(57)【要約】  本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により、アルブミン結合体及び非結合アルブミンを含む溶液中において、非結合アルブミンからアルブミン結合体を分離する方法に関する。当該溶液は、高塩分含有量をもつ水性緩衝液中において平衡にある疎水性カラムに充填され、当該カラムに低減する塩濃度勾配を適用し、そして当該溶出されたアルブミン結合体を回収する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミン結合体及び非結合アルブミンを含む溶液中、非結合アルブミンからアルブミン結合体を分離する方法であって、以下のステップ：
ａ）高塩分含有量をもつ水性緩衝液中で、平衡にある疎水性固形支持体上に、上記溶液を充填し；
ｂ）上記支持体に低減する塩分含有量勾配を適用し；そして
ｃ）溶出されるアルブミン結合体を回収する、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記アルブミン結合体が、それに共有結合するところのマイケル受容体を有する分子から成り、当該マイケル受容体がアルブミンに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結合が、前記マイケル受容体と前記アルブミンのシステイン３４との間にある、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記マイケル受容体がマレイミド基である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記マレイミド基がマレイミド−プロピオン酸（ＭＰＡ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アルブミンが、血清アルブミン、組換えアルブミン、及びゲノム源由来のアルブミンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アルブミンが、ヒトアルブミン、ラットアルブミン、マウスアルブミン、ブタアルブミン、ウシアルブミン、イヌアルブミン、及びウサギアルブミンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アルブミンが、脂肪酸、金属イオン、アルブミンに対し高親和力を有する小分子、及び糖からなる群より選択される少なくとも１つで修飾される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記糖が、グルコース、ラクトース、及びマンノースからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分子が、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小有機分子、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、少なくとも５７ダルトンの分子量を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドが、ＧＬＰ−１、ＡＮＰ、Ｋ５、ダイノルフィン、ＧＲＦ、インシュリン、ナトリウム利尿ペプチド、Ｔ−２０、Ｔ−１２４９、Ｃ−３４、ＳＣ−３５、ＰＹＹ、及びそれらの類似体からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記小有機分子が、ビノレルビン、ゲムシタビン、及びパクリタキセルからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記分子が、酸感受性共有結合又は蛋白質分解的開裂の影響を受けやすいペプチド配列を介して前記アルブミンに共有結合し、それにより、前記分子とアルブミンの分離、及び細胞内への当該分子の侵入が可能となる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記疎水性固形支持体が疎水性樹脂を含むカラムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記疎水性樹脂が、オクチルセファロース、フェニルセファロース、及びブチルセファロースからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記疎水性樹脂がブチルセファロースである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記塩が十分な塩析効果を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記塩が、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、及びリン酸マグネシウムからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記塩が、リン酸アンモニウム又は硫酸アンモニウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記塩が硫酸アンモニウムである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（ａ）技術分野
本出願は、アルブミン結合体及び非結合アルブミンの双方を含む溶液からアルブミン結合体を分離する精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（ｂ）先行技術の記載
国際特許公開第ＷＯ９５／１０３０２号、及び同第ＷＯ９９／２４０７４号は、アルブミンの結合体の形成を記載し、ここで着目の分子はそれに結合する反応性官能基を有し、当該反応官能基はアルブミンに共有的に結合するように構成され、それ故、結合体を形成する。これらの結合体は、生体内で形成され得るが、同様に生体外でも形成され得る。生体外における当該結合体の形成は、アルブミン溶液への反応性官能基に結合する分子の付加を伴って生じる。この反応の主要最終産物は、非結合アルブミン、当該アルブミン結合体、及び当該反応性官能基に結合される未反応分子である。
【０００３】
アルブミン結合体及び非結合アルブミンを含む溶液からアルブミン結合体を精製する方法を提供することが、非常に望まれる。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の概要
本発明に関して、アルブミン結合体及び非結合アルブミンを含む溶液中、非結合アルブミンからアルブミン結合体を分離する方法であって、以下のステップ：
ａ）高塩分含有量をもつ水性緩衝液中で、平衡にある疎水性固形支持体上に、当該溶液を充填し；
ｂ）当該支持体に低減する塩分含有量勾配を適用し；そして
ｃ）溶出されるアルブミン結合体を回収する、
を含む当該方法を提供する。
【０００５】
本発明の好ましい態様において、当該アルブミン結合体は、それに共有結合するマイケル受容体を有する分子から成り、当該マイケル受容体はアルブミンに結合する、そしてより好ましくは、当該結合は当該マイケル受容体とアルブミンのシステイン３４との間にある。
【０００６】
本発明のより好ましい態様において、当該マイケル受容体はマレイミド基であり、より好ましくは、当該マレイミド基はマレイミド−プロピオン酸（ＭＰＡ）である。当該マイケル受容体は、場合により、リンカーを介して当該分子と結合する。当該リンカーは、好ましくは、（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、２−［２−（２−アミノ）エトキシ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）、アミノエトキシエチルアミノコハク酸（ＡＥＥＡＳ）の如きヒドロキシエチルモチーフ；グリシン、３−アミノプロピオン酸（ＡＰＡ）、８−アミノオクタン酸（ＡＯＡ）、オクタン酸（ＯＡ）、４−アミノ安息香酸（ＡＰｈＡ）の如き１又は複数のアルキル鎖（Ｃ１〜Ｃ１０）モチーフからなる群より選択される。より好ましいリンカーは、ＯＡ、ＡＤＥ、ＡＥＡ、ＡＥＥＡ、及びＡＥＥＡＳである。２つのリンカーの組み合わせも、例えば、ＡＥＥＡ−ＥＤＡ、ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ、ＡＥＥＡＳ−ＡＥＥＡＳ、及びＡＥＡ−ＡＥＥＡの如く使用され得る。
【０００７】
本発明の好ましい態様において、当該アルブミンは、血清アルブミン、組換えアルブミン、及びゲノム源のアルブミンからなる群より選択される。
【０００８】
本発明の好ましい態様において、当該アルブミンは、ヒトアルブミン、ラットアルブミン、マウスアルブミン、ブタアルブミン、ウシアルブミン、イヌアルブミン、及びウサギアルブミンからなる群より選択され、より好ましくは、ヒト血清アルブミンである。
【０００９】
本発明の好ましい態様において、当該アルブミンは、脂肪酸、金属イオン、アルブミンに対し高親和力を有する小分子、及び非制限的にグルコース、ラクトース、及びマンノースの如き糖からなる群より選択される少なくとも１つで修飾される。
【００１０】
本発明の好ましい態様において、当該分子は、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小有機分子、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。当該ペプチドは、選択的に、少なくとも５７ダルトンの分子量を有する。当該ペプチドは、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＡＮＰ、Ｋ５、ダイノルフィン、ＧＲＦ、インシュリン、ナトリウム利尿ペプチド、Ｔ−２０、Ｔ−１２４９、Ｃ−３４、及びＰＹＹを非制限的に含むことを意図される。当該小有機分子は、ビノレルビン、ゲムシタビン、及びパクリタキセルを非制限的に含むことを意図される。本発明のより好ましい態様において、当該分子がＤＮＡ、ＲＮＡ又は小有機分子であるとき、当該分子は、酸感受性共有結合又は蛋白質分解的開裂の影響を受けやすいペプチド配列を介して当該アルブミンに共結合し、それにより、アルブミンからの当該分子の分離、及び細胞内への当該分子の侵入が可能となる。
【００１１】
本発明の好ましい態様において、当該疎水性固形支持体は、疎水性樹脂を含むカラムであって、ここで、当該疎水性樹脂は、非制限的に、オクチルセファロース、フェニルセファロース、及びブチルセファロース、そしてより好ましくはブチルセファロースである。
【００１２】
本発明の他の態様において、疎水性固形支持体は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  Ｆ３Ｇ−Ａの如き疎水性リガンド、ポリスチレン／ジビニルベンゼン基質の如き支持体に関連するエーテル又はイソプロピル基を含む。
【００１３】
物質は、非荷電基質に固定化された疎水性リガンドとの疎水性相互作用の様々な強度に基づいて分離される。この技術は、出発緩衝剤において、中程度に高い塩濃度（１Ｍ）で、通常、実施される（塩が吸着作用を促進する）。溶出は、塩濃度において直線的又は段階的な低減により実施される。
【００１４】
当該吸着過程において使用される、リガンドの型、置換の程度、ｐＨ及び型及び塩濃度は、ＨＩＣ基質（疎水性相互作用クロマトグラフィー基質）の全体的性能（例えば、選択性及び限度容量）に関する多大な影響を有する。
【００１５】
当該溶媒は、ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）における限度容量及び選択性に影響を与える最も重要なパラメーターの内の１つである。一般的に、当該吸着過程は、脱着過程より、より選択性が高い。それ故、ｐＨ、溶媒の型、塩の型、及び塩濃度に関して、当該出発緩衝剤を最適化することが重要である。当該サンプルに対する様々な「塩析」塩の付加は、ＨＩＣにおけるリガンド−蛋白質相互作用を促進する。塩濃度を増大するにつれて、結合蛋白質の量は、当該蛋白質の沈殿点まで増大される。塩の各型は、疎水性相互作用を促進する能力において異なる。疎水性相互作用に関する異なる塩の影響は、以下のよく知られたホフマイスター系列に従う。
【化１】
2007535507.tif 000002
【００１６】
塩析効果の増大は疎水性相互作用を強め、一方、カオトロピック効果の増大はそれらを弱める。それ故、硫酸アンモニウムは、塩化ナトリウムより、より強い塩析効果を示す。ＨＩＣ用に通常使用される塩は、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、硫酸ナトリウム（（Ｎａ）２ＳＯ４）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳ０４）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、及び酢酸アンモニウム（ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４）である。
【００１７】
ＨＩＣ吸着剤に結合する蛋白質は、中程度から高濃度の「塩析」塩により促進され、その多くは、天然球状タンパク質からのそれらの選択的排斥に起因して、蛋白質構造に関する安定化作用も有する、すなわち、当該塩と当該蛋白質表面との相互作用は熱力学的に不利である。当該塩濃度は、さらに低いリガンド−蛋白質相互作用を促進するために十分に高くあるべき（例えば、５００〜１０００ｍＭ）であるが、当該サンプル中の蛋白質の沈殿を生ずるより低くあるべきである。アルブミンの場合、当該塩濃度は、３Ｍ（モル／リットル）より低く保つべきである。当該塩析の主要機構は、水の表面張力の塩誘導増大からなる（Ｍｅｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｒｖａｔｈ，１９７７）。それ故、小型構造はエネルギー的により有利である、なぜならば、それはより小さい蛋白質−溶液の界面積と対応するからである。
【００１８】
興味深いことに、我々は、同条件下（すなわち、いずれかの対イオンを有するＳＯ４２−、ＰＯ４２−又はＣＨ３ＣＯＯ−からなる緩衝剤）、これらの塩が、非結合アルブミン（すなわち、メルカプトアルブミン、及びシステインでキャップされたアルブミン）と異なる方法で、本明細書中に記載の原則的に全ての結合アルブミンに関するそれらの塩析効果を示し、それ故、結合アルブミン対非結合アルブミン間の一貫したクロマトグラフ分離を可能とすることを見出した。すなわち、我々は、リガンドと非結合アルブミンとの間の相互作用よりリガンドと結合アルブミンとの間の相互作用を促進するために、より低い塩濃度が必要とされることを観察した。このクロマトグラフ分離は、（ａ）アルブミンの配列（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）、（ｂ）アルブミンの起源（すなわち、血しょう由来又は組み換え型）、（ｃ）当該結合分子の分子量、（ｄ）当該分子構造内のマイケル受容体（又はマレイミド基）の位置、（ｅ）ペプチド配列又は当該分子の化学的構造、及び（ｆ）結合分子の三次元構造、例えば、直線状対ループ構造に本質的に依存する。
【００１９】
本発明の好ましい態様において、当該水性緩衝液の塩は、十分な塩析効果を有する。十分な塩析効果を提供するために、当該塩は、好ましくは、非制限的に、リン酸塩、硫酸塩、及び酢酸塩である。より好ましくは、当該塩は、リン酸塩又は硫酸塩である。当該緩衝剤の陽イオンの選択は、あまり気にかけなくともよく、それ故、そのような陽イオンは、ＮＨ４＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃｓ＋、Ｌｉ＋、Ｍｇ２＋、及びＢａ２＋からなる群より非制限的に選択され得る。
【００２０】
当該水性緩衝液は、好ましくは、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、及びリン酸マグネシウムであり、さらに好ましくは、硫酸アンモニウムである。
【００２１】
本発明の好ましい態様において、当該緩衝剤のｐＨは、３．０〜９．０であり；よりさらに好ましくは、６．０〜８．０であり、及びさらに好ましくは、当該ｐＨは７．０である。
【００２２】
本発明の好ましい態様において、当該緩衝剤及び疎水性固形支持体は、室温（約２５℃）又は４℃又はその間である。
【００２３】
表１は、ブチルセファロース樹脂を使用して、ＨＳＡ溶液から予備成形されたＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体結合体の精製のために、様々な塩の効果の例を示す（当該第１ＧＬＰ−１類似体の構造を、下記実施例１において記載する。）。
【００２４】
【表１】
2007535507.tif 000003
【００２５】
当該用語「ペプチド」は、少なくとも５７キロダルトンの分子量を有するアミノ酸配列を意味することを意図される。当該ペプチド配列は、ＡＮＰの如き環状（ループ構造）となり得、インシュリンの如き複数のアミノ酸鎖を含み得、又はＫ５、ダイノルフィンＡ、Ｃ−３４、及びＧＬＰ−１の如き直線状を含み得る。
【００２６】
本明細書中の全引用文献の全内容を本願明細書中に援用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の好ましい態様における詳細な説明
本発明に関して、アルブミン結合体及び非結合アルブミンを含む溶液からアルブミン結合体の精製方法を提供する。
【００２８】
方法
対照（非結合）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及び予備形成アルブミン結合体の製造
マイケル受容体を有する各化合物を、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水中に（又は、もし当該化合物が難溶性であればＤＭＳＯ中に）１０ｍＭの濃度で可溶性にし、次いでＨＳＡの溶液（２５％，２５０ｍｇ／ｍｌ，Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）の中へ１ｍＭまで希釈した。次いで、当該サンプルを３７℃で３０分間培養した。それらの精製に先立ち、各結合体溶液を、５ｍＭのオクタン酸ナトリウムからなる２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７）中、５％、５０ｍｇ／ｍｌＨＳＡまで希釈した。溶出勾配において使用される初期塩濃度は、当該混合溶液を希釈するための緩衝剤に追加され得る。好ましくは、当該塩の初期濃度は、約７５０〜約１７００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４である。
【００２９】
好ましい態様による精製手順
ＡＫＴＡ精製装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、各結合体を、２．５ｍｌ／分の流速で、５ｍＭのオクタン酸ナトリウム、及び７５０ｍＭ〜１．７Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４からなる２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７）において平衡化されたブチルセファロース  ４  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上に充填した。これらの条件下、非結合ＨＳＡと比較して２ｋＤａ超の分子量の追加を有するＨＳＡ結合体は、疎水性樹脂上に吸着され、一方、ほぼ全ての非結合ＨＳＡは、当該カラムの空隙用量の範囲内で溶出される。２ｋＤａ未満の分子量の追加について、より高い初期塩含有量が使用され得、その後、塩を低減する段階的勾配が使用される。各結合体を、４カラム容量にわたり、塩の連続的又は非連続的低減勾配（７５０〜０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４）を適用することにより、さらに精製した。好ましい態様において、次いで、各精製された結合体を、脱塩し、そして、例えば、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）超遠心ろ過装置（３０ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用することにより、ダイアフィルトレーションにより濃縮した。最終的に、長期保存の間、各結合体溶液は、好ましくは、液体窒素中に浸し、及びＬａｂｃｏｎｃｏ凍結乾燥システム［ＦｒｅｅＺｏｎｅ（登録商標）４．５］を使用して凍結乾燥され、そして、−２０℃で保存される。
【００３０】
ＬＣ／ＥＭＳ分析の実施例
精製後、各結合体サンプルの１μｌは、好ましくは、ＬＣ／ＥＭＳ系に投入される。当該ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体を、システイン３４が遊離チオール型であるメルカプトアルブミン（６６，４４８Ｄａ）、プラス第１ＧＬＰ−１類似体のたった１つの分子量（３７１９．９Ｄａ）に相当する７０，１６０Ｄａの全容量を有する最も高い存在量の一種の検出より確認した。当該第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の構造は、下記の実施例１に記載される。この事を表２に示す。
【００３１】
【表２】
2007535507.tif 000004
【００３２】
当該ＨＳＡ：第１ＧＲＦ類似体（配列番号２）結合体を、システイン３４が遊離チオール型であるメルカプトアルブミン（６６，４４８Ｄａ）、プラス第１ＧＲＦ類似体のたった１つの分子量（３６４８．２Ｄａ）に相当する７０，０８６Ｄａの全容量を有する最も高い存在量の一種の検出より確認した。当該第１ＧＲＦ類似体（配列番号２）の構造は、下記の実施例２に記載される。この事を表３に示す。
【００３３】
【表３】
2007535507.tif 000005
【００３４】
下記の実施例は、アルブミンと結合し本発明の方法により精製された、マイケル受容体のようなマレイミド基を有するいくつかの化合物を示す。
【００３５】
当該以下の実施例は、本発明を例証する目的であり、その範囲を限定するものではない。
【００３６】
当該以下の実施例において、勾配番号は、以下の勾配の詳細を言及し、ここでＣＶは、５０ｍｌのカラム容量を意味する。
【００３７】
勾配＃１：直線状７５０〜０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、４ＣＶに渡り、２．５ｍｌ／分の流速。
【００３８】
勾配＃２：段階的勾配１．７５Ｍ〜１．２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、０．５ＣＶに渡り、その後１．２Ｍ〜８７５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、５ＣＶに渡り、そして最後に８７５ｍＭ〜０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、０．５ＣＶに渡り、２．５ｍｌ／分の流速。
勾配＃３：直線状９００〜０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、４ＣＶに渡り、２．５ｍｌ／分の流速。
勾配＃４：段階的勾配１．５Ｍ〜１．１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、０．５ＣＶに渡り、その後１．１Ｍ〜３７５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、６ＣＶに渡り、そして最後に３７５ｍＭ〜０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、０．５ＣＶに渡り、２．５ｍｌ／分の流速。
【００３９】
勾配＃５：直線状７５０〜０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、２ＣＶに渡り、２．５ｍｌ／分の流速。
勾配＃６：段階的勾配１．７５Ｍ〜０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、６ＣＶに渡り、２．５ｍｌ／分の流速。
勾配＃７：直線状７５０〜０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、６ＣＶに渡り、２．５ｍｌ／分の流速。
【実施例】
【００４０】
実施例１
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化２】
2007535507.tif 000006
【００４１】
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、ｐＨ７．０の２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成される緩衝剤９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１において、当該精製された結合体画分を、（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を低減する勾配間で、画分Ｂ（Ｆ８−９）として溶出し、一方、非結合アルブミンは、当該カラムの空隙容量の範囲内で溶出する（画分Ａ）。当該結合体画分を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）の３０ｋＤａろ過材で濃縮し、ＬＣ−ＥＭＳを使用して分析した。
【００４２】
実施例２
ＨＳＡ：第１ＧＲＦ類似体（配列番号２）結合体の精製
当該第１ＧＲＦ類似体は、ＧＲＦ（１−２９）ｄＡｌａ２Ｇｌｎ８Ａｌａ１５Ｌｅｕ２７Ｌｙｓ３０（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化３】
2007535507.tif 000007
【００４３】
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＲＦ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２において、当該精製された結合体画分は画分Ｂ（Ｆ６−Ｆ７）に現れ、一方、非結合アルブミンは、当該カラムの空隙容量の範囲内で溶出する（画分Ａ）。当該結合体画分を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）の３０ｋＤａろ過材で濃縮し、ＬＣ−ＥＭＳを使用して分析した。
【００４４】
実施例３
非結合ＨＳＡの１ｍｌの精製
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成される緩衝剤（ｐＨ７．０）の９ｍｌ中に希釈された１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌの非結合ＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。ほぼ全てのアルブミン分子が当該空隙容量内で溶出し、そして、蛋白質種は、（ＮＨ４）２ＳＯ４勾配の間、２８０ｎｍで観察されなかった。図３は、得られた分離曲線を示す。
【００４５】
実施例４
ｒＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列を実施例１に示す。
【００４６】
５ｍｌ、５％のｒＨＳＡ（組み換え型ＨＳＡ、ｎｅｗ  ｃｅｎｔｕｒｙ  培養グレード）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成される緩衝剤５ｍｌ中に希釈された２００μＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４において、当該精製された結合体画分は画分Ｂ（Ｆ７−Ｆ８−Ｆ９）に現れる。
【００４７】
実施例５
ＨＳＡの１０ｍｌの精製
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成される緩衝剤の４０ｍｌ中に希釈された１０ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。ほぼ全てのアルブミン分子が、空隙容量内で溶出し、そして、蛋白質種は、（ＮＨ４）２ＳＯ４勾配の間、２８０ｎｍで観察されなかった。図５は、得られた分離曲線を示す。
【００４８】
実施例６
ＨＳＡ：Ｋ５類似体（配列番号３）結合体の精製
当該Ｋ５類似体は、Ａｃ−Ｋ５Ｌｙｓ８（ε−ＭＰＡ）−ＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化４】
2007535507.tif 000008
【００４９】
４ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１６ｍｌ中に希釈された１ｍＭのＫ５類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６において、当該精製された結合体画分は、アルブミンとともに画分Ａに、及び画分Ｂ（Ｆ６−Ｆ７−Ｆ８）に現れる。
【００５０】
実施例７
ＨＳＡ：第１インシュリン誘導体（配列番号４）結合体の精製
当該第１インシュリン誘導体は、Ｂ１の位置上でＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、以下の図１に表される。
【化５】
2007535507.tif 000009
【００５１】
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１インシュリン誘導体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７において、当該精製された結合体画分は画分Ｂ（Ｆ６−Ｆ７−Ｆ８）に現れる。
【００５２】
実施例８
ＨＳＡ：第２インシュリン誘導体（配列番号５）結合体の精製
当該第２インシュリン誘導体は、Ａ１の位置上でＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、上記実施例７における図１に表される。
【００５３】
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２インシュリン誘導体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図８において、当該精製された結合体画分は画分Ｂ（Ｆ６−Ｆ７−Ｆ８）に現れる。
【００５４】
実施例９
ＨＳＡ：第１Ｃ３４類似体（配列番号６）結合体の精製
当該第１Ｃ３４類似体は、ＭＰＡ−ＡＥＥＡ−Ｃ３４−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化６】
2007535507.tif 000010
【００５５】
５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２０ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１Ｃ３４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図９において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【００５６】
実施例１０
ＨＳＡ：第２Ｃ３４類似体（配列番号７）結合体の精製
当該第２Ｃ３４類似体は、Ｃ３４（１−３４）Ｌｙｓ３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化７】
2007535507.tif 000011
【００５７】
５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２０ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２Ｃ３４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１０において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【００５８】
実施例１１
ＨＳＡ：第３Ｃ３４類似体（配列番号８）結合体の精製
当該第３Ｃ３４類似体は、Ｃ３４（１−３４）Ｌｙｓ１３（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化８】
2007535507.tif 000012
【００５９】
５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２０ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第３Ｃ３４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１１において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【００６０】
実施例１２
ｌ−システインの精製
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成される緩衝剤の２ｍｌ中のｌ−システインの１２１ｍｇの精製を、上記勾配＃５を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１２は、得られた分離曲線を示し、ここで、Ｌ−システインは当該カラムの空隙容量範囲内で溶出する（Ｆ３）。
【００６１】
実施例１３
Ｌ−システイン：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列を、実施例１において示す。
【００６２】
１２１ｍｇのＬ−システインと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２ｍｌ中に希釈された３６．３６ｍｇの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃５を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１３は、得られた分離曲線を示し、ここで、余分なＬ−システインはＦ３に溶出され（カラム空隙容量）、当該Ｌ−システイン：第１ＧＬＰ−１類似体結合体は、０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４において、溶出する。
【００６３】
実施例１４
ＨＳＡ：第２ＧＬＰ−１Ｆ類似体（配列番号９）結合体の精製
当該第２ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ３７（ε−ＭＰＡ）−ＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化９】
2007535507.tif 000013
【００６４】
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１０ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃５を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１４において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【００６５】
実施例１５
ＨＳＡ：第３ＧＬＰ−１類似体（配列番号１０）結合体の精製
当該第３ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＭＰＡ）−ＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化１０】
2007535507.tif 000014
【００６６】
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の緩衝剤１０ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第３ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃５を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１５において、当該精製された結合体画分は、画分Ｆ２に現れる。
【００６７】
実施例１６
ＨＳＡ：第４ＧＬＰ−１類似体（配列番号１１）結合体の精製
当該第４ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ２６（ε−ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）であり、以下の配列を有する。
【化１１】
2007535507.tif 000015
【００６８】
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１０ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第４ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１６において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【００６９】
実施例１７
ＨＳＡ：第５ＧＬＰ−１類似体（配列番号１２）結合体の精製
当該第５ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ３４（ε−ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）であり、以下の配列を有する。
【化１２】
2007535507.tif 000016
【００７０】
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１０ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第５ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１７において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【００７１】
実施例１８
ＨＳＡ：第１エキセンディン（Ｅｘｅｎｄｉｎ）類似体（配列番号１３）結合体の精製
当該第１エキセンディン−４類似体は、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４−（１−３９）Ｌｙｓ４０（ε−ＭＰＡ）−ＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化１３】
2007535507.tif 000017
【００７２】
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１エキセンディン−４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１８において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【００７３】
実施例１９
ＨＳＡ：第２エキセンディン類似体（配列番号１４）結合体の精製
当該第２エキセンディン−４類似体は、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４（９−３９）Ｌｙｓ４０（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化１４】
2007535507.tif 000018
【００７４】
３．５ｍｌ、２５％のＨＳＡ  Ｃｏｒｔｅｘと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２１．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２エキセンディン−４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１９において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【００７５】
実施例２０
ＨＳＡ：ＭＰＡの精製
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された２ｍＭのＭＰＡとの反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃２を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２０において、当該メルカプトアルブミンの画分は画分Ａ（Ｆ５）に現れ、キャップド（ｃａｐｐｅｄ）アルブミンは、画分Ｂ（Ｆ７−Ｆ８）に現れる。当該結合体画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）の３０ｋＤａろ過材で濃縮した。
【００７６】
実施例２１
ＨＳＡの精製
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）の精製を、上記勾配＃２を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。勾配＃１及び＃５とは違い、勾配＃２を使用するとき、複合アルブミン及び非結合アルブミンの双方は、サンプルの充填の間、当該疎水性樹脂上に吸着する。図２１は、Ｆ４及びＦ５がメルカプトアルブミンの豊富な場合、並びにＦ６、Ｆ７、及びＦ８がキャップドアルブミンの豊富な場合に得られた分離曲線を示す。
【００７７】
実施例２２
ＨＳＡ：第２Ｃ３４類似体（配列番号３）結合体の精製
当該第２Ｃ３４類似体は、Ｃ３４（１−３４）Ｌｙｓ３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その構造は実施例１０に示される。
【００７８】
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２Ｃ３４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃２を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２２において、メルカプトアルブミンは画分Ａ（Ｆ５）に現れ、そしてキャップドアルブミン及び精製された複合アルブミンは、画分Ｂ（Ｆ７−Ｆ８）に現れる。
【００７９】
実施例２３
ＨＳＡ：第１ダイノルフィンＡ類似体（配列番号１５）結合体の精製
当該第１ダイノルフィンＡ類似体は、ＤｙｎＡ（１−１３）（ＭＰＡ）−ＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化１５】
2007535507.tif 000019
【００８０】
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ダイノルフィンＡ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃２を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２３において、当該精製された複合画分は画分Ａ（Ｆ１１−Ｆ１２）に現れる。
【００８１】
実施例２４
ＨＳＡ：第１ＡＮＰ類似体（配列番号１６）結合体の精製
当該第１ＡＮＰ類似体は、ＭＰＡ−ＡＥＥＡ−ＡＮＰ（９９−１２６）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
【化１６】
2007535507.tif 000020
【００８２】
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＡＮＰ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃２を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２４において、当該精製された複合画分は画分Ａ（Ｆ１４）に現れる。
【００８３】
実施例２５
ＨＳＡ：第２ダイノルフィン類似体（配列番号１７）結合体の精製
当該第２ダイノルフィン類似体は、ＤｙｎＡ（７−１３）Ｌｙｓ１３（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
【化１７】
2007535507.tif 000021
【００８４】
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２ダイノルフィンＡ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃２を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２５において、当該精製された複合画分は画分Ａ（Ｆ９）に現れる。
【００８５】
実施例２６
ＨＳＡ：ＡＣＥ阻害剤（配列番号１８）結合体の精製
本実施例に使用されるＡＣＥ阻害剤は、アセチル−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−シクロヘキシルスタチル（ｓｔａｔｙｌ）−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
【化１８】
2007535507.tif 000022
【００８６】
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭのＡＣＥ阻害剤との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃２を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２６において、当該精製された複合画分は画分Ａ（Ｆ１４）に現れる。
【００８７】
実施例２７
ＨＳＡ：第６ＧＬＰ−１類似体（配列番号１９）結合体の精製
当該第６ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ２３（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
【化１９】
2007535507.tif 000023
【００８８】
３ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第６ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２７において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【００８９】
実施例２８
ＨＳＡ：第７ＧＬＰ−１類似体（配列番号２０）結合体の精製
当該第７ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ１８（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
【化２０】
2007535507.tif 000024
【００９０】
３ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第７ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２８において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【００９１】
実施例２９
ＨＳＡ：第８ＧＬＰ−１類似体（配列番号２１）結合体の精製
当該第８ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ２６（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
【化２１】
2007535507.tif 000025
【００９２】
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第８ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２９において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【００９３】
実施例３０
ＨＳＡ：第９ＧＬＰ−１類似体（配列番号２２）結合体の精製
当該第９ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３７）Ｌｙｓ２７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
【化２２】
2007535507.tif 000026
【００９４】
３ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第９ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３０において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【００９５】
実施例３１
ＨＳＡ：第１０ＧＬＰ−１類似体（配列番号２３）結合体の精製
当該第１０ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
【化２３】
2007535507.tif 000027
【００９６】
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１０ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３１において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【００９７】
実施例３２
ＨＳＡ：第１１ＧＬＰ−１類似体（配列番号２４）結合体の精製
当該第１１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
【化２４】
2007535507.tif 000028
【００９８】
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３２において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【００９９】
実施例３３
ＨＳＡ：第３エキセンディン−４類似体（配列番号２５）結合体の精製
当該第３エキセンディン−４類似体は、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４−（１−３９）Ｌｙｓ４０（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
【化２５】
2007535507.tif 000029
【０１００】
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第３エキセンディン−４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３３において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１０１】
実施例３４
ＨＳＡ：第１２ＧＬＰ−１類似体（配列番号２６）結合体の精製
当該第１２ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ３４（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
【化２６】
2007535507.tif 000030
【０１０２】
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１２ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３４において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１０３】
実施例３５
ＨＳＡ：第１インシュリン誘導体（配列番号４）結合体の精製
当該第１インシュリン誘導体は、Ｂ１の位置上でＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、その構造を実施例７において詳述する。
【０１０４】
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１インシュリン誘導体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３５において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１０５】
実施例３６
ＨＳＡ：第３インシュリン誘導体（配列番号２７）結合体の精製
当該第３インシュリン誘導体は、Ｂ１の位置上でＯＡ−ＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、実施例７に示される図１において表される。
【０１０６】
４ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２１ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第３インシュリン誘導体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３６において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１０７】
実施例３７
ＨＳＡ：第２インシュリン誘導体（配列番号５）結合体の精製
当該第２インシュリン誘導体は、Ａ１の位置上でＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、実施例７に示される図１において表される。
【０１０８】
３ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２インシュリン誘導体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３７において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１０９】
実施例３８
ＨＳＡ：第４インシュリン誘導体（配列番号２８）結合体の精製
当該第４インシュリン誘導体は、Ｂ２９の位置上でＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、実施例７に示される図１において表される。
【０１１０】
３ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第４インシュリン誘導体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３８において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１１１】
実施例３９
ＨＳＡ：第１ＧＲＦ類似体（配列番号２）結合体の精製
当該第１ＧＲＦ類似体は、ＧＲＦ（１−２９）ｄＡｌａ２Ｇｌｎ８Ａｌａ１５Ｌｅｕ２７Ｌｙｓ３０（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列を実施例２において示す。
【０１１２】
３．７ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＲＦ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３９において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１１３】
実施例４０
ＨＳＡ：第２ＧＲＦ類似体（配列番号２９）結合体の精製
当該第２ＧＲＦ類似体は、ＧＲＦ（１−２９）Ｌｙｓ３０（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化２７】
2007535507.tif 000031
【０１１４】
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び９００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２ＧＲＦ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃３を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４０において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１１５】
実施例４１
ＨＳＡ：第３ＧＲＦ類似体（配列番号３０）結合体の精製
当該第３ＧＲＦ類似体は、ＧＲＦ（１−２９）ｄＡｌａ２Ｇｌｎ８ｄＡｒｇ１１Ａｌａ１５Ｌｅｕ２７Ｌｙｓ３０（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化２８】
2007535507.tif 000032
【０１１６】
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第３ＧＲＦ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃３を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４１において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１１７】
実施例４２
ＨＳＡ：第４ＧＲＦ類似体（配列番号３１）結合体の精製
当該第４ＧＲＦ類似体は、ＧＲＦ（１−２９）ｄＡｌａ２Ｌｙｓ３０（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化２９】
2007535507.tif 000033
【０１１８】
２．５ｍｌ、２５％のＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び９００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第４ＧＲＦ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃３を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４２において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１１９】
実施例４３
ＨＳＡ：第１３ＧＬＰ−１類似体  ＣＪＣ  １３６５（配列番号３２）結合体の精製
当該第１３ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（９−３６）Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化３０】
2007535507.tif 000034
【０１２０】
３．５ｍｌ、２５％のＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２１．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１３ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４３において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１２１】
実施例４４
ＨＳＡラクトース：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は上記実施例１において示される。
【０１２２】
４ｍｌ、２５％のラクトサミネート（ｌａｃｔｏｓａｍｉｎａｔｅ）されたアルブミン（３７℃、ｐＨ７．０で過剰なラクトースと予備培養されたＨＳＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成された緩衝剤の４ｍｌ中の２００μＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４４において、当該精製されたラクトサミネート複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１２３】
実施例４５
ＨＳＡ：第１Ｔ２０類似体（配列番号３３）結合体の精製
当該第１Ｔ２０類似体は、Ａｃ−Ｔ２０（１−３６）Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化３１】
2007535507.tif 000035
【０１２４】
２．５ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１０ｍｌ中の１ｍＭの第１Ｔ２０類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４５において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１２５】
実施例４６
ＨＳＡ：第１Ｔ１２４９類似体（配列番号３４）結合体の精製
当該第１Ｔ１２４９類似体は、Ａｃ−Ｔ１２４９（１−３９）Ｌｙｓ４０（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化３２】
2007535507.tif 000036
【０１２６】
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１０．５ｍｌ中の１ｍＭの第１Ｔ１２４９類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４６において、当該精製された複合画分は画分Ｆ４に現れる。
【０１２７】
実施例４７
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８−Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、この配列は、実施例１において示される。
【０１２８】
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１２．５ｍｌ中の第１ＧＬＰ−１類似体の予備成形された結合体の１１４．４５ｍｇの精製を、上記勾配＃５を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４７は、画分Ｆ２において見出された当該結合体と共に得られた分離曲線を示す。
【０１２９】
実施例４８
ＨＳＡ：第１Ｃ３４類似体（配列番号６）の精製
当該第１Ｃ３４類似体は、ＭＰＡ−ＡＥＥＡ−Ｃ３４−ＣＯＮＨ２であり、この配列は、実施例９において示される。
【０１３０】
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１２．５ｍｌ中の第１Ｃ３４類似体の予備成形された結合体の１１４．４５ｍｇの精製を、上記勾配＃５を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４８は、画分Ｆ２において見出された当該結合体と共に得られた分離曲線を示す。
【０１３１】
実施例４９
ＨＳＡ：第２ＧＲＦ類似体（配列番号２９）の精製
当該第２ＧＲＦ類似体は、ＧＲＦ（１−２９）ＬＹＳ３０（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、この配列は、上記実施例４０において示される。
【０１３２】
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０の、１２．５ｍｌ中の第２ＧＲＦ類似体の予備成形された結合体の１２５．５３ｍｇの精製を、上記勾配＃５を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４９は、画分Ｆ２において見出された当該結合体と共に得られた分離曲線を示す。
【０１３３】
実施例５０
ＨＳＡ：ビノレルビン類似体（配列番号３５）結合体の精製
当該ビノレルビン類似体は、以下の構造中に示されるように、それに結合するＡＥＥＡ−ＭＰＡを有するビノレルビン類似体である。
【化３３】
2007535507.tif 000037
【０１３４】
２．５ｍｌ、２５％のＨＳＡ、及び２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成されたｐＨ７．０の緩衝剤の２２．５ｍｌ中における１ｍＭのビノレルビン類似体から生成された結合体の精製を、上記勾配＃４を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５０において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。当該結合体画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）の３０ｋＤａろ過材で濃縮した。
【０１３５】
実施例５１
Ｌ−システインの精製
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１５００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中の２．５ｍｌ、４０ｍＭのＬ−システインの精製を、上記勾配＃４を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５１において、当該カラムの空隙容量の範囲内において溶出するＬ−システインと共に得られた分離曲線を示す。
【０１３６】
実施例５２
Ｌ−システイン：ビノレルビン類似体（配列番号３５）結合体の精製
当該ビノレルビン類似体は、実施例５０に示される構造中に示されるように、それに結合するＡＥＥＡ−ＭＰＡを有するビノレルビンの分子である。
【０１３７】
２．５ｍｌ、４０ｍＭのＬ−システインと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４２２．５ｍｌ中の１ｍＭのビノレルビン類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃４を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５２において、画分Ｆ８、Ｆ９、及びＦ１０の範囲内の当該Ｌ−システイン結合体の溶出と共に得られる分離曲線を示す。
【０１３８】
実施例５３
ＲＳＡ：第３エキセンディン−４類似体（配列番号２５）結合体の精製
当該第３エキセンディン−４類似体は、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４−（１−３９）Ｌｙｓ４０（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は実施例３３に示される。
【０１３９】
１１ｍｌ、５％のＲＳＡ（ラット血清アルブミン）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１１ｍｌ中の２００μＭの第３エキセンディン−４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５３において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１４０】
実施例５４
ＨＳＡ：第４Ｃ３４類似体（配列番号３６）結合体の精製
当該第４Ｃ３４類似体は、Ｃ３４（１−３４）Ｌｙｓ１３（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化３４】
2007535507.tif 000038
【０１４１】
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１３ｍｌ中の１ｍＭの第４Ｃ３４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５４において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１４２】
実施例５５
ＨＳＡ：第５Ｃ３４類似体（配列番号３７）結合体の精製
当該第５Ｃ３４類似体は、Ｃ３４（１−３４）Ｌｙｓ３５（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化３５】
2007535507.tif 000039
【０１４３】
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１３ｍｌ中の１ｍＭの第５Ｃ３４類似体とから生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５５において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１４４】
実施例５６
ＨＳＡ：第６Ｃ３４類似体（配列番号３８）結合体の精製
当該第６Ｃ３４類似体は、ＭＰＡ−Ｃ３４（１−３４）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化３６】
2007535507.tif 000040
【０１４５】
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１３ｍｌ中の１ｍＭの第６Ｃ３４類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５６において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１４６】
実施例５７
ＨＳＡ：第７Ｃ３４類似体（配列番号３９）結合体の精製
当該第７Ｃ３４類似体は、Ａｃ−Ｃ３４（１−３４）Ｇｌｕ２Ｌｙｓ６Ｌｙｓ７Ｇｌｕ９Ｇｌｕ１０Ｌｙｓ１３Ｌｙｓ１４Ｇｌｕ１６Ｇｌｕ１７Ｌｙｓ２０Ｌｙｓ２１Ｇｌｕ２３Ｇｌｕ２４Ｌｙｓ２７Ｇｌｕ３１Ｌｙｓ３４Ｌｙｓ３５Ｌｙｓ３６（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化３７】
2007535507.tif 000041
【０１４７】
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１３ｍｌ中の１ｍＭの第７Ｃ３４類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５７において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１４８】
実施例５８
ＨＳＡ：第８Ｃ３４類似体（配列番号４０）結合体の精製
当該第８Ｃ３４類似体は、ＭＰＡ−ＡＥＥＡ−Ｃ３４（１−３４）Ｇｌｕ２Ｌｙｓ６Ｌｙｓ７Ｇｌｕ９Ｇｌｕ１０Ｌｙｓ１３Ｌｙｓ１４Ｇｌｕ１６Ｇｌｕ１７Ｌｙｓ２０Ｌｙｓ２１Ｇｌｕ２３Ｇｌｕ２４Ｌｙｓ２７Ｇｌｕ３１Ｌｙｓ３４Ｌｙｓ３５−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化３８】
2007535507.tif 000042
【０１４９】
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１３ｍｌ中の１ｍＭの第８Ｃ３４類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５８において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１５０】
実施例５９
ＨＳＡ：第１ＰＹＹ類似体（配列番号４１）結合体の精製
当該第１ＰＹＹ類似体は、ＰＹＹ（３−３６）Ｌｙｓ４（ε−ＯＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化３９】
2007535507.tif 000043
【０１５１】
１．５ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の６ｍｌ中の１ｍＭの第１ＰＹＹ類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５９において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１５２】
実施例６０
ＨＳＡ：第２ＰＹＹ類似体（配列番号４２）結合体の精製
当該第２ＰＹＹ類似体は、ＭＰＡ−ＯＡ−ＰＹＹ（３−３６）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化４０】
2007535507.tif 000044
【０１５３】
１．５ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の６ｍｌ中の１ｍＭの第２ＰＹＹ類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６０において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１５４】
実施例６１
ＨＳＡ：第５インシュリン誘導体（配列番号４３）結合体の精製
当該第５インシュリン誘導体は、Ｂ２９の位置上においてＡＥＥＡＳ−ＡＥＥＡＳ−ＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、上記実施例７に示される図１において表される。
【０１５５】
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１５ｍｌ中の１ｍＭの第５インシュリン誘導体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６１において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１５６】
実施例６２
ＨＳＡ：第６インシュリン誘導体（配列番号４４）結合体の精製
当該第６インシュリン誘導体は、Ｂ１の位置上においてＡＥＥＡＳ−ＡＥＥＡＳ−ＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、上記実施例７に示される図１において表される。
【０１５７】
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１５ｍｌ中の１ｍＭの第６インシュリン誘導体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６２において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１５８】
実施例６３
ＨＳＡ：第７インシュリン誘導体（配列番号４５）結合体の精製
当該第７インシュリン誘導体は、Ｂ２９の位置上においてＯＡ−ＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、上記実施例７に示される図１において表される。
【０１５９】
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１５ｍｌ中の１ｍＭの第７インシュリン誘導体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６３において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１６０】
実施例６４
ＨＳＡ：第３ＰＹＹ類似体（配列番号４６）結合体の精製
当該第３ＰＹＹ類似体は、ＭＰＡ−ＰＹＹ（３−３６）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化４１】
2007535507.tif 000045
【０１６１】
３ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１８ｍｌ中の１ｍＭの第３ＰＹＹ類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６４において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１６２】
実施例６５
ＨＳＡ：第４ＰＹＹ類似体（配列番号４７）結合体の精製
当該第４ＰＹＹ類似体は、ＭＰＡ−ＰＹＹ（３−３６）Ｌｙｓ３７（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化４２】
2007535507.tif 000046
【０１６３】
３ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１８ｍｌ中の１ｍＭの第４ＰＹＹ類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６５において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１６４】
実施例６６
ＨＳＡ：第５ＰＹＹ類似体（配列番号４８）結合体の精製
当該第５ＰＹＹ類似体は、ＭＰＡ−ＰＹＹ（２２−３６）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化４３】
2007535507.tif 000047
【０１６５】
６ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び９００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の３６ｍｌ中の１ｍＭの第５ＰＹＹ類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃３を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６６において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１６６】
実施例６７
ＨＳＡ：第６ＰＹＹ類似体（配列番号４９）結合体の精製
当該第６ＰＹＹ類似体は、Ａｃｅｔｙｌ−ＰＹＹ（２２−３６）Ｌｙｓ３７（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化４４】
2007535507.tif 000048
【０１６７】
６ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び９００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の３６ｍｌ中の１ｍＭの第６ＰＹＹ類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃３を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６７において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１６８】
実施例６８
ＨＳＡ：第２ＡＮＰ類似体（配列番号５０）結合体の精製
当該第２ＡＮＰ類似体は、ＭＰＡ−ＡＮＰ（９９−１２６）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化４５】
2007535507.tif 000049
【０１６９】
１ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１４ｍｌ中の１ｍＭの第２ＡＮＰ類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃３を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６８において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１７０】
実施例６９
ＨＳＡ：第３ＡＮＰ類似体（配列番号５１）結合体の精製
当該第３ＡＮＰ類似体は、Ｓｅｒ９９と結合するＭＡＬ−ｄＰＥＧ４（登録商標）（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ，ＵＳＡ）と反応されるＡＮＰ（９９−１２６）である。当該得られたＡＮＰ類似体は、ＭＰＡ−ＥＥＥＥＰ−ＡＮＰ（９９−１２６）であって、ここでＥＥＥＥＰは、エトキシ・エトキシ・エトキシ・エトキシプロピオン酸であり、当該ＡＮＰ類似体は以下の配列を有する。
【化４６】
2007535507.tif 000050
【０１７１】
１ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び９００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１４ｍｌ中の１ｍＭのＣＪＣ１６８１との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃３を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６９Ａ及び６９Ｂにおいて、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１７２】
実施例７０
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は、上記実施例１において示される。
【０１７３】
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１．７５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃６を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７０において、当該精製された結合体画分は画分Ｂに現れる。
【０１７４】
実施例７１
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は、上記実施例１において示される。
【０１７５】
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１．７５Ｍの硫酸マグネシウムの９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃６を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７１において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１７６】
実施例７２
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は、上記実施例１において示される。
【０１７７】
７５０ｍＭの硫酸アンモニウムの例において、１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７２において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１７８】
実施例７３
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は、上記実施例１において示される。
【０１７９】
１．７５Ｍのリン酸アンモニウムの例において、１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１．７５Ｍのリン酸アンモニウムの９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃６を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７３において、当該精製された結合体画分は画分Ｂに現れる。
【０１８０】
実施例７４
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は、上記実施例１において示される。
【０１８１】
７５０ｍＭのリン酸アンモニウムの例において、１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭのリン酸アンモニウムの９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７４において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１８２】
実施例７５
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−２類似体（配列番号５２）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−２類似体は、ＧＬＰ−２（１−３３）Ｇｌｙ２Ｌｙｓ３４（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
【化４７】
2007535507.tif 000051
【０１８３】
２ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成される緩衝剤の１４ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−２類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７５において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１８４】
実施例７６
ＲＳＡ：第１ＧＬＰ−２類似体（配列番号５２）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−２類似体は、ＧＬＰ−２（１−３３）Ｇｌｙ２Ｌｙｓ３４（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は、上記実施例７５に示される。
【０１８５】
９ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＲＳＡ（ラット血清アルブミン）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成される緩衝剤の１４ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−２類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７６において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
【０１８６】
本発明はそれらの特定の態様に関連して記載されるが、さらなる改良が可能であり、本出願は、一般的に、本発明の原則に加えて、本発明のいずれの変更、使用又は適応をも含むことを意図され、本発明の属する分野において知られた又は慣習的な手順に含まれるくらい近いような、及び上記の本質的特徴に適用され得るような、並びに当該添付の請求項の範囲に含まれるような本発明の開示からの出発物の如きものを含むと理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図１は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図２】図２は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＲＦ類似体（配列番号２）の精製を示す。
【図３】図３は、本発明の方法の好ましい態様による、非結合ＨＳＡの精製を示す。
【図４】図４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ｒＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図５】図５は、本発明の方法の好ましい態様による、ＨＳＡｃｏｒｔｅｘの精製を示す。
【図６】図６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：Ｋ５類似体（配列番号３）の精製を示す。
【図７】図７は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１インシュリン誘導体（配列番号４）の精製を示す。
【図８】図８は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２インシュリン誘導体（配列番号５）の精製を示す。
【図９】図９は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１Ｃ３４類似体（配列番号６）の精製を示す。
【図１０】図１０は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２Ｃ３４類似体（配列番号７）の精製を示す。
【図１１】図１１は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３Ｃ３４類似体（配列番号８）の精製を示す。
【図１２】図１２は、本発明の方法の好ましい態様によるＬ−システインの精製を示す。
【図１３】図１３は、本発明の方法の好ましい態様による、Ｌ−システイン：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図１４】図１４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ＧＬＰ−１類似体（配列番号９）の精製を示す。
【図１５】図１５は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３ＧＬＰ−１類似体（配列番号１０）の精製を示す。
【図１６】図１６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第４ＧＬＰ−１類似体（配列番号１１）の精製を示す。
【図１７】図１７は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第５ＧＬＰ−１類似体（配列番号１２）の精製を示す。
【図１８】図１８は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１エキセンディン（Ｅｘｅｎｄｉｎ）−４類似体（配列番号１３）の精製を示す。
【図１９】図１９は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２エキセンディン−４類似体（配列番号１４）の精製を示す。
【図２０】図２０は、本発明の方法の好ましい態様によるＨＳＡ：ＭＰＡの精製を示す。
【図２１】図２１は、本発明の方法の好ましい態様によるＨＳＡの精製を示す。
【図２２】図２２は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２Ｃ３４類似体（配列番号３）の精製を示す。
【図２３】図２３は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ダイノルフィンＡ類似体（配列番号１５）の精製を示す。
【図２４】図２４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＡＮＰ類似体（配列番号１６）の精製を示す。
【図２５】図２５は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ダイノルフィンＡ類似体（配列番号１７）の精製を示す。
【図２６】図２６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：ＡＣＥ阻害剤（配列番号１８）の精製を示す。
【図２７】図２７は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第６ＧＬＰ−１類似体（配列番号１９）の精製を示す。
【図２８】図２８は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第７ＧＬＰ−１類似体（配列番号２０）の精製を示す。
【図２９】図２９は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第８ＧＬＰ−１類似体（配列番号２１）の精製を示す。
【図３０】図３０は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第９ＧＬＰ−１類似体（配列番号２２）の精製を示す。
【図３１】図３１は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１０ＧＬＰ−１類似体（配列番号２３）の精製を示す。
【図３２】図３２は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１１ＧＬＰ−１類似体（配列番号２４）の精製を示す。
【図３３】図３３は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３エキセンディン−４類似体（配列番号２５）の精製を示す。
【図３４】図３４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１２ＧＬＰ−１類似体（配列番号２６）の精製を示す。
【図３５】図３５は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１インシュリン誘導体（配列番号４）の精製を示す。
【図３６】図３６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３インシュリン誘導体（配列番号２７）の精製を示す。
【図３７】図３７は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２インシュリン誘導体（配列番号５）の精製を示す。
【図３８】図３８は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第４インシュリン誘導体（配列番号２８）の精製を示す。
【図３９】図３９は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＲＦ類似体（配列番号２）の精製を示す。
【図４０】図４０は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ＧＲＦ類似体（配列番号２９）の精製を示す。
【図４１】図４１は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３ＧＲＦ類似体（配列番号３０）の精製を示す。
【図４２】図４２は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第４ＧＲＦ類似体（配列番号３１）の精製を示す。
【図４３】図４３は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１３ＧＬＰ−１類似体  ＣＪＣ  １３６５（配列番号３２）の精製を示す。
【図４４】図４４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡラクトース：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図４５】図４５は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１Ｔ２０類似体（配列番号３３）の精製を示す。
【図４６】図４６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１Ｔ１２４９類似体（配列番号３４）の精製を示す。
【図４７】図４７は、本発明の方法の好ましい態様による、化合物ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図４８】図４８は、本発明の方法の好ましい態様による、化合物ＨＳＡ：第１Ｃ３４類似体（配列番号６）の精製を示す。
【図４９】図４９は、本発明の方法の好ましい態様による、化合物ＨＳＡ：第２ＧＲＦ類似体（配列番号２９）の精製を示す。
【図５０】図５０は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：ビノレルビン類似体結合体（配列番号３５）の精製を示す。
【図５１】図５１は、本発明の方法の好ましい態様によるＬ−システインの精製を示す。
【図５２】図５２は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体Ｌ−システイン：ビノレルビン類似体（配列番号３５）の精製を示す。
【図５３】図５３は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＲＳＡ：第３エキセンディン−４類似体（配列番号２５）の精製を示す。
【図５４】図５４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第４Ｃ３４類似体（配列番号３６）の精製を示す。
【図５５】図５５は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第５Ｃ３４類似体（配列番号３７）の精製を示す。
【図５６】図５６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第６Ｃ３４類似体（配列番号３８）の精製を示す。
【図５７】図５７は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第７Ｃ３４類似体（配列番号３９）の精製を示す。
【図５８】図５８は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第８Ｃ３４類似体（配列番号４０）の精製を示す。
【図５９】図５９は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＰＹＹ類似体（配列番号４１）の精製を示す。
【図６０】図６０は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ＰＹＹ類似体（配列番号４２）の精製を示す。
【図６１】図６１は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第５インシュリン誘導体（配列番号４３）の精製を示す。
【図６２】図６２は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第６インシュリン誘導体（配列番号４４）の精製を示す。
【図６３】図６３は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第７インシュリン誘導体（配列番号４５）の精製を示す。
【図６４】図６４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３ＰＹＹ類似体（配列番号４６）の精製を示す。
【図６５】図６５は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第４ＰＹＹ類似体（配列番号４７）の精製を示す。
【図６６】図６６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第５ＰＹＹ類似体（配列番号４８）の精製を示す。
【図６７】図６７は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第６ＰＹＹ類似体（配列番号４９）の精製を示す。
【図６８】図６８は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ＡＮＰ類似体（配列番号５０）の精製を示す。
【図６９】図６９（Ａ−Ｂ）は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３ＡＮＰ類似体  ＣＪＣ  １６８１（配列番号５１）の精製を示す。
【図７０】図７０は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図７１】図７１は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図７２】図７２は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図７３】図７３は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図７４】図７４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図７５】図７５は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−２類似体（配列番号５２）の精製を示す。
【図７６】図７６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＲＳＡ：第１ＧＬＰ−２類似体（配列番号５２）の精製を示す。
【図１】
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【図２】
2007535507.tif 000053
【図３】
2007535507.tif 000054
【図４】
2007535507.tif 000055
【図５】
2007535507.tif 000056
【図６】
2007535507.tif 000057
【図７】
2007535507.tif 000058
【図８】
2007535507.tif 000059
【図９】
2007535507.tif 000060
【図１０】
2007535507.tif 000061
【図１１】
2007535507.tif 000062
【図１２】
2007535507.tif 000063
【図１３】
2007535507.tif 000064
【図１４】
2007535507.tif 000065
【図１５】
2007535507.tif 000066
【図１６】
2007535507.tif 000067
【図１７】
2007535507.tif 000068
【図１８】
2007535507.tif 000069
【図１９】
2007535507.tif 000070
【図２０】
2007535507.tif 000071
【図２１】
2007535507.tif 000072
【図２２】
2007535507.tif 000073
【図２３】
2007535507.tif 000074
【図２４】
2007535507.tif 000075
【図２５】
2007535507.tif 000076
【図２６】
2007535507.tif 000077
【図２７】
2007535507.tif 000078
【図２８】
2007535507.tif 000079
【図２９】
2007535507.tif 000080
【図３０】
2007535507.tif 000081
【図３１】
2007535507.tif 000082
【図３２】
2007535507.tif 000083
【図３３】
2007535507.tif 000084
【図３４】
2007535507.tif 000085
【図３５】
2007535507.tif 000086
【図３６】
2007535507.tif 000087
【図３７】
2007535507.tif 000088
【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
2007535507.tif 000091
【図４１】
2007535507.tif 000092
【図４２】
2007535507.tif 000093
【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
2007535507.tif 000096
【図４６】
2007535507.tif 000097
【図４７】
2007535507.tif 000098
【図４８】
2007535507.tif 000099
【図４９】
2007535507.tif 000100
【図５０】
2007535507.tif 000101
【図５１】
2007535507.tif 000102
【図５２】
2007535507.tif 000103
【図５３】
2007535507.tif 000104
【図５４】
2007535507.tif 000105
【図５５】
2007535507.tif 000106
【図５６】
2007535507.tif 000107
【図５７】
2007535507.tif 000108
【図５８】
2007535507.tif 000109
【図５９】
2007535507.tif 000110
【図６０】
2007535507.tif 000111
【図６１】
2007535507.tif 000112
【図６２】
2007535507.tif 000113
【図６３】
2007535507.tif 000114
【図６４】
2007535507.tif 000115
【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
2007535507.tif 000118
【図６８】
2007535507.tif 000119
【図６９】
2007535507.tif 000120
【図７０】
2007535507.tif 000121
【図７１】
2007535507.tif 000122
【図７２】
2007535507.tif 000123
【図７３】
2007535507.tif 000124
【図７４】
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【図７５】
2007535507.tif 000126
【図７６】
2007535507.tif 000127
【配列表】
2007535507000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月20日(2006.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミン結合体及び非結合アルブミンを含む溶液中、非結合アルブミンからアルブミン結合体を分離する方法であって、以下のステップ：
ａ）高塩分含有量をもつ水性緩衝液中で、平衡にある疎水性相互作用クロマトグラフィー充填材上に、上記溶液を充填し；
ｂ）上記充填材に低減する塩分含有量勾配を適用し；そして
ｃ）アルブミン結合体又は非結合アルブミンを含む所望の溶出内容物を回収する、
を含み、ここで前記アルブミン結合体はアルブミンのシステイン３４と共有結合を形成するためにアルブミンと反応する分子からなる、前記方法。
【請求項２】
前記アルブミン結合体が、それに共有結合するところのマイケル受容体を有する分子から成り、当該マイケル受容体がアルブミンに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結合が、前記マイケル受容体と前記アルブミンのシステイン３４との間にある、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記マイケル受容体がマレイミド基である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記マレイミド基がマレイミド−プロピオン酸（ＭＰＡ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アルブミンが、血清アルブミン、組換えアルブミン、及びゲノム源由来のアルブミンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アルブミンが、ヒトアルブミン、ラットアルブミン、マウスアルブミン、ブタアルブミン、ウシアルブミン、イヌアルブミン、及びウサギアルブミンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アルブミンが、脂肪酸、金属イオン、アルブミンに対し高親和力を有する分子、及び糖からなる群より選択される少なくとも１つで修飾される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記糖が、グルコース、ラクトース、及びマンノースからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分子が、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、有機分子、及びそれらの組合わせからなる群より選択され、ここで、ステップ（Ｃ）で回収された溶出内容物がアルブミン結合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、少なくとも５７ダルトンの分子量を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドが、ＧＬＰ−１、エキセンディン−４、ＡＮＰ、Ｋ５、ダイノルフィン、ＧＲＦ、インシュリン、ナトリウム利尿ペプチド、Ｔ−２０、Ｔ−１２４９、Ｃ−３４、ＳＣ−３５、ＰＹＹ、及びそれらの類似体からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記有機分子が、ビノレルビン、ゲムシタビン、及びパクリタキセルからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記分子が、酸感受性共有結合又は蛋白質分解的開裂の影響を受けやすいペプチド配列を介して前記アルブミンに共有結合し、それにより、前記分子とアルブミンの分離、及び細胞内への当該分子の侵入が可能となる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記疎水性相互作用クロマトグラフィー充填材が疎水性樹脂を含むカラムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記疎水性樹脂が、オクチルセファロース、フェニルセファロース、及びブチルセファロースからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記疎水性樹脂がブチルセファロースである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記塩が十分な塩析効果を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記塩が、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、及びリン酸マグネシウムからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記塩が、リン酸アンモニウム又は硫酸アンモニウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記塩が硫酸アンモニウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アルブミン結合体の分子がシステインであって、ステップ（Ｃ）で回収された溶出内容物が非結合アルブミンである、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
実施例７
ＨＳＡ：第１インシュリン誘導体（配列番号４）結合体の精製
当該第１インシュリン誘導体は、Ｂ鎖（配列番号４）のＢ１の位置上でＭＰＡ、及び天然Ａ鎖（配列番号３５）を有するヒトインシュリンである。以下の図１は、本実施例に記載される第１インシュリン誘導体、及びさらなる実施例において記載される全ての他のインシュリン誘導体を表す。図１は、全インシュリン誘導体について、Ａ鎖内におけるジスルフィド結合、及びＡ鎖とＢ鎖との間の２つのジスルフィド結合に関する情報を提供する。
【化５】
2007535507.tif 000128
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
実施例８
ＨＳＡ：第２インシュリン誘導体（配列番号５）結合体の精製
当該第２インシュリン誘導体は、Ａ鎖（配列番号５）のＡ１の位置上でＭＰＡ、及び天然Ｂ鎖（配列番号５３）を有するヒトインシュリンであり、上記実施例７における図１に表される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
実施例３５
ＨＳＡ：第１インシュリン誘導体（配列番号４）結合体の精製
当該第１インシュリン誘導体は、Ｂ鎖（配列番号４）のＢ１の位置上でＭＰＡ、及び天然Ａ鎖（配列番号３５）を有するヒトインシュリンであり、その構造を実施例７において詳述する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
実施例３６
ＨＳＡ：第３インシュリン誘導体（配列番号２７）結合体の精製
当該第３インシュリン誘導体は、Ｂ鎖（配列番号２７）のＢ１の位置上でＯＡ−ＭＰＡ、及び天然Ａ鎖（配列番号３５）を有するヒトインシュリンであり、実施例７に示される図１において表される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
実施例３７
ＨＳＡ：第２インシュリン誘導体（配列番号５）結合体の精製
当該第２インシュリン誘導体は、Ａ鎖（配列番号５）のＡ１の位置上でＭＰＡ、及び天然Ｂ鎖（配列番号５３）を有するヒトインシュリンであり、実施例７に示される図１において表される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
実施例３８
ＨＳＡ：第４インシュリン誘導体（配列番号２８）結合体の精製
当該第４インシュリン誘導体は、Ｂ鎖（配列番号２８）のＢ２９の位置上でＭＰＡ、及び天然Ａ鎖（配列番号３５）を有するヒトインシュリンであり、実施例７に示される図１において表される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
実施例６１
ＨＳＡ：第５インシュリン誘導体（配列番号４３）結合体の精製
当該第５インシュリン誘導体は、Ｂ鎖（配列番号４３）のＢ２９の位置上においてＡＥＥＡＳ−ＡＥＥＡＳ−ＭＰＡ、及び天然Ａ鎖（配列番号３５）を有するヒトインシュリンであり、上記実施例７に示される図１において表される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
実施例６２
ＨＳＡ：第６インシュリン誘導体（配列番号４４）結合体の精製
当該第６インシュリン誘導体は、Ｂ鎖（配列番号４４）のＢ１の位置上においてＡＥＥＡＳ−ＡＥＥＡＳ−ＭＰＡ、及び天然Ａ鎖（配列番号３５）を有するヒトインシュリンであり、上記実施例７に示される図１において表される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
実施例６３
ＨＳＡ：第７インシュリン誘導体（配列番号４５）結合体の精製
当該第７インシュリン誘導体は、Ｂ鎖（配列番号４５）のＢ２９の位置上においてＯＡ−ＭＰＡ、及び天然Ａ鎖（配列番号３５）を有するヒトインシュリンであり、上記実施例７に示される図１において表される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
各図は、各実施例において記載される化合物の分離／精製の本発明に関して実施されるクロマトグラフィーの連続的に溶出される画分における内容のＬＣ／ＥＭＳ検出を示す。各画分は、「好ましい態様による精製手順」において本明細書中に記載されるようなＬＣ／ＥＭＳ検出に先立ち、脱塩され、そして濃縮される。
【図１】図１は、実施例１に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図２】図２は、実施例２に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＲＦ類似体（配列番号２）の精製を示す。
【図３】図３は、実施例３に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、非結合ＨＳＡの精製を示す。
【図４】図４は、実施例４に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ｒＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図５】図５は、実施例５に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、ＨＳＡの精製を示す。
【図６】図６は、実施例６に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：Ｋ５類似体（配列番号３）の精製を示す。
【図７】図７は、実施例７に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：Ｂ鎖上に修飾を有する第１インシュリン誘導体（配列番号４）の精製を示す。
【図８】図８は、実施例８に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：Ａ鎖上に修飾を有する第２インシュリン誘導体（配列番号５）の精製を示す。
【図９】図９は、実施例９に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１Ｃ３４類似体（配列番号６）の精製を示す。
【図１０】図１０は、実施例１０に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２Ｃ３４類似体（配列番号７）の精製を示す。
【図１１】図１１は、実施例１１に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３Ｃ３４類似体（配列番号８）の精製を示す。
【図１２】図１２は、実施例１２に記載されるような本発明の方法の好ましい態様によるＬ−システインの精製を示す。
【図１３】図１３は、実施例１３に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、Ｌ−システイン：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図１４】図１４は、実施例１４に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ＧＬＰ−１類似体（配列番号９）の精製を示す。
【図１５】図１５は、実施例１５に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３ＧＬＰ−１類似体（配列番号１０）の精製を示す。
【図１６】図１６は、実施例１６に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第４ＧＬＰ−１類似体（配列番号１１）の精製を示す。
【図１７】図１７は、実施例１７に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第５ＧＬＰ−１類似体（配列番号１２）の精製を示す。
【図１８】図１８は、実施例１８に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１エキセンディン（Ｅｘｅｎｄｉｎ）−４類似体（配列番号１３）の精製を示す。
【図１９】図１９は、実施例１９に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２エキセンディン−４類似体（配列番号１４）の精製を示す。
【図２０】図２０は、実施例２０に記載されるような本発明の方法の好ましい態様によるＨＳＡ：ＭＰＡの精製を示す。
【図２１】図２１は、実施例２１に記載されるような本発明の方法の好ましい態様によるＨＳＡの精製を示す。
【図２２】図２２は、実施例２２に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２Ｃ３４類似体（配列番号３）の精製を示す。
【図２３】図２３は、実施例２３に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ダイノルフィンＡ類似体（配列番号１５）の精製を示す。
【図２４】図２４は、実施例２４に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＡＮＰ類似体（配列番号１６）の精製を示す。
【図２５】図２５は、実施例２５に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ダイノルフィンＡ類似体（配列番号１７）の精製を示す。
【図２６】図２６は、実施例２６に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：ＡＣＥ阻害剤（配列番号１８）の精製を示す。
【図２７】図２７は、実施例２７に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第６ＧＬＰ−１類似体（配列番号１９）の精製を示す。
【図２８】図２８は、実施例２８に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第７ＧＬＰ−１類似体（配列番号２０）の精製を示す。
【図２９】図２９は、実施例２９に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第８ＧＬＰ−１類似体（配列番号２１）の精製を示す。
【図３０】図３０は、実施例３０に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第９ＧＬＰ−１類似体（配列番号２２）の精製を示す。
【図３１】図３１は、実施例３１に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１０ＧＬＰ−１類似体（配列番号２３）の精製を示す。
【図３２】図３２は、実施例３２に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１１ＧＬＰ−１類似体（配列番号２４）の精製を示す。
【図３３】図３３は、実施例３３に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３エキセンディン−４類似体（配列番号２５）の精製を示す。
【図３４】図３４は、実施例３４に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１２ＧＬＰ−１類似体（配列番号２６）の精製を示す。
【図３５】図３５は、実施例３５に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：Ｂ鎖上に修飾を有する第１インシュリン誘導体（配列番号４）の精製を示す。
【図３６】図３６は、実施例３６に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：Ｂ鎖上に修飾を有する第３インシュリン誘導体（配列番号２７）の精製を示す。
【図３７】図３７は、実施例３７に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：Ａ鎖上に修飾を有する第２インシュリン誘導体（配列番号５）の精製を示す。
【図３８】図３８は、実施例３８に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：Ｂ鎖上に修飾を有する第４インシュリン誘導体（配列番号２８）の精製を示す。
【図３９】図３９は、実施例３９に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＲＦ類似体（配列番号２）の精製を示す。
【図４０】図４０は、実施例４０に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ＧＲＦ類似体（配列番号２９）の精製を示す。
【図４１】図４１は、実施例４１に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３ＧＲＦ類似体（配列番号３０）の精製を示す。
【図４２】図４２は、実施例４２に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第４ＧＲＦ類似体（配列番号３１）の精製を示す。
【図４３】図４３は、実施例４３に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１３ＧＬＰ−１類似体  ＣＪＣ  １３６５（配列番号３２）の精製を示す。
【図４４】図４４は、実施例４４に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡラクトース：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図４５】図４５は、実施例４５に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１Ｔ２０類似体（配列番号３３）の精製を示す。
【図４６】図４６は、実施例４６に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１Ｔ１２４９類似体（配列番号３４）の精製を示す。
【図４７】図４７は、実施例４７に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、化合物ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図４８】図４８は、実施例４８に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、化合物ＨＳＡ：第１Ｃ３４類似体（配列番号６）の精製を示す。
【図４９】図４９は、実施例４９に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、化合物ＨＳＡ：第２ＧＲＦ類似体（配列番号２９）の精製を示す。
【図５０】図５０は、実施例５０に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：ビノレルビン類似体結合体（配列番号３５）の精製を示す。
【図５１】図５１は、実施例５１に記載されるような本発明の方法の好ましい態様によるＬ−システインの精製を示す。
【図５２】図５２は、実施例５２に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体Ｌ−システイン：ビノレルビン類似体（配列番号３５）の精製を示す。
【図５３】図５３は、実施例５３に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＲＳＡ：第３エキセンディン−４類似体（配列番号２５）の精製を示す。
【図５４】図５４は、実施例５４に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第４Ｃ３４類似体（配列番号３６）の精製を示す。
【図５５】図５５は、実施例５５に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第５Ｃ３４類似体（配列番号３７）の精製を示す。
【図５６】図５６は、実施例５６に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第６Ｃ３４類似体（配列番号３８）の精製を示す。
【図５７】図５７は、実施例５７に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第７Ｃ３４類似体（配列番号３９）の精製を示す。
【図５８】図５８は、実施例５８に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第８Ｃ３４類似体（配列番号４０）の精製を示す。
【図５９】図５９は、実施例５９に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＰＹＹ類似体（配列番号４１）の精製を示す。
【図６０】図６０は、実施例６０に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ＰＹＹ類似体（配列番号４２）の精製を示す。
【図６１】図６１は、実施例６１に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：Ｂ鎖上に修飾を有する第５インシュリン誘導体（配列番号４３）の精製を示す。
【図６２】図６２は、実施例６２に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：Ｂ鎖上に修飾を有する第６インシュリン誘導体（配列番号４４）の精製を示す。
【図６３】図６３は、実施例６３に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：Ｂ鎖上に修飾を有する第７インシュリン誘導体（配列番号４５）の精製を示す。
【図６４】図６４は、実施例６４に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３ＰＹＹ類似体（配列番号４６）の精製を示す。
【図６５】図６５は、実施例６５に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第４ＰＹＹ類似体（配列番号４７）の精製を示す。
【図６６】図６６は、実施例６６に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第５ＰＹＹ類似体（配列番号４８）の精製を示す。
【図６７】図６７は、実施例６７に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第６ＰＹＹ類似体（配列番号４９）の精製を示す。
【図６８】図６８は、実施例６８に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ＡＮＰ類似体（配列番号５０）の精製を示す。
【図６９】図６９（Ａ−Ｂ）は、実施例６９に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３ＡＮＰ類似体  ＣＪＣ  １６８１（配列番号５１）の精製を示す。
【図７０】図７０は、実施例７０に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図７１】図７１は、実施例７１に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図７２】図７２は、実施例７２に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図７３】図７３は、実施例７３に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図７４】図７４は、実施例７４に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。
【図７５】図７５は、実施例７５に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−２類似体（配列番号５２）の精製を示す。
【図７６】図７６は、実施例７６に記載されるような本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＲＳＡ：第１ＧＬＰ−２類似体（配列番号５２）の精製を示す。
【国際調査報告】
2007535507.tif 000129
2007535507.tif 000130