(57)【要約】  試料採取、培養、均質化、及び／又は流体の計量などの液体を取り扱う操作を実行するための、閉鎖型ではあるが柔軟性に富み、容易に適用することのできる反応容器システムをモジュール式で構築することができる。このシステムは、第一容器と、該第一容器に接続された少なくとも２つの第二容器とを有し、該第二容器の内容物は、１つの第二容器から前記第一容器に移動させ、又、戻すことができ、他の第二容器にも移動させることができる。【選択図】          図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つの第一容器と、それに接続された少なくとも２つの第二容器とを有し、これらの容器は、少なくとも２つの第二容器の内容物が第一容器に送られるように、又は１つの第二容器から別の第二容器に送られるように接続され、この接続部の大きさと性質とは内容物を混合するのに適合するようになっていることを特徴とする、流体を取り扱う閉鎖型反応容器システム。
【請求項２】
試料を前記システムに導入するための流入口と、任意に廃液を排出するための流出口とをさらに有していることを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記少なくとも２つの第二容器が該容器の容積を制御する手段を有しており、この手段によって、１つの第二容器から前記第一容器へと、又は１つの第二容器から別の第二容器へと流体を移動させることを特徴とする、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
前記流出口が閉鎖された容器又は廃液貯蔵容器への接続部であることを特徴とする、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記容積を制御する手段が、ステッピングモータによって駆動されるピストンであることを特徴とする、請求項３に記載のシステム。
【請求項６】
前記容積を制御する手段が、空気式作動装置によって駆動されるピストンであることを特徴とする、請求項３に記載のシステム。
【請求項７】
前記容積を制御する手段が、人手によって又は自動的に操作される、前記容器の柔軟性のある側壁に作用するローラであることを特徴とする、請求項３に記載のシステム。
【請求項８】
前記容積が柔軟性のある側壁に包まれた収容部の容積であり、前記容積を制御する手段が前記側壁に作用する加圧流体であることを特徴とする、請求項３に記載のシステム。
【請求項９】
前記第一容器が、該容器中を長手方向に移動することができ、該第一容器を複数の部分収容部に分割する少なくとも１枚の仕切壁を有し、該１枚以上の仕切壁が、該仕切壁が容器中で動かされるときに、流体が通過する開口部を有することを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記開口部の大きさが、該開口部を通過させられる液体内容物を完全に混合することができるように定められていることを特徴とする、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記第一容器が該容器中を長手方向に可動なピストンを有しており、少なくとも２つの第二容器が該第一容器に接続されており、該第二容器の容積は、１つの第二容器を除いた残り全部の第二容器の合計の容積が、除いた１つの第二容器の容積に等しいことを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記第一容器が、該容器内の固定された位置に、該容器を２つの収容部に分割する仕切壁を有しており、該仕切壁は、開口部と、長手方向に動くことのできる少なくとも１つのピストンと、そして、第一容器に接続されている少なくとも１つの第二容器を有することを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は閉鎖型反応容器システム、及びこの反応容器システムを用いて化学反応を行う方法に関する。より詳しくは、本発明は、１つの容器の内容物を他の容器に移動する手段（例えば、柔軟性のある壁及び／又は１台以上のピストン、並びに任意に作動装置）、弁、管、及び所望により任意部材として試薬、多量の化学薬品、及び廃棄物用の容器を有する相互接続された容器の装置又はシステム、そして、高度な均質性を得つつ、例えば試料及び試薬を扱う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液相での化学反応を伴う実験は、例えば、反応に直接的に関係する化学薬品（一般に反応体と称される）を含む反応混合物を調製し、反応緩衝剤、酵素又は他の触媒、洗剤などの、化学薬品や反応を容易にする因子を場合によっては加えるというようなバッチ式反応として行われることが多い。
【０００３】
これらの反応体は、通常、試験管、ビーカー、フラスコ、又は大型の容器もしくはタンク（例えば、バイオリアクター）等の反応容器中で、一緒にされる。シールした後引き続いて、反応容器の内容物は、温度、圧力及び／又は制御された雰囲気など、所望の反応が起こるのに最適な条件におかれ、反応が起こるのに適切な時間、その状態に保たれる。この段階は、温置と称されることが多い。
【０００４】
反応の中には時間がかかるものもあり、そのような反応を容易にするために、何らかの種類の混合、撹拌又はかき混ぜをおこなってもよい。このような撹拌を行うと、反応混合物における固形分の輸送を向上させることができ、反応に利する。このような混合は、電磁攪拌機、渦発生器、振とう機等の様々な型の装置を用いて自動で行うこともできるし、また、反応容器を振る若しくは撹拌するなど人手によって行うこともできる。
【０００５】
免疫学的検定、ブロット、マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション、そして他の固相反応などの不均質系においては、ゆっくりとした固形分輸送に関連する深刻な問題がよく発生する。典型的には、そのような反応に関係する２つの分子種の内１つが固体担体の上で動かなくなってしまう。これは、動的な限界に帰着する。さらに、電磁攪拌機及び他の撹拌方法を固相反応に使用される反応形式に適用するのは困難である。
【０００６】
粒子懸濁型の非均質系で起こる反応、即ち、食物、血液、食物又は動物の組織又は細胞、土壌、及び他の試料から得られた物質に関連する細胞及びビーズ懸濁液及び反応もある。
【０００７】
非均質系の他の例としては、生体反応過程、発酵等の試料調製又は他の目的を行う際の反応を挙げることができる。このような系において、タービン撹拌などの激しく撹拌する手段又は他の均質化手段は、反応条件を最適化するのみならず、重力による粒子の沈殿を避けるため、又は分離フィルタの塞栓を避けるためなどに使用される。
【０００８】
滴下反応などの非平衡系においては、効果的な均質化が非常に重要である。このような分析においては、１つの反応体が微量ずつ添加されて行く。これは、人が操作するか、又は自動化されたビュレットを用いて行われることが多い。各添加の結果は、比色又は他の手段によって記録することができ、通常、電磁攪拌機が撹拌に使用される。
【０００９】
反応混合物を混合撹拌することによって固形分の輸送を増加すると望ましいのは、個々の反応の速度が増すためだけではない。もう１つの理由は、均一な温度にすることによって、特に、反応容器底部において温度が高くなりすぎるのを避けるためである。温度が高くなり過ぎると、実験又は合成を損ねてしまうことがある。
【００１０】
殆どの混合操作に関連する問題は、通常、反応容器が、反応混合物とシール手段、例えば、蓋又は栓、との間に一定量の空気を含有していることである。これによって、発泡又は他の望ましくない効果などが生じることがある。また、撹拌を行うことによって所望の利益をもたらすのに十分な固形分輸送が行われるかどうかも確かではない。固形分輸送によって達成される性質も続いて行われる実験において再現するのが困難である。逆に、もし、最小量の空気を反応混合物の上部に残しただけで反応容器を蓋まで完全に満たしてしまうと、固形分輸送を望ましい状態に向上させるように混合又は対流を起こすのがより困難になる。この場合における例外は、鉄の棒を反応容器の底部に載置する電磁攪拌機を使用することである。鉄と反応混合物との化学的な相互作用を防ぐために、通常、反応性のないポリマーがそのような棒を被覆している。反応容器の下で回転する磁気要素はこの棒を回転させ、これによって対流が生じて反応混合物中での固形分移動が増加する。
【００１１】
しかしながら、電磁気撹拌にも欠点がある。最も大きな問題は、磁気攪拌機などの攪拌機を反応混合物中に導入することである。攪拌機は別個の物理的要素であるので、次工程に進む前にそれを除去しなければならない。ある種の実験においては、この攪拌機は汚染源になることもある。
【００１２】
さらに、これまで述べてきた反応体を撹拌・混合する方法は、ある目的、即ち、高度の均質化が求められる状況や、液体が高粘度である場合には、十分に効率的ではない。ある種のホモジナイザーはこの目的のために設計されている。典型的な装置は高圧をかけて反応混合物を、狭い開口部やトンネルを通過させるものである。該開口部又はトンネルにはバッフルや類似の構造体が設けられており、これによって最終的には、強力な対流、又は乱流すら発生する。このような構造体に係る問題は、均質状態の持続時間が短いことと、反応混合物の成分に剪断力がかかることの危険性である。したがって、均質化手続を何サイクルか繰り返して、このようなホモジナイザーを用いた反応を完遂する必要があることが多い。
【００１３】
化学反応を均質化する前記方法に係る他の欠点は、反応形式がバッチ式であるということである。即ち、反応容器に導入される薬剤、又は反応容器から取り出されるアリコートは、ピペット又はディスペンサによって移す必要がある。このことは、反応チャンバの何らかの覆いを開けなければできないことであって、その手続の後に、反応チャンバを再シールしなければならないことも多い。殆どの場合において、連続流プロセス又は閉鎖した状態での取り扱いが望ましい。
【００１４】
WO 01/42487は、試料と緩衝剤とが予めディスペンスされた複数の容器が相互に結合されており、これら複数の容器の内容物が混合したものを、狭い通路を介してある容積の容器から他の容積の容器へと、液体を前後に動かす力を加えることによって均質化する、核酸を抽出する装置を開示している。予め分配されている容器を用いて一度に１つずつ結合マトリクスを含有している容器に接続することによって、ピペット段階を避けることができる。
【００１５】
米国特許第6,566,461号公報は、セミバッチ又は連続モードで、複数の異なる混合物を並列に反応させる方法と装置とを開示している。反応が進行するにつれ、全装置を混合物用回転プレートのロッカーに載置することができる。
【００１６】
オーシャン・オプティクス（米国フロリダ州ダニーディン（Dunedin））は、コンピュータ制御された六方弁、シリンジポンプ、及び分光光度計フローセルを有する、化学分析用の連続注入分析機（sequential injection analyzer）（FIA-SIA-LOVユニット）を提供している。この分析機は、試料の希釈、試薬の添加、及び試料の混合などの湿式化学研究室諸方法を自動化する。この機器においては、化学反応は弁のマニホルド内で起こる。この機器は、ＵＶ、光学繊維分光器、光源、及び吸光・蛍光分析用光ファイバー等の様々な構成要素と組み合わせることができる。
【００１７】
ローブ・イクィップメント＆アプレイザル・カンパニー（米国イリノイ州シカゴ）は、タービン撹拌、被覆された推進翼又は類似の手段を用いて均質化を達成する、一連のバイオリアクターを提供している。このような手段においては、均質化を達成するのに十分なほど高い固形分輸送力を発生すると同時に、反応混合物における剪断力の発生を避けることが重要である。
【００１８】
アドファリテックス・アー・ゲー（Advalytex AG、ドイツ国ブルンタル（Brunnthal））は、マイクロアレイ状で固形分輸送を増加する機器を提供している。これらの機器においては、マイクロアレイ分析を迅速化し、その感度と再現性を向上させるために音波が照射される。
【００１９】
米国特許第5,817,954号と第6,301,980号との両方は、自動点滴装置を開示している。両装置とも、均質化の手段として電磁撹拌を行っている。
【００２０】
WO 2000/58013とWO 2004/045771との両方は、熱サイクル及び等温工程中に均質化を行うための装置を開示しており、該装置においては、反応容器中で効率的な対流を発生させるために遠心力が加えられる。
【００２１】
【特許文献１】WO 01/42487
【特許文献２】米国特許第6,566,461号
【特許文献３】米国特許第5,817,954号
【特許文献４】米国特許第6,301,980号
【特許文献５】WO 2000/58013
【特許文献６】WO 2004/045771
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的の１つは、反応速度を増加させ、従来技術の前記欠点及び不都合さを克服するために、反応混合物を均質化する手段を提供することである。
【００２３】
他の目的は、混合及び同時投与、又は試薬及び／若しくは試料を計量するシステムを提供することである。
【００２４】
第三の目的は、オンラインで試料を取得して試料を扱うシステムを提供することである。
【００２５】
第四の目的は、閉鎖された状態で流体、好ましくは液体を扱う、複雑ではあるが柔軟なシステムを構築するコンポーネント、及びこれらのコンポーネントを用いて構築されるシステムを提供することである。
【００２６】
更なる目的とその達成方法、及びそれらに係る効果は、本願明細書の記載、例、及び請求項を研究することにより、当業者には明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本願の発明者は、驚くべきことに、閉鎖された状態で流体を扱う反応容器システムを用いることによって、撹拌、均質化、そして試薬及び／又は試料を投与又は分配することに係る従来技術の問題を解決することができることを示した。このシステムは、１つの第一容器を有しており、該第一容器には少なくとも２つの第二容器が接続されている。接続は、少なくとも２つの第二容器は、それらの内容物が前記第一容器に送られるように、又は１つの第二容器から別の第二容器に送られるようになされており、この接続部の大きさと性質は内容物を完全に混合するのに適合するようになっている。
【００２８】
本発明の更なる面は、発明の説明、例、及び図面、そしてこの参照によって明細書にその記載が取り込まれる添付の請求項から理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下の記載、例、及び添付の図面において、本発明をより詳細に記述する。
【００３０】
以下の記載及び本願の他の箇所で、以下に定義された関連する用語が使用されている。
【００３１】
「開口部」という用語は、少なくとも２つの収容部の間に設けられた孔を意味して使用される。開口部は、程度の差はあれ管状であり、該開口部を通過する流体の動的状態を最適にするバッフル、フィン、又は他の構造体を有していてもよい。本発明によると、開口部の長さ、幅、及び直径は、該開口部を通過させられる液体内容物が完全に混合するように作られる。この開口部をより長くして、流路と称している態様もある。
【００３２】
「構成要素」という用語は、以下の群に属する種に対して使用される。容器、シリンダ、パネル、反応容器、シリンジ、ピストンポンプ、水力ポンプ、人が操作するピペット、自動ピペット、ステッピングモータ、キューベット、光ファイバーケーブル、レンズ、光フィルタ、磁石、バイアル瓶、バキュテイナ（Vacutainer (R)）、採水器、エアサンプラ、フラスコ、タンク、反応器、内燃機関、管類、分離フィルタ、膜、送り台、計量棒、ドットブロット膜（dot-blot membrane）、マイクロアレイ、ビュレット、分光光度計、ｐＨメータ、導電率計、比色計、輝度計、蛍光検出器（fluorescence meter）、光度計、放射計、クロマトグラフ、二次元クロマトグラフィ用装置、カメラ、バイオセンサ、電気泳動装置、質量分析装置、イオン濃度記録装置、ガス濃度記録装置、分子濃度記録装置、エタノール濃度記録装置、濃度計、重力計、圧力計、射出成形装置、分子の固相結合用の表面、ビーズ懸濁液（bead suspension）、抽出マトリクス（extraction matrix）、フローサイトメトリー装置、粒子計数機、濁度計、水分量測定装置、空気量測定装置、加熱器、ランプ、ハロゲンランプ、ＩＲ照射源、マグネトロン、マイクロ波発生器、超音波発生器、冷却器、液体窒素冷却器、冷却ガス冷却器、冷凍空気冷却器、サーミスタ、熱電対、ニップル、弁、ストッパ、又は類似のもの、及びこれらの組み合わせ。「構成要素」として列挙された前記装置の内のあるものは、下記「容器」の定義にも入る場合がある。
【００３３】
「容器」という用語は、流体を保持することができ、その意図された機能又は使用に応じた形状を有し、また、蓋を有する、或いは有さない１以上の開口部、他の容器との間の弁又は接続部を有している、あらゆる中空の部材を意味して使用される。
【００３４】
「均質化」という用語は、ある試料又は反応混合物が、温度又は濃度に関して均一になり、温度、濃度、ｐＨ、または他のパラメータにおける勾配を最小化するか、なくすかした状態を意味して用いられる。
【００３５】
「マニホルド」という用語は、少なくとも２つの構成要素を接続するのに使用される部材を意味して使用される。該マニホルド及び構成要素中の空所が最小限になるように、このようなマニホルドは構成され、その構成要素は選択される。
【００３６】
「反応混合物」という用語は、少なくとも一種の化学薬品、一種以上の相、溶融物、気体発酵媒体、溶媒、反応緩衝剤、反応体、溶液、ビーズのような粒子状物質の懸濁液、原核細胞若しくは真核細胞、有機分子を含有する流体状物であり、その中で、混合、あらゆる型の物理的又は化学的反応が起こり得るものを意味する。
【００３７】
「反応」という用語は、ＰＣＲ増幅、リアルタイム検出ＰＣＲ分析、サイクルシーケンス分析、蛋白質シーケンス反応、ＬＣＲ増幅、ＲＣＡ増幅、近接結紮アッセイ、ターゲットＤＮＡ増幅、信号増幅、転写、逆転写、翻訳、制限反応、連結反応、クローニング過程、酵素反応、DNAse反応、RNAse反応、プロテイナーゼ反応、細胞溶解過程、重合工程、DNA抽出過程、RNA抽出過程、蛋白質抽出過程、DNA精製過程、RNA精製過程、生体分子分離過程、滴定、低温試料調製などを包含することを意図する。
【００３８】
その最も広い面において、本発明によると、流体を均質化／測定する反応容器を提供することができる。図１に概略的に示されているように、このシステムは、１つの第一容器Ａと、それに接続された少なくとも２つの第二容器、例えば、Ｂ〜Ｆ、又はＧ〜Ｌを有し、これらの容器は、少なくとも２つの第二容器の一方又は両方の内容物が第一容器に送られるように、又は１つの第二容器から別の第二容器に送られるように接続される。このような接続は、弁又は弁のマニホルドによってなされると好ましい。弁の位置、そして流れの方向は所望に応じて調節することができ、弁に作用する操作装置を用いて自動的に調節されるのが好ましい。弁を操作することのできる操作装置は当業者にはよく知られており、本発明によるマニホルド中の弁を操作するのに適した装置を特定するのには、発明的な努力を要しない。
【００３９】
前記第一容器及び第二容器において、該容器中の流体の容積を制御する手段、例えばある第二容器から前記第一容器に、又はある第二容器から別の第二容器に流体を移動させる手段が設けられていると好ましい。このような手段は、大きな収容部を２つ以上の小さな収容部に分割する可動側壁、ピストン、又は可動開口部のような内的手段でもよいし、容器の柔軟性のある壁に作用するピストンやローラなどの外的手段であってもよい。
【００４０】
図２は、多数の第二容器Ｂ〜Ｆが前記第一容器Ａに接続され、さらにまた別の、好ましくは先に記載した第一容器と全第二容器の全容積に対応する容積を有する第二容器Ｇに接続されている、本発明の別の態様を示している。図２に示されているシステムは、受容容器Ｇに移すことによって、一連の第二容器に含有されている一種以上の試薬の等しい又は異なる体積を計量するのに好適に使用することができる。逆に、容器Ｇに含有されている流体を、マニホルドを介して、任意にその内容物を１つの第一容器Ａに入っている試薬と混合した後に、複数の容器Ｂ〜Ｆに分配するのに同じシステムを好適に使用することもできる。
【００４１】
図２に示されているシステムは、試薬を順番に添加して混合するのにも使用することができる。残りの容器Ｃ〜Ｆと容器Ａ及びＢとの間の接続部又は弁を閉じた状態で、最も上にある容器Ａの内容物をまず容器Ｂに移し、さらに、受容容器Ｇに移せば、最も上の容器Ａに入っている試薬が容器Ｂに入っている他の試薬に添加・混合されて受容容器Ｇに送られる。次いで、容器ＡとＢとの間の接続部／弁を閉じて、次の容器との接続部／弁を開ければ、各容器Ｃ〜Ｆについて同じ手続を繰り返すことができる。
【００４２】
本発明の一態様によると、前記第一容器は容積を有する実質的に管状の容器である。この容積は、前記第二容器のどの１つの容器の体積よりも非常に小さいのが好ましい。逆に、前記第一容器の容積を、全第二容器の合計容積と等しいか、それよりも大きいものとすることもできる。
【００４３】
図１〜５，及び７においては、容器はシリンジとして概略的に図示されているが、これは説明という目的のためのみであって、本発明を制限することを意図していない。シリンジ又は円筒状の容器は本発明に密接に関連するが、可動なピストンも代替品として使うことができる場合もある。第二容器は柔軟性のある容器、圧力容器などであってもよい。前記第二容器の容積を制御する手段はピストンとして図示したが、これも図示説明という目的のためのみであって、本発明を制限することを意図していない。容積を制御する手段は、好ましくは、ステッピングモータ、空気作動装置、電磁石等によって駆動されるピストンであるが、柔軟性のある容器の外側に作用する手段、又は圧力容器の圧力及び／又は流出口を調整する手段であってもよい。
【００４４】
本発明の一態様によると、図３に示されているように、第一容器Ｇは、該容器を２つの部分収容部に分割し、容器の内部を長さ方向に動くことのできる少なくとも一枚の仕切壁を有している。該１枚又はそれ以上の仕切壁は、仕切壁が容器の中を動いたときに、流体が通り抜けることのできる開口部を有している。開口部の大きさは、該開口部を通過させられる液体内容物を完全に混合するように設定される。
【００４５】
図４は、前記第一容器Ｅが、該容器中を長手方向に動くことのできるピストンと、第一容器に接続された少なくとも２つの第二容器Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤとを有する、また別の態様を示している。第二容器の容積は、１つの第二容器を除いた残りの全部の第二容器（Ａ、Ｂ、Ｃ）の合計の容積が、除いた１つの第二容器（Ｄ）の容積に等しいようになっている。前記第一容器Ｅは、任意に、さらに別の補助容器又は機器とつながる流出口／流入口を有している。
【００４６】
図５に示されている更なる態様によると、第一容器Ｃは容器内の固定位置に、該容器を２つの収容部Ｃ１とＣ２とに分割する、少なくとも１枚の仕切壁を有する。この仕切壁は開口部と、長手方向に動くことのできる少なくとも１つのピストンと、そして、第一容器に接続されている少なくとも１つの第二容器Ａ又はＢとを有している。図５に示されているシステムを用いると、試料又は反応混合物を第二容器Ａから収容部Ｃ１／Ｃ２に導入し、該試料又は反応混合物を開口部を通して完全に混合することができる。十分な混合／培養の後、第二容器Ｂから収容部Ｃ１／Ｃ２に試薬を添加することができ、再び、開口部を通して内容物を完全に混合することができる。
【００４７】
図６は、容器又は収容部Ａ及びＢが柔軟性のある膜で作られ、これらの収容部が狭い流路によって接続されている態様を示している。収容部Ａ及びＢの両方とも、所望に応じて、さらに流入口／流出口を備えていてもよい。収容部Ａを覆っている柔軟性のある膜に圧力を加えることによって、収容部Ａの内容物を収容部Ｂに移動させることができ、その逆も同様にして行うことができる。この移動は、人手で容器を押圧したり絞ったりすることによって、又は容器の上にローラを通過させることによって行うことができる。適切な手段、好ましくは、やはり図６に示されているように、１基のローラ又は１セットのローラを用いることによって、この移動も当然に自動化することができる。
【００４８】
図７には、図３に示されているものに類似する態様が示されているが、この態様においては２以上の可動仕切板が設けられている。図中には２枚の可動仕切板が示されており、その各々は、前記２枚の可動仕切板によって部分収容部ｇ１、ｇ２、及びｇ３に分割されている収容部Ｇの内容物を混合するために、開口部を任意に有していてもよい。この態様は、図６に示されているように、柔軟性のある膜を用いても実現することができる。
【００４９】
前記態様において、容器も仕切壁も共に固定しておいて、容器の２枚の端部壁を前後に動かすことによって、最初の２つの態様に対応する、１つ以上の開口部を通る流れを作ることができる。この態様は、本発明の反応容器が、バイアル瓶、フラスコ、フィルタ、加熱手段、冷却手段、マイクロアレイ、光源、蛍光記録手段、輝度記録手段、膜、マトリクス、ファイバーオプティック装置、ステッピングモータ、又は分析機器を有する他の構成要素に接続されたシステムにおいて、好適である。本発明の前記面又は態様の組み合わせは、生反応、化学合成、生化学分析、微生物分析、環境モニタ、及びバイオハザード剤の分析に使用することができる。
【００５０】
なお、全ての態様において、マニホルド（Ｍ）と収容部Ｇ及びＥとは、補助機器、分析機器、又はそれ自身の容器を有している別のマニホルドに任意に接続することができる。
【００５１】
図９及び１０に係る態様は、国際出願の提出時に追加された。
【００５２】
図９は、複数の容器１及び２が第一の温度に保たれた第一領域又は区画、例えば冷凍領域（図中では「低温」と表示されている。）に置かれている。一方、前記容器と流体接続状態にある他の容器４及び５は、第二の温度に保たれた第二領域又は区画、例えば、加熱領域（図中では「高温」と表示されている。）に配置されている。これら容器は、弁３及び７を介して相互に、また、流入口／流出口７と流体流通可能であるように接続されている。そして、「高温」領域と「低温」領域とは、絶縁性の仕切によって分けられており、該仕切を通って流体流通がなされている。「高温」領域と「低温」領域とは、冷却手段を１以上の容器の近傍に配し、所望であれば、加熱手段を１以上の容器の近傍に配することによっても得ることができる。冷却手段としては、１つ又はそれ以上の容器と熱交換機との周囲を輪状に循環する、空気、水、又は他の冷却媒体を挙げることができる。同様に、加熱手段としては、循環する流体、電気加熱、ＩＲ照射、マイクロ波要素などを挙げることができる。加熱は部分的に行うこともできるし、激しく撹拌することによって全体的に行うこともできる。
【００５３】
本発明の装置は、また、反応混合物の温度を測定する手段、そして複数の容器を接続する複数の弁を制御する手段を有しているのが好ましい。同様に、本発明の装置は、例えば、吸光度、反射率、濁度、ｐＨ等（これらに限定されない）の関連するパラメータを測定する手段を有していると好ましい。装置の技術的な適用によってどのパラメータが重要であるかが決まり、当業者であればこれらのパラメータを制御／測定する必要な手段を選択することができる。
【００５４】
この態様、及び類似の態様において、流入口７を介して試料をシステム中に導入することができ、例えば容器１中で適当な試薬と混合し、得られた反応混合物を弁３を介して容器１から容器２へと激しく送ることによって該混合物を混合することができる。それ自体反応混合物の温度を上げる可能性のある激しい混合によって、効果的な固形分輸送と均質化、そして急速で効果的な温度の均一化を達成することができる。「外部」の温度と、「低温」又は「高温」領域内での混合の持続時間を制御することによって、反応混合物の温度が正確に制御されるだけではなく、予め設定された温度から迅速に変化することができる。この急速で効果的な撹拌がなければ、温度制御がゆっくりになる、又は反応混合物の温度が高くなりすぎる、若しくは低すぎるという危険を冒すことになる。本発明のシステムを用いると、効果的な温度調整を行うことができる。従来のＰＣＲシステムにおいては、約１〜３゜／秒という急速な温度勾配速度を得ることができている。本発明によるシステムを使用すると、正確さと均質性とを犠牲にすることなく、従来のものに比べてかなり高速の温度勾配速度を達成することができる。WO 2000/58013による装置を用いて得られたデータでは、約６゜／秒という勾配速度を達成することができた。この温度勾配速度は高度に容積に依存するが、本発明による装置の典型的な一例を用いた予備データでは、約10゜／秒の勾配速度を達成することができる。したがって、本発明の一態様は、容積約100μリットルの試料を用いてＰＣＲを実行する装置であり、熱サイクルは３゜／秒よりも大きい、好ましくは４゜／秒よりも大きい温度勾配速度で、もっとも好ましくは約５〜15゜／秒以上の温度勾配速度で行われる。容積が小さい場合は、それに応じた速い勾配速度を得ることができる。
【００５５】
ＰＣＲ（polymerase chain reaction＝ポリメラーゼ連鎖反応）は、核酸分子のインビトロ増幅のための分子生物学的方法である。本発明による技術を用いると、熱サイクル段階の速度と正確さを向上させることができる。さらに、本発明の方法と装置とは、反応混合物の温度の均一性を保証する。さらに、本発明は容積から独立したＰＣＲを可能にする。換言すれば、容積に関わらず前記効果を達成することが可能になる。最近では、そうでなければ熱的均質化が不可能か過大な時間を要するので、ＰＣＲにおける試料の容積は10μリットル程度に制限されている。現状より容積の大きい試料を扱うことができれば、多くのメリットがある。即ち、２，３の例を挙げれば、容積が大きい試料を使うことができれば、感度が向上し、試料体積の重要性が低減し、試料の調製を最小化するか、そのようなステップを排除することすらできる。このように、本発明は、試料の量ということに関して大きな柔軟性を有する装置と方法とに関する。即ち約１μl〜約10 ml、そしてそれ以上の量の試料を扱うことができる。実行されるプロセスがＰＣＲの準備である場合は、10 mlを若干下回る量から10 mlを越える量を扱うことは特に重要である。
【００５６】
容器の容積を制御する手段、又は反応混合物の容積の一部を１つ又は複数の開口部を通過させる手段としては、先に示したように、可動ピストン又は仕切壁を用いた手段を挙げることができる。或いは、ピストン又は仕切壁を固定した状態で、１つ又は複数の容器を動かしてもよい。すると、液体は１つ又はそれ以上の開口部を通って流れる。また、第２の態様におけるように、仕切壁を動かして容器を固定することもできる。本発明による反応容器が、バイアル瓶、フラスコ、タンク、胴器、弁、フィルタ、加熱手段、冷却手段、マトリクス又はバイオリアクター又は化学合成器を構成する他の要素等の他のシステム構成要素に接続されているシステムにおいて本発明が使用される場合は、いずれかの原理を使用することができる。
【００５７】
本発明によるシステムは、溶解、懸濁、相互に可溶ではない二相反応体の混合など、全ての均質化目的に効果的に使用される。
【００５８】
本発明の効果の１つは、取り扱いが真に閉鎖された環境下でなされるので、エアポケット、泡などを除去することができる。このことは、所望であれば、反応を一相のみで行うことができることを意味している。このような反応は、空気の存在、発泡、又は泡の形成が、反応の進行、最終生成物の品質、反応又は最終生成物について行われる分析若しくは測定の正確さにマイナスの影響を与えるような試料、試薬、又は反応を扱う場合に好適である。
【００５９】
他の効果は、本発明による閉鎖されたシステムによって提供される安全性の側面にある。
【００６０】
また別の効果は、本発明のシステムによって提供される自動化の可能性を含む。
【実施例】
【００６１】
各々その一端が空気式作動装置に接続されている可動ピストン（図示せず）となっている２つの往復運動容器（Ａ及びＢ）を有してなる試料抽出及び分析装置が設計された。前記２つの容器は、四方弁（Ｙ）を介して相互に流体が接触するようになっている。この装置は概略的に図８に示されている。
【００６２】
１つの実施典型例においては、使い捨てシリンジが使用された。各シリンジはシリンジ中のピストンに作用する空気式作動装置に接続されている。空気式作動装置には、圧縮機、複数の管、複数の弁、及び往復動形式で複数のモータを同期させるサーボ機構を備えたタンクから、圧縮された空気が供給された。
【００６３】
前記四方弁（Ｙ）は１つの流入口（Ｘ）と流出口とを有しており、該流入口と流出口とのいずれか一方は比較的大きな容積を有する容器と液体流通状態にあり、該容器から試料がオンラインで採取された。該流入口と流出口との他方は、４つの往復動容器（Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦ）を有するマニホルドと液体流通状態にあった。該４つの往復動容器の各々は、その一端が可動ピストンとなっており、空気式作動装置に接続されていた。これら４つの容器は相互に、そして前記最初の２つの第一容器と流体流通状態にあった。廃液を排出するための流出口（Ｚ）も設けられていた。
【００６４】
ピストンと一方又は両方の第一容器の壁とで定められる容積が大きくなって試料を吸引するように、対応する空気ポンプ駆動することによって、200μlの血液試料が（図示されていない）前記比較的大きな容積を有する容器から流入口Ｘを介して抜き出され、２つの第一往復動容器、又はそれらの内の一方の空間内に導入された。
【００６５】
試料が加工流体である例においては、前記四方弁を介して２つの第一容器の間で該試料を送り合うことによって、試料を効果的に均質化することができる。試料を吸引するときに、２つの第一往復動容器の内の一方は溶解緩衝液（５Ｍのヨウ化ナトリウム溶液）と固体結合マトリクス（ガラス繊維）を含有していた。試料を均質化したときに、同時に、このマトリクスは、前記試薬／緩衝剤と完全に混合された。
【００６６】
複数の実験において、空気式作動装置は５〜20 Hz又はストローク／秒の異なる周波数で動作した。試料の体積は１〜10 mlであった。異なる容器間を接続する狭い通路は、容器の直径の約１／10の直径を有していた。
【００６７】
洗浄溶液（EtOH、塩化ナトリウム、EDTA、TrisHCLを含有し、ｐＨ８である「ニュー・ウォッシュ（New Wash）」）と溶出緩衝剤が容器Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦの１つから添加された。十分な均質化及び／又は培養の後に、試料は容器Ｙ中で、例えば、比色法、測光法、当業者に公知のその他の適した方法によって分析された。ある実験においては、試料を採取して従来技術のゲルに塗布したところ、効果的な増幅が達成されたことが示された。
【００６８】
分析又は他の測定に続いて、試料は流出口Ｚを介して排出された。四方弁、並びに容器Ａ及びＢとこれらの接続部は洗浄され、望ましいと考えられる場合は、容器Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦの１以上に貯えられている一種以上の適当な溶液を用いてポンピングと均一化ステップを繰り返すことによって殺菌された。取り扱いをさらに簡便化するために、容器Ａ〜Ｆは単一回使用又は再充填可能なカートリッジ、例えば、１、10、20、50、若しくは100回測定用、又は適切な測定回数用の試薬及び洗浄緩衝液を含有するカートリッジであってもよい。
【００６９】
本発明を、発明者が現在のところ知っているベストモードである、その好ましい態様に関して記載してきたが、当業者には明らかであるように、本明細書に添付の請求項に記載されている本発明の範囲から離れることなく、様々な変更や修正を加えることができると理解するのが妥当である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、１２個の往復動容器（Ａ〜Ｆ、及びＧ〜Ｌ）を有するシステムを概略的に示している。全容器はマニホルド（Ｍ）に接続されており、該マニホルドは、左側にある１つ若しくは複数の容器の内容物が、右側にある１つ若しくは複数の容器へと流れるのを、又はマニホルドに対して同じ側にある容器間で流れるのを制御するのを可能にする複数の弁を有している。弁を用いると、Ａの内容物を、容器Ｂ〜Ｆ及びＧ〜Ｌのどの１つにも、また、これら容器の組み合わせにも移すことができる。例えば、ＡからＢに、そしてＢからＧ、Ｈ、及びＩへと移すことができる。さらに、１つ又は複数の容器の内容物をポンプを用いることによって効率的に混合することができる。例えば、容器Ａ、Ｂ、及びＣの内容物を容器Ｇに移し、混合した内容物を容器ＧとＡとの間で相互に送り合い、十分に混合されるまでこれを繰り返す。
【図２】図２は、６つの第一容器（Ａ〜Ｆ）がマニホルド（Ｍ）に、該マニホルドに１つの第二容器（Ｇ）が接続されており、該第二容器の容積は該第一容器の容積の合計量と同じかそれよりも大きくなっている態様を概略的に示している。この配置によると、容器Ａ〜Ｆの内容物を容器Ｇに送ることによって非常に効率的に混合することができ、所望であれば、容器Ｇから混合された内容物の６つのアリコートを作ることができる。任意に、マニホルド（Ｍ）は、補助機器、分析機器、又はそれ自身の容器を有する別のマニホルドに接続することができる。
【図３】図３は、マニホルドそれ自身が、それに接続されている容器（Ａ〜Ｆ）の容積分の流体の少なくとも一部を受け入れるのに十分な容積の収容部（Ｇ）を有している態様を概略的に示している。さらに、マニホルドは開口部を有する可動仕切板を有しており、内容物の混合を助ける。或いは、仕切板を固定してそれを取り囲む容器部分を可動とすることもできる。例えば、９６−区画形式など、いくつかの混合を平行して行いたい場合は、後者の方が望ましい。
【図４】図４は、マニホルドそれ自身が、それに接続されている容器（Ａ〜Ｄ）の容積分の流体の少なくとも一部を受け入れるのに十分な容積の収容部（Ｅ）を有している態様を概略的に示している。上記態様と同様に、マニホルドは可動仕切板を有しているが、この場合は開口部が設けられておらず、可動側壁を形成している。この可動側壁によってマニホルドに含有される流体の体積を調節する。可動側壁は柔軟性のある壁と該柔軟性のある壁の外側に作用する手段とに置換することもできる。さらに、マニホルドに接続されている容器の内の１つ（Ｄ）は他の容器に比べて大きな容積を有しており、マニホルドに接続されている残りの容器（Ａ〜Ｃ）に含まれる流体の全容積の少なくとも一部を受け入れることができる。これによって、容器Ａ、Ｂ、及びＣの内容物を順次、又は同時に収容部Ｅに入れて混合し、容器Ｄに移して培養や分析などを行うことができる。
【図５】図５は、２つの容器（Ａ、Ｂ）が、開口部を有する壁によって分割された２つの収容部（Ｃ１及びＣ２）を有するマニホルドに接続された態様を示している。開口部を設けられたこの壁は固定されており、一方、Ａ、Ｂ、Ｃ１、及びＣ２の容量は可動側壁またはピストンによって決定される。この可動側壁及びピストンは、柔軟性のある壁と該柔軟性のある壁の外側に作用する手段とに置換することもできる。収容部は柔軟性のある材料に完全に包むことができ、該材料の外側から圧力を加えることによって、該収容部に流体を流れ込ませ、及び該収容部から流体を流れ出させる。
【図６】図６は、原理的には図５に示したものに類似する態様を概略的に示している。この態様においては、柔軟性のある２つの収容部を有する容器が、混合及び培養などの試料の扱いを行うのに使用されている。２つの収容部Ａ及びＢは柔軟性のある膜で包まれており、狭い流路を介して接続されている。該流路の長さ、幅、及び直径は、内容物が前記流路を通過されられたときに、乱流を起こして収容部Ａ及びＢの内容部分を完全に混合するように作られる。両収容部Ａ及びＢは流入口／流出口とを有していてもよく、例えば試料採取のために、流入口／流出口は前記狭い流路に接続されていてもよい（図示せず）。
【図７】図７は、図３に示されているものに類似する態様を概略的に示している。しかしながら、この態様は２枚以上の仕切板を有しており、その各々が、前記仕切板によって収容部ｇ１、ｇ２、及びｇ３に分割されている収容部Ｇの内容物を混合するための開口部を、任意に有していてもよい。図には２枚の可動仕切板として図示されている。
【図８】図８は、本発明の一態様によって、オンライン試料抜き取り、処理、及び分析のための装置を概略的に示している。
【図９】図９は、２つの相互に連結された容器（ここでは、可動ピストンを有する実質的に円筒形の容器（１及び２）として図示されている。）が、ある温度に保たれた（ここでは、「低温」と表示されている。）第一領域（Ｉ）に配置され、別の２つの容器（４及び５）が異なる温度（ここでは、「高温」と表示されている。）に保たれた第二領域（II）に配置されている態様を、概略的に示している。弁（３及び６）を設けることによって、所望に応じて、流体に容器間を流通させることができる。流入口／流出口（７）が示されている。例えば熱電対などの温度感知器からの入力（Ｔ’及びＴ”）を受け取り、弁（３及び６）に制御信号（Ｃ’及びＣ”）を送る制御ユニットが概略的に示されている。
【図１０】図１０は、図９に示されている態様に関連する態様を概略的に示しているが、別々の温度に保たれている領域間に設けられている仕切壁が、図９に示されている態様に対して垂直に延在している。この態様においても、２つの容器（８及び13）がある温度に保たれた（ここでは、「低温」と表示されている。）第一領域（Ｉ）に配置され、別の２つの容器（９及び14）が異なる温度（ここでは、「高温」と表示されている。）に保たれた第二領域（II）に配置されている。流入口／流出口（12）と共に弁（10、11、及び15）も配されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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