(57)【要約】  本発明は、リノール酸（１８：２、ＬＡ）からα−リノレン酸（１８：３、ＡＬＡ）への転換を触媒できる真菌Δ１５脂肪酸デサチュラーゼに関する。デサチュラーゼをコードする核酸配列、それにハイブリダイズする核酸配列、デサチュラーゼ遺伝子を含んでなるＤＮＡコンストラクト、および増大したレベルのデサチュラーゼを発現する組換え宿主植物および微生物について記載されている。１５脂肪酸デサチュラーゼの過剰発現によって特定のω−３およびω−６脂肪酸の生成の増大方法についてもまた本明細書に記載されている。
2007515951.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸断片、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸断片、または
（ａ）または（ｂ）と相補である単離された核酸断片
からなる群から選択される、真菌Δ１５デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸断片。
【請求項２】
配列番号１に記載の請求項１に記載の単離された核酸断片。
【請求項３】
フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）から単離された請求項１に記載の単離された核酸断片。
【請求項４】
配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも８６％の同一性を有する、少なくとも４０２個のアミノ酸があるΔ１５デサチュラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、または
第１のヌクレオチド配列の相補体
を含んでなる第２のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸断片。
【請求項５】
酵素基質としてオレイン酸およびリノール酸の双方に結合する請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸断片によってコードされるポリペプチド。
【請求項６】
適切な制御配列に作動的に結合された請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸断片を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された核酸断片を含んでなる、形質転換宿主細胞。
【請求項８】
植物、藻類、細菌、酵母、および真菌からなる群から選択される、請求項７に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞が、ダイズ、コーン、ナタネ、サクラソウ、亜麻、カノーラ、トウモロコシ、ベニバナ、およびヒマワリからなる群から選択される植物である、請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１０】
宿主細胞が、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、およびモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）種からなる群から選択される真菌である請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１１】
酵母が油性酵母である請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１２】
油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される請求項１１に記載の形質転換酵母。
【請求項１３】
油性酵母がヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種である、請求項１２に記載の形質転換酵母。
【請求項１４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号８８６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号１８９４４、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１からなる群から選択される、請求項１３に記載の形質転換されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種。
【請求項１５】
ａ）（ｉ）配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも４６．２％の同一性を有するΔ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片、および
（ｉｉ）リノール酸供給源
を含んでなる宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸断片が発現し、かつリノール酸がα−リノレン酸に転換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のα−リノレン酸を回収する工程
を含んでなるα−リノレン酸の製造方法。
【請求項１６】
ａ）（ｉ）配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも４６．２％の同一性を有するΔ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片、および
（ｉｉ）オレイン酸供給源
を含んでなる宿主細胞を提供工程と、
ｂ）Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸断片が発現し、かつオレイン酸がα−リノレン酸に転換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のα−リノレン酸を回収する工程
を含んでなるα−リノレン酸の製造方法。
【請求項１７】
Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片が、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、フザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）、およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）からなる群から選択される真菌から単離される請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片が、配列番号２、６、１０、１４、および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質が、リノール酸から少なくとも約５０％のα−リノレン酸への基質転換百分率を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質が、リノール酸から少なくとも約８０％のα−リノレン酸への基質転換百分率を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質が、リノール酸から少なくとも約９０％のα−リノレン酸への基質転換百分率を有する求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質が、リノール酸から少なくとも約９５％のα−リノレン酸への基質転換百分率を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質が、酵素基質としてオレイン酸およびリノール酸の双方に結合する請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）ｉ）配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも４６．２％の同一性を有するΔ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片、および
（ｉｉ）機能的なω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子
を含んでなる、宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）オレイン酸からなるデサチュラーゼ基質源を提供する工程と、
ｃ）ω−３脂肪酸が生成する条件下で工程（ａ）の宿主細胞を工程（ｂ）のデサチュラーゼ基質と共に生育させる工程と、
ｄ）場合により工程（ｃ）のω−３脂肪酸を回収する工程
を含んでなる宿主細胞におけるω−３脂肪酸の製造方法。
【請求項２５】
ａ）ω−３脂肪酸およびω−６脂肪酸を生成する宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも４６．２％の同一性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片を（ａ）の宿主細胞に導入する工程
を含んでなり、ここでポリペプチドが酵素基質としてオレイン酸およびリノール酸の双方に結合し、ω−３脂肪酸のω−６脂肪酸に対する比率が増大する
ω−３脂肪酸からω−６脂肪酸を生成する宿主細胞においてω−３脂肪酸のω−６脂肪酸に対する比率の増大方法。
【請求項２６】
ω−３脂肪酸およびω−６脂肪酸を生成する宿主細胞が、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドを欠く請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片が、配列番号２、６、１０、１４、および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】
ω−３脂肪酸がα−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の酵素をコードする遺伝子が、Δ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、およびΔ１７デサチュラーゼからなる群から選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
宿主細胞が、植物、藻類、細菌、酵母、および真菌からなる群から選択される請求項１５、１６、２４、および２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
宿主細胞が、ダイズ、コーン、亜麻、ナタネ、サクラソウ、カノーラ、トウモロコシ、ベニバナ、およびヒマワリからなる群から選択される植物である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
宿主細胞が、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、およびモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）種からなる群から選択される真菌である請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
酵母が油性酵母である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号８８６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号１８９４４、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１からなる群から選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１５、１６、２４、および２５のいずれか一項に記載の方法によって製造される微生物油。
【請求項３７】
（ａ）請求項１に記載の核酸断片によってゲノムライブラリーをプローブする工程と
（ｂ）請求項１に記載の核酸断片とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片を配列決定する工程と
を含んでなり、かつ、配列決定されたゲノム断片がΔ１５デサチュラーゼ酵素をコードする、Δ１５デサチュラーゼ酵素をコードする核酸断片を得る方法。
【請求項３８】
（ａ）配列番号１に記載の配列の部分に対応する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成する工程と、
（ｂ）工程（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在する挿入断片を増幅する工程
を含んでなり、かつ、増幅された挿入断片がΔ１５デサチュラーゼ酵素をコードするアミノ酸配列の部分をコードする、Δ１５デサチュラーゼ酵素をコードする核酸断片を得る方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は２００３年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／５１９１９１号明細書の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明はバイオテクノロジー分野に関する。より具体的には本発明は、油性酵母菌として知られる微生物をはじめとする植物および生物において多価不飽和脂肪酸の生成を中断または向上させるのに有用な、Δ１５脂肪酸デサチュラーゼ酵素をコードする核酸断片の同定に関する。
【背景技術】
【０００３】
特定の多価不飽和脂肪酸、すなわちＰＵＦＡが健康な細胞の重要な生物学的構成要素であることが、長期にわたり認識されている。例えばこのようなＰＵＦＡは、
哺乳類において新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成できず、食餌中で得られなくてはならない、またはリノール酸（ＬＡ）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ）のさらなる不飽和化と延長によって誘導されなくてはならない「必須」脂肪酸、
リン脂質またはトリグリセリドなどの形態で見いだされてもよい細胞原形質膜の構成物、
特に成長中の幼児の脳において適切な発達、そして組織形成および修復に必要である、
プロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン、およびプロスタグランジンをはじめとする、哺乳類において重要ないくつかの生物学的に活性なエイコサノイドの前駆物質として認識されている。
【０００４】
１９７０年代に、グリーンランドのエスキモーの観察から、心疾患の低発生率と長鎖ω−３ＰＵＦＡの高摂取量とが結びつけられた（非特許文献１、非特許文献２）。より最近の研究はω−３ＰＵＦＡの心臓血管保護効果を確証した（非特許文献３、非特許文献４）。さらに血管形成術後の再狭窄率、炎症および関節リウマチ、喘息、乾癬および湿疹の症状などのいくつかの障害はω−３脂肪酸による処置に反応することが見いだされている。γ−リノレン酸（ＧＬＡ、ω−６ＰＵＦＡ）はストレスに関係した血圧上昇を低下させ、算術試験能力を改善することが示されている。ＧＬＡおよびジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、別のω−６ＰＵＦＡ）は、血小板凝集を阻害し、血管拡張を引き起こし、コレステロールレベルを低下させ、血管壁平滑筋および繊維組織の増殖を阻害することが示されている（非特許文献５）。ＧＬＡまたはＤＧＬＡの単独でのまたはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、ω−３ＰＵＦＡ）との組み合わせでの投与は、非ステロイド性抗炎症薬によって引き起こされる消化管出血およびその他の副作用を低下させ、または防止することが示されている（特許文献１）。さらにＧＬＡおよびＤＧＬＡは、子宮内膜症および月経前症候群を防止または治療し（特許文献２）、筋痛性脳脊髄炎およびウィルス感染後の慢性疲労（特許文献３）を治療することが示されている。その他の証拠は、ＰＵＦＡがカルシウム代謝調節に関与するかもしれないことを示唆し、骨粗鬆症および腎臓または尿道結石の治療または防止においてそれらが有用であるかもしれないことを示唆する。最後にＰＵＦＡは癌および糖尿病の治療において使用できる（特許文献４、非特許文献６）。
【０００５】
ＰＵＦＡは、必須脂肪酸であるＬＡおよびＡＬＡそれぞれの不飽和化および延長によって誘導される、２つの主要なクラス（ω−６およびω−３脂肪酸からなる）に概して分けられる。天然供給源からの多様なＰＵＦＡの商業的供給源［例えばサクラソウ、ルリヂサ、およびクロフサスグリの種子や糸状菌（モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、チノリモ属（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）（紅藻）、魚油および海洋性プランクトン（キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、クリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ））］にもかかわらず、これらの生成方法と結びついたいくつかの不都合がある。第１に魚および植物などの天然供給源は、高度に不均一な油組成物を有しがちである。したがってこれらの供給源から得られた油は、所望のＰＵＦＡの１つもしくはそれ以上を分離または濃縮するために大規模な精製を必要とすることがある。天然供給源はまた、制御できない供給のばらつきを被りやすい（例えば魚資源の場合、天候、疾患、または乱獲に起因する）。ＰＵＦＡを生成する作物は、食物生成のために開発されたハイブリッド作物と、経済的競争力がないことが多い。またＰＵＦＡを自然に生成するいくつかの生物体（例えばポルフィリディウム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ））の大規模発酵は、商業的規模で培養するのが高価、および／または困難なことがある。
【０００６】
上述の限界の結果として、次に向けた大規模な研究が行われている。１．）商業的に容易に生成できるＰＵＦＡの組換え供給源の開発、および２．）所望のＰＵＦＡ生成を可能にする脂肪酸生合成経路の修正。例えば過去数年間にわたり、様々な生物体からの脂肪酸デサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の単離、クローニング、および操作において進歩があった。これらの遺伝子配列の知識は、ＰＵＦＡを自然に生成しない新しい宿主生物体中で、所望の脂肪酸、および／または脂肪酸組成物を生成する見込みを提供する。文献は、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における以下のようないくつかの例を報告する。
（非特許文献７）では、海洋珪藻フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）からの２個のデサチュラーゼがＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中にクローンされ、ＥＰＡの生成をもたらす。
（非特許文献８）では、シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）からの遺伝子を使用して、ω−３およびω−６ＰＵＦＡ生合成経路がＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に再構成される。
（非特許文献９）では、植物脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ２およびＦＡＤ３）がＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に発現し、ＡＬＡの生成をもたらす。
アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のナットゾン（Ｋｎｕｔｚｏｎ）らに付与された（特許文献５）では西洋油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）からの１個のデサチュラーゼおよび真菌モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）からの２個のデサチュラーゼが、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中にクローンされ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＡＬＡ、およびＳＴＡの生成をもたらす。
【０００７】
しかしこれらのタイプの遺伝子を発現させて、商業的量の１つもしくはそれ以上のＰＵＦＡの経済的生成を提供できる適切な植物、および／または微生物のシステムに対する必要性がなおもある。さらに特定のＰＵＦＡ、特にＥＰＡおよびＤＨＡが濃縮されている油に対する必要性が存在する。
【０００８】
ＰＵＦＡの生成プラットフォームとしてこれまで調査されていない微生物の１つのクラスは、油性酵母菌である。これらの生物体は、乾燥細胞重量の８０％までの油を蓄積できる。高い油含量で油性酵母菌を生育させる技術は十分に開発されており（例えば（特許文献６、非特許文献１０）を参照されたい）、ω−３またはω−６ＰＵＦＡ生成のための商業的な微細藻類発酵と比べてコスト優位性を提供するかもしれない。そのままの酵母菌細胞はまた、機能食品および動物飼料サプリメントで使用するためのω−３またはω−６ＰＵＦＡ濃縮油を封入する都合よい方法になるかもしれない。
【０００９】
上述の利点にもかかわらず、ほとんどの油性酵母菌中の自然に生成されるＰＵＦＡは、通常１８：２脂肪酸に限定されるので、これらの生物体は自然にはω−６ＰＵＦＡを欠いている。したがって解決すべき問題は、ω−３、および／またはω−６脂肪酸が濃縮された油を蓄積する油性酵母菌を開発することである。このような目的で、油性酵母菌におけるω−３、および／またはω−６脂肪酸の合成および蓄積を可能にするデサチュラーゼおよびエロンガーゼを導入するだけでなく、１８：３基質（すなわちω−３生成のためのＡＬＡ）の利用可能性を増大させることも必要である。概してこの基質の利用可能性は、ＬＡからＡＬＡへの転換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ活性によって制御される。
【００１０】
本発明がなされた時点で、光合成生物体（例えば植物）およびシノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）からのものをはじめとする、多様な既知のΔ１５デサチュラーゼが公共の文献で開示されている。これらのデサチュラーゼが油性酵母中の脂肪酸組成を変更するのに効果的であることは知られておらず、油性酵母における使用は好まれてはいない。さらに非油性酵母サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるこれらのデサチュラーゼの非相同発現は、５％未満のＡＬＡの生成をもたらしている（非特許文献１１、非特許文献１２、特許文献７）。したがってＰＵＦＡの生成で使用される油性微生物（例えば油性酵母）における高レベルの１８：３（ＡＬＡ）生成、およびω−３のω−６脂肪酸に対するより高い比率を支持できる、Δ１５デサチュラーゼをコードする遺伝子の同定および単離に対する必要性がある。
【００１１】
本発明は、特に真菌フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）からのΔ１５デサチュラーゼをコードする遺伝子の単離に関し、油性酵母中での発現に際して１８：２（ＬＡ）から１８：３（ＡＬＡ）への思いがけない効率的な転換を実証する。このΔ１５デサチュラーゼのオルソログが、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、フザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）において同定された。しかしフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）およびマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）デサチュラーゼ活性をさらに実験的に分析すると、双方のΔ１５デサチュラーゼが、Δ１２デサチュラーゼ活性もまた有することが思いがけなく示された（したがって酵素はここで二機能的なΔ１２／Δ１５デサチュラーゼ活性を有するとして特徴付られた）。
【００１２】
ＰＵＦＡ生成基盤としての油性酵母に対する関心に加えて、代案のＰＵＦＡ生成基盤として植物に対しても関心が向けられている。
【００１３】
２００２年４月４日に公開された（特許文献８）は、例えばスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ピチウム・イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、シジキトリウム（Ｓｃｈｉｚｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）、およびクリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）などのＬＣＰＵＦＡ生成生物体中で発現する、ＦＡＤ４、ＦＡＤ５、ＦＡＤ５−２、およびＦＡＤ６脂肪酸デサチュラーゼファミリーの一員をコードする単離された核酸断片について述べる。植物、動物、および微生物をはじめとするあらゆる発現システムで、ＬＣＰＵＦＡを生成できる細胞の生成のために、デサチュラーゼ遺伝子を含有するコンストラクトが使用できることが示唆される。
【００１４】
２００２年４月４日に公開された（特許文献８）は、ＦＡＤ４、ＦＡＤ５、ＦＡＤ５−２、およびＦＡＤ６脂肪酸デサチュラーゼの一員、そして長鎖多価不飽和脂肪酸を生成するためのその使用について述べる。
【００１５】
１９９８年１２月１９日に公開された（特許文献９）は、植物中でのポリケチド様合成遺伝子の発現による多価不飽和脂肪酸の生成について述べる。
【００１６】
１９９８年１０月２２日に公開された（特許文献１０）は、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、およびΔ１２デサチュラーゼをはじめとする、脂肪酸デサチュラーゼをコードする核酸配列およびコンストラクトを利用する植物、植物の部分、および植物細胞において長鎖脂肪酸を調製するための組成物および方法について述べる。
【００１７】
２０００年６月１３日にナットゾン（Ｋｎｕｔｚｏｎ）らに付与された（特許文献１１）は、植物における長鎖多価不飽和脂肪酸合成のための方法および組成物について述べる。
【００１８】
２００２年１０月１日にナットゾン（Ｋｎｕｔｚｏｎ）らに付与された特許文献１２は、Δ６デサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列を含んでなるコンストラクトを使用して、植物種子中でステアリドン酸を製造する方法について述べる。
【００１９】
（非特許文献１３）は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）中で発現させると、一連の１８−および２０−炭素脂肪酸中へのω−３二重結合導入を触媒できる脂肪酸デサチュラーゼをコードする、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）からのｃＤＮＡの単離および特徴付けについて述べる。
【００２０】
【特許文献１】米国特許第４，６６６，７０１号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７５８，５９２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，１１６，８７１号明細書
【特許文献４】米国特許第４，８２６，８７７号明細書
【特許文献５】米国特許第６，１３６，５７４号明細書
【特許文献６】ＥＰ０  ００５  ２７７Ｂ１号明細書
【特許文献７】国際公開第２００３／０９９２１６号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０２／２６９４６号パンフレット
【特許文献９】国際公開第９８／５５６２５号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第９８／４６７６４号パンフレット
【特許文献１１】米国特許第６,０７５,１８３号明細書
【特許文献１２】米国特許第６,４５９,０１８号明細書
【非特許文献１】ダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ），Ｊ．ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．２８：９５８〜９６６（１９７５）
【非特許文献２】ダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ），Ｊ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ２（８０８１）：１１７〜１１９（１９７８年７月１５日）
【非特許文献３】シモカワ（Ｓｈｉｍｏｋａｗａ）Ｈ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  Ｄｉｅｔ、８８：１００〜１０８（２００１）
【非特許文献４】フォンシャッキー（ｖｏｎ  Ｓｃｈａｃｋｙ），Ｃ．およびダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ），Ｊ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  Ｄｉｅｔ、８８：９０〜９９（２００１）
【非特許文献５】ブレナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８３：８５〜１０１（１９７６）
【非特許文献６】ホロビン（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．５７（別冊）７３２Ｓ〜７３７Ｓ（１９９３）
【非特許文献７】ドマーグ（Ｄｏｍｅｒｇｕｅ），Ｆ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４１０５〜４１１３（２００２）
【非特許文献８】ボードイン（Ｂｅａｕｄｏｉｎ），Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７（１２）：６４２１〜６（２０００）
【非特許文献９】ダイヤー（Ｄｙｅｒ），Ｊ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｉｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５９：２２４〜２３０（２００２）
【非特許文献１０】ラトレッジ（Ｒａｔｌｅｄｇｅ），Ｃ．、Ｐｒｏｇ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：１１９〜２０６（１９８２）
【非特許文献１１】リード（Ｒｅｅｄ），Ｄ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２２：７１５〜７２０（２０００）
【非特許文献１２】ミーサプヨズク（Ｍｅｅｓａｐｙｏｄｓｕｋ），Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１１９４８〜１１９５４（２０００）
【非特許文献１３】スパイカラ（Ｓｐｙｃｈａｌｌａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９４巻、１１４２〜１１４７（１９９７年２月）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、新たに発見された真菌Δ１５デサチュラーゼ酵素、および該物質をコードする核酸配列を提供する。この酵素、およびここで同定された真菌オルソログは、Δ１５およびΔ１２不飽和化反応の双方を遂行する能力においてユニークである。さらに本発明は、本真菌Δ１５デサチュラーゼ酵素を発現する宿主細胞を提供する。
【００２２】
したがって本発明は、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸断片、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸断片、または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と相補である単離された核酸断片
からなる群から選択される、真菌Δ１５デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸断片を提供する。
【００２３】
代案としては本発明は、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて、配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較して、少なくとも８６％の同一性を有する、少なくとも４０２個のアミノ酸を含むΔ１５デサチュラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸断片、または
第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列を提供する。
【００２４】
さらに本発明は、ここで述べられる核酸、ならびに該物質を含んでなる遺伝的キメラおよび形質転換された宿主によってコードされるポリペプチドを提供する。本発明で使用するのに好ましい宿主細胞としては、植物、藻類、細菌、酵母、および真菌が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて、配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較して、少なくとも４６．２％の同一性を有するΔ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片、および
（ｉｉ）リノール酸供給源
を含んでなる宿主細胞を提供工程と、
ｂ）Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸断片が発現し、かつリノール酸がα−リノレン酸に転換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のα−リノレン酸を回収する工程
を含んでなる、α−リノレン酸の製造方法を提供する。
【００２６】
同様に本発明は、
ａ）（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて、配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較して、少なくとも４６．２％の同一性を有するΔ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片、および
（ｉｉ）オレイン酸供給源
を含んでなる宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸断片が発現し、かつオレイン酸がα−リノレン酸に転換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のα−リノレン酸を回収する工程
を含んでなる、α−リノレン酸の製造方法を提供する。
【００２７】
代案としては本発明は、
ａ）（ｉ）配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも４６．２％の同一性を有するΔ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片、および
（ｉｉ）機能的なω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子
を含んでなる宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）オレイン酸からなるデサチュラーゼ基質源を提供する工程と、
ｃ）ω−３脂肪酸が生成される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を工程（ｂ）のデサチュラーゼ基質と共に生育させる工程と、
ｄ）場合により工程（ｃ）のω−３脂肪酸を回収する工程
を含んでなる、宿主細胞におけるω−３脂肪酸の製造方法を提供する。
【００２８】
代案の実施態様では、本発明は、
ａ）ω−３脂肪酸およびω−６脂肪酸を生成する宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも４６．２％の同一性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片を（ａ）の宿主細胞に導入する工程
を含んでなり、ここでポリペプチドが酵素基質としてオレイン酸およびリノール酸の双方に結合し、ω−３脂肪酸のω−６脂肪酸に対する比率が増大する、ω−３脂肪酸からω−６脂肪酸を生成する宿主細胞において、ω−３脂肪酸のω−６脂肪酸に対する比率の増大方法を提供する。
【００２９】
さらに本発明は、本発明の方法によって生成される微生物油を提供する。
【００３０】
別の実施態様では、本発明は、油料種子植物の成熟種子の全脂肪酸プロフィールを変更して、０．４を超えるω−３：ω−６比を有する油を生成するための組換えコンストラクトに関し、前記コンストラクトは、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部または一部をコードする単離された核酸断片、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄すると、（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸断片、
（ｃ）ＣｌｕｓｔａｌＶ法によるアライメントに基づいて、配列番号２、６、１０、１４、１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも４６．２％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする単離された核酸断片、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と完全に相補である単離された核酸断片
からなる群から選択される単離された核酸断片を含んでなり、
前記単離された核酸断片は少なくとも１つの制御配列に作動的に結合する。
【００３１】
第２の実施態様では、本発明は、それらのゲノムに本発明の組換えコンストラクトを含んでなる、油料種子植物、植物細胞、植物組織または植物部分に関する。
【００３２】
第３の実施態様では、本発明はまた、このような植物から得られる種子、これらの種子から得られる油、およびこの油の加工から得られる副産物にも関する。
【００３３】
第４の実施態様では、本発明は、食物、動物飼料または産業用途における本発明の油の使用、および食物または動物飼料における本発明の副産物の使用に関する。
【００３４】
第５の実施態様では、本発明は、
ａ）本発明の組換えコンストラクトで油料種子植物細胞を形質転換する工程と、
ｂ）工程（ａ）の形質転換された植物細胞から油料種子植物を再生する工程と、
ｃ）形質転換されていない植物中のω−３脂肪酸のω−６脂肪酸に対する比率と比較して、増大したω−３脂肪酸のω−６脂肪酸に対する比率を有する形質転換された植物を選択する工程
を含んでなる、油料種子植物においてω−３脂肪酸のω−６脂肪酸に対する比率の増大方法に関する。
【００３５】
第６の実施態様では、本発明は、この方法によって作られる油料種子植物、このような植物から得られる種子、これらの種子から得られる油、食物または動物飼料におけるこの油の使用、この油の加工から得られる副産物、および食物または動物飼料におけるこれらの副産物の使用に関する。
【００３６】
第７の実施態様では、本発明は、
ａ）本発明の組換えコンストラクトで油料種子植物細胞を形質転換する工程と、
ｂ）工程（ａ）の形質転換された植物細胞から油料種子植物を再生する工程と、
ｃ）種子油の全脂肪酸含量の少なくとも２５％のα−リノレン酸を有する形質転換された植物を選択する工程
を含んでなる、種子中の油のα−リノレン酸含量が種子油の全脂肪酸含量の少なくとも２５％である、油料種子植物の種子中でα−リノレン酸を製造する方法に関する。
【００３７】
第８の実施態様では、本発明は、この方法によって作られる油料種子植物、このような植物から得られる種子、これらの種子から得られる油、食物または動物飼料におけるこの油の使用、この油の加工から得られる副産物、および食物または動物飼料におけるこれらの副産物の使用に関する。
【００３８】
さらに別の実施態様では、本発明は、２を超えるω−３のω−６に対する比率を有する油を生成するための油料種子植物の成熟種子の全脂肪酸プロフィールを変更するための組換えコンストラクトに関し、前記油は２％を超えるエイコサペンタエン酸含量を有し、前記コンストラクトは、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部または一部をコードする単離された核酸断片、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄すると、（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸断片、
（ｃ）ＣｌｕｓｔａｌＶ法によるアライメントに基づいて、配列番号２、６、１０、１４、１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも４６．２％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする単離された核酸断片、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と完全に相補である単離された核酸断片
からなる群から選択される単離された核酸断片を含んでなり、
前記単離された核酸断片は少なくとも１つの制御配列に作動的に結合する。
【００３９】
さらに実施態様では、本発明は、それらのゲノム中に本発明の組換えコンストラクトを含んでなる油料種子植物、植物細胞、植物組織、または植物部分に関する。本発明はまた、このような植物から得られる種子、これらの種子から得られる油、食物または動物飼料におけるこの油の使用、この油の加工から得られる副産物、および食物または動物飼料におけるこれらの副産物の使用に関する。
【００４０】
さらに本発明は、本発明の方法によって生成される微生物油を提供する。
【００４１】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）油料種子植物細胞を本発明の組換えコンストラクトで形質転換する工程と、
ｂ）工程（ａ）の形質転換された植物細胞から油料種子植物を再生する工程と、
ｃ）種子油の全脂肪酸含量の少なくとも２％のエイコサペンタエン酸を有する形質転換された植物を選択する工程
を含んでなる、種子油の全脂肪酸含量の２％を超えるエイコサペンタエン酸含量を有する、２を超えるω−３のω−６に対する比率を有する油を生成するための油料種子植物の種子中でエイコサペンタエン酸を製造する方法に関する。
【００４２】
さらなる実施態様では、本発明は、それらのゲノムに本発明の組換えコンストラクトを含んでなる油料種子植物、植物細胞、植物組織、または植物部分に関する。本発明はまた、このような植物から得られる種子、これらの種子から得られる油、食物または動物飼料におけるこの油の使用、この油の加工から得られる副産物、および食物または動物飼料におけるこれらの副産物の使用に関する。
【００４３】
さらに本発明は、本発明の方法によって生成される微生物油を提供する。
【００４４】
生物学的寄託
以下のプラスミドを１０８０１ユニバーシティ・ブールヴァード、マナッサス、ＶＡ２０１１０〜２２０９の米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託し、以下の称号、登録番号、および寄託日を有する。
【００４５】
【表１】
2007515951.tif 000003
【００４６】
配列説明
本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明によって、本発明をより完全に理解できるであろう。
【００４７】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列、および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ    ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  −  ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００４８】
配列番号１〜２０、５４および５５は、表１で特定されるような遺伝子またはタンパク質をコードするＯＲＦである。
【００４９】
【表２】
2007515951.tif 000004
【００５０】
配列番号２１および２２はそれぞれ、ＴＥＦプロモーターを単離するのに使用されるプライマーＴＥＦ５’およびＴＥＦ３’である。
【００５１】
配列番号２３および２４はそれぞれ、ＸＰＲ２転写ターミネーターを単離するのに使用されるプライマーＸＰＲ５’およびＸＰＲ３’である。
【００５２】
配列番号２５〜３６は、それぞれプラスミド構築のために使用される、プライマーＹＬ５、ＹＬ６、ＹＬ９、ＹＬ１０、ＹＬ７、ＹＬ８、ＹＬ３、ＹＬ４、ＹＬ１、ＹＬ２、ＹＬ６１、およびＹＬ６２に対応する。
【００５３】
配列番号３７は、「ＧＰＤＰｒｏ」と称される９７１ｂｐの断片に対応し、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の推定上のグリセルアルデヒド−３−リン酸塩デヒドロゲナーゼプロモーターとして同定された。
【００５４】
配列番号３８および３９はそれぞれ、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のグリセルアルデヒド−３−リン酸塩−デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーターを含むＤＮＡ断片を増幅するために使用される、プライマーＹＬ２１１およびＹＬ２１２である。
【００５５】
配列番号４０および４１はそれぞれ、ＧＰＤプロモーターを再増幅するために使用されるプライマーＧＰＤセンスおよびＧＰＤアンチセンスである。
【００５６】
配列番号４２および４４はそれぞれ、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の単離のために使用される、Ｐ７３およびＰ７６として同定される変性プライマーである。
【００５７】
配列番号４３および４５は、それぞれ変性プライマーＰ７３およびＰ７６に対応する、アミノ酸共通配列である。
【００５８】
配列番号４６〜４９はそれぞれ、天然Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の標的を定めた中断のために使用される、プライマーＰ９９、Ｐ１００、Ｐ１０１、およびＰ１０２に対応する。
【００５９】
配列番号５０〜５３はそれぞれ、中断されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の標的を定めた組み込みをスクリーンするために使用される、プライマーＰ１１９、Ｐ１２０、Ｐ１２１、およびＰ１２２に対応する。
【００６０】
配列番号５６および５７はそれぞれ、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ（「Ｆｍ１」）コード領域を増幅するのに使用される、プライマーＰ１９２およびＰ１９３である。
【００６１】
配列番号５８は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中で最適に発現される遺伝子のためのコドン最適化された翻訳開始部位に対応する。
【００６２】
配列番号５９〜６４はそれぞれ、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）Δ１５デサチュラーゼ（「Ｍｇ１」）を増幅するのに使用される、プライマーＰ１８６、Ｐ１８７、Ｐ１８８、Ｐ１８９、Ｐ１９０、およびＰ１９１である。
【００６３】
配列番号６５〜７２はそれぞれ、フザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）Δ１５デサチュラーゼ（「Ｆｇ１」）を増幅するのに使用される、プライマーＰＦｇ１ＵＰ１、ＰＦｇ１ＬＰ１、ＰＦｇ１ＵＰ２、ＰＦｇ１ＬＰ２、ＰＦｇ１ＵＰ３、ＰＦｇ１ＬＰ３、ＰＦｇ１ＵＰ４、およびＰＦｇ１ＬＰ４である。
【００６４】
配列番号７３は、実施例６で述べられるように、Ｋｔｉプロモーターの上流に導入される複数制限酵素部位配列である。
【００６５】
配列番号７４は、実施例６で述べられるように、制限酵素部位があるダイズアルブミン転写ターミネーターの配列を記載する。
【００６６】
配列番号７５は、アルブミン転写ターミネーターの増幅のために使用されるプライマーｏＳａｌｂ−１２である。
【００６７】
配列番号７６は、アルブミン転写ターミネーターの増幅ために使用されるプライマーｏＳａｌｂ−１３である。
【００６８】
配列番号７７は、実施例６で述べられるように、β−コングリシニンプロモーター配列の前に導入される複数制限酵素部位である。
【００６９】
配列番号７８は、実施例１１および図５で述べられるプラスミドｐＫＲ５７８の完全な配列である。
【００７０】
配列番号７９は、ダイズアネキシンプロモーターを増幅するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーＧＳＰ１を記載する。
【００７１】
配列番号８０は、ダイズアネキシンプロモーターを増幅するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーＧＳＰ２を記載する。
【００７２】
配列番号８１は、アネキシンプロモーターの配列を記載する。
【００７３】
配列番号８２は、ダイズＢＤ３０プロモーターを増幅するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーＧＳＰ３を記載する。
【００７４】
配列番号８３は、ダイズＢＤ３０プロモーターを増幅するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーＧＳＰ４を記載する。
【００７５】
配列番号８４は、ダイズＢＤ３０プロモーターの配列を記載する。
【００７６】
配列番号８５は、ダイズβ−コングリシニンβ−サブユニットプロモーターの配列を記載する。
【００７７】
配列番号８６は、ダイズβ−コングリシニンβ−サブユニットのためのプロモーターを増幅するのに使用される、オリゴヌクレオチドプライマーβ−ｃｏｎ  ｏｌｉｇｏ  Ｂａｍを記載する。
【００７８】
配列番号８７は、ダイズβ−コングリシニンβ−サブユニットのためのプロモーターを増幅するのに使用される、オリゴヌクレオチドプライマーβ−ｃｏｎ  ｏｌｉｇｏ  Ｎｏｔを記載する。
【００７９】
配列番号８８は、ダイズグリシニンＧｌｙ−１プロモーターの配列を記載する。
【００８０】
配列番号８９は、Ｇｌｙ−１プロモーターを増幅するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーｇｌｙｏｌｉｇｏ  Ｂａｍを記載する。
【００８１】
配列番号９０は、Ｇｌｙ−１プロモーターを増幅するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーｇｌｙｏｌｉｇｏ  Ｎｏｔを記載する。
【００８２】
配列番号９１は、Ｋｔｉ／ＮｏｔＩ／Ｋｔｉ３’カセットの増幅のために使用されるプライマーｏＫＴｉ５である。
【００８３】
配列番号９２は、Ｋｔｉ／ＮｏｔＩ／Ｋｔｉ３’カセットの増幅のために使用されるプライマーｏＫＴｉ６である。
【００８４】
配列番号９３は、ダイズＢＤ３０３’転写ターミネーターの増幅のために使用されるプライマーｏＳＢＤ３０−１である。
【００８５】
配列番号９４は、ダイズＢＤ３０３’転写ターミネーターの増幅のために使用されるプライマーｏＳＢＤ３０−２である。
【００８６】
配列番号９５は、実施例１３および図６で述べられるプラスミドｐＫＲ５８５の完全な配列である。
【００８７】
配列番号９６は、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼの増幅のために使用されるプライマーｏＣＧＲ５−１である。
【００８８】
配列番号９７は、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼの増幅のために使用されるプライマーｏＣＧＲ５−２である。
【００８９】
配列番号９８は、グリシニンＧｙ１プロモーターの増幅のために使用されるプライマーｏＳＧｌｙ−１である。
【００９０】
配列番号９９は、グリシニンＧｙ１プロモーターの増幅のために使用されるプライマーｏＳＧｌｙ−２である。
【００９１】
配列番号１００は、ｌｅｇＡ２プロモーター配列の増幅のために使用されるプライマーＬｅｇＰｒｏ５’である。
【００９２】
配列番号１０１は、ｌｅｇＡ２プロモーター配列の増幅のために使用されるプライマーＬｅｇＰｒｏ３’である。
【００９３】
配列番号１０２は、ｌｅｇ２Ａ転写ターミネーターの増幅のために使用されるプライマーＬｅｇＴｅｒｍ５’である。
【００９４】
配列番号１０３は、ｌｅｇ２Ａ転写ターミネーターの増幅のために使用されるプライマーＬｅｇＴｅｒｍ３’である。
【００９５】
配列番号１０４は、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）デサチュラーゼの増幅のために使用されるプライマーＣＧＲ４ｆｏｒｗａｒｄである。
【００９６】
配列番号１０５は、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）デサチュラーゼの増幅のために使用されるプライマーＣＧＲ４ｒｅｖｅｒｓｅである。
【００９７】
配列番号１０６は、モルティエレラ・アルピン（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅ）エロンガーゼの増幅のために使用される、順方向プライマーＲＰＢ２ｆｏｒｗａｒｄである。
【００９８】
配列番号１０７は、モルティエレラ・アルピン（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅ）エロンガーゼ増幅のために使用される、逆方向プライマーＲＰＢ２ｒｅｖｅｒｓｅである。
【００９９】
配列番号１０８は、ＡｓｃＩ  ｌｉｋｅｒを形成するのに使用されるプライマーＡｓｃ５である。
【０１００】
配列番号１０９は、ＡｓｃＩ  ｌｉｋｅｒを形成するのに使用されるプライマーＡｓｃ３である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０１】
参照される全ての特許、特許出願、および公報は、その内容全体を本願明細書に引用したものとする。
【０１０２】
本発明は、Δ１５デサチュラーゼをコードする、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）遺伝子およびマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）遺伝子、およびその他の真菌において同定されたそれらのオルソログの単離および同一性の確認に関する。さらに油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））および植物（例えばダイズ、コーンおよびヒマワリ）をはじめとする植物、特に油料種子植物および油性生物体の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量および組成の変更を可能にする方法および組成物が提供される。本発明のΔ１５デサチュラーゼ酵素は、さらに２つの酵素基質、オレイン酸およびリノール酸に作用するそれらの能力によって特徴付けられる。
【０１０３】
本発明は、健康的なＰＵＦＡ生成のための生化学的経路の操作のために使用してもよい、新しいΔ１５デサチュラーゼ酵素、および該物質をコードする遺伝子に関する。したがって本発明には多くの用途がある。ここで開示される方法によって製造されるＰＵＦＡ、またはその誘導体は、食餌代用品、またはサプリメント、特に乳児用調製粉乳として、静脈内栄養補給を受けている患者のために、または栄養不良を防止または処置するために使用できる。代案としては、精製されたＰＵＦＡ（またはその誘導体）は、正常な使用で受領者が食餌栄養補給のための所望量を受容するように調合された料理用油、脂肪またはマーガリンに組み込まれてもよい。ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養サプリメントまたはその他の食品に組み込まれてもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としての用途があるかもしれない。場合により組成物は、医薬用途（ヒトまたは獣医学）のために使用されてもよい。この場合、ＰＵＦＡは概して経口投与されるが、例えば非経口的（例えば皮下、筋肉内または静脈内）、経直腸、経腟または局所的（例えば皮膚用軟膏またはローションとして）など、それによって成功裏に吸収されるあらゆる経路で投与することができる。
【０１０４】
組換え手段によって製造されたＰＵＦＡによるヒトまたは動物の栄養補給は、追加的なＰＵＦＡ、ならびにそれらの代謝誘導体の増大したレベルをもたらすことができる。例えばアラキドン酸（ＡＲＡ）による処置は、ＡＲＡの増大したレベルだけでなく、プロスタグランジンなどのＡＲＡの下流生成物ももたらすことができる。複雑な制御機序は、このような機序を防止、制御または克服して、個体中で特定のＰＵＦＡの所望のレベルを達成するために、様々なＰＵＦＡを組み合わせ、または異なるＰＵＦＡコンジュゲートを追加することを望ましいものにする。
【０１０５】
本開示の文脈で、いくつかの用語を使用する。
【０１０６】
「読み取り枠」はＯＲＦと略記する。
【０１０７】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記する。
【０１０８】
「米国微生物系統保存機関」はＡＴＣＣと略記する。
【０１０９】
「多価不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記する。
【０１１０】
「フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）」という用語は、フザリウム・ベルティシロイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｏｉｄｅｓ）と同義である。
【０１１１】
「食物類似物」は、肉、チーズ、ミルクなどに関わらず、その食物対応物と似ているように製造される食物様製品であり、その対応物の外見、味、および歯ごたえを有することが意図される。したがって「食物」という用語は、ここでの用法では食物類似物もまた包含する。
【０１１２】
「水産養殖飼料」とは、淡水または海水中での水生生物体、動物、および／または植物の繁殖、培養または飼育に関する養殖で使用される飼料を指す。「動物飼料」という用語は、ここでの用法では水産養殖飼料もまた包含する。
【０１１３】
「脂肪酸」という用語は、（より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られているが）約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指す。優勢な鎖長は、Ｃ１６〜Ｃ２２の間である。脂肪酸の構造は単純な表記法システム「Ｘ：Ｙ」によって表され、ここでＸは特定の脂肪酸中のＣ原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。
【０１１４】
概して脂肪酸は、飽和または不飽和として分類される。「飽和脂肪酸」という用語は、炭素主鎖間に「二重結合」を有さない脂肪酸を指す。対照的に「不飽和脂肪酸」は、それらの炭素主鎖に沿って「二重結合」を有する（それらは最も一般的にｃｉｓ−配置である）。「一価不飽和脂肪酸」は、（例えばパルミトレイン酸（１６：１）およびオレイン酸（１８：１）のように通常９および１０番目の炭素原子の間に）炭素主鎖に沿って１個の「二重結合」のみを有し、他方「多価不飽和脂肪酸」（すなわち「ＰＵＦＡ」）は、（例えばリノール酸（１８：２）のように９および１０番目、および１２および１３番目の炭素原子間、およびα−リノレン酸（１８：３）のように９および１０番目、１２および１３番目目、および１５および１６番目の炭素原子間に）炭素主鎖に沿って少なくとも２個の二重結合を有する。
【０１１５】
「ＰＵＦＡ」は、（脂肪酸炭素鎖のメチル末端に最も近い第１の二重結合の位置（ｎ）次第で）２つの主要ファミリーに分類できる。したがって「ω−６脂肪酸」（ω−６またはｎ−６）は、第１の不飽和二重結合を分子のω（メチル）末端から６個めの炭素原子に有し、さらに分子のカルボキシル末端に向かって３個めの追加的な炭素原子にそれぞれの続く不飽和がある、全部で２つ以上の二重結合を有する。対照的に「ω−３脂肪酸」（ω−３またはｎ−３）は、第１の不飽和二重結合を分子のω末端から３個離れた炭素原子に有し、さらに分子のカルボキシル末端に向かって３個目の追加的な炭素原子にそれぞれの続く不飽和がある、全部で３個以上の二重結合を有する。
【０１１６】
本開示の目的のために、ω参照システムを使用して、炭素数、二重結合数、およびω炭素（この目的では１番目とする）から数えたω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。この命名法を下の表２で、「省略表記法」と題された欄に示す。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸の一般名、明細書全体で使用される略語、および各化合物の化学名をまとめる。
【０１１７】
【表３】
2007515951.tif 000005
【０１１８】
具体的にはここではω−３脂肪酸は、括弧中の数字が脂肪酸カルボキシ−末端からの二重結合の位置を示す、以下の脂肪酸一覧からのものとして定義される。α−リノレン酸［ＡＬＡ；１８：３（９,１２,１５）］、ステアリドン酸［ＳＴＡ；１８：４（６,９,１２,１５）］、エイコサテトラエン酸［ＥＴＡ；２０：４（８,１１,１４,１７）］、エイコサペンタエン酸［ＥＰＡ；２０：５（５,８,１１,１４,１７）］、ドコサペンタエン酸［ＤＰＡ；２２：５（７,１０,１３,１６,１９）］、およびドコサヘキサエン酸［ＤＨＡ；２２：６（４,７,１０,１３,１６,１９）］。
【０１１９】
同様にω−６脂肪酸は、括弧中の数字が脂肪酸のカルボキシ−末端からの二重結合の位置を示す、以下の脂肪酸一覧からのものとして定義される。リノール酸［ＬＡ；１８：２（９,１２）］、γ−リノレン酸［ＧＬＡ；１８：３（６,９,１２）］、ジホモ−γ−リノレン酸［ＨＧＬＡまたはＤＧＬＡ；２０：３（８,１１,１４）］、アラキドン酸［ＡＲＡ；２０：４（５,８,１１,１４）］、およびドコサテトラエン酸［ＤＴＡ；２２：４（７,１０,１３,１６）］。
【０１２０】
あらゆる個々の脂肪酸の濃度について適用される「濃度」という用語は、ここでは、サンプル中の全脂肪酸の総量で除した特定の脂肪酸量を意味するために使用される。ω−３脂肪酸濃度は、サンプル中の全脂肪酸の総量で除した（上で定義されるような）全ω−３脂肪酸量として定義される。ω−６脂肪酸濃度は、サンプル中の全脂肪酸の総量で除した（上で定義されるような）全ω−６脂肪酸量として定義される。脂肪酸濃度は、典型的に重量％（ｗｔ．％−脂肪酸総質量で除した個々の脂肪酸質量に１００％をかけたもの）またはモル％（ｍｏｌ％−脂肪酸総モルで除した個々の脂肪酸のモルに１００％をかけたもの）として表わされる。
【０１２１】
「ω−３のω−６脂肪酸に対する比率」または「ω−３対ω−６比」（ｎ−３／ｎ−６）という用語は、ω−６脂肪酸濃度で除したω−３脂肪酸濃度（ω−３重量％／ω−６重量％またはω−３モル％／ω−６モル％）として定義される。
【０１２２】
「必須脂肪酸」と言う用語は、個体が特定の必須脂肪酸を新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成できないことから、生きるために摂取しなくてはならない特定のＰＵＦＡを指す。ヒトはリノール（１８：２、ω−６）およびリノレン（１８：３、ω−３）脂肪酸を合成できず、それらを食餌中で得なくてはならないので、これらは「必須脂肪酸」である。
【０１２３】
「脂肪」と言う用語は、２５℃で固体であり、通常飽和である脂質物質を指す。
【０１２４】
「油」と言う用語は、２５℃で液体であり、通常多価不飽和である脂質物質を指す。ＰＵＦＡは、いくつかの藻類、油性酵母菌、および糸状菌の油中に見られる。「微生物油」または「単細胞油」は、微生物がそれらの寿命中に自然に生成する油である。このような油は長鎖ＰＵＦＡを含有することができる。
【０１２５】
「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と言う用語は、ＰＵＦＡの生合成に関連した以下の酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）のいずれかを指す。Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、および／またはエロンガーゼ。
【０１２６】
「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」と言う用語は、適切な条件下で発現すると、ω−３およびω−６脂肪酸の片方または双方の生成を触媒する酵素をコードする一揃いの遺伝子を指す。典型的にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子は、以下の酵素のいくつかまたは全てをコードする。Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、およびΔ４デサチュラーゼ。代表的な経路は図２に示され、ＤＨＡへの様々な中間体を通じたオレイン酸の変換が提供され、共通の供給源からいかにしてω−３およびω−６脂肪酸の双方が生成できるかを実証する。経路は２つの部分に自然に分けられ、１つの部分はω−３脂肪酸を生じ、別の部分はω−６脂肪酸のみを生じる。ω−３脂肪酸のみを生じる部分はここではω−３脂肪酸生合成経路と称され、他方ω−６脂肪酸のみを生じる部分はここではω−６脂肪酸生合成経路と称される。
【０１２７】
ヒトでは、ω−３脂肪酸が血液トリアシルグリセロールレベルに対して低下効果を示す証拠がある。その他の証拠は、致命的心臓発作を被ることに対する保護的役割を支持する。リノール酸およびα−リノレン酸の双方が、それらの鎖長がより長い代謝産物から誘導されるエイコサノイドの合成のための前駆物質である。合成中にこれらの代謝産物は同一酵素について競合する。α−リノレン酸（ω−３）から誘導されるものは、リノール酸（ω−６）から誘導されるものよりも炎症性および免疫学的効果がより低い傾向がある。α−リノレン酸はまた、ヒト脳および網膜の主成分であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を生じさせる。α−リノレン酸が豊富な供給源は、亜麻仁油、菜種油、ダイズ油などのいくつかの種子油、および特にクルミなどのいくつかのナッツである。体内でα−リノレン酸から作ることができる非常に長い鎖のω−３脂肪酸ＤＨＡおよびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は、魚油および油が豊富な魚肉（缶詰のマグロではない）中で提供される。α−リノレン酸が豊富な亜麻仁油などの亜麻からの油は、ワニスおよび塗料中で使用するための「乾性油」としての産業用途もまた有する。
【０１２８】
「機能的な」と言う用語は、ここでω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の文脈における用法では、経路中の遺伝子のいくつか（または全て）が活性酵素を発現することを意味する。いくつかの脂肪酸生成物はこの経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要とするので、「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」または「機能的なω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」は、上の段落に列挙する全ての遺伝子が必要であることを暗示しないものとする。
【０１２９】
「デサチュラーゼ」と言う用語は、不飽和化できる、すなわち１つもしくはそれ以上の脂肪酸中に二重結合を導入して、関心のある一価または多価の不飽和脂肪酸または前駆物質を生じるポリペプチドを指す。特定の脂肪酸を指すために、本願明細書全体を通じてω参照システムを使用するのにもかかわらず、Δシステムを使用して基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼ活性を示す方が都合よい。ここで特に関心が高いのは、分子のカルボキシル末端から数えて１５および１６番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化し、ＬＡからＡＬＡへの転換を触媒するΔ１５デサチュラーゼである。本開示に関連したその他のデサチュラーゼとしては、オレイン酸からＬＡへの転換を触媒するΔ１２デサチュラーゼ、ＤＧＬＡからＥＴＡ、および／またはＡＲＡからＥＰＡへの転換を触媒するΔ１７デサチュラーゼ、ＬＡからＧＬＡへの、および／またはＡＬＡからＳＴＡへの転換を触媒するΔ６デサチュラーゼ、ＤＧＬＡからＡＲＡへの、および／またはＥＴＡからＥＰＡへの転換を触媒するΔ５デサチュラーゼ、ＤＰＡからＤＨＡへの転換を触媒するΔ４デサチュラーゼ、ＥＤＡからＤＧＬＡへの、および／またはＥＴｒＡからＥＴＡへの転換を触媒するΔ８デサチュラーゼ、およびパルミチン酸からパルミトレイン酸（１６：１）、および／またはステアリン酸からオレイン酸（１８：１）への転換を触媒するΔ９デサチュラーゼが挙げられる。当技術分野で、Δ１５およびΔ１７デサチュラーゼはまた、「ω−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」、および／または「ω−３デサチュラーゼ」と称されることもある。いくつかのデサチュラーゼは、２つ以上の基質に対する活性を有する（例えばＡＲＡおよびＤＧＬＡを含むサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼの基質、ＬＡおよびＧＬＡを含むシノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ω−３デサチュラーゼの基質、およびＬＡ、ＧＬＡおよびＤＧＬＡを含む、ここで述べられるフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼの基質）。
【０１３０】
本発明のΔ１５デサチュラーゼに関して言及される「二機能的な」という用語は、ポリペプチドが、オレイン酸およびリノール酸の双方を酵素基質として使用する能力を有することを意味する。「酵素基質」とは、ポリペプチドが活性部位で基質に結合し、およびそれに触媒的に作用することを意味する。
【０１３１】
「ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼに対する相同性を有するタンパク質」という用語は、ここで配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０として同定され、ここで配列番号５５として同定されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）デサチュラーゼ（参照によってその全体をここに援用する同時係属米国特許出願第１０／８４０３２５号明細書で特徴付けられる）に対する相同性を有するタンパク質を指す。系統学的分析は、これらのタンパク質（すなわち配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０）が、「亜科１」および「亜科２」と称される２つの明確な亜科にクラスター化することを判定した。具体的には亜科１タンパク質（すなわち配列番号２、６、１０、１４、および１８）は、ここで特徴付けられるΔ１５デサチュラーゼをコードするようである。対照的に亜科２タンパク質は、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする（すなわち配列番号４、８、１２、１６、および２０。参照によってその全体をここに援用する同時係属米国仮特許出願６０／５７０６７９明細書を参照されたい）。
【０１３２】
「変換効率」および「％基質変換」と言う用語は、それによって特定の酵素（例えばデサチュラーゼまたはエロンガーゼ）が基質から生成物に変換できる効率を指す。変換効率は以下の式に従って測定される。（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００（式中、「生成物」には即時の生成物およびそれから誘導される経路中の全生成物が含まれる）。本願明細書では、油性酵母宿主などの真核生物で発現する場合に、高い基質転換百分率（（［１８：３］／［１８：２＋１８：３］）＊１００）によって特徴付けられるΔ１５デサチュラーゼを同定することが望ましい。したがって例えば少なくとも約５０％のＡＬＡへの転換効率が有用であり、少なくとも約８０％のＡＬＡへの転換効率が好ましく、少なくとも約９０％のＡＬＡへの転換効率が特に適切であり、少なくとも約９５％のＡＬＡへの転換効率が最も好ましい。
【０１３３】
「エロンガーゼ」と言う用語は、脂肪酸炭素鎖を伸長して、エロンガーゼが作用した脂肪酸基質よりも炭素２個分長い酸を生成できるポリペプチドを指す。この延長プロセスは、ＣｏＡがアシルキャリアである脂肪酸合成酵素と関連した多段階機序で起きる（ラスナー（Ｌａｓｓｎｅｒ）ら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：２８１〜２９２（１９９６））。手短に述べると、マロニル−ＣｏＡが長鎖アシル−ＣｏＡと縮合して、ＣＯ２およびβ−ケトアシル−ＣｏＡ（アシル部分が炭素原子２個分伸長された）を生じる。引き続く反応には、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水、および伸長されたアシル−ＣｏＡを生じる第２の還元が含まれる。エロンガーゼによって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡ、ＳＴＡからＥＴＡ、およびＥＰＡからＤＰＡへの転換である。したがってエロンガーゼは、異なる特異性を有することができる。例えばＣ１６／１８エロンガーゼはＣ１６基質を好み、Ｃ１８／２０エロンガーゼはＣ１８基質を好み、Ｃ２０／２２エロンガーゼはＣ２０基質を好む。同様にΔ９エロンガーゼは、ＬＡおよびＡＬＡからＥＤＡおよびＥＴｒＡへの転換をそれぞれ触媒できる。
【０１３４】
「油性」と言う用語は、それらのエネルギー源を脂質の形態で保存する傾向がある生物体を指す（ウィーテ（Ｗｅｅｔｅ）「真菌脂質生化学（Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第二版、Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０）。これらとしては、油料種子植物（例えばダイズ、コーン、ベニバナ、ヒマワリ、カノーラ、アブラナ、亜麻、トウモロコシ、およびサクラソウ）、および微生物（例えばスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）種、および特定の油性酵母）が挙げられる。
【０１３５】
「油性酵母」という用語は、油を生成できる酵母として分類される微生物を指す。概して油性微生物の細胞油またはトリアシルグリセロール含量はＳ字形曲線に従い、脂質濃度は、対数増殖後期または増殖静止初期において最大に達するまで増大し、次に増殖静止後期および死滅期中に徐々に減少する（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５（１９９１））。油性微生物が、約２５％を超えるそれらの乾燥細胞重量を油として蓄積することは、珍しいことではない。油性酵母菌の例としてはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、決してこれに限定されるものではない。
【０１３６】
「発酵性炭素基質」と言う用語は、微生物が代謝してエネルギーを引き出す炭素源を意味する。本発明の典型的な炭素基質としては、単糖類、少糖類、多糖類、アルカン、脂肪酸、脂肪酸のエステル、モノグリセリド、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、および炭素含有アミンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１３７】
様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸断片のコード領域について言及する場合、「コドン最適化」と言う用語は、ＤＮＡがコードするポリペプチドを改変することなく、宿主生物体の典型的なコドン使用を反映させる、遺伝子中のコドンまたは核酸断片のコード領域の改変を指す。
【０１３８】
ここでの用法では、「単離された核酸断片」は、場合により合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸断片は、１つまたはそれ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの断片を含んでなってもよい。「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、および「核酸断片」／「単離された核酸断片」という用語は、ここで区別なく使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を場合により含有する、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。ヌクレオチド（通常それらの５’一リン酸塩形態で存在する）は、次のような一文字記号によって言及される。アデニレートまたはデオキシアデニレート（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡ）を示す「Ａ」、シチジレートまたはデオキシシチジレートを示す「Ｃ」、グアニレートまたはデオキシグアニレートを示す「Ｇ」、ウリジレートを示す「Ｕ」、デオキシチミジレートを示す「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）を示す「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）を示す「Ｙ」、ＧまたはＴを示す「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴを示す「Ｈ」、イノシンの「Ｉ」、およびあらゆるヌクレオチドを示す「Ｎ」。
【０１３９】
「機能的同等物である細断片」および「機能的同等物細断片」という用語は、ここで区別なく使用される。これらの用語は、その中で断片または細断片が活性酵素をコードするか否かに関わらず、遺伝子発現を変更するまたは特定の表現型を生成する能力が保持される、単離された核酸断片の部分またはサブ配列を指す。例えば断片または細断片をキメラ遺伝子のデザインで使用して、形質転換された植物において所望の表現型を生成できる。それが活性酵素をコードするか否かに関わらず、植物プロモーター配列に対してセンスまたはアンチセンス方向で核酸断片またはその細断片を連結することにより、キメラ遺伝子を抑制において使用するためにデザインできる。
【０１４０】
核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸断片の一本鎖形態がその他の核酸断片とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）の特に第１１章およびその表１１．１で例証される（参照によってその全体をここに援用する）。温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を定める。ストリンジェンシー条件は、（遠縁の生物からの相同的配列などの）中程度に類似の断片をスクリーニングするため、そして（機能的酵素を複製する近縁の生物からの遺伝子などの）高度に類似した断片をスクリーニングするために調節できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件のセットは、室温において６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１５分間に始まり、次に４５℃において２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間を反復し、次に５０℃において０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを３０分間を２回反復する、一連の洗浄を使用する。より好ましいストリンジェントな条件のセットはより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に増大させること以外は上述したのと同一である。別の好ましい高度にストリンジェントな条件のセットは、６５℃において０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の最終洗浄を使用する。さらに別のストリンジェントな条件のセットは、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃でのハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む。
【０１４１】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要求する。核酸がハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、当技術分野で良く知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前述９．５０〜９．５１参照）。より短かい核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのためにはミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前述１１．７〜１１．８参照）。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくともヌクレオチド約１０個である。ハイブリダイズ可能な核酸の好ましい最小の長さは少なくともヌクレオチド約１５個、より好ましくは少なくともヌクレオチド約２０個、そして最も好ましくは長さが少なくともヌクレオチド約３０個である。さらに当業者は、温度および洗浄液の塩濃度が、プローブの長さなどの要因次第で必要に応じて調節できることを認識する。
【０１４２】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性整列化検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化配列比較および同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、概して１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージ・プラークの原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション）において使用しても良い。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとしてＰＣＲで使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定、および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。本願明細書は、特定の真菌タンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者はここで報告される配列の恩恵を被り、当業者に既知の目的のために、今や開示された配列の全てまたはかなりの部分を使用できる。したがって本発明は、添付の配列表で報告される完全な配列、ならびに上で定義される配列のかなりの部分を含んでなる。
【０１４３】
「相補的」と言う用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は添付の配列表で報告されるような完全な配列、ならびに実質的に類似した核酸配列に相補である単離された核酸断片も含む。
【０１４４】
当技術分野で既知の「％同一性」と言う用語は、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。当技術分野において「同一性」は、場合によってはこのような配列ストリング間の整合によって判定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１）「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（レスク（Ｌｅｓｋ），Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ（１９８８）、２）「バイオコンピューティング：情報科学およびゲノム・プロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」（スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ（１９９３）、３）「配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）」、第一部、（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ａ．Ｍ．、およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ、ＮＪ（１９９４）、４）「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」フォン・ハインェ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ），Ｇ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ（１９８７）、５）「配列分析入門（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」（グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ），Ｍ．およびデュヴルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ），Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ、ＮＹ（１９９１）で述べられたものをはじめとするが、これに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算できる。同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるように設計される。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化される。配列整合および同一性百分率の計算は、ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実施しても良い。特に断りのない限り、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメント（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１１５３（１９８９））を使用して、デフォルトのパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で、配列の複数の整合を実施する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用した対整合のデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。
【０１４５】
適切な核酸断片（本発明の単離ポリヌクレオチド）は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約７５％同一、そしてより好ましくは少なくとも約８０％同一のポリペプチドをコードする。好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と約８５％同一のアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列をコードする。最も好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列をコードする。適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【０１４６】
「相同性」、「相同的」、「実質的に類似」、および「実質的に対応する」という用語は、実質的にここで区別なく使用される。これらは、その中において１つ以上のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を仲介するまたは特定の表現型を生成する核酸断片の能力に影響しない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の未変性断片と比べて、得られる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の変更も指す。したがって当業者によって理解されるように、本発明は具体的な例示的配列を超えるものを包含する。
【０１４７】
「オルソログ」または「オルソロガス配列」という用語は、ここでは配列分岐が種分化に続く関係を指す（すなわち異なる種における相同的配列が、種分化中に共通の先祖遺伝子から生じる）。対照的に「パラロガス」という用語は、遺伝子重複によって生じる単一種内の相同的配列を指す。当業者は、相同的、オルソロガス、およびパラロガス配列を同定するのに必要な技術になじみが深い。
【０１４８】
さらに当業者は、本発明によって包含される実質的に類似した核酸配列が、中程度にストリンジェントな条件（例えば０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）下で、ここで例証される配列と、またはここで開示される核酸配列のいずれかの機能的同等物であるここで開示されるヌクレオチド配列のあらゆる部分とハイブリダイズする、それらの能力によってもまた定義されることを認識する。ストリンジェンシー条件を調節して、遠縁の生物体からの相同的配列などの中程度に類似した断片から、近縁の生物体からの機能的な酵素を複製する遺伝子などの高度に類似した断片までをスクリーンすることができる。ハイブリダイズ後洗浄がストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件のセットは、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで室温で１５分に始まり、次に２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで４５℃で３０分を繰り返し、次に０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで５０℃で３０分を２回繰り返す一連の洗浄を伴う。より好ましいストリンジェントな条件のセットはより高い温度の使用を伴い、その中で０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中の最後の２回の３０分の洗浄温度が６０℃に増大されること以外は、洗浄は上と同一である。別の好ましい高度にストリンジェントな条件のセットは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃の２回の最後の洗浄の使用を伴う。
【０１４９】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードの性質を指す。当業者は、特定のアミノ酸を特定化するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドン−バイアス」についてよく知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【０１５０】
ＤＮＡ配列に関連して「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドが、生体外で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）構築されたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は確立した手順を使用して達成されてもよく、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。「合成遺伝子」は、当業者に知られる手順を使用して、化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲーションしアニールして、遺伝子断片を形成し、次にそれを酵素的に構築して所望の遺伝子全体を構成する。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みを理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞から誘導される遺伝子の調査に基づくことができる。
【０１５１】
「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物体ゲノムにおいてその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物体に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物体中に導入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入される遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされる遺伝子である。
【０１５２】
「対立遺伝子」とは、染色体上の特定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代案の形態の１つである。染色体上の特定の遺伝子座に存在する全ての対立遺伝子が、同一である場合、その植物はその遺伝子座で同型接合性である。染色体上の特定遺伝子座に存在する対立遺伝子が異なる場合、その植物はその遺伝子座で異型接合性である。
【０１５３】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでも良い。
【０１５４】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的なＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。概してコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーター配列は近位およびより遠位の上流要素からなり、後者の要素はエンハンサーとして言及されることが多い。したがって「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激できるＤＮＡ配列であり、プロモーターに固有の要素、またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を向上させるために挿入される異種の要素であってもよい。プロモーターは、そっくりそのまま天然遺伝子から誘導されても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなっても良く、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえ良い。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発育段階で、あるいは異なる環境条件に呼応して、遺伝子の発現を導いても良いことが当業者には理解される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に確定されていないので、いくつかのバリエーションがあるＤＮＡ断片が、同一プロモーター活性を有するかもしれないこともさらに認識される。ほとんどの場合にほとんどの細胞タイプ中で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構造プロモーター」と称される。植物細胞で有用な様々なタイプの新しいプロモーターが、絶えず発見されている。多数の例がオカムロ（Ｏｋａｍｕｒｏ），Ｊ．Ｋ．およびゴールドバーグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ），Ｒ．Ｂ．による編纂（１９８９）「植物生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ）」１５：１〜８２にある。
【０１５５】
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に位置するポリヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流である完全にプロセスされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの転写一次産物のプロセッシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響するかもしれない。翻訳リーダー配列の例については、ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ），Ｒ．およびフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ），Ｇ．Ｄ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２２５〜２３６で述べられている。
【０１５６】
「３’非翻訳配列」および「転写ターミネーター」と言う用語は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列およびその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴付けられる。３’領域は、転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響できる。
【０１５７】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼが触媒する転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であるかもしれず、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とはイントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それから誘導される二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１７０，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列にあっても良い。「機能ＲＮＡ」とは、翻訳されないがそれでもなお細胞プロセスに影響するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。
【０１５８】
「作動可能に連結した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターはコード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動可能に連結する（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結できる。別の例では相補的ＲＮＡ領域は標的ｍＲＮＡに５’で、または標的ｍＲＮＡに３’で、または標的ｍＲＮＡ内に直接または間接的に作動的に結合でき、または標的ｍＲＮＡに対して第１の相補的領域は５’であり、その相補体は３’である。
【０１５９】
「発現」という用語は、ここでの用法では、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆物質または成熟）などの機能的な最終生成物の生成を指す。
【０１６０】
「発現カセット」という用語は、ここでの用法では、その中に核酸配列または断片が移動できる、個別の核酸断片を指す。
【０１６１】
「成熟」タンパク質とは翻訳後処理された、すなわちそれから一次翻訳生成物中に存在するあらゆるプレまたはプロペプチドが除去された、ポリペプチドを指す。「前駆物質」タンパク質はｍＲＮＡ翻訳の一次生成物を指し、すなわちプレおよびプロペプチドがなおも存在する。プレおよびプロペプチドは細胞内局在化シグナルであってもよいが、これに限定されるものではない。
【０１６２】
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物体中への核酸断片の転移を指す。核酸断片は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物体のゲノム中に組み込まれてもよい。形質転換核酸断片を含有する宿主生物体は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物体と称される。
【０１６３】
「安定安定な形質転換」とは、遺伝的に安定な遺伝をもたらす、核およびオルガネラゲノムの双方を含む宿主生物体ゲノム中への核酸断片の転移を指す。対照的に「一過性形質転換」は、組み込みまたは安定な遺伝なしに遺伝子発現をもたらす、宿主生物体の核、またはＤＮＡ含有オルガネラ中への核酸断片の転移を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物体は、「トランスジェニック」生物体と称さる。
【０１６４】
「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク発現を抑制できるアンチセンスＲＮＡ転写物の生成を指す。「コサプレッション」とは、同一のまたは実質的に類似の外来性または内在性遺伝子の発現を抑制できるセンスＲＮＡ転写物の生成を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。植物中のコサプレッションコンストラクトは、センス方向において、内在性ｍＲＮＡに対する相同性を有する核酸配列の過剰発現に注目することにより、以前にデザインされており、それは過剰発現される配列に対して相同性を有する全てのＲＮＡの減少をもたらす（ヴォーシェール（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ）ら、（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６：６５１〜６５９、およびグーラ（Ｇｕｒａ）、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：８０４〜８０８参照）。この現象の全体的効率は低く、ＲＮＡ減少の程度は大きく異なる。最近の研究は、発現されるＲＮＡのための潜在的な「ステム−ループ」構造をもたらす、相補的方向で配列をコードするｍＲＮＡの全部または一部を組み込んだ「ヘアピン」構造の使用について述べている（１９９９年１０月２１日に公開されたＰＣＴ公報国際公開第９９／５３０５０号パンフレット、およびより最近では２００２年１月３日に公開され、国際公開第０２／００９０４号パンフレットの国際公報番号を有する出願人の譲受人のＰＣＴ出願）。これは回収されるトランスジェニック植物中のコサプレッションの頻度を増大させる。別のバリエーションは、配列をコードする近位ｍＲＮＡの抑制または「サイレンシング」を制御するための植物ウィルス性配列の使用について述べる（１９９８年８月２０日に公開されたＰＣＴ公報国際公開第９８／３６０８３号パンフレット）。これらのコサプレッション現象のどちらも機構的には解明されていないが、遺伝的証拠がこの複雑な状況を解き明かし始めた（エルマヤン（Ｅｌｍａｙａｎ）ら、（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０：１７４７〜１７５７）。
【０１６５】
抑制のために使用されるポリヌクレオチド配列は、必ずしも抑制する遺伝子中のポリヌクレオチド配列と１００％相補的でなくてよい。例えばαサブユニットをコードする遺伝子の部分から誘導されるポリヌクレオチドを使用して、ダイズ種子貯蔵タンパク質β−コングリシニンの全てのサブユニットの抑制が達成されている（米国特許第６,３６２,３９９号明細書）。β−コングリシニンは、α、α’、およびβとして同定される３つの高度に負に帯電したサブユニットの様々な組み合わせから構成される不均一な糖タンパク質である。αおよびα’サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は互いに８５％同一であるのに対し、βサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、αおよびα’サブユニットと７５〜８０％同一である。したがって抑制の標的であるポリヌクレオチドの領域と少なくとも７５％同一であるポリヌクレオチドは、所望の標的を抑制するのに効果的であることが示されている。ポリヌクレオチドは、少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるべきで、またはポリヌクレオチドは所望の標的と１００％同一であってもよい。
【０１６６】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に連結または組換えられ、それは選択された遺伝子産物のために、例えば適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。
【０１６７】
「形質転換カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。
【０１６８】
「組換え」という用語は、例えば化学合成による、または遺伝的工学技術による核酸の単離されたセグメントの操作による、２つのさもなければ分離した配列のセグメントの人工的組み合わせを指す。
【０１６９】
「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡコンストラクト」という用語は、ここで区別なく使用される。組換えコンストラクトは、例えば自然には一緒に存在しない制御およびコード配列などの核酸断片の人工的組み合わせを含んでなる。例えばキメラコンストラクトは、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、または同一源から誘導されるが自然に存在するのとは異なる様式で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。このようなコンストラクトはそれ自体で使用してもよく、またはベクターとの組み合わせで使用してもよい。ベクターが使用される場合、当業者によく知られているように、ベクターの選択は、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に左右される。例えばプラスミドベクターが使用できる。当業者は、本発明の単離された核酸断片のいずれかを含んでなる宿主細胞を成功裏に形質転換して選択し増殖させるために、ベクター上に存在すべき遺伝的要素を十分承知している。当業者はまた、異なる独立した形質転換イベントが、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１〜２４１８；デアルメイダ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ）ら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８〜８６）、したがって所望の発現レベルおよびパターンを示すラインを得るために、複数イベントをスクリーンしなくてはならないことも認識する。このようなスクリーニングは、例えばＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現の免疫ブロット法分析、または表現型分析によって達成されてもよい。
【０１７０】
「相同遺伝子組換え」と言う用語は、（交差中における）２つのＤＮＡ分子間のＤＮＡ断片の交換を指す。交換される断片は、２個のＤＮＡ分子間で同一のヌクレオチド配列部位（すなわち「相同性領域」）に挟まれる。「相同性領域」と言う用語は、相同遺伝子組換えに関与する、核酸断片上の互いに相同性を有するひと続きのヌクレオチド配列を指す。効果的な相同遺伝子組換えは、長さが少なくとも約１０ｂｐである相同性領域で起き、少なくとも約５０ｂｐの長さが好ましい。典型的に遺伝子組換えが意図される断片は、標的を定めた遺伝子中断または置換が所望される領域に少なくとも２つの相同性領域を含む。
【０１７１】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、一連の反復サイクル（米国コネチカット州ノーウォークのパーキン・エルマー・シータスＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ））からなる、大量の特定ＤＮＡセグメント合成のための技術である。典型的に二本鎖ＤＮＡは加熱変性され、標的セグメントの３’境界に相補である２つのプライマーは低温でアニールされ、次に中温で延長される。これらの３つの連続したステップの１組がサイクルと称される。
【０１７２】
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）ウィスコンシン州マディソンのジェネティック・コンピュータ・グループからのＧＣＧパッケージプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０））、および３．）ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、４．）ミシガン州アンアーバーのジーンコーズ社（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）、および５．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）著、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、１９９２年会議、１１１〜２０編集者：スハイ，サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに元からロードされる、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。
【０１７３】
ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）（以下マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７）で述べられている。
【０１７４】
脂肪酸の微生物生合成
一般に油性微生物中の脂質の蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素の窒素に対する率に応答してトリガーされる（図１）。細胞が利用できる窒素供給を消耗した場合（例えば炭素の窒素に対する比率が約４０を超える場合）、細胞アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の枯渇は、ミトコンドリア中のＡＭＰ−依存イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性の休止、およびクエン酸の蓄積、クエン酸の細胞質ゾル内への輸送、そして引き続くＡＴＰクエン酸リアーゼによるクエン酸の切断をもたらして、アセチル−ＣｏＡが生成する。アセチル−ＣｏＡは、脂肪酸の新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）生合成の主要構成ブロックである。効果的に代謝されてアセチル−ＣｏＡを生成できるあらゆる化合物が脂肪酸前駆物質の役割を果たせるが、このタイプの反応ではグルコースが炭素の主な供給源である（図１）。グルコースは解糖を通じてピルビン酸に変換され、次にピルビン酸はミトコンドリア中に輸送され、そこでピルビン酸デヒドロゲナーゼ（「ＰＤ」）によってアセチル−ＣｏＡに変換される。アセチル−ＣｏＡはミトコンドリア膜を越えて細胞質中に直接輸送できないので、アセチル−ＣｏＡからの２個の炭素がオキサロ酢酸と縮合して、クエン酸を生成する（クエン酸合成酵素によって触媒される）。クエン酸は細胞質内に直接輸送されて、そこでＡＴＰ−クエン酸リアーゼによって切断され、アセチル−ＣｏＡおよびオキサロ酢酸が再生する。オキサロ酢酸は、リンゴ酸への転換を通じてトリカルボン酸サイクルに再び入る。
【０１７５】
マロニル−ＣｏＡの合成は、細胞質内で起きる脂肪酸生合成の第１の前駆ステップである。マロニル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（「ＡＣＣ」）によって、アセチル−ＣｏＡのカルボキシル化を通じて生成される。脂肪酸合成は、多酵素脂肪酸合成酵素複合体（「ＦＡＳ」）によって触媒され、８個の二炭素断片（アセチル−ＣｏＡからのアセチル基）の縮合によって起き、炭素１６個の飽和脂肪酸であるパルミチン酸が形成する。より具体的には、ＦＡＳは以下が関与する一連の７つの反応を触媒する（スミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｓ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、８（１５）：１２４８〜５９（１９９４））。
１．アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡが、ＦＡＳのアシルキャリアタンパク（ＡＣＰ）に転移される。次にアセチル基がマロニル基に転移されて、β−ケトブチリル−ＡＣＰが形成し、ＣＯ２を放出する。
２．β−ケトブチリル−ＡＣＰが還元（β−ケトアシル還元酵素による）および脱水（β−ヒドロキシアシルデヒドラターゼによる）を被り、ｔｒａｎｓ−一価不飽和脂肪アシル基が形成する。
３．二重結合がＮＡＤＰＨによって還元され、最初のものよりも炭素が２個分長い飽和脂肪−アシル基が生じる。次に新しいマロニル基と縮合して、延長プロセスを繰り返すブチリル基の能力が再生する。
４．脂肪アシル基が炭素１６個の長さになったら、チオエステラーゼ活性がそれを加水分解して遊離パルミチン酸を放出する。
【０１７６】
パルミチン酸（１６：０）は、小胞体膜に存在するエロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じた、より鎖長が長い飽和および不飽和脂肪酸（例えばステアリン酸（１８：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、およびオレイン酸（１８：１））の前駆物質である。パルミチン酸およびステアリン酸は（ＣｏＡ、および／またはＡＣＰエステルとして）、Δ９デサチュラーゼの作用によってそれらの不飽和誘導体であるパルミトレイン酸（１６：１）およびオレイン酸（１８：１）酸にそれぞれ変換される。
【０１７７】
トリアシルグリセロール（脂肪酸の主な貯蔵単位）は、リン酸１,２−ジアシルグリセロール（一般にホスファチジン酸として同定される）を生じる、アシル−ＣｏＡの２個の分子からグリセロール−３−リン酸へのエステル化によって形成される（図１）。次にホスファチジン酸ホスファターゼによってリン酸が除去され、１,２−ジアシルグリセロールが生成する。例えば第３の脂肪酸を添加すると、ジアシルグリセロール−アシルトランスフェラーゼの作用によってトリアシルグリセロールが形成する。
【０１７８】
ω脂肪酸の生合成
非常に単純化すると、ＬＡをＧＬＡ、ＤＧＬＡ、およびＡＲＡ（ω−６経路）に、ＡＬＡをＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡ（ω−３経路）に変換する代謝プロセスは、２−炭素単位の付加を通じた炭素鎖の延長と、二重結合の添加を通じた分子の不飽和化を伴う（図２）。これは小胞体膜に存在する一連の特別な不飽和化および延長酵素を必要とする。
【０１７９】
ω−６脂肪酸
オレイン酸は、Δ１２デサチュラーゼの作用によって、最初のω−６脂肪酸であるＬＡ（１８：２）に変換される。引き続くω−６脂肪酸は、次のようにして生成される。１．）ＬＡがΔ６デサチュラーゼの作用によってＧＬＡに変換され、２．）ＧＬＡがエロンガーゼの作用によってＤＧＬＡに変換され、３．）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼの作用によってＡＲＡに変換される。
【０１８０】
ω−３脂肪酸
リノール酸（ＬＡ）は、Δ１５−デサチュラーゼの作用によって、最初のω−３脂肪酸であるＡＬＡに変換される。引き続くω−３脂肪酸は、ω−６脂肪酸と類似した一連のステップで生成される。具体的には、１．）ＡＬＡがΔ６デサチュラーゼ活性によってＳＴＡに変換され、２．）ＳＴＡがエロンガーゼ活性によってＥＴＡに変換され、３．）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼ活性によってＥＰＡに変換される。代案としては、ＥＴＡおよびＥＰＡは、Δ１７デサチュラーゼ活性によって、ＤＧＬＡおよびＡＲＡからそれぞれ生成できる。ＥＰＡは、エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ活性によって、ＤＨＡにさらに変換できる。
【０１８１】
代案の実施態様では、Δ９エロンガーゼは、ＬＡおよびＡＬＡのＥＤＡおよびＥｔｒＡへの転換をそれぞれ触媒できる。次にΔ８デサチュラーゼはこれらの生成物をそれぞれＤＧＬＡおよびＥＴＡに転換する。
【０１８２】
ω脂肪酸生成に関与する遺伝子
藻類、細菌、カビおよび酵母菌をはじめとする多くの微生物は、通常の細胞代謝経路内でＰＵＦＡおよびω脂肪酸を合成できる。特によく適するのは、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の種であるシゾキトリウム・アグレガトム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｍ）、およびモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｅｒｉｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）をはじめとする真菌である。さらに多くの渦鞭毛藻類（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａａｅ）は、高濃度のＰＵＦＡを自然に生成する。このようにして油生成に関与する多様な遺伝子が遺伝的手段を通じて同定されており、これらのいくつかの遺伝子のＤＮＡ配列は公的に入手できる（制限を意図しない例を下の表３に示す）。
【０１８３】
【表４】
2007515951.tif 000006
【０１８４】
【表５】
2007515951.tif 000007
【０１８５】
さらに特許文献は、油生成に関与する多くの追加的な遺伝子のＤＮＡ配列（および／または上の遺伝子のいくつかに関する詳細およびそれらの単離方法）を提供する。例えば米国特許第５,９６８,８０９号明細書（Δ６デサチュラーゼ）、米国特許第５,９７２,６６４号明細書および米国特許第６,０７５,１８３号明細書（Δ５デサチュラーゼ）、国際公開第９１／１３９７２号パンフレットおよび米国特許第５,０５７,４１９号明細書（Δ９デサチュラーゼ）、米国出願公開公報第２００３／０１９６２１７  Ａ１号（Δ１７デサチュラーゼ）、国際公開第０２／０９０４９３号パンフレット（Δ４デサチュラーゼ）、国際公開第９４／１１５１６号パンフレット、米国特許第５,４４３,９７４号明細書、および米国特許出願第１０／８４０３２５号明細書（Δ１２デサチュラーゼ）、および国際公開第００／１２７２０号パンフレット、および米国出願公開公報第２００２／０１３９９７４  Ａ１号（エロンガーゼ）を参照されたい。これらの各特許および出願は、参照によってその全体をここに援用したものとする。
【０１８６】
ここで特に関心が高いのは、Δ１５デサチュラーゼ、より具体的には油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中での非相同発現に適したΔ１５デサチュラーゼである。Δ１５デサチュラーゼをコードする遺伝子は当技術分野で知られている。例えばそれらは、以前に植物（例えばアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（国際公開第９３／１１２４５号パンフレット））、シアノ細菌、およびＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）からクローンされている。さらにここで述べられる出願人の本発明に従って、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ボトリチス・シネリア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）からの真菌Δ１５デサチュラーゼが国際公開第０３／０９９２１６号パンフレット（２００３年１２月４日に公開）で開示されている。
【０１８７】
ＰＵＦＡ生成のために宿主細胞中で発現させるΔ１５デサチュラーゼ活性を有する特異的ポリペプチドの選択（場合によりその他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼとの組み合わせで）には、多くの要素が影響する。宿主細胞、基質の入手可能性、および所望の最終生成物次第で、いくつかのポリペプチドが関心対象である。しかしデサチュラーゼ活性を有する特定のポリペプチドを選択する上での考察には、ポリペプチドの基質特異性、ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、ポリペプチドが必要とする所望のＰＵＦＡ、および／または補助要素の合成のためにデサチュラーゼが必須であるかどうかが含まれる。発現するポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中でのその位置の生化学的環境と適合性のパラメータを有する。例えばポリペプチドは、宿主細胞内で基質獲得のためにその他の酵素と競争しなくてはならないかもしれない。したがってポリペプチドのＫＭおよび特異的活性分析は、特定の宿主細胞内でＰＵＦＡ生成を修正するために、特定のポリペプチドの適性を判定する上で考慮される。特定の宿主細胞で使用されるポリペプチドは、意図される宿主細胞中に存在する生化学的条件下で機能できるものであるが、その他の点では所望の脂肪酸（すなわちＬＡ）を修正できる、Δ１５デサチュラーゼ活性を有するあらゆるポリペプチドであることができる。したがって配列は、例えば天然供給源（細菌、藻類、真菌、植物、動物など）から単離され、半合成経路によって生成され、または新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成される、あらゆる供給源に由来してもよい。
【０１８８】
しかしここで本発明の目的のためには、所望の真核生物宿主細胞中で発現する際に、Δ１５デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドが少なくとも約５０％の転換効率（すなわち（［１８：３］／［１８：２＋１８：３］）＊１００）を有することが有用であり、少なくとも約８０％の転換効率がより望ましく、少なくとも約９０％の転換効率が特に適切であり、少なくとも約９５％の転換効率が最も好ましい。
【０１８９】
新しい真菌Δ１５デサチュラーゼの同定
糸状菌類マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、フザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）、およびフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）をはじめとするいくつかの真菌が１８：３を生成することが知られている（国際公開第０３／０９９２１６号パンフレット、国際公開第０３／０９９２１６号パンフレット）。ここで開示される教示および発見に鑑みて、これらの各真菌は、Δ１５デサチュラーゼ酵素活性を有することが予想される。これらの配列は、特に油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中での遺伝子発現のためのものである。
【０１９０】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼタンパク質配列（配列番号５５）をクエリー配列として使用し、配列比較によってフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）からの新しいΔ１５デサチュラーゼが同定された。具体的には、このヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）クエリー配列を使用して、デラウェア州ウィルミントンのＥ．Ｉ．デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー（Ｅ．Ｉ．  ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）からのフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）株Ｍ−８１１４の専売特許デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）発現配列タグ（ＥＳＴ）ライブラリーの推定上のコードされるタンパク質配列を検索した。これはそれぞれ配列番号１および３のヌクレオチド配列によってコードされる２つの相同的配列、Ｆｍ１（配列番号２）およびＦｍ２（配列番号４）の同定をもたらした。
【０１９１】
いくつかの糸状菌類公開データベースに対するクエリーとして、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼ配列もまた使用した。具体的にはアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）（配列番号６および８）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）（配列番号１０および１２）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（配列番号１４および１６）、およびフザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）（配列番号１８および２０）中において相同的タンパク質配列が同定された。ＣｌｕｓｔａｌＷ法（緩慢、正確、Ｇｏｎｎｅｔオプション；トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０（１９９４））を使用した、これらの配列（すなわち配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０）の比較に基づいた引き続く系統学的および相同性分析からは、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼとの相同性を有する２つの明確なタンパク質「亜科」が明らかにされた。具体的には「亜科１」の全てのタンパク質（配列番号２、６、１０、１４、および１８）は互いに少なくとも４６．２％同一であり、「亜科２」のタンパク質（配列番号４、８、１２、１６、および２０）に対しては３９．６％未満同一であった（図４および５、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメント（前出））。亜科２のタンパク質は互いに少なくとも５６．３％同一であった。
【０１９２】
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）が１８：２のみを合成できる（しかし１８：３は合成できない）のに対して、上述の各糸状菌類は１８：２およびＡＬＡの双方を生成でき、そしてヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）が単一のΔ１２デサチュラーゼを有するのに対して、各糸状菌類はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼの２つの相同体を有するので、出願人はこれらの生物体中のデサチュラーゼの１つの亜科がΔ１２デサチュラーゼに相当し、もう１つがΔ１５デサチュラーゼに相当すると仮定した。発現分析を使用して、２つの各亜科中で代表的なタンパク質の活性を測定し、この仮説を試験した。具体的にはＦｍ２がヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で発現され、Δ１２デサチュラーゼをコードすることが分かったのに対し（同時係属米国仮特許出願第６０／５７０６７９号明細書参照）、Ｆｍ１およびＭｇ１はここで述べられるようにＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で発現され、Δ１５デサチュラーゼ（さらにいくらかのΔ１２デサチュラーゼ活性有する）として特徴付けられた。
【０１９３】
期待値１０、マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、および低複雑性フィルター（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２（１９９７））のパラメータで、Ｂｌａｓｔｐ２．２．５整合プログラムを使用して、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列（すなわちそれぞれ配列番号１および２）を公開データベース配列と比較した。このようにしてフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼヌクレオチド配列は、ジェンバンク登録番号ＸＭ＿３８８０６６．１（長さ５７３ｂｐにわたり８６％同一）として提供されるジベレラ・ゼア（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）ＰＨ−１配列と最も類似している。ジェンバンク登録番号ＸＭ＿３８８０６６．１は、ジェンバンク登録番号ＸＰ＿３８８０６６．１およびここでの配列番号１７（すなわちフザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）Δ１５デサチュラーゼＯＲＦ）のジベレラ・ゼア（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）ＰＨ−１タンパク質に対応する。直接比較からは、Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）およびＦ．グラミネアリウム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）Δ１５デサチュラーゼＯＲＦが、長さ１２１１ｂｐにわたり８７．４％同一であることが明らかにされる。
【０１９４】
フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ推定アミノ酸配列と公開データベースの比較からは、％同一性に基づいて最も近縁の配列が、ジェンバンク登録番号ＸＭ＿３８８０６６．１（１９３のアミノ酸長にわたり８９％）であることが明らかにされる。これは全長４０３のアミノ酸にわたり８８．８％同一である、完全長フザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）Δ１５デサチュラーゼをコードする、ここでの配列番号１８に対応する部分的アミノ酸配列である。
【０１９５】
より好ましいアミノ酸断片は、ここでの配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一である配列が特に適切であり、約９５％同一である配列が最も好ましい。同様に本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好ましいΔ１５デサチュラーゼは、活性タンパク質をコードするものであり、それはここで報告するＦ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼをコードする核酸配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一である配列が特に適切であり、約９５％同一である配列が最も好ましい。本発明を実施するのに有用な％同一性としては、４５．４％、４６．２％、４７％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が挙げられるが、これに限定されるものではない。４６％および１００％の間のあらゆる整数百分率が、有用と考えられる。
【０１９６】
相同体の同定および単離
本発明のΔ１５デサチュラーゼ核酸断片を使用して、同一またはその他の細菌、藻類、真菌または植物種から、相同的タンパク質をコードする遺伝子を同定および単離してもよい。
【０１９７】
同定技術
例えば当業者による配列手動評価、またはＢＬＡＳＴ（基本的局在性整合検索ツール；アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３））およびＣｌｕｓｔａｌＷ（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム）などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化配列比較および同定のいずれかによって、ここで述べられるフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼのアミノ酸またはヌクレオチド配列のかなりの部分を使用して、近縁ポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定できる。上述のようにヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ（配列番号５５）を使用することで、分析すると２つの明確なタンパク質の亜科（すなわち亜科１および亜科２）としてクラスター化する一揃いの真菌デサチュラーゼの同定が可能になった。亜科１は、上述のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ、ならびにそのコードＤＮＡ配列が以下に見られるタンパク質を含んでなる。
・マサチューセッツ州ケンブリッジのゲノム研究センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＧＲ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）の後援を受けている、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ゲノム・プロジェクト中のコンティグ１．１２２（骨格９）（配列番号６）、
・ＣＧＲおよび国際イネＢｌａｓｔゲノム・コンソーシアム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｉｃｅ  Ｂｌａｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）の後援を受けている、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）ゲノム・プロジェクト中のコンティグ２．１５９７中の遺伝子座ＭＧ０８４７４．１（配列番号１０）、
・ジェンバンク登録番号ＡＡＢＸ０１０００５７７（ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ））（配列番号１４）、および
・ＣＧＲおよび国際ジベレラ・ゼア・ゲノミックス・コンソーシアム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＩＧＧＲ）の後援を受けている、フザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）ゲノム・プロジェクト中のコンティグ１．３２０；ＢＡＡ３３７７２．１（配列番号１８）。
【０１９８】
上の各タンパク質は、Δ１５デサチュラーゼをコードすると仮定された。国際公開第０３／０９９２１６号パンフレットでは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）についてこの仮説が確認され、ここではマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）について確認された。
【０１９９】
Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメント（前出）（図５）によれば、上のタンパク質の分析から、これらのタンパク質がフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ（配列番号２）に対して少なくとも４６．２％の配列同一性を有することが明らかになった。さらに本発明における亜科１のΔ１５デサチュラーゼを他の既知のΔ１５デサチュラーゼタンパク質とも比較したが、ここにおける亜科１のΔ１５デサチュラーゼは、いかなる既知のΔ１５デサチュラーゼよりも亜科２のタンパク質にさらに相同的（３９．６％同一）である。当業者は類似の方法を使用して、亜科１（Δ１５デサチュラーゼとして同定された）内でクラスター化するその他のオルソロガスタンパク質を同定できる。
【０２００】
代案としては、相同体同定のためのハイブリダイゼーション試薬として、本デサチュラーゼ配列（すなわち配列番号１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８）のいずれかを用いても良い。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、関心のある遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。本発明のプローブは典型的に、検出する核酸配列に相補である一本鎖核酸配列である。プローブは、検出する核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。本発明のプローブの長さは、５個の塩基から数万個の塩基の間で変動しても良く、実施する特定の試験に左右される。典型的に、約１５個の塩基から約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出する核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列との相補性は完璧でなくても良い。ハイブリダイゼーションは不完全に相補である分子間でも生じ、その結果、ハイブリダイズした領域内の特定の塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
【０２０１】
ハイブリダイゼーション法は良く定義されている。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触しなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を添加しても良い。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化させる。さらにカオトロピック剤は、室温において短いオリゴヌクレオチドプローブの高感応性でストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（ヴァン・ネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３〜５１５１（１９９１））。適切なカオトロピック剤としては、特に塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、リチウムテトラクロロ酢酸、過塩素酸ナトリウム、ルビジウムテトラクロロ酢酸、ヨウ化カリウム、およびセシウムトリフルオロ酢酸が挙げられる。典型的にカオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望ならば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）で添加できる。
【０２０２】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的にそれらは約２０〜６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶剤からなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウムと、（例えばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの）約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液と、（例えばドデシル硫酸ナトリウムなどの）約０．０５〜０．２％の洗剤、または０．５〜２０ｍＭＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）Ｉｎｃ．）（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識の担体核酸、（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母菌ＲＮＡなどの）破片核酸ＤＮＡ、および場合により約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌのグリシンも含まれる。様々な（例えばポリエチレングリコールなどの）極性水溶性または水性膨張剤、（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどの）陰イオンポリマー、（例えばデキストラン硫酸などの）陰イオン糖類ポリマーをはじめとする容積排除剤などのその他の添加剤を含めても良い。
【０２０３】
核酸ハイブリダイゼーションは多様なアッセイ型式に適合できる。最も適切なもの１つは、サンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合できる。サンドイッチ−タイプアッセイの主要構成要素は固形担体である。固形担体はそれに吸着され、あるいはそれと共有結合的に結合する、未標識で配列の一部分と相補である固定核酸プローブを有する。
【０２０４】
単離方法
本発明のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ核酸断片（またはここで同定されたΔ１５デサチュラーゼのいずれか［配列番号５、６、９、１０、１３、１４、１７、および１８］）を使用して、同一またはその他の細菌、藻類、真菌または植物種から相同的タンパクをコードする遺伝子を分離しても良い。配列−依存性プロトコルを使用した相同的遺伝子の分離は、当技術分野で周知である。配列依存性プロトコルの例としては１．）核酸ハイブリダイゼーション法、２．）様々な核酸増幅技術の使用で例証されるように、ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法［例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らの米国特許第４，６８３，２０２号明細書、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（タボール（Ｔａｂｏｒ），Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、１０７４（１９８５））、または連鎖置換増幅（ＳＤＡ）（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、３９２（１９９２））］、および３．）ライブラリー構築および相補性によるスクリーニング法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２０５】
例えばここで述べられるデサチュラーゼに類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者によく知られている方法を使用して、本核酸断片の全てまたは一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用して、あらゆる所望の酵母菌または真菌からライブラリーをスクリーニングして直接単離できる（そこではＡＬＡ［またはＡＬＡ誘導体］を生成する酵母または真菌が好ましい）。本核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野で既知の方法によって、デザインおよび合成できる（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）前述）。さらに当業者に既知の方法（例えばランダムプライマーＤＮＡ標識、ニック翻訳または末端標識技術）によって、配列全体を直接使用してＤＮＡプローブを合成でき、または利用できる生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転写システムを使用してＲＮＡプローブを合成できる。さらに特定のプライマーをデザインして使用し、本配列の一部（または全長）を増幅できる。得られる増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、適切なストリンジェンシーの条件下でプローブとして使用し、完全長ＤＮＡ断片を単離できる。
【０２０６】
典型的にＰＣＲ−タイプ増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインすべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は当技術分野で一般的であり、よく知られている（「ヒトにおける遺伝病：実際的アプローチ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｋ．Ｅ．デービス（Ｄａｖｉｓ）編より、テリン（Ｔｈｅｉｎ）およびウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）著「遺伝的障害診断における特異的ハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用（Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」、（１９８６）ｐ３３〜５０、ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ。「分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）Ｂ．Ａ．編より、ライクリック（Ｒｙｃｈｌｉｋ）Ｗ．著「ＰＣＲプロトコル：最近の方法と応用（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（１９９３）第１５巻、ｐ３１〜３９、Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）。
【０２０７】
概してポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおいて、本配列の２本の短い断片を使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅しても良い。またポリメラーゼ連鎖反応はクローンされた核酸断片のライブラリーにおいて実施しても良く、そこでは１つのプライマーの配列が本核酸断片から誘導され、もう一つのプライマーの配列は、微生物細胞をコードするｍＲＮＡ前駆物質の３’末端のポリアデニル酸トラクトの存在を利用する。
【０２０８】
代案としては、第２のプライマー配列は、クローニングベクターから誘導される配列に基づいても良い。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：８９９８（１９８８））に従って、ＰＣＲを使用して、転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅し、ｃＤＮＡを作り出すことができる。３’および５’方向に向けたプライマーは、本配列からデザインできる。メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））から商業的に入手できる３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム系を使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：５６７３（１９８９）；ロー（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７（１９８９））。
【０２０９】
本ヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列が利用できれば、ＤＮＡ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングが容易になる。本アミノ酸配列の部分をなす合成ペプチドは合成してもよい。これらのペプチドを使用して、アミノ酸配列を含んでなるペプチドまたはタンパク質に対して特異性があるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成するように、動物を免疫できる。次にこれらの抗体を使用してＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし、関心のある完全長ＤＮＡクローンを単離できる（レーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）Ｒ．Ａ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１（１９８４）、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）前述）。
【０２１０】
改善された異種発現のための遺伝子最適化
多様な技術を使用して、代案の宿主において関心のある特定のΔ１５デサチュラーゼの発現を改善できる。このような２つの技術としては、コドン最適化および遺伝子の変異誘発が挙げられる。
【０２１１】
コドン最適化
いくつかの実施態様では、例えばΔ１５デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするコドンの部分を修正して、代案の宿主（すなわち油性酵母菌）におけるこれらのポリペプチドをコードする遺伝子の発現を向上させることが望ましいかもしれない
【０２１２】
一般に宿主が好むコドンは、タンパク質（好ましくは最も大量に発現するタンパク質）中でのコドン使用を調べ、いずれのコドンが最高頻度で使用されるか判定することで、関心のある特定の宿主種内で判定できる。次に宿主種で好まれるコドンを使用して、デサチュラーゼ活性を有する関心のあるポリペプチドのコード配列を全部または部分的に合成できる。ＤＮＡの全部（または部分）はまた、転写ｍＲＮＡ中に存在するあらゆる不安定化配列または二次構造領域を除去するように合成できる。ＤＮＡの全部（または部分）はまた、塩基組成を所望の宿主細胞中でより好まれるものに変更するように合成できる。
【０２１３】
本発明の好ましい実施態様では、例えばフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）およびフザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）からのΔ１５デサチュラーゼが、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの異種油性酵母宿主中でのそれらの発現に先だって、コドン最適化できる。
【０２１４】
変異誘発
配列を合成し、配列を一緒にまとめる方法は、文献においてよく確立されている。例えば生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での変異誘発および選択、部位特異的変異誘発、誤りがちなＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７（４）：１０５６〜１０６２（１９９９年２月１５日））、「遺伝子シャフリング」（米国特許第５,６０５,７９３号明細書、米国特許第５,８１１,２３８号明細書、米国特許第５,８３０,７２１号明細書、および米国特許第５,８３７,４５８号明細書）またはその他の手段を用いて、本明細書に記載のΔ１５デサチュラーゼなどの天然デサチュラーゼ遺伝子の変異を得ることができる。これによって生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でデサチュラーゼ活性を有し、宿主細胞中で機能するためのより望ましい物理的および動力学的パラメータ（例えば所望ＰＵＦＡのより長い半減期またはより高い生成率）があるポリペプチドの生成が可能になる。
【０２１５】
所望ならば、酵素活性に重要なデサチュラーゼポリペプチドの領域は、ルーチンの変異誘発、得られる変異体ポリペプチドの発現、およびそれらの活性の算出を通じて判定できる。変異体は、欠失、挿入、および点変異、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。典型的な機能分析は、欠失変異誘発に始まって機能に必要なタンパク質のＮ−およびＣ−末端限界を判定し、次に内部欠損、挿入または点変異体を作り出し、機能に必要な領域をさらに判定する。カセット変異誘発または完全合成などのその他の技術もまた使用できる。欠失変異誘発は例えば、エキソヌクレアーゼを使用して、５’または３’コード領域を逐次除去して達成される。このような技術のためのキットが入手できる。欠失後、開始または停止コドンを含有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ５’または３’欠失後に、欠失コード領域にライゲーションして、コード領域が完成する。代案としては、部位特異的変異誘発、変異原性ＰＣＲをはじめとする多様な方法によって、または既存の制限部位において消化されたＤＮＡ上へのライゲーションによって、開始または停止コドンをコードするオリゴヌクレオチドをコード領域に挿入する。内部欠損は、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲを通じた変異原性プライマーの使用によって、ＤＮＡ中の既存の制限部位の使用をはじめとする多様な方法を通じて同様に作り出せる。挿入は、リンカー−スキャニング変異誘発、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲなどの方法を通じて作り出される。点変異は、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲなどの技術を通じて作り出される。
【０２１６】
化学変異誘発もまた、活性に重要なデサチュラーゼポリペプチドの領域を同定するために使用できる。変異したコンストラクトが発現し、得られる改変タンパク質がデサチュラーゼとして機能する能力がアッセイされる。このような構造−機能分析は、どの領域が欠失してもよいか、どの領域が挿入を許容するか、どの点変異によって変異体タンパク質が、天然デサチュラーゼと実質的に同じように機能できるようにするかを判定できる。ここで述べるデサチュラーゼ遺伝子から誘導されるこのような全ての変異体タンパク質、およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。
【０２１７】
したがって本発明は、添付の配列表で報告されるようなΔ１５デサチュラーゼ遺伝子の完全な配列、これらの完全な配列の相補体、これらの配列のかなりの部分、それから誘導されるコドン最適化されたデサチュラーゼ、およびそれらと実質的に相同的な配列を含んでなる。
【０２１８】
ω−３、および／またはω−６脂肪酸の微生物による生成
微生物によるω−３、および／またはω−６脂肪酸の生成は、魚または植物などの天然供給源からの精製に比べて、例えば以下のようないくつかの利点を有することができる。
１．）多くの微生物は、油組成が高等生物のものと比べてはるかに単純であることが知られており、所望の構成要素の精製を容易にする。
２．）微生物による生成には、天候および食物供給などの外部変数によって引き起こされるばらつきがない。
３．）微生物的に生成された油は、実質的に環境汚染物質による混入物フリーである。
４．）微生物は特定用途を有するかもしれない特定形態のＰＵＦＡを提供できる。
５．）微生物による油生成は、培養条件を制御することで、特に微生物的に発現される酵素のために特定の基質を提供することで、または化合物の添加または遺伝子工学アプローチによって望まれない生化学的経路を抑制することで操作できる。
【０２１９】
これらの利点に加えて、組換え微生物からのω−３、および／またはω−６脂肪酸の生成は、宿主中に新しい生合成経路を提供することによって、または所望されない経路を抑制することによって、所望のＰＵＦＡ（またはその抱合形態）レベルを増大させ、所望されないＰＵＦＡレベルを低下させることで、自然発生的微生物の脂肪酸プロフィールを変更する能力を提供する（参照によってその全体をここに援用する同時係属米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書参照）。
【０２２０】
様々なω−３、および／またはω−６脂肪酸の生成方法
適切なプロモーターの制御下における、ここで述べられるΔ１５デサチュラーゼをコードするキメラ遺伝子の導入は、形質転換された宿主生物体においてＡＬＡの増大する生成をもたらすことが予想される。このようにして本発明は、基質が所望の脂肪酸生成物（すなわちＡＬＡ）に転換されるように、ここで述べられる脂肪酸基質（すなわちＬＡ）をＰＵＦＡ酵素（例えばフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ）に曝す工程を含んでなる、ＰＵＦＡの直接的生成方法を包含する。より具体的には、微生物（例えば油性酵母）におけるＡＬＡの製造方法を提供することが本発明の目的であり、そこでは微生物に
（ａ）配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較して、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて、少なくとも４６．２％の同一性を有するΔ１５デサチュラーゼ活性を有する真菌タンパク質をコードする単離された核酸断片、および
（ｂ）ＬＡからなるデサチュラーゼ基質源
が提供され、キメラのデサチュラーゼ遺伝子が発現し、ＬＡがＡＬＡに転換されるような条件下で酵母を生育させ、ＡＬＡが場合により回収される。したがってこの方法は、少なくともここで述べられるような配列番号２、６、１０、１４、および１８のΔ１５デサチュラーゼの使用を含む。
【０２２１】
代案としては、ここで述べられる各ＰＵＦＡ遺伝子およびその対応する酵素生成物が、ω−３ＰＵＦＡの生成のために間接的に使用できる。ω−３ＰＵＦＡの間接的生成は、中間ステップまたは経路中間体の手段を通じて、脂肪酸基質が所望の脂肪酸生成物に間接的に転換する場合に起きる。したがって一連の反応が起きて所望の生成物を生成するように、ここで述べられるΔ１５デサチュラーゼが、その他の酵素をコードする１つもしくはそれ以上の遺伝子との組み合わせで発現してもよいことが考察される。好ましい実施態様では、例えばＰＵＦＡ生合成経路の酵素をコードする追加的遺伝子を含んでなるベクターで宿主生物体を同時形質転換して、ω−３脂肪酸（例えばＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡ）のより高レベルの生成を得てもよい。具体的には、例えば以下もまた発現する宿主細胞中で、ここで述べられるΔ１５デサチュラーゼの１つを過剰発現することが望ましいかもしれない。１．）ＡＬＡ過剰生成のためにΔ１２デサチュラーゼをコードする遺伝子（Δ１５デサチュラーゼ単独発現に比べて生成が増大する）、２．）ＳＴＡ過剰生成のためにΔ６デサチュラーゼ（および場合によりΔ１２デサチュラーゼ）をコードする遺伝子、３．）ＥＴＡ過剰生成のためにΔ６デサチュラーゼおよび高親和力エロンガーゼ（および場合によりΔ１２デサチュラーゼ）をコードする遺伝子、および４．）ＥＰＡ過剰生成のためにΔ６デサチュラーゼ、高親和力エロンガーゼおよびΔ５デサチュラーゼ（および場合によりΔ１２デサチュラーゼ）をコードする遺伝子。当業者にはよく知られているように、ここでのデサチュラーゼとの組み合わせで宿主において発現させるのに、以下の酵素活性の様々な別の組み合わせが有用かもしれない。Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、および／またはエロンガーゼ（図２参照）。特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主細胞（およびそのＰＵＦＡプロフィール、および／またはデサチュラーゼプロフィール）、基質の入手可能性、および所望の最終生成物に左右される。
【０２２２】
代案の実施態様では、ここで述べられる完全な配列、それらの完全な配列の相補体、それらの配列のかなりの部分、それらから誘導されるコドン最適化されたデサチュラーゼ、およびそれらに実質的に相同的な配列に基づいて、宿主生物体の天然Δ１５デサチュラーゼを中断することが有用かもしれない。例えば宿主生物体におけるΔ１５デサチュラーゼの標的を定めた中断は、ＡＬＡを合成できない変異株を生成する。この変異株は、「純粋」なω−６脂肪酸（ω−３脂肪酸の同時合成なしの）生成のために有用かもしれない。
【０２２３】
発現システム、カセット、およびベクター
ここで述べられる本配列の遺伝子および遺伝子生成物は、異種の微生物宿主細胞、特に油性酵母菌（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））の細胞中で発現されてもよい。組換え微生物宿主中での発現は、様々なＰＵＦＡ経路中間体の生成のため、または宿主を使用して従来可能でなかった新しい生成物を合成するために宿主中に既に存在するＰＵＦＡ経路を調節するために有用かもしれない。
【０２２４】
微生物の発現システム、および外来タンパク質の高レベル発現を導く制御配列を含有する発現ベクターは、当業者によく知られている。これらのいずれも本配列の遺伝子生成物のいずれかを生成するためのキメラ遺伝子を構築するのに使用できる。次に形質転換を通じてこれらのキメラ遺伝子を適切な微生物に導入して、コードされた酵素の高レベル発現を提供できる。
【０２２５】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはＤＮＡカセットは、当技術分野でよく知られている。コンストラクト中に存在する配列の特定の選択は、所望の発現生成物（上述）、宿主細胞の性質、および提案される形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する手段に左右される。しかし典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択性標識、および自律性複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。双方の制御領域が形質転換された宿主細胞の遺伝子に由来することが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも生成宿主として選択された特定種に天然の遺伝子に由来しなくてよいものと理解される。
【０２２６】
所望の宿主細胞中で、本ＯＲＦの発現を推進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者にはなじみが深い。選択された宿主細胞中でのこれらの遺伝子の発現を導くことができる、実質的にあらゆるプロモーターが本発明に適する。宿主細胞中での発現は、一過性または安定様式で達成できる。一過性発現は、関心のある遺伝子に作動可能に連結された、調節可能プロモーターの活性を誘導することで達成できる。安定発現は、関心のある遺伝子に作動可能に連結された構成プロモーターの使用によって達成できる。一例として宿主細胞が酵母菌の場合、酵母菌細胞中で機能する転写および翻訳領域が、特に宿主種から提供される。転写開始調節領域は、例えば以下から得ることができる。１．）アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書参照）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書参照）、フルクトース−ビスリン染色体外要素アルドラーゼ（米国仮特許出願第６０／５１９９７１号明細書参照）、ホスホグルコース−異性化酵素、ホスホグリセラートキナーゼ、グリセロール−３−リン酸塩Ｏ−アシル転移酵素（米国仮特許出願第６０／６１００６０号明細書参照）などの解糖経路中の遺伝子、または２．）酸ホスファターゼ、ラクターゼ、メタロチオネイン、グルコアミラーゼ、翻訳延長要素ＥＦ１−α（ＴＥＦ）タンパク質（米国特許第６，２６５，１８５号明細書）、リボソームタンパク質Ｓ７（米国特許第６，２６５，１８５号明細書）などの調節可能遺伝子。構成または誘導転写が所望されるかどうか、関心のあるＯＲＦを発現する上でのプロモーター効率、構築の容易さなど次第で、いくつかの制御配列のいずれでも使用できる。
【０２２７】
翻訳開始コドンＡＴＧを取り囲むヌクレオチド配列は、酵母菌細胞中の発現に影響することが分かっている。本Δ１５デサチュラーゼのいずれかが酵母菌中で発現不良であれば、外来性遺伝子のヌクレオチド配列を修正して効率的な酵母菌翻訳開始配列を含め、最適遺伝子発現を得ることができる。酵母菌における発現では、これは、非効率的に発現する遺伝子をインフレームで内在性酵母菌遺伝子、好ましくは高度に発現する遺伝子に融合させることによる部位特異的変異誘発によって実施できる。代案としては、宿主中の共通翻訳開始配列を判定して、関心のある宿主中でのそれらの最適発現のために、この配列を異種性遺伝子内に遺伝子操作できる（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に適用できる特定の教示については例えば米国特許出願第１０／８４０４７８号明細書参照）。
【０２２８】
終結領域は、開始領域がそれから得られる遺伝子の３’領域から、または異なる遺伝子から誘導されることができる。多数の終結領域が知られており、多様な宿主において満足に機能する（それらが由来するのと同一のおよび異なる属および種の双方で使用した際に）。終結領域は、通常、特定の特性のためと言うよりも便宜的に選択される。好ましくは終結領域は、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）である酵母菌遺伝子から誘導される。γ−インターフェロンおよびα−２インターフェロンをコードする哺乳類の遺伝子の３’−領域もまた、酵母菌中で機能することが知られている。終結制御領域もまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子から誘導されてもよい。場合により終結部位は不必要かもしれないが、含まれることが最も好ましい。
【０２２９】
当業者は気づいているように、遺伝子をクローニングベクターに単に挿入するだけでは、それが必要なレベルで成功裏に発現することは保証されない。高発現率の必要性に応答して、転写、翻訳、タンパク質安定性、酸素限界、および宿主細胞からの分泌の態様を制御するいくつかの異なる遺伝的要素を操作することで、多くの特殊化した発現ベクターが作り出されている。より具体的には、遺伝子発現を制御するように操作される分子の特徴のいくつかとして以下が挙げられる。１．）関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、２．）クローンされた遺伝子のコピー数、および遺伝子がプラスミド上にあるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれているかどうか、３．）合成された外来タンパク質の最終細胞内位置、４．）宿主生物体中の翻訳効率、５．）宿主細胞内のクローン遺伝子タンパク質の本質的な安定性、および６．）頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度に近づくようなクローン遺伝子内のコドン使用。これらの各タイプの修正は、ここで述べられるΔ１５デサチュラーゼの発現をさらに最適化する手段として、本発明中に包含される。
【０２３０】
微生物宿主の形質転換
適切な微生物宿主中での発現に適したポリペプチドをコードするＤＮＡがひとたび得られると、それは宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクター中に入れられ、またはそれは宿主細胞のゲノム中に直接組み込まれる。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座との遺伝子組換えにおいて標的を定めるのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的を定めることができる。コンストラクトが内在性遺伝子座に標的を定めると、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域が、内在性遺伝子座によって提供できる。
【０２３１】
別々の複製ベクターから２つ以上の遺伝子が発現する場合、各ベクターが異なる選択手段を有することが望ましく、他のコンストラクトに対する相同性を欠いて、安定した発現を維持し、コンストラクト中の要素の再集合を防止すべきである。調節領域、選択手段、および導入コンストラクト増殖方法の思慮深い選択は、全ての導入された遺伝子が必要なレベルで発現して、所望の生成物の合成を提供するように実験的に判定できる。
【０２３２】
関心のある遺伝子を含んでなるコンストラクトは、あらゆる標準的技術によって宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６〜１８７（１９９１）］）、プロトプラスト融合、微粒子銃衝撃、電気穿孔、微量注入、または宿主細胞中に関心のある遺伝子を導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。油性酵母菌（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））に適用できるより具体的な教示としては、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびチェン（Ｃｈｅｎ）Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５（１９９７））が挙げられる。
【０２３３】
便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を「形質転換された」または「組換え」とここで称する。形質転換された宿主は、遺伝子がゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数のコピー数を有する染色体外要素上に存在するかどうか次第で、発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。形質転換された宿主細胞は、導入されたコンストラクト上に含有される標識について選択することで同定できる。多くの形質転換技術は、多くのＤＮＡ分子を宿主細胞中に導入するので、代案としては、別の標識コンストラクトを所望のコンストラクトと共に同時形質転換してもよい。典型的に形質転換された宿主は、選択的培地上で生育するそれらの能力について選択される。選択培地には抗生物質が組み込まれていてもよく、または栄養素または成長要素などの非形質転換宿主の生育に必要な要素が欠如していてもよい。導入された標識遺伝子は、形質転換された宿主中で発現すると、抗生物質抵抗性を与え、または必須成長要素または酵素をコードしてもよく、それによって選択培地上での生育を可能にしてもよい。また発現した標識タンパク質が直接または間接に検出できる場合に、形質転換された宿主の選択ができる。標識タンパク質は単独で、または別のタンパク質と融合して発現してもよい。標識タンパク質は、次によって検出できる。１．）その酵素活性（例えばβ−ガラクトシダーゼは基質Ｘ−ｇａｌ［５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド］を着色生成物に変換でき、ルシフェラーゼはルシフェリンを発光生成物に変換できる）、または２．）その発光性または光修正特性（例えばオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質は青色光で照明されると蛍光を発する）。代案としては抗体を使用して、標識タンパク質、または例えば関心のあるタンパク質の上の分子タグを検出できる。標識タンパク質またはタグを発現する細胞は、例えば視覚的に、またはＦＡＣＳ、または抗体を使用したパニングなどの技術によって選択できる。酵母菌形質転換体の選択のためには、酵母菌で機能するあらゆる標識を使用してもよい。望ましくはカナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシルまたはロイシンを欠く培地で生育する能力も重要である。
【０２３４】
形質転換に続いて、本Δ１５デサチュラーゼ（そして場合により宿主細胞内で同時発現するその他のＰＵＦＡ酵素）に適切な基質が、宿主によって自然にまたは遺伝子組換え的に生成されてもよく、またはそれらは外来性に提供されてもよい。
【０２３５】
微生物中でのω−３、および／またはω−６脂肪酸生合成の代謝エンジニアリング
本Δ１５デサチュラーゼの配列の知識は、油性酵母菌、特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるω−３、および／またはω−６脂肪酸生合成を操作するために有用であろう。これは直接ＰＵＦＡ生合成経路内での代謝エンジニアリング、または炭素をＰＵＦＡ生合成経路に与える経路の追加的操作を必要とするかもしれない。生化学的経路を操作するのに有用な方法は、当業者にはよく知られている。
【０２３６】
望ましい生合成経路を上方制御する技術
典型的にマルチコピープラスミドの使用を通じて、デサチュラーゼ（および場合によりエロンガーゼ）遺伝子の追加的コピーを宿主に導入して、ω−３、および／またはω−６脂肪酸生合成経路の生成量を増大させてもよい。デサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の発現はまた、ｍＲＮＡまたはコードされたタンパク質のいずれかから不安定化配列を除去／消去することで、または安定化配列をｍＲＮＡ（米国特許第４,９１０,１４１号明細書）に追加することで、（制御されたまたは構成的な）より強力なプロモーターの使用を通じて増大する発現を引き起こして、転写レベルで増大できる。異種のデサチュラーゼまたはエロンガーゼ遺伝子の発現を増大させるさらに別のアプローチは、選択された宿主微生物中での最適遺伝子発現のためのコドンで、天然遺伝子中のコドンを置換することにより、コードされたｍＲＮＡの翻訳効率を増大させることである。
【０２３７】
望ましくない生合成経路を下方制御する技術
反対に、エネルギーまたは炭素についてω−３、および／またはω−６脂肪酸生合成経路と競合する生化学的経路、または特定のＰＵＦＡ最終生成物の生成を妨げる天然ＰＵＦＡ生合成経路酵素を遺伝子中断または下方制御、またはその他の手段（例えばアンチセンスｍＲＮＡ）によって除去してもよい。遺伝子中断では、そのコード配列を妨害し、それによって遺伝子を機能的に不活性化するために、中断させたい構成的遺伝子中に外来ＤＮＡ断片（典型的に選択可能標識遺伝子）を挿入し、中断させる。中断カセットの宿主細胞中への形質転換は、相同的組換えによって、機能的天然遺伝子の非機能的中断遺伝子による置換をもたらす（例えばハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７〜４６２２（１９８９）；バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら、Ｇｅｎｅ、１３６：２１１〜２１３（１９９３）；ゲルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２４：２５１９〜２５２４（１９９６）；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２７０〜２７７（１９９６）参照）。
【０２３８】
アンチセンス技術は、標的遺伝子配列が既知の場合に遺伝子を下方制御する別の方法である。これを達成するためには、ＲＮＡのアンチセンスストランドが転写されるように、所望の遺伝子からの核酸セグメントをクローンしてプロモーターに作動的に結合する。次にこのコンストラクトを宿主細胞中に導入し、ＲＮＡのアンチセンスストランドを生成する。アンチセンスＲＮＡは、関心のあるタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を防止することで、遺伝子発現を阻害する。当業者は特定遺伝子の発現を低下させるためのアンチセンス技術の使用に関連して、特別な配慮があることを理解するであろう。例えばアンチセンス遺伝子発現の適切なレベルは、当業者に既知の異なる制御要素を使用する異なるキメラ遺伝子の使用を必要とするかもしれない。
【０２３９】
配列が知られている場合、標的を定めた遺伝子中断およびアンチセンス技術が遺伝子を下方制御する効果的手段を提供するが、配列ベースではないその他のより特異性が低い方法が開発されている。例えば細胞をＵＶ放射線暴露して、次に所望の表現型についてスクリーンしてもよい。変異体を作り出すために、化学薬品による変異誘発もまた効果的であり、一般に使用される物質としては非複製ＤＮＡに影響する化学物質（例えばＨＮＯ２およびＮＨ２ＯＨ）、ならびに複製ＤＮＡに影響する薬剤（例えばフレームシフト変異を引き起こすことで注目に値するアクリジン染料）が挙げられる。放射線または化学薬品を使用して変異体を作り出す特定の方法は、当技術分野でよく文書化されている。例えばトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第二版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ、またはデシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７（１９９２）を参照されたい。
【０２４０】
別の非特異的遺伝子中断方法は、転移要素またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡに無作為に挿入される遺伝的要素であるが、後で配列に基づいて検索して、挿入がどこで起きたのか判定できる。生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）および生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転位法の双方が知られている。どちらの方法にもトランスポザーゼ酵素と組み合わされた転移要素の使用が関与する。転移要素またはトランスポゾンがトランスポザーゼ存在下で核酸断片に接触すると、転移要素が核酸断片中に無作為に挿入される。中断された遺伝子は転移要素配列に基づいて同定されてもよいので、技術は、ランダム変異誘発のため、そして遺伝子単離のために有用である。生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転位のためのキットは市販される。例えば１．）ニュージャージー州ブランチバーグのパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ））から入手できる酵母菌Ｔｙ１要素に基づく、プライマー・アイランド転位キット、２．）マサチューセッツ州のニュー・イングランド・バイオ・ラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））から入手できる細菌性トランスポゾンＴｎ７に基づくゲノム・プライミング・システム、および３．）ウィスコンシン州マディソンのエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））から入手できる、Ｔｎ５細菌性転移要素に基づくＥＺ：：ＴＮトランスポゾン挿入システムを参照されたい。
【０２４１】
本発明の文脈では、上述のいずれか１つの方法によって、脂肪酸生合成経路の発現を調節することが有用であるかもしれない。例えば本発明は、ω−３、および／またはω−６脂肪酸生成をもたらす、生合成経路中の重要な酵素をコードする遺伝子（すなわちΔ１５デサチュラーゼ）を提供する。宿主生物体の代謝遺伝子操作のための様々な手段を使用して、不十分な量の１８：３脂肪酸を生成する油性酵母菌においてこれらの遺伝子を発現し、これおよびその他のＰＵＦＡ生合成遺伝子発現を調節して、好ましいＰＵＦＡ生成物の生成を最大化することは特に有用であろう。同様にこれらの遺伝子によってＰＵＦＡ生成を最大化するために、ＰＵＦＡ生合成に向かう炭素の流れを得るために競合する経路を中断させることが必要かもしれない。別の実施態様では、ここにおけるΔ１５デサチュラーゼを中断させてω−６脂肪酸合成を促進し、同時にω−３脂肪酸の同時合成を防止することが望ましいかもしれない。別の実施態様では、本Δ１５デサチュラーゼ遺伝子のいずれかを誘導性または調節プロモーターの制御下に置くことにより、ω−３、および／またはω−６脂肪酸の生成を調節することが可能である。
【０２４２】
Δ１５デサチュラーゼの組換え発現のための好ましい宿主
本遺伝子および核酸断片の発現のための宿主細胞は、広範な温度およびｐＨで、単純または複合炭水化物、有機酸およびアルコール、および／または炭化水素をはじめとする多様な原材料上で生育する微生物宿主を含んでもよい。本発明で述べられる遺伝子は、油性酵母菌、そして特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために単離されているが、転写、翻訳およびタンパク質生合成器管は高度に保存されているので、あらゆる細菌、酵母菌、藻類、および／または糸状菌が、本核酸断片の発現のための適切な宿主になることが考察される。
【０２４３】
好ましい宿主は、油性酵母菌などの油性生物体である。これらの油性生物体は自然に油の合成および蓄積ができ、油は細胞乾燥重量の約２５％を超え、より好ましくは細胞乾燥重量の約３０％を超え、最も好ましくは細胞乾燥重量の約４０％を超える量を構成できる。油性酵母菌として典型的に同定されている属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には、例証的な油合成酵母菌としては、ロドスポリジウム・トルイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルティナス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類されていた）が挙げられる。
【０２４４】
最も好ましいのは油性酵母菌ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらなる実施態様で最も好ましいのは、ＡＴＣＣ番号７６９８２、ＡＴＣＣ番号２０３６２、ＡＴＣＣ番号８８６２、ＡＴＣＣ番号１８９４４、および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（パパニコラオウ（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ）Ｓ．、およびアゲリス（Ａｇｇｅｌｉｓ）Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３〜９（２００２））。
【０２４５】
その他の好ましい微生物宿主としては、油性細菌、藻類、およびその他の真菌が挙げられ、この微生物宿主グループの中で特に関心が高いのは、ＧＬＡおよびＡＲＡなどのω−６脂肪酸を合成する微生物である。したがって例えば誘導可能プロモーターまたは調節プロモーターの制御下にある本Δ１５デサチュラーゼ遺伝子のいずれかによる、（商業的ＡＲＡ生成のために使用される）モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）の形質転換からは、ＥＰＡを合成できる形質転換生物体を生じることができる。さらにそれらの天然Δ１２デサチュラーゼに中断または変異を有する株を形質転換することで（例えば当技術分野でよく知られている手段を使用して、本Δ１５デサチュラーゼのいずれかを天然Δ１２遺伝子の遺伝子座に導入することで）、この遺伝子改変生物体中のω−３のω−６脂肪酸に対する比率を改善できる。Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）の形質転換方法については、マッケンジー（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ）ら（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６６：４６５５（２０００））で述べられる。
【０２４６】
ＰＵＦＡ生成のための発酵プロセス
形質転換された微生物宿主細胞を脂肪酸生合成遺伝子活性が最適化され、脂肪酸（例えば様々なω−３脂肪酸の生成を増大できるＡＬＡ）の最大かつ最も経済的な収率を生じる条件下で生育させる。一般に最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞採取時間が挙げられる。油性酵母菌などの関心のある微生物を複合培地（例えば酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ））上で生育させ、または生育に必要な構成要素が欠如する合成最少培地（例えばミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））からの酵母菌窒素ベース）上で生育させて、所望の発現カセットの選択を強要する。
【０２４７】
本発明における発酵培地は、適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源としては、単糖類（例えばグルコース、フルクトース）、二糖類（例えばラクトースまたはスクロース）、少糖類、多糖類（例えばデンプン、セルロースまたはそれらの混合物）、糖アルコール（例えばグリセロール）または再生可能原材料からの混合物（例えば乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜モラセス、大麦の麦芽）が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに炭素源としては、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、および植物油（例えばダイズ油）、および動物脂肪をはじめとする脂肪酸の様々な商業的供給源が挙げられる。さらに炭素基質としては、重要な生化学的中間体への代謝転換が実証されている一炭素基質（例えば二酸化炭素またはメタノール）が挙げられる。したがって本発明で使用される炭素源は多種多様な炭素含有基質を包含し、宿主生物体の選択によってのみ制限されることが考察された。上述の全ての炭素基質およびそれらの混合物が本発明で適切であることが予想されるが、好ましい炭素基質は糖、および／または脂肪酸である。最も好ましいのは、１０〜２２個の炭素含有グルコース、および／または脂肪酸である。
【０２４８】
窒素は、無機源（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機源（例えば尿素、グルタミン酸）から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、適切なミネラル、塩、補助要素、緩衝液、ビタミン、および当業者には既知である微生物の生育とＰＵＦＡ生成に必要な酵素的経路の促進に適したその他の構成要素を含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えばＭｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）が注目されている（ナカハラ（Ｎａｋａｈａｒａ）Ｔ．ら、「単細胞油の工業的応用（Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ）」、Ｄ．Ｊ．カイル（Ｋｙｌｅ）およびＲ．コリン（Ｃｏｌｉｎ）編、ｐ６１〜９７（１９９２））。
【０２４９】
本発明における好ましい増殖培地は、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））からの酵母菌窒素ベースなどの一般的な商業的調製培地である。またその他の合成または人工増殖培地を使用してもよく、特定の微生物の生育に適した培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．０が最初の生育条件の範囲として好ましい。発酵は好気性または好気性条件下で実施されてもよく、マイクロ好気性条件が好ましい。
【０２５０】
典型的に、油性酵母菌細胞におけるＰＵＦＡの高レベルの蓄積は、代謝状態が生育と脂肪合成／貯蔵間で「バランスが取れて」いなくてはならないので、二段階プロセスを必要とする。したがって最も好ましくは、油性酵母菌におけるＰＵＦＡ生成には二段階発酵プロセスが必要である。このアプローチでは、発酵の第１段階は細胞集団の生成および蓄積のみを行い、迅速な細胞生育および細胞分割によって特徴付けられる。発酵の第２段階では、培養内の窒素欠乏条件を確立して高レベルの脂質蓄積を促進することが好ましい。この窒素欠乏の効果は、細胞内のＡＭＰの効果的濃度を低下させることにより、ミトコンドリアのＮＡＤ−依存イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させることである。これが起きるとクエン酸が蓄積するので、細胞質中にアセチル−ＣｏＡの豊富なプールが形成し、脂肪酸合成の下準備をする。したがってこの相は、細胞分割休止と、それに続く脂肪酸合成および油蓄積によって特徴付けられる。
【０２５１】
細胞は典型的に約３０℃で生育させるが、いくつかの研究は、より低い温度における不飽和脂肪酸の増大した合成を示している（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５（１９９１））。プロセスの経済に基づけば、この温度シフトは、大部分の生物体の生育が起きる二段階発酵の第１相後に起きるはずである。
【０２５２】
多様な発酵プロセスデザインを適用してもよいことが考察され、本Δ１５デサチュラーゼ遺伝子を使用したω脂肪酸の商業生産が所望される。例えば、組換え微生物宿主からのＰＵＦＡの商業生産は、バッチ、供給バッチまたは連続発酵プロセスによって生成されてもよい。
【０２５３】
バッチ発酵プロセスは閉鎖システムであり、培地組成がプロセス開始時に設定され、プロセス中にｐＨおよび酸素レベル維持のために必要とされるもの以外は、さらなる追加を受けない。したがって培養プロセスの始めに所望の生物体を培地に接種し、培地への追加的基質（すなわち炭素および窒素源）の添加なしに、生育または代謝活性を生じさせる。バッチプロセスでは、システムの代謝産物およびバイオマス組成物は、培養が終結するまで絶えず変化する。典型的なバッチプロセスでは、細胞は静止対数相から高生育対数相を通過して、最終的に発達速度が減少または停止する定常相に減速する。処置されない場合、定常相の細胞は次第に死滅する。標準バッチプロセスのバリエーションが供給バッチプロセスであり、基質は発酵プロセス経過中に発酵槽に連続的に添加される。供給バッチプロセスもまた、本発明に適している。供給バッチプロセスは分解産物抑制が、細胞代謝を阻害する傾向がある場合に、またはあらゆる時点で培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に有用である。供給バッチシステム中の基質濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶解酸素、および排ガス（例えばＣＯ２）分圧などの測定可能な要素の変化に基づいて推定してもよい。バッチおよび供給バッチ培養方法は一般的で当技術分野でよく知られており、実例が以下にある。トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）著、バイオテクノロジー：工業的微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第二版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１９８９）、またはデシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７（１９９２）。これらは参照によってここに援用される。
【０２５４】
本Δ１５デサチュラーゼを使用したω脂肪酸の商業生産はまた、連続発酵プロセスによって達成されてもよく、そこでは生成物の回収のため等量の培養物を除去するのと同時に、合成培地をバイオリアクター内に連続的に添加する。連続培養は、概して細胞を一定細胞密度の対数増殖期に保つ。連続または半連続培養法は、細胞生育または最終生成物濃度に影響する１つの要素またはあらゆるいくつかの要素の調節を可能にする。例えば１つのアプローチでは炭素源を制限して、あらゆるその他のパラメータが代謝を調節できるようにしてもよい。その他のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、生育に影響するいくつかの要素を連続的に変化させてもよい。連続システムは定常状態生育を維持することを目指すので、細胞生育率は、培養から培地が抜き取られることによる細胞損失に対してバランスが取れていなくてはならない。連続的培養プロセスのために栄養素および成長要素を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は工業微生物学の当技術分野でよく知られており、多様な方法が上記のブロック（Ｂｒｏｃｋ）で詳述される。
【０２５５】
ＰＵＦＡの精製
ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピドまたは糖脂質などのエステル化形態で宿主微生物中に見ることができ、当技術分野でよく知られている多様な手段を通じて宿主細胞から抽出されてもよい。酵母菌脂質の抽出技術、品質分析、および許容性基準に関する１つのレビューは、Ｚ．ジェーコブス（Ｊａｃｏｂｓ）（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２（５／６）：４６３〜４９１（１９９２））である。下流プロセスに関する簡潔なレビューは、Ａ．シン（Ｓｉｎｇｈ）およびＯ．ワード（Ｗａｒｄ）（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：２７１〜３１２（１９９７））にもある。
【０２５６】
一般にＰＵＦＡの精製手段としては、有機溶剤、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば二酸化炭素を使用して）による抽出と、鹸化と、圧搾などの物理的手段またはそれらの組み合わせが挙げられる。特に興味深いのは、水存在下でのメタノールおよびクロロホルムによる抽出である（Ｅ．Ｇ．ブライ（Ｂｌｉｇｈ）およびＷ．Ｊ．ダイヤー（Ｄｙｅｒ）、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７（１９５９））。望ましい場合、水性層を酸性化して負の電荷を帯びた部分をプロトン化することで、有機層中への所望の生成物の分配を増大できる。抽出後、有機溶剤は窒素流の下で蒸発によって除去できる。コンジュゲートされた形態で単離されると、生成物は酵素的にまたは化学的に切断されて、関心のある遊離脂肪酸またはより単純なコンジュゲートを遊離させしてもよく、次にさらに操作されて所望の最終生成物を生成してもよい。望ましくはコンジュゲートされた形態の脂肪酸は、水酸化カリウムによって切断される。
【０２５７】
さらに精製が必要ならば、標準法を用いることができる。このような方法としては、抽出、尿素処理、分別結晶化、ＨＰＬＣ、分留、シリカゲルクロマトグラフィー、高速遠心分離または蒸留、またはこれらの技術の組み合わせが挙げられる。酸またはアルケニル基などの反応性基の保護は、既知の技術（例えばアルキル化またはヨウ素化）を通じて、あらゆるステップで実施してもよい。使用される方法としては、メチルエステルを生成するための脂肪酸のメチル化が挙げられる。同様に保護基は、あらゆるステップで除去されてもよい。望ましくはＧＬＡ、ＳＴＡ、ＡＲＡ、ＤＨＡ、およびＥＰＡを含有する画分の精製は、尿素、および／または分留による処置によって達成されてもよい。
【０２５８】
植物におけるω−３、および／またはω−６脂肪酸生成
本発明のコード領域は、植物、特に油料種子植物において発現できる。これは以下によって達成される。１．）キメラ遺伝子（プロモーターおよび３’転写ターミネーターなどの適切な制御配列の制御下にある本発明のΔ１５デサチュラーゼを含んでなる）の構築、２．）適切な植物宿主中へのキメラ遺伝子の形質転換、および３．）ＰＵＦＡ生成のための前記キメラ遺伝子の発現。
【０２５９】
したがって本発明は、０．４を超えるω−３：ω−６比を有する油を生成するための、油料種子植物の成熟種子の全脂肪酸プロフィールを変更するための組換えコンストラクトに関し、前記コンストラクトは、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部または一部をコードする単離された核酸断片、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄すると、（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸断片、
（ｃ）ＣｌｕｓｔａｌＶ法によるアライメントに基づいて、配列番号２、６、１０、１４、１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも４６．２％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする単離された核酸断片、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と完全に相補である単離された核酸断片
からなる群から選択される単離された核酸断片を含んでなり、前記単離された核酸断片は少なくとも１つの制御配列に作動的に結合する。
【０２６０】
ω−３のω−６に対する比率は、約２：５から少なくとも約４５：１の範囲であることができる。有用な比率としては、約１のω−６に対して、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２３、２４、２７、２９、３１、３６、４２、および４５のω−３が挙げられるが、これに限定されるものではない。その他の有用なω−３のω−６に対する比率としては、２：５、３：５、４：５、１：１、および２：１が挙げられるが、これに限定されるものではない。少なくとも約２：５から少なくとも約４５：１のω−３対ω−６のあらゆる整数比率が、有用であると考えられる。
【０２６１】
フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）から単離されたここで述べられる単離された核酸断片は、本発明を実施するのに使用できる。
【０２６２】
本発明はまた、それらのゲノム中に本発明の組換えコンストラクトを含んでなる、油料種子植物、植物細胞、植物組織、および／または植物部分に関する。
【０２６３】
なおさらに別の態様では、本発明はまた、これらの形質転換された油料種子植物から得られる種子、これらの種子から得られる油、油の加工から得られる製品、食物、動物飼料または産業用途におけるこの油の使用、食物または動物飼料における副産物の使用にも関する。
【０２６４】
本発明は、ここで述べられるΔ１５デサチュラーによる形質転換のための多様な植物宿主を提供する。このように形質転換された植物は、単子葉植物または双子葉植物であることができ、好ましくはそれらは油性として同定されたクラスの植物（例えば油料種子植物）に属する。好ましい油料種子植物宿主の例としてはダイズ（グリシンおよびソヤ種）、コーン（ジー・メイズ）、亜麻（リナム種）、アブラナ（ブラシカ種）、サクラソウ、カノーラ、トウモロコシ、ベニバナ（カルタムス種）、およびヒマワリ（ヘリアンタス種）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２６５】
遺伝的に、本発明の変性された植物は、本Δ１５デサチュラーゼの過剰発現によって生成される。これは最初に、発達の所望の段階で所望の組織において遺伝子発現を誘導できる制御配列に、Δ１５デサチュラーゼコード領域がその中で作動可能に連結するキメラ遺伝子を構築して達成してもよい。これらの制御配列はプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、イントロン配列、３’ＵＴＲ、および／または５’ＵＴＲ領域、およびタンパク質、および／またはＲＮＡ安定化要素を含んでなってもよい。このような要素は、それらの強度および特異性が異なってもよい。便宜上キメラ遺伝子は、同一遺伝子から誘導されるプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含んでなる。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列もまた、提供されなくてはならない。キメラ遺伝子がベクターを通じて導入され、Δ１５デサチュラーゼ配列を含むベクターはまた、１つ以上の選択可能な標識遺伝子を含有し、キメラ遺伝子で形質転換された細胞が形質転換されていない細胞から選択できることが好ましい。
【０２６６】
本発明は、多様な植物プロモーターを利用して、ここで述べられるΔ１５デサチュラーゼ遺伝子またはその機能的な断片の発現を進める。構成的植物プロモーター、植物組織特異的プロモーター、植物発達段階特異的プロモーター、誘導可能植物プロモーター、ウィルス性プロモーター、オス生殖細胞系特異的プロモーター、メス生殖細胞系特異的プロモーター、花特異的プロモーター、および栄養期茎頂分裂組識特異的プロモーターをはじめとする（がこれに限定されるものではない）植物中で機能的なあらゆるプロモーターが適切である。
【０２６７】
上述のように、プロモーターは植物の細胞機構を誘導して、プロモーター下流（３’）のコンティグコード配列からＲＮＡを生成するＤＮＡ配列である。プロモーター領域は速度、発達段階、そしてその中で遺伝子のＲＮＡ転写物が作られる細胞タイプに影響する。ＲＮＡ転写物は処理されて、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列へのＲＮＡ配列の翻訳テンプレートの役割をするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が生成する。５’非翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡの開始および翻訳の役割を果たすかもしれない、タンパク質コード領域上流のｍＲＮＡの領域である。３’転写終結／ポリアデニル化シグナルは、植物細胞中で機能して、ＲＮＡ転写終結およびＲＮＡ３’末端へのポリアデニレートヌクレオチド付加を引き起こす、タンパク質コード領域下流の非翻訳領域である。
【０２６８】
適切な時点で所望の宿主組織において所望の核酸断片をコードする翻訳可能ｍＲＮＡを発現することで、本発明を達成するのに十分な転写活性を有しさえすれば、コード配列の発現を進めるために選択されるプロモーターの起源は重要でない。異種のまたは非異種の（すなわち内在性）プロモーターのいずれかが本発明を実施するのに使用できる。
【０２６９】
本発明を実施するのに使用できる適切なプロモーターとしては、βコングリシニンプロモーターのαプライムサブユニット、Ｋｕｎｉｔｚトリプシン阻害因子３プロモーター、アネキシンプロモーター、Ｇｌｙ１プロモーター、βコングリシニンプロモーターのβサブユニット、Ｐ３４／Ｇｌｙ  Ｂｄ  ｍ  ３０Ｋプロモーター、アルブミンプロモーター、Ｌｅｇ  Ａ１プロモーター、およびＬｅｇ  Ａ２プロモーターが挙げられるが、これに限定されるものではない。アネキシンまたはＰ３４プロモーターの活性レベルは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（アタナソバ（Ａｔａｎａｓｓｏｖａ）ら、（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７：２７５〜２８５；バタロー（Ｂａｔｔｒａｗ）およびホール（Ｈａｌｌ）、（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：５２７〜５３８；ホルトロフ（Ｈｏｌｔｏｒｆ）ら、（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：６３７〜６４６；ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）ら、（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３９０１〜３９０７；ウィルミンク（Ｗｉｌｍｉｎｋ）ら、（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：９４９〜９５５）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）オレオシンプロモーター（プラント（Ｐｌａｎｔ）ら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：１９３〜２０５；リ（Ｌｉ）、（１９９７）Ｔｅｘａｓ  Ａ  ＆  Ｍ大学博士論文、ｐ．１０７〜１２８）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ユビキチン延長タンパク質プロモーター（カリス（Ｃａｌｌｉｓ）ら、１９９０）、トマトユビキチン遺伝子プロモーター（ロールフィンケ（Ｒｏｌｌｆｉｎｋｅ）ら、１９９８）、ダイズ熱ショックタンパク質プロモーター（ショフル（Ｓｃｈｏｆｆｌ）ら、１９８９）、およびトウモロコシＨ３ヒストン遺伝子プロモーター（アタナソバ（Ａｔａｎａｓｓｏｖａ）ら、１９９８）などの多くの既知の強力なプロモーターと比較できる。
【０２７０】
ほとんどの植物細胞中でのキメラ遺伝子の発現は、アネキシンまたはＰ３４プロモーターを生成し、それは２００４年８月２６日に公開された、国際公開第２００４／０７１１７８号パンフレットの対象を構成し、標的とする異種核酸断片の種子特異的発現が必要な場合に特に有用である。アネキシンプロモーターの別の有用な特色は、発達中の種子におけるその発現プロフィールである。本発明のアネキシンプロモーターは、初期段階（受粉の１０日後以前）の発達中の種子において最も活性であり、後期にはほとんど静止する。アネキシンプロモーターの発現プロフィールは、例えば発達後期に最高活性を提供することが多い種子貯蔵タンパク質プロモーターなどの多くの種子特異的プロモーターのそれとは異なる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、（１９８９）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１１２〜１２２；エルマーソン（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍ）ら、（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１０１９〜１０２７；ケディ（Ｋｅｄｄｉｅ）ら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３２７〜３４０；プラント（Ｐｌａｎｔ）ら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：１９３〜２０５；リ（Ｌｉ）、（１９９７）Ｔｅｘａｓ  Ａ  ＆  Ｍ大学博士論文、ｐ．１０７〜１２８）。Ｐ３４プロモーターはより従来型の発現プロフィールを有するが、その他の知られている種子特異的プロモーターとは、なおも相異なる。したがってアネキシンまたはＰ３４プロモーターは、初期発達段階において胚芽中の遺伝子の過剰発現または抑制が所望される場合、非常に魅力的な候補であろう。例えば初期胚芽発達を制御する遺伝子、または種子成熟に先だって代謝に関与する遺伝子を過剰発現することが望ましいかもしれない。
【０２７１】
次にプロモーターは、当業者によく知られている従来の手段を使用して、センス方向で作動的に結合される。
【０２７２】
ひとたび組換えコンストラクトが生成すると、次にそれを上述のように、例えば形質移入、形質転換、および電気穿孔をはじめとする当業者によく知られている方法によって、選択された油料種子植物細胞に導入してもよい。次に形質転換された植物細胞をＰＵＦＡの発現を可能にする適切な条件下で培養して再生し、次にそれを回収し精製する。
【０２７３】
本発明の組換えコンストラクトを１個の植物細胞中に導入してもよく、または代案としては各コンストラクトを別々の植物細胞に導入してもよい。
【０２７４】
植物細胞中における発現は、上述のように一過性または安定な様式で達成してもよい。
【０２７５】
所望のＰＵＦＡは種子内で発現できる。またこのような形質転換された植物から得られる種子または植物部分も本発明の範囲内である。
【０２７６】
分化および未分化組織を含む植物部分としては、根、茎、芽、葉、花粉、種子、腫瘍組織、および単細胞、プロトプラスト、胚芽、および、カルス組織などの様々な形態の細胞および培養物が挙げられるが、これに限定されるものではない。植物組織は、植物中、または器官、組織または細胞培養物中にあってもよい。
【０２７７】
主としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の使用によって、トランスジェニック植物を得ることで双子葉植物を形質転換する方法は例えば綿（米国特許第５,００４,８６３号明細書、米国特許第５,１５９,１３５号明細書）、ダイズ（米国特許第５,５６９,８３４号明細書、米国特許第５,４１６,０１１号明細書）、アブラナ属（米国特許第５,４６３,１７４号明細書）、ピーナッツ（チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１５：６５３〜６５７、マッケントリー（ＭｃＫｅｎｔｌｙ）ら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１４：６９９〜７０３）、パパイア（リング（Ｌｉｎｇ），Ｋ．ら（１９９１）Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：７５２〜７５８）、およびエンドウ豆（グラント（Ｇｒａｎｔ）ら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１５：２５４〜２５８）について公開されている。その他の一般に使用される植物形質転換方法のレビューについては、ニューウェル（Ｎｅｗｅｌｌ），Ｃ．Ａ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：５３〜６５を参照されたい。これらの形質転換方法の１つは、アグロバクテリウム・リゾジーン（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ）（テフラー（Ｔｅｐｆｌｅｒ），Ｍ．およびケース−デルバート（Ｃａｓｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ），Ｆ．（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：２４〜２８）を使用する。ＰＥＧ融合（ＰＣＴ公報国際公開第９２／１７５９８号パンフレット）、電気穿孔（チョウリラ（Ｃｈｏｗｒｉｒａ），Ｇ．Ｍ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：１７〜２３；クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ），Ｐ．ら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：３９６２〜３９６６）、微量注入、または粒子衝撃（マッカーブ（ＭｃＣａｂｅ），Ｄ．Ｅ．ら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３；クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）ら（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１〜６７４）を使用した、ＤＮＡの直接的デリバリを使用したダイズの形質転換が公開されている。
【０２７８】
植物組織からの植物再生のための多様な方法がある。特定の再生方法は、開始植物組織および再生する特定の植物種に左右される。単一植物プロトプラスト形質転換体からの、または様々な形質転換された外植片からの植物の再生、発達、および培養については当技術分野でよく知られている（ワイスバハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）およびワイスバハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）、（１９８８）、「植物分子生物学法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。この再生および生育過程は、典型的に形質転換された細胞を選択する工程と、根付いた小植物段階を経る通常の胚芽発達段階を通じてそれらの個別化細胞を培養する工程を含む。トランスジェニック胚芽および種子は同様に再生される。得られるトランスジェニック根付き芽は、その後土壌などの適切な植物成長培地に定植される。好ましくは再生した植物は自己受粉して、同型接合性トランスジェニック植物を提供する。さもなければ、再生植物から得られる花粉を農業経済学的に重要な系統の種子から成長させた植物に交配する。反対に、これらの重要な系統の植物からの花粉を使用して、再生植物を受粉させる。所望のポリペプチドを含有する本発明のトランスジェニック植物は、当業者によく知られている方法を使用して栽培される。
【０２７９】
上で考察した手順に加えて、当業者は、巨大分子（例えばＤＮＡ分子、プラスミドなど）の構築、操作および単離のための特異的条件および手順、組換えＤＮＡ断片および組換え発現コンストラクトの産生、およびクローンのスクリーニングおよび単離について述べる標準的リソース材料を熟知している（例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；マリガ（Ｍａｌｉｇａ）ら（１９９５）「植物分子生物学法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら（１９９８）「ゲノム分析：遺伝子検出（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅｓ）」、１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら（１９９８）「ゲノム分析：ＤＮＡ分析（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ）」、２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；「植物分子生物学：実験室マニュアル（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、クラーク編（Ｃｌａｒｋ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）参照）。
【０２８０】
別の態様では、本発明は、
ａ）本発明の組換えコンストラクトで油料種子植物細胞を形質転換する工程と、
ｂ）工程（ａ）の形質転換された植物細胞から油料種子植物を再生する工程と、
ｃ）形質転換されていない植物中のω−３脂肪酸のω−６脂肪酸に対する比率と比較して、ω−３脂肪酸のω−６脂肪酸に対する増大する比率を有する形質転換された植物を選択する工程
を含んでなる、油料種子植物中のω−３脂肪酸のω−６脂肪酸に対する比率の増大方法に関する。
【０２８１】
なおさらに別の態様では、本発明は、種子中の油のα−リノレン酸含量が種子油の全脂肪酸含量の少なくとも２５％である、油料種子植物の種子中でα−リノレン酸を製造する方法に関し、前記方法は、
ａ）油料種子植物細胞を本発明の組換えコンストラクトで形質転換する工程と、
ｂ）工程（ａ）の形質転換された植物細胞から油料種子植物を再生する工程と、
ｃ）種子油の全脂肪酸含量の少なくとも２５％のα−リノレン酸を有する形質転換された植物を選択する工程
を含んでなる。
【０２８２】
このような種子中の油のα−リノレン酸含量は、少なくとも２５％〜約８９％の範囲、または例えば２６％、２７％などの２５％と８９％の間のあらゆる整数百分率であることができる。
【０２８３】
本発明はまた、それらのゲノム中に本発明の方法によって作られた本発明の組換えコンストラクトを含んでなる、油料種子植物、植物細胞、植物組織、および／または植物部分に関する。
【０２８４】
さらに別の態様では、本発明はまた、これらの形質転換された油料種子植物から得られる種子、これらの種子から得られる油、油の加工から得られる製品、食物、動物飼料または産業用途におけるこの油の使用、食物または動物飼料における副産物の使用にも関する。
【０２８５】
種子油を単離する方法は当技術分野でよく知られている（「脂質ハンドブック（Ｔｈｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」（ガンストーン（Ｇｕｎｓｔｏｎｅ）ら編）から（ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、「脂肪および油の加工（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｆａｔｓ  ａｎｄ  Ｏｉｌｓ）」、第５章、ｐ２５３〜２５７；Ｌｏｎｄｏｎ、Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ、１９９４）。
【０２８６】
次に改変された種子油は、栄養サプリメント、食品、乳児用調製粉乳、動物飼料、ペットフードなどの栄養組成物に添加できる。
【０２８７】
その他の植物油と比較して、本発明の油は物理的観点から食物用途においてその他の油と同様に機能すると考えられる。ダイズ油などの部分的に水素付加された油は、スプレッド、マーガリン、およびベーキングおよび揚げ物のためのショートニングの成分として広く使用される。
【０２８８】
その中に本発明の改変された種子油または改変された種子を組み込んでもよい食物製品または食物類似物の例としては処理済肉製品などの肉製品、シリアル食品、スナック食品、焼き菓子、揚げ物、健康食品、乳児用調製粉乳、飲料、栄養サプリメント、乳製品、ペットフード、動物飼料または水産養殖食品が挙げられる。食物類似物は、当業者にはよく知られているプロセスを使用して製造できる。米国特許第６,３５５,２９６  Ｂ１号明細書および米国特許第６,１８７,３６７  Ｂ１号明細書は、乳化肉類似物および乳化肉増量材について述べる。米国特許第５,２０６,０５０  Ｂ１号明細書は、調理済み食物類似物で有用なダイズタンパク質カードについて述べる（食物類似物を製造するのに有用なカードを形成するプロセスとしても使用できる）。ウァ（Ｈｗａ）に授与された米国特許第４,２８４,６５６号明細書は、食物類似物で有用なダイズタンパク質カードについて述べる。ヒバート（Ｈｉｂｂｅｒｔ）らに授与された米国特許第３,９８８,４８５号明細書は、スパン植物性タンパク質繊維から形成される肉様タンパク質食品について述べる。プスキ（Ｐｕｓｋｉ）らに授与された米国特許第３,９５０,５６４号明細書は、ダイズベースの肉代用品を製造するプロセスについて述べ、ラインハルト（Ｒｅｉｎｈａｒｔ）らに授与された米国特許第３,９２５,５６６号明細書は、擬似肉製品について述べる。例えば食物成分として使用するため、構造、チャンクまたは繊維を与えるように処理されたダイズタンパク質は、「テクスチャー加工ダイズタンパク質」（ＴＳＰ）と称される。ＴＳＰは水和時に構造および外見が、肉、海産食品、または家禽肉と似ているように作られることが多い。
【０２８９】
肉類似物、チーズ類似物、ミルク類似物などについても言及できる。
【０２９０】
ダイズからできた肉類似物は、共に混合されて様々な種類の肉をシミュレートする、ダイズタンパク質または豆腐およびその他の成分を含有する。これらの肉代用品は冷凍、缶詰または乾燥食品として販売される。通常、それらは代用する食物と同様に使用できる。ダイズからできた肉代用品は、タンパク質、鉄、およびＢビタミンの優れた供給源である。肉類似物の例としてはハム類似物、ソーセージ類似物、ベーコン類似物などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２９１】
食物類似物は、それらの機能および組成特性次第で、模造品または代用品として分類できる。例えば模造チーズは、それが置き換えるチーズと似ているようにデザインされていれば十分である。しかし製品は概して、それが置き換えるチーズと栄養的に同等であり、そのチーズの最小組成物要件を満たす場合にのみ、代用チーズと称されることができる。したがって代用チーズは模造チーズよりも高いタンパク質レベルを有し、ビタミンおよびミネラルが強化されることが多い。
【０２９２】
ミルク類似物または乳成分を含まない食品としては、模造ミルク、ダイズ、および／またはダイズタンパク質製品からできた乳成分を含まない冷菓などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２９３】
肉製品は、多種多様な製品を包含する。米国では「肉」は、牛、豚および羊からの「赤肉」製品を含む。赤肉に加えて、鶏、七面鳥、ガチョウ、ホロホロチョウ、アヒルをはじめとする家禽肉アイテム、そして魚および貝類がある。生、塩漬けフライ、および塩漬け調理済みなどの幅広い種類の調味および加工肉製品がある。ソーセージおよびホットドッグは、加工肉製品の例である。したがって「肉製品」という用語は、ここでの用法では、処理済肉製品を含むが、これに限定されるものではない。
【０２９４】
シリアル食品は、シリアル穀粒の加工から誘導される食品である。シリアル穀粒は、食用穀粒（種子）を生じるイネ科草本からのあらゆる植物を含む。最も人気の高い穀粒は、オオムギ、コーン、アワ、カラス麦、キノア、米、ライ麦、モロコシ、ライコムギ、コムギ、およびワイルドライスである。シリアル食品の例としては全粒粉、破砕穀粒、あらびき穀物、穀粉、ふすま、胚芽、朝食用シリアル、押出し食品、パスタなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２９５】
焼き菓子製品は、上で言及されたシリアル食品のいずれかを含んでなり、ベーキング、すなわち熱をかけることによって乾燥または硬化させるのと同等の様式で、焼かれまたは加工されている。焼き菓子製品の例としてはパン、ケーキ、ドーナツ、パン粉、ベークトスナック、ミニビスケット、ミニクラッカー、ミニクッキー、およびミニプレッツェルが挙げられるが、これに限定されるものではない。上で言及されるように、本発明の油が成分として使用できる。
【０２９６】
一般に、ダイズ油は、油含有種子からの食用油製品の抽出および精製を伴う一連のステップを使用して製造される。ダイズ油およびダイズ副産物は，下のダイアグラムに示す汎用ステップを使用して生産される。
【０２９７】
【表６】
2007515951.tif 000008
【０２９８】
ダイズ種子を清潔にし、テンパー、脱皮して、薄片にして油抽出効率を高める。油抽出は、通常溶剤（ヘキサン）抽出によって達成されるが、物理的圧力、および／または溶剤抽出の組み合わせによっても達成される。得られる油は粗製油と称される。リン脂質およびその他の極性および中性脂質複合体を水和させて、非水和トリグリセリド画分（ダイズ油）からの分離を容易にすることで、粗製油を脱ガムしてもよい。得られるレシチンガムをさらに加工して、乳化および剥離（抗粘着）剤として多様な食物および工業製品で使用される、商業的に重要なレシチン製品を製造してもよい。
【０２９９】
レシチンという用語それ自体は、化学および生化学で使用する場合、商業的に使用する場合とは異なる意味を有する。化学的にはレシチンはホスファチジルコリンである。商業的には、それは中性および極性脂質の天然混合物を指す。極性脂質であるホスファチジルコリンは、商業的レシチン中に２０〜９０％の濃度で存在する。ホスファチジルコリンを含有するレシチンは、植物、動物および微生物源から生成されるが、主に植物源からである。ダイズ、ヒマワリ、およびアブラナが商業的レシチンの主な植物源である。ダイズは最も一般的な供給源である。植物レシチンはＧＲＡＳ（概して安全と見なされる）とされる。主に遊離脂肪酸、顔料、および残留ガムなどの不純物除去のために、脱ガム油をさらに精製してもよい。精製は、遊離脂肪酸と反応して、粗製油中に石鹸およびホスファチド水和物およびタンパク質を形成する苛性剤の添加によって達成される。水を使用して精製中に形成された微量の石鹸を洗い流す。石鹸ストック副産物を動物飼料中で直接に使用してもよく、または酸性にして遊離脂肪酸を回収してもよい。色は、クロロフィルおよびカロテノイド化合物のほとんどを除去する漂白土による吸着を通じて除去される。精製油は水素付加でき、様々な融解特性およびテクスチャの脂肪が得られる。脱ろう（分画）を使用して、注意深く制御される冷却条件下での結晶化を通じて、水素付加された油からステアリンを除去してもよい。主に真空下の蒸気蒸留である脱臭は最終ステップであり、油に臭いまたは風味を与える化合物を除去するようにデザインされている。脱臭プロセス中にトコフェロールおよびステロールなどのその他の価値ある副産物を除去してもよい。これらの副産物を含有する脱臭された蒸留物は、天然ビタミンＥおよびその他の高価値医薬品製品生産のために販売されてもよい。精製され、漂白され（水素付加され、分画され）、脱臭された油および脂肪は、包装して直接販売してもよく、またはより特殊な製品にさらに加工してもよい。ダイズ種子加工、ダイズ油生成および副産物利用に関するより詳細な参考文献はエリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）、１９９５、「ダイズ加工および利用の実用的ハンドブック（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」、米国油化学会および米国大豆協議会にある。
【０３００】
ダイズ油は、ココナツ、ヤシ、パーム核、およびココアバターなどの油と比較すると飽和脂肪酸が比較的少ないので、室温で液体である。スプレッド、製菓用脂肪、硬質バター、マーガリン、ベーキングショートニングなどをはじめとする多くの加工脂肪は、室温で様々な程度の硬さを必要とし、ダイズ油からは、その物理特性の変性を通じてのみ製造できる。これは触媒的水素付加を通じて最も一般的に達成される。
【０３０１】
水素付加は、ニッケルなどの触媒の助けによって、不飽和脂肪酸二重結合に水素が付加される化学反応である。不飽和オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸脂肪酸、そしてこれらのそれぞれを含有する高オレイン酸ダイズ油は、水素付加できる。水素付加は、２つの主な効果を有する。第１に不飽和脂肪酸含量減少の結果として油の酸化安定性が増大する。第２に脂肪酸変化が融点を上昇させるため油の物理特性が変化して、室温において半液体または固形脂肪が得られる。
【０３０２】
水素付加反応に影響する多くの変数があり、それは次に最終生成物の組成を変更する。圧力、温度、触媒タイプおよび濃度、撹拌および反応器デザインをはじめとする操作条件は、制御できるより重要なパラメータである。選択的水素付加条件を使用して、不飽和性がより低いものに優先して、より不飽和性が高い脂肪酸に水素付加できる。非常に軽いまたはブラシ水素付加がしばしば用いられて、液体油の安定性を増大させる。さらに水素付加は、液体油を物理的に固形の脂肪に転換する。水素付加の程度は、特定の最終製品のためにデザインされた所望の性能および融解特性に左右される。ベーキング製品の製造で使用される液体ショートニング、商業的揚げ物および焙焼操作のために使用される固形脂肪およびショートニング、そしてマーガリン製造のためのベースストックが、水素付加を通じて得られる無数の可能な油および脂肪製品の例である。水素付加および水素付加された製品のより詳細な説明は、パターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ），Ｈ．Ｂ．Ｗ．、１９９４、「脂肪および油の水素付加：理論と実践（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｔｓ  ａｎｄ  Ｏｉｌｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、米国油化学会、にある。
【０３０３】
水素付加された油はまた、水素付加プロセスから帰結するトランス脂肪酸異性体の存在のために物議を醸している。トランス異性体の大量摂取は、血清中の低密度−対−高密度リポタンパク質の比率の増大、および冠動脈心疾患リスク増大をはじめとする健康に対する悪影響と関連づけられている。
【０３０４】
スナック食品は、上または下で述べられる食品のいずれかを含んでなる。
【０３０５】
揚げ物食品は、上または下で述べられる揚げられた食品のいずれかを含んでなる。
【０３０６】
健康食品は、健康上の利点を与えるあらゆる食品である。多くの油料種子誘導食品は、健康食品と見なされてもよい。
【０３０７】
飲料は液体または乾燥粉末形態であることができる。
【０３０８】
例えば非炭酸飲料、フレッシュ、冷凍、缶入りまたは濃縮のフルーツジュース、味付きまたはプレーンミルク飲料などに言及できる。成人および乳児栄養ミルクは当技術分野でよく知られており、市販される（例えばシミュラック（Ｓｉｍｉｌａｃ）（登録商標）、エンジュア（Ｅｎｓｕｒｅ）（登録商標）、ジェヴィティ（Ｊｅｖｉｔｙ）（登録商標）、およびアボット・ラボラトリー（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のロス・プロダクツ部門（Ｒｏｓｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）からのアリメンタム（Ａｌｉｍｅｎｔｕｍ）（登録商標））。
【０３０９】
乳児用調製粉乳は、乳児および幼児に与える液体または水を加えてもとに戻す粉末である。それらは人乳代用品の役割を果たす。乳児用調製粉乳は乳児の唯一の栄養供給源であることが多いので、それらは乳児の食餌において特別な役割を有する。母乳は未だに乳児にとって最良の栄養物であるが、乳児用調製粉乳は、十分近い２番目に良い栄養物であるので乳児は、生きるだけでなくよく育つ。乳児用調製粉乳は、ますます母乳に近くなってきている。
【０３１０】
乳製品は、ミルク製品から誘導される。ミルク類似物、または乳成分を含まない生成物は、例えば上で述べたような豆乳のように、ミルク以外の供給源から誘導される。これらの製品としては、全乳、スキムミルク、ヨーグルトまたはサワークリームなどの発酵乳製品、クリーム、バター、コンデンスミルク、粉ミルク、コーヒーホワイトナー、コーヒークリーマー、アイスクリーム、チーズなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３１１】
ペットフード製品は、犬、猫、小鳥、爬虫類、魚、齧歯類などのペットに与えることが意図される製品である。これらの製品は、上のシリアルおよび健康食品と、ならびに肉および肉副産物と、ダイズタンパク質製品と、アルファルファ、オオアワガエリ、カラスムギまたはブロムグラス、野菜などをはじめとするがこれに限定されるものではない草および干し草製品を含むことができる。
【０３１２】
動物飼料は、七面鳥、鶏、牛、および豚などの動物に与えることが意図される製品である。上のペットフード同様、これらの製品は上に列挙したようなシリアルおよび健康食品、ダイズタンパク質製品、肉および肉副産物、および草および干し草製品を含むことができる。
【０３１３】
水産養殖飼料は、淡水または海水内の水生生物体、動物、および／または植物の繁殖、培養または飼育に関する養殖で使用することが意図される製品である。
【０３１４】
さらになお別の実施態様では、本発明は、このような植物の種子から得られる油を含む。
【０３１５】
さらになお別の態様では、本発明は、油料種子植物の成熟種子の全脂肪酸プロフィールを変更して、ω−３のω−６に対する比率が２を超える油を生成するための組換えコンストラクトに関し、前記油は２％を超えるエイコサペンタエン酸含量を有し、前記コンストラクトは、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部または一部をコードする単離された核酸断片、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄すると、（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸断片、
（ｃ）ＣｌｕｓｔａｌＶ法によるアライメントに基づいて、配列番号２、６、１０、１４、１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも４６．２％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする単離された核酸断片、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と完全に相補である単離された核酸断片
からなる群から選択される単離された核酸断片を含んでなり、前記単離された核酸断片は少なくとも１つの制御配列に作動的に結合する。
【０３１６】
また本発明は、それらのゲノム中に本発明の組換えコンストラクトを含んでなる、油料種子植物、植物細胞、植物組織、または植物部分に関する。本発明はまた、このような植物から得られる種子、これらの種子から得られる油、食物または動物飼料におけるこの油の使用、この油の加工から得られる副産物、および食物または動物飼料におけるこれらの副産物の使用にも関する。
【０３１７】
さらに本発明は、本発明の方法によって製造される微生物油を提供する。
【０３１８】
さらに別の態様では、本発明は、油料種子植物の種子中でエイコサペンタエン酸を生成して、２を超えるω−３のω−６に対する比率を有する油を製造する方法に関し、前記油は種子油の全脂肪酸含量の２％を超えるエイコサペンタエン酸含量を有し、前記方法は、
ａ）油料種子植物細胞を本発明の組換えコンストラクトで形質転換する工程と
ｂ）工程（ａ）の形質転換された植物細胞から油料種子植物を再生する工程と、
ｃ）種子油の全脂肪酸含量の少なくとも２％エイコサペンタエン酸を有する形質転換された植物を選択する工程
を含んでなる。
【０３１９】
さらに、本発明は、それらのゲノム中に本発明の組換えコンストラクトを含んでなる、油料種子植物、植物細胞、植物組織、または植物部分に関する。本発明はまた、このような植物から得られる種子、これらの種子から得られる油、食物または動物飼料におけるこの油の使用、この油の加工から得られる副産物、および食物または動物飼料におけるこれらの副産物の使用に関する。
【０３２０】
さらに本発明は、本発明の方法によって製造される微生物油を提供する。
【０３２１】
次に当業者によく知られている方法を使用して、キメラのΔ１５デサチュラーゼ遺伝子を含んでなる様々なプラスミドおよびベクターが、構築できる。例えば本技術についてはサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９、（以下「マニアティス」）、およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７）で述べられる。
【０３２２】
プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換するのに使用される方法に左右される。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を成功裏に形質転換、選択、および増殖させるために、プラスミドベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素について十分承知している。例えば通常用いられる終結シグナルは、ノパリンシンターゼプロモーターから、またはＣＡＭＶ  ３５Ｓプロモーターからのものである。使用されることが多い植物翻訳エンハンサーは、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）ω配列であり、さらに、イントロン（例えばトウモロコシのからのＳｈｒｕｎｋｅｎ遺伝子イントロン−１）の包含は、発現レベルを１００倍まで増大させることが示されている（メート（Ｍａｉｔ）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６：１４３〜１５６（１９９７）；ニ（Ｎｉ）、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ７：６６１〜６７６（１９９５））。追加的な制御要素としては、転写（ならびに翻訳）エンハンサーが挙げられる。
【０３２３】
好ましい発現ベクターについて上述した制御要素に加えて、選択可能な、および／またはスコア可能な標識を含んでなることもまたベクターにとって有用である。好ましくは標識遺伝子は、それによって適切な抗生物質を使用して、形質転換されていない細胞から形質転換された細胞を選択できる、抗生物質抵抗性遺伝子である。形質転換された植物細胞、カルス、植物組織、および植物の選択に有用な選択可能な標識遺伝子は、当業者によく知られている。例としてはアミノグリコシドネオマイシン、カナマイシン、およびパロマイシン抵抗性を与えるｎｐｔと、ハイグロマイシン抵抗性を与えるｈｙｇｒｏと、細胞がトリプトファンの代わりにインドール利用できるようにするｔｒｐＢと、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール利用できるようにするｈｉｓＤ（ハルトマン（Ｈａｒｔｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８０４７（１９８８））と、細胞がマンノースを利用できるようにするマンノース−６−リン酸塩イソメラーゼ（国際公開第９４／２０６２７号パンフレット）と、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（または「ＤＦＭＯ」、マクローニュ（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ）、「分子生物学現行通信（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８７））抵抗性を与えるＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）と、ブラストサイジンＳ抵抗性を与えるアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）からのデアミナーゼ（タムラ（Ｔａｍｕｒａ）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９  ２３３６〜２３３８（１９９５））が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３２４】
ルシフェラーゼをコードする遺伝子（ジャコミン（Ｇｉａｃｏｍｉｎ）、Ｐｌ．Ｓｃｉ．１１６：５９〜７２（１９９６）；シカンタ（Ｓｃｉｋａｎｔｈａ）、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７８：１２１（１９９６））、緑蛍光性タンパク質（ゲルデス（Ｇｅｒｄｅｓ）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８９：４４〜４７（１９９６））またはＲ−グルクロニダーゼ（ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３９０１〜３９０７（１９８７））などの有用なスコア可能な標識もまた当業者に知られており、市販される。この実施態様は、特にΔ１５デサチュラーゼを含んでなるベクターを含有する細胞、組織、および生物体の簡潔で迅速なスクリーニングのために有用である。
【０３２５】
用途によっては、Δ１５デサチュラーゼタンパク質を異なる細胞区画に誘導することが有用かもしれない。したがってそれらのコード領域に対する適切な細胞内標的配列の添加によって（および／または既に存在する標的配列を除去して）、上述のキメラ遺伝子をさらに変性してもよいことが想定された。これらの追加的標的配列としては、クロロプラスト輸送ペプチド（キーグストラ（Ｋｅｅｇｓｔｒａ）ら、Ｃｅｌｌ  ５６：２４７〜２５３（１９８９））、タンパク質を小胞体に誘導するシグナル配列（クリスピール（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．４２：２１〜５３（１９９１））、および核局在化シグナル（ライケル（Ｒａｉｋｈｅｌ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１００：１６２７〜１６３２（１９９２））が挙げられる。引用した参考文献はこれらのそれぞれの例を与えるが、一覧は網羅的でなく、本発明で有用なより多くの実用的標的シグナルが将来発見されるかもしれない。
【０３２６】
植物細胞宿主へのコンストラクト導入のための多様な技術が利用でき、当業者に知られている。これらの技術としては、形質転換作用因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはＡ．リゾジーン（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ）を用いたＤＮＡによる形質転換が挙げられる。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種のＴｉおよびＲｉプラスミドのバイナリータイプベクターを使用することが特に好ましい。Ｔｉ−誘導ベクターは、ダイズ、綿、菜種、タバコ、および米などの単子葉および双子葉植物をはじめとする多種多様な高等植物を形質転換する（パチオッティ（Ｐａｃｃｉｏｔｔｉ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：２４１（１９８５）；バーン（Ｂｙｒｎｅ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ,Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ８：３（１９８７）；スカピンダ（Ｓｕｋｈａｐｉｎｄａ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：２０９〜２１６（１９８７）；ローズ（Ｌｏｒｚ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１７８（１９８５）；ポトリカス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３（１９８５）；パーク（Ｐａｒｋ）ら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．３８（４）：３６５〜７１（１９９５）；ヒエイ（Ｈｉｅｉ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：２７１〜２８２（１９９４））。植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡの使用は広く研究されており、十分に説明されている（ＥＰ  １２０５１６号明細書；「バイナリー植物ベクターシステム（Ｔｈｅ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）」第５章より、フクマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）、Ｏｆｆｓｅｔ−ｄｒｕｋｋｅｒｉｊ  Ｋａｎｔｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ（１９８５）；「細菌−植物相互作用の分子遺伝学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）」、ピューラー（Ｐｕｈｌｅｒ），Ａ．編よりクナウフ（Ｋｎａｕｆ）ら、「アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による宿主域発現の遺伝分析（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｏｓｔ  Ｒａｎｇｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８３、ｐ２４５；およびアン（Ａｎ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２７７〜２８４（１９８５））。本発明のキメラ遺伝子は、実施例で述べられるように、植物への導入のためにバイナリーベクターに挿入できる。
【０３２７】
当業者は、１．）外来性ＤＮＡコンストラクトの直接取り込み（ＥＰ  ２９５９５９号明細書参照）、２．）電気穿孔技術（フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１９：７９１（１９８６）参照）、３．）核酸コンストラクトで被覆された金属粒子による高速弾道衝撃（クライン（Ｋｌｉｎｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０（１９８７）および米国特許第４,９４５,０５０号明細書）、または４．）微量注入（「植物への遺伝子移入（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ）」、ポトリカス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）およびシュパンゲンベルク（Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ）編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ、ＮＹ（１９９５）参照）などのその他の形質転換方法も利用できる。一般に使用される植物形質転換法のレビューはニューウェル（Ｎｅｗｅｌｌ），Ｃ．Ａ．（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：５３〜６５（２０００））を参照されたい。上述の方法でほとんどの双子葉植物の形質転換が可能である。しかし単子葉植物の成功裏の形質転換のために、追加的な形質転換技術が開発されている。これらとしては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を使用したインプランタ（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）法によるプロトプラスト形質転換および形質転換が挙げられる。このインプランタ（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）法（ベッヒトルト（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ）およびペレティエ（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ），Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ、３１６：１１９４（１９９３）；またはクロフ（Ｃｌｏｕｇｈ）Ｓ．Ｊ．、ベント（Ｂｅｎｔ）Ａ．Ｆ．；Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ１６（６）：７３５〜４３（１９９８））では、発達中の花芽外側へのＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の塗布、次に発達中の小胞子、および／または大胞子、および／または発達中の種子へのバイナリーベクターＤＮＡの導入によって、サイトカイニン、および／またはジベレリンの外来性塗布なしに形質転換された種子を生成する。当業者は、このような手順で使用するための組織の選択が様々であることを承知している。しかしインプランタ（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）形質転換手順のためには、概して接合体形成段階の植物材料を使用することが好ましい。
【０３２８】
ひとたび形質転換すると、植物組織からの植物再生のための多様な方法がある。特定の再生方法は、開始植物組織および再生する特定の植物種に左右される。単一植物プロトプラスト形質転換体から、または様々な形質転換された外植片からのからの植物の再生、発達、および培養は、当技術分野でよく知られている（「植物分子生物学法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」ワイスバハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）およびワイスバハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）編、Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、（１９８８））。特に関連があるのは、アブラナなどの商業的に重要な油料種子作物に外来性遺伝子を形質転換する方法である（デブロック（Ｄｅ  Ｂｌｏｃｋ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：６９４〜７０１（１９８９）；米国特許第５,４６３,１７４号明細書参照）、ヒマワリ（エヴェレット（Ｅｖｅｒｅｔｔ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：１２０１（１９８７））、ダイズ（マッケーブ（ＭｃＣａｂｅ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３（１９８８）；ヒンチー（Ｈｉｎｃｈｅｅ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９１５（１９８８）；チー（Ｃｈｅｅ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：１２１２〜１２１８（１９８９）；クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ８６：７５００〜５０４（１９８９）；ＥＰ３０１７４９号明細書；米国特許第５,５６９,８３４号明細書；米国特許第５,４１６,０１１号明細書）、およびコーン（ゴードン−カム（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３〜６１８（１９９０）；フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３〜８３９（１９９０））。
【０３２９】
典型的に、生育してカルスになるトランスジェニック細胞の選択のために、トランスジェニック植物細胞を適切な選択的培地に入れる。カルスから芽が生育し、発根培地で生育させることで芽から小植物が生じる。植物細胞における選択のために、様々なコンストラクトが常態では標識と結合される。標識が都合良く、殺生剤（特にカナマイシンなどの抗生物質、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、除草剤など）に抵抗性であってもよい。使用される特定の標識は、導入されたＤＮＡが欠けている細胞に照らして、形質転換された細胞の選択を可能にする。
【０３３０】
当業者は、植物中の導入遺伝子の発現レベルおよび制御が、系統毎に顕著に異なることができることを認識する。したがっていくつかの系統を試験して、所望の発現レベルおよび制御があるものを見つけなくてはならない。当業者は、異なる独立した形質転換イベントが、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらすので（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１〜２４１８（１９８５）；デアルメイダ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８〜８６（１９８９））、所望の発現レベルおよびパターンを示す系統を得るためには、複数イベントをスクリーンしなくてはならないこともまた認識する。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロチェック（Ｋｒｏｃｚｅｋ）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１〜２）：１３３〜１４５（１９９３））、タンパク質発現のウェスタン分析または表現型分析によって達成してもよい。タンパク質発現を定量化し、異なる植物組織内の複製を検出するのに特に有用な１つの方法は、レポーター遺伝子（例えばＧＵＳ）を使用することである。ひとたびトランスジェニック植物が得られると、それらを生育させて、所望の表現型を有する植物組織または部分を生成してもよい。植物組織または植物部分を収穫し、および／または種子を採取してもよい。種子は、所望の特性を有する組織または部分がある追加的植物の生育源の役割を果たすかもしれない。
【０３３１】
上で考察したように、種子油を単離する方法は当技術分野でよく知られている（「脂肪ハンドブック（Ｔｈｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」、ガンストーン（Ｇｕｎｓｔｏｎｅ）ら編より、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ：Ｌｏｎｄｏｎ、１９９４；ｐ２５３〜２５７）。次に改変された種子油は，様々な栄養組成物中で使用できる（例えば栄養サプリメント、食品、乳児用調製粉乳、動物飼料、ペットフードなど）。
【０３３２】
ここで述べられる研究の究極の目標は、ω−３  ＰＵＦＡが豊富な油を蓄積する生物体の開発であり、１つの好ましい宿主は油性植物または油性酵母である。このような目的で、これらの宿主において好ましいω−３  ＰＵＦＡの合成および大量蓄積を可能にする、効率的に機能するデサチュラーゼを同定しなくてはならない。宿主細胞中で生成されるω−３のω−６  ＰＵＦＡに対する比率の操作のために、効率的なΔ１５およびω−３デサチュラーゼの同定もまた必要である。
【０３３３】
以前の研究で、天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼが単離されており、このタンパク質が過剰発現され、野生型細胞に対して増大しているオレイン酸からＬＡへの転換が得られている（参照によってその全体をここに援用する米国特許出願第１０／８４０３２５号明細書、ここでの実施例２および配列番号５４および５５もまた参照されたい）。しかしこれらの宿主細胞内のＬＡの増大した可用性にもかかわらず、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体細胞内で、多様なω−３  ＰＵＦＡ（例えばＥＰＡ）の高レベル生成を可能にするのに適した、さらにより大きい基質プールを得ることが望ましかった。したがって高レベルのΔ１５デサチュラーゼ活性を有する異種タンパク質の発現は、生物体の経路エンジニアリングにおいて有利であった。植物源から以前に単離されたΔ１５デサチュラーゼは、油性酵母中で効率的に機能することが予想されなかったので、真菌Δ１５デサチュラーゼを単離することが本発明の目的であった。この真菌デサチュラーゼの過剰発現が、油性酵母宿主内のＡＬＡの基質プールを増大させ、それによってこれらの宿主における好ましいω−３  ＰＵＦＡ（例えばＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡ）の合成および多量蓄積が可能になることが予想された。増大したΔ１５デサチュラーゼ活性はまた、ω−３のω−６  ＰＵＦＡに対する比率の変更を可能にする。
【０３３４】
これらの目標を達成するために、本発明で出願人は、Δ１５デサチュラーゼ酵素をコードするフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）からＤＮＡ断片を単離およびクローンした（「Ｆｍ１」、配列番号１および２）。Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Ｆｍ１デサチュラーゼを含んでなるキメラ遺伝子による形質転換時における、野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞中でのＡＬＡ生成に基づいて、Δ１５デサチュラーゼとしてのこの遺伝子の活性の確認が得られた（実施例５では、［１８：３］／［１８：２＋１８：３］＊１００）で計算した基質転換百分率は８２．５％）。
【０３３５】
しかし意外にも、Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼはまた、以前に知られているΔ１５デサチュラーゼと比較していくつかのユニークな特性も有する。具体的には、Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼの新しい配列に加えて、それは顕著なΔ１２デサチュラーゼ活性（すなわち酵素基質としてオレイン酸を使用する能力を有する）、％ＡＬＡ生成物蓄積、および幅広い基質特異性によっても特徴付けられる。
【０３３６】
顕著なΔ１２デサチュラーゼ活性
実施例で示されるように、ここで開示されるフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ（Ｆｍ１）は、顕著なΔ１２デサチュラーゼ活性（表９、実施例５参照）を有し、そこでは配列番号２をコードするキメラ遺伝子で形質転換された、Δ１２デサチュラーゼが中断されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株が、９６％のＬＡをＡＬＡに転換する（［１８：３］／［１８：２＋１８：３］＊１００）として基質転換百分率が計算される）のに加えて、２４％のオレイン酸をＬＡに転換できた（（［１８：２＋１８：３］／［１８：１＋１８：２＋１８：３］）＊１００として基質転換百分率が計算される）。この二機能性は、あらゆるその他の知られているΔ１５デサチュラーゼに比べて著しく異なる。そしてデサチュラーゼは１つを超える基質に対する特異性で知られているが、Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）デサチュラーゼの二機能性（タンパク質がΔ１２およびΔ１５デサチュラーゼ活性の双方を有する）は、これまでに同定されたあらゆる既知のΔ１２またはΔ１５脂肪酸デサチュラーゼとも区別される。
【０３３７】
％ＡＬＡ生成物蓄積
ここで開示されるフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼは、その他の異種性発現（例えば蠕虫および植物）されたΔ１５デサチュラーゼについて述べられたものと比べて、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で発現するとＡＬＡの極めて高い合成が可能になる。具体的にはフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）酵素は非常に活性であった（すなわち配列番号２をコードするキメラ遺伝子で形質転換されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、形質転換体宿主細胞中の全脂肪酸に対して３１％のＡＬＡの％生成物蓄積を実証できた（表９、実施例５参照））。これは８３％のＡＬＡへの転換効率を表す（［１８：３］／［１８：２＋１８：３］＊１００として計算される）。配列番号２をコードするキメラ遺伝子で形質転換されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のΔ１２デサチュラーゼ−中断株では、ＡＬＡへの９６％の転換効率が実証された。対照的に非油性酵母サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）Δ１５デサチュラーゼを発現した場合のＡＬＡの％生成物蓄積はわずか４．１％であり（ミーサプヨズク（Ｍｅｅｓａｐｙｏｄｓｕｋ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１１９４８〜１１９５４（２０００））、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でＢ．ナパス（Ｂ．ｎａｐｕｓ）Δ１５デサチュラーゼを発現した場合のＡＬＡの％生成物蓄積はわずか１．３％であった（リード（Ｒｅｅｄ），Ｄ．Ｗ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２２：７１５〜２０（２０００））。
【０３３８】
特にＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のΔ１２デサチュラーゼ−中断株における、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼの高い効率は、Δ１２不飽和化の生成物がΔ１５デサチュラーゼの基質である、タンパク質の二機能的なΔ１２およびΔ１５デサチュラーゼ活性の結果である。当業者は、１８：２を合成する能力をほとんどまたは全く有さない宿主生物体（例えば油性酵母のΔ１２デサチュラーゼ−ｎｕｌｌ系統、またはアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｆａｄ２変異体）中でここで開示される酵素を発現することで、１８：３／１８：２の比率が最大化できることを認識するであろう。
【０３３９】
幅広い基質特異性
最後に、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５酵素は、１８：２の下流ω−６誘導体に対して比較的幅広い基質特異性を有する。具体的にはここで述べられるΔ１５デサチュラーゼは、ＧＬＡからＳＴＡ、ＤＧＬＡからＥＴＡ、およびＡＲＡからＥＰＡへの転換を触媒できる。しかしＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における蠕虫（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））および植物（Ｂ．ナパス（Ｂ．ｎａｐｕｓ）Δ１５デサチュラーゼ（ミーサプヨズク（Ｍｅｅｓａｐｙｏｄｓｕｋ）ら、前出；リード（Ｒｅｅｄ）ら、前出）の非相同発現とは対照的に、出願人のここでのデータは、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼがヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中で発現した際に、ω−６基質をそれらのω−３対応物にはるかにより効率的に、すなわちより高い基質転換百分率で転換することを実証する（表４）。
【０３４０】
【表７】
2007515951.tif 000009
【０３４１】
したがって本発明の真菌Δ１５デサチュラーゼの非相同発現は、ＡＬＡの生合成を高めることで、ω−３脂肪酸生合成経路内への細胞炭素の流れを増大させる。その結果、ここでのΔ１５デサチュラーゼと共にその他のＰＵＦＡ生合成酵素が同時発現すると、ω−３／ω−６脂肪酸比が増大してより下流のω−３脂肪酸（例えばＳＴＡ、ＥＴＡおよびＥＰＡ）の生成が可能になる。本発明のΔ１５デサチュラーゼが発現されるあらゆる微生物で、これらの結果が生じることが予想される。代案の実施態様では、出願人は、植物油料種子宿主におけるフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼの過剰発現によって、同様の結果を実証した。したがってあらゆる宿主細胞における本フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼの発現は、宿主細胞が全脂肪酸の約１０％を超えるレベルでＡＬＡを生成できるようにすることが予想され、そこでは約３０％を超えるレベルが好ましく、約５０％を超えるレベルが最も好ましい。同様にこのような形質転換体はＡＬＡのＬＡに対する改変された比率を実証し、そこでは少なくとも約４のＡＬＡ：ＬＡ比が典型的であり、少なくとも８の比率が好ましく、少なくとも１２の比率が最も好ましい。これらの形質転換体から抽出された微生物油は約１０％を超えるＡＬＡを含有し、約３０％を超えるＡＬＡが等しく予想され、５０％を超えるＡＬＡが典型的であることが予想される。
【０３４２】
さらに出願人は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、およびフザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）から、上述のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）タンパク質に対する一揃いのΔ１５デサチュラーゼオルソロガスも同定した（すなわちそれぞれ配列番号６、１４、１０、および１８）。これらの真菌タンパク質もまた、油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））をはじめとする異なる宿主細胞におけるΔ１５デサチュラーゼ活性発現のために、有用であることが予想された。これらのタンパク質（フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ（配列番号２）を含む）は、明確なタンパク質亜科（ここで「亜科１」と称される）にクラスター化し、ここで配列番号５５として同定された（同時係属米国特許出願第１０／８４０３２５号明細書で特徴付けられた）Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼに相同的とされる全タンパク質の同定にもかかわらず、それは「亜科２」にクラスター化するタンパク質（すなわち配列番号４、８、１２、１６、および２０、同時係属米国仮特許出願第６０／５７０６７９号明細書でΔ１２デサチュラーゼとして同定された）とははっきり区別される。全体的に、亜科１タンパク質は、互いに少なくとも４６．２％の同一性であるタンパク質群（ここでΔ１５デサチュラーゼとして同定された）に相当し（実施例３）、配列相同性によって、以前に述べられたΔ１５デサチュラーゼからはっきり区別される。
【０３４３】
それらのΔ１５デサチュラーゼとしての活性を確認する、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）タンパク質の特徴付けについては、国際公開第０３／０９９２１６号パンフレットで述べられている。推定上のマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）Δ１５デサチュラーゼ（「Ｍｇ１」、配列番号９および１０）遺伝子のΔ１５デサチュラーゼとしての活性の確認は、Ｍｇ１を含んでなるキメラ遺伝子での形質転換時における、野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞中のＡＬＡの生成に基づいてここで提供される（実施例６）。しかし上述のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ活性と、これらのΔ１５デサチュラーゼ活性の比較からは、亜科１のΔ１５デサチュラーゼタンパク質の全てが、二機能的なΔ１２／Δ１５デサチュラーゼ活性を有するとして特徴付けされないことが明らかになった。具体的には、国際公開第２００３／０９９２１６号パンフレットで提供される結果に基づいて、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）タンパク質は、二機能的なΔ１２／Δ１５デサチュラーゼ活性を示さなかった。対照的にマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）タンパク質は、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）タンパク質と同様に挙動したので、両者は二機能的なΔ１２／Δ１５デサチュラーゼ活性を有するとして分類された。二機能的なＦｍ１とＭｇ１は６０．９％のみ同一であるのに対し、Ｆｇ１はＦｍ１と最も近縁（８８．８％同一）であるので、フザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）（「Ｆｇ１」、配列番号１７および１８）もまた、二機能的なΔ１２／Δ１５デサチュラーゼ活性を有することが仮定される。
【０３４４】
このユニークなクラスの真菌Δ１５デサチュラーゼは、それらが高い効率（すなわち基質転換百分率、ＬＡからＡＬＡへの少なくとも約５０％の基質転換百分率が有用であり、ＡＬＡへの少なくとも約８０％の転換効率が好ましく、ＡＬＡへの少なくとも約９０％の基質転換百分率が特に適切であり、ＡＬＡへの少なくとも約９５％の基質転換百分率が最も好ましい）で機能するという予想に基づいて、脂肪酸組成を変更する手段として、油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））および植物における発現のために有用であることが予想された。したがって本発明の一実施態様は、油性酵母において脂肪酸プロフィールを変更する方法であり、そこでは亜科１のΔ１５デサチュラーゼタンパク質が、単独またはその他の脂肪酸生合成遺伝子（例えばΔ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、および／またはエロンガーゼ）との組み合わせで発現する。第２の実施態様は、植物において脂肪酸プロフィールを変更する方法であり、そこでは亜科１のΔ１５デサチュラーゼタンパク質が単独またはその他の脂肪酸生合成遺伝子との組み合わせで発現して、油中のω−３：ω−６比を変更し、および／または植物ＰＵＦＡの蓄積または組成を変更する。
【実施例】
【０３４５】
以下の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を示すが、例証のためにのみ提供されることを理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特性を確認でき、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更と修正を実施して、それを様々な用途と条件に適合させることができる。
【０３４６】
一般方法
実施例で使用する標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当技術分野でよく知られており、１．）サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）「Ｔ．分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、２．）Ｔ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８４）、および３．）オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｇｒｅｅｎｅ  ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版；１９８７）で述べられる。
【０３４７】
細菌培養の維持および生育に適した材料および方法は、当技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、次で述べられる。「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、フィリップス・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）または２．）トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）著、バイオテクノロジー：工業的微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第二版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１９８９）。細菌細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ））、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））、メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））から得た。
【０３４８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エレクトロマックス（Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ）ＤＨ１０Ｂ細胞は、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αのマックスエフィシェンシー（Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）コンピテント細胞は、メリーランド州ゲーサーズバーグのＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）コンピテント細胞は、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン社（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））から購入した。全ての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的にルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）プレート上で３７℃で生育させた。
【０３４９】
一般分子クローニングは、標準法に従って実施された（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、同上）。オリゴヌクレオチドはシグマジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ、テキサス州スプリング（Ｓｐｒｉｎｇ、ＴＸ））によって合成された。ＰＣＲ生成物は、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローンした。
【０３５０】
ＤＮＡ配列は、ベクターと挿入特異性プライマーの組み合わせを使用して、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、ＥＰ２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩ自動シーケンサー上に生成した。ミシガン州アンアーバーのジーンコーズ社（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）中で配列編集を実施した。全配列は、双方向で少なくとも２回のカバレッジを示す。遺伝的配列の比較は、ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して達成された。
【０３５１】
略語の意味は以下の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」マイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０３５２】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の培養
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ番号７６９８２およびＡＴＣＣ番号９０８１２は、メリーランド州ロックビルの米国微生物系統保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））株は、通常、２８℃においてＹＰＤ寒天（１％酵母菌抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）上で生育させた。形質転換体選択のために最少培地（ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））からの硫酸アンモニウムを含まない、そしてアミノ酸を含まない０．１７％酵母菌窒素ベース、２％グルコース、０．１％プロリン、ｐＨ６．１）を使用した。適切ならばアデニン、ロイシン、リジン、および／またはウラシル・サプリメントを最終濃度０．０１％に添加した。
【０３５３】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
ブライ（Ｂｌｉｇｈ）Ｅ．Ｇ．およびダイヤー（Ｄｙｅｒ）Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７（１９５９））で述べられるように、脂肪酸分析のために細胞を遠心分離し収集して脂質を抽出した。ナトリウムメトキシド（ローガン（Ｒｏｕｇｈａｎ）Ｇ．およびニシダ（Ｎｉｓｈｉｄａ）Ｉ．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８〜４６（１９９０））による脂質抽出物のエステル交換反応によって、脂肪酸メチルエステルを調製し、３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを装着したヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０  ＧＣで引き続き分析した。オーブン温度は１７０℃（２５ｍｉｎ保持）から１８５℃に３．５℃／ｍｉｎで上昇させた。
【０３５４】
直接塩基エステル転移反応のためには、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ｃｕｌｔｕｒｅ（３ｍＬ）を採取し、蒸留水中で１回洗浄して、スピードバック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）内で５〜１０分、真空下で乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μｌの１％）をサンプルに添加して、次にサンプルをボルテックスし、２０分振盪した。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌおよび４００μｌヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスし遠沈した。上層を除去して、上述のようにＧＣで分析した。
【０３５５】
実施例１
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）発現ベクターの構築
本実施例は、ｐＹ５−１３（キメラのＴＥＦプロモーター：：ＸＰＲターミネーター遺伝子を含んでなる）、ｐＹ５−１３ＧＰＤＮ（キメラのＧＰＤプロモーター：：ＸＰＲターミネーター遺伝子を含んでなる）、およびｐＹ５−２０（キメラのハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含んでなる）の構築について述べる。
【０３５６】
プラスミドｐＹ５−１３の構築
ｐＩＮＡ５３２の誘導体であるプラスミドｐＹ５（Ｉｎｓｉｔｕｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｃｓ、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＡｇｒｏＩｎｄｕｓｔｒｉｅｌｌｅ、ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ  Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  ｅｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒｉｅ  ＩＮＲＡ−ＣＮＲＳ、Ｆ−７８８５０、Ｔｈｉｖｅｒｖａｌ−Ｇｒｉｇｎｏｎ、Ｆｒａｎｃｅのクロード・ガィヤルダン（Ｃｌａｕｄｅ  Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ）博士からの贈与）をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における異種性遺伝子発現のために構築した（図３）。
【０３５７】
最初に、ｐＩＮＡ５３２のＡＲＳ１８配列およびＬＥＵ２遺伝子を含有する部分的に消化された３５９８ｂｐのＥｃｏＲＩ断片をカリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））からのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしてｐＹ２を生成した。ＴＥＦ５’（配列番号２１）およびＴＥＦ３’（配列番号２２）をプライマーとして使用して、ＰＣＲによりヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムのＤＮＡからＴＥＦプロモーターを増幅した（ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）Ｓ．ら、Ｙｅａｓｔ、１４：１２６７１２８３（１９９８））。
【０３５８】
１００ｎｇのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡと、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（最終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液と、各２００μＭのデオキシリボヌクレオチド三リン酸と、１０ｐｍｏｌｅの各プライマーと、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））からの１μＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼとを含有する、５０μＬの総容積でＰＣＲ増幅を実施した。増幅は以下のように実施した。９５℃で３ｍｉｎの初期変性、続いて９５℃で１ｍｉｎ、５６℃で３０ｓｅｃ、７２℃で１ｍｉｎを３５サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルを実施し、続いて４℃での反応終結。４１８ｂｐのＰＣＲ生成物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔにライゲーションしてｐＩＰ−ｔｅｆを生成した。ｐＩＰ−ｔｅｆのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ断片をｐＹ２のＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ部位にサブクローニングして、ｐＹ４を生成した。
【０３５９】
テンプレートとしてｐＩＮＡ５３２、プライマーとしてＸＰＲ５’（配列番号２３）およびＸＰＲ３’（配列番号２４）を使用して、ＰＣＲによってＸＰＲ２転写ターミネーターを増幅した。上述の構成要素および条件を使用して、ＰＣＲ増幅を５０μＬの総容積中で実施した。１７９ｂｐのＰＣＲ生成物をＳａｃＩＩで消化し、ｐＹ４のＳａｃＩＩ部位にライゲーションしてｐＹ５を生成した。したがってｐＹ５（図３に示す）は、以下を含有するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルプラスミドとして有用である。
１．）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自律性複製配列（ＡＲＳ１８）、
２．）ＣｏｌＥ１プラスミド複製起点、
３．）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択のためのアンピシリン−抵抗性遺伝子（ＡｍｐＲ）、
４．）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における選択のためのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＬＥＵ２遺伝子、
５．）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における異種性コード領域発現のための翻訳延長プロモーター（ＴＥＦ）、および
６．）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の異種性遺伝子発現の転写終結のための細胞外のプロテアーゼ遺伝子ターミネーター（ＸＰＲ２）。
【０３６０】
ｐＹ５−１３をｐＹ５の誘導体として構築して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のサブクローニングおよび異種性遺伝子発現を容易にした。
【０３６１】
具体的にはｐＹ５をテンプレートとして使用して、６ラウンドの部位特異的変異誘発により、ｐＹ５−１３を構築した。オリゴヌクレオチドＹＬ５およびＹＬ６（配列番号２５および２６）を使用して、部位特異的変異誘発によってＳａｌＩおよびＣｌａＩ部位の双方をｐＹ５から除去し、ｐＹ５−５を生成した。オリゴヌクレオチドＹＬ９およびＹＬ１０（配列番号２７および２８）を使用して、部位特異的変異誘発によってＳａｌＩ部位をＬｅｕ２遺伝子とＴＥＦプロモーターの間でｐＹ５−５に導入し、ｐＹ５−６を生成した。オリゴヌクレオチドＹＬ７およびＹＬ８（配列番号２９および３０）を使用して、ＰａｃＩ部位をＬＥＵ２遺伝子とＡＲＳ１８との間でｐＹ５−６に導入し、ｐＹ５−８を生成した。オリゴヌクレオチドＹＬ３およびＹＬ４（配列番号３１および３２）を使用して、ＡＮｃｏＩ部位をＴＥＦプロモーターの翻訳開始コドン周囲でｐＹ５−８に導入し、ｐＹ５−９を生成した。ＹＬ１およびＹＬ２オリゴヌクレオチド（配列番号３３および３４）を使用して、ｐＹ５−９のＬｅｕ２遺伝子の内側のＮｃｏＩ部位を除去し、Ｙ５−１２を生成した。最後に、オリゴヌクレオチドＹＬ６１およびＹＬ６２（配列番号３５および３６）を使用して、ＢｓｉＷＩ部位をＣｏｌＥＩとＸＰＲ領域との間でｐＹ５−１２に導入し、ｐＹ５−１３を生成した。
【０３６２】
プラスミドｐＹ５−１３ＧＰＤＮの構築
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ２１１（配列番号３８）およびＹＬ２１２（配列番号３９）で、グリセルアルデヒド−３−リン酸塩−デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーター領域（「ＧＰＤＰｒｏ」参照によってその全体をここに援用する同時係属米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書参照）を含むＤＮＡ断片を増幅した。簡単に述べると、このプロモーター断片（配列番号３７）はＧＰＤ遺伝子の−９６８〜＋３領域間のヌクレオチド領域を含んでなり、そこでは「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの「Ａ」位置は＋１とされる。
【０３６３】
増幅されたＧＰＤＰｒｏ  ＤＮＡ断片をＳａｌＩで完全に消化して、次にＮｃｏＩで部分的に消化した。１％（ｗ／ｖ）アガロース中でのゲル電気泳動法に続いて、ＧＰＤＰｒｏを含有するＳａｌＩ／ＮｃｏＩ断片を精製し、ＮｃｏＩ／ＳａｌＩ消化したｐＹ５−１３ベクター（ＮｃｏＩ／ＳａｌＩ消化はｐＹ５−１３ベクター主鎖からＴＥＦプロモーターを切除する）にライゲートして、ｐＹ５−１３ＧＰＤを得た。したがってｐＹ５−１３ＧＰＤは、ＧＰＤＰｒｏ：：ＸＰＲターミネーター発現カセットを含んでなった。
【０３６４】
ｐＹ５−１３ＧＰＤ中のプロモーター断片の３’末端のＮｃｏ  Ｉ部位をＮｏｔ  Ｉ部位に転換して、ｐＹ５−１３ＧＰＤＮを得た。このためにはＮｏｔ  Ｉ部位があるＧＰＤセンス（配列番号４０）およびＧＰＤアンチセンス（配列番号４１）プライマーを使用して、ＰＣＲによってＧＰＤＰｒｏを再増幅した。得られたプロモーター断片をＳａｌ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化し、ｐＹ５−１３のＳａｌ／ＮｏｔＩ部位にクローンして（それによってＴＥＦプロモーターを除去し）、ｐＹ５−１３ＧＰＤＮを生成した。
【０３６５】
プラスミドｐＹ５−２０の構築
プラスミドｐＹ５−２０はｐＹ５の誘導体である。これは、キメラのハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含有するＮｏｔ  Ｉ断片をｐＹ５のＮｏｔ  Ｉ部位に挿入して構築された。キメラ遺伝子は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＴＥＦプロモーターの制御下にあるハイグロマイシン抵抗性ＯＲＦを有した。
【０３６６】
実施例２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼのクローニングおよび内在性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の中断
生物体がＬＡ（１８：２）を作れるがＡＬＡ（１８：３）を作れないことを実証する、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ番号７６９８２）の脂肪酸組成に基づいて、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）がおそらく、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するが、Δ１５デサチュラーゼ活性は有さない遺伝子を含有することが想定された。したがって本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼの部分的コード配列を単離するための変性ＰＣＲプライマーの使用、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の天然遺伝子を中断するための部分的配列の使用、および引き続く遺伝子全長のクローニングについて述べる。
【０３６７】
変性ＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲによるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの部分的推定Δ１２デサチュラーゼ配列のクローニング
ＤＮイージー（ＤＮｅａｓｙ）組織キット（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号６９５０４）を使用して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ番号７６９８２）からゲノムＤＮＡを単離し、ＤＮＡ濃度０．５μｇ／μｌでキット緩衝液ＡＥ中に再懸濁した。ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、および異なるΔ１２デサチュラーゼ間で保存されたアミノ酸配列に対して作られた数組の変性プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。それぞれ下の表で示されるように、上方および下方変性プライマーＰ７３およびＰ７６の組によって最良の結果を得た。
【０３６８】
【表８】
2007515951.tif 000010
【０３６９】
製造業者の推奨に従って、エッペンドルフマスターサイクラー勾配サーモサイクラー内でＰＣＲを実施した。増幅を以下のようにして実施した。９５℃で１ｍｉｎの初期変性、それに続いて９５℃で３０ｓｅｃの変性、５８℃で１ｍｉｎのアニール、および７２℃で１ｍｉｎの延長を３０サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルを実施し、それに続いて４℃での反応終結。
【０３７０】
アガロース・ゲル電気泳動法によって、予想された（約７４０ｂｐ）サイズのＰＣＲ生成物を検出して単離、精製し、ｐＴＡベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中にクローンし、配列決定した。ＢＬＡＳＴプログラム分析（基本的局在性整合検索ツール；アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３））に基づいて、得られた配列は既知のΔ１２デサチュラーゼと相同性を有した。
【０３７１】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の標的を定めた中断
ｐＹ２３Ｄ１２と命名した標的とするカセットによるΔ１２デサチュラーゼ遺伝子の相同的遺伝子組換え媒介置換によって、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２中のΔ１２デサチュラーゼ遺伝子の標的を定めた中断を実施した。ｐＹ２３Ｄ１２はプラスミドｐＹ５−２０から誘導された（実施例１）。
【０３７２】
具体的にはｐＹ２３Ｄ１２は、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片を同様に直線化されたｐＹ５−２０中に挿入して作り出された。この６４２ｂｐの断片は（５’〜３’に向けて）以下から構成された。（配列番号５４中のコード配列（ＯＲＦ）の）位置＋７１８〜＋１０３１の３’相同配列、（配列番号５４中のコード配列（ＯＲＦ）の）位置＋４０３〜＋７１７のＢｇｌＩＩ制限部位、および５’相同配列。ＰＣＲプライマーＰ９９およびＰ１００（配列番号４６および４７）およびＰ１０１およびＰ１０２（配列番号４８および４９）のそれぞれの組を使用して、６４２ｂｐのＰＣＲ生成物からの３’および５’配列のＰＣＲ増幅によって断片を調製した。
【０３７３】
ＢｇｌＩＩ制限酵素消化によってｐＹ２３Ｄ１２を直線化し、チェン（Ｃｈｅｎ）Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５（１９９７））の方法に従った酢酸リチウム法によって、対数中期Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２細胞に形質転換した。手短に述べると、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）をＹＰＤプレート上に画線して、３０℃でおよそ１８時間生育させた。いくつかの大型白金耳を満たす細胞をプレートからこすり取り、以下を含有する１ｍＬの形質転換緩衝液に再懸濁した。
２．２５ｍＬの５０％ＰＥＧ、平均分子量３３５０、
０．１２５ｍＬの２Ｍ酢酸Ｌｉ、ｐＨ６．０、
０．１２５ｍＬの２Ｍ  ＤＴＴ、および
５０μｇの剪断サケ精子ＤＮＡ。
【０３７４】
１００μＬの再懸濁細胞中で約５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを培養して３９℃に１時間保ち、１５ｍｉｎ間隔でボルテックス混合した。細胞をＹＰＤハイグロマイシン選択プレート上に接種して、３０℃に２〜３日間保った。
【０３７５】
４個のハイグロマイシン抵抗性コロニーを単離し、ＰＣＲによって標的を定めた中断についてスクリーニングした。ＰＣＲプライマー（Ｐ１１９［配列番号５０］およびＰ１２０［配列番号５１］）の１つの組をデザインし、相同遺伝子組換えに続いて特定の接合部断片を増幅した。ＰＣＲプライマー（Ｐ１２１［配列番号５２］およびＰ１２２［配列番号５３］）の別の組をデザインして、天然遺伝子を検出した。４つのハイグロマイシン抵抗性コロニーの内３つが接合部断片について陽性であり、天然断片について陰性であったので標的を定めた組み込みが確認された。
【０３７６】
Δ１２デサチュラーゼを中断させた株における脂肪酸プロフィールの判定
Ｑ−ｄ１２Ｄと命名された中断させた株の１つにおける総脂質のＧＣ分析によって、天然Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の中断をさらに確認した。野生型（ＡＴＣＣ番号７６９８２）およびＱ−ｄ１２Ｄの単一コロニーをそれぞれ３ｍＬの最少培地（調合物／Ｌ：２０ｇグルコース、１．７ｇ酵母菌窒素ベース、１ｇＬ−プロリン、０．１ｇＬ−アデニン、０．１ｇＬ−リジン、ｐＨ６．１）中で３０℃でＯＤ６００が約１．０になるまで生育させた。細胞を収集して蒸留水で洗浄し、高速真空乾燥させて、直接トランスエステル化してＧＣ分析した（一般方法で述べたように）。
【０３７７】
野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）および中断させたΔ１２デサチュラーゼを含んでなる形質転換体Ｑ−ｄ１２Ｄの脂肪酸プロフィールを下の表６に示す。脂肪酸は１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）および１８：２（ＬＡ）として同定され、それぞれの組成は総脂肪酸の％として表される。
【０３７８】
【表９】
2007515951.tif 000011
【０３７９】
結果は、Ｑ−ｄ１２Ｄ株中の天然Δ１２デサチュラーゼ遺伝子が不活性化されたことを示唆した。したがってヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２中には、機能性Δ１２デサチュラーゼをコードする遺伝子が１つだけある。
【０３８０】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子のプラスミドレスキュー
Δ１２デサチュラーゼ遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アンピシリン抵抗性遺伝子および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｏｒｉもまた含有するｐＹ２３Ｄ１２ベクター全体の挿入によって中断させたので、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の側方配列をレスキューすることが可能であった。このためにはＤＮイージー（ＤＮｅａｓｙ）組織キットを使用して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｑ−ｄ１２ＤのゲノムＤＮＡを単離した。具体的には１０μｇのゲノムＤＮＡを反応容積２００μＬ中の５０μＬの制限酵素Ａｇｅ  Ｉ、Ａｖｒ  ＩＩ、Ｎｈｅ  Ｉ、およびＳｐｈ  Ｉで消化した。消化されたＤＮＡをフェノール：クロロホルムで抽出し、４０μＬの脱イオン水に再懸濁した。３ＵＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する２００μＬライゲーション混合物中で、消化されたＤＮＡ（１０μＬ）を自己ライゲーションさせた。ライゲーションを１６℃で１２時間実施した。ライゲーションさせたＤＮＡをフェノール：クロロホルムで抽出し、４０μＬの脱イオン水に再懸濁した。最後に１μＬの再懸濁ライゲーションＤＮＡを使用して、電気穿孔によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換し、アンピシリン（Ａｐ）を含有するＬＢプレート上に接種した。Ａｐ−抵抗性コロニーを単離して、ミニプレップによりプラスミドの存在について分析した。以下のインサートサイズが、回復またはレスキューされたプラスミド中に見いだされた（表７）。
【０３８１】
【表１０】
2007515951.tif 000012
【０３８２】
プラスミドの配列決定は、配列決定プライマーＰ９９（配列番号４６）およびＰ１０２（配列番号４９）によって開始した。
【０３８３】
配列決定結果に基づき、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子をコードする遺伝子全長をアセンブルした（１９３６ｂｐ、配列番号５４）。具体的には本配列が１２５７塩基の読み取り枠（配列番号５４のヌクレオチド＋２８３〜＋１５３９）をコードし、他方推定されたアミノ酸配列は４１９個の残基の長さであった（配列番号５５）この遺伝子はまた、「Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ＬａＢＲＩ、Ｔａｌｅｎｃｅ  Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）（ドゥジョン（Ｄｕｊｏｎ），Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３０（６９９５）：３５〜４４（２００４）もまた参照されたい）の公共Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベース内でＹＡＬＩ−ＣＤＳ３０５３．１として公開される。
【０３８４】
実施例３
糸状菌類からのΔ１５デサチュラーゼの同定
本実施例は、様々な糸状菌類中のΔ１５デサチュラーゼの同定について述べる。これらの配列は、それらのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ（実施例２）との相同性に基づいて同定され、それぞれの種からの配列は、系統学的分析に基づいて２つの「亜科」の１つに属する。
【０３８５】
シネコシティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｈｙｔｉｓ）Δ１５デサチュラーゼとの相同性検索
最初にクエリー配列としてシネコシティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｈｙｔｉｓ）Δ１５デサチュラーゼタンパク質配列（遺伝子ｄｅｓＢ；ジェンバンク登録番号Ｄ９０９１３）を使用して、糸状菌類ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）およびマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）の配列の公開データベースで、ＢＬＡＳ検索（基本的局在性整合検索ツール；アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３））を実施した。意外にもこれらの検索は、いかなる相同的配列も同定できなかった。
【０３８６】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼによる相同性検索
次に出願人は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼタンパク質配列（配列番号５５）をクエリー配列として、同一データベースのＢＬＡＳＴ検索を実施した。これらの検索の結果、各生物体中に２つの相同的配列が同定された。引き続いて、配列番号５５を１．）アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびフザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）の公開データベース、および２．）フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）株Ｍ−８１１４のデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）ＥＳＴライブラリー（デラウェア州ウィルミントンのＥ．Ｉ．デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー（Ｅ．Ｉ．  ｄｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ））（ペンシルベニア州ユニバーシティ・パークのフザリウム研究センター（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ、ＰＡ））から入手できるＦ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）株Ｍ−８１１４；Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ８１（２）：２１１〜２１６（１９９７）もまた参照されたい）に対するクエリーとして使用した。これらの検索からも各生物体中に、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼタンパク質の２つの相同体が同定された。下の表にこれらの各相同体に関する詳細をまとめる。
【０３８７】
【表１１】
2007515951.tif 000013
【０３８８】
全ての相同体は、注釈なし、またはΔ１２デサチュラーゼまたは脂肪酸デサチュラーゼとして注釈されるのいずれかであった。さらにＦ．グラミネアリウム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）からのヌクレオチド配列は、推定上のイントロン配列のゲノムであった。出願人は、その他の相同体からのアミノ酸配列との比較のために、推定アミノ酸の暫定的アセンブリーを作製した。
【０３８９】
ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））のレーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（Ｗｉｎｄｏｗｓ  ３２  Ｍｅｇａｌｉｇｎ  ５．０６  １９９３−２００３）を使用した、それぞれの種からのΔ１２デサチュラーゼ相同体の系統樹分析からは、意外にも２つの亜科が明らかになった。図４に示すように、Ｎｃ１、Ｍｇ１、Ｆｇ１、Ｆｍ１、およびＡｎ１は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼに対する相同性を有するタンパク質の「亜科１」にクラスター化したのに対し、Ｆｇ２、Ｆｍ２、Ｍｇ２、Ｎｃ２、およびＡｎ２は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼタンパク質相同体中の「亜科２」にクラスター化した。
【０３９０】
次にＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのＭｅｇａｌｉｇｎプログラムのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法（緩慢、正確、Ｇｏｎｎｅｔオプション；トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０（１９９４））を使用して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼに対する相同性を有する各タンパク質を整合した。この方法で明らかにされた％同一性を使用して、タンパク質がオルソログかどうかを判定した（図５）。具体的には、図は以下を示す。１．）亜科１にクラスター化したタンパク質中の％同一性（左上隅三、太線で示す）、２．）亜科１および亜科２のタンパク質の間の％同一性（右上隅四角、点線で示す）、および３．）亜科２にクラスター化したタンパク質中の％同一性（右下隅三角）。したがって亜科１の全てのタンパク質（配列番号２、６、１０、１４、および１８）は、互いに少なくとも４６．２％同一であり、亜科２（配列番号４、８、１２、１６、および２０）のタンパク質とは３９．６％未満同一である。さらに亜科２のタンパク質は互いに少なくとも５６．３％同一である。
【０３９１】
上の分析は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ（配列番号５５）に対する相同性を有する２つのタンパク質亜科を明らかに区別した。さらにＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの酵母が１８：２のみを合成できる（しかし１８：３は合成できない）のに対し、５つの各糸状菌類は１８：２および１８：３の双方を合成できることが知られている。さらにヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から単一のΔ１２デサチュラーゼが単離されたのに対し、全ての真菌はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼに対する２つの相同体を有した。したがって出願人は、これらの生物体中のデサチュラーゼの亜科の１つがΔ１２デサチュラーゼ（オレイン酸からＬＡ（１８：２）への転換を可能にする）に相当し、その他がΔ１５デサチュラーゼ（ＬＡからＡＬＡ（１８：３）への転換を可能にする）に相当すると仮定した。
【０３９２】
最後に、ＣｌｕｓｔａｌＷ法によるアライメントアルゴリズム（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム、前出）を用いて、広範な種からの既知のΔ１５デサチュラーゼタンパク質に対する類似性について、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼタンパク質配列を個別に分析した。ここで報告されるＦｍ１アミノ酸配列は、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ジェンバンク登録番号Ｌ４１８０７と２５．４％同一であり、シネコシスイティス・デスＢ（Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ  ｄｅｓＢ）（ＧＩ  １６５３３８８）と３３．１％同一であり、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ｆａｄ２遺伝子と３３．７％同一であり、米国特許公開第２００３／０１９６２１７号明細書のサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）デサチュラーゼと２９．１％同一である。
【０３９３】
実施例４
亜科１のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）デサチュラーゼを含んでなる発現プラスミドｐＹ３４（ＧＰＤＰｒｏ：：Ｆｍ１：：ＸＰＲ）（推定上のΔ１５デサチュラーゼをコードする）の構築
本実施例は、実施例３で同定された亜科１（「Ｆｍ１」）のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼを含んでなる、発現プラスミドの構築について述べる。具体的にはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＧＰＤプロモーター（「ＧＰＤＰｒｏ」）の制御下で、推定上のΔ１５デサチュラーゼが発現するようにキメラ遺伝子が作り出される。これによって、発現したＯＲＦが野生型株中でＡＬＡ生成をもたらし、Δ１２デサチュラーゼ−中断変異体を補完する能力を試験することで、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のタンパク質活性の引き続く判定が可能になるであろう（実施例２）。
【０３９４】
全長ｃＤＮＡをテンプレートとして含有するｃＤＮＡクローンｆｆｍ１ｃ．ｐＫ００１．ｇ２３およびｆｆｍ１ｃ．ｐＫ０１３．ｎ７を使用し、上方および下方プライマーＰ１９２（配列番号５６）およびＰ１９３（配列番号５７）を使用して、Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼをコードするＯＲＦをＰＣＲ増幅した。製造業者の推奨に従って、ｐｆｕポリメラーゼを使用して、エッペンドルフマスターサイクラー勾配サイクラー内でＰＣＲを実施した。増幅を以下のようにして実施した。９５℃で１ｍｉｎの初期変性、それに続いて９５℃で３０ｓｅｃの変性、５８℃で１ｍｉｎのアニール、および７２℃で１ｍｉｎの延長を３０サイクル。７２℃で１０ｍｉｎの最終延長サイクルを実施し、それに続いて４℃での反応終結。
【０３９５】
双方のテンプレートから正確なサイズの（約１２４０ｂｐ）断片が得られた。カリフォルニア州バレンシアのキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ））からのキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）ＤＮＡ精製キットを使用して、アガロース・ゲルから、クローンｆｆｍ１ｃ．ｐＫ００１．ｇ２３から誘導される断片を精製し、Ｎｏｔ  Ｉで消化して、プラスミドｐＹ５−１３ＧＰＤＮ（実施例１から）のＧＰＤＰｒｏとＸＰＲターミネーター間でＮｏｔ  Ｉ部位にクローンした。この結果、プラスミドｐＹ３４が作りだされ、それはＧＰＤＰｒｏ：：Ｆｍ１：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含有した。得られた８８７８ｂｐのプラスミド中でＦｍ１ＯＲＦの配列が確認された。プラスミドｐＹ３４は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点、細菌アンピシリン抵抗性遺伝子、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｌｅｕ  ２遺伝子、およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自律性複製配列（ＡＲＳ）をさらに含有した。
【０３９６】
実施例５
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における亜科１のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）デサチュラーゼを含んでなるプラスミドｐＹ３４（ＧＰＤＰｒｏ：：Ｆｍ１：：ＸＰＲ）（推定上のΔ１５デサチュラーゼをコードする）の発現
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中におけるプラスミドｐＹ３４（実施例４からのキメラのＧＰＤＰｒｏ：：Ｆｍ１：：ＸＰＲ遺伝子を含んでなる）の発現について述べる。具体的には発現したＦ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）ＯＲＦがＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）野生型株中でＡＬＡ生成をもたらし（それによってＯＲＦのΔ１５デサチュラーゼ活性を確認する）、Δ１２デサチュラーゼ−中断変異体（実施例２から、それによってＯＲＦの二機能的なΔ１２／Δ１５デサチュラーゼ活性を確認する）を補完する能力を試験した。
【０３９７】
実施例２で述べられる形質転換手順を使用して、プラスミドｐＹ５（ベクター単独対照、実施例１から）およびｐＹ３４（ＧＰＤＰｒｏ：：Ｆｍ１：：ＸＰＲ）をそれぞれ個別に、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６８９２の野生型（ＷＴ）およびΔ１２デサチュラーゼ−中断（Ｑ−ｄ１２Ｄ）株に形質転換した。Ｂｉｏ１０１  ＤＯＢ／ＣＳＭ−Ｌｅｕプレート上で形質転換体細胞を選択した。
【０３９８】
実施例２および一般方法で述べられるようにして、野生型および形質転換体細胞の単一コロニーをそれぞれ３ｍＬの最小培地上に生育させ、採取して洗浄し、乾燥させて分析した。
【０３９９】
野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）および各形質転換体の脂肪酸プロフィールを下の表９に示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、および１８：３（ＡＬＡ）として同定され、それぞれの組成は全脂肪酸の％として表される。「ｄ１２ｄ％ＳＣ」は、以下の式に従って計算され（［１８：２＋１８：３］／［１８：１＋１８：２＋１８：３］）＊１００、１８：２への基質転換百分率を表す。「ｄ１５ｄ％ＳＣ」は以下の式に従って計算され（［１８：３］／［１８：２＋１８：３］）＊１００、ＡＬＡへの基質転換百分率を表す。
【０４００】
【表１２】
2007515951.tif 000014
【０４０１】
上の結果は、ここでＦｍ１と称され、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼに対する相同性を有するタンパク質の亜科１内のタンパク質して同定されるＦ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）ＯＲＦが、Δ１５デサチュラーゼであることを実証した。この確認に基づいて出願人は、亜科１の全ての他のメンバー（配列番号６、１０、１４、および１８）がΔ１５デサチュラーゼの機能を有すると予測する。
【０４０２】
Ｆｍ１のΔ１５デサチュラーゼ活性に関して、タンパク質がヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中でのその活性において、その他の酵母中で以前に発現されたΔ１５デサチュラーゼよりもさらにより効率的（３１％のＡＬＡ蓄積）なことは注目に値する。具体的には、非油性酵母サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）Δ１５デサチュラーゼを発現させた場合、ＡＬＡの％生成物蓄積はわずか４．１％であり（ミーサプヨズク（Ｍｅｅｓａｐｙｏｄｓｕｋ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１１９４８〜１１９５４（２０００））、一方Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でＢ．ナパス（Ｂ．ｎａｐｕｓ）Δ１５デサチュラーゼを発現させた場合、ＡＬＡの％生成物蓄積はわずか１．３％（リード（Ｒｅｅｄ），Ｄ．Ｗ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２２：７１５〜７２０（２０００））であった。ここで得られた結果に基づいて、ＰＵＦＡ生合成のためのその他の遺伝子（例えばΔ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ）と組み合わせた、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼの発現は、以前に同定されたあらゆるΔ１５デサチュラーゼを使用して得られるのよりも高いω−３  ＰＵＦＡの生成をもたらすことが予想された。
【０４０３】
さらに結果は、意外にもフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ（Ｆｍ１）がいくらかのΔ１２デサチュラーゼ活性を有することを実証した。具体的にはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のΔ１２デサチュラーゼ−中断株（すなわちＱ−ｄ１２Ｄ＋ＧＰＤＰｒｏ：：Ｆｍ１：：ＸＰＲ）中でのＦｍ１発現は、Ｆｍ１のΔ１２デサチュラーゼ機能のために、オレイン酸からＬＡへの２４％の基質転換をもたらした（「ｄ１２ｄ％ＳＣ」参照）。これに加えて、Ｆｍ１のΔ１５デサチュラーゼ機能に起因する、ＬＡからＡＬＡへの高い基質転換（９６％、「ｄ１５ｄ％ＳＣ」参照）もある。この二機能性は、あらゆるその他の知られているΔ１２またはΔ１５デサチュラーゼに比べて著しく異なる。当業者には、低いΔ１２デサチュラーゼ活性（またはこのような活性の完全な欠如）を有する宿主生物体中におけるフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼの発現が、最大化された１８：３／１８：２の比率をもたらすことが明らかであろう。上述のようなフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼがあるタイプの宿主生物体中で、ＰＵＦＡ生合成のためのその他の遺伝子（例えばΔ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ）が発現すると、ω−３のω−６脂肪酸に対する増大した比率が帰結することが予想される。
【０４０４】
実施例６
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における亜科１のマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）デサチュラーゼ（推定上のΔ１５デサチュラーゼをコードする）の発現
本実施例は、推定上のマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）Δ１５デサチュラーゼ（「Ｍｇ１」）を含んでなる発現プラスミドの構築、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でのこのプラスミドの発現について述べる。これにより、発現したＯＲＦが野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株にＡＬＡ生成をもたらす能力を試験することで、Δ１５デサチュラーゼとしてのＭｇ１の確認が可能になり、発現したＯＲＦがヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のΔ１２デサチュラーゼ−中断変異体（実施例２から）にＡＬＡ生成をもたらす発現ＯＲＦの能力を試験することで、二機能的なΔ１２／Δ１５デサチュラーゼとしてのＭｇ１の確認が可能になる。
【０４０５】
具体的にはキメラのＴＥＦ：：Ｍｇ１遺伝子を構築し、そこではヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＴＥＦプロモーターの制御下で推定上のΔ１５デサチュラーゼが発現した（ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ），Ｓ．ら、Ｙｅａｓｔ、１４：１２６７１２８３（１９９８））。最初に実施例２でヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）について述べられたのと同様にして、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）ゲノムＤＮＡが単離された。次に推定上のΔ１５デサチュラーゼ（配列番号９）をコードするマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）Ｍｇ１遺伝子は２つのイントロンを有するので、最初に３個のエクソンを別々にＰＣＲ増幅して、次にＰＣＲプライマーの重なりを使用して３個のエクソンを共に結合させて全長ＯＲＦをＰＣＲ増幅し、これらの配列をＰＣＲ増幅中に除去した。このようにして下の表１０に示す上方および下方プライマーを使用して、３つの別個のＰＣＲ反応においてゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用した。
【０４０６】
【表１３】
2007515951.tif 000015
【０４０７】
次にテンプレートとしてゲル精製された３個の全てのＰＣＲ生成物、および上方プライマーＰ１８６および下方プライマーＰ１９１を使用して、全長ＯＲＦをＰＣＲ増幅した。プライマーＰ１８６およびＰ１９１はＮｏｔ  Ｉ部位を含有し、発現ベクター中でのクローニングを容易にした。具体的には正確なサイズの断片をゲル精製し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化し、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＴＥＦプロモーターの制御下でＮｏｔ  Ｉ−ｃｕｔヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）発現ベクターｐＹ５−１３（実施例１）中にクローンした。得られたクローンをｐＹ３１と命名した。
【０４０８】
いくつかのｐＹ３１クローンを配列決定した。予想されたように、上方プライマー中に作られてクローニングを容易にするＮｃｏＩ部位のために、全てＯＲＦの第３位でＴからＣへの置換を有した。これはＳｅｒからＡｌａへの第２のアミノ酸の変化をもたらした。３個のプラスミドクローン（すなわちｐＹ３１プラスミドクローン番号２１、番号２４、および番号２８）は配列番号１０によってコードされた（上述の第２のアミノ酸変化を除く）。しかしそのいずれも配列番号９と同一のヌクレオチド配列を有さなかった（すなわちそれらは、推定アミノ酸配列変化させず、ＰＣＲエラーによって生じた可能性が最も高い、追加的サイレントヌクレオチド置換を有した）。より具体的には、プラスミドクローン番号２１、番号２４、および番号２８は全て以下の塩基置換を有した。３０９位におけるＣからＴへの置換、３９０位におけるＣからＴへの置換、５４９位におけるＴからＣへの置換、および５６７位におけるＧからＣへの置換。さらにクローン番号２４は６４５位におけるＴからＡへの置換を有し、クローン番号２１および番号２８のどちらも６６９位におけるＣからＴへの置換を有した。
【０４０９】
実施例２で述べられる方法に従って、ＴＥＦ：：Ｍｇ１キメラ遺伝子を含んでなるプラスミド（すなわちクローン番号２１、番号２４、および番号２８）をそれぞれヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ番号７６９８２）の野生型（Ｑ）、およびΔ１２デサチュラーゼ−中断株（Ｑ−ｄ１２Ｄ）に形質転換した。一般方法述べられるように、各形質転換からの３個のコロニー（下の表１１で「ａ」、「ｂ」、および「ｃ」として同定される）を選択し、３ｍＬのＤＯＢ／ＣＳＭ培地に接種して３０℃で７２時間生育させた。培養物（１．５ｍＬ）を採取し、直接エステル転移反応およびＧＣ分析を行った（実施例２および一般方法で述べられるように）。
【０４１０】
野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）および各形質転換体の脂肪酸プロフィールを下の表１１に示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、および１８：３（ＡＬＡ）として同定され、それぞれの組成は全脂肪酸の％として表される（ＴＦＡ）。「ｄ１２ｄ％ＳＣ」は、以下の式に従って計算され（［１８：２＋１８：３］／［１８：１＋１８：２＋１８：３］）＊１００、１８：２への基質転換百分率を表す。「ｄ１５ｄ％ＳＣ」は以下の式に従って計算され（［１８：３］／［１８：２＋１８：３］）＊１００、ＡＬＡへの基質転換百分率を表す。
【０４１１】
【表１４】
2007515951.tif 000016
【０４１２】
上に示されるように、ＡＬＡは、ＴＥＦ：：Ｍｇ１キメラ遺伝子で形質転換された、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の野生型（Ｑ）およびΔ１２デサチュラーゼ−中断株（Ｑ−ｄ１２Ｄ）の双方で生成される。したがってこれらの結果に基づいて、二機能的なΔ１２／Δ１５活性を有するデサチュラーゼとしてのＭｇ１の同定が確認された。
【０４１３】
実施例７
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における亜科１のフザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）デサチュラーゼ（推定上のΔ１５デサチュラーゼをコードする）の発現
本実施例は、推定上のフザリウム・グラミン（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅ）Δ１５デサチュラーゼ（「Ｆｇ１」）を含んでなる発現プラスミドの構築、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でのこのプラスミドの発現について述べる。これにより、発現したＯＲＦが野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株にＡＬＡ生成をもたらす能力を試験することで、Δ１５デサチュラーゼとしてのＦｇ１の確認が可能になり、発現したＯＲＦがヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のΔ１２デサチュラーゼ−中断変異体（実施例２から）にＡＬＡ生成をもたらす能力を試験することで、二機能的なΔ１２／Δ１５デサチュラーゼとしてのＦｇ１の確認が可能になる。
【０４１４】
具体的にはキメラのＴＥＦ：：Ｆｇ１遺伝子が合成され、そこではヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＴＥＦプロモーターの制御下で推定上のΔ１５デサチュラーゼが発現する。実施例６で述べられるのと同様にして、推定上のΔ１５デサチュラーゼ（配列番号１７）をコードする、フザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）Ｆｇ１遺伝子中に存在する３個のイントロンがＦｇ１ＯＲＦの発現に先だってＰＣＲ増幅中に除去される。このようにして下の表１２に示すように上方および下方プライマーを使用して、４つの別個のＰＣＲ反応においてゲノムＦ．グラミネアリウム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）ＤＮＡを最初にテンプレートとして使用する。
【０４１５】
【表１５】
2007515951.tif 000017
【０４１６】
次にテンプレートとしてゲル精製された４個の全てのＰＣＲ生成物、および上方プライマーＰＦｇ１ＵＰ１および下方プライマーＰＦｇ１ＬＰ４を使用して、全長ＯＲＦをＰＣＲ増幅する。プライマーＰＦｇ１ＵＰ１およびＰＦｇ１ＬＰ４はＮｏｔ  Ｉ部位を含有し、発現ベクター中でのクローニングを容易にする。実施例６でＭｇ１コード領域について述べられるようにして、正確なサイズの断片をゲル−精製し、Ｎｏｔ  Ｉで消化し、Ｎｏｔ  Ｉ−ｃｕｔヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）発現ベクター中にクローンする。
【０４１７】
ＴＥＦ：：Ｆｇ１キメラ遺伝子を含んでなるプラスミドをヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ番号７６９８２）の野生型（Ｑ）およびΔ１２デサチュラーゼ−中断（Ｑ−ｄ１２Ｄ）株に形質転換する。最少培地内での野生型および形質転換体細胞の単一コロニーの生育に続いて、細胞を採取し、直接エステル転移反応およびＧＣ分析を行う（実施例２および一般方法で述べられるように）。
【０４１８】
ＴＥＦ：：Ｆｇ１キメラ遺伝子で形質転換された、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の野生型およびΔ１２デサチュラーゼ−中断株の双方で、ＡＬＡが生成することで、二機能的なΔ１２／Δ１５デサチュラーゼとしてのＦｇ１の同定が確認されることが予想される。この予想は％同一性比較に基づいて、Ｆｇ１タンパク質配列がＦｍ１の配列と最も近いことに基づく。
【０４１９】
実施例８
亜科１（Ｆｍ１）のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼを含んでなるキメラ遺伝子によるアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の形質転換
この実施例は、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）Δ１５デサチュラーゼコード領域を含有するキメラ遺伝子で、野生型およびｆａｄ２−１変異体アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）を形質転換するのに有用な方法について述べる。
【０４２０】
発現ベクターＦｍ１を含んでなるアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の構築
Ｆｍ１Δ１５デサチュラーゼコード領域を含有するｐＹ３４のＮｏｔＩ断片（実施例４）をダイズ発現ベクターｐＫＲ３５３のＮｏｔＩ部位中にクローンする。下の実施例１８で述べられるように、ｐＫＲ３５３は、Ｋｔｉ３（ｋｕｎｉｔｚトリプシン阻害因子３）遺伝子からの種子特異的プロモーターおよびＫｔｉ３転写ターミネーターに挟まれたＮｏｔＩ部位を含有する。
【０４２１】
ｐＫＲ３５３（Δ１５）からキメラのＫｔｉ３プロモーター：：Ｆｍ１：：Ｋｔｉ３ターミネーター遺伝子がＡｓｃ１断片として単離され、バイナリーベクターｐＺＢＬ１１（Ａｓｃ１）中のユニークなＡｓｃ１部位中にクローンされる。ｐＺＢＬ１１（ＡｓｃＩ）は、左右のＴ−ＤＮＡ境界間のＰａｃＩおよびＡｓｐ７１８部位間にＡｓｃＩリンカーを付加することで、バイナリーベクターｐＺＢＬ１１から誘導された。ｐＺＢＬ１１（米国特許第５,９６８,７９３号明細書、ＥＰ  １００３８９１号明細書、および国際公開第９８５９０６２号パンフレット）は、Ｔ−ＤＮＡ境界内に、３５Ｓ：スルホニル尿素抵抗性アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）導入遺伝子もまた含有し、それはスルホニル尿素除草剤抵抗性を与え、植物選択可能標識の役割を果たす。ｐＺＢＬ１１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）双方の複製起点、および細菌アンピシリン抵抗性遺伝子もまた有する。
【０４２２】
得られるバイナリープラスミドｐＺＢＬｌ（Δ１５）をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４に形質転換する。形質移入されたアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を引き続いて使用して、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｄｉｐ法によって、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の野生型およびｆａｄ２−１変異体を形質転換する（オキュレイ（Ｏｋｕｌｅｙ），Ｊ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ６：１４７〜１５８（１９９４））。形質転換体をスルホニル尿素上で選択し、種子中でのＡＬＡ生成について試験する。
【０４２３】
Δ１５デサチュラーゼを発現するキメラ遺伝子で形質転換された野生型アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）は、形質転換されていない植物よりも高いＡＬＡ含量を含有する。同一キメラ遺伝子で形質転換されたＦａｄ２−１植物は、形質転換されていない変異体よりも高いＡＬＡ含量を含有し、形質転換体ｆａｄ２−１植物は、形質転換されていない変異体ならびに野生型形質転換体よりも高い１８：３／１８：２比を有する。
【０４２４】
実施例９
亜科１（Ｆｍ１）のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼを含んでなるキメラ遺伝子による体細胞性ダイズ胚芽培養物の形質転換
この実施例は、Ｆｍ１Δ１５デサチュラーゼコード領域を含有するキメラ遺伝子によるダイズの形質転換に続いて、それらの培養のために使用される方法について述べる。
【０４２５】
Ｆｍ１を含んでなるダイズ発現ベクターの構築
プラスミドｐＫＲ３５３（Δ１５）（実施例８で作られる）は、ハイグロマイシンＢリン転移酵素遺伝子（「ｈｐｔ」；グリッツ（Ｇｒｉｔｚ），Ｌ．およびＪ．ディビス（Ｄａｖｉｅｓ）、Ｇｅｎｅ  ２５：１７９〜１８８（１９８３））を含んでなる２個のカセットもまた含有する。
（１）ＡＴ７プロモーター：：ｈｐｔ：：Ｔ７ターミネーターカセット
このカセットは、細菌性複製起点（ｏｒｉ）に加えて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での選択および複製を可能にする。
（２）Ａ３５Ｓプロモーター：：ｈｐｔ：：ＮＯＳ３’転写ターミネーターカセット
このカセットはダイズ中での選択を可能にする（３５Ｓ、オーデル（Ｏｄｅｌｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０〜８１２（１９８５）参照）；ＮＯＳ３’、デピッカー（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１：５７０（１９８２）参照）。
【０４２６】
体細胞性ダイズ胚芽培養物の形質転換
光度６０〜８５μＥ／ｍ２／ｓの冷白色蛍光灯による１６：８時間の昼／夜光周期で、１５０ｒｐｍ、２６℃の回転振盪器上の３５ｍＬ液体培地ＳＢ１９６（下記）中にダイズ胚芽形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）を維持する。
【０４２７】
【表１６】
2007515951.tif 000018
【０４２８】
【表１７】
2007515951.tif 000019
【０４２９】
培養物は、およそ３５ｍｇの組織を３５ｍＬの新鮮な液体ＳＢ１９６に接種して、７〜１４日毎に継代培養される（好ましい継代培養間隔は７日毎である）。
【０４３０】
粒子ガン衝撃法（クライン（Ｋｌｉｎｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０（１９８７））によって、ダイズ胚芽形成懸濁培養物をｐＫＲ３５３（Δ１５）（前出）で形質転換する。デラウェア州ウィルミントンのＥ．Ｉ．デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー（Ｅ．Ｉ．  ｄｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ））からのデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）遺伝子銃ＰＤＳ１０００／ＨＥ装置（ヘリウム後付け）を全ての形質転換のために使用する。
【０４３１】
ダイズ胚芽形成懸濁液の培養開始
各開始の間を５〜７日間開けて、ダイズ培養を毎月２回開始する。
【０４３２】
定植後４５〜５５日の間に、入手可能なダイズ植物から未熟種子入りサヤを摘み取って、種子を外皮から取り出して滅菌マゼンタ・ボックスに入れる。９５ｍＬのオートクレーブ済み蒸留水に５ｍＬのクローラックス（Ｃｌｏｒｏｘ）および１滴の石鹸を添加した溶液中で１５分間振盪して、ダイズ種子を滅菌する。２本の１Ｌ入り滅菌蒸留水を使用して種子をすすいで、４ｍｍ未満のものを個々の顕微鏡スライドに載せる。種子の小さな端を切断して、子葉を種子被膜から押し出す。子葉（プレート当たり２５〜３０個）をＳＢ１培地を含有するプレートに移す。
【０４３３】
ＳＢ１固体培地（１Ｌあたり）：
１袋のＭＳ塩（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、カタログ番号１１１１７−０６６）
１ｍＬ  Ｂ５ビタミン原液（下記）
３１．５ｇスクロース
２ｍＬ  ２,４−Ｄ（最終濃度２０ｍｇ／Ｌ；２,４−Ｄ原液は１ｍｇ／ｍＬとしてファイトテク（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ）から既製品が得られる、カタログ番号Ｄ２９５）
ｐＨ５．７
８ｇ  ＴＣ寒天
【０４３４】
Ｂ５ビタミン原液（１００ｍＬあたり）：
１０ｇミオイノシトール
１００ｍｇニコチン酸
１００ｍｇピリドキシンＨＣｌ
１ｇチアミン
＊注記：アリコートを−２０℃で保存する。溶液が十分迅速に溶解しない場合、加熱撹拌プレートによって低レベルの熱を加える。
【０４３５】
子葉を含有するプレートをファイバーテープで覆って８週間保存する。その後、二次胚芽を切断してＳＢ１９６液体培地に７日間入れる。
【０４３６】
衝撃のためのＤＮＡ調製
無処置プラスミド、または関心のある遺伝子と選択可能な標識遺伝子とを含有するＤＮＡプラスミド断片のいずれかが、衝撃のために使用される。断片は二重消化したプラスミドのゲル単離によって得られる。各例において、０．５ｍＬの適切な酵素混合物中で１００μｇのプラスミドＤＮＡを消化する。得られるＤＮＡ断片を１％シープラーク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）ＧＴＧアガロース（メイン州ロックランドのバイオウィッタカー・モレキュラー・アプリケーションズ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ））上でゲル電気泳動法によって分離し、キメラ遺伝子を含有するＤＮＡ断片をアガロース・ゲルから切り取る。製造業者（ウィスコンシン州マディソンのエピセンター（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）））のプロトコルに従って、ゲルイーズ（ＧＥＬｅａｓｅ）消化酵素を使用して、ＤＮＡをアガロースから精製する。
【０４３７】
５μｌの１μｇ／μｌ  ＤＮＡ溶液（無処置プラスミドまたは上述のように調製されたＤＮＡ断片のいずれか）、５０μｌの２．５ＭＣａＣｌ２、および２０μｌの０．１Ｍスペルミジンに、３ｍｇの金粒子（３ｍｇの金）を含有する滅菌蒸留水の５０μｌのアリコートを添加する。ボルテックス振盪器のレベル３で、混合物を３分間振盪し、卓上遠心分離器内で１０秒間遠沈する。４００μｌの１００％エタノールでの洗浄後、超音波処理によって４０μｌの１００％エタノール中にペレットを懸濁する。遺伝子銃ＰＤＳ１０００／ＨＥ装置ディスクの各フライングディスクに、５μｌのＤＮＡ懸濁液を小分けして入れる。各５μｌのアリコートは衝撃あたり（すなわちディスクあたり）およそ０．３７５ｍｇの金を含有する。
【０４３８】
組織調製およびＤＮＡによる衝撃
およそ１５０〜２００ｍｇの７日齢の胚芽懸濁培養物を空の滅菌６０×１５ｍｍペトリ皿に入れ、皿をプラスチックメッシュで覆う。膜破裂圧力を１１００ＰＳＩに設定して、チャンバーを２７〜２８インチ水銀圧の真空に脱気して、組織をプレートあたり１または２回衝撃する。組織を保持／停止スクリーンからおよそ３．５インチに置く。
【０４３９】
形質転換された胚芽の選択
ハイグロマイシン（ハイグロマイシンリン転移酵素、ＨＰＴ、遺伝子が選択可能な標識として使用される場合）またはクロルスルフロン（アセト乳酸シンターゼ、ＡＬＳ、遺伝子が選択可能な標識として使用される場合）を使用して、形質転換された胚芽を選択する。どちらの場合も組織は、上述のように衝撃に続いて新鮮なＳＢ１９６培地に入れられて培養される。衝撃の６日後に、ＳＢ１９６を３０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンまたは１００ｎｇ／ｍＬのクロルスルフロン（０．０１Ｎ水酸化アンモニウム中に１ｍｇ／ｍＬのクロルスルフロン原液）のいずれかの選択物質を含有する新鮮なＳＢ１９６で交換する。選択培地は毎週新しくする。選択の４〜６週後に、形質転換されていない壊死性胚芽形成クラスターから、緑色の形質転換された組織が生育しているのが観察されるかもしれない。孤立した緑色組織を取り出して、ＳＢ１９６を含有するマルチウェルプレートに接種し、新しいクローン増殖し形質転換された胚芽形成懸濁培養物を生成する。
【０４４０】
ダイズ体細胞性胚芽の植物への再生
胚芽形成懸濁培養物から植物全体を得るために、組織を再生しなくてはならない。
【０４４１】
胚芽成熟
胚芽は、１６：８時間の光度９０１２０μＥ／ｍ２／ｓの明期で、冷白色蛍光灯（フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）冷白色エコノワット（Ｅｃｏｎｏｗａｔｔ）Ｆ４０／ＣＷ／ＲＳ／ＥＷ）およびアグロ（Ａｇｒｏ）（フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）Ｆ４０アグロ（Ａｇｒｏ）、４０Ｗ））電球の下、ＳＢ１９６中２６℃で４〜６週間培養する。その後、胚芽クラスターを取り出して、１〜２週間ＳＢ１６６固形物寒天培地に入れる。
【０４４２】
ＳＢ１６６固体培地（１Ｌあたり）：
１袋のＭＳ塩（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、カタログ番号１１１１７−０６６）
１ｍＬ  Ｂ５ビタミン  １０００×原液
６０ｇマルトース
７５０ｍｇ  ＭｇＣｌ２六水和物
５ｇ活性炭
ｐＨ５．７
２ｇ  ゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）
【０４４３】
次にクラスターをＳＢ１０３培地（活性炭が含まれないこと以外はＳＢ１６６と同様に調製された培地）で３週間継代培養する。この間に個々の胚芽をクラスターから取り出して、それらの脂肪酸組成の変更についてスクリーンできる。関心のある遺伝子の発現から得られるあらゆる検出可能な表現型は、この段階でスクリーンできることに留意すべきである。脂肪酸プロフィールの変更、タンパク質プロフィールおよび含量、炭水化物含量、成長速度、生活能力またはダイズ植物に正常に発育する能力などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０４４４】
胚芽乾燥および発芽
成熟した個々の胚芽を空の小型ペトリ皿（３５×１０ｍｍ）に入れておよそ４〜７日間乾燥させる。プレートをファイバーテープで密封する（小型湿度室を作る）。乾燥させた胚芽をＳＢ７１−４培地に定植し、そこで上述したのと同一の培養条件で発芽させる。
【０４４５】
ＳＢ７１−４固体培地（１Ｌあたり）：
１瓶のＧａｍｂｏｒｇのＢ５塩、スクロース添加（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、カタログ番号２１１５３−０３６）
ｐＨ５．７
５ｇ  ＴＣ寒天
【０４４６】
発芽した小植物を発芽培地から取り出して水ですすぎ、次に２４−セルパックトレー内のレディアース（Ｒｅｄｉ−Ｅａｒｔｈ）に定植し、透明なプラスチックドームで覆う。２週間後ドームを除去して、植物をさらに１週間、強化する。小植物が丈夫そうであれば、それらを鉢あたり３本までの小植物を１０インチの鉢内のレディアース（Ｒｅｄｉ−Ｅａｒｔｈ）に移植する。１０〜１６週後、成熟種子を採取して、細断して脂肪酸について分析する。
【０４４７】
実施例１０
亜科１（Ｆｍ１）のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼを含んでなる体細胞性ダイズ胚芽の分析
この実施例は、Ｆｍ１Δ１５デサチュラーゼコード領域を含有するキメラ遺伝子を含んでなる、形質転換体ダイズ中の脂肪酸含量を分析するのに有用な方法について述べる。
【０４４８】
理論
成熟体細胞性ダイズ胚芽は接合体胚芽の良好なモデルである。液体培養中の球状胚芽状態では、体細胞性ダイズ胚芽は、成熟した接合体ダイズ胚芽に典型的なトリアシルグリセロールまたは貯蔵タンパク質を非常に少量含有する。この発達段階では、全トリアシルグリセリドと全極性脂質（リン脂質および糖脂質）の比率は約１：４であり、これはそれから体細胞性胚芽培養が開始できる発達段階の接合体ダイズ胚芽に典型的である。球状段階ではさらに、顕著な種子タンパク質、β−コングリシニンのα’−サブユニット、ｋｕｎｉｔｚトリプシン阻害因子３、および種子レクチンのためのｍＲＮＡは本質的に不在である。ホルモンを含まない培地に移して成熟体細胞性胚芽状態に分化させると、トリアシルグリセロールは最も豊富な脂質クラスになり、β−コングリシニンのα’−サブユニット、ｋｕｎｉｔｚトリプシン阻害因子３、および種子レクチンのためのｍＲＮＡは、全ｍＲＮＡ集団中で非常に豊富なメッセージになる。これに基づいて体細胞性ダイズ胚芽システムは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の成熟接合体ダイズ胚芽と非常に同様に挙動し、したがって脂肪酸生合成経路中の遺伝子発現の変化の表現型効果を分析するための良好で迅速なモデルシステムである。最も重要なことには、モデルシステムはまたトランスジェニック胚芽から誘導される植物からの種子の脂肪酸組成の予測でもある。
【０４４９】
脂肪酸分析
トランスジェニック体細胞性ダイズ胚芽を分析する。このためにはエステル転移反応によって、脂肪酸メチルエステルを単一の成熟体細胞性ダイズ胚芽から調製する。胚芽を５０μＬの水酸化トリメチルスルホニウム（ＴＭＳＨ）および０．５ｍＬのヘキサンを含有するバイアルに入れて、室温で振盪しながら３０分間インキュベートする。脂肪酸メチルエステル（５μＬ、ヘキサン層から注入される）が分離し、ペンシルベニア州ベルフォンテのスペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ．，（Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ））からのオメガワックス（Ｏｍｅｇａｗａｘ）３２０溶融シリカキャピラリーカラム（カタログ番号２４１５２）を装着したヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ガスクロマトグラフを使用して定量される。体細胞性胚芽の一部は、対照体細胞性胚芽よりも高レベルのＡＬＡを有する。
【０４５０】
形質転換された胚芽から成熟植物が再生され、再生植物によって生成される種子について脂肪酸分析が実施される。次にこれらの植物をω−３脂肪酸生合成経路遺伝子を発現するその他のトランスジェニック植物（ＥＰＡおよびＤＰＡを合わせたレベルが総量の１５％を超えることが多く、２３．５％にも達する）と交配させる。長鎖ＰＵＦＡ（例えばＥＰＡ）を作るのに好ましい代表的な遺伝子としては、以下の１つ以上が挙げられる。
【０４５１】
【表１８】
2007515951.tif 000020
【０４５２】
実施例１１
フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）Δ１５デサチュラーゼのダイズ発現ベクター（ｐＫＲ５７８）中へのクローニング
この実施例は、ダイズ中におけるΔ１５デサチュラーゼの強力な種子特異的発現のためのベクターであるｐＫＲ５７８の構築について述べる。
【０４５３】
ベクターｐＫＳ１２１（国際公開第０２／００９０４号パンフレット）は、Ｋｕｎｉｔｚダイズトリプシン阻害因子（ＫＴｉ）プロモーター［ジョフク（Ｊｏｆｕｋｕ）ら、（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ１：１０７９〜１０９３］およびＫＴｉ３’終結領域、で挟まれたＮｏｔＩ部位を含有し、その単離については、米国特許第６,３７２,９６５号明細書で述べられる（ＫＴｉ／ＮｏｔＩ／ＫＴｉ３’カセット）。ベクターｐＫＲ４５７はｐＫＳ１２１の誘導体であり、Ｋｔｉ／ＮｏｔＩ／Ｋｔｉ３’カセットの上流および下流制限酵素部位が、いくつかのサブクローニングステップを通じて変更されている。ベクターｐＫＲ４５７はまた、Ｋｔｉターミネーター下流のダイズアルブミン転写ターミネーターも含有して、転写終結を延長および強化する。ｐＫＲ４５７では、ｐＫＳ１２１中のＫｔｉプロモーター上流のＢａｍＨＩ部位が除去され、ＢｓｉＷＩ、ＳａｌＩ、ＳｂｆＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有する新しい配列（配列番号７３）が付加され、ＢｓｉＷＩ部位がＫｔｉプロモーターの５’末端に最も近い。さらにｐＫＳ１２１中のＫｔｉターミネーター下流のＳａｌＩ部位が除去され、ＸｂａＩ（Ｋｔｉターミネーターの３’末端に最も近い）、ＢａｍＨＩ部位、ダイズアルブミン転写ターミネーター配列、ＢｓｉＷＩ部位、および別のＢａｍＨＩ部位（Ｋｔｉ／ＮｏｔＩ／ＫｔｉＳａｌｂカセット）を含有する新しい配列（配列番号７４）が付加された。アルブミン転写ターミネーターは、ターミネーターの３’末端にＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＢｓｉＷＩ部位を導入するようにデザインされたプライマーｏＳａｌｂ−１２（配列番号７５）、およびターミネーターの５’末端にＢａｍＨＩ部位を導入するようにデザインされたプライマーｏＳａｌｂ−１３（配列番号７６）を使用して、ダイズゲノムＤＮＡからあらかじめ増幅された。
【０４５４】
開始プラスミドｐＫＳ１２３（国際公開第０２／０８２６９号パンフレット、参照によってその内容をここに援用する）は、Ｔ７プロモーターおよび転写ターミネーター（Ｔ７ｐｒｏｍ／ｈｐｔ／Ｔ７ｔｅｒｍカセット）によって挟まれたハイグロマイシンＢリン転移酵素遺伝子（ＨＰＴ）［グリッツ（Ｇｒｉｔｚ），Ｌ．およびディビス（Ｄａｖｉｅｓ），Ｊ．（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１７９〜１８８］、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌中の選択および複製のための細菌性複製起点（ｏｒｉ）を含有する。さらにｐＫＳ１２３は、ダイズなどの植物における選択のために、３５Ｓプロモーター［オーデル（Ｏｄｅｌｌ）ら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０〜８１２］およびＮＯＳ３’転写ターミネーター［デピッカー（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ）ら、（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１：５７０］（３５Ｓ／ｈｐｔ／ＮＯＳ３’カセット）で挟まれたハイグロマイシンＢリン転移酵素遺伝子もまた含有する。ｐＫＳ１２３はまた、β−コングリシニンのα’サブユニットのためのプロモーター［ビーチー（Ｂｅａｃｈｙ）ら、（１９８５）ＥＭＢＯＪ．４：３０４７〜３０５３］およびファゼオリン遺伝子の３’転写終結領域［ドイル（Ｄｏｙｌｅ），Ｊ．Ｊ．ら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８〜９２３８］で挟まれたＮｏｔＩ制限酵素部位も含有し、それによってダイズ種子中におけるＮｏｔＩ部位にクローンされた遺伝子の強力な組織−特異的発現を可能にする。ベクターｐＫＲ７２はｐＫＳ１２３の誘導体であり、そこではβ−コングリシニン／ＮｏｔＩ／ファセオリンカセットを含有するＨｉｎｄＩＩＩ断片が反転され、ＳｂｆＩ、ＦｓｅＩ、およびＢｓｉＷＩ制限酵素部位を含有する配列（配列番号７７）が、β−コングリシニンプロモーターの前で、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位の間に導入された。ベクターｐＫＲ７２はＨｉｎｄＩＩＩで消化され、βｃｏｎ／ＮｏｔＩ／Ｐｈａｓ３’カセットが除去されてｐＫＲ３２５が得られた。
【０４５５】
Ｋｔｉ／ＮｏｔＩ／ＫｔｉＳａｌｂカセットを含有するｐＫＲ４５７のＢｓｉＷＩ断片をｐＫＲ３２５のＢｓｉＷＩ部位中にクローニングして、中間体クローニングベクターが形成された。次にフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）Δ１５デサチュラーゼを含有するｐＹ３４のＮｏｔＩ断片（実施例４参照）をこの中間体ベクターのＮｏｔＩ部位中にクローンして、ｐＫＲ５７８を得た。プラスミドｐＫＲ５７８（配列番号７８）は図６に示す。プラスミドｐＫＲ５７８は、１０８０１ユニバーシティ・ブールヴァード、マナッサス、ＶＡ２０１１０〜２２０９の米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）に２００４年１１月４日の寄託日に、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−ＸＸＸＸで寄託された。
【０４５６】
実施例１２
ダイズ種子特異的プロモーターの単離
ダイズ種子特異的プロモーターのクローニングについては、国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられており、ここで再度述べる。
【０４５７】
使用説明（ＰＴ３０４２−１）に従って、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の汎用ゲノム歩行（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ）システムで、ダイズアネキシンおよびＢＤ３０プロモーター（２００４年８月２６日に公開された国際公開第０４／０７１１７８号パンフレットで述べられる）を単離した。ダイズゲノム歩行ライブラリーを作るために、ダイズゲノムＤＮＡのサンプルをＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、およびＳｔｕＩで別々に２時間消化した。ＤＮＡ精製後、消化したゲノムＤＮＡをゲノム歩行アダプターＡＰ１およびＡＰ２にライゲートした。
【０４５８】
デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）ＥＳＴデータベース中のアネキシンｃＤＮＡ中の５’コード配列に基づいて、ダイズアネキシン遺伝子のために、２個の遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ１およびＧＳＰ２）がデザインされた。ＧＳＰ１およびＧＳＰ２の配列は、配列番号７９および８０で記載される。
【０４５９】
ゲノム歩行システムプロトコルで定義された条件を使用して、ＡＰ１およびＧＳＰ１プライマーを１回目のＰＣＲで使用した。サイクル条件は、９４℃で４分間、９４℃で２秒間および７２℃で３分間を７サイクル、９４℃で２秒間および６７℃で３分間を３２サイクル、６７℃で４分間であった。１回目のＰＣＲからの生成物を５０倍に希釈した。ＡＰ２およびＧＳＰ２をプライマーとして、１μＬの希釈生成物を２回目のＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。サイクル条件は９４℃で４分間、９４℃で２秒間および７２℃で３分を５サイクル、９４℃で２秒間および６７℃で３分間を２０サイクル、６７℃で３分間であった。ＥｃｏＲＶ−消化ゲノム歩行ライブラリーから２．１ｋｂのゲノム断片が増幅され単離された。ゲノム断片をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化して、配列決定のためにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター中にクローンした。この２０１２ｂｐダイズアネキシンプロモーター断片のＤＮＡ配列は、配列番号８１で記載される。
【０４６０】
ＮＣＢＩジェンバンク（Ｊ０５５６０）中のＢＤ３０ｃＤＮＡ中の５’コード配列に基づいて、ダイズＢＤ３０のために２つの遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ３およびＧＳＰ４）がデザインされた。ＧＳＰ３およびＧＳＰ４プライマーのオリゴヌクレオチド配列は、配列番号８２および８３に記載の配列を有した。
【０４６１】
ゲノム歩行システムプロトコルで定義されたのと同一条件を使用して、ＡＰ１およびＧＳＰ３プライマーを１回目のＰＣＲで使用した。ダイズアネキシンプロモーターのために使用されるサイクル条件は、ゲノム歩行実験のダイズＢＤ３０プロモーターのためには良く機能しない。修正タッチダウンＰＣＲプロトコルを使用した。サイクル条件は、９４℃で４分間、９４℃で２秒間および７４℃で３分間を６サイクル（アニーリング温度をサイクル毎に１℃低下させる）、９４℃で２秒間および６９℃で３分間を３２サイクル、６９℃で４分間であった。１回目のＰＣＲからの生成物を５０倍に希釈した。ＡＰ２およびＧＳＰ４をプライマーとして、１μＬの希釈生成物を２回目のＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。サイクル条件は、９４℃で４分間、９４℃で２秒間および７４℃で３分を６サイクル（アニーリング温度をサイクル毎に１℃低下させる）、９４℃で２秒間および６９℃で３分間を２０サイクル、６９℃で３分間であった。ＰｖｕＩＩ−消化ゲノム歩行ライブラリーから１．５ｋｂのゲノム断片が増幅され単離された。ゲノム断片をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化して、配列決定のためにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター中にクローンした。ＤＮＡ配列決定からは、このゲノム断片が１４０８ｂｐのダイズＢＤ３０プロモーター配列（配列番号８４）を含有すると判定された。
【０４６２】
ＮＣＢＩデータベース（Ｓ４４８９３）中のダイズβ−コングリシニンβ−サブユニットプロモーター配列の配列に基づいて、５’末端にＢａｍＨＩまたはＮｏｔＩ部位のどちらかがある２個のオリゴをデザインして、ダイズβ−コングリシニンβ−サブユニットプロモーター（配列番号８５）を増幅した。これらの２つのオリゴのオリゴヌクレオチド配列は、配列番号８６および８７に記載される。
【０４６３】
ＮＣＢＩジェンバンクデータベース（Ｘ１５１２１）中のダイズグリシニンＧｙ１プロモーター配列の配列に基づいて、５’末端にＢａｍＨＩまたはＮｏｔＩ部位のどちらかがある２個のオリゴをデザインして、ダイズグリシニンＧｙ１プロモーター（配列番号８８）を増幅した。これらの２つのオリゴのオリゴヌクレオチド配列は、配列番号８９および９０に記載される。
【０４６４】
実施例１３
Δ１７デサチュラーゼ（ｐＫＲ５８５）との同時発現のためのフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）Δ１５デサチュラーゼのダイズ発現ベクター中へのクローニング
この実施例は、ダイズ中におけるΔ１５デサチュラーゼおよびサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼの強力な種子特異的発現のためのベクターであるｐＫＲ５８５の構築について述べる。ダイズアネキシンプロモーター制御下における、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ［ペレイラ（Ｐｅｒｅｉｒａ）ら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７８、６６５〜６７１］を含有する中間体クローニングベクター（ｐＫＲ２７１）の構築については、以前に国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられておりここで再度述べる。
【０４６５】
カセットの両端にＸｂａＩおよびＢｓｉＷＩ部位を導入するようにデザインされた、プライマーｏＫＴｉ５（配列番号９１）およびｏＫＴｉ６（配列番号９２）を使用して、ｐＫＳ１２１からＫＴｉ／ＮｏｔＩ／ＫＴｉ３’カセットをＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ断片をクローニングベクターｐＵＣ１９のＸｂａＩ部位中にサブクローニングして、プラスミドｐＫＲ１２４を得て、それによりＫｔｉ転写ターミネーターの３’末端にＰｓｔＩおよびＳｂｆＩ部位を付加した。
【０４６６】
ダイズＢＤ３０プロモーター（国際公開第０１／６８８８７号パンフレット）を含有するｐＪＳ９３のＳａｌＩ断片をｐＵＣ１９のＳａｌＩ断片と合わせてｐＫＲ２２７を得て、それによりＰｓｔＩおよびＳｂｆＩ部位をＢＤ３０プロモーターの５’末端に付加した。
【０４６７】
ＮｏｔＩ部位をターミネーターの５’末端に導入するようにデザインされたプライマーｏＳＢＤ３０−１（配列番号９３）、およびＢｓｉＷＩ部位をターミネーターの３’末端に導入するようにデザインされたプライマーｏＳＢＤ３０−２（配列番号９４）を使用して、ダイズゲノムＤＮＡからＢＤ３０３’転写ターミネーターをＰＣＲ増幅した。
【０４６８】
製造業者のプロトコルに従って、得られたＰＣＲ断片を中間体クローニングベクターｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡＭＰＳＫ（＋）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中にサブクローニングし、プラスミドｐＫＲ２５１ｒを得た。ＢＤ３０３’転写ターミネーターを含有するｐＫＲ２５１ｒからのＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ断片を中間体クローニングベクターｐＫＲ２２７のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ断片中にクローニングして、ｐＫＲ２５６を得た。
【０４６９】
ｐＪＳ９２からのアネキシンプロモーター（配列番号８１）をＢａｍＨＩ消化によって遊離させ、末端を充填した。得られた断片をｐＫＲ１２４ベクター主鎖からの充填ＢｓｉＷＩ断片中に、ＰｓｔＩおよびＳｂｆＩ部位をアネキシンプロモーターの５’末端に付加する方向でライゲートし、ｐＫＲ２６５を得た。ＳｂｆＩおよびＮｏｔＩでの消化によって、ｐＫＲ２６５からアネキシンプロモーターを遊離させ、ＢＤ３０３’転写ターミネーター、アンピシリン抵抗性遺伝子および細菌性ｏｒｉ領域を含有するｐＫＲ２５６のＳｂｆＩ／ＮｏｔＩ断片中にクローニングして、ｐＫＲ２６８を得た。
【０４７０】
ＮｏｔＩでの部分的消化によって、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼの遺伝子をｐＫＳ２０３［ペレイラ（Ｐｅｒｅｉｒａ）ら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７８、６６５〜６７１］から遊離させ、ｐＫＲ２６８のＮｏｔＩ部位中にクローニングして、ｐＫＲ２７１を得た。
【０４７１】
次にプラスミドｐＫＲ２７１をＰｓｔＩで消化し、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼを含有する断片をｐＫＲ５７８のＳｂｆＩ部位中にクローニングして、ｐＫＲ５８５を得た。このようにして、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）Δ１５デサチュラーゼは、強力な種子特異的プロモーターの背後で、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼと同時発現できた。ｐＫＲ５８５（配列番号９５）のマップを図７に示す。プラスミドｐＫＲ５８５は、１０８０１ユニバーシティ・ブールヴァード、マナッサス、ＶＡ２０１１０〜２２０９の米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）に２００４年１１月４日の寄託日に、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−ＸＸＸＸで寄託された。
【０４７２】
実施例１４
ダイズ（ｐＫＲ２７４）中での発現のためのＥＰＡ生合成経路遺伝子の組み立て
この実施例は体細胞性ダイズ胚芽およびダイズ種子中におけるＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ（米国特許第５,９６８,８０９号明細書）、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（国際公開第００／１２７２０号パンフレット）およびＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ（米国特許第６,０７５,１８３号明細書）の強力な種子特異的発現のためにデザインされたベクターであるｐＫＲ２７４の構築について述べる。このベクターの構築については、以前に国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられており、ここで再度述べる。
【０４７３】
ファセオリン遺伝子の３’転写終結領域［ドイル（Ｄｏｙｌｅ），Ｊ．Ｊ．ら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８〜９２３８］がそれに続く、β−コングリシニンのα’サブユニット［ビーチー（Ｂｅａｃｈｙ）ら、（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：３０４７〜３０５３］（βｃｏｎ／Ｍａｄ６／Ｐｈａｓ３’カセット）のためのプロモーターの背後で、Δ６デサチュラーゼをクローニングした。
【０４７４】
その単離について米国特許第６,３７２,９６５号明細書で述べられるＫＴｉ３’終結領域がそれに続く、Ｋｕｎｉｔｚダイズトリプシン阻害因子（ＫＴｉ）プロモーター［ジョフク（Ｊｏｆｕｋｕ）ら、（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ１：１０７９〜１０９３］（ＫＴｉ／Ｍａｄ５／ＫＴｉ３’カセット）の背後で、Δ５デサチュラーゼをクローニングした。
【０４７５】
エンドウレグミンＡ２  ３’終結領域がそれに続く、グリシニンＧｙ１プロモーター（配列番号８８）（Ｇｙ１／Ｍａｅｌｏ／ｌｅｇＡ２カセット）の背後で、エロンガーゼをクローニングした。
【０４７６】
これらの全てのプロモーターは、ダイズ種子中で強力な組織特異的発現を示す。プラスミドｐＫＲ２７４はまた、λＤＥ３のために溶原性である（そしてｌａｃＵＶ５制御下のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む）ウィスコンシン州マディソンのノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのノヴァブルー（ＮｏｖａＢｌｕｅ）（ＤＥ３）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の特定株におけるハイグロマイシンＢ上でのプラスミドの選択のために、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの背後でクローニングされ、Ｔ７ターミネーターがそれに続く、ハイグロマイシンＢリン転移酵素遺伝子［グリッツ（Ｇｒｉｔｚ），Ｌ．およびディビス（Ｄａｖｉｅｓ），Ｊ．（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１７９〜１８８］（Ｔ７ｐｒｏｍ／ＨＰＴ／Ｔ７ｔｅｒｍカセット）も含有する。さらにプラスミドｐＫＲ２７４は、ベクターｐＳＰ７２（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で機能的である細菌性複製起点（ｏｒｉ）を含有する。
【０４７７】
ＮｏｔＩ制限酵素部位をΔ６デサチュラーゼの両端に、ＮｃｏＩ部位を酵素の読み枠の開始コドンに導入するようにデザインされた、プライマーｏＣＧＲ５−１（配列番号９６）およびｏＣＧＲ５−２（配列番号９７）を使用して、ｐＣＧＲ５（米国特許第５,９６８,８０９号明細書）から、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼの遺伝子をＰＣＲ増幅した。
【０４７８】
製造業者のプロトコルに従って、得られたＰＣＲ断片を中間体クローニングベクターｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡＭＰＳＫ（＋）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中にサブクローニングし、プラスミドｐＫＲ１５９を得た。
【０４７９】
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ遺伝子を含有するｐＫＲ１５９のＮｏｔＩ断片をｐＺＢＬ１１７のＮｏｔＩ部位中に、センス方向でクローニングして、植物発現カセットｐＺＢＬ１１９を作った。
【０４８０】
Ｔ７ｐｒｏｍ／ｈｐｔ／Ｔ７ｔｅｒｍカセットおよび細菌性ｏｒｉを含有するプラスミドｐＫＳ１０２（国際公開第０２／００９０４号パンフレット）からのＡｓｃＩ断片と、βｃｏｎ／ＮｏｔＩ／Ｐｈａｓカセットを含有するプラスミドｐＫＲ７２のＡｓｃＩ断片とを合わせて、ベクターｐＫＲ１９７を構築した。
【０４８１】
プラスミドｐＫＲ１５９をＮｏｔＩで消化してＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼを遊離させ、それを次にダイズ発現ベクターｐＫＲ１９７のＮｏｔＩ部位中にクローニングしてｐＫＲ２６９を得た。
【０４８２】
ＳｂｆＩ／ＰｓｔＩ部位をプロモーターの５’末端に導入するようにデザインされたプライマーｏＳＧｌｙ−１（配列番号９８）、およびＮｏｔＩ部位をプロモーターの３’末端に導入するようにデザインされたプライマーｏＳＧｌｙ−２（配列番号９９）を使用して、ｐＺＢＬ１１９からグリシニンＧｙ１プロモーターを増幅した。
【０４８３】
製造業者のプロトコルに従って得られたＰＣＲ断片を中間体クローニングベクターｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡＭＰＳＫ（＋）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中にサブクローニングし、プラスミドｐＳＧｌｙ１２を得た。
【０４８４】
ＸｂａＩおよびＢｓｉＷＩ部位をプロモーターの５’末端に導入するようにデザインされたプライマーＬｅｇＰｒｏ５’（配列番号１００）、およびＮｏｔＩ部位をプロモーターの３’末端に導入するようにデザインされたプライマーＬｅｇＰｒｏ３’（配列番号１０１）を使用して、エンドウゲノムＤＮＡからｌｅｇＡ２プロモーターを増幅した。
【０４８５】
ＮｏｔＩ部位をターミネーターの５’末端に導入するようにデザインされたプライマーＬｅｇＴｅｒｍ５’（配列番号１０２）、およびＢｓｉＷＩおよびＸｂａＩ部位をターミネーターの３’末端に導入するようにデザインされたプライマーＬｅｇＴｅｒｍ３’（配列番号１０３）を使用して、エンドウゲノムＤＮＡからｌｅｇＡ２転写ターミネーターを増幅した。
【０４８６】
次に得られたＰＣＲ断片を合わせて、プライマーＬｅｇＰｒｏ５’およびＬｅｇＴｅｒｍ３’を使用して再増幅し、それによってｌｅｇＡ２／ＮｏｔＩ／ｌｅｇＡ２３’カセットを形成した。製造業者のプロトコルに従ってｌｅｇＡ２／ＮｏｔＩ／ｌｅｇＡ２３’カセットＰＣＲ断片を中間体クローニングベクターｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡＭＰＳＫ（＋）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中にサブクローニングし、プラスミドｐＫＲ１４０を得た。細菌性ｏｒｉおよびアンピシリン抵抗性遺伝子を含有するｐＫＲ１２４のＢｓｉＷＩ部位中に、ｌｅｇＡ２／ＮｏｔＩ／ｌｅｇＡ２３’カセットを含有するｐＫＲ１４０のＢｓｉＷＩ断片をクローニングして、プラスミドｐＫＲ１４２を構築した。次にプラスミドｐＫＲ１４２からのＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ断片と、グリシニンＧｙ１プロモーターを含有するプラスミドｐＳＧｌｙ１２のＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ断片とを合わせ、ｐＫＲ２６３を得た。
【０４８７】
ＮｏｔＩ制限酵素部位をデサチュラーゼの両端に導入するようにデザインされた、プライマーＣＧＲ４ｆｏｗａｒｄ（配列番号１０４）およびＣＧＲ４ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号１０５）を使用して、ｐＣＧＲ４（米国特許第６,０７５,１８３号明細書）からＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼの遺伝子を増幅した。
【０４８８】
得られたＰＣＲ断片をＮｏｔＩで消化し、ベクターｐＫＲ１２４のＮｏｔＩ部位中にクローニングし、ｐＫＲ１３６を得た。
【０４８９】
ＮｏｔＩ制限酵素部位をエロンガーゼの両端に導入するようにデザインされた、プライマーＲＰＢ２ｆｏｗａｒｄ（配列番号１０６）およびＲＰＢ２ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号１０７）を使用して、ｐＲＰＢ２（国際公開第００／１２７２０号パンフレット）から、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼの遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ断片をＮｏｔＩで消化し、ベクターｐＫＲ２６３のＮｏｔＩ部位中にクローニングし、ｐＫＲ２７０を得た。
【０４９０】
ＢｓｉＷＩおよびＳｂｆＩでの消化によってプラスミドｐＫＲ２７０からＧｙ１／Ｍａｅｌｏ／ｌｅｇＡ２カセットを遊離させ、Δ６デサチュラーゼ、Ｔ７ｐｒｏｍ／ｈｐｔ／Ｔ７ｔｅｒｍカセット、および細菌性ｏｒｉ領域を含有するプラスミドｐＫＲ２６９のＢｓｉＷＩ／ＳｂｆＩ部位中にクローニングした。これをプラスミドｐＫＲ２７２と命名した。
【０４９１】
ＢｓｉＷＩでの消化によってｐＫＲ１３６から遊離させたＫＴｉ／Ｍａｄ５／ＫＴｉ３’カセットをｐＫＲ２７２のＢｓｉＷＩ部位中にクローニングし、ｐＫＲ２７４（図８）を得た。
【０４９２】
実施例１５
ダイズ（ｐＫＫＥ２）中における発現のためのＥＰＡ生合成経路遺伝子組み立て
この実施例は、体細胞性ダイズ胚芽およびダイズ種子中における、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ（国際公開第０２／０８１６６８号パンフレット）、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（国際公開第００／１２７２０号パンフレット）およびＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ（米国特許第６,０７５,１８３号明細書）の強力な種子特異的発現のためにデザインされたベクターであるｐＫＫＥ２構築について述べる。このベクターは、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼがサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ６デサチュラーゼで置換されていること以外は、ｐＫＲ２７４と同一である。このベクターの構築については、以前に国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられており、ここで再度述べる。
【０４９３】
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によって、ｐＲＳＰ１（国際公開第０２／０８１６６８号パンフレット）からＳ．ディクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）Δ６デサチュラーゼを除去する。得られたＤＮＡ断片の末端を充填し、断片をｐＫＳ１２３の充填ＮｏｔＩ部位中にクローニングし、ｐＫＳ２０８を得た。
【０４９４】
ＨｉｎｄＩＩＩでの消化によってプラスミドｐＫＳ２０８からβｃｏｎ／Ｓｄｄ６／Ｐｈａｓ３’カセットを遊離させ、プラスミドｐＫＲ２７２のＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローニングし、ｐＫＲ３０１を得た。
【０４９５】
ＢｓｉＷＩでの消化によってｐＫＲ１３６から遊離されたＫＴｉ／Ｍａｄ５／ＫＴｉ３’カセットをｐＫＲ３０１のＢｓｉＷＩ部位中にクローニングし、ｐＫＫＥ２を得た（図９）。
【０４９６】
実施例１６
体細胞性ダイズ胚芽培養物の形質転換
培養条件
光度６０〜８５μＥ／ｍ２／ｓの冷白色蛍光灯による１６：８時間の昼／夜光周期で、１５０ｒｐｍ、２６℃の回転振盪器上の３５ｍＬ液体培地ＳＢ１９６（下の処方参照）中にダイズ胚芽形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）を維持する。培養物は、およそ３５ｍｇの組織を３５ｍＬの新鮮な液体ＳＢ１９６に接種して、７日〜２週間毎に継代培養される（好ましい継代培養間隔は７日毎である）。
【０４９７】
粒子ガン衝撃法（クライン（Ｋｌｉｎｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０（１９８７））によって、ダイズ胚芽形成懸濁培養物を実施例１８で述べられるｐＫＲ３５３（Δ１５）プラスミドで形質転換する。デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）遺伝子銃ＰＤＳ１０００／ＨＥ装置（ヘリウム後付け）を全ての形質転換のために使用する。
【０４９８】
ダイズ胚芽形成懸濁液の培養開始
各開始の間を５〜７日間開けて、ダイズ培養を毎月２回開始する。
【０４９９】
定植後４５〜５５日の入手可能なダイズ植物から未熟種子入りサヤを摘み取って、種子を外皮から取り出して滅菌マゼンタ・ボックスに入れる。１滴のアイボリー（ｉｖｏｒｙ）石鹸添加５％クローラックス（Ｃｌｏｒｏｘ）溶液（９５ｍＬのオートクレーブ済み蒸留水に５ｍＬのクローラックス（Ｃｌｏｒｏｘ）および１滴の石鹸を添加）中で１５分間振盪して、ダイズ種子を滅菌する。良く混合する。２本の１Ｌ入り滅菌蒸留水を使用して種子をすすいで、４ｍｍ未満のものを個々の顕微鏡スライドに載せる。種子の小さな端を切断して、子葉を種子被膜から押し出す。子葉（プレート当たり２５〜３０個）をＳＢ１培地を含有するプレートに移す。子葉を含有するプレートをファイバーテープで覆って８週間保存する。その後、二次胚芽を切断してＳＢ１９６液体培地に７日間入れる。
【０５００】
衝撃のためのＤＮＡ調製
無処置プラスミド、または関心のある遺伝子と選択可能な標識遺伝子とを含有するＤＮＡプラスミド断片のいずれかが、衝撃のために使用される。断片は二重消化したプラスミドのゲル単離によって得られる。各例において、０．５ｍＬの適切な酵素混合物中で１００μｇのプラスミドＤＮＡを消化する。得られるＤＮＡ断片を１％シープラーク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）ＧＴＧアガロース（バイオウィッタカー・モレキュラー・アプリケーションズ（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）上でゲル電気泳動法によって分離し、キメラ遺伝子を含有するＤＮＡ断片をアガロース・ゲルから切り取る。製造業者のプロトコルに従って、ゲルイーズ（ＧＥＬｅａｓｅ）消化酵素を使用して、ＤＮＡをアガロースから精製する。
【０５０１】
５μｌの１μｇ／μｌ  ＤＮＡ溶液（無処置プラスミドまたは上述のように調製されたＤＮＡ断片のいずれか）、５０μｌの２．５ＭＣａＣｌ２、および２０μｌの０．１Ｍスペルミジンに、３ｍｇの金粒子（３ｍｇの金）を含有する滅菌蒸留水の５０μｌのアリコートを添加する。ボルテックス振盪器のレベル３で、混合物を３分間振盪し、卓上遠心分離器内で１０秒間遠沈する。４００μｌの１００％エタノールでの洗浄後、超音波処理によって４０μｌの１００％エタノール中にペレットを懸濁する。遺伝子銃ＰＤＳ１０００／ＨＥ装置ディスクの各フライングディスクに、５μｌのＤＮＡ懸濁液を小分けして入れる。各５μｌのアリコートは衝撃あたり（すなわちディスクあたり）およそ０．３７５ｍｇの金を含有する。
【０５０２】
組織調製およびＤＮＡによる衝撃
およそ１５０〜２００ｍｇの７日齢の胚芽懸濁培養物を空の滅菌６０×１５ｍｍペトリ皿に入れ、皿をプラスチックメッシュで覆う。膜破裂圧力を１１００ＰＳＩに設定して、チャンバーを２７〜２８インチ水銀圧の真空に脱気して、組織をプレートあたり１または２回衝撃する。組織を保持／停止スクリーンからおよそ３．５インチに置く。
【０５０３】
形質転換された胚芽の選択
ハイグロマイシン（ハイグロマイシンリン転移酵素、ＨＰＴ、遺伝子が選択可能な標識として使用される場合）またはクロルスルフロン（アセト乳酸シンターゼ、ＡＬＳ、遺伝子が選択可能な標識として使用される場合）のいずれかを使用して、形質転換された胚芽を選択する。
【０５０４】
ハイグロマイシン（ＨＰＴ）選択
衝撃に続いて、上述のように組織を新鮮なＳＢ１９６培地に入れて培養する。衝撃の６日後に、ＳＢ１９６を３０ｍｇ／Ｌハイグロマイシンの選択物質を含有する新鮮なＳＢ１９６で交換する。選択培地は毎週新しくする。選択の４〜６週後に、形質転換されていない壊死性胚芽形成クラスターから、緑色の形質転換された組織が生育しているのが観察されるかもしれない。孤立した緑色組織を取り出して、マルチウェルプレートに接種し、新しいクローン増殖し形質転換された胚芽形成懸濁培養物を生成する。
【０５０５】
クロルスルフロン（ＡＬＳ）選択
衝撃に続いて、組織を新鮮なＳＢ１９６培地を入れた２つのフラスコに分割し、上述のように培養する。衝撃の６〜７日後、ＳＢ１９６を０．１ｍｇ／Ｌクロルスルフロンの選択物質を含有する新鮮なＳＢ１９６と交換する。選択培地は毎週新しくする。選択の４〜６週後に、形質転換されていない壊死性胚芽形成クラスターから、緑色の形質転換された組織が生育しているのが観察されるかもしれない。孤立した緑色組織を取り出して、ＳＢ１９６を含有するマルチウェルプレートに接種し、新しいクローン増殖し形質転換された胚芽形成懸濁培養物を生成する。
【０５０６】
ダイズ体細胞性胚芽の植物への再生
胚芽形成懸濁培養物から植物全体を得るために、組織を再生しなくてはならない。
【０５０７】
胚芽成熟
胚芽は、１６：８時間の光度９０１２０μＥ／ｍ２／ｓの明期で、冷白色蛍光灯（フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）冷白色エコノワット（Ｅｃｏｎｏｗａｔｔ）Ｆ４０／ＣＷ／ＲＳ／ＥＷ）およびアグロ（Ａｇｒｏ）（フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）Ｆ４０アグロ（Ａｇｒｏ）、４０Ｗ））電球の下、ＳＢ１９６中２６℃で４〜６週間培養する。その後、胚芽クラスターを取り出して、１〜２週間ＳＢ１６６固形物寒天培地に入れる。次にクラスターをＳＢ１０３培地で３週間継代培養する。この間に個々の胚芽をクラスターから取り出して、それらの脂肪酸組成の変更についてスクリーンできる。関心のある遺伝子の発現から得られるあらゆる検出可能な表現型は、この段階でスクリーンできることに留意すべきである。脂肪酸プロフィールの変更、タンパク質プロフィールおよび含量、炭水化物含量、成長速度、生活能力またはダイズ植物に正常に発育する能力などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０５０８】
胚芽乾燥および発芽
成熟した個々の胚芽を空の小型ペトリ皿（３５×１０ｍｍ）に入れておよそ４〜７日間乾燥させる。プレートをファイバーテープで密封する（小型湿度室を作る）。乾燥させた胚芽をＳＢ７１−４培地に定植し、そこで上述したのと同一の培養条件で発芽させる。発芽した小植物を発芽培地から取り出して水ですすぎ、次に２４−セルパックトレー内のレディアース（Ｒｅｄｉ−Ｅａｒｔｈ）に定植し、透明なプラスチックドームで覆う。２週間後ドームを除去して、植物をさらに１週間、強化する。小植物が丈夫そうであれば、それらを鉢あたり３本までの小植物を１０インチの鉢内のレディアース（Ｒｅｄｉ−Ｅａｒｔｈ）に移植する。１０〜１６週後、成熟種子を採取して、細断して脂肪酸について分析する。
【０５０９】
【表１９】
2007515951.tif 000021
【０５１０】
【表２０】
2007515951.tif 000022
【０５１１】
ＳＢ１固体培地（１Ｌあたり）
１袋のＭＳ塩（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、カタログ番号１１１１７−０６６）
１ｍｌ  Ｂ５ビタミン  １０００×原液
３１．５ｇスクロース
２ｍｌ  ２,４−Ｄ（最終濃度２０ｍｇ／Ｌ）
ｐＨ５．７
８ｇ  ＴＣ寒天
【０５１２】
ＳＢ１６６固体培地（１Ｌあたり）
１袋のＭＳ塩（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）−カタログ番号１１１１７−０６６）
１ｍｌ  Ｂ５ビタミン  １０００×原液
６０ｇマルトース
７５０ｍｇ  ＭｇＣｌ２六水和物
５ｇ活性炭
ｐＨ５．７
２ｇゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）
【０５１３】
ＳＢ１０３固体培地（１Ｌあたり）
１袋のＭＳ塩（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）−カタログ番号１１１１７−０６６）
１ｍｌ  Ｂ５ビタミン  １０００×原液
６０ｇマルトース
７５０ｍｇ  ＭｇＣｌ２六水和物
ｐＨ５．７
２ｇゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）
【０５１４】
ＳＢ７１−４固体培地（１Ｌあたり）
１瓶のＧａｍｂｏｒｇのＢ５塩、スクロース添加（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）−カタログ番号２１１５３−０３６）
ｐＨ５．７
５ｇ  ＴＣ寒天
【０５１５】
２,４−Ｄ原液
ファイトテク（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ）からカタログ番号Ｄ２９５の既製品を得た−濃度は１ｍｇ／ｍｌ
【０５１６】
Ｂ５ビタミン原液（１００ｍｌあたり）−アリコートを−２０℃に保存する
１０ｇミオ−イノシトール
１００ｍｇニコチン酸
１００ｍｇピリドキシンＨＣｌ
１ｇチアミン
溶液が十分迅速に溶解しない場合、加熱撹拌プレートによって低レベルの熱を加える。
【０５１７】
クロルスルフロン原液
０．０１Ｎ水酸化アンモニウム中１ｍｇ／ｍｌ
【０５１８】
実施例１７
フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）Δ１５デサチュラーゼを含有する体細胞性ダイズ胚芽の分析
成熟体細胞性ダイズ胚芽は接合体胚芽の良好なモデルである。液体培養中の球状胚芽状態では、体細胞性ダイズ胚芽は、成熟した接合体ダイズ胚芽に典型的なトリアシルグリセロールまたは貯蔵タンパク質を非常に少量含有する。この発達段階では、全トリアシルグリセリドと全極性脂質（リン脂質および糖脂質）の比率は約１：４であり、これはそれから体細胞性胚芽培養が開始できる発達段階の接合体ダイズ胚芽に典型的である。球状段階ではさらに、顕著な種子タンパク質、β−コングリシニンのα’−サブユニット、ｋｕｎｉｔｚトリプシン阻害因子３、および種子レクチンのためのｍＲＮＡは本質的に不在である。ホルモンを含まない培地に移して成熟体細胞性胚芽状態に分化させると、トリアシルグリセロールは最も豊富な脂質クラスになる。同じく、β−コングリシニンのα’−サブユニット、ｋｕｎｉｔｚトリプシン阻害因子３、および種子レクチンのためのｍＲＮＡは、全ｍＲＮＡ集団中で非常に豊富なメッセージになる。これに基づいて体細胞性ダイズ胚芽システムは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の成熟接合体ダイズ胚芽と非常に同様に挙動し、したがって脂肪酸生合成経路中の遺伝子発現の変化の表現型効果を分析するための良好で迅速なモデルシステムである（国際公開第０２／００９０４号パンフレットの実施例３）。最も重要なことには、モデルシステムはまたトランスジェニック胚芽から誘導される植物からの種子の脂肪酸組成の予測でもある。
【０５１９】
上述のコンストラクトを含有するトランスジェニック体細胞性ダイズ胚芽を同様にして分析する。このためにはエステル転移反応によって、脂肪酸メチルエステルを単一の成熟体細胞性ダイズ胚芽から調製する。胚芽を５０μＬの水酸化トリメチルスルホニウム（ＴＭＳＨ）および０．５ｍＬのヘキサンを含有するバイアルに入れて、室温で振盪しながら３０分間インキュベートする。脂肪酸メチルエステル（５μＬ、ヘキサン層から注入される）が分離し、スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ．）からのオメガワックス（Ｏｍｅｇａｗａｘ）３２０溶融シリカキャピラリーカラム（カタログ番号２４１５２）を装着したヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ガスクロマトグラフを使用して定量される。オーブン温度をプログラムして２２０℃に２．７分保持し、２０℃／ｍｉｎで２４０℃に上昇させ、次にさらに２．３分保持した。ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）水素発生装置によってキャリアガスを供給した。滞留時間を市販される標準物質のメチルエステルと比較した（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．カタログ番号Ｕ−９９−Ａ）。
【０５２０】
ｐＫＲ５７８を含有する最良の１０系統の結果、ならびに選択のみで形質転換された対照胚芽の結果を表１４に示す。最良の胚芽の系統のみが示されるが、対照（２２％）から最良（８９％）の範囲のＡＬＡレベルを有するその他の系統が得られた。同様に０．４〜４５の範囲のω−３のω−６に対する比率を有するその他の系統が得られる。１９％の平均１８：３含量を有し、最良の胚芽が２２％の１８：３を有した対照と比べて、最良の系統は平均１８：３含量が７９％の胚芽を有し、分析された最良の胚芽は８９％の１８：３を有した。これは対照胚芽と比較して、１８：３の平均４倍の改善に相当する。ｐＫＲ５７８で形質転換された系統における１８：３含量の範囲は、５１〜８９％である。この系統はまた、平均および最良で０．４の１８：３／１８：２の比率を有した対照と比べて、２４：１のω−３：ω−６脂肪酸（１８：３／１８：２）の平均比率も有し、最良の胚芽は４２：１の比率を有した。これはω−３：ω−６比率における平均６６倍の改善に相当する。ｐＫＲ５７８で形質転換された系統におけるω−３：ω−６脂肪酸（１８：３／１８：２）の比率範囲は、３：１−４２：１であった。
【０５２１】
【表２１】
2007515951.tif 000023
【０５２２】
【表２２】
2007515951.tif 000024
【０５２３】
【表２３】
2007515951.tif 000025
【０５２４】
ｐＫＫＥ２およびｐＫＲ５８５を含有する最良の系統の結果を表１５に示す。最良の系統は、平均ω−３含量が６３％および平均ＥＰＡ含量が７％の胚芽を有した。分析された最良のω−３胚芽は７２％のω−３含量を有した。分析された最良のＥＰＡ胚芽は、ＥＰＡが１６％でω−３含量が５７％であった。この系統はまた、８：１のω−３：ω−６（１８：３／１８：２）脂肪酸の平均比率も有し、最良の胚芽は１６：１の比率を有した。最良のＥＰＡ胚芽は４：１のω−３：ω−６比率を有した。
【０５２５】
【表２４】
2007515951.tif 000026
【０５２６】
【表２５】
2007515951.tif 000027
【０５２７】
実施例１８
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の形質転換
ベクターｐＫＲ１９７をＨｉｎｄＩＩＩで消化してβ−コングリシニン発現カセット除去し、ベクター主鎖を再ライゲートしてｐＫＲ２７７を得た。
【０５２８】
ＢｓｉＷＩで消化して、ｐＫＲ１２４からのＫｔｉ／ＮｏｔＩ／Ｋｔｉ３’カセットを除去し、末端を充填して断片をｐＫＲ２７７の充填ＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローニングし、ｐＫＲ３５３を得た。
【０５２９】
フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）Δ１５デサチュラーゼを含有するｐＹ３４のＮｏｔＩ断片をｐＫＲ３５３のＮｏｔＩ部位中にクローニングし、ｐＫＲ３５３（Δ１５）を得た。
【０５３０】
左右Ｔ−ＤＮＡ境界間のＰａｃＩおよびＡｓｐ７１８部位間にＡｓｃＩリンカーを付加することで、ベクターｐＨＤ１がバイナリーベクターｐＺＢＬ１１［米国特許第５,９６８,７９３号明細書、ＥＰ  １００３８９１号明細書、および国際公開第９８５９０６２号パンフレット］から誘導された。オリゴヌクレオチドＡｓｃ５（配列番号１０８）をＡｓｃ３（配列番号１０９）にアニーリングして、ＡｓｃＩリンカーが形成された。
【０５３１】
ベクターｐＺＢＬ１１［米国特許第５,９６８,７９３号明細書、ＥＰ  １００３８９１号明細書、および国際公開第９８５９０６２号パンフレット］は、Ｔ−ＤＮＡ境界内に３５Ｓ：スルホニル尿素抵抗性アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）導入遺伝子を含有し、それはスルホニル尿素除草剤抵抗性を与え、植物選択可能な標識の役割を果たす。ｐＺＢＬ１１はまた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）双方の複製起点、および細菌カナマイシン抵抗性遺伝子も有する。
【０５３２】
ｐＫＲ３５３（Δ１５）からキメラ遺伝子Ｋｔｉ３プロモーター：ＦｍΔ１５デサチュラーゼＯＲＦ：Ｋｔｉ３ターミネーターをＡｓｃ１断片として単離し、バイナリーベクターｐＨＤ１中のユニークなＡｓｃ１部位中にクローニングして、ｐＺＢＬＩ（Ｄ１５）を得た。
【０５３３】
プラスミドｐＺＢＬｌ（Ｄ１５）をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＮＴＬ４［ルオ（Ｌｕｏ）ら（２００１）ＭＰＭＩ１４：９８］に形質転換し、この培養物を使用して、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｄｉｐ法により、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のｆａｄ２−１変異体［オキュレイ（Ｏｋｕｌｅｙ）ら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ６：１４７］を形質転換した。ＮＹと命名された形質転換体をスルホニル尿素上で選択し、植物を生育させＴ２種子を得た。形質転換はまた、対照としてｐＨＤ１を使用して同様に実施した。バルクＴ２種子（ＴＤＮＡおよびスルホニル尿素抵抗性についてなおも分離される）バッチからの脂質を次のようにして分析した。ガラス棒を使用して、およそ２５〜５０個のＴ２種子を５０μＬのＴＭＳＨ中でつぶした。絶えず撹拌しながら室温でおよそ１５分のインキュベーション後、５００μＬのヘキサンを添加し、サンプルを撹拌しながら室温でさらに１５分間インキュベーションした。次にヘキサン層を別個のＧＣバイアルに移し、述べられるようにしてＧＣによって脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）分析を実施した（国際公開第０４／０７１４６７号パンフレット）。複数系統についての結果を表１６に示す。平均１８：３のレベルは、Δ１５−発現系統（ＦｍＤ１５−ＮＹ）で、空のベクター対照（ＨＤ１対照）系統よりもおよそ１．５倍高く、一方１８：３／１８：２比は同一系統内では２倍高かった。野生型アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）中のｎ３／ｎ６比率は０．６１［シャー（Ｓｈａｈ）ら（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ１１４：１５３３］である。当業者は、分離種子（野生型、半接合性、および同型接合性種子を含む）を含有したバルク種子が分析されたために、ＡＬＡのレベルが過小評価されたことを理解するであろう。当業者はまた、同型接合性系統がΔ１５デサチュラーゼの２倍のコピーを含有し、したがってヘテロ接合性系統よりも高いレベルのＡＬＡを有することが予想されることも理解するであろう（遺伝子量効果）。
【０５３４】
【表２６】
2007515951.tif 000028
【０５３５】
野生型アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）は、同様にして、Δ１５デサチュラーゼを発現するキメラコンストラクトで形質転換でき、それらの植物からの種子は形質転換されていない植物よりも高いＡＬＡ含量を含有する。
【０５３６】
したがって植物油中のω−３／ω−６脂肪酸の比率は、キメラのΔ１５デサチュラーゼ遺伝子を野生型植物中または低下した１８：２を有する植物中のどちらかに形質転換することで改善できる。後者は、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）Δ１５デサチュラーゼが二機能的なΔ１２／Δ１５デサチュラーゼであることから帰結する。したがって当業者は、ＬＡをほとんどまたは全く作らない変異体植物中に二機能的なΔ１２／Δ１５デサチュラーゼを形質転換でき、または野生型植物に二機能的なΔ１２／Δ１５デサチュラーゼ、および宿主の天然Δ１２デサチュラーゼ遺伝子を抑制するようにデザインされたＤＮＡ抑制コンストラクトを導入または同時形質転換できる。天然Δ１２デサチュラーゼ遺伝子は、色素胞外および色素胞Δ１２デサチュラーゼの双方をコードする遺伝子を含む。
【図面の簡単な説明】
【０５３７】
【図１】油性酵母における脂質蓄積のための生化学的機序の概略図を示す。
【図２】ω−３およびω−６脂肪酸の生合成経路を図示する。
【図３】ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における遺伝子発現のためのプラスミドベクターｐＹ５の構築を図示する。
【図４】メガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して作製された、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ酵素に対する相同性を有する、異なる糸状菌類（すなわちアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、Ｆ．グラミネアリウム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ））からのタンパク質の系統樹を示す。
【図５】ＣｌｕｓｔａｌＷ分析（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム）を使用した、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ酵素に対する相同性を有する異なる糸状菌からのタンパク質間のペア比較（％同一性）を示す。
【図６】プラスミドｐＫＲ５７８（実施例１１参照）の概略図である。
【図７】プラスミドｐＫＲ５８５（実施例１３参照）の概略図である。
【図８】プラスミドｐＫＲ２７４（実施例１４参照）の概略図である。
【図９】プラスミドｐＫＫＥ２（実施例１５参照）の概略図である。
【図１】
2007515951.tif 000029
【図２】
2007515951.tif 000030
【図３】
2007515951.tif 000031
【図４】
2007515951.tif 000032
【図５】
2007515951.tif 000033
【図６】
2007515951.tif 000034
【図７】
2007515951.tif 000035
【図８】
2007515951.tif 000036
【図９】
2007515951.tif 000037
【配列表】
2007515951000001.xml
【国際調査報告】
2007515951.tif 000096
2007515951.tif 000097
2007515951.tif 000098