(57)【要約】  RhoGAP活性ドメインと、特異的なRhoタンパク質を標的化する少なくとも1つの特異性ドメインとを含むキメラペプチドまたは融合タンパク質が開示される。本発明の融合タンパク質は、細胞内のいずれかのGTPase活性を阻害するために使用することができる。本発明の融合タンパク質は、ガンを処置するために特に好都合である。本発明は一般には、GTPaseを調節することができるキメラペプチドに関連し、より具体的には、GTPase活性化タンパク質を使用することによって個々のGTPaseを標的化する方法に関連する。そのようなタンパク質は、ガンおよび他のGTPase関連疾患を処置するために使用することができる。本発明は、核酸分子およびそのコードされるGTPase活性化タンパク質、ならびに、それらの変化体に関連し、また、細胞のシグナル伝達、免疫、および細胞増殖性障害（特にガン）の特長づけ、診断、防止および処置におけるこれらの分子の使用に関連する。本明細書中において、選択された遺伝子の転写を調節するための化合物および方法が開示される。様々な方法が、選択された遺伝子の転写を調節するためにそのような化合物を構築し、また、そのような化合物を使用するために提供される。
2007535479.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
GAP活性ドメイン、および
少なくとも1つの特異的なGTPaseタンパク質を標的化する少なくとも1つの標的化ドメイン
を含むキメラポリペプチド。
【請求項２】
前記標的化ドメインがGTPase由来のC末端配列である（GTPaseのC末端配列に由来する）、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３】
膜移行タンパク質ドメインをさらに含む、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４】
前記GTPaseがRho GTPaseである、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５】
6個〜12個のアミノ酸をキメラポリペプチドのいずれかの末端においてさらに含む、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６】
前記Rho C末端配列が前記GAP活性ドメインに対してC末端側である、請求項2に記載のキメラポリペプチド。
【請求項７】
前記Rho C末端配列が前記GAP活性ドメインに対してN末端側である、請求項2に記載のキメラポリペプチド。
【請求項８】
前記GAP活性ドメインが、GTPase活性化タンパク質活性のために必要な最小限の構造的ドメインを含有するペプチド配列である、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項９】
前記GAP活性ドメインが、p50RhoGAP、p190、p122-RhoGAP、p190-A、p190-B、オリゴフレニン-1、GRAF、MacGAP、Cdc42GAP(p50RhoGAP)、SrGAP1-SrGAP3、n-キメリン（chimaerin）、CdGAP、Bcr、Abr、MgcRacGAP、ARAP1、ARAP2、RICH-1、NADRIN、3BP-1、RhoGAP8およびそれらの変化体からなる群から選択されるRhoファミリーのGAPである、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１０】
前記GAPドメインが、GAPタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも15個、20個、25個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、125個、150個、170個、200個、250個またはそれ以上の連続したアミノ酸を含む、GAPタンパク質由来のGAP GTPaseドメインのポリペプチドフラグメントである、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１１】
特異性ドメインが、RhoA、RhoB、RhoC、Cdc42、Racl、Rac2、Rac3、TC10、RhoG、RhoD、Chp、WRCH1、TCLおよびRIFからなる群から選択されるGTPaseのC末端アミノ酸配列に由来する、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１２】
特異性ドメインが、GTPaseのC末端アミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むGTPaseフラグメントである、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１３】
前記C末端配列がRhoGTPaseファミリーのメンバーの1つに由来する、請求項2に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１４】
前記RhoGTPaseが、RhoA、RhoB、RhoC、Cdc42、Rac1、Rac2、Rac3、TC10、RhoG、RhoD、Chp、WRCH1、TCLおよびRIFからなる群から選択される、請求項13に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１５】
前記GAPドメインペプチドが、下記の式のアミノ酸配列：
XN--GAP--XC
（式中、「GAP」は、GAPタンパク質由来のGAP GTPaseドメインのポリペプチドフラグメントである；
XNは、GAPタンパク質のN末端アミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである；かつ
XCは、GAPタンパク質のC末端アミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである）
を含む、GAPタンパク質由来のGAP GTPaseドメインのポリペプチドフラグメントである、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６】
前記XNが、配列番号2のアミノ酸1〜1260、配列番号4のアミノ酸1〜256、配列番号6のアミノ酸1〜1013、またはそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むポリペプチドフラグメントである、請求項15に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１７】
前記XNが、配列番号2のアミノ酸1249〜1260、配列番号4のアミノ酸237〜256、配列番号6のアミノ酸996〜1013、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項15に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１８】
前記XCが、配列番号2のアミノ酸1432〜1513、配列番号4のアミノ酸427〜439、配列番号6のアミノ酸1206〜1227、またはそれらのフラグメントの少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである、請求項15に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１９】
前記XCが、配列番号2のアミノ酸1432〜1513、配列番号4のアミノ酸427〜439、配列番号6のアミノ酸1206〜1227、およびそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項15に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２０】
前記標的化ポリペプチド特異性ドメインが、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20のアミノ酸配列、およびそれらのフラグメントからなる群から選択される配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むペプチドフラグメントである、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２１】
前記標的化ポリペプチドフラグメントが、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20のアミノ酸配列、およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２２】
膜移行ペプチドをさらに含む、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２３】
前記膜移行ペプチドが膜会合性のイソプレニル化修飾を含む、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２４】
前記膜移行タンパク質が脂質修飾ペプチドを含む、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２５】
前記膜移行タンパク質が約8残基〜約50残基のペプチドである、請求項22に記載のキメラペプチド。
【請求項２６】
前記膜移行ペプチドが、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも8個の連続する残基を含む約8残基〜約50残基のペプチドである、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２７】
前記膜移行ペプチドが、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも8個の連続する残基を含む約8残基〜約24残基を有するアミノ酸配列である、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２８】
前記膜移行ペプチドが、一般には約8アミノ酸残基〜約50アミノ酸残基またはそれ以上の長さを有するアミノ酸の配列であり、この場合、前記残基の少なくとも55％は、それらが疎水性の脂質可溶性部分を有するように疎水性である、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２９】
前記膜移行配列は、Pro-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro-Cys-Ser-Leu-Leu（配列番号21）、Pro-Gln-Pro-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro-Cys-Ser-Leu-Leu（配列番号22）、Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro（配列番号23）、Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Arg-Pro-Arg-Gln-Thr-Gln-Lys（配列番号24)、および、Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro-Cys-Leu-Leu（配列番号25）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号13からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも15個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、125個、150個、175個、200個、250個のアミノ酸（例えば、連続するアミノ酸）を含む、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12または配列番号13からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３２】
請求項1に記載されるポリペプチドを、医薬的に許容され得るキャリア中に含む組成物。
【請求項３３】
哺乳動物におけるGTPase活性のアップレギュレーションに関連づけられる疾患を処置する方法であって、請求項29に記載される組成物を、GTPase活性を低下させるために効果的な量で哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３４】
前記疾患がGTP加水分解関連障害である、請求項30に記載の方法。
【請求項３５】
細胞におけるGTPase活性を調節するための方法であって、
前記細胞を、GTPase活性を調節する活性な化合物と接触させることを含み、前記活性な化合物が、a）GAP活性ドメインと、b）少なくとも1つの特異性ドメインとを含むキメラポリペプチドである、方法。
【請求項３６】
患者におけるガンを処置するための方法であって、
請求項29に記載される組成物を、GTP活性を阻害するために効果的な量で前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項３７】
前記ガンが、GTPaseの増大した活性によって特徴づけられる、請求項33に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた補助金第R01GM60523号を受けた政府援助により一部がなされた。政府は本発明において一定の権利を有し得る。
（関連出願）
【０００２】
本出願は米国仮特許第60/494,719号（2004年8月13日出願）（これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００３】
本発明は、一般には、GTPaseを調整することができるキメラなペプチドに関連し、より具体的には、GTPase活性化タンパク質を使用することによって個々のGTPaseを標的化する方法に関連する。そのようなタンパク質は、ガンおよび他のGTPase関連疾患を処置するために使用することができる。
【背景技術】
【０００４】
Rasに関連したRhoファミリーである小さいGTPaseが、アクチン細胞骨格の組織化、細胞−細胞または細胞−細胞外マトリックスの接着、細胞内膜輸送、遺伝子転写、アポトーシスおよび細胞周期進行の調整をはじめとする広範囲の様々な細胞プロセスに関与している。GTPaseと同様に、Ras（RhoファミリーのGTPase）は不活性なGDP結合型の立体配座および活性なGTP結合型の立体配座で存在する。Rho GTPaseは、結合しているGDPの放出を触媒し、GTPの結合を促進させる一群の正の調節因子（Dblファミリーのグアニンヌクレオチド交換因子（GEF1））によって活性化され、これに対して、Rhoタンパク質の脱活性化が、一群の負の調節因子（GTPase活性化タンパク質（GAP））によってさらに刺激されるその固有的なGTP加水分解活性によって達成される。Rho GTPaseの第3のクラスの調節因子（Rho GDP解離阻害剤）が、それらをGDP結合型の状態に隔離し、これら2つの立体配座状態の間での効果的な循環を妨げることによってRhoタンパク質の活性に負の影響を及ぼし得る。GTPに結合したとき、Rho GTPaseは、一連の潜在的なエフェクター分子とさらに相互作用して、細胞応答を誘発することができる。
【０００５】
Rhoタンパク質がガンの発生の多くの局面で重要な役割を果たしていること、および、Rhoファミリーのそれぞれのメンバーが異なる腫瘍進行状態において異なる程度に関与し得ることがますます明らかになってきている。例えば、構成的に活性なRhoAは潜在的な発ガン能を有し、また、RhoAはRas誘導による形質転換におけるシグナル伝達成分として作用することが示された。さらに、RhoAはラット肝腫瘍細胞の侵入性を促進させ、また、NIH 3T3繊維芽細胞の転移を誘導し、その一方で、RhoCがヒト黒色腫細胞株の遊走および転移の重要な調節因子として明らかにされた。正常な哺乳動物上皮細胞に導入されたとき、RhoCは形質転換および侵入を容易に生じさせ、炎症性乳ガン細胞の表現型をもたらした。他方で、RhoBは、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤またはDNA損傷剤によって誘導されるアポトーシス応答のために要求されており、また、ガンの進行における抑制因子機能または負の調節因子機能を有し得る。Rasとは異なり、腫瘍におけるRhoタンパク質の、変異により引き起こされる構成的な活性化は報告されていない。原発性ヒト腫瘍の最近の研究では、RhoAおよびRhoCを含めて、多くのRho GTPaseが、様々なガンタイプ（例えば、結腸ガン、肺ガン、精巣生殖細胞ガン、頭頸部ガン、扁平上皮ガン、膵管腺ガンおよび炎症性乳ガンなど）では非常に発現しており、また、場合により、Rhoタンパク質のアップレギュレーションおよび／または過剰発現が不良な予後と相関することが明らかにされた。これらの観察結果は、Rhoタンパク質を抗ガン治療のための潜在的な分子標的の一団に加えることを助けている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
1つの実施形態は、GAP活性ドメインと、少なくとも1つの特異的なGTPaseタンパク質を標的化する少なくとも1つの標的化ドメインとを含むキメラポリペプチドである。1つの局面において、標的化ドメインはGTPase由来のC末端配列である（GTPaseのC末端配列に由来する）。さらなる局面において、キメラポリペプチドはまた、膜移行タンパク質ドメインをさらに有する。1つの局面において、GTPaseはRho GTPaseである。さらなる局面において、キメラペプチドはまた、6個〜12個のアミノ酸をキメラポリペプチドのいずれかの末端において含む。1つの局面において、Rho C末端配列はGAP活性ドメインに対してC末端側である。あるいは、Rho C末端配列はGAP活性ドメインに対してN末端側である。1つの局面において、GAP活性ドメインは、GTPase活性化タンパク質活性のために必要な最小限の構造的ドメインを含有するペプチド配列である。さらなる局面において、GAP活性ドメインは、p50RhoGAP、p190、p122-RhoGAP、p190-A、p190-B、オリゴフレニン-1、GRAF、MacGAP、Cdc42GAP（p50RhoGAP）、SrGAP1-SrGAP3、n-キメリン（chimaerin）、CdGAP、Bcr、Abr、MgcRacGAP、ARAP1、ARAP2、RICH-1、NADRIN、3BP-1、RhoGAP8およびそれらの変化体からなる群から選択されるRhoファミリーのGAPである。あるいは、GAPドメインは、GAPタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも15個、20個、25個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、125個、150個、170個、200個、250個またはそれ以上の連続したアミノ酸を含む、GAPタンパク質由来のGAP GTPaseドメインのポリペプチドフラグメントである。
【０００７】
1つの局面において、特異性ドメインは、RhoA、RhoB、RhoC、Cdc42、Racl、Rac2、Rac3、TC10、RhoG、RhoD、Chp、WRCH1、TCLおよびRIFからなる群から選択されるGTPaseのC末端アミノ酸配列に由来する。さらなる局面において、特異性ドメインは、GTPaseのC末端アミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むGTPaseフラグメントである。
【０００８】
本発明のキメラポリペプチドは、C末端配列がRhoGTPaseファミリーのメンバーの1つに由来する。1つの局面において、RhoGTPaseは、RhoA、RhoB、RhoC、Cdc42、Rac1、Rac2、Rac3、TC10、RhoG、RhoD、Chp、WRCH1、TCLおよびRIFからなる群から選択される。
【０００９】
さらなる実施形態は、GAPドメインペプチドが、GAPタンパク質由来のGAP GTPaseドメインのポリペプチドフラグメントである上記で定義されるようなキメラポリペプチドであり、この場合、前記フラグメントは下記の式のアミノ酸配列を含む：XN--GAP--XC（式中、「GAP」は、GAPタンパク質由来のGAP GTPaseドメインのポリペプチドフラグメントである；XNは、GAPタンパク質のN末端アミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである；かつ、XCは、GAPタンパク質のC末端アミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである）。
【００１０】
1つの局面において、XNは、配列番号2のアミノ酸1〜1260、配列番号4のアミノ酸1〜256、配列番号6のアミノ酸1〜1013、またはそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個またはそれ以上の連続するアミノ酸を有するポリペプチドフラグメントである。さらなる局面において、XNは、配列番号2のアミノ酸1249〜1260、配列番号4のアミノ酸237〜256、配列番号6のアミノ酸996〜1013、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される。さらなる局面において、XCは、配列番号2のアミノ酸1432〜1513、配列番号4のアミノ酸427〜439、配列番号6のアミノ酸1206〜1227、またはそれらのフラグメントの少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである。1つの局面において、XCは、配列番号2のアミノ酸1432〜1513、配列番号4のアミノ酸427〜439、配列番号6のアミノ酸1206〜1227、およびそれらのフラグメントからなる群から選択される。1つの局面において、標的化ポリペプチド特異性ドメインは、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20のアミノ酸配列、およびそれらのフラグメントからなる群から選択される配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むペプチドフラグメントである。さらなる局面において、標的化ポリペプチドフラグメントは、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20のアミノ酸配列、およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる局面は、膜会合性のイソプレニル化修飾を有し得る膜移行ペプチドをさらに有するキメラポリペプチドである。1つの局面において、膜移行タンパク質は脂質修飾ペプチドを含む。さらなる局面において、膜移行タンパク質は約8残基〜約50残基のペプチドである。さらなる局面において、膜移行タンパク質は、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも8個の連続する残基を含む約8残基〜約50残基のペプチドである。1つの局面において、膜移行ペプチドは、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも8個の連続する残基を含む約8残基〜約24残基を有するアミノ酸配列である。さらなる局面において、膜移行ペプチドは、一般には約8アミノ酸残基〜約50アミノ酸残基またはそれ以上の長さを有するアミノ酸の配列である（ただし、前記残基の少なくとも55％は、それらが疎水性の脂質可溶性部分を有するように疎水性である）。1つの局面において、膜移行配列は、Pro-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro-Cys-Ser-Leu-Leu（配列番号21）、Pro-Gln-Pro-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro-Cys-Ser-Leu-Leu（配列番号22）、Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro（配列番号23）、Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Arg-Pro-Arg-Gln-Thr-Gln-Lys（配列番号24）、および、Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro-Cys-Leu-Leu（配列番号25）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。さらなる局面において、キメラポリペプチドは、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号13からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも15個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、125個、150個、175個、200個、250個のアミノ酸（例えば、連続するアミノ酸）を含む。
【００１１】
請求項1に記載されるキメラポリペプチドは、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12または配列番号13からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
1つの実施形態は、上記に記載されるようなポリペプチドを、医薬的に許容され得るキャリア中に含む組成物である。
【００１３】
さらなる実施形態は、上記に開示されるような組成物を、GTPase活性を低下させるために効果的な量で哺乳動物に投与することによって、哺乳動物におけるGTPase活性のアップレギュレーションに関連づけられる疾患を処置する方法である。1つの局面において、疾患はGTP加水分解関連障害である。
【００１４】
1つの実施形態は、細胞を、GTPase活性を調節する活性な化合物と接触させることによって、細胞におけるGTPase活性を調節するための方法であり、この場合、活性な化合物は、a）GAP活性ドメインと、b）少なくとも1つの特異性ドメインとを含むキメラポリペプチドである。1つの局面において、GTP活性を阻害するために効果的な量で患者に組成物を投与する工程が提供される。1つの局面において、ガンは、GTPaseの増大した活性によって特徴づけられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
開示された化合物はGTPaseの強力かつ選択的な調節因子である。これらの化合物を使用して、非常に特異的な様式でGTPaseを特異的に標的化することができる。例えば、RhoAを、細胞におけるRhoB活性またはRhoC活性または他のRho GTPase活性に影響を及ぼすことなく標的化することができる。このことは、ヒト腫瘍細胞などの細胞における障害を処置するために使用することができる。さらに、これらの阻害剤は、GTPaseの脱調節に関連する疾患（例えば、ガンなど）を処置するために使用することができる。本開示では、特異的なGTPase活性を標的化するそのような方法が、GTPaseの異なるサブタイプ（例えば、Rho GTPaseなど）の脱調節に関連する細胞表現型を無効にすることにおいてどのように有用であり得るかが詳しく記載される。
【００１６】
Rho GTPase経路を小さいGタンパク質のレベルで標的化するための現在利用可能な分子ツールには、Rhoタンパク質の優性ネガティブ変異体（Feig, L.A.、1999、Nat. Cell Biol.、1、E25〜E27、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）、エフェクターのp21結合ドメイン（PBD）、および、Rho GTPase機能を改変することができる一群の細菌トキシンが含まれる。それらは細胞生物学的研究において広く使用されているが、これらの試薬はそれぞれがそれら自身の欠点を有している。優性ネガティブ形態のRhoタンパク質は、内因性のRho GTPaseの上流のGEF活性化因子を封鎖することによって作用しており、また、近縁のRhoファミリーメンバーの間では非特異的である傾向を有する。さらに、それらの非触媒的性質のために、内因性Rhoタンパク質レベルに対して3倍〜5倍の過剰発現が、典型的には、内因性活性の効果的な遮断のために必要とされ、このことは多くのインビボ状況において望ましくないことがある。同様に、エフェクターPBDおよび細菌トキシン（例えば、C. botulinum C3-トランスフェラーゼなど）の限定された特異性は、非常に相同的なイソ型（例えば、RhoA、RhoBおよびRhoCなど）の役割を区別することに関して面倒である。その上、これらのRho GTPase阻害剤の抗ガン能についてはほとんど知られていない。
【００１７】
Rho GAPはRho GTPaseシグナル伝達の負の調節因子の主要なクラスとして明らかにされており、また、それらのいくつかは実際にその腫瘍抑制因子機能のために知られているため、腫瘍細胞におけるRho GTPase活性を阻害するための別の可能な方法は、Rho GAPをRho活性に対するアンタゴニストとして用いることである。Rho GAPにおける保存されたGAPドメインは、Rhoタンパク質認識およびGTPase触媒作用のための必要かつ十分な構造的決定基を含有しており、また、限定された基質特異性を呈する。例えば、p190 RhoGAPのRhoGAPドメインは、RhoA、RhoBおよびRhoCのGTP加水分解を同等に良く触媒することができ、しかし、RacまたはCdc42に対しては弱く作用する。それは、インビボでの基質選択および触媒作用を導き、かつ調節するために、RhoGAPにおける他の調節ドメインに依存する。逆に、Rhoタンパク質は90％までの同一性を互いに有し得るが、それぞれのRhoサブタイプは細胞の形質転換および転移において別個の役割を果たしているようである。Rho GTPase機能における違いは、部分的には、それぞれの場合において特有のC末端の超可変配列によってほとんどが決定されるそれらの異なる細胞内局在化パターンから生じているかもしれない（Qui他、1995、PNAS 92、11781〜11785、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。RhoA、RhoBおよびRhoCは、NIH 3T3細胞におけるアクチンストレスファイバー形成および限局性複合体組立てを刺激することにおいて同等に効果的であるが、RhoAおよびRhoBは細胞を形質転換することができ、これに対して、RhoCは細胞遊走を誘導する。
【００１８】
本明細書中の開示は、新規なキメラポリペプチド、および、キメラなGAPタンパク質またはGAPポリペプチド（CGP）をコードする核酸の方法および組成物を提供する。キメラGAPポリペプチドの活性は、例えば、下記において実施例に記載されるように、または、当業者が知っている方法に従ってアッセイすることができる。キメラ体は少なくとも2つの領域を含む：GTPaseの阻害の基本的機能を有し、かつ、特異性においてある程度の機能を有するGAP領域（GAPペプチド）。しかしながら、GAPペプチドは、一群のGTPaseを標的化することができるように単に特異性を有するだけである。さらに、特異性は標的化ペプチド（標的化領域）によって提供され得る。このペプチドは、キメラタンパク質を細胞の特定の部分に標的化するドメインまたはモチーフを含む。標的化ペプチドはGAPドメインに対してN末端側またはC末端側に設置することができる。ペプチドはまた、融合タンパク質またはキメラタンパク質が脂質膜を横断して移動することを可能にする膜移行ドメインを含むことができる。これらの領域、モチーフおよびドメイン、ならびに、活性のための最小限の領域が、本明細書中に、また、実施例を参照してさらに記載される。
【００１９】
従って、1つの実施形態は、特に製薬産業における化合物およびその使用に関連する。抗増殖活性を有する化合物が開示される。さらに、本発明の化合物を投与することによって異常な細胞増殖に関連する様々な疾患（ガンを含む）を処置するための方法が開示される。化合物は、異常なGTPase活性に関連する任意の疾患を処置するために有用であり、ガンを処置するために特に有用である医薬組成物に含めることができる。
【００２０】
Rho GTPaseは例示的なGTPaseであり、また、ガンの発達に関連づけられる多数の細胞機能の重要な調節因子である。Rho GTPaseは、細胞−細胞または細胞−細胞外マトリックスの接着、細胞の運動および形態学的形質転換、遺伝子誘導、アポトーシスおよび細胞周期進行に影響を及ぼす。その上、RhoA、Rac1およびCdc42は、Ras誘導による形質転換のための不可欠な成分として関係している。蓄積しつつある証拠は、増大した増殖、接触阻害の喪失、形質転換、隣接組織内への侵入、および、離れた器官への転移をはじめとする腫瘍発達の種々の異なる局面におけるRhoファミリーの個々のメンバーの特異的な役割を示している。従って、Rasと同様に、Rho GTPase、および、それらによって制御されるシグナル伝達経路は、ガンにおける治療的介入のための魅力的な標的になっている。
【００２１】
Rho GTPaseのRhoGAPファミリー調節タンパク質には、70を超える哺乳動物メンバーが含まれる（Moon他、2003、Trends Cell Biol.、13、13〜22、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。RhoGAPのGAP活性は、複雑なタンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−脂質相互作用を介して細胞において厳重に制御されており、その結果、Rho GTPaseは四六時中オフ状態ではない。しかしながら、多くのRhoGAPドメインは、構成的に活性な構造的モジュールを表し、かつ、Rho GTPase基質に対する限定された特異性を呈するようである。過剰発現または顕微注入の状態のもとでは、RhoGAPドメインは単独で、Rho GTPaseのダウンレギュレーションおよびある種のRho媒介による細胞機能の破壊を生じさせることができる（Ridley他、1993、EMBO J.、12、5151〜60）。このことは、おそらくは、導入されたRhoGAPドメインによる細胞内区画の部分的な飽和のためであることが考えられ、従って、Rho GTPaseの個々のメンバーのより特異的な機能を引き出すための研究では望ましくない場合がある。これに関連して、Rhoタンパク質のダウンレギュレーションのためにRhoGAPドメインを単独で利用するときにおける特異性に対する懸念は、優性ネガティブなRho GTPaseまたは細菌トキシンの使用と類似している。
【００２２】
本明細書中の方法および化合物は、個々のRhoタンパク質活性を特異的にダウンレギュレーションするためにRhoGAPドメインの負の調節的役割を活用している。そのような方法および化合物の例には、それぞれの細胞Rho GTPase活性の特異的なダウンレギュレーションのために有用な、RhoA、RhoB、Rhoc、Cdc42、Rac1、Rac2およびRac3のC末端配列と融合されたp190GAP、Cdc42GAP、またはBcrGAPが含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
RhoB機能の以前の遺伝子標的化研究では、RhoAまたはRhoCによる腫瘍の成長または転移に対する正の影響とは異なり、RhoBがガンの発達における負の調節因子または抑制因子として作用し、これにより、DNA損傷またはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤に対する細胞応答を媒介し得ることが示されている。従って、Rhoタンパク質の異なるサブタイプの特異的な標的化を達成することは、RhoBの腫瘍抑制因子機能を保持しながら、RhoAまたはRhoCの過剰発現により引き起こされる成長表現型および／または侵入表現型を無効するための、細胞増殖疾患（例えば、腫瘍細胞）の処置において非常に望ましい。
【００２４】
1つの実施形態は、インビトロでRho GTPaseに対するGAPとして生化学的に活性であり、かつ、RhoペプチドのC末端配列によって指定される異なる細胞内位置に局在化されるRhoGAP−Rhoキメラ体である。RhoGAPに基づく方法により、細胞における個々のRhoサブタイプの生化学的活性および生物学的活性が特異的にダウンレギュレーションされる。
【００２５】
GTPase活性化タンパク質およびその変化体をコードする核酸配列の発見は、ガンをはじめとする細胞増殖障害の特長づけ、診断、防止および処置において有用である新しい組成物を提供する。1つの実施形態はRho特異的なキメラペプチドを提供する。
【００２６】
さらなる実施形態は、生物学的に活性なキメラペプチドを無傷の細胞に移入するための方法である。そのような分子は、移入能を有するシグナルペプチド配列を選択された生物学的に活性なキメラGAP分子に結合することにより複合体を形成し、その複合体を細胞を投与することによって操作することができる。
【００２７】
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列および方法を記載する前に、本明細書中に開示される方法および組成物は、これらは変化し得るため、記載される特定の方法論、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬に限定されないことが理解される。本明細書中で使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、添付された請求項によってのみ限定される本発明の範囲を限定することが意図されないこともまた理解しなければならない。
【００２８】
本明細書中および添付された請求項において使用されているように、「a」、「an」および「the」の単数形態は、文脈がそうでないことを明瞭に指示しない限り、複数の指示物を包含することに留意しなければならない。従って、例えば、「宿主細胞（a host cell）」に対する参照は複数のそのような宿主細胞を包含する。
【００２９】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料はどれも、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、装置および材料が次に記載される。本明細書中で言及されるすべての参考文献、刊行物、特許、特許出願および商業物は、本発明と一緒に使用することができる、刊行物に報告されている細胞株、ベクターおよび方法論を記載および開示するために参考として本明細書中に組み込まれる。本明細書中のいかなるものも、本発明には、先行発明によってそのような開示に先行する権利が与えられていないことの承認として解釈してはならない。
定義
【００３０】
本明細書における目的のための「活性な」または「活性」は、生来的なGAPまたは天然に存在するGAPの生物学的活性および／または免疫学的活性を保持するGTPaseまたはGAPポリペプチドの形態（1つまたは複数）を示し、この場合、「生物学的」活性は、生来的なGAPまたは天然に存在するGAPによって引き起こされる生物学的機能（阻害性または刺激性のいずれか）を示す。
【００３１】
「アミノ酸配列」が、天然に存在するタンパク質分子のアミノ酸配列を示すために本明細書中で列挙される場合、「アミノ酸配列」および類似する用語（例えば、「ポリペプチド」または「タンパク質」など）は、アミノ酸配列を、列挙されたタンパク質分子に関連する完全かつ生来的なアミノ酸配列に限定することを意味しない。
【００３２】
本明細書中で使用される「増幅」は核酸配列のさらなるコピー体の作製を示し、一般には、この分野で広く知られているポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Dieffenbach, C.WおよびG.S. Dveksler (1995)、PCR Primer, a Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Plainview、N.Y.）を使用して行われる。
【００３３】
本明細書中で使用される用語「アンチセンス」は、特定のDNA配列またはRNA配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を示す。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に対して相補的である核酸鎖に関連して使用される。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターに対して逆向きで目的の遺伝子（1つまたは複数）を連結することによる合成をはじめとする任意の方法によって作製することができる。細胞内に導入されると、この転写された鎖は、細胞によって産生された天然配列と結合して、二重鎖を形成する。このような二重鎖は、その後、さらなる転写または翻訳のいずれかを阻止する。この様式で変異表現型を生じさせることができる。「負」の明示は、アンチセンス鎖に関連して使用されることがあり、「正」がセンス鎖に関連して使用されることがある。
【００３４】
本明細書中で使用される用語「生物学的に活性な」は、天然に存在する分子の構造的機能、調節機能または生化学的機能を有するタンパク質を示す。「生物学的活性」は、生物学的状況において（すなわち、生物内またはそのインビトロ複製において）分子によって行われる機能または1組の活性を示す。生物学的活性には、応答性細胞株からの細胞外マトリックス分泌の誘導、ホルモン分泌の誘導、走化性の誘導、有糸分裂生起の誘導、分化の誘導、または、応答性細胞の細胞分裂の阻害が含まれ得る。組換えタンパク質または組換えペプチドは、その生来的な対応体の1つまたは複数の生物学的活性を示すならば、生物学的に活性であると見なされる。
【００３５】
用語「ガン」および用語「ガン性」は、調節されない細胞成長によって典型的には特徴づけられる哺乳動物における生理学的状態を示すか、または、そのような生理学的状態を記述する。ガンの例には、ガン腫、リンパ腫、芽細胞種、肉腫および白血病が含まれるが、これらに限定されない。そのようなガンのより具体的な例には、乳ガン、前立腺ガン、結腸ガン、扁平上皮ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、胃腸ガン、膵臓ガン、神経膠芽細胞種、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、肝ガン、結腸直腸ガン、子宮内膜ガン、唾液腺ガン、腎臓ガン、肝臓ガン、外陰部ガン、甲状腺ガン、肝臓ガン腫、および様々なタイプの頭頸部ガンが含まれる。
【００３６】
本明細書中で使用される「キャリア」には、用いられた投薬量および濃度でさらされている細胞または哺乳動物に対して非毒性である医薬的に許容され得るキャリア、賦形剤または安定化剤が含まれる。多くの場合、生理学的に許容され得るキャリアは水性のpH緩衝化溶液である。生理学的に許容され得るキャリアの例には、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸など；アスコルビン酸をはじめとする抗酸化剤；低分子量（約10残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンなど；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなど；単糖、二糖および他の炭水化物（これらには、グルコース、マンノースまたはデキストリンが含まれる）；キレート化剤、例えば、EDTAなど；糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトールなど；塩形成対イオン、例えば、ナトリウムなど；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN、ポリエチレングリコール（PEG）およびPLURONICSなどが含まれる。
【００３７】
「化学療法剤」は、ガンの処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、5-フルオロウラシル、シトシン、アラビノシド（「Ara-C」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド、例えば、パクリタキセル（タキソール、Bristol-Myers Squibb Oncology（Princeton、N.J.）およびドキセタキセル（タキソテレ、Rhne-Poulenc Rorer（Antony、Rnace））、トキソテレ、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、エスペラマイシン類（米国特許第4,675,187号を参照のこと）、5-FU、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン、アクチノマイシンD、VP-16、クロラムブチル、メルファランおよび他の関連するナイトジェンマスタードが含まれる。この定義にはまた、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用するホルモン剤が含まれる（例えば、タモキシフェンおよびオナプリストンなど）。
【００３８】
本明細書中で使用される「キメラGAPポリペプチド」または「CGP」は、Gタンパク質（特に、RhoA、RhoB、RhoC、Cdc42、Rac1、Rac2、Rac3、TC10、RhoG、RhoD、Chp、WRCH1、TCLおよびRIF）に対する特異的な結合親和性を有するポリペプチド、または、そのような結合親和性を有するキメラGAPポリペプチドをコードする核酸を意味する。特異的な結合親和性によって、ポリペプチドが1つまたは複数の特異的なGタンパク質についての結合優先性を有することが意味される。様々なキメラGAPペプチド融合産物が図1に図示される。
【００３９】
「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に存在しないヌクレオチド配列が連結されているDNA配列を示す。この局面を記載するために使用されるように、用語「キメラ（な）」は、キメラな分子のアミノ酸配列が、その領域が得られた天然に存在するポリペプチドに由来する少なくとも1つのアミノ酸区域（好ましくは、50アミノ酸〜300アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸の区域）を含むことを要求する。従って、キメラなポリペプチドは2つ以上のポリペプチドの「ハイブリッド」または「モザイク体」である。「キメラ（な）」によって、そのポリペプチドが、任意の天然に存在するポリペプチド配列（または天然ポリペプチド配列のフラグメント）と同一でないことが意味される。
【００４０】
「長期の」投与は、最初の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するように、急性様式とは対照的に、連続した様式での薬剤（1つまたは複数）の投与を示す。「間断的」投与は、中断することなく連続して行われず、むしろ、事実上は周期である処置である。
【００４１】
「クローン」は、有糸分裂によって1つの細胞または共通する祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は、多世代にわたってインビトロで安定して成長することができる初代細胞培養の誘導体である。
【００４２】
DNA「コード配列」、または、特定のタンパク質「をコードするヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれているとき、インビボで転写され、かつ、ポリペプチドに翻訳されるDNA配列である。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端における開始コドンと、3'（カルボキシ）末端における翻訳停止コドンとによって決定される。コード配列には、原核生物配列、真核生物のmRNAに由来するcDNA、真核生物（例えば、哺乳動物）のDNAに由来するゲノムDNA配列、および、合成DNA配列でさえ含まれ得るが、これらに限定されない。転写終結配列が通常の場合にはコード配列の3'に存在する。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「相補的（な）」または用語「相補性」は、塩基対形成によって、塩および温度の許容し得る条件のもとでポリヌクレオチドが自然に結合することを示す。例えば、配列「A-G-T」はその相補的な配列「T-C-A」に結合する。2つの一本鎖分子の間での相補性は、核酸の一部のみが結合する「部分的」であり得るか、または、全体的な相補性が一本鎖分子の間に存在するときには、相補性は完全であり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強さに対する著しい影響を有する。このことは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応では特に重要である。
【００４４】
本明細書中で使用される「コンセンサス」は、要求されない塩基を除くために再配列されている核酸配列、あるいは、XL-PCR（Perkin-Elmer、Norwalk、Conn.）を使用して5'方向および／または3'方向で伸長されている核酸配列、あるいは、GELVIEWフラグメントアセンブリーシステム（GCG、Madison、Wis.）を使用して2つ以上のIncyteクローンの重複する配列から組み立てられている核酸配列、あるいは、伸長および組立ての両方が行われている核酸配列を示す。
【００４５】
DNA「制御配列」は、宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳を共同して規定するプロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流の調節ドメイン、エンハンサーなどを総称的に示す。
【００４６】
「共有結合性結合」は2つの有機分子の間における単結合の形成として定義される。「非共有結合性結合」は、共有結合性結合以外のすべての相互作用を包含することが意味される。非共有結合性結合には、イオン相互作用、水素結合、π−π結合、疎水性相互作用およびファンデルワールス相互作用が含まれる。
【００４７】
本明細書中で使用される用語「細胞傷害性薬剤」は、細胞の機能を阻害または防止し、かつ／あるいは、細胞の破壊を引き起こす物質を示す。この用語は、放射性同位体、化学療法剤およびトキシン（例えば、細菌起源、菌類起源、植物起源または動物起源の酵素的に活性なトキシン、あるいはそのフラグメントなど）を包含することが意図される。
【００４８】
本明細書中で使用される「欠失」は、1つまたは複数のアミノ酸残基またはヌクレオチド残基がそれぞれ存在しない、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のいずれかにおける変化を示す。
【００４９】
本明細書中で使用される用語「誘導体」は、GAPをコードする核酸またはコードされたGAPの化学的修飾を示す。そのような修飾には、アルキル基、アシル基またはアミノ基による水素の置換が例示される。核酸誘導体は、天然分子の本質的な生物学的特徴を保持するポリペプチドをコードする。
【００５０】
DNAの「消化」は、DNAにおける特定の配列においてのみ作用する制限酵素によるDNAの触媒的切断を示す。本明細書中で使用される様々な制限酵素が市販されており、また、それらの反応条件、補因子および他の要件が、当業者に知られているように使用された。消化後、反応物は、所望するフラグメントを単離するために、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルで直接、電気泳動される。
【００５１】
「DNA構築物」は、全体として、そうでない場合には自然界に存在しない様式で組み合わされ、かつ、並置されたDNAのセグメントを含有するようにヒトの介入によって改変されている一本鎖または二本鎖のいずれかのDNA分子またはそのような分子のクローンである。
【００５２】
「二本鎖DNA分子」は、二本鎖らせんでのデオキシリボヌクレオチド（塩基：アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のポリマー形態（弛緩型または超コイル型の両方）を示す。この用語は分子の一次構造および二次構造を示すのみであり、分子を任意の特定の三次構造に限定しない。従って、この用語は、とりわけ、線状DNA（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミドおよび染色体に見出される二本鎖DNAを包含する。特定の二本鎖DNA分子の構造を議論する際には、配列が、DNAの転写されない鎖（すなわち、mRNAと相同的な配列を有する鎖）に沿って5'から3'の方向で配列のみを与える通常の慣例に従って本明細書中に記載され得る。
【００５３】
本明細書中に開示される活性な薬剤の「効果的な量」または「治療効果的な量」は、標的細胞内の少なくとも1つのGTPaseの活性をある程度調節することができる量であり、好ましくは、標的細胞の成長または活性をある程度調節することができる量である。この用語は、標的細胞の成長阻害作用、細胞増殖抑制作用および／または細胞傷害性作用および／またはアポトーシスを生じさせることができる量を包含する。「効果的な量」は、経験的に、また、日常的な様式で決定することができる。本明細書中に開示されるポリペプチドまたはそのアンタゴニストの「効果的な量」は、新生物細胞の成長、腫瘍の成長、またはガン細胞の成長の阻害に関連して、標的細胞の成長をある程度阻害することができる量である。この用語は、標的細胞の成長阻害作用、細胞増殖抑制作用および／または細胞傷害性作用および／またはアポトーシスを生じさせることができる量を包含する。
【００５４】
用語「をコードする」は、一般には、配列情報が、通常的にはプロモーターに機能的に連結されている翻訳可能な形態で存在することを示す。配列は、機能的なプロモーターがその配列の転写または発現を高めるとき、プロモーターに機能的に連結されている。アンチセンス鎖は、センス鎖の発現を促進する配列に連結されたときには特に、同じ情報的内容が容易に利用可能な形態で存在するため、配列を同様にコードしていると見なされる。情報は、標準的な遺伝暗号または修正された遺伝暗号を使用して変換可能である。例えば、Watson他（1987）、The Molecular Biology of the Gene（第4版）（第1巻＆第2巻、Benjamin、Menlo Park、Calif.）（これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。
【００５５】
「充填する」または「平滑化する」は、制限酵素で消化された核酸の付着末端における一本鎖の端部が二本鎖に変換される手法を示す。これにより、付着末端が除かれ、平滑端が形成される。このプロセスは、1つだけの制限酵素または少数の他の制限酵素によって生じる端部と付着可能であり得る制限切断端部を、任意の平滑切断制限エンドヌクレアーゼまたは他の充填された付着末端と適合し得る末端に変換するための万能的なツールである。典型的には、平滑化は、2μg〜15μgの標的DNAを、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトール、50mM NaCl、10mM Tris（pH 7.5）の緩衝液において、約37℃で、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントの8ユニットおよび4つのデオキシヌクレオシド三リン酸の各250μMの存在下でインキュベーションすることによって達成される。このインキュベーションは一般には、30分後に停止させられ、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿が行われる。
GTPase
【００５６】
「Rho GTPase」は、GTPと結合し、GTPを加水分解することによって機能する小さい膜結合したRas関連のGTP結合性タンパク質である。Rho GTPaseは、不活性なGDP結合型の立体配座と、活性なGTP結合型の立体配剤との間を循環する分子スイッチとして機能し、これには、RhoA、RhoB、RhoC、Cdc42、Rac1、Rac2、Rac3、TC10、RhoG、RhoD、Chp、WRCH1、TCLおよびRIFが含まれる。用語「RhoGTPase」または用語「Rho GTPaseタンパク質ポリペプチド」は、任意の生物種（特に、哺乳動物、これには、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、および、好ましくはヒトが含まれる）から得られ、天然、合成、半合成または組換えのいずれかであっても任意の供給源に由来するRas関連のGTP結合性タンパク質、その変化体またはフラグメントのタンパク質配列またはポリペプチド配列を示す。
GAPタンパク質およびGAPドメイン
【００５７】
Rho GTPaseに対する調節分子の重要な一群がRho GTPase活性化タンパク質（GAP）である。Rho GAPは、Rho GTPaseのGTP結合型形態を優先的に認識し、その固有的なGTPase活性を刺激して、結合しているGTPをGDPに加水分解する。従って、Rho GAPは、活性なGTP結合型形態に由来するRho GTPaseを不活性なGDP結合型形態に変換することを刺激することによってRho GTPaseの負の調節因子または抑制因子として機能する。
【００５８】
本明細書中で使用される用語「GTPase活性化タンパク質」または「GAP」は、任意の生物種（特に、哺乳動物、これには、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、および、好ましくはヒトが含まれる）から得られ、天然、合成、半合成または組換えのいずれかであっても任意の供給源に由来するGTPase活性化タンパク質のアミノ酸配列を示す。「GAPs」は2つ以上のGAPを示す。一般に、Rho GAPタンパク質は、GAP活性のために必要な最小限の構造的ドメインを含有すると考えられる約170アミノ酸〜190アミノ酸の相同性領域（これはRho GAPドメインと呼ばれる）を互いに有する。Rho GAPタンパク質はこのドメインにおいて20％〜24％のアミノ酸同一性を互いに有しており、しかしながら、いくつかの特定の残基は高度に保存されている。
【００５９】
Rhoファミリーのタンパク質に対して活性である数多くのGAPが同定されている（LamarcheおよびHall、TIG、10:436〜440 (1994)に総説される）。これらには、p50RhoGAP（Lancaster他、J. Biol. Chem.、269:1137〜1142、1994)、Myr5 (Reinhard他、EMBO J.、14:697〜704、1995)、およびp190（Settleman他、Nature、359:153-154、1992）が含まれ、これらはまた、RacおよびCdc42に対して活性である。別のGAP、すなわち、p122-RhoGAP（HommaおよびEmori、EMBO J.、14:286〜291、1995）はRhoに対して特異的であるようである。加えて、rhoGAPには、p190-A、p190-B、オリゴフレニン-1、GRAF、MacGAP、Cdc42GAP（p50RhoGAP）、SrGAP1-SrGAP3、n-キメリン、CdGAP、Bcr、Abr、MgcRacGAP、ARAP1、ARAP2、RICH-1、NADRIN、3BP-1、RhoGAP8、およびそれらの変化体が含まれる（Moon, S.Y.およびZheng, Y. (2003)、細胞調節におけるRho GTPase活性化タンパク質、Trends Cell Biol.、13、14〜23；Peck, J.、Douglas, G.、Wu, C.H.およびBurbelo, P.D. (2002)、ヒトRhoGAPドメイン含有タンパク質：構造、機能および進化論的関係性、FEBS Letters、528、27〜34）。
【００６０】
用語「GAPポリペプチド」および用語「GAP」は、本明細書中で使用される場合、およびは、数字表示が直後に続くとき、様々なポリペプチドを示し、この場合、完全な表示（すなわち、GAP/数字）は、本明細書中に記載されるような特定のポリペプチド配列を示す。用語「GAP/数字ポリペプチド」および用語「GAP/数字」（この場合、用語「数字」は、本明細書中で使用されるような実際の数字表示として提供される）は、（本明細書中でさらに定義される）生来的配列のポリペプチドおよびポリペプチド変化体を包含する。本明細書中に記載されるGAPポリペプチドは、様々な供給源から、例えば、ヒト組織タイプから、または、別の供給源から単離することができ、あるいは、組換え方法または合成方法によって調製することができる。用語「GAPポリペプチド」は、本明細書中に開示されるそれぞれの個々のGAP/数字ポリペプチドを示す。「GAPポリペプチド」を示す本明細書におけるすべての開示は、ポリペプチドのそれぞれを一緒に示すだけでなく、ポリペプチドのそれぞれを個々に示す。例えば、の調製、の精製、の導出、に対する抗体、または、  に対抗する抗体の形成、の投与、を含有する組成物、による疾患の処置などは、それぞれのポリペプチドに個々に関連する。用語「GAPポリペプチド」はまた、本明細書中に開示されるGAP/数字ポリペプチドの変化体を包含する。
【００６１】
「GAPポリペプチド変化体」は、本明細書中に開示されるような全長の生来的配列のGAPポリペプチド配列（例えば、配列番号2、配列番号4、配列番号6）との少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有する上記または下記で定義されるような活性なGAPポリペプチド、本明細書中に開示されるようなシグナルペプチドを有しないGAPポリペプチド配列、本明細書中に開示されるような、シグナルペプチドを有するか、またはシグナルペプチドを有しないGAPポリペプチドの細胞外ドメイン、あるいは、本明細書中に開示されるような全長GAPポリペプチド配列の任意の他のフラグメントを意味する。そのようなGAPポリペプチド変化体には、例えば、1つまたは複数のアミノ酸残基が全長の生来的なアミノ酸配列のN末端またはC末端において付加または欠失しているGAPポリペプチドが含まれる。通常、GAPポリペプチド変化体は、少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約81％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約82％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約83％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約84％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約86％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約87％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約88％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約89％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約91％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約92％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約93％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約94％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約96％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約97％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約98％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を、本明細書中に開示されるような全長の生来的配列のGAPポリペプチド配列に対して、本明細書中に開示されるようなシグナルペプチドを有しないGAPポリペプチド配列に対して、本明細書中に開示されるような、シグナルペプチドを有するか、またはシグナルペプチドを有しないGAPポリペプチドの細胞外ドメインに対して、あるいは、本明細書中に開示されるような全長GAPポリペプチド配列の任意の他の具体的に規定されるフラグメントに対して有する。通常、GAP変化体ポリペプチドは、長さが少なくとも約10アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約20アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約30アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約40アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約50アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約60アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約70アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約80アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約90アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約100アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約150アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約200アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約300アミノ酸またはそれ以上である。
【００６２】
他のGAP変化体を、下記の総説（これらはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）を参照して作製することができる：Chardin, P.、Curr Biol.、2003（9月16日）：13(18)：R702〜4、GTPase調節：Rnd RockおよびRho阻害の獲得；Bernads, A.、Biochem Biophys Acta.、2003（3月17日）：1603(2)：47〜82、多数のGAP！ヒトおよびショウジョウバエにおける推定されるRasスーパーファミリーのGTPase活性化タンパク質の調査；Douglas他、FEBS letters、2002（9月25日）：528(1-3)：27〜34、ヒトRhoGAPドメイン含有タンパク質：構造、機能および進化論的関係性；Moon SY、Zheng, Y.、Trends Cell Biol.、2003（1月）：13(1)：13〜22、細胞調節におけるRho GTPase活性化タンパク質；Lamarche N、Hall A.、Trends Genet.、1994（12月）：10(12)：436〜40、rho関連GTPaseに対するGAP。
【００６３】
必要な最小限の構造的ドメインは、阻害活性をGAPドメインにもたらすために必要である最少量のアミノ酸である。従って、例えば、有用な融合タンパク質を作製するために、様々な短縮化、置換および他の小さい変化をGAPドメインに対して行うことができ、それらは十分な活性を依然として提供する。
GAP変化体、同族体、モチーフ、および、活性に必要な最小領域
【００６４】
下記の参考文献および研究では、モチーフ、配列類似性、および、GAPドメインの活性に必要な最小領域が同定されている。これらの参考文献およびこの情報を使用して、GAP変化体を作製することができ、また、この領域の活性を与えるために必要なGAP領域における最少数のアミノ酸を同定することができる。さらに、これらの参考文献は、同族体、および、そのような同族体における必要な領域を同定するために使用することができる。
【００６５】
例えば、Bernards他、Biochimica Biophys acta、1603、2003、47頁〜82頁（これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）では、結晶構造および保存されている残基が議論されている。p120GAP触媒作用ドメインの334アミノ酸フラグメントの結晶構造により、完全なαらせんドメイン構造が解明された。RasGAPの間で保存されている残基が、完全な触媒活性を保持するニューロフィブロミンの最小セグメントに対応する中心の218残基ドメインに存在する。ニューロフィブロミンの333残基のGAPドメインフラグメントの構造もまた決定されており、類似する全体的な構造が明らかにされている。RasGAP-334複合体の結晶構造により、RasのスイッチII領域における触媒的に重要なGln61を正しくアラインメントすることによって、また、アルギニンフィンガー残基を与えることによって、様々なGAPがRas-GTPの加水分解を促進することが確認された。
【００６６】
RhoA GDPとの複合体でのp50PhoGAPの触媒作用ドメインを表す約230アミノ酸のC末端セグメントの3D構造もまた決定されている。ブレークポイントクラスター領域相同性ドメインまたはBHドメインと呼ばれることがある完全なαらせん触媒作用ドメインは、RhoGAPの間で保存されているほとんどの残基を含む束になった4つのらせんからなるコアを含む。RasGAPについて見出されていたことと同様に、p50RhoGAPの不可欠なアルギニン残基がGTPase活性部位の中に突き出ている。
【００６７】
遠い関係にあるRasGAPおよびRhoGAPは、触媒作用において直接的に関係する相同的なアルギニンフィンガーを含む。潜在的なアルギニンフィンガーが、ほとんどのRasスーパーファミリーメンバーに対するGAPにおいて同定されている。
【００６８】
GAPに見出されるモチーフの様々な例が、Lamarche他、TIG、1994（12月）、第10巻、第12号（これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に示される。さらに、様々な同族体に対する構造、機能および進化論的関係性が、Peck他、FEBS letters、528、2002、27頁〜34頁、および、Moon他、Trends in Cell Biol.、第13巻、第1号、2003（1月）に示される（それらはともにその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００６９】
本明細書中で交換可能に使用されるように、「GAP活性」「GAPの生物学的活性」または「GAPの機能的活性」は、標準的な技術に従ってインビボまたはインビトロで明らかにされるような、GAP応答性の細胞または組織に対して、あるいは、GAPタンパク質基質に対して、GAPタンパク質分子、GAPポリペプチド分子またはGAP核酸分子によって発揮される少なくとも1つの活性を包含する。1つの実施形態において、GAP活性は、GAP標的分子との会合などの直接的な活性である。本明細書中で使用される「標的分子」または「結合パートナー」は、GAP媒介による機能が達成されるように、GAPタンパク質が事実上結合または相互作用する分子である。GAP標的分子は非GAP分子またはGAPタンパク質またはGAPキメラポリペプチドであり得る。例示的な実施形態において、GAP標的分子はGAPリガンド（例えば、GTPase）である。あるいは、GAP活性は、GAPタンパク質がGAPリガンド（例えば、GTPase）と相互作用することによって媒介される細胞シグナル伝達活性などの間接的な活性である。好ましくは、GAP活性は、例えば、GTPase分子との相互作用を介してGTPの加水分解を調節することができることである。
【００７０】
別の実施形態において、キメラなGAP分子が、タンパク質または対応する核酸分子における「GAPドメイン」の存在に基づいて同定される。本明細書中で使用される用語「GAPドメイン」には、約50アミノ酸残基〜約300アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する、タンパク質のドメインまたは変化体または短縮化されたドメインが含まれる。さらなる実施形態において、GAPドメインは約150アミノ酸残基を有する。さらなる実施形態において、GAPドメインは約120アミノ酸残基〜約265アミノ酸残基を有する。さらなる実施形態において、GAPドメインは約140アミノ酸残基〜約205アミノ酸残基または約145アミノ酸〜約175アミノ酸を有する。1つの実施形態において、GAPドメインはRhoGAPドメインである。別の好ましい実施形態において、GAPドメインは、少なくとも約40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％または100％の配列同一性をヒトp190GAPのRhoGAPドメイン（例えば、配列番号2の残基1261〜1431）に関して有する。さらなる実施形態において、保存された領域は、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％または100％（これらに限定されない）をはじめとする約40％〜約100％の同一性を有する。さらなる実施形態において、非保存領域は、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％および95％（これらに限定されない）をはじめとする約10％〜約100％の同一性を有する。
【００７１】
別の実施形態において、キメラなGAP分子が、タンパク質または対応する核酸分子における「Cdc42GAPドメイン」の存在に基づいて同定される。本明細書中で使用される用語「Cdc42GAPドメイン」には、約150アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するタンパク質ドメインが含まれる。好ましくは、Cdc42GAPドメインは、少なくとも約120個〜265個のアミノ酸残基、より好ましくは約140個〜205個のアミノ酸残基、または、約145個〜175個のアミノ酸を含む。別の好ましい実施形態において、Cdc42GAPドメインは、少なくとも約40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％または100％の配列同一性をヒトまたはラットのCdc42GAPのCdc42GAPドメイン（例えば、配列番号4の残基257〜426）に関して有する。
【００７２】
別の実施形態において、キメラなGAP分子が、タンパク質または対応する核酸分子における「BcrGAPドメイン」の存在に基づいて同定される。本明細書中で使用される用語「BcrGAPドメイン」には、約150アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するタンパク質ドメインが含まれる。好ましくは、BcrGAPドメインは、少なくとも約120個〜265個のアミノ酸残基、より好ましくは約140個〜235個のアミノ酸残基、または、約145個〜195個のアミノ酸を含む。別の好ましい実施形態において、BcrGAPドメインは、少なくとも約40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％または100％の配列同一性をヒトまたはラットのBcrGAPのBcrGAPドメイン（例えば、配列番号6の残基1014〜1205）に関して有する。
【００７３】
さらなる実施形態において、GAPドメインが下記のタンパク質配列の少なくとも1つから提供される。
【００７４】
「GAPポリヌクレオチド」または「GAP核酸配列」は、本明細書中で定義されるような活性なGAPポリペプチドをコードする核酸分子で、本明細書中に開示されるような全長の生来的配列のGAPポリペプチド配列と、あるいは、本明細書中に開示されるようなシグナルペプチドを有しない全長の生来的配列のGAPポリペプチド配列と、あるいは、本明細書中に開示されるような、シグナルペプチドを有するか、またはシグナルペプチドを有しないGAPポリペプチドの細胞外ドメインと、あるいは、あるいは、本明細書中に開示されるような全長GAPポリペプチド配列の任意の他のフラグメントをコードするヌクレオチド配列と少なくとも約80％の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、GAP変化体ポリヌクレオチドは、少なくとも約80％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約81％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約82％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約83％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約84％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約85％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約86％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約87％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約88％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約89％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約90％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約91％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約92％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約93％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約94％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約95％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約96％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約97％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約98％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約99％の核酸配列同一性を、本明細書中に開示されるような全長の生来的配列のGAPポリペプチド配列、本明細書中に開示されるような全長の生来的配列のGAPポリペプチド配列、または、全長のGAPポリペプチド配列の任意の他のフラグメントをコードする核酸配列（例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号5）に関して有する。変化体は生来的なヌクレオチド配列を含まない。
さらなる定義および説明
【００７５】
表現「遺伝子増幅」および表現「遺伝子重複化」は交換可能に使用され、遺伝子または遺伝子フラグメントの多数のコピー体が特定の細胞または細胞株において形成されるプロセスを示す。重複化された領域（増幅されたDNAの区域）は「アンプリコン」と呼ばれることが多い。通常、産生されたメッセンジャーRNA（mRNA）の量、すなわち、遺伝子発現のレベルもまた、発現した特定の遺伝子から作製されるコピー体の数に比例して増大する。
【００７６】
「遺伝子融合」は、ある遺伝子（「レスポンダー」）からのコード配列が別の遺伝子（「コントローラー」）の制御配列の指揮のもとで転写および／または翻訳されることをもたらすDNA構築（これはインビトロまたはインビボで行われる）である。レスポンダー遺伝子は、分析上または操作上の役割をそれぞれ有するレポーターおよびエフェクターの2つのクラスに分けることができる。
【００７７】
「成長阻害剤」は、本明細書中で使用されるとき、細胞（特に、本明細書中で特定される遺伝子のいずれかを過剰発現するガン細胞）の成長をインビトロまたはインビボのいずれかであっても阻害する化合物または組成物を示す。従って、成長阻害剤は、S期においてそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を著しく低下させる薬剤である。成長阻害剤の例には、細胞周期の進行を（S期以外のところで）阻止する薬剤、例えば、G1停止およびM期停止を誘導する薬剤などが含まれる。古典的なM期阻止剤には、ビンカアルカロイド（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキソール、およびトポII阻害剤（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシドおよびブレオマイシンなど）が含まれる。G1を停止させるそのような薬剤はまた、S期停止にまで波及する（例えば、DNAアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、5-フルオロウラシルおよびara-Cなど）。
【００７８】
本明細書中で使用される用語「相同性」は相補性の程度を示す。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）が存在し得る。部分的に相補的な配列は、同一の配列が標的核酸にハイブリダイゼーションすることを少なくとも部分的に妨げる配列であり、これは、機能的な用語「実質的に相同的な」を使用して示される。完全に相補的な配列が標的配列にハイブリダイゼーションすることの阻害は、低いストリンジェンシーの条件のもとでのハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を使用して調べることができる。実質的に相同的な配列またはプローブは、完全に相同的な配列またはプローブが低いストリンジェンシーの条件のもとで標的配列に結合すること（すなわち、ハイブリダイゼーション）について競合し、そのような結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）を阻害する。このことは、低いストリンジェンシーの条件が、非特異的な結合を許容するような条件であることを断定するものではない。低いストリンジェンシーの条件では、2つの配列が互いに結合することが特異的（例えば、選択的）な相互作用であることが要求される。非特異的な結合が存在しないことを、部分的な程度の相補性（すなわち、約30％未満の同一性）さえ有しない第2の標的配列の使用によって試験することができる。非特異的な結合が存在しない場合、プローブは第2の非相補的な標的配列にハイブリダイゼーションしない。
【００７９】
「宿主細胞」は、外因性のDNA配列によって形質転換されている細胞、または、外因性のDNA配列によって形質転換することができる細胞である。
【００８０】
本明細書中で使用される用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対形成によって相補的な鎖と結合する任意のプロセスを示す。
【００８１】
本明細書中で使用される用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なG塩基およびC塩基の間、そして、相補的なA塩基およびT塩基の間での水素結合の形成によって2つの核酸配列の間で形成される複合体を示す。これらの水素結合は塩基積み重なり相互作用によってさらに安定化され得る。2つの相補的な核酸配列は反平行の形態で水素結合する。
【００８２】
1つまたは複数のさらなる治療剤「との組合せでの」投与は、同時（併用）投与、および、任意の順序での連続投与を包含する。
【００８３】
本明細書中で使用される「挿入」または「付加」は、天然に存在する分子と比較したとき、1つまたは複数のアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の付加をそれぞれもたらすアミノ酸配列またはヌクレオチド配列における変化を示す。
【００８４】
「単離された」核酸は、生来的なヒト配列を天然の状態では随伴する他のDNA配列（例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、および多くの他のヒトゲノム配列）から実質的に分離されている核酸（例えば、RNA、DNAまたは混合ポリマー）である。この用語は、その天然に存在する環境から取り出されている核酸配列を包含し、また、組換えDNA単離体またはクローン化されたDNA単離体、および化学合成されたアナログ、または、異種のシステムによって生物学的に合成されたアナログを包含する。実質的に純粋な分子には、単離された形態の分子が含まれる。単離された核酸は、一般には、分子の均一な組成物であり、しかし、いくつかの実施形態では小さい不均一性を含有する。この不均一性は典型的には、ポリマー末端において、または、所望する生物学的な機能または活性にとって重要でない部分において見出される。
【００８５】
「単離された」は、本明細書中に開示される様々なポリペプチドを記載するために使用されるときには、同定され、かつ、その天然の環境の少なくとも1つの成分から分離および／または回収されているポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、そのポリペプチドが天然の状態で会合し、かつ、その活性を実質的に妨害する実質的にすべての混入物成分を伴っていない。その天然の環境の混入物成分は、ポリペプチドについての診断的使用または治療的使用を典型的には妨害する物質であり、これには、酵素、ホルモン、および、他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれる。
【００８６】
2つ以上のDNAコード配列は、DNAコード配列の間での読み枠を合わせた融合の結果として、または、正常な細胞プロセシングによる介在配列の除去の結果として、DNAコード配列がポリペプチド融合体に翻訳されるとき、「つながっている」と言われる。
【００８７】
用語「標識」は、本明細書中で使用されるとき、「標識された」実体をもたらすようにペプチドまたはヌクレオチドに直接的または間接的にコンジュゲート化される検出可能な化合物または組成物を示す。標識は、自身によって検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識または蛍光性標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能である、基質化合物または基質組成物の化学的変化を触媒することができる。
【００８８】
「リポソーム」は、哺乳動物に対する薬物（例えば、GAPポリペプチドなど）の送達のために有用である、様々なタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小さい小胞である。リポソームの成分は、生物学的膜の脂質配置に類似する二重層形成で一般には配置される。
【００８９】
本明細書中で使用される用語「ミメティクス」は、その構造がGAPまたはその一部の構造の知識から開発される分子を示し、そのため、Rhoタンパク質に関連づけられ分子の作用の一部またはすべてを行うことができる。
【００９０】
「連結」は、2つの二本鎖核酸フラグメントの間でホスホジエステル結合を形成するプロセスを示す。別途示されない限り、連結は、T4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）、および、ほぼ等モル量の連結されるDNAフラグメントを用いて、知られている緩衝液および条件を使用して達成される。
【００９１】
処置のための「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物を示し、これには、ヒト、家畜および農場動物、ならびに、動物園の動物、競技動物またはペット動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなど）が含まれる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００９２】
「適度にストリンジェントな条件」は、Sambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（New York：Cold Spring Harbor Press、1989）によって記載されるように特定することができ、そのような条件には、上記に記載される洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件よりも低いストリンジェンシーの洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％SDS）の使用が含まれる。適度にストリンジェントな条件の一例が、20％のホルムアミド、5xSSC（150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH 7.6）、5xデンハルト溶液、10％のデキストラン硫酸、および20mg/mLの変性された剪断サケ精子DNAを含む溶液における37℃での一晩のインキュベーション、それに続く、約37℃〜50℃で1xSSCにおいてフィルターを洗浄することである。当業者は、プローブ長さなどの要因を適合させるために必要に応じて、温度、イオン強度などをいかに調節するかを理解する。
【００９３】
本明細書中で使用される用語「調節する」は、少なくとも1つのGTPaseの生物学的活性における変化または変更を示す。調節は、タンパク質活性の増大または低下、結合特性の変化、あるいは、GTPaseの生物学的性質、機能的性質または他の性質における任意の他の変化であり得る。
【００９４】
「生来的配列のGAPポリペプチド」は、自然界に由来する対応するGAPポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような生来的配列のGAPポリペプチドを自然界から単離することができ、あるいは、組換え手段または合成的手段によって作製することができる。用語「生来的配列のGAPポリペプチド」は、特定のGAPポリペプチドの天然に存在する短縮化型形態または分泌型形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に存在する変化体形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態）、および、そのポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子形態を特に包含する。様々な実施形態において、本明細書中に開示される生来的配列のGAPポリペプチドは、添付された図に示される全長のアミノ酸配列を含む成熟型または全長の生来的配列のポリペプチドである。開始コドンおよび停止コドンが太字で示され、また、これらは図では下線が引かれている。しかしながら、添付された図に開示されるGAPポリペプチドは、図ではアミノ酸位置1として本明細書中では表示されるメチオニン残基から始まることが示されるが、図におけるアミノ酸位置1の上流側または下流側のいずれかに存在する他のメチオニン残基がGAPポリペプチドのための開始アミノ酸残基として用いられ得ることが考えられ、かつ、可能である。
【００９５】
本明細書中で使用される「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそのフラグメントまたは一部、ならびに、一本鎖または二本鎖であり得るゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAを示し、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。同様に、本明細書中で使用される「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列、および、そのフラグメントまたは一部、ならびに、天然に存在する分子または合成分子を示す。
【００９６】
「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる一本鎖ポリデオキシヌクレオチド鎖または2つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかを示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは5'のリン酸を有しておらず、従って、キナーゼの存在下でATPとともにリン酸を加えることなく、別のオリゴヌクレオチドには連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。
【００９７】
核酸は、別の核酸配列との機能的な関係に置かれたとき「機能的に連結される」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのDNAは、ポリペプチドが、ポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドに対するDNAに機能的に連結されている。プロモーターまたはエンハンサーは、プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に機能的に連結されている。あるいは、リボソーム結合部位は、リボソーム結合部位が、翻訳を促進させるように配置されるならば、コード配列に機能的に連結される。一般に、「機能的に連結され（てい）る」は、連結されているDNA配列が連続していること、また、分泌リーダーの場合には、連続し、かつ読み相が一致していることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、都合の良い制限部位における連結によって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーが従来の実施に従って使用される。
【００９８】
ガンの「病理学」には、対象の健康を損なうすべての現象が含まれる。これには、限定されないが、異常または制御不能な細胞成長、転移、周りの細胞の正常な機能発現の妨害、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌生成物の放出、炎症性応答または免疫学的応答の抑制または悪化などが含まれる。
【００９９】
本明細書中において特定されるGAPポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列同一性の一部としての保存的置換を何ら考慮することなく、配列をアラインメントし、かつ、最大のパーセント配列同一性を達成するために、必要ならば、ギャップを導入した後で、特定のGAPポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントを、当業者の範囲に含まれる様々な方法で達成することができ、例えば、BLASTソフトウエアなどの公開されているコンピュータソフトウエアを使用して達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムをはじめとする、アラインメントを評価するための適切なパラメーターを決定することができる。
【０１００】
用語「ポリペプチド」はアミノ酸のポリマーおよびその均等物を示し、生成物の特定の長さを示さない。従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質はポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの様々な修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を排除しない。定義には、例えば、アミノ酸の1つまたは複数のアナログ（これには、例えば、非天然アミノ酸などが含まれる）を含有するポリペプチド、置換された連結を有するポリペプチド、ならびに、この分野で知られている他の修飾（天然および非天然の両方で存在する）が含まれる。
【０１０１】
ポリペプチドのいずれか1つの「ポリペプチド変化体」は、少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも約81％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約82％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約83％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約84％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約86％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約87％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約88％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約89％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約91％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約92％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約93％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約94％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約96％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約97％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約98％のアミノ酸配列同一性、そして、最も好ましくは、少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を、本明細書中に開示されるような全長の生来的配列に関して有しており、そのような変化体ポリペプチドは、長さが少なくとも約10アミノ酸であり、多くの場合には長さが少なくとも約20アミノ酸であり、より多くの場合には長さが少なくとも約30アミノ酸であり、より多くの場合には長さが少なくとも約40アミノ酸であり、より多くの場合には長さが少なくとも約50アミノ酸であり、より多くの場合には長さが少なくとも約60アミノ酸であり、より多くの場合には長さが少なくとも約70アミノ酸であり、より多くの場合には長さが少なくとも約80アミノ酸であり、より多くの場合には長さが少なくとも約90アミノ酸であり、より多くの場合には長さが少なくとも約100アミノ酸であり、より多くの場合には長さが少なくとも約150アミノ酸であり、より多くの場合には長さが少なくとも約200アミノ酸であり、より多くの場合には長さが少なくとも約300アミノ酸であり、またはそれ以上である。
【０１０２】
用語「一部」は、（「所与のタンパク質の一部」におけるように）タンパク質に関して本明細書中で使用されるとき、そのタンパク質のフラグメントを示す。フラグメントは、サイズが、4アミノ酸残基から、全アミノ酸配列-1個のアミノ酸にまで及び得る。従って、「配列番号2のアミノ酸配列の少なくとも一部を含む」タンパク質は全長のヒトGAPおよびそのフラグメントを包含する。
【０１０３】
本出願において使用される用語「プロドラッグ」は、元の薬物と比較して腫瘍細胞に対して細胞傷害性が低く、かつ、より活性な元の形態に酵素により活性化または変換され得る、医薬的に活性な物質の前駆体形態または誘導体形態を示す。プロドラッグには、より活性な細胞傷害性の遊離薬物に変換され得るリン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されたフェノキシアセトアミドを含有するプロドラッグ、または、必要に応じて置換されたフェニルアセトアミドを含有するプロドラッグ、5-フルオロシトシンプロドラッグおよび他の5-フルオロウリジンプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
「プロモーター配列」は、細胞においてRNAポリメラーゼと結合することができ、下流側（3'方向）のコード配列の転写を開始させることができるDNA調節領域である。プロモーター配列は、その3'末端においてコード配列の翻訳開始コドン（ATG）が結合し、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始させるために必要な最少数の塩基またはエレメントを含むために上流側（5'方向）に広がっている。プロモーター配列内には、転写開始部位（これは、都合よくは、ヌクレアーゼS1を用いたマッピングによって明らかにされる）、ならびに、RNAポリメラーゼが結合することに関わるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
【０１０５】
用語「タンパク質」は、天然に存在するポリペプチドを示すために本明細書中では使用される。用語「ポリペプチド」はその最も広い意味で使用される：すなわち、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の任意のポリマー（ジペプチドまたはそれよりも大きいもの）。従って、用語「ポリペプチド」には、タンパク質、オリゴペプチド、タンパク質フラグメント、アナログ、ムテイン、融合タンパク質などが含まれる。「生来的」なタンパク質またはポリペプチドは、自然界に存在する供給源から回収されたタンパク質またはポリペプチドを示す。
【０１０６】
本明細書中で特定されるGAPコード核酸配列に関して「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列をアラインメントし、かつ、最大のパーセント配列同一性を達成するために、必要ならば、ギャップを導入した後で、目的とするGAP核酸配列におけるヌクレオチドと同一である候補配列におけるヌクレオチドの百分率として定義される。パーセント核酸配列同一性を決定するためのアラインメントを、当業者の範囲に含まれる様々な方法で達成することができ、例えば、BLASTソフトウエアなどの公開されているコンピュータソフトウエアを使用して達成することができる。
【０１０７】
用語「組換え」は、天然に存在しない核酸配列、または、そうでない場合には2つの分離された配列セグメントの人為的な組合せによって作製される核酸配列を示す。この人為的な組合せは、多くの場合、化学的な合成手段によって、または、例えば、遺伝子操作技術による、単離された核酸セグメントの人為的な操作によって、そのいずれでも達成される。そのようなことは、通常的には、コドンを、同じアミノ酸または保存的アミノ酸をコードする重複コドンで置き換え、その一方で、典型的には配列認識部位を導入または除去するために行われる。あるいは、そのようなことは、一般的な天然形態には見出されない機能の所望する組合せを含む単一の遺伝的実体を作製するために、所望する機能の核酸セグメントを一緒につなぐために行われる。制限酵素認識部位が多くの場合にはそのような人為的操作の標的であり、しかし、他の部位特異的標的（例えば、プロモーター、DNA複製部位、調節配列、制御配列、または他の有用な特徴物）を意図的に組み込むことができる。類似する概念が組換えポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）のために意図される。「組換え」ポリペプチドは、組換えDNA技術によって作製されるポリペプチド（すなわち、所望のポリペプチドをコードする外因性DNA構築物によって形質転換された細胞から産生されるポリペプチド）を示す。「合成」ポリペプチドは、化学合成によって調製されるポリペプチドである。
【０１０８】
「レプリコン」は、インビボでDNA複製の自律的ユニットとして機能する任意の遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である：すなわち、レプリコンはそれ自身の制御のもとで複製することができる。
【０１０９】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者によって容易に決定可能であり、一般には、プローブの長さ、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、より長いプローブでは、より高い温度が適切なアニーリングのために要求され、一方で、より短いプローブでは、より低い温度が必要である。ハイブリダイゼーションは一般に、相補的な鎖がそれらの融解温度よりも低い環境に存在するときの、変性されたDNAが再アニーリングする能力に依存する。プローブと、ハイブリダイゼーション可能な配列との間での所望する相同性の程度が大きいほど、使用することができる相対的な温度が高くなる。結果として、より高い相対的温度は反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、一方、より低い温度は反応条件をストリンジェントにしないという結果になる。
【０１１０】
用語「シグナルペプチド」は、シグナルペプチドが結合しているポリペプチドを標的細胞に向かわせ、好ましくは、細胞膜を横断するその輸送を行わせる任意のペプチド配列を示す。「移入能を有するシグナルペプチド配列」は、結合したペプチド配列を、細胞膜を横断して移行させるために依然として能力を有する配列である。
【０１１１】
本明細書中で使用される用語「ストリンジェントな条件」は、およそTm-5℃（プローブの融解温度（Tm）より5℃低い）から、Tmより約20℃〜25℃低い温度の範囲において生じる「ストリンジェンシー」である。当業者によって理解されるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、同一のポリヌクレオチド配列または関連したポリヌクレオチド配列を同定または検出するために変更することができる。この分野で知られているように、数多くの同等な条件を、低いストリンジェンシーの条件または高いストリンジェンシーの条件のいずれかを含むために用いることができる。様々な要因、例えば、配列の長さおよび性質（DNA、RNA、塩基組成）、標的の性質（DNA、RNA、塩基組成、溶液中での存在または固定化など）、ならびに、塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸および／またはポリエチレングリコールの存在または非存在）が検討され、また、ハイブリダイゼーション溶液は、上記に示された条件とは異なるが、同等である低いストリンジェンシーまたは高いストリンジェンシーのいずれかの条件を作製するために変化させることができる。
【０１１２】
本明細書中で使用される用語「実質的に精製された」は、それらの天然の環境から除かれ、単離または分離され、かつ、天然では会合する他の成分の少なくとも60％（好ましくは75％、最も好ましくは90％）が存在しない核酸配列またはアミノ酸配列を示す。
【０１１３】
本明細書中で使用される「置換」は、1つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチドを異なるアミノ酸またはヌクレオチドによってそれぞれ置き換えることを示す。
【０１１４】
腫瘍の処置に関連して、「治療効果的な量」は、下記の効果の1つまたは複数を生じさせることができる量を示す：(1)鈍化および完全な成長停止をはじめとする腫瘍成長のある程度の阻害；(2)腫瘍細胞の数の減少；(3)腫瘍サイズの減少；(4)周辺器官への腫瘍細胞浸潤の阻害（すなわち、低下、鈍化または完全な停止）；(5)転移の阻害（すなわち、低下、鈍化または完全な停止）；(6)腫瘍の退行または拒絶を生じさせ得る（しかし、生じさせる必要はない）抗腫瘍免疫応答の強化；および／または、(7)障害に関連する1つまたは複数の症状のある程度の緩和。
【０１１５】
「転写融合体」は、すべてのコード配列がレスポンダー遺伝子に由来する遺伝子融合体である。
【０１１６】
細胞は、そのような外因性DNAが細胞膜の内部に導入されるとき、外因性DNAによって「形質転換」される。外因性DNAは、細胞のゲノムを構成する染色体DNAに（共有結合的に連結されて）組み込まれてもよく、または組み込まれなくてもよい。例えば、原核生物および酵母では、外因性DNAはエピソームエレメント（例えば、プラスミドなど）に保持され得る。真核生物細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、外因性DNAが染色体に組み込まれ、その結果、外因性DNAが染色体の複製を介して娘細胞によって受け継がれる細胞である。この安定性は、外因性DNAを含有する娘細胞の集団から構成される細胞株またはクローンを確立する真核生物細胞の能力によって明らかにされる。
【０１１７】
「翻訳融合体」は、コントローラー遺伝子およびレスポンダー遺伝子のコード情報を含むポリペプチドをコードする遺伝子融合体である。
【０１１８】
「処置」は、障害の発達を妨げるか、または障害の病理を変化させるという意図を伴って行われる介入である。従って、「処置」は治療的処置および予防的処置または防止的処置の両方を示す。処置を必要としているものは、障害を既に有するもの、ならびに、障害が防止されることになるものである。腫瘍（例えば、ガン）の処置において、治療剤は腫瘍細胞の病理を直接的に低下させることができ、または、腫瘍細胞を他の治療剤による処置（例えば、放射線および／または化学療法）に対してより感受性にすることができる。
【０１１９】
本明細書中で使用される「腫瘍」は、すべての新生物性の細胞成長および増殖（悪性または良性のいずれかであっても）、ならびに、すべての前ガン性およびガン性の細胞および組織を示す。
【０１２０】
本明細書中で使用される「変化体」は、1つまたは複数のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を示す。変化体は、置換されたアミノ酸が類似する構造的性質または化学的性質を有する「保存的」変化（例えば、イソロイシンによるロイシンの置換）を有することができる。より希ではあるが、変化体は「非保存的」変化（例えば、トリプトファンによるグリシンの置換）を有することができる。類似する小さい変化にはまた、アミノ酸の欠失または挿入、あるいは、その両方が含まれることがある。どのアミノ酸残基が、生物学的活性または免疫学的活性を破壊することなく、置換、挿入または欠失され得るかを決定することにおける指針が、この分野で広く知られているコンピュータプログラム（例えば、DNASTARソフトウエア）を使用して見出され得る。
【０１２１】
「ベクター」は、結合しているセグメントの複製をもたらすように別のDNAセグメントが結合され得るレプリコン（例えば、プラスミド、ファージまたはコスミドなど）である。
様々な実施形態の説明
【０１２２】
1つの実施形態は、新規なキメラポリペプチド、および、キメラなGAPタンパク質またはGAPポリペプチド（CGP）をコードする核酸を提供する。キメラなGAPポリペプチドの活性は、例えば、下記において実施例に記載されるように、または、当業者が知っているであろう方法に従ってアッセイすることができる。
【０１２３】
1つの実施形態は、a)GAPドメインペプチドと、b)標的化ペプチドとを含む単離された融合ポリペプチドであるキメラポリペプチド、および、そのようなキメラなGAPタンパク質またはGAPポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【０１２４】
好ましくは、GAPドメインは、GTPase活性化タンパク質の活性のために必要な最小限の構造的ドメインを含有するペプチド配列である。より好ましくは、GAPは、p50RhoGAP、p190、p122-RhoGAP、p190-A、p190-B、オリゴフレニン-1、GRAF、MacGAP、Cdc42GAP（p50RhoGAP）、SrGAP1-SrGAP3、n-キメリン、CdGAP、Bcr、Abr、MgcRacGAP、ARAP1、ARAP2、RICH-1、NADRIN、3BP-1、RhoGAP8、およびそれらの変化体を含むRhoファミリーのGAPである。変化体、GAPドメインおよび最小限の構造的ドメインは、特定のGAPタンパク質に関連して上記で特定されている。特定のドメインおよびモチーフの遺伝的保存のために、  ことが理解される。
キメラポリペプチド
【０１２５】
1つの実施形態において、GAPドメインペプチドは、GAPタンパク質に由来するGAP GTPaseドメインのポリペプチドフラグメントであり、この場合、フラグメントは、p50RhoGAP、p190、p122-RhoGAP、p190-A、p190-B、オリゴフレニン-1、GRAF、MacGAP、Cdc42GAP（p50RhoGAP）、SrGAP1-SrGAP3、n-キメリン、CdGAP、Bcr、Abr、MgcRacGAP、ARAP1、ARAP2、RICH-1、NADRIN、3BP-1、RhoGAP8、およびそれらの変化体を含むRhoファミリーのGAPであるGAPタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも15個、20個、25個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、125個、150個、170個、200個、250個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含む。
【０１２６】
別の実施形態において、標的化ポリペプチドは、RhoGTPaseファミリーに由来するGTPaseのC末端アミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むGTPaseフラグメントである。好ましくは、C末端テールは、RhoA、RhoB、RhoC、Cdc42、Rac1、Rac2、Rac3、TC10、RhoG、RhoD、Chp、WRCH1、TCLおよびRIFからなる群から選択されるRhoGTPaseに由来する。
【０１２７】
別の実施形態において、GAPドメインは、GAPsのより良好な結合を提供するために、C末端およびN末端に付加されたいくつかの短いアミノ酸配列を有することができる。従って、1つの実施形態において、GAPドメインペプチドは、下記の式のアミノ酸配列を含む、GAPタンパク質に由来するGAP GTPaseドメインのポリペプチドフラグメントである：
XN--GAP--Xc
【０１２８】
式中、「GAP」は、本明細書中に記載されるようなGAPタンパク質に由来するGAP GTPaseドメインのポリペプチドフラグメントである；
【０１２９】
式中、XNは、GAPタンパク質のN末端アミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである；かつ
【０１３０】
式中、XCは、GAPタンパク質のC末端アミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである。
【０１３１】
好ましくは、XNは、配列番号2のアミノ酸1〜1260、配列番号4のアミノ酸1〜256、配列番号6のアミノ酸1〜1013、またはそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むペプチドフラグメントである；
【０１３２】
より好ましくは、XNは、配列番号2のアミノ酸1249〜1260、配列番号4のアミノ酸237〜256、配列番号6のアミノ酸996〜1013、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される。
【０１３３】
好ましくは、XCは、配列番号2のアミノ酸1432〜1513、配列番号4のアミノ酸427〜439、配列番号6のアミノ酸1206〜1227、またはそれらのフラグメントの少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである。
【０１３４】
より好ましくは、XCは、配列番号2のアミノ酸1432〜1513、配列番号4のアミノ酸427〜439、配列番号6のアミノ酸1206〜1227、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される。
標的化ペプチド
【０１３５】
本明細書中に開示される融合タンパク質またはキメラタンパク質は、GAPドメインに対してN末端側あるいはGAPドメインのC末端側であり得る標的化ペプチドエレメントを有する。好ましくは、標的化ペプチドはGAPドメインのC末端側である。一般に、標的化ペプチドはGTPaseのC末端アミノ酸配列に由来する。C末端アミノ酸配列は、RhoA、RhoB、RhoC、Cdc42、Rac1、Rac2、Rac3、TC10、RhoG、RhoD、Chp、WRCH1、TCLおよびRIFをはじめとするRhoGTPaseのC末端テール（これに限定されない）をはじめとする当業者に知られている任意のGTPaseに由来し得る。標的化ペプチドは、必要なモチーフおよび／またはドメインが、細胞の特定の部分を依然として標的化するように含まれる限り、GTPaseのC末端の任意の部分であり得る。そのようなドメインおよびモチーフが数多くのGTPaseファミリーについて同定されており、そのようなドメインおよびモチーフには、Rho GTPaseのC末端のイソプレニル化（CAAXボックス）ドメインおよびポリ塩基性ドメインの膜標的化配列が含まれる。1つの実施形態において、GTPaseのC末端配列は、膜に伴うイソプレニル化修飾を含む。さらなる実施形態において、C末端配列は、脂質により修飾されたペプチドである。これらのC末端配列は少なくとも12個のアミノ酸を含むが、配列の標的化活性に影響を及ぼすことなく、さらに多くのアミノ酸を含有することができる。
【０１３６】
別の実施形態において、標的化ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むペプチドフラグメントである：
【０１３７】
LQARRGKKKSG---CLVL（配列番号14）
LQKRYGSQNGCINCCKVL（配列番号15）
LQVRKNKRRRG---CPIL（配列番号16）
PEPKKSRRCVLL（配列番号17）
PVKKRKRKCLLL（配列番号18）
PTRQQKRACSLL（配列番号19）
PVKKPGKKCTVF（配列番号20）
あるいはそれらのフラグメントまたは誘導体。
【０１３８】
より好ましくは、標的化ポリペプチドは、下記のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む標的化ポリペプチドフラグメントである：
LQARRGKKKSG---CLVL（配列番号14）
LQKRYGSQNGCINCCKVL（配列番号15）
LQVRKNKRRRG---CPIL（配列番号16）
PEPKKSRRCVLL（配列番号17）
PVKKRKRKCLLL（配列番号18）
PTRQQKRACSLL（配列番号19）
PVKKPGKKCTVF（配列番号20）
あるいはそれらのフラグメントまたは誘導体。
【０１３９】
生物学的に活性なキメラペプチドを無傷の細胞の中に移入する方法もまた本明細書中に開示される。そのような分子は、移入能を有するシグナルペプチド配列を選択された生物学的に活性なキメラGAP分子に結合することにより複合体を形成し、複合体を細胞に投与することによって操作することができる。その後、複合体は細胞によって細胞膜を横断して移入される。従って、生物学的に活性な分子を細胞にエクスビボまたはインビボで移入する方法が提供され、この方法は、移入能を有するシグナルペプチドに連結された分子を含む複合体を移入条件のもとで細胞に投与し、それによりその分子を細胞内に移入することを含む。1つの実施形態において、キメラなGAPポリペプチドは、シグナルペプチドに連結され、細胞内に輸送されたとき、造血幹細胞および始原体細胞における可動化応答を誘導する。
【０１４０】
好適な移入条件が本明細書中に例示されており、好適な移入条件には、約18℃〜約42℃の間での細胞および複合体の温度が含まれ、好ましい温度は約22℃〜約37℃の間である。対象において細胞への投与のために、複合体は、対象の体内に入ると、当然のことではあるが、対象の体温に調節される。エクスビボ投与については、複合体は、細胞の生存性を維持する任意の標準的な方法によって、例えば、複合体を（標的細胞について適切な）培養培地に加え、この培地を細胞に直接加えることなどによって投与することができる。この分野では知られているように、この方法で使用される培地はいずれも、細胞を非生存性にしないように水性かつ非毒性であり得る。加えて、培地は、所望するならば、細胞の生存性を維持するための標準的な栄養物を含有することができる。インビボ投与については、複合体を、例えば、医薬的に許容され得るキャリア（例えば、生理的食塩水および緩衝化生理的食塩水）に加え、この分野で知られているいくつかの手段のいずれかによって投与することができる。投与の例には、例えば、標的細胞（1つまたは複数）を有する組織（1つまたは複数）または器官（1つまたは複数）に供給する血管を介した局部的な灌流をはじめとする静脈内注射による非経口投与、あるいは、エアロゾルの吸入、皮下注射または筋肉内注射、皮膚創傷部および病巣部などへの局所投与、直接的なトランスフェクション（例えば、移植のために調製された骨髄細胞への直接的なトランスフェクション）およびその後の対象体内への移植、ならびに、続いて対象の体内に移植される器官への直接的なトランスフェクションによる非経口投与が含まれる。さらなる投与方法には、特に複合物がカプセル化されているときには経口投与が含まれ、または、特に複合体が坐薬形態であるときには直腸投与が含まれる。医薬的に許容され得るキャリアには、生物学的またはそれ以外に望ましくないことがない任意の物質が含まれる。すなわち、そのような物質は、何らかの望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく、または、そのような物質が含有される医薬組成物のそれ以外の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、選択された複合体と一緒に個体に投与することができる。
【０１４１】
固体組成物の場合、従来の非毒性の固体キャリアには、例えば、製薬規格のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。液体の医薬的に投与され得る組成物を、例えば、本明細書中に記載されるような活性な化合物および場合により使用される薬学的佐剤を賦形剤（例えば、水、生理的食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、エタノールなど）に溶解、分散などし、それにより、溶液または懸濁物を形成することによって調製することができる。所望するならば、投与される医薬組成物はまた、少量の非毒性の補助的な物質（例えば、湿潤化剤または乳化剤、pH緩衝化剤など）を含有することができる。そのような投薬形態物を調製する実際の様々な方法が当業者には知られており、また、当業者には明らかである。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciencesを参照のこと。
【０１４２】
1つの実施形態において、移入能を有するシグナルペプチドに連結されている選択された生物学的に活性なキメラGAPペプチドを含む複合体が利用される。上記で議論されたように、生物学的に活性な分子を様々な分子のいずれかから選択することができ、この場合、その選択は、分子を選択された細胞に移入することによって達成されるべき目的に依存する。
【０１４３】
1つの実施形態において、a)膜移行ペプチド、b)GAPドメインペプチド、およびc)GTPaseのC末端アミノ酸配列に由来する標的化ペプチドを含む単離された融合ポリペプチドが開示される。
【０１４４】
一般に、膜移行ペプチドは約8残基〜約50残基のペプチドである。好ましくは、膜移行ペプチドは、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24または配列番号25の少なくとも8個の連続する残基を含む約8残基〜約50残基のペプチドである。より好ましくは、シグナルペプチドは、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24または配列番号25の少なくとも8個の連続する残基を含む約8残基〜約50残基を有する、移入能を有するシグナルペプチド配列（「膜移行ペプチド」）である。
【０１４５】
本明細書中で使用される「移入能を有するシグナルペプチド」または「膜移行ペプチド」は、長さが一般には約8残基〜約50残基またはそれ以上であるアミノ酸の配列であり、それらの多くの残基（典型的には約55％〜60％）は、それらの残基が疎水性の脂溶性部分を有するように疎水性である。好ましくは、移入能を有するシグナルペプチドは、長さが一般には約8残基〜約24残基またはそれ以上であるアミノ酸の配列である。疎水性部分はシグナルペプチドの共通する主要なモチーフであり、多くの場合、細胞から分泌されるタンパク質のシグナルペプチドの中心となる部分である。シグナルペプチドは、細胞タンパク質の移出を可能にするために細胞膜を突き抜けることができるペプチドである。シグナルペプチドはまた「移入能を有する」。すなわち、シグナルペプチドは細胞の外側から細胞の内部に細胞膜を突き抜けることができる。改変がペプチドの移行媒介機能に影響を及ぼさない限り、アミノ酸残基を変異させることができ、かつ／または改変することができる（すなわち、ミメティクスを形成するために）。従って、用語「ペプチド」はミメティクスを包含し、用語「アミノ酸」は、本明細書中で使用されるような修飾アミノ酸、非通常型アミノ酸、およびD型アミノ酸を包含する。本明細書中において包含される移入能を有するシグナルペプチドのすべてが、細胞膜を横断して細胞の外側から細胞の内側への移行を媒介する機能を有する。そのような移入能を有するシグナルペプチドは潜在的には、シグナルペプチドがタンパク質を移出する能力を失い、しかし、分子を細胞内に移入する能力を維持するように改変することができる。推定されるシグナルペプチドは、任意の選択された細胞タイプに対する特異性について試験することを含めて、本明細書中に提供される教示に従って、この移入活性について容易に調べることができる。
【０１４６】
移入能を有するシグナルペプチド配列が結合しているキメラGAPペプチド、ならびに、ポリペプチド、タンパク質ドメインまたは全長タンパク質の膜移行および細胞内への移入を媒介することにおけるその使用が本明細書中に開示される。これらの移入能を有するシグナルペプチド配列は、タンパク質移入については8個〜24個のアミノ酸を含むことができ、また、この8アミノ酸〜24アミノ酸の移入能を有するシグナルペプチド配列を細胞内への移入のために標的タンパク質との融合体として発現させることによって細胞膜透過性を有するタンパク質を遺伝子操作するためのプラスミド発現ベクターを構築するために、この8アミノ酸〜24アミノ酸のペプチドをコードするDNA配列を提供することができる。さらなる実施形態において、膜移行ドメインまたは移入能を有するドメインは、脂質により修飾されたペプチドを含み、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、ならびにそのフラグメントおよび変化体からのアミノ酸配列の少なくとも8個の連続する残基を含む約8残基〜約50残基のペプチドである。しかしながら、変化体およびフラグメントは移行のために必要な最小限の配列を依然として含有する。さらなる実施形態において、脂質により修飾されたペプチドは約8個〜約24個の残基を有する。さらなる実施形態において、これらの残基の少なくとも約55％は、これらの残基が疎水性の脂溶性部分を有するように疎水性である。
【０１４７】
好ましい実施形態において、移入能を有するシグナルペプチド配列のアミノ酸配列は、Pro-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro-Cys-Ser-Leu-Leu（配列番号21）、Pro-Gln-Pro-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro-Cys-Ser-Leu-Leu（配列番号22）、Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro（配列番号23）、Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Arg-Pro-Arg-Gln-Thr-Gln-Lys（配列番号24）、およびGly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro-Cys-Leu-Leu（配列番号25）からなる群から選択される。しかしながら、本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」は、ミメティクスを包含することが意図され、用語「アミノ酸」は、D型アミノ酸および修飾アミノ酸を包含することが意図される。これらの置換を、分子間の知られている構造的類似性を使用して、当業者によって行うことができる。膜移行配列を、本明細書中における組換えヌクレオチドベクターによって産生されるような積み荷タンパク質にじかに隣接させて、または、そのような積み荷タンパク質からある程度の距離で配置することができる。従って、アミノ酸配列はまた、さらなるアミノ酸を、示された配列のN末端またはC末端のいずれかに、あるいその両方に含むことができる任意のペプチド配列またはタンパク質配列を包含することが意図される。代替的配列は、代替的アミノ酸、ならびに、さらなるC末端アミノ酸またはN末端アミノ酸を包むことが意図される。
【０１４８】
シグナルペプチドは、例えば、シグナルペプチドの起源をも列挙するSIGPEPデータベースから選択することができる。造血細胞など特定の細胞タイプが標的化されることになるとき、そのような細胞タイプによって使用されるシグナルペプチドを選ぶことができる。加えて、細胞タイプにとって内因性のシグナルペプチドを、生物学的に活性な分子をそのような細胞タイプに移入するために選ぶことができる。再度ではあるが、任意の選択されたシグナルペプチドを、本明細書中の教示に従って、任意の所与の細胞タイプの細胞膜を横断して移送する能力について日常的に調べることができる。具体的には、選ばれたシグナルペプチドを生物学的に活性な分子（例えば、細胞タンパク質の機能的ドメインまたはレポーター構築物）にコンジュゲート化し、細胞に投与することができ、その後、細胞を活性な分子の存在についてスクリーニングする。様々なシグナルペプチドがこの分野では知られている。例えば、米国特許第6,573,068号、同第6,548,633号、同第6,495,518号、同第6,451,601号、同第6,432,680号、同第6,312,922号、同第6,248,558号、同第6,245,739号、同第6,043,339号、同第5,807,746号、同第5,464,822号を参照のこと（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。しかしながら、選択された標的細胞の内部に細胞膜を横断して移行させることができる任意のシグナルペプチドを使用することができる。
【０１４９】
シグナルペプチドにおける修飾アミノ酸の存在はさらに、複合体（この場合、生物学的に活性な分子は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である）を対象におけるペプチダーゼに対してより抵抗性にするために有用であり得る。従って、このようなシグナルペプチドは、より多くのペプチドがその標的に到達することを可能にすることによって、また、ペプチドが分解されるまでのペプチドの寿命を長くすることによってより効果的な処置を可能にすることができる。加えて、シグナルペプチドのアミノ酸配列を改変して、シグナル配列を除くための元のシグナル配列に存在する何らかのタンパク質分解切断部位を変更することができる。切断部位は、側鎖を有しない小さい正荷電のアミノ酸によって特徴づけられる。
【０１５０】
本明細書中で使用される「連結された」によって、シグナルペプチドが細胞膜を横断するとき、分子もまた細胞膜を横断して移入されるような様式で、生物学的に活性な分子がシグナルペプチドに結合していることが意味される。そのような連結手段の例には、(1)分子がペプチドであるときには、シグナルペプチド（および、所望するならば、核局在化ペプチド）をペプチド結合によって連結することができる（すなわち、2つのペプチドが連続して合成され得る）；(2)分子がポリペプチドまたはタンパク質であるときには、シグナルペプチド（および、所望するならば、核局在化ペプチド）を、ペプチド結合によって、または非ペプチドの共有結合性結合（例えば、架橋剤を用いてシグナルペプチドをタンパク質にコンンジュゲート化することなど）によって分子に連結することができる；(3)負荷電を有する分子（例えば、核酸など）については、分子およびシグナルペプチド（および、所望するならば、核局在化ペプチド）を、負荷電分子とペプチド内の正荷電アミノ酸と間での電荷による会合によって、または、核酸とアミノ酸との間での他のタイプの会合によって結合することができる；(4)化学的連結方法を、シグナルペプチド（および、所望するならば、核局在化ペプチド）のカルボキシ末端アミノ酸と分子との間での共有結合性の結合を作製するために用いることができる。方法(1)および方法(2)が典型的には好まれる。
【０１５１】
方法(1)の様々な例が下記に示されており、この場合、アミノ末端からの線形順序で、シグナルペプチド配列、場合により使用されるスペーサーアミノ酸領域、および生物学的に活性なアミノ酸配列（例えば、キメラGAPペプチド）を含有するペプチドが、この分野で知られている標準的な手段によって合成される。そのようなペプチドはまた、ペプチドを作製するために、組換えDNA技術によって作製し、上記アミノ酸をコードする組換え構築物から発現させることができる。
【０１５２】
方法(2)については、上記のようなペプチド結合を利用することができ、または、非ペプチドの共有結合性結合を使用して、シグナルペプチドを生物学的に活性なポリペプチドまたはタンパク質と連結することができる。この非ペプチドの共有結合性結合は、この分野では標準的な方法によって、例えば、シグナルペプチドを架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）によりポリペプチドまたはタンパク質にコンジュゲート化することなどによって形成させることができる。そのような方法はこの分野では標準的である。方法(3)については、分子をシグナルペプチドと一緒に単に混合することができ、従って、分子を会合させることができる。これらの方法は、核酸をカチオン性リポソームと会合させるのと同じ様式で行われる。あるいは、共有結合性の（チオエステル）結合を核酸とタンパク質との間で形成させることができる。そのような方法はこの分野では標準的である。
【０１５３】
方法(4)については、標準的な化学的連結方法、例えば、シグナルペプチドのカルボキシ末端アミノ酸と相互作用する化学的架橋剤を使用することなどを利用することができる。そのような方法この分野では標準的であり、シグナルペプチドのカルボキシ末端を任意の選択された生物学的に活性な分子に連結するために容易に行うことができる。
【０１５４】
対象に投与される複合体はリポソームをさらに含むことができる。カチオン性リポソームおよびアニオン性リポソームが、中性脂質を有するリポソームと同様に、本明細書中では考えられる。カチオン性リポソームは、シグナルペプチドおよび負荷電の生物学的に活性な分子との複合体を、これらの成分を混合し、それらを電荷により会合させることによって形成することができる。カチオン性リポソームは、生物学的に活性な分子が核酸であるとき、核酸の負荷電のために、特に有用である。カチオン性リポソームの例には、リポフェクチン、リポフェクタミン、リポフェクターセ（lipofectace）およびDOTAPが含まれる。アニオン性リポソームは一般に、細胞に送達される物質をリポソーム内に包むために利用される。物質を包むカチオン性リポソームを形成させるための手法はこの分野では標準的であり、複合体を包むために当業者によって本明細書中において容易に利用すことができる。
【０１５５】
複合体を選択された細胞との接触状態にするための手段が存在する限り、生物学的に活性な分子の移入が有用である任意の選択された細胞をこの方法によって標的化することができる。細胞は、例えば、複合物が投与される血管によって供給される組織または器官に存在し得る。加えて、細胞は、例えば、肺の上皮を標的化するためにペプチドに連結された分子の吸入によって標的化することができる。本発明の方法によって標的化され得る細胞のいくつかの例には、なかでも、繊維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、血液細胞および腫瘍細胞が含まれる。加えて、複合体は体内の組織部位に直接投与することができる。上記で議論されたように、利用されるシグナルペプチドは、選択された標的細胞によって利用されることが知られているシグナルペプチドから選ぶことができ、または、所望するシグナルペプチドを、本明細書中の教示に示される移入能力について調べることができる。しかしながら、一般に、すべてのシグナルペプチドは、少なくとも部分的にはその疎水的な特性のために、細胞膜を横断する共通の能力を有する。従って、一般に、膜透過性シグナルペプチドを任意の野細胞タイプについて設計および使用することができる。これは、すべての真核生物細胞の細胞膜は類似する脂質二重層を有するからである。
【０１５６】
特に有用な一例が、キメラペプチドを造血細胞内に移入し、それにより、幹細胞を対象によって可動化させることを可能にすることである。移入能を有するシグナルペプチドに連結され、かつ、核局在化ペプチドに連結された生物学的に活性な分子を含む複合体もまた本明細書中には提供される。
【０１５７】
1つの実施形態は、核酸、炭水化物、脂質、糖脂質および治療剤からなる群から選択される生物学的に活性な分子に連結された移入能を有するシグナルペプチドを含む複合体である。この複合体はリポソームをさらに含むことができる。このような複合体は上記のように形成させることができる。リポソームを上記のように選択することができる。複合体を医薬的に許容され得るキャリアに入れることができる。
【０１５８】
別の局面は、単離または組換えのキメラなGAPタンパク質またはGAPポリペプチドを特徴とする。好ましい実施形態において、単離されたキメラGAPは下記ドメインの少なくとも1つまたは複数を含む：RhoGAPドメイン、膜標的化ドメインおよび／または膜移行ドメイン。
【０１５９】
好ましい実施形態において、キメラGAPは、配列番号2、配列番号4および配列番号6からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％またはそれ以上が同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、GAPドメインの少なくとも1つまたは複数を含む。別の好ましい実施形態において、キメラGAPはGTPase活性を調節し、かつ、少なくとも1つまたは複数のGAPドメインを含む。
【０１６０】
さらに別の好ましい実施形態において、キメラGAPは、配列番号2、配列番号4および配列番号6からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとでハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされ、かつ、少なくとも1つまたは複数のGAPドメインを含む。
【０１６１】
別の実施形態において、配列番号2、配列番号4または配列番号6のアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントが提供され、この場合、フラグメントは、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号13からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも15個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、125個、150個、175個、200個、250個のアミノ酸（例えば、連続するアミノ酸）を含む。別の実施形態において、タンパク質は、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12または配列番号13のアミノ酸配列を有する。
【０１６２】
別の実施形態において、配列番号1、配列番号3または配列番号5からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその相補体に対して少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％またはそれ以上が同一であるヌクレオチド配列からなる核酸分子によってコードされる単離されたキメラGAPが特徴とされる。配列番号1、配列番号3または配列番号5からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとでハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列からなる核酸分子によってコードされる単離されたキメラタンパク質が開示される。
【０１６３】
別の好ましい実施形態において、キメラGAPタンパク質は、(1)非GAPタンパク質分子（例えば、GTPaseまたはGAPリガンドまたはGAP基質）との相互作用；(2)GAP依存性のシグナル伝達経路を調節すること；(3)Rho GTPase依存性のシグナル伝達を調節すること；(4)Rho GTP加水分解活性を調節すること；(5)Rhoタンパク質に結合しているGTP/GDPのレベルを調節すること（これらに限定されない）を含む活性について調べることができる。
【０１６４】
キメラなGAPタンパク質またはその生物学医的に活性な部分を、医薬的に許容され得るキャリアを場合により含む医薬組成物に配合することができる。
【０１６５】
別の局面において、GTPase活性を調節するための方法が提供され、この方法は、細胞を、GTPase活性を調節するキメラなGAPペプチドと接触させ、その結果、細胞におけるGTPase活性が調節されるようにすることを含む。1つの実施形態において、活性な化合物はGTPase活性を阻害する。別の実施形態において、活性な化合物はGTPase活性を刺激する。別の実施形態において、活性な化合物は、GTPaseの発現を、遺伝子の転写またはmRNAの翻訳を調節することによって調節する。さらに別の実施形態において、活性な化合物は、mRNAまたはGAP遺伝子のコード鎖に対してアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する核酸分子である。
【０１６６】
1つの実施形態において、様々な方法が、GTPase調節因子である活性な化合物を対象に投与することによって、異常な、または望ましくないGAPタンパク質発現またはGAP核酸発現またはGAP活性により特徴づけられる障害を有する対象を処置するために使用される。1つの実施形態において、GTPase調節因子はキメラなGAPタンパク質である。1つの実施形態において、GTPase調節因子は、異なるGTPaseの活性を調節する少なくとも2つのキメラなGAPタンパク質である。別の実施形態において、GTPase調節因子はキメラなGAP核酸分子である。さらに別の実施形態において、GTPase調節因子は、ペプチド、ペプチドミメティクスまたは他の小分子からなる群から選択される1つまたは複数のさらなる因子を含む。好ましい実施形態において、異常な、または望ましくないタンパク質発現または核酸発現により特徴づけられる障害はGTP加水分解関連障害であり、例えば、アテローム性動脈硬化、高血圧、顔生殖器（faciogenital）異形成、腫瘍形成および転移、心臓疾患、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、ならびにウイルス感染などである。
【０１６７】
別の好ましい実施形態において、核酸分子は、配列番号1、配列番号3および配列番号5からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその相補体の少なくとも50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、200ヌクレオチド、300ヌクレオチド、400ヌクレオチド、500ヌクレオチド、600ヌクレオチド、700ヌクレオチド、800ヌクレオチド、900ヌクレオチド、1000ヌクレオチド、1100ヌクレオチド、1200ヌクレオチド、1300ヌクレオチド、1400ヌクレオチド、1500ヌクレオチド、1600ヌクレオチド、1700ヌクレオチド、1800ヌクレオチド、1900ヌクレオチド、2000ヌクレオチド、2100ヌクレオチド、2200ヌクレオチド、2300ヌクレオチド、2400ヌクレオチド、2500ヌクレオチド、2600ヌクレオチド、2700ヌクレオチド、2800ヌクレオチド、2900ヌクレオチド、3000ヌクレオチド、3100ヌクレオチド、3200ヌクレオチド、3300ヌクレオチド、3400ヌクレオチド、3500ヌクレオチドまたはそれ以上のヌクレオチド（例えば、連続するヌクレオチド）のフラグメントを含む。
【０１６８】
別の実施形態において、キメラなGAP核酸分子は、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号13からなる群から選択されるアミノ酸配列と十分に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１６９】
好ましい実施形態において、キメラなGAP核酸分子は、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号13からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長に対して少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％またはそれ以上が同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１７０】
他の好ましい実施形態において、核酸分子は、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号13からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの変化体をコードし、この場合、核酸分子は、配列番号1、配列番号3および配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションする。
【０１７１】
別の局面は、キメラなGAP核酸分子を含むベクターを提供する。特定の実施形態において、ベクターは組換え発現ベクターである。別の実施形態において、ベクターを含有する宿主細胞が提供される。さらに別の実施形態において、核酸分子を含有する宿主細胞が提供される。さらなる実施形態において、タンパク質を産生するための方法が、タンパク質が産生されるように、組換え発現ベクターを含有する本発明の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞、例えば、非ヒト哺乳動物細胞など）を好適な培地で培養することによって提供される。
【０１７２】
さらなる実施形態はキメラGAPポリペプチドのポリペプチドフラグメントである。このフラグメントは好ましくは生物学的に活性である。生物学的に活性によって、ポリペプチドフラグメントが、生体系において、または、生体系の成分とともに活性を有することが意味される。生物学的な活性には、Gタンパク質（特に、RhoA、RhoB、RhoC、Cdc42、Rac1、Rac2、Rac3）に対する特異的な結合親和性、あるいは、Rho GTPase活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することが含まれる。そのような活性は、例えば、上記および下記に記載される方法に従って日常的にアッセイすることができる。様々なフラグメントを調製することができる。
【０１７３】
そのようなキメラポリペプチドは、化学的方法、合成的方法、準合成的方法および／または組換え方法を含めて、様々な方法に従って調製することができる。キメラポリペプチドをコードするキメラ核酸は、様々なドメインまたは所望のポリペプチドを、例えば、イントロン、スプライス部位、エンハンサーなどを含有する連続したオープンリーディングフレームまたは中断されたオープンリーディングフレームで含有することができる。
【０１７４】
キメラ核酸を様々な方法に従って調製することができる。例えば、米国特許第5,439,819号を参照のこと。ドメインまたは所望のポリペプチドは、生物学的機能（例えば、触媒作用、シグナル伝達、成長促進、細胞標的化など）、構造的機能（例えば、疎水性、親水性、膜貫通など）、受容体−リガンド機能、および／または検出可能な機能（例えば、酵素、蛍光性ポリペプチド、緑色蛍光タンパク質GFPと組み合わされた機能）をはじめとする任意の所望する性質を有することができる。
【０１７５】
本明細書中に開示されるポリペプチドは発現システム（例えば、インビボ、インビトロ、無細胞、組換え、細胞融合などのシステム）で産生させることができる。そのようなシステムによってもたらされるポリペプチドに対する修飾には、グリコシル化、アミノ酸置換（例えば、異なるコドン使用による置換）、ポリペプチドのプロセシング（例えば、消化、切断、エンドペプチダーゼ活性またはエキソペプチダーゼ活性、化学的成分（脂質、リン酸などを含む）の結合が含まれる。例えば、一部の細胞株では、末端メチオニンを発現したポリペプチドから除くことができる。
【０１７６】
本明細書中に開示されるようなポリペプチドなどのポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーをはじめとする通常的な方法に従って、天然の供給源、形質転換された宿主細胞（培養培地または細胞）から回収することができる。低い濃度（約0.1ｍM〜5mM）のカルシウムイオンを精製時に存在させることは有用であり得る（Price他、J. Biol. Chem.、244：917 (1969)）。タンパク質リフォールディング工程を、成熟型タンパク質の立体配置を完成させる際には必要に応じて使用することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最後の精製工程のために用いることができる。本明細書中に開示されるようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、キメラGAPのコード配列のみを含むことができ；キメラGAPのコード配列およびさらなるコード配列（例えば、リーダーペプチド、分泌ペプチド、標的化ペプチド、酵素ペプチド、蛍光性ペプチドまたは他の診断用ペプチドをコードする配列）、キメラGAPのコード配列および非コード配列（例えば、3'末端または5'末端のいずれかにおける非翻訳配列）またはコード配列に分散された非翻訳配列（例えば、イントロン）を含むことができる。キメラGAPポリペプチドを中断することなくコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、そのヌクレオチド配列が、非コードヌクレオチドの中断または介在をコード配列に有することなく、例えば、イントロンを存在させることなく、キメラGAPポリペプチドに対するアミノ酸コード配列を含有することを意味する。そのようなヌクレオチド配列はまた、連続していると記載することができる。
【０１７７】
本明細書中に開示されるような核酸はまた、上記で記載されたように核酸に機能的に連結された発現制御配列を含むことができる。表現「発現制御配列」は、発現制御配列が機能的に連結されている核酸によってコードされたポリペプチドの発現を調節する核酸配列を意味する。発現はmRNAまたはポリペプチドのレベルで調節することができる。従って、発現制御配列には、mRNA関連エレメントおよびタンパク質関連エレメントが含まれる。そのようなエレメントには、プロモーター、エンハンサー（ウイルス性または細胞性）、リボゾーム結合配列、転写ターミネーターなどが含まれる。発現制御配列は、発現制御配列が、コード配列の発現を行うか、またはコード配列の発現を達成するような様式で配置されているとき、ヌクレオチドコード配列に機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の5'側に機能的に連結されているとき、プロモーターはコード配列の発現を行わせる。発現制御配列は正常な遺伝子に対して異種または内因性にすることができる。
【０１７８】
本明細書中に開示されるような核酸は、核酸ハイブリダイゼーションに基づいて選択することができる。2つの一本鎖核酸調製物が一緒にハイブリダイゼーションする能力は、それらのヌクレオチド配列相補性（例えば、ヌクレオチド間の塩基対形成、例えば、A-T、G-Cなど）の尺度である。
【０１７９】
1つの実施形態において、核酸またはポリペプチドは1つまたは複数の違いをヌクレオチド配列またはアミノ酸配列において含むことができる。ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列に対する変化または改変を、特異的変異誘発またはランダム変異誘発を含む任意の利用可能な方法によって達成することができる。キメラGAPポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然に存在する遺伝子、転写物またはcDNAに見出されるコドンを含有することができ、あるいは、同じアミノ酸配列をコードする縮重コドンを含有することができる。
【０１８０】
キメラGAP配列に対する改変体（例えば、変異化体）もまた、遺伝子データベース（例えば、GenBank、EMBL）からの相同性検索に基づいて調製することができる。配列相同性検索を、BLASTファミリーのコンピュータプログラムに記載されるアルゴリズム、Smith-Watermanアルゴリズムなどをはじめとする様々な方法を使用して達成することができる。
【０１８１】
本明細書中に開示されるような核酸は、例えば、DNA、RNA、合成核酸、ペプチド核酸、修飾ヌクレオチド、または混合体を含むことができる。DNAは二本鎖または一本鎖が可能である。核酸を構成するヌクレオチドは、所望する目的に依存して、例えば、ヌクレアーゼ（例えば、RNase Hなど）に対する抵抗性、改善されたインビボ安定性などに依存して、様々な知られている連結（例えば、エステル、スルファマート、スルファミド、ホスホロチオアート、ホスホルアミダート、メチルホスホナート、カルバマートなど）によって結合することができる。例えば、米国特許第5,378,825号を参照のこと。
【０１８２】
様々な改変を核酸に対して行うことができる（例えば、検出可能なマーカー（アビジン、ビオチン、放射性元素）、ハイブリダイゼーション、検出または安定性を改善する成分を結合することなど）。核酸はまた、所望の方法に従って、固体担体（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、アガロース、ジアゾ化セルロース、ラテックス固体マイクロスフェア、ポリアクリルアミドなど）に結合することができる。例えば、米国特許第5,470,967号、同第5,476,925号、同第5,478,893号を参照のこと。
【０１８３】
本明細書中に開示されるような核酸は、所望の方法に従って、様々な異なるシステムでインビトロおよびインビボにおいて発現させることができる。例えば、核酸を発現ベクターに挿入し、所望の宿主に導入し、核酸によってコードされるポリヌクレオチドの発現を達成するために効果的な条件のもとで培養することができる。効果的な条件には、効果的な温度、pH、培地、宿主細胞が培養される培地への添加物（例えば、発現を増幅または誘導する添加物、例えば、ブチラート、または、コード核酸がdhfr遺伝子に隣接する場合にはメトトレキサート）、シクロヘキサミド、細胞密度、培養ディッシュなどをはじめとする、宿主細胞によるポリペプチドの産生を達成するために好適である任意の培養条件が含まれる。核酸は、例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、注入、DEAEデキストラン媒介によるトランスフェクション、リポソームとの融合、およびウイルストランスフェクションをはじめとする任意の効果的な方法によって細胞に導入することができる。核酸が導入されている細胞は、形質転換された宿主細胞である。核酸は染色体外であり得るか、または、宿主細胞の染色体（1つまたは複数）に組み込まれ得る。核酸は安定的または一過性であり得る。発現ベクターは宿主細胞とのその適合性のために選択される。宿主細胞には、哺乳動物細胞（例えば、COS-7、CHO、HeLa、LTK、NIH 3T3、Rat 1繊維芽細胞）、酵母、昆虫細胞（例えば、Sf9（S. frugipeda）およびショウジョウバエなど）、細菌（例えば、大腸菌、ストレプトコッカス属細胞、枯草菌属細胞、酵母細胞、菌類細胞）、植物、胚性幹細胞（例えば、哺乳動物性、例えば、マウスまたはヒトなど）、ガン細胞または腫瘍細胞が含まれる。Sf9での発現を、Graziani他、Oncogene、7：229〜235（1992）に類似して達成することができる。様々な発現制御配列が、宿主適合性および所望の目的（例えば、高コピー数、大きい量、誘導、増幅、制御された発現）のために同様に選択される。用いることができる他の配列には、エンハンサー（例えば、SV40、CMVなどに由来するエンハンサー）、誘導可能なプロモーター、細胞タイプ特異的なエレメント、または、選択的もしくは特異的な細胞発現を可能にする配列が含まれる。
【０１８４】
キメラGAP核酸に加えて、目的とする別の遺伝子を、例えば、キメラGAPの発現を調節するために、キメラGAPの機能または目的とする遺伝子の機能を評価するために、同じ宿主に導入することができる。目的とする遺伝子には、他のガン遺伝子、細胞周期に関与する遺伝子などが含まれる。そのような遺伝子は、正常な遺伝子、または変化体（例えば、変異化体、キメラ体、多型など）であり得る。
【０１８５】
キメラGAPまたはその誘導体によるGTPase活性の調節は、様々な知られている手法（例えば、EvaおよびAaronson、Nature、316：273〜275（1985）；Hart他、J. Biol. Chem.、269：62〜65（1994））に従って測定することができる。化合物を、キメラGAPのGTPase活性に対するその影響を明らかにするために、その方法の期間中の任意の時間で加えることができる。様々な細胞株もまた使用することができる。
【０１８６】
GTPase媒介によるシグナル伝達についての他のアッセイを、例えば、米国特許第5,141,851号、同第5,420,334号、同第5,436,128号および同第5,482,954号に記載されるようなこの分野では知られている手法と同様の方法に従って達成することができる。加えて、キメラGAPとGタンパク質（例えば、RhoAなど）との間での相互作用（例えば、結合）を相互作用を阻害するペプチドを欧州特許第496162号に従って同定および調製することができる。
【０１８７】
様々なGAP分子が、GTPの加水分解およびGTP/GDPレベルの調節において役割を果たしている。本明細書中で使用される用語「GTP（の）加水分解」には、GDPまたは他の形態のグアニンの形成を生じさせるGTPの脱リン酸化が含まれる。GTPの加水分解は様々なGTPase（例えば、Rho-GTPase、ras-GTPase、rac-GTPase、およびrab-GTPase）によって媒介される。本明細書中で使用される用語「GTP/GDPレベルの調節」には、GTPおよびGDPのレベル（例えば、細胞内レベル）を調節することに、また、GTPおよびGDPのレベル（例えば、細胞内レベル）に影響を及ぼすことに関与する細胞機構が含まれる。そのような機構には、例えば、GTPaseによる、生物学的合図に応答したGDPへのGTPの加水分解（GTPの加水分解）が含まれる。GTP/GDPレベルの維持は、細胞のシグナル伝達要求のために特に重要である。従って、GAP分子は、GTPの加水分解およびGTP/GDPレベルの調節に関係することによって、GTPの加水分解およびGTP/GDPのレベルを調節することができ、かつ、GTP加水分解関連障害を抑制するための新規な診断標的および治療剤を提供することができる。
【０１８８】
本明細書中で使用される用語「GTP加水分解関連障害」には、異常な（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされた）GTP加水分解、ならびに／あるいは、異常な（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされた）GTPレベルおよび／またはGDPレベルによって特徴づけられる障害、疾患または状態が含まれる。そのような障害の例には、心臓血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化、虚血再灌流傷害、再狭窄、動脈の炎症、血管壁再構築、心室再構築、速い心室拍動速度、冠状動脈微小塞栓症、頻脈、徐脈、血圧過負荷、大動脈湾曲、冠状動脈結紮、血管性心臓疾患、心房細動、長QT症候群、うっ血性心不全、洞房結節機能不全、狭心症、心不全、高血圧、心房細動、心房粗動、拡張型心筋症、特発性心筋症、心筋梗塞、冠状動脈疾患、冠状動脈スパズムまたは不整脈が含まれ得る。
【０１８９】
GTP加水分解関連障害の他の例には、中枢神経系の障害、例えば、嚢胞性線維症、Ｉ型神経線維腫症、うっ血性傷害および神経変性障害（その例には、アルツハイマー病、アルツハイマー病に関連づけられる認知症（例えば、ピック病など）、パーキンソン病および他のびまん性レーヴィ小体疾患、老人性認知症、ハンチングトン病、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺、てんかんおよびヤコブ・クロイツフェルト病（これらに限定されない）が含まれる）など；自律神経機能障害、例えば、高血圧および睡眠障害など、ならびに神経精神医学的傷害、例えば、うつ病、統合失調症、分裂情動障害、コルサコフ精神病、躁病、不安障害または恐怖症障害など；学習障害または記憶障害、例えば、健忘症および加齢性記憶喪失、注意欠陥障害、気分変調性障害、大うつ病性障害、躁病、強迫性障害、精神活性物質服用障害、不安、恐怖症、パニック障害、ならびに双極性情動障害（例えば、重度の双極性情動（気分）障害（BP-1）および双極性情動性神経学的障害（例えば、片頭痛および肥満）が含まれる。さらなるCNS関連障害には、例えば、アメリカ精神医学会の精神障害の診断と統計の手引き（DSM）（その最新版はその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に示される障害が含まれる。
【０１９０】
GTP加水分解関連障害のさらに他の例には、細胞増殖、細胞成長、細胞分化または細胞遊走の障害が含まれる。細胞増殖、細胞成長、細胞分化または細胞遊走の障害には、細胞増殖、細胞成長、細胞分化または細胞遊走のプロセスに影響を及ぼすそのような障害が含まれる。本明細書中で使用される「細胞増殖、細胞成長、細胞分化または細胞遊走のプロセス」は、細胞が、数、サイズまたは含有量において増大するプロセス、細胞が、他の細胞の特殊化した一群の特徴とは異なる特殊化した一群の特徴を発達させるプロセス、あるいは、細胞が特定の位置もしくは刺激因子に対してより接近するか、または、特定の位置もしくは刺激因子からさらに遠ざかるプロセスである。そのような障害には、ガン、例えば、ガン腫、肉腫または白血病；腫瘍の血管形成および転移；骨格形成異常；肝臓障害；ならびに、造血障害および／または骨髄増殖性障害が含まれる。
【０１９１】
GTP加水分解関連障害のさらに他の例には、免疫系の障害、例えば、ヴィスコット・オールドリッチ症候群、ウイルス感染、自己免疫障害または免疫不全障害など、例えば、先天性X連鎖幼児低ガンマグロブリン血症、一過性の低ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全症、選択的IgA欠乏症、慢性粘膜皮膚カンジダ症、または重症複合免疫不全症が含まれる。GTP加水分解関連障害の他の例には、先天性の奇形（顔生殖器（facio-genital）異形成が含まれる）；および、皮膚障害（線状皮膚欠陥症候群を伴う小眼球症を含む）が含まれる。
【０１９２】
本明細書中に記載される核酸分子、タンパク質および誘導体は下記の方法の1つまたは複数において使用することができる：a)スクリーニングアッセイ；b)予測医療（例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、臨床試験のモニターリング、および薬理遺伝学）；およびc)処置方法（例えば、治療および予防）。本明細書中に記載されるように、キメラGAPタンパク質は下記活性の1つまたは複数を有する：(1)キメラGAPタンパク質は非GAPタンパク質分子（例えば、GTPaseまたはGAPリガンド）と相互作用する；(2)キメラGAPタンパク質はGAP依存性のシグナル伝達経路を調節した；(3)キメラGAPタンパク質はGTP/GDPレベルを調節する；かつ、(4)キメラGAPタンパク質はGTPaseのシグナル伝達機構を調節し、従って、例えば、(1)非GAPタンパク質分子（例えば、GTPase）との相互作用を調節するために、(2)GAP依存性のシグナル伝達経路を活性化するために、(3)GTP/GDPレベルを調節するために、かつ、(4)GTPaseのシグナル伝達機構を調節するために使用することができる。
【０１９３】
キメラGAPタンパク質または融合タンパク質をコードする単離された核酸分子は、下記においてさらに記載されるように、例えば、キメラGAPタンパク質を発現させるために、また、GAP活性を調節するために使用することができる。キメラGAPタンパク質は、GAPリガンドまたはGAP基質の不十分な産生または過度な産生、あるいは、GAP阻害剤の産生によって特徴づけられる障害を処置するために使用することができる。加えて、キメラGAPタンパク質は、天然に存在するGAPリガンドまたはGAP基質についてスクリーニングして、GAP活性を調節する薬物または化合物をスクリーニングするために、ならびに、GAPタンパク質の不十分な産生または過度な産生、あるいは、GAP野生型タンパク質と比較して、低下した活性、異常な活性または望ましくない活性を有する様々なGAPタンパク質形態の産生によって特徴づけられる障害（例えば、GTP加水分解関連障害、および／または、GTP/GDPのレベルに関連づけられる障害）を処置するために使用することができる。
【０１９４】
さらなる実施形態は、異常または望ましくないGAP発現またはGAP活性に伴う障害の危険性を有する対象（もしくはそのような障害に罹りやすい対象）、またはそのような障害を有する対象を処置する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。
【０１９５】
1つの局面において、1つの方法が、GAP発現または少なくとも1つのGAP活性を調節するキメラGAPまたは薬剤を対象に投与することによって、異常な、または望ましくないGAP発現またはGAP活性に伴う疾患または状態を対象において予防するために提供される。異常な、または望ましくないGAP発現またはGAP活性によって引き起こされるか、あるいは、異常な、または望ましくないGAP発現またはGAP活性が一因となっている疾患に対する危険性を有する対象を、例えば、本明細書中に記載されるような診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかによって、あるいは、本明細書中に記載されるような診断アッセイまたは予後アッセイの組合せによって同定することができる。予防剤の投与を、GAP異常に特徴的な症状が発現する前に行うことができ、その結果、疾患または障害が防止されるように、あるいは、その進行において遅延するようにすることができる。GAP異常のタイプに依存して、例えば、GAP剤、GAPアゴニスト剤またはGAPアンタゴニスト剤を、対象を処置するために使用することができる。適切な薬剤を、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。
【０１９６】
別の局面は、GAP発現またはGAP活性を治療目的のために調節する方法に関連する。従って、例示的な実施形態において、この調節方法では、細胞を、細胞に関連するGAPタンパク質活性の活性の1つまたは複数を調節するGAP化合物または活性な化合物と接触させることが伴う。GAPタンパク質活性を調節する活性な化合物は、本明細書中に記載されるような薬剤（例えば、核酸またはタンパク質、GAPタンパク質の天然に存在する標的分子（例えば、GAPリガンドまたはGAP基質）、GAPアゴニストまたはGAPアンタゴニスト、GAPアゴニストまたはGAPアンタゴニストのペプチドミメティクス、あるいは他の小分子）であり得る。1つの実施形態において、活性な化合物は1つまたは複数のGAP活性を刺激する。そのような刺激性の活性な化合物の例には、活性なGAPタンパク質、および、細胞内に導入されている、GAPをコードする核酸分子が含まれる。別の実施形態において、活性な化合物は1つまたは複数のGAP活性を阻害する。そのような阻害性の活性な化合物の例には、アンチセンスGAP核酸分子、抗GAP抗体およびGAP阻害剤が含まれる。これらの調節方法はインビトロで（例えば、活性な化合物とともに細胞を培養することによって）行うことができ、あるいは、インビボで（例えば、活性な化合物を対象に投与することによって）行うことができる。そのため、GAPタンパク質分子またはGAP核酸分子の異常な、または望ましくない発現または活性によって特徴づけられる疾患または障害（例えば、GTP加水分解関連障害など）に冒されている個体を処置する方法が提供される。1つの実施形態において、この方法では、活性な化合物（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される活性な化合物）、あるいは、GAP発現またはGAP活性を調節（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）する活性な化合物の組合せを投与することが伴う。別の実施形態において、この方法では、キメラなGAPタンパク質分子またはGAP核酸分子を、低下した、異常な、または望ましくないGAP発現またはGAP活性を補償するための治療剤として投与することが伴う。
【０１９７】
GAP活性を刺激することが、GAPが異常にダウンレギュレーションされている状況、および／または、増大したGAP活性が有益な効果を有すると考えられる状況では望ましい。同様に、GAP活性を阻害することが、GAPが異常にアップレギュレーションされている状況、および／または、低下したGAP活性が有益な効果を有すると考えられる状況では望ましい。
【０１９８】
本明細書中における実施では、別途示されない限り、当業者に広く知られている、合成有機化学、タンパク質化学、分子生物学、微生物学および組換えDNA技術の従来の技術が用いられる。そのような技術は文献に詳しく説明されている。
【０１９９】
好ましい実施形態において、キメラGAPペプチドは水溶性であり、すなわち、生理学的流体（好ましくは、生理学的pHにある生理学的流体、例えば、血液血漿）に可溶性である。
【０２００】
「に由来する」によって、本明細書中で使用される場合、血管関連タンパク質の配列と同一であるか、または実質的に同一であるアミノ酸配列を有することが意味される。「に実質的に同一」によって、保存的アミノ酸置換によってのみ異なるか、あるいは、ペプチドの生物学的活性を破壊しない位置に存在する非保存的アミノ酸置換、欠失または挿入によって異なるアミノ酸配列を有することが意味される。
【０２０１】
局所的な電荷分布（および全体的な正味荷電）および二次構造、ならびに、従って、生物学的活性が維持されるならば、異なるアミノ酸配列を有する数多くのペプチドアナログを設計することが可能である。そのようなペプチドアナログは一般には、生化学の当業者には広く知られている保存的アミノ酸置換（例えば、LeuをValの代わりに使用すること、または、ArgをLysの代わりに使用することなど）によって生来的なタンパク質配列とは異なる。
【０２０２】
ペプチドは、設計されると、例えば、そのペプチドをコードする組換えDNAを適切な宿主細胞において発現させることをはじめとする数多くの確立された手法のいずれかによって合成することができる。あるいは、このようなペプチドは、固相ペプチド合成の確立された手法によって作製することができる。簡単に記載すると、この手法では、成長中のペプチドの末端が不溶性の担体に連結されたまま、適切なアミノ酸を所望の配列のペプチドに順次組み立てることが伴う。通常、ペプチドのカルボキシル末端が、切断試薬により処理されたときにペプチドを遊離させることができるポリマーに連結される。そのように合成されたペプチドは、その後、患者への投与の後でのペプチドのモニターリングを可能にする試薬により標識される。
【０２０３】
本明細書中で使用される用語「実質的に対応する」は、ペプチドのアミノ酸配列がキメラGAPペプチドに対してアミノ酸配列において約70％の相同性を有することを意味する。
【０２０４】
用語「化学的誘導体」は、本明細書中に開示されるようなペプチドに由来する任意のペプチドで、ペプチドに存在するアミノ酸残基の1つまたは複数の機能的な側鎖基の反応によって1つまたは複数のアミノ酸が化学的に誘導体化されている任意のペプチドを包含することが意味される。従って、本明細書中で使用される「化学的誘導体」は、1つまたは複数の化学的工程によって本明細書中に特定されるペプチドに由来するペプチドである。誘導体化された分子の例には、フリーのアミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、チオウレタン型誘導体、トリフルオロアセチル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成している分子が含まれる。フリーのカルボキシル基を誘導体化して、塩、メチルエステルおよびエチルエステルまたは他のタイプのエステル、あるいはヒドラジドを形成させることができる。
【０２０５】
フリーのヒドロキシル基を誘導体化して、0-アシル誘導体または0-アルキル誘導体を形成させることができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化して、N-im-ベンジルヒスチジンを形成させることができる。また、化学的誘導体として、20個の標準的なアミノ酸の1つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するそのようなペプチドが含まれる。例えば、4-ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに使用することができ、5-ヒドロキシリシンをリシンの代わりに使用することができ、3-メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに使用することができ、ホモセリンをセリンの代わりに使用することができ、また、オルニチンをリシンの代わりに使用することができる。
【０２０６】
用語「フラグメント」は、本明細書中に記載される任意のペプチドのアミノ酸配列よりも短いアミノ酸配列を有する任意の対象ペプチドを示し、そのようなフラグメントは対象ペプチドとしてのGTPase調節特性を保持する。ペプチド同族体およびそのアナログを数多くの知られている技術によって合成することができる。例えば、ペプチドを、当業者には広く知られている固相合成技術または他のペプチド合成技術を使用して調製することができる。本発明のペプチドはまた、キメラGAPペプチドのより大きな部分からの化学的切断または酵素的切断によって調製することができる。
【０２０７】
加えて、ペプチドはまた、組換えDNA技術によって調製することができる。タンパク質を組み立てるために使用されるアミノ酸のほとんどについて、2つ以上のコードヌクレオチドトリプレット（コドン）により、特定のアミノ酸残基がコードされ得る。遺伝暗号のこの性質は縮重性として知られている。従って、数多くの異なるヌクレオチド配列により、特定の対象食用抑制因子ペプチドがコードされ得る。さらなる実施形態ではまた、ポリペプチドが酵素的または化学的に切断され得る対象ポリペプチドまたは対象キメラポリペプチドをコードする遺伝子、すなわち、ポリペプチドが酵素的または化学的に切断され得る対象ポリペプチドまたは対象キメラポリペプチドを発現することができる遺伝子を規定するデオキシリボ核酸（DNA）分子またはセグメントが意図される。
【０２０８】
対象ペプチドをコードするDNA分子を、化学的技術によって、例えば、Matteuccie他（Chem. Soc.、103：3185 (1981)）のホスホトリエステル法によって合成することができる。化学的なDNA合成技術を使用して、ペプチド配列における所望の改変を、生来的なアミノ酸配列をコードする塩基に対する置換を行うことによって行うことができる。上記DNA分子のリボ核酸等価体もまた使用することができる。
【０２０９】
対象ポリペプチドまたは対象キメラポリペプチドに対するコード配列を規定するDNA分子の複製および発現が可能であるベクターを構成する核酸分子もまた意図される。
【０２１０】
さらなる実施形態は、キメラタンパク質をコードするDNA分子を提供する。DNA構築物は一般に、キメラタンパク質をコードするDNA配列が下流側に、かつ、そのようなDNA配列との適正な読み枠で続く転写プロモーター配列と、転写ターミネーターとを含む。
【０２１１】
DNA組成物は、合成により調製されたゲノムDNAまたはcDNAに由来し得るか、あるいは、様々な組合せのハイブリッドであり得る。組換えでない場合には天然に存在しない配列を含む組換え核酸もまた提供される。単離されたDNA配列には、プライマー反応またはハイブリダイゼーション反応によって得られているか、あるいは、制限酵素などによる処理を受けている任意の配列が含まれる。新規なDNA配列、発現カセットおよび発現ベクターの一部としてのそのようなDNA配列、ならびに、細胞におけるそれらの存在が提供され、この場合、新規な配列は、天然の状態では一緒に存在しないドメインを含む。
【０２１２】
広範囲の様々な転写調節配列および翻訳調節配列を宿主の性質に依存して用いることができる。転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルは、調節シグナルが、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連するウイルス供給源（例えば、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなど）に由来し得る。あるいは、哺乳動物の発現産物（例えば、アクチン、コラーゲン、ミオシンなど）に由来するプロモーターを用いることができる。抑制または活性化を可能にする転写開始調節シグナルを選択することができ、その結果、遺伝子の発現を調製することができる。温度感受性であり、その結果、温度を変えることによって、発現を抑制または開始させることができる調節シグナル、あるいは、化学的調節を受けやすい調節シグナル（例えば、代謝産物）は注目される。
【０２１３】
広く知られているように、真核生物のmRNAの翻訳は、最初のメチオニンをコードするコドンから開始される。この理由のために、真核生物プロモーターと、所望のキメラタンパク質分子をコードするDNA配列との連結は、メチオニンをコードし得る何らかの介在するコドン（すなわち、AUG）を含有しないことを確実にすることが好ましい。そのようなコドンの存在は、異なる融合タンパク質の形成（AUGコドンが、所望のキメラタンパク質分子をコードするDNA配列と同じ読み枠で存在する場合）、または、フレームシフト変異（AUGコドンが、所望のキメラタンパク質分子をコードする配列と同じ読み枠でない場合）のいずれかを生じさせる。
【０２１４】
構成的または誘導的（この場合、誘導は特定の細胞タイプまたは特定レベルの成熟化に関連し得る）である広範囲の様々なプロモーターが文献に記載されている。あるいは、同様に使用することができる数多くのウイルスプロモーターが知られている。注目されるプロモーターには、β-アクチンプロモーター、SV40の初期プロモーターおよび後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、およびフレンド脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。プロモーターはエンハンサーを伴ってもよく、またはエンハンサーを伴わなくてもよく、この場合、エンハンサーには、天然の状態で特定のプロモーターが伴ってもよく、または、異なるプロモーターが伴ってもよい。
【０２１５】
オープンリーディングフレームの配列はゲノムDNAまたはcDNAから得ることができ、あるいは合成することができ、あるいはそれらの組合せを含むことができる。ゲノムDNAのサイズおよびイントロンの数に依存して、cDNAまたはその組合せを使用したいと思うことができる。多くの場合、イントロンはmRNAを安定化させることが見出されている。また、mRNAを安定化させる非コード領域が提供され得る。
【０２１６】
所望のキメラタンパク質分子をコードする配列および機能的に連結されたプロモーターを、線状分子、または、より好ましくは、閉じた共有結合性の環状分子のいずれかであり得る複製しないDNA（またはRNA）分子としてレシピエント細胞に導入することができる。そのような分子は自律的に複製することができないため、所望のキメラタンパク質分子の発現を、導入された配列の一過性発現によって行うことができる。あるいは、永続的な発現を、導入された配列の宿主ゲノム内への組み込みによって行うことができる。
【０２１７】
組換えDNA技術の標準的な技法を使用して、好適な宿主細胞を形質転換するためのベクターで、キメラGAP融合タンパク質のための構造遺伝子に対応するcDNA配列を含有するベクターを構築することができる。好適なベクターは、例えば、キメラGAPタンパク質をコードするcDNA配列に機能的に連結された制御配列および調節配列を含むプラスミドベクターである。
【０２１８】
キメラタンパク質分子をコードするDNA分子またはRNA分子を発現ベクターに機能的に連結し、宿主細胞に導入して、細胞によるキメラGAPタンパク質の発現を可能にすることができる。2つのDNA配列（例えば、プロモーター領域配列、および所望のキメラタンパク質分子をコードする配列など）は、これら2つのDNA配列の間での連結の性質により、(1)フレームシフト変異の導入がもたらされず、(2)所望のキメラタンパク質分子をコードする遺伝子配列の転写を行わせるプロモーター領域配列の能力が妨害されず、または、(3)所望のキメラタンパク質分子の遺伝子配列がプロモーター領域配列によって転写される能力が妨害されないならば、機能的に連結されていると言われる。
【０２１９】
キメラタンパク質分子をコードするDNA配列を、連結のための平滑末端化または食い違い末端化された末端、適切な末端を提供するための消化、適するような付着末端の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および、適切なリガーゼによる連結をはじめとする従来の技術に従ってベクターDNAと組み換えることができる。
【０２２０】
これらの細胞のための発現ベクターは、様々な発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、および必要なプロセシング情報部位（例えば、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列など）などを含むことができる。好ましくは、エンハンサーまたはプロモーターは、目的とする宿主細胞において効果的であることが以前に示されたものである。だが、多くの場合、他のエンハンサーまたはプロモーターが同等またはより適切であることが理解される。
【０２２１】
本明細書中における使用のための哺乳動物発現ベクターは、クローン化された遺伝子またはcDNAの転写を行わせることができるプロモーターを含む。好ましいプロモーターには、ウイルスプロモーターおよび細胞プロモーターが含まれる。好ましいウイルスプロモーターには、アデノウイルス2に由来する主要後期プロモーター（KaufmanおよびSharp、Mol. Cell. Biol.、2：1304〜13199、1982）およびSV40プロモーター（Subramani他、Mol. Cell. Biol.、1：854〜864、1981）が含まれる。好ましい細胞プロモーターには、マウスメタロチオネイン1プロモーター（Palmiter他、Science、222：809〜814、1983）およびマウスVκプロモーター（Grant他、Nuc. Acids Res.、15：5496、1987）が含まれる。特に好ましいプロモーターはマウスVHプロモーター（Loh他、同上）である。そのような発現ベクターはまた、プロモーターの下流側と、目的とするペプチドまたはタンパク質をコードするDNA配列の上流側とに配置された1組のRNAスプライス部位を含有することができる。好ましいRNAスプライス部位をアデノウイルスおよび／または免疫グロブリンの遺伝子から得ることができる。また、発現ベクターには、目的とするコード配列の下流側に配置されたポリアデニル化シグナルが含有される。ポリアデニル化シグナルには、SV40に由来する初期ポリアデニル化シグナルまたは後期ポリアデニル化シグナル（KaufmanおよびSharp、同上）、アデノウイルス5のEIB領域に由来するポリアデニル化シグナル、およびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（DeNoto他、Nuc. Acids Res.、9：3719〜3730、1981）が含まれる。特に好ましいポリアデニル化シグナルはVH遺伝子ターミネーター（Loh他、同上）である。発現ベクターは、プロモーターと、RNAスプライス部位との間に配置されたコードしないウイルスリーダー配列（例えば、アデノウイルス2の三成分リーダーなど）を含むことができる。好ましいベクターはまた、エンハンサー配列（例えば、SV40エンハンサーおよびマウスエンハンサー（Gillies、Cell 33：717〜728、1983）など）を含むことができる。発現ベクターはまた、アデノウイルスVAのRNAをコードする配列を含むことができる。
【０２２２】
一般に、組換え宿主細胞との適合性を有する、複製配列および制御配列を含有するプラスミドベクターが、DNA分子のためのクローニングベクターとして使用される。キメラタンパク質をコードするDNA配列を好適な真核生物発現ベクターに挿入することができ、この真核生物発現ベクターは次いで、真核生物細胞をトランスフェクションするために使用される。真核生物発現ベクターは、本明細書中で使用される場合、目的のキメラタンパク質をコードするDNA配列の転写および翻訳を行わせるエレメントを含有するDNA構築物を示すことが意味される。そのようなエレメントには、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルが含まれる。DNA構築物内で機能的に連結されたこれらのエレメントを含むことによって、得られる真核生物発現ベクターは、目的とするポリペプチドの発現のために必要な情報を含有する。
【０２２３】
哺乳動物宿主については、いくつかの可能なベクターシステムを所望のキメラタンパク質分子の発現のために利用することができる。1つのクラスのベクターでは、動物ウイルス（例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスまたはSV40ウイルスなど）に由来する自律的に複製する染色体外プラスミドを提供するDNAエレメントが利用される。別のクラスのベクターは、所望の遺伝子配列の宿主染色体内への組み込みに依拠する。導入されたDNAがその染色体内に安定に組み込まれている細胞を、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする1つまたは複数のマーカーをもまた導入することによって選択することができる。選択マーカー遺伝子は、発現されるDNA配列に対して直接に連結することができ、あるいは、同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入することができる。さらなるエレメントがまた、mRNAの最適な合成のために必要とされることがある。このようなエレメントには、スプライスシグナル、ならびに、転写プロモーター、エンハンサーおよび終結シグナルが含まれ得る。
【０２２４】
レトロウイルスベクターは、RhoGAPキメラ体の送達のために特に有用であることが明らかにされている。レトロウイルスに基づく遺伝子移入法の他の場合と同様に、宿主細胞における導入されたRhoGAP-Rhoキメラ体のコピー数がその適用効率のために重要であると考えられる。p190-RhoC-Cは、低コピー数ベクターMIEG3と一緒に発現させられたとき、RhoCの生化学的活性および遊走表現型をダウンレギュレーションすることにおいて効果的であったが、本発明者らは、MIEG3を伴うp190-RhoA-Cまたはp190-RhoB-Cの発現が、RhoA-F30LまたはRhoB-F30Lの生化学的活性または形質転換活性をダウンレギュレーションするために十分でないことを見出している。しかしながら、高コピー数のレトロウイルスベクターSF91-EMCV-IRES-GFP（これは遺伝子治療試験のために使用中である）を伴うp190-RhoA-Cの発現は、同じベクターを使用することにより発現したp190-RhoB-C、p190-RhoC-Cまたはp190単独が、RhoA-F30L活性にも、また、RhoA-F30L誘導による形質転換にも影響を及ぼさなかった条件のもとで、F30LRhoAの生化学的活性およびRhoA-F30L誘導による形質転換の両方を特異的に低下させることができる。これらの結果は、この方法を将来の動物試験およびヒト試験に適用するときの有効性および特異性における用量依存性の重要性を強調している。
【０２２５】
そのような発現ベクターはまた、プロモーターの下流側と、目的とするポリペプチドまたはタンパク質をコードするDNA配列の上流側と配置された1組のRNAスプライス部位を含有することができる。好ましいRNAスプライス部位をアデノウイルスおよび／または免疫グロブリンの遺伝子から得ることができる。また、発現ベクターには、目的とするコード配列の下流側に配置されたポリアデニル化シグナルが含有される。
【０２２６】
ポリアデニル化シグナルには、SV40に由来する初期ポリアデニル化シグナルまたは後期ポリアデニル化シグナル（KaufmanおよびSharp、同上）、アデノウイルス5のE1B領域に由来するポリアデニル化シグナル、およびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（DeNoto他、Nuc. Acids Res.、9：3719〜3730、1981）が含まれる。発現ベクターは、プロモーターと、RNAスプライス部位との間に配置されたコードしないウイルスリーダー配列（例えば、アデノウイルス2の三成分リーダーなど）を含むことができる。ベクターはまた、エンハンサー配列（例えば、SV40エンハンサーおよびマウスエンハンサー（Gillies、Cell 33：717〜728、1983）など）を含むことができる。発現ベクターはまた、アデノウイルスVAのRNAをコードする配列を含むことができる。
【０２２７】
構築物を含有するベクターまたはDNA配列が発現のために調製されると、DNA構築物を適切な宿主に導入することができる。様々な技術を用いることができ、例えば、リン酸カルシウム沈殿DNA形質転換、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、バイオリスティク（biolistic）、DNA被覆粒子を使用すること、トランスフェクションおよび感染などを用いることができ、この場合、キメラ構築物が適切なウイルス（特に、ウイルスの非複製形態）などに導入される。融合後、細胞を培地において成長させ、細胞が適切な活性についてスクリーニングされる。配列の発現により、キメラGAPタンパク質の産生がもたらされる。
【０２２８】
クローン化されたDNAが組み込まれている細胞を同定するために、選択マーカーが、一般には、目的とする遺伝子またはcDNAと一緒に細胞に導入される。培養された哺乳動物細胞において使用される好ましい選択マーカーには、薬物（例えば、ネオマイシン、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートなど）に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。選択マーカーは増幅可能な選択マーカーであってもよい。好ましい増幅可能な選択マーカーはDHFR遺伝子である。特に好ましい増幅可能なマーカーはDHFRr cDNA（SimonsenおよびLevinson、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80：2495〜2499、1983）である。様々な選択マーカーがThilly（Mammalian Cell Technology、Butterworth Publishers、Stoneham、Mass.）によって総説されており、選択マーカーの選択は十分に当業者の範囲内である。
【０２２９】
選択マーカーは、目的とする遺伝子と同時に別個のプラスミドで細胞に導入することができ、または、同じプラスミドで導入することができる。同じプラスミドでの場合、選択マーカーおよび目的とする遺伝子を異なるプロモーターまたは同じプロモーターの制御下に置くことができ、後者の配置では、二シストロン性メッセージが産生される。このタイプの構築物がこの分野では知られている（例えば、LevinsonおよびSimonsen、米国特許第4,713,339号を参照のこと）。「キャリアDNA」として知られているさらなるDNAを、細胞に導入される混合物に加えることもまた好都合であり得る。
【０２３０】
1つの実施形態において、所望の遺伝子配列を宿主細胞の染色体に組み込むことができるベクターが用いられる。導入されたDNAがその染色体に安定に組み込まれている細胞を、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする1つまたは複数のマーカーを同様に導入することによって選択することができる。マーカーは、宿主における栄養要求性、殺生物剤抵抗性（例えば、抗生物質）または重金属（例えば、銅）などを補完することができる。選択マーカー遺伝子は、発現されるDNA遺伝子配列に対して直接に連結することができ、あるいは、同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入することができる。
【０２３１】
好ましい実施形態において、導入された配列は、レシピエント宿主において自律的に複製することができるプラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれる。広範囲の様々なベクターのいずれかをこの目的のために用いることができる。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択することにおける重要な要因には、ベクターを含有するレシピエント細胞が認識され、かつ、ベクターを含有しないそのようなレシピエント細胞から選択され得る容易さ；特定の宿主において所望されるベクターのコピー体の数；および、ベクターを異なる種の宿主細胞の間で「移し替える」ことができることが望ましいかどうかが含まれる。
【０２３２】
形質転換された宿主が、キメラタンパク質を、所望の調節に従って、また、所望のレベルで細胞質タンパク質または細胞表面タンパク質として発現することができることが明らかにされると、その後、そのタンパク質は、所望のシグナル誘導を提供するために宿主において機能的であるかどうかを決定することができる。特定の細胞質ドメインのシグナル誘導の効果は知られているため、誘導を明らかにするための確立された方法論を、キメラタンパク質の機能的能力を確認するために使用することができる。当然のことではあるが、補助的なシグナルが、特定の細胞湿ドメインと一緒に他のタンパク質から要求されないことを知ることは重要であり、その結果、シグナルの伝達を提供することができないことは、キメラタンパク質が特定の標的宿主において使用できないことに単に起因すると考えられ得る。
【０２３３】
細胞がインビトロでトランスフェクションされるならば、トランスフェクションされた哺乳動物細胞は、目的とするDNA配列（1つまたは複数）の発現を開始させるために一定の期間（典型的には1日間〜2日間）にわたって成長させられる。その後、薬物選択が、選択マーカーを好適な様式で発現している細胞の成長について選択するために適用される。増幅可能な選択マーカーによりトランスフェクションされている細胞については、薬物濃度を、クローン化された配列の増大したコピー数について選択するために段階的な様式で増大させることができ、それにより、発現レベルを増大させることができる。
【０２３４】
DNA構築物を含有する宿主細胞は適切な成長培地において成長させられる。本明細書中で使用される用語「適切な成長培地」は、細胞の成長のために要求される栄養分を含有する培地を意味する。細胞成長のために要求される栄養分には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび増殖因子が含まれ得る。成長培地は、一般には、例えば、薬物選択によって、あるいは、細胞がDNA構築物における選択マーカーにより相補されるか、または、DNA構築物と同時トランスフェクションされた選択マーカーにより相補される必須栄養分の欠乏によって、DNA構築物を含有する細胞について選択する。培地のpHは、好ましくは、約2よりも大きく、約8よりも小さいpHで維持される（これには、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5および7.8のpH（これらに限定されない）が含まれる）。安定なpHを維持するための方法には、緩衝化および一定pHの制御（好ましくは、水酸化ナトリウムの添加による一定pHの制御）が含まれる。好ましい緩衝化剤には、コハク酸およびBis-Tris（Sigma Chemical Co.、St. Louis、Mo.）が含まれる。培養されている哺乳動物細胞は一般には、市販の血清含有培地または血清非含有培地で成長する。使用された特定の細胞株について適切な培地の選択は当業者のレベルの範囲内である。
【０２３５】
本明細書中に開示されるペプチドはどれも、医薬的に許容され得る塩の形態で使用することができる。ペプチドとの塩を形成することができる好適な酸には、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸など；および有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、ケイ皮酸、ナフタレンスルホン酸またはスルファニル酸などが含まれる。
【０２３６】
対象ペプチドとの塩を形成することができる好適な塩基には、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウムおよび水酸化カリウムなど；ならびに、有機塩基、例えば、モノアルキルアミン、ジアルキルアミンおよびトリアルキルアミン（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミンおよびジメチルアミンなど）、および、場合により置換されたエタノールアミン（例えば、エタノールアミンおよびジエタノールアミンなど）などが含まれる。
【０２３７】
治療効果的な量または用量、キメラGAPペプチド、その誘導体またはフラグメントの効果的なGTPase調節量またはGTPase調節用量を決定する際には、数多くの要因が担当診断医によって検討され、そのような要因には、哺乳動物の種；そのサイズ、年齢および全身の健康状態；個々の患者の応答；投与される特定の化合物；投与様式；投与された調製物の生体利用能特性；選択された服薬法；同時投薬の使用；および他の関連する状況（これらに限定されない）が含まれる。
【０２３８】
キメラGAPタンパク質を医薬的組成物に配合し、対象にインビボで投与することができる。キメラGAPタンパク質の使用は、例えば、(i)GAPタンパク質をコードする遺伝子の異常な改変または変異；(ii)GAP遺伝子の誤った調節；および(iii)GAPタンパク質の異常な翻訳後修飾によって引き起こされる障害を処置するために治療的に有用であり得る。
【０２３９】
キメラGAP核酸分子およびキメラGAPタンパク質（これらはまた、本明細書中では「活性な化合物」と呼ばれる）を投与のために好適な医薬組成物に配合することができる。そのような組成物は典型的には、核酸分子、タンパク質または他の活性な薬剤と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む。本明細書中で使用される表現「医薬的に許容され得るキャリア」は、薬学的投与と適合し得るありとあらゆる溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張性薬剤および吸収遅延剤などを包含することが意図される。医薬的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用はこの分野では広く知られている。任意の従来の媒体または薬剤が活性な化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性な化合物もまた組成物に配合することができる。
【０２４０】
本明細書中で定義されるように、タンパク質またはポリペプチドの治療効果的な量（すなわち、効果的な投薬量）は約0.001mg/kg体重〜30mg/kg体重の範囲であり、好ましくは約0.01mg/kg体重〜25mg/kg体重の範囲であり、より好ましくは約0.1mg/kg体重〜20mg/kg体重の範囲であり、さらにより好ましくは、約1mg/kg体重〜10mg/kg体重、2mg/kg体重〜9mg/kg体重、3mg/kg体重〜8mg/kg体重、4mg/kg体重〜7mg/kg体重、または5mg/kg体重〜6mg/kg体重の範囲である。当業者は、疾患または障害の重篤度、以前の処置、対象の全身の健康状態および／または年齢、ならびに、存在する他の疾患（これらに限定されない）をはじめとするいくつかの要因が、対象を効果的に処置するために要求される投薬量に影響し得ることを理解する。そのうえ、治療効果的な量のタンパク質、ポリペプチドまたは誘導体を用いた対象の処置は単回の処置を含むことができ、または、好ましくは、一連の処置を含むことができる。
【０２４１】
本明細書中に開示される核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第5,328,470号を参照のこと）、または定位固定注入（例えば、Chen他（1994）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：3054〜3057を参照のこと）によって対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は遺伝子治療ベクターを受容され得る希釈剤に含むことができ、または、遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子治療ベクターが組換え細胞から無傷で産生される場合（例えば、レトロウイルスベクター）、医薬調製物は、遺伝子送達システムをもたらす1つまたは複数の細胞を含むことができる。
【０２４２】
しかしながら、本発明は、最終使用適用におけるその有効性を説明するための何らかの特定の理論または提案された機構によって限定されないされないことが理解される。
【０２４３】
患者の処置を行う際に、キメラGAPペプチド、その誘導体、アナログ、同族体、フラグメントおよび混合物を、経口経路および非経口経路を含めて、化合物を効果的な量で生体利用可能にする任意の形態または様式で投与することができる。例えば、化合物を、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経皮投与、鼻腔内投与、直腸投与などによって投与することができる。経口投与が一般には好まれる。配合物を調製する分野の当業者は、関連する状況に依存して、適正な投与形態および投与様式を容易に選択することができる。
【０２４４】
キメラGAPペプチド、その誘導体、アナログ、同族体、フラグメントおよび混合物は、キメラGAPペプチド、その誘導体、アナログ、同族体、フラグメントおよび混合物を医薬的に許容され得るキャリアまたは賦形剤と組み合わせることによって作製される医薬組成物または医薬品の形態で投与することができ、その割合および性質は、選ばれた投与経路、および標準的な薬学的実務によって決定される。
【０２４５】
医薬組成物または医薬品は、製薬分野では広く知られている様式で調製される。キャリアまたは賦形剤は、有効成分に対するビヒクルまたは媒体として役立ち得る固体、半固体または液体の物質であり得る。好適な様々なキャリアまたは賦形剤がこの分野では広く知られている。医薬組成物は、経口使用または非経口使用のために適合化することができ、また、錠剤、カプセル、坐薬、溶液剤または懸濁物などの形態で患者に投与することができる。
【０２４６】
医薬組成物は、例えば、不活性な希釈剤とともに、または、食用ビヒクルとともに経口投与することができる。医薬組成物はゼラチンカプセルに入れることができ、または、錠剤に圧縮成形することができる。経口治療投与のために、キメラGAPペプチド、その誘導体またはフラグメントを賦形剤とともに配合し、錠剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁物、シロップ、オブラート剤および咀嚼ガム剤などの形態で使用することができる。これらの調製物は、有効成分として、少なくとも4％のキメラGAPペプチド、その誘導体またはフラグメントを含有しなければならず、しかし、特定の形態に依存して変化させることができ、また、好都合には、ユニット物の重量の4％〜約70％の間であり得る。組成物に存在する有効成分の量は、投与のために好適な単位投薬形態物が得られるようにされる。
【０２４７】
錠剤、ピル、カプセルおよびトローチ剤などはまた、1つまたは複数の下記の佐剤を含有することができる：結合剤、例えば、微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなど；賦形剤、例えば、デンプンまたはラクトースなど、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Primogelおよびトウモロコシデンプンなど；滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはSterotexなど；流動促進剤（glidant）、例えば、コロイド状二酸化ケイ素など；および甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリンなど、あるいは、風味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料など。投薬単位形態物がカプセルであるとき、カプセルは、上記タイプの物質に加えて、液体キャリア、例えば、プロピレングリコールまたは脂肪油などを含有することができる。他の投薬単位形態物は、例えば、被覆として、投薬単位物の物理的形態を改変する他の様々な物質を含有することができる。従って、錠剤またはピルは、糖、シェラックまたは他の腸溶性被覆剤で被覆することができる。シロップは、有効成分に加えて、甘味剤としてのスクロース、および、ある種の保存剤、色素および着色剤、ならびに香料を含有することができる。これらの様々な組成物を調製する際に使用される物質は、使用される量で製薬的に純粋かつ非毒性でなければならない。
【０２４８】
非経口投与のために、キメラGAPペプチド、その誘導体、アナログ、同族体、フラグメントまたは混合物を溶液または懸濁物に配合することができる。これらの調製物は、少なくとも0.1％の本明細書中に開示される化合物を含有しなければならず、しかし、その重量の0.1％〜約50％の間であるように変化させることができる。そのような組成物に存在する有効成分の量は、好適な投薬量が得られるようにされる。
【０２４９】
静脈内投与されるとき、ペプチド組成物は他の成分（例えば、キャリアおよび／または佐剤など）と組み合わせることができる。ペプチドはまた、ペプチドの排除を最小限に抑えるように、タンパク質キャリア（例えば、アルブミンなど）に共有結合的に結合することができる。医薬的に許容可能であり、その意図された投与のために有効でなければならず、かつ、組成物の有効成分の活性を低下させることができないことを除いて、そのような他の成分の性質には制限がない。ペプチド組成物はまた、好ましくは液体または半液体の形態で、経皮パッチに含浸させることができ、または、皮下挿入物に含有させることができ、この場合、パッチまたは挿入物により、対象ペプチドの1つまたは複数の治療効果的な量が時間放出される。
【０２５０】
注射のために好適な薬学的形態には、無菌の注射可能な溶液または分散物を直ちに調製するための無菌の水溶液または水性分散物および無菌の粉末が含まれる。すべての場合において、最終的な溶液形態は無菌かつ流体でなければならない。典型的なキャリアには、例えば、水、緩衝化された水溶液（すなわち、生体適合性の緩衝液）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、それらの好適な混合物など）、界面活性剤または植物油を含有する溶媒または分散媒体が含まれる。無菌化は、ろ過、抗菌剤または抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸またはチメロサール）の添加（これらに限定されない）をはじめとするこの分野では認められている任意の技術によって達成することができる。さらに、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウムなど）を対象組成物に配合することができる。
【０２５１】
対象ペプチドを含有する無菌の注射用溶液の製造が、要求に応じて、上記で列挙された様々な成分とともに、これらの成分を、要求される量で、適切な溶媒に配合し、その後、無菌化（好ましくは、フィルター滅菌）することによって達成することができる。無菌の粉末を得るために、上記の溶液が、必要に応じて、真空乾燥または凍結乾燥される。
【０２５２】
溶液または懸濁物はまた、キメラGAPペプチド、その誘導体またはフラグメントの溶解性および他の性質に依存して、下記佐剤の1つまたは複数を含むことができる：無菌の希釈剤、例えば、注射用水、生理的食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒など；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなど；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸など；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩など、ならびに、毒性調節のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）。
【０２５３】
非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックから作製されたアンプル、使い捨てシリンジまたは多回投薬バイアルに入れることができる。
【０２５４】
薬理学的組成物は、好ましくは、キメラGAPペプチドまたはその誘導体もしくはフラグメントを医薬的に許容され得るキャリア、充填剤または賦形剤と一緒に含む。投与工程では、キメラGAPペプチド、その誘導体またはフラグメントを医薬的に許容され得るキャリア、充填剤または賦形剤と一緒に含む薬理学的組成物を投与することを含むことができる。
【０２５５】
方法は、前記哺乳動物へのGTPase調節組成物またはその医薬的に許容され得る塩もしくは誘導体の経口投与による方法であり得る。方法はまた、約1mg〜約1000mgの単位用量で投与されるキメラ分子の投与を可能にする。単位用量が一般には、1日あたり約1回から約3回で投与される。
【０２５６】
投与工程では、前記哺乳動物へのキメラ化合物またはその医薬的に許容され得る塩もしくは誘導体の非経口投与を含むことができる。この投与は、経皮投与、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、クモ膜下注射、脳室内注射および注入技術により行われ得る。
【０２５７】
方法ではまた、キメラ化合物またはその医薬的に許容され得る塩もしくは誘導体を親油性化合物（例えば、親油性の溶媒またはキャリアなど）と一緒に投与することを含む。親油性の溶媒またはキャリアは、有機溶媒、ホスファチジルコリンおよびコレステロールであり得る。
【０２５８】
医薬組成物は、投薬単位物で、また、医薬用の賦形剤またはビヒクルとの混合で、経口投与、舌下投与、皮下投与、静脈内投与、経皮投与または直腸投与のために配合することができる。従来の投薬形態物には、経口投与用の形態物の中では、錠剤、粉末剤、顆粒剤が含まれ、また、非経口投与用の形態物の中では、特に、経皮投与、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、クモ膜下注射、脳室内注射および注入技術のための溶液が含まれる。
【０２５９】
投薬量は、患者の年齢、体重および健康状態、病気の性質および重篤度、ならびに、投与経路の関数として広範囲に変化させることができる。これらの用量は、当然のことではあるが、観測された結果および以前に行われた血液分析に従って各患者について調節することができる。
【０２６０】
様々な方法および組成物が下記の米国仮特許出願（これらはその全体が参考として組み込まれる）に開示される：第60/527,589号（幹細胞生着を高める方法）（2003年12月5日出願）、第60/494,718号（造血細胞の可動化）（2003年8月13日出願）、および第60/523,599号（GTPase阻害剤および使用方法）（2003年11月20日出願）。
【実施例】
【０２６１】
次に、キメラポリペプチドまたは融合ポリペプチドの様々な実施形態が下記の実施例を参照して記載される。提供される方法は、変法または代わりの方法が示されない限り、実施例のすべてにおいて使用される。
（実施例１）
【０２６２】
細胞の形質転換および遊走におけるRhoA、RhoBおよびRhoCの異なる役割
これら３つの近縁Rhoタンパク質（RhoA、RhoBおよびRhoC）の中で、RhoAが、最も良く特長づけされたタンパク質であり、アクチンストレスファイバーおよび限局性（focal）複合体の形成を調節すること、細胞成長を促進させること、そして、NIH 3T3繊維芽細胞を形質転換することが示されている。それに反して、繊維芽細胞におけるRhoBまたはRhoCの機能は詳細には調べられておらず、また、RhoAの役割と直接的には比較されていない。RhoA、RhoBおよびRhoCの細胞性役割の比較を行うために、2組の活性化変異体をこれらのRhoタンパク質のそれぞれについて作製した（速く循環するRho-F30L、および、GTPase欠損のRho-Q63L）。両タイプの変異体は、関与する異なる機能を含んでいたが、細胞における活性なRho-GTP化学種の正味の増強をもたらしている：Rho-F30Lタンパク質は、著しく増大した固有的なGDP/GTP交換活性を含有し、RhoGAP刺激に対する応答を保持して、GDP結合型の状態と、GTP結合型の状態との間を循環した。一方、Rho-Q63L変異体は、結合しているGTPを加水分解することができず、GTP結合型の活性な立体配座に固定されていた。これらの変異体をNIH 3T3細胞に導入し、変異体を発現する安定なクローンを作製した。ウエスタンブロットでは、3つすべてのRho GTPaseの2つの変異体形態が細胞において十分に発現していることが示された。
【０２６３】
蛍光標識されたファロイジンまたは抗ビンキュリン抗体で細胞を染色することにより、血清非含有状態のもとでは、RhoBおよびRhoCの両方の活性な形態がアクチンストレスファイバーおよびフォーカルアドヒージョンプラークの形成を刺激した。これは、活性なRhoA変異体によって、または、10％CSの刺激によって誘導される作用と類似する作用である。これら3つのRhoタンパク質のアミノ酸配列は全体で85％を超える同一性を有しており、また、スイッチＩエフェクタードメインにおいてはほぼ100％の同一性を有するため、それらは、アクチンの構造的変化およびフォーカルアドヒージョンアセンブリーを媒介するために同じセットのエフェクター標的を利用している可能性がある。
【０２６４】
RhoBはRas媒介の発ガン性形質転換に関与することが示唆されているが、RhoAが、形質転換活性を有することが示されている、これら3つの中では唯一のものである。RhoA、RhoBおよびRhoCの変異体の形質転換能力がフォーカス形成アッセイで直接的に比較されたとき、RhoBは、RhoB-F30L形態およびRhoB-Q63L形態の両方において、RhoAに類似する強力な形質転換活性を示した。対照的に、RhoCの活性な形態はいずれも細胞を形質転換することができなかった。RhoAは、細胞体の収縮による繊維芽細胞の細胞運動に関与することが以前に示されていた。RhoA、RhoBまたはRhoCの活性な変異体を発現する細胞の遊走速度が創傷治癒アッセイで比較されたとき、RhoAまたはRhoBではなく、RhoCが、創傷部の端から創傷部の中央における空き空間への細胞の遊走を著しく増大させることができた。これらの結果は、個々のRhoタンパク質が、腫瘍形成に関連づけられる2つの局面（すなわち、形質転換および遊走）において特有の機能を有することを示している。特に、RhoAは細胞の成長制御および形質転換のために重要であり、一方、RhoCは、細胞運動を媒介することにおいて重要な役割を果たしているかもしれない。RhoBは、過剰発現の状態のもとで細胞を形質転換することができるが、DNA損傷シグナルに対するセンサーとして役立つことができ、遺伝子的証拠に基づいて細胞のアポトーシス応答を媒介することができる。これらRhoタンパク質の機能的な違いは、それらのC末端の超可変領域（それらの異なる細胞内分布に関与することが知られている区域）における配列の相違に起因すると考えられ得る。
【０２６５】
これらのRho変異体を下記のような部位特異的変異誘発を使用して作製した：ヒトRhoA、ヒトRhoBおよびヒトRhoCの部位特異的変異体を、発表されたプロトコル（Li他、1997、J. Biol. Chem.、272、32830〜5、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に従って、所望の変異を含有するプライマーとともにPfuポリメラーゼを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって作製した。変異cDNAを哺乳動物発現ベクターpCEFL-GSTのBamHI部位およびEcoRI部位にサブクローン化し、変異体をグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）融合体として発現させた（Vanni他、2002、J. Biol. Chem.、277、19745〜19753、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。変異誘発されたDNA挿入物の配列を自動化された配列決定によって確認した。使用されたすべての点変異が一文字アミノ酸表記によって記載される。
【０２６６】
細胞の培養および形質転換。NIH 3T3細胞を、10％の子ウシ血清（CS）が補充されたDMEMにおいて、5％CO2のインキュベーターで、37℃で培養した。Cos-7細胞およびレトロウイルスパッケージングPhoenix細胞を、10％のウシ胎児血清（FBS）が補充されたDMEMにおいて培養した。A375腫瘍細胞株およびHME腫瘍細胞株を記載のように維持した（8；8；9）。安定なトランスフェクタントを作製するために、NIH 3T3細胞を、10％のCSが補充されたDMEM培地において1.5x105細胞の密度で6ウエルプレートに播種した。翌日、これらの細胞を、LipofectAMINE Plus（Life Technologies）を製造者の説明書に従って使用してpCEFL-GST-Rho構築物によりトランスフェクションした。安定なトランスフェクタントの選択を、0.35mg/mLのG418を培養培地にトランスフェクション後48時間で加えることによって行った。選択培地における約2週間の培養の後、生存している細胞クローンを抗GST免疫ブロッティングによってGST融合タンパク質の発現について調べた。
【０２６７】
形質転換アッセイ。変異Rhoタンパク質を発現する細胞または腫瘍細胞の足場非依存的成長の測定を記載のように行った（38、39）。簡単に記載すると、2x104個の細胞を、増殖因子および0.3％のアガロースを含む10％FBS補充のハムF-12完全培地に懸濁し、固化させた0.6％アガロースの上部に置床した。細胞には、1mLの培地を加えることによって毎週、培地が与えられた。置床後3週間目に、直径が50μmよりも大きく成長したコロニーを顕微鏡下で記録した。細胞形質転換活性を測定するために、様々なRho構築物によりトランスフェクションされた5x103個の細胞を4x104個の野生型NIH 3T3細胞と混合し、10％のCSが補充されたDMEMを含有する培地に100mmディッシュにおいて置床した。細胞には1日置きに培地が与えられ、認められるフォーカスを置床後14日目に記録した。
【０２６８】
創傷治癒アッセイおよび遊走アッセイ。創傷治癒アッセイのために、細胞を、2x106個／ディッシュの密度で、直径が60mmのディッシュに置床した。細胞がコンフルエンシーに達した後、プラスチック製ピペットチップでプレートの中心をまたいで線を引き、清浄な1mm幅の創傷区域を作製した。0.5％のCSが補充されたDMEMにおいて12時間の培養を行った後、創傷区域内への細胞の動きを、位相差顕微鏡を使用して、異なる時点で調べた。遊走している細胞の先端と、創傷部の端との間の距離を比較した（Guo他、J. Biol. Chem.、2003、印刷中）。
【０２６９】
細胞遊走はまた、6.5mmのポリカーボネートメンブラン（8.0μmの細孔サイズ、Costar Corporation）とともに挿入されたTranswellプレートを使用することによって測定された。簡単に記載すると、5x104個の細胞を0.2mLの培養培地に懸濁し、上部チャンバーに加えた。培養培地における10％のFBSを下部チャンバーにおける化学誘因物質として使用した。細胞を加湿CO2インキュベーターにおいて37℃で16時間インキュベーションした。8.0μmのメンブラン細孔を横断し、メンブランの下部表面に広がった細胞を5％ギムザ溶液で染色し、メンブランに保持された細胞を少なくとも6つの異なる視野で計数した。各実験を三連で行った。誤差バーは平均標準誤差を表す。
【０２７０】
侵入アッセイ。細胞侵入アッセイを、8.0μmの細孔サイズを有するPETメンブランフィルター（Becton-Dickinson）を備える6.4mmのBiocoat Matrigel侵入チャンバーを製造者の説明書に従って使用して行った。簡単に記載すると、2.5x104個の細胞を0.5mLの培養培地に懸濁し、上部チャンバーに加えた。培養培地における10％のFBSを化学誘因物質として下部チャンバーに入れた。侵入チャンバーにおける細胞を加湿インキュベーターにおいてインキュベーションした。Matrigelマトリックスおよび8.0μmのメンブラン細孔を横断し、フィルターの下部表面に広がった細胞を可視化のために5％ギムザ溶液で染色した。侵入試験の各データ点は三連のチャンバーから得られた。誤差バーは平均標準誤差を表す。
（実施例２）
【０２７１】
p190-Rhoキメラ体による個々のRho GTPase活性の標的化
特定のシグナル伝達経路におけるRhoタンパク質の関与を示すための一般に使用されている生化学的ツールでは、Rhoタンパク質の優性ネガティブ変異体、および、Rhoタンパク質機能を改変することができるいくつかの細菌トキシンが含まれる。これらの試薬は、Rho GTPaseの機能を妨害することにおけるそれらの非特異的な性質によって制限され（Geig他、1999、Nat. Cell. Biol.、1、E25-E27、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）、また、特異的なRhoタンパク質を標的化することにおいて制限された治療的価値を有し得る。個々のRhoタンパク質機能を特異的に阻害するために、本発明者らは、活性なRho GTPase基質が細胞に存在するところにRhoGAPドメインが導かれるならば、RhoGAP（特に、RhoGAPドメイン）の負の調節的役割が、Rhoタンパク質活性をダウンレギュレーションするために利用され得ることを仮定している。p190のRhoGAPドメインが、RacまたはCdc42ではなく、RhoのGTP加水分解を特異的に刺激するための触媒として以前に明らかにされており、しかし、p190のRhoGAPドメインは、RhoAサブタイプ、RhoBサブタイプおよびRhoCサブタイプの間を区別することができない（Zhang他、1998、Biochemistry 37、5249〜5257；および、Settleman他、1992、Cell 69、539〜49：これらはともにその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。顕微注入によって細胞内に導入されたとき、ほとんどが細胞質ゾル性であり、アクチンのストレスファイバー構造が容易に分解される（Ridley他、1993、EMBO J.、12、5151〜60）。細胞において、RhoGAPドメインは全長のp190における他の構造的モチーフによって厳しく調節されている可能性があり、その触媒活性および細胞内位置の両方が、細胞外の刺激に応答したリン酸化およびタンパク質−タンパク質相互作用によって影響され得る（Prendergast他、2001、Nature Review Cancer、1、162〜168；Feig他、1999、Nat. Cell Biol.、1、E25〜E27；および、Wang他、1997、Cancer Res.、57、2478〜2484；これらのすべてはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。他方で、Rhoタンパク質のC末端の多塩基性の超可変領域（この領域には、CAAXイソプレニル化モチーフが含まれる）は、それぞれのRho GTPaseの細胞内分布を決定しているようである（Yoshioka他、1998、J. Biol. Chem、273、5146〜5154、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。従って、RhoGAPドメインを個々のRhoタンパク質のC末端領域と融合することによって、特異的なRho標的化シグナルを有する触媒作用性のGTP加水分解ドメインが提供されることは論理的であると考えられた。制御された様式で低いレベルで発現したとき、そのようなGAP-Rhoキメラ体は個々のRho活性の効果的かつ特異的な阻害剤を構成するかもしれない。従って、本発明者らは、この仮説を検証するために、1組のp190 GAPドメインおよびRhoAキメラ構築物、RhoBキメラ構築物またはRhoCキメラ構築物のC末端を作製した。
【０２７２】
p190-Rhoキメラ体のcDNAを、ラットp190のRhoGAPドメインをコードするcDNAと、ヒトRhoA、ヒトRhoBまたはヒトRhoCのC末端をコードするcDNAとを、それぞれの配列のPCR増幅の後で融合することによって作製した。プライマー配列は、RhoAのC末端については5'GCGAATTCTCACAAGACAAGGCAACCAGATTTTTTCTTCCCACGTCTAGCTTGC AGAGAAGACAACTGATTTTCCTGC3'（配列番号26）であり、RhoBのC末端については5'GCGAATTCTCATAGCACCTTGCAGCAGTTGATGCAGCCGTTCTGGGAGCCGTAGCTTCTGCAGAGAAGACAACTGATTTTCCTGC3'（配列番号27）であり、RhoCのC末端については5'GCGAATTCTCAGAGAATGGGACAGCCCCTCCGACGCTTGTTCTTGCGGACCTGGAGAGAAGACAACTGATTTTCCTGC3'（配列番号28）である。p190RhoGAPドメインおよびそれぞれのRho配列をコードするcDNAの連結産物を、哺乳動物細胞における一過性発現のためのpCEFL-GSTベクターだけでなく、二シストロン的に強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）と一緒に(HA)3融合体としてキメラ体を発現するMIEG3-(HA)3レトロウイルスベクター（Jordan他、1999、Oncogene、18、6835〜6839、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）にクローン化した。
（実施例３）
【０２７３】
インビトロでの融合タンパク質のGAP活性の比較
p190のGAPドメインに融合された様々なRhoタンパク質のC末端配列がp190のGAP機能を妨害しないことを確実にするために、本発明者らはGSTタグ化p190およびp190-Rhoキメラ体をCos-7細胞において発現させ、それらをグルタチオン−アガロースアフィニティービーズによって精製し、インビトロでのそれらのGAP活性を比較した。類似する用量のもとで、p190-RhoA-C、p190-RhoB-Cおよびp190-RhoC-Cは、RhoA基質に対してp190 GAPドメイン単独のように匹敵するGAP活性を示して、[γ32P]GTPの加水分解を時間依存的な様式で刺激した。このことは、4つすべてのp190およびp190-Rhoキメラタンパク質が機能的であることを示している。細胞におけるキメラ構築物の効力および特異性を評価するために、本発明者らは、Rho GTPaseのF30L変異体形態はGAP刺激に対して完全に応答性であり、その一方で、GTPase欠損のRho-Q61L変異体はRhoGAP処理によって影響されず、しかし、両方の変異体形態は、形質転換または遊走の誘導などの細胞作用を生じさせることにおいて類似して挙動するという事実を利用して、上記の、速く循環するRho-F30L変異体およびGTPase欠損変異体Rho-Q63Lを発現する細胞を試験系として用いた。本発明者らは、レトロウイルスMIEG3発現ベクターを構築物の送達のために選んでいる。このベクターは、宿主細胞への1コピーの目的とする遺伝子の安定な導入を可能にし、かつ、EGFPの蛍光に基づくp190発現細胞の迅速かつ半定量的な単離を可能にするマーカーとして、二シストロン的に発現するEGFPを含有するからである（Gu他、2001、J. Biol. Chem.、276、15929〜15938；および、Yang他、2001、PNAS, USA、98、5614〜5618、これらはともにその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。FACS精製されたEGFP陽性細胞をウエスタブロットによってHAタグ化p190-Rhoキメラ体の発現について調べたとき、すべての構築物が類似するレベルで発現していることが見出された。
【０２７４】
GTPase活性のアッセイ。RhoAの固有的なGTPase活性およびp190GAPにより刺激されたGTPase活性をニトロセルロースフィルター結合法によって記載のように測定した（Li他、1997、J. Biol Chem.、272、32830〜5、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)。簡単に記載すると、組換えRhoAに、50mMのHEPES（pH 7.6）、0.2mg/mLのBSA、および0.5mMのEDTAを含有する100μLの緩衝液において、[γ-32P]GTP（10μCi、6000Ci/mmol、NEN）を周囲温度で10分間にわたって事前に負荷し、その後、MgCl2を5mMの最終濃度に加えた。[γ-32P]GTP負荷されたRhoAの一定量を、50mMのHEPES（pH 7.6）、100mMのNaCl、0.2mg/mLのBSA、および0.5mMのMgCl2を様々なGAPの存在下または非存在下で含有するGAPアッセイ緩衝液と混合した。種々の時点で、反応を、反応混合物をニトロセルロースフィルターでろ過することによって停止させた。その後、フィルターに保持された放射能をシンチレーション計数による定量に供した。
【０２７５】
レトロウイルスによる遺伝子移入。様々なp190-Rhoキメラ体をレトロウイルス感染法によってNIH 3T3細胞または腫瘍細胞において発現させた。レトロウイルスパッケージングPhoenix細胞における組換えレトロウイルスの産生、および、その後の宿主細胞感染を、記載されたプロトコルに従って行った（Suwa他、1998、Br. J. Cancer、77、147〜152、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。感染細胞を感染後72時間で集めた。EGFP陽性細胞（典型的には10％〜50％）を蛍光活性化細胞分取（FACS）によって単離し、さらなる分析のために使用した。
（実施例４）
【０２７６】
C末端配列による細胞局在化の特異性
キメラ体におけるRhoタンパク質のC末端配列は、融合されたp190 GAPドメインの細胞内局在化を実際に指図し得るかどうかを明らかにするために、p190-RhoA-C、p190-RhoB-Cおよびp190-RhoC-Cの局在化パターンを免疫蛍光によって調べ、これらの細胞において発現されるそれぞれのRho-F30Lタンパク質の局在化パターンとの比較を行った。p190-RhoA-Cはほとんどが細胞質ゾルに見出され、小さい割合が形質膜に局在化していた。このことは、抗GST免疫染色によって明らかにされるGST-F30LRhoAの分布パターンの局在化パターンと同様である。p190-RhoB-Cは、エンドソームを連想させる細胞内小胞に見出され、これはRhoB-F30Lの位置と類似していた。同様に、p190-RhoC-Cは、RhoC-F30Lと類似した局在化パターンを示したが、他とは異なって広がっているが、中断されたパターンを伴っていた。これらの結果は、Rhoタンパク質の異なるC末端配列により、p190-Rhoキメラ体が、Rho GTPaseそのものと類似する異なった位置に導かれ得ることを示唆している。
【０２７７】
免疫蛍光。カバーガラス上で成長させた細胞を、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（PBS）における3.7％ホルムアルデヒドにより15分間にわたって固定処理し、PBSにより1回洗浄し、続いて、0.1％のTriton X-100による透過処理を20分間行った。その後、細胞を2％のウシ血清アルブミン（BSA）により20分間ブロッキング処理した。アクチン染色のために、細胞をローダミン−ファロイジンとインキュベーションした。ビンキュリン染色のために、細胞を抗ビンキュリンモノクローナル抗体（Sigma, Inc.）により標識し、その後、ローダミンコンジュゲート化ヤギ抗マウス二次抗体とインキュベーションした。様々なRhoタンパク質またはp190-Rhoキメラ体の細胞内局在化を決定するために、FACSによって単離されたEGFP陽性細胞を抗HAモノクローナル抗体または抗GSTポリクローナル抗体のいずれかにより標識し、その後、ローダミンコンジュゲート化二次抗体染色を行った。染色された細胞をAqua-mountでスライドガラスに載せ、解析ソフトエア（Improvision, Inc.）を備えたZeiss LSM510共焦点顕微鏡またはLeica蛍光顕微鏡を用いて調べた。
（実施例５）
【０２７８】
キメラ体はインビトロでRho GTPase活性を特異的に標的化することができるか
p190-Rhoキメラ体を使用して、個々のRho GTPase活性を特異的に標的化することができるかどうかを調べるために、RhoC-F30Lと、p190、p190-RhoA-C、p190-RhoB-Cまたはp190-RhoC-Cとを同時発現する細胞におけるRhoC-F30LのGTP結合型形態が、固定化されたHis-Rhotekinとの親和性沈殿によってプローブ探査された。p190、p190-RhoA-Cまたはp190-RhoB-Cのいずれでもなく、p190-RhoC-CがRhoC-F30Lの活性を特異的にダウンレギュレーションさせた。そのうえ、RhoCのGTPase欠損形態を発現する細胞では、RhoC-Q63L、p190-RhoC-Cは、Rhotekinにより細胞溶解物から沈殿されたRhoC-Q63L-GTPの量に影響を与えなかった。従って、p190-Rhoキメラ体（特に、p190-RhoC-C）は、RhoGAPドメインに融合されたRhoタンパク質のC末端配列に依存して、個々のRhoタンパク質活性を特異的にダウンレギュレーションすることができる。
【０２７９】
Rhoエフェクタープルダウンアッセイ。細胞におけるRhoA活性、RhoB活性またはRhoC活性を測定するために、エフェクタープルダウンアッセイ（Zhu他、2000、J. Biol. Chem.、275、25993〜26001、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）を、20時間の血清飢餓処理が行われたそれぞれの細胞において行った。Rho-GTPに対するエフェクタープローブ（組換え(His)6-Rhotekin）を発現させ、大腸菌から精製し、Ni-NTAアガロースビーズに固定化した。ビーズに結合させた(His)6-Rhotekin（約1μg／サンプル）を、様々なGST-Rhoタンパク質を発現するそれぞれの細胞溶解物と4℃で45分間インキュベーションし、共沈殿物を抗GSTモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングによって分析した。
（実施例６）
【０２８０】
キメラ体によりトランスフェクションされた細胞の遊走表現型
p190-Rhoキメラ体適用の機能的結果を明らかにするために、RhoC-F30Lの発現によって引き起こされる遊走表現型を、RhoC-F30Lおよび様々なキメラ体を同時発現する細胞において調べた。図６は、RhoC-F30Lにより刺激された細胞遊走が、ベクターコントロール、p190GAP、p190-RhoA-Cまたはp190-RhoB-Cによってではなく、p190-RhoC-Cによって特異的に復帰し得ることを示している。対照的に、p190-RhoC-Cは、それ以外のキメラ体と同様に、RhoC-Q63Lにより誘導された細胞遊走に対して影響がなかった。これらの結果は、p190-Rhoキメラ体が、個々のRho活性の上昇によって引き起こされる細胞表現型を機能的に復帰させるための有用なツールであることをさらに示唆している。
（実施例７）
【０２８１】
p190-RhoC-Cキメラ体による腫瘍細胞の形質転換および／または侵入の取り消し
p190-Rhoキメラ体が機能的結果を明らかにし得るかどうかを確認するために、p190-Rhoキメラ体を、特異的なRho GTPaseの過剰発現またはアップレギュレーションに起因する形質転換および／または侵入の特徴を示すヒトガン細胞に適用した。以前には、ヒト乳房上皮細胞（HME）がRhoCの過剰発現により形質転換活性および浸襲活性を獲得し、これにより、炎症性乳ガン細胞の表現型と類似する表現型をもたらしたことが明らかにされていた（van Golen他、2000、Cancer Res.、60、5832〜8、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。軟寒天に基づく成長アッセイにおいて、コロニーが、コントロールのレトロウイルスで処理されたHME細胞ではほとんど成長しなかった（図1A）。RhoCを導入したとき、細胞（HME-RhoC）のコロニー形成活性が劇的に増大した。図７Ａに示されるように、HME-RhoC細胞のコロニー形成活性が、p190-RhoC-Cを発現するレトロウイルスにより処理されたとき、約1/5に阻害され、その一方で、HME-RhoC細胞のコロニー形成活性は、コントロールのEGFP発現ウイルス、あるいは、p190、p190-RhoA-Cまたはp190-RhoB-Cを発現するウイルスによって影響を受けなかった。そのうえ、HME-RhoCの浸襲活性もまた、EGFP単独、あるいは、p190、p190-RhoA-Cまたはp190-RhoB-Cによってではなく、p190-RhoC-Cによって特異的に阻害された（図1B）。
【０２８２】
以前の遺伝子アレイスクリーニングでは、RhoCのmRNAレベルが、非浸襲性の元のA375細胞と比較して、非常に転移性のヒト黒色腫A375-M細胞において著しく上昇していることが見出されていた（Clark他、2000、Nature、406、532〜5、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。A375-Mの浸襲性および転移性は部分的には、増大したRhoC活性に起因していた（Clark他、2000、Nature、406、532〜5、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。1組のp190-Rhoキメラ体がA375-M腫瘍細胞に適用されたとき、p190-RhoC-Cキメラ体は、A375-Mの遊走活性および侵入活性の両方を著しく低下させることが見出された（図2Aおよび図2B）。これは、優性ネガティブなRhoAの過剰量の強制的な発現によって引き超される程度と類似していた（Clark他、2000、Nature、406、532〜5、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。再度ではあるが、p190、p190-RhoA-Cまたはp190-RhoB-C、ならびに、EGFPを発現するレトロウイルスは、腫瘍細胞の遊走または侵入の特性に対する検出可能な影響を有していなかった。従って、p190-Rhoキメラ体は、個々のRho GTPase活性を特異的にダウンレギュレーションするために、また、異なるサブタイプのRho GTPaseの過剰発現に伴う成長および／または侵入の表現型を取り消すためにヒト腫瘍細胞に適用できるようである。
【０２８３】
これらの結果から、RhoGAPに基づく方法が、細胞における個々のRhoサブタイプの生化学的活性および生物学的活性を特異的にダウンレギュレーションするために有効であることが確認される。p190-Rhoに基づく方法は、個々のRhoサブタイプの活性を特異的にダウンレギュレーションすることにおいて、また、腫瘍細胞の表現型を取り消すことにおいて、腫瘍細胞レベルで並はずれて良好に機能するようである。
【０２８４】
p190に加えて、BcrのGAPドメインが、Racに対して特異的であることが示されており、しかし、BcrのGAPドメインは、Rac1サブタイプ、Rac2サブタイプおよびRac3サブタイプの間を区別することができず（Zhang他、1998、J. Biol. Chem.、273、8776〜8782、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）、これに対して、Cdc42GAPは、Cdc42のGTP加水分解を触媒することを助け、しかし、他のRhoタンパク質に対して依然としてかなり活性のままである。RhoA、RhoBおよびRhoCのC末端配列と同様に、Rac1、Rac2、Rac3およびCdc42のC末端配列は、脂質修飾のCAAXモチーフを含んでおり、それらの異なる細胞内局在化パターンを導いていることが知られている（Michaelson他、2001、J. Cell Biol.、152、111〜26、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）これらのRhoGAP型構築物もまた、優性ネガティブ変異体法またはトキシン処置によって以前には理解されていなかったかもしれない個々のRhoタンパク質機能の細胞生化学的研究のための有益なツールを提供する。
（実施例８）
【０２８５】
RhoGTPase Rac2がp210 Bcr-Abl融合ガン遺伝子によるインビボ形質転換活性のために要求される
Bcr-Abl（ヒト慢性骨髄性白血病（CML）に関係するフィラデルフィア染色体の転座産物）は、増殖、アポトーシス、接着および遊走に関して造血幹細胞（HSC）の挙動に影響を及ぼすキナーゼである。Rho GTPase（特にRacサブファミリー）が、正常なHSCにおいてこれらの同じ細胞機能を調節していることが示されており、また、多くの哺乳動物細胞において遺伝子発現を調節していることが示されている。BCRは「GTPase活性化タンパク質」ドメインおよびグアニンヌクレオチド交換ドメインを含有しており、後者はp210 Bcr-Ablにおいて保存されている。Bcr-AblおよびRacによって調節されるHSC機能は類似しているため、Bcr-Ablのシグナル伝達カスケードにおけるRac活性化の潜在的な関与が研究されていた。ヒトCMLサンプルから、ST1571によるインビトロ処置によって取り消される、Racタンパク質の基礎的活性化が明らかにされる。Rac2の特異的な関与を研究するために、Rac2ヌル骨髄を有する遺伝子標的化されたマウスモデルが使用された（表1を参照のこと）。レトロウイルス媒介による遺伝子移入を使用して、p210 Bcr-AblをMSCVベクターにおいて野生型またはRac2-/-のHSC/Pに導入し、これらの細胞の挙動をインビトロおよびインビボで研究した。
【表１】
2007535479.tif 000003
【０２８６】
p210により形質導入されたLDBM細胞を注射した放射線照射レシピエントマウスは一様に致死的な骨髄増殖性症候群を発症し（メジアン生存：45日、N＝12）、一方、p210形質導入されたRac2-/- LDBM細胞を注射したマウス（N＝12、2つの独立した実験）は100％の生存を有し、白血球増加症、脾腫、または、造血細胞の臓器浸潤の発生を有しなかった。これらのデータは、Rac GTPaseがBcr-AblによるHSCの形質転換に関与し、また、Rac GTPaseはCMLにおける介入のためのさらなる治療的標的を提供することを示唆している。
【０２８７】
上記に記載された様々な方法および技術は、本発明を行うための数多くの方法を提供する。当然のことではあるが、必ずしもすべての記載された目的または利点が、本明細書中に記載されるいずれかの特定の実施形態に従って達成されないことがあることを理解しなければならない。従って、例えば、当業者は、本発明の方法が、本明細書中に教示または示唆され得るような他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書中に教示されるような1つの利点または1群の利点を達成または最適化する様式で行われ得ることを理解する。
【０２８８】
さらに、当業者は、異なる実施形態に由来する様々な特徴の交換可能性を理解する。同様に、上記で議論された様々な特徴および工程、ならびに、それぞれのそのような特徴または工程に対する他の知られている均等物は、本明細書中に記載される原理に従って方法を行うために当業者によって組み合わせることができ、また、合致させることができる。
【０２８９】
本発明が特定の実施形態および実施例に関連して開示されているが、本発明は、そのような具体的に開示された実施形態を超えて、他の代わりとなる実施形態および／または使用、ならびに、それらの自明な改変および均等物にまで及ぶことが当業者によって理解される。従って、本発明は、本明細書中における好ましい実施形態の具体的な開示によって限定されることは意図されず、その代わり、本明細書に添付された請求項を参照して限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２９０】
【図１】いくつかの例示的なGAPドメインと、C末端の様々な細胞内標的化配列との融合ペプチドの図式描写である。
【０２９１】
【図２】ヒト乳ガン細胞HME-RhoCの足場非依存的な成長および侵入の性質に対するp190-RhoC-Cの影響を示すグラフである。Ａ、HME、MHE-RhoC、および、MIEG3ベクターとともに様々なp190-Rhoキメラ体により形質導入されたHME-RhoCが軟寒天で成長する能力を、0.3％の軟寒天に細胞を置床した後の3週間目に比較した。Ｂ、HME-RhoC細胞、および、様々なp190-Rhoキメラ体により形質導入されたHME-RhoC細胞の侵入活性をMatrigel被覆トランスウエルにおいてアッセイした。Matrigel内への侵入に成功した細胞を置床後16時間で定量した。
【０２９２】
【図３】p190-RhoC-Cキメラ体が、転移性ヒト黒色腫A375-M細胞の遊走表現型および侵入表現型を無効にすることにおいて効果的であったことを示すグラフである。Ａ、MIMG3ベクター単独、p190GAP、または様々なp190-Rhoキメラ体をコードするレトロウイルスにより形質導入されたA375親細胞および転移性A375-M細胞の遊走能力をトランスウエルにおいてアッセイした。16時間のインキュベーションの後におけるトランスウエルのメンブランの細孔の中に移動した細胞を定量した。Ｂ、細胞を、トランスウエルにおいて48時間、10％のFBSによってmatrigel被覆メンブランに侵入するように誘導した。matrigel内に侵入した細胞の数を計数した。定量結果が、三連で行われた実験から得られた。
【図１】
2007535479.tif 000004
【図２】
2007535479.tif 000005
【図３】
2007535479.tif 000006
【配列表】
2007535479000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月3日(2007.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
GAP活性ドメイン、および
少なくとも1つの特異的なGTPaseタンパク質を標的化する少なくとも1つの標的化ドメイン
を含むキメラポリペプチド。
【請求項２】
前記標的化ドメインがGTPase由来のC末端配列である（GTPaseのC末端配列に由来する）、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３】
膜移行タンパク質ドメインをさらに含む、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４】
前記GTPaseがRho GTPaseである、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５】
6個〜12個のアミノ酸をキメラポリペプチドのいずれかの末端においてさらに含む、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６】
前記Rho C末端配列が前記GAP活性ドメインに対してC末端側である、請求項2に記載のキメラポリペプチド。
【請求項７】
前記Rho C末端配列が前記GAP活性ドメインに対してN末端側である、請求項2に記載のキメラポリペプチド。
【請求項８】
前記GAP活性ドメインが、GTPase活性化タンパク質活性のために必要な最小限の構造的ドメインを含有するペプチド配列である、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項９】
前記GAP活性ドメインが、p50RhoGAP、p190、p122-RhoGAP、p190-A、p190-B、オリゴフレニン-1、GRAF、MacGAP、Cdc42GAP(p50RhoGAP)、SrGAP1-SrGAP3、n-キメリン（chimaerin）、CdGAP、Bcr、Abr、MgcRacGAP、ARAP1、ARAP2、RICH-1、NADRIN、3BP-1、RhoGAP8およびそれらの変異体からなる群から選択されるRhoファミリーのGAPである、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１０】
前記GAPドメインが、GAPタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも15個、20個、25個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、125個、150個、170個、200個、250個またはそれ以上の連続したアミノ酸を含む、GAPタンパク質由来のGAP GTPaseドメインのポリペプチドフラグメントである、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１１】
特異性ドメインが、RhoA、RhoB、RhoC、Cdc42、Racl、Rac2、Rac3、TC10、RhoG、RhoD、Chp、WRCH1、TCLおよびRIFからなる群から選択されるGTPaseのC末端アミノ酸配列に由来する、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１２】
特異性ドメインが、GTPaseのC末端アミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むGTPaseフラグメントである、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１３】
前記C末端配列がRhoGTPaseファミリーのメンバーの1つに由来する、請求項2に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１４】
前記RhoGTPaseが、RhoA、RhoB、RhoC、Cdc42、Rac1、Rac2、Rac3、TC10、RhoG、RhoD、Chp、WRCH1、TCLおよびRIFからなる群から選択される、請求項13に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１５】
前記GAPドメインペプチドが、下記の式のアミノ酸配列：
XN--GAP--XC
（式中、「GAP」は、GAPタンパク質由来のGAP GTPaseドメインのポリペプチドフラグメントである；
XNは、GAPタンパク質のN末端アミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである；かつ
XCは、GAPタンパク質のC末端アミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである）
を含む、GAPタンパク質由来のGAP GTPaseドメインのポリペプチドフラグメントである、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６】
前記XNが、配列番号2のアミノ酸1〜1260、配列番号4のアミノ酸1〜256、配列番号6のアミノ酸1〜1013、またはそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むポリペプチドフラグメントである、請求項15に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１７】
前記XNが、配列番号2のアミノ酸1249〜1260、配列番号4のアミノ酸237〜256、配列番号6のアミノ酸996〜1013、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項15に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１８】
前記XCが、配列番号2のアミノ酸1432〜1513、配列番号4のアミノ酸427〜439、配列番号6のアミノ酸1206〜1227、またはそれらのフラグメントの少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである、請求項15に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１９】
前記XCが、配列番号2のアミノ酸1432〜1513、配列番号4のアミノ酸427〜439、配列番号6のアミノ酸1206〜1227、およびそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項15に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２０】
前記標的化ポリペプチド特異性ドメインが、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20のアミノ酸配列、およびそれらのフラグメントからなる群から選択される配列の少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むペプチドフラグメントである、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２１】
前記標的化ポリペプチドフラグメントが、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20のアミノ酸配列、およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２２】
膜移行ペプチドをさらに含む、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２３】
前記膜移行ペプチドが膜会合性のイソプレニル化修飾を含む、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２４】
前記膜移行タンパク質が脂質修飾ペプチドを含む、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２５】
前記膜移行タンパク質が約8残基〜約50残基のペプチドである、請求項22に記載のキメラペプチド。
【請求項２６】
前記膜移行ペプチドが、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも8個の連続する残基を含む約8残基〜約50残基のペプチドである、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２７】
前記膜移行ペプチドが、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも8個の連続する残基を含む約8残基〜約24残基を有するアミノ酸配列である、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２８】
前記膜移行ペプチドが、一般には約8アミノ酸残基〜約50アミノ酸残基またはそれ以上の長さを有するアミノ酸の配列であり、この場合、前記残基の少なくとも55％は、それらが疎水性の脂質可溶性部分を有するように疎水性である、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２９】
前記膜移行配列は、Pro-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro-Cys-Ser-Leu-Leu（配列番号21）、Pro-Gln-Pro-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro-Cys-Ser-Leu-Leu（配列番号22）、Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro（配列番号23）、Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Arg-Pro-Arg-Gln-Thr-Gln-Lys（配列番号24)、および、Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Thr-Arg-Gln-Gln-Lys-Arg-Pro-Cys-Leu-Leu（配列番号25）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号13からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも15個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、125個、150個、175個、200個、250個のアミノ酸（例えば、連続するアミノ酸）を含む、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12または配列番号13からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３２】
請求項1に記載されるポリペプチドを、医薬的に許容され得るキャリア中に含む医薬組成物。
【請求項３３】
インビボで細胞におけるGTPase活性を調節するための方法であって、
前記細胞を、GTPase活性を調節する活性な化合物と接触させることを含み、前記活性な化合物が、a）GAP活性ドメインと、b）少なくとも1つの特異性ドメインとを含むキメラポリペプチドである、方法。
【国際調査報告】
2007535479.tif 000040
2007535479.tif 000041
2007535479.tif 000042
2007535479.tif 000043
2007535479.tif 000044
2007535479.tif 000045