(57)【要約】  本発明は、不妊症の処置のための方法及び組成物を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質を含んで成る第一の組成物を哺乳動物に投与することを含んで成る、哺乳動物において排卵を刺激する方法。
【請求項２】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質が、配列番号：２の配列を含んで成る成熟Ｋｉｓｓ−１タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質が、成熟Ｋｉｓｓ−１タンパク質から得られるペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質が、ＧＰＣＲ５４受容体を活性化することのできるＫｉｓｓ−１由来ペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質が、配列番号：７のアミノ酸配列を含んで成るペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質が、配列番号：３の配列を有するペプチド、配列番号：３のペプチドのアナログ、配列番号：３のフラグメント、又は配列番号：３のフラグメントのアナログである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
配列番号：３のアナログが、配列番号：３の保存的変異体であるペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
排卵を刺激する第二の組成物を投与することを更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
排卵を刺激する第二の組成物が、排卵のホルモン又は化学的刺激薬を含んで成る、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
排卵の化学的刺激薬が、クエン酸クロミフェン又はレトラゾールである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
排卵のホルモン刺激薬が、ヒト閉経期尿性ゴナドトロピン（ｈＭＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）から成る群から選択されるゴナドトロピンホルモンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＧｎＲＨアンタゴニストを含んで成る組成物を投与することを更に含んで成る、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ゴナドトロピンがＦＳＨである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
非ＦＳＨゴナドトロピンホルモンを投与することを更に含んで成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＦＳＨ及びＬＨを等量で投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＦＳＨを約５〜４５０ ＩＵ／日の範囲の用量で投与する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＦＳＨを約５〜７５ ＩＵ／日の範囲の用量で投与する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ゴナドトロピンホルモンを注入により投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質を含んで成る組成物を哺乳動物に投与することを含んで成る、哺乳動物においてＦＳＨ産生を刺激する方法。
【請求項２１】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質が、配列番号：２の配列を含んで成る成熟Ｋｉｓｓ−１タンパク質である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質が、成熟Ｋｉｓｓ−１タンパク質から得られるペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質が、Ｇ−タンパク質結合受容体５４を活性化することができるＫｉｓｓ−１由来ペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質が、配列番号：７のアミノ酸配列を含んで成るペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質が、配列番号：３の配列を有するペプチド、配列番号：３のペプチドのアナログ、配列番号：３のフラグメント、又は配列番号：３のフラグメントのアナログである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号：３のアナログが、配列番号：３の保存的変異体であるペプチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物においてＦＳＨ産生を刺激する第二の組成物を投与することを更に含んで成る、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
ＦＳＨ産生を刺激する第二の組成物が、抗エストロゲン化合物を含んで成る、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
抗エストロゲン化合物が、クロミフェン及びレトラゾールから成る群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質を含んで成る組成物を哺乳動物に投与することを含んで成る、哺乳動物においてＬＨ産生を刺激する方法。
【請求項３１】
ａ)哺乳動物において内因性ゴナドトロピン産生を抑制すること、
ｂ）哺乳動物における卵巣卵胞の成長を刺激するのに有効な量のＫｉｓｓ−１関連ペプチドの組成物を哺乳動物に投与すること；及び
ｃ）哺乳動物において排卵を誘導し、卵子を産生すること
を含んで成る、哺乳動物おける不妊症の治療的介入のための方法。
【請求項３２】
前記方法が、卵巣卵胞の成長を刺激するためのゴナドトロピン調製物を投与することを更に含んで成る、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ゴナドトロピン調製物が、組み換えＬＨを含み又は含まずに、尿性又は組み換えＦＳＨ又はＨＭＧを含んで成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ゴナドトロピン調製物が組み換えＦＳＨを含んで成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
排卵の誘導が、ＨＣＧ、天然ＬＨＲＨ、ＬＨＲＨアゴニスト又は組み換えＬＨを含んで成る組成物を哺乳動物に投与することを含んで成る、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物における内因性ゴナドトロピン産生の抑制が、ＧｎＲＨアンタゴニストを投与することを含んで成る、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
精子注入による卵子の子宮腔内授精を更に含んで成る、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
Ｋｉｓｓ−１由来ペプチドを、哺乳動物においてＦＳＨ産生を刺激するのに有効な複合量の抗エストロゲン剤と組み合わせて投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
哺乳動物が、正常な排卵の標準的ゴナドトロピン刺激に応答しない、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
不妊症疾患が、低ゴナドトロピン性性機能低下症である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
不妊症疾患が、多嚢胞性卵巣症候群である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
卵巣卵胞産生の最初の刺激の１２日後に、卵母細胞を集めることを更に含んで成る、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
集めた卵母細胞をインビトロで受精させること、及び集め、受精させた卵母細胞を４〜８細胞期まで培養することを更に含んで成る、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
４〜８細胞期の受精卵母細胞を哺乳動物の子宮に移すことを更に含んで成る、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
受精卵母細胞を、卵母細胞を集めたのと同一の哺乳動物の子宮に移す、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
受精卵母細胞を、卵母細胞を集めたのと異なる哺乳動物の子宮に移す、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
治療有効量のＫｉｓｓ−１由来ペプチドを個々に投与することを含んでなる、対象における低ゴナドトロピン性性機能低下症の１又は複数の症状を軽減する方法。
【請求項４８】
対象が雄性の対象である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
対象が雌性の対象である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
不妊症の処置における使用のための、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質を含んで成る組成物。
【請求項５１】
ａ．医薬として許容される製剤中にＫｉｓｓ−１由来タンパク質を含んで成る第一の組成物、及び
ｂ．不妊症の処置のための第二の組成物
を含んで成る、不妊症の処置のためのキット。
【請求項５２】
不妊症の処置のための第二の組成物が、医薬として許容される製剤中にＦＳＨ調製物を含んで成る、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
ＦＳＨ調製物が、尿性ＦＳＨ調製物及び組み換えＦＳＨから成る群から選択される、請求項５１に記載のキット。
【請求項５４】
ＦＳＨがヒトＦＳＨである、請求項５２に記載のキット。
【請求項５５】
ＦＳＨが、約５ ＩＵ ＦＳＨ〜約７５ ＩＵ ＦＳＨの単位用量で存在する、請求項５２に記載のキット。
【請求項５６】
医薬として許容される製剤中に、ＬＨを含んで成る第三の組成物を更に含んで成る、請求項５１に記載のキット。
【請求項５７】
ＬＨが、約７５ ＩＵ ＬＨ〜約１５０ ＩＵ ＬＨの単位用量で存在する、請求項５６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に生殖疾患を処置することを対象とする。より具体的には、本発明は、Ｋｉｓｓ−１由来ペプチドを含んで成る組成物を投与することによる、そのような疾患の処置に関連する。
【背景技術】
【０００２】
１９９８年、米国生殖医学会は、米国には不妊の問題を有する６１０万のカップルが存在すると予測した。精子と卵子をコンバインする高度な技術手段を用いることによって、これらの個々の不妊の問題を克服する努力により、介助生殖技術（ＡＲＴ）の領域において多くの進歩がなされた。ほとんどのカップルは、ＡＲＴ治療を考慮する前に、多くの不妊評価及び処置を経験する。ＡＲＴは、典型的には、様々なホルモン及び／又は外科的介入と組み合わせた、インビトロでの受精技術のみを含む。
【０００３】
不妊の処置は、排卵誘発（ＯＩ）及び／又は過排卵誘起（ＣＯＨ）をしばしば必要とする。ＯＩは、単一の卵胞を単一の卵母細胞として排卵への周期を通過させることに関与し、一方、ＣＯＨは、様々なインビトロでのＡＲＴ手段の使用のために（例えば、インビトロでの受精のために）多数の卵母細胞を集める際に対象となる。これらの手段は双方とも、女性における卵巣卵胞の発達及び排卵を制御する２つの主要なホルモン（卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）と黄体化ホルモン（ＬＨ）という名前の）の使用に頼る。
【０００４】
正常な卵巣機能を有する女性は、各月経周期の中期のある時に排卵する。各月経周期において、卵母細胞の成熟のために多くの卵胞が動員（ｒｅｃｒｕｉｔ）される。およそ２８日の月経周期の初めにおいて、卵胞は始原形態、すなわち細胞の単層により囲まれた卵母細胞において存在する。卵胞の成長及び成熟がＦＳＨにより活性化されると、顆粒膜細胞の多層が初期の細胞の単層の周りに形成する（月経中期へと続く過程）。これらの顆粒膜細胞は、卵母細胞に栄養分を与え、エストロゲンの産生及び放出することに関与する。下垂体により産生されるＦＳＨは、顆粒膜細胞におけるアロマターゼ活性を誘導し、それによりエストロゲンの産生を増大させる。従って、卵胞の成熟と同時に、２８日の月経周期の早期において、エストロゲン産生の増大が存在する。卵胞は、第二の下垂体ゴナドトロピンであるＬＨに対する受容体も含む。卵胞が月経中期（およそ、１４日）まで成長及び成熟すると、空間（腔）が顆粒膜細胞内で発達する。月経中期で、ＬＨ産生の上昇はＬＨ受容体に作用して、卵胞を破裂させ、卵管を下る卵母細胞を放出させる。卵母細胞は、後に受精し得る。
【０００５】
正常な排卵する女性は、各月経周期に対しておよそ３００の未成熟卵母細胞を動員する。通常の周期の間、一つだけ除いた全ての卵胞は退化（閉鎖）し、単一の支配的な卵胞が出現し、そして卵母細胞を放出する。女性及び男性の生殖能力の衰えに対して一般的に用いられる処置である、ヒト卵母細胞のインビトロ受精（ＩＶＦ）は、精子を用いた成熟卵母細胞の受精が後に続く、成熟ヒト卵母細胞の回復に基づいている。ヒト成熟卵母細胞の動員は、ホルモン治療法により達成される。例えば、標準的なＩＶＦ処置プロトコルは、女性患者の長期間のホルモン刺激（例えば、３０日）を含む。このプロトコルは、ゴナドトロピン放出ホルモンＧｎＲＨ又はＧｎＲＨのアナログにより患者自身のＦＳＨ及びＬＨを抑制することによって開始し、その後外因性ゴナドトロピン、例えばＦＳＨ及び／又はＬＨを注入し、多数の排卵前卵胞の発達を確実にする。卵胞成長の適切な段階で、多数の卵母細胞を、排卵前に直ちに吸引により集める。吸引した卵母細胞は、その後インビトロで受精させ、そして得られた胚を４〜８細胞期に子宮に移す前に、典型的には３日間培養する。
【０００６】
自然に排卵しない女性では、介入の初期の目的は、少なくとも１つの卵母細胞の排卵を誘導することである。いくつかの薬物が入手可能であり、そして卵胞の発達を人工的に引き起こし、持続させるのに用いられている。これらの薬剤としては、クエン酸クロミフェン（Ｃｌｏｍｉｄ（登録商標）、Ｓｅｒｏｐｈｅｎｅ（登録商標））又はレトロゾール（Ｆｅｍｅｒａ（登録商標））、或いは患者がクロミフェンに応答しない場合は、注入可能なホルモン、例えばヒト閉経期尿性ゴナドトロピン（ｈＭＧ）（レプロネクスＲｅｐｒｏｎｅｘ、Ｐｅｒｇｏｎａｌ（登録商標）、Ｈｕｍｅｇｏｎ（登録商標））、ＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ−Ｆ（登録商標）、Ｆｏｌｌｉｓｔｉｍ（登録商標）、Ｂｒａｖｅｌｌｅ（登録商標））、単独又はＧｎＲＨアンタゴニスト、例えばＬｕｐｒｏｎ（登録商標）、Ｓｙｎａｒｅｌ（登録商標）、Ａｎｔｉｇｏｎ（登録商標）との組み合わせで投与する卵子の放出を引き起こすヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｐｒｏｆａｓｉ（登録商標）、Ｐｒｅｇｎｙｌ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｅｌ（登録商標）、Ｏｖｕｄｒｅｌ（登録商標））、又は天然ＬＨの上昇の発生を防ぐＣｅｔｒｏｔｉｄｅ（登録商標）が挙げられる。
【０００７】
クエン酸クロミフェンは、比較的安価で、錠剤の形態で利用可能であるので、不妊症処置においてしばしば用いられる第一の薬剤であり、この薬剤で処置した女性の６０％〜８０％が排卵するだろう。クロミフェンは中枢神経系で抗エストロゲンとして作用し、パルス周波数の増大及び下垂体により放出されるＦＳＨの集中を引き起こし、そしてＬＨ破裂の刺激をもたらし、それにより卵巣への穏やかなゴナドトロピン刺激を与える。クロミフェンは、周期の初期の５日間にわたって、典型的には５０ｍｇ／日で始まり後の周期では２００ｍｇまで増大し得る用量で投与される。
【０００８】
しかし、クロミフェン投与は顕著な副作用を有する。例えば、良く特徴付けされた多胎妊娠の可能性がある。更に、クロミフェンの長期の使用は卵巣癌のリスクを増大し得ることが示唆されてきた。更に、クロミフェンは排卵率の増大をもたらす一方で、クロミフェンで刺激した女性の妊娠率は驚くほど低下する。排卵率と妊娠率の間のこの相違に関して、様々な理由が示唆されてきた。クロミフェンは子宮内膜上で抗エストロゲン作用を有するようであり、子宮内膜の減少を引き起こすようである。第二に、クロミフェンの頸部での抗エストロゲン作用は、頸部から産生される粘液の量を減少させる。更に、クロミフェン投与は、子宮の血流の減少を引き起こすようであり、胎盤タンパク質１４の産生を低下させ、卵母細胞への有害な作用を有し得る。（Ｔａｒｌａｔｚｉｚ＆Ｇｒｉｍｂａｉｓ，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１３：９ ２３５６−２３５８，１９９８；Ｏｕｔ他，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１３：９ ２３５８−２３６１，１９９８；Ｄｉｃｋｅｙ他．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１３：９ ２３６１−２３６５，１９９８を参照）。最後に、クロミフェンは、天然のタンパク質又は他の分子に由来する「天然」の卵巣刺激薬ではなく、人工の化学物質であるので、安全な刺激薬だと見なすには、このような化学的介入の副作用（ほてり、気分変動、不眠、めまい、視覚障害）が、この介入に関して広範且つ多様であり過ぎるという懸念が存在する。実際に、「今日登録を求めたならば、クエン酸クロミフェンが市場に入ることを許可する可能性は極めて低い」ということが示唆されている。（Ｏｕｔ他，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１３：９ ２３５８−２３６１，１９９８を参照）。
【０００９】
従って、クロミフェン誘導卵巣刺激の使用に関しては明らかな問題が存在する。ホルモン刺激は、卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）のリスク、体重の増加、膨満、吐き気、嘔吐、監視プロセスに関する時間、及び未知の長期間の癌のリスクを含む欠点も有する。従って、ＯＩ及び／又はＣＯＨに関しては、新規で効果的な方法に対する必要性が依然として存在する。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、卵巣刺激のための、及び不妊処置のための現存する方法を置換し又は増強するための、方法及び組成物を対象とする。特定の実施態様において、本発明は、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質を含んで成る第一の組成物を哺乳動物に投与することを含んで成る、哺乳動物において排卵を刺激するための方法を考慮する。より特別な実施態様において、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質は、配列番号：２の配列を含んで成る成熟Ｋｉｓｓ−１タンパク質である。他の側面において、本方法は、成熟Ｋｉｓｓ−１タンパク質由来のペプチドであるＫｉｓｓ−１由来タンパク質の使用に関連する。好ましくは、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質は、ＧＰＣＲ５４受容体を活性化することのできるＫｉｓｓ−１由来ペプチドである。具体的実施態様において、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質は、配列番号：７のアミノ酸配列を含んで成るペプチドである。
【００１１】
本明細書を通して記載されているように、本明細書中では多くのＫｉｓｓ−１ペプチドが包含される。具体的な好ましい実施態様において、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質は、配列番号：３の配列を有するペプチド、配列番号：３のペプチドのアナログ、配列番号：３のフラグメント、又は配列番号：３のフラグメントのアナログである。変異体、突然変異体、ホモログ及びアナログを考慮する。具体的な実施態様において、配列番号：３のアナログは、配列番号：３の保存的変異体であるペプチドである。
【００１２】
本発明のＫｉｓｓ−１に関連するペプチド組成物は、他の組成物と組み合わせて用いることができる。例えば、排卵を刺激する方法は、排卵を刺激する第二の組成物を投与することを更に含んで成ることができる。排卵を刺激する組成物は、一般的に当業者に知られており、排卵のホルモン及び化学的刺激薬を含む。典型的実施態様において、排卵の化学的刺激薬は、クエン酸クロミフェン又はレトラゾール（Ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）である。クエン酸クロミフェン又はレトラゾールのアナログ又は変異体である他の薬剤、或いは類似した作用機構で作用する他の薬剤も、本明細書中に記載した方法において用いることができる。排卵のホルモン刺激薬は、このような目的に対して用いられる任意のホルモンであることができる。典型的なこのようなホルモンとしては、ヒト閉経期尿性ゴナドトロピン（ｈＭＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）から成る群から選択されるゴナドトロピンホルモンが挙げられる。更なる実施態様において、ゴナドトロピンホルモンは、ＧｎＲＨアンタゴニストを含んで成る組成物の投与と組み合わせることができる。特に好ましい実施態様において、ゴナドトロピンはＦＳＨである。
【００１３】
ＦＳＨの投与を用いる本発明の方法は、非ＦＳＨゴナドトロピンホルモンの投与と更に組み合わせることもできる。特定の実施態様において、非ＦＳＨホルモンはＬＨである。ＦＳＨ及びＬＨは、等量で投与することができ、或いは非等量で投与することができる。ＦＳＨは、同時又は別々に投与することができる。
【００１４】
特定の典型的な実施態様において、ＦＳＨは約５〜４５０ ＩＵ／日の範囲の用量で投与する。他の実施態様において、ＦＳＨは約５〜７５ ＩＵ／日の範囲の用量で投与する。具体的な側面において、ホルモンは、ホルモン処置に用いられる任意の投与経路で投与することができる。より詳細には、ゴナドトロピンホルモンは注入により投与する。本発明の方法は、好ましくはヒトの処置に関連する。
【００１５】
本発明の更なる側面は、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質を含んで成る組成物を哺乳動物に投与することを含んで成る、哺乳動物においてＦＳＨ産生を刺激する方法を包含する。Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質は、配列番号：２の配列を含んで成る成熟Ｋｉｓｓ−１タンパク質に由来する任意のタンパク質であることができる。当該タンパク質は、成熟Ｋｉｓｓ−１タンパク質に由来するペプチドであることができる。好ましくは、本方法は、Ｇ−タンパク質結合受容体５４を活性化することのできるＫｉｓｓ−１由来ペプチドの使用に関連する。より詳細には、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質は、配列番号：７のアミノ酸配列を含んで成るペプチドである。Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質は、好ましくは、配列番号：３の配列を有するペプチド、配列番号：３のペプチドのアナログ、配列番号：３のフラグメント、又は配列番号：３のフラグメントのアナログである。具体的な実施態様において、配列番号：３のアナログは、配列番号：３の保存的変異体であるペプチドである。本方法は、哺乳動物においてＦＳＨ産生を刺激する第二の組成物を投与することを更に含んで成ることができる。ＦＳＨ産生を刺激する第二の組成物は、抗エストロゲン化合物を含んで成る。例えば、抗エストロゲン化合物は、クロミフェン及びレトラゾールから成る群から選択される。
【００１６】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質を含んで成る組成物を哺乳動物に投与することを含んで成る、哺乳動物におけるＬＨ産生を刺激する方法も、本明細書中に記載されている。
【００１７】
本発明の方法は、哺乳動物において内因性ゴナドトロピン産生を抑止すること、哺乳動物において卵巣卵胞の成長を刺激するのに有効な量のＫｉｓｓ−１関連ペプチドの組成物を哺乳動物に投与すること；及び哺乳動物において排卵を誘導し、卵子を産生することを含んで成る、哺乳動物における不妊症の治療的介入のための方法も包含する。不妊処置方法は、ゴナドトロピン調製物を投与して卵巣卵胞の成長を刺激することを、更に含んで成ることができる。このようなゴナドトロピン調製物は、組み換えＬＨを含み又は含まずに、尿性又は組み換えＦＳＨ又はＨＭＧを含んで成ることができる。特定の実施態様において、ゴナドトロピン調製物は、組み換えＦＳＨを含んで成る。具体的実施態様において、排卵の誘導は、ＨＣＧ、天然ＬＨＲＨ、ＬＨＲＨアゴニスト又は組み換えＬＨを含んで成る組成物を哺乳動物に投与することを含んで成る。より具体的な実施態様において、哺乳動物における内因性ゴナドトロピン産物の抑制は、ＧｎＲＨアンタゴニストを投与することを含んで成る。
【００１８】
好ましい実施態様において、Ｋｉｓｓ−１由来ペプチドは、哺乳動物においてＦＳＨ産生を刺激するのに有効な複合量の抗エストロゲン剤と組み合わせて投与する。本発明の他の側面において、本明細書中に記載した方法は、正常な排卵の標準的ゴナドトロピン刺激に応答しない哺乳動物において用いることができる。具体的実施態様において、不妊症疾患は、低ゴナドトロピン性性機能低下症である。他の方法は、不妊症疾患である多嚢胞性卵巣症候群の処置に関連する。
【００１９】
本明細書中に記載した不妊症処置方法は、精子注入による卵子の子宮腔内授精を更に含んで成る。他の実施態様において、本方法は、卵巣卵胞産生の最初の刺激の１２日後に、卵母細胞を集めることを更に含んで成る。より具体的な実施態様において、本方法は、集めた卵母細胞をインビトロで受精させること、及び集め、受精させた卵母細胞を４〜８細胞期まで培養することを更に含んで成る。好ましい実施態様において、本方法は、４〜８細胞期の受精卵母細胞を哺乳動物の子宮に移すことを更に含んで成る。具体的な実施態様において、受精卵母細胞は、卵母細胞を集めたのと同一の哺乳動物の子宮に移す。しかし、他の実施態様において、受精卵母細胞は、卵母細胞を集めたのと異なる哺乳動物の子宮に移す。
【００２０】
本発明の方法は、治療有効量のＫｉｓｓ−１由来ペプチドを個々に投与することにより、対象における低ゴナドトロピン性性機能低下症の１又は複数の症状をも軽減する。このような実施態様において、対象は雄性の対象である。低ゴナドトロピン性性機能低下症の罹患する対象は、雌性の対象であることができる。
【００２１】
本発明は、不妊症の処置における使用のためのＫｉｓｓ−１由来タンパク質を含んで成る組成物を更に考慮する。更なる実施態様において、本発明は、不妊症の処置のためのキットを提供する。ここで、当該キットは、医薬として許容される製剤においてＫｉｓｓ−１由来タンパク質を含んで成る第一の組成物、及び不妊症の処置のための第二の組成物を含んで成る。好ましくは、不妊症の処置のための第二の組成物は、医薬として許容される製剤においてＦＳＨ調製物を含んで成る。具体的実施態様において、ＦＳＨ調製物は、尿性ＦＳＨ調製物及び組み換えＦＳＨから成る群から選択される。好ましくは、ＦＳＨはヒトＦＳＨである。具体的実施態様において、ＦＳＨは、約５ ＩＵ ＦＳＨ〜約７５ ＩＵ ＦＳＨの単位用量で存在する。キットは、医薬として許容される製剤において、ＬＨを含んで成る第三の組成物を更に含んで成ることもできる。より詳細には、ＬＨは、約７５ ＩＵ ＬＨ〜約１５０ ＩＵ ＬＨの単位用量で存在する。
【００２２】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかし、本発明の精神及び範囲の中で様々な変化及び変更が、この詳細な説明から当業者にとって明らかであるので、詳細な説明及び具体的実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例示のみによって与えられることが理解されるべきである。
【００２３】
好ましい実施態様の説明
不妊症は、様々な機構を通して処置されてきた。それらのほとんどは、ＦＳＨ及び／又はＬＨの効果を刺激又は増強することに依存する。本発明の前は、不妊症に対抗する介入の第一のコースは、抗エストロゲン化合物、例えばクロミフェン又はレトラゾールを用いていた。しかし、これらの薬剤は所望されない副作用を有することが発見された。従って、不妊症に対する効果的な追加の処置が、依然として必要とされている。本発明は、内因性ゴナドトロピン産生を刺激するための、新規の方法及び組成物を提供する。より詳細には、本発明の方法及び組成物は、ＦＳＨ及び／又はＬＨの産生及び／又は放出の刺激を引き起こす。この刺激は、それが様々な不妊症疾患の処置に用いることができる点で有益である。
【００２４】
本発明は、Ｋｉｓｓ−１ペプチド関連タンパク質を含んで成る組成物を投与することによる、不妊症を処置する方法を説明する。この有益な結果を達成するための方法及び組成物は、以下の本明細書中で更に詳細に説明する。
【００２５】
Ｋｉｓｓ−１タンパク質及びその受容体
本発明は、Ｋｉｓｓ−１関連タンパク質を投与することによる様々な不妊症疾患を処置する方法を対象とする。本発明の好ましい側面において、Ｋｉｓｓ−１及びそれ由来のペプチドは、視床下部下垂体性腺（Ｈ−Ｐ−Ｇ）軸の調節、及び様々なホルモン、例えば黄体形成放出ホルモン（ＬＨＲＨ）（ＧｎＲＨとしても知られている）、ＦＳＨ、ＬＨ、並びに性腺ステロイド、例えばエストロゲン及びテストステロン、の産生及び血中濃度の調節に用いることができることが見出された。具体的実施例において、Ｋｉｓｓ−１タンパク質由来のＧＰＣＲ５４のアゴニストが、ＦＳＨ及び／又はＬＨの産生及び放出を刺激することが実証された。例えば、本発明者によって、配列番号：３の１０アミノ酸ＲＦアミドの単一投与は、ＧｎＲＨと同様にＬＨ及びＦＳＨを産生させるのに十分であることが示された。重要なことには、この知見は、ＦＳＨ産生の誘導のレベルが、治療として適切な範囲内であることを明らかにする。Ｈ−Ｐ−Ｇ軸は生殖システム（例えば、思春期のタイミング、受精の持続、及び更年期の開始の時が挙げられるが、これらに限定されない）の様々な側面において関連しているので、本発明の刺激薬は、様々な生殖疾患の処置に用いることができる。以下の部分は、不妊症の処置に有用であり得る、Ｋｉｓｓ−１タンパク質及びそれから得ることのできる化合物の説明を目的とする。
【００２６】
Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）は、膜受容体の大きなファミリーである。このファミリーに属する多くの遺伝子が同定されてきたが、多くの場合、それらのリガンド及び機能は依然として未解明である。ＧＰＣＲ５４は、ラットの脳から最初にクローニングされ、ラットの中枢神経系、例えば視床下部、中脳、橋、骨髄、海馬、及びへんとうで広く発現していることが見出されたオーファンＧＰＣＲの１つである。ヒトＧＰＣＲ５４をコードする遺伝子は、第二染色体にマップされる細菌人工染色体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ０２３５８３）中に存在する。最近、胎盤組織抽出物が、ＧＰＣＲ５４のアゴニストである転移抑制因子遺伝子ＫｉＳＳ−１（配列番号：１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２２５６及びＳｗｉｓｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ１５７２６を参照）に由来する活性ペプチドを含むことが示された（Ｋｏｔａｎｉ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（３７）：３４６３１−３４６３６，２００１）。Ｋｏｔａｎｉにおいて記載されたペプチド（キスペプチン（ｋｉｓｓｐｅｐｔｉｎ）と呼ばれる）は、５４−、１４−、及び１３−アミノ酸長（それぞれ、配列番号：４、配列番号：５、及び配列番号：６）であり、Ｃ−末端にＲＦ−アミドを含んでいた。これらのペプチドは、完全長のＫｉｓｓ−１タンパク質（配列番号：２）から得られる。本発明は、Ｋｉｓｓ−１を含んで成る組成物を最初に記載し、そしてキスペプチンは、不妊症の処置及びゴナドトロピン（特に、ＦＳＨ及び／又はＬＨ）の産生及び／又は放出の増強に用いることができる。
【００２７】
本明細書中で用いる場合、「Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質」という用語は、配列番号：２の配列から得られる任意のタンパク質を包含することが意図され、配列番号：２のフラグメント、又はＧＰＣＲ５４受容体又はＧＰＣＲ５４受容体の変異体に対して任意のアゴニスト作用を有する配列番号：２のタンパク質のアナログ若しくは保存的変異体である。本発明において、Ｋｉｓｓ−１由来のＹＮＷＮＳＦＧＬＲＦ（配列番号：３）の配列を有するペプチドは、不妊症の処置において用いることのできる特に好ましいキスペプチンである。しかし、配列番号：２の任意の変異体、アナログ又はフラグメントは、本発明の方法において用いることができることが理解されるべきである。実際、５アミノ酸長のＫｉｓｓ−１タンパク質由来のＲＦアミドペプチドが、ＧＰＣＲ５４のアゴニストとしての活性を有することが見いだされた。従って、ＦＧＬＲＦ（配列番号：７）；ＳＦＧＬＲＦ（配列番号：８）；ＮＳＦＧＬＲＦ（配列番号：９）；ＷＮＳＦＧＬＲＦ（配列番号：１０）；ＮＷＮＳＦＧＬＲＦ（配列番号：１１）などの配列、又は受容体ゴニスト活性を有するそれらの変異体若しくはアナログが、本発明において有用であることを考慮する。
【００２８】
本明細書において有用であり得る他の具体的なキスペプチンとしては、配列番号：１のアミノ酸９３−１２１を有するＫｉｓｓ−１のフラグメント（ここで、フラグメントのＣ−末端は配列番号：１の１２０−１２１の位置のＲＦから得られるＲＦアミドである）；配列番号：１のアミノ酸１０６−１２１を有するＫｉｓｓ−１のフラグメント（ここで、フラグメントのＣ−末端は配列番号：１の１２０−１２１の位置のＲＦから得られるＲＦアミドである）、配列番号：１のアミノ酸１０８−１２１を有するＫｉｓｓ−１のフラグメント（ここで、フラグメントのＣ−末端は配列番号：１の１２０−１２１の位置のＲＦから得られるＲＦアミドである）、配列番号：１のアミノ酸６８−１２１を有するＫｉｓｓ−１のフラグメント（ここで、フラグメントのＣ−末端は配列番号：１の１２０−１２１の位置のＲＦから得られるＲＦアミドである）；配列番号：１のアミノ酸９４−１２１を有するＫｉｓｓ−１のフラグメント（ここで、フラグメントのＣ−末端は配列番号：１の１２０−１２１の位置のＲＦから得られるＲＦアミドである）；配列番号：１のアミノ酸１０７−１２１を有するＫｉｓｓ−１のフラグメント（ここで、フラグメントのＣ−末端は配列番号：１の１２０−１２１の位置のＲＦから得られるＲＦアミドである）；配列番号：１のアミノ酸１０９−１２１を有するＫｉｓｓ−１のフラグメント（ここで、フラグメントのＣ−末端は配列番号：１の１２０−１２１の位置のＲＦから得られるＲＦアミドである）；配列番号：１のアミノ酸１１２−１２１を有するＫｉｓｓ−１のフラグメント（ここで、フラグメントのＣ−末端は配列番号：１の１２０−１２１の位置のＲＦから得られるＲＦアミドである）；及び配列番号：１のアミノ酸１１４−１２１を有するＫｉｓｓ−１のフラグメント（ここで、フラグメントのＣ−末端は配列番号：１の１２０−１２１の位置のＲＦから得られるＲＦアミドである）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
好ましい実施態様において、ペプチドは、配列番号：１のアミノ酸１１０−１２１；配列番号：１のアミノ酸１０９−１２１、配列番号：１の１０８−１２１；配列番号：１の１０７−１２１；配列番号：１の１０６−１２１；配列番号：１の１０５−１２１；配列番号：１の１０４−１２１；配列番号：１の１０３−１２１；配列番号：１の１０２−１２１；配列番号：１の１０１−１２１；配列番号：１の１００−１２１；配列番号：１の９９−１２１；配列番号：１の９８−１２１；配列番号：１の９７−１２１；配列番号：１の９６−１２１；配列番号：１の９５−１２１；配列番号：１の９４−１２１；配列番号：１の９３−１２１；配列番号：１の９２−１２１；配列番号：１の９１−１２１；配列番号：１の９０−１２１；配列番号：１の８９−１２１；配列番号：１の８８−１２１；配列番号：１の８７−１２１；配列番号：１の８６−１２１；配列番号：１の８５−１２１；配列番号：１の８４−１２１；配列番号：１の８３−１２１；配列番号：１の８２−１２１；配列番号：１の８１−１２１；配列番号：１の８０−１２１；配列番号：１の７９−１２１；配列番号：１の７８−１２１；配列番号：１の７７−１２１；配列番号：１の７６−１２１；配列番号：１の７５−１２１；配列番号：１の７４−１２１；配列番号：１の７３−１２１；配列番号：１の７２−１２１；配列番号：１の７１−１２１；配列番号：１の７０−１２１；配列番号：１の６９−１２１；配列番号：１の６８−１２１；配列番号：１の６７−１２１；配列番号：１の６６−１２１；配列番号：１の６５−１２１；配列番号：１の６４−１２１；配列番号：１の６３−１２１；配列番号：１の６２−１２１；配列番号：１の６１−１２１；配列番号：１の６０−１２１；配列番号：１の５９−１２１；配列番号：１の５８−１２１；配列番号：１の５７−１２１；配列番号：１の５６−１２１；配列番号：１の５５−１２１；配列番号：１の５４−１２１；配列番号：１の５３−１２１；配列番号：１の５２−１２１；配列番号：１の５１−１２１；配列番号：１の５０−１２１；配列番号：１の４９−１２１；配列番号：１の４８−１２１；配列番号：１の４７−１２１；配列番号：１の４６−１２１；配列番号：１の４５−１２１；配列番号：１の４４−１２１；配列番号：１の４３−１２１；配列番号：１の４２−１２１；配列番号：１の４１−１２１；配列番号：１の４０−１２１；配列番号：１の３９−１２１；配列番号：１の３８−１２１；配列番号：１の３７−１２１；配列番号：１の３６−１２１；配列番号：１の３５−１２１；配列番号：１の３４−１２１；配列番号：１の３３−１２１；配列番号：１の３２−１２１；配列番号：１の３１−１２１；配列番号：１の３０−１２１；配列番号：１の２９−１２１；配列番号：１の２８−１２１；配列番号：１の２７−１２１；配列番号：１の２６−１２１；配列番号：１の２５−１２１；配列番号：１の２４−１２１；配列番号：１の２３−１２１；配列番号：１の２２−１２１；配列番号：１の２１−１２１；配列番号：１の２０−１２１；配列番号：１の１９−１２１；配列番号：１の１８−１２１；配列番号：１の１７−１２１；配列番号：１の１６−１２１；配列番号：１の１５−１２１；配列番号：１の１４−１２１；配列番号：１の１３−１２１；配列番号：１の１２−１２１；配列番号：１の１１−１２１；配列番号：１の１０−１２１；配列番号：１の９−１２１；配列番号：１の８−１２１；配列番号：１の７−１２１；配列番号：１の６−１２１；配列番号：１の５−１２１；配列番号：１の４−１２１；配列番号：１の３−１２１；配列番号：１の２−１２１；配列番号：１の１−１２１を含んで成ることができる。
【００３０】
本発明の特に好ましいペプチドは、配列番号：３の配列を有するぺプチドである。しかし、なおも配列番号：３のペプチドの三次元配座構造を保持し、そして／或いはＧＰＣＲ５４受容体のアゴニスト並びに／又はＦＳＨ及び／若しくはＬＨ産生の刺激薬としての配列番号：３のペプチドの機能活性を保持する、このペプチドのアミノ酸残基の保存的置換も生み出すことができることも考慮する。本明細書中で用いる場合、「保存的置換」という用語は、疎水性、親水性、陽イオン電荷、陰イオン電荷、形、極性、配座傾向などに関して生物学的に類似した別の残基による、アミノ酸残基の置換を意味する。保存的置換の例としては、１つの疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン又はメチオニンの別のものへの置換、或いは１つの極性残基の別のものへの置換、例えばアルギニンのリジンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、又はグルタミンのアスパラギンへの置換などが挙げられる。互いに置換することのできる中性親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン及びスレオニンが挙げられる。「保存的置換」という用語は、置換ポリペプチドに対して上昇した抗体が非置換ポリペプチドとも免疫反応をするならば、非置換親アミノ酸の代わりとしての置換又は修飾アミノ酸の使用も含む。「置換」又は「修飾」により、本発明は、天然のアミノ酸を変え又は修飾したこれらのアミノ酸を含む。
【００３１】
このように、本発明との関連においては、保存的置換は、１つのアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸への置換として当業界では認識されることを理解すべきである。典型的な保存的置換が説明されている。例えば、或いは、保存的なアミノ酸は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒにおいて説明されているようにグループ化することができる［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１−７７］。当業者は、具体的な保存的置換を示す多くの表を知っている。１つの典型的なそのような表を以下に提供する：
【００３２】
【表１】
2007533748.tif 000002
【００３３】
ＹＮＷＮＳＦＧＬＲＦ（配列番号：３）の任意の保存的変異体は、そのような変異体がＧＰＣＲ５４のアゴニストの特性、そして／或いはＦＳＨ及び／又はＬＨの産生を刺激する能力を保持する限り、本発明の有用なペプチドであると考慮される。このような活性は、以下の本明細書中で記載するように容易に評価することができる。
【００３４】
他の新規なペプチドとしては、類似の配座傾向を有する、上記の本明細書中で議論した任意の配列の突然変異体が挙げられる。アミノ酸の配座傾向の類似性は、以下の表で示すように、それらのＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットを比較することにより得ることができる：
【００３５】
【表２】
2007533748.tif 000003
【００３６】
ペプチドの基本的なアミノ酸構造に加えて、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質／ペプチドは、それらの吸収、循環、及び／又はペプチドを治療上より効果的にする他の修飾を強化するために修飾することができることを考慮する。例えば、キスペプチン及びＫｉｓｓ−１由来タンパク質が、中枢神経系、及び恐らく血液脳関門内の部位に作用することによる受精関連ホルモンの刺激に対して有益な効果を有することが、ここで発見された。従って、ペプチド／タンパク質のＨ−Ｐ−Ｇ軸内の部位へのターゲティング／取り込みを可能にする任意の修飾が有用である。
【００３７】
例えば、ペプチドの効果を長引かせるために、その分解を妨げることが望ましい。これは、非加水分解性ペプチド結合（当業界で知られている）を、そのような結合を含むペプチドを合成するための手順と共に使用することより達成することができる。非加水分解性結合としては、−−［ＣＨ2ＮＨ］−−還元アミドペプチド結合、−−［ＣＯＣＨ2］−−ケトメチレンペプチド結合、−−［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−−（シアノメチレン）アミノペプチド結合、−−［ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）］−−ヒドロキシエチレンペプチド結合、−−［ＣＨ2Ｏ］−−ペプチド結合、及び−−［ＣＨ2Ｓ］−−チオメチレンペプチド結合（例えば、米国特許第６，１７２，０４３号を参照）、及びペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）が挙げられる。ペプトイドは、注目の薬剤の最適な吸収に用いることができるＮ置換グリシンである。ペプトイドは、陽イオン性脂質様化合物を作るのに用いられ（Ｍｕｒｐｈｙ他，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１５１７，１９９８）、標準的な方法を用いて合成することができる（例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ他  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０６４６，１９９２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ他  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４０：４９７，１９９２）。陽イオン性脂質及びペプトイド、リプトイド（ｌｉｐｔｏｉｄ）の組み合わせは、対象の組成物の最適な吸収に用いることもできる（Ｈｕｎａｇ他  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．５：３４５，１９９８）。リプトイドは、ペプトイドを合成すること、及びアミノ末端サブモノマーをそのアミノ基により脂質に結合することにより合成することができる（Ｈｕｎａｇ他  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．５：３４５，１９９８）。当業者は、例えば米国特許公開第２００３０１８７１８８号（引用文献により本明細書中に組み込まれる）を参照する。これは、ペプトイド置換化合物の合成について記載する。セリンプロテアーゼ阻害剤を含むペプトイドを作る方法は、米国特許第６，５４８，６３８号；米国特許公開第２００３０１７６６４２号（引用文献により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
【００３８】
本発明において有用なＫｉｓｓ−１由来タンパク質は、直鎖、又は環状であることができ、或いは自然又は合成手段により環化することができる。例えば、システイン残基の間のジスルフィド結合は、ペプチド配列を環化することができる。二官能性試薬は、ペプチドの２以上のアミノ酸の間の結合を提供することができる。ペプチドを環化するための他の方法、例えばＡｎｗｅｒ他（Ｉｎｔ．Ｊ  Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３６：３９２−３９９，１９９０）及びＲｉｖｅｒａ−−Ｂａｅｚａ他（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ３０：３２７−３３３，１９９６）により説明されているものも、当業界で知られている。
【００３９】
論理的薬剤設計は、現在知られている生物活性Ｋｉｓｓ−１由来のポリペプチドの構造的アナログを産生するのに用いることができる。このようなアナログを作ることにより、天然の分子より活性があり又は安定なＫｉｓｓ−１由来タンパク質、改変に対する異なった感受性を有するＫｉｓｓ−１由来タンパク質、又は様々な他の分子の機能に影響し得るＫｉｓｓ−１由来タンパク質を作り出すことができる。１つのアプローチにおいて、注目のＫｉｓｓ−１由来タンパク質又はそのフラグメントに対する三次元構造を生み出す。例えば、これは、ｘ−線結晶学、コンピューターモデリング又は双方のアプローチの組み合わせにより達成することができる。代替方法である、「アラニンスキャン」は、分子中の残基のアラニンによるランダムな置換を伴い、得られる機能への影響を決定する。
【００４０】
Ｋｉｓｓ−１とその配列アナログ、例えば異なる種からのもの又は関連するリガンドファミリーのものとのマルチプルシークエンスアラインメントは、論理的置換の更なるガイダンスを提供する。Ｋｉｓｓ−１配列中の残基は、異なる種又は関連するリガンドファミリーからの関連配列からの対応する残基により置換することができる。
【００４１】
機能分析により選択したＫｉｓｓ−１の特異的抗体を単離し、その結晶構造を解析することもできる。原理上は、このアプローチは、その後の薬剤設計のベースとすることのできるファーマコアを生み出す。機能的な薬理活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体を生み出すことにより、タンパク質結晶学全体にバイパスをつけることができる。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は、元の抗原のアナログであると予測される。次に、抗イディオタイプは、化学的又は生物学的に生成されたペプチドのバンクからペプチドを同定し、単離することができる。選択されたペプチドは、次にファーマコアとして役立つ。抗イディオタイプは、Ｋｉｓｓ−１に特異的な抗体を産生し、次に抗原としてそのような抗体を用いることにより、生み出すことができる。
【００４２】
従って、向上したＫｉｓｓ−１由来タンパク質の活性を有するか、又はＫｉｓｓ−１タンパク質若しくはＧＰＣＲ５４受容体の刺激物質、アゴニストとして作用する薬剤をデザインすることができる。クローニングしたＫｉｓｓ−１配列の利用可能性によって、十分な量の様々なＫｉｓｓ−１由来タンパク質を、結晶学的試験を実施するために産生することができる。更に、ポリペプチド配列の知識は、コンピューターを利用した構造−機能の関連性の予測を可能にする。
【００４３】
更に、安定化構造又は減少した生分解を提供するＫｉｓｓ−１由来タンパク質の非ペプチドアナログも考慮する。Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質に基づいて、注目のタンパク質の１又は複数のアミノ酸残基を非ペプチド部分により置換することによって、ペプチド模倣アナログを調製することができる。好ましくは、非ペプチド部分は、そのペプチドが、自然配座を保持し、又は好ましい（例えば、生物活性）配座を安定化することを可能にする。ペプチドからの非ペプチド模倣アナログを調製するための方法の１つの例は、Ｎａｃｈｍａｎ他，Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．５７：３５９−３７０（１９９５）に記載されている。本明細書で用いるペプチドは、前記の全てを包含する。
【００４４】
本発明の治療方法において用いるＫｉｓｓ−１由来タンパク質は、それらの治療有効性を向上させるために修飾することができる。治療化合物のそのような修飾は、毒性を減少させ、循環時間を増大させ、又は生体内分布を変えるのに用いることができる。例えば、潜在的に重要な治療化合物の毒性は、生体内分布を変える様々な薬剤担体賦形剤との組み合わせにより、顕著に減少させることができる。素晴らしい例は、最近承認されたＷｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ化学療法薬であるＭｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）である。それは、ＣＤ３３（特定の白血病細胞の表面上に見出される）を標的とした抗体に結合した、有力な細胞毒性薬であるカリケアマイシンから構成される。この抗体−薬剤複合体は、遊離薬剤に対して劇的に向上した治療指数を有した。Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質は、下垂体に作用してＦＳＨの産生及び／又は放出を刺激することにより、Ｈ−Ｐ−Ｇ軸への治療効果を有する。このように、ペプチドを取り込まれるようにし、Ｈ−Ｐ−Ｇ軸に沿った効果を有する任意の修飾が有用である。
【００４５】
薬剤生存率を向上させるためのストラテジーは、水溶性ポリマーの利用である。生体内分布を変え、細胞吸収の様式を改善し、生理学的バリアーの透過性を変え、そして体からのクリアランスの程度を変えるための、様々な水溶性ポリマーが示されてきた。（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ他，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒａｐ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２０００；１７：１０１−１６１；Ｋｏｐｅｃｅｋ他，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．，７４：１４７−１５８，２００１）。ターゲティング又は持続放出効果のどちらかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖上のペンダント基として薬剤部分を含む水溶性ポリマーが合成されてきた。
【００４６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、薬剤担体として広く用いられており、高度な生体適合性及び修飾の容易性を与える。Ｈａｒｒｉｓ他，Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２００１；４０（７）：５３９−５１。様々な薬剤、タンパク質、及びリポソームへの付着は、滞留時間を改善し、毒性を軽減することが示されてきた。（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ他，ＣｒｉｔＲｅｖ  Ｔｈｅｒａｐ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２０００；１７：１０１−１６１；Ｚａｌｉｐｓｋｙ他，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１９９７；８：１１１−１１８）。ＰＥＧは、鎖の末端のヒドロキシル基により、そして他の化学的方法により活性物質と結合することができる；しかし、ＰＥＧ自身は、１分子あたり多くとも２つの活性物質に限定される。異なるアプローチにおいて、ＰＥＧの生体適合特性を保持しているが、１分子あたりに多くの付着ポイントの付加的利点を有し（より大きな薬剤充填を提供する）、そして様々な適用に適するように合成的に設計することのできる新規の生体材料として、ＰＥＧとアミノ酸の共重合体が探索された（Ｎａｔｈａｎ他，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．１９９２；２５：４４７６−４４８４；Ｎａｔｈａｎ他，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ．１９９３；４：５４−６２）。
【００４７】
当業者は、薬剤の効果的な修飾のためのＰＥＧ化技術を知っている。例えば、ＰＥＧ及び三官能性モノマー、例えばリジン及びシステインの交互ポリマーからなる薬剤送達ポリマーが、ＶｅｃｔｒａＭｅｄ（Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、ＮＪ）又はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ（ＮＪ）により用いられてきた。ＰＥＧ鎖（典型的には、２０００ダルトン又はそれ未満）は、安定なウレタン結合により、リジンのａ−及びｅ−アミノ基と結合する。このような共重合体は、ＰＥＧの所望の特性を保持し、同時にポリマー鎖に沿って、厳格に制御された所定の間隔で反応性ペンダント基（リジンのカルボン酸基）を提供する。反応性ペンダント基は、誘導体化、架橋、又は他の分子との複合に用いることができる。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧ部分の分子量、及び薬剤とポリマーとの間の開裂可能な結合を変えることにより、安定で長期循環するプロドラッグを生成するのに有用である。ＰＥＧ部分の分子量は、薬剤／結合基複合体の間隔、及び複合体の分子量あたりの薬剤の量（より少ないＰＥＧ部分は、より多くの薬剤充填を提供する）に影響する。一般的に、ブロック共重合体複合体の全体の分子量の増大は、複合体の循環半減期を増大させるだろう。それにもかかわらず、複合体は、容易に分解され、又は閾値を制限した糸球体濾過未満（例えば、４５ｋＤａ未満）の分子量を有しなければならない。従って、本発明のＰＥＧ化Ｋｉｓｓ−１由来ペプチドは、好ましくは２０ｋＤａ〜３５ｋＤａの分子量の範囲であるべきである。
【００４８】
薬剤の効果的な修飾は、ＰＥＧ化技術に限定されない。分子のグリコシル化、別の分子、例えば抗体又はヒト血清アルブミン又はその組み合わせへの融合は、より効果的又は効率的な薬物送達を容易にするのに用いることができる他の修飾の例である。
【００４９】
更に、循環半減期の保持、及び生体内分布において重要なポリマー骨格に対して、特定のトリガー（典型的には、標的組織における酵素活性）により骨格ポリマーから放出されるまで、治療剤をプロドラッグの形態で保持するのに、リンカーを用いることができる。例えば、生体内分布の特定部位への送達が必要であり、治療剤が病変の部位又はその近くで放出される場合に、このタイプの組織活性化薬物送達が特に有用である。活性化薬剤送達における使用のための結合基ライブラリーは、当業者に知られており、酵素動力学、活性酵素の普及、及び選択された疾患特異的な酵素の開列特異性に基づくことができる（例えば、ＶｅｃｔｒａＭｅｄ（Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ＮＪ）によって確立された技術を参照）。このようなリンカーは、治療送達のために本明細書中に記載したＫｉｓｓ−１由来タンパク質を修飾する際に用いることができる。
【００５０】
Ｋｉｓｓ−１由来ペプチドを作る方法
本発明は、不妊症の処置のための薬物における使用のためのタンパク質及びペプチドを提供する。このようなタンパク質又はペプチドは、従来の自動ペプチド合成法又は組み換え発現により産生することができる。タンパク質を設計し作るための一般的な原理は、当業者に周知である。
【００５１】
Ａ．自動固相ペプチド合成
本発明のペプチド又は実際に完全長のＫｉｓｓ−１でさえも、従来技術に従って、溶液中又は固体支持体上で合成することができる。様々な自動合成機は商業的に入手可能であり、既知のプロトコルに従って利用することができる。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，（１９８４）；Ｔａｍ他，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１０５：６４４２，（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：３４１−３４７，（１９８６）；及び Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１−２８４，（１９７９）を参照（各々は、引用文献により本明細書中に組み込まれる）。本発明の新規のＫｉｓｓ−１由来タンパク質は、容易に合成し、ＧＰＣＲ５４レセレプター結合／活性分析においてスクリーニングすることができる。
【００５２】
例えば、ペプチドは、典型的なペプチド合成機、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＩｎｃのＭｏｄｅｌ ４３３Ａを用いて、固相技術により合成することができる。自動ペプチド合成又は組み換え方法により作り出された任意の所定のペプチド基質の純度は、逆相ＨＰＬＣ分析を用いて決定することができる。各ペプチドの化学的信頼性は、当業者に周知の任意の方法により確立することができる。好ましい実施態様において、その信頼性は、質量分析により確立することができる。更に、マイクロ波加水分解を実施する、アミノ酸分析を用いて、ペプチドを定量することができる。このような分析は、電子レンジ、例えばＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ’ｓ ＭＤＳ ２０００電子レンジを用いることができる。ペプチド（およそ、２μｇのタンパク質）は、例えば、およそ０．５％（体積に対する体積）フェノール（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）を含む６Ｎ ＨＣｌ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｂｏｉｌｉｎｇ  例えば約４ｍｌ）と接触させる。加水分解の前に、試料をＮ2で交互に排出し流す。タンパク質の加水分解は、２段階の工程を用いて実施する。第一段階の間、ペプチドは約１００℃の反応温度を受け、１分間その温度を保つ。この段階の直後に、温度を１５０℃まで上げ、その温度で約２５分間保つ。冷却後に、試料を乾燥させ、加水分解ペプチド試料からのアミノ酸を６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートを用いて誘導体化し、３９５ｎｍで蛍光を発する安定な尿素を得る（Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃｃＱ  Ｔａｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐａｃｋａｇｅ）。試料を逆相ＨＰＬＣにより分析し、強化した積分器を用いて定量化を達成することができる。
【００５３】
Ｂ．組み換えタンパク質の産生
自動ペプチド合成の代わりとして、組み換えＤＮＡ技術を用いることができる。ここで、以下の本明細書中に記載するように、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトし、発現に適した条件下で培養する。組み換え法は、本発明のペプチド配列を含んで成るより長いポリペプチドを産生するのに特に好ましい。
【００５４】
様々な発現ベクター／宿主系を利用して、ペプチド又はタンパク質をコードする配列を含み発現させることができる。これらとしては、微生物、例えば組み換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターを形質転換した細菌；酵母発現ベクターを形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）をトランスフェクションした、又は細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）を形質転換した植物細胞系；又は動物細胞系が挙げられるが、それらに限定されない。組み換えタンパク質の産生に有用な哺乳動物細胞としては、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２及び２９３細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細菌、酵母及び他の無脊椎動物におけるペプチド基質又は融合ポリペプチドの組み換え発現のための典型的なプロトコルは、当業者に知られており、以下の本明細書中で簡潔に説明する。
【００５５】
原核細胞宿主における使用のための発現ベクターは、一般的に１又は複数の表現型の選択可能なマーカー遺伝子を含んで成る。このような遺伝子は一般的に、例えば抗生物質耐性を与える又は栄養要求性を供給するタンパク質をコードする。様々なこのようなベクターは、商業的供給源から容易に入手可能である。例としては、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＰＲＯＥＸベクター（ＬＴＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が挙げられる。所定のペプチド基質又は融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列はＰＣＲにより増幅され、このようなベクター、例えばベクターによりコードされたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含んで成る融合タンパク質、及びベクターのクローニングサイトに挿入されたＤＮＡフラグメントによりコードされたタンパク質を産生するように設計されたｐ−ＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にクローングする。ＰＣＲのためのプライマーは、例えば適切な開列部位を含むように作り出すことができる。トロンビン又はファクターＸａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｓｉｃａｔｗａｙ，ＮＪ）を有する組み換え融合タンパク質の処理は、融合タンパク質を開列して、ＧＳＴ部分から基質又はポリペプチドを含む基質を放出すると予想される。ｐＧＥＸ−３Ｘ／Ｋｉｓｓ−１ペプチドコンストラクトを、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）に形質転換し、個々の形質転換体を単離し、生育した。個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、自動シークエンサーを用いて部分的にシークエンスし、所望のペプチド又はポリペプチドをコードする適切な方向の核酸インサートの存在を確認する。ＧＳＴ／Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質の融合タンパク質が、水溶性タンパク質として細菌中で産生される場合、それはＧＳＴ精製モジュール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製することができる。
【００５６】
或いは、融合ポリペプチドを含む予測された基質をコードするＤＮＡ配列は、所望のプロモーター及び、任意でリーダー配列を含むプラスミド内にクローニングすることができる（例えば、Ｂｅｔｔｅｒ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１−４３，１９８８を参照）。このコンストラクトの配列は、自動シークエンシングにより確認することができる。次にプラスミドは、細菌のＣａＣｌ2インキュベーション及びヒートショック処理を用いる標準的な手順を用いて、Ｅ．コリに形質転換する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，ｓｕｐｒａ）。形質転換した細菌は、カルベニシリンを添加したＬＢ培地中で成育し、発現タンパク質の産生を適切な培地中での生育により誘導する。もし存在するならば、リーダー配列は、成熟Ｋｉｓｓ−１ペプチド又は融合タンパク質の分泌をもたらし、分泌の間に開裂する。
【００５７】
分泌された組み換えタンパク質は、本明細書を通して記載した方法により細菌培地から精製する。酵母宿主細胞における組み換えタンパク質のための類似の系は、容易に商業的に入手可能であり、例えばピチア属発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）である（製造業者の指示に従う）。別の代わりの組み換え体産生は、昆虫系を用いて達成することができる。タンパク質発現のための昆虫系は当業者に周知である。このような系の１つにおいて、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、外来遺伝子をヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞又はトリコプルシア・ラルバエ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅ）において発現するためのベクターとして用いる。Ｋｉｓｓ−１をコードする配列は、ウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子内にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置く。Ｋｉｓｓ−１の成功した挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、コートタンパク質を欠く組み換えウイルスを産生する。組み換えウイルスは、Ｋｉｓｓ−１を発現するヨトウガ細胞又はトリコプルシア・ラルバエを感染させるのに用いる（Ｓｍｉｔｈ他，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ４６：５８４，１９８３；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ ＥＫ他，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：３２２４−７，１９９４）。
【００５８】
組み換えタンパク質の発現のための哺乳動物宿主系も、当業者に周知である。宿主細胞株は、発現タンパク質をプロセシングし又はタンパク質活性を提供する際に有用な特定の翻訳後修飾をもたらす特定の能力を求めて、選択することができる。ポリペプチドのこのような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ（ｐｒｅｐｒｏ）」形態を開裂する翻訳後プロセシングも、正確な挿入、折り畳み及び／又は機能に重要であり得る。異なる宿主細胞、例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などは、そのような翻訳後活性のための特異的な細胞機構及び特徴のある機構を有し、導入された外来タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを確実にするように選択することができる。
【００５９】
形質転換細胞は、長期間の高収量のタンパク質産生に用いることが好ましく、そのような安定な発現が望ましい。いったんこのような細胞に、所望の発現カセットとともに選択可能なマーカーを含むベクターを形質転換したら、細胞を選択培地に移す前に、それらを富栄養培地中で１〜２日間生育することができる。選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与えるように設計され、その存在は、導入した配列をうまく発現する細胞の成育及び回収を可能にする。安定的に形質転換した細胞の耐性群は、その細胞に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【００６０】
多くの選択系を、組み換えタンパク質産生のために形質転換した細胞を回収するのに用いることができる。このような選択系としては、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、又はａｐｒｔ−細胞のそれぞれにおける）が挙げられるが、それらに限定されない。また、抗−代謝産物耐性は、ｄｈｆｒ（これはメトトレキサートに対する耐性を与える）；ｇｐｔ（これはミコフェノール酸に対する耐性を与える）；ｎｅｏ（これはアミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を与える）；ａｌｓ（これはクロルスルフロンに対する耐性を与える）；及びｈｙｇｒｏ（これはハイグロマイシンに対する耐性を与える）に対する選択の基礎として用いることができる。有用であり得る追加の選択可能な遺伝子としては、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを用いることを可能にする）、又はｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）が挙げられる。形質転換体の同定のための可視指示を与えるマーカーとしては、アントシアニン、ｂ−グルクロニダーゼ及びその基質（ＧＵＳ）、並びにルシフェラーゼ及びその基質（ルシフェリン）が挙げられる。
【００６１】
Ｃ．組み換えタンパク質産生のための発現コンストラクト
本発明のＫｉｓｓ−１由来タンパク質の組み換え産生において、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含んで成るベクターを用いることが必要であろう。このようなベクターを調製する方法及びこのようなベクターを形質転換した宿主細胞を産生する方法は、当業者に周知である。このような試みにおいて用いられるポリヌクレオチド分子は、宿主内での増殖のために、選択可能なマーカー及び複製起点を一般的に含むベクターに結合することができる。発現コンストラクトのこれらのエレメントは、当業者に周知である。一般的に、発現ベクターは、適切な転写又は翻訳制御配列、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス、又は昆虫の遺伝子から得られたものに作用可能に結合した所定のタンパク質をコードするＤＮＡを含む。制御配列の例としては、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写及び翻訳を制御する適切な配列が挙げられる。
【００６２】
「発現ベクター」、「発現コンストラクト」又は「発現カセット」という用語は、本明細書を通して交換可能に使用され、一部又は全部の核酸コード配列が転写されることのできる、遺伝子産物をコードする核酸を含む遺伝子コンストラクトの任意のタイプを含むことが意図されている。
【００６３】
本発明のペプチド又はポリペプチドの発現のための適切な発現ベクターの選択は、もちろん用いる具体的な宿主細胞に依存し、当業者の技術の範囲内である。哺乳動物の発現ベクターの構築のための方法は、例えばＯｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ（ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９８３））；Ｃｏｓｍａｎ他（ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５（１９８６））；Ｃｏｓｍａｎ他（Ｎａｔｕｒｅ３１２：７６８（１９８４））；ＥＰ−Ａ−０３６７５６６；及びＷＯ９１／１８９８２において開示されている。
【００６４】
発現コンストラクトは、ペプチド又はポリペプチドの発現の検出を可能にする選択可能なマーカーを更に含んで成ることができる。通常、薬物選択マーカーの包含は、クローニング及び形質転換体の選択において助けとなり、例えばネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ゼオシン及びヒスチジノールである。或いは、酵素、例えば単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）（真核生物）、ｂ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ） （原核生物）を用いることができる。免疫学的マーカーも用いることができる。例えば、エピトープ標識、例えばＦＬＡＧ系（ＩＢＩ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）、ＨＡ及び６ｘＨｉｓ系（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いることができる。更に、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）又はマルトース結合タンパク質系（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）も用いることができる。遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現することができれば、用いる選択可能なマーカーは重要であるとは信じられていない。選択可能なマーカーの更なる例は、当業者に周知である。
【００６５】
発現には、適切なシグナルがベクター中に提供されることが必要であり、例えば宿主細胞中で注目の核酸を発現させるのに用いることのできる、ウイルス及び哺乳動物起源の双方からのエンハンサー／プロモーターである。通常、発現する核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の具体的な転写を開始するのに必要な、細胞の合成機構により認識される、又は合成機構が導入されたＤＮＡ配列を指す。ヌクレオチド配列は、制御配列がペプチド基質又は融合ポリペプチドをコードするＤＮＡと機能的に関連している場合に、作用可能に結合している。従って、プロモーターヌクレオチド配列が所定のＤＮＡ配列の転写を対象としている場合、そのプロモーターヌクレオチド配列はそのＤＮＡ配列と作用可能に結合している。同様に、「転写制御下」という語句は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始及び遺伝子発現を制御する核酸との関連で、正確な位置及び方向に存在していることを意味する。核酸を発現させる任意のプロモーターを用いることができる。標的細胞において核酸の発現を導くことができるならば、注目の核酸配列の発現を制御するのに用いる特定のプロモーターは重要であると信じられていない。従って、ヒト細胞が標的とされている場合、ヒト細胞中で発現することのできるプロモーターの近傍又はその制御下に、核酸コード領域を位置させるのが好ましい。一般的に、このようなプロモーターは、ヒト又はウイルスプロモーターのどちらかを含むことができる。一般的なプロモーターとしては、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復、β-アクチン、ラットインシュリンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター及びグリセルアルデヒド３−リン酸塩デヒドロゲナーゼプロモーターが挙げられる。それらの全ては、当業者に周知のプロモーターであって、且つ容易に入手可能であり、注目のコード配列の高レベルの発現を得るのに用いることができる。発現のレベルが所定の目的に対して十分であれば、注目のコード配列の発現を得るために、当業界で周知の、他のウイルス細胞、哺乳動物細胞又は細菌性ファージプロモーターの使用も考慮する。周知の特性を有するプロモーターを用いることにより、トランスフェクション又は形質転換の後に注目のタンパク質の発現のレベル及びパターンを最適化することができる。誘導性プロモーターも用いることができる。
【００６６】
タンパク質発現において用いられる別の制御エレメントは、エンハンサーである。ＤＮＡの同じ分子上のある距離の場所に位置するプロモーターからの転写を増大させる遺伝学的エレメントが存在する。発現コンストラクトがｃＤＮＡインサートを用いる場合、典型的には、遺伝子転写の適切なポリアデニル化をもたらすポリアデニル化シグナル配列を含むことを望まれる。選択した遺伝子組み換え動物種の細胞により認識される任意のポリアデニル化シグナル配列が、本発明の実施に適している。例えば、ヒト又はウシ成長ホルモン及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。
【００６７】
発現カセットのエレメントとして、ターミネーターも考慮する。これらのエレメントは、メッセージレベルを増大し、カセットから他の配列への読み通しを最小にするのに役立つことができる。適用（例えば本発明により考慮されるもの）のためのターミネーション領域は、比較的交換可能であるようなので、主に用いるターミネーション領域は便宜のために選択されるものであろう。ターミネーション領域は、転写開始とともに天然であることができ、注目のＤＮＡ配列に対して天然であることができ、或いは別の供給源から得ることができる。
【００６８】
Ｄ．部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発は、本発明の方法において用いる個々のＫｉｓｓ−１由来タンパク質の調製において有用な別の技術である。この技術は、基礎のＤＮＡ（これは修飾の標的であるアミノ酸配列をコードする）の特異的突然変異誘発を用いる。この技術は、ＤＮＡ中に１又は複数のヌクレオチド配列の変異を導入することにより、１又は複数の前記の考慮を組み込んで、配列変異体を調製し試験する迅速な能力を更に提供する。部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列、並びに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介した変異体の産生を可能にし、横断される欠失結合部の両側に安定な二重鎖を形成するのに十分な大きさで且つ十分な配列複雑性のプライマー配列を提供する。典型的には、約１７〜２５ヌクレオチド長のプライマーが好ましく、配列の結合部の両側にある、約５〜１０残基が変更される。
【００６９】
この技術は典型的に、一本鎖および二本鎖の双方の形態で存在するバクテリオファージベクターを用いる。部位特異的突然変異誘発において有用な典型的なベクターとしては、例えば、Ｍ１３ファージなどのベクターが挙げられる。これらのファージベクターは、商業的に入手可能であり、それらの使用は一般的に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、部位特異的突然変異誘発において慣用的に使用され、それは、注目の遺伝子をファージからプラスミドへと移入する段階を削除する。
【００７０】
一般的に、部位特異的突然変異誘発技術は、第一に、一本鎖のベクターを得るか、又は所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をその配列内に含む二本鎖ベクターの２つの鎖を融解することにより実施する。所望の変異した配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、合成的に調製する。次に、ハイブリダイゼーション（アニーリング）条件を選択する際に、ミスマッチの程度を考慮しながら、このプライマーを一本鎖ＤＮＡ調製物とアニールさせ、ＤＮＡ重合酵素、例えばＥ．コリポリメラーゼＩＫｌｅｎｏｗフラグメントにかけ、変異を有する鎖の合成を完了する。このようにして、第一の鎖は元の非変異配列をコードし、第二の鎖は所望の変異を有するヘテロ二重鎖を形成する。次に、このヘテロ二重鎖ベクターは、適切な細胞、例えば、Ｅ．コリ細胞を形質転換するために使用し、変異した配列配置（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を有する組換えベクターを含むクローンを選択する。
【００７１】
もちろん、部位特異的突然変異誘発のための上記のアプローチが、潜在的に有用な突然変異ペプチド種を生み出す唯一の方法ではなく、限定することを意図するものではない。本発明は、突然変異誘発を得る他の方法も考慮する。例えば、注目の遺伝子を有する組み換えベクターを突然変異誘発物質、例えばヒドロキシルアミンで処理し、配列変異体を得る。潜在的に有用な突然変異ペプチドを生み出す他の例としては、酵母又はファージディスプレイ法が挙げられる。
【００７２】
Ｅ．タンパク質精製
本発明のペプチドを精製することが望まれるだろう。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、あるレベルにおいて、ポリペプチド及び非ポリペプチド画分への、細胞環境の粗分画を伴う。本発明のペプチド又はポリペプチドを他のタンパク質から分離したら、注目のポリペプチド又はペプチドを、クロマトグラフィー技術及び電気泳動技術を用いて更に精製し、部分的又は完全な精製（又は、均質性への精製）を達成することができる。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動法である。ぺプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＲＬＣ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。
【００７３】
本発明のある側面は、精製、そして特定の実施態様においては、コードされたポリペプチド、タンパク質又はペプチドの実質的な精製に関する。本明細書中で用いる場合、「精製されたポリペプチド、タンパク質又はペプチド」という用語は、他の成分から単離された組成物を指すことが意図されている。ここで、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドは、天然に得られる状態と比較して、任意の程度で精製される。従って、精製されたポリペプチド、タンパク質又はペプチドは、それが自然に生じ得る環境から解放された、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドも指す。
【００７４】
一般的に、「精製された」は、様々な他の成分を取り除くために分画を受けたポリペプチド、タンパク質又はペプチド組成物を指し、その組成物は発現された生物活性を実質的に保持する。「実質的に精製された」という用語が用いる場合、この指示は、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドが組成物の主な成分を形成する組成物を指し、例えば組成物において約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又はそれ以上をタンパク質が構成する。
【００７５】
タンパク質精製における使用に適した様々な技術は、当業者に周知であろう。これらとしては、例えば遠心後の、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などによる又は熱変性による沈殿；クロマトグラフィー段階、例えばイオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト及びアフィニティークロマトグラフィー；等電点電気泳動法；ゲル電気泳動法；及びこのような又は他の技術の組み合わせが挙げられる。一般的に当業界で知られているように、様々な精製段階を実施する順序は変えることができ、又は特定の段階を省略して、更に実質的に精製したポリペプチド、タンパク質又はペプチドを調製するための適切な方法をもたらすことができると信じられている。
【００７６】
キスペプチンのＧＰＣＲ５４受容体アゴニスト活性を決定する方法
上記の本明細書中で示したように、本明細書中で用いるＫｉｓｓ−１由来タンパク質はＧＰＣＲ受容体のアゴニストである。この受容体は当業者により知られており、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０２２９５４１（引用文献により本明細書中に組み込まれている）に記載されている配列によりコードされる。細胞の表面上で発現するこのような受容体をコードする発現コンストラクトを、細胞、例えば哺乳動物細胞にトランスフェクトする方法は、当業界で周知である。（例えば、米国特許第５，０５３，３３７号；同第５，１５５，２１８号；同第５，３６０，７３５号；同第５，４７２，８６６号；同第５，４７６，７８２号；同第５，５１６，６５３号；同第５，５４５，５４９号；同第５，５５６，７５３号；同第５，５９５，８８０号；同第５，６０２，０２４号；同第５，６３９，６５２号；同第５，６５２，１１３号；同第５，６６１，０２４号；同第５，７６６，８７９号；同第５，７８６，１５５号；及び同第５，７８６，１５７号を参照。これらの開示は、それらの全てが引用文献により本出願に組み込まれる。）
【００７７】
このようなトランスフェクションにより産生された細胞は、本明細書中に記載されたＫｉｓｓ−１由来ペプチドの、オーファンＧＰＣＲ５４受容体への結合活性を試験し、この受容体のアゴニストとして役立てるのに容易に用いことができる。（例えば、米国特許第５，０５３，３３７号；同第５，１５５，２１８号；同第５，３６０，７３５号；同第５，４７２，８６６号；同第５，４７６，７８２号；同第５，５１６，６５３号；同第５，５４５，５４９号；同第５，５５６，７５３号；同第５，５９５，８８０号；同第５，６０２，０２４号；同第５，６３９，６５２号；同第５，６５２，１１３号；同第５，６６１，０２４号；同第５，７６６，８７９号；同第５，７８６，１５５号；及び同第５，７８６，１５７号を参照。これらの開示は、それらの全てが引用文献により本出願に組み込まれる。）
【００７８】
「アゴニスト」という用語は、本出願を通して、対象発明の任意のＧＰＣＲ５４受容体の活性を増大させる、任意のＫｉｓｓ−１由来タンパク質、ペプチド又はＫｉｓｓ−１由来タンパク質化合物のペプチド模倣体を指すのに用いる。好ましくは、このような物質は、ＦＳＨ及び／又はＬＨの産生及び／又は放出も刺激する。好ましくは、１つの又は他のこれらのホルモンの放出のこのような刺激は、１つの又は他のこれらのホルモンのＧｎＲＨ刺激放出に匹敵する。これらのペプチドは、ＧｎＲＨ放出を刺激するのにも有用であり得る。
【００７９】
典型的には、トランスフェクトし、ＧＰＣＲ５４受容体を発現する細胞又は細胞の膜調製物を調製して、或いは当該受容体を発現することが知られている細胞から、細胞又は膜調製物を得て、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質とともに、受容体−リガンド結合を可能にする条件下で試験することにより、受容体結合活性を決定する。例示的なこのような条件は、Ｋｏｔａｎｉ他，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（３７）：３４６６１−３４６３６，２００１）において提供される。Ｋｏｔａｎｉ他に記載されている受容体結合試験のような試験に従うことは、試験するＫｉｓｓ−１由来タンパク質の受容体結合活性の決定を容易に可能にするだろう。典型的には、このような活性は、受容体に結合することが知られているキスペプチンの結合に匹敵し得る。
【００８０】
リガンド結合試験
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質の結合特性は、標識リガンド結合試験を用いて試験することができる。例えば、本発明のオーファン受容体を発現する細胞は、例えば標識リガンド結合試験により、Ｋｉｓｓ−１タンパク質の活性を試験するのに用いることができる。例えば、標識キスペプチン、例えば配列番号：４，５又は６のものを、試験する非標識試験Ｋｉｓｓ−１タンパク質、及び結合バッファーと共に、マルチウェルマイクロタイタープレート中で、その受容体を発現する膜調製物又は無傷細胞のどちらかと接触させることができる。結合反応混合物は、何回（ｆｏｒ  ｔｉｍｅｓ）かインキュベートし、温度は、別個の平衡結合試験において最適であるように決定する。典型的には、このような試験はＫｏｔａｎｉ他において与えられている。この反応は、ＧＦ／Ｂフィルターによる濾過、細胞ハーベスターの使用、又は結合リガンドの直接的な測定により止める。リガンドを放射性同位体、例えば3Ｈ、14Ｃ、125Ｉ、35Ｓ、32Ｐ、33Ｐなどで標識した場合は、結合リガンドは、液体シンチレーション計数、シンチレーション近接、又は放射性同位体を検出する任意の他の方法を用いることにより検出することができる。リガンドを蛍光性化合物で標識した場合、結合標識リガンドは、蛍光強度、時間分解蛍光、蛍光偏光、蛍光移動、又は蛍光相関分光法（これらに制限されない）などの方法により測定することができる。この方法において、オーファン受容体に結合するアゴニストＫｉｓｓ−１由来タンパク質を同定することができる。なぜなら、それらが膜タンパク質又は当該受容体を発現する無傷細胞への標識リガンドの結合を阻害するからである。非特異的結合は、高濃度（例えば、１００〜１０００ｘＫD）の非標識リガンドの存在下における膜タンパク質のインキュベーション後に残存する標識リガンドの量として規定される。
【００８１】
平衡飽和結合試験において、オーファン受容体をトランスフェクトした膜調製物又は無傷細胞を、増大する濃度の標識化合物の存在下でインキュベートし、標識リガンドの結合親和性を決定する。非標識化合物の結合親和性は、変動する濃度の置換リガンドの存在下における固定濃度の標識化合物を用いて、平衡競合的結合試験において決定することができる。例えば、本発明のＫｉｓｓ−１由来タンパク質も、ＧＰＣＲ５４受容体結合に関して、配列番号：４，５若しくは６のキスペプチチン又は他のＧＰＣＲ５４受容体の天然のリガンドの競合的阻害剤であり得る。選択されたＫｉｓｓ−１由来タンパク質の相対的結合親和性を決定するために、ＥＬＩＳＡ型アプローチを用いることができる。例えば、ＧＰＣＲ５４受容体に対する結合親和性を調べるために、配列番号：４，５又は６の競合するキスペプチンの連続希釈物、及び亜飽和濃度のｍｙｃエピトープで標識した候補Ｋｉｓｓ−１由来ペプチドを、ＧＰＣＲ５４で被覆したマイクロタイタープレートに添加し、平衡が確立されるまでインキュベートする。次に、プレートを洗い、非結合タンパク質を取り除く。受容体被覆プレートに結合したペプチドは、容易に検出可能な標識、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼと複合した抗ｍｙｃ抗体を用いて検出する。結合親和性（ＥＣ50）は、最大半量（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ）の結合をもたらす、競合Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質の濃度として計算することができる。これらの値は、配列番号：４，５又は６のキスペプチンの試験から得られるものと比較し、試験したＫｉｓｓ−１由来タンパク質の受容体に対する相対的結合親和性を決定することができる。
【００８２】
機能試験
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質を試験して、試験タンパク質がＧＰＣＲ５４受容体に関連する任意のシグナル伝達活性を増大するかを決定することができる。それによりＫｉｓｓ−１由来タンパク質がＧＰＣＲ５４受容体アゴニストであるか決定する。このシグナル応答はＧＰＣＲ５４の二次メッセンジャー応答であり得、例えば塩素イオンチャネル活性化、細胞内カルシウムレベルの変化、イノシトールリン酸の放出、ＭＡＰキナーゼの活性化、ｃＡＭＰレベルの変化、アラキドン酸の放出、又はＧＰＣＲ５４に典型的に関連する他の二次メッセンジャー応答を挙げることができる。
【００８３】
リガンド結合試験の代わりとして、ＧＰＣＲ５４受容体ＤＮＡを発現する細胞を、機能試験による受容体に対するリガンドのスクリーニングに用いることができる。Ｇタンパク質結合受容体の過剰発現が、細胞内シグナル伝達経路の構成的活性化をもたらすことができることは、当業者に周知である。同様の様式において、上記の任意の細胞株におけるオーファン受容体の過剰発現は、下記の機能的応答の活性化をもたらすことができ、本明細書中に記載の任意の試験は、ＧＰＣＲ５４オーファン受容体のアゴニストリガンドとしてのＫｉｓｓ−１由来タンパク質の活性をスクリーニングするのに用いることができる。このように同定したアゴニストは、本発明の治療方法において有用であるだろう。
【００８４】
上記に示したとおり、ＧＰＣＲ受容体リガンドの存在をスクリーニングするために、広範囲な試験を用いることができる。これらの試験は、総イノシトールリン酸蓄積、ｃＡＭＰレベル、細胞内カルシウム動員、及びカリウム電流の伝統的な測定から、例えば；これらの同様な二次メッセンジャーを測定する系であるが、より高いスループットで、より一般的で且つより敏感であるように変更及び適合された系；受容体活性化から生じるより一般的な細胞的事象、例えば代謝変化、分化、細胞分裂/増殖を報告する、細胞に基づいた試験にまで及ぶ。典型的なこのような試験は、米国特許出願公開番号２００３／００２２８３９Ａ１の、具体的には段落０１００〜０１３５に詳細が記載されている。この文書は、本発明のＫｉｓｓ−１由来タンパク質の受容体結合及び機能活性を決定する教示的な方法として、その全てが具体的に組み込まれている。本明細書中に記載の通りに産生した任意のタンパク質又はペプチドは、米国特許出願公開番号２００３／００２８３９号に記載されたもののような試験法において試験し、このようなタンパク質又はペプチドが受容体アゴニスト活性を保持しているかを決定することができる。生み出されたタンパク質又はペプチドがこのような典型的な試験の任意の１つ又は複数において活性を保持していれば（例えば、細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）カルシウムの上昇、又はトランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるＥＲＫのリン酸化）、それは本発明において用いることができる。
【００８５】
不妊症を処置する方法
本明細書を通して記載されているように、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質が、ＦＳＨ及び／又はＬＨの放出を強化、刺激、促進又は別の方法で増大させるのに用いることができることが発見された。このように、配列番号：３の活性に類似した活性を有する任意のＫｉｓｓ−１ペプチド／タンパク質は、不妊症疾患の処置に用いることができる。本明細書中で処置され得る不妊症疾患は、ＦＳＨシグナル、ＬＨシグナル又は双方の量の増大によって利益を享受し得る任意の疾患を含む。好ましくは、本発明の処置方法によりもたらされたＦＳＨ産生の増大は、ＦＳＨの血中濃度のかなりの増大をもたらす。好ましい実施態様において、本方法は２倍超のＦＳＨの血中濃度の増大をもたらすが、ＦＳＨの任意の増大は有益であるようである。本発明のペプチド／タンパク質をベースとする組成物は、不妊症疾患の処置において現在クロミフェンなどの薬剤が用いられている、任意のそして全てのプロトコルにおいて用いることができることを考慮する。このように、本発明のタンパク質／ペプチドをベースとした治療法は、無排卵の女性の排卵の誘導における処置、及び不妊症の原因が機能的で且つ一次卵巣障害によらない無排卵不妊症患者における妊娠の処置、又は低ゴナドトロピン性性機能低下症に罹患する個々の処置において用いることができる。男性では、これらのペプチドは、一次及び二次低ゴナドトロピン性性機能低下症を有する男性における精子形成の誘導に有用であり得る。これらのペプチドは、子宮内膜症の処置にも有用であり得る。
【００８６】
Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質の投与のためのプロトコルは、ゴナドトロピン放出の他の刺激薬の投与のためのプロトコルに類似していることができる。一般的な指針として、クロミフェン及びＫｉｓｓ−１関連ペプチドが双方ともゴナドトロピン産生を刺激するのに用いられるように、クロミフェンの投与のために開発されたプロトコルは、本発明のペプチドの投与のための出発点を形成し得る。従って、例えば排卵を刺激するために、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質をベースとした組成物（例えば、配列番号：３のアミノ酸配列のペプチド）は、５日間の各周期で、典型的には各特定日における1日1回投与として処方することができる。しかし、用量は、患者の個々の応答に基づいて、医師により増加又は減少させることができる。典型的な処置（クロミフェンのような）において、患者がＫｉｓｓ−１由来タンパク質に応答するかを決定する、Ｋｉｓｓ−１タンパク質充填試験を実施することが必要であり得る。クロミフェン充填試験は当業者に周知である（例えば、米国特許第５，０９１，１７０号を参照）。このような試験は、クロミフェンを、刺激薬として用いるＫｉｓｓ−１由来タンパク質で置き換えることにより変えることができる。
【００８７】
排卵刺激のための典型的なプロトコルにおいて、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質は、周期３日目で開始して最初に投与し、周期７日目まで毎日服用させることができる。周期９日目又は１０日目で、患者のＬＨ及びＦＳＨレベルを測定する。ＬＨレベルがＦＳＨレベルよりも２〜３倍高い場合は、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質は効果的でないかもしれない。周期１２日目では、患者の尿をＬＨの上昇（すなわち、排卵が２４〜３６時間以内に起こるというシグナル。）に関して毎日試験する。この試験に関して、排卵予測キット（ＬＨ予測）を用いることができる。周期１６日目までに上昇が起きない場合は、超音波検査を実施して、卵胞発達を確認し、子宮内層の厚さを測定することができる。ＬＨ上昇の後に、排卵は２日で起こるはずである。
【００８８】
妊娠が起こらない場合は、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質治療の更なる周期を開始する。このようなその後の周期での、月経出血の開始において、３日目の前に、骨盤内診察及び／又は超音波検査を実施することができる。
【００８９】
代わりの実施態様において、上記のプロトコルが妊娠に失敗した場合には、子宮腔内授精を用いて受精の可能性を向上させることができる。このような子宮腔内授精は、クロミフェン、レトロゾール、ＨＭＧ／授精又はＧｏｎａｌ−Ｆ／フォリスチム注入及び子宮腔内授精の内の１又は複数と組み合わせることができる。子宮腔内授精において、周期３日目又は周期３日目の前に、ベースライン超音波検査を実施する。３日目でＫｉｓｓ−１由来タンパク質治療を開始し、周期の７日目まで継続する。組み合わせた治療においては、クロミフェン（又はレトロゾール）／ＦＳＨ又はＨＭＧ／及び子宮腔内授精と組み合わせて、患者をＫｉｓｓ−１由来タンパク質で処置することができる。このようなプロトコルにおいては、１５０ユニットのＦＳＨ又はＨＭＧ（例えば、ブラベレ／Ｇｏｎａｌ−Ｆ又はレプロネクス）の注入を、８日目又は９日目に行うことができる。９日目又は１０日目に、ＬＨ及びＦＳＨを測定する。
【００９０】
患者が周期１６日目までにＬＨ上昇を有さない場合は、超音波検査を実施して、卵胞発達を確認し、そして子宮内層の厚さを測定すべきである。卵胞の大きさが１９ｍｍ超であって、子宮内膜の厚さが７ｍｍ超であることが測定された場合は、ｈＣＧ注入を行って、卵子の放出を引き起こすことができる。
【００９１】
Ｋｉｓｓ−１タンパク質と共に投与する付加的化合物／組成物
上記で議論したとおり、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質の投与のためのプロトコルは、例えば排卵刺激をもたらす他の物質と組み合わせることができる。従って、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質はＦＳＨ放出の増大、ＬＨの上昇又はこれらの効果の双方をもたらすのに十分である（従って、排卵の刺激の改善及び不妊症の克服に用いることができる）と考慮されるが、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質は、不妊症のための他の処置と組み合わせた治療において投与することもできることを考慮する。このような付加的な処置としては、ゴナドトロピン放出の他の刺激薬、例えばクロミフェン及びレトロゾール、並びに排卵誘導及び／又は卵胞成熟を高める様々なゴナドトロピンの投与が挙げられる。
【００９２】
本明細書中で考慮する組み合わせ治療において適切な治療成果を達成するために、すなわち排卵誘導の増大を達成し、ＦＳＨ産生の増大をもたらし、ＬＨ上昇をもたらし、処置している哺乳動物における排卵可能な卵母細胞の数の増大をもたらすなどのために、一般的に、所望の治療成果をもたらすのに効果的な量のＫｉｓｓ−１由来タンパク質組成物を対象に投与する。更に、付加的な外因性ＦＳＨを、７〜１２日まで続く毎日の投与の過程に提供することもできる。ＦＳＨ組成物については、以下で更に詳細を説明する。
【００９３】
ＦＳＨは、２つのサブユニットから構成される下垂体糖タンパク質ホルモンである。α−サブユニットはＦＳＨ並びに他の糖タンパク質（ＬＨ、ｈＣＧ及びＴＳＨ）に共通しており、β−サブユニットはＦＳＨの特異性を与える。不妊症処置の分野は進歩しており、現在では商業的に入手可能であって、本発明の方法において用いることのできる多くのＦＳＨ調製物が存在する。このような市販の調製物としては、尿由来ＦＳＨ組成物及び組み換えＦＳＨ組成物が挙げられる。これらの組成物としては、例えばＰｅｒｇｏｎａｌ（登録商標）（Ｓｅｒｏｎｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒａｎｄｏｌｐｈ，ＭＡ；例えば、ＰＤＲ（登録商標），５２ｎｄ Ｅｄｎ．１９９８，ページ２７７３−２７７５に記載されている典型的な投与のためのプロトコル及び組成物）、Ｆｅｒｔｉｎｅｘ（登録商標）（Ｓｅｒｏｎｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒａｎｄｏｌｐｈ，ＭＡ；例えば、ＰＤＲ（登録商標），５２ｎｄ Ｅｄｎ．１９９８，ページ２７７１−２７７３に記載されている典型的な投与のためのプロトコル及び組成物）、Ｒｅｐｒｏｎｅｘ（登録商標）（Ｆｅｒｒｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＪ；ＰＤＲ（登録商標），５７ｔｈ Ｅｄｎ．２００３，ページ１３２５−１３２７に記載されている典型的な投与のためのプロトコル及び組成物）（Ｆｅｒｒｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＪ；例えば、ＰＤＲ（登録商標），５７ｔｈ Ｅｄｎ．２００３，ページ１３２５−１３２７に記載されている）、Ｈｕｍｅｇｏｎ（登録商標）（Ｏｒｇａｎｏｎ，Ｗｅｓｔ Ｏｒａｎｇｅ，ＮＪ；例えば、ＰＤＲ（登録商標），５２ｎｄ Ｅｄｎ．１９９８，ページ１９４９−１９５１に記載されている典型的な投与のためのプロトコル及び組成物）、Ｇｏｎａｌ−Ｆ（（ＰＤＲ（登録商標），５７ｔｈ Ｅｄｎ．２００３，ページ３１２４−３１２８）、Ｆｏｌｌｉｓｔｉｍ（登録商標）が挙げられる。これらは単なる例示的な市販のＦＳＨ調製物であり、当業者は、本発明の方法及び組成物における使用のための、他のこのようなＦＳＨ調製物を産生することが可能であり得ることを理解するだろう。前記組成物が、用いることのできるＦＳＨの製剤及び用量に関する例示的ガイダンスを提供するという限りで、それらを以下で更に詳細に議論する。しかし、このような用量及び製剤は、容易に変更することができ、そしてこのような投与を行わない場合に産生される卵母細胞の数と比較して、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質との組み合わせで投与する場合に、そのＦＳＨ用量及び製剤が、治療として効果的なＬＨ上昇及び／又はインビボにおける排卵可能な卵母細胞の数の増大をもたらす限り、本発明との関連では依然として有用であり得ることを理解すべきである。
【００９４】
これらの商業的に入手可能な組成物に加えて、当業者は、当業者に周知の技術を用いて、天然供給源、例えば閉経後の女性の尿からのＦＳＨを精製することを選択することができる（例えば、米国特許第５，７６７，０６７を参照）。
【００９５】
或いは、当業者は、当業者に周知の技術を用いて、組み換えＦＳＨの産生を選択することができる。長期持続性ＦＳＨアゴニストが本発明の方法において有用であるだろうことを、特に考慮する。例えば、ｈＣＧはＦＳＨよりも長い半減期を有することが知られている。これらのゴナドトロピンは双方とも、β−サブユニットにより与えられる特異的活性と共に、共通のα−サブユニットを共有する。１つのゴナドトロピンのα−サブユニットを、もう１つのβ−サブユニットと共に用いて、生理学的に活性なキメラゴナドトロピンを得ることさえもできることが、以前実証された。更に、ＬＨと比較したｈＣＧの増大した生物学的有効性（ｂｉｏｐｏｔｅｎｃｙ）は、ｈＣＧのβ−サブユニットのカルボキシ末端ペプチドによることが実証された（Ｍａｔｚｕｋ他，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１２６：３７６−３８３，１９９０）。ＦＳＨｂサブユニットのカルボキシ末端において、ｈＣＧβ−サブユニットのカルボキシ末端ペプチド伸長を含む、ＦＳＨの長期持続性アゴニストを産生することができる。（ＬａＰｏＩｔ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３１：６，２５１４−２５２０，１９９２）。このようなキメラ分子は、野生型ＦＳＨと比較して、顕著に増大した循環半減期及び有効性を有することが示された（Ｆａｒｅｓ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８９：４３０４−４３０８，１９９２）。本出願の他の部分で記載したように、より長い半減期は、追加のグリコシル化又はＰＥＧ化によっても達成することができる。
【００９６】
ＦＳＨは、ゴナドトロピンホルモンの投与のために通常用いる任意の経路により、投与することができる。最も好ましくは、この投与は、筋肉内又は皮下注射のどちらかによる。処置プロトコルを通して、患者の拒絶反応の徴候、例えばＯＨＳＳの徴候を観察する。
【００９７】
ＦＳＨに加えて、他のゴナドトロピンホルモンを本発明の方法において使用し、本明細書中に記載のキット中に包装する。このようなホルモンとしては、ｈＣＧが挙げられる。これは、Ｎｏｖａｒｅｌ（登録商標）（Ｆｅｒｒｉｎｇ Pharmaceutical Inc．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＪ）として商業的に入手可能であって、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（例えば、ＰＤＲ（登録商標），５７ｔｈ  Ｅｄｎ．２００３，ページ１３２４−１３２５を参照）に記載されており、そしてヒト胎盤により産生される、又は妊娠した女性の尿から得られるゴナドトロピンである。別のｈＣＧの市販の調製物はＰｒｅｇｎｙｌ（登録商標）（Ｏｒｇａｎｏｎ，Ｗｅｓｔ  Ｏｒａｎｇｅ，ＮＪ）である。このホルモンの使用に関する特性、示唆及びプロトコルは、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅにおいて詳細に議論されている。（例えば、ＰＤＲ（登録商標）、５７ｔｈ  Ｅｄｎ．２００３，ページ２４０１を参照）。これらの調製物は双方とも、筋肉内投与のためのものである。典型的には、このホルモンは、排卵を誘導するために、約５０００ユニット〜１００００ユニットの用量で投与する。
【００９８】
本明細書中で使用し、包装することのできる更に別のホルモンは、ＧｎＲＨである。このホルモンの多くの商業的供給源が存在する。ＧｎＲＨ及びそのアナログは、Ｃｅｔｒｏｔｉｄｅ（登録商標）（Ｓｅｒｏｎｏ；ＰＤＲ（登録商標）、５７ｔｈ  Ｅｄｎ．２００３，ページ３１１９−３１２１を参照）; Ｅｌｉｇａｒｄ（登録商標）（Ｓａｎｏｆｌ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ，ＰＤＲ（登録商標）、５７ｔｈ  Ｅｄｎ．２００３，ページ２９９４）；Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標）（ＰＤＲ（登録商標）、５７ｔｈ  Ｅｄｎ．２００３，ページ３１８５）; 及びＺｏｌａｄｅｘ（登録商標）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＰＤＲ（登録商標）、５７ｔｈ  Ｅｄｎ．２００３，ページ６９５）として商業的に入手可能である。これらの物質は、女性においてＬＨ／ＦＳＨ産生を抑制するのに使用され、従って排卵を遅延するのに用いられる。これらの物質の典型的な用量は、約０．２５ｍｇ〜約３ｍｇまで変わる。ＦＳＨによる卵巣刺激治療は、典型的には月経周期の２日目又は３日目で開始する。ＧｎＲＨ又はそのアナログは、一日に一回（例えば、０．２５ｍｇ未満の用量）、又は初期から中期の卵胞段階の間における単回投与（例えば、３ｍｇ）として投与する。ＧｎＲＨは、ｈＣＧ投与の日まで投与する。超音波試験により卵胞が適切な大きさであることが明らかになったら、排卵及び卵母細胞の最終的な成熟を誘導するためにｈＣＧを投与する。
【００９９】
共同投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）する多数の治療剤が存在する他の実施態様において、共同投与剤は、互いに同時に投与し、又は適切な時間間隔の後に別々に投与することができる。例えば、クロミフェンは、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質をベースとした組成物として、同時に投与することができる。クロミフェンの市販の調製物は、当業者に知られており、例えばＣｌｏｍｉｄ（登録商標）及びＳｅｒｏｐｈｅｎｅ（登録商標）が挙げられる。他の実施態様において、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質は、ＧｎＲＨアンタゴニストと共同投与することができる。このようなＧｎＲＨアンタゴニスト（例えば、Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標）、Ｓｙｎａｒｅｌ（登録商標）、Ａｎｔｉｇｏｎ（登録商標）、又はＣｅｔｒｏｔｉｄｅ（登録商標））及び不妊症処置におけるそれらの投与のためのプロトコルは、当業者に周知であり、容易に商業的に入手可能である。
【０１００】
患者の選択及び観察
本発明の処置を受ける患者は、２０〜４５歳の範囲の女性患者である。本発明の方法のための患者の選択は、上記のＦＳＨをベースとした治療の使用のためのＰＤＲ（登録商標）の項目において記載されているのと同様のパラメーターを用いることができる。例えば、処置の前に、患者を、徹底的な婦人病試験及び内分泌評価（例えば骨盤解剖の評価）を受けさせる。一次卵巣障害は、基礎血清ゴナドトロピンレベルを測定することにより排除すべきであり、そしてその患者は妊娠していないと確定すべきである。
【０１０１】
本発明の処置計画を通して、治療前、治療の間、及び治療後に患者を評価し、ＯＨＳＳの徴候を観察するべきである。ＯＨＳＳの症状としては、腹痛、腹部膨張、胃腸症状（例えば、吐き気）、下痢、重度の卵巣腫大、体重増加、呼吸困難及び乏尿が挙げられるが、これらに限定されない。臨床的には、症状は、血液量減少、血液濃縮、電解質平衡異常、腹水、腹腔内出血、胸水、水胸症急性肺苦痛及び血栓塞栓症において発症する。ＯＨＳＳの症状が、ＦＳＨをベースとした治療又は卵胞成熟の刺激のために投与される任意の他の物質の投与の間に生じる場合、投与は中断すべきであり、被験者を医学的管理の下に置き、入院又は他の介入が必要かどうかを決定すべきである。ＦＳＨをベースとした治療を観察するのに利用することのできる他の症状としては、膣細胞診における変化、膣粘膜の出現及び体積、牽糸性並びにシダ状結晶形成が挙げられる。これらの後者の症状は、治療のエストロゲン効果の指標であり、ＦＳＨ投与がエストロゲン産生を刺激するため観察しなければならない。好ましくは、これらのエストロゲン効果は、卵胞発達のより直接的な測定（例えば、血清エストラジオール及び超音波検査の測定）と組み合わせて観察すべきである。
【０１０２】
妊娠以外の排卵の臨床症状は、プロゲステロン産生の直接的又は間接的尺度のいずれかにより得ることができる。このような徴候はとしては：基礎体温の上昇、血清黄体ホルモンの増加、体温の変動の後の月経が挙げられる。プロゲステロン産生の上記の指標と共同して、排卵が起きたかを決定するのを助けるために、卵巣の超音波視覚化を用いることができる。このようなモノグラフモニタリングは、盲嚢中の流動体、卵巣スチグマ及び崩壊した卵胞の存在の評価を含むことができる。超音波測定は、卵巣がＯＨＳＳにおいて肥大したかを測定する際にも助けとなるだろう。
【０１０３】
医薬組成物
本発明の投与のための医薬組成物は、少なくとも１つのＫｉｓｓ−１由来タンパク質を含んで成ることができる（例えば、配列番号：３のペプチド、ＦＳＨ産生及び／又は放出を刺激するその変異体若しくはアナログ又は任意の他のＫｉｓｓ−１由来タンパク質）。医薬組成物は、ＦＳＨ産生の別の刺激薬（例えば、クロミフェン及び／又は少なくとも１つのゴナドトロピンホルモン、好ましくはＦＳＨ）も含むことができる。これらの各調製物は、好ましくは、任意で医薬として許容される担体と組み合わせて、医薬として許容される形態で提供する。これらの組成物は、それらの意図した目的を達成する任意の手段により投与することができる。本発明の方法を用いて卵胞成熟を刺激するための組成物の投与のための個別の量及び計画は、無排卵疾患を処置する際のこのような組成物の使用及び生殖補助技術におけるそれらの使用のための、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅにより提供されるガイダンスを用いて、当業者により容易に決定することができる。上記で議論したように、当業者は初めに、このような医療状況において現在用いられている、ＦＳＨ、クロミフェンなどの量及び計画を用いることができる。この効果に対して、当業者は、上記で議論したＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ中の各項目を具体的に参照し、そしてそれらの項目は、上記の本明細書中で議論したＳｅｒｏｐｈｅｎｅ（登録商標）、Ｃｌｏｍｉｄ（登録商標）、Ｆｅｒｔｉｎｅｘ（登録商標）、Ｇｏｎａｌ Ｆ（登録商標）、Ｂｒａｖｅｌｌｅ（登録商標）などの物質の投与のための教示的方法及び組成物のために、それらの全てが引用文献により本明細書中に組み込まれる。Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ中のそれらの各項目は、ＦＳＨの投与において用いることのできる、製剤のタイプ、投与の経路及び処置計画に関して、例示的ガイダンスを提供する。そこに記載されている任意のプロトコル、製剤、投与の経路などは、本発明における使用のために容易に変えることができる。
【０１０４】
本発明の範囲内の組成物は、排卵を刺激し、増大し又は別の方法で誘導するといった意図した目的を達成するのに効果的な量において、少なくも１つの本発明のＫｉｓｓ−１由来タンパク質を含んで成る全ての組成物を含む。好ましくは、このような誘導は、これらの医薬タンパク質を投与しない場合のこれらのパラメーターと比較して、ＦＳＨ産生の増大及び／又はＬＨ上昇の増大が先行する。いくつかの場合において、動物における排卵可能な卵母細胞の数は、これらのペプチドの投与（単独又は複数のいずれかで投与した場合、好ましくは少量のＦＳＨとの組み合わせで投与した場合）の結果として増大することを考慮する。本発明の方法において使用する活性物質は、このような投与に通常用いる任意の手段により投与することができる。最も好ましくは、本発明において用いるＫｉｓｓ−１由来タンパク質組成物は、経口により投与する。
【０１０５】
本発明の組成物の適切な用量は、受容者の年齢、健康及び体重、併用処置の種類（もしあるならば）、処置の頻度、並びに所望される効果の性質に依存するだろうことが理解される。しかし、過度の実験をせずに当業者により理解され決定可能であるように、最も好ましい用量を、個々の対象に対して調整することができる。これは典型的には、標準用量の調節を伴う（例えば、患者の体重が軽い場合は、用量を減らす）。ＯＨＳＳの症状が観察される場合は、治療を中止するべきである。
【０１０６】
上記で議論したように、各処置に対して必要とされる総用量を、複数回投与又は単回投与で投与することができる。この組成物は、単独で、或いはその疾病を対象にした又はそれに関する他の症状を対象にした他の治療剤と共同して投与することができる。
【０１０７】
本発明の組成物は、適切な医薬組成物（すなわち、不妊症疾患の治療介入におけるインビボでの適用に適した形態）に製剤するべきである。一般的に、これは、発熱物質、及びヒト又は動物に対して有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物（好ましくは、経口投与のための）を調製することを必要とするだろう。本明細書を通して議論する現在利用可能なＦＳＨ調製物と同種のＦＳＨ製剤を製剤することができる。このペプチド／タンパク質製剤は、任意の他の低分子タンパク質組成物と同様に製剤することができる。好ましくは、これらの製剤は、経口投与用でるが、他の投与経路を考慮する（例えば、注入、クモ膜下腔投与など）。キスペプチンのＦＳＨ刺激特性の結果は、キスペプチン作用の主な部位が中枢神経系であろうという結論を導く。このような作用の部位は、血液脳関門（ＢＢＢ）内であり得る。このように、このペプチド／タンパク質がＢＢＢを容易に越えるのを促進する製剤及び投与経路が特に有用であろうことを考慮する。ＢＢＢを横切る受容体媒介吸収は、特に有用であり得る。
【０１０８】
適切な塩及びバッファーを用いて、組成物を安定化し、標的部位での組成物の吸収を可能にすることが、一般的に望まれるだろう。一般的に、本発明のホルモン組成物は、投与前に再生される凍結乾燥の形態で提供され、Ｋｉｓｓ−１由来タンパク質組成物は、錠剤形態に製剤されるようである。ホルモンの再生のためのバッファー及び溶液を、医薬製剤と共に提供して、投与のための本発明の水性組成物を製造することができる。このような水性組成物は、医薬として許容される担体又は水性溶媒中で使用し、溶解し又は分散するのに有効な量の各治療剤を含んで成るだろう。このような組成物は、接種としても見なされる。「医薬として又は薬理学的に許容される」という語句は、動物又はヒトに投与した場合に、副作用、アレルギー又は他の有害な反応をもたらさない分子部分及び組成物を指す。本明細書中で用いる場合、「医薬として許容される担体」は、任意のそして全ての、溶媒、分散溶媒、被覆、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質用のこのような溶媒及び物質の使用は、当業界で周知である。任意の従来の溶媒又は物質が治療組成物と適合しない場合を除いて、治療組成物中でのその使用を考慮する。追加の活性成分も、組成物に組み入れることができる。
【０１０９】
本発明の活性組成物は、本明細書中で議論した及び当業者に知られた、古典的なＦＳＨの医薬調製物を含む。治療投与のためのタンパク質及びペプチドを製剤する方法も、当業者に知られている。本発明のこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路により利用可能である限り、任意の一般的な経路によるだろう。最も一般的には、これらの組成物は、経口投与用に製剤される。しかし、他の従来の投与経路（例えば、皮下、静脈、皮内、筋肉内、乳房内、腹膜内、クモ膜下腔内、眼内、眼球後、肺内（例えば、期間放出）、エアゾール、舌下、鼻、肛門、膣、又は経皮的送達により、或いは特定部位での外科的移植により）もまた、特に経口投与が問題である場合に有用であり得る。この処置は、ある期間にわたる単回投与又は複数回投与から成ることができる。
【０１１０】
活性化合物は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合した、水中の遊離塩基又は薬理学的に許容される塩の溶液として、投与のために調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物中において、並びに油中においても調製することができる。貯蔵及び使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を抑制するための保存剤を含む。
【０１１１】
注入可能な使用に適した医薬形態は、滅菌注入可能溶液又は分散液の即時調製のための、滅菌水溶液又は分散液及び滅菌粉末を含む。全ての場合において、その形態は滅菌でなければならず、且つ容易な注入可能性が存在する範囲で流体でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、且つ微生物（例えば、細菌及び真菌）の汚染作用から保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール、など）、適切なそれらの混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散溶媒であることができる。例えばレシチンなどの被覆の使用、分散液の場合における必要な粒径の保持、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を保持することができる。微生物の作用の抑制は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によりもたらすことができる。多くの場合において、等張剤（例えば、糖及び塩化ナトリウム）を含むことが好ましいだろう。注入可能な組成物の長期吸収は、組成物中での、吸収を遅延する物質（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）の使用によりもたらすことができる。
【０１１２】
滅菌注入可能溶液は、必要量の適切な溶媒中の活性化合物を、上記に列挙した様々な他の成分と一緒にし、そして必要応じて、その後濾過滅菌することにより調製する。一般的に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、塩基性分散溶媒及び上記に列挙したものからの必要な他の活性成分を含む滅菌賦形剤に組み入れることにより調製する。滅菌注入可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分及び前もって滅菌濾過したその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を生成する、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【０１１３】
本明細書中で用いる場合、「医薬として許容される担体」は、任意のそして全ての、溶媒、分散溶媒、被覆、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質用のこのような溶媒及び物質の使用は、当業界で周知である。任意の従来の溶媒及び物質が活性成分と適合しない場合を除いて、治療組成物中でのその使用を考慮する。追加の活性成分も、組成物に組み入れることができる。
【０１１４】
本発明の組成物は、中性又は塩の形態で製剤することができる。医薬として許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ酸と形成）を含み、そしてそれは無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）、又は有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）と形成する。遊離カルボキシル基と形成する塩も、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄）、及び有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から得ることができる。
【０１１５】
製剤に関して、溶液は、用量製剤と適合する様式において、治療に効果的な量で投与する。製剤は、注入可能溶液、薬剤放出カプセルなどの様々な投薬形態で、容易に投与される。水溶液における非経口的投与の場合、例えば、溶液は必要であれば適切に緩衝化し、液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水又はグルコースで等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹膜内投与に対して特に適している。
【０１１６】
「単位用量」は、適切な担体中に分散した治療組成物の個別の量として定義される。治療化合物の非経口投与は、持続注入が後に続く最初のボーラスにより実施し、製剤の治療血中濃度を保持することができる。優れた医療行為及び個々の患者の臨床症状により決定されるように、当業者は効果的な用量及び投与計画を容易に最適化するだろう。
【０１１７】
投薬の頻度は、薬剤の薬物動態パラメーター及び投与経路に依存するだろう。最適な医薬製剤は、投与経路及び所望の用量に依存して、当業者により決定されるだろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ：（１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ  １８０４２）を参照（引用文献により本明細書組み込まれる）。このような製剤は、投与した物質の物理的状態、安定性、インビボでの放出の程度及びインビボでのクリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）の程度に影響し得る。投与経路に依存して、適切な用量は、体重、体表面積又は臓器の大きさにより計算することができる。適切な処置用量の決定に必要な計算の更なる改良は、過剰な試験をせずに当業者により通常行われる（特に、本明細書中で開示された用量の情報及び試験、並びに動物又はヒトの臨床試験で見られる薬物動態データに照らして）。
【０１１８】
適切な用量は、関連の用量応答データと共同して、血中濃度の測定に関する確立した試験の使用により確かめることができる。最終的な用量は、薬剤の作用を変える因子（例えば、薬剤の具体的活性、損傷の重症度及び患者の反応性、患者の年齢、状態、体重、性及び食生活、任意の感染症の重症度、投与の時間並びに他の臨床的因子）を考慮して、担当医により決定されるだろう。試験が実施されると、具体的な疾病及び症状に対する適切な用量レベル及び処置の持続時間に関する更なる情報が明らかになるだろう。
【０１１９】
本発明の医薬組成物及び処置方法が、ヒト医学及び獣医学の分野において有用であり得ることが認識されるだろう。従って、処置する対象は、哺乳動物、好ましくはヒト又は他の動物であることができる。獣医を目的とする場合は、対象としては、例えば家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ及びヤギ）、コンパニオン・アニマル（例えば、イヌ及びネコ）、外来の及び／又は動物園の動物、実験室の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット及びハムスター）；及び家禽（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ及びガチョウ）が挙げられる。
【０１２０】
本発明は、不妊症疾患の処置における使用のためのキットも考慮する。このようなキットは、医薬として許容される担体中に、上記のタンパク質／ペプチドを含んで成る、少なくとも第一の組成物を含む。別の成分は、医薬として許容される担体中のＦＳＨであることができる。キットは、第一及び第二の組成物の送達をもたらすための、溶液又はバッファーを更に含んで成ることができる。キットは、ＦＳＨ産生／放出の更なる刺激薬、例えば追加の他のＫｉｓｓ−１由来タンパク質、他の刺激薬、例えばクロミフェン及び／又は更なるホルモン、例えばｈＣＧ、ＬＨなどを含む、追加の組成物を更に含んで成ることができる。キットは、本発明の方法において用いられる１又は複数の組成物の送達のための、カテーテル、シリンジ又は他の送達装置を更に含んでなることができる。キットは、治療計画のための投与プロトコルを含む説明書を、更に含んで成ることができる。
【実施例】
【０１２１】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を実証するために含めた。以下の実施例において開示する技術が、本発明者により発見された技術が本発明の実施においてうまく機能することを示し、従ってその実施に対する好ましい様式を構成すると考えることができることは、当業者は認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示する具体的実施態様において多くの変更が可能であり、本発明の精神及び範囲から離れることなく、同様の又は類似した結果を依然として得ることができることを認識すべきである。
【０１２２】
実施例１  例示的な物質及び方法
動物
全ての実験は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（ＭＡ）から得た、雌性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ラット（１８０〜２００ｇ）において実施し、標準的な実験室の食事及び水を自由に与え、温度及び湿度を制御した部屋において１２時間の明−暗を保った。
【０１２３】
外科処置
全ての外科処置を、麻酔下で、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１５ｍｇ／ｋｇ）の混合物の１回の注入（ｉ．ｐ．）を用いて実施した。
【０１２４】
ｉ．ｃ．ｖ．実験のための脳室内カニューレの移植。麻酔したラットの頭部を定位固定装置中に置き、ブレグマとラムダが水平となるような位置に置いた。矢状正中線に沿って前部から後部の方向に、切開を行った。直径１．５ｍｍの穴を、頭がい骨の後部に０．９ｍｍ、ブレグマの横に０．０ｍｍ開けた。シラスティック管の５ｃｍの部分によってカニューレに接続した１ｃｃの注射器により、第３脳室から脳脊髄液を吸引することができるまで、２５ｍｍｘ２２の寸法のステンレス鋼カニューレを約７ｍｍ降ろした。カニューレの外側開口に封をした後に、それを３つのステンレス鋼ネジと歯科用アクリルセメントで頭蓋骨に固定し、その後切り口を閉じた。ラットは１４日間で回復させた。
【０１２５】
卵巣摘出及びエストロゲン含有カプセルの移植。変わり易い発情周期による血漿エストロゲン濃度の日差変動をなくすために、両方の卵巣を、麻酔下でその動物の背中の切り口から摘出した。切り口を閉じる直前に、２つのエストロゲン含有カプセル（０．５ｍｇ／カプセル、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，ＦＬ）を、動物の背中の中央において皮下挿入し、血漿エストロゲンの一貫した基礎生理学的濃度を保持した。ラットは７日間で回復させた。
【０１２６】
頸静脈カニューレの挿入及び自動血液サンプラーへのテザリング（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）。麻酔したラットの右頸静脈を、頸部切開により曝露させた。静脈を扱うために、吻端において曝露した静脈に、保持縫合糸を結んだ。静脈の尾部端を小さな鉗子で固定して出血を防ぎ、同時にカニューレ（ポリエテン管（ＯＤ  １．０ｍｍ））を、虹彩（ｉｒｉｓ）ハサミで作った０．５ｍｍの切り口から、静脈の中央に挿入した。カニューラの挿入後に、尾方端における静脈のまわりに縫合糸を結び、カニューラを静脈内に固定した。頸部の切り口を創傷クリップで閉じ、カニューラの外端を、ヘパリン含有（２０ ＩＵ／ｍｌ）滅菌生理食塩水で満たした自動血液サンプラー（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，ＩＮ）の管に取り付けた。フードボックス及びウォーターボトルを備えた回転ケージ、バランスアーム（ｂａｌａｎｃｅｄ ａｒｍ）、ポンプ装置、画分コレクタ並びに制御装置から成る自動血液サンプラーを用いて、血液試料を集めた。頸静脈カニューレを挿入したラットを、ゆるく取り付けたプラスチックカラーによりバランスアームにテザリングした。動物の動きとは反対方向にケージを回転させて、サンプラーの管に接続した頸静脈カニューレのねじれを防ぎ、また血液採取の間にラットが自由に食べ、飲みそして動くことを可能にする。ラットは、２４時間で回復させた。
【０１２７】
試験化合物
ＧｎＲＨ、ポジティブコントロール、Ａｎｔｉｄｅ、ＧｎＲＨ受容体のアンタゴニスト、及びＫｉｓｓ−１（４５−５４；Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；配列番号：３）を、Ｓｉｇｍａ（ＭＯ）、Ｓｅｒｏｎｏ（ＭＡ）及びＰｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＫＹ）、それぞれから得た。単にＫｉｓｓ−１のこの１０アミノ酸フラグメントが、ＧＰＣＲ５４に対して最も強力な結合親和性を示したことが以前報告されたという理由で、そのフラグメントを用いた（Ｋｏｔａｎｉ他，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：３４６３１−３４６３６）。受容体結合活性を有する任意の他のキスペプチンは、本明細書中に記載の方法において同様に用いることができる。
【０１２８】
実験手順
全ての実験を、およそ１３時間〜１４時間の間で実施した。リン酸で緩衝化した生理食塩水中に溶解したＧＰＣＲ５４アゴニスト、Ｋｉｓｓ−１を、それぞれ２００ｕｌ及び１０ｕｌの体積で、頸静脈及び脳室内カニューラを通して、ｉ．ｖ．及びｉ．ｃ．ｖ．注入した。血液試料（１００ｕｌ）は、注入の前（−１５分及び０分）及び後（１５分、３０分、４５分）に、自動血液サンプラーを用いて取り除いた。各血液試料は、等しい体積のヘパリン含有（２０ ＩＵ／ｍｌ）滅菌生理食塩水で置き換えた。血漿を抽出し、酵素結合免疫測定法及び標識免疫測定法それぞれによる、ＬＨ及びＦＳＨの測定まで、−２０℃で保存した。
【０１２９】
データ分析
注入後の血漿のＬＨ及びＦＳＨ濃度（ｎｇ／ｍｌ）の変化を、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）として得た。それは、最初に、処理後１５分、３０分及び４５分のホルモン濃度の合計を、それぞれから基礎レベル（処理前−１５分及び０分の濃度の平均）を差し引いて計算することにより、各動物に対して決定し、次に群として平均化した。処置群間の統計的差異を、事後試験としてＬＳＤが続く一方向ＡＮＯＶＡにより決定した。初期のデータセットを図１Ａ〜Ｐに示す。更なるデータを、以下の実施例２及び３において説明する。
【０１３０】
実施例２  Ｋｉｓｓ−１のｉ．ｖ．注入による性腺軸の刺激
この試験は、Ｋｉｓｓ−１の末梢処置のＬＨ及びＦＳＨ放出への影響を決定することを目的とする。それは、４００ｕｇ／ｋｇのＫｉｓｓ−１の注入の１５分前に、ＧｎＲＨ受容体アンタゴニスト（Ａｎｔｉｄｅ）の前処理により、Ｋｉｓｓ−１の効果が下垂体におけるＧｎＲＨ受容体によって介在されたことも確認した（ゴナドトロピンの制御における確立した機構）。これらの結果を図２に要約した。最も高い用量でのＬＨ応答を除いて、血漿のＬＨ及びＦＳＨ濃度における、Ｋｉｓｓ−１処置による用量依存的な増加が存在した。ＧｎＲＨ受容体の遮断は、ＧｎＲＨ−及びＫｉｓｓ−１−誘導性の血中ゴナドトロピン濃度の上昇を首尾よく妨げた。これらの結果は、Ｋｉｓｓ−１による性腺軸の刺激が、下垂体におけるＧｎＲＨ受容体により介在されることを実証する。
【０１３１】
実施例３  Ｋｉｓｓ−１のｉ．ｃ．ｖ．注入による性腺軸の刺激
実施例２で示した、ＧｎＲＨアンタゴニストがＫｉｓｓ−１のＬＨ及びＦＳＨ放出の促進作用を妨げるという観測結果に基づいて、Ｋｉｓｓ−１はＧｎＲＨニューロンが位置する脳において作用し、それらの神経活性を刺激すると仮定した。この仮定を試験するために、この試験は、Ｋｉｓｓ−１のｉ．ｃ．ｖ．注入が性腺軸を刺激するかを確認することを目的とした。これらの結果を図３に要約した。Ｋｉｓｓ−１は用量依存的にＬＨ放出を刺激した。更に、高用量のＫｉｓｓ−１は低用量と同じくらい効果的ではないが、Ｋｉｓｓ−１注入後にＦＳＨ濃度の顕著な増加が存在した。ｉ．ｖ．注入試験におけるＬＨ及びＦＳＨの応答をもたらすＫｉｓｓ−１のｉ．ｃ．ｖ．用量は、それぞれｉ．ｖ．用量の１／２５及び１／１００まで低かったことは、言及する価値がある。これらの結果は、ＬＨ及びＦＳＨ放出の促進におけるＫｉｓｓ−１の主な作用部位が脳の中にあり、その制御機構がＧｎＲＨニューロンの刺激を伴い得ることを実証する。
【０１３２】
ここで開示及びクレームした全ての組成物及び／又は方法は、本開示に照らして、過剰な実験をせずに実施及び実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施態様との関連で記載したが、本発明の概念、精神及び範囲から離れることなく、この組成物及び／又は方法並びに本明細書中に記載した方法の段階又は段階の順序において、変化を適用できことは、当業者により明らかだろう。更に具体的には、同一又は類似の結果が得られる限り、化学的及び生理学的に関連した特定の物質が、本明細書中に記載した物質と置き換わることができることは明らかであろう。当業者に明らかな、全てのこのような類似の置換及び修飾は、添付した特許請求の範囲により規定した発明の精神、範囲及び概念の中に存在すると考えられる。
【０１３３】
本明細書を通して引用した引用文献は、それらが、本明細書中に記載したものを補充する典型的な手順又は他の詳細を提供する限り、全て具体的に引用文献により本明細書中に組み込まれる。
【０１３４】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の側面を更に説明するために含められる。本発明は、本明細書中の具体的実施態様の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することにより、より良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１Ａ−Ｐ】図１Ａ−Ｐは、４５分間にわたる、ＬＨ（図１Ａ−Ｈ）及びＦＳＨ（図１Ｉ−Ｐ）の放出に関する、ＧｎＲＨ及びＫｉｓｓ１のインビボでの効果の比較を示す。図１Ａ及び図１Ｂは、ＬＨ放出への賦形剤単独の効果を示す。図１Ｃ及び図１Ｄは、ＬＨ放出への、９０ｎｇ／ｋｇのＧｎＲＨ−Ｉ投与の効果を示す。図１Ｅ及び図１Ｆは、ＬＨ放出への、９μｇ／ｋｇのＧｎＲＨ−Ｉ投与の効果を示す。図１Ｇ及び図１Ｈは、ＬＨ放出への、４μｇ／ｋｇのＫｉｓｓ１投与の効果を示す。図１Ｉ及び図１Ｊは、ＦＳＨ放出への、賦形剤単独の効果を示す。図１Ｋ及び図１Ｌは、ＦＳＨ放出への、９０ｎｇ／ｋｇのＧｎＲＨ−Ｉ投与の効果を示す。図１Ｍ及び図１Ｎは、ＦＳＨ放出への、９μｇ／ｋｇのＧｎＲＨ−Ｉ投与の効果を示す。図１Ｏ及び図１Ｐは、ＦＳＨ放出への、４μｇ／ｋｇのＫｉｓｓ１投与の効果を示す。
【図２Ａ−Ｂ】エストロゲン処理した卵巣切除ラットにおける、血漿ＬＨ（図２Ａ）及び血漿ＦＳＨ（図２Ｂ）レベルへのｉ．ｖ．注入によるＫｉｓｓ−１の効果、及びＧｎＲＨアンタゴニスト（Ａｎｔｉｄｅ）の前処理によるこれらの効果の抑制。排他的文字は、事後試験としてのＦｉｓｈｅｒ’ｓ最小有意差（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ＬＳＤ）分析に続く、一方向ＡＮＯＶＡにより決定した、Ｐ＜０．０５での統計的な差を示す。
【図３Ａ−Ｂ】エストロゲン処理した卵巣切除ラットにおける、血漿ＬＨ（図３Ａ）及び血漿ＦＳＨ（図３Ｂ）レベルへのｉ．ｃ．ｖ．注入によるＫｉｓｓ−１の効果。排他的文字は、事後試験としてのＦｉｓｈｅｒ’ｓ  ＬＳＤに続く、一方向ＡＮＯＶＡにより決定した、Ｐ＜０．０５での統計的な差を示す。
【図１Ａ−Ｐ】
2007533748.tif 000004
【図２Ａ−Ｂ】
2007533748.tif 000005
【図３Ａ−Ｂ】
2007533748.tif 000006
【配列表】
2007533748000001.app
【国際調査報告】
2007533748.tif 000007
2007533748.tif 000008
2007533748.tif 000009
2007533748.tif 000010