(57)【要約】  本発明はとりわけ、新規のローソニア・イントラセルラーリスタンパク質をコード化する核酸に関する。本発明はさらに、これらの配列を含むＤＮＡ断片、組み換えＤＮＡ分子、及び生きた組み換え担体に関する。本発明は、このような核酸、ＤＮＡ断片、組み換えＤＮＡ分子、及び生きた組み換え担体を含む宿主細胞にも関する。さらに、本発明は、これらのヌクレオチド配列によりコード化されるタンパク質、及びワクチンの調製のためのそれらの使用に関する。本発明は、ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチン、及びその調製のための方法にも関する。最後に、本発明は、ローソニア・イントラセルラーリス抗原及びローソニア・イントラセルラーリスに対する抗体を検出するための診断用検査に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されている配列を有する核酸と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する、７５ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質をコード化する核酸又は前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する前記核酸の一部。
【請求項２】
配列番号３に記載されている配列を有する核酸と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する、２７ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質をコード化する核酸又は前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する前記核酸の一部。
【請求項３】
配列番号５に記載されている配列を有する核酸と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する、６２ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質をコード化する核酸又は前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する前記核酸の一部。
【請求項４】
配列番号７に記載されている配列を有する核酸と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する、５７ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質をコード化する核酸又は前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する前記核酸の一部。
【請求項５】
配列番号９に記載されている配列を有する核酸と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する、７４ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質をコード化する核酸又は前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する核酸の一部。
【請求項６】
配列番号１１に記載されている配列を有する核酸と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する、４４ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質をコード化する核酸又は前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する前記核酸の一部。
【請求項７】
配列番号１３に記載されている配列を有する核酸と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する、４３ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質をコード化する核酸又は前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する前記核酸の一部。
【請求項８】
配列番号１５に記載されている配列を有する核酸と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する、２６／３１ｋＤのローソニア・イントラセルラーリスタンパク質をコード化する核酸又は前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する前記核酸の一部。
【請求項９】
配列番号１７に記載されている配列を有する核酸と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する、１０１ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質をコード化する核酸又は前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する前記核酸の一部。
【請求項１０】
請求項１ないし９に記載の核酸を含むＤＮＡ断片。
【請求項１１】
機能的に連結されたプロモーターの調節下にある、請求項１ないし９に記載の核酸を含む組み換えＤＮＡ分子又は請求項１０に記載のＤＮＡ断片。
【請求項１２】
請求項１ないし９に記載の核酸、請求項１０に記載のＤＮＡ断片、又は請求項１１に記載の組み換えＤＮＡ分子を含む、生きた組み換え担体。
【請求項１３】
請求項１ないし９に記載の核酸、請求項１０に記載のＤＮＡ断片、請求項１１に記載の組み換えＤＮＡ分子、又は請求項１２に記載の生きた組み換え担体を含む宿主細胞。
【請求項１４】
配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％相同であるアミノ酸配列を含む７５ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、又は該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項１５】
配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％相同であるアミノ酸配列を含む２７ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、又は該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項１６】
配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％相同であるアミノ酸配列を含む６２ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、又は該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項１７】
配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％相同であるアミノ酸配列を含む５７ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、又は該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項１８】
配列番号１０に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％相同であるアミノ酸配列を含む７４ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、又は該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項１９】
配列番号１２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％相同であるアミノ酸配列を含む４４ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、又は該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２０】
配列番号１４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％相同であるアミノ酸配列を含む４３ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、又は該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２１】
配列番号１６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％相同であるアミノ酸配列を含む２６ｋＤ／３１ｋＤのローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、又は該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２２】
配列番号１８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％相同であるアミノ酸配列を含む１０１ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、又は該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２３】
ワクチン中で使用するための請求項１４ないし２２に記載のローソニア・イントラセルラーリスタンパク質。
【請求項２４】
ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチンを製造するための、請求項１４ないし２２に記載のローソニア・イントラセルラーリスタンパク質の使用。
【請求項２５】
請求項１ないし９に記載の核酸、請求項１０に記載のＤＮＡ断片、請求項１１に記載の組み換えＤＮＡ分子、請求項１２に記載の生きた組み換え担体、請求項１３に記載の宿主細胞又は請求項１４ないし２２に記載のタンパク質と医薬的に許容できる担体とを含むことを特徴とする、ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチン。
【請求項２６】
アジュバントを含むことを特徴とする、請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２７】
ブタに対して病原性のあるウィルス又は微生物に由来するさらなる抗原又は前記抗原をコード化する遺伝情報を含むことを特徴とする、請求項２５又は請求項２６に記載のワクチン。
【請求項２８】
ブタに対して病原性のある前記ウィルス又は微生物が、仮性狂犬病ウィルス、ブタインフルエンザウィルス、ブタパルボウィルス、感染性胃腸炎ウィルス、ロタウィルス、エシェリヒア・コリ、エリシペォスリックス・ルシオパシアエ、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、サルモネラ・コレラスイス、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・ムルトシダ、ストレプトコッカス・スイス、マイコプラズマ・ハイオニューモニアエ、ブラチスピラ・ハイオダイセンテリエ及びアクチノバチラス・プレウロニューモニアエからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２７に記載のワクチン。
【請求項２９】
請求項１４ないし２２に記載のタンパク質に対する抗体を含むことを特徴とする、ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチン。
【請求項３０】
請求項１ないし９に記載の核酸、請求項１０に記載のＤＮＡ断片、請求項１１に記載の組み換えＤＮＡ分子、請求項１２に記載の生きた組み換え担体、請求項１３に記載の宿主細胞、請求項１４ないし２２に記載のタンパク質、又は請求項１４ないし２２に記載のタンパク質に対する抗体と、医薬的に許容できる担体とを混合することを含む、請求項２５ないし２９に記載のワクチンを調製する方法。
【請求項３１】
前記検査が請求項１４ないし２２に記載のタンパク質又はその断片を含むことを特徴とする、ローソニア・イントラセルラーリスに対する抗体の検出のための診断用検査。
【請求項３２】
前記検査が請求項１４ないし２２に記載のタンパク質又はその断片に対する抗体を含むことを特徴とする、ローソニア・イントラセルラーリスの抗原性材料の検出のための診断用検査。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、とりわけ、新規のローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）のタンパク質をコード化する核酸、これらの配列を含むＤＮＡ断片、組み換えＤＮＡ断片及び生きた組み換え担体、このような核酸、ＤＮＡ断片、組み換えＤＮＡ分子及び生きた組み換え担体を含む宿主細胞、これらのヌクレオチド配列によりコード化されるタンパク質、及びワクチンの製造のためのそれらの使用、ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチン及びその調製方法、並びにローソニア・イントラセルラーリス抗原の検出及びローソニア・イントラセルラーリスに対する抗体の検出のための診断用検査に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ増殖性腸疾患（ＰＰＥ又はＰＥ）は世界的に、現代の養豚産業の重要な疾病となっている。前記疾病は成育集団の１５〜５０％、及び既定の問題の集団における個々の動物の３０％にまで影響を及ぼす。今日、年間経済損失は、影響を受けたブタ１匹につき余分な食餌と設備時間コストが５〜１０米国ドルであると概算されている。ＰＰＥは広く異なる臨床徴候（死亡、青白く及び貧血の動物、水っぽく濃い又は明るい赤色の下痢、鬱、食欲減退及び鈍い動き、成長の遅延、及びＦＣＲの上昇）の一群の慢性及び急性疾患である。しかしながら、２つの一貫した特徴がある。第１に、剖検でのみ観察できる病理学的変化は小腸及び結腸の粘膜の肥厚症である。第２は、影響を受けた腸の腸細胞における細胞質内のわずかに曲がったバクテリアの存在である。これらのバクテリアは今やＰＰＥの病因論学的因子として確立されており、ローソニア・イントラセルラーリスと名づけられている。
【０００３】
何年にもわたり、ローソニア・イントラセルラーリスは、サル、ウサギ、フェレット、ハムスター、キツネ、ウマ、及びダチョウ及びエモー（ｅｍｏｅ）と同じ程度分化した他の動物を含む大きなグループの動物に影響を及ぼすことがわかってきた。ローソニア・イントラセルラーリスは真核生物腸細胞のみにおいて繁殖する、グラム陰性の鞭毛を有するバクテリアであり、無細胞培養はこれまで記述されていない。細胞内において存続及び繁殖するため、ローソニア・イントラセルラーリスは分割している腺窩細胞に浸潤しなければならない。バクテリアは細胞膜と会合し、入り口空胞を介して腸細胞へ迅速に進入する。このことは次に迅速に機能停止し（３時間以内）、及びバクテリアが繁茂し、細胞質中で自由に繁殖する。バクテリアがそれに感染した細胞に成長しそこなわせ、有糸分裂を行い続けさせ、形成不全性腺窩細胞を形成させるメカニズムはまだわかっていない。
【０００４】
疾病に関するローソニア・イントラセルラーリス感染、治療、及び駆除についての最新の理解は、ローソニア・イントラセルラーリスが無細胞培地中で培養できないという事実によって妨げられてきた。ラット腸細胞においてローソニア・イントラセルラーリスをうまく共培養することに関する報告はあるが、このことはローソニア・イントラセルラーリスを撲滅するための不活性化されたワクチンの開発には至っていないが、このようなワクチンに対する必要性は明らかに存在する。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の目的は、ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチンを提供することである。
【０００６】
驚くべきことに、ローソニア・イントラセルラーリスがローソニア・イントラセルラーリスに対する保護的な免疫性をそれぞれ誘導できる９つの新規のタンパク質を、個別に又はこれらの９つの新規のタンパク質のうちのその他のいずれかとともに生成することが、本発明によって今や発見された。
【０００７】
これらの９つの新規タンパク質のうちの第１は７５ｋＤタンパク質と称される。
【０００８】
前記新規タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２で記される。このタンパク質をコード化する遺伝子は配列決定されており、及びその核酸配列は配列番号１において示される。前記遺伝子はまた、実施例において「遺伝子５０７４」と称される。
【０００９】
これら９つの新規のタンパク質の第２は２７ｋＤタンパク質と称される。
【００１０】
前記新規タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４で記される。このタンパク質をコード化する遺伝子は配列決定されており、及びその核酸配列は配列番号３において示される。前記遺伝子はまた、実施例において「遺伝子５６６９」と称される。
【００１１】
これら９つの新規のタンパク質の第３は６２ｋＤタンパク質と称される。
【００１２】
前記新規タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６で記される。このタンパク質をコード化する遺伝子は配列決定されており、及びその核酸配列は配列番号５において示される。前記遺伝子はまた、実施例において「遺伝子４４２３」と称される。
【００１３】
これら９つの新規のタンパク質の第４は５７ｋＤタンパク質と称される。
【００１４】
前記新規タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８で記される。このタンパク質をコード化する遺伝子は配列決定されており、及びその核酸配列は配列番号７において示される。前記遺伝子はまた、実施例において「遺伝子３１２３」と称される。
【００１５】
これら９つの新規のタンパク質の第５は７４ｋＤタンパク質と称される。
【００１６】
前記新規タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１０で記される。このタンパク質をコード化する遺伝子は配列決定されており、及びその核酸配列は配列番号９において示される。前記遺伝子はまた、実施例において「遺伝子５２９３」と称される。
【００１７】
これら９つの新規のタンパク質の第６は４４ｋＤタンパク質と称される。
【００１８】
前記新規タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１２で記される。このタンパク質をコード化する遺伝子は配列決定されており、及びその核酸配列は配列番号１１において示される。前記遺伝子はまた、実施例において「遺伝子５４６４」と称される。
【００１９】
これら９つの新規のタンパク質の第７は４３ｋＤタンパク質と称される。
【００２０】
前記新規タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１４で記される。このタンパク質をコード化する遺伝子は配列決定されており、及びその核酸配列は配列番号１３において示される。前記遺伝子はまた、実施例において「遺伝子５４７３」と称される。
【００２１】
これら９つの新規のタンパク質の第８は２６ｋＤもしくは３１ｋＤタンパク質と称される。
【００２２】
前記新規タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１６で記される。このタンパク質をコード化する遺伝子は配列決定されており、及びその核酸配列は配列番号１５において示される。前記遺伝子はまた、実施例において「遺伝子４３２０」と称される。
【００２３】
これら９つの新規のタンパク質の第９は１０１ｋＤタンパク質と称される。
【００２４】
前記新規タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１８で記される。このタンパク質をコード化する遺伝子は配列決定されており、及びその核酸配列は配列番号１７において示される。前記遺伝子はまた、実施例において「遺伝子２００８」と称される。
【００２５】
多くの異なる核酸配列が、１つ及び同一タンパク質をコード化できることは本分野で周知である。この現象は、アミノ酸をコード化する各トリプレットの第２塩基及び特に第３塩基における動揺として共通して知られる。この現象は、同一のタンパク質をなおもコード化する２つの核酸配列に約３０％の相違をもたらす。それゆえ、約７０％の配列相同性を有する２つの核酸配列は１つ及び同一タンパク質をさらにコード化できる。
【００２６】
したがって、１つの実施態様は、配列が配列番号１の少なくとも９０％に与えられる核酸とあるレベルの相同性を有する、ローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸及び前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する核酸の一部に関する。
【００２７】
好ましくは、このローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸又は前記核酸の一部は配列番号１に与えられる配列を有する核酸と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する。さらに好ましくは、９８％又は１００％もの相同性レベルである。
【００２８】
ヌクレオチド相同性のレベルは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ．で見つけることができるサブプログラム「ＢＬＡＳＴＮ」を選択することによってコンピュータプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」により決定できる。
【００２９】
このプログラムについての参考文献はＴａｔｉａｎａ  Ａ．  Ｔａｔｕｓｏｖａ，  Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．  Ｍａｄｄｅｎ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７４：  ２４７−２５０  （１９９９）である。用いられる因子はデフォルト因子であり、適合についての報酬は＋１、ミスマッチについての罰則は−２、開いた間隙は５、伸長間隙は２、間隙ｘ 低下は５０である。
【００３０】
ある核酸が本発明の核酸であるか否かを決定するための別のアプローチは、その核酸がストリンジェントな条件下で配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズするかどうかという疑問に関する。
【００３１】
ある核酸が、ストリンジェントな条件下で、配列番号１に図示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズすれば、本発明の核酸であると考えられる。
【００３２】
ストリンジェントな条件の定義は、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ及びＷａｈｌの式から得られる（１９８４．  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｎ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３８：  ２６７−２８４．）。
【００３３】
Ｔｍ＝［８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ］−１℃／１％ミスマッチ。
【００３４】
この式において、Ｍは一価の陽イオンの重量モル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡにおけるグアノシンヌクレオチドとシトシンヌクレオチドの割合であり、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さである。
【００３５】
ストリンジェントな条件は、核酸又はその断片が最大１０％のミスマッチを有する場合に、それらが配列番号１に示される配列を有する核酸となおハイブリダイズするという条件である。
【００３６】
第２の実施態様は、配列が配列番号３の少なくとも９０％に与えられる核酸とあるレベルの相同性を有する、ローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸及び前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する核酸の一部に関する。
【００３７】
好ましくは、このローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸又は前記核酸の一部は配列番号３に与えられる配列を有する核酸と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する。さらに好ましくは、９８％又は１００％もの相同性レベルである。
【００３８】
第３の実施態様は、配列が配列番号５の少なくとも９０％に与えられる核酸とあるレベルの相同性を有する、ローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸及び前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する核酸の一部に関する。
【００３９】
好ましくは、このローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸又は前記核酸の一部は配列番号５に与えられる配列を有する核酸と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する。さらに好ましくは、９８％又は１００％もの相同性レベルである。
【００４０】
第４の実施態様は、配列が配列番号７の少なくとも９０％に与えられる核酸とあるレベルの相同性を有する、ローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸及び前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する核酸の一部に関する。
【００４１】
好ましくは、このローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸又は前記核酸の一部は配列番号７に与えられる配列を有する核酸と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する。さらに好ましくは、９８％又は１００％もの相同性レベルである。
【００４２】
第５の実施態様は、配列が配列番号９の少なくとも９０％に与えられる核酸とあるレベルの相同性を有する、ローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸及び前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する核酸の一部に関する。
【００４３】
好ましくは、このローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸又は前記核酸の一部は配列番号９に与えられる配列を有する核酸と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する。さらに好ましくは、９８％又は１００％もの相同性レベルである。
【００４４】
第６の実施態様は、配列が配列番号１１の少なくとも９０％に与えられる核酸とあるレベルの相同性を有する、ローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸及び前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する核酸の一部に関する。
【００４５】
好ましくは、このローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸又は前記核酸の一部は配列番号１１に与えられる配列を有する核酸と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する。さらに好ましくは、９８％又は１００％もの相同性レベルである。
【００４６】
第７の実施態様は、配列が配列番号１３の少なくとも９０％に与えられる核酸とあるレベルの相同性を有する、ローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸及び前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する核酸の一部に関する。
【００４７】
好ましくは、このローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸又は前記核酸の一部は配列番号１３に与えられる配列を有する核酸と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する。さらに好ましくは、９８％又は１００％もの相同性レベルである。
【００４８】
第８の実施態様は、配列が配列番号１５の少なくとも９０％に与えられる核酸とあるレベルの相同性を有する、ローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸及び前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する核酸の一部に関する。
【００４９】
好ましくは、このローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸又は前記核酸の一部は配列番号１５に与えられる配列を有する核酸と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する。さらに好ましくは、９８％又は１００％もの相同性レベルである。
【００５０】
第９の実施態様は、配列が配列番号１７の少なくとも９０％に与えられる核酸とあるレベルの相同性を有する、ローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸及び前記タンパク質の免疫原性断片をコード化する核酸の一部に関する。
【００５１】
好ましくは、このローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコード化する核酸又は前記核酸の一部は配列番号１７に与えられる配列を有する核酸と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する。さらに好ましくは、９８％又は１００％もの相同性レベルである。
【００５２】
本発明は、新規ローソニア・イントラセルラーリスタンパク質をコード化する核酸を開示するので、これらのタンパク質を十分量で得ることが今や初めて可能となる。このことは例えば、前記タンパク質をコード化する遺伝子を発現する発現システムを用いることによってなされうる。
【００５３】
それゆえ、より好ましい実施態様において、本発明は、本発明の核酸を含むＤＮＡ断片に関する。このようなＤＮＡ断片は、例えば、その中に本発明の核酸がクローニングされるプラスミドであり得る。このようなＤＮＡ断片は、例えば、以下に記述されるように、プライマーとして使用するためのＤＮＡの量を増大するのに有用である。
【００５４】
核酸の発現のための不可欠な必要条件は、核酸がプロモーターの調節下にあるように、核酸へ機能的に連結された適切なプロモーターである。プロモーターの選択が、タンパク質発現用の宿主細胞として使用される細胞中で遺伝子転写を誘導することのできる任意の真核細胞プロモーター、原核細胞プロモーター、又はウィルスプロモーターに及ぶことは、当業者に自明である。
【００５５】
それゆえ、本実施態様のさらにより好ましい形態は、機能的に連結されたプロモーターの調節下に置かれた本発明のＤＮＡ断片又は核酸を含む組み換えＤＮＡ分子に関する。これは、例えば標準的な分子生物学的技術によって達成できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２００１．  ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５７７−３）。
【００５６】
機能的に連結されるプロモーターとは、それらが連結される核酸の転写を調節できるプロモーターである。
【００５７】
このようなプロモーターはローソニアプロモーター例えば前記９つの新規タンパク質をコード化する遺伝子のいずれかの生体内発現に関与するプロモーターでありえ、前記プロモーターが発現に使用される細胞において機能的であることが提供される。前記プロモーターは、異種性プロモーターでもありうる。宿主細胞がバクテリアである場合には、使用され得る有用な発現調節配列には、Ｔｒｐプロモーター及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ８，  ４０５７，１９８０）、ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ２７５，  ６１５，  １９７８）、外膜タンパク質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｅ，  Ｍ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １，７７１−７７５，  １９８２）、バクテリオファージλプロモーター及びオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，  ４６７７−４６８８，  １９８３）、α−アミラーゼ（枯草菌）プロモーター及びオペレーター、終結配列、並びに選択される宿主と互換性のある他の発現亢進及び調節配列が含まれる。
【００５８】
宿主細胞が酵母であるとき、有用な発現調節配列には例えばα−接合因子が含まれる。昆虫細胞について、ポリヘドリン又はバキュロウィルスのｐ１０プロモーターが使用できる（Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３，  ２１５６−６５，  １９８３）。宿主細胞が哺乳類由来である場合には、実例となる有用な発現調節配列には、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，  Ｐ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２２，５２４−５２７，  １９８３）、又はメタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，  Ｒ．  Ｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２９６，３９−４２，  １９８２）、又は熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２，  ４９４９−５３，  １９８５）が含まれる。
【００５９】
バクテリア細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞の発現システムは非常に頻繁に用いられるシステムである。このようなシステムは本分野において周知であり、一般に例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｎｏｖａｇｅｎ（ｗｗｗ．ｍｅｒｃｋｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ）、又はＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  ４０３０  Ｆａｂｉａｎ  Ｗａｙ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４３０３−４６０７，  ＵＳＡを通じて商業的に入手可能である。これらの発現システムに次いで、寄生生物ベースの発現システムは非常に興味ある発現システムである。このようなシステムは例えば、発行番号２７１４０７４の仏国特許出願及び発行番号ＵＳ０８／０４３１０９（Ｈｏｆｆｍａｎ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ，  Ｗ．：  Ｐｕｂｌｉｃ．  Ｄａｔｅ  １  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９３）の米国ＮＴＩＳにおいて記述されている。
【００６０】
本発明の前記実施態様のさらに好ましい形態は、本発明の前記９つの新規タンパク質若しくはその免疫原性断片をコード化する遺伝子、本発明のＤＮＡ断片又は本発明の組み換えＤＮＡ分子をコード化する核酸のいずれかをコード化する核酸を含む、生きた組み換え担体（ＬＲＣ）に関する。このような担体は例えばバクテリア及びウィルスである。これらのＬＲＣは、さらなる遺伝情報、この場合本発明の９つの新規タンパク質もしくはその免疫原性断片をコード化する遺伝子のいずれかをコード化する核酸がクローニングされた微生物又はウィルスである。このようなＬＲＣによって感染された動物は担体の免疫原に対してのみでなく、遺伝コードがＬＲＣへとさらにクローニングされるタンパク質、例えば本発明の７５ｋＤタンパク質もしくはその他のタンパク質の免疫原性部分に対しても免疫原性反応を生じるだろう。
【００６１】
バクテリアＬＲＣの一例として、本分野において既知の弱毒化サルモネラ系が興味深く使用できる。
【００６２】
生きた組み換え担体寄生生物はとりわけ、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，  Ａ．  Ｎ．  （Ｉｎｔ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ２８：  １１２１−１１３０  （１９９８））によって記述されている。
【００６３】
また、ＬＲＣウィルスは前記核酸を標的細胞へと輸送する方法として使用されてもよい。生きた組み換え担体ウィルスはまたベクターウィルスとも呼ばれる。ベクターとしてしばしば用いられるウィルスは、ワクチニアウィルス（Ｐａｎｉｃａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７９：  ４９２７  （１９８２））、ヘルペスウィルス（Ｅ．Ｐ．Ａ．０４７３２１０Ａ２）、及びレトロウィルス（Ｖａｌｅｒｉｏ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ；  ｉｎ  Ｂａｕｍ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｄｉｃｋｅ，  Ｋ．  Ａ．，  Ｌｏｔｚｏｖａ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｐｌｕｚｎｉｋ，  Ｄ．  Ｈ．  （Ｅｄｓ．），  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｔｏｄａｙ  −  １９８８．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  ｐｐ．  ９２−９９  （１９８９））である。
【００６４】
本分野で周知の生体内相同性組み換えの技術は、宿主動物において本発明に記載の挿入される核酸の発現を誘導できるよう選択されたバクテリア、寄生生物、又はウィルスのゲノムへと組み換え核酸を導入するのに使用できる。
【００６５】
最後に、本発明のこの実施態様の別の形態は、本発明に記載のタンパク質をコード化する核酸、このような核酸を含むＤＮＡ断片、又は機能的に連結されるプロモーターの調節下でこのような核酸を含む組み換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞に関する。この形態は、本発明の９つの新規のタンパク質もしくはその断片をコード化する遺伝子のいずれかをコード化する核酸分子を含む、生きた組み換え担体を含む宿主細胞にも関する。
【００６６】
宿主細胞は、ｐＢＲ３２２のようなバクテリアベースのプラスミド、又はｐＧＥＸのようなバクテリア発現ベクターと組み合わせた、又はバクテリオファージとの組み合わせた、バクテリア由来、例えば大腸菌種、枯草菌種、及び乳酸菌種由来の細胞であってもよい。宿主細胞は、酵母特異的ベクター分子との組み合わせの真核生物由来、例えば酵母細胞由来のものであるか、又はベクターもしくは組み換えバキュロウィルスと組み合わせた昆虫細胞（Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ；  Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：  ４７−５５  （１９８８））、例えばＴｉプラスミドベースのベクターもしくは植物ウィルスベクターとの組み合わせの植物細胞（Ｂａｒｔｏｎ，  Ｋ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ；  Ｃｅｌｌ  ３２：  １０３３  （１９８３））、これもまた適切なベクター又は組み換えウィルスとの組み合わせのＨｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、又はクランデルフェリン（Ｃｒａｎｄｅｌｌ  Ｆｅｌｉｎｅ）腎細胞のような哺乳類細胞のようなより高度の真核細胞に属していてもよい。
【００６７】
本発明の別の実施態様は、本発明の前記新規タンパク質及びその免疫原性断片に関する。
【００６８】
免疫原性断片の概念は以下に定義されるだろう。
【００６９】
この実施態様の１つの形態はとりわけ、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９０％相同性のあるアミノ酸配列を有するローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００７０】
好ましい形態において、前記実施態様は配列番号２に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性のある配列相同性を有するようなローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００７１】
さらにより好ましくは、９８％又は１００％までもの相同性レベルである。
【００７２】
タンパク質相同性のレベルは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ．で見つけることができるサブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択することによってコンピュータプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」により決定できる。
【００７３】
このプログラムについての参考文献は、Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．  Ｔａｔｕｓｏｖａ，  Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．  Ｍａｄｄｅｎ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７４：  ２４７−２５０  （１９９９）である。用いられるマトリクスは「ｂｌｏｓｕｍ６２」である。用いられる因子はデフォルト因子であり、開いた間隙は１１、伸長間隙は１、間隙ｘ＿低下は５０である。
【００７４】
本明細書に含まれる特定のタンパク質について、天然のバリエーションが個々のローソニア・イントラセルラーリス系の間に存在しうることは理解されるだろう。これらのバリエーションは総体的な配列におけるアミノ酸の差異によって、又は前記配列におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入、反転、又は付加によって示されてもよい。生物学的及び免疫学的活性を本質的に変化させないアミノ酸置換は、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  “Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９７９）によって記述されている。関連するアミノ酸の間のアミノ酸置換又は進化において頻繁に生じた置換はとりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈｏｆ，  Ｍ．  Ｄ．，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．  Ｃ．，  １９７８，  ｖｏｌ．  ５，  ｓｕｐｐｌ．  ３参照）。他のアミノ酸置換にはＡｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、及びＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。この情報に基づいて、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎは迅速かつ高感度でタンパク質を比較し（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２７，  １４３５−１４４１，  １９８５）、相同性のあるタンパク質間の機能的類似性を決定するための方法を開発した。本発明の典型的な実施態様に関するこのようなアミノ酸置換並びに欠失及び／又は挿入を有するバリエーションと同様、結果として生じるタンパク質がそれらの免疫反応性を保持する限り、本発明の範囲に属する。このことは、異なる場の単離物から単離されるとき、本発明のローソニア・イントラセルラーリスタンパク質が同じ免疫学的特徴を有する同一タンパク質を呈しながらも、約９０％の相同性レベルを有し得る理由を説明する。
【００７５】
ローソニア・イントラセルラーリスによる感染に対する又は感染の臨床症状に少なくとも対する免疫反応を誘導できるタンパク質をなお提供する本発明の特定のタンパク質のアミノ酸配列におけるそのようなバリエーションは「免疫原性に本質的に影響を及ぼさない」として考慮される。
【００７６】
この実施態様の第２の形態はとりわけ、配列番号４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９０％相同性のあるアミノ酸配列を有するローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００７７】
好ましい形態において、前記実施態様は配列番号４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性のある配列相同性を有するようなローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００７８】
さらにより好ましくは、９８％又は１００％までもの相同性レベルである。
【００７９】
この実施態様の第３の形態はとりわけ、配列番号６に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９０％相同性のあるアミノ酸配列を有するローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００８０】
好ましい形態において、前記実施態様は配列番号６に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性のある配列相同性を有するようなローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００８１】
さらにより好ましくは、９８％又は１００％までもの相同性レベルである。
【００８２】
この実施態様の第４の形態はとりわけ、配列番号８に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９０％相同性のあるアミノ酸配列を有するローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００８３】
好ましい形態において、前記実施態様は配列番号８に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性のある配列相同性を有するようなローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００８４】
さらにより好ましくは、９８％又は１００％までもの相同性レベルである。
【００８５】
この実施態様の第５の形態はとりわけ、配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９０％相同性のあるアミノ酸配列を有するローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００８６】
好ましい形態において、前記実施態様は配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性のある配列相同性を有するようなローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００８７】
さらにより好ましくは、９８％又は１００％までもの相同性レベルである。
【００８８】
この実施態様の第６の形態はとりわけ、配列番号１２に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９０％相同性のあるアミノ酸配列を有するローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００８９】
好ましい形態において、前記実施態様は配列番号１２に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性のある配列相同性を有するようなローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００９０】
さらにより好ましくは、９８％又は１００％までもの相同性レベルである。
【００９１】
この実施態様の第７の形態はとりわけ、配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９０％相同性のあるアミノ酸配列を有するローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００９２】
好ましい形態において、前記実施態様は配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性のある配列相同性を有するようなローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００９３】
さらにより好ましくは、９８％又は１００％までもの相同性レベルである。
【００９４】
この実施態様の第８の形態はとりわけ、配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９０％相同性のあるアミノ酸配列を有するローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００９５】
好ましい形態において、前記実施態様は配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性のある配列相同性を有するようなローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及びこのようなタンパク質の免疫原性断片に関する。
【００９６】
さらにより好ましくは、９８％又は１００％までもの相同性レベルである。
【００９７】
この実施態様の第９の形態はとりわけ、配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９０％相同性のあるアミノ酸配列を有するローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００９８】
好ましい形態において、前記実施態様は配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性のある配列相同性を有するようなローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００９９】
さらにより好ましくは、９８％又は１００％までもの相同性レベルである。
【０１００】
タンパク質が例えば予防接種の目的又は抗体上昇のために使用されるとき、前記タンパク質の全体を使用することはしかしながら必要ではない。また、いわゆる免疫原性断片である当該タンパク質に対する免疫反応を、そのまま又は例えばＫＬＨのような担体へ連結されて誘導できる当該タンパク質の断片を使用することは可能である。「免疫原性断片」は宿主において免疫反応を誘導する能力をなお保持し、すなわちＢ細胞もしくはＴ細胞のエピトープを含む全長のタンパク質の断片であると理解される。このとき、抗原性断片（決定因子）をコード化するＤＮＡ断片を簡単に同定するために多様な技術が利用可能である。Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ  （特許出願ＷＯ  ８４／０３５６４，  特許出願ＷＯ  ８６／０６４８７，  米国特許ＮＲ４８３３０９２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８１：  ３９９８−４００２  （１９８４），  Ｊ．  Ｉｍｍ．  Ｍｅｔｈ．  １０２，  ２５９−２７４  （１９８７））によって記述される方法、いわゆるＰＥＰＳＣＡＮ法は、タンパク質の免疫学的に重要な領域であるエピトープの検出のための迅速かつ十分に確立された方法を実行するための簡易法である。前記方法は世界的に用いられており、そのこと自体は当業者に周知である。この（実証的）方法はＢ細胞エピトープの検出に特に適している。また、いずれかのタンパク質をコード化する遺伝子の配列を付与される場合、コンピュータアルゴリズムは、今や既知のエピトープを有する特定のタンパク質断片の配列及び／又は構造の一致に基づいて、前記タンパク質断片を免疫学的に重要なエピトープとして示すことができる。これらの領域の決定はＨｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７８：  ３８２４８−３８２８  （１９８１））に記載の親水性基準及び、Ｃｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４７：  ４５−１４８  （１９８７）及び米国特許第４５５４１０１号）に記載の二次構造の見解の組み合わせに基づいている。Ｔ細胞のエピトープはＢｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準を活用してコンピュータによって配列から同様に予測できる（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５，１０５９−１０６２  （１９８７）及び米国特許出願ＮＴＩＳ  ＵＳ  ０７／００５８８５）。詳細な概説は、共通原理に関してはＳｈａｎ  Ｌｕ，  Ｔｉｂｔｅｃｈ．  ９：  ２３８−２４２  （１９９１）で、マラリアエピトープに関してはＧｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：  １０５９−１０６２  （１９８７）で、総説についてはＬｕ，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １０：  ３−７  （１９９２）で、ＨＩＶエピトープについてはＢｅｒｚｏｗｓｋｙ，  Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ５：  ２４１２−２４１８  （１９９１）で見られる。
【０１０１】
それゆえ、本発明のさらに別の実施態様の１つの形態は、上述のような本発明のタンパク質又はその免疫原性断片を含み、医薬的に許容できる担体とともに、ローソニア・イントラセルラーリス感染に対してブタを保護できるワクチンに関する。
【０１０２】
本発明のさらに別の実施態様は、ワクチンにおける使用のための本発明のタンパク質に関する。
【０１０３】
さらに別の実施態様は、ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチンの製造向けの、本発明のタンパク質の使用に関する。
【０１０４】
本発明のワクチンを作製する１つの方法は本発明の前記タンパク質又はその免疫原性断片を、感染した腸壁から採取された粘膜剥離物を通じて得られるバクテリアから生化学的に精製することによる。この方法はしかしながら、ワクチンを作製するのに非常に時間を消費する方法である。
【０１０５】
それゆえ、ワクチンにおいて本発明の前記タンパク質又はその免疫原性断片をコード化する遺伝子の発現産物を使用することが非常により簡便である。前記９つの新規のタンパク質をコード化する遺伝子の核酸配列は本発明によって提供される。
【０１０６】
これらの遺伝子の発現産物に基づいたこのようなワクチンは、本発明のタンパク質又は本発明のその免疫原性断片を、後述のように医薬的に許容できる担体と混合することによって簡単に作製できる。
【０１０７】
あるいは、本発明のワクチンは、本発明のタンパク質又は本発明のその免疫原性断片を発現できる、上述のような、生きた組み換え担体を含むことができる。例えば腸上皮組織又は例えば呼吸器系上皮組織を感染させるサルモネラ担体又はウィルス担体に基づいたこのようなワクチンは、ローソニア・イントラセルラーリスの感染の自然な方法をよりよく模倣するサブユニットワクチンであるという点で有利である。さらに、自己増殖は、少量の組み換え担体のみが免疫性の付与に必要であるため有利である。
【０１０８】
上述のワクチンはすべて活発な予防接種に寄与し、すなわち、宿主の免疫系は本発明のタンパク質又はその免疫原性断片によって惹起され、これらのタンパク質に対する抗体を産生する。
【０１０９】
あるいは、このような抗体は、例えばウサギにおいて産出できるか、又は後述のように抗体産生細胞系から得られることができる。このような抗体は次に、前記宿主動物へ投与できる。この方法の予防接種、すなわち受動的予防接種は動物がすでに感染しており、及び自然な免疫反応が惹起できる時間がないときに選択される予防接種である。それはまた、免疫が危険に暴露された動物を予防接種するための好ましい方法でもある。ローソニア・イントラセルラーリスに対する投与される抗体はこれらの場合、バクテリアへ直接結合できる。このことはローソニア・イントラセルラーリスの成長を即時低下又は停止する利点を有する。
【０１１０】
それゆえ、本発明のこの実施態様の他の１つの形態は本発明の新規ローソニア・イントラセルラーリスタンパク質の少なくとも１つに対する抗体を含むワクチンに関する。
【０１１１】
ワクチンは本発明の前記タンパク質又はその免疫原性断片を含む、上述のような宿主細胞に基づいていてもよい。
【０１１２】
予防接種の別の及び効率のよい方法は前記関連抗原をコード化するＤＮＡによる直接的な予防接種である。タンパク質をコード化するＤＮＡによる直接的な予防接種は、多くの異なるタンパク質において成功している（例えばＤｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：  ２０−２６  （１９９３）において総説されるように）。
【０１１３】
この方法の予防接種はローソニア・イントラセルラーリス感染に対するブタの予防接種にとって非常に興味深い。
【０１１４】
それゆえ、本発明のこの実施態様のさらに他の形態は、本発明のタンパク質又は本発明のその免疫原性断片をコード化する核酸を含むワクチン、及びこのような核酸を含むＤＮＡ断片を含むワクチンに関する。
【０１１５】
この実施態様のさらに他の形態は、本発明の組み換えＤＮＡ分子を含むワクチンに関する。
【０１１６】
ＤＮＡワクチンは皮内適用を通じて、例えば針なし注射器を使用して簡単に投与できる。この方法の投与はＤＮＡを、予防接種される動物の細胞へ直接送達する。１〜１００μｇの間の範囲のＤＮＡの量は、非常によい結果をもたらす。
【０１１７】
さらなる実施態様において、本発明のワクチンは、他のブタ病原性生命体及びウィルスに由来する一つ以上の抗原、又はこのような抗原をコード化する遺伝情報をさらに含む。
【０１１８】
このような生命体及びウィルスは、仮性狂犬病ウィルス、ブタインフルエンザウィルス、ブタパルボウィルス、伝染性胃腸炎ウィルス、ロタウィルス、大腸菌、ブタ丹毒菌、気管支敗血症菌、豚コレラ菌、ヘモフィラスパラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、パストゥレラムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ブタ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、マイコプラズマハイオプヌーモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブラキスピラハイオダイセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、及びアクチノバチラス胸膜肺炎のグループから好んで選択される。
【０１１９】
本発明のすべてのワクチンは医薬的に許容できる担体を含む。医薬的に許容できる担体は、例えば滅菌水又は滅菌生理塩類溶液でありうる。より複雑な形態において、担体は例えば緩衝液でありうる。
【０１２０】
ワクチンの調製のための方法は、本発明のタンパク質又はその免疫原性断片と、医薬的に許容できる担体との混合物を含む。
【０１２１】
本発明のワクチンは、好ましい呈示において、アジュバントも含んでもよい。アジュバントは一般に、非特異的な様式で宿主の免疫反応を惹起する物質を含む。多くの異なるアジュバントが本分野において既知である。
【０１２２】
アジュバントの例は、Ｆｒｅｕｎｄｓの完全及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、クィルＡ（Ｒ）、鉱油例えばバイヨール（Ｒ）又はマルコール（Ｒ）、野菜油、及びカルボポール（Ｒ）（ホモポリマー）、又はディルバック（Ｒ）フォルトである。
【０１２３】
ワクチンは、いわゆるビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）も含有してもよい。ビヒクルとは、ある化合物へ共有結合せずにポリペプチドが接着する化合物である。しばしば使用されるビヒクル化合物は、例えば水酸化アルミニウム、リン酸化アルミニウム、又は酸化アルミニウム、シリカ、カオリン、及びベントナイトである。
【０１２４】
前記抗原がビヒクルに部分的に組み込まれるこのようなビヒクルの特殊な形態は、いわゆるＩＳＣＯＭ（ＥＰ１０９．９４２、ＥＰ１８０．５６４、ＥＰ２４２．３８０）である。
【０１２５】
さらに、ワクチンは１つ以上の適切な界面活性化合物又は乳化剤、例えばスパン又はトゥイーンを含有してもよい。
【０１２６】
しばしば、ワクチンは安定化剤と混合され、例えば分解傾向性ポリペプチドを分解されることから保護し、ワクチンの有効期間を延長し、又は凍結乾燥の効率性を亢進する。有用な安定化剤はとりわけ、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ  ；  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ５９：  ５０９  （１９５０））、炭水化物例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、ショ糖、デキストラン、又はブドウ糖、アルブミン又はカゼインのようなタンパク質、又はそれらの分解産物、及びアルカリ金属リン酸塩のような緩衝剤である。
【０１２７】
さらに、ワクチンは生理学的に許容できる希釈剤中に懸濁されてもよい。アジュバント処理し、担体化合物又は希釈剤を添加し、ポリペプチドを乳化又は安定化させることに関する他の方法も、本発明において具現化されることは言うまでもない。
【０１２８】
本発明のワクチンは１〜１００μｇの間の範囲にある量で非常に適切に投与できるが、より少量の用量は原理上使用できる。１００μｇを超える用量は免疫学的に非常に適切ではあるが、商業上の理由のためあまり興味深くはないだろう。
【０１２９】
上述のＬＲＣウィルス及びバクテリアのような生きた弱毒化された組み換え担体に基づいたワクチンは、感染期間中ワクチンがそれ自体を繁殖させるため、非常により少量の用量で投与できる。それゆえ、非常に適切な量はバクテリア及びウィルスについてそれぞれ、１０３〜１０９ＣＦＵ／ＰＦＵの範囲であろう。
【０１３０】
多くの投与方法が適用できる。経口適用は、前記感染が消化管の感染であるため、非常に興味深い方法の投与である。経口投与の好ましい方法は、本分野において既知でありかつ頻繁に使用される、カプセルが胃の非常に酸性の環境を通過した後で崩壊するだけであるカプセル入りのワクチンの包装である。またワクチンは、胃のｐＨを一時的に亢進するために、本分野において既知である化合物と混合されてもよい。
【０１３１】
全身性適用も適切であり、例えばワクチンの筋内適用によって行われる。もしこの経路にしたがえば、全身性適用についての本分野で既知の標準的な手法は適切である。
【０１３２】
疾病に対する保護の観点から、ローソニア・イントラセルラーリス感染の迅速かつ正確な診断は重要である。
【０１３３】
それゆえ、本発明の別の目的は、ローソニア・イントラセルラーリス感染の検出に適した診断ツールを提供することである。
【０１３４】
血清中のローソニア・イントラセルラーリス抗体の検出のための診断用検査は、例えば、本発明の新規のタンパク質のいずれか又は本発明のその抗原性断片がＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁へコーティングされる単純で標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ検査でありうる。このような抗体の検出のための方法は、例えば、検査される哺乳類由来の血清とともに前記７５ｋＤタンパク質（もしくは本発明のその他のタンパク質）又はその抗原性断片をインキュベートした後、例えば、関連哺乳類抗体に対する標識された抗体とともにインキュベートすることである。次に、呈色反応はローソニア・イントラセルラーリスに対する抗体の有無を評価できる。診断用検査システムの別の例は、例えば本発明の７５ｋＤタンパク質もしくはその抗原性断片を含むウェスタンブロットを、検査される哺乳類の血清とともにインキュベートした後、前記ブロットを分析することである。
【０１３５】
したがって、本発明の別の実施態様は、ローソニア・イントラセルラーリスに対する抗体の検出のための診断用検査に関する。このような検査は本発明のタンパク質又はその断片を含む。
【０１３６】
ローソニア・イントラセルラーリス抗原の前記９つのタンパク質のいずれかに関する抗原性材料の検出に基づいた、及びそれゆえローソニア・イントラセルラーリス感染の検出に適した診断用検査は、例えば標準的なＥＬＩＳＡ検査でもありうる。このような検査の一例において、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁は、前記７５ｋＤタンパク質（もしくは本発明のその他のタンパク質）に対して向かう抗体でコーティングされる。検査される材料とともにインキュベートした後、標識された抗ローソニア・イントラセルラーリス抗体が前記ウェルへ添加される。次に、呈色反応はローソニア・イントラセルラーリス由来の抗原性材料の存在を評価する。
【０１３７】
それゆえ、本発明のさらに別の実施態様は、ローソニア・イントラセルラーリスの抗原性材料の検出のための診断用検査に関する。このような検査は本発明のタンパク質又はその断片に対する抗体を含む。
【０１３８】
上述に特徴付けられるように発現される、本発明のポリペプチド又はその免疫原性断片は、ポリクローナル、モノ特異的、又はモノクローナル（又はそれらの誘導体）であってもよい抗体を産生するのに使用できる。もしポリクローナル抗体が望まれれば、ポリクローナル血清を産生及び処理するための技術は本分野において周知である（例、Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｔｅｒ，  ｅｄｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９８７）。
【０１３９】
本発明のポリペプチド（又は本発明のその変異体もしくは断片）に対して反応性のあるモノクローナル抗体は、本分野でこれもまた既知の技術によって近交系のマウスを免疫付与することによって調製できる（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６，  ４９５−４９７，  １９７５）。
【０１４０】
本発明の抗体の大規模な産生のための方法も本分野で既知である。このような方法は、ファージディスプレイのための糸状ファージにおいて、本発明の前記タンパク質をコード化する遺伝情報の（断片の）クローニングに依存する。このような技術はとりわけ、ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ａｅｐｐｈａｇｅ．ｈｔｍｌにおける「ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ」の下での「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｇｅ」で、及び、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．  １２：  ２６２−２６７のＣｏｒｔｅｓｅ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）によって、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．  １２：  １７３−１８３のＣｌａｃｋｓｏｎ，  Ｔ．  ＆  Ｗｅｌｌｓ，  Ｊ．  Ａ．  （１９９４）によって、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：  １６００７−１６０１０のＭａｒｋｓ，  Ｊ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）によって、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：  ４３３−４５５のＷｉｎｔｅｒ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）によって、及びＬｉｔｔｌｅ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．  Ａｄｖ．  １２：  ５３９−５５５による総説において記述されている。ファージはその後、ラクダ科動物重鎖抗体を発現するラクダ科動物発現ライブラリをスクリーニングするのに使用される（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ，  Ｍ．，  Ｊｏｕｒｎ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｒｅｃｏｇｎ．  １２：  １３１−１４０  （１９９９）及びＧｈａｈｒｏｕｄｉ，  Ｍ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４：  ５１２−５２６  （１９９７））。望まれる抗体を発現するライブラリからの細胞は複製でき、その後、抗体の大規模発現のために使用できる。
【０１４１】
実施例
【実施例１】
【０１４２】
感染したブタ回腸からのローソニア・イントラセルラーリスの単離。
【０１４３】
組織病理学及び酸性の迅速なＺｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ染色によって確認されるローソニア・イントラセルラーリスに感染した回腸がＰＥで死亡したブタから回収され、−８０℃で保存された。解凍後、ローソニア・イントラセルラーリスバクテリアを、感染した腸壁から採取した粘膜剥離物から単離した。前記回腸剥離物をオムニミキサー中のＰＢＳにおいて繰り返し均質化し、Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖｅｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １０：  ３０３−３２３  （１９８５））によって記述されるように細胞内バクテリアを放出した。低速遠心分離で細胞くずを除去した後に得られる上清を、５．０μｍ、３．０μｍ、１．２μｍ、及び０．８μｍのフィルター（ミリポア）でろ過した。前記ろ液をその後、８０００ｇで３０分間遠心分離し、小さなペレットのローソニア・イントラセルラーリスバクテリアを得た。これらのバクテリアをさらにＰｅｒｃｏｌｌ勾配を使用して精製した。前記精製されたバクテリアの同定はＰＣＲにより査定され（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３１：  ２６１１−２６１５（１９９３））、一方で、単離されたバクテリアの精製度（＞９５％）を位相差顕微鏡により査定し、存在するいずれかの夾雑するバクテリアもしくは腸のくずを評価した。
【０１４４】
バクテリアの系及びプラスミド
ローソニア・イントラセルラーリス細胞を上述のように、感染した回腸材料から単離した。ベクターｐＬｙｓＳｒａｒｅ及びプラスミドｐＥＴ−Ｈｉｓ−１を含む大腸菌宿主系ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）をＮｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡ）から購入した。大腸菌系ＴＯＰ１０Ｆ’をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，  ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。３０％グリセロールを含有しているすべてのバクテリア系のストックを−７０℃で保存した。ＬＢ培地及びＬＢプレートを標準的な手技にしたがって調製した。
【０１４５】
ＤＮＡ単離
高度に精製されたローソニア・イントラセルラーリス染色体ＤＮＡを得るため、Ｂｉｏｒａｄ染色体ＤＮＡ単離キット（Ｂｉｏｒａｄ，  Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，  ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用してＤＮＡをバクテリア細胞から調製した。Ｑｉａｇｅｎ製品を使用して、プラスミドＤＮＡを単離した。
【０１４６】
ＰＣＲ増幅
５２Ｕ／ｍｌ伸長高忠実度酵素ミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、２．５ｍＭＭｇＣｌ２、１６ｍＭｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡ）、２０ｐｍｏｌのプライマー、及びテンプレートとしての１５ｎｇのローソニア・イントラセルラーリス染色体ＤＮＡを含む伸長ＨＦ緩衝液を含有しているＰＣＲ混合物を用いて、ＰＣＲ増幅を実行した。
【０１４７】
標準的な適用（つまり、コロニーＰＣＲ）のため、前記ＰＣＲ混合物は、２０Ｕ／ｍｌスーパータック（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）及び、８ｍＭｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡ）、１０ｐｍｏｌのプライマー、及び１５ｎｇのテンプレートを含有するスーパータック緩衝液（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）を含有した。
【０１４８】
ライゲーション及び形質変換
ライゲーションは１単位のライゲーション酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）を有する１×ライゲーション緩衝液中で、１６℃で一晩実行した。１μｌのライゲーション反応液を大腸菌コンピテント細胞へ、熱ショックにより形質変換した。ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）大腸菌コンピテント細胞及びＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌コンピテント細胞は標準的な方法を使用して形質変換受容性にした。
【０１４９】
８×ＨＩＳ融合タンパク質の発現
前記７５ｋＤ、２７ｋＤ、６２ｋＤ、及び５７ｋＤの遺伝子について、以下の発現方法を使用した。前記発現ベクターのＤＮＡ配列を標準的な配列決定技術により確認した後、ｐＬｙｓＳｒａｒｅを含有するＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）へ発現ベクターを形質変換した。結果として生じる系を１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有の５ｍｌＬＢ中で一晩、３７℃、２００ｒｐｍで成育した。前記一晩の培養物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有の５０ｍｌＬＢ中で１：１００に希釈した。この培養物を同一条件下で、ＯＤ６００が０．５に到達するまで成育した。前記培養物をＩＰＴＧにより終濃度１ｍＭになるよう誘導し、その後３時間成育し続けた。１００μｌの試料を分析用に採取した。ｐＬｙｓＳｒａｒｅを含有する大腸菌系ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）を同一条件下で成育及び誘導し、試料をネガティブコントロールとして採取した。前記試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１５０】
試験管内転写及び翻訳
前記７４ｋＤ、４４ｋＤ、４３ｋＤ、２６ｋＤもしくは３１ｋＤ、及び１０１ｋＤの遺伝子について以下の発現方法にしたがった。製造者のプロトコールにしたがってＲｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  ＦＲＧ）からのＲａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して試験管内転写及び翻訳を実行した。要約すると、まず、知識に基づいた配列最適化ツールＰｒｏｔｅｏＥｘｐｅｒｔ  ＲＴＳ大腸菌ＨＹがもとの遺伝子の高産生変異体をデザインするのに使用された。このプログラムはＤＮＡ配列における突然変異を示唆することによって翻訳段階のためのＤＮＡテンプレートを最適化する。サイレント変異のみが可能であり、前記タンパク質レベルに関して同一のアミノ酸配列に至った。しかしながら、最初の６個のコドン内での８個までのヌクレオチドの変化はよりよい発現結果を与えるようＰｒｏｔｅｏＥｘｐｅｒｔサービスによって提唱された。２０個のヌクレオチドの５’重複領域及び３０〜３８個のさらなる遺伝子特異的ヌクレオチドを含有する１０個のセンスプライマー及び普遍的なアンチセンスプライマーが１０個の異なるＰＣＲ反応に使用され、これらの変異体を、精製されたローソニア・イントラセルラーリス染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用して増幅した。前記得られたアンプリコンをゲルから精製し及びＲＴＳ大腸菌線形テンプレート発生セット、Ｈｉｓタグを使用する無細胞タンパク質発現のための線形発現コンストラクトの発生に使用し、必要なＴ７調節要素を導入した。
【０１５１】
この場合も先と同様に、前記得られたアンプリコンをゲルから精製し、及び定量後、５０μｌのＲＴＳ  １００大腸菌ＨＹ反応混合物におけるタンパク質発現分析のために適切な量のＤＮＡを使用した。抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティングを使用して発現を分析した。
【０１５２】
最も高いタンパク質産生量を与えるコンストラクトを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットを使用してｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ  ＴＡベクターへ連結した。ＲＴＳ  ５００大腸菌ＨＹキットを使用する中規模タンパク質産生のために、前記得られたプラスミドを使用した。前記試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにより分析した。
【０１５３】
ＡＢＩ３１０自動配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）を使用して、前記発現ベクターのＤＮＡ配列を確認した。
【０１５４】
もし必要なら、変性条件を使用して精製するために製造者のプロトコールにしたがったＴＡＬＯＮ固定化金属アフィニティクロマトグラフィー樹脂を使用してタンパク質を精製した。その後、前記精製されたタンパク質画分をＰＢＳに対して透析し、前記試料から尿素を除去した。
【０１５５】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロッティング
ＮｕＰＡＧＥ電気泳動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）からの４〜１２％ビス−トリスゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行した。ウェスタンブロッティングはセミドライブロッティング手法を使用して実行した。ウェスタンブロットは水：油が４５：５５の乳化剤中の全細胞調製物に対して上昇するニワトリ抗ローソニアポリクローナル血清を使用して、又は精製したローソニア・イントラセルラーリス細胞で経口試験し、及びローソニア・イントラセルラーリス感染に対して臨床的な徴候及び死後の障害を発現した動物から得られたブタ血清を使用して現像した。４℃で４時間、ベクターｐＬｙｓＳｒａｒｅを含有するＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）由来の等量の細胞粗抽出物を使用して、前記血清をあらかじめ吸着させた。
【０１５６】
結果
Ｔ７ベースの発現ベクターにおけるローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５０７４のクローニング
プライマー２０７５（ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＴＣＴＴＡＣＡＧＣＡＧＧＡＡＴＧＴＧ）及びプライマー２０７６（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＧＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＡＣＡＡＣＴＧ）を使用して、遺伝子５０７４を増幅した。前記処理において、５’ＮｃｏＩ及び３’ＸｈｏＩの部位を前記ＰＣＲ産物へ導入した。前記得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩを使用して消化した。前記消化したＰＣＲ産物をその後、前記同一の２つの制限酵素で切断しておいたｐＥＴ２２ｂへ連結した。前記ライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆへ形質変換し、及び３７℃で一晩インキュベートした。推定上の形質変換因子を、コロニーＰＣＲを使用して正確なプラスミドについてチェックした。コロニーＰＣＲ陽性の形質変換因子の前記プラスミドインサートを、ヌクレオチド配列分析によりチェックした。クローン戦略に基づいて期待される配列を含有したクローンのうちの１つを選択し、ｐＥＴ５０７４と命名した。
【０１５７】
大腸菌におけるＴ７プロモーターからのローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５０７４の発現
プラスミドｐＥＴ５０７４をＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｒａｒｅへ形質変換した。結果として生じる系を、上述のように組み換えタンパク質産生のために検査した。前記誘導される培養物の試料及び対照試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析した（図１Ａ）。約７５ｋＤａの透明なタンパク質のバンドが、誘導されていない試料（図１Ａ、レーン２）と比較して、誘導３時間後に採取した試料（図１Ａ、レーン３）において観察された。
【０１５８】
前記同一試料をまた、ブタ及びニワトリの血清を使用したウェスタンブロットにより分析した。前記７５ｋＤタンパク質との反応は、精製されたローソニア・イントラセルラーリス細胞で経口試験したブタ由来の血清（図１Ｂ、レーン３）及びニワトリ抗ローソニア・イントラセルラーリス血清（図１Ｃ、レーン３）を使用して観察された。
【０１５９】
結論
前記７５ｋＤワクチン成分は、多量にうまく発現でき、及び、経口試験したブタ抗ローソニア・イントラセルラーリス血清及びニワトリ抗ローソニア・イントラセルラーリス血清の両者ともによって実際に明らかに認識される。
【０１６０】
Ｔ７ベースの発現ベクターにおけるローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５６６９のクローニング
プライマー２１８５（ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＡＣＡＡＧＡ）及びプライマー２１８６（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＴ）を使用して、遺伝子５６６９を増幅した。前記処理において、５’ＮｃｏＩ及び３’ＸｈｏＩの部位を前記ＰＣＲ産物へ導入した。前記得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩを使用して消化した。前記消化したＰＣＲ産物をその後、前記同一の２つの制限酵素で切断しておいたｐＥＴ２２ｂへ連結した。前記ライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆへ形質変換し、及び３７℃で一晩インキュベートした。推定上の形質変換因子を、コロニーＰＣＲを使用して正確なプラスミドについてチェックした。コロニーＰＣＲ陽性の形質変換因子の前記プラスミドインサートを、ヌクレオチド配列分析によりチェックした。クローン戦略に基づいて期待される配列を含有したクローンのうちの１つを選択し、ｐＥＴ５６６９と命名した。
【０１６１】
大腸菌におけるＴ７プロモーターからのローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５６６９の発現
プラスミドｐＥＴ５６６９をＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｒａｒｅへ形質変換した。結果として生じる系を、上述のように組み換えタンパク質産生のために検査した。前記誘導される培養物の試料及び対照試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析した（図２Ａ）。約２７ｋＤａの透明なタンパク質のバンドが、誘導されていない試料（図２Ａ、レーン２）と比較して、誘導３時間後に採取した試料（図２、レーン３）において観察された。
【０１６２】
前記同一試料をまた、ブタ及びニワトリの血清を使用したウェスタンブロットにより分析した。前記２７ｋＤタンパク質との反応は、精製されたローソニア・イントラセルラーリス細胞で経口試験したブタ由来の血清（図２Ｂ、レーン３）及びニワトリ抗ローソニア・イントラセルラーリス血清（図２Ｃ、レーン３）を使用して観察された。
【０１６３】
結論
前記２７ｋＤワクチン成分は、多量にうまく発現でき、及び、経口負荷試験したブタ抗ローソニア・イントラセルラーリス血清及びニワトリ抗ローソニア・イントラセルラーリス血清の両者によって実際に明らかに認識される。
【０１６４】
Ｔ７ベースの発現ベクターにおけるローソニア・イントラセルラーリス遺伝子４４２３のクローニング
プライマー２１７１（ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴＡＧＣＴＡＴＧＴＧＧＴＴＴＴＧＣＣ）及びプライマー２１７２（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＴＡＴＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＴＡＧ）を使用して、遺伝子４４２３を増幅した。前記処理において、５’ＮｃｏＩ及び３’ＸｈｏＩの部位を前記ＰＣＲ産物へ導入した。前記得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩを使用して消化した。前記消化したＰＣＲ産物をその後、前記同一の２つの制限酵素で切断しておいたｐＥＴ２２ｂへ連結した。前記ライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆへ形質変換し、及び３７℃で一晩インキュベートした。推定上の形質変換因子を、コロニーＰＣＲを使用して正確なプラスミドについてチェックした。コロニーＰＣＲ陽性の形質変換因子の前記プラスミドインサートを、ヌクレオチド配列分析によりチェックした。クローン戦略に基づいて期待される配列を含有したクローンのうちの１つを選択し、ｐＥＴ４４２３と命名した。
【０１６５】
大腸菌におけるＴ７プロモーターからのローソニア・イントラセルラーリス遺伝子４４２３の発現
プラスミドｐＥＴ４４２３をＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｒａｒｅへ形質変換した。結果として生じる系を、上述のように組み換えタンパク質産生のために検査した。前記誘導される培養物の試料及び対照試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析した（図３Ａ）。約６２ｋＤａの透明なタンパク質のバンドが、誘導されていない試料（図３Ａ、レーン２）と比較して、誘導３時間後に採取した試料（図３Ａ、レーン３）において観察された。
【０１６６】
前記同一試料をまた、ブタの血清を使用したウェスタンブロットにより分析した。前記６２ｋＤタンパク質との反応は、精製されたローソニア・イントラセルラーリス細胞で経口試験したブタ由来の血清（図３Ｂ、レーン３）を使用して観察された。
【０１６７】
結論
前記６２ｋＤワクチン成分は、多量にうまく発現でき、及び、経口試験されたブタ抗ローソニア・イントラセルラーリス血清によって実際に明らかに認識される。
【０１６８】
Ｔ７ベースの発現ベクターにおけるローソニア・イントラセルラーリス遺伝子３１２３のクローニング
プライマー２１６７（ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＣＡＧＴＴＴＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＴ）及びプライマー２１６８（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＴＴＣＧＡＣＣＡＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴ）を使用して、遺伝子３１２３を増幅した。前記処理において、５’ＮｃｏＩ及び３’ＸｈｏＩの部位を前記ＰＣＲ産物へ導入した。前記得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩを使用して消化した。前記消化したＰＣＲ産物をその後、前記同一の２つの制限酵素で切断しておいたｐＥＴ２２ｂへ連結した。前記ライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆへ形質変換し、及び３７℃で一晩インキュベートした。推定上の形質変換因子を、コロニーＰＣＲを使用して正確なプラスミドについてチェックした。コロニーＰＣＲ陽性の形質変換因子の前記プラスミドインサートを、ヌクレオチド配列分析によりチェックした。クローン戦略に基づいて期待される配列を含有したクローンのうちの１つを選択し、ｐＥＴ３１２３と命名した。
【０１６９】
大腸菌におけるＴ７プロモーターからのローソニア・イントラセルラーリス遺伝子３１２３の発現
プラスミドｐＥＴ３１２３をＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｒａｒｅへ形質変換した。結果として生じる系を、上述のように組み換えタンパク質産生のために検査した。前記誘導される培養物の試料及び対照試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析した（図４Ａ）。約５７ｋＤａのタンパク質のバンドが、誘導されていない試料（図４Ａ、レーン２）と比較して、誘導３時間後に採取した試料（図４、レーン３）において観察された。
【０１７０】
前記同一試料をまた、ブタ血清を使用したウェスタンブロットにより分析した。前記５７ｋＤタンパク質との反応は、精製されたローソニア・イントラセルラーリス細胞で経口試験したブタ由来の血清（図４Ｂ、レーン３）を使用して観察された。
【０１７１】
結論
前記５７ｋＤワクチン成分は、多量にうまく発現でき、及び、全細胞を予防接種されたブタ抗ローソニア・イントラセルラーリス血清によって実際に明らかに認識される。
【０１７２】
ローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５２９３のクローニング
前記ＰｒｏｔｅｏＥｘｐｅｒｔの示唆の評価のため、ＲＴＳ線形テンプレート発生セットを使用するＰＣＲを介して線形ＤＮＡテンプレートを生じた。これらの実験で使用されるプライマーはまた、検出及び精製のためにＣ末端にＨｉｓ６−タグを導入した。前記ＰＣＲにより生じたテンプレートを、ＲＴＳ１００大腸菌ＨＹキットを使用してそれらの発現性能について検討した。最も高い産生量を与える前記示唆されたＤＮＡ配列は第一ＰＣＲにおいてプライマー５２９３Ａ５及び５２９３Ｂ（表１）を使用して構築された。前記得られた発現コンストラクトをｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ  ＴＡベクターへ連結し、及び結果として生じるベクターを大腸菌ＴＯＰ１０Ｆへ形質変換し及び３７℃で一晩インキュベートした。コロニーＰＣＲを使用して推定上の形質変換体を正確なプラスミドについてチェックした。コロニーＰＣＲ陽性形質変換体のプラスミドインサートをヌクレオチド配列分析によりチェックした。前記クローニング戦略に基づいて予測される配列を含むクローンの１つが選択され及びｐＴＯＰＯ５２９３と命名された。
【０１７３】
【表１】
2007537721.tif 000002
【０１７４】
ＲＴＳ技術を使用するローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５２９３の発現
プラスミドｐＴＯＰＯ５２９３を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆから精製し、及びＤＮＡの適切な量をＲＴＳ５００バイアルへ添加した。インキュベーション後、製造者のプロトコールにしたがい、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を使用する分析のために採取した（図５Ａ）。約７４ｋＤａの透明なタンパク質のバンドが、対照試料（図５Ａ、レーン２）と比較して、誘導３０時間後に採取した試料（図５Ａ、レーン３）において観察された。
【０１７５】
前記同一試料をまた、ブタ血清を使用したウェスタンブロットにより分析した。前記７４ｋＤタンパク質は、この実験において使用されるポリクローナルブタ血清により特異的に認識された（図５Ｂ、レーン３）。
【０１７６】
結論
本発明の７４ｋＤタンパク質は効率よく発現でき、及びポリクローナルブタ血清により特異的に認識される。前記７４ｋＤタンパク質はローソニア・イントラセルラーリス感染に対するブタの保護のための重要なワクチン成分である。
【０１７７】
ローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５４６４のクローニング
前記ＰｒｏｔｅｏＥｘｐｅｒｔの示唆の評価のため、ＲＴＳ線形テンプレート発生セットを使用するＰＣＲを介して線形ＤＮＡテンプレートを生じた。これらの実験で使用されるプライマーはまた、検出及び精製のためにＣ末端にＨｉｓ６タグを導入した。前記ＰＣＲにより生じたテンプレートを、ＲＴＳ１００大腸菌ＨＹキットを使用してそれらの発現性能について検討した。最も高い産生量を与える前記示唆されたＤＮＡ配列は第一ＰＣＲにおいてプライマー５４６４Ａ５及び５４６４Ｂ（表２）を使用して構築された。前記得られた発現コンストラクトをｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ  ＴＡベクターへ連結し、及び結果として生じるベクターを大腸菌ＴＯＰ１０Ｆへ形質変換し及び３７℃で一晩インキュベートした。コロニーＰＣＲを使用して、正確なプラスミドについて推定上の形質変換体をチェックした。コロニーＰＣＲ陽性形質変換体のプラスミドインサートをヌクレオチド配列分析によりチェックした。前記クローニング戦略に基づいて予測される配列を含むクローンの１つが選択され及びｐＴＯＰＯ５４６４と命名された。
【０１７８】
【表２】
2007537721.tif 000003
【０１７９】
ＲＴＳ技術を使用するローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５４６４の発現
プラスミドｐＴＯＰＯ５４６４を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆから精製し、及びＤＮＡの適切な量をＲＴＳ５００バイアルへ添加した。インキュベーション後、製造者のプロトコールにしたがい、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を使用する分析のために採取した（図６Ａ）。約４４ｋＤａの透明なタンパク質のバンドが、対照試料（図６Ａ、レーン２）と比較して、誘導３０時間後に採取した試料（図６Ａ、レーン３）において観察された。ウェスタンブロットにおける抗ポリヒスチジンモノクローナルを使用することは、前記遺伝子における内部翻訳開始部位又は前記成熟タンパク質の翻訳後修飾の存在を示唆する第二反応性タンパク質を明らかにした（図６Ｂ、レーン３）。
【０１８０】
ポリクローナル血清は、精製された４４ｋＤタンパク質に対して上昇した。ＥＬＩＳＡにおいて、この血清は、妥当な力価（２ｌｏｇ９超）のコーティング材料として使用される、精製された全ローソニア・イントラセルラーリス細胞を特異的に認識した。低い力価は対照血清を使用して測定された（２ｌｏｇ３未満）。
【０１８１】
結論
本発明の４４ｋＤタンパク質は効率よく発現できる。さらに前記発現されたタンパク質に対して上昇する抗血清は、ローソニア・イントラセルラーリス細胞を完全に認識できる。前記４４ｋＤタンパク質はローソニア・イントラセルラーリス感染に対するブタの保護のための重要なワクチン成分である。
【０１８２】
ローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５４７３のクローニング
前記ＰｒｏｔｅｏＥｘｐｅｒｔの示唆の評価のため、ＲＴＳ線形テンプレート発生セットを使用するＰＣＲを介して線形ＤＮＡテンプレートを生じた。これらの実験で使用されるプライマーはまた、検出及び精製のためにＣ末端Ｈｉｓ６−タグを導入した。前記ＰＣＲにより生じたテンプレートを、ＲＴＳ１００大腸菌ＨＹキットを使用してそれらの発現性能について検討した。最も高い産生量を与える前記示唆されたＤＮＡ配列は第一ＰＣＲにおいてプライマー５４７３Ａ２及び５４７３Ｂ（表３）を使用して構築された。前記得られた発現コンストラクトをｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ  ＴＡベクターへ連結し、及び結果として生じるベクターを大腸菌ＴＯＰ１０Ｆへ形質変換し及び３７℃で一晩インキュベートした。コロニーＰＣＲを使用して、推定上の形質変換体を正確なプラスミドについてチェックした。コロニーＰＣＲ陽性形質変換体のプラスミドインサートをヌクレオチド配列分析によりチェックした。前記クローニング戦略に基づいて予測される配列を含むクローンの１つが選択され及びｐＴＯＰＯ５４７３と命名された。
【０１８３】
【表３】
2007537721.tif 000004
【０１８４】
ＲＴＳ技術を使用するローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５４７３の発現
プラスミドｐＴＯＰＯ５４７３を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆから精製し、及びＤＮＡの適切な量をＲＴＳ５００バイアルへ添加した。インキュベーション後、製造者のプロトコールにしたがい、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を使用する分析のために採取した（図７Ａ）。しかしながら、前記反応混合物が約４０ｋＤａのタンパク質を生じたか否かを見ることは重要であり、その理由は前記混合物が約４０ｋＤａの優性タンパク質をすでに含むからである（図７Ａ、レーン2及びレーン４）。ｐＴＯＰＯ５４７３を含有する前記ＲＴＳ５００反応物及びその対照混合物をＩＭＡＣカラムへかけ、及び前記カラムへ結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。ゲルから、対照試料（図７Ａ、レーン３）から精製されない４３ｋＤａタンパク質がカラムから溶出され（図７Ａ、レーン５）、そのためタンパク質を発現することが明らかになった。
【０１８５】
前記同一試料をまた、ブタ由来及びニワトリ由来のローソニア・イントラセルラーリス抗血清を使用したウェスタンブロットにより分析した。前記４３ｋＤタンパク質との反応は、ローソニア・イントラセルラーリスバクテリン接種したブタ由来の血清（図７Ｂ、レーン５）及びニワトリ由来の血清（図７Ｃ、レーン５）を使用する両者で観察された。
【０１８６】
結論
本発明の４３Ｄタンパク質は効率よく発現できる。さらにニワトリ及びブタの両者由来のローソニア・イントラセルラーリス細胞に対して上昇する抗血清は、前記発現されたタンパク質を認識する。前記４３ｋＤタンパク質はローソニア・イントラセルラーリス感染に対するブタの保護のための重要なワクチン成分である。
【０１８７】
ローソニア・イントラセルラーリス遺伝子４３２０のクローニング
前記ＰｒｏｔｅｏＥｘｐｅｒｔの示唆の評価のため、ＲＴＳ線形テンプレート発生セットを使用するＰＣＲを介して線形ＤＮＡテンプレートを生じた。これらの実験で使用されるプライマーはまた、検出及び精製のためにＣ末端にＨｉｓ６−タグを導入した。前記ＰＣＲにより生じたテンプレートを、ＲＴＳ１００大腸菌ＨＹキットを使用してそれらの発現性能について検討した。最も高い産生量を与える前記示唆されたＤＮＡ配列は第一ＰＣＲにおいてプライマー４３２０Ａ８及び４３２０Ｂ（表４）を使用して構築された。前記得られた発現コンストラクトをｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ  ＴＡベクターへ連結し、及び結果として生じるベクターを大腸菌ＴＯＰ１０Ｆへ形質変換し及び３７℃で一晩インキュベートした。コロニーＰＣＲを使用して、推定上の形質変換体を正確なプラスミドについてチェックした。コロニーＰＣＲ陽性形質変換体のプラスミドインサートをヌクレオチド配列分析によりチェックした。前記クローニング戦略に基づいて予測される配列を含むクローンの１つが選択され及びｐＴＯＰＯ４３２０と命名された。
【０１８８】
【表４】
2007537721.tif 000005
【０１８９】
ＲＴＳ技術を使用するローソニア・イントラセルラーリス遺伝子４３２０の発現
プラスミドｐＴＯＰＯ４３２０を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆから精製し、及びＤＮＡの適切な量をＲＴＳ５００バイアルへ添加した。インキュベーション後、製造者のプロトコールにしたがい、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を使用する分析のために採取した（図８Ａ）。約３１ｋＤａ及び２６ｋＤａの２つの透明なタンパク質のバンドが対照試料（図８Ａ、レーン２）と比較して誘導３０時間後に採取された試料中に観察された（図８Ａ、レーン３）。両バンドは、前記遺伝子における内部翻訳開始部位又は前記成熟タンパク質の翻訳後修飾の存在を示唆する抗ポリヒスチジンモノクローナルと反応した（図８Ｂ、レーン２）。ポリクローナルブタ及びニワトリ血清を使用して、高い力価（２ｌｏｇ１０超）が、精製された２６ｋＤもしくは３１ｋＤタンパク質及び精製された全ローソニア・イントラセルラーリス細胞をコーティング材料として使用するＥＬＩＳＡにおいて観察された。ＩＨＣを使用して、我々は、ポリクローナル抗２６ｋＤもしくは３１ｋＤタンパク質がローソニア・イントラセルラーリス感染した腸細胞を特異的に認識するのに対し、健常なブタの回腸から切断されたクーペとの反応が見られないことを見出した。ＩＨＣに使用される血清はまたＥＬＩＳＡにおいて全ローソニア・イントラセルラーリス細胞に対して高い力価（２ｌｏｇ１５超）を与えた。
【０１９０】
結論
本発明の２６ｋＤもしくは３１ｋＤのタンパク質は効率よく発現できる。さらにニワトリ及びブタの両者由来のローソニア・イントラセルラーリス細胞に対して上昇する抗血清は前記発現されたタンパク質を、ウェルが前記２６ｋＤａもしくは３１ｋＤａのタンパク質でコーティングされたＥＬＩＳＡ検査において認識する。
【０１９１】
さらに、前記２６ｋＤもしくは３１ｋＤのタンパク質に対して上昇したポリクローナル抗血清はローソニア・イントラセルラーリスにより感染した腸細胞を特異的に認識した。
【０１９２】
前記２６ｋＤもしくは３１ｋＤのタンパク質はローソニア・イントラセルラーリス感染に対するブタの保護のための重要なワクチン成分である。
【０１９３】
ローソニア・イントラセルラーリス遺伝子２００８のクローニング
遺伝子２００８の配列分析は、前記遺伝子が推定上のＮ末シグナル配列及びＣ末端βバレル構造をコード化することを明らかにした。両構造は非常に疎水性であることがわかっている。大きな疎水性領域を含むタンパク質の発現に前記ＲＴＳシステムが不適切であることがわかっていたため、遺伝子２００８を３７番目ないし１９５８番目の塩基で増幅することが決定された。この遺伝子断片の発現は６３ｋＤのタンパク質を結果的に生じた。前記ＰｒｏｔｅｏＥｘｐｅｒｔの示唆の評価のため、ＲＴＳ線形テンプレート発生セットを使用するＰＣＲを介して線形ＤＮＡテンプレートを生じた。これらの実験で使用されるプライマーはまた、検出及び精製のためにＣ末端にＨｉｓ６−タグを導入した。前記ＰＣＲにより生じたテンプレートを、ＲＴＳ１００大腸菌ＨＹキットを使用してそれらの発現性能について検討した。最も高い産生量を与える前記示唆されたＤＮＡ配列は第一ＰＣＲにおいてプライマー２００８Ａ６及び２００８Ｂ（表５）を使用して構築された。前記線形発現コンストラクトをｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ  ＴＡベクターへ連結し、及び結果として生じるベクターを大腸菌ＴＯＰ１０Ｆへ形質変換し及び３７℃で一晩インキュベートした。コロニーＰＣＲを使用して、推定上の形質変換体を正確なプラスミドについてチェックした。コロニーＰＣＲ陽性形質変換体のプラスミドインサートをヌクレオチド配列分析によりチェックした。前記クローニング戦略に基づいて予測される配列を含むクローンの１つが選択され及びｐＴＯＰＯ２００８と命名された。
【０１９４】
【表５】
2007537721.tif 000006
【０１９５】
ＲＴＳ技術を使用するローソニア・イントラセルラーリス遺伝子２００８の発現
プラスミドｐＴＯＰＯ２００８を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆから精製し、及びＤＮＡの適切な量をＲＴＳ５００バイアルへ添加した。インキュベーション後、製造者のプロトコールにしたがい、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を使用する分析のために採取した（図９Ａ）。約６３ｋＤａの透明なタンパク質のバンドが対照試料（図９Ａ、レーン２）と比較して誘導３０時間後に採取された試料中（図９Ａ、レーン３）に観察された。
【０１９６】
前記同一試料をまた、ブタ及びニワトリの両者の抗血清を使用したウェスタンブロットにより分析した。前記６３ｋＤタンパク質との強い反応は、ポリクローナルブタ（図９Ｂ、レーン３）及びニワトリ血清（図９Ｃ、レーン３）の両者を使用して観察された。
【０１９７】
結論
本発明のタンパク質の６３ｋＤ断片は効率よく発現できる。さらにローソニア・イントラセルラーリス細胞に対するニワトリ及びブタの両者の抗血清により、前記６３ｋＤタンパク質断片は強く及び等しく十分に認識される。
【０１９８】
本発明の１０１ｋＤタンパク質及びその６３ｋＤタンパク質断片はローソニア・イントラセルラーリス感染に対するブタの保護のための重要なワクチン成分である。
【実施例２】
【０１９９】
この実験の目的は、前記７５ｋＤ、４４ｋＤ、２６ｋＤもしくは３１ｋＤ及び２７ｋＤタンパク質を含む実験的ローソニア組み換えコンビサブユニットワクチンにより誘導されるブタにおける活発な保護について検査することであった。
【０２００】
ワクチン
ミクロ−Ｄｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅにおける不活性化組み換えサブユニットコンビワクチン
以下の抗原、すなわち前記７５ｋＤ、４４ｋＤ、２６ｋＤもしくは３１ｋＤ及び２７ｋＤタンパク質が組み込まれた。組み換え抗原の混合物を透析緩衝液（５０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭ酸化型グルタチオン、３ｍＭ還元型グルタチオン、１０ｍＭＣＨＡＰＳ）に対して透析し、及びＰＥＧ２００００を使用して濃縮した。すべての抗原の濃度を、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓソフトウェア（Ｓｙｎｇｅｎｅ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用してクーマシー染色したＮｕＰａｇｅゲルから概算した。前記抗原を１ｍｌあたり各単一抗原５０μｇの濃度で前記ワクチンに処方した。
【０２０１】
実験デザイン
１８匹の６週齢ＳＰＦブタ（各群６匹の３群）を本実験に使用した。グループ１のブタをＴ＝０及びＴ＝４ｗで２ｍｌの前記組み換えコンビサブユニットワクチンで筋肉内（頸部）に予防接種した。グループ２は予防接種していない負荷試験対照群として残した。グループ３は未処理の性能対照群であった。
【０２０２】
Ｔ＝６ｗ（１２週齢）で、グループ１及び２は均質化した感染した粘膜で経口負荷試験した。その後、すべてのブタを３週間、ブタ増殖性腸疾患（ＰＰＥ）の臨床兆候について毎日観察した。
【０２０３】
Ｔ＝９ｗ（１５週齢）で、すべての残っているブタを安楽死させ、及び死後検討した。腸（回腸）をローソニア・イントラセルラーリス感染について典型的な巨視的変化について検討し、及び組織学的検討のために試料を採取した。
【０２０４】
負荷試験材料の調製
負荷試験材料を確立されたＰＰＥケースの回腸の粘膜をかきとることによって調製した。さらなる使用まで、前記材料を２００ｇのバッチに−２０℃で保存した。負荷試験の直前に、２００ｇの前記感染した粘膜を解凍し、及び２００ｍｌの生理塩類溶液と混合した。この混合をオムニミキサーで１分間、全速力で均質化し、及び次にさらに４００ｍｌの生理塩類溶液で（８００ｍｌまで）希釈した。
【０２０５】
予防接種
前記ブタを以下のような３つの処理群に割り当てた。
【０２０６】
【表６】
2007537721.tif 000007
【０２０７】
負荷試験
グループ１及びグループ２をＴ＝６ｗ（１２週齢）時に２０ｍｌの負荷接種菌液で経口負荷試験した。グループ３を未処理の対照群として残した。
【０２０８】
死後検査及び組織病理学
すべてのブタをＴ＝９ｗ（１５週齢、負荷試験３週間後）時に屠殺し、及び死後検査へ供して、異なるワクチンの効能を査定した。
【０２０９】
【表７】
2007537721.tif 000008
【０２１０】
各ブタから（もしあれば影響を受けた領域からの）回腸の少なくとも１つの試料を組織学のために採取した。
【０２１１】
回腸試料の組織学的スコアリングは、
ａ）スライドにおけるローソニア・イントラセルラーリス菌体の存在：ワルチン・スタリー染色がバクテリアの検出のために実行された。
【０２１２】
ｂ）ヘマトキシリン・エオシンスライドにおける病理障害の評価：ローソニア・イントラセルラーリス特異的障害（腺腫性腺増殖）の重症度が評価された。他の障害が記述されている。
【０２１３】
【表８】
2007537721.tif 000009
【０２１４】
結果の評価
すべてのデータは各ブタについて個々に記録された。グループあたりの平均スコアは組織病理学的スコア及び死後のスコアの因子について算出された。負荷試験対照グループのスコアから開始して、予防接種されたグループにおける％保護が算出された。病理学的スコアは両側性マン・ホイットニーＵ検定を使用して比較された。
【０２１５】
結果
死後及び組織学
負荷試験後の死後の結果は表１に示されている。組織病理学的スコアは明確な結果を示した。対照のブタのみが典型的な組織病理学的障害（＝重度の拡散腺腫性腺増殖）を示し、及び対照の組織病理学スライドにおける腸細胞のみが多くのローソニアバクテリアを含んでいたのに対し、予防接種した動物及び負荷試験していない動物の腸細胞においてバクテリアは観察されなかった。
【０２１６】
結論
死後及び組織病理学的検査は明確な結果を与えた。検査された前記サブユニットワクチンは組織病理学的障害に対する１００％の保護ならびに腸細胞（＝感染に対する）におけるローソニアの発生を誘導するように見えた。
【０２１７】
【表９】
2007537721.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）並びにポリクローナルブタ血清（Ｂ）及びポリクローナルニワトリ血清（Ｃ）を使用するウェスタンブロッティングによる大腸菌ＢＬ２１ＳＴＡＲ／ｐＬｙｓＳＲＡＲＥにおけるローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５０７４の過剰発現の分析。レーン１、分子量マーカー；レーン２、ｐＥＴ５０７４、Ｔ＝０；レーン３、ｐＥＴ５０７４、Ｔ＝３。矢印は発現産物の位置を示す。
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）並びにポリクローナルブタ血清（Ｂ）及びポリクローナルニワトリ血清（Ｃ）を使用するウェスタンブロッティングによる大腸菌ＢＬ２１ＳＴＡＲ／ｐＬｙｓＳＲＡＲＥにおけるローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５６６９の過剰発現の分析。レーン１、分子量マーカー；レーン２、ｐＥＴ５６６９、Ｔ＝０；レーン３、ｐＥＴ５６６９、Ｔ＝３。矢印は発現産物の位置を示す。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）並びにポリクローナルブタ血清（Ｂ）及びポリクローナルニワトリ血清（Ｃ）を使用するウェスタンブロッティングによる大腸菌ＢＬ２１ＳＴＡＲ／ｐＬｙｓＳＲＡＲＥにおけるローソニア・イントラセルラーリス遺伝子４４２３の過剰発現の分析。レーン１、分子量マーカー；レーン２、ｐＥＴ４４２３、Ｔ＝０；レーン３、ｐＥＴ４４２３、Ｔ＝３。矢印は発現産物の位置を示す。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）並びにポリクローナルブタ血清を使用するウェスタンブロッティング（Ｂ）による大腸菌ＢＬ２１ＳＴＡＲ／ｐＬｙｓＳＲＡＲＥにおけるローソニア・イントラセルラーリス遺伝子３１２３の過剰発現の分析。レーン１、分子量マーカー；レーン２、ｐＥＴ３１２３、Ｔ＝０；レーン３、ｐＥＴ３１２３、Ｔ＝３。矢印は発現産物の位置を示す。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）並びにポリクローナルブタ血清を使用するウェスタンブロッティング（Ｂ）によるＲＴＳ５００技術を使用するローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５２９３の発現の分析。レーン１、分子量マーカー；レーン２、対照；レーン３、ｐＥＴ５２９３。矢印は発現産物の位置を示す。
【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）並びに抗ポリヒスチジンモノクローナルを使用するウェスタンブロッティング（Ｂ）によるＲＴＳ５００技術を使用するローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５４６４の発現の分析。レーン１、分子量マーカー；レーン２、対照；レーン３、ｐＥＴ５４６４。矢印は発現産物の位置を示す。
【図７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）並びにポリクローナルブタ血清（Ｂ）及びポリクローナルニワトリ血清（Ｃ）を使用するウェスタンブロッティングによるＲＴＳ５００技術を使用するローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５４７３の発現の分析。レーン１、分子量マーカー；レーン２、対照；レーン３、結合されるタンパク質画分ＩＭＡＣ精製対照試料；レーン４、ｐＥＴ５４７３；レーン５、結合されるタンパク質画分ＩＭＡＣ精製ｐＥＴ５４７３。矢印は発現産物の位置を示す。
【図８】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）並びに抗ポリヒスチジンモノクローナルを使用するウェスタンブロッティング（Ｂ）によるＲＴＳ５００技術を使用するローソニア・イントラセルラーリス遺伝子４３２０の発現の分析。レーン１、分子量マーカー；レーン２、対照；レーン３、ｐＥＴ４３２０。矢印は発現産物の位置を示す。
【図９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）並びに抗ポリクロクローナルブタ血清を使用するウェスタンブロッティング（Ｂ）によるＲＴＳ５００技術を使用するローソニア・イントラセルラーリス遺伝子２００８の発現の分析。レーン１、分子量マーカー；レーン２、対照；レーン３、ｐＥＴ２００８。矢印は発現産物の位置を示す。
【図１】
2007537721.tif 000011
【図２】
2007537721.tif 000012
【図３】
2007537721.tif 000013
【図４】
2007537721.tif 000014
【図５】
2007537721.tif 000015
【図６】
2007537721.tif 000016
【図７】
2007537721.tif 000017
【図８】
2007537721.tif 000018
【図９】
2007537721.tif 000019
【配列表】
2007537721000001.xml
【国際調査報告】
2007537721.tif 000060
2007537721.tif 000061
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