(57)【要約】  ＣＮＳおよびＰＮＳグリア細胞（乏突起膠細胞、および、シュヴァン細胞、および、これらの系統に含まれる前駆細胞）のＥｐｈＢ１が介在する細胞の反発を阻害することによって、脱髄障害（例えば多発性硬化症）を治療することができる化合物を同定する方法、および、それらを用いる方法である。【選択図】  図１
2007535934.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エフリンＢが介在するＥｐｈＢ１活性を阻害することができる化合物を同定する方法であって：
（ａ）候補化合物の非存在下で、該ＥｐｈＢ１の活性を測定する工程；および、
（ｂ）候補化合物の存在下で、該ＥｐｈＢ１の活性を測定する工程、
を含み、ここにおいて、該候補化合物は、工程（ｂ）で測定された活性が工程（ａ）で測定された活性より低い場合に、エフリンＢが介在するＥｐｈＢ１活性を阻害することができると同定される、上記方法。
【請求項２】
測定する工程（ａ）は、候補化合物の非存在下で、ＥｐｈＢ１を発現する細胞のエフリンＢが介在する反発を測定することを含み、測定する工程（ｂ）は、該候補化合物の存在下で、該細胞のエフリンＢが介在する反発を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞のエフリンＢが介在する反発の測定は、
（ｉ）プレート上の少なくとも１つの特定の領域に、エフリンＢリガンドを塗布する工程；
（ii）プレートに、ＥｐｈＢ１を発現する細胞の培養物を添加する工程；および、
（iii）少なくとも１つの特定の領域と比較して、該細胞の培養物の移動の程度、速度および方向を測定する工程、
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
エフリンＢリガンド は、エフリンＢ−Fc 融合タンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
エフリンＢリガンドは、エフリンＢを発現する細胞を用いて、プレートに塗布される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
エフリンＢリガンドは、細胞質膜を用いて、プレートに塗布される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
測定する工程（ａ）は、候補化合物の非存在下で、ＥｐｈＢ１の細胞内チロシンキナーゼドメインのキナーゼ活性を測定することを含み、測定する工程（ｂ）は、該候補化合物の存在下で、該ＥｐｈＢ１の細胞内チロシンキナーゼドメインのキナーゼ活性を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＥｐｈＢ１の細胞内チロシンキナーゼドメインの活性を測定することは、無傷細胞のチロシンキナーゼ活性を測定することである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
測定する工程（ａ）は、候補化合物の非存在下で、動物における脱髄障害の進行を測定することを含み、そして、測定する工程（ｂ）は、該候補化合物の存在下で、動物における脱髄障害の進行または修復の速度／程度を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
動物は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）モデル、および、エチジウムブロマイド（「ＥｔＢｒ」）モデルからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＥｐｈＢ１活性を阻害する治療が必要なヒト宿主においてＥｐｈＢ１遺伝子産物の活性を阻害する化合物を投与することを含む、ヒト宿主においてＥｐｈＢ１活性を阻害する方法であって、ここにおいて、該化合物のＥｐｈＢ１遺伝子産物の活性を阻害する能力は：
（ａ）候補化合物の非存在下で、ＥｐｈＢ１遺伝子産物の活性を測定すること；および、
（ｂ）該候補化合物の存在下で、ＥｐｈＢ１遺伝子産物の活性を測定すること、
によって同定され、ここにおいて、該候補化合物は、工程（ｂ）で測定された活性が工程（ａ）で測定された活性より低い場合、ＥｐｈＢ１活性を阻害することができると同定される、上記方法。
【請求項１２】
化合物は、該化合物および製薬上許容できる補助剤を含む医薬組成物として投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
測定する工程（ａ）は、候補化合物の非存在下で、ＥｐｈＢ１を発現する細胞のエフリンＢが介在する反発を測定することを含み、そして測定する工程（ｂ）は、該候補化合物の存在下で、該細胞のエフリンＢが介在する反発を測定することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
エフリンＢが介在する細胞の反発を測定することは：
（ｉ）プレート上の少なくとも１つの特定の領域に、エフリンＢリガンドを塗布する工程；
（ii）プレートに、ＥｐｈＢ１を発現する細胞の培養物を添加する工程；および、
（iii）少なくとも１つの特定の領域と比較して、該細胞の培養物の移動の程度、速度および方向を測定する工程、
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
エフリンＢリガンドは、エフリンＢ−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
エフリンＢリガンドは、エフリンＢを発現する細胞を用いて、プレートに塗布される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
エフリンＢリガンドは、細胞質膜を用いて、プレートに塗布される請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
測定する工程（ａ）は、候補化合物の非存在下で、ＥｐｈＢ１の細胞内チロシンキナーゼドメインのキナーゼ活性を測定することを含み、そして測定する工程（ｂ）は、該候補化合物の存在下で、該ＥｐｈＢ１の細胞内チロシンキナーゼドメインのキナーゼ活性を測定することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
ＥｐｈＢ１の細胞内チロシンキナーゼドメインの活性を測定することは、無傷細胞のチロシンキナーゼ活性を測定することである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
測定する工程（ａ）は、候補化合物の非存在下で、動物における脱髄障害の進行を測定することを含み、そして測定する工程（ｂ）は、該候補化合物の存在下で、動物における脱髄障害の進行または修復の程度／速度を測定することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
動物は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）モデル、および、エチジウムブロマイド（「ＥｔＢｒ」）モデルからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多発性硬化症を治療する分野に関し、具体的には、ＣＮＳおよび末梢グリア細胞（乏突起膠細胞およびシュヴァン細胞）ならびにこれらの系統に含まれる前駆細胞において、ＥｐｈＢ１が介在する細胞の反発を阻害することによって多発性硬化症を治療する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
引用された全ての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に包含される。
【０００３】
エリスロポイエチンを生産する肝細胞（「Ｅｐｈ」）受容体は、受容体チロシンキナーゼのファミリーであり、シグナル伝達に関与する細胞内チロシンキナーゼドメインと共に、独特なシステインリッチモチーフと２個のフィブロネクチンＩＩＩ型モチーフを有する細胞外領域を含む（Ｃｏｎｎｏｒ  ＲＪおよびＰａｓｑｕａｌｅ  ＥＢ．（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１：２４２９〜３８１９９５）。（Ｖｉｎｄｉｓ等，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００３年８月１８日；１６２（４）：６６１〜７１）。Ｅｐｈ受容体は、神経の発達と生理学に関与し、発達中の神経系と成人の神経系で発現される。（Ｔｕｚｉ  ＮＬおよびＧｕｌｌｉｃｋ  ＷＪ．（１９９４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６９：４１７〜２１）。Ｅｐｈ受容体に対するリガンドは、エフリンとして知られている。全ての既知のエフリンリガンドはいずれも、膜結合型である。エフリン−Ａサブクラスは、グリコシルホスファチジルイノシトール（「ＧＰＩ」）基を介して膜に結合している。エフリンＢサブクラスは、膜貫通ドメインを介して結合している。（ＦｌａｎａｇａｎおよびＶａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９８．２１：３０９〜４５）。エフリンリガンドは、直接の細胞間の接触によってそれらのＥｐｈ受容体と相互作用する（Ｄａｖｉｓ，Ｓ．等（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６，８１６〜８１９；Ｄｒｅｓｃｈｅｒ，Ｕ．等（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．７，７５〜８０；Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｊ．Ｇ．およびＶａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ，Ｐ．（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１，３０９〜３４５；Ｆｒｉｓｅｎ，Ｊ．等（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８，５１５９〜５１６５；Ｍｅｌｌｉｔｚｅｒ，Ｇ．等（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４００，７７〜８１）。
【０００４】
エフリンリガンドは、軸索反発を誘導するきっかけとして作用することが示されており、Ｅｐｈ受容体は、インビボでの正しい軸索のナビゲーションに必要である。（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｓ．Ｊ．等（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ８，１１７〜１２７）。ＥｐｈＢ１受容体チロシンキナーゼ（「ＥｐｈＢ１」）はまた、Ｅｌｋ、Ｃｅｋ６、ＮｅｔおよびＨｅｋ６としても知られており、中枢および末梢神経系の発達中に、適切な空間的なパターン形成を確立することによって特徴のある役割を果たす。ＥｐｈＢ１受容体とエフリンＢリガンドとの相互作用は、神経の発達において役割を果たすことが示されている。（Ｓｍｉｔｈ等，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．１９９７年８月１日；７（８）：５６１〜７０）。例えば、ＥｐｈＢ１およびエフリンＢ２は、中脳ドーパミン作動性ニューロンとそれらの標的で相補的なパターンで発現されるが、これは、それらの相互作用は、別個の神経経路の確立に寄与する可能性があることを示す。（Ｙｕｅ等，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９９年３月１５日；１９（６）：２０９０〜１０１）。ＥｐｈＢは、シナプス形成（Ｄａｌｖａ等（２０００）Ｃｅｌｌ  １０３：９４５．）、同様に、細胞の移動および増殖において役割を果たすことが示されている。（Ｃｏｎｏｖｅｒ等（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３：１０９１）。Ｅｐｈ受容体およびエフリンリガンドは、細胞の運動性に関する細胞のシグナル伝達経路に関連付けられており、細胞の移動および反発におけるそれらの役割を裏付けている。（ＳｃｈｍｕｃｋｅｒおよびＺｉｐｕｒｓｋｙ（２００１）Ｃｅｌｌ  １０５：７０１）。エフリンＢ１は、新皮質の神経形成と相関して神経上皮細胞で発現される。（Ｓｔｕｃｋｍａｎｎ等（２００１）ＪＮＳ  ２１：２７２６）。ニューロンの発達に加えて、Ｅｐｈおよびエフリンは、成人のＣＮＳで機能することが示されている。例えば、ＥｐｈＢ１とエフリンＢとの相互作用は、脊髄におけるシナプス効率と痛みの処理を調節することが示されている。（Ｂａｔｔａｇｌｉａ等（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ６：３３９）。
【０００５】
Ｅｐｈファミリーとエフリンファミリーはいずれも膜結合型であって、直接的な細胞間相互作用で互いに伝達しあっているため、Ｅｐｈファミリーが「受容体」であり、エフリンが「リガンド」であるという指定は、多少任意である。実際に、Ｅｐｈとエフリンとのシグナル伝達は、二方向性が可能であることが示されている。Ｅｐｈ受容体との相互作用により、エフリンＢリガンドがチロシン−リン酸化を引き起こし、それによって細胞内シグナルが変換され、エフリンＢ発現細胞の細胞骨格の再編成が起こる。（Ｘｕ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，第２７８巻，２７号，２４７６７〜２４７７５）。エフリンＢは、ＳＨ２／ＳＨ３ドメインに関する既知のアダプタータンパク質であるＧｒｂ４タンパク質を用いて逆のシグナル伝達経路を変換することが示されている。（Ｃｏｗａｎ  ＣＡおよびＨｅｎｋｅｍｅｙｅｒ  Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００１年９月１３日；４１３（６８５２）：１７４〜９）。
【０００６】
エフリンリガンドは、中枢神経系（ＣＮＳ）の胚域で高度に発現され（Ｃｏｎｏｖｅｒ等，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，第３巻，１１号，１０９１〜１０９７；Ｓｔｕｃｋｍａｎｎ等，２００１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，第２１巻，８号，２７２６〜２７３７）、これは、これらは、グリア前駆細胞の、周囲の軟膜への移動および正中線を超えた軸索誘導の調節に関与する可能性があることを示唆している。
【０００７】
出願人により、Ｅｐｈは、細胞の移動を調節することによって神経学的な発達において役割を果たすことが示されている。抗Ｅｐｈ抗体とＰＣＲの使用によって、ＥｐｈＢ１は、培養した未成熟の、および成熟したげっ歯類の乏突起膠細胞で発現され、ＥｐｈＢ１の発現レベルは、細胞が成熟するにつれて減少することが示されている。また、これらの研究は、希突起膠細胞の移動は、エフリンＢリガンドの影響を受ける可能性があることも実証している。
【０００８】
エフリンＢリガンドの希突起膠細胞の移動に対する作用は、ストライプ分析（ｓｔｒｉｐｅ  ａｓｓａｙ，出典：Ｂｏｎｈｏｅｆｆｅｒ等，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１９８７年１２月；１０１（４）：６８５〜９６）として知られている細胞の移動分析を用いて測定された。典型的なストライプ分析において、推定の誘引物質または防虫剤が、プレートに、ストライプとして知られている縞模様に付着させる。次に、このプレート上に細胞懸濁液を置き、平衡化させる。その後、このストライプと比較して、細胞の移動の速度および方向を測定する。ストライプに化学的忌避剤が含まれる場合、培養皿中の細胞は、ストライプ領域に移動しないか、または、ストライプから離れて移動するかのいずれかと予想される。それゆえに、細胞が、ストライプを回避するか、または、ストライプから離れて移動することが観察される場合、ストライプの内容物は、細胞の培養物中の細胞の種類に適した化学的忌避剤と同定される。
【０００９】
Ｅｐｈとエフリンは、インビボで、直接の細胞間相互作用を介して相互作用するが、ＩｇＧ  ＦｃにＥｐｈまたはエフリンの細胞外ドメインを連結させることにより、そのそれぞれのエフリンまたはＥｐｈを活性化することができる可溶性融合タンパク質が生産可能であることが示されている。（Ｋａｎｅｋｏ  ＭおよびＮｉｇｈｏｒｎ  Ａ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００３年１２月１７日；２３（３７）：１１５２３〜３８）。
【００１０】
ストライプ分析は、細胞間相互作用を必要とすることなく、ＥｐｈＢ１受容体を活性化することができるエフリンＢ−Ｆｃ融合タンパク質を用いて行われた。エフリンＢ−Ｆｃ融合タンパク質を、プレート中の縞模様の領域（ストライプとして知られている）に付着させた。次に、乏突起膠細胞の懸濁液をプレートに置き、エフリンＢ−Ｆｃストライプと比較して、培養した乏突起膠細胞の移動の速度および方向を測定した。エフリンＢ−Ｆｃのストライプは、インビトロでは、培養した乏突起膠細胞の移動に反発することが示されている。
【００１１】
ＣＮＳにおいて、軸索の周りのミエリン鞘は、軸索に沿ったシグナル伝達速度を高める絶縁物質としてとして役立つ。ミエリンは、乏突起膠細胞で生産され、軸索を包む希突起膠細胞の多層膜からなる。多発性硬化症（「ＭＳ」）のような脱髄疾患において、神経学的な症状は、脱髄した軸索における伝達が十分に機能しないために起こる。その他の脱髄障害としては、橋中央ミエリン溶解、白質萎縮症、急性散在性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、および、亜急性硬化性全脳炎が挙げられる。脱髄性のＭＳの病巣の神経病理学的な試験により、希突起膠細胞数が顕著に減少することが解明されている。乏突起膠細胞の損失は、急性および慢性ＭＳの病巣の両方で観察されている。ＭＳの病巣における乏突起膠細胞の減少は、希突起膠細胞の死の結果であることが示唆されている（Ｂｒｕｃｋ，Ｗ．等（１９９４）Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ３５，６５〜７３）。
【００１２】
エフリンリガンドは、希突起膠細胞とニューロン移動を直接阻害することが示されている。その上、ＥｐｈＢ１受容体と対応するエフリンリガンドは、多発性硬化症の病巣、脊髄の損傷、ならびに、肺および乳房腫瘍などの病的状態でアップレギュレートされており、これは、この受容体が、罹患した組織における細胞移動の制限に関与することを示唆している（Ｂｕｎｄｅｓｅｎ等，２００３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２３（２１），７７８９〜７８００）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
新たに形成された乏突起膠細胞は、ＭＳの病巣中とその周辺に存在しており、これは、これらの細胞が病巣に移動することができるならば、自己修復が可能であることを示唆している。近年の研究によれば、これらの希突起膠細胞の前駆細胞の移動は、ＥｐｈＢ１が介在する阻害シグナルの発現の影響を受ける可能性があることが示唆されている。さらに、ＥｐｈＢ１シグナル伝達経路を妨害することにより、希突起膠細胞の前駆細胞を損傷した脳領域に移動させ、修復プロセスにプラスの影響を与える可能性があることも示唆されている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、ＥｐｈＢ１が介在する細胞の反発を妨害する化合物を同定することが望ましい。本発明は、ＥｐｈＢ１受容体活性のモジュレーターに関するスクリーニング分析を行うことによって、ＥｐｈＢ１シグナル伝達経路を妨害する化合物を同定する方法を提供する。さらに望ましくは、このようにして同定された化合物を、脱髄障害（例えばＭＳ）に罹った患者を治療するのに使用することである。
【００１５】
発明の簡単な要約
一形態において、本発明は、ＥｐｈＢ１活性を阻害することができる化合物を同定する方法に関し、本方法は、候補化合物の非存在下で、ＥｐｈＢ１活性を測定する工程；および、該候補化合物の存在下で、ＥｐｈＢ１活性を測定する工程を含み、ここにおいて、前記候補化合物は、該候補化合物の存在下で測定された活性が、該候補化合物の非存在下で測定された活性より低い場合、ＥｐｈＢ１活性を阻害することができると同定される。本発明のさらなる形態において、ＥｐｈＢ１活性は、以下で示す３つの分析：細胞の反発の分析、チロシンキナーゼ分析、および、インビボでの分析のいずれか１つで測定することもできる。
【００１６】
細胞の反発は、プレート上の特定の領域または領域にエフリンＢリガンドを塗布すること、プレートにＥｐｈＢ１を発現する細胞の懸濁液を添加すること、および、特定の領域または領域と比較して、細胞移動の速度、程度および方向を測定することによって測定することもできる。エフリンＢリガンドは、エフリンＢ−Ｆｃ融合タンパク質として、プレートに塗布される細胞の表面で発現されるタンパク質として、または、プレートに塗布される細胞質膜に包含されるタンパク質として、プレートに塗布してもよい。
【００１７】
ＥｐｈＢ１チロシンキナーゼ活性は、ＥｐｈＢ１の細胞内チロシンキナーゼドメインのリン酸化活性を測定することによって決定される。チロシンキナーゼ活性は、無傷細胞で測定することもできる。
【００１８】
ＥｐｈＢ１活性は、インビボで、脱髄性の動物モデルにおける修復の進行または速度を測定することによって決定してもよい。動物モデルは、げっ歯類ＥＡＥでもよいし、または、ＥｔＢｒで誘導された病巣でもよい。
【００１９】
その他の側面において、本発明は、ＥｐｈＢ１活性を阻害する治療が必要なヒト宿主においてＥｐｈＢ１遺伝子産物の活性を阻害する化合物を投与することによって、ヒト宿主においてＥｐｈＢ１活性を阻害することに関し、ここにおいて、該化合物のＥｐｈＢ１遺伝子産物の活性を阻害する能力は、候補化合物の非存在下で、前記ＥｐｈＢ１遺伝子産物の活性を測定すること、および、該候補化合物の存在下で、前記ＥｐｈＢ１遺伝子産物の活性を測定することによって同定され、ここにおいて、該候補化合物は、該候補化合物の存在下で測定された活性が、該候補化合物の非存在下で測定された活性より低い場合、ＥｐｈＢ１活性を阻害することができると同定される。さらなる側面において、該化合物は、該化合物と製薬上許容できる補助剤とを含む医薬組成物として投与される。
【００２０】
図面の簡単な説明
図１は、ラット希突起膠細胞の前駆細胞（ＯＬＰ）、成熟乏突起膠細胞（ＯＬ）、星状細胞および小グリア細胞におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現の相対レベルを示す棒グラフである。
図２は、全身から選択される多種多様なヒトの組織型におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現の相対レベルを示すチャートである。
図３は、成人の脳の異なる小区域におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現の相対レベルを示すチャートである。
図４は、ヒトの病理学的な組織におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現の相対レベルを示すチャートである。
図５は、正常な脳およびＭＳの脳由来のヒト白質におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現の相対レベルを示す棒グラフである。ＭＳ組織サンプルは、様々な重症度の病巣の代表的なものであり、これらは、組織病理学的な評価（「ＭＳ−ＰＶＣ」、血管周囲の尖を含む組織；「５０％プラーク」、約５０％未満またはそれに等しいプラークを含む組織；「＞５０％プラーク」、５０％より多いプラークを含む組織；「１００％プラーク」、１００％プラークを含む組織；「ＭＳ−ＮＡＷＭ」、正常な「外観の」白質を含む組織；「Ｃ−ＷＭ」、正常な成人の脳由来の組織）に基づく。
図６は、様々な重症度のＭＳの病巣を含む様々な組織型におけるＥｐｈＢ１発現の相対レベルを示す棒グラフである。
【００２１】
発明の詳細な説明
ＥｐｈＢ１のｍＲＮＡが発現される組織、同様に発現の相対レベルを決定するために、一連のＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現の特徴付けを、多種多様な細胞型で行った。
【００２２】
ＥｐｈＢ１のｍＲＮＡレベルは、乏突起膠細胞で高濃度化されることが見出された。図１は、４タイプの細胞、成熟乏突起膠細胞（「ＯＬ」）、希突起膠細胞の前駆（「ＯＬＰ」）細胞、星状細胞および小グリア細胞におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現の相対レベルを示す棒グラフである。ＥｐｈＢ１発現の測定は、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」）分析を用いてなされた。ＲＴ−ＰＣＲは、蛍光に基づく分析であり、定常状態のｍＲＮＡレベルの定量化に関して当業界で十分に確立されている。このＲＴ−ＰＣＲ分析において、ＥｐｈＢ１のｍＲＮＡは逆転写され、次に、ＰＣＲを用いて増幅される。このＰＣＲは、蛍光団が各増幅ラウンド毎にそれらのクエンチャーから分離するように特別に設計された（その結果として、蛍光レベルが増幅されたＥｐｈＢ１の量に比例して増加する）、蛍光団とクエンチャーを含むプローブを用いて行われる。蛍光レベルが予め決められたしきい値に到達するのに必要な増幅サイクル数を測定する。蛍光レベルが予め決められたしきい値に到達するのに必要な増幅サイクルの数は、Ｃｔと定義される。多数の増幅反応を行い、Ｃｔ値をいくつも測定する。次に、これらのＣｔ値の平均を算出する。平均Ｃｔ値は、ｄＣｔと定義される。しきい値に到達するサイクル数が多いことは、転写の開始量が低いことを示す。逆に言えば、しきい値に到達するのに必要なサイクル数が少なければ少ないほど、転写の開始量は高くなる。従って、ｍＲＮＡ発現は、ｄＣｔに反比例する。特に他の規定がない限り、本明細書におけるチャートに示された発現レベルは、測定されたｍＲＮＡ発現レベルを、１８ＳＲＮＡまたはβ２ミクログロブリンのような１種またはそれ以上のハウスキーピング遺伝子の発現レベルに合わせて標準化することによって計算された。図１で示されるように、ＥｐｈＢ１のｍＲＮＡのレベルは、星状細胞と小グリア細胞と比べて、ラット希突起膠細胞の前駆細胞（「ＯＬＰ」）と成熟乏突起膠細胞（「ＯＬ」）で著しく高濃度化されている。
【００２３】
ＥｐｈＢ１のｍＲＮＡレベルは、ヒト中枢神経系（「ＣＮＳ」）で高濃度化されていることが見出された。図２は、全身から選択される多種多様の組織型におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現の相対レベルを示すチャートである。これらのレベルは、ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定された。図２で示されるように、ＥｐｈＢ１のｍＲＮＡは、胎児および成人の脳の組織で比較的高い発現レベルを有する。
【００２４】
成人のＣＮＳにおいて、ＥｐｈＢ１のｍＲＮＡは、ヒト成人の白質より低いレベルで発現される。図３は、成人の脳の異なる小区域におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現の相対レベルを示すチャートである。図３で示されるように、ＥｐｈＢ１のｍＲＮＡは、成人ヒトの白質では比較的低い。
【００２５】
ＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現レベルは、特定のヒトの病理学において増加することが示されている。図４で観察されるように、ＥｐｈＢ１のｍＲＮＡレベルは、ヒト肺および乳房腫瘍で増加する。これらの組織型における発現は、ＥｐｈＢ１は、罹患した組織における細胞の移動の調節に関与することを示唆している。
【００２６】
図５は、様々な重症度のＭＳの病巣におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフである。図５で示されるように、ＥｐｈＢ１のｍＲＮＡレベルは、プラーク材料の量が増加するにつれて増加しており、ＭＳの病巣の灰白質において最大であることを示唆している。同様に、図６は、正常な白質に対する、様々な重症度のＭＳの病巣におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡの発現を示す棒グラフである。図６で示されるように、ＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現レベルは、最も重度のＭＳの病巣において最大である。
【００２７】
これらの結果から、細胞表面でＥｐｈＢ１を発現するグリア前駆細胞は、ＭＳプラーク中とその周辺において、エフリンＢが介在する細胞の反発が増加する傾向があることが示され、その結果として、それらの炎症および髄鞘脱落領域に移動する能力が、著しく損なわれるか、または阻害される可能性がある。このエフリンＢが介在する細胞の反発がブロックされる場合、数が増加した希突起膠細胞の前駆細胞が、ＭＳの病巣に移動すると予想され、そこでそれらは軸索と相互作用し、分化してミエリン鞘を改質することができると予想される。
【００２８】
乏突起膠細胞のようなＥｐｈＢ１を発現する細胞のエフリンＢが介在する細胞の反発を妨害する１つの方法は、ＥｐｈＢ１受容体とエフリンＢリガンドとの相互作用、または、ＥｐｈＢ１の機能（具体的にはＥｐｈＢ１シグナル伝達経路）のいずれかを妨害することができる化合物を同定することを含む。次に、このようにして同定された化合物は、脱髄障害（例えば多発性硬化症）に罹った患者投与することができる。その他の脱髄障害としては、橋中央ミエリン溶解、白質萎縮症、急性散在性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、および、亜急性硬化性全脳炎が挙げられる。
【００２９】
本発明の一実施形態において、エフリンＢが介在する細胞の反発を妨害することができる化合物は、候補化合物の存在および非存在下で、このような反発の速度を測定することによって同定される。
【００３０】
細胞の反発の速度を測定するのに用いられる分析の１つは、ストライプ分析として知られている。Ｂｏｎｈｏｅｆｆｅｒ等，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１９８７年１２月；１０１（４）：６８５〜９６。本発明の目的において、「ストライプ分析」は、インビトロで行われる細胞の移動の分析であって、この分析において、推定の誘引物質または防虫剤が、プレート中で、１またはそれ以上の縞模様の領域（ストライプとして知られている）に塗布され、このプレート上に、細胞の培養物が置かれ、ストライプまたはストライプ群と比較して、細胞移動の速度および方向が測定される。
【００３１】
典型的なストライプ分析は、縞模様の領域（ストライプとして知られている）を１つ用い、この領域は、そのストライプと隣接して平板培養した細胞懸濁液と共に、プレートに付着した推定の反発分子を含む。次に、リアルタイムフォトイメージング技術を用いて、細胞移動の程度、速度および／または方向が測定される。ストライプが化学的忌避剤を含む場合、細胞は、そのストライプを回避するか、または、そのストライプから離れて移動するかのいずれかと予想される。ストライプ分析のその他の改変型は、推定の反発分子の一連の平行な縞模様の領域（ストライプとして知られている）を用いるものであり、これらのストライプは、既知の距離（ギャップと呼ばれる）で分離されている。この改変型では、ストライプが防虫剤を含む場合、細胞の培養物中の細胞は、ストライプを回避するか、または、そのストライプから離れてストライプ間のギャップに移動するかのいずれかと予想される。
【００３２】
ストライプ分析の一実施形態において、付着させたエフリンＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むストライプまたはストライプ群が用いられる。Ｅｐｈとエフリンが、インビボで、直接の細胞間相互作用で相互作用するとしても、ＩｇＧ  Ｆｃに対するＥｐｈまたはエフリンの細胞外ドメインとの連結により、そのそれぞれのエフリンまたはＥｐｈを活性化することができる可溶性融合タンパク質を形成することができることが示されている。（Ｋａｎｅｋｏ  ＭおよびＮｉｇｈｏｒｎ  Ａ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００３年１２月１７日；２３（３７）：１１５２３〜３８）。エフリンＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ領域に機能するように結合したエフリンＢ受容体の機能的な部分を含む。適切なエフリンＢ−Ｆｃ融合タンパク質の構築は、Ｂｅｃｋｍａｎｎ，Ｍ．Ｐ．等，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３７５７〜３７６２（１９９４）、および、Ｄａｖｉｓ，Ｓ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６，８１６〜８１９（１９９４）で説明されている。その代わりの実施形態において、ストライプまたはストライプ群は、塗布された、エフリンＢリガンドを含む細胞膜を含む。さらにその他の実施形態において、ストライプまたはストライプ群は、付着させた、それらの表面でエフリンＢリガンドを発現する細胞を含む。
【００３３】
上述の分析の改変型において、２群のストライプ分析は、ストライプまたはストライプ群と比較した、ＥｐｈＢ１を発現する細胞の細胞移動の程度、速度および方向を測定することによって行われる。分析の第一群において、移動は、候補化合物の非存在下で測定される。第二群において、候補化合物が添加され、移動は、該化合物の存在下で測定される。次に、２つの分析群の間で、移動度、速度および方向を比較する。候補化合物の非存在下よりも存在下において、測定されたストライプ上への移動度が増加する場合、または、ストライプまたはストライプ群から離れた細胞移動の程度または速度が低い場合、その候補化合物は、エフリンＢが介在する細胞の反発を妨害することができる化合物と同定される。同様に、候補化合物の非存在下よりも存在下において、測定されたストライプへの細胞の移動の程度または方向が高い場合、または、ストライプまたはストライプ群から離れた移動の程度または方向が低い場合、その候補化合物は、エフリンＢが介在する細胞の反発を妨害することができる化合物と同定される。代わりの実施形態において、細胞の移動の分析に、縞模様以外の形状でプレートに塗布された反発分子が用いられる。例えば、反発物質は、プレート上の１つの特定の地点に塗布してもよい。
【００３４】
ＥｐｈＢ１を発現する細胞のエフリンＢが介在する細胞の反発を減少させるその他のアプローチは、シグナル伝達経路を調節することによってＥｐｈＢ１の機能を妨害することである。ＥｐｈＢ１タンパク質は、シグナル伝達に関与する細胞内チロシンキナーゼドメインを含む。（Ｖｉｎｄｉｓ等，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００３年８月１８日；１６２（４）：６６１〜７１）。ＥｐｈＢ１の細胞内チロシンキナーゼドメインは、配列番号１の６１３位〜８８１位に位置する。このチロシンキナーゼドメインの機能を妨害することにより、ＥｐｈＢ１経路に沿ったシグナル伝達が予防されるため、エフリンＢが介在する細胞の反発が弱められると予想される。
【００３５】
従って、本発明のその他の実施形態において、ＥｐｈＢ１の細胞内チロシンキナーゼドメインのチロシンキナーゼ活性を妨害することができる化合物は、候補化合物の存在および非存在下で、ＥｐｈＢ１が介在するチロシンキナーゼ活性を測定することによって同定される。この実施形態において、チロシンキナーゼ分析の２つの群が行われる。第一群は、候補化合物の非存在下で行われる。第二群において、上記化合物が添加され、上記化合物の存在下で活性が測定される。次に、２つの分析群の間で、チロシンキナーゼ活性を比較する。候補化合物は、測定されたチロシンキナーゼ活性が、それらの非存在下よりも存在下において著しく低い場合、ＥｐｈＢ１の細胞内チロシンキナーゼドメインのチロシンキナーゼ活性を妨害することができる化合物と同定される。
【００３６】
チロシンキナーゼ活性を測定する方法は、当業界で十分に確立されている。例えば、チロシンキナーゼ分析キットが、ロシュ・モレキュラー・バイオシステムズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、パーキン・エルマー・ライフサイエンス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、アップステート・バイオテクノロジーズ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から商業的に利用可能である。チロシンキナーゼ分析は、ビーズまたはウェルのような表面に塗布されるリン酸化チロシンに特異的な蛍光タグおよび抗体を含む基質ペプチドを用いてもよい。基質ペプチドがリン酸化されると、基質ペプチドは抗体に結合するため、基質ペプチドとその蛍光タグは、抗体が結合した部分に局在化する。基質がリン酸化されない場合、基質とその蛍光タグは、散在したままである。チロシンキナーゼ活性のレベルは、抗体が結合した位置の蛍光レベルを決定することによって測定することができる。
【００３７】
チロシンキナーゼ活性はまた、無傷のＥｐｈＢ１を発現する細胞、または、表面にＥｐｈＢ１タンパク質を含む原形質膜の小胞で測定してもよい。これらの小胞は、無傷のＥｐｈＢ１を発現する細胞を音波破砕することによって作製してもよい。また、チロシンキナーゼ活性は、ＥｐｈＢ１を発現する細胞の細胞溶解産物を用いて、または、細胞内ドメインを含むＥｐｈＢ１の単離したフラグメントを用いて測定してもよい。また、組換えによって作製されたＥｐｈＢ１の細胞内チロシンキナーゼドメインを用いて、本発明を実施してもよい。この実施形態において、ＥｐｈＢ１のチロシンキナーゼドメインのＤＮＡ配列（配列番号２のヌクレオチド２０５１〜２８５７）は、発現ベクターにクローニングするが、例えば、ｐＭＡＬシステムのプロトコールに従って、ｐＭＡＬベクター（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）より入手可能）にクローニングし、これを次に、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞で発現させ、精製する。（ニューイングランドバイオラボ製のｐＭＡＬタンパク質融合および精製システムマニュアル（ｐＭＡＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ），ニューイングランドバイオラボより入手可能）。
【００３８】
ＥｐｈＢ１活性は、そのシグナル伝達経路上のその他の要素の活性を測定することによっても測定することもできる。ＥｐｈＢ１の下流にある既知の要素としては、Ｃｄｃ４２およびＲａｃが挙げられる。（ＭｕｒａｉおよびＰａｓｑｕａｌｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１６，２８２３〜２８３２（２００３））。Ｃｄｃ４２およびＲａｃは、ＧＴＰアーゼであり、その活性は、標識されたＧＴＰ基質から放出された標識の量を測定することによって測定してもよいし、または、Ｋｒａｙｎｏｖ，Ｖ．Ｓ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：３３３〜３３７（２０００）で説明されている蛍光共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）分析を測定することによって測定してもよい。典型的なＦＲＥＴ分析では、無傷細胞にマイクロインジェクションされた基質からのフルオロフォアの放出が測定される。この実施形態において、下流の構成要素の活性は、２つの分析群で測定される。第一群は、該候補化合物の非存在下で行われる。第二群において、該化合物が添加され、該化合物の存在下で活性が測定される。次に、２つの分析群の間で、下流の要素の活性を比較する。候補化合物は、測定されたチロシンキナーゼ活性が、それらの非存在下よりも存在下において著しく低い場合、ＥｐｈＢ１の細胞内チロシンキナーゼドメインのチロシンキナーゼ活性を妨害することができる化合物と同定される。
【００３９】
本発明のさらにその他の実施形態において、候補化合物のエフリンＢが介在する細胞の反発に対する作用は、インビボで、髄鞘脱落および再ミエリン化の動物モデルで測定されるが、このようなモデルとしては、哺乳動物のエチジウムブロマイド（「ＥｔＢｒ」）モデル、および、ラット、マウスおよびマーモセットの実験的自己免疫性脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）モデルが挙げられる。この実施形態において、上記動物において、「ＭＳ」様の症状および病態生理学が誘導される。次に、上記動物を候補化合物で処理する。上記動物におけるＭＳの進行をモニターする。典型的には、動物モデルにおけるＭＳの進行は、「臨床スコア」として知られている数値として定量化され、このスコアは、典型的には、動物におけるＭＳ症状の重症度に基づいてゼロ（健康）〜５（瀕死または死亡）のスケールの範囲である。特定のタイムポイントで、動物を殺し、ＬＵＸＯＬ  ＦＡＳＴ  ＢＬＵＥ（「ＬＦＢ」）とミエリン塩基性タンパク質（「ＭＢＰ」）染色によって再ミエリン化について評価し、再ミエリン化を確認する。候補化合物は、処理した動物が、未処理動物の臨床スコアまたは再ミエリン化を上回る著しく改善された臨床スコアまたは再ミエリン化を示す場合、エフリンＢが介在する細胞の反発を妨害することができると同定される。あるいは、化合物の有効性は、未処理動物の再ミエリン化の速度および／または程度を上回って再ミエリン化の速度および／または程度を高める可能性がある。
【００４０】
候補化合物の例としては、これらに限定されないが、コンビナトリアルケミストリー法で生成したような低分子物質、または、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類のような高分子、上記の分子のあらゆる修飾された誘導体、同様に、上記の分子の１種またはそれ以上を含むあらゆる複合体が挙げられる。候補化合物の一例は、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）に用いられる二本鎖ＲＮＡである。ＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現を阻害する方法であり、例えば、米国特許第６,５０６,５５９号で詳細に説明されている。ＲＮＡｉ法および材料は、米国特許出願公報第２００２００８６３５６号、および、２００３０１０８９２３号でさらに説明されており、さらに、ＲＮＡｉの大要は、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２；２（４）：２３９〜４５（Ａｐｒｉｌ，２００１）で示されている。
【００４１】
前述の方法によって同定された化合物は、単独で投与してもよいし、または、製薬上許容できるキャリアーまたは賦形剤と組み合わせた医薬組成物の形態で投与することができる。同定された化合物は、化合物が有効量で生物的に利用可能になるようならばどのような形態または様式で投与してもよい。同定された化合物は、経口、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、鼻腔内、直腸、眼内等に投与してもよい。経口投与が好ましい。同定された化合物の医薬組成物は、投与経路に適合させることができる。同定された化合物の医薬組成物の例としては、投与経路が経口、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）または局所の場合、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、シロップ、カシェ剤、チューインガム、坐剤、溶液または懸濁液が挙げられる。同定された化合物の好ましい経口用医薬組成物は、上記化合物を不活性希釈剤または食用キャリアーと共に含む。医薬製剤製造の当業者であれば、化合物の具体的な特徴、治療しようとする病気、病気の段階、その他の患者の反応およびその他の関連する環境を決定することによって、同定された化合物に適した形態を容易に決定することができる。
【００４２】
脳に同定された化合物を投与することが望ましい場合がある。脳に同定された化合物を投与する方法の例としては、これらに限定されないが、外科手術中の局所的な注入、注射、カテーテルの使用、坐剤の使用、または、インプラントの使用が挙げられる。インプラントは、多孔質、非多孔質またはゲル状の材料を含んでいてもよく、このような材料としては、メンブレン、例えばシラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）メンブレンまたはファイバーが挙げられる。薬物を中枢神経系に誘導することが望ましい場合、血液脳関門を、薬物をそこを通過させて送達するのに十分な時間、適宜開くことができる技術を用いることができる。例えば、５％マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｓｅ）と水との組成物を用いることができる。
【００４３】
本発明の医薬組成物は、病気が盛んに発症している間と寛解期の両方に、単独で、または、１種またはそれ以上の抗炎症薬と共にのいずれかで定期的に投与されるべきであろうと予想される。本発明の医薬組成物は、適切に投与された場合、ＥｐｈＢ１を発現する細胞（例えば希突起膠細胞の前駆細胞）を、細胞の反発作用物質（例えばエフリンＢリガンド）を発現する罹患した部位に移動させることが可能になると予想される。さらに、本発明の材料および方法を用いて、細胞の反発を弱めることによって回復が可能なその他の病理（例えば、髄鞘脱落に関連する病理）を治療することができると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ラット希突起膠細胞の前駆細胞（ＯＬＰ）、成熟乏突起膠細胞（ＯＬ）、星状細胞および小グリア細胞におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現の相対レベルを示す棒グラフである。
【図２】全身から選択される多種多様なヒトの組織型におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現の相対レベルを示すチャートである。
【図３】成人の脳の異なる小区域におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現の相対レベルを示すチャートである。
【図４】ヒトの病理学的な組織におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現の相対レベルを示すチャートである。
【図５】正常な脳およびＭＳの脳由来のヒト白質におけるＥｐｈＢ１のｍＲＮＡ発現の相対レベルを示す棒グラフである。
【図６】様々な重症度のＭＳの病巣を含む様々な組織型におけるＥｐｈＢ１発現の相対レベルを示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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