(57)【要約】二重特異性抗体の使用により目的の抗原または組織でコーティングした、パルスした樹状細胞は、治療用の用途を有する。本発明は、二重特異性抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングされた半成熟樹状細胞を含有する組成物であって、上記二重特異性抗体がまた、特異的な抗原もしくは組織に結合し得る、組成物を提供する。また、上記樹状細胞がＧＭ−ＣＳＦで処理される上記組成物を提供する。本発明は、組織特異的寛容を誘導するための方法を提供し、上記方法は、以下：（ａ）樹状細胞を目的の抗原で成熟させてＴ細胞を活性化する工程；および（ｂ）該活性化Ｔ細胞を、抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングされた樹状細胞と接触させ、樹状細胞に結合し得る二重特異性抗体の第二の腕を介して該活性化Ｔ細胞の表面にＣＴＬＡ−４を結合させる工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングされた半成熟樹状細胞を含有する組成物であって、該二重特異性抗体がまた、特異的な抗原もしくは組織に結合し得る、組成物。
【請求項２】
前記樹状細胞がＧＭ−ＣＳＦで処理される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記樹状細胞が、目的の抗原でパルスされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体がまた特異的抗原に結合し得る、半成熟樹状細胞にコーティングした二重特異性抗ＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項５】
前記抗体がまた特異的な組織もしくは細胞に結合し得る、請求項４に記載の二重特異性抗ＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項６】
組織特異的寛容を誘導するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）樹状細胞を目的の抗原で成熟させてＴ細胞を活性化する工程；および
（ｂ）該活性化Ｔ細胞を、抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングされた樹状細胞と接触させ、樹状細胞に結合し得る二重特異性抗体の第二の腕を介して該活性化Ｔ細胞の表面にＣＴＬＡ−４を結合させる工程；
を包含する、方法。
【請求項７】
抗原特異的寛容を誘導するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも一つの特異的抗原を樹状細胞に提示する工程；
（ｂ）該樹状細胞のプロセシングおよび該抗原の提示を促進する工程；
（ｃ）該樹状細胞に、細胞表面分子の発現を安定化させることを可能にする工程；
（ｄ）さらなる抗原のプロセシングを防止する工程；ならびに
（ｅ）抗原発現性樹状細胞を、該樹状細胞表面に結合しＴ細胞または他のリンパ球の表面上のＣＴＬＡ−４分子に結合する能力を保持する二重特異性抗体で処理する工程；
を包含する、方法。
【請求項８】
抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）樹状細胞をＧＭ−ＣＳＦで処理して半成熟樹状細胞を得る工程；
（ｂ）該半成熟樹状細胞を目的の抗原でパルスする工程；および
（ｃ）調節性Ｔ細胞の産生を調節する工程；
を包含する、方法。
【請求項９】
ＣＴＬＡ−４に結合し得る二重特異性抗体で、パルスされた半成熟樹状細胞をコーティングする工程をまた包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記目的の抗体が、アロ抗原または自己抗原である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記半成熟樹状細胞が、インビトロで調節性Ｔ細胞の産生を誘導する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記調節性Ｔ細胞を宿主内に注入して同種移植片拒絶を抑制するか、または自己免疫疾患を処置する工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＧＭ−ＣＳＦおよび前記二重特異性抗体が、インビボで導入されて、前記調節性Ｔ細胞の産生を調節する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物において、宿主−移植片拒絶から移植片を防御するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）樹状細胞に対する宿主−移植片拒絶を担う抗原を提示する工程；
（ｂ）二重特異性抗体でコーティングされた樹状細胞をＴ細胞とともに培養して、抗原特異的なＴ細胞寛容を誘導する工程；および
（ｃ）該Ｔ細胞を該宿主に投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項１５】
樹状細胞の成熟に作用するための方法であって、該細胞は、調節性Ｔ細胞を誘導し得る半成熟状態に保持され、該方法は、以下：
（ａ）樹状細胞をパルスする工程；
（ｂ）該樹状細胞をＧＭ−ＣＳＦと接触させる工程；および
（ｃ）該パルスした樹状細胞を適切な二重特異性抗体と接触させる工程であって、一方の腕が、標的または抗原に対する特異性を提供し、もう一方の腕が、ＣＴＬＡ−４連結を提供する、工程；
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）が、一般的であるか、または抗原特異的である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
調節性Ｔ細胞が、Ｔｒｅｇｓが免疫応答を抑制し得るのを媒介するＴＧＦ−βおよび／またはＩＬ−１０を産生する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
Ｔ細胞およびＢ細胞に仲介される自己免疫疾患を処置し、同種移植片拒絶を防止するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）樹状細胞を、目的の抗原の存在下でＧＭ−ＣＳＦで処理する工程であって、該抗原が、アロ抗原または自己抗原である、工程；
（ｂ）半成熟樹状細胞をインビトロまたはインビボで誘導する工程；
（ｃ）半成熟樹状細胞をインビボまたはインビトロのどちらかで抗原提示細胞として使用して、エフェクターＴ細胞の機能を抑制するＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−βを産生し得る調節性Ｔ細胞を誘導する工程；ならびに
（ｄ）該自己免疫疾患を該調節性Ｔ細胞で処置する工程；
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記疾患が、橋本甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、アトピー性皮膚炎および多発性硬化症からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記調節性Ｔ細胞が、インビボで投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
処置の必要な患者に、抗原活性化半成熟樹状細胞を含有する組成物を治療有効量投与する工程を包含する自己免疫疾患を処置する方法であって、該樹状細胞が、ＧＭ−ＣＳＦおよび非樹状細胞前駆体の増殖または成熟を阻害する少なくとも一つの他の因子を含有する培養培地中で組織供給源を培養する工程を包含する方法により産生され、それにより該培養物中で樹状細胞前駆体の産生を増加させる工程；
を包含する、方法であって、
該樹状細胞が、自己タンパク質またはアロ抗原でパルスされ、該樹状細胞が、自己タンパク質をプロセシングして修飾された自己タンパク質抗原またはアロ抗原を産生し、該自己タンパク質抗原またはアロ抗原が該樹状細胞により発現される、方法。
【請求項２２】
Ｔ細胞およびＢ細胞に仲介される自己免疫疾患の発症を予防するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）樹状細胞を、自己免疫疾患の原因である自己抗原を保有する自系組織と一緒にインキュベートする工程；
（ｂ）該樹状細胞を成熟させる工程；
（ｃ）該樹状細胞を、調節型を担うように抗原特異的Ｔ細胞にシグナルを出す二重特異性抗体でコーティングする工程；
（ｄ）調節性Ｔ細胞を使用して、抗原特異的Ｂ細胞を調節して自己免疫疾患の体液性成分を調節する工程；
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（開示の背景）
Ｔ細胞は、細胞性免疫応答の制御の中心として作用している。Ｔ細胞活性は、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされ、それぞれ抗原への攻撃または抗原の無視を生じ得る。特異的抗原をダウンレギュレートする能力または特異的抗原に寛容になる能力は、「自己」抗原（正常な機能のために人の身体に生来存在する分子）の保存に重要である。他方で、非寛容化Ｔ細胞は、人の身体に対して異質である抗原を攻撃し、破壊する。異物の例は、ウイルスまたは癌細胞の表面上にある欠損タンパク質である。
【０００２】
Ｔ細胞は、人の身体の完全性を保存するために異種抗原を攻撃することは、有益であるが、攻撃性Ｔ細胞が問題となる状況が生じ得る。例えば、器官が別のヒト（または動物であったとしても）から身体に移植された後、異種組織の細胞の表面に多数の異種抗原が存在する。Ｔ細胞は、腫瘍と有益な腎臓移植物との間の差を認識しない。従って、Ｔ細胞は、新しく移植された腎臓を身体に有害であるかのように攻撃する。Ｔ細胞による攻撃は、新しい腎臓の破壊を生じる。この事象は、移植の拒絶といわれる。
【０００３】
別のヒトまたは動物から提供された器官の拒絶は、Ｔ細胞が新規の組織の細胞表面上の異種抗原を攻撃しないことを確実にすることにより避けられ得る。医師は、免疫抑制薬を用いてＴ細胞を遮断し、それによりＴ細胞は提供された器官の異種抗原を攻撃しなくなる。従って、異種器官は、身体により耐容され、拒絶されない。残念なことに、免疫抑制薬は、全免疫系を抑制し、そして他の異種抗原（例えば、ウイルスに感染した細胞および腫瘍細胞上に存在する）は、Ｔ細胞によりチェックされず、Ｔ細胞から干渉されることなく増加し得る。実際、免疫抑制薬は、免疫系の他の部分（例えば、Ｂ細胞）を無力化し、身体を細菌、ウイルスおよび真菌生物による攻撃に感受性にさせる。結果的に免疫抑制薬は、器官移植の拒絶をなくすことには有効であるが、また感染性生物の危険性を生じる。この問題は、器官移植レシピエントを感染性因子が可能な限り取り除かれた環境で維持することにより扱われているが、環境を完全に感染性因子のない状態で維持することは不可能である。
【０００４】
免疫系の驚異の一つは、免疫系が、数百万の抗原のそれぞれを個々に認識するように設計されていることである。免疫系に適切な抗原性の情報が提示される場合、Ｔ細胞は、その特異的抗原のみを攻撃する。同様に、Ｔ細胞は、特異的抗原が、適切な様式で免疫系に提示される場合のみ特異的抗原に対して寛容化され得る。従って、移植器官の抗原のみが、寛容に関してＴ細胞に提示される場合、Ｔ細胞は、移植片のみを放置し、感染性因子に対してなお防御する。
【０００５】
任意の所定の抗原に対する免疫応答の調節の中心となるのは、ヘルパーＴ細胞の役割である。これらのＣＤ４＋細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原と複合化した特異的抗原性ペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と相互作用する。二つのシグナルが、Ｔリンパ球の効果的な活性化に必要であることが、一般的に認められている。第一のシグナルは、Ｔ細胞レセプターと、ＭＨＣタンパク質と複合化したそのレセプター特異的抗原性ペプチドとの相互作用により提供される。第二のシグナルは、同時刺激シグナルといわれるが、これはＴ細胞表面タンパク質であるＣＤ２８により送達される二つのシグナルの主要な伝達物質であると現在は考えられている。ＣＤ２８リガンドであるＢ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）は、主に抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に見出されるが、他の非リンパ系組織にも発現される。ＣＤ２８の結合はまたＣＴＬＡ−４の細胞表面発現に増加を生じる。ＣＴＬＡ−４は、重要なＴ細胞表面レセプターであり、ＣＴＬＡ−４を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞応答の下方調節を生じる。ＣＴＬＡ−４ノックアウトマウスは、重篤なリンパ球増殖性の障害から早期に致死に到る。ＴＣＲシグナル伝達およびＣＤ２８架橋の存在下での抗ＣＴＬＡ−４抗体による架橋実験は、Ｔ細胞活性を妨害したことを示す。記憶Ｔ細胞は、ＣＴＬＡ−４に仲介される阻害に対して、未処置の細胞より感受性であった。抗ＣＴＬＡ−４抗体によるＣＴＬＡ−４の結合は、免疫応答に特異的な望ましくない抗原または組織を効果的に抑制する、抗原特異的もしくは標的特異的免疫調節性Ｔ細胞を産生する。ＣＤ２５マーカーを構成的に発現するＴ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞）が、自己応答性Ｔ細胞に対する末梢の寛容を確実にするために重要であることが示唆されている。
【０００６】
樹状細胞は、全ての器官に事実上少数存在する専門的抗原提示細胞（ＡＰＣ）に属する抗原提示細胞（ＤＣ）である。ＤＣは、高度に移動性であり。末梢組織から血液および／またはリンパ管を介してリンパ系器官に移動する点で固有であり、この性質は、一般的に他のＡＰＣとは関連しない。ＤＣの全てのサブタイプの一般的な性質は、その寿命までの間に成熟のいくつかの段階を通過することである。未成熟なＤＣは、低レベルのＭＨＣ−クラスＩＩおよび同時刺激分子を発現するが、これらの分子の表面の発現は、適切な抗原性刺激または炎症性刺激に応答して成熟の際に劇的に増加する。微生物の産物および炎症性ケモカイン（例えば、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびＩＬ−１）により提供される多くの刺激が、ＤＣの移動を誘導し得、ＤＣの表面上のケモカインレセプターおよび接触タンパク質の発現における変化を調節し得る。未成熟なＤＣは、末梢では、エンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスによる抗原の捕捉に特殊化しているが、一旦成熟すると、ＤＣは、抗原を捕捉する能力を失い、高度に有効な抗原提示細胞になる。これらのＡＰＣは、末梢のリンパ系器官におけるネイティブのＴ細胞に特異的な抗原を活性化し、この抗原は捕捉され、両方の細胞型が共存する。そのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）との相互作用に加えて、ＤＣは、いくつかの膜結合レセプターとリガンドとの相互作用を介して、およびサイトカイン産生を介してＴ細胞を活性化し得る。これらの相互作用は、Ｔ細胞応答の大きさに有意に作用し得るだけでなく、Ｔ細胞応答の定性的な性質にも有意に作用し得る。ＤＣの別の注目すべき特徴は、ＤＣがリンパ系器官のＴ細胞区域に移動した後でさえ、抹消組織において抗原が遭遇する能力を維持することである。このことは、ＭＨＣクラス−１／ＩＩペプチドの複合体の蓄積および持続（１００時間より長く）を可能にする。対照的に、クラス−ＩＩペプチド複合体の細胞内の隔離および未成熟ＤＣ内でのＭＨＣ分子へのペプチドロードの遮断は、ＭＨＣとの関連でペプチドの提示を遅延させ得る。これらの事象は、炎症性の刺激により調節され、これは、ＤＣにロードされたペプチドの、リンパ節のＴ細胞区域への移動を促進する。成熟ＤＣの表面上で発現された適切なＭＨＣペプチド複合体は、未処置のＴ細胞を免疫学的なシナプスを形成し、最適なＴ細胞活性化を生じる。
【０００７】
ＣＴＬＡ−４の結合は、調節性Ｔ細胞を誘導し得、自己免疫応答を抑制し得る。ＣＴＬＡ−４は、重要なＴ細胞表面レセプターであり、ＣＴＬＡ−４を介したシグナル伝達じゃ、Ｔ細胞応答の下方調節を生じる。インビボでの末梢Ｔ細胞寛容の誘導がＣＴＬＡ−４の結合を必要とするという証拠は、蓄積し続けている。さらに、最近の研究は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞がＣＴＬＡ−４を構成的に発現することを示し、このことは、ＣＴＬＡ−４を介したシグナル伝達が、これらの細胞の機能および維持に不可欠であることを示唆する。Ｂ７．２の相互作用ではなく、Ｂ７．１のＣＴＬＡ−４との高親和性の相互作用は、Ｔ細胞の下方調節に重要であり、Ｂ７．１のＩｇ定常様ｃドメインは、この高親和性の相互作用に重要である。さらに、Ｂ７．１と活性化Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４との間の相互作用は、調節性表現型を有するＴ細胞を生じる。アロ抗原系、ならびに橋本甲状腺炎のマウスモデルにおけるＣＴＬＡ−４の結合の標的特異的な免疫寛容を生じる効果は、本発明者らにより実証された。このＣＴＬＡ−４の結合により誘導される寛容は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞により仲介され、サイトカイン（ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−β１）は、これらの細胞により産生される。
【０００８】
免疫仲介疾患の経費は、膨大である。米国では、これらの状態は、１００億ドルを上回る直接的および間接的な費用を生じる。自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病および多発性硬化症）は、合わせて米国人口の約５％が罹患している。アメリカの小児の少なくとも７％が喘息であり、米国の５人に１人より多くの個人がアレルギーに罹患している。さらに、免疫に仲介される移植片拒絶は、命を救う可能性のある器官の首尾よい移植に対して依然として大きな障害である  （ＮＩＡＩＤ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、２００１年、１月２３日）。
【０００９】
炎症、自己免疫疾患および移植拒絶に対して有効な介入は、免疫応答をダウンレギュレートする能力を必要とする。これらの状態に対する伝統的な臨床アプローチは、免疫応答の全体的な減衰を生じる免疫抑制薬の投与に依存している。ＡＩＤＳを罹患する患者または移植拒絶を予防する免疫抑制剤を受ける患者により証明されるように、弱められた免疫応答を有する個体は、広い範囲の日和見感染症の因子に対して感受性であり、悪性疾患を発症する危険性が増加する。これらの潜在的に致命的な副作用は、現在の免疫抑制薬の制限要因であり続けている。
【００１０】
他のヒト（または理論的には他の動物から）の器官移植片は、移植された器官の細胞上の抗原を正常に攻撃するＴ細胞がダウンレギュレートされる場合、実現可能になる。
【００１１】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、潜在的に、実験的自己免疫性甲状腺炎（ＥＡＴ）を防止するだけでなく、またその疾患を抑制する。マウスにおけるＧＭ−ＣＳＦに誘導されたＥＡＴの抑制は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の頻度の増加を伴った。この増加は、インビトロでマウスのサイログロブリン（ｍＴｇ）特異的Ｔ細胞応答を抑制し得るが、この抑制の基礎となる機構は、解明されていない。ＧＭ−ＣＳＦは、半成熟表現型（調節性Ｔ細胞の誘導および維持に重要な役割を果たすことが公知であるＤＣの重要な特徴）を有するＤＣを誘導し得る。ＧＭ−ＣＳＦ処置し、ｍＴｇで初回抗原刺激したドナーから、未処置であるがｍＴｇで初回抗原刺激したレシピエントへのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の養子免疫転移は、ｍＴｇ特異的なＴ細胞応答の減少を生じた。さらに、これらの養子免疫転移後のドナーおよびレシピエントから得たリンパ球は、ｍＴｇで初回抗原刺激した未処置のコントロールマウスに比べて有意に高いレベルのＩＬ−１０を産生した。ＧＭ−ＣＳＦ処置したマウスへの抗ＩＬ−１０レセプター（αＩＬ−１０）抗体の投与は、ｍＴｇ特異的Ｔ細胞応答、甲状腺リンパ球浸潤および小胞の破壊の増加によって示されるようにＥＡＴの抑制を誘導した。興味深いことに、ＩＬ−１０レセプターのインビボの遮断は、ＧＭ−ＣＳＦに誘導されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の拡大には影響しなかった。しかし、ＩＬ−１０に誘導された免疫抑制は、ｍＴｇ特異的エフェクターＴ細胞に対するその直接的な効果に起因した。まとめると、これらの結果は、半成熟ＤＣによって誘導されるようなＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって産生されたＩＬ−１０が、ＧＭ−ＣＳＦで処置したマウスにおける疾患の抑制に不可欠であることを示唆した。
【００１２】
樹状細胞（ＤＣ）は、異種抗原に対する有効な免疫応答の誘導に不可欠であるが、それらはまた、自己抗原に対する寛容を促進し維持することにおいて重要な役割を果たし得る。インビトロおよびインビボでのＤＣ表現型および成熟状態の調節は、Ｔ細胞の活性化および分化に大きな効果を有し得、免疫応答を歪める。ＤＣの異なる部分集合は、潜在的にＴｈ１型応答またはＴｈ２型応答に影響し得る。特に、ＣＤ８ａ＋ＤＣの注射は、Ｔｈ１細胞の発生を引き起こすが、ＣＤ８ａ−ＤＣは、可溶性抗原に対するＴＨ２型応答を誘導する。従って、特定のＤＣの部分集合の標的化された拡大は、一つの型から別の型へ免疫応答を移行させるために使用され得、それによって自己免疫疾患の発症を防止する。さらに、ＤＣ成熟は、種々のサイトカインを用いて調節性Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞のどちらかを誘導して調節され得る。
【００１３】
ＣＤ８ａ＋ＤＣもＣＤ８ａ−ＤＣもどちらも、未成熟な場合には最適なＴ細胞応答を誘導し得ないが、成熟するとＴ細胞に対する強力なアクチベーターになる。未成熟なＤＣは、同時刺激分子および炎症誘発性サイトカインの低いレベルの発現によって特徴付けられ、アネルギーを促進し得るが、かなりのレベルのＭＨＣクラスＩＩおよび同時刺激分子を発現するが、成熟ＤＣに比べて低いレベルの炎症誘発性サイトカインを発現する半成熟ＤＣは、調節性Ｔ細胞を誘導し得る。ＤＣの機能的な性質の調節は、自己免疫状態に対して有効な治療アプローチであり得る。
【００１４】
実験的自己免疫性甲状腺炎は、橋本甲状腺炎（ＨＴ）に対する十分に確立されたマウスモデルである。橋本甲状腺炎は、最終的には小胞の破壊を生じる甲状腺のリンパ球浸潤により特徴付けられる器官特異的自己免疫疾患である。ＨＴにおいて、サイログロブリン特異的Ｔ細胞が産生され、それらは、甲状腺に移動する。これらの細胞は、ＩＦＮ−γを産生し、それは、甲状腺細胞上でＭＨＣクラスＩＩの発現を誘導し、さらに活性化されたｍＴｇ特異的Ｔ細胞の拡大および蓄積をさらに生じる。甲状腺破壊の機構は完全には理解されていないが、カスパーゼ活性化を介して甲状腺細胞のアポトーシスを促進し得るＴ細胞を浸潤する甲状腺によるサイトカインの産生を包含するようである。
【００１５】
ＧＭ−ＣＳＦまたはＦｌｔ３−Ｌ（潜在的な樹状細胞増殖因子）の投与は、それぞれＥＡＴの抑制または増加を生じた。ＧＭ−ＣＳＦによる処置は、同時に生じるＩＦＮ−γ産生の減少を伴ったＩＬ−４産生の増加に見られるように、ＣＤ８ａのＤＣを誘導し、Ｔｈ１応答からＴｈ２応答へのサイログロブリンに対する免疫応答の移行を引き起こした。しかし、ＧＭ−ＣＳＦに誘導されるＥＡＴの抑制は、単なるＴｈ２の歪みとは関連しないが、インビトロでｍＴｇ特異的応答を抑制し得るＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の選択的拡大とも関連しなかった。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞は、自己免疫の抑制において、重要な役割を果たす。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の枯渇または存在しないことにより、自己免疫疾患の発症を生じることが報告されている。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞がどのようにして自己免疫を抑制するかは十分に理解されていないが、サプレッサーサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）は関与している。ＧＭ−ＣＳＦ処置マウスにおいて、ＩＬ−１０のレベルのかなりの増加が存在し、ＧＭ−ＣＳＦ処置したマウス由来のリンパ球培養物におけるＩＬ−１０の中和は、ｍＴｇ特異的Ｔ細胞応答を回復した。さらに、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇するＧＭ−ＣＳＦ処置したマウス由来のリンパ球は、同時に生じるインビトロでのＩＬ−１０のレベルの減少を伴うｍＴｇ特異的増殖の増強を示し、このことは、これらの細胞が、ＩＬ−１０の供給源であることを示唆する。
【００１６】
ＧＭ−ＣＳＦに誘導されたＥＡＴの抑制におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＩＬ−１０の直接的な役割の研究は、ＧＭ−ＣＳＦ処置したマウスからｍＴｇ初回免疫刺激したマウスへのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の養子免疫転移が、ｍＴｇ特異的増殖を抑制し得、レシピエントマウス由来の細胞がより高いレベルでＩＬ−１０を産生し得ることを示した。さらに、ＩＬ−１０レセプターのインビボの遮断は、ＧＭ−ＣＳＦに誘導された抑制を排除し得、ＥＡＴの発症を生じるｍＴｇ特異的Ｔ細胞応答を回復し得る。ＧＭ−ＣＳＦ処置したマウスにおける半成熟表現型を有するＤＣの増加が観察された。半成熟ＤＣは、調節性Ｔ細胞を誘導し得るので、本発明者らの結果は、調節性Ｔ細胞の誘導のための機構を示唆した。結果は、ＧＭ−ＣＳＦに誘導されたＥＡＴの抑制におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＩＬ−１０が果たす役割を支持する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
開示される方法および組成物は、抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングされた樹状細胞を包含し、この抗体はまた、特異的抗原または特異的組織に結合し得る。
【００１８】
二重特異性抗体は、特異的抗原または特異的組織にも結合し得る、抗ＣＴＬＡ−４抗体に結合した樹状細胞を含む。
【００１９】
組織特異的寛容を誘導するための方法であって、上記方法は、以下の工程：
（ａ）樹状細胞を目的の抗原で成熟させて、Ｔ細胞を活性化する工程；および
（ｂ）上記活性化Ｔ細胞を抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングされた樹状細胞と接触させ、上記活性化Ｔ細胞の表面にＣＴＬＡ−４を結合させる工程；
を包含する。
【００２０】
抗原特異的寛容を誘導するための方法であって、上記方法は、以下：
（ａ）少なくとも一つの特異的抗原を樹状細胞に提示する工程；
（ｂ）上記樹状細胞のプロセシングおよび抗原の提示を促進する工程；
（ｃ）上記樹状細胞に、細胞表面分子の発現を安定化させることを可能にする工程；
（ｄ）さらなる抗原のプロセシングを防止する工程；ならびに
（ｅ）抗原発現性樹状細胞を、上記樹状細胞表面に結合しＴ細胞または他のリンパ球の表面上のＣＴＬＡ−４分子に結合する能力を保持する二重特異性抗体で処理する工程；
を包含する。
【００２１】
抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導するための方法は、二重特異性抗体でコーティングした樹状細胞をＴ細胞とともに培養する工程を包含する。上記培養は、インビボであり得る。
【００２２】
哺乳動物において、宿主−移植片拒絶から移植片を防御するための方法であって、上記方法は、以下：
（ａ）樹状細胞に対する宿主−移植片拒絶を担う抗原を提示する工程；
（ｂ）二重特異性抗体でコーティングされた樹状細胞をＴ細胞とともに培養して、抗原特異的なＴ細胞寛容を誘導する工程；および
（ｃ）上記Ｔ細胞を上記宿主に投与する工程
を包含する。
【００２３】
樹状細胞の成熟に作用するための方法であって、上記細胞は、調節性Ｔ細胞を誘導し得る半成熟状態に保持され、上記方法は、以下：（ａ）樹状細胞をパルスする工程；（ｂ）上記パルスした樹状細胞を適切な二重特異性抗体と接触させる工程であって、一方の腕が標的／抗原特異性を提供し、もう一方の腕が、ＣＴＬＡ−４連結を提供する工程；および（ｃ）上記細胞をＧＭ−ＣＳＦと接触させる工程を包含する。
【００２４】
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）は、一般的であるか、または抗原特異的である。上記調節性Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇｓが、免疫応答を抑制し得るのを媒介するＴＧＦ−βおよび／またはＩＬ−１０を産生する。
【００２５】
処置の必要な患者に、抗原活性化半成熟樹状細胞を含有する組成物を治療有効量投与する工程を包含する自己免疫疾患を処置する方法であって、上記樹状細胞が、ＧＭ−ＣＳＦおよび非樹状細胞前駆体の増殖または成熟を阻害する少なくとも一つの他の因子を含有する培養培地中で、基質上で組織供給源を培養する工程を包含する方法により産生され、それにより上記培養物中で樹状細胞前駆体の産生を増加させる工程を包含し、上記樹状細胞が、自己タンパク質でパルスされ、上記樹状細胞が、自己タンパク質をプロセシングして修飾された自己タンパク質抗原を産生し、この自己タンパク質抗原が樹状細胞によって発現される。
【００２６】
疾患としては、橋本甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、アトピー性皮膚炎および多発性硬化症が挙げられる。
【００２７】
調節性Ｔ細胞を作製するための方法は、以下：
１．樹状細胞をＧＭ−ＣＳＦで処理して、インビトロまたはインビボで半成熟細胞を誘導する工程、
を包含する。
【００２８】
２．これらの半成熟樹状細胞は、目的のアロ抗原または自己抗原でパルスされ得る。
【００２９】
３．次いで、これらは、ＣＴＬＡ４に結合する能力を有する二重特異性抗体でコーティングされ得る。
【００３０】
４．コーティングされた細胞は、インビトロで調節性Ｔ細胞を誘導するために使用され得る、そして／またはインビボで調節性Ｔ細胞を誘導するために、宿主に接種され得る。
【００３１】
５．インビトロで誘導された調節性Ｔ細胞は宿主に注入されて、同種移植片拒絶を予防／抑制し得るか、または自己免疫疾患を処置し得る。
【００３２】
６．ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＣＴＬＡ−４に結合する能力を有する二重特異性抗体を、一緒にまたは連続して直接接種して、調節性Ｔ細胞をインビボで誘導することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
（開示の詳細な説明）
移植分野の最先端は、全Ｔ細胞を抑制し、移植片の異種抗原がＴ細胞によって攻撃されないようにする（すなわち、身体が移植された器官を拒絶しないようにする）ことに関する。このアプローチの欠点は、全免疫系が抑制されて、感染性因子または癌性腫瘍の異種抗原が認識されないことである。身体は、防御そのものに無力になる。開示される方法は、移植された器官を拒絶する免疫応答の部分のみの抑制をもたらし、これによって免疫系が有害な異種因子に対して身体を防御することを可能にする（図１）。
【００３４】
所望の抗原（例えば、移植された器官の抗原）をＴ細胞に提示し、これによってＴ細胞にこれらの抗原を無視させるための方法が開示される。この方法は、結合分子を使用して、ＣＴＬＡ−４表面分子を介したＴ細胞のダウンレギュレーションのために抗原提示細胞とＴ細胞とを非常に近接させる。抗原の抗原提示細胞への提示は、二重特異性抗体複合体による抗原提示細胞のコーティングのように、インビトロで行われる。次いで、抗原提示細胞は、インビボで付与され、二重特異性抗体複合体の遊離（ｆｅｅ）結合部位がＴ細胞を見出して寛容化する。
【００３５】
全身性の免疫抑制は、器官移植片に対して必要とされるだけでなくが、身体が身体の「良い」細胞を攻撃する任意の状況においても必要とされる。例えば、自己免疫疾患の全ては、未知の理由により、共通のＴ細胞攻撃「自己」抗原を有する。自己免疫疾患は、多数あり、これらとしては、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、全身性硬化症、狼蒼、橋本甲状腺炎などが挙げられる。
【００３６】
本明細書において開示される方法および組成物は、所与の所望されない免疫応答に特異的に関与するこれらのリンパ球の標的化された除去または不活性化に関与する一方、残りの免疫系をインタクトのまま残すことに関する。この特異的除去は、所与の抗原特異性または組織特異性を有するこれらのリンパ球のみを不活性化する工程を包含し、これによって日和見感染、悪性疾患もしくは他の副作用を回避し得る。
【００３７】
抗原特異的な様式でＴ細胞にＣＴＬＡ−４を結合するための方法論は、ＣＴＬＡ−４の強力な阻害性シグナル伝達特性と樹状細胞（ＤＣ）の並外れた抗原提示特性とを組み合わせる。ＤＣ結合抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＤＣ上のＭＨＣ抗原性ペプチドのＴＣＲ結合によって活性化Ｔ細胞の表面に結合する。これは、Ｔ細胞活性化を抑制し、次いで、目的の抗原に特異的なＴｒｅｇ細胞誘導を引き起こす。
【００３８】
ＣＴＬＡ−４結合を介した抗原特異的寛容誘導は、二重特異性抗体を使用する。寛容は、樹状細胞結合抗ＣＴＬＡ−４によるＴ細胞上のＣＴＬＡ−４を介したシグナル伝達によって、抗原特異的な様式で誘導される。抗ＣＴＬＡ−４抗体は、架橋し、Ｔ細胞寛容をもたらすＣＴＬＡ−４シグナルを誘導することが知られている。抗ＣＴＬＡ−４抗体のこのシグナル伝達能力は、抗原特異的な様式で操作される。この目的のため、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、樹状細胞特異的抗体に結合され、樹状細胞は、特異的抗原でパルスされた樹状細胞でコーティングされ、これによってインビボまたはインビトロでの送達において、ＢｉＡｂの抗ＣＴＬＡ−４部分は、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４に結合し、Ｔ細胞を弱らせる。
【００３９】
開示された方法および組成物は、以下の理由に起因して、有用である：１．自己免疫性標的抗原に対する寛容を誘導し、種々の自己免疫状態を防止／処置する；２．アロ抗原または異種抗原に対する寛容を誘導し、移植組織（例えば、膵臓の島、腎臓、心臓、肝臓、象徴、皮膚など）の拒絶を防ぐ；３．アレルゲンに対する寛容の誘導；４．遺伝子治療用途におけるトランスジーンの産物およびそれらのキャリアベクターに対する寛容の誘導；５．対宿主性移植片病の処置；６．炎症状態（例えば、炎症性腸疾患）に対する寛容の誘導；７．分子的模倣を介して自己免疫疾患もしくは炎症性免疫媒介性疾患の誘導体として作用する、細菌病原もしくはウイルス病原に対する寛容の誘導。
【００４０】
選択的組織特異的（または抗原特異的）免疫調節の誘導のための臨床的に有用な療法の開発は、一般的に、以下の基準を満たす：１．所望されない免疫応答に関与するＴ細胞の特異的不活性化；２．全ての他の抗原に対する免疫応答に対する影響をほとんど有さないか、まったく有さず、したがって日和見感染もしくは免疫監視の不全の危険を最小限にする；３．毒性の副作用のない生物学的に分解可能な因子を含む；４．種々の疾患状態において異なる組織型で発現される種々の抗原に対する免疫抑制に指向するための柔軟性を有する；５．併用免疫調節療法のために、標的抗体への種々の阻害シグナルに結合する能力を有する。
【００４１】
抗原特異的免疫調節療法に対するこのアプローチは、遺伝子治療と異なり、多岐にわたる組織および抗原に対して介入する柔軟性を有する。その投薬量は、容易に力価測定されて、所望の効果を達成し得るか、または有害な副作用の事象を迅速に終わらせ得る。これは、免疫監視の長期阻害および悪性疾患の発現の遅延に関する問題を最小にする。
【００４２】
バリエーションとしては、以下が挙げられる：１．任意の樹状細胞表面分子、器官もしくは組織に結合し得、そして抗ＣＴＬＡ−４抗体と化学的に結合した抗体。この二重特異性抗体は、移植前もしくは自己免疫プロセスの間に樹状細胞上または標的組織にコーティングされる；２．目的の組織とＣＴＬＡ−４との療法に特異性を有する遺伝的に操作された抗体が作製される。この遺伝的に操作された抗体は、化学的に架橋された抗体と少なくとも同じ程度に有効である；３．樹状細胞組織または標的組織は、抗ＣＴＬＡ−４抗体によって受動的にまたは能動的に（化学的修飾によって）コーティングされる；４．ＭＨＣを介して提示されるペプチドは、化学的に、遺伝的操作を介して、または任意の同等の手段を介して生成され得る。
【００４３】
抗ＣＴＬＡ−４抗体のシグナル伝達能力は、組織特異的な様式で操作される。この目的のため、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、組織特異的抗体に結合され、インビボ送達もしくはインビトロ送達によって、抗体は目的の組織に結合して、標的組織に特異的な組織攻撃性Ｔ細胞を弱める。例えば、膵臓島Ｔ細胞は、自己免疫ならびにアロ免疫応答もしくは異種免疫応答から、島を、抗島Ｔ細胞特異的抗体（例：Ｇｌｕｔ−２もしくはＭＨＣクラスＩ抗体）を抗ＣＴＬＡ−４抗体に結合させることによって作製された二重特異性抗体でコーティングすることによって、防御される。目的の組織に特異的なあらゆる抗体は、抗ＣＴＬＡ−４に結合されて、特定の組織を防御するために使用され得る。
【００４４】
ＧＭ−ＣＳＦは、免疫系に対するその効果を延長および増強し、かつ任意の所望されない効果を防ぐように、改変され得る。
【００４５】
半成熟樹状細胞は、そのＴｒｅｇ誘導効率を増強するように、さらに改変または処理され得る。
【実施例】
【００４６】
（実施例１：抗ＣＴＬＡ−４抗体コーティングされたＤＣを使用した免疫寛容および調節性Ｔ細胞の誘導）
組織標的化ＣＴＬＡ−４結合方法の制限（組織特異的抗体に対する要求）を克服し、抗原特異的様式で頑強なＴｒｅｇ細胞応答を誘導するための新規のアプローチは、抗ＣＴＬＡ−４抗体コーティングされた抗原でパルスされたＤＣを使用して、その特異的抗原に対する寛容およびＴｒｅｇ細胞を誘導する。抗原でパルスされたＤＣは、抗ＣＤ１１ｃ抗体に対する抗ＣＴＬＡ−４抗体の結合の後に、架橋抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングされる。これらの細胞は、オボアルブミン（ｏｖａ）もしくはサイログロブリン（Ｔｇ）のいずれかでパルスされて、１０日前にこれらの抗原で初回免疫されたマウスに静脈内注入される。抗ＣＴＬＡ−４抗体コーティングされたＤＣを注入されたマウスは、アイソタイプコントロール抗体でコーティングされたＤＣを受容したマウスと比較して、有意に抑制されたＴ細胞増殖およびＩＬ−２産生を示したが、同じ抗原でのエキソビボ再刺激によりＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１応答の上昇を示した（図２４）。これらのマウスは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞集団の有意な上昇を示した（図２４）。
【００４７】
マウス（試験群）がｏｖａで２回免疫され、そして抗ＣＴＬＡ−４コーティングされたｏｖａでパルスされたＤＣで２回処理され、１５日間休止する場合、記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞数は、アイソタイプコントロール抗体コーティングされたＤＣを受容したマウス（コントロール群）と比較してより低下した。記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞数は低下したが、これらのマウスは、約７０％大きいＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を示した。ナイーブＣＤ２５＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ）数は、試験群とコントロール群とでほぼ同じであったが、記憶Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）数は、試験マウスにおいてはコントロールマウスと比較して約１５０％であった（図２５）。これらのＴｒｅｇ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞応答を、ナイーブ表現型によるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞と比較して、より強く抑制し得る（図２６）。このことは、試験群において産生された多数の記憶細胞がＴｒｅｇ細胞表現型を有し、そしてそれらが寛容を維持するのに重要であることを示唆する。
【００４８】
６０％を超えるＮＯＤマウスが、２０週齢以内に自発性糖尿病（グルコースレベル、＞２５０ｇ／ｄｌ）を発症した。最近、抗ＣＴＬＡ−４  コーティングされたＤＣアプローチをＮＯＤマウスにおいてインビトロで試験した。３つのＧＡＤ−６５ペプチド（ＧＡＤ２０６−２２６、ＧＡＤ２１７−２３６およびＧＡＤ２８６−３００）のプール（これは、ＮＯＤマウスにおける自己反応性Ｔ細胞に対する一次および初期標的である）を、糖尿病マウスから回収したＴ細胞を用いたインビトロ実験における抗原として使用した。図２７に示されるように、数は少ないが、これらのペプチドに対する自己反応性Ｔ細胞は、糖尿病マウス中に存在した。前糖尿病マウスから回収されたＤＣ（ＬＰＳおよびＴＮＦ−αでエキソビボにおいて処理された）を、これらのペプチドでパルスし、（ＢｉＡｂアプローチを用いて）抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングし、糖尿病マウス由来のＣＤ３＋Ｔ細胞に対して試験した。図２８に示されるように、抗ＣＴＬＡ−４抗体コーティングされたＤＣは、コントロール抗体でコーティングされたＤＣと比較して、Ｔ細胞応答を有意に抑制した。これらの結果は、ＤＣ結合抗ＣＴＬＡ−４抗体による免疫学的シナプスにおけるＣＴＬＡ−４の結合が、ＮＯＤマウスにおいてさえネガティブシグナルを送達し、Ｔｒｅｇ細胞の分化を誘導することを示唆する。
【００４９】
上記の観察は、異なる手段によってＴｒｅｇ細胞が産生され得ることを示す。種々の条件下で異なって産生されたＴｒｅｇ細胞の表現型（およびその阻害性の性質）は、多様であり得る。例えば、上記のように、３つの異なるサイトカイン誘導パターン（ＴＧＦ−β１単独、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−４およびＩＬ−１０、またはＩＬ−１０単独）を有するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞集団が、３つの異なる実験において観察された。これは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞は単一の集団を含むように見えるが、機能的および／または表現型的に異なる下位集団が存在し得ることを示唆する。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体コーティングされた、ｏｖａまたはＴｇでパルスされたＤＣは、記憶表現型を伴う頑強なＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞応答を誘導した（図２５）。
【００５０】
（実施例２：二重特異性抗体を使用したＣＴＬＡ−４結合を介した組織特異的寛容誘導（図２））
二重特異性抗体を用いたＣＴＬＡ−４結合の、組織式特異的寛容を誘導する治療上の潜在力を、甲状腺刺激ホルモンレセプターに対して特異的な抗体に結合した抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用して調べた。インビボ投与の後、この二重特異性抗体（ＢｉＡｂ）は、マウスサイログロブリン（ｍＴｇ）で免疫されたマウスにおいて、甲状腺に蓄積され、実験的自己免疫性甲状腺炎（ＥＡＴ）の発祥を防止した。ＢｉＡｂ処置マウス由来のリンパ球は、ｍＴｇ再刺激に応じて増殖し、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αを産生するその能力において、未処置マウス由来のリンパ球と比較して、有意な減少を示した。さらにＢｉＡｂ処置マウスは、抗ｍＴｇ抗体応答、甲状腺のリンパ球浸潤、および濾胞破壊の抑制を示した。ＢｉＡｂは、甲状腺を標的し、おそらくＣＴＬＡ−４の結合を促進し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数の増加をもたらした。これらの調節性Ｔ細胞は、インビトロのｍＴｇ特異的Ｔ細胞応答を抑制し、これはトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−β１産生の増強に関連した。ＴＧＦ−β１の中和は、ＢｉＡｂ処置マウス由来のＴ細胞のｍＴｇ特異的インビトロ増殖、およびＢｉＡｂ処置マウス由来のＴ細胞によるＩＬ−２産生を増加させた。活性化自己反応性Ｔ細胞上に発現されたＣＴＬＡ−４の、甲状腺に密接した結合は、調節性Ｔ細胞の数、およびＴＧＦ−β１を産生する能力を上昇させ、それに伴ってＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを減少させ、ＥＡＴの抑制をもたらす。
【００５１】
抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングされた同種異系細胞は、炎症誘発性サイトカインＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の抑制ならびに調節性サイトカインＩＬ−１０、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−４のアップレギュレーションを介して、おそらく活性化Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４の結合を介して、免疫反応性低下を誘導した。アロ抗原による再チャレンジは無反応性を破ることはできないが、高濃度の外因性ＩＬ−２、飽和濃度の中和性抗ＴＧＦ−β１抗体および抗ＩＬ−１０抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体遮断の存在下で、ならびにＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の枯渇によって、一過性の寛容からの回復が観察された。寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ−４ｈｉｇｈＴｒｅｇ細胞は、抗原初回免疫マウス由来のＣＤ２５−Ｔ細胞のエフェクター機能を抑制した。抗原初回免疫マウスへのこれらのＴｒｅｇ細胞の養子免疫転移は、有意に減少したアロ抗原特異的応答をもたらした。さらなる特徴づけは、免疫表現型（ＣＤ６２Ｌ−）を有するＴｒｅｇ細胞が、アロ抗原特異的Ｔ細胞応答の抑制においてより協力であることを実証した。これらの結果は、ＣＴＬＡ−４の標的化された結合が、移植片拒絶の防止に関する治療上の潜在力を有することを示す。膵臓島へのＢｉＡｂのコーティングは、島へのＴ細胞応答を抑制し得る（図１０、１１、１２および１３）。
【００５２】
図３、４、５および６は、寛容を誘導した二重特異性抗体（標的特異的抗体＋抗ＣＴＬＡ−４抗体）が、調節性Ｔ細胞産生の増加に関連することを示し、そしてこれらの節性Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞への効果を示す。これらの結果はまた、標的特異的Ｔ細胞寛容を誘導したＢｉＡｂが、特異的免疫調節性Ｔ細胞に関連することを示す。このことは、ＢｉＡｂ処置動物の、ＢｉＡｂコーティングされた細胞上に発現されていない他の抗原に応答するそれらの能力を保持する能力を介して示された。
【００５３】
（実施例３：Ｔ細胞寛容は、標的化ＣＴＬＡ−４結合により誘導される）
ＢｉＡｂ療法を通じて誘導された免疫抑制をさらに特徴付けするため、コントロール抗体またはＣＴＬＡ−４抗体でコーティングされた同種異系ｍＭ１２細胞を、ＣＢＡ／Ｊマウスに注入した。１つの群（ＢｉＡｂ処理群２）のマウスは、チャレンジ免疫の間のみ抗ＣＴＬＡ−４コーティングされたｍＭ１２細胞を受容し、第二の免疫応答の間にＴ細胞応答が制御され得るか否かを試験した。図１４に示されるように、コントロール抗体でコーティングされたｍＭ１２細胞で免疫されたマウス由来の脾臓細胞は、ｍＭ１２細胞によるエキソビボ再刺激において、強力なＴ細胞増殖性、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの応答を示したが、抗ＣＴＬＡ−４抗体コーティングされたｍＭ１２細胞で両方の時間または第二の免疫の間のみ免疫されたマウスは、有意に減少したＴ細胞増殖、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの応答を示した。興味深いことに、ＣＴＬＡ−４結合によって誘導された自己免疫抑制は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１の産生の増加に関連した（図１４ｂ）。抗ＣＴＬＡ−４抗体コーティングされたｍＭ１２細胞を受容したマウス由来の脾臓細胞は、コントロール抗体でコーティングされたｍＭ１２細胞を受容したマウス由来の脾臓細胞と比較して、これらのサイトカインの約３〜４倍高いレベルを示した。ＣＴＬＡ−４結合による炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２）の低レベルの産生ならびに調節性サイトカイン（ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１０およびＩＬ−４）の産生の増加は、抗ＣＴＬＡ−４抗体コーティングされた同種異系細胞を受容したマウスにおけるアロ反応の抑制において、重要な役割を果たしているようにみえる。
【００５４】
（実施例４：ＣＴＬＡ−４結合で誘導される免疫抑制は持続性である）
図７、８、および９は、ＢｉＡｂに誘導された免疫寛容が持続的であり、標的細胞に特異的であることを示す。１つの標的に誘導された寛容は、別の標的に対して免疫系の能力への効果を有さない。
【００５５】
抗原特異的無反応性の持続性を試験するため、マウスから、それらの最後のＢｉＡｂ処理受けた１０日後に、脾臓細胞を回収した。これらの脾臓細胞をＭ１２細胞でインビトロにおいて５日間刺激した。これらの培養物から細胞を回収し、Ｍ１２細胞による再刺激に応答するそれらの能力について試験した。寛容マウス由来の脾臓細胞は、エキソビボ再チャレンジにおいて、寛容からの回復の徴候を示さず、Ｍ１２細胞による三次刺激に応じて、増殖または有意な量のＩＬ−２を産生することはできなかった（図１５ａおよびｂ）。しかし、試験群由来の細胞およびコントロール群由来の細胞の両方は、分裂促進刺激（ＣｏｎＡ）に応答し、このことは明らかに、細胞が生存可能であり、増殖し得ることを示す。これらの結果は、ＣＴＬＡ−４結合により誘導されたアロ抗原に対する寛容が、エキソビボアロ抗原チャレンジによって容易に逆転し得ることを示唆する。次に、ＣＴＬＡ−４結合によって誘導された寛容が、アロ抗原によるインビボチャレンジによって逆転し得るか否か、そしてそれが長期持続性であるか否かを試験するため、コントロール（ｍＭ１２免疫）マウスおよび試験（ＢｉＡｂ処理）マウスの両方を、５０日間そのままにし、６０日目にＭ１２細胞でチャレンジし、これらのマウス由来の脾臓細胞を、エキソビボＭ１２再刺激に対するそれらの応答について試験した。図１５ｂに示されるように、寛容（ＢｉＡｂ処理）マウス由来の脾臓細胞は、Ｍ１２細胞に対するその応答に上昇を示さなかった。このことは、ＣＴＬＡ−４結合によって誘導された寛容が、アロ抗原によるインビボチャレンジ後でさえも維持されることを示唆する。
【００５６】
（実施例５：標的化されたＣＴＬＡ−４結合により誘導される寛容は、標的特異的である）
ＣＴＬＡ−４結合による抗Ｈ２ｄ免疫応答の抑制の特異性を、ＢｉＡｂコーティングされたｍＭ１２細胞であらかじめ免疫されたマウスを、（ａ）異なるマウス系統（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、Ｈ２ｂ）由来の脾臓細胞、（ｂ）脾臓細胞（Ｂａｌｂ／ｃマウス、Ｈ２ｄ）および無細胞系（Ａｇ８、Ｈ２ｄ）で、第２０日目；第３０日目において免疫することによって、試験した。これらのマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓細胞、Ａｇ８およびＭ１２細胞による再刺激に対するＴ細胞増殖およびＩＬ−２産生について試験した。抗ＣＴＬＡ−４抗体コーティングされたｍＭ１２細胞で免疫されたマウスおよびコントロール抗体でコーティングされたｍＭ１２細胞で免疫されたマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６脾臓細胞に対して同じレベルのＴ細胞増殖およびＩＬ−２応答を示した（図１６ａ）。しかし、Ｂａｌｂ／ｃ脾臓細胞およびＡｇ８細胞に対する応答のパターンは、ｍＭ１２細胞で刺激された場合に示されたパターンとほぼ同様であった（図１６ｂおよびｃ）。これらの結果は、ＣＴＬＡ−４結合によってＨ２ｄアロ抗原に対する免疫応答の間に誘導されるＴ寛容が、標的特異的であり、同じ抗原（すなわちＨ２ｄ）を保有する細胞に対して有効であるが、他の抗原を保有する（すなわち、Ｈ２ｂ）細胞に対して有効でないことを示唆する。
【００５７】
（実施例６：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、寛容マウスにおいて選択的に増殖する）
寛容誘導がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の変化に関与していたか否かを知るため、ナイーブマウス、コントロールマウスおよび寛容マウスを第２０日目に屠殺し、マウス由来のリンパ節細胞と脾臓細胞とをフローサイトメトリーによってＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団について分析した。ｔＢｉＡｂ処置（寛容）マウスにおいて脾臓およびＬＮの両方に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージにおける有意な増加が観察されたが、コントロールマウスにおいては観察されなかった（図１７）。寛容マウス由来のリンパ様細胞におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージの増加が単にＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の減少に起因するものであるか否かを試験するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団内のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の両方のパーセンテージならびに脾臓中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の絶対数を測定した。図１７ａに示されるように、コントロールに対して、寛容マウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞中において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のかなりの増加があった。しかし、Ｔ細胞集団内のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の数には、処置マウスと未処置マウスとで有意な差はなかった。ＢｉＡｂ処置マウス由来の脾臓におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の絶対数に、コントロールマウス由来の細胞数と比較して、有意な増加があった。例えば、コントロールマウスは、脾臓あたり、平均で１．７４×１０７のＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞および１．６２×１０６のＣＤ２５＋Ｔ細胞を示すが、寛容マウスは、平均で１．７６ｘ１０７のＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞および２．５ｘ１０６のＣＤ２５＋Ｔ細胞を示した。ＣＤ２５＋Ｔ細胞における同様の増加はまた、寛容マウスのリンパ節においても観察された。
【００５８】
ＣＴＬＡ−４がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞上に構成的に発現され、そしてインビボおよびインビトロにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の調節性活性の媒介に関与することが示された。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞上でのＣＴＬＡ−４発現が決定された。図１７ｂに示すように、寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、コントロールマウスもしくはナイーブマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞と比較して、ＣＴＬＡ−４の増加した発現を示した。
【００５９】
（実施例７：エキソビボチャレンジによるＢｉＡｂ処置マウスにおけるＴ細胞表現型）  
ＢｉＡｂ処置マウス由来の脾臓細胞の表現型変化を試験するため、脾臓細胞を標的（Ｍ１２）細胞とともにインキュベートし、そして異なる時点において種々のマーカーについて試験した（図１８）。初期活性マーカーＣＤ６９を発現する細胞の数は、ＢｉＡｂ処置マウス由来の脾臓細胞において、刺激の２４時間後、コントロール免疫マウスと比較して有意に少なかった（図１８ａ）。種々のサイトカイン分泌細胞の数を、刺激の３６時間後、細胞内染色によって決定した。ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞の数は、寛容マウスと比較してｍＭ１２免疫マウスにおいて有意に多かったが、より多くのＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１産生細胞が寛容マウスにおいて観察された（図１８ｂ）。記憶マーカーＣＤ６２Ｌの発現を、刺激の５日後に試験した。この記憶マーカーを発現するＴ細胞の数は、コントロールと比較して、ＢｉＡｂ処置マウス由来のＣＤ３＋細胞において有意に少なかった（図１８ｃ）。調節性Ｔ細胞表現型を試験するため、類似の培養物由来の細胞を徹底的に洗浄し、３日間静置し、そしてＣＤ２５発現について分析した。寛容マウス由来の脾臓細胞におけるＣＤ２５を発現するＣＤ４＋細胞の数は、コントロール免疫マウスのほぼ２倍であった（図１８ｄ）。
【００６０】
寛容マウスおよびコントロールマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方による、Ｍ１２細胞に対する増殖応答を、ＣＦＳＥ希釈アッセイによってエキソビボでモニタリングした。ＣＦＳＥ染色された脾臓細胞を、Ｍ１２細胞とともに７日間インキュベートし、そしてＰＥ標識された抗ＣＤ４抗体もしくは抗ＣＤ８抗体で染色した後にＣＦＳＥ希釈について分析した。図１８ｅに示されるように、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖応答は、免疫コントロールと比較して、寛容マウス由来の脾臓細胞において有意に低い。ナイーブマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方は、長期にわたる細胞分裂を示したが、寛容マウスおよびナイーブマウスの両方に由来するこれらの細胞によって経験される分裂数は、ほぼ同じであるようにみえた。このことは、寛容マウス由来の全てのアロ抗原反応性Ｔ細胞が寛容化されていなくともよく、そして抗原反応性エフェクター細胞は、寛容化マウスになお存在し得ることを示唆する。
【００６１】
（実施例８：外来性ＩＬ−２は、アロ抗原に対する無反応性を部分的に逆転したが、寛容を逆転しなかった）
外来性ＩＬ−２がＣＴＬＡ−４結合により誘導された寛容を逆転し得るか否かを試験するため、Ｍ１２細胞および種々の量の組換えマウスＩＬ−２（ｒｍＩＬ−２）を、種々のマウスの脾臓細胞に加えた。図１７は、外来性に加えられたｒｍＩＬ−２の非存在下もしくは存在下のいずれかにおける、抗原性の再刺激後の脾臓細胞の増殖性応答ならびにｒｍＩＬ−２単独での応答を示す。少量のｒｍＩＬ−２の添加は寛容化マウス由来のＴ細胞の有意な増殖を誘導しなかったが、部分的な回復（コントロールマウスと比較して６０％まで）が、高濃度のｒｍＩＬ−２の存在下で観察された。さらに、反応性低下状態は、ＩＬ−２およびアロ抗原の両方の存在下においてのみ逆転されたが、アロ抗原またはＩＬ−２単独では逆転されなかった。このことは、反応性低下は、抗原と過剰なレベルのＩＬ−２とが同時に存在する場合にのみ逆転され得ることを示唆する。
【００６２】
寛容マウス由来のＴ細胞によるアロ抗原に対する三次応答を評価するため、上記の培養物由来のエフェクター細胞（図１９ａ）を第５日目において回収し、洗浄し、静置し、新鮮な標的Ｍ１２細胞とともにインキュベートした。興味深いことに、寛容Ｔ細胞は、ＩＬ−２およびアロ抗原に反応して増殖するが、その後の三次刺激におけるアロ抗原との遭遇の間、なお無反応性であっ（図１９ｂ）。このことは、これらの細胞が寛容を維持し続けており、寛容（増殖によって測定される）の逆転は高レベルのＩＬ−２およびアロ抗原の存在下においてのみ起こることを示す。
【００６３】
（実施例９：ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１は、寛容マウス由来のＴ細胞の反応性低下に重要な役割を果たす）
標的化されたＣＴＬＡ−４結合による寛容誘導において、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１の増加ならびにＩＦＮ−γのような炎症誘発性サイトカインの減少があった。ＣＴＬＡ−４結合によって誘導される阻害効果がこれらの阻害性サイトカインに依存するか否かを決定するため、それらに対する中和性抗体をエキソビボで細胞培養物に添加した。図１９ｃに示されるように、ＩＬ−４の遮断は、Ｍ１２刺激に対する寛容細胞の増殖性応答に何も有意な効果を示さなかったが、抗体の飽和濃度におけるＩＬ−１０の中和は、（中和抗体の非存在下でのコントロール脾臓細胞と比較して）反応性低下からの部分的な回復をもたらした。しかし、ＴＧＦ−β１に対する中和抗体単独または抗ＩＬ−１０抗体との組み合わせは、Ｔ細胞の、反応性低下からのほぼ完全な回復をもたらした（図１９ｃ）。中和抗体の存在下において増殖し得る細胞は、三次刺激内容物において抗体が除去されて新鮮な標的細胞が使用された後、反応性低下をとった。
【００６４】
（実施例１０：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４は、寛容の維持に重要である）
図１７ｂで観察されるように、寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、その表面に増加したレベルのＣＴＬＡ−４が発現される。増加したＣＴＬＡ−４発現の寛容に対する役割を試験するため、抗ＣＴＬＡ−４抗体の遮断性Ｆ（ａｂ）フラグメントを種々の濃度で添加した。飽和濃度での抗ＣＴＬＡ−４  Ｆ（ａｂ）の添加は、Ｔ細胞の、反応性低下からのほぼ完全な回復をもたらした（図１９ｃ）。このことは、標的細胞上のＢ７分子によるＣＴＬＡ−４の直接的結合が、アロ抗原に対する反応性低下を開始させるために必要であり得ることを示唆する。
【００６５】
（実施例１１：ＧＭ−ＣＳＦ誘導ＤＣは、半成熟表現型を維持する）
ＤＣの成熟に対するＧＭ−ＣＳＦ処置の効果を決定するため、ＭＨＣクラスＩＩおよび同時刺激性分子の発現、ならびにｍＴｇ免疫の前後に、ＧＭ−ＣＳＦ処置マウスおよび未処置マウスから単離されたＤＣからの炎症誘発性サイトカインの産生を分析した。ＧＭ−ＣＳＦで処理されたマウス由来の脾臓は、未処置コントロール（３．６１  ％）と比較して、増加した数のＣＤ１１ｃ＋細胞（７．５１％）を示した（図２９Ａ）。樹状細胞数の増加にもかかわらず、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７．１、Ｂ７．２およびＣＤ４０の発現レベルは、ｍＴｇでの免疫後、ＧＭ−ＣＳＦ処置マウスおよび未処置マウスの両方において類似していた（図２９Ｂ）。しかし、ＲＴ−ＰＣＲによって評価された炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２およびＩＬ−１α）は、ＧＭ−ＣＳＦ処置ｍＴｇ免疫マウス由来のＤＣと比較して、未処置ｍＴｇ免疫マウス由来のＤＣにおいて有意に高かった（図２９Ｃ）。これらのデータは、ＧＭ−ＣＳＦ処置由来のＤＣは、ｍＴｇ免疫後に半成熟状態を維持するが、未処置マウスにおいてはそうではないことを意味すると解釈される。
【００６６】
（ＧＭ−ＣＳＦ処置マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、インビボにおける抗ｍＴｇ応答を抑制する）
ＧＭ−ＣＳＦ処置マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞がインビボにおけるｍＴｇ特異的自己免疫応答を抑制し得るか否かを決定するため、ＧＭ−ＣＳＦ処置およびｍＴｇ初回刺激をされたマウス由来の精製されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、ｍＴｇで初回刺激された未処置マウスに養子免疫転移した。図３０Ａに示すように、ＧＭ−ＣＳＦ処置マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を受容するマウスは、ｍＴｇコントロールマウスと比較して、有意に低いｍＴｇ特異的増殖を示した（ｐ＝０．０２１）。種々のマウス群由来の脾臓細胞によるｍＴｇ誘導性サイトカイン産生の分析は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞レシピエントおよび非レシピエントｍＴｇコントロールマウスの両方において、同様のレベルのＩＦＮ−γを示した（図３０Ｂ）。対照的に、レシピエントマウス由来の細胞は、非レシピエントｍＴｇ初回刺激マウスに対して、有意に多い量のＩＬ−４（ｐ＝０．０４５）およびＩＬ−１０（ｐ＝０．０３５）を産生した（それぞれ、図３０ＣおよびＤ）。
【００６７】
（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって産生されたＩＬ−１０は、ｍＴｇ特異的Ｔ細胞応答を抑制するために重要である）
ＧＭ−ＣＳＦ誘導性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって産生されたＩＬ−１０がｍＴｇ特異的Ｔ細胞応答を抑制することの原因であるか否かを決定するため、未処置ｍＴｇ初回刺激マウス由来のＴ細胞を、ｍＴｇ初回刺激ＧＭ−ＣＳＦ処置マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞と、抗ＩＬ−１０レセプター（αＩＬ−１０Ｒ）ｍＡｂもしくはアイソタイプコントロールの存在下において共培養した。ナイーブマウス由来のＴ細胞枯渇脾臓細胞（図３１Ａ）または単離ＤＣ（図３１Ｂ）を、フィーダー細胞として使用した。図３１に示すように、アイソタイプコントロールＡｂの存在下でｍＴｇ初回刺激ＧＭ−ＣＳＦ処置マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞とともに培養されたｍＴｇ初回刺激Ｔ細胞は、コントロールと比較して、減少したＣＦＳＥ希釈（２．４２％および１１．４６％と比較して、それぞれ０．７２％および８．１８％）によって示されるように、低下したｍＴｇ特異的Ｔ細胞増殖を示した。しかし、この応答は、αＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂの存在下では、コントロールレベルをとるかまたはより高いレベルをとった（すなわち、２．１５％および１６．６２％）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって産生されたＩＬ−１０は、ｍＴｇ特異的増殖を抑制するために必要である。
【００６８】
（αＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂによる処置は、ＥＡＴのＧＭ−ＣＳＦ誘導性抑制を無効にする）
ＥＡＴのＧＭ−ＣＳＦ誘導性抑制におけるＩＬ−１０の役割を調べた。ＩＬ−１０の効果を、疾患誘導の間の種々の時間におけるＧＭ−ＣＳＦ処置マウスに対する飽和濃度のαＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂの投与によって、遮断した。投与時間にかかわらず、ＧＭ−ＣＳＦ処置の直後にαＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂで処置された一部のマウス（すなわちＧＭ−ＣＳＦ／αＩＬ−１０Ｒ  ＃２）を除いて、αＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂを受容したほぼ全ての動物が、ＧＭ−ＣＳＦとアイソタイプコントロールｍＡｂとを受容したマウスに対して、増加したｍＴｇ特異的増殖を示した。増殖における有意な増加は、ＧＭ−ＣＳＦ処置後５日目αＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂを受容するマウス（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ／αＩＬ−１０Ｒ  ＃３）、または疾患の経過全体にわたってαＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂを受容するマウス（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ／αＩＬ−１０Ｒ  ＃１）において見出された（それぞれ、ｐ＝０．００１およびｐ＝０．００５）（図３２Ａ）。αＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂの投与の時間にかかわらず、全ＧＭ−ＣＳＦ処置マウスにおいてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の頻度の増加が観察された（図３２Ｂ）。このことは、ＩＬ−１０の遮断が、ＧＭ−ＣＳＦ誘導性ＤＣによるこれらの細胞の増殖に効果を有さないことを示唆する。
【００６９】
図３２Ｃおよび表１に見られるように、マウスのαＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂ群由来の甲状腺は、ＧＭ−ＣＳＦ処置の直後にαＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂで処置された一部のマウス（すなわちＧＭ−ＣＳＦ／αＩＬ−１０Ｒ  ＃２）を除いて、ＧＭ−ＣＳＦ／アイソタイプコントロール群のマウスに由来する甲状腺と比較して、より重篤なリンパ球浸潤を示した。ＩＬ−１０は、ＧＭ−ＣＳＦ誘導性疾患抑制の主要な伝達物質である。
【００７０】
（甲状腺微小環境に対するＧＭ−ＣＳＦ処置の効果）
標的器官に対するＧＭ−ＣＳＦの効果を、処置マウスの甲状腺における細胞型およびサイトカイン産生によって調べた。ＧＭ−ＣＳＦ処置は、末梢におけるＣＤ８ａ−ＤＣの増殖をもたらした（図２９Ａ）。しかし、この増殖は、甲状腺内部を反映していなかった。対照的に、未処置マウスに対して、ＧＭ−ＣＳＦ処置マウスの甲状腺におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージの増加があった（それぞれ、２４．５７％および２０．０６％）（図３３Ａ）。以前の研究は、ＭＣＰ−１が優先的にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を甲状腺に誘引し、一方ＲＡＮＴＥＳは優先的にＣＤ４＋エフェクターＴ細胞を誘引することを示している。これら２種のケモカインのレベルを試験した。ＭＣＰ−１産生は、全ての実験群の間で同等であったが、ＲＡＮＴＥＳは検出できなかった。これらのことは、これらのケモカインが、観察されたＧＭ−ＣＳＦ処理甲状腺におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の頻度の増加を説明しないことを示唆する。
【００７１】
甲状腺細胞および甲状腺残留リンパ球によるサイトカイン産生を定量した。ｍＴｇコントロールマウスと比較して、ＩＦＮ−γ産生のわずかな減少を伴うＩＬ−１０産生のわずかな増加がＧＭ−ＣＳＦ処置マウスにおいて観察されたが（図３３Ｂ）、これらの差異は、有意ではなかった。
【００７２】
数件の研究は、ＨＴにおける甲状腺細胞破壊が、増加されたカスパーゼ発現を介したＦａｓ媒介性アポトーシスに起因することを示唆している。甲状腺細胞におけるＦａｓおよびＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ならびにカスパーゼ８の発現レベルが、ＲＴ−ＰＣＲによって試験された。ＣＦＡおよびｍＴｇコントロールマウスと比較して、ＧＭ−ＣＳＦ処置マウスにおけるＦａｓ発現にわずかな増加が観察されたが、いずれの群においても、検出可能なＦａｓＬ発現はなかった。さらに、種々のマウスの群の間で、カスパーゼ８の発現レベルにおける大きな差はなかった（図３３Ｃ）。
【００７３】
ＧＭ−ＣＳＦ処置がＥＡＴの抑制を引き起こし得る機構を調べた。ＧＭ−ＣＳＦがＤＣを増殖させ、それらをインビボで半成熟状態に維持し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を促進し、そしてＥＡＴ抑制に必要なより高いレベルのＩＬ−１０産生を誘導する。これらの結果はさらに、ＧＭ−ＣＳＦ処置がＣＤ８ａ−ＤＣおよびＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞を増殖させて、ＥＡＴを抑制させ得るという結果をもたらす。
【００７４】
ＤＣ機能は伝統的に、一次Ｔ細胞応答の誘導に関与するが、それらが末梢寛容に重要な役割を果たすという証拠が増加しつつある。ＤＣは、数段階の成熟段階を経るものであり、そして初期の研究は、半成熟ＤＣが調節性Ｔ細胞の誘導および増殖に重要な役割を果たすことを示した。ＧＭ−ＣＳＦ処置は、調節特性を有するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の頻度の増加をもたらしたので、ＧＭ−ＣＳＦがＤＣ成熟に影響を及ぼすことによりその効果を発揮したか否かを試験した。ＧＭ−ＣＳＦ処置マウス由来のＤＣは、未処置ｍＴｇコントロールマウスと比較してＭＨＣクラスＩＩおよびＢ７分子の高レベルの発現、および炎症誘発性サイトカインの低レベルの発現によって示されるような、半成熟表現型を示した。このことは、ＧＭ−ＣＳＦ処置がおそらく、調節性Ｔ細胞の産生を補助することが知られている半成熟ＤＣの増殖を介して、寛容を誘導および／または促進したことを示唆する。
【００７５】
初期のレポートは、低濃度のＧＭ−ＣＳＦ中で骨髄前駆細胞を培養することによって産生されたＤＣが、成熟抵抗性であること、およびアロペプチド（ａｌｌｏ−ｐｅｐｔｉｄｅ）でパルスされたこれらのＤＣの接種が、インビボで同種移植片生存を延長したことを示した。このようなＤＣの主な特性の１つは、活性化されない限り有意なレベルのＣＤ２５を発現しないＩＬ−１０産生性１型調節性Ｔ（Ｔｒ１）細胞を誘導するこれらの能力である。しかし、他の研究は、未成熟ＤＣおよび他の免疫寛容を生じるＤＣがＩＬ−１０産生性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の増殖を補助し得、これらがＴｒ１細胞の誘導および分化において重要な役割を果たし得ることを、明らかに示している。
【００７６】
数種の型の調節性Ｔ細胞が記載されており、各々、特異的な表面表現型およびサイトカインプロフィールを有するが、天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の５〜１０％を構成する）は、中枢性の寛容を逃れる自己反応性Ｔ細胞の優勢な抑制因子である。ＧＭ−ＣＳＦ処置マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、インビトロでエフェクターＴ細胞のｍＴｇ特異的増殖応答を抑制し得ることが実証された。しかし、未処置であるがｍＴｇで初回刺激されたマウスに由来するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、同様のｍＴｇ特異的応答の抑制を示すことができなかった。ＧＭ−ＣＳＦ処置マウス由来のリンパ球のインビトロ培養物中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の枯渇は、ｍＴｇ特異的増殖を復活させた。このことは、エフェクターＴ細胞は、それらが未処置ｍＴｇ初回刺激マウスで産生されたのと同様にＧＭ−ＣＳＦ処置マウス中で産生されるが、それらの機能は、ＧＭ−ＣＳＦ処置マウスにおいて誘導／増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって抑制されたことを示した。ＧＭ−ＣＳＦ処置マウスからｍＴｇ初回刺激マウスへのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の養子免疫転移は、ｍＴｇ初回刺激非レシピエントと比較して、ｍＴｇ特異的増殖の有意な抑制をもたらした。この抑制性特性は、この集団が主にＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞から構成されていたことを示唆した。さらに、レシピエントマウス由来のリンパ球は、ｍＴｇによるインビトロ刺激によって、ｍＴｇ初回刺激コントロールと比較して、より高レベルのＩＬ−１０およびＩＬ−４を産生した。このことは、養子免疫転移されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ処置ドナーマウスにおいて見られるような、レシピエントエフェクターＴ細胞に対する抑制性効果を発揮したことを示した。
【００７７】
ＧＭ−ＣＳＦ誘導性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によるｍＴｇ特異的応答の抑制の機構を探索するため、さらなる研究を行った。ＧＭ−ＣＳＦ処置マウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖および機能の両方におけるＩＬ−１０の役割を試験した。αＩＬ−１０Ｒ抗体を使用したインビボでのＩＬ−１０機能の遮断は、ＧＭ−ＣＳＦ処置マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のインビトロにおけるｍＴｇ特異的Ｔ細胞応答に対する抑制性効果を逆転させた。このことは、ＥＡＴのＧＭ−ＣＳＦ誘導性抑制におけるこのサイトカインの重要な役割を示唆する。インビボでのＩＬ−１０機能の遮断は、ＧＭ−ＣＳＦの疾患抑制効果を無効にし、ＥＡＴの発生を可能にした。疾患発達の間の種々の時点におけるαＩＬ−１０Ｒ抗体による処置の開始は、ＩＬ−１０がインビボにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の誘導および／または増殖に必要であること、ならびにそれが自己反応性エフェクターＴ細胞機能を抑制し、結果としてＥＡＴの抑制をもたらすためにのみ必要とされるのか否かを示した。処置の時間にかかわらず、ＩＬ−１０の遮断は、大多数のマウスにおいてＥＡＴ抑制能を無効にした。興味深いことに、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数は、αＩＬ−１０Ｒ抗体処置にかかわらず、未処置マウスと比較して、全てのＧＭ−ＣＳＦ処置マウスにおいてより多かった。ＩＬ−１０は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖のために必須ではない。しかし、これらの調節性Ｔ細胞によって産生されたＩＬ−１０は、エフェクターＴ細胞の抑制のために重要である。
【００７８】
（表Ｉ：ＧＭ−ＣＳＦ誘導性ＥＡＴ抑制に対する抗ＩＬ−１０Ｒ  Ａｂの効果）
【００７９】
【表１】
2007537753.tif 000002
材料および方法に記載されるように、マウスをＧＭ−ＣＳＦで処置し、ｍＴｇで免疫し、そしてさらに抗ＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂもしくはアイソタイプコントロールＡｂで処理した。これらのマウスをコントロールマウスとともに第４５日目に屠殺し、屠殺と同時にマウスから甲状腺を回収し、ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、そして組織学的Ｈ＆Ｅ染色のために薄切した。材料および方法に記載されるように、甲状腺炎細胞浸潤指数を決定した。αＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂ処置マウスとアイソタイプコントロールマウスとを比較することによって、ｐ値を計算した。
【００８０】
ＩＬ−１０は、炎症の重要な調節因子であり、これは、炎症誘発性サイントカインおよびＴ細胞の増殖応答の抑制を介して、Ｔｈ１型およびＴｈ２型両方の免疫応答を阻害し得る。Ｔ細胞のＩＬ−１０媒介性抑制の主要な機構の１つは、ＣＤ２８同時刺激経路の選択的阻害を介する。しかし、甲状腺炎において、ＩＬ−１０の作用の代替的機構は提唱されている。ＩＬ−１０をコードするｃＤＮＡ発現ベクターの甲状腺への注入は、リンパ球浸潤およびＥＡＴの発生を顕著に阻害して疾患の進行を妨げ得る。ＩＬ−１０のこの抑制効果は、以下のいずれかを介して媒介される：甲状腺細胞上のＦａｓリガンド発現の増強と甲状腺浸潤リンパ球の活性化誘導性細胞死の誘導、または抗アポトーシス分子（例えば、ｃＦＬＩＰおよびＢｃｌ−ｘＬ）の強力なアップレギュレーション（これらは、甲状腺細胞のＣＤ９５誘導性アポトーシスを防止し得る）。反対に、ｍＴｇ初回刺激マウスの甲状腺へのＩＬ−１およびＴＮＦ−αの直接注入は、甲状腺細胞のアポトーシスを誘導し、炎症誘発性サイトカインが甲状腺破壊に重要な役割を果たすことを示した。これは、ＩＬ−１０が、炎症誘発性サイトカイン産生の抑制を介してその効果を媒介しているかもしれないという可能性を浮上させた。
【００８１】
ＧＭ−ＣＳＦ処置マウスにおける増加したＩＬ−１０応答が、甲状腺微小環境に対する何らかの効果を有するか否かを知るため、ＧＭ−ＣＳＦ処置マウスの甲状腺における種々のアポトーシス誘発性（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）分子の発現レベルを試験した。ＧＭ−ＣＳＦ処置マウスの甲状腺において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＩＬ−１０の産生の頻度の増加があったが、ＧＭ−ＣＳＦ処理マウスの甲状腺と未処置ｍＴｇコントロールマウスの甲状腺との間に、アポトーシス誘発性分子の発現における有意差はなかった。ＥＡＴのＧＭ−ＣＳＦ媒介性抑制は、主に、ｍＴｇ特異的エフェクターＴ細胞に対するＩＬ−１０の直接的効果に起因する。
【００８２】
まとめると、半成熟ＤＣのＧＭ−ＣＳＦ誘導性増殖およびこれらのＤＣによるサイログロブリンペプチド提示は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の増殖をもたらした可能性がある。これらの調節性Ｔ細胞によって産生されたＩＬ−１０が、ｍＴｇ特異的Ｔ細胞の自己免疫エフェクター機能を阻害し、結果としてＥＡＴを抑制した。これらの結果は、ＥＡＴ、およびＥＡＴと同様の病因を有する他の自己免疫疾患における、ＧＭ−ＣＳＦの治療上の潜在力を示す。
【００８３】
（実施例１２．ＣＴＬＡ−４結合を介した寛容誘導）
ＣＴＬＡ−４（ＣＤ  １５２）は、Ｔ細胞活性化をダウンレギュレートすることおよびリンパ球ホメオスタシスを維持することに積極的に関与する。ＣＴＬＡ−４の標的化された結合は、Ｔ細胞応答を下方調節してアロ免疫応答および自己免疫応答を抑制し得る。標的化されたＣＴＬＡ−４結合は、Ａｇ特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ−４ｈｉｇｈ調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）集団の選択的誘導を介した特異的標的に対する免疫寛容を誘導し得る。抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂでコーティングされた同種異系細胞は、炎症誘発性サイトカインＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の抑制、そして調節性サイトカインＩＬ−１０、ＴＧＦ−β１、およびＩＬ−４のアップレギュレーション（おそらく、活性化Ｔ細胞へのＣＴＬＡ−４の結合を介する）を介して、免疫反応性低下を誘導した。アロ抗原による再チャレンジは無反応性を破ることはできなかったが、高濃度の外来性ＩＬ−２、飽和濃度の中和性抗ＴＧＦ−β１および抗ＩＬ−１０  Ａｂ、抗ＣＴＬＡ−４抗体遮断の存在下で、そしてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の枯渇によって、寛容からの一過性の回復が観察された。寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ−４ｈｉｇｈＴｒｅｇ細胞は、Ａｇ初回刺激マウス由来のＣＤ２５−Ｔ細胞のエフェクター機能を抑制した。Ａｇ初回刺激マウスへのこれらのＴｒｅｇ細胞の養子免疫転移は、顕著に低下したアロ抗原特異的応答をもたらした。さらなる特徴づけは、記憶表現型（ＣＤ６２Ｌ−）を有するＴｒｅｇ細胞が、アロ抗原特異的Ｔ細胞応答の抑制においてより強力であったことを実証した。この標的化されたＣＴＬＡ−４結合は、移植片拒絶の防止のための治療上の潜在力を有する。
【００８４】
アロ抗原特異的Ｔ細胞寛容は、移植片拒絶の予防における主な目標の１つである。Ａｇ特異的パターンにおいて同種反応性Ｔ細胞を標的するようなより指向的な（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）治療の探索は続くが、非特異的な免疫抑制薬は、現在の治療戦略の中心となる。Ｔ細胞応答性低下の誘導またはＴ細胞寛容の誘導は、慢性の免疫抑制薬の必要のない持続性の移植片生存を促進することにおいて、可能性を維持する。
【００８５】
成熟Ｔリンパ球の活性化は、ＴＣＲ複合体のＡｇ特異的誘発およびＣＤ２８−Ｂ７．１／Ｂ７．２経路を通して仲介される同時刺激の両方を必要とする、多工程のプロセスである。ＣＤ２８リガンド、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）は、ＡＰＣ上に見出され、そしてこれらのＴ細胞上のＣＤ２８への連結は、ＩＬ−２のアップレギュレーションおよび細胞周期を通した進行をもたらす。ＣＴＬＡ−４は、ＣＴＬＡ−４ノックアウトマウスにおいて見られる致死性のリンパ球増殖によって証明される、Ｔ細胞活性化の重要なインヒビターである。Ｂ７／ＣＤ２８経路は、Ｔ細胞ホメオスタシスにおいて主な役割を果たし、そしてこの経路の操作は、臨床適用で免疫応答を調節するための強力な戦略として出現している。抗原性刺激の存在下でのこの同時刺激の経路の阻害は、Ｔ細胞アネルギーをもたらし得る。これは、ＣＤ８６および／またはＣＤ８０をブロックすることによって同種移植片拒絶を予防し、それによって移植片生存の延長をもたらすために動物モデルにおいて首尾よく使用されている。Ａｇ刺激と同時のＣＴＬＡ−４の結合は、Ｔ細胞機能を抑制し得るか、またはＴ細胞応答性低下をもたらし得る。この観察は、ＴＣＲ−ＭＨＣ  Ａｇ複合体相互作用と同時のＣＴＬＡ−４の結合が、同時に起こるＣＤ２８を通した同時刺激にもかかわらずＴ細胞活性化の阻害をもたらし得るという、より初期の視点を支持する。同時刺激をブロックすることによって移植片拒絶および自己免疫状態を予防し得るかまたは抑制し得るＣＴＬＡ−４−Ｉｇは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の産生を促進しないと考えられている。ＣＤ２８／Ｂ７同時刺激は、Ａｇ−特異的Ｔｒｅｇ細胞の産生および維持に必要である。
【００８６】
標的細胞と接触している同種反応性Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４の結合は、Ｔ細胞応答を下向き調節（ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅ）し得る。標的化されたＣＴＬＡ−４結合は、自己免疫性甲状腺炎のモデルにおいて自己反応性Ｔ細胞を下向き調節し得る。このアプローチは、甲状腺Ａｇ特異的寛容を誘導し、この甲状腺Ａｇ特異的寛容は、疾患の抑制をもたらす。
【００８７】
アロ抗原認識の間のＣＴＬＡ−４結合におけるＡｇ特異的寛容誘導の機構を、本明細書中で分析する。この寛容誘導系において、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）レセプター発現性Ｍ１２（Ｈ２ｄ）細胞（ｍＭ１２細胞）を、本明細書中で記載されるように、Ｈ２ｋマウスを刺激するためのアロ抗原供給源として使用した。ＴＳＨＲおよびＣＴＬＡ−４に対する特異性を有する二重特異性Ａｂ（ＢｉＡｂ）であって、ＢｉＡｂの抗ＴＳＨＲ部分がＴＳＨＲ発現性アロ抗原性ｍＭ１２細胞に結合し得、ＣＴＬＡ−４に結合する抗ＣＴＬＡ−４部分を残している二重特異性Ａｂ（ＢｉＡｂ）は、攻撃性Ｔ細胞上に発現した。寛容誘導は、二次免疫応答の間に達成され得るが、また、そのアロ抗原再チャレンジは、この寛容状態に何ら効果を有さなかった。さらに、この寛容誘導は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の下位集団の選択的拡大と関連していた。この選択的拡大は、非寛容マウス由来のＴ細胞の同種応答を下向き調節し得た。この結果は、以下の通りである。
【００８８】
（同種認識におけるＣＴＬＡ−４の結合は、同種免疫応答を抑制する）
標的化ＣＴＬＡ−４結合がインビボアロ抗原性Ｔ細胞応答を阻害するか否かに取り組むため、コントロールＡｂ（ｃＢｉＡｂ）でコーティングされたアロ抗原性ｍＭ１２細胞またはＣＴＬＡ−４  Ａｂ（ｔＢｉＡｂ）でコーティングされたアロ抗原性ｍＭ１２細胞を、ＣＢＡ／Ｊマウスに注射した。１つの群のマウス（ＢｉＡｂ処置群２）に、ｔＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞をチャレンジ免疫の間のみ与えて、二次免疫応答の間Ｔ細胞応答が弱められるか否かを試験した。図３４に示されるように、コントロールマウス由来の脾臓細胞は、ｍＭ１２細胞によるエキソビボ再刺激において、強いＴ細胞増殖、ＩＬ−２応答およびＩＦＮ−γ応答を示した。しかし、２回とも免疫された処置マウスまたはＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞による第二の免疫の間のみ免疫された処置マウスは、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２応答、およびＩＦＮ−γ応答の有為な低下を示した。ＣＴＬＡ−４結合において誘導される同種免疫抑制は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１の増大に関連していた（図３４ｂ）。ＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞を与えたマウス由来の脾臓細胞は、コントロールであるＡｂコーティングｍＭ１２細胞を与えたマウス由来の脾臓細胞と比較して、これらのサイトカインの約３〜４倍高いレベルを示した。
【００８９】
ＣＴＬＡ−４結合において誘導される同種免疫抑制は、持続性である。インビトロのＢｉＡｂ処置マウス由来のリンパ球の再刺激が寛容を壊すか否かを試験するため、脾臓  細胞を、インビトロでＭ１２細胞によって５日間刺激した。細胞を、これらの培養物から回収し、そしてＭ１２細胞によるさらなる再刺激に対するその応答を試験した。これらの細胞は、エキソビボ再チャレンジにおいて寛容からの回復の何らの兆候も示さず、Ｍ１２細胞による三次刺激に対する応答におけるＩＬ−２の有為な量の増殖または産生をしなかった（図３５、ａおよびｂ）。しかし、両試験群およびコントロール群のマウス由来の細胞は、細胞分裂性の刺激（Ｃｏｎ  Ａ）に対して応答し、この細胞が生存可能であり、増殖可能であることを明らかに示した。これらの結果は、アロ抗原に対して標的化ＣＴＬＡ−４結合において誘導される寛容は、エキソビボアロ抗原チャレンジによって容易に逆転しないことを示唆する。
【００９０】
インビボのＣＴＬＡ−４結合によって誘導された寛容の持続時間および逆転可能性を試験した。コントロールマウスおよびＢｉＡｂ処置マウスを、５０日間休ませ、そしてＭ１２細胞でチャレンジし、そしてこれらのマウスからの脾臓細胞を、エキソビボＭ１２再刺激に対して応答する能力について試験した。図３５ｃおよび図３５ｄに示すように、寛容（ＢｉＡｂ処置）マウス由来の脾臓細胞は、Ｍ１２細胞に対する応答において、何ら増大の兆候を示さなかった。このことは、ＣＴＬＡ−４結合において誘導される寛容は、アロ抗原によるインビボチャレンジ後でさえ維持されることを示唆する。
【００９１】
（標的化ＣＴＬＡ−４結合において誘導される寛容は、標的特異的である）
ＣＴＬＡ−４結合における抗Ｈ２ｄ免疫応答の抑制の特異性を、異なったＴ細胞によるＢｉＡｂ処置ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ２ｋ）マウスのチャレンジによって試験した。処置後２０日目に、これらのマウスに、異なったマウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、Ｈ２ｂ）系統由来の脾臓細胞またはＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞もしくはＡｇ８細胞株（どちらもＭ１２細胞（Ｈ２ｄ）に対して同系である）のいずれかを与えた。３０日目に、これらのマウスを、Ｃ５７ＢＬ／マウス由来の脾臓細胞およびＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞、Ａｇ８細胞およびＭ１２細胞による再刺激に対する応答におけるＴ細胞増殖およびＩＬ−２産生について試験した。コントロールマウスおよびＢｉＡｂ処置マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６脾臓細胞に対して同じレベルのＴ細胞増殖応答およびＩＬ−２応答を示した（図３６ａ）。しかし、ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞およびＡｇ８細胞のこの応答パターンは、Ｍ１２細胞で刺激した場合に記録した応答パターンとは多少類似していた（図３６、ｂおよびｃ）。Ｈ２ｄアロ抗原に対する免疫応答の間のＣＴＬＡ−４結合におけるＴ細胞寛容は、標的特異的であり、そして同じＡｇを保有する細胞（すなわち、Ｈ２ｄ）に対して有効であるが、他のＡｇを保有する細胞（すなわち、Ｈ２ｂ）に対しては有効でない。
【００９２】
（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、寛容マウスにおいて選択的に発現される）
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞において、寛容誘導がチャレンジと関連するか否かを試験した。ネイティブのマウス、コントロールマウスおよびＢｉＡｂ処置マウスを、２０日目に屠殺し、そしてリンパ節および脾臓細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団についてのフローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の百分率における有為な上昇が、ＢｉＡｂ処置（寛容）マウスにおいて脾臓およびリンパ節の両方で観察されたが、コントロールマウスにおいて観察されなかった（図３７）。寛容マウス由来のリンパ細胞におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の百分率の上昇が、単にＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の減少に起因するか否かを試験するため、脾臓において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の両方における百分率をＣＤ４＋Ｔ細胞集団内において測定し、そしてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の絶対数を測定した。図３７ａで示すように、コントロールマウスと比較し、寛容マウスにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞において、有為な上昇（ｐ＜０．０３４）があった。しかし、Ｔ細胞集団におけるＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の数は、処置マウスおよび未処置マウスにおいて有為に異ならなかった（示さず）。コントロールマウス由来の脾臓と比較して、脾臓におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の絶対数の有為な増加（ｐ＜０．０２１）を、ＢｉＡｂ処置マウスから観察した。例えば、コントロールマウスが脾臓あたり平均１．７４×１０７のＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞および平均１．６２×１０６のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を示したのに対し、寛容マウスは、平均１．７６×１０７のＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞および平均２．５×１０６のＣＤ２５＋細胞を示した。寛容マウスのリンパ節において、ＣＤ２５＋Ｔ細胞における類似の増加を観察した。
【００９３】
ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞上で構成的に発現され、そしてインビトロおよびインビボでその調節活性の媒介に関連する。図３７ｂに示すように、寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、コントロールマウスまたはネイティブマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞と比較してＣＴＬＡ−４の発現の増加を示した。しかし、３群全てに由来するＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞とも、表面ＣＴＬＡ−４発現を殆ど示さなかったか、または全く示さなかった。
【００９４】
（エキソビボチャレンジにおけるＢｉＡｂ処置マウスにおけるＴ細胞表現型）
ＢｉＡｂ処置マウスにおけるアロ抗原性標的に対するＴ細胞応答性低下の機構およびＴｒｅｇ細胞産生の機構を理解するための最初のステップとして、ＢｉＡｂ処置マウス由来のＴ細胞の表現型変化を、標的（Ｍ１２）細胞でのエキソビボチャレンジにおいて試験した。脾臓細胞を、Ｍ１２細胞と共にインキュベートし、そして種々のマーカーについて異なる時点で試験した（図３８）。初期活性化マーカーであるＣＤ６９を発現する細胞の数は、刺激の２４時間後のＢｉＡｂ処置マウス由来の脾臓において、コントロール免疫マウスと比較して有為に少なかった（図３８ａ）。種々のサイトカインを分泌するＴ細胞を、刺激３６時間後に、細胞内染色によって検出した。ＩＦＮ−γを分泌しているＴ細胞の数は、ｍＭ１２免疫マウスにおいて寛容マウスと比較して有為に多かった一方で、ＩＬ−４産生細胞、ＩＬ−１０産生細胞、およびＴＧＦ−β１産生細胞の増加を、寛容マウスにおいて観察した（図３８ｂ）。ＣＤ６２Ｌの低レベルの発現または発現がないことは記憶表現型に関連しているので、刺激５日後のＣＤ６２Ｌ発現を試験した。低レベルのＣＤ６２Ｌを発現しているＴ細胞の数は、ＢｉＡｂ処置マウス由来のＣＤ３＋細胞において、コントロールと比較して有為に低かった（図３８ｃ）。Ｔｒｅｇ細胞表現型を試験するため、類似の培養物由来の細胞を、完全に洗浄し、３日間休ませ、そしてＣＤ２５発現について分析した。寛容マウス由来の脾臓細胞においてＣＤ２５を発現するＣＤ４＋細胞の数は、免疫マウス由来の脾臓細胞においてＣＤ２５を発現するＣＤ４＋細胞の数のほぼ２倍であった（図３８ｄ）。ＣＦＳＥ染色した脾臓細胞を、Ｍ１２細胞と共に７日間インキュベートし、そしてＣＦＳＥ希釈について試験した。図３８ｅに示すように、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖性応答は、寛容マウス由来の細胞において、免疫コントロールと比較して有為に低かった。しかし、寛容マウスおよびコントロールマウスに由来するこれらの細胞によって行われた分裂の数は、およそ同じであるようであった。
【００９５】
（外因性ＩＬ−２は、アロ抗原に対する非応答性を部分的に逆転したが、寛容を逆転しない）
外因性ＩＬ−２がＣＴＬＡ−４結合において誘導された寛容を逆転し得るか否かを試験するため、Ｍ１２細胞および種々の量のｒｍＩＬ−２を、異なるマウス由来の脾臓細胞に加えた。図３９ａは、外因性で加えられたｒｍＩＬ−２非存在下または存在下における、抗原性再刺激後の脾臓細胞の増殖性応答を示す。少量のｒｍＩＬ−２の添加は寛容化マウス由来のＴ細胞の有為な増殖を誘導しなかったが、高濃度でのｒｍＩＬ−２存在下で部分的逆転（コントロールマウスの逆転と比較して６０％まで）を観察した。さらに、応答性低下状態は、ＩＬ−２およびアロ抗原の両存在下でのみ逆転されたが、いずれのアロ抗原単独またはＩＬ−２単独でも逆転されなかった。このことは、応答性低下は、Ａｇおよび過剰レベルのＩＬ−２が同時に存在する場合にのみ逆転されることを示唆する。
【００９６】
寛容マウス由来のＴ細胞によるアロ抗原に対する三次応答を評価するため、上記培養物（図３９ａ）由来のエフェクター細胞を、５日目に回収し、休ませ、そして新しい標的Ｍ１２細胞と共にインキュベートした。ＩＬ−２およびアロ抗原の存在下で増殖した寛容Ｔ細胞は、三次刺激におけるその後のアロ抗原との遭遇の間、非応答性であった（図３９ｂ）。このことは、これらの細胞は、寛容であり続け、そして増殖性応答の逆転は、高レベルのＩＬ−２およびアロ抗原の存在下でのみ起こることを示す。
【００９７】
（ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１は、寛容マウス由来のＴ細胞の応答性低下において重要な役割を果たす）
標的化ＣＴＬＡ−４結合による寛容誘導において、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）の減少に伴ってＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＴＧＦ−β１における増大を観察した。ＣＴＬＡ−４結合による誘導の抑制的効果がこれらの阻害性サイトカインに依存するか否かを決定するため、これらのサイトカインに対する中性化Ａｂをエキソビボ細胞培養物に添加した。図３９ｃに示すように、ＩＬ−４の遮断は、Ｍ１２刺激に対する寛容細胞の増殖性応答に何ら効果を示さなかったが、ＩＬ−１０中性化は、応答性低下からの部分的逆転をもたらした（中性化Ａｂ非存在下のコントロール脾臓細胞と比較した）。しかし、ＴＧＦ−β１に対する中性化Ａｂ単独または中性化Ａｂと抗ＩＬ−１０  Ａｂとの組み合わせは、Ｔ細胞の低応答性からのほぼ完全な逆転をもたらした（図３９ｃ）。また、外因性ＩＬ−２によって見られるように、これらの培養物から回収した細胞の中性化Ａｂ非存在下における標的細胞と一緒のその後のインキュベーションは、サイトカイン中性化Ａｂの存在下の増殖性応答の逆転は、一過性であることを示した。
【００９８】
（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４は、寛容の維持に重要である）
図３７ｂにおいて観察されるように、寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、その表面上のＣＴＬＡ−４の上昇したレベルを発現した。寛容における増大したＣＴＬＡ−４発現の役割を試験するため、抗ＣＴＬＡ−４ＡｂのブロッキングのＦａｂを、種々の濃度で加えた。飽和濃度での抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂの添加は、Ｔ細胞の応答性低下からのほぼ完全な逆転をもたらした（図３９ｃ）。このことは、標的Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４の結合は、アロ抗原に対する応答性低下を開始するために必要であることを示唆する。
【００９９】
（標的化ＣＴＬＡ−４結合によって誘導された寛容におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の役割）
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞がアロ抗原特異的Ｔ細胞応答のダウンレギュレーションにおいて役割を有するか否かを見るため、寛容マウスおよびコントロールマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を、磁気細胞分離系を用いて単離した（図４０ａ）。寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋枯渇ＣＤ３＋細胞は、Ｍ１２細胞に対して有為に増大した増殖性応答を示したが、コントロールマウスは示さなかった（図４０ａ）。寛容化マウス由来のＣＤ２５＋細胞を欠損した培養物は、普通に応答し、アロ抗原による再刺激においてほとんどサイトカイン応答を示さなかったか、または全く示さなかった（図４０、ｃ〜ｅ）。ＩＬ−１０応答およびＴＧＦ−β１応答の両方は、主にＣＤ２５＋Ｔ細胞に制限されるが、ＩＬ−４の主な供給源は、ＣＤ２５−Ｔ細胞であることを見出した。寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、免疫マウス由来のＣＤ２５−Ｔ細胞と共に共培養（ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ）した場合、Ｍ１２細胞に対する応答は、有為に抑制された（図４０ｆ）。しかし、免疫マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の寛容マウス由来のＣＤ２５−Ｔ細胞への添加は、Ｍ１２細胞に対するＴ細胞の応答の抑制をしなかった。
【０１００】
（接触依存性は、寛容の維持における主要な機構である）
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞による寛容誘導が、可溶性因子によって仲介されるかまたはＴ細胞−Ｔ細胞接触を必要とするかを調べるため、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーアッセイを行った。図４０ｆに示されるように、寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は、コントロールマウス由来のリンパ球の増殖を抑制した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー内での２つの集団（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞およびＣＤ２５−Ｔ細胞）の分離は、ＣＤ４＋細胞が枯渇した場合に事実上同じ効果を示した（図４０ｇ）。その上、寛容マウス由来のＣＤ２５＋細胞は、ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答性低下を誘導したが、これらを別々のチャンバー内にＭ１２細胞と共に維持した場合、同様の抑制は見られなかった。しかし、両チャンバーにおけるＭ１２細胞の存在は、増殖において約３０％の低下をもたらした。このことは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生は、アロ抗原刺激を必要とし、そしてこれらのサイトカインは、アロ抗原と接触しているＣＤ２５−細胞に、低い効果であるが効果を有することを示唆する。図４０ｆにおいて観察されるように、同じチャンバー内のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞とＣＤ２５−細胞との共培養は、最大の抑制をもたらした。直接の細胞−細胞接触（標的細胞−調節細胞の接触、標的細胞−エフェクター細胞の接触、および調節細胞−エフェクター細胞の接触）は、寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞による最適な阻害のために必要である。
【０１０１】
（ＣＴＬＡ−４結合において誘導された寛容は、適応的に伝達される）
Ｍ１２細胞（Ｈ２ｄ）およびＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ２ｂ）脾臓細胞でプライムしたマウスに、寛容マウスおよびコントロールマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞をｉ．ｖ．注射した。これらのマウスを、Ｍ１２細胞で２時間チャレンジし、そして１５日後にこれらを屠殺して、標的細胞に応答する能力を試験した。寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を与えたレシピエントマウス由来の脾臓細胞は、非レシピエントマウスおよびコントロールＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞レシピエントマウスと比較して、Ｍ１２細胞に対する増殖性応答およびＩＬ−２応答の有為な低下を示した（図４１ａ）。また、レシピエント由来の脾臓細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６脾臓細胞でエキソビボチャレンジした。図４１ａに示すように、寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞もコントロールマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞も、Ｃ５７ＢＬ／６脾臓細胞に対する増殖性応答およびＩＬ−２応答を何ら有さず、そして伝達された寛容の標的特異性を示した。
【０１０２】
（記憶表現型を有するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、応答性低下の誘導においてより強力である）
記憶集団またはネイティブ集団に対するこの調節効果を局在化するために、寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、ＣＤ６２Ｌ＋画分およびＣＤ６２Ｌ−画分にさらに分離し（図４２ａ）、そして表面ＣＴＬＡ−４発現、ならびにＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１を産生する能力、ならびにＴ細胞増殖応答を抑制する能力について試験した。ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞と比較して、ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ−細胞は、より高いレベルのＣＴＬＡ−４を発現し、そしてＭ１２細胞への曝露において有為に高い量のＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１を産生した（図４２ｃおよびｄ）。両集団とも、有為な量のＩＬ−４、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生しなかった（示さず）。ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔｒｅｇ細胞およびＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇ細胞の両方は、アロ抗原に対するエフェクターＴ細胞応答を抑制する能力を示し、記憶表現型を有するＣＤ２５＋集団（ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ−）は、より強力であった（図４２ｅ）。
【０１０３】
有効なアロ抗原特異的寛容を、標的化したＣＴＬＡ−４の結合において誘導し、そしてこの寛容誘導に関連する推定機構を調べた。アロ抗原性細胞に対するＴ細胞活性化は、マウスに抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂ（ｔＢｉＡｂ）コーティングアロ抗原性細胞を注射した場合のみダウンレギュレートされたが、イソ型コントロールＡｂ（ｃＢｉＡｂ）コーティング細胞を注射した場合はダウンレギュレートされなかった。ｃＢｉＡｂコーティング細胞と比較して、ｔＢｉＡｂコーティング細胞は、有為に多い量のＩＬ−１０、ＩＬ−４およびＴＧＦ−β１、ならびに低レベルのＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生を誘導した。その上、ｔＢｉＡｂコーティングアロ抗原性細胞を注射したマウス由来のＴ細胞のインビトロまたはインビボの再刺激は、低応答性を壊さなかった。このことは、これらのマウスにおいて観察された抑制は、阻害性サイトカインのみに仲介される一時的な効果ではなく、持続性であり、そしてＴｒｅｇ細胞は、重要な役割を果たし得ることを示唆する。
【０１０４】
標的化ＣＴＬＡ−４結合において産生される寛容の特異性を試験するため、同じ（Ｈ２ｄ）または異なる（Ｈ２ｂ）アロ抗原を保有する刺激細胞を使用した。Ｈ２ｋマウスは、Ｈ２ｄアロ抗原を有する異なる細胞に対する寛容を示したが、Ｈ２ｂアロ抗原を有する細胞には、普通に応答した。これらの結果は、特定の標的Ａｇに対する特異性を有するＴ細胞のサブセットのみが寛容であり、そして残りの細胞は作用せず、非関連のアロ抗原に対して応答し得ることを示した。Ｔ細胞は、高用量の外因性ＩＬ−２の存在下での抗原性再刺激によって誘導されて、応答性低下から回復し得る。しかし、これはアネルギー状態の永久的な逆転をもたらさない。何故なら、その後のＩＬ−２非存在下におけるＩＬ−２処理細胞の抗原性再刺激は、有為な応答を示さなかったからである。
【０１０５】
Ｔｒｅｇ細胞は、標的化ＣＴＬＡ−４結合の後に特異的Ａｇに対する応答性低下の維持を媒介する。ＣＴＬＡ−４結合は、より低いＩＬ−２産生ならびにより高いＩＬ−１０産生およびＴＧＦ−β１産生を誘導し得、これは、Ｔｒｅｇ細胞の発生を導く条件である。組織／標的特異的パターンでのＣＴＬＡ−４結合は、標的自己抗原特異的免疫寛容を誘導し得る。アロ抗原保有標的Ｔ細胞に対するＣＴＬ応答は、ＢｉＡｂコーティングアロ抗原性細胞を与えたマウスにおいて有為に減少する。寛容マウスの脾臓およびリンパ節の両方におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の数の増大は、コントロールマウスおよびネイティブマウスに比較して観察され、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞数の比例的な減少を伴わなかった。
【０１０６】
Ｔｒｅｇ細胞は、多くの場合、その細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４およびグルココルチコイド誘導ＴＮＦＲファミリーによって調節される遺伝子）の構成的発現によって特徴づけられる。しかし、これらのタンパク質はまた、活性化Ｔ細胞上でも発現され、これらの分子を決定的マーカーとして使用することは、エフェクターＴ細胞機能を抑制するその能力が決定されない限り、信頼できない。フォークヘッド転写因子Ｆｏｘｐ３は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞において特異的に発現され、この細胞の発生に必要とされる。これらの細胞の枯渇は、動物を自己免疫疾患により罹患しやすくする。しかし、そのインビボの誘導および作用の正確な機構は、よく決定されていない。他のＴ細胞集団と異なり、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞は、その表面上にＣＴＬＡ−４を構成的に発現する。これと関連して、同種寛容（ａｌｌｏｔｏｌｅｒａｎｔ）マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞は、免疫コントロールマウスまたはネイティブマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞と比較して、上昇したレベルのＣＴＬＡ−４をその表面上に発現した。ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞機能において重要であり、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞によって仲介される寛容によって果たされるＣＴＬＡ−４の役割は、議論され続けている。抗ＣＴＬＡ−４のＦａｂによる処置は、外因性ＩＬ−２処置後に言及した回復に類似して、一時的にエフェクターＴ細胞の免疫応答を回復する。このことは、標的化ＣＴＬＡ−４結合におけるＴｒｅｇ細胞の寛容発生（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）機能の維持のために、ＣＴＬＡ−４が不可欠であることを示した。
【０１０７】
ＣＴＬＡ−４遮断における応答性低下の逆転は、Ｔｒｅｇ細胞上に構成的に発現されるＣＴＬＡ−４の結合を示唆する。実際に、研究は、リガンドによるＣＴＬＡ−４結合が天然に発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の維持およびホメオスタシスに必要であることを、Ｂ７．１ノックアウトマウスおよびＢ７．２ノックアウトマウスを用いて実証している。この関係において、Ｍ１２細胞（使用した標的細胞株）は、Ｂ７．１およびＢ７．２の両方を発現する。さらに、標的細胞との接触は、Ｔｒｅｇ細胞が調節性サイトカインを産生し、そしてＴＣＲ結合を含む機構を介してそのＡｇ特異性を維持するために必要である。同種反応性Ｔ細胞は、寛容マウスにおいて低応答性状態で存在し、この状態は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の除去において逆転され得るか、または過剰なＩＬ−２もしくはＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１中性化Ａｂの存在下において逆転され得る。Ａｇ特異的Ｔ細胞は、恐らくＩＬ−１０およびＴＧＦ−βによって、アネルギー状態で維持されるが、検出されない。
【０１０８】
Ｔｒｅｇ細胞の主要な特徴の１つは、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１を産生するその能力、ならびにこれらのサイトカインがＴｒｅｇ細胞によって誘導される抑制において果たす役割である。寛容化マウスは、より高いレベルのＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１を産生し、そしてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、これらのサイトカインの主要な供給源であった。寛容化マウス由来のＴ細胞は、より多い量のＩＬ−４を産生したが、ＣＤ２５−細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞以外の細胞は、このサイトカインの供給源であった。ＩＬ−４の中性化は、Ｔ細胞応答性低下に有為な効果を有さなかったが、一方で、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βｌの中性化は、アロ抗原に応答するエフェクターＴ細胞の能力を一時的であるが回復した。しかし、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ実験からの結果は、Ｔｒｅｇ細胞がエフェクター細胞に直接接触しない場合、これらのサイトカインについての役割がより小さくなることを示唆した。エフェクター細胞（ＣＤ２５−）は、Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ２５＋）および標的細胞（アロ抗原）との同時の相互作用を必要とし得る。あるいは、同じチャンバー内のこれらの細胞の存在は、Ｔｒｅｇ細胞によって放出されたサイトカインの希釈を防ぎ得、そしてこれらを近接するエフェクター細胞により容易に結合させ、そしてより容易にエフェクター細胞上で作用させる。
【０１０９】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞は、ネイティブのＴ細胞またはＡｇ特異的Ｔ細胞に由来し得る。Ａｇ特異的Ｔｒｅｇ細胞は、事前に存在するＡｇ非特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団およびＡｇ特異的エフェクターＴ細胞から産生され得る。Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なサブセットが、報告されている。天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の第１のサブセットは、Ａｇ特異性を示さず、ＴＧＦ−β１を通して作用する。適合性Ｔｒｅｇ細胞の第二のサブセットは、エキソビボで誘導され得、最適未満のＡｇ曝露および／または同時刺激によって、成熟Ｔ細胞の活性化の結果として発生する。適合性Ｔｒｅｇ細胞は、主に分泌された因子（例えば、ＩＬ−１０）を通して作用する。表面分子、サイトカイン分泌パターン、および作用様式の異なる、発現レベルの明らかなＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団は、寛容誘導についての方法に依存して活性化され得る。
【０１１０】
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４を通したシグナル伝達は、インビトロでアネルギーの２つの明らかな形態を制御する。１つの形態は、明らかにＣＤ２８同時刺激非存在下かつＣＴＬＡ−４シグナル伝達の非存在下におけるＴＣＲ占拠から生じ、ＩＬ−２によって逆転され得る。アネルギーの他の形態は、活性化後の増殖の欠損に関連し、この欠損は、ＣＤ２８同時刺激シグナルの存在にもかかわらず起こり、ＩＬ−２によって逆転され得ない。長期的な寛容を誘導する、アネルギーの第１形態（ＣＤ２８シグナル伝達の欠損）の能力は、十分に確立されていない。しかし、ＣＤ２８活性化およびＴＣＲ結合と同時に起こるＣＴＬＡ−４シグナル伝達は、細胞のさらなる増殖を阻止し、そして細胞にＡｇ特異性を獲得させ、そして恐らくは、Ｔｒｅｇ細胞に分化させる。
【０１１１】
ＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔｒｅｇ細胞と比較して、Ｍ１２細胞に対するエフェクターＴ細胞応答を抑制することにおいて、より強力であった。その上、ＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇ細胞のこのよりよい阻害性質は、ＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇ細胞の相対的により高いＣＴＬＡ−４の表面発現ならびにＣＴＬＡ−４アロ抗原に対する曝露におけるＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１の産生と関連していた。このことは、両サブセットはアネルギー性であるがＣＤ６２Ｌ＋集団がＣＤ６２Ｌ−集団または未分離のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞より、細胞あたりの基準でより強力であり、そして増殖し得かつ抑制機能をはるかによく維持するという、より初期の知見とは逆である。これらの研究はまた、ＣＤ６２Ｌ＋サブセットは培養物中でずっとはるかに拡大しやすく、そしてケモカインによって駆動される二次リンパ器官への移動に対してより応答性であるということを実証した。この食い違いは、寛容を誘導するために用いた戦略における相違に起因する。本明細書中の開示において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞は、最もＡｇ特異的になりやすく、従って、ＣＤ６２Ｌ−サブセットは、記憶表現型を表し得る。
【０１１２】
要約すると、標的化されたＣＴＬＡ−４結合によって作製されるＴｒｅｇ細胞は、治療的可能性を有する。移植片に対するアロ抗原特異的Ｔ細胞寛容の誘導が、行われる。ランゲルハンス島のような同種移植片は、移植の前に島に結合された抗ＣＴＬＡ−４  ＡｂまたはＭＨＣ特異的Ａｂでコーティングされ得る。あるいは、上記移植片のＭＨＣ  Ａｇｓと同系である細胞は、移植の前に寛容を誘導するために、アロ抗原特異的Ａｂに結合された抗ＣＴＬＡ−４でコーティングされ得、そしてレシピエントに注射され得る。
【０１１３】
（材料および方法）
（インスリン産生細胞に対する免疫応答の調節）
インスリン分泌細胞株のＮＩＴ−１を、インビトロでの同種異系β細胞の代用物として使用した。抗Ｈ２−Ｄｂ抗体を抗ＣＴＬＡ−４抗体に結合することによって、Ｈ−２ｂＮＩＴ−１細胞に結合するＢｉＡｂ試薬を調製した。未処置またはＮＩＴ−１細胞で初回抗原刺激されたＣＡＢ／ｊマウス（Ｈ２−Ｋｋ）由来の脾臓細胞をＢｉＡｂの存在下においてＮＩＴ−１細胞と共にインキュベートし、そしてＴ細胞増殖およびＮＩＴ細胞がインスリンを産生する能力について試験した。このＢｉＡｂは、ＮＩＴ−１細胞に対するＴ細胞応答を、コントロール抗体と比較して有意に抑制した。さらに、ＢｉＡｂおよび初回抗原刺激された脾臓細胞と共にインキュベートされたＮＩＴ−１細胞は、インスリンを産生し続け、このことは、これらの細胞が、アロ応答性Ｔ細胞による殺傷から免れることを示す（図２０）。
【０１１４】
（インビトロのアロ−島防御アッセイ）
Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ２Ｋｄ）マウスを島ドナーとして使用し、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ２Ｋｂ）をレシピエントとして使用して、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ２−Ｋｂ）マウスからの免疫攻撃に対する防御の際の抗Ｈ２−Ｋｄ／抗ＣＴＬＡ−４  ＢｉＡｂを試験する。膵島は、コラゲナーゼ処置、その後のパーコール勾配遠心分離によって、Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈ２−ｄ）から慣用的に単離されている（図２１）。これらの島は、抗Ｈ２−Ｋｄ／抗ＣＴＬＡ−４  ＢｉＡｂがＣ５７ＢＬ／６（Ｈ２−ｂ）マウスからの免疫攻撃に対して防御する能力について試験するためのインビボおよびインビトロのアッセイにおいて使用されている。
【０１１５】
最初に、抗Ｈ２−Ｋｄ抗体を抗ＣＴＬＡ−４抗体に結合させて、抗Ｈ２−Ｋｄ／抗ＣＴＬＡ−４  ＢｉＡｂを生成した。抗Ｈ２−Ｋｄ／抗ＣＴＬＡ４  ＢｉＡｂが、インビトロでアロ応答性Ｔ細胞からＨ２−Ｋｄ島を防御する可能性を決定した。ハムスターＩｇＧに結合した抗Ｈ２Ｋｄ抗体をアイソタイプコントロールＢｉＡｂとして使用した。未処置またはＨ２ｄ（Ｍ１２細胞）で初回抗原刺激したＣ５７ＢＬ／６（Ｈ２−Ｋｂ）マウスのいずれか由来の脾臓細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のトリプシン消化単一島細胞懸濁液と共に、ＢｉＡｂまたはアイソタイプコントロールＢｉＡｂのいずれかの存在下においてインキュベートした。その後、アロ応答性の指標としてＴ細胞増殖を試験し、島細胞生存の指標として島細胞がインスリンを産生する能力を試験した。図２２に示すように、ＢｉＡｂは、島に対してＴ細胞増殖応答を、コントロールＢｉＡｂと比較して有意に抑制した。アロ応答性が抑制される場合、島がより長期間生存してインスリンを産生し続けることが予想される。予想されるように、ＢｉＡｂ処理培養物由来の島は、コントロールＢｉＡｂで処理した培養物に対して、より高い量のインスリンを産生した（図２３）。
【０１１６】
移植手順の有効性について試験するために、膵島をＢａｌｂ／ｃ（Ｈ２−Ｋｄ）マウスから単離し、そして適切な腎臓カプセルのもとで同系（Ｂａｌｂ／ｃ）マウスまたは同種異系（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｈ２ｂ）マウスのいずれかに移植した（２００島／マウス）。これらのマウスは、ストレプトゾトシン（２００ｍｇ／ｋｇ）での前処置によって糖尿病性にしてあった。血液グルコースレベルについて２０日間、レシピエントをモニタリングした。図１２に示すように、同系島を受容したマウスは、移植の７日以内は、正常なグルコースレベルを示した。しかし、同系異種島を受容したマウスは、正常なグルコースレベルを示さず、これは、アロ応答に起因する移植片拒絶反応を示唆した。島細胞が、それらを防御するＢｉＡｂでコーティングされたか否かを調べるために、ＢｉＡｂと一緒のＢａｌｂ／ｃ（Ｈ２−Ｋｄ）マウス由来の島を洗浄し、ストレプトゾトシン前処置のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ２−Ｋｂ）糖尿病マウスにそれらを移植した。レシピエントのグルコースレベルを２０日間モニタリングした。抗Ｈ２−Ｋｄ／抗ＣＴＬＡ−４  ＢｉＡｂでコーティングされた島を受容したマウスのグルコースレベルにおいて、アイソタイプコントロールＢｉＡｂでコーティングされた島を受容したマウスと比較して減少が見られたが、これらは、正常グルコースレベルに達しなかった（図１３）。
【０１１７】
（マウス）
６〜８週齢の雌ＣＢＡ／Ｊを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。イリノイ大学（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）のＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ研究施設でマウスを飼育し、自由に食物および水を提供した。イリノイ大学のＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって記載されるガイドラインに従って、動物の世話をした。全てのマウスを、８週齢〜１０週齢において使用した。
【０１１８】
（ＧＭ−ＣＦＳ、Ａｂおよびマウスサイログロブリン）
組換えマウスＧＭ−ＣＳＦを、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。フローサイトメトリーにおいて、ＦＩＴＣ結合体化の抗ＣＤ１１ｃおよびＰＥ結合体化の抗Ｉ−Ａｋ（ＭＨＣクラスＩＩ）、抗ＣＤ８ａ、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、および抗ＣＤ４０（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＰＥ結合体化の抗ＣＤ４、抗ＣＤ８ａ、および抗ＣＤ２５（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）Ａｂを使用した。マウスＩＬ−１０レセプターに対する中和ラットモノクローナルＡｂ（クローン１Ｂ１．３ａ）は、親切にもＫｅｖｉｎ  Ｍｏｏｒｅ（ＤＮＡＸ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔａ，ＣＡ）によって提供された。精製ラットＩｇＧ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）を、アイソタイプコントロールとして使用した。Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞、および樹状細胞の磁気ビーズ単離キットを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）から得た。ＢｉｏｃｈｅｍＭｅｄから得た正常マウス甲状腺およびサイログロブリンを調製した（Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）。
【０１１９】
（ＧＭ−ＣＳＦ処置およびサイログロブリンによる免疫化）
特定しない限り、３つの群のマウス（ｖｉｚ，１，ＣＦＡコントロール；２，ｍＴｇコントロール；３，ＧＭ−ＣＳＦ／ｍＴｇ）を使用した。１群および２群のマウスにＰＢＳを注射し、３群のマウスに２ｇのＧＭ−ＣＳＦ／マウス／日を注射した（１〜５日目および１５〜１９日目）。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化したｍＴｇ（１００μｇ／マウス）で、６日目および２０日目に２群および３群のマウスを免疫化した（ｓ．ｃ．）。１群のマウス（ＣＦＡコントロール）は、６日目および２０日目にＣＦＡ中に乳化したＰＢＳを受容した。ＧＭ−ＣＳＦ仲介性免疫調節の種々の局面を理解するために、これらの３群のマウスを、以下のように異なる実験のために異なる時点において屠殺した。
【０１２０】
（ＤＣ成熟に対するＧＭ−ＣＳＦ処置の効果）
上で言及した２群および３群のマウス（すなわち、それぞれ、ｍＴｇコントロールおよびＧＭ−ＣＳＦ／ｍＴｇ）を使用した。各ｍＴｇ免疫化の前（６日目および２０日目）および後（８日目および２２日目）で動物を屠殺した。全ての動物を同時に屠殺するような方法で、免疫化スケジュールをずらした。これらのマウス由来の脾臓細胞をＰＥ結合体化抗マウスＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、またはＣＤ４０抗体と組み合わせて、ＦＩＴＣ結合体化抗マウスＣＤ１１ｃで染色し、ＦＡＣＳ分析器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）で分析した。ＣＤ１１ｃ単離キットを使用して脾細胞からＤＣを単離し、ｍＲＮＡ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用してｍＲＮＡを抽出した。全ての手順を製造業者の指示に従って実施した。ｃＤＮＡｓをｍＲＮＡサンプルから合成し、ＰＣＲのために使用した。ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、およびＩＬ−１２についてのサイトカイン転写レベルを、多重ＰＣＲ方法を使用して製造業者（Ｍａｘｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）のガイドラインに従って決定した。
【０１２１】
（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の養子転移）
ＣＦＡコントロール、ｍＴｇコントロール、ＧＭ−ＣＳＦ／ｍＴｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のレシピエント群を、この実験に含めた。ＧＭ−ＣＳＦ／ｍＴｇ群由来のマウスをドナーとして使用し、３４日目に屠殺して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋単離キットを使用して製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の指示に従って、脾細胞およびリンパ節からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を単離した。単離集団は、＞９０％純粋であった。ｍＴｇ免疫化マウスの１つのセットを、免疫化の２８日後にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（１×１０６／マウス）をｉ．ｖ．注射をすることによってドナーに養子転移した。動物を４５日目（転移の１８日後）に屠殺し、リンパ節、脾臓、甲状腺、および血清を、ｍＴｇ特異的免疫応答を分析するために収集した。
【０１２２】
（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の同時培養）
ｍＴｇコントロールおよびＧＭ−ＣＳＦ  ｍＴｇのマウス群を使用した。本明細書において記載されるように、マウスをＧＭ−ＣＳＦで処置し、ｍＴｇで免疫化した。これらのマウスを３５日目に屠殺し、脾臓およびリンパ節の細胞を収集し、そして上記に記載のようにＧＭ−ＣＳＦ／ｍＴｇ群のマウスからＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を単離した。ｍＴｇコントロール群のマウスからの脾臓およびリンパ節の細胞から、磁気細胞分取（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してエフェクターＴ細胞を単離し、ＣＦＳＥ（濃度１μＭ）で１０分間３７℃で染色した。細胞を３回洗浄し、９６ウェル平底プレートに０．５×１０６細胞／ウェルでプレートした。３群から単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、５：１のエフェクター：Ｔｒｅｇの比で培養物に添加した。ナイーブマウス由来のＴ細胞枯渇脾臓細胞（０．５×１０６細胞／ウェル）または濃縮樹状細胞（０．１×１０６細胞／ウェル）（両方とも磁気細胞分取によって達成した）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、支持細胞として使用した。７日後に培養物から細胞を収集し、ＦＡＣＳ分析器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してＣＦＳＥ希釈について試験した。
【０１２３】
（ａＩＬ−１０Ｒ抗体処置）
６つの群（ｖｉｚ，１，ＣＦＡコントロール；２，ｍＴｇコントロール；３，ＧＭ−ＣＳＦ／アイソタイプコントロール；４，ＧＭ−ＣＳＦ／αＩＬ−１０Ｒ  ＃１；５，ＧＭ−ＣＳＦ／αＩＬ−１０Ｒ  ＃２；６，ＧＭ−ＣＳＦ／αＩＬ−１０Ｒ  ＃３）を、この組の実験に含めた（１群につき４〜５匹のマウス）。１群、２群、および３群は、３群の動物が、６日目、１１日目、２０日目、２５日目および３２日目にラットＩｇＧアイソタイプコントロール抗体（０．５ｍｇ／マウス）のｉ．ｐ．注射を受けた以外は、上で言及した群と対応する。４群、５群および６群の動物をＧＭ−ＣＳＦで処置し、上記に記載のとおりｍＴｇで免疫化し、そしてこれらの動物は、６日目、１１日目、２０日目、２５日目および３２日目；６日目および２０日目；ならびに１１日目、２５日目および３２日目にそれぞれαＩＬ−１０Ｒのｉ．ｐ．注射を受けた（０．５ｍｇ／マウス）。全ての動物を４５日目に屠殺し、リンパ節、脾臓、甲状腺、および血清を収集して甲状腺炎を評価した。
【０１２４】
（甲状腺微小環境に対するＧＭ−ＣＳＦ処置の効果）
ＣＦＡコントロール、ｍＴｇコントロール、およびＧＭ−ＣＳＦ／ｍＴｇマウスを使用した。各群の３匹のマウスを２１日目に屠殺し、甲状腺を収集し、群内でプールしてコラゲナーゼＤ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で１時間３７℃で消化し、単一細胞懸濁液を調製した。２％ＦＢＳを補充したＰＢＳで細胞を洗浄し、氷上で３０分間、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２  Ｆｃ−Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）でブロックした。ＰＥ結合体化抗マウスＣＤ２５  ｍＡｂと一緒にＦＩＴＣ結合体化抗マウスＣＤ４を使用して氷上で１５分間、細胞を染色し、洗浄し、そしてＦＡＣＳ分析器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。１つのサンプルにつき少なくとも１０，０００個の細胞を分析した。サイトカイン／ケモカインの産生を決定するために、甲状腺細胞の懸濁液を２％正常マウス血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で３６時間維持した。これらの培養物から細胞を含まない上清を収集し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＰｉｔｔｓｂｕｒｇｈのＬｕｍｉｎｅｘコア施設においてＬｕｍｉｎｅｘ技術を使用して、自発的なサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−α）およびケモカインの産生（ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳ）を複合サイトカイン／ケモカインアッセイキットによって検出した。このキットを使用して示唆される最も低い検出レベルは、ＩＬ−４について５ｐｇ／ｍｌ、ＩＦＮ−αについて１ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−１０について１５ｐｇ／ｍｌ、ＭＣＰ−１について５ｐｇ／ｍｌ、およびＲＡＮＴＥＳについて５ｐｇ／ｍｌである。
【０１２５】
甲状腺細胞でのアポトーシス分子の発現を評価するために、甲状腺細胞を他の常在の細胞から分離し、製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｔｏｅｃｈ）の指示に従ってｍＲＮＡ単離キットを使用してｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡおよびＦａｓ、ＦａｓＬ、カスパーゼ−８に対する遺伝子特異的プライマー（Ｍａｘｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。α−アクチンをコントロールとして使用し、このアッセイ中でＲＮＡが当量であることを確実にした。
【０１２６】
（ｍＴｇ特異的Ｔ細胞増殖）
マウスの脾細胞またはリンパ節細胞（５×１０５細胞／ウェル）を、２％正常マウス血清を含むＲＰＭＩ  １６４０中（最終容量０．２５ｍｌ／ウェル）に３重で９６ウェル平底組織培養プレートにプレートした。ｍＴｇを２０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。Ｃｏｎ  Ａ（１μｇ／ｍｌ）をポジティブコントロールとして使用した。ＣＯ２インキュベーター中で７２時間３７℃において細胞をインキュベートした。培養の最後の１６時間、細胞を１μＣｉ［３Ｈ］チミジン／ウェルでパルスし、９６ウェルＵ底組織培養プレートに移し、ＰＢＳで２回洗浄し、水中に溶解して３７℃で一晩乾燥させた。シンチレーション流体をこれらのウェルに添加し（５０μｌ／ウェル）、９６ウェルプレートＭｉｃｒｏｂｅｔａ  ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して計測した。Ｔ細胞の増殖パターンを評価して試験するために、上記のように細胞をＣＦＳＥで染色し、２％正常マウス血清を含むＲＰＭＩ  １６４０中のｍＴｇ（２０ｇ／ｍｌ）（最終容量０．２５ｍｌ／ウェル）の存在下または非存在下において、９６ウェル平底組織培養プレートに細胞をプレートし、７日間維持し、収集し、そしてＦＡＣＳ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＣＦＳＥ希釈について試験した。
【０１２７】
（サイトカイン産生の測定）
脾臓またはリンパ節５×１０６細胞／ウェル（１２ウェルプレート）を、２％正常マウス血清を補充した１．５ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地において、ｍＴｇ（２０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下において３６時間インキュベートした。細胞を含まない培養上清を３６時間後に遠心分離によって収集した。細胞を含まない上清中のサイトカインレベルを、製造業者（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の指示に従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−４およびＩＦＮ−αの検出のための対のＡｂを使用するＥＬＩＳＡによってアッセイし、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用してＯＤ４５０を記録した。対応するサイトカイン標準を使用してサイトカインの量を決定した。このキットを使用して示唆される最も低い検出レベルは、ＩＬ−２について２ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−４について４ｐｇ／ｍｌ、ＩＦＮ−αについて１５ｐｇ／ｍｌ、およびＩＬ−１０について１５ｐｇ／ｍｌである。
【０１２８】
（ＥＡＴの評価）
屠殺時にマウスから収集した甲状腺をホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、切り出してＨ＆Ｅで染色した。疾患重症度のマーカーとして、甲状腺のリンパ性炎症の程度について甲状腺をスコア付けした（１＋〜５＋のスケールを使用）。１または数個の病巣における少なくとも１２５個の細胞の浸潤をスコア１＋をした；細胞浸潤の１０〜２０の病巣（腺の２５％までを含む）をスコア２＋とした；腺の２５〜５０％までを含む浸潤をスコア３＋とした；腺の５０％を超える破壊をスコア４＋とした；そして腺のほとんど完全な破壊（小胞がほとんど残っていないか、または全く残っていない）をスコア５＋とした。
【０１２９】
（統計学的分析）
平均、ＳＤ、および統計学的有意性を、ＳＰＳＳ適用を使用して計算した。統計学的有意性を、ノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ符号検定（ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ
Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｓｉｇｎｅｄ  ｔｅｓｔ）を使用して決定した。ほとんどの場合において、個体処置群および免疫化群の値を、未処置であるが、免疫化された群の値と比較した。＜０．０５のｐ値を有意であるとみなした。平均、ＳＤ、および統計学的有意性（ｐ値）を、ＳＳＰＳ統計学的適用（ＳＳＰＳ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用して計算した。ｐ値は、ノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ符号検定を使用して決定した。多くの場合において、ＢｉＡｂ処置群（抗ＣＴＬＡ−４  ＡｂでコーティングされたｍＭ  １２細胞を受けたマウス）の値を、特定しない限りｍＭ１２免疫群（アイソタイプコントロールＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞を受けたマウス）の値と比較した。試験群とコントロール群との間の蛍光陽性細胞のパーセントの差を、ノンラパメトリック符号検定を使用して試験した。＜０．０５のｐ値を有意をみなした。
【０１３０】
（マウス系統）
６週齢の雌のＣＢＡ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃ、およびＣ５７ＢＬ／６マウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。イリノイ大学（Ｃｈｉｃａｇｏ）のＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ研究所でマウスを飼育し、自由に食物および水を提供した。イリノイ大学（Ｃｈｉｃａｇｏ）のＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって記載されるガイダンスに従って、全てのマウスを８週齢において使用し、世話をした。
【０１３１】
（Ａｂおよび細胞株）
Ｍ１２は、ＢＡＬＢ／ｃ起源（Ｈ−２ｄ）のＢ細胞リンパ種である。Ｍ１２細胞を、マウスＴＳＨＲ  ｃＤＮＡ（ｍＭ１２細胞）で安定にトランスフェクトし、Ａｇ／８マウスＢ細胞リンパ腫（Ｈ−２ｄ）を使用した。ハムスター抗マウスＣＴＬＡ−４ハイブリドーマ（ＵＣ１０−４−Ｆ−１０−１１；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）およびマウス抗マウスＴＳＨＲハイブリドーマ（Ｄ６−４）を、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１５ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、２−ＭＥ（５×１０−５Ｍ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ファンギゾン（１ｇ／ｍｌ）、および１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において増殖させた。自己免疫性グレーヴズ病を有するＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞をマウスＢ細胞骨髄腫Ｓｐ２／０と融合させることによって、Ｄ６−４ハイブリドーマを調製した。プロテインＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）アフィニティーカラムを使用して、Ａｂを使用済み培地から精製し、濃縮し、そしてＰＢＳ（０．０１Ｍ；ｐＨ７．２）に対して透析した。これらのＡｂをペプシンで消化し、Ｆ（ａｂ）２フラグメントをゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。抗ＣＴＬＡ−４−抗ＴＳＨＲ  ＢｉＡｂを、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート）−ＳＭＰＢ（スクインイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート）化学結合によって調製した。次いで、この結合Ａｂを抗マウスＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを最初に通して、その後抗ハムスターＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティーカラムを通すことによって、未結合のＡｂから精製した。精製Ａｂを、試験ＢｉＡｂ（ｔＢｉＡｂ）として標識した。精製ハムスターＩｇＧをＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）から購入し、そしてＦ（ａｂ）２フラグメントを調製して、抗ＴＳＨＲ  Ｆ（ａｂ）２に結合することによってコントロールＢｉＡｂ（ｃＢｉＡｂ）を調製するために使用した。全ての調製物の結合および標的結合の効力を試験した。
【０１３２】
（抗ＣＤ１６／ＣＤ３２  Ａｂ）
ＦＩＴＣ結合体化の抗マウスＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８ａ；ならびにＰＥ標識の抗マウスＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、およびＴＧＦ−β１（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，およびＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、フローサイトメトリーで使用した。ＥＬＩＳＡにおいては、対のＡｂと、マウスＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γ（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を検出するため、ならびにＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を検出するために必要なサイトカイン標準とを使用した。マウスＩＬ−４（ラットＩｇＧ１；クローン  １１Ｂ１１）およびＩＬ−１０（ラットＩｇＧ１；クローンＪＥＳ５−２Ａ５）に対する中和Ａｂを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）から購入した。組換えマウスＩＬ−２（ｒｍＩＬ−２）、マウスＴＧＦ−β１（ラットＩｇＧ１；クローン１Ｄ１１）に対する中和Ａｂ、および正常ラットＩｇＧ１アイソタイプコントロールをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した；磁気ビーズ結合体化抗ＰＥの抗マウスＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ  Ａｂ、汎Ｔ細胞単離キット、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ−細胞を単離した。抗ＣＴＬＡ−４のＦａｂを、パパイン結合アガロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を製造業者の指示に従って使用して、パパイン消化によって調製した。
【０１３３】
（ＣＴＬＡ−４結合による寛容誘導）
ｍＭ１２細胞をマイトマイシンＣ（５０μｇ／１０７細胞／ｍｌ）で処理し、１×１０７細胞を氷上で３０分間、ｃＢｉＡｂまたはｔＢｉＡｂ（１００μｇ）のいずれかと共にインキュベートした。次いで、８週齢の雌ＣＢＡ／Ｊマウス（Ｈ−２ｋ）に、１０日間隔で２度（０日目および１０日目）、これらの細胞をｉ．ｐ．注射した。コントロールマウス（ｍＭ１２免疫群）は、コントロールＡｂ（抗ＴＳＨＲ抗ハムスターＩｇＧ  ＢｉＡｂ）から調製したｃＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞を受けたが、特定しない限り試験マウス（ＢｉＡｂ処置群）は、抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂと抗ＴＳＨＲ  Ａｂとを結合することによって調製したｔＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞を受けた。以後、ｃＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞を受けたマウスおよびｔＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞を受けたマウスを、それぞれコントロール群およびＢｉＡｂ処置群という。ブースター注射の１０日後（２０日目）にマウスを屠殺し、脾臓およびリンパ節からリンパ球を収集した。一部の研究のために、６０日目にＭ１２細胞で寛容化マウスを再チャレンジし、７０日目に屠殺した。
【０１３４】
（アロ抗原による免疫化／チャレンジ）
上記に記載のように、ＣＴＬＡ−４結合によってマウスを寛容化した。２０日目に、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ２ｂ）マウスもしくはＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）マウス由来のマイトマイシンＣ処置脾臓細胞（１×１０７細胞／マウス）、またはＡｇ８（Ｈ２ｄ）細胞（２×１０６細胞／マウス）でこれらのマウスを免疫した（ｉ．ｐ．）。これらのマウスを３０日目に屠殺し、これらの細胞がＭ１２および他のアロ抗原に対して応答する能力をリンパ球増殖およびＩＬ−２産生アッセイによって試験した。
【０１３５】
（増殖アッセイ）
エファクター細胞（脾臓細胞または精製Ｔ細胞の集団；０．５×１０６細胞）およびマイトマイシンＣ処理標的細胞（Ｍ１２細胞、０．５×１０５細胞／ウェル；脾臓細胞、５×１０５）を、２％正常マウス血清を含むＲＰＭＩ  １６４０中で（最終容量０．２５ｍｌ／ウェル）、３連で９６ウェル平底組織培養プレートにプレートした。いくつかの実験において、このアッセイを種々の濃度（５〜２００Ｕ／ｍｌ）のｒｍ  ＩＬ−２の存在下において実施した。４８時間後、２％正常マウス血清を補充した上記の培地の１００μｌにおいて、１μＣｉ／ウェル［３Ｈ］チミジンで１８時間、細胞をパルスした。細胞を収集し、そして［３Ｈ］チミジンの取り込みをＭｉｃｒｏｂｅｔａシンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して測定した。Ｍ１２細胞を含まないエフェクター細胞培養物のバックグラウンドの数値を、試験値から差し引いて実際の数値を計算した。
【０１３６】
（ＣＦＳＥ染色）
免疫マウスもしくは寛容マウスのいずれかに由来する脾臓のリンパ球または精製リンパ球の単一細胞懸濁液を、ＨＢＳＳ中に１×１０６細胞／ｍｌの濃度で懸濁し、追跡用蛍光色素ＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で標識した。細胞を５分間最終濃度１μＭのＣＦＳＥ（ＨＢＳＳ中）と共にインキュベートし、ＦＣＳの添加（総容量の１０％）によって標識化を終わらせた。完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中で細胞を２回洗浄し、上記に記載のように増殖アッセイにおいて使用した。インキュベーションの７日後に、ＣＦＳＥの希釈をフローサイトメトリー分析によって測定した。
【０１３７】
（フローサイトメトリー）
脾臓およびリンパ節の単一細胞懸濁液を２％ＦＢＳを補充したＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、氷上で１５分間抗ＣＤ１６／ＣＤ３２  Ｆｃブロックでブロッキングした。種々の濃度のＦＩＴＣ標識、ＰＥ標識、およびシトクロム標識の適切なＡｂで、細胞を氷上で３０分間染色し、洗浄してＦＡＣＳ分析器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析し、これらのデータをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアまたはＷｉｎＭＤＩソフトウェアを使用して分析した。コントロール細胞をアイソタイプ適合のコントロールＡｂで染色し、分析した。全ての実験において少なくとも１０，０００個の細胞を分析した。
【０１３８】
（サイトカイン産生）
合計５×１０６個の脾臓細胞／ウェル（１２ウェルプレート）を、２％正常マウス血清を補充した１．５ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地において、０．５×１０６個のマイトマイシンＣ処理標的Ｍ１２細胞の存在下で４８時間インキュベートした。４８時間後に細胞を含まない培養上清（使用済み培地）を収集し、そして製造業者の指示に従って、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、およびＴＧＦ−β１を検出するための対のＡｂおよびそれぞれのサイトカイン標準を使用するＥＬＩＳＡによって、サイトカインレベルをアッセイした。ＨＲＰ標識のストレプトアビジンを添加し、その後洗浄してテトラメチルベンジジン−Ｈ２Ｏ２基質（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を５〜１０分添加することによって、サイトカインを検出した。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、ＯＤ４５０を読み取った。サイトカインの量を、適切なサイトカイン特異的標準曲線を使用して決定した。Ｍ１２細胞を含まないエフェクター細胞培養物のバックグラウンドのサイトカインレベルを試験値から差し引いて、実際のサイトカイン応答を計算した。
【０１３９】
細胞内サイトカイン発現分析のために、実験の終わりに収集した脾臓細胞を、マイトマイシンＣ処置Ｍ１２細胞で活性化するか、または３６時間静止させておくかのいずれかにした。細胞を、ＣＤ３に対してＦＩＴＣ結合体化Ａｂで染色し、次いで固定してＣｙｔｏｆｉｘ／ｐｅｒｍ試薬（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して透過化処理した。その後、上記に記載のように、これらの細胞をＰＥ標識の特異的抗サイトカインＡｂで染色し、洗浄し、そしてＦＡＣＳ分析器で分析した。いくつかの実験において、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）のＬｕｍｉｎｅｘコア施設においてＬｕｍｉｎｅｘ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）技術を使用する複合サイトカインアッセイによって、サイトカインを検出した。
【０１４０】
（サイトカイン中和およびＣＴＬＡ−４遮断アッセイ）
上記に記載のように、ＣＦＳＥ希釈アッセイのために、マイトマイシンＣ処理Ｍ１２細胞の存在下でＴ細胞を培養した。これらの培養物に対して、種々の濃度の中和抗マウスＩＬ−４（１０〜２０００ｎｇ／ｍｌ）、抗マウスＩＬ−１０（１０〜５０００ｎｇ／ｍｌ）、抗マウスＴＧＦ−β１（１０〜２０００ｎｇ／ｍｌ）、および／またはアイソタイプ適合コントロールＡｂを添加し、７日間インキュベートした。抗マウスＣＴＬＡ−４のＦａｂの種々の濃度（１００ｎｇ〜１０ｇ／ｍｌ）またはアイソタイプコントロールＡｂを一部の培養物に添加し、ＣＴＬＡ−４相互作用をブロックした。インキュベーションの７日後、フローサイトメトリー分析によってＣＦＳＥの希釈を測定した。
【０１４１】
（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞および他のＴ細胞小集団の単離）
製造業者の指示に従って、磁気ビーズに結合体化したＡｂと磁気分離カラムとを使用して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を単離した。プールしたマウス脾臓細胞およびリンパ節細胞を、抗ＣＤ１６／３２  Ａｂと共に氷上で１５分間インキュベートしてＦｃＲをブロックし、その後、製造業者の指示に従って汎Ｔ細胞単離（ネガティブ選択）キットを使用してＣＤ３＋Ｔ細胞を単離した。ＰＥ標識抗マウスＣＤ２５および磁気ビーズ標識抗ＰＥ  Ａｂ、またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞単離キットのいずれかを使用して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、脾臓細胞集団またはＣＤ３＋集団から単離した。ＰＥ標識抗マウスＣＤ２５  Ａｂと共に３０分間氷上で細胞をインキュベートした。次いで、磁気ビーズ結合体化抗ＰＥ  Ａｂと共に１５分間氷上で細胞をインキュベートし、洗浄し、そしてＬＳ磁気カラムまたは自動機械（Ａｕｔｏｍａｃｓ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して分取した。単離した細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ標識またはＰＥ標識の適切なＡｂで染色し、そしてフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において純度について試験した。いくつかの実験のために、磁気分離手順を使用して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞をＣＤ６２Ｌ＋集団およびＣＤ６２Ｌ−集団について濃縮した。このために、汎Ｔ細胞単離キットを使用してＣＤ３＋細胞を単離し、磁気ビーズ標識抗マウスＣＤ６２Ｌ  Ａｂを使用してＣＤ６２Ｌ＋細胞およびＣＤ６２Ｌ−細胞を濃縮した。上記に記載のように、ＣＤ６２Ｌ−画分からのＣＤ２５＋細胞を濃縮した。ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞を酸性化ＰＢＳを使用して洗浄して結合されたビーズを除き、ＣＤ２５＋集団を濃縮した。
【０１４２】
（ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ２５−Ｔ細胞の同時培養）
コントロールマウス（ｍＭ１２免疫）由来のＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞と混合した（比率１０：１）。逆もまた同じに行った。いくつかのアッセイにおいて、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋濃縮集団またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ−濃縮集団をＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の代わりに使用した。種々の比率のこれらの混合物または個々の細胞集団を、上記に記載のとおりＭ１２細胞の存在下または非存在下のいずれかで行われるＴ細胞増殖アッセイ（合計０．６×１０５細胞／ウェル）において使用した。
【０１４３】
（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｔ細胞阻害アッセイ）
寛容マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を上記に記載のように単離した。ウェル挿入物（上の成分）中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞（２．５×１０５）＋マイトマイシンＣ処理Ｍ１２細胞（０．５×１０５）およびウェル（下の成分）中のＣＤ２５−Ｔ細胞＋Ｍ１２細胞（２．５×１０６）を、Ｆａｌｃｏｎ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ組織培養ウェル挿入物（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイ系において２４ウェルプレート様式で培養した。４８時間後、細胞を２．５μＣｉの［３Ｈ］チミジンで１８時間パルスした。上区画および下区画からの細胞をプールし、シンチレーションカウンターにおける［３Ｈ］チミジン取り込みとして増殖を測定した。
【０１４４】
（Ｔｒｅｇ細胞の養子転移）
上記のように、コントロールマウスおよび試験マウス（ＣＢＡ／Ｊ；Ｈ２ｋ）両方からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を単離した。レシピエントマウスをＭ１２細胞（Ｈ２ｄ）で０日目に免疫し、Ｃ５７ＢＬ／６脾臓細胞（Ｈ２ｂ）で１０日目に免疫した。およそ５×１０６個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、２０日目のＭ１２細胞によるチャレンジ注射の２時間前にレシピエントマウスに養子転移（ｉ．ｖ．）した。これらのマウスを転移後３０日目に屠殺し、上記のようにＴ細胞増殖ならびにＭ１２細胞およびＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞に対するＩＬ−２応答について試験した。
【０１４５】
（文献）
以下の文献が、本開示において使用される材料および方法に関連する範囲に対して引用される。
【０１４６】
【化１】
2007537753.tif 000003
【０１４７】
【化２】
2007537753.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、二重特異性抗体（ＢｉＡｂ）が、寛容の誘導を媒介することを示し、以下；（ａ）活性化されたＴ細胞が、ＢｉＡｂとの相互作用の際に、抗ＣＴＬＡ−４抗体によるＣＴＬＡ−４の結合により低下すること；一方で（ｂ）ＣＴＬＡ−４と相互作用しない抗体（アイソタイプコントロール抗体）が、抗原に対するＴ細胞応答を調節すること；および（ｃ）タンデムなＴＣＲとＣＴＬＡ−４との結合は、おそらく抗原特異性を有する調節性Ｔ細胞の直接的または間接的な拡大を引き起こし、これは、次に、活性化Ｔ細胞の抗原特異的応答をダウンレギュレートし、寛容を誘導することを示す。
【図２】図２は、二重特異性抗体に媒介される寛容の誘導が、組織特異的であることを示し；組織特異的抗体を使用して抗ＣＴＬＡ−４抗体を目的の組織に標的化する際に、この抗体は、ＢｉＡｂが抗原に結合しているか否かに関係なく、組織に存在する任意の抗原に特異的なＴ細胞を低下することにより組織を防御するが、関連していない抗原に対する免疫応答は、関連していない抗原に特異的なＴ細胞が、ＢｉＡｂｓが存在する組織に存在しない場合、この組織を標的化したＣＴＬＡ−４の結合により影響を受けない。
【図３】図３は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞に対するＦＡＣＳ分析を示す：同種異系の（Ｈ２ｄ）ｍＭ１２細胞で免疫したマウス（Ｈ２Ｋ）（ａおよびｃ）またはＢｉＡｂと一緒にｍＭ１２（４）細胞で免疫したマウス（Ｈ２Ｋ）；脾臓細胞およびリンパ節細胞を収集し、ＦＩＴＣを結合体化したマウスＣＤ４抗体またはＰＥ標識した抗マウスＣＤ２５抗体で染色し；ＣＤ４＋細胞集団は、上記グラフのためにゲートされた。ＣＤ２５＋細胞の割合を、内側の長方形内に示し、各群の５個体のマウスのＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の割合を大きな長方形内に示す。
【図４】図４は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞によるＴ細胞増殖の阻害を示す：ｍＭ１２（Ｈ２ｄ）細胞で免疫したＨ２Ｋマウスから単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、二重特異性抗体と一緒にｍＭ１２細胞で免疫したマウス由来のＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞を欠く脾細胞と一緒に培養し、逆もまた同じである。同種増幅のために、マイトマイシンＣ処置したｍＭ１２細胞を培養物に添加し、増殖を、標準３Ｈ−チミジン取り込みによって測定した。
【図５】図５は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞の養子免疫転移に関し、Ｍ１２細胞で初回抗原刺激し、ｍＭ１２細胞で免疫したマウスから単離したＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞を養子免疫転移したか、ＢｉＡｂで処置した（ＢｉＡｂ）か、または未処理コントロール（免疫）または細胞を受けていない（なし）マウス（Ｈ２Ｋ）におけるＭ１２（Ｈ２ｄ）に対するエキソビボＴ細胞増殖応答に関する。
【図６】図６は、ナイーブマウス（ナイーブ）、ｍＭ１２（Ｈ２ｄ）細胞のみで免疫したマウス（未処置）または二重特異性抗体と一緒にｍＭ１２で免疫したマウス（ＢｉＡｂ処置）から単離されたＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞のＣＴＬＡ−４の発現についてのＦＡＣＳ分析を示す。
【図７】図７は、インビボ同種応答の阻害を例証する：ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ２ｋ）マウスをＢｉＡｂの存在下でｍＭ１２細胞で免疫した；群１は、０日目および１０日目にｍＭ１２細胞およびＢｉＡｂを受け、群２は、０日目および１０日目にｍＭ１２細胞を受けたが、ＢｉＡｂは、１０日目のみに受けた。ナイーブマウスまたはｍＭ１２細胞のみで免疫したマウスまたはＢｉＡｂとともにｍＭ１２細胞で免疫したマウス由来の脾臓細胞（０．６×１０６脾臓細胞）を、３連のウェルで、Ｍ１２細胞（０．５×１０５／ウェル）で５日間刺激した；（ａ）リンパ球を収集し、洗浄し、計数し、Ｔ細胞増殖アッセイのために、Ｍ１２細胞またはＣｏｎＡで４８時間再刺激した。；（ｂ）使用済みの培地をＩＬ−２についてＥＬＩＳＡにより試験した。
【図８】図８は、同種異系寛容特異性の分析を表す：ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ２ｋ）マウスを、表面結合抗ＴＳＨＲ抗ＣＴＬＡ−４  ＢｉＡｂ（試験ＢｉＡｂ）の存在下でｍＭ１２（Ｈ２ｄ）細胞で免疫した；ナイーブマウスは、ｍＭ１２細胞もＢｉＡｂも受けなかった；ｍＭ１２免疫群は、アイソタイプコントロールＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞を０日目および１０日目に受け；ＢｉＡｂ処置群は、試験ＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞を０日目および１０日目に受け；ｍＭ１２およびＢｉＡｂの処置群のマウスは、２０日目にＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞（１×１０７細胞）の腹腔内注入を受けた；３つ全ての群由来の脾臓細胞（０．６×１０６脾臓細胞）を３連のウェルで、マイトマイシン処理Ｃ５７ＢＬ６（Ｈ２−ｋＢ）脾臓細胞（２×１０５）またはＭ１２細胞（０．５×１０５／ウェル）のどちらかで４８時間刺激した。Ｔ細胞の増殖応答（黒塗りの棒グラフ）を標準３Ｈ−チミジン取り込み（１８時間）方法により測定し、これらの培養物から４８時間後に使用済みの培地を収集し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２応答について試験した（白抜きの棒グラフ）。
【図９】図９は、同種異系寛容の効果の分析を表す：ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ２ｋ）マウスを、図８に記載されるように、ＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞で免疫した。ｍＭ１２およびＢｉＡｂ処理した群は、２０日目にＡｇ８（Ｈ２ｄ）細胞（２×１０６）またはＢａｌｂ／ｃ脾臓細胞（１×１０７）の腹腔内注射を受けた。これらのマウス由来の脾臓細胞（０．６×１０６）を、３連でマイトマイシン処理したＡｇ８細胞（０．５×１０５／ウェル）（黒塗りのグラフ）またはＢａｌｂ／ｃ脾臓細胞（２×１０５細胞／ウェル）（白抜きのグラフ）で４８時間刺激した；（ａ）増殖応答を、標準３Ｈ−チミジン取り込み（１８時間）方法により測定し、（ｂ）使用済みの培地をＥＬＩＳＡによりＩＬ−２について試験した。
【図１０】図１０は、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の膵島細胞に対する同種応答のインビトロ阻害を示す。トリプシン消化により調製した単一の細胞懸濁液として使用した；膵島細胞を、アイソタイプコントロールＢｉＡｂまたは抗Ｈ２−Ｋｄ−抗ＣＴＬＡ−４ＢｉＡｂのどちらかでコーティングし、予めＨ２Ｋｄアロ抗原で免疫したマウス由来の膵臓細胞と一緒にインキュベートした；Ｔ細胞増殖応答を、３Ｈ−チミジン取り込み方法により測定した。
【図１１】図１１は、インビトロインスリン産生アッセイを示す。膵島を、Ｂａｌｂ／ｃマウスから単離し、トリプシン消化により調製した単一の細胞懸濁液として使用した；膵島細胞を、アイソタイプコントロールＢｉＡｂまたは抗Ｈ２Ｋｄ抗ＣＴＬＡ−４ＢｉＡｂでコーティングし、Ｈ２−Ｋｄアロ抗原に対して免疫されたマウス由来の脾臓細胞と一緒にインキュベートした。全ての培養物由来の上清を３日後に廃棄し、新鮮な培地を添加した。３〜５日間の培養物由来の使用済みの培地を収集し、マウスインスリンに対するＥＬＩＳＡキットを使用してインスリンレベルについて試験した。
【図１２】図１２は、同種異系のマウスおよび同系のマウスにおける膵島移植を示す：膵島をＢａｌｂ／ｃマウスから単離し、約２００の膵島を、糖尿病を誘導するために腹腔内にストレプトゾシン（２００ｍｇ／ｋｇ）で処置したＢａｌｂ／ｃマウス（同系）またはＣ５７ＢＬ／６マウス（同種異系）それぞれの右側の腎臓の被膜の下に移植した；これらのマウスのグルコースレベルを２０日間モニタリングした。
【図１３】図１３は、同種異系マウスおよび同系マウスにおける膵島移植を示す：膵島をＢａｌｂ／ｃマウスから単離し、アイソタイプコントロールＢｉＡｂまたは抗Ｈ２Ｋｄ抗ＣＴＬＡ−４ＢｉＡｂのどちらかでコーティングし、約２００の膵島を、糖尿病を誘導するために腹腔内にストレプトゾシン（２００ｍｇ／ｋｇ）で処置した各Ｃ５７ＢＬ／６マウス（同種異系）それぞれの右側の腎臓の被膜の下に移植した；これらのマウスのグルコースレベルを２０日間モニタリングした；この実験を２回繰り返し、同様の結果を得た。
【図１４】図１４は、インビボ同種異系応答の阻害を示す；ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ２ｋ）マウスを、ｍＭ１２細胞で免疫した；ＢｉＡｂ処置群１に、０日目および１０日目に、抗ＣＴＬＡ−４抗体（ｔＢｉＡｂ）でコーティングされたｍＭ１２細胞を接種し、群２は、０日目に、アイソタイプコントロール抗体（ｃＢｉＡｂ）でコーティングされたｍＭ１２細胞を受け、１０日目にｔＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞を受けた。ナイーブマウス（ナイーブ）またはｃＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞で免疫したマウス（ｍＭ１２免疫）またはｔＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２で免疫したマウス（ＢｉＡｂ処置１および２）由来の脾臓細胞を、Ｔ細胞増殖アッセイのためにマイトマイシンＣ処理したＭ１２細胞で３連のウェルで刺激した（０．５×１０５ウェル）；（ａ）４８時間後、これらの細胞を、さらに１８時間３Ｈ−チミジンでパルスし、マイクロβシンチレーションカウンターで計数した；（ｂ）使用済みの培地を上記の培養物から４８時間後に収集し、ＥＬＩＳＡにより対のモノクローナル抗体を使用してサイトカイン応答について試験した。５個体のマウスから得た３連の値の平均±ＳＤとして、結果を表す。この実験を３度繰り返し、同様の結果を得た。処置群に対する各値を、ｍＭ１２免疫群の対応する値と比較することによりｐ値（統計的有意さ）を計算した。処置したマウスについては、統計的に有意な値であった。
【図１５】図１５は、ＣＴＬＡ−４の結合の際に誘導される寛容の持続効果を実証する；ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ２ｋ）マウスを、０日目および１０日目に、ＢｉＡｂでコーティングしたｍＭ１２細胞で免疫した；これらのマウスを２つの組に分け、それぞれ２０日目または７０日目のどちらかに屠殺した；２０日目に、ナイーブマウス（ナイーブ）またはｃＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞で免疫したマウス（ｍＭ１２免疫）またはｔＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２で免疫したマウス（ＢｉＡｂ処置）由来の脾臓細胞を、マイトマイシンＣ処理したＭ１２細胞（０．５×１０５ウェル）で３連のウェルで５日目まで刺激した（０．５×１０６脾臓細胞／ウェル）；（ａ）リンパ球を洗浄し、計数し、３Ｈ−チミジン取り込み方法によるＴ細胞増殖アッセイのために４８時間Ｍ１２細胞またはＣｏｎＡで再刺激した；（ｂ）４８時間後に収集した使用済みの培地を、ＩＬ−２についてＥＬＩＳＡにより試験した；（ｃ）および（ｄ）６０日目にｍＭ１２免疫マウスおよびＢｉＡｂ処置マウスの第二の組をＭ１２細胞でチャレンジし、ナイーブマウスと一緒に７０日目に屠殺し、Ｔ細胞増殖およびＭ１２細胞に対するＩＬ−２応答を試験した。５個体のマウスから得た３連の値の平均±ＳＤとして、結果を表す。処置群の値を、コントロール群（ｍＭ１２免疫）に対応する値と比較することによりｐ値（統計的有意さ）を計算した。処置したマウスについては、統計的に有意な値であった。
【図１６】図１６は、同種異系寛容の特異性の分析を表す；ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ２ｋ）マウスを、表面結合コントロールＢｉＡｂまたは試験ＢｉＡｂの存在下でｍＭ１２（Ｈ２ｄ）細胞で免疫した；ナイーブマウスは、ｍＭ１２細胞もＢｉＡｂも受けなかった；ｍＭ１２免疫群は、０日目および１０日目にｃＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞を受け、ＢｉＡｂ処置群は、０日目および１０日目にｔＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞を受け；ｍＭ１２免疫した群およびＢｉＡｂ処置した群のマウスは、２０日目にＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞（５×１０６細胞）を受けた；３０日目に３つの群全てから収集した脾臓細胞を、３連のウェル（０．５×１０６細胞／ウェル）中で、マイトマイシン処理した（ａ）Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ２ｂ）由来の脾臓細胞（１×１０５／ウェル）または（ｂ）Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ２ｄ）マウス（１×１０５／ウェル）またはＡｇ８  Ｂ細胞（Ｈ２ｄ）（０．５×１０５／ウェル）または（ｃ）Ｍ１２細胞（Ｈ２ｄ）（０．５×１０５／ウェル）のいずれかで刺激した；Ｔ細胞増殖応答（左側のパネル）を、標準３Ｈ−チミジン取り込み方法（１８時間）により測定した。使用済みの培地をこれらの培養物から４８時間後に収集し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２について試験した（右側のパネル）。３個体のマウスから得た３連の値の平均±ＳＤとして、結果を表す。この実験を繰り返し、同様の結果を得た。処置群に対する値を、ｍＭ１２免疫群の対応する値と比較することによりｐ値（統計的有意さ）を計算した。処置したマウスについては、統計的に有意な値であった。
【図１７】図１７は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞が、標的されたＣＴＬＡ−４の結合の際に誘導されたことを表す；ＣＢＡ／Ｊマウス（Ｈ２ｋ）を、ｃＢｉＡｂまたはｔＢｉＡｂと一緒に同種異系（Ｈ２ｄ）ｍＭ１２細胞で免疫した；（ａ）脾臓細胞およびリンパ節細胞を、これらのマウスおよびナイーブマウスから収集し、ＦＡＣＳ分析のためにＦＩＴＣが結合体化した抗マウスＣＤ４抗体およびＰＥ標識した抗マウスＣＤ２５抗体で染色した；ＣＤ４＋細胞集団は、上記のグラフのためにゲートされた；ＣＤ２５＋細胞の割合を、内側の長方形内に示し、各群の５個体のマウスのＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の割合を大きな長方形内に示す；（ｂ）ナイーブマウス（ナイーブ）、ｃＢｉＡｂでコーティングしたｍＭ１２で免疫したマウス（Ｈ２ｄ）（免疫）またはｔＢｉＡｂでコーティングしたｍＭ１２細胞から単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞上でのＣＴＬＡ−４の発現を、抗ＣＴＬＡ−４−ＰＥ抗体で染色した。
【図１８】図１８は、ＢｉＡｂ処置したマウス由来の脾臓細胞の抗Ｈ２ｄ応答を表す。ＣＢＡ／Ｊマウス（Ｈ２ｋ）を、ｃＢｉＡｂまたはｔＢｉＡｂと一緒に同種異系（Ｈ２ｄ）ｍＭ１２細胞で免疫した。ナイーブマウス（左側のパネル）、ｍＭ１２免疫したマウス（真ん中のパネル）またはＢｉＡｂ処置したマウス（右側のパネル）から脾臓細胞を収集し、マイトマイシンＣ処理したＭ１２細胞と一緒にインキュベートし、ＦＡＣＳ分析により種々の分子について試験した；細胞を、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ３抗体、およびＰＥ標識した抗マウスＣＤ６９抗体で２４時間後に染色し（ａ）、抗マウスＩＦＮ−γ抗体、抗マウスＩＬ−４抗体、抗マウスＩＬ−１０抗体および抗マウスＴＧＦ−β１抗体で３６時間後に染色し（ｂ）、抗ＣＤ６２Ｌ抗体で５日後に染色し（ｃ）；５日目に細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ４抗体およびＰＥ標識した抗マウスＣＤ２５抗体を用いて調節性Ｔ細胞について試験するためにさらに３日間インキュベートし（ｄ）；屠殺の際にマウスから収集した細胞のアリコートを、ＣＦＳＥで染色し、その後Ｍ１２細胞と一緒にインキュベーションし、７日目にＰＥ標識した抗マウスＣＤ４抗体またはＰＥ標識した抗マウスＣＤ８抗体で染色した後にＣＦＳＥ希釈について試験した；（ｅ）ＣＤ３＋、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋の細胞集団は、上記グラフのためにゲートされた。これらの実験を３回繰り返し、同様の結果を得た。選択した領域に対する細胞の割合を、各グラフに示す。
【図１９】図１９は、ＣＴＬＡ−４の結合により誘導された寛容におけるサイトカインおよびＣＴＬＡ−４の役割を図示する。（ａ）寛容のマウス（左側のパネル）またはコントロールマウス（右側のパネル）から収集した脾臓細胞を、単独でまたはＭ１２細胞とともに（１：１０の標的：エフェクターの比で）インキュベートした、寛容細胞の二つの培養物に、種々の濃度のｒｍＩＬ−２を添加し、５日目までインキュベートした；（ａ）２日目に、一つの組の培養物を、Ｔ細胞増殖を試験するために３Ｈ−チミジンで１８時間パルスし；（ｂ）５日目に、残りの細胞を洗浄し、４８時間そのままにし、等しい数の生存可能な細胞を、ｒｍＩＬ−２の非存在下で４８時間さらにＭ１２細胞と一緒にインキュベートし、３Ｈ−チミジン取り込み方法によりＴ細胞増殖を試験した；（ｃ）細胞のアリコートを、ＣＦＳＥで染色し、その後Ｍ１２細胞と一緒にインキュベーションし、抗マウスＩＬ−４、抗マウスＩＬ−１０、抗マウスＴＧＦ−β１または抗マウスＣＴＬＡ−４抗体のＦ（ａｂ）フラグメントを中和する飽和濃度で補充した。細胞を、ＰＥ標識した抗マウスＣＤ３抗体で染色した後７日目に、ＣＦＳＥ希釈について試験した。この実験を繰り返し、同様の結果を得た。選択した領域の細胞の割合を、各グラフに示す。
【図２０】図２０は、インビトロの同種異系の応答の阻害を図示する；ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ２ｋ）マウスを、０日目および１０日目にＮＩＴ−１細胞で免疫した；２０日目にナイーブマウス（ａ）または免疫したマウス（ｂ）から収集した脾臓細胞を、３連で、抗体の存在下または非存在下で４８時間ＮＩＴ−１細胞で刺激し、使用済みの培地を新鮮な培地と取替え、さらに４８時間インキュベートした；この培養物から収集した上清を、インスリンの産生についてＥＬＩＺＡにより試験した。
【図２１】図２１は、膵島の単離を示す；Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の膵島を、コラゲナーゼ消化により単離し、その後パーコール密度勾配遠心を行なった；（ａ）および（ｂ）コラゲナーゼ消化の間の膵島；（ｃ）および（ｄ）精製した膵島；ならびに（ｅ）および（ｆ）膵島の単離画分；膵島特異的染色（ジチアゾン）を使用した。
【図２２】図２２は、膵島に対する同種異系応答のインビトロ阻害を示す；膵島をＢａｌｂ／ｃマウスから単離し、トリプシン消化により調製した単一の細胞懸濁物として使用した。膵島細胞を、アイソタイプコントロールＢｉＡｂまたは抗Ｈ２抗ＣＴＬＡ−４ＢｉＡｂのどちらかでコーティングし、Ｈ２Ｋ同種異系抗原で予め免疫したマウス由来の脾臓細胞と一緒にインキュベートした；Ｔ細胞増殖応答を、３Ｈ−チミジン取り込み方法により測定した。
【図２３】図２３は、インビトロインスリン増殖アッセイを示す；膵島をＢａｌｂ／ｃマウスから単離し、トリプシン消化により調製した単一の細胞懸濁物として使用した；膵島細胞を、アイソタイプコントロールＢｉＡｂまたは抗Ｈ２Ｋｄ抗ＣＴＬＡ−４ＢｉＡｂのどちらかでコーティングし、Ｈ２−Ｋｄ同種異系抗原に対して免疫されたマウス由来の脾臓細胞と一緒にインキュベートした；全ての培養物由来の上清を、３日後に廃棄し、新鮮な培地を添加した；３〜５日の培養物の使用済みの培地を収集し、マウスインスリンに対するＥＬＩＳＡキットを使用してインスリンレベルについて試験した。
【図２４】図２４は、抗ＣＤ１１ｃ抗ＣＴＬＡ−４ＢｉａｂでコーティングしたＤＣによる寛容の誘導を示す。マウスを、オボアルブミン（ｏｖａ）またはサイログロブリン（Ｔｇ）で０日目に免疫した。これらのマウスに、８日目に、アイソタイプコントロールＢｉＡｂ（ｏｖａ＋ＤＣまたはＴｇ＋ＤＣ）でコーティングしたＤＣまたは抗ＣＤ１１ｃ抗ＣＴＬＡ−４ＢｉＡｂ（ｏｖａ＋ＤＣ＋ＢｉＡｂまたはＴｇ＋ＤＣ＋ＢｉＡｂ）でコーティングしたＤＣでパルスしたそれぞれの抗原（ｏｖａまたはＴｇ）を静脈内投与した；これらのマウスから２０日目に収集した脾臓細胞を、Ｔ細胞増殖（ａ）、ＩＬ−２応答（ｂ）、ＩＬ−１０応答（ｃ）およびＴＧＦβ１応答（ｄ）について試験した。パネルＣ  これらのマウスから収集した休止細胞をＦＩＴＣが結合体化したマウスＣＤ４抗体およびＰＥ標識した抗マウスＣＤ２５抗体で染色した。ＣＤ４＋細胞集団は、パネル（ｃ）、（ｄ）の両方にゲートされた。ポジティブ細胞の割合を、内側の長方形内に示す。
【図２５】図２５は、抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングしたＤＣをパルスしたｏｖａによる、ｏｖａに対するＴｒｅｇ細胞の誘導を示す：マウスを、０日目および１０日目にｏｖａ＋ＬＰＳで免疫し、２０日目および３０日目にコントロールＤＣまたは抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングしたＤＣ（２×１０６細胞／マウス）をパルスしたｏｖａで処置した；これらのマウスを４５日目に屠殺し、（ａ）記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞について（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）；（ｂ）調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞について（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）；（ｃ）記憶調節性Ｔ細胞について（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ）試験した。パネル（ａ）および（ｂ）は、ＣＤ４＋細胞に対してゲートされ、パネル（ｃ）は、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞に対してゲートされ、パネル（ｄ）は、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ細胞に対してゲートされた。
【図２６】図２６は、抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングされたＤＣをパルスされたｏｖａにより産生されたｏｖａに対するＴｒｅｇ細胞の免疫抑制性特性を図する；マウスを、以下（ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞を、コントロール抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体をコーティングしたＤＣを受けたマウスから単離し、ＣＤ２５＋細胞の枯渇した培養物をｏｖａおよびＡＰＣの存在下で培養した；（ｂ）抗ＣＴＬＡ−４抗体をコーティングしたＤＣを受けたマウスから単離したナイーブＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）を、コントロールマウス由来の（ＣＤ４＋ＣＤ２５−）Ｔ細胞と一緒に１：１０の比で共培養し；Ｔ細胞増殖アッセイを、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイを使用して行なった、に開示するように処置した。
【図２７】図２７は、ＮＯＤマウスにおけるＧＡＤ６５ペプチド特異的Ｔ細胞を示す；脾臓細胞を、前糖尿病マウスおよび糖尿病マウスから収集し、プールしたＧＡＤ６５ペプチド（ＧＡＤ２０６−２２６、ＧＡＤ−２１７−２３６およびＧＡＤ２８６−３００）と一緒にインキュベートし、Ｔ細胞増殖応答について試験した；標準３Ｈ−チミジン取り込みアッセイを用いてＴ細胞増殖アッセイを行なった。
【図２８】図２８は、ＤＣの指向するＣＴＬＡ−４結合の際のＧＡＤ６５ペプチド特異的Ｔ細胞応答のインビトロ抑制を示す；前糖尿病ＮＯＤマウスから単離したＤＣを、プールしたＧＡＤ６５ペプチド（ＧＡＤ２０６−２２６、ＧＡＤ１７−２３６およびＧＡＤ２８６−３００）でパルスし、アイソタイプコントロール抗体（コントロールＢｉＡｂ）または抗ＣＴＬＡ−４抗体（試験ＢｉＡｂ）でコーティングし、糖尿病のＮＯＤマウス由来のＴ細胞と一緒にインキュベートした；標準３Ｈ−チミジン取り込みアッセイを用いてＴ細胞増殖アッセイを行なった。
【図２９】図２９は、樹状細胞成熟に対するＧＭ−ＣＳＦ処理の効果を示す。ＣＢＡ／Ｊマウスを、材料および方法の節に記載のように１日目および１５日目に開始して連続５日間未処理のままにするか、ＧＭ−ＣＳＦで処理した。さらに、６日目および２０日目にマウスを、ＣＦＡ中で乳化したｍＴｇにより免疫した。脾臓を得るために、マウスを第一のｍＴｇ免疫および第二のｍＴｇ免疫の前（６日目および２０日目）ならびにそれらの免疫の後（８日目および２２日目）に屠殺した。（Ａ）８日目に屠殺したマウスから単離した脾細胞を、ＦＩＴＣ抗ＣＤ１１ｃで染色し、そして、ＰＥ抗ＭＨＣ  ＩＩまたはＰＥ抗ＣＤ８ａのどちらかで染色し、ＦＡＣＳにより分析した。（Ｂ）同じ細胞を、ＦＩＴＣ抗ＣＤ１１ｃで染色し、ＰＥ抗Ｂ７．１、ＰＥ抗Ｂ７．２またはＰＥ抗ＣＤ４０のいずれかで染色し、ＦＡＣＳにより分析した。黒い線は、アイソタイプコントロールを示し、濃い灰色の線は、ｍＴｇコントロールを示し、薄い灰色の線は、ＧＭ−ＣＳＦ処理を示す。（ｃ）ＤＣをｍＴｇ免疫の前または後に磁気カラム分離を用いて脾臓から単離した。ｍＲＮＡを単離し、多重ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて使用してサイトカイン転写物を検出した。示した結果は、群あたり２匹のマウスを使用した２つの独立した実験の代表である。
【図３０】図３０は、ＧＭ−ＣＳＦ処置したマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の養子免疫転移を示す。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ処置したマウスから精製し、方法および材料の節に記載されるように、ｍＴｇで免疫した。精製したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、養子免疫によりｍＴｇ免疫したマウスに転移し（１×１０６細胞／マウス）、転移後１８日に屠殺し、ｍＴｇに対する免疫応答をコントロールと比較して評価した。（Ａ）脾細胞を、ｍＴｇの存在下または非存在下で培養した。ｍＴｇに対する増殖応答を、３Ｈ取り込みアッセイにより測定した。ΔＣＰＭ（ｍＴｇ刺激したＣＰＭ−（非刺激の）バックグラウンドＣＰＭ）をプロットした。バックグラウンドＣＰＭは、このアッセイでは、２００未満であった。上記培養物から３６時間で収集した使用済み培地を、ＥＬＩＳＡにより、（Ｂ）ＩＦＮ−γ、（Ｃ）ＩＬ−４および（Ｄ）ＩＬ−１０について試験した。３個体のマウスの３連で得られた値の平均±ＳＤとして結果を表す。＊は、Ｔｇコントロールマウスに対して統計的に有意な差を示す。
【図３１】図３１は、ｍＴｇ特異的Ｔ細胞増殖のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞誘導性抑制におけるＩＬ−１０の役割を示す。ＣＢＡ／Ｊマウスを、材料および方法に記載されるように、ＧＭ−ＣＳＦによってかまたはＧＭ−ＣＳＦなしで、第１日目および第１５日目に開始して連続５日間処置し、ＣＦＡ中で乳化されたｍＴｇで第６日目および第２０日目に免疫した。マウスを第３５日目に屠殺し、リンパ節細胞および脾臓細胞を得た。ＧＭ−ＣＳＦ処理マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞、および未処理マウス由来のＴ細胞（エフェクター細胞）を、プールした脾臓細胞およびリンパ節細胞から、磁気分離法を使用して精製した。エフェクターＴ細胞をＣＦＳＥで染色し、単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞とともに共培養し（エフェクター：Ｔｒｅｇ比５：１）、そして飽和濃度のαＩＬ−１０ＲもしくはアイソタイプコントロールｍＡｂの存在下で、ｍＴｇによって刺激した。ナイーブマウス由来のＴ細胞枯渇脾臓細胞（Ａ）または濃縮（ｅｎｒｉｃｈ）ＤＣ（Ｂ）のいずれかを、ＡＰＣとして使用した。ｍＴｇの増殖応答を、第７日目において、ＦＡＣＳによって判定されるＣＦＳＥ希釈によって評価した。示されるヒストグラムは、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団においてゲート（ｇａｔｅ）された。結果は、３連で行われた２つの個別の実験の代表である。＊は、中央のパネルに示すアイソタイプコントロールと比較した場合の統計的有意差を示す。
【図３２−１】図３２は、ＥＡＴのＧＭ−ＣＳＦ誘導性抑制に対するαＩＬ−１０Ｒ  Ａｂのインビボ効果を示す。ＧＭ−ＣＳＦ処理マウスを、材料および方法に記載されるように、αＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂで処理し、そしてコントロールマウスとともに第４５日目に屠殺して、リンパ節細胞および脾臓細胞を得た。（Ａ）脾細胞をＣＦＳＥで染色して、ｍＴｇで７日間刺激した。ｍＴｇに対する増殖応答を、ＦＡＣＳによって判定されるＣＦＳＥ希釈によって評価した。ＣＤ４＋Ｔ細胞集団においてゲートされた。（Ｂ）脾細胞をＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４抗体およびＰＥ標識抗マウスＣＤ２５抗体によって染色し、ＦＡＣＳで分析した。パネル（Ａ）および（Ｂ）に示される括弧内の範囲は、４〜５匹の個別のマウスについての値に対応する。
【図３２−２】図３２は、ＥＡＴのＧＭ−ＣＳＦ誘導性抑制に対するαＩＬ−１０Ｒ  Ａｂのインビボ効果を示す。ＧＭ−ＣＳＦ処理マウスを、材料および方法に記載されるように、αＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂで処理し、そしてコントロールマウスとともに第４５日目に屠殺して、リンパ節細胞および脾臓細胞を得た。（Ｃ）種々の群（表１に示される）についてのＨ＆Ｅ染色甲状腺切片の代表的顕微鏡写真が示される（現物、４０×）。括弧内に示される数字は、甲状腺炎細胞浸潤指数に対応する。
【図３３】図３３は、甲状腺微小環境におけるＧＭ−ＣＳＦ処置の効果を示す。マウスのＣＦＡコントロール群、ｍＴｇコントロール群、およびＧＭ−ＣＳＦ／ｍＴｇ群（材料および方法に記載される）を使用した。３匹のマウスを第２１日目に屠殺し、甲状腺を得た。（Ａ）甲状腺から得られたリンパ球をＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４抗体およびＰＥ標識抗マウスＣＤ２５抗体で染色し、ＦＡＣＳで分析した。示される結果は、１群あたり３匹のマウスの３つの別の実験の代表である。（Ｂ）コラゲナーゼ処理甲状腺から得られた全細胞を、エキソビボで２４時間維持し、多重サイトカインアッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｓｓａｙ）によってＩＬ−１０およびＩＦＮ−γについて上清を試験した。示される結果は、２つの別個の実験の代表である。１００個のデータの平均値を示す。（Ｃ）甲状腺細胞を甲状腺単一細胞懸濁物から単離し、ｍＲＮＡを得てＲＴ−ＰＣＲに供し、プライマーの特別なセットを使用して、Ｆａｓ、ＦａｓＬおよびカスパーゼ８を検出した。β−アクチンを内部コントロールとして含めた。コントロールレーンは、ポジティブコントロールｍＲＮＡおよび特別なプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲを表す。
【図３４】図３４は、インビボアロ反応を示す。材料および方法に記載されるように、ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ２ｋ）マウスをｍＭ１２細胞で免疫した。ＢｉＡｂ処置群１に、第０日および第１０日において、抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂ（ｔＢｉＡｂ）コーティングされたｍＭ１２細胞を接種し、群２は、アイソタイプコントロールＡｂ（ｃＢｉＡｂ）コーティングされたｍＭ１２細胞を、第０日目に受容し、そしてｔＢｉＡｂコーティングされたｍＭ１２細胞を第１０日目に受容した。ナイーブマウス（ナイーブ）、またはｃＢｉＡｂコーティングされたｍＭ１２細胞で免疫されたマウス（コントロール）、またはｔＢｉＡｂコーティングされたｍＭ１２細胞で免疫されたマウス（ＢｉＡｂ処理１および２）由来の脾臓細胞（０．５×１０６細胞／ウェル）を、３つ組のウェルにおいて、Ｔ細胞増殖アッセイのため、マイトマイシンＣ処置Ｍ１２細胞（０．５×１０５ウェル）によって刺激した。ａ、４８時間後、これらの細胞を［３Ｈ］チミジンでさらに１８時間パルスし、マイクロベータシンチレーションカウンターで計数した。ｂ、使用済み培地を４８時間後上記培養物から回収し、ＥＬＩＳＡにおいて対（ｐａｉｒｅｄ）ｍＡｂを用いてサイトカイン応答について試験した。Ｍ１２細胞を含まない脾臓細胞培養物における１分あたりのバックグラウンド計数（＜２００）およびサイトカイン（＜１０ｐｇ／ｍｌ）の値を、それぞれの試験値から差し引いた。結果を、５匹の別個のマウスから得られた３つ組の値の平均±ＳＤとして表わす。この実験を３回繰り返し、同様の結果を得た。処理群についての各値をコントロール群の対応する値と比較することによって、ｐ値を計算した。＊ｐ≦０．０５。
【図３５】図３５は、ＣＴＬＡ−４結合により誘導された寛容の永続的効果を示す。材料および方法に記載されるように、ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ２ｋ）マウスをＢｉＡｂコーティングされたｍＭ１２細胞で、第０日目および第１０日目において免疫した。これらのマウスを２つのセットに分け、第２０日目もしくは第７０日目のいずれかにおいて屠殺した。第２０日目において、ナイーブマウス由来の脾臓細胞（ナイーブ）、またはｃＢｉＡｂコーティングされたｍＭ１２細胞で免疫されたマウス（コントロール）、またはｔＢｉＡｂコーティングされたｍＭ１２細胞で免疫されたマウス（ＢｉＡｂ処理）を３つ組のウェルにおいて（０．５×１０６脾臓細胞／ウェル）、マイトマイシンＣ処理Ｍ１２細胞（０．５×１０５／ウェル）で、５日までの間刺激した。ａ、リンパ球を洗浄し、計数し、そして［３Ｈ］チミジン取り込み法によるＴ細胞増殖アッセイのために、Ｍ１２細胞もしくはＣｏｎ  Ａ（１μｇ／ｍｌ）で４８時間再刺激した。ｂ、使用済み培地を４８時間後回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２について試験した。ｃおよびｄ、第６０日目において、ｍＭ１２免疫およびＢｉＡｂ処置されたマウスの第二のセットを、Ｍ１２細胞によってチャレンジし、ナイーブマウスとともに第７０日目に屠殺し、そしてＭ１２細胞に対するＴ細胞増殖およびＩＬ−２応答について試験した。Ｍ１２細胞またはＣｏｎＡを含まない脾臓細胞培養物における１分あたりのバックグラウンドカウント（＜２００）およびサイトカイン（＜１０ｇ／ｍｌ）の値を、それぞれの試験値から差し引いた。結果を、５匹の別個のマウスから得られた３つ組の値の平均±ＳＤとして表わす。この実験を繰り返し、同様の結果を得た。処理群の値をコントロール群の対応する値と比較することによって、ｐ値を計算した。＊ｐ≦０．０５。
【図３６】図３６は、アロ寛容（ａｌｌｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ）特異性の分析を示す。ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ２ｋ）マウスを、材料および方法に記載されるように、表面結合ｃＢｉＡｂもしくはｔＢｉＡｂの存在下でｍＭ１２（Ｈ２ｄ）細胞で免疫した。ナイーブマウスは、ｍＭ１２細胞もＢｉＡｂも受けなかった。コントロール群は、第０日目および第１０日目において、ｃＢｉＡｂでコーティングされたｍＭ１２細胞を受容し、ＢｉＡｂ処置群は、第０日目および第１０日目において、ｔＢｉＡｂコーティングされたｍＭ１２細胞を受容した。ｍＭ１２免疫群およびＢｉＡｂ処置群のマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６脾臓細胞（５×１０６細胞）を第２０日目において受容した。脾臓細胞を、免疫後３０日目において３群全てから回収し、３つ組ウェル（０．５×１０６細胞／ウェル）において、以下に由来するマイトマイシンＣ処理脾臓細胞のいずれかで刺激した：Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ２ｂ）（１×１０５／ウェル）（ａ）、またはＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）（１×１０５／ウェル）マウスもしくはＡｇ８Ｂ細胞（Ｈ２ｄ）（０．５×１０５／ウェル）（ｂ）、またはＭ１２細胞（Ｈ２ｄ）（０．５×１０５／ウェル）、４８時間（ｃ）。Ｔ細胞増殖応答（左パネル）を、標準的［３Ｈ］チミジン取り込み法（１８時間）によって測定した。使用済み培地をこれらの培養物から４８時間後に回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２について試験した（右パネル）。結果を、３匹の別個のマウスから得られた３つ組の値の平均±ＳＤとして表わす。この実験を繰り返し、同様の結果を得た。処理群の値をコントロール群の対応する値と比較することによって、ｐ値を計算した。＊ｐ≦０．０５。
【図３７】図３７は、標的化ＣＴＬＡ−４結合においてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞が誘導されることを示す。ＣＢＡ／Ｊマウス（Ｈ２ｋ）を、材料および方法に記載されるように、同種異系（Ｈ２ｄ）ｍＭ１２細胞、ならびにｃＢｉＡｂもしくはｔＢｉＡｂで免疫した。ａ、脾臓細胞およびリンパ節細胞をこれらのマウスおよびナイーブマウスから回収し、ＦＡＣＳ分析のためにＦＩＴＣ結合体化抗マウスＣＤ４  Ａｂ抗体およびＰＥ標識抗マウスＣＤ２５  Ａｂ抗体で染色した。ＣＤ４＋細胞集団を上記グラフのためにゲートした。ＣＤ２５＋細胞のパーセンテージは、内部の四角の中に示され、各群からの５匹の個別のマウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞のパーセンテージの範囲は、主要な四角の中に示される。処理群の各値をコントロール群の対応する値と比較することによって、ｐ値を計算した。＊ｐ≦０．０５。ｂ、ナイーブマウス（ナイーブ）、ｃＢｉＡｂコーティングされたｍＭ１２細胞（Ｈ２ｄ）で免疫されたマウス（コントロール）、またはｔＢｉＡｂコーティングされたｍＭ１２細胞（ＢｉＡｂ処理）で免疫されたマウスから単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞上のＣＴＬＡ−４の発現を、抗ＣＴＬＡ−４−ＰＥ  Ａｂによる染色後にＦＡＣＳ分析によって試験した。
【図３８】図３８は、ＢｉＡｂ処理マウス由来の脾臓細胞の抗Ｈ２ｄ応答を示す。材料および方法に記載されるように、ＣＢＡ／Ｊマウス（Ｈ２ｋ）を、同種異系（Ｈ２ｄ）ｍＭ１２細胞ならびにｃＢｉＡｂもしくはｔＢｉＡｂで免疫した。ナイーブマウス（左パネル）、コントロールマウス（中央パネル）またはＢｉＡｂ処置マウス（右パネル）から脾臓細胞を回収し、マイトマイシンＣ処理Ｍ１２細胞とともにインキュベートし、そして種々の分子についてＦＡＣＳ分析によって試験した。細胞を、以下によって染色した：ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ３  Ａｂ抗体およびＰＥ標識抗マウスＣＤ６９  Ａｂ抗体、２４時間後（ａ）；抗マウスＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１  Ａｂ、３６時間後（ｂ）；ならびに抗ＣＤ６２Ｌ  Ａｂ、５日後（ｃ）。第５日目、細胞を洗浄し、さらに３日間インキュベートして、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４抗体およびＰＥ標識抗マウスＣＤ２５  Ａｂを用いてＴｒｅｇ細胞について試験した（ｄ）。屠殺マウスから回収された細胞のアリコートを、ＣＦＳＥで染色し、Ｍ１２細胞とともにインキュベーションし、ＰＥ標識抗マウスＣＤ４またはＣＤ８  Ａｂで染色した後、７日目においてＣＦＳＥ希釈について試験した（ｅ）。ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞の集団を上記のグラフのためにゲートした。これらの実験を３回繰り返し、同様の結果を得た。選択領域についての細胞のパーセンテージを、各グラフに示す。
【図３９】図３９は、ＣＴＬＡ−４結合誘導性寛容におけるサイトカインおよびＣＴＬＡ−４の役割を示す。ａ、寛容マウス（左パネル）または免疫マウス（右パネル）マウスから回収された脾臓細胞を、単独またはＭ１２細胞（標的：エフェクター比１：１０）とともにインキュベートした。寛容細胞の培養物は、種々の濃度のｒｍＩＬ−２を受容し、５日間までインキュベートされた。ａ、第２日において、培養物の１つのセットを［３Ｈ］チミジンで１８時間パルスし、Ｔ細胞増殖について試験した。ｂ、第５日目において、残りの細胞を洗浄し、４８時間静置した。そして同数の生存可能な細胞を、ｒｍＩＬ−２の非存在下で、４８時間、Ｍ１２細胞とともにさらにインキュベートし、［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイによってＴ細胞増殖について試験した。ｃ、細胞のアリコートをＣＦＳＥで染色し、Ｍ１２細胞とともにインキュベートし、材料および方法に記載されるように、飽和濃度の中和性抗マウスＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β１、または抗マウスＣＴＬＡ−４  ＡｂのＦａｂを補充した。細胞を、ＰＥ標識抗マウスＣＤ３  Ａｂによる染色後７日目においてＣＦＳＥ希釈について試験した。この実験を繰り返し、同様に結果を得た。選択領域についての細胞のパーセンテージを、各グラフに示す。
【図４０】図４０は、ＣＴＬＡ−４結合誘導性寛容におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の役割を示す。ａ、材料および方法に記載されるように、ｃＢｉＡｂコーティングされたｍＭ１２細胞もしくはｔＢｉＡｂコーティングされたｍＭ１２細胞で免疫されたマウスから回収された脾臓細胞およびリンパ節細胞を混合し、次いでＣＤ２５−Ｔ細胞集団およびＣＤ２５＋Ｔ細胞集に分画化した。ＣＤ２５−細胞およびＣＤ２５＋細胞（５×１０５細胞／ウェル）を、個別にインキュベートした（ｂ〜ｄ）か、またはＭ１２細胞（０．５×１０５細胞／ウェル）とともに、（ｆ）９６ウェルプレート中でインキュベートしたか、もしくは（ｇ）０．１μｍの孔サイズのインサートを備える２４トランスウェルプレート中でインキュベートした。４８時間後、細胞を［３Ｈ］チミジンで１８時間パルスし、Ｔ細胞増殖を測定した。ｂに関して記載したアッセイからの使用済み培地を、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術（ｃ〜ｅ）を用いた多重サイトカインアッセイを使用して、種々のサイトカインについて試験した。結果を、３匹の別個のマウスから得られた３つ組の値の平均±ＳＤとして表わす。
【図４１】図４１は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の養子免疫転移を示す。ドナーのＣＢＡ／Ｊマウス（Ｈ２ｋ）を、材料および方法に記載されるように、同種異系（Ｈ２ｄ）ｍＭ１２細胞ならびにｃＢｉＡｂ（コントロール）もしくはｔＢｉＡｂ（試験）で免疫した。コントロールドナーマウス（コントロール）および試験ドナーマウス（ＢｉＡｂ処理）から単離された５×１０６ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞全体を、第２０日目において、レシピエントマウスに、Ｍ１２細胞（上パネル）またはＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞（下パネル）によるチャレンジ免疫の２時間前に、それぞれ移送した。第３５日目において、レシピエントおよびＴ細胞を受容していない（なし）コントロールマウスから脾臓細胞を回収し、Ｍ１２細胞（ａおよびｂ）またはＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞（ｃおよびｄ）に対するエキソビボＴ細胞増殖について試験した（左パネル）およびＩＬ−２（右パネル）。結果を、４匹の別個のマウスから得られた３つ組の値の平均±ＳＤとして表わす。この実験を繰り返し、同様の結果を得た。養子免疫転移レシピエント群についての値を非レシピエント群の対応する値と比較することによって、ｐ値を計算した。＊ｐ≦０．０５。
【図４２】図４２は、反応性低下の誘導におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞部分集団の有効性を示す。ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ２ｋ）マウスを、材料および方法に記載されるように、抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂ（ｔＢｉＡｂ）コーティングされたｍＭ１２（Ｈ２ｄ）細胞で免疫した。実験終了時に回収された脾臓細胞およびリンパ節細胞をプールし、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ−細胞を、磁気分離システムを使用して濃縮し（ａ）、そしてＦＡＣＳ分析によって表面ＣＴＬＡ−４発現について試験した（ｂ）。これらの濃縮された集団を、Ｍ１２細胞の存在下で３６時間培養し、使用済み培地をＩＬ−１０レベル（ｃ）およびＴＧＦ−β１レベル（ｄ）について、ＥＬＩＳＡによって試験した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋部分集団をコントロールマウス由来のＣＤ２５−Ｔ細胞とともに、種々の調節Ｔ細胞：エフェクターＴ細胞比（全部で０．６×１０６細胞／ウェル）で、マイトマイシンＣ処理Ｍ１２細胞（０．５×１０５／ウェル）の存在下で共培養した。増殖応答を、標準的［３Ｈ］チミジン取り込み法（１８時間）によって測定した（ｅ）。結果を、３つ組の値の平均±ＳＤとして表し、この実験を２回繰り返し、同様の結果を得た。
【図１】
2007537753.tif 000005
【図２】
2007537753.tif 000006
【図３】
2007537753.tif 000007
【図４】
2007537753.tif 000008
【図５】
2007537753.tif 000009
【図６】
2007537753.tif 000010
【図７】
2007537753.tif 000011
【図８】
2007537753.tif 000012
【図９】
2007537753.tif 000013
【図１０】
2007537753.tif 000014
【図１１】
2007537753.tif 000015
【図１２】
2007537753.tif 000016
【図１３】
2007537753.tif 000017
【図１４】
2007537753.tif 000018
【図１５】
2007537753.tif 000019
【図１６】
2007537753.tif 000020
【図１７】
2007537753.tif 000021
【図１８】
2007537753.tif 000022
【図１９】
2007537753.tif 000023
【図２０】
2007537753.tif 000024
【図２１】
2007537753.tif 000025
【図２２】
2007537753.tif 000026
【図２３】
2007537753.tif 000027
【図２４】
2007537753.tif 000028
【図２５】
2007537753.tif 000029
【図２６】
2007537753.tif 000030
【図２７】
2007537753.tif 000031
【図２８】
2007537753.tif 000032
【図２９】
2007537753.tif 000033
【図３０】
2007537753.tif 000034
【図３１】
2007537753.tif 000035
【図３２−１】
2007537753.tif 000036
【図３２−２】
2007537753.tif 000037
【図３３】
2007537753.tif 000038
【図３４】
2007537753.tif 000039
【図３５】
2007537753.tif 000040
【図３６】
2007537753.tif 000041
【図３７】
2007537753.tif 000042
【図３８】
2007537753.tif 000043
【図３９】
2007537753.tif 000044
【図４０】
2007537753.tif 000045
【図４１】
2007537753.tif 000046
【図４２】
2007537753.tif 000047
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月21日(2006.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングされた半成熟樹状細胞を含有する組成物であって、該二重特異性抗体がまた、特異的な抗原もしくは組織に結合し得る、組成物。
【請求項２】
前記樹状細胞がＧＭ−ＣＳＦで処理される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記樹状細胞が、目的の抗原でパルスされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体がまた特異的抗原に結合し得る、半成熟樹状細胞にコーティングされた二重特異性抗ＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項５】
前記抗体がまた特異的な組織もしくは細胞に結合し得る、請求項４に記載の二重特異性抗ＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項６】
組織特異的寛容を誘導するための組成物であって、該組成物は、Ｔ細胞を活性化するために目的の抗原で成熟させた樹状細胞を含有し、該活性化Ｔ細胞が、樹状細胞に結合し得る二重特異性抗体の第二の腕を介して該活性化Ｔ細胞の表面にＣＴＬＡ−４を結合させるために、抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングされた樹状細胞と接触させるのに適している、組成物。
【請求項７】
抗原特異的寛容を誘導するための組成物であって、該組成物は、少なくとも一つの特異的抗原を発現する樹状細胞であって、樹状細胞表面に結合しＴ細胞または他のリンパ球の表面上のＣＴＬＡ−４分子に結合する能力を保持する二重特異性抗体でコーティングされた樹上細胞を含有する、組成物。
【請求項８】
抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導するための組成物であって、該組成物は、目的の抗原でパルスするのに適した半成熟樹状細胞を含有し、ここで該樹状細胞は、調節性Ｔ細胞の産生を調節する、組成物。
【請求項９】
前記パルスされた半成熟樹状細胞がＣＴＬＡ−４に結合し得る二重特異性抗体でコーティングされる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記目的の抗原が、アロ抗原または自己抗原である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記半成熟樹状細胞が、インビトロで調節性Ｔ細胞の産生を誘導する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記調節性Ｔ細胞が、同種移植片拒絶を抑制するためまたは自己免疫疾患を処置するための、宿主内への注入に適している、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＧＭ−ＣＳＦおよび請求項４に記載の二重特異性抗体が、前記調節性Ｔ細胞の産生を調節するためのインビボ導入に適している、請求項８に記載の組成物。
【請求項１４】
哺乳動物におけるＴ細胞およびＢ細胞に仲介される自己免疫疾患を処置するため、ならびに宿主による移植片拒絶の危険性を減少させるための組成物であって、該組成物は、該自己免疫疾患または該宿主による該移植片拒絶を担う抗原を提示され、かつ二重特異性抗体でコーティングされた樹状細胞、および抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導したＴ細胞の集団であって、二重特異性抗体でコーティングされた該樹状細胞とともに培養されたＴ細胞の集団を含有し、該二重特異性抗体は抗原と結合し、またＴ細胞レセプターを介してＴ細胞と結合した樹状細胞に結合し得る、組成物。
【請求項１５】
樹状細胞の成熟に作用するための組成物であって、ここで該細胞は、調節性Ｔ細胞を誘導し得る半成熟状態に保持され、該組成物は、ＧＭ−ＣＳＦと接触し、かつ適切な二重特異性抗体でコーティングされた、パルスした樹状細胞を含有し、ここで、一方の腕が、標的または抗原に対する特異性を提供し、もう一方の腕が、ＣＴＬＡ−４連結を提供する、組成物。
【請求項１６】
前記調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）が、一般的であるか、または抗原特異的である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
調節性Ｔ細胞が、Ｔｒｅｇｓが免疫応答を抑制し得るのを媒介するＴＧＦ−βおよび／またはＩＬ−１０を産生する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｔ細胞およびＢ細胞に仲介される自己免疫疾患を処置し、同種移植片拒絶を防止するための組成物であって、該組成物は、目的の抗原の存在下で半成熟状態の樹状細胞を維持するためにＧＭ−ＣＳＦで処理された樹状細胞を含有し、ここで、該抗原が、アロ抗原または自己抗原であり、かつインビトロまたはインビボで誘導され、該細胞が、エフェクターＴ細胞の機能を抑制するためにＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−βを産生し得る調節性Ｔ細胞を誘導するための抗原提示細胞としての使用に適しており、該調節性Ｔ細胞が、インビボでＧＭ−ＣＳＦによって誘導され、その後Ｔ細胞機能を抑制するために二重特異性抗体で処置される、組成物。
【請求項１９】
前記疾患が、関節リウマチ、全身性硬化症、狼瘡、橋本甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、アトピー性皮膚炎および多発性硬化症からなる群より選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
治療有効量の抗原活性化半成熟樹状細胞を含有する、自己免疫疾患を処置するための組成物であって、該樹状細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１０、ＩＬ−４またはＴＧＦβからなる群より選択された少なくとも一つの他の因子を含有する培養培地中で組織供給源を培養する工程であって、該他の因子は、非樹状細胞前駆体の増殖または成熟を阻害し、それにより該培養物中で樹状細胞前駆体の産生を増加させ、ここで、該樹状細胞が、自己タンパク質またはアロ抗原でパルスされ、該樹状細胞が、自己タンパク質をプロセシングして修飾された自己タンパク質抗原またはアロ抗原を産生し、該自己タンパク質抗原またはアロ抗原が該樹状細胞により発現される工程、ならびに半成熟抗原を有する該樹状細胞を、抗原と結合しＴ細胞レセプターを介してＴ細胞とも結合した樹状細胞に結合し得る二重特異性抗体で、コーティングする工程を包含する方法によって産生される、組成物。
【請求項２１】
Ｔ細胞およびＢ細胞に仲介される自己免疫疾患の発症を予防するための組成物であって、該組成物は、自己免疫疾患を担う自己抗原を保有する自系組織と一緒にインキュベートされ、かつ自己免疫疾患の体液性成分を調節するために抗原特異的Ｂ細胞を調節する工程に適した、調節型を担うように抗原特異的Ｔ細胞にシグナルを出す二重特異性抗体でコーティングされた、成熟樹状細胞を含有する、組成物。
【請求項２２】
組織特異的寛容を誘導するためのインビトロ方法であって、該方法は、以下：
（ａ）樹状細胞を目的の抗原で成熟させてＴ細胞を活性化する工程；および
（ｂ）該活性化Ｔ細胞を、抗ＣＴＬＡ−４抗体でコーティングされた樹状細胞と接触させ、樹状細胞に結合し得る二重特異性抗体の第二の腕を介して該活性化Ｔ細胞の表面にＣＴＬＡ−４を結合させる工程；
を包含する、方法。
【請求項２３】
抗原特異的寛容を誘導するためのインビトロ方法であって、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも一つの特異的抗原を樹状細胞に提示する工程；
（ｂ）該樹状細胞のプロセシングおよび該抗原の提示を促進する工程；
（ｃ）該樹状細胞に、細胞表面分子の発現を安定化させる工程；
（ｄ）さらなる抗原のプロセシングを防止する工程；ならびに
（ｅ）抗原発現性樹状細胞を、該樹状細胞表面に結合しＴ細胞または他のリンパ球の表面上のＣＴＬＡ−４分子に結合する能力を保持する二重特異性抗体で処理する工程；
を包含する、方法。
【請求項２４】
抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導するためのインビトロ方法であって、該方法は、以下：
（ａ）樹状細胞をＧＭ−ＣＳＦで処理して半成熟樹状細胞を得る工程；
（ｂ）該半成熟樹状細胞を目的の抗原でパルスする工程；および
（ｃ）調節性Ｔ細胞の産生を調節する工程；
を包含する、方法。
【請求項２５】
ＣＴＬＡ−４に結合し得る二重特異性抗体で、パルスされた半成熟樹状細胞をコーティングする工程をまた包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記目的の抗原が、アロ抗原または自己抗原である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記半成熟樹状細胞が、インビトロで調節性Ｔ細胞の産生を誘導する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
樹状細胞の成熟に作用するためのインビトロ方法であって、該細胞は、調節性Ｔ細胞を誘導し得る半成熟状態に保持され、該方法は、以下：
（ａ）樹状細胞をパルスする工程；
（ｂ）該樹状細胞をＧＭ−ＣＳＦと接触させる工程；および
（ｃ）該パルスした樹状細胞を適切な二重特異性抗体でコーティングする工程であって、該二重特異性抗体において、一方の腕が、標的または抗原に対する特異性を提供し、もう一方の腕が、ＣＴＬＡ−４連結を提供する、工程；
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）が、一般的であるか、または抗原特異的である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
調節性Ｔ細胞が、Ｔｒｅｇｓが免疫応答を抑制し得るのを媒介するＴＧＦ−βおよび／またはＩＬ−１０を産生する、請求項２８に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月1日(2006.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2007537753.tif 000048
【図２】
2007537753.tif 000049
【図３】
2007537753.tif 000050
【図４】
2007537753.tif 000051
【図５】
2007537753.tif 000052
【図６】
2007537753.tif 000053
【図７】
2007537753.tif 000054
【図８】
2007537753.tif 000055
【図９】
2007537753.tif 000056
【図１０】
2007537753.tif 000057
【図１１】
2007537753.tif 000058
【図１２】
2007537753.tif 000059
【図１３】
2007537753.tif 000060
【図１４】
2007537753.tif 000061
【図１５】
2007537753.tif 000062
【図１６】
2007537753.tif 000063
【図１７】
2007537753.tif 000064
【図１８】
2007537753.tif 000065
【図１９】
2007537753.tif 000066
【図２０】
2007537753.tif 000067
【図２１】
2007537753.tif 000068
【図２２】
2007537753.tif 000069
【図２３】
2007537753.tif 000070
【図２４】
2007537753.tif 000071
【図２５】
2007537753.tif 000072
【図２６】
2007537753.tif 000073
【図２７】
2007537753.tif 000074
【図２８】
2007537753.tif 000075
【図２９】
2007537753.tif 000076
【図３０】
2007537753.tif 000077
【図３１】
2007537753.tif 000078
【図３２−１】
2007537753.tif 000079
【図３２−２】
2007537753.tif 000080
【図３３】
2007537753.tif 000081
【図３４】
2007537753.tif 000082
【図３５】
2007537753.tif 000083
【図３６】
2007537753.tif 000084
【図３７】
2007537753.tif 000085
【図３８】
2007537753.tif 000086
【図３９】
2007537753.tif 000087
【図４０】
2007537753.tif 000088
【図４１】
2007537753.tif 000089
【図４２】
2007537753.tif 000090
【国際調査報告】
2007537753.tif 000091