(57)【要約】  本発明は、新規ＲＧＤ包含ポリペプチド、それらを含む組成物および複合体ならびにそれらの使用に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ１Ｘ４Ｘ５Ｘ６若しくは一般式（ＩＩ）Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ１Ｘ１０Ｙ１Ｘ１１によって示されるアミノ酸配列、あるいはＮ末端若しくはＣ末端の１若しくは２個、好ましくは１個のアミノ酸（群）またはＮおよびＣ末端の１アミノ酸を欠いている該アミノ酸配列を有する少なくとも１つの結合ペプチドを含むポリペプチドであって、式中：
Ｙ１はＣｙｓであり
Ｙ２はＡｒｇであり
Ｙ３はＧｌｙであり
Ｙ４はＡｓｐであり
Ｘ１はＡｌａ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＳｅｒ、特にＡｌａまたはＬｅｕであり；
Ｘ２はＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、またはＳｅｒ、特にＡｒｇまたはＳｅｒであり；
Ｘ３はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、特にＧｌｙ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒであり；
Ｘ４はＧｌｎ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＶａｌ、特に、ＰｈｅまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎ、特にＡｓｐまたはＧｌｎであり；
Ｘ６はＡｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、特にＡｌａ、ＧｌｎまたはＧｌｙであり；
Ｘ７はＧｌｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、またはＶａｌ、特にＧｌｕまたはＶａｌであり；
Ｘ８はＡｌａまたはＣｙｓ、特にＣｙｓであり；
Ｘ９はＡｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、またはＨｉｓ、特にＧｌｎであり；
Ｘ１０はＬｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、特にＬｅｕであり；ならびに
Ｘ１１はＧｌｎ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、またはＶａｌ、特にＰｒｏであり、
式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４は、互いに独立して、それぞれ指定されるアミノ酸のＤ若しくはＬアミノ酸またはアミノ酸残基模倣物である、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１のポリペプチドであって、式中：
Ｘ１はＡｌａまたはＬｅｕであり；
Ｘ２はＡｒｇまたはＳｅｒであり；
Ｘ３はＧｌｙ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒであり
Ｘ４はＰｈｅまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｓｐまたはＧｌｎであり；
Ｘ６はＡｌａ、Ｇｌｎ、またはＧｌｙであり；
Ｘ７はＧｌｕまたはＶａｌであり；
Ｘ８はＣｙｓであり；
Ｘ９はＧｌｎであり；
Ｘ１０はＬｅｕであり；ならびに
Ｘ１１はＰｒｏである、ポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列が、配列番号１〜１５に示される、請求項１のポリペプチド。
【請求項４】
１００、好ましくは２０、最も好ましくは１２アミノ酸長を有する、請求項１〜３のいずれか一項のポリペプチド。
【請求項５】
サイトカイン、ケモカイン、成長因子、接着分子、抗体軽鎖および／若しくは重鎖、単鎖抗体、毒素、酵素、受容体リガンド、溶解性ペプチド、膜挿入配列および蛍光タンパク質またはその断片からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項のポリペプチド。
【請求項６】
少なくとも１つの化学的部分に取り付けられている、請求項１〜５のいずれか一項のポリペプチド。
【請求項７】
化学的部分が、スペーサー、マーカー、タグ、脂質、特にリン脂質、薬物、キャップ基および、第二の化学的部分に取り付けられているスペーサーからなる群から選択される、請求項６のポリペプチド。
【請求項８】
スペーサーが、二官能性ポリエチレングリコールおよびその誘導体、１〜４０個の範囲の天然または合成アミノ酸を含むオリゴペプチド、８−アミノ−３，６−ジオキサタン酸（ｄｏｏ）、および（ｄｏｏ）ｎ、式中ｎ＝２〜１０、からなる群から選択される、請求項７のポリペプチド。
【請求項９】
マーカーが、高電子密度分子、常磁性分子、超常磁性分子、放射性分子、非放射性同位体、および蛍光性分子からなる群から選択される、請求項７のポリペプチド。
【請求項１０】
脂質が、グリセリド、グリセロリン脂質、グリセロホスフィノリピド、グリセロホスホノリピド、スルホリピド、スフィンゴ脂質、リン脂質、イソプレノリド、ステロイド、ステアリン、ステロール、および炭水化物含有脂質からなる群から選択される、請求項７のポリペプチド。
【請求項１１】
リン脂質が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、特にジステアロイルホスファチジル（ＤＳＰＥ）またはアルファ−（ジパルミトイルホスファチジル（ＤＰＰ）からなる群から選択される、請求項１０のポリペプチド。
【請求項１２】
脂質が、以下からなる群から選択される、請求項７のポリペプチド：Ｎ−カプロイルアミン−ＰＥ、Ｎ−ドデカニルアミン−ＰＥ、ホスファチジルチオエタノール、Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−カルボキサミド−ＰＥ（Ｎ−ＭＣＣ−ＰＥ）、Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド］−ＰＥ（Ｎ−ＭＰＢ）、Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート］−ＰＥ（Ｎ−ＰＤＰ）、Ｎ−スクシニル−ＰＥ、Ｎ−グルタリル−ＰＥ、Ｎ−ドデカニル−ＰＥ、Ｎ−ビオチニル−ＰＥ、Ｎ−ビオチニル−ｃａｐ−ＰＥ、ホスファチジル−（エチレングリコール）、ＰＥ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−カルボン酸、ＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥ−ＰＥＧ−ＰＤＰ、ＰＥ−ＰＥＧ−アミン、ＰＥ−ＰＥＧ−ビオチン、ＰＥ−ＰＥＧ−ＨＮＳ、ジパルミトイル−グリセロスクシニル−リシン、アルファ−メトキシ−オメガ−（１，２−ジオクタデセノイルオキシグリセリル）（ＤＯ）、アルファ−メトキシ−オメガ−（１，２−ジテトラデセノイルオキシグリセリル）（ＤＴ）。
【請求項１３】
第二の化学的部分が、薬物、マーカー、タグおよび脂質からなる群から選択される、請求項７のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜５の少なくとも１つのポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１４のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１４または１５のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドが、原核および／または真核宿主細胞での発現を許容する発現制御配列に作動的に連結されている、請求項１０のベクター。
【請求項１８】
請求項１４若しくは１５のポリヌクレオチド、または請求項１６若しくは１７のベクターで遺伝子改変されている宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１４若しくは１５のポリヌクレオチド、請求項１６若しくは１７のベクター、および／または請求項１８の宿主細胞を含有するトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２０】
請求項１〜１３のポリペプチド内のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体。
【請求項２１】
少なくとも１つの、請求項１〜１３のいずれか一項のポリペプチドおよび、リポソーム、ウイロソーム、ミクロスフェア、ニオソーム、デントリマー、安定化剤、バッファー、賦形剤および添加物からなる群から選択される少なくとも１つの追加の成分を含む組成物。
【請求項２２】
ポリペプチドが、リポソーム、ミクロスフェア、ニオソーム、デントリマー、またはウイロソーム内に組み込まれているか、あるいはそれらに取り付けられている、請求項２１の組成物。
【請求項２３】
リポソームまたはウイロソームが、グリセリド、グリセロリン脂質、グリセロホスフィノリピド、グリセロホスホノリピド、スルホリピド、スフィンゴ脂質、リン脂質、イソプレノリド、ステロイド、ステアリン、ステロール、および炭水化物含有脂質からなる群から選択される脂質を含む、請求項２１または２２の組成物。
【請求項２４】
リポソームまたはウイロソームがコレステロール（ＣＨ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項の組成物。
【請求項２５】
ＣＨおよびＳＭが、リポソームまたはウイロソームの総モル脂質組成に関して、それぞれ４０〜６０ｍｏｌ％および１０〜２０ｍｏｌ％のモル比で存在する、請求項２４の組成物。
【請求項２６】
ＣＨおよびＳＭが、リポソームまたはウイロソームの総モル脂質組成に関して、それぞれ４８〜５２ｍｏｌ％および１２〜１６ｍｏｌ％のモル比で存在する、請求項２５の組成物。
【請求項２７】
ＰＥおよび／またはＰＣをさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか一項の組成物。
【請求項２８】
ＰＥおよびＰＣが、リポソームまたはウイロソームの総モル脂質組成に関して、それぞれ５〜２５ｍｏｌ％および１５〜４０ｍｏｌ％のモル比で存在する、請求項２７の組成物。
【請求項２９】
以下からなる群から選択される薬物をさらに含む、請求項２１〜２８の組成物：鎮痛薬、抗リウマチ薬、駆虫薬、抗アレルギー薬、抗貧血薬、抗不整脈薬、抗生物質、血管形成阻害剤、抗感染薬、抗痴呆薬（向知性薬）、抗糖尿病薬、解毒薬、制吐薬、抗目眩薬、抗てんかん薬、抗出血薬、抗高血圧薬、抗低血圧薬、抗凝血薬、抗真菌薬、鎮咳薬、抗ウイルス薬、ベータ−受容体およびカルシウムチャネルアンタゴニスト、気管支溶解および抗喘息薬、ケモカイン、サイトカイン、分裂促進因子、細胞増殖抑制薬、細胞障害性物質およびそのプロドラッグ、皮膚薬、催眠薬および鎮静薬、免疫抑制薬、免疫賦活薬、ペプチドまたはタンパク質薬物、特にホルモンおよび、分裂促進因子、ケモカイン、またはサイトカインの生理学的若しくは薬理学的阻害剤またはそれらの各プロドラッグ−この場合、当然ながら、一度に１以上の薬物を本発明のリポソームに含ませることも想定される。
【請求項３０】
細胞増殖抑制薬および細胞障害性薬物が、以下からなる群から選択される、請求項２９の組成物：アルキル化用物質、代謝拮抗剤、抗生物質、エポシロン、核内受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、白金化合物、ホルモンおよび抗ホルモン、インターフェロンおよび細胞周期依存性プロテインキナーゼ（ＣＤＫ）の阻害剤、シクロオキシゲナーゼおよび／若しくはリポキシゲナーゼの阻害剤、生合成脂肪酸および脂肪酸誘導体、例えばプロスタノイドおよびロイコトリエン、プロテインキナーゼの阻害剤、プロテインホスファターゼの阻害剤、脂質キナーゼの阻害剤、白金配位錯体、エチレンイメン、メチルメラミン、トラジン、ビンカアルカロイド、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、アルキルスルホナート、葉酸アナログ、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、特にアセジアスルホン、アクラルビシン、アンバゾン、アミノグルテチミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、フォリン酸カルシウム、カルボプラチン、カルペシタビン、カルムスチン、セレコキシブ、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン ダプゾン、ダウノルビシン、ジブロムプロパミジン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エネジイン、エピルビシン、エポシロンＢ、エポシロンＤ、エストラムシンホスファート、エストロゲン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド ホスフェストロール、フラゾリドン、ゲムシタビン、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシメチルニトロフラントイン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イドクスウリジン、イホスファミド、インターフェロンα、イリノテカン、ロイプロリド、ロムスチン、ルルトテカン、マフェナイドサルファートオールアミド、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メガストロール、メルファラン、メパクリン、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトロニダゾール、マイトマイシンＣ、ミトポドジド、ミトタン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ナリジクス酸、ニフラテル、ニフロキサジド、ニフララジン、ニフルチモクス、ニムスチン、ニノラゾール、ニトロフラントイン、ナイトロジェンマスタード、オレオムシン、オキソリニン酸、ペンタミジン、ペントスタチン、フェナゾピリジン、フタリルスルファチアゾール、ピポブロマン、プレドニムスチン、プレドニゾン、プレウシン、プロカルバジン、ピリメタミン、ラルチトレキセド、ラパマイシン、ロフェコキシブ、ロシグリタゾン、サラゾスルファピリジン、スクリフラビニウムクロライド、セムスチン ストレプトゾシン、スルファカルバミド、スルファセタミド、スルファクロピリダジン、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファエチドール、スルファフラゾール、スルファグアニジン、スルファグアノール、スルファメチゾール、スルファ���トキサゾール、コトリモキサゾール、スルファメトキシジアジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモキソール、スルファニルアミド、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファチアゾール、スルフイソミジン、スタウロスポリン、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、テルチポシド、テストラクトン、プロピオン酸テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チニダゾール、トポテカン、トリアジクォン、トレオスルファン、トリメトプリム、トロホスファミド、ＵＣＮ−０１、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびゾルビシン、またはそれらの各誘導体またはそのアナログ。
【請求項３１】
増殖性疾患、免疫疾患、特に自己免疫疾患、感染症、血管疾患、リウマチ様疾患、特に骨関節炎および関節リウマチまたは、疾患部位中若しくは疾患部位に隣接する細胞がαＶβ３および／若しくはαＶβ５インテグリンを発現している疾患、および炎症性疾患の治療用の医薬品の製造に関する、請求項１〜１３のいずれか一項のポリペプチドまたは請求項２１〜３０のいずれか一項の組成物の使用。
【請求項３２】
増殖性疾患が、以下からなる群から選択される、請求項３１の使用：胃腸管または結腸直腸管、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、前立腺、子宮内膜、卵巣、精巣の癌腫、黒色腫、形成異常の口腔粘膜、浸潤性経口癌、小細胞および非小細胞肺癌腫、ホルモン依存性乳癌、非依存性乳癌、移行および扁平細胞癌、神経学的悪性腫瘍、例えば神経芽細胞腫、神経膠腫、星細胞腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、血管腫、内分泌学的腫瘍、血液学的異常増殖、例えば白血病、リンパ腫、および他の骨髄増殖性およびリンパ球増殖性疾患、上皮内癌、過形成性病変、腺腫、線維腫、組織球増殖症、慢性炎症性増殖性疾患、血管増殖性疾患およびウイルス誘発性増殖性疾患。
【請求項３３】
増殖性疾患、免疫疾患、感染症、血管疾患、リウマチ様疾患、炎症性疾患、および、αＶβ３および／またはαＶβ５インテグリンの発現の増加若しくは減少に関連する疾患の診断に関する、請求項１〜１３のポリペプチドおよび／あるいは請求項２１〜３０の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のＲＧＤ包含ポリペプチド、それらを含む組成物および複合体ならびに、特に増殖性疾患、免疫疾患、感染症、血管疾患、リウマチ様疾患、疾患部位中または疾患部位に隣接する細胞がαＶβ３および／またはαＶβ５インテグリンを発現している疾患および炎症性疾患の治療に関するその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物を体内の特定部位にのみ送達することが標的薬物療法の主たる目標の１つである。この概念は、身体の組織または細胞型の亜集団においてのみの特定の標的構造の発現差に依存する。したがって多数のグループが、種々の組織型間または健康および疾患状態の組織または細胞間における細胞表面マーカーの発現差を解明しようとしてきた。標的化薬物送達は、特に、通常非常に有毒な物質を全身投与する癌の化学療法に関して魅力的な概念である。主に腫瘍細胞または少なくとも主に腫瘍細胞付近への標的化薬物送達によれば、化学治療薬の量を増やすことが可能であり、該治療薬は同一レベルの全身毒性で投与することができるが、腫瘍部位で増大した効果を有し、あるいは化学治療薬の量を減らすことが可能であり、該治療薬はそれゆえに低下した全身毒性で投与されつつ、依然として腫瘍部位で同一の効果を誘発するであろうと考えられる。
【０００３】
現在までに同定されている多数の発現差を示す標的構造のうち、αＶβ３およびαＶβ５インテグリンは特に魅力的な標的構造である。その理由は、それらが腫瘍脈管構造の増殖性内皮細胞において上方制御されるからである。ゆえに腫瘍脈管構造のターゲティングは癌標的治療に関する有望な新規アプローチである（Matter (2001) Drug Discov. Today 6: 1005-1024（非特許文献１））。血管ターゲティング用物質は、腫瘍の脈管構造に特異的に、細胞障害性、抗血管原性、凝血原、またはプロアポトーシス物質を送達するように設計される。使用されるリガンドは、腫瘍血管に関連する構造、すなわち内皮細胞によって発現され、あるいは細胞外基質に結合しているタンパク質を認識する（Thorpe et al., (2003) Cancer Res. 63: 1144-1147（非特許文献２）; Halin et al. (2001) News Physiol. Sci. 16: 191-194（非特許文献３））。脈管構造のターゲティングは腫瘍細胞のターゲティングと比べていくつかの利点を有する（Augustin (1998) Trends. Pharmacol. Sci. 19: 216-222（非特許文献４））。内皮細胞は循環担体系に容易に接近でき、また腫瘍内に浸透する必要がないので、生理学的障壁は存在しない。少数の毛細管内皮細胞を破壊するだけで、それに依存する多数の腫瘍細胞に影響を与える。すべての固形腫瘍は直径数ミリメートルを超えて成長するのに新血管新生に依存するため、本アプローチは広く適用可能であろう。最後に、内皮細胞は遺伝的に安定であり、変異のせいで治療に抵抗性になることはない。
【０００４】
さらにαＶβ３およびαＶβ５インテグリンは種々の腫瘍細胞、例えば転移性黒色腫細胞上に認められる（Conforti et al. (1992) Blood 80: 437-446（非特許文献５）; Gehlsen et al. (1992) Clin. Exp. Metastasis 10: 111-120（非特許文献６）; Seftor et al. (1999) Cancer Metastasis Rev. 18: 359-375（非特許文献７）およびVarner & Cheresh (1996) Curr. Opin. Cell. Biol. 8: 724-730（非特許文献８）; Nahde et al, (2001) J. Gene Med. 3: 353-361（非特許文献９））。αＶβ３およびαＶβ５インテグリンへのターゲティングは、ＲＧＤ含有ペプチドによって達成することができ、この場合、種々の線状および環状ＲＧＤ含有ペプチドを用いる（DeNardo et al. (2000) Cancer Biother. Radiopharm. 15: 71-79（非特許文献１０）; Pasqualini et al. (1997) Nat. Biotechn. 15: 542-546（非特許文献１１））。これらのＲＧＤペプチドのいくつかは、インビトロおよびインビボで放射性核種、タンパク質、細胞障害性薬物またはウイルス性および非ウイルス性担体系をインテグリン発現細胞に送達するためにすでに使用されている（Arab et al. (1998) Science 279: 377-380（非特許文献１２）; Schraa et al. (2002) Int. J. Cancer 102: 469-475（非特許文献１３）; Jansen et al. (2002) Cancer Res. 62: 6146-6151（非特許文献１４）; Erbacher et al. (1999) Gene Ther. 6: 138-145（非特許文献１５）; Mueller et al. (2001) Cancer Gene Ther. 8: 107-117（非特許文献１６）およびWicknam et al. (1997) J. Virol. 170: 8221-8229（非特許文献１７）; Nahde et al, (2001) J. Gene Med. 3: 353-361（非特許文献９））。
【０００５】
ＲＧＤ包含インテグリン結合ペプチドを設計する際の１つの問題は、得られるペプチドのコンフォメーション上の安定性が欠けていることにある。この問題は、例えばUS 5,880,092（特許文献１）ではＲＧＤ含有ペプチド配列の環化によって対処されている（同様に、例えばKoivunen, et al. (1995) Biotechnology 13: 265-280（非特許文献１８）, U.S. 5,880,092（特許文献２）; US 5,981,468（特許文献３）; US 6,020,460（特許文献４）; US 5,906,975（特許文献５）; US 5,985,827（特許文献６）; US 5,827,821（特許文献７）;およびUS 6,353,090（特許文献８）を参照のこと）。コンフォメーションが安定なＲＧＤ包含インテグリン結合ペプチドを提供する他のアプローチは４個のシステイン残基の導入を含み、これは段階的様式で酸化されて、１−４および２−３コンフォメーションにおいて好ましい２個の分子間架橋を形成する。これは例えばAssa-Munt et al. (2001) Biochemistry 40: 2373-2378（非特許文献１９）に記載される通りである。しかし、このような安定化型ペプチドの作成には２回の独立した酸化段階が関与し、この段階は煩雑である。
【特許文献１】米国特許第5,880,092号公報
【特許文献２】米国特許第5,880,092号公報
【特許文献３】米国特許第5,981,468号公報
【特許文献４】米国特許第6,020,460号公報
【特許文献５】米国特許第5,906,975号公報
【特許文献６】米国特許第5,985,827号公報
【特許文献７】米国特許第5,827,821号公報
【特許文献８】米国特許第6,353,090号公報
【非特許文献１】Matter (2001) Drug Discov. Today 6: 1005-1024
【非特許文献２】Thorpe et al., (2003) Cancer Res. 63: 1144-1147
【非特許文献３】Halin et al. (2001) News Physiol. Sci. 16: 191-194
【非特許文献４】Augustin (1998) Trends. Pharmacol. Sci. 19: 216-222
【非特許文献５】Conforti et al. (1992) Blood 80: 437-446
【非特許文献６】Gehlsen et al. (1992) Clin. Exp. Metastasis 10: 111-120
【非特許文献７】Seftor et al. (1999) Cancer Metastasis Rev. 18: 359-375
【非特許文献８】Varner & Cheresh (1996) Curr. Opin. Cell. Biol. 8: 724-730
【非特許文献９】Nahde et al, (2001) J. Gene Med. 3: 353-361
【非特許文献１０】DeNardo et al. (2000) Cancer Biother. Radiopharm. 15: 71-79
【非特許文献１１】Pasqualini et al. (1997) Nat. Biotechn. 15: 542-546
【非特許文献１２】Arab et al. (1998) Science 279: 377-380
【非特許文献１３】Schraa et al. (2002) Int. J. Cancer 102: 469-475
【非特許文献１４】Jansen et al. (2002) Cancer Res. 62: 6146-6151
【非特許文献１５】Erbacher et al. (1999) Gene Ther. 6: 138-145
【非特許文献１６】Mueller et al. (2001) Cancer Gene Ther. 8: 107-117
【非特許文献１７】Wicknam et al. (1997) J. Virol. 170: 8221-8229
【非特許文献１８】Koivunen, et al. (1995) Biotechnology 13: 265-280
【非特許文献１９】Assa-Munt et al. (2001) Biochemistry 40: 2373-2378
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ゆえに当技術分野では、新規ＲＧＤ包含ペプチドであって、高いインテグリン結合親和性を示し、ならびに／あるいは容易に安定型で製造することができるペプチドを同定する必要性が依然として存在する。この目的を達成するために、本発明者らは新規ＲＧＤ包含ペプチドを同定した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって本発明の一側面では、一般式（Ｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ１Ｘ４Ｘ５Ｘ６若しくは一般式（ＩＩ）Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ１Ｘ１０Ｙ１Ｘ１１によって示されるアミノ酸配列、あるいはＮ末端若しくはＣ末端の１若しくは２個、好ましくは１個のアミノ酸（群）またはＮおよびＣ末端の１アミノ酸を欠いている該アミノ酸配列を有する少なくとも１つの結合ペプチドを含むポリペプチドを提供し、式中：
Ｙ１はＣｙｓであり
Ｙ２はＡｒｇであり
Ｙ３はＧｌｙであり
Ｙ４はＡｓｐであり
Ｘ１はＡｌａ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＳｅｒ、特にＡｌａまたはＬｅｕであり；
Ｘ２はＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、またはＳｅｒ、特にＡｒｇまたはＳｅｒであり；
Ｘ３はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ、特にＧｌｙ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒであり；
Ｘ４はＧｌｎ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＶａｌ、特に、ＰｈｅまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎ、特にＡｓｐまたはＧｌｎであり；
Ｘ６はＡｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、特にＡｌａ、ＧｌｎまたはＧｌｙであり；
Ｘ７はＧｌｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、またはＶａｌ、特にＧｌｕまたはＶａｌであり；
Ｘ８はＡｌａまたはＣｙｓ、特にＣｙｓであり；
Ｘ９はＡｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、またはＨｉｓ、特にＧｌｎであり；
Ｘ１０はＬｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、特にＬｅｕであり；ならびに
Ｘ１１はＧｌｎ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、またはＶａｌ、特にＰｒｏであり、
式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４は、互いに独立して、それぞれ指定されるアミノ酸のＤ若しくはＬアミノ酸またはアミノ酸残基模倣物である。
【発明の効果】
【０００８】
式Ｉに記載のポリペプチドはαＶβ３および／またはαＶβ５インテグリンに関して特に高い結合親和性を有し、構造（ＩＩ）に記載のポリペプチドは高い結合活性を有するが、これらはＲＧＤモチーフの安定化に関して１酸化段階しか必要としない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
用語「アミノ酸残基模倣物（mimetic）」とは、ペプチド化合物中で、該ペプチドの機能（例えば、ペプチドとαＶβ３および／またはαＶβ５インテグリンとの相互作用）を重大な程度にまで有害に妨害することなく、コンフォメーションおよび／または機能的に特定のアミノ酸の置換物として働く部分を表し、疑似模倣物（pseudomimetics）および二次構造模倣物が含まれるものとする（Peptides: Chemistry and Biology by Norbert Sewald (Author), Hans-Dieter Jakubke (Author), Publisher: Wiley-VCHに記載される通りである）。アミノ酸をその模倣物で置換することによって、ペプチドまたはポリペプチドは多数の生物学的に重要なその親の構造上の特徴を保持する一方、低減または修飾型ペプチド特性を有する。
【００１０】
アミノ酸残基模倣物は、必ずしも、それらが取って代わるアミノ酸と同一の接触を構成する必要はなく、それらが全体のコンフォメーションを変化させず、機能、例えばαＶβ３および／またはαＶβ５インテグリンへの結合が重大な影響を受けないならば十分であることが多い。いくつかの環境では、アミノ酸残基模倣物での置換によりペプチドの特性（例えば、ペプチドとαＶβ３および／若しくはαＶβ５インテグリンの相互作用またはペプチドの安定性または経口摂取）が実際に増強されることがある。本発明のポリペプチドの結合ペプチドを構成するアミノ酸に関するアミノ酸残基模倣物は、当技術分野において周知であり、アミノ酸残基模倣物を含むペプチドを設計するアプローチもまた当技術分野において周知である。例えば、Farmer, P. S. in Drug Design (E. J. Ariens, ed.) Academic Press, New York, 1980, vol. 10, pp. 119-143; Ball. J. B. and Alewood, P. F. (1990) J. Mol. Recognition 3: 55; Morgan, B. A. and Gainor, J. A. (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243-252;およびFreidinger, R. M. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10: 270; A. D. Abell (editor) Advances in peptidomimetics and amino acid mimics, JAI Press, USA, Volume 1, 1997を参照のこと。
【００１１】
１個またはそれ以上のアミノ酸残基模倣物を含む本発明のポリペプチドの相互作用の強度は、当技術分野において既知の各種アッセイによって測定することができ、該アッセイは２種の化学的要素間の結合を測定するのに適切なものであり、これには、非限定的に、実施例に記載の結合アッセイならびにＥＬＩＳＡおよびプラズモン共鳴のような方法が含まれる。１個またはそれ以上のアミノ酸残基模倣物を含むポリペプチドは、それらが、完全にＬアミノ酸から構成される結合ペプチドを含むポリペプチドの結合強度の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％および最も好ましくは少なくとも１００％を有する場合には、依然として結合の重大な減少を示さないとみなす。
【００１２】
結合ペプチドを構成するアミノ酸に関する特に好ましいアミノ酸残基模倣物には、非限定的に以下のものが含まれる：
Ａｌａ：炭素または窒素残基の位置で、アルキル、シクロアルキルまたはアリールで置換されているアラニン；
Ａｓｐ：アスパラギン酸のアリールおよびアルキルエステル；
Ｃｙｓ：硫黄原子の位置で、アルキル、アルケニルまたはフェニル、これは場合によりハロ、シアノ、ニトロ、ハロアルキル、アミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、アルキルカルボキサミド、アリールカルボキサミド、アルキルチオまたはハロアルキルチオで置換されている、で置換されているシステイン；
Ｇｌｎ：窒素原子の位置で、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキルまたはシクロアルキル、ビシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ビシクロアルキルアルキルまたは縮合アリール−シクロアルキルアルキル、これは場合により、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個またはそれ以上のヘテロ原子を含む、で置換されているグルタミン；
Ｇｌｕ：グルタミン酸のアリールおよびアルキルエステル；
Ｇｌｙ：炭素または窒素残基の位置で、アルキル、シクロアルキルまたはアリールで置換されているグリシン、特にｔ−ブチルグリシン；
Ｌｅｕ：イソロイシン；
Ｐｈｅ：ホモ−フェニルアラニン、デヒドロ−フェニルアラニン、インドリン−２−カルボン酸；テトラヒドロイソキノリン−２−カルボン酸、これは場合によりハロ、シアノ、ニトロ、ハロアルキル、アミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ（dialkylarino）、アルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、アルキルカルボキサミド、アリールカルボキサミド、アルキルチオまたはハロアルキルチオで置換されている；
Ｓｅｒ：アルキルまたはアリールで置換されているセリン；
Ｔｙｒ：アルキルまたはアリールで置換されているチロシン；
Ｖａｌ：ノルバリンまたはノルロイシン。
【００１３】
本発明において使用される用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって互いに連結されている天然および／または非天然に存在するアミノ酸、例えばＤアミノ酸を含む、の鎖を表す。アミノ酸鎖の長さは、少なくとも上に指定されるアミノ酸配列を有する結合ペプチドを含む限り、特に限定されない。好ましくはポリペプチドは、依然として、その標的、例えば上に規定されるαＶβ３および／またはαＶβ５インテグリンとの相互作用の重大な減少を示さない。
【００１４】
好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドは、一般式（Ｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ１Ｘ４Ｘ５Ｘ６若しくは一般式（ＩＩ）Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ１Ｘ１０Ｙ１Ｘ１１によって示されるアミノ酸配列、あるいはＮ末端またはＣ末端の１または２個、好ましくは１個のアミノ酸（群）またはＮおよびＣ末端の１アミノ酸を欠いている該アミノ酸配列を有する少なくとも１つの結合ペプチドを含み、式中：
Ｙ１はＣｙｓであり
Ｙ２はＡｒｇであり
Ｙ３はＧｌｙであり
Ｙ４はＡｓｐであり
Ｘ１はＡｌａまたはＬｅｕであり；
Ｘ２はＡｒｇまたはＳｅｒであり；
Ｘ３はＧｌｙ、ＬｅｕまたはＴｙｒであり；
Ｘ４はＰｈｅまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｓｐまたはＧｌｎであり；
Ｘ６はＡｌａ、Ｇｌｎ、またはＧｌｙであり；
Ｘ７はＧｌｕまたはＶａｌであり；
Ｘ８はＣｙｓであり；
Ｘ９はＧｌｎであり；
Ｘ１０はＬｅｕであり；ならびに
Ｘ１１はＰｒｏであり、
式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４は、互いに独立して、それぞれ指定されるアミノ酸のＤ若しくはＬアミノ酸またはアミノ酸残基模倣物である。
【００１５】
さらにより好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号１〜１５に記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの結合ペプチドを含む。
【００１６】
さらに好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドは、好ましくは５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０または９アミノ酸長を有する。特に好ましいのは、約１０〜２０アミノ酸の範囲の長さを有するポリペプチドである。
【００１７】
さらに好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドは追加のエンコード対象のタンパク質を含むことができ、このタンパク質は本質的に任意の所望のタンパク質またはタンパク質断片であってよいが、本発明の好ましい実施態様では、結合ペプチドを含むポリペプチドは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、接着分子、抗体軽鎖および／若しくは重鎖、単鎖抗体、毒素、酵素、受容体リガンド、溶解性ペプチド、膜挿入配列並びに蛍光タンパク質またはその断片からなる群から選択されるタンパク質をさらに含む。
【００１８】
このような融合ポリペプチドは、１またはそれ以上の追加エンコード対象のタンパク質またはその断片をαＶβ３および／またはαＶβ５インテグリン発現細胞に向けて補充する効率的な方法を提供することができる。特に、上記インテグリンの１つを発現する細胞にサイトカイン、ケモカインまたはそのプロドラッグまたは毒素を送達する場合、局所的な細胞障害効果を得ることができる。
【００１９】
本発明の別の好ましい実施態様では、ポリペプチドを少なくとも１つの化学的部分に取り付ける。本明細書を通して使用される用語「取り付け（attached）」とは、本発明のポリペプチドおよび別の化学的要素間の、直接または間接的な、共有結合性または非共有結合性のそれぞれ結合および連結を意味する。本明細書中で交換可能に使用される用語「化学的部分（chemical moiety）」または「要素（entity）」は、特定タイプの化学物質に限定されないが、好ましい実施態様では、化学的部分は、スペーサー、マーカー、タグ、および脂質、および特にリン脂質、薬物、キャップ基および、第二の化学的部分に取り付けられているスペーサーからなる群から選択される。
【００２０】
本発明の意義の範囲内の「キャップ基（capping group）」は、その取り付け対象である分子を例えば化学分解または酵素分解から保護する化学的部分である。キャップ基またはキャップ基群は、本発明のポリペプチドに直接取り付けることができ、あるいはそれ自身が本発明のポリペプチドに取り付けられている任意の他の化学的部分に取り付けることができる。本発明のポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端が、例えばスペーサーのような別の化学的部分に取り付けられておらず、言い換えればその「遊離」型、すなわち−ＣＯＯＨおよび／または−ＮＨ２である本発明の特定の好ましい側面では、キャップ基を一端または両端に取り付けて、例えばエキソプロテイナーゼ等による分解を回避または最小化する。
【００２１】
好ましい実施態様では、本発明のキャップ基は以下の構造の１つを有する：
【化１】
2007535909.tif 000002
式中、Ａは本発明のポリペプチドのアミノ酸若しくはアミノ酸残基模倣物または、本発明のポリペプチドに取り付けられている任意の他の化学的部分であり、ならびにＲおよびＲ'はそれぞれ独立して以下の意義を有し：−Ｃ（Ｏ）Ｒ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１、ＣＲ１またはＲ１、
式中、Ｒ１は以下の意義を有してよい：Ｈ；直線状または分岐状アルキル、特に低級アルキル（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルまたはイソ−ペンチル）；置換されている直線状または分岐状アルキル、特に低級置換アルキル；直線状または分岐状アルケニル、特に低級アルケニル（Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５、例えばエテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソ−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル；置換されている直線状または分岐状アルケニル、特に低級置換アルケニル；直線状または分岐状アルキニル、特に低級アルキニル（Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５）；置換されている直線状または分岐状アルキニル、特に低級置換アルキニル；直線状または分岐状アルカノール、特に低級アルカノール（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５）；直線状または分岐状アルカナール（alkanal）、特に低級アルカナール（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５、例えばＣＯＨ、ＣＨ２ＣＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＨ；アリール、特にフェニル；置換アリール、特に置換アリール；ハロアルキル、特に低級ハロアルキル（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５）；ハロアルコキシ、特に低級ハロアルコキシ（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５）；Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される１〜４個のヘテロ原子を場合により含むヘテロアリール；Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される１〜４個のヘテロ原子を場合により含む置換ヘテロアリール；アリール、特にＣ５〜Ｃ１２）；アルキルアリール、特にＣ５〜Ｃ１２、例えばベンジル、イソキノリニル、キノリニル、ナフチル；置換アルキルアリール、特にＣ５〜Ｃ１２、例えば置換ベンジル；Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される１〜４個のヘテロ原子を場合により含むＮ、Ｏ、Ｓから選択される１〜４個のヘテロ原子を場合により含むアルキルヘテロアリール；Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される１〜４個のヘテロ原子を場合により含む置換アルキルヘテロアリール；アミノアルキル、特にＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５、例えば−ＮＨＣＨ３、−ＮＨＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２；置換アミノアルキル；ジアルキルアミノ；アミノケトン、特に−ＮＨＣＯＣＨ３；置換アミノケトン；アミノアリール、特に−ＮＨ−Ｐｈ；置換アミノアリール、特に置換−ＮＨ−Ｐｈ；カルボキシル、カルボアルコキシ；アルキルカルボキサミド；シクロアルキル；アルキルシクロアルキル；ＣＮ；ＮＨ２；ハロゲン、特にＦ、Ｃｌ、およびＢｒ；上記残基が置換されている場合、それらはハロゲン、特にＦ、Ｃｌ、およびＢｒ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ、ＣＮ、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール（akylheteroaryl）、ＣＯＨまたはＣＯＯＨの群から選択される置換基で好ましくは一、二、または三置換されている；
ＲおよびＲ'は、Ｃ、Ｎ、ＳおよびＯから選択される５〜７個の原子を含む環を形成し；あるいは
ＲおよびＲ'は独立してトルエンスルホニル、メタンスルホニル、ＦＭＯＣまたは（＋）−メンチルオキシ−ＣＯ−である。
【００２２】
用語「スペーサー」とは、スペーサーなしでは本発明のポリペプチドとその標的構造の結合を立体的に妨げる可能性がある他の化学的部分に取り付けられている場合でさえ、結合ペプチドの接近性（accessibility）を提供する目的を果たす化学的部分を表す。本発明の意義の範囲内のスペーサーは少なくとも０．５ｎｍの直線的伸長部分であり、好ましくはスペーサーは１〜１０ｎｍの範囲およびさらにより好ましくは２〜５ｎｍの範囲の直鎖的伸長部分を有する。スペーサーは好ましくは直鎖状若しくは分岐状の飽和または不飽和炭水化物鎖（糖鎖）である。この炭水化物鎖は好ましくは単量体の構成要素の多量体反復物を含む。それぞれの単量体の構成要素の長さに応じて、単量体の構成要素の２〜１０個の範囲の多量体反復物が好ましい。好ましい実施態様では、スペーサーは親水性である。スペーサーは、一方の末端に本発明のポリペプチドへの取り付けを許容する官能基を含み、他方の末端に別の化学的部分へのスペーサーの取り付けを許容する別の官能基を含むことができる。
【００２３】
好ましいスペーサーは、好ましくは約１〜４０個の範囲の反復単位を含む二官能性分子、特に二官能性ポリエチレンまたはポリプロピレングリコール誘導体、天然および／または合成アミノ酸を含み、好ましくは１〜４０、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜１０個の範囲のアミノ酸を含むオリゴペプチドである。本発明のスペーサーの特に好ましい構成要素は、８−アミノ−３，６−ジオキサタン酸（8-amino-3,6-dioxatanoic acid）（ｄｏｏ）であり、１〜１０個の範囲のｄｏｏの反復単位を含むスペーサーが好ましい。２〜５個の範囲のｄｏｏ単位を含むスペーサーがより好ましく、３ｄｏｏ単位を含むスペーサーが最も好ましい。リポソームの関連では、最適な長さのスペーサーが存在し、２〜５ｎｍの範囲であることが見出されている。一方、０．５ｎｍ未満の長さのスペーサーは、ほとんどの場合、例えば本発明のポリペプチドが取り付けられているリポソーム表面からの、本発明の結合ペプチドおよびインテグリン保持細胞間の効率的相互作用、すなわち結合を許容するのに十分な距離を提供しない。他方１０ｎｍより長いスペーサーは増大する「柔軟性」を示し、これもまた細胞への結合に不利である。
【００２４】
用語「マーカー」とは、分析方法、例えば蛍光、核磁気共鳴、コンピュータ断層撮影またはシンチグラムの測定によって直接または間接的に検出可能な化学的部分を表し、非限定的に、高電子密度分子、常磁性分子、超常磁性分子、放射性分子、例えば１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、５１Ｇｒ、５４Ｆｅ、６０Ｃｏ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１２ｍＡｇ、１１３ｍＩｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、１４８Ａｕ、３５Ｓ、３３Ｐ、３２Ｐ、または１１Ｃ、非放射性同位体、例えば２Ｈおよび１３Ｃ、並びに蛍光性分子または蛍光もしくは発光を発生する分子、例えば緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、および種々の蛍光色素が含まれる。これらはすべて当業者に周知である。
【００２５】
用語「タグ」とは、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドを含む複合体の精製を可能にする化学的部分、例えばビオチン、キチン−タグ、Ｍｙｃ−タグ、Ｈｉｓ−タグ等を表す。これらはすべて当技術分野において周知である。
【００２６】
好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドを直接または間接的に脂質に取り付ける。ポリペプチドを取り付けることができる脂質のタイプは特に限定されない。しかし、好ましい実施態様では、それぞれの脂質を脂質ベースの担体、例えばリポソームまたはウイロソームに挿入し、あるいは組み入れることができる。特に適切な脂質は、グリセリド、グリセロリン脂質、グリセロホスフィノリピド（glycerophosphinolipids）、グリセロホスホノリピド、スルホリピド、スフィンゴ脂質、リン脂質、イソプレノリド（isoprenolides）、ステロイド、ステアリン、ステロール、および／または炭水化物含有脂質である。本発明のポリペプチドの取り付けに特に好ましい脂質は、リン脂質、好ましくはホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、特にジステアロイルホスファチジル（ＤＳＰＥ）またはアルファ−（ジパルミトイルホスファチジル（ＤＰＰ））であり、これらは薬物送達に使用されるリポソーム中に含まれることが多い。
【００２７】
別の実施態様では、本発明のポリペプチドに取り付けられる脂質は、以下からなる群から選択される：Ｎ−カプロイルアミン−ＰＥ、Ｎ−ドデカニルアミン−ＰＥ、ホスファチジルチオエタノール、Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−カルボキサミド−ＰＥ（Ｎ−ＭＣＣ−ＰＥ）、Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド］−ＰＥ（Ｎ−ＭＰＢ）、Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート］−ＰＥ（Ｎ−ＰＤＰ）、Ｎ−スクシニル−ＰＥ、Ｎ−グルタリル−ＰＥ、Ｎ−ドデカニル−ＰＥ、Ｎ−ビオチニル−ＰＥ、Ｎ−ビオチニル−ｃａｐ−ＰＥ、ホスファチジル−（エチレングリコール）（phosphatidyl-(ehtylene glycol)）、ＰＥ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−カルボン酸、ＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥ−ＰＥＧ−ＰＤＰ、ＰＥ−ＰＥＧ−アミン、ＰＥ−ＰＥＧ−ビオチン、ＰＥ−ＰＥＧ−ＨＮＳ、ジパルミトイル−グリセロスクシニル−リシン、アルファ−メトキシ−オメガ−（１，２−ジオクタデセノイルオキシグリセリル）（alpha-methoxy-omega-(1,2-dioctadecenoyloxy glyceryl)）（ＤＯ）、アルファ−メトキシ−オメガ−（１，２−ジテトラデセノイルオキシグリセリル）（alpa-methoxy-omega-(1,2-ditetradecenoyloxy glyceryl)）（ＤＴ）。
【００２８】
別の好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドを少なくとも１つの薬物に取り付ける。用語「薬物」は任意の治療的に活性な化合物を包含し、特に化合物は、免疫抑制薬、免疫賦活薬、抗生物質、抗感染薬、抗アレルギー薬、細胞増殖抑制薬、細胞障害性物質およびそのプロドラッグ、分裂促進因子、ケモカイン、サイトカイン、皮膚薬（dermatics）および／または、分裂促進因子、ケモカイン若しくはサイトカインの生理学的若しくは薬理学的阻害剤からなる群から選択される。好ましい実施態様では、薬物を本発明のポリペプチドに放出可能な様式で取り付け、好ましくは、本発明のポリペプチドが結合する身体の組織または領域、すなわち主に腫瘍内皮または腫瘍で薬物の放出が主に生じるようにする。特に好ましい薬物の取り付け手段は、例えば標的部位で放出される酵素によって切断可能な短いポリペプチド伸長物である。ゆえに、好ましくは薬物は腫瘍内皮または腫瘍において放出される。このタイプの酵素には、例えばメタロプロテイナーゼが含まれる。このような解放可能な連結は当技術分野において既知であり、本発明のポリペプチドの標的特異的結合によってすでに達成されている特異性の上にさらなる特異性を提供するように選択することができる。このような切断部位の組み込みは、本発明のポリペプチドに取り付けられている薬物が、その放出後に細胞に対して細胞障害効果および／または成長阻害効果を発揮する場合に特に望ましい。
【００２９】
上記スペーサーを使用する本発明の好ましい実施態様では、スペーサーの片側を本発明のポリペプチドに取り付け、もう片側を第二の化学的部分に取り付ける。好ましくは第二の化学的部分は、薬物、マーカー、タグおよび脂質からなる群から選択される。この関連で、用語「薬物」、「マーカー」、「タグ」、および「脂質」は上で概説される意義および好ましい意義を有する。
【００３０】
本発明の別の側面は、上に概説されるアミノ酸配列を有する結合ペプチドを含む少なくとも１つの本発明のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドである。本発明の核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、二本鎖または一本鎖の、センスおよび／またはアンチセンス鎖であってよい。本発明のポリヌクレオチド分子は、遺伝暗号の縮重に起因して、上に概説されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１〜１５に記載のアミノ酸配列の１つを有する結合ペプチドを含むポリペプチドをエンコードする任意の配列を含有することができる。さらに本発明の核酸分子はコード配列に限定されず、例えばそれらは本発明のポリペプチドをエンコードする配列から上流または下流に位置し得る非コード（none-coding）配列を含むことができる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチド分子は、例えばホスホルアミダイトベースの合成によってインビトロで合成することができ、あるいは細胞、例えば細菌細胞または哺乳類細胞から取得することができる。
【００３２】
本発明の別の側面は、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターである。本明細書中で使用される用語「ベクター」とは、本発明のポリヌクレオチドを特に維持および増殖のために細胞内に導入するための手段を表す。好ましい実施態様では、本発明のベクターには、プラスミド、ファージミド、ファージ、コスミド、人工の哺乳類または酵母染色体、ノックアウトまたはノックイン構築物、ウイルス、特にアデノウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、レンチウイルス（Chang, L. J. Gay, E. E. (2001) Curr. Gene Therap. 1: 237-251）、ヘルペスウイルス、特に単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）（Carlezon, W. A. et al. (2000) Crit. Rev. Neurobiol.）、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ；Carter, P. J. and Samulski, R. J. (2000) J. Mol. Med. 6: 17-27）、ライノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フィロウイルスおよびその遺伝子改変型（例えばCobinger G. P. et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19: 225-230を参照のこと）、ウイロソーム、「裸の」ＤＮＡ、リポソームおよび核酸コーティング粒子、特に金粒子が含まれる。特に好ましいのは、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである（Lindemann et al. (1997) Mol. Med. 3: 466-476およびSpringer et al. (1998) Mol. Cell. 2: 549-258）。一般にリポソームは、カチオン性、中性および／またはアニオン性脂質から、例えば脂質懸濁物の超音波処理によって作成される小さい単層または多層状の小胞である。ＤＮＡは、例えば、リポソーム表面にイオン結合させるか、あるいはリポソームの内部に封入することができる。適切な脂質混合物は当技術分野において既知であり、例えばＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオキシプロピル−トリメチルアンモニウムブロミド（1,2-dioleyloxypropyl-trimethylamoniumbromid）およびＤＰＯＥ（ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン）が含まれ、これらはともに種々のセルラインのトランスフェクションまたは形質導入に使用されている。
【００３３】
核酸コーティング粒子は、粒子を細胞内に機械的に導入することを可能にする、いわゆる「遺伝子銃」を使用して核酸を細胞内に導入するための別の手段である。好ましくは粒子そのものは不活性であり、したがって好ましい実施態様では粒子は金粒子から構成される。
【００３４】
別の側面では、本発明のポリヌクレオチドは１またはそれ以上の発現制御配列に作動的に連結される。この発現制御配列は原核および／または真核宿主細胞での発現を可能にするものである。「発現制御配列」は好ましくは転写／翻訳調節エレメントであり、非限定的に、誘導性および非誘導性、構成的、細胞周期調節型、代謝的調節型プロモーター、エンハンサー（enhances）、オペレーター、サイレンサー、リプレッサーおよび、当業者に既知の、遺伝子発現を駆動または別の様式で調節する他のエレメントが含まれる。構成的発現を指揮する調節エレメントの例には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写されるプロモーター、例えばｓｎＲＮＡ Ｕ６またはｓｃＲＮＡ ７ＳＫ遺伝子のプロモーター；誘導性発現を指揮する、例えばＮＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶ、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＭＭＴＶまたはＨＩＶ由来のウイルスプロモーターおよびアクチベーター配列、特にサイトメガロウイルスｈＣＭＶ前初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの初期または後期プロモーター、例えばＣＵＰ−１プロモーター、ｔｅｔ−リプレッサー、これは例えばｔｅｔ−ｏｎまたはｔｅｔ−ｏｆｆ系、ｌａｃ系、ｔｒｐ系で使用される；組織特異的発現エレメント；細胞周期特異的発現エレメント、例えばｃｄｃ２、ｃｄｃ２５ＣまたはサイクリンＡ；またはＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージＡの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、および酵母α−またはａ−接合因子のプロモーターが含まれる。
【００３５】
本明細書中で使用される「作動的に連結」とは、発現制御配列が目的のコード配列の発現および／または翻訳を有効に制御するように遺伝子構築物内に組み込まれていることを意味する。
【００３６】
本発明の別の側面は、上に概説されるポリヌクレオチドまたはベクターで遺伝子改変された宿主細胞である。本発明の目的のために使用してよい宿主細胞には、非限定的に、原核細胞、例えば細菌（例えばE. coliおよびB. subtilis）、この細胞は、例えば本発明のポリヌクレオチド分子を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換することができる；単純な真核細胞、例えば酵母（例えばSaccharomycesおよびPichia）、この細胞は、例えば本発明のポリヌクレオチド分子を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換することができる；昆虫細胞系、例えばＳｆ９ Ｈｉ５細胞、この細胞は、例えば本発明のポリヌクレオチド分子を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染させることができる；アフリカツメガエル卵母細胞、この細胞には、例えばプラスミドを注入することができる；植物細胞系、この細胞は、例えば本発明のポリヌクレオチド分子を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染させることができ、あるいは組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換することができる；または哺乳類細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、Ｗｉ３８、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞）、この細胞は、例えば哺乳類細胞のゲノム由来（例えばメタロチオネインプロモーター）、哺乳類ウイルス由来（例えばアデノウイルス後期プロモーターおよびワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）または細菌細胞由来（例えばｔｅｔ−ｏｎおよびｔｅｔ−ｏｆｆ系で使用されるｔｅｔ−リプレッサー結合）の例えばプロモーターを含有する組換え発現構築物で形質転換することができる、が含まれる。また宿主細胞として有用なのは、哺乳類から直接取得した初代または二次細胞を、プラスミドベクターでトランスフェクトしたもの、またはウイルスベクターで感染させたものである。本発明のポリヌクレオチドの導入に使用される宿主細胞およびそれぞれのベクターに応じて、ポリヌクレオチドは例えば染色体またはミトコンドリアＤＮＡ内に融合することができ、あるいは染色体外に例えばエピソームとして維持されてよく、あるいは一時的にのみ細胞中に含まれてよい。
【００３７】
本発明の別の側面は、上記ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または宿主細胞を含有するトランスジェニック非ヒト動物である。動物はモザイク動物であってよく、これはその身体を構成する細胞の部分のみが本発明のポリヌクレオチド、ベクター、および／または細胞を含むことを意味し、あるいは動物はトランスジェニック動物であってよく、これは該動物のすべての細胞が本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含むか、あるいは本発明の細胞由来であることを意味する。モザイクまたはトランスジェニック動物は、細胞に含有される本発明のポリヌクレオチドに関してホモまたはヘテロ接合性であってよい。動物は概して任意の動物であってよいが、好ましくは非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、またはスナネズミの群から選択される哺乳類である。
【００３８】
結合ペプチドを含む本発明のポリペプチドは、直接治療薬として、あるいは追加の物質と組み合わせて使用することができ、したがって別の側面では、本発明は、少なくとも１つの本発明のポリペプチドおよび、リポソーム、ウイロソーム、ミクロスフェア、ニオソーム、デンドリマー（dendrimeres）、安定化剤、バッファー、賦形剤、添加物からなる群から選択される少なくとも１つの別の成分を含む組成物に関する。
【００３９】
リポソームは、種々のサイズの単層または多層状の脂質小胞である。サイズは、好ましくは１０〜１０００ｎｍの範囲であり、さらに好ましくは５０〜５００ｎｍの範囲であり、最も好ましくは８０〜２００ｎｍの範囲である。ウイロソームは、ウイルスの脂質組成物に極めて類似している脂質組成物を伴うリポソームであり、好ましい実施態様では、膜内に組み込まれたタンパク質を有する（Kaneda (2000) Adv. Drug. Deliv. Rev. 43: 197-205）。ミクロスフェアは、サイズが大きく（２ｍｍまで）、コア物質を含有する強固な形態を有する球状粒子である（Ravi & Kumar (2000) J. Pharm. Sci. 3: 234-258）。ニオソームは非イオン性界面活性小胞である（Baillie et al. (1985) J. Pharm. Pharmacol. 37: 863-868）。デンドリマーは、合成の、高度に分枝した、ナノメートル寸法の単分散高分子である（Patri et al. (2002) Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 466-471）。本発明の組成物に含ませるバッファーは、任意の生理学的バッファー物質、例えばリン酸バッファーまたはＨｅｐｅｓであってよい。
【００４０】
本発明の組成物の製造および投与を促進する賦形剤は当技術分野で既知の賦形剤であり、例えばアルギナート、炭酸カルシウム、デキストロース、フルクトース、ラクトース、マルトース、バクガデキストリン、等が含まれる。安定化剤もまた当技術分野において既知であり、例えばα−トコフェロールおよび種々の炭水化物が含まれる。
【００４１】
本発明の組成物の好ましい実施態様では、ポリペプチドを、リポソーム、ウイロソーム、ミクロスフェア、ニオソームまたはデンドリマー内に組み込むか、あるいはそれらに取り付ける。したがってそれぞれの要素が、αＶβ３および／またはαＶβ５インテグリンを発現する身体の部位および組織を標的にすることが可能になる。ポリペプチドをコンポーネントの１つに取り付けることができ、このコンポーネントを、それぞれの構造の形成前、形成中または形成後に、リポソーム、ウイロソーム、ミクロスフェア、ニオソーム、またはデンドリマーの作成に使用することができる。特にリポソームおよびウイロソームに関して、上に規定される介在性スペーサーを用いてあるいは用いずに脂質に連結された本発明のポリペプチドをリポソームまたはウイロソームの脂質単層若しくは多層内に組み込むことが想定される。好ましい実施態様では、ポリペプチドをまずそれぞれのリポソームまたはウイロソームの外側表面上に含ませて、好ましくは本発明の組成物を患者に投与した時点で、本発明のポリペプチドとその標的の相互作用を可能にする。好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドを、それぞれの構造の生成に使用される全コンポーネントのうちの約０，１ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％の範囲に取り付ける。この範囲はリポソームおよびウイロソームに関して特に好ましい。
【００４２】
好ましい実施態様では、本発明のリポソームまたはウイロソームは、グリセリド、グリセロリン脂質、グリセロホスフィノリピド、グリセロホスホノリピド、スルホリピド、スフィンゴ脂質、リン脂質、イソプレノリド、ステロイド、ステアリン、ステロール、および炭水化物含有脂質からなる群から選択される脂質を含む。好ましい実施態様では、リポソームまたはウイロソームはコレステロール（ＣＨ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）を含む。さらに好ましくは、リポソームまたはウイロソームの総モル脂質組成に関して、約４０〜約６０ｍｏｌ％、より好ましくは約４５〜約５５ｍｏｌ％、最も好ましくは約４８〜約５２ｍｏｌ％のモル比でコレステロールを含ませる。一方ＳＭは、好ましくは、リポソームの総モル脂質組成に関して、約１０〜約２０ｍｏｌ％、より好ましくは約１１〜１８ｍｏｌ％、最も好ましくは約１２〜約１６ｍｏｌ％のモル比で存在させる。特に好ましい実施態様では、リポソームまたはウイロソームは、総モル脂質組成に関して、それぞれ約４０〜約６０ｍｏｌ％および約１０〜約２０ｍｏｌ％のモル比、さらにより好ましくはそれぞれ約４５〜約５５ｍｏｌ％および約１１〜約１８ｍｏｌ％のモル比、最も好ましくはそれぞれ約４８〜約５２ｍｏｌ％および約１２〜約１６ｍｏｌ％のモル比でＣＨおよびＳＭを含む。
【００４３】
本発明の組成物に含まれるリポソームまたはウイロソームは別の脂質（群）を含有する。これ（ら）は好ましくは上記好ましい脂質から選択される。好ましい実施態様では、少なくとも１つの追加の脂質はＰＥおよびＰＣから選択される。特に好ましい実施態様では、本発明のリポソームまたはウイロソーム中にＰＥを存在させ、そうするのは特にＣＨおよびＳＭが同様にリポソームまたはウイロソーム中に存在する場合である。好ましくは、ＣＨおよびＳＭはＰＥとともに上記好ましい範囲および特に好ましい範囲で存在させる。好ましい実施態様では、ＰＥ自体は、総モル脂質組成に関して、約５〜約２５ｍｏｌ％、好ましくは約１０〜約２０ｍｏｌ％、最も好ましくは約１２〜約１８ｍｏｌ％で存在させる。やはり特に好ましい実施態様では、ＣＨ、ＳＭ、およびＰＥを上記好ましい範囲または特に好ましい範囲で存在させる。
【００４４】
別の実施態様では、追加の脂質はＰＥおよびＰＣを含み、好ましい実施態様では、ＰＥおよびＰＣは、リポソームまたはウイロソームの総モル脂質組成に関して、それぞれ約５〜約２５ｍｏｌ％および約１５〜約４０ｍｏｌ％のモル比で存在させる。ＣＨおよびＳＭのモル比が上記の通りである場合、ＰＥに関する上記範囲はＰＣに特に好ましい（The above ranges for PE are PC particular preferred）。
【００４５】
別の実施態様では、本発明のリポソームの膜を構成する任意のコンポーネントを別の化学的部分に取り付けることができる。化学的部分という用語は特に限定されない。しかし、好ましい実施態様では、この化学的部分は、以下でさらに詳細に考察されるターゲティング用部分または安定化用部分である。本発明の意義の範囲内の安定化用部分は、投与後のリポソームの循環期間を増大させる。特に好ましい安定化用部分は、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトールまたはＰＥＧであり、特に好ましいＰＥＧは約１，０００〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲、より好ましくは約５，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。
【００４６】
好ましい実施態様では、リポソームの膜を構成する分子のフラクションのみに化学的部分、特に安定化用部分を取り付ける。約１〜約２０ｍｏｌ％の範囲、より好ましくは約３〜約１０ｍｏｌ％の範囲、さらにより好ましくは約５ｍｏｌ％のリポソーム膜のコンポーネントが、取り付けられた化学的部分を保持するのが好ましい。
【００４７】
化学的部分の取り付け、特に安定化用部分に関して好ましいリポソームコンポーネントは脂質コンポーネントである。種々の化学的部分を種々の脂質コンポーネントに取り付けることができるが、化学的部分（群）を本発明のリポソーム内に含まれる１またはそれ以上のリン脂質に取り付けるのが好ましい。さらに好ましい実施態様では、１またはそれ以上の化学的部分をＰＥに取り付ける。特に、安定化用物質、例えばＰＥＧを使用する場合、取り付けにＰＥを使用する。
【００４８】
安定化用部分の取り付けに加えて、本発明のリポソームの脂質二重層を安定化するために、界面活性剤、タンパク質およびペプチドをリポソーム内に組み込むことができる。二重層安定化用コンポーネントとして使用することができる界面活性剤には、非限定的に、トリトンＸ−１００、デオキシコール酸、オクチルグルコシドおよびリソ−ホスファチジルコリンが含まれる。二重層安定化用コンポーネントとして使用することができるタンパク質には、非限定的に、グリコホリンおよびシトクロム酸化酵素が含まれる。好ましい実施態様では、リポソームには０．０５〜１５ｍｏｌ％の範囲の安定化用物質を含ませることができる。
【００４９】
治療効果を発揮するために、本発明の組成物にはさらに薬物を含ませることができる。好ましくは、この薬物を直接または間接的に本発明のポリペプチドに連結するか、あるいは取り付け、あるいはリポソーム、ウイロソーム、ミクロスフェア、等に含ませるか、あるいは取り付ける。
【００５０】
薬物または診断薬をリポソーム内に含ませる場合、薬物または診断薬をリポソームの内側に含ませるか、あるいは親油性薬物の場合にはまた、脂質二重層内または脂質二重層間に含ませるのが特に好ましい。好ましい実施態様では、リポソーム、ウイロソーム、ミクロソームまたはニオソーム内に薬物を含ませる。先行技術において、リポソーム、ウイロソーム、ミクロソームまたはニオソームに既定の薬物または診断薬を「積載」する種々の方法が利用可能である。その最も単純な形式では、薬物および／または診断薬をリポソームの形成時に脂質コンポーネントと混合する。他の受動的な積載方法には、脱水−再水和（Kirby & Gregoriadis (1984) Biotechnology 2: 979）、逆相（revers-phase）蒸発（Szoka & Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194-）、または界面活性剤−枯渇（detergent-depeletion）（Milsmann et al. (1978) Biochim. Biophys. Acta 512: 147-155）が含まれる。しかし、これらの技術では、積載中に薬物の実質的な喪失に至ることが多く、薬物が高価である場合には特に不都合である。
【００５１】
薬物および／または診断薬をカプセル化するための他の方法論には、いわゆる「遠隔積載（remote loading）」または「能動積載（active loading）」が含まれる。この場合、あらかじめ形成されたリポソームの外側および内側間の勾配、例えばｐＨまたは塩勾配に起因して、勾配に沿って薬物および／または診断薬がリポソーム内に輸送される（例えばCheung et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1414: 205-216; Cullis et al. (1991) Trends Biotechnol. 9: 268-272; Mayer et al. (1986) Chem. Phys. Lipids 40: 333-345を参照のこと）。
【００５２】
前記受動および能動積載技術および当技術分野において周知の他の方法は、非限定的に、すべて当業者が使用することができるものである。任意の既定の薬物または診断薬に関する最も効率的な積載方法は、日常的実験法により、十分に確立されている手順によって決定することができる。典型的に調節対象である変数は、ｐＨ、温度、塩のタイプおよび濃度、バッファーのタイプ等である。
【００５３】
好ましい実施態様では、リポソーム、ウイロソーム、ミクロソームまたはニオソーム内に遠隔積載によって薬物および／または診断薬を積載する。その理由は、この方法は積載対象の物質の喪失が非常に少ないからである。好ましい実施態様では、積載にｐＨ勾配を使用する。積載対象の物質に応じて、典型的にリポソームの内側をその外側より酸性にする。好ましくは、薬物または診断薬の積載前にその内側は１〜６の範囲のｐＨを有する。
【００５４】
特に好ましい薬物は、以下からなる群から選択される：鎮痛薬、抗リウマチ薬、駆虫薬、抗アレルギー薬、抗貧血薬、抗不整脈薬、抗生物質、血管形成阻害剤、抗感染薬、抗痴呆薬（antidemenics）（向知性薬）、抗糖尿病薬、解毒薬、制吐薬、抗目眩薬（antivertiginosics）、抗てんかん薬、抗出血薬、抗高血圧薬（antihypertonics）、抗低血圧薬（antihypotonics）、抗凝血薬、抗真菌薬、鎮咳薬、抗ウイルス薬、ベータ−受容体およびカルシウムチャネルアンタゴニスト、気管支溶解（broncholytic）および抗喘息薬（antiastmatic agent）、ケモカイン、サイトカイン、分裂促進因子、細胞増殖抑制薬、細胞障害性物質およびそのプロドラッグ、皮膚薬、催眠薬および鎮静薬、免疫抑制薬、免疫賦活薬、ペプチドまたはタンパク質薬物、特にホルモンおよび、分裂促進因子、ケモカイン、またはサイトカインの生理学的若しくは薬理学的阻害剤またはそれらの各プロドラッグ。当然ながら、一度に１以上の薬物を本発明のリポソームに含ませることも想定される。各カテゴリーに関する多数の薬物が当業者に既知であり、非限定的にすべて含まれる。
【００５５】
αＶβ３およびαＶβ５インテグリンは増殖性の内皮および特に腫瘍内皮細胞上で主に見出されるため、本発明のポリペプチドは薬物の特異的ターゲティングを可能にし、腫瘍増殖および／または疾患の進行を標的化様式で妨害することができ、したがって本発明の組成物は新血管新生に関連する過剰増殖性疾患の処置に特に適している。したがって、特に好ましい薬物は細胞増殖抑制薬および細胞障害性薬物である。このような各種薬物は当技術分野において既知である。特に好ましい細胞増殖抑制薬および細胞障害性薬物は、以下からなる群から選択される：アルキル化用物質、代謝拮抗剤、抗生物質、エポシロン、核内受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、白金化合物、ホルモンおよび抗ホルモン、インターフェロンおよび細胞周期依存性プロテインキナーゼ（ＣＤＫ）の阻害剤、シクロオキシゲナーゼおよび／若しくはリポキシゲナーゼの阻害剤、生合成（biogeneic）脂肪酸および脂肪酸誘導体、例えばプロスタノイドおよびロイコトリエン、プロテインキナーゼの阻害剤、プロテインホスファターゼの阻害剤、脂質キナーゼの阻害剤、白金配位錯体、エチレンイメン（ethyleneimenes）、メチルメラミン、トラジン（trazines）、ビンカアルカロイド、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、アルキルスルホナート、葉酸アナログ、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、特にアセジアスルホン（acediasulfone）、アクラルビシン（aclarubicine）、アンバゾン（ambazone）、アミノグルテチミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、フォリン酸カルシウム、カルボプラチン、カルペシタビン（carpecitabine）、カルムスチン、セレコキシブ、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン ダプゾン、ダウノルビシン、ジブロムプロパミジン、ジエチルスチルベストロール（diethylstilbestrole）、ドセタキセル、ドキソルビシン、エネジイン、エピルビシン、エポシロンＢ、エポシロンＤ、エストラムシンホスファート（estramucin phosphate）、エストロゲン、エチニルエストラジオール（ethinylestradiole）、エトポシド、フラボピリドール（flavopiridol）、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド ホスフェストロール、フラゾリドン、ゲムシタビン、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシメチルニトロフラントイン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン（hydroxyprogesteronecaproat）、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イドクスウリジン、イホスファミド、インターフェロンα、イリノテカン、ロイプロリド、ロムスチン、ルルトテカン（lurtotecan）、マフェナイドサルファートオールアミド（mafenide sulfate olamide）、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メガストロール（megastrolacetate）、メルファラン、メパクリン、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトロニダゾール、マイトマイシンＣ、ミトポドジド（mitopodozide）、ミトタン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ナリジクス酸、ニフラテル、ニフロキサジド（nifuroxazide）、ニフララジン（nifuralazine）、���フルチモクス（nifurtimox）、ニムスチン、ニノラゾール（ninorazole）、ニトロフラントイン、ナイトロジェンマスタード、オレオムシン（oleomucin）、オキソリニン酸、ペンタミジン、ペントスタチン、フェナゾピリジン、フタリルスルファチアゾール、ピポブロマン、プレドニムスチン（prednimustine）、プレドニゾン、プレウシン（preussin）、プロカルバジン、ピリメタミン、ラルチトレキセド、ラパマイシン、ロフェコキシブ、ロシグリタゾン、サラゾスルファピリジン、スクリフラビニウムクロライド（scriflavinium chloride）、セムスチン ストレプトゾシン（streptozocine）、スルファカルバミド（sulfacarbamide）、スルファセタミド、スルファクロピリダジン（sulfachlopyridazine）、スルファジアジン、スルファジクラミド（sulfadicramide）、スルファジメトキシン、スルファエチドール、スルファフラゾール、スルファグアニジン、スルファグアノール（sulfaguanole）、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、コトリモキサゾール、スルファメトキシジアジン（sulfamethoxydiazine）、スルファメトキシピリダジン、スルファモキソール、スルファニルアミド、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファチアゾール、スルフイソミジン、スタウロスポリン（staurosporin）、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、テルチポシド（tertiposide）、テストラクトン、プロピオン酸テストステロン（testosteronpropionate）、チオグアニン、チオテパ、チニダゾール、トポテカン、トリアジクォン（triaziquone）、トレオスルファン（treosulfan）、トリメトプリム、トロホスファミド（trofosfamide）、ＵＣＮ−０１、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびゾルビシン、またはそれらの各誘導体またはそのアナログ。現在の癌治療ではいくつかの上記薬物を同時に投与する。したがって、本発明のリポソームに１以上の細胞増殖抑制薬および／または細胞障害性薬物を含ませることも想定される。
【００５６】
別の側面では、本発明のリポソームに、抗血管原性薬物、例えばフマジリンアナログ、サリドマイド、２−メトキシエストラジオール、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤を含ませることができる。このような薬物は、活性化型および／または増殖性内皮細胞が関与する疾患の処置に好ましいものである。しかし、活性化型および／または増殖性内皮細胞が関与する疾患の処置では、細胞増殖抑制薬または細胞障害性薬物、特に、好ましい細胞増殖抑制薬または細胞障害性薬物として上に記載されるものを使用することも可能である。
【００５７】
用語「免疫抑制薬」には、免疫応答の活性を低下させる物質ならびに抗炎症性作用を有する物質の両者が含まれ、好ましい例は、糖質コルチコイド、特にベクロメタゾン、ベタメタゾン、クロコルトロン（clocortolone）、クロプレドノール（cloprednol）、コルチゾン、デキサメタゾン、フルドロコルチゾン、フルドロキシコルチド、フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルプレドニデン（fluprednidene acetate）、ヒドロコルチゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニリデン（prednylidene）、プレグネノロン、トリアムシノロンまたはトリアムシノロンアセトニド、シクロスポリン、特にシクロスポリンＡ、ミコフェノール酸モフェチル、タクロリムス、ラパマイシン、ＦＫ ５０６、シクロヘキシミド−Ｎ−（エチルエタノアート）、アザチオプリン、ガンシクロビル、抗リンパ球グロブリン、アスコマイシン、ミリオシン、ＭＡＰキナーゼの薬理学的阻害剤（特にｐ３８阻害剤、例えばＶＸ−７４５）、カスパーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、および／またはメトトレキセートである。
【００５８】
用語「免疫賦活薬」は、免疫応答の媒介に直接または間接的に関与する細胞の機能に影響し、この場合、その影響が免疫応答を生じさせる、すべての物質を包含する。これらの細胞には、例えばマクロファージ、ランゲルハンス細胞および他の樹状細胞、リンパ球、未定の細胞（indeterminate cells）、さらに、それ自体は免疫系に属さないが皮膚の免疫障害に関与する細胞、例えば線維芽細胞、ケラチノサイトおよびメラニン形成細胞が含まれる。しかし、とりわけランゲルハンス細胞である。免疫応答の強度は、例えば生産されるサイトカイン（例えばインターフェロン−ガンマ）の量、樹状細胞上の活性化マーカー（例えばＭＨＣＩＩまたはＣＤ８６）の検出または皮膚中の活性化型ＣＤ８陽性Ｔ細胞の数によって決定することができる。本発明のための免疫賦活薬は、特に、例えばEchinacea pallidaまたはEchinacea purpureaから取得される植物の免疫賦活薬、サイトカイン、例えばインターロイキン、インターフェロンおよびコロニー刺激因子、並びに後者を模倣する細菌成分または分子［例えば細菌ＤＮＡおよびＣｐＧ配列を含む非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド、および細菌細胞壁または被膜の成分、特にリポ多糖およびそれ由来の分子、例えばモノホスホリル−脂質Ａ、ムラミルジペプチド（Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）、および／またはＰａｍＣｙｓ３、および他の分子、例えばテタヌストキソイド、ポリ−Ｌ−アルギニンまたはＭＨＣＩＩペプチド］である。
【００５９】
用語「抗生物質」は、例えばペニシリン系、セファロスポリン系、テトラサイクリン系、アミノ配糖体系、マクロライド系抗生物質、リンコサミド系、ジャイレース阻害剤、スルホンアミド系、トリメトプリム、ポリペプチド系抗生物質、ニトロイミダゾール誘導体、アンフェニコール（amphenicol）、特にアクチノマイシン、アラメチシン（alamethicin）、アレキシジン（alexidine）、６−アミノペニシラン酸、アモキシシリン、アンホテリシン、アンピシリン、アニソマイシン、アンチアモエビン（antiamoebin）、アンチマイシン、アフィディコリン、アジダムフェニコール（azidamfenicol）、アジドシリン（azidocillin）、バシトラシン、ベクロメタゾン、ベンザチン、ベンジルペニシリン、ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、カプレオマイシン、カルベニシリン、セファセトリル、セファクロル、セファマンドールナファート、セファゾリン、セファレキシン（cefalexin）、セファログリシン（cefaloglycin）、セファロリジン（cefaloridine）、セファロチン（cefalotin）、セファピリン、セファゾリン、セフォペラゾン、セフトリアキソン、セフロキシム、セファレキシン（cephalexin）、セファログリシン（cephaloglycin）、セファロチン（cephalothin）、セファピリン（cephapirin）、セルレニン、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、クロラムフェニコール二酢酸、シクラシリン、クリンダマイシン、酢酸クロルマジノン、クロルフェニラミン、クロモマイシンＡ３、シンナリジン、シプロフロキサシン、クロトリマゾール、クロキサシリン、コリスチンメタンスルホナート、サイクロセリン、デアセチルアニソマイシン（deacetylanisomycin）、デメクロサイクリン、４，４'−ジアミノジフェニルスルホン、ジアベリジン、ジクロキサシリン、ジヒドロストレプトマイシン、ジピリダモール、ドキソルビシン、ドキシサイクリン、エピシリン、エリスロマイシン、エリスロマイシンストラート（erythromycin stolate）、エチルコハク酸エリスロマイシン、ステアリン酸エリスロマイシン、エタンブトール、フルクロキサシリン、フルオシノロンアセトニド、５−フルオロシトシン、フィリピン（filipin）、ホルマイシン（formycin）、フマルアミドマイシン（fumaramidomycin）、フラルタドン、フシジン酸、ジェネテシン、ゲンタマイシン（gentamycin）、硫酸ゲンタマイシン、グリオトキシン、グラミシジン、グリセオフルビン、ヘルボン酸、溶血素、ヘタシリン、カスガマイシン、カナマイシン（Ａ）、ラサロシド、リンコマイシン、マグネシジン（magnesidin）、メルファラン、メタサイクリン（metacycline）、メチシリン、メビノリン、ミカマイシン（micamycin）、ミトラマイシン、ミトラマイシンＡ、ミトラマイシン複合体、マイトマイシン、ミノサイクリン、ミコフェノール酸、ミクソチアゾール（myxothiazole）、ナタマイシン、ナフシリン、ネオマイシン、硫酸ネオマイシン、５−ニトロ−２−フルアルデヒドセミカルバゾン、ノボビオシン、ニスタチン、オレアンドマイシン、リン酸オレアンドマイシン、オキサシヒン（oxacihin）、オキシテトラサイクリン、パロモマイシン、ペニシリン、ペシロシン（pecilocin）、フェネチシリン（pheneticillin）、フェノキシメチルペニシリン、フェニルアミノサリチラート、フレオマ���シン（phleomycin）、ピバンピシリン、ポリミキシンＢ、プロピシリン、ピューロマイシン、ピューロマイシンアミノヌクレオシド、ピューロマイシンアミノヌクレオシド５'−一リン酸、ピリジノールカルバメート、ロリテトラサイクリン、リファンピシン、リファマイシンＢ、リファマイシンＳＶ、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、硫酸ストレプトマイシン、スルファベンズアミド、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、テトラサイクリン、チアンフェニコール、トブラマイシン、トロレアンドマイシン、ツニカマイシン（tunicarnycin）、ツニカマイシンＡ１相同体、ツニカマイシンＡ２相同体、バリノマイシン、バンコマイシン、ビノマイシンＡ１（vinomycin A1）、バージニアマイシンＭ１、バイオマイシンおよび／またはキシロスタシン（xylostasin）を包含する。
【００６０】
用語「抗感染薬」は、例えば抗真菌薬、駆虫性効果を有する物質およびウイルス抑止薬、特にアンホテリシン、ビフォナゾール（vifonazole）、ブクロサミド（buclosamide）、硫酸キノリン、クロルミダゾール（chlormidazole）、クロルフェネシン、クロルキナルドール（chlorquinaldol）、クロダントイン（clodantoin）、クロキシキン（cloxiquine）、シクロピロックスオーラミン（cyclopirox olamine）、デカリニウムクロライド、ジマゾール（dimazole）、フェンチクロル、フルシトシン、グリセオフルビン、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナタマイシン、スルベンチン（sulbentine）、チオコナゾール、トインアフタート（toinaftate）、抗レトロウイルス薬および／またはヘルペス治療薬を包含する。
【００６１】
用語「抗アレルギー薬」は、例えばグロブリン、コルチコイドまたは抗ヒスタミン薬のクラス由来の物質、特にベクロメタゾンおよびその誘導体、ベタメタゾンコルチゾンおよびその誘導体、デキサメタゾンおよびその誘導体、酢酸バミピン（bamipine acetate）、バクリジン、クレマスチン、クレミゾール、クロモグリク酸（cromoglicic acid）、シプロヘプタジン、吉草酸ジフルコルトロン、ジメトチアジン、ジフェンヒドラミン、ジフェニルピラリン、エフェドリン、フルオシノロン、ヒスタピロジン（histapyrrodine）、イソチペンジル、メトジラジン、オキソメマジン（oxomemazine）、パラメタゾン、プレドニリデン（prednylidene）、テオフィリン、および／またはトルプロパミン トリトカリンを包含する。
【００６２】
用語「分裂促進因子」、「ケモカイン」および「サイトカイン」は、例えばインターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、インターロイキン−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１−アルファ／ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦ、塩基性または酸性ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータおよび／またはＴＮＦ−アルファを包含する。
【００６３】
用語「皮膚薬（dermatics）」は、例えば頁岩油スルホン酸塩、タールおよびタール誘導体、収斂薬、制汗薬、ざ瘡治療薬、乾癬治療薬、抗脂漏薬および／または皮膚障害を処置するための酵素調製物を包含する。
【００６４】
したがって本発明の別の側面は、増殖性疾患、免疫疾患、特に自己免疫疾患、感染症、血管疾患、リウマチ様疾患、特に骨関節炎および関節リウマチまたは、健康または正常な組織と比較された場合に疾患部位中の、あるいは疾患部位に隣接する細胞がαＶβ３および／またはαＶβ５インテグリンを発現し、特に過剰発現している疾患および炎症性疾患を治療するための医薬品の製造に関する本発明のポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞または組成物の使用である。
【００６５】
αＶβ３および／またはαＶβ５インテグリンの発現若しくは過剰発現は特に増殖性疾患に関して報告されているため、このタイプの疾患は本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物で処置することができる好ましい疾患である。特に好ましい増殖性疾患は、以下からなる群から選択される：胃腸管または結腸直腸管、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、前立腺、子宮内膜、卵巣、精巣の癌腫、黒色腫、形成異常の口腔粘膜、浸潤性経口癌、小細胞および非小細胞肺癌腫、ホルモン依存性乳癌、非依存性乳癌、移行および扁平細胞癌、神経学的悪性腫瘍、例えば神経芽細胞腫、神経膠腫、星細胞腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、血管腫（hemangioamas）、内分泌学的腫瘍、血液学的異常増殖、例えば白血病、リンパ腫、および他の骨髄増殖性およびリンパ球増殖性疾患、上皮内癌、過形成性病変、腺腫、線維腫、組織球増殖症、慢性炎症性増殖性疾患、血管増殖性疾患およびウイルス誘発性増殖性疾患。
【００６６】
さらにまた、本発明のポリペプチドおよび組成物を診断目的で使用することができる。診断目的で使用できるのは、特に、それらを上に規定されるマーカーに取り付けた場合である。したがって本発明の別の側面は、疾患、特に、増殖性疾患、免疫疾患、特に自己免疫疾患、感染症、血管疾患、リウマチ様疾患、炎症性疾患および、αＶβ３および／またはαＶβ５インテグリンの発現の増加若しくは減少に関連する疾患の群から選択される疾患の診断に関する、本発明のポリペプチドまたは組成物の使用である。例えば患者の生体組織検査においてインビトロで、あるいは患者において例えば断層撮影法によってインビボでマーカーを検出することにより、検体内または患者内の新血管新生部位の検出が可能である。
【００６７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を実証するために含まれるものである。以下の実施例において開示される技術は、発明者らによって発見された、本発明の実施において良好に機能する技術であり、ゆえにその実施に関する好ましい様式であるとみなし得ることが当業者には認識されよう。しかし、本開示内容に照らして、特許請求の範囲に記載される本発明の思想および範囲から逸脱することなく、開示されている具体的実施態様に多数の変更を施し得ることを当業者は認識するであろう。引用されるすべての参考文献は参照により本明細書中に包含される。
【実施例１】
【００６８】
実施例
実施例１：新規ＲＧＤペプチドの選択
システイン残基が隣接するＲＧＤモチーフを含有する２つの構成ペプチドライブラリー（ＣＰＬ４ｂ、ＣＰＬ４ｃ）を作成した。中心の−ＣＲＧＤＣ−モチーフの先行の３個および後続の３個の６アミノ酸位置をランダム化し、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、およびＡｓｎを除くすべてのアミノ酸をエンコードするコドンＢＮＫ（Ｂ＝Ｇ、Ｔ、Ｃ；Ｋ＝Ｇ、Ｔ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を導入した。リシン残基は、Ｎ末端アミノ基を介する指向性の化学カップリングを容易にするために回避した。ＣＰＬ４ｂはＣ末端のＡｓｐ−Ｇｌｙ配列がＣＰＬ４ｃと異なっていた。ヒト真皮微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）、ヒト黒色腫セルライン（ＭｅＷｏ）、またはマウス黒色腫セルラインＢ１６．Ｆ１およびＢ１６．Ｆ１０の混合物に関してペプチドを選択した。
【００６９】
複数回出現する配列を含み、総数１５の諸配列を同定した。それらを表Ｉにまとめる。
【００７０】
表１：単離されたＲＧＤペプチド
【表１】
2007535909.tif 000003
＊ＲＧＤ−４Ｃ（１）およびＲＧＤ−４Ｃ（２）配列はKoivunen, et al. (1995) Bio/Technol. 13, 265-270由来である。
【００７１】
ＭｅＷｏに関して選択された２ペプチドを除いて、すべてのペプチドはＣＰＬ４ｂライブラリー由来であった。同定された配列を２群に分けることができる。群１のペプチド（４Ｃ−ＲＧＤペプチド）は４、６、１０、および１２位（ペプチド１〜５）または５、６、１０および１２位（ペプチド６）に４個のシステイン残基を含有し、６および１０位は固定のシステイン残基に対応する。ペプチド１〜５はすべて５位に親水性残基（Ｑ、Ｅ、Ｈ）を含有し、１１位に疎水性残基（Ｌ、Ｆ）を含有していた。群２のペプチド（２Ｃ−ＲＧＤペプチド）は６および１０位の２個の固定システイン残基しか含有しない。６ペプチドのうちの４つは４位にアルギニン残基を有し、１２位にアスパラギン酸またはグルタミン酸残基を有する（ペプチド７〜１２）。これらのペプチドは３位のアラニン残基および１１位のバリン残基を好むものであった。
【実施例２】
【００７２】
実施例２：ペプチドＲＧＤ−１０の特徴付け
４Ｃおよび２Ｃペプチドを内皮または黒色腫細胞への結合に関して分析すると、αＶ−インテグリンの高親和性リガンドであることが既知の、コントロールとして含まれるＲＧＤ−４Ｃと同様またはより良好な結合活性が示された。さらに分析するために、発明者らは２Ｃ−ＲＧＤペプチドＲＧＤ−１０（ＤＧＡＲＹＣＲＧＤＣＦＤＧ）を選択した。配列ＧＡＲＹＣＲＧＤＣＦＤＧを有し、ゆえにＣ末端アスパラギン酸残基を欠き、したがって正味無電荷であるＲＧＤ−１０ペプチドを合成した。合成カルボキシフルオレセイン標識化ＲＧＤ−１０ペプチドを用いて、ＲＧＤ−１０とＨＵＶＥＣの直接結合を実証した（図１）。ＲＧＤ−１０ペプチドは、ＲＧＤ−４Ｃに匹敵する強度でＨＤＭＥＣに結合した。これらの実験では、ＲＧＤ−４Ｃを２段階工程で酸化して、高親和性結合に必須であると報告されているＣ１−Ｃ４およびＣ２−Ｃ３間のジスルフィド結合を取得した（Assa-Munt, et al. (2001) Biochemistry 40: 2373-2378）。ＲＧＤ−４Ｃと比較して、ＲＧＤ−１０は２個のシステイン残基しか含有しない。これにより１段階酸化反応を使用する酸化型ペプチドの合成が容易になる。さらにまた、ＲＧＤ−１０は２個の芳香族残基を含有し、したがって２８０ｎｍでの分光光度法による検出が可能である。遊離のＲＧＤ−１０、ＲＧＤ−４Ｃ、および非ＲＧＤコントロールペプチドを用いる競合実験では、両ＲＧＤペプチドがＲＧＤ−４Ｃと同一のエピトープに結合することが示された。競合を滴定すると、ＲＧＤ−１０およびＲＧＤ−４Ｃに関して約０．２μｍｏｌ／ｌの同一のＩＣ５０値が得られた（図２）。ゆえに、ＲＧＤ−１０はＲＧＤ−４Ｃと同一の親和性でインテグリン発現細胞に結合するが、その製造はずっと簡単である。
【実施例３】
【００７３】
実施例３：ＲＧＤ１０リポペプチド含有リポソームと内皮および黒色腫細胞の結合
ＲＧＤ−１０ペプチドが１または３コピーの８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ｄｏｏ）をスペーサーとして使用してカップリングされている１，２−ジパルミトイル−グリセロ−３−スクシニル−リシンアンカーから構成される新規リポペプチド構造（図３）を設計した。
【００７４】
リポソームは以下の脂質組成を有するものであった：３５ｍｏｌ％コレステロール、３２，１ｍｏｌ％パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１４，７ｍｏｌ％ジラウロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１８．２ｍｏｌ％ミルク由来のＳＭ。リポペプチドアンカーを０．１〜３ｍｏｌ％のモル比で加えた。したがって比例的に脂質の濃度は減少する。すべての脂質はAvanti Polar Lipids（USA）から購入し、リポペプチドはemc（Germany）に合成を依頼した。脂質およびリポペプチドはさらに精製することなく使用した。乾燥脂質フィルムから再水和によってリポソームを調製した。このために、脂質およびリポペプチドをクロロホルムまたはクロロホルム／メタノール（１：１）に溶解し、指定の割合で混合した。結合研究のために、０，０３ｍｏｌ％ローダミン−ＤＰＰＥを加えた。回転式蒸発装置を使用して脂質を乾燥し、残留した溶媒を高度減圧下で除去した。その後、脂質フィルムをＰＢＳ ｐＨ７．４で再水和して、最終脂質濃度を１０μｍｏｌ／ｍｌにした。５０ｎｍメンブレンを通してリポソームを２１回押し出した。すべてのリポペプチド含有リポソームは７６＋／−２ｎｍの平均サイズを有した。ゆえに１ｍｏｌ％リポペプチドの組み込みは、リポソーム当たり約３５０の表面表示型リガンドの理論値に相当する。腫瘍細胞をリポソーム（５０ｎｍｏｌ脂質）と４℃で３０分間インキュベートし、その後、細胞結合活性に関してフローサイトメトリーによって分析した。
【００７５】
これらのＲＧＤ−１０リポペプチドを含有するリポソーム（１−ｄｏｏスペーサーを伴うＲＧＤ１０−ＬＰ１、３−ｄｏｏスペーサーを伴うＲＧＤ１０−ＬＰ３）を用いて、内皮細胞ならびに黒色腫細胞への特異的結合を検出することができた。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に関して強い結合が観察され、マウス黒色腫セルラインＢ１６．Ｆ１０に関してはいくらか弱い程度に結合が観察された（図４Ａ）。平均の蛍光の分析により、Ｂ１６．Ｆ１０と比較して２〜３倍強いＨＵＶＥＣへの結合が示された。ＭｅＷｏでは弱い結合しか観察されなかった（図４Ｂ）。インテグリン陰性セルラインとして含まれるＡ４３１腫瘍細胞では結合が観察されなかった（図４Ｂ）。０．１、１、または５ｍｏｌ％ＲＧＤ１０−ＬＰ１またはＲＧＤ１０−ＬＰ３を含有するリポソームを用いる結合実験では、これらの細胞への結合がリポペプチド濃度の増加に応じて増加することが示された（図４Ａ）。１ｍｏｌ％ＬＰ１またはＬＰ３に関して、０．１ｍｏｌ％リポペプチドと比べて１．５〜２倍強い結合が観察された。さらに、ＲＧＤ１０−ＬＰ３を含有するリポソームは、ＲＧＤ１０−ＬＰ１を含有するリポソームと比べてＨＵＶＥＣまたはＢ１６．Ｆ１０に対する高い結合（１．５〜２倍）を示した。これはｄｏｏスペーサーが長いほど細胞表面への結合が向上することを示す。
【００７６】
ＲＧＤ−１０ペプチドによって結合が媒介されることを実証するために、種々の競合実験を実施した。無関係のコントロールペプチドではなく、合成ペプチドＲＧＤ−１０またはＲＧＤ−４Ｃは、ＲＧＤ１０ ＬＰ１含有リポソームとＨＵＶＥＣまたはＢ１６．Ｆ１０の結合を完全に阻害した（図５）。さらに、ＲＧＥペプチドでは結合の阻害は観察されなかった。これはＲＧＤ−１０リガンドの特異性をさらに実証する。ゆえに、インテグリン発現細胞への結合はＲＧＤペプチドによって特異的に媒介される。ＲＧＤ１０リポソームを５ｄｏｏ単位からなる過剰量の分子（５−ｄｏｏ）とインキュベートしても、ＨＵＶＥＣへの結合は阻害されなかった。これは１または３ｄｏｏ単位からなるリポペプチドのスペーサー領域は細胞結合に寄与しないことを示す。
【００７７】
ＲＧＤ１０−ＬＰ３リポソームと３７℃で１時間インキュベートしたＨＵＶＥＣを蛍光顕微鏡検査に付すると、内部移行化リポソームの徴候である核周囲の染色パターンが示された。対照的に、４℃でのインキュベーション後では細胞表面の染色しか観察されなかった（図６）。これらの実験において、ＲＧＤ１０リポペプチドを欠いているリポソームでは染色が観察されなかった。これらの実験は、ＲＧＤ標的化リポソームがインテグリン発現細胞によって取り込まれることを実証する。
【実施例４】
【００７８】
実施例４：ＲＧＤ１０−ＬＰ３リポソームの薬物動態
種々の量のリポペプチドを含有する３Ｈ−コレステリルオレイルエーテル（3H-cholesteryloleylether）標識化リポソームを注射したヌードマウスにおいて薬物動態を分析した（図７）。実施例３に記載されるようにリポソームを調製した。１ｍｏｌ％ＲＧＤ１０−ＬＰ１またはＲＧＤ１０−ＬＰ３を含有するリポソームは血流から急速に排除された。ｔ１／２は約９〜１０分であった。リポソーム内に組み込まれるリポペプチドの量を０．１ｍｏｌ％に減少させると、５０％値に関して算出される血清滞在時間が１０２分に延長された（ｔ１／２α＝４４分、ｔ１／２β＝９．２時間）。この値はリポペプチドを欠いているリポソームの血清滞在時間である約１０８分に近い値である。注射後６時間の器官分布を測定したところ、発明者らは、すべてのリポペプチド含有製剤が肝臓（５１〜５４％注射用量）および脾臓（４〜１１％注射用量）で蓄積し、腎臓および肺では不十分にしか蓄積しないことを発見した。
【実施例５】
【００７９】
実施例５：ドキソルビシン積載型ＲＧＤ１０リポソームの抗腫瘍効果
薬物動態学的データに基づき、発明者らは０．１％リポペプチドを含有するＲＧＤ１０−ＬＰ３リポソームを使用して、インビボ抗腫瘍効果を分析した。このために、リポソームにドキソルビシンを積載し、Ｃ２６結腸癌マウスモデルにおいて分析した。
【００８０】
０．１％リポペプチドを含有するリポソーム（組成に関しては実施例３を参照のこと）内にドキソルビシンをカプセル化した。発明者らはコントロールとしてＲＧＤ−１０リポペプチドを欠いているリポソームを含ませた。脂質フィルムを３００ｍｍｏｌ／ｌクエン酸（citrat）バッファーｐＨ４．０で再水和した。押し出し後、外部水性溶液のｐＨをＮａＯＨでｐＨ７．４に調節した。リポソームを６０℃に加熱し、ＰＢＳ中のドキソルビシンを加えて１５分間インキュベートした。これらの実験では、１：５（ｗ／ｗ）の薬物対脂質比を使用した。Vivaspinカラムを使用する限外濾過（２８００ｒｐｍで１０分間の遠心分離）によって未カプセル化ドキソルビシンを除去した。ＲＰ１８カラムでのドキソルビシンのＨＰＬＣ分析によってカプセル化効率を測定し、７０〜９０％の範囲であることを見出した。
【００８１】
Ｃ２６マウス結腸癌モデルにおいて薬力学的実験を実施した。このために、腫瘍細胞をヌードマウス内に皮下注射した。そして腫瘍保持マウスをドキソルビシン積載型リポソームで処置した。この処置では、腫瘍が約５０〜１００ｍｍ３のサイズに達した後１、３および６日目に４ｍｇ／体重ｋｇのドキソルビシン用量を注射した。
【００８２】
これらの実験では、ドキソルビシン積載型ＲＧＤ１０−ＬＰ３リポソームの抗腫瘍効果が遊離のドキソルビシンおよび非標的化リポソームと比べて向上することが示された（図８）。１１日後、非標的化リポソームで処置されたマウスと比べて、腫瘍増殖が４５％阻害（腫瘍容量から算出）された。この向上した抗腫瘍効果は平均生存期間の延長にも反映された。平均生存期間は、非標的化リポソームでは１５日であったのに比べて、ドキソルビシン積載型ＲＧＤ１０−ＬＰ３リポソームで処置された動物では１８日であった。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１：カルボキシフルオレセイン標識化ＲＧＤ−１０とＨＵＶＥＣの結合。細線−ペプチドなしの細胞、太線−ＣＦ標識化ＲＧＤ−１０とインキュベートされた細胞。
【図２】図２：細胞ＥＬＩＳＡによって分析されたペプチドＲＧＤ−１０またはＲＧＤ−４Ｃに基づくＲＧＤ−１０結合の阻害の滴定。
【図３】図３：アセチル化されたＮ末端を有するペプチドリガンド、ジパルミトイル−グリセロ−スクシニル−リシンアンカーに連結されたｄｏｏスペーサーからなるリポペプチドの構造。
【図４】図４：Ａ）ＲＧＤ１０リポソームとＨＵＶＥＣまたはＢ１６.Ｆ１０の結合。０．１ｍｏｌ％（細線）、１ｍｏｌ％（通常線）、または５ｍｏｌ％（太線）の濃度でＲＧＤ１０−ＬＰ１またはＲＧＤ１０−ＬＰ３リポペプチドを含有するリポソームを、ＨＵＶＥＣまたはＢ１６．Ｆ１０（０でマーク）への結合に関して分析した。リポペプチドを欠いているリポソームの結合を破線で示す。Ｂ．）ＲＧＤ１０−ＬＰ３リポペプチドを１ｍｏｌ％の濃度で含有するリポソームを、ＭｅＷｏまたはＡ４３１細胞への結合に関して分析した。破線＝細胞のみ、通常線＝リポペプチドなしのリポソーム、太線、ＲＧＤ１０−ＬＰ３リポソーム。
【図５】図５：競合実験。ＲＧＤ１０−ＬＰ３リポソーム（１ｍｏｌ％リポペプチド）を１００μＭ合成ペプチドＲＧＤ１０（Ａ）またはＲＧＤ−４Ｃ（Ｂ）と同時インキュベートすると、リポソームとＨＵＶＥＣの結合が完全に阻害された。対照的に、ＲＧＥペプチド（Ｃ）または５ｄｏｏ単位からなる分子は全く阻害を引き起こさなかった。細線＝細胞のみ、通常線＝＋ペプチドまたは５ｄｏｏ、太線＝競合者なしのリポソーム。
【図６】図６：ＲＧＤ−１０−ＬＰ３リポソームの細胞結合および内部移行。蛍光顕微鏡検査による、４℃または３７℃でのＲＧＤ１０−ＬＰ３リポソームまたはリポペプチドを欠いているリポソーム（非標的化リポソーム）とＨＵＶＥＣの結合の分析。４℃ではＲＧＤ１０−ＬＰ３リポソームに関して細胞表面の染色が観察されるが、３７℃で２時間インキュベートすると蛍光が核周囲に蓄積した。これはリポソームの内部移行を示す。
【図７】図７：１ｍｏｌ％ＬＰ１、１ｍｏｌ％ＬＰ３、または０．１ｍｏｌ％ＬＰ３を含有するリポソームの薬物動態学的分析。
【図８】図８：Ｃ２６マウス結腸癌腫瘍モデルで分析された、非標的化リポソーム（Ｄｏｘリポソーム）または遊離ドキソルビシンと比較した場合の、ドキソルビシン積載型ＬＰ３−リポソーム（Ｄｏｘ−ＬＰ３リポソーム）の抗腫瘍効果。
【図１】
2007535909.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007535909.tif 000014
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