(57)【要約】  本発明は、乳癌の診断に関する。本発明は、乳癌の診断におけるタンパク質ASCの使用を開示する。本発明は、個体由来の液体試料からの、該試料におけるASCの測定による乳癌の診断方法に関する。ASCの測定は、例えば乳癌の早期の検出または診断において使用され得る。
2007507695.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）個体から得た液体試料を提供すること、
ｂ）前記試料と、カスパーゼ関連リクルートドメインを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質（ASC）に対する特異的な結合剤とを、前記結合剤とASCの間での複合体の形成に適切な条件下で接触させること、および
ｃ）（ｂ）で形成された複合体の量を乳癌の診断に相関させること
を含む、乳癌の診断方法。
【請求項２】
前記試料が血清であることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記試料が血漿であることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記試料が全血であることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記試料が乳頭吸引液であることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
個体から得た液体試料からの乳癌の診断における、マーカー分子としてのタンパク質ASCの使用。
【請求項７】
個体から得た液体試料からの乳癌の早期診断における、マーカー分子としてのタンパク質ASCの使用。
【請求項８】
早期診断をTis〜3; N0; M0期におけるBC患者由来の試料で行なう、請求項７記載の使用。
【請求項９】
個体から得た液体試料からの乳癌の診断における、乳癌に対する1つ以上のマーカー分子と組み合わせた、乳癌に対するマーカー分子としてのタンパク質ASCの使用。
【請求項１０】
少なくとも1つの他のマーカー分子がCA 15-3である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
少なくとも1つの他のマーカー分子が細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）である、請求項９記載の使用。
【請求項１２】
少なくとも2つの他のマーカー分子が細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）およびCA 15-3である、請求項９記載の使用。
【請求項１３】
ASCに対する少なくとも1つの特異的な結合剤およびASCの測定のための補助試薬を含む、免疫学的キット。
【請求項１４】
ASCに対する少なくとも1つの特異的な結合剤、CA 15-3に対する少なくとも1つの特異的な結合剤ならびにASCおよびCA 15-3の測定のための補助試薬を含む、免疫学的キット。
【請求項１５】
ASCに対する少なくとも1つの特異的な結合剤、細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）に対する少なくとも1つの特異的な結合剤ならびにASCおよび細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）の測定のための補助試薬を含む、免疫学的キット。
【請求項１６】
ASCに対する少なくとも1つの特異的な結合剤、細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）に対する少なくとも1つの特異的な結合剤、CA 15-3に対する少なくとも1つの特異的な結合剤ならびにASC、CA 15-3および細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）の測定のための補助試薬を含む、免疫学的キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、乳癌の診断に関する。本発明は、乳癌の診断におけるカスパーゼ関連リクルートドメインを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質（＝ASC）の使用を開示する。さらに、本発明は特に個体由来の液体試料からの、該試料におけるASCの測定による乳癌の診断方法に関する。ASCの測定は、例えば乳癌の早期の検出または診断において使用され得る。
【０００２】
癌は、検出および治療の発達にもかかわらず、主要な公衆の健康課題のままである。様々な型の癌の中で、乳癌（＝BC）は、西洋の女性の間で最も頻度の高い癌の一つである。
【０００３】
癌が早期に検出／診断され得るほど、総合的な生存率はより良くなる。これはBCに対して特に当てはまる。進行した段階の腫瘍における予後は不良である。3分の1より多くの患者は診断後5年以内に進行性の疾患で死亡し、これは5年間で約40％の生存率に相当する。現在の治療は、ごく一部の患者を治療するのみで、疾患の早期で診断された患者について明らかに最大の効果がある。
【０００４】
公衆の健康問題としてのBCに関して、乳癌に対するより効果的なスクリーニングおよび予防的な手段が開発されることが必須である。
【０００５】
現在乳癌に対して有用な最も早期な検出手順は、臨床的な乳房の検査および乳房撮影を使用することを含む。しかし、腫瘍が触診できるかまたは乳房Ｘ線像で検出され得る前に、重大な腫瘍のサイズが典型的に存在することが必要である。乳房組織の密度および年齢は、乳房撮影のスクリーニングの正確度の重要な予測材料である。感度は、極めて密度の高い乳房を有する女性における63％からほとんど全体的に脂肪の乳房を有する女性における87％にわたる。感度は、約40歳の女性における69％から80歳以上の女性における83％まで、年齢とともに高くなっている（Carney, P.A.ら, Ann. Intern. Med. 138 (3) (2003) 168-175）。生検された、乳房撮影で検出した異常の20〜25％のみが、悪性であると判明した。前癌および癌病変の視覚化は、早期の検出に最も良いアプローチであるが、乳房撮影は、実行するためにおよび結果の解釈において、大変な注意および専門技術を必要とする高価な検査である（WHO, Screening for Breast Cancer, 2002年5月10日; Esserman, L.ら,J. Natl. Cancer Inst. 94 (2002) 369-375）。
【０００６】
近年、多大な量のいわゆる乳房特異的な、またはいわゆる乳癌特異的とさえいわれる遺伝子が報告されている。相当する研究論文または特許出願の大部分は、乳房（癌）組織対異なる組織または近接した正常組織のそれぞれにおけるRNA発現パターンの解析によって得たデータを基にしている。かかるアプローチはディファレンシャルmRNAディスプレイ技術として要約され得る。
【０００７】
mRNAディスプレイ技術から得られるデータの例として、WO 00/60076が言及され、議論されるはずである。この出願は、200より多くの単離したポリヌクレオチドおよび相当するポリペプチドそのもの、ならびにBCの検出におけるそれらの使用を記載し、特許請求している。しかし、mRNAのレベルでの差が、対応するタンパク質のレベルに反映されないことは一般的な知識である。希少なmRNAでコードされたタンパク質が非常に多くの量で見出され得、豊富なmRNAでコードされたタンパク質が検出され、発見されるのがそれでもなお困難であり得る（Chen, G.ら, Molecular and Cellular Proteomics, 1.4 (2002) 304-313）。mRNAのレベルとタンパク質のレベルの間でのかかる相関性の欠如は、mRNAの安定性、翻訳の効率性、タンパク質の安定性等のような理由による。
【０００８】
BCの診断に使用され得る候補マーカー分子を同定するために、異なる組織間あるいは健康な組織と罹患した組織との間でのタンパク質パターンにおける差を調査する近年のアプローチもある。WulfkuhleらCancer Research 62 (2002) 6740-6749は、BC組織と近接した正常組織の間で異なって発現していた57個のタンパク質を同定した。個体から得た液体試料からのデータは報告されていない。
【０００９】
WO 02/23200は表面増強レーザ脱離およびイオン化（SELDI）で見出された12個の乳癌関連スポットについて報告している。これらのスポットは健康な対照から得た血清と比較して、BCを有する患者から得た血清においてより高い頻度で見られる。しかし、かかるスポットに含まれる分子（ら）の同定、例えばその配列、は知られていない。
【００１０】
乳頭吸引液（NAF）は、乳癌特異的なマーカーを同定する潜在的な非侵襲性の方法として何年もの間使用されてきた。Kuererらは、片側の浸潤性の乳癌を有する女性からの両側の組み合わせた対の乳頭吸引液を２次元電気泳動によって比較した（Kuerer, H.M.ら, Cancer 95 (2002) 2276-2282）。30〜202の異なるタンパク質スポットが、乳癌を患っている乳房のNAFにおいて検出されたが、健康な乳房の組み合わせたNAFにおいては検出されなかった。これらのスポットはゲル画像解析で検出された。しかし、タンパク質のスポットの同定は知られていない。
【００１１】
BCの分野で、候補タンパク質マーカーのリストが多く、また増加する傾向にあるにもかかわらず、現在までこれらの分子の臨床上／診断上の有用性は知られていない。臨床上有用であるには、単一のマーカーとしての新しい診断マーカーは少なくとも当該分野で公知の一番良い単一のマーカーと同程度に優れているべきである。または、新しいマーカーは、単独で使用するかまたは１つ以上の他のマーカーと組み合わせて使用するかのいずれかの場合で、それぞれ診断上の感度および／または特異性において進歩をもたらすべきである。検査の診断上の感度および／または特異性は、以下に詳細に記載するその受信者動作特性で最も評価される。
【００１２】
現在、癌抗原15-3（CA 15-3）、腫瘍関連ムチン、および癌胎児抗原（CEA）、腫瘍関連糖タンパク質の検出に基づく診断上の血液検査だけがBCの分野で診断を補助するのに有用である。CA 15-3は、進行した乳癌を有する患者で通常増加している。CA 15-3のレベルは早期乳癌を有する女性ではめったに上昇していない（Duffy, M.J., Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225-262）。卵巣、肺および前立腺の癌もまた、CA 15-3のレベルを上昇させ得る。上昇したCA 15-3のレベルは、良性の乳房または卵巣の疾患、子宮内膜症、骨盤腹膜炎、および肝炎等の非癌性の状態と関連し得る。妊娠および乳汁分泌もまた、CA 15-3のレベルを上昇させ得る（National Cancer Institute, Cancer Facts, Fact Sheet 5.18 (1998)1-5）。CEAの主たる使用は、特に疾患が転移する場合、結腸癌のモニタリングにおいてである。しかし、乳癌を含む、様々な癌が、上昇したCEAのレベルをもたらし得る。
【００１３】
器官および腫瘍の特異性の欠如により、CA 15-3の測定もCEAの測定もBCのスクリーニングには推奨しない。これらの腫瘍マーカーはBC患者の追跡ケアでの有用な診断ツールとなる（Untch, M.ら, J. Lab. Med. 25 (2001) 343-352）。
【００１４】
全血、血清、血漿または乳頭吸引液が臨床慣例において最も広く使用される試料の供給源である。信頼できる癌の検出を可能にするか、または早期の予後の情報を提供する早期BC腫瘍マーカーの同定が、この疾患の診断および管理において大変手助けとなる診断アッセイをもたらし得る。それゆえに、血液からのBCの診断が改良される、緊急な臨床上の必要性がある。疾患の進行した段階で診断される患者と比べて、早期に診断される患者にとって生存の機会は遥かに高くなるので、BCの早期診断を改良することが特に重要である。
【００１５】
BCの診断で役立ち得る新しいマーカーを同定し得るか調査することが、本発明の課題であった。
【００１６】
驚くべきことに、マーカーASCの使用は、当該分野の状態から公知の問題を少なくとも部分的に克服し得るということが見出されている。
【００１７】
本発明はそれゆえに、ａ）個体から得た液体試料を提供すること、ｂ）該試料と、ASCに対する特異的な結合剤とを、該結合剤とASCとの間での複合体の形成に適切な条件下で接触させること、およびｃ）(ｂ)で形成された複合体の量を乳癌の診断に相関させることを含む、乳癌の診断方法に関する。
【００１８】
本発明の別の好ましい態様は、ａ）個体から得た液体試料と、ASCに対する特異的な結合剤とを、該結合剤とASCとの間での複合体の形成に適切な条件下で接触させること、およびｂ）（ａ）で形成した複合体の量を乳癌の診断に相関させることを含む、乳癌の診断方法である。
【００１９】
当業者が認めるように、任意のかかる診断はインビトロで行なう。患者試料は以後、廃棄する。患者試料は本発明のインビトロの診断方法に対して使用されるだけであり、患者試料の物質は患者の体内に戻されない。典型的には、試料は液体試料である。
【００２０】
「カスパーゼ関連リクルートドメインを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質」（ASC）は、「メチル化誘導性サイレンシング１の標的」（TMS1）（Swiss-PROT: Q9ULZ3）としても公知であり、配列番号：1に示す配列で特徴づけられる。この配列は、翻訳されて21,627 Daの理論分子量およびpH6.29での理論等電点となる。
【００２１】
カスパーゼ関連リクルートドメイン（CARD）は、APAF1（アポトーシス性プロテアーゼ活性化因子１）等のアダプタータンパク質と、アポトーシスに関与するカスパーゼの前駆体（例えばCASP9）との間の相互作用を媒介する。ASCは、CARD含有アダプタータンパク質ファミリーのメンバーである。
【００２２】
前骨髄細胞系を免疫スクリーニングすることによって、Masumotoらは、ASCをコードするcDNAを単離した。推定195アミノ酸のタンパク質は、N末端のピリン様ドメイン（PYD）および87残基のC末端のCARDを含む。ウェスタンブロット解析によって、22 kDaのタンパク質の発現が示され、また抗癌剤によるアポトーシスの刺激に対する白血病細胞系の感受性を高めることによってASCがプロアポトーシス性活性を有し得ることが示唆された（Masumoto, J.ら, J. Biol. Chem. 274 (1999) 33835-33838）。
【００２３】
Conwayらによるメチル化感受性制限PCRおよびメチル化特異的PCR（MSP）解析から、ASCのサイレンシングはエキソン1を取り巻くCpG島の過剰メチル化と相関があること、およびDNMT1（DNAシトシン-5-メチルトランスフェラーゼ-1）の過剰発現がASCの過剰メチル化およびサイレンシングを促進することが示唆された。正常な乳房組織ではなく乳癌細胞系は、ASCの完全なメチル化を示し、ASCメッセージは発現しなかった。乳癌細胞系におけるASCの発現は増殖を阻害し、生存するコロニーの数を減少させた。Conwayらは、ASCがカスパーゼ依存アポトーシスの促進において機能し、またASCの過剰発現が乳癌細胞の増殖を阻害すると結論付けた（Conway, K.E.ら, Cancer Research 60 (2000) 6236-6242）。
【００２４】
McConnellおよびVertinoは、ASCの誘導性の発現が細胞増殖を阻害し、カスパーゼ阻害因子によってブロックされ得るDNA断片化を誘導することを示した。免疫蛍光顕微鏡検査によって、アポトーシスの誘導は、拡散した細胞質発現から球状の核周囲の集合体への、CARD依存的な変化を引き起こすことが示された（McConnell, B.B.およびVertino, P.M., Cancer Research 60 (2000) 6243-6247）。
【００２５】
Morianiらは、ASC遺伝子のメチル化を乳癌細胞だけでなく、胃癌においても観察した。彼らは、プロアポトーシス性ASC遺伝子のダウンレギュレーションに関わる、乳癌および胃癌の進行におけるASC遺伝子の異常なメチル化に対する直接の役割を示唆した（Moriani, R.ら, Anticancer Research 22 (2002) 4163-4168）。
【００２６】
Conwayらは、原発性乳房組織を、TMS1メチル化に関して調べ、その結果を健康な組織におけるメチル化と比較した（Conway K.E.ら, Cancer Research 60 (2000) 6236-6242）。Levineらは、ASCサイレンシングが特定のCpG部位のメチル化と相関がないが、むしろASC CpG島の密度の高いメチル化と関連があることを見出した。排他的にメチル化ASCコピーを含む乳房腫瘍細胞系はASCを発現せず、一方、部分的にメチル化された細胞系では、ASC発現のレベルは、細胞集団に存在するメチル化ASC対立遺伝子の割合に直接関係する（Levine, J.J.ら, Oncogene 22 (2003) 3475-3488）。
【００２７】
Virmaniらは、肺癌および乳癌組織におけるASCのメチル化状態を調べた。彼らは、ASCの異常なメチル化が乳癌細胞系の46％において、および乳房腫瘍組織の32％において存在していることを見出した。メチル化は非悪性乳房組織ではまれであった（7％）（Virmani, A.ら, Int. J. Cancer 106 (2003) 198-204）。
【００２８】
Shioharaらは、ASCのアップレギュレーションがヒト好中球における炎症およびアポトーシスに密接に関連することを見出した（Shiohara, M.ら, Blood 98 (2001) 229a）。
【００２９】
Masumotoらは、上皮細胞および白血球で豊富に発現される、高レベルのASCを観察した（Masumoto, J.ら, Journal of Histochemistry and Cytochemistry 49 (2001) 1269-1275）。
【００３０】
当業者に明らかなように、本発明は、配列番号:1の全長タンパク質ASCに限定されると解釈すべきではない。ASCの生理的または人工的な断片、ASCの二次修飾,およびASCの対立形質変異体もまた、本発明によって包括される。人工断片は、好ましくは合成によってまたは組換え技術によって産生したペプチドを包括し、配列番号:1に開示した配列由来の少なくとも6つの連続したアミノ酸からなる診断上意義のある1つのエピトープを少なくとも含む。かかる断片は抗体の産生に対してまたはイムノアッセイにおける基準として有利に使用され得る。更に好ましくは、人工断片はサンドイッチイムノアッセイをセットアップするのに適切な、少なくとも2つの目的のエピトープを含む。
【００３１】
好ましい態様において、新規のマーカーASCはモニタリングのためおよびスクリーニングの目的に使用され得る。
【００３２】
患者のモニタリングに使用した場合、本発明の診断方法は、患者の継続管理における腫瘍負荷、治療の効能および腫瘍の再発を評価するのに役立ち得る。上昇したASCのレベルは腫瘍負荷と直接的に相関する。化学療法の後、ASCの短期間（数時間〜14日）の増加は、腫瘍細胞の死の指標として役立ち得る。患者の継続管理（3ヶ月〜10年）において、ASCの増加は、腫瘍の再発に対する指標として使用され得る。
【００３３】
好ましい態様において、本発明の診断方法は、スクリーニング目的に使用される。つまり、ASCのレベルを測定することでおよび測定したレベルをBCの有無と相関させることでBCの事前の診断なしに被験体を評価するために使用される。
【００３４】
癌の病期分類は、程度、進行、および重症度に関する疾患の分類である。これは一般化が予後および治療の選択について行われ得るように、癌患者を分類する。
【００３５】
今日では、TNM系が癌の解剖学的な程度の、最も広く使用されている分類である。これは国際的に承認され、統一された病期分類の系である。3つの基本的な変数がある：T(原発腫瘍の程度)、N(局所的なリンパ節の状態)およびM（遠隔転移の有無）。TNMの基準はUICC（International Union Against Cancer）（Sobin, L.H., Wittekind, Ch.(編)：TNM Classification of Malignant Tumours,第5版,1997）によって公開されている。乳癌に対する病期分類の系は最近改定されている（Singletary, S.E.ら,Journal of Clinical Oncology 20 (2002) 3628-3636）。
【００３６】
特に重要なことは、BCの早期の診断は遥かにより良い予後につながることである。それゆえに、一番の予後はTis、N0、M0期またはT1〜3; N0; M0期ほど早期の患者にあり、遠隔転移が既に存在するときに診断された患者に対してわずか18％の5年生存率と比較して、適切に処置された患者は診断後5年の生存の機会が90％より高い。
【００３７】
本発明の意味において、BCの早期診断は前癌状態(DCIS)または転移の全くない（近位でも遠位でもない）、つまりTis、N0、M0またはT1〜4; N0; M0が存在する腫瘍段階での診断を指す。Tisはインシチュの癌腫を示す。
【００３８】
好ましい態様において、ASCは非転移性の段階においてBCの診断に使用される。つまり、診断は、Tis,N0, M0期またはT1〜3; N0; M0期(＝Tis〜3; N0; M0)に行われる。
【００３９】
本発明の診断方法は、個体由来である液体試料を基にする。当該分野から公知の方法とは異なり、ASCは特異的な結合剤の使用によってこの液体試料から特異的に測定される。
【００４０】
特異的な結合剤は、例えばASCに対するレセプター、ASCに結合するレクチンまたはASCに対する抗体である。特異的な結合剤はその対応する標的分子に対して少なくとも107l/molの親和性を有する。特異的な結合剤は好ましくは、その標的分子に対して108 l/molの親和性またはさらにより好ましくは109l/molの親和性を有する。当業者が認めるように、用語、特異的は、試料中にある他の生体分子がASCに対する特異的な結合剤と実質的に結合しないことを指すのに使用する。好ましくは、標的分子以外の生体分子に結合するレベルは、標的分子の親和性のわずか10％、より好ましくはわずか5％またはそれより低い結合親和性となる。最も好ましい特異的な結合剤は、親和性および特異性に対する上記の最小の基準の両方を満たす。
【００４１】
特異的な結合剤は好ましくは、ASCと反応性がある抗体である。用語、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、かかる抗体の断片、および抗体の結合領域を含む遺伝子構築物を指す。特異的な結合剤の上記の基準を保持する任意の抗体断片もまた使用され得る。
【００４２】
例えば、Tijssen（Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11 (1990）本全体、特に43〜78ページ; Elsevier, Amsterdam)に記載されるように、抗体は最先端技術の手順で産生される。加えて、当業者は、抗体の特異的な単離に使用され得る抗体吸着剤を基にした方法を充分承知している。これらの手段によって、ポリクローナル抗体の質および、そのためイムノアッセイにおけるそれらの性能が、増強され得る（Tijssen, P.,前掲 108-115頁）。
【００４３】
本発明で開示した達成のために、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が使用されている。ポリクローナル抗体はウサギで惹起されている。しかし、異なる種、例えばラットまたはモルモットからのポリクローナル抗体もまた明らかに使用され得る。モノクローナル抗体は免疫したマウスからの脾臓細胞を用いて産生されている。モノクローナル抗体は一定の特性を有して必要な任意の量で産生され得るので、それらは臨床上の習慣的な手段のためのアッセイの開発における理想的なツールとなる。本発明の方法におけるASCに対するモノクローナル抗体の産生および使用は、さらに別の好ましい態様である。
【００４４】
当業者が認めるように、今やASCがBCの診断に有用なマーカーとして同定されているので、本発明の達成に匹敵する結果に到達するように代替方法が使用され得る。例えば、抗体を産生する代替戦略が使用され得る。かかる戦略は、中でも合成ペプチドの使用を含み、これは免疫化のためのASCのエピトープとなる。好ましくは、合成ペプチドはASCに対して特異的である、すなわち他の／関連するポリペプチドに対して比較的低いホモロジーを有する配列番号:1の部分配列を含む。合成ぺプチドは配列番号:1の5〜25のアミノ酸残基からなる連続した部分配列を含むことが好ましい。更に好ましくは、ペプチドは配列番号:1の10〜15のアミノ酸残基からなる連続した部分配列を含む。他の戦略は、免疫化のための、実施例２に記載されるようなSlyD-ASC融合タンパク質の使用を含む。好ましくは、式SlyD-(GGGS)5-GGG-IEGR-ASC-GGGS-HHHHHHの融合タンパク質が用いられ、ここで-(GGGS)5-GGGは第一のグリシンリッチリンカー配列であり、ここでIEGRは第Xa因子切断部位であり、ここでGGGSは第二のグリシンリッチリンカー配列であり、HHHHHHはHis-tagである。
【００４５】
あるいは、DNAワクチンとしても知られるDNA免疫が使用され得る。
【００４６】
測定のために、個体から得た液体試料をASCに対する特異的な結合剤とともに、結合剤ASC複合体の形成に適切な条件下でインキュベートする。かかる条件は特定される必要はない、というのも当業者は発明の努力なしにかかる適切なインキュベーション条件を容易に同定し得るからである。
【００４７】
本発明に開示した方法の最終工程として、複合体の量を測定し、BCの診断に相関させる。当業者が認めるように、特異的な結合剤ASC複合体の量を測定する多数の方法があり、全ては関連する教科書で詳細に記載されている（例えば、Tijssen P.,前掲またはDiamandis ら,編(1996) Immunoassay, Academic Press, Bostonを参照）。
【００４８】
好ましくは、ASCはサンドイッチ型のアッセイ形式で検出する。かかるアッセイにおいて、第一の特異的な結合剤は一方でASCを捕捉するのに使用され、かつ第二の特異的な結合剤は、直接または間接的に検出できるように標識されて、他方で使用される。
【００４９】
上記のように、ASCは個体試料から得た液体試料から測定され得るということが驚くべきことに見出された。組織および生検試料はBCの診断においてマーカーASCを適用する必要はない。
【００５０】
好ましい態様において、本発明の方法は、液体試料物質としての血清を用いて実施される。
【００５１】
さらに好ましい態様において、本発明の方法は、液体試料物質としての血漿を用いて実施される。
【００５２】
さらに好ましい態様において、本発明の方法は、液体試料物質としての全血を用いて実施される。
【００５３】
さらに好ましい態様において、本発明の方法は、液体試料物質としての乳頭吸引液を用いて実施される。
【００５４】
組織試料に対する慣例的なプロテオミクス法の適用が、選択した組織に対する多くの潜在的なマーカー候補の同定をもたらす一方で、本発明の発明者らは個体の体液試料においてASCを驚くべきことに検出し得た。更に驚くべきことに、本発明者らは、個体から得たかかる液体試料におけるASCの存在を乳癌の診断に相関させ得るということを示すことができた。
【００５５】
大変有利なASCに対する抗体は、確立した手順、例えばインシチュ、生体組織検査、または免疫組織学的手順において乳癌細胞を検出する手順で使用され得る。
【００５６】
好ましくは、ASCに対する抗体は定性的（ASCの有無）または定量的（ASCの量を決定する）イムノアッセイで使用され得る。
【００５７】
タンパク質ASCのレベルを測定することは、BCの分野で非常に有利であると判明した。それゆえに、更に好ましい態様において、本発明は個体から得た液体試料からの、乳癌の診断におけるマーカー分子としてのタンパク質ASCの使用に関する。
【００５８】
用語、マーカー分子は、個体の体液から測定した、被験体の上昇したASCのレベルがBCの存在の兆候であるということを示すのに使用する。
【００５９】
乳癌の早期診断において新規のマーカーのASCを使用することが特に好ましい。
【００６０】
タンパク質ASCそれ自体の使用は、BC診断の難しい分野への重大な進歩を意味する。ASCの測定と他の公知のマーカー、例えばCA 15-3およびCEA、細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）または現在知られているか、もしくは未だ発見されていないBCの他のマーカーとの組み合わせは、更なる改良をもたらす。それゆえに、さらに好ましい態様において、本発明は、個体から得た液体試料からの乳癌の診断における、乳癌に対する一つ以上のマーカー分子と組み合わせた、乳癌に対するマーカー分子としてのASCの使用に関する。これに関して、語句「一つ以上」は、1〜10、好ましくは1〜5、更に好ましくは3を表す。好ましく選択される、ASCの測定と組み合わせ得る他のBCのマーカーは、CEA、細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）およびCA 15-3である。さらにより好ましくは、ASCは少なくともASCおよびCA 15-3を含むマーカーの枠の一部として使用される。このように、本発明の更に好ましい態様は、個体から得た液体試料からの乳癌の診断における、乳癌に対する一つ以上のマーカー分子と組み合わせた乳癌のマーカー分子としてのタンパク質ASCの使用であり、ここで少なくとも1つの他のマーカー分子はCA 15-3である。さらにより好ましくは、ASCは少なくともASCおよび細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）を含むマーカーの枠の一部として使用される。このように、本発明の更に好ましい態様は、個体から得た液体試料からの乳癌の診断における、乳癌に対する一つ以上のマーカー分子と組み合わせた乳癌のマーカー分子としてのタンパク質ASCの使用であり、ここで少なくとも1つの他のマーカー分子は細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）である。さらにより好ましくは、ASCは少なくともASC、細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）、およびCA 15-3を含むマーカーの枠の一部として使用される。このように、本発明の更に好ましい態様は、個体から得た液体試料からの乳癌の診断における、乳癌に対する2つ以上のマーカー分子と組み合わせた乳癌のマーカー分子としてのタンパク質ASCの使用であり、ここで少なくとも2つの他のマーカー分子は細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）およびCA 15-3である。
【００６１】
好ましくは、本発明の方法は、乳癌を患っている疑いのある患者の試料を用いて使用される。乳癌を患っている疑いのある個体は他の型の癌を除外した個体である。他の癌としては結腸、肺、胃、卵巣、および前立腺の癌が挙げられるが、それらに限定されない。本発明の好ましい態様はそれゆえに、ａ）乳癌を患っている疑いのある個体から得た液体試料を提供すること、ｂ）該試料と、ASCに対する特異的な結合剤とを、該結合剤とASCの間での複合体の形成に適切な条件下で接触させること、およびｃ）（ｂ）で形成された複合体の量を乳癌の診断に相関させることを含む、乳癌の診断方法である。
【００６２】
イムノアッセイのような、特異的結合アッセイの分野における診断試薬は、通常、キットの形態で最もよく提供され、これは特異的な結合剤およびアッセイを行なうのに必要な補助試薬を含んでいる。本発明はまたそれゆえに、ASCに対する少なくとも1つの特異的な結合剤およびASCの測定のための補助試薬を含む免疫学的なキットに関する。ASCに対する少なくとも1つの特異的な結合剤、CA 15-3に対する少なくとも1つの特異的な結合剤ならびにASCおよびCA 15-3の測定のための補助試薬を含む免疫学的キットもまた好ましい。ASCに対する少なくとも1つの特異的な結合剤、細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）に対する少なくとも1つの特異的な結合剤ならびにASCおよび細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）の測定のための補助試薬を含む免疫学的キットもまた好ましい。ASCに対する少なくとも1つの特異的な結合剤、細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）に対する少なくとも1つの特異的な結合剤、CA 15-3に対する少なくとも1つの特異的な結合剤ならびにASC、CA 15-3および細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）の測定のための補助試薬を含む免疫学的キットもまた好ましい。
【００６３】
検査の正確度は、その受信者動作特性(ROC)によって最もよく記載される（特に、Zweig, M. H.およびCampbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577を参照)。ROCグラフは、観察したデータの全範囲にわたって連続的に変化する判定基準から生じる全ての感度／特異性対のプロットである。
【００６４】
検査室検査の臨床上の性能は、その診断の正確度、または被験体を臨床上関係するサブグループに正しく分類する能力に依存する。診断の正確度が、調査した被験体の2つの異なる状態を正しく区別する検査の能力を評価する。かかる状態は例えば、健康および疾患または良性疾患対悪性疾患である。
【００６５】
各場合において、ROCプロットは判定基準の全範囲に対する感度対１-特異性をプロットすることによって2つの分布間での重複を記述している。y軸に感度つまり真陽性分数[（真陽性検査結果の数）（真陽性の数＋偽陰性検査結果の数）として定義する]がある。これはまた、疾患または状態の存在における確実性とも呼ばれている。これは罹患のサブグループからのみ計算される。x軸に偽陽性分数つまり1-特異性[（偽陽性結果の数）/（真陰性の数＋偽陽性結果の数）として定義する]がある。これは特異性の指標であり、非罹患のサブグループから完全に計算される。2つの異なるサブグループからの検査結果を用いて、真および偽陽性分数が完全に別々に計算されるので、ROCプロットは試料における疾患の有病率には依存しない。ROCプロット上の各点は特定の判定基準に相当する感度／-特異性対を表す。完全に区別された検査（2つの結果の分布に重複がない）は、左上角を通過するROCプロットを有し、ここでは真陽性分数は1.0、つまり100％（完全な感度）であり、かつ偽陽性分数は0（完全な特異性）である。区別されない検査（2つの集団に対する結果の同一の分布）に対する理論的なプロットは、左下角から右上角への45°の対角線である。ほとんどのプロットはこれら2つの端の間に入る。（ROCプロットが45°の対角線の下に完全に入る場合、これは、「より大きい」から「より小さい」へと「確実性」の判定基準を逆転させることで容易に修正され、またはその逆も同じである。）定性的には、プロットが左上角に近くなるほど、検査の総合的な正確度は高くなる。
【００６６】
検査室検査の診断上の正確度を定量化するためのある便利な目標は、一つの数字でその性能を表すことである。最も普遍的で世界的な測定はROCプロット下の面積である。慣例として、この面積は常に0.5以上（そうでない場合、そうするために決定規則を逆転し得る）である。値は、1.0(2つの群の検査値の完全な分離)と0.5（2つの群の検査値の間で明らかな分布差がない）の間で変化する。面積は、対角線に一番近い点または90％の特異性での感度等のプロットの特定の部分だけに依存せず、全プロットに依存する。これは、ROCプロットが完全なもの（面積＝1.0）にどれくらい近いかについての、定量的で記述的な表示である。
【００６７】
新規のマーカーASCの臨床上の有用性は、受信者動作特性曲線解析（ROC; Zweig, M. H.およびCampbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577）を用いて、確立されたマーカーCA 15-3との比較および組み合わせで評価される。この解析は、それぞれT1〜3; N0; M0における浸潤性の腺管癌または小葉癌、さらに進行した腫瘍、つまり、T4および／または様々な重症度の転移（N+および／または M+）、それぞれ髄様癌、乳頭状癌、粘液性癌腫および管状腺癌、非浸潤性腺管癌ならびに健康対照の患者からの各50の試料からなる明確な患者のコホートを基にしている。
【００６８】
以下の実施例、参考文献、配列表及び図面は、本発明の理解を補助するために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の意図から逸脱すること無く、示した手順において変更がなされ得ることが理解されよう。
【００６９】
略語
ABTS  2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸(6)]二アンモニウム塩
BSA  ウシ血清アルブミン
cDNA  相補DNA
CHAPS  (3-[(3-コールアミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパン-スルホン酸)
DMSO  ジメチルスルホキシド
DTT  ジチオスレイトール
EDTA  エチレンジアミン四酢酸
ELISA  酵素結合免疫吸着定量法
HRP  ホースラディッシュペルオキシダーゼ
IAA  ヨードアセタミド
IgG  免疫グロブリンG
IEF  等電点電気泳動法
IPG  固定化pH勾配
LDS  ドデシル硫酸リチウム
MALDI-TOF  マトリックス支援レーザ脱離イオン化-飛行時間型質量分析
MES  メシチル,2,4,6-トリメチルフェニル
OD  光学密度
PAGE  ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBS  リン酸緩衝生理食塩水
PI  等電点
RTS  迅速翻訳装置
SDS  ドデシル硫酸ナトリウム
UICC  国際対癌連合
【００７０】
実施例1
潜在的な乳癌マーカーとしてのASCの同定
組織の供給源
乳癌の潜在的な診断マーカーとして腫瘍特異的なタンパク質を同定するために、プロテオミクス方法を用いて2つの異なる種類の組織の分析を行なう。
【００７１】
乳癌を患う全部で14人の患者に由来する組織標本を分析する。各患者から、2つの異なる組織型を治療的切除から収集する：腫瘍組織（＞80％腫瘍）（Ｔ）、および隣接する健康な組織（Ｎ）。後者の組織型は、対応する健康な対照試料として働く。組織を切除後すぐにスナップ凍結し、処理する前に−80℃で保存する。腫瘍を組織病理学的基準により診断する。
【００７２】
組織調製
0.8〜1.2gの凍結組織を乳鉢に入れ、液体窒素で完全に凍結させる。組織を乳鉢中で粉砕し、10倍容積（ｗ/ｖ）の溶解バッファー（40mM クエン酸Na、5mM MgCl2、1％ Genapol X-080、0.02％アジドNa、Complete（登録商標）EDTAフリー [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号 1 873 580]）中に溶解させ、続いてWheaton（登録商標）グラスホモジナイザー（20×ルーズフィッティング、20×タイトフィッティング）でホモジナイズする。3 mlのホモジェネートを１時間、4,500 xgでショ糖密度遠心分離（10〜60％ショ糖）に供する。この遠心分離工程後、３つの画分を得る。グラジェントの上部画分は、可溶性タンパク質を含み、更なる解析に用いる。
【００７３】
CNBr活性化セファロース4Bへのモノクローナル抗体抗ヒトアルブミンの固定
凍結乾燥したCNBr活性化セファロース4B（Amersham Biosciences, 17-0430-01）を製造業者の使用説明書に従って再膨潤させ洗浄する。ヒトアルブミンに対するモノクローナル抗体を、0.1 M NaHCO3, pH 8.3, 0.5 M NaClに、10 mg/ml溶解する。1 mlの抗体溶液を1 mlの再膨潤させたCNBr活性化セファロース4Bと混合する。反応時間は1時間である。製造業者の使用説明書に従って、残存活性基のブロッキングおよびゲルの洗浄を行う。
【００７４】
血清アルブミンの除去
7 mlの抗アルブミンゲルをGenapol X-080を含まない溶解バッファーで平衡にする。ショ糖密度遠心分離の上部画分の7 ml（上記、組織調製参照）をカラムにアプライし、Genapol X-080を含まない溶解バッファーで洗い流す。混合した溶出液を等電点電気泳動実験に用いる。
【００７５】
等電点電気泳動（IEF）およびSDS-PAGE
IEFのために、3 mlのHSAを除去した組織調製液を12 mlの試料バッファー（7M 尿素、2M チオ尿素、2％ CHAPS、0.4％ IPGバッファー pH4〜7、0.5％ DTT）と混合し、１時間インキュベートする。試料をAmicon（登録商標）Ultra-15装置（Millipore GmbH, Schwalbach, Germany）で濃縮し、Bio-Rad（登録商標）タンパク質アッセイ（カタログ番号 500-0006; Bio-Rad Laboratories GmbH, Muenchen, Germany）を用いて供給業者のマニュアルの指示に従ってタンパク質濃度を測定する。1.5 mgのタンパク質試料に相当する容積に、最終体積350μlまでバッファーを加える。この溶液を用いてIPG細片pH4〜7（Amersham Biosciences, Freiburg, Germany）を一晩再水和させる。以下の勾配プロトコルを用いてIEFを行なう：（1.）500Ｖまで1分；（2.）3500Ｖまで２時間；（3.）3500Vの一定で22時間、82 kVhを生じさせる。IEF後、細片を-80℃で保存するか、またはSDS-PAGEに直接使用する。
【００７６】
SDS-PAGEの前に、細片を平衡バッファー（6M 尿素、50 mM Tris/HCl、pH8.8、30％ グリセロール、2％SDS）中でインキュベートし、還元のためにDTT（15分、＋50 mg DTT/10 ml）、およびアルキル化のためにIAA（15分、＋235 mg ヨードアセトアミド/10 ml）を加える。細片を12.5％ポリアクリルアミドゲル上に置き、1W/ゲルおよびその後17W/ゲルで1時間電気泳動に供する。続いて、ゲルを固定し（50％メタノール、10％酢酸塩）、NovexTMColloidal Blue Stainingキット(Invitrogen, Karlsruhe, Germany, カタログ番号 LC6025, 45-7101)で一晩染色する。
【００７７】
乳癌の潜在的なマーカーとしてのASCの検出
各患者を、ProteomeWeaver（登録商標）ソフトウェア（Definiens AG, Germany, Muenchen）を用いてイメージ分析により別々に分析する。さらに、ゲルの全てのスポットをピッキングロボットにより切り出し、スポットに存在するタンパク質をMALDI-TOFマススペクトロメトリー（UltraflexTMTof/Tof, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany）により同定する。各患者について、腫瘍試料由来の４つのゲルを、それぞれの隣接する組織由来の４つのゲルと比較し、特異に発現したタンパク質に対応する独自のスポットについて分析する。この手段により、タンパク質ASCは腫瘍組織中に特異的に発現するか、強く過剰発現するが、健康な対照組織中では検出されないことが見出される。それゆえ、多くのタンパク質の中でもとりわけ、乳癌の診断に使用するための候補マーカーとして適切である。
【００７８】
実施例2
乳癌マーカータンパク質ASCに対する抗体の産生
乳癌マーカータンパク質ASCに対するポリクローナル抗体を、免疫検出アッセイ、例えば、ウェスタンブロッティングおよびELISAによりASCの血清および血漿および血液レベルの測定における抗体のさらなる使用のために産生する。
【００７９】
組換えタンパク質の発現および精製
ASCに対する抗体を産生するために、免疫原を得るためにタンパク質の組換え発現を行なう。発現は、RTS100発現系と大腸菌の組み合わせを適用して行なう。第一の工程において、DNA配列を分析し、高収率cDNAサイレント変異バリアントおよび個々のPCRプライマー配列の推奨を「ProteoExpert RTS E.coli HY」系を用いて得る。これは商業用のウェブベースサービスである（www.proteoexpert.com）。推奨されたプライマー対を用いて、ASCタンパク質をコードするヌクレオチド配列のインビトロ転写および発現のためcDNAから直鎖PCRテンプレートを産生するために「RTS 100 E.coli Linear Template Generation Set, His-tag」（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号 3186237）系を使用する。ウェスタンブロット検出およびその後の精製のために、発現タンパク質はHis-tagを含む。最良の発現バリアントを同定する。PCRから発現および検出までの全ての工程を製造業者の使用説明書に従って行なう。全ての必要なT7調節領域（プロモーター、リボソーム結合部位およびT7ターミネーター）を含む各々のPCR産物を、製造業者の使用説明書に従ってpBAD TOPO（登録商標）ベクター（Invitrogen, Karlsruhe, Germany, カタログ番号 K 4300/01)にクローニングする。T7調節配列を用いた発現のために、構築物を大腸菌BL 21（DE 3）に形質転換し（Studier, F.W.ら、Methods Enzymol. 185 （1990）60-89）、形質転換細菌をタンパク質発現のために1lバッチ中で培養する。
【００８０】
His-ASC融合タンパク質の精製は、以下の標準的な手順に従いNiキレートカラムにおいて行なう。手短にいえば、His-ASC融合タンパク質の発現ベクターを含む1lの細菌培養物を遠心分離によりペレット化する。細胞ペレットをリン酸塩、pH8.0、7M 塩酸グアニジン、イミダゾールおよびチオグリセロールを含む溶解バッファーに再懸濁し、続いてUltra-Turrax（登録商標）を用いてホモジナイズする。不溶性物質を高速遠心分離によってペレット化し、上清をNiキレートクロマトグラフィーカラムにアプライする。カラムを数ベッド容積の溶解バッファーで洗浄し、続いてリン酸塩、pH8.0、および尿素を含むバッファーで洗浄する。最後に、結合した抗原を酸性条件下でSDSを含むリン酸塩バッファーを用いて溶出する。
【００８１】
抗体の産生のためのヘモシアニン−ペプチドコンジュゲートの合成
ヘテロ二官能性化学（マレイミド／SH化学）を用いて合成を行う。選択されたシステイン含有ASCペプチドを、Concholepas concholepas由来の3-マレイミドヘキサノイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MHS）活性化ヘモシアニン（Sigma, B-8556）にカップリングさせる。
【００８２】
ヘモシアニンを、100 mM NaH2PO4／NaOH, pH7.2中に10 mg/mlにする。ヘモシアニン1 mlあたり100μlのMHS（DMSO中に12.3 mg）を加え、１時間インキュベートする。試料を100 mM NaH2PO4／NaOH, pH6.5に対して一晩透析し、透析バッファーで6 mg/mlに調整する。選択されたシステイン含有ASCペプチドをDMSOに溶解する（1500ダルトンのペプチドについて5 mg/ml）。MHS活性化ヘモシアニン（6 mg/ml）1 mlあたり20μlの100 mM EDTA, pH7.0および100μlの選択されたシステイン含有ASCペプチドを加える。１時間後、反応混合物1 mlあたり10μlの0.5 M システイン／HClを加えることによって、残存マレイミド基をブロッキングする。この調製物をさらなる精製なしで免疫化のために用いる。
【００８３】
組換え融合タンパク質の発現および精製
ASCに対する抗体を産生するために、SlyD-ASC融合タンパク質の組換え発現を行い、免疫原を得る。したがって、発現ベクターはSlyD-(GGGS)5-GGG-IEGR-ASC-GGGS-HHHHHHをコードする遺伝子を含んで構築される。精製およびウェスタンブロット検出のために、構築物はカルボキシ末端のHis-Tag(HHHHHH)を含む。さらなるGSリンカー((GGGS)5-GGG)および第Xa因子の切断部位（IEGR）をSlyDとASCの間に挿入する。発現は大腸菌中、T5プロモーターの制御下で行われる。
【００８４】
第一の工程において、ベクターpSO60（SlyD-(GGGS)5-GGG-SlyDをコードする発現カセットを保有するpET24）を鋳型として用いてPCRを行う。プライマー１（配列番号：２）およびプライマー２（配列番号：３）を用いることによって、EcoRI部位およびリボソーム結合部位を5'末端に、BamHI部位、IEGRコード配列およびSacI部位を3'末端にそれぞれ保有するモノSlyDが得られる。生成されたPCR産物は、EcoRI/SacI断片としてpQE80L（Qiagen、Hilden）にクローニングされ、pQE80-SlyDを生じる。
【００８５】
次に、鋳型としてpBC14（ASCを保有するpET24）からASCを増幅する。プライマー３（配列番号：４）およびプライマー４（配列番号：５）を用いることによって、BamHI部位およびIEGRコード配列が5'末端に、ならびにGGGS-HHHHHHコード配列およびさらなるHindIII部位が3'末端に挿入される。
【００８６】
このPCR産物は、BamHI/HindIII断片としてpQE80-SlyDにクローニングされて、最終発現構築物（pQE80-SlyD-ASC）を生じる。全てのPCR工程およびクローニング工程は、製造業者の使用説明書に従って行う。
【００８７】
T5プロモーター制御下での発現のために、大腸菌C600細胞（Stratagene、Heidelberg）を最終構築物で形質転換する。発現株は、タンパク質生成のために1 lバッチ中で培養する。
【００８８】
His-SlyD-ASC融合タンパク質の精製は、標準的な手順に従って、Niキレートカラムで行う。手短にいえば、SlyD-ASC-His融合タンパク質の発現ベクターを含有する1 lの細菌培養物を遠心分離によりペレット化する。細胞ペレットを、Tris/HCl、pH 8、CHAPS、EDTAおよびリゾチームを含有する溶解バッファーに再懸濁し、続いてUltra-Turrax（登録商標）を用いてホモジナイズする。塩化マグネシウムおよびDNアーゼの添加によってDNAを酵素的に分解する。封入体を遠心分離によってペレット化する。ペレットをリン酸バッファー、pH 8.0、7M塩化グアニジニウムに溶解し、Niキレートカラムに負荷する。数ベッド容積のリン酸バッファー、pH 8.0、7M塩化グアニジニウムでカラムを洗浄する。次いで、リン酸バッファー、pH 8.0、7 M塩化グアニジニウムをリン酸バッファー、pH 8.0、NaClに置換し、マトリックス結合タンパク質の再折りたたみを誘導する。再折りたたみされた融合タンパク質は、リン酸バッファー、pH 8.0、NaCl、イミダゾールで溶出される。
【００８９】
ASCに対するモノクローナル抗体の産生
a)マウスの免疫化
12週齢のA/Jマウスを100μgのASC、融合タンパク質またはヘモシアニン−ペプチドコンジュゲート（上記参照）で腹腔内に初回免疫する。6週間後、一月間隔で２回のさらなる腹腔内免疫を行なう。この過程において、各マウスに水酸化アルミニウムに吸着した100μgのASCまたはヘモシアニン−ペプチドコンジュゲートおよび109個の細菌の百日咳菌を投与する。続いて、最後の２回の免疫を、PBSバッファー中の100μgのASCまたはヘモシアニン−ペプチドコンジュゲートを用いて融合の３日前および２日前におのおの静脈内に行う。
【００９０】
b)融合およびクローニング
a)に従って免疫化したマウスの脾臓細胞をGalfre, G.およびMilstein, C., Methods in Enzymology 73（1981）3-46に従ってミエローマ細胞と融合する。この過程において、免疫化マウスの約1×108個の脾臓細胞を2×107個のミエローマ細胞（P3X63-Ag8-653、ATCC CRL1580）と混合し、遠心分離（300 xgおよび4℃で10分間）する。次いで細胞を、ウシ胎仔血清（FCS）を含まないRPMI 1640培地で一度洗浄し、50 mlコニカルチューブ中にて400 xgで再び遠心分離する。上清を廃棄し、細胞沈殿物をタッピングにより穏やかに解し、1 mlのPEG（分子量4000、Merck、Darmstadt）を加え、ピペッティングにより混合する。37℃の水浴中で１分間の後、4〜5分間以内に室温でFCSを含まない5 mlのRPMI 1640を滴下する。その後、10％FCSを含む5 mlのRPMI 1640を約１分以内に滴下し、十分に混合し、培地（RPMI 1640+10％ FCS）で50 mlにし、続いて400 xgおよび4℃で10分間遠心分離する。沈殿した細胞を、10％ FCSを含むRPMI 1640培地中にとり、ヒポキサンチン-アザセリン選択培地（RPMI 1640+10％ FCS中に100 mmol/l ヒポキサンチン、1μg/ml アザセリン）中に播種する。100 U/mlのインターロイキン6を増殖因子として培地に添加する。
【００９１】
約10日後、初代培養物を特異的抗体について試験する。ASC陽性初代培養物を蛍光活性化細胞ソーターにより96ウェル細胞培養プレート中でクローニングする。この過程において、再び100 U/mlのインターロイキン6を増殖添加物として培地に添加する。
【００９２】
c)細胞培養物上清からの免疫グロブリンの単離
得られたハイブリドーマ細胞を、10％FCSを含むRPMI 1640培地中に1 mlあたり1×105個の細胞の密度で播種し、発酵槽（Thermodux Co., Wertheim/Main, Model MCS-104XL, 注文番号 144-050）中で7日間増殖させる。1 mlあたり100μgの平均濃度のモノクローナル抗体が培養物上清中に得られる。培養物上清からのこの抗体の精製を、タンパク質化学における従来の方法（例えば、Bruck, C.ら、Methods in Enzymology 121（1986）587-695による）により行なう。
【００９３】
ポリクローナル抗体の産生：
a)免疫
免疫のために、タンパク質溶液（100μg/ml ASC、融合タンパク質またはヘモシアニン−ペプチドコンジュゲート）および完全フロイントアジュバントの1：1の比の新鮮なエマルジョンを調製する。各ウサギをそれぞれの1 mlのエマルジョンで1、7、14および30、60および90日に免疫する。血液を抜き取り、得られた抗ASC血清を実施例3および4に記載されるさらなる実験のために使用する。
【００９４】
b)カプリル酸および硫酸アンモニウムを用いた連続沈殿によるウサギ血清からのIgG（免疫グロブリンG）の精製
１容積のウサギ血清を4容積の酢酸バッファー（60 mM、pH4.0）で希釈する。pHを、2 M Tris塩基を用いて4.5に調整する。カプリル酸（希釈試料の25μl/ml）を激しい攪拌下で滴下する。30分後、試料を遠心分離（13,000 xg、30分、4℃）し、ペレットを廃棄し、上清を収集する。上清のpHを2 M Tris塩基を加えることによって7.5に調整し、濾過（0.2μm）する。
【００９５】
上清の免疫グロブリンを最終濃度2 Mまでの4 M硫酸アンモニウム溶液の滴下により激しい攪拌下で沈殿させる。沈殿した免疫グロブリンを遠心分離（8,000 xg、15分、4℃）により収集する。
【００９６】
上清を廃棄する。ペレットを10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl中に溶解し、完全に透析する。透析物を遠心分離（13,000 xg、15分、4℃）し、濾過（0.2μm）する。
【００９７】
ポリクローナルウサギIgGのビオチン化
ポリクローナルウサギIgGを10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl中に10 mg/mlにする。IgG溶液1 mlあたり、50μlのビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミド（DMSO中に3.6 mg/ml）を加える。室温で30分後、試料をSuperdex 200（10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl）においてクロマトグラフを行う。ビオチン化IgGを含む画分を収集する。モノクローナル抗体を同じ手順に従ってビオチン化する。
【００９８】
ポリクローナルウサギIgGのジゴキシゲニン化
ポリクローナルウサギIgGを10mM NaH2PO4/NaOH、30mM NaCl、pH7.5中に10 mg/mlにする。IgG溶液1 mlあたり、50μlのジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, カタログ番号 1 333 054）（DMSO中に3.8 mg/ml）を加える。室温で30分後、試料をSuperdex（登録商標）200（10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl）においてクロマトグラフを行う。ジゴキシゲニン化IgGを含む画分を収集する。モノクローナル抗体を同じ手順に従ってジゴキシゲニンで標識する。
【００９９】
実施例3
ヒト血清および血漿試料中のASCの検出のためのウェスタンブロッティング
SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングをInvitrogen, Karlsruhe, Germanyの試薬および装置を使用して行なう。ヒト血漿試料を還元NuPAGE（登録商標）（Invitrogen）LDS試料バッファーに1:20に希釈し、95℃で5分間加熱する。10μlのアリコートをMESランニングバッファー系中の4〜12％ NuPAGE（登録商標）ゲル（Bis-Tris）において泳動する。ゲル分離したタンパク質混合物を、Invitrogen XCell IITM Blot Module（Invitrogen）およびNuPAGE（登録商標）トランスファーバッファー系を使用してニトロセルロース膜上にブロットする。膜をPBS/0.05％ Tween-20で3回洗浄し、SuperBlockブロッキングバッファー（Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA）でブロックする。ビオチン化一次抗体をSuperBlockブロッキングバッファーに希釈し（0.01〜0.2μg/ml）、膜とともに１時間インキュベートする。膜をPBS/0.05％ Tween-20で3回洗浄する。特異的に結合するビオチン化一次抗体をストレプトアビジンHRPコンジュゲート（SuperBlock ブロッキングバッファー中に20 mUABTS/ml）で標識する。１時間のインキュベーション後、膜をPBS/0.05％ Tween-20で3回洗浄する。結合したストレプトアビジンHRPコンジュゲートを化学発光基質（SuperSignal West Femto Substrate, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA）およびオートラジオグラフフィルムを用いて検出する。曝露時間は10分から一晩まで変動する。
【０１００】
実施例4
ヒト血清および血漿試料中のASCの測定のためのELISA
ヒト血清または血漿中のASCの検出のために、ストレプトアビジン被覆96ウェルマイクロタイタープレートを用いて、サンドイッチELISAを開発した。
【０１０１】
20μlアリコートのヒト血清もしくは血漿試料または標準抗原として組換えSlyD-ASC-His融合タンパク質の連続希釈物を10 mMリン酸塩、pH7.4、1％ BSA、0.9％ NaClおよび0.1％ Tween-20中において100μlのビオチン化ポリクローナル抗ASC抗体（1μg/ml）およびジゴキシゲニン化ポリクローナル抗ASC抗体（1μg/ml）とインキュベートした。30℃で90分インキュベーション後、プレートを0.9％ NaCl、0.1％ Tween-20で3回洗浄した。抗原抗体複合体の検出のために、10 mMリン酸塩、pH7.4、1％ BSA、0.9％ NaClおよび0.1％ Tween-20中のモノクローナル抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼコンジュゲート150μlを加えて30℃で30分インキュベートした。コンジュゲートの過剰量はプレートを0.9％ NaCl、0.1％ Tween-20で3回洗浄することによって除いた。結合したコンジュゲート量を200μlのTMB溶液（Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany, カタログ番号 12034425）と15分間インキュベーションすることによって検出した。50μlの1 M H2SO4の添加によって、酵素反応を停止させた。色の展開はELISAリーダーを用いて450 nmで定量化した。血清または血漿試料中のASCの濃度を組換えSlyD-ASC-His融合タンパク質の連続希釈物を用いた標準曲線から計算した。
【０１０２】
実施例５
マーカー評価、感受性および特異性；
診断の正確度の点から臨床的有用性の評価するためのROC分析
正確度を、十分に特徴づけられた患者コホートから得られた個々の液体試料を分析することにより評価する。対照集団（表1参照）は、172人の血液提供者および乳房撮影を受けた62人の患者からなる234人の女性を含む。これらの62人の患者は乳房撮影陰性と見出され、他の胸部疾患の症状は検出されない。
【０１０３】
174人の乳癌患者を異なる病期の腺管癌、小葉癌、管状腺癌、髄様癌および粘液性癌腫を有する患者から集めた。乳癌を早期に診断する目的のために、UICC IおよびUICC II期の割合が80％であった。他の非悪性胸部疾患に対する特異性を分析するために、77人の異なる非悪性胸部疾患および9人の非悪性婦人科疾患が試料コホートに含まれる。該コホートを表１にまとめる。
【０１０４】
CA 15-3およびCEAを、市販のアッセイ（Elecsys（登録商標）Systemsイムノアッセイアナライザー用のRoche Diagnostics, CA 15-3アッセイ：カタログ番号 0 304 5838およびCEAアッセイ：カタログ番号 1731629））によって測定し、上記のように、これらの個体の各々から得られた血清アリコート中でASCを測定した。
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
カットオフは95％特異性に等しい、健康な対照集団の95％百分位数に関して定義する。こうして本一連の実験において、ASCに関するカットオフ値を0.60 ng/mlに設定する。
【０１０７】
疾患対照群に注目すると、乳房撮影の特異性は非常に低い（18.2％）。乳癌マーカーの利点は、乳房撮影に比べてより高い特異性である。0.6 ng/mlのカットオフを用いて、疾患対照群におけるASCの特異性を68.6％と測定したが、これはCA 15-3またはCEAに関してより低い。疾患対照群における、健康な対照と比較してより高レベルのASCのために、カットオフ濃度の決定に、疾患対照を含む必要がある。しかし、乳癌試料にこのカットオフ値を用いて、30.5％の感度が得られたが、これは周知のマーカーCA 15-3およびCEAよりも高い。また、早期のASCの非常に高い検出率もある（表２参照）。
【０１０８】
マーカーCEAおよびCA 15-3と比較したASCの感度および特異性を要約するデータを表２および表３に示す。
【０１０９】
【表２】
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【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
カットオフ値を考慮せずに新しいマーカーの識別能力を調べるために、ROC分析をZweig, M. H.およびCampbell,上掲に従って行なった。「健康な」対照群から乳癌群における患者を区別するための判別能力は、曲線下面積により測定されるように、確立されたマーカーCA 15-3（57％）およびCEA（69％）各々と比べて、ASCについて80％以上であった。疾患対照が「対照」群に含まれる場合、曲線下面積は72％に落ちるが、常にCA 15-3およびCEAよりも高かった。
【０１１２】
【表４】
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【０１１３】
マーカーの感度および特異性はカットオフ値を変えることで容易に変化させ得るので、新しいマーカーの識別能力を分析する最良のツールは、ROC分析である。このツールを用いると、ASCは、周知のマーカーCA 15-3およびCEAと比較して、乳癌患者と、他の胸部疾患を含む対照試料との間の最良の識別能力を有する。さらに、ASCは早期により多くの腫瘍を検出することができる。疾患対照を含む全ての対照試料を用いると、ASCの判別能力（72％）はCA 15-3（57％）およびCEA（67％）より高い。データは、ASCが乳癌の診断または手術後の患者の継続管理において大変有用であり得ると示唆する。
【０１１４】
BC患者由来の試料のいくつかにおいて、ASCのレベルおよびCA 15-3のレベルの両方が高くなる。さらに、異なる乳癌患者から得られた個々の試料においてASCまたはCA 15-3のいずれかが陽性である。このことによって、両方のマーカーが患者試料において測定される場合、より高い感度がもたらされる。患者試料が陽性として分類される場合、マーカーASCまたはCA 15-3の一つは陽性であると、より高い感度が達成され得る。
【０１１５】
予備データは、ASCがまた、手術後の患者の継続管理において非常に有用であり得ることを示す。
【０１１６】
2007507695.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図は腫瘍試料を負荷した2Dゲル（左側）、および対応する対照試料を負荷したゲル（右側）の典型的な例を示す。これらのゲルの拡大部分にある円は、タンパク質ASCの位置を示す。同じ方法を用いて、このタンパク質は健康な組織では検出されなかった。ASCは約pH 6の等電点および約22 kDaの見かけの分子量に相当して2Dゲル中で移動する。
【図２】図は、CA 15-3に対するROC曲線を示す：乳癌対健康な対照（点線；ROC：57％）ならびに乳癌対健康な対照および疾患対照（実線；ROC：57％）。x軸は、1から特異性値を引くことによって計算した値を示す。y軸は感度を示す。両方において、1の値は100％に相当する。乳癌：174試料。健康な対照：234試料。疾患対照：86試料。
【図３】図は、CEAに対するROC曲線を示す：乳癌対健康な対照（点線；ROC：69％）ならびに乳癌対健康な対照および疾患対照（実線；ROC：67％）。x軸は、1から特異性値を引くことによって計算した値を示す。y軸は感度を示す。両方において、1の値は100％に相当する。乳癌：174試料。健康な対照：234試料。疾患対照：86試料。
【図４】図は、ASCに対するROC曲線を示す：乳癌対健康な対照（点線；ROC：80％）ならびに乳癌対健康な対照および疾患対照（実線；ROC：72％）。x軸は、1から特異性値を引くことによって計算した値を示す。y軸は感度を示す。両方において、1の値は100％に相当する。乳癌：174試料。健康な対照：234試料。疾患対照：86試料。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年3月30日(2006.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）個体から得た液体試料を提供すること、
ｂ）前記試料と、カスパーゼ関連リクルートドメインを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質（ASC）に対する特異的な結合剤とを、前記結合剤とASCの間での複合体の形成に適切な条件下で接触させること、および
ｃ）（ｂ）で形成された複合体の量を乳癌の診断に相関させること
を含む、乳癌の診断方法。 
【請求項２】
個体から得た液体試料からの乳癌の診断における、マーカー分子としてのタンパク質ASCの使用。 
【請求項３】
個体から得た液体試料からの乳癌の診断における、乳癌に対する1つ以上のマーカー分子と組み合わせた、乳癌に対するマーカー分子としてのタンパク質ASCの使用。
【請求項４】
少なくとも1つの他のマーカー分子がCA 15-3である、請求項３記載の使用。
【請求項５】
少なくとも1つの他のマーカー分子が細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）である、請求項３記載の使用。 
【請求項６】
ASCに対する少なくとも1つの特異的な結合剤およびASCの測定のための補助試薬を含む、免疫学的キット。 
【請求項７】
ASCに対する少なくとも1つの特異的な結合剤、細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）に対する少なくとも1つの特異的な結合剤、CA 15-3に対する少なくとも1つの特異的な結合剤ならびにASC、CA 15-3および細胞性レチノイン酸結合タンパク質II（Swiss-PROT: P29373）の測定のための補助試薬を含む、免疫学的キット。
【国際調査報告】
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