(57)【要約】  本発明は、かかる治療を必要としている哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害を治療するための方法に関する。この方法は、適切な手段により、前記対象の体内でＮＫＴ細胞集団を操作する工程を含み、ＮＫＴ細胞集団の前記操作の結果、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスは抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かって変調されることになる。ＮＫＴ細胞集団の操作は、適切な手段による前記細胞の枯渇によってか、又は代替的には、ｅｘ  ｖｉｖｏ教育済みＮＫＴ細胞がＴｈ１／Ｔｈ２バランスを抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かって変調させる能力を有するような形でのＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ教育によって、実施可能である。該発明はさらに、哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害の治療用の薬学組成物にも関する。これらの組成物は、ｅｘ  ｖｉｖｏ教育済みＮＫＴ細胞を有効成分として含んでいる。該発明はさらに、ｅｘ  ｖｉｖｏ教育済みＮＫＴ細胞及び免疫関連又は免疫介在性の障害の治療におけるその使用を提供している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、前記対象におけるＮＫＴ細胞集団を操作する方法であり、
前記ＮＫＴ細胞集団の操作が、炎症性応答に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスの変調をもたらし、前記変調は、前記対象又はもう１つの対象における異なる構成要素、細胞、組織又は器官によって媒介される、治療方法。
【請求項２】
治療を必要とする哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、前記対象におけるＮＫＴ細胞集団を操作する方法であり、
前記ＮＫＴ細胞集団の操作が、抗炎症性又は炎性誘発性応答に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスの変調をもたらし、前記変調は、前記対象又はもう１つの対象の免疫系における異なる構成要素、細胞、組織又は器官によって媒介される、治療方法。
【請求項３】
治療を必要とする哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、前記対象におけるＮＫＴ細胞集団を操作する方法であり、
前記ＮＫＴ細胞集団の操作が、抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスの変調をもたらし、前記変調は、前記対象又はもう１つの対象の免疫系の異なる構成要素、細胞、組織又は器官によって媒介されている、治療方法。
【請求項４】
前記構成要素が細胞免疫反応要素、体液性免疫反応要素及びサイトカインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記操作が、前記ＮＫＴ細胞集団を枯渇させることにより実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ａ．前記対象又はもう１つの対象からＮＫＴ細胞を得る工程；
ｂ．結果として得られる教育済みＮＫＴ細胞が、抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させ得るような形で、工程（ａ）で得られたＮＫＴ細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏ教育する工程；及び
ｃ．抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させ得る工程（ｂ）で得られた教育済みＮＫＴ細胞を前記対象に再導入し、結果としてＩＬ４及びＩＬ１０のいずれか１つとＩＦＮγとの定量比の増大をもたらす工程；
を含む、請求項３に記載の哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法。
【請求項７】
ａ．治療すべき前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患に関連する抗原又はエピトープ、免疫介在性炎症性応答に関連する抗原、又はエピトープ、又はそれらの任意の組合せ；
ｂ．前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない対象の、又は前記対象の、少なくとも１つの肝臓関連細胞；
ｃ．少なくとも１つのサイトカイン、又は接着分子、又はそれの任意の組合せ；及び
ｄ．（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の任意の組合せ；
のうちのいずれか１つの存在下で前記ＮＫＴ細胞を培養することにより工程（ｂ）の前記ｅｘ  ｖｉｖｏ教育が実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｅｘ  ｖｉｖｏ教育が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患に関連する抗原の存在下で前記ＮＫＴ細胞を培養することによって実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患うドナーから得た同種抗原、異種抗原、同系抗原、自家抗原、非自家抗原、組換えにより調製された抗原、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記肝臓関連細胞が、クッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、肝臓関連幹細胞、アポリポタンパク質、又は任意のその他の肝臓関連リンパ球を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記サイトカインがＩＬ４、ＩＬ１０、ＴＧＦβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１２、ＩＬ２、ＩＬ１８又はＩＬ１５を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記接着分子がインテグリン、セレクチン又はＩＣＡＭを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記教育済みＮＫＴ細胞が、養子免疫伝達により前記対象に再導入される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う任意の同種ドナー、異種供給源、同系供給源、自家供給源、非自家供給源、免疫学的に機能的な等価物、又はそれらの任意の組合せに由来する構成要素、細胞、組織、及び／又は器官を前記対象に投与することによって、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の免疫変調を前記対象の体内で惹起する工程をさらに含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項１５】
前記構成要素、細胞、組織又は器官が経口投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
治療を必要とする哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、
経口寛容化によって免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患に対する免疫応答のアップ又はダウンレギュレーションを前記対象の体内で惹起する、治療方法。
【請求項１７】
治療を必要とする哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、
経口寛容誘発又は経口免疫調節を介して免疫変調する、治療方法。
【請求項１８】
経口寛容誘発又は経口免疫調節を介する前記免疫変調には、肝臓抽出物の経口投与が関与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与方法には、経口、静脈内、非経口、経皮、皮下、膣内、腹腔内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所又は直腸投与、又はそれらの任意の組合せが含まれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
経口寛容誘発又は経口免疫調節を介する前記免疫変調には、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う任意の同種ドナー、異種供給源、同系供給源、自家供給源、非自家供給源、免疫学的に機能的な等価物又はそれらの任意の組合せに由来する構成要素、細胞、組織、及び／又は器官を含む材料の経口投与が関与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
経口寛容化、経口寛容誘発又は経口免疫調節による前記障害又は疾患に対する免疫応答のアップ又はダウンレギュレーションを前記対象の体内で惹起することをさらに含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項２２】
経口寛容誘発又は経口免疫調節を介する免疫変調をさらに含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項２３】
治療を必要とする哺乳類の対象における、骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まない）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、経口寛容誘発又は経口免疫調節を介して免疫変調する方法であり、
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスがＴｈ２、即ち抗炎症性応答に向かってシフトし、その結果ＣＤ４＋ＩＬ４＋ＩＬ１０＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ比が増大する、治療方法。
【請求項２４】
治療を必要とする哺乳類の対象における、骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まない）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、ＮＫＴ細胞を変調する方法であり、
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスがＴｈ２、即ち抗炎症性応答に向かってシフトし、その結果ＣＤ４＋ＩＬ４＋ＩＬ１０＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ比が増大する、治療方法。
【請求項２５】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まず）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳類の対象がヒトの患者である、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＮＫＴ細胞が、ＣＤ５６マーカーを発現しているＮＫＴ細胞である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項３３】
哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための治療用組成物であって、
前記組成物は、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かって変調させる能力をもつｅｘ  ｖｉｖｏ教育済みの異種、同系、自家又は非自家ＮＫＴ細胞を有効成分として含み、さらに薬学的に受容可能な担体、希釈剤、賦形剤及び／又は添加剤を任意に含む、治療用組成物。
【請求項３４】
前記教育済みＮＫＴ細胞がＩＬ４及びＩＬ１０のうちのいずれか１つ対ＩＦＮγの定量比の増大を媒介する、請求項３３に記載の治療用組成物。
【請求項３５】
前記教育済みＮＫＴ細胞が、
ａ．治療すべき前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患と関連する抗原又はエピトープ、免疫介在性炎症性応答に関連する抗原、又はエピトープ、又はそれらの任意の組合せ；
ｂ．前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない対象の、又は前記対象の、少なくとも１つの肝臓関連細胞；
ｃ．少なくとも１つのサイトカイン、又は接着分子、又はそれの任意の組合せ；及び
ｄ．（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の任意の組合せ；
のうちのいずれか１つの存在下でｅｘ  ｖｉｖｏ培養することにより得られる、請求項３４に記載の治療用組成物。
【請求項３６】
前記教育済みＮＫＴ細胞が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害に関連する抗原の存在下でｅｘ  ｖｉｖｏ培養することによって得られる、請求項３５に記載の治療用組成物。
【請求項３７】
前記抗原が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患うドナーから得た同種抗原、異種抗原、同系抗原、自家抗原、非自家抗原、組換えにより調製された抗原、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項３６に記載の治療用組成物。
【請求項３８】
前記肝臓関連細胞が、クッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、及び任意のその他の肝臓関連リンパ球を含む、請求項３５に記載の治療用組成物。
【請求項３９】
前記サイトカインがＩＬ４、ＩＬ１０、ＴＧＦβ、ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ１８、ＩＬ１２又はＩＬ１５を含む、請求項３５に記載の治療用組成物。
【請求項４０】
前記接着分子がインテグリン、セレクチン又はＩＣＡＭを含む、請求項３５に記載の治療用組成物。
【請求項４１】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項４２】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項４３】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項４４】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項４５】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項４６】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まず）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項４７】
免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う哺乳類の対象の体内で抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させるための治療用組成物の製造における、教育済み自家、異種、同系又は非自家ＮＫＴ細胞の使用。
【請求項４８】
哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための治療用組成物の製造における教育済み自家、異種、同系又は非自家ＮＫＴ細胞の使用であって、該教育済みＮＫＴ細胞はＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かって変調させる、使用。
【請求項４９】
前記教育済みＮＫＴ細胞が、ＩＬ４及びＩＬ１０のいずれか１つ対ＩＦＮγの定量比の増大を媒介する、請求項４７又は４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記組成物の教育済みＮＫＴ細胞が、免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う哺乳類の対象においてＴｈ１／ＴＨ２細胞バランスを抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かって変調させ、前記ＮＫＴ細胞が、ＩＬ４及びＩＬ１０のうちのいずれか１つ対ＩＦＮγの定量比の増大を媒介する、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項５１】
前記組成物の教育済みＮＫＴ細胞がＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かって変調させる、哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項５２】
治療を必要とする哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療において使用するためのｅｘ  ｖｉｖｏ教育済み自家、同系、異系又は非自家ＮＫＴ細胞。
【請求項５３】
前記教育済みＮＫＴ細胞が、
ａ．治療すべき前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患と関連する抗原又はエピトープ、免疫介在性炎症性応答に関連する抗原、又はエピトープ、又はそれらの任意の組合せ；
ｂ．前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない対象の、又は前記対象の、少なくとも１つの肝臓関連細胞；
ｃ．少なくとも１つのサイトカイン、又は接着分子、又はそれの任意の組合せ；及び
ｄ．（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の任意の組合せ；
のうちのいずれか１つの存在下でｅｘ  ｖｉｖｏ培養されている、請求項５２に記載の教育済みＮＫＴ細胞。
【請求項５４】
前記抗原が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患うドナーの同種抗原、異種抗原、同系抗原、自家抗原、非自家抗原、組換えにより調製された抗原、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項５３に記載の教育済みＮＫＴ細胞。
【請求項５５】
前記肝臓関連細胞が、クッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、又は任意のその他の肝臓関連リンパ球を含む、請求項５３に記載の教育済みＮＫＴ細胞。
【請求項５６】
前記サイトカインがＩＬ４、ＩＬ１０、ＴＧＦβ、ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ１８、ＩＬ１２又はＩＬ１５を含む、請求項５３に記載の教育済みＮＫＴ細胞。
【請求項５７】
前記接着分子がインテグリン、セレクチン又はＩＣＡＭを含む、請求項５３に記載の教育済みＮＫＴ細胞。
【請求項５８】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の教育済みＮＫＴ細胞。
【請求項５９】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の教育済みＮＫＴ細胞。
【請求項６０】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の教育済みＮＫＴ細胞。
【請求項６１】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の教育済みＮＫＴ細胞。
【請求項６２】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の教育済みＮＫＴ細胞。
【請求項６３】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まず）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の教育済みＮＫＴ細胞。
【請求項６４】
治療を必要とする哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療における、ｅｘ  ｖｉｖｏ教育済みの自家、同系、異種又は非自家ＮＫＴ細胞の使用。
【請求項６５】
前記教育済みＮＫＴ細胞が、請求項５３〜５７のいずれか１項に記載の通りである、請求項６４に記載の使用。
【請求項６６】
ＮＫＴ細胞を特異的に認識する抗体を有効成分として含む、免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための治療用組成物。
【請求項６７】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項６６に記載の治療用組成物。
【請求項６８】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項６６に記載の治療用組成物。
【請求項６９】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項６６に記載の治療用組成物。
【請求項７０】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項６６に記載の治療用組成物。
【請求項７１】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項６６に記載の治療用組成物。
【請求項７２】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まず）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項６６の治療用組成物。
【請求項７３】
免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う哺乳類の対象においてＮＫＴ細胞集団の操作をするための治療用組成物の製造における、ＮＫＴ細胞を特異的に認識する抗体の使用。
【請求項７４】
前記操作が、前記ＮＫＴ細胞集団の枯渇である、請求項７３に記載の使用。
【請求項７５】
前記ＮＫＴ細胞集団の枯渇が、結果として抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させることになる、請求項７４に記載の使用。
【請求項７６】
哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための治療用組成物の製造における、ＮＫＴ細胞を特異的に認識する抗体の使用。
【請求項７７】
前記免疫関連の障害又は疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項７３〜７６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７８】
前記免疫関連の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項７３〜７６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７９】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項７３〜７６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８０】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項７３〜７６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８１】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項７３〜７６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８２】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まず）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項７３〜７６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８３】
治療を必要とする哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害の治療方法であって、前記対象におけるＮＫＴ細胞集団を操作する方法であり、
前記ＮＫＴ細胞集団の操作が、炎性誘発性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスの変調をもたらし、前記変調は、前記対象又はもう１つの対象における免疫系の異なる構成要素、細胞、組織又は器官によって媒介されている、治療方法。
【請求項８４】
前記構成要素が細胞免疫反応要素、体液性免疫反応要素及びサイトカインを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記操作が、前記ＮＫＴ細胞集団の枯渇により実施される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
ａ．前記対象又はもう１つの対象からＮＫＴ細胞を得る工程；
ｂ．結果として得られる教育済みＮＫＴ細胞が、炎性誘発性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させ得るような形で、工程（ａ）で得られた前記ＮＫＴ細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏ教育する工程；及び
ｃ．炎性誘発性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させ得る工程（ｂ）で得られた教育済みＮＫＴ細胞を前記対象に再導入し、結果としてＩＬ４及びＩＬ１０のいずれか１つ対ＩＦＮγの定量比の減少をもたらす工程；
を含む、請求項８３に記載の哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害の治療方法。
【請求項８７】
ａ．治療すべき免疫関連又は免疫介在性の障害に関連する抗原又はエピトープ、免疫介在性炎症性応答と結びつけられる抗原又はエピトープ、又はそれらの任意の組合せ；
ｂ．前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない対象の、又は前記対象の少なくとも１つの肝臓関連細胞；
ｃ．少なくとも１つのサイトカイン、又は接着分子、又はその任意の組合せ；及び
ｄ．（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかの組合せ；
のうちのいずれか１つの存在下で前記ＮＫＴ細胞を培養することにより工程（ｂ）のｅｘ  ｖｉｖｏ教育が実施される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ｅｘ  ｖｉｖｏ教育が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害に関連する抗原の存在下で前記ＮＫＴ細胞を培養することによって実施される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記抗原が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患うドナー対象から得た同種抗原、異種抗原、自家抗原又は組換えにより調製された抗原、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記肝臓関連細胞が、クッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、肝臓関連幹細胞及び任意のその他の肝臓関連リンパ球から成る群から選択されている、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
前記サイトカインがＩＬ４、ＩＬ１０、ＴＧＦβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１２、ＩＬ２、ＩＬ１８又はＩＬ１５を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
前記接着分子がインテグリン、セレクチン又はＩＣＡＭを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９３】
前記教育済みＮＫＴ細胞が、養子免疫伝達により前記対象に再導入される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９４】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う任意の同種ドナー、異種供給源、自家供給源又は免疫学的に機能的な等価物又はそれらの任意の組合せに由来する構成要素、細胞、組織、及び／又は器官を前記対象に投与することによって、免疫関連又は免疫介在性の障害の免疫変調を前記対象の体内で惹起する工程をさらに含む、請求項８６又は８７に記載の方法。
【請求項９５】
前記構成要素、細胞、組織又は器官が経口投与される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
経口寛容化による免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患に対する免疫応答のアップ又はダウンレギュレーションを哺乳類の対象の体内で惹起することにより、かかる治療を必要としている哺乳類の対象において免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を治療するための方法。
【請求項９７】
経口寛容誘発又は経口免疫調節を通した免疫変調により、かかる治療を必要としている哺乳類の対象の体内で免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を治療するための方法。
【請求項９８】
経口寛容誘発又は経口免疫調節を通した前記免疫変調には、肝臓抽出物の経口投与が関与している、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記投与方法には、経口、静脈内、非経口、経皮、皮下、膣内、腹腔内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所又は直腸投与、又はそれらの任意の組合せが含まれる、請求項９４に記載の方法。
【請求項１００】
経口寛容誘発又は経口免疫調節を通した前記免疫変調には、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う任意の同種ドナー、異種供給源、同系供給源、自家供給源、非自家供給源、免疫学的に機能的な等価物、又はそれらの任意の組合せに由来する構成要素、細胞、組織、及び／又は器官を含む材料の経口投与が関与する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
経口寛容化、経口寛容誘発又は経口免疫調節による前記障害又は疾患に対する免疫応答のアップ又はダウンレギュレーションを前記対象の体内で惹起することをさらに含む、請求項８６又は８７に記載の方法。
【請求項１０２】
経口寛容誘発又は経口免疫調節を介した免疫変調をさらに含む、請求項８６又は８７に記載の方法。
【請求項１０３】
治療必要とする哺乳類の対象における、骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まない）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、経口寛容誘発又は経口免疫調節を介して免疫変調にする方法であり、
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスがＴｈ１、即ち炎症誘発性応答に向かってシフトし、その結果ＣＤ４＋ＩＬ４＋ＩＬ１０＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ比が減少する、方法。
【請求項１０４】
治療を必要とする哺乳類の対象における、骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まず）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、ＮＫＴ細胞を変調する方法であり、
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスがＴｈ１、即ち炎性誘発性応答に向かってシフトし、その結果ＣＤ４＋ＩＬ４＋ＩＬ１０＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ比が減少することになる、方法。
【請求項１０５】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項８３〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項８３〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項８３〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項８３〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項８３〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まず）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項８３〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記哺乳類の対象がヒトの患者である、請求項１０５〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＮＫＴ細胞が、ＣＤ５６マーカーを発現しているＮＫＴ細胞である、請求項８６又は８７に記載の方法。
【請求項１１３】
哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための治療用組成物であって、
前記組成物は、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを炎性誘発性サイトカイン産生細胞に向かって変調させる能力をもつｅｘ  ｖｉｖｏ教育済みの異種、同系、自家又は非自家ＮＫＴ細胞を有効成分として含み、さらに薬学的に受容可能な担体、希釈剤、賦形剤及び／又は添加剤を任意に含む、治療用組成物。
【請求項１１４】
前記教育済みＮＫＴ細胞がＩＬ４及びＩＬ１０のうちのいずれか１つ対ＩＦＮγの定量比の減少を媒介する、請求項１１３に記載の治療用組成物。
【請求項１１５】
ａ．治療すべき前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患と関連する抗原又はエピトープ、免疫介在性炎症性応答に関連する抗原、又はエピトープ、又はそれらの任意の組合せ；
ｂ．前記障害又は疾患を患う寛容化された又はされていない患者の又は前記対象の少なくとも１つの肝臓関連細胞；
ｃ．少なくとも１つのサイトカイン、又は接着分子、又はその任意の組合せ；及び
ｄ．上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかの組合せ；
のうちのいずれか１つの存在下でｅｘ  ｖｉｖｏ培養することにより前記教育済みＮＫＴ細胞が得られる、請求項１１４に記載の治療用組成物。
【請求項１１６】
前記教育済みＮＫＴ細胞が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害と結びつけられる抗原の存在下でｅｘ  ｖｉｖｏ培養することによって得られる、請求項１１５に記載の治療用組成物。
【請求項１１７】
前記抗原が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患うドナーからの同種抗原、異種抗原、同系抗原、自家抗原、非自家抗原、組換えにより調製された抗原、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項１１６に記載の治療用組成物。
【請求項１１８】
前記肝臓関連細胞が、クッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、及び任意のその他の肝臓関連リンパ球を含む、請求項１１５に記載の治療用組成物。
【請求項１１９】
前記サイトカインがＩＬ４、ＩＬ１０、ＴＧＦβ、ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ１８、ＩＬ１２又はＩＬ１５を含む、請求項１１５に記載の治療用組成物。
【請求項１２０】
前記接着分子がインテグリン、セレクチン又はＩＣＡＭを含む、請求項１１５に記載の治療用組成物。
【請求項１２１】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項１１３〜１２０のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項１２２】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項１１３〜１２０のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項１２３】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項１１３〜１２０のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項１２４】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項１１３〜１２０のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項１２５】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項１１３〜１２０のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項１２６】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まず）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項１１３〜１２０のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項１２７】
免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う哺乳類の対象において、炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させるための治療用組成物の製造における、教育済み自家、異種、同系又は非自家ＮＫＴ細胞の使用。
【請求項１２８】
哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための治療用組成物の製造における教育済み自家、異種、同系又は非自家ＮＫＴ細胞の使用であって、該教育済みＮＫＴ細胞がＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かって変調させる、使用。
【請求項１２９】
前記教育済みＮＫＴ細胞が、ＩＬ４及びＩＬ１０のいずれか１つ対ＩＦＮγの定量比の増大を媒介する、請求項１２７又は１２８に記載の使用。
【請求項１３０】
前記組成物の教育済みＮＫＴ細胞が、免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う哺乳類の対象において炎性誘発性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／ＴＨ２細胞バランスを変調させ、前記ＮＫＴ細胞が、ＩＬ４及びＩＬ１０のうちのいずれか１つ対ＩＦＮγの定量比の減少を媒介する、請求項１２７または１２８に記載の治療用組成物。
【請求項１３１】
前記組成物の教育済みＮＫＴ細胞が炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させる、哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための請求項１２７または１２８に記載の治療用組成物。
【請求項１３２】
免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う哺乳類の対象のＮＫＴ細胞集団の操作のための治療用組成物の製造における、ＮＫＴ細胞を特異的に認識する抗体の使用。
【請求項１３３】
前記操作が、前記ＮＫＴ細胞集団の枯渇である、請求項１３２に記載の使用。
【請求項１３４】
前記ＮＫＴ細胞集団の枯渇が、結果として炎性誘発性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させることになる、請求項１３３に記載の使用。
【請求項１３５】
前記免疫関連の障害又は疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項１３２〜１３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３６】
前記免疫関連の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項１３２〜１３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３７】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項１３２〜１３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３８】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項１３２〜１３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３９】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項１３２〜１３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４０】
前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まず）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項１３２〜１３４のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願に対するリファレンス
本出願は、２００１年１２月２４日付けで出願された国際特許出願公開第ＰＣＴ／ＩＬ０１／０１１９７号明細書の３７１である２００３年６月２５日付けで出願されたヤロン・イラン（Ｙａｒｏｎ  Ｉｌａｎ）ら、による「教育済みＮＫＴ細胞及び免疫関係の障害の治療におけるその使用」という題の米国特許出願の部分継続出願である。上述の特許出願の内容は、その全体が本明細書に参照として援用されている。
【０００２】
発明の分野
本発明は、哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害の治療における治療用方法、組成物及びその使用の分野に関する。より特定的には、該発明の方法及び組成物は、抗炎症性又は炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かってのＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスの変調を結果としてもたらす対象のＮＫＴ細胞集団の操作及び免疫関係の障害の治療におけるそれらの使用に向けられている。
【０００３】
背景
本出願内で引用又は識別されている全ての特許、特許出願、特許公報、科学論文などは、本発明が関係する技術の現状をより完全に記述する目的でその全体が本明細書に参照として援用されるものである。
【背景技術】
【０００４】
免疫系は、潜在的に有害な作用物質に対する防御の主要な部分を担っている。しかしながら、この系は、自己抗原にも対抗し、炎症性腸疾患といった自己免疫障害をもたらす可能性がある。これらの障害は、炎症誘発性（Ｔｈ１）及び抗炎症性（Ｔｈ２）サイトカインの間のバランス不全として感知される。
【０００５】
免疫応答の克服には、望ましくない副作用を導く可能性の高い全身的免疫抑制が関与する傾向がある。かくして、抗原特異的免疫抑制の誘発のための代替的戦略に対する必要性が存在する。免疫寛容は、２つのタイプの機序によって誘発され得る。第１の「劣性」と呼ばれるものには、抗原に応答する能力をもつ圧倒的多数の免疫細胞のクローン・アネルギー又は排除が関与する［マッツィンガー（Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ）、Ｐ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：９９１〜１０４５頁（１９９４年）：キン（Ｑｉｎ）、Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９７４〜９７７頁（１９９３年）］。代替的には、「優性」タイプの寛容においては、負の免疫調節リンパ球が寛容化手順の結果として現われ得る。クローン排除又はエネルギーとは対照的に、これらのリンパ球が少しだけ存在する場合、それは、はるかに多いエフェクタ細胞をダウンレギュレートし得る。
【０００６】
炎症性腸疾患の病因論における免疫系の役割
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、Ｔｈ１−炎症誘発性及びＴｈ２−抗炎症性亜型の免疫応答の間のバランス不全の結果であるものとして感知され得る一般的な胃腸障害である［ストローバ（Ｓｔｒｏｂｅｒ）、Ｗ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １８：６１〜６４頁、（１９９７年）；ノイラート（Ｎｅｕｒａｔｈ）、Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２６０５〜２６１５頁（１９９６年）］。
【０００７】
ＩＢＤに随伴する腸外徴候がいくつか存在する。例えば、自己免疫現象、つまり疾病を緩和するのに用いられるグルココルチユイド、アザチオプリン、メトトレキサート及びサイクロスポリンといった標的器官の損傷及び免疫抑制剤において１つの役割をもつ免疫複合体の形成がある［ポドルスキー（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ）、Ｄ．Ｋ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５：９２８〜９３５頁（１９９１年）；ストローバ、Ｗ．ら、Ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中、Ｍｏｓｂｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．Ｒ．Ｒ．Ｒｉｃｈ編、１４０１〜１４２８１〜２（１９９５年）］。ＩＢＤ患者は、結腸細胞の構成要素に対する抗体及び複数の異なる細菌抗原を有している。これらの抗原は、上皮損傷の結果として免疫系に進入可能となる［ヒビ（Ｈｉｂｉ）、Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５４：６３〜１６８頁（１９８３年）；ダス（Ｄａｓ）、Ｋ．Ｍ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ９８：４６４〜６９頁（１９９０年）］。同時代アネルギー及び応答性低下を含めたＴ細胞媒介免疫の異常は同様に、これらの患者において記述されてきた［チバ（Ｃｈｉｂａ）、Ｍ．ら、Ｇｕｔ、２２：１７７〜１８２頁（１９８１頁）；レードラ（Ｒａｅｄｌｅｒ）、Ａ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６０：５１８〜５２６頁（１９８５年）］。さらに、抗原刺激を示唆するＴ細胞サブセット内の変化及び粘膜ＩｇＧ細胞の濃度増加を含めた、粘膜細胞媒介免疫の変化が同定された。［ダスグプタ（Ｄａｓｇｕｐｔａ）、Ａ．ら、Ｇｕｔ３５：１７１２〜１７頁（１９９４年）；タカハシ、Ｆら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：３１１〜３１８頁（１９８５年）］。感染性免疫又は毒性損傷の後の標的抗原の暴露は、粘膜免疫細胞の活性化を導き、その結果、サイトカインが粘膜炎症性応答を導くことになる［ノイラート、Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２６０５〜２６１６頁（１９９６年）］。ＩＦＮγといった炎症誘発性サイトカインの分泌は、粘膜透過性の増大に貢献し、ＩＢＤの動物モデルにおいて記述されてきた［ストローバ、Ｗ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１８：６１〜６４頁（１９９７年）］。同様にして、ＩＬ１及びＩＬ６を媒介とするコラーゲン合成の増大が、これらの動物で検出できる［ストローバ、Ｗ．ら、上掲書］。Ｂａｌｂ／ＣマウスからＣＢ−１７ｓｃｉｄマウスへの正常なＣＤ４５ＲＢＴの養子免疫伝達により、Ｔｈ１−媒介型肉芽腫性大腸炎モデルが確立されてきた。ＣＤ４５ＲＢからのＣＤ４細胞は、ＣＤ４５ＲＢ集団と共に注射された場合、疾病を予防することが示された。この予防は、ＴＧＦβ１に対する抗体の添加により逆転させることができた［サドラック（Ｓａｄｌａｃｋ）、Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ７５：２５３〜２６１頁（１９９３年）；パウリ（Ｐｏｗｒｉｅ）、Ｆ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１：５５３〜５６２頁（１９９４年）］。
【０００８】
炎症性腸疾患におけるＴｈ１／Ｔｈ２のバランス不全
ＣＤ４及びＣＤ８の両方のリンパ球が共に、ＩＬ−２及びＩＦＮγを産生するＴｈ１細胞か又はＩＬ−４及びＩＬ−１０を産生するＴｈ２細胞のいずれかとして型別可能である。免疫系が外来性及び自己抗原に応答する方法は、２つの亜型の応答間のバランスの結果である［ウェイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）、Ｈ．Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：３３５〜３４３頁アドリーニ（Ａｄｏｒｉｎｉ）、Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１８：２０９〜２１１頁（１９９７年）；ラバニ（Ｒａｂｂａｎｉ）Ｅ．ら、欧州特許出願公開第１１４９５８６Ａ１号明細書（２００１年４月２７日出願）、本明細書に参照として援用］。Ｔｈ１型の応答は、ＩＢＤといった複数の自己免疫及び慢性炎症性障害の病因に関与している。［アドリーニ（Ａｄｏｒｉｎｉ）、Ｌ．ら（１９９７年）上掲書；ミゾグチ（Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ）、Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８４７〜８５６頁（１９９６年）］。かくして、ヒトにおける実験的結腸炎及びＩＢＤは、炎症誘発性Ｔｈ１型及び抗炎症性Ｔｈ２型サイトカインの間のバランス不全として感知できる。最近、動物及びヒトの両方において、ＩＬ１０といった抗炎症性サイトカインがＴｈ１媒介型サイトカインの炎症誘発性効果をダウンレギュレートしかくして免疫介在性障害を緩和することができる、ということが示されてきた［ミゾグチ、Ａ．ら、（１９９６年）同上；マドセン（Ｍａｄｓｅｎ）、Ｋ．Ｌ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１１３：１５１〜１５９頁（１９９７年）；ヴァン・デバンター・サンダー（Ｖａｎ  Ｄｅｖｅｎｔｅｒ  Ｓａｎｄｅｒ）、Ｊ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１１３：３８３〜３８９頁（１９９７年）］。
【０００９】
免疫介在性障害の改善のための経口寛容誘発（経口免疫調節）
経口寛容（経口免疫調節）は、抗原特異的末梢免疫低応答性の誘発のための認知された手順である［ウェイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）、Ｈ．Ｌ．ら、（１９９７年）同上；ウェイナー、Ｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１０７６２〜１０７６５頁（１９９４年）；ロイ・チョードリ（Ｒｏｙ−Ｃｈｏｗｄｕｒｙ）ら、国際公開第９８／３７９１７号パンフレット（１９９８年２月２６日出願）、本明細書に参照として援用］。抗原の経口投与は、動物及びヒトの両方において、コラーゲン誘発された関節炎、ブドウ膜炎、糖尿病及び実験的アレルギー性脳脊髄炎といった複数の自己免疫障害を防止する又は緩和することが示されてきた。［エスビョルン（Ｅｓｂｊｏｒｎ）、Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２１９〜２２３頁（１９９７年）；ヴォン・ヘラース（Ｖｏｎ  Ｈｅｒｒａｔｈ）、Ｍ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ．９８：１３２４〜１３３１頁（１９９６年）；ハンコック（Ｈａｎｃｏｃｋ）、Ｗ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４７：１１９３〜１１９７頁（１９９３年）；ウェイナー、Ｈ．Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１３２１〜１３２４頁（１９９３年）］。
【００１０】
高用量の抗原に対する経腸暴露は、抗原特異的Ｔ細胞のクローン不活性化による寛容を誘発し、一方低用量の抗原の補給は、抗原特異的エフェクタ細胞の生成を抑制する調節細胞分泌因子の誘発を導く［ウェイナー、Ｈ．Ｌ．ら、（１９９７年）上掲書］。動物及びヒトの両方において、寛容誘発は、ＩＬ１０、ＩＬ４及びＴＧＦβ１といった免疫抑制サイトカインの分泌を導くＴｈ２／Ｔｈ３型免疫応答と結びつけられる［ウェイナー、Ｈ．Ｌ．ら、（１９９７年）上掲書］。多数の密に関係する抗原に対する反応性が関与する傍観者効果が、複数のモデルで経口寛容誘発における１つの役割を果たすことが示された。［ウェイナー、Ｈ．Ｌ．ら、（１９９７年）上掲書；カルバルホ（Ｃａｒｖａｌｈｏ）、Ｂ、Ａ．ら、Ｓｃａｎｄ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：２７６〜２８１頁（１９９７年）］。調節細胞は、補給された抗原によりトリガーされた後に非抗原特異的サイトカインを分泌することから、これらは、補給済み抗原が局在化されている徴環境内で炎症を抑制することができる。該手順は、免疫寛容誘発用の方法として充分確立されているが、正確な機序はまだ発見されていない。１つの抗原がプロセッシング及び／又は吸収されるべきか否か及び寛容誘発にとってタンパク質変性が必要であるか否かについては、相反する結果が発表されている［カルバルホ、Ｂ．Ａ．ら、（１９９７年）上掲書：ブラナス（Ｂｌａｎａｓ）、Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：１７０７〜１７０９頁（１９９６年）］。
【００１１】
抗原提示には、腸内へ全タンパク質を提示することが必要とされ得る。しかしながら、タンパク質のプロセッシング及び吸収も同様に、寛容誘発又は消化管後機序を通してその維持に関与する可能性がある［（カルバルホ、Ｂ．Ａ．ら（１９９７年））上掲書］。消化管壁上皮細胞、パイエル板、腸間膜リンパ節又は腸外細胞が、免疫寛容誘発を媒介するものとして示唆されてきた［ストローバ、Ｗ．ら（１９９７年）上掲書］。しかしながら、抗原の経口投与は同様に、エピトープ特異的免疫も惹起することができる［カルバルホ、Ｂ．Ａ．ら、（１９９７年）上掲書；ブラナス、Ｅ．ら、（１９９６年）上掲書」。実際、経口寛容化の後に現われる免疫抑制サイトカイン分泌細胞（例えばＴＧＦβを分泌するＴｈ３細胞）と並んで、炎症誘発性サイトカイン（例えばＩＦＮγ）を分泌する第２の細胞集団を、消化管壁、主としてパイエル板の中に発見できる［ウェイナー、Ｈ．Ｌ．ら、（１９９７年）上掲書」。経口投与された抗原は、全身性ＴＧＦβ及びＩＬ−４媒介型抗炎症性応答と共に消化管粘膜内でＩＦＮγ媒介型の局所的炎症誘発性応答を惹起する。経口寛容化された動物由来の脾細胞とは対照的に、消化管抽出されたリンパ球は、実験未使用の動物内に寛容を伝達することができない［ストローバ、Ｗ．ら、（１９９７年）上掲書；ウェイナー、Ｈ．Ｌ．ら（１９９７年）上掲書」。かくして、経口寛容の誘発には、Ｔｈ１（及び炎症誘発性サイトカインの分泌）からＴｈ２（及び抗炎症性サイトカインの分泌）免疫応答へのシフトを伴って、免疫原性及び寛容原性細胞集団の間のバランスが必要である。
【００１２】
その他の研究者及び本発明者らにより、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）で処置されたマウスを利用するモデル系内で実験的結腸炎を防止又は緩和するのに経口寛容を使用できるということが示されてきた［マドセン（Ｍａｄｓｅｎ）、Ｋ．Ｌ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１３：１５１〜１５９頁（１９９７年）；トロップ（Ｔｒｏｐ）、Ｓ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：７４６〜７５５頁（１９９９年）］。結腸炎抽出されたタンパク質に対する経口寛容の誘発は、抗結腸免疫応答をダウンレギュレートし、かくして、免疫介在性結腸炎を改善する。サプレッサリンパ球は、炎症誘発性から抗炎症性への免疫応答のシフトの誘発により、寛容を媒介する［マドセン、Ｋ．Ｌ．ら、（１９９７年）上掲書、；トロップ、Ｓ．ら、上掲書］。
【００１３】
免疫寛容誘発における肝臓の役目
肝臓は、長い間免疫調節機能に関与することが示唆されてきた。それは、体内で最大の網内系器官であり、その細胞の複数の亜集団が抗原の提示及び／又はプロセッシングに関与している［カルリ（Ｃａｌｌｅｒｙ）、Ｍ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．４６：３９１〜３９４頁（１９８９年）；ナカノ（Ｎａｋａｎｏ）、Ｙ．ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  １１１：６６８〜６７６頁（１９９２年）；ユー（Ｙｕ）、Ｓ．Ｙ．ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  １１６：２２９〜２３４頁（１９９４年）］。
【００１４】
門脈大静脈シャント又はクッパー細胞の遮断は、複数の動物モデルにおいて経口寛容の誘発を妨げた［カルリ、Ｍ．Ｐ．ら、（１９８９年）上掲書；ナカノ、Ｙ．ら、（１９９２年）上掲書；ユー、Ｓ．Ｙ．ら、（１９９４年）上掲書」。腸内細菌叢に対する抗体力価は、門脈大静脈シャントを受けた慢性肝疾患をもつヒトにおいて高くなることが発見された［クリスプ（Ｃｒｉｓｐｅ）、Ｎ．ら、Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ１１：２３６〜２４５頁（１９９６年）；イラン（Ｉｌａｎ）、Ｙ．ら、Ｇａｓｔｒｏ１１４：２６０頁（１９９８年）］。ドナー細胞の門脈投与は、同種特異的低応答性を促進することが示されてきた［クリスプ、Ｎ．ら、（１９９６年）上掲書」。かくして、肝臓は、細胞又はペプチドの特異的亜集団の第１の通過クリアランスを通した末梢免疫寛容誘発のために必要であり得る。
【００１５】
当該例は、マウス肝臓抽出の連続的給餌による経口免疫調節の誘発は、ｏｂ／ｏｂマウスグルコース不寛容を改善し、その肝脂肪含有量を低減させる一方、コンカナバリン−Ａにより媒介される肝損傷を受けやすくする、ということを示している。この機序には、Ｔｈ１／Ｔｈ２シフト応答が関与している。
【００１６】
肝臓関連リンパ球
成人の肝臓は、その免疫変調機能に関与する細胞の複数の亜集団を含有している。クッパー細胞は、門脈循環を通って肝臓に入る抗原に対する第１線の防御において重要であることが発見された。抗原活性化されたクッパー細胞は、抗原提示、食作用を有し、サイトカインの分泌を介して殺傷特性を示した。これらの細胞は同様に走化性及びリンパ球凝集をも誘発する［クリスプ．Ｎ．ら、（１９９６年）上掲書」。さらに、成人肝臓は、多能性幹細胞を含有し、胸腺及び胸腺外Ｔ細胞、顆粒球及び赤血球系統細胞を含めた多数の細胞系統を発生させる［クリスプ．Ｎ．ら、（１９９６年）上掲書」。実際、Ｔ細胞は、成人肝臓内で胸腺外で分化できる［コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：３１１４〜３１１８頁（１９９６年）］。
【００１７】
肝臓は、高ＴＣＲ（ＴＣＲｈｉｇｈ）を伴う胸腺由来のＴ細胞及び中間ＴＣＲ（ＴＣＲｉｎｔ）を伴う胸腺外Ｔ細胞から成る２つのＴ細胞集団のための遭遇場所であると思われる。主流Ｔ細胞としても知られている第１のＴ細胞セットは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の二流の集団の混合物及び、ＮＫ細胞マーカー又はＩＬ２Ｒβを発現せずかつ循環するＴ細胞プールに密に連結しているＣＤ−ＣＤ８−ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞の大きな集団を含有する［クリスプ、Ｎ．ら、（１９９６年）上掲書」。ＤＮ細胞の多くは、Ｂ細胞マーカーＢ２２０を発現し、その誘発は肝臓へのアポトーシスするＴ細胞のトラフィックを導く［クリスプ．Ｎ．ら、（１９９６年）上掲書；Ｉｌａｎ、Ｙ．ら、（１９９８年）上掲書；コリンズ、Ｃ．ら、（１９９６年）上掲書；ガルシア・バルシナ（Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｃｉｎａ）、Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏ  ｌ８２：９５〜８頁（１９９４年）；マクドナルド（ＭａｃＤｏｎａｌｄ）Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：６３３〜６３８頁（１９９５年）］。代替的Ｔ細胞として知られる肝臓Ｔ細胞の第２のサブセットは、ＣＤ４＋、又はＣＤ４−８−及びＣＤ１６−、高速（ｅｘｐｒｅｓｓ）αβＴＣＲｉｎｔ及び、ＮＫＲ−Ｐ１、Ｌｙ−４９Ａ及びＩＬ２レセプタβ−鎖を含めた既知のＮＫレセプタである。［ガルシア・バルシナ、Ｍ．ら、（１９９４年）上掲書、マクドナルド、Ｒ．Ｈ．ら、（１９９５年）上掲書、；バンドラック（Ｂｅｎｄｅｌａｃ）、Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３６７〜３７４頁（１９９５年）］。肝臓ＩＬ２Ｒβ＋ＴＣＲｉｎｔ細胞の大部分はＮＫ１．１＋である。これらの細胞は、末梢リンパ様器官を通って循環するプール内で稀である。しかしながらこれらの細胞の小さな集団は、胸腺髄質、脾臓及び骨髄の中に存在する。ＴＣＲｉｎｔ、ＩＬ２Ｒβ＋、ＮＫ１．１＋細胞は、従来の胸腺経路を通ってではなく原始経路、胸腺及び胸腺外代替経路を通って分化し、胸腺摘出された動物の肝臓内で発達し得る［マクドナルド、Ｒ．Ｈ．ら、（１９９５年）上掲書；ベンドラック、Ａ．ら、（１９９５年）上掲書；タカハシ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：２４３６〜２４４２頁（１９９６年）；ドハティ（Ｄｏｈｅｒｔｙ）、Ｄ．Ｇ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２６：４４５Ａ頁（１９９７年）］。それらの機能は、従来のＴ細胞のいずれかのサブセットのものの特徴ではないが、細胞毒性及びＢ細胞ヘルプの要素を含む。一次活性化の時点で、これらはＴｈ１及びＴｈ２の両方に由来する多様なサイトカインを放出する。［マクドナルド、Ｒ．Ｈ．ら、（１９９５年）上掲書；ベンドラック、Ａ．ら、（１９９５年）上掲書；タカハシ、Ｍ．ら、（１９９６年）上掲書；ドハティ、Ｄ．Ｇ．ら、（１９９７年）上掲書」。これらは同様にＩＬ１２に応答し、ＩＦＮγを産生し、これらの両方共がＴｈ１サイトカインであり、抗腫瘍及び抗菌エフェクタ細胞を誘発する。［タカハシ、Ｍ．ら、（１９９６年）上掲書；ドハティ、Ｄ．Ｇ．ら、（１９９７年）上掲書」。さらに肝臓内でこれらの細胞はＩＬ１２及びＩＦＮαに応答して増殖し、末梢欠失中、主流Ｔ細胞に対する致死ヒットに積極的に関与し得る［タカハシ��Ｍ．ら、（１９９６年）上掲書；ドハティ、Ｄ．Ｇ．ら、（１９９７年）上掲書」。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的の１つは、末梢免疫寛容誘発、脾細胞の養子免疫伝達を介した炎症及び／又は寛容の誘発、特定的にはリンパ球の免疫原性及び寛容原性サブセットの間のバランスを保つ上でのＮＫ１．１＋リンパ球の役割を判定することにある。本研究の結果は、初めて、ＮＫ１．１＋リンパ球が免疫介在性障害において２重の役割を果たし得るということを示している。「寛容化された環境」において、これらは、抗炎症性方向でのＴｈ１／Ｔｈ２パラダイムの改変を介して免疫低応答性を誘発しかつ／又は維持する。一方、「寛容化されていない環境」においては、これらは炎症誘発性パラダイムを支援する。該発明のこの目的及びその他の目的は、記述が進むにつれてさらに明白になることだろう。
【００１９】
哺乳類の対象における免疫関連又は媒介型の障害又は疾患、感染性疾患、代謝疾患及び異なる型の癌の治療のためにさまざまな方法が記述されてきた。これらの方法の１つには、対象中の免疫応答の変調が関与している。これには、選択的免疫ダウンレギュレーション（ＳＩＤＲ）と呼ばれる新しくかつ予想外の免疫変調を産生し適用するための手順又は手順の組合せを用いた免疫応答系のダウンレギュレーションが含まれる。免疫学的変調は、試薬、手順及びプロセスの導入に応答した対象の免疫系における人工的に誘発された変動である。これらの手順は、１９９７年２月２８日付けの米国特許出願第０８／８０８，６２９号明細書、２００３年３月４日付けの米国特許出願第１０／３７７，６２８号明細書、２００３年３月４日付けの米国特許出願第１０／３７７，６０３号明細書、１９９７年２月８日付けの米国特許出願第０９／４４７，７０４号明細書、２００１年５月９日付けの米国特許出願第１０／３８５，４４０号明細書及び１９９９年７月１６日付けの米国特許出願第０９／３５６，２９４号明細書の中で詳述されてきた。以上の特許の各々はその全体が本出願の中に参照として援用されており、本発明と併用してさらに使用可能である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明の要約
第１の態様では、該発明は、かかる治療を必要とする哺乳類の対象において免疫関連又は免疫介在性の障害を、適切な手段により前記対象のＮＫＴ細胞集団を操作することによって治療するための方法において、該ＮＫＴ細胞集団の前記操作が抗炎症性又は炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かってのＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスの変調を結果としてもたらす治療方法に関する。
【００２１】
好ましい実施形態においては、該発明は前記細胞の枯渇によりＮＫＴ細胞集団を操作する方法に関する。特定的に好ましい実施形態として、ＮＫＴ細胞集団の枯渇は、ＮＫＴ細胞を特異的に認識する抗体を有効成分として含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することによって実施され得る。代替的には、ＮＫＴ細胞集団の枯渇は、ＮＫＴ細胞を特異的に認識する抗体でコーティングされたビーズを用いてｅｘ  ｖｉｖｏフェレーシスによって実施され得る。
【００２２】
代替的に好ましい実施形態では、該発明は、哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害の治療方法において、抗炎症性又は炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２バランスを変調させる能力を有するような形での前記ＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ教育によるＮＫＴ細胞集団の操作が関与する方法に関する。
【００２３】
特定的に好ましい実施形態は、
ａ．  対象又はもう１つの対象からＮＫＴ細胞を得る工程；
ｂ．  結果として得られた教育済みＮＫＴ細胞が、抗炎症性又は炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かって前記Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させる能力を有するような形で、工程（ａ）で得られたＮＫＴ細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏ教育する工程；及び
ｃ．  工程（ｂ）で得られた教育済みＮＫＴ細胞を前記対象に再導入する工程；
を含む、哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害の治療のための方法に関する。抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってのＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスの変調は、結果としてＩＬ４及びＩＬ１０のいずれか１つ対ＩＦＮγの定量比の増大をもたらす。炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かってのＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスの変調は、ＩＬ４及びＩＬ１０のいずれか１つの対ＩＦＮγの定量比の減少を結果としてもたらす。
【００２４】
より特定的には、ＮＴＫ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ教育は、
ａ．  治療すべき免疫関連又は免疫介在性の障害と結びつけられる抗原又はそれらの任意の組合せ；
ｂ．  同じ免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない患者の又は前記対象の少なくとも１つの肝臓関連細胞；
ｃ．  少なくとも１つのサイトカイン又は接着分子；及び
ｄ．  上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかの組合せ；
のうちのいずれか１つの存在下でこれらの細胞を培養することにより実施可能である。
【００２５】
該発明の方法に従ったｅｘ  ｖｉｖｏ教育済みＮＫＴ細胞は、治療対象への養子免疫伝達により再導入される。
【００２６】
もう１つの好ましい実施形態は、免疫関連又は免疫介在性の障害が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、該発明の方法に関する。より特定的には、前記疾病はクローン病であり得る。
【００２７】
もう１つの特定的に好ましい実施形態においては、該発明の方法は、黒色腫、癌腫、リンパ腫及び肉腫から成る群から選択された悪性腫瘍の治療用である。この目的で、ＮＫＴ細胞は、有利な抗腫瘍免疫を増大させるべく炎症誘発性方向に免疫応答を増強させる方向で操作され得る。
【００２８】
好ましい実施形態は、免疫関連又は免疫介在性の障害が非アルコール性脂肪性肝炎である該発明の方法に関する。
【００２９】
もう１つの好ましい実施形態では、該発明の方法は、肥満の治療用である。
【００３０】
該発明のもう１つの好ましい実施形態は、真性糖尿病又は耐糖能異常の治療用の方法である。
【００３１】
さらにもう１つの好ましい実施形態においては、該発明の方法は、移植片対宿主病の治療用である。
【００３２】
もう１つの好ましい実施形態は、骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まず）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む免疫関連又は媒介型の障害又は疾患の治療用の該発明の方法に関する。
【００３３】
好ましい実施形態は、免疫関連又は媒介型の障害又は疾患の治療のための経口寛容誘発又は経口免疫調節を通した免疫変調方法に関する。
【００３４】
好ましい実施形態は、非アルコール性脂肪性肝炎の治療用の経口寛容誘発又は経口免疫調節を通した免疫変調方法に関する。
【００３５】
もう１つの好ましい実施形態は、真性糖尿病又は耐糖能異常の治療用の経口寛容誘発又は経口免調節を通した免疫変調方法に関する。
【００３６】
さらにもう１つの好ましい実施形態においては、該発明は、肥満の治療用の経口寛容誘発又は経口免調節を通した免疫変調方法に関する。
【００３７】
該発明の方法は任意には、好ましくは経口寛容化により免疫関連又は免疫介在性の障害に対する免疫応答のアップ又はダウンレギュレーションを対象の体内で惹起する工程をさらに含み得る。
【００３８】
さらにもう１つの好ましい実施形態は、骨粗鬆症、ＧＶＨＤ、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まず）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む免疫関連又は媒介型の障害又は疾患の治療のための経口寛容誘発又は経口免疫調節を通した免疫変調の方法に関する。
【００３９】
さらにもう１つの特定的に好ましい実施形態では、該発明の方法は、ヒトの患者の治療用である。
【００４０】
本発明の第２の態様は、哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害の治療のための治療用組成物に関する。該発明の組成物は、抗炎症性又は炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させる能力をもつｅｘ  ｖｉｖｏ教育済み自家又は非自家ＮＫＴ細胞を有効成分として含んでいる。これらの教育済みＮＫＴ細胞は、ＩＬ４及びＩＬ１０のいずれか１つ対ＩＦＮγの定量比の増大又は減少を媒介する。該発明の組成物は、任意にはさらに、薬学的に受容可能な担体、希釈剤、賦形剤及び／又は添加剤を含み得る。
【００４１】
好ましい実施形態においては、該発明の治療用組成物内に含まれる教育済みＮＫＴ細胞は、
ａ．  前記免疫関連又は免疫介在性の障害と結びつけられる抗原又はそれらの任意の組合せ；
ｂ．  前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない患者の又は治療すべき対象の少なくとも１つの肝臓関連細胞；
ｃ．  少なくとも１つのサイトカイン又は接着分子；及び
ｄ．  上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかの組合せ；
のうちのいずれか１つの存在下で、該発明の組成物中でのその使用に先立ちｅｘ  ｖｉｖｏで培養される。
【００４２】
好ましい実施形態では、該発明の治療用組成物は、哺乳類の対象、特にヒトにおける腸の感染性疾患の治療、より特定的にはクローン病の治療用である。
【００４３】
もう１つの好ましい実施形態では、該発明の治療用組成物は、黒色腫、癌腫、リンパ腫及び肉腫から成る群から選択された悪性腫瘍の治療用である。
【００４４】
好ましい実施形態では、該発明の治療用組成物は、非アルコール性脂肪性肝炎の治療用である。
【００４５】
もう１つの好ましい実施形態では、該発明は、肥満治療のための治療用組成物に関する。
【００４６】
該発明のもう１つの好ましい実施形態は、真性糖尿病又は耐糖能異常治療のための治療用組成物である。
【００４７】
さらにもう１つの好ましい実施形態においては、該発明の治療用組成物は、移植片対宿主病の治療のために使用可能である。
【００４８】
さらにもう１つの好ましい実施形態では、該発明は、免疫関連又は免疫介在性の障害の治療のための治療用組成物に関する。この組成物は、ＮＫＴ細胞を特異的に認識する抗体を有効成分として含む。
【００４９】
一実施形態においては、該発明の治療用組成物は、クローン病といった腸炎症性疾患の治療のために使用可能である。
【００５０】
もう１つの実施形態においては、該発明の治療用組成物は、黒色腫、癌腫、リンパ腫及び肉腫から成る群から選択された悪性腫瘍の治療のために使用することができる。この目的で、ＮＫＴ細胞は、有利な抗腫瘍免疫を増大させるべく炎症誘発性方向に免疫応答を増強させる方向に操作され得る。
【００５１】
もう１つの好ましい実施形態は、骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まず）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む免疫関連又は媒介型の障害又は疾患の治療用の該発明の方法に関する。
【００５２】
好ましい実施形態は、免疫関連又は媒介型の障害又は疾患の治療のための治療用組成物の製造における経口抗原の使用に関する。
【００５３】
好ましい実施形態は、非アルコール性脂肪性肝炎治療のための治療用組成物の製造における経口抗原の使用に関する。
【００５４】
もう１つの好ましい実施形態は、真性糖尿病又は耐糖能異常の治療のための治療用組成物の製造における経口抗原の使用に関する。
【００５５】
さらにもう１つの好ましい実施形態においては、該発明は、肥満治療のための治療用組成物の製造における経口抗原の使用に関する。
【００５６】
もう１つの好ましい実施形態では、経口抗原は、骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まず）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む免疫関連又は媒介型の障害又は疾患の治療のための治療用組成物の製造において使用される。
【００５７】
第３の態様としては、本発明は、免疫関連又は免疫介在性の障害を患う哺乳類の対象の体内で抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２バランスを変調させるための治療用組成物の製造における、教育済みの自家又は非自家ＮＫＴ細胞の使用に関する。
【００５８】
特定的に好ましい実施形態においては、該発明は哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害の治療のための治療用組成物の製造においてｅｘ  ｖｉｖｏ教育済みの自家又は非自家ＮＫＴ細胞の使用に関する。教育済みＮＫＴ細胞は、抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させる能力をもちかくして、ＩＬ４とＩＬ１０のいずれか１つ対ＩＦＮγの定量比の増大を媒介する。
【００５９】
１つの特定的に好ましい実施形態においては、該発明は、哺乳類の対象特にヒトの患者の腸炎症性疾患の治療用、特にクローン病の治療用の治療用組成物の製造におけるｅｘ  ｖｉｖｏ教育済みの自家又は非自家ＮＫＴ細胞の使用に関する。
【００６０】
もう１つの特定的に好ましい実施形態においては、該発明は、悪性腫瘍の治療、より特定的には黒色腫、癌腫、リンパ腫及び肉腫の治療のための治療用組成物の製造におけるｅｘ  ｖｉｖｏ教育済み自家又は非自家ＮＫＴ細胞の使用に関する。
【００６１】
好ましい実施形態においては、該発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の治療のための治療用組成物の製造におけるｅｘ  ｖｉｖｏ教育済み自家又は非自家ＮＫＴ細胞の使用に関する。
【００６２】
もう１つの好ましい実施形態においては、該発明は、肥満の治療のための治療用組成物の製造におけるｅｘ  ｖｉｖｏ教育済み自家又は非自家ＮＫＴ細胞の使用に関する。
【００６３】
該発明のもう１つの好ましい実施形態は、真性糖尿病又は耐糖能異常の治療のための治療用組成物の製造におけるｅｘ  ｖｉｖｏ教育済み自家又は非自家ＮＫＴ細胞の使用に関する。
【００６４】
さらにもう１つの実施形態においては、該発明は、移植片宿主病の治療のための治療用組成物の製造におけるｅｘ  ｖｉｖｏ教育済み自家又は非自家ＮＫＴ細胞の使用に関する。
【００６５】
もう１つの好ましい実施形態は、骨粗鬆症、多発性硬化症、ＳＬＥ、関節リウマチ、ＪＲＡ、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患（糖尿病を含まず）、脈管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む免疫関連又は媒介型の障害又は疾患の治療用の該発明の方法に関する。
【００６６】
本発明はさらに、かかる治療を必要としている哺乳類の対象の体内の免疫関連又は免疫介在性の障害の治療において使用するためのｅｘ  ｖｉｖｏ教育済み自家ＮＫＴ細胞を提供する。該教育済みＮＫＴ細胞は、
ａ．  治療すべき免疫関連又は免疫介在性の障害と結びつけられる抗原又はそれらの任意の組合せ；
ｂ．  前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない患者の又は前記対象の少なくとも１つの肝臓関連細胞；
ｃ．  少なくとも１つのサイトカイン又は接着分子；及び
ｄ．  上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかの組合せ；
のうちのいずれか１つの存在下でｅｘ  ｖｉｖｏ培養されてきたものである。
【００６７】
本態様のもう１つの実施形態においては、該発明は、かかる治療を必要としている哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害の治療におけるｅｘ  ｖｉｖｏ教育済みの自家又は非自家ＮＫＴ細胞の使用に関する。
【００６８】
さらにもう１つの好ましい実施形態においては、本発明は、免疫関連又は免疫介在性の障害を患う哺乳類の対象の中のＮＫＴ細胞集団の操作のための治療用組成物の製造における、ＮＫＴ細胞を特異的に認識する抗体の使用に関する。
【００６９】
ＮＫＴ細胞集団の枯渇は結果として、抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させることになる。
【００７０】
１つの特定的に好ましい実施形態においては、該発明は、哺乳類の対象内の免疫関連又は免疫介在性の障害の治療のための治療用組成物の製造におけるＮＫＴ細胞を特異的に認識する抗体の使用に関する。
【００７１】
１つの特定的実施形態においては、免疫関係の障害は、クローン病といった腸の炎症性疾患であり得る。もう１つの特定的実施形態においては、免疫関連又は免疫介在性の障害は、黒色腫、癌種、リンパ腫及び肉腫といった悪性腫瘍であり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】
発明の詳細な説明
ＮＫ１．１Ｔ細胞は、サイトカイン分泌を介して抗炎症性及び炎症誘発性リンパ球の間のバランスを保つこと及び／又は殺傷することに関与している可能性があり、又、Ｔヘルパー細胞の分化の判定に関与する可能性もある［アラセ（Ａｒａｓｅ）、Ｈ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：３０７〜３１０頁（１９９３年）；ヨシモト（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ）、Ｔ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１２８５〜１２９５頁（１９９４年）；マクドナルド、Ｈ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：６３３〜６３８頁（１９９５年）；セダー（Ｓｅｄｅｒ）、Ｒ．Ａ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ．１２：６３５〜６７３頁（１９９４年）；ヨシモト、Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１８４５〜１８４７頁（１９９５年）］。ＮＫ１．１Ｔ細胞活性化について多数のシグナリング経路が同定された。ＮＫ１．１＋Ｔ細胞は安定した形で分極されず、異なるトリガーの時点で、ＴＣＲ係合がこれらの細胞由来のＴｈ１及びＴｈ２の両方のサイトカインの分泌をトリガーする、と仮定されている。［ベンデラク、Ａ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：５３５〜５６２頁（１９９７年）；アラセ、Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５４６頁（１９９３年）；カワムラ、Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１６〜１９頁（１９９８年）；チェン、Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｏｎｏｌ．１５９：２２４０〜２２４９頁（１９９７年）；アラセ、Ｈ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：３０７〜３１０頁（１９９８年）；ヨシモト、Ｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１２８５〜１２９５頁（１９９４年）；マクドナルド、Ｈ．Ｒ．Ｊ．上掲書、（１９９５年）］。ＮＫ１．１Ｒ又はＩＬ１２Ｒ係合は、Ｔｈ１分泌パラダイムを選択的に促進し得る［ベンデラク（Ｂｅｎｄｅｌａｃ）、ら．（１９９７年）上掲書；アラセ、Ｈ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２３９１〜２３９６頁（１９９６年）；ハヤカワ（Ｈａｙａｋａｗａ）、Ｔ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：２６９〜２７４頁（１９９２年）］。
【００７３】
上述のように、ＮＫ１．１＋Ｔリンパ球は、免疫調節において複雑な役割を果たす。本発明に記述された結果は、ＮＫ１．１Ｔリンパ球が、免疫介在性実験的結腸炎を調節する上で２重の役割をもつということを示している。経口寛容誘発の後のＮＫ１．１Ｔリンパ球の枯渇は、ＣＤ４＋細胞により分泌されたＩＬ４対ＩＦＮγの定量比を有意に減少させながら、寛容の養子免疫伝達を防げた。これと対照的に、寛容化されていないマウス内のＮＫ１．１Ｔリンパ球は、結腸炎を緩和し、ＣＤ４＋により分泌されたＩＬ４とＣＤ４−により分泌されたＩＦＮγの間の定量比を有意に増大させた。
【００７４】
第１の態様においては、該発明はかくして、かかる治療を必要としている哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害の治療のための方法に関する。該発明の方法は、適切な手段により、対象の体内のＮＫＴ細胞集団を操作する工程を含む。ＮＫＴ細胞集団の操作は結果としてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスの変調をもたらし、それを抗炎症性又は前抗炎症性サイトカイン産生細胞の産生に向かってシフトさせる。あらゆる免疫変調が免疫応答をダウン又はアップレギュレートし得るということを強調しておくべきである。この変調はさらに該対象の又はもう１つの対象の免疫系の異なる構成要素によって媒介される。かかる構成要素は、例えば細胞免疫反応要素、体液性免疫反応要素及びサイトカインである。
【００７５】
好ましい実施形態においては、ＮＫＴ細胞集団の操作は、この細胞集団を枯渇させることによる。ＮＫＴ細胞集団の枯渇は、例えば、ＮＫＴ細胞を特異的に認識する抗体を有効成分として含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することによって実施され得る。この特定的方法は、ポリクローナル抗体ならびに好ましくはモノクローナル抗体の使用を包含する。
【００７６】
タンパク質に対するポリクローナル抗体の生成は、ウィンレーエンドサンズ（Ｗｉｎｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙの第２章に記述されている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド細胞の成長に有利に作用する条件下での不死化されたＢ細胞との融合により、特にラット又はマウスといった免疫化された動物の脾臓又はリンパ節から取ったＢ細胞から調製可能である。マウスＢ細胞の融合のためには、細胞系Ａｇ−８が好まれる。モノクローナル抗体を生成する技術は、上述のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙの第２章といった数多くの論文及び教科書で記述されている。これらの動物の脾臓又はリンパ節細胞は、その中の第２章に記述された通りのモノクローナル抗体の生成のために、タンパク質−免疫化された動物の脾臓又はリンパ節と同じ要領で使用可能である。モノクローナル抗体を生成するのに用いられる技術は、クーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７頁（１９７５年）によって、及び米国特許第４，３７６，１１０号明細書の中でさらに記述されている。
【００７７】
「抗体」という用語は、抗原を結合する能力をもつ例えばＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２といった無傷の分子ならびにそのフラグメントの両方を含むように意図されている。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、無傷の抗体のＦｃフラグメントが欠如し、無傷の抗体に比べ、循環からより急速に削減し、より少ない非特異的組織結合を有し得る［ウォール（Ｗａｈｌ）ら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６〜３２５頁（１９８３年）］。本発明において有用である抗体のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２及びその他のフラグメントは、無傷抗体分子のために本明細書で開示された方法に従ってＮＫＴ細胞の選択的枯渇のために使用可能であり得るということがわかるだろう。かかるフラグメントは標準的に、（Ｆａｂフラグメントを産生するための）パパイン又は（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するための）ペプシンといった酵素を用いて、タンパク質分解分割により産生される。
【００７８】
抗体は、この特定の例においては前記細胞によって発現された細胞外マーカー分子である抗原と特異的に反応しかくして該分子を該抗体に結合させる能力をもつ場合に、或る種の細胞を「特異的に認識する能力を有する」と言われる。
【００７９】
「抗原」というのは、その抗原のエピトープに結合する能力をもつ抗体を産生するよう動物を誘発する能力を付加的に有する、抗原により結合される能力をもつ分子又はその一部分である。抗原は、１つ又はそれ以上のエピトープを有する可能性がある。「エピトープ」という用語は、同様に該抗体によって認識され得る、抗体により結合される能力をもつ任意の分子の一部分を意味するように意図されている。エピトープ又は「抗原決定基」は通常、アミノ酸又は糖側鎖といった分子の化学的に活性な表面集団から成り、特異的な３次元構造特性ならびに特異的電荷特性を有する。
【００８０】
一変形形態として、ＮＫＴ細胞集団の枯渇は、ＮＫＴ細胞を特異的に認識する抗体でコーティングされたビーズを用いてｅｘ  ｖｉｖｏフェレーシスによって実施可能である。フェレーシス手順では、全血は治療を受ける対象から採血され、血漿、赤血球及び白血球へと直ちに分離される。ＮＫＴ細胞は、ＮＫＴ細胞マーカーに対する特異的抗体を用いることによって白色細胞集団から枯渇され、その間その他の血液成分は同時に、治療を受ける対象へと戻るよう移送されている。
【００８１】
ＮＫ１．１＋Ｔ細胞上のＮＫ１．１分子は、ＩＬ４産生に対してではなくＩＦＮγ産生を導くレセプタとして役立つ［アラセ、Ｈ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２３９１〜２３９６頁（１９９６年）；セダー、Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０１８８〜９２頁（１９９３年）］。グリコシルポスファチジルイノシトール定着したタンパク質又はＬＰＳリガンドでの刺激時点で、ＮＫ１．１Ｔ細胞はＩＦＮγ産生細胞となり、Ｔｈ２細胞分化を阻害し、ＩｇＥ応答を抑制する［キュイ（Ｃｕｉ、Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（Ｎ−６）：７８３〜７９２頁（１９９９年）］。外因性ＩＬ２は、ＮＫ１．１Ｒ−Ｐ１架橋の時点でＩＦＮγ産生を増大させる［アラセ、Ｈ．ら、（１９９６年）上掲書」。ＮＫ１．１＋Ｔ細胞は、抗−ＣＤ３でのインビボ刺激の時点で迅速に大量のＩＬ４の分泌を介してＣＤ４＋Ｔ細胞の分化に関与する［ヨシモト、Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１８４５〜７頁（１９９５年）］。ＣＤ１制限されたＮＫ１．１Ｔ細胞集団が、抗−ＣＤ３で誘発される早期ＩＬ４バーストに不可欠である［セダー、Ｒ．Ａ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍ．１２：６３５〜６７３頁（１９９４年）］。細菌ＬＰＳが、クッパー細胞からのＩＬ−１２産生を介してＮＫ１．１＋細胞を活性化することが示されており、それに続いてＩＦＮγ産生を誘発する［マー（Ｍａ）、Ｘ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１４７〜１５７頁（１９９６年）］。樹状細胞とＮＫ及び／又はＴリンパ球の間の細胞同士の接触の結果、細胞の細胞溶解活性及びＩＦＮγ産生の両方が実質的に増大した［Ｄｅ−Ｍｏｒａｅｓ、Ｌ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１５０７〜１５１５頁（１９９８年）］。ＩＬ１８及び白血球機能関連抗原−１は、肝臓及びその細胞毒性活性においてＮＫ１．１＋Ｔ細胞の蓄積の中で一つの役割を果たし得る［サカモト（Ｓａｋａｍｏｔｏ）、Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３（５ｐｔ２）：４４５〜５１頁（１９９９年）］。ＮＫ１．１＋Ｔ細胞は、それらがＴ細胞応答に影響を及ぼすもう１つの経路でありうる抗原提示の中で１つの役割を果たしているものとして示唆されてきた［セキ（Ｓｅｋｉ）、Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖ１４７：１２１４〜１２２１頁（１９９１年）］。この細胞の亜型は以前に、高レベルの自家死滅を有することが示された［クリプス、Ｎ．ら、Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ  １１：２３６〜２４５頁（１９９６年）；カワムラ、Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｉｌ．１６０：１６〜１９頁（１９９８年）；ドハティ、Ｄ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２８：５９Ａ（１９９８年）］。ＬＡＬによるＦａｓ発現は、活性化されたＦａｓ発現Ｔ細胞の死を結果としてもたらした［ドハティ、Ｄ．Ｇ．ら、（１９９８年）上掲書；ジョンソン（Ｊｏｎｓｓｏｎ）Ｊ．Ｒ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２６：２６９Ａ（１９９７年）；ドハティ、Ｄ．Ｇ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２６：４４５Ａ（１９９７頁）］。かくして、寛容化された環境の中で、ＮＫ１．１Ｔ細胞が、そのＩＬ−４媒介型抗炎症性サイトカイン分泌に加えて、感作された炎症誘発性細胞の死滅に関与し、その一方で、寛容化されていない環境内でそれらがそのＩＦＮγ分泌に加えて抗炎症性細胞の死滅に関与しうるということが可能である。ＩＬ４及びＩＬ１２は両方共がＮＫ１．１Ｔ細胞の細胞毒性潜在力を増大させる［ハシモト（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ）、Ｗ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｏｎｏｌ．１５４：４３３３〜４３４０頁（１９９５年）；バラス（Ｂａｌｌａｓ）、Ｚ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｏｎｏｌ．１５０：１７〜３０頁（１９９３年）］。炎症の間、免疫応答のバランス化において１つの役割を果たすＩＬ１２／ＩＦＮγループが存在する［マー、ら．（１９９６年）上掲書」。ＩＬ１２は、ＩＦＮγ分泌ならびにＮＫ１．１＋Ｔ細胞の細胞分解活性及び増殖を増大させる［キュイ、ら、（１９９９年）上掲書；ベンデラク、ら、（１９９７年）上掲書；アラセ、ら、（１９９６年）上掲書；デ・モラエス（Ｄｅ−Ｍｏｒａｅｓ）、ら、（１９９８年）上掲書；ノイラート、Ｍ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍａｄ．１８２：１２８１〜１２９０頁（１９９５年）］。
【００８２】
従って、代替的な好ましい実施形態として、該発明は、哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害の治療のための方法に関する。この方法には、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを変調させそれを抗炎症性サイトカイン産生細胞の産生及び前記対象内への教育済み細胞の投与に向けてシフトさせる能力を教育済みＮＫＴ細胞が有するような形で、前記細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ教育によりＮＫＴ細胞集団を操作することが関与している。この変調は、ＩＬ４とＩＬ１０のうちのいずれか１つ対ＩＦＮγの定量比（これは明細書全体を通してＣＤ４＋ＩＬ４、ＩＬ１０／ＣＤ４＋比とも呼ばれる可能性がある）の増大という結果をもたらす。免疫介在性障害においては、該比は、疾病の重症度に従って減少し、回復中に増大し得る。従って、ＩＬ４及びＩＬ１０のいずれか一方対ＩＦＮγの定量比の変化は、治療前レベルに対し関係づけされるべきである。
【００８３】
さらにもう１つの好ましい実施形態では、該発明は、哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害の治療のための方法に関する。この方法には、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを変調させそれを炎症誘発性サイトカイン産生細胞の産生及び前記対象内への教育済み細胞の投与に向けてシフトさせる能力を教育済みＮＫＴ細胞が有するような形で、前記ＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ教育によりＮＫＴ細胞集団を操作することが関与している。この変調は、ＩＬ４とＩＬ１０のうちのいずれか１つ対ＩＦＮγの定量比（これは明細書全体を通してＣＤ４＋ＩＬ４、ＩＬ１０／ＣＤ４＋比とも呼ばれる可能性がある）の減少という結果をもたらす。
【００８４】
「ＣＤ４＋ＩＬ４」という用語は、ＣＤ４＋細胞により産生されたＩＬ４を意味し、「ＣＤ４＋ＩＬ１０」というのは、ＣＤ４＋細胞により産生されたＩＬ１０を意味し、「ＣＤ４＋ＩＦＮγ」というのは、ＣＤ４＋細胞により産生されたＩＦＮγを意味する。本発明の中で使用される用語「ＣＤ４＋ＩＬ４  ＩＬ１０／ＣＤ４＋ＩＦＮγ比」は、好ましくはＣＤ４＋細胞により産生されたＩＬ４及びＩＬ１０のいずれか１つ対好ましくはＣＤ４＋細胞により産生されたＩＦＮγの定量比を意味する。これらのサイトカインの各々の数量を定義するための定量測定が、本明細書で記述された実施例（実験手順）で記述されている通りに実施された。
【００８５】
特定的に好ましい実施形態は、哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害の治療のための方法に関する。この治療方法は、
ａ．  対象又はもう１つの対象からＮＫＴ細胞を得る工程；
ｂ．  結果として得られた教育済みＮＫＴ細胞が、抗炎症性又は炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かって前記Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させる能力を有するような形で、工程（ａ）で得られたＮＫＴ細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏ教育する工程；及び
ｃ．  工程（ｂ）で得られた教育済みＮＫＴ細胞を前記対象に再導入する工程；
を含む。抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってのＴｈ１／Ｔｈ２バランスの変調は、結果としてＩＬ４及びＩＬ１０のいずれか１つ対ＩＦＮγの定量比の増大をもたらす。炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かってのＴｈ１／Ｔｈ２バランスの変調は、ＩＬ４及びＩＬ１０のいずれか１つの対ＩＦＮγの定量比の減少を結果としてもたらす。
【００８６】
ＮＫＴ細胞は、骨髄、肝臓、脾臓又は子宮から得ることができるが、上述のサイトフェレーシス方法により末梢血から得ることもできる。
【００８７】
より特定的には、ＮＴＫ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ教育は、
ａ．  治療すべき免疫関連又は免疫介在性の障害に対して第３者エピトープと結びつけられる少なくとも１つの抗原又はそれらの任意の組合せ；
ｂ．  同じ免疫障害を患う寛容化された又はされていない患者の又は治療すべき対象の少なくとも１つの肝臓関連細胞又はそれらの任意の組合せ；
ｃ．  少なくとも１つのサイトカイン、又は接着分子、又はその任意の組合せ；及び
ｄ．  上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかの組合せ；
のうちのいずれか１つの存在下でこれらの細胞を培養することにより実施可能である。
【００８８】
ＮＫＴ細胞は、上述の方法のいずれかを介してインビボでも教育され得るということがわかるはずである。これらの細胞は、同種エピトープ又は抗原に対する暴露の前又はその後の任意の時点で変調され得る。
【００８９】
１つの特定の実施形態においては、ＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ教育は、治療すべき免疫関連又は免疫介在性の障害と結びつけられる抗原の存在下でこれらの細胞を培養することによって実施され得る。これらの抗原は、前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患うドナー患者から採取した同種抗原、異種抗原、自家抗原、組換えにより調製された抗原又はその任意の組合せであり得る。
【００９０】
これらの抗原は、対象に関して未変性又は未変性でない可能性がある。これらは天然でも合成でも、又修飾済み又は未修飾でも、その全体でもフラグメントでもあり得る。フラグメントは、フラグメントとしての合成から又はより大きな疾患単位からフラグメントを作り出すべく消化又はその他の修飾手段によって誘導され得る。かかる抗原は、タンパク質、糖タンパク質、酵素、抗体、組織適合性決定基、リガンド、レセプタ、ホルモン、サイトカイン、細胞膜、細胞構成要素、ウイルス、ウイルス構成要素、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、全細胞、組織又は器官を含むが、これらに制限されるわけではない。抗原は、単一の分子又はさまざまな個々の分子の混合物で構成され得る。抗原は、ウイルス表面、細胞表面、膜、マトリクス、又は複合体という状況の中で又はレセプタ、リガンド、抗体又はその他の任意の結合パートナと接合された状態で自らを提示できる。かかる抗原は、単独で又はさらに摂取、安定性、反応性又はターゲティングに貢献できる作用物質と共に対象に対し導入可能である。
【００９１】
重合及び分解、分画及び化学的修飾は全て、潜在的免疫応答に関して特定の抗原の特性を改変する能力を有する。これらの小さなセグメント、フラグメント又はエピトープは単離されているか又は合成されているかのいずれかであり得る。制限的意味のない例として、かかる抗原は、実施例７中でｅｘ  ｖｉｖｏ教育のために使用されるＣＥＰといった、身体抽出物に由来する異なる抗原の組合せであり得る。
【００９２】
本発明の方法はさらに、組換えにより調製された抗原を包含する。組換え型抗原の調製には、当該技術分野において周知のものである一般的な分子生物学技術の使用が関与する。かかる技術には例えば、適切な発現ベクターに対する所望の抗原のクローニングが含まれる。
【００９３】
本明細書で使用する「ベクター」というのは、宿主のゲノム内へのＤＮＡフラグメントの組込みを可能にするプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント及びその他のビヒクルを包含する。発現ベクターは、標準的には、所望の遺伝子又はそのフラグメント及び適切な宿主細胞中で認識され所望の遺伝子の発現をもたらす操作可能な形で連結された遺伝子制御要素を含有する自己複製するＤＮＡ又はＲＮＡ構成体である。これらの制御要素は、適切な宿主の内部で発現をもたらす能力をもつ。一般に、該遺伝子制御要素は、原核生物プロモータ系又は真核生物プロモータ発現制御系を内含し得る。これには標準的に、転写プロモータ、転写の開始を制御するための任意のオペレータ、ＲＮＡ発現のレベルを上昇させるための転写エンハンサ、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ＲＮＡスプライス部位、転写及び翻訳を終結する配列などが含まれる。発現ベクターは通常、ベクターが宿主細胞とは独立して複製できるようにする複製起点を含む。
【００９４】
ベクターは付加的には、適切な制限部位、ベクター含有細胞の選択のための、抗生物質耐性又はその他のマーカーを含み得る。プラスミドは、同等の機能に役立ち、かつ当該技術分野において既知であるか又は既知となったその他の形のベクターも、本明細書での使用に適している。例えば、本明細書に参照として援用されているパウエルズ（Ｐｏｕｗｅｌｓ）、ら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８５年及び追補）、エルスヴィア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、Ｎ．Ｙ．；及びロドリケス（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｓ）ら、（ｅｄｓ．）Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ．Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ（１９８８年）を参照のこと。
【００９５】
最近になって、肝臓がＴ細胞破壊の主要な部位であること及び自己免疫マウスＩｐｒ／Ｉｐｒの肝臓内に肝臓から末梢リンパ様組織までの細胞の漏出を伴うこのプロセスの不具合が存在することが提案されてきている［クリプス、Ｎ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗ、１７４：４７〜６２頁（２０００年）］。肝臓は、Ｔ細胞分化において一定の役割を果たすことが示されてきた。肝臓実質細胞との培養によりＣＤ４−８−ＴＣＲβ胸腺欠損ヌード骨髄細胞からＣＤ３−ＣＤ４＋／ＣＤ８＋ＴＣＲβ細胞及びＣＤ３−４−ＴＣＲβ＋細胞を生成することができる［マブチ（Ｍａｂｕｃｈｉ）、Ａ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６３：５７５〜５８３頁（１９９８年）］。従って、もう１つの特定の実施形態においては、肝臓関連細胞の存在下でこれらの細胞を培養することによってＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ教育を実施することができる。これらの細胞は、例えばクッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、肝臓関連幹細胞、又はその他の任意の肝臓関連リンパ球であり得る。
【００９６】
同じ免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない患者から又は治療を受けている対象からの末梢リンパ球の存在下でＮＫＴ細胞を同時培養することも同様に本発明では考慮されている。対象から、それも特にヒトの対象からのリンパ球を得るために、その他の血液成分が同時に患者に戻るよう移行されている間に、多数の白血球を得られるようにする手順であるサイトフェレーシスにより患者から血液を採取する。
【００９７】
実施例７に記述されているように、ＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ教育は、ＣＤ４又はＣＤ８細胞とＮＫＴ細胞の同時培養により実施される。これらの細胞は好ましくは、寛容化された対象から得られる（経口寛容化としてマウスはＣＥＰを受けた）。
【００９８】
もう１つの特定の実施形態においては、ＩＬ４、ＩＬ１０、ＴＧＦβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１２及びＩＬ１５といったサイトカインの存在下で、又はインテグリン、セレクチン及びＩＣＡＭといった接着分子の存在下で細胞を培養することにより、ＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ教育を実施し得る。
【００９９】
ＩＬ１２はＮＫ１．１Ｔ細胞によるＩＦＮγ誘発の効果をもたらすが、ＩＦＮγの方はその調節に貢献し得る［マーら、（１９９６年）上掲書」。急性ＧＶＨＤを受けたマウスからの胸腺細胞の細胞溶解活性は、ＮＫ１．１＋細胞枯渇の後に有意に減少した［ノイラートら、（１９９５年）上掲書」。急性ＧＶＨＤを患うマウスの胸腺内のＮＫ１．１＋Ｔ細胞の増加の前には、胸腺内のＩＬ１２産生の過渡的増加が先行していた［ノイラート、ら、（１９９５年）上掲書」。ＩＬ１２は急性ＧＶＨＤを患うマウスの胸腺中でのＮＫ１．１＋Ｔ細胞の増加を誘発することが報告された［オノエ（Ｏｎｏｅ）、Ｙ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９５：２４８〜２５６頁（１９９８年）］。最近になって、抗−ＩＬ１２抗体がトランスジェニック動物中の経口寛容を増強することが示され、これは、ＴＧＦβ分泌の増加と結びつけられた［マルス（Ｍａｒｔｈ）、Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：２３４８〜２３５７頁（１９９６年）］。ＩＬ１２とＴＮＦαは両方共、実験的結腸炎の免疫病因において重要な役割を有することが示された［ブラガー（Ｂｒａｇｇｅｒ）、Ｍ．Ｓ．Ｈ．ら、Ｇｕｔ  ３４：１７０５頁（１９９８年）；パロンキ（Ｐａｒｒｏｎｃｈｉ）、Ｐ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０：８２３頁（１９９７年）］。ＴＮＢＳで誘発された結腸炎を維持する上で単球／マクロファージによるＩＬ１２産生が不可欠であり、Ｔｈ１−媒介型炎症性応答のために必要とされた［クーン（Ｋｕｈｎ）、Ｒ．ら、Ｃｅｌｌ  ７５：２６３〜２７４頁（１９９３年）；セロン（Ｓｅｌｌｏｎ）、Ｒ．Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎ．６６：５２２４〜５２３１頁（１９９８年）；ノイラートら（１９９５年）上掲書；マルス、Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５７：２３４８〜２３５７頁（１９９６年）］。
【０１００】
ＩＬ１２に対する抗体は、慢性ＴＮＢＳ誘発の結腸炎を抑止した［ノイラートら、（１９９５年）上掲書」。従って、ＩＬ１２は、ＮＫ１．１＋Ｔ細胞活性化を介した疾病病因の中で支配的な役割を有する可能性がある。このリンパ球サブセットの活性化がＩＦＮγ分泌を誘発し、その後寛容化されていないマウスにおけるＴｈ１免疫シフトが続くことが可能である［アラセ、ら、（１９９６年）上掲書；ブライヒャ（Ｂｌｅｉｃｈｅｒ）、Ｐ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：６７９〜６８２頁（１９９０年）；キタムラ（Ｋｉｔａｍｕｒａ）、Ｈ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１１２１〜１１２７頁（１９９９年）］。
【０１０１】
ＮＫ１．１＋Ｔ細胞は、実験的結腸炎においてＩＬ１２の存在下で効能あるＩＦＮγ産生体である［キュイら、（１９９９年）上掲書；ベンデラクら、（１９９７年）上掲書；アラセら、（１９９６年）上掲書；デ・モラエスら、（１９９８年）上掲書］。本発明の結果は、ＩＬ１２経路とは独立してＮＫ１．１Ｒを介して炎症性状態でＮＫ１．１Ｔ細胞によりＩＦＮγが分泌されたということを示唆している。これには、ＩＬ１２Ｒを介したＩＬ１２誘発のＩＦＮγ分泌を伴う、ＩＦＮγでトリガーされたＩＬ１２の産生が後続していた可能性がある。これとは対照的に、抗炎症性の寛容化された状態では、ＮＫ１．１Ｔ細胞は、ＩＬ４分泌の増加と共に活性化される。実際、寛容化されていないＮＫ１．１で枯渇されたマウスからのリンパ球の養子免疫伝達が、抗炎症性Ｔｈ２サイトカインをアップレギュレートした。異なる刺激がサイトカイン応答の型を判定することが可能である。
【０１０２】
かくして、ケモカイン又はその他のメディエータが、ＮＫ１．１＋Ｔ細胞機能及び異なる免疫学的環境下でのそれらのＴｈ１／Ｔｈ２パラダイムに対する影響の仕方を判定することができる。
【０１０３】
特定の好ましい実施形態においては、上述のようにｅｘ  ｖｉｖｏ教育されてきたＮＫＴ細胞は、治療を受ける対象に再導入され得る。これは、養子免疫伝達と呼ばれてきたプロセスによって実施可能である。この伝達のために使用される特定の教育済みＮＫＴ細胞は好ましくは、対象に由来するものであってよい（自家伝達）。同系又は非同系ドナー（非自家伝達）は排除されない。伝達された細胞の貯蔵、成長又は拡張は、インビボ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はインビトロで行なわれた可能性がある。
【０１０４】
伝達に先立つ細胞のインビトロ貯蔵、成長又は拡張方法は、当業者にとって周知である。伝達で使用するための教育済みＮＫＴ細胞がドナーから誘導される場合、これらの細胞は同様に、上述の通りインビボ又はインビトロで貯蔵、成長又は拡張を受けるかもしれない。
【０１０５】
細胞療法は、例えば静脈内での注射によるか又は本明細書で上述した手段のうちのいずれかによるものであり得る。投与の時点又は様式のいずれも、本発明にとっての制限とはならない。細胞療法投薬計画は、当業者にとって既知のその他の考慮事項の中でも教育済み細胞の考えられる細胞毒性、疾病の病期及び症状などといった要因を考慮に入れて容易に調整可能である。
【０１０６】
該発明の方法は任意にはさらに、免疫関連又は免疫介在性の障害に対する免疫応答のアップ又はダウンレギュレーションを治療を受ける対象の体内で惹起する工程を含む。ダウンレギュレーション応答は、前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う任意の同種ドナーに由来する構成要素、細胞、組織又は器官、異種供給源、自家供給源、免疫学的等価物又はそれらの任意の組合せを前記対象に投与することによって達成され得る。
【０１０７】
本発明は、その治療が過渡的なものであれ、又それが長期間にわたり反復的に行なわれるものであれ、かかる治療の有効性を減少させ得る免疫応答の危険性の無い非未変性活性化合物の投与を提供する。本発明はかくして、身体の免疫応答による妨害無くこれらの非未変性活性化合物の有効な生物学的機能を提供する。これは、過渡的又は短期治療のための全身免疫抑制としてそれが使用されている本発明で提供されている通りの免疫変調の使用によって及び／又は、長期治療のための免疫応答の変調により提供される寛容化によって、達成可能である。一部のケースでは、２つ以上のこのような免疫変調投薬計画の組合せが有利であるかもしれない。かかる治療は、非未変性活性化合物の投与の前及び／又は最中に適用できる。
【０１０８】
特定的に好ましい実施形態においては、前記構成要素、細胞、組織又は器官は、単回用量又は複数回用量で投与され得る。これらの構成要素、細胞、組織又は器官は、単一の投与経路によってか又は少なくとも２つの異なる投与経路によって投与可能である。
【０１０９】
構成要素は、治療を受けるべき対象に対し直接投与されてもよいし、そうでなければ、化合物のサイズに応じて、投与前に担体にそれらを接合させることが望ましい場合もある。治療用処方を、任意の従来の投薬量処方で投与してよい。処方は標準的に、上述のように、１つ以上のその受容可能な担体と共に、少なくとも１つの活性成分を含んでいる。
【０１１０】
各々の担体は、その他の成分と相容性があり患者にとって不利でないという意味で薬学的にも生理学的にも受容可能であるべきである。処方には、経口、直腸、経鼻、又は非経口（皮下、筋内、静脈内及び皮内）投与に適したものが含まれる。該処方は、単回投薬量形態で便利な体裁をとることができ、薬局技術で周知のあらゆる方法によって調製され得る。対象の体内で望ましい効果を生み出すのに必要な有効量を含む全てのこのような化合物の投与は、当該技術分野において周知であり、ここでさらに記述される必要はない。
【０１１１】
特定的には、前記構成要素、細胞、組織又は器官は、経口、静脈内、非経口、経皮、皮下、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所及び直腸投与及びそれらの任意の組合せの中から選択された経路により投与され得る。好ましくは、これらの構成要素、細胞、組織又は器官は、経口寛容化として経口投与される。
【０１１２】
該発明の方法のもう１つの好ましい実施形態は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、特にクローン病の治療に関する。哺乳類、特にヒトの対象におけるクローン病の治療は、
ａ．  前記対象からＮＫＴ細胞を得る工程；
ｂ．  結果としての教育済みＮＫＴ細胞が抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させる能力を有するような形で、工程（ａ）で得られたＮＫＴ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏ教育する工程；及び
ｃ．  工程（ｂ）で得られた教育済みＮＫＴ細胞を前記対象に再導入する工程；
を含む。抗炎症性サイトカイン産生細胞の産生に向かってのＴｈ１／Ｔｈ２バランスの変調は、結果としてＩＬ４及びＩＬ１０のいずれか一方対ＩＦＮγの定量比の増加をもたらす。
【０１１３】
該発明の方法は、特にヒトにおける免疫関連又は免疫介在性の障害の治療用であるが、その他の哺乳動物も内含されている。制限的な意味のないとしては、哺乳類の対象には、サル、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びブタが含まれる。
【０１１４】
ヒトの患者を治療するためには、ｅｘ  ｖｉｖｏ教育のための該発明の方法は、ＣＤ５６マーカーを発現するＮＫＴ細胞であるＮＫＴ細胞の特定の亜型を利用し得る。マウスについては、ｅｘ  ｖｉｖｏ教育のための本発明の方法は、ＮＫ１．１＋Ｔ細胞の特定の亜型を利用することができる。本発明の実施例は、マウスモデルのＮＫ１．１＋細胞を用いた実験を開示している。これらの結果が、ヒトの体内でＣＤ５６マーカーを発現するＮＫＴ細胞にもあてはまるということがわかるはずである。該発明に従ったＣＤ５６マーカー発現ＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ教育は、以下のもののいずれか１つの存在下でこれらの細胞を培養することによるものである；
ａ．  クローン病と結びつけられる少なくとも１つの抗原；これらの抗原には、クローン病を患うドナーからの同種抗原、異種抗原、患者自身からの自家抗原及び組換えにより調製された抗原又はそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに制限されるわけではない；
ｂ．  クローン病を患う寛容化された又はされていない患者から又は治療を受ける患者からの少なくとも１つの肝臓関連細胞；これらの細胞には、クッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、肝臓関連幹細胞及び任意のその他の肝臓関連リンパ球又はそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに制限されるわけではない；
ｃ．  ＩＬ４、ＩＬ１０、ＴＧＦβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１２及びＩＬ１５といった少なくとも１つのサイトカイン、又はインテグリン、セレクチン及びＩＣＡＭといった接着分子又はそれらの任意の組合せ；及び
ｄ．  上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の組合せ。
【０１１５】
該発明の方法に従った教育済みＮＫＴ細胞は、治療を受ける対象に対し養子免疫伝達により再導入される。
【０１１６】
該発明の方法は、任意には、炎症を起こした腸に対する免疫応答のアップ又はダウンレギュレーションを対象内で惹起する工程をさらに含み得る。ダウンレギュレーション応答の惹起は、クローン病を患う対象の炎症を起こした腸から又は治療を受ける対象の腸から抽出されたタンパク質であり得る構成要素を対象に投与することによって誘発され得る。
【０１１７】
構成要素は、細胞、組織、器官又はその一部分であり得、これらは、単回用量又は複数回用量で投与され得る。これらの構成要素は、単一の投与経路によって又は少なくとも２つの異なる投与経路によって投与され得る。特定的には、前記構成要素は、経口、静脈内、非経口、経皮、皮下、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所及び直腸投与、又はそれらの任意の組合せにより投与され得る。好ましくは、構成要素は、実施例で記述されている通り、経口寛容化（ＣＥＰの経口導入）として経口投与される。
【０１１８】
もう１つの特定的に好ましい実施形態においては、該発明の方法は、悪性腫瘍の治療用である。癌性状況では、ＮＫＴ細胞の変調は、炎症誘発性応答を誘発する方向か又は抗腫瘍関連抗原免疫性を増大させる上でのものである。本発明を記述するために本明細書で使用されているように、「癌」、「腫瘍」及び「悪性腫瘍」というのは全て、組織又は器官の過形成に同等に関係する。組織がリンパ系又は免疫系の一部である場合、悪性細胞は、循環する細胞の非充実性腫瘍を含み得る。その他の組織又は器官の悪性腫瘍は、充実性腫瘍を産生し得る。一般に、本発明の方法及び組成物は、非充実性及び充実性腫瘍の治療において使用可能である。
【０１１９】
本発明で考慮されている通りの悪性腫瘍は、黒色腫、癌腫、リンパ腫及び肉腫から成る群から選択され得る。本発明において有用でありうる悪性腫瘍には、血液悪性腫瘍（白血病、リンパ腫及び骨髄増殖症候群を含む）、再生不良性貧血及び無形成貧血（ウイルス誘発性及び特発性の両方）、骨髄異形成症候群、全ての型の傍腫瘍性症候群（免疫介在性及び特発性の両方）及び充実性腫瘍（肺、肝臓、乳房、結腸、前立腺、消化管、膵臓及びカルポジを含む）が含まれるがこれらに制限されるわけではない。
【０１２０】
癌を患う哺乳類の対象を治療するためには、該発明の方法により使用される教育済みＮＫＴ細胞は、さまざまなやり方で投与可能である。制限的意味のない例としては、教育済み細胞は、静脈内で、又は腹腔内といった充実性腫瘍の場所の近傍にある体腔内に送達されてもよいし、又は充実性腫瘍内又はその近傍に直接注射され得る。
【０１２１】
さらに又、本発明は、ＮＫＴ細胞の教育の方法をも提供している。この教育は、以下のいずれかのものの存在下でこれらの細胞を培養することによって実施可能である：
ａ．  治療すべき免疫関連又は免疫介在性の障害に対して第３者エピトープと結びつけられる少なくとも１つの抗原又はそれらの任意の組合せ；
ｂ．  同じ免疫障害を患う寛容化された又はされていない患者の又は治療すべき対象の少なくとも１つの肝臓関連細胞又はそれらの任意の組合せ；
ｃ．  少なくとも１つのサイトカイン、又は接着分子、又はその任意の組合せ；及び
ｄ．  上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかの組合せ。
【０１２２】
該発明の方法は、癌治療において有用であるその他の治療と組合わせることができる。同様に、疾病に起因してすでに免疫抑制されている哺乳類の対象に対しこの治療を施すことができるとも予想されている。ヒト又は動物の患者の免疫状態の評価は、当業者によって容易に判定可能である。
【０１２３】
第２の態様として、本発明は、哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害の治療のための治療用組成物に関する。該発明の組成物は、抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってＴｈ１／Ｔｈ２バランスを変調させる能力をもつｅｘ  ｖｉｖｏ教育済み自家ＮＫＴ細胞を有効成分として含む。これらの教育済み自家ＮＫＴ細胞は、ＩＬ４及びＩＬ１０のいずれか一方対ＩＦＮγの定量比の増加を媒介する。
【０１２４】
該発明の組成物はさらに、薬学的に受容可能な担体、添加剤、希釈剤又は賦形剤を含有し得る。適切な担体には、例えばリン酸緩衝生理食塩水及び５％のＨＳＡ又はＰＰＦを伴う食塩水が含まれる。その他の適切な担体は当業者にとって周知であり、本発明に対する制限とはならない。同様にして、当業者であれば該発明の薬学組成物の中に含み入れるためのその他の所望の構成要素を容易に選択することができ、かかる構成要素は、本発明の制限条件ではない。
【０１２５】
１つの好ましい実施形態においては、該発明の治療用組成物の教育済み自家ＮＫＴ細胞は、以下のもののいずれか１つの存在下でｅｘ  ｖｉｖｏ培養される：
ａ．  治療すべき免疫関連又は免疫介在性の障害と結びつけられる少なくとも１つの抗原；これらの抗原は、同じ免疫関連又は免疫介在性の障害を患うドナーからの同種抗原、異種抗原、治療を受ける患者からの自家抗原、及び組換えにより調製された抗原又はそれらの任意の組合せのうちのいずれか１つであり得る；
ｂ．  前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない患者の又は治療を受ける対象からの少なくとも１つの肝臓関連細胞；これらの細胞には、クッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、及び任意のその他の肝臓関連リンパ球又はそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに制限されるわけではない；
ｃ．  ＩＬ４、ＩＬ１０、ＩＧＦβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１２及びＩＬ１５といった少なくとも１つのサイトカイン、又はインテグリン、セレクチン及びＩＣＡＭといった接着分子；及び
ｄ．  上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の組合せ。
【０１２６】
１つの好ましい実施形態においては、該発明の治療用組成物は、哺乳類の対象における腸炎症性疾患の治療用、そしてより特定的にはクローン病の治療用である。この組成物は、有効成分として、抗炎症性サイトカイン産生細胞の産生に向かってＴｈ１／Ｔｈ２バランスを変調させる能力を付与された教育済み自家ＮＫＴ細胞を含んでいる。
【０１２７】
該発明の治療用組成物内に含有されている教育済み自家ＮＫＴ細胞は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを変調させる能力をもち、それを抗炎症性サイトカイン産生細胞の産生に向かってシフトさせる。このバランスシフトの結果は、ＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ比（ＩＬ４及びＩＬ１０のいずれか一方対ＩＦＮγの定量比）の増加である。これらの変調プロセスは、さらに、細胞免疫反応要素、体液性免疫反応要素及びサイトカインといった対象の免疫系の異なる構成要素によってさらに媒介される。
【０１２８】
組成物中に含有されている自家ＮＫＴ細胞の教育は、好ましくは上述の通りに実施される。
【０１２９】
もう１つの好ましい実施形態においては、該発明の治療用組成物は、黒色腫、癌腫、リンパ腫及び／又は肉腫といった悪性腫瘍の治療用である。癌性状況下では、該発明の組成物中に含有されているＮＫＴ細胞の変調は、炎性誘発性応答を誘発する方向にあってもよいし又抗腫瘍関連抗原免疫性の増大にあってもよい。
【０１３０】
さらにもう１つの好ましい実施形態においては、該発明は、免疫関連又は免疫介在性の障害の治療のための治療用組成物に関する。この組成物は、ＮＫＴ細胞を特定的に認識する抗体を有効成分として含んでいる。該発明の組成物はさらに、薬学的に受容可能な担体を含有し得る。適切な担体としては例えばリン酸緩衝生理食塩水、及び５％のＨＳＡ又はＰＰＦを伴う食塩水が含まれる。その他の適切な担体は、当業者にとって周知であり、本発明に対する制限とはならない。同様にして、当業者であれば該発明の薬学組成物の中に含み入れるためのその他の所望の構成要素を容易に選択することができ、かかる構成要素は、本発明の制限条件ではない。
【０１３１】
一実施形態においては、該発明のこの治療用組成物は、クローン病といった腸炎症性疾患の治療のために使用可能である。腸炎症性疾患の治療のため、特にクローン病の治療のためには、経口薬学組成物が有利であり得る。経口投与は全身的免疫抑制又は侵襲的手段の必要なく、患者の症状の改善を可能にすることになる。
【０１３２】
もう１つの実施形態においては、該発明の治療用組成物は、黒色腫、癌腫、リンパ腫及び肉腫から成る群から選択された悪性腫瘍の治療のために使用可能である。
【０１３３】
組成物投薬量は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを変調させるのに充分なあらゆる量であり得る。当業者であれば、好ましい投薬量は、優良試験所基準及び良質の医療のための基準に従って患者に応じて個別に調節されることになるということがわかる。
【０１３４】
本明細書で使用されている通り、「Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを変調させるのに充分な量」というのは、選択された結果を達成するのに必要な量を意味する。例えば、該発明の組成物の有効量は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かって変調させることになる。
【０１３５】
本発明の組成物及び方法はさらに、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）といった自己免疫疾患の治療を提供し得る。
【０１３６】
該発明の組成物は、さまざまな要領で投与可能であり得る。制限的な意味のない例としては、組成物を静脈内で送達することができる。
【０１３７】
注射用に適した薬学的形態には、無菌水溶液又は分散及び無菌注射溶液又は分散の即席調製のための無菌粉末が含まれる。あらゆる場合において、該形態は無菌でなくてはならず、注射針を容易に通過させる程度に流動性でなくてはならない。それは、製造及び貯蔵条件下で安定していなくてはならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用に対し保護されていなくてはならない。
【０１３８】
微生物の作用の防止は、例えばパラペン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどといったさまざまな抗菌剤及び抗真菌剤によってもたらされ得る。数多くの場合において、例えば糖又は塩化ナトリウムといった等張性作用物質を内含することが好ましいであろう。例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンといった吸収を遅延させる作用物質を組成物中に使用することによって、注射用組成物の長時間の吸収をもたらすことができる。
【０１３９】
必要に応じて以上で列挙したさまざまなその他の成分を伴って、適切な溶剤の中に必要な量で活性化合物を取込み、その後ろ過処理式滅菌を行なうことによって、無菌注射溶液が調製される。一般に、基本分散媒及び以上で列挙されたものからその他の必要とされる成分を含有する無菌ビヒクルの中にさまざまな滅菌済み活性成分を取込むことによって、分散が調製される。
【０１４０】
無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め無菌ろ過されたその溶液から活性成分プラス任意の付加的な所望の成分の粉末を生成する真空及び凍結乾燥技術である。
【０１４１】
該発明の薬学組成物は一般に、緩衝剤、その浸透圧を調整する作用物質及び任意には当該技術分野において既知の通りである１種以上の薬学的に受容可能な担体、賦形剤及び／又は添加剤を含む。補足的な活性成分も組成物中に取込むことができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物及び植物油を含有する溶剤又は分散媒であり得る。適切な流動率は、レシチンなどのコーティングの使用、分散の場合における必要とされる粒度の維持及び界面活性剤の使用によって維持され得る。
【０１４２】
本明細書で使用されている「薬学的に受容可能な担体」というのは、任意の溶剤、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒質及び作用物質の使用は、当該技術分野において周知である。いずれかの従来の媒質又は作用物質がその活性成分と非相溶性である場合を除いて、治療用組成物内でのその使用が考慮される。
【０１４３】
第３の態様として、本発明は、免疫関連又は免疫介在性の障害を患う哺乳類の対象の体内で抗炎症性サイトカイン産生細胞の産生に向かってＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを変調させるための治療用薬学組成物の製造における教育済み自家ＮＫＴ細胞の使用に関する。好ましい用途は、哺乳類の対象の腸炎症性疾患の治療、特にヒトの対象のクローン病の治療のための組成物の製造である。代替的には、黒色腫、癌種、リンパ腫及び肉腫といった悪性腫瘍の治療のための治療用薬学的組成物の調製において、教育済み自家ＮＫＴ細胞を使用することができる。癌性状況においては、該発明のＮＫＴ細胞の変調は、炎性誘発性応答を誘発する方向にあっても又は、有利な方向に向かっての抗腫瘍関連抗原免疫の増加にあってもよい。
【０１４４】
本発明はさらに、ｅｘ  ｖｉｖｏ教育済み自家ＮＫＴ細胞を提供する。教育済みＮＫＴ細胞は、以下のもののいずれか１つの存在下でｅｘ  ｖｉｖｏ培養された：
ａ．  前記免疫関連又は免疫介在性の障害と結びつけられる少なくとも１つの抗原、又はその任意の組合せ；
ｂ．  前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない患者の又は前記対象の少なくとも１つの肝臓関連細胞、又はその任意の組合せ；
ｃ．  少なくとも１つのサイトカイン、又は接着分子；及び
ｄ．  上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかの組合せ。
【０１４５】
さらに、該発明は、かかる治療を必要としている哺乳類の対象の体内の免疫関連又は免疫介在性の障害の治療において使用するための該発明のｅｘ  ｖｉｖｏ教育済み自家ＮＫＴ細胞を提供する。
【０１４６】
当該態様のもう１つの実施形態において、本発明は、かかる治療を必要としている哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害の治療におけるｅｘ  ｖｉｖｏ教育済み自家ＮＫＴ細胞の使用に関する。
【０１４７】
さらにもう１つの好ましい実施形態においては、本発明は、免疫関連又は免疫介在性の障害を患う哺乳類の対象のＮＫＴ細胞集団の操作特定的には、前記対象の前記ＮＫＴ細胞集合の枯渇のための治療用薬学的組成物の製造における、ＮＫＴ細胞を特異的に認識する抗体の使用に関する。ＮＫＴ細胞集合の枯渇の結果として抗炎症性サイトカイン産生細胞の選好産生に向かってＴｈ１／Ｔｈ２バランスが変調されることになるということがわかるはずである。特に、哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害の治療、特定的にはヒトの対象におけるクローン病といった腸炎症性疾患の治療のための治療用薬学的組成物の調製に抗体を使用することができる。
【０１４８】
もう１つの特定的実施形態においては、免疫関連又は免疫介在性の障害は、黒色腫、癌種、リンパ腫及び肉腫といった悪性腫瘍である。
【０１４９】
非アルコール性脂肪性肝炎の病因における免疫系の役割
非アルコール系脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、アルコール消費の履歴を全くもたない患者における肝脂肪蓄積、炎症及び線維形成から成る臨床病理学的疾患単位である。これは２０％の症例で肝硬変まで進行することになり、西欧世界では特発性肝硬変の最も一般的な原因と考えられている（カルドウェル（Ｃａｌｄｗｅｌｌ）ＳＨ、ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２９：６６４頁（１９９９年）；マッテオーニ（Ｍａｔｔｅｏｎｉ）ＣＡ、ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１６：１４１３頁（１９９９年））。ＮＡＳＨは該障害の病因における貢献的役割を果たすものとして示唆されているその他の代謝障害を患う患者に一般的である。これらの代謝障害としては、インシュリン耐性（サニアル（Ｓａｎｙａｌ）ＡＪ、ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２０：１１８３頁（２００１年）、肥満関係のＡＴＰ枯渇（コルテス−ピント（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｐｉｎｔｏ）Ｈ．ら、Ｊａｍａ  ２８２：１６５９頁（１９９９年））、遊離脂肪酸ベータ過酸化の増大（ハーシュケヴィッツ（Ｈｒｕｓｚｋｅｗｙｃｚ）ＡＭ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １５３：１９１頁（１９８８年））、鉄分蓄積（ジョージ（Ｇｅｏｒｇｅ）ＤＫ、ら、ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１４：３１１頁（１９９８年））、酸化防止剤枯渇（ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）ＳＡ．ら、ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２３：Ｍ１３３２頁（２００２年））及びレプチン欠損症（コーエン（Ｃｏｈｅｎ）、Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１１８５頁（１９９６年））が含まれる。それでも体重の低下、厳重な糖尿病制御、脂質レベルの正常化及び酸化防止剤治療を含めたいかなる治療的介入も全くなされない場合、該障害の自然な進行の改変を一貫して示したことがない（Ａｎｇｕｌｏ  Ｐ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３４６：１２２１〜１２３１頁（２００２年））。
【０１５０】
ＮＡＳＨについての大部分の情報は、２つの哺乳類モデルつまりレプチン欠損症のｏｂ／ｏｂマウス及びレプチンレセプタ欠損ｆａ／ｆａ  Ｚｕｃｋｅｒラットから導出された。レプチンは、体重の調節に関与するタンパク質である（チャン（Ｚｈａｎｇ）Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：４２５〜４３２頁（１９９４年））。ゲッ歯類及びヒトにおけるその欠損症は結果として、病的肥満、耐糖能異常、高脂血症及び重症肝臓脂肪症から成る「メタボリック・シンドローム」（以前Ｘ症候群と呼ばれていたもの）の重症形態をもたらす（ペレイマウンター（Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒ）Ｍ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：５４０〜５４３頁（１９９５年））。それでも、上述のように、これらの代謝障害の一部を矯正することを目的とするいかなる介入も、肝臓脂肪症、線維形成及び炎症の改善を結果としてもたらさなかった。
【０１５１】
最近の証拠は、レプチン欠損症モデルにおいて免疫系がＮＡＳＨの病因の中で極めて重要な役割を果たし得るということを示唆している。レプチン欠損症のマウスでは、リポ多糖類による肝損傷誘発の後に、肝マクロファージ（クッパー細胞）応答不全が観察された（ディール（Ｄｉｅｈｌ）ＡＭ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８２：Ｇ１〜Ｇ５（２００２年））。類似のモデルにおいて、ＩＬ６のＬＰＳ誘発が大幅に増強され、一方ＩＬ１０のものは阻害された（ロフレッダー（Ｌｏｆｆｒｅｄａ）Ｓ、ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １２：５７〜６５頁（１９９８年））、ｏｂ／ｏｂマウス肝マクロファージは、ＬＰＳ攻撃誘発に応答して対照マウスよりも多いＩＬ１２と少ないＩＬ１５と産生することが観察され、このことは、これらのマウスで観察されるＮＫＴリンパ球の数及び機能の著しい低下を説明しているのかもしれない（ヤング（Ｙａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：２５５７〜２５６２頁（１９９７年））。その他の観察は、レプチン欠損症ｏｂ／ｏｂマウスの血液及び肝臓内のＣＤ４Ｔリンパ球の数の減少を示した（ハワード（Ｈｏｗａｒｄ）ＪＫ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０４：１０５１〜１０５９頁（１９９９年）及びロード（Ｌｏｒｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：８９７〜９０１頁（１９９８年））。これにより、ＣＤ４Ｔリンパ球によって媒介されるコンカナバリンＡ肝炎に対するレプチン欠損症マウスの相対的耐性の説明がつくかもしれない（ファッジオーニ（Ｆａｇｇｉｏｎｉ）Ｒ  ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：２３６７〜２３７２頁（２０００年））。
【０１５２】
非アルコール系脂肪性肝炎におけるＴｈ１／Ｔｈ２バランス不全
ＣＤ４及びＣＤ８リンパ球は、ＩＬ−２を産生するＴｈ１細胞、ＩＦＮγ、又はＩＬ−４及びＩＬ−１０を産生するＴｈ２細胞のいずれかとして分類される。免疫系は、応答の２つの亜型の間のバランスシフトによって外来性及び自己抗原に応答する［ウェイナー、Ｈ．Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：３３５〜３４３頁（１９９７年）；アドリーニ、Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：２０９〜２１１頁（１９９７年）］。通常、Ｔｈ１型の応答は、炎性誘発性反応［アドリーニ、Ｌ．ら、（１９９７年）上掲書；ミゾグチ、Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３−８４７〜８５６頁（１９９６年）］。をひき起こし、一方、ＩＬ１０といった抗炎症性サイトカインは、抗炎症性Ｔｈ２反応に向かってバランスをシフトさせ、かくして免疫介在性障害を緩和する［ミゾグチ、Ａ．ら（１９９６年）上掲書；マドセン、Ｋ．Ｌ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１３：１５１〜１５９頁（１９９７年）；ファン・デベンター・サンダー（Ｖａｎ  Ｄｅｖｅｎｔｅｒ  Ｓａｎｄｅｒ）、Ｊ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１３：３８３〜３８９頁（１９９７年）］。異なる内因性及び外因性刺激に応答して、ＮＫＴ細胞は、Ｔｈ１又はＴｈ２経路のいずれかに向かっての免疫系の誘導において主たる役割を果たすと考えられている。
【０１５３】
レプチンは、Ｔｈ１及びＴｈ２応答の間のバランスの免疫調節において主たる役割を果たすことが示されてきた（ロード（Ｌｏｒｄ）ＧＭ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：８９７〜９０１頁（１９９８年））。レプチン欠損症ｏｂ／ｏｂマウスＮＡＳＨモデルにおいては、ＮＫＴ細胞の数及び機能の改変がＴｈ１応答に向かって、免疫系を傾動させるものと示唆されてきた。これは、ＬＰＳ誘発型肝臓毒性に対する感応性の増大及びコンカナバリンＡの肝臓毒性効果に対するユニークな耐性という結果をもたらすものと示唆されている。違いはそれらの病原性機序の相違にあり得る。前者は、レプチン欠損症マウスにおいて超活性である先天的肝臓免疫系の作用に依存し、一方後者は、レプチン欠損症マウスにおいて抑制され不全であるＮＫＴリンパ球の活性化により左右される。（ファジオーニ、Ｒ．ら、ＰＮＡＳ  ９７：２３６７〜２３７２頁（２０００年）、ジピング（Ｚｈｉｐｉｎｇ）ＬＩ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２３：１３０４〜１３１０頁（２００２年））。
【０１５４】
免疫系と肥満
免疫系と脂肪組織代謝の調節は相互に密に連結していると思われる。脂肪組織内部の最高５０パーセントの細胞は、数多くの免疫細胞を含めて非脂肪細胞から成る（モンタギュ（Ｍｏｎｔａｇｕｅ）ＣＴ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４７：１３８４〜９１頁（１９９８年））。大部分の研究が病的肥満の免疫学的結果に焦点をあてたものであった。肥満の動物及びヒトに存在するものとして知られる免疫学的改変には、ＤＴＨの減少及び分裂刺激されたリンパ球増殖応答（チャンドラ（Ｃｈａｎｄｒａ）ＲＫ．ら、Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｓｃａｎｄ  ６９：２５〜３０頁（１９８０年））、食細胞の数及び機能の低下（クリシュナン（Ｋｒｉｓｈｎａｎ）ＥＣ．ら、Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  ３３：８９〜９７頁（１９８２年））、インシュリン誘発型リンパ球細胞毒性の減衰（コッフラー（Ｋｏｆｆｌｅｒ）Ｍ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４０：３６４〜３６０頁（１９９１年））、及び特に減量試行中のＣＤ４／ＣＤ８比の変化（フィールド（Ｆｉｅｌｄ）ＣＪ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．５４：１２３〜１２９頁（１９９１年））が含まれる。
【０１５５】
脂肪細胞は、ＴＮＦ−α［ホタミスリギル（Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ）ＧＳ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：８７〜９１頁（１９９３年）］及びＩＬ６［ピューロヒット（Ｐｕｒｏｈｉｔ）Ａ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ８０：３０５２〜５８頁（１９９５年）］を含む炎性誘発性サイトカインを分泌するものとして知られており、両方共脂肪過多症のレベルに関係づけされている（ホタミスリギル、ＧＳ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２４５：６２１〜６２５頁（１９９９年））。これらのサイトカインの一部は、ＴＮＦ−αにより媒介されるインシュリン耐性［オガワＨ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ  １００３：１３１〜１３５頁（１９８９年）］及びＩＬ６によって媒介されるリポタンパク質リパーゼ阻害［ファインゴールド（Ｆｅｉｎｇｏｌｄ）ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４１：９７ｓ〜１０１ｓ頁（１９９２年）］といった代謝効果を有するものとみなされている。ＴＮＦ−αノックアウトマウスは、その正常な同腹子に比べて高いインシュリン感受性及び改善された脂質プロファイルを有する［ウイサル（Ｕｙｓａｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：６１０〜６１４頁（１９９７年）］。脂肪細胞によって産生される免疫系のその他の構成要素としては、代替的補体系の一部でありヒト補体因子Ｄと同一の形で機能するタンパク質アジプシンが含まれる［ローゼン（Ｒｏｓｅｎ）ＢＳ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１４８３〜７頁（１９８９年）］。
【０１５６】
肥満のメディエータとしての免疫系の役割については、ほとんど情報が知られていないが、いくつかの最近の研究は、肥満の発達において免疫系が重要な貢献的役割をもち得るということを示唆している。複数のサイトカインは、脂肪組織調節因子として作用することがわかっている。ＴＮＦ−αは、交感神経媒介型リポリーシスに関与する脂肪細胞上でのβ３アデノ−レセプタの発現を抑制し、一方ＩＬ１は、脂肪レプチン分泌を刺激する［サラフ（Ｓａｒｒａｆ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８５：１７１〜１７５頁（１９９７年）］。脂肪細胞の代謝活性速度は、部分的にＩＬ４、ＩＬ６及びＴＮＦ−αによって媒介される機序を通して（マタック（Ｍａｔｔａｃｋｓ）ＣＡ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １１：３３４〜３４６頁（１９９９年））最も近いリンパ節からのその距離に密に相関することが観察された［ポンド（Ｐｏｎｄ）ＣＭ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｓｏｃｉｅｔｙ  ６０：３６５−３７４（２００１年）］。
【０１５７】
肥満の動物及びヒトが同様に免疫系の異なる群におけるさまざまな改変に苦しんでいる可能性があるという事実を指摘するこれらの観察結果は、病的肥満の発達の原因となる病原性機序のいくつかを免疫系の変調が変更し得るということを示唆している。
【０１５８】
移植片対宿主病の病因における免疫系の役割
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、骨髄移植の成分にとっての主たる障害物である。ＧＶＨＤは、幹細胞の移植（ＳＣＴ）の後に発生する多臓器不全である［フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）ＪＬＭ、デーク（Ｄｅｅｇ）ＨＪ．Ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  ｏｆ  Ｍｅｄ  １９９１年；３２４：６６７〜７２頁）］。病因には、組織破壊を結果としてもたらす同種反応性抗原の認識及びＴ細胞及びその他の免疫コンピテントエフェクタ細胞の活性化が関与する［ボーゲルサング（Ｖｏｇｅｌｓａｎｇ  ＧＢ．Ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓｔ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｂａｓｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  ａｎｄ  Ｒｅｓ  １９９７年；７７：８７〜９７頁］。ＧＶＨＤにおける肝臓の関与は、レシピエントの胆管に対する移植されたドナーのリンパ球による免疫攻撃の結果である。
【０１５９】
複数の研究が、ＧＶＨＤ内の調節用Ｔ細胞サブセットの重要性を示してきた。例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節用Ｔ細胞の輸液が近年、ＧＶＨＤ致死性を阻害することが示されてきた［テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ＰＡ、リース（Ｌｅｅｓ）ＣＪ、ブレーザー（Ｂｌａｚａｒ）Ｂ．Ｔｈｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ−ｄｉｓｅａｓｅ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００２年；９９：３４９３〜９９頁］。ＮＫＴ細胞は、重要な免疫変調効果を伴うユニークな調節用Ｔリンパ球サブセットである。これらの細胞は、さまざまな感染性、炎症性及び新生物形成過程を含めたさまざまな免疫介在性障害においてきわめて重要性の高いものであることがこれまでに示されてきた。ＮＫＴ細胞は、異なるサイトカインの分泌を介して（すなわちＩＦＮガンマ又はＩＬ−４）か又は異なる免疫細胞サブセットの活性化によって、Ｔｈ１及びＴｈ２型の両方の免疫性に関与し得る［ゴッドフレイ（Ｇｏｄｆｒｅｙ）ＤＪ、ハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ）ＫＪ、プーロン（Ｐｏｕｌｏｎ）ＬＤ、スミス（Ｓｍｙｔｈ）ＭＪ、バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）ＡＧ、ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ：ｆａｃｔｓ、ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｆａｌｌａｃｉｅｓ．Ｉｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２００、２１：５７３〜８３頁］。最近、本発明人らは、それぞれ結腸炎［トロップ、Ｓ．、イラン、Ｙ．ＮＫ１．１＋Ｔ  ｃｅｌｌ；Ａ  ｔｗｏ−ｆａｃｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＬ４／ＩＦＮ  ｐａｒａｄｉｇｍ？  Ｊ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２２：２７０〜８０頁（２００２年）］、及び肝臓癌［シボレート（Ｓｈｉｂｏｌｅｔ）Ｏ．、アルパー（Ａｌｐｅｒ）Ｒ、ズロットガロブ（Ｚｌｏｔｏｇａｒｏｖ）Ｌ、ターレンフェルド（Ｔｈａｌｅｎｆｅｌｄ）Ｂ、エンゲルハート（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ）Ｄ．、ラバニ（Ｒａｂａｎｎｉ）Ｅ．、イラン（Ｉｌａｎ）Ｙ．ＮＫＴ  ａｎｄ  ＣＤ８  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｖｉａ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｕｌｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２０；１０６：２３６〜４３頁、２００３年］のマウスモデルにおける経口免疫変調節により誘発された抗炎症性及び抗新生物効果においてＮＫＴ細胞は極めて重要な役割を有する、ということを示してきた。以前の研究は、急性及び慢性ＧＶＨＤにおけるＮＫＴ細胞の役割を実証してきた。例えば、ＮＫ１．１陽性Ｔ細胞サブセットはＧＶＨＤを抑制することが示され、一方ＮＫ１．１陰性Ｔリンパ球はＧＶＨＤを悪化させ、これはサイトカインの産生差に結びつけられる効果であった［ゼング（Ｚｅｎｇ）Ｄ．、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｄ．、デジャバクシュ−ジョーンズ（Ｄｅｊｂａｋｈｓｈ−Ｊｏｎｅｓ）Ｓ．、ラン（Ｌａｎ）Ｆ．、グラシア−オヘダ（Ｇａｒｃｉａ−Ｏｊｅｄａ）Ｍ．、シブレー（Ｓｉｂｌｅｙ）Ｒ．、ストロ��バ（Ｓｔｒｏｂｅｒ）Ｓ．、Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ＮＫ１．１−ａｎｄ  ＮＫ１．１＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ａｃｕｔｅ  ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｓ．１９９９年；１８９：１０７３〜８１頁］。
【０１６０】
急性ＧＶＨＤは、同種ＳＣＴ後の主たる合併症であり、移植、事後低強度条件づけ又は非骨髄機能廃絶投薬計画を含めた近代の移植方法が利用される場合でさえ、ＳＣＴの成功にとっての主たる障害物であり続けている。急性ＧＶＨＤを研究するための１つの実験モデルは、移植に先立って７Ｇｙ６０Ｃｏの全身照射（ＴＢＩ）を受けた（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｂａｌｂ／ｃ）Ｆ１レシピエントマウス内にＣ５７ＢＬ／６ドナーマウスからの２×１０７の脾細胞を輸液することによってＧＶＨＤを生成させることのできる、半同種Ｃ５７ＢＬ／６から（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｂａｌｂ／ｃ）Ｆ１のマウスモデルである［ナグラー（Ｎａｇｌｅｒ）Ａ．、オハナ（Ｏｈａｎａ）Ｍ．、アルパー（Ａｌｐｅｒ）Ｒ．、ドビナー（Ｄｏｖｉｎｅｒ）Ｖ．、シャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）Ｙ．、ラバニ（Ｒａｂｂａｎｉ）Ｅ．、エンゲルハルト（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ）Ｄ．、及びイラン（Ｉｌａｎ）Ｙ．、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｓｅｍｉ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００３年、（印刷中）］。本発明人らは最近、このモデルの中で、レシピエント脾細胞でのドナーの移植前給餌による経口免疫調節の誘発が、インビトロ同種反応性の抑制、生存率の改善、リンパ球浸潤の低減及び標的器官におけるその他の標準的な組織病理学的ＧＶＨＤ徴候といった形で現われる急性ＧＶＨＤを緩和する、ということを示してきた。
【０１６１】
開示及び記述を行なってきたが、本発明が本明細書で開示された特定の実施例、方法工程及び組成物に制限されるものではなく、かかる方法、工程及び組成物は幾分か変動しうるものであるということを理解すべきである。同様に、本明細書に使用された用語が、特定の実施形態を記述する目的のためのみに使用され、制限することを意図されたものでなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ制限されることになるということも理解すべきである。
【０１６２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されているように、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、内容が明らかに相反する判断を示しているのでないかぎり、複数の指示対象も含まれる、という点を指摘しておかなければならない。
【０１６３】
本明細書及び以下の実施例及び特許請求の範囲全体を通して、内容が求めているのでないかぎり、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」という語及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」といった活用形は、言及された整数又は工程又は整数群又は工程群の内容を意味するものの、その他の何らかの整数又は工程又は整数群又は工程群の除外を意味するものではないというように理解されることになる。
【０１６４】
以下の実施例は、本発明の態様を実施する上で発明人らが利用する技術を代表するものである。これらの技術は、該発明の実践のための好ましい実施形態の一例であるが、当業者であれば本開示に照らして、該発明の精神及び意図された範囲から逸脱することなく数多くの修正を認識することになるということがわかるはずである。
【実施例】
【０１６５】
Ｉ．
材料と方法
動物
ハーラン（Ｈａｒｌａｎ）から正常な近交系の生後２〜４ヵ月のＣ５７ＢＬ雄マウスを得、ハダサ・ヘブライ（Ｈａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒｅｗ）大学医学部の動物コア内に維持した。標準的研究室用食事でマウスを維持し、１２時間の明暗サイクルに保った。
【０１６６】
結腸炎の誘発
記述された通り、５０％のエタノール１００ｍｌ中に溶解させたマウス１匹あたり１ｍｇのＴＮＢＳを直腸点滴注入により、ＴＮＢＳ−結腸炎を誘発した［コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）Ｃ、ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：３１１４〜３１１８頁（１９９６年）］。
【０１６７】
経口抗原の調製及び投与
ＴＮＢＳで誘発した結腸炎のマウスから結腸をとり出し、小片にカットし、機械で均質化した。４０ｍｍのナイロン製セルストレーナを通してろ過した後、無傷の細胞をスピンダウンし、取出した。タンパク質検定キット（バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）、ドイツ、ミュンヘン）を用いて、タンパク質を定量化した。結腸炎抽出タンパク質（ＣＥＰ）を、１１日間隔日に給餌用無外傷性針を用いて（合計５用量）、以下に記述された実験グループに導入した。
【０１６８】
ＮＫ１．１細胞枯渇
以前に記述された通りに［カワムラ、Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１６〜１９頁（１９９８年）］、マウス抗マウスＮＫ１．１モノクローナル抗原（セロテック（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、英国、オクスフォード）を用いて、ＮＫ１．１＋細胞の枯渇を実施した。ドナーマウスからの脾細胞収獲より３６時間前に一日５０μｇをマウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。
【０１６９】
リンパ球の養子免疫伝達
全てのグループからのドナーマウスを、結腸炎の導入から１４日目に屠殺し、脾臓から誘導したリンパ球の単一の懸濁液を記述通りに調製した［ウェイナー、Ｈ、ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：８０９〜８３７頁（１９９４年）］。移植の前にＰＢＳ中に細胞を再懸濁させた。全てのグループからの脾臓リンパ球を実験未使用のレシピエントマウス内に移植し、ひき続き２４時間後にＴＮＢＳで直腸に攻撃誘発した。
【０１７０】
実験用結腸炎に対する寛容誘発の効果の評価
結腸炎について以下のパラメータを監視することにより、寛容誘発の効果を評価した。
【０１７１】
結腸炎の臨床査定：
研究全体を通して毎日下痢が続いた。
【０１７２】
結腸炎の巨視的評点
標準パラメータを用いて、結腸炎誘発から１４日後に結腸査定を実施した［マドセン、Ｋ．Ｌ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１３：１５１〜１５９頁（１９９７年）；トロップ、Ｓ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：７４６〜７５５頁（１９９９年）］。
【０１７３】
４つの巨視的パラメータすなわち結腸潰瘍形成度；腸及び腹膜接着；壁厚；及び粘膜浮腫度を決定した。各パラメータを２人の経験豊かな盲検検査官により０（完全に正常）から４（最も重症）までの尺度で等級づけされた。
【０１７４】
組織学的病巣の等級づけ
炎症の組織学的評価のために、遠位結腸組織（最後の１０ｃｍ）を取出し、１０％のホルムアルデヒドで定着させた。各マウスからの５つのパラフィン切片を次に、標準技術を用いてヘマトキシリン−エオシンで染色した。結腸の顕微鏡断面上の炎症度を０から４まで半定量的に等級づけした（マドセンら、（１９９７年）上掲書；トロップら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：７４６〜７５５頁（１９９９年）。等級０：炎症の兆候が全く無く正常、等級１：非常に低レベルの白血球浸潤；等級２：低レベルの白血球浸潤；及び等級３：高い血管密度を伴う高レベルの浸潤及び腸壁の肥厚；等級４：杯細胞の喪失を伴う貫壁性浸潤物、高い血管密度、壁肥厚及び正常な腸アーキテクチャの破断。等級づけは２人の経験豊かな盲検検査官により実施された。
【０１７５】
実験的結腸炎モデル内の寛容誘発に対するＮＫ１．１リンパ球の役割の評価
肝臓及び脾臓リンパ球の単離
以前に記述された通りに脾細胞を単離し、赤血球を取り出した［ビカーリ（Ｖｉｃａｒｉ、Ａ．Ｐ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １７（２）：７１頁（１９９６年）］。幾分かの修正を加えて、以前に記述された通りに肝内リンパ球を研究の終りで全てのマウスグループから単離した［ビカーリら、（１９９６年）上掲書；Ｂｌｅｉｃｈｅｒ、Ｐ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：６７９〜６８２頁（１９９０年）］。横隔膜より上で下大動脈をカットし、青くなるまで肝臓を低温ＰＢＳ５ｍｌで洗い流した。結合組織と胆のうを除去し、肝臓を１０−ｍｌ入りの皿の中で低温無菌ＰＢＳ内に置いた。肝臓と脾臓をステンレスメッシュを通してつぶした（サイズ６０、シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）セントルイス、ミズーリ州）。３分間５０ｍｌ入りの管の中に細胞懸濁液を入れ、低温ＰＢＳ中（１０分間１，２５０×ｒｐｍ）で２回洗浄し、デブリを除去した。細胞をＰＢＳ中で再懸濁させ、細胞懸濁液を予めＰＢＳ中に浸漬したナイロンメッシュを通して入れ、未結合の細胞を収集した。細胞を４５ｍｌのＰＢＳ中で２回（室温で１，２５０×ｒｐｍ）洗浄した。肝臓及び脾臓リンパ球の単離のために、５０ｍｌ入り管内でＰＢＳ７ｍｌ中に懸濁させられた細胞の下に２０ｍｌのヒストパーク１０７７（シグマダイアグノスティクス（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）セントルイス、ミズーリ州）をゆっくりと入れた。管を１，６４０ｒｐｍで室温にて１５分間遠心分離した。界面にある細胞を収集し、５０ｍｌ入りの管内に希釈し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した（１０分間１，２５０ｒｐｍ）。マウス１匹につきおよそ１×１０６個の細胞を回収した。トリパンブルー染色による生存可能性は、９５％を上回っていた。脾細胞及び肝臓関連リンパ球の両方を、全実験グループ中の全ての動物から単離した。
【０１７６】
ＮＫ１．１＋リンパ球枯渇の判定のためのフローサイトメトリ分析
リンパ球単離の直後に、１０分間１％のＢＳＡ４ｍｌでインキュベートしたＦａｌｃｏｎ２０５２管の中に２〜５×１０４個の細胞／５００μｌのＰＢＳのトリプリケートを入れ、５分間１４００ｒｐｍで遠心分離した。１：２０のＦＩＴＣ−抗マウスＮＫ１．１抗体（ＮＫＲ−Ｐ１Ｃ、ファーミンゲン、米国）を伴う１０μｌのＦＣＳ中に細胞を再懸濁させ、３０分間にわたり１０分毎に混合した。細胞を１％のＢＳＡ中で２回洗浄し、読取るまで４℃内に保った。対照グループについては、５μｌの１％ＢＳＡしか添加しなかった。螢光細胞分析分離装置（ファクスタープラス（ＦＡＣＳＴＡＲ  ｐｌｕｓ）、ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて、各グループからの１×１０４個の細胞上で分析的細胞選別を実施した。生きた細胞だけを計数し、抗体処理されていないリンパ球からの背景螢光を、得られたレベルから演繹した。前方−側方散乱装置上でゲートにセットして、死んだ細胞及び赤血球を排除した。コンソート（Ｃｏｎｓｏｒｔ）３０の２色輪郭プロットプログラム（ベクトン・ディキンソン、オクスナード、カリフォルニア州）又はセルクエスト（ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ）プログラムを用いてデータを分析した。
【０１７７】
脾細胞及び肝臓関連リンパ球の培養
脾細胞及び肝臓関連リンパ球を全てのグループ（Ａ’〜Ｆ’）の中のマウスから収獲し、２４ウエルの組織培養平板の中で培養した。トリプリケートを、全ての研究グループ内の各動物から調製し、１２時間培養した。５％で３７℃で１２時間細胞からサイトカインが放出されるのを防ぐのに必要とされる２μＭのモネンシン（バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、カリフォルニア州）及びＣｏｎＡ  ２μｇ／ｍｌを共に、ＲＰＭＩ１６４０  １ｍｌあたり１×１０６個の脾細胞の割合でリンパ球を細胞皿の中で活性化させた。ＲＰＭＩ培地は、次のものを含有する：１０％のＦＣＳ、２００ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００Ｕのペニシリン及び１００Ｍｇのストレプトマイシン／ｍｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ＩＬ２−１０Ｕ／ｍｌ、ＣＥＰ−５０Ｍｇ／ｍｌ。細胞はモネンシン２μＭ（バイオソース、カリフォルニア州）と共に、２．５×１０６個の脾細胞と０．５×１０６個のＬＡＬを含んでいた。上清流体を、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン測定のため両方のセットから収集し、記述された通り［コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）、Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：３１１４〜３１１８頁（１９９６年）］、フローサイトメトリによりリンパ球を分析した。
【０１７８】
細胞内染色及びフローサイトメトリ
全てのウエルから細胞を収獲し、２重染色した。以下の抗体を用いて、以前に記述された通りに、ＣＤ４＋Ｔ−細胞集団（Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）を検出するための細胞外及び細胞内染色を使用した。すなわち、ＣＤ４＋ＩＬ４＋細胞の検出のためには、ＦＩＴＣ接合された抗ＣＤ４及びＰＥ接合された抗ＩＬ４ｍＡｂを使用した（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）。ＣＤ４＋ＩＦＮγ細胞の検出のためには、ＦＩＴＣ接合された抗ＣＤ４及びＰＥ接合された抗ＩＦＮγｍＡｂを使用した（フィーミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア州）。全てはメーカーの指示事項に従って行なわれた（ＩＣスクリーン、バイオソース細胞内染色キット、カリフォルニア州）。リンパ球をフローサイトメトリにより分析した。
【０１７９】
肝臓リンパ球細胞毒性検定
これらの研究内で使用された標的細胞は、１０％のＦＣＳを伴う補足済みＲＰＭＩを利用することによって、組織培養内での連続的成長に適合されたリンパ腫細胞系であるＹＡＣ−１細胞であった。ＹＡＣ−１細胞を、ＲＰＭＩ１０％のＦＣＳを伴う２５ｍｌ入りフラスコ中で２×１０５細胞／ｍｌの密度でそれらを播種し２４時間後にこれらを収集することにより、ＮＫ検定用に調製した。細胞を５０ｍｌ入り管内で懸濁させ収集し、１０分間遠心分離（１２５０ｒｐｍ）により培地で２回洗浄した。この手順により、５１Ｃｒを用いて効果的な標識及びＮＫ細胞による溶解の高感受性が保証された。標的細胞を５１Ｃｒ（ニューライフサイエンス（Ｎｅｗ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ボストンＭＡ、ガミドール、イスラエル）で標識し、３７℃で９０分間インキュベートした（３００μｌのＲＰＭＩ培地中２×１０６個の細胞あたり２００ｍＣｉ）。１０分毎に細胞を手作業で混合した。インキュベーションの後、２０％のＦＣＳ  ＲＰＭＩ３ｍｌを添加し、３７℃で３０分間再インキュベートした。ＲＰＭＩ１０％ＦＣＳ中で３回細胞を洗浄し、計数した。標識効率度を判定するために、１００μｌの細胞を計数し、最低０．６ｃｐｍ／細胞を測定した。エフェクタ細胞は、上述のグループＡ−Ｈ由来の肝臓から単離された肝臓リンパ球であった。５１Ｃｒ−放出検定をＣｏｓｔａｒ  ９６ウエル平板内で実施した。１００μｌ中の等級付けされた数のエフェクタ細胞を、１００：１、５０：１、及び１０：１のエフェクタ対標的比（Ｅ：Ｔ比）で、１００μｌ中５０００個の標識された標的細胞と混合させた。各ウエルは、合計２００μｌの体積で標的及びエフェクタ細胞を収納していた。各試料からの各比率について、５つのウエルをテストした。自然放出の判定のためには、６ウエルの類似した数の標的細胞を１００μｌのＲＰＭＩ１０％ＦＣＳを用いて平板固定した。最大放出の判定のためには、１００μｌの培地中の６ウエルの標的細胞を１００μｌのトリトンＸと混合した。平板を２分間遠心分離に付し（５００ｒｐｍ）その後３７℃で５％のＣＯ２内で４時間インキュベートした。平板を次に再び２分間（５００ｒｐｍ）遠心分離に付し、ガンマ計数器を用いて上清を収獲し計数した。結果は、細胞毒性％＝検定の平均ｃｐｍ−自然放出からのｃｐｍ／トリトンＸで溶解させた標的からのｃｐｍ−自然放出からのｃｐｍ×１００という等式を用いて計算される標的細胞の特異的溶解パーセントとして表現された。
【０１８０】
サイトカイン分泌
両方のトリプリケートセットから上清流体を収集し、全ての寛容化された及びされていないグループからの全てのマウス、ＮＫ１．１枯渇したマウス及び枯渇していないウスについて、サイトカインレベルを測定した。メーカーの指示事項に従ってジェンザイムダイアグノスティクス（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）キット（ジェンザイムダイアグノスティクス、マサチューセッツ州、米国）を用いて「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡによりＩＬ４、ＩＬ１０、ＩＬ１２及びＩＦＮγレベルを測定した。寛容化された及びされていないＮＫ１．１枯渇された及びされていないマウスからの５匹のマウスにおいて、結腸炎誘発から１０日目に血清レベルを測定した。
【０１８１】
インビトロ教育実験
リンパ球の単離及び分離
脾細胞を調製し、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＮＫ及び樹状細胞という４つのリンパ球サブセットへと分離した。磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いて、細胞分離を行なった。各々のリンパ球サブセットについて特異的マイクロビーズを使用した。すなわちＣＤ４及びＣＤ８マイクロビーズ及び抗−ＮＫビーズ［ミルテニルバイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ドイツ］である。リンパ球単離の直後に、１０分間１％のＢＳＡ４ｍｌでインキュベートしたＦａｌｃｏｎ２０５２管の中に２〜５×１０４個の細胞／５００μｌのＰＢＳのトリプリケートを入れ、５分間１４００ｒｐｍで遠心分離した。１：２０のＦＩＴＣ−抗マウスＮＫ１．１抗体（ＮＫＲ−ＰＩＣ、ファーミンゲン、米国）を伴う１０μｌのＦＣＳ中に細胞を再懸濁させ、３０分間にわたり１０分毎に混合した。細胞を１％のＢＳＡ中で２回洗浄し、読取るまで４℃内に保った。対照グループについては、５μｌの１％ＢＳＡしか添加しなかった。螢光細胞分析分離装置（ファクスタープラス、ベクトンディッキンソン）を用いて、各グループからの１×１０４個の細胞上で分析的細胞選別を実施した。生きた細胞だけを計数し、抗体処理されていないリンパ球からの背景螢光を、得られたレベルから演繹した。前方−側方散乱装置上にゲートをセットして、死んだ細胞及び赤血球を排除した。Ｃｏｎｓｏｒｔ３０の２色輪郭プロットプログラム（ペクトン・ディキンソン、オクスナード、カリフォルニア州）又はセルクエストプログラムを用いてデータを分析した。
【０１８２】
脾細胞及び肝臓関連リンパ球の培養
脾細胞を全てのグループの中のマウスから収獲し、２４ウエルの組織培養平板の中で培養した。トリプリケートを、全ての研究グループ内の各動物から調製し、１２時間培養した。上清流体を、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン測定のため両方のセットから収集した。
【０１８３】
実施例１
実験的結腸炎における寛容誘発の効果
実験的結腸炎における寛容誘発の効果を評価するために、各々２０匹の動物から成る６つのマウスグループを研究した（表１）。直腸ＴＮＢＳ（グループＡ、Ｂ、Ｄ及びＥ）又は標準的食塩水（対照グループＣ及びＦ）を用いて研究一日目に全てのマウスを攻撃誘発した。全てのグループ中のマウスを、結腸炎誘発の日から始めて１１日間隔日に給餌した（５０μｇ／マウス）。グループＢ及びＥは、結腸炎抽出タンパク質（ＣＥＰ）での給餌を受けたマウスを含んでいた。グループＡ、Ｃ、Ｄ及びＦ内のマウスは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、５０μｇ／マウス）の給餌を受けた。全てのグループ中のマウスを、結腸炎誘発から１４日目に屠殺した。グループＤ〜Ｆ内のマウスは、上述の通り、研究が終結する３６時間前に抗ＮＫ１．１抗マウスモノクローナル抗体で処置した。グループＡ〜Ｃのマウスは、ＮＫ１．１枯渇されていなかった。
【０１８４】
【表１】
2007533633.tif 000002
【０１８５】
結腸炎の臨床検査
それぞれマウスＣＥＰで給餌されるか又はＮＫ１．１−枯渇されたグループＢ及びＤからの寛容化されたマウスの中で、下痢の著しい減少が観察された。これとは対照的に、ＢＳＡで給餌されたか又はマウス−ＣＥＰで給餌されＮＫ１．１で枯渇されたグループＡ及びＥからのマウスは、重症の下痢に苦しんだ。マウスの体重の追跡調査は、グループＡ及びＥ中のマウスと比較してグループＢ及びＤ中の寛容化されたマウスの間で統計的に有意な体重の減少を明らかにした（それぞれ１３．５％及び１１．６５％対３．２％及び４．８％、ｐ＜０．００５）。
【０１８６】
結腸炎の巨視的等級付け
マウス抽出の結腸炎由来のタンパク質の給餌又はＮＫ１．１−枯渇（グループＢ及びＤ）による経口寛容の誘発は、結腸炎の巨視的等級付けを有意に緩和した。結腸炎のテストされた巨視的パラメータについての評点は、結腸炎潰瘍形成の度合い、腸及び腹膜接着、壁厚み及び粘膜浮腫の度合い、であった。合計巨視的評点は、それぞれ、未処理対照及びＣＥＰ給餌ＮＫ１．１枯渇グループＡ及びＥにおいて３．１±０．５４及び３．０５±０．６７（ｐ＜０．００５）であったのに比べ、グループＢ及びＤのマウスではそれぞれ０．３５±０．０１及び０．６３±０．０３であった。
【０１８７】
組織学的病巣の等級付け
腸組織の組織学的評価は、グループＡ及びＥの中の寛容化されていないマウスと比べて、グループＢ及びＤ内の寛容化されたか又はＮＫ１．１枯渇されたマウスにおいて、炎症性応答及び粘膜潰瘍形成の著しい減少を示した。グループＢ及びＤ内のマウスでは、ほぼ正常な切片又は最小限のリンパ球浸潤しか検出されなかった。これとは対照的に、寛容化されていないマウスから取った腸標本の中には重症の炎症性反応（等級３〜４）が見られた。
【０１８８】
実施例２
ＮＫ１．１＋リンパ球は、寛容化されたマウスにおいてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を増大させ、実験的結腸炎を有する寛容化されていないマウスにおいてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を減少させた
寛容化されたマウス
寛容化されたマウスにおけるＮＫ１．１＋リンパ球の効果を研究するため、全てのグループ内のマウスから脾細胞及び肝臓関連リンパ球（２．５×１０６個の脾細胞と０．５×１０６のＬＡＬ）を収獲し、ＣＥＰ及びＡＰＣの存在下で７２時間培養した。フローサイトメトリ分析は、経口寛容誘発の後のＮＫ１．１−枯渇が、ＮＫ１．１ＬＡＬ枯渇されていない寛容化されたマウスと比べてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を減少させた（それぞれグループＥ及びＢにおいて０．９９±０．０３対１．８±０．３５のＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋、ｐ＜０．００５、図２）ということを示した。対照ＮＫ１．１−枯渇されたグループ（グループＦ）は、ＮＫ１．１枯渇されてないグループＣに比べてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比の減少を明らかにした（それぞれグループＣ及びＦについて２．１３±０．３６対１．６±０．２９）。
【０１８９】
寛容化されていないマウス
寛容化されたグループとは対照的に、ＮＫ１．１−枯渇は、実験的結腸炎を有する寛容化されていないマウスに対し反対の効果を示した。ＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比は、ＮＫ１．１枯渇も寛容化もされていないグループと比べて、ＮＫ１．１−枯渇された寛容化されていないグループ内で増大した（それぞれグループＡ及びＤにおいて０．７４±０．０６対０．５６±０．０５）。
【０１９０】
寛容化されたマウスと寛容化されていないマウスの間のＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比の比較は、全ての寛容化されたグループにおいて、より高い比率を明らかにした。ＴＮＢＳで処置されＣＥＰを経口給餌されたマウス（グループＢ）は、ＢＳＡで給餌された寛容化されていないマウス（グループＡ）と比べて有意に高い比を示した。グループＡ、Ｂ及びＣ中のＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比は、それぞれ０．５６±０．０５、１．８±０．３５及び２．１３±０．３６（ｐ＜０．００５）であった。図４は、それぞれ、グループＢ及びＥからの寛容化されたＮＫ１．１枯渇されていない及び枯渇されているマウス及びグループＡ及びＤからの寛容化されていないＮＫ１．１枯渇されていない及び枯渇されているマウスから単離されたリンパ球上でのＩＬ４及びＩＦＮγの発現の代表的結果を示す。
【０１９１】
実施例３
インビトロ感作の役割及び、実験的結腸炎を有する寛容化された及びされていないマウスにおけるＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比に対する疾病−標的−抗原の効果
ＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比に対する疾病標的抗原のインビトロ暴露の効果を評価するために、全てのグループ（表１に列挙）の中のマウスから、脾細胞及び肝臓関連リンパ球（２．５×１０６）の脾細胞及び（０．５×１０６）のＬＡＬを収獲し、ＣｏｎＡの存在下で及びＣＥＰ及びＡＰＣの不在下で１２時間培養した。抗原の不在下でＮＫ１．１枯渇の効果の評価は、抗原の存在下で見い出されるものと類似であった。グループＢの中の寛容化されたマウスから収獲されたリンパ球は、寛容化されたグループＥ内のＮＫ１．１−枯渇されたマウスに比べて、有意に高いＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を明らかにした（それぞれ０．７±０．０２対１．１±０．０２、ｐ＜０．００５）。これとは対照的に、ＮＫ１．１枯渇は、抗原の不在下でグループＡ及びＤからの寛容化されていないマウスにおいてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比の増大を誘発した（それぞれ１．２１±０．０３対０．９６±０．０１、ｐ＜０．００５、表２、図５）。これらの結果は、免疫教育がインビボで達成され、インビトロでの細胞−抗原インキュベーションに影響されなかったということを示唆する。
【０１９２】
同様にして、フローサイトメトリ分析は、ＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比がグループＢ及びＥ内及び対照グループＣ及びＦ内の寛容化されたマウス内で有意に減少し、グループＡ及びＤ中の寛容されていないマウス内で有意に増大した（ｐ＜０．００５、図５）ということを示した。
【０１９３】
【表２】
2007533633.tif 000003
【０１９４】
寛容化された及びされていないマウスにおけるサイトカインレベルの変化
上清流体を、両方のトリプリケートセットから収集し、全ての寛容化された及びされていないグループからの全てのマウスについてサイトカインレベルを測定した。「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡによりＩＬ４及びＩＦＮγレベルを測定した。寛容化されたマウスは、Ｔｈ１からＴｈ２の免疫応答サイトカイン分泌のシフトを明示した。これらのマウス（グループＢ）はＩＬ４レベルの増加及びＩＦＮγレベルの減少を明示した。これとは対照的に、寛容化されていないグループ（グループＡ、Ｅ）からのマウスは、高いＩＦＮγと低いＩＬ４レベルを示した。グループＢ内の寛容化されたマウスから収獲したリンパ球は、寛容化されたグループＥ内のＮＫ１．１枯渇されているマウスと比べて、有意に高いＩＬ４及び低いＩＦＮγレベルを明らかにした（それぞれ２４．４±１．４及び１４．１±０．４対２２．６±０．７及び１８９．８±８．４、図６）。これとは対照的にＮＫ１．１枯渇は、抗原の不在下でグループＡ及びＤからの寛容化されていないマウスにおいてＩＦＮγの増大及びＩＬ４レベルの減少を誘発した（それぞれ１２８．３±３．７及び０．６±０．０１対４８．３±４．１及び１９．１±０．４、図６）。ＮＫ１．１枯渇は、ＣＥＰの給餌を受けたグループではＩＬ１２レベルの増大を導く（４７５±２３．３対１４５±５．７及びグループＥについて、それぞれ、図７）が、ＣＥＰの給餌を受けていないグループ内では反対の効果を有していた（それぞれ、グループＡ及びＤについて１６５±７．４及び７４±３．３）。
【０１９５】
実施例４
実験的結腸炎における脾細胞の養子免疫伝達に対する寛容誘発の効果
実験的結腸炎モデルにおける寛容誘発の効果を評価するために、各々１０匹の動物から成る６つのドナーマウスグループを研究した（表３に異なるグループが列挙されている）。ＴＮＢＳでの直腸攻撃誘発により、グループＧからＪまでのマウスにおいて結腸炎を誘発した。グループＫ及びＬ内の対照マウスは、標準食塩水で攻撃誘発した。グループＫ及びＬ中の対照マウスは、標準食塩水で攻撃誘発した。全てのグループ内のマウスに、結腸炎誘発の日から開始して１１日間隔日で５０μｇ／マウスでの給餌を施した。グループＩ及びＪは、結腸炎抽出タンパク質（ＣＥＰ）での給餌を受けたマウスを含んでいた。グループＧ、Ｈ、Ｋ及びＬ内のマウスには、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ５０μｇ／マウス）を給餌した。脾細胞収獲の３６時間前に、グループＧ、Ｉ及びＫからのマウスにおいて、上述の通りＮＫ１．１枯渇を実施した。全てのグループ内のマウスを、結腸炎誘発から１４日後に屠殺した。
【０１９６】
各々１０匹の動物から成るレシピエントマウスグループＧ’−Ｌ’も研究した。０．５ｍｌのＰＢＳ中で１×１０６個のドナー細胞を静脈内で注射する２４時間前に、３００ラドの全身照射で、レシピエントマウスに亜致死線量で照射した。全てのマウスを、細胞移植の２４時間後にＴＮＢＳ浣腸剤で処置した。結腸炎についての臨床的、巨視的及び組織学的パラメータを以下で記述する通り結腸炎誘発から１４日後に決定した。
【０１９７】
【表３】
2007533633.tif 000004
【０１９８】
結腸炎の臨床査定
マウスＣＥＰで給餌されたグループＪ’からの寛容化されたマウスからの寛容化された細胞のレシピエント内、ならびにグループＪの寛容化されたマウス内において、下痢の著しい減少が見られた。これとは対照的に、グループＨ’からの寛容化されていない脾細胞のレシピエント及びグループＨからのＢＳＡでの給餌を受けたマウスは、重症の下痢に苦しんだ。マウスの体重の追跡調査は、グループＨ及びＨ’中の寛容化されていないマウスと比較してグループＪ及びＪ’中の寛容化されたマウスの間で統計的に有意な体重の減少を明らかにした（それぞれ１０．８％及び１１．２％対５．７％及び５．５％、ｐ＜０．００５）。
【０１９９】
グループＧ’からのＮＫ１．１枯渇されているマウス由来の脾細胞のレシピエント及びグループＧからのそのドナーは、グループＨ及びＨ’内の寛容化されていないマウスを比較して下痢による苦しみが少なかった。両方のグループ（Ｇ及びＧ’）からのマウスは、体重の増加を示した（それぞれ９．９％及び１０．２％対５．７％及び５．５％、ｐ＜０．００５）。これとは対照的に、グループＩ’からのＮＫ１．１枯渇されたマウス由来の脾細胞のレシピエントは、寛容化効果の喪失を導いた。そのドナーにおいては、類似の効果が見られた（グループＩ）。これらのマウスは、グループＨ及びＨ’と比べた場合、下痢が少なかったが、ＮＫ１．１枯渇されない対照よりも悪いものであった。同様にして、両方のグループにおいてマウス内には体重のいかなる有意な増大も見られなかった（グループＪ及びＪ’内の寛容化されたマウスに比較してそれぞれグループＩ及びＩ’のマウスについて６．０％及び５．１％、ｐ＜０．００５）。
【０２００】
グループＫ及びＬからのマウスは、ＴＮＢＳでの攻撃誘発は受けず、疾患の臨床上の証拠も示さなかった。その体重はそれぞれ１１．４％及び１２．３％だけ増大した。これとは対照的にグループＫ’及びＬ’からのマウスは、重症の下痢を発達させ、その体重はそれぞれ４．５％及び５．２％しか増大しなかった。
【０２０１】
結腸炎の巨視的等級付け
マウス抽出の結腸炎由来のタンパク質の給餌（グループＪ）及び寛容化されたリンパ球の養子免疫伝達（グループＪ’）による経口寛容の誘発は、結腸炎の巨視的等級付けを有意に緩和した。結腸炎のテストされた巨視的パラメータについての評点は、結腸炎潰瘍形成の度合い、腸及び腹膜接着、壁厚み及び粘膜浮腫の度合いであった。合計巨視的評点は、それぞれ、グループＨ及びＨ’の寛容化されていないマウスにおける３．２２±０．１５及び３．３２±０．２６に比べて、それぞれグループＪ及びＪ’において０．３１±０．２４及び０．３±０．２５であった。グループＧからのＮＫ１．１枯渇されたマウス及びグループＧ’からのそのリンパ球のレシピエントは、疾病の緩和を明示した（それぞれ０．８±０．４及び０．８５±０．５）。これとは対照的に、グループＩからのＮＫ１．１枯渇されたマウス及びそのリンパ球のレシピエント（グループＩ’）は、重症の結腸炎を明示した（それぞれ３．７２±０．２２及び３．７７±０．６、ｐ＜０．００５）。グループＫ’及びＬ’からのマウスは、重症の結腸炎の証拠を示した（それぞれ３．４±０．２９及び３．２７±０．２２）。
【０２０２】
組織学的病巣の等級付け
腸組織の組織学的評価は、グループＪ及びＪ’の中の寛容化されたマウスにおいて、炎症性応答及び粘膜潰瘍形成の著しい減少を示し、組織学的評点は、それぞれ１．８及び１．７であった。これらのマウスにおいては、ほぼ正常な切片又は最小限のリンパ球浸潤しか検出されなかった。これとは対照的に、グループＨ及びＨ’内の寛容化されていないマウスから取った腸標本の中に重症の炎症性反応が見られ、組織学的評点は３．３及び３．０８（それぞれグループＨ及びＨ’、ｐ＜０．００５、図８）であった。グループＧ内の寛容化されていないＮＫ１．１枯渇されたマウス及びその脾細胞のレシピエント（グループＧ’）において、炎症性反応及び粘膜潰瘍形成の著しい減少が検出された。グループＧ及びＧ’についての組織学的標点はそれぞれ２．０８及び２であった。グループＩからのＮＫ１．１枯渇されたマウス及びそのリンパ球のレシピエント（グループＩ’）は、重症の結腸炎を明示した。グループＩ及びＩ’内のマウスについての評点はそれぞれ２．９及び２．５であった。グループＫ及びＬは、ＴＮＢＳでの直腸攻撃誘発を受けなかった。
【０２０３】
実施例５
ＮＫ１．１＋リンパ球は、寛容化されたマウスにおいてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を増大させ、実験的結腸炎を有する寛容化されていないマウスにおいてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を減少させた
寛容化されたマウス
寛容化された及びされていないレシピエントマウスの間のＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比の比較は、全ての寛容化されたグループにおいて高い比率を明らかにした。グループＪ’からの寛容化されたレシピエントマウスは、グループＨ’内の寛容化されていないマウスと比較して有意に高い比率を示した。ＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比はそれぞれ２．１６と０．５５であった（ｐ＜０．００５）。
【０２０４】
寛容化されたマウスからのリンパ球の養子免疫伝達は、レシピエントマウス内でＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を増大させた。フローサイトメトリ分析は、ＮＫ１．１枯渇されたＣＥＰ給餌を受けたドナーマウスからの脾細胞の養子免疫伝達が、寛容化され枯渇されていないマウスから収獲された脾細胞に比べてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を減少させるということを示した（それぞれグループＩ’及びＪ’について０．５８対２．１６、ｐ＜０．００５、図９）。
【０２０５】
寛容化されていないマウス
寛容化されていないリンパ球の養子免疫伝達は、レシピエントマウスにおいてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を減少させた。寛容化されたグループとは対照的に、ＮＫ１．１枯渇は、実験的結腸炎を有する寛容化されていないマウスに対して反対の効果を有していた。フローサイトメトリ分析は、ＮＫ１．１枯渇された寛容化されていないドナーマウスからの脾細胞の養子免疫伝達が、寛容化されていないＮＫ１．１枯渇されていないマウスからの脾細胞と比べてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を増加させたことを示した（それぞれ、グループＧ’及びＨ’において１．７対０．５５、ｐ＜０．００５、図９及び表４）。図１０は、寛容化されたＮＫ１．１枯渇されていない及び枯渇されたドナーのレシピエントから、及び寛容化されていないＮＫ１．１枯渇されていない及び枯渇されたドナーから（グループＧ’−Ｊ’）の単離済みリンパ球上のＩＬ４及びＩＦＮγの発現の代表的結果を示している。
【０２０６】
【表４】
2007533633.tif 000005
【０２０７】
対照リンパ球からの養子免疫伝達
フローサイトメトリ分析は、対照のＮＫ１．１枯渇されているマウスからの脾細胞の養子免疫伝達が、ＮＫ１．１枯渇されていないドナーマウスに比べてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を増加させることを示した（それぞれグループＫ’及びＬ’、１．１３対０．６９、ｐ＜０．００５）。
【０２０８】
実施例６
ＮＫ１．１による肝臓リンパ球細胞毒性
これらの研究では、１００：１、５０：１溶解及び１０：１のＥ：Ｔ比で標的細胞としてＹＡＣ−１細胞を使用した。ＮＫ１．１枯渇された及び枯渇されていない寛容化された及び寛容化されていないマウスのレシピエントから単離した肝臓リンパ球を用いて、研究を実施した。寛容化されずＮＫ１．１枯渇されていないマウス（グループＨ’）からのレシピエントは、その他のグループ（１２．３７％の細胞毒性）に比べて溶解をほぼ全く示さなかった（１００：１のＥ：Ｔ、図１１）。グループＧ’内の寛容化されておらずＮＫ１．１枯渇されたマウスからのレシピエントは、グループＨ’に比べ高い溶解を示した（それぞれ２０．４％対１２．３７％の細胞毒性）。グループＩ’からのＮＫ１．１枯渇されＣＥＰ給餌を受けたマウスからのレシピエントは、グループＪ’内のＮＫ１．１枯渇されていないマウスよりも低い溶解を示した（それぞれ４２．５８％対４６．９８％の細胞毒性）。対照グループからのレシピエントは、それぞれ、グループＬ’と比べてグループＫ’内のマウスについて、２３．１％対２２．４７％の細胞毒性を有していた（ｐ＜０．００５、図１１）。
【０２０９】
サイトカイン検定
両方のトリプリケートセットから上清流体を収集し、全ての寛容化された及びされていないグループからの全てのマウスについてサイトカインレベルを測定した。「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡによってＩＬ４、ＩＬ１０及びＩＦＮγレベルを測定した。寛容化されたマウスは、Ｔｈ１からＴｈ２までの免疫応答サイトカイン分泌のシフトを明示した。これらのマウス（グループＨ）は、ＩＬ４、ＩＬ１０レベルの増加及びＩＦＮγレベルの減少を明示した。これとは対照的に、寛容化されていないグループ（グループＧ、Ｊ、Ｋ）からのマウスは高いＩＦＮγ及び低いＩＬ１０レベルを示した。グループＨ内の寛容化されたマウスから収獲したリンパ球は、寛容化されたグループＫ内のＮＫ１．１枯渇されたマウスと比べて、有意に高いＩＬ４、ＩＬ１０及び低いＩＦＮγレベルを明らかにした（それぞれ１８．４±３．７、２３．１±２．９及び５．１±０．４対２．９±０．６、０．８±０．１及び１９．８±３．８、図１２）。これとは対照的に、ＮＫ１．１枯渇は、抗原の不在下でグループＧ及びＪからの寛容化されていないマウスにおいて、ＩＦＮγレベルの増加及びＩＬ４、ＩＬ１０レベルの減少を誘発した（それぞれ２４．３±３．７、３．１±０．９及び４．６±０．４対１８．３±１．１、３．２±０．１及び２．１±０．４、図１２）。
【０２１０】
実施例７
ＮＫＴリンパ球のｅｘ  ｖｉｖｏ免疫プログラミング
先行する実施例で示されているように、マウス抽出された結腸炎由来のタンパク質の給餌による経口寛容の誘発は、寛容化されていないマウスと比べて、結腸炎の異なる症候（結腸炎の巨視的等級づけ、重症の下痢、炎症性応答及び粘膜潰瘍形成）を有意に緩和した。
【０２１１】
従って、本発明者は、細胞特にＮＫ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ教育が、いかなる経口寛容処置も受けていない誘発された結腸炎を患う動物における異なる結腸炎の症候を改善しうるか否かを調べることによって、ＮＫＴ細胞のインビトロ／ｅｘ  ｖｉｖｏ免疫プログラミングの可能性を判定する目的で、以下の実験を実施した。
【０２１２】
８つの異なる組合せの異なる細胞サブグループ（表５に列挙した通りのＣＤ４、ＣＤ８、脾細胞及び樹状細胞）を、以下の６つの実験的グループの各々から調製した：
１．  結腸炎無し及び処置（経口寛容化）無しの対照動物から収獲された細胞。これらの細胞を、ＢＳＡと共にｅｘ  ｖｉｖｏでインキュベートした。
２．  結腸炎を有し処置（経口寛容化）無しの対照動物から収獲された細胞。これらの細胞を、ＢＳＡと共にｅｘ  ｖｉｖｏでインキュベートした。
３．  結腸炎を有し経口寛容化を介した処置を受けた動物から収獲された細胞。細胞をＢＳＡと共にインビトロでインキュベートした。
４．  結腸炎無し及び処置（経口寛容化）無しの対照動物から収獲された細胞。これらの細胞を、ＣＥＰと共にｅｘ  ｖｉｖｏでインキュベートした。
５．  結腸炎を有し処置（経口寛容化）無しの対照動物から収獲された細胞。細胞を、ＣＥＰと共にｅｘ  ｖｉｖｏでインキュベートした。
６．  結腸炎を有し経口寛容化を介した処置を受けた動物から収獲された細胞。細胞を、ＣＥＰと共にｅｘ  ｖｉｖｏでインキュベートした。
【０２１３】
【表５】
2007533633.tif 000006
【０２１４】
実験グループ１、２及び３由来の細胞が、ＢＳＡの存在下でインビトロでインキュベートされ、従って対照として役立ち、一方実験グループ４、５及び６の細胞が抗原（ＣＥＰ）の存在下でインビトロでインキュベートされ、従ってテストグループとして役立ったという点に留意されたい。ｅｘ  ｖｉｖｏ教育を、異なる処置済み細胞による（ＩＦＮγの分泌と比べた）ＩＬ１０の分泌を測定することによって検査した。
【０２１５】
処置（経口寛容化）を受けていないもののＣＥＰの存在下でインビトロでインキュベートされた結腸炎を患う動物（サブグループ５Ａ”〜５Ｈ”）から調製された異なる細胞型又は細胞組合せ（サブグループＡ”〜Ｈ”）か、抗原とのインキュベーションによるｅｘ  ｖｉｖｏ教育の実現可能性を示す主要なテスト対象グループであることがわかるはずである。表６に示されているように、疾病関連抗原（サブグループＥ”５）の存在下でＮＫ１．１＋Ｔ細胞を培養することは、ＩＬ１０分泌の増加によって明示されるような寛容化された細胞のものと類似したサイトカインパターンを導く。
【０２１６】
ＣＤ４細胞及び抗原（サブグループＡ”５）の培養について、類似のパターンが観察された。これらの結果は、疾病に結びつけられる抗原に対し細胞を暴露することによるｅｘ  ｖｉｖｏ教育の成功を示している。しかしながら、抗原によるＮＫＴ教育がＣＤ４、ＣＤ８又はＤＣ（それぞれＦ”５、Ｇ”５及びＨ”５）の添加によって妨げられたことから、抗原の存在下で２つ以上の細胞型を組合せることは、この望ましい効果を低減させた。
【０２１７】
疾病に結びつけられる抗原とのインキュベーションによるＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ教育の実現可能性に加えて、発明人らは、ＩＬ１０上昇した分泌によって反映されるように、その他の細胞型とのＮＫＴ細胞の同時培養が所望のｅｘ  ｖｉｖｏ教育を結果としてもたらし得るか否かを調べた。表６に示されているように、寛容化されたマウスから得られたＣＤ４又はＣＤ８細胞とＮＫＴ細胞の組合せのみが、ＩＬ１０上昇した分泌を結果としてもたらした（それぞれサブグループＦ３及びＧ３）。抗原に対するｅｘ  ｖｉｖｏ暴露と組合せて、寛容化されたマウスから得られたＣＤ４細胞とＮＫＴ細胞は、類似の効果を有し（サブグループＦ６）、一方抗原の存在は、寛容化されたマウスからのＮＫＴＣＤ８、組合せが検査された時点で（サブグループＧ６）ＩＬ１０の分泌を有意に低減させた。
【０２１８】
しかしながら、樹状細胞とＮＫＴ細胞の同時培養は、検査したいずれの組合せ（サブグループＨ３〜Ｈ６）においてもＩＬ１０分泌を誘発できなかった。
【０２１９】
【表６】
2007533633.tif 000007
【０２２０】
【表７】
2007533633.tif 000008
【０２２１】
【表８】
2007533633.tif 000009
【０２２２】
本発明の実施例は、Ｔｈ２特異的記憶細胞が伝達されたと仮定されることから、実験未使用のマウス内への寛容化された脾細胞の養子免疫伝達が寛容を誘発する、ということを示した。これとは対照的に、ＮＫ１．１枯渇されたＣＥＰ給餌マウス由来のリンパ球の養子免疫伝達は、寛容を伝達できず、炎症性Ｔｈ１媒介型応答をアップレギュレートした。ＮＫ１．１＋Ｔ細胞が急速にＩＬ４を産生し、実験的アレルギー性脳脊髄炎及び糖尿病性ＮＯＤマウスモデルにおける自己免疫応答の調節の役割を果たすということが発見された［ベンデラック、Ａ．ら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：５３５〜５６２頁（１９９７年）；サカモト（Ｓａｋａｍｏｔｏ）Ａ．ら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０３（５  ｐｔ  ２）：ｓ４４５〜５１頁（１９９９年）；セキ（Ｓｅｋｉ），Ｓ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：１２１４〜１２２１頁（１９９１年）］。しかしながら、経口寛容誘発の終結時におけるＮＫ１．１Ｔ細胞の枯渇は、サイトカイン分泌の型に影響を及ぼし、寛容化された枯渇されていないＮＫ１．１Ｔ細胞マウスと比較してＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を減少させた。本発明の結果は、ＮＫ１．１Ｔ細胞が、ＩＦＮγ炎性誘発性サイトカイン分泌か又はＩＬ４抗炎症性サイトカイン分泌を介して、免疫応答のＴｈ１／Ｔｈ２プロファイルに影響を及ぼしうるということを示唆している。両方の条件において、そのインパクトは、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞によるものよりもはるかに大きい［チェン（Ｃｈｅｎ）、Ｈ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏ  １５９：２２４０〜２２４９頁（１９９７年）］。
【０２２３】
その上、本発明者らは、さらに、ＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ教育が実現可能であることを示した。疾病標的抗原に対しインビトロでＮＫＴ細胞を暴露することで抗炎症性ＩＬ１０分泌パターンに向かってのこれらの細胞の教育が可能となった。
【０２２４】
結論としては、ＮＫ１．１＋リンパ球は、免疫変調において及び免疫原性又は寛容原性の方向で免疫応答の切換えにおいて、２重の役割を果たしている。それらが活性化された状態となる環境、異なる刺激タイプ又はシグナリングレセプタが、それらの機能を決定し得る。全く異なる免疫調節機序に関与するＮＫ１．１＋Ｔ細胞は、免疫介在性障害におけるＴｈ１／Ｔｈ２パラダイム及びエフェクタ細胞の型を変調させる。
【０２２５】
結論としては、ＮＫ１．１＋リンパ球は、免疫変調において及び免疫原性又は寛容原性の方向で免疫応答の切換えにおいて、２重の役割を果たしている。それらが活性化された状態となる環境、異なる刺激のタイプ又はシグナリングレセプタが、それらの機能を判定し得る。全く異なる免疫調節機序に関与するＮＫ１．１＋Ｔ細胞は、免疫介在性障害におけるＴｈ１／Ｔｈ２パラダイム及びエフェクタ細胞の型を変調させる。
【０２２６】
ＩＩ．
材料と方法
動物
雌の免疫コンピテント（異型接合）胸膜欠損Ｂａｌｂ／ｃマウスをジャクソンラボラトリ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）バーハーバー、メイン州から購入した。全ての動物を滅菌したケージ内で層流フード内に保ち、照射済みの食料及び無菌酸性化水を与えた。動物実験を、Ｈｅｂｒｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓの指針及び委員会の承認に従って実施した。
【０２２７】
細胞培養
可欠アミノ酸及び１０％の熱不活性化済みウシ胎児血清で補足された培地の中で、単層としての培養で、ヒト肝臓癌細胞系Ｈｅｐ−３Ｂを分泌するＨＢｓＡｇを成長させた。
【０２２８】
胸膜欠損マウス内の腫瘍及び脾細胞の移植
胸膜欠損マウスを、亜致死線量照射（６００ｃＧｙ）で条件づけした。照射から２４時間後に、マウスに、１０７個のヒト肝臓癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞を右肩に皮下注射した。照射から３日後、ドナー免疫コンピテントマウスから脾細胞を収獲した。レシピエント胸膜欠損マウスには、１×１０７細胞／マウスの割合でドナー脾臓細胞を静脈内注射し、レシピエント内にコンピテントな免疫系を確立した。次に抗原パルスしたＮＫＴ細胞をマウスに注射した。
【０２２９】
リンパ球の単離及びＮＫＴ細胞の分離
ドナー免疫コンピテントＢａｌｂ／Ｃマウスから収獲した脾臓から、脾細胞を調製した。脾臓から結合組織を除去した後、脾臓を１０ｍｌ入り皿の低温滅菌ＰＢＳ中に入れ、ステンレス鋼メッシュ（サイズ６０、シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州）を通して圧壊した。リンパ球の単離のためには、５０ｍｌ入り管の中で、ＰＢＳ７ｍｌ中に懸濁させられた細胞の下側に、ヒストパーク１０７７  ２０ｍｌ（シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州）を置いた。界面にある細胞を収集し、５０ｍｌ入り管内で希釈し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した（１０分間１２５０ｒｐｍ）。約１×１０８個の細胞／マウスを回収した。特異的抗ＮＫマイクロビーズ（ミルテニルバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ドイツ）と共に磁気細胞選択（ＭＡＣＳ）を用いてＮＫＴ細胞分離を行なった。
【０２３０】
パルスによるＮＫＴ細胞教育
腫瘍又はウイルス関連抗原でｅｘ  ｖｉｖｏパルスすることでＮＫＴ細胞を教育した。０．５ｍｌのＰＢＳ中の１×１０６個のＮＫＴ細胞をフラスコ中に設置し、７２時間、ＨＣＣ溶解物（３μｇ／ｍｌ）、Ｈｅｐ３Ｂ細胞又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。
【０２３１】
ＮＫＴ細胞の養子免疫伝達
免疫コンピテンスの回復後７日後に養子免疫伝達を実施した。これは、ＨＣＣ溶解物、Ｈｅｐ３Ｂ細胞又はＢＳＡに対しインビトロで暴露されたＮＫＴ細胞の静脈内注射によって実施された。
【０２３２】
ｅｘ  ｖｉｖｏ免疫変調済み調節ＮＫＴリンパ球の養子免疫伝達の効果の評価
ｅｘ  ｖｉｖｏ教育済みＮＫＴリンパ球の養子免疫伝達の効果を、以下のパラメータを監視することによって評価した。
【０２３３】
腫瘍成長の追跡調査
６週間２週間隔でレシピエントマウスを追跡調査した。生存率、体重及び腫瘍体積（カリパスを用いて）を査定した。苦痛の徴候を示したマウス及び過度に体重低下（測定間で１０％超又は初期体重の２５％超）したマウスを屠殺した。
【０２３４】
サイトカイン分泌
４週目の間、全てのグループ内のマウスから血液を採取し、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。ジェンザイムダイアグノステックスキッツ（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｋｉｔｓ）（ジェンザイムダイアグノスティックス（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、マサチューセッツ州、米国）を用いて「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにより血清サイトカインレベルを測定した。
【０２３５】
肝臓及び脾臓リンパ球の単離及びＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＮＫＴ細胞のフローサイトメトリ判定
肝臓及び脾臓由来のリンパ球の単離を上述の通りに実施し、Ｆａｌｃｏｎ２０５２管の中に２×１０４細胞／５００μｌＰＢＳのトリプリケートを置いた。細胞を、１：２０のＦＩＴＣ抗マウスＮＫ１．１抗体［ＮＫＲ−Ｐ１Ｃ、ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、米国］を伴う１０μｌのウシ胎児血清（ＦＣＳ）中に再懸濁させ、３０分間１０分毎に混合した。１％のＢＳＡ中で細胞を２回洗浄し、読取りまで４℃中に保った。螢光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳｔａｒｐｌｕｓ、ベクトンディッキンソン、カリフォルニア州）を用いて各グループからの１×１０４個の細胞について分析的細胞選別を実施した。生きた細胞のみを計数し、抗原処置されていないリンパ球からの背景螢光を、得られたレベルから差し引いた。データをコンソート（Ｃｏｎｓｏｒｔ）３０、２色輪郭プロットプログラム（ベクトンディッキンソン、カリフォルニア州）で分析した。
【０２３６】
ＳＴＡＴ１−６用のウエスタンブロット分析
ＳＴＡＴタンパク質発現の判定のため、全てのグループ中のマウスから脾細胞を得た。モーター駆動式テフロン（登録商標）乳棒が備わったガラスホモジナイザを用いて０．２５Ｍのスクロース／１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中で組織ホモジェネート（２００ｍｇ／ｍｌ）を調製した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（７．５％）ゲル上での電気泳動により、タンパク質（１００μｇ／レーン）を分解し、ニトロセルロース膜に対し電気ブロットした。ＳＴＡＴタンパク質を検出するために、異なるＳＴＡＴタンパク質に導かれたポリクローナルウサギ抗マウス抗体そしてそれに続いてアルカリホスファターゼでカップリングされたヤギ抗ウサギＩｇＧ（ベッチルラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂ．）、モンゴメリ、テキサス州）を用いて、膜をプローブ探査した。
【０２３７】
実施例１
ｅｘ  ｖｉｖｏ免疫変調済み調節ＮＫＴリンパ球の養子免疫伝達の効果
教育済みＮＫＴ細胞の養子免疫伝達のインビボ抗腫瘍効果を評価するために、各々１０匹の動物から成る胸膜欠損Ｂａｌｂ／Ｃマウスの４つのグループ（グループＡ−Ｄ）を研究した（表１）。全てのマウスを亜致死線量照射し、ヒトＨｅｐ３ＢＨＣＣを移植した。免疫コンピテントＢａｌｂ／Ｃマウスから調製したＮＫＴ細胞を、ＨＣＣ由来の抗原（ＨＣＣ溶解物）、Ｈｅｐ３Ｂ細胞及びＢＳＡを用いてｅｘ  ｖｉｖｏでパルスした。その後、１×１０６個の教育済みＮＫＴ細胞を養子免疫伝達により各ＨＣＣ包含マウスの体内に注射した。グループＡは、ＨＣＣ溶解物でパルスしたＮＫＴ細胞を受け；グループＢは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞でパルスしたＮＫＴ細胞を受け；グループＣはＢＳＡでパルスしたＮＫＴ細胞を受け；グループＤはＮＫＴ移植を受けなかった。
【０２３８】
【表９】
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【０２３９】
抗腫瘍効果の機序を判定するために、ＮＫＴ、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーについてＦＡＣＳにより脾臓内リンパ球集団を分析した。腫瘍サイズ及び重量、血清サイトカインレベル及び脾細胞ＳＴＡＴ１−６タンパク質発現も同様に査定された。
【０２４０】
結果
ＨＣＣ由来の抗原でパルスされたＮＫＴ細胞（グループＡ）の養子免疫伝達は、結果として、４週間以内で腫瘍を完全に消滅させ、体重減少を弱めた（６．５％）。これとは対照的に、グループＢ、グループＣ及びグループＤ内のマウスは、大きい壊死腫瘍及び重大な体重減少（グループＢ、グループＣ及びグループＤ内でそれぞれ２１％、１７％及び２３％の体重減少、ｐ＜０．０５）を発生させた；従って、生存率を査定することができなかった。
【０２４１】
グループＡ内で、ＮＫＴ／ＣＤ４及びＣＤ８／ＣＤ４比が有意に増大した（ＮＫＴ／ＣＤ４比についてグループＢ、グループＣ及びグループＤ内でそれぞれ１２．３対６．４、４．８及び５．６、ｐ＜０．０５）。グループＡ内で、転写因子ＳＴＡＴ４の発現が有意に増大したが、グループＢ−Ｄでは増大しなかった。ＩＦＮγの血清レベルは、グループＢ、Ｃ及びＤ（それぞれ３．２４、１．７７及び１．３８倍、ｐ＜０．０５）に比べてグループＡ内で増大させられた。
【０２４２】
ＨＣＣ由来の抗原を用いてｅｘ  ｖｉｖｏでパルスされたＮＫＴリンパ球の養子免疫伝達は、マウスＨＣＣの抑制を導く。ＮＫＴ媒介型抗腫瘍活性は、抗腫瘍ＮＫＴ及びＣＤ８リンパ球の数の増加、ＩＬ−２活性についてのマーカーであるＳＴＡＴ４の発現の増加、及び血清炎性誘発性サイトカインレベルの上昇によって明示されるＴｈ１免疫の増強と結びつけられた。ＮＫＴリンパ球のｅｘ  ｖｉｖｏ変調は、ＨＣＣのための免疫療法の新しい様式として期待できる。
【０２４３】
ＩＩＩ．
材料と方法
試薬
コンカナバリンＡをウォーシントンバイオケミカル（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国から購入した。
【０２４４】
抗ＨＢＶワクチン（Ｂｉｏ  Ｈｅｐ  Ｂ）をバイオテクノロジカルジェネラル（Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国から購入した。
【０２４５】
動物
実験用プロトコルは、Ａｎｉｍａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｃｏｍｍｉｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ  Ｈｅｂｒｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌにより承認された。ハーラン（Ｈａｒｌａｎ）研究所から、生後１０週間の雄レプチン欠乏Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びその脂肪の少ない同腹子（＋／？）を購入した。ハダサ・ヘブライ大学医学部の動物コアで動物達を恒温で収納した。マウスを規則的な１２時間の明暗サイクルに保ち、標準的なマウス食を給餌し、びんから水道水を入手することができた。隔日にマウスを計量し、食物摂取を記録した。実験の終了時に、イソフルラン麻酔下での頸部断頭によりマウスを屠殺した。
【０２４６】
経口抗原の調製及び投与
肝臓を関係するマウスから取り出し、小片にカットし、機械で均質化した。４０ｍｍのナイロン細胞ストレーナを通したろ過の後、無傷の細胞をスピンダウンし、取出した。タンパク質検定キット（バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）、ミュンヘン、ドイツ）を使用してタンパク質を定量し、３０日間隔日に（合計１５用量）、給餌用無外傷性針を用いて以下に記述する実験グループの体内に導入した。
【０２４７】
トランスアミナーゼ及びトリグリセリドの測定
自動型手順を用いて血清ＡＬＴ及びＡＳＴ血漿活性を測定した。ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）トリグリセリトＧＰＯ−ＲＡＰ酵素試行キットを用いて、血清２２０ｃｃ血液試料を処理した。試料のトリグリセリドレベルを、５５０ｎｍの波長を用いてＣｏｂａｓ  ＤＰ−２５分光光度計で測定した。
【０２４８】
グルコース寛容測定
グルコース寛容の測定のためには、マウスは、体重１キログラムあたり１グラムの量でグルコースの給餌を受けた。経口給餌の後、時点０でそして次に１５分毎に合計３時間イソフルラン麻酔の下で尾から血液を採取した。エリート（Ｅｌｉｔｅ）グルコース試験片及びグルコメータでグルコースレベルを測定した。
【０２４９】
脾臓及び肝臓リンパ球単離
以前に記述された通りに脾細胞を単離し、赤血球を取り出した［ビカーリ、Ａ．Ｐ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １７（２）：７１頁（１９９６年）］。幾分かの修正を加えて、以前に記述された通りに肝内リンパ球を研究の終りで全てのマウスグループから単離した［ビカーリら、（１９９６年）上掲書；ブライシャー、Ｐ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：６７９〜６８２頁（１９９０年）］。横隔膜より上で下大動脈をカットし、青くなるまで肝臓を低温ＰＢＳ５ｍｌで洗い流した。結合組織と胆のうを除去し、肝臓を１０ｍｌ入りの皿の中で低温無菌ＰＢＳ内に置いた。肝臓と脾臓をステンレスメッシュを通してつぶした（サイズ６０、シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州）。３分間５０ｍｌ入りの管の中に細胞懸濁液を入れ、低温ＰＢＳ中（１０分間１，２５０×ｒｐｍ）で２回洗浄し、デブリを除去した。細胞をＰＢＳ中で再懸濁させ、細胞懸濁液を予めＰＢＳ中に浸漬したナイロンメッシュを通して入れ、未結合の細胞を収集した。細胞を４５ｍｌのＰＢＳ中で２回（室温で１，２５０×ｒｐｍ）洗浄した。肝臓及び脾臓リンパ球の単離のために、５０ｍｌ入り管内でＰＢＳ７ｍｌ中に懸濁させられた細胞の下に２０ｍｌのヒストパーク１０７７（シグマダイアグノスティクス、セントルイス、ミズーリ州）をゆっくりと入れた。管を１，６４０ｒｐｍで室温にて１５分間遠心分離した。界面にある細胞を収集し、５０ｍｌ入りの管内に希釈し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した（１０分間１，２５０ｒｐｍ）。マウス１匹につきおよそ１×１０６個の細胞を回収した。トリパンブルー染色による生存可能性は、９５％を上回っていた。脾細胞及び肝臓関連リンパ球の両方を、全実験グループ中の全ての動物から単離した。
【０２５０】
リンパ球の養子免疫伝達
関係するグループ全てのドナーマウスを養子免疫伝達実験の一日目に屠殺し、脾臓に由来するリンパ球の単一懸濁液を、記述されている通り［ウィナー、Ｈ．ら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：８０９〜８３７頁（１９９４年）］に調製した。移植の前にＰＢＳ中に細胞を再懸濁させた。全てのグループからの脾臓リンパ球を、先行する照射無しで、実験未使用のレシピエント内に移植した。
【０２５１】
サイトカイン測定
１．  血清サイトカイン：全ての寛容された及び寛容されないグループからの全てのマウスについて、サイトカインレベルを測定した。メーカーの指示事項に従って、ジェンザイムダイアグノステックスキッツ（ジェンザイムダイアグノスティックス、マサチューセッツ州、米国）を用いて「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡによりＩＦＮγ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ、ＩＬ４、ＩＬ６及びＩＬ１０レベルを測定した。
２．  脾臓サイトカイン：上述の通り１００万個／ｍｌの脾細胞を収集した。その後、Ｅｌｉｓｐｏｔ方法（ダイアクローンリサーチ（Ｄｉａｃｌｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国）を用いて、ＩＦＮγ及びＩＬ１０レベルを計算した。
【０２５２】
ＮＫＴ１．１リンパ球集団の判定のためのフローサイトメトリ分析
リンパ球単離の直後に、２〜５×１０４細胞／５００μｌＰＢＳのトリプリケートを、Ｆａｌｃｏｎ２０５２管内に入れ、１０分間１％のＢＳＡ４ｍｌでインキュベートし、５分間１４００ｒｐｍで遠心分離した。１：２０のＦＩＴＣ−抗マウスＮＫ１．１抗体（ＮＫＲ−Ｐ１Ｃ、ファーミンジェン、米国）と共に１０μｌのＦＣＳ中で細胞を再懸濁させ、３０分間１０分毎に混合した。１％のＢＳＡ中で２回細胞を洗浄し、読取りまで４℃に保った。対照グループについては、５μｌの１％ＢＳＡのみを添加した。螢光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳＴＡＲ  ｐｌｕｓ、ベクトンディッキンソン）を用いて各々のグループから１×１０４個の細胞について分析的細胞選別を実施した。生きた細胞のみを計数し、抗原処置されていないリンパ球からの背景螢光を、得られたレベルから差し引いた。ゲートを前方散乱及び側方散乱上にセットして、死滅細胞及び赤血球を排除した。データをコンソート３０  ２色輪郭プロットプログラム（ベクトンディッキンソン、オクスナード、カリフォルニア州）又はセルクエストプログラムで分析した。
【０２５３】
Ｓｔａｔウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析キットを用いてＳｔａｔ１、３、４、６レベルを推定した。
【０２５４】
脂肪含有量の肝臓ＭＲＩ測定
マウスの肝臓中の脂肪の査定／定量化のため、単一回の捕捉で、同相（ｉｎ−ｐｈａｓｅ）及び対向相（ｏｐｐｏｓｅｄ−ｐｈａｓｅ）画像を提供する２重エコー化学シフト勾配−エコー磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）シーケンスの技術を用いて、肝脂肪含有量を測定した。Ｔ１−加重対向相ＭＲＩ技術は、組織内の脂肪の比較的小さな割合の検出に関し感度が高い。全てのＭＲＩは、１．５−Ｔシステム（シグナ（Ｓｉｇｎａ）ＬＸ；ＧＥ、ミルウウォーキ州、米国）で実施された。２重エコーＭＲ映像法を、１２５ｍｓｅｃの繰返し時間（ＴＲ）、４及び６．５ｍｓｅｃの２重エコー時間（ＴＥｓ）及び８０°のフリップ角度で実施した。画像形成パラメータには、３ｍｍの切片厚み、１３ｃｍの視野、２５６＊１６０のマトリクス、そして膝コイルを用いて１つの信号の捕捉が含まれていた。交差点ギャップ無く切片厚み３ｍｍで肝臓のレベルで横方向（軸方向）及び冠状画像が捕捉された。以前の報告書で記述されている通り［ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）ＤＧ  ら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ  ２６：１０４１〜１０５２頁（１９９１年）；トモヒロ（Ｔｏｍｏｈｉｒｏ）Ｎ．ら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２１８：６４２〜６４６頁（２００１年）］同相及び対向相の画像間のＳＩ変化の信号強度（ＳＩ）測定の定量的査定を計算した。ＳＩインデックスは、以下の式から計算した：ＳＩインデックス＝（ＳＩｉｐ−Ｓｉｏｐ）／ＳＩｉｐ、（式中、ＳＩｉｐは同相画像上のＳＩであり、ＳＩｏｐは、対向相画像上のＳＩである。ＳＩインデックスは、同相画像上のＳＩと比較した対向相画像上のＳＩ損失の分数を反映している。
【０２５５】
肝臓組織学検査
各々のマウスについて、１０％の緩衝ホルムアルデヒドの中で単一の肝臓セグメントを定着させ、組織学的分析のためパラフィン内に包埋した。切片（μｍ）を、ヘマトキシリン／エオシンで染色し、組織学的評点を実施した。
【０２５６】
統計学的分析
データは、平均±ＳＥＭとして表現されている。上述のパラメータに関する異なるグループ間の統計学的有意性は、対応のないスチューデントｔ検定を用いて計算された。０．０５未満のｐ値は、統計的に有意な差を表わすものとみなされた。
【０２５７】
実施例１
グルコース寛容に対するＮＫＴ１．１リンパ球養子免疫伝達の効果
ｏｂ／ｏｂＮＡＳＨモデル中で観察された代謝及び肝臓の機能の乱れにおけるＮＫＴ１．１リンパ球の役割を査定するために、表１に示されている通りに、マウスを５つのグループへと分割した。実験１２日目に、上述のように全てのマウスグループ内で耐糖能試験を実施した。
【０２５８】
【表１０】
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【０２５９】
本発明人らの先行実験において示されているように、免疫学的操作（グループＣ）に付されなかったｏｂ／ｏｂマウスは、グルコール寛容試験でひどく混乱を受けた（表２、及び図１参照）。同様にして、規則的ｏｂ／ｏｂ脾細胞で養子免疫伝達を受けるｏｂ／ｏｂマウスは、耐糖能試験全体を通して有意に上昇したグルコースレベルを有していた。
【０２６０】
【表１１】
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【０２６１】
対照的に、野生型（グループＡ）又はｏｂ／ｏｂ（グループＢ）ＮＫＴ１．１リンパ球のいずれかが注射されたマウスは、グループＤに比べて（最高１２０分の時限まで全ての時限についてｐ＜０．００１）耐糖能試験の著しい改善を特色としていた。実際、耐糖能試験中のｏｂ／ｏｂグループの各々とその脂肪の少ない同腹子の間のグルコースレベルの差は、統計的に異なるものではなかった（耐糖能試験全体を通してＰ値は０．２０〜０．６３の間の範囲内にある）。野生型脾細胞が移植されたグループＣのマウスのグルコースレベルは、グループＤ及びグループＥマウスの有意に高いレベルとグループＡ及びグループＢマウスの事実上正常なレベルの中間であった。
【０２６２】
これらの結果は、ｏｂ／ｏｂＮＫＴ１．１リンパ球の数の減少及び／又は機能の混乱が、ｏｂ／ｏｂマウスにおけるグルコース寛容の発達の中で主要な役割を果たす、ということを示唆している。野生型又はｏｂ／ｏｂＮＫＴリンパ球のいずれかを補充することにより、これらのマウス内のグルコース不寛容を矯正することができる。
【０２６３】
実施例２
肝脂肪含有量に対するＮＫＴ１．１リンパ球の養子免疫伝達効果
肝臓脂肪症のレベルに対するＮＫＴ１．１リンパ球の養子免疫伝達の効果を査定するために、実験の終りにおいて、全てのグループのマウス（表３参照）は腹部ＭＲＩを受け、肝脂肪含有量を上述の方法に従って推定し、ＳＩインデックスとして提示した。
【０２６４】
【表１２】
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【０２６５】
野生型（グループＡ）及びｏｂ／ｏｂ（グループＢ）のＮＫＴ１．１リンパ球の養子免疫伝達を受けるマウスは両方共、図２ａ及び２ｂに示されているように、ＭＲＩによる肝脂肪含有量のレベル低下を示した。養子免疫伝達とＭＲＩ記録の間の経過時間は短かいものにすぎなかった（１２日間）が、これらの差は、統計的有意性（それぞれＰ＝０．０６３、Ｐ＝０．００８）に近づいていた。このことは、ＮＫＴ１．１リンパ球の枯渇又は機能不良がｏｂ／ｏｂモデル内の非アルコール系脂肪性肝炎の病因に関与していること、そしてその補充が肝臓脂肪症を矯正し得ることを示唆している。
【０２６６】
実施例３
コンカナバリン−Ａ肝炎に対する罹病性に対するＮＫＴ１．１リンパ球の養子免疫伝達の効果
Ｃｏｎ−Ａで誘発された肝炎に対するｏｂ／ｏｂマウスのこれまでに既知の耐性に対するＮＫＴ１．１リンパ球の役割を査定する目的で、全てのグループのマウス（表４）は、実験の１２日目に、その尻尾の１本の静脈内に、合計体積を０．１ｃｃとして発熱物質無しの食塩水の中に溶解された２００μｇのＣｏｎ−Ａの静脈内注射を受けた。２４時間後、全てのマウスを屠殺し、血清トランスアミナーゼレベル及び肝臓炎症の組織学的度合を判定した。図４及び図３ａ及び３ｂに示されているように、グループＤ及びグループＥのマウスは、Ｃｏｎ−Ａ攻撃誘発に応答したその基線レベルに比べて穏やかな肝臓トランスアミナーゼの上昇しか発生させなかった（ＡＳＴ、その基線レベルのそれぞれ１．４８及び１．４０倍、及びＡＬＴ、その基線レベルのそれぞれ１．５２及び１．７９倍）。これとは対照的に、グループＡ及びＢは、ＣｏｎＡに応答して、ＡＳＴ（その基線レベルの３．６及び２．４４倍）及びＡＬＴ（その基線レベルの５．２及び３．４６倍）の両方において有意な上昇を発生させた。野生型脾細胞の移植を受けたグループＣのマウスは、グループＡ及びグループＢのものとグループＤとグループＥのものの中間で肝臓トランスアミナーゼの控めな上昇を特色としていた。この実験の結果は、ＮＫＴリンパ球の養子免疫伝達が、場合によってＣｏｎ−Ａ肝炎に関与するＣＤ４リンパ球の活性化によって、ｏｂ／ｏｂマウスをよりＣｏｎ−Ａ肝炎にかかりやすいものにする可能性があるということを示唆している。
【０２６７】
【表１３】
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【０２６８】
実施例４
グルコース寛容に対する経口免疫調節（肝臓抽出物給餌による）の効果
ＮＡＳＨモデルのさまざまな代謝及び免疫学的成分に対する経口免疫調節の効果を評価するために、マウスを表５に記されているように各々１４のマウスから成る６つのグループへと分割した。隔日に、各グループに、マウス１匹につき５０μｇのｏｂ／ｏｐ肝臓抽出物、５０μｇの正規同腹子肝臓抽出物又は５０μｇのウシ血清アルブミンのいずれかを与えた。
【０２６９】
【表１４】
2007533633.tif 000015
【０２７０】
３０日目に、全ての肝臓抽出物の給餌（合計１５回の給餌）が終結した。５９日目に、以上で記述されているように、全てのマウスに対して耐糖能試験を実施した。予想された通り、ｏｂ／ｏｂマウスの全てのグループは、その脂肪の少ない同腹子グループ（ｐ＜０．００１、表６）に比べ、グルコース食の後血中のグルコースレベルを有意に上昇させた。しかしながら、野生型及びｏｂ／ｏｂ肝臓抽出物での食餌を受けたグループＢ及びグループＣのｏｂ／ｏｂマウスはそれぞれ、図４に描かれているように、ＢＳＡでの給餌を受けたグループＣのｏｂ／ｏｂマウス（ｐ＜０．００１）に比べて、経口グルコースに応答して有意に低いグルコースレベルを発生させた。
【０２７１】
このことは、経口免疫調節誘発を通した免疫変調がｏｂ／ｏｂマウスの代謝プロファイルを改変し、そのグルコース寛容の結果を改善し、それらの糖尿病性をより低くする、ということを示唆している。
【０２７２】
【表１５】
2007533633.tif 000016
【０２７３】
実施例５
肝脂肪含有量に対する肝臓抽出物給餌による経口免疫調節誘発の効果
肝脂肪含有量に対する経口免疫調節の効果を判定するために、６つのグループ全てのマウスに、実験５９日目に腹部ＭＲＩを行った（表７）。肝脂肪含有量を、上述の方法を用いて判定し、ＳＩインデックスとして記述した。３匹の野生型マウスは全て、ｏｂ／ｏｂマウスグループよりも有意に低い肝脂肪含有量を特色としてもち（全てのグループでｐ＜０．００１）、肝臓抽出物の給餌の効果は全く指摘されなかった（図２ａ）。野生型及びｏｂ／ｏｂ肝臓抽出物をそれぞれ受けたグループＡ及びグループＢのマウスは、グループＣのマウスに比べて肝脂肪含有量における有意な減少を示した（それぞれにｐ＝０．０３及びｐ＝０．０１９）。図５ａ及び図５ｂにこれらの結果が示されている。
【０２７４】
この耐性は、肝臓抽出物の給餌を通した経口免疫調節誘発が、罹病性の高い哺乳動物の肝臓内のＮＡＳＨ及び脂肪蓄積速度の減少を結果としてもたらすような形で代謝プロファイルを改変するということを示唆している。
【０２７５】
【表１６】
2007533633.tif 000017
【０２７６】
実施例６
コンカナバリン−Ａ肝炎への罹病性に対する肝臓抽出物給餌による経口免疫調節誘発の効果
野生型マウスとは対照的に、ｏｂ／ｏｂ（レプチン欠乏症の脂肪質のマウス）マウスは、以前、コンカナバリン−Ａ誘発型肝炎に対するユニークな耐性を提示することが示されてきた。この耐性は、これらのマウスの体内のＮＫＴ１．１リンパ球集団内の定量的及び定性的改変から判定された。実験６０日目に、Ｃｏｎ−Ａ肝炎への罹病性に対する肝臓抽出物給餌による経口免疫調節誘発の効果を判定するために、イソフルラン麻酔下で全てのマウスの眼窩後方神経叢から血液を採取し、血清トランスアミナーゼレベルを測定した。同じ日に、全てのマウスは、合計体積０．１ｃｃとなるよう発熱物質を含まない食塩水の中で溶解させられた２００μｇのＣｏｎ−Ａをその尾部静脈中の静脈注射で受けた。２４時間後に、全てのマウスを屠殺し、血清トランスアミナーゼレベル及び肝炎症の組織学的度合いを判定した。
【０２７７】
前述した通り、ｏｂ／ｏｂマウスは自発性肝炎を患らっていた（平均ＡＳＴ＝２２７、平均ＡＬＴ＝２０４）が、一方その脂肪の少ない同腹子は患らっていなかった（平均ＡＳＴ＝３７、平均ＡＬＴ＝１０２）。グループＣとグループＦのマウス（ＢＳＡが与えられたｏｂ／ｏｂマウス及びその脂肪の少ない同腹子）は、２００μｇのＣｏｎ−Ａの注射に付され、ｏｂ／ｏｂマウスは、ｏｂ／ｏｂマウスがＣｏｎ−Ａ肝炎に対し比較的耐性があったことを示唆する以前の観察事実と一致して、その脂肪の少ない同腹子（平均ＡＳＴはその基線値の５．９４倍まで増加）に比べ、有意なほど穏やかなＡＳＴ増加（平均ＡＳＴはその基線値の１．８３倍まで増加）を有していた。未知の理由で、ＡＬＴレベルは、ｏｂ／ｏｂ及び脂肪の少ない同腹子グループにおいて匹敵する形で増加した（それぞれその基線値の２．７５及び２．０９８倍）。Ｃｏｎ−Ａの投与に応答した野生型マウス内のトランスアミナーゼ上昇度に対する肝臓抽出物給餌の効果は全く存在しなかった（グループＥ及びグループＦ内でＡＳＴはそれぞれその基線値の５．５６及び６．６７倍まで増加する）。このことは、図６ａ及び図６ｂに示されている。
【０２７８】
これとは対照的に、野生型及びｏｂ／ｏｂ肝臓抽出物での給餌を受けたグループＡ及びグループＢのｏｂ／ｏｂマウスは、ＢＳＡの給餌を受けたｏｂ／ｏｂに比べ、有意にはるかに顕著なＡＳＴの上昇を発生させた（ＡＳＴはそれぞれその基線値の２．７１及び２．８９倍まで増大する）。ＡＬＴは、さらに控めな効果を示した（ＡＬＴは、グループＣでのその正常値の２．７５倍に比べ、グループＡ及びグループＢでそれぞれその基線値の３．１及び３．７２倍まで増大する）。Ｃｏｎ−Ａ肝炎に対する罹病性度のこの差異は、これらのマウスにおいてより顕著なＣＤ４リンパ球媒介型肝損傷に向かってのシフトをひき起こした、グループＡ及びグループＢにおける肝臓抽出物給餌によって誘発される免疫変調に原因がある。
【０２７９】
実施例７
Ｂ型肝炎ワクチン接種に対する応答
外部刺激に対する免疫学的Ｔ細胞媒介型応答に関してｏｂ／ｏｂマウスとその脂肪の少ない同腹子の間に存在する深遠な差異を確認するために、１０匹のｏｂ／ｏｂマウスと１０匹の脂肪の少ない同腹子をＢ型肝炎に対し免疫化した。実験１日目、１４日目、２１日目、２５日目及び３０日目に、全てのマウスに腹腔内で０．４μグラムのｂｉｏ  Ｈｅｐ  Ｂワクチンを注射した。３０日目に、全てのマウスを屠殺し、標準的な機器を用いて抗−ＨＢＳ抗体力価を測定した。その脂肪の少ない同腹子に比べて、ｏｂ／ｏｂマウスは減衰された免疫応答を示し、有意に低い抗ＨＢＳ抗体力価を特色としていた（ｐ＝０．０２７）。このことは表８及び図７に描かれている。このことは、ｏｂ／ｏｂマウスが深く損われたＴ細胞免疫応答を有するという、先行する実験からの印象の正当性を立証しており、このことは、ｏｂ／ｏｂマウス内での上述の代謝的及び免疫学的な現象の発生において主たる役割を果たす可能性がある。肝臓抽出物との経口寛容及びＮＫＴ細胞の養子免疫伝達がこの応答を矯正し得る。
【０２８０】
【表１７】
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【０２８１】
ＩＶ．
材料と方法
ＧＶＨＤにおけるＮＫＴ細胞の推定上の保護的役割を査定するために、ＮＫＴ枯渇された脾細胞の移植を受けたマウスに対する増大する数のＮＫＴリンパ球（０〜４．５×１０６細胞）の養子免疫伝達を実施した。レシピエントマウスを、ＧＶＨＤ関連の肝臓、腸及び皮膚の損傷の組織学的パラメータについて追跡調査した。ＮＫＴ細胞媒介型免疫変調機序及び寛容誘発における肝臓の役割を判定するために、肝内及び脾臓内リンパ球を単離しＦＡＣＳによりＣＤ４＋及びＣＤ８＋亜集団について分析し、血清サイトカインレベルを判定した。
【０２８２】
動物
ドナーマウスは、ジャクソンラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（アンヌハーバー、メイン州）から得た生後１２週間のＣ５７ＢＬ／６の雄であった。レシピエントは（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｂａｌｂ／ｃ）Ｆ１の雌のマウスであった。マウスをハダッシュヘブライ大学医学部の動物コアにおいて１２時間の明暗サイクル中に保った。全ての動物を、正規の実験室食で給餌し、不断吸水させた。全ての動物実験は、Ｈｅｂｒｅｗ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓにより承認された。照射及び脾細胞移植の後、マウスを層流アイソレータ内に維持した。
【０２８３】
リンパ球の単離及びＮＫＴ細胞の分離
ドナーＣ５７ＢＬマウスから収獲した脾臓から、脾細胞を調製した。結合組織を除去した後、脾臓を１０ｍｌ入り皿の低温滅菌ＰＢＳ中に入れ、ステンレスメッシュ（サイズ６０、シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州）を通して圧壊した。リンパ球の単離のためには、５０ｍｌ入り管の中で、ＰＢＳ７ｍｌ中に懸濁させられた細胞の下側に、ヒストパーク１０７７  ２０ｍｌ（シグマダイアグノスティックス、セントルイス、ミズーリ州）を置いた。界面にある細胞を収集し、５０ｍｌ入り管内で希釈し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した（１０分間１２５０ｒｐｍ）。約１×１０８個の細胞／マウスを回収した。特異的抗ＤＸ５マイクロビーズ（ミルテニルバイオテク、ドイツ）と共に磁気細胞選択（ＭＡＣＳ）を用いてＮＫＴ細胞分離を行なった。
【０２８４】
脾細胞の移植
ＧＶＨＤを誘発するため、Ｃ５７ＢＬ／６ドナーマウスからの２×１０７脾臓細胞を（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｂａｌｂ／ｃ）Ｆ１レシピエントマウス内に静脈内注射した。移植前にマウスに６０Ｃｏ全身照射（７Ｇｙ）を行った。
【０２８５】
実験グループ（ｎ＝８マウス／グループ）
ＧＶＨＤにおけるＮＫＴ細胞の推定上の保護的役割を査定するため、増大する数のＮＫＴリンパ球の養子免疫伝達を実施した。グループＡのマウスに全脾細胞を移植し、グループＢのマウスにＮＫＴ枯渇された脾細胞を移植し、グループＣ、グループＤ及びグループＥのマウスには、０．５、２．５及び４．５×１０６個のＮＫＴ細胞を添加したＮＫＴ枯渇脾細胞を移植した。グループＦのマウスは脾細胞移植を受けなかった。
【０２８６】
ＧＶＨＤの組織学的変化の等級付け
皮膚、肝臓及び腸の炎症の度合いを評価するために、組織を全てのグループ内のマウスから採取し、１０％のホルムアルデヒド内に保つ。各マウスからの５つの組織切片をパラフィン内に包埋し、切片化し、標準的手順によりヘマトキシリン−エオシンで染色し、実験条件を知らない経験豊かな病理学者がこれを検査した。
【０２８７】
ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔリンパ球の判定のためのフローサイトメトリ分析
リンパ球単離の直後に、Ｆａｌｃｏｎ２０５２管の中に２〜５×１０６個の細胞／５００μλのＰＢＳのトリプリケートを入れ、１０分間１％のＢＳＡ４ｍｌでインキュベートし、５分間１４００ｒｐｍで遠心分離した。１：２０のＦＩＴＣ−抗マウスＣＤ４及びＣＤ８１抗体（ファーミンゲン、米国）を伴う１０μｌのＦＣＳ中に細胞を再懸濁させ、１０分毎に３０分間混合した。細胞を１％のＢＳＡ中で２回洗浄し、読取るまで４℃内に保った。螢光細胞分析分離装置（ファクスタープラス（ＦＡＣＳＴＡＲ  ｐｌｕｓ、ベクトンディッキンソン）を用いて、各グループからの１×１０４個の細胞上で分析的細胞選別を実施した。生きた細胞だけを計数し、抗体処置されていないリンパ球からの背景螢光を、得られたレベルから差し引いた。前方−側方散乱装置上でゲートをセットして、死んだ細胞及び赤血球を排除した。コンソート３０の２色輪郭プロットプログラム（ベクトン・ディキンソン、オクスナード、カリフォルニア州）又はセルクエスト２５プログラムのいずれかを用いてデータを分析した。
【０２８８】
サイトカインレベルの測定
全てのグループ内のマウスから血液を採取し、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。ジェンザイムダイアグノステックスキッツ（ジェンザイムダイアグノスティックス、マサチューセッツ州、米国）を用いて「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにより血清ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２レベルを測定した。
【０２８９】
統計学的分析
スチューデントｔ検定（両側検定）により分析した。
【０２９０】
ＧＶＨＤ関連組織損傷に対するＮＫＴ細胞の養子免疫伝達の効果
実施例１
皮膚のＧＶＨＤの緩和
全てのグループからのマウス内で皮膚生検を実施した。ＧＶＨＤにおける表皮は、基底細胞層の広汎性脈管化、海綿状態及び異常角化ケラチノサイト及び表皮下裂溝形成、急性ＧＶＨＤの等級ＩＩを特徴づける形態変化を示した。一部においては、表皮の局所性完全喪失を伴う表皮下裂溝形成が観察され、これは急性ＧＶＨＤの等級ＩＩＩ−ＩＶと相容性あるものであった。ＮＫＴ細胞の養子免疫伝達はこれらの変化を改善した。
【０２９１】
実施例２
小腸ＧＶＨＤの緩和
小腸生検を、全てのグループからのマウスにおいて実施した。ＮＫＴ細胞の移植を受けたマウスにおいて、全てのＧＶＨＤ関係組織学パラメータの有意な減衰が観察された。対照においては、等級Ｉの急性ＧＶＨＤの特徴であるアポトーシス体（単一細胞壊死）が、数多くの腺窩の中に見られた。一部の標本では、腸腺窩の中に壊死破片が存在し、これは等級ＩＩの急性ＧＶＨＤと相容性あるものであった。
【０２９２】
実施例３
ＧＶＨＤ関連肝臓病の改善
ＮＫＴ細胞の移植を受けたマウスにおいて、穏やかな門脈炎症、リンパ球浸潤及び肝内胆管の断裂が指摘された。これとは対照的に、ＮＫＴ枯渇されたマウスは、内皮炎が随伴する重症の非化膿性の胆管炎を発生させた。この内皮炎は、静脈内皮に対する損傷、リンパ球浸潤及び腐肉の形成として明らかであった。
【０２９３】
実施例４
ＧＶＨＤ関連死亡率に対するＮＫＴ細胞の養子免疫伝達の効果
４．５×１０６個のＮＫＴ細胞の養子免疫伝達は、生存率を有意に改善した（２８日目で８５％の生存率）。これとは対照的に、ＮＫＴ細胞の枯渇は、高い死亡率を導いた（１４日目で１００％の死亡率）。移植されたＮＫＴ細胞の数との直接的相関が指摘された（４．５×１０６個のＮＫＴ細胞の移植で最大の効果）。これらの結果は図８に示されている。
【０２９４】
実施例５
末梢寛容誘発としての肝内ＣＤ８リンパ球トラッピングに対するＮＫＴ細胞の養子免疫伝達の効果
寛容誘発は、ＮＫＴ細胞枯渇されたマウス（ｐ＜０．０５）と比べた４．５×１０６個のＮＫＴ細胞の移植を受けたマウスにおける肝内ＣＤ４／ＣＤ８比の１６分の１減少と同時の末梢ＣＤ４／ＣＤ８比の２．２６倍増加によって明示されるＣＤ８リンパ球の肝内トラッピングと結びつけられた。これらの結果は図９及び図１０の中に示されている。
【０２９５】
実施例６
血清サイトカインに対するＮＫＴ細胞の養子免疫伝達の効果
血清ＩＬ−１２レベルは、ＮＫＴ細胞枯渇された動物（ｐ＜０．０５）と比べて、４．５×１０６個のＮＫＴ細胞の移植を受けた寛容化されたマウスにおいて、有意に低く（５２ｐｇ／ｍｌ対７３５ｐｇ／ｍｌ）、血清ＩＬ−１０レベルは有意に高い（１１２ｐｇ／ｍｌ対５０ｐｇ／ｍｌ）ものであった。グループ間の血清ＩＦＮγ及びＴＮＦαレベルの有意な差異は全く存在しなかった。これらの結果は図１１及び図１２で描かれている。
【０２９６】
結論
４．５×１０６個のＮＫＴ細胞の養子免疫伝達は、ＧＶＨＤに関係する肝臓、腸及び皮膚の傷害を有意に緩和した。これとは対照的に、ＮＫＴ細胞の枯渇は、重症のＧＶＨＤ関連多器官傷害を導いた。
【０２９７】
少数の調節ＮＫＴ細胞の移植は、移植片宿主寛容の発達を容易にすることによって、ＧＶＨＤ関係の肝臓、腸及び皮膚損傷の改善を導く。この効果は、Ｔｈ２型免疫応答に向かってのエフェクタ細胞サブセット及び血清サイトカインの変調と結びつけられた。肝臓は、リンパ球トラッピングを介した寛容誘発に重要な役割を果たす。ＮＫＴ細胞の移植は、ＧＶＨＤに対する新規の治療措置として期待できるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２９８】
図面の簡単な説明
【図１Ａ−１Ｂ】実験的結腸炎における腸粘膜の組織学的評価に対する寛容化の効果
【図１Ａ】寛容化されていないマウスの遠位結腸組織（最後の１０ｃｍ）由来のパラフィン切片を示す。
【図１Ｂ】寛容化されたマウスの遠位結腸組織（最後の１０ｃｍ）由来のパラフィン切片を示す。  切片はヘマトキシリン−エオシンで染色された。マウス由来のＣＥＰの給餌は、炎症応答及び粘膜損傷の著しい減少（グループＢ、図１Ｂ）により明示される実験的結腸炎の著しい緩和を導いた。これとは対照的に、ＢＳＡの給餌を受けた寛容化されていないマウス内（グループＡ、図１Ａ）では、重症の結腸炎がみられた。
【図２】ＮＫ１．１＋リンパ球は、寛容されたマウスにおいてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を増大させる。  全てのグループ内のマウスから脾細胞及び肝臓関連リンパ球（ＬＡＬ）（２．５×１０６個の脾細胞と０．５×１０６のＬＡＬ）を収獲し、ＣＥＰ及びＡＰＣの存在下で７２時間培養した。以下のヒストグラム内で要約されているフローサイトメトリ分析は、経口寛容誘発の後のＮＫ１．１−ＬＡＬ枯渇が、ＮＫ１．１枯渇されていない寛容化されたマウス（グループＥ、白色棒）と比べてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を減少させた（グループＢ、黒色棒）ということを示した。対照ＮＫ１．１−枯渇されたグループ（グループＦ、黒色棒）は、ＮＫ１．１枯渇されてないグループ（グループＣ、白色棒）に比べてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比の減少を示した。略号：ＥＸＰ．ＧＲ．＝実験グループ、ｒａｔ．＝比、ＣＥＰ＝結腸炎抽出タンパク質、ｎ−ｄｅｐ．＝枯渇されていない、ＮＫ１．１−ｄｅｐ．（ＮＫ１．１−枯渇されている）、ｃｏｎｔ．＝対照
【図３】ＮＫ１．１＋リンパ球は、実験的結腸炎を有する寛容化されていないマウスにおけるＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を減少させた。  寛容化されたグループとは対照的に、ＮＫ１．１枯渇は、実験的結腸炎を有する寛容化されていないマウス（Ｎ−ＣＥＰ）において反対の効果を有していた。ＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比は、ＮＫ１．１枯渇されておらず寛容化されていないグループ（グループＡ、白色棒）と比べて、ＮＫ１．１枯渇され寛容化されていないグループ（グループＤ、黒色棒）において増大した。略号：ＥＸＰ．ＧＲ．＝実験グループ、ｒａｔ．＝比、ＣＥＰ＝結腸炎抽出タンパク質、ｎ−ｄｅｐ．＝枯渇されていない、ＮＫ１．１−ｄｅｐ．（ＮＫ１．１−枯渇されている）、ｃｏｎｔ．＝対照
【図４】異なる実験グループからの単離済みリンパ球上でのＩＬ４及びＩＦＮγの発現  該図は、ＩＬ４及びＩＦＮγ発現の判定のためのフローサイトメトリ分析の代表的結果を示す。それぞれ、グループＢ及びＥからの寛容化されたＮＫ１．１枯渇されていない及びされているマウス、及びグループＡ及びＤからの寛容化されていないＮＫ１．１枯渇されている及びされていないマウスからの単離済みリンパ球内のＩＬ４及びＩＦＮγの発現。５×１０４個の小さいリンパ球のゲーティングの後のドットプロットとしてデータが表示されている。ドットプロットの下の数字は、染色済み細胞を表わす。  異なる実験グループがＢ、Ｅ、Ａ及びＤで表わされている。略号：ＥＸＰ．ＧＲ．＝実験グループ。
【図５】実験的結腸炎をもつ寛容化された及びされていないマウスにおけるＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比に対するインビトロ抗原の暴露の効果  ＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比に対する疾病標的抗原の効果の評価のため、全てのグループ（Ｂ、Ｅ、Ａ、Ｄ、Ｃ、Ｆ）のマウスから脾細胞及び肝臓関連リンパ球（２．５×１０６個の脾細胞及び０．５×１０６個のＬＡＬ）を収獲し、ＣｏｎＡ（コンカナバリン−Ａ）の存在下でかつＣＥＰ及びＡＰＣの不在下（白色棒）で１２時間培養した。フローサイトメトリ分析は、ＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比が、グループＢ及びＥ内及び対照グループＣ及びＦの寛容化されたマウスにおいて有意に減少し、グループＡ及びＤ内の寛容化されていない（ｎ−ＣＥＰ）マウスにおいて有意に増大することを示した。  抗原の不在下でのＮＫ１．１枯渇の効果の評価は、抗原の存在下で記述されたものと類似の効果を示した（黒色棒）。グループＢ内の寛容化されたマウスから収獲されたリンパ球は、寛容化されたグループＥ内のＮＫ１．１枯渇されたマウスと比べて有意に高いＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を明らかにした。これとは対照的に、ＮＫ１．１枯渇は、疾病標的抗原の不在下でグループＡ及びＤからの寛容化されていないマウスにおいてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比の増加を誘発した。略号：ＥＸＰ．ＧＲ．＝実験グループ、ｒａｔ．＝比、ＣＥＰ＝結腸炎抽出タンパク質、ｎ−ＣＥＰ＝寛容化されていない。
【図６】異なる実験グループにおけるＩＬ４及びＩＦＮγレベル。  両方のトリプリケートセットから上清流体を収集し、全ての寛容化された及びされていないグループ（異なるグループがＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆとして表わされている）からの全てのマウスについて、サイトカインレベルを測定した。「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ４及びＩＦＮγレベルを測定した。寛容化されたマウスは、Ｔｈ１からＴｈ２までの免疫応答サイトカイン分泌のシフトを明示した。これらのマウス（グループＢ）は、ＩＬ４レベルの増加及びＩＦＮγレベルの減少を明示した。これとは対照的に、寛容化されていないグループ（グループＡ、Ｅ及びＦ）からのマウスは高いＩＦＮγ及び低いＩＬ４レベルを示した。略号：ＥＸＰ．ＧＲ．＝実験グループ。
【図７】ＩＬ１２レベルに対するＮＫ１．１枯渇の効果  両方のトリプリケートセットから上清流体を収集し、全ての寛容化された及びされていないグループ（異なるグループがＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆとして表わされている）からの全てのマウスについて、サイトカインレベルを測定した。ＮＫ１．１枯渇は、ＣＥＰの給餌を受けたグループ（それぞれグループＥ及びＢ）内のＩＬ１２レベルの増加を導くがＣＥＰの給餌を受けていないグループ（グループＡ及びＤ）においては反対の効果を有していた。略号：ＥＸＰ．ＧＲ．＝実験グループ。
【図８Ａ−８Ｂ】実験的結腸炎における腸粘膜の組織学的評価に対する寛容化の効果
【図８Ａ】寛容化されていないマウスの遠位結腸組織（最後の１０ｃｍ）からのパラフィン切片を示す。
【図８Ｂ】寛容化されたマウスの遠位結腸組織（最後の１０ｃｍ）からのパラフィン切片を示す。  切片はヘマトキシリン−エオシンで染色された。マウス由来のＣＥＰの給餌は、炎症応答及び粘膜損傷の著しい減少（グループＨ、図８Ｂ）により明示される実験的結腸炎の著しい緩和を導いた。これとは対照的に、ＢＳＡの給餌を受けた寛容化されていないマウス内（グループＧ、図８Ａ）では、重症の結腸炎がみられた。
【図９】ＮＫ１．１＋リンパ球は、寛容化されたマウスにおいてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を増大させる。  全てのグループ内のマウスから脾細胞及び肝臓関連リンパ球（ＬＡＬ）（２．５×１０６個の脾細胞と０．５×１０６のＬＡＬ）を収獲し、ＣＥＰ及びＡＰＣの存在下で７２時間培養した。異なる実験グループはＧ’、Ｈ’、Ｉ’、Ｊ’、Ｋ’及びＬ’で表されている。フローサイトメトリ分析は、経口寛容誘発の後のＮＫ１．１−ＬＡＬ枯渇が、ＮＫ１．１枯渇されていない寛容化されたマウス（グループＫ’）と比べてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を減少させた（グループＨ’）ということを示した。対照ＮＫ１．１−枯渇されたグループ（グループＬ’）は、ＮＫ１．１枯渇されてないグループ（グループＩ’）に比べてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比の減少を示した。ＮＫ１．１＋リンパ球は、実験的結腸炎を有する寛容化されていないマウスにおいてＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比を減少させた。寛容化されたグループとは対照的に、ＮＫ１．１枯渇は、実験的結腸炎をもつ寛容化されていないマウスにおいて反対の効果を示した。ＣＤ４＋ＩＬ４＋／ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋比は、ＮＫ１．１枯渇されず寛容化されていないグループ（グループＧ’）に比べてＮＫ１．１枯渇され寛容化されていないグループ（グループＪ’）において増大した。略号：ＥＸＰ．ＧＲ．＝実験グループ、ｒａｔ＝比。
【図１０】異なる実験グループからの単離済みリンパ球上でのＩＬ４及びＩＦＮγの発現  該図は、ＩＬ４及びＩＦＮγ発現の判定のためのフローサイトメトリ分析の代表的結果を示す。寛容化されたＮＫ１．１枯渇されていない及びされているマウス、及び寛容化されていないＮＫ１．１枯渇されていない及び枯渇されているマウスからの単離済みリンパ球内のＩＬ４及びＩＦＮγの発現。５×１０４個の小さいリンパ球のゲーティングの後のドットプロットとしてデータが表示されている。ドットプロットの下の数字は、染色済み細胞のパーセンテージを表わす。代表的な結果が示されている。実験グループ（ＥＸＲ．ＧＲ）  異なる実験グループがＧ、Ｈ、Ｉ及びＪで表わされている。略号：ＥＸＰ．ＧＲ．＝実験グループ。
【図１１】ＮＫ１．１による肝臓リンパ球細胞毒性  これらの研究においては、１００：１〜１０：１のＥ：Ｔ比で標的細胞としてＹＡＣ−１細胞を使用した。寛容化されておらずＮＫ１．１枯渇されていないマウス（グループＨ’）からのレシピエントはその他のグループと比べてほぼ全く溶解を示さなかった。グループＧ’内の寛容化されずＮＫ１．１枯渇されたマウスからのレシピエントは、それぞれグループＨ’よりも高い溶解を示した。グループＩ’からのＮＫ１．１枯渇されＣＥＰ給餌を受けたマウスからのレシピエントは、グループＪ’内のＮＫ１．１枯渇されていないマウスに比べ低い溶解を示した。対照グループからのレシピエントは、それぞれグループＬ’と比べたグループＫ’内のマウスについて、２３％対２２．４７％の細胞毒性を有していた。異なる実験グループは、Ｇ’、Ｈ’、Ｉ’、Ｊ’、Ｋ’及びＬ’により表わされている。略号：ＥＸＰ．ＧＲ．＝実験グループ
【図１２】異なる実験グループにおけるサイトカインレベル。  両方のトリプリケートセットから上清流体を収集し、全ての寛容化された及びされていないグループからの全てのマウスについて、サイトカインレベルを測定した。「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ４、ＩＬ１０及びＩＦＮγレベルを測定した。寛容化されたマウスは、Ｔｈ１からＴｈ２までの免疫応答サイトカイン分泌のシフトを明示した。これらのマウス（グループＨ）は、ＩＬ４、ＩＬ１０レベルの増加及びＩＦＮγレベルの減少を明示した。これとは対照的に、寛容化されていないグループ（グループＧ、Ｊ及びＫ）及び対照グループＩからのマウスは高いＩＦＮγ及び低いＩＬ１０レベルを示した。グループＨ内の寛容化されたマウスから収獲されたリンパ球は、寛容化されたグループＫ内のＮＫ１．１枯渇されたマウスと比べて有意に高いＩＬ４、ＩＬ１０及び低いＩＦＮγレベルを明らかにした。これとは対照的に、ＮＫ１．１枯渇は、抗原の不在下でグループＧ及びＪからの寛容化されていないマウスにおいてＩＦＮγレベルの増加及びＩＬ４、ＩＬ１０レベルの減少を誘発した。異なる実験グループは、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＫにより表わされている。略号：ＥＸＰ．ＧＲ．＝実験グループ。ＩＬ４及びＩＬ１０は、黒色棒でＩＦＮγは白色棒で表わされている。
【図１３】グルコース寛容時間曲線
【図１４ａ】ＭＲＩ脂肪含有量（ＩＰ−ＯＰ）
【図１４ｂ】ＭＲＩＳＩインデックス（ＩＰ−ＯＰ／ＩＰ）
【図１５ａ】養子免疫伝達グループ内のＣｏｎ−Ａに応答したＡＳＴレベル
【図１５ｂ】養子免疫伝達グループ内のＣｏｎ−Ａレベルに応答したＡＬＴ
【図１６】６マウスグループについての平均グルコース寛容曲線
【図１７ａ】平均ＭＲＩ肝脂肪含有量（ＳＩインデックス）野生型マウス
【図１７ｂ】平均ＭＲＩ肝脂肪含有量（ＳＩインデックス）−ｏｂ／ｏｂマウス
【図１８ａ】野生型マウスにおけるＡＳＴレベル
【図１８ｂ】ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡＳＴレベル
【図１９】ワクチン接種（Ｍｉｕ／ｍｌ）ＨＢＶワクチン接種（Ｍｉｕ／ｍｌ）後の平均抗−ＨＢＳ力価
【図２０】生存率に対するＮＫＴ細胞の移植の効果
【図２１】末梢ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比に対するＮＫＴ細胞の移植の効果
【図２２】肝臓ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比に対するＮＫＴ細胞の移植の効果
【図２３】血清ＩＬ−１２（ｐｇ／ｍｌ）に対するＮＫＴ細胞の移植の効果
【図２４】血清ＩＬ−１０（ｐｇ／ｍｌ）に対するＮＫＴ細胞の移植の効果
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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