(57)【要約】【解決手段】本発明は、核酸混合物のクロマトグラフィー分離方法であり、特に、核酸混合物の他の成分、特に他の核酸からの、プラスミドＤＮＡの分離精製方法 u関する。本発明の方法は、特に、リボヌクレアーゼの添加を要せず、費用効率が高く環境適合性のある成分を使用して、プラスミドＤＮＡを夾雑ＲＮＡから分離することができることを特徴とする。これらのパラメーターにより、プラスミドＤＮＡの大規模生産にこの方法を使用することも可能になる。加えて、本発明は、遺伝子治療または遺伝子ワクチン接種に使用するためのプラスミドＤＮＡを含有する薬剤の製造のための、本発明の方法によって得られるプラスミドＤＮＡの使用を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミドＤＮＡが核酸混合物の他の成分、特に他の核酸から分離される、核酸混合物のクロマトグラフィー分離方法であって、
ｂ）適宜、前記核酸混合物を、水溶液中、一以上のアルカリ塩および／またはアルカリ土類塩で調整して、ｐＨ４．８〜５．４、２０℃の温度で７０ｍＳ〜９５ｍＳのコンダクタンスと等価のコンダクタンスとし、そして、
ｃ）前記核酸混合物を、クロマトグラフィー固定相と接触させ、
ｄ）次に、前記固定相を、アルカリ塩をｐＨ７〜７．４に基づく９００ｍＭ〜１８００ｍＭの濃度範囲で、および／または、アルカリ土類塩をｐＨ７〜７．４に基づく１００ｍＭ〜２４０ｍＭの濃度範囲で含む溶液で、少なくとも１回洗浄し、そして、
ｅ）次に、前記クロマトグラフィーの固定相に結合したプラスミドＤＮＡを、アルカリ塩をｐＨ７〜７．４に基づく１３００ｍＭ以上の濃度、および／または、アルカリ土類塩をｐＨ７〜７．４に基づく２７０ｍＭ以上含む溶液で溶出する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記アルカリ塩がハロゲン化アルカリであり、前記アルカリ土類塩がアルカリ土類ハロゲン化物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ハロゲン化アルカリが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣｓＣｌおよび／またはＬｉＣｌであり、前記アルカリ土類ハロゲン化物がＣａＣｌ2であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸混合物が、ｐＨ４．８〜５．４および２０℃の温度で、７０ｍＳ〜８５ｍＳのコンダクタンスと等価のコンダクタンスにＫＣｌで調整されることを特徴とする、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸混合物が、ｐＨ４．８〜５．４および２０℃の温度で、７０ｍＳ〜８０ｍＳのコンダクタンスに相当するコンダクタンスにＫＣｌで調整されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸混合物が、ｐＨ４．８〜５．４および２０℃の温度で、７０ｍＳ〜９５ｍＳのコンダクタンスに相当するコンダクタンスにＮａＣｌで調整されることを特徴とする、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸混合物が、ｐＨ４．８〜５．４および２０℃の温度で、８５ｍＳ〜９５ｍＳのコンダクタンスに相当するコンダクタンスにＮａＣｌで調整されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１の工程ｂ）からの洗浄工程が、ｐＨ７〜７．４に基づく１１００ｍＭ〜１８００ｍＭの濃度範囲のＫＣｌを含む溶液で実施されることを特徴とする、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１の工程ｂ）からの洗浄工程が、ｐＨ７〜７．４に関する１３００ｍＭ〜１７００ｍＭの濃度範囲のＫＣｌを含む溶液で実施されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１の工程ｂ）からの洗浄工程が、ｐＨ７〜７．４に基づく９５０ｍＭ〜１２００ｍＭの濃度範囲のＫＣｌを含む溶液で実施されることを特徴とする、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１の工程ｂ）からの洗浄工程が、ｐＨ７〜７．４に基づく１１００ｍＭ〜１１５０ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌを含む溶液で実施されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１の工程ｃ）からの溶出工程が、ｐＨ７〜７．４に基づく１９００ｍＭ以上の濃度範囲のＫＣｌを含む溶液で実施されることを特徴とする、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１の工程ｃ）からの溶出工程が、ｐＨ７〜７．４に基づく１３００ｍＭ以上の濃度範囲のＮａＣｌを含む溶液で実施されることを特徴とする、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記クロマトグラフィー固定相がアニオン交換体であることを特徴とする、請求項１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
クロマトグラフィー固定相として、シリカゲル、珪藻土、ガラス、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ヒドロキシアパタイト、デキストラン、アガロース、アクリルアミド、ポリスチレン樹脂、または名前を挙げた物質の共重合体を用いることを特徴とする、請求項１〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記クロマトグラフィー固定相が、第一工程において、請求項１５に名前を挙げた固定相の１つを一般構造Ｉのシラン化試薬と反応させ、その後の第二工程によって、第一工程で修飾された固定相を一般構造ＩＩの試薬と反応させることにより得られることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
2007519407.tif 000005
式中、Ｒ1は、炭素数１〜１０のアルコキシ残基、特に−ＯＣＨ3、−ＯＣ2Ｈ5または−ＯＣ3Ｈ7であるか、またはハロゲン原子、特に−Ｃｌであるか、または炭素数１〜６の同一または異なるアルキル残基を有するジアルキルアミノ基であり、
Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して、炭素数１〜１０の炭化水素残基、特に、−ＣＨ3、−Ｃ2Ｈ5または−Ｃ3Ｈ7であるか、または炭素数１〜１０のアルコキシ残基、特に−ＯＣＨ3、−ＯＣ2Ｈ5または−ＯＣ3Ｈ7であるか、または、ハロゲン原子または少なくとも１つの酸素原子またはアミノ基で中断される炭素数４〜２０のアルキル残基であり、ここでこの残基は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシまたはアリールで一回または数回置換されることもでき；
Ｒ4は、炭素数１〜２０の炭化水素鎖または少なくとも１つの酸素原子またはアミノ基で中断されるアルキル残基であり、それによってこの残基はハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ、ヒドロキシ、アリールおよび／またはエポキシ、特に
2007519407.tif 000006
で１回または数回置換されることもできる；
2007519407.tif 000007
式中、
Ｘは、アミノ−、ヒドロキシ−、エポキシ基またはハロゲン原子であり、
Ｒは、炭素数２〜２０の炭化水素鎖または少なくとも１つの酸素原子またはアミノ基で中断されるアルキル残基であり、ここでこの残基は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ、ヒドロキシ、アリールおよび／またはエポキシで一回または数回置換されることもでき；
Ｙは、アミノ−、モノアルキルアミノ−、ジアルキルアミノ−、トリアルキルアンモニウムで一回または数回置換されることができる、炭素数１〜１０の官能基を形成するアニオン交換体を有する炭化水素残基である。
【請求項１７】
前記方法が室温で実施されることを特徴とする、請求項１〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも請求項１の工程ｂ）において、ＫＣｌが塩として使用されることを特徴とする、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項１９】
異なるアルカリ塩および／またはアルカリ土類塩の混合物が、請求項１の工程ａ）、ｃ）およびｄ）においても使用できることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸混合物が、原核細胞由来の除去溶解物であることを特徴とする、請求項１〜１９に記載の方法。
【請求項２１】
プラスミドＤＮＡの精製のための、請求項１〜２０に記載の方法の使用。
【請求項２２】
遺伝子治療または遺伝子ワクチン接種に使用するためのプラスミドＤＮＡを含有する薬剤の製造のための、請求項１〜２０に記載の方法によって得られるプラスミドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、核酸混合物のクロマトグラフィー分離方法であり、特に、核酸混合物の他の成分、特に他の核酸からの、プラスミドＤＮＡの分離精製方法である。本発明の方法は、特に、リボヌクレアーゼの添加を要せず、費用効率が高く環境適合性のある成分を使用して、プラスミドＤＮＡを夾雑ＲＮＡから分離することができることを特徴とする。これらのパラメーターにより、プラスミドＤＮＡの大規模生産にこの方法を使用することも可能になる。さらに、本発明は、遺伝子治療または遺伝子ワクチン接種に使用するためのプラスミドＤＮＡを含有する薬剤の製造のための、この方法によって単離されるプラスミドＤＮＡの使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
プラスミドの精製における基本的な問題は、製品からの他の核酸種の除去である。この問題は、主として、特に純粋なプラスミドＤＮＡの製造が必要とされる領域、例えば、遺伝子治療でプラスミドＤＮＡを使用する際に現れる。上述の他の核酸種は主に種々のＲＮＡ類であるが、ゲノムＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ（１本鎖）等も含まれる。特にＲＮＡの除去が困難である。当業界で知られている技術は、リボヌクレアーゼによりＲＮＡを除去する。ＲＮＡは、リボヌクレアーゼによってリボヌクレオチドに分解され、その後のクロマトグラフィー分離方法において、プラスミドＤＮＡから遥かにより容易に除去することができる。この方法の重大な不利点はＲＮａｓｅを使用することであり、これは通常、異質のタンパク質に相当する。ＲＮａｓｅは動物材料、通常はウシから単離される。ヒトに投与するための非経口の治療用薬剤の製造において、特に、製造工程で動物タンパク質を添加することは、製品がバクテリア、ウイルスまたはタンパク由来の病原体で汚染される可能性があるために、避けるべきである。このことは、ＢＳＥの問題のため、特にウシタンパク質にあてはまる。
【０００３】
さらに、ＲＮａｓｅおよびアルコール含有緩衝液を使用することは、大きなコスト要因を意味する。特にプラスミドＤＮＡの大規模製造では、約２ｇ以上の範囲であり、これは軽く考えるべきではないコスト要因である。また、アルコールの使用は、関係する従業員および環境に大きな負担を加える。
【０００４】
原核生物細胞から、また真核生物細胞からの核酸の精製における一般的な問題は、核酸の放出を引き起こすために最初に実施しなければならない細胞の溶解である。本発明の方法においては、主にビルンボーン(Birnborn)およびドーリイ(Dohly)が記載したアルカリ溶解 (Nucl. Acids Res. 7, pp. 1513 - 1522; 1979) が好ましいが、これに限定されない。さらなる可能性は、熱による溶解および洗浄剤の存在における溶解である。高圧（加圧型細胞破壊装置）による溶解は、高剪断力によってゲノムＤＮＡの非常に小さな断片が生じ、これはプラスミドＤＮＡから本質的に分離できないので、好適でないことが判っている。
【０００５】
このような溶解物から核酸を精製するためのクロマトグラフ法は、当業界において知られている。ここでは、一般に、２つの独特な方法を区別することができる。当業界において知られている１つの方法は、ギレスピー(Gillespie)およびフォーゲルシュタイン(Vogelstein)の方法である(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76 pp. 615 - 619; 1979)。この方法において、核酸の精製は、例えば、ＧｕＨＣｌ、ＮａＩ等のカオトロピック塩の存在下で、シリカゲルまたは珪藻土に結合させることによって行われる。アニオン交換体と異なり、ＤＮＡの結合は高濃度の塩の存在下で起こり、一方、溶出は低濃度の塩の存在で実施される。この方法において、核酸の結合は「全部かゼロか」の原則に従うので、ＲＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびタンパク質の定量的な分離は可能ではない。従って、この方法によって得られるＤＮＡ試料は、ＲＮＡおよびタンパク質による汚染のため、遺伝子治療における使用には不適当である。
【０００６】
引用した第二の方法は、欧州特許EP 0268 946号に記載される通り、イオン交換体による精製である。この場合、細胞、例えばバクテリアは、好ましくはアルカリ溶解によって分解される。細胞タンパク質およびゲノムＤＮＡは、洗浄剤と、その後の遠心分離によって分離される。このようにして得られるプラスミドＤＮＡを含む上澄は、除去(cleared)溶解物と呼ばれる。この除去溶解物は、ＲＮＡおよびｓｓＤＮＡの定量的分離が行われる場合、アニオン交換カラム（例えば、キアゲン(QIAGEN(登録商標)) 、キアゲン社(QIAGEN GmbH)、ドイツ、ヒルデン）で精製される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の方法の基礎を形成する技術的問題は、核酸混合物からのプラスミドＤＮＡの精製、および、ＲＮａｓｅを使用しない、ＲＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ等の汚染物質の分離の向上である。本発明の基礎を形成するさらなる課題は、大規模であっても費用効率が高く環境に優しい、プラスミドの精製を可能にする方法を提供することでもある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、本発明の基礎を形成する技術的問題は、特許請求の範囲に記載された通りの方法によって解決された。本発明の方法において、核酸混合物の他の成分、特に他の核酸種からのプラスミドＤＮＡの分離は、
ａ）適宜、前記核酸混合物を、水溶液中、一以上のアルカリ塩および／またはアルカリ土類塩で調整して、ｐＨ４．８〜５．４、２０℃の温度で７０ｍＳ〜９５ｍＳのコンダクタンスと等価のコンダクタンスとし、そして、
ｂ）前記核酸混合物を、クロマトグラフィー固定相と接触させ、
ａ）次に、前記固定相を、アルカリ塩をｐＨ７〜７．４に基づく９００ｍＭ〜１８００ｍＭの濃度範囲で、および／または、アルカリ土類塩をｐＨ７〜７．４に基づく１００ｍＭ〜２４０ｍＭの濃度範囲で含む溶液で、少なくとも１回洗浄し、そして、
ｃ）次に、前記クロマトグラフィーの固定相に結合したプラスミドＤＮＡを、アルカリ塩をｐＨ７〜７．４に基づく１３００ｍＭ以上の濃度、および／または、アルカリ土類塩をｐＨ７〜７．４に基づく２７０ｍＭ以上含む溶液で溶出する。
【０００９】
核酸混合物を単離するために、先ず、原核生物または真核生物であってもよい、細胞を溶解する。これは、上述の方法によって実施することができる。本発明の方法において、主に、ビーンボーン(Birnborn)およびドーリイ(Dohly)によって記載されたアルカリ溶解（Nucl. Acids Res. 7, pp. 1513 - 1522; 1979）が好ましいが、これに限定されない。さらなる可能性は、熱による分解または洗浄剤の存在下での分解である。高圧（加圧型細胞破壊装置）による溶解は、高剪断力によってゲノムＤＮＡの非常に小さな断片が生じ、これはプラスミドＤＮＡから本質的に分離できないので、好適でないことが判っている。
【００１０】
本発明の意義の範囲内での核酸混合物は、それによる細胞溶解物または同様に精製前の溶解物または除去溶解物であることができるが、プラスミドＤＮＡが少なくとも１つのさらなる核酸種および適宜他の汚染物質で汚染された人工的な混合物であることもできる。本発明の方法の好ましい態様において、関与している核酸混合物は原核生物の除去溶解物である。
【００１１】
本発明の方法は、記述した汚染物質のクロマトグラフィー分離を確実にし、遺伝子治療または遺伝子ワクチン接種に使用するための純度の要求を満たすプラスミドＤＮＡを提供する。当業者は、固定相と移動相との間で物質混合物の分配が異なることに基づく物質混合物の物理化学的分離の総称として、クロマトグラフィーを理解する。ここでの代表的な方法において、汚染物質からのプラスミドＤＮＡの分離にはイオン交換材料が使用される。驚くべきことに、市販されている材料のキアゲン(QIAGEN(登録商標))（キアゲン社(QIAGEN GmbH)、ドイツ、ヒルデン）は特に本発明の方法に使用するのが好適であることが判っている。この材料は、本発明の方法により、プラスミドＤＮＡからＲＮＡ、および、例えばｓｓＤＮＡを非常に効率的に分離することを可能にする。ここにより詳細に記載された条件下では、ＲＮＡおよびｓｓＤＮＡは、本発明の方法において、プラスミドＤＮＡの同様に明確なピークから非常に遠くに位置する明確なピークに溶出する。このように、プラスミドＤＮＡおよびＲＮＡおよび／またはｓｓＤＮＡの共溶出(co-elution)の危険性は、当業界で知られている方法と比較してかなり縮小される。
【００１２】
キアゲン(QIAGEN(登録商標))（キアゲン社(QIAGEN GmbH)、ドイツ、ヒルデン）の名前で知られているクロマトグラフィーの固定相は、修飾された多孔性の無機材料である。本発明の方法においてクロマトグラフィーの固定相に無機担体として好適なものは、シリカゲル、珪藻土、ガラス、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ハイドロキシアパタイトであり、有機固定相としては、デキストラン、アガロース、アクリルアミド、ポリスチレン樹脂または名前を挙げた材料のモノマー成分の共重合体等である。
【００１３】
本発明の方法において好ましく用いられるアニオン交換体は、例えば、上記の固定相材料の１つと一般構造Ｉのシラン化試薬との第一工程において反応させ、その後の第二工程によって、第一工程で修飾された固定相を一般構造ＩＩの試薬と反応させることによって得られる。
2007519407.tif 000002
式中、Ｒ1は、炭素数１〜１０のアルコキシ残基、特に−ＯＣＨ3、−ＯＣ2Ｈ5または−ＯＣ3Ｈ7であるか、またはハロゲン原子、特に−Ｃｌであるか、または炭素数１〜６の同一または異なるアルキル残基を有するジアルキルアミノ基であり、
Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して、炭素数１〜１０の炭化水素残基、特に、−ＣＨ3、−Ｃ2Ｈ5または−Ｃ3Ｈ7であるか、または炭素数１〜１０のアルコキシ残基、特に−ＯＣＨ3、−ＯＣ2Ｈ5または−ＯＣ3Ｈ7であるか、または、ハロゲン原子または少なくとも１つの酸素原子またはアミノ基で中断される炭素数４〜２０のアルキル残基であり、ここでこの残基は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシまたはアリールで一回または数回置換されることもでき；
Ｒ4は、炭素数１〜２０の炭化水素鎖または少なくとも１つの酸素原子またはアミノ基で中断されるアルキル残基であり、それによってこの残基はハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ、ヒドロキシ、アリールおよび／またはエポキシ、特に
2007519407.tif 000003
で１回または数回置換されることもできる；
2007519407.tif 000004
式中、
Ｘは、アミノ−、ヒドロキシ−、エポキシ基またはハロゲン原子であり、
Ｒは、炭素数２〜２０の炭化水素鎖または少なくとも１つの酸素原子またはアミノ基で中断されるアルキル残基であり、ここでこの残基は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ、ヒドロキシ、アリールおよび／またはエポキシで一回または数回置換されることもでき；
Ｙは、アミノ−、モノアルキルアミノ−、ジアルキルアミノ−、トリアルキルアンモニウムで一回または数回置換されることができる、炭素数１〜１０の官能基を形成するアニオン交換体を有する炭化水素残基であり、欧州特許EP 0 743 949号、第４−５頁にも記載されており、ここに内容面で引用される。
【００１４】
好ましい態様において、核酸混合物は、上述の本発明の方法の上記任意の工程ａ）に従って、水溶液中で１つ以上のアルカリ塩および／またはアルカリ土類塩で調整し、ｐＨ４．８〜５．４、２０℃の温度で７０ｍＳ〜９５ｍＳのコンダクタンスと等価のコンダクタンスとする。当業者は、塩含有溶液のコンダクタンスが、それぞれ温度およびｐＨによって大きく変わり得ることを承知しており、知っている法則に基づいて、温度および／またはｐＨを変化させることによって対応するコンダクタンスの調整を行うことができ、その結果、本発明の方法は問題なく実施することが可能である。
【００１５】
本発明の方法において好ましく使用される塩は、アルカリ塩、即ち元素の周期律表の１族の元素に由来するカチオン性成分またはカチオン性成分の一部との塩、および／または、アルカリ土類塩、即ち元素の周期律表の２族の元素に由来するカチオン性成分またはカチオン性成分の一部との塩である。アルカリ塩の場合に特に好ましいものは、ハロゲン化アルカリであり、アルカリ土類塩の場合は、アルカリ土類ハロゲン化物である。特に好ましくは、ハロゲン化アルカリのＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＣｓＳｌおよび／またはＬｉＣｌ、および、アルカリ土類ハロゲン化物のＣａＣｌ2を使用する。本発明の方法において、アルカリまたはアルカリ土類塩の代わりに、アンモニウム塩（擬似アルカリ塩）を使用することができ、好ましくは、カルボン酸のアンモニウム塩、より好ましくは酢酸アンモニウムを使用することができる。最も好ましくは、使用される塩はＫＣｌおよび／またはＮａＣｌである。個々の塩に加えて、異なるアルカリ塩および／またはアルカリ土類塩の混合物もまた、本発明の方法において使用することができる。
【００１６】
汚染物質の溶出のための上述の洗浄工程ｃ）において、アルカリ塩をｐＨ７〜７．４に基づく９００ｍＭ〜１８００ｍＭの濃度範囲で使用し、および／または、アルカリ土類塩をｐＨ７〜７．４に基づく１００ｍＭ〜２４０ｍＭの濃度範囲で使用する。基本的に、当業者に明るいと思われる全ての水溶液は、洗浄段階に使用することができ、例えば緩衝液、制限されないが例として、トリス、酢酸カリウム、ホウ酸塩またはＭＯＰＳ緩衝系等、または代わりに、非緩衝系、即ち塩を単に水に溶解したものが挙げられる。異なるｐＨ値もまた、異なる緩衝系から得られる可能性があり、またはｐＨ値は調整することができる。ここで選択される濃度範囲は、ｐＨ７〜７．４に関連し、一般に洗浄液のｐＨ値は上述のｐＨの範囲内で変えることができる。このような洗浄液のｐＨ値を変える間、そこに含有される塩の濃度もまた同様の効果、この場合、汚染物質の溶出を達成するために変化させなければならないことは、当業者に知られている：即ち、方法を実施する間、洗浄および溶出液の同一のｐＨ値で、汚染物質（例えば、ＲＮＡ）およびプラスミドＤＮＡの溶出点がシフトするが、溶出点に関連するシフトはせず、このことは、異なる核酸種の溶出点における分離は有利なことに変化しないことを意味する。これに必要なパラメーターは、当業者が発明的入力なく、技術的ノウハウに基づいて計画される。本発明の方法は、少なくとも１回の洗浄上程を含むが、回数は当業者に重要であると思われるが、数回の洗浄工程もまた、それぞれ異なる本発明の洗浄緩衝液を用いても、実施することができる。
【００１７】
本発明の好ましい態様においては、ｐＨ７〜７．４に基づく１１００ｍＭ〜１８００ｍＭの濃度範囲のＫＣｌを含む溶液で、少なくとも一回の洗浄工程を実施し、特に好ましくは、ｐＨ７〜７．４に基づく１３００ｍＭ〜１７００ｍＭの濃度範囲のＫＣｌを含む溶液で、少なくとも一回の洗浄工程を実施する。
【００１８】
本発明のさらに好ましい態様においては、ｐＨ７〜７．４に基づく９５０ｍＭ〜１２００ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌを含む溶液で、少なくとも一回の洗浄工程を実施し、特に好ましくは、ｐＨ７〜７．４に基づく１１００ｍＭ〜１１５０ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌを含む溶液で、少なくとも一回の洗浄工程を実施する。
【００１９】
プラスミドＤＮＡを溶出する上述の溶出工程ｄ）において、アルカリ塩はｐＨ７〜７．４に基づく１３００ｍＭ以上の濃度範囲で使用され、および／または、アルカリ土類塩はｐＨ７〜７．４に基づく２７０ｍＭ以上の濃度で使用される。洗浄工程と同様に、当業者に明らかと思われる全ての水溶液は、原則として洗浄工程に使用することができ、例えば緩衝液、制限されないが例として、トリス、酢酸カリウム、ホウ酸塩またはＭＯＰＳ緩衝系等、または代わりに非緩衝系、即ち塩を単に水に溶かしたものが挙げられる。異なるｐＨ値もまた、異なる緩衝系から得られる可能性があり、またはｐＨ値は調整することができる。ここで選択される濃度範囲は、ｐＨ７〜７．４に関連し、一般に溶出液のｐＨ値は上述のｐＨの範囲内で変えることができる。このような溶出液のｐＨ値を変えるため、そこに含有される塩の濃度もまた同様の効果、この場合、汚染物質の溶出を達成するために変化させなければならないことは、当業者に知られている：即ち、方法を実施する間、洗浄および溶出液の同一のｐＨ値で汚染物質（例えば、ＲＮＡ）およびプラスミドＤＮＡの溶出点がシフトするが、溶出点に関連するシフトはせず、このことは、異なる核酸種の溶出点における分離は有利なことに変化しないことを意味する。これに必要なパラメーターは、当業者が発明的情報入力なしに、技術的ノウハウに基づいて計画される。
【００２０】
好ましい態様において、溶出工程は、ｐＨ７〜７．４に基づく１９００ｍＭ以上の濃度のＫＣｌを含む溶液を用いて実施される。ＫＣｌの上記の濃度は、使用される溶媒中の、その溶解度によってのみ限定される。
【００２１】
さらに好ましい態様において、溶出工程は、ｐＨ７〜７．４に基づく１３００ｍＭ以上の濃度のＮａＣｌを含む溶液を用いて実施される。ＮａＣｌの上記の濃度は、使用される溶媒中の、その溶解度によってのみ限定される。
【００２２】
核酸混合物をクロマトグラフィー固定相と接触させる前に、核酸混合物のコンダクタンスの調整もまたアルカリ塩および／またはアルカリ土類塩を用いて、既に上で記した通り実施される。特に好ましい態様において、核酸混合物は、ＫＣｌで、ｐＨ４．８〜５．４および２０℃の温度で７０ｍＳ〜８０ｍＳのコンダクタンスと等価のコンダクタンスに調整され、最も好ましくはｐＨ４．８〜５．４および２０℃の温度で７０ｍＳ〜８０ｍＳのコンダクタンスと等価のコンダクタンスに調整される。さらに特に好ましい態様において、核酸混合物は、ＮａＣｌで、ｐＨ４．８〜５．４、２０℃の温度で７０ｍＳ〜９５ｍＳのコンダクタンスと等価のコンダクタンスに調整され、最も好ましくはｐＨ４．８〜５．４および２０℃の温度で８５ｍＳ〜９５ｍＳのコンダクタンスと等価のコンダクタンスに調整される。
【００２３】
本発明の方法の１つの好ましい態様では、ｃ）によって特定されるクロマトグラフィー固定相の少なくとも１回の洗浄工程において、ハロゲン化アルカリのＫＣｌが使用される。
【００２４】
本発明の方法は、好ましくは室温で実施される。この場合において、室温とは、およそ１８℃〜２５℃の範囲に対応する通常の方法条件下で、方法が実施されることを意味する。基本的に、方法は、当業者に有用であると思われる全ての温度で実施することができる。
【００２５】
好ましくは、本発明の方法は、プラスミドＤＮＡの精製に好適である。驚くべきことに、かつ、有利なことには、非常に異なる大きさのプラスミドは、溶出点において有意な差を示さず、即ち、クロマトグラフィー固定相からのプラスミドＤＮＡの溶出が起こる塩濃度に有意な差を示さないことが明らかであった。従って、本発明のパラメーター、例えば、塩濃度またはｐＨ値を、異なるプラスミドの大きさに適合させることは必要ではない。
【００２６】
本発明の主題から、遺伝子治療または遺伝子ワクチン接種における使用のための血漿ＤＮＡ含有薬剤の製造のため、大規模でプラスミドを得ることができる方法が提供されるので、エンドトキシンの除去が、全く問題なく、本発明の方法に有利に組み込むことができる。当業界で知られているほとんど全ての方法が、このために使用することができる。例えば、除去された溶解物は、当業界で知られているエンドトキシン除去緩衝液で処理することができ（例えば、トリトン(Triton)Ｘ１００、トリトンＸ１１４、ポリミキシン(Polymyxin)等を含むもの）、本発明の方法において変更無くさらに使用することができる。
【実施例】
【００２７】
実施例１：大腸菌ＤＨ５αからのｐＣＭＶβの精製
大腸菌ＤＨ５αを一晩発酵させた培養物３０Ｌから、遠心分離により、ｐＣＭＶβプラスミドを含むバイオマス１Ｋｇを得た。このバイオマスを、再懸濁緩衝液（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ；５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８）１５Ｌ中に再懸濁した後、溶解緩衝液（２００ｍＭ  ＮａＯＨ；１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）１５Ｌで、１０分間、室温でインキュベートした。続いて、中和緩衝液（３Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ５．５）１５Ｌを加えた。次に、この工程で形成された沈殿（タンパク質、膜成分、ゲノムＤＮＡ等）を除去した。次に、精製溶解物が産生された場合には、このように精製前の溶解物を濾過した。精製溶解物はｐＨ５．２であり、続いて、３Ｍ  ＫＣｌで２０℃の温度でのコンダクタンスを８０ｍＳに調整した。
【００２８】
クロマトグラフィーカラムを、キアゲン(QIAGEN(登録商標))クロマトグラフィー固定相（カラム容量約７Ｌ）で充填し、カラム容量の１０倍量の平衡緩衝液（２０ｍＭ酢酸カリウム）で流速３．３ｃｍ／分で平衡化した。クロマトグラフィー材料で平衡化した後、精製溶解物をカラムに負荷し、流速１．１ｃｍ／分でクロマトグラフィーを実施した。続いて、カラム容量の５倍量の平衡緩衝液（２０ｍＭ酢酸カリウム）を流速３．３ｃｍ／分でカラムに通過させた。
【００２９】
直後に、カラムをカラム容量の１０倍量のＫＣｌ溶液（１３５０ｍＭ  ＫＣｌ；５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．２）で流速３．３ｃｍ／分で洗浄した。これに続き、プラスミドが、カラム容量の溶出緩衝液（１６００ｍＭ  ＮａＣｌ；５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．２）で溶出された。続く限外／透析濾過および最終滅菌濾過の後、約４００ｍｇのｐＣＭＶβが得られた。
【００３０】
実施例２：
異なる４バッチにおいて、それぞれ６００μｇの精製プラスミド（１：プラスミドＡ［３２６６ｂｐ］；２：プラスミドＢ［７２００ｂｐ］；３：プラスミドＣ［７６８７ｂｐ］；プラスミドＤ［１９５３５ｂｐ］）をそれぞれ６００μｇの精製ＲＮＡ（大腸菌ＨＢ１０１）と共に、６０ｍＭ酢酸カリウム５ｍｌ中に溶解した。
【００３１】
ＨＰＬＣカラム（カラム容量４．４ｍｌ）をキアゲン (QIAGEN(登録商標))クロマトグラフィー固定相で充填し、カラム容量の２倍量（流速１ｍｌ／分）の平衡緩衝液（６０ｍＭ酢酸カリウム）で平衡化した。次に、４本の個々のＨＰＬＣカラムを各回新たに充填して、５ｍｌのプラスミド−ＲＮＡ混合物を１ｍｌ／分でカラムに負荷した。次にカラムを、カラム容量の３倍量の６０ｍＭ酢酸カリウムでリンスした。
【００３２】
カラムにトリス緩衝液を連続勾配で通過させ（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ；ｐＨ７．２；勾配０→３Ｍ  ＫＣｌ）、ＤＮＡおよびＲＮＡの溶出を光度計で測定した（２５４ｎｍで発光測定）。このようにして、部分的に分解された、短鎖のＲＮＡが明確なピーク（７８０ｍＭ  ＫＣｌで最大）に溶出され、その後より長鎖のＲＮＡの幾分広がったピーク（１１２０ｍＭ  ＫＣｌで最大、１３１０ｍＭ  ＫＣｌで溶出終了）が続くことを示すことができた。プラスミドＤＮＡの溶出は、１９００ｍＭ  ＫＣｌで最大に達し、２１５０ｍＭ  ＫＣｌで終了した。この結果は、図１の二重の痕跡において示される。プラスミドは大きさに関係なく有利に溶出されることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】キアゲン(QIAGEN(登録商標))クロマトグラフィー固定相を充填したＨＰＬＣカラムを通過したものの、２５４ｎｍでの吸光を、ＫＣｌ濃度に対してプロットする。ＫＣｌ濃度の増加に伴う異なる核酸種の溶出が示される。実験条件は、実施例２においてより詳細に記述される。図１の説明ピーク１：部分的に分解した、および短鎖のＲＮＡピーク２：長鎖のＲＮＡピーク３：プラスミドＤＮＡ
【図１】
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【国際調査報告】
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