(57)【要約】外部ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）およびキナーゼドメインの双方から調製される融合タンパク質および、コイルドコイル誘導性二量体が開示される。レセプタードメインは、コイルドコイルタグによってホモ二量体またはヘテロ二量体の形態で存在する場合、増強されたリガンド結合活性、または増強されたキナーゼ活性を有する。結合の反応速度論および外部ドメイン二量体のアンタゴニスト能力、ならびにシグナル伝達を変化または阻害するためのそれらの使用が記載される。リガンドの結合およびキナーゼ活性の阻害を可能とする化合物を選択するためのアッセイにおける、外部ドメインおよびキナーゼドメインのそれぞれの適用が記載される。
2007503820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、トランスフォーミング増殖因子−βの細胞表面レセプターの細胞外ドメイン、およびαヘリックス性コイルドコイルのペプチドサブユニットを含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記ペプチドサブユニットが、３〜１０個の７つ揃いの反復ユニットを有する、ＫコイルまたはＥコイルである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記７つ揃いの反復が、配列番号１１〜１７として識別される配列の群から選択される配列を有する、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ペプチドサブユニットが、配列番号８として本明細書中で識別される配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ペプチドサブユニットが、配列番号５として本明細書中で識別される配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記レセプターが、ＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βおよびＩＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βからなる群より選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
第二の融合タンパク質と結合し、コイルドコイル二量体を形成する請求項１に記載の融合タンパク質であって、該第二の融合タンパク質が、トランスフォーミング増殖因子−βレセプターの細胞外ドメインおよび前記αヘリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニットを含む、融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
コイルドコイル二量体タンパク質であって、
第一の融合タンパク質であって、トランスフォーミング増殖因子−βに対する細胞表面レセプターの細胞外ドメイン、およびαヘリックス性コイルドコイルの第一のペプチドサブユニットを含む、第一の融合タンパク質；および
第二の融合タンパク質であって、トランスフォーミング増殖因子−βに対する細胞表面レセプターの細胞外ドメイン、およびαヘリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニットを含む、第二の融合タンパク質
を含む、コイルドコイル二量体タンパク質。
【請求項１１】
前記第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質が、トランスフォーミング増殖因子−βに対する細胞表面レセプターの細胞外ドメインと同じ細胞外ドメインを含む、請求項１０に記載のコイルドコイルタンパク質。
【請求項１２】
前記第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質が、トランスフォーミング増殖因子−βに対する細胞表面レセプターの細胞外ドメインと異なる細胞外ドメインを含む、請求項１０に記載のコイルドコイルタンパク質。
【請求項１３】
前記細胞表面レセプターの細胞外ドメインが、ＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βおよびＩＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βからなる群より選択される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のコイルドコイルタンパク質。
【請求項１４】
前記αヘリックス性コイルドコイルの前記第一のペプチドサブユニットが、配列番号８として本明細書中で識別される配列を有する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のコイルドコイルタンパク質。
【請求項１５】
前記αヘリックス性コイルドコイルの前記第二のペプチドサブユニットが、配列番号５として本明細書中で識別される配列を有する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のコイルドコイルタンパク質。
【請求項１６】
ＴＧＦ−βレセプターに結合するＴＧＦ−βにより特徴付けられる状態の処置のための生物薬学薬剤としての、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のコイルドコイルタンパク質の使用。
【請求項１７】
リガンドがトランスフォーミング増殖因子−βの細胞外ドメインへ結合するのを阻害する能力のある化合物を選択する方法であって、
請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のコイルドコイルタンパク質を調製する工程；
該細胞外ドメインに対するリガンドの存在下において、該コイルドコイルタンパク質を試験化合物とともにインキュベートする工程；および
該試験化合物の、該リガンドと該コイルドコイルタンパク質との相互作用を阻害する能力を測定する工程
を包含する、方法。
【請求項１８】
前記測定する工程が、競合的結合アッセイまたは表面プラスモン共鳴により測定する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる状態の処置における、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のコイルドコイルタンパク質の使用。
【請求項２０】
前記状態が組織線維増殖性障害（ｔｉｓｓｕｅ  ｆｉｂｒｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記状態が、腎臓の進行性腎糸球体疾患、急性呼吸窮迫症候群、肝硬変、糖尿病性腎障害、ヒトメサンギウム増殖性糸球体腎炎、または腫瘍転移である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
キットであって、
（ｉ）請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のコイルドコイルタンパク質；
（ｉｉ）前記細胞外ドメインへの結合活性を有し、そして検出し得るリガンド；および
（ｉｉｉ）使用のための指示書
を備えるキット。
【請求項２３】
細胞表面レセプターの細胞質内ドメインおよび、αヘリックス性コイルドコイルのペプチドサブユニットを含む融合タンパク質。
【請求項２４】
前記ペプチドサブユニットが、３〜１０個の７つ揃いの反復ユニットを有するＫコイルまたはＥコイルである、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記ペプチドサブユニットが、配列番号８として本明細書中で識別される配列を有する、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
前記ペプチドサブユニットが、配列番号５として本明細書中で識別される配列を有する、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記細胞質内ドメインが、トランスフォーミング増殖因子−βまたは上皮細胞増殖因子に対する細胞表面レセプターに由来する、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
第二の融合タンパク質と結合し、コイルドコイル二量体を形成する請求項２３に記載の融合タンパク質であって、該第二の融合タンパク質が、細胞表面レセプターの細胞質内ドメインおよびαヘリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニットを含む、融合タンパク質。
【請求項２９】
請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項２９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３１】
コイルドコイル二量体タンパク質であって、該コイルドコイル二量体タンパク質は、
第一の融合タンパク質であって、細胞表面レセプターの細胞質内ドメインに対応する配列を有するレセプターペプチド、およびαヘリックス性コイルドコイルの第一のペプチドサブユニットを含む、第一の融合タンパク質；および
第二の融合タンパク質であって、細胞表面レセプターの細胞質内ドメインに対応する配列を有するレセプターペプチド、およびαヘリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニットを含む、第二の融合タンパク質
を含む、コイルドコイル二量体タンパク質。
【請求項３２】
前記第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質の前記レセプターペプチド配列が同じ配列を有する、請求項３１に記載のコイルドコイルタンパク質。
【請求項３３】
前記第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質の前記レセプターペプチド配列が異なる配列を有する、請求項３１に記載のコイルドコイルタンパク質。
【請求項３４】
前記細胞表面レセプターが、トランスフォーミング増殖因子−βまたは上皮細胞増殖因子に対するレセプターである、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のコイルドコイルタンパク質。
【請求項３５】
前記αヘリックス性コイルドコイルの前記第一のペプチドサブユニットが、配列番号８として本明細書中で識別される配列を有する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のコイルドコイルタンパク質。
【請求項３６】
前記αヘリックス性コイルドコイルの前記第二のペプチドサブユニットが、配列番号５として本明細書中で識別される配列を有する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のコイルドコイルタンパク質。
【請求項３７】
キナーゼ活性の阻害能力またはリガンドへの結合能力のある化合物を選択する方法であって、該方法は、
請求項３１〜３６のいずれか１項に記載のコイルドコイルタンパク質を提供する工程；
該コイルドコイルタンパク質を試験化合物とともにインキュベートする工程；および
該試験化合物の以下の能力を測定する工程であって、以下：
（ｉ）リン酸化のレベルを検出するための適切な技術によって測定する、レセプタークロスリン酸化の阻害能力を測定する工程、または
（ｉｉ）該コイルドコイルタンパク質の、相互作用リガンドへの結合の阻害能力を測定する工程
を含有する、方法。
【請求項３８】
前記測定する工程が、３３Ｐ−ＡＴＰまたは質量分析法を用いて測定する工程を含有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
レセプターの活性における試験化合物の効果を決定する際に使用するためのキットであって、
（ｉ）請求項３１〜３６のいずれか１項に記載のコイルドコイルタンパク質；および
（ｉｉ）使用のための指示書
を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般に、細胞表面レセプターのドメインおよびαヘリックス性コイルドコイルのペプチドサブユニットを含む融合タンパク質の組成物および使用方法に関連する。より具体的には本発明は、レセプターの細胞質内ドメインおよびαへリックス性コイルドコイルのペプチドサブユニットを含む融合タンパク質、ならびにこのような融合タンパク質のホモ二量体およびヘテロ二量体に関連する。本発明はまた具体的には、トランスフォーミング増殖因子β膜結合レセプターの外部ドメインのタンパク質およびαへリックス性コイルドコイルのペプチドサブユニットを含む融合タンパク質、ならびにこのような融合タンパク質のホモ二量体およびヘテロ二量体にも関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質の生物学的活性はたいてい高次構造に依存し、ここで特定の三次構造または四次構造が活性に必要である。医薬品としての使用のために、またはスクリーニング方法および診断方法において、生物学的に活性な高次構造の組換えタンパク質の発現は、重大な技術的挑戦である。
【０００３】
膜貫通タンパク質の細胞外ドメインの可溶性の形態を調製する一つのアプローチは、タンパク質の可溶性の形態の分泌を可能とする適切なシグナルペプチドを保持または加える一方で、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインを消去することである（非特許文献１；非特許文献２）。別のアプローチは、タンパク質の細胞外ドメインを、免疫グロブリン重鎖定常領域に接続することによる融合タンパク質として可溶性のタンパク質を発現することである（非特許文献３）。しかし、これらのアプローチはたいてい、最大の生物学的活性に必要な適切な三次構造または四次構造を達成しない、またはその実現を許容しない。たとえ上記のタンパク質が活性であった場合でも、不十分にしか発現しないか、または不安定である。したがって、生物学的に活性でかつ安定な組換えタンパク質を調製することが、当該分野において必要であり続けている。
【０００４】
特定の目的のタンパク質の１セットは、成熟したトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）および対応するレセプターであり、これらは、細胞増殖の制御、分化、および免疫反応を含む通常の生理学的プロセスに関与する。ＴＧＦ−βは、Ｉ型ＴＧＦ−βレセプター（ＴβＲＩ）、ＩＩ型ＴＧＦ−βレセプター（ＴβＲＩＩ）およびＩＩＩ型ＴＧＦ−βレセプター（ＴβＲＩＩＩ）として公知の３種類の細胞表面レセプターと結合し、そして複合体を形成することで、シグナル伝達を媒介する（非特許文献４）。リガンドがない場合、Ｉ型レセプターおよびＩＩ型レセプターの双方はホモ二量体を形成し得る（非特許文献５）。しかし、これらのリガンド独立性レセプター二量体は、それらの細胞外ドメインによってはたらく負の制御効果によって、活性ではない（非特許文献６）。少なくとも３つのＴＧＦ−βアイソフォーム（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３）が哺乳動物細胞に存在する。ＴＧＦ−β１リガンドアイソフォームおよびＴＧＦ−β３リガンドアイソフォームは、ＩＩ型レセプターの細胞外ドメインに高い親和性を有するが、２つのＩＩ型レセプターの細胞外ドメインに同時に結合することで、シグナル伝達に適格な複合体の形成を促進する（非特許文献７；非特許文献８）。この結合現象は、細胞表面のＩＩ型レセプターを再指向させると考えられ（非特許文献９）、シグナル伝達に適格な様式で２つのＩ型レセプターのレクルートメントを許容する（非特許文献１０）。そしてＩＩ型レセプターキナーゼは、上記複合体内でＩ型レセプターの細胞質内ドメインをトランスリン酸化し得る。そしてシグナルは、スマッドファミリー（Ｓｍａｄ  ｆａｍｉｌｙ）の主要なメンバーに関与する現象のカスケードによって核に転位される（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。
【０００５】
ＴβＲＩＩＩは一般に「アクセサリーの」レセプターであると考えられ、その機能はシグナル伝達レセプターにリガンドを与えることである（非特許文献１４）。この種の「アクセサリーの」レセプターの必要性があるとする考えは、ＴＧＦ−β２アイソフォームのＴβＲＩＩへの親和性が、他の哺乳動物のアイソフォームに比べて低いという事実によって支持される（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。しかし最近の研究からは、ニワトリ胚の心臓の発達の間のＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２の双方が促進する間葉形質転換にＴβＲＩＩＩが必要であるため、ＴβＲＩＩＩの役割はより複雑であることが示唆される（非特許文献１８）。また、ＴβＲＩＩＩの細胞質内ドメインがＴβＲＩＩによってリン酸化され得、および相互作用され得ること、ならびに、この相互作用がシグナル伝達の促進に必要であることが示された（非特許文献１９）。反対に他の細胞種では、ＴβＲＩ−ＴβＲＩＩ複合体形成を阻害することで、ＴβＲＩＩＩがＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する（非特許文献２０）。ＴβＲＩＩＩは細胞表面において、硫酸グリコサミノグリカン鎖を含む形態で見出され、この硫酸グリコサミノグリカン鎖はＴβＲＩＩＩを電気泳動的に異質にする（非特許文献２１）。変異解析により、ＴβＲＩＩＩの外部ドメイン内に２つの独立したＴＧＦ−β結合ドメインが確認された（非特許文献２２；非特許文献２３）。このことに一致して、ＴβＲＩＩＩの可溶性外部ドメインは２つのＴＧＦ−β分子に同時に結合し得ることが示された（非特許文献２４）。
【０００６】
ＴＧＦ−βの過剰発現からは、細胞外マトリックスの異常蓄積により特徴付けられる線維性疾患を含む、いくつかのヒトの障害において重要な役割を果たすことが示された（非特許文献２５）。これは腫瘍においても役割を果たし、ここで、スマッドシグナル伝達タンパク質およびＴβＲＩＩの遺伝子中の変異または欠失がヒトの腫瘍において観察されるので、ＴＧＦ−βは腫瘍サプレッサーとして有意な役割を果たすようである（非特許文献２６）。反対に、腫瘍の進行の後期においてＴＧＦ−βが転位を促進する強力な証拠がある（非特許文献２７）。
【非特許文献１】Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８７年、２３８、ｐ．１７０４
【非特許文献２】Ｔｒｅｉｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８６年、１３６、ｐ．４０９９
【非特許文献３】Ｆａｎｓｌｏｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９２年、１４９、ｐ．６５
【非特許文献４】Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９８年、６７、ｐ．７５３−７９１
【非特許文献５】Ｇｉｌｂｏａ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９８年、１４０、ｐ．７６７−７７７
【非特許文献６】Ｚｈｕ，Ｈ．Ｊ．およびＳｉｚｅｌａｎｄ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、２７４、ｐ．２９２２０−２９２２７
【非特許文献７】Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ，Ｏ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９６年、２２４、ｐ．７０９−７１６
【非特許文献８】Ｈａｒｔ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２００２年、９、ｐ．２０３−２０８
【非特許文献９】Ｚｈｕ，Ｈ．Ｊ．およびＳｉｚｅｌａｎｄ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、２７４、ｐ．１１７７３−１１７８１
【非特許文献１０】Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４年、２６９、ｐ．２０１７２−２０１７８
【非特許文献１１】Ａｔｔｉｓａｎｏ，ＬおよびＷｒａｎａ，Ｊ．Ｌ．、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、１９９６年、Ｒｅｖ．７、ｐ．３２７−３３９
【非特許文献１２】Ａｔｔｉｓａｎｏ，Ｌ．およびＷｒａｎａ，Ｊ．Ｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９８年、１０、ｐ．１８８−１９４
【非特許文献１３】Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２０００年、１、ｐ．１６９−１７８
【非特許文献１４】Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｓｉｌｌａｓ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９３年、７３、ｐ．１４３５−１４４４
【非特許文献１５】Ｃｈｅｉｆｅｔｚ，Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ、１９８７年、４８、ｐ．４０９−４１５
【非特許文献１６】Ｃｈｅｉｆｅｔｚ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９０年、２６５、ｐ．２０５３３−２０５３８
【非特許文献１７】Ｓｅｇａｒｉｎｉ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１９８９年、３、ｐ．２６１−２７２
【非特許文献１８】Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、２８３、ｐ．２０８０−２０８２
【非特許文献１９】Ｂｌｏｂｅ，Ｇ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、２７６、ｐ．２４６２７−２４６３７
【非特許文献２０】Ｅｉｃｋｅｌｂｅｒｇ，Ｏ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００２年、２７７、ｐ．８２３−８２９
【非特許文献２１】Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｓｉｌｌａｓ，Ｆら、Ｃｅｌｌ、１９９１年、６７、ｐ．７８５−７９５
【非特許文献２２】Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９３年、２６８、ｐ．２２７１０−２２７１５
【非特許文献２３】Ｐｅｐｉｎ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９４年、９１、ｐ．６９９７−７００１
【非特許文献２４】Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、２７６、ｐ．２９６３２−２９６３４
【非特許文献２５】Ｂｏｒｄｅｒ，Ｗ．Ａ．およびＮｏｂｌｅ，Ｎ．Ａ．、Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．１９９３年、２２、ｐ．１０５−１１３
【非特許文献２６】Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊら、Ｃｅｌｌ、２０００年、１０３、ｐ．２９５−３０９
【非特許文献２７】Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｍ．およびＲｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、２００２年、１２、ｐ．２２−２９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ＴＧＦ−βレセプター群またはこれらのレセプター群のドメイン群を、治療薬としての使用に、またはスクリーニングおよび診断アッセイにおける使用に適切な、生物学的に活性な形態にて提供することが望ましい。より一般的には、任意の選択されたタンパク質のレセプタードメインを、可溶性の形態で、かつ治療薬としての使用のための、そして種々のスクリーニングおよび診断アッセイにおける使用のための、ならびに好ましくは無細胞アッセイにおける使用のための、生物学的に活性な高次構造において提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
一つの局面において、本発明は融合タンパク質を提供し、それはトランスフォーミング増殖因子−βに対する細胞表面レセプターの細胞外ドメインの全てまたは一部分、およびαヘリックス性コイルドコイルのペプチドサブユニットを含む。
【０００９】
一つの実施形態において、上記融合タンパク質は、３〜１０個の７つ揃いの反復ユニットを有するＫコイルペプチドサブユニットまたはＥコイルペプチドサブユニットを含む。上記７つ揃いの反復は、別の実施形態において、配列番号１１〜１７として識別される配列の群から選択される配列を有する。好ましい実施形態において上記ペプチドサブユニットは、本明細書中で配列番号８（Ｋ５）または配列番号５（Ｅ５）として識別される配列を有する。
【００１０】
別の実施形態において、上記細胞外ドメインは、ＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βおよびＩＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βに対するレセプターからなる群より選択される細胞表面レセプターに由来する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質は、コイルドコイル二量体を形成するために第二の融合タンパク質と結合し、ここで上記第二の融合タンパク質は、トランスフォーミング増殖因子−βレセプターの細胞外ドメイン、およびαへリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニットを含む。
【００１２】
別の局面において、本発明は、上に記述した融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【００１３】
なお別の局面において、本発明は、上記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを予期する。
【００１４】
また別の局面において、本発明はコイルドコイル二量体タンパク質を含み、これは、（１）トランスフォーミング増殖因子−βに対する細胞表面レセプターの全てまたは一部分の第一の細胞外ドメイン、およびαへリックス性コイルドコイルの第一のペプチドサブユニット、ならびに（２）（ｉ）第一の細胞外ドメインおよびαへリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニット、または（ｉｉ）トランスフォーミング増殖因子−βに対する細胞表面レセプターの全てまたは一部分の第二の細胞外ドメイン、およびαへリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニットのいずれか、を含む。
【００１５】
一つの実施形態において上記コイルドコイルタンパク質は、第一のペプチドサブユニットおよび第二のペプチドサブユニットに結合した第一の細胞外ドメインを含むことに基づいて、ホモ二量体である。別の実施形態において上記コイルドコイルタンパク質は、それぞれ第一のペプチドサブユニットおよび第二のペプチドサブユニットに結びついた、第一の細胞外ドメインおよび第二の細胞外ドメインを含むことに基づいて、ヘテロ二量体であり、上記第一の細胞外ドメインおよび第二の細胞外ドメインは異なる。
【００１６】
別の実施形態において、上記細胞外ドメインは、ＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βレセプターおよびＩＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βレセプターからなる群より選択される細胞表面レセプターである。
【００１７】
別の実施形態において、上記αへリックス性コイルドコイルの第一のペプチドサブユニットは、本明細書中にて配列番号８（Ｋ５）として識別される配列を有する。上記αへリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニットは、本明細書中にて配列番号５（Ｅ５）として識別される配列を有し得る。
【００１８】
別の局面において、本発明は、上に記述された融合タンパク質の、ＴＧＦ−βレセプターに結合するＴＧＦ−βによって特徴付けられる状態の処置のための生物薬学的薬剤としての使用を含む。
【００１９】
別の局面において、本発明はまた、結合活性を阻害し得る化合物の選択の方法も含む。上記方法は、（ｉ）ＴＧＦ−βレセプターの細胞外ドメインの全てまたは一部分、およびαへリックス性コイルドコイルの第一のペプチドサブユニット、ならびに（ｉｉ）（ａ）同じＴＧＦ−βレセプターの細胞外ドメインまたは（ｂ）異なるＴＧＦ−βレセプターの細胞外ドメイン、およびαへリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニットを含むコイルドコイルタンパク質の調製工程；第一のレセプター細胞外ドメインまたは第二のレセプター細胞外ドメインに対するリガンドの存在下で、上記コイルドコイルタンパク質を試験化合物とともにインキュベートする工程；そして、上記試験化合物の、上記リガンドと上記コイルドコイルタンパク質との相互作用を阻害する能力を測定する工程を包含する。
【００２０】
一つの実施形態において、上記方法は、ＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βおよびＩＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βからなる群より選択されるトランスフォーミング増殖因子−βレセプターの細胞外ドメインを含むコイルドコイルタンパク質を調製する工程を包含する。
【００２１】
別の実施形態において、上記方法は、コイルドコイルホモ二量体を形成するために、αヘリックス性コイルドコイルの第一のペプチドサブユニットおよび第二のペプチドサブユニットに結合した、ＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βレセプターの細胞外ドメインを含むコイルドコイルタンパク質を調製する工程を包含する。
【００２２】
また別の実施形態において、上記方法は、コイルドコイルへテロ二量体を形成するために、ＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βレセプターの細胞外ドメインおよびＩＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βレセプターの細胞外ドメインを含むコイルドコイルタンパク質を調製する工程を包含する。
【００２３】
上記方法において、上記測定する工程は、競合的結合アッセイまたは表面プラスモン共鳴によって測定する工程を包含する。
【００２４】
本発明のなお別の局面において、ＴＧＦ−βの過剰発現によって特徴付けられる状態の処置のための方法が提供される。上記方法は、ＴＧＦ−βのシグナル伝達を阻害し得るコイルドコイルタンパク質を投与する工程を包含し、ここで上記コイルドコイルタンパク質は、（ｉ）ＴＧＦ−βレセプターの細胞外ドメインおよびαへリックス性コイルドコイルの第一のペプチドサブユニット；ならびに（ｉｉ）（ａ）同じＴＧＦ−βレセプターまたは（ｂ）異なるＴＧＦ−βレセプターの細胞外ドメイン、およびαへリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニット、を含む。
【００２５】
上記方法によって処置される状態としては、組織線維増殖性障害（ｔｉｓｓｕｅ  ｆｉｂｒｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、腎臓の進行性腎糸球体疾患、急性呼吸窮迫症候群、肝硬変、糖尿病性腎障害、ヒトメサンギウム増殖性糸球体腎炎、または腫瘍転移が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
別の局面において、本発明はまた、トランスフォーミング増殖因子−βに対する細胞表面レセプターに由来する細胞質内ドメイン、およびαへリックス性コイルドコイルのペプチドサブユニットを含む融合タンパク質を含む。
【００２７】
上記融合タンパク質の上記ペプチドサブユニットは、Ｋ５およびＥ５から選択される。例えば上記ペプチドサブユニットは、本明細書中にて配列番号８（Ｋ５）として識別される配列、または配列番号５（Ｅ５）として識別される配列を有し得る。
【００２８】
上記融合タンパク質において上記レセプターは、Ｉ型トランスフォーミング増殖因子−βおよびＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βからなる群より選択される。一つの実施形態において上記融合タンパク質は、コイルドコイル二量体を形成するために第二の融合タンパク質と結合し、上記第二の融合タンパク質は、トランスフォーミング増殖因子−β膜結合レセプターの細胞質内ドメインおよびαへリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニットを含む。
【００２９】
別の局面において、本発明は、上記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および上記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
【００３０】
また予期されるのはコイルドコイル二量体タンパク質であり、これは、トランスフォーミング増殖因子−βに対する細胞表面レセプターの第一の細胞質内ドメインの全てまたは一部分、およびαへリックス性コイルドコイルの第一のペプチドサブユニット、ならびに（ｉ）上記第一の細胞質内ドメインおよびαへリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニット、あるいは（ｉｉ）トランスフォーミング増殖因子−βに対する細胞表面レセプターに由来する第二の細胞質内ドメイン、およびαヘリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニットを含む。
【００３１】
一つの実施形態において、上記コイルドコイルタンパク質は、第一のペプチドサブユニットおよび第二のペプチドサブユニットに結合した第一の細胞質内ドメインを含むことに基づいたホモ二量体である。別の実施形態において、上記コイルドコイルタンパク質は、第一のペプチドサブユニットおよび第二ペプチドサブユニットにそれぞれ結合する、第一の細胞質内ドメインおよび第二の細胞質内ドメイン（これらは異なる）を含むことに基づいたヘテロ二量体である。
【００３２】
種々の実施形態において、上記コイルドコイルタンパク質の上記レセプターは、Ｉ型トランスフォーミング増殖因子−βおよびＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βからなる群より選択される。一つの実施形態において、αへリックス性コイルドコイルの上記第一のペプチドサブユニットは、本明細書中にて配列番号８（Ｋ５）として識別される配列を有する。一つの実施形態において、αへリックス性コイルドコイルの上記第二のペプチドサブユニットは、本明細書中にて配列番号５（Ｅ５）として識別される配列を有する。
【００３３】
なお別の局面において、本発明は、キナーゼ活性を阻害し得る化合物を選択するための方法を提供する。上記方法は、（ｉ）ＴＧＦ−βの細胞質内ドメインおよびαへリックス性コイルドコイルの第一のペプチドサブユニット；ならびに（ｉｉ）（ａ）同じＴＧＦ−βレセプターまたは（ｂ）異なるＴＧＦ−βレセプターの細胞質内ドメイン、およびαへリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニット、を含むコイルドコイルタンパク質を調製する工程を包含する。上記コイルドコイルタンパク質は試験化合物と共にインキュベートされ；そして上記試験化合物のレセプタークロスリン酸化の能力を、リン酸化のレベルを検出するための適切な技術（例えば３３Ｐ−ＡＴＰまたは質量分析）によって測定することで決定される。
【００３４】
一つの実施形態において、上記方法は、Ｉ型トランスフォーミング増殖因子−βおよびＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βからなる群より選択されるトランスフォーミング増殖因子−βレセプターの細胞質内ドメインを含むコイルドコイルタンパク質を調製する工程を包含する。
【００３５】
別の実施形態において、上記方法は、コイルドコイルホモ二量体を形成するために、αへリックス性コイルドコイルの第一のペプチドサブユニットおよび第二のペプチドサブユニットに結合した、Ｉ型トランスフォーミング増殖因子−βレセプターの細胞質内ドメインを含むコイルドコイルタンパク質を調製する工程を包含する。
【００３６】
別の実施形態において、上記方法は、コイルドコイルホモ二量体を形成するために、αへリックス性コイルドコイルの第一のペプチドサブユニットおよび第二のペプチドサブユニットに結合した、ＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βレセプターの細胞質内ドメインを含むコイルドコイルタンパク質を調製する工程を包含する。
【００３７】
コイルドコイルへテロ二量体を形成するために、上記コイルドコイルタンパク質が、Ｉ型トランスフォーミング増殖因子−βレセプターの細胞質内ドメインおよびＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βレセプターの細胞質内ドメインを含む実施形態もまた企図される。
【００３８】
本発明のこれらの目的および特徴、ならびに他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な説明を添付の図面と共に読んだ場合に、より完全に理解される。
【００３９】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、図１Ａに示される融合タンパク質のアミノ酸配列であり、これは、Ｅコイルサブユニット（配列番号５）にリンカー（配列番号４）によって結合され、ｍｙｃでタグを付けられたＴＧＦ−βレセプターＩＩの細胞外ドメイン（ＴβＲＩＩＥＤ、配列番号２）、および２つのグリシンを付加されたＣ末端Ｈｉｓタグ（配列番号６）を含む。
【００４０】
配列番号２は、ＴＧＦ−βレセプターＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列であり、ｍｙｃタグ配列（下線、配列番号３）を含む。
【００４１】
配列番号３は、配列番号１、７、および９に含まれる、ｍｙｃタグのアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号４は、ＴＧＦ−βレセプターＩＩの細胞外ドメインとコイルドコイルサブユニットとの間のリンカーのアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号５は、コイルドコイルヘテロ二量体のＥコイルサブユニットのアミノ酸配列であり、５個の７つ揃いの反復ユニットから形成される。
【００４４】
配列番号６は、２つのグリシンを付加されたヒスチジンタグのアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号７は、図１Ｂに示される融合タンパク質のアミノ酸配列であり、Ｋコイルサブユニット（配列番号８）にリンカー（配列番号４）によって結合され、ｍｙｃでタグを付けられたＴＧＦ−βレセプターＩＩの細胞外ドメイン（ＴβＲＩＩＥＤ、配列番号２）、および２つのグリシンを付加されたＣ末端Ｈｉｓタグ（配列番号６）を含む。
【００４６】
配列番号８は、コイルドコイルヘテロ二量体のＫコイルサブユニットのアミノ酸配列であり、５個の７つ揃いの反復ユニットから形成される。
【００４７】
配列番号９は、図１Ｃに示される融合タンパク質のアミノ酸配列であり、Ｋコイルサブユニット（配列番号８）にリンカー（配列番号４）によって結合され、ｍｙｃでタグを付けられたＴＧＦ−βレセプターＩＩＩの細胞外ドメインの膜近位ドメイン（配列番号１０）、および２つのグリシンを付加されたＣ末端Ｈｉｓタグ（配列番号６）を含む。
【００４８】
配列番号１０は、ＴＧＦ−βレセプターＩＩＩの細胞外ドメインの膜近位ドメイン（ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ）のアミノ酸配列であり、ｍｙｃタグ（下線）を含む。
【００４９】
配列番号１１は、配列番号５のＥコイルサブユニットにおいて用いられた７つ揃いの反復のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号１２は、コイルドコイル二量体のＥコイルサブユニットにおける使用のための、７つ揃いの反復のアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号１３は、コイルドコイル二量体のＥコイルサブユニットにおける使用のための、７つ揃いの反復のアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号１４は、コイルドコイル二量体のＥコイルサブユニットにおける使用のための、７つ揃いの反復のアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号１５は、配列番号８のＫコイルサブユニットにおいて用いられる、７つ揃いの反復のアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号１６は、コイルドコイル二量体のＫコイルサブユニットにおける使用のための、７つ揃いの反復のアミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号１７は、コイルドコイル二量体のＥコイルサブユニットにおける使用のための、７つ揃いの反復のアミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号１８は、５個の７つ揃いのユニットを有する、Ｅコイルサブユニットペプチドである。
【００５７】
配列番号１９は、５個の７つ揃いのユニットを有する、Ｋコイルサブユニットペプチドである。
【００５８】
配列番号２０は、Ｎ末端にさらなるＣｙｓ残基およびＧｌｙ残基を有するコイルドコイルヘテロ二量体の、Ｋコイルサブユニットのアミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号２１は、Ｅコイルサブユニット（配列番号５）にグリシンリンカーによって結合した、ＴＧＦ−βレセプターＩＩの細胞質ドメインを含む融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号２２は、Ｋコイルサブユニット（配列番号８）にグリシンリンカーによって結合した、ラットＴＧＦ−βレセプターＩの細胞質ドメインを含む融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号２３は、Ｋ５コイル（配列番号８）についてコードしたｃＤＮＡの増幅のための、核酸プライマーである。
【００６２】
配列番号２４は、Ｋ５コイル（配列番号８）についてコードしたｃＤＮＡの増幅のための、核酸プライマーである。
【００６３】
配列番号２５は、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤについてコードしたｃＤＮＡの増幅のための、核酸プライマーである。
【００６４】
配列番号２６は、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤについてコードしたｃＤＮＡの増幅のための、核酸プライマーである。
【００６５】
配列番号２７は、ＩＩ型ＴＧＦβレセプターキナーゼドメインについてコードしたｃＤＮＡの増幅のための、核酸プライマーである。
【００６６】
配列番号２８は、ＩＩ型ＴＧＦβレセプターキナーゼドメインについてコードしたｃＤＮＡの増幅のための、核酸プライマーである。
【００６７】
配列番号２９は、Ｉ型ＴＧＦβレセプターキナーゼドメインについてコードしたｃＤＮＡの増幅のための、核酸プライマーである。
【００６８】
配列番号３０は、Ｉ型ＴＧＦβレセプターキナーゼドメインについてコードしたｃＤＮＡの増幅のための、核酸プライマーである。
【００６９】
配列番号３１は、図１０Ａに示したｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５融合タンパク質のアミノ酸配列であり、そして６アミノ酸リンカー（配列番号３２）；Ｋ５コイル（配列番号８）；７アミノ酸リンカー（配列番号３３）、およびヒトｅｒｂＢ１配列（受託番号Ｐ００５３３）の残基６６９〜１２１０、続いて６つのヒスチジン残基を含む。
【００７０】
配列番号３２は、ｅｒｂＢ１の細胞質ドメインのＮ末端におけるリンカーのアミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号３３は、コイルドコイルサブユニットとｅｒｂＢ１の細胞質ドメインの間のリンカーのアミノ酸配列である。
【００７２】
配列番号３４は、図１０Ｂに示したｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｅ５融合タンパク質のアミノ酸配列であり、そして６アミノ酸リンカー（配列番号３２）；Ｅ５コイル（配列番号５）；７アミノ酸リンカー（配列番号３３）、およびヒトｅｒｂＢ１配列（受託番号Ｐ００５３３）の残基６６９〜１２１０、続いて６つのヒスチジン残基を含む。
【００７３】
配列番号３５は、ｅｒｂＢ１細胞質ドメインをコードしたｃＤＮＡを増幅するための核酸プライマーである。
【００７４】
配列番号３６は、結びついたＣ末端の６×Ｈｉｓタグ配列を有する、ｅｒｂＢ１細胞質ドメインをコードしたｃＤＮＡを増幅するために使用される核酸プライマーである。
【００７５】
配列番号３７は、ｅｒｂＢ１細胞質ドメインをコードするｃＤＮＡを増幅するために使用される核酸プライマーである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義および略語）
他に示されない限り、本明細書中の全ての用語は、本発明の当該分野における当業者にとって有するのと同じ意味を有する。当該分野の定義および用語について、実行者は特に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｄｉａ  Ｐａ．）を指向する。
【００７７】
アミノ酸残基についての略語は、２０種の通常のＬ−アミノ酸の１つを呼ぶ、当該分野で用いられる標準の３文字コード、および／または１文字コードである。
【００７８】
「ペプチド」および「ポリペプチド」は本明細書中で交換可能に用いられ、そして、ペプチド結合によって結びつけられたアミノ酸残基の鎖から作り上げられる化合物を呼ぶ。他に示さない限り、ペプチドの配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への順番で与えられる。
【００７９】
用語「細胞外ドメイン」および「外部ドメイン」は交換可能に用いられ、そして「ＥＤ」と略される。
【００８０】
用語「細胞質ドメイン」および「キナーゼドメイン」は交換可能に用いられる。
【００８１】
「ＴβＲＩＩＥＤ」は、細胞表面ＩＩ型ＴＧＦ−βレセプターの細胞外ドメインを呼ぶ。
【００８２】
「ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ」は、ＩＩＩ型ＴＧＦ−βレセプター外部ドメインの膜近位ドメイン（すなわち、Ｃ末端）を呼ぶ。
【００８３】
ＥＧＦＲは上皮細胞増殖因子のためのレセプターを呼び、ｅｒｂＢ１、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４を含む。
【００８４】
ＳＰＲは表面プラスモン共鳴を呼ぶ。
【００８５】
ＲＵは共鳴ユニットを呼ぶ。
【００８６】
（ＩＩ．外部ドメイン融合タンパク質の調製および特徴づけ）
第一の局面において、本発明は、αヘリックス性コイルドコイルのペプチドサブユニットに結びつけられた、膜結合レセプターの外部ドメインを含む融合タンパク質に関連する。この節において、ＴＧＦ−βレセプターに由来する２つの外部ドメインをモデルとして用いる、例示的な融合タンパク質の調製および特徴づけが記載される。具体的には、第１のモデルは、ＩＩ型ＴＧＦ−βレセプター由来の外部ドメイン（ＴβＲＩＩＥＤ）、およびＥ５／Ｋ５コイルドコイルのＫ５コイルまたはＥ５コイルを含む融合タンパク質である。第２のモデルは、Ｋ５コイルに融合した、ＩＩＩ型ＴＧＦ−βレセプター外部ドメインの膜近位ドメイン（すなわち、Ｃ末端）（ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ）を含む融合タンパク質である。これらの融合タンパク質は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）に基づいたバイオセンサーを用いた、ＴＧＦ−β１への結合の動力学の面において、特徴づけをされた。Ｅ５コイルでタグを付けられた融合タンパク質の、Ｋ５コイルでタグを付けられた融合タンパク質と二量体化する能力が調査され、そして以下に記載される。コイルドコイル誘導性のホモ二量体レセプター外部ドメインおよびヘテロ二量体レセプター外部ドメインのＴＧＦ−β１への結合、およびそれらのインビトロにおけるＴＧＦ−β１シグナル伝達の阻害能力が調べられ、そして以下に記載される。
【００８７】
（Ａ．融合タンパク質の調製および発現）
図１Ａ〜１Ｃは、本明細書中に記載された本発明のために設計され、そして発現された例示的な融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。図１Ａは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５として呼ばれる融合タンパク質を示し、そして本明細書中で配列番号１として識別される。この融合タンパク質は、以下に記載されるように、コイルドコイル二量体の、５個の７つ揃いの反復ユニットを形成するＥコイル（配列番号５；図１Ａ中の配列のアミノ酸残基１８２〜２１６）にリンカー（配列番号４）を介して結合した、ｍｙｃでタグを付けられたＩＩ型ＴＧＦ−βレセプターの細胞外ドメイン（配列番号２）を含む。
【００８８】
図１Ｂは第二の例示的な融合タンパク質を示し、本明細書中でＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５と呼ばれ、そして配列番号７として識別される。この融合タンパク質は、コイルドコイル二量体の、５個の７つ揃いの反復ユニットを形成するＫコイル（配列番号８）にリンカー（配列番号４）を介して結合した、ｍｙｃでタグを付けられたＩＩ型ＴＧＦ−βレセプターの細胞外ドメイン（配列番号２）を含む。
【００８９】
図１Ｃは、本明細書中でＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５と呼ばれ、そして配列番号９として識別される、第三の例示的な融合タンパク質を示す。ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤは、コイルドコイル二量体のＫコイル（配列番号８）にリンカー（配列番号４）を介して結合した、ｍｙｃでタグを付けられたＩＩＩ型ＴＧＦ−βレセプターの細胞外ドメインの膜近位ドメイン（配列番号１０）を含む。
【００９０】
図１Ａ〜１Ｃに示される、上記の３つの例示的な融合タンパク質は、検出のためにＮ末端にｍｙｃ（配列番号３）でタグを付けられ、そして精製のためにＣ末端にＨｉｓ（配列番号６）でタグを付けられた。
【００９１】
本明細書中に記載される融合タンパク質およびペプチド二量体の構築に用いられるコイルドコイルペプチドは、第一のコイル形成ペプチド（本明細書中で第一のペプチドサブユニットとも呼ばれる）、および第二のコイル形成ペプチド（本明細書中で第二のペプチドサブユニットとも呼ばれる）を含む。上記の２つのコイルは、平行な配置または逆平行な配置のいずれかで、ヘテロ二量体コイルドコイル（コイルドコイルヘテロ二量体）に集合する。平行な配置においては、上記の２つのヘテロ二量体サブユニットペプチドヘリックスは、それらが同じ配向（アミノ末端からカルボキシル末端へ）を有するように整列される。逆平行な配置においては、上記の２つのヘテロ二量体サブユニットペプチドヘリックスが、一方のヘリックスのアミノ末端が他方のヘリックスのカルボキシル末端に整列され、そして逆もまた同じように、整列される。例示的なヘテロダイマーサブユニットは、「Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｔｈｏｄ」と題される国際公開９５／３１４８０号パンフレット（国際公開日１９９５年１１月２３日）に記載され、本明細書中にその全体が参考として援用される。国際公開９５／３１４８０号パンフレットにある手引きに従って設計されたヘテロ二量体サブユニットペプチドは、典型的に逆平行な配向に対して平行な配向に集合する方に優先度を示す。
【００９２】
コイルドコイルへテロ二量体の第一のペプチドサブユニットおよび第二のペプチドサブユニットはまた、本明細書中で「Ｋコイル」（「Ｋ」）（正に荷電したサブユニットであって、その荷電がリジン残基によって主に提供されるサブユニットを呼ぶ）、およびＥコイル（「Ｅ」）（負に荷電したサブユニットであって、その荷電がグルタミン酸残基によって主に提供されるサブユニットを呼ぶ）と呼ばれる。上記ＫコイルおよびＥコイルは、典型的には７アミノ酸残基（７つ揃いのユニットと呼ばれる）を含み、これは選択された回数だけ反復される。上記コイルドコイルペプチドのペプチドサブユニットは一般に類似した大きさであり、典型的には同じ大きさであり、それぞれは長さが約２１残基〜約７０残基（３〜１０個の７つ揃い）の範囲である。例示的な配列番号５は、５個の７つ揃いの反復を含み、それゆえ、本明細書中では「Ｅ５」と呼ばれる。しかし、より少ない反復またはより多い反復が用いられ得ることが認められる。同様に、配列番号８（Ｋコイルサブユニット）は、５個の７つ揃いの反復を含み、そして本明細書中で「Ｋ５」と呼ばれるが、３〜１０個の７つ揃いのユニットが、コイルの形成のために適すると考えられる。
【００９３】
上記Ｋコイルおよび上記Ｅコイルの形成のための７つ揃いのユニットを形成する７残基は変化し得る。配列番号５として識別される、上記Ｅ５コイルの形成のための７つ揃いのユニットは、以下のアミノ酸を含む：ＥＶＳＡＬＥＫ（配列番号１１）。上記Ｅコイルのための他の７つ揃いのユニットとしては、ＥＶＳＡＬＥＣ（配列番号１２）、ＥＶＳＡＬＥＫ（配列番号１３）、ＥＶＥＡＬＱＫ（配列番号１４）が挙げられる。上記Ｋコイルに関しては、例示的な７つ揃いのユニットとしては、ＫＶＳＡＬＫＥ（配列番号１５）、ＫＶＳＡＬＫＣ（配列番号１６）、およびＫＶＥＡＬＫＫ（配列番号１７）が挙げられる。ＥコイルサブユニットまたはＫコイルサブユニットを構成する上で、単一の７つ揃いのユニットは、所望の長さのサブユニットを形成するために反復され得る。例えば、配列番号５として識別される上記Ｅ５コイルサブユニットは、５回反復される、７つ揃いのユニットＥＶＳＡＬＥＫ（配列番号１１）に基づく。ＥコイルまたはＫコイルはまた、所望の長さのコイルを得るために、２種以上の異なる７つ揃いのユニットから構成され得る。例えば、配列番号１１、１２、および１４として識別される７つ揃いのユニット群を含むＥ５コイルサブユニットは、本明細書中にて配列番号１８として識別される。配列番号１８中において、２つの末端の７つ揃いのユニットは配列番号１４として表される配列を有し、そして３つの中間の７つ揃いのユニットは、配列番号１１および配列番号１２によって表される配列を有する。他の例として、配列番号１９がＫ５コイルサブユニットに対応し、ここで上記５個の７つ揃いのサブユニットは、２つの末端の７つ揃いのユニットが配列番号１７として表され、中間のユニットが配列番号１５および配列番号１６によって表される配列を有するように整列される。配列番号１６によって表される配列は、システイン連結残基を含む。
【００９４】
ここで、図１Ａ〜１Ｃに示される融合タンパク質に戻り、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５（配列番号１）、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５（配列番号７）、およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５（配列番号９）をコードするｐＴＴ２発現ベクターの構成を、実施例１に記載する。上記タンパク質を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をトランスフェクトビヒクルとして用いた、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ  ２９３ＳＦ細胞によって発現した。また、実施例１に記載するように、上記融合タンパク質を、アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって細胞培養培地から精製した。
【００９５】
上記融合タンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの、銀染色またはクーマシーブルー染色、およびウエスタンブロットを、図２Ａ〜２Ｂおよび図３Ａ〜３Ｇに示す。図２Ａ〜２Ｂは、標準のＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによるＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５タンパク質の精製を示す。図２Ａは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の精製の間に収集された種々の画分の、４〜１２％の勾配ゲル（還元条件）にてタンパク質を分離した後の、クーマシーブルー染色を示す。レーンＷ１およびレーンＷ２は２つの洗浄工程に対応し；レーンＦＴはフロースルーに対応し、レーン１はイミダゾールによる溶出に対応する。
【００９６】
図２Ｂは、精製の間に収集された種々の画分の、１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元条件）にてタンパク質を分離した後の、ウエスタンブロッティングを示し、一次抗体として抗ｍｙｃ抗体を、および二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化したヤギ抗マウス抗体を使用している。レーン１は、図２Ａのレーン１に示したイミダゾール溶出に対応する。レーン２およびレーン３は、同様の精製に由来する２つの他のイミダゾール溶出に対応する。
【００９７】
図３Ａ〜３Ｇは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５の精製を示す。ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５の精製の場合、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーカラムより溶出したタンパク質を、非還元条件下（図３Ａ）および還元条件下（図３Ｂおよび図３Ｃ）にて１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にて電気泳動し、続いてウエスタンブロッティング（図３Ａおよび図３Ｂ；一次抗体および二次抗体は図２の通り）または銀染色（図３Ｃ）を行った。ジスルフィド架橋された凝集体を除くためのＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３０デバイスによる分離の後、単量体ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５の１０μＬアリコートを、非還元条件下にて１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動し、そしてウエスタンブロットした（図３Ｄ）。レーンＡに示されるサンプルの１／１５希釈の１０μＬアリコートをまた、比較のために電気泳動した（図３Ｅ）。ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５の精製の場合、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出したタンパク質を、非還元条件下にて１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動し、続いてウエスタンブロッティング（一次抗体：抗ｍｙｃ、図３Ｆ）および銀染色（図３Ｇ）を行った。
【００９８】
（Ｂ．ホモ二量体およびヘテロ二量体の形成）
別の調査において、上記コイルのタグがＴＧＦ−βレセプター細胞外ドメインの二量体化を媒介する能力を、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくバイオセンサー（ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）を用いて示した。このバイオセンサーは、表面に固定化したタンパク質（リガンド）と、その結合相手（分析物）との間の相互作用のリアルタイムの監視を可能とし、上記結合相手は上記表面上に注入される。注入が進むにつれて（塗布（ｗａｓｈ−ｏｎ）段階）、分析物がリガンドに結合するに従い、分析物の質量の蓄積が任意の共鳴ユニット（ＲＵ）として記録される。次いで分析物溶液を緩衝液で置換し、そして表面複合体の解離を記録する（洗浄段階）。必要に応じて上記表面は再生され、すなわち、バイオセンサー表面に残る分析物が溶出される。この一連の工程は、センサーグラムを構成する。
【００９９】
実施例２は、上に議論したＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５（配列番号７）融合タンパク質およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５（配列番号９）融合タンパク質を用いて行った調査を記載する。上記融合タンパク質は、Ｋ５コイルタグおよびＥ５コイルタグのコイルドコイル相互作用を通して、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５融合タンパク質（配列番号１）と二量体化して、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５二量体およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５二量体を形成した。ＴβＲＩＩの細胞外ドメインに結合する抗体である抗ＴＧＦ−βＲＩＩを、上記バイオセンサーの表面に連結した。図４Ａに示す、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５のヘテロ二量体化を示すために設計された第一の調査において、以下の一連の注入を行った。まず、抗ＴβＲＩＩ抗体へのＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５の任意の非特異的結合があるかどうか評価するために、抗体表面にＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５を注入した（図４Ａ、「１」）。この注入に続いて、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５を注入し（図４Ａ、「２」）、次いでＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５を注入した（図４Ａ、「３」）。図４Ａに見られるように、予想した通り、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５は、上記抗体と顕著に相互作用することは無かった。しかし、抗体／ＴβＲＩＩＥＤ相互作用を通して、バイオセンサー表面に２００ＲＵのＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５が捕らえられた場合、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５の注入は、結果としてＳＰＲ信号の強い増加（１４０ＲＵ）を招き、このことは、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５が、捕らえられたＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５に結合したことを示した。
【０１００】
ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５への結合が、コイルドコイル相互作用を通して媒介されたことを明白に立証するために第二の調査を行い、ここで、タグを付けないＴβＲＩＩＥＤの注入（図４Ｂ、「１」）に続いて、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５の注入を行った（図４Ｂ、「２」）。この調査はまた、実施例２に記載される。図４Ｂは、Ｅ５タグの非存在下では、ＴβＲＩＩＥＤはＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５と顕著に結合し得なかったことを示す。それゆえ、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５融合タンパク質およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５融合タンパク質のＥ５ドメインおよびＫ５ドメインは、上記の２つの融合タンパク質の二量体化の原因となっている。
【０１０１】
実施例２に記載される第三の調査において、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５ホモ二量体化を媒介するコイルドコイル相互作用の可能性を評価した。濃度の増加するＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５融合タンパク質（３１ｎＭ、６２ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ）を、抗体を充填したバイオセンサー表面上、およびコントロールのバイオセンサー表面上に連続的に注入した。結果を図４Ｃに示し、そしてこの結果は、この一連の注入の後、抗体表面はほとんど飽和されることを示す。しかし、一連のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の注入に続いてＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５（５０ｎＭ）を注入した場合、ＳＰＲシグナルの強い増加が観察された。この増加は、抗体に捕らえられたＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５のＥ５ドメイン、および注入されたＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５のＫ５ドメインに関連するコイルドコイル相互作用に起因する。この調査は、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の相互作用の場合と同様に、Ｅ５コイルおよびＫ５コイルがＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５ホモ二量体化を誘導することを示す。
【０１０２】
（Ｃ．動力学的解析）
単量体の形態の融合タンパク質ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５および融合タンパク質ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５の、ＴＧＦ−β１への結合の動力学を、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭバイオセンサーを用いて調査した。同じ方法論を用いて、コイルドコイル誘導性ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５二量体およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５二量体の結合の動力学もまた調査した。
【０１０３】
（１．ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５のＴＧＦ−β１への結合）
単量体のＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５融合タンパク質（配列番号７）のＴＧＦ−βへの結合の特性を、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭバイオセンサーを用いて調査した。実施例３に記載するように、ＴＧＦ−β１を、標準のアミノ連結手順によってバイオセンサー表面に連結した（約２５０ＲＵ）。次いで、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５溶液（９．８ｎＭ、１４．８ｎＭ、２２．２ｎＭ、３３．３ｎＭ、および５０ｎＭ）を、ＴＧＦ−β１表面上、およびコントロール表面（ＴＧＦ−β１無し）上に、ランダムに二連で注入した。「二重参照（ｄｏｕｂｌｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ）」法によるデータの調製の後、ＴＧＦ−β１分子上に２つの独立したＴβＲＩＩＥＤ結合サイトが存在することを示す動力学モデル（２対１の化学量論モデル）を用いて、センサーグラムのセットを全体的にあてはめた。このモデルは、タグの無いＴβＲＩＩＥＤまたはＥ５でタグを付けたＴβＲＩＩＥＤとＴＧＦ−β１との間の相互作用を示すことが出来るので、選択した（Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２８（５）：１１７３−８３（２００３）；Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２９６３２−２９６４３（２００１））。
【０１０４】
図５Ａは、センサーグラムのセット、および上記の２対１の化学量論モデルを用いた場合に得られる適合を示す。比較のために、単純な動力学モデルをまた、データの解析に用いた。残差（実験的な点と計算上の点との間の差、図５Ｂおよび５Ｃ）の分布から判断されるように、２対１の化学量論モデルによって、より良いあてはめが得られた。加えて、表１に示すように、２対１の化学量論モデルに由来する動力学定数および熱力学定数は、タグを付けないＴβＲＩＩＥＤについて予め決定された動力学定数および熱力学定数によく一致し、このことは、ＴＧＦ−β１に結合するＴβＲＩＩＥＤにＫ５タグが影響しないことを示す。
【０１０５】
（表１：ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５、またはタグを付けないＴβＲＩＩＥＤと相互作用するＴＧＦ−β１（結合した）に対する、動力学定数および熱力学定数）
【０１０６】
【表１】
2007503820.tif 000003
＊Ｋｄ１およびＫｄ２について与えられた値は、ｎ回の独立した実験の平均値±標準偏差に対応する。
＊＊Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：２９６３２−２９６４３（２００１）より。
【０１０７】
（２．コイルドコイル誘導性ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５二量体のＴＧＦ−β１への結合）
実施例３でまた記述される、別の調査において、ＴβＲＩＩＥＤのコイルドコイル誘導性二量体化の効果を調べるために、同じＴＧＦ−β１バイオセンサー表面を用いた。等モル濃度（０〜５０ｎＭ）でインキュベートしたＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５溶液を、ＴＧＦ−β１バイオセンサー表面上およびコントロール表面上に、二連で、５０μＬ／分の流速でランダムに注入した。図５Ｄは、データの調製の後に結果として得られたセンサーグラムを示す。このセンサーグラムのセットは、塗布段階および洗浄段階の双方におけるＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５注入に対応するセンサーグラムのセットと、著しく異なる（図５Ａおよび図５Ｄを比較せよ）。コイルドコイル誘導性ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５二量体と比較して、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５の動力学挙動におけるこの相違は、融合タンパク質のコイルドコイルドメインの二量体化が起きたこと、および、結果として生じたＴβＲＩＩＥＤ人工二量体が、単量体のＴβＲＩＩＥＤよりもより遅い見かけ上の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有することを示す。
【０１０８】
次いで、異なる動力学モデルを用いて、ＴＧＦ−β１／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５−ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５センサーグラムを全体的にあてはめた。単純な１対１のモデルによる、センサーグラムのセットの解析は、ほとんどあてはまらなかった（残差の標準偏差は６．１に等しい、表２を参照のこと）。単純な結合モデルからのこのような逸脱は、最適化されていない実験条件（例えば、集団輸送の限界、またはクラウディング効果（ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ））の結果として生じる人為的影響の存在に起因し得る（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ，Ｄ．Ｊ．およびＷｉｎｚｏｒ，Ｄ．Ｊ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６：２７５−２８３（１９９６））。あるいは、それはより複雑な結合機構に起因し得る。次いで、集団輸送の人為的影響の無いことを検証するために、最低濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５を１００μＬ／分で注入した。結果として生じたセンサーグラムは、５０μＬ／分で行ったセンサーグラムと重ね合わせることができ（データは示さず）、このことは集団輸送の限界が無いことを示す。比較的少量の結合ＴＧＦ−β１が用いられたこと、および、同様のＴＧＦ−β１表面密度の場合に、クラウディングの人為的影響が無かった（Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：２９６３２−２９６４３（２００１））ことが過去に示されたことから、クラウディングの人為的効果の存在もまた無いようである。
【０１０９】
人為的効果の可能性が減少したことから、次いで、より複雑な生物学的モデルをデータの適合に用いた。ＴＧＦ−β１は共有結合性の二量体であり、そしてＴβＲＩＩＥＤはコイルドコイル相互作用を通して人工的に二量体化されたことから、２つの結合のシナリオを評価した。第一に、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５二量体が、同時に２つのＴＧＦ−β１分子に結合し得（親和力モデル）、または第二に、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５二量体内のそれぞれのＴβＲＩＩＥＤドメインが、１つのＴＧＦ−β１単量体に結合する（二量体ＴＧＦ−βが、２つのＴβＲＩＩＥＤドメインを架橋するように）。このことは結果として、コイルドコイル誘導性二量体内の１つのＴβＲＩＩＥＤドメインが、１つの単量体のＴＧＦ−β１に結合し、もう一方のＴβＲＩＩＥＤドメインの、同じＴＧＦ−β１二量体のもう一つの単量体への相互作用に続く、連続的結合モデルになる。このことは、最初の結合の後の再構成工程を含む、全体的な１対１の（二量体対二量体の）化学量論モデルに対応する（再構成モデル）。残差の標準偏差ならびにＺ１統計学的値およびＺ２統計学的値に加えて、これらのモデルを用いた全体的な適合に由来する動力学定数および熱力学定数を、表２に収載する。
【０１１０】
双方の複雑な動力学モデルは、単純な１対１のモデルよりも良い適合を与えた。図５Ｅ〜５Ｆに示すように、再構成モデル（図５Ｅ）は、親和力モデル（図５Ｆ）よりも良く、相互作用を示した。このことは、このモデルが残差のより少ない傾向を示したからである。この結論は、残差の標準偏差の値、ならびに、再構成モデルの場合に最低であったＺ１統計学的値およびＺ２統計学的値によって、補強された（表２）。
【０１１１】
（表２：コイルドコイル相互作用を通して二量体化したＴβＲＩＩＥＤと相互作用するＴＧＦ−β１（結合した）についての動力学定数および熱力学定数）
【０１１２】
【表２】
2007503820.tif 000004
＊Ｍ−１ｓ−１にて
＊＊Ｍにて
コイルドコイル誘導性ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５二量体とＴＧＦ−β１との相互作用は、再構成工程を含む１対１の化学量論モデルによって最もよく説明され（図５Ｅ、表２）、このことは、前もって形成された二量体のＴβＲＩＩＥＤがＴＧＦ−β１に結合し、そして再構成を起こすことを示唆した。このことを確かめるために、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５と合成Ｋ５コイルの相互作用についての見かけ上のＫｄ（Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２８（５）：１１７３−８３（２００３）によって、０．５ｎＭと報告された）を、等モル量のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５およびＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５をプレインキュベートした場合に二量体化する全てのＴβＲＩＩＥＤのパーセントを計算するために用いた。この計算は、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５およびＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５との間にコイルドコイル相互作用が起きる場合、このコイルドコイル相互作用が、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の合成Ｋ５コイルとの相互作用と同じ親和性（Ｋｄ）を有することを仮定する。この計算に基づくと、二量体のパーセントは、図５Ｄにて用いられた濃度の範囲に対して８０〜９１％まで変化し、このことは、ＴβＲＩＩＥＤは二量体としてＴＧＦ−β１に結合、すなわち、コイルドコイル誘導性二量体内の１つのＴβＲＩＩＥＤドメインがＴＧＦ−β１の１つの単量体に結合し、続いて、他のＴβＲＩＩＥＤドメインが、同じＴＧＦ−β１二量体のもう一つの単量体に結合することを示唆した。
【０１１３】
加えて、単量体ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５の注入、およびコイルドコイル誘導性ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５−ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５二量体の注入の双方について、同じＴＧＦ−β１表面を用いたことから、ＴＧＦ−β１と、結合するタンパク質との相互作用を示す、双方の動力学モデルが適切である場合、表面上の活性なＴＧＦ−β１の計算量（これは、データのあてはめの間に決定される全体的なパラメーターである）は同じであるべきである。単量体のＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５の相互作用を、２対１の化学両論モデルによってあてはめた場合、活性ＴＧＦ−β１の量は、６２．５±２ＲＵであると決定された。ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５データの場合においてＴＧＦ−β１の量は、再構成モデルによって６１．７±１ＲＵであり、単純モデルによって４０±３ＲＵであり、そして親和性モデルによって１４５±４ＲＵであった。この知見は、ＴＧＦ−β１の、単量体のＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５との相互作用に対する２対１の化学量論モデル、およびＴＧＦ−β１の、コイルドコイル誘導性ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５二量体との相互作用に対する再構成モデルの妥当性を、さらに支持する。
【０１１４】
（３．ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ融合タンパク質、およびＭＰ−ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５コイルドコイル誘導性二量体の、ＴＧＦ−β１への結合）
ＴＧＦ−β１のＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５融合タンパク質（配列番号９）への結合の動力学を、実施例３に記載するように評価した。また、ＴＧＦ−β１との結合相互作用に与える、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５とＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の二量体化の効果も調査した。ＴＧＦ−β１をバイオセンサー表面に結合させ（７５ＲＵ未満）、そして単量体ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５、または、コイルドコイル相互作用を通してＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５と二量体化したＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５のいずれかを、上記のバイオセンサー表面上に注入した。
【０１１５】
図６Ａ〜６Ｄは、この調査の結果を示す。双方のセンサーグラムのセットの全体的な適合は、ＴＧＦ−β１の、単量体ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５との相互作用、およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５二量体との相互作用が、単純な結合機構から逸脱していたことを示した。図６Ａにおいて、６２．５ｎＭ〜５００ｎＭの範囲の異なる濃度のＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５単量体融合タンパク質を、７５ＲＵの結合したＴＧＦ−β１上に、およびコントロールの表面上に注入した。点は、実施例２に記載したようなデータの調製の後に得られた共鳴ユニットであり、そして実線は、再構成モデルを用いて全ての曲線を同時にまとめた場合の適合を表す。図６Ｂ〜６Ｃは、再構成モデルを用いた相互作用データの適合からの残差（図６Ｂ）、および単純な１対１のモデルを用いた相互作用データの適合からの残差（図６Ｃ）を示す。単純なモデルを用いた、ＴＧＦ−β１／ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５相互作用の全体的な解析は、以下の動力学定数を与えた：見かけ上の会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）は（５．０±０．２）×１０４Ｍ−１ｓ−１と見積もられ、そして見かけ上の解離速度は（２．５±０．１）×１０−３ｓ−１と見積もられ、４９ｎＭの見かけ上のＫｄという結果となった（残差の標準偏差は０．５２７）。再構成モデルを用いて決定した見かけ上のＫｄは、８６ｎＭと見積もられた（残差の標準偏差は０．３５９）。
【０１１６】
図６Ｄは、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５単独で用いられたのと同じＴＧＦ−β１表面上に注入された、１８．８ｎＭ〜５０ｎＭの範囲の異なる濃度のＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５コイルドコイル二量体についての相互作用センサーグラムを示す。点は、データの調製の後に得られた共鳴ユニットである。
【０１１７】
ＴＧＦ−β１と結合する、非二量体化ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５（図６Ａ）、およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５二量体の比較（図６Ｄ）は、１２５ｎＭのＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５（図５Ａ）対１５０ｎＭのＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５（図６Ｄ）の注入の終わりに、それぞれ６ＲＵ対６０ＲＵに達したことから証明されるように、コイルドコイル誘導性二量体化が、見かけ上の親和性の増大という結果になることを示した。この著しいＲＵの相違は、単量体に対する二量体の分子量の増大にのみ起因するものではないようであり、上記のヘテロ二量体に対する結合の複数の接触様式に、より起因するもののようである。それゆえ、上記のコイルドコイル誘導性ヘテロ二量体は、１つのＴＧＦ−β１二量体内のＴβＲＩＩ部位およびＴβＲＩＩＩ部位の双方に結合するようであり、その結果、コイルドコイル二量体化ＴβＲＩＩＥＤについて観察されたのと同じような機構によって、親和性に影響する。
（表３．Ｋ５でタグを付けられたＴβＲＩＩＩＥＤ、またはタグを付けられないＣ末端ＴβＲＩＩＩＥＤと相互作用するＴＧＦ−β１（結合した）についての、動力学定数および熱力学定数。（３連で行った。））
【０１１８】
【表３】
2007503820.tif 000005
本発明の別の実施形態において、コイルドコイル誘導性のＴβＲＩＩＥＤの二量体化を達成するための、代替のアプローチが提供される。この実施形態において、２つのタンパク質を架橋するためのアダプターとして作用するように、二量体コイルが用いられる。例えば、本明細書中の調査において、２つのＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５タンパク質の架橋を可能にするＫ５共有結合性二量体を形成するために、Ｎ末端にＣｙｓを有するＫ５サブユニット（配列番号２０）を酸化することによって、Ｋ５ｏｘと呼ばれる二量体コイルを得た。実施例３に記載した、この実施形態を支持する上で行った調査において、種々の濃度のＫ５ｏｘ（配列番号２０）と共にＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５融合タンパク質（配列番号１）をプレインキュベートし、そして固定化したＴＧＦ−β１バイオセンサー表面上、およびコントロールのバイオセンサー表面上に、上記溶液を注入した。結果を図７に示し、そしてこの結果は、５０ｎＭ（センサーグラム２）および１５０ｎＭ（センサーグラム３）のＫ５ｏｘと共にＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５（３００ｎＭ）をインキュベートした場合（それぞれ、６：１および２：１のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５：Ｋ５ｏｘモル濃度比）、そのセンサーグラムは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５単独での注入に対応するセンサーグラム（センサーグラム１）と非常に異なったことを示す。センサーグラム２およびセンサーグラム３の形は、Ｅ５／Ｋ５相互作用の結果であるＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５二量体について得られたセンサーグラムに類似していた（図５Ｄおよび図７（センサーグラム２およびセンサーグラム３）を比較せよ）。対照的に、過剰のＫ５ｏｘ（９００ｎＭ）をＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５に加えた場合（３：１の比）、その結合は、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５単独の結合に類似していた（図７のセンサーグラム（１）およびセンサーグラム（４）を比較せよ）。これらの結果は、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の濃度を下回る濃度の場合、Ｋ５ｏｘはＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５に１対２の化学量論によって結合し、その結果、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５二量体のＴＧＦ−β１結合性質（遅い見かけ上の解離速度）に類似したＴＧＦ−β１結合性質を有する三量体になったことを示唆する。過剰なＫ５ｏｘが用いられた場合、結合の化学量論は、１つのＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５に対して１つのＫ５ｏｘに転じ、その結果、単量体のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５と同じＴＧＦ−β１結合特性（速い見かけ上の解離速度）を有する複合体になった。
【０１１９】
（Ｄ．アンタゴニストの効力）
行った他の調査において、上記融合タンパク質および上記コイルドコイル誘導性二量体の、ＴＧＦ−β１シグナル伝達に拮抗する能力を試験した。実施例４に記載したこれらの調査において、ルシフェラーゼをトランスフェクトしたミンク肺上皮細胞（ＭＬＥＣ）を９６ウェルプレートに接着させた。融合タンパク質またはコイルドコイル誘導性二量体（ヘテロ二量体またはホモ二量体）の存在下において、ＴＧＦ−β１を上記細胞に加え、そして一晩インキュベートした。次いで細胞を溶解し、そして発光の測定によってルシフェラーゼ活性についてアッセイした。拮抗する融合タンパク質、ホモ二量体、またはヘテロ二量体の非存在下におけるＴＧＦ−β１の活性のパーセントとして、活性を表した。結果を図８Ａ〜８Ｅに示す。
【０１２０】
図８Ａは、融合タンパク質アンタゴニストＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５（白ひし形）およびＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５（白三角）についての、ならびにアンタゴニストであるコイルドコイル誘導性二量体ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５（等モル濃度の混合物、黒四角）についての、アンタゴニスト濃度（ｎＭ）の関数として、パーセント相対的ルシフェラーゼ活性を示す。図８Ａに見られるように、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５（白ひし形）およびＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５（白三角）は、試験した濃度の範囲の全体で（０．１〜３０ｎＭ）、ＴＧＦ−β１誘導性レセプターシグナル伝達を阻害できなかった。等モル濃度のＥ５コイルでタグを付けたＴβＲＩＩＥＤおよびＫ５コイルでタグを付けたＴβＲＩＩＥＤをプレインキュベートすることで形成した、コイルドコイル誘導性二量体形態のＴβＲＩＩＥＤは、７．５ｎＭの濃度において、シグナル伝達を５０％阻害することが出来た。
【０１２１】
Ｋ５ｏｘ誘導性のＴβＲＩＩＥＤの二量体化が同じ効果を有するかどうかを評価するために、１５０ｎＭのＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５を、量の増加するＫ５ｏｘと共にプレインキュベートした。１５０ｎＭの濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５単独（データは示さず）、および１００ｎＭまでの濃度のＫ５ｏｘ単独（図８Ｂ中の白四角）は、ＴＧＦ−β１シグナル伝達に拮抗することは出来なかった。しかし、３４ｎＭのＫ５ｏｘの存在下において、１５０ｎＭのＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５（図８Ｂ中の黒四角）は、シグナル伝達の５０％を阻害した。逆の実験（すなわち、濃度の増加するＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５と共に、１５０ｎＭのＫ５ｏｘをプレインキュベートする）は、図８Ｃに示すように同様の結果を与え、１５０ｎＭのＫ５ｏｘの存在下で、５３ｎＭのＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５であるＩＣ５０が観察された。
【０１２２】
二量体化していないＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５、およびコイルドコイル誘導性ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５／ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５二量体もまた、拮抗効力について試験した。図８Ｄは、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５（白四角）についての、およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５等モル濃度混合物（黒四角）についての、アンタゴニスト濃度の関数として、相対的ルシフェラーゼ活性の割合を示す。ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５単独は、ＴＧＦ−β１シグナル伝達を亢進した。この亢進効果は、Ｋ５の疎水性残基を遮蔽するために、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５を等モル量のＥ５コイルとプレインキュベートした場合にも存在し、このことは、この効果がコイルに媒介されるものではないことを示唆した（データは示さず）。対照的に、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５を等モル量のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５とプレインキュベートした場合（図８Ｄ、黒四角）、結果として生じたコイルドコイル誘導性二量体は、４０ｎＭのそれぞれの外部ドメイン濃度において、シグナル伝達を５０％阻害し得た。
【０１２３】
増加する濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５を、１５０ｎＭのＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５と共にプレインキュベートする、さらなる調査を行った。結果を図８Ｅに示し、そしてこの結果は、７ｎＭのＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５を１５０ｎＭのＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５と共にプレインキュベートした場合に、上記二量体がＴＧＦ−β１シグナル伝達を５０％阻害したことを示す。
【０１２４】
要約すると、上記外部ドメインの拮抗効力は、コイルドコイル誘導性二量体化によって亢進された。ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５を、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５またはＫ５ｏｘのいずれかとプレインキュベーションすることによる、コイルドコイル相互作用を通して二量体化したＴβＲＩＩＥＤは、ＴＧＦ−β１シグナル伝達を阻害し得た。シグナル伝達の阻害のＩＣ５０は、コイルドコイル二量体およびＫ５ｏｘ二量体について、それぞれ約７．５ｎＭおよび約３０ｎＭであった。Ｋ５ｏｘ誘導性二量体化についてよりＩＣ５０が高いことは、Ｅ５コイルでタグを付けたＴβＲＩＩＥＤおよびＫ５コイルでタグを付けたＴβＲＩＩＥＤの単純な混合に比べて、Ｋ５ｏｘがより非効果的に二量体化を誘導する事実に起因するようである。
【０１２５】
１５０ｎＭを超える濃度における、二量体化していないＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５は、ＴＧＦ−β１シグナル伝達を著しく亢進した（図８Ｄ）。ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５を合成Ｅ５コイルと共にインキュベーションした結果、同じ結果が与えられたこと（データは示さず）から、この活性の亢進は、対合していないコイルタグの存在に起因するものではなかった。
【０１２６】
ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５ヘテロ二量体について、拮抗効果が観察された（図８Ｄ）。ＴβＲＩＩＥＤコイルドコイル誘導性ホモ二量体におけるように、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５混合物の拮抗効力は、コイルドコイル相互作用の親和性によって限定されているようである。実際に、双方のコイルでタグを付けた外部ドメインを等モル濃度プレインキュベートした場合、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５の濃度が４０ｎＭであった場合に、ＴＧＦ−β１シグナル伝達は５０％阻害された（図８Ｄ）。しかし、より高い濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５（１５０ｎＭ）と、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５をプレインキュベートした場合、シグナル伝達の５０％阻害は、７ｎＭのＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５において観察された（図８Ｅ）。このことは、同じ濃度のＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５濃度における、ヘテロ二量体の数が増加の結果であるようである。
【０１２７】
このように、コイルドコイル誘導性二量体化は、細胞表面レセプターシグナル伝達を阻害するための、ＴＧＦ−βレセプター外部ドメインの効力を亢進するための戦略として用いることができる。このコイルドコイル誘導性二量体化戦略は、迅速に生成され得、そして評価され得る、レセプター外部ドメインの単量体形態、ホモ二量体形態、およびヘテロ二量体形態を提供する。
【０１２８】
前述から、いかに種々の、発明のこの局面の対象および特徴が触れられるかが分かり得る。Ｅ５コイルおよびＫ５コイルを含む融合タンパク質（すなわち、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５、およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５）は、単量体の形態および二量体の形態にて調製され、そして特徴付けられた。上記融合タンパク質のホモ二量体およびヘテロ二量体は、コイルタグの相互作用によって容易に形成する。上記ホモ二量体およびヘテロ二量体はＴＧＦ−β１に結合し得、そしてインビトロでＴＧＦ−β１シグナル伝達を阻害し得る。上記ホモ二量体およびヘテロ二量体によるＴＧＦ−β１の阻害は、それらの生物薬学的因子としての使用、およびＴＧＦ−β１結合を阻害し得る化合物のスクリーニングアッセイにおける使用を許容する。
【０１２９】
上に記載された調査は、ヒトＩＩ型ＴＧＦ−β細胞表面レセプターの外部ドメイン、およびラットＩＩＩ型ＴＧＦ−β細胞表面レセプターの外部ドメインを用いて、完了された。他の種に由来するＴＧＦ−βレセプター外部ドメインもまた企図され、そして使用に適切であることが認められる。マウス、ラット、ブタ、ニワトリのＴＧＦ−β外部ドメイン配列が、文献に報告される（Ｇｕｉｍｏｎｄ，Ａ．ら、ＦＥＢＳ、５１５：１３−１９（２００２））。これらの配列は、本明細書中に参考として引用される。上記レセプター外部ドメインの全て、または選択された部分を用いて、融合タンパク質が構成され得ることもまた認められる。例えば、生物学的活性を有するレセプターの部分が、融合タンパク質における使用のために選択され得る。より一般的には、本明細書中に記載された外部ドメインと、少なくとも約８０％の配列同一性を、より好ましくは８５％の配列同一性を、なおより好ましくは９０％の配列同一性を、および最も好ましくは９５％の配列同一性を有するレセプター外部ドメインが、使用について企図される。
【０１３０】
（Ｅ．使用の方法）
別の局面において、本発明は、ＴＧＦ−β１の、１つ以上のそのレセプターへの結合活性を阻害し得る化合物を選択するためのスクリーニングアッセイを提供する。上記アッセイを実行するために、上に記載したように、コイルドコイルホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質が調製される。上記タンパク質は、（ｉ）第一の膜貫通レセプターの細胞外ドメイン、およびαヘリックス性コイルドコイルの第一のペプチドサブユニット；ならびに（ｉｉ）（ａ）第一の膜貫通レセプター、または（ｂ）第二の膜貫通レセプターの細胞外ドメイン、およびαヘリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニットを含む。特にＴＧＦ−βレセプターに関して、上記コイルドコイル二量体は、第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質を含む。上記第一の融合タンパク質は、Ｋ５コイルドコイルサブユニットペプチドまたはＥ５コイルドコイルサブユニットペプチドのいずれかでタグを付けられた、ＴβＲＩＩレセプターまたはＴβＲＩＩＩレセプターに由来する外部ドメイン、または外部ドメインの部分を含む。上記第二の融合タンパク質は、上記第一の融合タンパク質に存在する、同じレセプター外部ドメイン（レセプターホモ二量体を完成するため）、あるいは、ＴβＲＩＩレセプターまたはＴβＲＩＩＩレセプターに由来する、第一の融合タンパク質に用いられたものとは異なる外部ドメイン、または外部ドメインの部分（レセプターへテロ二量体を完成するため）を含む。上記第二の融合タンパク質中の外部ドメインは、上記第一の融合タンパク質中で用いられたコイルドコイルサブユニットペプチドと反対のコイルドコイルサブユニットペプチドでタグを付けられる。
【０１３１】
上記コイルドコイルホモ二量体またはコイルドコイルへテロ二量体を、このコイルドコイル二量体内のレセプター外部ドメインに対するリガンドの存在下で、試験化合物とインキュベートする。例えば、ＴＧＦ−βレセプター由来の外部ドメインを有する、調製された二量体に対しては、適切なリガンドは、このコイルドコイル二量体内の外部ドメインへの結合親和性を有するＴＧＦ−βのアイソフォームである。試験化合物の、上記レセプターリガンドと上記コイルドコイル二量体との相互作用を阻害する能力は、当業者に公知の適切な方法（例えば、競合結合アッセイ、バイオセンサーを用いたＳＰＲなど）によって測定される。例えば、競合結合アッセイにおいては、上記コイルドコイル二量体が９６ウェルプレートに接着され得、次いで試験化合物と共にインキュベートされ得る。次いで放射標識されたＴＧＦ−βリガンドを上記プレートに加え、そしてインキュベートさせておく。未結合のリガンドを除くために洗浄した後、結合したＴＧＦ−βの量をアッセイする。試験化合物の存在下および非存在下における、結合したＴＧＦ−βの量の比較から、ＴＧＦ−βの上記レセプターへの結合を阻害する、試験化合物の能力の決定が可能となり、ここで、ＴＧＦ−βの量の減少が、試験化合物が阻害活性を有することを示す。
【０１３２】
試験化合物の、ＴＧＦ−β結合の阻害能力はまた、バイオセンサーを用いても測定され得、ここで、上記ＴＧＦ−βリガンドは、バイオセンサーの表面に接着される。試験化合物の、上記コイルドコイル誘導性レセプター二量体と、固定化されたリガンドとの間の相互作用を阻害する能力がアッセイされる。
【０１３３】
本発明のさらに別の局面において、ＴＧＦ−βの過剰発現によって特徴付けられる状態の処置の方法が企図される。ＴＧＦ−βの過剰発現は、例えば、組織線維増殖性障害に特徴的である。組織線維症は、細胞外マトリックスの有害な蓄積によって特徴付けられる病理学的状態である。例えば、進行性の腎臓の糸球体の疾患において、細胞外マトリックスはメサンギウム内または糸球体基底膜に沿って蓄積し、最終的に末期の疾患および尿毒症を引き起こす。同様に、成人の、または急性呼吸窮迫症候群は、肺におけるマトリックス物質の有害な蓄積に関与し、一方、肝硬変は、肝臓の瘢痕によって証拠付けられる、有害なマトリックスの蓄積によって特徴付けられる。ＴＧＦ−βの過剰発現、従って、細胞外マトリックスの有害な蓄積によって特徴付けられる別の状態は糖尿病性腎障害であり、これは現在、進行性の腎不全の最も一般的な原因である。同様に、ヒトメサンギウム増殖性糸球体腎炎および照射後線維症（ｐｏｓｔｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）は、過剰なＴＧＦ−βおよび結合組織の過剰生成によって特徴付けられる。腫瘍転移もまた、過剰はＴＧＦ−βの発現によって特徴付けられる。
【０１３４】
このように、ＴＧＦ−βの制御されない合成は、組織線維症の発達の根底にある、細胞外マトリックスの有害な蓄積を引き起こす、一つの要因である。進行性の腎臓、肝臓、肺、心臓、骨髄、および皮膚の線維症は、苦しみおよび死の主用な原因、ならびに健康管理の費用の重要な一因の双方である。ＴＧＦ−βはまた細胞を、よりタンパク質（コラーゲン、ビグリカン、デコリン、およびフィブロネクチンが挙げられる）を生産するように、および、これらのタンパク質を分解する酵素を阻害するように刺激する。
【０１３５】
従って、２つの外部ドメインまたは外部ドメインの部分を含む、コイルドコイル誘導性レセプター二量体（ホモ二量体またはヘテロ二量体）の投与による、ＴＧＦ−βの生成および／または過剰発現によって特徴付けられる、これらの状態および他の状態を処置する方法を、本発明は企図するものである。上記外部ドメインまたは外部ドメインの部分は、同じであっても（ホモ二量体に対して）異なっても（ヘテロ二量体に対して）よく、それぞれの外部ドメインはαヘリックス性コイルドコイルのサブユニットでタグを付けられる。上記コイルドコイルホモ二量体またはヘテロ二量体は、細胞表面レセプターへのＴＧＦ−βの結合の阻害に効果的であり、それによって、ＴＧＦ−βレセプター結合によって開始される事象の下流のカスケードを阻止する。
【０１３６】
所与の患者のための、コイルドコイルホモ二量体またはヘテロ二量体の適切な投与レジメンの決定は、受け持ちの医師の技術の範囲に十分入る。適切な投与量は、年齢および健康の全身状態に基づいて、人から人へ変化するので、患者を「用量滴定する（ｄｏｓｅ−ｔｉｔｒａｔｅ）」ことが、医師の一般的な業務である；すなわち、所望の反応を生じるのに必要なレベルを下回るレベルの投与レジメンを患者に始めさせ、そして、所望の効果が達成されるまで、徐々に用量を増加させる。
【０１３７】
本発明はまた、ＴＧＦ−βレセプター結合を阻害および／または競合し得る化合物を識別する上での使用のための、ＴＧＦ−β外部ドメインに基づいたコイルドコイル二量体を含むキットを企図する。上記キットは、コイルドコイル二量体化レセプター外部ドメインホモ二量体またはヘテロ二量体を保有する第一の容器を含み、上記二量体は２つの外部ドメイン、または外部ドメインの部分を含み、それは同じであっても（ホモ二量体に対して）異なっても（ヘテロ二量体に対して）よく、それぞれの外部ドメインはαヘリックス性コイルドコイルのサブユニットでタグを付けられる。コイルドコイル二量体化レセプター外部ドメインを供給するよりも、上記キットは、第一の融合タンパク質を有する容器、第二の融合タンパク質を有する容器を提供し得；上記２つの融合タンパク質は、使用に先立って使用者によって併せられ、コイルドコイル二量体化レセプター外部ドメインを形成することが理解される。上記キットはまた、上記コイルドコイル二量体化レセプターに対するリガンド（用語リガンドは、一般的に結合相手を呼ぶ）を保有する容器を備え、例えばこのリガンドは、タンパク質であってもペプチドであってもよい。ＴＧＦ−β外部ドメインを用いて形成されるコイルドコイル二量体に対するリガンドの特定な例は、ＴＧＦ−βである。上記リガンドは、通常の技術を用いて、検出のために標識を付けられ；この標識は、放射性標識、蛍光標識、光標識などであり得る。上記キットはまた、上記キットの構成成分の使用を記載した、記述された使用説明書を備え、ここで使用者は、１つ以上の試験化合物の存在下および／または非存在下において、上記コイルドコイル二量体の全てまたは一部分を、上記の標識されたリガンドと混合する。試験化合物の、標識されたリガンドへのコイルドコイル二量体の結合の阻害能力が検出される。上記使用説明書はまた、必要に応じて、洗浄工程および／または分離工程のための指導を提供し得る。
【０１３８】
（ＩＩＩ．細胞質ドメイン融合タンパク質の調製および特徴付け）
別の局面において、本発明は、膜貫通結合レセプターの細胞質ドメイン、およびコイルドコイル二量体のペプチドサブユニットを含む融合タンパク質を含む。上記融合タンパク質は、好ましくは、細胞レセプターの可溶性の細胞内ドメインを用いて構成され；すなわち、細胞レセプターの膜貫通架橋セグメントが除かれる。ＴＧＦ−βおよび上皮細胞増殖因子に対する細胞表面レセプターに由来する細胞質ドメインを含み、αヘリックス性コイルドコイルのペプチドサブユニットに結合した融合タンパク質を、ここで記述されるように、調製した。
【０１３９】
実施例５に詳述するように、本明細書中で配列番号２１として識別される配列を有する、ＩＩ型ＴＧＦ−βレセプター由来のキナーゼドメイン、および、コイルドコイル二量体のＮＨ２末端Ｅコイル（配列番号５）を含む融合タンパク質を調製した。本明細書中で配列番号２２として識別される配列を有する、Ｉ型ＴＧＦ−βレセプター由来のキナーゼドメイン、および、コイルドコイル二量体のＮＨ２末端Ｋコイル（配列番号８）を含む第二の融合タンパク質を、実施例５に記載するように調製した。手短に言うと、レセプタードメインについてコードする配列を、コイルドコイル尾部を導入するようにＰＣＲ増幅した。増幅した配列をｐＢｌｕｅＢａｃベクターに結合し、そして昆虫細胞内でタンパク質を発現するために用いた。組換え融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして電気泳動で特徴付けた。
【０１４０】
図９は、コイルドコイルポリペプチドのペプチドサブユニット（Ｋ５またはＥ５）でタグを付けたＴＧＦ−βレセプターＩまたはＴＧＦ−βレセプターＩＩのキナーゼドメインを含む融合タンパク質、およびこの２つの融合タンパク質のヘテロ二量体の自己リン酸化を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動である。それぞれの融合タンパク質または二量体を、Ｐ３３−γＡＴＰと共にインキュベートし、ついで電気泳動した。図中のレーン１は、Ｋ５ペプチドサブユニットに結合した、ＴＧＦ−βレセプターＩ細胞質ドメインに対応し；レーン２は、Ｅ５ペプチドサブユニットでタグを付けられたＴＧＦ−βレセプターＩＩ細胞質ドメインに対応し；レーン３は、ＴＧＦ−βレセプターＩ−Ｋ５およびＴＧＦ−βレセプターＩＩ−Ｅ５の混合物であり；そしてレーン４は、ＴＧＦ−βレセプターＩ−Ｋ５およびＴＧＦ−βレセプターＩＩ−Ｅ５を共発現したサンプルである。見られるように、ヘテロ二量体に対応するレーン４は最も強い自己リン酸化を示し、このことは、コイルドコイルへテロ二量体として存在する場合、キナーゼドメインが生物学的に活性である、すなわち、クロスリン酸化（シグナル伝達を開始する事象）を促進するような配向にあることを示す。
【０１４１】
上皮細胞増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）ｅｒｂＢ１細胞質ドメイン（ＣＤ）を含む融合タンパク質を、実施例６に記載するように調整した。ｅｒｂＢ１をコードするＤＮＡ構造物を、Ｅ５またはＫ５のためのＤＮＡ構造物に結合させ、そして、ＥＧＦＲ  ｅｒｂＢ１−Ｋ５（配列番号３１）タンパク質、およびＥＧＦＲ  ｅｒｂＢ１−Ｅ５（配列番号３４）融合タンパク質を産生するための発現ベクターにサブクローン化した。ｅｒｂＢ１−Ｋ５細胞質ドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列を図１０Ａに示し（ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５）、そして、ｅｒｂＢ１−Ｅ５細胞質ドメイン（ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｅ５）融合タンパク質のアミノ酸配列を図１０Ｂに示す。図１０Ａは、ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３１）を示す。ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５残基１〜６（下線）は、６アミノ酸リンカー（配列番号３２）に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５残基７〜４１は、Ｋ５コイル（配列番号８）に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５残基４２〜４８（下線）は、７アミノ酸リンカー（配列番号３３）に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５残基４９〜５９０は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベース（受託番号Ｐ００５３３）にて用いられる番号付けに従い、ヒトｅｒｂＢ１配列の細胞質ドメインを含む残基６６９〜１２１０に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５残基５９１〜５９６（下線）は、６アミノ酸Ｈｉｓタグペプチド配列に対応する。
【０１４２】
図１０Ｂは、ｅｒｂＢ１細胞質ドメイン−Ｅ５（ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｅ５）融合タンパク質（配列番号３４）のアミノ酸配列を示す。ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｅ５残基１〜６（下線）は、６アミノ酸リンカー（配列番号３２）に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｅ５残基７〜４１は、Ｅ５コイル（配列番号５）に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｅ５残基４２〜４８（下線）は、７アミノ酸リンカー（配列番号３３）に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｅ５残基４９〜５９０は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベース（受託番号Ｐ００５３３）にて用いられる番号付けに従い、ヒトｅｒｂＢ１配列の細胞質ドメインを含む残基６６９〜１２１０に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｅ５残基５９１〜５９６（下線）は、６アミノ酸Ｈｉｓタグペプチド配列に対応する。
【０１４３】
実施例６Ｂに記載するように、ｅｒｂＢ１の細胞質ドメインを、上記融合タンパク質（ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５およびｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｅ５）を、およびｅｒｂＢ１全長をコードするプラスミドを、ヒト胚性腎臓２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト後、ｅｒｂＢ１キナーゼインヒビターＡＧ１４７８を加えた。細胞溶解物のウエスタンブロット解析を行い、そしてその結果を図１０Ｃ〜１０Ｄに示す。図１０Ｃは、ＡＧ１４７８インヒビターのＥＧＦＲ自己リン酸化への効果を決定するための、ホスホチロシンの検出のためのウエスタンブロットである。図１０Ｄは、抗ｅｒｂＢ１ウエスタンブロットであり、それぞれのサンプル中のトランスフェクトされたＥＧＦＲの量を示す。図１０Ｃ〜１０Ｄのレーン１〜２は、コイルを有しないｅｒｂＢ１キナーゼドメインをトランスフェクトした細胞溶解物に対応し、ここでレーン１は、ＡＧ１４７８インヒビターで処置していないコントロールであり、そしてレーン２は、ＡＧ１４７８インヒビターで処置した。このインヒビターは、コイルドコイル二量体化していないｅｒｂＢ１細胞質ドメインのリン酸化には、ほとんど、または全く効果を有しなかった。レーン３および４は、ｅｒｂＢ１−Ｋ５およびｅｒｂＢ１−Ｅ５をトランスフェクトした細胞に対応し、そして、ＡＧ１４７８インヒビターで処置していない（レーン３）、またはインヒビターで処置した（レーン４）細胞に対応する。レーン５および６は、全長のｅｒｂＢ１をトランスフェクトした細胞に対応し、そして、インヒビターで処置していない（コントロール、レーン５）、またはインヒビターで処置し（レーン６）、続いてＥＧＦで刺激した細胞に対応する。このインヒビターによる自己リン酸化の阻害は、全長のｅｒｂＢ１（レーン６）、およびコイルドコイル二量体化したｅｒｂＢ１細胞質ドメイン（レーン４）において観察されたが、コイルを有しないｅｒｂＢ１細胞質ドメイン（レーン２）においては観察されなかった。このことは、ｅｒｂＢ１のコイルドコイル二量体化が、ｅｒｂＢ１の、ｅｒｂＢ１キナーゼインヒビターに対する感受性をより高めることを示す。すなわち、キナーゼドメインが二量体化した場合、この阻害の性質は、リガンドによって活性化された野生型のレセプターの性質により類似する。
【０１４４】
（Ａ．使用の方法）
タンパク質−タンパク質相互作用は、環境の刺激に対する細胞の反応のほとんどに関与する。例えば、シグナル伝達において、タンパク質−タンパク質相互作用は、原形質膜から細胞質を通って核へと届くシグナル伝達の促進または制御に用いられる。シグナル伝達経路の特定の段階のインヒビターをスクリーニングするための方法およびアッセイであるような、これらの相互作用を調節する手段、および分子レベルでの生物学的反応を調査するための手段が所望される。このようなインヒビターは、治療因子の候補である。上に記載したように、ＴＧＦ−β過剰について、レセプターシグナル伝達が、線維性障害、免疫抑制、および転移における疾患の進行に、原因として関連する。セリン−トレオニンキナーゼレセプターのＴＧＦ−βレセプタースーパーファミリーにおいて、シグナル伝達が起きるためには、２つの膜貫通レセプター（Ｉ型およびＩＩ型）が必要である。具体的には、ＩＩ型レセプターへのＴＧＦ−βの結合が、複合体へのＩ型レセプターの補充および配向を誘導し、このことが、構成的に活性なＩＩ型レセプターキナーゼが、Ｉ型レセプターをリン酸化することを許容する。順番に、Ｉ型レセプターキナーゼが、シグナル伝達経路の下流の基質をリン酸化する。このように、ＴＧＦ−βレセプターからのシグナル伝達を選択的に阻害するための方法および因子は、臨床的に価値がある。
【０１４５】
従って、別の局面において、本発明は、キナーゼ活性を阻害し得る化合物の選択のための方法を提供する。この方法において、細胞表面レセプターの細胞質ドメインに対応する配列を有するレセプターペプチド、およびαヘリックス性コイルドコイルの第一のペプチドサブユニットを含む第一の融合タンパク質；ならびに、細胞表面レセプターの細胞質ドメインに対応する配列を有するレセプターペプチド、およびαヘリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニットを含む第二の融合タンパク質を含むコイルドコイルタンパク質が調製される。上記レセプターペプチドは、第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質において同じであっても異なってもよく、結果としてそれぞれホモ二量体またはヘテロ二量体を生じる。より特定の実施形態において、上記コイルドコイルタンパク質は、（ｉ）ＴＧＦ−βレセプターまたはＥＧＦレセプターの細胞質ドメイン、およびαヘリックス性コイルドコイルの第一のペプチドサブユニット；ならびに（ｉｉ）（ａ）同じＴＧＦ−βレセプターまたはＥＧＦレセプター、あるいは（ｂ）異なるＴＧＦ−βレセプターまたはＥＧＦレセプターの細胞質ドメイン、およびαヘリックス性コイルドコイルの第二のペプチドサブユニットを含む。上記コイルドコイルタンパク質を、試験化合物と共にインキュベートする。適切な時間だけインキュベートした後、試験化合物の、レセプタークロスリン酸化を阻害する能力を、適切な技術（例えば、Ｐ３３γＡＴＰを用い、続いてＳＤＳゲル電気泳動を行うか、または、非放射性ＡＴＰを用い、続いてリン酸化の質量分析解析を行う）によって測定する。
【０１４６】
この方法において、上記コイルドコイルタンパク質はホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれであってもよい。換言すれば、ホモ二量体のためには、上記コイルドコイルタンパク質は２つの融合タンパク質を含み得、双方の融合タンパク質は、例えばＴＧＦ−βレセプターＩ、ＴＧＦ−βレセプターＩＩ、またはＥＧＦレセプターに由来する同じキナーゼドメインを有し、一方の融合タンパク質はＫコイルサブユニットを有し、他方はＥコイルサブユニットを有する。こうして、上記融合タンパク質はホモ二量体に二量体化する。ヘテロ二量体のためには、上記の２つの融合タンパク質は、ＴＧＦ−βレセプターまたはＥＧＦレセプターの異なる細胞質ドメインを有する。ヘテロ二量体についての例示的な融合タンパク質は、一方の融合タンパク質がＴＧＦ−βレセプターＩについてのキナーゼドメインを有し、そして他方がＴＧＦ−βレセプターＩＩについてのキナーゼドメインを有する。上記２つの融合タンパク質は、二量体化してヘテロ二量体を形成する。
【０１４７】
本発明はまた、レセプターキナーゼ活性を阻害または減少し得る化合物の同定、および、上記コイルドコイル二量体化レセプターの、相互作用リガンド（ペプチドまたはタンパク質が挙げられるが、これらに限られない）との結合を崩壊させ得る化合物の同定における使用のためのキットが企図される。上記キットは、レセプター細胞質ドメインおよびαヘリックス性コイルドコイルの第一のサブユニットの第一の融合タンパク質、ならびに、レセプター細胞質ドメインおよびαヘリックス性コイルドコイルの第二のサブユニットの第二の融合タンパク質から形成されるコイルドコイル二量体を含み；上記２つの融合タンパク質はコイルドコイル二量体を形成する。上記第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質が、使用に先立って、コイルドコイルを形成するために使用者によって合わせられる、別々の容器において提供され得ることが理解される。上記コイルドコイル二量体における使用のために選択されるキナーゼドメインは、ホモ二量体を提供してもヘテロ二量体を提供してもよく、そして上記融合タンパク質の細胞質ドメインは、レセプター細胞質ドメインの全てからなっても、部分からなってもよい。上記キットはまた、キットの構成成分の使用のための、記述された使用説明書を備え、ここで使用者は、上記コイルドコイル二量体の全てまたは一部を、１つ以上の試験化合物の存在下または非存在下において、キナーゼ反応を可能とする、キットの供給する化合物または使用者の供給する化合物（例えば、標識されたＡＴＰ）と混合する。試験化合物の、キナーゼ反応（すなわち自己リン酸化）を阻害または亢進する能力は、通常の技術を用いて検出される。上記キットはまた、必要に応じて、目的のレセプターによってリン酸化され得る、またはこれに結合し得る別のタンパク質またはペプチドを提供し得る。
【０１４８】
（ＩＶ．融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびベクター）
本発明の別の局面において、上に記載した融合タンパク質、すなわち、膜貫通レセプターの外部ドメインまたは細胞質ドメイン、およびコイルドコイル二量体サブユニットを含む融合タンパク質についてコードするポリヌクレオチドが提供される。上記融合タンパク質についてのアミノ酸配列が、対応する核酸配列、典型的にはＤＮＡ配列を生成するために用いられる。生成されたＤＮＡ配列のコドン使用頻度は、当該分野で公知であるように、特定の宿主系における発現に最適化され得る。ＤＮＡ配列の合成は、当該分野で周知の技術によって、合成的になされる。
【０１４９】
また本発明に含まれるのは、上記融合タンパク質をコードする配列を含む発現ベクターである。上記発現ベクターはまた典型的には、適切な宿主におけるコード領域の発現を達成するために、発現制御エレメントを含む。上記制御エレメントは一般的に、プロモーター、翻訳開始コドン、ならびに翻訳終止配列および転写終止配列、そして上記ベクターへの挿入を導入するための挿入部位を含む。
【０１５０】
上記融合タンパク質をコードするＤＮＡは、適切な宿主系におけるタンパク質の発現をもたらすために、任意の数のベクターにクローン化され得る。さらなる特徴が、上記発現ベクターに操作され得る（例えば、発現した配列の培養培地への分泌を促進するリーダー配列）。組換え的に生成されたタンパク質は、溶解された細胞または培養培地から単離され得る。精製は当該分野で公知の方法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど）によってなされる。
【実施例】
【０１５１】
（Ｖ．実施例）
以下の実施例は、本明細書中に記載された本発明をさらに例示するものであり、そして、決して、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１５２】
（実施例１  ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５融合タンパク質、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５融合タンパク質、およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５融合タンパク質の生産についての発現ベクターの構築）
（Ａ．材料）
Ｅ５コイルおよびＫ５コイルをコードするｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３ベクター（ｐｃＤＮＡ３−Ｋ５ｃｏｉｌおよびｐｃＤＮＡ３−Ｅ５ｃｏｉｌ）、ならびに、Ｎ末端性ｍｙｃタグ付きＩＩ型ＴＧＦ−βレセプターについてコードするｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３ベクター（ｐｃＤＮＡ３−ＴβＲＩＩ）を、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ）から入手した。ｍｙｃタグ付きの、ＩＩＩ型ＴＧＦ−βレセプター細胞外ドメインの膜近位ドメインを含むｐｃＤＮＡ３ベクター（ｐｃＤＮＡ３−ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ）を、以前に記載された（Ｐｅｐｉｎ，Ｍ．Ｃ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７７：３６８−３７２、（１９９５））ように調製した。全ての酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．から入手し、そして製造業者の推奨に従って用いた。全てのプライマーは、Ｈｕｋａｂｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ．（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。組換えヒトＴＧＦ−β１および抗ｈＴＧＦ−βＲＩＩ抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現し、精製し、そしてリフォールディングした組換えヒトＴβＲＩＩＥＤ（Ｈａｒｔ，Ｐ．Ｊ．ら，２００２）は、Ｄｒ．Ｈｉｎｃｋ（Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏのテキサス大学健康科学センター（Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ））からの親切な贈り物であった。発現ベクターｐＴＴ２は、Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２８（５）：１１７３−８３（２００３）にて、他で記載されたように調製した。
【０１５３】
ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００、ＣＭ５センサーチップ、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）、および１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）は、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）から購入した。
【０１５４】
（Ｂ．ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５、およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５の発現ベクターの構築）
ｐＴＴ２  ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５ベクターの構築は、Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２８（５）：１１７３−８３（２００３）に記載される。
【０１５５】
ｐＴＴ２  Ｋ５ｃｏｉｌの構築のために、Ｋ５コイルについてコードするｃＤＮＡを、テンプレートとしてｐｃＤＮＡ３−Ｋ５ｃｏｉｌ、および以下のプライマー：
Ｋｆｏｒ
【０１５６】
【表４】
2007503820.tif 000006
（配列番号２３；ＮｏｔＩ制限酵素部位に下線を施される）、および
Ｋｒｅｖ：
【０１５７】
【表５】
2007503820.tif 000007
（配列番号２４；ＢａｍＨＩ制限酵素部位に下線を施される）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１５８】
結果として生じる断片をＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩで消化し、そして同じ酵素で消化したｐＴＴ２に結合した。
【０１５９】
ｐＴＴ２  ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５の構築のために、ｍｙｃタグ付きＴβＲＩＩＥＤについてコードするｃＤＮＡを、他に記載するように（Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２８（５）：１１７３−８３（２００３））ＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩで消化し、そして同じ酵素で消化したｐＴＴ２  Ｋ５ｃｏｉｌに結合した。
【０１６０】
ｐＴＴ２  ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５の構築のために、ｍｙｃタグ付きのＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤについてコードするｃＤＮＡを、テンプレートとしてｐｃＤＮＡ３−ＭＰ−βＲＩＩＩ、および以下のプライマー：ＩＩＩｆｏｒ
【０１６１】
【表６】
2007503820.tif 000008
（配列番号２５；ＮｈｅＩ制限酵素部位に下線を施される）
およびＩＩＩｒｅｖ
【０１６２】
【表７】
2007503820.tif 000009
（配列番号２６；ＮｏｔＩ制限酵素部位に下線を施される）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１６３】
結果として生じる断片をＮｈｅＩ／ＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＴＴ２  Ｋ５ｃｏｉｌに結合した。
【０１６４】
次いで、ｐＴＴ２  ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５連結、ｐＴＴ２  ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５連結、およびｐＴＴ２  ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５連結をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）に形質転換し、そしてＭＡＸＩ  ｐｒｅｐカラム（ＱＩＡｇｅｎ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を用いて、プラスミドを精製した。それぞれの構造物を配列決定によって検証した。定量のために、プラスミドをｐＨ７．４で５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌに希釈し、そして２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸収を測定した。Ａ２６０／Ａ２８０の比が１．８〜２．０であるプラスミド調製物のみを、一過性トランスフェクトに用いた。
【０１６５】
（Ｃ．一過性トランスフェクト）
上記ベクターを、Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｇ．ら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２８（５）：１１７３−８３（２００３））に記載されるように、トランスフェクトビヒクルとしてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、ＨＥＫ  ２９３ＳＦ細胞に一過性にトランスフェクトした。組換えタンパク質を、一過性にトランスフェクトされた細胞によって発現させ、そして培養液中に分泌させた。培養物をトランスフェクト後５日で収集し、そして３５００×ｇで１０分間の遠心分離により、培養液から不純物を除去した。
【０１６６】
（Ｄ．ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５融合タンパク質、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５融合タンパク質、およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５融合タンパク質の精製）
ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５を、Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｇ．ら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２８（５）：１１７３−８３（２００３））に記載され、そして図２に示されるように精製した。ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５融合タンパク質およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５融合タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースアフィニティーカラム（総容積２ｍＬ、ＱＩＡｇｅｎ）を用い、培養物培養液を重力フローにより充填することで精製した。次いで、上記カラムを２５ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で２回洗浄した。緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋ｐＨ７．４で１００ｍＭのイミダゾール、８ｍＬの画分を収集）で溶離を達成した。フロースルー画分を２回再充填し、そして上と同じ条件を用いて溶離した。次いで、溶離画分（それぞれ８ｍＬ）を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０デバイス（Ａｍｉｃｏｎ）を、製造業者の推奨に従って用いて、個々に濃縮した（ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５については、この工程は、ＰＢＳへの緩衝液交換を含んだ）。精製された融合タンパク質の濃度を、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いて、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。５００ｍＬの調製済みの培養液から得たＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５、およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５の収量は、それぞれ約７６６μｇ、約５７０μｇ、および約６００μｇであった。
【０１６７】
（Ｅ．電気泳動、ウエスタンブロッティング、銀染色、クーマシーブルー染色）
上記融合タンパク質の純度を、還元条件下にて１１％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルまたは４〜１２％勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分離した後に、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた銀染色、またはクーマシーブルー染色のいずれかによって評価した。精製したタンパク質をまた、還元条件下および非還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでのタンパク質分離に続くウエスタンブロット（抗ｍｙｃ９Ｅ１０、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）によって検出した。結果を図２および図３に示す。ここで、ウエスタンブロット検出は、一次抗体として抗ｍｙｃを、および二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗マウスを用いて行った。図面において、レーンＦＴはアフィニティーカラムのサンプル培養液通過の後のフロースルーに対応し；レーンＷ１およびレーンＷ２は、緩衝液Ａによる２回のカラム洗浄に対応し；図２のレーン１、レーン２、およびレーン３は、緩衝液ＢによるＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｅ５の３つの溶離液に対応する。図３は、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５の精製を示す。ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５の精製の場合において、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶離したタンパク質を、非還元条件下（Ａ）および還元条件下（ＢおよびＣ）において１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動し、続いてウエスタンブロッティング（ＡおよびＢ；一次抗体および二次抗体は図２の通り）、または銀染色（Ｃ）を行った。ジスルフィド架橋された凝集体を除くための、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３０デバイスによる分離の後、単量体のＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５の１０μＬアリコートを、非還元条件下において１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動し、そしてウエスタンブロットした（Ｄ）。レーンＡに示されるサンプルの１／１５希釈の１０μＬもまた、比較のために電気泳動した（Ｅ）。ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５の精製の場合において、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶離したタンパク質を、非還元条件下において１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動し、続いてウエスタンブロッティング（一次抗体：抗ｍｙｃ、Ｆ）および銀染色（Ｇ）を行った。
【０１６８】
（Ｆ．より高次の凝集体からのＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５単量体の分離）
ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の場合のように、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５に対する非還元条件下におけるウエスタンブロットから、より高次の凝集体が観察された。単量体のＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５を以下のように調製した。ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５（３２０μｇ）をＰＢＳ中に、１０ｍＬの最終用量まで希釈し、そしてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３０（Ａｍｉｃｏｎ）中で回転した。次いで、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０を用いて濾液を濃縮し、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５の濃度が５５５ｎＭである５００μＬの画分に導いた。単量体からのオリゴマーの分離の効力を、ウエスタンブロッティング（非還元条件）によって評価し、そして上の５に記載されるようにタンパク質濃度を決定した。
【０１６９】
（実施例２  ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５との二量体化）
全ての試験分析物の希釈のために、ＨＢＳ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）を含む流動緩衝液を用いる、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭバイオセンサー（例えば、米国特許第６，１６５，３３５号明細書および関連する特許を参照のこと）を用いて、表面プラスモン共鳴調査を行った。
【０１７０】
抗ｈＴＧＦ−βＲＩＩ抗体を、標準のアミン結合手順を用いてＣＭ５バイオセンサーチップ表面に結合し、そして流速を５μＬ／分に設定した。０．０５ＭのＮＨＳ／０．２ＭのＥＤＣ混合物（２５μＬ）を含む連続的な注入に続いて、所望の結合量に達する（３５００ＲＵを超える）まで、１０ｍＭ酢酸（ｐＨ４．０）中の抗ｈＴＧＦ−βＲＩＩ抗体の注入（２０μｇ／ｍＬ）を行った。次いで、残留する活性カルボキシル基をブロックするために、０．１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５、３５μＬ）の溶液を用いた。コントロールのデキストラン表面をまた、抗ｈＴＧＦ−βＲＩＩ抗体溶液を流動緩衝液に代えることで生成した。
【０１７１】
次いで、流速５μＬ／分にて３つの調査を行った：
１−抗ＴＧＦ−βＲＩＩ抗体表面およびコントロール表面上に、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５（２００ｎＭ、２５μＬ）を注入し（図４Ａ中の「１」）、続いてＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５を注入し（２００ｎＭ、２５μＬ；図４Ａ中の「２」）、そしてもう一回ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５を注入した（２００ｎＭ、２５μＬ；図４Ａ中の「３」）。
２−抗ＴＧＦ−βＲＩＩ抗体表面およびコントロール表面上に、タグを付けないｈＴβＲＩＩ  ＥＤ（１μＭ、２５μＬ）を注入し（図４Ｂ中の「１」）、続いてＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５を注入した（２００ｎＭ、２５μＬ；図４Ｂ中の「２」）。
３−抗ＴＧＦ−βＲＩＩ抗体表面およびコントロール表面上に、５種の異なるＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５濃度（３１ｎＭ、６２ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、それぞれ１５μＬ；図４Ｃ中の「１〜５」）の溶液を連続的に注入し、続いてＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５を注入した（５０ｎＭ、１５μＬ；図４Ｃ中の「６」）。
【０１７２】
異なる実験の間の再生を、２０ｍＭのＨＣｌ（１００μＬ／分にて２５μＬ）の２回のパルス、続いてＢＩＡＣＯＲＥの説明書に従って行ったＥＸＴＲＡＣＬＥＡＮ手順およびＲＩＮＳＥ手順によって行った。結果を図４Ａ〜４Ｃに示す。
【０１７３】
（実施例３  ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５融合タンパク質およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５融合タンパク質の結合動力学）
（Ａ．ＴＧＦ−β１のＣＭ５バイオセンサーチップ上への固定化）
別に記載したように（Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６、２９６３２−２９６４３（２００１））、標準のアミン結合手順を用いて、ＣＭ５センサーチップ上のＴＧＦ−β１表面およびコントロールのデキストラン表面を調製した。
【０１７４】
（Ｂ．動力学アッセイ）
（１．ＴＧＦ−β１上への、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５、またはＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５およびＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の等モル混合物の注入）
全ての動力学実験を、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５注入の場合には流速５μＬ／分で、およびＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５−ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５混合物注入の場合には５０μＬ／分で、２５℃において行った。異なる濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５（９．８ｎＭ、１４．８ｎＭ、２２．２ｎＭ、３３．３ｎＭ、５０ｎＭ）、または等モル濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５と混合したＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５（０〜５０ｎＭ）を、ＴＧＦ−β１表面およびコントロール表面上に２連でランダムに注入し（２４０秒の注入）、続いて３６０秒間、分析物溶液を緩衝液で置換した。連続的な注入のためのセンサーチップの再生は、２パルスのＨＣｌ（２０ｍＭ、１２０秒）、続いてＢＩＡＣＯＲＥ説明書に従って行ったＥＸＴＲＡＣＬＥＡＮ手順によって達成した。結果を図５Ａ〜５Ｆに示す。
【０１７５】
（２．ＴＧＦ−β１上への、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５、またはＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５およびＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の等モル混合物の注入）
動力学実験を、流速１００μＬ／分にて２５℃において行った。異なる濃度のＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５（０〜５００ｎＭ）、または等モル濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５  Ｋ５と混合したＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−（０〜１５０ｎＭ）を、ＴＧＦ−β１表面およびコントロール表面上に２連でランダムに注入し（１５０μＬの注入）、続いて分析物溶液を、少なくとも２１０秒間緩衝液で置換した。連続的な注入のためのセンサーチップの再生は、２パルスのＨＣｌ（２０ｍＭ、１２０秒）、続いてＢＩＡＣＯＲＥ説明書に従って行ったＥＸＴＲＡＣＬＥＡＮ手順によって達成した。結果を図６Ａ〜６Ｄに示す。
【０１７６】
（Ｃ．データ調製および解析）
センサーグラムを調製し、そして非線形最小二乗解析、およびＳＰＲｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（著作権）ソフトウェアパッケージを用いた微分速度方程式（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒａｔｅ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）の数的な積分を用いて、全体的に適合させた。データの調製を、「二重参照」法（Ｋｈａｌｅｇｈｐｏｕｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：５２００−５２１３、（２００１））を用いて行った。手短に言うと、コントロール表面を用いて生成されたそれぞれのセンサーグラムを、対応する実験的なセンサーグラムから減算し、結果として生じる曲線を濃度単位に変換した。最終的に、緩衝液の注入に対応するカーブを、コントロール表面の補正した曲線から減算した。次いで、同一の表面上への異なる濃度の分析物の注入に由来するセンサーグラムからなる、それぞれのデータセットを、ＳＰＲｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（著作権）ソフトウェアで利用可能な、数個の動力学モデルを用いて解析した。
【０１７７】
必要に応じて、異なる動力学モデルの使用から得られた適合の良いところを、他で記された以下の３つの統計学的値（Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｊ．Ｖ．、Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ−Ｆｒｅｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｓ、Ｎｅｗ−Ｊｅｒｓｅｙ、（１９６８））を用いて比較し、そして、それが同じデータセットを適合するために異なる動力学モデルを用いる場合の適合の質の分析に適切であることを示した（Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６、２９６３２−２９６４３（２００１））：
１）残差の標準偏差：Ｓ．Ｄ．。
２）「＋または−符号」統計量（Ｚ１）。
３）「上昇および下降（Ｒｕｎ  ｕｐ  ａｎｄ  ｄｏｗｎ）」統計量（Ｚ２）。
【０１７８】
（Ｄ．ＴＧＦ−β１上への、Ｋ５ｏｘとプレインキュベートしたＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の注入）
（１．Ｋ５ｏｘを与えるための、ＣＧＧＫ５コイル（配列番号２０）の酸化）
システインリンカーを有するＫ５コイル（２０ｍｇ、配列番号２０）を、室温にてｐＨ８．０で１００ｍＭの炭酸水素アンモニウム２ｍＬに溶解した。反応混合液のアリコートを、酸化の進行をモニターするために、分析用のＣ１８ＨＰＬＣシステムに、規則的な間隔をもって適用した。ペプチドの酸化を、９０％完了するまでか、または１２時間まで、進行させたままにした。酸化の終点において、溶液をｐＨ６に酸性化させるために、酢酸を混合液に加えた。次いで、このペプチドを凍結乾燥し、そして使用に先立ってＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。
【０１７９】
（２．Ｋ５ｏｘとプレインキュベートしたＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の結合）
３００ｎＭのＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５を、種々の濃度のＫ５ｏｘ（０ｎＭ、５０ｎＭ、１５０ｎＭ、９００ｎＭ）とプレインキュベートし、そして結果として生じた溶液を、ＴＧＦ−β１を有するＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー表面上およびコントロール表面上に２連でランダムに注入し（１５μＬの注入）、続いて、分析物溶液を緩衝液で３６０秒間置換した。センサーチップの再生は、上に記載したように行った。結果を図７に示す。
【０１８０】
（実施例４  融合タンパク質、ホモ二量体、およびヘテロ二量体の拮抗性効力）
ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合したＰＡＩ−１プロモーターを安定にトランスフェクトされたミンク肺上皮細胞（ＭＬＥＣ）（Ａｂｅ，Ｍ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１６：２７６−２８４、（１９９４））を、５％のウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ／５％  ＦＢＳ）中の９６ウェル組織培養プレート（２×１０４細胞／ウェル）にプレートした。上記ＭＬＥＣを、５％ＣＯ２大気中で３７℃にて少なくとも５時間、付着させたままにした。次いで細胞をＰＢＳで洗浄した。次いで、以下の添加と共に１時間プレインキュベートした、ＤＭＥＭ／１％  ＦＢＳ／０．１％  ＢＳＡ中のＴＧＦ−β１（１０ｐＭ）を、細胞に加えた：
Ａ）種々の濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５、またはＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５等モル混合物（図８Ａ）；
Ｂ）種々の濃度のＫ５ｏｘを有する、１５０ｎＭのＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の非存在下においてまた、同じ一連の実験を行った（図８Ｂ）。
Ｃ）種々の濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５を有する、１５０ｎＭのＫ５ｏｘ（図８Ｃ）。
Ｄ）種々の濃度のＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５、またはＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５等モル混合物（図８Ｄ）。
Ｅ）種々の濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５を有する、１５０ｎＭのＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５（図８Ｅ）。
【０１８１】
一晩のインキュベートの後、培養液を除き、そして細胞をＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した。次いで細胞を溶解し、そしてＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを製造業者の使用説明書に従って用いて、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。発光を、Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０１  照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、ＵＳＡ）によって測定した。この活性を、アンタゴニストの非存在下におけるＴＧＦ−β１の活性の割合として表した。結果を図８Ａ〜８Ｅに示す。
【０１８２】
拮抗の挙動が観察される場合、見かけ上のＩＣ５０を、以下の式を用いて実験データの点に適合させることで決定した：反応＝底辺＋（頂点−底辺）／（１＋［インヒビター］／ＩＣ５０）、ここで、反応は、上に定義したシグナル伝達の算出された割合に対応し、そして［インヒビター］はアンタゴニストの濃度である。頂点、底辺、およびＩＣ５０はパラメーターとしてセットであり、そして、それぞれ最大シグナル値および最低シグナル値、ならびに見かけ上のＩＣ５０値に対応する。ＥｘｃｅｌＴＭソルバー（ｓｏｌｖｅｒ）ツールを用いて、（Ｅｘｐ−反応）／Ｅｘｐの合計を最小化することで、非線形回帰によって上記データを適合させ、ここでＥｘｐは、所与のアンタゴニスト濃度に対する実験データの点の値に対応する。結果は表３にある。
【０１８３】
（実施例５  ＤＮＡ構成物、ならびにＴＧＦ−βキナーゼドメイン融合タンパク質および二量体の生成のための、バキュロウイルス発現ベクターの構築）
ＩＩ型ＴＧＦ−βレセプターキナーゼドメインに融合したＮ末端性Ｅコイル、およびＩ型ＴＧＦ−βレセプターキナーゼドメインに融合したＮ末端性Ｋコイルからなる融合タンパク質を、それぞれ配列番号２１（ｐＡＥｃｏｉｌＲＩＩ−ＫＤ（ΔＴＭ）＃５）または配列番号２２（ｐＡＫｃｏｉｌＲＩ−ＫＤ（ΔＴＭ）＃２）をコードする哺乳動物発現ベクターをテンプレートとして用いたＰＣＲによって作製した。
【０１８４】
Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するＥコイル−ＩＩ型ＴＧＦβレセプターキナーゼドメインを、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＮｈｅＩ制限酵素部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を、それぞれプライマー配列５’ＥＩＩＨｉｓおよび３’ＥＩＩＨｉｓにおいて下線を引いた：
５’ＥＩＩＨｉｓ
【０１８５】
【表８】
2007503820.tif 000010
（配列番号２７）
および
３’ＥＩＩＨｉｓ：
【０１８６】
【表９】
2007503820.tif 000011
（配列番号２８）
Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するＫコイル−Ｉ型ＴＧＦβレセプターキナーゼドメインを、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＮｈｅＩ制限酵素部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を、それぞれプライマー配列５’ＫＩＨｉｓおよび３’ＥＩＨｉｓにおいて下線を引いた：
５’ＫＩＨｉｓ
【０１８７】
【表１０】
2007503820.tif 000012
（配列番号２９）
および
３’ＫＩＨｉｓ
【０１８８】
【表１１】
2007503820.tif 000013
（配列番号３０）
結果として生じた断片をＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして同じ酵素で消化したｐＢｌｕｅＢａｃ  ４．５ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合した。次いで、ｐＢｌｕｅＢａｃ−ＴＧＦβＲＩＫＤ−ＫおよびｐＢｌｕｅＢａｃ−ＴＧＦβＲＩＩＫＤ−Ｅを形成するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）に結合を形質転換した。Ｍａｘｉｐｒｅｐカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製し、そして配列決定によって検証した。
【０１８９】
Ｓｆ９昆虫細胞を用いたトランスフェクトおよびバキュロウイルス発現を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手されるＭａｘＢａｃ  ２．０  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ説明書に従って行った。組換えタンパク質の精製を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースアフィニティーカラムを用いて行った。
【０１９０】
ＴＧＦ−βレセプターＩ−Ｋコイル融合タンパク質、ＴＧＦ−βレセプターＩＩ−Ｅコイル融合タンパク質、上記二つの融合タンパク質の混合、および／または共発現したＴＧＦ−βレセプターＩ−Ｋコイル／ＴＧＦ−βレセプターＩＩ−Ｅコイル融合タンパク質のそれぞれの等量を、Ｐ３３−γＡＴＰの存在下で、３０℃において３０分間、別々にインキュベートした。次いで、それぞれの反応サンプルのアリコートを、還元条件下において、８％アクリルアミドゲル中で電気泳動した。ゲルを乾燥し、そしてリン酸化されたキナーゼを蛍光物質画像化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）によって検出した。結果を図９に示し、ここで、Ｉ型レセプターおよびＩＩ型レセプターの位置を右側に示す。
【０１９１】
（実施例６  哺乳動物細胞中におけるインヒビター感受性の解析のための、ＥＧＦＲ細胞質ドメイン融合タンパク質および二量体の発現のためのＤＮＡ構造物の構築）
（Ａ．ＤＮＡ構築物および融合タンパク質の調製）
コイル化ｅｒｂＢ１細胞質ドメイン発現構築物の生成のために用いられるサブクローン化戦略を、以下に示す：
工程１．ｅｒｂＢ１細胞質ドメインを、ヒトＥＧＦＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ  ００５２２８）由来の全長ｃＤＮＡをコードするｐｃＤＮＡ３−ｅｒｂＢ１哺乳動物発現ベクターから、以下のＸｈｏＩ（５’）プライマー、およびＨｉｓでタグを付けたＮｈｅＩ（３’）プライマー（制限酵素部位に下線を引いた）によってＰＣＲ増幅した。
５’ＸｈｏＩＥＧＦＲ
【０１９２】
【表１２】
2007503820.tif 000014
（配列番号３５）
３’ＮｈｅＩ  ＥＧＦＲ−ＨＩＳ６Ｃ
【０１９３】
【表１３】
2007503820.tif 000015
（配列番号３６）
工程２．Ｋ５−ＴＧＦβＲＩキナーゼ（配列番号２２）またはＥＧ−ＴＧＦβＲＩＩキナーゼ（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡを含むｐＧｅｍＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ｐＧｅｍＴ／Ｋ５−ＲＩＫＤおよびｐＧｅｍＴ／Ｅ５−ＲＩＩＫＤ−Ｅ５−ＴＧＦ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｎｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａの所有権）を、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）で制限し、ＲＩキナーゼドメインおよびＲＩＩキナーゼドメインを除いた。Ｘｈｏ１−Ｎｈｅ１（平滑末端）で制限したｅｒｂＢ１細胞質ドメインＰＣＲ生産物（工程１）を、この部位に挿入した。
【０１９４】
工程３．結果として生じたｐＧｅｍｔ／Ｅ５−またはＫ５−コイル化ｅｒｂＢ１ＣＤプラスミドのＮｈｅＩ−Ｎｏｔ１断片を、ｐＴＴ２哺乳動物発現ベクター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａの所有権）のＮｈｅＩ−Ｎｏｔ１部位にサブクローン化し、ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５融合タンパク質（配列番号３１）をコードするｐＴＴ２／Ｋ５−ｅｒｂＢ１ＣＤ構築物、およびカルボキシル末端性Ｈｉｓタグペプチド配列に付着した、Ｅ５−ｅｒｂＢ１ＣＤ融合タンパク質（配列番号３４）をコードするｐＴＴ２／Ｅ５−ｅｒｂＢ１ＣＤ構築物を生成した。結合後、プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）に形質転換し、ＣＯＮＣＥＲＴプラスミドＤＮＡ精製カラム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて精製し、そして配列決定により確かめた。
【０１９５】
天然の（非コイル化）ｅｒｂＢ１細胞質ドメイン発現構築物の生成のために用いられるサブクローン化戦略を、以下に示す：
工程１．ｅｒｂＢ１細胞質ドメインを、ヒトＥＧＦＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ  ００５２２８）の全長ｃＤＮＡをコードするｐｃＤＮＡ３−ｅｒｂＢ１哺乳動物発現ベクターから、以下のＸｂａＩ（５’）プライマーおよびＨｉｓでタグを付けたＮｈｅＩ（３’）プライマー（制限部位に下線を引いた）を用いてＰＣＲ増幅した。
５’ＸｂａＩＥＧＦＲ
【０１９６】
【表１４】
2007503820.tif 000016
（配列番号３７）
３’ＮｈｅＩＥＧＦＲ−ＨＩＳ６Ｃ
【０１９７】
【表１５】
2007503820.tif 000017
（配列番号３６）
工程２．ＸｂａＩおよびＮｈｅＩで制限したＰＣＲ産物をｐＴＴ２哺乳動物発現ベクター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａの所有権）にサブクローン化し、カルボキシル末端Ｈｉｓタグペプチド配列に付着したｅｒｂＢ１の細胞質ドメインをコードするｐＴＴ２／ｅｒｂＢ１ＣＤ＃２構築物を生成した。結合の後、プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）に形質転換し、ＣＯＮＣＥＲＴプラスミドＤＮＡ精製カラム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて精製し、そして配列決定により確かめた。
【０１９８】
（Ｂ．インヒビター試験のための、ＥＧＦＲ融合タンパク質および二量体の発現および解析）
ヒト胚性腎臓２９３細胞を、前日に２４ウェル組織培養皿中に５×１０（５）細胞／ウェルでプレートし、そしてそれぞれの示したプラスミド５００ｎｇをトランスフェクトした：（１）ｐＴＴ２／ｅｒｂＢ１ＣＤ＃２、（２）ｐＴＴ２／Ｋ５−ｅｒｂＢ１ＣＤ＃２およびｐＴＴ２／Ｅ５−ｅｒｂＢ１ＣＤ＃３、ならびに（３）ｐｃＤＮＡ３−ｅｒｂＢ１。１００ｎｇのＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミドに加えて、ｐｃＤＮＡ３ベクターを、全てで１．５μｇのＤＮＡ量に必要なだけ加えた。トランスフェクトを、ポリエチレンイミンを過去に記載した（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（２）：Ｅ９（２００２））ように用いて行った。トランスフェクトの２４時間後、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中のｅｒｂＢ１キナーゼインヒビターＡＧ１４７８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を５００ｎＭ加え、そして一晩インキュベートした。ビヒクルのコントロールとして、細胞をまた０．１％ＤＭＳＯと共にインキュベートした。一晩のインキュベート（約２０時間）に続いて、熱した２％ＳＤＳで細胞を溶解した。ｐｃＤＮＡ３中の全長ｅｒｂＢ１  ｃＤＮＡをトランスフェクトした場合には、収集の前に、細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）の存在下で処理した。
【０１９９】
種々のトランスフェクトからの細胞溶解物を、還元条件下における８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でのタンパク質の分離に続くウエスタンブロットによって解析した。結果を図１０Ｃ〜１０Ｄに示し、ここで、ＥＧＦＲ自己リン酸化へのインヒビターの効果の測定にホスホチロシン検出（抗ホスホチロシン４Ｇ１０、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を用い、そしてそれぞれのサンプル中のトランスフェクトされたＥＧＦＲのレベルの測定に、抗ＥＧＦレセプター細胞質ドメイン抗体（ｓｃ−０３、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）によるＥＧＦＲ検出を用いた。
【０２００】
本発明は、特定の実施形態に関して記載したが、種々の変化および改変が、本発明から離れることなく成され得ることが、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】図１Ａは、ＩＩ型トランスフォーミング増殖因子βレセプターの外部ドメイン（ＴβＲＩＩＥＤ）およびＥ５コイルを含む融合タンパク質のアミノ酸配列（ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５；配列番号１）を示し、ここで残基１〜２６は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔｅｉｎデータベース（受託番号：Ｐ３７１７３）において用いられる番号付けに従って、ＴβＲＩＩ配列（配列番号２）の残基１〜２６に対応し；ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の残基２７〜３６（下線）はｍｙｃタグ（配列番号３）に対応し；ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の残基３７〜１７０はＳｗｉｓｓ−ＰｒｏｔｅｉｎデータベースにおけるＴβＲＩＩ配列の残基２７〜１６０に対応し；残基１７１〜１８１（下線）は１１アミノ酸のリンカー（配列番号４）に対応し；残基１８２〜２１６はＥ５コイル（配列番号５）に対応し；そして残基２１７〜２２４は、Ｅ５コイル配列から２残基のグリシンで分けられたＨｉｓタグ（下線）（配列番号５）に対応する。図１Ｂは、ＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βレセプターの外部ドメイン（ＴβＲＩＩＥＤ）およびＫ５コイルを含む融合タンパク質のアミノ酸配列（ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５；配列番号７）を示す。残基１〜２６は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔｅｉｎデータベース（受託番号：Ｐ３７１７３）において用いられる番号付けに従って、ＴβＲＩＩ配列（配列番号２）の残基１〜２６に対応し；ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５の残基２７〜３６（下線）はｍｙｃタグ（配列番号３）に対応し；ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５の残基３７〜１７０はＳｗｉｓｓ−ＰｒｏｔｅｉｎデータベースにおけるＴβＲＩＩ配列の残基２７〜１６０に対応し；残基１７１〜１８１（下線）は１１アミノ酸のリンカー（配列番号４）に対応し；残基１８２〜２１６はＫ５コイル（配列番号３）に対応し、そして残基２１７〜２２４は、Ｋ５コイル配列から２残基のグリシンで分けられたＨｉｓタグ（下線）（配列番号６）に対応する。図１Ｃは、ＩＩ型トランスフォーミング増殖因子−βレセプターの外部ドメインの膜近位領域（ＭＰ−ＴβＲＩＩＥＤ）およびＫ５コイルを含む融合タンパク質のアミノ酸配列（ＭＰ−ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５；配列番号９）を示す。残基１〜２５は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔｅｉｎデータベース（受託番号：Ｐ２６３４２）において用いられる番号付けに従って、ラットＴβＲＩＩＩ配列（配列番号１０）の残基１〜２５に対応し；ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５の残基２６〜３５（下線）はｍｙｃタグ（配列番号３）に対応し；ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５の残基３６〜２４２はＳｗｉｓｓ−ＰｒｏｔｅｉｎデータベースにおけるラットＴβＲＩＩＩ配列の残基５７６〜７８２に対応し；残基２４３〜２５３（下線）は１１アミノ酸のリンカー（配列番号４）に対応し；残基２５４〜２８８はＫ５コイル（配列番号３）に対応し；そして残基２９１〜２９６は、Ｋ５コイル配列から２残基のグリシンで分けられたＨｉｓタグ（下線）（配列番号６）に対応する。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、標準のＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いた、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５融合タンパク質（配列番号１）の精製を示す。図２Ａは、タンパク質を４〜１２％の勾配ゲル（還元状態）上で分離した後での、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の精製の間に収集された種々の画分のクーマシーブルー染色を示す。レーンＷ１およびレーンＷ２は、２つの最初の緩衝液Ａ洗浄工程に対応し；レーンＦＴは、最後のカラム充填の後のフロースルーに対応し；レーン１は第一の溶出に対応する。図２Ｂは、タンパク質を１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元状態）上で分離した後での、精製の間に収集された種々の画分のウエスタンブロッティングの結果を示し、ここで一次抗体には抗ｍｙｃ抗体を、二次抗体には西洋わさびペルオキシダーゼと結合体化したヤギ抗マウス抗体を用いた。レーン１は第一の溶出（図２Ａのレーン１におけるものと同じサンプル）に対応し、そしてレーン２およびレーン３はそれぞれ、第二の溶出および第三の溶出に対応する。
【図３】図３Ａ〜３Ｇは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５（配列番号７）およびＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５（配列番号９）の精製を示す。ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５タンパク質をＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出し、そして１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を非還元条件下（図３Ａ）および還元条件下（図３Ｂおよび図３Ｃ）で電気泳動し、続いてウエスタンブロッティング（図３Ａおよび図３Ｂ；一次抗体および二次抗体は図２の通り）または銀染色（図３Ｃ）を行った。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３０デバイスで分離した後、単量体のＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５の１０μＬアリコートを、非還元条件下にて１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動し（図３Ｄ）、レーンＡに示すサンプルの１／１５希釈の１０μＬもまた比較のために電気泳動した（図３Ｅ）。Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出されたＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５タンパク質を、非還元条件下で１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にて電気泳動し、続いてウエスタンブロッティング（一次抗体：抗ｍｙｃ；二次抗体：西洋わさびペルオキシダーゼと結合体化されたヤギ抗マウス；図３Ｆ）および銀染色（図３Ｇ）を行った。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、二量体化を任意の共鳴ユニット（ＲＵ）において時間の関数として示す、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー調査から生成されたセンサーグラムである。図４Ａでは、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５（配列番号９）を、抗ＴＧＦ−βＲＩＩ抗体充填バイオセンサー表面（「１」）およびコントロール表面上に注入し、続いてＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５（配列番号１）を注入（「２」）し、そして他のＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５を注入（「３」）した。図４Ｂでは、タグをつけていないｈＴβＲＩＩ  ＥＤを、抗ＴＧＦ−βＲＩＩ抗体充填バイオセンサー表面およびコントロール表面上に注入し（「１」）、続いてＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５（「２」）を注入した。図４Ｃでは、５種類の濃度のＴβＲＩＩ  ＥＤ−Ｅ５コイル溶液を連続的に、抗ＴＧＦ−βＲＩＩ充填バイオセンサー表面およびコントロール表面上に注入し（「１〜５」）、続いてＴβＲＩＩ  ＥＤ−Ｋ５を注入した（「６」）。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｆは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５のＴＧＦ−β１との結合相互作用（図５Ａ〜５Ｃ）、およびＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩ−Ｅ５のＴＧＦ−β１との結合相互作用（図５Ｄ〜５Ｆ）の動力学的解析の結果を示す。プロットは、センサー表面に結合したＴＧＦ−β１の表面プラスモン共鳴バイオセンサーから生成されたセンサーグラムである。相互作用の程度は、時間の関数として、任意の共鳴ユニット（ＲＵ）に示される。図５Ａは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴＧＦ−β１相互作用センサーグラムの全体的なあてはめであり、ここで、９．９〜５０ｎＭの範囲の異なる濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５が、２５０ＲＵの結合したＴＧＦ−β１上、およびコントロールの表面上に、（緩衝液の注入に加えて）注入された。点は、データ調製の後の共鳴ユニットに対応し、そして実線は、データセットを２対１の化学量論モデルに全体的にあてはめさせる場合のあてはめを表す。図５Ｂは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴＧＦ−β１相互作用の、２対１の化学量論モデルへの全体的なあてはめからの残差を示す。図５Ｃは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴＧＦ−β１相互作用の、単純な１対１モデルへの全体的なあてはめからの残差を示す。図５Ｄは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５のＴＧＦ−β１との相互作用のセンサーグラムの全体的なあてはめであり、ここで、等量のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５とプレインキュベートした、９．９〜５０ｎＭの範囲の異なる濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５が、同じＴＧＦ−β１表面上、およびコントロールの表面上に注入された。点は、データ調製の後に得られた共鳴ユニットであり、そして実線は、データセットを再構成モデルに全体的にあてはめさせる場合の適合を表す。図５Ｅは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５のＴＧＦ−β１との相互作用のセンサーグラムの、再構成モデルとの全体的なあてはめからの残差を示す。図５Ｆは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５のＴＧＦ−β１との相互作用の、親和力モデルとの全体的なあてはめからの残差を示す。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｆは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５のＴＧＦ−β１との結合相互作用（図５Ａ〜５Ｃ）、およびＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩ−Ｅ５のＴＧＦ−β１との結合相互作用（図５Ｄ〜５Ｆ）の動力学的解析の結果を示す。プロットは、センサー表面に結合したＴＧＦ−β１の表面プラスモン共鳴バイオセンサーから生成されたセンサーグラムである。相互作用の程度は、時間の関数として、任意の共鳴ユニット（ＲＵ）に示される。図５Ａは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴＧＦ−β１相互作用センサーグラムの全体的なあてはめであり、ここで、９．９〜５０ｎＭの範囲の異なる濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５が、２５０ＲＵの結合したＴＧＦ−β１上、およびコントロールの表面上に、（緩衝液の注入に加えて）注入された。点は、データ調製の後の共鳴ユニットに対応し、そして実線は、データセットを２対１の化学量論モデルに全体的にあてはめさせる場合のあてはめを表す。図５Ｂは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴＧＦ−β１相互作用の、２対１の化学量論モデルへの全体的なあてはめからの残差を示す。図５Ｃは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴＧＦ−β１相互作用の、単純な１対１モデルへの全体的なあてはめからの残差を示す。図５Ｄは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５のＴＧＦ−β１との相互作用のセンサーグラムの全体的なあてはめであり、ここで、等量のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５とプレインキュベートした、９．９〜５０ｎＭの範囲の異なる濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５が、同じＴＧＦ−β１表面上、およびコントロールの表面上に注入された。点は、データ調製の後に得られた共鳴ユニットであり、そして実線は、データセットを再構成モデルに全体的にあてはめさせる場合の適合を表す。図５Ｅは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５のＴＧＦ−β１との相互作用のセンサーグラムの、再構成モデルとの全体的なあてはめからの残差を示す。図５Ｆは、ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５のＴＧＦ−β１との相互作用の、親和力モデルとの全体的なあてはめからの残差を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、ＴＧＦ−β１とＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５との結合相互作用、またはＴＧＦ−β１と、等モル濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５とプレインキュベートしたＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５との結合相互作用を示す、バイオセンサーセンサーグラムである。図６Ａは、異なる濃度のＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５（配列番号９）に対する時間の関数としての、任意の共鳴ユニット（ＲＵ）を示す。図６Ｂ〜６Ｃは、ＭＰ−ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５コイル／ＴＧＦ−β１相互作用の、再構成モデルとの全体的な適合からの残差を（図６Ｂ）、および単純な１対１モデルとの全体的な適合からの残差（図６Ｃ）を示す。図６Ｄは、同量のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５とプレインキュベートした、異なる濃度のＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５に対する時間の関数としてのＲＵを示す。
【図７】図７は、（１）ＴＧＦ−β１に結合したＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の；および、（２）５０ｎＭのＫ５ｏｘとＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５のプレインキュベーション後にＴＧＦ−β１に結合したＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の；（３）１５０ｎＭのＫ５ｏｘとＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５のプレインキュベーション後にＴＧＦ−β１に結合したＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の；または（４）９００ｎＭのＫ５ｏｘとＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５のプレインキュベーション後にＴＧＦ−β１に結合したＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５の、時間の関数としての任意の共鳴ユニット（ＲＵ）としての、結合相互作用を示したバイオセンサーセンサーグラムである。
【図８】図８Ａは、融合タンパク質アンタゴニストＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５（白菱形）、および融合タンパク質アンタゴニストＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５（白三角）についての、ならびに、アンタゴニストホモ二量体ＴβＲＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５（等モル混合物、黒四角）についての、アンタゴニスト濃度（ｎＭ）の関数としての、％で表した、相対的ルシフェラーゼ活性を示す。図８Ｂは、Ｋ５ｏｘ単独（白四角）についての、およびＫ５ｏｘを含む１５０ｎＭのＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５（黒四角）についての、ｎＭで表した、Ｋ５ｏｘ濃度の関数としての、％相対的ルシフェラーゼ活性を示す。図８Ｃは、種々の濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５を含む、１５０ｎＭのＫ５ｏｘについての、％相対的ルシフェラーゼ活性を示す。図８Ｄは、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５（白四角）についての、および、種々の濃度の、ＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５／ＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５等モル混合物（黒四角）についての、％相対的ルシフェラーゼ活性を示す。図８Ｅは、種々の濃度のＴβＲＩＩＥＤ−Ｅ５を含む、１５０ｎＭのＭＰ−ＴβＲＩＩＩＥＤ−Ｋ５についての、％相対的ルシフェラーゼ活性を示す。
【図９】図９は、コイルドコイルポリペプチドのペプチドサブユニット（Ｋ５またはＥ５）でタグを付けたＴＧＦ−βレセプターＩまたはＴＧＦ−βレセプターＩＩのキナーゼドメインのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動であり、ここで、レーン１はＫ５ペプチドサブユニットと結合したＴＧＦ−βレセプターＩであり；レーン２はＥ５ペプチドサブユニットでタグを付けたＴＧＦ−βレセプターＩＩであり；レーン３はＴＧＦ−βレセプターＩ−Ｋ５およびＴＧＦ−βレセプターＩＩ−Ｅ５の混合物であり；そして、レーン４は、共発現したＴＧＦ−βレセプターＩ−Ｋ５およびＴＧＦ−βレセプターＩＩ−Ｅ５のサンプルである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３１）を示す。ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５残基１〜６（下線）は６アミノ酸リンカー（配列番号３２）に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５残基７〜４１はＫ５コイル（配列番号８）に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５残基４２〜４８（下線）は７アミノ酸リンカー（配列番号３３）に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５残基４９〜５９０は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベース（受託番号Ｐ００５３３）にて用いられる番号付けに従い、ヒトｅｒｂＢ１配列の細胞質ドメインを含む残基６６９〜１２１０に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｋ５残基５９１〜５９６（下線）は、６アミノ酸Ｈｉｓタグペプチド配列に対応する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ｅｒｂＢ１細胞質ドメイン−Ｅ５（ｅｒｂＢ１Ｃｄ−Ｅ５）融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｅ５残基１〜６（下線）は６アミノ酸リンカー（配列番号３２）に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｅ５残基７〜４１はＥ５コイル（配列番号５）に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｅ５残基４２〜４８（下線）は７アミノ酸リンカー（配列番号３３）に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｅ５残基４９〜５９０は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベース（受託番号Ｐ００５３３）にて用いられる番号付けに従い、ヒトｅｒｂＢ１配列の細胞質ドメインを含む残基６６９〜１２１０に対応し；ｅｒｂＢ１ＣＤ−Ｅ５残基５９１〜５９６（下線）は、６アミノ酸Ｈｉｓタグペプチド配列に対応する。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、異なるｅｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）構造物をトランスフェクトしたヒト胚性腎臓２９３細胞における、ＡＧ１４７８インヒビターアッセイの結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットである：レーン１〜２：インヒビターＡＧ１４７８を含まないｅｒｂＢ１キナーゼドメイン（レーン１、コントロール）、およびインヒビターＡＧ１４７８を含むｅｒｂＢ１キナーゼドメイン（レーン２）；レーン３〜４：インヒビターを含まないｅｒｂＢ１−Ｋ５／ｅｒｂＢ１−Ｅ５コイルドコイル二量体（レーン３、コントロール）、およびインヒビターを含むｅｒｂＢ１−Ｋ５／ｅｒｂＢ１−Ｅ５コイルドコイル二量体（レーン４）；レーン５〜６：インヒビターを含まない全長ｅｒｂＢ１（ポジティブコントロール）（レーン５）、およびインヒビターを含む全長ｅｒｂＢ１（レーン６）。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、異なるｅｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）構造物をトランスフェクトしたヒト胚性腎臓２９３細胞における、ＡＧ１４７８インヒビターアッセイの結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットである：レーン１〜２：インヒビターＡＧ１４７８を含まないｅｒｂＢ１キナーゼドメイン（レーン１、コントロール）、およびインヒビターＡＧ１４７８を含むｅｒｂＢ１キナーゼドメイン（レーン２）；レーン３〜４：インヒビターを含まないｅｒｂＢ１−Ｋ５／ｅｒｂＢ１−Ｅ５コイルドコイル二量体（レーン３、コントロール）、およびインヒビターを含むｅｒｂＢ１−Ｋ５／ｅｒｂＢ１−Ｅ５コイルドコイル二量体（レーン４）；レーン５〜６：インヒビターを含まない全長ｅｒｂＢ１（ポジティブコントロール）（レーン５）、およびインヒビターを含む全長ｅｒｂＢ１（レーン６）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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