【誤訳訂正書】
【提出日】平成28年7月5日(2016.7.5)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え真核生物宿主細胞により発現され、分泌される抗体のジスルフィド結合の還元を防止する方法であって、（ａ）アンチセンスヌクレオチドを含む核酸分子又は（ｂ）干渉ＲＮＡにより該真核生物宿主細胞のＴｒｘ系の酵素の発現レベルを減少させること及び分泌された抗体を収集することを含み、それにより収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）において、抗体のジスルフィド結合の還元が阻害される方法。
【請求項２】
（ａ）アンチセンスヌクレオチドを含む核酸分子又は（ｂ）干渉ＲＮＡによりＴｒｘ系の酵素の発現レベルが減少した組換え真核生物宿主細胞中で抗体を発現し、抗体が分泌されること及び分泌された抗体を収集することを含み、それにより、収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）において、抗体のジスルフィド結合の還元が阻害される、抗体を製造するための方法。
【請求項３】
酵素が、チオレドキシンレダクターゼ、Ｇ６ＰＤ又はヘキソキナーゼである、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
酵素発現レベルが、ｓｉＲＮＡの使用により減少させられる、請求項１又は２の方法。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスヌクレオチドが、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子配列に特異的に結合する、請求項１、２又は４の方法。
【請求項６】
チオレドキシンレダクターゼ遺伝子配列がＣＨＯのチオレドキシンレダクターゼ遺伝子配列である、請求項５の方法。
【請求項７】
真核生物宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項５の方法。
【請求項８】
哺乳動物宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項７の方法。
【請求項９】
抗体が、治療用抗体又はその生物学的に機能的な断片である、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
治療用抗体の生物学的に機能的な断片が、抗体断片から形成されたＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、及び多重特異的抗体からなる群から選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】
治療用抗体又はその生物学的に機能的な断片が、抗ＨＥＲ２抗体；抗ＣＤ２０抗体；抗ＩＬ−８抗体；抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＣＤ４０抗体，抗ＣＤ１１ａ抗体；抗ＣＤ１８抗体；抗ＩｇＥ抗体；抗Ａｐｏ−２レセプター抗体；抗組織因子（ＴＦ）抗体；抗ヒトα４β７インテグリン抗体；抗ＥＧＦＲ抗体；抗ＣＤ３抗体；抗ＣＤ２５抗体；抗ＣＤ４抗体；抗ＣＤ５２抗体；抗Ｆｃレセプター抗体；抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体；乳房上皮細胞に対する抗体；結腸癌細胞に結合する抗体；抗ＣＤ３８抗体；抗ＣＤ３３抗体；抗ＣＤ２２抗体；抗ＥｐＣＡＭ抗体；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体；抗ＲＳＶ抗体；抗ＣＭＶ抗体；抗ＨＩＶ抗体；抗肝炎抗体；抗ＣＡ１２５抗体；抗αｖβ３抗体；抗ヒト腎細胞癌抗体；抗ヒト１７−１Ａ抗体；抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌；及び抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、及び抗ＨＬＡＤＲ抗体からなる群から選択される、請求項９又は１０の方法。
【請求項１２】
治療用抗体又はその生物学的に機能的な断片が、ＨＥＲレセプター、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４０、又はＤＲ５に結合する、請求項９又は１０の方法。
【請求項１３】
前記ＨＥＲレセプターがＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
ＨＥＲレセプターがＨＥＲ２である、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記治療用抗体が、配列番号１６、１７、１８、及び１９からなる群から選択される重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記治療用抗体がＣＤ２０に結合する抗体である、請求項１２の方法。
【請求項１７】
前記治療用抗体が、配列番号１から１５からなる群から選択される重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記治療用抗体が、ＶＥＧＦに結合する抗体である、請求項１２の方法。
【請求項１９】
前記治療用抗体が、配列番号２０から２５からなる群から選択される重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記治療用抗体がＣＤ１１ａに結合する抗体である、請求項１２の方法。
【請求項２１】
前記治療用抗体が、配列番号２６から２９からなる群から選択される重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記治療用抗体がＤＲ５レセプターに結合する、請求項１２の方法。
【請求項２３】
前記治療用抗体が、Ａｐｏｍａｂｓ１．１、２．１、３．１、４．１、５．１、５．２、５．３、６．１、６．２、６．３、７．１、７．２、７．３、８．１、８．３、９．１、１．２、２．２、３．２、４．２、５．２、６．２、７．２、８．２、９．２、１．３、２．２、３．３、４．３、５．３、６．３、７．３、８．３、９．３、及び２５．３からなる群から選択される、請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記治療用抗体がＡｐｏｍａｂ８．３又はＡｐｏｍａｂ７．３である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記治療用抗体がＡｐｏｍａｂ７．３である、請求項２４の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７１】
細胞溶解は、典型的にはホモジナイゼーション又はヘッドミル等の機械的破壊技術を用いて達成される。対象のタンパク質は一般に効率的に遊離されるが、そのような技術には幾つかの欠点がある（Engler, Protein Purification Process Engineering, Harrison編, 37-55 (1994)）。処理の間にしばしば温度が上昇し、タンパク質の不活性化が起こる場合がある。更に、得られた懸濁液が幅広いスペクトルの汚染タンパク質、核酸及び多糖類を含む。核酸及び多糖類により溶液の粘度が増大し、引き続いて行われる遠心分離、クロスフロー濾過、又はクロマトグラフィーによる処理が困難となる可能性がある。これら汚染物質が対象のタンパク質と複雑に関連することにより、精製プロセスが複雑化し、その結果十分な産生量が得られない場合がある。微生物発酵ブロス又はホモジネートからの異種性ポリペプチドの改良された精製法は、例えば、その全開示が出典明示によりここに明示的に援用される米国特許第７１６９９０８号に記載されている。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３１】
収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）調製物
ＣＣＦの完全な溶解は、Microfluidics HC-8000 ホモジナイザーを使用して高圧ホモジナイゼーションによって達成した。機器の圧力調整器を４０００−８０００ｐｓｉに設定し、ＣＣＦを、ホモジナイザーを通して引き込み、単一パス後に完全な細胞溶解（膜破壊）を達成した。系に水をパージしたところで、ＣＣＦホモジネートを集めた。ホモジネートを遠心ボトルに移し、２０℃にてSorval RC-3Bローター遠心機で４５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。遠心物をデカントした後、デプスフィルターで濾過し、ついでシリコンチュービングを備えた蠕動ポンプを使用して０．２２μｍの滅菌濾過を施し、ホモジナイズされたＣＣＦ（１００％細胞溶解物）から最終ＨＣＣＦを生成した。別法では、ＣＣＦをホモジナイゼーションなしに発酵槽からそのまま遠心分離した後、遠心物を０．２２μｍの滅菌フィルターで濾過してＨＣＣＦを生成した。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３４】
透析実験
透析実験を、オクレリズマブの還元を引き起こす成分が小分子か巨大分子（つまり、酵素）かを決定するために実施した。３ｍＬの精製し製剤化したオクレリズマブの試料（３０．２ｍｇ／ｍＬ）を１Ｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，１０ｍＭ ｐＨ７．２）で２４時間透析し、ＰＢＳを８時間後に変えた。ついで、オクレリズマブ試料の濃度を、２８０ＮＭでの吸光度を使用して１ｍｇ／ｍＬに調節した。アリコートを使用前に−７０℃で保存した。透析チュービングを０．０５％のアジド溶液で一晩水和させ、使用前に滅菌水ですすいだ。３Ｌの発酵槽からＣＣＦのホモジナイゼーションから得られたＨＣＣＦを解凍し、蠕動ポンプを使用して０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐａｋフィルターで濾過した。６つの短いミニタンクに３０ｍＬのＨＣＣＦをそれぞれ満たした。各ミニタンクに、密封した透析チュービング内の５００μＬのオクレリズマブ試料を加えた。ミニタンクを密封し、３５ｒｐｍと雰囲気温度で操作するベンチトップミキサー(Barnstead Lab-Line MAX Q 4000)中に入れた。各時点で、一つのミニタンクをミキサーから取り除き、ＨＣＣＦ（ミニタンク中）及びオクレリズマブ試料（透析バッグ中）のアリコートを取り上げて、遊離チオールアッセイ及びバイオアナライザーアッセイ(以下に記載)で分析するまで、−７０℃で保存した。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４０】
阻害剤添加及び細胞培養液（ＣＣＦ）混合
２５０ｍＭのＥＤＴＡ又は５０ｍＭのＣｕＳＯ４の原液をホモジナイゼーション前のＣＣＦに添加して最終濃度の範囲を評価して、抗体のジスルフィド還元を防止した。最終ＨＣＣＦをホモジナイズされたＣＣＦから生成したところで、希釈し１００％最大以下まで細胞溶解物の全レベルを減少させるためにホモジナイズされていないＣＣＦ（またＥＤＴＡ又はＣｕＳＯ４を含む）から生成したＨＣＣＦとこれら溶液をついで混合した。あるいは、１Ｍの酢酸の原液を週の配合ＨＣＣＦ溶液（ホモジナイズされたＣＣＦ及びホモジナイズされていないＣＣＦ）に加え、抗体のジスルフィド還元を防止するために溶液のｐＨを減少させた。
およそ３０−５０ｍＬの各ＨＣＣＦ溶液（ＥＤＴＡ、ＣｕＳＯ４、酢酸を含むか、又はコントロールでは無添加）を５０ｍＬの３１６Ｌステンレス鋼製バイアルに入れた。バイアルをクランプで密封し、溶液は曝気又は攪拌はしなかった。バイアルを室温（１８−２２℃）で保存した。予め定めた時点で、溶液を取り除き、実験室規模のプロテインＡアフィニティ樹脂で精製した。
同様の結果を、他の酸化剤、例えばシスチン及び酸化型グルタチオンを用いて得ることができる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４１】
空気スパージング
抗体のジスルフィド還元を防止するためのホモジナイズされたＣＣＦから生産したＨＣＣＦの空気スパージングを評価するために、３Ｌのガラス製又は１５Ｌのステンレス鋼製容器を利用した。およそ１−５ＬのＨＣＣＦを０．２２μｍで滅菌濾過し、各滅菌容器に入れた。実験条件は、二酸化炭素の添加によってｐＨ制御を伴うか伴わないで１８−２２℃及び５０（１５Ｌ発酵槽）又は２７５ｒｐｍ（３Ｌ発酵槽）に維持した。溶液に空気をスパージングして空気飽和状態まで溶存酸素レベルを増加させるか窒素（コントロール）をスパージングして溶液中の溶存酸素を除去した。各容器へのガス流は、一定の曝気速度が使用されたか又は最小レベルの溶存酸素が維持されたかに応じて変動した。予め定めた時点で、２５−５０ｍＬの試料を両方の容器から取り除き、分析の前に実験室規模のプロテインＡアフィニティ樹脂で精製した。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４６】
（ｉｉ）ＡＴＧ及びＡＴＭによるＨＣＣＦ中の組換え抗体の還元の阻害
ＴｒｘＲの２種の市販の特異的阻害剤オーロチオグルコース（ＡＴＧ）及び金チオリンゴ酸塩（ＡＴＭ）について、インビトロでＴｒｘ系を阻害しオクレリズマブの還元を阻害するその能力を試験した。ＡＴＧ及びＡＴＭ共、上述のアッセイにおいてオクレリズマブの還元を効果的に阻害することができる（図６及び７を参照）。図５の脚注に記載したものと同じ反応混合物に１ｍＭの濃度でオーロチオグルコース又は金チオリンゴ酸塩を添加すると、バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像に示されているようにオクレリズマブの還元を効果的に阻害した。
Ｔｒｘ系がＨＣＣＦ中で活性であり、還元オクレリズマブが還元抗体分子を生じる製造実験又は実験室規模の実験で観察されるならば、双方の金化合物（ＡＴＧ及びＡＴＭ）がＨＣＣＦ中のオクレリズマブの還元を阻害することができなければならない。図１０は、インキュベーションの期間後３Ｌの発酵槽から生成したホモジナイズされたＣＣＴからのＨＣＣＦ中においてオクレリズマブが直ぐに還元されたことを示している。しかしながら、オクレリズマブ還元事象は、１ｍＭのＡＴＧかＡＴＭがＨＣＣＦに添加されたときには完全に阻害された（図１１及び１２）。これらの結果は、Ｔｒｘ系がＨＣＣＦにおいて活性であり、オクレリズマブの還元の直接的な原因であることを証明している。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５２】
実施例７
（ｉ）ＥＤＴＡ、（ｉｉ）硫酸銅、及び（ｉｉｉ）酢酸の添加による組換え抗体の還元の阻害
４種の異なったＨＣＣＦを保存し、ステンレス鋼製バイアルに入れた。溶液は、ホモジナイズされたＣＣＦからのＨＣＣＦをホモジナイズされていないＣＣＦからのＨＣＣＦで希釈することによって生成された細胞溶解物の量では同様であった。例えば、１５０ｍＬの第一溶解溶液を、５０ｍＬの第二溶液とそれぞれ混合した。この研究で評価された４種のＨＣＣＦ混合物は、（１）２０ｍＭのＥＤＴＡ、（２）３０μＭのＣｕＳＯ４、（３）１５ｍＭの酢酸（ｐＨ５．５）の何れかを含んでおり、（４）コントロール溶液には化学的阻害剤は添加しなかった。４種全ての混合物からのオクレリズマブ抗体はプロテインＡクロマトグラフィーを使用して直ぐに（ｔ＝０時間）精製し、ついでステンレス鋼製バイアル中に２０時間及び４０時間保存した後に再び生成した。精製したプロテインＡ溶離プールをバイオアナライザーアッセイによって分析して、インタクトな抗体（１５０ｋＤａ）の割合を定量した。結果は、９０％のインタクトな抗体が初期時点で４種全ての混合物中に存在していることを示している（図１９）。しかしながら、２０時間の時点では、インタクトな抗体はコントロール混合物（添加なし）では検出されず、抗体ジスルフィド結合の還元を示している。他の３種の混合物では、９０％を越えるインタクトな抗体が２０時間及び４０時間の双方の時点でも尚検出されており、試験した３種全ての阻害剤によるジスルフィド結合の還元の防止を証明している。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５３】
実施例８
ＨＣＣＦの空気スパージングによる組換え抗体の還元の阻害
ホモジナイズされたＣＣＦから生成した一つのＨＣＣＦ混合物を保存し、二つの別個の１０Ｌのステンレス鋼製発酵槽に入れた。一方の容器に空気をスパージすると共に、他方の容器に窒素ガスをスパージした。オクレリズマブ抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して、初期混合物から直ぐに（ｔ＝０時間）精製した。選択された時点で、５０ｍＬの試料を各容器から除去し、抗体をプロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。ついで、精製したプロテインＡ溶離プールをバイオアナライザーアッセイによって分析して、１５０ｋＤａのインタクトな抗体の割合を定量した。結果は、およそ８５％のインタクトな抗体が初期溶液中に存在していることを示しており（図２０）、酸素への暴露（つまり発酵槽への空気スパージ）の前の抗体ジスルフィド結合のある程度の初期の還元を示している。混合物に２時間の間、空気をスパージすると、３６時間の研究の残りに対して９０％より多いインタクトな抗体が測定された。これに対して、混合物に窒素ガスをスパージした場合は、２時間（２８％の１５０ｋＤａピーク）及び６時間（５％の１５０ｋＤａピーク）に測定したところ抗体還元事象が継続した。これらの結果は、ホモジナイズされたＣＣＦから生成したＨＣＣＦ混合物が酸素に暴露されると、抗体中のジスルフィド結合の還元を防止できることを証明している。