(57)【要約】  Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメント、およびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含むキメラタンパク質、およびその用途、特に悪性腫瘍の治療におけるその用途が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメント、およびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含むキメラタンパク質。
【請求項２】
殺腫瘍物質がアポトーシスを誘導する、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントが造血性の幹細胞または前駆細胞の増殖を刺激する、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントが骨髄前駆細胞、単球細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞、およびＮＫ細胞からなる群から選択される細胞の増殖を刺激する、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントが哺乳動物Ｆｌｔ３リガンドである、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
哺乳動物Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントがヒトＦｌｔ３リガンドである、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントが可溶性Ｆｌｔ３リガンドである、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
Ｆｌｔ３リガンドが少なくとも１００個のアミノ酸残基を含み、Ｆｌｔ３リガンドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を有し、ここで、同一性のパーセンテージはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と同サイズのアミノ酸配列に関して測定され、Ｆｌｔ３リガンドがその生物学的活性を実質的に保持している、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
Ｆｌｔ３リガンドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に結合し、Ｆｌｔ３リガンドがその生物学的活性を実質的に保持している、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
Ｆｌｔ３リガンドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
Ｆｌｔ３リガンドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２８から１２８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
Ｆｌｔ３リガンドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２８から１２８を含む、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
Ｆｌｔ３リガンドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基２８-１６０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基２８-１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
殺腫瘍物質が抗体である、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
抗体が、無傷の抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディー、１本鎖抗体、および抗体フラグメントから生成される多特異性抗体からなる群から選択される、請求項１４記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
抗体が、抗ｐ２３０抗体、抗ＣＤ２９抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗Ｈｅｒ３抗体、抗Ｈｅｒ４抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、または生物学的に活性なそのフラグメントからなる群から選択される、請求項１４記載のキメラタンパク質。
【請求項１７】
抗体がヒトまたはヒト化抗体である、請求項１４記載のキメラタンパク質。
【請求項１８】
殺腫瘍物質が、Ｆａｓリガンド、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、または生物学的に活性なその細胞外ドメインからなる群から選択される、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項１９】
Ｆｌｔ３リガンドがキメラタンパク質のＮ末端に位置する、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項２０】
Ｆｌｔ３リガンドがキメラタンパク質のＣ末端に位置する、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項２１】
Ｆｌｔ３リガンドおよび殺腫瘍物質が連結ペプチドで分離されている、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項２２】
連結ペプチドが（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3である、請求項２１記載のキメラタンパク質。
【請求項２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項２４】
請求項１記載のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項２５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項２４記載の核酸。
【請求項２６】
請求項２４記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項２７】
請求項１記載のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２８】
Ｆｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質をコードする核酸に機能的に結合した発現調節配列を更に含む、請求項２７記載のベクター。
【請求項２９】
請求項２４記載の核酸を含む組換え細胞。
【請求項３０】
真核細胞である、請求項２９記載の組換え細胞。
【請求項３１】
ＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＮＳＯ細胞である、請求項３０記載の組換え細胞。
【請求項３２】
キメラタンパク質の生成法であって、請求項２４記載の核酸を含有する組換え細胞を増殖させてコードされるキメラタンパク質を細胞によって発現させ、発現したキメラタンパク質を回収することを含む上記方法。
【請求項３３】
回収されたキメラタンパク質を単離および／または精製することを更に含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
請求項３２記載の方法の生成物。
【請求項３５】
Ｆｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質および医薬的に許容されるキャリアーまたは賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３６】
Ｆｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質、および該キメラタンパク質の投与法の説明書を含むキット。
【請求項３７】
哺乳動物において新生物を治療する方法であって、同治療が必要または所望される哺乳動物にＦｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質を投与することを含む上記方法。
【請求項３８】
哺乳動物がヒトである、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
新生物が黒色腫、乳癌、または肝細胞癌である、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
ａ）Ｆｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質；および
ｂ）有効量の抗新生物物質
を含む複合剤。
【請求項４１】
抗新生物剤が黒色腫、乳癌、または肝細胞癌を治療する物質である、請求項４０記載の複合剤。
【請求項４２】
哺乳動物において新生物を治療する方法であって、同治療が必要または所望される哺乳動物に有効量の請求項４０記載の複合剤を投与することを含む上記方法。
【請求項４３】
細胞においてカスペース３介在型アポトーシスを誘導する方法であって、同誘導が必要または所望される細胞にＦｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質を投与することを含む上記方法。
【請求項４４】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
細胞が哺乳動物新生物細胞である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
細胞が哺乳動物中に含まれる、請求項４３記載の方法。
【請求項４７】
Ｆｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質および免疫応答増強剤を含むワクチン。
【請求項４８】
哺乳動物において抗新生物免疫応答を誘発する方法であって、同誘発が必要または所望される哺乳動物に有効量の請求項４７記載のワクチンを投与することを含む上記方法。
【請求項４９】
腫瘍特異的リンパ球を製造する方法であって、哺乳動物にＦｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質を投与して腫瘍特異的リンパ球を生成させ、該生成させた腫瘍特異的リンパ球を該哺乳動物から回収することを含む上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願の参照
本明細書は中国特許出願第03129290.9号（2003年6月13日出願）および2003101199300号（2003年11月25日出願）；米国特許出願第10/723,003号（2003年11月26日出願）；および台湾特許出願第092133577号（2003年11月28日出願）（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張するものである。
【０００２】
連邦政府のスポンサーによる研究または開発に関する記載
不適用。
【０００３】
発明の背景
発明の属する分野
本発明は腫瘍免疫学の分野、主に抗腫瘍二元機能(bifunctional)融合タンパク質およびその核酸配列、それらの製造方法および抗腫瘍薬の調製における適用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の記載
腫瘍の免疫療法は、宿主が本来保有する防御機構の調節または免疫物質での処置による腫瘍退縮の誘導を伴う。免疫療法は、外科切除、放射線療法、および化学療法といった伝統的な療法と共に、悪性病変の治療のための認知された療法である。事実、免疫療法は手術および放射線のようなより一般的な療法の“補足療法”として使用される場合がある。そのような併用療法が強く望まれるのは伝統的な療法の短所のためである。例えば中国では、肝臓癌、乳癌、およびリンパ腫は最も一般的に見られる癌である。しかしながら、肝癌患者の３分の２は診断時に手術不可能な量の腫瘍を有する。更に重要なことに、外科切除による療法がそれらの患者に可能な場合でも、遠隔した検出されない微小転移の問題はそれらの療法では処理されないまま残存する。同様に、伝統的療法である放射線療法および化学療法には著しい制限があり、最も顕著なものは造血系および免疫系の全身性阻害である。このため、放射線療法が最も所望される場合（診断時に顕著な量の腫瘍を有する患者）において、放射線療法および化学療法の毒性効果によってこれらの療法の有効性は制限される。従って、伝統的な療法を補足する新規の有効な方法を発見することが所望される。
【０００５】
腫瘍の免疫療法は、腫瘍抗原に特異的な抗体の投与によって行うことができる。一般に抗体は毒性部分への運搬剤として使用されてきたが、最近の研究で、ある種の細胞表面分子（例えばＦＡＳ、ＥＧＦＲ、およびＨＥＲ２）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）がアポトーシス経路の誘発によって腫瘍細胞死を直接誘導することが明かとなった。例えばShimizuら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 228 (2 : 375-79 (1996)参照。これは、特定のシグナリング経路（特に腫瘍細胞死を起こすもの)の調節によって抗体介在型の腫瘍免疫療法のための有効な手段が得られうることを示唆している。この手段を利用した少なくとも１つの抗体について、臨床試験が成功している。ハーセプチン（Herceptin）はヒトＨＥＲ２に特異的な抗体であり、Ｈｅｒ２+腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し、インビボでの乳癌治療への使用が成功している。例えばBursteinら, J. Clin. Oncol. 21: 2889-95 (2003)参照。しかしながら、それらの抗体療法で認識されている制限の一つは、遠隔転移がそれらの療法から逃れるか、または抗原陰性変異体が発生し、それによって後に転移疾患が再発する可能性があることである。
【０００６】
免疫療法は、腫瘍ワクチン投与後に患者から活性抗腫瘍免疫応答を引き出すことによって行うこともできる。理想的には、腫瘍ワクチンは免疫原性の腫瘍抗原を好適な抗原提示細胞に運搬し、それによって有効な長期間にわたる抗腫瘍免疫応答を生じさせる。研究で明らかになっているところによれば、樹状細胞（ＤＣ）（抗原提示細胞の一種）は有効な抗腫瘍免疫応答において重要な役割を果たす。例えばZitvogelら, J Exp. Med. 183: 87-97 (1996)；Choudhuryら, Blood 89: 1133-42 (1997)；および DiNicolaら, Cytokines Cell Mol. Therapy 4: 265-73 (1998)参照。ＤＣはナイーブのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が分化してそれぞれＴヘルパー細胞（Ｔｈ）および細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）になるのを刺激する。ＤＣは高レベルの主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原のクラスＩおよびクラスII、共刺激分子、接着分子を発現し、高レベルのＩＬ-１２（ＣＴＬの分化および活性化における有効なサイトカイン）を分泌する。例えばBanchereauら, Nature 392: 245-52 (1998)；Banchereauら, Ann. Rev. Immunol. 18: 767-811 (2000)参照。ＣＴＬが介在する抗腫瘍応答は腫瘍の再生に対して長期的な防御作用を生ずると考えられているので、ＤＣは腫瘍免疫療法のために選択すべき抗原提示細胞であると考えられる。
【０００７】
腫瘍ワクチンによって明らかに腫瘍の転移増殖およびその後の腫瘍攻撃に対する長期的な防御作用が得られるが、この知見の臨床的な適用は困難であることが明らかになっている。例えばFongら, Ann. Rev. Immunol. 18: 245-73 (2000)参照。第一に、エクスビボの増殖プロトコールでは機能性ＤＣの信頼度の高い増殖を行うことが困難であることが証明されている。免疫は必然的にＭＨＣ制限的であるため、免疫療法で使用されるエクスビボのＤＣは治療される患者のＤＣでなければならない。第二に、インビボにおけるＤＣの再現性のある活性化にはまだ成功していない。第三に、所望のＤＣ集団の活性化および抗原負荷が可能な、すなわち抗腫瘍応答を誘引する能力のある、明らかなプロトコールが未だ確立されていない。要するに、免疫原性の腫瘍抗原を提示する腫瘍部位に選択的に局在化された活性ＤＣの増殖が、未解決の問題である。
【０００８】
従って、免疫分子、例えば腫瘍特異的抗体および免疫応答を誘発するワクチンは腫瘍増殖に有効であることは明らかであるが、腫瘍増殖の同時低下および長期的防御免疫応答の生成を可能とする統一された方法は未だ得られていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の簡単な概要
腫瘍細胞の同時根絶および有効な抗腫瘍免疫応答の刺激を可能とするキメラタンパク質を本明細書で提供する。特に、キメラタンパク質は少なくとも２つの成分を含む。第一の成分はＦｌｔ３リガンド（ＦＬ）、または生物学的に活性なそのフラグメントである。ＦＬは有効な走化性分子であり、ＤＣおよび他の抗腫瘍エフェクター（例えばＮＫ細胞）の活性化物質である。第二の成分は細胞死を誘引する殺腫瘍物質(tumoricidal agent)である。それらの物質は、直接（すなわちアポトーシスカスケードを直接開始させることによって）アポトーシスを誘導するリガンドもしくは腫瘍特異的抗体（例えばＦａｓリガンド）、または間接的に（すなわちサイトカインの欠乏が関連するアポトーシスによって）アポトーシスに介在する腫瘍特異的抗体（例えば抗ＥＧＦＲ抗体）であってもよい。従って、キメラタンパク質は腫瘍細胞のアポトーシスを直接誘導すると同時に、ＤＣおよび他の抗腫瘍エフェクター（例えばＮＫ細胞）を標的化および活性化して腫瘍組織に浸潤させることによって腫瘍の量を減少させる。次いで、死滅する腫瘍細胞によって放出される腫瘍抗原を処理し、ＦＬ活性化ＤＣによって提示させ、特定の抗腫瘍免疫応答の抗原提示細胞として有効に使用することもできる。従って、このキメラタンパク質は直接的および間接的な腫瘍細胞の除去を同時に行うと共に、腫瘍細胞に対する有効な活性免疫応答を誘引し、これによって腫瘍増殖の再発が防止される。
【００１０】
ある観点では本発明は、Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含むキメラタンパク質に関する。
【００１１】
別の態様では、本発明はＦｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含むキメラタンパク質をコードする単離された核酸に関する。核酸を含む組換え細胞および核酸を使用するキメラタンパク質の製造法も提供する。
【００１２】
更に別の観点では、本発明はＦｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質および医薬的に許容されるキャリアーまたは賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００１３】
本発明のある態様では、キメラタンパク質のアミノ酸配列およびキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列は図16-18、20-22、27-29、35-37、および39-42に示す配列を含む。ヌクレオチド配列を含むプラスミドは受託番号    で寄託されている。
【００１４】
更なる観点では、本発明は、ａ）Ｆｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質；およびｂ）有効量の抗新生物物質、を含有する複合剤に関する。
【００１５】
更に別の観点では、本発明は哺乳動物における新生物の治療法に関し、方法は同治療が必要または所望される哺乳動物に有効量の上記複合剤を投与することを含む。
【００１６】
別の観点では、本発明はＦｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質および該キメラタンパク質を投与するための説明書を含むキットに関する。
【００１７】
ある観点では、本発明は哺乳動物における新生物の治療法に関し、方法は同治療が必要または所望される哺乳動物にＦｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質を投与することを含む。
【００１８】
別の観点では、本発明は細胞においてカスペース３介在型アポトーシスを誘導するための方法に関し、方法は同誘導が必要または所望される細胞にＦｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質を投与することを含む。
【００１９】
更に別の観点では、本発明はＦｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質および免疫応答増強剤を含むワクチンに関する。
【００２０】
別の観点では、本発明は哺乳動物における抗新生物免疫応答を誘引する方法に関し、方法は同誘引が必要または所望される哺乳動物に有効量の本明細書に開示するワクチンを投与することを含む。
【００２１】
更に別の観点では、本発明は腫瘍特異的リンパ球の製造法に関し、この方法は、Ｆｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質を哺乳動物に投与して腫瘍特異的リンパ球を生成させ、該哺乳動物から該生成させた腫瘍特異的リンパ球を回収することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
限定する目的ではなく開示内容を明確にするために、本発明の詳細な説明を以下の項に分割して記載する。
【００２３】
Ａ．定義
特に記載しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する分野の技術者によって一般に理解されるのと同様の意味を有する。本明細書で引用される全ての特許、出願書、公開された出願書、および他の文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この項に記載される定義が参照によって本明細書に組み込まれる特許、出願書、公開された出願書、および他の文献に記載される定義と反対であるか矛盾する場合、この項に記載される定義が参照により本明細書に組み込まれる定義に優先する。
【００２４】
本明細書で使用する“ａ”または“ａｎ”は“少なくとも１つの”または“１つ以上の”を意味する。
【００２５】
本明細書で使用する“核酸”は、いずれかの形態（特に１本鎖、２本鎖、３本鎖、直鎖、および環状型）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）をいう。また、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸のキメラ、およびその類似体も含む。本明細書に記載される核酸は周知のデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドから構成されてもよく、それらはアデノシン、シトシン、グアニン、チミジン、およびウリジンから構成されるか、またはそれらの塩基の類似体もしくは誘導体から構成されてもよい。更に、慣例的でないホスホジエステル骨格を有する種々の他のオリゴヌクレオチド誘導体も含まれ、それらには例えばホスホトリエステル、ポリヌクレオペプチド（ＰＮＡ）、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ポリヌクレオチドプライマー、ロックト核酸（ＬＮＡ）などがある。
【００２６】
本明細書で使用する“組成物”とは２つ以上の産物または化合物の混合物をいう。これは溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらを組み合わせたものでもよい。
【００２７】
本明細書で使用する“組み合わせ”とは、２つ以上のものを合わせることをいう。
【００２８】
Ｂ．Ｆｌｔ３リガンドおよび殺腫瘍物質を含むキメラタンパク質およびそれをコードする核酸
ある観点では本発明は、Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含むキメラタンパク質に関する。好ましくはキメラタンパク質は単離されたタンパク質である。すなわち他のタンパク質、ポリペプチド、または他の分子を含有しない。ある態様では、キメラタンパク質は組換え宿主細胞培養液の精製産物または精製された抽出物である。
【００２９】
任意の好適なＦｌｔ３リガンドを本明細書に記載する組成物および方法に含んでもよい。本明細書で使用する“Ｆｌｔ３リガンド”という用語は、前駆細胞中に見いだされる、Ｆｌｔ３受容体に結合し、それを介するシグナリングを誘導するポリペプチドの種類をいう。Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントは、その活性を実質的に変更しない保存的なアミノ酸置換を含んでもよい。好適なアミノ酸の保存的置換は当業者に周知であり、一般に、得られる分子の生物学的活性を変更することなく施与することができる。当業者に認識されるように、一般にポリペプチドの非本質的な領域における１個のアミノ酸置換は生物学的活性を実質的に変更しない。例えばWatsonら, MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 第４版, 1987, The Benjamin/Cummirigs Pub. Co. , p. 224参照。それらの代表的な置換は好ましくは以下の表１に記載されるものに従って施与される。
【００３０】
【表１】
2007515946.tif 000002
他の置換も可能であり、経験的に、または既知の保存的置換に従って決定することができる。
【００３１】
Ｆｌｔ３リガンドは可溶性ホモダイマータンパク質として放出されうるＩ型膜貫通タンパク質である。例えばLymanら, Flt3 ligand in THE CYTOKINE HANDBOOK (Thomsonら編, 第４版(2003))参照。ある態様では、Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントは可溶性Ｆｌｔ３リガンドである。本明細書に記載する組成物および方法のある態様では、Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントは、哺乳動物Ｆｌｔ３リガンド、より好ましくはヒトＦｌｔ３リガンドである。ヒトＦｌｔ３リガンドはマウスタンパク質とアミノ酸レベルで７２％の同一性を有し、マウスタンパク質の多くの特徴（グリコシル化部位、重要なシステイン残基、およびスプライス部位を含む）を保存している。好適なＦｌｔ３リガンドタンパク質にはLymanら, Cell 75: 1157-67 (1993)；Hannumら, Nature, 368 : 364-67 (1996)；米国特許第5,843,423号；米国特許出願第200030113341号および20030148516号に開示されるもの、およびGenebank登録番号NM 001459、U2 9874、U03858、およびU04806がある。
【００３２】
Ｆｌｔ３リガンド受容体、Ｆｌｔ３はクラスIII受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫIII）受容体ファミリーのメンバーである。正常細胞では、Ｆｌｔ３は未成熟造血細胞、一般にＣＤ３４＋細胞、胎盤、生殖腺、および脳で発現する。例えばRosnetら, Blood 82: 1110-19 (1993)；Smallら, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 459-63 (1994)；およびRosnetら, Leukemia 10: 238-48 (1996)参照。Ｆｌｔ３は、急性骨髄性白血病、Ｂ前駆細胞急性リンパ芽球性白血病、骨髄異形成白血病、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、および慢性骨髄性白血病を含む血液腫瘍でも高度に発現される。Ｆｌｔ３リガンドによるその受容体の刺激により、ＳＴＡＴ５、ホスホチジルイノシトール３’-キナーゼ、ＰＬＣｙ、ＭＡＰＫ、ＳＨＣ、ＳＨＰ２、およびＳＨＩＰを含むシグナル変換経路が活性化される。例えばGilliandら, Curr. Opin. Hemato. 9: 274-81 (2002)参照。膜結合型および可溶性ＦＬはいずれもＦｌｔ３受容体に結合し、これを活性化する。
【００３３】
ある態様では、Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントは造血性の幹細胞または前駆細胞の増殖を刺激する。特定の態様では、Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントは骨髄前駆細胞、単核細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）からなる群から選択される細胞の増殖を刺激する。Ｆｌｔ３リガンドは骨髄環境における造血細胞および他の細胞（線維芽細胞、並びにＢ、Ｔ、および骨髄細胞前駆体を含む）で主に発現される。Ｆｌｔ３リガンドはＣＤ３４＋前駆細胞の増殖因子であり、樹状細胞およびＮＫ細胞の増殖および分化の両方を刺激する。例えばある研究では、Ｆｌｔ３はＮＫ細胞の活性化を通して、有意な抗癌活性に介在することが示唆されている。Peronら, J. Immunol. 161: 6164-70 (1998)。
【００３４】
Ｆｌｔ３リガンドはＤＣの成熟も促進し、これによってＤＣは腫瘍抗原の抗原提示細胞としてより有効となる。例えばFongら, Gene Ther. 9 (17) : 1127-38 (2002)参照。更に重要なことに、成熟ＤＣはＦｌｔ３リガンドによって誘導されると骨髄から末梢組織に放出され、それによって免疫応答を刺激できる抗原提示細胞の数が増加する。しかしながら、Ｆｌｔ３リガンドによる増殖の効率的な誘導には、一般に他の造血増殖因子およびインターロイキンの存在が必要とされる。
【００３５】
ＦＬのいずれの生物学的フラグメントも本発明の組成物および方法に使用することができる。本明細書で使用する“生物学的に活性な”という用語は、Ｆｌｔ３の刺激物質としてのその機能を実質的に保持しているＦＬの誘導体またはフラグメントをいう。一般に、Ｆｌｔ３リガンドは細胞上のＦｌｔ３に結合し、１つ以上のシグナル変換経路を刺激し、細胞応答、例えば増殖を引き起こす。通常、誘導体またはフラグメントはそのＦｌｔ３刺激活性の少なくとも５０％を保持する。好ましくは、誘導体またはフラグメントはそのＦｌｔ３刺激活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、および１００％を保持する。Ｆｌｔ３刺激活性は好適な方法で測定することができ、それらには、限定されるわけではないがシグナリング分子（例えばＳＴＡＴ５、ＰＬＣγ）の活性化の測定、またはＦｌｔ３依存型細胞系におけるインビトロでの増殖活性の評価がある。例えば、ＢＡＦ／ＢＯ３細胞系はＦｌｔ３受容体を有さず、ＩＬ-３に依存的である。しかしながら、ＢＡＦＢＯ３細胞系にＦｌｔ３をトランスフェクトすると、Ｆｌｔ３リガンド誘導型増殖に応答するようになる。Hatakeyamaら, Cell 59: 837-45 (1989)参照。
【００３６】
ある態様では、キメラタンパク質中のＦｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する。ある態様では、Ｆｌｔ３リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に結合し、Ｆｌｔ３リガンドは実質的にその生物学的活性を保持する。いずれのＦｌｔ３リガンド特異的抗体を使用してもよい。別の態様では、Ｆｌｔ３リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２８から１２８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。更に別の態様では、Ｆｌｔ３リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基２８-１６０、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基２８-１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、Ｆｌｔ３リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２８から１２８を含む。別の態様では、Ｆｌｔ３リガンドは少なくとも１００個のアミノ酸残基を含み、Ｆｌｔ３リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を有し（同一性のパーセンテージはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列と同一サイズのアミノ酸配列について測定する）、そしてＦｌｔ３リガンドはその生物学的活性を実質的に保持する。
【００３７】
任意の殺腫瘍物質または生物学的に活性なそのフラグメントを本明細書に記載する方法および組成物に使用することができる。本明細書で使用する“殺腫瘍物質”という用語は腫瘍細胞の細胞死を引き起こす物質をいう。殺腫瘍物質は好ましくはタンパク質性またはペプチド性の物質である。細胞死はアポトーシス性、壊死性などである。ある態様では、細胞死はアポトーシスから起こる。アポトーシスはアポトーシスシグナリング経路を誘導するリガンド（例えばＦａｓリガンド）を通して直接的に、または例えば増殖因子の喪失によって間接的に誘導できる。本明細書で使用する“アポトーシス”という用語は、最終的にクロマチンの濃縮およびＤＮＡのフラグメンテーションを起こす、腫瘍細胞のプログラムされた細胞死をいう。好適な方法を使用してアポトーシスを評価することができ、それらには、限定されるわけではないが、フローサイトメトリー分析、例えばＴＵＮＥＬ分析、アガロースゲル分析、およびカスペース３活性化がある。別の態様では、キメラタンパク質の殺腫瘍物質は天然に存在する抗腫瘍物質である。それらの物質には、腫瘍細胞において活動停止状態（stasis）または細胞死を誘発する受容体のリガンドが含まれる。アポトーシスを誘導する天然に存在する分子（例えばリガンド）の代表的なものには、ＴＮＦ-α、Ｆａｓ（ＣＤ９５）リガンド、ＴＲＡＩＬ、リンホトキシン（ＬＴ）、ＴＷＥＡＫ、およびＴＮＦリガンド・スーパーファミリーの他のメンバーがある。ある態様では、殺腫瘍物質はＦａｓリガンド、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、または生物学的に活性なそれらの細胞外ドメインからなる群から選択される。別の態様では、殺腫瘍物質の生物学的に活性なフラグメントはそのアポトーシス活性の少なくとも５０％を保持する。好ましくは誘導体またはフラグメントはそのアポトーシス活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、および１００％を保持する。
【００３８】
別の態様では、キメラタンパク質の殺腫瘍物質は腫瘍の増殖を阻害し、場合によってはアポトーシスを誘導する抗体である。それらの抗体の代表的な標的には増殖因子受容体がある。例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）サブファミリーはＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４から成り、それらは全てチロシンキナーゼ活性を有する膜貫通タンパク質である。これらのタンパク質は多くの悪性腫瘍（前立腺癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、および肺癌を含む）で高レベルに発現される。特定の抗ＥＧＦＲまたは抗ＨＥＲ２  ｍＡｂはＥＧＦＲまたはＨＥＲ２がそのリガンドに結合するのを阻害し、それに伴って腫瘍の増殖シグナリング経路を阻害して腫瘍の増殖を阻止し、腫瘍細胞のアポトーシスを直接的または間接的に誘導する。例えばClin. Cancer Res. 8: 1720-30 (2002)；Brodowiczら, Br. J. Cancer 85: 1764- 70 (2001)；Crombet-Ramosら, Int. J Cancer 101: 567-75 (2002)；Herbstら, Expert Opin. Biol. Ther. 1: 719-32 (2001)参照。
【００３９】
更に別の態様では、キメラタンパク質の殺腫瘍物質はアポトーシスを誘導する、腫瘍特異的または腫瘍関連抗原に結合する抗体である。例えばｐ２３０はヒト肝臓癌、乳癌、および黒色腫細胞で特異的に発現するタンパク質である。その名称の由来は、ｍＡｂ  ＳＭ５-１を使用するウェスタンブロットで現れる明白な特有の２３０ＫＤのバンドである。例えば米国特許出願第09/915,746号参照。Ｐ２３０は非常に特異的であるため、腫瘍の免疫療法において標的遺伝子として使用できる。アポトーシスはＰ２３０とそのリガンドまたは抗体との結合によって誘導される。抗ＳＭ５-１抗体の一部を実施例３に記載する。特定の態様では、抗体は共出願中の特許出願（Attorney Docket No. 54906-2000100 ;標題: ANTIBODIES SPECIFIC FOR CANCER ASSOCIATED ANTIGEN SM5-1 AND USES THEREOF）（2003年11月26日出願；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるＳＭ５-１抗体である。本明細書に記載するヒト化抗ＳＭ５-１抗体は、共出願特許中のＲｅＳＭ５-１をさす。
【００４０】
ある態様では、殺腫瘍物質は抗体または生物学的に活性なそのフラグメントである。本明細書で使用する“抗体”という用語は、無傷の抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディー、１本鎖抗体、および抗体フラグメントから生成される多特異性抗体を指し、ここで分子はその所望される生物学的活性の全てを実質的に保持する。本発明の方法および組成物に有用な抗体は細胞培養液、ファージ、または種々の動物内で生成でき、それらの動物には、限定されるわけではないが以下がある：ウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、類人猿。従って本発明の方法に有用な抗体は哺乳動物抗体である。
【００４１】
ファージ技術を使用して最初の抗体の単離、または特異性もしくは結合活性を変化させた変異体の生成を行うことができる。それらの技術は当該分野で慣例的かつ周知である。ある態様では、抗体を当該分野で知られる組換え法によって生成する。例えば、抗体をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトして組換え抗体を生成することができる。１つ以上のベクターを使用して、宿主細胞において少なくとも１つのＶLおよび１つのＶH領域を発現するＤＮＡ配列をトランスフェクトすることができる。抗体の創製および生成のための組換え法に関する代表的な記述はDelves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997)；Shephardら, MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000)；およびGoding, MONOCLONAL ANTIBODIES : PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993)に見られる。
【００４２】
本発明の方法に有用な抗体を組換え法によって修飾し、所望の機能への介在における抗体の有効性を増加することができる。組換え法を使用して、置換によって抗体を修飾することも企図される。一般に、置換は保存的な置換である。例えば抗体の不変領域の少なくとも１つのアミノ酸を異なる残基で置換することができる。例えば米国特許第5,624,821号、米国特許第6,194,551号、国際特許出願WO 9958572号；およびAngalら, Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993)参照。アミノ酸の修飾にはアミノ酸の欠失、付加、置換がある。場合によっては、所望しない活性（例えば補体依存性細胞障害）を低下させるためにそれらの変更を行う。
【００４３】
抗体はヒト化抗体であってもよい。ここで使用する“ヒト化抗体”という用語は、非抗原結合領域におけるアミノ酸配列を変化させて、元の抗原特異性は保持しつつ、ヒト抗体により近似させた抗体をいう。一般に可変領域は１つの種（例えばマウス）、不変領域はヒトに由来する。抗体はキメラ抗体であってもよい。本明細書で使用する“キメラ抗体”という用語は、アミノ酸配列を変化させて、元の抗原特異性は保持しつつ、１つより多い哺乳動物由来の配列を含有させた抗体をいう。本明細書で使用する“１本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）”という用語は、フレキシブルなペプチドリンカーで連結された免疫グロブリンの可変重鎖（ＶH）および軽鎖（ＶL）から成る遺伝子組換え抗体を言う。
【００４４】
好ましくは、本発明の方法および組成物の抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で使用する“モノクローナル抗体”という用語は単一のＢ細胞によって生成される単一の抗体をいう。
【００４５】
抗体はヒト抗体であってもよい。本明細書で使用する“ヒト抗体”という用語は、軽鎖および重鎖配列の本質的に全ての配列（相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む）がヒト遺伝子由来である抗体をいう。ある態様では、ヒトモノクローナル抗体の調製はトリオーマ法、ヒトＢ細胞法（例えばKozborら, Immunol. Today 4; 72 (1983)参照）、ＥＢＶ形質転換法（例えばColeら, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77-96 (1985)参照）、またはファージディスプレー法（例えばMarksら, J. Mol. Biol. 222: 581 (1991)参照）を使用して行う。特定の態様では、ヒト抗体をトランスジェニックマウスにおいて産生させる。そのような部分的または完全長のヒト抗体の生成法は当該分野で周知であり、それらの方法を使用することができる。ある特定の好ましい態様では、ヒト重鎖および軽鎖抗体遺伝子を発現するように操作したトランスジェニックマウスで完全長のヒト抗体配列を生成させる。ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスの調製に関する代表的な記述は国際特許出願WO 02/43478号に見られる。次いで、所望の抗体を産生するトランスジェニックマウス由来のＢ細胞を融合させ、抗体の連続的産生のためのハイブリドーマ細胞系を生成することができる。例えば米国特許第5,569,825号；5,625,126号；5,633,425号；5,661,016号；および；5,545, 806号；並びにJakobovits, Adv. DrugDel. Rev. 31: 33- 42 (1998)；Greenら, J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998)参照。
【００４６】
ある態様では、本明細書に記載する抗体は標的とされた腫瘍細胞の増殖を阻害する。抗体が細胞の増殖を抗体の非存在下または非結合性抗体の存在下における細胞の増殖に比較して阻害している場合、同抗体は増殖阻害性である。増殖は任意の好適な方法を使用して定量してもよい。一般に、増殖の測定はインビトロにおけるＤＮＡへの放射性標識ヌクレオチドの取り込みの評価によって行う（例えば3Ｈ-チミジン）。ある態様では、増殖はＡＴＰ発光、例えばCellTiter-GIo（商標） Luminescent Cell Viability Assay (Promega)によって測定する。従って抗体は細胞の生存能力または細胞増殖を調節する分子に特異的であるか、またはそれを標的とするものであってもよい。
【００４７】
ある態様では、抗体は抗ｐ２３０抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗Ｈｅｒ３抗体、抗Ｈｅｒ４抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、または生物学的に活性なそれらのフラグメントからなる群から選択される。これらの抗体の代表的な態様には下記の実施例の項並びに米国特許第5,677,171号； 6,399,061号；6,458,356号；6,455,043号；および5,705,157号に開示されるものがある。
【００４８】
Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントおよび殺腫瘍物質を含有するキメラタンパク質は任意の好適な結合で連結させてもよい。例えばＦｌｔ３リガンドおよび殺腫瘍物質はペプチド性リンカー、開裂可能なリンカーなどで結合してもよい。特定の態様では、結合ペプチドは（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3である。
【００４９】
本明細書に記載する組成物および方法のキメラタンパク質は、任意の順で結合したＦｌｔ３リガンドおよび殺腫瘍物質を含むことができる。ある態様では、Ｆｌｔ３リガンドはキメラタンパク質のＮ末端に位置する。別の態様では、Ｆｌｔ３リガンドはキメラタンパク質のＣ末端に位置する。
【００５０】
キメラタンパク質は、ペプチド性タグを含むペプチド性フラグメントをそのＣ末端に更に含んでもよい。任意の好適なタグを使用してもよい。例えばタグはFLAG、HA、HA1、c-Myc、6-His、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE、およびTy1タグであってもよい（表２参照）。それらのタグはキメラタンパク質の精製プロトコールに有用である。
【００５１】
【表２】
2007515946.tif 000003
【００５２】
ある態様では、キメラタンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６で表されるアミノ酸配列を含む。
【００５３】
別の態様では本発明はキメラタンパク質をコードする単離された核酸またはその相補鎖に関し、同キメラタンパク質はＦｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む。ある態様では、キメラタンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５で表されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸にコードされる。キメラタンパク質をコードする単離された核酸を含むベクターも企図される。ベクターはＦｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質をコードする核酸に機能的に結合する発現調節配列を更に含んでもよい。
【００５４】
Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントをコードする好適なＤＮＡコンストラクトを本発明に使用することができる。それらのコンストラクトには、限定されるわけではないがGenbank登録番号U03858およびＡＴＣＣ登録番号ATCC 69382の核酸配列がある。米国特許第5,843,423号；および米国特許出願第200030113341号および第20030148516号に記載されるＤＮＡ配列およびそれから得られるタンパク質も本発明における使用が企図される。
【００５５】
殺腫瘍物質または生物学的に活性なそのフラグメントをコードする好適なＤＮＡコンストラクトを本明細書の組成物および方法に使用することができる。代表的な配列には下記の実施例の項に開示するものがある。
【００５６】
任意の好適なベクターを使用することができる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主と共に使用するための代表的なクローニングおよび発現ベクターは例えばPouwelsら, CLONING VECTORS: A LABORATORY MANUAL (Elsevier最新版)に記載されている。
【００５７】
発現ベクターには好適な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列（例えば哺乳動物、微生物、ウィルス、または昆虫遺伝子由来のもの）に機能的に結合したキメラタンパク質ＤＮＡ配列がある。調節配列の例には転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳の開始および停止を調節する好適な配列がある。調節配列がキメラタンパク質ＤＮＡ配列と機能的に関係するとき、ヌクレオチド配列は“機能的に結合している”。従って、プロモーターヌクレオチド配列がキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写を調節するとき、プロモーターヌクレオチド配列はキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列に機能的に結合する。所望の宿主細胞における複製能力（通常、複製起点によって与えられる）およびトランスフォーマントを同定するための選択遺伝子を発現ベクターに更に導入してもよい。
【００５８】
更に、天然ではＦｌｔ３リガンドまたは殺腫瘍物質と結合しない好適なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクターに導入することができる。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列をキメラタンパク質をコードする配列にインフレームで融合し、配列がまずシグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるようにしてもよい。企図する宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドはキメラポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは細胞からのキメラポリペプチドの分泌の際、キメラポリペプチドから開裂される。
【００５９】
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系を使用して組換えキメラポリペプチドを発現させてもよい。昆虫細胞における異種タンパク質の生成のためのバキュロウィルス系はLuckowおよびSummers, Bio/Technology 6: 47 (1988)に記載されている。哺乳動物由来の確立された細胞系を使用してもよい。好適な哺乳動物宿主細胞系の例には以下がある：サル腎臓細胞のＣＯＳ-７系（ATCC CRL 1651）（Gluzmanら, Cell23 : 175, 1981）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ATCC CCL 163）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ（ATCC CRL 10）細胞系、およびアフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶＩ（ATCC CCL 70）由来のＣＶ-１／ＥＢＮＡ-１細胞系（McMahanら(EMBO J : 10: 2821, 1991)に記載）、およびＮＳＯ細胞系（Galfreら, Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981)）。
【００６０】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターの転写および翻訳調節配列はウィルスゲノムから切り出してもよい。一般に使用されるプロモーター配列およびエンハンサー配列はポリオーマウィルス、アデノウィルス２、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウィルスに由来する。ＳＶ４０ウィルスゲノムに由来するＤＮＡ配列（例えばＳＶ４０の起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位）を使用して、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素を提供してもよい。ウィルスの初期および後期プロモーターはいずれも、ウィルス複製起点も含むフラグメントとしてウィルスゲノムから容易に得られるので、特に有用である。例えばFiersら, Nature 273 : 113 (1978)参照。より小さい、またはより大きいＳＶ４０フラグメントを使用してもよく、これはＳＶ４０ウィルス複製起点部位に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌ１部位までの約２５０ｂｐ配列で提供される。
【００６１】
哺乳動物宿主細胞で使用するための代表的な発現ベクターはOkayamaおよびBerg, Mol. Cell. Biol. 3 : 280 (1983)に開示されるように構築できる。Ｃ１２７マウス乳房上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定な高レベル発現に有用な系を実質的にCosmanら(Mol. Immunol. 23: 935, 1986)に記載されるようにして構築することができる。有用な高度発現ベクター、PMLSV N1/N4（Cosman ら, Nature 312: 768, 1984に記載）は登録番号ATCC 39890で寄託されている。更なる有用な哺乳動物発現ベクターはヨーロッパ特許出願EP-A-0367566号および米国特許出願第07/701,415号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ベクターはレトロウィルス由来でもよい。天然のシグナル配列の代わりに以下のような異種シグナル配列を付加してもよい：米国特許第4,965,195号に記載されるＩＬ-７のシグナル配列；Cosmanら, Nature 312: 768 (1984)に記載されるＩＬ-２受容体のシグナル配列；ヨーロッパ特許EP 367,566号に記載されるＩＬ-４シグナルペプチド；米国特許第4, 968,607号に記載されるＩ型ＩＬ-１受容体シグナルペプチド；およびヨーロッパ特許EP 460,846号に記載されるII型ＩＬ-１受容体シグナルペプチド。
【００６２】
キメラタンパク質の生成法も企図され、方法は、Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントおよび殺腫瘍物質を含むキメラタンパク質をコードする核酸を含む組換え細胞を増殖させ、コードされるキメラタンパク質を細胞で発現させ、発現されたキメラタンパク質を回収することを含む。ある態様では、方法は回収されたキメラタンパク質を単離および／または精製することを更に含む。方法の産物も更に企図される。キメラタンパク質は、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）による分析で１本のタンパク質バンドで示されるように実質的に均質にすることができる。例えば、組換えタンパク質を分泌する発現系を使用する場合、市販のタンパク濃縮フィルター（例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニット）を使用して培養液をまず濃縮してもよい。濃縮段階に続き、濃縮物を精製マトリクス（例えばゲル濾過メディウム）に適用することができる。あるいはまたアニオン交換樹脂、例えばペンダント・ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリクスまたは基質を使用することができる。マトリクスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、または一般にタンパク質精製に使用される他の型のものであってもよい。あるいはまた、カチオン交換段階を使用してもよい。好適なカチオン交換にはスルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリクスがある。スルホプロピル基は好ましい。最後に、１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ）段階（疎水性ＲＰ-ＨＰＬＣメディア、例えばペンダント・メチルまたは他の脂肪族基を使用）を使用してキメラタンパク質を更に精製することができる。上記の精製段階の一部または全部を種々に組み合わせたものは周知であり、これを使用して実質的に均質な組換えタンパク質を提供することができる。
【００６３】
Ｆｌｔ３受容体のリガンド結合ドメインを含むアフィニティーカラムを使用して、発現されたキメラポリペプチドのアフィニティー精製を行うことができる。アフィニティーカラムからのキメラポリペプチドの除去は慣例的な方法を使用して（例えば高塩溶出バッファーを使用し、その後低塩バッファーに対して透析して使用するか、または使用するアフィニティーマトリクスによってｐＨもしくは他の成分を変化させることによって）行うことができる。あるいはまた、アフィニティーカラムはＦＬに結合する抗体を含んでもよい。
【００６４】
形質転換した酵母宿主細胞を使用し、分泌されたポリペプチドとしてキメラタンパク質を発現させ、精製を容易にしてもよい。酵母宿主細胞発酵からの分泌された組換えポリペプチドをUrdalら(J. Chromatog. 296: 171, 1984)に開示されるのと類似した方法で精製できる。
【００６５】
核酸を含む組換え細胞も提供される。ある態様では、細胞は真核細胞である。特定の態様では、細胞はＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＮＳＯ細胞である。
【００６６】
キメラタンパク質およびキメラタンパク質をコードする核酸は任意の好適な方法、例えば化学合成、組換え生成、またはそれらを組み合わせて調製してもよい。例えばCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubelら編, John Wiley & Sons, Inc. (2000)および Sambrookら, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory press, (1989)参照。代表的な方法では、キメラタンパク質をコードする核酸を、Prodromouら, Protein Eng. 5(8) : 827-29 (1992)に開示されるように再帰的ＰＣＲ法を使用して調製する。
【００６７】
Ｆｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントおよびまたはペプチド性殺腫瘍物質を含むキメラタンパク質および医薬的に許容されるキャリアーまたは賦形剤を含有する医薬組成物が企図される。従って、本発明の方法に従って使用するための医薬組成物の調製は、慣例的な方法によって、活性化合物を医薬的に使用できる製剤に加工するのを容易にする添加剤および補助剤を含む１つ以上の生理学的に許容されるキャリアーを使用して行ってもよい。これらの医薬組成物の製造は周知の方法（例えば慣例的な混合、溶解、顆粒化、糖衣、微粒子化、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥加工）で行ってもよい。好適な製剤は選択する投与経路に依存する。液体投与の場合、液体キャリアー、例えば水、石油、動物もしくは植物由来の油（例えばピーナツ油、鉱油、大豆油、またはゴマ油）、または合成油を添加してもよい。液体の医薬組成物は生理食塩水、デキストロースもしくは他の糖溶液、またはグリコール（例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）を更に含んでもよい。液体投与の場合、医薬組成物は約0.5から90％（重量比）、好ましくは約1から50％の本発明のタンパク質を含む。
【００６８】
別の観点では、ａ）Ｆｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質；およびｂ）有効量の抗新生物物質を含有する複合剤を提供する。ある態様では、抗新生物物質は黒色腫、乳癌、または肝細胞癌の増殖を阻害する物質である。増殖阻害は腫瘍細胞における活動停止状態または細胞死の誘導を通して起こりうる。代表的な抗新生物物質にはサイトカイン、リガンド、抗体、放射性核種、および化学療法薬がある。それらの物質には以下がある：インターロイキン２（ＩＬ-２）、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＴＮＦ；光増感剤（アルミニウム（III）フタロシアニンテトラスルホネート、ヘマトポルフィリン、およびフタロシアニンを含む）；放射性核種（例えばイオジン-１３１（131Ｉ）、イットリウム-９０（90Ｙ）、ビスマス-２１２（212Ｂｉ）、ビスマス-２１３（213Ｂｉ）、テクネチウム-９９ｍ（99ｍＴｃ）、レニウム-１８６（186Ｒｅ）、およびレニウム-１８８（188Ｒｅ））；化学療法薬（例えばドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、メトトレキサート、ダウノマイシン、ネオカルジノスタチン、およびカルボプラチン）；細菌、植物、および他の毒素（例えばジフテリア毒素、シュードモナス・エキソトキシンＡ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、アブリンＡ毒素、リシンＡ（脱グリコシル化リシンＡおよび天然のリシンＡ）、ＴＧＦ-α毒素、チャイニーズコブラ（naja naja atra）由来のサイトトキシン、およびゲロニン（gelonin；植物毒））；植物、細菌、および真菌由来のリボソーム不活性化タンパク質（例えばレストリクトシン（restrictocin）（アスペルギウス・レストリクツス（Aspergillus restrictus）由来のリボソーム不活性化タンパク質）、サポリン（サボンソウ（Saponaria officinalis）由来のリボソーム不活性化タンパク質）、およびＲＮアーゼ）；チロシンキナーゼ阻害剤；ly207702（２フッ化プリンヌクレオシド）；リポソーム含有抗腫瘍物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、毒素をコードするプラスミド、メトトレキサートなど）；および他の抗体または抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ））。
【００６９】
ある観点では、本明細書に開示する方法を実施するためのキットを提供する。それらのキットは１つ以上の容器、医薬的に許容される形態のＦｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質、および企図されるキメラタンパク質の投与のための説明書を含む。ある態様では、キットは有効量の上記の抗新生物物質を更に含む。好ましい医薬形態は無菌食塩水、デキストロース溶液、もしくはバッファー溶液、または他の医薬的に許容される無菌液と組み合わせたものである。あるいはまた、組成物を凍結乾燥または乾燥してもよい；その場合、キットは必要により容器に入れた医薬的に許容される溶液（好ましくは無菌）を更に含み、複合物を再構成して注射用の溶液を調製する。医薬的に許容される溶液の代表的なものは食塩水およびデキストロース溶液である。別の態様では、本発明のキットは組成物を注射するための（好ましくは無菌包装した）針またはシリンジ、および／またはパッケージングしたアルコールパッドを更に含む。必要により医師または患者が組成物を投与するための説明書を含んでもよい。
【００７０】
本明細書で使用する“治療的有用量”または“有効量”という用語は、単独で、または更なる治療物質と併せて細胞、組織、または被験体に投与した際に、腫瘍もしくは腫瘍関連疾患の症状または腫瘍増殖の進行を阻害または改善するのに有効なキメラタンパク質の量をいう。更に治療的有効量は、症状の改善、例えば関連する医学的状態の治療、治癒、予防、もしくは改善、またはそれらの症状の治療、治癒、予防、もしくは改善の速度の増加をもたらすのに十分な化合物の量も指す。個別の活性成分の単独投与に適用する場合、治療的有効量はその成分だけをいう。複合剤に適用する場合、治療的有効量は、連続的または同時に組み合わせて投与した際に治療的有効性が得られる、活性成分の合わせた量をいう。
【００７１】
Ｃ．Ｆｌｔ３リガンドおよび殺腫瘍物質を含むキメラタンパク質を使用する方法
別の観点では、細胞においてカスペース-３介在型アポトーシスを誘導する方法を提供し、方法はそれらの誘導が必要または所望される細胞に、Ｆｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質を投与することを含む。ある態様では、細胞は哺乳動物細胞である。特定の態様では、細胞は哺乳動物新生物細胞である。ある態様では、細胞は哺乳動物に含まれる。
【００７２】
カスペース活性化は細胞におけるアポトーシス変化において重要な役割を果たす。例えばBudihardjoら, Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 15: 269-90 (1999)参照。カスペースはシステインプロテアーゼのファミリーであり、開裂はアスパラギン酸の直後であり、開裂部位まで少なくとも４個のＮ末端アミノ酸から成る認識配列が存在することを絶対条件とする。例えばGrutter, Curr. Op. Struct. Biol. 10: 649-55 (2000)参照。カスペース３はＣＰＰ３２、ＹＡＭＡ、およびアポパイン（apopain）としても知られ、ＷＥＨＤ開裂部位への特異性を有する。これはラミン、ＰＡＲＰ、ＤＦＦなどのような種々の基質を開裂するように作用する下流または実行カスペースである。細胞内に不活性チモーゲンとして存在するカスペース３の活性化は、リガンド（例えばＦａｓリガンド、ＴＮＦ、またはＴＲＡＩＬ）が好適なその受容体に結合することによって誘引される細胞外アポトーシス刺激に次いで活性化されるカスペース９およびＡｐａｆ-１（上流カスペース）による開裂に続いて起こる。カスペースの活性化は当該分野で周知の方法を使用して容易に測定できる。代表的な方法は、例えばAPOPTOSIS: A PRACTICAL APPROACH (Studzinski, 編 1999)に記載されている。
【００７３】
カスペース３はアポトーシスまたはプログラム細胞死に重要なシステインプロテアーゼ・ファミリーのメンバーである。例えばGrutter, Curr. Opin. Structural Biol. 10: 649-55 (2000); Budihardjoら, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 15: 269-90 (1999)参照。カスペース３はプロ酵素として細胞内に存在し、（一般に“開始（initiator）カスペース”、例えばカスペース８、９、または１０による）タンパク質分解によって活性化される。次いで活性カスペース３は他のタンパク質（主にＤＮＡ修復過程または細胞骨格もしくは核の足場（scaffold）の構成要素に関係するもの）を、認識配列ＤＥＶＤを含む部位のアスパラギン酸の後で開裂する。カスペース３の活性化の検出は当該分野で慣例的かつ周知である。例えば米国特許第6,342,611号；6,391,575号；6,335,429号；および米国特許出願第20030186214号参照。従って、カスペース３の活性化を検出する好適な方法を本明細書で使用してもよい。
【００７４】
本明細書は、哺乳動物の新生物の治療におけるＦｌｔ３リガンドまたは生物学的に活性なそのフラグメントおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含むキメラタンパク質の使用法を提供し、方法はそれらの治療が必要または所望される哺乳動物に有効量の上記Ｂ項に開示するキメラタンパク質を投与することを含む。ある態様では、新生物は黒色腫、乳癌、または肝細胞癌である。
【００７５】
更に別の観点では、本明細書は腫瘍特異的リンパ球の生成法を提供し、方法は哺乳動物にＦｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質を投与して腫瘍特異的リンパ球を生成させ、該生成された腫瘍特異的リンパ球を該哺乳動物から回収することを含む。
【００７６】
Ｂ項に開示するキメラタンパク質およびＢ項に開示する抗新生物物質の複合剤の有効量を、それらの治療が必要または所望される哺乳動物に投与する方法も企図される。
【００７７】
任意の被験体を本明細書に記載する方法および組成物で治療することができる。それらの被験体は哺乳動物、好ましくはヒトである。ある特定の態様では、被験体は癌を有する。開示する方法および組成物の獣医学における使用も企図される。
【００７８】
本発明の方法で治療する被験体には腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、肉腫、または奇形癌を有する被験体がある。腫瘍は以下の癌であってもよい：副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頸、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮。それらの腫瘍には、限定されるわけではないが以下がある：中枢神経系の新生物；多形神経膠芽腫、星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、上衣細胞および脈絡叢腫瘍、松果体部腫瘍、ニューロン性腫瘍（neuronal tumors）、髄芽腫、神経鞘腫、髄膜腫、髄膜肉腫；眼部の新生物；基底細胞癌；扁平上皮癌、黒色腫、横紋筋肉腫、網膜芽腫；内分泌腺の新生物；脳下垂体の新生物、甲状腺の新生物、副腎皮質の新生物、神経内分泌系の新生物、胃腸膵管内分泌系の新生物、性腺の新生物；頭頚部の新生物；頭頚部癌、口腔、咽頭、喉頭、歯性腫瘍；胸部の新生物；大細胞肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胸部の新生物、悪性中皮腫、胸腺腫、胸部の原発性胚細胞癌；消化管の新生物；食道の新生物、胃の新生物、肝臓の新生物、胆嚢の新生物、膵臓外分泌腺の新生物、小腸、虫垂、および腹膜の新生物、結腸および直腸の腺癌、肛門の新生物；尿生殖路の新生物；腎細胞癌、腎盂の新生物、膀胱の新生物、尿道の新生物、前立腺の新生物、陰茎の新生物、精巣の新生物；女性生殖器の新生物；外陰および膣部の新生物、子宮頚の新生物、子宮体の腺腫、卵巣癌、婦人科の肉腫；乳房の新生物；皮膚の新生物；基底膜癌、扁平上皮癌、皮幹線維肉腫、メルケル細胞腫瘍；悪性黒色腫；骨および軟組織の新生物；骨原性肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原始神経外胚葉腫瘍、血管肉腫；造血系の新生物；脊髄形成異常症候群、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、HTLV-1およびＴ細胞性白血病／リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、ヘアリーセル白血病、ホジキン氏病、非ホジキン氏リンパ腫、肥満細胞性白血病；小児の新生物；急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄球性白血病、神経芽腫、骨腫瘍、横紋筋肉腫、リンパ腫、腎臓および肝臓腫瘍。
【００７９】
本明細書で使用する“阻害する”または“治療する”もしくは“治療”とは、制御されていない腫瘍増殖に伴う症状の発生の遅延および／または発生が予想される症状の重篤度の低減を含む。用語は更に、存在する制御されていないもしくは所望されない、または腫瘍増殖に関連する症状の改善、更なる症状の予防、そして潜在的な症状の代謝原因の改善または予防を含む。従って用語は、悪性腫瘍を有する、またはそれらの疾病もしくは症状を発生する可能性のある哺乳動物に有益な結果がもたらされることを意味する。
【００８０】
本明細書に記載する治療法または使用法の実施において、治療的有効量の本明細書に記載するキメラタンパク質を治療すべき症状を有する哺乳動物に投与する。キメラタンパク質の投与は本明細書に記載する方法に従って単独で、または他の療法（例えば他の免疫強化因子（例えばサイトカイン）、化学療法薬、抗新生物物質などを使用する治療）と組み合わせて行ってもよい。１つ以上の生物学的に活性な物質と共投与する場合、本明細書に記載するキメラタンパク質を生物学的に活性な物質と同時に、あるいは連続的に投与してもよい。連続的に投与する場合、治療を行う医師が本発明のタンパク質を生物学的に活性な物質と併せて投与するための好適な順序を決定する。それらの治療計画の毒性および治療有効性の測定は細胞培養液または実験動物において標準的な医薬的方法によって、例えばＬＤ50（集団の５０％致死量）およびＥＤ50（集団の５０％治療的有効量）の測定によって行うことができる。毒性および治療有効性間の用量比が治療指数であり、ＬＤ50およびＥＤ50間の比で表すことができる。高い治療指数を示すキメラタンパク質が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータを使用して、ヒトへの使用のための用量範囲を公式化することができる。それらの化合物の投与量は好ましくは、ＥＤ50を含み、毒性をほとんどまたは全く含まない循環濃度範囲内である。投与量は使用する投与形態および使用する投与経路によってこの範囲内で変化しうる。正確な処方、投与経路、および投与量は個々の医師が患者の状態を考慮して選択できる。例えばFinglら, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1（最新版）参照。投与量および間隔を個々に調整して、活性部分の血漿レベルが所望の治療効果または最小有効濃度（ＭＥＣ）を保持するのに十分であるようにしてもよい。ＭＥＣは各化合物で変化するが、インビトロのデータ（例えば本明細書に記載するアッセイを使用して腫瘍増殖を50-90％阻害するのに必要な濃度）から算出できる。
【００８１】
任意の好適な投与経路を使用してもよい。投与の様式は特に重要ではない。投与の形態には錠剤、トローチ剤、カシェ剤、分散液、懸濁液、溶液、カプセル、パッチなどがある。例えばREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co., Easton, Pa.（最新版）参照。
【００８２】
ある態様では、投与の様式は静脈内ボーラスである。通常、処方者が本明細書に記載する抗体の投与量を決定する。投与量は個々の患者の年齢、体重、および反応に従って変化すると予想される。
【００８３】
本発明の方法のタンパク質を調製および投与する方法はREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co. , Easton, Pa.（最新版）に見られうる。本明細書に記載するキメラタンパク質を考慮した調製および投与は抗体のものと同様であると考えられる。好適な投与経路には例えば経口、直腸、経粘膜、または腸管投与；非経口運搬、例えば筋肉内、皮下、骨髄内注射、並びに髄腔内注射、心室内への直接注射、静脈内、腹膜内、鼻腔内、または眼内注射がある。医薬組成物に使用する、または本発明の方法の実施のためのキメラタンパク質の投与は種々の慣例的な方法、例えば経口摂取、吸入、局所適用または皮膚適用、皮下、腹膜内、非経口、動脈内、または静脈内注射で行うことができる。患者に静脈内投与するのが好ましい。
【００８４】
あるいはまた、例えば抗体の腫瘍への直接注射によって、キメラタンパク質を全身ではなく局所投与してもよく、これは多くの場合デポー剤または徐放剤で行われる。更に、標的化した薬剤運搬系、例えば（例えば腫瘍を標的とする）組織特異的抗体でコーティングしたリポソームでキメラタンパク質を投与してもよい。リポソームは腫瘍組織に標的化され、これによって選択的に吸収される。
【００８５】
本明細書に記載する治療的有効量のキメラタンパク質を静脈内、皮膚、または皮下注射によって投与する場合、本明細書に記載するタンパク質は発熱性物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形態である。それらの非経口的に許容されるタンパク質溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮して、当業者の技術範囲内である。静脈内、皮膚、または皮下注射のための好ましい医薬組成物は本発明のタンパク質に加えて等張賦形剤、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル液、または当該分野で知られるその他の賦形剤を含むべきである。本発明の医薬組成物は安定化剤、保存剤、バッファー、抗酸化剤、または当業者に周知の他の添加剤を含んでもよい。経粘膜投与では、浸透させるべきバリアに好適な浸透剤を製剤に使用する。それらの浸透剤は一般的に当業者に周知である。
【００８６】
吸入による投与では、本発明の方法に従って使用するためのキメラタンパク質を、好適な噴射剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガス）を使用して圧縮パックまたはネブライザーから噴射させるエアロゾルスプレーの形態で便宜に運搬する。圧縮エアロゾルの場合、一定量を運搬するためのバルブを付けることによって投与単位を測定してもよい。吸入または通気に使用するための（例えばゼラチンの）カプセルおよびカートリッジを、化合物および好適な粉末基剤（例えばラクトースまたはデンプン）の粉末混合物を含有するように調製してもよい。化合物を注射（例えばボーラス注射または持続点滴）による非経口投与用に調製してもよい。注射用製剤は保存剤を添加して、例えばアンプルまたはマルチドーズ容器に封入した単位投与の形態であってもよい。組成物は油性または水性媒質中の懸濁液、液体、またはエマルジョンの形態であってもよく、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤のような製剤化物質を含んでもよい。
【００８７】
非経口投与のための医薬製剤には水溶性の形態の活性化合物の水溶液がある。更に、活性化合物の懸濁液を好適な油性注射用懸濁液として調製してもよい。好適な親油性溶媒または賦形剤には脂肪油（例えばゴマ油）もしくは合成脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド）、またはリポソームがある。注射用水性懸濁液は懸濁液の粘性を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含んでもよい。必要により、懸濁液は好適な安定化剤または化合物の溶解度を増加して高濃度溶液の調製を可能にする物質を含んでもよい。あるいはまた、活性成分は粉末であって、使用前に好適な賦形剤（例えば発熱物質を含有しない無菌水）と調合してもよい。
【００８８】
本明細書に記載する医薬組成物に有用なキメラ抗体の量は治療すべき症状の性質および重篤度、および患者が以前に受けた治療の性質に依存する。最終的には治療を行う医師が本発明のタンパク質の量を決定し、それによって個別の患者を治療する。まず、治療を行う医師は低量の本発明のキメラタンパク質を投与し、患者の反応を観察する。患者に最適な治療効果が得られるまで本発明のキメラタンパク質の投与量を増加させ、その時点で投与量の増加を中止する。本明細書に記載する方法の実施のために使用する種々の医薬組成物は体重１kg当たり約0.01μgから約100mg（好ましくは約0.1μgから約10mg、より好ましくは約0.1μgから約1mg）の本発明のキメラタンパク質を含有すべきことが考えられる。投与の際、本発明に使用する治療組成物は、当然発熱物質を含有しない、生理学的に許容される形態である。必要により上記の組成物に含有されてもよい本発明のキメラタンパク質以外の治療的に有用な物質を代替として、または付加的に、本発明の方法において医薬組成物と同時または連続的に投与してもよい。キメラタンパク質と合一する代表的な物質には上記Ｃ項に開示するような抗新生物物質がある。
【００８９】
本明細書に記載するキメラタンパク質は単独で、または他の治療法と併用して投与できる。例えば治療法はキメラタンパク質に接触させた細胞にイオン化放射線を運搬する段階を更に含んでもよい。イオン化放射線は、有害な増殖をする細胞においてかなりの程度の細胞死が誘導されるのに十分な投与量で運搬し、この判断は生存可能な悪性細胞を測定するアッセイによって行う。好ましくは誘導される細胞の死滅の程度は、抗体単独で、またはイオン化放射線単独で誘導されるものより実質的に高い。イオン化放射線の典型的な形態にはベータ線、ガンマ線、アルファ粒子、およびＸ線がある。これらは外部の線源、例えばＸ線装置もしくはガンマ線カメラから運搬するか、または患者に投与した放射線核種から悪性組織へ運搬してもよい。当該分野で周知の方法を使用して放射線核種を利用することもできる。悪性腫瘍の治療におけるイオン化放射線の使用は、例えばS. Hellman, Principles of Radiation Therapy, in CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY 248 (V. T. DeVita, Jr.,ら編 , 第４版 , 1993)に報告されている。一般に使用できる投与量の範囲は約1から500cGy（すなわち約1から約500ラド）である。
【００９０】
ある観点では、Ｆｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質および免疫応答増強剤を含むワクチンを提供する。
【００９１】
別の観点では、哺乳動物において抗新生物免疫応答を誘引するための方法を提供し、方法はそれらの誘引が必要または所望される哺乳動物にＦｌｔ３リガンドおよびタンパク質性またはペプチド性の殺腫瘍物質を含む有効量のキメラタンパク質および免疫応答増強剤を含む有効量のワクチンを投与することを含む。
【００９２】
本明細書で使用する“免疫応答増強剤”という用語は標的抗原（例えば腫瘍抗原）への免疫応答を向上または延長する物質をいう。免疫応答の向上は相加的であっても相乗的であってもよい。本明細書で使用する“免疫応答”という用語はＢ細胞介在型応答、Ｔ細胞介在型応答、またはＢ細胞介在型応答およびＴ細胞介在型応答を組み合わせたものを含む。代表的な免疫応答増強剤には、他のサイトカイン、例えばＩＬ-１２、ＩＬ-２、ＩＦＮ-γ、アジュバント、免疫刺激ペプチドなどがある。本発明の組成物および方法の免疫応答増強剤は、キメラタンパク質と同時に、または連続的に、同じ投与経路で、または異なる経路で投与できる。
【００９３】
ワクチン接種は慣例的な方法で実施できる。例えば免疫原を好適な希釈剤、例えば食塩水もしくは水、または完全もしくは不完全アジュバントに混合して使用してもよい。更に、免疫原はキャリアーに結合して免疫原タンパク質を形成しても、あるいはキャリアーに結合しなくてもよい。それらのキャリアー分子の例には、限定されるわけではないがウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイドなどがある。免疫原をリポタンパクに結合させるか、またはリポソームの形態で、もしくはアジュバントと共に投与してもよい。免疫原は抗体産生に好適な任意の経路で投与してもよく、それらには静脈内、腹膜内、筋肉内、皮下などがある。免疫原は一度に投与するか、または有意な力価の抗腫瘍細胞Ｔ細胞応答もしくは抗腫瘍細胞抗体が産生されるまで一定間隔をあけて投与してもよい。抗腫瘍細胞応答の存在は免疫化の前後での腫瘍抗原に対する前駆ＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）の頻度の測定によって評価してもよい。例えばCoulie, P.ら, Int. J. Cancer 50: 289-97 (1992)参照。抗体は当該分野で知られる免疫アッセイを使用して血清中で検出してもよい。
【００９４】
本発明のワクチンの投与は予防または治療目的のいずれであってもよい。予防的に用いる場合、いずれの形跡にも先立って、または悪性腫瘍による症状に先立って、キメラタンパク質を投与する。キメラタンパク質の予防的投与は哺乳動物、好ましくはヒトにおける悪性腫瘍を予防する、または減衰させる役割を果たす。治療的に用いる場合、疾病の発症時（またはその直後）、または疾病の症状の発生時にキメラタンパク質を投与する。キメラタンパク質の治療的投与は疾病を減衰させる役割を果たす。
【００９５】
罹患部位への局所投与は当該分野で周知の方法によって行ってもよく、それらには、限定されるわけではないが局所適用、注射、および組換えにより融合体を発現する細胞を含む多孔性装置のインプラント、キメラタンパク質を単独または免疫応答増強剤と共に含む多孔性装置のインプラントがある。
【００９６】
ワクチン製剤はまず動物モデルで、最初に齧歯類、そして非ヒト霊長類、そして最後にヒトで評価してもよい。免疫化法の安全性は免疫化した動物の一般的な健康状態に対する免疫化の影響の観察（体重変化、発熱、食欲など）、および剖検での病理学的変化の観察によって測定する。動物における初期試験後、癌患者を試験することができる。慣例的な方法を使用して患者の免疫応答を評価し、ワクチンの有効性を確認する。例えばCURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY（最新版）参照。Ｔリンパ球が単離できる例には、限定されるわけではないが末梢血細胞リンパ球（ＰＢＬ）、リンパ節、または腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）がある。それらのリンパ球を治療すべき個体またはドナーから当該分野で周知の方法によって単離し、インビトロで培養できる。例えばKawakami, Y. ら, J. Immunol. 142: 2453-61 (1989)参照。リンパ球は当該分野で周知の技術を使用して培地中で培養することができる。増殖力はトリパンブルー色素の排除能アッセイで評価する。これらの感作Ｔリンパ球の有効性を確認するために評価しうるパラメーターには、それらに限定されるわけではないが、治療すべき哺乳動物における免疫細胞の生成または腫瘍の退縮がある。慣例的な方法を使用してこれらのパラメーターを評価する。それらの方法には細胞障害性アッセイ、混合リンパ球反応、およびサイトカイン生成アッセイがある。
【００９７】
好適な腫瘍モデルを使用してキメラタンパク質の試験のためのモデルを提供することができる。マウス腫瘍レシピエントは任意の好適な系であってもよい。腫瘍は、腫瘍と同系、同種異系、または異系であってもよい。レシピエントは１つ以上の免疫関連機能において免疫競合的または免疫無防備状態であってもよく、それらには、限定されるわけではないがｎｕ／ｎｕ、ｓｃｉｄ、およびｂｅｉｇｅマウスがある。ある態様では、レシピエントはトランスジェニックマウスである。ある特定の態様では、マウスはＢａｌｂ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスである。任意の好適な腫瘍源を動物モデル実験に使用してもよく、それらには確立された細胞系、新鮮腫瘍サンプルから分離した細胞、および短期ポリクローナル腫瘍細胞がある。代表的な腫瘍細胞系にはＲｅｎｃａ細胞、Ｂ１６黒色腫細胞、Ｈｅｐａｌ細胞、ＢＴ-４７４細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＱＹＣ細胞、Ｄ２Ｆ２細胞、４Ｔ１細胞、Ａ２０細胞がある。キメラタンパク質の投与量は少なくとも１回の投与で、１μg/マウスから１mg/マウスの範囲である。抗体は任意の好適な経路によって投与できる。ある態様では、抗体の投与量は週２回、100μg/マウスである。特定の態様では、０日目に腫瘍を皮下注射し、所定の時点でキャピラリ-を使用して原発腫瘍の体積を測定する。任意の好適なコントロールタンパク質を使用することができる。ある例ではコントロール抗体は、パプテン（ジニトロフェニル）に対して産生させた精製ＩｇＧ1アイソタイプコントロール抗体である。
【実施例】
【００９８】
本発明の広範な範囲については、以下の実施例を参照にすると最も理解されるが、それらの実施例は本発明を特定の態様に限定することを意図するものではない。
【００９９】
Ｄ．実施例
実施例１  ヒトＦｌｔ３リガンド細胞外領域（ｈＦＬｅｘ）ｃＤＮＡの合成
目的：Ｆｌｔ３リガンドはＩ型膜貫通タンパク質で、その細胞外領域はＮ末端であるため、ＦＬのＮ末端の修飾はその生物学的活性に不利な影響を与えうる。従って出願人は四価の生物学的特異的抗体の構築に使用される方法を使用した（図１Ａ参照）。Columnら, Nat Biotech 15: 159-163 (1997)参照。一般に、１本鎖抗体をコードするＤＮＡを異なる特異性を有する抗体のＣ末端で融合させることによって四価の二重特異性抗体を構築した。生物学的活性の高い二元機能融合タンパク質を得るために、出願人はＮ末端にＦＬｅｘ、Ｃ末端に抗体分子を有する融合タンパク質を構築した（図１Ｂ参照）。まず、ＦＬｅｘ遺伝子をヒトＩｇＧ１  ｃＤＮＡ（ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３）の５’末端に融合させてＦｌｅｘ-Ｉｇ融合遺伝子を生成した。次いでｈＦＬｅｘ-Ｉｇ融合遺伝子を１本鎖抗体遺伝子の５’末端に融合させ、Ｆｌｅｘ-Ｉｇ-ｓｃＦｖ融合遺伝子を生成した。
【０１００】
ｈＦＬｅｘ  ｃＤＮＡの合成：ヒトＦＬｔ３リガンド遺伝子のｃＤＮＡ配列、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース（登録番号U03858）。ヌクレオチド８４から１６１はＦＬｔ３リガンドのシグナルペプチドをコードし、ヌクレオチド１６２から６２９はＦｌｔ３リガンドの細胞外領域をコードした。従って、Ｆｌｔ３リガンドのシグナルペプチドおよび細胞外領域の両方をコードする遺伝子のサイズは５４６ｂｐであった。
【０１０１】
Prodromou Cら, Protein Eng. 5 (8): 827-829に記載されるようにＦＬｅｘ遺伝子を合成した。簡単に記載すると、ＦＬｅｘ  ｃＤＮＡを約７５ｂｐの１０個のＤＮＡフラグメントに分割した。フラグメントは以下の基準を使用して設計した：（１）各フラグメントは隣接するフラグメントと２０ｂｐ長重複する；（２）最後のフラグメントのサイズは７５ｂｐより短くなりうる；そして（３）アンチセンス鎖を最後のフラグメントのプライマーとして選択し、センス鎖を他の全てのフラグメントに関するプライマーとして選択する。次いで上記のプライマーを市販の方法で合成した（Shengong Biotechnology Inc. (Shanghai, China)）。
【０１０２】
８５ｎＭの各プライマー、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２００ｍＭ  ｄＮＴＰ、および２．５ユニットのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する５０μｌ容量でＰＣＲを実施した。ＰＣＲサイクルのプロトコールは以下である：プレインキュベーション（９４℃で５分間）；変性（９４℃で１分間）、アニーリング（５６℃で１分間）、および伸長（７２℃）を３０サイクル。伸長時間はプライマーの数によって変化し、以下の等式を使用して時間を算出した：伸長時間（秒）＝プライマー数ｘ６（秒）。最後の伸長は７２℃で５分間行った。
【０１０３】
ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲルで分離した。正しいＤＮＡフラグメントをゲル精製し、ｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローニングし、その配列を確認した。図２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２）参照。クローンをｐＧＥＭ-Ｔ／ｈＦｌｅｘで示す。
【０１０４】
実施例２  ヒトＩｇＧ１不変領域のクローニングおよび同定
天然のヒトＩｇＧ１  ｃＤＮＡ（１４１６ｂｐ）は４７１個のアミノ酸および翻訳終止コドンをコードする。ＩｇＧ１の不変領域を以下のプロトコールを使用してＲＴ-ＰＣＲでクローニングした：フィコール・ハイパーク（Ficoll-Hypaque）密度勾配遠心分離によって健常なボランティアのヘパリン化した血液からヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。TRIzol試薬（Gibco BRL）を用いてＰＢＭＣからＲＮＡを単離した。Onestep RT-PCR（Qiagen）によってＩｇＧ１  ＦｃフラグメントのｃＤＮＡを得た。ＲＴ-ＰＣＲのプライマーは以下である：Ｆｃセンス、5'-gca ctc gag ttt tac ccg gag aca ggg aga g-3'；Ｆｃアンチセンス、5'-gag ccc aaa tct tgt gac aaa ac-3'。ＲＴ-ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離した。正しいＤＮＡフラグメントをゲル精製し、ｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローニングし、その配列を確認した。クローンをｐＧＥＭ-Ｔ／ＩｇＦｃで示す。
【０１０５】
実施例３  ＳＭ５-１キメラ抗体およびヒト化抗体の構築
１．マウスＳＭ５-１重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のクローニング。TRIzol試薬（Gibco BRL, Grand Island, NY）を使用してＳＭ５-１（ＩｇＧ１、κ）ハイブリドーマ細胞（登録番号HB-12588でＡＴＣＣに寄託されている）からＲＮＡを単離した。ＳＭ５-１の重鎖および軽鎖可変領域のｃＤＮＡのクローニングを、５’ＲＡＣＥ系（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）を使用し、製造者の説明書に従って行った。Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分析した（図５）。明確な重鎖ＰＣＲフラグメント（約５９０ｂｐ）および軽鎖フラグメント（約５３０ｂｐ）をそれぞれゲル精製し、ｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega, Madison, WI）にクローニングし、配列を確認した。重鎖（ＳＭ  ＶH）および軽鎖（ＳＭ  ＶL）可変領域のＤＮＡ配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（図６）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（図７）である。
【０１０６】
２．キメラ抗体の発現ベクターの構築。SL Morrison博士（Dept. of Microbiology and Molecular Genetics, UCLA）より２つのベクターｐＡＨ４６０４およびｐＡＧ４６２２の供与を受けた。Colomaら, J Immunol Methods 152: 89 (1992)参照。ＰＣＲ法を用いてＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩ部位を重鎖可変領域遺伝子（ＶH）の５’末端に、ＮｈｅＩ部位を３’末端に付加した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ-Ｔベクターにクローニングし、その配列を確認した。ＥｃｏＲＶおよびＮｈｅＩによってＶHを切り出し、ヒトガンマ-１不変領域遺伝子（ＣH）を含有するｐＡＨ４６０４ベクターのＥｃｏＲＶ／ＮｈｅＩ部位に挿入した。得られたｐＡＨ４６０４-ＶHベクターをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで開裂し、齧歯動物／ヒトキメラ抗体重鎖遺伝子を含む３．３ｋｂのフラグメントをｐＤＲベクターにクローニングし、キメラ重鎖発現ベクター、ｐＤＲ-ＳＭＶHＣHを得た。ＳＭ５-１キメラ重鎖（ｃｈＳＭＶＨＣＨ）のヌクレオチドおよび推論されるアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２に示す（図８）。
【０１０７】
ヒトκ鎖不変領域ｃＤＮＡ（ＣL）をｐＡＧ４６２２由来の０．３ｋｂ  ＰＣＲ産物として得た。S. L. Morrison博士（Department of Microbiology and Molecular Genetics, UCLA）よりｐＡＧ４６２２の供与を受けた。オーバーラップＰＣＲ法により、ＳＭ５-１の軽鎖可変領域遺伝子（ＶL）をＣLの５’末端に融合させた。得られたキメラ軽鎖遺伝子（ＶLＣL）は開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有した。次いでキメラ軽鎖をｐＧＥＭ-Ｔベクター遺伝子にクローニングし、その配列を確認した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によってＶLＣL遺伝子を切り出し、ｐＤＲベクターにライゲートし、キメラ軽鎖発現ベクターｐＤＲ-ＳＭＶLＣLを得た。ＳＭ５-１キメラ軽鎖（ｃｈＳＭＶＬＣＬ）のヌクレオチド配列および推論されるアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４に示す（図９）。発現ベクターｐＤＲ-ＳＭＶHＣHおよびｐＤＲ-ＳＭＶLＣLを図１０および図１１に示す。
【０１０８】
３．ヒト化抗体遺伝子の構築。ヒト化重鎖の骨格としてヒト抗体ＫＯＬのＶHを選択し、ヒト化軽鎖にはヒト・ベンス・ジョーンズタンパク質ＲＥＩのＶLを選択した。ヒト化抗体の軽鎖および重鎖可変領域遺伝子の合成を、実施例１に記載するＰＣＲ法によって行った。ヒト化抗体の軽鎖および重鎖発現ベクターを、上記のキメラ抗体と同じ方法で構築した。まず、ＳＭ５-１軽鎖または重鎖由来の３つのＣＤＲをヒト抗体軽鎖または重鎖骨格領域に直接移入し、ヒト化抗体遺伝子を得た。ヒト化ＶLおよびＶHをそれぞれ発現ベクターにクローニングし、次いでＣＯＳ細胞で一時的に共発現させた。トランスフェクトしたＣＯＳ細胞はヒト化ＳＭ５-１  Ａｂを産生した。ＣＯＳ細胞培養液上清中のヒト化抗体をＥＬＩＳＡで定量し、黒色腫細胞への抗体の結合をフローサイトメトリー分析で測定した。抗原結合活性アッセイから、この抗体はヒト・ヘパトーマ細胞ＱＹＣにわずかにしか結合しないことが明らかになり、これは完全な結合活性を再構築するためにはいくつかのヒトＦＲ残基を変更しなければならないことを示唆している。結合活性に影響を及ぼしうる重要なＦＲ残基を分析し、逆変異（backmutation）アッセイを行った。非ヒト化ＳＭ５-１と同じ抗原結合活性を示すヒト化抗体を得、これを“ｈｕＳＭ”とした。競合結合アッセイにおいて、ｈｕＳＭ５-１抗体はマウスＳＭ５-１抗体またはキメラＳＭ５-１抗体と同等の結合活性を示した。軽鎖および重鎖発現ベクターをｐＤＲ-ｈｕＳＭＶHＣHおよびｐＤＲ-ｈｕＳＭＶLＣLで表す。ｈｕＳＭの重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５および１６（図１２）、並びにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７および１８（図１３）に示す。ｈｕＳＭの重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９および２０（図１４）、並びにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１および２２（図１５）に示す。
【０１０９】
４．キメラおよびヒト化抗体の発現。トランスフェクションに先立ち、ＣＨＯｄｈｆｒ-細胞をグリシン、ヒポキサンチン、およびチミジン（ＧＨＴ）を含有するＤＭＥＭ完全培地中で保持した。リポフェクタミン２０００（Invitrogen, Carlsbad, CA）を使用し、製造者の説明書に従って、好適な軽鎖および重鎖発現ベクターをＣＨＯｄｈｆｒ-細胞へ共トランスフェクトした。次いで、ＭＴＸを１．０μＭまで段階的に濃度を増加させて含有するＧＨＴ未含有ＤＭＥＭ培地中で、トランスフェクトした細胞を選択した。薬剤耐性クローンを選別し、増殖させて更なる分析を行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ）を捕捉抗体、ヤギ抗ヒトκ-ＨＲＰ（ＫＰＬ）を検出抗体として使用）により、融合タンパク質の生成について細胞クローンからの培養液上清を分析した。精製したヒトＩｇＧ１／κ（Sigma）をＥＬＩＳＡアッセイの標準物質として使用した。最も多量の抗体を産生するクローンを選択し、血清未含有培地中で増殖させた。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、血清未含有培地上清から組換え抗体を精製した。
【０１１０】
５．アフィニティー測定。キメラおよびヒト化抗体のアフィニティー（Ｋｄ）の測定は、BIAcore（Pharmacia）を使用してKarlsson Rら. J Immunol. Methods 145: 229 (1991)に記載されるように行った。キメラ抗体およびヒト化抗体のＫｄ値はそれぞれ３．７８ｘ１０-9および９．３１ｘ１０-9である。
【０１１１】
これらの結果は、ヒト化ＳＭ５-１抗体が好ましい結合活性を有し、ヒトの治療に使用してもよいことを示している。
【０１１２】
実施例４  ｈｕＳＭ／ＦＬおよびｃｈＳＭ／ＦＬ二元機能融合タンパク質の構築
３つの異なる融合タンパク質を構築し、その生体機能を更に検討した。
Ａ．ｈｕＳＭＶH／Ｆｃ／ＦＬの構築。ヒトＦｌｔ３リガンド細胞外領域（ｈＦＬｅｘ）のｃＤＮＡを、ｐＧＥＭ-Ｔ／ｈＦＬｅｘ５由来の５００ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントとして得た。オーバーラップＰＣＲを用いてＦＬｅｘ遺伝子をｈｕＳＭ重鎖遺伝子の３’末端に融合させた。得られた融合遺伝子ＰＣＲ産物は開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有した。融合産物をｐＧＥＭ-Ｔベクターにクローニングし、その配列を確認した。ｈｕＳＭＶH／Ｆｃ／ＦＬのヌクレオチド配列および推論されるアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２４に示す（図１６）。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によってｈｕＳＭＶH／Ｆｃ／ＦＬ融合遺伝子を切り出し、ｐＤＲベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、融合遺伝子発現ベクターｐＤＲ-ｈｕＳＭＶH／Ｆｃ／ＦＬを得た。
【０１１３】
リポフェクタミン２０００を使用して、好適な軽鎖（ｐＤＲ-ｈｕＳＭＶＬＣＬ）および融合遺伝子（ｐＤＲ-ｈｕＳＭＦｖ／Ｆｃ／ＦＬ）発現ベクターをＣＨＯｄｈｆｒ細胞に共トランスフェクトした。次いで、ＭＴＸを１．０μＭまで段階的に濃度を増加させて含有するＧＨＴ未含有ＤＭＥＭ培地中で、トランスフェクトした細胞を選択した。薬剤耐性クローンを選別し、増殖させて更なる分析を行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ）を捕捉抗体、ヤギ抗ヒトκ-ＨＲＰ（ＫＰＬ）を検出抗体として使用）により、融合タンパク質の生成について細胞クローンからの培養液上清を分析した。精製したヒトＩｇＧ１／κ（Sigma）をＥＬＩＳＡアッセイの標準物質として使用した。最も多量の融合タンパク質を産生するクローンを選択し、血清未含有培地中で増殖させた。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで血清未含有培地上清から融合タンパク質を精製した。
【０１１４】
Ｂ．ｈｕＳＭＦｖ／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬの構築。ヒトＦｌｔ３リガンド細胞外領域（ｈＦＬｅｘ）のｃＤＮＡを、ｐＧＥＭ-Ｔ／ｈＦｌｅｘ由来の５００ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントとして得た。オーバーラップＰＣＲを用いてｈＦＬｅｘ遺伝子をｈｕＳＭ重鎖遺伝子の３’末端にリンカー遺伝子を介して融合させた。リンカーペプチドのアミノ酸配列は（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６。図４）。開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有する最終的なＰＣＲ産物をｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローニングし、その配列を確認した（図１７のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５および２６）。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によってｈｕＳＭＦｖ／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬ融合遺伝子を切り出し、ｐＤＲベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、融合遺伝子発現ベクターｐＤＲ-ｈｕＳＶＨｖ／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬを得た。
【０１１５】
リポフェクタミン２０００を使用して、好適な軽鎖（ｐＤＲ-ｈｕＳＭＶＬＣＬ）および融合遺伝子（ｈｕＳＭＶＨ／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬ）発現ベクターをＣＨＯｄｈｆｒ-細胞に共トランスフェクトした。次いで、ＭＴＸを１．０μＭまで段階的に濃度を増加させて含有するＧＨＴ未含有ＤＭＥＭ培地中で、トランスフェクトした細胞を選択した。薬剤耐性クローンを選別し、増殖させて更なる分析を行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ）を捕捉抗体、ヤギ抗ヒトκ-ＨＲＰ（ＫＰＬ）を検出抗体として使用）により、融合タンパク質の生成について細胞クローンからの培養液上清を分析した。精製したヒトＩｇＧ１／κ（Sigma）をＥＬＩＳＡアッセイの標準物質として使用した。最も多量のタンパク質を産生するクローンを選択し、血清未含有培地中で増殖させた。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで血清未含有培地上清から融合タンパク質を精製した。
【０１１６】
Ｃ．ＦＬ／Ｆｃ／ｈｕＳＭＦｖの構築。ヒトＦｌｔ３リガンド細胞外領域＋シグナルペプチドのｃＤＮＡをｐＧＥＭ-Ｔ／ｈＦｌｅｘ由来の５５０ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントとして得た。ｈＦＬｅｘ  ＰＣＲ産物は５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位、次いで発現を促進するＫｏｚａｋ配列を含有した。ヒトＩｇＧ１のｃＤＮＡ（ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３）をｐＧＥＭ-Ｔ／ＩｇＦｃからＰＣＲによって増幅させた。オーバーラップＰＣＲ法によりＦｌｅｘ遺伝子をヒトＩｇＧ１  ｃＤＮＡの５’末端に融合させ、ＦＬ／Ｆｃ融合遺伝子を生成した（図３のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４）。
【０１１７】
オーバーラップＰＣＲ法によってｈｕＳＭ重鎖可変領域のｃＤＮＡを軽鎖可変領域遺伝子の５’末端にリンカー遺伝子を介して融合させ、ｈｕＳＭ１本鎖抗体（ＳｃＦｖ）遺伝子を生成した。リンカーペプチドのアミノ酸配列は（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）である。次いでオーバーラップＰＣＲ法によってＦＬ／Ｆｃ融合遺伝子をｈｕＳＭ  ＳｃＦｖ遺伝子の５’末端に融合させ、ＦＬ／Ｆｃ／ｈｕＳＭＦｖ融合遺伝子を生成した。ＦＬ／Ｆｃ／ｈｕＳＭＦｖ融合遺伝子のＰＣＲ産物は５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有した。次いで産物をｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローニングし、その配列を確認した（図１８のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７および２８）。その後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によって融合遺伝子を切り出し、ｐＤＲベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、融合遺伝子発現ベクターｐＤＲ-ＦＬ／Ｆｃ／ｈｕＳＭＦｖを得た。ＦＬ／Ｆｃ／ｈｕＳＭＦｖ融合遺伝子の図式を図１９に示す。
【０１１８】
リポフェクタミン２０００を使用して、好適な融合遺伝子発現ベクター（ｐＤＲ-ＦＬ／Ｆｃ／ｈｕＳＭＦｖ）をＣＨＯｄｈｆｒ-細胞にトランスフェクトした。次いで、ＭＴＸを１．０μＭまで段階的に濃度を増加させて含有するＧＨＴ未含有ＤＭＥＭ培地中で、トランスフェクトした細胞を選択した。薬剤耐性クローンを選別し、増殖させて更なる分析を行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）を捕捉抗体、ヤギ抗ヒトＦＬｅｘを検出抗体として使用）により、融合タンパク質の生成について細胞クローンからの培養液上清を分析した。最も多量の融合タンパク質を産生するクローンを選択し、血清未含有培地中で増殖させた。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで血清未含有培地上清から融合タンパク質を精製した。
【０１１９】
上記のｈｕＳＭ／ＦＬ融合タンパク質と同じ方法で、３つの異なるＣｈＳＭ／ＦＬ融合タンパク質を構築、発現、および精製した。ｃｈＳＭＶH／Ｆｃ／ＦＬ、ｃｈＳＭＶH／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬ、ＦＬ／Ｆｃ／ｃｈＳＭＦｖのヌクレオチド配列および推論されるアミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９および３０（図２０）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１および３２（図２１）、並びにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４（図２２）に示す。
【０１２０】
実施例５  ＣＤ２０／ＦＬ二元機能融合タンパク質の構築
１．抗ＣＤ２０  ｍＡｂ  ２Ｂ８の可変領域遺伝子の合成。抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体２Ｂ８の可変領域ｃＤＮＡの合成を実施例１に記載するように、米国特許第6,399,061号に開示される配列を使用して行った。ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲルで分離した。正しいＤＮＡフラグメントをゲル精製し、ｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローニングし、その配列を確認した。２Ｂ８の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５および３６（図２３）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７および３８（図２４）に示す。本実施例では、２Ｂ８の軽鎖および重鎖ベクターのための正しいクローンをそれぞれｐＧＥＭ-Ｔ／ＣＤ２０ＨおよびｐＧＥＭ-Ｔ／ＣＤ２０Ｌで表す。
【０１２１】
２．キメラ抗体の発現ベクターの構築。ＰＣＲを使用して、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩ部位を重鎖可変領域遺伝子（ＶH）の５’末端に、ＮｈｅＩ部位を３’末端に付加した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ-Ｔベクターにクローニングし、その配列を確認した。ＥｃｏＲＶおよびＮｈｅＩ消化によってＶHを切り出し、ヒトγ-１不変領域遺伝子（ＣH）を含有するｐＡＨ４６０４ベクターのＥｃｏＲＶ／ＮｈｅＩ部位に挿入した。得られたｐＡＨ４６０４-ＶHベクターをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで開裂し、齧歯動物／ヒトキメラ抗体重鎖遺伝子を含む３．３ｋｂのフラグメントをｐＤＲベクターにクローニングし、キメラ重鎖発現ベクター、ｐＤＲ-ＣＤ２０ＶHＣHを得た。抗ＣＤ２０キメラ重鎖（ＣＤ２０ＶHＣH）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９および４０に示す（図２５）。
【０１２２】
ヒトκ鎖不変領域ｃＤＮＡ（ＣL）をｐＡＧ４６２２由来の０．３ｋｂ  ＰＣＲ産物として得た。オーバーラップＰＣＲ法によって２Ｂ８の軽鎖可変領域遺伝子（ＶL）をＣLの５’末端に融合させた。得られたキメラ軽鎖遺伝子（ＶLＣL）は開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有した。次いでキメラ軽鎖をｐＧＥＭ-Ｔベクター遺伝子にクローニングし、その配列を確認した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によってＶLＣL遺伝子を切り出し、ｐＤＲベクターにライゲートし、キメラ軽鎖発現ベクターｐＤＲ-ＣＤ２０ＶLＣLを得た。抗ＣＤ２０キメラ軽鎖（ＣＤ２０ＶLＣL）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１および４２に示す（図２６）。
【０１２３】
３．ＣＤ２０ＶH／Ｆｃ／ＦＬの構築。ヒトＦｌｔ３リガンド細胞外領域（ｈＦＬｅｘ）のｃＤＮＡをｐＧＥＭ-Ｔ／ｈＦｌｅｘ由来の５００ｂｐ  ＰＣＲ増幅フラグメントとして得た。オーバーラップＰＣＲ法によってＦＬｅｘ遺伝子を２Ｂ８重鎖遺伝子の３’末端に融合させた。得られた融合遺伝子ＰＣＲ産物は開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有した。次いで産物をｐＧＥＭ-Ｔベクターにクローニングし、その配列を確認した。ＣＤ２０ＶH／Ｆｃ／ＦＬのヌクレオチド配列および推論されるアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３および４４（図２７）に示す。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によってＣＤ２０ＶH／Ｆｃ／ＦＬ融合遺伝子を切り出し、ｐＤＲベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、融合遺伝子発現ベクターｐＤＲ-ＣＤ２０ＶH／Ｆｃ／ＦＬを得た。
【０１２４】
４．ＣＤ２０ＶH／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬの構築。ヒトＦｌｔ３リガンド細胞外領域（ｈＦＬｅｘ）のｃＤＮＡを、ｐＧＥＭ-Ｔ／ｈＦｌｅｘ由来の５００ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントとして得た。オーバーラップＰＣＲ法を用いてｈＦＬｅｘ遺伝子を２Ｂ８重鎖遺伝子の３’末端にリンカー遺伝子を介して融合させた。リンカーペプチドのアミノ酸配列は（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）である。開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有する最終的なＰＣＲ産物をｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローニングし、その配列を確認した（図２８のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５および４６）。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によってＣＤ２０ＶＨ／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬ融合遺伝子を切り出し、ｐＤＲベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、融合遺伝子発現ベクターｐＤＲ-ＣＤ２０ＶＨ／Ｌｉｎｋ／ＦＬを得た。
【０１２５】
５．ＦＬ／Ｆｃ／ＣＤ２０Ｆｖの構築。ヒトＦｌｔ３リガンド細胞外領域＋シグナルペプチドのｃＤＮＡをｐＧＥＭ-Ｔ／ｈＦｌｅｘ由来の５５０ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントとして得た。ｈＦＬｅｘ  ＰＣＲ産物は５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位、次いで発現を促進するＫｏｚａｋ配列を含有した。ヒトＩｇＧ１のｃＤＮＡ（ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３）をｐＧＥＭ-Ｔ／ＩｇＦｃからＰＣＲによって増幅させた。オーバーラップＰＣＲ法によりＦｌｅｘ遺伝子をヒトＩｇＧ１  ｃＤＮＡの５’末端に融合させ、ＦＬ／Ｆｃ融合遺伝子を生成した。
【０１２６】
オーバーラップＰＣＲ法によって２Ｂ８重鎖可変領域のｃＤＮＡを軽鎖可変領域遺伝子の５’末端にリンカー遺伝子を介して融合させ、２Ｂ８  １本鎖抗体（ＳｃＦｖ）遺伝子を生成した。リンカーペプチドのアミノ酸配列は（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3である。次いでオーバーラップＰＣＲ法によってＦＬ／Ｆｃ融合遺伝子を２Ｂ８  ＳｃＦｖ遺伝子の５’末端に融合させ、ＦＬ／Ｆｃ／ＣＤ２０Ｆｖ融合遺伝子を生成した。ＦＬ／Ｆｃ／ＣＤ２０Ｆｖ融合遺伝子のＰＣＲ産物は５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有した。次いで産物をｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローニングし、その配列を確認した（図２９のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７および４８）。その後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によって融合遺伝子を切り出し、ｐＤＲベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、融合遺伝子発現ベクターｐＤＲ-ＦＬ／Ｆｃ／ＣＤ２０Ｆｖを得た。ＦＬ／Ｆｃ／ＣＤ２０Ｆｖ融合遺伝子の図式を図３０に示す。
【０１２７】
６．２Ｂ８キメラ軽鎖発現ベクターの構築。ヒトκ鎖不変領域ｃＤＮＡ（ＣL）をｐＡＧ４６２２由来の０．３ｋｂ  ＰＣＲ産物として得た。SL Morrison博士（Department of Microbiology and Molecular Genetics, UCLA）よりｐＡＧ４６２２の供与を受けた。オーバーラップＰＣＲ法により、ＳＭ５-１の軽鎖可変領域遺伝子（ＶL）をＣLの５’末端に融合させた。得られたキメラ軽鎖遺伝子（ＶLＣL）は開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有した。次いで産物をｐＧＥＭ-Ｔベクター遺伝子にクローニングし、その配列を確認した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によってＶLＣL遺伝子を切り出し、ｐＤＲベクターにライゲートし、キメラ軽鎖発現ベクターｐＤＲ-ＣＤ２０ＶLＣLを得た。
【０１２８】
７．融合タンパク質の発現および精製。３つの異なる融合タンパク質を実施例４に記載するように発現および精製した。
【０１２９】
実施例６  ｈｅｒ２／ＦＬ二元機能融合タンパク質の構築
１．抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２の可変領域遺伝子の合成。組換えヒト化抗ＨＥＲ２抗体（ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、ハーセプチン）の可変領域ｃＤＮＡの合成を実施例１に記載するように、Carterら, Proc Natl Acad Sci USA, 89: 4285 (1992)にか開示される配列を使用して行った。ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲルで分離した。正しいＤＮＡフラグメントをゲル精製し、ｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローニングし、その配列を確認した。抗ｈｅｒ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９および５０（図３１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１および５２（図３２）に示す。本実施例では、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２軽鎖（ＶL）および重鎖（ＶH）ベクターのためのクローンをそれぞれｐＧＥＭ-Ｔ／ｈｅｒ２ＨおよびｐＧＥＭ-Ｔ／ｈｅｒ２Ｌで表す。
【０１３０】
２．キメラ抗体発現ベクターの構築。ＰＣＲ法を使用して、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩ部位を重鎖可変領域遺伝子（ＶH）の５’末端に、ＮｈｅＩ部位を３’末端に付加した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ-Ｔベクターにクローニングし、その配列を確認した。ＥｃｏＲＶおよびＮｈｅＩ消化によってＶHを切り出し、ヒトγ-１不変領域遺伝子（ＣH）を含有するｐＡＨ４６０４ベクターのＥｃｏＲＶ／ＮｈｅＩ部位に挿入した。得られたｐＡＨ４６０４-ＶHベクターをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで開裂し、齧歯動物／ヒトキメラ抗体重鎖遺伝子を含む３．３ｋｂのフラグメントをｐＤＲベクターにクローニングし、キメラ重鎖発現ベクターｐＤＲ-ｈｅｒ２ＶHＣHを得た。抗ｈｅｒ２ヒト化重鎖（ｈｅｒ２ＶHＣH）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３および５４に示す（図３３）。
【０１３１】
ヒトκ鎖不変領域ｃＤＮＡ（ＣL）をｐＡＧ４６２２由来の０．３ｋｂ  ＰＣＲ産物として得た。オーバーラップＰＣＲ法により、ヒト化軽鎖可変領域遺伝子（ＶL）をＣLの５’末端に融合させた。得られたヒト化軽鎖遺伝子（ＶLＣL）は開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有した。次いでヒト化軽鎖をｐＧＥＭ-Ｔベクター遺伝子にクローニングし、その配列を確認した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によってＶLＣL遺伝子を切り出し、ｐＤＲベクターにライゲートし、ヒト化軽鎖発現ベクターｐＤＲ-ｈｅｒ２ＶLＣLを得た。抗ｈｅｒ２ヒト化軽鎖（ｈｅｒ２ＶLＣL）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５および５６に示す（図３４）。
【０１３２】
３．Ｈｅｒ２Ｆｖ／Ｆｃ／ＦＬの構築。ヒトＦｌｔ３リガンド細胞外領域（ｈＦＬｅｘ）のｃＤＮＡをｐＧＥＭ-Ｔ／ｈＦｌｅｘ由来の５００ｂｐ  ＰＣＲ増幅フラグメントとして得た。オーバーラップＰＣＲ法によってＦＬｅｘ遺伝子をｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２重鎖遺伝子の３’末端に融合させた。得られた融合遺伝子のＰＣＲ産物は開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有した。次いで産物をｐＧＥＭ-Ｔベクターにクローニングし、その配列を確認した。Ｈｅｒ２／Ｆｖ／Ｆｃ／ＦＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７および５８（図３５）に示す。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によってＨｅｒ２／Ｆｖ／Ｆｃ／ＦＬ融合遺伝子を切り出し、ｐＤＲベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、融合遺伝子発現ベクターｐＤＲ-Ｈｅｒ２／Ｆｖ／Ｆｃ／ＦＬを得た。
【０１３３】
４．Ｈｅｒ２ＶH／Ｆｖ／Ｆｃ／ＦＬの構築。ヒトＦｌｔ３リガンド細胞外領域（ｈＦＬｅｘ）のｃＤＮＡをｐＧＥＭ-Ｔ／ｈＦｌｅｘ由来の５００ｂｐ  ＰＣＲ増幅フラグメントとして得た。オーバーラップＰＣＲ法によってｈＦＬｅｘ遺伝子をｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２重鎖遺伝子の３’末端にリンカー遺伝子を介して融合させた。リンカーペプチドのアミノ酸配列は（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3である。最終的なＰＣＲ産物は開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有した。次いで産物をｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローニングし、その配列を確認した（図３６のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９および６０）。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によってＨｅｒ２ＶH／Ｆｖ／Ｆｃ／ＦＬ融合遺伝子を切り出し、ｐＤＲベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、融合遺伝子発現ベクターｐＤＲ-Ｈｅｒ２ＶH／Ｆｖ／Ｆｃ／ＦＬを得た。
【０１３４】
５．ＦＬ／Ｆｃ／ＨＥＲ２Ｆｖの構築。ヒトＦｌｔ３リガンド細胞外領域＋シグナルペプチドのｃＤＮＡをｐＧＥＭ-Ｔ／ｈＦｌｅｘ由来の５５０ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントとして得た。ｈＦＬｅｘ  ＰＣＲ産物は５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位、次いで発現を促進するＫｏｚａｋ配列を含有した。ヒトＩｇＧ１のｃＤＮＡ（ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３）をｐＧＥＭ-Ｔ／ＩｇＦｃからＰＣＲによって増幅させた。オーバーラップＰＣＲ法によりＦｌｅｘ遺伝子をヒトＩｇＧ１  ｃＤＮＡの５’末端に融合させ、ＦＬ／Ｆｃ融合遺伝子を生成した。
【０１３５】
オーバーラップＰＣＲ法によってｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２重鎖可変領域のｃＤＮＡを軽鎖可変領域遺伝子の５’末端にリンカー遺伝子を介して融合させ、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２  １本鎖抗体（ＳｃＦｖ）遺伝子を生成した。リンカーペプチドのアミノ酸配列は（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3である。次いでオーバーラップＰＣＲ法によってＦＬ／Ｆｃ融合遺伝子をｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２  ＳｃＦｖ遺伝子の５’末端に融合させ、ＦＬ／Ｆｃ／ＨＥＲ２Ｆｖ融合遺伝子を生成した。ＦＬ／Ｆｃ／ＨＥＲ２Ｆｖ融合遺伝子のＰＣＲ産物は５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有した。次いで産物をｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローニングし、その配列を確認した（図３７のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１および６２）。その後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によって融合遺伝子を切り出し、ｐＤＲベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、融合遺伝子発現ベクターｐＤＲ-ＦＬ／Ｆｃ／ＨＥＲ２Ｆｖを得た。ＦＬ／Ｆｃ／ＨＥＲ２Ｆｖ融合遺伝子の図式を図３８に示す。
【０１３６】
６．ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２キメラ軽鎖発現ベクターの構築。ヒトκ鎖不変領域のｃＤＮＡ（ＣL）をｐＡＧ４６２２由来の０．３ｋｂ  ＰＣＲ産物として得た。オーバーラップＰＣＲ法により、ＳＭ５-１の軽鎖可変領域遺伝子（ＶL）をＣLの５’末端に融合させた。得られたキメラ軽鎖遺伝子（ＶLＣL）は開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有した。次いで産物をｐＧＥＭ-Ｔベクターにクローニングし、その配列を確認した（図３４のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５および５６）。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によってＶLＣL遺伝子を切り出し、同じ制限酵素で開裂したｐＤＲベクターにライゲートし、キメラ軽鎖発現ベクターｐＤＲ-ＨＥＲ２ＶLＣLを得た。
【０１３７】
７．融合タンパク質の発現および精製。３つの異なる融合タンパク質を実施例４に記載するように発現および精製した。
【０１３８】
実施例７  ｈＦＬ／Ｔｒａｉｌ融合タンパク質の構築
１．ｈＦＬｅｘ／Ｔｒａｉｌｅｘ融合タンパク質の構築。使用したヒトＦｌｔ３リガンド遺伝子のｃＤＮＡ配列はGenbank登録番号HSU37518である。ヒトＴｒａｉｌの細胞外ドメインｃＤＮＡ（アミノ酸残基９５-２８１）を実施例１に記載するように合成した。ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲルで分離した。正しいＤＮＡフラグメントをゲル精製し、ｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローニングし、その配列を確認した。同クローンをｐＧＥＭ-Ｔ／ｈＴｒａｉｌで表す。
【０１３９】
ヒトＦＬｅｘ  ｃＤＮＡをｐＧＥＭ-Ｔ／ｈＦｌｅｘ由来の５５０ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントとして得た。オーバーラップＰＣＲによってｈＦＬｅｘ遺伝子をＴｒａｉｌex遺伝子（Pittiら, J. Biol. Chem. 271: 12687-90 (1996)）の５’末端にリンカー遺伝子を介して融合させた。リンカーペプチドのアミノ酸配列は（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）である。融合遺伝子のＰＣＲ産物は開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有した。次いで産物をｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローニングし、その配列を確認した（図３９のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３および６４）。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によってｈＦＬｅｘ／Ｔｒａｉｌｅｘ融合遺伝子フラグメントを切り出し、ｐＤＲベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。ｈＦＬｅｘ／Ｔｒａｉｌｅｘ融合遺伝子の図式を図４０に示す。
【０１４０】
リポフェクタミン２０００試薬（Gibco  BRL）を使用し、製造者の説明書に従って、好適なｐＤＲ-ｈＦＬｅｘ／Ｔｒａｉｌｅｘ発現ベクターをＣＨＯｄｈｆｒ-細胞にトランスフェクトした。次いで、ＭＴＸを１．０μＭまで段階的に濃度を増加させて含有するＧＨＴ未含有ＤＭＥＭ培地中で、トランスフェクトした細胞を選択した。薬剤耐性クローンを選別し、増殖させて更なる分析を行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ（ヤギ抗ヒトＴｒａｉｌｅｘを捕捉抗体、ヤギ抗ヒトＦＬｅｘ-ＨＲＰを検出抗体として使用）により、融合タンパク質の生成について、細胞クローンからの培養液上清を分析した。最も多量の融合タンパク質を産生するクローンを選択し、血清未含有培地中で増殖させた。その後、アフィニティークロマトグラフィー（セファロース-４Ｂに固定化させたヤギ抗ヒトｔｒａｉｌ抗体）でｈＦＬｅｘ／Ｔｒａｉｌｅｘ融合タンパク質を血清未含有培地上清から精製した。
【０１４１】
２．ｈＦＬｅｘ／ＩＺ／Ｔｒａｉｌｅｘ融合タンパク質の構築。オーバーラップＰＣＲにより、イソロイシン・ジッパー（isoleucine zipper；ＩＺ）をコードするＤＮＡ配列を介してｈＦＬｅｘ遺伝子をＴｒａｉｌｅｘ遺伝子の５’末端に融合させた。Harbury ら, Science, 1993, 262: 1401 (1993)参照。融合遺伝子ＰＣＲ産物は開始コドンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ部位を含有した。次いで産物をｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローニングし、その配列を確認した（図４１のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５および６６）。最後に実施例７．１に記載するｈＦＬｅｘ／Ｔｒａｉｌｅｘ融合遺伝子と同じ方法で、ｈＦＬｅｘ／ＩＺ／Ｔｒａｉｌｅｘ融合遺伝子を発現ベクターｐＧＳにクローニングした。実施例７．１に記載するように融合タンパク質の発現および精製を行った。
【０１４２】
３．ｈＦＬｅｘ／Ｆｃ／Ｔｒａｉｌｅｘ融合タンパク質の構築。ヒトＦｌｔ３リガンド細胞外領域＋シグナルペプチドのｃＤＮＡをｐＧＥＭ-Ｔ／ｈＦｌｅｘ由来の５５０ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントとして得た。ｈＦＬｅｘのＰＣＲ産物は５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位、次いで発現を促進するＫｏｚａｋ配列を含有した。ヒトＩｇＧ１のｃＤＮＡ（ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３）をｐＧＥＭ-Ｔ／ＩｇＦｃからＰＣＲによって増幅させた。オーバーラップＰＣＲ法によりＦｌｅｘ遺伝子をヒトＩｇＧ１  ｃＤＮＡの５’末端に融合させ、ｈＦＬｅｘ／Ｆｃ融合遺伝子を生成した。
【０１４３】
ＰＣＲ増幅によってヒトＴｒａｉｌの細胞外ドメインのｃＤＮＡ（Ｔｒａｉｌｅｘ）をｐＧＥＭ-Ｔ／ｈＴｒａｉｌから得た。Ｔｒａｉｌｅｘ  ＰＣＲフラグメントは３’末端にＥｃｏＲＩ部位を含有した。既に得られていたｈＦＬｅｘ／Ｆｃ融合遺伝子を、オーバーラップＰＣＲ法によってＴｒａｉｌｅｘ遺伝子の５’末端に融合させた。最終のＰＣＲ産物を精製し、ｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローニングして配列を確認した（図４２のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７および６８）。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によってｈＦＬｅｘ／Ｆｃ／Ｔｒａｉｌｅｘ融合遺伝子フラグメントを切り出し、同じ制限酵素で開裂したｐＤＲベクターに挿入した。ｈＦＬｅｘ／Ｆｃ／Ｔｒａｉｌｅｘ融合遺伝子の図式を図４３に示す。
【０１４４】
リポフェクタミン２０００（Gibco  BRL）を使用し、製造者の説明書に従って、好適なｐＤＲ-ｈＦＬｅｘ／Ｆｃ／Ｔｒａｉｌｅｘ発現ベクターをＣＨＯｄｈｆｒ-細胞にトランスフェクトした。次いで、ＭＴＸを１．０μＭまで段階的に濃度を増加させて含有するＧＨＴ未含有ＤＭＥＭ培地中で、トランスフェクトした細胞を選択した。薬剤耐性クローンを選別し、増殖させて更なる分析を行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ（ヤギ抗ヒトＴｒａｉｌを捕捉抗体、ヤギ抗ヒトＦＬ-ＨＲＰを検出抗体として使用）により、融合タンパク質の生成について細胞クローンからの培養液上清を分析した。最も多量の融合タンパク質を産生するクローンを選択し、血清未含有培地中で増殖させた。その後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーでｈＦＬｅｘ／Ｆｃ／Ｔｒａｉｌｅｘ融合タンパク質を血清未含有培地上清から精製した。
【０１４５】
実施例８-１６において、ｃｈＳＭ／ＦＬ、ＳＭ／ＦＬ、ｈｕＳＭ／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、ｈｅｒ２／ＦＬ、Ｔｒａｉｌ／ＦＬはそれぞれＦＬ／Ｆｃ／ｃｈＳＭＦｖ、ＦＬ／Ｆｃ／ｈｕＳＭＦｖ、ＦＬ／Ｆｃ／ＣＤ２０Ｆｖ、ＦＬ／Ｆｃ／ＨＥＲ２Ｆｖ、およびｈＦＬｅｘ／ＩＺ／Ｔｒａｉｌｅｘを表す。
【０１４６】
実施例８  ｃｈＳＭ／ＦＬ（ＦＬ／Ｆｃ／ｃｈＳＭＦｖ）およびｈｕＳＭ／ＦＬ（ＦＬ／Ｆｃ／ｈｕＳＭＦｖ）二元機能融合タンパク質のキャラクタリゼーション
１．インビトロにおけるヒト臍帯血ＣＤ３４+細胞の増殖に対するＳＭ／ＦＬの影響。ヒト臍帯血由来のＣＤ３４+細胞を、免疫磁気ビーズ（Pharmacia）を使用し、製造者の説明書に従って単離した。ＣＤ３４+細胞の純度をフローサイトメトリーで分析した。培地は１０％  スクリーニング済（prescreened）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Hyclone, Logan, UT）存在中の０．４％アガロースまたは０．３％寒天培地とし、これを用いてインビトロにおけるＳＭまたはＳＭ融合タンパク質の非存在下および存在下でのＧＭ-ＣＳＦ、ＩＬ-３、Ｇ-ＣＳＦ、ＳＣＦ、またはＣＳＦ-１に応答するＣＦＵ-ＧＭ、ＣＦＵ-Ｇ、ＯＦ  ＣＵＲ-Ｍコロニーの評価を行った。細胞を５％  ＣＯ2中、３７℃でインキュベートし、培地の半量を週１回、培養開始時に交換した。１４日目に各群のＣＤ３４+細胞のクローン数を計数した。
【０１４７】
結果（図４４）はＳＭ／ＦＬがＦＬと同様にＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する能力を有することを示している。
【０１４８】
２．インビボにおけるｃｈＳＭ／ＦＬおよびｈｕＳＭ／ＦＬのＮＫおよびＤＣ細胞に対する影響。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはExperimental Animal Center (Shanghai, China)から購入した。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ３、ＰＥコンジュゲート抗ＮＫ１．１、およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ１１ｃを購入した（R&DまたはSigma）。
【０１４９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに０、３、６、８、１０、１２、１５、または１８日間、１日１回、１０μｇのｃｈＳＭ／ＦＬおよびｈｕＳＭ／ＦＬまたはＦＬを腹膜内注射した。最後の注射の２４時間後にマウスを殺処分した。骨髄、脾臓、および肝臓を回収し、単一の細胞懸濁液を調製した。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ３およびＰＥコンジュゲート抗ＮＫ１．１で二色染色してＮＫ細胞を同定した。細胞をＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ１１ｃで染色してＤＣ細胞を同定した。フローサイトメトリー分析を実施してＮＫおよびＤＣ細胞のパーセンテージを評価した。各臓器におけるＮＫおよびＤＣ細胞の絶対数を図４５に示す。
【０１５０】
結果は、ＳＭ／ＦＬ二元機能タンパク質が脾臓、肝臓、および骨髄においてＦＬに匹敵するＮＫおよびＤＣ細胞の増殖誘導能力を有することを示している。ＮＫおよびＤＣ細胞の数は１０から１３日目でピークとなり、そのピークは３から４日間続いた。これはＳＭ／ＦＬが癌治療にかなりの可能性を有していることを示唆している。
【０１５１】
３．腫瘍細胞増殖に対するＳＭ／ＦＬ二元機能融合タンパク質の阻害効果
細胞系（Ｈｅｐａｌ-６、Ｂ１６）をＡＴＣＣから得た。細胞系Ｈｅｐａｌ-６にｐ２３０遺伝子をトランスフェクトしてＨｅｐａｌ-６／２３０細胞系を創製した。細胞Ｂ１６にｐ２３０遺伝子をトランスフェクトしてＢ１６ｐ２３０細胞系を創製した。フローサイトメトリー分析を行ったところ、ｐ２３０は細胞系Ｈｅｐａｌ-６／２３０およびＢ１６ｐ２３０の細胞表面で高度に発現されていた。対数増殖期の細胞（ＳＭＭＵ、Ｂ１６ｐ２３０、Ｈｅｐａｌ-６ｐ２３０、またはＲａｊｉ）を０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで消化した後、１％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１６４０／ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに再懸濁し、６ｘ１０4細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を９６ウェルプレートに添加し（１００ｕｌ／ウェル）、ｃｈＳＭ／ＦＬまたはｈｕＳＭ／ＦＬの連続希釈液と共に７％ＣＯ2中、３７℃で７日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ（Promega）を使用し、製造者の説明書に従って３つの腫瘍細胞系の増殖を測定した。図４６に示す結果は、ｃｈＳＭ／ＦＬおよびｈｕＳＭ／ＦＬがＳＭＭＵ、Ｂ１６ｐ２３０、Ｈｅｐａｌ-６ｐ２３０腫瘍細胞の増殖を有効に阻害するが、コントロール細胞（Ｒａｊｉ細胞）の増殖は阻害しないことを示している。これはＳＭ／ＦＬの阻害効果がこれら３つの腫瘍細胞に特異的であることを示唆している。
【０１５２】
４．インビトロにおけるｃｈＳＭ／ＦＬおよびｈｕＳＭ／ＦＬの抗腫瘍活性。細胞系（ＳＫ-ＢＲ-３、ＱＹＣ）をInternational Joint Cancer Institute (Shanghai, China)から得た。細胞系（Ｈｅｐａｌ-６、Ｂ１６）をＡＴＣＣから得た。細胞系Ｈｅｐａｌ-６にｐ２３０遺伝子をトランスフェクトし、Ｈｅｐａｌ-６／２３０細胞系を創製した。細胞Ｂ１６にｐ２３０遺伝子をトランスフェクトし、Ｂ１６ｐ２３０細胞系を創製した。フローサイトメトリー分析を行ったところ、ｐ２３０は細胞系Ｈｅｐａｌ-６／２３０およびＢ１６ｐ２３０の細胞表面で高度に発現されていた。
【０１５３】
対数増殖期の細胞（Ｈｅｐａｌ-６、Ｂ１６、Ｈｅｐａｐ２３０、またはＢ１６ｐ２３０）を０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで消化した後、１０％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１６４０／ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに再懸濁し、６ｘ１０4細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を９６ウェルプレートに添加し（１００ｕｌ／ウェル）、ｃｈＳＭ／ＦＬまたはｈｕＳＭ／ＦＬの連続希釈液と共に７％ＣＯ2中、３７℃で７日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ（Promega）を使用し、製造者の説明書に従って腫瘍細胞系の増殖を測定した。図４７に示す結果はｃｈＳＭ／ＦＬおよびｈｕＳＭ／ＦＬがＨｅｐａｐ２３０およびＢ１６ｐ２３０腫瘍細胞の増殖を有効に阻害することを示している。Ｈｅｐａｌ-６およびＢ１６の増殖は融合タンパク質によって阻害されなかった。
【０１５４】
実施例９  インビトロにおけるＨｅｒ２／ＦＬ（ＦＬ／Ｆｃ／ＨＥＲ２Ｆｖ）、ＣＤ２０／ＦＬ（ＦＬ／ＦｃＣＤ２０Ｆｖ）、およびＴｒａｉｌ／ＦＬ（ｈＦｌｅｘ／ＩＺ／Ｔｒａｉｌｅｘ）のキャラクタリゼーション
この実験で、インビトロにおける３つの二元機能融合タンパク質、Ｈｅｒ２／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、およびＴｒａｉｌ／ＦＬによる腫瘍細胞に対する腫瘍阻害効果を評価した。結果はＨｅｒ２／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、およびＴｒａｉｌ／ＦＬがそれぞれハーセプチン、リツキシマブ、およびＴｒａｉｌと同様の有効な腫瘍阻害活性を有することを示した。
【０１５５】
１．腫瘍細胞増殖に対するＨｅｒ２／ＦＬ二元機能融合タンパク質の阻害効果。細胞系SK-ＢＲ-３をInternational Joint Cancer Institute (Shanghai, China)から得た。細胞系ＢＴ-４７４、Ｄ２Ｆ２、４Ｔ１をＡＴＣＣから得た。細胞系Ｄ２Ｆ２にヒトｈｅｒ２遺伝子をトランスフェクトし、Ｄ２Ｆ２／Ｅ２細胞系を創製した。細胞系４Ｔ１にｈｅｒ２遺伝子をトランスフェクトして４Ｔ１ｈｅｒ２細胞系を創製した。フローサイトメトリー分析を行ったところ、ｈｅｒ２抗原は細胞系Ｄ２Ｆ２／Ｅ２および４Ｔ１ｈｅｒ２の細胞表面で高度に発現されていた。
【０１５６】
２．対数増殖期の細胞（SK-ＢＲ-３、ＢＴ-４７４、Ｄ２Ｆ２、４Ｔ１、Ｄ２Ｆ２／Ｅ２、または４Ｔ１ｈｅｒ２）を０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで消化した後、１％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１６４０／ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに再懸濁し、６ｘ１０4細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を９６ウェルプレートに添加し（１００ｕｌ／ウェル）、ｈｅｒ２／ＦＬ融合タンパク質またはポジティブコントロール、ハーセプチンの連続希釈液と共に７％ＣＯ2中、３７℃で７日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ（Promega）を使用し、製造者の説明書に従って腫瘍細胞系の増殖を測定した。融合タンパク質またはハーセプチンのＥＤ50値を４変数演算Ｙ＝（Ａ-Ｂ）／［１＋（Ｘ／Ｃ）D］＋Ｂを使用して算出した。図４８に示す結果はｈｅｒ２／ＦＬおよびハーセプチンがSK-ＢＲ-３、ＢＴ-４７４、Ｄ２Ｆ２／ｈｅｒ２、および４Ｔ１／ｈｅｒ２腫瘍細胞の増殖を有効に阻害することを示している。Ｄ２Ｆ２および４Ｔ１細胞の増殖は融合タンパク質またはハーセプチンによって阻害されなかった。
【０１５７】
３．腫瘍細胞に対するＨｅｒ２／ＦＬ融合タンパク質の細胞障害性。細胞系SK-ＢＲ-３をInternational Joint Cancer Institute (Shanghai, China)から得た。細胞系ＢＴ-４７４、Ｄ２Ｆ２、４Ｔ１をＡＴＣＣから得た。細胞系Ｄ２Ｆ２にヒトｈｅｒ２遺伝子をトランスフェクトし、Ｄ２Ｆ２／Ｅ２細胞系を創製した。細胞系４Ｔ１ｈｅｒ２はヒトｈｅｒ２遺伝子をトランスフェクトした細胞系４Ｔ１である。フローサイトメトリー分析を行ったところ、ｈｅｒ２抗原は細胞系Ｄ２Ｆ２／Ｅ２および４Ｔ１ｈｅｒ２の細胞表面で高度に発現されていた。
【０１５８】
対数増殖期の細胞（SK-ＢＲ-３、ＢＴ-４７４、Ｄ２Ｆ２、４Ｔ１、Ｄ２Ｆ２／Ｅ２、または４Ｔ１ｈｅｒ２）を０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで消化した後、１％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１６４０／ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに再懸濁し、６ｘ１０4細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を９６ウェルプレートに添加し（１００ｕｌ／ウェル）、Ｈｅｒ２／ＦＬ融合タンパク質またはポジティブコントロール（ハーセプチン）の連続希釈液と共に７％ＣＯ2中、３７℃で７日間インキュベートした。ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞障害性アッセイ（Promega）を使用し、製造者の説明書に従ってＨｅｒ２／ＦＬおよびハーセプチンの細胞障害性を測定した。融合タンパク質またはハーセプチンのＥＤ50値を４変数演算を使用して算出した。図４９に示す結果はｈｅｒ２／ＦＬおよびハーセプチンがSK-ＢＲ-３、ＢＴ-４７４、Ｄ２Ｆ２／Ｅ２、および４Ｔ１ｈｅｒ２腫瘍細胞の溶解を効果的に誘導することを示している。Ｄ２Ｆ２および４Ｔ１細胞の溶解はｈｅｒ２／ＦＬまたはハーセプチンのいずれでも誘導されなかった。
【０１５９】
４．腫瘍細胞に対するＣＤ２０／ＦＬ融合タンパク質の細胞障害性。細胞系ＲａｊｉをＡＴＣＣから得た。対数増殖期のＲａｊｉ細胞を１０％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１６４０／ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに再懸濁し、２ｘ１０5細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を９６ウェルプレートに添加し（１００ｕｌ／ウェル）、ＣＤ２０／ＦＬ融合タンパク質またはポジティブコントロール（リツキシマブ）の連続希釈液と共に７％ＣＯ2中、３７℃で７日間インキュベートした。ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞障害性アッセイ（Promega）を使用し、製造者の説明書に従ってＣＤ２０／ＦＬおよびリツキシマブの細胞障害性を測定した。図５０に示す結果は、ＣＤ２０／ＦＬおよびリツキシマブがＲａｊｉ腫瘍細胞を効果的に死滅させることを示している。
【０１６０】
５．腫瘍細胞増殖に対するＴｒａｉｌ／ＦＬ二元機能融合タンパク質の阻害効果。細胞系Ｌ９２９、ＭＤＡ-ＭＢ-２３１およびＵ-１３８ＭＧをＡＴＣＣから得た。細胞系ＲｅｎｃａをKorea Cancer Instituteから得た。対数増殖期の細胞（Ｌ９２９、ＭＤＡ-ＭＢ-２３１またはＲｅｎｃａ）を０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで消化した後、１％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１６４０／ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに再懸濁し、５ｘ１０5細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を９６ウェルプレートに添加し（１００ｕｌ／ウェル）、Ｔｒａｉｌ／ＦＬ融合タンパク質またはポジティブコントロール（Ｔｒａｉｌ）の連続希釈液と共に７％ＣＯ2中、３７℃で１２時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ（Promega）を使用し、製造者の説明書に従って腫瘍細胞の増殖を測定した。図５１に示す結果はＴｒａｉｌ／ＦＬがＴｒａｉｌと同様にＬ９２９、ＭＤＡ-ＭＢ-２３１、およびＲｅｎｃａ腫瘍細胞の増殖を阻害することを示している。Ｔｒａｉｌ／ＦＬまたはＴｒａｉｌはいずれもネガティブコントロール細胞Ｕ-１３８ＭＧの増殖を阻害しなかった。これはＴｒａｉｌ／ＦＬおよびＴｒａｉｌの阻害効果が特異的であることを示している。
【０１６１】
６．Ｔｒａｉｌ／ＦＬ融合タンパク質の細胞障害性。対数増殖期のＬ９２９およびＵ-１３８ＭＧ細胞を０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで消化した後、１０％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１６４０／ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに再懸濁し、５ｘ１０5細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を９６ウェルプレートに添加し（１００ｕｌ／ウェル）、Ｔｒａｉｌ／ＦＬ融合タンパク質またはポジティブコントロール（Ｔｒａｉｌ）の連続希釈液と共に７％ＣＯ2中、３７℃で１４または１６時間インキュベートした。ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞障害性アッセイ（Promega）を使用し、製造者の説明書に従ってＴｒａｉｌ／ＦＬおよびＴｒａｉｌの細胞障害性を測定した。融合タンパク質またはハーセプチンのＥＤ50値を４変数演算を使用して算出した。図５２に示す結果はＴｒａｉｌ／ＦＬおよびＴｒａｉｌがＬ９２９細胞の溶解を効果的に誘導することを示している。コントロール（Ｕ-１３８ＭＧ）細胞の溶解はＴｒａｉｌ／ＦＬまたはＴｒａｉｌのいずれでも誘導されなかった。
【０１６２】
実施例１０  インビボにおけるｃｈＳＭ／ＦＬおよびｈｕＳＭ／ＦＬの抗腫瘍活性
これらの実験で使用したタンパク質には以下がある：ＳＭ５-１キメラ抗体（ｃｈＳＭ）；ＳＭ５-１ヒト化抗体（ｈｕＳＭ）；ｃｈＳＭ／ＦＬ二元機能融合タンパク質；ｈｕＳＭ／ＦＬ二元機能融合タンパク質；抗ＣＤ３キメラ抗体-ＦＬ融合タンパク質（ｃｈＣＤ３／ＦＬ）；抗ＣＤ３ヒト化抗体-ＦＬ融合タンパク質（ｈｕＣＤ３／ＦＬ）。
【０１６３】
メスＣ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６、Ｈｅｐａｌ-６、Ｂ１６ｐ２３０、またはｈｅｐａｐ２３０腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍の直径が0.5cmに達した時点で、マウスを無作為に１０匹ずつ７群に分けた。６群のマウスに、ｃｈＣＤ３／ＦＬ、ｈｕＣＤ３／ＦＬ、ｃｈＳＭ、ｈｕＳＭ、ｃｈＳＭ／ＦＬ、またはｈｕＳＭ／ＦＬの静脈注射を４ｍｇ／ｋｇ／週の用量で連続６週間行った。ＰＢＳを静脈注射したマウスの群をネガティブコントロール群とした。処理後、腫瘍の退縮を観察した。
【０１６４】
実験結果（表３）はｃｈＳＭ、ｈｕＳＭ、ｃｈＳＭ／ＦＬ、およびｈｕＳＭ／ＦＬがｐ２３０抗原を発現する腫瘍の退縮を効果的に誘導することを示している。ＦＬ融合タンパク質はｃｈＳＭまたはｈｕＳＭ抗体の抗腫瘍活性を有意に向上した。
【０１６５】
【表３】
2007515946.tif 000004
【０１６６】
実施例１１  インビボにおけるｃｈＳＭ／ＦＬおよびｈｕＳＭ／ＦＬによって誘導される特異的腫瘍免疫応答
これらの実験に使用されたタンパク質には以下がある：ＳＭ５-１キメラ抗体（ｃｈＳＭ）；ＳＭ５-１ヒト化抗体（ｈｕＳＭ）；ｃｈＳＭ／ＦＬ二元機能融合タンパク質；ｈｕＳＭ／ＦＬ二元機能融合タンパク質；抗ＣＤ３キメラ抗体-ＦＬ融合タンパク質（ｃｈＣＤ３／ＦＬ）；および抗ＣＤ３ヒト化抗体-ＦＬ融合タンパク質（ｈｕＣＤ３／ＦＬ）。
【０１６７】
メスＣ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６ｐ２３０またはｈｅｐａｐ２３０腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍の直径が0.5cmに達した時点で、マウスを無作為に８匹ずつ７群に分けた。６群のマウスに、ｃｈＳＭ、ｈｕＳＭ、ＦＬと組み合わせたｃｈＳＭ、ＦＬと組み合わせたｈｕＳＭ、ｃｈＳＭ／ＦＬ、またはｈｕＳＭ／ＦＬの静脈注射を４ｍｇ／ｋｇ／週の用量で連続６週間行った。ＰＢＳを静脈注射したマウスの群をネガティブコントロール群とした。処理後、腫瘍の退縮を観察した。
【０１６８】
実験結果（表４）は、ＦＬと組み合わせたｃｈＳＭ（またはｈｕＳＭ）の投与からはｃｈＳＭ（またはｈｕＳＭ）単独より高い抗腫瘍活性が得られることを示している。この試験で二元機能融合タンパク質ｃｈＳＭ（またはｈｕＳＭ）はこの試験で最も強い抗腫瘍活性を示した。
【０１６９】
【表４】
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【０１７０】
融合タンパク質によって誘導された腫瘍退縮によって活性抗腫瘍免疫応答が起こるのかどうかを確認するために、マウス（例えば融合タンパク質を静脈注射したもの）に腫瘍細胞の親株（例えばＢ１６ｐ２３０またはｈｅｐａｐ２３０細胞のいずれか）を再び皮下接種して攻撃感染させた。接種後、腫瘍の退縮を観察した。結果（表５）はｃｈＳＭまたはｈｕＳＭが活性抗腫瘍免疫応答を誘導しないことを示している。しかしながら、ｃｈＳＭ／ＦＬおよびｈｕＳＭ／ＦＬは共に親腫瘍に対する活性抗腫瘍免疫応答を誘導し、腫瘍細胞の第２の攻撃感染から腫瘍の増殖は起こらなかった。
【０１７１】
【表５】
2007515946.tif 000006
【０１７２】
上記の実験で観察された抗腫瘍免疫応答の特異性を確認するために、融合タンパク質処理で退縮したＢ１６ｐ２３０腫瘍を有するマウスにＢ１６またはｈｅｐａｌ-６腫瘍細胞を攻撃感染した。融合タンパク質処理後に退縮したｈｅｐａｐ２３０腫瘍を有するマウスに再びｈｅｐａｌ-６またはＢ１６を皮下注射して攻撃感染した。処理後、腫瘍の退縮を観察した。結果（表５）は、Ｂ１６ｐ２３０腫瘍の退縮が誘導されたマウスにおいてＢ１６腫瘍は排除されたが、Ｂ１６ｐ２３０腫瘍の退縮が誘導されたマウスにおいてｈｅｐａｌ-６腫瘍は漸進的に増加することを示している。他の実験で、ｈｅｐａｐ２３０腫瘍の退縮が誘導されたマウスにおいてｈｅｐａｌ-６腫瘍は排除されたが、Ｂ１６は漸進的に増殖した。これらの結果から、二元機能融合タンパク質によって誘導される抗腫瘍免疫応答は攻撃感染によって得られる腫瘍に特異的であることが明らかになった。
【０１７３】
実施例１２  インビボにおける  Ｈｅｒ２／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、Ｔｒａｉｌ／ＦＬ融合タンパク質の抗腫瘍活性
腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する他の抗体または分子にＦＬを融合することによって構築される二元機能融合タンパク質のインビボにおける抗腫瘍活性を研究するために、以下の実験を行った。実験結果から、抗ｈｅｒ２  ｍＡｂ、抗ＣＤ２０  ｍＡｂ、またはＴｒａｉｌにＦＬを融合させて構築される二元機能融合タンパク質は全て、腫瘍増殖に対して阻害性を有することが明らかになった。
【０１７４】
１．インビボにおけるｈｅｒ２／ＦＬの抗腫瘍活性。ヒト乳癌細胞系ＢＴ４７４をＡＴＣＣから得た。オスＢａｌｂ／ｃヌードマウスをExperimental Animal Center (Shanghai, China)から得た。
【０１７５】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに５ｘ１０6のＢＴ-４７４腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍の直径が0.5cmに達した時点で、マウスを無作為に１０匹ずつ実験群およびコントロール群に分けた。実験群のマウスに、ｈｅｒ２／ＦＬの静脈注射を１０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で連続６週間行った。コントロール群のマウスにはＰＢＳを静脈注射した。全ての動物について６週間、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。
【０１７６】
差異の統計分析を、スチューデントのｔ検定を用いて行った。結果（図５３）は、ｈｅｒ２／ＦＬ融合タンパク質での処理は非常に有意な抗腫瘍活性を有することを示している（ｐ＜０．０３８）。
【０１７７】
２．インビボにおけるＣＤ２０／ＦＬの抗腫瘍活性。細胞系ＲａｊｉをＡＴＣＣから得た。メスＢａｌｂ／ｃヌードマウスをExperimental Animal Center (Shanghai, China)から得た。
【０１７８】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに週１回で連続３週間、２ＧＹ照射を行った。その後、照射したヌードマウスに２ｘ１０7のＲａｊｉ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍の直径が0.5cmに達した時点で、マウスを無作為に１０匹ずつ実験群およびコントロール群に分けた。実験群のマウスに、ＣＤ２０／ＦＬの静脈注射を１０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で連続６週間行った。コントロール群のマウスにはＰＢＳを静脈注射した。全ての動物について６週間、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。
【０１７９】
差異の統計分析を、スチューデントのｔ検定を用いて行った。結果（図５４）は、ＣＤ２０／ＦＬ融合タンパク質での処理は非常に有意な抗腫瘍活性を有することを示している（ｐ＜０．０３）。
【０１８０】
３．インビボにおけるＴｒａｉｌ／ＦＬの抗腫瘍活性。ヒト肝細胞癌細胞系ＱＹＣをInternational Joint Cancer Institute (Shanghai, China)から得た。メスＢａｌｂ／ｃヌードマウスをExperimental Animal Center (Shanghai, China)から得た。
【０１８１】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに１ｘ１０7のＱＹＣ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍の直径が0.5cmに達した時点で、マウスを無作為に１０匹ずつ実験群およびコントロール群に分けた。実験群のマウスに、Ｔｒａｉｌ／ＦＬの静脈注射を１０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で連続６週間行った。コントロール群のマウスにはＰＢＳを静脈注射した。全ての動物について６週間、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。
【０１８２】
差異の統計分析を、スチューデントのｔ検定を用いて行った。結果（図５５）は、Ｔｒａｉｌ／ＦＬ融合タンパク質での処理は非常に有意な抗腫瘍活性を有することを示している（ｐ＜０．０３９）。
【０１８３】
実施例１３  ｈｅｒ２／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、およびＴｒａｉｌ／ＦＬによって誘導される特異的腫瘍免疫応答
１．ｈｅｒ２／ＦＬによって誘導される特異的腫瘍免疫応答。Ｂａｌｂ／ｃ由来のマウス乳癌細胞系Ｄ２Ｆ２、４Ｔ１をＡＴＣＣから得た。細胞系Ｄ２Ｆ２／Ｅ２はヒトｈｅｒ２遺伝子をトランスフェクトしたＤ２Ｆ２細胞系である。細胞系４Ｔ１ｈｅｒ２はｈｅｒ２遺伝子をトランスフェクトした４Ｔ１細胞系である。ｈｅｒ２抗原は細胞系Ｄ２Ｆ２／Ｅ２および４Ｔ１ｈｅｒ２の細胞表面で高度に発現された。Ｄ２Ｆ２／Ｅ２および４Ｔ１ｈｅｒ２腫瘍細胞系により、Ｂａｌｂ／ｃマウスに皮下腫瘍が発生した。マウスにおけるＤ２Ｆ２／Ｅ２および４Ｔ１ｈｅｒ２腫瘍の増殖は抗ｈｅｒ２  ｍＡｂによって有効に阻害された。
【０１８４】
メスＢａｌｂ／ｃマウスにＤ２Ｆ２、４Ｔ１、Ｄ２Ｆ２／Ｅ２、または４Ｔ１ｈｅｒ２腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍の直径が0.5cmに達した時点で、腫瘍細胞を接種したマウスを無作為に８匹ずつ５群に分けた。マウスに、ＦＬ、抗ｈｅｒ２  ｍＡｂ、ＦＬと組み合わせた抗ｈｅｒ２  ｍＡｂ、またはｈｕＳＭ／ＦＬの静脈注射を４ｍｇ／ｋｇ／週の用量で連続６週間行った。ＰＢＳを静脈注射したマウス群をコントロール群とした。全ての動物について６週間、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。
【０１８５】
実験結果（表６）は、二元機能融合タンパク質ｈｅｒ２／ＦＬが抗ｈｅｒ２  ｍＡｂに匹敵するＤ２Ｆ２／Ｅ２および４Ｔ１ｈｅｒ２増殖阻害能を有することを示している。
【０１８６】
融合タンパク質またはｍＡｂでの処理後にＤ２Ｆ２／Ｅ２または４Ｔ１ｈｅｒ２が退縮したマウスに親腫瘍細胞を再び皮下注射して攻撃感染した。全ての動物について６週間、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。結果（表６）は抗ｈｅｒ２  ｍＡｂが活性免疫応答の誘導に有効ではないことを示している。しかしながら、ｈｅｒ２／ＦＬは親腫瘍に対する活性な免疫応答を誘引した。
【０１８７】
【表６】
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【０１８８】
融合タンパク質ｍＡｂでの処理後にＤ２Ｆ２／Ｅ２が退縮したマウスにＤ２Ｆ２または４Ｔ１腫瘍細胞を再び皮下注射して攻撃感染した。融合タンパク質での処理後に４Ｔ１ｈｅｒ２腫瘍が退縮したマウスにＤ２Ｆ２または４Ｔ１腫瘍細胞を再び皮下注射して攻撃感染した。全ての動物について６週間、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。結果（表６）は、Ｄ２Ｆ２／Ｅ２腫瘍の退縮が誘導されたマウスではＤ２Ｆ２腫瘍が排除されたが、４Ｔ１腫瘍は漸進的に増殖することを示している。別の実験では、４Ｔ１ｈｅｒ２腫瘍の退縮が誘導されたマウスにおいて４Ｔ１腫瘍は排除されたが、Ｄ２Ｆ２は漸進的に増殖した。これらの結果から、二元機能融合タンパク質によって誘導される抗腫瘍免疫応答が腫瘍特異的であることが明らかになった。
【０１８９】
２．ＣＤ２０／ＦＬによって誘導される活性腫瘍免疫応答。細胞系Ａ２０をＡＴＣＣから得た。Ｄ２Ｆ２細胞系にヒトＣＤ２０遺伝子をトランスフェクトして細胞系Ａ２０／ＣＤ２０を創製した。フローサイトメトリー分析を行ったところ、ＣＤ２０抗原はＡ２０／ＣＤ２０細胞の表面で高度に発現されていた。Ａ２０／ＣＤ２０腫瘍細胞系により、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて皮下腫瘍が発生した。マウスにおけるＡ２０／ＣＤ２０腫瘍の増殖は、抗ＣＤ２０  ｍＡｂ処理で有効に阻害された。
【０１９０】
メスＢａｌｂ／ｃマウスに２ｘ１０6のＡ２０／ＣＤ２０腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍の直径が0.5cmに達した時点で、マウスを無作為に８匹ずつの群に分けた。マウスにＦＬ、抗ＣＤ２０  ｍＡｂ、ＦＬと組み合わせた抗ＣＤ２０  ｍＡｂ、またはＣＤ２０／ＦＬの静脈注射を４ｍｇ／ｋｇ／週の用量で連続６週間行った。ＰＢＳを静脈注射したマウス群をネガティブコントロール群とした。全ての動物について６週間、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。
【０１９１】
実験結果（表７）は、二元機能融合タンパク質ＣＤ２０／ＦＬが抗ＣＤ２０  ｍＡｂ処理に匹敵するＡ２０／ＣＤ２０腫瘍増殖阻害能を有することを示している。
【０１９２】
融合タンパク質またはｍＡｂでの処理後にＡ２０／ＣＤ２０腫瘍が退縮したマウスに再び親腫瘍細胞を皮下注射して攻撃感染した。全ての動物について６週間、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。結果（表７）は抗ＣＤ２０  ｍＡｂが活性な抗腫瘍免疫応答を誘導しなかったことを示している。しかしながら、ＣＤ２０／ＦＬは親腫瘍に対する活性免疫応答を誘引した。
【０１９３】
【表７】
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【０１９４】
３．Ｔｒａｉｌ／ＦＬによって誘導される活性腫瘍免疫応答。細胞系ＲｅｎｃａをKorea Cancer Instituteから得た。メスＢａｌｂ／ｃマウスにＲｅｎｃａ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍の直径が０．５ｃｍに達した時点で、マウスを無作為に８匹ずつの群に分けた。マウスにＦＬ、Ｔｒａｉｌ、ＦＬと組み合わせたＴｒａｉｌ、またはＴｒａｉｌ／ＦＬの静脈注射を４ｍｇ／ｋｇ／週の用量で連続６週間行った。ＰＢＳを静脈注射したマウス群をコントロール群とした。全ての動物について６週間、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。
【０１９５】
実験結果（表８）は二元機能融合タンパク質Ｔｒａｉｌ／ＦＬがＴｒａｉｌに匹敵するＲｅｎｃａ腫瘍増殖阻害能を有することを示している。
【０１９６】
融合タンパク質またはＴｒａｉｌでの処理後にＲｅｎｃａ腫瘍が退縮したマウスに再び親腫瘍細胞を皮下注射して攻撃感染した。全ての動物について６週間、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。結果（表８）はＴｒａｉｌが活性な免疫応答を有効に誘導しなかったことを示している。しかしながら、Ｔｒａｉｌ／ＦＬは親腫瘍に対する活性免疫応答を誘引した。
【０１９７】
【表８】
2007515946.tif 000009
【０１９８】
要約すると、本研究により、二元機能融合タンパク質はインビボにおいて腫瘍の退縮を誘導するだけでなく、その後の親腫瘍に対する強い活性をもつ抗腫瘍免疫応答も誘引することが明らかになった。
【０１９９】
実施例１４  腫瘍の免疫組織化学的分析
ＳＭ／ＦＬおよびｈＳＭ／ＦＬ融合タンパク質の機構を更に明らかにするために、融合タンパク質で処理したマウスについて腫瘍の免疫組織化学的分析を行った。これらの実験で、ほとんどの腫瘍細胞はｃｈＳＭ／ＦＬおよびｈｕＳＭ／ＦＬ融合タンパク質の投与後に死滅した。腫瘍の周辺にはＤＣ、ＮＫ、または他のリンパ球細胞が広範に浸潤しており、これはｃｈＳＭ／ＦＬおよびｈｕＳＭ／ＦＬ融合タンパク質によって腫瘍組織へのＤＣおよびＮＫ細胞の集合が起こり、腫瘍細胞の死滅が仲介または促進されることを示している。
【０２００】
１．接種および腫瘍増殖。これらの実験に使用した物質はリポフェクタミン２０００形質転換キット（Invitrogen）；ＨｅｐａＰ２３０細胞系を含む。
【０２０１】
Ｈｅｐａ／Ｐ２３０細胞を０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで消化し、２．７ｘ１０7細胞／ｍｌに調整した。Ｈｅｐａ／Ｐ２３０細胞を２００ｕｌの腫瘍細胞懸濁液としてＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下接種した。腫瘍の直径が0.5cmに達した時点で、ｃｈＳＭ／ＦＬの静脈注射を４ｍｇ／ｋｇ／週の用量で連続３週間行った。全ての動物について、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。処理後、腫瘍サンプルの免疫組織化学的分析を行った。
【０２０２】
２．免疫組織化学的分析（ＨＥ染色）。標準的な方法を用いてＨＥ染色による免疫組織化学的分析を行った。簡潔に記載すると、腫瘍サンプルを１０％ホルマリン中で２４時間固定化し、パラフィンに包埋した。その後４μｍ厚の切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。
【０２０３】
結果はＦＬの単独投与が腫瘍細胞の死滅に有意な有効性を有さないことを示した。しかしながら、ＳＭ５-１キメラまたはヒト化ｍＡｂをＦＬと組み合わせた場合、観察される細胞の死滅のレベルは上昇した。同時に、ＤＣ、ＮＫ、Ｔ細胞、およびＢ細胞を含むリンパ球の浸潤が腫瘍組織中およびその周辺に観察された。留意すべきことに、ＳＭ／ＦＬ融合タンパク質はインビボで腫瘍細胞の溶解を誘導し、それによって腫瘍塊へのリンパ球の広範な浸潤が起こるが、コントロール融合タンパク質（すなわち抗ＣＤ３ｍＡｂ／ＦＬ）ではこれが起こらなかった。
【０２０４】
これは、インビボにおいてＳＭ／ＦＬ融合タンパク質がＤＣ、ＮＫ、および他のリンパ球を誘導して腫瘍部位に集合させる能力を有することを示唆している。結果を表９に示す。
【０２０５】
【表９】
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【０２０６】
３．ｈｅｒ２／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、またはＴｒａｉｌ／ＦＬ融合タンパク質投与後の腫瘍の免疫組織化学的分析。他の融合タンパク質の機構を更に明らかにするために、ｈｅｒ２／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、またはＴｒａｉｌ／ＦＬ融合タンパク質処理をしたマウス（Ｄ２Ｆ２／Ｅ２、Ａ２０／ＣＤ２０、またはＲｅｎｃａを有する）から切除した腫瘍の免疫組織化学的分析を上記のように行った。結果を表１０に示す。
【０２０７】
【表１０】
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【０２０８】
結果はｃｈＳＭ／ＦＬ、ｈｕＳＭ／ＦＬ、ｈｅｒ２／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、およびＴＲＡＩＬ／ＦＬ融合タンパク質がリクルーティングおよび活性化によって腫瘍細胞の増殖を阻害することを示している。融合タンパク質はＮＫおよびＤＣ細胞の腫瘍部位への集合を誘導し、ＤＣ、ＮＫ、および他のリンパ球はその抗腫瘍活性を誘導した。
【０２０９】
実施例１５  インビボにおける融合タンパク質の生態分布
ｃｈＳＭ／ＦＬまたはｈｕＳＭ／ＦＬの腫瘍細胞への特異的結合を研究するために、融合タンパク質の生態分布特性を試験した。
【０２１０】
Ｂ１６ｐ２３０腫瘍を有するマウスにそれぞれ125Ｉ-標識したＳＭ、ｃｈＳＭ／ＦＬ、ｈｕＳＭ、およびｈｕＳＭ／ＦＬを静脈注射した。４８時間後、選択した臓器を直ちに除去し、放射活性を測定した。
【０２１１】
結果（図５６）はｃｈＳＭ／ＦＬおよびｈＳＭ／ＦＬ融合タンパク質の生態分布がキメラｍＡｂ  ｃｈＳＭまたはヒト化ｍＡｂ  ｈｕＳＭのものと同様であることを示している。融合タンパク質は全て、その親ｍＡｂの特異性を保持し、腫瘍部位に高度に濃縮されていた。
【０２１２】
ｍＡｂおよび融合タンパク質の生態分布はその特異性に依存し、これは臨床における有意な因子である。特異的な組織分布により、所望の効果を得るために必要な薬剤の量が低減され、同時に非標的組織への損傷が低減される。
【０２１３】
ｈｅｒ２／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、およびＴＲＡＩＬ／ＦＬ融合タンパク質のインビボにおける分布特性も試験した。４Ｔ１／ｈｅｒ２、Ａ２０／２０、およびＲｅｎｃａ腫瘍を有するマウスに125Ｉ-標識したｈｅｒ２／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、ＴＲＡＩＬ／ＦＬ、およびｈｕＳＭ／ＦＬをそれぞれ静脈注射した。４８時間後、選択した臓器を直ちに除去し、放射活性を測定した。
【０２１４】
試験結果（図５７）はｈｅｒ２／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、およびＴＲＡＩＬ／ＦＬ融合タンパク質がｃｈＳＭ／ＦＬおよびｈＳＭ／ＦＬと同様に腫瘍部位に局在化していることを示している。
【０２１５】
実施例１６  腫瘍特異的リンパ球での養子免疫療法
ｈｅｐａＰ２３０細胞またはＢ１６ｐ２３０細胞を０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで消化し、２．７ｘ１０7細胞／ｍｌに調整した。Ｈｅｐａｌ-６／Ｐ２３０またはＢ１６／Ｐ２３０細胞を２００ｕｌの腫瘍細胞懸濁液としてＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下接種した。腫瘍の直径が0.5cmに達した時点で、ｃｈＳＭ／ＦＬの静脈注射を４ｍｇ／ｋｇ／週の用量で連続３週間行った。全ての動物について、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。
【０２１６】
融合タンパク質ｃｈＳＭ／ＦＬまたはｈｕＳＭ／ＦＬで処理し、腫瘍ｈｅｐａｐ２３０またはＢ１６ｐ２３０の退縮が起きたマウスを殺処分し、脾臓を回収した。脾臓細胞を単離し、１．０ｘ１０9細胞／ｍｌに調整した。次いで、未処理のマウスに、ｈｅｐａｐ２３０またはＢ１６ｐ２３０腫瘍の退縮が起きたマウス由来の脾臓細胞（５．０ｘ１０7）を注射し、それぞれｈｅｐａｐ２３０またはＢ１６ｐ２３０腫瘍で攻撃感染した。全ての動物について、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。
【０２１７】
結果（表１１）は、融合タンパク質ｃｈＳＭ／ＦＬまたはｈｕＳＭ／ＦＬで処理し、腫瘍ｈｅｐａｐ２３０またはＢ１６ｐ２３０の退縮が起きたマウスの脾臓細胞由来のマウス養子脾臓細胞は親腫瘍を排除することを示している。非融合タンパク質の組み合わせ、すなわちｃｈＳＭ、ｈｕＳＭ、ＦＬ、ＦＬと組み合わせたｃｈＳＭ、またはＦＬと組み合わせたｈｕＳＭで処理したマウス由来の脾臓細胞の移植ではレシピエント・マウスにおける腫瘍の排除は誘導されなかった。これらの結果は、移植したリンパ球が特異的抗腫瘍免疫応答を保有し、特異的免疫応答がＤＣおよびＮＫ細胞によって促進されることを示唆している。
【０２１８】
【表１１】
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【０２１９】
結果はまた、ｃｈＳＭ／ＦＬおよびｈｕＳＭ／ＦＬ融合タンパク質の抗腫瘍機構が特異的活性腫瘍免疫応答に依存することを示している。
【０２２０】
４Ｔ１／ｈｅｒ２、Ａ２０／２０、およびＲｅｎｃａ細胞を０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで消化し、２．７ｘ１０7細胞／ｍｌに調整した。４Ｔ１／ｈｅｒ２、Ａ２０／２０、またはＲｅｎｃａ細胞を２００ｕｌの腫瘍細胞懸濁液としてマウスに皮下接種した。腫瘍の直径が0.5cmに達した時点で、マウスにｈｅｒ２／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、またはＴｒａｉｌ／ＦＬの静脈注射を４ｍｇ／ｋｇ／週の用量で連続３週間行った。全ての動物について、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。
【０２２１】
融合タンパク質ｈｅｒ２／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、またはＴｒａｉｌ／ＦＬで処理し、腫瘍４Ｔ１／ｈｅｒ２、Ａ２０／２０、またはＲｅｎｃａ細胞の退縮が起きたマウスを殺処分し、脾臓を回収した。脾臓細胞を単離し、１．０ｘ１０9細胞／ｍｌに調整した。次いで、未処理のマウスに、Ｔ１／ｈｅｒ２、Ａ２０／２０、またはＲｅｎｃａ腫瘍の退縮が起きたマウス由来の脾臓細胞（５．０ｘ１０7）を注射し、それぞれ４Ｔ１／ｈｅｒ２、Ａ２０／２０、またはＲｅｎｃａ腫瘍で攻撃感染した。全ての動物について６週間、連続的な腫瘍増殖の観察を行った。
【０２２２】
結果（表１１）は、融合ｃｈＳＭ／ＦＬまたはｈｕＳＭ／ＦＬで処理し、腫瘍ｈｅｐａｐ２３０またはＢ１６ｐ２３０の退縮が起きたマウスの脾臓細胞由来のマウス養子脾臓細胞は親腫瘍を排除することを示している。
【０２２３】
結果（表１２）はｃｈＳＭ／ＦＬおよびｈｕＳＭ／ＦＬのものと一致しており、ｃｈＳＭ／ＦＬ、ｈｕＳＭ／ＦＬ、ｈｅｒ２／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、およびＴｒａｉｌ／ＦＬがリンパ球の活性化によって抗腫瘍活性を仲介することを示している。
【０２２４】
【表１２】
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【０２２５】
当業者に明白なように、本発明の多くの修飾および変更をその意図および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載する特定の態様は単に例として記載するものであり、本発明は付記する特許請求の範囲、およびそれらの請求の範囲に与えられるものに相当する全範囲によって制限されるものである；そして本発明は例として本明細書に記載する特定の態様に制限されることはない。
【０２２６】
上記の出版物および文献の引用は上記のいずれかが適切な従前技術であることを容認することを意図するものではなく、また、これらの出版物または文献の内容または日付を容認するものでもない。本明細書で引用する米国特許および他の文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２２７】
【図１】（Ａ）四価の二重特異性抗体および（Ｂ）ＦＬｅｘ／Ｆｃ／Ｆｖ二元機能融合タンパク質の構造を示す。
【図２】ｈＦｌｅｘのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を示す。ＳＰはシグナルペプチド。
【図３】ＦＬ／ＦCのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を示す。ＳＰはシグナルペプチド。
【図４】リンカー（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を示す。
【図５】１％アガロースゲル上での抗ｐ２３０抗体（ＳＭ５-１）可変領域遺伝子のＰＣＲ産物のアガロースゲル分析を示す。
【図６】ｍＳＭ５-１重鎖可変領域のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を示す。ＳＰはシグナルペプチド。
【図７】ｍＳＭ５-１軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を示す。
【図８】ＳＭ５-１キメラ抗体（ＣｈＳＭ）の重鎖のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。影付きの部分はイントロンを示す。
【図９】ＳＭ５-１キメラ抗体の軽鎖のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。
【図１０】ＳＭ５-１キメラ重鎖発現ベクターの図式を示す。異なる機能をコードする発現ベクター領域部分を示す：ＨＣＭＶ  ｐｒｏｍ（ヒト・サイトメガロウィルス主要即時型初期プロモーター）；ＶH（ｈｕＳＭの重鎖可変領域遺伝子）；ＣH（ヒトγｌ鎖不変領域遺伝子）；ＢＧＨｐＡ（ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル）；ＳＶ４０  ｏｒｉ（シミアンウィルス４０初期プロモーターおよび複製起点）；ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子）；ｐＵＣ起点（プラスミド複製起点）；Ａｍｐはβ-ラクタマーゼ遺伝子を示す。
【図１１】ＳＭ５-１キメラ軽鎖発現ベクターの図式を示す。異なる機能をコードするベクター領域部分を示す：ＨＣＭＶ  ｐｒｏｍ（ヒト・サイトメガロウィルス主要即時型初期プロモーター）；ＶL（ｈｕＳＭの軽鎖可変領域遺伝子）；ＣL（ヒトκ鎖不変領域遺伝子）；ＢＧＨｐＡ（ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル）；ＳＶ４０  ｏｒｉ（シミアンウィルス４０初期プロモーターおよび複製起点）；ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子）；ｐＵＣ起点（プラスミド複製起点）；Ａｍｐはβ-ラクタマーゼ遺伝子を示す。
【図１２】ＳＭ５-１ヒト化抗体（ｈｕＳＭ）重鎖可変領域のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）を示す。ＳＰはシグナルペプチド。
【図１３】ＳＭ５-１ヒト化抗体（ｈｕＳＭ）軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）を示す。ＳＰはシグナルペプチド。
【図１４】ＳＭ５-１ヒト化抗体（ｈｕＳＭ）重鎖のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。影付きの部分はイントロンを示す。
【図１５】ＳＭ５-１ヒト化抗体軽鎖のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。
【図１６Ａ】ＨｕＳＭＶＨ／Ｆｃ／ＦＬのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。影付きの部分はイントロンを示す。
【図１６Ｂ】ＨｕＳＭＶＨ／Ｆｃ／ＦＬのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。影付きの部分はイントロンを示す。
【図１７Ａ】ｈｕＳＭＶＨ／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を示す。
【図１７Ｂ】ｈｕＳＭＶＨ／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を示す。
【図１８Ａ】ＦＬ／Ｆｃ／ｈｕＳＭＦｖのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を示す。
【図１８Ｂ】ＦＬ／Ｆｃ／ｈｕＳＭＦｖのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を示す。
【図１９】ＳＭ５-１ＡｂおよびＦＬｅｘの融合遺伝子産物ｈＦＬｅｘ／Ｆｃ／Ｆｖの構造を示す。
【図２０Ａ】ｃｈＳＭＶＨ／Ｆｃ／ＦＬのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。影付きの部分はイントロンを示す。
【図２０Ｂ】ｃｈＳＭＶＨ／Ｆｃ／ＦＬのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。影付きの部分はイントロンを示す。
【図２１Ａ】ｃｈＳＭＶＨ／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）を示す。
【図２１Ｂ】ｃｈＳＭＶＨ／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）を示す。
【図２２Ａ】ＦＬ／Ｆｃ／ｃｈＳＭＦｖのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）を示す。
【図２２Ｂ】ＦＬ／Ｆｃ／ｃｈＳＭＦｖのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）を示す。
【図２３】２Ｂ８重鎖可変領域のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）を示す。ＳＰはシグナルペプチド。
【図２４】２Ｂ８軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）を示す。ＳＰはシグナルペプチド。
【図２５】抗ＣＤ２０キメラ抗体重鎖のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。影付きの部分はイントロンを示す。
【図２６】抗ＣＤ２０キメラ抗体の軽鎖のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。
【図２７Ａ】ＣＤ２０ＶＨ／Ｆｃ／ＦＬ重鎖のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。影付きの部分はイントロンを示す。
【図２７Ｂ】ＣＤ２０ＶＨ／Ｆｃ／ＦＬ重鎖のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。影付きの部分はイントロンを示す。
【図２８Ａ】ＣＤ２０ＶＨ／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）を示す。
【図２８Ｂ】ＣＤ２０ＶＨ／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）を示す。
【図２９Ａ】ＦＬ／Ｆｃ／ＣＤ２０Ｆｖのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）を示す。
【図２９Ｂ】ＦＬ／Ｆｃ／ＣＤ２０Ｆｖのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）を示す。
【図３０】抗ＣＤ２０ＡｂおよびＦＬｅｘの融合遺伝子産物ｈＦＬｅｘ／Ｆｃ／Ｆｖの構造を示す。
【図３１】抗ｈｅｒ２重鎖可変領域のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）を示す。ＳＰはシグナルペプチド。
【図３２】抗ｈｅｒ２軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）を示す。ＳＰはシグナルペプチド。
【図３３】抗ｈｅｒ２ヒト化抗体重鎖のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。影付きの部分はイントロンを示す。
【図３４】抗ｈｅｒ２ヒト化抗体軽鎖のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。
【図３５Ａ】ｈｅｒ２ＶＨ／Ｆｃ／ＦＬの重鎖のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。影付きの部分はイントロンを示す。
【図３５Ｂ】ｈｅｒ２ＶＨ／Ｆｃ／ＦＬの重鎖のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。影付きの部分はイントロンを示す。
【図３６Ａ】ｈｅｒ２ＶＨ／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）を示す。
【図３６Ｂ】ｈｅｒ２ＶＨ／Ｆｃ／Ｌｉｎｋ／ＦＬのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）を示す。
【図３７Ａ】ＦＬ／Ｆｃ／ｈｅｒ２Ｆｖのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。影付きの部分はイントロンを示す。
【図３７Ｂ】ＦＬ／Ｆｃ／ｈｅｒ２Ｆｖのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。影付きの部分はイントロンを示す。
【図３８】抗ｈｅｒ２ＡｂおよびＦＬｅｘの融合遺伝子産物ｈＦＬｅｘ／Ｆｃ／Ｆｖの構造を示す。
【図３９】ｈＦＬｅｘ／Ｔｒａｉｌｅｘのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。
【図４０】ＴｒａｉｌおよびＦＬｅｘの融合遺伝子ｈＦｌｅｘ／Ｔｒａｉｌｅｘの構造を示す。
【図４１】ｈＦＬｅｘ／ＩＺ／Ｔｒａｉｌｅｘのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。
【図４２】ｈＦＬｅｘ／Ｆｃ／Ｔｒａｉｌｅｘのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）を示す。ＳＰはシグナルペプチド；Ｓｔｏｐは翻訳停止コドン。
【図４３】ＴｒａｉｌおよびＦＬｅｘの融合遺伝子ｈＦＬｅｘ／Ｆｃ／Ｔｒａｉｌｅｘの構造を示す。
【図４４】ヒト臍帯血ＣＤ３４（＋）細胞に対するＳＭ／ＦＬの増殖効果を示す。
【図４５】インビボでのＮＫおよびＤＣ細胞に対するｃｈＳＭ／ＦＬおよｈｕＳＭ／ＦＬの効果を示す。
【図４６Ａ】インビトロでの異なる細胞系に対するｃｈＳＭ／ＦＬ融合タンパク質の阻害効果を示す。
【図４６Ｂ】インビトロでの異なる細胞系に対するｈｕＳＭ／ＦＬの阻害効果を示す。
【図４７Ａ】インビトロでのＢ１６黒色腫細胞に対する種々のＦＬ融合タンパク質の阻害効果を示す。
【図４７Ｂ】インビトロでのＨｅｐａｌ-６細胞増殖に対する種々のＦＬ融合タンパク質の阻害効果を示す。
【図４７Ｃ】インビトロでのＢ１６／ｐ２３０細胞増殖に対する種々のＦＬ融合タンパク質の阻害効果を示す。
【図４７Ｄ】インビトロでのＨｅｐａ１-６／ｐ２３０細胞増殖に対する種々のＦＬ融合タンパク質の阻害効果を示す。
【図４８Ａ】インビトロでのｈｅｒ２／ＦＬの阻害効果を示す。
【図４８Ｂ】インビトロでのハーセプチンの阻害効果を示す。
【図４９Ａ】インビトロでのｈｅｒ２／ＦＬの細胞障害性を示す。
【図４９Ｂ】インビトロでのハーセプチンの細胞障害性を示す。
【図５０】インビトロでのＣＤ２０／ＦＬの細胞障害性を示す。
【図５１Ａ】インビトロでの異なる細胞系に対するＴｒａｉｌ／ＦＬの阻害効果を示す。
【図５１Ｂ】インビトロでの異なる細胞系に対するＴｒａｉｌの阻害効果を示す。
【図５２Ａ】インビトロでのＴｒａｉｌ／ＦＬの細胞障害性を示す。
【図５２Ｂ】インビトロでのＴｒａｉｌの細胞障害性を示す。
【図５３】インビボでの腫瘍増殖に対するｈｅｒ２／ＦＬの効果を示す。
【図５４】インビボでの腫瘍増殖に対するＣＤ２０／ＦＬの効果を示す。
【図５５】インビボでの腫瘍増殖に対するＴｒａｉｌ／ＦＬの効果を示す。
【図５６】ＳＭ／ＦＬおよびｈｕＳＭ／ＦＬの生体内分布を示す。
【図５７】ｈｅｒ２／ＦＬ、ＣＤ２０／ＦＬ、およびＴｒａｉｌ／ＦＬの生体内分布を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007515946.tif 000020
【図８】
2007515946.tif 000021
【図９】
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【図１０】
2007515946.tif 000023
【図１１】
2007515946.tif 000024
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
2007515946.tif 000050
【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
2007515946.tif 000059
【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
2007515946.tif 000063
【図３９】
2007515946.tif 000064
【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７Ａ】
2007515946.tif 000073
【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４７Ｄ】
2007515946.tif 000076
【図４８Ａ】
2007515946.tif 000077
【図４８Ｂ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
2007515946.tif 000080
【図５０】
2007515946.tif 000081
【図５１Ａ】
2007515946.tif 000082
【図５１Ｂ】
2007515946.tif 000083
【図５２Ａ】
2007515946.tif 000084
【図５２Ｂ】
2007515946.tif 000085
【図５３】
2007515946.tif 000086
【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【国際調査報告】
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