(57)【要約】本発明は、乳清タンパク質単離物が関与する方法および組成物に関する。本発明の方法は、等電点を含む、あるpH範囲にわたって実質的に非変性の乳清タンパク質を調製する精製プロセスを含む。従って、このような乳清タンパク質は溶液中で、pH値の広い範囲にわたって低い濁度を有する。乳清タンパク質単離物は、栄養的な用途、薬学的な用途、および他の用途を有する組成物および溶液に組み込むことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳清タンパク質を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法：
a)乳清タンパク質が陽イオン交換支持体に吸着される条件下で、乳清タンパク質を陽イオン交換支持体に接触させる工程；および
b)支持体にpH7またはそれ以上の脱着溶液を流す工程であって、脱着した乳清タンパク質が非変性である、工程。
【請求項２】
脱着溶液のpHが約7〜約13である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
脱着溶液のpHが約11.5である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
支持体が、ビーズ、膜、またはパドルの上にある、請求項1記載の方法。
【請求項５】
支持体がビーズの上にある、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ビーズが樹脂またはゲルの中にある、請求項5記載の方法。
【請求項７】
樹脂またはゲルが非反応性構造の中にある、請求項6記載の方法。
【請求項８】
非反応性構造がカラムである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
ビーズの直径が約30μm〜約500μmである、請求項5記載の方法。
【請求項１０】
ビーズの直径が約100μm〜約300μmである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
脱着溶液が緩衝剤で処理されている、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
緩衝剤がホスフェートおよびシトレートからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
緩衝剤がホスフェートである、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
脱着溶液中の緩衝剤の濃度が約0.5mM〜約100mMである、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
脱着溶液中の緩衝剤の濃度が約20mM未満である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
脱着溶液が塩を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
塩がナトリウム塩である、請求項9記載の方法。
【請求項１８】
ナトリウム塩がリン酸ナトリウムである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
脱着溶液が塩化ナトリウムをさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
脱着溶液が約10支持体体積/時間〜約200支持体体積/時間の流速で支持体を流れる、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
流速が約50支持体体積/時間〜約150支持体体積/時間である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
乳清タンパク質が支持体に接触される時に、pH約1〜約7の溶液の中にある、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
乳清タンパク質が支持体に接触される時に、pH約4〜約7の溶液の中にある、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
脱着した乳清タンパク質を限外濾過に供する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
脱着した乳清タンパク質を乾燥させる工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
脱着した乳清タンパク質が噴霧乾燥される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約400NTU未満の濁度を有する、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約200NTU未満の濁度を有する、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約100NTU未満の濁度を有する、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
乳清タンパク質を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法：
a)カラムに乳清タンパク質が吸着される条件下で、乳清タンパク質をカラムに適用する工程であって、カラムが直径が約50μm〜約300μmのビーズを有する陽イオン交換樹脂またはゲルを含む、工程；
b)脱着溶液をカラムに流す工程であって、脱着溶液のpHが約7またはそれ以上である、工程；および
c)脱着した乳清タンパク質を収集する工程であって、脱着した乳清タンパク質が非変性である、工程。
【請求項３１】
脱着溶液のpHが約7〜約13である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
脱着溶液のpHが約11.5である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
脱着溶液が緩衝剤で処理されている、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
緩衝剤がホスフェートおよびシトレートからなる群より選択される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
緩衝剤がホスフェートである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
脱着溶液がリン酸ナトリウムを含む、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
リン酸ナトリウムの濃度が約0.5mM〜約100mMである、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
脱着溶液中のリン酸ナトリウムの濃度が約20mM未満である、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
ビーズの直径が約100μm〜約300μmである、請求項30記載の方法。
【請求項４０】
脱着溶液が塩を含む、請求項30記載の方法。
【請求項４１】
塩がナトリウム塩である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
ナトリウム塩がリン酸ナトリウムおよび/または塩化ナトリウムである、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
脱着溶液が、約10カラム体積/時間〜約200カラム体積/時間の流速でカラムに適用される、請求項30記載の方法。
【請求項４４】
流速が約50カラム体積/時間〜約150カラム体積/時間である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
乳清タンパク質がpHが約1〜約7の溶液中でカラムに適用される、請求項30記載の方法。
【請求項４６】
乳清タンパク質がpHが約4の溶液中でカラムに適用される、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
脱着した乳清タンパク質を限外濾過に供する工程をさらに含む、請求項30記載の方法。
【請求項４８】
脱着した乳清タンパク質を乾燥させる工程をさらに含む、請求項30記載の方法。
【請求項４９】
脱着した乳清タンパク質が噴霧乾燥される、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約400NTU未満の濁度を有する、請求項30記載の方法。
【請求項５１】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約200NTU未満の濁度を有する、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約100NTU未満の濁度を有する、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
乳清タンパク質を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法：
a)乳清タンパク質が陽イオン交換カラムに吸着される条件下で、乳清タンパク質を陽イオン交換カラムに適用する工程；
b)脱着溶液を約10カラム体積/時間〜約150カラム体積/時間の流速でカラムに流す工程であって、脱着溶液が緩衝剤および約7またはそれ以上のpHを有する、工程；ならびに
c)脱着した乳清タンパク質を収集する工程であって、脱着した乳清タンパク質が非変性である、工程。
【請求項５４】
脱着溶液のpHが約7〜約13である、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
脱着溶液のpHが約11.5である、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
カラムが樹脂またはゲルを含む、請求項53記載の方法。
【請求項５７】
樹脂またはゲルがビーズを含む、請求項4記載の方法。
【請求項５８】
ビーズの直径が約50μm〜約500μmである、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
ビーズの直径が約100μm〜約300μmである、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
脱着溶液が緩衝剤で処理されている、請求項53記載の方法。
【請求項６１】
緩衝剤がホスフェートおよびシトレートからからなる群より選択される、請求項61記載の方法。
【請求項６２】
緩衝剤がホスフェートである、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
吸着溶液がリン酸ナトリウムを含む、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
脱着溶液中の緩衝剤の濃度が約0.5mM〜約100mMである、請求項61記載の方法。
【請求項６５】
脱着溶液中の緩衝剤の濃度が20mMまでである、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
脱着溶液が塩を含む、請求項53記載の方法。
【請求項６７】
塩がナトリウム塩である、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
ナトリウム塩がリン酸ナトリウムである、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
脱着溶液が塩化ナトリウムをさらに含む、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
脱着溶液が、約30カラム体積/時間〜約120カラム体積/時間の流速で支持体に適用される、請求項53記載の方法。
【請求項７１】
流速が約50カラム体積/時間〜約90カラム体積/時間である、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
乳清タンパク質がpHが約1〜約7の溶液中でカラムに適用される、請求項53記載の方法。
【請求項７３】
乳清タンパク質がpHが約4の溶液中でカラムに適用される、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
脱着した乳清タンパク質を限外濾過に供する工程をさらに含む、請求項53記載の方法。
【請求項７５】
脱着した乳清タンパク質を乾燥させる工程をさらに含む、請求項53記載の方法。
【請求項７６】
脱着した乳清タンパク質が噴霧乾燥される、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約400NTU未満の濁度を有する、請求項53記載の方法。
【請求項７８】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約200NTU未満の濁度を有する、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約50NTU未満の濁度を有する、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
乳清タンパク質を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法：
a)乳清タンパク質が陽イオン交換支持体に吸着される条件下で、乳清タンパク質を陽イオン交換支持体に接触させる工程；
b)脱着溶液を支持体に接触させる工程であって、脱着溶液が約0.5mM〜約100mMのイオン強度および約7またはそれ以上のpHを有する、段階；ならびに
c)脱着した乳清タンパク質を収集する工程。
【請求項８１】
脱着溶液のpHが約7〜約13である、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
脱着溶液のpHが約11.5である、請求項81記載の方法。
【請求項８３】
支持体が、ビーズ、膜、またはパドルの上にある、請求項80記載の方法。
【請求項８４】
支持体がビーズの上にある、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
ビーズが樹脂またはゲルの中にある、請求項83記載の方法。
【請求項８６】
樹脂またはゲルが非反応性構造の中にある、請求項85記載の方法。
【請求項８７】
非反応性構造がカラムである、請求項86記載の方法。
【請求項８８】
ビーズの直径が約30μm〜約2000μmである、請求項85記載の方法。
【請求項８９】
ビーズの直径が約100μm〜約500μmである、請求項88記載の方法。
【請求項９０】
脱着溶液が緩衝剤で処理されている、請求項81記載の方法。
【請求項９１】
脱着溶液中の緩衝剤の濃度が約0.5mM〜約100mMである、請求項73記載の方法。
【請求項９２】
脱着溶液中の緩衝剤の濃度が約20mM未満である、請求項91記載の方法。
【請求項９３】
脱着溶液がホスフェートを用いて緩衝剤処理されている、請求項92記載の方法。
【請求項９４】
脱着溶液が塩を含む、請求項80記載の方法。
【請求項９５】
塩がナトリウム塩である、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
ナトリウム塩がリン酸ナトリウムである、請求項95記載の方法。
【請求項９７】
脱着溶液が塩化ナトリウムをさらに含む、請求項96記載の方法。
【請求項９８】
脱着溶液が約10支持体体積/時間〜約100支持体体積/時間の流速で支持体を流れる、請求項80記載の方法。
【請求項９９】
流速が約50支持体体積/時間〜約90支持体体積/時間である、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
乳清タンパク質がpHが約1〜約7の溶液中で支持体に適用される、請求項80記載の方法。
【請求項１０１】
乳清タンパク質がpHが約4の溶液中で支持体に適用される、請求項100記載の方法。
【請求項１０２】
脱着した乳清タンパク質を限外濾過に供する工程をさらに含む、請求項80記載の方法。
【請求項１０３】
脱着した乳清タンパク質を乾燥させる工程をさらに含む、請求項80記載の方法。
【請求項１０４】
脱着した乳清タンパク質が噴霧乾燥される、請求項103記載の方法。
【請求項１０５】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約400NTU未満の濁度を有する、請求項80記載の方法。
【請求項１０６】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約200NTU未満の濁度を有する、請求項105記載の方法。
【請求項１０７】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約50NTU未満の濁度を有する、請求項106記載の方法。
【請求項１０８】
乳清タンパク質単離物を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法：
a)乳清タンパク質がカラムに吸着される条件下で、乳清タンパク質をカラムに適用する工程であって、カラムが少なくとも約100μmの直径のビーズを有する陽イオン交換樹脂またはゲルを含む、工程；
b)脱着溶液を約10カラム体積/時間〜150カラム体積/時間の流速で支持体に流す工程であって、脱着溶液が緩衝剤、約0.5mM〜約100mMのイオン強度、および約7またはそれ以上のpHを有する、工程；ならびに
c)脱着した乳清タンパク質を収集する工程。
【請求項１０９】
脱着溶液のpHが約7〜約13である、請求項108記載の方法。
【請求項１１０】
脱着溶液のpHが約11.5である、請求項109記載の方法。
【請求項１１１】
脱着溶液中の塩の濃度が約20mM未満である、請求項108記載の方法。
【請求項１１２】
脱着溶液が塩を含む、請求項108記載の方法。
【請求項１１３】
塩がナトリウム塩である、請求項112記載の方法。
【請求項１１４】
ナトリウム塩がリン酸ナトリウムおよび/または塩化ナトリウムである、請求項112記載の方法。
【請求項１１５】
約30カラム体積/時間〜約100カラム体積/時間の流速で、脱着溶液が支持体に適用される、請求項108記載の方法。
【請求項１１６】
流速が約50カラム体積/時間〜約90カラム体積/時間である、請求項115記載の方法。
【請求項１１７】
乳清タンパク質がpHが約1〜約7の溶液中でカラムに適用される、請求項108記載の方法。
【請求項１１８】
乳清タンパク質がpHが約4の溶液中でカラムに適用される、請求項117記載の方法。
【請求項１１９】
脱着した乳清タンパク質を限外濾過に供する工程をさらに含む、請求項108記載の方法。
【請求項１２０】
脱着した乳清タンパク質を乾燥させる工程をさらに含む、請求項108記載の方法。
【請求項１２１】
脱着した乳清タンパク質が噴霧乾燥される、請求項120記載の方法。
【請求項１２２】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約400NTU未満の濁度を有する、請求項108記載の方法。
【請求項１２３】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約200NTU未満の濁度を有する、請求項122記載の方法。
【請求項１２４】
脱着した乳清タンパク質が、25mg/mlの脱着した乳清タンパク質を含む溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約50NTU未満の濁度を有する、請求項123記載の方法。
【請求項１２５】
乳清タンパク質の濃度が25g/Lである時に、約2〜約8のpH範囲にわたって約200NTU未満の濁度を有する、乳清タンパク質を含む溶液。
【請求項１２６】
約100NTU未満の濁度を有する、請求項125記載の溶液。
【請求項１２７】
約50NTU未満の濁度を有する、請求項125記載の溶液。
【請求項１２８】
乳清タンパク質の濃度が25g/Lである時に、約4〜約6のpH範囲にわたって約200NTU未満の濁度を有する、乳清タンパク質を含む溶液。
【請求項１２９】
乳清タンパク質の濃度が25g/Lである時に、約4〜約6のpH範囲にわたって約50NTU未満の濁度を有する、請求項128記載の溶液。
【請求項１３０】
薬理学的に許容される製剤をなしている、請求項125記載の溶液。
【請求項１３１】
実質的に単離された非変性の乳清タンパク質を含む、組成物。
【請求項１３２】
組成物が食品である、請求項131記載の組成物。
【請求項１３３】
食品が飲料である、請求項132記載の組成物。
【請求項１３４】
組成物が薬学的に許容される製剤に製剤化される、請求項131記載の組成物。
【請求項１３５】
実質的に精製された乳清タンパク質を含む、透明な高タンパク質飲料。
【請求項１３６】
pHが約4〜約8である、請求項135記載の透明な高タンパク質飲料。
【請求項１３７】
240ml当たり約10グラム〜約40グラムの糖をさらに含む、請求項135記載の透明な高タンパク質飲料。
【請求項１３８】
240ml当たり約18グラムまたはそれ未満の糖をさらに含む、請求項137記載の透明な高タンパク質飲料。
【請求項１３９】
実質的に精製され、かつ非変性の乳清タンパク質を含む、食用組成物。
【請求項１４０】
実質的に精製され、かつ非変性の乳清タンパク質を含む、食品成分。
【請求項１４１】
実質的に精製され、かつ非変性の乳清タンパク質を含む、増粘用安定化用食品。
【請求項１４２】
食品が人工栄養乳(infant formula)である、請求項141記載の食品。
【請求項１４３】
食品が経腸栄養剤(enteral formula)である、請求項141記載の食品。
【請求項１４４】
実質的に精製され、かつ非変性の乳清タンパク質を含む、乳濁液。
【請求項１４５】
実質的に精製され、かつ非変性の乳清タンパク質を含む、発泡体。
【請求項１４６】
約6〜約8のpH範囲にわたって約50NTU未満の濁度を有する、請求項126記載の溶液。
【請求項１４７】
実質的に単離された非変性の乳清タンパク質が、該乳清タンパク質の濃度が約25g/Lの溶液に、約2〜約8のpH範囲にわたって200NTU未満の濁度を付与する、請求項131記載の組成物。
【請求項１４８】
カラムを通過した脱着溶液のpHが約10未満である、請求項11記載の方法。
【請求項１４９】
バッチ式で乳清タンパク質を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法：
a)乳清タンパク質が陽イオン交換支持体に吸着される条件下で、乳清タンパク質を陽イオン交換支持体に接触させる工程；および
b)支持体をpH7の脱着溶液に接触させる工程であって、脱着した乳清タンパク質が非変性である、工程。
【請求項１５０】
脱着溶液のpHが約7〜約13である、請求項149記載の方法。
【請求項１５１】
支持体が、ビーズ、膜、またはパドルの上にある、請求項149記載の方法。
【請求項１５２】
支持体がタンクの中にある、請求項151記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.発明の分野
本発明は、一般的に、タンパク質化学の分野に関する。より具体的には、本発明は、乳清タンパク質を単離するプロセスを提供する。さらに、本発明は、pH値の広い範囲にわたって低い濁度を有する乳清タンパク質単離物が関与する方法および組成物に関する。なお、本願は、2004年5月7日に出願された仮出願第60/569,078号に対して優先権を主張する。仮出願第60/569,078号はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
2.関連技術の説明
食用タンパク質の最も重要な種類の1つが乳清タンパク質である。乳清タンパク質は、優れたアミノ酸特性、高いシステイン含有量、素早い消化、および興味深い生理活性タンパク質(ラクトグロブリン、免疫グロブリン、およびラクトフェリン)で知られている。栄養的に言うと、乳清タンパク質は、毎日の食事に必要な必須アミノ酸を全て含んでいるために天然で完璧なタンパク質として知られている。乳清タンパク質はまた、筋肉タンパク質合成において大きな役割を果たす分枝アミノ酸(BCAA)の最も豊富な供給源の1つである。さらに、乳清タンパク質の個々の成分のいくつかは、動物においてウイルス感染および細菌感染を防ぎ、免疫を調節することが示されている。
【０００３】
乳清タンパク質は、乳に含まれる2つの主なタンパク質群の1つを構成し、乳に含まれる総タンパク質の約20％を占めている。カゼインは乳に含まれる他のタンパク質部分に相当する。栄養面では、乳清タンパク質はカゼインより質の高いタンパク質として評価されている。さらに、乳清タンパク質はカゼインより溶けやすく、そのために食品添加物として魅力的なものとなっている。組成面では、乳清タンパク質は、実際は、様々な生物学的タンパク質の混合物からなっている。乳清タンパク質の大部分はα-ラクトアルブミン(α-LB)およびβ-ラクトグロブリン(β-LG)からなっている。さらに少ない量で、免疫グロブリン、ウシ血清アルブミン、グリコマクロペプチド、ラクトフェリン、およびラクトペルオキシダーゼが存在し得る。
【０００４】
乳清タンパク質は、チーズ製造プロセスの副産物である乳清から調製することができる、または乳をミクロフィルターに通し、フロースルーを集めることによって調製することができる。チーズ製造プロセスを使用した場合、乳清タンパク質の生成はいくつかの工程を伴う。新鮮な乳を低温殺菌した後、チーズを製造するためにカゼインすなわち「カード」が取り除かれる。残っている液体は乳清として知られている。液体の乳清から乳清タンパク質を単離および精製するために多くの方法が用いられる。これらのプロセスには、選択的沈殿、膜濾過、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。乳清タンパク質の2つの主な商業的単離法がイオン交換法および精密濾過であり、これによって約90％〜95％の乳清タンパク質が得られる。
【０００５】
選択的沈殿では、乳清は、ある特定のタンパク質の不溶性を促進するように物理的に調節される。タンパク質は、ある特定のpHおよび温度で凝集および沈殿する傾向がある。例えば、α-ラクトアルブミンはpH4.2および温度65℃で沈殿する。対照的に、膜濾過は、分子量によって液体乳清を本質的に分離する。他の成分から乳清タンパク質を分離するために、液体乳清は半透膜に通される。これらのプロセスは両方とも体積依存的であり、多量の液体乳清を処理するために大きく高価な装置を必要とする。
【０００６】
イオン交換クロマトグラフィーによる精製は、2種類のプロセス：選択的吸着または選択的溶出によって行うことができる。選択的吸着では、1種類のタンパク質が吸着剤に結合し、乳清の残りは交換カラムを通過する。このようなやり方で、固定化レチナールを用いてβ-ラクトグロブリンが単離されている。または、選択的溶出は、全てのタンパク質が同時に吸着剤にトラップされることを必要とする。汚染物質がなくなるようにタンパク質は洗浄され、次いで、多くの異なる精製タンパク質を製造するために1つずつ溶出される。1種類のタンパク質しか単離しない選択的吸着とは対照的に、選択的溶出は、いくつかの異なるタンパク質の単離を可能にする。膜濾過および選択的沈殿と比較して、イオン交換クロマトグラフィーは、能力が回収タンパク質の質量に依存し、処理液体の体積に依存しないので体積依存的でない。
【０００７】
現在、2種類の乳清タンパク質：乳清タンパク質濃縮物および乳清タンパク質単離物が市場に出されている。乳清タンパク質濃縮物は乳清タンパク質が豊富にあるが、脂肪およびラクトースも含有している。一般的に、乳清タンパク質濃縮物は膜濾過によって生成される。他方で、乳清タンパク質単離物は主に乳清タンパク質からなり、脂肪およびラクトースはわずかしかない。乳清タンパク質単離物は、通常、より厳密な分離プロセス(例えば、精密濾過および限外濾過またはイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせ)を必要とする。チーズ製造プロセスでは牛乳から乳清タンパク質が生成され、カードが取り除かれた後に、残りの副産物である液体乳清に含まれる固形物の約12％がタンパク質である。乳清タンパク質単離物は、固形物の少なくとも90％が乳清タンパク質である混合物を意味すると一般に理解されている。乳清タンパク質濃縮物は、乳清タンパク質のパーセントが副産物中の初期量と乳清タンパク質単離物の間であると理解されている。
【０００８】
未変性の状態の乳清タンパク質は可溶性であり、約4.6の平均等電点(pI)を有する。2種類の主な乳清タンパク質：β-ラクトグロブリンおよびα-ラクトアルブミンが総乳清タンパク質の約90％を構成し、それぞれ、4.4(Etzel 1998)(非特許文献1)および5.2(Hambling 1997)(非特許文献2)のpI値を有する。乳清タンパク質は、あるpH範囲にわたって可溶性のままであることが知られている。これは等電点での可溶性を含み、このために、この点に関して乳清タンパク質は他に例を見ないものとなっている(Damodaran 1996)(非特許文献3)。しかしながら、変性が起きれば、乳清タンパク質は凝集し、特に、等電点pHおよび等電点pH付近で、溶液を濁らせる沈殿物を形成することがある(Damodaran 1996)(非特許文献3)。過酷な処理条件への曝露は乳清タンパク質を変性させることが知られている(Damodaran 1996)(非特許文献3)。ほとんどの市販の乳清タンパク質製品は約4.0〜5.5のpH範囲で濁った溶液を形成する。
【０００９】
ヒト用食品への乳清タンパク質の使用は潜在性があると示されていたが、乳清タンパク質の機能的特性に関して(特に、可溶性および濁度において)制限がある。これらの欠点のために、乳清タンパク質は大きな、かつ成長中の飲料市場において適切に利用することができなかった。ソフトドリンクおよびフルーツジュースなどの低タンパク質、高炭水化物飲料は、飲料市場の約80％を占めている。これらの製品はどれも多量のタンパク質を含んでいない。栄養価のより高い代替品は高タンパク質、低糖の飲料であろう。
【００１０】
乳清タンパク質単離物は、このような飲料に理想的な高品質タンパク質添加物となるだろう。甘味と酸味のバランスをとることは飲料配合物において重要である。透明なソフトドリンクの大半は酸性である(例えば、Coca Cola(商標)のpHは2.5である)。非常に低いpHでは、溶液は非常に酸味がきつく、結果として、飲料を甘くするために多量の糖が必要とされる。タンパク質含有量が高く、糖含有量が低い飲料では、望ましい甘味を実現するために、標的pHは、好ましくは、3.0〜4.6でなければならないだろう。残念なことに、乳清タンパク質は液体に添加されると沈殿層を形成し、pH4.0〜5.5では濁った溶液を生じる。しかしながら、3.0未満のpHでは、乳清タンパク質を含む溶液は、沈殿のない透明な溶液を生じる。問題は、飲料の糖含有量を少なくするには、それに対応してpHを上げることが必要なことである。その結果として、望ましい範囲のpHでは、乳清タンパク質含有量の高い飲料は濁っており、平均的な消費者にとって食欲をそそるものではないだろう。他方で、pHを下げると飲料は透明になるが、かなりの量の甘味料を添加しない限り美味しくないだろう。従って、濁った高pHの乳清タンパク質含有溶液の問題を克服する方法が必要とされている。
【００１１】
【非特許文献１】Etzel 1998
【非特許文献２】Hambling 1997
【非特許文献３】Damodaran 1996
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、乳清タンパク質を単離する間の乳清タンパク質の変性を阻止するために開発された技法に基づいている。乳清タンパク質が陽イオン交換カラムから脱着される環境を制御することによって、変性がかなり低下する、または阻止される。従って、本発明は、乳清タンパク質を調製または単離するための方法、ならびに調製された乳清タンパク質の使用に関する組成物および方法に関する。本発明の方法は、乳清タンパク質単離物、または実質的に非変性の乳清タンパク質を提供する。結果として、本発明の方法によって生成された乳清タンパク質は、等電点pHを含む広いpH範囲にわたって可溶性である。結果として生じるタンパク質は、様々なやり方で、例えば、食料品において、タンパク質サプリメントとして、または薬学的製剤もしくは治療用途において使用することができる。用語「pH範囲」は、少なくとも3pH単位の生物系に関連するpH範囲を含む。例えば、pH範囲は約4〜約6(pH単位4、5、および6を含む)であり得る。用語「広いpH範囲」は少なくとも4pH単位の範囲を含む。例えば、広いpH範囲は約3〜約6であり得る。
【００１３】
乳清タンパク質を調製するための本発明の方法は、精製プロセス中にタンパク質が変性および凝集しないようにする特定の精製プロセスを伴う。ある態様において、「乳清タンパク質単離物」(2つまたはそれ以上の異なる乳清タンパク質を含む乳清タンパク質混合物を意味する)を得る方法がある。ここで、組成物中の固形物の90％以上が乳清タンパク質である(すなわち、単離物中の全固形物重量の少なくとも90％が乳清タンパク質の重量に起因し得る)。ある特定の態様において、単離物は、約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または多くとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の乳清タンパク質であり、あるいはその中で得られる任意の範囲の乳清タンパク質である。多くの態様において、単離物はβ-ラクトグロブリンおよびα-ラクトアルブミンを含有する。他の態様において、単離物はグリコマクロペプチドを含有しない。他で具体的に示されない限り、乳清タンパク質の調製に関して説明される態様は乳清タンパク質単離物の調製に適用可能であり、逆もまた同じであることが理解されるだろう。さらに、本発明の方法を用いて、他の濃度の乳清タンパク質を得ることができる。
【００１４】
これらの方法は、イオン交換クロマトグラフィーの実施およびクロマトグラフィー支持体から乳清タンパク質を取り出すための特定の条件の使用を伴う。本発明の態様において、方法は、a)乳清タンパク質が陽イオン交換支持体に吸着される条件下で、乳清タンパク質と陽イオン交換支持体を接触させる工程；b)支持体にpH約7以上の脱着溶液を流す工程；およびc)脱着した乳清タンパク質を収集する工程を含む。本発明のある特定の態様において、タンパク質の溶出または脱着は指向的に実施される。「指向的に」は、脱着が概して一方向に行われることを意味する。従って、本発明のある特定の態様において、脱着溶液が支持体に適用され、この溶液は、乳清タンパク質が脱着する支持体に流される。用語「流す」は、「流れに沿って移動させる」ことを意味するものとして、その普通のおよび通常の意味に従って用いられる。「流れに沿って移動させる」は、指向的(すなわち、概して一方向)を意味する。「概して一方向に」は、溶液が概してA点からB点へ直接流れることを意味することが理解されるだろう。ある特定の態様において、脱着溶液は概してA点からB点へ流れ、B点からA点へは流れないことも理解されるだろう。用語「接触する」は、「一緒にする」または「近くに配置する」ことを言うために、その普通のおよび通常の意味に従って用いられる。用語「適用する」は、その普通のおよび通常の意味に従って用いられ、「配置する」および「加える」を含む。
【００１５】
本発明のある態様において、乳清タンパク質を調製する方法は、市販の乳清タンパク質単離物と比較して比較的濁度の低い乳清タンパク質単離物を生成することに関し、この比較的低い濁度は、等電点を含む、pH値のある範囲にわたって保たれる。従って、本発明の方法は、約2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0もしくはそれ以上、少なくとも約2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0もしくはそれ以上、または多くとも約2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0もしくはそれ以上、あるいはその中で得られる任意の範囲にわたって、またはその中で得られる任意の範囲内のpHを有する溶液中で、約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800比濁計濁度単位(Nephelos Turbidity Unit)(NTU)、少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800NTU、もしくは多くとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800NTU、またはその中で得られる任意の範囲の濁度を有する乳清タンパク質単離物(約25g/L)の調製を可能にする。ある特定の態様において、単離された乳清タンパク質(約25g/L)は、約2〜約8のpH範囲にわたって約400NTU未満の濁度を有するか、または約2〜約8のpH範囲にわたって約200NTU未満の濁度を有するか、または約2〜約8のpH範囲にわたって約50NTU未満の濁度を有する。他の態様において、約25g/Lの濃度で、単離された乳清タンパク質を含有する溶液は、約4〜約6のpH範囲にわたって約200NTU未満の濁度を有す���か、または約4〜約6のpH範囲にわたって約50NTU未満の濁度を有する。用語「低い濁度」は、25g/Lの濃度の溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって400NTUまたはそれ未満になるような物理的特性を有する乳清タンパク質を意味することが理解されるだろう。用語「実質的に低い濁度」は、25g/Lの濃度の溶液中にある時に、約2〜約8のpH範囲にわたって200NTUまたはそれ未満になるような物理的特性を有する乳清タンパク質を意味する。本発明の溶液中での乳清タンパク質の濃度は25g/Lを含む。しかしながら、この濃度は、いかようにも、限定するものと意図されず、溶液の濁度のレベルを求めるための基準として用いられる。従って、25g/Lという基準は、単に、乳清タンパク質単離物の物理的性質(すなわち、変性の程度)が測定される濃度である。言い換えると、単離された乳清タンパク質がその濃度で溶液中にある時、ある特定のpHで、ある特定のレベルの濁度を有する。グラム/リットル単位で標準化されたタンパク質量の濁度レベルは、濃度が25g/Lの試料を用いた測定値から外挿することができる。従って、前記のpH範囲内における濁度単位は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100g/Lもしくはそれ以上、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100g/Lもしくはそれ以上、または多くとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100g/Lもしくはそれ以上、あるいはその中で得られる任意の範囲の乳清タンパク質濃度に適用することができる。濁度は、本明細書に記載のように(例えば、実施例に記載のように)NTUで測定できることが意図される。
【００１６】
「非変性の」乳清タンパク質または乳清タンパク質単離物は、(25g/Lの乳清タンパク質を有する溶液中で)約2〜約8のpH範囲にわたってNTUが約1000またはそれ未満の乳清タンパク質を意味することが理解されるだろう。「実質的に非変性の」乳清タンパク質または乳清タンパク質単離物は、(25g/Lの乳清タンパク質、「標準濃度」を有する溶液中で)約2〜約8のpH範囲にわたってNTUが約200またはそれ未満の乳清タンパク質を意味することが理解されるだろう。従って、「非変性の」乳清タンパク質または乳清タンパク質単離物は、標準濃度の時に、乳清タンパク質の等電点において、NTUが約1000、900、800、700、600、500、400、300、200、またはそれ未満の乳清タンパク質を意味する。
【００１７】
本発明の方法は、イオン交換クロマトグラフィー(特に、乳清タンパク質の化学的特性のために陽イオン交換クロマトグラフィー)を使用することを伴う。態様は、陽イオン交換支持体(陽イオン交換体を含有する、すなわち、負に荷電した固定相を有する物理的構造を意味する)を伴う。交換体は、フィルターもしくは半透膜の上にあってもよく、フィルターもしくは半透膜の一部でもよく、または固体構造(例えば、粒子、ビーズ、パドル、スターラー、スライド、プレート、もしくはディッシュ)の上にあってもよい。特定の態様において、支持体はビーズである。ビーズは多孔性でもよく、多孔性でなくてもよい。本発明の方法は、ある態様において、多孔性でないビーズを伴う。イオン交換クロマトグラフィー用のビーズは容易に入手することができ、多くの供給業者から購入することができる。ビーズのサイズは異なってもよいが、特定の態様において、湿ったビーズの平均直径は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500μm(マイクロメートル)もしくはそれ以上、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500μm(マイクロメートル)もしくはそれ以上、または多くとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500μm(マイクロメートル)もしくはそれ以上、あるいはその中で得られる任意の範囲である。ある特定の態様において、ビーズのサイズは直径が約80μm〜約150μmであり、特定の態様において、ビーズのサイズは直径が約100μm〜約300μmである。
【００１８】
ある特定の態様において、荷電支持体はゲルもしくは樹脂であるか、またはゲルもしくは樹脂の一部である。ビーズはこのような混合物に入れることができる。ゲルまたは樹脂は、非反応性構造(荷電した物を保持する物理的構造を意味する)に入れてもよい。物理的構造は、カラム(例えば、クロマトグラフィー法において容易に用いられるカラム)、ならびに試料およびイオン交換が行われる物(例えば、ビーズまたは他の多孔性支持体もしくは固体支持体)を保持することができるタンクまたは他の容器でもよいことが意図される。特定の態様において、カラムは、電荷に基づいて分子を分離する支持体となるビーズを保持する。さらに、予め充填されたカラムも容易に入手することができる(例えば、Amersham BiosciencesのMono Sカラム)。さらに、カラム直径は異なってもよい。ある特定の態様において、カラム直径は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500cmもしくはそれ以上、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500cmもしくはそれ以上、または多くとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500cmもしくはそれ以上、あるいはその中で得られる任意の範囲である。しかしながら、本明細書に記載の反応をスケールアップすることによって、本発明の方法を用いた大規模生成が可能であることが意図される。従って、かなり大きなカラム(例えば、前記のカラムよりほぼ約2×、5×、10×、20×、50×、もしくは100×、または少なくとも約2×、5×、10×、20×、50×、もしくは100×大きなカラム)を使用することができる。構造または支持体の体積は異なってもよい。体積は、約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000mlもしくはリットルまたはそれ以上、少なくとも約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000mlもしくはリットルまたはそれ以上、あるいは多くとも約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000mlもしくはリットルまたはそれ以上、あるいはその中で得られる任意の範囲であり得ることが意図される。乳清タンパク質の大規模単離のために、より大きな体積が特に意図される。
【００１９】
本発明の方法において、乳清タンパク質が陽イオン交換支持体に適用される。乳清タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにかける前に、乳清タンパク質の単離または精製に向けて他の工程を実施してもよいことが意図される。乳清タンパク質は任意の様々なチーズまたは乳製品から単離することができる。乳清タンパク質は、乳が低温殺菌された後に(乳清中で)収集されてもよく(例えば、チーズ製造プロセス中に収集されてもよい)、チーズ製造プロセスを経ずに(例えば、マイクロフィルターにかけられた乳から)収集されてもよいことが意図される。乳清または乳清タンパクが収集された後、本発明のある態様では、物理的分離手段が用いられる。特定の態様において、乳清タンパク質を陽イオン交換支持体に適用する前に、乳清タンパク質は濾過される。プリーツシートカートリッジフィルターの使用を含む、様々な濾過装置および濾過方法を使用することができる。
【００２０】
標準的な方法(例えば、試料適用前のカラムの平衡化)を用いて、クロマトグラフィーのためにイオン交換支持体を調製することができる。一般的に、支持体は、試料を含んでいる溶液と類似した(例えば、pHが類似した)溶液(「平衡化溶液」)で平衡化される。本発明の態様において、この溶液は塩を含み、約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0もしくはそれ以上、少なくとも約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0もしくはそれ以上、または多くとも約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0もしくはそれ以上、あるいはその中で得られる任意の範囲のpHを有する。
【００２１】
乳清タンパク質は、陽イオン交換支持体への乳清タンパク質の吸着を促進する条件下で支持体に適用される。用語「吸着」は、タンパク質生化学者にとって普通のおよび通常の意味に従って用いられる。この意味は、「溶液中の特定の物質が、この物質が接触している固体材料の曝露反応基に付着するプロセス」と理解される。本発明のある特定の態様において、乳清タンパク質は、約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0もしくはそれ以上、少なくとも約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0もしくはそれ以上、または多くとも約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0もしくはそれ以上、あるいはその中で得られる任意の範囲のpHを有する溶液中で、支持体に適用される。ある特定の態様において、溶液のpHは約1〜約7、または特に約4もしくは4.1である。
【００２２】
さらに、乳清タンパク質は、約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50℃もしくはそれ以上、少なくとも約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50℃もしくはそれ以上、または多くとも約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50℃もしくはそれ以上、あるいはその中で得られる任意の範囲の温度で、支持体に適用することができる。ある特定の態様において、温度は約10℃〜約40℃である。さらに、これらの温度はまた、クロマトグラフィー中の他の工程(例えば、溶出工程もしくは脱着工程または洗浄工程)の間にも適用できることが意図される。乳清タンパク質の支持体への適用は、乳清タンパク質を含有する溶液を、支持体の上に、または支持体に接触させて複数回(すなわち、1回より多く)通過させることを伴ってもよい。
【００２３】
乳清タンパク質がイオン交換支持体に吸着された後に、1つまたは複数の工程が続いてもよい。ある特定の態様において、支持体は洗浄溶液で洗浄されてもよい。典型的に、支持体に吸着されなかった物質を除去するために、洗浄溶液が支持体に適用または添加される。本発明の態様において、洗浄溶液は平衡化溶液および/または吸着溶液と同じ溶液である。本発明の態様において、支持体は、約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0もしくはそれ以上、少なくとも約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0もしくはそれ以上、または多くとも約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0もしくはそれ以上、あるいはその中で得られる任意の範囲のpHを有する溶液でリンスされる。ある態様において、溶液は塩を含む。他の態様において、支持体は水でリンスされてもよい。
【００２４】
ある態様において、平衡化溶液、吸着溶液、および/または洗浄溶液は、荷電支持体からタンパク質を脱着するpHを有さないことが意図される。従って、本発明の態様は、約7、6、5、4、3、もしくは2のpH、または約7、6、5、4、3、もしくは2未満のpH、あるいはその中で得られる任意の範囲のpHを有する非脱着溶液を含む。
【００２５】
さらに、脱着溶液に加えて、これらの溶液は緩衝剤で処理されてもよい。本発明のいくつかの態様において、吸着溶液は緩衝剤を有する。特定の態様において、緩衝剤のpKaは約4.0以上であることが意図される。従って、本発明の方法において用いられる緩衝剤は、約4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0もしくはそれ以上、または少なくとも約4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0もしくはそれ以上、あるいはその中で得られる任意の範囲のpKaを有することが意図される。例えば、緩衝剤は、ホスフェート緩衝剤、グリシン緩衝剤、シトレート緩衝剤、TRIS緩衝剤、HEPES緩衝剤、TES緩衝剤、カーボネート緩衝剤、およびイミジゾール(imidizole)緩衝剤を含んでもよい。本発明の特定の態様において、緩衝剤は、ホスフェート、シトレート、またはその両方の組み合わせである。溶液中の緩衝剤の濃度は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900mM(ミリモーラー)もしくはそれ以上、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900mM(ミリモーラー)もしくはそれ以上、または多くとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2���4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900mM(ミリモーラー)もしくはそれ以上、あるいはその中で得られる任意の範囲である。本発明の特定の局面において、溶液中の1つまたは複数の緩衝剤の濃度は合計で約0.5mM〜約100mMであるか、または約20mM未満である。
【００２６】
緩衝剤は塩として溶液に添加されてもよい。従って、場合によっては、吸着溶液は、塩および緩衝剤として働く化合物(例えば、リン酸ナトリウム)を含有する。ある特定の態様において、溶液は塩化ナトリウムも含有する。
【００２７】
ある特定の態様において、溶液は塩を含有する。「塩」は、化学における普通のおよび通常の意味に従って用いられる用語である。用語「塩」は、「酸ラジカルと塩基ラジカルが結合することによって形成される化合物」を指すものと理解される。溶液のイオン強度(0.5[モル濃度×(原子価)2])、または溶液中の1つもしくは複数の種類の塩の濃度は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900mM(ミリモーラー)もしくはミリモーラル、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900mM(ミリモーラー)もしくはミリモーラル、または多くとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900mM(ミリモーラー)もしくはミリモーラル、あるいはその中で得られる任意の範囲でもよい。特定の態様において、脱着溶液中の塩の濃度は約0.5mM〜約100mMであり、または約20mM未満でもよい。本発明の態様において、塩はナトリウム塩を含むが、これに限定されない。しかしながら、溶液に使用するために、カリウム塩などの他の塩が意図される。
【００２８】
乳清タンパク質が吸着された後、脱着溶液を用いて支持体から乳清タンパク質を脱着することができる。用語「脱着」は、「物質が吸着されている支持体からの物質の遊離」を言うために、タンパク質化学分野におけるその普通のおよび通常の意味に従って用いられる。前記のように、脱着溶液は緩衝剤(例えば、ホスフェート系および/またはシトレート系)で処理されてもよい。ある態様において、脱着溶液は複数の種類の緩衝薬を含むことがある。ある特定の態様において、脱着溶液は、前記のような塩を含む。さらに、乳清タンパク質上の電荷のために、本発明の方法において、脱着溶液は、塩基性pHを有する、あるいは約5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0のpH、もしくは少なくとも約5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0のpH、またはその中で得られる任意の範囲のpHを有する。
【００２９】
ある態様では、支持体を流れる脱着溶液の1つまたは複数の特性がモニタリングされることがある。例えば、支持体から脱着したタンパク質の量を求めるために、溶液のタンパク質濃度がモニタリングされることがある。ある特定の態様において、溶液が支持体と接触する前、接触した後、および/または接触している間に、溶液のpHがモニタリングされる。特定の態様において、支持体から離れた脱着溶液(排出溶液)のpHがモニタリングされる。従って、ある態様において、脱着したタンパク質および緩衝剤は、ある特定のpHに達した時に収集されてもよい。例えば、支持体とインキュベートされている溶液、または支持体とインキュベートされた溶液が約5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0のpHに達した時に、または多くとも約5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0に達した時に、溶出したタンパク質が収集されてもよい。場合によっては、溶液が約9.0のpHに達した時に、脱着したタンパク質は収集される。本発明のさらなる態様において、脱着したタンパク質の溶液はプールされ、溶出タンパク質画分のpHが求められる。ある特定の態様において、溶出タンパク質溶液全体のpHは、約5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0であるか、または約5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0未満である。ある特定の態様において、溶出タンパク質画分全体のpHは約6.5またはそれ以下である。
【００３０】
本発明の態様において、1つまたは複数の溶液は、イオン交換支持体に指向的に適用されてもよい。溶液の「指向的な」適用は、溶液が概して一方向に支持体の中を移動するように支持体に適用されたことを意味することが理解されるだろう。その結果として、本発明の態様において、1つまたは複数の溶液が支持体の中を流される。例えば、クロマトグラフィーのためにカラムが用いられる時、概して一方向に溶液をカラムに通して移動させるように(すなわち、溶液が支持体の中を流れるように)、重力またはポンプもしくは他の機械装置が用いられる。脱着溶液が適用される速度、または脱着溶液が支持体の中を流れる、もしくは支持体上を流れる速度はかなり速くてもよい。ある特定の態様において、速度は、時間の問題として、支持体が保持する体積(支持体体積)で表される。本発明の特定の方法において、脱着溶液は、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、13、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200支持体体積/時間もしくはそれ以上、少なくとも約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、13、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200支持体体積/時間もしくはそれ以上、または多くとも約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、13、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200支持体体積/時間もしくはそれ以上、あるいはその中で得られる任意の範囲の流速で、支持体に適用される、および/または支持体の中を流される。ある態様において、流速は、約10支持体体積/時間〜約100支持体体積/時間、約50支持体体積/時間〜約90支持体体積/時間、または約90支持体体積/時間である。支持体がカラムである時、速度は「カラム体積/時間」で表すことができる。前もって吸着された乳清タンパク質は脱着すると、溶出液中にある。バッチ式環境で行われる(成分が交換されない場合の)クロマトグラフィーは、典型的に流速が関与しないが、攪拌機構または他の機構が関与することが理解されるだろう。精製がバッチ式で行われる態様では、多くの場合(例えば、精製がタンク内で行われる時および/または脱着溶液の支持体全��への曝露が同時に行われる時)、脱着溶液は指向的に流れないことが理解されるだろう。
【００３１】
ある特定の態様において、緩衝剤が支持体を通過する時に、脱着溶液のpHが徐々に変化することがある。例えば、脱着緩衝剤が支持体に適用されている時に、脱着溶液のpHが徐々に上がることがある。脱着緩衝剤が支持体に適用されている時に、溶液が支持体を通過するにつれて、溶液のpHが変化し、pHフロント(pH front)が生じることは当業者に理解されるだろう。従って、ある態様において、吸着緩衝剤が適用されている間に、先端にあるpH値がある特定の最大値に達するように、脱着緩衝剤が支持体に適用されている時に、脱着緩衝剤のpHが下がることがある。例えば、吸着緩衝剤のpHは、初期値から、先端の最大pHが約6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、もしくは10.0、または約6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、もしくは10.0未満になるように下がることがある。ある特定の態様において、脱着溶液のpHの変化は、吸着した乳清タンパク質を含む支持体に2つまたはそれ以上の溶液を適用する前に、これらの溶液を様々な比で混合することを含んでもよい。さらなる態様において、混合された溶液は異なる緩衝薬を含んでもよく、場合によっては、これらの緩衝薬は、異なるpH範囲を超えた最大緩衝能を有してもよい。
【００３２】
脱着後、脱着した乳清タンパク質を収集し、1つまたは複数の追加操作に供することができる。本発明のある特定の態様において、脱着した乳清タンパク質の濃度が変更される。例えば、本発明のある態様では、脱着した乳清タンパク質は限外濾過に供される。例えば、脱着した乳清タンパク質は、限外濾過によって、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30パーセント全固形分まで、または約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30パーセント全固形分を超えて濃縮することができる。他の態様において、脱着した乳清タンパク質は乾燥または凍結乾燥される。場合によっては、タンパク質は噴霧乾燥することができる。さらに、その後、乳清タンパク質単離物は溶液に溶解されてもよい。
【００３３】
本発明の特定の態様は以下の方法および前記の任意の並び替えを含む。本発明は、a)直径が少なくとも100μmのビーズを有する陽イオン交換樹脂またはゲルを含むカラムに、乳清タンパク質が吸着される条件下で、乳清タンパク質とカラムを接触させる工程；およびb)pHが約7またはそれ以上の脱着溶液を支持体に流す工程を含む、乳清タンパク質を調製するための方法を含む。さらに、本発明は、a)乳清タンパク質が陽イオン交換カラムに吸着される条件下で、乳清タンパク質をカラムに適用する工程；およびb)pHが約7またはそれ以上の脱着溶液を、約10カラム体積/時間〜200カラム体積/時間の流速でカラムに流す工程を含む、乳清タンパク質を調製するための方法を含む。乳清タンパク質を調製するための他の方法は、a)乳清タンパク質が陽イオン交換支持体に吸着される条件下で、乳清タンパク質を支持体に適用する工程；およびb)緩衝剤を有し、イオン強度が約0.5mM〜約100mM、pHが約11.5の脱着溶液を、支持体に流す工程を含む。特定の態様において、a)直径が少なくとも100μmのビーズを有する陽イオン交換樹脂またはゲルを含むカラムに、乳清タンパク質が吸着される条件下で、乳清タンパク質をカラムに適用する工程；およびb)緩衝剤を有し、イオン強度が約0.5mM〜約100mM、pHが約7またはそれ以上の脱着溶液を、約10カラム体積/時間〜200カラム体積/時間の流速で支持体に流す工程を含む、実質的に非変性の乳清タンパク質を調製するための方法がある。
【００３４】
特定の乳清タンパク質が荷電支持体から選択的に脱着できることも意図される。従って、本発明の方法は、1つまたは複数の種類の特定の乳清タンパク質を、乳清中の他の成分(他の乳清タンパク質を含む)から分離することを含む。これはpH依存的に実施することができる。特定の態様では、pH約4.9の溶液を用いて、α-ラクトアルブミンが最初に脱着され、pH約11.5の脱着溶液を用いて、β-ラクトグロブリンに富むタンパク質画分が特異的に脱着される。
【００３５】
ある態様において、本発明の方法は、バッチ式で乳清タンパク質のアフィニティ精製を実施することを伴う。用語「バッチ」は、精製プロセスの成分が、概して順序も方向も関係なく一緒にインキュベートされるプロセスを言うために、この分野におけるその普通のおよび通常の意味に従って用いられる。本発明の状況において、バッチ式の精製がしないことが意図される。本発明のこれらの態様において、方法は、a)乳清タンパク質が陽イオン交換支持体に吸着される条件下で、乳清タンパク質と支持体を接触させる工程；b)支持体と、pHが約7またはそれ以上の脱着溶液を接触させる工程；およびc)脱着した乳清タンパク質を収集する工程を含む。ある態様では、支持体はタンクに入れられることがあり、ある特定の態様では、支持体および溶液は互いに対して動いていることがある。例えば、本発明の方法の1つまたは複数の工程中に、溶液は攪拌されてもよく、かきまわされてもよい。バッチ精製のある態様では、精製の間に、脱着溶液および/または脱着した乳清タンパク質溶液のpHがモニタリングされることがある。従って、ある特定の態様において、脱着溶液および/または脱着したタンパク質溶液のpHは調整されることがある。本発明のバッチ精製方法のなおさらなる態様において、精製の間に、脱着溶液および/または脱着したタンパク質溶液の濁度がモニタリングされることがある。指向性クロマトグラフィーに関して本明細書に説明される態様はバッチ精製に関して実施することができ、逆もまた同じである。
【００３６】
乳清タンパク質単離物を調製するプロセス方法に加えて、本発明は、乳清タンパク質単離物を含む組成物を含む。溶液および組成物は飲用でもよく、食用の食品組成物に用いられてもよく、薬理学的または薬学的に許容されるような製剤でもよいことが意図される。組成物および溶液には、食品(例えば、飲料)、栄養補助食品、および薬物が含まれるが、これに限定されない。
【００３７】
本発明は、乳清タンパク質を含む溶液を含む。この溶液は、乳清タンパク質の濃度が約25g/Lの時に前記の濁度特性を有する。ある特定の態様において、溶液の濁度は、約2〜約8のpH範囲にわたって約400NTU未満である。または、溶液の濁度は、このpH範囲にわたって約200NTU未満でもよい。さらに、溶液の濁度は約50NTU未満でもよい。さらに、他の態様において、25g/Lの乳清タンパク質を含む溶液の濁度は、約4〜約6のpH範囲にわたって約200NTU未満であるか、または約4〜約6のpH範囲にわたって約50NTU未満である。ある特定の態様において、本発明の溶液の濁度は、約6〜約8のpH範囲にわたって約50NTUまたは約50NTU未満になることがある。従って、乳清タンパク質溶液の濁度は、pH約7で約40NTU未満および/またはpH約6で約50NTU未満でもよい。ある態様において、タンパク質溶液の濁度は、約4.5〜約5.5のpH範囲で約150NTU未満になることがある。従って、溶液の濁度はpH約5.5で約75NTU未満でもよい。本発明のなおさらなる態様において、乳清タンパク質溶液の濁度はpH約4で約110NTU未満である。
【００３８】
本発明のある特定の態様は、約2〜約8のpH範囲にわたって実質的に可溶性の乳清タンパク質単離物を含む組成物に関する。実質的に可溶性の乳清タンパク質単離物とは、約25g/Lの濃度の溶液にある時に、約2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、またはその中で得られる任意の範囲のpHで、約10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、または200NTU未満の濁度を付与するものと定義される。ある特定の態様において、本発明の乳清タンパク質単離物の濁度は、約6〜約8のpH範囲にわたって約50NTUまたは約50NTU未満になることがある。従って、実質的に可溶性の乳清タンパク質単離物の濁度は、pH約7で約40NTU未満および/またはpH約6で約50NTU未満でもよい。ある態様において、乳清タンパク質の濁度は、約4.5〜約5.5のpH範囲で約150NTU未満になることがある。従って、溶液の濁度はpH約5.5で約75NTU未満でもよい。本発明のなおさらなる態様において、実質的に可溶性の乳清タンパク質単離物の濁度はpH約4で約110NTU未満である。本発明のある態様において、実質的に可溶性の乳清タンパク質単離物は、約2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、もしくは多くとも2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、またはその中で得られる任意の範囲のpHを有する溶液中で用いられることがある。
【００３９】
本発明の他の態様は、実質的に単離された非変性の乳清タンパク質を、乳清タンパク質単離物として、または個々の乳清タンパク質として含む組成物に関する。前記の「乳清タンパク質単離物」の定義に加えて、用語「実質的に単離された」または「実質的に精製された」は、所望のタンパク質が、試料中の固形物の重量の総重量の約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99パーセントもしくはそれ以上、または少なくとも約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99パーセントもしくはそれ以上、あるいはその中で得られる任意の範囲の量になるように、他の望ましくない成分(他の乳清タンパク質であり得る)から1つまたは複数の種類の乳清タンパク質が分離されることを意味することが理解されるだろう。もちろん、この用語の理解を変えることなく、実質的に単離された乳清タンパク質を含む組成物に、カゼイン、脂肪、またはラクトースを添加することができる。さらに、用語「実質的に単離された非変性の」乳清タンパク質は、前記のような、実質的に単離された、および実質的に非変性の乳清タンパク質を意味する。
【００４０】
本発明の乳清タンパク質単離物を用いて実現することができる透明度のために、この単離物を有する飲料および他の食料品が意図される。ある態様において、実質的に精製された乳清タンパク質を含む、透明な高タンパク質飲料がある。「透明な高タンパク質飲料」は、タンパク質濃度が少なくとも約25g/Lであり、少なくとも約4〜約6のpHにわたって濁度が約100NTUまたは約100NTU未満の飲料を意味する。本発明のさらなる態様において、飲料は、糖などの天然甘味料または人工甘味料を有することが意図される。ある特定の態様において、甘味料の量は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500g/Lもしくはそれ以上、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500g/Lもしくはそれ以上、または多くとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500g/Lもしくはそれ以上、あるいはその中で得られる任意の範囲である。特定の態様において、飲料中の糖の量は約100g/Lである。または、この量は、液体240ml当たり、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50gの糖、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50gの糖、または多くとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50gの糖、あるいはその中で得られる任意の範囲で表すことができる。特定の態様において、糖の量は18グラム/240mlまたはそれ未満である。さらに、このような飲料は、業界標準に従って「低糖」または「低カロリー」であるとみなされてもよい。具体的には、本発明の乳清タンパク質単離物はスポーツ飲料およびダイエット飲料に使用できると考えられる。飲料のpH値は、前記の乳清タンパク質単離物に関して述べられた任意のpHであり得る。
【００４１】
他の本発明の態様には、食用組成物、食品成分、増粘用安定化用食品 (例えば、人工栄養乳(infant formula)もしくは経腸栄養剤(enteral formula))、乳濁液、発泡体、または薬学的組成物が含まれるが、これに限定されない。このような組成物は、ダイエット食品および健康食品として知られる食料品に見られるように低糖含有量を有してもよく、低糖含有量を有さなくてもよい。
【００４２】
本明細書に記載の任意の方法または組成物は本明細書に記載の他の任意の方法または組成物に関して実施できることが意図される。さらに、態様を互いに両立できる程度まで組み合わせることができることがはっきりと意図される。
【００４３】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを意味する、すなわち、選択肢が互いに相容れないことを意味するように明確な指示が出されていない限り「および/または」を意味するように用いられるが、この開示は選択肢のみと「および/または」を意味する定義を裏付ける。
【００４４】
本願全体を通じて、用語「約」は、ある値が、この値を求めるために用いられている装置または方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。
【００４５】
具体的には、実施例の項に記載のどの態様も本発明の態様として含められると意図される。
【００４６】
長年にわたる特許法に従って、語句「a」および「an」は特許請求の範囲または明細書において語句「含む(comprising)」と共に用いられた場合、特に断りのない限り、1つまたは複数を表す。
【００４７】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は本発明の特定の態様を示すが、この詳細な説明から本発明の精神および範囲の中で様々な修正および変更が当業者に明らかになるので、例示にすぎないことが理解されるはずである。
【００４８】
例示的な態様の説明
本発明は、乳清タンパク質単離物が関与する方法および組成物に関する。本発明は、pH値のある範囲にわたって乳清タンパク質の変性を実質的に制限または阻止するやり方で、試料から乳清タンパク質を単離または精製するための方法を提供する。結果として、このような反応からの生成物には多くの用途がある。なぜなら、非変性の乳清タンパク質が実質的に純粋であり、凝集しておらず、従って、溶液が不透明にならない、または濁らないからである。本発明の方法は、一般的に、イオン交換クロマトグラフィーと、クロマトグラフィー法の間に多くの改善された乳清タンパク質脱着法を使用することを伴う。このようなやり方は、イオン交換支持体の物理的特性(イオン交換支持体の体積および/または表面積(ビーズのサイズ)を含む)、緩衝剤の条件、ならびに緩衝剤および溶液の適用と関係がある。
【００４９】
I.乳清タンパク質性組成物
乳清タンパク質は牛乳の2つの主なタンパク質群の1つを構成し、牛乳組成物の約20％を占める。しかしながら、本発明は、牛乳由来の乳清タンパク質に限定されず、他の種に由来する乳に関して実施することができる。乳清タンパク質はチーズ製造プロセスの天然副産物として得られる。未加工の形態は、タンパク質に加えて脂肪、ラクトース、および他の物質を含有する。未加工の形態は、特に、タンパク質に富んだ乳清タンパク質濃縮物(WPC)および乳清タンパク質単離物(WPI)を生成するために加工処理される。従って、乳清タンパク質は、生物価の高いタンパク質および異なる機能を有するタンパク質からなる。主要な乳清タンパク質は、全乳清タンパク質の約70〜80％を占める2種類の小さな球状タンパク質であるβ-ラクトグロブリンおよびα-ラクトアルブミンである。より少ない量で存在するタンパク質には、免疫グロブリンIgG、IgA、およびIgMが含まれるが、特に、IgG、グリコマクロペプチド、ウシ血清アルブミン、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、およびリゾチームが含まれる。
【００５０】
従って、ある特定の態様において、本発明は、少なくとも1種類のタンパク質性分子(例えば、乳清タンパク質)を含むタンパク質組成物に関する。典型的に、乳清タンパク質は、非組換えタンパク質(すなわち、細胞の天然産物)である。本明細書で使用する「タンパク質性分子」、「タンパク質性組成物」、「タンパク質性化合物」、「タンパク質性鎖」、または「タンパク質性材料」は、一般的に、遺伝子から翻訳された約50アミノ酸を超えるタンパク質もしくは完全長内因性配列、約100アミノ酸を超えるポリペプチド、および/または約3〜約100アミノ酸のペプチドを指すが、これに限定されない。前記の用語「タンパク質性」は全て本明細書において同義に使用することができる。
【００５１】
ある特定の態様において、タンパク質性組成物は、少なくとも1種類のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む。例えば、乳清タンパク質単離物はタンパク質性組成物である。さらなる態様において、タンパク質性組成物は、生体適合性のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む。本発明の方法によって、組換え乳清タンパク質または改変された乳清タンパク質を単離できることが意図される。改変された乳清タンパク質は、様々な用途に望ましい性質を有してもよい。これらの改変された乳清タンパク質は生体適合性でもよい。本明細書で使用する用語「生体適合性」は、本明細書に記載の方法および量に従って、ある特定の生物に適用または投与された時に、都合の悪い重大な作用を生じない物質を意味する。このような都合の悪い、または望ましくない作用は、重大な毒性または有害な免疫学的反応などの作用である。好ましい態様において、生体適合性のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含有する組成物は、一般的に、哺乳動物のタンパク質もしくはペプチドまたは合成のタンパク質もしくはペプチド(それぞれ、毒素、病原体、および有害な免疫原を本質的に含まない)である。
【００５２】
用語「生物学的に機能的な等価物」は当技術分野においてよく理解されており、本明細書において詳細にさらに定義される。従って、タンパク質の生物学的活性が維持されていれば、約70％〜約80％、またはより好ましくは約81％〜約90％、またはさらにより好ましくは約91％〜約99％の、乳清タンパク質のアミノ酸と同一な、または機能的に等価なアミノ酸を有する配列である。
【００５３】
II.乳清タンパク質の単離および精製
特定の態様において、本発明は、乳清タンパク質含有試料から乳清タンパク質を調製または入手する方法を提供する。これは、試料から乳清タンパク質を抽出または単離することによって達成することができる。試料からの高分子(例えば、乳清タンパク質)の単離に関与する生化学のために、用語「抽出する」および「単離する」は、乳清タンパク質含有試料中の他の成分から乳清タンパク質を分離するプロセスを言うために同義に用いられる。特定の態様において、本発明は、乳清タンパク質含有試料から乳清タンパク質を調製、入手、または収集するためのイオン交換法を提供する。さらなる態様において、本発明は、イオン交換支持体に適用され、適切なpHの脱着緩衝剤を用いて指向的に脱着された乳清タンパク質または乳清タンパク質含有試料を意図する。さらに、本発明は、脱着した乳清タンパク質が緩衝剤として作用するように、移動相にある脱着した乳清タンパク質と固定相にある吸着した乳清タンパク質との間に移動界面を生じさせるために、乳清タンパク質を指向的に脱着することを意図する。
【００５４】
一般的に、精製方法は最初のチーズ製造法を伴い、その後に、乳清タンパク質からカードが分離される。チーズ製造法は当業者に周知である。このような方法には、参照により本明細書に組み入れられる以下の特許：第6,572,901号；第6,558,716号；第6,551,635号；第6,548,089号；第6,485,762号；第6,475,538号；第6,468,570号；第6,465,033号；第6,458,394号；第6,455,092号；第6,443,379号；第6,416,797号；第6,413,568号；第6,410,076号；第6,401,604号；第6,399,121号；第6,335,040号；第6,297,042号；第6,270,823号；第6,258,390号；第6,242,036号；第6,183,804号；第6,140,078号；第6,139,889号；第6,120,809号；第6,103,277号；第6,026,740号；第5,988052号；第5.948,459号；第5,853,786号；第5,688,542号；第5,643,621号；第5,635,228号；第5,554,398号；第5,547,691号；第5,505,979号；第5,462,755号；第5,429,829号；第5,395,631号；第5,356,639号；第5,106,631号に記載の方法が含まれる。
【００５５】
A.イオン交換クロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィー(IEC)は、溶液中のイオンが、荷電した固体マトリックスまたは高分子網状構造に可逆的に吸着-脱着することに依拠する。この技法は、タンパク質分離に最も一般的に用いられるクロマトグラフィー技法である。イオン交換クロマトグラフィーでは、荷電した物質が、反対の電荷を有するカラム材料を介して分離される。イオン交換クロマトグラフィーでは以下の3つの重要な工程が用いられる：試料の適用、弱く結合しているタンパク質を除去するためのカラムの洗浄、および適切に設計された勾配を用いた、選ばれたタンパク質の溶出。
【００５６】
交換体カラムのイオン基はゲルマトリックスと共有結合しており、緩衝剤に存在する低濃度の対イオンによって相殺される。カラムに試料が添加されると、弱く結合している対イオンが置換される。イオン交換クロマトグラフィー(IEC)は、ほとんど全ての種類の荷電分子(大きなタンパク質から小さなヌクレオチドおよびアミノ酸まで)の分離に適用することができる。イオン交換クロマトグラフィーは、多種多様な条件下でタンパク質およびペプチドによく用いられる。しかしながら、アミノ酸には標準化された条件が用いられる。
【００５７】
1.イオン交換体およびカラム
イオン交換クロマトグラフィーでは、2つの交換体型：塩基性(正電荷)および酸性(負電荷)が区別されている。これらの2つの型はさらに、弱塩基性交換体もしくは弱酸性交換体または強塩基性交換体もしくは強酸性交換体に分けることができる。強塩基性材料または強酸性材料を使用した場合、全ての官能基は常にイオン化している形で存在し、指定された操作範囲内のpH値に全く依存しない。例えば、第4級アミノ基(R3N+-)は正に荷電しているのに対して、スルホン酸基(-SO3-)は負に荷電している。第4級アミノ基のpK値は約14であり、スルホン酸残基のpK値は1未満である。
【００５８】
さらに、弱塩基性型(pK値8〜11)および弱酸性型(4〜6)が存在する。弱塩基性型は第2級および第3級アミノ官能基からなる。弱酸性型はカルボキシル官能基からなる。従って、弱塩基性交換体は、8.5未満のpH値でしか用いられず、弱酸性交換体は6を超えるpH値でしか用いられないはずである。これらの範囲外では、強塩基性交換体または強酸性交換体が用いられるはずである。多くのタンパク質は、ポリアニオン(pH>pI)またはポリカチオン(pH<pI)として(関心対象のタンパク質のpH安定性がこの選択を妨げない限り)分離することができる。
【００５９】
一般的な機能的イオン交換体基には、トリメチルアンモニウムエチル基(TMAE基),pK>13,強塩基性；ジエチルアミノエチル基(DEAE基),pK11,弱塩基性；ジメチルアミノエチル基(DMAE基),pK8〜9,弱塩基性；カルボキシ基(COO基),pK4.5,弱酸性；スルホイソブチル基(SO3基),pK<1,強酸性；スルホエチル基(SE基),pK<1,強酸性が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００６０】
イオン交換クロマトグラフィーにおいて、正に荷電したマトリックスは負に荷電したイオン(陰イオン)を結合するために、陰イオン交換体と呼ばれる。陰イオン交換体は、弱陰イオン交換体または強陰イオン交換体として分類することができる。弱陰イオン交換体にある荷電基は弱塩基である。弱塩基は高pHでは脱プロトンし、従って、電荷を失う。DEAE-セルロースが弱陰イオン交換体の一例である。DEAE-セルロースでは、アミノ基はpH約9未満で正の電荷をもち、それより高いpH値では電荷を徐々に失う。その一方で、強陰イオン交換体は強塩基を含有する。強塩基は、イオン交換クロマトグラフィーに通常用いられるpH範囲(pH1〜14)全体にわたって正の電荷をもち続ける。陰イオン交換体は、緩衝剤のpH値がタンパク質のpI値より1.5〜2高い時に最良の結果をもたらす。pH値を下げると保持時間が短くなる(陰イオン交換体を使用した場合)。対イオンのイオン強度を上げると、保持時間が短くなる(陰イオン交換体および陽イオン交換体を使用した場合)。
【００６１】
イオン交換クロマトグラフィーに用いられる、もう1つの型のイオン交換体が、正に荷電したイオン(陽イオン)を結合する負に荷電したマトリックスである陽イオン交換体である。陽イオン交換体は、弱陽イオン交換体または強陽イオン交換体として分類することができる。強陽イオン交換体は、pH1〜14で電荷をもち続ける強酸(例えば、スルホプロピル基)を含有するのに対して、弱陽イオン交換体は、弱酸(例えば、カルボキシメチル基)を含有する。弱酸は、pHが4または5未満に下がるにつれて電荷を徐々に失う。陽イオン交換体は、緩衝剤のpH値がタンパク質のpIより1.5〜2単位低い時に最良の結果をもたらす。pH値を上げると保持時間が短くなる(陽イオン交換体を使用した場合)。
【００６２】
分析用イオン交換カラムには、強陰イオン交換体または弱陰イオン交換体(それぞれ、官能基/樹脂は第4級アンモニウム(QA)およびジエチルアミノエチル(DEAE))、ならびに強陽イオン交換体または弱陽イオン交換体(それぞれ、官能基/樹脂はスルホプロピル(SP)およびカルボキシメチル(CM))が含まれる。これらのカラムは2〜12のpHで使用することができ、1.5M未満の塩濃度の使用を伴うことができる。
【００６３】
本発明では、テンタクルイオン交換体を使用できることも意図される。ほとんどのイオン交換ゲルでは、イオン基(交換体)はマトリックス表面に直接固定される。どんなゲルマトリックスでも、使用される化学的特性およびマトリックスの限定された内部表面のために、ある特定の数のイオン基しか取り付けることができない。取り付けられたら、イオン基は生体高分子を結合するために生体高分子に接近しなければならない。この結合プロセスのための空間的条件によって、これらの種類のイオン交換体のタンパク質結合能力が限定される。
【００６４】
しかしながら、テンタクルイオン交換体は、ポリマー直鎖を介して交換体基をマトリックスに共有結合している。従って、タンパク質交換能力を相当上げることができる。ポリマー鎖の中間的な長さは15〜50モノマー単位であり、同数の側鎖リガンドを有する。テンタクルには柔軟性があるので、立体障害が小さいために、これらの部位は生体高分子に接近しやすい。大きなタンパク質の場合、テンタクル媒体は従来の支持体と比較して高い結合能をもたらす。
【００６５】
熱または極端なpH条件に加えて、カラムマトリックス上での様々な表面現象がタンパク質の変性およびタンパク質の生物学的活性の喪失につながることがある。高次構造変化による変性は、多くの場合、不可逆的であるが、固定相のバックボーンが隠されているテンタクルイオン交換体を使用することによって阻止または最小限にすることができる。
【００６６】
乳清タンパク質含有試料からの乳清タンパク質の分離、単離、または抽出は、カラム、膜、またはスライドなどの支持体の使用をさらに含んでもよい。固体支持体には、シリカを含む支持体が含まれ得る。ある態様において、シリカはガラスである。さらに、支持体には、カラムおよびフィルター(例えば、ガラス繊維フィルターもしくはカラム)、セルロース、ポリマーをベースとするモノリシック支持体、ビーズ、ゲル、または樹脂が含まれ得るが、これに限定されない。
【００６７】
テンタクル媒体が充填されたカラムは良好な選択性および高い効率のために優れたクロマトグラフィー結果をもたらし、高濃縮画分が得られる。カラムはまた、シリカベース、樹脂ベース、ポリマーベース、または含水酸化物(hydrous oxide)ベースのマトリックスを有する、ステンレス鋼カラム、アクリルカラム、または高密度カラムでもよい。
【００６８】
望ましい分離に応じて、Sタイプゲル(強い陽イオンゲル)には380cm/hr(=5ml/min(1cmカラムの場合))までの直線流速を使用することができる。流速を支持体体積/時間の尺度で表すことに加えて、流速はcm/分で表されることもある。実施例1のカラムを使用した時、約30カラム体積/時間は約7.5cm/minであった。または、約150カラム体積は約375cm/minであった。本明細書において支持体体積/hrで記載された流速に対応する流速(cm/min)は本発明の一部とみなされる。Fractogel(登録商標)テンタクル材料の機械的安定性は、能力を失うことなく速い流速(Mタイプゲルの場合、800cm/hまで)の使用を可能にする。
【００６９】
2.イオン交換クロマトグラフィーにおけるpHおよび選択性
タンパク質にある電荷は、イオン交換クロマトグラフィーにおけるタンパク質の挙動に影響を及ぼす。タンパク質は、タンパク質アミノ酸の側鎖ならびにタンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端に、多くのイオン化可能な基を含有する。これらのイオン化可能な基には、リジン、アルギニン、およびヒスチジンの側鎖にある塩基性基、ならびにグルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、およびチロシンの側鎖にある酸性基が含まれる。溶液のpH、側鎖のpK、および側鎖の環境が、それぞれの側鎖の電荷に影響を及ぼす。一般的に言うと、溶液のpHが上がると、タンパク質にある酸性基および塩基性基が脱プロトンし、その結果、カルボキシル基はカルボン酸陰イオンに変わり(R-COOH→R-COO-)、アンモニウム基はアミノ基に変わる(R-NH3+→R-NH2)。タンパク質において、等電点(pI)は、タンパク質が実効電荷を有さないpHと定義される。pH>pIの時、タンパク質は負の実効電荷を有し、pH<pIの時、タンパク質は正の実効電荷を有する。様々なタンパク質についてpIは異なる。
【００７０】
イオン交換体へのタンパク質の吸着を支配するタンパク質の性質は表面実効電荷である。表面電荷はタンパク質の弱酸性基および弱塩基性基の結果であるので、分離はかなりpH依存的である。低pH値から高pH値になると、タンパク質の表面電荷は正電荷の表面電荷から負電荷の表面電荷にシフトする。pH対表面実効電荷の曲線は、タンパク質の1つ1つ異なる性質であり、IECにおける選択性の基礎となるものである。等電点より低いpH値では、タンパク質(+表面電荷)は陽イオン交換体(-)(例えば、CM基を含有する交換体)に吸着する。等電点より上では、タンパク質(-表面電荷)は陰イオン交換体(+)(例えば、DEAE基を含有する交換体)に吸着する。
【００７１】
全ての形態の液体クロマトグラフィーのように、試料成分を異なる速度でカラムの中を移動させる条件が用いられる。低イオン強度では、イオン交換体に対して親和性を有する全ての成分がイオン交換体上部でしっかりと吸着し、移動相には何も残らない。中性塩を添加することによって移動相のイオン強度が上がると、塩イオンはタンパク質と競合し、試料成分のより多くが部分的に脱着し、カラム下部へ移動し始める。イオン強度をさらに上げると、より多くの試料成分が脱着し、カラム下部へ移動する速度が上昇する。タンパク質の実効電荷が大きければ大きいほど、脱着を引き起こすのに必要なイオン強度は高くなる。ある特定の高いレベルのイオン強度では、試料成分は全て完全に脱着し、移動相と同じ速度でカラム下部へ移動する。全吸着と全脱着の間のどこかで、移動相のある特定のpH値について最適選択性が得られる。従って、イオン交換クロマトグラフィーにおける選択性を最適化するために、試料成分間で十分に大きな実効電荷差を生じさせるpH値が選択される。次いで、これらの成分を部分的に脱着することによって、これらの電荷差を完全に活用するイオン強度が選択される。カラム下部への各成分のそれぞれの速度は、移動相に見出される成分の画分と比例する。従って、本発明の勾配、溶出もしくは試料緩衝剤、または緩衝剤成分のpHは、約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5の間でもよく、少なくとも約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5の間でもよく、または多くとも約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5の間でもよく、あるいはその中の任意の範囲でもよく、またはそれより大きくてもよい。好ましい態様において、脱着緩衝剤/溶液のpHは、7.0、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、もしくはそれ以上より大きく、または約7.0、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6��10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、もしくはそれ以上である。
【００７２】
3.緩衝剤
関心対象のタンパク質が樹脂に結合するように、樹脂および緩衝剤を選択することが必要である。陽イオン交換分離において、関心対象のタンパク質は、カラムの中の固定相に結合するために正に荷電している必要がある。イオン強度を変えた時の緩衝イオンの吸着または脱着に起因し得るpH変化を避けるために、緩衝イオンは、使用されるイオン交換体と同じ符号の電荷を有することが一般的に好ましい。本発明の状況において、本発明による使用について考えられる緩衝剤には、pKaが約4.0を超える緩衝剤が含まれる。これには、ホスフェート、グリシン、シトレート、TRIS、TES、イミジゾレム(Imidizolem)、コハク酸、およびホウ酸が含まれる。これらは全て一般的な生物学的緩衝剤である。場合によっては、乳酸グリシンまたはpKaが4.0を超える別の緩衝剤が用いられる。
【００７３】
正に荷電した緩衝イオンが陰イオン交換体に用いられ、負に荷電した緩衝イオンが陽イオン交換体に用いられる。陰イオン交換体または陽イオン交換体に対して、ホスフェート緩衝剤が一般的に用いられる。本発明のある態様では、本発明の緩衝剤はさらに塩(ナトリウム)を含んでもよい。緩衝剤の濃度は、約0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、5000mMもしくはそれ以上の間、少なくとも約0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、5000mMもしくはそれ以上の間、または多くとも約0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、5000mMもしくはそれ以上の間、あるいはその中の任意の範囲である。ナトリウムは、NaClとして緩衝剤に提供することができる。さらに、ナトリウムは、複数のやり方で(例えば、ナトリウムを含む2種類以上の化合物を添加することによって)緩衝剤に提供することができる。緩衝剤は全て可能な限り純粋であり、MilliQ水から作成され、濾過されてもよい(0.45または0.22μmフィルター)。
【００７４】
IECにおいて一般的に用いられるいくつかの緩衝剤には、Tris (DEAEイオン交換体を使用した場合、pH範囲7〜9)、ホスフェート(CM(DEAE)イオン交換体を使用した場合、pH範囲6〜8)、およびアセテート(DEAEイオン交換体を使用した場合、pH範囲4〜6)が含まれるが、これらに限定されない。ジエチルアミノエチル(DEAE)基またはカルボキシメチル(CM)基を含有するイオン交換が最も頻繁に用いられる。他の緩衝剤には、20mM L-ヒスチジン(緩衝範囲pH5.5〜6.8)、20mM bis-Tris(緩衝範囲pH5.8〜7.0)、20mM bis-Trisプロパン(緩衝範囲pH6.4〜7.3)、20mMトリエタノールアミン(緩衝範囲pH7.3〜8.2)、または20mMジエタノールアミン(緩衝範囲pH8.4〜9.4)が含まれ得、これらは全て陰イオン交換クロマトグラフィーに使用することができる。陽イオン交換クロマトグラフィーの場合、使用される緩衝剤は酸であり、20mMフォルメート(緩衝範囲pH3.3〜4.3)、20mM MES(緩衝範囲pH5.5〜6.7)、20mMアセテート(緩衝範囲pH4.2〜5.2)、20mMホスフェート(緩衝範囲pH2.0〜7.6)、および20mM HEPES(緩衝範囲pH7.6〜8.2)を含み得る。さらなる緩衝剤には、CHES/TEAまたはTEAAが含まれ得る。本明細書に記載の任意の緩衝剤の濃度は異なってもよい。本発明において用いられる任意の緩衝剤の濃度は、約0、0.5、1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mMもしくはそれ以上でもよく、または約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0Mもしくはそれ以上でもよい。さらに、前記の特定の緩衝剤は、本発明に従って(例えば、イオン強度を下げることによって、(吸着および洗浄のために)より低いpH(例えば、約4.0)で使用することによって、または(溶出または脱着のために)より高いpH(例えば、約11.5)で使用することによって)改変できることが意図される。
【００７５】
緩衝剤は使用前に徹底的に脱気され、フィルター(例えば、1ミクロンフィルター)に通される。次いで、塩濃度を上げることによって、または移動相のpHを変えることによって、脱着が行われる。移動相のpHの変更は他で説明する。
【００７６】
4.溶出勾配
カラムから関心対象のタンパク質を溶出するために、塩勾配などの勾配をイオン交換クロマトグラフィーにおいて使用することができる。単一のイオン強度値では、遅い試料成分が妥当な時間でカラムを通過できないように、非常に多くの場合、試料成分はイオン交換体への吸着の点で異なる。これらのタンパク質を溶出するために、移動相においてイオン強度を連続的に上げる塩勾配を使用することができる。IECに用いられる緩衝剤/溶媒の塩濃度はまた、弱く結合しているタンパク質が正に荷電していてもカラムから洗浄液中へ洗い流されるように変えることもできる。塩勾配があることで、全ての成分が完全に脱着するまで、実効電荷が小さな順に試料成分を徐々に脱着することができる。しかしながら、この時点で、試料成分は既に分離されている。従って、塩勾配は、広範囲に異なる吸着性質を有する成分を妥当な時間内で溶出するようにクロマトグラムを圧縮する。この勾配の中のどこかで分離を選択的に増大させることが必要であるが、遅い成分を妥当な時間内で溶出することが依然として必要な場合、分離を高めることが望まれるクロマトグラム部分をカバーするように、さらに小さな勾配の区画が勾配に組み込まれる。これは適合勾配法(adapted gradient technique)と呼ばれ、プログラム可能な高性能勾配装置を必要とする。
【００７７】
勾配溶出はバンド広幅化(band broadening)において役割を果たしている。移動相と固定相の間の試料分子の交換は拡散によって支配され、バンド広幅化効果は分子がカラムを通過する時に働く。小さな粒子は迅速な物質移動を促すので、最適流速をより高い値に押し上げ、均一な球状粒子は渦拡散効果を最小限にする。勾配において、試料区画の後部は、前部よりわずかに速い速度で移動する。これは、後部では、勾配のイオン強度がわずかに高いためである。結果として、この区画は、勾配が無い場合より鮮明になる。急勾配であればあるほど、区画は鮮明になる。
【００７８】
勾配溶出カラムの分離能を十分に利用するために、カラムの長さは、最後の成分を完全に脱着するのに必要な長さを超えない。その長さを超えたカラムを用いても分離は良くならず、余分なバンド広幅化をもたらし得る。最善の結果を得るために、溶出に使用する勾配は急すぎてはならない。4〜5ml(=50-10カートリッジの容積)のカラム体積を使用した場合、20〜25mlの勾配体積が十分である。
【００７９】
B.乳清タンパク質のバッチ精製
ある特定の状況において、前記の方法は、透明度が高く、タンパク質変性が少ない乳清タンパク質単離物を生成するバッチ法でも使用できることが意図される。バッチ精製の方法および条件(カラムプロセスについて説明したような、樹脂の平衡化、吸着の促進、樹脂の洗浄、および吸着したタンパク質の脱着に用いられるpH、温度、イオン強度、および濃度を含む)もバッチプロセスにおいて使用することができる。
【００８０】
例えば、本発明のバッチ精製は、陽イオン交換樹脂を、平衡化溶液が入っているタンクに入れる工程および混合する工程を含んでもよい。次いで、平衡化溶液を排出し、乳清タンパク質を含有する試料溶液をタンクの中に入れ、樹脂へのタンパク質吸着を促進する条件下で樹脂に曝露してもよい。吸着を促進する条件は、カラムプロセスについて説明した条件と類似している。この工程の後に、タンパク質を枯渇させた試料溶液をタンクから排出する工程、および前記で説明したように、樹脂を含む系を洗浄溶液で1回または複数回洗浄する工程を行ってもよい。次いで、この後に、洗浄溶液をタンクから排出する工程、および洗浄された樹脂を、タンパク質の脱着を促進する条件に曝露する工程を行ってもよい。これは、脱着溶液をタンクに入れる工程、およびタンパク質の脱着を促進するために脱着溶液と樹脂を混合する工程によって達成することができる。前記のように、場合によっては、溶液と樹脂を混合する間に、脱着溶液のpHを変えてもよい。脱着の後、脱着した乳清タンパク質の溶液を収集し、本明細書に記載のように1つまたは複数の追加操作にかけてもよい。
【００８１】
C.乳清タンパク質の精製および濃縮
乳清タンパク質をIECにかける前または乳清タンパク質をIECにかけた後に、乳清タンパク質を、当業者に周知のさらなる精製法にかけてもよい。
【００８２】
従って、本発明のある特定の局面は乳清タンパク質の精製と関係し、特定の態様では、乳清タンパク質の実質的な精製と関係する。本明細書で使用する用語「精製されたタンパク質またはペプチド」は、他の成分から単離可能な組成物を指すことが意図される。ここで、タンパク質またはペプチドは、天然で得られる状態を基準にして任意の程度まで精製される。従って、精製されたタンパク質またはペプチドは、天然に生じ得る環境を含まないタンパク質またはペプチドも指す。
【００８３】
一般的に、「精製された」は、他の様々な成分を除去するために分画にかけられているタンパク質組成物またはペプチド組成物を指し、この組成物は、特定のまたは望ましいタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドについて、(例えば、当業者に公知のタンパク質アッセイによって)評価され得る発現活性を実質的に保持している。これらの技法は、ある段階では、細胞環境から、異なるポリペプチドの特定の画分への粗分画を伴う。
【００８４】
タンパク質またはペプチドが最も精製された状態で常に提供されるという一般要件はない。実際には、ある特定の態様において、実質的に精製されていない生成物が有用であることが意図される。部分精製は、より少ない数の精製工程を併用することによって、または同じ一般的な精製法の異なる形態を使用することによって達成することができる。例えば、HPLC装置を用いて行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーの精製は、一般的に、低圧クロマトグラフィー装置を用いた同じ技法の精製より「何倍か」大きいことが理解される。精製比が小さな方法は、タンパク質生成物の全回収において、または発現タンパク質の活性の維持において有利な場合がある。
【００８５】
従って、本明細書において開示されるイオン交換法を用いて、他のタンパク質またはタンパク質成分から本発明の乳清タンパク質が分離または単離または抽出された後に、乳清タンパク質は、部分精製もしくは完全精製を行うために(または均一になるまで精製するために)クロマトグラフィー法および電気泳動法を用いてさらに精製することができる。タンパク質精製における使用に適した様々な技法が当業者に周知である。これらの技法には、例えば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体などを用いた沈殿または熱変性による沈殿と、それに続く遠心分離；クロマトグラフィー工程(例えば、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、およびアフィニティクロマトグラフィー)；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこのような技法および他の技法の組み合わせが含まれる。純粋な乳清タンパク質の調製に特に適した分析法には、限外濾過、ダイアフィルトレーション、逆ミセル抽出(RM)、チャンネルモジュール、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動が含まれる。特定の効率的なペプチド精製法は高速タンパク質液体クロマトグラフィー(fast protein liquid chromatography)であり、またはさらにHPLCである。従って、精製された、または実質的に精製された乳清タンパク質を入手または調製するために、当業者に公知の多数のタンパク質精製法のいずれかを、本発明のイオン交換法と併用することができる。当技術分野において一般に知られているように、様々な精製工程を実施する順序は変更可能である、またはある特定の工程は省略可能であり、それでもなお、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に適した方法が得られると考えられる。
【００８６】
乳清タンパク質の精製の程度を数量化する様々な方法は、当業者に公知の任意の方法によるものであろう。一例は、参照により本明細書に組み入れられる、Association of Official Analytical Chemists, 2000 Official Methods for Analysis, VoI II, 17th Ed. AOAC, Gainthersberg, MDのMethod No. 991.20において見られる。
【００８７】
他の方法には、例えば、活性画分の比活性の測定、またはSDS/PAGE分析による画分中のポリペプチド量の評価が含まれる。画分の純度を評価する方法は、画分の比活性を計算し、その比活性を初回抽出物の比活性と比較し、純度の程度を計算する方法である(純度の程度は、本明細書において「倍精製数(-fold purification number)」で評価される)。もちろん、活性の量を表すのに用いられる実際の単位は、精製の後に行われる選択された特定のアッセイ法、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すかどうかに左右されるだろう。前記のように、乳清タンパク質生成の分野におけるタンパク質単離について説明するやり方は、試料中の全固形物の総重量のパーセントとしての試料中の乳清タンパク質の重量に関する。
【００８８】
D.他のタンパク質抽出/精製法
さらに、本発明は、本発明のイオン交換法と併用することができる、乳清タンパク質を抽出または単離または精製するさらなる方法の使用を意図する。このような方法は、タンパク質の吸着特性、またはタンパク質の大きさもしくはタンパク質の電荷が関与し得る。
【００８９】
1.pHに基づくタンパク質分離法
a.アフィニティクロマトグラフィー
吸着クロマトグラフィーは、混合物が通過するカラム内に入れられた固体マトリックスにおける選択的吸着-脱着による化合物の分離を伴う。分離は、固体マトリックスに対する異なるタンパク質の異なる親和性に基づいている。アフィニティクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質の分離に一般的に用いられている2つの主なタイプの吸着クロマトグラフィーである。オープンカラムクロマトグラフィーまたは高圧液体クロマトグラフィーのいずれかを用いて、分離を行うことができる。
【００９０】
アフィニティクロマトグラフィーでは、固体支持体に共有結合したリガンドからなる固定相が用いられる。リガンドは、ある特定のタンパク質に対して非常に特異的で、かつ独特の可逆的親和性を有する分子である。分析しようとする試料がカラムに通され、関心対象のタンパク質がリガンドに結合するのに対して、汚染タンパク質はまっすぐに通過する。次いで、カラムからの関心対象のタンパク質の脱着に有利な緩衝剤を用いて、関心対象のタンパク質が溶出される。この技法は、タンパク質混合物から個々のタンパク質を分離する最も効率的な手段であるが、特異的リガンドが結合しているカラムを有する必要があるために最も高価な手段である。
【００９１】
アフィニティクロマトグラフィーは、単離しようとする物質と、この物質が特異的に結合することができ、かつ当技術分野において周知の分子との間の特異的親和性に頼るクロマトグラフィー法である。これは受容体-リガンド型相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの一方と不溶性マトリックスを共有結合することによって合成される。その後に、カラム材料は、溶液から物質を特異的に吸着することができる。溶出は、条件を、結合が起こらない条件に変えることによって(例えば、pH、イオン強度、および温度を変えることによって)行なわれる。
【００９２】
b.電気泳動によるタンパク質分離
電気泳動は、電場が加えられた時の溶液中の荷電分子の移動差に依拠している。電気泳動は、タンパク質を大きさ、形状、または電荷に基づいて分離するのに使用することができる。
【００９３】
i.非変性電気泳動
非変性電気泳動では、緩衝化されたネイティブタンパク質溶液が多孔性ゲル(通常、ポリアクリルアミド、デンプン、またはアガロース)に注がれ、ゲルに電圧が適用される。タンパク質は、ゲルの中を、タンパク質の電荷符号に応じた方向へ、電荷の大きさおよびタンパク質の移動に対する摩擦に応じた速度で移動する。
【００９４】
タンパク質は、タンパク質の等電点(pI)および溶液のpHに応じて溶液中で正に荷電したり、負に荷電したりする。pHがpIより大きければ、タンパク質は負に荷電し、pHがpIより小さければ、タンパク質は正に荷電している。電荷の大きさおよび印加される電圧によって、ある特定の時間でタンパク質がどれくらい移動するかが決まる。電圧が大きいほど、またはタンパク質上の電荷が大きいほど、タンパク質は遠くに移動する。分子の摩擦は、ゲルの中の移動に対する抵抗の尺度であり、主に、分子の有効サイズと、ゲルの中の孔のサイズとの関係によって決まる。分子のサイズが小さいほど、またはゲルの中の孔のサイズが大きいほど、抵抗が小さくなり、従って、分子がゲルの中を移動する速度が速くなる。異なる多孔度を有するゲルは化学供給業者から購入することができる、または実験室において作成することができる。より小さな孔径は、高濃度の架橋試薬を使用してゲルを形成することによって得られる。ゲルは2枚の平行プレートの間に入れてもよく、円筒チューブの中に入れてもよい。非変性電気泳動において、ネイティブタンパク質は、その電荷、サイズ、および形状の組み合わせに基づいて分離される。
【００９５】
ii.等電点電気泳動
この技法は電気泳動の改良版である。等電点電気泳動では、タンパク質は、pH勾配を有するゲルマトリックス上での電荷によって分離される。タンパク質は、等電点とpHが等しくなる位置に移動し、次いで、もはや電荷をもたなくなるために移動を停止する。この方法は、タンパク質分離に用いられる全ての技法の中で最も高い分離の1つを有する。狭いpH範囲(2〜3単位)をカバーするゲルまたは広いpH範囲(3〜10単位)をカバーするゲルが入手可能であり、従って、分離されるタンパク質に最も適したゲルが選択されるはずである。
【００９６】
iii.二次元電気泳動
複雑なタンパク質混合物の分離を改善するために、等電点電気泳動およびSDS-PAGEを一緒に使用することができる。タンパク質は、等電点電気泳動を用いて電荷に基づいて一方向に分離され、次いで、SDS-PAGEを用いてサイズに基づいて垂直方向に分離される。
【００９７】
2.サイズの違いによるタンパク質分離
タンパク質はサイズに従って分離することもできる。典型的に、タンパク質の分子量は約10,000〜1,000,000ダルトンとばらつきがある。実際には、分離は、タンパク質の分子量に直接依存するのではなく、タンパク質のストークス半径に依存する。ストークス半径は、溶液中でのタンパク質の平均半径であり、タンパク質の三次元分子構造に依存する。同じ分子量を有するタンパクの場合、ストークス半径は、以下の順：密度の高い球状タンパク質<可撓性のあるランダムコイル<棒状タンパク質で大きくなる。
【００９８】
a.限外濾過
本発明のある態様において、脱着した乳清タンパク質は限外濾過にかけてもよいことが意図される。この方法を使用する時、半透膜を収容しているセルにタンパク質溶液が入れられ、圧力が加えられる。小さな分子は膜を通過するが、大きな分子は溶液に残る。従って、この技法の分離原理は透析と似ているが、圧力が加えられるために、分離は透析よりかなり速い。約1,000〜100,000のカットオフ点を有する半透膜を利用することができる。セルに保持された溶液部分(大きな分子)は保持液と呼ばれるのに対して、膜を通過した部分(小さな分子)は限外濾過液の一部をなす。限外濾過は、タンパク質溶液の濃縮、塩の除去、緩衝剤の交換、またはサイズに基づくタンパク質の分画に使用することができる。
【００９９】
b.透析
透析は、ある特定のサイズより小さな分子を通すが、それより大きな分子は通さない半透膜を用いて、溶液中の分子を分離するのに用いられる。透析チューブにタンパク質溶液が入れられる。透析チューブは密封され、ゆっくりと攪拌されている多量の水または緩衝剤の中に入れられる。低分子量の溶質はバックを通過するが、高分子量のタンパク質分子はバックに残る。透析は比較的ゆっくりとした方法であり、完了するのに12時間までかかる。従って、透析は実験室において最も頻繁に用いられる。透析は、多くの場合、タンパク質が塩析によって分離された後にタンパク質溶液から塩を除去するのに、および緩衝剤を交換するのに用いられる。
【０１００】
c.サイズ排除クロマトグラフィー
時としてゲル濾過として知られる、この技法もサイズに従ってタンパク質を分離する。架橋高分子材料(例えば、デキストランまたはアガロース)で作られた多孔性ビーズが充填されているカラムに、タンパク質溶液が注がれる。ビーズの中の孔より大きな分子は排除され、素早くカラムの中を移動するのに対して、孔の中に入る分子の移動は遅い。従って、分子は、サイズの大きい順にカラムから溶出される。様々な分子量のタンパク質を分離するために、様々な平均孔径のビーズが入手可能である。これらのビーズの製造業者は、分離に最も適している分子量範囲についての情報を提供している。未知タンパク質の分子量は、溶出体積(Vo)と、既知分子量のタンパク質を用いて求められた溶出体積を比較することによって求めることができる。溶出体積対log(分子量)のプロットは直線となるはずである。この方法の問題の1つは、分子量が、異なる形状のタンパク質のストークス半径と直接関係しないことである。
【０１０１】
3.他の方法
逆ミセル抽出(RM)法は、混合物水溶液から特定のタンパク質を連続抽出する能力をもたらし、特定のタンパク質の濃縮および精製を効率的に同時に行う。RM溶媒は、界面活性剤によって有機溶媒中で安定化されている水小滴を含有する。多くの場合、タンパク質分子は、最初の水相から、これらの小さなカプセル化された水小滴に移動するために、RM抽出は、水溶液からタンパク質を分離する魅力的なアプローチである。
【０１０２】
III.乳清タンパク質組成物の濁度の評価
本発明は、他の方法によって得られた乳清タンパク質濃縮物または単離物より、広いpH範囲にわたって水溶液中での濁度が低い〜無い、本明細書において開示された方法によって入手または調製または収集された乳清タンパク質生成物を具体化する。透明度もまた、ある特定のpHで異なることがある。本明細書に記載のイオン交換単離プロセスにおいて用いられる条件を変更することによって、タンパク質生成物の透明度特性をある程度制御することができる。透明な溶液を形成する本発明の乳清タンパク質生成物の特性は、生理活性のある非変性の乳清タンパク質を必要とする食品(例えば、飲料、ゲル、および健康食品を含む食料品)において使用するのに極めて重要である。
【０１０３】
従って、本発明は、溶液中の乳清タンパク質の濁度および/または濁りを測定または評価する方法を提供する。最も一般的に用いられる濁度単位はNTUすなわち比濁計濁度単位である。比濁計は、外観が乳と似たポリマーであるホルマジンを含有した標準を用いて較正される。比濁計は、入射光の軸に対して90度の角度で散乱光を測定する。濁りおよび濁度は、比濁計によって濁度(FTU(Formazin Turbidity Unit))として測定され、そしてまた、これらのFTUは粒子濃度と比例する。濁りは、「前方散乱光」法を利用する計器を用いて測定することができる。散乱光検出器を入射光の軸に対して90度の角度に配置するのではなく、この方法は、検出器を軸からさらに小さな角度(10〜25度)で配置する。前方散乱光の測定は、大きな粒子に対して感度が高くなるようにされている。
【０１０４】
タンパク質溶液の別の濁度測定法は、分光光度計を用いて、400〜600nmの範囲のいずれかの波長で吸光度を測定する方法である。400nm、500nm、および600nmの波長が一般的に用いられる。参照により本明細書に組み入れられる、Zhu and Damodaran (1994), Heat-induced conformational changes in whey protein isolate and its relation to foaming propertiesを参照されたい。
【０１０５】
濁度に関する基本的な情報は、ワールドワイドウェブ上のchemie.uni-lueneburg.de/wtw/turb_e.pdfで見られる「Determination of Turbidity」(参照により本明細書に組み入れられる)において述べられている。
【０１０６】
V.乳清タンパク質の特徴および使用
乳から乳清タンパク質生成物を濃縮および精製するための費用対効果の大きく大規模な技法は、乳製品産業、食品産業、薬学的産業、および栄養補助食品産業にとって有益である。さらに、本発明は、あるpH範囲にわたって可溶性の乳清タンパク質単離物を提供する。この可溶性は商業製品に特に望ましい性質である。
【０１０７】
A.栄養上の使用および機能的特性
栄養的に、乳清タンパク質は、乳製品(例えば、牛乳)の中にある高品質完全タンパク質である。高品質完全タンパク質は、必要とされる必須アミノ酸の全てを身体に提供する。乳清タンパク質はまた分枝アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、およびバリンを豊富に含む。これらのアミノ酸は筋肉の成長および修復に重要である。乳清タンパク質を構成する短鎖およびペプチドのために、乳清タンパク質は身体に吸収される(すなわち、摂取して少なくとも10分以内に、またはほぼ10分以内に吸収される)。乳清タンパク質の中には、吸収され、様々な活性を有し得るペプチド(生理活性ペプチド)に消化され得るものもある。他の乳清タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン、β-ラクトグロブリン)は、消化の間にグルタミルシステインを生じることがある。グルタミルシステインは、吸収され、いくつかの組織においてグルタチオン前駆体として働き得る。
【０１０８】
機能的には、乳清タンパク質は広いpH範囲にわたって高度に可溶性であり、乳化特性または可溶性、水結合性、増粘性または粘性、起泡性、ゲル化特性、およびフィルム形成特性を食品系および飲料系に付与する。乳清タンパク質はまた、エネルギー強化特性、筋肉増強特性、免疫系増強特性のために健康食品にも用いられる。
【０１０９】
乳清タンパク質はまた味がないので、中性pHおよび低pHの乳製品飲料ならびに乳製品食品に混合しやすい。乳清タンパク質の単離または抽出または調製に用いられるイオン交換法の結果として、本発明の乳清タンパク質配合物では、誰も開発していないように、味を隠す必要はない。
【０１１０】
乳清の2つの主な成分であるβ-LGおよびα-LBは、食品成分として使用した時に望ましい機能特性(いくつかの潜在的な応用例を挙げてみると、食品乳濁液を発泡体として安定化する能力、菓子、スープ、およびソースにタンパク質ベースのゲルを作り出す能力を含む)を有する。
【０１１１】
乳清タンパク質はまた薬学的製品の中での有用性のために価値がある。他の薬物送達法(例えば、吸入剤または皮膚パッチ送達)の代わりとなる経口製剤の作成において関心がある。このタンパク質はまた、薬物の安定性を大きくすることによって、または可溶性を高め、さらにはこれらの薬物の吸収を高めることによって、薬物開発業者がマイクロエマルジョンを作成するのを助ける。
【０１１２】
B.食品
本発明は、広いpH範囲にわたって懸濁液中で透明であり、かつ味のない、またはいやな味のない乳清タンパク質を提供する。乳清タンパク質単離物は乾燥重量ベースで90％を超えるタンパク質を含有し、脂肪、ラクトース、および無機質はごくわずかしかない。乳清タンパク質中の脂肪濃度およびラクトース濃度は低いために、乳清タンパク質は、無糖、低脂肪、または無脂肪の乳製品食品を配合するのに理想的な成分である。乳清タンパク質は、食品(例えば、プディング、ベーカリー製品、菓子、押し出し成形されたスナックおよびオートミール)ならびに飲料(例えば、ドライパウダー式飲料、そのまま飲める(ready-to-drink)飲料、人工栄養乳、経腸栄養剤)のタンパク質強化のための優れた成分である。乳清タンパク質はまた、低炭水化物、高タンパク質の甘いスナック食品を作るために、ダイズタンパク質単離物と組み合わせることができる。
【０１１３】
焼いた適用には、栄養バーまたはプロテインバー、チョコレートチップクッキー、およびピーナッツバタークッキーが含まれ得るが、これらに限定されない。乳清タンパク質はまた、バーおよび焼いた品において水に結合するように機能することができ、これによって、ある期間にわたって柔らかな口当たりが維持される。乳清タンパク質の気泡能力は、ヌガーまたはホイップされた製品のような菓子の製造において(特に、安定剤と併用した時に)役に立つ性質である。
【０１１４】
乳清タンパク質(例えば、本発明の乳清タンパク質)は、そのフィルム形成特性のために様々な用途において使用することができる。例えば、乳清タンパク質を用いてスペアミント風味のブレスフィルム(braeth film)が開発されている。乳清タンパク質は、低い〜中程度の相対湿度で、優れた酸素遮断、芳香遮断、および油遮断フィルムを作る。乳清タンパク質フィルムの機械的特性は、同種食品の簡単な吸湿防止の包装用フィルムバックまたはフィルム分離層と一緒に、酸化しやすい食品または芳香を失いやすい食品(例えば、低湿度食品)へのコーティングとして使用した時に、耐久性を十分にもたらす。乳清タンパク質はまた、貯蔵中および輸送中の新鮮な果物および野菜の呼吸低下コーティングとして、ならびに油を豊富に含む成分(例えば、ナッツ)を異種食品の他の成分から分離する油障壁フィルムまたはコーティングとして使用することもできる。乳清タンパク質はまた、砕けやすい製品(例えば、フリーズドライ食品および朝食用の加工食品)への構造強化コーティングに、ならびにチョコレートおよび他の菓子への光沢コーティングとして使用することもできる。
【０１１５】
C.乳清タンパク質の健康上の使用
乳清タンパク質は抗菌活性、抗酸化活性、免疫調節活性、および/または抗癌活性を有する可能性があることが当技術分野において示されている。乳清タンパク質は、グリコマクロペプチドならびに抗菌性ラクトペルオキシダーゼおよび抗菌性抗炎症性の免疫系増強画分ラクトフェリンなどの成分を含有する。従って、本発明は、本明細書に記載の方法によって入手、調製、または収集された乳清タンパク質を、微生物による状態もしくは疾患、炎症、または癌の治療または予防に使用することを意図するが、このようなものに限定されない。
【０１１６】
ラクトフェリンは、微生物の増殖(特に、病原性細菌の増殖)を助けるのに必須の栄養素である鉄と密接に結合することが知られている。ラクトフェリンはまた、腸壁における細菌およびウイルスの吸着および/または透過を阻害し得る。ラクトペルオキシダーゼは、活性酸素種を生成する酵素活性を介して微生物を不活化または死滅し得る。乳清タンパク質は、トリペプチドグルタチオンの前駆体である2つのアミノ酸L-システインおよびL-グルタミン酸を豊富に含んでいる。乳清タンパク質はまた、グルタミルシステインシンのジペプチド配列も豊富にある。このジペプチドもグルタチオンの前駆体である。乳清タンパク質の取り込みは単球グルタチオン濃度を上昇させることが示されている。グルタチオン濃度の上昇は、乳清タンパク質の可能性のある免疫調節的な役割、ならびにこれらのタンパク質の可能性のある抗酸化活性に寄与しているのかもしれない。
【０１１７】
乳清タンパク質は、一部の人工栄養乳では唯一のタンパク質として用いられており、乳児におけるアレルギーを少なくすることが報告されている。人工栄養乳中の乳清タンパク質は乳児におけるアトピー性疾患をかなり軽減し得る、ならびに牛乳タンパク質感受性の発生率を少なくし得る。乳清タンパク質はまた、乳児における非感染由来の湿疹および下痢を軽減するのに使用することができる。従って、本発明の乳清タンパク質は人工栄養乳の調製に使用できることが意図される。
【０１１８】
本発明の乳清タンパク質は、腫瘍量の減少、腫瘍の後退、または腫瘍成長の安定化によって、被験体における癌の治療、軽減、または予防に使用することができる。本発明において意図される癌には、悪性癌または転移性癌(例えば、結腸癌)が含まれ得るが、これに限定されない。本発明の乳清タンパク質は、抗癌剤(例えば、癌治療剤または癌治療に一般的に用いられる放射線療法剤)と併用されてもよい。
【０１１９】
乳清タンパク質は、心血管疾患の独立した危険因子である高血圧にかかっている、5000万人を超える米国成人を助けるのに重要な役割を果たしてきた。ACE阻害剤は、アンジオテンシン変換酵素(ACE)がアンジオテンシンIを、高血圧の原因となるアンジオテンシンIIに変換するのを阻止する。ある特定の加水分解プロセスは、乳清タンパク質からアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害物質を放出することが示されている。これらの生理活性ペプチドは、ACE酵素が、高血圧の原因となるプロセスを触媒しないようにし、それによって、血圧を下げることが示唆されている。従って、本発明の乳清タンパク質は、被験体における高血圧の治療、予防、または軽減に使用することができる。本発明の乳清タンパク質は他の高血圧治療剤(例えば、カルシウムチャンネルブロッカーなどの降圧剤があるが、これに限定されない)と併用することもできる。
【０１２０】
本発明の乳清タンパク質はまた、必要とされるアミノ酸を生成するために必要な基本要素を身体に提供することによって、筋肉組織の増強に使用することもできる。乳清タンパク質は、体内での最適な遂行のために正しい濃度で、全アミノ酸組成の完全な組み合わせを含むことが分かっている。重要なことに、運動と一緒に乳清タンパク質を一貫して摂取すると、筋肉を一貫して増強することができる。従って、本発明の乳清タンパク質は、他の多くの身体利益および健康利益に加えて、除脂肪体重(lean muscle mass)の増加、体脂肪の減少、および活発な活動から筋肉が回復するのに必要な燃料の筋肉への供給において役割を果たし得る。このような利益は、本発明の乳清タンパク質を含有する、錠剤、カプセル、もしくは丸剤の形で、または食品の形で、経口によって被験体に提供することができる。他の場合において、本発明の乳清タンパク質は、吸入によって、静脈内に、微粒子銃によって、哺乳動物などの被験体に供給することができるが、このような供給方法または投与方法に限定されず、当業者に公知の任意の方法によるものでよい。
【０１２１】
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を証明することを目的としている。以下の実施例に開示される技法は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者によって発見された技法であり、従って、本発明を実施するための好ましい態様を構成するとみなされることが当業者によって理解されるはずである。しかしながら、本開示を考慮すれば、開示された特定の態様において多くの変更が可能であり、それでもなお、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似した結果が得られることを、当業者は理解するはずである。
【０１２２】
実施例1
材料および方法
モッツァレッラチーズ乳清(Grande Cheese Co., Brownsville, WI)をクリーム分離器後に収集し、3μmプリーツシートカートリッジフィルターに通して濾過した。次いで、20％H2SO4溶液を用いて、乳清をpH4.0に調節した。
【０１２３】
実験のイオン交換パートを行うために、プログラム可能なオペレーティングシステム(BioProcess Engineering system, Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA)に接続された、100μmビーズポリスチレン/スルホン酸メチル置換ジビニルベンゼン陽イオン交換樹脂(Mono-S, Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA)2.38リットルが充填されたイオン交換カラム(直径10cm)(BPG 100, Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA)を使用した。このパートの間、まず最初に、0.01M乳酸ナトリウム(pH4.0)を用いて、未使用のイオン交換カラムを平衡化した。次いで、乳清から樹脂へのタンパク質の結合を促進するために、カラムに、6カラム体積(14.26L)の乳清(pH4.0)を通した。次いで、0.01M乳酸ナトリウム(pH4.0)を用いて、結合しなかった乳清構成成分をカラムからリンスした。次いで、0.01Mリン酸ナトリウム(pH11.5)(図1A、線C)または0.01Mリン酸ナトリウム、0.015M塩化ナトリウム(pH11.5)(図1B、線C)を用いた溶出によって、結合タンパク質を回収した。最後に、カラムを水でリンスした。流速は、これら全てのイオン交換工程を通じて90カラム体積(214L)/hrに維持した。イオン交換は10〜15℃で行った。カラムのリンスおよび緩衝剤の調製には脱イオン水を使用した。
【０１２４】
10kDa渦巻き状ポリサルホン膜を用いた20℃での限外濾過によって、溶出液を10〜30％全固形分まで濃縮し、次いで、並流シングルステージ乾燥機(フィード圧10,000〜15000kPa、入口温度=180〜185℃、出口温度=87〜90℃、および生成物温度=18〜20℃)において噴霧乾燥させた。
【０１２５】
粉末状生成物の総タンパク質および含水量を、それぞれ、標準的なケルダール法および重量測定法によって分析した。粉末状生成物の濁度も、異なるpHでのタンパク質変性の相対レベルの尺度として分析し、次いで、結果を、異なる方法を用いて異なる製造業者が作成したWPI粉末の濁度と比較した。異なる方法を用いて製造された噴霧乾燥乳清タンパク質単離物の試料は、タンパク質濃度が25g/Lとなるように脱イオン水に溶解した。異なるpH値：2.0、3.0、4.0、4.3、4.6、5.0、6.0、7.0、および8.0でのこれらの試料の濁度は、濁度計(Model 966, Orbeco-Hellige, Orbeco Analytical Systems, Inc., Farmingdale, NY)を用いて、比濁計濁度単位(NTU)として測定した。WPI溶液のpHを調節するために、0.1Nおよび1.0NのHClならびに0.1Nおよび1.0NのNaOHを使用した。pH調節中に標的pH値を通り越した試料は全て捨て、考慮に入れなかった。
【０１２６】
結果
噴霧乾燥したWPI試料は92.5〜93％の総タンパク質および5〜6％の水分を含有していた。濁度測定の結果を図1A〜Bに示した。図1Aおよび図1Bにおける生成物C(本発明の乳清タンパク質生成物)の濁度は、特に、約4.0〜5.5のpH範囲において、他の市販の乳清タンパク質単離物(図1のAおよびB)より小さかった。この結果は、生成物Cの乳清タンパク質は、他の試験生成物の乳清タンパク質より変性していないことを示している(Damodaran 1996)。溶出緩衝剤(0.01Mリン酸ナトリウム(pH11.5)(図1A)および0.01Mリン酸ナトリウム、0.015M塩化ナトリウム(pH11.5)(図1B))を用いて作成されたWPI生成物の性能は、濁度測定中、ほぼ同じであった。しかし、0.015M NaClが緩衝剤に存在する時に、同量のタンパク質を溶出するのに必要な緩衝剤は約15〜20％少なかった。
【０１２７】
実施例2
材料および方法
モッツァレッラチーズ乳清(Grande Cheese Co., Brownsville, WI)をクリーム分離器後に収集し、3μmプリーツシートカートリッジフィルターに通して濾過した。次いで、20％H2SO4溶液を用いて、乳清をpH4.0に調節し、1個のSタイプ陽イオン交換カラムに通した。0.01M乳酸ナトリウム(pH4.0)を用いて結合タンパク質をリンスしてラクトースおよび無機質を除き、流出液がpH9.0に達するまで、0.01Mリン酸ナトリウム、0.15M塩化ナトリウム(pH11.0)緩衝剤を用いて結合タンパク質を脱着した。この溶液を、20℃での限外濾過によって濃縮した。透明な試作飲料組成物は、タンパク質濃度およびスクロース濃度を、それぞれ、25g/Lおよび100g/Lまで調節することによって製造した。比較のために、指示したように、他の2つの商業的供給業者(BiPRO, Davisco Foods Intl., Eden Prairie, MN, U.S.A.およびB=PowerPro, Land O'Lakes Food Ingredients, Arden Hills, MN, U.S.A.)からのタンパク質単離物を用いた飲料も製造した。異なるpHで、これらの飲料の濁度を測定した(図2)。
【０１２８】
結果
本発明のタンパク質飲料溶液(図2、線C)は、広いpH範囲にわたって透明な(NTU<50)高タンパク質飲料(25g/Lのタンパク質および100g/Lのスクロースを含有する)の目標に達している。他の方法によって乳清から得られたタンパク質を用いて調製された水溶液は、この目標に達しなかった(図2、線Aおよび線B)。
【０１２９】
実施例3
材料および方法
モッツァレッラチーズ乳清(Grande Cheese Co., Brownsville, WI)をクリーム分離器後に収集し、3μmプリーツシートカートリッジフィルターに通して濾過した。次いで、20％H2SO4溶液を用いて、乳清をpH4.0に調節した。
【０１３０】
実験のイオン交換パートを行うために、プログラム可能なオペレーティングシステム(BioProcess Engineering system, Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA)に接続された、100μmビーズ状ポリスチレン/スルホン酸メチル置換ジビニルベンゼン陽イオン交換樹脂(Mono-S, Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA)2.38リットルが充填されたイオン交換カラム(直径10cm)(BPG 100, Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA)を使用した。このパートの間、まず最初に、0.01M乳酸ナトリウム(pH4.0)を用いて、未使用のイオン交換カラムを平衡化した。次いで、乳清から樹脂へのタンパク質の結合を促進するために、カラムに6カラム体積(14.26L)の乳清(pH4.0)を通した。次いで、0.01M乳酸ナトリウム(pH4.0)を用いて、結合しなかった乳清構成成分をカラムからリンスした。次いで、0.01Mリン酸ナトリウム(pH11.5)または0.01Mリン酸ナトリウム、0.015M塩化ナトリウム(pH11.5)を用いた溶出(図1)によって、結合タンパク質を回収した。最後に、カラムを水でリンスした。流速は、これら全てのイオン交換工程を通じて90カラム体積(214L)/hrに維持した。イオン交換は10〜15℃で行った。カラムのリンスおよび緩衝剤の調製には脱イオン水を使用した。
【０１３１】
10kDa渦巻き状ポリサルホン膜を用いた20℃での限外濾過によって、溶出液を10〜12％全固形分まで濃縮し、次いで、並流シングルステージ乾燥機(フィード圧10,000〜15000kPa、入口温度=180〜185℃、出口温度=87〜90℃、および生成物温度=18〜20℃)において噴霧乾燥させた。
【０１３２】
粉末状生成物の総タンパク質および含水量を、それぞれ、標準的なケルダール法および重量測定法によって分析した。粉末状生成物の濁度も、異なるpHでのタンパク質変性の相対レベルの尺度として分析し、次いで、結果を、異なる方法を用いて異なる製造業者が作成したWPI粉末の濁度と比較した(表1に列挙した)。異なる方法を用いて製造された噴霧乾燥乳清タンパク質単離物の試料は、タンパク質濃度が25g/Lとなるように脱イオン水に溶解した。異なるpH値：2.0、3.0、4.0、4.3、4.6、5.0、6.0、7.0、および8.0でのこれらの試料の濁度は、濁度計(Model 966, Orbeco-Hellige, Orbeco Analytical Systems, Inc., Farmingdale, NY)を用いて、比濁計濁度単位(NTU)として測定した。WPI溶液のpHを調節するために、0.1Nおよび1.0NのHClならびに0.1Nおよび1.0NのNaOHを使用した。pH調節中に標的pH値を通り越した試料は全て捨て、考慮に入れなかった。
【０１３３】
結果
溶出緩衝剤(0.01Mリン酸ナトリウム(pH11.5)および0.01Mリン酸ナトリウム、0.015M塩化ナトリウム(pH11.5))を用いて作成されたWPI生成物の性能(図3)は、濁度測定中、ほぼ同じであった。しかし、0.015M NaClが緩衝剤に存在する時に、同量のタンパク質を溶出するのに必要な緩衝剤は約15〜20％少なかった。
【０１３４】
図3に示した乳清タンパク質単離物の濁度は両方とも、他の市販の乳清タンパク質単離物(表1、ならびに図4および図5)より小さく、低い濁度は、他の市販の製品よりかなり広いpH値範囲にわたって維持された。これらの違いは、約4.0〜5.5のpH範囲において特にはっきりとしていた。この結果は、本発明の組成物の乳清タンパク質が他の試験生成物の乳清タンパク質より変性していないことを示している(Damodaran 1996)。
【０１３５】
【表１】
2007535940.tif 000002
【０１３６】
実施例4
モッツァレッラチーズ乳清(Grande Cheese Co., Brownsville, WI, U.S.A)を、1M H2SO4を用いてpH4.0に調節し、3μm孔径フィルター(Sartopure PP2 Capsule, Sartorius Corp., Edgewood, NY, U.S.A.)を用いて濾過した後に、クロマトグラフィーカラムに適用した。IndEX 200クロマトグラフィーカラム(20cm直径、Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, U.S.A.)にSP Sepharose Big Beads陽イオン交換体(Amersham Biosciences)を充填した。カラムのベット高(bed height)は、5.34Lの陽イオン交換体を保持するために17cmであった。流速は2.5L/minであった。全ての緩衝剤を22±2℃でカラムに適用した。乳清は4℃で適用した。
【０１３７】
カラムは20Lの50mM乳酸ナトリウム(pH4.0)で平衡化した。乳清タンパク質を捕らえるために、乳清(30L)をカラムにポンプで送った。10mM乳酸ナトリウム(pH4.0)を用いて、結合しなかったタンパク質をカラムからリンスした。流出液がpH9.0に達するまで、45Lの10mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム(pH11.0)を用いて、結合タンパク質をカラムから溶出した。プールされた溶出液は望ましい生成物であり、pH6.45であった。
【０１３８】
3kDA膜を用いた限外濾過によって、プールされた溶出液を6％全固形分まで濃縮し、25g/Lタンパク質、100g/Lスクロースを含有し、pH値が異なるモデル飲料溶液を配合するのに使用した。濁度は、濁度計(Model 966, Orbeco Analytical Systems, Farmingdale, NY, U.S.A.)を用いて、比濁計濁度単位(NTU)で測定した(図6)。全ての溶液は、全てのpH値で視覚的に透明であった(NTU<50)。低い濁度は、本発明の方法を用いて製造されたタンパク質への損傷が無いことを示している。
【０１３９】
実施例5
高pHへの曝露を阻止することによってタンパクへの損傷を防ぐ提案された方法の有用性が調べられた。商業的製造プロセスにおいて生じる高pH曝露をシミュレートするために、実施例4からの溶出液を、10分間または60分間、高pHに調節した。この溶液は、25g/Lのタンパク質および100g/Lのスクロースを含有していた。高pHへの曝露後、溶液を、濁度が最も高くなるpH4.6に調節し、濁度を測定した。このpH4.6での測定は、最も感度の高いタンパク質損傷試験であることが見出された。
【０１４０】
高pHへの曝露後に、濁度は劇的に増大した(図7)。濁度は、pH11.0への10分間の曝露後に360倍、pH11.0への60分間の曝露後に430倍増大した。この比較は、高pHへの曝露の無い、pH4.6での濁度34±3NTU(対照試料)に対して行った。逆に、低pHへの曝露によって濁度は有意に増大しなかった。pH7.0への10分間の曝露後の濁度は35±2NTUであった。
【０１４１】
pH9.0への10分間の曝露によって、濁度は1.3倍しか増大しなかった。しかしながら、プールされた溶出液はpH6.45であり、溶出液がpH11.0であっても高pHに曝露されなかったことに留意されたい。これは溶出液が支持体の中を流れるためである。溶出液が支持体の中を流れると、タンパク質の緩衝作用のために、支持体に吸着されているタンパク質と溶出液が接触するとすぐに、pHは低下する。このために、タンパク質を高pH曝露の損傷に曝露することなく、溶出のために高pHを使用することができる。
【０１４２】
本明細書において開示および主張される組成物および方法は全て、本開示を考慮すれば過度の実験なく製造および実施することができる。本発明の組成物および方法は好ましい態様の点から説明されたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および方法ならびに方法の工程または工程の順序に変更を加えることができることは当業者に明らかであろう。より具体的には、本明細書に記載の薬剤の代わりに、化学的および生理学的に関連しているある特定の薬剤を使用することができ、同時に、同じ結果または類似する結果が得られることは明らかであろう。当業者に明らかな、このような全ての類似の代用および修正は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内と考えられる。
【０１４３】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載のものを補足する例示的な手順の詳細または他の詳細を示す程度まで、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
2007535940.tif 000003
2007535940.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
図面の簡単な説明
以下の図面は本明細書の一部をなし、本発明のある特定の局面をさらに証明するために含まれる。これらの図面の1つまたは複数を、本明細書において示された特定の態様の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、本発明をさらに深く理解することができる。
【図１】25g/L乳清タンパク質を含有する乳清タンパク質単離物溶液の比濁計濁度単位(NTU)対pHを示す。市販の試料(A=ALACEN乳清タンパク質単離物, NZMP, Lemoyne, PA, USA、B=BiPRO, Davisco Foods Intl., Eden Prairie, MN, U.S.A.)を、前記のプロセスを用いて製造した本発明の生成物を用いて作成した試料(C=Grande Cheese Co., Brownsville, WI)と比較した。図1A。0.01Mリン酸ナトリウム(pH11.5)を用いた溶出後の濁度特性を示したグラフである。図1B。0.01Mリン酸ナトリウムおよび0.015塩化ナトリウム(pH11.5)を用いた溶出後の濁度特性を示したグラフである。
【図２】25g/L乳清タンパク質および100g/Lスクロースを含有する試作飲料の比濁計濁度単位(NTU)対pHを示す。市販の試料(A= BiPRO, Davisco Foods Intl., Eden Prairie, MN, U.S.A.およびB = PowerPro, Land O'Lakes Food Ingredients, Arden Hills, MN, U.S.A.)を、提案されたプロセスを用いてウィスコンシン大学(Madison)で作成した試料(C=Wisconsin)と比較した。影付きの領域は、米食品医薬品局によって規定された酸性食品のpH範囲をカバーしている。
【図３】モッツァレッラチーズ乳清からタンパク質を単離し、本明細書に記載のようにイオン交換クロマトグラフィーによって分離した。指示したように0.01Mリン酸ナトリウム(pH：11.5)または0.01Mリン酸ナトリウム、0.015M NaCl(pH：11.5)のいずれかを用いて、試料を溶出した。溶出後、タンパク質溶液を噴霧乾燥させ、濁度分析のために25g/Lのタンパク質濃度まで平衡化した。グラフは、指示した溶出緩衝剤を用いて単離した乳清タンパク質単離物溶液の比濁計濁度単位(NTU)対pHをプロットしている。
【図４】NZMP 8890, NZMP, Lemoyne, PA, USA(図4A)、NZMP 89400, NZMP, Lemoyne, PA(図4B)、ALACEN 895, NZMP Lemoyne, PA, USA,(図4C)、BiPRO, Davisco Foods Intl., Eden Prairie, MN, U.S.A(図4D)からの乳清タンパク質単離物の比較を示す。全試料を25gタンパク質/Lまで平衡化した。グラフは、乳清タンパク質単離物溶液の比濁計濁度単位(NTU)対pHをプロットしている。
【図５】Europrotein WPI 90, Euro Proteins, Wapakoneta, OH, USA(図5A)、EuroProtArmor, Euro Proteins, Wapakoneta, OH, USA(図5B)、Provon 190, Glanbia Nutritionals, Monroe, WI, USA(図5C)、Provon 190 HS, Glanbia Nutritionals, Monroe, WI, USA(図5D)、Thermax 690, Glanbia Nutritionals, Monroe, WI, USA(図5E)、およびProteient WPI, Protient, St. Paul, MN, USA(図5F)からの乳清タンパク質単離物の比較を示す。全試料を25gタンパク質/Lまで平衡化した。グラフは、乳清タンパク質単離物溶液の比濁計濁度単位(NTU)対pHをプロットしている。
【図６】25g/L乳清タンパク質および100g/Lスクロースを含有する試作飲料の比濁計濁度単位(NTU)対pHを示す。透明な試作飲料を製造するために本発明の乳清タンパク質単離物を使用し、pH3〜7の範囲にわたって飲料の濁度を求めた。エラーバーは平均からの標準偏差を示している。
【図７】本発明の乳清タンパク質単離物(25g/L)および100g/Lスクロースを含有する溶液を、図に示したように10分間または60分間、高pHに曝露した。次いで、溶液をpH4.6に調節し、濁度(NTU)を測定した。データは、pH4.6での濁度(y軸)対曝露pH(x軸)としてプロットした。各データ点でのエラーバーは平均からの標準偏差を示している。
【図１】
2007535940.tif 000005
【図２】
2007535940.tif 000006
【図３】
2007535940.tif 000007
【図４Ａ】
2007535940.tif 000008
【図４Ｂ】
2007535940.tif 000009
【図４Ｃ】
2007535940.tif 000010
【図４Ｄ】
2007535940.tif 000011
【図５Ａ】
2007535940.tif 000012
【図５Ｂ】
2007535940.tif 000013
【図５Ｃ】
2007535940.tif 000014
【図５Ｄ】
2007535940.tif 000015
【図５Ｅ】
2007535940.tif 000016
【図５Ｆ】
2007535940.tif 000017
【図６】
2007535940.tif 000018
【図７】
2007535940.tif 000019
【国際調査報告】
2007535940.tif 000020
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