(57)【要約】本発明の方法は、インプラントデバイスを被覆するためのものである。インプラントデバイスを、フィブリノゲン等のタンパク質膜によって被覆する。第一ビスホスホネート物質、例えば、パミドロネートをタンパク質膜に固定化する。第二ビスホスホネート物質、例えばイバンドロネートを、第一ビスホスホネート物質に吸着させるが、第一ビスホスホネート物質は、第二ビスホスホネート物質と異なる。
2007533345.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インプラントデバイスをタンパク質で被覆すること、
アミノ基を有する第一物質をタンパク質に共有結合で固定化すること、及び
ビスホスホネート物質を、第一物質に吸着させること（ただし、第一物質は、そのビスホスホネート物質と異なる）、
を含むインプラントデバイスを被覆する方法。
【請求項２】
固定化工程は、ビスホスホネートのアミノ基等の反応性基を、タンパク質に、共有結合で結合することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
吸着工程は、化学的に非反応性のビスホスホネートを用いることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被覆工程は、架橋されたタンパク質を用いることを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
インプラントデバイスの表面をエッチングすることを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
エチル−ジメチル−アミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）とヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）によって、タンパク質層を架橋することで、複数のタンパク質層を形成することを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
被覆工程は、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）の取り付けを介して、インプラントデバイスの表面に第一タンパク質層を固定化することを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
被覆工程は、グルタルアルデヒドを用いて、ＡＰＴＥＳとグルタルアルデヒドを第一タンパク質層のアミノ基と化学的に結合させることを更に含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
インプラントデバイスの表面に化学的に結合したタンパク質の複数の層、
タンパク質膜に共有結合で結合した化学的に固定化可能なビスホスホネート層、及び
その第一ビスホスホネート層に非共有結合で結合した化学的に非反応性のビスホスホネート層
を含んで成るインプラントデバイス。
【請求項１０】
第二のビスホスホネート層が、非共有結合相互作用のみによってタンパク質膜に結合する請求項９に記載のインプラントデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人間に使用することを意図するビスホスホネート（ビスフォスフォネート：bisphosphonate）被覆（又はコート）インプラントデバイス（implant device）及びそのための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インプラントに隣接する生きている人間の骨は、骨の吸収と新しい骨の形成を同時に受ける。同様に、インプラントの周囲の軟組織は、初期の傷の治癒期間後に作り直される。
【０００３】
骨中において、上述のプロセスは、骨に関する外形の充填と機能要求への骨構造の適応を生ずる。通常の骨折箇所では、骨の吸収と形成の間の動的な相互作用が、骨の健康な再生を確保する。ある病的状況、例えば整形外科のジョイント人工器官のゆるみ、悪性腫瘍、及び骨粗鬆症等では、骨の吸収が骨の堆積より大きい。しかし、整形外科のインプラントが骨と接触する場合、吸収が促進された速度で起こりえる。これは、正常に機能しないインプラントの初期の固定化及び一体化と、移植箇所での初期の又は終わりの全体の骨の損失をもたらす。
【０００４】
軟組織では、偽物の部分の周囲よりインプラントの周囲のほうで、長期の炎症がよりしばしば観察される。これは、例えば免疫組織化学の方法によって観察されるように、マクロファージ及び単球（又は単核白血球）等の炎症性細胞が遅れて存在しているとして、表すことができる。長期の炎症過程は、軟組織インプラントの繊維性カプセル化を生ずると考えられる。
【０００５】
ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）とトリカルシウムホスフェート（ＴＣＰ）被覆が、二三週間〜数ヶ月の期間、骨へのインプラントの固定を向上するために広く用いられている。しかし、ＨＡとＴＣＰ被覆は、製造するには高価であり、不一致の生物学的挙動が報告された。ＨＡとＴＣＰ被覆は、しばしば、長期使用に不適切である。ある用途については、現在利用できる被覆されたインプラントは、不適当であり、例えば何年も使用した後、亀裂等のために機能しなくなることもある。
【０００６】
金属製インプラントの周囲の骨の修復時間は、数ヶ月の程度であり得、繊維、孔（又は穴）、割れ目及び表面粗さ（又は凹凸）等への骨の成長の観点でしばしば述べられる。ある用途では、インプラントは、このプロセス（又は過程）が十分な表面／組織結合強度をもたらすまで、負荷を受けることはできないし、負荷をうけるべきではない。そのような非負荷は、必ずしも可能ではなく、非負荷期間を短くすることが好ましい。
【０００７】
更に、インプラントの中には、バクテリアが、隣接する皮膚又は粘膜から、インプラントと周囲の組織の間の境界に入る可能性を生じさせる。骨折の処置で使用されるいわゆる外部固定デバイス（external fixation device）の場合、これは、しばしば骨の吸収をもたらし、デバイスは数ヶ月内にゆるむ。既に上述したように、常套のインプラントも長期の炎症と他の望ましくない組織の反応を、特に軟組織内で、起こさせる傾向を有する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
本発明のビスホスホネート被覆（又はコート）インプラントとその方法が、先に概略を説明した課題についての解を提供する。より特には、本発明の方法は、インプラントデバイスを被覆するためのものである。インプラントデバイスを、例えばフィブリノゲン等のタンパク質の複数層を用いて被覆する。ビスホスホネート物質、例えばパミドロネート（pamidronate）（化学的に反応性の基、例えばアミノ基等を有する）を、タンパク質膜上に共有結合で固定化する。化学的に非反応性のビスホスホネート物質、例えばイバンドロネート（ibandronate）を、第一ビスホスホネート物質上に吸着するが、その二つの物質は異なる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
図１を参照すると、ビスホスホネート被覆インプラントデバイス１０は、好ましくは、エッチング処理された表面１１と複数のタイプの被覆層を有し、被覆層は、適するタンパク質層１２、層１２に化学的に結合した第一ビスホスホネート１４及び第一ビスホスホネート層１４の上部に配置されて一体化した第二ビスホスホネート層１６を含む。本発明の一の重要な特徴は、第一ビスホスホネート層１４は、強く結合するが、第二層１６は、ゆるく結合し、素早く脱離（又は剥離）することができるということである。これは、インプラントデバイス１０を挿入後、最初の２〜３日間のデバイス−組織相互作用のために重要である。強く結合した第一ビスホスホネート層１４は、ゆっくり時間をかけてゆっくり脱離し、インプラントデバイス１０の長期間の使用性を向上する。
【００１０】
インプラントデバイス１０は、いずれかの適する材料、例えばステンレス鋼、チタン、又は十分な支持をもたらすいずれかの他の非金属材料であってよい。ステンレス鋼の機械特性は、極めて高い強度ゆえにしばしば好ましい。インプラントは、いずれかのデバイス、例えば被覆された又は被覆されていない金属スクリュー又はポリマーパッドであってよい。説明に有用な例として、インプラントデバイス１０は、ステンレス鋼でできている。インプラントデバイス１０の表面１１は、エッチングされており、又は表面が粗くされている。インプラントデバイス１０の表面のトポロジー、特にその粗さ及び多孔性（又は空隙率）に関するトポロジーが、組織の回復及びインプラントの成功に影響し得る。他の表面処理方法、例えばカルシウム無機物被覆も使用できる。
【００１１】
好ましくは、デバイス１０は、まず、フッ化水素酸（ＨＦ）又は硝酸等の酸でエッチングした後、過酸化水素溶液で洗浄する。過酸化水素は、フッ化水素酸と比較してより温和なエッチングをもたらす。
【００１２】
タンパク質層１２は、表面１１を被覆するために使用される、例えば固定化され架橋されたフィブリノゲン等のいずれかの適するタンパク質であってよい。複数の層を用いることが好ましい。例えば、金属製デバイス１０の金属酸化物（ＭＯＨ−）上にタンパク質を結合させるために、シラン物質を用いることができる。シランを使用することで、強いエーテル共有結合を、金属デバイスと第一タンパク質層の間に形成することができる。より特には、金属表面１１のヒドロキシル基へのアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ：amino propyl triethoxy silane）の共有結合アタッチメント（又は取り付け）を介して、第一フィブリノゲン層１２ａを、ステンレス鋼表面１１に固定化することができる。ＡＰＴＥＳを、アミノ基、カルボキシル基、ＳＨ基又はいずれかの他の適する化学基を有するいくつかの他の物質で置き換えることも可能である。ＡＰＴＥＳのアミノ基も、アルデヒド系物質（例えば、グルタルアルデヒド）の一端のアルデヒド基と反応する。グルタルアルデヒドは、第一タンパク質層１２ａのアミン末端と化学的に結合し得る第二アルデヒド基を有する。
【００１３】
第一ビスホスホネート層１４をグルタルアルデヒドのアルデヒド基と直接化学的に結合させることが可能であろう。しかし、そのとき、単層１４の厚さは、約５〜６オングストロームに制限され得る。ちょうど一つの層より多くのビスホスホネートを結合させることが、しばしば望ましい。
【００１４】
更に、第一タンパク質層１２ａの遊離のカルボキシル末端を、カルボジイミド、例えばエチル−ジメチル−アミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ：ethyl-dimethyl-aminopropylcarbodiimide）、及びヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ：hydroxy-succinimide）によって活性化して、引き寄せて、ペプチド結合形成によって、より多くのタンパク質を捕まえて、第二タンパク質層１２ｂを形成することができる。ＥＤＣは、第一タンパク質層のカルボキシル基を活性化して、その結果、それに、溶液中のタンパク質のアミノ基を化学的に結合させることができる。ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化手順の繰り返しによって、複数のタンパク質層を固定化し、架橋することができる。タンパク質層１２の全体の厚さは、層の数を増加させることで増してよい。例えば、１０層のフィブリノゲンは、図２に示すように約２８０オングストローム（又はÅ）の厚さであり得る。フィブリノゲンの複数の層を、従って多数の反応性基を、デバイス１０に架橋することで、かなりの量である、二つの層１４ａ〜ｂ（１０〜１２オングストローム）に対応する第一ビスホスホネートと、第二ビスホスホネート１６（６〜７オングストローム）の一つの層を加えることが可能となる。従って、全部のビスホスホネート層は、約１８オングストロームであり得る。ビスホスホネート層は、タンパク質層１２ｆの上部に配置されるのみならず、層１２ａ〜ｅのネットワーク中に混合されてもよい。層１６の第二ビスホスホネート、例えばイバンドロネートは、層１４中に混合されてもよい。
【００１５】
上述したように、第一ビスホスホネート層１４ａ、１４ｂを、タンパク質層１２ａ〜ｆに固定化してよい。好ましくは、第一層１４ａ、１４ｂは、例えば、架橋したタンパク質層１２ａ〜ｆと共有結合で結合することができるパミドロネート物質等の化学的に反応性の基を含むビスホスホネートである。例えば、パミドロネート分子のアミン基を、ＥＤＣ／ＮＨＳを用いてタンパク質を活性化後、最上の層１２ｆに取り付けてよい。
【００１６】
植え込みによる外傷は、しばしば、インプラントデバイスの機械的固定化に負の影響を与える骨の吸収をもたらす。薬を局所的に突然施す方法によって適用する場合、又は薬を長期間かけて系統的に施す方法によって適用する場合、ビスホスホネートの一の特徴は、それらが骨の吸収を抑制し、単球（又は単核白血球）及びマクロファージの炎症活性を、おそらく減少させ、それによって、時間をかけてインプラントデバイスの固定化と一体化（又は融合）を、おそらく向上させることである。約１２０ｎｇ／ｃｍ２の局所的な表面用量は、固定化を増大させるには十分である。インプラントデバイス１０の迅速な機械的な固定化は、損傷した骨の回復能を有する患者のためであるのみならず、通常の健康な患者のためにも、金属製人工器官（又はプロテーゼ）の発展のために重要である。より速い機械的固定化は、より早い及びより高い機械的負荷吸収能のために、人工器官の機能を、おそらく向上させる。これと平行して、それは、繊維状の（繊維質の又は繊維から成る）カプセル化の厚さも減少させ、界面の新たな脈管化も促進する。従って、インプラントデバイスの早期の微小な動きを、最小化し、後にゆるむ危険性を減少させる。
【００１７】
好ましくは、第二のビスホスホネート層１６は、例えば疎水性相互作用及びファンデアワールス相互作用等の他の結合機構によって、タンパク質層１２ａと層１４ａ、１４ｂに適用される化学的に低反応性の又は非反応性の物質、例えばイバンドロネートである。その結合は、カルシウムイオン（Ｃａ＋＋）−架橋を伴ってもよい。この方法では、第二ビスホスホネート層１６は、化学的に反応性の基を有することは必要ではない。低反応性の又は非反応性のビスホスホネートは、タンパク質膜上に又はタンパク質中に固定化されたパミドロネートに吸着され又は取り付けられてよく、その結果、約６オングストロームの層が、一夜の低温放置の間に形成され、全部で少なくとも三つのビスホスホネートの層が存在する。
【００１８】
ゆるく結合したビスホスホネート層１６は、インプラントデバイス１０から容易に解放されるという事実は、重要な長所を有する（インプラントデバイスを挿入後、２４時間以下の短時間である）。組織へのインプラントの挿入は、しばしば、組織マトリックスの損傷とインプラントのすぐ近くで微小循環の途絶を起こす。骨の場合、マトリックスの損傷は、破骨細胞（又は溶骨細胞）の活性化及び再形成（又はリモデリング：remodelling）に関係し得る骨細胞アポートシス（又は細胞自然死）を起こし得、インプラントデバイスの周囲の全体的な骨吸収を起こし得る。これは、おそらくインプラントの固定の欠陥をもたらす。ビスホスホネートの第二層１６の急性の迅速な解放は、本質的にかつ効果的に破骨細胞の活性化を抑制し、骨の吸収を減少させる。インプラントデバイスの挿入後、はじめの２〜３日間又はより長い間、これは、特に重要である。更に、ビスホスホネートは、骨形成細胞に関して直接促進効果を有する可能性がある。上述したように、ビスホスホネートは、軟組織中の破骨細胞前駆体（単球／マクロファージ）の活性を減少させ、それによって、急性でない、インプラントの長期の炎症過程の段階を低下させる。長期の炎症活動は、軟組織の線維症の主な理由の一つであると疑われる。ビスホスホネートの表面での放出（又は解放）は、炎症活動を短くし、インプラントの周囲でより速い傷の治癒過程をもたらす。アミノ基を有さないビスホスホネート物質は、炎症反応を減少させるために特に有用であり得る。これは、例えば心筋と接触するペースメーカー−リード（pacemaker-lead）の電圧の閾値を低下させること等のインプラントの機能を向上させ、種々の軟組織の測定を向上させ、即ち、バイオセンサー内で、体液の性質の測定を向上させる。
【００１９】
図２に示すように、ビスホスホネート層１４ａ、１４ｂ及び１６の合計の厚さは、約１８オングストローム又はそれ以上である。表面１１を粗にし、表面積を増加させると、約３５〜３６オングストローム又はそれ以上のビスホスホネート層の全厚さを得ることもできる。ビスホスホネート解放機構は、非共有結合で結合したビスホスホネートの自発的な脱離と、タンパク質の酵素による開裂（又は切断）又は加水分解を介する共有結合で結合したビスホスホネートの解放（又は放出）に依存し得る。およそ３０〜５０％のビスホスホネート層１６は、蒸留水中で一夜間の定温放置の間に、脱離することができる。
【実施例】
【００２０】
直径が１．７ｍｍで長さが３ｍｍのねじ山を有するステンレス鋼スクリュー（ねじ、ボルト又はビス）を用いた。各々のスクリューは、その頭部に規定される穴を有し、材料試験機に吊されているフックでしっかり留めることができた。超音波浴のアセトン中で５分間、スクリュー試験品を清浄にした。その後、試験品を１００％フッ化水素酸（ＨＦ）で２０分間エッチングし、８０℃で５分間塩基性過酸化水素溶液で洗浄し、最後に蒸留水ですすいだ。エッチングした表面に、０．１〜１００マイクロメーターの範囲の寸法の穴（又は割れ目）及び粗さ（又は凹凸）が観察された。
【００２１】
スクリュー試験品を、０．２Ｍの３−アミノプロピルトリエトキシシラン Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）３（ＡＰＴＥＳ、ＡＢＣＲ社、ドイツ）と一緒にチャンバーに入れ、６０℃、６ｂａｒで１０分間焼いた（又はベークした）。その後、１時間温度を１５０℃に上げた。試験品の表面を超音波浴のキシレン（９９％濃度、メルク社、米国）中で２分間すすいだ。その後、表面をキシレンですすぎ、試験品を再び処理するまで、１時間もかからない間キシレン中で保管した。そのような被覆試験品を流通する窒素で吹いて乾かし、０．２Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ９中で新たに調製した６％グルタルジアルデヒド、ＯＨＣ（ＣＨ２）３ＣＨＯ中で、３０分間室温で放置して、アルデヒド基と反応するための良好な環境を作った。その後、表面を広範囲にすすいで、トリス緩衝液、ｐＨ９中で保管した。
【００２２】
１０層のフィブリノゲンを有するスクリューを、下記のようにして製造した。ＡＰＴＥＳとグルタルジアルデヒド−被覆試験品を、リン酸塩で緩衝された生理食塩水（ＰＢＳ：phosphate buffered saline）、ｐＨ７．４中に１ｍｇ／ｍｌタンパク質が溶解したものの中で、３０分間定温で放置した。その後、試験品表面を広範囲にＰＢＳ中ですすぎ、０．２Ｍのエチル−ジメチル−アミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ、シグマ社、米国）を含む、ｐＨ５．５のＰＢＳ中で３０分間定温放置した。再び試験品表面を、ＰＢＳ、ｐＨ５．５中の新たに作った１ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液中で３０分間定温放置した後、ＰＢＳ緩衝液中ですすぎ、再びＥＤＣ／ＮＨＳ溶液中で定温放置した。この手順を１０回繰り返して、１０層のフィブリノゲン被覆を形成した。ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液は、室温条件では不安定なので、新しい溶液を２時間おきに調製した。
【００２３】
パミドロネートジナトリウム（pamidronate disodium）（ＡＲＥＤＩＡ、蒸留水中に１ｍｇ／ｍｌ、ノバルティス社（Novartis）、スウェーデン）を、フィブリノゲンの複数層に、上述のＥＤＣ／ＮＨＳカップリング技術を用いて固定化した。イバンドロネート溶液（ＢＯＮＤＲＯＮＡＴＥ、蒸留水中に５０ｍｇ／ｍｌ、ロシュ社（Roche）、スイス）を、パミドロネートの上部に一夜間で吸着させた。スクリュー試験品をネズミの頸骨に挿入するまで、２４時間までイバンドロネート溶液中に保管した。
【００２４】
架橋したフィブリノゲン層の厚さは、およそ２８０オングストロームであり、パミドロネート層の厚さは、約１２オングストロームであった。よりゆるく取り付けられたイバンドロネート層は、約６オングストロームの厚さであった。固定化ビスホスホネートの全量は、およそ１２０ｎｇ／ｃｍ２であった。パミドロネート分子のアミノ基は、ＥＤＣ／ＮＨＳを用いるフィブリノゲン膜の活性化後に、一番上のフィブリノゲン層に取り付けられた。固定化パミドロネートに吸着された又は取り付けられたイバンドロネートは、およそ単層（６オングストローム）であり、一夜間定温放置する間に形成した。
【００２５】
ステンレス鋼製インプラントデバイスのパミドロネート／イバンドロネート被覆表面は、図３に示すように、ビスホスホネートで被覆していない対照試験品と比較して、破損（又は破壊）時に、平均で２８％（ｐ＝０．０００９）増加した引き抜き力を示した。骨の剛性は、対照試験品と比較して８％減少したが、その変化は統計上重要ではない。破損するまでの引き抜きエネルギーは、９０％まで増加し、これは、ネズミの頸骨とビスホスホネート被覆試験品との間の界面で、機械的な特性が劇的に変化したことを示している。これは、インプラントデバイス１０の固定化ビスホスホネート層１４ａ、１４ｂ、１６によって、骨の中への金属製生体材料の固定が改良されたことを、強く示している。
【００２６】
好ましい組成と態様に関して本発明を説明したが、特許請求の範囲の精神及び範囲から離れることなく、置き換え及び変更が可能であることが、理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、本発明の被覆されたインプラントデバイスの概略の断面図である。
【図２】図２は、タンパク質層の数に対する被覆の厚さの概略図である。
【図３】図３は、本発明の方法に基づいて被覆されたインプラントデバイスの向上した機械的特性を示す表である。
【図１】
2007533345.tif 000003
【図２】
2007533345.tif 000004
【図３】
2007533345.tif 000005
【国際調査報告】
2007533345.tif 000006
2007533345.tif 000007
2007533345.tif 000008
2007533345.tif 000009
2007533345.tif 000010
2007533345.tif 000011