(57)【要約】  被験体から採取された生物試料中のmitofusin遺伝子の変異の有無を検出することによって、シャルコー・マリー・ツース病２A型のリスクについて被験体をスクリーニングするために、またはシャルコー・マリー・ツース病もしくは被験体においてシャルコー・マリー・ツース病を発症する素因を診断するために、方法が開示される。方法はまた、患者の核酸中でmitofusin遺伝子配列を増幅して増幅産物を生じること；および増幅産物中のシャルコー・マリー・ツース病２A型関連多型の存在の同定によって患者の核酸試料中のシャルコー・マリー・ツース病２A型に関連した遺伝的多型の存在を検出するために開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体から採取した生物試料におけるmitofusin遺伝子の変異の有無を検出すること；および
該被験体の、mitofusin遺伝子の変異の存在によるシャルコー・マリー・ツース病２A型のリスクが、増大または減少していることを決定すること
を含む、シャルコー・マリー・ツース病２A型のリスクに関して被験体をスクリーニングする方法。
【請求項２】
前記生物試料が染色体核酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
染色体核酸が染色体１またはその断片である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
変異が、mitofusin 2遺伝子の核酸配列またはmitofusin遺伝子の相同領域中の2219、839、751、493、281、227および205からなる群より選択される位置で起こる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
変異がmitofusin 2遺伝子のアミノ酸配列またはmitofusin遺伝子の相同領域中の740、280、251、165、76および69からなる群より選択される位置で起こる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記変異が、G2219C、G839A、C751G、C493G、G281A、T227CおよびG205Tからなる群より選択される核酸配列の変化をもたらす、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記変異がTrp740Ser；Arg280His、Pro251Ala、His165Asp、Leu76ProおよびVal69Pheからなる群より選択されるアミノ酸配列の変化をもたらす、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記検出工程が、前記被験体が前記変異についてホモかどうかを検出することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記検出工程が、前記被験体が前記変異についてヘテロかどうかを検出することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
患者核酸中のmitofusin遺伝子配列を増幅して増幅産物を生成すること；および
該増幅産物を用いて、シャルコー・マリー・ツース病２A型遺伝的多型の有無を同定すること
を含む、患者核酸の試料において、シャルコー・マリー・ツース病２A型に関連する遺伝的多型の有無を検出する方法。
【請求項１１】
シャルコー・マリー・ツース病２A型多型が増幅産物の配列決定によって同定される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
増幅産物を制限酵素で消化することおよびシャルコー・マリー・ツース病２A型多型を制限酵素断片の配列決定によって同定することをさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
変異が、mitofusin 2遺伝子の核酸配列またはmitofusin遺伝子の相同領域中の2219、839、751、493、281、227および205からなる群より選択される位置で起こる、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸がmitofusin遺伝子のアミノ酸配列をコードし、ここで変異が、mitofusin遺伝子のアミノ酸配列またはmitofusin遺伝子の相同領域中の740、280、251、165、76および69からなる群より選択される位置で起こる、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
前記mitofusin遺伝子がmitofusin 2遺伝子である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記変異が、G2219C、G839A、C751G、C493G、G281A、T227CおよびG205Tからなる群より選択される核酸配列の変化をもたらす、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記変異が、Trp740Ser；Arg280His、Pro251Ala、His165Asp、Leu76ProおよびVal69Pheからなる群より選択されるアミノ酸配列の変化をもたらす、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
被験体由来の生物試料を提供することであって、ここで前記試料がmitofusin遺伝子を含むこと；
mitofusin遺伝子の1つ以上の変異を検出すること；および
被験体が、mitofusin遺伝子の少なくとも1つのゲノムコピーに少なくとも1つの検出される変異を有することを決定することであって、ここでmitofusin遺伝子の少なくとも1つの検出される変異の存在が被験体においてシャルコー・マリー・ツース病、またはシャルコー・マリー・ツース病を発症する遺伝的素因についての診断となること
を含む、被験体においてシャルコー・マリー・ツース病、またはシャルコー・マリー・ツース病を発症する遺伝的素因を診断する方法。
【請求項１９】
変異が、mitofusin 2遺伝子の核酸配列またはmitofusin遺伝子の相同領域中の2219、839、751、493、281、227および205からなる群より選択される位置で起こる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
変異が、mitofusin 2遺伝子のアミノ酸配列またはmitofusin遺伝子の相同領域中の740、280、251、165、76および69からなる群より選択される位置で起こる、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記変異が、G2219C、G839A、C751G、C493G、G281A、T227CおよびG205Tからなる群より選択される核酸配列の変化をもたらす、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記変異が、Trp740Ser；Arg280His、Pro251Ala、His165Asp、Leu76ProおよびVal69Pheからなる群より選択されるアミノ酸配列の変化をもたらす、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記決定工程が、前記被験体が前記変異についてヘテロかどうかを検出することをさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
前記決定工程が、前記被験体が前記変異についてホモかどうかを検出することをさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
変異が、補足の表１または補足の表２に示される変異である、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
変異が、補足の表１または補足の表２に示される変異である、請求項１０記載の方法。
【請求項２７】
変異が補足の表１または補足の表２に示される変異である、請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は2003年11月14日に出願された米国仮出願第60/520,429号の恩恵を主張する。上記出願の全教示は参照によって本明細書中に援用される。
【０００２】
（政府支援）
本発明は国立衛生研究所の認可2P01-NS26630-14および2R01-NS29416-09により、完全または部分的に、支持された。政府は本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
遺伝性運動および感覚神経障害としても公知である、シャルコー・マリー・ツース（CMT）神経障害は、末梢神経の遺伝性の疾患の不均質な群である。CMTは小児と成人の両方に影響を及ぼす一般的な障害である。CMTは重大な神経筋欠陥を引き起こす。2500人に1人がCMTの形態を有すると推定され、遺伝的疾患の最大の部類の一つをなす。
【０００４】
臨床像はかなり一様であるにもかかわらず、CMTは、高頻度の起こる、末梢神経障害の遺伝的不均質な群を含む。Vanceら、The many faces of Charcot-Marie-Tooth disease. Arch Neurol 57, 638-640 (2000) 参照。電気生理学的な診断基準によると、CMTは二つの主要な形態、神経伝導速度（NCV）の低下を伴う脱髄鞘性のCMT１型、および軸索形態、CMT２型に分類される。CMT１表現型を引き起こす周知の分子遺伝学的な欠損とは対照的に、CMT２の基礎となる数個の遺伝子が最近同定されたのみである。これまでに、常染色体の優性CMT２型についての７個の遺伝子座が染色体1p35-36(CMT2A)、3q13-22(CMT2B)、12q23-24(CMT2C)、7p14(CMT2D)、8p21(CMT2E)、7q11-21(CMT2F)、および12q12-13.3(CMT2G)に割り当てられた。例えば、Ben Othmaneら、Localization of a gene (CMT2A) for autosomal dominant Charcot-Marie-Tooth disease type 2 to chromosome 1p and evidence of genetic heterogeneity. Genomics 17, 370-375(1993); Kwonら、 Assignment of a second Charcot-Marie-Tooth type II locus to chromosome 3q. Am J Hum Genet 57, 853-858(1995); Kleinら、The gene for HMSN2C maps to 12q23-24: a region of neuromuscular disorders. Neurology 60, 1151-1156(2003); Ionasescuら、Autosomal dominant Charcot-Marie-Tooth axonal neuropathy mapped on chromosome 7p(CMT2D). Hum Mol Genet 5, 1373-1375(1996); Mersiyanovaら、A new variant of Charcot-Marie-Tooth disease type 2 is probably the result of a mutation in the neurofilament-light gene. Am J Hum Genet 67, 37-46(2000); Ismailovら、A new locus for autosomal dominant Charcot-Marie-Tooth disease type 2 (CMT2F) maps to chromosome 7q11-q21. Eur J Hum Genet 9, 646-650(2001) 参照。
【０００５】
現在、CMT2A、CMT2B、CMT2DおよびCMT2Eを含む四つの遺伝子が同定されている。ニューロフィラメント軽鎖（neurofilament-light）遺伝子（NEFL）がCMT2Eの原因であるとされており、多くの研究によりNEFL変異がCMT患者の２％のみに起こっていることが明らかにされた。Jordanovaら、Mutations in the neurofilament light chain gene (NEFL) cause early onset severe Charcot-Marie-Tooth disease, Brain 126, 590-597(2003) 参照。RAS関連後期エンドソームGTP結合タンパク質RAB7中の二つのミスセンス変異により、三つの拡張家族および人種の背景の異なる二つの家族の症例においてCMT2Bが起こるということが示されている。Verhoevenら、Mutations in the small GTP-ase late endosomal protein RAB7 cause Charcot-Marie-Tooth type 2B neuropathy. Am J Hum Genet 72, 722-727(2003) 参照。グリシルtRNAシンテターゼ（GARS）をコードする遺伝子におけるミスセンス変異は、異なる家族においてCMT2Dおよび遠位遺伝性運動神経障害VII型を引き起こすということが報告されている。Antonellisら、Glycyl tRNA Synthetase Mutations in Charcot-Marie-Tooth Disease Type 2D and Distal Spinal Muscular Atrophy Type V. Am J Hum Genet 72, 1293-1299(2003) 参照。
【０００６】
CMT2A遺伝子座との連鎖を支持する次の確率のある一組の日本人家族において、KIF1B-β遺伝子（c.293A>T; Gln98Leu）におけるミスセンス変異は疾患と共分離することが発見された。Zhaoら、Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bb. Cell 105, 587-597(2001)。Leu98対立遺伝子は９５人の健康な対照個体には見られなかった。さらに、この研究の著者らは、Kif1B+/-マウスはヒトにおけるCMT表現型に似た慢性の末梢神経障害を発症することを立証した。Zhaoら、2001。しかし、KIF1B-βの変異を有するCMT2Aの家族はこれ以上報告されていない。それゆえ、シャルコー・マリー・ツース病の異なる診断方法を発見することが望ましいであろう。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、被験体から回収した生物試料中のmitofusin遺伝子の変異の有無を検出すること；および被験体がmitofusin遺伝子の変異があるためにシャルコー・マリー・ツース病２A型の増加または減少するリスクを負っているかどうかの決定を含んだ、シャルコー・マリー・ツース病２A型のリスクについての被験体のスクリーニングの方法を含む。本発明はまた、患者の核酸中のmitofusin遺伝子配列を増幅して増幅産物を生じること；および増幅産物中のシャルコー・マリー・ツース病２A型関連多型の存在の同定を含む、患者の核酸試料中のシャルコー・マリー・ツース病２A型に関連した遺伝的多型の存在の検出のための方法を含む。本発明はまた、試料がmitofusin遺伝子を含む被験体の生物試料を提供することを含む、被験体におけるシャルコー・マリー・ツース病の発症にシャルコー・マリー・ツース病または対する遺伝的素因の診断；mitofusin遺伝子中の一つ以上の変異の検出；および、被験体がmitofusin遺伝子の少なくとも一つのゲノムのコピー中に少なくとも一つの検出された変異を有すること、ここで被験体中においてmitofusin遺伝子の少なくとも一つの検出された変異の存在がシャルコー・マリー・ツース病またはシャルコー・マリー・ツース病を発症する素因の診断となること、を決定する方法を含む。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、被験体におけるシャルコー・マリー・ツース病等の疾患についてのスクリーニング（例えば、診断または予後）の方法を提供する。本発明はシャルコー・マリー・ツース病の遺伝的診断のための方法、ならびにシャルコー・マリー・ツース病の遺伝的診断のためのプローブに関する。本発明の態様はまた、シャルコー・マリー・ツース病に関する遺伝子の遺伝的多型の有無を検出することに関する。本発明は六つのCMT2A家族におけるKIF1B遺伝子の変異を除いたデータに関する。この家族においてKIF1B変異がないことはCMT2Aの遺伝子座において遺伝的に不均質であることを示す。
【０００９】
本発明の態様の一つは、被験体から回収した生物試料中のmitofusin遺伝子中の変異の有無の検出を含んだ、シャルコー・マリー・ツース病２A型のリスクについて被験体のスクリーニングする方法を含む。mitofusin遺伝子の変異の有無を検出することは、被験体がmitofusin遺伝子の変異の存在によって、増加または減少するシャルコー・マリー・ツース病のリスクを負っているかどうかを決定することに役立ち得る。該検出工程により、ホモまたはヘテロの変異の有無を検査し得る。生物試料は核酸およびアミノ酸の両方を含み得る。該試料はまた、染色体の核酸を含み得る。該染色体の核酸は第一染色体またはその断片であり得る。さらにこれらの断片は染色体1p36およびこの断片の断片そのものを含み得る。該染色体の核酸はマーカーD1S160およびD1S434（図１A）内に存在するものとして、さらに定義され得る。検出された変異はmitofusin遺伝子内の任意の位置で起こり得る。これらの種々の変異はミスセンスおよびナンセンス変異の両方を含み得、ならびに染色体1p36上のKIF1B遺伝子座から1.65Mb下流に位置する、Mitofusin2（MFN2）遺伝子内に局在し得る（図1）。本発明の態様のいくつかは、mitofusin2（遺伝子受託番号AAH17061、参照によって援用される）の核酸配列中の2219、839、751、493、281、227および205からなる群よれ選択される位置において変異を含む。当業者は、同様の欠失が、参照によって援用されるmitofusin1、受託番号AAH40557等の、他のmitofusin遺伝子の相同な領域で起こり得ることを評価するであろう。mitofusin2についての該変異は核酸配列を以下：2219G>C, 839G>A, 751C>G, 493C>G, 281G>A, 227T>Cおよび205G>T、のように変化させ得る。Lupasら、Predicting coiled coils from protein sequences. Science 252, 1162-1164(1991)、によるアルゴリズムを適用することでさらなる変異が局在し得る。このように、当業者はアミノ酸配列中の変化はシャルコー・マリー・ツース病を示すであろうfzo_mitofusinドメインの末端で起こるコイルドコイル構造を伸長し得ることを決定し得た。さらに当業者は、mitofusin2遺伝子の変異と同様のmitofusin遺伝子の相同な領域を決定し得る。
【００１０】
本発明の態様はまた、核酸配列の変異によって起こるアミノ酸変異を含む。該変異はmitofusin2遺伝子のアミノ酸配列の740、280、251、165、76および69の位置、またはmitofusin遺伝子の相同な領域で起こり得る。該変異は上記の核酸変異に基づいている。該変異はアミノ酸変異を引き起こすミスセンス変異をもたらし得る。特定の態様において、該変異は次の変化：740Trp>Ser; 280Arg>His, 251Pro>Ala, 165His>Asp, 76Leu>Proおよび69Val>Phe、もたらし得る。
【００１１】
本発明の別の態様は患者の核酸試料中のシャルコー・マリー・ツース病２A型に関する遺伝的多型の存在を検出するための方法を含む。該方法は増幅産物を作るための患者の核酸中のmitofusin遺伝子配列を増幅して増幅産物を生じること、および増幅産物中の多型に関するシャルコー・マリー・ツース病２A型の存在を同定することを含み得る。該多型は増幅産物の配列決定により同定され得る。さらに、シャルコー・マリー・ツース病２A型多型が消化断片の配列決定により同定されるために、増幅産物は制限酵素により消化され得る。
【００１２】
本発明の態様はまた、被験体のシャルコー・マリー・ツース病またはシャルコー・マリー・ツース病の発症についての遺伝的素因の診断方法を含み得る。該方法は被験体由来のmitofusin遺伝子を提供すること、生物試料中の一つ以上の変異を検出すること、および少なくとも一つのmitofusin遺伝子のゲノムコピー中に被験体が少なくとも一つの検出された変異を有することを決定すること、を含み得る。このように、被験体がシャルコー・マリー・ツース病に対してホモまたはヘテロであるかどうか試験により決定がなされ得る。少なくとも一つのmitofusin遺伝子をコードしている配列のコピー中の少なくとも一つの検出された変異の存在は、被験体またはその子孫においてシャルコー・マリー・ツース病またはシャルコー・マリー・ツース病の発症についての遺伝的素因の診断となる。
【００１３】
MFN2の変異はシャルコー・マリー・ツース神経障害２A型の主要な遺伝子座を表す。MFNは、ミトコンドリア外膜に存し、ミトコンドリアの融合によるミトコンドリアネットワークの構築を制御することが示されている。ミトコンドリアは、融合および分裂反応間のバランスのダイナミックな制御を受ける、管状で分岐した膜ネットワークを有する。MFN2は一つのヒトホモログ、MFN１、および高度に保存された異なる種、センチュウおよびショウジョウバエのfuzzy onions（Fzo）遺伝子を含む、における一員を有する（図３）。
【００１４】
CMT2Aの家族で同定された変異の大多数は、エクソン４、エクソン８、および９ならびに、Mfn2のミトコンドリア融合活性に必要不可欠であるということが示されているGTPアーゼドメイン（図１B）中に存在した。Santelら、Control of mitochondrial morphology by a human mitofusin. J Cell Sci 114, 867-874(2001); Halesら、 Developmentally regulated mitochondrial fusion mediated by a conserved, novel, predicted GTPase. Cell 90, 121-129(1997); およびHermannら、Mitochondrial fusion in yeast requires the transmembrane GTPase Fzo1p. J Cell Biol 143, 359-373(1998)参照。影響を受けたアミノ酸は様々な種で保存されていた（図３）。PSORTおよびMITOPROTによるMFN2の解析によりN末端サイトのミトコンドリアの標的シグナルが明らかにされ、このようなCMT2A家族中に検出された変異V69F、L76P、およびR94Qはミトコンドリアの標的となるものを変更し得る。一つの変異がエクソン１９中のfzo_mitofusinドメインに生じた（図１B）。この変異は、効率的なミトコンドリアの標的に必要とされる、C末端のコイルドコイルドメインを伸長させ得る。
【００１５】
別に定義しない限り、本明細書中で使用された全ての技術的および科学的な用語は、本発明に従事する一般のある当業者により共通に理解されるような同様な意味を有する。本明細書中の発明の説明において使用された用語は特定の態様のみを記載することを目的とし、本発明を限定することを意図しない。全ての出版物、特許出願、特許、および本明細書中で参照した他の参考文献は、それらの全体が参考によって援用される。
【００１６】
本明細書中で使用される「機能的多型」は、その遺伝子にコードされたタンパク質の活性の質的または量的な変化を生じる遺伝子の塩基対配列の変化（例えば、活性の特異性の変化；活性のレベルの変化）を言う。機能的多型の存在は、一般的な集団と比較して被験体が特定の疾患が発症するより大きなリスクを有しているということを示す。例えば、機能的多型を有する患者はシャルコー・マリー・ツース病寄与する環境的毒素に慢性的に曝されることに対して特に感受性があり得る。用語「機能的多型」は変異、欠損および挿入を含む。
【００１７】
用語「変異」は本明細書中で用いられる場合、集団の５％未満に生じ、遺伝子の存在に強く相関している機能的多型をいうことがある。（すなわち、かかる変異の存在が疾患に苦しむ被験体の高いリスクを示す）。しかしながら、特定の変異が特定の疾患を個体にもたらすリスクの程度に関係なく、「変異」はまた、本明細書中で特異的なサイトおよび機能的多型の種類をいうように用いられている。
【００１８】
本発明を伴ったスクリーニングおよび／または治療の被験体は、一般的に、ヒトの被験体で、女性および男性の被験体の両方を含んでいる。該被験体はいかなる人種のおよびいかなる年齢のものであってもよく、子供、青年、および成人を含む。本方法は特定の治療に対する患者の適合性の最初の指標を提供するための被験体のスクリーニングに有用であるが、任意の所定の被験体が受けるはずの治療に関する最終的な判断にいたる他の要素および経験に照らしてこの情報は臨床医または医学実務者により典型的に考慮されるであろうことは、当業者によって理解されよう。
【００１９】
適切な被験体としては、以前にシャルコー・マリー・ツース病に苦しんでいると診断されていない人、以前にシャルコー・マリー・ツース病の発症のリスクがあると決定された人、および確実な情報が望まれる場合シャルコー・マリー・ツース病に苦しんでいるとして最初に診断された人が挙げられる。このように、シャルコー・マリー・ツース病を罹患したもしくはかかる疾患を発症するリスクを有する疑いのある被験体の評価において使用される、当該分野で公知のまたは記載されている他の臨床的診断の情報と関連して本明細書中で述べられた方法が使用されることが考慮される。
【００２０】
検出の工程は、被験体由来のDNAを含む生物試料を採取すること、および次いで生物試料中の変異をコードしているまたは示しているDNAの有無を決定すること等の、公知の技術に従って行われ得る。その被験体のDNAを含む任意の生物試料は、組織試料、および血液細胞が特に都合のよい供給源である血液試料を含んで用いられ得る。
【００２１】
一般的に、目的の多型の検出の工程は被験体由来のDNAを含む生物試料を採取すること、および次いで生物試料中の目的の多型を含むDNAの有無を決定することにより行われ得る。その被験体のDNAを含む任意の生物試料は、組織試料、および血液細胞が特に都合のよい供給源である血液試料を含んで用いられ得る。mitofusin遺伝子のヌクレオチド配列は、公知の適切なプローブであり、制限酵素による消化技術、または他の多型の検出手段は、標準的技術に従って、この公知の配列に基づいて実施され得る。例えば、A. Rosesらに対する米国特許第6,027,896号および第5,767,248号参照（出願人は本明細書中に引用される全ての米国特許参考文献の開示が本明細書中に参照によってその全体が援用されることを特に意図する）。
【００２２】
特定の変異をコードするDNAの有無の決定は適切な検出可能な基で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、および／またはポリメラーゼ連鎖反応もしくはリガーゼ連鎖反応等の増幅反応（該増幅反応の産物は、次いで標識されたオリゴヌクレオチドプローブまたは他の多くの技術により検出され得る）により行われ得る。さらに、検出の工程は被験体が特定の変異についてヘテロであるかホモであるかを検出する工程も含み得る。数多くの様々なオリゴヌクレオチドプローブアッセイ法の形式は本発明を行うために用いられ得る公知のものである。例えば、Wahlらに対する米国特許第4,302,204号；Falkowらに対する米国特許第4,358,535号；Rankiらに対する米国特許第4,563,419号；およびStavrianopoulosらに対する米国特許第4,994,373号参照（出願人は本明細書中に引用される全ての米国特許参考文献の開示が本明細書中に参照によって援用されることを特に意図する）。
【００２３】
選択された、または標的の核酸配列の増幅は任意の適切な手段により行われ得る。一般的にKwohら、Am. Biotechnol. Lab. 8, 14-25(1990)参照。適切な増幅技術の例としては、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換反応増幅（一般的に、G. Walkerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396(1992); G. Walkerら、Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696(1992)参照）、転写ベースの増幅（transcription-based amplification）（D. Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177(1989) 参照）、自立した配列複製（self-sustained sequence replication）法（または「3SR」）（J. Guatelliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878(1990)参照）、Qβレプリカーゼ系（P. Lizardiら、BioTechnology 6, 1197-1202(1988)参照）、核酸配列ベースの増幅（または「NASBA」）（R. Lewis, Genetic Engineering News 12(9), 1(1992)参照）、修復連鎖反応（または「RCR」）（R. Lewis、上記参照）、および、ブーメランDNA増幅（または「BDA」）（R. Lewis、上記参照）が挙げられるが、これらに限定されない。ポリメラーゼ連鎖反応が特に使用される。
【００２４】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は公知の技術に従って行われる。例えば、米国特許第4,683,195号; 第4,683,202号; 第4,800,159号; および第4,965,188号参照。一般的に、PCRは、まず、核酸試料を各プライマーの伸長産物が各核酸鎖に相補的に合成されるようにハイブリダイズ条件下で検出される特定の配列の各鎖に対するあるオリゴヌクレオチドプライマーで（例えば、熱安定性DNAポリメラーゼ存在中で）処理することであって、ここでプライマーは、加えて各プライマーから合成される伸長産物が、その相補鎖から分離される際に、もう一方のプライマー伸長産物の合成のための鋳型として供給され得るように特定の配列の各鎖にハイブリダイズするのに十分に相補的なプライマー、で処理すること、および次いで該試料を検出される一つまたは複数の検出される配列が存在する場合にプライマー伸長産物をその鋳型から分離するために変性条件下で処理することを含む。これらの工程は所望される増幅の程度が得られるまで周期的に繰り返される。増幅された配列の検出は反応産物にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドプローブを反応産物に加えること（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ）（プローブは検出可能な標識を有する）、および次いで公知の技術に従った標識を検出することによって、またはゲル上での直接の可視化により行われるであろう。PCR条件により全ての対立遺伝子の型の増幅を考慮し、その型は対立遺伝子特異的なプローブとのハイブリダイゼーションによって、制限エンドヌクレアーゼ消化によって、変性勾配ゲル上での電気泳動によって、または他の技術により識別され得る。
【００２５】
リガーゼ連鎖反応（LCR）はまた公知の技術に従って行われる。例えば、R. Weiss, Science 254, 1292(1991)参照。一般的に、該反応は二組のオリゴヌクレオチドプローブ：一組は検出される配列の一方の鎖に結合する；もう一方の組は検出される配列の他方の鎖に結合する、を用いて行われる。各組は共に対応する鎖に完全に重複する。該反応は、まず、検出される配列の鎖を変性させること（例えば、分離すること）、次いでオリゴヌクレオチドプローブの各組が互いにライゲートするように熱安定性リガーゼの存在下で鎖を二組のオリゴヌクレオチドプローブと反応させること、次いで反応産物を分離すること、および次いで所望の程度に配列が増幅されるまで該過程を周期的に繰り返すこと、によって行われる。検出は次いでPCRに関して上述の際の同様の手法により行われる。
【００２６】
前述のもの等のDNA増幅技術は、機能的多型を含んでいるDNAに特異的に結合するが機能的多型を含んでいないDNAには結合しない、一つのプローブ、一組のプローブ、または二組のプローブの使用を含み得る。あるいは、該プローブまたはプローブの組は機能的多型を含むおよび含まない両方のDNAに結合し得えたが、検出可能な差が確認され得る（例えば、機能的多型が欠損変異である、短い産物）産物（例えば、伸長産物）を産生または増幅し得た。かかるプローブは標準的技術に従ってシャルコー・マリー・ツース病に関連した遺伝子中または該遺伝子に関連した公知のDNA配列からまたは標準的技術に従ってかかる遺伝子より生成され得る配列より生成され得る。
【００２７】
本明細書中で記載された検出の工程が直接または間接的に行われ得ることが理解されよう。VNTR（数が変化するタンデム反復（variable number tandem repeat））について説明されているように、対立遺伝子の型を間接的に決定する他の手段は特定の機能的多型に関連した多型マーカーを測定することを含む。
【００２８】
被験体がシャルコー・マリー・ツース病に苦しんでいるもしくはいた（死亡した被験体の場合）または該疾患の発症するリスクが増加しているもしくはいたかどうかを決定するキットは本明細書中に記載される少なくとも一つの機能的な多型の有無の検出のための少なくとも一つの特異的な試薬および少なくとも一つの機能的多型が検出されるのであれば被験体がシャルコー・マリー・ツース病に苦しんでいるもしくはいた（死亡した被験体の場合）または該疾患の発症するリスクが増加しているもしくはいたことを観察するための使用説明書を含むであろう。該キットは任意に、現在利用されているPCRを用いた、上述の技術のいずれかによる機能的多型の増幅および／または検出のための一つ以上の核酸プローブを含み得る。
【００２９】
分子生物学は核酸およびタンパク質配列の解析のための種々の技術を含む。これらの技術および手順の多くは臨床の診断的アッセイ法および試験の基礎を形成している。これらの技術としては、核酸ハイブリダイゼーション解析、制限酵素解析、遺伝子配列解析、ならびに核酸およびタンパク質の分離および精製が挙げられる（例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, およびT. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ２版, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989参照）。
【００３０】
これらの技術のほとんどは多数の試料における数多くの操作（例えば、ピペッティング、遠心分離、および電気泳動）を実行することを含む。それらはしばしば複雑で時間を消費するものであり、一般的に高い程度の精度が必要とされる。多くの技術は感度、特異性、または再現性の欠如によりその実用性において制限されている。
【００３１】
例えば、遺伝性または感染性の疾患のDNAハイブリダイゼーション解析を行うための完全な過程は非常に複雑である。概して、完全な過程は多くの工程および副工程に分割され得る。遺伝性疾患の診断の場合、最初の工程は試料（例えば、唾液、血液または組織）を得ることを含む。試料の型により、多様な前処理がなされ得る。第２の工程は他の細胞の内容物に沿った粗DNA物質を放出する細胞を破壊または溶解することを含む。
【００３２】
一般的に、いくつかの副工程が細胞残屑を除去するためおよび粗試料からDNAをさらに精製するために必要である。この点においてさらなる処理および解析のためいくつかの選択肢がある。一つ目の選択肢はDNAの変性および多くの形式（ドットブロット法、マイクロビーズ法、マイクロプレート法、等）の一つで直接ハイブリダイゼーション解析を行うこと含む。サザンブロットハイブリダイゼーションと呼ばれる第二の選択肢は、制限酵素によりDNAを切断すること、電気泳動ゲル上でDNA断片を分離すること、膜フィルターにDNAを転写すること、および次いでブロットを特異的なDNAプローブ配列とハイブリダイゼーションさせることを含む。この手順により効果的にゲノムDNA試料の複雑さが減少し、およびそれによりハイブリダイゼーションの特異性および感受性を改善することに役立つ。不運にも、この手順は長く困難である。第三の選択肢はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または鎖置換増幅（SDA）等の増幅の手順を行うことである。これらの手順により非標的配列に対して標的DNA配列の数が増幅（増加）する。標的DNAの増幅はゲノムDNA解析の複雑さおよび感度に関する課題を克服することに役立つ。これらの試料の調製およびDNAの処理の工程の後、実際のハイブリダイゼーション反応を行う。最終的に、検出およびデータの解析によりハイブリダイゼーションの事象が解析結果に変換される。
【００３３】
核酸ハイブリダイゼーション解析は一般的に、相対的に大量の複雑な非標的核酸中での、過剰なプローブDNAを用いた非常に少数の特異的な標的核酸（DNAまたはRNA）の検出を含む。試料中の核酸の複雑さの減少は低コピー数（すなわち、10,000〜100,000）の核酸標的の検出に役立つ。標的核酸の増幅によりDNAの複雑さの減少はある程度に達成される。（SDA増幅に関しては、M. A. Innisら、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, 1990、Spargoら、1996, Molecular & Cellular Probes参照）。これは標的核酸の増幅の結果非標的配列に対して数多くの標的核酸配列が生じ、それに続く標的のハイブリダイゼーションの工程が改善されるためである。
【００３４】
実際のハイブリダイゼーション反応は全工程中で最も重要で中心的な工程の一つである。該ハイブリダイゼーション工程は標的DNA配列とプローブとの間で生じるハイブリダイゼーションの規定の最適な条件において、調製されたDNA試料を特異的なレポータープローブに接して配置することを含む。
【００３５】
ハイブリダイゼーションは多数の形式の任意の一つにおいて行われ得る。例えば、複数の試料核酸のハイブリダイゼーション解析は多様なフィルターおよび固形の支持形式（Beltzら、Methods in Enzymology, Vol. 100, Partら編、Academic Press, New York, Chapter 19, pp. 266-308, 1985参照）内で行われている。ある形式、いわゆる「ドットブロット」ハイブリダイゼーション、は標的DNAのフィルターへの非共有の接触およびそれに続く放射性同位体で標識された一つ（または複数）のプローブへのハイブリダイゼーションを含む。「ドットブロット」ハイブリダイゼーション法は多くの版が開発されてきた過去二十年にわたり広い使用を獲得した（AndersonおよびYoung, Nucleic Acid Hybridization--A Practical Approach中, HamesおよびHiggins編、 IRL Press, Washington, D.C. 第4章, pp. 73-111, 1985参照）。例えば、該ドットブロット法はゲノムの変異（Nanibhushanらに対するEPA 0228075）の複数の解析のためならびに部分的に重複したクローンの検出およびゲノムマップの構築のために開発されてきた（Evansに対する米国特許第5,219,726号）。
【００３６】
複数の試料核酸のハイブリダイゼーション解析を行うためのさらなる技術としては、マイクロフォーマットマルチプレックスまたはマトリックス装置（例えば、DNAチップ）（M. Barinaga, 253 Science, pp. 1489, 1991; W. Bains, 10 Bio/Technology, pp. 757-758, 1992参照）が挙げられる。これらの方法では通常、DNAチップのマイクロウェル等の、固形の支持体の非常に小さな特定の領域に特異的なDNA配列を接着させる。これらのハイブリダイゼーション形式は従来の「ドットブロット」および「サンドウィッチ」ハイブリダイゼーション系の微小規模版である。
【００３７】
マイクロフォーマットハイブリダイゼーションを用いて「ハイブリダイゼーションによる配列決定法（sequencing by hybridization）」（SBH）（M. Barinaga, 253 Science, pp. 1489, 1991; W. Bains, 10 Bio/Technology, pp. 757-758, 1992参照）を行い得る。SBHは、全ての可能性のあるｎヌクレオチドのオリゴマー（n量体）を利用することにより、DNA配列を生成するためのアルゴリズム解析により次にアラインされる、未知のDNA試料中のn量体を同定する（Drmanac米国特許第5,202,231号参照）。
【００３８】
SBHを行うための二つの形式がある。第一の形式は支持体上の、次いで標的配列とハイブリダイズする、全ての可能性のあるn量体のアレイの作製を含む。第二の形式は標的配列を、次いで全ての可能性のあるn量体に連続的に特定部位を検出する支持体に接触させることを含む。両形式は直接のプローブハイブリダイゼーション法の基本的な問題および多重ハイブリダイゼーションに関するさらなる困難を有している。
【００３９】
Southern、（英国特許出願第GB8810400号, 1988; E. M. Southernら、13 Genomics 1008, 1992）、はDNAの解析または配列決定のために第一の形式を用いることを提案した。SouthernはPCR増幅されたゲノムDNAを用いて公知の一つの点変異を同定した。SouthernはまたSBHのための固形の支持体上でオリゴヌクレオチドのアレイを合成するための方法を述べた。しかしながら、Southernはアレイ上の各オリゴヌクレオチドにとって最適なストリンジェントな条件に達する方法を扱っていなかった。
【００４０】
Drmanacら、（260 Science 1649-1652, 1993）、は数個の短い（116bp）DNA配列の配列決定のために第二の形式を用いた。標的DNAは膜状の支持体に接していた（「ドットブロット」形式）。各フィルターは272の標識された10量体および11量体のオリゴクレオチドと連続的にハイブリダイズした。広範囲なストリンジェントな条件を用いて各n量体のプローブの特異的なハイブリダイゼーションに達した。洗浄時間を5分から一晩に０℃から１６℃の温度を使用して変更した。ほとんどのプローブは１６℃、３時間の洗浄を要した。ハイブリダイゼーションのシグナルを検出するためにフィルターを２〜１８時間爆露しなければならなかった。単純な標的配列、オリゴマープローブの減少したセット、および利用可能な最もストリンジェントな条件にもかかわらず全体の偽陽性のハイブリダイゼーションの割合は５％であった。
【００４１】
現在、多様な方法が該ハイブリダイゼーションの事象の検出および解析に利用可能である。DNAプローブの標識に用いられるレポーター基（フルオロフォア、酵素、放射性同位体等）に依存して、蛍光測定的に、比色定量的に、またはオートラジオグラフィーにより検出および解析を行う。蛍光の放射または粒子の放射等、放射された放射能を観察および測定することによりハイブリダイゼーションの事象について情報が得られ得る。検出方法が非常に高い固有の感度を有する場合でさえ、ハイブリダイゼーションの事象の検出は非特異的に結合した物質のバックグラウンドの存在のために困難である。このように、ハイブリダイゼーションの事象の検出はどの程度特異的および高感度にハイブリダイゼーションがなされ得るかに依存している。遺伝学的解析に関して、特異性および感度を増加させようと試みているいくつかの方法が開発されている。
【００４２】
遺伝学的解析の一つの形態は一塩基多型または（「SNP」）の解明を中心とした解析である。SNPの使用に有利な要素は、それらがヒトゲノム中に高度に豊富にあること（特に短いタンデム反復（short tandem repeat）（STR）と比較して）、それらが頻繁に遺伝子のコード領域または制御領域（タンパク質構造または発現レベルに影響し得る）内に位置すること、およびある世代から次へと受け継がれる際のそれらの安定性（Landegrenら、Genome Research, Vol. 8, pp. 769-776, 1998）である。
【００４３】
SNPは二つのバリアントに存在するゲノム中の任意の位置として定義され、最も一般的なバリアントは99％未満の頻度（less than 99% of the time）で生じる。広く知れ渡った遺伝子マーカーとしてSNPを使用するために容易に、迅速に、正確に、および高い費用効果で、それらの遺伝子型を決定できることが重要である。公知の苦しみに関係があると以前に証明されたSNPの小副集団と同様に、多くの座が一つの疾患の要因となる複雑な障害（Rischおよび Merikangas, Science, Vol. 273, pp. 1516-1517, 1996）を調査するためにSNPの両大集団を分類することは非常に興味深い。
【００４４】
SNPを分類するために数多くの技術が現在利用可能である（総論としてLandegrenら、Genome Research, Vol. 8, pp. 769-776, (1998) 参照、その全てが標的の増幅を必要とする。それらは直接配列決定法（Carothersら、BioTechniques, Vol. 7, pp. 494-499, 1989）、一本鎖コンフォメーション多型法（Oritaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, pp. 2766-2770, 1989）、対立遺伝子特異的増幅法（Newtonら、Nucleic Acids Research, Vol. 17, pp. 2503-2516, (1989）、制限酵素消化法（DayおよびHumphries, Analytical Biochemistry, Vol. 222, pp. 389-395, 1994）、およびハイブリダイゼーションアッセイを含む。それらの最も基本的な形態において、ハイブリダイゼーションアッセイは対応するおよび対応しない標的に対する短いオリゴヌクレオチドレポーターを識別することにより機能する。基本的なプロトコールに対する多くの適合が開発されてきた。これらにはライゲーション連鎖反応（Wuおよび Wallace, Gene, Vol. 76, pp. 245-254, 1989）およびミニシークエンス（Syvanenら、Genomics, Vol. 8, pp. 684-692, 1990）が含まれる。他の増強としてはTaq DNAポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性（Hollandら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 7276-7280, 1991）、分子ビーコン（TyagiおよびKramer, Nature Biotechnology, Vol. 14, pp. 303-308, 1996）、熱変性曲線（Howellら、Nature Biotechnology, Vol. 17, pp. 87-88, 1999）およびDNA「チップ」（Wangら、Science, Vol. 280, pp. 1077-1082, 1998）の使用が挙げられる。
【００４５】
SNPの識別に使用し得るさらなる現象は一つの標的に対する複数の標的特異的プローブのハイブリダイゼーション由来の核酸相互作用エネルギーまたは塩基スタッキングエネルギーである。（R. Ornsteinら、「An Optimized Potential Function for the Caluculation of Nucleic Acid Interaction Energies」, Biopolymers, Vol. 17, 2341-2360 (1978); J. NorbergおよびL. Nilsson, Biophysical Journal, Vol. 74, pp. 394-402, (1998); およびJ. Pietersら、Nucleic Acids Research, Vol. 17, no. 12, pp. 4551-4565 (1989)参照）。この塩基スタッキング現象は本発明の独自の形式において使用され、核酸試料中のSNPの直接の検出を可能にする高感度なTmの差を提供している。
【００４６】
関連する生物中の核酸配列の区別またはDNA配列の決定ためにさらなる方法が用いられている。例えば、Hoganらによる米国特許第5,030,557号は「プローブ」オリゴヌクレオチドに加えて「ヘルパー」オリゴヌクレオチドが結合することにより一本鎖の標的核酸の二次および三次構造が影響を受け得、プローブと標的核酸との間により高いTmが示されるようになることを開示した。しかしながら該出願は、変化しないままであればプローブの標的へのハイブリダイズを妨げようとする、自己アニールしているRNA鎖の二次および三次構造を変化させるためにのみハイブリダイゼーションエネルギーを用いることにアプローチが限定されていた。
【００４７】
DNA配列決定に関して、例えば、K. Khrapkoら、Federation of European Biochemical Societies Letters, Vol. 256, no. 1, 2, pp. 118-112 (1989)、は連続的なスタッキングハイブリダイゼーションは結果として二本鎖の安定化をもたらすということを開示した。加えて、J. Kieleczawaら、Science, Vol. 258, pp. 1787-1791 (1992)は、連続する鎖が開始を安定化させるようであるDNA合成を開始するための連続するヘキサマー鎖の使用を開示した。同様に、L. Kotlerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90, pp. 4241-4245, (1993)は、ヘキサマーおよびペンタマーオリゴヌクレオチドモジュールの使用によるDNA配列決定反応の開始における配列特異性を開示した。さらに、S. Parinovら、Nucleic Acids Research, Vol. 24, no. 15, pp. 2998-3004, (1996)、は受動的なDNA配列決定マイクロチップに関連するDNA配列決定のための塩基スタッキングオリゴマーの使用を開示した。さらに、G. Yershovら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp. 4913-4918 (1996)は、受動的なマイクロチップ上でのSBHにおける塩基スタッキングエネルギーの適用を開示した。Yershovの例において、１０量体のDNAプローブはさらなる短いプローブに関連して、マイクロチップの表面に固定され、標的配列にハイブリダイズし、その短いプローブの組み合わせはプローブの結合を安定化させるようである。この形式において、核酸配列の短いセグメントがDNA配列決定のために解明され得た。Yershovはさらにその系においてより短いプローブ（例えば、5量体）を用いることによりミスマッチの不安定化効果が上がることを記した。DNA配列決定におけるかかる短いプローブの使用は、プローブ／標的ハイブリダイゼーション複合体のある特定の位置におけるただ一つのミスマッチよりもプローブされる配列に沿ったミスマッチの存在を見分ける能力を提供した。より長いプローブ（例えば、8量体、10量体、および13量体オリゴ）の使用はかかる目的にとってより機能的ではない。
【００４８】
核酸の解析における塩基スタッキングを用いる方法論のさらなる例としては、結合する標的と関連して作用してスタッキングエネルギーにより二本鎖形成を安定化させる一本鎖ループおよび二本鎖領域を有する単分子捕捉プローブを用いて核酸標的を捕捉する方法が開示された、Laneらによる、米国特許第5,770,365号が挙げられる。
【００４９】
塩基スタッキングの現象の知識にもかかわらず、上述の出願は結果として商業上許容され得るDNA配列決定または臨床的目的のSNPの検出の方法またはプロトコールにはならなかった。われわれは本明細書中で塩基スタッキングの原理の使用および電子的に呼び出し可能なマイクロチップ形式を組み合わせることにより数多くの遺伝学的および医学的な適用におけるかかる区別を行うためのかかる商業上有用な方法を提供する。
【００５０】
本発明の方法を実行するために有用なキットは、一般的に、一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブおよび上述の該方法を実行するための、制限酵素等の他の試薬を含み、任意に、該方法を実行するための適切な使用説明書とともに包装される。
【００５１】
本発明はまた複数のヒト被験体または患者において臨床試験を行う方法を提供する。かかる方法は特定の治療計画（典型的には薬理学的に活性のある有機化合物活性剤の投与）の利点が、特に特定の患者の副集団に関して、より正確に検出され得るように有利に患者集団の改善を可能にする。一般的に、かかる方法は、複数の被験体に対する試験活性剤または治療（対照またはプラシーボ治療は、典型的に別々だが同様に特徴付けられた複数の被験体に施与される）を施与することおよび複数の被験体において少なくとも一つの上述の変異または多型の有無を検出することを含む。該多型は試験治療の施与の工程の前、後、または該工程と同時に検出され得る。試験治療において一つ以上の検出された多型もしくは多型がなかったことの影響は、次いで前述の治療の効果、該治療の副作用の欠如等を含むがこれらに限定されない、任意の適切なパラメータまたは潜在的な治療成果もしくは結果に関して決定され得る。
【００５２】
本明細書中に記載される新規のタンパク質、およびそれをコードするヌクレオチドにおける、本明細書中で開示された変異を記載する際、命名の方法は下記の通りである：
[置換された核酸][公知の配列の配列中の核酸番号][代わりの核酸]。例えば、2219位に対してはグアニンであり、シトシンに置換される。
【００５３】
本発明は以下の制限されない実施例においてより詳細に説明される。
【００５４】
実施例１：CMT2Aに関連する該Mitofusion 2遺伝子の変異の同定
同定された全家族において、遺伝子Mitofusin 2（MFN2）中の種々のミスセンス変異を位置決定する。遺伝子Mitofusin 2（MFN2）は染色体1p36上のKIF1B座から1.65 Mb下流に位置する（図１）。
【００５５】
方法
患者
CMT2A家族DUK662、DUK1706、DUK1241、DUK156を研究した。ロシア人家族RU45はメディカルジェネティクス研究センター、モスクワにおいて確認された。トルコ人家族CMT166はイスタンブール大学とアントワープ大学の共同研究において同定された。対照は末梢神経障害の臨床的徴候を有さないCMT家族の関係のない配偶者およびトルコ国籍の関係の無い個人からなった。全試料はインフォームドコンセントを伴って回収された。RT-PCRのための組織は神経病理学部、大学病院、ラインラントヴェストファーレン技術大学のヒト組織バンクから得られた。該研究は各共同研究者施設内治験審査委員会または同等のものにより承認された。
【００５６】
変異のスクリーニング
全てのPCRプライマーはウェブベースプライマー３アルゴリズムを用いて設計した。PCR反応は標準的なプロトコールに従った。PCR産物はエチジウムブロマイドで染色した1.5％アガロースゲル上で可視化した。該反応産物をQiaquick PCR purification kit (Quiagen, Hilden, Germany)を適用して精製した。増幅したDNA試料はABI3730のBig dye Terminator reaction kit（Applied Biosystems, Foster City, USA）を適用して直接配列決定した。
【００５７】
遺伝子はコードエクソンおよび両側に両方向（順方向および逆方向）で位置するイントロンの配列の変異のスクリーニングのために配列決定された。
【００５８】
RT-PCR
cDNAレベルでの転写物解析のために、PAXgene Blood RNA Kit（PreAnalytiX、Hombrechtikon、Switzerland）およびRNeasy（Qiagen、Hilden、Germany）を用いて、血液試料から全RNAを単離した。ランダムプライマー（Reverse Transcription System、Promega、Madison、USA）を用いて、mRNAをcDNAに逆転写した。プライマーセットを用いてKIF1B-βおよびMFN2 cDNAを増幅し、重複する産物を生成した。
【００５９】
遺伝子型決定および連鎖解析
RU45家族の遺伝子型決定のために、以下のマイクロサテライトマーカーを用いて、CMT2A遺伝子座への連鎖を試験した：D1S2663（AFMa210xg9）、D1S508（AFMa128ye9）、D1S2667（AFMa224wg9）、D1S228（AFM196xb4）。コンティーグAC019262で新規に設計されたSTRマーカーを、プライマーAC019262-F：GGAGTGCATTTCTGCTTGGTAG（配列番号：１９）およびAC019262-R：AACACTTGGCTTATACCTTTTCTAG（配列番号：２０）によって増幅した。全てのPCR反応は、標準的なプロトコールに従って行った。プログラムMLINKおよびILINK（LINKAGEパッケージ、version 5.1）によって、二点連鎖解析を行った。均等なマーカー対立遺伝子頻度を仮定してLOD値を計算し、0.0001の疾患対立遺伝子頻度を有する常染色体優性形質として、疾患を評価した。データのマルチポイント解析のために、FASTLINK パッケージ（version 4.1P）を用いた。
【００６０】
電子データベース情報
本明細書中に示されるデータの受託番号およびURLは以下の通りである：
2007511221.tif 000002
2007511221.tif 000003
2007511221.tif 000004
【００６１】
家族データおよびハプロタイプ解析
元々のCMT2A家族（DUK662）、以前に報告されているイタリア（CMT156）および北アメリカ（DUK1241、DUK1706）からの３つの家族、ならびにロシア（RU45）およびトルコ（CMT166）を起源とする２つの新規に確かめられた家系を調べた（図２、３）。６つ全ての家族についてのCMT2A遺伝子座への連鎖解析によって、2.20〜5.88にわたるLOD値が提供された（表１）。
【００６２】
【表１】
2007511221.tif 000005
2007511221.tif 000006
【００６３】
CMT2A遺伝子座に対するフランキングマーカーを、DUK662家族で独自に設計し、後に、CMT156家族における組換え体によって、10.0 cM領域まで改良した（３、１６参照）。トルコのCMT166家族によって、CMT2A遺伝子座がさらに、マーカーD1S160およびD1S434によって特定される9.3 cMまで減少した（図１Ａ）。要約した臨床的および電気生理学的データを表２に示す。
【００６４】
【表２】
2007511221.tif 000007
【００６５】
新規に確かめられたCMT2A家族の説明
RU45家系は、ロシアを起源とするCMT2A家族を表す。該家族の全ての患者において、疾患は、四肢の衰弱ならびに腓骨、遠位の大腿および遠位の手の筋肉の重症な萎縮によって特徴付けられる。さらに、「靴下状および手袋状」感覚喪失、くるぶし反射および手根橈骨反射の欠如、凹足、ならびにニワトリ歩行が観察された。ある罹患者（図３中、灰色で示す）は、脳性麻痺を患っており、そのためそのCMT状態は明らかに確立されなかった。３人の罹患した女性の電気生理学的解析によって、運動正中神経については正常で、脛骨神経については中程度に減少したNCV値が証明された（表２）。3.55の最大二点LOD値が、D1S434の近くにあるマーカーAC019262で得られた。
【００６６】
KIF1Bにおける変異スクリーニング
DUK662、DUK1706、DUK1241、RU45、CMT156およびCMT166の家族における増幅されたKIF1B-βのコードエクソンの直接の配列決定によって、変異は明らかにされなかった。さらに、CMT156およびCMT166の家族における、二つの罹患した被験体のKIF1B-β cDNAの直接の配列決定によって、さらなる配列の変化、欠失または挿入は明らかにされなかった。遺伝子全体にわたり、重複PCR産物を生じるプライマーを用いたRT-PCRによって、末梢神経組織のヒト試料において、KIF1B-βの近隣のさらなるエクソンについての証拠は明らかにならなかった。しかしながら、この実験によって、先に述べたエクソン25を欠くKIF1B-βのスプライスバリアントが証明された。KIF1B-βの、このより短いスプライスバリアントは、血液、末梢神経、脊髄、脳および筋肉組織から回収されたcDNA中に存在していた。長い方のアイソフォームは、筋肉、脊髄および脳で発現していた。
【００６７】
遺伝子全体にわたって分布するいくつかの一塩基多型（SNP）が、患者および40人の健康な対照における、コードエクソンおよびフランキングイントロン配列において検出された。KIF1B遺伝子は頭部ならびに二つの選択的スプライシングされた尾部、αおよびβからなるので、KIF1B-βの変異もまた、配列決定により除外された。
【００６８】
Mitofusin 2（MFN2）変異検出
9.6 cMの微細な（refined）染色体領域は、少なくとも55の公知の、または予測される遺伝子を含む。神経系における発現が知られている候補遺伝子を、変異解析のために優先した。以下の遺伝子を、検査した家族の、罹患した個体における変異についてスクリーニングした：UBE4B、PEX、TARDBP、PMSLC、FRAP1、KIAA1337、FBXO2、FBG3、FBXO6、CLCN6、NPPA、NPPB、TNFRSF8、KIAA0453およびMFN2（図１）。遺伝子MFN2において、６つの家族で６つの異なるミスセンス変異が同定された。DUK662家族において、c.2219G＞C置換（Trp740Ser）がCMT2表現型と完全に共分離したが、250人の健康な白色人種の対照においては明らかでなかった。Lupasらのアルゴリズムを適用して、芳香族のトリプトファンから小型で極性のセリンへの交換は、fzo_mitofusinドメインの末端に生じるコイルドコイル構造を伸長すると予測された（図１）。DUK1241家族における変異（c.839G＞A、Arg280His）およびCMT156家族における変異（c.751C＞G、Pro251Ala）が、タンパク質のGTPアーゼドメインに見られた。Pro251およびArg280アミノ酸は、両方ともショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）およびセンチュウ（Caenorhabditis elegans）において高度に保存されており、機能の重要性を示唆する（図３）。RU45家族において、Arg94Gln変異は、281位でのG＞Aの転位（c.281G＞A）によって引き起こされた。このアミノ酸は、GTPアーゼドメインの予測される始まりを示し、MFN2のホモログタンパク質であるMFN1のGTPアーゼドメインにおいて保存されている（図３）。DUK1706家族における変異（Leu76Pro、c.227T＞C）もまた、GTPアーゼドメインの始まりにある。Leu76対立遺伝子はまた、哺乳動物およびショウジョウバエ（D. melanogaster）において保存されている(図３)。トルコ人の家族であるCMT166において、G＞Tの交換は、バリンをフェニルアラニンに置換する（c.205G＞T、Val69Phe）。Val69対立遺伝子も、MFN2において同様に高度に保存されている（図３）。少なくとも250の健康な対照試料において、変異は検出されなかった。
【００６９】
ヒト神経組織におけるMFN2の発現
RT-PCRによって、ヒト筋肉、腓腹神経、脊髄および脳において、MFN2転写物の存在を示した。以前に予測された選択的エクソン4b（図１ｂ）は、全ての試料において確認された。この選択的転写物はエクソン4bで転写を開始し、タンパク質のN末端での短縮（96アミノ酸）をもたらした。
【００７０】
実施例２  CMT 2A個体に見出されたさらなる変異
本明細書中に記載される方法を用いて、CMT2患者のMFN2において、さらなる変異を同定した。ある変異は493C＞G変化であり、165His＞Aspをもたらした。この変異はCMT2および臨床検査における軽度の痙攣性の特性に関連があり、中枢神経系の関与を強く示唆する。該変異は大きなオーストラリアの家族において分離し、500の対照染色体においては見られなかった。
【００７１】
さらなる変異は、以下の補足の表１および２に記載される。
【００７２】
【表３】
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【００７３】
【表４】
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【００７４】
MFN2におけるArg418X変化は、上記の補足の表２に記載されており、CMT2患者における翻訳の未成熟な終了を引き起こした。この患者の臨床上の表現型は、発症の年齢が早いこと、嗄声を伴う声帯不全麻痺、および視覚欠陥を含んでいた。視覚欠陥は、ミトコンドリア病から、および視神経萎縮からも公知の表現型に類似した、網膜の病的変化による。したがって、ミトコンドリアゲノムの変異がなく、レーバー遺伝性視神経萎縮と診断された患者の一部は、MFN2の変異を有するようなものである。
【００７５】
前記のものは、本発明の例示であって、これを制限すると解釈されないものである。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の均等物は、そこに含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは染色体1p35.2上のCMT2A領域の転写物地図を図解する。図１Ａは連続する、KIF1Bを含むNT_021937、典型的なSTRマーカー、およびMFN2を含むスクリーニングされた遺伝子を伴う物理的な地図を図解する。CMT2A遺伝子座はマーカーD1S160およびD1S434により定義される。図１Ｂは機能ドメイン（白棒）；翻訳されるmRNA（黒棒）、非翻訳mRNAおよび選択的スプライシングによるエクソン（灰棒）、中の六つの検出された独自の変異を有するMFN2のゲノムの構造を表す; tel: テロメアの; cen: セントロメアの; TM: 膜貫通ドメイン; Cc: コイルドコイル。
【図２】図２Ａ〜２Ｅは五つのCMT2Aの家族における家系図および検出された変異を図解する。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは予想されるドメインに関連のある異なる種におけるMFN2およびMFN1の配列保存を図解する。CMT2Aの家族で同定された変異のサイトは三角で示される。図３ＡはGTPアーゼドメインの開始点で同定された三つの異なるミスセンス変異を図解する。破線はGTPアーゼ開始点に対応する。配列はヒト(H. sapiens)Mfn2（配列番号：1）；マウス(M. musculus)Mfn2（配列番号：２）；ショウジョウバエ(D. melanogaster)（配列番号：３）；センチュウ(C. elegans)Mfn2（配列番号：４）；ヒト(H. sapiens)Mfn１（配列番号：５）；およびマウス(M. musculus)Mfn１（配列番号：６）由来のものを含む。図３ＢはGTPアーゼドメインにおける二つの保存されたミスセンス変異を表す。配列はヒト(H. sapiens)Mfn2（配列番号：７）；マウス(M. musculus)Mfn2（配列番号：８）；ショウジョウバエ(D. melanogaster)（配列番号：９）；センチュウ(C. elegans)Mfn2（配列番号：１０）；ヒト(H. sapiens)Mfn1（配列番号：１１）；およびマウス(M. musculus)Mfn1（配列番号：１２）由来のものを含む。図３Ｃはfzo_mitofusinドメインの末端に生じたミスセンス変異を示す。この図の黒背景は高度に保存されたアミノ酸を示す。スケールはヒトMFN2タンパク質配列（NM_014874）に関して並べる。配列はヒト(H. sapiens)Mfn2（配列番号：１３）；マウス(M. musculus)Mfn2（配列番号：１４）；ショウジョウバエ(D. melanogaster)（配列番号：１５）；センチュウ(C. elegans)Mfn2（配列番号：１６）；ヒト(H. sapiens)Mfn1（配列番号：１７）；およびマウス(M. musculus)Mfn1（配列番号：１８）由来のものを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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