(57)【要約】本発明は、パラミクソウイルス感染（特に、ＲＳウイルス（ＲＳウイルス）感染）に対して感受性である哺乳動物宿主（例えば、ヒト）に対して投与するための抗ウイルス剤に関する。特定の実施形態において、本発明の抗ウイルス分子は、ポリペプチド、ケモカインポリペプチド、ケモカインポリペプチドフラグメント、有機低分子、またはペプチド模倣物であり、これらの抗ウイルス分子は、哺乳動物細胞のパラミクソウイルス感染を阻害または防止する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＣＬ５ポリペプチドを含む抗ウイルス組成物であって、該ＣＣＬ５ポリペプチドは、哺乳動物被験体において、パラミクソウイルス科のウイルス（パラミクソウイルス）による感染を阻害する、組成物。
【請求項２】
前記パラミクソウイルスが、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＣＣＬ５ポリペプチドが、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質と哺乳動物上皮細胞との間の相互作用をブロックすることによって、ＲＳＶ感染を阻害する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＣＣＬ５ポリペプチドが、合成ＣＣＬ５ポリペプチドまたは組換え発現されたＣＣＬ５ポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＣＣＬ５ポリペプチドが、哺乳動物被験体においてケモカインとして生物学的に不活性である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記哺乳動物被験体がヒトである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記哺乳動物被験体が、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される、家畜化された非ヒト哺乳動物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＣＣＬ５ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＣＣＬ５ポリペプチドが、ＮＨ２末端が改変されたＣＣＬ５ポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＮＨ２末端が改変されたＣＣＬ５ポリペプチドが、アミノオキシペンタン−ＣＣＬ５（ＡＯＰ−ＣＣＬ５）、Ｍｅｔ−ＣＣＬ５、Ｎα−ノナノイル−ＣＣＬ５（ＮＮＹ−ＣＣＬ５）、Δ１−２短縮型ＣＣＬ５およびΔ１−８短縮型ＣＣＬ５からなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
１種以上のＣＣＬ５ペプチドフラグメントをさらに含み、該フラグメントが、配列番号１のＣＣＬ５ポリペプチドの約１０個〜２０個の連続するアミノ酸を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記１種以上のＣＣＬ５ペプチドフラグメントが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＣＣＬ５ペプチドフラグメントが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記配列番号２のペプチドフラグメントが、配列番号１のＮＨ２末端ペプチドとしてさらに規定されている、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＣＣＬ５ポリペプチドが、さらに、ヒトＣＣＬ５ポリペプチドとして規定されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
配列番号１のＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端のペプチド模倣物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端のペプチド模倣物が、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１のアミノ酸配列を含むレトロインバート型ＣＣＬ５ポリペプチドである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ＣＣＲ３ケモカインレセプターに結合する有機分子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記有機分子が、ＣＣＲ３レセプターアンタゴニストである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記有機分子が、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの１種以上の化学構造を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、鼻腔内投与または非経口投与によって哺乳動物被験体に投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
ＣＣＲ１アンタゴニストまたはＣＣＲ５アンタゴニストである有機分子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１のＣＣＬ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載のベクターでトランスフェクト、形質転換または感染された、宿主細胞。
【請求項２５】
ＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端ペプチドフラグメントを含み、該フラグメントが、ＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端の約１０個〜２０個の連続するアミノ酸を含み、かつ、該フラグメントが、パラミクソウイルス科のウイルス（パラミクソウイルス）による感染を阻害する、抗ウイルス組成物。
【請求項２６】
前記パラミクソウイルスがＲＳＶである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＣＣＬ５ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＮＨ２末端ペプチドフラグメントが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＮＨ２末端ペプチドフラグメントが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物が、哺乳動物被験体において、ケモカインとして生物学的に不活性である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物が、鼻腔内投与または非経口投与によって哺乳動物被験体に投与される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ＮＨ２末端ペプチドフラグメントが、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質と哺乳動物上皮細胞との間の相互作用をブロックすることによってＲＳＶ感染を阻害する、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３３】
アミノオキシペンタン−ＣＣＬ５（ＡＯＰ−ＣＣＬ５）、Ｍｅｔ−ＣＣＬ５、Ｎα−ノナノイル−ＣＣＬ５（ＮＮＹ−ＣＣＬ５）、Δ１−２短縮型ＣＣＬ５およびΔ１−８短縮型ＣＣＬ５からなる群より選択される１種以上のＮＨ２末端が改変されたＣＣＬ５ポリペプチドをさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３４】
配列番号１のＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端のペプチド模倣物をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端のペプチド模倣物が、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１のアミノ酸配列を含むレトロインバート型ＣＣＬ５ポリペプチドである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
ＣＣＲ１レセプター、ＣＣＲ３レセプターまたはＣＣＲ５レセプターのアンタゴニストである有機分子をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３７】
請求項２５に記載のＮＨ２末端ＣＣＬ５ペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクター。
【請求項３８】
請求項３７に記載のベクターで、トランスフェクト、形質転換または感染された、宿主細胞。
【請求項３９】
配列番号１の最初の１５個のＣＣＬ５  ＮＨ２末端アミノ酸のＸ、Ｙ、Ｚ原子座標を用いる、コンピューターベースの分子モデリングによって設計された、有機低分子模倣物であって、該Ｘ、Ｙ、Ｚ座標は、１ＲＴＮ、１ＲＴＯ、１ＥＱＴおよび１Ｂ３Ａからなる群より選択される、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋファイルに見出される、有機低分子模倣物。
【請求項４０】
請求項３９に記載の有機分子を含む、抗ウイルス組成物。
【請求項４１】
ＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端のペプチド模倣物であって、該ペプチド模倣物は、哺乳動物被験体において、パラミクソウイルス科のウイルス（パラミクソウイルス）による感染を阻害する、ペプチド模倣物。
【請求項４２】
前記模倣物が、配列番号１の最初の１５個のＣＣＬ５  ＮＨ２末端アミノ酸のＸ、Ｙ、Ｚ原子座標を用いる、コンピューターベースの分子モデリングによって設計されており、該Ｘ、Ｙ、Ｚ座標は、１ＲＴＮ、１ＲＴＯ、１ＥＱＴおよび１Ｂ３Ａからなる群より選択される、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋファイルに含まれる、請求項４１に記載のペプチド模倣物。
【請求項４３】
前記模倣物が、逆ターン模倣物である、請求項４１に記載のペプチド模倣物。
【請求項４４】
前記逆ターン模倣物が、β−ターン模倣物、単環式β−ターン模倣物、二環式β−ターン模倣物、γ−ターン模倣物または単環式γ−ターン模倣物である、請求項４３に記載のペプチド模倣物。
【請求項４５】
請求項４１に記載のペプチド模倣物を含む、抗ウイルス組成物。
【請求項４６】
哺乳動物宿主において、パラミクソウイルス科のウイルス（パラミクソウイルス）による感染を防止または阻害するための方法であって、該方法は、請求項１に記載の組成物の薬学的に有効な量を該宿主に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４７】
哺乳動物宿主において、パラミクソウイルス感染を防止または阻害するための方法であって、該方法は、請求項２５に記載の組成物の薬学的に有効な量を該宿主に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４８】
哺乳動物宿主において、パラミクソウイルス感染を防止または阻害するための方法であって、該方法は、請求項３９に記載の組成物の薬学的に有効な量を該宿主に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４９】
哺乳動物宿主において、パラミクソウイルス科のウイルス（パラミクソウイルス）による感染を防止または阻害するための方法であって、該方法は、請求項４１に記載の組成物の薬学的に有効な量を該宿主に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的には、微生物学、ウイルス学、感染性疾患、および免疫学の分野に関連する。より詳しくは、本発明は、哺乳動物においてパラミクソウイルス科のウイルス（パラミクソウイルス）による感染を阻害または防止する、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、および有機低分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）は、非分節性マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、これは、基礎疾患または免疫学的異常を有する若齢乳児、および加齢した成人における、下気道（ＬＲＴ）疾患の主要原因である（非特許文献１；非特許文献２）。実際、６５００万症例のＲＳＶ感染が、世界中で毎年生じており、１６０，０００人が死亡している（ＲｏｂｂｉｎｓおよびＦｒｅｅｍａｎら（１９８８））。米国だけにおいて、１００，０００人の小児が、ＲＳＶ感染から生じる肺炎および気管支炎の重篤な症例によって毎年入院している（Ｇｌｅｚｅｎら（１９８６）；Ｋａｔｚ（１９８５））。米国におけるＲＳＶ感染している小児についての入院患者および外来診療は、１９９２年において、１年間当たり３４０００万ドルを超えるコストがかかると見積もられた。（ＷｅｒｔｚおよびＳｕｌｌｅｎｄｅｒ（１９９２））。
【０００３】
現在、ヒト疾患を防止するための認可を受けたワクチンは、利用可能ではない。従って、季節性流行の間に生まれた免疫学的に未処置の乳児は、ＲＳＶにより引き起こされる重篤なＬＲＴ疾患を防止するために、母系抗体に依存しなければならない。高リスクの乳児について、これは、母親の免疫状態と母系抗体の限りある半減期とが原因で、問題があり得る。現在、２種類の生物薬剤（ＩＶＩＧ、およびヒト化モノクローナル抗体であるパリビツマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））が、高リスクの乳児における感染を防止するために認可されている（非特許文献２；Ｋｒｉｌｏｖ（２００２））。免疫防止の利点は明白ではあるが、コストが大きい。上記の生物薬剤に加えて、ＲＳＶにより引き起こされる急性気道疾患を処置する認可を受けた１種類の薬剤（リバビリン）もまた、存在する（非特許文献３）。しかし、リバビリンは、催奇形物質であり、病院スタッフ、親および妊娠可能年齢の多の親戚に対して安全性リスクを引き起こす。従って、リバビリンの利点は、議論の余地がある（非特許文献２；Ｋｒｉｌｏｖ（２００２））。従って、認可を受けたワクチンが存在しない状況で、現在、パラミクソウイルス（例えば、ＲＳＶ）によって引き起こされるＬＲＴ疾患を防止するための改善された有効性および増加した安全性プロフィールを備える、新規な薬剤および／または生物化合物についての必要性が大きい。
【非特許文献１】Ｄｏｍａｃｈｏｗｓｋｅら、「Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，（１９９９）１２：２９８−３０９
【非特許文献２】Ｈａｌｌ、「Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ」，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２００１，２１：３４４：１９１７−２８
【非特許文献３】Ｔｏｒｒｅｎｃｅら、「Ｔｈｅ  ｑｕｅｓｔ  ｆｏｒ  ａｎ  ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｆｏｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ」，Ａｎｔｉｖｉｒ  Ｃｈｅｍ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２００２，１３：３２５−３４４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、広範には、哺乳動物において感染を阻害または防止する抗ウイルス組成物に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物細胞におけるパラクミソウイルス科のウイルス（パラミクソウイルス）による感染を阻害または防止する、新規な抗ウイルス分子およびその薬学的組成物に関する。
【０００５】
従って、特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＬ５ポリペプチドを含む抗ウイルス組成物に関し、このＣＣＬ５ポリペプチドは、哺乳動物被験体において、パラミクソウイルス科のウイルス（パラミクソウイルス）による感染を阻害する。特定の一実施形態において、上記パラミクソウイルスは、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）である。別の実施形態において、上記ＣＣＬ５ポリペプチドは、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質と哺乳動物上皮細胞との間の相互作用をブロックすることによって、ＲＳＶ感染を阻害する。特定の実施形態において、上記ＣＣＬ５ポリペプチドは、合成ＣＣＬ５ポリペプチドまたは組換え発現されたＣＣＬ５ポリペプチドである。他の特定の実施形態において、上記ＣＣＬ５ポリペプチドは、哺乳動物被験体において、ケモカインとして生物学的に不活性である。特定の実施形態において、上記哺乳動物被験体は、ヒトである。他の実施形態において、上記哺乳動物被験体は、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される、家畜化された非ヒト哺乳動物である。
【０００６】
別の実施形態において、上記ＣＣＬ５ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、上記ＣＣＬ５ポリペプチドは、ＮＨ２末端が改変されたＣＣＬ５ポリペプチドである。特定の一実施形態において、上記ＮＨ２末端が改変されたＣＣＬ５ポリペプチドは、アミノオキシペンタン−ＣＣＬ５（ＡＯＰ−ＣＣＬ５）、Ｍｅｔ−ＣＣＬ５、Ｎα−ノナノイル−ＣＣＬ５（ＮＮＹ−ＣＣＬ５）、Δ１−２短縮型ＣＣＬ５およびΔ１−８短縮型ＣＣＬ５からなる群より選択される。他の実施形態において、本発明の抗ウイルス組成物は、１種以上のＣＣＬ５ペプチドフラグメントをさらに含み、これらのフラグメントは、配列番号１のＣＣＬ５ポリペプチドの約１０個〜約２０個連続するアミノ酸を含む。特定の実施形態において、上記１種以上のＣＣＬ５ペプチドフラグメントは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択される。他の実施形態において、上記ＣＣＬ５ペプチドフラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、上記配列番号２のペプチドフラグメントは、配列番号１のＮＨ２末端ペプチドとしてさらに規定されている。他の特定の実施形態において、上記ＣＣＬ５ポリペプチドは、ヒトＣＣＬ５ポリペプチドとしてさらに規定されている。
【０００７】
なお他の実施形態において、本発明の抗ウイルス組成物は、配列番号１のＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端のペプチド模倣物をさらに含む。特定の一実施形態において、上記ＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端のペプチド模倣物は、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１のアミノ酸配列を含む、レトロインバート型（ｒｅｔｒｏｉｎｖｅｒｔｅｄ）ＣＣＬ５ポリペプチドである。
【０００８】
他の特定の実施形態において、本発明の抗ウイルス組成物は、ＣＣＲ３ケモカインレセプターに結合する有機分子をさらに含む。これらのうちの特定の実施形態において、上記有機分子は、ＣＣＲ３レセプターアンタゴニストである。特定の一実施形態において、上記有機分子は、化学構造
【０００９】
【化１】
2007537148.tif 000002
【００１０】
【化２】
2007537148.tif 000003
のうちの１つ以上を含む。
【００１１】
他の特定の実施形態において、本発明の抗ウイルス組成物は、鼻腔内投与または非経口投与によって哺乳動物被験体に投与される。
【００１２】
他の実施形態において、本発明の抗ウイルス組成物は、ＣＣＲ１アンタゴニストまたはＣＣＲ５アンタゴニストである有機分子をさらに含む。特定の実施形態において、ＣＣＲ１アンタゴニストである有機分子は、化学構造
【００１３】
【化３】
2007537148.tif 000004
のうちの１つ以上を含む。
【００１４】
特定の実施形態において、ＣＣＲ５アンタゴニストである有機分子は、化学構造
【００１５】
【化４】
2007537148.tif 000005
のうちの１つ以上を含む。
【００１６】
他の実施形態において、本発明は、上記ＣＣＬ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクターに関する。なお他の実施形態において、本発明は、上記ＣＣＬ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターでトランスフェクト、形質転換または感染された、宿主細胞に関する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、ＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端ペプチドフラグメントを含む抗ウイルス組成物に関し、このフラグメントは、ＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端の約１０個〜約２０個連続するアミノ酸を含み、かつ、このフラグメントは、哺乳動物被験体におけるパラミクソウイルス科のウイルス（パラミクソウイルス）による感染を阻害する。特定の一実施形態において、上記パラミクソウイルスは、ＲＳＶである。別の実施形態において、上記ＣＣＬ５ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、上記ＮＨ２末端ペプチドフラグメントは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、上記ＮＨ２末端ペプチドフラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態において、上記組成物は、哺乳動物被験体において、ケモカインとして生物学的に不活性である。なお他の実施形態において、上記抗ウイルス組成物は、鼻腔内投与または非経口投与によって哺乳動物被験体に投与される。なお他の実施形態において、上記ＮＨ２末端ペプチドフラグメントは、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質と哺乳動物上皮細胞との間の相互作用をブロックすることによってＲＳＶ感染を阻害する。他の特定の実施形態において、上記抗ウイルス組成物は、アミノオキシペンタン−ＣＣＬ５（ＡＯＰ−ＣＣＬ５）、Ｍｅｔ−ＣＣＬ５、Ｎα−ノナノイル−ＣＣＬ５（ＮＮＹ−ＣＣＬ５）、Δ１−２短縮型ＣＣＬ５およびΔ１−８短縮型ＣＣＬ５からなる群より選択される、１種以上のＮＨ２末端が改変されたＣＣＬ５ポリペプチドをさらに含む。一実施形態において、抗ウイルス組成物は、配列番号１のＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端のペプチド模倣物をさらに含む。他の特定の実施形態において、上記ＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端のペプチド模倣物は、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１のアミノ酸配列を含む、レトロインバート型（ｒｅｔｒｏｉｎｖｅｒｔｅｄ）ＣＣＬ５ポリペプチドである。別の実施形態において、抗ウイルス組成物は、ＣＣＲ１レセプターのアンタゴニスト、ＣＣＲ３レセプターのアンタゴニストまたはＣＣＲ５レセプターのアンタゴニストである、有機分子をさらに含む。特定の一実施形態において、ＣＣＲ１レセプターのアンタゴニスト、ＣＣＲ３レセプターのアンタゴニスト、またはＣＣＲ５レセプターのアンタゴニストは、式Ｉ〜式ＸＩＩによって示される化学構造を含む。
【００１８】
他の特定の実施形態において、本発明は、ＮＨ２末端ＣＣＬ５ペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクターに関する。他の特定の実施形態において、本発明は、ＮＨ２末端ＣＣＬ５ペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む上記ベクターで、トランスフェクト、形質転換または感染された、宿主細胞に関する。
【００１９】
他の特定の実施形態において、本発明は、配列番号１の最初の１５個のＣＣＬ５  ＮＨ２末端アミノ酸のＸ原子座標、Ｙ原子座標、Ｚ原子座標を用いるコンピューターベースの分子モデリングによって設計された、有機低分子模倣物に関し、このＸ座標、Ｙ座標、Ｚ座標は、１ＲＴＮ、１ＲＴＯ、１ＥＱＴおよび１Ｂ３Ａからなる群より選択される、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋファイルにおいて見出される。別の実施形態において、本発明は、上記のコンピューターベース分子モデリングによって設計された有機分子を含む、抗ウイルス組成物に関する。
【００２０】
他の特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端のペプチド模倣物に関し、このペプチド模倣物は、哺乳動物被験体において、パラミクソウイルス科のウイルス（パラミクソウイルス）による感染を阻害する。特定の実施形態において、上記模倣物は、配列番号１の最初の１５個のＣＣＬ５  ＮＨ２末端アミノ酸のＸ原子座標、Ｙ原子座標、Ｚ原子座標を用いるコンピューターベースの分子モデリングによって設計されており、このＸ座標、Ｙ座標、Ｚ座標は、１ＲＴＮ、１ＲＴＯ、１ＥＱＴおよび１Ｂ３Ａからなる群より選択される、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋファイルに含まれる。特定の一実施形態において、上記模倣物は、逆ターン模倣物である。特定の実施形態において、上記逆ターン模倣物は、β−ターン模倣物、単環式β−ターン模倣物、二環式β−ターン模倣物、γ−ターン模倣物または単環式γ−ターン模倣物である。他の特定の実施形態において、上記ペプチド模倣物は、抗ウイルス組成物中に含まれる。
【００２１】
他の特定の実施形態において、本発明は、哺乳動物宿主において、パラミクソウイルス科のウイルス（パラミクソウイルス）による感染を防止または阻害するための方法に関し、この方法は、本発明の抗ウイルス組成物の薬学的に有効な量をこの宿主に投与する工程を包含する。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、その好ましい実施形態から、そして特許請求の範囲から、明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、パラミクソウイルス感染（特に、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）感染）に対して感受性である哺乳動物宿主（例えば、ヒト）に投与するために有効な抗ウイルス分子についての当該分野における必要性に、以後取り組む。従って、特定の実施形態において、本発明は、新規な抗ウイルス分子およびその薬学的組成物に関する。本明細書中で以後定義されるように、本発明の「抗ウイルス分子」とは、その抗ウイルス分子が哺乳動物細胞のパラミクソウイルス感染を阻害または防止する、「ポリペプチド」、「ケモカインポリペプチド」、ケモカイン「ポリペプチドフラグメント」（本明細書中で以後は「ペプチドフラグメント」、「有機低分子」（もしくは「低分子模倣物」）、またはペプチド模倣物（「ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ」（もしくは「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ」」）である。
【００２４】
ケモカインとは、損傷部位もしくは感染部位に対して細胞の移動を向わせる際に重要な役割を果たす、低分子量ケモカインである。例えば、ケモカインＣＣＬ５（「ＲＡＮＴＥＳ」として公知である；これは、ａｃｒｏｎｙｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄである）は、ＲＳＶ複製により引き起こされる組織損傷領域へと白血球を動員する際に重要な役割を果たすと考えられる（ＡｐｐａｙおよびＲｏｗｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ，２００１；ＭｏｓｅｒおよびＬｏｅｔｓｃｈｅｒ，２００１）。ケモカインは、保存システインモチーフ（Ｃ、ＣＣ、ＣＸＣ、およびＣＸ３Ｃと呼ばれる）の数および間隔に基づいて、サブファミリーへと分割される。ＲＳＶによる感染は、気道上皮細胞におけるケモカインの遺伝子発現および分泌を誘導することが、以前に確立されている（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，１９９９；Ｎｏａｈら、２００２；Ｚｈａｎｇ，２００１）。さらに、ＣＣファミリーの特定のケモカインポリペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に対する強力な抗ウイルス特性を保有することが示されている（Ｌｕｓｓｏ，２００２；Ｌｅｈｎｅｒ，２００２；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら、２００３）。例えば、ＨＩＶ−１は、ＣＣＲ５に主要な共レセプターとして結合することによって、Ｔ細胞およびマクロファージに侵入する。ケモカインポリペプチドであるＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、およびＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）は、ＨＩＶ−１共レセプターとしてＣＣＲ５をブロックすることによってＨＩＶ−１感染を防止する、阻害リガンドである。
【００２５】
本発明は、組換えＣＣＬ５（ｒＣＣＬ５）ポリペプチド、Ｎ末端改変ＣＣＬ５ポリペプチド、およびＮ末端ＣＣＬ５ペプチドフラグメントが、（ａ）ＲＳＶによるヒト上皮細胞の感染を阻害し（実施例２）、（ｂ）上皮細胞とＲＳＶの融合（Ｆ）タンパク質との間の相互作用をブロックし（実施例３）、そして（ｃ）インビボでＲＳＶ感染を阻害する（実施例４）ことを、初めて示す。
【００２６】
ＨＩＶ−１感染のケモカイン（例えば、ケモカインＣＣＬ３、ＣＣＬ４、およびＣＣＬ５）阻害についての公開された報告（Ｌｕｓｓｏ、２００２；Ｌｅｈｎｅｒ、２００２；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら，２００３）とは対称的に、本発明のデータは、ＲＳＶ感染のケモカイン阻害が、ＣＣＬ５によってのみ生じるが、他のＣＣインヒビター（例えば、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）またはＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β））では生じないことを示す（実施例２を参照のこと）。このことは、ＲＳＶが、（ＨＩＶ−１とは対称的に）ＣＣＲ５以外のレセプターを利用し得ることを示唆する。
【００２７】
ヒト上皮細胞が、ＣＣＬ５に結合することが公知であるレセプター（ＣＣＲ１、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５）について、フローサイトメトリーによって試験された。その結果は、ＣＣＲ３が、ＨＥｐ−２上皮細胞およびＡ５４９上皮細胞の表面にて発現された（が、ＣＣＲ１もＣＣＲ５も発現されなかった）ことを示した。このことは、ＣＣＬ５が、ＲＳＶと、上皮細胞表面上のＣＣＲ３との間の相互作用をブロックすることを示唆する。ＣＣＲ３に結合することが公知であるさらなる組換えＣＣケモカイン（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，２００１）が、ＲＳＶ感染性を非常に減少させたか否かを決定するために試験された。ＨＥｐ−２細胞単層を、漸増量の組換えＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ８（ＭＣＰ−２）、またはＣＣＬ１５（ＭＩＰ−１δ）で事前処理しても、ＲＳＶ感染性を損なわなかった（表１０および表１２）。さらに、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３および／またはＣＣＲ５に対する、ポリクローナル抗ケモカインレセプター抗体またはモノクローナル抗ケモカインレセプター抗体の存在下でＨＥｐ−２細胞単層をプレインキュベートしても、ＲＳＶ感染性を減少しなかった（データは、示さない）。
【００２８】
Ｆ（融合）タンパク質は単独でＲＳＶ付着を媒介するのに充分であることが、インビトロで、ＳＨ（小疎水性）タンパク質および／またはＧ（付着）タンパク質を欠く変異体ＲＳＶ株を使用して、以前に示された（Ｋａｒｒｏｎら、１９９７）。従って、ＣＣＬ５阻害は、Ｇタンパク質および／またはＳＨタンパク質を欠くＲＳＶ株による感染をｒＣＣＬ５が阻害する能力を試験することによって、さらに調査された。一連の研究は、ＳＨタンパク質を欠く遺伝子改変ＲＳＶ株（ＲＳＶΔＳＨ）またはアミノ酸１１８にてＧタンパク質のＣ末端エクトドメインが短縮された遺伝子改変ＲＳＶ株（ＲＳＶΔ１１８）を使用して、実施された。これらの研究は、培地単独中でウイルスとともに培養されたコントロール細胞と比較して、１０μｇ／ｍｌのｒＣＣＬ５もしくはＭｅｔ−ＣＣＬ５で事前処理すると、ＲＳＶΔ１１８ウイルスおよびＲＳＶΔＳＨウイルスの感染性が減少したことを示した。ｒＣＣＬ５（１０μｇ／ｍｌ）での事前処理はまた、ＲＳＶの変異体ｃｐ３２／Ｄ１株（ＳＨタンパク質およびＧタンパク質の両方を欠く）および親Ｂ１株による感染も減少させた（実施例３、表１５）。従って、ｒＣＣＬ５は、Ｇタンパク質および／またはＳＨタンパク質を欠くＲＳＶ株による感染を阻害した。
【００２９】
ＣＣＬ５のどの領域がＲＳＶ感染を阻害するかを決定するために、配列番号１の６８個すべてのアミノ酸を示す一連の９つのＣＣＬ５ペプチドフラグメント（７アミノ酸ずつ重複する、１５マー）が、合成され（実施例４および表２）、感染についてインビボマウスモデルにおいて試験された。ＣＣＬ５  ＮＨ２末端の最初の１５アミノ酸残基を示すペプチド１（配列番号２）は、ＲＳＶ感染と同時にかまたはＲＳＶ感染の前に投与された場合に、インビボで最も阻害性のペプチドであった（実施例４、表１６および表１７）。
【００３０】
まとめると、本発明のデータは、新規なＣＣＬ５阻害機構を示し、この機構において、ＣＣＬ５は、ＲＳＶエンベロープ中のＦタンパク質と、上皮細胞タンパク質との間で生じる相互作用をブロックする。さらに、ＲＳＶ感染を阻害する、ＣＣＬ５のＮＨ２末端部分を示すＣＣＬ５ペプチドフラグメントが、同定された。
【００３１】
従って、特定の実施形態において、本発明の抗ウイルス分子は、ＣＣＬ５ポリペプチド、ＮＨ２末端改変ＣＣＬ５ポリペプチド、ＮＨ２末端ＣＣＬ５ペプチドフラグメント、改変型ＮＨ２末端ＣＣＬ５ペプチドフラグメント、ＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端部分を模倣するように設計されたペプチド模倣物、またはＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端部分を模倣するように設計された低分子であり、これらの抗ウイルス分子は、哺乳動物細胞（特に上皮細胞）のパラミクソウイルス感染を阻害または防止する。本明細書中で以後に規定されるように、「パラミクソウイルス」とは、パラミクソウイルス科のウイルスを包含し、これには、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）型１〜４、麻疹ウイルス、ヘンドラウイルス、牛疫ウイルス、およびイヌジステンバーウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
（Ａ．抗ウイルス分子）
上記のように、本発明の抗ウイルス分子は、哺乳動物細胞のパラミクソウイルス感染を阻害または防止する、ポリペプチド、ペプチドフラグメント、有機低分子、もしくはペプチド模倣物である。より詳細には、抗ウイルス分子は、パラミクソウイルスのＦタンパク質と、上皮細胞表面レセプターとの間の相互作用をブロック、阻害、または防止し、それによってそのパラミクソウイルスがその細胞に侵入するのを防ぐ、ポリペプチド、ペプチドフラグメント、有機低分子、もしくはペプチド模倣物である。本発明の抗ウイルスポリペプチド（およびそのフラグメント）ならびに抗ウイルスペプチド模倣物／抗ウイルス低分子模倣物が、それぞれ、節Ａ．１および節Ａ．２に示される。
【００３３】
（１．ＣＣＬ５ポリペプチドおよびそのフラグメント）
特定の実施形態において、本発明の抗ウイルス分子は、ＣＣＬ５ポリペプチド、化学改変されたＣＣＬ５ポリペプチド、または遺伝子改変されたＣＣＬ５ポリペプチドである。特定の一実施形態において、ＣＣＬ５ポリペプチドは、そのＮＨ２末端にて改変されている。他の実施形態において、本発明の抗ウイルス分子は、ＮＨ２末端ＣＣＬ５ペプチドフラグメント、化学改変されたＮＨ２末端ＣＣＬ５ペプチドフラグメント、または遺伝子改変されたＮＨ２末端ＣＣＬ５ペプチドフラグメントであり、そのペプチドフラグメントは、哺乳動物細胞のパラミクソウイルス感染を阻害するＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端部分を含む。
【００３４】
本明細書において以後定義されるように、全長ＣＣＬ５ポリペプチドは、分子量約７．８ｋＤａを有し、配列番号１のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、配列番号１の全長ＣＣＬ５ポリペプチドは、合成ＣＣＬ５ポリペプチドまたは組換え発現したＣＣＬ５ポリペプチドである。本発明の全長ＣＣＬ５ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一性を有するアミノ酸配列を含み、そのポリペプチドは、哺乳動物細胞のパラミクソウイルス感染を阻害または防止する。従って、ＣＣＬ５ポリペプチドは、（ａ）配列番号１において示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）配列番号１のポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子改変体を含むポリペプチド、（ｃ）ヒト以外の生物から単離されたポリペプチド（例えば、ＣＣＬ５ポリペプチドのオルソログ）、ならびに配列番号１のＮＨ２末端改変されたＣＣＬ５ポリペプチドを包含する。
【００３５】
本発明に従うＣＣＬ５ポリペプチドの対立遺伝子改変体は、（１）ヒト細胞から単離され、そして（２）配列番号１のヒトＣＣＬ５ポリペプチドに対して実質的な相同性を含む、ポリペプチドを包含する。ＣＣＬ５ポリペプチドの対立遺伝子改変体は、哺乳動物細胞のパラミクソウイルス感染を阻害または防止する能力を維持する、ＣＣＬ５ポリペプチドの天然に存在するアミノ酸配列改変体である。従って、ＣＣＬ５ポリペプチドの対立遺伝子改変体は、「機能的改変体」として定義される。機能的改変体とは、配列番号１の１つ以上のアミノ酸の保存的置換のみを含むか、またはそのポリペプチドの重要ではない領域中の重要ではない残基の置換、欠失、もしくは挿入を含む。例えば、ＮＨ２末端ＣＣＬ５ペプチドフラグメント（配列番号２）は、哺乳動物上皮細胞のパラミクソウイルス感染を阻害することが観察された（実施例４）。さらに、ＨＩＶ−１感染のＣＣＬ５阻害の構造および機能の研究によって、ＣＣＬ５のアミノ酸残基Ｐｈｅ１２、Ｔｙｒ１４およびＩｌｅ１５は、抗ＨＩＶ−１活性にとって重要であることが示唆される（Ｎａｒｄｅｓｅら、２００１）。従って、特定の好ましい実施形態において、全長ＣＣＬ５ポリペプチドの対立遺伝子改変体は、配列番号１のヒトＣＣＬ５ポリペプチドに対して実質的な相同性を有するポリペプチドを包含し、そのポリペプチドは、アミノ酸残基Ｐｈｅ１２、Ｔｙｒ１４およびＩｌｅ１５の置換も欠失も含まない。
【００３６】
本発明は、ＣＣＬ５ポリペプチドの非ヒトオルソログをさらに提供する。ＣＣＬ５ポリペプチドのオルソログとは、非ヒト哺乳動物生物から単離され、かつ上記ＣＣＬ５ポリペプチドの抗ウイルス特性を保有する、ポリペプチドである。ＣＣＬ５ポリペプチドのオルソログは、配列番号１に対して実質的に相同であるアミノ酸配列を含むものとして容易に同定される。ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）、ＡＡＣｏｍｐＩｄｅｎｔおよびＡＡＣＯｍｐＳｉｍ（Ｗｉｌｋｅｎｓら、１９９８）などのプログラムが、ｔｈｅ  Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＳＩＢ）のＥｘＰＡＳｙ（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）プロテオミクスサーバーから公共に利用可能である。これらは、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＰＲＦ）などの公共のデータベースにおいて相同的ポリペプチドを同定するために、特に有用である。
【００３７】
上記のように、ケモカイン（走化性サイトカインとしても公知である）とは、損傷部位もしくは感染部位に向って細胞（例えば、単層）の移動を方向付けるかまたは動員する際に中心的な役割を果たす、低分子量（例えば、約８ｋＤａ〜約１０ｋＤａ）ポリペプチドである。特定の実施形態において、ＣＣＬ５ポリペプチド（またはそのフラグメント）は、化学改変されたＣＣＬ５ポリペプチドまたは遺伝子改変されたＣＣＬ５ポリペプチドであり、その改変されたＣＣＬ５ポリペプチドは、哺乳動物被験体におけるケモカインアゴニストとしては生物学的に不活性である。例えば、ＣＣＬ５改変は、ケモカインアゴニストとしてのＣＣＬ５ポリペプチドの生物学的活性を減少、低減、または不活化する改変であり、改変されたＣＣＬ５ポリペプチドは、パラミクソウイルス感染を阻害する能力を保持する。本明細書中で定義される場合、「ケモカインアゴニスト」または「ケモカインの生物学的活性もしくはケモカインアゴニストの生物学的活性」とは、ケモカインポリペプチド（例えば、ＣＣＬ５）が、走化性、カルシウム移動、炎症などを、誘導もしくは刺激する能力を指す。
【００３８】
本発明のケモカインポリペプチドのアゴニスト活性は、カルシウム移動アッセイ、走化性アッセイ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼアッセイなど（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら、１９９６；Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９９７；ＧｏｎｇおよびＣｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ、１９９５；Ｆｉｎｃｈａｍ、１９８８）などの方法によって、検出または測定される（例えば、実施例６参照のこと）。
【００３９】
特定の実施形態において、ＣＣＬ５ポリペプチドは、そのＮＨ２末端において遺伝子改変および／または化学改変されており、そのＮＨ２末端改変は、ケモカインアゴニストとしてのＣＣＬ５を不活化する。ＣＣＬ５ケモカイン活性を不活化する７種のＣＣＬ５  ＮＨ２末端改変が、当該分野において記載されている。例えば、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）の開始メチオニン（Ｍｅｔ）が保持される場合、生じるＭｅｔ−ＣＣＬ５（Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ）ポリペプチドは、（１）ケモカインアゴニストとして不活性であり（例えば、Ｍｅｔ−ＣＣＬ５は、Ｃａ２＋移動も走化性も、刺激も誘導もしない）、（２）ＣＣＲ５レセプターにおいてＣＣＬ５およびＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）により誘導される「ケモカイン」効果をアンタゴナイズし（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら、１９９６）、そして（３）初代ヒトマクロファージ培養物のＨＩＶ−１感染を阻害する（Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９９７）。本明細書において以後定義されるように、「Ｍｅｔ−ＣＣＬ５」ポリペプチドまたは「Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ」ポリペプチドとは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１の１位にあるセリン残基のＮＨ２末端側にメチオニンアミノ酸をさらに含む。
【００４０】
ＣＣＬ５ケモカイン活性を不活化する短縮型ＮＨ２末端ＣＣＬ５ポリペプチドもまた、記載されている。例えば、Ａｒｅｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓら（１９９６）は、最初の８アミノ酸が欠失している短縮型ＣＣＬ５ポリペプチド（ＲＡＮＴＥＳ（９−６８）と呼ばれる）（これは、本明細書中では以後、「ＣＣＬ５（Δ１−８）」と呼ばれる）、および最初の２アミノ酸が欠失している短縮型ＣＣＬ５ポリペプチド（ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）と呼ばれる）（これは、本明細書中では以後、「ＣＣＬ５（Δ１−２）」と呼ばれる）を合成した。これらの短縮型ポリペプチドは、走化性特性および白血球活性化特性を欠如し、かつＨＩＶ−１感染を阻害した。本明細書において以後で定義されるように、「ＣＣＬ５（Δ１−８）」ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基９〜６８を含む。本明細書において以後で定義されるように、「ＣＣＬ５（Δ１−２）」ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基３〜６８を含む。
【００４１】
ＣＣＬ５ケモカイン活性を不活化するＣＣＬ５ポリペプチドの化学改変もまた、記載されている。これらの改変としては、ＣＣＬ５のＮＨ２末端セリン残基に対するアミノオキシペンタン基の付加（「ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ」または「ＡＯＰ−ＣＣＬ５」と呼ばれる）（Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９９７）、ならびにＣＣＬ５のＮＨ２末端セリン残基に対するＮα−ノナノイル基の付加（Ｎα−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ」、「ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ」もしくは「ＮＮＴ−ＣＣＬ５」と呼ばれる）（Ｍｏｓｉｅｒら、１９９９）が挙げられる。本明細書において以後定義されるように、ＡＯＰ−ＣＣＬ５ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１の最初のセリン残基に共有結合しているアミノオキシペンタン基をさらに含む。本明細書において以後定義されるように、ＮＮＹ−ＣＣＬ５ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１の最初のセリン残基に共有結合しているＮα−ノナノイル基をさらに含む。あるいは、そのＳｅｒ１残基は、別のアミノ酸で置換されており（例えば、Ｇｌｙ１）、その１位の置換されたアミノ酸は、共有結合しているＡＯＰまたは共有結合しているＮＮＹを含む。
【００４２】
従って、特定の実施形態において、ケモカインアゴニストとしてのＣＣＬ５を不活化する改変および変更が、本発明のＣＣＬ５ポリペプチドの一次配列においてなされ、その改変されたＣＣＬ５は、抗パラミクソウイルス特性を保持する。例えば、ポリペプチドの機能的活性および／または生物学的活性は、一次配列レベル、二次配列レベル、および三次配列レベルにおける複雑な相互作用によって決定され、従って、特定のアミノ酸配列置換が、ポリペプチド配列（またはその基礎となるＤＮＡコード配列）においてなされ得、同様の特性（例えば、抗ウイルス特性）を有するポリペプチドが、得られる。
【００４３】
そのような変化を生じる際に、アミノ酸の疎水性親水性指標が、考慮される（例えば、図１０Ａおよび図１０Ｂを参照のこと）。ポリペプチドに対して相互作用的生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当該分野において一般的に理解されている（例えば、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８４；ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１）。特定のアミノ酸が、同様の疎水性親水性指標もしくは疎水性親水性スコアを有する他のアミノ酸の代わりにされ、依然として同様の生物学的活性を有するポリペプチドを生じることが、公知である。例えば、アミノ酸残基の相対的疎水性親水性特徴が、得られるポリペプチドの二次構造および三次構造に影響を与える。これらの二次構造および三次構造は、そのポリペプチドと他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。
【００４４】
上記のように、アミノ酸置換は、一般的には、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさなど）に基づく。種々の上記の特徴を考慮に入れる例示的な置換が、当業者にとって周知であり、表１に示される。
【００４５】
（表１）
（アミノ酸置換）
【００４６】
【表１】
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特定の実施形態において、ＣＣＬ５ポリペプチドは、そのＮＨ２末端において改変されており、そのＮＨ２末端改変は、ケモカインアゴニストとしてのＣＣＬ５を不活化する。従って、これらのうちの特定の実施形態において、ＣＣＬ５ポリペプチドは、部位特異的変異誘発を使用してそのＮＨ２末端において改変される（例えば、ＣＣＬ５Δ１−８、Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓら、１９９６）。あるいは、ＣＣＬ５ポリペプチド（またはそのフラグメント）は、当該分野で公知である化学的改変または合成改変によってそのＮＨ２末端にて改変される（例えば、ＡＯＰ−ＣＣＬ５、Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９９７；ＮＮＹ−ＣＣＬ５、Ｍｏｓｉｅｒら、１９９９）。
【００４７】
部位特異的変異誘発もまた、基礎となるＤＮＡの特異的変異誘発を介して第二世代ＣＣＬ５ポリペプチド（例えば、ケモカイン活性が減少した抗ウイルスポリペプチド（もしくはそのフラグメント）、および／または抗ウイルス特性が増加したＣＣＬ５ポリペプチド（もしくはそのフラグメント）を調製する際に、有用である。部位特異的誘発は、望ましい変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに充分な数の隣接ヌクレオチドを使用して、横断される欠失連結部の両方の側に安定な二重鎖を形成するために充分な大きさおよび配列複雑性のプライマー配列を提供することを介して、変異体を生成することを可能にする。代表的には、長さが約１７ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドのプライマーが好ましく、その配列の連結部の両側にある約５残基〜約１０残基が変化される。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野で周知であり、代表的には、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在し得るファージベクターを使用する（例えば、米国特許第５，５５６，７４７号；米国特許第５，７８９，１６６号；および米国特許第６，３９１，５４８号（各々、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【００４８】
特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＬ５ポリペプチドフラグメントに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチドフラグメント」、「ペプチドフラグメント」、または「タンパク質フラグメント」とは、全長ＣＣＬ５アミノ酸配列もしくは成熟ＣＣＬ５アミノ酸配列の一部（しかし、すべてではない）とほぼ同じアミノ酸配列を有する、ＣＣＬ５ポリペプチドである。従って、ポリペプチドフラグメントは、配列番号１のＣＣＬ５ポリペプチドの、例えば、７個以上（例えば、８個、１０個、１２個、１４個、１６個、１８個、２０個以上）連続するアミノ酸を含む。ＣＣＬ５ペプチドフラグメントは、組換え発現方法を介して、合成ペプチド化学を介して、または全長ＣＣＬ５ポリペプチドの化学的切断もしくは酵素的切断によって、産生もしくは生成される。フラグメントは、「独立的（ｆｒｅｅｓｔａｎｄｉｎｇ）」であるか、またはそのフラグメントが部分もしくは領域（好ましくは、一本の連続領域）を形成するもっと大きなポリペプチド中に含まれる。一実施形態において、ＣＣＬ５ペプチドフラグメントは、配列番号１の全長ＣＣＬ５ポリペプチドの約１０個連続するアミノ酸〜約２０個連続するアミノ酸（例えば、１０マー、１１マー、１２マー、１３マー、１４マー、１５マーなど）を含む。
【００４９】
実施例４において記載されるように、一連の９種の重複ＣＣＬ５ペプチドフラグメント（１５マー）が、作製され（下記の表２を参照のこと）、そしてインビトロＲＳＶ感染アッセイおよびインビボＲＳＶ感染アッセイを介して試験された。ＣＣＬ５の最初の１５アミノ酸（すなわち、配列番号１のアミノ酸１〜１５）を示すペプチド番号（配列番号２）が、試験された９種の重複ＣＣＬ５ペプチドのうちで最も阻害性であったことが、これらのアッセイにおいて観察された。ＮＨ２末端ＣＣＬ５ペプチドフラグメントは、白血球のＨＩＶ−１感染を阻害することもまた、ケモカインの分野で公知である。例えば、Ｎａｒｄｅｓｅら（２００１）は、ＣＣＬ５において疎水性パッチを形成するＮＨ２−ループ残基およびβ１−鎖残基の両方を含む一連の合成１２マーペプチド（例えば、下記の節Ａ．２および表５Ａを参照のこと）、ＮＨ２−ループおよびβ１−鎖芳香族クラスターの両方に広がる１９マー、ならびにＣｙｓ１１−Ｃｙｓ４３に広がる環状２４マーを、設計した。これらのペプチドは、下記に示されるアミノ酸位置においてアシル化（Ａｃ）およびアミド化された。実際の感染アッセイにおいて、ＮＨ２−ループおよびβ１−鎖芳香族クラスターの両方に広がる１９マー（Ａｃ−Ｃｙｓ１１−Ｔｙｒ２９−ＮＨ２；配列番号１６）の抗ＨＩＶ−１効力は、ＮＨ２−ループ由来のドデカマーＡｃ−Ｃｙｓ１１−Ａｌａ２２−ＮＨ２（配列番号１３）の抗ＨＩＶ−１効力よりも有意に高かった（平均ＩＤ５０＝８．９±３．８μＭ  対  ５１．５±６．３μＭ；Ｐ＜０．０００１）。β１鎖芳香族クラスターを欠く、もっと短い２つのペプチド（Ｃｙｓ１１−Ｌｙｓ２５およびＣｙｓ１１−Ｇｌｕ２６）は、それよりも効果的ではなかった（それぞれ、平均ＩＤ５０＝４８．１±６．８μＭおよび４４．７±３．３μＭ）。このことは、ＨＩＶ−１抗ウイルス活性についてのこのような芳香族クラスターの重要性を確認した。２番目のシステインと３番目のシステインとの間の領域全体に広がる環状２４マー（環状Ｃｙｓ１１−Ｃｙｓ３４；配列番号１７）は、もとのドデカマー（配列番号１３）よりも強力にＨＩＶ−１を阻害した（平均ＩＤ５０＝２９．８±１．６μＭ）が、上記の１９マー（配列番号１６）よりも弱かった。ＣＸＣＲ４リガンドであるＳＤＦ−１に由来する共直線性（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒ）コントロール環状ペプチドを用いても、効果は観察されなかった。これらの知見は、ＣＣＬ５のβ１鎖内の芳香族クラスターが、抗ＨＩＶ−１活性にとって重要であることを示した。これにより、この領域は、ＮＨ２−ループとともに、ＣＣＲ５レセプター境界面に関与することが、確認された。
【００５０】
ＲＳＶ感染を阻害したＣＣＬ５ペプチドフラグメント（表２；ペプチド番号１）およびＨＩＶ−１感染を阻害したＣＣＬ５ペプチドフラグメント（表３）が、整列された。これらは、下記の表４において示される。表４（太字）において、配列番号１８のアミノ酸配列を含むコンセンサスＣＣＬ５ペプチドフラグメント（ペプチド番号１７）も、示される。
【００５１】
（表２）
（重複するＣＣＬ５合成ペプチドペンタデカマー（１５マー）のアミノ酸配列）
【００５２】
【表２】
2007537148.tif 000007
（表３）
（抗ＨＩＶ  ＣＣＬ５ドデカマー（１２マー）、ＣＣＬ５ノナデカマー（１９マー）、および環状２４マーのアミノ酸配列）
【００５３】
【表３】
2007537148.tif 000008
（表４）
（抗ＲＳＶ  ＣＣＬ５フラグメントおよび抗ＨＩＶ−１  ＣＣＬ５フラグメントならびにコンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸配列アライメント）
【００５４】
【表４】
2007537148.tif 000009
従って、特定の実施形態において、ＣＣＬ５ペプチドフラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列（全長ＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端の１５残基を表す）を含む。他の実施形態において、配列番号２のＣＣＬ５ペプチドは、そのＮＨ２末端のアミノ酸残基のうちの１つ以上で改変されている。他の実施形態において、ＣＣＬ５ペプチドフラグメントは、配列番号１８のアミノ酸配列またはそのＮＨ２末端改変フラグメントを含む。特定の他の実施形態において、配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８のＣＣＬ５ペプチドフラグメントの一次配列または二次配列は、以下の第Ａ．２節において記載されるペプチド模倣物または有機低分子模倣物を設計するために使用される。
【００５５】
本発明の特定の実施形態において、ＣＣＬ５ポリペプチドは、化学的開裂または酵素開裂によってそのフラグメントに開裂されることが企図される。このことは、タンパク質分解酵素（すなわち、プロテイナーゼ）で精製ＣＣＬ５ポリペプチドを処理することにより達成される。このプロテイナーゼとしては、セリンプロテイナーゼ（例えば、キモトリプシン、トリプシン、プラスミン、エラスターゼ、トロンビン、ズブチリシン）、金属プロテイナーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、ロイシンアミノペプチダーゼ、サーモリシン、コラゲナーゼ）、チオールプロテイナーゼ（例えば、パパイン、ブロメライン、レンサ球菌性プロテイナーゼ、クロストリパイン）および／または酸プロテイナーゼ（例えば、ペプシン、ガストリクシン、トリプシノゲン）が挙げられるが、これらに限定されない、ポリペプチドフラグメントはまた、化学的な手段（例えば、そのポリペプチドと、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸、イソ安息香酸、ＢＮＰＡ−スカトール、ヒドロキシルアミンまたは希酸溶液との処理）を用いて生成される。他の実施形態において、この本発明のＣＣＬ５ポリペプチドフラグメントは、当該分野で公知の、実施例１に記載されるペプチド合成法（Ｂａｒａｎｙら，１９９７；Ｓｉｍｍｏｎｓら；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら，１９９６；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら，１９９９；米国特許第５，２５８，４５４号）を介して組換え発現されるかまたは調製される。
【００５６】
（２．ペプチド模倣物および有機低分子模倣物）
創薬の一般的アプローチは、特定の疾患と関連したタンパク質−タンパク質相互作用の試験、続いて、その相互作用するタンパク質のうちの１つに結合し得るかまたはこれを模倣し得る低分子の設計を包含する。しばしば、生物活性は、二次構造要素（例えば、α−ヘリックス、β−シート、β−ターン、γ−ターン、β−鎖、ループ構造など）によって作られるタンパク質表面の小さな局在化した領域のみ由来する。従って、低有機分子模倣物およびペプチド模倣物は、しばしば、そのタンパク質折りたたみ表面（すなわち、三次構造）のこれらの局在化した構造要素（すなわち、二次構造）を模倣することにより、それらの生物学的活性を発揮するように設計される。
【００５７】
「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」は、得られた分子が、望ましいポリペプチド二次（または局在化した三次）構造要素を模倣しているかまたは似ている限りにおいて、分子の種々の型またはクラスをいう。例えば、ペプチド模倣物は、アミド結合アイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅｓ）および／または天然のペプチド骨格の改変（鎖伸長もしくはヘテロ原子組み込みが挙げられる）の使用を介してペプチド二次骨格を模倣するオリゴマーである；その例としては、アザペプチド、オリゴカルバメート、オリゴウレア、β−ペプチド、γ−ペプチド、オリゴ（フェニレンエチニレン）、ビニルスルホンペプチド（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ  ｓｕｌｆｏｎｏｐｅｐｔｉｄｅ）、ポリ−Ｎ−置換グリシン（ペプトイド）などが挙げられる（例えば、Ｇｅｌｌｍａｎ，１９９８；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍら，１９９９；Ｂａｒｒｏｎ  ａｎｄ  Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，１９９９を参照のこと）。ペプチド模倣物を設計および合成するための方法は、当業者に周知である。特定の実施形態において、ペプチド模倣物は、プロテアーゼ感受性を克服し、二次構造を安定化させ、そして／または天然に存在するＣＣＬ５ペプチドアナログと比較してバイオアベイラビリティーを改善するために使用されることが企図される。特定の実施形態において、本発明のペプチド模倣物は、リバースターン（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｕｒｎ）模倣物（例えば、β−ターン模倣物、単環式β−ターン模倣物、二環式β−ターン模倣物、γ−ターン模倣物または単環式γ−ターン模倣物）である。
【００５８】
β−鎖二次構造は、しばしば、ランダム配置であると考えられてきたが、最近になって、広い範囲の生体分子レセプターによって認識されるタンパク質構造の基本的かつ不連続の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）要素と認識された。例えば、全てのタンパク質分解酵素が伸長したβ−鎖構造において、それらのインヒビター／基質を結合することが、納得できるように実証された。この構造において、このペプチド骨格または等価な非ペプチド分子は、直線状の配置（ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）にある（ＴｙｎｄａｌｌおよびＦａｉｒｌｉｅ，１９９９；Ｆａｉｒｌｉｅら，２０００；ＢｏｄｅおよびＨｕｂｅｒ，１９９２）。β−ターンは、ポリペプチド構造における部位である。このβ−ターンにおいてポリペプチド鎖は、その方向を逆にする。これらのターンは、極性であり、かつ主にタンパク質分子の表面に位置し（すなわち、溶媒に曝される）、よって、レセプター結合、抗体認識およびペプチド模倣物設計のための理想的な部位として働く。
【００５９】
従って、特定の実施形態において、哺乳動物被験体におけるパラミクソウイルス感染を阻害または予防する分子は、ペプチド模倣物または有機低分子模倣物（本明細書以降、「低分子」または「低分子模倣物」）である。本発明のペプチド模倣物または低分子模倣物は、本明細書中以下に記載されるＣＣＬ５ポリペプチドまたはその改変ＣＣＬ５ポリペプチド（例えば、Ｍｅｔ−ＣＣＬ５；ＡＯＰ−ＣＣＬ５）の特定の二次構造要素または三次構造要素を模倣するかまたはまねるように設計される。
【００６０】
ＣＣＬ５の三次元の液相構造（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）は、二次元ＮＭＲおよび三次元ＮＭＲを介して解明された（Ｓｋｅｌｔｏｎら，１９９５）。得られたＮＭＲデータを使用して、エネルギーが最小のＣＣＬ５構造の２０種のメンバーの集合を生成した。これらの構造を、登録名称１ＲＴＮの下でＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに登録した。平均的なＣＣＬ５構造（２０種のＣＣＬ５構造を用いたインシリコエネルギー最小化の２０００工程により計算（Ｓｋｅｌｔｏｎら，１９９５）もまた、登録した（ＰＤＢ登録名称１ＲＴＯ）。より最近になって、ＡＯＰ−ＣＣＬ５を化学合成し、その高分解能（１．６Å）結晶構造が解明され、ＰＤＢ登録名称１Ｂ３Ａの下で登録され（Ｗｉｌｋｅｎら，１９９９）、その後直ぐに、ＰＤＢ登録名称１ＥＱＴ（Ｈｏｏｖｅｒら，２０００）の下で登録したＭｅｔ−ＣＣＬ５の高分解能（１．６Å）結晶構造が、解明された。
【００６１】
ＣＣＬ５のポリペプチド折りたたみは、ＣＯＯＨ−末端α−ヘリックスに隣接した３本鎖アンチパラレルβ−シートを形成する、他のＣＣポリペプチドおよびＣＸＣポリペプチドのものに類似である。以下の表５Ａおよび表５Ｂに列挙されるのは、それぞれ、ＮＭＲによって決定された場合（ＰＤＢ  １ＲＴＯ；Ｓｋｅｌｔｏｎら，１９９５）およびＸ線結晶学によって決定された場合（ＰＤＢ  １Ｂ３Ａ；Ｗｉｌｋｅｎら，１９９９）の、ＣＣＬ５およびＡＯＰ−ＣＣＬ５の二次構造要素である。
（表５Ａ）
（ＣＣＬ５２次構造）
【００６２】
【表５Ａ】
2007537148.tif 000010
（表５Ｂ）
（ＡＯＰ−ＣＣＬ５２次構造）
【００６３】
【表５Ｂ】
2007537148.tif 000011
ＣＣＬ５二量体のＮＭＲ液相構造（Ｓｋｅｌｔｏｎら，１９９５）は、部分的に分解された（ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ）ＮＨ２−末端領域、続いて、シグナチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の２システインモチーフにつながる短い鎖（β０）、３１０ターンで終わる伸長領域（ＮＨ２−ループ）、ループおよびＣＯＯＨ−末端α−ヘリックスによって接続される３つのアンチパラレルβ−鎖（β１-β３）を示す。このケモカイン二量体の生理学的関連性はなお論争中であるが、最近の研究により、ＣＣＬ５の生物学的機能が、二量体構造に依存することが示されている（Ｎａｒｄｅｓｅら，２００１）。２部位ケモカインモデルによれば、このケモカインの２つの異なる領域が、ケモカインレセプターとの相互作用に関与する：レセプター活性化に重要なＮＨ２−末端、および最初のドッキング事象を担う、ＮＨ２−ループ領域が関連していると示唆された別のドメイン（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，１９９４；Ｓｃｈｒａｕｆｓｔaｔｔｅｒ，１９９５；Ｌｏｗｍａｎら，１９９６；Ｐａｋｉａｎａｔｈａｎら，１９９７；Ｃｒｕｍｐら，１９９７；Ｈｅｍｍｅｒｉｃｈら，１９９９；Ｌａｕｒｅｎｃｅら，２０００）。このＮＨ２−ループは、ＨＩＶ−１感染の生理学において中心的な役割を果たすと考えら得る。なぜなら、ケモカイン媒介性のＨＩＶ−１阻害（ｂｌｏｃｋａｄｅ）も、ＨＩＶ−１コレセプター機能も、ケモカインレセプターのシグナル伝達活性を要しないからである（Ｎａｒｄｅｓｅら，２００１）。
【００６４】
ＣＣＬ５の機能的マッピング（上記第Ａ．１節で記載される）は、ＮＭＲ液相構造と相関していた（Ｎａｒｄｅｓｅら，２００１）。ＣＣＬ５二量体の表面電位の分析により、ＨＩＶ−１抗ウイルス活性にとって重要なＮＨ２−ループ残基（Ｐｈｅ１２，Ｔｙｒ１４およびＩｌｅ１５）が、分子表面に示されていることが示され、この分子表面において、このＮＨ２−ループ残基は、大きな（１８０Å２）疎水性の溶媒に曝された区画（ｐａｔｃｈ）の形成に寄与する。この構造的特徴は、レセプタードッキング部位としての潜在的な役割と一致する。例えば、Ｐｈｅ１２は、関連したＣＣケモカインＭＣＰ−１においてＴｙｒ１３（他のＮＨ２−ループ残基とともに、ＣＣＲ２結合および疎水性表面の溝の形成に対する寄与に影響を与えている残基）に構造的に等価である。同様に、ＭＩＰ−１βにおける等価な残基であるＰｈｅ１３は、ＣＣＲ５結合およびケモカイン二量体化にとって重要である。しかし、ＣＣＬ５上の疎水性区画はまた、ＨＩＶ−１抗ウイルス活性を示したβ１−鎖ペプチドの中心にある芳香族残基のクラスタ（Ｔｙｒ２７-Ｔｙｒ２９）を含む（例えば、上記第Ａ．１節を参照のこと）。従って、Ｎａｒｄｅｓｅらの構造分析は、ＮＨ２−ループおよびβ１−鎖残基の両方が、推定されるＣＣＲ５レセプター界面の形成に寄与することを示唆する。興味深いことに、このＣＣＬ５のβ１−鎖残基は、哺乳動物上皮細胞のＲＳＶ感染の阻害に必要でない。このことは、（すなわち、ＨＩＶ−１感染と比較して）ＲＳＶ感染のＣＣＬ５阻害にとって代替機構（または代替的構造要素）の可能性を示唆する。
【００６５】
アミノ酸キラリティーが逆になったペプチド模倣物（すなわち、天然に存在するＬ−アミノ酸立体異性体のＤ−アミノ酸立体異性体）は、プロテアーゼ媒介性消化に本質的に耐性であるので、治療的適用にとっての適した候補になる。Ｎａｒｄｅｓｅら（２００１）は、本来の側鎖位相化学（ｔｏｐｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を保存するためにペプチド結合の方向が逆になった、ＮＨ２−ループ／β１−鎖１９マーのインバート型（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）模倣物を合成した。レトロインバート型ペプチド（Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ２９−Ｄ−Ｃｙｓ１１−ＮＨ２；配列番号１９）は、そのＬ−アミノ酸対応物（配列番号１６）の抗力に匹敵する効力（平均ＩＤ５０＝１３．３＋／−２．７μＭ）およびその拮抗された走化性で、ＨＩＶ−１エンベロープ媒介性細胞融合を効率的に阻害した。対照的に、類似のアミノ酸組成および疎水性値を有する、コントロールのレトロインバート型ペプチドでは、何ら効果が認められなかった。これらの生物学的効果により、レトロインバート化が、そのペプチド側鎖の本来の空間的配向の保存を生じるという推測が確認された。
【００６６】
従って、特定の実施形態において、本発明は、配列番号１のほぼアミノ酸残基１〜ほぼアミノ酸残基３０までのＣＣＬ５ポリペプチドのペプチド模倣物に関し、ここでこのペプチド模倣物は、哺乳動物被験体におけるパラミクソウイルス感染を阻害する。１つの特定の実施形態において、ペプチド模倣物は、配列番号１のＮＨ２−末端のＣＣＬ５ペプチドフラグメントのアミノ酸残基１〜１５（配列番号２によって表される）に基づき、ＲＳＶ感染を阻害することが示される（実施例４）。別の実施形態において、ペプチド模倣物は、配列番号１のアミノ酸残基１〜２２に基づく。別の実施形態において、ペプチド模倣物は、配列番号１のアミノ酸残基１〜２９に基づく。別の実施形態において、ペプチド模倣物は、以下のように、逆の順序で配列番号１のアミノ酸残基１１〜２９を含むレトロインバート型ペプチドである：Ａｃ−ＹＦＹＥＫＩＨＡＲＰＬＰＲＡＩＹＡＦＣ−ＮＨ２（配列番号１９）（本明細書中以降、「Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ２９−Ｄ−Ｃｙｓ１１−ＮＨ２」と表される）。別の実施形態において、ペプチド模倣物は、以下のように、逆の順序で配列番号１のアミノ酸残基１〜３４を含むレトロインバート型ペプチドである：Ａｃ−ＣＫＧＳＴＹＦＹＥＫＩＨＡＲＰＬＲＰＡＩＹＡＦＣＣＰＴＴＤＳＳＹＰＳ−ＮＨ２（配列番号２０）（本明細書中以降「Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ３４−Ｄ−Ｓｅｒ１−ＮＨ２」と表される）。なお別の実施形態において、ペプチド模倣物は、以下のように、逆の順序で配列番号１のアミノ酸残基１〜１５を含むレトロインバート型ペプチドである：Ａｃ−ＩＹＡＦＣＣＰＴＴＤＳＳＹＰＳ−ＮＨ２（配列番号２１）（本明細書中以降「Ａｃ−Ｄ−Ｉｓｏ１５−Ｄ−Ｓｅｒ１−ＮＨ２」と表される）。別の実施形態において、ペプチド模倣物または低分子模倣物は、ＮＨ２−ループアミノ酸Ｐｈｅ１２、Ｔｙｒ１４およびＩｌｅ１５の二次構造要素および三次構造要素を含む。これらの構造要素は、インシリコ分子モデリングおよび以下に記載されるように、１ＥＱＴ（Ｍｅｔ−ＣＣＬ５）、１Ｂ３Ａ（ＡＯＰ−ＣＣＬ５）および１ＲＴＯ（ＣＣＬ５）からなる群より選択されるＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ分子座標登録ファイルの視覚化を介して容易に決定される。なお他の実施形態において、ＣＣＬ５（ＰＤＢ  １ＲＴＮ；ＰＤＢ  １ＲＴＯ）、Ｍｅｔ−ＣＣＬ５（ＰＤＢ  １ＥＱＴ）および／またはＡＯＰ−ＣＣＬ５（ＰＤＢ  １Ｂ３Ａ）の分子座標は、配列番号１、配列番号２、配列番号１８またはこれらのＮＨ２−末端フラグメントの第２世代ペプチド模倣物を（インシリコ分子モデリングを介して）生成するために使用される。
【００６７】
上記で議論されるように、ＣＣＬ５についてのポリペプチド折りたたみは、他のＣＣケモカインおよびＣＸＣケモカイン（例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４）の折りたたみに類似である。しかし、本発明において、ＣＣＬ５（ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）でもＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）でもない）が、上皮細胞のＲＳＶ感染を阻害したことが実証された。このことは、ＲＳＶ（ＨＩＶ−１とは対照的に）は、ＣＣＲ５以外のレセプターを利用し得ることを示唆する。ＲＳＶ感染のＣＣＬ５媒介性阻害の配列および／または構造的要件をさらに解明するために、ＣＣＬ５ポリペプチドおよびＣＣＬ３ポリペプチドを、アミノ酸配列アラインメント（表６）、ヒドロパシープロット（図４Ａおよび図４Ｂ）、および分子モデリング／可視化（図１１）によって比較した。実施例５において記載されるように、ＣＣＬ５およびＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）配列の比較により、ｉｎｄｉｃａｔｅｄ  ｔｈａｔ  ＣＣＬ５およびＣＣＬ３は、３２個の同一のアミノ酸（すなわち、４８％同一性）を共有し、約７８％のアミノ酸配列類似性を有する（表６）。
（表６）
（ＣＣＬ５およびＣＣＬ３のＢＬＡＳＴアライメント）
【００６８】
【表６】
2007537148.tif 000012
全長ＣＣＬ５  対  全長ＣＣＬ３のヒドロパシープロット（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）の比較（図４Ａおよび図４Ｂ）により、ＣＣＬ５とＣＣＬ３との間の最大のヒドロパシー配列の相違が、これらのポリペプチドのＮＨ２−末端内で起こることが示唆された（例えば、実施例５を参照のこと）。ＣＣＬ５（ＰＢＤ  １ＲＴＯ）およびＣＣＬ３（ＰＢＤ  １Ｂ５３）のエネルギーが最小の構造を、インシリコで（ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬおよびＳｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（ＧｕｅｘおよびＰｅｉｔｓｃｈ，１９９７））モデリングし、三次構造（または折りたたみ）を、ＮＨ２−末端アミノ酸１〜７（データは示さず）およびＣＯＯＨ−末端アミノ酸６４〜６８を除いて、重ね合わせた。ＣＣＬ５／ＣＣＬ３ヒドロパシープロット（図４Ａ）と同様に、ＣＣＬ５とＣＣＬ３との間の最大の構造的な配列相違は、ＮＨ２−末端アミノ酸残基において生じる。いずれの特定の理論に梗塞されることも望まないが、ｉｔ  ｉｓ  ｃｏｎｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ｔｈａｔ  ＲＳＶ感染の阻害に比較した、ＨＩＶ−１感染のＣＣＬ５阻害の間の差異は、一部、ＣＣＬ５  ＮＨ２−末端の最初の１５アミノ酸によって調節され得る。
【００６９】
従って、特定の実施形態において、本発明のペプチド模倣物または低分子模倣物は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＣＬ５  ＮＨ２−末端ペプチドフラグメントを模倣する。１つの特定の実施形態において、ペプチド模倣物は、表７に示されるようなＣＣＬ５、ＡＯＰ−ＣＣＬ５またはＭｅｔ−ＣＣＬ５の最初の１５個のアミノ酸の二面角に基づく。      
【００７０】
（表７）
（ＣＣＬ５、ＭＥＴ−ＣＣＬ５、およびＡＯＰ−ＣＣＬ５の最初の１５のＮＨ２−末端アミノ酸についての二面角）
【００７１】
【表７】
2007537148.tif 000013
本発明の他の実施形態において、抗ウイルス性分子は、哺乳動物細胞のパラミクソウイルス感染を阻害または予防する非ペプチド低分子模倣物（ペプチド模倣物とは対照的に）である。ペプチド模倣物の設計と同様に、本発明の非ペプチド低分子は、配列番号１のＣＣＬ５ポリペプチドの重要な構造要素またはアミノ酸残基を模倣するように設計される。１つの特定の実施形態において、低分子は、配列番号１のＮＨ２−末端ＣＣＬ５ペプチドフラグメントのアミノ酸残基１〜１５（配列番号２によって表される）に基づく。別の実施形態において、低分子は、配列番号１のアミノ酸残基１１〜２２（配列番号１３によって表される）に基づく。別の実施形態において、低分子は、配列番号１のアミノ酸残基１１〜２９（配列番号１６によって表される）に基づく。別の実施形態において、低分子は、配列番号１８のレトロインバート型ペプチド模倣物Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ２９−Ｄ−Ｃｙｓ１１−ＮＨ２に基づく。
【００７２】
好ましい実施形態において、本発明の低分子は、ＮＨ２−ループのアミノ酸残基Ｐｈｅ１２、Ａｌａ１３、Ｔｙｒ１４およびＩｌｅ１５によって形成されるＣＣＬ５疎水性区画を模倣する。特定の実施形態において、この低分子模倣物は、機能的で折りたたまれたＣＣＬ５ポリペプチドにおいて見出されるようなアミノ酸Ｐｈｅ１２、Ｔｙｒ１４およびＩｌｅ１５の三次元分子配置を含み、ここでＰｈｅ１２、Ｔｙｒ１４およびＩｌｅ１５は、ＣＣＬ５（ＰＤＢ  １ＲＴＯ）の分子座標、ＡＯＰ−ＣＣＬ５（ＰＤＢ  １Ｂ３Ａ）の分子座標またはＭｅｔ−ＣＣＬ５（ＰＤＢ  １ＥＱＴ）の分子座標の二面角に従って空間的に束縛される。他の実施形態において、本発明の低分子は、Ｎａｒｄｅｓｅら（２００１）に記載されるように、アミノ酸残基Ｐｈｅ１２、Ａｌａ１３、Ｔｙｒ１４およびＩｌｅ１５またはＮＨ２−ループ、ならびにβ１−シートの残基Ｔｙｒ２７、Ｐｈｅ２８およびＴｙｒ２９によって形成されるＣＣＬ５疎水性区画を模倣する。特定の他の実施形態において、ＣＣＬ５（ＰＤＢ  １ＲＴＮ；ＰＤＢ  １ＴＲＯ）、Ｍｅｔ−ＣＣＬ５（ＰＤＢ  １ＥＱＴ）および／またはＡＯＰ−ＣＣＬ５（ＰＤＢ  １Ｂ３Ａ）ＣＣＬ５の分子座標は、疎水性区画を模倣する低分子を（インシリコ分子モデリングおよび計算を介して）生成するために使用される。
【００７３】
上記のように、本発明の特定のデータは、ＣＣＲ３が、哺乳動物上皮細胞へのＲＳＶ進入のためのコレセプターであることを示す。従って、別の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ３レセプターの低分アンタゴニスト、ＣＣＲ３レセプターのペプチドアンタゴニスト、ＣＣＲ３レセプターの模倣物またはこれらの組み合わせと組み合わせて投与される、本発明の抗ウイルス性分子に関する。特定の実施形態において、ＣＣＲ３アンタゴニストは、以下の化学構造のうちの１つ以上を含む分子である：
【００７４】
【化５】
2007537148.tif 000014
他の実施形態において、本発明の抗ウイルス性分子は、ＣＣＲ１レセプターの低分子アンタゴニストと組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ＣＣＲ１アンタゴニストは、以下の化学構造のうちの１つ以上を含む分子である：
【００７５】
【化６】
2007537148.tif 000015
なお他の実施形態において、本発明の抗ウイルス性分子は、ＣＣＲ５レセプターの低分子アンタゴニストと組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、以下の化学構造のうちの１つ以上を含む分子である：
【００７６】
【化７】
2007537148.tif 000016
【００７７】
【化８】
2007537148.tif 000017
（Ｂ．ケモカインをコードするポリヌクレオチド、組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
特定の実施形態において、ケモカインポリペプチド（例えば、ＣＣＬ５、ＣＣＬ３）、短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ケモカインポリペプチド（例えば、ＣＣＬ５D１−８）、ケモカインフラグメント（例えば、配列番号２のＣＣＬ５）などが、組換え発現される。好ましい実施形態において、ケモカインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プラスミドベクター中に含まれ、原核生物宿主細胞において発現される。本発明の全長ＣＣＬ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２３として示される。
【００７８】
ケモカインポリヌクレオチドが、ケモカインポリペプチド、そのフラグメントまたはその短縮型の組換え生成のために使用される場合、このポリヌクレオチドは、このポリペプチドについてのコード配列、または他のコード配列とともにリーディングフレーム中にあるこのポリペプチドについてのコード配列（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列をコードするもの、プレタンパク質配列、プロタンパク質配列もしくはプレプロタンパク質配列、または他の融合ペプチド部分）を含む。例えば、その融合されたポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列が、コード配列に連結され得る（Ｇｅｎｔｚら，１９８９（その全体が本明細書以降、参考として援用される）を参照のこと）。従って、本発明において企図されるのは、発現産物のＨｉｓ−タグ精製を可能にする融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの調製である。このポリヌクレオチドはまた、非コード５’配列および非コード３’配列（例えば、転写された非翻訳配列、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナル）を含み得る。
【００７９】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」とは、融合タンパク質もしくは非融合タンパク質いずれかの発現を指向する構成性プロモーターもしくは誘導性プロモーターを含むベクターを有するＥ．ｃｏｌｉ中で行われる。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、その組換えタンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシ末端に、多くのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増大させること；２）その組換えタンパク質の可溶性を増大させること；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することによって、その組換えタンパク質の精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解の切断部位は、融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入されて、融合タンパク質を精製した後に、組換えタンパク質を融合部分から分離することを可能にする。このような酵素およびそれらの同族認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。
【００８０】
代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，１９８８）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ；ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられ、これらは、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを融合して、組換えタンパク質を標的とする。適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら，１９８８）およびｐＥＴ  ＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，１９９０）が挙げられる。
【００８１】
特定の実施形態において、組換え発現ベクターは、そのケモカインポリペプチドが発現される「宿主細胞」に導入される。「遺伝子操作された宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書で交換可能に使用される。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ケモカインポリペプチドは、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞）、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳＯ細胞またはＣＯＳ細胞）において発現される。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００８２】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換、感染またはトランスフェクション技術を介して、原核生物細胞または真核生物細胞に導入される。本明細書で使用される場合、用語「形質転換」、「感染」および「トランスフェクション」は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該分野で認識された種々の技術（リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクチン、感染またはエレクトロポレーションが挙げられる）をいうことが意図される。宿主細胞を形質転換、感染またはトランスフェクトするための適切な技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、および他の実験マニュアルにおいて見出され得る。
【００８３】
本発明の宿主細胞（例えば、培養した原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）はまた、大量の望ましいケモカインポリペプチドを生成（すなわち、発現）するために使用される。よって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ケモカインポリペプチドを生成するための方法を提供する。一実施形態において、この方法は、本発明の宿主細胞（この細胞の中に、ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されている）を、ケモカインポリペプチドが生成されるまで、適切な培地中で培養する工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、この培地または宿主細胞からケモカインポリペプチドを単離する工程を包含する。
【００８４】
本発明の発現ベクターは、ある量のケモカインポリペプチド自体をコードするＤＮＡを調製するための手段、およびそのコードされたポリペプチドを調製するための手段の両方として有用である。本発明のケモカインポリペプチドが組換え手段によって作製される場合、シャトル系として原核生物細胞または真核生物細胞いずれかの発現ベクターが使用され得ることが企図される。
【００８５】
（Ｃ．抗ウイルス薬学的組成物）
特定の好ましい実施形態において、本発明は、本発明の抗ウイルス性分子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。この抗ウイルス性分子は、哺乳動物被験体（例えば、ヒト）への投与に適した薬学的組成物に組み込まれる。このような組成物は、代表的には、「活性な」組成物（すなわち、抗ウイルス性分子）および「薬学的に受容可能なキャリア」を含む。本明細書中以降で使用される場合、語句「薬学的に受容可能なキャリア」とは、薬学的投与と適合性の、任意のかつ全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のために、このような媒体および薬剤を使用することは、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、このような媒体は、本発明の組成物において使用され得る。補充的な活性化合物もまた、この組成物に組み込まれ得る。
【００８６】
本発明の薬学的組成物は、意図された投与経路と適合性であるように処方される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内）、粘膜（例えば、経口、直腸、鼻内、口内、膣、呼吸器）および経皮（局所）が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈液（例えば、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝剤（例えば、酢酸、クエン酸またはリン酸）ならびに塩化ナトリウムもしくはデキストロースなどの張度を調節するための薬剤が挙げられる。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調節され得る。非経口調製物は、ガラスもしくはプラスチックから作られた、アンプル、使い捨てシリンジ、または複数回用量バイアル中に封じられ得る。
【００８７】
注射用途に適した薬学的組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）、または滅菌注射溶液もしくは分散液の即時の調製のための分散液および滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与に関して、適切なキャリアは、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬTM（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は、無菌でなければならず、容易にシリンジが使える程度まで流動性であるべきである。これはまた、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば、細菌または真菌）の汚染作用から保護されなければならない。このキャリアは、溶媒または分散媒であり、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含む。例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散液の場合には必要な粒径を維持することによって、そして界面活性剤を使用することによって、適切な流動性が維持される。微生物作用からの保護は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸など）により達成される。多くの場合、等張化剤（例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を組成物中に含めることは、好ましい。注射用組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる因子（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物中に含めることによってもたらされる。
【００８８】
適切な注射用溶液は、必要な場合、上記に挙げた成分の１つまたはそれらの組み合わせとともに、適切な溶媒中に、必要とされる量の活性化合物を組み込み、次に、濾過滅菌することによって調製される。概して、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒および上記に列挙した必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、その調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、この方法によって、活性成分の粉末と、任意のさらなる望ましい成分を、その予め滅菌濾過した溶液から得る。
【００８９】
経口組成物は、一般に、不活性希釈液または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封じられてもよいし、錠剤へと打錠されてもよい。経口治療的投与の目的で、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセル剤の形態において使用される。経口用組成物はまた、マウスウォッシュとして使用するための液体キャリアを使用して調製され、ここで流体キャリア中の化合物は、経口的に適用されるか、うがいされるか、はき出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチなどは、以下の成分のいずれかまたは類似の性質の化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、澱粉またはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギニン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅ）；滑剤（例えば、コロイド性二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；または矯味矯臭剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ調味剤）。
【００９０】
吸入による投与に関して、化合物は、適切なプロペラント（例えば、二酸化炭素のようなガス）を含む加圧容器またはディスペンサ、またはネブライザからエアロゾルスプレーの形態で送達される。全身投与はまた、粘膜手段または経皮手段によっても行われ得る。粘膜投与または経皮投与に関して、浸透されるべき障壁に適した浸透剤が、処方物中で使用される。このような浸透は、一般に当該分野で公知であり、例えば、粘膜投与に関しては、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成される。経皮投与に関して、上記の化合物は、当該分野で一般に公知であるように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム剤へと処方される。
【００９１】
この化合物はまた、坐剤（例えば、従来の坐剤用基剤（例えば、カカオ脂および他のグリセリドを用いて）または直腸送達のための保持浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｎｅｍａ）の形態に調製される。
【００９２】
一実施形態において、活性化合物は、身体からの急速な排除から化合物を保護するキャリアとともに調製される（例えば、インプラントおよびマイクロカプセル送達形態を含む、制御放出処方物）。
【００９３】
生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。これらのポリマーとしては、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ酢酸が挙げられる。このような処方物の調製のための方法は、当業者に明らかである。この材料はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから市販されている。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞を標的化したリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用される。これらは、当業者に公知の方法（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号（本明細書中以降、参考として援用される）に記載されるもの）に従って調製される。
【００９４】
投与しやすさおよび投与量を均一にするために、投薬単位形態で経口組成物または非経口組成物を処方することは、特に遊離である。本明細書中以降で使用される場合、投薬単位形態とは、処置される被験体にとって一体の投薬量として好都合な物理的に別個の単位をいう；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して望ましい治療効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態の仕様は、活性化合物の特有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに固体の処置のためにこのような活性化合物を調合することの当該分野で固有の制限により必然的に決まり、これらに直接依存する。
【００９５】
薬学的に受容可能なビヒクルは、副作用を引き起こさず、かつ例えば、活性化合物の投与を容易にすること、身体におけるその寿命および／もしくはその有効性を増大させること、溶液中でのその溶解性を増大させること、または代わりにその貯蔵を高めることを可能にする、薬学的組成物へと入れられる化合物または化合物の組み合わせを表すことが理解される。これらの薬学的に受容可能なビヒクルは周知であり、選択された活性化合物の性質およびその投与様式に従って、当業者により適合される。
【００９６】
本発明の組成物は、代表的には、望ましい場合、標準的で周知の非毒性の生理学的に受容可能な、キャリア、アジュバント、およびビヒクルを含む投薬単位処方物において、非経口的に投与される。本明細書中以降で使用される場合、用語、非経口的とは、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、動脈内の注射または注入の技術を含む。
【００９７】
注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性懸濁液または滅菌注射用油性懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて、公知の技術に従って処方される。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口で受容可能な希釈液または溶媒中（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として）の滅菌注射用溶液または滅菌注射用懸濁液であり得る。
【００９８】
使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌した不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来通り使用される。この目的で、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の刺激の少ない不揮発性油が使用され得る。さらに、脂肪酸（例えば、オレイン酸）は、注射用の調製物における使用が見出される。
【００９９】
好ましいキャリアとしては、リン酸、ラクトース、Ｔｒｉｓなどで緩衝化した中性生理食塩水溶液が挙げられる。ウイルスベクターを投与する場合、このベクターは、望ましくない夾雑物を本質的に含まない（例えば、妨害アデノウイルス粒子またはエンドトキシンおよび他の発熱物質がない）ようにするために十分精製されなければならない。その結果、ベクター構築物を受容する固体において何ら都合の悪い反応を引き起こさない。ベクターを精製する好ましい手段は、浮遊密度勾配（例えば、塩化セシウム勾配遠心分離）の使用を含む。
【０１００】
キャリアはまた、リポソームであり得る。送達ビヒクルとしてリポソームを使用するための手段は、当該分野で周知である。
【０１０１】
本明細書で引用された全ての特許および刊行物は、本明細書に参考として援用される。
【実施例】
【０１０２】
（Ｄ．実施例）
以下の実施例は、特に詳細に説明されるものを除いて、当業者に周知であり、かつ当業者に慣用的である、標準的な技術を使用して実施される。以下の実施例は、例示の目的で提示され、本発明の範囲を多少なりとも制限するものとして解釈されるべきでない。
【０１０３】
（実施例１  材料および方法）
（ケモカインおよび試薬）
特に示されない限り、全ての組み換え（ｒ）ヒトケモカインおよび抗ヒトケモカインレセプター抗体は、Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。組み換えヒトＣＣＬ５およびストロマ細胞由来因子（ＣＸＣＬ１２）は、それぞれ、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）およびＷｙｅｔｈ（Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）から入手した。ＣＣケモカインレセプター（ＣＣＲ）に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方を、これらの研究に使用した。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ヒトＣＣＲ３に対するもの（カタログ番号ＭＡＢ１５５）またはＣＣＲ５に対するもの（カタログ番号ＭＡＢ１８２）であった。ＣＣＲ１に由来するペプチド配列に対して惹起したアフィニティー精製ポリクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ−７９３４）、ＣＣＲ３に由来するペプチド配列に対して惹起したアフィニティー精製ポリクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ−７８９７）、ＣＣＲ４に由来するペプチド配列に対して惹起したアフィニティー精製ポリクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ−６１２６）、またはＣＣＲ５に由来するペプチド配列に対して惹起したアフィニティー精製ポリクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ−８２８３）を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入した。抗ヒトＣＸ３ＣＲ１ポリクローナル抗体（カタログ番号ＴＰ５０２ＡＦ）を、Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｂｉｏｌａｂｓ  （Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入した。ＣＣＬ５の一連の９つの重なり合う合成ペプチド（表１）（Ｓｃｈａｌｌら、１９８８）を、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から購入したか、または、標準的なペプチド化学を用いて合成した。これらのペプチドを、製造業者の説明書（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に従って、ＥＺ−ＬＩＮＫＴＭＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン）化学を用いてビオチンで標識した。インビトロ実験およびインビボ実験に関して、ペプチドは、それぞれ、５％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび２％  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの最小基本培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中に溶解するか、または、ＰＢＳ中で再構築させ、示した濃度で使用した。これらのペプチドは、９０％より高い純度であった。抗融合インヒビターであるＲＦＩ−６４１（Ｒａｚｎｉｋｏｖら、２００１）をＰＢＳ中に希釈し、インビボにて、２５μｇ／用量で投与した。
【０１０４】
（ウイルスストック）
野生型ＲＳＶ株Ａ２およびＢ１（Ｗｒｉｇｈｔら、１９７３）および変異型ＲＳＶ株ｃｐｔｓ２４８／４０４（Ａｃｋｅｒｌｉｎｄら、１９８８）、ｒＡ２ｃｐｔｓ２４８／４０４ΔＳＨ（Ｃｒｏｗｅら、１９９４）、ならびにＳＨ遺伝子およびＧ遺伝子（ヌクレオチド４０６４−  ５４６２）  を欠失したｃｐ３２／Ｄ１（Ｋａｒｒｏｎら、１９９７）を、以前に記載されたように、完全培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２％  ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％  ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ、３７℃、５％  ＣＯ２）中で培養したＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２３）中で増殖させた。ｃｐ３２／Ｄ１変異体を、ｃｐ５２について以前に記載された方法論（Ｃｒｏｗｅら、１９９６；Ｋａｒｒｏｎら、１９９７）を使用して、Ｂ１株から単離した。組み換えＲＳＶ（一般には、Ｇタンパク質のアミノ酸１１７が短縮されている）もまた、調査において使用した。全てのウイルスストックを、４℃にて１５分間の低速（２０００ｇ）遠心分離によって清澄にした細胞溶解物から調製した。
【０１０５】
（インビトロでのウイルス感染性の阻害）
ＨＥｐ−２を、完全培地の入った９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅ，ＮＪ）中で増殖させた。単層を、三連のウェルにおいて、４℃または３７℃にて１時間、示された量の組み換えケモカインまたは抗ケモカインレセプター抗体で予め処理した。ケモカインまたは抗体を除いた後、単層を、同じ温度にて１時間、示した野生型ＲＳＶ株または変異体ＲＳＶ株で感染させ、ついで、２％  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を重ねた。抗ウイルス活性もまた、細胞を感染してから１時間後に評価するか、または、示された用量のケモカインもしくはＣＣＬ５ペプチドとの１：１混合物において単層をウイルスに対して同時曝露した後に、評価した。抗ケモカインレセプター抗体の阻害特性を、単独でか、または組み合わせて、培養培地１ｍｌあたり５〜１００μｇの範囲の用量で試験した。
【０１０６】
（インビボでのウイルス感染性の阻害）
雌性のＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１０週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＥ）に、ペプチド（１２５μｇ〜５００μｇ／用量）を、ＲＳＶのＡ２株（約２×１０６ｐｆｕ）でのチャレンジの１時間前、もしくはチャレンジの１時間後、ＲＳＶのＡ２株（約２×１０６ｐｆｕ）との１：１混合物中で、同時に、投与した。全ての投与は、鼻腔内（０．０５ｍｌ）であり、麻酔（６０ｍｇケタミン／ｋｇおよび２．５ｍｇキシラジン／ｋｇ（Ｔｈｅ  Ｂｕｔｌｅｒ  Ｃｏ．；Ｄｕｂｌｉｎ  ＯＨ））の注射下で行なった。４日後に、肺を除去し、ホモジェナイズし、そして、低速遠心分離により清澄にし、瞬間凍結して、そして、ＨＥｐ−２細胞を用いてプラークアッセイを行なうまで保存した（Ｈａｎｃｏｃｋら、１９９６）。全ての動物を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅにより認定された施設に収容した。
【０１０７】
（プラークアッセイ）
ウイルスのプラークを、抗Ｆタンパク質（Ｌ４）ｍＡｂ（Ｐａｒａｄｉｓｏら、１９９１；ＷａｌｓｈおよびＨｒｕｓｋａ、１９８３）を用いて、以前に記載されたようにして可視化した（Ｈａｎｃｏｃｋら、１９９６）。その後、細胞を、ブロットブロッキング剤（ＰＢＳ、５％粉ミルク）でリンスし、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と共にインキュベートした。結合した抗体を、ＰＢＳ中に０．１％  Ｈ２Ｏ２を含有する０．０５％  ４−クロロ−１−ナフトールを用いて検出した。プラークを数えた後、平均感染率（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）（三連のウェルの±１標準偏差）をケモカインもしくは抗ケモカインレセプター抗体なしの培養培地のみにおいて、ウイルスに曝露された単層に対して計算した。
【０１０８】
（ＣＣＬ５ペプチドとＨＥｐ−２細胞との相互作用）
ＥＬＩＳＡを用いて、ＨＥｐ−２細胞単層に対する合成ペプチドの相対的な結合を評価した。簡単に述べると、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に、０．２ｍｌの完全培地中、１ウェルあたり３×１０４個のＨＥｐ−２細胞を撒いた。一晩のインキュベーション（３７℃、５％  ＣＯ２）の後、単層を、約１５分間氷上で冷却した。ビオチン化したペプチドを、１ｍｌのＤＭＥＭ（１％  ＦＢＳ、２％ペニシリン／ストレプトマイシン、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充）あたり０．４９μｇ〜５００μｇの上昇する用量（ａｓｃｅｎｄｉｎｇｄｏｓｅ）で、二連のウェルに加え、４℃で１時間インキュベートした。このビオチン化したペプチドを、次いで、８０％メタノール（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ；Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）で固定した（室温で２０分）。ＰＢＳで洗浄した後、単層を、０．３％（Ｖ／Ｖ）Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）と共にインキュベートし（室温で３０分）、再度洗浄し、そして、ビオチン化抗ヒトＣＣＬ５  ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブした（４℃で３０分）。その後、単層を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ；Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）と共にインキュベートした（室温で１時間）。このウェルを、ＴＭＢ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＡＫＯ；Ｃａｒｐｉｔｅｒｉａ，ＣＡ）で発色させた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ３ｓ  Ｖｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて光学密度を測定した（４５０ｎｍ、参照５５０ｎｍ）。
【０１０９】
（フローサイトメトリー）
ＣＣＲの発現を確認するため、Ａ５４９細胞およびＨＥｐ−２細胞を、セルスクレーパーを用いて６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）からやさしく取り除き、ＣＣＲ１に対するビオチン化ｍＡｂ（カタログ番号ＦＡＢ１８２Ｆ）、ＣＣＲ３に対するビオチン化ｍＡｂ（カタログ番号ＦＡＢ１４５Ｐ）、またはＣＣＲ５に対するビオチン化ｍＡｂ（カタログ番号ＦＡＢ１５５Ｐ）と共にインキュベートし（４℃にて３０分）、その後、ストレプトアビジン‐フィコエリスリンと共にインキュベートした。これらの細胞を、標準的なフローサイトメトリー技術（ＦＡＣＳｏｒｔ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて分析した。全ての試薬を、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【０１１０】
（ＣＣＬ５の検出）
ＥＬＩＳＡを、製造業者（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）の指示書に従って使用して、ＲＳＶでの感染後２４時間でＨＥｐ−２上皮細胞およびＡ５４９冗費細胞の培養上清中に分泌されたＣＣＬ５を検出した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｖｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダーを用いて、光学密度を測定した（４５０ｎｍ、参照５５０ｎｍ）。感染後のＣＣＬ５  ｍＲＡＮのコピー数およびＲＳＶのゲノムの数を測定するために、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）アッセイを開発した。総細胞ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）およびＱｕｉａＳｈｒｅｄｄｅｒｓ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて、細胞単層から単離した。ＲＮＡの濃度を、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を添加した後、ＣｙｔｏＦｌｏｕｒ（登録商標）４０００蛍光プレートリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて測定した。１μｇの総細胞ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造業者の説明書に従って使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡを、ＲＳＶ  Ａ２に由来するＬ遺伝子の領域に相補的な、ＤＮＡプライマー‐プローブセットを用いて、ＲＳＶゲノムの存在についてアッセイした。さらに、このプライマー‐プローブセットを含むヒトＲＡＮＴＥＳ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＤＡＲ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を、製造業者の説明書に従って使用して、ＣＣＬ５  ｃＤＮＡを検出した。ＰＣＲ、蛍光検出、およびデータ分析を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）にて行なった。
【０１１１】
（統計的分析）
有意差（ｐ＜０．０５）を、対数変換の後に、ＪＭＰ（登録商標）統計ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．；Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いる、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ＨＳＤ多重比較またはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって決定した。データは、±１標準偏差で表される。全てのデータを、類似の結果を有する別個の研究において確認した。
【０１１２】
（実施例２  ＣＣＬ５は、ＲＳＶによる上皮細胞の感染を阻害する）
この実施例において、ヒト気道上皮細胞が、ＲＳＶによる感染に嘔吐して、ＣＣＬポリペプチドを産生することが、インビトロにおいて実証された。表８および表９は、それぞれ、Ａ５４９細胞単層およびＨＥｐ−２細胞単層からのＣＣＬ５のｍＲＮＡコピー数および分泌の定量的な増加に対する、ＲＳＶ感染の効果を試験した、実験からの代表的な結果を示す。Ａ５４９炭層において、ＣＣＬ５のｍＲＮＡコピー数は、感染後２日で７倍に、そして感染後３日で２０倍に増加した（表８）。このデータは、さらに、ＲＳＶの複製が進行するにつれて、ＣＣＬ５転写物の数が、ＲＳＶゲノムのコピー数に対して、劇的に増加したことを示した（表８）。ＣＣＬ５のＲＳＶゲノムコピー数に対する比率は、培養の１日目と３日目の間に、１６倍増加した。ＣＣＬ５タンパク質は、早ければ感染後２４時間に培養上清中で検出された（表９）。従って、ＲＳＶ感染に応答して、単層は、ＣＣＬ５ポリペプチドの量を増加した。
【０１１３】
（表８）
（ＲＳＶでのヒト肺上皮細胞株の感染は、ＣＣＬ５の発現を誘導するａ）
【０１１４】
【表８】
2007537148.tif 000018
ａ．Ａ５４９細胞を、ＲＳＶ  Ａ２（ＲＳＶ）で感染（ＭＯＩ＝０．０９）させるか、または、培地単独の中で培養し（コントロール）、その後、１〜３日で、定量的リアルタイムＰＣＲにより、総細胞ＲＮＡにおけるＣＣＬ５のコピー数およびネガティブ鎖のＲＳＶゲノムのコピー数を決定した。
ｂ．総ＲＮＡｎｇあたりのＣＣＬ５  ｍＲＮＡのコピー数を示す。
ｃ．ＲＳＶゲノムコピー数に対するＣＣＬ５  ｍＲＮＡコピー数の比を示す。
【０１１５】
（表９）
（ＲＳＶで感染されたヒト上皮細胞は、培養培地中に増加した量のＣＣＬ５を分泌するａ）
【０１１６】
【表９】
2007537148.tif 000019
ａ．Ａ５４９細胞およびＨＥｐ−２細胞を、ＲＳＶ  Ａ２（ＲＳＶ）で感染（ＭＯＩ＝０．０９）させるか、または、培地単独の中で培養した（コントロール）。その後１〜３日で培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡにより、分泌されたＣＣＬ５について分析した。
ｂ．数は、培養培地１ｍｌあたりのＣＣＬ５（ｐｇ）を表す。
ｃ．ＮＤは、決定していないことを示す。
【０１１７】
ＣＣＬ５が、ＲＳＶによる上皮細胞の感染を阻害する能力を、さらに調べた。表１０および表１１は、上昇する量のヒトｒＣＣＬ５へのＨＥｐ−２細胞の事前曝露（１時間）が、感染を消失した、別個の実験を示す。試験した最大用量（１０μｇ  ｒＣＣＬ５／ｍｌ）において、感染性は、培地のみで培養したコントロールに対して、約３０％（表１０）および約２０％（表１１）まで減少した。阻害効果は、７２６ｎｍのメジアン阻害濃度（ＩＣ５０）と同等とみなした。阻害は、用量依存的であった。なぜならば、１μｇおよび５μｇが、１０μｇのｒＣＣＬ５／ｍｌ培養培地よりも阻害性が低かったからである。類似の濃度の、組換えＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４、ＭＣＰ−２／ＣＣＬ８もしくはエオタキシン／ＣＣＬ１１（表１０および表１１）、または、組換えＭＩＰ−１δ／ＣＣＬ１５もしくはＳＤＦ−１α／ＣＸＣＬ１２（表１２）へのＨＥｐ−２細胞の事前曝露（１時間）は、感染性を損なわなかった。このデータは、さらに、感染性の阻害が、ウイルスを単層に加える前（表１２）または加えるのと同時（表１３）に、ｒＣＣＬ５（１０μｇ／ｍｌ）での細胞単層の処理を必要としたことを示した。ｒＣＣＬ５は、ウイルス吸着の１時間後（表１２）または、熱変性後（表１３）に投与された場合、インビトロにおいて感染性を低減しなかった。Ａ５４９単層のｒＣＣＬ５での前処理はまた、ＲＳＶでの感染を阻害しなかった（データ示さず）。
【０１１８】
（表１０）
（ＣＣＬ５は、ＲＳＶによるヒト上皮細胞の感染を阻害するａ）
【０１１９】
【表１０】
2007537148.tif 000020
ａ．ＨＥｐ−２細胞単層を、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ８（ＭＣＰ−２）またはＣＣＬ１１（エオタキシン）に、１時間曝露した。その後、単層を、培地で３回洗浄し、ＲＳＶのＡ２株で１時間感染させた。３日インキュベーションした後、プラークを数えて、ウイルス感染性の度合いを決定した。データは、培地のみでウイルスと共にインキュベートし、ケモカインには曝露しなかったコントロールウェル（１００％  感染性）に対する、平均感染率（±１標準偏差）として表す。
【０１２０】
（表１１）
（ＣＣＬ５は、ＲＳＶによりヒト上皮細胞の感染を阻害するa）
【０１２１】
【表１１】
2007537148.tif 000021
ａ．ＨＥｐ−２細胞単層を、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）またはＣＣＬ４（ＭＩＰ‐１β）に、１時間曝露した。その後、単層を、培地で３回洗浄し、ＲＳＶのＡ２株で１時間感染させた。３日インキュベーションした後、プラークを数えて、ウイルス感染性の度合いを決定した。データは、培地のみでウイルスと共にインキュベートし、ケモカインには曝露しなかったコントロールウェル（１００％  感染性）に対する、平均感染率（±１標準偏差）として表す。
【０１２２】
（表１２）
（ＲＳＶによる感染の阻害は、ＣＣＬ５の事前投与に依存しているａ）
【０１２３】
【表１２】
2007537148.tif 000022
ａ．ＨＥｐ−２細胞単層を、ＲＳＶ  Ａ２の感染前１時間（ＰＲＥ）または除去後１時間（ＰＯＳＴ）に、１０μｇ／ｍｌのＣＣＬ５、ＣＣＬ３、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−１δ）またはＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ‐１）に、１時間曝露した。その後、プラークを数えて、培地のみでウイルスと共にインキュベートし、ケモカインには曝露しなかったコントロールウェル（１００％  感染性）に対する、平均感染率（±１標準偏差）として表した。
【０１２４】
（表１３）
（感染の阻害は、ＣＣＬ５の事前投与、またはＲＳＶとの同時投与に依存し、熱に感受性である）
【０１２５】
【表１３】
2007537148.tif 000023
ａ．ＣＣＬ５（１０μｇ／ｍｌ）または／および同じ容量のＰＢＳを、ＨＥｐ−２細胞単層に、感染の１時間前に投与する（ＰＲＥ）か、または、ＲＳＶと同時に混合した（ＳＩＭ）。ＣＣＬ５を含むさらなる群は、熱により変性させた（ＨＥＡＴ）。その３日後に、プラークを数えた。
【０１２６】
（実施例３  ＣＣＬ５は、上皮細胞と、ＲＳＶの融合（Ｆ）タンパク質との間の相互作用をブロックする）
感染の阻害が、細胞表面リガンドとのウイルスの相互作用をブロックすることによって直接生じるのか、または、リガンド−レセプター相互作用の後のシグナル伝達の外側（ｏｕｔｓｉｄｅ）に対して二次的に生じるのかを確認するために、Ｎ末端メチオニン（ｍｅｔ）−ＣＣＬ５（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら、１９９６）を保持するｒＣＣＬ５を用いて実験を行なった。ｍｅｔ−ＣＣＬ５は、開始メチオニンを保持し、レセプター結合の際に、生物学的に活性ではない（Ｓｉｍｍｏｎｓら、２０００）。試験した最大用量（１ｍｌあたり２０μｇのｍｅｔ−ＣＣＬ５）において、感染性は、コントロール細胞の約２５％であった（図１）。ｍｅｔ−ＣＣＬ５の阻害特性もまた、用量依存的であった。１ｍｌあたり１．２５μｇのｍｅｔ−ＣＣＬ５での前処理により、約８０％の感染性を生じ、一方で、１ｍｌあたり０．３１３μｇまたは０．１５６μｇのｍｅｔ−ＣＣＬ５の用量は、阻害性でなかった。複製の阻害をまた、ｒＣＣＬ５の感染および投与の両方を、４℃において連続的に行い、ＣＣＲ凝集を妨害した場合に行なった。このＣＣＲ凝集は、シグナル伝達の外側について重要である（Ｂｌａｎｐａｉｎら、２００２）。４℃にて１ｍｌあたり２０μｇのｒＣＣＬ５を用いた前処理（１時間）の後の感染性は、コントロールの約１４％であり、単層をｒＣＣＬ５で連続的に処理し、３７℃において感染させた場合に観察されるもの（１６％）と類似していた（表１４）。従って、これらのデータは、ｒＣＣＬ５が、細胞間シグナル伝達カスケードを制限する条件下で、複製を阻害し得ることを示唆した。
【０１２７】
（表１４）
（４℃または３７℃における、ＣＣＬ５によるヒト上皮細胞株の前処理は、ＲＳＶによる感染を阻害するａ）
【０１２８】
【表１４】
2007537148.tif 000024
ａ．ＨＥｐ−２細胞単層を、４℃または３７℃において、示された用量の組換えＣＣＬ５で前処理した。ＲＳＶ  Ａ２での感染の３日後にプラークを数えて、培地のみでウイルスと共にインキュベートし、ケモカインには曝露しなかったコントロールウェル（１００％  感染性）に対する、平均感染率（±１標準偏差）として表した。
【０１２９】
活性化された気管支上皮細胞が、ＣＣＲ３を発現することが、最近報告された（Ｓｔｅｌｌａｔｏら、２００１）。ＣＣＬ５もまた、ＣＣＲ１およびＣＣＲ５についてのリガンドである（Ｐａｋｉａｎａｔｈａｎら、１９９７）ので、これらの上皮細胞を、ＣＣＬ５に結合することが公知のレセプターについてフローサイトメトリーにより試験した。図２に示す結果は、ＣＣＲ３が、ＨＥｐ−２上皮細胞およびＡ５４９細胞の表面上で発現されたことを確認した。ＣＣＲ１およびＣＣＲ５は検出されなかった。従って、データは、上皮細胞表面において、ＣＣＬ５が、ＲＳＶとＣＣＲ３との間の相互作用をブロックすることを示した。ＣＣＲ３に結合することが知られているさらなる組換えケモカイン（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ、２００１）を、これらが感染性を過度に低減し過ぎないかどうかを決定するために試験した。上昇する量の組換えエオタキシン／ＣＣＬ１１、ＭＣＰ−２／ＣＣＬ８またはＭＩＰ−１δ／ＣＣＬ１５でのＨＥｐ−２細胞単層の前処理は、ＲＳＶの感染性を損なわなかった（表１０および表１２）。ＣＸＣＲ４もまた、活性化された気管支上皮細胞において機能的に発現される（Ｅｄｄｌｅｓｔｏｎら、２００２）ので、組換えＳＤＦ−１α／ＣＸＣＬ１２もまた試験したが、感染を損なわなかった（表１２）。ＨＥｐ−２細胞単層のプレインキュベート、またはポリクローナルもしくはモノクローナルの抗ケモカインレセプター抗体の存在下での感染は、ＲＳＶの感染性を低減しなかった（データ示さず）。
【０１３０】
阻害の機構を、さらに、ウイルスエンエンベロープ中に位置する３つの糖タンパク質（Ｆタンパク質、Ｇタンパク質およびＳＨタンパク質）の１つまたは２つを欠失するＲＳＶ株による感染を阻害するｒＣＣＬ５の能力を試験することによって調べた。一連の研究を、ＳＨタンパク質を欠失した遺伝的に改変された株（ｒＡ２ｃｐｔｓ２４８／４０４０ΔＳＨ）、または、アミノン酸１１８において短縮されたＧタンパク質のＣ末端外部ドメイン（ｒＡ２ｃｐＧΔ１１８）を用いて行なった。表１５は、１０μｇ／ｍｌのｒＣＣＬ５またはｍｅｔ−ＣＣＬ５での処理が、培地のみでウイルスと共にインキュベートしたコントロール細胞に対して、ｒＡ２ｃｐＧΔ１１８ウイルスおよびｒＡ２ｃｐｔｓ２４８／４０４０ΔＳＨウイルスの感染性を低減したことを示す。ｒｒＣＣＬ５（１μｇ／ｍｌ）での前処理はまた、変異体ｃｐ３２／Ｄ１（ＳＨタンパク質およびＧタンパク質の両方を欠失する）、およびＲＳＶの親Ｂ１株による感染を低減した（表８）。従って、ｒＣＣＬ５は、Ｇタンパク質および／またはＳＨタンパク質を欠失するウイルスによる感染を阻害した。合せると、データは、ｒＣＣＬ５が、エンベロープ中のＦタンパク質と上皮細胞表面との間で生じた相互作用をブロックしたことを示した。
【０１３１】
（表１５）
（ＣＣＬ５は、ＳＨおよび／またはＧエンベロープ糖タンパク質を欠失する変異型ＲＳＶ株の、ＨＥｐ−２細胞への感染を阻害するａ）
【０１３２】
【表１５】
2007537148.tif 000025
ａ．ＨＥｐ−２細胞単層を、１０μｇ／ｍｌの組換えＣＣＬ５またはｍｅｔ−ＣＣＬ５で１時間処理した。ＣＣＬ５を除去した後、これらの単層を、示されえたＲＳＶ株で感染させた。実験１および実験２は、２つの別個の研究からの結果を示す。インキュベーションの３日後（Ａ２）または５日後（ｒＡ２ｃｐΔ１１８、２４８／４０４、２４８／４０４ΔＳＨ、Ｂ１およびｃｐ３２／Ｄ１）に、プラークが目に見えるようになった。データは、培地のみでウイルスと共にインキュベートし、ケモカインには曝露しなかったコントロールウェル（１００％感染性）に対する、平均感染性として表す。
ｂ．ＮＤは、なされていないことを示す。
【０１３３】
（実施例４  ＲＳＶ感染は、ＣＣＬ５の合成Ｎ末端ペプチドにより、インビボで阻害される）
ＣＣＬ５は、エンベロープ中のＦタンパク質と、上皮細胞表面上のケモカインレセプター（例えば、ＣＣＲ３）、または負に荷電したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）との間の相互作用をブロックすることによって感染を阻害し得る。Ｆタンパク質は、気道上皮細胞の感染に重要な正に荷電したアミノ酸から構成されるヘパリン結合（ＨＢＤ）モチーフを有する（Ｆｅｌｄｍａｎら、２０００）。ＣＣＬ５のＣ末端αらせん状領域は、ＨＩＶ−１感染の阻害において役割を果たすことが示されている（Ｂｕｒｎｓら、１９９８）。同族レセプター（ｃｏｇｎａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）またはＧＡＧと相互作用するアミノ酸残基は、それぞれ、ＣＣＬ５のＮ末端領域（Ｐａｋｉａｎａｔｈａｎら、１９９７）およびＣ末端領域（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら、２００１）に位置する。これらの可能性を調べるために、ＣＣＬ５の全６８のアミノ酸を表す一連のペプチド（１５マー、７アミノ酸重なっている）を合成した（表２）。最初のスクリーニングとして、ペプチドをビオチン化し、そして、ヒト上皮細胞への結合について評価した。図３は、増加する濃度のビオチン化したペプチドを、生存可能なＨＥｐ−２細胞と共に４℃にてインキュベートした、代表的な実験を示す。得られた結果は、ＣＣＬ５のＮ末端１５残基を表すｒＣＣＬ５およびペプチド１（配列番号２）が、上皮細胞単層に容易に結合したことを示した。ＲＳＶ  Ｇタンパク質のコンセンサスＨＢＤ（Ｆｅｌｄｍａｎら、１９９９）を含む合成ペプチド（ペプチド１９）もまた、単層に結合した。ＣＣＬ５のＨＢＤを表すペプチド７−９は、容易には単層に結合しなかった。従って、データは、ＣＣＬ５のＮ末端領域（ペプチド１；配列番号２）が、エンベロープ中のＦタンパク質と上皮細胞表面との間の相互作用をブロックしたので、感染の阻害が起こったことを示した。
【０１３４】
この仮説をさらに検証するために、ＣＣＬ５の同じペプチドを、ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおいて、ＲＳＶのＡ２株による感染の阻害について評価した。表１６および表１７に示した結果は、５つの実験の代表的なものである。これらの結果は、ペプチド１（５００μｇ／用量、１０ｍｇ／ｍｌ）は、ウイルスと共に同時に投与される（表１６および表１７）か、または。感染の１時間前に与えられる（表１７）場合に、インビボで阻害性であったことを実証した。ナイーブなＢＡＬＢ／ｃマウスの肺は、感染の４日後に、組織１グラムあたり、約５  ｌｏｇ１０ＰＦＵを含んだ。対照的に、ペプチド１を同時に投与したマウスの肺におけるＲＳＶ力価は、１，０００倍（表１６および表１７）〜１００倍（表１６）低かった。ペプチド１を感染の１時間前に投与した場合、ウイルスの負荷は、５０倍以上消失し、そして、ナイーブなマウスにおいて観察されたものよりも有意に低かった（表１７）。５回の実験における、３００μｇ以上のペプチド１の投与に伴うウイルス負荷の平均減少は、２．４  ｌｏｇ１０であった。ペプチド１の阻害特性は、用量依存的であった。３００〜５００μｇのペプチド１の同時投与は、ウイルス負荷を有意に減少した。これは、２５０μｇまたは１２５μｇの用量では観察されなかった（表１６）。ｒＣＣＬ５を用いたインビトロ研究（表１２）と同様に、ペプチド１は、感染の１時間後に投与された場合、感染を阻害しなかった（表１７）。
【０１３５】
データは、ＣＣＬ５のＣ末端ＨＢＤを表すペプチド（ペプチド７−９）（５００μｇ／用量、１０ｍｇ／ｍｌ）が、あまり阻害性でなかったことを示唆した。表１６に示されたデータは、ペプチド８または９をＲＳＶと同時投与することにより感染性が減少した（約１０倍）したことを実証する。全ての実験についての、５００μｇ／用量でのペプチド７−９に伴うウイルス負荷の平均減少は、それぞれ、１．１  ｌｏｇ１０、１．０  ｌｏｇ１０および１．４  ｌｏｇ１０であった。全ての実験についての、５００μｇ／用量でのペプチド２、４および６に伴うウイルス負荷の平均減少は、それぞれ、０．９  ｌｏｇ１０、１．２  ｌｏｇ１０および０．５  ｌｏｇ１０であった（データ示さず）。アミノ酸１８４−１８９およびＲＳＶ  Ｇタンパク質のＨＢＤを表すペプチド１９、ならびに、薬学的化合物ＲＦＩ−６４１（Ｒａｚｉｎｋｏｖら、２００１）は、ＲＳＶ感染に対して阻害性であった。従って、ＣＣＬ５のペプチドの中でもとりわけ、ペプチド１が、インビトロで生存可能な上皮細胞に結合し、そして、インビボでは最も阻害性であった。インビトロでの全てのペプチドによる阻害は、３９１μＭ〜５２５μＭのＩＣ５０においてのみ生じた（データ示さず）。
【０１３６】
（表１６）
（ＣＣＬ５の合成ペプチドのインビボにおける抗ウイルス活性ａ）
【０１３７】
【表１６】
2007537148.tif 000026
ａ．ＢＡＬＢ／ｃマウスに、示された用量（μｇ／用量）の合成ペプチドと、等容量で混合したＲＳＶ  Ａ２（約１×１０６ＰＦＵ）とを同時に投与した。その４日後、肺において、感染ウイルス力価の幾何学平均（±１標準偏差）を決定した。アッセイの検出限界は、約１．５  ｌｏｇ１０であった。１群あたり５匹のマウスであった。
ｂ．コントロールマウスに、示された量のペプチド＃１９（ＲＳＶ  Ｇタンパク質のヘパリン結合ドメインを表す）、ＲＳＦＩ−６４１またはＰＢＳと混合したＲＳＶを投与した。
【０１３８】
（表１７）
（ＲＳＶによる感染後ではなく、ＲＳＶによる感染の前に与えられた場合に、ＣＣＬ５のペプチド１は、インビボで阻害性である。）
【０１３９】
【表１７】
2007537148.tif 000027
ａ．ＢＡＬＢ／ｃマウスに、感染の１時間前（Ｐｒｅ）もしくは感染の１時間後（Ｐｏｓｔ）に示されたＣＣＬ５ペプチド（５００μｇ）を投与するか、または、ＲＳＶ  Ａ２と同時に（同時）投与した。コントロールマウスに、等容量のペプチド＃７もしくはＰＢＳと混合した等用量（約１×１０６ＰＦＵ）のＲＳＶを投与した。その４日後、感染ウイルス力価の幾何学平均（±１標準偏差）を決定した。アッセイの検出限界は、約１．５  ｌｏｇ１０であった。１群あたり５匹のマウスであった。
【０１４０】
（実施例５  ＣＣＬ５およびＣＣＬ３のポリペプチド配列の比較）
実施例２に詳述したように、ケモカインＣＣＬ５は、上皮細胞のＲＳＶ感染を阻害するが、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）またはＣＣＬ５（ＭＩＰ−１β）は阻害しない。このことは、ＲＳＶが、ＣＣＲ５以外のレセプターを利用することを示した。従って、ＲＳＶ感染のＣＣＬ５媒介性の阻害の配列および／または構造上の要件をさらに明らかにするために、ＣＣＬ５ポリペプチドおよびＣＣＬ３ポリペプチドを、アミノ酸配列アラインメント（表６）、ヒドロパシープロット（図４Ａおよび図４Ｂ）、および分子モデリング／可視化（データ示さず）によって比較した。
【０１４１】
ＣＣＬ５のアミノ酸配列（配列番号１）およびＣＣＬ３のアミノ酸配列（配列番号２１）を、まず、ギャップト（ｇａｐｐｅｄ）「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」アラインメントアルゴリズム（ＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．６；Ｄｅｆａｕｌｔ  Ｍａｔｒｉｘ  ＢＬＯＳＵＭ６２）により比較した。このアルゴリズムは、ペアワイズのタンパク質−タンパク質（またはＤＮＡ−ＤＮＡ）配列比較のためにＢＬＡＳＴエンジンを利用する対話型のツール（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｔｏｏｌ）であり、整列した残基の中央の対を広げるダイナミックプログラミングを使用することによって、ギャップトアラインメントを生成する（ＴａｔｕｓｏｖａおよびＭａｄｄｅｎ、１９９９）。ＣＣＬ５アミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴＰアラインメントの上に示し（四角で囲んだ残基）、そしてＣＣＬ３アミノ酸配列を、アラインメントの下に示す（表６）。ＣＣＬ５（アミノ酸残基４−６８）およびＣＣＬ３（アミノ酸残基３−６９）のＢＬＡＳＴアラインメントは、これらのポリペプチドが、３２の同一のアミノ酸を共有し、（すなわち、４８％の配列同一性）、そして、約７８％のアミノ酸配列類似性を有することを示す。アラインメントは、ＣＣＬ５（配列番号１）のＴｙｒ７とＴｙｒ８との間の１アミノ酸ギャップ、ＣＣＬ５の最初の３つのＮＨ２−末端アミノ酸（配列番号１のＳｅｒ１−Ｔｙｒ３）の脱落、およびＣＣＬ３の最初の２つのＮＨ２−末端アミノ酸（配列番号２１のＳｅｒ１−Ｌｅｕ２）の脱落、およびＣＣＬ３のＣＯＯＨ末端アミノ酸（配列番号２１のＡｌａ６９）の脱落を含む。
【０１４２】
全長ＣＣＬ５対全長ＣＣＬ３のヒドロパシープロット（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）の比較（図４Ａおよび図４Ｂ）は、ＣＣＬ５とＣＣＬ３との間の最大の疎水性配列相違は、これらのポリペプチドのＮＨ２末端に生じることを示した。例えば、ＣＣＬ５の最初の４つのＮＨ２末端アミノ酸（Ｓｅｒ１−Ｐｒｏ２−Ｔｙｒ３−Ｓｅｒ４）は親水性であるが、ＣＣＬ３の最初の４つのＮＨ２末端アミノ酸（Ｓｅｒ１−Ｌｅｕ２−Ａｌａ３−Ａｌａ４）は、主に疎水性である（データ示さず）。ＣＣＬ５およびＣＣＬ３の最初の４つのアミノ酸についてのヒドロパシースコアは、９のスライドする窓のサイズ（ｓｌｉｄｉｎｇ  ｗｉｎｄｏｗ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｎｉｎｅ）を用いて計算され得、従って、これらのアミノ酸は、図４Ａおよび図４Ｂに示されるヒドロパシープロットからは省略される。ＣＣＬ５のＮＨ２末端は、およそアミノ酸８（Ｓｅｒ８）まで親水性のままであり、その後、ＮＨ２−ループ構造の疎水性アミノ酸Ｐｒｏ９−Ｃｙｓ１０−Ｃｙｓ１１−Ｐｈｅ１２−Ａｌａ１３−Ｔｙｒ１４−ｌｓｏ１５−Ａｌａ１６が続く。興味深いことに、ＣＣＬ３のＮＨ２末端は、およそアミノ酸３０まで、ＣＣＬ５のヒドロパシープロフィールとは逆の関係（すなわち、鏡の関係）を有する。対照的に、ＣＯＯＨ末端の、末端のおよそアミノ酸３１から最後まででは、これらの２つのポリペプチドのヒドロパシープロフィールは、ほぼ同一である（図４Ａ）。
【０１４３】
ＣＣＬ５のエネルギーを最小にした構造（ＰＢＤ  １ＲＴＯ；Ｓｋｅｌｔｏｎら、１９９５）おおびＣＣＬ３のエネルギーを最小にした構造（ＰＢＤ  １Ｂ５３；Ｃｚａｐｌｅｗｓｋｉら、１９９９）を、公的に利用可能（すなわち、ＥｘＰＡＳｙワールドワイドウェブサーバからアクセス可能）なソフトウェアパッケージであるＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬおよびＳｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（ＧｕｅｘおよびＰｅｉｔｓｃｈ、１９９７）を用いてモデリングした。２つのタンパク質の三次構造（または折り畳み）は、ＮＨ２末端アミノ酸１−７およびＣＯＯＨ末端アミノ酸６４−６８を除いて、重なった（データ示さず）。全長ＣＣＬ５ポリペプチド（配列番号１のアミノ酸Ｓｅｒ１〜Ｓｅｒ６８）の炭素骨格のトレース（ｔｒａｃｅ）（リボンダイアグラムとして描かれる）と、全長ＣＣＬ３ポリペプチド（配列番号２２のアミノ酸Ｓｅｒ１〜Ａｌａ６９）の炭素骨格のトレースのベストフィット分析（ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ「Ｍａｇｉｃ  Ｆｉｔ」）。ヒドロパシープロットと同様に、ＣＣＬ５とＣＣＬ３との間の最大の構造的配列相違は、ＮＨ２末端アミノ酸残基で生じる。
【０１４４】
最後に、ＲＳＶ感染に対して最も阻害性であることが実証された、ペプチド１フラグメントを含むＣＣＬ５ポリペプチドのＮＨ２末端部分（すなわち、アミノ酸１〜１５）を、構造的に分析した（データ示さず）。ＣＣＬ５、Ｍｅｔ−ＣＣＬ５およびＡＯＰ−ＣＣＬ５の二面角（ΦおよびΨ）を、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ分子座標を用いて、インシリコで計算し、それぞれ、ＰＤＭ名１ＲＴＰ、１ＥＱＴおよび１Ｂ３Ａとして寄託した。これらの計算の結果を表７に示す。
【０１４５】
（実施例６  ケモカインアゴニストアッセイ）
（化学走性アッセイ）
ＴＨＰ−１細胞の化学走性（細胞移動）を、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら（１９９６）により改変されたＧｏｎｇおよびＣｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ（１９９５）の方法に従って行なう。簡単に述べると、２００μｌの培地（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび０．００５％ゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ）中の５．６×１０６個の細胞を、５μｍフィルタにフィットさせた９６ウェルのＢｏｙｄｅｎマイクロチャンバ（ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ；Ｃａｂｉｎ  Ｊｏｈｎ，ＭＤ）の上側チャンバに置く。その後、リガンドおよび適切な希釈のＭｅｔ−ＣＣＬ５を含む上記の培地（ウシ胎仔血清を含まない）（３７０μｌ）を、９６ウェルのＢｏｙｄｅｎマイクロチャンバの下側のチャンバに置く。
【０１４６】
５％  ＣＯ２下、３７℃にて６０分間のインキュベーションの後、細胞を上側のウェルに移し、そして、２０μＭ  ＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（２００μｌ）を添加して、フィルタに結合した細胞をはがす。４℃にて２０分間インキュベーションした後、プレートを、１８００×ｇで１０分間遠心分離し、そして、上清を、下側のウェルに移す。移動する細胞の数を、テトラゾリウムブルーの、そのホルマザン生成物への変換をモニターする、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６ＴＭ非放射活性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定する。
【０１４７】
単球および好中球の化学走性を、Ｆｉｎｃｈａｍら（１９８８）により記載されたように測定する。簡単に述べると、５０ｍｌの新鮮な血液を、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、３％デキストランおよび３％グルコースを含有する１５ｍｌ溶液に回収し、凝集を防止する。この混合物を、３７℃にて１時間沈殿させる。このＰＭＮおよびリンパ球を、７ｍｌのＦｉｃｏｌｌ上に１４ｍｌの血漿を重ねることによって分離し、そして、ブレーキオフした（ｂｒａｋｅ  ｏｆｆ）遠心機で、２９６×ｇおよび１５℃にて２０分間遠心分離する。リンパ球を、Ｆｉｃｏｌｌとプラズマの界面に置くと、ＰＭＮがペレットを形成する。混入した赤血球を、低張溶解によりＰＭＮ（主に好中球）から取り除き、そして、残った白血球を洗浄し、ＲＰＭＩ  １６４０培地中に、１ｍｌあたり１０６個の白血球の濃度で再懸濁する。１０６／ｍｌのヒツジ赤血球を加えて、４℃にて６０分間ロゼッティング（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）させ、その後、さらに、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離することによって、約４０〜５０×１０６個の単球／ｍｌを、リンパ球分画から精製する。単球を、ＰＢＳ緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）中で洗浄し、ＲＰＭＩ  １６４０培地中に再懸濁する。
【０１４８】
９６ウェルのＢｏｙｄｅｎマイクロチャンバを使用して、単球および好中球の化学走性をアッセイする。試験抗ウイルス分子の連続希釈（例えば、改変されたＮＨ２末端ＣＣＬ５ペプチドフラグメント）を、培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０）中で作製する。
【０１４９】
２５μｌの化学遊走物質を、アッセイウェルの下側のチャンバに加え、そして、好中球について３μｍ、単球について５μｍの孔径を有するポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネート膜で覆った。次いで、１ｍｌあたり１０６個の細胞を含む５０μｌの溶液を上のウェルに添加した。アッセイプレートを、３７℃にて、好中球について２０分間、そして、単球について３０分間インキュベートした。次いで、膜の上側表面を、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、そして、膜の裏面上の細胞をメタノール中で固定した。膜を、ＦｉｅｌｄのＡ株およびＢ株（ＢｅｎｄｅｒおよびＨｏｂｅｉｎ）の混合物で染色し、風乾させた。次いで、膜の裏面上の細胞を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡およびＶＩＤＡＳ画像分析ソフトウェア（ＫＯＮＴＲＯＮ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて計数した。
【０１５０】
（カルシウム動員アッセイ）
好中球の細胞内カルシウムの動員を、１０〜１０Ｍの濃度範囲にわたる、組換えまたは合成のＣＣＬ５、および、試験抗ウイルス分子を用いて測定する。細胞を、Ｋｒｅｂｓ  Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液（１．３６ｍＭ  ＮａＣｌ、１．８ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．２１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中で、２μＭのＦｕｒａ−２色素と共に３７℃にて３０分間インキュベートする。
【０１５１】
Ｆｕｒａ−２色素を、３４０ｎｍにおいて得力させ、蛍光光度計を用いて、蛍光の放出を、５００ｎｍにてモニターする。細胞内Ｃａ２＋を、等式［Ｃａ］＝Ｋｄ（Ｆ−Ｆｍｉｎ）／（Ｆｍａｘ−Ｆ）（この等式において、Ｋｄは、色素に結合するＣａ２＋についての解離定数であり、そしてＦは、任意の蛍光単位においてである）を用いて算出する。過剰の１０ｍＭ  ＥＧＴＡを添加して、Ｃａ２＋をキレート化し、Ｆｍｉｎを算出する。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓを加えてｐＨを８．５に調整し、そして、細胞を、５０μＭのジギトニンで溶解させる。溶解した細胞を過剰の１ｍＭ  Ｃａ２＋に曝露した後、Ｆｍａｘを蛍光値から算出する。
【０１５２】
（参考文献）
【０１５３】
【表１８−１】
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【０１５４】
【表１８−２】
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【０１５５】
【表１８−３】
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【０１５６】
【表１８−４】
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【０１５７】
【表１８−５】
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【０１５８】
【表１８−６】
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【０１５９】
【表１８−７】
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【０１６０】
【表１８−８】
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【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１は、ＣＣＬ５が上皮細胞においてＲＳＶ感染を阻害することを示す。Ｈｅｐ−２細胞単層が、ＲＳＶ  Ａ２による感染の前に、示される用量の組換えｒＣＣＬ５（円形）またはｍｅｔ−ＣＣＬ５（四角形）で予め処理された（感染前１時間）。その3日間後、プラークが、数えられ、培地のみにおいてウイルスとともにインキュベートされたがケモカインには暴露されていないコントロールウェル（１００％感染性）に対する感染性パーセント（±１標準偏差）として示された。
【図２】図２は、ＨＥｐ−２細胞およびＡ５４９細胞におけるＣＣＲ１、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５の発現を示す。ＨＥｐ−２細胞単層およびＡ５４９細胞単層が、細胞スクレーパーを使用して組織培養フラスコから穏やかに取り除かれた。その細胞が、フィコエリトリン結合体化抗ヒトＣＣＲ１  ｍＡｂもしくはフィコエリトリン結合体化抗ＣＣＲ３  ｍＡｂまたはＦＩＴＣ結合体化抗ＣＣＲ５で染色された（ＦＬ２−Ｈ，ｘ軸、実線）。相対的細胞数（数）が、ｙ軸上に示される。
【図３】図３は、Ｈｅｐ−２細胞単層に対するＣＣＬ５の重複合成ペプチドの結合を示す。生存可能なＨｅｐ−２細胞単層が、漸増濃度（０．００３９μｇ／ｍｌ〜４．０μｇ／ｍｌ）の示されるビオチン化ペプチドとともにインキュベートされた（４℃）。すすいだ後、単層が、メタノール中に固定され、そしてペプチドの結合が、ＯＤ４５０〜５５０にてＥＬＩＳＡによって可視化された。
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、ＣＣＬ３ポリペプチドに対するＣＣＬ５ポリペプチドのヒドロパシープロットを示す。図４Ａは、ＣＣＬ３（配列番号２２のアミノ酸５〜アミノ酸６９）と整列したＣＣＬ５（配列番号１のアミノ酸５〜アミノ酸６８）のヒドロパシープロット）である。図４Ｂは、ＣＣＬ３（配列番号２２のアミノ酸５〜アミノ酸３１）と整列したＣＣＬ５（配列番号１のアミノ酸５〜アミノ酸３１）のヒドロパシープロット）である。ｙ軸におけるヒドロパシーの尺度は、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）のアミノ酸ヒドロパシー値を９アミノ酸移動平均ウィンドウとともに使用して作成された。この尺度における負のヒドロパシー値は、親水性環境を示し、この尺度における正の数は、疎水性環境を示す。
【図４Ｂ】図４Ａおよび図４Ｂは、ＣＣＬ３ポリペプチドに対するＣＣＬ５ポリペプチドのヒドロパシープロットを示す。図４Ａは、ＣＣＬ３（配列番号２２のアミノ酸５〜アミノ酸６９）と整列したＣＣＬ５（配列番号１のアミノ酸５〜アミノ酸６８）のヒドロパシープロット）である。図４Ｂは、ＣＣＬ３（配列番号２２のアミノ酸５〜アミノ酸３１）と整列したＣＣＬ５（配列番号１のアミノ酸５〜アミノ酸３１）のヒドロパシープロット）である。ｙ軸におけるヒドロパシーの尺度は、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）のアミノ酸ヒドロパシー値を９アミノ酸移動平均ウィンドウとともに使用して作成された。この尺度における負のヒドロパシー値は、親水性環境を示し、この尺度における正の数は、疎水性環境を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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