(57)【要約】本発明は、定量的遺伝子発現情報を分析するためのアルゴリズムを用いた、肝毒性予測モデルを構築する方法及び検査薬の肝毒性予測の方法を含む。本発明はまた、検査薬の毒性を決定するため、遠隔の使用者によってコンピュータシステムを使用する方法と共に、その毒性予測モデルを含むコンピュータシステム及びマイクロアレイを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある試験薬剤の少なくとも１種の毒作用を予測する方法であって、
（ａ）前記試験薬剤に曝された少なくとも１種の肝臓細胞又は組織試料の複数の遺伝子に関する核酸ハイブリダイゼーションデータを提供するステップと、
（ｂ）表２の遺伝子又は遺伝子断片に対応する少なくとも１種の遺伝子からの前記ハイブリダイゼーションデータを遺伝子発現測度に変換するステップと、
（ｃ）前記少なくとも１種の遺伝子に関する前記遺伝子発現測度から遺伝子調節スコアを作成するステップと、
（ｄ）前記薬剤に関する試料予測スコアを作成するステップと、
（ｅ）前記試料予測スコアを肝毒性参照予測スコアと比較し、それにより前記試験薬剤の少なくとも１種の毒作用を予測するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも１種の細胞又は組織試料を試験薬剤ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）に曝す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）は、バックグラウンドハイブリダイゼーションに関するハイブリダイゼーションデータ及び試験薬剤ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）によって誘導される発現に関するハイブリダイゼーションデータ、を正規化することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子発現測度は、遺伝子ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ値である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ値は、対数尺度の線形加法モデルによって計算される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記対数尺度の線形加法モデルは、ロバストマルチアレイ（ｒｏｂｕｓｔ  ｍｕｌｔｉａｒｒａｙ）（ＲＭＡ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸ハイブリダイゼーションデータは、異常値データを測定する品質管理プロセスによってスクリーニングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）は、部分最小二乗（ＰＬＳ）を使用した次元縮小を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記試料予測スコアは、各遺伝子に関する加重インデックススコア（ｗｅｉｇｈｅｄ  ｉｎｄｅｘ  ｓｃｏｒｅ）を用いて作成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記加重インデックススコア（ｗｅｉｇｈｅｄ  ｉｎｄｅｘ  ｓｃｏｒｅ）は、表２のＰＬＳスコアである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤に関する試料予測スコアは、前記少なくとも１種の遺伝子に関する遺伝子調節スコアから作成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤に関する試料予測スコアは、少なくとも約１０種の遺伝子に関する遺伝子調節スコアから作成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤に関する試料予測スコアは、少なくとも約５０種の遺伝子に関する遺伝子調節スコアから作成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤に関する試料予測スコアは、少なくとも約１００種の遺伝子に関する遺伝子調節スコアから作成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記毒性参照予測スコアは、
（ａ）ある肝毒素に曝された少なくとも１種の肝臓細胞又は組織試料、及びその毒素ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）に曝された少なくとも１種の肝臓細胞又は組織試料、の複数の遺伝子に関する核酸ハイブリダイゼーションデータを提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１種の遺伝子からの前記ハイブリダイゼーションデータをｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ値に変換するステップと、
（ｃ）前記少なくとも１種の遺伝子に関するｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ値から遺伝子調節スコアを作成するステップと、
（ｄ）前記毒素に関する毒性参照予測スコアを作成するステップと、
を含む方法によって作成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記肝毒素は、１７−α−エチニルエストラジオール（ＥＥ）、２−アセチルアミノフルオレン（２−ＡＡＦ）、３−メチルコラントレン、アバカビル、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ；パラセタモール）、アセチルサリチル酸（アスピリン）、アリルアルコール、アミネプチン、アミオダロン、アミトリプチリン、ＡＮＩＴ（１−ナフチルイソチオシアネート）、エーザイ（アリセプト（登録商標））、アロクロール１２５４、ＡＹ−２５３２９、ＢＩ化合物、ビカルタミド、ブロモベンゼン、
ブプロピオン、カルバマゼピン、四塩化炭素（ＣＣｌ４）、セフタジジム、クロロホルム、マレイン酸クロルフェニラミン（クロールトリメトン）、ＣＩ１０００、シプロフィブラート、クロフィブラート、コルヒチン、化合物Ａ（ＡＺ）、化合物Ｂ（ＡＺ）、スリンダク、酢酸シプロテロン、ＣＺＢ７７７、ダントロレン、デメクロサイクリン、ジクロフェナク、ジエチルニトロサミン（ＤＥＮ）、ジフルニサル、ジフェンヒドラミン、ジクワット、ＤＭＮ（ジメチルニトロサミン）、ドーパミン、エピルビシン、エリスロマイシンエストレート、エタノール、エトポシド、ファモチジン（ペプシドＡＣ）、フェルバメート、フェノフィブレート、フルタミド、ゲムフィブロジル、ゲンタマイシン、ヒドラジン（イソニアジド）、ヒドロキシウレア、インドメタシン、ラベタロール、Ｌ−エチオニン、ＬＰＳ（リポ多糖）、マンニトール（ｄ−マンニトール）、メナジオン、メトホルミン、メタピリレン、メトトレキセート、メチルドパ、ロバスタチン（メバコール）、モノクロタリン、Ｏｒｇ１００００、Ｏｒｇ２００００、パラコート、ペルヘキシレン（Ｐｅｒｈｅｘｉｌｅｎｅ）、フェナセチン、フェノバルビタール、
フィゾスチグミン、プリカマイシン、リファブチン、リファンピン、ロシグリタゾン、シンバスタチン、スタブジン、ストレプトマイシン、タクリン、タモキシフェン、ＴＣＤＤ（２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン）、テモゾロマイド、テトラサイクリン、チオアセトアミド、バルプロ酸、Ｗｙ−１４，６４３、ジドブジン、及びジロートンからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）は、核酸ハイブリダイゼーションデータを、リモート接続を介してサーバーにロードすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記リモート接続は、インターネットを通じたものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記毒性参照予測スコアは、データベース中に提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記毒性参照予測スコアは、肝毒性モデルから導き出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記毒性モデルは、個々の毒素モデル、一般毒性モデル及び組織病態モデルからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記一般毒性モデルは、一般肝毒性モデルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記毒性モデルは、ヒト特異的肝毒性モデルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記組織病態モデルは、一般毒性モデル、ネガティブコントロールモデル、薬理学的に活性があるネガティブコントロールモデル、遺伝毒性／発癌モデル、非遺伝毒性モデル、ラット特異的非遺伝毒性モデル、胆汁うっ滞モデル、肝炎モデル、ヒト特異的毒性モデル、肝肥大誘発剤モデル、ペルオキシソーム増殖因子モデル、微小胞脂肪症モデル、大滴性脂肪症モデル、一般脂肪症モデル及び壊死モデルからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
（ｆ）前記毒作用に関係する情報を含むレポートを作成するステップ、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記レポートは、前記毒作用の機序に関係する情報を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記レポートは、前記毒性参照予測スコアを準備するのに使用する毒素に関係する情報を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記レポートは、前記試験薬剤とある毒素との間の少なくとも１種の類似性に関係する情報を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ハイブリダイゼーションデータは、普通テキストファイル中に含まれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ハイブリダイゼーションデータは、ＣＥＬファイル中に含まれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸ハイブリダイゼーションデータは、顧客データ、細胞又は組織試料データ、ハイブリダイゼーション技術データ及び試験薬剤データからなる群から選択される情報を用いてアノテートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ａ）は、前記少なくとも１種の毒作用を予測するための少なくとも１種の毒性モデルを選択することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３３】
ある試験薬剤の少なくとも１種の毒作用の予測を含むレポートを提供する方法であって、
（ａ）前記試験薬剤に曝された少なくとも１種の肝臓細胞又は組織試料、及びその試験薬剤ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）に曝された少なくとも１種の肝臓細胞又は組織試料、の複数の遺伝子に関する核酸ハイブリダイゼーションデータを、リモートリンクを介してサーバーに受信するステップであって、前記複数の遺伝子が表２の遺伝子又は遺伝子断片がら選択されるステップと、
（ｂ）少なくとも１種の遺伝子からの前記ハイブリダイゼーションデータをＲＭＡ（ロバストマルチアレイ平均）ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ値に変換するステップと、
（ｃ）前記少なくとも１種の遺伝子に関するＲＭＡ  ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ値から遺伝子調節スコアを作成するステップと、
（ｄ）前記薬剤に関する試料予測スコアを作成するステップと、
（ｅ）前記試料予測スコアを毒性参照予測スコアと比較するステップと、
（ｆ）前記少なくとも１種の毒作用に関係する情報を含むレポートを提供するステップと、
を含む方法。
【請求項３４】
毒性学的モデルを創造する方法であって、
（ａ）ある毒素に曝された少なくとも１種の肝臓細胞又は組織試料の複数の遺伝子に関する核酸ハイブリダイゼーションデータを提供するステップと、
（ｂ）表２の遺伝子又は遺伝子断片に対応する少なくとも１種の遺伝子からの前記ハイブリダイゼーションデータを遺伝子発現測度に変換するステップと、
（ｃ）前記少なくとも１種の遺伝子に関する遺伝子発現測度から遺伝子調節スコアを作成するステップと、
（ｄ）前記毒素に関する毒性参照予測スコアを作成し、それにより毒性学的モデルを創造するステップと、
を含む方法。
【請求項３５】
前記毒素は、１７−α−エチニルエストラジオール（ＥＥ）、２−アセチルアミノフルオレン（２−ＡＡＦ）、３−メチルコラントレン、アバカビル、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ；パラセタモール）、アセチルサリチル酸（アスピリン）、アリルアルコール、アミネプチン、アミオダロン、アミトリプチリン、ＡＮＩＴ（１−ナフチルイソチオシアネート）、エーザイ（アリセプト（登録商標））、アロクロール１２５４、ＡＹ−２５３２９、ＢＩ化合物、ビカルタミド、ブロモベンゼン、ブプロピオン、カルバマゼピン、四塩化炭素（ＣＣｌ４）、セフタジジム、クロロホルム、マレイン酸クロルフェニラミン（クロールトリメトン）、ＣＩ１０００、シプロフィブラート、クロフィブラート、コルヒチン、化合物Ａ（ＡＺ）、化合物Ｂ（ＡＺ）、スリンダク、酢酸シプロテロン、ＣＺＢ７７７、ダントロレン、デメクロサイクリン、ジクロフェナク、ジエチルニトロサミン（ＤＥＮ）、ジフルニサル、ジフェンヒドラミン、ジクワット、ＤＭＮ（ジメチルニトロサミン）、ドーパミン、エピルビシン、エリスロマイシンエストレート、エタノール、エトポシド、ファモチジン（ペプシドＡＣ）、フェルバメート、フェノフィブレート、フルタミド、ゲムフィブロジル、ゲンタマイシン、ヒドラジン（イソニアジド）、ヒドロキシウレア、インドメタシン、ラベタロール、Ｌ−エチオニン、ＬＰＳ（リポ多糖）、マンニトール（ｄ−マンニトール）、メナジオン、メトホルミン、メタピリレン、メトトレキセート、メチルドパ、ロバスタチン（メバコール）、モノクロタリン、Ｏｒｇ１００００、Ｏｒｇ２００００、パラコート、ペルヘキシレン、フェナセチン、フェノバルビタール、フィゾスチグミン、プリカマイシン、リファブチン、リファンピン、ロシグリタゾン、シンバスタチン、スタブジン、ストレプトマイシン、タクリン、タモキシフェン、ＴＣＤＤ（２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン）、テモゾロマイド、テトラサイクリン、チオアセトアミド、バルプロ酸、Ｗｙ−１４，６４３、ジドブジン、及びジロートンからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１種の細胞又は組織試料は、試験薬剤ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）に曝される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ステップ（ｂ）は、バックグラウンドハイブリダイゼーション、及び試験薬剤ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）によって誘導される発現に関するハイブリダイゼーションデータを正規化することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記遺伝子発現測度は、遺伝子ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ値である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ値は、対数尺度の線形加法モデルによって計算される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記対数尺度の線形加法モデルは、ロバストマルチアレイ（ｒｏｂｕｓｔ  ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ）（ＲＭＡ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記ステップ（ｃ）の作成は、部分最小二乗（ＰＬＳ）を使用した次元縮小を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ｄ）は、各遺伝子に関する加重インデックススコア（ｗｅｉｇｈｅｄ  ｉｎｄｅｘ  ｓｃｏｒｅ）の作成を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記毒素に関する毒性参照予測スコアは、前記少なくとも１種の遺伝子に関する遺伝子調節スコアから作成される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記薬剤に関する毒性参照予測スコアは、少なくとも約１０種の遺伝子に関する遺伝子調節スコアから作成される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記薬剤に関する毒性参照予測スコアは、少なくとも約５０種の遺伝子に関する遺伝子調節スコアから作成される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記薬剤に関する毒性参照予測スコアは、少なくとも約１００種の遺伝子に関する遺伝子調節スコアから作成される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記毒性モデルは、個々の毒素モデル、一般毒性モデル及び組織病態モデルからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４８】
前記一般毒性モデルは、一般肝毒性モデルである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記毒性モデルは、ヒト特異的肝毒性モデルである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記組織病態モデルは、一般毒性モデル、ネガティブコントロールモデル、薬理学的に活性があるネガティブコントロールモデル、遺伝毒性／発癌モデル、非遺伝毒性モデル、ラット特異的非遺伝毒性モデル、胆汁うっ滞モデル、肝炎モデル、ヒト特異的毒性モデル、肝肥大誘発剤モデル、ペルオキシソーム増殖因子モデル、微小胞脂肪症モデル、大滴性脂肪症モデル、一般脂肪症モデル及び壊死モデルからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記モデルを確認するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項５２】
前記確認は、クロス確認手順を使用することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記クロス確認手順は、２／３  ／  １／３確認手順である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
（ａ）請求項２９に記載の方法によって作成された、ある試験薬剤の毒性を予測するための毒性モデルを含むコンピュータ可読媒体と、
（ｂ）ユーザーが、試料予測スコアを前記毒性モデルにおける毒性参照予測スコアと比較することにより、前記試験薬剤の少なくとも１種の毒作用を予測することを可能にするソフトウェアと、
を含むコンピュータシステム。
【請求項５５】
前記毒性モデルは、表２から選択されるモデルを含む、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項５６】
前記毒性モデルは、表２の少なくとも１種の遺伝子又は遺伝子断片に関する加重インデックススコア（ｗｅｉｇｈｅｄ  ｉｎｄｅｘ  ｓｃｏｒｅ）を含む、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項５７】
前記毒性モデルは、表２の少なくとも５０種の遺伝子又は遺伝子断片に関する加重インデックススコア（ｗｅｉｇｈｅｄ  ｉｎｄｅｘ  ｓｃｏｒｅ）を含む、請求項５６に記載のコンピュータシステム。
【請求項５８】
前記毒性モデルは、表２の少なくとも１００種の遺伝子又は遺伝子断片に関する加重インデックススコア（ｗｅｉｇｈｅｄ  ｉｎｄｅｘ  ｓｃｏｒｅ）を含む、請求項５６に記載のコンピュータシステム。
【請求項５９】
前記毒性モデルが、表２のほぼすべての遺伝子又は遺伝子断片に関する加重インデックススコア（ｗｅｉｇｈｅｄ  ｉｎｄｅｘ  ｓｃｏｒｅ）を含む、請求項５６に記載のコンピュータシステム。
【請求項６０】
前記ソフトウェアは、核酸ハイブリダイゼーションデータからの試料予測スコアを計算することをユーザーに可能とする、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項６１】
前記ソフトウェアは、ある試験薬剤に曝された細胞又は組織試料から得られる定量的な遺伝子発現情報を、前記毒性モデルにおける定量的な遺伝子発現情報と比較することを、ユーザーに可能とし、前記試験薬剤が毒素であるかどうか予測する、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項６２】
ある試験薬剤に曝された細胞又は組織試料からの核酸ハイブリダイゼーションデータをリモートロケーションから伝送することをユーザーに可能とし、前記試験薬剤が毒素であるかどうか予測するソフトウェアをさらに含む、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項６３】
前記試料からの核酸ハイブリダイゼーションデータは、インターネット経由で伝送可能である、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項６４】
前記核酸ハイブリダイゼーションデータは、マイクロアレイハイブリダイゼーションデータである、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項６５】
前記核酸ハイブリダイゼーションデータは、ＰＣＲデータである、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項６６】
少なくとも１種の毒性参照予測スコアを含むデータ構造をさらに含む、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項６７】
前記データ構造は、少なくとも１種の遺伝子ＰＬＳスコアをさらに含む、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項６８】
前記データ構造は、少なくとも１種の遺伝子調節スコアをさらに含む、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項６９】
前記データ構造は、少なくとも１種の試料予測スコアをさらに含む、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項７０】
少なくとも１種の毒性参照予測スコアを含むデータ構造と、前記データ構造にアクセスするためのソフトウェアとを含む、コンピュータ可読媒体。
【請求項７１】
前記毒性モデルは、個々の毒素モデル、一般毒性モデル及び組織病態モデルからなる群から選択される、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項７２】
前記一般毒性モデルは、一般肝毒性モデルである、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項７３】
前記毒性モデルは、ヒト特異的肝毒性モデルである、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項７４】
前記組織病態モデルは、一般毒性モデル、ネガティブコントロールモデル、薬理学的に活性があるネガティブコントロールモデル、遺伝毒性／発癌モデル、非遺伝毒性モデル、ラット特異的非遺伝毒性モデル、胆汁うっ滞モデル、肝炎モデル、ヒト特異的毒性モデル、肝肥大誘発剤モデル、ペルオキシソーム増殖因子モデル、微小胞脂肪症モデル、大滴性脂肪症モデル、一般脂肪症モデル及び壊死モデルからなる群から選択される、請求項５４に記載のコンピュータシステム。
【請求項７５】
少なくとも２種のプローブを含む固体支持体であって、前記プローブのそれぞれは、表２中の１種の遺伝子又は遺伝子断片に特異的にハイブリッド形成する配列を含む、固体支持体。
【請求項７６】
前記プローブのそれぞれは、表２中の少なくとも５種の遺伝子又は遺伝子断片に特異的にハイブリッド形成する配列を含む、請求項７５に記載の固体支持体。
【請求項７７】
前記プローブのそれぞれは、表２中の少なくとも１０種の遺伝子又は遺伝子断片に特異的にハイブリッド形成する配列を含む、請求項７５に記載の固体支持体。
【請求項７８】
前記プローブのそれぞれは、表２中の少なくとも５０種の遺伝子又は遺伝子断片に特異的にハイブリッド形成する配列を含む、請求項７５に記載の固体支持体。
【請求項７９】
前記プローブのそれぞれは、表２中の少なくとも１００種の遺伝子又は遺伝子断片に特異的にハイブリッド形成する配列を含む、請求項７５に記載の固体支持体。
【請求項８０】
前記固体支持体は、表２中の実質上すべての遺伝子又は遺伝子断片にそれぞれ特異的にハイブリッド形成するプローブを含むアレイである、請求項７５に記載の固体支持体。
【請求項８１】
前記固体支持体は、メンブレン、ガラス支持体、ビースの集まり及びケイ素支持体からなる群から選択される、請求項７５に記載の固体支持体。
【請求項８２】
前記固体支持体は、１平方センチメートルあたり別個の位置に少なくとも１０種の異なるオリゴヌクレオチドを含むアレイである、請求項７５に記載の固体支持体。
【請求項８３】
前記固体支持体は、１平方センチメートルあたり別個の位置に少なくとも約１００種の異なるオリゴヌクレオチドを含むアレイである、請求項８２に記載の固体支持体。
【請求項８４】
前記固体支持体は、１平方センチメートルあたり別個の位置に少なくとも約１０００種の異なるオリゴヌクレオチドを含むアレイである、請求項８２に記載の固体支持体。
【請求項８５】
前記固体支持体は、１平方センチメートルあたり別個の位置に少なくとも約１０，０００種の異なるオリゴヌクレオチドを含むアレイである、請求項８２に記載の固体支持体。
【請求項８６】
ある化合物の少なくとも１種の毒作用を予測する方法であって、
（ａ）表１、２、５及び６からの１０種以上の遺伝子又はタンパク質の化合物に曝された１種の細胞又は組織試料における発現レベルを検出するステップを含み、表１、２、５及び６中の前記遺伝子の差次的発現が少なくとも１種の毒作用を示す方法。
【請求項８７】
ある化合物の毒作用の進行を予測する方法であって、
（ａ）表１、２、５及び６からの１０種以上の遺伝子又はタンパク質の化合物に曝された１種の細胞又は組織試料における発現レベルを検出するステップを含み、表１、２、５及び６中の前記遺伝子の差次的発現が毒性の進行を示す方法。
【請求項８８】
ある化合物の肝毒性を予測する方法であって、
（ａ）表１、２、５及び６からの１０種以上の遺伝子又はタンパク質の化合物に曝された１種の細胞又は組織試料における発現レベルを検出するステップを含み、表１、２、５及び６中の前記遺伝子の差次的発現が肝毒性を示す方法。
【請求項８９】
毒性反応の開始又は進行を調節する作用物質を同定する方法であって、
（ａ）細胞を前記作用物質及び既知の毒素に曝すステップと、
（ｂ）表１、２、５及び６からの１０種以上の遺伝子又はタンパク質の発現レベルを検出するステップと、
を含み、表１、２、５及び６中の前記遺伝子の差次的発現が毒性を示す方法。
【請求項９０】
ある化合物が細胞内で調節する細胞経路を予測する方法であって、
（ａ）表１、２、５及び６からの１０種以上の遺伝子又はタンパク質の化合物に曝された組織又は細胞試料における発現レベルを検出するステップを含み、表１、２、５及び６中の前記遺伝子の差次的発現が、少なくとも１種の細胞経路の調節に関連している方法。
【請求項９１】
ある試験化合物の少なくとも１種の毒作用を検出する方法であって、
（ａ）前記試験化合物に曝された肝臓の細胞又は組織試料の遺伝子発現プロファイルを準備するステップと、
（ｂ）、前記遺伝子発現プロファイルを、表１、２、５及び６中の少なくとも１０種の遺伝子、遺伝子断片又はタンパク質に関する少なくとも１種の毒素に曝された肝臓細胞又は組織試料の定量的な遺伝子発現情報、及び、表１、２、５及び６中の少なくとも１０種の遺伝子、遺伝子断片又はタンパク質に関する毒素賦形剤に曝されたコントロールの肝臓細胞又は組織試料の定量的な遺伝子発現情報を含むデータベースと比較するステップであって、それにより前記試験化合物の少なくとも１種の毒作用を予測するステップと、
を含む方法。
【請求項９２】
前記タンパク質は、分泌タンパク質である、請求項８６〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】  関連出願
［０００１］  本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の規定に準じて、２００４年４月７日に出願された米国仮出願６０／５５９，９４９に基づく優先権が与えられている。本出願はまた、２００４年３月２２日に出願された「分子毒性モデリングのための方法」という名称の米国仮出願６０／５５４，９８１、２００３年１月３１日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／０３１９４及び２００１年７月３１日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２３８７２と関連し、これら総ての出願は、参照によりそっくりそのまま本明細書に組み入れられる。
【０００２】  コンパクトディスクによる配列表提出
［０００２］  米国特許法施行規則１．８２１条（ｃ）及び１．８２１条（ｅ）に基づいて、本明細書と同時にコンパクトディスクで提出された配列表は、これを参照することによりそっくりそのまま本明細書に組み入れられるものである。４部の配列表（４枚のコンパクトディスクのそれぞれに１部）が提供される。コピー１、コピー２及びコピー３は同一である。コピー１、コピー２及びコピー３はＣＲＦとも同一である。配列表の電子的複製物はそれぞれが２００５年３月２８日に作製され、ファイルサイズは５９９５ＫＢである。ファイル名は以下の通りである：コピー１−ｇｅｎｅ  ｌｏｇｉｃ  ５１３４−ｗｏ．ｔｘｔ；コピー２−ｇｅｎｅ  ｌｏｇｉｃ  ５１３４−ｗｏ．ｔｘｔ；コピー３−ｇｅｎｅ  ｌｏｇｉｃ  ５１３４−ｗｏ．ｔｘｔ；及びＣＲＦ−ｇｅｎｅ  ｌｏｇｉｃ  ５１３４−ｗｏ．ｔｘｔ。
【０００３】  発明の背景
［０００３］  細胞又は生物体に対する、化合物、薬剤又は環境汚染物質の有毒な影響力を評価する方法の必要性により、生物学的モニターとして生物体を利用する手法の開発につながってきた。これらの系統の最も単純であり、そして最も便利なものは、酵母やバクテリアのような単細胞の微生物を利用する、というのは、それらが最も簡単に維持され、そして操作されるからである。さらに、単細胞のスクリーニング系は、細胞に対する試験化合物の効果をモニターするために、たびたび表現型の簡単に検知できる変化を使用する。しかしながら、単細胞の生物は、生体内変換を実行する能力を有しないので、複雑な多細胞の動物に対する多くの化合物の潜在的な効果を評価するための適当なモデルではない。
【０００４】  ［０００４］  多細胞生物による化合物の生体内変換は、それらが曝される薬剤の全体的な毒性を決定する上での重要なファクターである。したがって、多細胞のスクリーニング系又は単離された真核生物細胞を用いたスクリーニング系が、化合物の毒作用を検知するのに、好まれるか、又は要求される。しかしながら、毒性学スクリーニングツールとして多細胞生物を使用することは、酵母又はバクテリアの系で利用できるような、便利なスクリーニングメカニズム又はエンドポイントの欠如によって、かなり阻害されてきた。さらに、毒性学的予測系を作成する以前からの試みによっては、毒性反応を正確に予測するための必要なモデリング情報及び統計情報を提供することができなかった（例えば、ＷＯ００／１２７６０、ＷＯ００／４７７６１、ＷＯ００／６３４３５、ＷＯ０１／３２９２８及びＷＯ０１／３８５７９）。
【０００５】  ［０００５］  製薬業界は、対象の治療用化合物がヒトに対して毒性がないことを保証するために多大な資源を費やしている。このプロセスは、長期にわたり、また費用もかかり、ラットをはじめとしてイヌ又はヒト以外の霊長類に至るまで一連の生物において試験することを必要とする。さらに、核酸、ペプチド、又は有機化合物のライブラリーにおいて候補薬剤及びその合成を設計するモデリング法により、毒性反応を予測するための安価で、迅速で、正確な方法の必要性が高まっている。核酸ハイブリダイゼーションプラットホームに基づいた毒性モデリング法により、化合物に曝されたラット又はラット肝細胞培養物などの動物又は細胞培養試料から得られる生体試料の使用が可能となって、現在まで可能であったものよりもずっと早くヒトの器官毒性が検出されるはずである。
【０００６】  発明の概要
［０００６］  本発明は、ある化合物の少なくとも１種の毒作用を予測する方法を含み、この方法は、表１、２、５及び６からの２種以上の遺伝子の化合物に曝された組織又は細胞試料中の発現レベルを検出することを含み、表１、２、５及び６中の遺伝子の差次的発現が少なくとも１種の毒作用を示す。本発明はまた、ある試験化合物の少なくとも１種の毒作用を予測する方法を含み、この方法は、試験化合物に曝された肝臓細胞又は組織試料の遺伝子発現プロファイルを準備すること、ならびにこの遺伝子発現プロファイルを、少なくとも１種の毒素に曝された肝臓細胞又は組織試料の、表１、２、５及び６中の少なくとも１種の遺伝子又は遺伝子断片に関する定量的な遺伝子発現情報と、毒素賦形剤に曝されたコントロールの肝臓細胞又は組織試料の、表１、２、５及び６中の少なくとも１種の遺伝子又は遺伝子断片に関する定量的な遺伝子発現情報とを含むデータベースと比較し、それによりこの試験化合物の少なくとも１種の毒作用を予測することを含む。
【０００７】  ［０００７］  様々な態様では、本発明は、薬剤に曝された試料からの遺伝子発現情報を、毒素に曝された試料及び対照試料（ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）に曝された試料、あるいは毒性のない化合物又は低レベルの毒性化合物に曝された試料）からの遺伝子発現情報のデータベースと比較することにより、ある試験薬剤の少なくとも１種の毒作用を予測する方法を含む。こうした方法は、その試料からの定量的な遺伝子発現情報を提供又は作成すること、ＲＭＡ（ｒｏｂｕｓｔ  ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  ａｖｅｒａｇｅロバストマルチアレイ平均）アルゴリズムにより、この遺伝子発現情報を変化倍率（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ  ｖａｌｕｅ）の行列に変換すること、ＰＬＳ（ｐａｒｔｉａｌ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅ部分最小二乗）アルゴリズムにより、この試験薬剤への曝露に対して差次的に発現される各遺伝子に関する遺伝子調節スコアを作成すること、及びその試験薬剤に関する試料予測スコア（ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）を計算することを含む。次いで、この試料予測スコアを１種又は複数の毒性モデルに関する参照予測スコア（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）と比較する。
【０００８】  ［０００８］  様々な態様では、本発明は、毒性学的モデルを創製する方法を含む。こうした方法は、ある毒素に曝された少なくとも１種の細胞又は組織試料及びその毒素ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）に曝された少なくとも１種の細胞又は組織試料の複数の遺伝子に関する定量的な核酸ハイブリダイゼーションデータを提供又は作成すること、ＲＭＡ（ロバストマルチアレイ平均）アルゴリズムにより、少なくとも１種の遺伝子からのこのハイブリダイゼーションデータを変化倍率などの遺伝子発現測度（ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅ）に変換すること、ＰＬＳ（部分最小二乗）アルゴリズムにより、少なくとも１種の遺伝子に関する遺伝子発現測度から遺伝子調節スコア（ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）を作成すること、及びその毒素に関する毒性参照予測スコアを作成し、それにより毒性学的モデルを創製することを含む。
【０００９】  ［０００９］  本発明は、さらに、そこからプローブを作製し固体支持体に取り付けることが可能な、表２に記載された遺伝子又は遺伝子断片のセットを提供する。これらの基本遺伝子は肝毒性のマーカーの好ましいセットとして役立ち、化合物の毒作用を予測若しくはモニターする又は毒性反応の発症若しくは進行を調節する本発明の方法に用いることができる。
【００１０】  ［００１０］  他の態様では、本発明は、ある試験薬剤の毒性を予測するための毒性モデルを含むコンピュータ可読媒体と、ユーザーが、この試験薬剤に関する試料予測スコアを、その毒性モデルに関する毒性参照予測スコアと比較することにより、試験薬剤の少なくとも１種の毒作用を予測することを可能にするソフトウェアとを含むコンピュータシステムを含む。
【００１１】  ［００１１］  本発明のさらなる態様では、試験薬剤に曝された組織又は細胞からの遺伝子発現情報を準備し、リモートの中央サーバー上に格納されている毒性モデルとの比較及び分析のためにインターネット経由で伝送してよい。処理後、テキストファイルを送信したユーザーは、その試験薬剤の毒性もしくは非毒性を示したレポートを受信する。
【００１２】  表
［００１２］  表１：表１は、表２に記載した各遺伝子断片についての配列番号及びＧｅｎＢａｎｋアクセション番号に関してＧＬＧＣ識別子（表２の断片名）を提供する（その全てが、参照により本明細書に、また複製により本明細書に添付の配列表に組み入れられる）。遺伝子名及びＵｎｉｇｅｎｅクラスター名も含める。
【００１３】  ［００１３］  表２：表２は、一連の肝毒性モデルからのおのおのの遺伝子についてのＰＬＳ加重スコア（インデックススコア）（ＰＬＳ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｃｏｒｅｓ（ｉｎｄｅｘ  ｓｃｏｒｅｓ））を表す。
【００１４】  ［００１４］  表３：表３に、各毒性モデルを構築及び訓練するのに使用される毒素及びネガティブコントロール化合物を記載する。特定のモデルにおける特定の化合物に関する表示「１」は、このモデルを訓練するために化合物は毒性／病態（毒性）側で使用されたことを示す。特定のモデルにおける特定の化合物に関する表示「−１」は、このモデルを訓練するために化合物は非毒性／非病態（非毒性）側で使用されたことを示す。特定のモデルにおける特定の化合物に関する表示「０」は、このモデルを訓練するのに化合物は使用されなかったことを示す。
【００１５】  ［００１５］  表４：表４は、各毒素をラットに投与するのに使用するプロトコールを提供し、ラットを屠殺し、組織試料を回収する時点を示す。
【００１６】  ［００１６］  表５：表５に、表１及び２の遺伝子及び遺伝子断片に対応する、ヒト遺伝子又は遺伝子断片、ならびに他の種の遺伝子及び遺伝子断片を記載する。これら対応する遺伝子に関するＵｎｉｇｅｎｅクラスター名も含める。
【００１７】  ［００１７］  表６：表６は、表１及び２の遺伝子及び遺伝子断片が機能している代謝経路に開する情報を供給する。
【００１８】  詳細な説明
［００１８］  多くの生物学的機能は、転写（例えば、開始の制御、ＲＮＡ前駆体の供給、ＲＮＡプロセッシング等を通して）及び／又は翻訳制御を通して、様々な遺伝子の発現を変化させることによって達成される。例えば、細胞周期、細胞分化及び細胞死のような基本的生物学的プロセスは、遺伝子群の発現レベルにおける変化によって、しばしば特徴づけられる。
【００１９】  ［００１９］  遺伝子発現の変化は、生物又は細胞に対する様々な化学物質、医薬、毒、薬剤及び汚染物質の影響とも関連する。例えば、薬剤に曝された後、機能的な腫瘍抑制遺伝子の十分な発現の欠如及び／又は癌遺伝子／癌原遺伝子の過剰発現によって、腫瘍形成又は細胞の過形成増殖がもたされるであろう（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃｅｌｌ，６４：３１３−３２６（１９９１）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１１３８−１１４６（１９９１））。このように、特定の遺伝子（例えば、癌遺伝子又は腫瘍サプレッサー）の発現レベルの変化は、特定の化合物に曝されたときの毒性の存在及び進行又はその他の細胞の応答の指標として役に立つであろう。
【００２０】  ［００２０］  遺伝子発現の変化をモニターすることによって、医薬スクリーニング及び開発の間、ある種の利点が提供されるであろう。しばしば、医薬はそれが細胞に対して持つ他の作用を無視して、主要な標的と相互作用する能力についてスクリーンされる。これらの細胞への作用は、動物個体において毒性を引き起こすかもしれないし、そして、それは可能性のある医薬の開発と臨床への使用を妨げる。
【００２１】  ［００２１］  本発明者は、有害な肝臓への影響を誘導する既知の肝臓毒に曝された動物から、組織を調べて、これらの化合物によって誘導される遺伝子発現の全体的な変化を確認した。遺伝子発現のこれらの変化は、発現プロファイルの作成によって検出することができるが、試験化合物による毒性及び／又は毒性進行をモニターするのに用いることができる有用な毒性マーカーを提供する。また、これらのマーカーの一部は、様々な病気又は生理的状態、病気の進行、医薬の効能及び薬物代謝をモニター又は検出するのに用いることができる。
【００２２】  定義
［００２２］  本発明で使用する場合、「核酸ハイブリダイゼーションデータ」は、１種又は複数の一連の参照核酸との核酸の試料のハイブリダイゼーションによって導き出された任意のデータをさす。このような参照核酸は、マイクロアレイ上のプローブ又は１組のビーズの形でよく、又は試料核酸とのプライマーのハイブリダイゼーションを検出するための、ＰＣＲ増幅などの重合反応で使用するプライマーの形でもよい。核酸ハイブリダイゼーションデータは、ハイブリダイゼーションの数値表現の形でよく、定量分析、半定量分析、又は非定量分析の技法、あるいは技術プラットホームによって導き出してよい。核酸ハイブリダイゼーションデータには、限定されるものではないが遺伝子発現データが含まれる。このデータは、マイクロアレイ、又は他のハイブリダイゼーション技術プラットホームからの、蛍光データあるいは蛍光プローブ強度の測定を含めてどんな形でもよい。核酸ハイブリダイゼーションデータは生データでよく、あるいはこのデータを正規化して、マイクロアレイの高／低強度スポット、かき傷、又は局所もしくは全体での高バックグラウンドによって生じるバックグラウンド、ならびにスキャナの電気的雑音及び試料の質の変動によって生じる生ノイズを含めたバックグラウンド又は生ノイズの値を補正し、あるいはこの値を考慮に入れてよい。
【００２３】  ［００２３］  本発明で使用する場合、「細胞又は組織試料」は、ラット、マウスなどの実験動物を含めて、動物もしくは他の生物の細胞又は組織を含む１種又は複数の試料をさす。細胞又は組織試料は、細胞又は組織の混合集団を含むことができ、あるいは実質上、肝細胞又は肝臓組織などの単一の細胞又は組織の型でよい。本発明で使用する場合、細胞又は組織試料は、初代細胞培養物、不死化細胞培養物、培養肝細胞、培養肝組織など、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた細胞又は組織でもよい。細胞又は組織は、限定されるものではないが、肝臓、腎臓、心臓、筋肉（骨格筋もしくは心筋）、又は脳を含めて任意の器官に由来するものでよい。
【００２４】  ［００２４］  本発明で使用する場合、「試験薬剤」は、本発明の方法で試験又は分析されている薬剤、化合物、又は組成物をさす。例えば、試験薬剤は、毒性学的データが所望される薬剤候補でよい。
【００２５】  ［００２５］  本発明で使用する場合、「試験薬剤ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）」は、試験薬剤を、その中に溶解し、懸濁させ、又は動物、生物、もしくは細胞に投与する希釈剤あるいは担体をさす。
【００２６】  ［００１２６］  本発明で使用する場合、「毒素ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）」は、毒素を、その中に溶解し、懸濁させ、又は動物、生物、もしくは細胞に投与する希釈剤あるいは担体をさす。
【００２７】  ［００２７］  本発明で使用する場合、「遺伝子発現測度」は、細胞又は組織試料中での遺伝子又は遺伝子断片の発現レベルの任意の数値表現をさす。「遺伝子発現測度」には、限定されるものではないが変化倍率が含まれる。
【００２８】  ［００２８］  本発明で使用する場合、「少なくとも１種の遺伝子」は、試料中で本発明の方法によって検出される核酸分子をさす。本発明で使用する場合、「遺伝子」という用語には、完全に特徴付けられたオープンリーディングフレーム、及びコードされているｍＲＮＡ、ならびに本明細書に記載の通りアッセイする細胞又は組織試料において、任意のハイブリダイゼーション法により検出可能な、発現されるＲＮＡ断片が含まれる。例えば、「遺伝子」には、表１の「遺伝子」など、マイクロアレイにおけるプローブとのハイブリダイゼーションによって検出可能な、任意の種の核酸が含まれる。本発明で使用する場合、少なくとも１種の遺伝子には、「複数の遺伝子」が含まれる。
【００２９】  ［００２９］  本発明で使用する場合、「変化倍率」は、任意の基準又は対照と比較しての、試験するもしくは処理された細胞又は組織試料など、実験パラダイム間での１種の遺伝子、複数の遺伝子、又は遺伝子断片の発現レベルの数値表現をさす。例えば、変化倍率を、曝されていない細胞又は組織試料あるいはビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）に曝された細胞又は組織試料などの対照と比較した、試験用の細胞又は組織試料の１種の遺伝子又は複数の遺伝子に関するマイクロアレイによって導き出した蛍光又はプローブ強度として表してよい。本明細書に記載のＲＭＡ  変化倍率は、本発明の方法によって計算される変化倍率の非限定的な一例である。
【００３０】  ［００３０］  本発明で使用する場合、「遺伝子調節スコア」は、各遺伝子に関する加重インデックススコア（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｉｎｄｅｘ  ｓｃｏｒｅ）又はＰＬＳスコア及び対照試料に対する処理試料からの変化倍率から導き出した、１種の遺伝子又は遺伝子断片に関する遺伝子発現の定量的測度をさす。
【００３１】  ［００３１］  本発明で使用する場合、「試料予測スコア」は、本明細書に記載の本発明の方法によって作成された数値スコアをさす。例えば、試料から作成された遺伝子発現プロファイルにおける少なくとも１種の遺伝子に関する加重インデックススコア（ｗｅｉｇｈｅｄ  ｉｎｄｅｘ  ｓｃｏｒｅ）又はＰＬＳスコア、及びその同一の遺伝子に関するＲＭＡ  変化倍率を使用して、「試料予測スコア」を計算してよい。ある所与の試料について計算された個々の遺伝子調節スコアを総計することにより、「試料予測スコア」を導き出す。
【００３２】  ［００３２］  本発明で使用する場合、「毒性参照予測スコア」は、毒性モデルから作成された数値スコアをさし、これは、ある試験薬剤の少なくとも１種の毒作用を予測するためのカットオフスコアとして使用することができる。例えば、試料予測スコアを毒性参照予測スコアと比較して、この試料スコアが毒性参照予測スコアを超えるが、又は下回るかどうかを判定することができる。毒性参照予測スコアの値を下回る試料予測スコアは、少なくとも１種の毒作用を示さないものとしてスコア付けされ、また毒性参照予測スコアの値を超える試料予測スコアは、少なくとも１種の毒作用を示すものとしてスコア付けされる。
【００３３】  ［００３３］  本発明で使用する場合、対数尺度の線形加法モデルには、対数尺度のロバストマルチアレイ平均、すなわちＲＭＡなどの任意の対数線形モデルが含まれる（Ｉｒｉｚａｒｒｙ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（４）ｅ１５（２００３））。
【００３４】  ［００３４］  本発明で使用する場合、「リモート接続」は、直接有線接続以外の手段によるサーバーへの接続をさす。この用語には、限定されるものではないが、ダイヤルアップ回線、ブロードバンド接続、Ｗｉ−Ｆｉ接続を介した、すなわちインターネットを介したサーバーへの接続が含まれる。
【００３５】  ［００３５］  本発明で使用する場合、「ＣＥＬファイル」は、マイクロアレイにおける座標位置、セル、又は特徴に関連する平均プローブ強度を含むファイルをさす。本明細書にあるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌを参照のこと。
【００３６】  ［００３６］  本発明で使用する場合、「遺伝子発現プロファイル」は、細胞の試料又は集団における少なくとも１種のｍＲＮＡ種の発現の任意の定量的な提示を含み、それには、ディフェレンシャルディスプレイ、ＰＣＲ、マイクロアレイ、他のハイブリダイゼーション分析などの様々な方法によって作成されるプロファイルが含まれる。
【００３７】  ［００３７］  本明細書では、「一般毒性モデル」とは、それだけには限らないが、特異的な病態又は機序であるモデルを指す。この範疇では、ヒトを含めた１種又は複数の種において毒性を誘導できるかどうかによって化合物が分類される。ラットにおいてしか毒性を引き起こさない化合物は、この定義によって除外される。
【００３８】  ［００３８］  本明細書では、「壊死モデル」とは、非エネルギー依存性膨潤を介した一般的な細胞死によって定義される、複数の種において観察される病態に基づいたモデルを指す。Ｓｐｒａｙｃａｒ，Ｍ．，ｅｄ．Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ．２６  ｅｄ．１９９５，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｂａｌｔｉｍｏｒｅを参照のこと。
【００３９】  ［００３９］  本明細書では、「脂肪症モデル」は、「脂肪過多モデル」とも称するが、複数の種において観察される、細胞液胞中での脂肪の蓄積によって定義される。
【００４０】  ［００４０］  本明細書では、「大滴性脂肪症モデル」とは、複数の種において観察される、核を圧排する１つの（又は極めて少ない）大きな小胞をそれぞれ含有する脂肪細胞によって定義される、一般的な脂肪症（上記参照）の１つの形である。
【００４１】  ［００４１］  本明細書では、「微小胞脂肪症モデル」とは、複数の種において観察される、核を圧排することはない多数の小さな小胞をそれぞれ含有する脂肪細胞によって定義される一般的な脂肪症（上記参照）の１つの形である。
【００４２】  ［００４２］  本明細書では、「胆汁うっ滞モデル」とは、複数の種において観察される、胆汁流の障害によって生じる病態を指す。Ｃｏｔｒａｎ，Ｒ．Ｓ．，Ｖ．Ｋｕｍａｒ，ａｎｄ  Ｔ．ｃｏｌｌｉｎｓ，ｅｄｓ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ．６  ｅｄ．１９９９，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照のこと。
【００４３】  ［００４３］  本明細書では、「肝炎モデル」とは、急性もしくは慢性炎症細胞の流入を伴う肝臓への損傷を指す。この病態は、ラットでは同定することが困難であるが、マウス及びヒトでは十分に記録されており、容易に同定される。Ｆｒｏｍｅｎｔｙ，Ｂ．，Ａ．Ｂｅｒｓｏｎ，ａｎｄ  Ｄ．Ｐｅｓｓａｙｒｅ，Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ，１９９７．２６  Ｓｕｐｐｌ  １：ｐ．１３−２２を参照のこと。
【００４４】  ［００４４］  本明細書では、「発癌モデル」とは、ヒト又は動物モデルにおいて腫瘍を誘発できること指す。
【００４５】  ［００４５］  本明細書では、「遺伝毒性による発癌モデル」とは、複数の種において観察される、化合物がＤＮＡを損傷し、腫瘍形成をもたらす事象のカスケードを開始する機序を指す。
【００４６】  ［００４６］  本明細書では、「非遺伝毒性による発癌モデル」とは、複数の種において観察される、化合物がＤＮＡ損傷なしに腫瘍形成を引き起こす機序を指す。
【００４７】  ［００４７］  本明細書では、「ラット特異的非遺伝毒性による発癌モデル」とは、化合物がＤＮＡ損傷なしに腫瘍形成を引き起こす機序を指す。この場合、げっ歯類においてしかこの種の腫瘍形成を引き起こさない化合物のサブセットが存在する。
【００４８】  ［００４８］  本明細書では、「ペルオキシソーム増殖モデル」とは、細胞内のペルオキシソームの数の増加によって証明される病態又は機序を指す。ヒトは、この表現型を発症しない。
【００４９】  ［００４９］  本明細書では、「誘発剤／肝肥大モデル」とは一般に、肝臓のサイズの増大によって証明される病態を指す。この肝臓は、複数の種において観察される、肥大、すなわち細胞のサイズの増大、又は増生、すなわち細胞数の増加のどちらかによってサイズが増大し得る。
【００５０】  ［００５０］  本明細書では、「ヒト特異的モデル」とは、特異的な病態又は機序を指すものではなく、これはむしろ、動物モデルにおいてその毒性がないが、ヒト患者において有害事象があることにより化合物を分類する。
【００５１】  毒性モデルを作成する方法
［００５１］  毒性が予測される遺伝子発現変化を評価及び同定するために、十分に特徴付けられた毒性を有する、選択された化合物を使用した検査を使用して、本発明のモデル又はデータベースを構築してよい。本検査では、以下の肝臓毒を使用して、本発明の１種又は複数のモデルを構築した：１７−α−エチニルエストラジオール（ＥＥ）、２−アセチルアミノフルオレン（２−ＡＡＦ）、３−メチルコラントレン、アバカビル、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ；パラセタモール）、アセチルサリチル酸（アスピリン）、アリルアルコール、アミネプチン、アミオダロン、アミトリプチリン、ＡＮＩＴ（１−ナフチルイソチオシアネート）、エーザイ（アリセプト（登録商標））、アロクロール１２５４、ＡＹ−２５３２９、Ｂ１化合物、ビカルタミド、ブロモベンゼン、ブプロピオン、カルバマゼピン、四塩化炭素（ＣＣｌ４）、セフタジジム、クロロホルム、マレイン酸クロルフェニラミン（クロールトリメトン）、ＣＩ１０００、シプロフィブラート、クロフィブラート、コルヒチン、化合物Ａ（ＡＺ）、化合物Ｂ（ＡＺ）、スリンダク、酢酸シプロテロン、ＣＺＢ７７７、ダントロレン、デメクロサイクリン、ジクロフェナク、ジエチルニトロサミン（ＤＥＮ）、ジフルニサル、ジフェンヒドラミン、ジクワット、ＤＭＮ（ジメチルニトロサミン）、ドーパミン、エピルビシン、エリスロマイシンエストレート、エタノール、エトポシド、ファモチジン（ペプシドＡＣ）、フェルバメート、フェノフィブレート、フルタミド、ゲムフィブロジル、ゲンタマイシン、ヒドラジン（イソニアジド）、ヒドロキシウレア、インドメタシン、ラベタロール、Ｌ−エチオニン、ＬＰＳ（リポ多糖）、ｄ−マンニトール、メナジオン、メトホルミン、メタピリレン、メトトレキセート、メチルドパ、ロバスタチン（メバコール）、モノクロタリン、Ｏｒｇ１００００、Ｏｒｇ２００００、パラコート、ペルヘキシレン（Ｐｅｒｈｅｘｉｌｅｎｅ）、フェナセチン、フェノバルビタール、フィゾスチグミン、プリカマイシン、リファブチン、リファンピン、ロシグリタゾン、シンバスタチン、スタブジン、ストレプトマイシン、タクリン、タモキシフェン、ＴＣＤＤ（２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン）、テモゾロマイド、テトラサイクリン、チオアセトアミド、バルプロ酸、Ｗｙ−１４，６４３、ジドブジン、及びジロートン。本発明のモデルを作成するのに使用した方法には、ＲＭＡ／ＰＬＳ法（部分最小二乗アルゴリズムによる予測能力の評価を伴う、ロバストマルチアレイ平均アルゴリズムによる生の遺伝子発現データの解析）が含まれる。
【００５２】  ［００５２］  一般に、本発明のモデルは、少なくとも１種の毒作用を示すことが知られている化合物への曝露の後に分析される細胞及び組織試料を使用して構築される。低用量のこうした化合物、又は化合物がその中で調製されるビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）をネガティブコントロールとして使用する。少なくとも１種の毒作用を示さないことが知られている化合物もネガティブコントロールとして使用することができる。化合物で処理された試料における遺伝子発現レベルの変化は、特異的な毒性反応を表すと考えられ、化合物で処理されるとその発現が上方もしくは下方調節される遺伝子をマーカー遺伝子として分類し、これは、特異的タイプの毒性反応、すなわち特異的タイプの肝臓病態の指標として使用することができる。こうしたマーカー遺伝子を使用して、特異的な肝毒性反応を特徴付ける参照遺伝子発現プロファイルを作成することもできる。毒性反応を示すか、又は毒性反応を示さないと分類された遺伝子発現情報のデータベースから最初に構築される毒性モデルを訓練するために、ある化合物で処理された試料の情報はモデルから除去され、また別の化合物で処理された試料の情報は保持される。保持された情報を有するモデルはまた、元のモデルがそのモデルと比較して試験試料において毒性反応と毒性反応なしとを引き続き区別できる場合、その発現が上方もしくは下方調節される、訓練モデルにおける遺伝子を使用して、特異的な毒性モデルが構築される。こうした遺伝子は、訓練モデルの毒性側で使用される。
【００５３】  ［００５３］  表３に、各毒性モデルを構築及び訓練するのに使用した毒素及びネガティブコントロール化合物を示す。特定のモデルにおける特定の化合物に関する表示「１」は、このモデルを訓練するために化合物は毒性／病態（毒性）側で使用されたことを示す。特定のモデルにおける特定の化合物が「−１」の表示を有する場合、化合物で処理した試料の遺伝子発現情報は、毒性反応又は病態がないことを表すと考えられる。この情報を、モデルを訓練するために非毒性側又はネガティブコントロール側で使用して、特異的な毒性モデルを作成した。こうした試料で分析された遺伝子は、毒性のマーカーでないと考えられる。特定のモデルにおける特定の化合物が「０」の表示を有する場合、このモデルを訓練１するのに化合物は使用されなかった。
【００５４】  ［００５４］  本発明では、毒性検査すなわち「ｔｏｘ  ｓｔｕｄｙ」は、１種又は複数の毒素に曝された１組の細胞又は組織試料を含み、これには毒素ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）又は毒性のない低用量の毒素に曝された対応試料が含まれ得る。上記の通り、この細胞又は組織試料をｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで毒素及び対照の処理物に曝してよい。ある検査では、細胞又は組織試料への毒素及び対照による曝露は、実験用ラットなどの動物モデルに適切な用量を投与することによって行われ得る。ある検査では、細胞又は組織試料への毒素及び対照による曝露は、初代ラット又はヒト肝細胞などのｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた細胞又は組織の試料に適切な用量を投与することによって行われ得る。こうした試料は通常、試験化合物、時間（例えば、試験化合物の投与開始からラットが屠殺されるまでの時間）、及び用量（投与される試験化合物の量）に応じてコホートに組織される。ｔｏｘ検査におけるすべてのコホートは通常、同じビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）対照を共有する。例えば、あるコホートは、高用量（１００ｍｇ／ｋｇ）でのアシクロビルで６時間処理したラットからの１組の試料でよい。時間を一致させたビヒクルコホート（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｈｏｒｔ）は、ｔｏｘ検査内での処理動物に対する対照として働く１組の試料であり、例えば、６時間アシクロビル処理した高用量試料に対する、時間を一致させたビヒクルコホート（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｈｏｒｔ）は、その検査と共に６時間ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）処理した試料であるはずである。
【００５５】  ［００５５］  毒性データベース又は「ｔｏｘ  ｄａｔａｂａｓｅ」は、参照データベースを単独で、又は組み合わせて含む１組のｔｏｘ  ｓｔｕｄｙである。例えば、参照データベースには、様々な用量の様々な試験化合物で処理され、試験化合物に様々な長さの時間曝されたラットからのラット組織及び細胞試料からのデータが含まれ得る。肝毒性データベースは、参照データベースを単独で、又は組み合わせて含む１組の肝毒性ｓｔｕｄｙである。
【００５６】  ［００５６］  ＲＭＡすなわちロバストマルチアレイ平均は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイとの試料核酸のハイブリダイゼーションによって導き出したものなど、生の蛍光強度を、発現値に、すなわちチップ上の各遺伝子断片に対する１個の値（Ｉｒｉｚａｒｒｙ等（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（４）：ｅ１５，８ｐｐ．；Ｉｒｉｚａｒｒｙ等（２００３）「Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｓｕｍｍａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙ  ｐｒｏｂｅ  ｌｅｖｅｌ  ｄａｔａ」Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ４（２）：２４９−２６４）に変換するアルゴリズムである。ＲＭＡでは、対照レベルを有意に超えて、又は下回って発現される遺伝子に関して、ｌｏｇ２の尺度で通常４〜１２の間で値が生じる。こうしたＲＭＡ値は、正又は負となり得、変化倍率が約１の場合０付近を中心とする。ＲＭＡによって作成された遺伝子発現値の行列をＰＬＳにかけて、毒性反応の予測のためのモデル、例えば肝臓又は腎臓の毒性を予測するためのモデルを作成することができる。好ましい一実施形態では、このモデルを、当分野の技術者に知られている技法によって確認する。交差検定技法を使用することが好ましい。このような技法では、そのデータをランダムに訓練及び試験セットに数回に分けてからモデル成功率を決定する。このような技法では、２／３  ／  １／３交差検定を使用することが最も好ましく、この場合、データの１／３を落とし、その残りの２／３を使用してそのモデルを再構築する。
【００５７】  ［００５７］  ＰＬＳすなわち部分最小二乗は、予測変数の行列及び監視スコアのベクトルを入力として取得し、入力した各予測変数に対して１組の予測重み（ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｗｅｉｇｈｔ）を作成するモデリングアルゴリズムである（Ｎｇｕｙｅｎ等（２００２），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８：３９−５０）。次いで、こうした予測重みを使用して、遺伝子調節スコアを計算し、それにより分析された各遺伝子により毒性反応を予測できるかどうかが示される。実施例に記載の通り、次いで、この遺伝子調節スコアを使用して毒性参照予測スコアを計算してよい。
【００５８】  ［００５８］  核酸ハイブリダイゼーションデータから、遺伝子発現測度を、その発現のレベルが核酸ハイブリダイゼーション値において検出される１種又は複数の遺伝子について計算する。上記の通り、この遺伝子発現測度は、ＲＭＡ  変化倍率を含むことができる。毒性参照スコア（ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｃｏｒｅ）＝ΣｗｉＲＦＣｉ。「ｉ」は、評価すべき遺伝子発現プロファイルにおける各遺伝子のインデックスナンバーである。「ｗｉ」は、各遺伝子に関するＰＬＳ重み（又はＰＬＳスコア、表２参照）である。「ＲＦＣｉ」は、（上記の）試料からの遺伝子発現データの正規化されたＲＭＡ行列から求めた、第ｉ番目の遺伝子に関するＲＭＡ  変化倍率である。ＰＬＳ重みにＲＭＡ  変化倍率を掛けると、各遺伝子に関する遺伝子調節スコアが得られ、その個々の遺伝子すべてに関する調節スコアを合計すると、試料又は試料のコホートに関する毒性参照予測スコアが得られる。毒性参照予測スコアを、少なくとも１種の遺伝子調節スコア、あるいは少なくとも約５種、１０種、２５種、５０種、１００種、５００種、又は約１，０００種以上の遺伝子調節スコアから計算することができる。
【００５９】  ［００５９］  本発明の一実施形態では、（ａ）ある毒素に曝された少なくとも１種の細胞又は組織試料及びその毒素ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）に曝された少なくとも１種の細胞又は組織試料の複数の遺伝子に関する核酸ハイブリダイゼーションデータを提供するステップと、（ｂ）少なくとも１種の遺伝子からのハイブリダイゼーションデータを遺伝子発現測度に変換するステップと、（ｃ）前記少なくとも１種の遺伝子に関する遺伝子発現測度から遺伝子調節スコアを作成するステップと、（ｄ）その毒素に関する毒性参照予測スコアを作成し、それにより毒性学的モデルを創製するステップにより、本発明の毒性学的モデル又は毒性モデルを準備又は作成する。この遺伝子発現測度は、ＲＭＡなどの、対数尺度の線形加法モデルによって計算される遺伝子変化倍率でよく、毒性参照予測スコアを、ＰＬＳを用いて作成してよい。次いで、この毒性参照予測スコアを、毒性モデルもしくはデータベースに追加してよく、このスコアを使用して、未知の試験薬剤又は化合物の少なくとも１種の毒作用を予測してよい。
【００６０】  ［００６０］  好ましい別の実施形態では、このモデルを当分野の技術者に知られている技法によって確認する。好ましくは、交差検定技法を使用する。このような技法では、そのデータをランダムに訓練及び試験セットに数回に分けてから許容されるモデル成功率を決定する。このような技法では、２／３  ／  １／３交差検定を使用することが最も好ましく、この場合、データの１／３を落とし、その残りの２／３を使用してそのモデルを再構築する。
【００６１】  毒作用を予測する方法
［００６１］  毒素に曝された細胞又は組織試料から導き出した遺伝子調節スコア及び毒性予測スコアを使用して、試験用の、もしくは未知の薬剤又は化合物の肝毒性、腎毒性、あるいは他の組織毒性を含めた少なくとも１種の毒作用を予測してよい。毒素に曝された細胞又は組織試料からの遺伝子調節スコア及び毒性予測スコアを使用して、ある試験薬剤又は化合物が、試料において肝臓壊死などの組織病態を誘導することができるか予測してもよい。本発明の毒性学的予測方法は、適切な毒性学的モデル及び毒性学的予測スコアを利用できるかどうかによってのみ制限される。例えば、追加の毒素、又は特異的な組織病態を誘導する薬剤、及び適切な細胞又は組織試料を使用して、本発明の新たな毒性学的検査及びモデルを単に実行することにより、本発明のコンピュータシステムもしくはデータベースなどの所与のシステムの予測方法を拡大することができる。
【００６２】  ［００６２］  本明細書で使用する場合、少なくとも１種の毒作用には、限定されるものではないが細胞又は生物の生理的状態の有害な変化が含まれる。この反応は、それを必要とするわけではないが、組織壊死などの特定の病態を伴う恐れがある。したがって、この毒作用には、分子レベル及び細胞レベルでの作用が含まれる。例えば、肝毒性は、本明細書で使用する作用であり、これには、限定されるものではないが、胆汁うっ滞、遺伝毒性／発癌、肝炎、ヒト特異的な毒性、肝腫大の誘導、脂肪症、大滴性脂肪症、微小胞脂肪症、壊死、非遺伝毒性／非発癌毒性、ペルオキシソーム増殖、ラット非遺伝毒性、及び一般的な肝毒性の病態が含まれる。
【００６３】  ［００６３］  一般に、ある試験薬剤（又は化合物又は多成分組成物）の毒性を予測するためのアッセイは、１種の細胞又は組織試料、あるいは細胞又は組織試料の集団をその試験薬剤又は化合物に曝すステップと、例えば、表２中の遺伝子のうちの１種又は複数など、遺伝子のうちの１種又は複数の相対的もしくは絶対的な遺伝子発現のレベルをアッセイ又は測定することにより、その試験薬剤に曝された１種（複数）の細胞又は組織試料の少なくとも１種の遺伝子に関する核酸ハイブリダイゼーションデータを提供するステップと、試料予測スコアを計算するステップと、この試料予測スコアを１種又は複数の毒性学的参照スコアと比較するステップとを含む（実施例１参照）。
【００６４】  ［００６４］  試料予測スコアは以下の通りに計算してよい。試料予測スコア＝ΣｗｉＲＦＣｉ。「ｉ」は、評価すべき遺伝子発現プロファイルにおける各遺伝子のインデックスナンバーである。「ｗｉ」は、ある毒性モデルから導き出した、各遺伝子に関するＰＬＳ重み（又はＰＬＳスコア）である。「ＲＦＣｉ」は、（上記の）試料からの遺伝子発現データの正規化ＲＭＡ行列から求めた、第ｉ番目の遺伝子に関するＲＭＡ  変化倍率である。所与のモデルからのＰＬＳ重みにＲＭＡ  変化倍率を掛けると、各遺伝子に関する遺伝子調節スコアが得られ、その個々の遺伝子すべてに関する調節スコアを合計すると、その試料に関する予測スコアが得られる。
【００６５】  ［００６５］  核酸ハイブリダイゼーションデータには、約（もしくは少なくとも）２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、５０種、７５種、１００種、２００種、５００種、１０００種、又はそれ以上の遺伝子、あるいはこうした数の範囲、例えば、約２〜１０種、約１０〜２０種、約２０〜５０種、約５０〜１００種、約１００〜２００種、約２００〜５００種、又は約５００〜１０００種の遺伝子に対応するプローブとの試料核酸の、遺伝子発現レベルを含めた、ハイブリダイゼーションの任意の測定値が含まれ得る。毒性予測のための核酸ハイブリダイゼーションデータには、ある毒性モデルにおけるほぼすべての遺伝子の測定値も含まれる。「ほぼすべての」遺伝子を、任意の１種の毒性モデルにおける遺伝子のうちの少なくとも８０％を意味すると考えてよい。
【００６６】  ［００６６］  ある試験薬剤又は化合物の少なくとも１種の毒作用を予測する本発明の方法を、１種の個体によって、又は１種の場所で実施してよく、あるいは複数の個体によって、又は複数の場所で実施してもよい。例えば、本発明の方法は、ある試験薬剤又は化合物の１種（複数）の細胞又は組織試料への曝露が１種の場所、すなわち核酸処理において達成され、核酸ハイブリダイゼーションデータの作成が別の場所で行われ、また遺伝子調節スコア及び試料予測スコアが別の場所で計算又は作成されるステップを含む。
【００６７】  ［００６７］  本発明の別の実施形態では、薬剤を実験ラットに投与することにより、細胞又は組織試料をある試験薬剤又は化合物に曝し、核酸を、選択された組織から処理し、マイクロアレイにハイブリッド形成させて、核酸ハイブリダイゼーションデータを作成する。次いで、この核酸ハイブリダイゼーションデータを、毒性学的参照データベース、及び核酸ハイブリダイゼーションデータからの個々の遺伝子調節スコア及び１種又は複数の試料予測スコアの作成を可能にするソフトウェアを含むリモートサーバーに送信する。このソフトウェアは、ユーザーが、特異的な毒性学的モデルを事前選択すること、及び作成された試料予測スコアを、このようなスコアのデータベース内に含まれている１種又は複数の毒性学的参照スコアと比較することを可能にしてもよい。次いで、ユーザーは、データ解析、遺伝子調節スコアと試料予測スコアの作成、及び／又は１種又は複数の毒性学的参照スコアとの比較の結果を提供もしくは提示する１種（複数）の適切な出力プロダクトを作成又は注文してよい。
【００６８】  ［００６８］  核酸ハイブリダイゼーションデータを含めて、データを、セキュアな直接ダイヤルアップ、又はセキュアもしくはアンセキュアなインターネット接続を含めて、利用可能ないかなる手段によってサーバーに伝送してもよい。毒性学的予測レポート、又は本明細書の方法の任意の結果を、その同一の機序を介して伝送してもよい。例えば、最初のユーザーは、核酸ハイブリダイゼーションデータを、セキュアなパスワードによって保護されたインターネットリンク経由でリモートサーバーに伝送してよく、次いでその同一のインターネットリンク経由でそのサーバーから毒性学的レポートの伝送を要求してよい。
【００６９】  ［００６９］  毒性データベース又はモデルのリモートユーザーによって伝送されたデータは、生の、正規化されていないデータでよく、又はこのデータを、伝送前に様々なバックグラウンドパラメータから正規化してもよい。例えば、マイクロアレイからのデータを、様々なチップ、及び上記のものなどのバックグラウンドパラメータについて正規化してよい。このデータは、データが利用可能なソフトウェア、又はデータベースもしくはコンピュータシステムの一環として提供されるソフトウェアによって認識、あるいは適正にフォーマットされ得るかぎり、いかなる形のものでもよい。例えば、マイクロアレイデータを、市販の技術プラットホームにおけるマイクロアレイベースのハイブリダイゼーションの分析によって作成されたｃｅｌファイル又は他の任意の共通データファイルで提供及び伝送してよい（例えば、ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍで利用可能なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌを参照のこと）。このようなファイルに、様々な情報、例えば、限定されるものではないが、顧客又はリモートユーザーに関係する情報、細胞もしくは組織試料のデータ又は情報、データが作成されるハイブリダイゼーション技術又はプラットホーム、ならびに／あるいは試験薬剤データ又は情報を用いて、注釈を付けても付けなくてもよい。
【００７０】  ［００７０］  データを受信する場合、任意の利用可能な手段により、核酸ハイブリダイゼーションデータをデータベース互換性についてスクリーニングしてよい。一実施形態では、一般に利用可能なデータ品質管理メトリクスを適用することができる。例えば、異常値分析の方法又は技法を利用して、データベースに不適合な試料、例えば、データとデータベース又は毒性モデルとの間で共通の、対照プローブからの誤った蛍光値を示す試料を同定してよい。さらに、米国特許仮出願第６０／３９９７２７号の優先権を主張する、２００３年８月１日出願のＰＣＴ／ＵＳ第０３／２４１６０号で開示されている１種又は複数のものを含めて、様々なデータＱＣメトリクスを適用することができる。
【００７１】  細胞又は組織試料の調製
［００７１］  上記の通り、試験薬剤、化合物、又は組成物に曝される細胞集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで曝してよい。例えば、培養された、又は新たに単離された肝臓細胞、特にラット肝細胞を、標準の実験室及び細胞培養の条件下で薬剤に曝してよい。別のアッセイフォーマットでは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの曝露を、生きている動物、例えば実験ラットへの薬剤の投与によって達成してよい。
【００７２】  ［００７２］  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系及びｉｎ  ｖｉｖｏ系で毒性試験を設計及び実施するための手順は、周知であり、またＬｏｏｍｉｓ等，Ｌｏｏｍｉｓ’ｓ  Ｅｓｓｔｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，４版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６；Ｅｃｈｏｂｉｃｈｏｎ，Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９２；Ｆｒａｚｉｅｒ編，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９９２など、この主題に関する多数のテキストに記載されている。
【００７３】  ［００７３］  インビトロ毒性試験では、２つのグループの試験生物が通常使用される。１つのグループは対照であり、他のグループは単一用量で（急性毒性試験用）、又は１つの投薬計画の用量で（遷延性又は慢性毒性試験用）、試験化合物を受ける。いくつかのケースでは、本発明の方法で要求される組織の抽出が、試験動物を犠牲にする必要があるので、実験の継続期間を通して遺伝子発現の動態を観察することが望ましいならば対照グループ及び化合物を受けているグループの両方とも、組織サンプリングのために動物を取り除くことができるように十分大きくなければならない。
【００７４】  ［００７４］  毒性研究を計画するに際して、試験される化合物のために適切な試験生物を選ぶこと、投与経路、用量の範囲などについて広範囲な指針が文献で提供されている。水又は生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ水溶液）が、試験化合物のために選択される溶質である。というのは、これらの溶剤が様々な経路による投与を許容するからである。溶解性の限界のために、これが可能でないとき、コーン油のような植物油、又はプロピレングリコールのような有機溶媒が使用できる。
【００７５】  ［００７５］  投与経路に関係なく、所与の用量を投与するのに要する容積は、使われる動物の大きさによって制限される。動物のグループ内又はグループ間で各用量の容積を均一に保つことが望ましい。ラット又はマウスを使用するとき、一般に経口経路で投与される容積は、動物のグラム当たり０．００５ｍＬを超えてはならない。水溶液又は生理的食塩水溶液が非経口的注入のために使われるときでも、そのような溶液は通常無害であると考えられているが、許容される容積は制限される。マウスでの蒸留水の静脈ＬＤ５０は、マウスグラム当たり約０．０４４ｍＬであり、等張性生理食塩水のそれはマウスグラム当たり０．０６８ｍＬである。ある場合には、試験動物への投与経路は、治療目的のためのヒトへの該化合物の投与経路と同一、又はできるだけ似通っているべきである。
【００７６】  ［００７６］  化合物が吸入によって投与されることになっているとき、試験空気を発生する特殊な手法が必要である。その方法は、通常、化合物を含む液のエーロゾル化又は噴霧化を含む。試験される薬剤が感知できる蒸気圧を持つ液であるならば、それは制御された温度条件下で空気を溶液に通すことによって投与できる。これらの条件下で、用量は単位時間当たりに吸入される空気の容積、溶液の温度及び関与する薬剤の蒸気圧から見積もられる。ガスは、ガス溜めからメーターで測られる。溶液の粒子が投与されることになっているとき、粒径が約２μｍより小さくなければ、粒子は肺で末端の肺胞嚢に達しない。吸入によって投与されるとき、様々な装置やチャンバーが、刺激物質又はその他の有毒なエンドポイントの効果を検出するための研究を実行するために利用できる。動物に薬剤を投与する好ましい方法は、挿管によるか又は飼料に薬剤を取り入れることによる、経口経路を通してある。
【００７７】  ［００７７］  薬剤がインビトロで、細胞又は細胞培養物に曝されるとき、薬剤に曝される細胞集団は、例えば、その集団を２つ以上の同一のアリコートに分割することによって、２つ以上の副集団に分割されるかもしれない。本発明の方法の好適ないくつかの実施の形態で、薬剤に曝される細胞は、肝臓組織に由来する。例えば、培養されたか、又は新たに単離されたラット肝細胞が使われる。
【００７８】  ［００７８］  本発明の方法は、一般に少なくとも１つの毒性反応を予測するのに使用でき、そして、実施例に記載されているように、化合物又は試験薬剤が、胆汁鬱滞性肝炎、遺伝毒性／発癌、肝炎、ヒト特異的毒性、肝肥大の誘導、脂肪肝、大滴性脂肪肝、小滴性脂肪肝、壊死、非遺伝毒性／非発癌性毒性、ペルオキシソーム増殖、ラット非遺伝毒性的毒性、一般肝毒性、又はその他の少なくとも１つの既知の毒に関連する症状などの様々な特定の症状を誘導するという見込みを予測するのに使用できる。また、本発明の方法を用いて、１つ又はそれ以上の個々の化合物に対する毒性反応の類似性を決定できる。それに加えて、本発明の方法を用いて、上記の化合物又は試験薬剤によって影響、誘導又は調節される可能性のある細胞経路を予測するか、又は解明できる。
【００７９】  データベースとコンピュータシステム
［００７９］  本発明のデータベース及びコンピュータシステムは通常、個々の遺伝子もしくは毒性学的マーカーの加重インデックススコア（ｗｅｉｇｈｅｄ  ｉｎｄｅｘ  ｓｃｏｒｅ）もしくはＰＬＳスコア（表２参照）、遺伝子調節スコア、試料予測スコア、及び／又は毒性参照予測スコアを含むモデルなど、本明細書に記載の毒性モデル又は毒性学的モデルを含む１種又は複数のデータ構造を含む。このようなデータベース及びコンピュータシステムは、ユーザーが、データベース内容を操作すること、あるいは核酸ハイブリダイゼーションデータからの個々の遺伝子調節スコア及び試料予測スコアを含めて本明細書に記載のスコアを計算又は作成することを可能にするソフトウェアも含む。このソフトウェアは、少なくとも１つの毒性モデルで、１種又は複数の試料予測スコアを、１種又は複数の毒性参照予測スコアデータと比較することを可能にするものでもよい。
【００８０】  ［００８０］  上記の通り、本発明のデータベース及びコンピュータシステムは、直接の、又は直接ダイヤルアップアクセス、又はパスワードによって保護されたインターネットリンクを介したアクセスなどのリモートリンクを通じたアクセスを可能にする装置及びソフトウェアを含むことができる。
【００８１】  ［００８１］  任意の利用可能なハードウェアを使用して、本発明のコンピュータシステムを創製してよい。任意の適切なコンピュータプラットホーム、ユーザーインターフェースなどを使用して、配列情報、遺伝子、又は毒性学的マーカー情報と、データベース内の他の任意の情報、又は入力として提供される情報との間の必要な比較を実行してよい。例えば、多数のコンピュータワークステーションは、様々な製造元から入手可能である。クライアント／サーバー環境、データベースサーバー、及びネットワークも、いろいろな場所から入手可能であり、本発明のデータベースのための適切なプラットホームである。
【００８２】  ［００８２］  このデータベースを、様々なパーツ、例えば配列データベース及び毒性学的参照データベースを含むように設計してよい。このようなデータベース、及びこのようなデータベースを含むコンピュータ可読媒体の構成及び構築のための方法は、いろいろな場所から入手可能であり、例えば、本明細書にその全体が参照により組み入れられる、２００２年３月５日出願の米国特許出願公開第２００３／０１７１８７６号（特許出願第１０／０９０１４４号）、２００２年１１月２３日公開のＰＣＴ出願国際公開第０２／０９５６５９号パンフレット、米国特許第５９５３７２７号を参照のこと。好ましい一実施形態では、このデータベースは、Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから市販されているＴｏｘＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）又はＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）のデータベースである。
【００８３】  ［００８３］  本発明のデータベースを、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ．ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ＫＥＧＧ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ｋｅｇｇ）、ＳＰＡＲ（ｗｗｗ．ｇｒｔ．ｋｙｕｓｈｕ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｐａｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ＨＵＧＯ（ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｈｕｇｏ）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ．ｓｐｒｏｔ）、Ｐｒｏｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｓｃｎｐｓｉｔｌ．ｈｔｍｌ）、ＯＭＩＭ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ）、及びＧＤＢ（ｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ）などの外側又は外部のデータベースとリンクしてよい。好ましい一実施形態では、この外部データベースは、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ国立バイオテクノロジー情報センター）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）によって維持されているＧｅｎＢａｎｋ及びそれに関連するデータベースである。
【００８４】  ［００８４］  任意の適切なコンピュータプラットホーム、ユーザーインターフェースなどを使用して、配列情報、遺伝子発現情報と、データベース内の他の任意の情報、又は出力として提供される情報との間の必要な比較を実行してよい。例えば、多数のコンピュータワークステーションは、様々な製造元から入手可能であり、このようなものはｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ社から入手可能なものを有する。クライアント／サーバー環境、データベースサーバー、及びネットワークも、いろいろな場所から入手可能であり、本発明のデータベースのための適切なプラットホームである。
【００８５】  ［００８５］  本発明のデータベースを使用して、ユーザーが所与の遺伝子が発現される細胞型又は組織を決定することを可能にする、数ある中でもｅＮｏｒｔｈｅｒｎｓ（登録商標）レポート（Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ社）を作成することができ、また特定の組織又は細胞における所与の遺伝子の豊富さ又は発現レベルの測定を可能にすることができる。
【００８６】  毒性又は毒性学的レポート
［００８６］  上記の通り、本発明の方法、データベース、及びコンピュータシステムを使用して、毒性、肝毒性又は毒性学的レポートを作成、送達、及び／又は送信することができる。本明細書で使用する「毒性」及び「毒性学的」という用語の使用と一致して、「毒性レポート及び「毒性学的レポート」は互換的である。
【００８７】  ［００８７］  本発明の毒性レポートは通常、発明の方法の実施の結果に関係する情報又はデータを含む。例えば、本明細書に記載の、ある試験薬剤又は化合物の少なくとも１種の毒作用を同定する方法の実施により、その方法の結果を記載するレポートが準備又は作成され得る。このレポートは、少なくとも１種の試料予測スコアをデータベースからの少なくとも１種の毒性参照予測スコアと比較することよって予測される毒作用に関係する情報を含むことができる。このレポートは、データの完全性など、核酸ハイブリダイゼーションデータに関する情報、ならびに核酸ハイブリダイゼーションデータに注釈を付けるのに使用する情報など、データベースのユーザー及び本発明の方法によって入力された情報を提供することもできる。
【００８８】  ［００８８］  例示的な非限定的一例として、本発明の毒性レポートは、本明細書にその全体が参照により組み入れられる、２００２年７月１８日出願のＰＣＴ  ＵＳ第０２／２２７０１号に開示されているレポートなどの形でよい。本明細書の他の場所で記載の通り、このレポートを、ユーザーによって核酸ハイブリダイゼーションデータがロードされているサーバー又はコンピュータシステムによって作成してよい。その核酸データに関係するレポートを作成し、インターネットを通じて利用可能な、パスワードによるセキュアな環境などのリモート手段を介して、又は電子メールなどの利用可能なコンピュータ通信手段を介してユーザーに送達してよい。
【００８９】  核酸ハイブリダイゼーションデータの構築
［００８９］  遺伝子発現を検出するいかなるアッセイ様式を核酸のハイブリダイゼーションデータの取得に使用してもよい。例えば、伝統的なノーザンブロッティング、ドットブロット又はスロットブロット、ヌクレアーゼ保護、プライマー指示された増幅、ＲＴ−ＰＣＲ、半定量的若しくは定量的ＰＣＲ、分枝鎖ＤＮＡ及びディファレンシャル・ディスプレイ法が、遺伝子の発現レベルの検出又は核酸のハイブリダイゼーションデータの取得のために使われるかもしれない。それらの方法は、本発明のいくつかの実施の形態に有用である。より少ない数の遺伝子が検出される場合には、ハイスループットな増幅に基づくアッセイが最も効率的であるかもしれない。しかしながら、本発明の方法及びアッセイは、多数の遺伝子の発現を検出するハイブリダイゼーションに基づく方法で、最も能率的に設計される。
【００９０】  ［００９０］  核酸ハイブリダイゼーションデータを作成するために、溶液ベース及び固体支持体ベースのアッセイフォーマットを含めて、いずれのハイブリダイゼーションアッセイフォーマットを使用してもよい。本発明の差次的に発現される遺伝子用の、オリゴヌクレオチドプローブを含む固体支持体は、フィルター、ポリ塩化ビニル皿、粒子、ビーズ、微粒子、又はシリコンもしくはガラスベースのチップなどとすることができる。このようなチップ、ウェーハ、及び、ハイブリダイゼーション法は、いろいろな場所、例えばＢｅａｔｔｉｅによって開示されているもの（国際公開第９５／１１７５５号パンフレット）から入手可能である。
【００９１】  ［００９１］  オリゴヌクレオチドが、直接的に又は間接的に、共有結合的に又は非共有結合的に、結合され得るいかなる固体の表面でも、使用することができる。好ましい固体支持体は、高密度アレイ又はＤＮＡチップである。これらは、アレイ上で予め決められた位置に特定のオリゴヌクレオチドプローブを含んでいる。予め決められた位置は、１分子以上のプローブを含むかもしれないが、その予め決められた位置内の各分子は同一の配列を持つ。そのようなあらかじめ決められた位置は、特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）と呼ばれる。例えば、単一の固体支持体上に２、１０、１００、１，０００から１０，０００、１００，０００個まで、又は４００，０００個以上のこのような特徴があるかもしれない。固体支持体又はプローブが取り付けられる範囲は、約１平方センチメートル程度である。表２の遺伝子又は遺伝子断片に対応するプローブは、単一の又は複数の固体支持体に取り付けることができる。例えば、それらのプローブは、単一のチップ又は１つのチップセットを構成する複数のチップに取り付けることができる。関連出願に記載された遺伝子又は遺伝子断片もまた、これらの固体支持体に取り付けることができる。
【００９２】  ［００９２］  ビーズアッセイ又はビーズの収集を含む、発現モニター用のオリゴヌクレオチドプローブアレイは、当該技術で知られているいかなる手法によっても作製し、使用することができる（例えば、Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６）１４，１６７５−１６８０；ＭｃＧａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３，１３５５５−１３４６０）。そのようなプローブアレイは、表２に記載した２個若しくはそれ以上の遺伝子に相補的であるか、又はハイブリダイズする少なくとも２個以上のオリゴヌクレオチドを含む。例えば、そのようなアレイは、本明細書に記載される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、７０、１００、５００叉は１０００個若しくはそれ以上の遺伝子に相補的であるか、又はハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含んでよい。好ましいアレイは、表２に記載された遺伝子又は遺伝子断片のすべて又は実質的にすべてを含む。
本明細書において、表２に記載された遺伝子の「実質的すべて」とは、表２に記載された遺伝子又は遺伝子断片の少なくとも８０％を含む遺伝子又は遺伝子断片のセットを参照する。好ましい実施の形態では、チップのような単一の固体支持体基質上に、表２に記載された遺伝子のすべて又はほぼすべての遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチドを含むように、アレイが構築される。
【００９３】  ［００９３］  表２の発現マーカー遺伝子の配列は、公共のデータベースにある。表１は、その配列の各々について、配列番号及びＧｅｎＢａｎｋ受入番号（ＮｃＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ）を提供し（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照）、その一部の遺伝子についてはクラスターのタイトルも提供している。本出願の出願日現在でのＧｅｎＢａｎｋ中の遺伝子の配列は、明示により本明細書にそれらの全体が関連付けにより組み入れられ、さらに関連する配列、例えば、異なる長さの同一遺伝子からの配列、該遺伝子の変異体配列、多型配列、ゲノム配列及び異なる種（適当な場合、ヒトの対応物を含む）からの関連配列も同様である。
【００９４】  ［００９４］  遺伝子配列及び断片に加えて、表１は、遺伝子配列に対応するタンパク質配列も提供する。このようなタンパク質は、分泌もしくは非分泌タンパク質とすることができる。それらのアノテーションは、タンパク質を提示するデータベースに基づく。例えば、タンパク質断片がＲｅｆＳｅｑヌクレオチドレコードにリンクしている場合、対応するＲｅｆＳｅｑタンパク質レコードが使用される。タンパク質断片がＧｅｎｅ  ＩｎｄｅｘデータベースによりＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔタンパク質レコードにリンクしている場合、このＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔタンパク質レコードが使用される。タンパク質断片は、アノテートされたタンパク質ＩＤのリストを有し得るＵｎｉｇｅｎｅクラスターにリンクすることができる。こうしたタンパク質ＩＤは、Ｕｎｉｇｅｎｅクラスター内の各ヌクレオチド配列と、ＧｅｎＢａｎｋ内の既知のタンパク質配列との間の検索の類似性に基づいたＮＣＢＩによって作成され、このＩＤは、オルソロガスタンパク質の代わりにパラロガスタンパク質を含み得る。したがって、カットオフスコア（配列パーセント同一性＞９８％及びアラインメント配列長＞２００）をパスしたものだけを最終結果に組み込む。
【００９５】  ［００９５］  商用データベース内のある種の遺伝子は、その遺伝子が分泌タンパク質をコードするかどうかを判定するのに使用することができる機能アノテーションを含み得る。しかし、このタンパク質自体はいまだ同定されていない。この理由から、表１のタンパク質配列アノテーションにおいて、既知のタンパク質配列レコードのみが検討され、ヌクレオチド配列からタンパク質配列へのｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ翻訳は含まれない。
【００９６】  ［００９６］  分泌タンパク質配列に関するアノテーションをいくつかのデータベースにおいて実行する。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースにおける「細胞内位置（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）」のセクションからのアノテーションを収集する。以下のキーワード、「分泌」、「細胞外」、「ホルモン」、「泌乳」、「ミルク」、「胆汁酸異化」、「サイトカイン」、「ＩｇＡ結合タンパク質」、「パルミチン酸」、「膵臓］、「下垂体」、「精嚢」、「胸腺」、［Ｗｎｔシグナル伝達経路」は、データベースのテキストファイルに対して検索される。すべての肯定的な結果をさらなる分析のために分泌タンパク質としてアノテートする。別の実施形態では、遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）からの細胞構成要素（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）及び分子機能（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）のアノテーションを収集する。生物学的プロセス（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ）のアノテーションは、その情報が対象の遺伝子の代わりにある遺伝子セットに関係しており、したがってあまりにも多くの偽陽性を引き起こすので無視される。遺伝子名及びＲｅｆＳｅｑ機能サマリを収集する。ＩｎｔｅｒＰｒｏタンパク質ファミリーデータベースの記述も収集する。サイトカイン遺伝子ファミリーのすべてのメンバー（Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎｄｅｘデータベース）に、分泌タンパク質としてフラグをたてる。
【００９７】  ［００９７］  分泌タンパク質としてアノテートされた各レコードについて、偽陽性が除去されたことを保証するためにその記述を検査する。例えば、ＧＯ：０００４８７は、細胞外又は細胞内メッセンジャーと結合して細胞活性の変化を開始する場合、受容体活性を有するとデータベースにおいて記載される。このように特徴付けすれば、それがタンパク質自体ではなく、タンパク質複合体を分泌タンパク質として挙動させることができる、タンパク質とメッセンジャータンパク質との結合であるので、偽陽性となるであろう。さらに結果を確認するために、ＮＣＢＩ  ＰｕｂＭｅｄ、又はさらにはＧｏｏｇｌｅなど外部データベースをクエリーすることがある。
【００９８】  ［００９８］  上述のように、表２に開示されたＧｅｎＢａｎｋ受入番号の配列に加えて、天然に起こっている変異体又は多型の配列のような配列を本発明の方法及び組成で使用してもよい。例えば、表２に開示された遺伝子の様々な対立形質（ａｌｌｅｌｉｃ）体又は相同体の発現レベルをアッセイできる。表２に挙げられた遺伝子の機能活性を変えない、いかなるそしてすべてのヌクレオチド変異−本明細書に開示された遺伝子の天然に起こっている対立形質変異体を含むが−を本発明の方法に用いて、本発明の組成（例えば、アレイ）を作ることができる。
【００９９】  ［００９９］  上記の遺伝子の配列に基づくプローブは、一般に利用できるいかなる方法によっても調製できる。組織若しくは細胞試料をスクリーニング又はアッセイするためのオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、適当な、相補的遺伝子又は転写物のみに特異的にハイブリダイズするのに十分な長さである。典型的には、オリゴヌクレオチドプローブが、長さで少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０又は２５個のヌクレオチドである。ある場合には、少なくとも３０、４０又は５０個のヌクレオチドのより長いプローブが望ましいこともある。
【０１００】  ［００１００］  本明細書で使用する場合、表２に記載された遺伝子の１個若しくはそれ以上に相補的であるオリゴヌクレオチド配列とは、ストリンジェントな条件下、該遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを指す。そのようなハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは典型的には、該遺伝子にヌクレオチドレベルで、少なくとも約７５％の配列同一性、好ましくは約８０％又は８５％の配列同一性、さらに好ましくは該遺伝子に約９０％又は９５％以上の配列同一性を示すことになる（参照することによりそっくりそのまま本明細書に組み入れられるＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標登録）発現分析マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｒｅｖ．３）を参照）。
【０１０１】  プローブ設計
［００１０１］  配列設計の莫大な数が本発明の実施に適切であることを当業者は理解するであろう。高密度アレイは、興味ある配列に特異的にハイブリダイズする数多くの試験プローブを典型的に含む。プローブは、表２及び付随する代表的な配列表において同定されている遺伝子又は遺伝子断片のいかなる領域から作製してもよい。表中の遺伝子参照が遺伝子断である例では、その配列から、又は配列データベース（例えば、本明細書に記載されたもの）のどれかで入手可能であろう対応する全長転写物の他の領域から、プローブは設計されてもよい。与えられた１又は複数の遺伝子のためのプローブを作製する方法については、ＷＯ９９／３２６６０を参照。それに加えて、利用できるソフトウェアならなんでも用いて特定のプローブ配列を作成することができるが、これは例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ、オリンパス光学工業（株）及びＢｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能なソフトウェアを含む。好ましい実施の形態では、そのアレイはまた、１個若しくはそれ以上の対照プローブを含む。
【０１０２】  ［００１０２］  本発明の高密度アレイチップは、「試験プローブ」を含む。その試験プローブは、長さで約５個〜約５００個、又は約７個〜約５０個のヌクレオチド、より好ましくは約１０個〜約４０個のヌクレオチド、そして、最も好ましくは約１５個〜約３５個のヌクレオチドの範囲にあるオリゴヌクレオチドであってもよい。他の特に好ましい実施の形態では、プローブが長さで２０個又は２５個のヌクレオチドである。好ましい別の実施の形態では、試験プローブは、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ配列である。ＤＮＡ配列は、自然源から単離されるかクローンされるか、或いは天然の核酸を鋳型に使用して増幅される。これらのプローブは、その発現を検出するように設計した遺伝子の特定の部分配列に相補的な配列を有する。このように、前記試験プローブは、それが検出するはずである標的核酸に、特異的にハイブリダイズすることができる。
【０１０３】  ［００１０３］  興味ある標的核酸と結合する試験プローブに加えて、高密度アレイは、数多くの対照プローブを含むことができる。その対照プローブは、本明細書において、１）規格化対照、２）発現レベル対照、そして３）ミスマッチ対照と呼ばれる３つのカテゴリーに分類されるかもしれない。
【０１０４】  ［００１０４］  規格化対照は、ラベルされた参照オリゴヌクレオチドに、又はスクリーンされる核酸試料に加えられた他の核酸配列に相補的であるオリゴヌクレオチド、又は他の核酸プローブである。ハイブリダイゼーション後、規格化対照から得られるシグナルは、ハイブリダイゼーション条件の変化、ラベル強度、「読み」効率及び完全ハイブリダイゼーションのシグナルをアレイ間で変化させる他の因子、のための対照を提供する。好ましい実施の形態において、アレイ中すべての他のプローブから読まれるシグナル（例えば、蛍光強度）は、対照プローブからのシグナル（例えば蛍光強度）によって割られ、かくして、測定を規格化している。
【０１０５】  ［００１０５］  実質的に、いかなるプローブでも、標準対照として役に立つかもしれない。しかしながら、ハイブリダイゼーション効率は、塩基組成及びプローブ長さとともに変化すると認識されている。好ましい規格化プローブは、アレイに存在する他のプローブの平均長を反映するように選ばれるが、それらはある範囲の長さをカバーするように選ばれることができる。規格化対照も、また、アレイ中の他のプローブの（平均）塩基組成を反映するように選ばれ得るが、好ましい実施の形態では、１個か、数個のみのプローブを使用し、それらはよくハイブリダイズし（すなわち、二次構造をとらない）、そしていかなる標的特異的プローブにもマッチしないように選択される。
【０１０６】  ［００１０６］  発現レベル対照は、生物学的試料中の恒常的に発現した遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブである。実質的に、恒常的に発現した遺伝子はどれも、発現レベル対照に対して適当な標的を提供する。典型的には、発現レベル対照プローブは、アクチン遺伝子、トランスフェリンレセプター遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子などを含むがこれらに限らない、恒常的に発現した「ハウスキーピング遺伝子」の部分配列に相補的な配列を有する。
【０１０７】  ［００１０７］  標的遺伝子に対するプローブ、発現レベル対照、又は規格化対照に対して、ミスマッチ対照が提供される。ミスマッチ対照は、１個以上のミスマッチ塩基の存在を除いて、対応する試験プローブ又は対照プローブと同一なオリゴヌクレオチドプローブ又は他の核酸プローブである。ミスマッチ塩基とは、そのプローブがそうでなければ特異的にハイブリダイズするだろう標的配列中の対応する塩基に相補的でないように、選ばれる塩基である。適切なハイブリダイゼーション条件下（例えば、ストリンジェントな条件）、試験プローブ又は対照プローブがその標的配列にハイブリダイズすると期待されるが、ミスマッチプローブはハイブリダイズしないであろう（又は、かなり少ない程度でしかハイブリダイズしないであろう）ように、１個以上のミスマッチが選択される。好ましいミスマッチプローブは、中央ミスマッチを含む。このように、例えばプローブが２０ｍｅｒである場合、対応するミスマッチプローブは、６位から１４位（中央ミスマッチ）のどの位置でも単一の塩基ミスマッチ（例えば、Ｇ、Ｃ又はＴをＡのかわりとする）を除いて、同一の配列を持つことになる。
【０１０８】  ［００１０８］  かくして、ミスマッチプローブは、試料中でそのプローブが指示する標的以外の核酸に非特異的に結合するか、又はクロスハイブリダイゼーションするための対照を提供する。例えば、標的が存在するならば、完全なマッチプローブはミスマッチプローブより絶えず明るいはずである。それに加えて、すべての中央ミスマッチが存在するならば、ミスマッチプローブを使用して、変異、例えば、表２の遺伝子又は遺伝子断片の変異を検出することができる。完全なマッチプローブとミスマッチプローブとの間の強度の違いは、ハイブリダイズした材料の濃度の良い尺度を提供する。
【０１０９】  ［００１０９］  「バックグランド」又は「バックグランドシグナル強度」という用語は、ラベルされた標的核酸とオリゴヌクレオチドアレイの成分（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、対照プローブ、アレイ基質等）との間の非特異的な結合又はその他の相互作用から生じるハイブリダイゼーションシグナルを指す。バックグランドシグナルは、また、アレイ成分自身の内部蛍光によって生じるかもしれない。単一のバックグランドシグナルは、全アレイのために計算することができ、或いは、異なるバックグランドシグナルを各標的核酸のために計算してもよい。好ましい実施の形態では、バックグランドはアレイ中のプローブの最も低い５％〜１０％に対する平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として計算されるか、或いは、異なるバックグランドシグナルを各標的遺伝子のため計算する場合、各遺伝子のプローブの最も低い５％〜１０％に対する平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として計算される。当然ながら、当業者は、特定の遺伝子へのプローブがよくハイブリダイズして、標的配列に特異的に結合しているようにみえる場合は、それらをバックグランドシグナル計算に使用してはならないと理解するであろう。別法として、試料中に見出されるいかなる配列にも相補的でないプローブ（例えば、反対のセンスの核酸に指向されているプローブ、又は、試料が哺乳類の核酸であるとき、バクテリア遺伝子のような試料中に見出されない遺伝子に指向されているプローブ）へのハイブリダイゼーションによって生成されるハイブリダイゼーションシグナル強度として計算してもよい。また、バックグランドは、全くプローブを欠くアレイの領域によって生じる平均シグナル強度として計算されることもできる。
【０１１０】  ［００１１０］  「特異的にハイブリダイズしている」叉は「特異的にハイブリダイズする」という表現は、配列が複雑な混合物（例えば、全細胞）のＤＮＡ又はＲＮＡに存在するとき、ストリンジェントな条件下、特定の１又は複数の核酸配列に実質的に又はそれらだけに、ある分子が結合、二本鎖形成（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）又はハイブリダイズすることを指す。
【０１１１】  ［００１１１］  本明細書で使用する場合、「プローブ」は、１種類以上の化学結合を通して、通常は相補的な塩基対形成を通して、通常は水素結合形成を通して、相補配列の標的核酸に結合することができる核酸として定義される。本明細書で使用する場合、プローブは天然型の塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ又はＴ）又は修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシン等）を含む。加えて、それがハイブリダイゼーションを妨げない限り、プローブ中の塩基は、ホスホジエステル結合以外の結合でつながれていてもよい。したがって、プローブは、構成塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合でつながれているペプチド核酸であってもよい。
【０１１２】  高密度アレイの作成
［００１１２］  合成のステップの最小数で、オリゴヌクレオチドの高密度アレイを作成する方法は、知られている。オリゴヌクレオチド類似体のアレイは、様々な方法で単一又は複数の固体基質上に合成することができ、これらは限定されないが、光指向された化学的カップリング及び機械的に指向されたカップリングを含む（Ｐｉｒｒｕｎｇ（米国特許第５，１４３，８５４号）を参照）。
【０１１３】  ［００１１３］  手短に言えば、ガラス表面上でのオリゴヌクレオチドアレイの光指向されたコンビナトリアル合成は、自動化されたホスホラミダイト化学とチップマスキング手法を用いて進む。１つの特定的実施において、ガラス表面を、官能基（例えば、光反応性保護基によってブロックされている水酸基又はアミン基）を有するシラン試薬で誘導体化する。光リソグラフ性マスクを通しての光分解を使用して、導入する５’光保護されたヌクレオシドホスホラミダイトと化学反応する準備ができている官能基を選択的に露出する。そのホスホラミダイトは、照射された（かくして、光反応性ブロック基の除去によって曝される）部位のみと反応する。このように、ホスホラミダイトは前のステップで選択的に曝されるそれらの領域にのみ付加する。所望の配列アレイが固体表面上に合成されるまで、これらのステップが繰り返される。アレイ上の異なる位置での異なるオリゴヌクレオチド類似体のコンビナトリアル合成は、合成の間の照射パターンとカップリング試薬の添加の順序によって決定される。
【０１１４】  ［００１１４］  前述のことに加えて、単一基質上でオリゴヌクレオチドのアレイを生成するために使用できる追加の方法は、ＰＣＴ公報ＷＯ９３／０９６６８号及びＷＯ０１／２３６１４号に記載されている。高密度核酸アレイは、予め調製した、又は天然の核酸を予め決められた位置に置くことによって組み立てることもできる。合成又は天然の核酸は、光指向ターゲティング及びオリゴヌクレオチド指向ターゲティングによって、基質の特定位置に置かれる。別の実施の形態は、区域から区域に移動し、核酸を特定スポットに置くディスペンサーを使用する。
【０１１５】  核酸サンプル
［００１１５］  細胞又は組織試料は、インビトロ又はインビボで試験薬剤に曝される。培養細胞又は組織が使用されるとき、肝臓抽出物のような適当な哺乳動物の細胞抽出物を試験薬剤と共に加え、毒性を示すのに生体内変換を要するかもしれない薬剤を評価してもよい。好ましい様式では、動物又はヒト肝細胞の培養細胞又は初代単離株（ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｓｏｌａｔｅ）が使われる。
【０１１６】  ［００１１６］  本発明によってアッセイされる遺伝子は、典型的にはｍＲＮＡ又は逆転写されたｍＲＮＡの形態である。その遺伝子は、クローン化されてもよいし、されなくてもよい。その遺伝子は、増幅されてもよいし、されなくてもよい。クローニング及び／又は増幅は、集団内での遺伝子の表現にバイアスをかけるようには見えない。しかし、いくつかのアッセイでは、より少ないプロセッシングステップで使用できるので、材料としてｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを用いることが好ましいかもしれない。
【０１１７】  ［００１１７］  当業者にとって明らかであるように、本発明の方法及びアッセイにおいて使われる核酸試料は、いかなる利用可能な方法又はプロセスによって調製されてもよい。トータルｍＲＮＡを単離する方法は、当業者に周知である。例えば、核酸の単離と精製の方法は、「生化学と分子生物学における研究室手法（第２４巻）核酸プローブとのハイブリダイゼーション：理論と核酸プローブ、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）」の第３章に詳しく記載されている。そのような試料は、ＲＮＡ試料を含むが、興味ある細胞若しくは組織から単離されるｍＲＮＡ試料から合成されるｃＤＮＡをも含む。また、そのような試料は、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、及びその増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡをも含む。当業者は、ホモジネートが使われる前に、ホモジネートに存在するＲＮＡ分解酵素を阻害又は破壊することが、望ましいと認めるだろう。
【０１１８】  ［００１１８］  生物学的試料は、どんな生物並びにインビトロで育てられた細胞（例えば、株化細胞及び組織培養細胞）からのいかなる生体組織、液体又は細胞のものでもよい。しばしば、その試料は、化合物、薬剤、医薬、医薬組成物、潜在的な環境汚染物質又は他の組成物に曝された組織又は細胞試料である。ある様式では、試料は、患者に由来する試料である「臨床試料」であるだろう。典型的な臨床試料には、痰、血液、血液細胞（例えば、白血球）、組織若しくは細針バイオプシーの試料、尿、腹膜液や胸水、或いはそれらからの細胞が含まれるが、これらには限定されない。生物学的試料は、組織学的目的で取られた凍結切片又はホルマリン固定切片のような、組織の切片をも含むかもしれない。
【０１１９】  ハイブリダイゼーション
［００１１９］  核酸ハイブリダイゼーションは、相補的な塩基対形成を通してプローブとその相補的な標的とが安定した混成二本鎖を形成することができる条件下、プローブと標的核酸とを接触させることを単に含む。ＷＯ９９／３２６６０を参照。混成二本鎖を形成しない核酸は、その後、洗い流されて、ハイブリダイズした核酸が検出されるのにまかせる（典型的には、付着した検出可能なラベルの検出を通して）。核酸を含んだ緩衝液の温度を上昇させるか、又はその塩濃度を減少させることによって、核酸が変性すると一般に認められている。低いストリンジェンシー条件下では（例えば、低温及び／又は高塩濃度）、アニールした配列が完全に相補的でない場合でも、混成二本鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＤＮＡ）が形成される。このように、ハイブリダイゼーションの特異性は、低いストリンジェンシーで減少する。逆に、より高いストリンジェンシー（例えば、より高温及び／又は低塩濃度）では、うまくゆくハイブリダイゼーションは、より少ないミスマッチしか許容しない。ハイブリダイゼーション条件を選択して、いかなる程度のストリンジェンシーをも提供できると当業者は認識するであろう。
【０１２０】  ［００１２０］  好ましい実施の形態では、ハイブリダイゼーションを確実にするために低いストリンジェンシー（この場合、３７℃で６×ＳＳＰＥＴ（０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００））でハイブリダイゼーションを実行し、それから、ミスマッチした混成二本鎖を除去するためにより高いストリンジェンシー（例えば、３７℃で１×ＳＳＰＥＴ）で、続く洗浄を実行する。続く洗浄はハイブリダイゼーション特異性の要求されるレベルが得られるまで、ストリンジェンシーをより高くしながら（例えば、３７℃から５０℃で０．２５×ＳＳＰＥＴまで低く落として）実行されるかもしれない。ストリンジェンシーは、ホルムアミドのような薬剤の添加によっても増加することができる。存在することがありえる様々な対照（例えば、発現レベル対照、規格化対照、ミスマッチ対照など）へのハイブリダイゼーションと試験プローブへのハイブリダイゼーションを比較することによって、ハイブリダイゼーション特異性を評価できる。
【０１２１】  ［００１２１］  一般に、ハイブリダイゼーション特異性（ストリンジェンシー）とシグナル強度の間にはトレードオフがある。このように、好ましい実施の形態では、一貫した結果を生む、そして、バックグランド強度を超えるシグナル強度を与える最も高いストリンジェンシーで、洗浄を実行する。このように、好ましい実施の形態では、ハイブリダイズしたアレイは、継続してより高いストリンジェンシー溶液で洗浄され、各洗浄の間に読み取られる。このようにでてきたデータセットの解析により、それ以上ではハイブリダイゼーションパターンが認めうるほどに変化せず、適切なシグナルを興味ある特定のオリゴヌクレオチドプローブのために適切なシグナルを提供する洗浄ストリンジェンシーが明らかとなる。
【０１２２】  シグナル検出
［００１２２］  リダイズした核酸は、試料核酸に付けられた１つ以上のラベルを検出することによって典型的に検出される。ラベルは、当業者に周知である数多い手段のいずれによって取り込まれてもよい。ＷＯ９９／３２６６０を参照。
【０１２３】  キット
［００１２３］  本発明は、異なる組合せで、高密度のオリゴヌクレオチドアレイ、アレイに使用する試薬、シグナル検出とアレイ−プロセッシング機器、毒物学データベースと分析と上記のデータベース管理ソフトウェアを組合せたキットをさらに含む。例えば、このキットは、試験化合物の毒性反応を予測し、モデリングするために使用できる。
【０１２４】  ［００１２４］  このキットと共にパッケージしてよいデータベースは上述している。具体的には、このデータベースソフトウェア及びパッケージする情報は、コンピュータ可読媒体に格納され、あるいはユーザーのローカルサーバーに転送されたデータベースを含むことができる。別のフォーマットでは、データベース及びソフトウェア情報を、ウェブサイトなどのリモートの電子フォーマットで提供してよく、またそのアドレスをキット中にパッケージしてよい。
【０１２５】  ［００１２５］  マイクロアレイと使用するように設計されたデータベースとソフトウェアは、Ｂａｌａｂａｎらの米国特許第６，２２９，９１１号（少数又は多数のマイクロアレイから収集され、インデックス化された表として保存されている情報を管理するためのコンピュータで実行される方法）及び第６，１８５，５６１号（遺伝子発現レベルデータを集め、追加の特性を加え、そしてそのデータをフォーマットし直して様々な質問に対する答えを出すデータマイニング能力を有する、コンピュータベースの方法）で議論されている。ｃｈｅｅらの米国特許第５，９７４，１６４号には、参照配列にハイブリダイズする野生型及び変異型配列間のプローブ蛍光強度の差異に基づいて、核酸配列中の変異を同定するためのソフトウェアベースの方法が開示されている。
【０１２６】  毒性マーカーの診断用途
［００１２６］  上述のように、化合物に曝された組織若しくは細胞試料の生理的状態の予測又は同定のための診断マーカーとして、或いは化合物又は薬剤の毒作用を同定するが、予測するのに表１及び２に提供されたような遺伝子や遺伝子発現情報、又はそれらの発現情報を備える遺伝子のポートフォリオを使用することができる。例えば、末梢血液細胞の試料のような組織試料又は他の簡単に得ることができる若干の組織試料を上記の方法のいずれかによってアッセイでき、そして、表２に記載された遺伝子又は遺伝子断片の発現レベルが本明細書に記載される毒に曝された組織若しくは細胞で見出される発現レベルと比較できる。これらの方法は、細胞での生理的状態の診断をもたらし、ある化合物（例えば、新規の又は未知の化合物又は薬剤）の潜在的な毒性を確認するために使用することができる。利用できる配列又は他の情報と同様に、発現データの比較は、研究者又は診断者が行ってもよいし、下記のようにコンピュータやデータベースの助けを借りてもなし得る。
【０１２７】  ［００１２７］  別の様式では、試料（例えば、身体の組織若しくは体液試料）中、表２の１又は複数の遺伝子のレベル、それがコードする１又は複数のタンパク質、又は該コードされたタンパク質によって生産されるいかなる代謝産物でも、モニター又は検出して、生物体の生理的状態を確認するか、診断することができる。そのような試料としては、尿、血液及び簡単に取得できる細胞（例えば、末梢リンパ球）を含む、いかなる組織又は液試料でも挙げられる。
【０１２８】  毒性進行をモニターするためのマーカーの使用
［００１２８］  上述のように、医薬、候補薬、毒、汚染物質などに最初に曝された後に見出されるような毒性進行をモニターするためのマーカーとして、表１及び２に提供される遺伝子や遺伝子発現情報を使用することもできる。例えば、組織試料又は細胞試料を上記の方法のいずれによってアッセイでき、そして、表２の遺伝子又は遺伝子断片の発現レベルが本明細書に記載される肝臓毒に曝された組織若しくは細胞で見出される発現レベルと比較できる。利用できる配列又は他の情報と同様に、発現データの比較は、研究者又は診断者が行ってもよいし、下記のようにコンピュータやデータベースの助けを借りてもなし得る。
医薬スクリーニングのための毒性マーカーの使用
【０１２９】  ［００１２９］  本発明によれば、表１及び２で同定された遺伝子を、マーカー又は薬標的として使用して、細胞又は組織試料に対する、候補薬、化学物質又は他の薬剤の効果を評価することができる。遺伝子をその発現や活性を調節する薬剤をスクリーニングするための薬標的として使用することもできる。様々な様式で、候補薬又は薬剤は、所定の１又は複数のマーカーの転写・発現を刺激する能力、或いは１又は複数のマーカーの転写・発現をダウンレギュレート又は妨げる能力をスクリーニングできる。本発明によれば、薬が誘導するマーカーの数を見て、そしてそれらを比較することによって、薬の効果の特異性を比較することもできる。より特異的な薬は、より少ない転写標的を持つ。２つの薬のために同定されたマーカーの類似したセットは、効果の類似性を示すかもしれない。
【０１３０】  ［００１３０］  表１及び２に定義するような１又は複数のマーカーの発現をモニターするためのアッセイは、本発明の核酸の発現レベル変化をモニターするのに利用可能ないかなる手段を利用してもよい。本明細書において、薬剤が細胞で本発明の核酸の発現をアップレギュレート又はダウンレギュレートする能力がある場合、薬剤は本発明の核酸の発現を調節するという。
【０１３１】  ［００１３１］  １つのアッセイ様式で、表２からの１個、２個若しくはそれ以上の遺伝子に対するプローブを含む遺伝子チップを使用して、処理又は曝露された細胞で、遺伝子発現の変化を直接モニター又は検出することができる。株化細胞、組織又は他の試料を最初に試験薬剤にさらし、そしてある場合には既知の毒にさらして、表２の遺伝子又は遺伝子断片のうちの１個若しくはそれ以上、又は好ましくは２個若しくはそれ以上の検出された発現レベルを、既知の毒単独で曝されたそれらと同一の遺伝子の発現レベルと比較する。既知の１又は複数の毒の発現パターンを調節する化合物は、インビボで潜在的に有毒な生理作用を調節することが期待されるだろう。表２中の遺伝子又は遺伝子断片は、既知の肝臓毒に曝されたとき、細胞で差次的に発現されるので、これらのアッセイにおいて特に適切な指標である。
【０１３２】  ［００１３２］  別の様式では、表２の遺伝子又は遺伝子断片のオープンリーディングフレーム及び／又は転写調節領域間のリポーター遺伝子融合を含む株化細胞及びアッセイ可能な融合パートナーを調製する。多数のアッセイ可能な融合パートナーが知られており、容易に入手可能であるが、ホタルルシフェラーゼ遺伝子及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が挙げられる（Ａｌａｍら、（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８：２４５−２５４）。リポーター遺伝子融合を含む株化細胞を、適切な条件と時間で試験される薬剤に曝す。薬剤に曝された試料と対照試料との間のリポーター遺伝子の示差発現は、核酸の発現を調節する薬剤を同定する。
【０１３３】  ［００１３３］  追加のアッセイ様式を用いて、表２中で同定された遺伝子の発現を調節する薬剤の能力をモニターできる。上述のように、例えば、ｍＲＮＡ発現は、本発明の核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションによって直接モニターできる。株化細胞を適切な条件と時間で、試験される薬剤にさらして、トータルＲＮＡ又はｍＲＮＡをｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に開示されているような標準的な手順によって単離する。
【０１３４】  ［００１３４］  本発明の別の実施の形態は、表２の遺伝子又は遺伝子断片によってコードされる１又は複数のタンパク質の少なくとも１つの活性を調節する薬剤を同定するための方法を提供する。そのような方法又はアッセイは、所望の活性をモニター又は検出するいかなる手段をも利用できる。
【０１３５】  ［００１３５］  １つの様式では、試験する薬剤に曝されていない対照細胞集団と比較されるこれに曝された細胞集団と既知の毒に曝された細胞集団との間における表２の遺伝子によってコードされるタンパク質の相対量をアッセイしてもよい。この様式の中で、特異的抗体のようなプローブを用いて、異なる細胞集団でのタンパク質の差次的な発現をモニターする。株化細胞又は細胞集団を、適切な条件と時間の下で試験される薬剤に曝す。曝された株化細胞又は細胞集団、及び対照の曝されていない株化細胞又は細胞集団から細胞溶解液を調製する。この細胞溶解液は、それから、プローブ（例えば、特異的抗体）で分析される。
【０１３６】  ［００１３６］  上記の方法でアッセイした薬剤を無作為に選ぶことができるが、又は合理的に選ぶか若しくは設計することができる。本明細書で使用する場合、薬剤が本発明のタンパク質単独で、又はその関連する基質、結合パートナーなどとの会合に関与する特異的配列を考慮することなく無作為に選ばれるとき、その薬剤は無作為に選ばれるという。無作為に選ばれた薬剤の例は、化学的なライブラリ若しくはペプチドのコンビナトリアルライブラリ、又は生物の成長プロスの使用である。
【０１３７】  ［００１３７］  本明細書で使用する場合、薬剤がその作用と関連して、標的部位の配列及び／又はその立体配座を考慮する、無作為な基準ではなく選ばれるとき、その薬剤は合理的に選ばれる又は設計されるという。薬剤は、これらの部位を構成するペプチド配列を利用することによって合理的に選ぶか、設計することができる。例えば、合理的に選ばれたペプチド薬剤は、そのアミノ酸配列が機能コンセンサス部位と同一であるが、又はその誘導体でありえる。
【０１３８】  ［００１３８］  本発明の薬剤は、例えば、ペプチド、小分子、ビタミン誘導体、同様に炭水化物でありえる。ドミナントネガティブなタンパク質、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ、これらのタンパク質に対する抗体、これらのタンパク質のペプチドフラグメント、又はこれらのタンパク質の模擬体（ミミック）は、機能に影響を及ぼすために細胞に導入される。本明細書で使用する「模擬体（ミミック）」とは、親ペプチドと化学的に構造は異なるが、組織分布的に、そして、機能的に親ペプチドと類似な構造を提供するためのペプチド分子の１つの領域又はいくつかの領域の改変を指す（Ｍｅｙｅｒｓ（編）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）中，６５９−６６４頁、Ｇｒａｎｔ  ＧＡ．の項を参照）。当業者は、本発明の薬剤の構造上の性質に関して、制限がないと容易に認識できる。
【０１３９】  ［００１３９］  さらに説明することなく、当業者は以上の記載と以下の例示的な実施例を使って、本発明の化合物を作りそして利用することができ、請求項に記載の方法を実施できると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好適な実施の形態を特定的に指摘するものであり、開示の残りをいかようにも制限するもとは解釈されるべきではない。
【０１４０】  実施例
実施例１：ＲＭＡ及びＬＰＳを用いた毒性モデルの構築
［００１４０］  様々な肝臓毒素を、上記で議論された関連出願で以前に記載され、また表４で指摘したのと同様に、当技術分野で以前に記載されている投与希釈剤、プロトコール、投与法及びサンプリング（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）の時点（ｔｉｍｅ  ｐｏｉｎｔ）を使用して、様々な時点でＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラットに投与する。使用するプロトコールの例示の通り、この毒素を投与し、動物を屠殺し、下記の時点で腎臓試料を採取する。
【０１４１】  動物の観察
［００１４１］  １．臨床観察−毎日２回、死亡率と瀕死性をチェックする。ケージ側面観察（皮膚と毛、目と粘膜、呼吸系、循環器系、自律神経系及び中心神経系、体性運動パターン及び行動パターン）。震え、痙攣、唾液分泌、下痢、傾眠、昏睡又は異常な行動や外見を含む、毒性の可能性のある兆候が起こったときに、発症の時間、程度及び持続時間も含めて記録した。
【０１４２】  ［００１４２］  ２．身体検査−ランダム化の前、最初の処置前に、そして犠牲（屠殺）の前に。
【０１４３】  ［００１４３］  ３．体重−ランダム化の前、最初の処置前に、そして犠牲の前に。
【０１４４】  臨床病理
［００１４４］  １．頻度−死体解剖の前に。
【０１４５】  ［００１４５］  ２．動物の数−総ての生き残っている動物。
【０１４６】  ［００１４６］  ３．出血手順−７０％ＣＯ２／３０％Ｏ２麻酔下にあるあいだに、眼窩洞に穴を開けて血液を得た。
【０１４７】  ［００１４７］  ４．血液試料の採取−血液学パラメーターの評価のために、約０．５ｍＬの血液をＥＤＴＡチューブに集めた。臨床化学分析のために、約１ｍＬの血液を血清セパレーターチューブに集めた。試験化合物／代謝産物の推定のために、約２００μＬの血漿を取得して、−８０℃で凍結した。追加の２ｍＬの血液を１５ｍＬ円錐状ポリプロピレン・バイアルに収集して、直ちに３ｍＬのＴｒｉｚｏｌを加えた。内容物を直ぐにボルテックス及び繰り返し逆さまにして混合した。それらチューブを液体窒素中で凍結して、−８０℃で保存した。
【０１４８】  終結手順
終結犠牲
［００１４８］  上記のタイムポイントで、ラットを計量し、身体検査して、断頭によって犠牲にし、失血させた。犠牲の約５分以内に動物を死体解剖した。機器は別々に滅菌し、使い捨てのものを各々の動物のために使用した。動物の死体解剖は、  委員会に認証された病理学者に承認された手順に従って実施された。
【０１４９】  ［００１４９］  終結犠牲まで生き残っていない動物は、死体解剖（もし瀕死であるなら、二酸化炭素仮死状態による安楽死に続いて）することなく捨てられた。瀕死又は死んでいるのが見つかった動物の死のおおよその時間を記録した。
【０１５０】  死後手順
［００１５０］  すべての組織は、動物の死のおよそ５分以内に回収して、凍結した。組織は、約−８０℃で保存するか、又は１０％中性緩衝ホルマリンに保存した。
【０１５１】  組織収集及びプロセッシング
［００１５１］  肝臓
１．内側右葉−液体窒素で瞬時に凍結し、そして−８０℃で保存した。
２．内側左葉−１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）に保存し、全体の及び顕微鏡での病理検査のために評価した。
３．外側左葉−液体窒素で瞬時に凍結し、そして−８０℃で保存した。
【０１５２】  ［００１５２］  心臓
１．２つの心房の部分及び２つの心室の部分を含んでいる矢状横断面を１０％ＮＢＦに保存した。残っている心臓を液体窒素で凍結して、−８０℃で保存した。
【０１５３】  ［００１５３］  腎臓（両方）
１．左−半分に切開した。半分を１０％ＮＢＦに保存して、そして残っている半分を液体窒素中で凍結して、−８０℃で保存した。
２．右−半分に切開した。半分を１０％ＮＢＦに保存して、そして残っている半分を液体窒素中で凍結して、−８０℃で保存した。
【０１５４】  ［００１５４］  精巣（両方）−各精巣の矢状横断面を１０％ＮＢＦに保存した。残っている精巣を液体窒素中、一緒に凍結して、−８０℃で保存した。
【０１５５】  ［００１５５］  脳（全部）−大脳半球及び間脳の横断面を１０％ＮＢＦに保存し、そして脳の残りを液体窒素中で凍結して−８０℃で保存した。
【０１５６】  ［００１５６］  マイクロアレイ試料の調製は、アフイメトリックス  ジーンチップ発現解析マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍａｎｕａｌ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）に記載されているプロトコールに従って、若干修正した上で実施した。凍結した組織は、Ｓｐｅｘ  Ｃｅｒｔｉｐｒｅｐ  ６８００  Ｆｒｅｅｚｅｒ  Ｍｉｌｌを使用して、粉末へすりつぶした。トータルＲＮＡは、製造業者のプロトコールを利用してＴｒｉｚｏｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で抽出した。ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ  Ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｍＲＮＡを単離し、エタノール沈殿を行った。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を使用して、ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを生成させた。第１鎖ｃＤＮＡ合成をＴ７−（ｄＴ２４）オリゴヌクレオチドでプライムした。ｃＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出して、終濃度１μｇ／ｍＬにエタノール沈殿した。２μｇのｃＤＮＡからＡｍｂｉｏｎ’ｓ  Ｔ７  ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してｃＲＮＡを合成した。
【０１５７】  ［００１５７］  ｃＲＮＡをビオチンラベルするために、ヌクレオチドＢｉｏ−１１−ＣＴＰとＢｉｏ１６−ＵＴＰ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を反応液に加えた。６時間、３７℃のインキュベーションに続いて、不純物をＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）に従って、ラベルされたｃＲＮＡから取り除いた。ｃＲＮＡを９４℃で３５分間、断片化した（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸、ｐＨ８．１、５００ｍＭ  酢酸カリウム、１５０ｍＭ  酢酸マグネシウムからなるフラグメンテーション緩衝液）。アフィメトリックスプロトコールに従って、５５μｇの断片化したｃＲＮＡを４５℃のハイブリダイゼーション・オーブンの中で、６０ｒｐｍで２４時間、アフィメトリックスラットアレイセットでハイブリダイズした。チップを洗浄して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎ中、ストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）で染色した。染色を増幅するために、抗ストレプトアビジン  ビオチン化抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）染色ステップを間に挟んで、ＳＡＰＥ溶液を２回加えた。プローブアレイへのハイブリダイゼーションは、蛍光測定スキャンニング（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｇｅｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ）によって検出した。データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐバージョン３．０及びＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ（ＥＤＭＴ）ソフトウェア、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓデータベース及びＳ−Ｐｌｕｓ統計分析ソフトウェア（Ｉｎｓｉｇｈｔｆｕｌ  Ｃｏｒｐ）を使用して解析した。
【０１５８】  ＲＭＡとＰＬＳのアルゴリズムを用いた、毒性マーカーと毒性モデルの構築の確認
［００１５８］  ＲＭＡ／ＰＬＳモデルを下記の通り構築する。１種又は複数の検査から得られたＤＮＡマイクロアレイデータから、ＲＭＡ変化倍率発現値の行列を作成する。こうした値を、例えば、次の式：Ｔ（ＰＭｉｊ）＝ｅｉ＋ａｊ＋εｉｊを使用して対数尺度の線形加法モデルを作成するＩｒｉｚａｒｒｙ等（Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ３１（４）：ｅ１５，２００３）の方法に従って作成する。Ｔは、バックグラウンドを補正し、正規化し、かつＰＭ（パーフェクトマッチ）強度を対数尺度に変換する変換値を表す。ｅｉは、アレイｉ＝１−１上で見出されるｌｏｇ２尺度の発現値を表し、ａｊは、プローブｊ＝１−Ｊに関する対数尺度の親和作用を表し、εｉｊは、誤差を表す（様々な強度で結合するプローブを使用する場合の分散の差を補正するため）。
【０１５９】  ［００１５９］  ＲＭＡ変化倍率行列では、行が個々の断片を表し、列が個々の試料である。次いで、ビヒクルコホートメディアン行列（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｈｏｒｔ  ｍｅｄｉａｎ  ｍａｔｒｉｘ）を計算するが、この行列では、行が断片を表し、列がビヒクルコホート（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｈｏｒｔ）を表し、検査／時点の組合せそれぞれに対して１つのコホートである。この行列における値は、こうしたコホート内の試料にわたるメディアンＲＭＡ発現値である。次に、正規化ＲＭＡ発現値の行列を作成するが、この行列では、行が個々の断片を表し、列が個々の試料である。正規化ＲＭＡ値は、ＲＭＡ値から、時間を一致させたビヒクルコホート（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｈｏｒｔ）に対応するビヒクルコボートメディアン行列からの値を引いたものである。次いで、ＰＬＳモデリングを正規化ＲＭＡ行列（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｈｏｒｔ  ｍｅｄｉａｎ  ｍａｔｒｉｘ）（ある断片を以下に記載の通りに取得することによる部分集合）に適用し、−１＝非毒性、＋１＝毒性である監視スコアベクトルを従属変数として、また正規化ＲＭＡ行列の行を独立変数として使用する。ＰＬＳは、１連のＰＬＳ成分を計算することによって機能するが、ここで各成分は断片値の加重線形結合である。ＰＬＳ成分を計算するためには、非線形反復部分最小二乗法が使用される。
【０１６０】  ［００１６０］  断片を選択するために、ビヒクルコホート平均行列（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｈｏｒｔ  ｍｅａｎ  ｍａｔｒｉｘ）を作成するが、この行列では、行が断片を表し、列がビヒクルコホート（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｈｏｒｔ）を表し、検査／時点の組合せそれぞれに対して１種のコホートである。この行列における値は、こうしたコホート内の試料にわたる平均ＲＭＡ発現値である。次いで、処理コホート平均行列を作成するが、この行列では、行が断片を表し、列が処理（ビヒクルでない）（ｎｏｎ−ｖｅｈｉｃｌｅ）コホートを表し、検査／時点／化合物／用量の組合せそれぞれに対して１つのコホートである。この行列における値は、こうしたコホート内の試料にわたる平均ＲＭＡ発現値である。次に、処理コホート変化倍率の行列を作成するが、この行列では、行が断片を表し、列が処理コホートを表し、検査／時点／化合物／用量の組合せそれぞれに対して１つのコホートである。この行列における値は、処理コホート平均行列における値から、時間を一致させた適切なビヒクルコホート（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｈｏｒｔ）に対応するビヒクルコホート平均行列（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｈｏｒｔ  ｍｅａｎ  ｍａｔｒｉｘ）における値を引いたものである。その後、処理コホートｐ値行列を作成するが、この行列では、行が断片を表し、列が処理コホートを表し、検査／時点／化合物／用量の組合せそれぞれに対して１つのコホートである。この行列における値は、処理コホート平均値を、時間を一致させた適切なビヒクルコホート（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｈｏｒｔ）に対応するビヒクルコホート（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｈｏｒｔ）平均値と比較する、２試料のｔ検定に基づくｐ値である。この行列を、０．０５未満であり（１としてコード）、又は０．０５を超える（０としてコード）ｐ値に基づくバイナリコードに変換する。
【０１６１】  ［００１６１］  バイナリ処理コホートｐ値行列の行の和を計算するが、この行列では、行の和が各断片に対する「遺伝子調節スコア」を表し、時間を一致させたそのビヒクルコホート（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｈｏｒｔ）と比較しての、断片が差次的調節（上方又は下方調節）を示した処理コホートの総数を提示する。次いで、ＰＬＳモデリング及び２／３  ／  １／３クロス確認を、上位Ｎ個の断片をその調節スコアに従って取得すること、Ｎ及びＰＬＳ成分の数を変更すること、ならびに組合せそれぞれに対するモデル成功率を記録することに基づいて実行する。Ｎは、クロス確認による誤差率を最小限に抑えるポイントとなるように選択される。ＰＬＳモデルでは、こうしたＮ個の断片のそれぞれが、このモデルにおける断片の有用性又は予測能力に対応するＰＬＳ重み（ＰＬＳスコア）を受け取る（様々な肝毒性モデルにおける個々の遺伝子及び遺伝子断片に関するＰＬＳ重みスコアのリストについては表２を参照されたい）。表２は、１３個の肝毒性モデルを表し、各モデルにおける各マーカーに関する遺伝子又は遺伝子断片名、及び各遺伝子又は遺伝子断片に関する対応するＰＬＳ重み又はインデックススコアを含む。そのモデルは以下の通りである：一般毒性、ネガティブコントロール、薬理学的に活性があるネガティブコントロール、遺伝毒性による発癌、非遺伝毒性／非発癌、ラット特異的非遺伝毒性、胆汁うっ滞、肝炎、ヒト特異的毒性、肝肥大誘発剤、ペルオキシソーム増殖因子、微小胞脂肪症、大滴性脂肪症、一般脂肪症、及び壊死。
【０１６２】  ［００１６２］  ある毒性モデルに関する毒性予測スコアのカットオフ値を確立するため、訓練セットにおけるすべての毒性及び非毒性試料からのスコアを使用して、可能な各スコアのカットオフ値に関する真陽性率及び偽陽性率を計算する。これによりＲＯＣ曲線が作成され、この曲線を使用して、〜５％の偽陽性率に相当するＲＯＣ曲線における点でカットオフスコアを設定する。
モデル                  カットオフ値
一般                      ０．２５６
胆汁うっ滞                ０．１４６
遺伝毒性／発癌性          ０．１９７
肝炎                      ０．２６
ヒト特異的毒性            ０．２８
肝腫大の誘導              ０．２５３
大滴性脂肪症              ０．１６８
微小胞脂肪症              ０．２２７
壊死                      ０．２９５
非遺伝毒性／非発癌性      ０．１６６
ペルオキシソーム増殖      ０．０９５
ラット非遺伝毒性          ０．１４７
脂肪症                    ０．２３２
【０１６３】  ［００１６３］  毒性反応を予測することができない各遺伝子に対して−１のスコアを設定することにより、また毒性反応を予測することができる各遺伝子に対して＋１のスコアを設定することにより、このモデルを訓練することができる。ＲＭＡ／ＰＬＳモデルの交差検定を、化合物ドロップ法（ｃｏｍｐｏｕｎｄ−ｄｒｏｐ  ｍｅｔｈｏｄ）によって、また２／３：１／３法によって実施してよい。化合物ドロップ法では、ある特定の試験化合物で処理した動物からの試料データをあるモデルから取り出し、このモデルにより毒性を予測できるかどうかを、全データセットを含むモデルと比較する。２／３：１／３法では、モデルにおけるランダムな３分の１の遺伝子からの遺伝子発現情報を取り出し、この部分集合モデルにより毒性を予測できるかどうかを、全データセットを含むモデルと比較する。
【０１６４】  実施例２：試験薬剤の少なくとも１種の毒作用を予測する方法
［００１６４］  ある試験薬剤又は化合物で処理した動物からの試料が少なくとも１種の毒作用又は毒性反応を示すか否かを判定するために、上記の実施例１に記載の通り、その薬剤に曝された細胞又は組織試料からＲＮＡを調製し、ＤＮＡマイクロアレイとハイブリッド形成させる。その核酸ハイブリダイゼーションデータから、以下の式に従って、その試料に関する予測スコアを計算し、毒性参照データベースからの参照スコアと比較する。試料予測スコア＝ΣｗｉＲＦＣｉ。「ｉ」は、評価すべき遺伝子発現プロファイルにおける各遺伝子のインデックスナンバーである。「ｗｉ」は、各遺伝子に関するＰＬＳ重み（又はＰＬＳスコア、腎臓の一般毒性モデルのＰＬＳスコアの例示リストに関する表２を参照）である。「ＲＦＣｉ」は、（上記の）試料からの遺伝子発現データの正規化ＲＭＡ行列から求めた、第ｉ番目の遺伝子に関するＲＭＡ  変化倍率である。ＰＬＳ重みにＲＭＡ  変化倍率を掛けると、各遺伝子に関する遺伝子調節スコアが得られ、その個々の遺伝子すべてに関する調節スコアを合計すると、その試料に関する予測スコアが得られる。
【０１６５】  ［００１６５］  品質管理（ＱＣ）チェックとして、それぞれの入力検査について、平均相関評価を実施する。ＲＭＡ行列を作成した後（試料ごとの遺伝子）、試料相互のＰｅａｒｓｏｎ相関行列を計算する。この行列は、試料ごとのものである。各試料の行列の行について、対角項（常に１である）を除いた、行列のその行におけるすべての相関値の平均を計算する。この平均は、その試料に関する平均相関である。その平均相関がある閾値（例えば０．９０）未満の場合、潜在的異常値として試料にフラグをたてる。このプロセスを検査の各行（試料）について反復する。平均相関ＱＣチェックによってフラグをたてられた異常値を、このプロセスにおける下流での任意の正規化、予測、又は化合物類似の工程から外す。
【０１６６】  ［００１６６］  表２の肝毒性モデルでは、カットオフ予測スコアは、以下に示す通り約０．０９５から約０．２９５の範囲にある。ある試料スコアが、特定の肝毒性モデル、例えば胆汁うっ滞病態モデルと比較すると、約０．１４６以上である場合、この試料は試験化合物への曝露後、毒性反応を示すことが予測され得る。この試料スコアが０．１４６より低い場合、この試料は毒性反応を示さないことが予測され得る。
【０１６７】  ［００１６７］  化合物類似を以下のように評価する。上記のものと同じようにして、検査／時点／化合物／用量の組合せそれぞれに対するコホート変化倍率ベクトルを計算する。このベクトルを、ＰＬＳ予測モデルで使用する断片のみにする。次に参照データベース内の各コホートベクトルを用いて、そのコホート変化倍率ベクトルに関するＰｅａｒｓｏｎ相関を計算する（これもＰＬＳ予測モデルで使用する断片のみにする）。最後に、こうしたＰｅａｒｓｏｎ相関を最高から最低まで計算して分類し、その結果を毒性モデルに保存し報告する。
【０１６８】  ［００１６８］  少なくとも１種の毒作用を予測する方法の結果に関係する情報又はデータを含むレポートを作成してよい。このレポートは、データベースからの少なくとも１種の毒性参照予測スコアとの少なくとも１種の試料予測スコアの比較によって予測される毒作用に関係する情報を含むことができる。このレポートは、データの完全性など、核酸ハイブリダイゼーションデータに関する情報、ならびに核酸ハイブリダイゼーションデータに注釈を付けるのに使用する情報など、データベースのユーザー及び本発明の方法によって入力された情報を提供することもできる。作成してよい毒性レポートの非限定的な一例についてはＰＣＴ  ＵＳ第０２／２２７０１号を参照のこと。
【０１６９】  ［００１６９］  本発明を、上記の実施例に関連して詳細に記載してきたが、本発明の精神から逸脱することなく様々な変更形態を実施することができることを理解されたい。したがって、本発明は、特許請求の範囲によってしか限定されない。本明細書において言及されるすべての引用された特許、特許出願、及び刊行物は、それらの全体が本明細書に参照により組み入れられる。
【０１７０】
【表１−１】
2007533005.tif 000002
【０１７１】
【表１−２】
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【０１７２】
【表１−３】
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【０１７３】
【表１−４】
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【０１７４】
【表１−５】
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【０１７５】
【表１−６】
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【０１７６】
【表１−７】
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【０１７７】
【表１−８】
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【０１７８】
【表１−９】
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【０１７９】
【表１−１０】
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【０１８０】
【表１−１１】
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【０１８１】
【表１−１２】
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【０１８２】
【表１−１３】
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【０１８３】
【表１−１４】
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【０１８４】
【表１−１５】
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【０１８５】
【表１−１６】
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【０１８６】
【表１−１７】
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【０１８７】
【表１−１８】
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【０１８８】
【表１−１９】
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【０１８９】
【表１−２０】
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【０１９０】
【表１−２１】
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【０１９１】
【表１−２２】
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【０１９２】
【表１−２３】
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【０１９３】
【表１−２４】
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【０１９４】
【表１−２５】
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【０１９５】
【表１−２６】
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【０１９６】
【表１−２７】
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【０１９７】
【表１−２８】
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【０１９８】
【表１−２９】
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【０１９９】
【表１−３０】
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【０２００】
【表１−３１】
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【０２０１】
【表１−３２】
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【０２０２】
【表１−３３】
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【０２０３】
【表１−３４】
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【０２０４】
【表１−３５】
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【０２０５】
【表１−３６】
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【０２０６】
【表１−３７】
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【０２０７】
【表１−３８】
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【０２０８】
【表１−３９】
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【０２０９】
【表１−４０】
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【０２１０】
【表１−４１】
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【０２１１】
【表１−４２】
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【０２１２】
【表２−１】
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【０２１３】
【表２−２】
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【０２１４】
【表２−３】
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【０２１５】
【表２−４】
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【０２１６】
【表２−５】
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【０２１７】
【表２−６】
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【０２１８】
【表２−７】
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【０２１９】
【表２−８】
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【０２２０】
【表２−９】
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【０２２１】
【表２−１０】
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【０２２２】
【表２−１１】
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【０２２３】
【表２−１２】
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【０２２４】
【表２−１３】
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【０２２５】
【表２−１４】
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【０２２６】
【表２−１５】
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【０２２７】
【表２−１６】
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【０２２８】
【表２−１７】
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【０２２９】
【表２−１８】
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【０２３０】
【表２−１９】
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【０２３１】
【表２−２０】
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【０２３２】
【表２−２１】
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【０２３３】
【表３−１】
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【０２３４】
【表３−２】
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【０２３５】
【表３−３】
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【０２３６】
【表３−４】
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【０２３７】
【表４−１】
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【０２３８】
【表４−２】
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【０２３９】
【表４−３】
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【０２４０】
【表４−４】
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【０２４１】
【表４−５】
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【０２４２】
【表５−１】
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【０２４３】
【表５−２】
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【０２４４】
【表５−３】
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【０２４５】
【表５−４】
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【０２４６】
【表５−５】
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【０２４７】
【表５−６】
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【０２４８】
【表５−７】
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【０２４９】
【表５−８】
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【０２５０】
【表５−９】
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【０２５１】
【表５−１０】
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【０２５２】
【表５−１１】
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【０２５３】
【表５−１２】
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【０２５４】
【表５−１３】
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【０２５５】
【表５−１４】
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【０２５６】
【表５−１５】
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【０２５７】
【表５−１６】
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【０２５８】
【表５−１７】
2007533005.tif 000090
【０２５９】
【表５−１８】
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【０２６０】
【表５−１９】
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【０２６１】
【表５−２０】
2007533005.tif 000093
【０２６２】
【表５−２１】
2007533005.tif 000094
【０２６３】
【表５−２２】
2007533005.tif 000095
【０２６４】
【表５−２３】
2007533005.tif 000096
【０２６５】
【表５−２４】
2007533005.tif 000097
【０２６６】
【表５−２５】
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【０２６７】
【表５−２６】
2007533005.tif 000099
【０２６８】
【表５−２７】
2007533005.tif 000100
【０２６９】
【表５−２８】
2007533005.tif 000101
【０２７０】
【表５−２９】
2007533005.tif 000102
【０２７１】
【表５−３０】
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【０２７２】
【表５−３１】
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【０２７３】
【表５−３２】
2007533005.tif 000105
【０２７４】
【表５−３３】
2007533005.tif 000106
【０２７５】
【表５−３４】
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【０２７６】
【表５−３５】
2007533005.tif 000108
【０２７７】
【表５−３６】
2007533005.tif 000109
【０２７８】
【表５−３７】
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【０２７９】
【表５−３８】
2007533005.tif 000111
【０２８０】
【表５−３９】
2007533005.tif 000112
【０２８１】
【表５−４０】
2007533005.tif 000113
【０２８２】
【表６−１】
2007533005.tif 000114
【０２８３】
【表６−２】
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【０２８４】
【表６−３】
2007533005.tif 000116
【０２８５】
【表６−４】
2007533005.tif 000117
【０２８６】
【表６−５】
2007533005.tif 000118
【０２８７】
【表６−６】
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【０２８８】
【表６−７】
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【０２８９】
【表６−８】
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【０２９０】
【表６−９】
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【０２９１】
【表６−１０】
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【０２９２】
【表６−１１】
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【０２９３】
【表６−１２】
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【０２９４】
【表６−１３】
2007533005.tif 000126
【０２９５】
【表６−１４】
2007533005.tif 000127
【０２９６】
【表６−１５】
2007533005.tif 000128
【０２９７】
【表６−１６】
2007533005.tif 000129
【０２９８】
【表６−１７】
2007533005.tif 000130
【０２９９】
【表６−１８】
2007533005.tif 000131
【０３００】
【表６−１９】
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【０３０１】
【表６−２０】
2007533005.tif 000133
【０３０２】
【表６−２１】
2007533005.tif 000134
【０３０３】
【表６−２２】
2007533005.tif 000135
【０３０４】
【表６−２３】
2007533005.tif 000136
【０３０５】
【表６−２４】
2007533005.tif 000137
【０３０６】
【表６−２５】
2007533005.tif 000138
【０３０７】
【表６−２６】
2007533005.tif 000139
【国際調査報告】
2007533005.tif 000140
2007533005.tif 000141
2007533005.tif 000142
2007533005.tif 000143