(57)【要約】ＷＲＮの調節因子の使用が、記載される。ＷＲＮのアクチベーターが、成長停止、アポトーシス、または増殖性老化を誘導するために使用され得る。一方、ＷＲＮのインヒビターは、成長停止、アポトーシス、または増殖性老化を低減するために使用され得る。ＷＲＮの調節因子を同定するための方法もまた、記載される。本出願において、ＷＲＮの調節因子をスクリーニングするための方法が、提供される。この方法は、（ａ）ＷＲＮを発現する細胞を提供する工程；（ｂ）候補調節因子を、上記調節因子が上記細胞によって取り込まれる条件下で、上記細胞と接触させる工程；および（ｃ）ＤＮＡ損傷応答経路の活性化と関連する上記細胞の特性を測定する工程；を包含し、コントロールと比較した上記特性の変化は、ＷＲＮの調節因子を示す。
2007537758.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＷＲＮの調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）ＷＲＮを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）候補調節因子を、該調節因子が該細胞によって取り込まれる条件下で、該細胞と接触させる工程；および
（ｃ）ＤＮＡ損傷応答経路の活性化と関連する該細胞の特性を測定する工程；
を包含し、コントロールと比較した該特性の変化は、ＷＲＮの調節因子を示す、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記候補調節因子は、ＷＲＮに特異的に結合する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記細胞の特性は、細胞増殖、細胞生存、細胞形態、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性、ｐ５３のリン酸化、ｐ９５のリン酸化、ＡＴＭのリン酸化、Ｈ２ＡＸのリン酸化、Ｓ期停止の誘導、およびアポトーシスの誘導からなる群より選択される、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のうちのいずれかに記載の方法であって、前記細胞は癌細胞である、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、方法。
【請求項６】
ＷＲＮに特異的に結合する因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）ＷＲＮを候補因子と接触させる工程；および
（ｂ）候補因子がＷＲＮに特異的に結合するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、ＷＲＮは固体支持体に結合している、方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法であって、前記候補因子は固体支持体に結合している、方法。
【請求項９】
ＷＲＮの調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）ＷＲＮを、ＷＲＮについての核酸基質の存在下でインビトロで候補因子と接触させる工程；および
（ｂ）該基質の加水分解を測定する工程であって、それによってコントロールと比較して該基質の加水分解を変化させることによって調節因子が同定される、工程；
を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記核酸基質は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも３３％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドであり、ｎ＝１〜２０である、方法。
【請求項１１】
癌を処置するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に対して、ＷＲＮのアクチベーターを含む組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項１２】
アポトーシスを誘導するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に対して、ＷＲＮのアクチベーターを含む組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項１３】
細胞老化を誘導するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に対して、ＷＲＮのアクチベーターを含む組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項１４】
日焼けを促進するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に対して、ＷＲＮのアクチベーターを含む組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項１５】
細胞分化を促進するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に対して、ＷＲＮのアクチベーターを含む組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項１６】
免疫抑制を促進するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に対して、ＷＲＮのアクチベーターを含む組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１１〜１６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記アクチベーターは、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも３３％のヌクレオチド配列同一性を有する、ＷＲＮのオリゴヌクレオチドアクチベーターであり、少なくとも最初のｘ個の３’ヌクレオチド結合は、３’→５’ヌクレアーゼによって加水分解可能であり、ｎ＝１〜２０であり、ｘは約１〜約１０である、方法。
【請求項１８】
アポトーシスを阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に対して、ＷＲＮのインヒビターを含む組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項１９】
細胞老化を阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に対して、ＷＲＮのインヒビターを含む組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項２０】
成長を促進するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に対して、ＷＲＮのインヒビターを含む組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項２１】
日焼けを阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に対して、ＷＲＮのインヒビターを含む組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項２２】
細胞分化を阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に対して、ＷＲＮのインヒビターを含む組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項２３】
癌処置の副作用を低減するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に対して、ＷＲＮのインヒビターを含む組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記組成物は、化学療法または電離放射線と組み合わせて与えられる、方法。
【請求項２５】
請求項１８〜２４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記インヒビターは、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも３３％のヌクレオチド配列同一性を有する、ＷＲＮのオリゴヌクレオチドインヒビターであり、少なくとも最初のｘ個の３’ヌクレオチド結合は、３’→５’ヌクレアーゼによって加水分解可能であり、ｎ＝１〜２０であり、ｘは約１〜約１０である、方法。
【請求項２６】
（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも３３％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドと、少なくとも１つの加水分解不可能なヌクレオチド間結合とを含む、組成物であって、少なくとも最初のｘ個の３’ヌクレオチド結合は、３’→５’ヌクレアーゼによって加水分解可能であり、ｎ＝１〜２０であり、ｘは約１〜約１０である、組成物。
【請求項２７】
請求項２６に記載の組成物であって、前記３’→５’ヌクレアーゼは、ＷＲＮである、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１．発明の分野）
本発明は、シグナル伝達経路の調節に関する。より具体的には、本発明は、テロメア開始型の老化、アポトーシス、日焼け、および他のＤＮＡ損傷応答の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
（２．関連技術の説明）
ヒトにおける癌の頻度は、人口が加齢するにつれて先進国で増加している。診断時にある種の型の癌および疾患病期について、罹患率および死亡率は、広汎な研究にも関わらず、近年顕著に改善していない。癌の進行の間に、腫瘍細胞は、負の調節制御（老化に対する抵抗性およびアポトーシスが挙げられる）（正常細胞とその組織特異的環境との相互作用がどのように調節されるかについての重要な局面である）からますます独立している。
【０００３】
細胞老化は、癌に対する重要な防御であることが示唆されている。広汎な証拠は、進行性テロメア短縮（染色体の３’末端を複製不能なことによって引き起こされる）または他の何らかの形態のテロメア機能不全を、老化と関連付ける。生殖系列細胞およびほとんどの癌細胞において、不死性は、テロメラーゼ（ＴＴＡＧＧＧ反復を染色体端部の３’末端に付加する酵素複合体である）によるテロメアの長さの維持と関連する。テロメア（ＴＴＡＧＧＧのタンデム反復）は、ループ構造で終端し、このループ構造は、近傍のテロメア二重鎖ＤＮＡ内に差し込まれ、かつテロメア反復結合因子（ＴＲＦ）（特にＴＲＦ２）によって安定化される、約１５０塩基〜約３００塩基の３’一本鎖突出を備える。ドミナントネガティブ形態のＴＲＦ２（ＴＲＦ２ＤＮ）の異所性発現は、一次線維芽細胞、線維肉腫細胞、および他のある種の細胞型において、テロメアループ構造を破壊し、その３’突出を露出させてＤＮＡ損傷応答を引き起こし、その後、老化を引き起こす。
【０００４】
老化はまた、過度のＤＮＡ損傷または特定のオンコジーンの過剰発現によって、実際には促進され得る。テロメラーゼ逆転写酵素触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）（これは、テロメラーゼの長さを触媒的に維持するかまたは構築する）の異所性発現は、ある種のヒト細胞型のその後の不死化によって老化を回避し得る。このことは、複製的老化のテロメラーゼ依存性機構を強く示唆する。さらに、悪性疾患細胞は、一般的に、ＴＥＲＴを発現し、かつ／またはその細胞が老化応答を回避するのを可能にする変異を含んで通常の老化細胞よりも短いテロメラーゼをしばしば有するにも関わらず、無限に増殖する。しかし、ある種の腫瘍細胞は、種々の抗癌剤に応答して老化する。このことは、不死の獲得は、ＤＮＡ損傷に対するこの基本的な細胞応答の喪失を必ずしも意味しないことを示す。
【０００５】
ヒト細胞における老化は、ｐ５３経路およびｐＲｂ経路に大きく依存する。腫瘍サプレッサーｐ５３は、種々の刺激（例えば、ＤＮＡ損傷、転写調節不全もしくは複製調節不全、オンコジーン形質転換、およびある種の化学療法剤により引き起こされる微小管の調節不全）を細胞増殖の停止もしくはアポトーシスへと変換することによって、細胞ストレス応答において重要な役割を果たす。活性化された場合、ｐ５３は、細胞増殖の停止またはプログラムされた自殺細胞死（アポトーシス）を引き起こす。このことは、次に、ゲノムの安定性のための重要な制御機構として作用する。詳細には、ｐ５３は、遺伝的に損傷した細胞を細胞集団から排除することによってゲノムの安定性を制御する。従って、ｐ５３の主要な機能のうちの１つは、腫瘍形成を防止することである。
【０００６】
インタクトな腫瘍サプレッサーｐＲｂ経路もまた、腫瘍形成の防止に寄与する。野生型ｐ５３を含まないｐＲｂ−／−腫瘍細胞において、ｐＲｂの導入は、老化を誘導する。子宮頚部癌細胞は、しばしば、野生型ｐ５３遺伝子およびｐＲｂ遺伝子を保持するが、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質およびＨＰＶ  Ｅ７タンパク質は、それぞれ、ｐ５３経路およびｐＲｂ経路を阻害する。ウイルスＥ２タンパク質の異所性発言は、ＥＰＶ  Ｅ６遺伝子およびＥＰＶ  Ｅ７遺伝子の転写を抑制し、子宮頚部癌細胞における迅速かつ顕著な廊下応答を誘導する。このこともまた、癌細胞老化におけるｐ５３およびｐＲｂの重要な役割を確認する。
【０００７】
ｐ５３経路またはｐＲＢ経路のみを抑制することは、線維芽細胞が複製的老化を回避するためには十分ではない。実際には、ＳＶ４０  Ｔ抗原でトランスフェクトされているか、またはアデノウイルスＥ１Ａ＋Ｅ１Ｂの組み合わせもしくはＨＰＶ  Ｅ６＋Ｅ７の組み合わせで形質導入されている（これらは、ｐ５３経路およびｐＲＢ経路の両方を抑制する）、ヒト線維芽細胞は、長期寿命を有し、複製的老化を免れる。
【０００８】
ＤＮＡにおける二本鎖破壊は、哺乳動物細胞に対して非常に細胞傷害性である。高度に保存されたＭＲＮ複合性は、真核生物における二本鎖破壊の修復に関与する。ＭＲＮ複合体は、二本鎖破壊部位に、その形成直後に付着する。このＭＲＮ複合体はまた、細胞周期のＳ期の間に、テロメア反復結合因子（ＴＲＦ）と会合したテロメアへと移動する。
【０００９】
ＭＲＮ複合体は、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮＢＳ（ｐ９５）からなる。Ｍｒｅ１１は、Ｍｒｅ１１／ｐ９５／Ｒａｄ５０複合体の一部として、細胞周期のＳ期の間にテロメアと会合する。Ｍｒｅ１１は、ＤＮＡ鎖の３’末端に対して優先性を有するエキソヌクレアーゼである。Ｍｒｅ１１の活性は、Ｒａｄ５０（これは、ＡＴＰアーゼである）との相互作用に依存性であると考えられる。Ｎｂｓ１は、ＭＲＮ複合体の核局在化および二本鎖破壊部位におけるＭＲＮ複合体のアセンブリに関与すると考えられる。
【００１０】
ヴェルナー症候群において変異しているタンパク質であるＷＲＮタンパク質は、ＭＲＮ複合体と相互作用することが公知である（Ｃｈｅｎｇら、２００４，Ｖｏｌ．２００４）。ヴェルナー症候群は、早期老化、悪性疾患増加、およびゲノムの不安定性によって特徴付けられる、常染色体劣性障害である。ＷＲＮは、ヘリカーゼドメインおよび３’→５’エキソヌクレアーゼドメインの両方を含む、核タンパク質である（非特許文献１）。現在まで、ヴェルナー症候群において同定されたすべての変異は、このタンパク質のＣＯＯＨ末端から核局在化シグナルを排除するＷＲＮ短縮である（Ｏｓｈｉｍａ，Ｊ．２００２）。従って、ヴェルナー症候群におけるＷＲＮ変異は、ＷＲＮタンパク質が核内のこのタンパク質の作用部位に到達することを妨げることによって、機能的ヌル表現型を生じると考えられる。ヴェルナー症候群患者由来の細胞は、ベースラインおよびＤＮＡ損傷後の両方で、欠失レベルおよびトランスロケーションレベルの増加を示す。このことは、ＷＲＮタンパク質が、ＤＮＡの修復、複製および組換えに関与することを示唆する（非特許文献２）。ヴェルナー症候群細胞はまた、年齢が一致するコントロールと比較して早期に老化し（非特許文献３）、そしてまた、加速されたテロメア短縮を示す（非特許文献４）。
【００１１】
ＭＲＮ複合体との相互作用に加えて、ＷＲＮは、ＤＮＡ損傷応答およびＤＮＡ修復／複製に関与する他のタンパク質（ＤＮＡ−ＰＫ／Ｋｕ（非特許文献５）、ｐ５３（非特許文献６）、早期加齢症候群であるブルーム症候群において変異するヘリカーゼ（非特許文献７））と相互作用することが公知である。さらに、ＷＲＮは、テロメア反復結合因子２であるＴＲＦ２と相互作用する。この相互作用は、ＷＲＮエキソヌクレアーゼの特異性を変化させて、テロメアＤＮＡの３’→５’消化を促進する（非特許文献８；非特許文献９）。まとめると、これらのデータは、ＤＮＡ代謝およびテロメア維持におけるＷＲＮの重要な役割を示す。しかし、これらの経路におけるＷＲＮの正確な役割は、理解されていない。
【００１２】
癌は、代表的には、非常に毒性のある治療（例えば、化学療法および放射線療法）により処置される。これは、すべての増殖性細胞（正常細胞であろうと、悪性疾患細胞であろうと）を同等に損傷させる。そのような処置の副作用としては、リンパ系に対する重篤な損傷、造血系に対する重篤な損傷、および腸上皮に対する重篤な損傷、ならびに毛髪喪失が挙げられる。より安全かつ有効な癌治療の必要性（特に、正常であるが増殖性である細胞よりも悪性疾患細胞を優先的に標的とすることによってこれらの副作用のうちのいくつかまたはすべてを回避する代替的治療についての必要性）が、存在し続けている。
【非特許文献１】Ｏｓｈｉｍａ，Ｊ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ（２００２）２２，８９４〜９０１
【非特許文献２】Ｏｐｒｅｓｋｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（２００３）２４，７９１〜８０２
【非特許文献３】Ｍａｒｔｉｎら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ（１９７０）２３，８６〜９２
【非特許文献４】Ｓｃｈｕｌｚら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ（１９９６）９７，７５０〜４
【非特許文献５】Ｋａｒｍａｋａｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００２）３０，３５８３〜９１
【非特許文献６】Ｂｒｏｓｈら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００１）２７６，３５０９３〜１０２
【非特許文献７】ｖｏｎ  Ｋｏｂｂｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００２）２７７、２２０３５〜４４
【非特許文献８】Ｍａｃｈｗｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００４）２３、１４９〜５６
【非特許文献９】Ｏｐｒｅｓｋｏら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００２）２７７、４１１１０〜９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、ＷＲＮの調節因子をスクリーニングするための細胞ベースの方法に関し、この方法は、候補調節因子を、細胞と、その調節因子がその細胞によって取り込まれる条件下で接触させる工程；およびＤＮＡ損傷応答経路の活性化と関連するその細胞の特性（細胞増殖、細胞生存、細胞形態、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性、ｐ５３のリン酸化、ｐ９５のリン酸化、ＡＴＭのリン酸化、Ｈ２ＡＸのリン酸化、Ｓ期停止の誘導、およびアポトーシスの誘導が挙げられるが、これらに限定はされない）を測定する工程；を包含する。調節因子は、コントロールと比較してこれらの特性を変化させることによって、同定され得る。上記候補調節因子は、ＷＲＮに特異的に結合する因子であり得る。ＷＲＮは、エキソヌクレアーゼ活性を有し得る、ＷＲＮフラグメント、ＷＲＮホモログ、ＷＲＮアナログ、またはＷＲＮ改変体として、発現され得る。
【００１４】
本発明はまた、ＷＲＮに特異的に結合する因子をスクリーニングするためのインビトロ方法に関する。この方法は、ＷＲＮを候補因子と接触させる工程；およびその候補因子がＷＲＮに特異的に結合するか否かを決定する工程；を包含する。ＷＲＮは、固体支持体に結合しているものであり得る。あるいは、上記候補因子は、固体支持体に結合しているものであり得る。
【００１５】
本発明はまた、ＷＲＮの調節因子をスクリーニングするためのインビトロ方法に関する。この方法は、ＷＲＮを、ＷＲＮについての核酸基質の存在下で候補因子と接触させる工程；およびその基質の加水分解を測定する工程；を包含する。調節因子は、コントロールと比較した上記基質の加水分解を変化させることによって、同定され得る。上記核酸基質は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも３３％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドであり得、ｎ＝１〜２０である。あるいは、上記核酸基質は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドであり得、ｎ＝１〜２０である。上記基質核酸の加水分解は、ＵＶ吸収、標識オリゴのゲル分析、または沈殿不能なヌクレオチド塩基の回収によって、測定され得る。
【００１６】
本発明はまた、ＤＮＡ損傷の調節因子をスクリーニングするための細胞ベースの方法に関する。この方法は、候補調節因子を、ＷＲＮを発現する細胞と、その調節因子がその細胞によって取り込まれる条件下で、オリゴヌクレオチドの存在下で接触させる工程；およびＤＮＡ損傷応答経路の活性化と関連するその細胞の特性（細胞増殖、細胞生存、細胞形態、老化関連性β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）活性、ｐ５３のリン酸化、ｐ９５のリン酸化、ＡＴＭのリン酸化、Ｈ２ＡＸのリン酸化、Ｓ期停止の誘導、およびアポトーシスの誘導が挙げられるが、これらに限定はされない）を測定する工程；を包含する。調節因子は、コントロールと比較した上記基質の加水分解を変化させることによって、同定され得る。上記オリゴヌクレオチドは、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも３３％のヌクレオチド配列同一性を有し得、ｎ＝１〜２０である。上記オリゴヌクレオチドは、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有し得、ｎ＝１〜２０である。ＷＲＮは、エキソヌクレアーゼ活性を有し得る、ＷＲＮフラグメント、ＷＲＮホモログ、ＷＲＮアナログ、またはＷＲＮ改変体として、発現され得る。
【００１７】
上記の細胞ベースのスクリーニング方法において使用される細胞は、癌細胞であり得る。記載される細胞ベースのスクリーニング方法において使用される細胞は、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路によって、テロメアを維持し得る。上記のインビトロスクリーニング方法および細胞ベースのスクリーニング方法において記載される候補調節因子および因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンまたは低分子量有機分子であり得る。
【００１８】
本発明はまた、ＷＲＮのアクチベーターを含む組成物の使用に関する。上記アクチベーターは、癌を処置するため、アポトーシスを誘導するため、細胞老化を誘導するため、日焼け促進を阻害するため、細胞分化を促進するため、または免疫抑制を促進するために、使用され得る。上記アクチベーターは、ＷＲＮのオリゴヌクレオチドアクチベーターであり得、これは、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも３３％のヌクレオチド配列同一性を有し得、ｎ＝１〜２０である。上記アクチベーターはまた、ＷＲＮのオリゴヌクレオチドアクチベーターであり得、これは、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有し得、ｎ＝１〜２０である。最初の３’ヌクレオチド結合のうちの約１個〜約１０個が、３’→５’ヌクレアーゼによって加水分解可能であり得る。
【００１９】
本発明はまた、ＷＲＮのインヒビターを含む組成物の使用に関する。上記インヒビターは、アポトーシスを阻害するため、細胞老化を阻害するため、増殖を促進するため、日焼けを阻害するため、細胞分化を阻害するため、または癌処置の副作用を低減するために、使用され得る。上記組成物は、化学療法または電離放射線と組合わせて与えられ得る。上記インヒビターは、ＷＲＮのオリゴヌクレオチドインヒビターであり得、これは、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも３３％のヌクレオチド配列同一性を有し得、ｎ＝１〜２０である。上記インヒビターはまた、ＷＲＮのオリゴヌクレオチドインヒビターであり得、これは、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有し得、ｎ＝１〜２０である。最初の３’ヌクレオチド結合のうちの約１個〜約１０個が、３’→５’ヌクレアーゼによって加水分解可能であり得る。
【００２０】
本発明また、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも３３％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドと、少なくとも１つの加水分解不可能なヌクレオチド間結合とを含む、組成物に関する。最初の３’ヌクレオチド結合のうちの１個〜約１０個は、３’→５’ヌクレアーゼ（例えば、ＷＲＮ）によって加水分解可能であり得る。上記オリゴヌクレオチドは、ＴＴＡＧＧＧと少なくとも３３％のヌクレオチド配列同一性を有し得る。上記オリゴヌクレオチドはまた、ＴＴＡＧＧＧと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有し得る。上記オリゴヌクレオチドはまた、配列ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧを有し得る。上記の加水分解不可能な結合は、ホスホロチオエート結合であり得る。上記オリゴヌクレオチドは、ＰＮＡであり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＷＲＮが、３’テロメア突出部配列の加水分解によって開始されるＤＮＡ損傷様シグナル伝達に関与するという発見に基づいている。テロメア配列の加水分解は、ＤＮＡ損傷（細胞老化、日焼け、およびアポトーシスが挙げられるが、これらに限定はされない）に対する防御細胞応答のために重要なシグナル伝達カスケードを開始する。本明細書および同時係属中の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８１９（これは、その全体が参考として援用される）において示されるように、３’末端においてヌクレアーゼ消化に対してブロックされているＴ−オリゴは、ＤＮＡ損傷応答を刺激するその能力を失う。ＷＲＮがＤＮＡ複製およびＤＮＡ修復ならびにテロメア維持に関与する３’→５’ヌクレアーゼであることを考慮すると、ＷＲＮは、Ｔ−オリゴの核「センサー」であり得る。
【００２２】
理論によって拘束はされないが、本発明者らは、ＤＮＡ損傷（例えば、ＵＶ照射、ＤＮＡに対する酸化的損傷）、またはＤＮＡに対する発癌性付加物の生成、または加齢に関連するテロメアの短縮が、テロメアループを不安定にし、ＴＴＡＧＧＧ反復を有する３’突出部配列を露出させると考える。次いで、テロメア関連タンパク質が、配列依存様式で上記突出部に付着し、単独でかまたは複合体の一部として、ＷＲＮに対する「アンカー」として作用する。ＷＲＮは、次に、３’末端からテロメア突出部を加水分解し始める。これは、さらなるシグナルカスケードを導き、最終的には、細胞周期の停止、遺伝子誘導、アポトーシス、および／または老化という生物学的終点に導く。本明細書において提示されるデータは、ＷＲＮタンパク質が、単独でかまたは複合体（例えば、Ｍｒｅ１１／Ｒａｄ５０／ｐ９５（Ｎｂｓ１）複合体）の一部として、Ｔ−オリゴを「感知し」そして分解し、ＡＴＭキナーゼおよびＤＮＡ−ＰＫキナーゼの活性化と、その後の下流基質のリン酸化をもたらす（図１２）ことを、示唆する。
【００２３】
提唱されるシグナル伝達経路におけるＷＲＮの役割に基づいて、ＷＲＮは、ＤＮＡ損傷の存在にもテロメアループ破壊の存在にも関わらず、ＤＮＡ損傷応答経路を活性化すると予期される。同様に、ＷＲＮのインヒビターは、ＤＮＡ損傷の存在下またはテロメアループ破壊の存在下でさえ、上記シグナル伝達経路を開始すると予期される。
【００２４】
本発明の製品、組成物および方法を開示し説明する前に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定的であることを意図するものではないことが、理解されるべきである。本明細書および添付された特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈がそうではないと明瞭に示さない限り、複数の参照物を含むことが、注意されなければならない。
【００２５】
本出願全体にわたって、特許または文献が参照される場合、これらの刊行物の開示全体が、本発明が属する分野の技術水準を完全に説明するために本明細書によって本出願中に参考として援用される。
【００２６】
（１．定義）
本明細書で使用される場合、用語「アクチベーター」とは、タンパク質を活性化するかまたはタンパク質の活性を増加する、任意の物質を意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「投与する」とは、ある調節因子の投薬量を説明するために用いられた場合、その因子の１回の投与または複数回の投与を意味する。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「アナログ」とは、ペプチドまたはポリペプチドに関して使用された場合、１つ以上の非標準アミノ酸、または従来のアミノ酸セットからの構造的変化を有し、好ましくは、少なくとも１種の生物学的活性を保持する、ペプチドもしくはポリペプチドを意味し；オリゴヌクレオチドに関して使用された場合、ホスホジエステルヌクレオチド間結合以外の１つ以上のヌクレオチド間結合を有し、好ましくは、少なくとも１種の生物学的活性を保持する、オリゴヌクレオチドを意味する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」とは、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥ、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含む）、および単鎖抗体、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、二官能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）抗体およびその誘導体を意味する。上記抗体は、所望されるエピトープまたはそのエピトープ由来の配列に対して十分な結合特異性を示す、モノクローン抗体、ポリクローン抗体、アフィニティ精製抗体またはそれらの混合物であってもよい。上記抗体は、キメラ抗体でもよい。上記抗体は、当該分野で公知の１種以上の化学物質部分、ペプチド部分またはポリペプチド部分の付着によって誘導体化され得る。上記抗体は、化学物質部分と結合体化され得る。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「アポトーシス」とは、細胞質の細胞小器官の完全性を保た状態での細胞体積の連続的な縮小；光学顕微鏡もしくは電子顕微鏡で観察した場合のクロマチンの凝縮（すなわち核凝縮）；および／または遠心沈降アッセイで決定した場合のヌクレオソームサイズ分画フラグメントへのＤＮＡ切断を含むがそれらに限定されない、ある形式の細胞死を意味する。食細胞による無傷の細胞フラグメント（アポトーシス体）の飲み込みを伴って細胞の膜完全性が失われた場合（例えば、膜小胞形成）に、細胞死が生じる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「生物学的活性」とは、ペプチドもしくはポリペプチドのアナログ、誘導体、フラグメント、ホモログ、または改変体に関して使用される場合、そのアナログ、誘導体、フラグメント、ホモログ、または改変体が、そのペプチドもしくはポリペプチドの少なくとも１つの活性（特異的抗体によって結合される能力が挙げられるが、これには限定されない）を保持することを意味し；ＷＲＮに関して使用される場合、ヘリカーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、およびＭＲＮ複合体と相互作用するに能力が挙げられるが、これらには限定されず；オリゴヌクレオチドのアナログ、誘導体、フラグメント、ホモログ、または改変体に関して使用される場合、そのアナログ、誘導体、フラグメント、ホモログ、または改変体が、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２（その内容は、本明細書において参考として援用される）によって記載されるようなストリンジェントな条件下で上記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることを意味する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「癌の処置」とは、当該分野で公知である任意の癌処置（化学療法および放射線療法が挙げられるが、これらに限定はされない）を意味する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「との組み合わせ」とは、調節因子の投与を説明するために使用された場合、その調節因子が、さらなる処置の前、さらなる処置と共に、もしくはさらなる処置の後、またはそれらの組み合わせで、投与され得ることを意味する。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「誘導体」とは、ペプチドまたはポリペプチドに関して使用される場合、一次構造（アミノ酸またはアミノ酸アナログ）以外が異なるペプチドまたはポリペプチドを意味し、好ましくは少なくとも１種の生物学的活性を保持する。例えば、ペプチドの誘導体またはポリペプチドの誘導体は、翻訳後修飾の一形式であるグリコシル化されていることによって、異なり得る。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、異種系中での発現に起因するグリコシル化パターンを示し得る。少なくとも１種の生物活性が保持される場合、これらのペプチドまたはポリペプチドは、本発明による誘導体である。他の誘導体としては、共有結合で修飾されたＮ末端もしくはＣ末端を有する融合ペプチドもしくは融合ポリペプチド；ＰＥＧ化ペプチドまたはＰＥＧ化ポリペプチド；脂質部分と会合したペプチドまたは脂質部分と会合したポリペプチド；アルキル化ペプチドまたはアルキル化ポリペプチド、アミノ酸側鎖官能基を介して他のペプチド、ポリペプチドまたは化学物質に結合した、ペプチドまたはポリペプチド；および当該分野で理解されるさらなる改変が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「フラグメント」とは、ペプチドまたはポリペプチドに関して使用される場合、好ましくは約５アミノ酸長〜約３００アミノ酸長、より好ましくは約８アミノ酸長〜約５０アミノ酸長であり、任意のペプチドフラグメントもしくはポリペプチドフラグメントを意味し、好ましくは少なくとも１種の生物学的活性を保持する；オリゴヌクレオチドに関して使用される場合、好ましくは約２ヌクレオチド長〜約２５０ヌクレオチド長、より好ましくは約２ヌクレオチド長〜約２０ヌクレオチド長である、任意のオリゴヌクレオチドフラグメントを意味し、好ましくは少なくとも１種の生物学的活性を保持する。ペプチドフラグメントまたはポリペプチドフラグメントの代表的な例は、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、２１アミノ酸長、２２アミノ酸長、２３アミノ酸長、２４アミノ酸長、２５アミノ酸長、２６アミノ酸長、２７アミノ酸長、２８アミノ酸長、２９アミノ酸長、３０アミノ酸長、３２アミノ酸長、３２アミノ酸長、３３アミノ酸長、３４アミノ酸長、３５アミノ酸長、３６アミノ酸長、３７アミノ酸長、３８アミノ酸長、３９アミノ酸長、４０アミノ酸長、４１アミノ酸長、４２アミノ酸長、４３アミノ酸長、４４アミノ酸長、４５アミノ酸長、４６アミノ酸長、４７アミノ酸長、４８アミノ酸長、４９アミノ酸長、または５０アミノ酸長である。オリゴヌクレオチドフラグメントの代表的な例は、２ヌクレオチド長、３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長または２０ヌクレオチド長である。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「ホモログ」とは、ペプチドまたはポリペプチドに関して使用される場合、共通の進化的祖先を共有するか、それらに対し少なくとも５０％同一性を有するペプチドまたはポリペプチドを意味し、好ましくは少なくとも１種の生物学的活性を保持し；オリゴヌクレオチドに関して使用される場合、共通の進化的祖先を共有するか、それに対し少なくとも５０％同一性を有するオリゴヌクレオチドを意味し、好ましくは少なくとも１種の生物学的活性を有する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「阻害する」とは、タンパク質の活性に言及する場合、その酵素の活性を阻害、抑制、抑止または除去することを意味する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」または「処置」とは、哺乳動物をある状態から保護することに言及する場合、その状態を防止、抑制、抑止または除去することを意味する。その状態を防止することには、その状態を発症する前に本発明の組成物を哺乳度物に投与することが含まれる。その状態を抑制することには、その状態の誘発後であるがその臨床症状が現れる前に、哺乳動物に本発明の組成物を投与することが含まれる。その状態を抑止することには、その状態が悪化することを低減するかまたは防止するように、その状態の臨床症状が現れた後に本発明の組成物を哺乳動物に投与することが含まれる。その状態を除去することには、哺乳動物がその状態をもはや発症しないように、臨床状態が現れた後に本発明の組成物を投与することが含まれる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「改変体」とは、ペプチドまたはポリペプチドに関して使用される場合、アミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によってアミノ酸配列が異なり、かつ少なくとも１種の生物活性を保持する、ペプチドまたはポリペプチドを意味し；オリゴヌクレオチドに関して使用される場合、ヌクレオチドの挿入、欠失または保存的置換によってヌクレオチド配列が異なり、かつ少なくとも１種の生物活性を保持する、オリゴヌクレオチドを意味する。
【００４０】
（２．調節因子）
（ａ．ＷＲＮの調節因子）
本発明は、ＷＲＮ活性の調節因子に関する。上記調節因子は、ＷＲＮ活性を誘導または増加し得る。上記調節因子はまた、ＷＲＮ活性を阻害または減少し得る。上記調節因子は、人工的に合成された化合物であっても、または天然起源化合物であってもよい。上記調節因子は、低分子量化合物、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドもしくはペプチド、またはそれらのフラグメント、アナログ、ホモログ、改変体または誘導体であり得る。
【００４１】
オリゴヌクレオチド調節因子は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝約１〜約２０）と少なくとも約３３％〜約１００％または少なくとも５０％〜約１００％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドであり得る。本明細書中で使用される場合、「（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ」とは、核酸配列同一性の比較に関して使用される場合、参照核酸を指す。配列分析は、そのオリゴヌクレオチドと参照核酸とのアライメントを実施すること、そしてそのアライメントにおける同じヌクレオチドの数（ａ）を、そのオリゴヌクレオチドの塩基対の総数（ｂ）で除算することによって、算出される。例えば、上記オリゴヌクレオチドは、配列ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧを有する１１ｂｐであり得、これは、（ＴＴＡＧＧＧ）２と＞９１％の配列同一性を有する。
【００４２】
上記オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、またはその組み合わせを含むがそれらには限定されない、形態であり得る。上記オリゴヌクレオチドは、好ましくは約２ヌクレオチド〜約２０００ヌクレオチド、より好ましくは約２ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドの、一本鎖３’末端を含む。上記オリゴヌクレオチドはまた、ＥＳＴであってもよい。上記オリゴヌクレオチドのアナログ、誘導体、フラグメント、ホモログまたは改変体もまた、具体的に企図される。
【００４３】
実施例において示されるように、本発明の特定のオリゴヌクレオチドは、細胞における増殖の阻害およびアポトーシスの誘導を引き起こしたが、一方、本発明の他のオリゴヌクレオチドは、成長停止の阻害およびアポトーシスの阻害を引き起こす。上記オリゴヌクレオチドの活性のこの違いは、加水分解可能な３’ヌクレオチド間結合の数に依存性であった。加水分解可能な３’ヌクレオチド間結合の数を変えることにより、上記オリゴヌクレオチドの効果が、変化した。
【００４４】
理論に制約されないが、本発明者らは、上記オリゴヌクレオチドが、ＷＲＮ複合体により認識され、３’エキソヌクレアーゼＷＲＮにとっての基質として作用すると考える。その推論の結果は、加水分解不可能な３’ヌクレオチド間結合を含む基質オリゴヌクレオチドが、ＷＲＮのアンタゴニストまたはインヒビターとして作用するということである。ＷＲＮ活性のレベルを決定する他の因子としては、加水分解不可能な３’ヌクレオチド間結合の全濃度、塩基配列およびＧ含有量が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４５】
ヌクレオチド間結合は、（ｉ）その結合が生理学的条件下でＷＲＮにより加水分解可能であるホスホジエステル結合またはそのアナログである場合、および（ｉｉ）その３’側にあるすべてのヌクレオチド間結合もまた加水分解可能である場合、本発明の目的のためには、加水分解可能であると考えられる。ヌクレオチド間結合は、その３’側にある加水分解可能なヌクレオチド間結合の数に関わらず、その結合が生理学的条件下でＷＲＮによって加水分解不可能である場合、加水分解不可能であると考えられる。加水分解不可能なヌクレオチド間結合の代表例としては、ホスホロチオエート結合およびペプチド核酸結合（ＰＮＡ）が挙げられるが、それらには限定されない。
【００４６】
本発明のある実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、加水分解可能なヌクレオチド間結合を含む。上記オリゴヌクレオチドは、約１個〜約２００個の加水分解可能なヌクレオチド間結合を含み得る。上記オリゴヌクレオチドはまた、約０個〜約１９９個の加水分解不可能なヌクレオチド間結合を含み得る。
【００４７】
別の実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、加水分解不可能なヌクレオチド間結合を含む。上記オリゴヌクレオチドは、約１個〜約２００個の加水分解不可能なヌクレオチド間結合を含み得る。上記オリゴヌクレオチドはまた、加水分解可能なヌクレオチド間結合を含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、約０個〜約５個の加水分解可能なヌクレオチド間結合を含む。好ましいオリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載されるＴ−オリゴ、および本明細書に参考として援用される２００２年４月１２日に出願された同時係属中の米国特許出願第１０／１２２，６３０号に記載されるＴ−オリゴである。
【００４８】
（ｂ．ＤＮＡ損傷経路の調節因子）
本発明はまた、ＤＮＡ損傷経路の調節因子に関する。上記調節因子は、ＤＮＡ損傷経路を誘発し得る。この調節因子は、また、ＤＮＡ損傷経路を阻害し得る。上記調節因子は、人工的に合成した化合物、または天然起源の化合物であり得る。上記調節因子は、低分子量化合物、ポリペプチド、もしくはペプチド、またはそれらのアナログ、ホモログ、改変体もしくは誘導体であり得る。
【００４９】
（３．組成物）
本発明はまた、上記のような調節因子を含む組成物に関する。上記組成物は、ＷＲＮアクチベーターを含み得る。上記組成物はまた、ＷＲＮインヒビターを含み得る。上記組成物はまた、１種よりも多くの本発明の調節因子を含み得る。上記組成物はまた。さらなる治療剤と共に１種以上の調節因子を含み得る。
【００５０】
本発明の一実施形態では、上記組成物は、本発明のオリゴヌクレオチドを含む。上記オリゴヌクレオチドは、加水分解可能なヌクレオチド間結合もしくは加水分解不可能なヌクレオチド間結合、またはその組み合わせを含み得る。好ましい実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、ＷＲＮのアクチベーターである。別の好ましい実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、ＷＲＮのインヒビターである。上記のように、上記オリゴヌクレオチドの活性は、加水分解可能なヌクレオチド間結合の全濃度に基づき、ＷＲＮを誘導または阻害するように調節され得る。
【００５１】
（ａ．処方）
本発明の組成物は、従来の方法で処方された錠剤またはロゼンジの形態であり得る。例えば、経口投与用の錠剤およびカプセルは、従来の賦形剤（結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤および湿潤剤が挙げられるがそれらに限定されない）を含み得る。結合剤としては、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、デンプン漿剤およびポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定はされない。充填剤としては、ラクトース、糖、微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウムおよびソルビトールが挙げられるが、これらに限定はされない。潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコールおよびシリカが挙げられるが、これらに限定はされない。崩壊剤としては、ジャガイモデンプンおよびナトリウムデンプングリコレートが挙げられるが、これらに限定はされない。湿潤剤としては、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられるが、これに限定はされない。錠剤は、当該分野で周知の方法に従ってコーティングされ得る。
【００５２】
本発明の組成物はまた、液体処方物（水性または油性の懸濁物、溶液、エマルジョン、シロップおよびエリキシルが挙げられるがそれらに限定はされない）であり得る。上記組成物はまた、使用前に水または他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として処方され得る。このような液体処方物は、添加剤（懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび保存剤が挙げられるがそれらに限定はされない）を含み得る。懸濁剤としては、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および硬化食用脂が挙げられるが、これらに限定はされない。乳化剤としては、レシチン、ソルビタンモノオレエートおよびアカシアが挙げられるが、これらに限定はされない。非水性ビヒクルとしては、食用油、アーモンド油、分別ココナッツ油、油性エステル、プロピレングリコールおよびエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定はされない。保存剤としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、およびソルビン酸が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００５３】
本発明の組成物は、坐剤としても処方され得、坐剤基剤（ココアバターまたはグリセリドが挙げられるがそれらに限定はされない）を含み得る。本発明の組成物はまた、吸入用に処方され得る。これは、乾燥粉末としてかまたは噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタンまたはトリクロロフルオロメタン）を用いるエアゾルの形態で投与され得る形態（溶液、懸濁液またはエマルジョンが挙げられるが、それらに限定はされない）であり得る。本発明の組成物はまた、水性ビヒクルまたは非水性ビヒクルを含む、経皮処方物（クリーム、軟膏、ローション、ペースト、薬物添加硬膏、パッチまたは膜が挙げられるがそれらに限定はされない）として処方されえる。
【００５４】
本発明の組成物はまた、注射または連続注入が挙げられ得るがそれらに限定されない方法による非経口投与用に、処方され得る。注射用の処方物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の、懸濁物、溶液、またはエマルジョンの形態であり得、処方剤（懸濁剤、安定化剤および分散剤が挙げられるがそれらに限定はされない）を含み得る。上記組成物は、適切なビヒクル（発熱物質を含まない滅菌無水が挙げられるがそれに限定はされない）で再構成するための粉末の形態で提供され得る。
【００５５】
本発明の組成物はまた、移植または筋肉内注射によって投与され得る蓄積調製物として処方され得る。上記組成物は、適切なポリマー材料または疎水性材料を用いて（例えば、受容可能な油中のエマルジョンとして）か、イオン交換樹脂を用いてか、または難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）、処方され得る。
【００５６】
本発明の組成物はまた、リポソーム調製物として処方してもよい。上記リポソーム調製物は、対象となる細胞または角質層に侵入し、細胞膜と融合して、リポソームの内容物をその細胞内に送達する、リポソームを含み得る。例えば、Ｙａｒｏｓｈの米国特許第５，０７７，２１１号、Ｒｅｄｚｉｎｉａｋらの米国特許第４，６２１，０２３号、またはＲｅｄｚｉｎｉａｋらの米国特許第４，５０８，７０３号に記載されたようなリポソームが、使用され得る。皮膚の状態を標的とすることが意図される本発明の組成物は、哺乳動物の皮膚をＵＶまたは酸化的損傷を生じる因子に曝露する前、曝露中または曝露した後に、投与され得る。他の適切な処方物は、ニオソームを使用し得る。ニオソームは、リポソームに似た脂質ビヒクルであり、その膜は、非イオン性脂質からほぼなり、そのうちのある形態は、角質を通って化合物を輸送するために有効である。
【００５７】
（４．処置法）
（ａ．ＷＲＮアクチベーター）
ＷＲＮの活性を誘導または増加する本発明の調節因子は、単独でかまたは他の処置と組み合わせて、成長停止の不全に関連する状態、アポトーシスの不全に関連する状態または増殖老化の不全に関連する状態を処置するために使用され得る。このような状態の代表例としては、過剰増殖疾患（例えば、癌、および正常範囲を超える細胞の良性成長（例えば、乾癬もしくは線維芽細胞過形成性廃痕およびケロイドにおけるケラチノサイト、または特定の自己免疫障害の場合における特定のリンパ球サブセット））が挙げられるが、これに限定はされない。これらの方法で処置される癌の形式は、様々な形態で認められ、例えば身体の種々の細胞型および器官において生じる（例えば、子宮頚部癌、リンパ腫、骨肉腫、メラノーマ、および皮膚に生じる他の癌、および白血病）。上記治療が向けられる癌細胞の型には、乳房、肝臓、前立腺、膵臓、卵巣、膀胱、子宮、結腸、脳、食道、胃および胸腺がある。上記調節因子はまた、日焼け促進を阻害するため、細胞分化を促進するため、および免疫抑制のために、使用され得る。
【００５８】
本発明の一実施形態では、加水分解可能なヌクレオチド間結合を含む本発明のオリゴヌクレオチドが、成長停止の不全に関連する状態、アポトーシスの不全に関連する状態または増殖老化の不全に関連する状態を処置するために、そのような処置を必要とする患者に上記オリゴヌクレオチドを投与することにより、使用される。上記オリゴヌクレオチドはまた、加水分解不可能なヌクレオチド間結合を含み得る。上記で議論したように、上記オリゴヌクレオチドの活性が、加水分解可能なヌクレオチド間結合の全濃度に基づいて、成長停止またはアポトーシスを誘導するように調節され得る。上記オリゴヌクレオチドは、本発明の調節因子または他の処置と組み合わせて投与され得る。
【００５９】
好ましい実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、子宮頚部癌、リンパ腫、骨肉種、メラノーマ、皮膚癌、白血病、乳癌、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、膵臓癌、卵巣癌、膀胱癌、子宮癌、結腸癌、脳腫瘍、食道癌、胃癌および胸腺癌からなる群より選択される癌を処置するために使用される。
【００６０】
Ｔ−オリゴは、ＴＮＦ−αおよびＩＬ１０（免疫抑制の公知の調節因子である）のアップレギュレーションを介して、マウスモデルにおけるＵＶ照射と同等に有効にアレルギー性接触過敏症の誘導または誘発を防止することが可能である。従って、ＷＲＮの局所アクチベーターまたは全身アクチベーターは、例えば、リンパ球媒介皮膚疾患（例えば、乾癬または湿疹）ならびにリンパ球媒介全身疾患（例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス）、および多くの他の疾患の処置における、ステロイド療法を置換し得る。
【００６１】
（ｂ．ＷＲＮのインヒビター）
ＷＲＮの活性を阻害または減少する本発明の調節因子は、単独でかまたは他の処置と組み合わせて、成長停止に関連する状態、アポトーシスに関連する状態または増殖老化に関連する状態を処置するために使用され得る。このような状態の代表例としては、ＵＶ照射への曝露、ならびに正常組織に対する癌処置（例えば、化学療法および放射線療法）の副作用、または日光に曝露された正常皮膚における日焼け応答阻害の促進が挙げられるが、それらに限定はされない。上記調節因子はまた、細胞分化を阻害するためにも使用され得る。
【００６２】
別の実施形態では、加水分解不可能なヌクレオチド間結合を含む本発明のオリゴヌクレオチドは、成長停止に関連する状態またはアポトーシスに関連する状態を処置するために、上記オリゴヌクレオチドをそのような処置を必要とする患者に投与することによって使用される。上記オリゴヌクレオチドはまた、加水分解可能なヌクレオチド間結合も含み得る。上記に議論したように、上記オリゴヌクレオチドの活性は、加水分解可能なヌクレオチド間結合の全濃度に基づき、成長停止を阻害するためまたはアポトーシスを阻害するために使用され得る。上記オリゴヌクレオチドは、本発明の調節因子または他の処置と組み合わせて投与され得る。
【００６３】
好ましい実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、ＵＶ光線への曝露、および癌処置（例えば、化学療法および放射線療法）の副作用からなる群より選択される状態を処置するために使用される。
【００６４】
（ｃ．投与）
本発明の組成物は、任意の様式（経口投与、非経口投与、舌下投与、経皮投与、直腸投与、経粘膜投与、局所投与、吸入、口腔内投与、またそれらの組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない）で投与され得る。非経口投与としては、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、髄腔内投与、および関節内投与が挙げられるが、それらに限定はされない。
【００６５】
（ｄ．投薬量）
治療において使用するために必要な上記組成物の治療有効量は、処置する状態の性質、活性を必要とする時間の長さ、ならびに患者の年齢および状態によって変化し、最終的には、担当医によって決定される。しかしながら、一般に、成人の処置のために用いられる用量は、典型的には、１日あたり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。その用量は、１日当たり約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇであり得る。望ましい用量は、通常は、単回投与で投与され得るか、適切な間隔で複数回投与（例えば、１日あたり２回、３回、４回またはそれ以上の分割投与）として、投与され得る。複数回投与が、しばしば望ましいか、または必要とされる。
【００６６】
調節因子の投薬量は、任意の投薬量（約１μｇ／ｋｇ、約２５μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約７５μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約１２５μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ、約１７５μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約２２５μｇ／ｋｇ、約２５０μｇ／ｋｇ、約２７５μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約３２５μｇ／ｋｇ、約３５０μｇ／ｋｇ、約３７５μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ、約４２５μｇ／ｋｇ、約４５０μｇ／ｋｇ、約４７５μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約５２５μｇ／ｋｇ、約５５０μｇ／ｋｇ、約５７５μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、約６２５μｇ／ｋｇ、約６５０μｇ／ｋｇ、約６７５μｇ／ｋｇ、約７００μｇ／ｋｇ、約７２５μｇ／ｋｇ、約７５０μｇ／ｋｇ、約７７５μｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ、約８２５μｇ／ｋｇ、約８５０μｇ／ｋｇ、約８７５μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、約９２５μｇ／ｋｇ、約９５０μｇ／ｋｇ、約９７５μｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇが挙げられるが、それらに限定はされない）であり得る。
【００６７】
（５．スクリーニング方法）
本発明はまた、ＷＲＮ活性の調節因子を同定するスクリーニング方法に関する。さらに、本発明は、ＤＮＡ損傷経路の調節因子を同定するスクリーニング方法に関する。上記スクリーニング方法は、種々の形態（インビトロアッセイ、細胞ベースアッセイ、遺伝的アッセイおよびインビボアッセイが挙げられるが、これらに限定はされない）で実施され得る。
【００６８】
ＷＲＮ調節因子は、ＷＲＮに特異的に結合する基質をスクリーニングすることにより同定され得る。特異的結合基質が、多数の標準的方法（免疫沈澱およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられるがそれらに限定はされない）を用いて、当業者によってインビトロで同定され得る。また、特異的結合基質はまた、多数の標準的方法（酵母ツーハイブリッドおよびファージディスプレイが挙げられるがそれらに限定はされない）を使用して当業者によって遺伝的スクリーニングを用いて同定され得る。また、特異的結合基質はまた、高スループット方法（ＷＲＮをチップ（例えば、ガラス、プラスチックまたはシリコン）に付着させることが挙げられるがそれに限定はされない）を用いてを同定され得る。
【００６９】
ＷＲＮ調節因子はまた、ＷＲＮの活性を調節する基質をインビトロでスクリーニングすることにより、同定され得る。調節因子は、予期される調節因子とＷＲＮを接触させること、およびその予期される調節因子がＷＲＮの活性を変化させるかどうかを決定することにより、同定され得る。ＷＲＮの活性は、ＷＲＮの核酸基質の加水分解を測定することにより測定され得る。核酸基質の加水分解は、ＵＶ吸収の測定、および好ましくは標識オリゴのゲル分析、または非沈殿性ヌクレオチド塩基の回収が挙げられるがそれらに限定はされない方法により、測定され得る。
【００７０】
ＷＲＮの調節因子は、細胞ベースアッセイにおいてＷＲＮの活性を調節する基質をスクリーニングすることにより、同定され得る。ＤＮＡ損傷経路の調節因子が、同様に同定され得る。調節因子は、疑わしい調節因子と細胞を接触させること、およびその疑わしい調節因子がアポトーシスレベル、老化、ｐ５３リン酸化、ｐ９５リン酸化、ＡＴＭリン酸化、Ｈ２ＡＸリン酸化、Ｓ期停止の誘導、またはアポトーシス誘導を変化させるかどうかを測定することによって、同定され得る。その候補調節因子は、上記で議論したように、ＷＲＮと特異的に結合する物質であり得る。アポトーシスの調節は、ＦＡＣＳ分析におけるサブＧ０／Ｇ１ピークのサイズの測定、ＴＵＮＥＬアッセイ、ＤＮＡラダーアッセイ、アネキシンアッセイ、またはＥＬＩＳＡアッセイが挙げられるがそれらに限定はされない方法によって、測定され得る。老化の調節は、老化関連性β−ガラクトシダーゼ活性を測定することによって、または細胞収量増加不全もしくはｐＲｂリン酸化不全またはマイトジェン刺激後の３Ｈ−チミジン取り込み不全を測定することによって、測定され得る。ｐ５３活性の調節は、ｐ５３プロモーター駆動性ＣＡＴまたはルシフェラーゼ構築物読み出しにより、またはｐ５３調節性遺伝子生成物（例えば、ｐ２１）の誘導により、ゲルシフトアッセイによってセリン１５またはセリン３７におけるｐ５３リン酸化を測定することによって、測定され得る。ｐ９５活性の調節は、ウェスタンブロット分析におけるｐ９５バンドの移動により、またはＳ期停止を検出するためのＦＡＣＳ分析により、セリン３４３におけるｐ９５リン酸化を測定することによって、測定され得る。ＷＲＮ調節因子はまた、インビボ腫瘍形成を調節する物質をスクリーニングすることによって、同定され得る。
【００７１】
任意の細胞が、細胞ベースアッセイにおいて使用され得る。好ましくは、本発明とともに使用するための細胞としては、哺乳動物細胞が挙げられ、より好ましくはヒト細胞および非ヒト霊長類細胞が挙げられる。適切な細胞の代表例としては、１次（正常）ヒト皮膚線維芽細胞、上皮ケラチノサイト、メラノサイト、および対応する不死化細胞株または形質転換細胞株；ならびに一次マウス細胞株、不死化マウス細胞株、または形質転換マウス細胞株が挙げられるがそれらに限定はされない。タンパク質リン酸化の量は、当該分野で標準的な技術（比色分析、発色分析、蛍光分析およびウェスタンブロットが挙げられるがそれらに限定はされない）によって測定され得る。
【００７２】
予期される調節因子が細胞に（例えば、混合によって）添加される条件は、アポトーシスまたはシグナル伝達を妨害する他の調節化合物が基本的に存在しない場合に、その細胞がアポトーシスもシグナル伝達も行わない条件である。有効な条件としては、細胞成長を可能にする適切な培地条件、温度条件、ｐＨ条件、および酸素条件が挙げられるが、これらに限定はされない。適切な培地は、代表的には、増殖因子、ならびに同化可能な炭素源、同化可能な窒素源および同化可能なリン源、ならびに適切な塩、ミネラル、金属、および他の栄養物（例えば、ビタミン）を含む、固体培地または液体培地であり、この培地としては、細胞がアポトーシスまたはシグナル伝達を示し得るように細胞が培養され得る有効な培地が挙げられる。例えば、哺乳動物細胞にとって、上記培地は、１０％ウシ胎仔血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地である。
【００７３】
細胞は、種々の容器（組織培養フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、およびペトリ皿が挙げられるがそれらに限定はされない）中で培養され得る。培養は、その細胞に対して適切な温度、ｐＨおよび二酸化炭素含有量で行われる。このような培養条件もまた、当業者の範囲内にある。
【００７４】
予期される調節因子を上記細胞に添加するための方法としては、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、細胞発現（すなわち、発現系（裸の核酸、組換えウイルス、レトロウイルス発現ベクター、およびアデノウイルス発現が挙げられる）を用いる）、上記培地への上記因子の添加、イオン対形成因子の使用、および細胞を透過性にするための界面活性剤の使用が挙げられる。
【００７５】
候補調節因子は、天然に存在する分子（例えば、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＤＮＡフラグメント、ＲＮＡおよびＲＮＡフラグメントなどを包含する）、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど）；または天然に存在する分子のアナログもしくは誘導体（例えば、ペプチド模倣物）；ならびに天然に存在しない分子（例えば、「低分子」有機化合物であり得る。用語「低分子有機化合物」とは、一般的に分子量約１０００未満、好ましくは約５００未満を有する、有機化合物を指す。
【００７６】
候補調節因子は、任意の手段（コンビナトリアル化学技術、発酵法、植物抽出手順および細胞抽出手順が挙げられるがそれらに限定はされない）によって調製または取得されるライブラリー（すなわち、化合物のコレクション）中に存在し得る。コンビナトリアルライブラリーの作成法は、当該分野で周知である。例えば、Ｅ．Ｒ．Ｆｅｌｄｅｒ、Ｃｈｉｍｉａ、１９９４、４８、５１２−５４１；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４、３７、１２３３−１２５１；Ｒ．Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．１９９３、９、２３５−２３９；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９、３５４、８４−８６；Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１、３５４、８２−８４；Ｃａｒｅｌｌら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９５、３、１７１−１８３；Ｍａｄｄｅｎら、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ、２、２６９−２８２；Ｃｗｉｒｌａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０、８７、６３７８−６３８２；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９、５３８１−５３８３；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４、３７、１３８５−１４０１；Ｌｅｂｌら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、１９９５、３７、１７７−１９８；およびそれらの中に引用された参考文献を参照のこと。
【００７７】
本発明は、以下の非限定的実施例によって示される複数の局面を有する。
【実施例】
【００７８】
（実施例１）
（オリゴヌクレオチドがアポトーシスを誘発し得る）
テロメア突出部反復配列（ＴＴＡＧＧＧ；配列番号１）と相同なオリゴヌクレオチド、配列（１１ｍｅｒ−１：ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号２）のオリゴヌクレオチド、この配列と相補的なオリゴヌクレオチド（１１ｍｅｒ−２：ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ；配列番号３）、およびテロメア配列とは無関係のオリゴヌクレオチド（１１ｍｅｒ−３：ｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ；配列番号４）を、テロメア破壊に応答してアポトーシスを行うと報告されているヒトＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞の培養物に添加した。コントロール細胞についての２５％〜３０％と比較して、４０μＭの配列番号２で処理した細胞のうちの５０％が、４８時間以内に、Ｓ期に蓄積し（ｐ＜０．０００３、対応のないｔ検定、図１Ａ〜１Ｄを参照のこと）、７２時間までに、コントロールの２％〜３％と比較して、これらの細胞のうちの１３％は、サブＧ０／Ｇ１  ＤＮＡの含有量によって決定した場合にアポトーシス性であった（ｐ＜０．０００７、対応のないｔ検定、図１Ｅ〜図１Ｈを参照のこと）。９６時間の時点では、コントロールの３％〜５％と比較して、１１ｍｅｒ−１処理細胞のうちの２０±３％がアポトーシス性であった（ｐ＜０．０００１、対応のないｔ検定）。その奇妙な効果の説明として１１ｍｅｒ−１の優先的な取込みを排除するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、フルオレセインホスホロアミダイトで３’末端にて標識したオリゴヌクレオチドで処理し、次いで、共焦点顕微鏡分析およびＦＡＣＳ分析に供した。上記細胞の蛍光強度は、４時間目および２４時間目に、すべての処理の後で同じであった。ウェスタン分析は、１１ｍｅｒ−１添加の２４時間後までｐ５３の増加を示したが、１１ｍｅｒ−２でも１１ｍｅｒ−３でも増加せず、Ｅ２Ｆ１転写因子のレベルが同時に増加した。このＥ２Ｆ１転写因子は、アポトーシスの誘導においてｐ５３と協同すること、ヒト線維芽細胞においてｐ５３依存性様式で老化表現型を誘導すること、およびＳ期チェックポイントを調節することが、知られている。
【００７９】
（実施例２）
（テロメア突出部ホモログである１１ｍｅｒ−１のホスホロチオエートバージョンは、アポトーシスを誘導しない）
ＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞の培養物を、希釈剤、１１ｍｅｒ−１（配列番号１）またはホスホロチオエート１１ｍｅｒ−１（１１ｍｅｒ−１−Ｓ）のいずれかで９６時間処理し、その後、収集してＦＡＣＳ分析用に処理した。２種類の濃度の上記オリゴヌクレオチド（０．４μＭ（図２Ａ〜図２Ｃ）および４０μＭ（図２Ｄ〜図２Ｆ））を試験した。０．４μＭでは、上記オリゴヌクレオチドのいずれも、Ｊｕｒｋａｔ細胞の予期された指数関数的に成長する細胞周期プロフィールに影響を及ぼさなかった。４０μＭでは、１１ｍｅｒ−１は、サブＧ０／Ｇ１ピークにより示される広範なアポトーシスを誘導したが、１１ｍｅｒ−１−Ｓは、何の影響も有さなかった。
【００８０】
（実施例３）
（１１ｍｅｒ−１のホスホロチオエートバージョンは、ホスフェート骨格１１ｍｅｒ−１によるＳ期停止の誘導をブロックする）
ケラチノサイト株の培養物（ＳＳＣ１２Ｆ、１００，０００細胞／３８ｃｍ２）を、１１ｍｅｒ−１（配列番号２）のみで、または漸増濃度の１１ｍｅｒ−１−Ｓの存在下において１１ｍｅｒ−１で、４８時間処理した。実施例１において先に示したように、１１ｍｅｒ−１は、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦａｃＳｃａｎ）によって示されるようにＳ期停止を誘導した。コントロールである希釈剤処理細胞の２６％と比較して、その細胞のうちの４３％がＳ期にあった。しかしながら、漸増濃度のホスホロチオエート１１ｍｅｒ−１をこれらの培養物に添加した場合、それよりも少ない細胞しか停止しなかった（図３Ａ〜図３Ｄ）。この停止の完全な阻害が、１１ｍｅｒ−１：１１ｍｅｒ−１−Ｓの比が２：１である場合に見られた。１１ｍｅｒ−１−Ｓ自体は、Ｓ期停止を誘導しなかった。
【００８１】
（実施例４）
（テロメアオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート型は、構成的色素沈着およびＵＶ誘導性色素沈着を誘導し、メラニン生成を刺激しない）
Ｓ９１マウスメラノーマの培養物（１００，０００細胞／３８ｃｍ２）を、１００μＭのｐＴｐＴもしくはホスホロチオエートｐＴｐＴ（図４）、または４０μＭの１１ｍｅｒ−１もしくはホスホロチオエート１１ｍｅｒ−１（１１ｍｅｒ−１−Ｓ）（図５）で６日間処理し、その後、収集し、計数し、メラニン含有量をアッセイした。ｐＴｐＴおよび１１ｍｅｒ−１は、これらの細胞においてメラニン生成を刺激したが（それぞれ、図４および図５）、ｐＴｓｐＴおよび１１ｍｅｒ−１−Ｓは、刺激しなかった（それぞれ、図４および図５）。さらに、ｐＴｓｐＴ（図４）および１１ｍｅｒ−１−Ｓ（図５）は、これらの細胞における構成的色素沈着を減少した。このことは、テロメア修復／複製中にこの配列に慢性的に曝露すると、メラニン生成に対する定常的な低レベルのシグナルを提供し、このシグナルがｐＴｓｐＴおよび１１ｍｅｒ−１−Ｓによってブロックされることを示唆している。
【００８２】
（実施例５）
（ホスホロチオエートｐＴｓｐＴは、ＵＶ誘発性メラニン生成を阻害する）
Ｓ９１細胞の二連培養物（１００，０００細胞／３９ｃｍ２）を、偽照射したか、またはリサーチラジオメータ（モデルＩＬ１７００Ａ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｇｈｔ、Ｎｗｅｂｕｒｙｐｏｒｔ、ＭＡ）を用いて２８５±５ｎｍで計測して、１ｋＷキセノンアークソーラーシミュレーター（ＸＭＮ１０００−２１、Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ、Ａｚｕｚａ、ＣＡ）からの５ｍＪ／ｃｍ２の日光シミュレート光で照射した。その後、２枚の偽照射プレートに、１００μＭのｐＴｓｐＴを補充し、２つの照射培養物も、同様にｐＴｓｐＴで処理した。１週間後、細胞を集めて計数し、そしてその細胞ペレットを１ＮのＮａＯＨ中に溶解することおよび４７５ｎｍでの光学濃度を測定することによって、メラニン含量について分析した。ＵＶ照射により、これらの細胞中のメラニン含有量は、２倍になった。しかしながら、この応答は、ｐＴｓｐＴを添加することによって、ブロックされた（図６）。さらに、図４および図５に示したデータと同様に、これらの細胞の構成的色素沈着が、偽照射培養物においてｐＴｓｐＴにより減少した。
【００８３】
（実施例６）
（活性には、Ｔ−オリゴの加水分解が必要である）
配列番号２に基づくオリゴヌクレオチドを、合成した。オリゴヌクレオチド１は、完全にホスホロチオエート骨格を用いて合成した。オリゴヌクレオチド２は、各末端に２個のホスホロチオエート骨格を有し、中央の他の結合は、ホスホジエステル結合であった。オリゴヌクレオチド３は、５’末端に２個のホスホロチオエート結合を有し（ブロックした５’末端）、オリゴヌクレオチド４は、３’末端に２個のホスホロチオエート結合を有し（ブロックした３’末端）、残りの結合は、ホスホジエステル結合であった。図７を参照のこと。
【００８４】
これらのオリゴヌクレオチドを、正常な新生児線維芽細胞の培養物に添加した。４８時間後、細胞を収集して、ウェスタンブロットによりｐ５３セリン１５のリン酸化およびｐ９５／Ｎｂｓ１のリン酸化を分析した。他の培養物を、上記オリゴヌクレオチドの存在下で１週間放置し、次いで、老化関連β−ガラクトシダーゼ活性（ＳＡ−β−Ｇａｌ）について染色した。β−ガラクトシダーゼ陽性細胞を、計数し、全細胞のパーセントとして表した（図８）。
【００８５】
ヌクレアーゼが接近可能な３’末端を有するオリゴヌクレオチドは、「初期」応答（例えば、ｐ５３リン酸化およびｐ９５／Ｎｂｓ１リン酸化）を刺激する際に、最も有効であった。しかしながら、ヌクレアーゼが接近可能な５’末端を有するオリゴヌクレオチドもまた、１週間後に老化表現型を誘導し得るが、４８時間目には上記リン酸化反応を誘導しない。このことは、３’→５’ヌクレアーゼ感受性が老化を誘導する際の活性のために好ましいことを示唆している。
【００８６】
（実施例７）
（ＷＲＮタンパク質レベルのダウンレギュレーションは、Ｔ−オリゴの応答をブロックする）
正常ヒト新生児線維芽細胞を、５０ｐｍｏｌのＷＲＮ  ｓｉＲＮＡまたはコントロールである緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対する５０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡで２日間連続して処理した。２回目のｓｉＲＮＡ処理の１日後に、代表的培養物をウェスタン部ロット分析のために収集して、上記タンパク質を除去することにおけるＷＲＮ  ｓｉＲＮＡの有効性を評価した。また、この時点で、ＷＲＮ  ｓｉＲＮＡ処理培養物またはＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ処理培養物の二連培養物に、４０μＭ  Ｔ−オリゴ（１１ｍｅｒ−１；配列番号２）または等量の希釈剤のいずれかを与えた。すべての条件からの細胞を、Ｔ−オリゴ添加または希釈剤添加の１日後もしくは２日後に収集し、セリン１５におけるｐ５３リン酸化またはヒストンＨ２ＡＸリン酸化（両方とも、充分に記載されたＤＮＡ損傷応答である（Ｌａｍｂｅｒｔら、１９９８、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，３３０４８〜５３；Ｂｕｒｍａら、２００１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６、４２４６２〜７））についてウェスタンブロットによって分析した。また、コントロールとして、偽照射細胞または１０Ｇｙ電離放射線照射細胞（ＩＲ）に由来する細胞溶解物を、含めた。それらのブロットを、ＷＲＮ特異的抗体、ｐ５３ホスホセリン１５特異的抗体、およびホスホＨ２ＡＸ特異的抗体を用いてプロービングした。図９において示されるデータは、ＷＲＮの「ノックダウン」は、０日目（Ｔ−オリゴ処理の日）にＷＲＮレベル、ならびにｐ５３およびＨ２ＡＸのリン酸化をＴ−オリゴが誘導する能力を劇的に低下させた。
【００８７】
（実施例８）
（ＤＮＡ−ＰＫは、Ｔ−オリゴの効果を媒介する）
正常な新生児線維芽細胞を、４０μＭ  Ｔ−オリゴまたは等体積の希釈剤で、４時間、６時間、８時間、１６時間、２４時間、または４８時間処理し、その後収集し、ＡＴＭホスホセリン１９８１に対する抗体を使用するウェスタンブロットによって分析した。図１０は、線維芽細胞におけるＴ−オリゴ処理が、ＡＴＭマーカー（３７０ｋＤａ）の上で移動する見かけの分子量４５０ｋＤａのタンパク質のリン酸化をもたらすことを示す。このリン酸化タンパク質は、ＡＴＭ関連性ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼの触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫＣＳ）と同時に移動することが示された。これは、非常に相同なＡＴＭタンパク質に対して惹起された抗体と結合することが、合理的に予期される。
【００８８】
ＤＮＡ−ＰＫＣＳは、Ｔ−オリゴ処理の後に生じることが示唆されるように、活性化された場合に自己リン酸化し（Ｄｉｎｇら、２００３、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２３、５８３６〜４８）、そしてまたヘテロダイマーＫｕタンパク質（ＤＮＡ−ＰＫ複合体の一部）５を介してＷＲＮと会合するので、線維芽細胞を、セリン３７（ＤＮＡ−ＰＫによりリン酸化されることが示されている部位）（Ｌｅｅｓら、１９９２、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２、５０４１〜９）におけるｐ５３リン酸化について分析した。新生児線維芽細胞を、上記のように処理し、セリン３７においてリン酸化されたｐ５３に対する抗体を使用して同様に分析した。ウェスタンブロットは、ｐ５３のセリン３７が、Ｔ−オリゴ処理に応答してリン酸化されることを示した（図１１）。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１Ａ〜図１Ｈは、希釈剤（図１Ａおよび図１Ｅ）；４０μＭ  １１ｍｅｒ−１  ｐＧＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号２）（図１Ｂおよび図１Ｆ）；４０μＭ  １１ｍｅｒ−２  ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ（配列番号３）（図１Ｃおよび図１Ｇ）；４０μＭ  １１ｍｅｒ−３  ｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ（配列番号４）（図１Ｄおよび図１Ｈ）で処理した、ヨウ化プロピジウム染色したＪｕｒｋａｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、分析前に４８時間（図１Ａ〜図１Ｄ）または７２時間（図１Ｅ〜図１Ｈ）、上記試薬を用いて処理された。
【図２】図２Ａ〜図２Ｆは、細胞に以下を添加することについての、蛍光活性化細胞ソーティングの結果を示すプロフィールである：図２Ａ、希釈剤；図２Ｂ、０．４μＭ  １１ｍｅｒ−１；図２Ｃ、０．４μＭ  １１ｍｅｒ−１−Ｓ；図２Ｄ、希釈剤；図２Ｅ、４０μＭ  １１ｍｅｒ−１；図２Ｆ、４０μＭ  １１ｍｅｒ−１−Ｓ。
【図３】図３Ａ〜図３Ｇは、細胞に以下を添加することについての、蛍光活性化細胞ソーティングの結果を示すプロフィールである：図３Ａ、希釈剤；図３Ｂ、１０μＭ  １１ｍｅｒ−１；図３Ｃ、１０μＭ  １１ｍｅｒ−１および１μＭ  １１ｍｅｒ−Ｓ；図３Ｄ、１０μＭ  １１マーおよび５μＭ  １１ｍｅｒ−１−Ｓ；図３Ｅ、１０μＭ  １１ｍｅｒ−１および１０μＭ  １１ｍｅｒ−１−Ｓ；図３Ｆ、２０μＭ  １１ｍｅｒ−１−Ｓ；図３Ｇ、１０μＭ  １１ｍｅｒ−１−Ｓ。
【図４】図４は、希釈剤、ｐＴｐＴ、またはｐＴｓｐＴで処理された、細胞のメラニン含量（ｐｇ／細胞）を示す棒グラフである。
【図５】図５は、希釈剤、１１ｍｅｒ−１、または１１ｍｅｒ−１−Ｓで処理された、細胞のメラニン含量（ｐｇ／細胞）を示す棒グラフである。
【図６】図６は、偽（照射なし、オリゴヌクレオチドなし）処理された細胞、または紫外線（ＵＶ）で処理された細胞、または照射していないがｐＴｓｐＴを与えられた細胞、またはＵＶで照射されｐＴｓｐＴを与えられた細胞の、メラニン含量（ｐｇ／細胞）を示す棒グラフである。
【図７】図７は、ホスホロチオエート結合を用いて合成された配列番号２のヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドの図である。
【図８】図８は、正常新生児ヒト線維芽細胞の培養物において老化を引き起こすことにおける、図７に示されるホスホロチオエートオリゴヌクレオチド１、２、３、および４の効果を試験する結果（β−ガラクトシダーゼ活性について染色陽性の細胞によって示される）を示す棒グラフである。オリゴヌクレオチド「１１−１」は、ホスホジエステル結合を全体的に用いて合成された配列番号２で処理された線維芽細胞培養物を示す。「Ｄｉｌ」は、オリゴヌクレオチドを含まない希釈剤で処理された線維芽細胞培養物を示す。
【図９】図９は、Ｔ−オリゴがｐ５３のリン酸化およびＨ２ＡＸのリン酸化を誘導する能力が、ＷＲＮをノックダウンすることによって低減されることを示す。Ｔ−オリゴ処理日におけるＷＲＮタンパク質レベルが、「０時間」で示される。Ｔ−オリゴ（４０μＭ，Ｔ）または希釈剤（Ｄ）が、添加され、そしてウェスタン分析のために２４時間後または４８時間後に細胞が収集された。コントロール線維芽細胞は、偽処理（ＩＲ，−）であるか、または１０ＧｌｙのＩＲで照射された（ＩＲ，＋）かいずれかをされ、１時間後に収集された。そのウェスタンブロットが、ＷＲＮ認識抗体、ｐ５３ホスホセリン１５認識抗体、またはホスホＨ２ＡＸ認識抗体でプローブされた。
【図１０】図１０は、Ｔ−オリゴが、ＡＴＭ関連ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫＣＳ）のリン酸化をもたらすことを示す。ＡＴＭの位置およびＤＮＡ−ＰＫＣＳの位置が、示されている。偽処理線維芽細胞および照射済み（１０Ｇｌｙ  ＩＲ）線維芽細胞が、コントロールとして含められた。
【図１１】図１１は、ｐ５３のセリン３７が、Ｔ−オリゴ処理に応答してリン酸化されることを示す。
【図１２】図１２は、露出したテロメア突出部およびＴ−オリゴをＷＲＮタンパク質が「感知し」、ＡＴＭおよびＤＮＡ−ＰＫの活性化をもたらし、ｐ５３および他の基質のリン酸化をもたらす、あり得る機構を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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