(57)【要約】  本発明は、ラット骨髄腫細胞株、特にYB2/0 において産生された抗Rhesus D IgG3 クラスのモノクローナル抗体に関する。この抗体は、強力な食作用活性を有し、がん及び感染症の治療のために投与しうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラット骨髄腫細胞株、特にYB2/0  (ATCC No. CRL 1662)またはYB2/0 の誘導もしくは改変株で産生されたキメラ、ヒト化またはヒトのIgG3クラスモノクローナル抗体の、各種がん疾患および感染症の治療用医薬の製造のための使用。
【請求項２】
CHO において発現されるIgG1またはIgG3での治療に弱い応答性の患者に関することを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項３】
診断の遅れた患者において使用することを特徴とする請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
前記がん疾患が、神経外胚葉腫瘍、結腸直腸がん、黒色腫、乳がん、白血病、特にHCL(ヘアリーセル白血病) 、リンパ種 (例、DLBCL 、一次びまん性ラージＢ細胞リンパ腫) 、急性白血病、骨肉腫からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜３のいずれかの項記載の使用。
【請求項５】
前記がん疾患がウイルスまたは細菌感染に関連することを特徴とする請求項１〜４のいずれかの項記載の使用。
【請求項６】
ウイルスまたは細菌源による感染が、前立腺がん、白血病およびカポジ肉腫からなる群より選択されることを特徴とする請求項５記載の使用。
【請求項７】
前記感染症が、ジフテリア、ウイルス性出血熱、腸チフス熱、インフルエンザ、Ｂ型およびＣ型肝炎、RSV による呼吸器感染症、HIV およびCMV による感染症、レジオネラ症、リーシュマニア症、らい病、狂犬病、エイズ、または結核からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかの項記載の使用。
【請求項８】
前記抗体の食作用を誘導する能力についての、請求項１〜７のいずれかの項記載の使用。
【請求項９】
前記医薬をIgG1と併用することを特徴とする請求項１〜８のいずれかの項記載の使用。
【請求項１０】
前記抗体の、IgG1により誘発されるサイトカイン、特にγIFN 、αTNF および／またはIL6 の放出を負に調節する能力についての、請求項１〜９のいずれかの項記載の使用。
【請求項１１】
「サイトカイン放出症候群」の患者におけるがん疾患の治療のための医薬の製造についての、請求項９または10記載の使用。
【請求項１２】
「サイトカイン放出症候群」による低体温症、急性腎臓壊死および肝臓疾患に罹患した患者の治療のための医薬の製造についての、請求項11記載の使用。
【請求項１３】
前記「サイトカイン放出症候群」が、抗-CD30 モノクローナル抗体の投与により生じることを特徴とする、請求項11または12記載の使用。
【請求項１４】
前記IgG3クラス抗体が、リツキシマブTM (IDEC-C2B8)により治療された患者における「サイトカイン放出症候群」の発生を防止するための抗-CD20 であることを特徴とする、請求項11または12記載の使用。
【請求項１５】
CAMPATH TMまたはOKT3抗体の望ましくない作用を防止するための請求項11または12記載の使用。
【請求項１６】
ラット骨髄腫細胞株、特にYB2/0 において産生されたIgG3を、IgG1を含有する生物系に添加することを特徴とする、IgG1により誘発されるサイトカインの放出を調節する方法。
【請求項１７】
前記IgG1が、ラット骨髄腫細胞株、特にYB2/0 において産生されることを特徴とする請求項16記載の方法。
【請求項１８】
IgG1、IgG3および少なくとも１種の賦形剤を含む治療用抗体の薬剤組成物。
【請求項１９】
前記IgG の少なくとも１種が、ラット骨髄腫細胞株、特にYB2/0 において産生されることを特徴とする請求項18記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラット骨髄腫細胞株、特にYB2/0 （ATCC No.CRL 1662）またはYB2/0 由来株または改変株において産生されたキメラ、ヒト化またはヒトのクラスIgG3モノクローナル抗体の、各種がんおよび感染症の治療用医薬の製造のための使用に関する。これらの抗体は強力な食作用活性を有し、がん及び感染症の治療のために投与しうる。
【背景技術】
【０００２】
現在、市販されているか、臨床試験が行われている治療用モノクローナル抗体の大多数はIgG １クラスに属する。しかし、IgG1とは別のサブクラスの抗体もある病状の治療には有利であろう。
【０００３】
特にIgG3は特定のエフェクター活性を有し、確かにin vivo で重要な役割を果たしている。それらはヒト血漿中のＩｇＧの７％を示すにすぎないが、その割合はある免疫応答中、例えばあるウイルス感染の後に増加する（IgG サブクラスの基本的および臨床的側面、巻編集者、F.Shakib,Basel, ニューヨーク,Karger, 1986 (Monographs in Allergy; Vol. 19, pp.122-133)、寄生虫感染 (J.Infect.Dis. 2003.3.1,187(5), 862-5, 2003, 「熱帯熱マラリア原虫グリコシルホスファチジルイノシトールに対する免疫グロブリンＧ (ＩｇＧ) 応答は短命であり主にIgG3サブクラスによる」Boutlis CS, Fagan PK, Gowda DC, Lagog M, Mgone CS, Bockarie MJ, Anstey NM)、またはRh(D) 抗原に対する追随免疫 (Iyer YS, Kurkarni SV, Gupte SC, 「母体抗-D血清におけるＩｇＧサブタイプの分布および新生児のRh溶血性疾患におけるその予想価値」 Acta Haematol. 1992,88(2-3), 78-81)。
【０００４】
IgG3の治療用途は今日まで非常に限られてきた。それらは特に新生児の溶血性疾患の予防的処置において使用される。というのは第１に、現在使用されているポリクローナル抗-D抗体は約20〜30％のIgG3からなり、第２に、IgG3抗-Dモノクローナル抗体を用いた臨床研究は既に行われ、Rh陽性赤血球のクリアランスに関して有望な結果がでているためである (Clin.Exp.Immunol. 2003,4月, 132(1), 81-6「モノクローナル抗体IgG3抗-Dによるin vivo での赤血球のクリアランスはFcγRIIIa (CD16)のVF多型により影響される」Kumpel BN, De Haas M, Koene HR, Van De Winkel JG, Goodrick MJ.) 。
【０００５】
母体の免疫の欠如に至る抗-Dポリクローナル抗体の作用機構は知られていないが、抗-DIgG1およびIgG3の対応する役割を実証するため多数の研究が試みられた。例えば、単球、T CD8 リンパ球、Ｂリンパ球およびNK細胞などのエフェクター細胞と、Rh陽性Ｄ赤血球との間のロゼット形成は、抗-D IgG3 を用いた方が IgG1 よりも速く、より重要である。これらの違いは、IgG1よりもIgG3のヒンジ領域がより長いことにより説明できる。この構造は、負に帯電した赤血球とエフェクター細胞との間の架橋の形成を容易にするであろう (Vox. Sang. 1989, 56(2), 101-3 「食作用分析におけるIgG1およびIgG3で感作された赤血球と単球との相互作用の速度」、Brojer E., Merry AH., Zupanska B, Immunology, 1992年６月, 76(3), 446-51 「ヒトリンパ球のサブセット上のFcγRII およびFcγRIIIの機能活性」Hadley AG, Zupanska B, Kumpel BM, Leader KA)。
【０００６】
IgG1とIgG3の２つのＩｇＧサブクラスは同じＦｃ受容体を認識し活性化することを示唆するこれらのIgG 間の競合の存在は別の研究において言及されている (Immunololgy, 1989 年４月,66(4), 491-8 「ＦｃγＲ媒介機能におけるIgG1およびIgG3アイソタイプの異なる役割」Rozsnyay Z. Sarmay G, Walker M, Maslanka K, Valasek Z, Jefferis R, Gergely J) 。
【０００７】
プラスモジウム・ファルシパルム (Plasmodium falciparum)などの寄生虫感染の間および細菌感染の間に、IgG3型応答が観察され、これはタンパク質抗原に対するIgG1産生に関連する。同様に、細菌源との抗−多糖応答 (抗-LPS) の場合は、主なサブクラスがIgG2からなる場合でさえ、強いIgG1型応答およびより限定されたIgG3応答がみられる。
【０００８】
がん疾患については、実験的にサイトカインと併用、または併用せずにIgG3を用いた抗腫瘍治療を用いても患者においてIgG3が産生するとのデータはない (Kemminer SE, Conradt HS,Nimtz M, Sagi D, Peter-Katalinic J, Diekmann O, Drmic I, Muthing J Biotechnol Prog. 2001年９−10月, 17(5), 809-21 「臨床第Ｉ相抗−黒色腫マウスIgG3モノクローナル抗体Ｒ24の製造および分子的特性決定）（Peng LS, Penichet ML, Dela Cruz JS, Sampogna SL, Morrison SL, J Interferon Cyotkine Res. 2001 年９月, 21(9),709-20「単鎖インタロイキン-12 IgG3抗体融合タンパク質 (mscIL-12.her2.IgG3) の抗腫瘍活性の機構」) 。
【０００９】
産生IgG1に改善された機能特性を与えるその能力のために、YB2/0 株が数年来選択されている。我々は、FcγRIII (CD16) 受容体を介した強いＡＤＣＣ活性を有する抗体を産生しうる細胞株を選択する重要性を実証した。また、我々は、YB2/0 などのラット骨髄腫株において産生される抗体の一定部分のグリコシル化に修飾を加えるとさらにＡＤＣＣ活性を改善することも見出した。
【００１０】
前記抗体のグリカン構造は、短鎖、低シアリル化および低フコシル化を特徴とするバイアンテナ (biantenna)型である。
我々はまた、CD16との強い相互作用が存在するという事実は、それがまたサイトカイン類の産生、特にIFN γおよび／もしくはその他のサイトカインまたはケモカインの産生を誘導するという利点を有することを見出した。
【００１１】
上記２つの特性は相補的である。選択された抗体により誘導されるエフェクター細胞によるIFN γもしくはその他のサイトカインおよび／またはケモカインの産生は、処置される患者においてＡＤＣＣ以外の免疫系のエフェクター機構を刺激することにより治療効果を増強しうる。かかる刺激のための作用機構はおそらくエフェクター細胞の正の自己分泌制御による。CD16に結合する抗体が細胞傷害活性およびIFN γもしくはその他のサイトカイン／ケモカインの産生を誘導し、最終的にサイトカイン活性をさらに向上させると仮定できる。
【００１２】
本発明の範囲において、ラット骨髄腫の株、特にYB2/0 が、IgG1の場合と同様に、産生された抗体に改善された機能特性を付与しうるかどうかを決定するために、この株において抗-D IgG3 を発現させた。
【００１３】
我々の結果は、こうして産生されたIgG3はIgG1の能力に匹敵するCD16への結合能を有することを示す。それにもかかわらず、CD16への結合のこの増加は、サイトカインの放出に関連せず、IgG1においてみられるよりも弱いＡＤＣＣの可能性を生じるだけである。しかし、ある「in vitro」条件、即ち固定された赤血球の存在下および抗体の高濃度でのみ、YB2/0 で産生したIgG3はサイトカインの放出を誘導しうるようである。他方、まったく意外にも、我々は食作用が増加することを観察した。
【発明の開示】
【００１４】
従って、第１の面によれば、本発明は、ラット骨髄腫の細胞株において産生されることを特徴とするキメラ、ヒト化またはヒトのIgG3クラスのモノクローナル抗体に関する。好ましくは、このIgG3は、YB2/0 株 (ATCC No. CRL 1662)またはYB2/0 株から誘導もしくは改変された株において産生される。
【００１５】
かかる抗体において、Fc領域のグリカン構造は、短鎖を有する、低シアリル化および低フコシル化のバイアンテナ型に相当する。
さらに、中間体のGlcNacの含量はゼロではない。
【００１６】
かかる抗体は特に以下の形態の中から選ばれる：
【００１７】
【化１】
2007533639.tif 000002
【００１８】
従って、本発明は、フコース含量が65％、60％、50％、40％または35％より低いIgG3クラスのモノクローナル抗体に関する。好ましくは、フコース含量は20％〜45％、より好ましくは25％〜40％である。例えば、フコース含量は35％より低い。
【００１９】
本発明はまた、同等の生物学的システム、特に遺伝的に改変もしくは形質転換された植物もしくは非ヒト動物細胞において、例えば、YB2/0 で得られるグリコシル化プロフィールに本質的に類似したプロフィールをもつ抗体を得るように１もしくは複数のグリコシルトランスフェラーゼを発現する配列の導入により産生される、上記グリコシル化プロフィールを有するIgG3クラスの抗体に関する。
【００２０】
YB2/0 株において産生されるIgG3はCHO などの株では生じない、例えば以下のような特定の機能特性を有する：
a)同じ細胞株で産生されたIgG １の結合力に匹敵する強いCD16への結合力、
b)IgG １により誘発されるサイトカインの放出の阻害を誘導しうる能力
c) YB2/0で産生されるIgG3の、CHO において産生されるIgG3よりも大きい、γIFN 、IL6 、αTNF の放出を誘発しうる能力、およびYB2/0 IgG3の、YB2/0 IgG1よりも小さいαTNF およびγIFN を放出する能力、
d)食作用の可能性。
【００２１】
本発明のIgG3クラス抗体は、例えば、CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11, CD18, CD19, CD20, CD25, CD45およびCD52 (例、Campath-1H TM ),  D30, CD33, CD38 またはCD44に対する抗体の中から選択しうる。
【００２２】
抗Ep-CAM、抗HER2、抗HER1、抗GD3 、抗CA125 、抗GD、抗GD2 、抗CD-23 および抗プロティンＣ、抗KIR3DL2 、抗EGFR、例えば凝固因子に対する阻害剤に特異的な抗イディオタイプ、HIV 、HBV 、HCV およびRSV 抗ウイルス剤の中からその他の抗体を選択することもできる。
【００２３】
本発明の第２の面は、細胞株、好ましくはラット骨髄腫YB2/0 株 (ATCC No. CRL 1662)またはYB2/0 の誘導もしくは改変株の、IgG3クラス抗体の重鎖および軽鎖のコード配列を含む１または複数のベクターでのトランスフェクション、トランスフェクトされた細胞株でのこの抗体の発現、抗体の抽出および精製を含む、上記機能特性を有するキメラ、ヒト化またはヒトIgG3クラスモノクローナル抗体の製造のための方法に関する。
【００２４】
好ましくは、２つの発現ベクター (例えば、RSV 由来のベクター) を有する系を使用し、１つは重鎖のコーディングベクターであり、他方は軽鎖のコーディングベクターである。有利には、各ベクターに異なる選択マーカーが存在する。具体的構造を図１に示す。本発明はまた、重鎖と軽鎖が等モル量で産生される、上記の系にも関する。
【００２５】
発現ベクターの作製は当業者に既知の操作を使用すればよい (「分子クローニング：実験マニュアル」第二版、Maniatis等, Cold Spring Harbor) 。
ラット骨髄腫株において２つのベクターを等モル量用い、リン酸カルシウムによる沈殿やリポフェクションなどの標準的操作を用いてコトランスフェクトすることができる。次いで、トランスフェクトされた株を適宜培地中で選択する。
【００２６】
その他の方法、特に抗体中のすべての鎖のための単一のコーディングベクターを使用できることは明らかである。
第３の面において、本発明は、機能性IgG3の発現を可能にする１または複数のベクターによりトランスフェクトされたラット骨髄腫の細胞株、特にYB2/0 および誘導株に関する。本発明はまた、上記１または複数のベクターによりトランスフェクトされた細胞にも関する。これらの細胞は、上述のグリコシル化プロフィールおよび上記a)からd)の特性の少なくとも１つを有するIgG3を産生することを特徴とする。
【００２７】
第４の面によれば、本発明は、上記IgG3、特にYB2/0 で発現されたIgG3の、医薬の製造のための使用に関する。
より具体的には、本発明は、ラット骨髄腫細胞株、特にYB2/0 株 (ATCC No. CRL 1662)またはYB2/0 の誘導もしくは改変株で産生されたキメラ、ヒト化またはヒトIgG3クラスモノクローナル抗体の、各種がん疾患またはウイルス、細菌もしくは感染性寄生虫感染による各種感染症の治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００２８】
本発明の別の面において、これらの抗体は胎児母体アロ免疫 (foetal mternal alloimmunization)の予防のための医薬の製造に使用できる。
好ましくは、対象患者は、CHO において発現されるIgG １またはIgG3での治療には弱い応答性の患者である。
【００２９】
「弱い応答性の患者」とは、病変の減少が50％より少なく、増加が25％より少なく、新規な病変のないいわゆる安定状態にある治療された患者を意味する。この患者群はまた、応答が観察されない患者 (死亡に至ることがある病気の進行) も含む。感染症に関しては、これらの患者は、慣用の治療ではウイルスまたは細菌の負荷の減少が50％より少ない患者である。
【００３０】
有利には、診断の遅れた患者において本抗体を使用できる。
本発明の抗体を用いて特に有利に治療できるがん疾患は、神経外胚葉腫瘍、結腸直腸がん、黒色腫、乳がん、白血病、特にHCL(ヘアリーセル白血病) 、リンパ種 (例、DLBCL 、一次びまん性ラージＢ細胞リンパ腫) 、急性白血病、骨肉腫、がん、特に肺がんを含む群の中から選ばれるが、これらに限らない。
【００３１】
本発明のある特定の面において、本発明により治療されるがん疾患は、前立腺がん、白血病およびカポジ肉腫などのウイルスまたは細菌感染に関連する(Lightfoot N, Conlon M, Kreiger N, Sass-Kortsak A, Purdham J, Darlington G. 「医学史、性的および成熟因子と前立腺がんリスク」Ann Epidemiol, 2004 年10月、14(9), 655-662；Huycke MM, Gaskins HR.「共生細菌、レドックスストレス、および結腸直腸がん：機構およびモデル」 Exp Biol Med (Marywood) , 2004 年７月, 229(7), 586-97) 、。がんに関連する感染症に見出される感染因子は、カンジダ属、アクロモバクター属、もしくはアルカリゲネス属 (Aisenberg G, Rolston KV, Safdar A.「がん患者46人においてアクロモバクターおよびアルカリゲネス・スピーシーズにより生じる菌血症 (1989-2003)」Cancer 2004 年９月23日； Boktour MR, Kontoyiannis DP, Hanna HA, Hachem RY, Girgawy E, Bodey GP, Raad II 「がん患者における多数種カンジダ敗血症」Cancer, 2004年８月31日) 、またはエプスタイン−バールウイルスでありうる。
【００３２】
本発明の抗体により有利に治療できる感染症には、ジフテリア、ウイルス性出血熱、腸チフス熱、インフルエンザ、Ｂ型およびＣ型肝炎、RSV による呼吸器感染症、HIV およびCMV による感染症、レジオネラ症、リーシュマニア症、らい病、狂犬病、エイズ、または結核があるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明のIgG3は、低親和性受容体Ｆｃ (CD16) への強い結合力、および／または食作用を誘導するその能力によりこれらの用途に有利である。
本発明のある特定の面において、本発明の医薬はIgG1と併用されるであろう。上に記載した本発明のIgG3の使用は、IgG1により誘発されるサイトカイン、特にγIFN 、αTNF および／またはIL6 の放出を負に調節するこれらのIgG3の能力のために本発明のこの面において特に有利である。
【００３４】
従って、本発明のある特定の面において、上記したようなIgG3は、「サイトカイン放出症候群」の患者、特にYB2/0 で産生されたIgG1により治療された患者においてがん疾患の治療のための医薬の製造に使用される。この適用は、サイトカインの放出を負に調節する前記IgG3の能力を使用するものである。例えば、抗-CD3モノクローナル抗体、例えば145-2C11の投与により生じる「サイトカイン放出症候群」による低体温症、急性腎臓壊死および肝臓疾患の発生 (Alegre ML 等, Immuno. 1991年２月15日, 146(4),1184-91；Chatenoud L.「抗-CD3抗体：臨床的抗原特異的免疫修飾に対する」Curr Opin Pharmacol. 2004 年８月, 4(4), 403-7 ；Yamada-Ohnishi Y, Azuma H, Urushibara N, Yamaguchi M, Fujihara M, Kobara T, Ikeda H.「抗-CD28 モノクローナル抗体の存在下および不在下での抗-CD3モノクローナル抗体で拡張したＴ細胞の細胞傷害性の差」Stem Cells Dev. 2004年６月, 13(3), 315-22)。
【００３５】
あるいは、本発明は、リツキシマブTM (IDEC-C2B8)により治療された患者における「サイトカイン放出症候群」の発生を防止するための抗-CD20 であってもよい、上記IgG3の使用を目的とする (Winkler U 等「Ｂ細胞慢性リンパ性白血病の患者におけるサイトカイン放出症候群および抗-CD20 モノクローナル抗体による治療後の高いリンパ球数」Blood 1999年10月, 94(7), 2217-24) 。
【００３６】
あるいは、本発明のIgG3はCAMPATH TMまたはOKT3抗体の望ましくない作用を防止するのに有用である。
リンパ球および単球上のCD52に結合するCAMPATH 1-H の投与は、「サイトカイン放出症候群」に至るTNF, IFN, IL-6の放出を誘発する (Mark G.Wing 等「CAMPATH 1-H による一次用量サイトカイン放出症候群：NK細胞上のCD16(FcRIII)およびCD11a/CD18(LFA-1) の関与」 J.Clin.Invest, Vol.98, No.12, 1996 年12月,2819-2826) 。同様に、CD3 に結合するOKT3もまたサイトカイン放出症候群を誘発するとして報告されている (First MR, Schroeder TJ, Hariharan S.「OKT3- 誘発サイトカイン放出症候群：腎臓の影響 (サイトカイン腎障害) 」Transplant Proc. 1993 年４月, 25 (Supple 1) ：25-6) 。
【００３７】
本発明の別の目的は、ラット骨髄腫細胞株、特にYB2/0 において産生されたIgG3をIgG1を含有する生物系に添加することでIgG1により誘発されるサイトカインの放出を調節する方法を提供することである。
【００３８】
IgG1とIgG3との組み合わせは、細胞傷害能力にあまり影響することなくIgG1による二次的作用を減少させ、かつ食作用を介して治療効果を増強しうるため重要な治療上の利点を有する。
【００３９】
本発明のある特定の面において、サイトカインの放出が調節されるIgG1は、ラット骨髄腫細胞株、特にYB2/0 において産生される。
最後の面において、本発明の目的は、IgG1、IgG3および少なくとも１種の賦形剤を含む治療用抗体の薬剤組成物である。
【００４０】
有利には、これらのIgG の少なくとも１種 (IgG1またはIgG3) は、ラット骨髄腫細胞株、特にYB2/0 において産生される。
【実施例１】
【００４１】
各種IgG3クラス抗-D抗体の獲得
図１は２種類の組換え抗体を製造するための発現ベクターの構造を示す。これらの発現ベクターの作製後、抗-D特異性を有するD29 IgG3を産生する形質転換体をYB2/0 およびCHO 株において得た。
【００４２】
こうして産生された各種抗体を図２に図式で示す。
−抗体１：YB2/0 株におけるD29 IgG3：D29-YB2/0 株
−抗体２：CHO  (組換えタンパク質の工業的製造のための参照株) において発現したIgG3：D29-CHO 株
−抗体３： P3x229 と融合したＢリンパ球により産生したD29 IgG3：D29-P3X229
【実施例２】
【００４３】
実施例１の３種類の抗体のJurkat CD16 細胞 (CFC)への結合の検討
この試験は、抗-D抗体の、Jurkat CD16 細胞上に発現したCD16受容体 (FcγRIIIa)への結合能力を評価するために組み立てた。
【００４４】
第１の工程は、抗-D抗体を、丸底の96ウェルプレートに予め被覆されたRh陽性赤血球の膜表面に発現したRh抗原と反応させることからなる (Fab による結合) 。この結合は、アルカリホスファターゼで標識したヒト抗-IgG抗体により同時に検出される。
【００４５】
第２の工程 (抗体をその抗原に結合させた後) は、抗体のＦｃ部分と相互作用しうるであろうJurkat CD16 細胞を添加することからなる。遠心分離の後、抗体に結合したJurkat CD16 細胞に対応するスコア (１〜３の結合指数) を視覚によって評価する。
【００４６】
図３はこの結果を示す。
結果より、YB2/0 細胞株におけるIgG3の発現はそのＦｃを介してそれ自身をCD16に結合する能力を高めるが、CHO 株において発現した、または融合Ｂリンパ球により発現した(D29-P3x229)同じ配列では結合が少ないことが結論付けられる。
【００４７】
さらに、YB2/0 株におけるIgG3の発現は、同じ細胞で発現したIgG1 (YB2/0 で発現したR297) の能力、および抗-Dポリクローナル抗体から精製したIgG3の能力に匹敵する、CD16へのそれ自身を結合させる能力を与える。
【実施例３】
【００４８】
フラックスサイトメトリーによる、実施例１の３種類の抗体のJurkat CD16 細胞への結合の競合による測定
抗体の各種希釈物をJurkat CD16 細胞およびPE標識3G8 抗-CD16 抗体の存在下で温置する。CD16により評価すべき抗体の反応性は、CD16 Fc 受容体へのＩｇＧ結合部位を認識するPE標識3G8 抗体の結合に反比例する。従って、評価すべき非標識抗体のCD16への結合は、PE標識3G8 抗体の結合を低下させるであろう。データを解析し、最終結果をCD16への結合割合として示す。図４は、YB2/0 において産生されたIgG1およびIgG3抗体は同等にCD16に結合するが、CHO で産生されたIgG3抗体またはＢリンパ球由来のIgG3抗体 (D29-P3X229) よりも強く結合することを示す。
【実施例４】
【００４９】
Jurkat CD16 細胞の活性化の測定 (実施例２の追試) 
Jurkat CD16 細胞に結合する抗体の評価後、プレートを37℃で一晩温置し、次いで遠心分離にかける。培地中のJurkat CD16 細胞により放出されたIL2 の量をELISA 法を用いて評価する。
【００５０】
結果を、CD16への一定の結合の関数としてのIl2 の量で示す (実施例２) 。図５は、IgG3のJurkat CD16 との相互作用が、IgG1の存在下でもよりもずっと少ないIL2 の放出しか誘発しないことを示す。このように、YB2/0 IgG1は、YB2/0 IgG3とは異なり、一次結合指数についてはIL2 の放出を誘発する；しかし、IgG3で得られた応答用量曲線は、IgG1で得られるものよりも低い。YB2/0 IgG3とCD16との間の強い相互作用 (最大結合指数が３) のみが、YB2/0 で産生されるIgG1で得られるものに匹敵するIL2 の放出を誘発する。
【実施例５】
【００５１】
PBMCまたは精製NK細胞の存在下でのRh陽性赤血球に対する抗-D抗体により誘発される細胞傷害性の検討
PBMC細胞溶解試験は、ヒト単核細胞 (PBMC) および多価免疫グロブリン (テゲリン、Tegelin)の存在下でRh陽性赤血球を溶解する抗体の能力を定量する。
【００５２】
結果を図６に示す。 CHOで発現したIgG3の細胞傷害活性は、融合Ｂリンパ球により発現する抗体、 D29-P3X229 で得られるものに匹敵する。他方、YB2/0 でのIgG3の発現は、CHO またはヘテロ骨髄腫により産生される同じ抗体と比べ、単核球 (PBL)の存在下での赤血球の溶解を誘発する能力を可能にする。
【００５３】
CHO で産生されたIgG3の活性に比べ、YB2/0 で発現したIgG3の細胞傷害活性の向上は2.8 倍大きく、また、WinRhoのIgG3ポリクローナル抗体画分により誘発されたものに匹敵する。
【００５４】
しかし、YB2/0 で産生されたIgG3の細胞傷害活性は、YB2/0 で産生されたIgG1および抗-Dポリクローナル抗体 (ポリ-D WinRho)の細胞傷害活性よりも低い。
精製NK細胞の存在下で (図７) 、YB2/0 IgG3は、CHO で産生された同じ抗体で得られる場合 (10％) に比べ5.5 倍大きい赤血球の溶解 (55％) を誘発する。ヘテロ骨髄腫 P3X229 により産生される抗体はもっとも低い値 (４％) を与える。
【００５５】
それにもかかわらず、YB2/0 で産生されたIgG3の細胞傷害活性は、YB2/0 で産生されたIgG1およびWinRhoポリクローナル抗体の細胞傷害活性よりも低い。
【実施例６】
【００５６】
懸濁状態の赤血球への抗体の結合後のJurkat CD16 によるIL-2の放出の測定
IgG3の添加によるYB2/0 IgG1で誘発された活性化の阻害の検討
IL2 の放出：Jurkat CD16 細胞を、Rh陽性赤血球、YB2/0 IgG1または各種発現系 (YB2/0, CHO, B-P3X 229)において発現されたD29 IgG3抗体と共に温置する。
【００５７】
結果：YB2/0 およびCHO において発現されるIgG3は、同濃度の抗体について、YB2/0 IgG1とは異なりIL2 放出を誘発しない (図８) 。YB2/0 で発現されたIgG1とは異なり、YB2/0 で発現されたIgG3のCD16への結合は溶液状態の赤血球およびJurkat CD16 細胞の存在下ではIL2 の放出を何ら誘発しないと結論しうる。このように、赤血球がマイクロプレートに被覆された実施例４は、CD16との強い相互作用のみがIL2 の放出を誘発しうることを示した。この実施例においてより生理学的な条件を使用して、YB2/0 IgG1とは異なり、Jurkat CD16 由来のIL2 の放出を誘発するYB2/0 IgG3の非常に弱い能力を確認する。
【００５８】
阻害の検討：Jurkat CD16 細胞を、Rh陽性赤血球、および各種発現系 (YB2/0, CHO, B-P3X229) において発現された各種D29 IgG3と混合したYB2/0 IgG1と共に温置する。IL2 の放出をELISA 法を用いて一晩温置の後のフロートにおいて測定する。
【００５９】
結果：CHO およびP3X229において産生されるIgG3は、YB2/0 IgG1により誘発されるIL2 放出に影響を及ぼさない。しかし、YB2/0 で産生されたIgG3はIL2 の誘発の低下を生じさせる (図８) 。
【００６０】
従って、YB2/0 でのIgG3の発現は、IgG １の活性化の負の調節を誘導する。
【実施例７】
【００６１】
抗-D抗体によるサイトカインの放出の誘発
NK細胞および単球をRh陽性赤血球、YB2/0 IgG1またはYB2/0 もしくはCHO において発現されたD29 IgG3抗体と共に温置する。ELISA 法により一晩温置後のフロートにおいて各種サイトカイン (βIL1, IL6, γIFN , αTNF)の放出を測定する。
【００６２】
図９に結果を示す。NK細胞の存在下ではすべての抗体についてβIL1 とIL6 の量は同等である。しかし、YB2/0 により発現されるIgG3の存在下でのNK細胞により産生されるαTNF とγIFN の量は、YB2/0 において発現されるIgG1により誘発される量よりも少ない (図９) 。それにもかかわらず、この放出はCHO により産生されるIgG3について観察される放出よりは多い。
【００６３】
単球の存在下ではすべての抗体についてβIL1 とγIFN の量 (ゼロ) は同じである。単球により産生されるIL6 の量は、YB2/0 において産生されるIgG １およびIgG3について同等であるが、CHO で産生されるIgG3についてはより低い。CHO により産生されるIgG3の存在下ではαTNF についてわずかな低下が見られる。
【実施例８】
【００６４】
THP-1 細胞によるRh陽性赤血球の食作用を誘発する抗-D IgG3 の能力
食作用試験：THP-1 細胞をRh陽性赤血球および抗体の存在下で温置する。少なくとも１個の赤血球を貪食した細胞の数を顕微鏡で計数することにより評価する。結果は、少なくとも１個の赤血球を貪食した細胞の割合 (％) で表す (図10参照) 。
【００６５】
WinRho抗-Dポリクローナル抗体のＩｇＧが、THP-1 細胞によるRh陽性赤血球の食作用を誘発する最も高い能力を有する (43.4％) 。YB2/0 IgG1はわずかな活性 (14.6％) をもつにすぎない。IgG3については、YB2/0 IgG3は34.5％の食作用を誘発し、これは精製ポリクローナル抗体IgG3(WinRho IgG3) よりも大きい。最も弱い食作用活性は、融合Ｂリンパ球により産生されるIgG3 (D29 P3X229) およびCHO で産生されるIgG3でみられる。
【００６６】
YB2/0 でのIgG3の発現は、食作用の誘発能を可能にし、この性質は、CHO で発現されるまたはヘテロ骨髄腫により放出されるIgG3と比べ、特に感染症およびアルツハイマー病に対して興味深い (McGeer PL, McGeer E.「アルツハイマー病の免疫治療」Sci Aging Knowledge Environ, 2004 年７月７日, 2004) 。
結論
YB2/0 で産生されるIgG3、即ち、フコース含量が35％より少ない非シアリル化形態の特定のグリカンのプロフィールは、上で実証したように新規な性質を付与する：
−IgG １に匹敵するCD16への強い結合、
−食作用の可能化、
−PBMCまたはNK細の存在下での、CHO で産生されるIgG3に比べた、ＡＤＣＣ活性の増加、
−CD16への結合においてIgG １と競合し、サイトカインの放出を負に調節する能力。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】発現ベクターを示す図である。
【図２】産生される抗体を説明する図である。
【図３】マイクロタイトレーションプレートに固定された赤血球上に被覆された抗体と、Jurkat CD16 細胞との相互作用を示す。ｘ軸は抗体の赤血球への結合を表し、ｙ軸はCD16への結合を表す。
【図４】標的不在下でのJurkat CD16 細胞へのIgG3の結合を示す。
【図５】Jurkat CD16 細胞との相互作用の後YB2/0 において発現されたIgG １およびIgG3により誘発されるIL-2の放出を示す。
【図６】PBMCおよび多価免疫グロブリンの存在下でのIgG １およびIgG3抗-D抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
【図７】NK細胞の存在下でのIgG1およびIgG3抗-D抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
【図８】抗-Rh IgG1およびIgG3により誘発されるJurkat CD16 細胞によるIL-2の放出を示す (懸濁状態の赤血球) 。YB2/0IgG１により誘発されるIL21の放出に及ぼす各種IgG3の添加の影響を示す。
【図９】NK細胞または単球の存在下での抗体により誘発されるサイトカインの放出を示す。
【図１０】１または数個の赤血球を貪食したTHP 1 細胞の割合 (％) を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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