(57)【要約】  本発明は、神経変性症状を処置、予防または改善する新しい治療剤を開発するのに適する遺伝子およびポリペプチド標的を開示する。本発明はまた、該症状を処置、予防または改善する方法およびそのための医薬組成物、並びに神経変性症状の処置に治療的有用性を有する化合物の同定方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性症状を処置、予防または改善する方法であって、それを必要としている対象に、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の調節因子の有効量を投与することを含む方法。
【請求項２】
該症状がアルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該調節因子が、該対象において該タンパク質の生化学的機能を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該調節因子が、該タンパク質に対する１種またはそれ以上の抗体またはそれらのフラグメントを含み、該抗体またはそれらのフラグメントが、該対象において該タンパク質の生化学的機能を阻害できる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該調節因子が、該対象において該タンパク質の生化学的機能を増強する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該調節因子が、該対象において該タンパク質の遺伝子発現を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該調節因子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、二本鎖および一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、該物質が該タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該調節因子が、該対象において該タンパク質の遺伝子発現を増強する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
神経変性症状を処置、予防または改善する方法であって、それを必要としている対象に、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の調節因子の有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項１０】
該症状がＡＤである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該調節因子が、該対象において該タンパク質の生化学的機能を阻害する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
該調節因子が、該タンパク質に対する１種またはそれ以上の抗体またはそれらのフラグメントを含み、該抗体またはそれらのフラグメントが、該タンパク質の生化学的機能を阻害できる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該調節因子が、該対象において該タンパク質の生化学的機能を増強する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
該調節因子が、該対象において該タンパク質の遺伝子発現を阻害する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
該調節因子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、二本鎖および一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、該物質が該タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該調節因子が、該対象において該タンパク質の遺伝子発現を増強する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
神経変性症状を処置、予防または改善するのに有用な調節因子を同定する方法であって、候補調節因子が表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の生化学的機能を調節する能力についてアッセイすることを含む方法。
【請求項１８】
該方法が、同定された調節因子が該症状のインビトロまたはインビボモデルで観察される病的効果を逆行させる能力についてアッセイすることをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該方法が、同定された調節因子が該症状を有する対象の臨床研究で観察される病的効果を逆行させる能力についてアッセイすることをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該症状がＡＤである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
神経変性症状を処置、予防または改善するのに有用な調節因子を同定する方法であって、候補調節因子が表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の遺伝子発現を調節する能力についてアッセイすることを含む方法。
【請求項２２】
該方法が、同定された阻害性調節因子が該症状のインビトロまたはインビボモデルで観察される病的効果を逆行させる能力についてアッセイすることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該方法が、同定された阻害性調節因子が該症状を有する対象の臨床研究で観察される病的効果を逆行させる能力についてアッセイすることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
該症状がＡＤである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
神経変性症状を処置、予防または改善するのに、それを必要としている対象において有効な量の、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の調節因子を含む医薬組成物。
【請求項２６】
該症状がＡＤである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
該調節因子が、該タンパク質の生化学的機能を阻害する、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
該調節因子が、該タンパク質に対する１種またはそれ以上の抗体またはそれらのフラグメントを含み、該抗体またはそれらのフラグメントが、該タンパク質の生化学的機能を阻害できる、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
該調節因子が、該タンパク質の生化学的機能を増強する、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
該調節因子が、該タンパク質の遺伝子発現を阻害する、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
該調節因子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、二本鎖および一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、該物質が該タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
該調節因子が、該タンパク質の遺伝子発現を増強する、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
神経変性症状を患っている、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の調節因子を用いる処置に適する候補であり得る対象の診断方法であって、該対象に由来する生物学的サンプルにおける、該タンパク質の１種またはそれ以上のｍＲＮＡレベルをアッセイすることを含み、対照と比較して変更されたレベルを有する対象は、調節因子による処置に適する候補である、方法。
【請求項３４】
神経変性症状を患っている、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の調節因子を用いる処置に適する候補であり得る対象の診断方法であって、該対象に由来する生物学的サンプルにおける、該タンパク質の１種またはそれ以上のレベルを検出することを含み、対照と比較して変更されたレベルを有する対象は、調節因子による処置に適する候補である、方法。
【請求項３５】
神経変性を処置、予防または改善する方法であって、
（ａ）対象における表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質のｍＲＮＡレベルについてアッセイすること；および、
（ｂ）対照と比較して変更されたレベルの該タンパク質のｍＲＮＡを有する対象に、該症状の病的効果を処置、予防または改善するのに十分な量で該タンパク質の調節因子を投与すること、
を含む方法。
【請求項３６】
該症状がＡＤである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
該調節因子が、該タンパク質の遺伝子発現を増強する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
該調節因子が、該タンパク質の遺伝子発現を阻害する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
神経変性症状を処置、予防または改善する方法であって、
（ａ）対象における表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質のレベルについてアッセイすること；および、
（ｂ）対照と比較して変更されたレベルの該タンパク質を有する対象に、該症状の病的効果を処置、予防または改善するのに十分な量で該タンパク質の調節因子を投与すること、
を含む方法。
【請求項４０】
該症状がＡＤである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
該調節因子が、該タンパク質の生化学的機能を増強する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
該調節因子が、該タンパク質の生化学的機能を阻害する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
生物学的サンプルにおける表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質のｍＲＮＡレベルを検出するための診断キットであって、該キットが、
（ａ）表３または３Ａに記載のポリペプチドのポリヌクレオチドまたはそれらのフラグメント；
（ｂ）（ａ）のものに相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドにコードされる、本発明の表３または３Ａのポリペプチド；
（ｄ）（ｃ）のポリペプチドに対する抗体；
（ｅ）（ａ）のものに相補的なＲＮＡｉ配列、
を含み、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）が実質的な成分を構成し得る、キット。
【請求項４４】
生物学的サンプルにおける表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質のレベルを検出するための診断キットであって、該キットが、
（ａ）表３または３Ａに記載のポリペプチドのポリヌクレオチドまたはそれらのフラグメント；
（ｂ）（ａ）のものに相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドにコードされる、本発明の表３または３Ａのポリペプチド；
（ｄ）（ｃ）のポリペプチドに対する抗体；
（ｅ）（ａ）のものに相補的なＲＮＡｉ配列、
を含み、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）が実質的な成分を構成し得る、キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、神経変性症状、特に、アルツハイマー病（ＡＤ）を含むがこれに限定されるものではない、Ａベータ（Ａβ）の異常な代謝、輸送または代謝回転に関連する症状の、発症および／または進行に関与する遺伝子に関する。本発明はまた、該神経変性症状の処置、予防または改善に有用な治療剤を開発するための薬物標的としての、該遺伝子の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ＡＤは、漸進的な認知および行動の変化および記憶喪失に至る進行性の神経変性症である。Selkoe, Physiol Rev, Vol. 81, No. 2, pp. 741-766 (2001); Selkoe and Podlisny, Annu Rev Genomics Hum Genet, Vol. 3, No. 3, pp. 67-99 (2002) 参照。家族性の形態のＡＤは、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）をコードする遺伝子の突然変異に関連付けられた。ＡＰＰの異なる切断は、Ａβ４０およびＡβ４２と呼ばれる４０または４２アミノ酸長のペプチドの産生を導く。ＡＰＰのミスセンス突然変異は、Ａβ切断部位の周囲にクラスター化しており、Ａβ−ペプチドの総産生量またはＡβ４２−／Ａβ４０−ペプチド比を高める。これらのペプチドは両方とも老人斑（ＡＤの神経病理学的特徴）の成分であるが、Ａβ４２の過剰産生は、その疎水性の性質および自己凝集特性のために、アミロイド斑形成を促す。Evin and Weidemann, Peptides, Vol. 23, No. 7, pp. 1285-1297 (2002)。
【０００３】
我々は、以前に、眼特異的ＧＭＲプロモーターを利用してアミロイド形成性Ａβ４２−ペプチドをハエの眼で過剰発現させることにより、ＡＤのハエモデルを開発した。米国特許番号ＵＳ２００２ ０１７４４４６参照。遺伝子導入ハエにおけるｐＧＭＲ−Ａβ４２コンストラクトの存在は、rough-eye 表現型をもたらす。眼の粗さ（eye roughness）は、ハエの老化に伴って段々高まり、これは、ＡＤの年齢依存性によく似ている。このハエモデルを使用して、我々はＡβ４２依存性の rough-eye 表現型のモディファイヤー（modifier）を探す遺伝学的スクリーニングを実行した。我々のスクリーニングは、ハエゲノムの様々な領域に独立の発現Ｐ（ＥＰ）エレメントの挿入を担持するハエ系統の公的に入手可能なコレクションを利用する。Rorth, Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 93, No. 22, pp. 12418-12422 (1996); Rorth et al., Development, Vol. 125, No. 6, pp. 1049-1057 (1998); および Berkley Drosophila Genome Project (BDGP) http://www.fruitfly.org/blast/参照。これらのハエ系統を作成するために使用されたＥＰエレメントは、Ｇａｌ４により活性化される上流活性化配列（ＵＡＳ）エレメントおよび最小ｈｓｐ７０−プロモーターからなる。Ｐエレメントは遺伝子の５'調節領域に挿入する傾向があるので [Liao, Rehm and Rubin, Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 97, No. 7, pp. 3347-3351 (2000）参照］、殆どのＥＰ挿入は、遺伝子を指向性異所性発現（directed mis-expression）に標的化すると期待される。従って、これらのＥＰ系統を、組織特異的Ｇａｌ４ドライバー（driver）を有するハエ系統と交配することにより、ＥＰに連鎖した遺伝子の所望の組織特異的異所性発現を達成できる。Duffy, Genesis, Vol. 34, Nos. 1 and 2, pp. 1-15 (2002）参照。ＥＰをベースとする遺伝学的スクリーニングを実行するために、我々は、我々のＡβ過剰発現ハエ系統において、eyeless Ｇａｌ４ドライバー（ｅｙＧａｌ４）［Sheng et al., Genes Dev, Vol. 11, No. 9, pp. 1122-1131 (1997); および Halder et al., Development, Vol. 125, No. 12, pp. 2181-2191 (1998）参照］を組み換え、眼におけるＥＰに連鎖した遺伝子の発現を導いた。この遺伝学的スクリーニングから、我々は、rough-eye 表現型の改変として顕在化する、Ａβ４２−ペプチドの安定性、凝集、毒性および／または分泌に影響する遺伝子の相互作用を決定できる。
【０００４】
出願人は、本明細書において、我々の遺伝子導入モデルにおいてＡβ４２−ペプチドがショウジョウバエの光受容細胞により分泌されることを示唆する、驚くべき証拠を開示する。このモデル系を使用して、出願人は、ＡＤの発症および／または進行に関与する数個の新しい遺伝子を見出し、本明細書に記載する。従って、本発明では、神経変性症状、特に、例えば、ＡＤを含むがこれに限定されるものではない、Ａβの異常な代謝、輸送または代謝回転などに関連する症状を、処置、予防または改善する治療剤を開発するための薬物標的として、これらの遺伝子およびこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質が役立ち得ることを企図している。
【０００５】
発明の要旨
本願は、ＡＤを含むがこれに限定されるものではない神経変性症状を、処置、予防または改善する新しい治療剤の開発に適する標的として、数個のショウジョウバエ遺伝子のヒトホモログを開示する。従って、ある態様では、本発明は、該症状の処置、予防または改善に有用な調節因子を同定する方法に関し、それは、
（ａ）インビトロまたはインビボで、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の生化学的機能を調節する、および／または、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する、候補調節因子の能力をアッセイすること、
（ｂ）該神経変性症状の動物モデルおよび／または該症状を有する対象の臨床研究で観察される病的効果を逆行させる、同定された調節因子の能力をアッセイすること、
を含む。
【０００６】
他の態様では、本発明は、ＡＤを含むがこれに限定されるものではない神経変性症状を処置、予防または改善する方法に関し、それは、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の調節因子の有効量を、それを必要としている対象に投与することを含み、ここで、該調節因子は、例えば、該タンパク質の生化学的機能を阻害または増強する。さらなる実施態様では、調節因子は、該タンパク質に対する抗体またはそのフラグメントを含み、ここで、該抗体は、該対象において、該タンパク質の生化学的機能を阻害できる。
【０００７】
他の実施態様では、調節因子は、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子のＲＮＡ発現を阻害または増強する。さらなる実施態様では、調節因子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、ここで、該物質は、該タンパク質をコードする遺伝子のＲＮＡ発現を阻害するように設計する。
【０００８】
他の態様では、本発明は、ＡＤを含むがこれに限定されるものではない神経変性症状を、処置、予防または改善する方法に関し、それは、それを必要としている対象に、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の調節因子の有効量を含む医薬組成物を投与することを含む。様々な実施態様で、該医薬組成物は、該タンパク質に対する抗体またはそのフラグメントを含み、ここで、該抗体は、該対象における該タンパク質の生化学的機能を阻害でき、および／または、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、ここで、該物質は、該タンパク質をコードする遺伝子のＲＮＡ発現を阻害するように設計する。ここで、１種またはそれ以上の該タンパク質の１種またはそれ以上の調節因子を同時に投与し得ることを企図している。
【０００９】
他の態様では、本発明は、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質に対する調節因子を、それを必要としている対象において、ＡＤを含むがこれに限定されるものではない神経変性症状を処置、予防または改善するのに有効な量で含む、医薬組成物に関する。ある実施態様では、該調節因子は、例えば、該タンパク質の生化学的機能を阻害または増強し得る。さらなる実施態様では、該調節因子は、該タンパク質に対する抗体またはそのフラグメントを含み、該抗体は、例えば、該タンパク質の生化学的機能を阻害できる。
【００１０】
さらなる実施態様では、該医薬組成物は、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子のＲＮＡ発現を阻害または増強し得る調節因子を含む。さらなる実施態様では、該調節因子は、該タンパク質の核酸配列に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡまたはＤＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡまたは二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、該物質は、該タンパク質をコードする遺伝子のＲＮＡ発現を阻害するように設計する。
【００１１】
他の態様では、本発明は、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の調節因子による処置に適する候補であり得る、神経変性症状を患う対象の診断方法に関し、その方法は、該対象からの生物学的サンプルにおける、１種またはそれ以上の該タンパク質のレベルを検出することを含み、対照と比較して変更されたレベルを有する対象は、調節因子による処置に適する候補である。
【００１２】
他の態様では、本発明は、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の調節因子による処置に適する候補であり得る、ＡＤを含むがこれに限定されるものではない神経変性症状を患う対象の診断方法に関し、その方法は、該対象からの生物学的サンプルにおける、１種またはそれ以上の該タンパク質のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルをアッセイすることを含み、対照と比較して変更されたレベルを有する対象は、調節因子による処置に適する候補である。
【００１３】
また他の態様では、ＡＤを含むがこれに限定されるものではない神経変性症状の処置、予防または改善する方法が提供され、それは、
（ａ）対象における表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルについてアッセイすること；および、
（ｂ）対照と比較して変更されたｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルを有する対象に、該症状を処置、予防または改善するのに十分な量で該タンパク質の調節因子を投与すること、
を含む。
【００１４】
特定の実施態様では、該調節因子は、該タンパク質の生化学的機能または該タンパク質をコードする遺伝子のＲＮＡ発現を阻害または増強する。
【００１５】
本発明のまた他の態様では、アッセイ方法および診断キットが提供され、それは、
（ａ）生物学的サンプル中の、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択される１種またはそれ以上のタンパク質のｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルの検出に必要な成分、該キットは、例えば、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択される１種またはそれ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む；および、
（ｂ）該タンパク質に相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）１種またはそれ以上の該タンパク質またはそのフラグメントに結合する抗体の、１種またはそれ以上の該タンパク質またはそのフラグメント、
を含む。
【００１６】
好ましい実施態様では、かかるキットはまた、キットの成分を使用する操作を詳述する指示書を含む。
【００１７】
本発明はまた、ＡＤを含むがこれに限定されるものではない神経変性症状の処置、予防または改善のための薬剤の製造における、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質に対する調節因子の使用に関する。ある実施態様では、該調節因子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、該物質は、該タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計する。またさらなる実施態様では、該調節因子は、該タンパク質に対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、ここで、該抗体またはそのフラグメントは、例えば、該タンパク質の生化学的機能を阻害できる。
【００１８】
本発明はまた、医薬として使用するための、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の調節因子に関する。ある実施態様では、該調節因子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、該物質は、該タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計する。またさらなる実施態様では、該調節因子は、該タンパク質に対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、該抗体またはそのフラグメントは、例えば、該タンパク質の生化学的機能を阻害できる。
【００１９】
本発明の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の説明から当業者に明らかになるであろう。しかしながら、以下の説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すものであるが、例示説明のためだけに与えられると理解すべきである。以下の説明を読むことから、そして本開示の他の部分を読むことから、開示する発明の精神および範囲の内の様々な改変および変更が当業者に容易に明らかとなるであろう。
【００２０】
図面の説明
図１は、Ａβに誘導される rough-eye 表現型のモディファイヤーを見出すための、ＥＰをベースとする遺伝学的スクリーニングに使用する典型的な親の交配を示す。ＦＭ７、ＭＫＲＳおよびＴＭ６は、Ｘ、第２および第３染色体で各々一般的に使用されるバランサー（balancer）である。
【００２１】
図２は、プレプロエンケファリンシグナル配列を有するＡβ４２の配列を示す。斜体の文字は、アミノ酸を示す。下線のない文字は、プレプロエンケファリンシグナル配列を示し、下線のある文字は、Ａβ４２の配列を示す。
【００２２】
発明の詳細な説明
本明細書で引用する全ての特許出願、特許および参照文献は、それらの全体を出典明示により本明細書の一部とする。
【００２３】
以下の説明で使用される略号には、以下が含まれる：
【表１】
2007511474.tif 000002
【００２４】
本発明の実施において、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡの多数の常套の技法が使用される。これらの技法は周知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I-III, Ausubel, Ed. (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II, Glover, Ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, Ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames and Higgins, Eds. (1985); Transcription and Translation, Hames and Higgins, Eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, Ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Meth Enzymol, Academic Press, Inc. (1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller and Calos, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1987); および Methods in Enzymology, Vols. 154 and 155, Wu and Grossman, and Wu, Eds., respectively (1987) で説明されている。周知のショウジョウバエの分子遺伝学的手法は、例えば、Drosophila, A Practical Approach, Robert, Ed., IRL Press, Washington DC (1986) に見出すことができる。
【００２５】
ハエ保存系統（flystock）の説明は、http://flybase.bio.indiana.edu の Flybase データベースに見出すことができる。
【００２６】
本明細書で言及する保存センターには、各々 Bloomington, IN および Szeged, Hungary にある、Bloomington および Szeged 保存センターが含まれる。
【００２７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ある」「ひとつの」および「その」には、文脈が明らかにそうではないと指図しない限り、複数形への言及が含まれる。従って、例えば、「その抗体」への言及は、１種またはそれ以上の抗体および当業者に知られるそれらの均等物への言及である、といったことである。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよびそれらのフラグメントまたは一部、およびゲノムまたは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡを表し、一本鎖または二本鎖であってよく、センスまたはアンチセンス鎖を表し得る。
【００２９】
用語「縮重ヌクレオチド配列」は、１種またはそれ以上の縮重コドンを（あるポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子と比較して）含むヌクレオチド配列を表す。縮重コドンは、異なるヌクレオチドの三つ組を含有するが、同じアミノ酸残基をコードする。即ち、ＧＡＵおよびＧＡＣの三つ組は、各々Ａｓｐをコードする。縮重配列に包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、いくつかの変異体アミノ酸を有し得るが、当業者は、表３または３Ａに開示されるタンパク質をコードするアミノ酸配列を参照することにより、そのような変異体配列を容易に同定できる。表３または３Ａに開示されるタンパク質の変異体は、Stemmer, Nature, Vol. 370, No. 6488, pp. 389-391 (1994); および Stemmer, Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 91, No. 22, pp. 10747-10751 (1994) により開示された通りのＤＮＡシャフリングを通じて生成できる。変異体配列は、本明細書に記載の通り、機能性について容易に試験できる。
【００３０】
「対立遺伝子変異体」は、同じ染色体の遺伝子座を占める遺伝子の２種またはそれ以上の代替的形態を表す。対立遺伝子の変異は、突然変異を通して自然に生じ、個体群内に表現型の多型をもたらし得る。遺伝子の突然変異は、サイレント（コードされるポリペプチドに変化がない）であることができ、または、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。対立遺伝子変異体の用語は、本明細書で、ある遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すのにも使用される。
【００３１】
対立遺伝子変異体は、標準的操作に従い、異なる個体に由来するｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを探索することによりクローニングできる。表３または３Ａに開示されるタンパク質およびそれらの変異体をコードするＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体は、サイレント突然変異を含有するものおよび突然変異がアミノ酸配列の変化をもたらすものを含めて、本発明の範囲内にある。
【００３２】
「スプライス変異体」は、ある遺伝子から転写されるＲＮＡの代替的形態を表す。スプライス変異は、転写されたＲＮＡ分子内の、またはあまり一般的ではないが別々に転写されたＲＮＡ分子間の、選択的スプライシング部位の使用を介して自然に生じ、同じ遺伝子から転写される数種のｍＲＮＡをもたらし得る。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。用語「スプライス変異体」は、ある遺伝子から転写されたｍＲＮＡのスプライス変異体によりコードされるタンパク質を示すのにも使用される。
【００３３】
用語「アンチセンス」は、本明細書で使用するとき、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を表す。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に相補的な核酸鎖に言及して使用される。アンチセンス分子は、関心のある遺伝子（群）をウイルスプロモーターに逆向きにライゲーションすること（これは、相補鎖の合成を可能にする）による合成を含む、任意の方法で産生し得る。一度細胞に導入されると、この転写された鎖は、その細胞により産生される天然の配列と合わさり、二本鎖を形成する。次いで、これらの二本鎖は、さらなる転写または翻訳を妨げる。名称「ネガティブ」は、アンチセンス鎖に言及して使用されるときがあり、「ポジティブ」は、センス鎖に言及して使用されるときがある。
【００３４】
「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ配列の一部に相補的であり、一般的に逆転写酵素を使用してｍＲＮＡ調製物から合成されるＤＮＡを表す。
【００３５】
本明細書で企図するとき、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡは、選択されたヌクレオチド配列が遺伝子発現の遺伝子特異的阻害をもたらすように、核酸配列に向けられる。例えば、あるヌクレオチド配列の知識は、そのｍＲＮＡに最強のハイブリダイゼーションを与えるアンチセンス分子の設計に使用し得る。同様に、リボザイムは、遺伝子の特定のヌクレオチド配列を認識してそれを切断するように合成できる。Cech, JAMA, Vol. 260, No. 20, pp. 3030-3034 (1988) 参照。遺伝子発現の標的化阻害で使用するためのかかる分子の設計のための技法は、当業者に周知である。
【００３６】
本明細書で言及される個々のタンパク質／ポリペプチドには、ヒトまたは任意の他の種に由来する、上記のいずれかの配列またはフラグメントを含有する部分的形態、アイソフォーム、変異体、前駆体、全長タンパク質、融合タンパク質を含むがこれらに限定されるものではない、これらのタンパク質の任意かつ全ての形態が含まれる。当業者には明らかであろうタンパク質ホモログまたはオルソログは、この定義に含まれる。これらのタンパク質／ポリペプチドは、得られるポリペプチドが、表３または３Ａから選択される配列の対応領域に、少なくとも８０−９０％、または他の実施態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である変異体をさらに含み得る。パーセント配列同一性は、常套法により決定される。例えば、Altschul and Erickson, Bull Math Biol, Vol. 48, Nos. 5-6, pp. 603-616 (1986); および Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 89, No. 22, pp. 10915-10919 (1992) 参照。簡単に述べると、ギャップ開口ペナルティー１０、ギャップ伸長ペナルティー１、および Henikoff および Henikoff の「BLOSUM62」スコア付け行列を使用して、２つのアミノ酸配列をアラインメントしてアラインメントスコアを最適化する。次いで、パーセント同一性を、
１［（一致する対の総数）長い配列の長さプラス２つの配列をアラインメントするために長い配列に導入されたギャップの数］ｘ１００
として算出する。
【００３７】
その用語が、例えばゲノムＤＮＡライブラリーなどの天然産生の任意の種の供給源、並びに発現システムを含む遺伝子改変された宿主細胞から単離されるか、または、例えば、自動化ペプチド合成機を使用する化学合成またはそれらの方法の組合せにより産生されるタンパク質を表すことも企図する。かかるポリペプチドを単離および調製する手段は、当分野でよく理解されている。
【００３８】
用語「サンプル」は、本明細書で使用するとき、その最も広い意味で使用する。対象由来の生物学的サンプルには、それを用いてタンパク質活性または遺伝子発現をアッセイし得る、血液、尿、脳組織、初代細胞株、不死化細胞株または他の生物学的物質が含まれる。生物学的サンプルには、例えば、例えば、Affymetrix チップなどの常套のガラスチップマイクロアレイ技術、ＲＴ−ＰＣＲまたは他の常套法を使用する遺伝子発現プロファイリングのために、それから総ＲＮＡを精製し得る血液、腫瘍または他の試料が含まれ得る。
【００３９】
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、そのままの分子、並びに、エピトープ決定因子に結合する能力のあるＦａ、Ｆ（ａｂ'）２およびＦｖなどのそれらのフラグメントを表す。特異的ポリペプチドに結合する抗体は、関心のあるそのままのポリペプチドまたは小さいペプチドを含有するフラグメントを免疫化抗原として使用して、調製できる。動物を免疫化するのに使用するポリペプチドまたはペプチドは、ＲＮＡの翻訳に由来できるか、または化学的に合成でき、キャリアータンパク質にコンジュゲートできる。ペプチドに化学的に結合する一般的に使用されるキャリアーには、ウシ血清アルブミンおよびチログロブリンが含まれる。次いで、結合したペプチドを、動物、例えば、マウス、ヤギ、ニワトリ、ラットまたはウサギを免疫化するのに使用する。
【００４０】
用語「ヒト化抗体」は、本明細書で使用するとき、ヒト抗体により近く似せるために非抗原結合領域でアミノ酸が置き換えられているが、依然として元の結合能力を保持している抗体分子を表す。
【００４１】
「治療的有効量」は、神経変性症状、特に、ＡＤを含むがこれに限定されるものではない、Ａβの異常な代謝、輸送または代謝回転に関連する症状を処置、予防または改善するのに十分な薬物の量である。
【００４２】
「遺伝子導入」生物は、本明細書で使用するとき、そのゲノムに挿入された余分の遺伝物質を有する生物を表す。本明細書で使用するとき、「遺伝子導入ハエ」には、それらのゲノムにランダムに挿入された同じまたは他の生物由来のＤＮＡ配列を含有するショウジョウバエの、胚、幼虫および成虫の形態が含まれる。キイロショウジョウバエが好ましいが、ショウジョウバエ属の任意のハエを本発明で使用し得ると企図している。
【００４３】
本明細書で使用するとき、用語「Ａβ」は、βおよびガンマ（γ）セクレターゼによるＡＰＰのタンパク質分解切断により産生される短い（４２アミノ酸）ペプチドであるベータ−（β−）アミロイドペプチドを表す。それは、アミロイド沈着の主成分、ＡＤの特徴並びに神経細胞の死および変性の原因である。Ａβ４２は、本明細書で配列番号１として提供される（図２参照）。
【００４４】
その用語が本明細書で使用されるとき、「rough-eye」表現型は、個眼および個眼間の剛毛（inter-ommatidial bristle）の組織崩壊を特徴とし、神経細胞の変性により引き起こされ得る。
【００４５】
本明細書で使用するとき、導入遺伝子の「異所」発現は、それが正常には発現されない組織もしくは細胞または特定の発生段階における、導入遺伝子の発現を表す。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「表現型」は、遺伝子構成および環境の影響により決定される、生物の観察可能な生理的または生化学的特徴を表す。
【００４７】
本明細書で使用するとき、「神経変性症状」には、例えば、ＡＰＰ経路の調節の誤りに起因する、神経系の進行性の悪化に関連する症状、特に、例えば、ＡＤを含むがこれに限定されるものではない、Ａβの異常な代謝、輸送または代謝回転に関わる症状が含まれる。
【００４８】
用語「転写因子」は、真核生物で転写を開始または調節するのに必要とされるいかなるタンパク質をも表す。例えば、眼特異的プロモーターＧＭＲは、眼特異的転写因子、ＧＬＡＳＳの結合部位である。Moses and Rubin, Genes Dev, Vol. 5, No. 4, pp. 583-593 (1991) 参照。
【００４９】
「ＵＡＳ領域」は、本明細書で使用するとき、Ｇａｌ４転写活性化因子により認識されるＵＡＳを表す。
【００５０】
本明細書で使用するとき、「対照ハエ」は、対照幼虫またはハエが、表現型の変化について試験されている突然変異を担持しないことを除き、本発明の方法で使用する幼虫またはハエと同じ遺伝子型である、幼虫またはハエを表す。
【００５１】
本明細書で使用するとき、「形質転換ベクター」は、生物のゲノムにおけるＤＮＡ断片の挿入を媒介するために転位性エレメント技法で使用される、改変された転位性のエレメントであり、当業者になじみ深い。
【００５２】
本明細書で使用するとき「ｍＲＮＡの転写の上昇」は、対照レベルと比較して、タンパク質、例えば表３または３Ａに記載のヒトタンパク質をコードする天然の内在性遺伝子から転写される、より多い量のｍＲＮＡを表す。タンパク質、例えば表３または３Ａに開示のヒトタンパク質のｍＲＮＡレベルの上昇は、神経変性症状を患っている個体の組織または細胞で、該症状を患っていない対象のレベルと比較して、存在し得る。特に、該症状を患っている対象におけるレベルは、該症状を患っていないヒトにおける対応組織で見出されるｍＲＮＡの量の少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、最も好ましくは少なくとも約１００倍であり得る。かかるｍＲＮＡレベルの上昇は、最終的には、健康な個体におけるレベルと比較して、該症状を患っている個体におけるそのようなｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質レベルの上昇を導く。
【００５３】
本明細書で使用するとき、「ショウジョウバエ形質転換ベクター」は、転位性エレメント配列を含有し、生物のゲノムにおけるＤＮＡ断片の挿入を媒介できる、ＤＮＡプラスミドである。この技術は、当業者になじみ深い。
【００５４】
遺伝子導入ショウジョウバエを含む、遺伝子導入生物を得る方法は、当業者に周知である。例えば、Ｐ−エレメント媒介形質転換ために一般的に使用される参考文献は、Spradling, Drosophila: A practical approach, Roberts, Ed., pp. 175-197, IRL Press, Oxford, UK (1986) である。ＥＰエレメント技術は、酵母Ｇａｌ４転写活性化因子を利用する二成分系を表し、内在性ショウジョウバエ遺伝子の転写を異所性に調節するために使用される。この技術は、Brand and Perrimon, Development, Vol. 118, No. 2, pp. 401-415 (1993); および前出の Rorth (1998) に記載されている。
【００５５】
「宿主細胞」は、本明細書で使用するとき、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染などの任意の手段により細胞に導入された異種ＤＮＡを含有する、原核生物または真核生物の細胞を表す。
【００５６】
「異種」は、本明細書で使用するとき、「異なる天然の起源の」を意味するか、または、非天然状態を表す。例えば、宿主細胞が、他の生物に由来するＤＮＡまたは遺伝子、特に他の種からのもの、で形質転換される場合、その遺伝子は、その宿主細胞に関して異種であり、その遺伝子を担持する宿主細胞の子孫に関してもそうである。同様に、異種は、同じ天然の元の細胞タイプに由来し、それに導入されるが、非天然状態で、例えば異なるコピー数または異なる調節エレメントの制御下で存在する、ヌクレオチド配列を表す。
【００５７】
「ベクター」分子は、それに異種核酸を挿入し得、次いで適切な宿主細胞に導入できる核酸分子である。ベクターは、好ましくは、１つまたはそれ以上の複製開始点および組換えＤＮＡを挿入できる１つまたはそれ以上の部位を有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞を有さない細胞から選択できる好都合な手段を有し、例えば、それらは薬物耐性遺伝子をコードする。一般的なベクターには、プラスミド、ウイルスゲノムおよび（主として酵母および細菌で）「人工染色体」が含まれる。
【００５８】
「プラスミド」は、一般的に、当業者になじみ深い標準的命名規則に従い、本明細書において、小文字ｐで始め、および／または大文字および／または数字を続けて表記される。本明細書で開示される出発プラスミドは、購入できるか、規制されていない基盤で公的に入手できるか、または、入手可能なプラスミドから周知の公表された操作の日常的な適用により構築できる。本発明に従い使用できる多数のプラスミドおよび他のクローニングおよび発現ベクターは、当業者に周知であり、容易に入手できる。さらに、当業者は、本発明における使用に適する他のプラスミドをいくつでも容易に構築し得る。本発明におけるかかるプラスミドの特性、構築および使用並びに他のベクターは、本開示から当業者に容易に明らかであろう。
【００５９】
用語「単離」は、物質がその元の環境から、例えば、天然産生であるならば、天然の環境から、取り出されることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然産生ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然のシステムで共に存在している物質のいくつかまたは全てから分離されると、たとえ後に天然のシステムに再導入されても、単離されている。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部であってよく、かつ／または、かかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であってよく、そして、かかるベクターまたは組成物が天然の環境の一部ではないという点で、依然として単離されている。
【００６０】
本明細書で使用するとき、用語「転写制御配列」または「発現制御配列」は、それらが機能し得るように連結している、タンパク質をコードする核酸配列の転写を誘導するか、抑制するか、または他のやり方で制御する、イニシエーター配列、エンハンサー配列およびプロモーター配列などのＤＮＡ配列を表す。それらは、組織特異的かつ発生段階特異的であり得る。
【００６１】
「ヒト転写制御配列」は、各々のヒト染色体において見出されるように、本発明の表３または３Ａに記載のポリペプチドをコードするヒト遺伝子に伴って通常見出される転写制御配列である。
【００６２】
「非ヒト転写制御配列」は、ヒトゲノム中に見出されない、任意の転写制御配列である。
【００６３】
用語「ポリペプチド」は、本明細書において、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」と互換的に使用される。
【００６４】
本発明の表３または３Ａに記載のタンパク質の化学的誘導体は、通常はその分子の一部ではない、さらなる化学的部分を含有するポリペプチドである。そのような部分は、分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改良し得る。あるいは、その部分は、分子の毒性を低減し、その分子の望まれない副作用を排除するか、または減弱する、などである。そのような効果を媒介する能力のある部分は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980) に開示されている。
【００６５】
表３または３Ａに記載のタンパク質またはそれらの変異体を「調節」する物質、即ち、「表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の調節因子」の能力には、該タンパク質および／またはそれらの変異体の活性を阻害または増強する、かつ／または該タンパク質または変異体をコードする遺伝子のＲＮＡ発現を阻害または増強する物質の能力が含まれるが、これらに限定されるものではない。かかる調節は、該タンパク質と相互作用する他のタンパク質、例えば、関連調節タンパク質または該タンパク質により改変されるタンパク質の能力に影響を与えることも含み得る。
【００６６】
用語「アゴニスト」は、本明細書で使用するとき、直接または間接に、ポリペプチド、例えば表３または３Ａに記載のポリペプチドまたはそれらの変異体を調節し得、該ポリペプチドの生物学的活性を高める分子、即ち、調節因子を表す。アゴニストには、タンパク質、核酸、炭水化物または他の分子が含まれ得る。遺伝子の転写またはタンパク質の生化学的機能を増強する調節因子は、各々、転写を高めるか、または、該タンパク質の生物学的特性または活性を刺激するものである。
【００６７】
用語「アンタゴニスト」または「阻害因子」は、本明細書で使用するとき、直接または間接にポリペプチドまたはそれらの変異体、例えば表３または３Ａに記載のポリペプチドを調節し得る、該ポリペプチドの生物学的活性を妨害または阻害する分子、即ち、調節因子を表す。アンタゴニストおよび阻害因子には、タンパク質、核酸、炭水化物または他の分子が含まれ得る。遺伝子の転写またはタンパク質の生化学的機能を阻害する調節因子は、各々、遺伝子発現または該タンパク質の生物学的活性を低減させるものである。
【００６８】
本明細書で一般的に言及するとき、「表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質または遺伝子」は、それらのタンパク質または遺伝子のヒト形態を表す。記載したレベルより低い表３または３Ａのタンパク質に対する配列同一性を含有し、スプライスまたは対立遺伝子変異体として生じるポリペプチド（またはそれらのポリペプチドをコードする核酸）、または、重要でない欠失により、保存的アミノ酸置換により、縮重コドンの置換により、改変されたものなども、本発明の範囲内に包含されると認識される。様々な既知のアルゴリズムが当分野で知られており、公的に開示され、相同性をベースとする類似性探索を実行するための様々な購入できるソフトウェアが入手可能であり、本明細書で開示するタンパク質の変異体の同定に使用できる。かかるソフトウェアの例には、FASTA (GCG Wisconsin Package)、Bic_SW (Compugen Bioccelerator)、BLASTN2、BLASTP2、BLASTD2 (NCBI) および Motifs (GCG) が含まれる。適するソフトウェアプログラムは、例えば、 Guide to Human Genome Computing, 2nd edition, Bishop, Ed., Academic Press, San Diego, CA (1998); および The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research, American Society for Microbiology, Peruski, Jr. and Harwood Peruski, Eds., Washington, DC (1997) に記載されている。
【００６９】
「神経変性症状、特にＡβの異常な代謝、輸送または代謝回転などに関連する症状のインビボモデル」には、当業者になじみ深いＡＤなどの神経変性症のインビボモデルが含まれる。かかるインビボモデルには、例えば、ＷＯ９４／００５６９に開示のＡＤのマウスモデルが含まれる。加えて、例えばそれらの細胞株を含む、多数の細胞株を、ＡＤのインビトロモデルとして使用し得、当業者になじみ深い。Xia et al., PNAS USA, Vol. 94, No. 15, pp. 8208-8213 (1997）参照。
【００７０】
本発明の遺伝子は、そのゲノムがＡβをコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子導入ハエ、キイロショウジョウバエ、を使用して同定された。従来の発現制御システムを使用して、Ａβペプチドを含む関心のあるタンパク質の異所性発現を達成し得る。かかる発現は、生化学的経路の崩壊および変更された表現型の発生をもたらし得る。あるそのような発現制御システムは、組織特異的に発現される遺伝子の発現制御配列、例えばプロモーターまたはエンハンサー、へのＤＮＡ配列の直接的融合を含む。使用し得る組織特異的発現制御システムは、二成分性Ｇａｌ４転写活性化システムである。前出の Brand and Perrimon (1993)参照。
【００７１】
Ｇａｌ４システムは、関心のある遺伝子の発現を組織特異的なやり方で駆動するために、酵母転写活性化因子Ｇａｌ４を使用する。Ｇａｌ４遺伝子は、時期および組織特異的なやり方で発現を駆動するゲノムのエンハンサーの制御下にくるように、常套の形質転換システムを使用してハエゲノムにランダムに挿入された。「ドライバー」と呼ばれる、これらの挿入を担持する個々のハエ系統が確立された。前出の Brand and Perrimon (1993) 参照。
【００７２】
Ｇａｌ４システムでは、関心のある遺伝子を、その転写がＵＡＳおよびＧａｌ４応答エレメントの制御下にあるように、形質転換ベクターにクローニングする。関心のある配列のＵＡＳ遺伝子を担持するハエ系統を、組織特異的エンハンサーの制御下でＧａｌ４遺伝子を発現するハエ系統と交配すると、その遺伝子は組織特異的なパターンで発現される。
【００７３】
成虫組織で容易に目に見え、従って遺伝学的スクリーニングで使用できる表現型を生じさせるために、ハエ発生の後期段階で発現を駆動するＧａｌ４「ドライバー」を本発明で使用し得る。これらのドライバーを使用すると、発現は、羽、目、脚、様々な感覚器および脳に起こりえる欠陥をもたらすであろう。これらの「ドライバー」には、例えば、apterous-Gal4 (羽)、elav-Gal4 (CNS)、sevenless-Gal4、eyGal4 および pGMR-Gal4 （目）が含まれる。Ｇａｌ４株の説明およびそれらの特異的発現パターンについての注釈は、Flybase (http://flybase.bio.indiana.edu）で入手できる。
【００７４】
遺伝子導入キイロショウジョウバエを生成させるために、様々なＤＮＡコンストラクトを使用し得る。例えば、コンストラクトは、転写領域の上流にＵＡＳを置くｐＵＡＳＴベクターにクローニングされたＡβ−配列を含有し得る［前出の Brand and Perrimon (1993)参照］。これらのコンストラクトのハエゲノムへの挿入は、Ｐ−エレメント組換え、Ｈｏｂｏエレメント組換え［Blackman et al., EMBO J, Vol. 8, No. 1, pp. 211-217 (1989）参照］、相同組換え［Rong and Golic, Science, Vol. 288, No. 5473, pp. 2013-2018 (2000) 参照] または当業者に知られている他の標準的技法を通して起こり得る。
【００７５】
上記で論じたように、異所性に発現される遺伝子は、特定の生化学的経路の崩壊により、変更された表現型をもたらし得る。同じ生化学的経路で作用する遺伝子の突然変異は、変更された表現型の改変を引き起こすと期待される。従って、Ａβ４２配列を担持する遺伝子導入ハエを使用して、この遺伝子導入ハエを、既知または予測された遺伝子に突然変異を含有するハエと交配し、交配の子孫を、Ａβ４２遺伝子導入ハエの「rough-eye」表現型に対照と比較して定量的または定性的な改変を示すハエについてスクリーニングすることにより、神経変性症状、例えばＡＤなどの、Ａβの異常な代謝、輸送または代謝回転に関連する症状の発症および／または進行に関与する遺伝子を同定する。
【００７６】
このシステムは、Ａβ遺伝子産物の機能の解明並びにそれらと直接または間接に相互作用する他の遺伝子の同定に極めて有益である。スクリーニングできる突然変異には、その挿入の近傍で遺伝子の異所性発現を活性化できるＧａｌ４誘導可能コンストラクトをショウジョウバエゲノムにランダムに挿入することにより生成される、既知遺伝子の機能喪失型対立遺伝子、欠失系統、Ｐ−エレメントにより生成される「エンハンサートラップ」系統および機能獲得型突然変異が含まれるが、これらに限定されるものではない。このようにして、神経変性症状の発症および／または進行に関与する遺伝子を同定でき、これらの遺伝子およびこれらの遺伝子にコードされるポリペプチドは、かかる症状を処置する治療剤の開発の標的として役立つことができる。
【００７７】
本明細書で開示される標的ポリペプチドのヒトホモログの核酸分子は、例えば、標的遺伝子の調節において有用な標的遺伝子のアンチセンス分子として、および／または標的遺伝子の核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして、作用し得る。さらに、かかる配列は、遺伝子調節のために用いられ得る、リボザイムおよび／または三重らせん配列の一部として、または、ｓｉＲＮＡまたは二本鎖または一本鎖ＲＮＡの標的として、使用し得る。なお、さらに、かかる分子は、本明細書で開示される診断キットの成分として使用し得る。
【００７８】
同定された遺伝子が正常または野生型遺伝子である場合、この遺伝子を使用して、この遺伝子の突然変異型対立遺伝子を単離し得る。かかる単離は、遺伝的基礎を有すると知られているか、または疑われる過程および障害において好ましい。突然変異型対立遺伝子は、ＡＤを含むがこれに限定されるものではない神経変性症状に関連する症状に寄与する遺伝子型を有すると知られているか、または疑われる個体から単離し得る。次いで、突然変異型対立遺伝子および突然変異型対立遺伝子の産物を、本明細書に記載の診断アッセイシステムで利用し得る。
【００７９】
突然変異遺伝子のｃＤＮＡを、例えば当業者に周知の技法であるＰＣＲを使用して単離し得る。この場合、オリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドを、突然変異型対立遺伝子を担持すると推定される個体で発現されると知られているか、または疑われる、組織から単離したｍＲＮＡにハイブリダイズさせ、そして逆転写酵素で新しい鎖を伸長させることにより、第１のｃＤＮＡ鎖を合成し得る。次いで、第２の相補鎖（ｃＤＮＡ）を、正常な遺伝子の５'末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用して合成する。次いで、当業者に周知の方法を介し、これらの２つのプライマーを使用して、ＰＣＲを介して産物を増幅し、適するベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析に付す。突然変異遺伝子のＤＮＡ配列を正常な遺伝子のものと比較することにより、突然変異型遺伝子産物の機能の喪失または変更を担う突然変異（群）を確認できる。
【００８０】
あるいは、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーは、突然変異型対立遺伝子を担持すると疑われるか、または知られている個体の、関心のある遺伝子を発現していると知られているか、または疑われる組織からの、各々ＤＮＡまたはＲＮＡを使用して、構築およびスクリーニングできる。次いで、正常な遺伝子またはそれらの任意の適するフラグメントを標識化し、ライブラリー中の対応する突然変異型対立遺伝子を同定するプローブとして使用し得る。次いで、この遺伝子を含有するクローンを、当分野で日常的に行われる方法を介して精製し、上記の通りに配列分析に付し得る。
【００８１】
加えて、突然変異型対立遺伝子を担持すると疑われるか、または知られている個体の、関心のある遺伝子を発現すると知られているか、または疑われる組織から単離されたＤＮＡまたは合成されたｃＤＮＡを利用して、発現ライブラリーを構築できる。このようにして、推定的突然変異組織により作成される遺伝子産物を発現させ、下記の通り、正常遺伝子産物に対して生じさせた抗体と併せて標準的抗体スクリーニング技法を使用して、スクリーニングし得る。スクリーニング技法について、例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Eds., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1988）参照。突然変異が、例えばミスセンス突然変異の結果として、変更された機能の遺伝子産物の発現をもたらす場合、ポリクローナルのセットの抗体は、突然変異遺伝子産物と交差反応する可能性が高い。かかる標識化抗体との反応により検出されるライブラリーのクローンを、上記の通り、精製でき、配列分析に付すことができる。
【００８２】
他の実施態様では、表３または３Ａに記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸またはそれらの機能的誘導体を、正常な生物学的機能、例えば正常なＡβ代謝回転、を促進するために、遺伝子治療のやり方で投与し得る。遺伝子治療は、対象への核酸の投与により実施される治療を表す。本発明のこの実施態様では、核酸は、それがコードするタンパク質を産生し、それは、例えば正常なＡβ代謝回転を促進することにより、治療効果を媒介する。
【００８３】
当分野で利用可能な任意の遺伝子治療法を、本発明に従い使用できる。例示的方法を後述する。
【００８４】
好ましい態様では、治療剤は、表３または３Ａのポリペプチドの核酸を含み、それは、表３または３Ａのタンパク質、それらのフラグメントまたはキメラタンパク質およびそれらの変異体を適する宿主で発現する発現ベクターの一部である。特に、かかる核酸は、表３または３Ａタンパク質のコード領域に機能し得るように連結したプロモーターを有し、該プロモーターは、誘導可能または構成的であり、場合により組織特異的である。他の特定の実施態様では、表３または３Ａのタンパク質のコード配列および任意の他の所望の配列が、ゲノム中の所望の部位で相同組換えを促進する領域に隣接している核酸分子を使用し、かくして表３または３Ａの核酸の染色体内発現をもたらす。Koller and Smithies, Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 86, No. 22, pp. 8932-8935 (1989); および Zijlstra et al., Nature, Vol. 342, No. 6248, pp. 435-438 (1989) 参照。
【００８５】
患者への核酸の送達は、直接（その場合、患者は直接的に核酸または核酸担持ベクターに曝される）であっても、または、間接（その場合、その核酸を用いて細胞を最初にインビトロで形質転換し、次いで患者に移植する）であってもよい。これらの２つのアプローチは、各々インビボまたはエクスビボの遺伝子治療として知られている。
【００８６】
特別な実施態様では、核酸を、それが発現されてコードする産物を産生する場所に、インビボで直接投与する。これは、当分野で知られている多数の方法により達成でき、例えば、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、細胞内に行くように投与することにより、例えば、欠損または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクターを使用する感染により（例えば、米国特許第４,９８０,２８６号および下記で言及する他のもの参照）、または、裸のＤＮＡの直接注入により、または、微小粒子銃、例えば遺伝子銃；Biolistic, Dupont の使用、または、脂質または細胞表面受容体または形質移入物質による被覆、リポソーム、微小粒子または微小カプセル中でのカプセル化、核に入ると知られているペプチドに連結して投与することにより、受容体媒介エンドサイトーシスに付されるリガンドに連結して投与する（その受容体を特異的に発現する細胞タイプを標的化するのに使用できる）ことによる（例えば、米国特許番号５,１６６,３２０；５,７２８,３９９；５,８７４,２９７および６,０３０,９５４、これらは全て、出典明示により全体を本明細書の一部とする）。他の実施態様では、エンドソーム乱すためにリガンドが融合性ウイルスペプチドを含む核酸−リガンド複合体を形成でき、核酸がリソソームで分解されるのを回避できるようにする。なお他の実施態様では、特異的受容体を標的化することにより、核酸をインビボで細胞特異的取込みおよび発現に標的化できる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１８０；ＷＯ９２／２２６３５；ＷＯ９２／２０３１６；ＷＯ９３／１４１８８およびＷＯ９３／２０２２１参照。あるいは、核酸を細胞内に導入でき、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に相同組換えにより組み込むことができる。例えば、米国特許番号５,４１３,９２３；５,４１６,２６０および５,５７４,２０５；および前出の Zijlstra et al. (1989) 参照。
【００８７】
特異的実施態様では、表３または３Ａのポリペプチドをコードする核酸を含有するウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターを使用できる。例えば、米国特許番号５,２１９,７４０；５,６０４,０９０および５,８３４,１８２参照。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みに必要でないレトロウイルス配列を欠失するように改変されている。遺伝子治療に使用すべき表３または３Ａのポリペプチドの核酸を、そのベクターにクローニングする。このことは、患者への遺伝子の送達を助長する。
【００８８】
アデノウイルスは、遺伝子治療で使用できる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、遺伝子を呼吸器上皮に送達するためにことさら魅力的な媒体である。アデノウイルスは、自然に呼吸器上皮に感染し、そこで穏やかな疾患を引き起こす。アデノウイルスをベースとする送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、分裂していない細胞に感染する能力を有するという利点を有する。アデノウイルスをベースとする遺伝子治療を実行する方法は、例えば、米国特許番号５,８２４,５４４；５,８６８,０４０；５,８７１,７２２；５,８８０,１０２；５,８８２,８７７；５,８８５,８０８；５,９３２,２１０；５,９８１,２２５；５,９９４,１０６；５,９９４,１３２；５,９９４,１３４；６,００１,５５７および６,０３３,８８４３に記載されており、これらは全て、出典明示により全体を本明細書の一部とする。
【００８９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も、遺伝子治療での使用のために提唱された。ＡＡＶを産生および利用する方法は、例えば、米国特許番号５,１７３,４１４；５,２５２,４７９；５,５５２,３１１；５,６５８,７８５；５,７６３,４１６；５,７７３,２８９；５,８４３,７４２；５,８６９,０４０；５,９４２,４９６および５,９４８,６７５に記載されており、これらは全て、出典明示により全体を本明細書の一部とする。
【００９０】
遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介遺伝子移入またはウイルス感染などの方法により、遺伝子を組織培養の細胞に移行させることを含む。通常、移行方法には、選択可能なマーカーを細胞に移行させることが含まれる。次いで、移行された遺伝子を取込み、発現している細胞を単離するために、細胞を選択下に置く。次いで、これらの細胞を患者に送達する。
【００９１】
得られる組換え細胞を、当分野で知られている様々な方法により患者に送達できる。好ましい実施態様では、例えば皮下に、上皮細胞を注入する。他の実施態様では、組換え皮膚細胞を皮膚移植片として患者に適用し得る。組換え血液細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞を、好ましく静脈内投与する。使用を想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などによって変わり、当業者により決定できる。
【００９２】
遺伝子治療のために核酸を導入できる細胞には、任意の所望の入手できる細胞タイプが包含され、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；様々な幹細胞または前駆細胞、特に、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓から得られるような、造血幹細胞または前駆細胞、などが含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００９３】
好ましい実施態様では、遺伝子治療に使用される細胞は、患者にとって自家のものである。
【００９４】
組換え細胞を遺伝子治療に使用するある実施態様では、表３または３Ａに記載のポリペプチドの核酸を、それが細胞またはそれらの子孫により発現可能なように細胞に導入し、次いで、組換え細胞を治療効果のためにインビボで投与する。特別な実施態様では、幹細胞または前駆細胞を使用する。インビトロで単離および維持できる任意の幹細胞および／または前駆細胞を、本発明のこの実施態様に従い潜在的に使用できる。かかる幹細胞には、造血幹細胞（ＨＳＣ）、皮膚および腸の内張などの上皮組織の幹細胞、胚性心筋細胞、肝臓幹細胞（例えば、ＷＯ９４／０８５９８参照）および神経幹細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。Stemple and Anderson, Cell, Vol. 71, No. 6, pp. 973-985 (1992) 参照。
【００９５】
上皮幹細胞（ＥＳＣ）またはケラチノサイトは、皮膚および腸の内張などの組織から、既知の操作により得ることができる。Rheinwald, Methods Cell Biol, Vol. 21A, pp. 229-254 (1980) 参照。皮膚などの重層化した上皮組織では、基底層に最も近い層である胚層内で幹細胞の有糸分裂による再生が起こる。腸の内張の中の幹細胞は、この組織に高速の再生速度をもたらす。患者またはドナーの皮膚または腸の内張から得られるＥＳＣまたはケラチノサイトは、組織培養で生育できる。Pittelkow and Scott, Mayo Clin Proc, Vol. 61, No. 10, pp. 771-777 (1986) 参照。ＥＳＣがドナーにより提供される場合、宿主対移植片の反応性を抑制する方法、例えば、適度な免疫抑制を促進する、照射、薬物または抗体の投与も使用できる。
【００９６】
ＨＳＣに関し、インビトロでのＨＳＣの単離、増殖および維持をもたらす任意の技法を、本発明のこの実施態様で使用できる。これを達成し得る技法には：
（ａ）将来の宿主またはドナーから単離された骨髄細胞からのＨＳＣ培養物の単離および樹立；または、
（ｂ）同種または異種であり得る過去に樹立された長期ＨＳＣ培養物の使用、
が含まれ得る。
【００９７】
非自家ＨＳＣは、好ましくは、将来の宿主／患者の移植免疫反応を抑制する方法と併せて使用する。本発明の特定の実施態様では、後腸骨稜から、穿刺吸引によりヒト骨髄細胞を得ることができる。例えば、Kodo, Gale and Saxon, J Clin Invest, Vol. 73, No. 5, pp. 1377-1384 (1984) 参照。本発明の好ましい実施態様では、ＨＳＣを、高度に濃縮するか、または実質的に純粋な形態にすることができる。この濃縮は、長期培養の前、中または後に達成でき、当分野で知られている任意の技法により行うことができる。骨髄細胞の長期培養は、例えば、改良した Dexter の細胞培養技法［参照 Dexter et al., J Cell Physiol, Vol. 91, No. 3, pp. 335-344 (1977)] または Witlock-Witte の培養技法を使用して、樹立および維持できる。Witlock and Witte, Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 79, No. 11, pp. 3608-3612 (1982) 参照。
【００９８】
特別な実施態様では、遺伝子治療のために導入される核酸は、核酸の発現が適切な転写誘導因子の有無を制御することにより制御可能であるように、コード領域に機能し得るように連結した誘導可能プロモーターを含む。
【００９９】
本発明のさらなる実施態様は、ＡＤを含むがこれに限定されるものではない神経変性症状を処置、予防または改善する方法に関し、それは、それを必要としている対象に、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質および／またはそれらの変異体の調節因子の有効量を投与することを含む。ある実施態様では、調節因子は、該タンパク質、変異体に対する１種またはそれ以上の抗体またはそれらのフラグメントを含み、該抗体またはそれらのフラグメントは、該対象において該タンパク質または変異体の生化学的機能を阻害できる。
【０１００】
本明細書で記載するのは、１種またはそれ以上の異なって発現される遺伝子のエピトープを特異的に認識する能力のある抗体の産生方法である。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。そのような抗体は、例えば、生物学的サンプル中の標的タンパク質の検出において、あるいは、タンパク質の生化学的機能の阻害方法として、使用し得る。従って、そのような抗体は、疾患の処置方法の一部として利用し得、かつ／または、例えば表３または３Ａに記載のポリペプチドの異常なレベルについて、またはこれらのポリペプチドの異常な形態の存在について、患者を試験し得る診断技法の一部として使用し得る。
【０１０１】
表３または３Ａのポリペプチドまたはそれらの変異体に対する抗体を産生するために、これらのポリペプチドまたはそれらの一部の注射により、様々な宿主動物を免疫し得る。そのような宿主動物には、いくつかを挙げると、ウサギ、マウス、ヤギ、ニワトリおよびラットが含まれ得るがこれらに限定されるものではない。免疫反応を高めるために、宿主の種に応じて、様々なアジュバントを使用し得、これには、フロイント（完全および不完全）；水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル；リゾレシチン、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油乳液、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールなどの界面活性物質；およびカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）およびコリネバクテリウム・パルバムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物またはそれらの抗原性機能的誘導体などの、抗原で免疫された動物の血清に由来する不均一な抗体分子の集団である。ポリクローナル抗体の産生のために、上記のものなどの宿主動物を、また上記の通りのアジュバントを添加された表３または３Ａのポリペプチドまたはそれらの一部の注射により、免疫し得る。
【０１０３】
モノクローナル抗体は、培養された継続的細胞株による抗体分子の産生をもたらす任意の技法により入手し得る、特定の抗原に対する均一な抗体の集団である。これらには、ハイブリドーマ技法［Kohler and Milstein, Nature, Vol. 256, No. 5517, pp. 495-497 (1975) および米国特許番号４,３７６,１１０参照］；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法[Kosbor et al., Immunol Today, Vol. 4, pp. 72 (1983) および Cole et al., Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 80, pp. 2026-2030 (1983) 参照］；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法が含まれるが、これらに限定されるものではない。Cole et al., Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-969 (1985) 参照。かかる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらの任意のサブクラスを含む、任意の免疫グロブリンのクラスのものであってよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養し得る。インビボでの高力価のｍＡｂの産生は、これを現在のところ好ましい産生方法にする。
【０１０４】
加えて、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技法［Morrison et al., Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 81, No. 21, pp. 6851-6855 (1984); Neuberger, Williams and Fox, Nature, Vol. 312, No. 5995, pp. 604-608 (1984); Takeda et al., Nature, Vol. 314, No. 6010, pp. 452-454 (1985）参照］を使用できる。キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来の可変または超可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域を有するもののような、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
【０１０５】
あるいは、一本鎖抗体の産生のために記載された技法 [米国特許番号 4,946,778; Bird, Science, Vol. 242, pp. 423-426 (1988); Huston et al., Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 85, No. 16, pp. 5879-5883 (1988); および Ward et al., Nature, Vol. 334, pp. 544-546 (1989)］を、異なって発現される遺伝子、一本鎖抗体の産生に適合させることができる。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結し、一本鎖ポリペプチドを得ることにより形成される。
【０１０６】
最も好ましくは、「ヒト化抗体」の産生に有用な技法を、本明細書に開示のポリペプチド、フラグメント、誘導体および機能的均等物に対する抗体を産生するために適合させることができる。そのような技法は、米国特許番号５,９３２,４４８；５,６９３,７６２；５,６９３,７６１；５,５８５,０８９；５,５３０,１０１；５,９１０,７７１；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,５４５,５８０；５,６６１,０１６および５,７７０,４２９に開示されており、これらの全ての開示を、出典明示により全体を本明細書の一部とする。
【０１０７】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の技法により生成させ得る。例えば、そのようなフラグメントには、抗体分子のペプシン分解により産生できるＦ（ａｂ'）２フラグメントおよびＦ（ａｂ'）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により生成できるＦａｂフラグメントが含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し［Huse et al., Science, Vol. 246, No. 4935, pp. 1275-1281 (1989) 参照］、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にし得る。
【０１０８】
本明細書で企図するとき、本発明の抗体は、好ましくは、表３または３Ａに開示されるタンパク質またはそれらの抗原性変異体のレベルを、生物学的サンプルで検出するための診断キットにおいて、並びに、表３または３Ａに開示するものからなる群から選択されるタンパク質の調節因子で処置するのに適する候補であり得る、神経変性症状を患っている対象を診断する方法において、使用できる。好ましくは、該検出段階は、該適切な組織の細胞、例えば生物学的サンプルを、表３または３Ａのポリペプチド、それらのフラグメントまたは変異体に特異的に結合する抗体と接触させ、該適切な組織、細胞またはサンプルにおける該抗体のポリペプチドとの特異的結合を検出することを含み、ここで、ポリペプチドへの特異的結合の検出は、表３または３Ａに記載のポリペプチドまたはそのフラグメントの存在を示すものである。
【０１０９】
検出の容易さのために、特に好ましいのは、サンドイッチアッセイである。それには数々の変法が存在し、それらの全てが本発明に包含されると意図する。例えば、典型的な順行アッセイでは、非標識抗体を固体表面に固定し、試験すべきサンプルを、結合した分子と接触させる。適当なインキュベーション期間、抗体−抗原二成分複合体を形成させるのに十分な時間の後、その時点で、検出可能なシグナルを誘導する能力のあるレポーター分子で標識した二次抗体を添加し、インキュベートし、抗体−抗原−標識抗体の三成分複合体の形成に十分な時間をおく。未反応の物質を洗い流し、抗原の存在を、シグナルの観察により決定するか、または、既知量の抗原を含有する対照サンプルと比較することにより定量し得る。順行アッセイの変法には、サンプルと抗体の両方を同時に結合抗体に添加する同時アッセイ、または、標識抗体と試験すべきサンプルを最初に合わせ、インキュベートし、非標識表面結合抗体に添加する逆行アッセイが含まる。これらの技法は当業者に周知であり、些細な変法の可能性は容易に明らかであろう。本明細書で使用するとき、「サンドイッチアッセイ」は、基礎的な二部位技法の全ての変法を包含すると意図する。本発明の免疫アッセイでは、唯一の限定的要素は、標識抗体が、表３または３Ａのポリペプチド、それらのフラグメントまたは変異体に特異的な抗体であることである。
【０１１０】
このタイプのアッセイで最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、蛍光または放射性核種含有分子である。酵素免疫アッセイの場合、酵素は、通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩を利用して、二次抗体にコンジュゲートされている。しかしながら、容易に認識される通り、広く多様な異なる連結技法が存在し、それらは当業者に周知である。一般的に使用される酵素には、なかんずく、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼが含まれる。特異的酵素と共に使用される基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解の際に、検出可能な色の変化を産生するために選択される。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートと共に使用するのに適する；ペルオキシダーゼコンジュゲートには、１,２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが一般的に使用される。上記の色素生産性基質よりも、むしろ蛍光生成物をもたらす蛍光発生基質を用いることも可能である。適切な基質を含有する溶液を、三成分複合体に添加する。基質は二次抗体に連結した酵素と反応し、定性的可視シグナルを与え、それを通常分光光度的にさらに定量し、血清サンプル中に存在する表３または３Ａポリペプチドまたは変異体の量の評価をもたらし得る。
【０１１１】
あるいは、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光化合物を、抗体の結合能力を変更せずに、化学的に抗体に結合させ得る。特定の波長の光の照明により活性化されると、蛍光色素標識抗体は、光エネルギーを吸収し、分子内に励起状態を誘導し、続いて特徴的な長い波長で光を発する。発光は、光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡ技法は、当分野で両方とも非常に良好に確立されており、本方法に特に好ましい。しかしながら、放射性同位元素、化学発光または生物発光分子などの他のレポーター分子も用い得る。求められる用途に合わせて操作を変える方法は、当業者に容易に明らかであろう。
【０１１２】
本発明の医薬組成物はまた、表３または３Ａに開示のタンパク質またはそれらの変異体の発現を核酸レベルで阻害する物質も含み得る。そのような分子には、そのようなタンパク質をコードする核酸の適切なヌクレオチド配列に向けられた、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび／または二本鎖または一本鎖ＲＮＡが含まれる。これらの阻害性分子は、過度の負担または実験を伴わず、常套の技法を使用して当業者により創成し得る。例えば、遺伝子発現の改変、例えば阻害は、本明細書で論じるポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域、即ち、プロモーター、エンハンサーおよびイントロン、に対するアンチセンス分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを設計することにより獲得できる。例えば、例えば開始部位から位置−１０と＋１０との間の転写開始部位に由来するオリゴヌクレオチドを使用し得る。それにも関わらず、ｍＲＮＡへの最強のハイブリダイゼーションを与えるものを創成するために、アンチセンス分子の設計に遺伝子の全領域を使用し得、そのような適するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者になじみ深い標準的アッセイ操作により産生および同定し得る。
【０１１３】
同様に、遺伝子発現の阻害は、「三重らせん」塩基対合法を使用して達成し得る。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合に十分な程に開く能力の阻害を引き起こすので、有用である。三重らせんＤＮＡを使用する最近の治療の進歩は、文献に記載された。Gee et al., Molecular and Immunologic Approaches, Huber and Carr, Eds., Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY (1994) 参照。これらの分子は、転写物がリボソームに結合するのを防ぐことにより、ｍＲＮＡの翻訳を妨害するようにも設計し得る。
【０１１４】
酵素的なＲＮＡ分子であるリボザイムも、ＲＮＡの特異的切断を触媒することにより、遺伝子発現の阻害に使用し得る。リボザイム作用のメカニズムは、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、続くヌクレオチド鎖切断に関与する。使用し得る例には、特異的かつ効果的に遺伝子配列のヌクレオチド鎖切断を触媒するように設計できる、加工された「ハンマーヘッド」または「ヘアピン」モチーフのリボザイム分子が含まれる。潜在的なＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、標的分子を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位についてスキャンすることにより、最初に同定する。一度同定したら、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に対応する１５ないし２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、そのオリゴヌクレオチドを機能不可能にし得る二次構造の特徴について評価し得る。候補標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのし易さを試験することによっても評価し得る。
【０１１５】
リボザイム法には、細胞をリボザイムに曝すこと、または、かかる小型ＲＮＡリボザイム分子の細胞での発現を誘導することが含まれる。Grassi and Marini, Ann Med, Vol. 28, No. 6, pp. 499-510 (1996); および Gibson, Cancer Metastasis Rev, Vol. 15, No. 3, pp. 287-299 (1996) 参照。少なくとも１つの本明細書で論ずる遺伝子に対応するｍＲＮＡに標的化されたハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムの細胞内発現を利用して、その遺伝子にコードされるタンパク質を阻害できる。
【０１１６】
リボザイムは、リボザイム配列を組み込んでいるＲＮＡオリゴヌクレオチドの形態で、細胞に直接送達できるか、または、所望のリボザイムのＲＮＡをコードする発現ベクターとして細胞に導入できる。リボザイムは、ｍＲＮＡの切断に触媒的に有効であるために十分な数で、インビボで日常的に発現でき、それにより細胞内のｍＲＮＡ存在量を改変する。Cotten and Birnstiel, EMBO J, Vol. 8, No. 12, pp. 3861-3866 (1989) 参照。特に、常套の周知の規則に従って設計され、例えば標準的ホスホラミダイト化学により合成される、リボザイムをコードするＤＮＡ配列は、ｔＲＮＡをコードする遺伝子のアンチコドンステムおよびループの中の制限酵素部位にライゲーションでき、次いでそれを、当分野で日常的な方法により、関心のある細胞に形質転換および発現できる。好ましくは、リボザイム発現を選択的に制御できるように、誘導可能プロモーターも、例えばグルココルチコイドまたはテトラサイクリン応答エレメントも、このコンストラクトに導入する。飽和的用途には、高度かつ構成的に活性なプロモーターを使用できる。ｔＤＮＡ遺伝子、即ち、ｔＲＮＡをコードする遺伝子は、それらの小さいサイズ、高速の転写、および様々な種類の組織における遍在的発現のために、この適用に有用である。
【０１１７】
従って、リボザイムは、事実上いかなるｍＲＮＡ配列をも切断するために日常的に設計でき、制御可能かつ触媒的に有効な量のリボザイムが発現されるように、かかるリボザイム配列をコードするＤＮＡで、細胞を日常的に形質転換できる。従って、事実上、細胞中のいかなるＲＮＡ種の存在量も、改変または撹乱できる。
【０１１８】
リボザイム配列は、アンチセンスヌクレオチドについて記載したのと本質的に同じやり方で改変でき、例えば、リボザイム配列は、改変された塩基部分を含むことができる。
【０１１９】
ＲＮＡアプタマーも、ＲＮＡの存在量または活性を改変するために、細胞に導入または細胞で発現できる。ＲＮＡアプタマーは、ＴａｔおよびＲｅｖＲＮＡなどのタンパク質に特異的なＲＮＡリガンドであり [Good et al., Gene Ther, Vol. 4, No. 1, pp. 45-54 (1997) 参照]、それらの翻訳を特異的に阻害できる。
【０１２０】
遺伝子発現の遺伝子特異的阻害は、常套の二本鎖または一本鎖ＲＮＡ技術を使用しても達成し得る。かかる技術の説明は、出典明示により全体を本明細書の一部とするＷＯ９９／３２６１９に見出し得る。加えて、ｓｉＲＮＡ技術も、遺伝子発現を阻害する手段として有用であると証明された。Cullen, Nat Immunol, Vol. 3, No. 7, pp. 597-599 (2002);および Martinez et al., Cell, Vol. 110, No. 5, pp. 563-574 (2002) 参照。
【０１２１】
本発明のアンチセンス分子、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムは、当分野で既知の任意の核酸分子合成方法により調製し得る。これらには、固相ホスホラミダイト化学合成などの、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する技法が含まれる。あるいは、本明細書で論じるポリペプチドの遺伝子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボの転写により、ＲＮＡ分子を生成させ得る。かかるＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６などの適するＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する幅広い様々なベクターに組み込み得る。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導可能に合成するｃＤＮＡコンストラクトを、細胞株、細胞または組織に導入できる。
【０１２２】
多くの利用可能な手段によりベクターを細胞または組織に導入し得、インビボ、インビトロまたはエクスビボで使用し得る。エクスビボ治療には、ベクターを患者から採られた幹細胞に導入し、同じ患者に戻す自家移植のために、クローン的に増殖させ得る。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当業者に周知の方法を使用して達成し得る。
【０１２３】
本明細書で開示するタンパク質のｍＲＮＡレベルの検出には、高ストリンジェンシー（stringency）条件（例えば０.１ｘＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、６５℃）で、表３または３Ａに記載のポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも約２０ヌクレオチド長の単離されたヌクレオチド配列と、生物学的サンプルを接触させることが、または、生物学的サンプルに由来する単離されたＲＮＡまたはＤＮＡ分子を接触させることさえも、含まれ得る。ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェンシーが高くても、ストリンジェンシーがあまり高くなくてもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（オリゴ）である例では、ストリンジェンシーが高い条件は、例えば、６ｘＳＳＣ／０.０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃（１４塩基のオリゴについて）、４８℃（１７塩基のオリゴについて）、５５℃（２０塩基のオリゴについて）および６０℃（２３塩基のオリゴについて）での洗浄を表す。様々な組成の核酸に適するそのようなストリンジェンシー条件の範囲は、上記で引用した Maniatis et al. に加え、Krause and Aaronson, Methods Enzymol, Vol. 200, pp. 546-556 (1991) に記載されている。
【０１２４】
いくつかの場合では、機能不全に関連する遺伝子の突然変異型の検出は、その遺伝子の低発現、過剰発現または変更された空間または時間的発現に由来する疾患または疾患への敏感性の診断に追加するか、またはそれを定義する、診断手段を提供する。その遺伝子に突然変異を保有する個体を、様々な技法によりＤＮＡレベルで検出し得る。
【０１２５】
診断用の核酸、特にｍＲＮＡは、血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料などの、対象の細胞から入手し得る。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用し得るか、または、分析に先立ちＰＣＲまたは他の増幅技法を使用して酵素的に増幅し得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも、類似の様式で使用し得る。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較した増幅産物のサイズの変化により検出できる。点突然変異は、増幅したＤＮＡを、表３または３Ａに開示のポリペプチドまたはそれらの変異体をコードする標識化ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることにより同定できる。完全に一致する配列は、ＲＮａｓｅ分解または融点の違いにより、一致しない二本鎖から区別できる。ＤＮＡ配列の差異は、また、変性剤を用いるかまたは用いない、ゲル中でのＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動度の変化により、または、直接的ＤＮＡ配列解読により、検出し得る。例えば、Myers, Larin and Maniatis, Science, Vol. 230, No. 4731, pp. 1242-1246 (1985) 参照。特異的位置での配列変化は、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイまたは化学的切断の方法によっても解明し得る。Cotton et al., Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 85, pp. 4397-4401 (1985) 参照。加えて、表３または３Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、かかるヌクレオチド配列の変異体またはフラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築し、例えば遺伝子の突然変異などの効率的なスクリーニングを実行できる。アレイ技術の方法は、周知であり、一般的適用性を有し、遺伝子発現、遺伝連鎖および遺伝子の変異性を含む様々な分子遺伝学の問題に取り組むために使用できる。例えば、Chee et al., Science, Vol. 274, No. 5287, pp. 610-613 (1996) 参照。
【０１２６】
診断アッセイは、記載した方法による表３または３Ａに記載のポリペプチドの遺伝子の突然変異の検出を介して、疾患への敏感性を診断または決定する方法をもたらす。加えて、そのような疾患は、対象に由来するサンプルから、異常に低下または上昇したポリペプチドまたはｍＲＮＡのレベルを決定することを含む方法により診断し得る。低下または上昇した発現は、核酸増幅、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノザンブロットおよび他のハイブリダイゼーション方法などの、ポリヌクレオチドの定量のための当分野で周知の任意の方法のいずれかを使用して、ＲＮＡレベルで測定できる。宿主に由来するサンプルにおける、本発明のポリペプチドなどのタンパク質レベルの決定に使用できるアッセイ技法は、当業者に周知である。かかるアッセイ方法には、放射性免疫アッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
【０１２７】
従って、他の態様では、本発明は、ｍＲＮＡレベル（またはタンパク質レベル）を検出するための診断キットに関し、それは、
（ａ）表３または３Ａに記載のポリペプチドのポリヌクレオチドまたはそれらのフラグメント；
（ｂ）段階（ａ）のものに相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）段階（ａ）のポリヌクレオチドにコードされる、本発明の表３または３Ａのポリペプチド；
（ｄ）段階（ｃ）のポリペプチドに対する抗体；および、
（ｅ）段階（ａ）のものに相補的なＲＮＡｉ配列、
を含む。
【０１２８】
任意のそのようなキットでは、段階（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）が実質的な成分を構成し得ることがわかるであろう。そのようなキットは、疾患または疾患への敏感性の診断で、特にＡＤなどの神経変性症に、利用される。
【０１２９】
本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体局在決定に役立つ。配列は、個々のヒト染色体の特定の位置に特異的に標的化され、ハイブリダイズできる。関連配列の染色体へのマッピングは、これらの配列を遺伝子関連疾患に相関させるのに重要な第一段階である。一度配列を正しい染色体位置にマッピングしたら、染色体上の配列の物理的位置を、遺伝子マップのデータに相関させることができる。そのようなデータは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins University Welch Medical Library を通して、オンラインで入手できる）に見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係を、連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝）により決定する。
【０１３０】
罹患した個体と罹患していない個体の間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異も決定できる。ある突然変異が罹患した個体の一部または全部で観察されるが、正常な個体では全く観察されないならば、その突然変異は疾患の原因物質である可能性が高い。
【０１３１】
本発明のさらなる実施態様は、上記で論じた任意の治療効果のための、医薬的に許容し得る担体、賦形剤または希釈剤と併せた医薬組成物の投与に関する。そのような医薬組成物は、例えば、表３または３Ａに記載のポリペプチド、そのポリペプチドに対する抗体、表３または３Ａポリペプチドまたはそれらの遺伝子の機能の疑似体（mimetic）、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害因子または他の調節因子を含み得る。その組成物は、単独で、または、安定化化合物などの少なくとも１種の他の物質と併せて投与し得、それは、塩水、緩衝塩水、デキストロースおよび水を含むがこれらに限定されるものではない、任意の滅菌、生物適合性医薬担体中で投与し得る。組成物は、単独で、または、他の物質、薬物またはホルモンと組み合わせて、患者に投与し得る。
【０１３２】
加えて、上記の任意の治療的タンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、アンチセンス配列または他の調節因子を、他の適切な治療剤と組み合わせて投与し得る。併用療法で使用するための適切な物質の選択は、常套の医薬の原則に従って、当業者により行い得る。治療剤の組合せは、全身的に作用して、ＡＰＰ経路の異常に関連する病状の処置または改善を果たし得る。このアプローチを使用して、より低い投与量の各物質を用いて治療効力を達成し、かくして起こりえる有害な副作用を低減し得る。表３または３Ａに記載のヒトポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする遺伝子およびそれらの変異体のアンタゴニスト、アゴニストおよび他の調節因子は、当分野で一般的に知られている方法を使用して、作成し得る。
【０１３３】
本発明に包含される医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、または直腸の手段を含むがこれらに限定されるものではない、いくつの経路によっても投与し得る。
【０１３４】
有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物の製剤への加工を補助し、医薬的に使用できる賦形剤および補助剤を含む、適当な医薬的に許容し得る担体を含有し得る。製剤化および投与の技法のさらなる詳細は、最新版の Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA) に見出し得る。
【０１３５】
経口投与用の医薬組成物は、当分野で周知の医薬的に許容し得る担体を、経口投与に適する投与量で使用して製剤化できる。かかる担体は、医薬組成物を、患者による摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠（dragee）、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することを可能にする。
【０１３６】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を固体賦形剤と組合せることにより得ることができ、場合により、得られる混合物を粉砕（grinding）し、顆粒の混合物を加工し、所望により適する補助剤の添加後、錠剤または糖衣錠のコアを得る。適する賦形剤は、炭水化物またはタンパク質の増量剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモまたは他の植物のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロースまたはナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース；アラビアおよびトラガカントを含むゴム；並びにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質である。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤を添加し得る。
【０１３７】
糖衣錠のコアは、濃縮糖溶液などの適するコーティングと併せて使用し得、それは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール（carbopol）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー（lacquer）溶液および適する有機溶媒または溶媒混合物も含有し得る。製品を同定するか、または有効化合物の量、即ち投与量を特徴付けるために、染料または色素を錠剤または糖衣錠コーティングに添加し得る。
【０１３８】
経口的に使用できる医薬製剤には、ゼラチン製の押し込み型（push-fit）のカプセル剤、並びにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングで作られるソフト密封カプセル剤が含まれる。押し込み型カプセル剤は、ラクトースまたはデンプンなどの増量剤または結合剤；タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；および、場合により安定化剤と混合された有効成分を含有できる。ソフトカプセル剤では、活性化合物を、脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールなどの適する液体に、安定化剤を用いて、または用いずに、溶解または懸濁し得る。
【０１３９】
非経腸投与に適する医薬製剤は、水性溶液中、好ましくはハンクス液、リンガー液または生理緩衝塩水などの生理的に適合し得るバッファー中で製剤化し得る。水性注射懸濁剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁剤の粘性を増す物質を含有し得る。加えて、活性化合物の懸濁剤は、適切な油性注射用懸濁剤として製造し得る。適する親油性溶媒または媒体には、ゴマ油などの脂肪油；またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。非脂肪性ポリカチオン性アミノポリマーも送達用に使用し得る。場合により、懸濁液は、高濃縮液剤の製造を可能にするために、適する安定化剤または化合物の溶解性を高める物質も含有し得る。
【０１４０】
局所または鼻腔投与には、透過させるべき特定の障壁に適する浸透剤を製剤中で使用する。かかる浸透剤は、当分野で一般的に知られている。
【０１４１】
本発明の医薬組成物は、当分野で知られているやり方で、例えば、常套の混合、溶解、造粒、糖衣錠作成、粉砕、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥工程を利用して、製造し得る。
【０１４２】
医薬組成物は、塩として提供し得、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含むがこれらに限定されるものではない、多数の酸で形成できる。塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性または他のプロトン性溶媒中でより可溶性である傾向がある。他の場合では、好ましい製剤は、以下のいくつかまたは全て：１−５０ｍＭヒスチジン、０.１−２％スクロースおよび２−７％マンニトール、ｐＨ範囲４.５−５.５、を含有し得る凍結乾燥粉末剤であり得、使用に先立ちバッファーと合わせる。
【０１４３】
医薬組成物を製造した後、それらを適切な容器に入れ、適応症の処置用に標識できる。そのような標識には、量、頻度および投与方法が含まれる。
【０１４４】
本発明における使用に適する医薬組成物には、意図する目的を達成するために、有効成分が有効量で含まれる組成物が含まれる。有効用量の決定は、十分に当業者の能力の内である。
【０１４５】
任意の化合物について、例えば新生物の細胞の細胞培養アッセイ、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタの動物モデルで、最初に治療的有効用量を見積もることができる。動物モデルは、適切な濃度範囲および投与経路の決定にも使用し得る。次いで、かかる情報を、ヒトでの投与に有用な用量および投与経路を決定するために使用できる。
【０１４６】
治療的に有効な用量は、症状または状態を改善する有効成分の量を表す。治療効力および毒性は、例えば集団の５０％で治療的に有効な用量（ＥＤ５０）および集団の５０％に致死的な量（ＬＤ５０）などの標準的な医薬の手法により、細胞培養または実験動物で決定し得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現できる。大きい治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物の研究から得られるデータを、ヒトに使用するための投与量範囲を製剤化するのに使用する。かかる組成物に含有される投与量は、好ましくは、ＥＤ５０を含み、毒性が殆どまたは全くない循環濃度内にある。投与量は、用いる投与形、患者の感受性および投与経路に応じて、この範囲内で変動する。
【０１４７】
厳密な投与量は、処置を必要としている対象に関する要因に照らして、医師により決定される。投与量および投与は、十分な有効成分のレベルを提供するために、または、所望の効果を維持するために、適合させる。考慮され得る要因には、病状の重篤度、対象の全般的健康、年齢、体重、対象の性別、食事、投与時間および頻度、薬物の組合せ、反応の感受性および治療への耐容／応答が含まれる。長期作用の医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率に応じて、３−４日毎に、毎週、または隔週で投与し得る。
【０１４８】
通常の投与量は、投与経路に依存して、０.１−１００,０００ｍｇ、総用量約１ｇまでで変動する。特定の投与量および送達方法に関する指針は、文献で提供されており、当分野の医師にとって一般的に入手可能である。当業者は、ヌクレオチドには、タンパク質またはそれらの阻害因子とは異なる製剤を用いる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、位置などに特異的である。タンパク質の経口投与に適する医薬製剤は、例えば、米国特許番号５,００８,１１４；５,５０５,９６２；５,６４１,５１５；５,６８１,８１１；５,７００,４８６；５,７６６,６３３；５,７９２,４５１；５,８５３,７４８；５,９７２,３８７；５,９７６,５６９および６,０５１,５６１に記載されている。
【０１４９】
以下の実施例は、本発明を、その範囲をどのようにも限定せずに例示説明する。
【０１５０】
下記で提供する実施例を実施するために、以下の方法を用いる:
【０１５１】
ＤＮＡコンストラクトおよび分子的技法
ＡＤのショウジョウバエモデルは、米国特許番号ＵＳ２００２０１７４４４６に詳細に記載されている。簡単に述べると、疾患に特異的なＡβ４２の過剰発現を模倣するための努力において、発生中のショウジョウバエの眼に導入遺伝子を異所性に発現させるために、ＧＭＲ融合発現系を使用して、ゲノムがＧＭＲ−Ａβ４２アミロイド導入遺伝子を含む遺伝子導入ハエが創成される。Ａβ４２−ペプチドをショウジョウバエの眼で発現させるために、眼の発生中並びに成虫時代に眼組織に向けられるｐＧＭＲベクターに、Ａβ４２−配列をクローニングし、Ａβ４２の発現に適する系とする。
【０１５２】
このモデルでは、Ａβ４２の異所性過剰発現は、個眼の光受容細胞（ショウジョウバエの複眼を形成する同一の単一のユニット）の規則的な台形の配置を乱し、混乱の重篤さは導入遺伝子のコピー数に依存し、ショウジョウバエの眼にＡβ４２導入遺伝子のコピーが多く導入されるほど、高レベルのＡβ−タンパク質に反映され、rough-eye 表現型に加算的影響を有するようになる。例えば、Ａβ−導入遺伝子（ハエ系統Ｋ１８.３）の２コピーがあると、顕微鏡レベルでの観察に一致して、眼は可変性の組織崩壊を示すことが見られる。表現型が悪化するにつれ、個眼周辺の濃い染色塊の濃度が高まり、組織中の間隙が増える。個眼はより小さく見え、光受容体を失っていく。２コピーのより高い発現の導入遺伝子（ハエ系統ＫＪ１０３）は、重篤さにおいて類似する表現型を示す。最後に、強力に発現する導入遺伝子を４コピー発現するショウジョウバエ（ハエ系統ＫＪ５４）の眼は、ほぼ完全な光受容体の喪失を示す。データはまた、Ａβを発現するハエの表現型の重篤さの、加齢に伴う移行も示す。
【０１５３】
遺伝子の交配、分析および表現型の可視化
表現型の最大の発現のために全交配を２９℃で維持することを除き、常套の方法に従いハエを交配する。二成分のＧａｌ４発現系では、この温度はＧａｌ４タンパク質の活性を最大化する。ｐＧＭＲ−Ａβ４２の場合、表現型が２９℃でより強いことが観察されるので、これらのハエを同様にこの温度で維持する。
【０１５４】
第２および第３染色体のＥＰ系統のために、ＥＰ系統の雄のハエ（２−３）およびＡβ過剰発現系統（ＫＪ５４）のバージンの雌（３−４）を使用して、交配を設定する。Ｘ染色体のＥＰ系統のために、３−４バージンの雌を個々のＥＰ系統から回収し、ＫＪ５４系統の２−３雄とかけ合わせる。交配を２５℃で設定し、雌に３−４日間卵を産ませ、続いて２９℃に移す。子孫を７−１０日間加齢させ、手術用顕微鏡を使用して眼の粗さについて評価する。
【０１５５】
Ｓ２細胞の形質移入およびＡβ分泌を検出するためのＥＬＩＳＡ
ショウジョウバエ組織培養Ｓ２細胞を、２４ウェルプレートで、２ｘ１０５−４ｘ１０５細胞／ｍＬ／ウェルの密度で、２５℃で、終夜培養する。各々２μｇ、３μｇおよび１０−２０μｇのＭＴＧａｌ４、ＵＡＳ−ＤｓＲｅｄ（公的に入手可能）およびＵＡＳＡβ４０ＤＮＡ（内部で構築した）コンストラクトを担持するプラスミドを、総体積３６０μＬで混合することにより、１７ｘ１００ｍｍポリカーボネートチューブ中で形質移入混合物を調製する。この混合物に、２.５Ｍ ＣａＣｌ２（１０ｘ）４０μＬを撹拌しながら滴下して添加し、続いて２ｘＢＢＳ４００μＬを同様に添加する。混合物を３０分間ＲＴでインキュベートし、２４ウェルプレートの１ウェルにつき混合物２００μＬを使用する。細胞を形質移入混合物またはＢＥＳバッファー単独（対照）と２４時間インキュベートし、新鮮な培地で２回洗浄する。ＭＴＧａｌ４遺伝子を誘導するために、０.７ＭＣｕＳＯ４１μＬを新鮮な培地１ｍＬで希釈し、形質移入された細胞を有するウェルに添加する。細胞を４８時間後に回収し、次いで遠心し、上清を分離する。ペレットと上清を別々に−８０℃で冷凍する。Biosource International (Camarillo, CA）のヒトＡ４０比色分析ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＫＨＢ３４８１）を使用して、上清をアッセイする。プレートをキットで提供される洗浄バッファーで３回洗浄する。キットで提供される標準ペプチドを使用して連続希釈物を作成し、標準ペプチド溶液またはＳ２細胞培養上清１００μＬを、予め被覆したプレートの適切なウェルに添加する。プレートを、４℃で終夜、平坦な表面上、暗所で、震盪せずに、インキュベートする。プレートを３回２００μＬ洗浄バッファー／ウェルで洗浄し、続いて希釈検出抗体（ウサギポリクローナル抗Ａβ４０、これもまたキットから）１００μＬを添加する。プレートをシェーカー（４５０ｒｐｍ）上、ＲＴで２時間インキュベートし、洗浄バッファー２００μＬ／ウェルで３回洗浄する。二次抗体溶液（ＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ抗体）を１００μＬ／ウェルでウェルに添加し、続いて、ＲＴ、シェーカー上で２時間インキュベートする。ウェルを再度洗浄バッファー各２００μＬで３回洗浄し、安定化色素原溶液１００μＬを各ウェルに添加する。プレートを３０分間ＲＴでインキュベートし、光から保護し、停止溶液１００μＬを各ウェルに添加することにより反応を停止させる。プレートリーダーを使用して光学密度を測定する。
【０１５６】
ＲＴＳ５００を使用するインビトロ翻訳
プレプロエンケファリンシグナル配列を結合したＡβ４２−ペプチド［Cescato et al., J Neurochem, Vol. 74, No. 3, pp. 1131-1139 (2000) 参照］を、Rapid Translation system 500 (RTS 500) （Roche, Indianapolis, IN, カタログ番号３０１８００８）を使用して、インビトロ翻訳により入手する。プレプロエンケファリン−Ａβ４２コンストラクトを、原核生物のインビトロタンパク質発現用に設計され、Ｔ７プロモーターを含有するテンプレートベクター（ｐＩＶＥＸ）（ＲＴＳ５００キットに含まれる）にクローニングする。ＲＴＳ５００システムを使用し、製造業者の指示に従う連続交換無細胞タンパク質合成（ＣＥＣＦ）のために、得られる組換えプラスミドを使用する。このシステムでは、転写および翻訳を同時に反応装置の１ｍＬの反応区画中で行う。持続反応に必須の基質およびエネルギー成分は、半透膜を介して連続的に供給する。同時に、潜在的に阻害性の反応副産物を、同じ膜を通す拡散を介して１０ｍＬの給送区画に希釈する。２４時間までに発現されるタンパク質は、５００μｇに上る機能的に活性なタンパク質をもたらす。
【０１５７】
ウエスタンブロット分析
所望の遺伝子型のハエを、液体窒素を使用してエッペンドルフチューブ中で凍結し、胴体から頭部を切断するために、迅速にボルテックス撹拌する。チューブの中身をドライアイス上に維持した計量ボートにあけ、予め冷却した細い絵筆を使用して頭部を他の体の部分から分離する。５０−１００個の頭部からタンパク質を抽出するために、Complete Protease Inhibitor Mini tablets (Roche, カタログ番号１８３６１５３）の２８ｘ原液５０μＬ（凍結頭部に最初に添加する）および２ｘサンプルバッファーＢ（０.３１８Ｍ Bicine、３０％スクロース、２％ＳＤＳ、０.７１８Ｍ Bistris）２００μＬをハエ頭部に添加する。その後プラスチック内筒を使用して手でサンプルをホモジェナイズし、次いで乾燥浴インキュベーター中で９５℃で５分間加熱し、微小遠心管中、１２Ｋｒｐｍで、５分間、２５℃で遠心する。ピペットのチップを使用して、上清をプロテアーゼフリーのチューブ（Biopur, SRL, Rosario, Argentina）に移す。Biorad (Hercules, CA）タンパク質アッセイを使用して（マイクロタイタープレートでの標準アッセイのための、製造業者の指示に従う）、タンパク質サンプルを定量する。５パーセント（５％）β−メルカプトエタノール（５０μＬ中の２.５μＬ）およびブロモフェノールブルー（ＢＢ）０.０１％（５０μＬに２％ＢＢ１μＬを使用）をサンプルに添加する。ロードする前に、サンプルを乾燥浴インキュベーター中１００℃で５分間インキュベートする。各サンプルにつき、総タンパク質抽出物５０μｇを、８Ｍ尿素を含有する１５％トリシン／トリスＳＤＳ ＰＡＧＥゲルにロードする（ゲル組成は以下に提示する）。
【０１５８】
使用するゲルは、尿素を含有しない。サンプルを、濃縮用ゲル中で４０Ｖで、分離用ゲル中で１２０Ｖで走らせる（約１.５時間）。１ｘトリス−トリシン／ＳＤＳ（Biorad の１０ｘ原液から希釈）バッファーをゲル間の陽極バッファーとして使用し、０.２Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.８（Biorad の１.５Ｍ原液から希釈）を、底部の陰極バッファーとして使用する。Ａβ１−４２ペプチド対照は、ヒトβ−アミロイド（１−４２）（Biosource International, Camarillo, CA, No. 03-111, Lot No. 0311219B）である。そのペプチドを１μｇ／μＬで溶解し、原液を作成する。ロードに先立ち、アリコートを２ｎｇ／μＬの濃度に希釈し、２ｘサンプルバッファーと１：１の比で混合する。ロードする前に、β−メルカプトエタノールおよびＢＢを各々５％および０.０１％で添加する。分子量マーカーＲＰＮ７５５（Amersham, Piscataway, NJ）をサイズマーカーとして使用する。それは、ロードのためにペプチドマーカーと同様に調製する。電気泳動後、サンプルを１時間、１００ＶでＰＶＤＦメンブレン（Biorad, No. 162-0174）に移し、その後、メンブレンを１ｘＰＢＳ中で３分間煮沸する（メンブレンのタンパク質側を下にする）。０.１％Tween 20 を含有する１ｘＰＢＳ中で調製した５％脱脂乳でメンブレンを１.５時間ないし終夜ブロックする。抗体のハイブリダイゼーションは、以下の通りである：Ａβ−ペプチドの最初の１９アミノ酸を認識する一次ｍＡｂ ６Ｅ１０（Senetek PLC, Napa, CA）を、０.１％Tween 20 を含有する１ｘＰＢＳに溶解した５％脱脂乳中、９０分間、ＲＴで、探索に使用する（１：１０００の濃度で）。メンブレンを５分間３回、１５分間、そして１５分間、各々１ｘＰＢＳ−０.１％Tween-20中で洗浄する。二次Ａβは、抗−マウスＨＲＰ（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, No. NA 931）であり、０.１％Tween 20 を含有する１ｘＰＢＳに溶解した５％脱脂乳中１：２０００で、９０分間、ＲＴで使用する。一次抗体のインキュベーション後と同様にサンプルを洗浄する。ＥＣＬ（Western Blotting Detection Reagents, Amersham Pharmacia Biotech, No. RPN2209）を検出に使用する。ブロット後、メンブレンを水で数回洗浄し、Ponceau 試薬で染色し、全レーンにおける均等なロードを確認する。
【表２】
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【０１５９】
免疫染色
手術用顕微鏡を使用して、所望の遺伝子型の３齢幼虫から１ｘＰＢＳ溶液中で複眼触角成虫原基を切離する。３０分間、ＲＴ、１ｘＰＢＳ中で調製した３％パラホルムアルデヒド中で組織を固定する。０.１％ triton X-100 を含有する１ｘＰＢＳ（１ｘＰＢＳＴ）で３回洗浄することにより固定液を除去する。１ｘＰＢＳＴ中で作成した２％ＢＳＡを使用して、組織を１時間室温でブロックする。１ｘＰＢＳＴで３回洗浄した後、一次抗体（マウス由来ｍＡｂ ６Ｅ１０、Senetek PLC）を１：３０００希釈で添加し、続いて終夜４℃でインキュベートする。１ｘＰＢＳＴで３回洗浄した後、蛍光二次抗体（抗−マウスAlexa-488、１：３００希釈、Molecular Probes, Eugene, OR）および蛍光ファロイジン（Alexa-568 Phalloidin、１：３０希釈、Molecular Probes）を添加し、ＲＴで１時間インキュベートする。１ｘＰＢＳＴで３回組織を洗浄し、遅延退色光抗退色媒体（slow-fade light anti-fade medium）(Molecular Probes）を使用してマウントする。Biorad 共焦点顕微鏡を使用してスライドを分析し、Lasersharp 4.1 ソフトウェア(Biorad）を使用して画像を集める。
【０１６０】
実施例１
ＥＰ挿入株を使用する一次スクリーニングの遺伝学的スキーム
ＡＤのショウジョウバエモデルを、眼特異的ＧＭＲプロモーターを使用して、Ａβ４２−ペプチドの過剰発現により創成する（上記の方法の部参照）。そのコンストラクトは、形質移入された哺乳動物細胞からのＡβ４２の分泌を媒介すると示された、プレプロエンケファリンシグナルペプチドに融合したＡβ４２コード領域を含有する。前出の Cescato (2000）参照。データは、以前に、ショウジョウバエにおけるＡβ４２の効果は、用量依存的であることを示している。Ａβ４２−表現型を増強および抑制する両方の突然変異を同定できるように、我々は、遺伝学的スクリーニングに使用するために、導入遺伝子の発現が比較的高レベルであるＡβ４２−系統を選択した。ＫＪ５４と命名されたこのＡβ４２−系統は、Ａβ４２−導入遺伝子を第２および第３染色体の両方に担持し、２５℃で顕著なrough-eye 表現型を示す。この表現型は、ハエを２９℃で飼育すると悪化する。rough-eye 表現型の温度依存性は、ＫＪ５４−系統を我々の意図する目的に適するものにする。この系統をＥＰをベースとする遺伝学的スクリーニングに使用するために、ｅｙＧａｌ４をハエ−系統ＫＪ５４の第２染色体に組換えた。ｅｙＧＡＬ４の制御下で、３齢幼虫の複眼成虫原基全体にＧＦＰ発現を検出できる。従って、ｅｙＧａｌ４は、ＥＰに連結した遺伝子の異所性発現を、ＧＭＲに駆動されるＡβ４２の発現に似たパターンで駆動すると期待される。
【０１６１】
遺伝学的スクリーニングに使用する典型的な親の交配スキームを図１に示す。これらの交配に由来する実験の子孫は、染色体２および３にＡβ導入遺伝子のコピーを、そして姉妹染色体の一方にＥＰエレメントのコピーを担持する。これらを、染色体２および３にＡβ導入遺伝子を有するが、姉妹染色体にＥＰのない対照の子孫と比較する。粗さの程度を実験および対照の子孫群間で比較する。ＥＰエレメントに駆動される遺伝子の異所性発現に起因する眼の粗さの抑制または増強を、軽度、中度、強度のカテゴリーに分類する。
【０１６２】
実施例２
ネプリライシンの異所性発現は、Ａβ４２に誘導される Rough-eye 表現型を強く抑制する
ＥＰをベースとする遺伝学的スクリーニングに我々のモデル系を使用するために、我々は、第２染色体のｅｙＧａｌ４遺伝子を組換えた。しかし、このモデルを大スケールの遺伝学的スクリーニングに使用する前に、我々は、生物学的に意味のある相互作用の解明におけるこの系の有効性を決定するために、いくつかの候補遺伝子を試験することに決めた。
【０１６３】
亜鉛メタロペプチダーゼファミリーのメンバーであるネプリライシンは、哺乳動物の脳におけるＡβの異化作用に強く関与する。Selkoe, Neuron, Vol. 32, No. 3, pp. 177-180 (2001); および Carson and Turner, J Neurochem, Vol. 81, No. 1, pp. 1-8 (2002) 参照。ネプリライシン様活性は、原核生物からヒトまで、良好に保存されている。少なくとも２４種のネプリライシン様遺伝子がキイロショウジョウバエに存在すると報告されている。Turner et al., Bioessays, Vol. 23, No. 3, pp. 261-269 (2001) 参照。我々の遺伝学的スクリーニングの有効性を決定するために、ハエネプリライシン遺伝子の近くに挿入を担持する系統を、rough-eye 表現型の改変について、試験し得る。ＥＰ（３）３５４９をハエネプリライシン２（Ｎｅｐ２）遺伝子の上流に挿入する。子孫の分析の際に、Ａβ４２導入遺伝子のみを担持するハエと比較して、Ａβ４２導入遺伝子およびＥＰ（３）３５４９の両方を担持するハエにおいて、rough-eye 表現型の明確かつ強い抑制が観察される（データは示さない）。このデータは、ヒトとハエの間にＡβ異化作用の重要な局面が保存されていることを示すので、重要である。この結果はまた、我々に遺伝学的スクリーニングの信頼性（robustness）への自信を与えた。
【０１６４】
我々の遺伝子導入モデルにおけるネプリライシンの共発現がＡβ４２−ペプチドの代謝回転に影響を与えるか否かを試験するために、Ａβ特異的抗体を用いる３齢幼虫の複眼成虫原基の免疫染色を実施する。データは、Ｎｅｐ２遺伝子の共発現が、Ａβ４２−ペプチドの殆どを複眼成虫原基から排除することを示す。また、遺伝子導入ハエの頭部タンパク質抽出物を使用して、ウエスタンブロット分析も実施する。結果は、Ａβ４２とネプリライシンの両方を発現するハエにおけるＡβ−ペプチドのレベルが、Ａβ４２のみを発現するハエと比較して、劇的に低下することを示す（データは示さない）。
【０１６５】
従って、ネプリライシンによる rough-eye 表現型の抑制、並びにこの酵素がハエの眼においてＡβ４２−ペプチドを分解する細胞生物学的および生化学的証拠は、遺伝学的スクリーニングに我々のハエＡＤモデルを使用することにより、ＡＤを含むＡβの異常な代謝、輸送または代謝回転を含む症状の発症および／または進行に関与する遺伝子を明らかにし得ることを強く示唆する。
【０１６６】
実施例３
Ａβ４２−ペプチドは、遺伝子導入ハエの眼で光受容細胞により分泌される
ネプリライシンは、膜に結合し、細胞外酵素ドメインを含有するエクトペプチダーゼのファミリーに属する。前出の Turner et al., (2001) 参照。酵素のネプリライシンファミリーは、細胞外空間の神経ペプチドを分解すると知られている。ネプリライシン機能についてのこの情報に基づき、我々は、Ａβ４２−ペプチドがハエ光受容細胞により分泌されるという仮説を設けた。そのようなＡβ４２の分泌は、ネプリライシンによる細胞外空間におけるこのペプチドの分解を導く。この仮説を試験するために、遺伝子導入ハエ頭部からのタンパク質抽出物中のプレプロエンケファリンシグナルペプチドのプロセシングを、最初に調べる。シグナル配列のあるＡβ−ペプチドとないものを区別するために、インビトロで翻訳したタンパク質を、遺伝子導入ハエの生成に使用したものと同じプレプロエンケファリンＡβ４２−コンストラクトから調製する。インビトロ翻訳産物を、市販（Biorad）の合成Ａβ４２−ペプチド（シグナル配列なし）と比較する。データは、シグナルペプチドの存在に起因する明らかな泳動の移行を示す。遺伝子導入ハエ抽出物からのＡβ４２−ペプチドを分析すると、我々は、それがシグナル配列のないＡβ−ペプチドと共泳動することを観察し、これは、光受容細胞分泌経路における遺伝子導入Ａβ４２のプロセシングを示唆する。
【０１６７】
培養したＳ２細胞（ATCC, Manassas, VA）における、我々のプレプロエンケファリンＡβ４０−導入遺伝子コンストラクトによる一過性形質移入後のＡβ４２の分泌を試験する。一過性に形質移入されたＳ２細胞の上清にＥＬＩＳＡを実施し、分泌されたＡβ４０−ペプチドの存在を検出する。結果は、Ａβ４０を発現する細胞の上清におけるＡβ４０の検出を示す。
【０１６８】
総合すると、これらの結果は、Ａβ−ペプチドがハエで分泌され得ることを示し、眼組織への毒性効果が細胞外Ａβ４２に媒介され得ることを示唆する。
【０１６９】
実施例４
Ａβ４２過剰発現依存性 Rough-eye 表現型を改変する遺伝子を見出すための遺伝学的スクリーニング
Ａβ４２に誘導される rough-eye 表現型を増強または抑制する新規の遺伝子相互作用を解明するための、我々のモデル系を使用する遺伝学的スクリーニングを実行する。スクリーニングは、公的に入手できるＥＰ挿入ストックのコレクションを利用する。ｅｙＧａｌ４を第２染色体に有する組換えＫＪ５４系統を、個々に１,９６７種のＥＰ系統と交配し、rough-eye 表現型のサプレッサーおよびエンハンサーによる眼の粗さの変化について子孫を評価し、改変の強度に応じて、３つの下位カテゴリー：強度、中度および軽度、に分ける。一次スクリーニングの後、２３８種のエンハンサー（３０種の強度、４８種の中度、および１６０種の軽度）および９７種のサプレッサー（７種の強度、１７種の中度、および７３種の軽度）を得る。
【０１７０】
ＥＰ−系統のｅｙＧａｌ４に駆動される発現自体が rough-eye 表現型（または他の種類の眼の欠陥）をもたらさないことを確認するために、１０２種の強度および中度のモディファイヤー（エンハンサーおよびサプレッサー）を、第２染色体にｅｙＧａｌ４挿入のみを担持するハエと交配する。この遺伝学的バックグラウンドチェックと並行して、１０２種のＥＰ−系統のＫＪ５４−系統との再スクリーニング交配も実施し、一次スクリーニングの結果を確認する。我々は、再スクリーニングには、一次スクリーニングで軽度のサプレッサーと評価されるにも関わらず、ＩＤＥの５'領域におけるＥＰ座位(sitting）も含める。別の軽度のエンハンサーＥＰ−系統であるＥＰ（Ｘ）３５６も、再試験した。このＥＰ挿入は、我々がＡＰＰ遺伝子で一過性に形質移入された培養哺乳動物細胞の上清に分泌されるＡβ４２のレベルを高めると示したヒトカルボキシペプチダーゼＺ遺伝子のハエホモログである、遺伝子 silver に影響すると期待される。再スクリーニングに加えて、我々は、また、これらの１０４種のＥＰ系統を、ｅｙＧａｌ４単独を担持するハエに交配し、ＥＰ−系統の異所性発現自体が、大きさ、形または粗さの変化などの眼の表現型をもたらすか否かを決定する。これらの２組の並行実験は、２３種のＥＰ−系統が、Ａβ４２に誘導される rough-eye 表現型に再現性のある特異的な効果を有することを確認する（表１参照）。表１に示すこれらの２３種の遺伝子は、ＥＰ−系統に担持される突然変異により影響を受ける例示的遺伝子配列である。これらの遺伝子の変異体を含むさらなる配列およびそれらがコードするタンパク質／ポリペプチドも、本明細書に示さないが、本発明に含まれるさらなる標的に含まれる。
【０１７１】
表１．２３種のモディファイヤーＥＰ系統の注釈
【表３】
2007511474.tif 000004
【０１７２】
【表４】
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【０１７３】
【表５】
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【０１７４】
【表６】
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【０１７５】
実施例５
２３種のＥＰモディファイヤーのヒトホモログ
ショウジョウバエの系で進行中の２３種のＡβ４２−モディファイヤーの確認アッセイと並行して、生物情報学的分析を使用して、これらのモディファイヤーＥＰ挿入に影響を受けるハエ遺伝子のヒトホモログ／オルソログを決定する。２３種のＥＰ−モディファイヤーの内３種［ＥＰ（２）０３３０、ＥＰ（Ｘ）１３１８およびＥＰ（Ｘ）１５０４］の挿入部位は入手不可能であり、従って、これらの系統で影響を受ける遺伝子は未知である。ウエスタン分析または他の二次的アッセイによるこれらのモディファイヤーＥＰ系統の効果のさらなる分析を継続し、インバースＰＣＲまたはプラスミドレスキューおよび配列解読により、ＥＰ−エレメントの挿入部位を得る。
【０１７６】
ＥＰ−エレメントの性質は、遺伝子の上流にその遺伝子自体の転写と同じ方向で挿入された場合にのみ遺伝子を過剰発現できるようなものである。上記の基準を満たさないＥＰ挿入は、影響を受ける遺伝子の転写を乱すと期待される。各ＥＰ挿入に起因する突然変異の性質を分析するには、挿入のすぐ次にある４つの隣接遺伝子を見出すために、Flybase および専売のデータベースである FlyDB3 から情報を集める。挿入からの相対的距離および方向に基づき、ＥＰ挿入によりに影響を受けている可能性のある遺伝子を拾い上げ、Blast 分析に使用する。２０種のＥＰの近傍に、潜在的にＥＰ挿入により影響を受け得るような２４種の遺伝子が見出される。これらの２４種の遺伝子を、常套の方法に従い Blast 分析に付す。キイロショウジョウバエタンパク質配列の Refseq、Celera および Compugen タンパク質配列へのマッピングのためのパラメーターは、以下の通りである：Ｅ値は＜１０ｅ−１０であるべきであり、質問配列の長さの＞２５％が、アラインメントの一部である。Blast 分析用のデータベースとして、２００２年４月公開の Refseq および Celera タンパク質 R26j を使用する。Refseq データベースで１８種／２４種の遺伝子について、そして Celera の専売データベースで２０種／２４種の遺伝子について、相同配列を見出す。
【０１７７】
１６種／２０種のヒトホモログについて、Celera データベースで注釈が見出される（表２参照）。２０種の内１２種（１２種／２０種）のヒトホモログは、ショウジョウバエタンパク質データベースにブラストし返すと、適する相手として我々の最初のヒット配列を引き出す（太字で強調される）。このことは、それらがオルソログであり得ることを示す。加えて、これらのハエ遺伝子のヒトホモログの染色体上の位置を使用して、これらのマップの位置にＡＤの連鎖があるか否かを決定する。
【０１７８】
１３種／２０種の入手し得るヒトホモログについて、全長ｃＤＮＡクローンを入手し得る（表３または３Ａ参照）。太字で強調されるクローンは、再整列された（re-arrayed）クローンを表す。再配列されたクローンを別として、クローンの順序は、ヒットの質を表す。我々の専売ライブラリーに含まれない３種の遺伝子について、全長クローンをＭＧＣ（公的なデータベース）から入手可能であり、全長ｃＤＮＡクローンの入手可能性を１６種／２０種の遺伝子に拡張する。
【０１７９】
表２．２３種のモディファイヤーＥＰ−系統のヒトホモログへの注釈
【表７】
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【０１８０】
【表８】
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【０１８１】
【表９】
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ヒト配列へのマッピング：キイロショウジョウバエタンパク質配列の、Refseq、Celera および Compugen タンパク質配列へのマッピングのためのパラメーター：Ｅ値＜１０ｅ−１０；質問配列の長さの＞２５％が、アラインメントの一部である；２００２年４月公開の Refseq、Celera タンパク質 R26j。
相互に最良の相手のＩＤを太字で強調する。
＊refseq における最上位のヒットは、トール様受容体３（ＮＭ＿００３２６５／ＮＰ＿００３２５６.１）であるが、ロイシンリッチリピートタンパク質は生物学的により意味のあるアラインメントを有する。
＊＊アラインメント中の質問配列部分＜４０であるが、非常に重要なヒット；ハンチンチン相互作用タンパク質は、二番目に良いヒットである。
【０１８２】
表３．ハエモディファイヤー遺伝子に相同なヒトｃＤＮＡクローン（所内財産（proprietary in house）（ＦＧＡ）およびＭＧＣコレクション）
【表１０】
2007511474.tif 000011
【０１８３】
【表１１】
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【０１８４】
【表１２】
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【０１８５】
【表１３】
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全長クローンの同定：＞１５０ｎｔ重複；最良の適合する Compugen 転写物を質問配列として使用して、＞＝９８％配列同一性
青色で強調される再配列したＦＧＡ ｆｌ−クローンを別として、クローンの順序は、ヒットの質を表す；隣接する列のクローンは、それらの順位を反映し、それらが相互に対応することを含意しない。
Alex により試験された４７８種の全長クローンのセットによる交差。
【０１８６】
表３Ａ．ハエ−モディファイヤーに相同なヒトｃＤＮＡクローン
【表１４】
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【０１８７】
実施例６
哺乳動物細胞をベースとするヒトｃＤＮＡのアッセイおよびＡβ分泌に対する効果
全てのヒトｃＤＮＡを、我々の哺乳動物細胞をベースとするアッセイで、分泌されるＡβのレベルに対する効果について試験する。このアッセイは、Haugabook et al. (2001) J. Neurosci. Methods 108: 171-179 に記載のプロトコールに従い実施し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１は、Ａβに誘導される rough-eye 表現型のモディファイヤーを見出すための、ＥＰをベースとする遺伝学的スクリーニングに使用する典型的な親の交配を示す。ＦＭ７、ＭＫＲＳおよびＴＭ６は、Ｘ、第２および第３染色体で各々一般的に使用されるバランサーである。
【図２】図２は、プレプロエンケファリンシグナル配列を有するＡβ４２の配列を示す。斜体の文字は、アミノ酸を示す。下線のない文字は、プレプロエンケファリンシグナル配列を示し、下線のある文字は、Ａβ４２の配列を示す。
【図１】
2007511474.tif 000016
【図２】
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【配列表】
2007511474000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月15日(2006.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007511474000001.app
【国際調査報告】
2007511474.tif 000057
2007511474.tif 000058
2007511474.tif 000059
2007511474.tif 000060
2007511474.tif 000061
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