(57)【要約】  本発明は、その発現が冠動脈疾患の罹患と相関する遺伝子に関する。特に、本発明は、遺伝子発現の測定に基づく、冠動脈疾患の予後、診断およびモニタリング方法に関する。加えて、本発明は、冠動脈疾患の処置で使用するための化合物のスクリーニング方法、並びに冠動脈疾患の同定に使用するキットおよびアレイに関する。
2007515155.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）対象における表６から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第１の値を提供すること、
（ｉｉ）対照または参照基準における該表６から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第２の値を提供すること、および、
（ｉｉｉ）該第１の値と第２の値との間に差異があるか否かを比較すること、
を含む、対象における冠動脈疾患の素因を同定または予測する方法。
【請求項２】
該対照または参照基準が、冠動脈疾患のない対象または対象群から決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の値が第２の値より高いことが、冠動脈疾患の存在または予測を示すものである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
冠動脈疾患の存在の予測が、少なくとも５０％の確率である、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
第１の値が、第２の値より少なくとも２０％高い、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）受託コードで：ＢＧ５３７１９０、Ｌ３７０３３、ＡＬ５８１７６８、ＡＦ０５５０００、ＮＭ０２５２４１、ＡＦ１５１０７４、ＡＦ２７９３７２およびＢＦ４３２４７８（表６）または、
（ｉｉ）配列番号で：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８（表７）
からなる遺伝子群から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
表９のＰＭＳ２Ｌ５（配列番号９）、ＲＸＲＡ（配列番号１０）、ＧＣＮ５Ｌ１（配列番号１１）、ＣＡＢＩＮ１（配列番号１２）、ＬＧＡＬＳ９（配列番号１３）、ＣＥＢＰＡ（配列番号１４）、ＬＲＲＮ４（配列番号１５）、ＳＴＸＢＰ２（配列番号１６）、ＳＨ３ＢＰ２（配列番号１７）、ＲＮＦ２４（配列番号１８）、ＰＬＡＵＲ（配列番号１９）、ＲＩＳ１（配列番号２０）、ＡＤＤ１（配列番号２１）、ＧＰＳＭ３（配列番号２２）、ＢＣ００２９４２（配列番号２３）、ＴＮＦＲＳＦ５（配列番号２４）、Ｎ４ＢＰ１（配列番号２５）、ＦＬＪ１２４３８（配列番号２６）およびＭＭＰ２４（配列番号２７）からなる遺伝子群から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
表１０のＰＴＰ４Ａ１（配列番号２８）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（配列番号２９）、ＳＯＸ４（配列番号３０）、ＡＳＮＡ１（配列番号３１）、ＭＡＮ２Ａ２（配列番号３２）、ＮＦＹＣ（配列番号３３）、ＮＯＴＣＨ２（配列番号３４）、ＨＤＡＣ５（配列番号３５）、ＨＣＦＣ１（配列番号３６）、ＮＦＸ１（配列番号３７）、ＣＲＳＰ２（配列番号３８）、ＩＣＡＭ１（配列番号３９）、ＰＳＧ３（配列番号４０）、ＳＴＣ２（配列番号４１）およびＳＥＭＡ３Ｃ（配列番号４２）からなる遺伝子群から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
表７の遺伝子から選択される少なくとも１種の遺伝子並びに／または表９および／もしくは表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）対象における表１１から選択される１種またはそれ以上のペプチドのレベルを決定し、第１の値を提供すること、
（ｂ）対照または参照基準における該表１１から選択される１種またはそれ以上のペプチドのレベルを決定し、第２の値を提供すること、および、
（ｃ）該第１の値と第２の値の間に差異があるか否かを比較すること、
を含む、対象における冠動脈疾患（ＣＡＤ）を同定または予測する方法。
【請求項１１】
表１１の疾患＞対照のペプチドについて、または、表１１の疾患で支配的であるペプチドについて、比較したペプチドレベルが冠動脈疾患の同定または予測において上昇している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
表１１の対照＞疾患のペプチドについて、または、表１１の対照で支配的であるペプチドについて、比較したペプチドレベルが冠動脈疾患の同定または予測において低下している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）対象における表１１から選択される１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび表６および／または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第１の値を提供すること、
（ｂ）対照または参照基準における該表１１から選択される１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび表６および／または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第２の値を提供すること、および、
（ｃ）該第１の値と第２の値の間に差異があるか否かを決定すること、
を含み、第１の値における表１１の１種またはそれ以上の疾患＞対照のペプチドおよび／または疾患で支配的なペプチドのペプチドレベルの上昇、および／または、第１の値における表１１の１種またはそれ以上の対照＞疾患および／または対照で支配的なペプチドのペプチドレベルの低下、および、第１の値における表６および／または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルの上昇が、冠動脈疾患の同定または予測である、
請求項１ないし請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
表７の配列番号１に相当する少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項６、請求項９または請求項１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
表７から選択される少なくとも２種ないし８種の配列の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項６、請求項９、請求項１３または請求項１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
表７から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項６、請求項９、または請求項１３ないし請求項１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
表７から選択される８種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項６、請求項９、または請求項１３ないし請求項１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
表９の配列番号９に相当する少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項５、請求項７、請求項９または請求項１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
表９から選択される少なくとも２種ないし１９種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項５、請求項７、請求項９、請求項１３または請求項１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
表９から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項５、請求項７、請求項９、請求項１３、請求項１８または請求項１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
表９から選択される１９種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項５、請求項７、請求項９、請求項１３、請求項１８ないし請求項２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
表１０の配列番号２８に相当する少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項５、請求項８、請求項９または請求項１３のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
表１０から選択される少なくとも２種ないし１５種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項５、請求項８、請求項９、請求項１３または請求項２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
表１０から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項５、請求項８、請求項９、請求項１３、請求項２２または請求項２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
表１０から選択される１５種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項１ないし請求項５、請求項８、請求項９、請求項１３、請求項２２または請求項２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
表１１から選択される複数のペプチドのペプチドレベルを決定する、請求項１０ないし請求項１３のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
表１１から選択される全てのペプチドのペプチドレベルを決定する、請求項１０ないし請求項１３または請求項２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
該ペプチドレベルが、血液、血漿または血清サンプルで決定される、請求項１０ないし請求項１３、請求項２６または請求項２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子発現レベルの決定が、タンパク質発現産物を測定することを含む、請求項１ないし請求項９または請求項１３ないし請求項２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
該タンパク質発現産物の量および／またはペプチドの量を、該タンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体または抗体フラグメントを使用して検出する、請求項１０ないし請求項１３または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
遺伝子発現レベルの決定が、該遺伝子の転写されたポリヌクレオチドの遺伝子発現を測定することを含む、請求項１ないし請求項９または請求項１３ないし請求項２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
該転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
発現レベルが、マイクロアレイ分析、ノザンブロット分析、逆転写ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲにより検出される、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該遺伝子発現レベルおよび／またはペプチドレベルが、血液、血清、血漿、リンパ、尿、涙、唾液、脳脊髄液、白血球サンプルまたは組織サンプルの群から選択されるサンプルにおいてエクスビボで測定される、請求項１ないし請求項３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
該方法がＣＡＤ指数の測定をさらに含む、請求項１ないし請求項３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
２３ないし１００のＣＡＤ指数が、冠動脈疾患の存在または素因の確率を示すものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
（ｉ）該対象における表６または表７の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを処置前に決定し、第１の値を提供すること、
（ｉｉ）（ｉ）と同じ少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを処置後に決定し、第２の値を提供すること、および、
（ｉｉｉ）該対象の処置前および処置後の遺伝子発現レベルの差異を比較すること、
を含む、冠動脈疾患を有すると同定された対象を、処置の前後にモニタリングする方法。
【請求項３８】
（ｉ）該対象における表９または表１０の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを処置前に決定し、第１の値を提供すること、
（ｉｉ）（ｉ）と同じ少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを処置後に決定し、第２の値を提供すること、および、
（ｉｉｉ）第１の値を第２の値と比較すること、
を含む、冠動脈疾患を有すると同定された対象を、処置の前後にモニタリングする方法。
【請求項３９】
（ｉ）該対象における表７から選択される少なくとも１種の遺伝子および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを処置前に決定し、第１の値を提供すること、
（ｉｉ）（ｉ）と同じ遺伝子の遺伝子発現レベルを処置後に決定し、第２の値を提供すること、および、
（ｉｉｉ）第１の値を第２の値と比較することにより、該対象の処置前および処置後の遺伝子発現レベルの差異を決定すること、
を含む、冠動脈疾患を有すると同定された対象を、処置の前後にモニタリングする方法。
【請求項４０】
（ｉ）該対象における表１１から選択される１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび表６および／または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを処置前に決定し、第１の値を提供すること、
（ｉｉ）（ｉ）と同じ少なくとも１種の遺伝子の１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび遺伝子発現レベルを処置後に決定し、第２の値を提供すること、および、
（ｉｉｉ）第１の値を第２の値と比較することにより、該対象の処置前および処置後の１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび遺伝子発現レベルの差異を決定すること、
を含む、冠動脈疾患を有すると同定された対象を、処置の前後にモニタリングする方法。
【請求項４１】
（ｉｖ）該対象における冠動脈疾患の処置の効力に対応する、遺伝子発現レベルおよび／またはペプチドのレベルの差異を決定すること、
をさらに含む、請求項３７ないし請求項４０のいずれかに記載の対象のモニタリング方法。
【請求項４２】
処置に対する正の応答が、遺伝子発現レベルの第２の値が第１の値より低い場合に測定される、請求項３７ないし請求項４１のいずれかに記載の対象のモニタリング方法。
【請求項４３】
表１１の１種またはそれ以上の疾患＞対照および／または疾患で支配的なペプチドについての第２の値のペプチドレベルの低下；および／または、表１１の１種またはそれ以上の対照＞疾患および／または対照で支配的なペプチドについての第２の値のペプチドレベルの上昇、および／または、第２の値における表６および／または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルの低下が、処置に対する正の応答を示すものである、請求項４０または請求項４１に記載の対象のモニタリング方法。
【請求項４４】
少なくとも配列番号１の遺伝子発現レベルを決定する、請求項３７、請求項３９ないし請求項４３のいずれかに記載の対象のモニタリング方法。
【請求項４５】
表７の複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項３７、請求項３９ないし請求項４４のいずれかに記載の対象のモニタリング方法。
【請求項４６】
表７に列挙される８種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項３７、請求項３９ないし請求項４５のいずれかに記載の対象のモニタリング方法。
【請求項４７】
少なくとも表９の配列番号９の遺伝子発現レベルを決定する、請求項３８ないし請求項４３のいずれかに記載の対象のモニタリング方法。
【請求項４８】
表９から選択される少なくとも２種ないし１９種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項３８ないし請求項４３または請求項４７のいずれかに記載の対象のモニタリング方法。
【請求項４９】
表９から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項３８ないし請求項４３、請求項４７または請求項４８のいずれかに記載の対象のモニタリング方法。
【請求項５０】
表９から選択される１９種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項３８ないし請求項４３、請求項４７ないし請求項４９のいずれかに記載の対象のモニタリング方法。
【請求項５１】
少なくとも表１０の配列番号２８の遺伝子発現レベルを決定する、請求項３８ないし請求項４３のいずれかに記載の対象のモニタリング方法。
【請求項５２】
表１０から選択される少なくとも２種ないし１５種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項３８ないし請求項４３または請求項５１のいずれかに記載の対象のモニタリング方法。
【請求項５３】
表１０から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項３８ないし請求項４３、請求項５１または請求項５２のいずれかに記載の対象のモニタリング方法。
【請求項５４】
表１０から選択される１５種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項３８ないし請求項４３、請求項５１ないし請求項５３のいずれかに記載の対象のモニタリング方法。
【請求項５５】
表１１の複数のペプチドのレベルおよび表６および／または表７および／または表９および／または表１０の遺伝子から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項４０ないし請求項４３のいずれかに記載の対象のモニタリング方法。
【請求項５６】
（ｉ）表６または表７の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを最初の時点で決定し、第１の値を提供すること、
（ｉｉ）表６または表７の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを最初の時点の後の時点で決定し、第２の値を提供すること、
（ｉｉｉ）第１の値の遺伝子発現レベルの第２の値に対する差異を比較すること、ここで、第２の値におけるより高い遺伝子発現レベルは、冠動脈疾患の重篤さの上昇を示すものである、
を含む、冠動脈疾患の進行または重篤さをモニタリングする方法。
【請求項５７】
（ｉ）表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定すること、
（ｉｉ）（ｉ）と同じ少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを最初の時点の後の時点で決定し、第２の値を提供すること、
（ｉｉｉ）第１の値の遺伝子発現レベルの第２の値に対する差異を比較すること、ここで、第２の値におけるより高い遺伝子発現レベルは、冠動脈疾患の重篤さの上昇を示すものである、
を含む、冠動脈疾患の進行または重篤さをモニタリングする方法。
【請求項５８】
第２の値におけるより低い遺伝子発現レベルが、冠動脈疾患の重篤さの低下を示すものである、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
（ｉ）表１１から選択される１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび表６および／または表７および／または表９および／または表１０からの少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを最初の時点で決定し、第１の値を提供すること、
（ｉｉ）（ｉ）と同じ１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを最初の時点の後の時点で決定し、第２の値を提供すること、
（ｉｉｉ）第１の値の１種またはそれ以上のペプチドおよび遺伝子発現のレベルの第２の値に対する差異を比較すること、ここで、第２の値における表１１の１種またはそれ以上の疾患＞対照および／または疾患で支配的なペプチドのより高いレベル、または、対照＞疾患のペプチドまたは対照で支配的なペプチドのより低いレベル、および、第２の値における表６および／または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子のより高い発現レベルは、冠動脈疾患の重篤さの上昇を示すものである、
を含む、冠動脈疾患の進行または重篤さをモニタリングする方法。
【請求項６０】
（ｉ）表６または表７から選択される遺伝子を発現する能力のある細胞または細胞のサンプルを、候補作用物質とエクスビボで接触させること、
（ｉｉ）該表６または表７の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第１の値を提供すること、
（ｉｉｉ）同じ表６または表７の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを、候補作用物質の非存在下の細胞または細胞のサンプルで決定し、第２の値を提供すること、および、
（ｉｖ）第１の値を第２の値と比較すること、ここで、遺伝子発現レベルの差異は、冠動脈疾患の処置に使用される能力を潜在的に有する作用物質を示すものである、
を含む、冠動脈疾患の処置で使用するための候補作用物質のスクリーニング方法。
【請求項６１】
（ｉ）表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子を発現する能力のある細胞または細胞のサンプルを、候補作用物質とエクスビボで接触させること、
（ｉｉ）（ｉ）の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第１の値を提供すること、
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを、候補作用物質の非存在下の細胞または細胞のサンプルで決定し、第２の値を提供すること、および、
（ｉｖ）第１の値を第２の値と比較すること、ここで、遺伝子発現レベルの差異は、冠動脈疾患の処置に使用される能力を潜在的に有する作用物質を示すものである、
を含む、冠動脈疾患の処置で使用するための候補作用物質のスクリーニング方法。
【請求項６２】
第１の値が第２の値より低いとき、候補作用物質の存在下での遺伝子発現レベルの低下が決定され、冠動脈疾患の処置に使用される能力を潜在的に有する作用物質を示すものである、請求項６１または請求項６２に記載のスクリーニング方法。
【請求項６３】
（ｉ）表１１から選択される少なくとも１種のペプチドを産生する能力のある、かつ、表６および／または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子を発現する能力のある細胞または細胞のサンプルを、候補作用物質とエクスビボで接触させること、
（ｉｉ）（ｉ）の１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび（ｉ）の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第１の値を提供すること、
（ｉｉｉ）（ｉ）の１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび（ｉ）の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを、候補作用物質の非存在下の細胞または細胞のサンプルで決定し、第２の値を提供すること、および、
（ｉｖ）第１の値を第２の値と比較すること、ここで、１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルの差異は、冠動脈疾患の処置に使用される能力を潜在的に有する作用物質を示すものである、
を含む、冠動脈疾患の処置で使用するための候補作用物質のスクリーニング方法。
【請求項６４】
第２の値と比較したとき、第１の値における少なくとも１種の表１１の疾患＞対照のペプチドおよび／または疾患で支配的なペプチドのより低いレベル、および／または、第１の値における少なくとも１種の対照＞疾患および／または対照で支配的なペプチドのより高いレベル、および、第１の値における表６および／または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子のより低いレベルは、冠動脈疾患の処置に使用される能力を潜在的に有する作用物質を示すものである、請求項６３に記載のスクリーニング方法。
【請求項６５】
少なくとも配列番号１の遺伝子発現レベルを決定する、請求項６０ないし請求項６４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６６】
表７から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項６０ないし請求項６５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６７】
表７から選択される８種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項６０ないし請求項６６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６８】
少なくとも表９の配列番号９の遺伝子発現レベルを決定する、請求項６１ないし請求項６４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６９】
表９から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項６１ないし請求項６４または請求項６８のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７０】
表９から選択される１９種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項６１ないし請求項６４、請求項６８または請求項６９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７１】
少なくとも表１０の配列番号２８の遺伝子発現レベルを決定する、請求項６１ないし請求項６４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７２】
表１０から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項６１ないし請求項６４または請求項７１のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７３】
表１０から選択される１５種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項６１ないし請求項６４、請求項７１または請求項７２のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７４】
表１１の複数のペプチドのレベルおよび表６、表７、表９および／または表１０から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する、請求項６３または請求項６４に記載のスクリーニング方法。
【請求項７５】
表６または表７の少なくとも１種の遺伝子または遺伝子発現産物の遺伝子発現、合成または活性のレベルの低下を誘導できる作用物質の有効量を、対象に投与することを含む、冠動脈疾患の処置または予防方法。
【請求項７６】
表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子または遺伝子発現産物の遺伝子発現、合成または活性のレベルの低下を誘導できる作用物質の有効量を、対象に投与することを含む、冠動脈疾患の処置または予防方法。
【請求項７７】
表１１の少なくとも１種の疾患＞対照および／または疾患で支配的なペプチドのレベルの低下、および／または、少なくとも１種の対照＞疾患および／または対照で支配的なペプチドのレベルの上昇、および／または、表６および／または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子または遺伝子発現産物の遺伝子発現、合成または活性の低下を誘導できる作用物質の有効量を、対象に投与することを含む、冠動脈疾患の処置または予防方法。
【請求項７８】
該作用物質が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、リボザイム、低分子、抗体または抗体フラグメントからなる群から選択される、請求項７５ないし請求項７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
表６または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子または遺伝子発現産物の遺伝子発現、合成または活性のレベルの低下を誘導できる有効量の作用物質を含む冠動脈疾患の処置または予防用の医薬の製造方法。
【請求項８０】
表６または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子または遺伝子発現産物の遺伝子発現、合成または活性のレベルの低下を誘導できる有効量の作用物質を含む物質の、冠動脈疾患の処置または予防用の医薬の製造における使用。
【請求項８１】
表１１の少なくとも１種の疾患＞対照および／または疾患で支配的なペプチドのレベルの低下、および／または、少なくとも１種の対照＞疾患および／または対照で支配的なペプチドのレベルの上昇、および／または、表６または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子または遺伝子発現産物の遺伝子発現、合成または活性のレベルの低下を誘導できる有効量の作用物質を含む物質の冠動脈疾患の処置または予防用の医薬の製造における使用。
【請求項８２】
（ｉ）表６または表７の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するための指示書、および、
（ｉｉ）表６または表７の少なくとも１種の遺伝子についての、正常な対象または冠動脈疾患のない対象に由来する対照または参照基準の遺伝子発現レベル、
を含む、対象における冠動脈疾患の素因を同定または予測するためのキット。
【請求項８３】
（ｉ）表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するための指示書、
（ｉｉ）（ｉ）の遺伝子についての、正常な対象または冠動脈疾患のない対象に由来する対照または参照基準の遺伝子発現レベル、
を含む、対象における冠動脈疾患の素因を同定または予測するためのキット。
【請求項８４】
表６および／または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する能力のある抗体、抗体誘導体または抗体フラグメントがさらに提供される、請求項８２ないし請求項８３のいずれかに記載のキット。
【請求項８５】
（ａ）表１１の少なくとも１種のペプチドのペプチドレベルを決定するための指示書、および、
（ｂ）表１１の少なくとも１種のペプチドについての、正常な対象または冠動脈疾患のない対象に由来する対照または参照基準のペプチドレベル、
を含む、対象における冠動脈疾患を同定または予測するためのキット。
【請求項８６】
（ｃ）該表１１の少なくとも１種のペプチドに結合する抗体、
をさらに含む、請求項８５に記載のキット。
【請求項８７】
（ａ）表１１の少なくとも１種のペプチドのペプチドレベルを決定するための、そして、表６および／または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するための、指示書、および、
（ｂ）（ｉ）の表１１の少なくとも１種のペプチドについての、そして表６および／または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するための、正常な対象または冠動脈疾患のない対象に由来する対照または参照基準のペプチドレベル、
を含む、対象における冠動脈疾患を同定または予測するためのキット。
【請求項８８】
（ｃ）該表１１の少なくとも１種のペプチドに結合する抗体、および、表６および／または表７、および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子にコードされるポリペプチドに結合する能力のある、さらなる抗体、抗体誘導体または抗体フラグメントが提供される、
をさらに含む、請求項８７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、その発現が冠動脈疾患の罹患（prevalence）と相関する遺伝子に関する。特に、本発明は、遺伝子発現の測定に基づく、対象における冠動脈疾患の同定、予測およびモニタリング方法に関する。加えて、本発明は、冠動脈疾患の処置で使用するための化合物のスクリーニング方法、および冠動脈疾患の同定に使用するためのキットに関する。
【０００２】
発明の背景
冠動脈疾患は、合衆国、ヨーロッパおよびアジアの殆どで、主要な死因である。複遺伝子性の疾患として、遺伝子発現パターンの理解は、この疾患に対する感受性の個体差を説明する助けとなり得る。
【０００３】
本発明によると、冠動脈疾患は、血液と酸素を心臓に供給する冠動脈が狭くなることであると定義される。冠疾患は、通常、脂質物質およびプラークの発達に起因する（アテローム性動脈硬化）。冠動脈狭窄の結果、心臓への血流は、遅延または停止し得る。この疾患は、胸部痛（安定狭心症）、息切れ、アテローム性動脈硬化、虚血／再灌流、高血圧、再狭窄および動脈の炎症を含むがこれらに限定されるものではない症状を特徴とする。
【０００４】
ゲノムの知識における革命にも関わらず、遺伝子の変異がどのように冠疾患に関連するかについての、決定的かつ再現可能な洞察は欠如している。遺伝子発現産物が、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質の集団全体の形態で、どのように病状に関連するかを定義することは、疾患への新しい洞察を得る機会をもたらす。
【０００５】
全身的および局所的炎症は、アテローム硬化性の冠動脈疾患（ＣＡＤ）に顕著な病原的役割を果たすが、対象から単離された血液、血漿または循環している白血球などのサンプルにおける発現型の変化とＣＡＤの程度との関係は、不明なままである。従って、当分野では、かかるサンプルにおける遺伝子発現パターンが、ＣＡＤの存在および程度に関係するか否かを理解することへの必要性がある。
【０００６】
発明の要旨
本発明は、冠動脈疾患を有する対象において、正常または非疾患状態での発現と比べて、異なって（differentially）発現される遺伝子に関する。そのようなものとして、それらは、冠動脈疾患のバイオマーカーとして使用できる。さらに、これらの同定された遺伝子は、それらの遺伝子発現産物を介して、冠動脈疾患に関与する他の遺伝子と共に作用し得る。さらに、本発明は、ＣＡＤを有する対象においてその存在量が変化するタンパク質に関する。
【０００７】
対象における冠動脈疾患の同定、冠動脈疾患の素因を有し得る患者の同定、および冠動脈疾患の処置および進行のモニタリングの方法が提供される。さらに提供されるのは、冠動脈疾患の処置に使用するための作用物質のスクリーニング方法である。本発明はまた、冠動脈疾患の同定およびモニタリングに使用できるキットを提供する。本発明のバイオマーカーの測定は、冠動脈疾患の診断と相関し得る情報を提供できる。
【０００８】
これらのバイオマーカーは実施例に記載の通り血液から同定されるが、それらが検出され得るサンプルは血液に限定されず、血清、血漿、リンパ、尿、涙、唾液、脳脊髄液または組織などの他のタイプのサンプルで検出され得る。
【０００９】
系統的かつ包括的なアプローチは、冠疾患を有する集団と有さない集団で異なって表示される、ｍＲＮＡまたはタンパク質などの多数の遺伝子発現産物を同定した。これらの遺伝子発現産物には、炎症介在因子および防御メカニズムのタンパク質およびそれらをコードするｍＲＮＡが含まれる。
【００１０】
８種の遺伝子（表７）、１９種の遺伝子（表９）、１５種の遺伝子（表１０）の同時発現パターン、および／または、１１種の疾患＞対照および疾患で支配的なペプチドの存在量、および／または、４種の対照＞疾患および対照で支配的なペプチドの存在量（表１１）は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）を高度に予測するものである。従って、血液、血漿または末梢白血球の遺伝子発現パターンは、冠動脈疾患の非侵襲性のバイオマーカーであり、新しい病態生理学的洞察を導く。
【００１１】
本発明のある態様では、対象における冠動脈疾患の素因を同定または予測する方法が提供され、それは、
（ｉ）対象における表６から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第１の値を提供すること、
（ｉｉ）対照または参照基準における該表６から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第２の値を提供すること、および、
（ｉｉｉ）該第１の値と第２の値との間に差異があるか否かを比較すること、
を含む。
【００１２】
本発明の別の実施態様では、対象における冠動脈疾患の素因を同定または予測する方法が提供され、それは、（ｉ）対象における表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第１の値を提供すること、（ｉｉ）対照または参照基準における該表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第２の値を提供すること、（ｉｉｉ）該第１の値と第２の値との間に差異があるか否かを比較すること、の各段階を含む。好ましくは、対照または参照基準は、冠動脈疾患のない対象または対象群から決定する。ここで、試験されている対象における遺伝子発現レベル（第１の値）が対照または参照基準のもの（第２の値）より高いならば、そのことは冠動脈疾患の存在または予測を示すものである。
【００１３】
本発明の別の態様は、対象における冠動脈疾患（ＣＡＤ）の同定または予測方法を提供し、該方法は、（ａ）対象における表１１から選択される１種またはそれ以上のペプチドのレベルを決定し、第１の値を提供すること、（ｂ）対照または参照基準における該表１１から選択される１種またはそれ以上のペプチドのレベルを決定し、第２の値を提供すること、（ｃ）該第１の値と第２の値の間に差異があるか否かを比較すること、の各段階を含む。ある実施態様では、第１の値が、表１１の１種またはそれ以上の疾患＞対照のペプチドおよび／または疾患で支配的なペプチドについて上昇している、かつ／または、第１の値が、表１１の１種またはそれ以上の対照＞疾患および／または対照で支配的なペプチドで低下しているならば、そのことは冠動脈疾患の同定または予測である。
【００１４】
本発明の別の実施態様では、対象における冠動脈疾患（ＣＡＤ）の同定または予測方法が提供され、それは、段階（ａ）対象における表１１から選択される１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび表６および／または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第１の値を提供すること、段階（ｂ）対照または参照基準における該表１１から選択される１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび該表６および／または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第２の値を提供すること、および段階（ｃ）該第１の値と第２の値との間に差異があるか否かを決定すること、ここで、第１の値における表１１の１種またはそれ以上の疾患＞対照および／または疾患で支配的なペプチドのペプチドレベルの上昇、および／または、第１の値における表１１の１種またはそれ以上の対照＞疾患および／または対照で支配的なペプチドのペプチドレベルの低下、および、第１の値における表６および／または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルの上昇は、冠動脈疾患の同定または予測である、を含む。
【００１５】
本発明の他の実施態様では、冠動脈疾患の存在の予測は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の確率（probability）である。
【００１６】
本発明の別の実施態様では、遺伝子発現レベルおよび／またはペプチドレベルは、絶対量（例えば、ｕｇ／ｍｌ）または相対量（例えば、相対的シグナル強度）として表現し得、一方のサンプルにおいて、他方のサンプルと比較して遺伝子発現レベルおよび／またはペプチドレベルの数倍の上昇があり得る。本発明の好ましい実施態様では、第１の値に第２の値と比較して少なくとも２０％大きい差異がある。
【００１７】
他の本発明の好ましい実施態様では、以下の遺伝子群：
（ｉ）受託コードで：ＢＧ５３７１９０、Ｌ３７０３３、ＡＬ５８１７６８、ＡＦ０５５０００、ＮＭ０２５２４１、ＡＦ１５１０７４、ＡＦ２７９３７２およびＢＦ４３２４７８（表６）、または、
（ｉｉ）配列番号で：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８（表７）
から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。さらなる好ましい実施態様では、表７から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。他の好ましい実施態様では、少なくとも表７の配列番号１に相当する遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。また別の好ましい実施態様では、表７から選択される少なくとも２種ないし８種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。好ましくは、表７の２種、３種、４種、５種、６種および／または７種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。最も好ましい実施態様では、表７から選択される８種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。
【００１８】
本発明の別の実施態様では、表９のＰＭＳ２Ｌ５（配列番号９）、ＲＸＲＡ（配列番号１０）、ＧＣＮ５Ｌ１（配列番号１１）、ＣＡＢＩＮ１（配列番号１２）、ＬＧＡＬＳ９（配列番号１３）、ＣＥＢＰＡ（配列番号１４）、ＬＲＲＮ４（配列番号１５）、ＳＴＸＢＰ２（配列番号１６）、ＳＨ３ＢＰ２（配列番号１７）、ＲＮＦ２４（配列番号１８）、ＰＬＡＵＲ（配列番号１９）、ＲＩＳ１（配列番号２０）、ＡＤＤ１（配列番号２１）、ＧＰＳＭ３（配列番号２２）、ＢＣ００２９４２（配列番号２３）、ＴＮＦＲＳＦ５（配列番号２４）、Ｎ４ＢＰ１（配列番号２５）、ＦＬＪ１２４３８（配列番号２６）およびＭＭＰ２４（配列番号２７）からなる遺伝子群から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。好ましい実施態様では、表９のＰＭＳ２Ｌ５（配列番号９）および／またはＲＮＦ２４（配列番号１８）に相当する少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。また別の好ましい実施態様では、表９から選択される少なくとも２種ないし１９種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。好ましくは、表９の２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種および／または１８種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。最も好ましい実施態様では、表９から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。より一層好ましい実施態様では、表９から選択される１９種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。
【００１９】
さらなる実施態様では、表１０のＰＴＰ４Ａ１（配列番号２８）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（配列番号２９）、ＳＯＸ４（配列番号３０）、ＡＳＮＡ１（配列番号３１）、ＭＡＮ２Ａ２（配列番号３２）、ＮＦＹＣ（配列番号３３）、ＮＯＴＣＨ２（配列番号３４）、ＨＤＡＣ５（配列番号３５）、ＨＣＦＣ１（配列番号３６）、ＮＦＸ１（配列番号３７）、ＣＲＳＰ２（配列番号３８）、ＩＣＡＭ１（配列番号３９）、ＰＳＧ３（配列番号４０）、ＳＴＣ２（配列番号４１）およびＳＥＭＡ３Ｃ（配列番号４２）からなる遺伝子群から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。好ましくは、表１０のＰＴＰ４Ａ１（配列番号２８）および／またはＭＡＮ２Ａ２（配列番号３２）に相当する遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。より好ましくは、表１０から選択される少なくとも２種ないし１５種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。好ましくは、表１０の２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種および／または１４種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。最も好ましい実施態様では、表１０から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。より一層好ましい実施態様では、表１０から選択される１５種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。
【００２０】
本発明の別の実施態様によると、表７の遺伝子から選択される少なくとも１種の遺伝子および／または表９の少なくとも１種の遺伝子および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。別の実施態様では、表９の遺伝子から選択される少なくとも１種の遺伝子および表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。好ましくは、表７の２種、３種、４種、５種、６種または７種の遺伝子の遺伝子発現レベル、および／または、表９の２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種または１８種の遺伝子の遺伝子発現レベル、および／または、表１０の２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種または１４種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。最も好ましい実施態様では、表７および／または表９および／または表１０から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。より一層好ましい実施態様では、表７および／または表９および／または表１０から選択される全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。２種またはそれ以上の遺伝子発現レベルの決定は、別々にまたは連続的に実施し得る。
【００２１】
他の本発明の好ましい実施態様では、表１１の２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種および／または９種の疾患＞対照のペプチドのレベルおよび／または２種の疾患で支配的なペプチドのレベル、および／または、２種または３種の対照＞疾患のペプチドおよび／または対照で支配的なペプチドのレベルを決定する。最も好ましくは、表１１の複数または全ての疾患＞対照のペプチドおよび／または全ての疾患で支配的なペプチドおよび／または全ての対照＞疾患のペプチドおよび／または全ての対照で支配的なペプチドのレベルを決定する。最も好ましい実施態様では、該ペプチドレベルは、血液、血漿または血清サンプルで測定する。２種またはそれ以上の遺伝子発現レベルおよび／またはペプチドレベルの決定は、別々にまたは連続的に実施し得る。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施態様では、表６の遺伝子から選択される少なくとも５種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、４０種、５０種、６０種、７０種、または、少なくとも８０種、９０種、１００種、または、少なくとも１１０種、１２０種、１４０または１５０種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。別の実施態様では、表６から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、さらなる実施態様では、表６の１６０種全ての遺伝子の発現レベルを決定する。
【００２３】
本発明によると、遺伝子発現レベルの決定は、タンパク質発現産物の測定を含み、該タンパク質発現産物の検出は、そのタンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体または抗体フラグメントを使用することにより行い得る。
【００２４】
本発明の別の実施態様では、遺伝子発現レベルまたはペプチドレベルの決定は、ペプチドをコードする遺伝子の転写されたポリヌクレオチドの遺伝子発現を測定することを含み、転写されたポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。従って、発現レベルは、マイクロアレイ分析、ノザンブロット分析、逆転写ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲにより検出し得る。
【００２５】
本発明のさらなる態様では、遺伝子発現レベルおよび／またはペプチドレベルは、血液、血清、血漿、リンパ、尿、涙、唾液、脳脊髄液、白血球サンプルまたは組織サンプルの群から選択されるサンプルにおいて、エクスビボで測定し得る。
【００２６】
本発明のまた別の実施態様では、ＣＡＤ指数を測定し得、２３ないし１００のＣＡＤ指数は、冠動脈疾患の存在する確率の指標である。
【００２７】
本発明の他の態様では、冠動脈疾患を有すると同定された対象を、処置の前後にモニタリングする方法が提供され、それは、（ｉ）該対象における表６または表７の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを処置前に決定し、第１の値を提供すること、（ｉｉ）同じ遺伝子の遺伝子発現レベルを処置後に決定し、第２の値を提供すること、および（ｉｉｉ）処置前および処置後の該対象の遺伝子発現レベルにおける差異を比較すること、を含む。本発明の別の態様は、冠動脈疾患を有すると同定された対象を、処置の前、間および／または後でモニタリングする方法を提供し、それは、段階（ｉ）該対象における表９または表１０の少なくとも１種の遺伝子遺伝子発現レベルを処置前に決定し、第１の値を提供すること、段階（ｉｉ）（ｉ）と同じ少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを、処置の間および／または後に決定し、第２の値を提供すること、および（ｉｉｉ）第１の値を第２の値と比較すること、を含む。別の実施態様は、冠動脈疾患を有すると同定された対象を、処置の前および間／後にモニタリングする方法を提供し、それは、表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現の分析をベースとする。本発明のさらなる実施態様は、該方法における、表１１から選択される１種またはそれ以上のペプチドのレベルの決定の使用に関する。なおさらなる本発明の実施態様は、表１１から選択される１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび表６または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルの決定をベースとする、かかる方法を提供する。
【００２８】
本発明のある実施態様では、対象のモニタリング方法は、さらに、（ｉｖ）遺伝子発現レベルの差異が、該対象における冠動脈疾患の処置の効力に対応することを決定することを含む。本発明の好ましい実施態様では、遺伝子発現レベルが低下するとき、処置に対する正の応答を測定する。別の好ましい実施態様では、表１１の１種またはそれ以上の疾患＞対照および／または疾患で支配的なペプチドについての第２の値のペプチドレベルの低下；および／または、表１１の１種またはそれ以上の対照＞疾患および／または対照で支配的なペプチドについての第２の値のペプチドレベルの上昇、および／または第２の値における表６または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルの低下は、処置に対する正の応答を示すものである。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様では、少なくとも配列番号１の遺伝子発現レベルを決定する。本発明の別の好ましい実施態様では、表７の複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。本発明の最も好ましい実施態様では、表７に列挙する８種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。他の本発明の好ましい実施態様では、表１１の１種またはそれ以上のペプチドおよび／または表６および／または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子の様々な組合せを、さらに上記したように決定する。
【００３０】
本発明の別の態様では、冠動脈疾患の進行または重篤さをモニタリングする方法が提供され、それは、
（ｉ）表６または表７の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを最初の時点で決定し、第１の値を提供すること、
（ｉｉ）表６または表７の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを最初の時点の後の時点で決定し、第２の値を提供すること、
（ｉｉｉ）第１の値の遺伝子発現レベルの第２の値に対する差異を比較すること、ここで、第２の値におけるより高い遺伝子発現レベルは、冠動脈疾患の重篤さの上昇を示すものである、を含む。本発明の別の実施態様は、冠動脈疾患の進行または重篤さをモニタリングする方法を提供し、それは、（ｉ）表９または表１０の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを最初の時点で決定し、第１の値を提供すること、（ｉｉ）（ｉ）と同じ少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを最初の時点の後の時点で決定し、第２の値を提供すること、および（ｉｉｉ）第１の値の遺伝子発現レベルの第２の値に対する差異を決定すること、ここで、第２の値におけるより高い遺伝子発現レベルは、冠動脈疾患の重篤さの上昇を示すものである、の各段階を含む。さらなる実施態様では、該方法は、表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルの決定をベースとする。本発明の好ましい実施態様では、第２の値におけるより低い遺伝子発現レベルは、冠動脈疾患の重篤さの低下を示すものである。なおさらなる本発明の実施態様は、冠動脈疾患の進行または重篤さをモニタリングする方法を提供し、それは、段階（ｉ）表１１から選択される１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび／または表６または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを最初の時点で決定し、第１の値を提供すること、段階（ｉｉ）（ｉ）と同じ遺伝子の１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび遺伝子発現レベルを最初の時点の後の時点で決定し、第２の値を提供すること、および段階（ｉｉｉ）第１の値の１種またはそれ以上のペプチドおよび遺伝子発現のレベルの第２の値に対する差異を決定すること、ここで、第２の値における表１１の１種またはそれ以上の疾患＞対照および／または疾患で支配的なペプチドのより高いレベル、または、対照＞疾患のペプチドまたは対照で支配的なペプチドのより低いレベル、および／または、第２の値における表６または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子のより高い発現レベルは、冠動脈疾患の重篤さの上昇を示すものである。
【００３１】
本発明のまた別の態様では、冠動脈疾患の処置で使用するための候補作用物質のスクリーニング方法が提供され、それは、
（ｉ）表６または表７から選択される遺伝子を発現する能力のある細胞を、候補作用物質とエクスビボで接触させること、
（ｉｉ）該表６または表７の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第１の値を提供すること、
（ｉｉｉ）同じ表６または表７の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを、候補作用物質の非存在下のサンプルで決定し、第２の値を提供すること、および、
（ｉｖ）第１の値を第２の値と比較すること、ここで、遺伝子発現レベルの差異は、作用物質が冠動脈疾患の処置に使用される能力を潜在的に有することを示すものである、を含む。本発明の別の態様は、冠動脈疾患の処置で使用するための候補作用物質のスクリーニング方法を提供し、該方法は、（ｉ）表７および／または表９および／または表１０から選択される遺伝子を発現する能力のある細胞または細胞のサンプルを、候補作用物質とエクスビボで接触させること、（ｉｉ）該表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第１の値を提供すること、（ｉｉｉ）同じ表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを、候補作用物質の非存在下の細胞または細胞のサンプルで決定し、第２の値を提供すること、および、（ｉｖ）第１の値を第２の値と比較すること、ここで、遺伝子発現レベルの差異は、作用物質が冠動脈疾患の処置に使用される能力を潜在的に有することを示すものである、の各段階を含む。本発明の別の実施態様は、以下の各段階（ｉ）表１１から選択される少なくとも１種のペプチドを産生する能力のある、および／または、表６または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子を発現する能力のある細胞または細胞のサンプルを、候補作用物質とエクスビボで接触させること、（ｉｉ）（ｉ）の１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび／または（ｉ）の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定し、第１の値を提供すること、（ｉｉｉ）（ｉ）の１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび／または（ｉ）の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを、候補作用物質の非存在下の細胞または細胞のサンプルで決定し、第２の値を提供すること、および、（ｉｖ）第１の値を第２の値と比較すること、ここで、１種またはそれ以上のペプチドのレベルおよび／または遺伝子発現レベルの差異は、作用物質が冠動脈疾患の処置に使用される能力を潜在的に有することを示すものである、を提供する。好ましくは、第１の値における少なくとも１種の表１１の疾患＞対照のペプチドおよび／または疾患で支配的なペプチドの低下、および／または第１の値における少なくとも１種の対照＞疾患および／または対照で支配的なペプチドの上昇、および／または、第１の値における表６または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の低下は、作用物質が冠動脈疾患の処置に使用される能力を潜在的に有することを示すものである。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様では、候補作用物質の存在下で、遺伝子発現レベルの低下がある。また別の好ましい実施態様では、少なくとも配列番号１の遺伝子発現レベルの低下を測定し得る。さらなる好ましい実施態様では、表７から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルの低下を測定できる。最も好ましい実施態様では、表７から選択される８種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルの低下を測定し得る。別の好ましい実施態様では、少なくとも表９の配列番号９および／または少なくとも表１０の配列番号２８の遺伝子発現レベルを決定する。最も好ましくは、複数の表１１のペプチドのレベルおよび／または表７および／または表９および／または表１０から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現のレベルを測定する。
【００３３】
本発明の別の態様では、冠動脈疾患の処置または予防方法が提供される。それは、表６または表７の少なくとも１種の遺伝子または遺伝子発現産物の遺伝子発現、合成または活性のレベルの低下を誘導できる作用物質の有効量を、対象に投与することを含む。本発明の別の態様では、冠動脈疾患の処置または予防方法が提供され、該方法は、表６または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子または遺伝子発現産物の遺伝子発現、合成または活性のレベルの低下を誘導できる作用物質の有効量を、対象に投与することを含む。さらに提供されるのは、冠動脈疾患の処置または予防方法であって、それは、表１１の少なくとも１種の疾患＞対照および／または疾患で支配的なペプチドのレベルの低下、および／または、少なくとも１種の対照＞疾患および／または対照で支配的なペプチドのレベルの上昇、および／または、表６または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子または遺伝子発現産物の遺伝子発現、合成または活性の低下を誘導できる作用物質の有効量を、対象に投与することを含む。好ましい実施態様では、該作用物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、リボザイム、低分子、抗体または抗体フラグメントからなる群から選択される。
【００３４】
本発明のまた別の態様では、冠動脈疾患の処置または予防用の医薬の製造方法が提供され、それは、表６または表７の少なくとも１種の遺伝子または遺伝子発現産物の遺伝子発現、合成または活性のレベルの低下を誘導できる作用物質の有効量を含む。
【００３５】
本発明の別の態様は、表６または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子または遺伝子発現産物の遺伝子発現、合成または活性のレベルの低下を誘導できる有効量の作用物質を含む物質の冠動脈疾患の処置または予防用の医薬の製造における使用に関する。別の態様は、表１１の少なくとも１種の疾患＞対照および／または疾患で支配的なペプチドのレベルの低下、および／または、少なくとも１種の対照＞疾患および／または対照で支配的なペプチドのレベルの上昇、および／または、表６または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子または遺伝子発現産物の遺伝子発現、合成または活性の低下を誘導できる有効量の作用物質を含む物質の、冠動脈疾患の処置または予防用の医薬の製造における使用に関する。
【００３６】
他の本発明の好ましい実施態様では、表１１のペプチドのレベルおよび取合せ／組合せ、および／または、表６および／または表７および／または表９および／または表１０の遺伝子の遺伝子発現レベルおよび取合せを決定する。
【００３７】
本発明により提供される、候補作用物質のスクリーニング方法、冠動脈疾患の進行または重篤さのモニタリング方法、冠動脈疾患を有すると同定された対象の処置の前後のモニタリング方法、冠動脈疾患の処置または予防方法、または冠動脈疾患の処置または予防用の医薬の製造方法では、ペプチドまたは遺伝子発現のレベルを、冠動脈疾患の素因を同定または予測する方法についてさらに上記した通り、ペプチドまたは遺伝子の取合せ／組合せについて決定し得る。従って、表７の２種、３種、４種、５種、６種または７種の遺伝子の遺伝子発現レベル、および／または表９の２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種または１８種の遺伝子の遺伝子発現レベル、および／または表１０の２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種または１４種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。最も好ましい実施態様では、表６または表７および／または表９および／または表１０から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。より一層好ましい実施態様では、表６または表７および／または表９および／または１０から選択される全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。他の本発明の好ましい実施態様では、表１１の２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種または９種の疾患＞対照のペプチドのレベルおよび／または２種の疾患で支配的なペプチドのレベル、および／または、２種または３種の対照＞疾患のペプチドのレベルおよび／または対照で支配的なペプチドを決定する。最も好ましくは、表１１の全ての疾患＞対照のペプチドおよび／または全ての疾患で支配的なペプチドおよび／または全ての対照＞疾患のペプチドおよび／または全ての対照で支配的なペプチドのレベルを決定する。さらなる実施態様は、複数または全ての該表１１のペプチドおよび／または表６または表７および／または表９および／または表１０の遺伝子のペプチドまたは遺伝子発現のレベルを決定することを提供する。
【００３８】
本発明のさらなる態様では、対象における冠動脈疾患の素因を同定または予測するためのキットが提供され、それは、（ｉ）表６または表７の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するための指示書、および（ｉｉ）表６または表７の少なくとも１種の遺伝子の、正常な対象または冠動脈疾患のない対象に由来する対照または参照基準の遺伝子発現レベル、を含む。別の態様では、対象における冠動脈疾患の素因を同定または予測するためのキットが提供され、該キットは、（ｉ）表６または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するための指示書、（ｉｉ）表６または表７および／または表９および／または表１０から選択される（ｉ）の遺伝子の、正常な対象または冠動脈疾患のない対象に由来する対照または参照基準の遺伝子発現レベルを含む。ある実施態様では、キットはさらに、表６および／または表７、および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する能力のある抗体、抗体誘導体または抗体フラグメントを含有する。さらに、本発明は、対象における冠動脈疾患を同定または予測するためのキットに関し、それは、（ａ）表１１の少なくとも１種のペプチドのペプチドレベルを決定するための指示書、および（ｂ）表１１の少なくとも１種のペプチドの、正常な対象または冠動脈疾患のない対象に由来する対照または参照基準のペプチドレベル、を含む。好ましい実施態様では、キットはさらに、（ｃ）該表１１の少なくとも１種のペプチドに結合する抗体、を含む。本発明の別の実施態様は、対象における冠動脈疾患を同定または予測するためのキットを提供し、それは、（ａ）表１１の少なくとも１種のペプチドのペプチドレベルを決定するための、そして、表６または表７および／または表９および／または表１０から選択される少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するための、指示書、および（ｂ）表１１の少なくとも１種のペプチドの、そして表６または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するための、正常な対象または冠動脈疾患のない対象に由来する対照または参照基準のペプチドレベル、および、場合によりまた（ｃ）該表１１の少なくとも１種のペプチドに結合する抗体、および、表６または表７、および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子にコードされるポリペプチドに結合する能力のある、さらなる抗体、抗体誘導体または抗体フラグメント、を含む。本発明のさらなる実施態様では、キットを本発明の方法のいずれかで使用し得る。
【００３９】
図面の簡単な説明
図１は、ｒ２＝０.７６４（ｐ＜０.００１）で回帰の信頼範囲９５％および予測区間９５％を含む予測モデルをもたらす、ｔ−スコア対ＣＡＤ指数の二次多項式回帰分析を図解し（Ａ）、８種の予測性（predictor）遺伝子に関わるモデル１の予測されるＣＡＤ指数対ＣＡＤ指数（Ｂ）を図解する。
【００４０】
図２は、３つの異なるコホートの別々のＰＬＳ分析についての各遺伝子の射影に重要な変数（Variable Importance in the Projection）（ＶＩＰ）を、全対象を含むＰＬＳ分析と比較したものを図解する。表示されているのは、最もＶＩＰが高い２４種の遺伝子である。曲線は、最初の８種の遺伝子について急勾配の減少を示す；その後、減少は幾分平坦になり、ほぼ直線状である。
【００４１】
図３は、本研究に参加した２２２人の対象全員に適用した、８種の最も重要な予測性遺伝子を含む最終的ＰＬＳ分析を図解する。対象は、彼らのＣＡＤ指数により順序付けられ、狭窄の重篤さに応じて２３−１００のＣＡＤ指数を有する。モデルの予測力をより良好に立証するために、ＣＡＤ指数をｔ−スコアに重ね合わせる。
【００４２】
図４は、１９種の予測性遺伝子に関わるモデル２（Ａ）および１５種の予測性遺伝子に関わるモデル３（Ｂ）の、予測されたＣＡＤ指数対ＣＡＤ指数を図解する。
【００４３】
発明の詳細な説明
別に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に本発明で使用される多くの用語の一般的定義を提供する: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed.  1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); および Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用するとき、以下の用語は、断りの無い限り、それらに与えられた意味を有する。
【００４４】
本発明の文脈における「バイオマーカー」は、冠動脈疾患を有する対象から取られたサンプルにおいて、対照の対象（例えば、陰性の診断または検出不可能な冠動脈疾患の者、正常または健康な対象）から取られた比較可能なサンプルと比較して異なって発現される遺伝子および遺伝子発現産物（即ち、タンパク質またはポリペプチド、ｍＲＮＡ）を表す。
【００４５】
本発明の「タンパク質またはポリペプチドまたはペプチド」は、その任意のフラグメント、特に、免疫学的に検出可能なフラグメントを含むことを企図している。当業者は、血管の損傷の間に損なわれた心臓の細胞から放出されるタンパク質は、かかるフラグメントに分解または切断され得ることを認識するであろう。加えて、ある種のタンパク質またはポリペプチドは、不活性形態で合成され、その後タンパク質分解により活性化され得る。そのような特定のタンパク質のフラグメントを、そのタンパク質自体の代用物として検出し得る。
【００４６】
本明細書で使用するとき、用語「サンプル」は、同定、診断、予測またはモニタリングのために得られた対象由来のサンプルを表す。本発明のある種の態様では、かかるサンプルは、進行中の状態または処置法の冠動脈疾患に対する効果の成果を決定するために入手し得る。好ましい試験サンプルには、血液、血清、血漿、リンパ、尿、涙、唾液、脳脊髄液、白血球または組織サンプルが含まれる。加えて、当業者は、いくつかの試験サンプルは、分画または精製操作、例えば、全血の血清または血漿成分への分離の後に、より容易に分析されることを了解するであろう。
【００４７】
「遺伝子発現レベル」または「ペプチドレベル」の差異は、相対的差異である。例えば、対照対象または参照基準と比較した、冠動脈疾患を有する対象から採取したサンプルの遺伝子発現レベルの差異であり得る。比較は、冠動脈疾患のリスクのある対象と、所定の症状がないとわかっている対象、即ち、「正常」または「対照」の、遺伝子発現レベル間で行うことができる。あるいは、比較は、冠動脈疾患を患っていない正常な固体の集団で見出される平均レベルなどの、良好な成果（例えば、冠動脈疾患がないこと）に伴うとわかっている「参照基準」に対して行うことができる。本発明によると、対比は、遺伝子発現レベルと、対象の冠動脈疾患を発症する同定または素因との間で行うことができる。
【００４８】
試験されているサンプルに存在する遺伝子発現レベルまたはタンパク質／ペプチドレベルは、絶対量（例えば、μｇ／ｍｌ）または相対量（例えば、相対的シグナル強度）であり得る。
【００４９】
遺伝子発現量が他方のサンプルのポリペプチド量と統計的に有意に異なるならば、２つのサンプル間に差異が存在する。例えば、ポリペプチド量が、他方のサンプルに存在するものより、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約４００％、少なくとも約６００％、少なくとも約８００％または少なくとも約１０００％多く存在するならば、２つのサンプル間の遺伝子発現またはタンパク質／ペプチドレベルに差異がある。
【００５０】
冠動脈疾患の素因の同定または予測は、診断技法と考えてもよい。診断方法は、それらの感度および特異性において異なる。当業者はしばしば、例えば１種またはそれ以上の診断指示物質をベースとして診断を行い、本発明では、これらは表６および／または表７および／または表９および／または表１０の遺伝子の発現レベル、および／または表１１のペプチドのレベルである。存在、非存在、またはその量は、冠動脈疾患の存在、重篤さ、または非存在を示すものである。
【００５１】
表６および／または表７および／または表９および／または表１０の１種またはそれ以上遺伝子の遺伝子発現、および／または表１１のペプチドレベルの多重の決定、並びに、遺伝子発現またはペプチド存在量の経時変化の決定を成すことができ、それは、疾患の進行または疾患の処置をモニターするのに使用できる。例えば、遺伝子発現／ペプチド存在量を、第１の時間に決定し、再度第２の時間に決定し得る。かかる態様では、第１の時間から第２の時間への遺伝子発現および／またはペプチドレベルの上昇は、冠動脈疾患の診断であり得る。同様に、第１の時間から第２の時間への遺伝子発現および／またはペプチドレベルの低下は、特定の冠動脈疾患の処置タイプに対する対象の応答性を示すものであり得る。さらに、１種またはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現の変化は、冠動脈疾患の重篤さおよび将来的な有害事象に関連し得る。
【００５２】
本発明のある実施態様では、表６の少なくとも１種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。好ましい実施態様では、少なくとも配列番号１（表７）の遺伝子発現レベルを決定する。別の好ましい実施態様では、表７の複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。最も好ましい実施態様では、表７の８種全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。他の好ましい実施態様では、少なくとも配列番号９（表９）および／または配列番号２８（表１０）の遺伝子発現レベルを決定する。また他の好ましい実施態様では、表７の２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種の遺伝子の遺伝子発現レベルおよび／またはおよび／または、表９の２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種または１９種の遺伝子の遺伝子発現レベル、および／または、表１０の２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種または１５種の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。最も好ましい実施態様では、表６または表７および／または表９および／または表１０から選択される複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。より一層好ましい実施態様では、表６または表７および／または表９および／または１０から選択される全ての遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。他の本発明の好ましい実施態様では、表１１の２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種または９種の疾患＞対照のペプチドのレベルおよび／または２種の疾患で支配的なペプチドのレベル、および／または、２種または３種の対照＞疾患のペプチドおよび／または対照で支配的なペプチドのレベルを決定する。最も好ましくは、表１１の全ての疾患＞対照のペプチドおよび／または全ての疾患で支配的なペプチドおよび／または全ての対照＞疾患のペプチドおよび／または全ての対照で支配的なペプチドのレベルを決定する。ペプチドレベルは、場合により、表６または表７および／または表９および／または表１０の遺伝子の遺伝子発現レベルと共に、同時に、または連続的に決定し得る。さらなる実施態様は、複数または全ての該表１１のペプチドおよび／または表６または表７および／または表９および／または表１０の遺伝子のペプチドまたは遺伝子発現のレベルが決定されることを提供する。
【００５３】
当業者は、ある種の態様では、遺伝子発現の比較測定は、同じ遺伝子を用いて複数の時点で行うが、所定の遺伝子を一時点で、第２の遺伝子を第２の時点で測定することもでき、これらの遺伝子の遺伝子発現の比較が診断情報を提供し得るか、または疾患の進行をモニターし得ることを理解するであろう。
【００５４】
本発明の好ましい態様では、表７および／または表９および／または表１０の１種またはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現および／または表１１のペプチドレベルを、異なる時点で比較して測定し得る。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、語句「冠動脈疾患の存在の確率」は、それにより当業者が対象の状態を予測できる方法を表す。それは、冠動脈疾患を１００％の精度で予測する能力を表さない。むしろ、当業者は、冠動脈疾患が存在するか、または発症する確率の上昇を表すと理解するであろう。例えば、冠動脈疾患は、ＣＡＤに冒されていないかまたは素因のない対象などの対照または参照基準と比較したとき、表６および／または表７および／または表９および／または表１０の高レベルの遺伝子発現、および／または表１１の疾患＞対照のペプチドおよび／または疾患で支配的なペプチドのレベルの上昇、および／または表１１の対照＞疾患および／または対照で支配的なペプチドのレベルの低下のある対象で、起こる見込みが高い。本発明のある態様では、冠動脈疾患が存在する確率は、約５０％の見込み、約６０％の見込み、約７５％の見込み、約９０％の見込み、および約９５％の見込みである。用語「約」は、この文脈では＋／−１％を表す。
【００５６】
当業者は、特定の遺伝子を冠動脈疾患の素因に関連付けることは、統計的分析であることを理解するであろう。加えて、基底レベルからの遺伝子発現および／またはペプチドレベルの変化は、患者の予後を反映するものであり得、遺伝子発現の変化の度合いは、有害事象の重篤さに関連付け得る。統計的有意さは、しばしば２つまたはそれ以上の集団を比較し、信頼区間および／またはｐ値を決定することにより決定される。本発明の好ましい信頼区間は、９０％、９５％、９７.５％、９８％、９９％、９９.５％、９９.９％および９９.９９％であり、一方好ましいｐ値は、０.１、０.０５、０.０２５、０.０２、０.０１、０.００５、０.００１および０.０００１である。
【００５７】
さらなる態様では、本発明は、対象における冠動脈疾患を同定するためのキットに関する。これらのキットは、対象のサンプルの遺伝子発現の測定および／またはペプチドレベルの決定のための器具および試薬、並びにアッセイの実施および結果の解釈のための指示書を含む。かかるキットは、好ましくは、１回またはそれ以上のかかる決定を実施するのに十分な試薬を含有する。
【００５８】
本発明によるアッセイの「感度」は、陽性と試験される疾患のある個体（冠動脈疾患のある者）の割合（「真の陽性」の割合）である。アッセイにより検出されない疾患のある個体は、「偽陰性」である。疾患がなく、かつアッセイで陰性と試験される対象は、「真の陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異性」は、１から擬陽性率を引いたものであり、ここで、「擬陽性率」は、陽性と試験される疾患のない者の割合として定義される。ある特定の診断方法は、状態の決定的な診断を提供し得ないが、その方法が診断の助けとなる肯定的な指示を提供すれば十分である。
【００５９】
遺伝子発現の測定
本発明の遺伝子発現の検出および分析並びにペプチドレベルの測定のために、多数の方法および器具が当業者に周知である。用語「遺伝子発現」は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡを含むがこれらに限定されるものではない特定の遺伝子、または、特定の遺伝子のポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質発現産物の、存在または量を表す。本発明の好ましい態様では、表６および／または表７および／または表９および／または表１０の遺伝子の遺伝子発現および／または表１１のペプチドのレベルを決定する。
【００６０】
本発明のある実施態様では、ＲＮＡレベルの測定により遺伝子発現を決定する。遺伝子発現は、ＰＣＲをベースとするアッセイを使用して検出し得る。あるいは、本発明の他の態様では、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用してＲＮＡの発現を検出する。ＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写酵素を使用してＲＮＡを酵素的にｃＤＮＡに変換する。次いで、ｃＤＮＡをＰＣＲ反応のテンプレートとして使用する。ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動およびＤＮＡ特異的染料による染色または標識化プローブへのハイブリダイゼーションを含むがこれらに限定されるものではない、任意の適する方法により検出できる。本発明のまた別の態様では、標準化した競合テンプレートの混合物を用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲを利用できる。
【００６１】
本発明の別の実施態様では、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して遺伝子発現を検出する。ハイブリダイゼーションアッセイでは、サンプル由来の核酸が、相補的核酸分子、例えばオリゴヌクレオチドプローブ、にハイブリダイズする能力をベースとして、バイオマーカーの有無を決定する。様々なハイブリダイゼーションアッセイが利用可能である。本発明のいくつかの実施態様では、関心のある配列へのプローブのハイブリダイゼーションを、結合したプローブを可視化することにより、例えば、ノザンまたはサザンアッセイにより、直接検出する。これらのアッセイでは、ＤＮＡ（サザン）またはＲＮＡ（ノザン）を単離する。次いで、ＤＮＡまたはＲＮＡを、ゲノム中でまれに切断し、アッセイするマーカーのいずれかの近くでは切断しない、一連の制限酵素で切断する。次いで、ＤＮＡまたはＲＮＡを例えばアガロースゲル上で分離し、メンブレンに転写する。例えば放射性ヌクレオチドの導入により標識化したプローブまたはプローブ群を、低−中程度−または高−ストリンジェンシー（stringency）条件下で、メンブレンに接触させる。結合していないプローブを除去し、標識化プローブの可視化により結合の存在を検出する。本発明の別の実施態様では、表６または表７および／または表９および／または表１０の遺伝子および／または表１１のペプチドをコードする遺伝子について、遺伝子発現を決定する。
【００６２】
本発明のまた他の実施態様では、ポリペプチドの遺伝子発現産物の測定により、遺伝子発現を決定する。本発明の好ましい態様では、表６または表７および／または表９および／または表１０の遺伝子の１つにコードされる１種またはそれ以上のポリペプチドの量、および／または表１１のペプチドの量を同定することにより、遺伝子発現を測定する。本発明は、遺伝子発現を検出または測定する方法により限定されない。
【００６３】
表６または表７および／または表９および／または表１０の遺伝子の１つによりコードされるタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドの発現産物、および／または表１１のペプチドは、適する方法により検出し得る。サンプル中のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に関して、免疫アッセイの器具および方法がしばしば使用される。これらの器具および方法は、関心のある被験物の存在または量に関連するシグナルを生成させるために、様々なサンドイッチ、競合、または非競合のアッセイ様式で、標識化分子を利用できる。加えて、バイオセンサーおよび光学的免疫アッセイなどのある種の方法および器具を用いて、標識化分子を必要とせずに、被験物の存在または量を決定し得る。
【００６４】
タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドの存在または量は、一般的に、特異的抗体を使用し、特異的結合を検出して決定する。例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、競合結合アッセイなどの、任意の適する免疫アッセイを利用し得る。抗体のタンパク質またはポリペプチドへの特異的免疫学的結合は、直接または間接的に検出できる。直接標識には、抗体に結合した、蛍光または発光タグ、金属、染料、放射性核種などが含まれる。間接標識には、アルカリ性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼなどの、当分野で周知の様々な酵素が含まれる。
【００６５】
タンパク質またはポリペプチドに特異的な固定抗体の使用も、本発明により企図されている。磁気またはクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイプレート（マイクロタイターウェルなど）の表面、固体基板材料片（プラスチック、ナイロン、紙など）などの、様々な固体支持体に抗体を固定できる。抗体または複数の抗体を固体支持体上にアレイで被覆することにより、アッセイ細片を調製できる。次いで、この細片を、試験サンプルに浸し、次いで洗浄および検出段階を介して迅速に加工し、着色スポットなどの測定可能なシグナルを生成させることができる。
【００６６】
本発明の複数の遺伝子および／またはペプチドの分析は、１つの試験サンプルで、別々または同時に実行し得る。加えて、当業者は、同じ個体からの複数のサンプル（例えば、連続的な時点で）を試験する価値を認識するであろう。かかる連続サンプルの試験は、経時的な遺伝子発現および／またはペプチドレベルの変化の同定を可能にする。遺伝子発現レベルの上昇または低下、並びに遺伝子発現および／またはペプチドレベルの変化のないことは、患者の状態についての有用な情報を提供でき、これには、事象発生からの概算時間の同定、回収可能なサンプルの存在および量、薬物治療の適切さ、再灌流または症状の回復により示される様々な治療の有効性、様々なタイプの冠動脈疾患の分別、事象の重篤さの同定、疾患の重篤さの同定、および将来的事象のリスクを含む患者の結果の同定が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
上記で言及した遺伝子を含むパネルを構築し、冠動脈疾患の診断または予後および冠動脈疾患を有する対象の管理に関する関連情報を提供し得る。かかるパネルは、好ましくは表７および／または表９および／または表１０の配列および／または表１１のペプチドを使用して構築できる。感度または特異性を最適化するために、単一の遺伝子またはより大きい遺伝子のパネルを含む遺伝子のサブセットの分析は、単独で、または単一のペプチドまたはペプチドのサブセットの分析と組み合わせて、当業者により実行できる。
【００６８】
遺伝子発現の分析および／またはペプチドレベルの決定は、同様に様々な物理的様式で実行できる。例えば、マイクロタイタープレートの使用または自動化により、高処理量形式での多数の試験サンプルの処理を助長し得る。
【００６９】
本発明の別の態様では、遺伝子産物、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ポリペプチドおよびそれらのフラグメントに配列において対応するプローブが、わかっている位置で特異的にハイブリダイズまたは結合できるアレイが提供される。本発明のある実施態様では、アレイは、各位置がある遺伝子によりコードされる産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）、好ましくは表７および／または表９および／または表１０に列挙した遺伝子および／または表１１に列挙したペプチドの独立した結合部位を表す、マトリックスである。本発明の別の態様では、「結合部位」、以後「部位」は、特定の同族ｃＤＮＡが特異的にハイブリダイズできる核酸または核酸類似体である。結合部位の核酸または類似体は、例えば、合成オリゴマー、全長ｃＤＮＡ、全長より短いｃＤＮＡまたは遺伝子フラグメントであり得る。
【００７０】
別の態様では、本発明は、遺伝子発現および／またはペプチドレベルの分析用のキットを提供する。かかるキットは、好ましくは、少なくとも１つの試験サンプルの分析用の器具および試薬、並びにアッセイを実施するための指示書を含む。場合により、キットは、遺伝子発現および／またはペプチド量を対象における冠動脈疾患の診断または予後に変換するための１種またはそれ以上の手段を含有し得る。対象の遺伝子発現パターンの対照または参照基準との比較は、対象が冠動脈疾患を有するか否かを示すであろう。
【００７１】
本発明のある実施態様では、キットは、少なくとも１種の遺伝子、好ましくは表７および／または表９および／または表１０からのもの、および／または少なくとも１種の表１１のペプチドに特異的な抗体を含有する。他の実施態様では、キットは、核酸の検出に特異的な試薬、例えばオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、を含有する。好ましい実施態様では、キットは、検出アッセイを実施するために必要な全ての成分を含有し、これには、全ての対照並びにアッセイの実施および結果の解析のための指示書が含まれる。本発明のある実施態様では、キットは、インビトロ診断アッセイおよび／または医薬または食品を標識するために、環境保護庁または米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により要求される使用意図の表示を含む指示書を含有する。
【００７２】
本発明の別の態様では、冠動脈疾患の処置で使用するための作用物質のスクリーニング方法が提供される。特に、表６または表７および／または表９および／または表１０の少なくとも１種の遺伝子または遺伝子発現産物の、遺伝子発現、合成または活性のレベルの低下を誘導でき、かつ／または、表１１の少なくとも１種の疾患＞対照および／または疾患で支配的なペプチドレベルの低下を誘導でき、かつ／または、少なくとも１種の対照＞疾患および／または対照で支配的なペプチドのレベルの上昇を誘導できる作用物質である。
【００７３】
例えば、ある実施態様では、冠動脈疾患を有するとわかっている試験対象を最初に試験作用物質で処置し、次いで、対象の代表的サンプルを、冠動脈疾患に応答して発現が変化する遺伝子または配列の発現レベル、および／またはペプチドのレベルについて分析する。次いで、サンプルの分析を、冠動脈疾患を有するとわかっているが試験化合物を与えられていない対照と比較し、それにより遺伝子発現を改変する能力がある試験化合物を同定する。
【００７４】
本発明の別の実施態様では、表７および／または表９および／または表１０および／または表１１で開示する遺伝子の配列を、治療の基礎とする。一般に、本明細書において冠動脈疾患で過剰発現されると同定される遺伝子の発現を低下させ、疾患＞対照および／または疾患で支配的なペプチドのレベルの低下を誘導し、本明細書で同定される対照＞疾患および／または対照で支配的なもののレベルの上昇を誘導しようと試みる。
【００７５】
該遺伝子の発現を低下させる方法は、当業者に知られている。発現の補充の例には、対象に付加的な遺伝子のコピーを供給することが含まれる。発現を低下させるために好ましい例には、ＲＮＡアンチセンス技術または医薬的介入が含まれる。表６または表７および／または表９および／または表１０に開示する遺伝子またはペプチドは、適切な薬物開発標的であり、表７および９および１０および／または表１１のものが好ましい。
【００７６】
本発明の１つまたはそれ以上の実施態様の詳細を、上記の付随する説明で記載する。本明細書で記載したものと類似または均等な任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法および作用物質をここで記載する。本発明の他の特質、目的および利点は、本説明から、そして特許請求の範囲から明らかであろう。明細書および添付の特許請求の範囲では、文脈が明確に指図しない限り、単数形は複数形への言及を含む。特記しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用する全ての特許および刊行物を、出典明示により本明細書の一部とする。
【００７７】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様をより詳細に例示説明するために提示する。これらの例は、決して添付の特許請求の範囲により規定される通りの本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。下記に例示説明するのは、サンプル研究プロトコールおよび、冠動脈疾患に正または負の相関を有するバイオマーカーの同定である。サンプルプロトコールはヒト血漿サンプルで開発されたが、同じ一般的実験構成を他の適する生物学的サンプルに使用して、バイオマーカーを検出し得る。本明細書で言及する全文書を、出典明示により完全に本明細書の一部とする。
【００７８】
実施例１
患者および対照の対象は、Duke Clinical Research Institute (DCRI) の "Duke Databank for Cardiovascular Disease and the Duke Cardiac Catheterization Laboratory" に由来する。対象がインフォームドコンセントを与えた後、その臨床データベースを補うさらなる臨床データを収集する。冠動脈疾患の患者を彼らの心臓カテーテル試験室での処置時に集め、対照集団を心臓カテーテル試験室および遡及的に心臓カテーテル処置の２年以内の両方から集める。
【００７９】
冠動脈疾患の有無に関連しない血漿タンパク質の差異を最小化するために集団を定義する。３つの異なる対象および対照のコホートを登録する：
（ｉ）「集積した男性群」は、年齢および人種群について調和させる。タンパク質の変化を伴うと知られている主要な疾患、例えば真性糖尿病および炎症状態、例えば最近の急性心筋梗塞または活性な悪性腫瘍を除外する。
（ｉｉ）「他の男性群」は、調和操作を必要としない。若い集団でより顕著であると予期される冠疾患関連因子をサンプルに増やすために、比較的若い冠動脈疾患の患者集団を含める意図である。
（ｉｉｉ）「女性群」は、包括的集団の特徴を定義できるように、そして、関心のある遺伝子多型を女性集団において評価できるように、第３のコホートとして登録する。
【００８０】
冠疾患患者集団への包含基準は：年齢４０ないし６５歳、および少なくとも１つの主要な冠動脈における＞５０％の冠動脈狭窄である。除外基準は、１ヶ月以内の急性心筋梗塞、真性糖尿病、非制御高血圧（収縮期血圧＞１８０ｍｍＨｇまたは弛緩期血圧＞１００ｍｍＨｇ）、および／または末端器官損傷、腎機能不全（血清クレアチニン＞２.０ｍｇ／ｄＬおよび／またはＢＵＮ＞４０ｍｇ／ｄＬ）、活性な悪性腫瘍、重大な心臓弁膜症、ＮＹＨＡクラスＩＩＩまたはＩＶの心不全、１日につき＞２パックの喫煙、総コレステロール＞３００ｍｇ／ｄＬまたはトリグリセリド＞４００ｍｇ／ｄＬ、血漿タンパク質組成に大変化をもたらすと予期される他の疾患または症状、貧血（女性でヘモグロビン＜１２.５ｇ／ｄＬ、または男性で＜１３.５ｇ／ｄＬ）、および低血圧（収縮期血圧＜９０ｍｍＨｇおよび弛緩期血圧＜５０ｍｍＨｇ）である。
【００８１】
「対照」集団への包含基準は：集積した男性群のみ、年齢４０ないし６５歳、２年以内の心臓カテーテル処置に関して＞２５％の冠動脈狭窄がないこと、および正常な左心室駆出分画および正常な局所壁運動である。除外基準は、典型的な狭心症のシグナル、またはストレス試験における心筋虚血の証拠、心筋梗塞または不安定狭心症、跛行、卒中、一過性脳虚血発作を含む末梢動脈または脳血管疾患の病歴、または非侵襲性イメージングまたは血管造影法での重大な血管狭窄、糖尿病、非制御高血圧（収縮期血圧＞１８０ｍｍＨｇまたは弛緩期血圧＞１００ｍｍＨｇ）、および／または末端器官損傷、腎機能不全（血清クレアチニン＞２.０ｍｇ／ｄＬおよび／またはＢＵＮ＞４０ｍｇ／ｄＬ）、活性な悪性腫瘍、重大な心臓弁膜症、ＮＹＨＡクラスＩＩＩまたはＩＶの心不全、１日につき＞２パックの喫煙、総コレステロール＞３００ｍｇ／ｄＬまたはトリグリセリド＞４００ｍｇ／ｄＬ、症候性心不全、重大な弁膜症、血漿タンパク質組成に大変化をもたらすと予期される他の疾患または症状、貧血（女性でヘモグロビン＜１２.５ｇ／ｄＬ、または男性で＜１３.５ｇ／ｄＬ）、および低血圧（収縮期血圧＜９０ｍｍＨｇおよび弛緩期血圧＜５０ｍｍＨｇ）である。
【００８２】
臨床パラメーターの評価
対象の個体群統計学的情報には、研究時の歳（年齢）、最後のカテーテル処置時の歳（年齢）、性別、人種、喫煙行動、収縮期および弛緩期の血圧（ｍｍＨｇ）、および冠動脈疾患の重篤さ（ＣＡＤ指数）が含まれる。病歴の評価には、狭心症、末端器官損傷を含む真性糖尿病、高血圧、心筋梗塞、ＰＣＩ、ＣＡＢＧ、末梢血管疾患、脳血管疾患、うっ血性心不全、うっ血性心不全の重篤さ、および腎機能不全が含まれる。
【００８３】
冠疾患に関し、以下の情報を収集する：ＬＶ駆出分画率（％）、有意にふさがれている血管の数、左冠動脈系の最大狭窄パーセント、左前下行枝の最大狭窄パーセント、右冠動脈の最大狭窄パーセント、左回旋枝動脈系の最大狭窄パーセント、僧帽弁の狭窄、僧帽弁閉鎖不全のグレード、弁膜症、大動脈の狭窄、冠動脈疾患の重篤さ、追跡ＭＩ、ＰＣＩおよびＣＡＢＧ、異なるならばカテーテル処置およびカテーテル処置後の診断が含まれる。
【００８４】
薬物療法の評価には、ＡＣＥ阻害剤、アミオダロン、アンギオテンシン受容体遮断剤（ＡＲＢ）、アスピリン製品、ベータ−遮断剤、カルシウム遮断剤、中枢作用物質、ジゴキシン、利尿剤、ドフェチリド、フィブラート、ホルモン補充治療剤、ナイアシン化合物、硝酸塩、他の抗血小板剤、ソタロール、スタチン、タイプ１作用物質、血管拡張剤およびワーファリンが含まれる。Duke 研究室で評価される臨床検査室のパラメーターには、総コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬ、ＨＤＬ、ＨｂＡ１Ｃ、Ｈｃｔ、クレアチニン、ＰＴ、ＰＴＴ、ＷＢＣ、リン、ナトリウム、カリウム、塩素、カルシウムおよび二酸化炭素が含まれる。
【００８５】
臨床検査室のパラメーターには、ナトリウム、カリウム、塩素血症（chloremia）、カルシウム、マグネシウム、リン、ＢＵＮ、クレアチニン、総タンパク質、総ＣＫ、ＣＫ−ＭＢ、ＬＤＨ、γ−ＧＴ、ＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ、アルカリ性ホスファターゼ、総ビリルビン、結合ビリルビン、Ｃ反応性タンパク質、コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬ、アルブミン、モル浸透圧濃度、ＬＤＬｃａｌｃ、Ｃａｃａｌｃ、トロポニンＩ、ＴＳＨ、ホモシステイン、ＨＩＶ１−２、ＨＣＶ３、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＩｇが含まれる。
【００８６】
冠動脈疾患の重篤さ（ＣＡＤ指数）は、以下の相互参照表に従ってスコアを付ける：
表１：ＣＡＤ指数のコード付け、ｖｄは有意にふさがれている血管を表す
【表１】
2007515155.tif 000003
【００８７】
血液サンプル採取
クエン酸塩、リン酸塩およびデキストロースを含有する２０ｍＬのチューブに、血液１００ｍＬの１つのアリコートを男性の疾患のある患者から収集し、血液２００ｍｌ（２ｘ１００ｍＬアリコート）を、男性の対照の対象から収集する。女性から２ｘ１０ｍＬチューブの血液を採る。収集プロセスの始めからチューブを２５℃の水浴に置くことにより、外界温度への温度低下を加速する。収集終了後、チューブを冷却し、温度を１時間かけて段々と２０−２２℃に低下させる。白血液細胞および血小板の減少（１ｘ１０６／ユニットより少ない）を、血液を標準的重力フィルターに通すことにより、室温での濾過で系統的に実施する。標準的なやり方でバッグを遠心分離する。
【００８８】
圧力を使用して血漿を赤血球と分離し、別のバックに収集する。プロテアーゼ阻害剤を添加する。チューブを−７０℃に冷凍し、GeneProt, Geneva, Switzerland へドライアイス上で貨物輸送するまで保存する。
【００８９】
マイクロアレイ分析
血液サンプル（２.５ｍＬ）を、ＲＮＡの即時安定化をもたらす試薬の専売混合物 (PreAnalytiX, Qiagen) を含有する PAXgene（商標）Blood RNA チューブに直接収集する。次いで、PAXgene Blood RNA Kit で供給されるシリカゲルメンブレン技術を使用して、ＲＮＡを単離する。得られるＲＮＡは、インビボの発現プロフィールを正確に表し、幅広い下流の適用で使用するのに適する。ＲＮＡの単離は、PAXgene Blood RNA Tube 中で核酸をペレットにする遠心分離段階から始まる。ペレットを洗浄し、プロテイナーゼＫを添加してタンパク質を分解する。アルコールを添加して結合条件を調節し、サンプルを PAXgene RNA スピンカラムに載せる。短い遠心分離の間に、ＲＮＡが PAXgene シリカゲルメンブレンに選択的に結合し、夾雑物は通り過ぎる。洗浄段階に続き、最適化バッファー中でＲＮＡを抽出する。λ＝２６０ｎｍ（Ａ２６０ｎｍ）の吸光度により総ＲＮＡを定量し、比Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍにより純度を評価する。ＲＮＡ分子の完全性を、非変性アガロースゲル電気泳動により確認する。分析までＲＮＡを約−８０℃で保存した。
【００９０】
ＤＮＡマイクロ−アレイ実験
全ての GeneChip 実験は、GeneChip システムの製造業者により推奨される通りに、Genomics Factory EU で実行する (Affymetrix, Santa Clara, CA; 発現分析技法のマニュアル：参考文献に加える）。ゲノムＵ１３３Ａ発現プローブアレイセット（Affymetrix, Inc., San Diego, CA, USA) を使用する。
【００９１】
GeneChip 実験
Ｔ７−（ｄＴ）２４ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で Superscript Choice System (Invitrogen Life Technologies) を使用して、出発量約１ないし１０μｇの全長総ＲＮＡを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する。合成後、ｃＤＮＡを親和性樹脂 (QiaQuick, Qiagen) で精製する。次いで、ビオチン化リボヌクレオチドの存在下で BioArray（登録商標） High Yield RNA Transcript Labeling Kit (ENZO) を使用して、精製ｃＤＮＡをインビトロで転写し、ビオチン標識ｃＲＮＡを形成させる。次いで、標識ｃＲＮＡを親和性樹脂 (RNeasy, Qiagen) で精製し、定量し、フラグメント化する。厳密に１０μｇの量の標識ｃＲＮＡを、約１６時間４５℃で発現プローブアレイにハイブリダイズさせる。次いで、GeneChip Fluidics Workstation 400 (Affymetrix) を使用して、アレイを洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリン (Molecular Probs) で２回染色する。次いで、共焦点レーザースキャナー (GeneArray Scanner, Agilent) を使用してアレイを２回スキャンし、１つのスキャンイメージ「.ｄａｔ−ファイル」を得る。
【００９２】
臨床データ
臨床データをＤＣＲＩによる臨床データベースに入力し、二重データ入力によりデータ検証を行う。データ入力およびデータベースのロックの完了後、暗号化ＳＡＳフォーマットでデータをスポンサーに送る。スポンサーのサイトで、臨床データを MSAccess データベースにロードする。６つの下位集団；即ち、集積した男性群および対照群、他の男性群の症例および対照並びに女性群の症例および対照、の各々について、記述統計パラメーターを算出する。記述統計には、サンプルのサイズ、頻度、算術平均、標準偏差、中央値、最小値および最大値が含まれる。個人の臨床データは、全部で２４１人の対象：１２１人の疾患のある対象および１２０対照である。集積した男性群のコホートは、５３人の疾患のある対象および５３人の対照を含み、他の男性群のコホートは４４人の疾患のある対象および３８人の対照を含み、女性群のコホートは２４人の疾患のある対象および２９人の対照を含む。
【００９３】
遺伝子発現データ
この得られた「.ｄａｔ−ファイル」を、ＭＡＳ５プログラム（Affymetrix）を使用して「.ｃｅｌ−ファイル」に加工する。「.ｃｅｌファイル」を取り込み、Affymetrix GeneChip Laboratory Information Management System（ＬＩＭＳ）にロードする。ＬＩＭＳデータベースを、ネットワークファイリングシステムを通して UNIX Sun Solaris サーバーに繋ぐ。それは、全てのプローブのセルの平均強度（ＣＥＬファイル）を Oracle データベース（ＮＰＧＮ）にダウンロードさせる。「標的強度」１５０を使用して、未加工データを発現レベルに変換する。表示される数値は、所定の転写物配列用のプローブ−セットを含むプローブ−ペアのシグナル強度の重みを付けられた平均値である（ＡｖｇＤｉｆｆ値）。個人の遺伝子発現データを、２４１人の患者中２２２人から得る。
【００９４】
部分最小二乗法によるＰＬＳ
ＰＬＳは、部分最小二乗法を利用する潜在的構造に対する射影（Projections to Latent Structures）を意味する。ＰＬＳは、従属応答変数を含有する行列Ｙと予測変数を含有する行列Ｘとの間に、線形または多項式の関係を見出す。ＰＬＳモデリングは、ＸおよびＹ空間の両方の低次元超平面への同時投影からなる。これらの超平面上の点の座標は、下記のＰＬＳ結果のグラフ表示においてｔ−スコアおよびｕ−スコアと呼ばれる行列ＴおよびＵの要素を構築する。ＰＬＳ分析は、ＸおよびＹ空間を良好に近似し、ＸとＹとの間の相関を最大にするという目的；即ち、正準相関分析と非常に似た目的を有する。Ｘ（予測）およびＹ（従属変数）行列に関し、直交シグナル補正−ＯＳＣ−の目的は、Ｙに無関係（直交）であり、関心のある情報に貢献しない全情報をＸから除去することである。ＰＬＳによる予測的モデリングに、SIMCA-P Version 10.0 (Umetrics, Sweden) を使用した。
【００９５】
データの統合
臨床データ、遺伝子発現データを、全データセットに亘り対象を唯一に同定するバーコードにより関連付ける。
【００９６】
研究集団
研究集団は、３つのコホートからなる。第１コホート−「集積した男性群」と呼ばれる−は、５３人の男性対照および５３人の男性症例であった。これらの個体は、彼らの年齢および人種が調和していた。「他の男性群」と呼ばれる第２コホートは、３８人の男性対照および４４人の男性症例を含み、「女性群」と呼ばれる第３コホートは、２９人の女性対照および２４人の症例からなる。１２０人の対照と１２１人の症例の全部で２４１人がこの臨床調査に参加した。２４１人中、１８８人が男性であり、５３人が女性であった。
【００９７】
個体群統計学的情報
研究集団の平均年齢は、５１.１歳ないし５７.６歳であり、「集積した男性群」コホートで症例と対照との差異が最小であった。男性の体重は９３.９−１００.６ｋｇの範囲にあり、女性は８３.９−８９.５ｋｇであった。一般に、対照は症例より重い体重であった。喫煙者頻度は集積した男性群の症例で２９／５３、集積した男性群の対照で２６／５３、他の男性群の症例で３４／４４、他の男性群の対照で２０／３８、そして、女性群の症例で１３／２４、女性群の対照で９／２９であり、対照と比較して症例により多くの喫煙者がいることを示す。個人の収縮期および弛緩期の血圧は、平均して正常範囲にあった。しかしながら、症例と比較して対照で血圧が高い傾向があった。研究集団の殆どがコーカサス人種に属し、次いでアフリカ系アメリカ人、少数のアジア人およびラテンアメリカ人であった。
【００９８】
病歴
狭心症は、各コホートにおいて最も顕著な臨床事象であり、症例と対照の間に明らかな差異はなかった。しかしながら、高血圧の病歴は、対照と比較して男性の症例でより多く報告された。女性群コホートには差異がなかった。心筋梗塞は、全コホートの症例で有意に高く、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）および末梢冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）も同様であった。少数の症例は冠動脈性心不全（ＣＨＦ）と報告されたが、対照ではいなかった。非常に少数の症例は、末梢または脳血管疾患を患っていたが、対照ではいなかった。真性糖尿病は報告されず、腎機能不全は２人の対象のみであった。
【００９９】
薬物療法
患者の殆どは、少なくとも１種の薬物療法（ＮＳＡＩＤ類）を受けており、それは対象の殆どが受けた薬物治療のクラスであり、症例と対照の間で、または３つのコホート間で差異はない。ベータ−遮断剤、ＡＣＥ−阻害剤、カルシウムチャネル遮断剤、利尿剤およびアンギオテンシン受容体遮断剤などの血圧低下剤は、一般に対照と比較して症例で多く摂られた。同じことがスタチン類について真である。あまり多くない薬物療法には、アミオダロン、フィブラート、ジゴキシン、硝酸塩、ナイアシンおよび抗凝血剤が含まれ、それらは対照よりも症例で多く摂られた。何人かの女性はホルモン補充治療剤を摂り、少数の患者のみが中枢作用性の薬物療法を受けた。
【０１００】
冠動脈疾患の重篤さ−ＣＡＤ指数
しかしながら、症例の間では、広い分布があった；症例の５２％は、４２より低いＣＡＤ指数を有した；症例の７９％は、５６より低いＣＡＤ指数を有した；症例の残りの２１％は、６３ないし１００％のＣＡＤ指数を有した。対照の殆どは、１５ないし２２のＣＡＤ指数の範囲に見出されるが、ＣＡＤ指数ゼロは全タイプの回帰分析に甚だしく高いレバレッジ効果を有するので、２３より低い全ＣＡＤ値は初期設定でゼロに設定した。
【０１０１】
表２：研究集団
【表２】
2007515155.tif 000004
【０１０２】
表３：平均個体群統計学的データ
【表３】
2007515155.tif 000005
【０１０３】
表４：病歴のまとめ（頻度）
【表４】
2007515155.tif 000006
【０１０４】
表５：薬物療法のまとめ（頻度）
【表５】
2007515155.tif 000007
【０１０５】
遺伝子発現とＣＡＤ指数を含む検査値の相関
パラメトリックおよびノンパラメトリック法による一変量相関分析を、全検査値および全遺伝子に適用した。検査室のパラメーターのセットにＣＡＤ指数を含めた。後の全ての一変量および多変量法の遺伝子フィルタリングは、この回帰分析に基づいた；即ち、部分最小二乗法分析で裁量的レベルのａｂｓ（ｒｈｏ）＞０.２より高いＣＡＤ指数との絶対的相関係数を示す遺伝子のみを分析に含めた。
【０１０６】
部分最小二乗法（ＰＬＳ）の潜在的構造に対する射影は、多変量応答データをモデル化するための代替的モデル化アプローチである。アルゴリズムが最適化されているので、短くて太い行列に対処することができる；即ち、変数の数は、観察の数よりはるかに多くてもよい。
【０１０７】
１６０種の遺伝子が、絶対的相関係数ｒｈｏ＞０.２でＣＡＤ指数と相関した（表６）；これらの遺伝子を、ＰＬＳ分析に含めた。ＬＰＳを実施する前に、遺伝子発現データを、ＣＡＤ指数を唯一の応答変数として直交シグナル補正（Orthogonal Signal Correction）（ＯＳＣ）に付した。
【０１０８】
表６：１６０種の各遺伝子の平均およびｐ値
【表６】
2007515155.tif 000008
【０１０９】
【表７】
2007515155.tif 000009
【０１１０】
【表８】
2007515155.tif 000010
【０１１１】
【表９】
2007515155.tif 000011
【０１１２】
【表１０】
2007515155.tif 000012
【０１１３】
得られるｔ−スコア対ＣＡＤ指数の二次多項式回帰分析は、ｒ２＝０.７６４（ｐ＜０.００１）で回帰の信頼範囲９５％および予測区間９５％を含む予測モデルをもたらす。幾分広い予測区間は、準定量的でしかないＣＡＤ指数評価の変動性および遺伝子発現の変動性の両方に起因する。
【０１１４】
モデルの安定性を試験するために、３つのコホート；即ち、「集積した男性群」、「他の男性群」および「女性群」で、別々にＰＬＳ分析を実施した。対照は−２の標準偏差の範囲で全く安定のままであり、一方症例のｔ１−スコアは、主に＋２の標準偏差範囲に局在し、ＣＡＤ指数の上昇に伴い上昇する。この関係は各コホートに存在し、最低の変動は「他の男性群」にある。３つの異なるコホートの別々のＰＬＳ分析についての各遺伝子の射影に重要な変数（ＶＩＰ）を、全対象を含むＰＬＳ分析と比較したものを、本文の図５に示す。表示されているのは、最もＶＩＰが高い２４種の遺伝子である。曲線は、最初の８種の遺伝子について急勾配の減少を示す；その後、減少は幾分平坦になり、ほぼ直線状である。これらの８種の遺伝子は別として、全ての他の遺伝子は、射影に少しばかり貢献するだけである。最初の２４遺伝子のＶＩＰは、異なるコホート間にほんのわずかの変動を示すのみであり、予測モデルの幾分高い安定性を指摘している。
【０１１５】
ＣＡＤ指数を予測できる８種の予測性の高い遺伝子の実体を表７に示す。
表７：予測モデルに主として貢献する８種の遺伝子の実体（モデル１）
【表１１】
2007515155.tif 000013
【０１１６】
８種の最も予測的な遺伝子を含む最終的ＰＬＳ分析を、本研究に参加した全２２２人の対象に適用した。この８種の遺伝子のｔ−スコアは、ＣＡＤ指数を非常に正確に予測できる。ＣＡＤ指数が、狭窄の準定量的評価にすぎず、同程度の狭窄でも本来的に対象間の変動を内包することを考慮すると、８種の最も予測的な遺伝子の発現パターン基づく予測は、説得力がある。
【０１１７】
８種の予測性遺伝子（表７）の異なる発現パターンを、ＲＴ−ＰＣＲにより確認する。以下のプライマーをこれらの遺伝子のＲＴ−ＰＣＲに使用した：
表８−プライマー
【表１２】
2007515155.tif 000014
【０１１８】
【表１３】
2007515155.tif 000015
【０１１９】
【表１４】
2007515155.tif 000016
【０１２０】
要約すると、循環している白血球の遺伝子発現パターンがＣＡＤの存在および程度に関連しているか否かを調べる。冠動脈造影検査を受ける患者を、彼らの Duke ＣＡＤ指数（ＣＡＤｉ）、即ち、結果と相関する、裏付けられた冠動脈アテローム性動脈硬化の程度の血管造影的測定に従って、選択した。１２０人のＣＡＤ患者（ＣＡＤｉ＞２３）および１２１人の部分的に合致するＣＡＤのない対照（ＣＡＤｉ＝０）から、ＲＮＡを抽出した。Affymetrix U1333A チップを使用して遺伝子発現を評価した。ＣＡＤと相関する遺伝子を、Spearman 試験を使用して同定し、予測的遺伝子発現パターンを、部分最小二乗法（ＰＬＳ）回帰分析を使用して同定した。
【０１２１】
１６０種の個々の遺伝子は、ＣＡＤｉと有意に相関する（ｒｈｏ＞０.２、Ｐ＜０.００２７、ｎ＝２２２）と見出されたが、個々の遺伝子発現の変化は比較的小さかった（１.２ないし１.５倍）。これらの１６０種の遺伝子を使用して、ＰＬＳ多変量回帰モデルは、予測性の高いモデルをもたらした（ｒ２＝０.７６４、Ｐ＜０.００１）。続く分析は、予測モデルの大部分が８種の遺伝子のみにより実行されることを示した（ｒ２＝０.７５２）（表７）。
【０１２２】
まとめると、８種の遺伝子の同時発現パターンは、ＣＡＤの予測性が高い。従って、末梢白血球遺伝子発現パターンは、ＣＡＤの非侵襲性バイオマーカーであり、新しい病態生理学的洞察を導く。
【０１２３】
実施例２
モデルの拡張（モデル２）
モデル化操作を１５２種の候補遺伝子、即ち、表６の１６０種の候補遺伝子から実施例１の表７の８種の予測性遺伝子を引いたものについて、モデル１（実施例１）と全く同じＰＬＳ方法を使用して繰り返す。医師により評価される実際のＣＡＤ指数に対する、１９種の遺伝子（表９）の遺伝子発現パターンにより予測されるＣＡＤ指数を図４に表示する。モデル２のｒ２は、モデル１（実施例１）のものよりわずかに小さいのみであり（０.７２対０.７５）、予測信頼帯９５％は匹敵する。
【０１２４】
表９：モデル２の１９種の最良の予測性遺伝子
【表１５】
2007515155.tif 000017
＊中央値は、シグナルの中央強度を表し、ｒｈｏは、各遺伝子のＣＡＤ指数との Spearman の順位相関である。
【０１２５】
実施例３
モデル化の拡張（モデル３）
第３のモデル化アプローチでは、残っている１３３種の遺伝子、即ち、１６０種の候補遺伝子（表６）からモデル１の８種の予測性遺伝子（表７；実施例１）を引き、モデル２の１９種の予測性遺伝子（表９；実施例２）を引いたものを、実施例１に記載の通りの部分最小二乗法回帰に付す。結果を図４に示し、対応する１５種の最良の予測性遺伝子を表１０にまとめる。
【０１２６】
表１０：モデル３の１５種の最良の予測性遺伝子
【表１６】
2007515155.tif 000018
＊中央値は、シグナルの中央強度を表し、ｒｈｏは、各遺伝子のＣＡＤ指数との Spearman の順位相関である。
【０１２７】
まとめると、１６０種の遺伝子の高い情報量のために、遺伝子発現パターンに基づいて冠動脈疾患の程度を予測し得る３つのモデルの生成が可能である。３つのモデルを、例えば新規の未知サンプルに並行して適用することにより、正しい予測の見込みが劇的に上昇し得る。さらに、予測モデルのロバスト性は、上昇し得る；即ち、何らかの技術的または生物学的理由により１つのモデルに含まれる遺伝子の質が悪い場合、予測に使用できるさらに２つの予測モデルが依然としてある。
【０１２８】
表７および／または表９および／または表１０の遺伝子に関する、ユニジーン＃、プローブセット＃および／または受託＃などのさらなる情報は、表６に列挙されている。
【０１２９】
実施例４
集めた血漿の産業スケールの分析を使用する、冠動脈疾患タンパク質のプロテオミクス的探索研究
確立されたのは、Duke Databank for Cardiovascular Disease からの、血管造影的に冠動脈疾患を有する（＞または＝５０％の狭窄の少なくとも１つの病変として定義される）５３人の患者および、血管造影的に冠動脈疾患を有さない５３人の患者の、男性の集団である。Duke Databank for Cardiovascular Disease の説明には、Allen LaPointe, Nancy M. et al., Journal of the American College of Cardiology 41(Suppl A):517A (2003）を参照。これらの患者は、年齢および人種について調和しており、リスク因子および主要な血漿タンパク質の異常の極端な者は、プレスクリーニングで除外された。各群の血漿サンプルを集めて大容積（各６リットル）にし、ピコモル濃度の範囲の存在量の少ないタンパク質を同定する。アルブミンおよび免疫グロブリンを特異的に除去し、より小さいタンパク質（＜２０−４０ｋＤａ）を豊富にした後、液体クロマトグラフィーによりサンプルを１２,９６０個の画分に分け、酵素的分解の前および後に、質量分析により分析した (LC-ESI MS/MS および MALDI-TOF)。Rose, Keith et al., Proteomics (2004) (DOI 10.1002/pmic.200300718) 参照。
【０１３０】
レプチンおよびブラジキニンなどの存在量の少ない成分を含む７３１種の血漿タンパク質またはフラグメントを同定した。１７種は、良好に検出され、疾患の状態に従って強く異なって表示された。カテゴリーに属するタンパク質を、それらの親の受託番号と共に次の表１１にまとめる：
【０１３１】
【表１７】
2007515155.tif 000019
【０１３２】
ペプチドＱ９６ＮＺ９についてのさらなる情報は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ０２／００６９０およびＷＯ０２／０８２８４（ＰＲＯ１１９５−配列番号２１２）で提供される。ペプチドＱ９ＮＳ７１についてのさらなる情報は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ０２／００６９０およびＷＯ０２／０８２８４（ＰＲＯ１００５−配列番号１４０）で提供される。
【０１３３】
まとめると、この統計的かつ包括的なアプローチは、冠疾患を有する集団と有さない集団で異なって表示される多数のタンパク質を同定した。これらのタンパク質は、炎症媒介物質および防御メカニズムのタンパク質を含み、今や、疾患の新規マーカーを同定するさらなる確認試験のための候補群を構成する。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１は、ｒ２＝０.７６４（ｐ＜０.００１）で回帰の信頼範囲９５％および予測区間９５％を含む予測モデルをもたらす、ｔ−スコア対ＣＡＤ指数の二次多項式回帰分析を図解し（Ａ）、８種の予測性遺伝子に関わるモデル１の予測されるＣＡＤ指数対ＣＡＤ指数（Ｂ）を図解する。
【図２】図２は、３つの異なるコホートの別々のＰＬＳ分析についての各遺伝子の射影に重要な変数（ＶＩＰ）を、全対象を含むＰＬＳ分析と比較したものを図解する。
【図３】図３は、本研究に参加した２２２人の対象全員に適用した、８種の最も重要な予測性遺伝子を含む最終的ＰＬＳ分析を図解する。
【図４】図４は、１９種の予測性遺伝子に関わるモデル２（Ａ）および１５種の予測性遺伝子に関わるモデル３（Ｂ）の、予測されたＣＡＤ指数対ＣＡＤ指数を図解する。
【図１】
2007515155.tif 000020
【図２】
2007515155.tif 000021
【図３】
2007515155.tif 000022
【図４】
2007515155.tif 000023
【配列表】
2007515155000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月13日(2006.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007515155000001.app
【国際調査報告】
2007515155.tif 000092
2007515155.tif 000093
2007515155.tif 000094
2007515155.tif 000095
2007515155.tif 000096
2007515155.tif 000097
2007515155.tif 000098
2007515155.tif 000099
2007515155.tif 000100