(57)【要約】本発明は、糸状菌、特に線虫捕食菌類用の培地を提供することであり、それにより、高生産高で、短期間に産業レベルでそのような微生物を製造することを可能にし、その結果、最終製品のコストを低減させることができる。しなわち、本発明は、糖蜜、麦芽エキス及び蔗糖からなる群から選択される少なくとも１つの炭素源ならびにイースト抽出物及びコーン・スティープ・リカーから選択される少なくとも１つの有機窒素源を含む糸状菌用培地である。【図面】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖蜜、麦芽エキス及び蔗糖からなる群から選択される少なくとも１つの炭素源ならびにイースト抽出物及びコーン・スティープ・リカーから選択される少なくとも１つの有機窒素源を含む糸状菌用培地。
【請求項２】
前記の少なくとも１つの炭素源は、培地の乾燥重量の７０〜８５重量％を構成し、前記の少なくとも１つの有機窒素源は、培地の乾燥重量の１５〜３０重量％を構成する請求項１の培地。
【請求項３】
さらに無機の窒素源を含む請求項１又は２の培地。
【請求項４】
無機の窒素源は、培地の乾燥重量の１０重量％未満、好ましくは、５〜８重量％の量で含まれる請求項３の培地。
【請求項５】
無機の窒素源は、硝酸アンモニウム又は塩からなる請求項３又は４の培地。
【請求項６】
７５〜８５％の麦芽エキス及び１５〜２５％のイースト抽出物、％は培地の乾燥重量の重さによる、からなる請求項１又は２の培地。
【請求項７】
６０〜６５％の糖蜜、１０〜１５％の蔗糖、１０〜１５％のコーン・スティープ・リカー及び１０〜１５％のイースト抽出物からなる培地。
【請求項８】
さらに、無機の窒素源の５〜８％を含む請求項７の培地。
【請求項９】
無機の窒素源がリン酸水素二アンモニウムからなる請求項８の培地。
【請求項１０】
２５〜３０％の麦芽エキス、４０〜４５％の糖蜜及び２５〜３０％のコーン・スティープ・リカーを含み、％は培地の乾燥重量の重さによる請求項１又は２の培地。
【請求項１１】
請求項１又は２の培地中に糸状菌の分生子を接種し、２３〜３０℃の温度で、５〜１０日間前記培地を保持して、前記菌の生殖及び成長を測定することを含む糸状菌、特に、線虫捕食菌を産業規模で製造する方法。
【請求項１２】
さらに、好ましくは分生子の接種後４日目から、徐々に少量の無機の窒素源を添加することを含む請求項１１の方法。
【請求項１３】
無機の窒素源は、硝酸アンモニウム及び塩からなり、該無機の窒素源を、培地の乾燥重量の１０％未満、好ましくは５〜８％の総量で添加する請求項１２に方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物検疫剤（phytosanitary agent）の技術分野に関する。
特に、本発明は、糸状菌（filamentous fungi）、より詳細には線虫捕食菌（nematophagus fungi）用の培地（culture medium）に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物検疫剤として微生物、特に真菌を用いることが、次第に慣習となってきている。
真菌ベースの製品が、すでに昆虫、植物検疫菌及び他の作物寄生虫（crop parasite）の対抗用に市販されている。
【０００３】
例えば、米国特許第５８１１０９２号には、線虫捕食菌が、糸状菌であるアルトロボトリス・コノイデス・ドレクスラー（Arthrobotrys conoides Dreschsler）の特定の株からなる、メロイドギネ（Meloidogyne）、ヘテロデラ（Hetherodera）及びディティレンカス（Ditylenchus）属の線虫に対して対抗することについて記載されている。
【０００４】
上述した線虫は、５０〜７０％の収穫損失を招くかもしれないということで、野菜及び菌類の重篤な病気に関与しており、莫大な経済損失を与えるかもしれない。
耕作に先駆けて土壌に対して適用するために、通常の抗寄生虫化学製品（例えば、臭化メチル、トリクロロニトロメタン、ジクロロプロペン等）又は農作物へ直接適用されるカルバメート類の使用に代えて、土壌の殺菌、生態系バランスの破壊ならびに人及び動物への潜在的毒性等の深刻な問題を防止することができる。
従って、農業用に利用できる、より安い線虫捕食菌を製造する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の根底の課題は、糸状菌、特に線虫捕食菌類用の培地を提供することであり、それにより、高生産高で、短期間に産業レベルでそのような微生物を製造することを可能にし、その結果、最終製品のコストを低減させることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、糖蜜、麦芽エキス及び蔗糖からなる群から選択される少なくとも１つの炭素源ならびにイースト抽出物及びコーン・スティープ・リカーから選択される少なくとも１つの有機窒素源を含む糸状菌用培地によって、上記課題を解決する。
【０００７】
好ましくは、少なくとも１つの炭素源は、培地の乾燥重量の７０〜８５重量％を構成し、少なくとも１つの有機窒素源は、培地の乾燥重量の１５〜３０重量％を構成する。
また、本発明の培地は、無機の窒素源（硝酸アンモニウムまたは塩類からなる）を含んでいてもよい。この無機の窒素源は、通常、培地の乾燥重量の１０重量％未満、通常、５〜８重量％の量で、菌が成長する間に徐々に培地に加えられる。
【０００８】
本発明の培地の好ましい組成は、７５〜８５％の麦芽エキス及び１５〜２５％のイースト抽出物（本記載の以下において、％は培地の乾燥重量の重さによる）からなる。
本発明の他の好ましい培地は、６０〜６５％の糖蜜、１０〜１５％の蔗糖、１０〜１５％のコーン・スティープ・リカー及び１０〜１５％のイースト抽出物からなる。有利には、そのような培地は、無機の窒素源、特にリン酸水素二アンモニウムの５〜８％をさらに含む。
本発明のさらに好ましい培地は、２５〜３０％のコーン・スティープ・リカーとともに、２つの炭素源、つまり、２５〜３０％の麦芽エキス及び４０〜４５％の糖蜜を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明について、限定されず、例示のためのいくつかの実施形態を参照しながら、さらに詳しく説明する。
実施例を例示する前に、我々は、本発明による培養培地の構成に関する若干の仕様を示すために役に立つと考える。
【００１０】
炭素源として、麦芽エキス及び／又は糖蜜及び／又は蔗糖を用いる。
麦芽エキスは、シリアル穀物（通常、大麦）の発芽によって得られる。発芽の時点で、特定の酵素（アミラーゼ）が生産され、それは澱粉を糖へ転化させることができる。麦芽エキスは、約６０％のマルトース、ビタミン及びいくつかのマイクロ栄養分を含む。
【００１１】
糖蜜は、砂糖産業の副産物を構成し、黒っぽい茶色の粘稠な液体の形態であり、１０％の水、３５％の蔗糖、２０％の他の糖及び１５％の灰を含む。
有機窒素源として、イースト抽出物及びコーン・スティープ・リカーを用いる。
イースト抽出物は、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）の自己分解によって得られ、微細な淡黄色粉末（容易に水に溶ける）の形態である。Ｂ群の水溶性ビタミンとともに、イースト抽出物は、ペプチド、遊離アミノ酸、プリン及びピリミジン塩基を含む。イースト抽出物は、総窒素含量１０％及びα−アンミニック（amminic）窒素含量５％を有する。
【００１２】
コーン・スティープ・リカーは、二酸化硫黄を含む水中で２４〜４８時間、５０℃でコーン穀物に浸漬することにより得られる。この剤は、澱粉穀物を囲む蛋白ネットワークの変性を可能にし、浸漬の間、好ましくない微生物の成長を防止する利点を提供する。コーン・スティープ・リカーは、総窒素含量７％及びα−アンミニック窒素含量１．７％を有し、さらに５％の糖、４％のカリウム、３％のリン及び１７％の種々のミネラルを含む。
【００１３】
上述した炭素及び窒素源に基づく種々の培地を試験した。これらの培地は、以下の３つのクラスに分類することができる。
クラス1：主な炭素源として麦芽エキスを有する培地、
クラス２：主な炭素源として糖蜜を有する培地、
クラス３：主な炭素源として麦芽エキス及び糖蜜からなる培地。
【００１４】
本発明の培地の有機窒素源の％含量は、そのような有機窒素源の一部を、無機の窒素源（硝酸アンモニウムまたは化合物）に置き換えることにより、減少することができ、培養中に少量ずつ徐々に加える。
培養中の無機窒素のこの添加は、微生物にとって良好な栄養源となり、糸状菌の場合、菌糸フィラメントを強化する。
有機窒素源（イースト抽出物及びコーン・スティープ・リカー）は本発明の培地の最も高価な構成要素を構成するため、有機窒素源の一部を無機窒素源に置き換えることは、生産コストを下げるという長所がある。
【００１５】
本発明の培地は、特にモニリアル（Moniliales）族の糸状菌の製造に用いるのに適している。特に、以下に示す実施例において、アルトロボトリス・コノイデス・ドレクスラーの糸状菌類を用いた。
【００１６】
実施例１
この実施例は、クラス１の培養培地に関する。
糸状菌類の成長を、１５０ｍｌの培地を含む３００ｍｌのエルレンフラスコ中で行った。
培地は、麦芽エキス２０ｇ／ｌ及びイースト抽出物４ｇ／ｌからなり、問題の菌の分生子を接種する前に滅菌した。
培地を、約２７℃の温度で、接種から６日間維持した。
３日以降から、サンプルを、乾燥質量（ｇ／ｌ）及び胎芽数（ＣＦＵ／ｌ）を測定するために、培地から採取した。乾燥質量を測定するために、培地の２０ｍｌをろ過し、２４時間１００℃にて、オーブン中で乾燥した。胎芽数を、１ｍｌの培地で測定した。
得られた結果の概要を、以下の表１に示す。
【００１７】
【表１】
2007521825.tif 000002
【００１８】
実施例２
実施例１で行った試験を、実施例１のように、１．２リットルの培地を含む２リットルのミニ反応器で繰り返した。実験条件は、サンプリングを分生子の接種の翌日から開始したことが異なる以外、実施例１と同様であった。
問題のミニ反応器は、丸底容器であり、ブレード攪拌機、加熱及び冷却手段、気流吹き込み機ならびにｐＨ、酸素及び温度検出器を備える。
得られた結果の概要を、以下の表２に示す。
【００１９】
【表２】
2007521825.tif 000003
培養７日の終わりに、培地１リットル当たり約８ｇの菌が、６．０８・１０9胎芽を得た。
【００２０】
実施例３
この実施例は、クラス２の培養培地で行った試験に関する。
糸状菌類の培養を、１５０ｍｌの培地を含む３００ｍｌのエルレンフラスコ中で行った。
培地は、糖蜜２５ｇ／ｌ、蔗糖５ｇ／ｌ、コーン・スティープ・リカー５ｇ／ｌ及びイースト抽出物５ｇ／ｌからなり、問題の菌の分生子を接種する前に滅菌した。
培地を、約２７℃の温度で、接種から６日間インキュベートした。
３日以降から、サンプルを、乾燥質量（ｇ／ｌ）及び胎芽数（ＣＦＵ／ｌ）を測定するために、培地から採取した。乾燥質量を測定するために、培地の２０ｍｌをろ過し、２４時間１００℃にて、オーブン中で乾燥した。胎芽数を、１ｍｌの培地で測定した。
得られた結果の概要を、以下の表３に示す。
【００２１】
【表３】
2007521825.tif 000004
【００２２】
実施例４
実施例３で行った試験を、実施例３のように、１．２リットルの培地を含む２リットルのミニ反応器で繰り返した。実験条件は、サンプリングを分生子の接種の翌日から開始したことが異なる以外、実施例３と同様であった。
得られた結果の概要を、以下の表４に示す。
【００２３】
【表４】
2007521825.tif 000005
【００２４】
５日目以降に示された結果は特異かもしれないが、これは培地中における菌の過度の濃縮によるものであり、もはや均一なサンプルが採取できない。
最後のサンプルは、直接反応器から採取した。
この場合、７日目に、培地１リットルあたり１０ｇより多い菌が、３．７７×１０9での分生子含量で得られた。
【００２５】
実施例５
この実施例は、クラス３の培養培地で行った試験に関する。
糸状菌類の培養を、１５０ｍｌの培地を含む３００ｍｌのエルレンフラスコ中で行った。
培地は、糖蜜１５ｇ／ｌ、麦芽抽出物１０ｇ／ｌ及びコーン・スティープ・リカー１０ｇ／ｌからなり、問題の菌の分生子を接種する前に滅菌した。
【００２６】
培地を、約２７℃の温度で、接種から６日間インキュベートした。
３日以降から、サンプルを、乾燥質量（ｇ／ｌ）及び胎芽数（ＣＦＵ／ｌ）を測定するために、培地から採取した。乾燥質量を測定するために、培地の２０ｍｌをろ過し、２４時間１００℃にて、オーブン中で乾燥した。胎芽数を、１ｍｌの培地で測定した。
得られた結果の概要を、以下の表５に示す。
【００２７】
【表５】
2007521825.tif 000006
【００２８】
実施例６
実施例５で行った試験を、実施例５のように、１．２リットルの培養培地を含む２リットルのミニ反応器で繰り返した。実験条件は、サンプリングを分生子の接種の翌日から開始したことが異なる以外、実施例５と同様であった。
得られた結果の概要を、以下の表６に示す。
【００２９】
【表６】
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７日目に、培地１リットルあたり１０ｇより多い菌が、２．２２×１０9の分生子含量で得られた。
【００３０】
実施例７
実施例３の培養培地において、２つの有機窒素源の含量を減少するように、以下のように改変した。それらは、もっとも高価な成分、
糖蜜２５ｇ／ｌ、
蔗糖５ｇ／ｌ
コーン・スティープ・リカー２．５ｇ／ｌ、
イースト抽出物２．５ｇ／ｌからなる。
【００３１】
このような培地で、上述した菌を用いた培養試験（Ａ）を、他の２つの培養試験（Ｂ及びＣ）と比較のために行った。Ｂ及びＣの培養試験は、同様の培養培地を用い、かつ４日以降から、無機の窒素源を徐々に添加した。
試験Ｂでは、リン酸水素二アンモニウム０．２１ｇを４日目から（厳密には、４日、６日及び８日目に）３回（合計０．６３ｇ）添加し、試験Ｃでは、０．２８ｇを４日目から（厳密には、４日、６日及び８日目に）３回（合計０．８４ｇ）添加した。
【００３２】
試験を、３００ｍｌの培地を含む５００ｍｌのエルレンフラスコ中で行い、分生子を接種する前に滅菌した。
培養の９日目及び最終日に、培地の総窒素含量は、Ａが０．８５ｇ／ｌと同量であり、一方、リン酸水素二アンモニウムを添加した培地（Ａ及びＢ）では、それぞれ、１．０５ｇ／ｌ（Ａ）及び１．２６ｇ／ｌ（Ｂ）であった。
【００３３】
３日以降から、サンプルを、乾燥質量（ｇ／ｌ）及び胎芽数（ＣＦＵ／ｌ）を測定するために、培地から採取した。乾燥質量を測定するために、培地の２０ｍｌをろ過し、２４時間１００℃にて、オーブン中で乾燥した。胎芽数を、１ｍｌの培地で測定した。
得られた結果の概要を、以下の表７に示す。
【００３４】
【表７】
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【００３５】
ＭＳ＝乾燥質量（ｇ／ｌ）
ＣＦＵ＝胎芽数／リットル
上述した表から明らかなように、無機の窒素源の添加、特に少量での（試験Ｂ）添加は、乾燥質量で顕著な増加が、培養の７日目で開始することが認められ、同じ培養期間で、胎芽数が１００％以上増加することが認められた。
【国際調査報告】
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