(57)【要約】【課題】【解決手段】カルボキシメチル化 アスパラギン酸塩 キレートリガンドに結合した磁気ポリマー粒子を含む結合体、および任意に金属イオンをキレートしている結合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシメチル化アスパラギン酸塩キレートリガンドに結合した磁気ポリマー粒子を含む結合体。
【請求項２】
金属原子またはイオンにキレートしているカルボキシメチル化アスパラギン酸塩リガンドに結合した磁気ポリマー粒子を含む結合体。
【請求項３】
前記金属が、遷移金属または１３族の金属である請求項２に記載の結合体。
【請求項４】
前記金属が、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｍｎ、Ｃｏ、ＣｕおよびＺｎである請求項３に記載の結合体。
【請求項５】
前記金属が、Ｆｅ、Ｇａ、ＭｎおよびＣｏである請求項４に記載の結合体。
【請求項６】
前記金属が、２＋または３＋の酸化状態である請求項２〜５のいずれかに記載の結合体。
【請求項７】
前記金属が、Ｃｏ2+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+およびＣｕ2+である請求項６に記載の結合体。
【請求項８】
前記金属が、Ｃｏ2+である請求項７に記載の結合体。
【請求項９】
前記カルボキシメチル化アスパラギン酸塩リガンドの窒素原子と、前記粒子表面との間に少なくとも３つの原子が存在する請求項１〜８のいずれか一つに記載の結合体。
【請求項１０】
式：
【化１】
2007519765.tif 000020
である請求項９に記載の結合体。
（ＭＰＰ＝磁気ポリマー粒子）
前記式中、波線は、ＮＨ−アルキレン、ＮＨ−ＣＯ−アルキレン、Ｏ−アルキレン、ＯＣＯ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＳＣＯ−アルキレンから選択される３から２０の原子のリンカーを意味する。
【請求項１１】
波線が、ＮＨ−Ｃ5Ｈ12−またはＮＨ−Ｃ6Ｈ13−を意味する請求項１０に記載の結合体。
【請求項１２】
前記ポリマーが、架橋スチレンジビニルベンゼンポリマーを含む請求項１〜１１のいずれか一つに記載の結合体。
【請求項１３】
前記磁気ポリマー粒子が、０．５から８μｍの直径を有する請求項１〜１２のいずれか一つに記載の結合体。
【請求項１４】
前記磁気ポリマー粒子が、０．８から１．２μｍの直径を有する請求項１２に記載の結合体。
【請求項１５】
非荷電している請求項１〜１４のいずれか一つに記載の結合体。
【請求項１６】
ヒスチジン標識組換えたんぱく質／ペプチド、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓおよび／もしくはＴｙｒ残基含有天然たんぱく質／ペプチドまたはリン酸化たんぱく質／ペプチドにさらにキレートされている請求項２〜１５のいずれか一つに記載の結合体。
【請求項１７】
ヒスチジン標識組換えたんぱく質／ペプチドにさらにキレートされている請求項２〜１６のいずれか一つに記載の結合体。
【請求項１８】
前記結合体が、リン酸化たんぱく質／ペプチドと結合し、前記金属が、ＦｅまたはＧａであることを特徴とする請求項１６に記載の結合体。
【請求項１９】
Ｃｍ−Ａｓｐリガンドに結合した磁気ポリマー粒子を含む結合体の製造方法であって、前記方法が、式（ＩＩ）のＣｍ−Ａｓｐリガンド
【化２】
2007519765.tif 000021
（前記式中、各Ｒは独立して、水素または保護基を意味し、Ｘは２から２０の原子基を意味する）を磁気ポリマー粒子と反応させること、および任意に、生じた結合体を金属原子またはイオンに配位させることを含む方法。
【請求項２０】
式（ＩＩ）の化合物
【化３】
2007519765.tif 000022
（前記式中、各Ｒは独立して水素または保護基を意味し、Ｘは２から２０の原子基を意味する。）
または前記Ｒ基が存在せず、金属がキレートされているその類似体。
【請求項２１】
ＸがＣ５またはＣ６−アルキレン基である請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
式（ＩＩＩ）の化合物または金属がキレートされているその類似体。
【化４】
2007519765.tif 000023
【請求項２３】
式：
【化５】
2007519765.tif 000024
（前記式中、各Ｒは独立して水素または保護基を意味し、Ｘは、Ｃ2-20のアルキレンリンカーを意味する）
の化合物の製造方法であって、
前記製造方法は、式Ｈａｌ−Ｘ1−ＣＮの化合物（前記式中、Ｈａｌはハロゲンであり、Ｘ1はＣ1-19のアルキレンリンカーを意味する）を式：
【化６】
2007519765.tif 000025
（前記式中、Ｐｒは保護基である）
の化合物と反応させ、
生じた生成物を、式Ｈａｌ−ＣＨ2ＣＯＯＰｒの化合物と反応させて、化合物：
【化７】
2007519765.tif 000026
を形成し、
ニトリルをアミノ基に還元し；任意に、前記カルボキシル基を脱保護することを含む製造方法。
【請求項２４】
アッセイにおける請求項２〜１８のいずれか一つに記載の結合体の使用。
【請求項２５】
ヒスチジン標識組換えたんぱく質／ペプチド、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓおよび／もしくはＴｙｒ残基含有天然たんぱく質／ペプチドまたはリン酸化たんぱく質／ペプチドの精製における請求項２〜１８のいずれか一つに記載の結合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
磁気ポリマー粒子における改善
本発明は、金属を積んでいるキレートマトリックスを運ぶ磁気ポリマー粒子、ならびに、前記キレートマトリックスを運ぶ磁気ポリマー粒子の製造方法に関する。特に、本発明は、カルボキシメチル化アスパラギン酸塩（Ｃｍ−Ａｓｐ）キレート基を運ぶ磁気ポリマー粒子ならびに、前記磁気ポリマー粒子と前記Ｃｍ−Ａｓｐ基とのカップリングに関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気ポリマー粒子は、様々な医療分野および生化学分野において、例えば、医薬製品の運搬のための輸送ビヒクルとして、診断目的において、分離のため、および合成目的のため、一般に有用である。このような粒子は、これらの機能を行うためには、その磁気特性に依存している。診断アッセイ適用において、例えば、磁気ポリマー粒子に結合した分析物を含有するサンプルに磁場を適用することにより、遠心分離またはろ過の使用をすることなく、前記分析物を単離することが可能である；また、治療適用において、例えば、磁場を患者に適用することにより、薬物運搬磁気ポリマー粒子を所望の身体部位へ狙いをつけるのに用いることができる。
【０００３】
磁気によりとは、ここでは、ポリマー粒子が超常磁性（super paramagnetic）結晶を含有することを意味する。したがって、この磁気ポリマー粒子は、磁気的に置き換え可能であるが、永久に磁化可能というものではない。磁気ポリマー粒子の製造方法が多く知られている。その多数は、マグヘマイト含有ポリマー粒子またはマグネタイト含有ポリマー粒子を、予備形成された磁気酸化鉄、例えば、マグネタイトから形成することを含む。それらの幾つかの関連方法は、米国特許出願公開第ＵＳ−Ａ−４，６５４，２６７（Ｕｇｅｌｓｔａｄ）（特許文献１）に記載されており、その内容はここに引例として組み入れる。
【０００４】
固定金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の使用は、長年にわたって公知である。ＩＭＡＣ精製法は、遷移金属イオン、例えばＣｕ2+またはＮｉ2+（このＣｕ2+またはＮｉ2+は、たんぱく質表面上に存在する電子供与基、特にヒスチジンのイミダゾール側鎖に結合することができる）を有するキレートマトリックスの使用に基づいている。電子供与性基は、前記金属イオンの周りの空配位部位に配位すると考えられている。前記たんぱく質表面上に存在する、前記電子供与性基と前記金属イオンとの間の相互作用は、例えば、ｐＨを変化させることにより変更することができ、ゆえに、精製を可逆性金属複合物／たんぱく質相互作用によって行うことができる。最も一般的には、たんぱく質が前記金属イオンとヒスチジンのイミダゾリル側鎖との相互作用によって、固相に結合されていれば、前記たんぱく質は、イミダゾール自体を添加することにより、すなわち、競合的溶離により、除去することができる。
【０００５】
幾つかの種々のキレートリガンドが、ＩＭＡＣにおいてたんぱく質を精製するのに用いられている。ニトリロトリアセテート（ＮＴＡ）（四座配位子）および五配位子リガンドのトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミンは、そのようなリガンドの例であり、しかし、これらは、非特異的たんぱく質相互作用、金属漏れ等の様々な短所がある。
【０００６】
米国特許第ＵＳ６２４２５８１号（特許文献２）では、カルボキシメチル化アスパラギン酸塩（Ｃｍ−Ａｓｐ）基をＩＭＡＣ（ここで、結合した遷移金属イオンは八面体形態を有する）において用いることにより金属漏れ問題の解決策を提案している。前記リガンドは、ヒスチジン標識組換えたんぱく質を単離するのに理想的であると言われている。Ｃｍ−Ａｓｐの他の長所、例えば、還元剤への耐性は、米国特許第ＵＳ５９６２６４１号（特許文献３）において説明されている。
【特許文献１】米国特許出願公開第４，６５４，２６７号明細書
【特許文献２】米国特許第ＵＳ６２４２５８１号明細書
【特許文献３】米国特許第ＵＳ５９６２６４１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
他のポリマーマトリックス、例えばポリスチレン、ナイロンおよびセファロースが提案されているが、これらの特許において、前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドは、アガロース固相（架橋しているのが好ましい）に結合している。これらのマトリックスは、磁気性であるが、前記磁気粒子は、懸濁液において磁気性では無く、前記固相は従ってアッセイにおいて使用に制限がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ここに、驚いたことに前記Ｃｍ−Ａｓｐキレートリガンドを、磁気ポリマー粒子にカップリングさせることができ、組換えたんぱく質中のヒスチジン標識、または天然たんぱく質もしくはペプチド中の金属たんぱく質活性部位中に存在するＨｉｓ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＬｙｓもしくはＴｙｒ残基に結合する能力、リン酸化たんぱく質もしくはペプチドに結合する能力、ならびに磁気をも有する部位を生じることを見出した。このことにより、当該分野の生化学者には、アッセイ方法において、更なる融通性を与えることが可能になった。
【０００９】
本発明者はまた、前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドを前記磁気ポリマー粒子に高収率でカップリングさせ、それにより、優れたＩＭＡＣ剤を製造することが可能になる方法も発明した。
【００１０】
第１の側面からは、従って、本発明は、カルボキシメチル化アスパラギン酸塩（asparate）キレートリガンドに結合した磁気ポリマー粒子を含む結合体（conjugate）を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
別の側面からは、本発明は、金属原子または金属イオンにキレートしているカルボキシメチル化アスパラギン酸塩リガンドに結合した磁気ポリマー粒子を含む結合体を提供する。
【００１２】
別の側面からは、本発明は、前記で定義したような結合体の製造方法に関し、その方法は、磁気ポリマー粒子をＣｍ−Ａｓｐキレートリガンドと反応させることを含む。
【００１３】
前記磁気ポリマー粒子（ＭＰＰ）に結合した前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドを、その非配位状態および金属に配位した状態（波線は、前記Ｃｍ−Ａｓｐと粒子との間の結合またはリンカーを意味する）の両方で以下に示す。
【００１４】
【化８】
2007519765.tif 000002
【００１５】
本発明の方法において用いられる磁気ポリマー粒子は、いずれの磁気ポリマー粒子であってもよく、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ−Ａ−４，６５４，２６７号に記載のようなものであってもよい。前記粒子は、多孔性のものであると、その孔中に超常磁性結晶が存在することが可能なので好ましい。前記磁気粒子の表面は、通常、官能化され、前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドが前記ポリマー粒子にカップリングできるようにされており、例えば、官能化されて、任意の公知の表面構造体、例えば、カルボキシル基、トシル基、アミノ基、エポキシ基、マレアミド基、チオール基等を有していてもよい。ゆえに、その表面は、Ｃｍ−Ａｓｐカップリングの前にアミン官能化されてもよい。その代わりに、アミン官能化表面はそれ自体、さらに官能化されて他の官能基、例えばＣＯＯＨ基を有してもよい。
【００１６】
前記ポリマー粒子は、ビニル系ポリマー（例えばスチレン）、アクリレート類および／またはメタクリレート類の組み合わせから形成されるのが好ましい。ポリマー系材料は、任意に架橋されてもよく、例えば、架橋剤、例えばコモノマーとして、例えばジビニルベンゼン（ＤＶＢ）またはエチレングリコールジメタクリレートの取り込みによる。必要な架橋剤（例えばコモノマー）の適切な量は、当業者にはよく知られているであろう。前記ポリマーは、架橋スチレン系ポリマー（例えば、スチレン−ジビニルベンゼンポリマー、ニトロ基含有コモノマー、例えばニトロスチレンの使用、およびその後の還元により表面官能化されている）または、エポキシ基含有コモノマー（例えば、グリシジルメタクリレート）の使用、およびその後のアミノ化（例えば、エチレンジアミンとの反応により）により表面官能化されている架橋（メタ）アクリルポリマーが好ましい。
【００１７】
本発明の方法で用いる前記ポリマー粒子における前記超常磁性結晶は、多孔性ポリマー粒子中の超常磁性結晶形態中に沈殿されることが可能な材料であればいずれも種類でもよい。磁気酸化鉄、例えばマグネタイトまたはマグヘマイトが好ましい；しかしながら、前記結晶は、所望であれば、混合金属酸化物または他の磁気材料の種類であってもよい。存在する結晶磁気材料の全体量は、通常１％より多く、好ましくは３％より多く、望ましくは５％またはそれより多い（重量比で、例えば４０重量％まで。割合は、被覆粒子の全体の乾燥重量を基にしたＦｅ（または酸化鉄以外の磁気材料の場合、同等の金属）重量基準を基に計算する。
【００１８】
本発明の様々な側面によるポリマー粒子は、通常マイクロメーター範囲のサイズ（すなわち直径）、例えば０．３から１００μｍ、特に０．５から５０μｍ、より特に０．８から８μｍ、例えば０．８から１．２μｍを通常有するであろう。
【００１９】
典型的には、用いられる前記多孔性粒子は、少なくとも１５ｍ2／ｇ（ＢＥＴ窒素吸着法により測定）の表面積、より好ましくは少なくとも３０ｍ2／ｇ、例えば、２．７μｍの平均粒子直径（すなわち、２．７／ＭＤまでの多表面積、ここでＭＤは、マイクロメーターでの平均直径である）に修正したとき７００ｍ2／ｇまでであろう。同様に縮尺を合わせたとき、前記粒子孔容積は、少なくとも０．１ｍＬ／ｇであるのが好ましい。
【００２０】
前記ポリマー粒子は、それらが被覆される前は、球状でありかつ、実質的には単分散であるのが典型的であり、一旦それら粒子が被覆されても球状のままであり、実質的に単分散であるのが特に好ましい。
【００２１】
実質的には単分散により、多数の粒子（例えば、少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１０００）について、前記粒子が、２０％より少ない、例えば１５％より少ない、好ましくは１２％より少ない、より好ましくは１１％より少ない、さらにより好ましくは１０％より少ない、最も好ましくは約８％以下、例えば２から５％の変動係数（ＣＶ）を有することを意味する。ＣＶは、以下のように割合で決定される。
【００２２】
【数１】
2007519765.tif 000003
【００２３】
前記式中、平均は、平均粒子直径であり、標準偏差は、粒子サイズにおける標準偏差である。ＣＶは、主最頻値を基に、すなわち、単峰性（monomodal）分布曲線を検出粒子サイズ分布に適合させることにより、計算されるのが好ましい。したがって、最頻値サイズより小さいかまたは大きい粒子の幾つかは、計算において無視されてもよく、例えば、約９０％（すなわち、検出可能な粒子の）の全粒子数を基にしてもよい。そのようなＣＶの測定は、コールター（Coulter）ＬＳ１３０粒子サイズ分析器で行うことができる。
【００２４】
前記ポリマー系材料の官能化は、重合の後、例えば、ニトロ化、次いで形成したニトロ基をペンダント・アミン基へ還元することにより；または、直接アミノ化、例えば、アミノエタノールで処理することにより、行うことができる。更なる別の選択肢としては、よく知られたUgelstadの２工程膨潤方法、および国際特許出願公報第ＷＯ００／６１６４７（Ｄｙｎｏ）に記載のその改良法により製造されたポリマー系粒子を用いてもよい。この公報に記載の方法に従い製造された多孔性ポリマー粒子は、標準的技術によりその孔中に磁気粒子を沈殿させてもよい。
【００２５】
更なる可能性としては、多孔性ポリマー粒子は、ニトロスチレンとＤＶＢと製造されてもよく、また、米国特許出願公開第ＵＳ−Ａ−４，６５４，２６７号に教示されたように導入された磁気材料であってもよい。
【００２６】
商標名ダイナビーズ（Dynabeads）、特にダイナビーズマイワン（Dynabeads MyOne）の名でダイナル・バイオテック・エイエスエー（Dynal Biotech ASA）により販売されている超常磁性ポリマービーズは、特に好ましい。ダイナビーズが特に有利である、というのも、ダイナビーズは、懸濁液中でそのままであり、他の磁気ビーズとしばしば関連した磁気粒子沈降を示さない。ダイナビーズはまた、高レベルの鉄が存在する他の磁気粒子と比較して優れた磁気可動性を示す。ダイナビーズは、反応時間を短くし、処理量を多くすることが可能になる有益な動態を示す。それらダイナビーズの非特異的結合は、他の磁気ビーズより低く、ダイナビーズの適切な使用により、より容易でより効率的な洗浄方法を生じる所望の材料に集結することになる。最後に、ダイナビーズ、例えば、マイワンビーズは、自動化するのが容易で単分散である。
【００２７】
前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドは、前記磁気ポリマー粒子に結合している。結合によりとは、前記リガンドが共有結合的に、任意に、以下に詳細に説明する連結基を用いて、前記ポリマー粒子に結合していることを意味する。前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドは、様々な方法により前記磁気ポリマー粒子に結合してもよいが、前記ポリマー粒子表面と前記Ｃｍ−Ａｓｐの窒素原子との間に少なくとも３つの連結原子が存在するのが好ましい。前記磁気ポリマー粒子表面から前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドを隔てる少なくとも５つの原子が存在するのが好ましく、前記磁気ポリマー粒子表面から前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドを隔てる６から２０の原子が存在するのがより好ましい。
【００２８】
前記磁気ポリマー粒子の表面を形成する原子は、前記リンカー／Ｃｍ−Ａｓｐリガンドとのカップリング寸前にその表面上にある原子である。したがって、前記磁気ポリマー粒子がその製造の間にいずれかの方法で活性化（例えば、硝酸処理および還元によりアミノ官能化表面を形成）されれば、前記磁気ポリマー粒子表面は、前記表面窒素原子により形成される。前記窒素原子は、前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドと前記粒子との間のリンカーの最初の原子を形成するであろう。求電子性表面、例えば、臭化物表面を有するように官能化された磁気粒子において、前記リンカーの最初の原子は、臭素を置き換えるものであろう。
【００２９】
したがって、好ましい実施形態において、本発明は、式（Ｉ）の結合体
【００３０】
【化９】
2007519765.tif 000004
【００３１】
（前記式中、ＭＰＰは磁気ポリマー粒子であり、波線は、少なくとも３つの原子、例えば３から２０の原子を含む連結基を意味する）または、金属イオンがキレートされているその類似体を提供する。
【００３２】
米国特許第ＵＳ  ６２４２５８１号においては、アスパラギン酸を、Ｃｍ−Ａｓｐリガンドを形成するカルボキシメチル化の前に固相にカップリングさせる。しかし、この技術を用いて磁気ポリマー粒子上にＣｍ−Ａｓｐ基を備えることは可能ではない。むしろ、本発明者は、前記磁気ポリマー粒子にカップリングする前に前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドが完全に形成されている別の合成を発明した。
【００３３】
この点で、前記ポリマー表面と前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドとの間に３つより少ない原子が存在するときには、カップリング収率が低いことが見出された。Ｃｍ−Ａｓｐ（米国特許出願公開第ＵＳ−Ａ−５９６２６４１号に説明のように）を有するアガロース支持体とは対照的に、前記磁気ポリマー粒子と前記Ｃｍ−Ａｓｐとの間のカップリング収率が比較的高いことを確実にすることが本発明において必要である。アガロース支持体の表面積は、ポリマー粒子の表面積より相当高く、したがって、Ｃｍ−Ａｓｐの前記（アガロース）支持体への結合は、有用なＩＭＡＣキレート剤について高収率で生じるよう達成する必要はない。本件において、収率は、充分なポリマー粒子が前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドを有することを確実にし、ゆえに、ＩＭＡＣが順調に行うことができることを確実にするよう、さらに高い必要がある。
【００３４】
少なくとも３つの原子のリンカーがアミノ基（−ＮＨ−）を有するのが好ましい。磁気ポリマービーズは、しばしば、スチレンポリマーを硝酸で処理し、その表面上にＮＯ2を形成して、形成される。これらの基の還元、例えばアンモニアを用いての還元の後、アミノ基が形成される。
【００３５】
したがって、前記リンカーは、求電子体の残基、すなわち、求核試薬と求電子体の反応の後、残っている基を含むのが好ましい。したがって、前記リンカーは、オキソ基（Ｃ＝Ｏ、エステル／カルボキシル基の残基）、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−基（エポキシドの残基）、−ＣＨ2−（ここで、前記求電子体は、例えば、ＣＨ2Ｈａｌである）を含んでもよい。前記リンカーは、前記Ｃｍ−Ａｓリガンドの窒素原子に実際の求電子性基を連結する多数の原子、例えば、アルキレン鎖またはエーテル鎖、例えば、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−もしくは−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−におけるアルキレン鎖またはエーテル鎖も組み込んでもよい。
【００３６】
したがって、式（Ｉ）中の波線は、−ＮＨ−Ｅｒ−Ｎ−を意味してもよく、前記式中、Ｅｒは２から２０の原子のリンカーを意味し、Ｅｒは求電子体残基（Ｅｒ）、例えば、−（ＣＨ2）n−（ここで、ｎは２から２０である）であり、Ｅｒは、前記粒子表面のアミノ基を前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドの窒素原子に連結する。
【００３７】
もちろん、求核基を有するように官能化されたＣｍ−Ａｓｐを有する求電子性基を有することは、磁気ポリマー粒子について本発明の範囲内である。前記粒子とリガンドのカップリングの他の方法は、技術のある化学者により工夫されるであろう。
【００３８】
特に好ましい実施形態において、炭素-炭素二重結合を有する粒子被覆が備えられている。これは、例えば、アリルまたはビニル化合物、例えばブテン酸と前記粒子の反応により、達成することができる。ヒドロキシ官能化粒子表面は、臭化アリルと反応し、前記粒子表面上に二重結合を形成することができる。また、カルボキシ官能化粒子表面は、アリルアミンと反応し、前記粒子表面上に二重結合を形成することができる。前記Ｃｍ−Ａｓｐは、その後、適切な化学を用いて二重結合に直接カップリングしてもよく、または、より好ましくは、二重結合は、その後、還元、例えば水性ハロゲンの存在下に還元されて、ハロゲン求電子体を生じてもよい。このハロゲン求電子体は、前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドと反応して、順調にカップリングすることを確実にしてもよい。
【００３９】
別の好ましい製造方法には、カルボキシル基を有するよう、前記磁気ポリマー粒子の表面を官能化させることを含む。カルボン酸基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応により活性化され、前述のようにＣｍ−Ａｓｐリガンドと反応させてもよい。
【００４０】
適切なリンカーには、したがって、２０までの原子を含む、アミノアルキレン、アミドアルキレン、エーテル、エステル、チオアルキレンまたはチオエステル、例えば、ＮＨ−アルキレン、ＮＨ−ＣＯ−アルキレン、Ｏ−アルキレン、ＯＣＯ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＳＣＯ−アルキレンを含む。前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドの窒素原子は、前記リンカーの一部を形成しない。
【００４１】
前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドも、前記磁気ポリマー粒子とカップリングする前に官能化されてもよい。例えば、前記粒子表面上の求電子性基との反応を助ける、第１の求核試薬を有する連結基を前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドが備えるのが有利であることが証明されている。前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドの窒素原子は、第２級である。この窒素原子は、おそらく立体的な束縛のため、前記粒子表面上の求電子性基、たとえばハロゲンと高収率で反応するには非常に非反応性であることが判明している。
【００４２】
したがって、少なくとも２つの原子を有し、求核試薬（例えば、アミン、ヒドロキシルまたはチオール基）を含むリンカーに前記Ｃｍ−Ａｓｐをカップリングさせるのが好ましい。前記リンカーは、アルキルアミン、例えばＣ５／６−アルキルアミンリンカーまたはエーテル／ポリエーテル橋架、例えば、１または２つの酸素原子および３から６の炭素原子を含むものが好ましい。前記リンカーを前記Ｃｍ−Ａｓｐ（その窒素原子を介して）へカップリングすることは、実施例で説明するように、公知の化学を用いて達成される。前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンド自体は、公知の化学を用いて製造することができる。全体のリンカーＣｍＡｓｐ構造体を合成することも可能である。
【００４３】
したがって、前記リンカーＣｍＡｓｐ構造体は、適切に保護されたアスパラギン酸化合物、例えば、前記カルボキシル基がエステル保護されているアスパラギン酸化合物から出発して製造することができる。この化合物は、式Ｈａｌ−Ｘ1−ＣＮ（前記式中、Ｘは、Ｃ1-9アルキレン基を意味し、Ｈａｌはハロゲン、例えばＢｒを意味する）の化合物（ここで、前記アスパラギン酸誘導体のアミノ基は、ハロゲン原子と置き換えられる）と反応することができる。生じた第２級アミノ化合物は、その後、Ｈａｌ−ＣＨ2ＣＯＯＰｒタイプ基（前記式中、Ｈａｌはハロゲン、例えばＢｒであり、Ｐｒは保護基である）と反応して、最終のメチレンカルボキシ基を導入し、前記Ｃｍ−Ａｓｐ構造体を形成してもよい。前記ニトリルの選択的還元、たとえば、水素および白金（ＩＶ）酸化物を用いる還元により、理想的なリンカーを生じ、必要であれば、そのリンカーは、その後脱保護してもよい。
【００４４】
したがって、さらなる側面からみれば、本発明は、式：
【００４５】
【化１０】
2007519765.tif 000005
【００４６】
（前記式中、各Ｒは独立して、水素または保護基を意味し、ＸはＣ2-20のアルキレンリンカー、特にＣ5/6−アルキレンを意味する）
の化合物の製造方法を提供し、前記方法は、
式Ｈａｌ−Ｘ1−ＣＮ（前記式中、Ｈａｌはハロゲンであり、Ｘ1はＣ1-19アルキレンリンカーを意味する）の化合物を、式：
【００４７】
【化１１】
2007519765.tif 000006
【００４８】
（前記式中、Ｐｒは保護基を意味する）
の化合物と反応させ、
生じた生成物と式Ｈａｌ−ＣＨ2ＣＯＯＰｒの化合物を反応させて化合物：
【００４９】
【化１２】
2007519765.tif 000007
【００５０】
を形成し、
（好ましくは保護基を除去することなく）
ニトリルをアミノ基へ還元することを含む。その後、これらは必要に応じて除去してもよい。熟練した化学者は、Ｘリンカーが、前記ニトリルから誘導されたＸ1リンカーよりも１つの炭素原子を多く有することが理解できるであろう。
【００５１】
熟練した化学者は、本発明において有用な前記Ｃｍ−Ａｓｐリンカー分子の合成方法をさらに工夫することが可能であろう。
【００５２】
別の側面から、本発明は、Ｃｍ−Ａｓｐリガンドに結合した磁気ポリマー粒子を含む結合体の製造方法を提供し、前記方法は、式（ＩＩ）：
【００５３】
【化１３】
2007519765.tif 000008
【００５４】
（前記式中、各Ｒは、独立して水素または保護基を意味し、Ｘは、２から２０の原子リンカー、例えばＣ2-10アルキレンリンカー、特にＣ5/6−アルキレンリンカーを意味する）
のＣｍ−Ａｓｐリガンドを磁気ポリマー粒子、例えば、求電子性被覆、例えば、エステル、エポキシド、アリル、アルキルハロゲン等被覆を有するよう１箇所官能化された磁気ポリマー粒子と反応させることを含む。
【００５５】
式（ＩＩ）の化合物および金属がキレートされているその類似体は、それら自体、新規であり、前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンド自体、すなわち式（ＩＩＩ）の化合物および金属がキレートされたその類似体と共に本発明の更なる側面を形成する。
【００５６】
【化１４】
2007519765.tif 000009
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態において、合成の間、前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドのカルボキシル基を保護する必要があるかもしれない。この保護は、公知の保護方法を用いることにより、例えば、当該分野で公知のように、酸または塩基中で加水分解することができるエステル保護を用いることにより、容易に達成することができる。
【００５８】
前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドは、任意の金属原子または金属イオンに配位することができる。金属により、は周期表の１から１３族の任意の金属、ランタニドもしくはアクチニドまたは金属Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｂ、Ａｓ、Ｓｂ、Ｂｉ、Ｔｅ、ＰｏもしくはＡｔを意味する。前記金属は、いずれのイオンであっても好ましく、遷移金属または１３族の金属が好ましい。好ましい金属イオンは、２＋または３＋の酸化状態にあるイオンである。前記金属イオンが２＋の酸化状態である場合、全体の粒子−リンカー−リガンド−金属イオンの集合体は、非荷電しており、そのことにより、非特異性結合の可能性が減少する。
【００５９】
好ましい金属は、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｍｎ、Ｃｏ、ＣｕおよびＺｎであり、そのうち、Ｆｅ、Ｇａ、ＭｎおよびＣｏが好ましく、特にＣｏ2+が好ましい。配位は、前記Ｃｍ−Ａｓｐを、例えば金属塩化物に暴露することにより容易に行うことができる。
【００６０】
結合金属を有する結合体は、一般に、ペプチド、たんぱく質または他のポリマー（例えば、抗体）に結合し、および結びつけるために用いることができ、ゆえに、多種多様なアッセイにおいて有用である。しかしながら、これらの結合体は、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーにより、標識されたかまたは天然のたんぱく質／ペプチドの単離において、特に有用である。特に、それら結合体は、ヒスチジン標識組換えたんぱく質／ペプチド、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓおよび／またはＴｙｒ含有天然たんぱく質および／またはペプチド、ならびにリン酸化たんぱく質またはペプチドの単離において有用である。特に好ましい、前記結合体は、ヒスチジン標識組換えたんぱく質／ペプチドの単離において、有用であるのが特に好ましい。したがって、別の側面から、本発明は、Ｃｍ−Ａｓｐリガンドに結合した磁気ポリマー粒子を含む結合体の使用を提供する。前記リガンドは、アッセイにおいて、金属原子またはイオンを配位する。適切なアッセイおよびこれらを行う方法は、熟練の生化学者に公知である。
【００６１】
例えば、本発明のＣｍ−Ａｓｐ官能化粒子上のヒスチジン−標識たんぱく質の捕捉には、種々の適用がある。単離されたたんぱく質の素早い反応動力学と穏やかな扱いやすさにより、この技術は大きなたんぱく質複合体の「引き下げ」によく適している。したがって、Ｃｍ−Ａｓｐ官能化ビーズは、質量スペクトロメトリ分析のためのサンプル調製に用いることができる。前記Ｃｍ−Ａｓｐ官能化ビーズで単離された複合体は、凹凸のある表面を有するカラムまたは他の固体支持体（他の磁気粒子を含む）で単離された複合体よりも無傷であり、したがって、質量スペクトロメトリのサンプル単離に用いられるのが理想的であると考えられている。
【００６２】
Ｃｍ−Ａｓｐ技術は、アッセイ方法において用いられる固相としても、作動することができる。Ｃｍ−Ａｓｐビーズは、凝集する傾向は無く、溶液中で非常に分散し、低い非特異性結合を示す。これらの特性により、高品質スクリーニング結果と、広範囲の自動化プラットフォームで容易に自動化できる実験計画を可能にする。前記Ｃｍ−Ａｓｐビーズは、また、おそらく固相としてファージ提示法において用いることができるか、または、ライブラリから発現ファージ提示法選択たんぱく質を精製するのに用いることができる。
【００６３】
したがって、一般に、ヒスチジン標識たんぱく質ならびに／またはＨｉｓ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓおよび／もしくはＴｙｒ残基含有天然たんぱく質もしくはペプチドの捕捉により、例えば、薬物発見、分子表示、アプタマー・スクリーニング、ファージ提示法、設計酵素スクリーニングおよび診断のため、ミクロスケールのたんぱく質精製、突然変異たんぱく質ライブラリの除去、たんぱく質／ペプチドの変性溶離、たんぱく質／ペプチドの穏やかな溶離、たんぱく質−たんぱく質相互作用研究およびスクリーニング技術が可能になりうる。
【００６４】
本発明を、以下の非限定的実施例を参照して、さらにここに説明する。
【実施例１】
【００６５】
実施例１
前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドの合成
以下のＣｍ−Ａｓｐトリエステルは、次のようにして製造する。
【００６６】
【化１５】
2007519765.tif 000010
【実施例２】
【００６７】
実施例２
Ｃｍ−Ａｓｐトリエステルの別の合成
【００６８】
【化１６】
2007519765.tif 000011
【００６９】
２−アミノ−コハク酸ジエチルエステルの合成
【００７０】
【化１７】
2007519765.tif 000012
【００７１】
ＤＬ−アスパラギン酸（９１．５ｇ、０．６９ｍｏｌ）の無水エタノール（８００ｍｌ）中の懸濁液に、０℃で塩化チオニル（１５０ｍｌ、２．０６ｍｏｌ）を滴下して加えた。冷却浴を除去して、混合物を３時間の間還流した。周囲温度に冷却した後、溶媒を真空下に蒸発させ、残渣にＫ2ＣＯ3の飽和水溶液をｐＨ８まで添加した。水相を酢酸エチルで抽出し（ｘ３）、合わせた有機相をブラインで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、ろ過し、真空下に蒸発させて化合物１の１２４．８ｇ（９６％）を黄色油状物として生じた。粗製生物を次の工程で直接用いた。
【００７２】
【数２】
2007519765.tif 000013
【００７３】
２−（４−シアノ−ブチルアミノ）−コハク酸ジエチルエステルの合成
【００７４】
【化１８】
2007519765.tif 000014
【００７５】
１（９３．０ｇ、０．４９ｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（３４．０ｇ、０．２５ｍｏｌ）およびＫＩ（１２．３ｇ、０．０７ｍｏｌ）のＴＨＦ（６００ｍｌ）中懸濁液に、５−ブロモバレロニトリル（２８．４ｍｌ、０．２５ｍｏｌ）を滴下して添加した。反応混合物を還流加熱して５日間攪拌した。周囲温度に冷却した後、混合物をろ過し、ろ液を真空下に蒸発させた。ヘキサン／酢酸エチル（７：３）で溶離するシリカゲルでの精製により、６４．１ｇ（９７％）の化合物２を黄色油状物として生じた。
【００７６】
【数３】
2007519765.tif 000015
【００７７】
２−［（４−シアノ−ブチル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−コハク酸ジエチルエステルの合成
【００７８】
【化１９】
2007519765.tif 000016
【００７９】
２（８６．６ｇ、０．３２ｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（４４．３ｇ、０．３２ｍｏｌ）およびＫＩ（１６．０ｇ、０．１０ｍｏｌ）のＴＨＦ（６５０ｍｌ）中の混合物に、ブロモ酢酸エチルエステル（４２．５ｍｌ、０．３８ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を加熱還流し、５日間攪拌した。周囲温度まで冷却した後、混合物をろ過し、ろ液を真空下に蒸発させた。ヘキサン／酢酸エチル（８：２）で溶離するシリカゲルでの精製により、１０３．７ｇ（９１％）の化合物３を生じた。
【００８０】
【数４】
2007519765.tif 000017
【００８１】
２−［（５−アミノ−ペンチル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−コハク酸ジエチルエステルの合成
【００８２】
【化２０】
2007519765.tif 000018
【００８３】
３（１５ｇ、４２ｍｍｏｌ）の９５％エタノール（６０ｍｌ）および濃ＨＣｌ（１０ｍｌ）の溶液に、ＰｔＯ2（６００ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）の９５％エタノール（２０ｍｌ）中の懸濁液を添加した。反応混合物に５０ｐｓｉで一晩中水素添加した。前記混合物をろ過し、ろ液を真空下に蒸発させ、一晩中空気を吸い出して、定量収率の標題化合物をＨＣｌ塩として生じた。
【００８４】
【数５】
2007519765.tif 000019
【実施例３】
【００８５】
実施例３：
臭素化
０．５ｍｍｏｌ／ｇアリル基を有する磁気スチレン粒子のメタノール懸濁液の１７．３ｇを、４５ｍＬ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．９）で４回洗浄した。粒子含有量を９重量％へ調節した後、１０ｍＬＤＭＦ中に溶解された０．９６ｇのピリジニウムトリブロマイドを、３５０ｒｐｍで攪拌しながら添加した。室温で５分後、前記粒子を５回４５ｍＬ脱イオン水で洗浄した。
【実施例４】
【００８６】
実施例４：
Ｃｍ−Ａｓｐキレート化合物による官能化
実施例３におけるように製造した粒子の懸濁液の１８．０ｇを、２０ｍＬの５０ｍＭの炭酸水素ナトリウムで３回洗浄した。粒子含有量を１２重量％に調節した。その懸濁液に、０．１７ｇのＣｍ−Ａｓｐトリエステル（実施例１で説明のように製造）を添加した。５０ｍＭの炭酸水素ナトリウムを、粒子含有量が１０重量％に達するまで添加した。反応混合物を、６００ｒｐｍで４０℃で１５時間の間振盪した。前記粒子をその後、２０ｍＬの脱イオン水で４回洗浄した。
【実施例５】
【００８７】
実施例５：
加水分解
実施例４におけるように製造した粒子の懸濁液の２０．０ｇを、２０ｍＬの１Ｍの水酸化リチウムで２回洗浄した。粒子含有量を１０重量％に調節した後、混合物を２５０ｒｐｍで４時間の間室温で振盪した。前記粒子をその後、脱イオン水でｐＨ６〜７まで洗浄した。
【実施例６】
【００８８】
実施例６：
一般的な金属負荷条件
実施例５におけるように製造した粒子の２５０ｍｇを、５ｍｌの逆浸透水で２回洗浄し、ついで、１５分間超音波処理する。５ｍｌの１０ｍＭ金属塩（ＭＸ）を前記粒子に添加し、３０分間保温する。管を磁石中に配置し、上澄み液を除去する。前記粒子を５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（０，０１％トゥイーン２０、ｐＨ７，４）で２回洗浄する。前記粒子をその後、２０％エタノールで１度洗浄する。前記粒子を２０％エタノール中で保管する。
【００８９】
以下のＭＸ＝ＣｏＣｌ2、ＣｕＳＯ4、ＦｅＣｌ3、ＧａＣｌ2、ＧａＣｌ3、ＭｎＳＯ4、ＭｇＣｌ2、ＮｉＣｌ2、ＣａＳＯ4、ＺｎＣｌ2の金属塩を用いた。
【実施例７】
【００９０】
実施例７
カルボン酸基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルへの官能化
マイワンカルボン酸ビーズ（ダイナル・バイオテック・エイエスエー）の粒子の５．０ｇの懸濁液５０．０ｇを、０．１Ｍ酢酸（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄することにより酸性化した。酸性化した粒子（０．５ｍｍｏｌｅ／ｇ  ＤＳのカルボン酸含有量を有している）を、その後、アセトン（４ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、磁石上で集めた。余分なアセトンを懸濁液全体が３５．６ｇに達するまで添加した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．９０ｇ、２５ｍｍｏｌｅ）とジイソプロピルカルボジイミド（３．１６ｇ、２５ｍｍｏｌｅ）をその後、添加した。反応混合物を室温で５時間の間攪拌した。前記粒子をその後、アセトン（５ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。
【実施例８】
【００９１】
実施例８：
Ｃｍ−Ａｓｐキレート化合物での官能化
実施例７のビーズのアセトン懸濁液４４ｇを、５０ｍＬのイソプロパノールで３回洗浄した。粒子含有量を１２重量％に調節した後、５．６ｇのトリエチルアミンを添加した。イソプロパノールに溶解した０．１０ｇのＣｍ−Ａｓｐトリエステル（実施例１で説明したように製造）をその後添加した。これにより、粒子含有量は１０重量％になる。反応混合物をその後、２５０ｒｐｍで室温で２０時間の間振盪した。前記粒子を５０ｍＬのイソプロパノールで３回洗浄した。
【実施例９】
【００９２】
実施例９：
Ｃｍ−Ａｓｐキレート化合物およびエタノールアミンでの官能化
実施例８におけるように製造した粒子のイソプロパノール懸濁液の１０ｇに、０．３２ｇのエタノールアミンを添加した。反応混合物をその後、２５０ｒｐｍで室温で１８時間の間振盪した。前記粒子をその後、１０ｍＬのイソプロパノールで３回洗浄した。
【実施例１０】
【００９３】
実施例１０
Ｃｍ−Ａｓｐキレート化合物での官能化
１，２グラムの乾燥ダイナビーズ２７０エポキシを、８，８グラムの５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムと混合した。この懸濁液に、０，１７グラムのＣｍ−Ａｓｐトリエステル（実施例１で説明したように製造）を添加し、反応混合物を６００ｒｐｍで６０℃で１６時間の間振盪した。前記粒子を２０ｍｌの脱イオン水で４回洗浄することにより後処理する。
【実施例１１】
【００９４】
実施例１１
ヒスチジン−標識組換えたんぱく質の精製
１．  実施例６におけるように製造したＣｏ2+を有する粒子の懸濁液２ｍｇを、７００μｌの５０ｍＭのＮａ−リン酸塩、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％トゥィーン（登録商標）−２０で洗浄した。
２．  上澄み液を除去し、前記粒子を１００μｌの工程１と同じ緩衝液中に再懸濁させた。
３．  発現組換えヒスチジン−標識たんぱく質を有する溶解大腸菌の懸濁液を、前記粒子懸濁液に添加した。全容量を工程１と同じ緩衝液で７００μｌに調節した。この懸濁液を１０分間の間、保温した。
４．  上澄み液を除去し、結合ヒスチジン−標識たんぱく質を有する前記粒子を、工程１と同じ緩衝液の７００μｌで４回洗浄した。
５．  前記ヒスチジン標識たんぱく質を１００μｌの１５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭのＮａ−リン酸塩、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、０，０１％のトゥィーン（登録商標）−２０中で溶離した。
６．  精製したたんぱく質を、ＳＤＳ−トリス−ＨＣｌポリアクリルアミドゲルおよびブロムフェノールブルー染色により分析した。
【実施例１２】
【００９５】
実施例１２
リン酸化ペプチドの精製
１．  実施例６におけるように製造したＦｅ3+を有する粒子の懸濁液２ｍｇを、５００ｍｌの５％酢酸で２回洗浄した。
２．  上澄み液を除去し、１００μｌの１０％酢酸を添加した。１００μｌの３０μｇトリプシン処理（ｔｒｙｐｓｉｎａｔｅｄ）ｂ−カゼインを添加した。これを３０分間保温した。
３．  上澄み液を除去して、結合リン酸化ペプチドを有する粒子を２５０μｌの１％酢酸で２回洗浄した。
４．  上澄み液を除去し、結合リン酸化ペプチドを有する粒子を２５０μｌの０，１％酢酸、１０％アセトニトリルで２回洗浄した。
５．  上澄み液を除去し、結合リン酸化ペプチドを有する粒子を２５０μｌのＨ2Ｏで洗浄した。
６．  前記リン酸化ペプチドを、５０μｌの０，１Ｍ炭酸水素アンモニウムで溶離した。
７．  精製したリン酸化ペプチドをＨＰＬＣにより分析した。
【実施例１３】
【００９６】
実施例１３
金属結合たんぱく質の精製
１．  実施例６におけるように製造したＭｎ2+を有する粒子の懸濁液の２ｍｇを、２５０μｌ酢酸緩衝液ｐＨ４．０、２５０ｍＭのＮａＣｌで２回洗浄した。
２．  上澄み液を除去し、２５０ｍｌの工程１と同じ緩衝液を添加した。３０μｇ（３μｌ）のＭｎ結合たんぱく質を添加した。これを１０分間保温した。
３．  上澄み液を除去し、結合たんぱく質を有する粒子を２５０μｌの工程１と同じ緩衝液で２回洗浄した。
４．  Ｍｎ−結合たんぱく質を５０μｌの０，１Ｍ炭酸水素アンモニウムで溶離した。
５．  溶離たんぱく質をＳＤＳ−トリス−ＨＣｌポリアクリルアミドゲルおよび銀染色により分析した。
【国際調査報告】
2007519765.tif 000027
2007519765.tif 000028
2007519765.tif 000029
2007519765.tif 000030