(57)【要約】  本発明は、健常ドナーから、新生物に特異的である、抗体のようなポリペプチドを同定する方法、こうした方法を使用して同定されたポリペプチド、そして新生物の治療及び診断におけるそれらの使用を特色とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
新生物細胞へ特異的に結合し、そして非新生物細胞へは結合しない、単離されたポリペプチドを同定するための方法であって、（１）健常ドナーに由来する単離された細胞を提供し、（２）細胞により産生されたポリペプチドを単離し、そして（３）該ポリペプチドが新生物細胞へ特異的に結合するか、そして非新生物細胞へは結合しないかどうかを決定する工程を含む、該方法。
【請求項２】
該新生物細胞が神経芽腫細胞ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（１）がさらに、該単離された細胞を不死化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該不死化することが、該単離された細胞とミエローマ又はヘテロミエローマ細胞を融合することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（３）が、該新生物細胞及び該非新生物細胞と該ポリペプチドを接触させることが、該新生物細胞においてアポトーシスを誘導するか、そして該非新生物細胞においては誘導しないかどうかを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（３）が、該新生物細胞及び該非新生物細胞と該ポリペプチドを接触させることが、該新生物細胞の増殖を減少させるか、そして該非新生物細胞の増殖を減少させないかどうかを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該新生物細胞が癌腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該癌腫が、結腸の腺癌、散在型胃癌腫、膵臓の腺癌又は肺の腺癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該ポリペプチドが抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該抗体がＩｇＭ抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
該ドナーがヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該単離された細胞が脾臓細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該単離された細胞がリンパ節に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該単離された細胞が血液に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該単離された細胞がリンパ球である、請求項１３、１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１の方法を使用して同定されたポリペプチドを発現する、単離された細胞。
【請求項１８】
配列番号１又は３のアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド。
【請求項１９】
該ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項２０】
該ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号５又は７のアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド。
【請求項２２】
該ポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項２３】
該ポリペプチドが配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号１の３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０７又は配列番号３の２３〜３３、４９〜５５及び８８〜９９のアミノ酸を含む、精製されたポリペプチド。
【請求項２５】
該ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０７を含む、請求項２４に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項２６】
該ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸２３〜３３、４９〜５５及び８８〜９９を含む、請求項２４に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号５の３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０８又は配列番号７の２３〜３６、５２〜５８及び９１〜１０１のアミノ酸を含む、精製されたポリペプチド。
【請求項２８】
該ポリペプチドが配列番号５のアミノ酸３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０８を含む、請求項２７に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項２９】
該ポリペプチドが配列番号７のアミノ酸２３〜３６、５２〜５８及び９１〜１０１を含む、請求項２７に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項３０】
該ポリペプチドが抗体又はそれらの機能性断片である、請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項３１】
該抗体がモノクローナル抗体又はそれらの機能性断片である、請求項３０に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項３２】
該機能性断片が、ＶＬ、ＶＨ、ＦＶ、ＦＣ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２から成る群より選択される、請求項３０に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項３３】
該ポリペプチドが結腸の腺癌、散在型胃癌腫、膵臓の腺癌及び肺の腺癌へ特異的に結合し、そして同一組織型の非新生物細胞へは結合しない、請求項３０に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項３４】
該機能性断片が、配列番号１の３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０７又は配列番号３の２３〜３３、４９〜５５及び８８〜９９のアミノ酸を含む、抗体の機能性断片。
【請求項３５】
該機能性断片が、配列番号５の３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０８又は配列番号７の２３〜３６、５２〜５８及び９１〜１０１のアミノ酸を含む、抗体の機能性断片。
【請求項３６】
該機能性断片が、モノクローナル抗体の機能性断片である、請求項３４又は３５に記載の機能性断片。
【請求項３７】
該機能性断片が、抗体のＶＬ鎖である、請求項３４又は３５に記載の機能性断片。
【請求項３８】
新生物細胞へ特異的に結合するが、非新生物細胞へは結合しない精製されたポリペプチドであって、結腸の腺癌、散在型胃癌腫、膵臓の腺癌及び肺の腺癌へ特異的に結合するが、同一組織型の非新生物細胞へは結合せず、そして配列番号１又は配列番号３の完全長配列と実質的に同一である、該精製されたポリペプチド。
【請求項３９】
該ポリペプチドが、ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ３８３）、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ１９６）、ＣＡＣＯ−２（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ１６９、ＡＴＣＣ受入番号ＨＢＴ−３７）、Ｃｏｌｏ−２０６Ｆ（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２１）、２３１３２／８７（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２０１）、ＡＳＰＣ−１（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１６８２）、ＤＵ−１４５（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２６１、ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−８１）及びＢＭ１６０４（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２９８）細胞の少なくとも一つへ特異的に結合する、請求項３８に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項４０】
該ポリペプチドが、該新生物細胞においてアポトーシスを誘導するが、該非新生物細胞においては誘導しない、請求項３９に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項４１】
該ポリペプチドが、新生物細胞の増殖を減少させるが、該非新生物細胞の増殖を減少させない、請求項３９に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項４２】
新生物細胞へ特異的に結合するが、非新生物細胞へは結合しない精製されたポリペプチドであって、結腸の腺癌、散在型胃癌腫、膵臓の腺癌及び肺の腺癌へ特異的に結合するが、同一組織型の非新生物細胞へは結合せず、そして配列番号５又は配列番号７の完全長配列と実質的に同一である、該精製されたポリペプチド。
【請求項４３】
該ポリペプチドが、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ１９６）、ＣＡＣＯ−２（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ１６９、ＡＴＣＣ受入番号ＨＢＴ−３７）、２３１３２／８７（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２０１）、ＤＵ−１４５（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２６１、ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−８１）及びＢＭ１６０４（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２９８）細胞の少なくとも一つへ特異的に結合する、請求項４２に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項４４】
該ポリペプチドが、該新生物細胞においてアポトーシスを誘導するが、該非新生物細胞においては誘導しない、請求項４３に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項４５】
該ポリペプチドが、新生物細胞の増殖を減少させるが、該非新生物細胞の増殖を減少させない、請求項４３に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項４６】
該ポリペプチドがまた、ＤＳＭＺ寄託受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６２４を有するＮＯＲＭ−１細胞株によっても産生される、請求項１８〜２０、２４〜２６、３４及び３６〜４１のいずれか一項に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項４７】
該ポリペプチドがまた、ＤＳＭＺ寄託受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６２６を有するＮＯＲＭ−２細胞株によっても産生される、請求項２１〜２３、２７〜２９、３５〜３７及び４２〜４５のいずれか一項に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項４８】
配列番号２の配列を含む単離された核酸分子。
【請求項４９】
配列番号４の配列を含む単離された核酸分子。
【請求項５０】
配列番号６の配列を含む単離された核酸分子。
【請求項５１】
配列番号８の配列を含む単離された核酸分子。
【請求項５２】
配列番号２の９１〜１０５、１４８〜１９８及び２９５〜３２１又は配列番号４の６７〜９９、１４５〜１６５及び２６２〜２９７の核酸を含む、単離された核酸分子。
【請求項５３】
該核酸分子が、配列番号２の核酸９１〜１０５、１４８〜１９８及び２９５〜３２１を含む、請求項５２に記載の単離された核酸分子。
【請求項５４】
該核酸分子が、配列番号４の核酸６７〜９９、１４５〜１６５及び２６２〜２９７を含む、請求項５２に記載の単離された核酸分子。
【請求項５５】
配列番号６の９１〜１０５、１４８〜１９８及び２９５〜３２４又は配列番号８の６７〜１０８、１５４〜１７４及び２７１〜３０３の核酸を含む、単離された核酸分子。
【請求項５６】
該核酸分子が、配列番号６の核酸９１〜１０５、１４８〜１９８及び２９５〜３２４を含む、請求項５５に記載の単離された核酸分子。
【請求項５７】
該核酸分子が、配列番号８の核酸６７〜１０８、１５４〜１７４及び２７１〜３０３を含む、請求項５５に記載の単離された核酸分子。
【請求項５８】
請求項４８〜５７のいずれか一項の核酸配列を含むベクター。
【請求項５９】
請求項５８のベクターを含む単離された細胞。
【請求項６０】
請求項１８〜２９のいずれか一項のポリペプチドを発現する、単離された細胞。
【請求項６１】
該単離された細胞が哺乳動物細胞である、請求項６０に記載の単離された細胞。
【請求項６２】
該哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項６１に記載の単離された細胞。
【請求項６３】
該ポリペプチドが抗体である、請求項６２に記載の単離された細胞。
【請求項６４】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項６３に記載の単離された細胞。
【請求項６５】
該抗体がＩｇＭ抗体である、請求項６３に記載の単離された細胞。
【請求項６６】
請求項１８〜２９のいずれか一項の精製されたポリペプチドを産生する方法であって、細胞と請求項５８のベクターを接触させ、そして該細胞により発現されたポリペプチドを単離することを含む、該方法。
【請求項６７】
哺乳動物の新生物を診断する方法における、請求項１８〜２９のいずれか一項の精製されたポリペプチドの使用であって、該方法は（ａ）該哺乳動物に由来する細胞又は組織試料と請求項１８〜２９のいずれか一項の精製されたポリペプチドを接触させ、そして（ｂ）該精製されたポリペプチドが該細胞又は組織試料へ結合するかどうかを検出する工程を含んでなり、ここにおいて、該細胞又は組織試料への該精製されたポリペプチドの結合は新生物を有する該哺乳動物の指標である、前記使用。
【請求項６８】
該哺乳動物がヒトである、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
該ポリペプチドが抗体である、請求項６７に記載の使用。
【請求項７０】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項６９に記載の使用。
【請求項７１】
該ポリペプチドが、放射性核種、蛍光マーカー、酵素、細胞毒素、サイトカイン及び増殖阻害剤から成る群より選択される検出可能な作用剤へコンジュゲートされている、請求項６７に記載の使用。
【請求項７２】
該検出可能な作用剤が、該細胞のアポトーシスを誘導することが可能である、請求項７１に記載の使用。
【請求項７３】
該ポリペプチドがタンパク質精製タグへコンジュゲートされている、請求項６７に記載の使用。
【請求項７４】
該タンパク質精製タグが切断可能である、請求項７３に記載の使用。
【請求項７５】
哺乳動物の増殖性障害を治療する方法における、請求項１８〜２９のいずれか一項の精製されたポリペプチドの使用であって、該方法は、細胞と請求項１８〜２９のいずれか一項の精製されたポリペプチドを接触させる工程を含んでなり、ここにおいて、該細胞への該精製されたポリペプチドの結合は、該細胞の増殖の減少を生じる、前記使用。
【請求項７６】
該哺乳動物がヒトである、請求項７５に記載の使用。
【請求項７７】
該ポリペプチドが抗体である、請求項７５に記載の使用。
【請求項７８】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項７７に記載の使用。
【請求項７９】
該ポリペプチドが、放射性核種、蛍光マーカー、酵素、細胞毒素、サイトカイン及び増殖阻害剤から成る群より選択される検出可能な作用剤へコンジュゲートされている、請求項７５に記載の使用。
【請求項８０】
該検出可能な作用剤が、該細胞の細胞増殖を抑制することが可能である、請求項７９に記載の使用。
【請求項８１】
該ポリペプチドがタンパク質精製タグへコンジュゲートされている、請求項７５に記載の使用。
【請求項８２】
該タンパク質精製タグが切断可能である、請求項８１に記載の使用。
【請求項８３】
薬学的に許容できる坦体中に、請求項１８〜２９のいずれか一項の精製されたポリペプチドを含む医薬品。
【請求項８４】
請求項１８〜２９のいずれか一項の精製されたポリペプチドを含む診断剤。
【請求項８５】
ＤＳＭＺ受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６２４を有する、抗体産生細胞株。
【請求項８６】
請求項８５の細胞株により産生された抗体。
【請求項８７】
ＤＳＭＺ受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６２６を有する、抗体産生細胞株。
【請求項８８】
請求項８７の細胞株により産生された抗体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、癌診断及び治療の分野、そしてより具体的には、哺乳動物、例えば、ヒトにおける新生物の診断、検出、モニタリング及び治療において有用な、抗体のようなポリペプチドの、健常ドナーからの同定に関する。
【０００２】
米国において、毎年百万をはるかに超える個体が癌と診断されている。医学分野における最近の進歩は、癌患者の生存の比率を著しく改良しているが、今もなお多数の癌関連死は、腫瘍の早期診断により防がれるかもしれない。従って、最初の診断時に、憂慮すべき数の患者が、すでに疾患の後期段階に到達している。
【０００３】
結腸直腸癌に関しては、疾患が広がりそして末期段階に達するまで腫瘍はしばしば検出されないので、通常、全ての症例の５０％で予後が不良である。明らかに、新生物（例えば、胃腺癌、結腸直腸腺癌、肺腺癌、膵臓の腺癌）の早期そして改良された検出及び治療が必要であり、このことは新生物を治療する機会を増加させ、それにより長期生存のための改良された予後を導くであろう。
【０００４】
発明の要旨
健常ドナーに由来する細胞を使用し、我々は新生物細胞に特異的なエピトープと反応するポリペプチドのクラスを発見した。これらのポリペプチドは優秀な診断道具であるのみでなく、それらが結合する新生物細胞のアポトーシスも誘導することが可能である。この後者の特性は、多くの現存する療法の副作用を欠く、新生物疾患のための治療を結果として生じる。加えて、健常ドナーが、新生物特異的ポリペプチドを発現する細胞を宿すことが可能であるという我々の発見は、癌のような新生物の診断及び治療に使用することが可能であるポリペプチドを同定する方法において、健常ドナーに由来する細胞及び組織の新規使用を提供する。
【０００５】
従って、第１の側面において、本発明は、新生物細胞へ特異的に結合し、そして非新生物細胞へは結合しない、単離されたポリペプチド、例えば、モノクローナル抗体のような抗体を同定するための方法を特色とする。この方法は、（１）健常ドナー、例えば、ヒトに由来する単離された細胞を提供し、（２）細胞により産生されたポリペプチドを単離し、そして（３）ポリペプチドが新生物細胞へ特異的に結合するか、そして非新生物細胞へは結合しないかどうかを決定する工程を包含する。
【０００６】
第１の側面の望ましい態様において、新生物細胞は神経芽腫細胞ではない。他の望ましい態様において、工程（１）はまた、例えば、単離された細胞とミエローマ又はヘテロミエローマ細胞を融合することにより、単離された細胞を不死化することを含み、そして工程（３）は、新生物細胞及び非新生物細胞とポリペプチドを接触させることが、新生物細胞においてアポトーシスを誘導するか、そして非新生物細胞においては誘導しないかどうかを決定することを含んでいる。第１の側面のさらに望ましい態様において、工程（３）は、新生物及び非新生物細胞とポリペプチドを接触させることが、新生物細胞の増殖を減少させ、そして非新生物細胞の増殖を減少させないかどうかを決定することを含んでいる。例えば、新生物細胞は、結腸の腺癌、散在型胃癌腫、膵臓の腺癌又は肺の腺癌のような癌腫であってもよい。加えて、抗体はＩｇＭでも又はモノクローナル抗体であってもよい。さらに、工程（１）の単離された細胞は、リンパ球、例えば、脾臓、リンパ節あるいは血液に由来するリンパ球であってもよい。
【０００７】
第２の側面において、本発明は、本発明の第１の側面の方法を使用して同定されたポリペプチドを発現する、単離された細胞を特色とする。
本発明の第３の側面は、配列番号１又は３のアミノ酸配列を包含する、精製されたポリペプチドを特色とし；本発明の第４の側面は、配列番号１及び３のアミノ酸配列を包含する、精製されたポリペプチドを特色とし；本発明の第５の側面は、配列番号５又は７のアミノ酸配列を包含する、精製されたポリペプチドを特色とし；本発明の第６の側面は、配列番号５及び７のアミノ酸配列を包含する、精製されたポリペプチドを特色とし；本発明の第７の側面は、配列番号１のアミノ酸３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０７又は配列番号３のアミノ酸２３〜３３、４９〜５５及び８８〜９９を包含する精製されたポリペプチドを特色とし；そして本発明の第８の側面は、配列番号５のアミノ酸３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０８又は配列番号７のアミノ酸２３〜３６、５２〜５８及び９１〜１０１を包含する精製されたポリペプチドを特色とする。第３から第８の側面の望ましい態様において、ポリペプチドは抗体、例えば、モノクローナル抗体、又はそれらの機能性断片である。例えば、機能性断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＦＶ、ＦＣ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２から成る群より選択することができる。加えて、機能性断片は、配列番号１のアミノ酸３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０７、配列番号３のアミノ酸２３〜３３、４９〜５５及び８８〜９９、配列番号５のアミノ酸３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０８、又は配列番号７のアミノ酸２３〜３６、５２〜５８及び９１〜１０１を包含することができ、そして望ましくは抗体のＶＬ鎖である。さらに、機能性断片は、結腸の腺癌、散在型胃癌腫、膵臓の腺癌及び／又は肺の腺癌へ特異的に結合することができるが、同一組織型の非新生物細胞へは結合することはできない。
【０００８】
第９の側面において、本発明は、結腸の腺癌、散在型胃癌腫、膵臓の腺癌及び肺の腺癌へ特異的に結合するが、同一組織型の非新生物細胞へは結合しない、精製されたポリペプチドを特色とする。加えて、第９の側面のポリペプチドは、配列番号１及び／又は配列番号３の完全長配列と実質的に同一である（例えば、少なくとも８０％）アミノ酸配列を包含する。例えば、ポリペプチドは、配列番号２又は４の完全長核酸配列と実質的に同一である核酸配列によりコードされたものであってもよい。本発明の第９の側面の望ましい態様において、ポリペプチドは、ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; German Collection of Microorganisms and Cell Cultures ）受入番号ＡＣＣ３８３）、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ１９６）、ＣＡＣＯ−２（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ１６９、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection ）受入番号ＨＴＢ−３７）、Ｃｏｌｏ−２０６Ｆ（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２１）、２３１３２／８７（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２０１）、ＡＳＰＣ−１  （ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１６８２）、ＤＵ−１４５（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２６１、ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−８１）及びＢＭ１６０４（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２９８）細胞へ特異的に結合する。
【０００９】
本発明の第９の側面の他の望ましい態様において、ポリペプチドは新生物細胞においてアポトーシスを誘導するが、非新生物細胞においてはアポトーシスを誘導せず、あるいは、ポリペプチドは新生物細胞の増殖を減少させるが、非新生物細胞の増殖は減少させない。
【００１０】
本発明の第１０の側面は、結腸の腺癌、散在型胃癌腫、膵臓の腺癌及び肺の腺癌へ特異的に結合するが、同一組織型の非新生物細胞へは結合しない、精製されたポリペプチドを特色とする。加えて、第１０の側面のポリペプチドは、配列番号５及び／又は配列番号７の完全長配列と実質的に同一である（例えば、少なくとも８０％）アミノ酸配列を包含する。例えば、ポリペプチドは、配列番号６又は８の完全長核酸配列と実質的に同一である核酸配列によりコードされたものであってもよい。本発明の第１０の側面の望ましい態様において、ポリペプチドは、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ１９６）、ＣＡＣＯ−２（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ１６９、ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−３７）、２３１３２／８７（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２０１）、ＤＵ−１４５（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２６１、ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−８１）及びＢＭ１６０４（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２９８）細胞へ特異的に結合する。
【００１１】
本発明の第１０の側面の他の望ましい態様において、ポリペプチドは新生物細胞においてアポトーシスを誘導するが、非新生物細胞においてはアポトーシスを誘導せず、あるいは、ポリペプチドは新生物細胞の増殖を減少させるが、非新生物細胞の増殖は減少させない。
【００１２】
本発明の第３から第１０の側面の追加の望ましい態様において、ポリペプチドはまた、ＤＳＭＺ寄託受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６２４を有するＮＯＲＭ−１細胞株、又はＤＳＭＺ寄託受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６２６を有するＮＯＲＭ−２細胞株によっても産生される。
【００１３】
本発明の第１１の側面は、配列番号２の配列を包含する、単離された核酸分子を特色とし；本発明の第１２の側面は、配列番号４の配列を包含する、単離された核酸分子を特色とし；本発明の第１３の側面は、配列番号６の配列を包含する、単離された核酸分子を特色とし；本発明の第１４の側面は、配列番号８の配列を包含する、単離された核酸分子を特色とし；本発明の第１５の側面は、配列番号２の核酸９１〜１０５、１４８〜１９８及び２９５〜３２１又は配列番号４の核酸６７〜９９、１４５〜１６５及び２６２〜２９７を包含する、単離された核酸分子を特色とし；そして、本発明の第１６の側面は、配列番号６の核酸９１〜１０５、１４８〜１９８及び２９５〜３２４又は配列番号８の核酸６７〜１０８、１５４〜１７４及び２７１〜３０３を包含する、単離された核酸分子を特色とする。望ましい態様において、本発明は、高度にストリンジェントな条件下、配列番号２、４、６又は８の配列、又はそれらの機能性断片へハイブリダイズする核酸分子を特色とする。他の望ましい態様において、第１５の側面の核酸分子は、配列番号２の核酸３２７−３５７又は配列番号４の核酸２９１〜３００を包含することができる。第１７の側面において、本発明は、本発明の第１１から第１６の側面のいずれか一つの核酸配列を含むベクターを特色とする。本発明の第１８の側面は、第１７の側面のベクターを含む、単離された細胞を特色とする。
【００１４】
第１９の側面において、本発明は、本発明の第３から第８の側面のいずれか一つのポリペプチドを発現する単離された細胞を特色とする。第１９の側面の望ましい態様において、単離された細胞は、ヒト細胞のような哺乳動物細胞である。第１９の側面の他の望ましい態様において、細胞により発現されたポリペプチドは抗体、例えば、ＩｇＭ抗体又はモノクローナル抗体である。
【００１５】
第２０の側面において、本発明は、本発明の第３から第８の側面のいずれか一つの精製されたポリペプチドを産生する方法を特色とする。この方法は、細胞と本発明の第１７の側面のベクターを接触させ、そして細胞により発現されたポリペプチドを単離することを含んでいる。
【００１６】
第２１の側面において、本発明は、哺乳動物の新生物を診断する方法における、本発明の第３から第８の側面のいずれか一つの精製されたポリペプチドの使用を特色とする。この方法は、（ａ）哺乳動物に由来する細胞又は組織試料と、本発明の第３から第８の側面のいずれか一つの精製されたポリペプチドを接触させ、そして（ｂ）精製されたポリペプチドが細胞へ結合するかどうかを検出する工程を含んでおり、ここにおいて細胞への精製されたポリペプチドの結合は、新生物を有する哺乳動物の指標である。本発明の第２１の側面の望ましい態様において、哺乳動物はヒトである。第２１の側面の別の望ましい態様において、ポリペプチドは抗体、例えば、モノクローナル抗体である。本発明の第２１の側面のさらに望ましい態様において、ポリペプチドは放射性核種、蛍光マーカー、酵素、細胞毒素、サイトカインそして増殖阻害剤から成る群より選択される、検出可能な作用剤へコンジュゲートされている。加えて、検出可能な作用剤は、細胞のアポトーシスを誘導することが可能であってもよい。さらに、本発明の第２１の側面で使用されるポリペプチドは、切断可能タンパク質精製タグのようなタンパク質精製タグへコンジュゲートすることができる。
【００１７】
第２２の側面において、本発明は、哺乳動物の増殖性障害を治療することにおける、本発明の３から８のいずれか一つの側面の精製されたポリペプチドの使用を特色とする。この方法は、細胞と本発明の３から８のいずれか一つの側面の精製されたポリペプチドを接触させる工程を含んでおり、ここにおいて、細胞への精製されたポリペプチドの結合は、細胞の増殖における減少を生じる。本発明の第２２の側面の望ましい態様において、哺乳動物はヒトである。第２２の側面の別の望ましい態様において、ポリペプチドは抗体である。第２２の側面のさらに望ましい態様において、ポリペプチドは放射性核種、蛍光マーカー、酵素、細胞毒素、サイトカイン及び増殖阻害剤から成る群より選択される、検出可能な作用剤へコンジュゲートされている。加えて、この検出可能な作用剤は、細胞の細胞増殖を抑制することが可能であってもよい。他の望ましい態様において、本発明の第２２の側面のポリペプチドは、切断可能タンパク質精製タグのようなタンパク質精製タグへコンジュゲートされている。
【００１８】
第２３の側面において、本発明は、薬学的に許容できる坦体中に、本発明の３から８のいずれか一つの側面の精製されたポリペプチドを含む医薬品を特色とし、そして第２４の側面において、本発明は、本発明の３から８のいずれか一つの側面の精製されたポリペプチドを包含する診断剤を特色とする。
【００１９】
他の望ましい側面において、本発明は、ＤＳＭＺ受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６２４又はＤＳＭ  ＡＣＣ２６２６を有する抗体産生細胞株、ならびにこれらの細胞株により産生された抗体を特色とする。
【００２０】
本発明の第１の側面の追加の望ましい態様において、単離されたポリペプチドは以下の神経芽腫細胞株の細胞へは特異的に結合しない：ＬＡ−Ｎ−１及びＬＡ−Ｎ−５（Juhl et al., MoI. Immunol. 27:957-964, 1990 ）；ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−１１）；ＮＭＢ−７（Cheung et al., Cancer Res. 45:2642-2649, 1985 ）；ＩＭＲ−３２（ＡＴＣＣ受入番号ＣＣＬ−１２７）；ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（Melino and Finazzi-Agro, Human Neuroblastoma  中: Recent Advances in Clinical and Genetic Analysis, 監修. Schwab, Tonini, and Benard, Harwood, Chur, Switzerland, pp. 55-71, 1993）；又はＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−１０）。
【００２１】
定義
「検出可能な作用剤」とは、検出を容易にするため、診断剤へ連結されている化合物を意味する。こうした「検出可能な作用剤」は、診断剤へ共有結合で又は非共有結合で連結することができる。加えて、連結は直接でもあるいは間接であってもよい。「検出可能な作用剤」の例には、タンパク質精製タグ、細胞毒素、酵素、常磁性標識、酵素基質、補因子、酵素阻害剤、色素、放射性核種、化学発光標識、蛍光マーカー、増殖阻害剤、サイトカイン、抗体及びビオチンが含まれる。
【００２２】
「診断剤」とは、上記のアッセイのいずれか一つ、ならびに当該技術分野で標準である任意の他の方法を用いることにより、新生物細胞を検出するために使用することができる化合物を意味する。診断剤は、例えば、以下の細胞：ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ３８３）、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ１９６）、ＣＡＣＯ−２（ＡＴＣＣ受入番号ＨＢＴ−３７；ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ１６９）、Ｃｏｌｏ−２０６Ｆ（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２１）、２３１３２／８７（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２０１）、ＡＳＰＣ−１（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１６８２）、ＤＵ−１４５（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２６１、ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−８１）及びＢＭ１０６０４（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２９８）、の少なくとも一つに特異的に結合するが、非新生物細胞へは結合しない抗体を含むことができる。加えて、診断剤は、結腸の腺癌、散在型胃癌腫、膵臓の腺癌及び／又は肺の腺癌へ特異的に結合することができるが、同一組織型の非新生物細胞へは結合できない。さらに、「診断剤」は、新生物細胞へ結合された時にのみ、細胞増殖の抑制、アポトーシスの誘導、又はその両方を行うことができるが、非新生物細胞へは結合しない。
【００２３】
こうした「診断剤」で検出することができる新生物細胞の例には、胃腺癌、結腸直腸腺癌、扁平上皮肺癌、肺腺癌、膵臓の腺癌そして前立腺の腺癌が含まれる。さらに、「診断剤」は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、合成有機分子、天然に存在する有機分子、核酸分子そしてこれらの成分、ならびに診断剤に共有結合で又は非共有結合で連結された一つまたはそれより多くの検出可能な作用剤を含むことができる。
【００２４】
ポリペプチドに関して本明細書において使用される「機能性断片」とは、完全長ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を保持する断片を意味する。こうした生物学的活性の例は、抗原を特異的に結合する、アポトーシスを誘導する、及び／又は細胞増殖を抑制する能力である。例えば、機能性断片は結腸の腺癌、散在型胃癌腫、膵臓の腺癌及び／又は肺の腺癌へ特異的に結合することができるが、同一組織型の非新生物細胞へは結合できない。機能性断片の生物学的活性は、例えば、本明細書に記載したアッセイのいずれか一つを使用して決定することができる。
【００２５】
抗体の機能性断片の例は、当業者には周知である、ＶＬ、ＶＨ、ＦＶ、ＦＣ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２断片である（例えば、Huston et al., Cell Biophys. 22:189-224, 1993 ；及びHarlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1999 を参照されたい）。望ましくは、「機能性断片」は配列番号１、３、５又は７のアミノ酸配列の断片と実質的に同一である（例えば、３、４、５、１０、１５、２０、１５、３０、５０、７５又は１００の連続したアミノ酸）、アミノ酸配列を有する。より望ましい態様において、「機能性断片」は配列番号１、３、５又は７のアミノ酸配列の断片と同一である。こうした「機能性断片」は、配列番号１、３、５又は７の３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、１５、３０、５０、７５又は１００の連続したアミノ酸を含んでいてもよいし、又は配列番号１、３、５又は７の全アミノ酸配列であってもよい。望ましい態様において、こうした断片は、ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２抗体のＶＨ又はＶＬ領域の一つまたはそれより多くの補体決定領域（ＣＤＲ）を包含する。例えば、機能性断片は、配列番号１のアミノ酸３１〜３５、５０〜６６及び／又は９９〜１０７；配列番号３のアミノ酸２３〜３３、４９〜５５及び／又は８８〜９９；配列番号５のアミノ酸３１〜３５、５０〜６６及び／又は９９〜１０８；又は配列番号７のアミノ酸２３〜３６、５２〜５８及び／又は９１〜１０１を包含することができる。
【００２６】
本明細書において使用される「健常ドナー」とは、悪性新生物が検出されない個体、例えば、ヒトを意味する。望ましい態様において、「健常ドナー」は新生物が検出されなかった個体である。例えば、「健常ドナー」は、悪性新生物を有しているとは診断されたことがないヒトであってもよい。
【００２７】
「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件」とは、例えば、約５０％ホルムアミド、０．１ｍｇ／ｍｌ剪断サケ精子ＤＮＡ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、２ＸＳＳＣ（クエン酸ナトリウム緩衝液）、１０％硫酸デキストラン中、およそ４２℃でのハイブリダイゼーション、約２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ中、およそ６５℃での最初の洗浄、続いての約０．１ＸＳＳＣ中、およそ６５℃での二回目の洗浄、を意味する。もしくは、「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件」は、約５０％ホルムアミド、０．１ｍｇ／ｍｌ剪断サケ精子ＤＮＡ、０．５％ＳＤＳ、５ＸＳＳＰＥ，１Ｘデンハート中、およそ４２℃でのハイブリダイゼーション、続いての２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温での２回の洗浄、そして０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５〜６０℃間での２回の洗浄を含むことができる。
【００２８】
本明細書において使用される「ハイブリドーマ」とは、活性化リンパ球のような正常細胞と新生物細胞（例えば、ミエローマ）との融合により人工的に作製された、何れかの細胞である。少なくとも二つの細胞の融合から生じるハイブリッド細胞は、免疫学的に適格性の親により産生されるものと同一のモノクローナル抗体又はＴ細胞生成物を産生することができる。加えて、これらの細胞は、新生物の親のように、不死である。
【００２９】
本明細書において使用される「不死化」とは、一次細胞を不死細胞へ融合し、それにより、一次細胞のいくつかの特性（例えば、抗体産生）を保持するが、しかし無限に培養することが可能な細胞を得ることを意味する。不死化することができる一次細胞の例には、健常ドナーの脾臓、リンパ節、血液又は骨髄に由来する細胞が含まれる。望ましくは、一次細胞は、健常ドナーの脾臓又はリンパ節に由来するリンパ球である。不死細胞の例はミエローマ及びヘテロミエローマである。例えば、一次細胞の不死化のために望ましいヘテロミエローマは、ＨＡＢ−１（Faller, et al., Br. J. Cancer 62:595-598, 1990 ）、ＣＢ−Ｆ７（Delvig et al., Hum. Antibodies Hybridomas 6:42-46, 1995 ）、Ｋ６Ｈ６Ｂ５（Delvig et al., Hum. Antibodies Hybridomas 6:42-46, 1995 ）、Ｈ７ＮＳ．９３４（Delvig et al., Hum. Antibodies Hybridomas 6:42-46, 1995 ）、ＳＨＭ−Ｄ３３（Bron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3214-3217, 1984 ）又はＢ６Ｂ１１（Borisova et al., Vopr. Virusol 44:172-174, 1999 ）であることができる。
【００３０】
本明細書において使用される「細胞増殖を抑制する」とは、同一条件下、その型の細胞の細胞分裂の正常速度と比較して、細胞の細胞分裂の速度における減少を指す。細胞増殖の抑制は、当該技術分野で標準的な多くの方法、例えば、本明細書に記載されているＭＴＴ細胞増殖アッセイ、ＢｒｄＵ取り込み、そして３Ｈチミジン取り込み、を使用してアッセイすることができる。こうしたアッセイは、例えば、Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001 ；及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y., 2001 、に記載されている。望ましくは、細胞増殖の抑制は２０％、４０％、５０％又は７５％である。望ましい態様において、細胞増殖の抑制は８０％、９０％、９５％あるいは細胞増殖の完全抑制さえでもある。
【００３１】
本明細書において使用される「アポトーシスを誘導する」とは、当該技術分野で詳細に明らかにされている細胞中の特性の出現を指す（例えば、Wyllie et al., Br. J. Cancer 80 Suppl. 1:34-37, 1999; Kerr et al., Br. J. Cancer 26:239-257, 1972 、を参照されたい）。これらの特性には、膜小疱形成、ＤＮＡ凝縮のような形態学的特性、ならびにＦ−アクチン含有、ミトコンドリア塊そして膜電位における変化を包含する。アポトーシスの誘導は、当該技術分野では標準の多くの方法、例えば、細胞死ＥＬＩＳＡ、ＴＵＮＥＬ染色、ＤＮＡ染色（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８）そして、アクリジンオレンジ、Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（登録商標）染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ユージーン，ＯＲ）及びＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（登録商標）染色（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ）のような多様な生体色素による染色、を使用してアッセイすることができる。本明細書において使用される「アポトーシスを誘導する」とは、同一条件下、対照細胞集団と比較した場合の、アポトーシスを起こしている細胞数の増加を指す。例えば、アポトーシスの増加は１０％、２０％、４０％、５０％又は７５％であることができる。望ましい態様において、アポトーシスの誘導は、対照細胞集団で見られるものの２倍、３倍、１０倍あるいは１００倍を超えることさえある、アポトーシスの増加を生じる。
【００３２】
本明細書において使用される「新生物細胞」とは、不適切な条件下、細胞分割を起こしている、アポトーシスを起こしていない、又はその両方である細胞を指す。例えば、「新生物細胞」は、対応する非新生物細胞が細胞分割を起こさない時に細胞分割を起こすことができ、又は、もしくは、「新生物細胞」は正常細胞周期チェックポイント制御へ応答することができない。
【００３３】
本明細書において使用される「増殖性疾患」とは、細胞の異常増殖を生じる何らかの障害を指す。増殖性疾患の具体的例は、胃腺癌、結腸直腸腺癌、肺腺癌及び膵臓の腺癌のような、新生物の多様な型である。しかしながら、増殖性疾患はまた、トランスフォーミングウイルスに感染される細胞の結果であってもよい。
【００３４】
本明細書において使用される「タンパク質精製タグ」とは、タンパク質の精製を助けるためにタンパク質へ共有結合で、あるいは非共有結合で加えられているペプチド、例えば、エピトープタグである。望ましくは、こうしたペプチドは、抗体又はビオチン又はアビジンのような別のペプチドへ高い親和性で結合する。市販品として入手可能なエピトープタグの例には、Ｈｉｓ−タグ、ＨＡ−タグ、ＦＬＡＧ（登録商標）−タグそしてｃ−Ｍｙｃ−タグが含まれる。しかしながら、抗体により認識されるいずれのエピトープもまたタンパク質精製タグとして使用することができる。例えば、Ausubel et ah, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001 ；及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 2001 、を参照されたい。タンパク質精製タグは、例えば、酵素（例えば、トロンビン）あるいは化学物質（例えば、ブロモシアン）を使用することにより、タンパク質から切断することができる。
【００３５】
ポリペプチド、例えば、抗体に関して、本明細書において使用される「特異的に結合する」そして「特異的に認識する」とは、等量の任意の他のタンパク質と比較して、特定のタンパク質、例えば、抗原に対するポリペプチドの増加した親和性を意味する。例えば、抗体、例えば、ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ３８３）、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ１９６）、ＣＡＣＯ−２（ＡＴＣＣ受入番号ＨＢＴ−３７；ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ１６９）、Ｃｏｌｏ−２０６Ｆ（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２１）、２３１３２／８７（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２０１）、ＡＳＰＣ−１（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１６８２）、ＤＵ−１４５（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２６１、ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−８１）及びＢＭ１０６０４（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２９８）細胞の少なくとも一つへ特異的に結合する、ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２ヒトモノクローナル抗体は、望ましくは、等量の関連抗原を含む任意の他の抗原に対するよりも、少なくとも２倍、５倍、１０倍、３０倍あるいは１００倍を超えるその抗原に対する親和性を有している。別のポリペプチドへのポリペプチドの結合は、本明細書に記載されているように、あるいは当該技術分野におけるかなり多数の標準法、例えば、ウェスタン分析、ＥＬＩＳＡ又は免疫共沈降により決定することができる。
【００３６】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸（例えば、配列番号１、３、５又は７の配列）又は核酸配列（例えば、配列番号２、４、６又は８の配列）又はそれらの断片と、少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一性を示すポリペプチド又は核酸を意味する。望ましい態様において、ポリペプチド又は核酸配列は、参照アミノ酸又は核酸配列と少なくとも９８％、９９％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％までも同一である。ポリペプチドについては、比較配列の長さは一般に少なくとも３、４、５、６、８、１０又は１５アミノ酸であり、そして望ましくは少なくとも２０又は２５の連続アミノ酸であろう。より望ましい態様において、比較配列の長さは少なくとも３０、５０、７５、９０又は９５の連続アミノ酸、又は完全長アミノ酸配列でさえある。核酸については、比較配列の長さは一般に少なくとも９、１０、１２、１５、１８、２０、２４又は２５の連続ヌクレオチドであり、そして望ましくは少なくとも３０の連続ヌクレオチドであろう。より望ましい態様において、比較配列の長さは少なくとも５０、７５、１５０、２２５、２７０、２８０、２８５又は２９０連続ヌクレオチド、又は完全長ヌクレオチド配列でさえある。
【００３７】
配列同一性は、デフォルト設定された配列分析ソフトウェアーを使用して測定することができる（例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705 の配列分析ソフトウェアーパッケージ）。こうしたソフトウェアーは、多様な置換、欠失そして他の修飾への相同性の程度を割り当てることにより、類似配列を一致させることができる。保存的置換は典型的には、以下のグループ内の置換を含んでいる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；そしてフェニルアラニン、チロシン。
【００３８】
複数の配列もまた、ペアワイズアライメントモードを「ｓｌｏｗ」に設定し、ペアワイズアライメントパラメーターを１０．０のオープンギャップペナルティー（ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）及び０．１のエックステンドギャップペナルティー（ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）を含むように、ならびに類似性マトリックスを「ｂｌｏｓｕｍ」に設定することにより、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（１．４）プログラム（European Molecular Biology Laboratory, Germany のJulie D. Thompson 及び Toby Gibson 、及びEuropean Bioinformatics Institute, Cambridge, UK,のDesmond Higgins 、により作製された）を使用して整列させることができる。加えて、マルチプルアライメントパラメーターは、１０．０のオープンギャップペナルティーそして０．１のエックステンドギャップペナルティーを含むことができ、ならびに類似性マトリックスを「ｂｌｏｓｕｍ」に、ディレイダイバージェント（ｄｅｌａｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）を４０％に、そしてギャップディスタンス（ｇａｐ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）を８に設定する。
【００３９】
「精製された」又は「単離された」とは、それに天然に付随する他の成分から分離されたことを意味する。典型的には、天然に付随しているタンパク質、抗体及び天然に存在する有機分子を含まずに、重量で少なくとも５０％である場合、あるいは核酸分子に関しては、生物体のゲノムにおける核酸分子の配列に天然に隣接する核酸配列を含んでいない場合、因子は「精製され」又は「単離され」ている。望ましくは、因子は重量で、少なくとも７５％、より望ましくは、少なくとも９０％、最も望ましくは、少なくとも９９％純粋である。実質的に純粋な因子は、化学合成、天然源からの因子の分離、あるいは天然には因子を産生しない組換え宿主細胞における因子の産生により得ることができる。タンパク質、小胞及び細胞小器官は、Ausubel et at.（Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001 ）により記載されているような標準技術を使用して、当業者は精製することができる。因子は、望ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、光学密度、ＨＰＬＣ分析又はウェスタン分析を使用して測定された場合（Ausubel et ah, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001 ）、出発材料の少なくとも２、５又は１０倍は純粋である。望ましい精製法には、免疫沈降、イムノアフィニティークロマトグラフィー及びニッケルアフィニティーカラムのようなカラムクロマトグラフィー、磁気ビーズイムノアフィニティー精製、そしてプレート結合抗体によるパニングが含まれる。
【００４０】
「ベクター」又は「発現ベクター」とは、発現系、核酸に基づいたシャトルビヒクル、核酸搬送に適応した核酸分子、又は自律性自己複製環状ＤＮＡ（例えば、プラスミド）を意味する。ベクターが宿主細胞中に維持されている場合、ベクターは自律性構造として、宿主細胞のゲノム内に組み込まれて、又は宿主細胞の核又は細胞質中に維持されて、有糸分裂の間に細胞により安定して複製されることが可能である。
【００４１】
本発明の他の特色及び利点は、以下の詳細な説明、図そして特許請求の範囲から明らかになるであろう。
詳細な説明
本発明は、健常ドナーからの細胞を使用して同定された、抗体のようなポリペプチド、そして新生物の治療及び診断におけるそれらの使用を特色とする。加えて、本発明は、健常ドナーから得られた細胞を使用した、新生物特異的ポリペプチドを同定する方法を特色とする。我々は、本発明の方法を使用して得た、そして多数の癌腫を特異的に認識する、二つのヒトモノクローナル抗体（ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２）を特徴付けた。これらのモノクローナル抗体はこれらの新生物を認識するのみならず、細胞への結合したうえで、これらは新生物細胞のアポトーシスを誘導でき、それらの増殖を抑制でき、又はその両方さえも可能である。それ故、ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２モノクローナル抗体、そしてこれらの抗体により認識される抗原に対して特異的である他の抗体又はそれらの断片は、新生物を診断するそして治療するための多様な方法において使用することができる。
【００４２】
ヒトＮＯＲＭ−１（受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６２４）及びＮＯＲＭ−２（受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６２６）モノクローナル抗体を産生する細胞株は、ブタペスト条約の約定により、２００３年１１月６日に、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (“DSMZ” - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, 38124 Braunschweig, Germany) へ寄託した。
【００４３】
抗体及びポリペプチド
抗体は個体の健康を維持することにおいて必須の役割を果たしている。特に、抗体は血清に提示され、そして細菌、ウイルス及び毒素のような多様な病原体へ結合しそして除去することを助けている。抗体は２つの重鎖及び２つの軽鎖から構築されたＹ形状タンパク質構造から成っている。各鎖はモジュラー構成を有している：各軽鎖は２つのドメインから成っており、そして各重鎖は少なくとも４つのドメインを有している。抗原結合部位は、重鎖からの１つのドメイン（ＶＨドメイン）及び軽鎖からの１つのドメイン（ＶＬドメイン）から作り上げられている。実際、これらの２つのドメインを非共有結合か又はジスルフィド結合又はペプチドリンカーを経た共有結合で結合させて連結することにより、小さな抗原結合断片を調製することが可能である。抗原結合ドメインは、抗体の他のドメインよりもアミノ酸配列が可変性であり、そしてそれ故、定常（Ｃ）ドメインと対照的に、可変（Ｖ）ドメインと称される。抗体の定常ドメインは、補体溶解及び細胞媒介死滅のような、抗体エフェクター機構の引き金を引くことに寄与する。
【００４４】
抗体は、遺伝子再構成を含むプロセスにおいてＢリンパ球により作製される。これらの細胞の発育の間、可変ドメインをコードする遺伝子が遺伝子要素から組み立てられる。ＶＨドメインの場合においては、３つの要素、未再構成ＶＨ遺伝子、Ｄセグメント及びＪＨセグメントが存在する。ＶＬドメインの場合においては、２つの要素、未再構成ＶＬ（Ｖラムダ又はＶカッパ）遺伝子及びＪＬ（Ｊラムダ又はＪカッパ）セグメントが存在する。これらの遺伝子セグメントの無作為な組み合わせ、そして再構成されたＶＨ及びＶＬドメインの無作為な組み合わせは、同等に多様な抗原の広範な多様性へ結合することが可能な抗体の広範なレパートリーを発生する。さらに、ＶＨ及びＶＬ領域は各々、３つの補体決定領域（ＣＤＲ）及び４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を有する。ＦＲは抗体の中軸であり、そしてＣＤＲは抗原へ結合する、抗体の一部である。当業者は、同一種で産生された、多数の抗体のアミノ酸配列を比較することにより、抗体のＦＲ及びＣＤＲ領域を決定することが可能である（例えば、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997 ；及びKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991 、を参照されたい）。
【００４５】
一般に、本発明の方法により同定されたポリペプチドは、ＥＰＬＣ−２７２Ｈ、Ｃｏｌｏ−６９９、ＣＡＣＯ−２、Ｃｏｌｏ−２０６Ｆ、２３１３２／８７、ＡＳＰＣ−１、ＤＵ−１４５及びＢＭ１０６０４細胞の何れか一つへ結合するが、非新生物細胞へは結合しない剤である。ポリペプチドは、ヒトモノクローナル抗体（例えば、ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２）のような抗体、又はそれらの機能性断片であることができる。全般的には、本発明の方法は、新生物組織及び新生物細胞の両方へ排他的に結合するが、非新生物組織又は細胞へは結合しないポリペプチドを同定するために使用することが可能である。本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドはまた、それが結合した新生物細胞のアポトーシスを誘導できるが、非新生物細胞では誘導できず、又は、あるいは、ポリペプチドはそれが結合した新生物細胞の増殖を抑制できるが、非新生物細胞では抑制できない。望ましくは、本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドは、同時に新生物細胞のアポトーシスを誘導しそして増殖を抑制することが可能であるが、非新生物細胞では可能ではない。それ故、こうしたポリペプチドは、哺乳動物における癌の検出、モニタリング、予防及び治療に有用である。本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドを使用する治療又は診断を受け入れられる癌の例には、結腸直腸癌腫、卵巣癌腫、扁平上皮細胞肺癌腫、小細胞肺癌腫、小葉及び腺管の乳癌腫、黒色腫、乳癌、肺腺癌のような肺癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌、膵臓腺癌のような膵臓癌、神経膠腫、肉腫、胃腸癌、脳腫瘍、食道扁平上皮細胞癌腫のような食道癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺腺癌のような前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、子宮腺癌、ホジキン病、リンパ腫及び白血病が含まれる。本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドは、胃腺癌、結腸直腸腺癌、肺腺癌及び膵臓の腺癌の検出及び治療に特に有用である。
【００４６】
新生物特異的ポリペプチドの同定
一般に、新生物細胞へ特異的に結合するが、非新生物細胞へは結合しないポリペプチド（例えば、ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２モノクローナル抗体）を発現するハイブリドーマは、健常ドナーの脾臓、リンパ節、血液又は骨髄から得られたリンパ球とミエローマ又はヘテロミエローマ細胞株を融合することにより発生させることができる。典型的には、健常ドナーから外科的に除去されたリンパ節又は脾臓の一部からリンパ球を得る。例えば、脾臓の一部は、脾臓破裂を生じた事故により、健常ドナーから除去することができる。しかしながら、リンパ球はまた、健常ドナーの血液又は骨髄からも得ることができる。例えば、リンパ球は、密度勾配遠心分離によって、健常ドナーの血液から単離することができる。従って、本発明の方法は、癌患者から細胞又は組織を得ることなく、健常ドナーのリンパ球からの新生物特異的ヒトモノクローナル抗体の発生を許容する。
【００４７】
特に、リンパ球を機械的手段により細胞懸濁液として調製することができ、続いて細胞融合が生じる条件下、ミエローマ又はヘテロミエローマ細胞株と例えば、１：２又は１：３の比で融合する。例えば、ヒトリンパ球とマウスミエローマＮＳ−０の融合により発生させたヘテロミエローマ細胞株ＨＡＢ−１（Faller, et al., Br. J. Cancer 62:595-598, 1990 ）をこの目的に使用することができる。他のヘテロミエローマ細胞株の例には、例えば、ＣＢ−Ｆ７（Delvig et al., Hum. Antibodies Hybridomas 6:42-46, 1995 ）、Ｋ６Ｈ６Ｂ５（Delvig et al., Hum. Antibodies Hybridomas 6:42-46, 1995 ）、Ｈ７ＮＳ．９３４（Delvig et al., Hum. Antibodies Hybridomas 6:42-46, 1995 ）、ＳＨＭ−Ｄ３３（Bron et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3214-3217, 1984 ）及びＢ６Ｂ１１（Borisova et al, Vopr. Virusol. 44: 172-174, 1999 ）が含まれる。健常ドナーに由来するリンパ球とヘテロミエローマ細胞株の融合に引き続いて、抗体産生ハイブリドーマ又はトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）を発生させる。
【００４８】
細胞融合は、例えば、４０％ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ１５００）の使用のような、当該技術分野において周知の何れかの方法により達成することができる。ハイブリドーマは、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）含有培地中で培養することができ、そして４週後、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体産生について上清をスクリーニングすることができる。次ぎに陽性クローンを、商業的に入手可能な腫瘍細胞株を使用する、付着阻害及び結合アッセイで試験することができる。陽性クローンはさらに、新生物及び正常組織の免疫ペルオキシダーゼ染色を使用して試験することができる。従って、クローンは新生物細胞との反応性そして正常細胞とは反応しないことに基づいて選択することができる。抗体は、例えば、Vollmers et al. (Oncology Reports 5:35-40, 1998) により記載されているように、イオン交換、疎水性交互作用、サイズ排除又はアフィニティークロマトグラフィー、ならびにこれらの方法の組み合わせの使用で、大量培養から精製することができる。抗体産生に引き続いて、トリオーマにより産生された抗体の、追加の機能性及び免疫組織化学的試験を実施することができる。例えば、トリオーマにより産生された抗体は、非処理対照細胞と比較した、アポトーシスを誘導する、細胞増殖を抑制する、又はその両方の能力を試験することができる。抗体はまた、非新生物細胞と比較した、新生物細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ、Ｃｏｌｏ−６９９、ＣＡＣＯ−２、Ｃｏｌｏ−２０６Ｆ、２３１３２／８７、ＡＳＰＣ−１、ＤＵ−１４５、ＢＭ１６０４へ特異的に結合する能力も試験することができる。
【００４９】
新生物特異的ポリペプチドの産生
ひとたび構築すれば、ハイブリドーマは数ヶ月の間、標準及び大量培養（フラスコ、ミニパーム（ｍｉｎｉＰｅｒｍ）、発酵槽その他）での増殖及び抗体産生において一般的に安定である。従って、本発明の方法に従って同定されたポリペプチドを発現するハイブリドーマは、ポリペプチドの小規模、大規模又は商業的製造のための、当該技術分野において周知の何れかの方法で使用することが可能である。抗体産生のレベルは、典型的には、フラスコでは０．０１〜０．１ｍｇ／ｍＬの間、そしてミニパームでは０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬの間の範囲である。
【００５０】
加えて、ひとたびポリペプチドが本発明の方法を使用して同定されたら、ポリペプチド（例えば、抗体）又はその断片はまた、大腸菌又は酵母（例えば、Ｓ．セレビジエ）、又は哺乳動物細胞株のような宿主細胞での発現によっても産生することができる。ポリペプチドの機能性断片もまた、例えば、組換え法を使用する直接合成により発生させることができる。これらの方法は当該技術分野において標準である。例えば、核酸配列はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅することができる。ＰＣＲ技術は当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されている。標準法そして本明細書において記載したように、ハイブリドーマ又はトリオーマにより発現されたモノクローナル抗体の配列を得ることができ、そして抗体の機能性断片を増幅することができる。例えば、全ＲＮＡを、腫瘍特異的モノクローナル抗体を発現しているハイブリドーマから単離することができる。次ぎにｃＤＮＡは逆転写酵素を使用してＲＮＡから発生させることができ、そして重および軽鎖の可変領域の機能性断片を含有するｃＤＮＡは、ＰＣＲを使用して増幅することができる。ＰＣＲ生成物は次ぎに、精製しそして発現ベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクター内へクローン化することができる。多くの標準ベクターが入手可能であり、適切なベクターの選択は、例えば、ベクター内へ挿入されるＤＮＡのサイズ及びベクターでトランスフェクトされるべき宿主細胞に依存するであろう。
【００５１】
本発明の方法を使用して同定された核酸分子は、多様な標準ベクター及び宿主細胞で発現させることができる。宿主細胞中で活性である任意のプロモーターを、核酸分子を発現させるために使用することができる。それにもかかわらず、哺乳動物細胞における抗体又は抗体の断片の発現は、免疫グロブリン遺伝子プロモーターの使用が望ましい。宿主細胞内へベクターを導入する方法は、当該技術分野において標準であり、電気穿孔、合成脂質ポリマー（例えば、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（商標））の使用、塩化カルシウムの使用、そしてＤＥＡＥデキストランの使用が含まれる。こうした方法はまた、例えば、Ausubel et ah, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001 ；及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 2001 、にも記載されている。
【００５２】
ポリペプチドのアミノ酸変異体（ｖａｒｉａｎｔ）の単離
抗体、例えば、ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２抗体のような、本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするＤＮＡ内へ適切なヌクレオチド変化を導入するか、又は所望のポリペプチドのインビトロ合成により調製することが可能である。こうした変異体は、例えば、ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、挿入又は置換を包含する。もし、最終構築物が所望の特性、例えば、新生物細胞のアポトーシスを誘導するが、非新生物細胞では誘導しない能力、又は新生物細胞の増殖を抑制するが、非新生物細胞では抑制しない能力、を所有するとすれば、最終構築物へ到達するために、欠失、挿入又は置換の任意の組み合わせを作ることが可能である。アミノ酸変化はまた、糖鎖形成部位の数又は位置を変化させる、膜繋留特性を改変する、又はタンパク分解性切断に対する感受性を修飾するような、抗体の翻訳後プロセスを改変することもできる。
【００５３】
抗体のような、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体の設計においては、変異部位の位置及び変異の性質は、修飾されるべき特性（単数または複数種類）に依存するであろう。変異のための部位は、個々に又は連続して、例えば、最初に保存的アミノ酸選択物で置換し、そして次ぎに達成された結果に依存してより過激な選択をするが、又は標的残基を欠失させることにより、修飾することが可能である。
【００５４】
ポリペプチド中の変異誘発のための、特定の残基又は領域の同定に有用な方法は「アラニンスキャニング変異誘発」と称され、例えば、Cunningham and Wells (Science 244:1081-1085, 1989) に記載されている。ここでは、標的残基の残基又はグループを同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕのような荷電残基）、中性又は陰性に荷電したアミノ酸（最も望ましくはアラニン又はフェニルアラニン）で置き換えて、アミノ酸と細胞内又は外部の周囲水性環境との相互作用に影響を及ぼす。次ぎに、置換部位に、又は置換部位の代わりにさらなる又は他の変異を導入することにより、置換に対して機能的感受性を示しているドメインをさらに正確にする。従って、アミノ酸配列変異を導入するための部位が前もって決定されている限り、変異の性質は前もって決定される必要はない。例えば、既定の部位での変異の遂行を最適にするため、アラニンスキャニング又は無作為変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された変異体を、例えば、新生物細胞のアポトーシスを誘導し、そして非新生物細胞では誘導しない、又は新生物細胞の増殖を抑制し、そして非新生物細胞では抑制しない能力でスクリーニングする。
【００５５】
置換的変異誘発に最も重要な部位には、ポリペプチドの生物学的活性に影響を及ぼすと同定された部位が含まれる。これらの部位、特に、少なくとも３つの他の全く同じに保存された部位の配列内に位置する部位、を比較的保存的様式で置換することができる。例えば、ａｌａはｖａｌ、ｌｅｕ又はｉｌｅで置換できる；ａｒｇはｌｙｓ、ｇｌｎ又はａｓｎで置換できる；ａｓｎはｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ又はａｒｇで置換できる；ａｓｐはｇｌｕで置換できる；ｃｙｓはｓｅｒで置換できる；ｇｌｎはａｓｎで置換できる；ｇｌｕはａｓｐで置換できる；ｇｌｙはｐｒｏで置換できる；ｈｉｓはａｓｎ，ｇｌｎ、ｌｙｓ又はａｒｇで置換できる；ｉｌｅはｌｅｕ、ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ又はｐｈｅで置換できる；ｌｅｕはｉｌｅ、ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ又はｐｈｅで置換できる；ｌｙｓはａｒｇ、ｇｌｎ又はａｓｎで置換できる；ｍｅｔはｌｅｕ、ｐｈｅ又はｉｌｅで置換できる；ｐｈｅはｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ又はａｌａで置換できる；ｐｒｏはｇｌｙで置換できる；ｓｅｒはｔｈｒで置換できる；ｔｈｒはｓｅｒで置換できる；ｔｒｐはｔｙｒで置換できる；ｔｙｒはｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ又はｓｅｒで置換できる；そしてｖａｌはｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ又はｐｈｅで置換できる。
【００５６】
抗体と検出可能な作用剤とのコンジュゲーション
もし望むなら、抗体（例えば、ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２のようなモノクローナル抗体）又はそれらの断片のような、本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドは、ポリペプチドの精製、ならびにそれを必要とする哺乳動物における新生物の診断、モニタリング又は治療を容易にするため、検出可能な作用剤へ連結することができる。適した検出可能な作用剤の選択は、ポリペプチドの意図された使用に依存し、そして当業者には明らかであろう。本発明に従った検出可能な作用剤には、例えば、タンパク質精製タグ、細胞毒素、酵素、常磁性標識、酵素基質、補因子、酵素阻害剤、色素、放射性核種、化学発光標識、蛍光マーカー、増殖阻害剤及びビオチンが含まれる。
【００５７】
タンパク質精製タグは、ポリペプチドの単離を容易にするため、本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドへコンジュゲートすることができる。使用することが可能なタグの例には、Ｈｉｓ−タグ、ＨＡ−タグ、ＦＬＡＧ（登録商標）−タグそしてｃ−Ｍｙｃ−タグが含まれる。タグを精製後に除去することが可能なように、酵素的又は化学的切断部位をポリペプチド及びタグ部分の間に工学処理することができる。適した毒素には、ジフテリア毒素、シュードモナス内毒素Ａ、リシン及びコレラ毒素が含まれる。適した酵素標識の例には、リンゴ酸ヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適した放射性同位元素標識の例には、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ及び１４Ｃが含まれる。望ましくは、放射性同位元素は１０〜５，０００ｋｅｖ範囲、より望ましくは、１００〜５００ｋｅｖで放射するであろう。常磁性同位元素もまたポリペプチドへコンジュゲートし、癌の診断及び治療のためにインビボで使用することができる。こうしたコンジュゲートされた抗体の使用は、インビボ核磁気共鳴イメージングのためである。こうした方法は当該技術分野で周知である（例えば、Schaefer et al., JACC 14:472-480, 1989; Shreve et al., Magn. Reson. Med. 3:336-340, 1986; Wolf, Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16:93-95, 1984; Wesbey et al., Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16:145-155, 1984; およびRunge et al., Invest. Radiol. 19:408-415, 1984 、を参照されたい）。もしくは、放射性標識抗体はまた、標識抗体が結合しているいずれかの組織の外科的除去を含む、放射性免疫ガイド手術（ＲＩＧＳ）にも使用することができる。従って、標識抗体は非新生物組織から新生物組織を区別することにより、新生物組織へ外科医を導く。腫瘍イメージングに有用な放射性標識は、好ましくは短寿命放射性同位元素である。スカンジウム−４７（３．４日）、ガリウム−６７（２．８日）、ガリウム−６８（６８分）、テクネチウム−９９ｍ（６時間）、インジウム−１１１（３．２日）及びラジウム−２２３（１１．４日）のような１時間から１１．４日の範囲の半減期を有する多様な放射活性金属が、抗体とのコンジュゲーションに利用可能であり、その中で、ガリウム−６７、テクネチウム−９９ｍ及びインジウム−１１１はガンマカメライメージングに好ましく、ガリウム−６８はポジトロン放出断層撮影に好ましく、そしてスカンジウム−４７及びラジウム−２２３（及び他のアルファ放出放射性核種）は腫瘍治療に好ましい。
【００５８】
適した蛍光マーカーの例には、フルオレセイン、イソチオシアレート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オフタルデヒド及びフルオレスカミンが含まれる。化学発光マーカーの例には、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識及びエクオリン標識が含まれる。当業者は、本発明に従って用いることができる、他の適した標識を承知しているであろう。モノクローナル抗体又はそれらの断片のような、本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドへの、これらの検出可能な作用剤のコンジュゲーションは、当該技術分野において周知の標準技術を使用して達成することが可能である。典型的な抗体コンジュゲーション技術は、Kennedy et al. (Clin. Chim. Acta 70, 1-31, 1976) 及びSchurs et al. (Clin. Chim. Acta 81, 1-40 , 1977) に記載されており、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル法が含まれる。抗体は、例えば、米国特許第４，４４４，７４４号に記載されている、当該技術分野において周知の、いくつかの技術のいずれかにより放射性標識することができる。全てのこれらの方法は、本明細書において援用される。
【００５９】
本発明の治療の全ての方法において、同一又は異なった腫瘍又は腫瘍細胞型に付随する、異なった抗原又は同一の抗原の異なったエピトープに特異的な、異なった又は同一の標識ポリペプチドの混合物を使用することができることが理解できる。こうした組み合わせは、特定の場合に検出、位置限定及び／又は療法を増強することができ、そしてまた、一つ以上の新生物又は新生物の型のための、広範なスクリーニングの範囲も増加させることが可能である。
【００６０】
抗腫瘍剤へコンジュゲートされたポリペプチド
本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドは、新生物細胞のアポトーシスを誘導し、新生物細胞の細胞増殖を抑制し、又はその両方を行うことができるが、ポリペプチドをさらに新生物細胞を殺す、又はそれらの増殖を抑制する剤へコンジュゲートすることができる。抗体又はそれらの断片のようなポリペプチドの標的化能力は、腫瘍への細胞毒性又は抗増殖剤の搬送を生じ、腫瘍の破壊を増強する。それ故、ポリペプチドはまた、ヒト患者のような哺乳動物において、新生物の治療及び予防のために使用することができる。ポリペプチドへ連結された細胞毒性剤は、ポリペプチドが結合した腫瘍細胞又は腫瘍を破壊する又は損傷する、いずれかの剤であることができる。こうした剤の例には、化学療法剤又は放射性同位元素、プロドラッグを活性化する酵素、又はサイトカインが含まれる。
【００６１】
適した化学療法剤は当業者には周知であり、例えば、タキソール、ミトラマイシン、デオキシコ−ホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン（特にＩＦＮ−アルファ）、エトプシド、テニポシド、アントラサイクリン（例えば、ダウノマイシン及びドキソルブシン）、メトトレキセート、ビンデシン、ネオカルジノスタチン、シス−プラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシン及びカリチェアミシンが含まれる。化学療法剤は、当該技術分野において周知の慣用法を使用して抗体へコンジュゲートすることができる。
【００６２】
細胞毒性剤としての使用に適した放射性同位元素もまた当業者には周知であり、例えば、１３１Ｉ又は２１１Ａｔのようなアスタチンが含まれる。これらの同位元素は、当該技術分野において周知の慣用技術を使用して、共有結合か又は非共有結合で、ポリペプチドへ結合させることができる。
【００６３】
もしくは、細胞毒性剤はまた、プロドラッグを活性化させる、酵素であってもよい。このことは、腫瘍部位で、不活性プロドラッグをその活性な細胞毒性形への変換を可能にし、「抗体指示酵素プロドラッグ療法」（ＡＤＥＰＴ）と称されている。従って、ポリペプチド−酵素コンジュゲートを患者に投与し、そして治療されるべき腫瘍の領域での位置限定を可能にすることができる。次ぎに、細胞毒性薬剤への変換が、位置限定した酵素の影響下、治療されるべき腫瘍の領域に位置限定するように、患者へプロドラッグを投与する。酵素の例は細菌カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）であり、その使用は例えば、ＷＯ８８／０７３７８に記載されている。もし望むなら、ポリペプチド−酵素コンジュゲートを、新生物の近傍ではない体の領域からのクリアランスを促進するように、ＷＯ８９／００４２７の教示に従って修飾することができる。ポリペプチド−酵素コンジュゲートはまた、例えば、腫瘍の近傍ではない体の領域に、酵素を不活性化する追加の成分を提供することにより、ＷＯ８９／００４２７に従って使用することもできる。
【００６４】
別の代替物として、本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドへコンジュゲートされた細胞毒性剤はまた、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）又は腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）のようなサイトカインであってもよい。サイトカインが、他の組織に影響することなく、腫瘍を損傷させることを又は腫瘍の破壊を仲介するように、ポリペプチドはサイトカインを腫瘍へ標的化する。サイトカインは、慣用組換えＤＮＡ技術を使用して、ＤＮＡレベルでポリペプチドへ融合させることができる。
【００６５】
加えて、細胞増殖のいずれかの抑制剤、例えば、ゲニステイン、タモキシフェン又はシクロホスファミド、を本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドとコンジュゲートすることができる。
【００６６】
用量
本発明の療法的方法に関し、本発明のポリペプチドの患者への投与が、特定の投与様式、用量又は投与の頻度に限定されることは意図されない；本発明は、筋肉内、静脈内、腹腔内、小胞内、関節内、病巣内、皮下、又は新生物細胞のアポトーシスを誘導することにより、腫瘍細胞の増殖を抑制することにより、又はその両方により、新生物細胞の数を減少させるのに適切な用量を提供するために十分な何れかの他の経路を含む、全ての投与様式を企図する。化合物（単数または複数種類）は、単回用量又は複数回用量で患者に投与することができる。複数回用量が投与される場合、用量を、例えば、１日、２日、１週、２週又は１ヶ月ずつ、互いに分割することができる。例えば、ポリペプチド（例えば、ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２のようなモノクローナル抗体）は週に１回、例えば、２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０又はそれより多くの週の間、投与することができる。いずれの特定の対象に対しても、個々の必要性及び組成物を投与している又は投与を監督している人の専門的判断に従って、特定の投与計画を、期間を通して調節しなければならないことを理解すべきである。正確な量は、使用されたポリペプチド、ポリペプチドが結合するリガンドの腫瘍表面上の密度、そしてポリペプチドのクリアランスの速度に依存して変化するであろう。例えば、もし、より低い用量が十分な抗新生物活性を提供しないならば、ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２抗体の投薬量を増加させることが可能である。逆に、もし、新生物が患者から除去されたら、ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２抗体の投薬量を減少させることが可能である。
【００６７】
主治医が最終的に適切な量及び投与計画を決定するであろうが、モノクローナル抗体又はそれらの断片のようなポリペプチドの治療的に有効量は、例えば、約０．１ｍｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日又は０．７０ｍｇ〜３５０ｍｇ／ｋｇ体重／週、の範囲であることができる。望ましくは、療法的有効量は、約０．５０ｍｇ〜２０．０ｍｇ／ｋｇの範囲、より望ましくは、約０．５０ｍｇ〜１５．０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、例えば、約０．２、０．３、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、７．０、８．０、８．５、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０又は１５．０ｍｇ／ｋｇ体重を、毎日、１日おき、又は週に２回投与する。
【００６８】
例えば、適した用量とは、上記のように投与された場合、ポリペプチドがアポトーシスを誘導することが可能であり、そしてそれが基礎（即ち、未治療）レベルより少なくとも２０％は超えている量である。一般に、適切な投薬量及び治療計画は、療法的及び／又は予防的利点を提供するのに十分な量で活性化合物（単数または複数種類）を提供する。こうした応答は非治療患者と比較して、治療患者における改良された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全に又は部分的に、又はより長い疾患のない生存）を確立することによりモニターすることが可能である。この発明に従うと、ポリペプチドの投与は、当該技術分野において周知のいずれかの標準アッセイにより測定されるように、未治療対照のアポトーシスと比較して、少なくとも２０％、４０％、５０％あるいは７５％以上も、新生物細胞アポトーシスを誘導することが可能である。より望ましくは、アポトーシスは、非治療対照のアポトーシスよりも少なくとも８０％、９０％、９５％あるいは１００％以上でさえも誘導される。もしくは、ポリペプチドの投与は、当該技術分野において周知のいずれかの標準アッセイにより測定されるように、未治療対照の増殖と比較して、少なくとも２０％、４０％、５０％あるいは７５％以下に新生物細胞増殖を抑制することが可能である。より望ましくは、増殖は、非治療対照の増殖よりも少なくとも８０％、９０％、９５％あるいは１００％以下でさえも抑制される。最も望ましくは、ポリペプチドは、非治療対照細胞と比較して、同時に新生物細胞の増殖を抑制しそしてアポトーシスを誘導することが可能である。こうした応答は、本明細書記載されている技術を含む、当該技術分野において周知のいずれかの標準技術によりモニターすることが可能である。一般に、医薬組成物のため、用量中に存在する抗体の量は、宿主のｋｇ当たり約２５μｇ〜５ｍｇの範囲である。適した用量サイズは患者のサイズで変化するであろうが、典型的には約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲であろう。
【００６９】
医薬組成物の製剤
本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドは、標的領域へ到達した時に抗新生物特性を有する濃度を生じる、いずれかの適した手段により投与することができる。ポリペプチドは、適切な量で、いずれかの適した坦体物質に含ませることができ、一般的には、組成物の総重量の１〜９５重量％の量で存在する。組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内又は腹腔内）投与経路に適している剤形で提供することができる。医薬組成物は、慣用薬務に従って製剤することができる（例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, 2000 及びEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York 、を参照されたい）。
【００７０】
医薬組成物は、慣用的な、無毒の薬学的に許容できる坦体及び補助剤を含有する、剤形、製剤中で、又は適した搬送装置又は移植物を経て、注射、注入又は移植（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内など）により非経口的に投与することができる。もし新生物細胞が血液と直接接触していれば（例えば、白血病）、又はもし腫瘍が血流からのみ到達可能であるとすれば、静脈内（Ｉ．Ｖ．）経路を使用することができる。腫瘍が、胸膜腔又は腹腔のような限定された空間で成長している場合、ポリペプチドは血流内よりむしろ腔内へ直接投与することができることがわかっている。こうした組成物の製剤及び調製は、医薬製剤の当業者にはよく知られている。製剤は、例えば、Remington (The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, 2000 及びEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York) に見出すことが可能である。
【００７１】
癌進行の診断及びモニタリング
上に議論したように、本発明の側面は、哺乳動物、好ましくはヒト患者において、新生物を検出する又は診断する方法に関する。典型的には、本発明のスクリーニング法を使用して同定されたポリペプチドの投与がアポトーシスの誘導又は増殖の減少を起こすいずれの新生物も、本明細書に記載した診断法に適用できる。
【００７２】
本発明のスクリーニング法を使用して同定されたポリペプチドは、新生物又は新生物細胞へ特異的に結合するが、正常細胞又は組織へは結合しないので特に有用である。従って、こうしたポリペプチドは腫瘍内の新生物細胞へは結合できるが、正常な周囲組織へは結合せず、それ故、哺乳動物中の新生物の検出、治療又はその両方を可能にしている。例えば、患者中にポリペプチドにより結合される細胞が残存していないことを検証することにより、あるいは、患者から除去された腫瘍が、ポリペプチドにより結合されない細胞により完全に囲まれていることを検証することにより、バイオプシーが全腫瘍を除去したかどうかを決定するため、本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドを使用することができる。
【００７３】
検出の感度を改良するため、複数の新生物マーカーを既定の試料又は個体内でアッセイすることができる。従って、異なった抗原に特異的な抗体又は機能性断片のようなポリペプチドを、単一アッセイ内に、又は複数アッセイに組み合わせることができる。さらに、新生物に特異的な複数のプライマー又はプローブを同時に使用することができる。マーカーの選択は、最適感度を生じる組み合わせを決定するための日常的な実験に基づくことができる。
【００７４】
新生物のインビトロ検出
一般に、哺乳動物における新生物の診断は、哺乳動物（例えば、ヒト患者）から生物学的試料を得、こうした試料と本発明の方法を使用して同定されたポリペプチド（例えば、ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２のようなモノクローナル抗体）を接触させ、試験試料中の、癌と診断されている哺乳動物からの又は新生物を有しないことが知られている別の患者からの健康な組織に由来する非新生物細胞に対応する対照試料と比較した、新生物細胞に対するポリペプチドの反応性又は結合のレベルを検出することを含んでいる。それ故、本発明の方法は、さもないと検出不能である、初期段階腫瘍又は転移の検出に特に有用である。従って、患者の新生物を診断することに加え、本発明の方法はまた、哺乳動物の新生物の進行をモニターするためにも使用することができる。それ故、本明細書に記載したポリペプチドは、新生物進行のためのマーカーとして使用することができる。この目的には、新生物の診断のために使用される下記のアッセイを、時間を通して実施することができ、反応性ポリペプチド（単数または複数種類）のレベルの変化を評価する。例えば、アッセイを２４〜７２時間毎に、６ヶ月〜１年の期間にわたって実施し、そしてその後必要に応じて実施することができる。一般に、検出された結合ポリペプチドのレベルが時間を通して増加している患者においては、新生物が進行している。対照的に、結合されたポリペプチドのレベルが一定に維持されるか又は時間とともに減少する場合、新生物は進行していない。もしくは、上で指摘したように、本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドはまた、腫瘍が哺乳動物から完全に除去されたかどうかを決定するため、外科的介入による腫瘍切除後に、哺乳動物における腫瘍細胞の存在を決定するためにも使用することができる。
【００７５】
望ましくは、ポリペプチドを、ポリペプチド反応性の検出又は測定を容易にする検出可能な作用剤へ連結する。生物学的試料は、新生物細胞を含有することができる任意の生物学的材料であり、例えば、血液、唾液、組織、血清、粘液、痰、尿又は涙が含まれる。生物学的試料はまた組織切片（それは固定された組織であってもよい）、新鮮な組織、又は凍結組織であってもよい。対照試料よりも、生物学的試料で抗体の反応性のレベルにおける増加があるならば、試料が得られた哺乳動物において新生物が検出される又は診断される。こうした増加は、対照レベルを超えること少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％あるいは５０％以上である。結合又は反応性のレベルは、当該技術分野において周知のいずれかの方法により決定することが可能であり、それは以下により詳細に記載されている。
【００７６】
インビトロ診断アッセイ
本発明のポリペプチドを使用する新生物の診断は、試料中のポリペプチドマーカーを検出するための結合剤を使用する、当業者には周知の任意の方法により実施することができる。例えば、Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y., 1999 、を参照されたい。例えば、ポリペプチドは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、又は組織試料中の腫瘍細胞のインサイツ検出に使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイは典型的には、生物学的試料中の腫瘍細胞へ結合するための、固体支持体上に固定された、抗体のようなポリペプチドの使用を含んでいる。結合された腫瘍細胞は次ぎに、レポーター基を含み、そして抗体／腫瘍細胞複合体へ特異的に結合する検出試薬を使用して検出することができる。こうした検出試薬には、例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡ又はレクチンのような、抗体へ特異的に結合する任意の結合剤を包含する。もしくは、競合アッセイを利用することができ、ここで、抗体はポリペプチドであり、そしてここで、抗体が特異的である抗原をレポーター基で標識し、そして、抗体と生物学的試料とのインキュベーション後に、固定化された抗体へ結合させる。試料の成分が、抗体への標識抗原の結合を阻害する程度は、試料と固定化抗体の反応性の指標である。患者の新生物の診断はまた、二抗体サンドイッチアッセイによっても決定することができる。このアッセイは、試料中のポリペプチドが固定化抗体へ結合されるように、最初に固体支持体（通常マイクロタイタープレートのウェル）上に固定化されている抗体と試料を接触させる。次ぎに未結合試料を固定化ポリペプチド−抗体複合体から除去し、レポーター基を含有する検出試薬（好ましくは、ポリペプチド上の異なった部位へ結合可能な第二抗体）を加える。次ぎに固体支持体上に結合されて残った検出試薬の量を、具体的レポーター基に適した方法を使用して決定する。例えば、胃腺癌のような新生物の存在又は不存在を決定するには、固体支持体に結合されて残った検出試薬から検出された信号を、前もって決定されたカットオフ値に対応する信号と一般に比較する。新生物の検出のためのカットオフ値とは、抗体と、新生物を有しない患者からの試料をインキュベートした場合に得られた信号の平均値である。
【００７７】
レポーター基の検出のために用いる方法は、レポーター基の性質に依存する。放射活性基に対しては、シンチレーション計数又はオートラジオグラフィー法を使用することができる。分光学的方法は、色素、化学発光及び蛍光基を検出するために使用することができる。ビオチンは、異なったレポーター基（通常、放射活性又は蛍光基、又は酵素）と共役されたアビジンを使用して検出することができる。酵素レポーター基は一般に、基質の添加（一般に、規定された一定期間）、続いての、反応生成物の分光学的又は他の分析により検出することができる。
【００７８】
本発明の本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドはまた、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡による、腫瘍細胞のインサイツ検出又は定量的決定のため、組織学的にも用いることができる。インサイツ検出又は決定は、患者から組織検体を取りだし、そして検体中の任意の腫瘍細胞へ標識抗体を結合させることにより達成する。こうした手法の使用は、試料中の新生物細胞の検出を可能にするのみでなく、またそれらの空間的分布の決定も可能にする。別の例として、生物学的試料は、スライド上に新生物細胞を含む生物学的材料の塗抹であることも可能であり、生物学的材料中の新生物細胞の検出は、顕微鏡で塗抹を試験することにより、又はフルオサイトメトリーにより達成する。
【００７９】
新生物のインビボ検出
もしくは、本発明の抗体はまた、新生物を検出するそして位置限定するために、インビボで使用することもできる。こうした方法は、検出可能な作用剤で標識されているそしてそれは例えば、米国特許第４，４４４，７４４号に記載されている、ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２のような本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドを、哺乳動物、望ましくはヒト患者へ非経口で注射することを含むことができる。例えば、ポリペプチドは、薬学的に不活性な放射性同位元素で放射性標識し、そして患者へ投与することが可能である。放射性同位元素の活性は、フォトスキャニング装置を使用して哺乳動物中で検出することが可能であり、対照と比較した活性の増加は、新生物の検出及び位置限定を反映する。
【００８０】
治療
哺乳動物における新生物の診断及びモニタリングに加え、本発明はまた、哺乳動物、望ましくはヒト患者において新生物を治療するための方法も特色とする。本方法は一般に、本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドの生物学的有効量を患者へ投与することを含んでいる。ポリペプチドは典型的には、クモ膜下腔内、皮下、粘膜下又は腔内注射による、ならびに静脈内又は動脈内注射のためのような、いずれかの投与経路を使用する注射手段により、哺乳動物へ投与する。従って、ポリペプチドを、例えば、患者の血流内への、ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２のようなポリペプチドの静脈内注射により、全身的に注射することができ、又はもしくは、ポリペプチドを、新生物の部位へ又は新生物細胞の近傍の位置へ直接注射することも可能である。
【００８１】
一般に、そして上で議論したように、本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドの新生物細胞への結合は、対照細胞と比較して、アポトーシスの誘導、細胞増殖の減少、又はその両方を生じる。もしくは、抗体はまた、補体経路も活性化することができ、それは最終的に細胞膜内へ穿刺される孔の原因となり、細胞死を生じる。
【００８２】
もし望むなら、ポリペプチドはまた、上記のように薬剤又は毒素へコンジュゲートすることもできる。一度細胞表面へ結合されたら、コンジュゲートは細胞原形質内へ貪食され、そこで細胞酵素が切断し、そして、それ故、コンジュゲートから薬剤又は毒素が活性化又は遊離される。一度放出されたら、薬剤又は毒素は細胞を損傷し、そして不可逆的に細胞死を誘導する。放射性標識抗体に関しては、新生物細胞への結合、そして結果として起こる、細胞ＤＮＡから短距離での放射線の放出は、ＤＮＡに損傷を生成し、それ故次の複製ラウンドで細胞死を誘導する。例えば、新生物が対象において検出されそして位置限定された後、より高い用量の標識抗体、７０ｋｇの患者体重に基づくと、一般に１３１Ｉについて２５〜２５０ｍＣｉ、好ましくは用量当たり５０ｎＣｉ〜１５０ｍＣｉ、を注射する。注射は、静脈内、動脈内、リンパ管内、クモ膜下腔内又は腔内であることができ、そして一回より多く反復することができる。いくつかの療法のためには、放射性標識ポリペプチド又はポリペプチド混合物の分割用量を、例えば、２０〜１２０ｍＣｉ（７０ｋｇ患者）の範囲で、複数回投与するのが有利であり、従って、通常、正常組織への照射の比例した増加をもたらすことなく、新生物へより高い細胞殺傷用量を提供している。
【００８３】
標識ポリペプチドを使用する療法は、第一の療法処置として有利に使用されるが、また他の抗新生物療法と組み合わせて（例えば、放射線及び化学療法）、そして外科手術の補助として使用することもできる。こうしたコンジュゲートされたポリペプチドの投与は、小さな転移が外科的に除去不可能である場合に特に有用である。
【００８４】
ポリペプチドと他の抗新生物療法の組み合わせ
化学療法剤及び／又は放射線及び／又は新生物の外科的除去は、随意に本発明のいずれかの方法と組み合わせることが可能である。化学療法剤として使用可能な化合物のクラスには：アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然物及びそれらの誘導体、ホルモン及びステロイド（合成類似体を含んで）、及び合成品が含まれる。アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、エチルエニミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素及びトリアゼン）の例には、ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（シトキサン（商標））、イフォスファミド、メルファレン、クロランブシル、ピポブロマン、トリエチレン−メラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン及びテモゾロミドが含まれる。代謝拮抗剤（葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含んで）は、例えば、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビンリン酸、ペントスタチン及びゲムシタビンを含むことができる。天然物及びそれらの誘導体（ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン及びエピポドフィロトキシンを含んで）もまた使用することができ、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、パクリタクセル（パクリタクセルはタキソール（商標）として商業的に入手可能である）、ミトラマイシン、デオキシコ−フォルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン（特にＩＦＮ−アルファ）、エトポシド及びテニポシドが含まれる。ホルモン及びステロイド（合成類似体を含んで）には、例えば、１７−アルファ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベステロール、テストステロン、プレドニソン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、タモキシフェン、メチルプレドニソロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド、トレミフェン又はゾラデックスが含まれる。合成品（白金配位化合物のような無機の複合体を含んで)の例には、シスプラチン、カルボプラチン、ヒドロキシ尿素、アムサクリン、プロカルバジン、ミトタン、ミトキサントロン、レバミソール及びヘキサメチルメラミンが含まれる。
【００８５】
これら化学療法剤のほとんどの、安全で有効な投与のための方法及び用量は当業者には周知である。加えて、これらの投与は標準文献に記載されている。例えば、化学療法剤の多くの投与は、その開示が本明細書において援用される“Physicians' Desk Reference” (PDR), 例えば１９９６年版(Medical Economics Company, Montvale, NJ. 07645-1742, USA) 、に記載されている。
【００８６】
以下の実施例は、本発明を例示することを目的として提供されており、制限と解釈すべきではない。
【実施例】
【００８７】
実施例１
材料及び方法
ハイブリドーマの産生
以下のように、ＨＡＢ−１ヘテロミエローマへ融合することにより、健常ドナーから得られた脾臓リンパ球を不死化した：
ＨＡＢ−１ヘテロミエローマ細胞を、添加物を含まないＲＰＭＩ１６４０（ＰＡＡ，ウィーン，オーストリア）で２回洗浄し、１５００ｒｐｍで５分、細胞を遠心分離した。次ぎに脾臓リンパ球を、添加物を含まないＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄し、そしてこれらの細胞を１５００ｒｐｍで５分、遠心分離した。ＨＡＢ−１及びリンパ球の両方の細胞ペレットを１０ｍｌの添加物を含まないＲＰＭＩ１６４０に再懸濁し、Ｎｅｕｂａｕｅｒ細胞計数チャンバーで計数した。細胞を再び洗浄し、ＨＡＢ−１細胞及びリンパ球を１：２から１：３の比で一緒に加え、それらを混合し、１５００ｒｐｍで８分、混合物を遠心分離した。ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ）を３７℃に前もって温め、５０ｍｌチューブをわずかに回転させながら、ペレット上へＰＥＧを注意深く滴加した。次ぎに、ペレットを穏やかに再懸濁し、そして３７℃水浴中で正確に９０秒、チューブを回転させた。ＰＥＧを除去するため、１０ｍｌピペットに満たした、添加物を含まないＲＰＭＩ１６４０で２回細胞を洗浄し、１５００ｒｐｍで５分、細胞を遠心分離した。２４ウェルプレートの各ウェルに、ＨＡＴサプリメント（ＰＡＡ，ウィーン，オーストリア）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補給した１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０を加えた。細胞ペレットはＨＡＴサプリメントを含むＲＰＭＩ−１６４０に溶解し、１ｘ１０６細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに加えた。次ぎに２４ウェルプレートを、加湿した３７℃のインキュベーター内に置き、毎週ＨＡＴサプリメントを含むＲＰＭＩ−１６４０を交換した。４〜６週間後、細胞培養物上清は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で抗体産生をスクリーニングした。
【００８８】
特に、ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２ヒトモノクローナル抗体を、上記の融合実験において、２人の健常ドナーに由来する２．５ｘ１０８の脾臓リンパ球を使用することにより同定した。この融合から、理論的な２５０クローンから１８１クローンを、７２％の融合頻度で得た。これら１８１クローンの内、ＩｇＭ産生クローンの数は４０であり（頻度＝２２％）、そしてこれら４０クローンの内、９が腫瘍特異的ＩｇＭ抗体を発現した（頻度＝２２％）。
【００８９】
ｃＤＮＡ合成及びＲＴ−ＰＣＲ
ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２抗体の配列を得るため、ＱｉａｇｅｎからのＲＮＡＳＥキットを使用し、トリオーマから全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡはまた、当該技術分野において標準の方法、例えば、Krenn et al. (Clin. Exp. Immunol. 115:168-175, 1999) により記載されている方法を使用しても調製することができる。ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２を発現しているハイブリドーマ細胞株から得られた全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成は、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（エッゲンスタイン，ドイツ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を製造元の説明書に従って使用し、５μｇの全ＲＮＡで実施した。ＶＨ及びＶＬ遺伝子の増幅は、１．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４ｐＭプライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ及び１Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，ザンクト  レオン・ロート，ドイツ）を含む２５μｌ容量で実施した。ＰＣＲ生成物は、以下のサイクルプロフィールを使用して増幅した：９５℃で２分、続いて３５サイクルの、９４℃で３０秒；６５℃で３０秒（ＶＨ３及びＶＨ４プライマーに対し）、各々、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ６に対しては６０℃そしてＶＬプライマーに対しては５２℃；７２℃で４分の最終伸長。
【００９０】
抗体の配列決定
ＰＣＲ生成物は、２％アガロース（Ｒｏｔｈ，カールスルーエ，ドイツ）を通したゲル電気泳動、続いてのＪＥＴＳＯＲＢゲル抽出キット（Ｇｅｎｏｍｅｄ，バート・オインハウゼン，ドイツ）を使用したＰＣＲ生成物のゲル抽出により精製した。ＰＣＲ生成物は次ぎに、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ＋クローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ハイデルベルク，ドイツ）を使用してクローン化した。ＤｙｅＤｅｏｘｙ終結サイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，ワイターシュタット，ドイツ）を使用して１０の陽性クローンを配列決定し、ＡＢＩＰｒｉｓｍ３７３自動化ＤＮＡシクエンサーで分析した。Ｔ３及びＴ７プライマーを使用して両方の鎖を配列決定した。配列は、ＤＮＡＳＩＳ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ配列比較ソフトウェアー及びＧｅｎＢａｎｋ及びＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴデータベースを使用して分析した。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（“ＩＭＧＴ”）データベースがUniversite Montpellier, Montpellier, France のMarie-Paule Lefranc により統合された。
【００９１】
パラフィン切片の免疫組織化学的染色
パラフィン包埋ヒト組織を切片となし（２μｍ）、除パラフィンし、そしてクエン酸（ｐＨ５．５）中、圧力釜で５分間加熱した。切片を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ  ５ｍｇ／ｍｌ）を用い、室温で３０分ブロックした。処理切片は次ぎに、異なったＩｇＭ抗体（１０μｇ／ｍｌ）又は陽性対照抗体（抗サイトケラチン８抗体又は抗サイトケラチン７抗体、Ｄａｋｏ，ハンブルグ，ドイツ，ＢＳＡ／ＰＢＳで１：２０に希釈）と、加湿インキュベーター中、３７℃で２．５時間インキュベートした。切片をトリス／ＮａＣｌ（３グラム  トリス、４０．５グラム  ＮａＣｌを５リットルの蒸留水に希釈し、ＨＣｌでｐＨを７．４に調節）で３回洗浄し、続いて、３０％ウサギ血清を含有するＰＢＳに１：５０で希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体（ヒトＩｇＭ抗体に対して）、又は３０％ヒトＡＢ血漿を含有するＰＢＳに１：５０で希釈したウサギ抗マウスコンジュゲート（Ｄａｋｏ，ハンブルグ，ドイツ）（陽性対照抗体に対して）と室温で１時間インキュベートした。トリス／ＮａＣｌで３回洗浄後、組織切片をＰＢＳ中で１０分インキュベートし、その後ジアミノベンジジン（０．０５％）−過酸化水素（０．０２％）（Ｓｉｇｍａ，タウフキルヒェン（ミュンヘン），ドイツ）を用いて、室温で別に１０分染色した。反応を流水道水で停止し、切片をヘマトキシリンで対比染色した。グリセロール−ゼラチンでマウントした後、切片は光学顕微鏡を使用して分析した。
【００９２】
腫瘍からの凍結切片の免疫組織化学的染色
凍結ヒト組織を切片化し（４μｍ）、アセトンで固定し、風乾しそしてトリス／ＮａＣｌ（３グラム  トリス、４０．５グラム  ＮａＣｌを５リットルの蒸留水に希釈し、ＨＣｌでｐＨを７．４に調節）で洗浄した。凍結切片は次ぎに、３％粉乳を含有するＰＢＳを用い、室温で３０分ブロックした。トリス／ＮａＣｌで３回洗浄後、切片を、同一濃度のＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２ヒトＩｇＭ抗体又は無関係のヒトモノクローナルＩｇＭ（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ，Ｄｉａｎｏｖａ）、又はＢＳＡ／ＰＢＳで１：５０で希釈したマウス抗サイトケラチン８抗体（Ｄａｋｏ，ハンブルグ，ドイツ）と、室温で３０分インキュベートした。切片をトリス／ＮａＣｌで３回洗浄し、続いて第二抗体（ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒト抗体又はウサギ抗マウスコンジュゲート１：５０）と室温で３０分インキュベートした。トリス／ＮａＣｌでの３回の洗浄及びＰＢＳ中での１０分のインキュベーション後、切片をジアミノベンジジン（０．０５％）−過酸化水素（０．０２％）（Ｓｉｇｍａ，タウフキルヒェン（ミュンヘン），ドイツ）を用いて、室温で１０分染色した。反応を流水道水で停止し、切片をヘマトキシリンで対比染色した。グリセロール−ゼラチンでマウントした後、切片は光学顕微鏡を使用して分析した。
【００９３】
サイトスピン調製
接着性増殖細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（ＰＡＡ，ウィーン，オーストリア）を加えることにより剥離させ、続いて加湿インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で５分インキュベートし、そして１，５００ｒｐｍで５分、遠心分離した。細胞を次ぎに１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０細胞培養培地（ＰＡＡ，ウィーン，オーストリア）で２回洗浄した。細胞数を１ｘ１０５細胞／ｍｌの密度に調節した。この溶液から１００μｌを、サイトスピン遠心機（ＣＹＴＯＳＰＩＮ  ２，シャンドン，ＵＫ）を用いて、５０ｒｐｍで２分、顕微鏡スライド上へ遠心分離した。生じたサイトスピンを少なくとも２時間乾燥し、以下のように染色した。
【００９４】
サイトスピンの免疫ペルオキシダーゼ染色
サイトスピンを少なくとも２時間室温で乾燥した。サイトスピンは次ぎに、アセトン中で１０分固定した。固定したサイトスピンは室温で３０分乾燥し、トリス／ＮａＣｌ（３グラム  トリス、４０．５グラム  ＮａＣｌを５リットルの蒸留水に希釈し、ＨＣｌでｐＨを７．４に調節）で３回洗浄し、そしてトリス／ＮａＣｌ中に５分間置いた。サイトスピンは、３％粉乳を含んだＰＢＳ（サイトスピン当たり１００μｌ）で１５〜３０分ブロックし、トリス／ＮａＣｌで３回洗浄した。サイトスピンは、サイトスピン当たり１００μｌの一次抗体（例えば、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、２０μｇ／ｍｌで；ＢＳＡ／ＰＢＳ中、１：５０の抗サイトケラチン８；又は陰性対照としてＲＰＭＩ  １６４０培地（ＰＡＡ，ウィーン，オーストリア））と、加湿チャンバー中、室温で３０分インキュベートした。インキュベーション後、サイトスピンをトリス／ＮａＣｌで３回洗浄した。
【００９５】
サイトスピンは次ぎに、サイトスピン当たり１００μｌの二次抗体含有溶液（７０％ＰＢＳ＋３０％ウサギ又はヒト血清＋例えば、１：５０ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス抗体、又は１：５０ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体；Ｄａｋｏ，ハンブルグ，ドイツ）と、加湿チャンバー中、室温で３０分インキュベートし、トリス／ＮａＣｌで３回洗浄し、そしてＰＢＳ中に１０分間置いた。サイトスピンは次ぎに、１００μｌの０．０５％ジアミノベンジジン及び０．０２％過酸化水素含有溶液（Ｓｉｇｍａ，タウフキルヒェン（ミュンヘン），ドイツ）中で１０分インキュベートした。インキュベーション後、サイトスピンを蒸留Ｈ２Ｏで洗浄し、ヘマトキシリン染色溶液（Ｒｏｔｈ，カールスルーエ，ドイツ）に５分浸した。サイトスピンは次ぎに流水道水で１５分すすぎ、蒸留Ｈ２Ｏで洗浄し、そして前もって温めたグリセロール−ゼラチンで被覆した。
【００９６】
以下の実験は、上記の材料及び方法を使用して実行した。
実施例２
ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２モノクローナル抗体を発現する細胞株の発生
上記のように、我々は、健常ドナーの脾臓から得られたリンパ球とヘテロミエローマ細胞株を融合することにより、ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２モノクローナル抗体発現ハイブリドーマを得た。生じた細胞は、三つの細胞の融合であるので、トリオーマとして知られているハイブリドーマの型である。正常Ｂリンパ球と同様、このトリオーマは抗体を産生する能力を有している。抗体の特異性は、トリオーマを発生させるために使用した、患者からの本来のリンパ球の特異性により決定される。
【００９７】
特に、単一細胞懸濁液を脾臓の機械的破壊により調製し、続いて直後に融合するか又は冷凍保存した。不死化のためには、健常ドナーから誘導された２．５ｘ１０８の脾臓リンパ球とヘテロミエローマＨＡＢ−１細胞(Faller, et al., Br. J. Cancer 62:595-598, 1990) をインキュベートし、リンパ球及びＨＡＢ−１細胞の融合を、ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ，マンハイム，ドイツ）を使用することにより容易にした。ハイブリドーマを２４ウェルプレートにまき、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び１０％ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）サプリメント（ＰＡＡ，ウィーン，オーストリア）、１％グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０（ＰＡＡ，ウィーン，オーストリア）中で培養した。約４週間後、ハイブリドーマの上清を、ＥＬＩＳＡを用いて抗体含量をスクリーニングした。４０のＩｇＭ産生クローンを得た。ＥＬＩＳＡ陽性クローンは次ぎに、腫瘍特異性を確認するため、異なった腫瘍組織及び正常組織のパネルについて免疫組織化学的に試験した。４０のＩｇＭ産生クローンの内、９が腫瘍特異的ＩｇＭ抗体を産生した。腫瘍特異的抗体はさらに、免疫組織化学的に、遺伝子的に、生化学的に、そして当該技術分野において標準の分子生物学的方法を使用して特徴付けた。
【００９８】
ヒトモノクローナル抗体ＮＯＲＭ−１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）及び核酸配列（配列番号２）は図７に示されている。図７に示されているように、ＮＯＲＭ−１可変領域重鎖の補体決定領域１（ＣＤＲ１）は、アミノ酸３１〜３５をコードするヌクレオチド９１〜１０５にまたがっており、ＣＤＲ２はアミノ酸５０〜６６をコードするヌクレオチド１４８〜１９８にまたがっており、そしてＣＤＲ３はアミノ酸９９〜１０７をコードするヌクレオチド２９５〜３２１にまたがっている。加えて、Ｄ領域はヌクレオチド２９７〜３１９にまたがっており、そしてＪ領域はヌクレオチド３２７〜３５７にまたがっている。
【００９９】
ヒトモノクローナル抗体ＮＯＲＭ−１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）及び核酸配列（配列番号４）は図８に示されている。図８に示されているように、ＮＯＲＭ−１可変領域軽鎖のＣＤＲ１は、アミノ酸２３〜３３をコードするヌクレオチド６７〜９９にまたがっており、ＣＤＲ２はアミノ酸４９〜５５をコードするヌクレオチド１４５〜１６５にまたがっており、そしてＣＤＲ３はアミノ酸８８〜９９をコードするヌクレオチド２６２〜２９７にまたがっている。加えて、Ｊ領域はヌクレオチド２９１〜３００にまたがっている。
【０１００】
ヒトモノクローナル抗体ＮＯＲＭ−２の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５）及び核酸配列（配列番号６）は図９に示されている。図９に示されているように、ＮＯＲＭ−２可変領域重鎖のＣＤＲ１は、アミノ酸３１〜３５をコードするヌクレオチド９１〜１０５にまたがっており、ＣＤＲ２はアミノ酸５０〜６６をコードするヌクレオチド１４８〜１９８にまたがっており、そしてＣＤＲ３はアミノ酸９９〜１０８をコードするヌクレオチド２９５〜３２４にまたがっている。加えて、Ｄ領域はヌクレオチド２９７〜３００にまたがっており、そしてＪ領域はヌクレオチド３０１〜３２４にまたがっている。
【０１０１】
ヒトモノクローナル抗体ＮＯＲＭ−２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７）及び核酸配列（配列番号８）は図１０に示されている。図１０に示されているように、ＮＯＲＭ−２可変領域軽鎖のＣＤＲ１は、アミノ酸２３〜３６をコードするヌクレオチド６７〜１０８にまたがっており、ＣＤＲ２はアミノ酸５２〜５８をコードするヌクレオチド１５４〜１７４にまたがっており、そしてＣＤＲ３はアミノ酸９１〜１０１をコードするヌクレオチド２７１〜３０３にまたがっている。加えて、Ｊ領域はヌクレオチド２９９〜３０６にまたがっている。
【０１０２】
実施例３
抗体の免疫組織化学的特徴付け
ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２ヒトモノクローナル抗体ＩｇＭ抗体の遺伝子起源を探索するため、ＶＨ及びＶＬ遺伝子を増幅し、クローン化し、そして配列決定した。最も相同的な生殖細胞系列遺伝子を同定し、そして体細胞突然変異を検出するため、配列をＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴデータベース中の生殖細胞系列配列と比較した。結果は表１に表されている。ＶＨセグメントのヌクレオチド配列の、最も近い、報告されている生殖細胞系列ＶＨ遺伝子のそのヌクレオチド配列との同一性の程度は１００％であった。抗体はＶＨ３遺伝子ファミリーによりコードされているＶＨ領域を含有する。生殖細胞系列遺伝子に対するＶＨ領域の密接な相同性及び低いＲ／Ｓ比は、ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２抗体が、抗原接触を原因とする体細胞突然変異による親和性成熟を起こさないことを示している。ＶＬセグメントのヌクレオチド配列の、それらのほとんど相同的なＶＬ生殖細胞系列遺伝子に対する同一性の程度は、９９．３から９９．６％の範囲であった（両方の抗体ともλ軽鎖遺伝子を利用している）。Ｒ／Ｓ比も再び低く、そして突然変異はフレームワーク領域に限定されていた。
【０１０３】
【表１】
2007521020.tif 000002
異なった腫瘍組織について最初に試験した後、抗体の反応パターンを、多様なパラフィンおよび凍結包埋された癌腫及び正常組織の免疫組織化学的染色を使用してより詳細に調べた。ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２抗体は、正常組織との結合活性を何も示さなかった（表２）。
【０１０４】
【表２】
2007521020.tif 000003
対照的に、ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２抗体は多数の腫瘍組織を特異的に染色する（表３参照）。
【０１０５】
【表３】
2007521020.tif 000004
図１及び２は、同一器官の正常組織の染色パターンと比較した、いくつかの腫瘍組織に対するＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２抗体の反応性パターンの例を示している。これらの図に示されているように、健常ドナーから単離されたＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２抗体は特異的に腫瘍細胞を染色するが、一方、周囲組織及び正常組織は染色されない。
【０１０６】
さらに、ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２モノクローナル抗体はまた、多数の癌腫細胞株も特異的に染色する。特に、ＮＯＲＭ−１抗体は、肺扁平上皮細胞癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ３８３）；肺腺癌細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ１９６）；結腸癌腫細胞株ＣＡＣＯ−２（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ１６９、ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−３７）；結腸癌腫細胞株Ｃｏｌｏ−２０６Ｆ（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２１）；胃癌腫細胞株２３１３２／８７（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２０１）；膵臓癌腫細胞株ＡＳＰＣ−１（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１６８２）；前立腺癌腫細胞株ＤＵ−１４５（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２６１、ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−８１）；及び前立腺癌腫細胞株ＢＭ１６０４（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２９８）を染色する。ＮＯＲＭ−２抗体はＣｏｌｏ−６９９；ＣＡＣＯ−２；２３１３２／８７；ＤＵ−１４５；及びＢＭ１６０４細胞を染色する。これらの細胞のスライドは、材料及び方法の節に記載したサイトスピンプロトコールに従って染色した。
【０１０７】
実施例４
抗体が細胞増殖を抑制するかどうかの決定
細胞増殖は、当該技術分野において標準である多数の方法、例えば、テトラゾリウム塩の還元によりアッセイすることができる。黄色テトラゾリウム塩、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（「ＭＴＴ」）（Ｓｉｇｍａ，セントルイス，ＭＯ）は、代謝的に活性な細胞により、一部、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨのような還元均等物を発生するミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素の作用により、還元される。生じる細胞内紫色ホルマザンを可溶化しそして分光光度的手段により定量することが可能である。ＭＴＴ細胞増殖アッセイは、細胞増殖の速度を、そして代謝現象がアポトーシスを導く場合、細胞生存度の減少を測定する。
【０１０８】
ＭＴＴアッセイのため、ヒト胃腺癌細胞株２３１３２／８７を使用した。この癌腫細胞株は、新しく調製した胃腫瘍患者の初代培養から誘導し、一般に、細胞培養の人為的結果を避けるため、この細胞株の初期継代（１０未満）を使用した。２３１３２／８７細胞をトリプシン処理し、それらを完全増殖培地中で１ｘ１０６細胞／ｍｌに希釈した。この懸濁液の５０μｌを９６ウェルプレートのウェル内へピペットで移すと、およそ５ｘ１０４細胞／ウェルを生じる。ウェルの最初の列を空にして残した。次ぎに、各ウェルへ、完全培地に希釈した５０μｌの抗体を加えた。正常増殖を示すため、細胞へ完全増殖培地を補給した（対照１）。同一濃度の無関係ヒトＩｇＭ抗体（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ，Ｄｉａｎｏｖａ）は陰性対照として働いた（対照２）。９６ウェルプレートは次ぎに、加湿３７℃インキュベーター中で、４８時間インキュベートした。インキュベーション期間後、５０μｌのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液）を各ウェルへ加えた。９６ウェルプレートを３７℃で３０分インキュベートし、８００ｘｇで５分遠心分離した。上清を吸引し、１５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各ウェルに加え、細胞ペレットを再懸濁した。ＥＬＩＳＡリーダー中、６９０ｎｍの参照波長を用い、５４０ｎｍの波長で吸光度を決定した。４８時間後、ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２抗体は、対照と比較して、２３１３２／８７胃癌腫細胞の細胞増殖を抑制した（図３）。
【０１０９】
実施例５
抗体がアポトーシスを誘導するかどうかの決定
当該技術分野において標準の多数のアッセイを、抗体が細胞のアポトーシスを誘導するかどうかを決定するために使用することができる。
【０１１０】
例えば、ＣＥＬＬ  ＤＥＡＴＨ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ，マンハイム，ドイツ）を、ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２抗体がアポトーシスを誘導する程度を分析するために使用した。細胞死検出ＥＬＩＳＡは、各々、ＤＮＡ及びヒストンへ方向付けられたマウスモノクローナル抗体使用する、定量的サンドイッチ−酵素−免疫アッセイ原理に基づいている。このアッセイは、アポトーシスで死んだ細胞の細胞質内へ放出されるモノ−及びオリゴ−ヌクレオソームの特異的決定を可能にする。
【０１１１】
特に、１ｘ１０４  ２３１３２／８７胃癌腫細胞を９６ウェルプレートにまき、異なった濃度のＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２抗体存在下、加湿ＣＯ２インキュベーター中、３７℃及び７％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。正常増殖を示すため、細胞へ完全増殖培地を補給した（対照１；ＲＰＭＩ）。同一濃度の無関係ヒトＩｇＭ抗体（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ，Ｄｉａｎｏｖａ）は陰性対照として働いた（対照２）。インキュベーション期間後、細胞を２００ｇで１０分遠心分離し、上清を除去した。生じた細胞ペレットは次ぎに、溶解緩衝液と室温で３０分インキュベートした。遠心分離後、上清をストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）内へ移し、免疫試薬（１０％抗ヒストン−ビオチン、１０％抗ＤＮＡ−ペルオキシダーゼ（抗ＤＮＡ  ＰＯＤ）及び８０％インキュベーション緩衝液の混合物）を加え、その後２５０ｒｐｍでのＭＴＰしんとう機上、室温で２時間インキュベーションした。インキュベーション期間に続いて、非結合成分を、インキュベーション緩衝液での洗浄工程により除去した。ペルオキシダーゼ活性を、基質としてＡＢＴＳ（商標）（ＡＢＴＳ（商標）（２，２’−アジノ−ジ［３−エチル−ベンゾ−チアゾリン−スルホン酸］）１錠を５ｍｌの基質緩衝液に溶解）を用いて測光法で決定した。抗体誘導アポトーシスは、ブランクとしてＡＢＴＳ（商標）溶液と比較して、４１５ｎｍ又は４０５ｎｍの波長で（およそ４９０ｎｍの参照波長）ＥＬＩＳＡリーダーを使用し、この反応の結果として形成された緑色の沈殿物の呈色強度を決定することにより測定した。この呈色強度に基づいて、抗体誘導アポトーシスのレベルを計算した。これらの実験は、培地対照及び対照抗体と比較した場合、各抗体、ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２が２４及び４８時間のインキュベーション後に、癌腫細胞においてアポトーシスを誘導することを明瞭に示した（図４、図５Ａ及び５Ｂ、図６Ａ及び６Ｂ）。
【０１１２】
実施例６
新生物のインビボイメージング
結腸直腸癌腫のような新生物を有していると疑われた患者に、本明細書に記載した方法を使用して、放射性ヨウ素化ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２抗体、又は別の腫瘍特異的ポリペプチド、及び放射性標識非特異的抗体の用量を与えることができる。イメージングのための腫瘍の位置限定はGoldenberg et al. (N. Engl. J. Med., 298:1384, 1978) の方法に従って達成することができる。Ｉ．Ｖ．により、１３１Ｉ−ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２抗体、及びＴｃ−９９ｍ−標識非特異的抗体の溶液の等量注入液を患者に投与することができる。試薬Ｉ．Ｖ．の投与に先立って、患者は典型的には、抗体調製液（非標識）に対する又は抗体調製液のような同一種の抗体に対する過敏性を前もって試験する。１３１Ｉの甲状腺取り込みを阻止するため、放射性ヨウ素化抗体の注射１日前又はそれ以前の日から開始し、１日２又は３回、５滴の用量でルゴール液を経口で投与する。多様な体の領域の画像及び投影図を、標識された調製液を注射して４、８及び２４時間後に撮ることができる。もし存在するならば、新生物（例えば、胃腺癌）が、DeLand et al. (Cancer Res. 40:3046, 1980) により、１３１Ｉ標識抗ＣＥＡ抗体及びＴｃ−９９ｍ−標識ヒト血清アルブミンのために記載されているように、１３１ＩのカウントからＴｃ−９９ｍのカウントを差し引いた、ガンマカメライメージングにより検出される。注射８時間後、イメージングを通常クリアーし、２４時間のスキャンに至るまで時間とともに向上させる。
【０１１３】
実施例７
標識抗体混合物を使用する新生物の治療
新生物を有すると診断された患者、例えば、胃腺癌を有すると診断された患者は、以下のように本発明の方法を使用して同定されたポリペプチドで治療することができる。ルゴール溶液を、例えば、１日３回７滴、患者に投与することができる。続いて、１３１Ｉ−ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２抗体の治療量を患者に投与することができる。例えば、５０ｍＣｉの１３１Ｉ用量を、３週間にわたって毎週与えることができ、血液学的毒性により治療を中断するまで、個体に基づいて調節された間隔（例えば、３ヶ月毎）で繰り返す。正確な治療計画は一般に主治医又は治療を監督する人が決定する。放射性ヨウ素化抗体は、５０ｍｌの無菌生理学的食塩水中、ゆっくりしたＩ．Ｖ．注入で投与することができる。３回目の注射投与量の後、原発性腫瘍のサイズの減少及び転移に注目する（特に、第二の治療サイクル後、又は治療開始から１０週後）。
【０１１４】
実施例８
コンジュゲートした抗体を使用する治療
新生物を有すると診断された患者、例えば、転移した胃癌を有する患者は、１３１Ｉ−ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２、１０Ｂ−ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２、及びＴｃ−９９ｍ標識非特異的抗体の溶液で治療することができる。７０ｋｇ患者体重に基づいた１００ｍＣｉの１３１Ｉ活性を提供するのに十分な量の１３１Ｉ−ＮＯＲＭ−１又はＮＯＲＭ−２抗体（５０ｍｌの無菌生理学的食塩水中）を患者に投与することができる。この投与量は、抗体分子当たり、４０〜８０ホウ素原子及び８〜１６ホウ素−１０原子を有する３．３ｍｇの抗体に等しい。新生物は最初に、実施例６の手法を使用して正確に位置限定する。加えて、前の実施例におけるように、ルゴール溶液を患者へ連続的に投与せねばならない。熱中性子のよく平行化されたビームは、決められた腫瘍位置に焦点を当てることができる。８〜２０分の時間に搬送される、４００〜８００ラドの熱中性子ビーム線量での照射が各腫瘍部位にもたらされ、同時外部照射療法が指示されていない限り、個体に基づいて調節された間隔で、腫瘍位置発見抗体の投与（放射性標識と又はなしで）とともに随意に繰り返すが、通常３２００ラドの総線量は超えないようにする。もし望むなら、この治療に加えて、化学療法剤のような抗腫瘍剤もまた、患者へ投与することができる。
【０１１５】
他の態様
本発明を、その特定の態様に関連して記載してきたが、さらなる修飾が可能であり、そして本出願は本発明の原理に一般に従う本発明のいずれもの変形、使用又は適用に及ぶことが意図されており、そして本発明が関与する当該技術分野内の、周知の又は慣用的な実施の範囲内にある本開示からのこうした離脱を含み、そして先に示した必須の特色へ適用することができることが理解されるであろう。
【０１１６】
国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ０３／０１３３５及びＰＣＴ／ＩＢ０３／０３４８７号、米国特許第５，３６７，０６０及び５，６４１，８６９号、そして本明細書で引用した全ての他の参照文献は、本明細書において援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは異なった癌腫及び正常組織に対するＮＯＲＭ−１及び対照抗体の免疫組織化学的染色を示している一連の画像である。パラフィン切片をヘマトキシリン−エオシン（「Ｈ＆Ｅ」）、陽性対照抗体（膵臓の腺癌に対しては抗サイトケラチン７、そして胃及び結腸の腺癌に対しては抗サイトケラチン８（「Ｃｋ」）、陰性対照として無関係ヒトＩｇＭ抗体（「対照ＩｇＭ」）、及びＮＯＲＭ−１で染色した。図１Ａは結腸の腺癌の染色を示しており；図１Ｂは散在型胃癌腫の染色を示しており；図１Ｃは膵臓の腺癌の染色を示しており；図１Ｄは正常結腸組織の染色を示しており；図１Ｅは正常胃組織の染色を示しており；そして図１Ｆは正常膵臓組織の染色を示している。これらの画像の原倍率は１００ｘであった。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは異なった癌腫及び正常組織に対するＮＯＲＭ−２及び対照抗体の免疫組織化学的染色を示している一連の画像である。パラフィン切片をヘマトキシリン−エオシン（「Ｈ＆Ｅ」）、陽性対照抗体（抗サイトケラチン８（「Ｃｋ」）、陰性対照として無関係ヒトＩｇＭ抗体（「対照ＩｇＭ」）、及びＮＯＲＭ−２で染色した。図２Ａは散在型胃癌腫の染色を示しており；図２Ｂは肺の腺癌の染色を示しており；図２Ｃは結腸の腺癌の染色を示しており；図２Ｄは正常胃組織の染色を示しており；図２Ｅは正常肺組織の染色を示しており；そして図２Ｆは正常結腸組織の染色を示している。これらの画像の原倍率は１００ｘであった。
【図３】図３は、インビトロでの抗体ＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２の機能的分析を示しているグラフである。胃癌腫細胞株２３１３２／８７（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ２０１）の増殖に対する抗体処理の結果は、ＭＴＴ増殖アッセイを使用して測定した。対照１においては抗体を含まない完全増殖培地を細胞へ加え、そして対照２においては、同様の濃度で無関係ＩｇＭ抗体を含んでいる完全増殖培地を細胞へ加えた。
【図４】図４はＮＯＲＭ−１及びＮＯＲＭ−２抗体がアポトーシスを誘導することを示しているグラフである。これらの実験において、２３１３２／８７細胞のアポトーシスはＣｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳアポトーシスアッセイ（Ｒｏｃｈｅ，マンハイム，ドイツ）を使用して検出した。対照１においては抗体を含まない完全増殖培地を細胞へ加え、そして対照２においては、同様の濃度で無関係ＩｇＭ抗体を含んでいる完全増殖培地を細胞へ加えた。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは、ＮＯＲＭ−１モノクローナル抗体が２３１３２／８７細胞のアポトーシスを、インキュベーション２４時間（図５Ａ）及び４８時間（図５Ｂ）後に誘導することを示している、細胞死酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の結果の一連のグラフである。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、ＮＯＲＭ−２モノクローナル抗体が２３１３２／８７細胞のアポトーシスを、インキュベーション２４時間（図６Ａ）及び４８時間（図６Ｂ）後に誘導することを示している、細胞死ＥＬＩＳＡの結果の一連のグラフである。
【図７】図７は、ヒトモノクローナル抗体ＮＯＲＭ−１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）及び核酸配列（配列番号２）である。Ｄ領域及びＪ領域が指示されており、そして補体決定領域（「ＣＤＲ」）１〜３もまた示されている。
【図８】図８は、ヒトモノクローナル抗体ＮＯＲＭ−１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）及び核酸配列（配列番号４）である。Ｊ領域が指示されており、そしてＣＤＲ１〜３もまた示されている。
【図９】図９は、ヒトモノクローナル抗体ＮＯＲＭ−２の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５）及び核酸配列（配列番号６）である。Ｄ領域及びＪ領域が指示されており、そしてＣＤＲ１〜３もまた示されている。
【図１０】図１０は、ヒトモノクローナル抗体ＮＯＲＭ−２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７）及び核酸配列（配列番号８）である。Ｊ領域が指示されており、そしてＣＤＲ１〜３もまた示されている。
【図１】
2007521020.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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