ（単一プラスミド形質転換体）又は７０ｍＭ（ライブラリークローンプール）を添加したＳＤ最小培地中の寒天プレート上で栄養レポーターＨＩＳ３の増殖選択を実施した。
【０３２１】
−Ｔｒｐアミノ酸混合物、Ｘ−ｇａｌ（８０ｍｇ／Ｌ）及び１×ＢＵ塩類（１０×＝Ｎａ２ＰＯ４・７Ｈ２Ｏ  ７０ｇ及びＮａＨ２ＰＯ４  ３０ｇ，ｐＨ７）を添加したＳＤ最小培地中の寒天プレート上でｉｎ  ｖｉｖｏ  β−ガラクトシダーゼアッセイを実施した。増殖選択的Ｘ−ｇａｌプレートにエストラジオール、タモキシフェン（Ｓｉｇｍａ）、テトラヒドロフルオレノン化合物又はＤＭＳＯを指定濃度で添加した。
【０３２２】
酵母細胞の形質転換
Ｌｉ  Ａｃ法とＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ酵母形質転換キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造業者のプロトコールに従って使用して酵母細胞を形質転換した。
【０３２３】
単一プラスミド小規模形質転換には、ＤＮＡ  ０．１μｇを使用して酵母コンピテント細胞０．１ｍｌを形質転換し、ＤＮＡ１μｇ当たり約１０５コロニー形成単位（ｃｆｕ）の形質転換効率を得た。
【０３２４】
突然変異誘発ＰＣＲ産物によるｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ／ＶＰ１６ＡＤの相同組換え用形質転換条件を設定するために、ＢｇｌＩＩによる制限消化により発現ベクターを線状化し、その半分をゲル精製前にＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理した。次に、突然変異ライブラリーを構築するようにデザインした縮重オリゴヌクレオチドに対応する野生型オリゴヌクレオチドを使用して得られた１６０ｂｐ  ＰＣＲフラグメント２００ｎｇ、３００ｎｇ又は４００ｎｇを使用して２種類の消化プラスミド各１００ｎｇを概説した通りに形質転換した。
【０３２５】
線状化平滑末端ベクター１００ｎｇをＰＣＲフラグメント３００ｎｇと同時形質転換した処、ＤＮＡ１μｇ当たり約１０５の効率を示し、レシピエントベクター単独によるバックグラウンドの１００倍であった。この条件をライブラリー規模の形質転換操作に使用し、突然変異誘発フラグメント集団６０μｇと線状化レシピエントベクター２０μｇを使用し、ＤＮＡ１μｇ当たり５×１０４ｃｆｕの推定効率で酵母細胞１ｍｌを形質転換した。
【０３２６】
ライブラリー構築及び選択
スプリット−プールストラテジーにより縮重オリゴヌクレオチド混合物を合成した。Ｌｅｕ３９１、Ｐｈｅ４０４、Ｍｅｔ４２１、Ｈｅ４２４又はＬｅｕ４２８に対応する各位置で従来合成されたカラム材料を独立プール１０個に分割し、１０種の可能なコドンを別々に合成し、プールを再び混合した。使用したコドンはＧＧＣ（Ｇｌｙ）、ＧＣＣ（Ａｌａ）、ＴＧＣ（Ｃｙｓ）、ＧＴＧ（Ｖａｌ）、ＡＴＣ（Ｉｌｅ）、ＣｒＧ（Ｌｅｕ）、ＡＴＧ（Ｍｅｔ）、ＴＴＣ（Ｐｈｅ）、ＴＡＣ（Ｔｙｒ）、ＴＧＧ（Ｔｒｐ）とした。
【０３２７】
やや多量のプールカラム材料（合計の１５％）を使用してｗｔコドンを合成し、その他の９種のコドンは各々９．４％とした。この「ｗｔスパイキング」によりライブラリークローンの大部分に相当する４又は５個の置換をもつクローンに対して置換数の少ない（１又は２）クローンの相対頻度を増加した。従って、単独又は二重突然変異体クローンがライブラリーの合成、構築又は選択中に失われる確率は有意に低下するはずである。均質「１０％ライブラリー」では単独置換クローンの可能な４５通りの組み合わせはライブラリー全体の僅か０．０４５％であったが、１５％ｗｔコドンを使用するとこの割合は０．２１５２％に増加し、即ちこれらのクローンはライブラリー中の頻度の約５倍になった。この結果、５個の置換をもつクローン（５９０４９通りの組み合わせ）の割合は約５９％から約４４％に低下した。
【０３２８】
２５０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５％  ＤＭＳＯ、Ｐｆｕ  １０×緩衝液６００μｌ及びＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）３００単位を含有する総反応容量６ｍｌに縮重オリゴヌクレオチドミックス各２．１ｎｍｏｌを加えることによりｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ｈＥＲα  ＬＢＤ／ＶＰ１６ＡＤ  ＤＮＡ鋳型６μｇのＰＣＲ増幅により分取量の突然変異ＬＢＤフラグメントを合成した。ＰＣＲ増幅は９５℃で１分、６５℃で１分、７２℃で２分を２５サイクルとした。
【０３２９】
突然変異誘発１６０ｂｐ産物混合物６０μｇをＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、概説したように線状化レシピエントベクター２０μｇと規模拡大同時形質転換実験に併用した。同時形質転換反応液３０ｍｌを２３ｃｍ×２３ｃｍ−Ｔｒｐ選択プレート２０枚に撒き、３０℃で３日間増殖後にコロニーを回収し、増幅ライブラリーの１ｍｌグリセロールストックを調製した。同時形質転換混合物の適切な希釈液を１００ｍｍプレートに撒き、相同組換え効率を制御すると共にライブラリー力価を測定した（５×１０４ｃｆｕ／μｇ  ＤＮＡ）。更にグリセロールストックの力価を測定した処、１．２×１０５ｃｆｕ／μｌであった。７０ｍＭ  ３−ＡＴと１μＭ（１回目の実験）又は１０μＭ（２回目の実験）ＣＭＰ１を加えた１００ｍｍ−Ｈｉｓ／−Ｔｒｐ選択プレート２０枚の各々に１×１０５ｃｆｕを撒いた（各実験合計２×１０６ｃｆｕを撒いた）。
【０３３０】
６日間３０℃で増殖後、プレート１枚当たりのＨｉｓ＋コロニーの平均数は１回目の実験で２００であり、２回目の実験で６０であった。夫々濃度１μＭ又は１０μＭのＤＭＳＯ又はＣＭＰ１を加えたＸ−ｇａｌ  １００ｍｍプレートに１回目のスクリーニングのコロニー２００個のうちの８０個と２回目のスクリーニングの全コロニーを各プレートから画線塗抹した（−Ｔｒｐマスタープレート上のレプリカも作製した）。３日間３０℃で増殖後、１０分の１の濃度でＤＭＳＯ又はＣＭＰ１を加えたＸ−ｇａｌプレートと−Ｔｒｐプレートに化合物の存在下で青変した全クローンと対照プレート上の白色クローンを対応するマスタープレートから画線塗抹した。化合物濃度が０．１μＭになるまでこの操作を繰り返し、夫々２８個と３１個の独立陽性クローンを更に分析するために採取した。
【０３３１】
酵母からのプラスミドレスキュー
該当突然変異体に対応するコロニーを−Ｔｒｐ  ＳＤ最小培地２ｍｌ中で３０℃にて１６時間飽和まで増殖させた。１．３ｍｌ培養フラクションからの細胞を遠心により集め、４０単位／μｌ  Ｌｙｔｉｃａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）溶液４００μｌを加えたプロトプラスト用緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１４．４ｍＭ  β−メルカプトエタノール）０．２ｍｌ中でボルテックスすることにより再懸濁した。２時間３７℃でインキュベーションにより細胞壁を溶かした後、溶解用溶液（０．２Ｍ  ＮａＯＨ，１％  ＳＤＳ）２００μｌを加え、サンプルを６５℃で２０分間インキュベーションした後、すぐに氷上に移した。
【０３３２】
サンプルを３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．４）２００μｌと混合した後、１５分間氷上でインキュベーションし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロ遠心管で３分間１３，０００ｒｐｍにて回転した。イソプロパノール０．６容量で沈殿させることによりプラスミドＤＮＡを上清から回収した。レスキューしたプラスミドをどちらもエレクトロコンピテント大腸菌ＤＨ１２Ｓ細胞に形質転換し、夫々突然変異誘発インサートの１００ｂｐ上流と下流にアニールするオリゴヌクレオチドプライマー（５’−ＣＴＧＡＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号５９）；５’−ＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＧＡＴＡＴＧＧＴＣＣ−３’（配列番号６０））を使用して３６０ｂｐフラグメントのＰＣＲ増幅により直接配列決定した。増幅したフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムで精製し、突然変異誘発インサート境界から７０ｂｐにアニールした２種のシーケンシングプライマー（５’−ＧＴＴＣＡＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＴＧＧＧＣＧ−３’（配列番号６１）；５’−ＧＡＧＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣ−３’（配列番号６２）の一方を使用して自動配列決定した。
【０３３３】
酵母蛋白質抽出物とウェスタンブロット分析
尿素／ＳＤＳ法を実施し、抗ＶＰ１６  ＡＤポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を使用するウェスタンブロット分析により突然変異体蛋白質発現を評価するのに適した酵母蛋白質抽出物を調製した。
【０３３４】
定量的β−ガラクトシダーゼアッセイ
このアッセイはＣｌｏｎｔｅｃｈ酵母プロトコールハンドブックに従って実施した。単一コロニーを−Ｔｒｐ  ＳＤ最小培地中で１６時間３０℃にて飽和まで増殖させ、細胞を遠心により集めた後、６００ｎＭで最適密度０．０４までＹＰＤ培地で希釈した。５ｍｌ容量の継代培養液を準備し、中期対数期（ＯＤ６００＝０．４−０．５）に達するまでＤＭＳＯ又は各種リガンド濃度の存在下に７時間３０℃で増殖させた。
【０３３５】
培養液１．５ｍｌ（各サンプル２本）からの細胞をペレット化し、ｌａｃＺ緩衝液（１０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４，及び１００ｍＭリン酸  ｐＨ７）で洗浄し、ｌａｃＺ緩衝液３００μｌに再懸濁した。懸濁液２５−１００μｌを凍結／融解サイクル３回により溶解させ、５０ｍＭ  β−メルカプトエタノールを加えたｌａｃＺ緩衝液０．７ｍｌと混合し、４ｍｇ／ｍｌ  ＯＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ）溶液１６０μｌをｌａｃＺ緩衝液に加えることにより酵素反応を開始した。
【０３３６】
反応は黄色に発色するまで３０℃で実施し、１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３  ０．４ｍｌを加えることにより停止し、遠心し、４２０ｎｍの光学密度を読み取ることによる定量した。（１０００×ＯＤ４２０）を［アッセイ時間（分）×（０．１ｍｌ×濃縮係数）×ＯＤ６００］で割った値としてβ−ガラクトシダーゼ単位を定義した。Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈソフトウェアにより非直線回帰分析を使用して用量応答データを解析した。
【０３３７】
細胞培養、トランスフェクション及びＳＥＡＰアッセイ
全細胞培養実験は１０％デキストラン活性炭（Ｓｉｇｍａ）で処理したウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加したフェノールレッド不含ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で実施した。トランスフェクションの２４時間前にＨｅＬａ細胞を２００，０００個／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種した。トランスフェクションはＦｕＧＥＮＥ  ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の指示に従って使用して実施した。
【０３３８】
レポータープラスミド５ＧＡＬ４ＵＡＳ−ｐＳＥＡＰ  １μｇ、内部対照としてｐＣＭＶ−Ｌｕｃ  ０．１μｇ、可変量のｐＧＢＴ９−ＧＡＬ４ＤＢＤ／ＥＲ  ＬＢＤ／ＶＰ１６ＡＤ発現ベクター及び可変量のキャリヤーｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ  ＤＮＡを細胞にトランスフェクトし、全サンプルを合計プラスミドＤＮＡ２μｇに正規化した。ＤＮＡを無血清培地１００μｌで希釈したＦｕＧＥＮＥ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ６μｌと混合し、細胞に加えた。７時間後に細胞に新鮮な培地を補充し、トランスフェクションから２４時間後に各種リガンド（又はＤＭＳＯビークル）を新鮮培地中指定濃度で加えた。
【０３３９】
その後、インデューサーの存在下で細胞を２４時間増殖させ、ルシフェラーゼアッセイ用に蛋白質を抽出し、一方で上清を集め、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）検出用に処理した。市販アッセイ（Ｔｒｏｐｉｘ  Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステム）を製造業者のガイドラインに従って使用することによりＳＥＡＰ活性を評価した。
【０３４０】
マイクロプレートで反応を実施し、マイクロプレートシンチレーションルミネッセンスカウンター（Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ，Ｐａｃｋａｒｄ）を使用してＳＥＡＰ活性を発光として測定した。未トランスフェクト細胞培地中の内因性アルカリホスファターゼを測定することにより得られたバックグラウンド値を値から差し引いた。ＳＥＡＰ値をルシフェラーゼ活性に基づいて決定したトランスフェクション効率の差について正規化した。その後、精製ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）で得られた標準活性曲線との比較によりＳＥＡＰ濃度値（ｎｇ／ｍｌ）に変換した。
【０３４１】
ｍ４５．２キメラ転写活性に対する化合物の効果を評価するために、トランスフェクションの１８時間前にＨｅＬａ細胞を６ウェルプレートに播種（３×１０５細胞／ウェル）した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）を製造業者の指示に従って使用することによりプラスミドＤＮＡ  １μｇ／ウェル（トランスアクチベーター０．５μｇ＋レポーター０．５μｇ）をトランスフェクトした。トランスフェクション効率用内部対照としてルシフェラーゼレポータープラスミド１００ｎｇをトランスフェクション混合物に加えた。トランスフェクションから６時間後に培地を交換し、細胞を各種リガンドで処理するか又は処理しなかった。更に２４時間後に培地を回収し、上述したようにヒトＳＥＡＰの発現を分析した。細胞抽出液で測定したルシフェラーゼ活性に対してＳＥＡＰレベルを正規化した。上記に概説したように用量応答データを分析した。
【０３４２】
（実施例１）
９ａ−ベンジル−７−ヒドロキシ−４−メチル−１．２，９，９ａ−テトラヒドロ−３ｈ−フルオレン−３−オン（ＣＭＰ４）の合成
【０３４３】
【化１２】
2007535906.tif 000015
【０３４４】
ステップ１：５−メトキシ−２−ベンジリデン−１−インダノン
５−メトキシインダノン（１ｇ，５．８９ｍｍｏｌ）とベンズアルデヒド（０．７９ｇ，７．４ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（６ｍＬ）懸濁液に室温で撹拌下にＫＯＨ（０．６ｇ）を加えた。２０時間後に形成された沈殿を濾別し、ＥｔＯＨで洗浄し、高減圧下に乾燥すると、標記化合物（１．４１ｇ）が得られた。
【０３４５】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）δ  ３．９０（ｓ，３Ｈ），４．１０（ｓ，２Ｈ），７．０４（ｍ，１Ｈ），７．１２（ｍ，１Ｈ），７．４２−７．５８（ｍ，４Ｈ），７．７２−７．８３（ｍ，２Ｈ）。
【０３４６】
ステップ２：５−メトキシ−２−ベンジル−１−インダノン
ステップ１からの生成物（７７７ｍｇ）と活性炭担持パラジウム（１０％，７８ｍｇ）のＥｔＯＡｃ懸濁液を水素雰囲気（０．４ｂａｒ）下に４０℃で撹拌した。３時間後に触媒を濾別し、溶液を減圧濃縮乾涸した。粗生成物のシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー後に標記化合物５５４ｍｇが白色固体として得られた。
【０３４７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）δ  ２．６０−２．７８（ｍ，２Ｈ），２．９３−３．１８（ｍ，３Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），６．９２−６．９８（ｍ，１Ｈ），７．０２（ｍ，１Ｈ），７．１５−７．３０（ｍ，５Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ）。
【０３４８】
ステップ３：７−メトキシ−９ａ−ベンジル−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン
５−メトキシ−２−ベンジル−１−インダノン（０．７ｇ，２．７８ｍｍｏｌ）とエチルビニルケトン（２９３ｍｇ）の無水メタノール（５．５ｍＬ）溶液にＮａＯＭｅのＭｅＯＨ中０．５Ｍ溶液０．９７ｍＬを加えた。混合物を６０℃まで１時間加熱撹拌した。減圧濃縮乾涸後に残渣をＨＯＡｃ／６Ｎ  ＨＣｌの１：１混合物（３０ｍＬ）で８０℃にて３時間処理した。室温まで冷却後、混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮乾涸すると、黄色い油状物が得られ、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル，溶離液ＣＨ２Ｃｌ２／２％  ＥｔＯＡｃ）にかけた。生成物フラクションを集めて減圧濃縮乾涸し、残渣にＥｔ２Ｏ／石油エーテルを加えて粉砕すると、標記化合物３３９ｍｇが白色固体として得られた。
【０３４９】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  １．９０−２．０２（ｍ，１Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ），２．１６−２．２５（ｍ，１Ｈ），２．５０−２．６２（ｍ，３Ｈ），２．７７−２．９３（ｍ，２Ｈ），３．０８（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），６．８３−６．９０（ｍ，２Ｈ），７．０５−７．１２（ｍ，２Ｈ），７．１９−７．３０（ｍ，３Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）。
【０３５０】
ステップ４：７−ヒドロキシ−９ａ−ベンジル−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン
７−メトキシ−９ａ−ベンジル−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン（２７９ｍｇ，０．８７７ｍｍｏｌ）のＣＨ２ＣＬ２（１０ｍＬ）溶液に−７８℃でＣＨ２Ｃｌ２中１Ｍ  ＢＢｒ３（２．６ｍＬ，２．６ｍｍｏｌ）を加えた。冷却浴を除去し、溶液を室温で２時間撹拌した。溶液をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、１Ｎ  ＨＣｌ（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧濃縮した。粗生成物のシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー後に標記化合物１９０ｍｇが淡黄色固体として得られた。
【０３５１】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ  １．８５−２．０７（ｍ，５Ｈ），２．８０−２．９０（ｍ，１Ｈ），２．４５（ｍ，２Ｈ，一部はＤＭＳＯシグナルと重なる），２．７５−３．００（ｍ，３Ｈ），６．７０−６．８０（ｍ，２Ｈ），７．０５−７．１２（ｍ，２Ｈ），７．１５−７．２８（ｍ，３Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）。
【０３５２】
（実施例２）
９ａ−（４−クロロベンジル）−７−ヒドロキシ−４−｛４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル｝−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３ｈ−フルオレン−３−オン（ＣＭＰ８）の合成
【０３５３】
【化１３】
2007535906.tif 000016
【０３５４】
ステップ１：２−（４−クロロベンジリデン）−５−メトキシ−１−インダノン
５−メトキシインダノン（１．５３ｇ，９．０１ｍｍｏｌ）と４−クロロベンズアルデヒド（２ｇ，１４．２ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（４０ｍＬ）懸濁液に室温で撹拌下にナトリウムメタノラートのメタノール（５．６ｍＬ）中０．５Ｍ溶液を加えた。３時間後に形成された沈殿を濾別し、ＥｔＯＨで洗浄し、高減圧下に乾燥すると、標記化合物２．３７ｇが薄茶色固体として得られた。
【０３５５】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）δ  ３．８８（ｓ，３Ｈ），４．０７（ｓ，２Ｈ），７．０３（ｍ，１Ｈ），７．１７（ｍ，１Ｈ），７．４４（ｍ，１Ｈ），７．５５（ｍ，２Ｈ），７．７０−７．８２（ｍ，３Ｈ）。
【０３５６】
ステップ２：２−（４−クロロベンジル）−５−メトキシ−１−インダノン
セレン（１８０ｍｇ，２．３ｍｍｏｌ）の無水エタノール（５ｍＬ）懸濁液にホウ水素化ナトリウム（９６ｍｇ，２．６ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。懸濁液を２０分間０℃で撹拌し、形成された透明溶液を窒素雰囲気下で２−（４−クロロベンジリデン）−５−メトキシ−１−インダノン（４５１ｍｇ，１．５７ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン懸濁液に加えた。混合物を５０℃まで２時間加熱撹拌した。室温まで冷却後、混合物を１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（１５０ｍＬ）とＥｔＯＡｃに分配した。有機相を濾過し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、再び濾過した。減圧濃縮乾涸後、標記化合物４２８ｍｇが茶色い油状物として得られた。
【０３５７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  ２．６５−２．８０（ｍ，２Ｈ），２．９１−３．００（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｍ，１Ｈ），３．３２（ｍ，１Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），６．７３（ｓ，１Ｈ），７．９１（ｍ，１Ｈ），７．１３−７．３０（ｍ，４Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）。ＭＳ：ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ＋）：２８７．０。
【０３５８】
ステップ３：９ａ−（４−クロロベンジル）−７−メトキシ−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン
２−（４−クロロベンジル）−５−メトキシ−１−インダノン（８．２７ｍｍｏｌ）の５０ｍＬ無水テトラヒドロフラン溶液に窒素雰囲気下でメチルビニルケトン（１．３４５ｇ，１９．２ｍｍｏｌ）とＤＢＵ（０．２８５ｍＬ，１．９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５５℃で２０時間撹拌した。室温まで冷却後、混合物を１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４とＥｔＯＡｃに分配した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過した。減圧濃縮乾涸後、粗油状物２．６６ｇが得られ、無水テトラヒドロフラン４ｍＬに再溶解した。ピロリジン（０．６２ｍＬ，７．４ｍｍｏｌ）と酢酸（０．４３ｍＬ，７．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を５５℃まで４時間加熱撹拌した。室温まで冷却後、混合物を１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４とＥｔＯＡｃに分配した。有機相を１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過した。減圧濃縮乾涸後、粗標記化合物２．１１ｇが油状物として得られ、それ以上精製せずに次段階で使用した。
【０３５９】
ＭＳ：ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ＋）：３３９．０。
【０３６０】
ステップ４：４−ブロモ−９ａ−（４−クロロベンジル）−７−メトキシ−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン
粗９ａ−（４−クロロベンジル）−７−メトキシ−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン（２．１１ｇ，約６．２ｍｍｏｌ）のＣＣｌ４（１２ｍＬ）溶液を固体ＮａＨＣＯ３（２．６ｇ，３１ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を氷浴で冷却し、臭素（０．３２２ｍＬ，６．３ｍｍｏｌ）を加えながら６分間迅速に撹拌した。０℃で１．５時間撹拌後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）と水（３００ｍＬ）に分配した。水相をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮乾涸した。粗生成物のシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：石油エーテル／ＥｔＯＡｃ，５：１）後、標記化合物６８３ｍｇが淡黄色固体として得られた。
【０３６１】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  ２．０５−２．２５（ｍ，２Ｈ），２．６３−３．１０（ｍ，６Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），６．７８（ｓ，ｌＨ），６．８５−７．２２（ｍ，５Ｈ），８．４５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）。
【０３６２】
ＭＳ：ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ＋）：４１６．６／４１９．０。
【０３６３】
ステップ５：９ａ−（４−クロロベンジル）−７−メトキシ−４−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン
無水トルエン（１２ｍＬ）中の４−ブロモ−９ａ−（４−クロロベンジル）−７−メトキシ−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン（６８３ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（９００ｍｇ，０．７７７ｍｍｏｌ）、及びトリブチル−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−スタナン（８６１ｍｇ，２．０２ｍｍｏｌ）の混合物を窒素雰囲気下に置き、１００℃の油浴中で加熱撹拌した。４日後に混合物を室温まで冷却し、減圧蒸発させると、暗色油状物（２．２０８ｇ）が得られた。４：１石油エーテル−ＥｔＯＡｃを溶離液としてこの材料をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、９ａ−（４−クロロベンジル）−７−メトキシ−４−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン（１４０ｍｇ）が黄色い油状物として得られた。
【０３６４】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  ２．１２−２．３１（ｍ，２Ｈ），２．６３−２．８０（ｍ，３Ｈ），２．８２−２．９６（ｍ，１Ｈ），２．９８−３．１０（ｍ，２Ｈ），３．５５（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），５．２５（ｍ，２Ｈ），６．４０（ｍ，１Ｈ），６．４９（ｍ，１Ｈ），６．７３（ｓ，１Ｈ），７．０２−７．７０（ｍ，８Ｈ）。
【０３６５】
ステップ６：９ａ−（４−クロロベンジル）−４−（４−ヒドロキシフェニル）−７−メトキシ−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン
９ａ−（４−クロロベンジル）−７−メトキシ−４−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン（１４０ｍｇ，０．２９５ｍｍｏｌ）のメタノール（１２ｍＬ）溶液を６０℃の油浴中で加温し、２Ｎ  ＨＣｌ水溶液（２．５ｍＬ）で処理した。得られた混合物を６０℃に２時間加熱撹拌した後、室温まで冷却し、減圧濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃと１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４に分配した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮すると標記化合物１２０ｍｇが黄色い油状物として得られた。
【０３６６】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  ２．１２−２．２３（ｍ，１Ｈ），２．２４−２．３３（ｍ，１Ｈ），２．６２−２．８０（ｍ，３Ｈ），２．８３−３．０８（ｍ，３Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），６．４０−６．５１（ｍ，２Ｈ），６．７２（ｓ，１Ｈ），６．８０−７．００（ｍ，４Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．２３（ｄ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）。
【０３６７】
ステップ７：９ａ−（４−クロロベンジル）−４−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−７−メトキシ−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン
９ａ−（４−クロロベンジル）−４−（４−ヒドロキシフェニル）−７−メトキシ−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン（１２０ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（２２０ｍｇ，３当量）及びピペリジンエタノール（１１２μＬ，３当量）の０℃無水テトラヒドロフラン（１．６ｍＬ）溶液にアゾジカルボン酸ジイソプロピルの０℃無水テトラヒドロフラン（１７５μＬ，６００μＬ中３当量）溶液を滴下した。溶液を０℃で１時間と室温で６時間撹拌した。２：１  ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨを溶離液として生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。溶媒の減圧除去後、標記化合物９６ｍｇが黄色い油状物として得られた。
【０３６８】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ  １．３０−１．５５（ｍ，６Ｈ），２．１４（ｍ，２Ｈ），２．４５（ｍ，４Ｈ，一部は溶媒シグナルと重なる），２．６７（ｍ，４Ｈ），２．７３（ｍ，１Ｈ），２．８６（ｍ，１Ｈ），３．０２（ｍ，２Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），４．１０（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），６．２１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．５０（ｍ，１Ｈ），６．８２（ｓ，１Ｈ），６．９５（ｓ，ｂｒ，４Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）。
【０３６９】
ステップ８：９ａ−（４−クロロベンジル）−４−｛４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル｝−７−ヒドロキシ−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン
９ａ−（４−クロロベンジル）−７−メトキシ−４−｛４−［２−（１−ピペリジニル）−エトキシ］フェニル｝−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン（９６ｍｇ，０．１７７ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）溶液を窒素雰囲気下に置き、０℃まで冷却した。ＡｌＣｌ３（２１５ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）の２−プロパンチオール（２ｍＬ）溶液をシリンジにより加えた。得られた混合物を３時間室温で撹拌した。溶媒を窒素流により除去し、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）を残渣に加えた。得られた混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液とＥｔＯＡｃに分配した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧蒸発させると、９ａ−（４−クロロベンジル）−７−ヒドロキシ−４−｛４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル｝−−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オンが黄色い固体として得られた。
【０３７０】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ  １．３３−１．４２（ｍ，２Ｈ），１．４５−１．５５（ｍ，６Ｈ），２．１２（ｍ，２Ｈ），２．４５（ｍ，４Ｈ，一部は溶媒シグナルと重なる），２．６０−２．７０（ｍ，４Ｈ），２．７３（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｍ，１Ｈ），２．９７（ｄ，Ｊ＝１５Ｈｚ，２Ｈ），４．１０（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），６．１２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３０（ｍ，１Ｈ），６．６１（ｓ，１Ｈ），６．９５（ｓ，ｂｒ，４Ｈ），７．１４（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）。
【０３７１】
ＭＳ：ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ＋）：５２８．２。
【０３７２】
（実施例３）
（３ｅ）−９ａ−ベンジル−７−ヒドロキシ−４−メチル−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３ｈ−フルオレン−３−オンメトキシムの合成
【０３７３】
【化１４】
2007535906.tif 000017
【０３７４】
ＥｔＯＨと無水ピリジンの１：１混合物（０．５ｍＬ）中の９ａ−ベンジル−７−ヒドロキシ−４−メチル−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン（５０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ，実施例１に記載したように製造）とＯ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（２７ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１６時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、１Ｎ  ＨＣｌとブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧蒸発させた。標記化合物が無色固体として得られた（２５ｍｇ）。
【０３７５】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ  １．４２−１．５６（ｍ，１Ｈ），１．９２（ｍ，ｌＨ），２．０９（ｓ，３Ｈ），２．３４（ｍ，２Ｈ），２．５３−２．７０（ｍ，２Ｈ），２．７８−２．９０（ｍ，２Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），６．６６（ｍ，２Ｈ），７．０４（ｍ，２Ｈ），７．１４−７．２６（ｍ，３Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ）。
【０３７６】
（実施例４）
６−メチル−９ａ−（４−フルオロベンジル）−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロインデノ［２，１−Ｅ］インダゾール−７（３ｈ）−オンの合成
【０３７７】
【化１５】
2007535906.tif 000018
【０３７８】
ステップ１：５−（アセチルアミノ）−４−ブロモ−１−インダノン
Ｎ−（１−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）アセトアミド（１．５０ｇ，７．９３ｍｍｏｌ）とＮ−ブロモスクシンイミド（１．４７ｇ，８．２６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（８ｍＬ）懸濁液を６０℃まで７時間加熱撹拌した。室温まで冷却後、形成された沈殿を濾別し、減圧乾燥すると、標記化合物が得られた（１．２８ｇ）。
【０３７９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ  ２．１６（ｓ，３Ｈ），２．６８（ｍ，２Ｈ），３．０１（ｍ，２Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），９．６２（ｓ，１Ｈ）。
【０３８０】
ステップ２：５−（アセチルアミノ）−４−メチル−１−インダノン
５−（アセチルアミノ）−４−ブロモ−１−インダノン（８．３４ｇ，３１．１ｍｍｏｌ）、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（１．０９ｇ，１．３８ｍｍｏｌ）、テトラメチル錫（４．３ｍＬ，１当量）、トリフェニルホスフィン（０．８２ｇ，１当量）及び塩化リチウム（２．６３ｇ，２当量）の無水ジメチルホルムアミド（８３ｍＬ）懸濁液を窒素雰囲気下で６時間１００℃まで加熱撹拌した。室温まで冷却後、混合物をセライトで濾過し、減圧濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２−５％  ＭｅＯＨに溶かし、溶液をブラインで洗浄した。減圧濃縮後、残渣にジエチルエーテルを加えて粉砕し、高減圧下で放置すると、標記化合物４．６ｇが得られた。
【０３８１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ  ２．１１（ｓ，３Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），２．６２（ｍ，２Ｈ），３．００（ｍ，２Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），９．５３（ｓ，１Ｈ）。
【０３８２】
ステップ３：５−（アセチルアミノ）−２−（４−フルオロベンジリデン）−４−メチル−１−インダノン
５−（アセチルアミノ）−４−メチル−１−インダノン（０．５ｇ，２．４６ｍｍｏｌ）と４−フルオロベンズアルデヒド（１．２当量）の無水ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）溶液に０．５Ｍ  ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ  １．５ｍＬを撹拌下に滴下した。混合物を１６時間室温で撹拌し、形成された沈殿を濾別し、ＥｔＯＨで洗浄した。減圧乾燥後、標記化合物６０６ｍｇが得られた。
【０３８３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ  ２．１２（ｓ，３Ｈ），２．３０（ｓ，３Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），７．３３（ｍ，２Ｈ），７．５０（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｍ，２Ｈ），９．５８（ｓ，１Ｈ）。
【０３８４】
ステップ４：５−（アセチルアミノ）−２−（４−フルオロベンジル）−４−メチル−１−インダノン
ステップ３からの生成物（６５１ｍｇ，２．１ｍｏｌ）と活性炭担持パラジウム（１０％，１５０ｍｇ）のＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）懸濁液を水素雰囲気下に４０℃で撹拌した。１．５時間後に触媒を濾別し、溶液を減圧濃縮乾涸すると、標記化合物（４３８ｍｇ）が得られた。
【０３８５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）：δ  ２．０９（ｓ，３Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），２．６０−２．７５（ｍ，２Ｈ），２．９５−３．２１（ｍ，３Ｈ），７．１１（ｍ，２Ｈ），７．３１（ｍ，２Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），９．５２（ｓ，１Ｈ）。
【０３８６】
ステップ５：７−アミノ−９ａ−（４−フルオロベンジル）−４，８−ジメチル−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン
５−（アセチルアミノ）−２−（４−フルオロベンジル）−４−メチル−１−インダノン（４３８ｍｇ，１．４１ｍｍｏｌ）とエチルビニルケトン（１．２５当量）の無水メタノール（２．８ｍＬ）懸濁液に撹拌下にナトリウムメトキシド（０．５Ｍ）のメタノール（０．５ｍＬ）溶液を滴下した。混合物を６０℃まで３時間加熱撹拌した。室温まで冷却後、混合物を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで希釈し、水とブラインで洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。油状物が得られ、ＨＯＡｃ  １０ｍＬと６Ｎ  ＨＣｌ  １０ｍＬの混合物に溶かした。混合物を８０℃まで３時間加熱撹拌した。室温まで冷却後、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で中和し、酢酸エチルで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮すると、標記化合物が黄色いフォームとして得られた（１９８ｍｇ）。
【０３８７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ  １．９４−２．０３（ｍ，１Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），２．１４−２．２３（ｍ，１Ｈ），２．４３（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ），２．５０−２．６９（ｍ，２Ｈ），２．７２−２．８３（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｄ，Ｊ＝１３．８Ｈｚ，１Ｈ），３．０２（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９４（ｓ，ｂｒ，２Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８６−７．０４（ｍ，４Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）。
【０３８８】
ステップ６：６−メチル−９ａ−（４−フルオロベンジル）−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロインデノ［２，１−ｅ］インダゾール−７（３Ｈ）−オン
７−アミノ−９ａ−（４−フルオロベンジル）−４，８−ジメチル−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン（１９６ｍｇ，０．５９ｍｍｏｌ）の−３５℃  ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）溶液にテトラフルオロ硼酸ニトロソニウム（６９ｍｇ，０．５９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１時間撹拌すると、この間に温度は４℃になった。混合物を再び−３５℃まで冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）で希釈し、酢酸カリウム（１２２ｍｇ，１．２４ｍｍｏｌ）とジベンゾ−１８−クラウン−６（８ｍｇ，２２μｍｏｌ）を加えた。冷却浴を除去し、混合物を１時間室温で撹拌した。次に混合物をＣＨ２Ｃｌ２と水に分配した。有機相を水とブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  ９：１，ｖ／ｖ）により精製した。標記化合物がオレンジ色固体として得られた（７８ｍｇ）。
【０３８９】
ＭＳ：ｍ／ｚ  ３４７．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３９０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）：δ  ２．０７（ｓ，３Ｈ），２．１−２．２（ｍ，２Ｈ），２．３３−２．４５（ｍ，１Ｈ），２．６３（ｄ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ，１Ｈ），２．７２−２．９５（ｍ，３Ｈ），３．３２（ｄ，１Ｈ，一部は水シグナルと重なる），６．８３−７．１２（ｍ，４Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），８．１５（ｓ，１Ｈ），１３．２７（ｓ，１Ｈ）。
【０３９１】
（実施例５）
９ａ−ベンジル−６−｛４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル｝−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロインデノ［２，１−Ｅ］インダゾール−７（３ｈ）−オンヒドロトリフルオロ酢酸塩（ＣＭＰ９）
【０３９２】
【化１６】
2007535906.tif 000019
2007535906.tif 000020
【０３９３】
ステップ１：５−（アセチルアミノ）−２−ベンジリデン−４−メチル−１−インダノン
実施例５に記載したように製造した５−（アセチルアミノ）−４−メチル−１−インダノン（２．０ｇ，９．８４ｍｍｏｌ）とベンズアルデヒド（１１．９ｍｍｏｌ）の無水ＥｔＯＨ（４０ｍＬ）懸濁液に撹拌下に０．５Ｍ  ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ６．０ｍＬを滴下した。混合物を６時間室温で撹拌し、形成された沈殿を濾別し、ＥｔＯＨで洗浄した。減圧乾燥後に標記化合物２．１１ｇが黄色い固体として得られた。
【０３９４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ  ２．１４（ｓ，３Ｈ），２．３０（ｓ，３Ｈ），４．３２（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｍ，４Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ｌＨ），７．６８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７３（ｍ，２Ｈ），９．５８（ｓ，１Ｈ）。
【０３９５】
ステップ２：５−（アセチルアミノ）−２−ベンジル−４−メチル−１−インダノン
ＥｔＯＡｃ  ４０ｍＬとＭｅＯＨ  ４０ｍＬの混合物中のステップ３からの生成物（２．１１ｇ，７．２５ｍｏｌ）と活性炭担持パラジウム（１０％，２００ｍｇ）の懸濁液を水素雰囲気下に４０℃で撹拌した。１．５時間後に触媒を濾別し、溶液を減圧濃縮乾涸した。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  ９：１，ｖ／ｖ）後に標記化合物が白色固体として得られた（１．６４ｇ）。
【０３９６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ  ２．１０（ｓ，３Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），２．６０−２．７５（ｍ，２Ｈ），２．９７−３．１２（ｍ，２Ｈ），３．１３−３．２２（ｍ，１Ｈ），７．１５−７．３２（ｍ，５Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），９．５２（ｓ，１Ｈ）。
【０３９７】
ステップ３：７−（アセチルアミノ）−９ａ−ベンジル−８−メチル−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン
５−（アセチルアミノ）−２−ベンジル−４−メチル−１−インダノン（１．６４ｇ，５．６０ｍｍｏｌ）とメチルビニルケトン（７．０６ｍｍｏｌ）の無水メタノール（１４ｍＬ）溶液に撹拌下にナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．５Ｍ，２．３ｍＬ）を滴下した。混合物を室温で１９時間撹拌した。次に減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルとブラインに分配した。水相を酢酸エチルで抽出し、有機相を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。油状物が得られ、ＴＨＦ  ５１ｍＬ、トルエン４．４ｍＬ、ピロリジン０．５ｍＬ及びＨＯＡｃ  ０．２７ｍＬの混合物に溶かした。混合物を１００℃まで７５分間加熱撹拌した。室温まで冷却後、混合物を減圧濃縮した。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  ８：２，ｖ／ｖ）後、標記化合物１．１８ｇが得られた。
【０３９８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ  １．９２−２．０３（ｍ，１Ｈ），２．０５−２．１３（ｍ，６Ｈ），２．１３−２．１９（ｍ，１Ｈ），２．３８−２．６３（ｍ，３Ｈ，一部は溶媒シグナルと重なる），２．７３−２．８６（ｍ，１Ｈ），２．９３（ｄ，Ｊ＝１３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．１０（ｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ，１Ｈ），６．２８（ｓ，１Ｈ），７．１０−７．２６（ｍ，ＳＨ），７．３７−７．５３（ｍ．２Ｈ），９．３９（ｓ，１Ｈ）。
【０３９９】
ステップ４：７−（アセチルアミノ）−４−ブロモ−９ａ−ベンジル−８−メチル−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン
７−アミノ−９ａ−ベンジル−８−メチル−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン（４２１ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）とＮａＨＣＯ３（５００ｍｇ）の０℃  ＣＨ２Ｃｌ２（１１ｍＬ）懸濁液に撹拌下に臭素（１当量）溶液を滴下した。混合物を更に１５分間０℃で撹拌した後、水（４０ｍＬ）で希釈した。有機相を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮すると、標記化合物が得られた（５９５ｍｇ）。
【０４００】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ  ２．０２−２．２０（ｍ，８Ｈ），２．５５−２．６７（ｍ，３Ｈ），２．９３−３．１３（ｍ，３Ｈ），７．０３−７．２２（ｍ，５Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），８．１８（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），９．４２（ｓ，１Ｈ）。
【０４０１】
ステップ５：７−アミノ−４−ブロモ−９ａ−ベンジル−８−メチル−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン
７−（アセチルアミノ）−４−ブロモ−９ａ−ベンジル−８−メチル−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン（１．５６ｇ，３．４１ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（２２ｍＬ）溶液とナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．５Ｍ，２１ｍＬ）を窒素下に８０℃まで６．５時間加熱撹拌した。
【０４０２】
室温まで冷却後、混合物を酢酸エチルとブラインに分配した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮すると、標記化合物が黄色いフォームとして得られた（９８３ｍｇ）。
【０４０３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ  １．９５−２．１０（ｍ，５Ｈ），２．４０−２．６０（ｍ，３Ｈ，一部は溶媒シグナルと重なる），２．９２−３．０９（ｍ，３Ｈ），５．８９（ｓ，ｂｒ，２Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０３−７．２６（ｍ，５Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）。
【０４０４】
ステップ６：６−ブロモ−９ａ−ベンジル−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロインデノ［２，１−ｅ］インダゾール−７（３Ｈ）−オン
７−アミノ−４−ブロモ−９ａ−ベンジル−８−メチル−１，２，９，９ａ−テトラヒドロ−３Ｈ−フルオレン−３−オン（９８３ｍｇ，２．５７ｍｍｏｌ）の−３５℃  ＣＨ２Ｃｌ２（１４ｍＬ）溶液にテトラフルオロ硼酸ニトロソニウム（３０４ｍｇ，２．６０ｍｍｏｌ）を加えた。７０分間撹拌を続けると、この間に温度は０℃に達した。溶液を再び−３５℃まで冷却し、ＫＯＡｃ（５０９ｍｇ，５．２ｍｍｏｌ）とジベンゾ−１８−クラウン−６（４８ｍｇ）を加えた。冷却浴を除去し、室温で２時間撹拌を続けた。溶液をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、水とブラインで洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  ９：１，ｖ／ｖ）後に、標記化合物３５３ｍｇが赤茶色固体として得られた。
【０４０５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）：δ  ２．１−２．３（ｍ，２Ｈ），２．６７−２．７８（ｍ，２Ｈ），２．９０−３．２０（ｍ，３Ｈ），３．４５（ｄ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９０−７．１５（ｍ，５Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ），８．３９（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），１３．４０（ｓ，１Ｈ）。
【０４０６】
ステップ７：６−ブロモ−９ａ−ベンジル−３−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロインデノ−［２，１−ｅ］インダゾール−７（３Ｈ）−オン
６−ブロモ−９ａ−ベンジル−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロインデノ［２，１−ｅ］インダゾール−７（３Ｈ）−オン（３５３ｍｇ，０．９０ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）−ピリジン（１６５ｍｇ，１．３５ｍｍｏｌ）及び塩化ｐ−トルエンスルホニル（２０７ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）溶液を窒素下に０℃で１時間と室温で２時間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２で希釈後、溶液を水、リン酸緩衝液（１Ｍ，ｐＨ３）、５％ＮａＨＣＯ３水溶液及びブラインで順次洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：石油エーテル／ＥｔＯＡｃ  ７：３，ｖ／ｖ）後に標記化合物１５６ｍｇが得られた。（２−［（４−メチルフェニル）スルホニル］異性体（２００ｍｇ）は標記化合物よりも先に溶出した）。
【０４０７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ２．１４−２．２５（ｍ，１Ｈ），２．３０−２．４８（ｍ，１Ｈ），２．４１（ｓ，３Ｈ），２．７４−３．１０（ｍ，ＳＨ），３．４０（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），６．９０−７．１３（ｍ，５Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１５（ｓ，１Ｈ），８．１８（ｄ，Ｊ＝９．１，１Ｈ），８．７２（ｄ，Ｊ＝９．１，１Ｈ）。
【０４０８】
ステップ８：９ａ−ベンジル−６−［４−（メトキシメトキシ）フェニル］−３−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロインデノ−［２，１−ｅ］インダゾール−７（３Ｈ）−オン
６−ブロモ−９ａ−ベンジル−３−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロインデノ−［２，１−ｅ］インダゾール−７（３Ｈ）−オン（１５６ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１８ｍｇ，１５．５μｍｏｌ）、及びトリブチル−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−スタナン（１６０ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）の無水トルエン（２．５ｍＬ）溶液を窒素パージし、窒素下に１００℃まで２４時間加熱撹拌した。混合物を室温まで冷却し、減圧濃縮した。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：石油エーテル／ＥｔＯＡｃ  １：１，ｖ／ｖ）後に標記化合物１３７ｍｇが得られた。
【０４０９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ２．２０−２．３１（ｍ，１Ｈ），２．３５−２．４５（ｍ，４Ｈ），２．６９−２．７７（ｍ，１Ｈ），２．８０−２．８８（ｍ，２Ｈ），２．９１−３．０８（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｄ，１＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．６０（ｓ，３Ｈ），５．２９（ｍ，２Ｈ），６．６１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．９０−７．３０（ｍ，１１Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），８．１２（ｓ，１Ｈ）。
【０４１０】
ステップ９：９ａ−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロインデノ−［２，１−ｅ］インダゾール−７（３Ｈ）−オン
メタノール（５．２ｍＬ）と２Ｎ  ＨＣｌ水溶液（０．５２ｍｏｌ）中の９ａ−ベンジル−６−［４−（メトキシメトキシ）フェニル］−３−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロインデノ−［２，１−ｅ］インダゾール−７（３Ｈ）−オン（１３７ｍｇ，０．２２６ｍｍｏｌ）の溶液を８０℃まで１時間加熱撹拌した。室温まで冷却後、混合物を減圧濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃと水に分配し、有機相をブラインで洗浄した。次に、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮すると、標記化合物１２４ｍｇが黄色いフォームとして得られた。
【０４１１】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ２．２０−２．３０（ｍ，１Ｈ），２．３４−２．４５（ｍ，４Ｈ），２．６９−２．７７（ｍ，１Ｈ），２．７９−２．８７（ｍ，２Ｈ），２．９１−３．０８（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８０−７．３２（ｍ，１１Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ）。
【０４１２】
ステップ１０：９ａ−ベンジル−６−｛４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル｝−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロインデノ−［２，１−ｅ］インダゾール−７（３Ｈ）−オンヒドロトリフルオロ酢酸塩
９ａ−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロインデノ−［２，１−ｅ］インダゾール−７（３Ｈ）−オン（１２４ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１７５ｍｇ，０．６６ｍｍｏｌ）及びピペリジンエタノール（８８μＬ，０．２２ｍｍｏｌ）の０℃無水テトラヒドロフラン（２．０ｍＬ）溶液に窒素下にアゾジカルボン酸ジイソプロピル（１４０μＬ，０．７２ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン（５００μＬ）溶液を滴下した。溶液を０℃で１時間と室温で５時間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２−５ｖｏｌ％  ＭｅＯＨを溶離液として生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。溶媒の減圧除去後、粗（４−メチルフェニル）スルホニル保護中間体が黄色いフォームとして得られ、ＥｔＯＨ  ２ｍＬ、１，４−ジオキサン２ｍＬ及び１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液１ｍＬの混合物に溶かした。混合物を３時間室温で撹拌し、ＨＯＡｃで酸性化し、溶媒を減圧除去した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２とブラインに分配した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。水（０．１％ＴＦＡ）とアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）を溶離液として粗生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐＣ１８，２２×１００ｍｍ）により精製した。プールした生成物フラクションを凍結乾燥すると、標記化合物２５ｍｇが得られた。
【０４１３】
ＭＳ：ｍ／ｚ  ５１８．２［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ  １．３３−１．５０（ｍ，１Ｈ），１．６４−１．９０（ｍ，５Ｈ），２．１８−２．３０（ｍ，２Ｈ），２．４０−２．５０（ｍ，１Ｈ，一部は溶媒シグナルと重なる），２．７９（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．８３−３．１０（ｍ，６Ｈ），３．５０−３．６２（ｍ，４Ｈ，一部は水シグナルと重なる），４．４１（ｍ，２Ｈ），６．３０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９４−７．２５（ｍ，１０Ｈ），８．１３（ｓ，１Ｈ），９．３８（ｓ，ｂｒ，１Ｈ）。
【０４１４】
（実施例６）
９ａ−（４−フルオロベンジル）−６−メチル−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロフルオレノ［１，２−Ｄ］［１，２，３］トリアゾール−７（３ｈ）オン（Ｌ８８４，６５３）の合成
【０４１５】
【化１７】
2007535906.tif 000021
【０４１６】
ステップ１：５−アセトアミド−インダン
酢酸（７５ｍＬ）と無水酢酸（５５ｍＬ）中の５−アミノインダン（３０ｇ，２２５．２ｍｍｏｌ）の溶液を１．５時間還流し、溶媒を減圧留去した。茶色い油状物が残り、室温で放置すると凝固した。粗材料（３９．８ｇ）をメタノール（１００ｍＬ）に溶かし、１ＭＫ２ＣＯ３水溶液（３５ｍＬ）を加えた。溶液を室温で３０分間放置した後、ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍｌ）と水（４００ｍＬ）に分配した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮すると、標記化合物３３．５ｇが薄茶色固体として得られた。
【０４１７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ７．４５（ｓ，１Ｈ），７．１５（ｓ，３Ｈ），２．８８（ｍ，４Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｍ，２Ｈ）。
【０４１８】
ステップ２：６−ブロモ−５−アセトアミド−インダン
約１０℃まで冷却した氷酢酸（１７０ｍＬ）中の５−アセトアミド−インダン（１０ｇ，５７．１ｍｍｏｌ）の溶液に温度を約１０℃に維持しながら臭素（３．６ｍＬ）を１時間加えた。更に１０分間１０℃で撹拌後、混合物を水（６００ｍＬ）で希釈した。固体沈殿が形成されるまで（１５分間）撹拌を続けた。沈殿を濾別し、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶かした。残留水相を分離し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮すると、標記化合物１２．４５が薄黄色固体として得られた。
【０４１９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ８．１４（ｓ，１Ｈ），７．５２（ｓ，ｂｒ，１Ｈ），７．３８（ｓ，１Ｈ），２．８８（ｍ，４Ｈ），２．１０（ｍ，２Ｈ）。
【０４２０】
ステップ３：６−ブロモ−５−アセトアミド−インダン−１−オン
１５℃まで冷却した酢酸（１７０ｍＬ）中の６−ブロモ−５−アセトアミド−インダン（１２．４５ｇ，４９ｍｍｏｌ）の溶液に撹拌下に温度を１５〜１７℃に維持しながらＣｒＯ３（１６．７ｇ，１６７ｍｍｏｌ）の水（３３ｍＬ）溶液を２５分間加えた。混合物を更に９０分間１６〜１８℃で撹拌した後、水（５２０ｍＬ）を加えた。３０分間５℃で撹拌を続けた。形成された沈殿を濾別し、冷水で洗浄し、高減圧下に１６時間乾燥した。標記化合物が薄黄色固体として得られた（８．０ｇ）。
【０４２１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ，８．６０（ｓ，ｌＨ），７．９４（ｍ，２Ｈ），３．１０（ｍ，２Ｈ），２．７１（ｍ，２Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ）。
【０４２２】
ステップ４：６−ブロモ−５−アセトアミド−４−ニトロ−インダン−１−オン
硝酸（６５ｍＬ）を−４０℃まで冷却した。次に６−ブロモ−５−アセトアミド−インダン−１−オン（８．０ｇ，２９．８ｍｍｏｌ）を２分間滴下した。得られた溶液を５０分間撹拌し、この間に温度を−２０℃まで漸増させた。反応混合物を水（１．１  Ｌ）に注いだ。形成された沈殿を濾別し、水洗し、まず空気流下で、次に高減圧下で１６時間乾燥した。標記化合物が薄黄色固体として得られた（７．５ｇ）。
【０４２３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ  １０．４３（ｓ，１Ｈ），８．１９（ｓ，１Ｈ），３．１８（ｍ，２Ｈ），２．７３（ｍ，２Ｈ），２．０９（ｓ，３Ｈ）。
【０４２４】
ステップ５：６−ブロモ−５−アミノ−４−ニトロ−インダン−１−オン
メタノール（１５０ｍＬ）とＨＣｌ水溶液（１２０ｍＬ，６．２５Ｎ）中の６−ブロモ−５−アセトアミド−４−ニトロ−インダン−１−オン（３ｇ，９．６ｍｍｏｌ）の懸濁液を２．５還流した。室温まで冷却後、混合物を水（１．８Ｌ）に注ぎ、５分間室温で撹拌した。形成された沈殿を濾別し、水洗（２００ｍＬ）した。高減圧下に２４時間乾燥後、標記化合物１．９がオレンジ色固体として得られた。
【０４２５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ  ７．９５（ｓ，１Ｈ），７．７９（ｓ，３Ｈ），３．３０（ｍ，２Ｈ），２．５５（ｍ，２Ｈ）。
【０４２６】
ステップ６：４，５−ジアミノ−インダン−１−オン
６−ブロモ−５−アミノ−４−ニトロ−インダン−１−オン（１３．９ｇ，５１ｍｍｏｌ）、ＮａＯＡｃ（３２ｇ）及び活性炭担持パラジウム（１０％，２．５５ｇ）の無水ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）懸濁液を水素雰囲気下に大気圧で２４時間撹拌した。更に触媒（１ｇ）を加え、撹拌を２４時間続けた。触媒を濾別し、ＥｔＯＨ（８００ｍＬ）で洗浄した。有機相を合わせて約５０ｍＬまで濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）と５％ＮａＨＣＯ３（５００ｍＬ）に分配した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮乾涸した。標記化合物がオレンジ色固体として得られた（５．３ｇ）。
【０４２７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ  ６．８０（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ），６．５５（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ），５．４５（ｓ，２Ｈ），４．５３（ｓ，２Ｈ），２．７０（ｍ，２Ｈ），２．４９（一部はＤＭＳＯと重なる，ｍ，２Ｈ）。
【０４２８】
ステップ７：７，８−ジヒドロインデノ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−６（３Ｈ）−オン
４，５−ジアミノインダン−１−オン（１．０ｇ，６．２ｍｍｏｌ）を加温下にＥｔＯＨ  ８０ｍｌに溶かした。室温まで冷却後、３７％  ＨＣｌ  ６．１ｍＬと水１．５ｍＬを加えた。溶液を０℃まで冷却し、ＮａＮＯ２  １．３８ｇの水（６．５ｍＬ）溶液を滴下した。得られた暗茶色混合物を約５℃で更に５０分間撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃ  ５００ｍＬと水４００ｍＬに分配した。有機相をブライン３００ｍＬで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧留去した。ＥｔＯＡｃ／石油エーテル（１：１，ｖ／ｖ）を溶離液として生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。標記化合物がオレンジ色固体として得られた（６３２ｍｇ）。
【０４２９】
ＭＳ：ｍ／ｚ  １７４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０４３０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）７．８５（ｄ，８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｄ，８．５Ｈｚ，１Ｈ），３．４５（ｍ，２Ｈ），２．７７（ｍ，２Ｈ）。
【０４３１】
ステップ８：７−（４−フルオロ−ベンジリデン）−７，８−ジヒドロインデノ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−６（３Ｈ）−オン
７，８−ジヒドロインデノ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−６（３Ｈ）−オン（２００ｍｇ，１．１６ｍｍｏｌ）を加温下にＥｔＯＨ  １７ｍｌに溶かした。室温まで冷却後、４−フルオロ−ベンズアルデヒド１３９μＬ（１．５当量）とＭｅＯＨ中０．５Ｍ  ＮａＯＭｅ  ５．０ｍＬ（１．５当量）を加えた。反応混合物を室温で１７時間撹拌した。１Ｎ  ＨＣｌ  ３．７ｍＬと水２００ｍＬを撹拌下に加えた。形成された沈殿を濾別し、高減圧下に乾燥した。標記化合物２６０ｍｇが得られた。
【０４３２】
ＭＳ：ｍ／ｚ  ２８０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０４３３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）１６．３（ｓ，ｂｒ，ｃａ．ｌＨ），８．００−７．８５（ｍ，３Ｈ），７．８１（ｍ，１Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｍ，２Ｈ），４．４９（ｓ，２Ｈ）。
【０４３４】
ステップ９：７−（４−フルオロ−ベンジル）−７，８−ジヒドロインデノ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−６（３Ｈ）−オン
７−（４−フルオロ−ベンジリデン）−７，８−ジヒドロインデノ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−６（３Ｈ）−オン（２３９ｍｇ，０．８６ｍｍｏｌ）を加温下にＥｔＯＡｃ−ＥｔＯＨ（１：１，ｖ／ｖ）３０ｍｌに溶かした。室温まで冷却後、Ｐｄ／Ｃ（１０％）４８ｍｇを加えた。反応混合物を水素下に大気圧で６時間４５℃にて撹拌した。触媒を濾別し、溶媒を減圧留去した。７−（４−フルオロ−ベンジル）−７，８−ジヒドロインデノ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−６（３Ｈ）−オン（２５３ｍｇ）が無色油状物として得られ、それ以上精製せずに次段階で使用した。
【０４３５】
ＭＳ：ｍ／ｚ  ２８２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０４３６】
ステップ１０：９ａ−（４−フルオロ−ベンジル）−６−メチル−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロフルオレノ［１，２ｄ］［１，２，３］−トリアゾール−７（３Ｈ）−オン
７−（４−フルオロ−ベンジル）−７，８−ジヒドロインデノ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−６（３Ｈ）−オン（２５３ｍｇ，０．８６ｍｍｏｌ）を０．５Ｍ  ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ  ３ｍＬに溶かした。ＥＶＫ（１２７μＬ，１．５当量）を加え、混合物を６０℃まで５時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ  １５０ｍＬと１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４水溶液１００ｍＬに分配した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧留去した。油状物が得られ、ＨＯＡｃ  ５ｍＬと６Ｎ  ＨＣｌ  ５ｍＬの混合物に溶かした。混合物を１００℃まで１時間加熱撹拌した。室温まで冷却後、混合物をＥｔＯＡＣと１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４水溶液ｍＬに分配した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過した。溶媒の減圧留去後に粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＥｔＯＡｃ／石油エーテル１：２，ｖ／ｖ）により精製した。プールした生成物フラクションを０．５Ｍ  ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ  １０ｍＬに溶かし、混合物を５０℃まで４０分間加熱撹拌した。室温まで冷却後、混合物をＥｔＯＡＣと１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４水溶液ｍＬに分配した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過した。溶媒の減圧留去後に粗生成物をメチル−ｔｅｒブチルエーテル（１０ｍＬ）に溶かし、石油エーテル（３５ｍＬ）を加えて沈殿させた。沈殿を石油エーテルで洗浄し、高減圧下に乾燥すると、９ａ−（４−フルオロ−ベンジル）−６−メチル−８，９，９ａ，１０−テトラヒドロ−フルオレノ［１，２ｄ］−［１，２，３］−トリアゾール−７（３Ｈ）−オン（３８ｍｇ）淡黄色固体として得られた。
【０４３７】
ＭＳ：ｍ／ｚ  ３４８．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０４３８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ−ｄ４，４００ＭＨｚ）：δ  ２．２１（ｓ，３Ｈ），２．２２−２．３０（ｍ，１Ｈ），２．３３−２．４０（ｍ，１Ｈ），２．５３−２．６２（ｍ，１Ｈ），２．８５−２，９８（ｍ，３Ｈ），３．０２（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．５８（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７４（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｍ，２Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）。
【０４３９】
上記実施例に記載した方法と同様の方法を使用して以下の化合物を製造した。
【０４４０】
【表２】
2007535906.tif 000022
2007535906.tif 000023
2007535906.tif 000024
【０４４１】
【表３】
2007535906.tif 000025
2007535906.tif 000026
【０４４２】
【表４】
2007535906.tif 000027
2007535906.tif 000028
【０４４３】
【表５】
2007535906.tif 000029
2007535906.tif 000030
2007535906.tif 000031
【０４４４】
（実施例７）
ＥＲ−ＬＢＤ突然変異体ライブラリーのデザインと構築。
【０４４５】
単独ＥＲα−ＬＢＤはキメラ構築物のコンテキストで機能することが従来示されていたので、真の直交転写スイッチに必要な修飾ＬＢＤを開発するために魅力的な候補であった。その天然アイソフォームとは異なり、修飾ＬＢＤはＥＲのリガンド（例えばエストラジオール）と結合できないが、リガンドの不活性類似体とは結合できなければならない。不活性類似体はリガンドと構造的に関連するが、天然エストロゲン受容体と結合することができない。
【０４４６】
本発明者らは以下の基準に従って不活性類似体の可能な候補を検討した。第１に、候補は他の点では全般に活性な系列内で（ｈＥＲαとｈＥＲβの両方に対して）不活性な化合物でなければならない。第２に、候補の一般構造はｈＥＲα  ＬＢＤのリガンド結合ポケットの周囲のみに制限された修飾を必要とする。第３に、候補は一般に許容可能な薬物動態プロフィルを示すことが好ましい。
【０４４７】
これらの基準に従い、９ａ位に大きなベンジル置換をもつ化合物であるＣＭＰ１（図１Ａ）を合成することにした。９ａ位を選択したのは、社内プログラムから開発した一連のｈＥＲβ選択的テトラヒドロフルオレノンリガンドでこの位置を修飾すると、一般に結合親和性が著しく低下することが観察されたためであった。更に、フェノール性ヒドロキシ基をピラゾール複素環で置換すると、活性系列の薬理的性質が改善されることが分かった。新規に合成されたＣＭＰ１は実際にｈＥＲαとｈＥＲβの両方に対する結合親和性が非常に低かった（夫々ＩＣ５０値＞１０４ｎＭ，図１Ａ）ので、受容体突然変異誘発ストラテジーをデザインするための有望な出発点であった。
【０４４８】
アゴニストに結合したｈＥＲα及びｈＥＲβ  ＬＢＤのＸ線結晶構造に従い、エネルギー計算により予想される９ａベンジル置換基（Ｒ２，表２）の３種の異なる主要コンホメーションをとるｈＥＲα及びｈＥＲβ結合ポケットにＣＭＰ１をモデル化した（図３）。ＣＭＰ１の結合を妨害する可能性の最も高い候補残基としてリガンド結合ポケット内の５個の残基（夫々ｈＥＲα又はｈＥＲβのＬ３９１／Ｌ３４３、Ｆ４０４／Ｆ３５６、Ｍ４２１／Ｉ３７３、１４２４／１３７６、Ｌ４２８／Ｌ３８０）を同定した。これらの５個の位置を含む突然変異体ライブラリーはベンジル置換基の全３種の主要コンホメーションを含む９ａベンジル回転異性体（Ｒ２，表２）のコンホメーション空間のほぼ３００°をカバーすると思われる。
【０４４９】
ＣＭＰ１の結合の妨害は側鎖と９ａベンジル部分（Ｒ２，表２）の立体衝突に起因すると予想されたので、もっと小さいか、又はより一般には別の残基に置換することによりこの障害がなくなると思われた。結合ポケットとベンジル置換基はいずれも一般に疎水性であるため、５個の位置の可能な置換基としてＧｌｙ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ又はＴｒｐのみを使用することにした。
【０４５０】
分析の結果、ＣＭＰ１の結合に影響するｈＥＲαとｈＥＲβの相違は夫々ｈＥＲα及びｈＥＲβのＬ３８４／Ｍ３３６とＭ４２１／Ｉ３７３のたった２個の残基であることが判明した。ピラゾール化合物系列はｈＥＲβに対して優先的結合を示した（図１Ａ）ので、Ｌ（３８４）Ｍ突然変異ｈＥＲαのコンテキストでライブラリーを作製することにした。第２の残基Ｍ４２１はライブラリー内の突然変異位置の１個に対応したので、Ｍ４２１の可能な置換としてＩｌｅを加えることにより、暗にｗｔ  ｈＥＲβリガンド結合ポケットも含むライブラリーが作製された。
【０４５１】
ｈＥＲβよりもｈＥＲαを選択したのは２つの理由からであった。第１に、ｈＥＲαの生物学は非常によく解明されている。第２に、ｈＥＲαリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を使用する関連実験の成功が既に文献に記載されている。ｈＥＲα  ＬＢＤの単独又は組合せＬ（３８４）Ｍ及びＭ（４２１）Ｉ変異体をもつＧＳＴ融合構築物を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の結果、全長ｗｔ  ｈＥＲβで観察された結合データが再現された（図１Ａ）。
【０４５２】
（実施例８）
酵母選択システムのコンテキストにおけるライブラリー複雑度の検証。
【０４５３】
ＣＭＰ１応答性変異体を遺伝的に選択するために、Ｌ３８４Ｍ突然変異ｈＥＲα  ＬＢＤをＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とＶＰ１６トランス活性化ドメインに融合した（図２Ａ）ピラゾール系列の化合物に対するこのキメラの応答性をエストラジオール（Ｅ２）（図２Ｂ）又は活性化合物ＣＭＰ２（図２Ｃ）に対する力価曲線により測定した。上述したように、Ｌ（３８４）Ｍ置換はキメラ転写因子に対する親和性を調節するために必要且つ十分であった。更に、ピラゾール系化合物は酵母膜に浸透できることが判明したが、酵母システムは多くの場合にこの性質をもたないために遺伝子セレクターとして使用できなかった。
【０４５４】
ｈＥＲα−ＬＢＤ変異体ライブラリーの作製は内在性酵母組換えシステムを利用した。相同組換えを行うために十分に長い（＞３０ｂｐ）定常フランキング領域を含むジヌクレオチドアセンブリストラテジーを使用して５個のライブラリー位置の各々に１０種の異なるアミノ酸の２種の縮重オリゴヌクレオチドを合成した。
【０４５５】
単独又は二重突然変異をもつクローンがライブラリーの合成、構築又は選択中に失われる確率を減らすために、ｗｔコドン濃度を各突然変異位置について１５％まで増加した。その結果、５残基変異体の相対比率が僅かに低下した（約０．８倍）のに対して１又は２残基変異体の相対比率は有意に増加した（夫々約８倍と４倍）。このストラテジーＣＭＰ１リガンドを受容すると同時にＬＢＤ構造枠組に許容されるためには複雑な変異体よりも主に１又は２残基変異体が必要であるという本発明者らの予想にも一致した。
【０４５６】
縮重オリゴヌクレオチドミックスを使用してｈＥＲ  ＬＢＤ鋳型のＰＣＲ増幅により分取量の突然変異ＬＢＤフラグメントを合成した。次に突然変異フラグメント集団を規模拡大同時形質転換実験で線状化レシピエントＬ（３８４）Ｍ  ｈＥＲ  ＬＢＤベクターと併用した。１０倍のライブラリー冗長性に対応する約１０６個のコロニーをプレーティングした処、１２個のランダムに選択されたクローンが予想通りのライブラリー複雑度であることが判明した（データは示さず）。
【０４５７】
ライブラリーの選択能をプローブするために、量を増加させながらｈＥＲβ選択的ＣＭＰ３で−Ｈｉｓ／−Ｔｒｐ増殖選択的プレートを処理した。９個のランダムに選択されたクローンを配列決定した処、非選択クローンと異なり、ＣＭＰ３選択クローンの大半は全５個の突然変異誘発位置のアミノ酸置換がゼロ又は殆どなく、Ｌ３９１及びＭ４２１残基は完全に保存されていることが分かった（データは示さず）。従って、ｗｔ受容体の高親和性リガンドとの生産的相互作用を維持するためにはｈＥＲ結合ポケットの非常に少数の突然変異しか許容されないと思われる。Ｍ（４２１）Ｉ置換を含むクローンは選択されず、Ｌ（３８４）Ｍ突然変異蛋白質にこの第２の置換を付加することによりＣＭＰ３に対する結合親和性のそれ以上の増加は認められないという知見に一致した（図１Ａ）。
【０４５８】
（実施例９）
遺伝子ライブラリースクリーニング及び選択されたＥＲ−ＬＢＤ突然変異体の分析。
【０４５９】
ライブラリーの予想通りの組成と応答性が確認されたので、１μＭの濃度の不活性類似体ＣＭＰ１の存在下で増殖選択を繰返した。その後、−Ｔｒｐ／Ｘ−ｇａｌ含有プレートで１μＭ  ＣＭＰ１又は対照としてＤＭＳＯに対して１６００個の独立クローンをスクリーニングした。この実験で５４個の独立クローンがβ−ガラクトシダーゼトランス活性化に陽性であると判定され、そのうち２８個が０．１μＭ  ＣＭＰ１の存在下でも陽性であった。初期増殖選択と最初の回の白／青スクリーニングを１０倍の化合物濃度（１０μＭ）の存在下で実施した以外は同一ストラテジーを使用して平行実験を実施した。０．１μＭ  ＣＭＰ１で攻撃した場合には３１個のクローンが陽性を維持したので、先の実験の２８個の陽性クローンと共に更に特性決定することにした。
【０４６０】
ＤＮＡ配列分析の結果、選択した突然変異体のコンセンサス配列（図４及び配列番号３−１５）が判明した。最も顕著な特徴は選択したクローンの８６％でＭ４２１がもっと小さい側鎖を含む残基（主にＧと少数のＡ）に突然変異したことであった。重要な点として、この突然変異は活性ピラゾール化合物ＣＭＰ３を使用して選択したクローンでは全く観察されなかった（データは示さず）ので、スクリーニング操作における偏りが排除された。単独Ｍ４２１Ｇ突然変異が比較的低頻度で存在しており、クローンの大半にＩ４２４→Ｍ、Ｖ又はＬの第２の突然変異が存在していた。更に、突然変異クローンの２８％にはＦ４０４→Ｗの第３の突然変異が存在していたが、Ｌ３９１位とＬ４２８位は全般に保存されていた。大半の選択変異体に存在するコンセンサス配列は元々Ｍ４２１とＩ４２４により占められていた位置にＣＭＰ１のベンジル置換基を配置するモデルに一致する（図４）。
【０４６１】
ＶＰ１６  ＡＤに対するモノクローナル抗体を使用して図４に示す代表的な全クローンからの酵母蛋白質抽出物をウェスタンブロット分析した処、対応するキメラ蛋白質の発現レベルに有意差はなかった（データは示さず）。
【０４６２】
（実施例１０）
新規テトラヒドロフルオレノン化合物はＥＲ−ＬＢＤのＭ４２１突然変異体と選択的に相互作用する。
【０４６３】
図４に示す一連の代表的選択突然変異をｐＧＥＸ−ｈＥＲα−Ｌ（３８４）Ｍ−ＬＢＤ原核発現構築物に導入し、対応するＧＳＴ−融合蛋白質変異体を大腸菌で発現させた。同等量の各種全蛋白質変異体を含有する粗細菌抽出物の適切なアリコートを濃度増加下の３［Ｈ］−エストラジオールとのｉｎ  ｖｉｔｒｏ直接結合について試験した。全変異体はｈＥＲα−Ｌ（３８４）Ｍ−ＬＢＤ蛋白質（全５個の突然変異誘発位置のｗｔ）に比較して低親和性で天然リガンドＥ２と結合した（データは示さず）。単独Ｍ（４２１）Ｇ選択突然変異体は最高の親和性でエストラジオールと結合し、ｋｄ値はｗｔの約９倍であった（夫々４６ｎＭ及び５ｎＭ）（図１Ａ）。他方、このホルモンのｋｄ値は３［Ｈ］Ｅ２置換アッセイにおいてＣＭＰ１、ＣＭＰ４、ＣＭＰ５（図１Ａ）と表１ａ、１ｂ、２、及び３に示す全化合物を含む一連の新規テトラヒドロフルオレノン化合物に対するこのポリペプチドの親和性を測定するために十分低かった。４２１位のグリシンは試験した化合物の大半との結合選択性を付与することが確認された（図１Ａ及び表１ｂ、２、３）。フェノール基を含むテトラヒドロフルオレノンに対する親和性はピラゾール置換基を含むテトラヒドロフルオレノンに対する親和性よりも有意に高かった。更に、４位にメチル基をもつ化合物に対する結合親和性は対応する位置に水素原子を含む化合物に対する親和性よりも高かった。
【０４６４】
（実施例１１）
ＥＲ−ＬＢＤのＭ４２１突然変異体はフルオレノン依存的転写活性を示す。
【０４６５】
組込まれたｌａｃＺレポーター遺伝子が無傷のＧＡＬ１プロモーターの制御下にあり、従って酵母株ＣＧ−１９４５（ライブラリーを含む株）よりも厳密に調節され、効率的に発現される酵母株Ｙ１８７に一連の代表的選択突然変異体を導入した。付加選択突然変異Ｍ（４２１）Ｇの共存下又は非共存下にＥＲ  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍを含むＧＡＬ４／ＶＰ１６キメラをＥ２、ＣＭＰ４又はＣＭＰ５化合物（図１Ａ）の存在下にリガンド依存的β−ガラクトシダーゼトランス活性化実験で試験した。代表的実験を図５Ａ−５Ｃに示す。その結果、４２１位にグリシンを含む突然変異体はｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定したＩＣ５０値に同等の夫々３６ｎＭ及び２１７ｎＭのＥＣ５０値でＣＭＰ４及びＣＭＰ５の両者のコグネイトリガンドにより選択的に活性化されることが確認された（図１Ａ）。
【０４６６】
Ｍ（４２１）Ｇ選択突然変異体のコンテキストで元の突然変異Ｌ（３８４）Ｍを復帰させ、単独置換ＥＲα  ＬＢＤ  Ｍ（４２１）Ｇキメラ蛋白質を作製した。ピラゾール化合物ＣＭＰ５により酵母で誘導される転写活性はＬ（３８４）Ｍ突然変異の不在下で著しく低下し（データは示さず）、選択突然変異体のリガンド特異性を規定するためには２種のアミノ酸置換の組み合わせが必要であることが示唆された。
【０４６７】
エストラジオール応答については、Ｍ（４２１）Ｇ突然変異体（１．５ｎＭ）で測定されたＥＣ５０値は親クローン（０．２ｎＭ）の該当値の約８倍であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された値と同程度の差であった（図１Ａ参照）。
【０４６８】
（実施例１２）
Ｄ（３５１）Ａ／Ｈ５２４Ｖ突然変異をもつＥＲ−ＬＢＤ変異体はエストラジオール応答性が低く、リガンド非依存的活性が低い。
【０４６９】
現時点で本発明者らは不活性類似体に対する特異性に所望シフトをもつＥＲ−ＬＢＤを獲得する第一歩を達成している。システムを実用化するためには、２つの付加必須特性を導入する必要があった。第１に、Ｌ（３８４）Ｍ／Ｍ（４２１）Ｇ（ＭＧ）−ＬＢＤ変異体は天然リガンドエストラジオールに対して直交でなければならない。第２に、リガンド非依存的転写活性をバックグラウンドレベルまで低下させなければならない。
【０４７０】
本発明者らはｈＥＲ  ＬＢＤ−ホルモン複合体の結晶構造でエストラジオールのＤ環と接触するアミノ酸残基に注目した。テトラヒドロフルオレノン化合物には公式にホルモンＤ環の構造等価物がないので、ＬＢＤのＤ環相互作用領域の改変はこれらのリガンドとの結合をさほど妨げないであろうと推測した。従って、エストラジオールの１７ヒドロキシルに水素結合したＨｉｓ５２４をＭＧ−ＬＢＤ変異体のコンテキストでＶａｌに突然変異させた。更に、エストラジオールのＤ環と疎水性ファン・デル・ワールス接触するＧｌｙ５２１もＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、又はＡｒｇで置換した。これらの新規突然変異をもつ対応するＧＡＬ４／ＶＰ１６キメラ蛋白質をエストラジオール又はリガンドＣＭＰ４の存在下にリガンド依存的β−ガラクトシダーゼ転写アッセイで攻撃した。
【０４７１】
Ｇｌｙ５２１の全置換は酵母における基線及びエストラジオールによるトランス活性化レベルを有意に低下させたが、フルオレノン化合物ＣＭＰ４に対する応答も劇的に低下した（データは示さず）。他方、Ｈ５２４Ｖはエストラジオールに対する親和性が約２００分の１に激減し（図６Ａ）、同時にリガンドＣＭＰ４に対する親和性も３分の１だけ低下した（図６Ｂ）。
【０４７２】
導入遺伝子発現のｉｎ  ｖｉｖｏ調節を目的とする転写因子を開発する重要な第３段階は付加リガンドの不在下でそのバックグラウンド活性を最小にすることであった。上記付加Ｈ（５２４）Ｖ突然変異を含むＭＧ−ＬＢＤ「リード」選択変異体は相対的に高い構成的活性レベルを維持していた（図７Ａ）。
【０４７３】
公表データによると、全長ｈＥＲαのコンテキストでＡｓｐ３５１の負電荷を除去するアミノ酸置換はリガンド依存的応答を妨害せずにその基線活性の有意低下を生じることが示されている。従って、付加Ｈ（５２４）Ｖ突然変異を含むＭＧ−ＬＢＤ「リード」選択変異体にＤ（３５１）Ａ突然変異を挿入した。Ｄ（３５１）Ａ突然変異の存在はリガンド非依存的活性を１４分の１に低下させると同時に、コグネイトリガンドＣＭＰ４による最大誘導倍率の有意増加を生じた（図７Ａ）。
【０４７４】
酵母でリガンド応答性活性化の特異性を変化させたｈＥＲα−ＬＢＤ内の一連の突然変異［Ｄ（３５１）Ａ、Ｌ（３８４）Ｍ、Ｍ（４２１）Ｇ、Ｈ（５２４）Ｖ］を決定したので、この改変特異性が哺乳動物細胞で維持されていることを確かめたいと思った。そこで、突然変異及びｗｔ両者のＧＡＬ４／ｈＥＲα−ＬＢＤ／ＶＰ１６配列を哺乳動物発現ベクターに導入し、５個のＧＡＬ４  ＵＡＳ反復配列（５ＧＡＬ４ＵＡＳ−ｐＳＥＡＰ）の制御下にＳＥＡＰを発現するＧＡＬ４応答性レポータープラスミドとＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションすることによりそのリガンド依存的転写活性を評価した。突然変異体キメラ転写因子がコグネイトリガンドＣＭＰ４及びエストラジオールに応答してレポーター遺伝子活性化を媒介する能力を、ｗｔ  ｈＥＲα−ＬＢＤを含むキメラの応答と比較した。
【０４７５】
図７Ｂに示す結果から明らかなように、突然変異体の構成的活性はｗｔと同程度に低かった。ＣＭＰ４濃度の飽和に応答して突然変異体が示した最大活性レベルはエストラジオール濃度の飽和に応答してｗｔで得られたレベルと同等であった（６０−９０倍誘導）。更に、エストラジオール濃度の飽和に対する突然変異体の最大応答は著しく低下した（ｗｔが示した応答の１０％）。
【０４７６】
（実施例１３）
Ｇ５２１Ｒ突然変異をもつＥＲ−ＬＢＤ変異体はエストラジオール応答性が低く、リガンド非依存的活性が低く、アンタゴニスト化合物により誘導することができる。
【０４７７】
Ｈ５２４Ｖ変異体以外に、ＥＲ−ＬＢＤ  Ｇ（５２１）Ｒ置換の周知生物学的性質を利用する別のストラテジーも実施した。そのＬＢＤにこの突然変異をもつエストロゲン受容体は基線転写活性が低く、エストラジオールリガンドに対する親和性が著しく低いという所望特性の両方を示す。実験によりＧ（５２１）Ｒ突然変異をもつアゴニスト系列のフルオレノン化合物の不適合性が判明したので、リガンドの可能な修飾を検討した。この推論の根拠はｗｔ  ＥＲ  Ｇ（５２１）Ｒについて記載したようなＧ（５２１）Ｒ置換ＭＧ−ＬＢＤ変異体がＥＲアンタゴニストである４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨ  Ｔａｍ）に高レベルで応答したためである（図８Ａ）。より一般には、「アンタゴニストテール」をもつリガンドはＧ（５２１）Ｒによりアゴニスト結合ポケットに導入される親和性の低下を相殺できると思われる。そこで、Ｒ３位のメチル基を「アンタゴニストテール」に似たもっと大きい側鎖に置換することにより新規系列の化合物を作製した（図１Ｂ及び表１ａ）。異なるＲ３側鎖を含むピラゾール（ＣＭＰ９，図１Ｂ．表２も参照）及びフェノール誘導体（図１Ｂ及び表１ａ）の両者をＭＧ−ＬＢＤ選択突然変異体とＥＲα  ｗｔ−ＬＢＤポリペプチドとの結合の競合放射ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで攻撃した。全化合物とも程度は異なるがｗｔ  ＬＢＤとα及びβ両者の全長ＥＲに比較して突然変異体に対する有意な選択性を示した。突然変異体とｗｔ  ＥＲα  ＬＢＤを比較すると、選択性は５０〜１５０倍であり、この差は全長受容体のほうが多少小さかった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定した場合にアンタゴニスト側鎖の存在は突然変異体に対する結合親和性に影響しないようであったが、１０μＭ濃度までの酵母転写アッセイでこれらの化合物の大半に対する有意応答は検出されなかった（データは示さず）。このことから、多くの公知抗エストロゲンで既に観察されている通り、嵩高な正電荷側鎖を含む化合物の酵母細胞取込みは著しく低下すると思われた。
【０４７８】
例外として、Ｒ３にフェノール置換基を含む化合物であるＣＭＰ６は酵母細胞でＬ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ，Ｇ（５２１）Ｒ変異体の転写活性を濃度依存的に有意に誘導することができた（図８Ｂ）。他方、Ｌ（３８４）Ｍ及びＧ（５２１）Ｒ突然変異のみを含む変異体では非常に弱い応答しか観察されず、化合物は１０μＭ濃度までｗｔ  ＥＲα  ＬＢＤキメラに完全に無効であった。ＣＭＰ７でも同様の結果が得られ（図８Ｃ）、リガンドに「アンタゴニスト」性質を付与するためにはＲ３をブチル置換基にすれば十分であることが判明した。より重要な点として、これらのデータによると、リガンドの９ａ位（Ｒ２，表１ａ）のフェニル基をＥＲ−ＬＢＤ  Ｍ（４２１）Ｇで置換することにより付与される特異性が維持された。予想通り、４−ＯＨ  Ｔａｍを試験すると相対応答レベルは逆転した。Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ，Ｇ（５２１）Ｒ変異体は実際にＬ（３８４）Ｍ及びＧ（５２１）Ｒとｗｔ  ＥＲα  ＬＢＤキメラに比較してこのアンタゴニストに対して有意に低い親和性を示した。
【０４７９】
（実施例１４）
アンタゴニスト系列の化合物による遺伝子発現の調節。
【０４８０】
このように、Ｌ３８４Ｍ／Ｍ４２１Ｇ／Ｇ５２１Ｒ  ＥＲ−ＬＢＤ変異体とアンタゴニストリガンドの組み合わせは遺伝子治療用途に適用可能にするために所望される性質を示した。そこで、システムを哺乳動物で試験するために、最近作製したＨＥＡ−１と呼ぶリガンド依存的転写レギュレーターを改変した。
【０４８１】
ＨＥＡ−１では、ヒトＨＮＦ−１αのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）（ａａ１−２８２）と、ヒトＥＲαのＬＢＤ（ａａ３０３−５９５）のＧ（５２１）Ｒ突然変異体と、ヒトｐ６５蛋白質の活性化ドメインの一部（ａａ２８５−５５１）の３個のエレメントを融合している。ＨＥＡ−１は細胞培養で１００倍の薬剤依存的導入遺伝子誘導倍率まで厳密に４−ＯＨ  Ｔａｍ依存的に多重ＨＮＦ−１結合部位の下流の導入遺伝子の転写を促進する（Ｒｏｓｃｉｌｌｉら，２００２  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．５：６５３−６６３）。更に、ＨＥＡ−１は主にｉｎ  ｖｉｖｏで４−ＯＨ  Ｔａｍ（ＲＥＦ）に代謝されるタモキシフェン（ＴＡＭ）をマウスに投与することにより遺伝子発現の厳密なｉｎ  ｖｉｖｏ調節を可能にする（Ｒｏｓｃｉｌｌｉら，２００２  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．５：６５３−６６３）。
【０４８２】
しかし、ＴＡＭ及びとその代謝産物４−ＯＨ  Ｔａｍの固有アンタゴニスト活性は多数の副作用（例えば子宮癌発生率の増加）の原因となり、長期投与中に一層顕著になるので、このシステムを長期遺伝子治療に使用することはできない。従って、内因性ＥＲ−α及びＥＲ−βに対する親和性が非常に低いインデューサー分子を使用すれば、ＨＥＡ−１による転写調節システムの潜在的利用範囲が広がるはずである。
【０４８３】
そこで、ＨＥＡ−１のコンテキストで三重ＥＲ−ＬＢＤ突然変異体Ｌ（３８４）Ｍ／Ｍ（４２１）Ｇ／Ｇ（５２１）ＲであるＨＥＡ−２（配列番号４３）を作製し、アンタゴニスト型化合物に対するその応答性を試験した。ＨＥＡ−２のアミノ酸配列を配列番号４３に示す。対応するｃＤＮＡを真核発現ベクターにクローニングし、ＨｅＬａ細胞にレポータープラスミド７ｘＨ１／ＣＲＰ／ＳＥＡＰとコトランスフェクトした（Ｒｏｓｃｉｌｌｉら，２００２  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．５：６５３−６６３）。濃度を増加させながら４種類のアンタゴニスト化合物で細胞を処理し、２４時間処理後に培地中のＳＥＡＰレベルを測定した。
【０４８４】
その結果、キメラは全４種の化合物により用量依存的的に刺激された。ＣＭＰ８化合物の代表的用量応答曲線を図９Ａに示す。化合物の不在下では、０．８±０．２ｎｇ／ｍｌの基線ＳＥＡＰレベルが測定され、レポータープラスミドのみをトランスフェクトした細胞培地で測定されたレベルと同等であった（データは示さず）。従って、この実験条件では有意基線活性が存在しないことが分かった。最高濃度のＣＭＰ８で約１９００ｎｇ／ｍｌのＳＥＡＰが測定され、非誘導条件に比較して約２０００倍の増加に対応した。二重実験でも全４種の化合物で同様の誘導倍率が一貫して観察された（データは示さず）。
【０４８５】
キメラが最高濃度のホルモンのみでＥ２により活性化されることは図９Ａからも明らかである（５００ｎＭ及び１μＭ  Ｅ２で誘導倍率１７倍及び５０倍）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合分析（図１Ｂ）と一致し、ＣＭＰ９はＥＣ５０約３００ｎＭの最低活性を示したが、他の化合物のＥＣ５０は１１〜４０ｎＭであった（図９Ｂ）。
【０４８６】
他の態様も特許請求の範囲に含まれる。数種の態様を例示及び記載したが、本発明の精神と範囲から逸脱せずに種々の変形が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０４８７】
【図１Ａ】図１Ａ及び１Ｂはエストラジオールと代表的活性（ＣＭＰ２及び３）及び不活性類似体（ＣＭＰ１，４−１０）の構造と結合特異性を示す。ＭＧ−ＬＢＤはＬ（３８４）ＭとＭ（４２１）ＧをもつｈＥＲα−ＬＢＤに対応する。
【図１Ｂ】図１Ａ及び１Ｂはエストラジオールと代表的活性（ＣＭＰ２及び３）及び不活性類似体（ＣＭＰ１，４−１０）の構造と結合特異性を示す。ＭＧ−ＬＢＤはＬ（３８４）ＭとＭ（４２１）ＧをもつｈＥＲα−ＬＢＤに対応する。
【図２Ａ】図２ＡはＧＡＬ４ＤＢＤ／ｈＥＲαＬＢＤ／ＶＰ１６ＡＤキメラ転写因子の模式図である。
【図２Ｂ】図２Ｂ及び２Ｃはｗｔ  ｈＥＲα−ＬＢＤ（四角）又はｈＥＲα−Ｌ（３８４）Ｍ−ＬＢＤ（丸）に基づくキメラを発現する酵母形質転換体におけるエストラジオールとｈＥＲβ特異的化合物ＣＭＰ２による転写活性化を示す。Ｅ２（図２Ｂ）又はＣＭＰ２（図２Ｃ）の濃度増加に伴うβ−ガラクトシダーゼ活性の用量応答曲線を求めた。材料と方法の項に記載したようにＥＣ５０値を求めた。
【図２Ｃ】図２Ｂ及び２Ｃはｗｔ  ｈＥＲα−ＬＢＤ（四角）又はｈＥＲα−Ｌ（３８４）Ｍ−ＬＢＤ（丸）に基づくキメラを発現する酵母形質転換体におけるエストラジオールとｈＥＲβ特異的化合物ＣＭＰ２による転写活性化を示す。Ｅ２（図２Ｂ）又はＣＭＰ２（図２Ｃ）の濃度増加に伴うβ−ガラクトシダーゼ活性の用量応答曲線を求めた。材料と方法の項に記載したようにＥＣ５０値を求めた。
【図３】ｈＥＲβ結合ポケットの結晶構造における溶媒接触面によるＣＭＰ１の３種の回転異性体のｈＥＲα−ＬＢＤ突然変異体ライブラリー：分子モデルのデザインを示す。ライブラリー内の５個の突然変異誘発アミノ酸残基を示す。
【図４】遺伝的に選択された変異体からレスキューされたプラスミドのＤＮＡ配列分析。同一突然変異組み合わせが認められた独立クローンの数を示す。より小さいアミノ酸（Ｇ又はＡ）へのＭ４２１のコンセンサス突然変異は回転異性体コンホメーション１をとるＣＭＰ１のＲ９ａベンジル置換基に一致する。
【図５Ａ】図５Ａ−５ＣはｌａｃＺレポーター酵母株Ｙ１８７におけるＭ（４２１）Ｇ選択突然変異体のリガンド依存的転写活性を示す。Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ選択突然変異体（四角）とＬ（３８４）Ｍ親クローン（丸）について２種のフルオレノン化合物ＣＭＰ４（図５Ｂ）、ＣＭＰ５（図５Ａ）、又はＥ２（図５Ｃ）の濃度増加に伴うβ−ガラクトシダーゼ活性の用量応答曲線を求めた。材料と方法の項に記載したようにＥＣ５０値を計算した。
【図５Ｂ】図５Ａ−５ＣはｌａｃＺレポーター酵母株Ｙ１８７におけるＭ（４２１）Ｇ選択突然変異体のリガンド依存的転写活性を示す。Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ選択突然変異体（四角）とＬ（３８４）Ｍ親クローン（丸）について２種のフルオレノン化合物ＣＭＰ４（図５Ｂ）、ＣＭＰ５（図５Ａ）、又はＥ２（図５Ｃ）の濃度増加に伴うβ−ガラクトシダーゼ活性の用量応答曲線を求めた。材料と方法の項に記載したようにＥＣ５０値を計算した。
【図５Ｃ】図５Ａ−５ＣはｌａｃＺレポーター酵母株Ｙ１８７におけるＭ（４２１）Ｇ選択突然変異体のリガンド依存的転写活性を示す。Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ選択突然変異体（四角）とＬ（３８４）Ｍ親クローン（丸）について２種のフルオレノン化合物ＣＭＰ４（図５Ｂ）、ＣＭＰ５（図５Ａ）、又はＥ２（図５Ｃ）の濃度増加に伴うβ−ガラクトシダーゼ活性の用量応答曲線を求めた。材料と方法の項に記載したようにＥＣ５０値を計算した。
【図６Ａ】図６Ａ及び６ＢはエストラジオールのＤ環と接触するＥＲアミノ酸残基の突然変異誘発を示す。三重突然変異Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ，Ｈ（５２４）Ｖキメラ（黒三角）と二重突然変異Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ選択キメラ（黒四角）についてエストラジオール（図６Ａ）又はＣＭＰ４（図６Ｂ）の濃度増加に伴うβ−ガラクトシダーゼ活性の用量応答曲線を求めた。材料と方法の項に記載したようにＥＣ５０値を計算した。
【図６Ｂ】図６Ａ及び６ＢはエストラジオールのＤ環と接触するＥＲアミノ酸残基の突然変異誘発を示す。三重突然変異Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ，Ｈ（５２４）Ｖキメラ（黒三角）と二重突然変異Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ選択キメラ（黒四角）についてエストラジオール（図６Ａ）又はＣＭＰ４（図６Ｂ）の濃度増加に伴うβ−ガラクトシダーゼ活性の用量応答曲線を求めた。材料と方法の項に記載したようにＥＣ５０値を計算した。
【図７Ａ】図７Ａ及び７ＢはＤ（３５１）Ａ突然変異がｈＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ，Ｈ（５２４）Ｖをもつ転写因子のリガンド非依存的活性を低下させることを示す。図７Ａは酵母におけるＣＭＰ４の濃度増加に伴うβ−ガラクトシダーゼ活性の用量応答を示す。図７Ｂでは材料と方法の項に記載したように指定量のＧＡＬ４ＤＢＤ／ｈＥＲα−ＬＢＤ／ＶＰ１６ＡＤ及びＧＡＬ４ＤＢＤ／ｈＥＲα−Ｄ（３５１）Ａ，Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ，Ｈ（５２４）Ｖ−ＬＢＤ／ＶＰ１６ＡＤ発現ベクターＤＮＡと５ＧＡＬ４ＵＡＳ−ｐＳＥＡＰレポータープラスミドＤＮＡ１μｇをＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後に濃度１μＭでリガンドを加え、更に２４時間後にＳＥＡＰ酵素アッセイ用に上清を採取した。
【図７Ｂ】図７Ａ及び７ＢはＤ（３５１）Ａ突然変異がｈＥＲα  ＬＢＤ  Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ，Ｈ（５２４）Ｖをもつ転写因子のリガンド非依存的活性を低下させることを示す。図７Ａは酵母におけるＣＭＰ４の濃度増加に伴うβ−ガラクトシダーゼ活性の用量応答を示す。図７Ｂでは材料と方法の項に記載したように指定量のＧＡＬ４ＤＢＤ／ｈＥＲα−ＬＢＤ／ＶＰ１６ＡＤ及びＧＡＬ４ＤＢＤ／ｈＥＲα−Ｄ（３５１）Ａ，Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ，Ｈ（５２４）Ｖ−ＬＢＤ／ＶＰ１６ＡＤ発現ベクターＤＮＡと５ＧＡＬ４ＵＡＳ−ｐＳＥＡＰレポータープラスミドＤＮＡ１μｇをＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後に濃度１μＭでリガンドを加え、更に２４時間後にＳＥＡＰ酵素アッセイ用に上清を採取した。
【図８Ａ】図８Ａ−８Ｃは酵母におけるアンタゴニストフルオレノン化合物による付加Ｇ（５２１）Ｒ突然変異を含むＭ（４２１）Ｇ選択突然変異体の転写誘導を示す。Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ，Ｇ（５２１）Ｒ突然変異体（黒四角）、Ｌ（３８４）Ｍ，Ｇ（５２１）Ｒ親クローン（丸）及びｗｔα（グレー三角）について２種のフルオレノン化合物ＣＭＰ６（図８Ｂ）又はＣＭＰ７（図８Ｃ）の濃度増加に伴うβ−ガラクトシダーゼ活性の用量応答曲線を求め、４−ＯＨ  Ｔａｍ（図８Ａ）と比較した。材料と方法の項に記載したようにＥＣ５０値を計算した。
【図８Ｂ】図８Ａ−８Ｃは酵母におけるアンタゴニストフルオレノン化合物による付加Ｇ（５２１）Ｒ突然変異を含むＭ（４２１）Ｇ選択突然変異体の転写誘導を示す。Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ，Ｇ（５２１）Ｒ突然変異体（黒四角）、Ｌ（３８４）Ｍ，Ｇ（５２１）Ｒ親クローン（丸）及びｗｔα（グレー三角）について２種のフルオレノン化合物ＣＭＰ６（図８Ｂ）又はＣＭＰ７（図８Ｃ）の濃度増加に伴うβ−ガラクトシダーゼ活性の用量応答曲線を求め、４−ＯＨ  Ｔａｍ（図８Ａ）と比較した。材料と方法の項に記載したようにＥＣ５０値を計算した。
【図８Ｃ】図８Ａ−８Ｃは酵母におけるアンタゴニストフルオレノン化合物による付加Ｇ（５２１）Ｒ突然変異を含むＭ（４２１）Ｇ選択突然変異体の転写誘導を示す。Ｌ（３８４）Ｍ，Ｍ（４２１）Ｇ，Ｇ（５２１）Ｒ突然変異体（黒四角）、Ｌ（３８４）Ｍ，Ｇ（５２１）Ｒ親クローン（丸）及びｗｔα（グレー三角）について２種のフルオレノン化合物ＣＭＰ６（図８Ｂ）又はＣＭＰ７（図８Ｃ）の濃度増加に伴うβ−ガラクトシダーゼ活性の用量応答曲線を求め、４−ＯＨ  Ｔａｍ（図８Ａ）と比較した。材料と方法の項に記載したようにＥＣ５０値を計算した。
【図９Ａ】図９ＡはＣＭＰ８化合物におけるキメラ転写因子ＨＥＡ−２の代表的用量応答曲線を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは各種化合物に対するキメラ転写因子ＨＥＡ−２の応答を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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