(57)【要約】本発明は、癌の治療のための治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドの発現を導く癌特異的制御配列に関する。具体的には、本発明は、乳癌、前立腺癌および膵癌に特異的な制御配列を含む。2種類の乳癌特異的配列は、特にエンハンサーとの組み合わせで、トポイソメラーゼIIαおよびトランスフェリン受容体プロモーターの特異的領域を利用する。前立腺癌特異的および膵癌特異的な制御配列は、組織特異的制御配列、二段階転写増幅配列および転写後制御配列の複合物を利用する。より特定的な態様において、これらのポリヌクレオチドはリポソームと組み合わせて投与される。
2007535315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌特異的制御配列を含むポリヌクレオチド構築物であって、該制御配列がトポイソメラーゼIIαプロモーターの選択された部分またはトランスフェリン受容体プロモーターの選択された部分を含む、構築物。
【請求項２】
制御配列がトポイソメラーゼIIαプロモーターの選択された部分を含む、請求項1記載の構築物。
【請求項３】
トポイソメラーゼIIαプロモーターの選択された部分がSEQ ID NO：12を含む、請求項2記載の構築物。
【請求項４】
制御配列がトランスフェリン受容体プロモーターの選択された部分を含む、請求項1記載の構築物。
【請求項５】
トランスフェリン受容体の選択された部分がSEQ ID NO：13を含む、請求項4記載の構築物。
【請求項６】
エンハンサーをさらに含む、請求項1記載の構築物。
【請求項７】
エンハンサーが、サイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（GAPDH）またはβ-アクチンプロモーターを含む、請求項6記載の構築物。
【請求項８】
転写後調節配列をさらに含む、請求項1記載の構築物。
【請求項９】
転写後調節配列がウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）である、請求項8記載の構築物。
【請求項１０】
二段階転写増幅（TSTA）配列をさらに含み、該TSTA配列がDNA結合ドメインおよび活性化ドメインを含む、請求項1記載の構築物。
【請求項１１】
DNA結合ドメインがGal1、Gal4またはLexAである、請求項10記載の構築物。
【請求項１２】
活性化ドメインがVP2またはVP16である、請求項10記載の構築物。
【請求項１３】
TSTA配列がGAL4-VP2またはGAL4-VP16である、請求項10記載の構築物。
【請求項１４】
制御配列が、治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している、請求項1記載の構築物。
【請求項１５】
治療用遺伝子産物が、細胞増殖の阻害因子、プログラム細胞死の調節因子または腫瘍抑制因子を含む、請求項14記載の構築物。
【請求項１６】
リポソーム中に含まれるものとしてさらに規定される、請求項1記載の構築物。
【請求項１７】
前立腺癌特異的制御配列を含むポリヌクレオチド構築物であって、該制御配列が以下の配列のうち少なくとも2つを含む、構築物：
前立腺組織特異的制御配列；
癌特異的制御配列；ならびに
二段階転写増幅（TSTA）配列であってDNA結合ドメインおよび活性化ドメインを含む該TSTA配列。
【請求項１８】
前立腺組織特異的制御配列がSEQ ID NO：17を含む、請求項17記載の構築物。
【請求項１９】
癌特異的制御配列がSEQ ID NO：18を含む、請求項17記載の構築物。
【請求項２０】
DNA結合ドメインがGal1、Gal4またはLexAである、請求項17記載の構築物。
【請求項２１】
活性化ドメインがVP2またはVP16である、請求項17記載の構築物。
【請求項２２】
TSTA配列がGAL4-VP2またはGAL4-VP16である、請求項17記載の構築物。
【請求項２３】
転写後調節配列をさらに含む、請求項17記載の構築物。
【請求項２４】
転写後調節配列がウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）配列である、請求項23記載の構築物。
【請求項２５】
制御配列が、治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している、請求項17記載の構築物。
【請求項２６】
治療用遺伝子産物が、細胞増殖の阻害因子、プログラム細胞死の調節因子または腫瘍抑制因子である、請求項25記載の構築物。
【請求項２７】
リポソーム中に含まれるものとしてさらに規定される、請求項17記載の構築物。
【請求項２８】
膵癌特異的制御配列を含むポリヌクレオチド構築物であって、該制御配列が以下を含む、構築物：
膵臓組織特異的制御配列；ならびに
二段階転写増幅（TSTA）配列であってDNA結合ドメインおよび活性化ドメインを含む該TSTA配列。
【請求項２９】
膵臓組織特異的制御配列がSEQ ID NO：14を含む、請求項28記載の構築物。
【請求項３０】
DNA結合ドメインがGal1、Gal4またはLexAである、請求項28記載の構築物。
【請求項３１】
活性化ドメインがVP2またはVP16である、請求項28記載の構築物。
【請求項３２】
TSTA配列がGAL4-VP2またはGAL4-VP16である、請求項28記載の構築物。
【請求項３３】
転写後調節配列をさらに含む、請求項28記載の構築物。
【請求項３４】
転写後調節配列がウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）である、請求項33記載の構築物。
【請求項３５】
制御配列が、治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している、請求項28記載の構築物。
【請求項３６】
治療用遺伝子産物が、細胞増殖の阻害因子、プログラム細胞死の調節因子または腫瘍抑制因子である、請求項46記載の構築物。
【請求項３７】
リポソーム中に含まれるものとしてさらに規定される、請求項28記載の構築物。
【請求項３８】
乳癌細胞の増殖を阻止する方法であって、乳癌細胞を、トポイソメラーゼIIαプロモーターの選択された部分またはトランスフェリン受容体の選択された部分を含むポリヌクレオチド構築物の有効量と接触させる段階を含み、該選択された部分が細胞増殖を阻止するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している、方法。
【請求項３９】
前立腺癌細胞の増殖を阻止する方法であって、前立腺癌細胞を、以下の配列のうち少なくとも2つを有するポリヌクレオチド構築物の有効量と接触させる段階を含み、それらの配列が、前立腺癌細胞の増殖を阻止するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している、方法：
前立腺細胞特異的制御配列；
二段階転写増幅配列；および
癌細胞特異的配列。
【請求項４０】
構築物が、前立腺癌細胞の増殖を阻止するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合した転写後制御配列をさらに含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
膵癌細胞の増殖を阻止する方法であって、膵癌細胞を、両方とも細胞増殖を阻止するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している膵臓細胞特異的配列および二段階増幅配列を含むポリヌクレオチド構築物の有効量と接触させる段階を含む、方法。
【請求項４２】
構築物が、細胞増殖を阻止するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合した転写後制御配列をさらに含む、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
癌を有する個体における乳癌の治療方法であって、個体の少なくとも1つの乳癌細胞を、トポイソメラーゼIIαプロモーターの選択された部分またはトランスフェリン受容体の選択された部分を含むポリヌクレオチド構築物の治療的有効量と接触させる段階を含み、該選択された部分が、乳癌を治療するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している、方法。
【請求項４４】
癌を有する個体における前立腺癌の治療方法であって、個体の少なくとも1つの前立腺癌細胞を、以下のうち少なくとも2つを含むポリヌクレオチド構築物の治療的有効量と接触させる段階を含み、それらの配列が、前立腺癌を治療するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している、方法：
前立腺細胞特異的制御配列；
癌細胞特異的制御配列；および
二段階転写増幅配列。
【請求項４５】
ポリヌクレオチド構築物が転写後制御配列をさらに含む、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
癌を有する個体における膵癌の治療方法であって、個体の少なくとも1つの膵癌細胞を、両方とも膵癌を治療するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している膵臓細胞特異的制御配列および二段階転写増幅配列を含むポリヌクレオチド構築物の治療的有効量と接触させる段階を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞生物学、分子生物学、癌生物学および医学の分野を対象とする。より詳細には、本発明は、癌治療のために有用な治療用ポリヌクレオチドの発現の調節のための癌特異的調節配列に関する。
【０００２】
本発明は、2004年4月2日に提出された米国仮出願第60／559,111号（これはその全体が本明細書に参照として組み入れられる）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
遺伝子導入の後に特定のポリヌクレオチドの発現を制御しうることは有用な機能であり、特異的な限局的活性が望まれるような用途にとっては特に有用である。このことは、破壊的または致死的な遺伝子産物を癌性細胞に限定しながら正常細胞におけるこのような活性を少なくとも部分的には防止することが賢明である、癌に関する場合に、当てはまる。
【０００４】
乳癌組織特異的な発現
化学療法（CT）および放射線療法などの現在の乳癌治療法は、腫瘍細胞に対する選択性が低く、正常組織に対する副作用がある。これらの副作用を最小限に抑えるため、これらの治療法は一般に、治療サイクルの間に正常細胞が回復しうるように間欠的な様式で行われる。しかし、回復期間の間に、生存している癌細胞の一部は遺伝子変異のために治療に対してさらに耐性化する。その結果として、癌の再発または進行が起こる可能性がある。腫瘍を標的とする遺伝子治療は、腫瘍特異的シグナル伝達経路に対して作用することにより、治療の副作用および耐性が生じるリスクを最小限に抑える。
【０００５】
本明細書に記載の乳癌特異的プロモーターは、トポイソメラーゼIIα遺伝子の選択された部分を含む。トポイソメラーゼIIα遺伝子の5'隣接領域はしばらく前から公知であるが（Hochhauser et al, 1992（非特許文献１））、本明細書に記載の特定の活性領域が乳癌組織に対して有用であることは、サイトメガロウイルスエンハンサーと結び付けられた場合でさえ示されていない（Mo et al,. 1998（非特許文献２））。
【０００６】
本明細書に記載のもう1つの乳癌特異的プロモーターは、トランスフェリン受容体プロモーターの選択された部分を含む。トランスフェリン受容体の発現が乳房組織（Fuernkranz et al., 1991（非特許文献３）；Shterman et al., 1991（非特許文献４））および乳癌（Bauman et al., 1997（非特許文献５）；Shindelman et al., 1981（非特許文献６））に局在することは突き止められているが、このような活性をもたらす具体的な領域は開示されていない。
【０００７】
前立腺癌組織特異的な発現
最近、PSA、プロバシンおよびhK2などの前立腺特異的プロモーターが明らかにされている。これらのプロモーターの活性はアンドロゲン依存的であり、前立腺組織に対する治療用遺伝子の発現を導くためにアンドロゲン応答性ベクターを用いることは、さまざまな病期にとって有益である。アンドロゲン受容体に応答するこのような前立腺特異的プロモーターは、本発明者ら（Xie et al., Cancer Res 2001（非特許文献７））および他のグループ（Zhang et al., Mol Endocrinol 2000（非特許文献８））によって明らかにされているが、これらのアンドロゲン依存的プロモーターは、進行性前立腺癌の治療のための主な治療手段である去勢術またはアンドロゲン除去療法の後には活性が低下する可能性がある。これらのプロモーターを含む組成物によって治療された患者は、この種の治療法が奏功せずに、再発性のアンドロゲン非依存的前立腺癌（AIPC）で死亡する恐れがある。転移性および再発性のホルモン抵抗性前立腺癌を治療するための、ADPCおよびAIPCの両方で活性のある前立腺癌の遺伝子治療用の新規なプロモーターが、当技術分野では欠けている。
【０００８】
膵癌組織特異的な発現
膵癌は最も悪性度の高いヒト悪性腫瘍の一つであり、有効な治療手段が存在しないことから、癌による死亡の5番目の原因である。本発明は、膵癌細胞において特異的に治療用ポリヌクレオチドの発現を調節するのに有効なプロモーターを提供することにより、このような需要に応える。
【０００９】
【非特許文献１】Hochhauser et al, 1992
【非特許文献２】Mo et al,. 1998
【非特許文献３】Fuernkranz et al., 1991
【非特許文献４】Shterman et al., 1991
【非特許文献５】Bauman et al., 1997
【非特許文献６】Shindelman et al., 1981
【非特許文献７】Xie et al., Cancer Res 2001
【非特許文献８】Zhang et al., Mol Endocrinol 2000
【発明の開示】
【００１０】
発明の簡単な概要
本発明は、治療用ポリヌクレオチドの発現の調節のための新規な組織特異的プロモーターを提供する。これらの治療用組成物およびそれらを利用する方法は癌治療に有用であり、当業者は、癌と戦うための兵器にさらなる手段が追加されることは公衆衛生にとって有益であることを認識している。
【００１１】
特に、本発明は、治療薬などの組成物、およびそれを、少なくとも例えば卵巣癌、乳癌、膵癌および前立腺癌などの癌に対する遺伝子治療において、治療用ポリヌクレオチドを癌特異的に調節される発現に向けて用いる方法を提供する。
【００１２】
したがって、本発明は一般に、癌細胞および／または腫瘍細胞における増殖を阻止するための方法であって、細胞を、本明細書に記載したものなどの癌特異的プロモーターを利用して、増殖を阻止するのに有効な量の治療用ポリペプチドと接触させる段階を含む方法に関する。増殖の阻止は、例示的な態様において、例えば、細胞のアポトーシスの誘導（例えば細胞培養物における）、癌細胞株の増殖の阻止、腫瘍のサイズの縮小、および／または生存度の増大によって示される。より好ましくは、いくつかの態様において、増殖を阻止しようとする細胞は、生きた生物、例えばヒトにおける細胞である。このようなトランスフォーメーションの阻害は、癌、腫瘍発生および／または転移のようにトランスフォーメーションによって導かれる事象の予防および／または治療において非常に有用である。
【００１３】
本発明は、特定の組織および／またはタイプの細胞における治療用ポリヌクレオチドの発現を導く制御配列を含むポリヌクレオチド構築物を含む。ポリヌクレオチドは、当業者に公知のさまざまな手段のうち任意のものによって、細胞と接触させること、またはそれに対して導入することができる。治療用ポリヌクレオチドを、関心対象の細胞または組織に対するポリヌクレオチドの直接導入によって導入することもできる。この場合には、治療用ポリヌクレオチドは当技術分野で公知の任意の方法によって入手しうる。
【００１４】
本発明の特定の局面において、治療用ポリヌクレオチドを含むRNAまたはDNAは、当技術分野で公知の任意の手段によって細胞に導入することができる。ある特定の好ましい態様において、治療用ポリヌクレオチドは、治療用遺伝子産物をコードするDNAセグメントの導入によって細胞に導入される。いくつかのこのような態様において、治療用ポリヌクレオチドを含むDNAセグメントは、本発明の制御配列と機能的に結合している。このような遺伝子／制御配列DNA構築物の構築は当技術分野で周知であり、本明細書中に詳述されている。
【００１５】
導入のためのある特定の態様において、DNAセグメントは、ベクター上、例えばプラスミドベクターまたはウイルスベクター上に位置してもよい。ウイルスベクターは例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノ随伴ウイルスであってよい。このようなDNAセグメントを、本発明に関係するさまざまな方法に用いることができる。ベクターは、特定の態様において、本発明の遺伝子治療態様の1つで、細胞に変異型bikポリヌクレオチドを送達するために用いることもできる。また、このようなベクターを培養細胞の形質転換のために用いることもでき、このような培養細胞は、とりわけ、インビトロでの変異型Bikの発現のために用いられうると考えられる。
【００１６】
当業者は、本発明のプロモーターが、非癌性細胞に特異的な発現、または自然下では細胞もしくは組織に特異的ではないポリヌクレオチドの発現さえも含む、あらゆる状況に有用であることを認識している。
【００１７】
1つの特定の態様において、治療用遺伝子産物は、各々、乳癌、膵癌または前立腺癌組織に対して有効である。例示的な態様において、本発明は、例えば、エストロゲン受容体陽性、EGF受容体過剰発現性、Her2／neu過剰発現性、Her-2／neu非過剰発現性、Akt過剰発現性、アンドロゲン依存性、および／またはアンドロゲン非依存性の癌を治療する遺伝子構築物を送達するのに有用である。すなわち、治療用遺伝子産物は、Her-2／neu、EGFR、AKTといった癌遺伝子の過剰発現の状態にかかわらず、またはその増殖がホルモン依存的であるか（例えば、MCF-7など）否か（例えば、PC3など）にかかわらず、各々の癌細胞に対して有効である。
【００１８】
治療用ポリヌクレオチドの配列が得られるNational Center for Biotechnology InformationのGenBankデータベースのなどの公開データベース、またはCelera Genomics, Inc.（Rockville, MD）などの市販のデータベースは当業者に公知である。本発明に用いうることが後になって見い出された当技術分野で公知の治療用ポリヌクレオチドは数多く存在するが、そのいくつかの例には、細胞増殖の阻害因子、プログラム細胞死の調節因子、腫瘍抑制因子、および細胞増殖の誘導因子のアンチセンス配列が含まれる。治療用ポリヌクレオチドが、例えば、短鎖干渉性RNAまたはアンチセンス配列をコードしてもよい。治療用ポリヌクレオチドの具体的な例には、例えば、変異型Bik、retinoblastoma、Blk、IL-12、IL-10、IFN-α、シトシンデアミナーゼ、GM-CSF、E1A、p53および他のアポトーシス促進タンパク質をコードするものが含まれる。また、構築物が、このような治療用ポリヌクレオチドを、TNFαもしくはp53として、またはBik、p53、Bax、Bak、Bcl-x、Bad、Bim、Bok、Bid、Harakiri、Ad E1B、BadおよびICE-CED3プロテアーゼを非制限的に含むアポトーシスの誘導因子として含んでもよい。本発明の特定の局面においては、トレオニン33、セリン35またはその両方の箇所でアミノ酸置換物をコードする変異型Bikポリヌクレオチドが用いられる。これらの態様の特定の局面において、変異型Bikポリペプチドのアミノ酸はアスパラギン酸によって置換されている。また別の特定の局面において、変異型Bikでは1つまたは複数のリン酸化部位が欠損している。さらに別の態様において、変異型Bikは細胞増殖抑制活性および／またはアポトーシス促進活性を保持している。
【００１９】
特定の態様において、本発明の治療用ポリヌクレオチドおよび各々の癌特異的制御配列を含む構築物は、ヒト細胞である細胞に導入される。多くの態様において、細胞は腫瘍細胞である。この際好ましいいくつかの態様において、腫瘍細胞は乳房腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞または膵臓腫瘍細胞である。いくつかの態様において、治療用ポリヌクレオチドおよび各々の癌特異的制御配列を含む構築物は注入によって導入される。特定の態様において、治療用ポリヌクレオチドおよび各々の癌特異的制御配列を含む構築物はリポソーム中に含まれる。
【００２０】
本発明のいくつかの態様において、治療用ポリヌクレオチドおよび各々の癌特異的制御配列を含む構築物は、他の抗トランスフォーメーション／抗癌療法と組み合わせて用いられる。これらの他の治療法は、本出願の時点で公知であってもよく、または本出願の日付以後に明らかになってもよい。治療用ポリヌクレオチドおよび各々の癌特異的制御配列を含む構築物を、例えば、他の治療用ポリペプチド、他の治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、化学療法薬、外科的方法または放射線照射と組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
治療用ポリヌクレオチドおよび各々の癌特異的制御配列を含む構築物を、任意の適した化学療法薬とともに用いてもよい。代表的な1つの態様において、化学療法薬はタキソールである。また、治療用ポリヌクレオチドおよび各々の癌特異的制御配列を含む構築物を放射線療法とともに用いてもよい。放射線療法を構成する電離放射線の種類には、例えば、X線、γ線およびマイクロ波が含まれうる。ある特定の態様において、電離放射線は遠隔照射によって、または放射性核種の投与によって供給される。また、癌特異的制御配列により調節される治療用遺伝子産物を他の遺伝子治療レジメンとともに用いることもできる。特定の態様において、治療用ポリヌクレオチドおよび各々の癌特異的制御配列を含む構築物は、腫瘍内に導入される。腫瘍は動物、特にヒトなどの哺乳動物の体内にあってもよい。
【００２２】
本発明の治療用遺伝子産物およびポリヌクレオチドの発現を調節する本発明の組織特異的プロモーターを有する構築物を、任意の適した方法を用いて導入することもできる。導入の「適した方法」とは、治療用遺伝子産物を、腫瘍細胞の増殖を好ましくは関心対象の組織もしくは細胞において低下させるため、および／または少なくとも1つの癌症状を改善するための位置に配置するもののことである。例えば、注射法、経口法および吸入法を用いることができ、この際、当業者は所定の状況に対して適した導入の方法を決定することが可能であり、本発明の組織特異的制御配列は少なくとも主として関心対象の組織または細胞において治療用ポリヌクレオチドの発現を導く。注射を用いる態様において、この注射は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腫瘍内もしくは胸腔内、または任意の他の適した形態であってよい。
【００２３】
本発明のある特定の他の局面においては、本発明の制御配列を含む構築物の薬学的製剤を適した容器内に含む、治療用キットが提供される。さらなる局面において、本発明の制御配列を含むポリヌクレオチドは、1つまたは複数のクローニング部位を、その部位に関心対象のポリヌクレオチドなどの所望のポリヌクレオチドをクローニングしうるように含む。特定の態様において、5'から3'への向きにあるポリヌクレオチド中で、1つまたは複数のクローニング部位は制御配列の5'側に位置してもよく、または制御配列の3'側に位置してもよい。さらなる局面において、1つまたは複数の治療用ポリヌクレオチドが、キット中に、本発明の制御配列と同じ核酸分子上などに含まれてもよい。このようなキットはさらに、治療用ポリペプチド、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または化学療法薬の薬学的製剤を含んでもよい。
【００２４】
治療用ポリヌクレオチドの遺伝子産物によって与えられる抗腫瘍活性、抗細胞増殖活性、および／またはアポトーシス促進活性は、治療用ポリヌクレオチドの由来となったものとは異なる生物に対して有用な可能性がある。例えば、マウス治療用ポリヌクレオチドをヒト治療のために代替的または補足的に用いることができる。
【００２５】
したがって、本発明は治療用ポリヌクレオチドの標的指向性発現のための癌特異的制御配列を提供し、それ故に本発明は、細胞増殖の阻止および／または細胞死の促進を含む、細胞増殖の制御に関する総合的技術の新たな改善に向けられる。1つの具体的な態様において、細胞増殖の阻止には、その増殖速度の遅延、その増殖細胞総数の遅延、またはその両方が含まれる。
【００２６】
本発明のさらにもう1つの目的には、個体における細胞の増殖を防止する方法であって、治療用ポリヌクレオチドの発現を制御する癌特異的制御配列を含む構築物を個体に投与する段階を含む方法がある。もう1つの具体的な態様において、本発明の制御配列を含む構築物の投与はリポソームによる。
【００２７】
本発明のもう1つの目的には、個体における細胞の増殖を防止する方法であって、本発明に含まれる組織特異的制御配列を含む核酸を個体に投与する段階を含む方法がある。もう1つの具体的な態様において、核酸の投与は、プラスミド、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、リポソームおよびそれらの組み合わせからなる群より選択されるベクターによる。核酸を含む組成物を、薬理学的に許容される添加剤中に分散させてもよく、組成物を増殖性細胞疾患を有する動物に投与してもよい。
【００２８】
本発明のさらにもう1つの目的において、治療用ポリヌクレオチドは、癌性組織を標的とするもののような組織特異的プロモーターによって調節される。非癌性組織よりも癌性組織を選好的に標的とする任意のプロモーターでよいが、1つの具体的な態様において、癌特異的プロモーターは、例えば、乳癌特異的プロモーター、前立腺癌特異的プロモーターまたは膵臓特異的プロモーターである。
【００２９】
1つの特定の態様において、乳癌特異的プロモーターは乳癌特異的配列を含み、さらなる態様において、組織特異的配列の発現、例えば発現レベルを増強するエンハンサー配列を含む。1つの特定の態様においては、CMVプロモーターのエンハンサー配列が、例示的なトポイソメラーゼIIα（トポIIα）プロモーターまたは例示的なトランスフェリン受容体プロモーターからの乳癌特異的セグメントと連結される。本発明者らは、本明細書において、これらの複合プロモーターが両方とも、乳癌細胞において選択的に遺伝子発現を生じさせること、およびCMVプロモーターと同程度の活性を有することを示す。それらは、正常組織に対する毒性を抑えつつ、原発性および転移性の乳癌を標的として治療するための遺伝子ターゲティングに有用である。
【００３０】
もう1つの態様において、治療用ポリヌクレオチドの発現は、膵癌特異的プロモーターによって調節される。1つの特定の態様においては、最小限のコレシストキニンA受容体（CCKAR、ヌクレオチド-726から+1まで）およびウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（WPRE）から構成される、本明細書中でCTPと称するもののような新規な膵癌特異的プロモーターが利用される。この組換え構築物は強力なプロモーター活性を有し、インビトロおよびインビボで膵癌細胞に対する特異性を示す。
【００３１】
本発明のもう1つの具体的な態様においては、前立腺癌特異的プロモーターが治療用ポリヌクレオチドの発現を調節する。1つの特定の態様において、本発明は、最小限のヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター（hTert）、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（WPRE）およびプラスミドARR2PB由来のARR2エレメントから構成され、アンドロゲン刺激に応答する、本明細書中でATTPと称するもののような新規な前立腺癌特異的プロモーターを利用する。この組換え構築物は強力なプロモーター活性を有し、インビトロでアンドロゲン依存的およびアンドロゲン非依存的な前立腺癌細胞の両方に対する特異性を示す。このプロモーターは、インビボで前立腺癌における治療用ポリヌクレオチドの遺伝子発現を特異的に生じさせるために用いることができる。
【００３２】
本発明の1つの目的には、トポイソメラーゼIIαプロモーターの選択された部分またはトランスフェリン受容体プロモーターの選択された部分を含む制御配列である乳癌特異的制御配列を含むポリヌクレオチド構築物がある。詳細には、この制御配列は、SEQ ID NO：12を含むもののような、トポイソメラーゼIIαプロモーターの選択された部分を含む。制御配列はまた、SEQ ID NO：13を含むもののような、トランスフェリン受容体プロモーターの選択された部分も含みうる。
【００３３】
特定の態様において、本発明の構築物は、エンハンサー（サイトメガロウイルス（CMV）エンハンサーなど）、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（GAPDH）またはβ-アクチンプロモーターを含む。構築物がさらに、転写後調節配列、例えばウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）などを含んでもよい。さらなる態様において、本発明の構築物は、二段階転写増幅（TSTA）配列を含み、この際、TSTA配列は例えば、Gal1、Gal4またはLexAなどのDNA結合ドメイン、およびVP2またはVP16などの活性化ドメインを含む。本発明の特定の局面において、TSTA配列は、例えば、GAL4-VP2またはGAL4-VP16である。
【００３４】
また別の特定の態様において、制御配列は、細胞増殖の阻害因子、プログラム細胞死の調節因子、腫瘍抑制因子であるもの、またはこれらの活性のうち2つもしくはそれ以上を含むもののような治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している。本発明の構築物がリポソーム中に含まれてもよい。
【００３５】
本発明のもう1つの目的には、以下の配列のうち少なくとも2つを含む前立腺癌特異的制御配列を含むポリヌクレオチド構築物がある：前立腺組織特異的制御配列；癌特異的制御配列；ならびに二段階転写増幅（TSTA）配列であってDNA結合ドメインおよび活性化ドメインを含む該TSTA配列。特定の態様において、前立腺組織特異的制御配列はSEQ ID NO：17を含む。また別の特定の態様において、癌特異的制御配列はSEQ ID NO：18を含む。さらにまた、TSTA配列のDNA結合ドメインはGal1、Gal4またはLexAであってよく、活性化ドメインはVP2またはVP16であってよい。特に、TSTA配列はGAL4-VP2またはGAL4-VP16である。
【００３６】
本発明の1つの具体的な局面において、前立腺癌特異的制御配列を含むポリヌクレオチド構築物は、さらに、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）配列などの転写後調節配列を含む。この制御配列は、いくつかの態様において、細胞増殖の阻害因子、プログラム細胞死の調節因子、腫瘍抑制因子、またはこれらの活性のうち2つもしくはそれ以上を含むもののような治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している。前立腺癌特異的制御配列を含むポリヌクレオチド構築物がリポソーム中に含まれてもよい。
【００３７】
本発明のもう1つの目的には、以下を含む膵癌特異的制御配列を含むポリヌクレオチド構築物がある：膵臓組織特異的制御配列、例えばSEQ ID NO：14を含むものなど；ならびに二段階転写増幅（TSTA）配列であってDNA結合ドメインおよび活性化ドメインを含む該TSTA配列。膵癌特異的制御配列を含むポリヌクレオチド構築物において、TSTAのDNA結合ドメインはGal1、Gal4またはLexAを含むことができ、TSTAの活性化ドメインはVP2またはVP16でありうる。特に、TSTA配列はGAL4-VP2またはGAL4-VP16である。
【００３８】
特に、構築物が、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）などの転写後調節配列を含んでもよい。制御配列は、細胞増殖の阻害因子、プログラム細胞死の調節因子もしくは腫瘍抑制因子であるもの、またはこれらの活性のうち1つもしくはそれ以上を含むもののような治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合しうる。構築物がリポソーム中に含まれてもよい。
【００３９】
本発明のもう1つの目的には、乳癌細胞の増殖を阻止する方法であって、乳癌細胞を、トポイソメラーゼIIαプロモーターの選択された部分またはトランスフェリン受容体の選択された部分を含むポリヌクレオチド構築物の有効量と接触させる段階を含み、選択された部分が、細胞増殖を阻止するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している、方法がある。トポイソメラーゼIIαプロモーターの選択された部分は、例えば、SEQ ID NO：12を含みうる。トランスフェリン受容体の選択された部分は、例えば、SEQ ID NO：13を含みうる。本発明の特定の局面において、構築物はさらに、CMV、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（GAPDH）またはβ-アクチンプロモーターなどのエンハンサーを含む。
【００４０】
本発明のもう1つの目的には、前立腺癌細胞の増殖を阻止する方法であって、前立腺癌細胞を、以下の配列のうち少なくとも2つを有するポリヌクレオチド構築物の有効量と接触させる段階を含み、それらの配列が、前立腺癌細胞の増殖を阻止するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している、方法がある：前立腺細胞特異的制御配列；二段階転写増幅配列；および癌細胞特異的配列。構築物がさらに、前立腺癌細胞の増殖を阻止するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合した転写後制御配列、例えばWPRE配列などを含んでもよい。
【００４１】
本発明のもう1つの目的には、膵癌細胞の増殖を阻止する方法であって、膵癌細胞を、両方とも細胞増殖を阻止するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している膵臓細胞特異的配列および二段階増幅配列を含むポリヌクレオチド構築物の有効量と接触させる段階を含む方法がある。構築物がさらに、細胞増殖を阻止するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している転写後制御配列、例えばWPRE配列などを含んでもよい。
【００４２】
本発明のさらにもう1つの目的には、癌を有する個体における乳癌の治療方法であって、個体の少なくとも1つの乳癌細胞を、トポイソメラーゼIIαプロモーターの選択された部分またはトランスフェリン受容体の選択された部分を含むポリヌクレオチド構築物の治療的有効量と接触させる段階を含み、選択された部分が、乳癌を治療するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している、方法がある。構築物が、SEQ ID NO：12を含むものである、トポイソメラーゼIIαプロモーターの選択された部分を含んでもよい。また、構築物が、SEQ ID NO：13を含むもののような、トランスフェリン受容体プロモーターの選択された部分を含んでもよい。構築物がさらに、CMVエンハンサーなどのエンハンサーを含んでもよく、ポリヌクレオチドがリポソーム中に含まれていてもよい。
【００４３】
本発明のもう1つの目的には、癌を有する個体における前立腺癌の治療方法であって、個体の少なくとも1つの前立腺癌細胞を、以下のうち少なくとも2つを含むポリヌクレオチド構築物の治療的有効量と接触させる段階を含み、それらの配列が、前立腺癌を治療するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している、方法がある：前立腺細胞特異的制御配列；癌細胞特異的制御配列；および二段階転写増幅配列。ポリヌクレオチド構築物がさらにWPRE配列などの転写後制御配列を含んでもよく、ポリヌクレオチドがリポソーム中に含まれてもよい。
【００４４】
本発明のさらにもう1つの目的には、癌を有する個体における膵癌の治療方法であって、個体の少なくとも1つの膵癌細胞を、両方とも膵癌を治療するのに有効な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合している膵臓細胞特異的制御配列および二段階転写増幅配列を含むポリヌクレオチド構築物の治療的有効量と接触させる段階を含む、方法がある。構築物がさらにWPRE配列などの転写後制御配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドがリポソーム中に含まれてもよい。
【００４５】
前記の内容では、以下に続く本発明の詳細な説明がより良く理解されるように、本発明の特徴および技術的な利点をむしろ大まかに概説してきた。本発明のその他の特徴および利点は以下に記載されていると考えられ、それらは本発明の特許請求の範囲の主題をなす。当業者は、開示される概念および具体的な態様を、本発明の同じ目的を実施するために他の態様を改変および設計するための基盤として容易に利用しうることを理解するはずである。また、当業者は、このような等価な態様が、添付する特許請求の範囲に示された本発明の精神および範囲を逸脱しないことも理解すると考えられる。その構成および動作方法の両者に関する、本発明の特徴であると考えられる新規な特徴は、その他の目的および利点とともに、添付の図面を伴って考察された場合に以下の説明によってより良く理解されると考えられる。しかし、図面のそれぞれは例示および説明のみを目的として提供されており、本発明の限界の定義であることは意図しないことが明示的に理解される必要がある。
【００４６】
発明の詳細な説明
本明細書中で用いる場合、「1つの（a）」または「1つの（an）」は、1つまたは複数であることを意味しうる。特許請求の範囲において、「含む（comprising）」という言葉とともに用いる場合、「1つの（a）」または「1つの（an）」という言葉は、1つまたは複数であることを意味しうる。本明細書で用いる場合、「もう1つの（another）」は、少なくとも2つ目またはそれ以上であることを意味しうる。具体的な態様において、本発明の諸局面は、例えば、本発明の1つまたは複数の配列「から実質的になり」うる。
【００４７】
いくつかの態様において、本発明の制御配列を含むポリヌクレオチドは、腫瘍の増殖および発達を抑制するために、例えば、ウイルス性または非ウイルス性の送達システムによって適切なレシピエント動物に送達される。本発明の1つの例示的な態様において、送達された治療用遺伝子産物はアポトーシス機構を経由して作用し、腫瘍の増殖および発達を抑制する。
【００４８】
本発明の1つの局面においては、組織特異的制御配列を含む構築物中に含まれる治療用ポリペプチドが、例えば乳癌、膵癌または前立腺癌における発現を標的とするポリヌクレオチドとして投与される。本発明のある特定の局面においては、乳癌特異的プロモーターが治療用ポリヌクレオチドの発現を制御する。本明細書で用いる場合、「治療用ポリヌクレオチド」という用語は、治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドのことを指し、これは例えば、RNA、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのいずれでもよい。
【００４９】
1つの具体的な態様において、本発明の制御配列は、複合（キメラ）プロモーターを含む。例えば、トポイソメラーゼIIαプロモーター（CT90と命名）またはトランスフェリン受容体プロモーター（CTR116と命名）中の乳癌特異的セグメントに結合したCMVプロモーターエンハンサー配列を含む乳癌特異的プロモーターを用いることができる。これらのキメラプロモーターはいずれも、乳癌細胞において選択的に遺伝子発現を生じさせ、CMVプロモーターと同等な活性レベルを有する。CT90またはCTR116キメラプロモーターを利用した構築物は、好ましくは乳癌細胞を選択的に死滅させること、ならびに／または乳房腫瘍の増殖および／もしくは増殖速度を有意に低下させることにより、正常組織に対する毒性を軽減しながら原発性および転移性乳癌を標的として治療するための遺伝子治療に用いられる。
【００５０】
本発明の他の局面においては、前立腺癌特異的または膵癌特異的なプロモーターが治療用ポリヌクレオチドの発現を制御する。本発明の1つの特定の態様には、前立腺癌特異的または膵癌特異的な複合物がある。例えば、前立腺癌特異的プロモーターはARR2制御配列を含んでよく、一方、膵癌特異的プロモーターはCCKAR制御配列を含んでよい。
【００５１】
治療用ポリヌクレオチドの発現を調節するために用いられる任意のプロモーター配列または制御配列は、例えば、発現および／または転写後プロセスを増強する特異的調節配列を利用しうる。具体的ではあるが例示的な配列には、エンハンサー、二段階転写増幅系、RNAのポリアデニル化、半減期などを調節するエレメント、すなわちWPREなど、および／または当技術分野における他のものが含まれる。
【００５２】
本発明の他の態様には、個体における細胞の増殖を防止する方法であって、本発明の構築物を個体に投与する段階を含む、方法がある。具体的な態様において、構築物はリポソーム中にある状態で投与され、かつ／または治療用遺伝子産物が例えばHIV Tatもしくはペネトラチンなどのタンパク質形質導入ドメイン（Schwarze et al., 1999）をさらに含んでもよい。治療用ポリヌクレオチドは、例えば、プラスミド、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、リポソームまたはそれらの組み合わせといったベクター中にある状態で投与しうる。
【００５３】
I．核酸を基にした発現系
本発明は、いくつかの態様において、特に癌治療のために、治療用ポリヌクレオチドを発現させるための系を利用する。これらのポリヌクレオチドに関する具体的で例示的な局面は本明細書に記載されている。
【００５４】
A．ベクター
「ベクター」という用語は、細胞への導入のために核酸配列を内部に挿入し、細胞内でそれを複製させることが可能な、担体核酸分子のことを指して用いられる。核酸配列は「外因性」であってもよく、このことはベクターが導入される細胞に対してそれが外来性であること、または配列は細胞内の配列に対して同種性であるが宿主細胞内の通常は認められない位置にあることを意味する。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）および人工染色体（例えば、YAC）が含まれる。当業者は、標準的な組換え法によってベクターを構築する手法を十分に把握していると考えられ、これはManiatis et al, 1988およびAusubel et al, 1994に記載され、これらは両方とも参照として本明細書に組み入れられる。
【００５５】
「発現ベクター」という用語は、転写されうる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸を含むベクターのことを指す。場合によっては、RNA分子は続いてタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドへと翻訳される。また別の場合には、これらの配列は翻訳されず、これは例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの作製の場合である。発現ベクターは種々の「制御配列」を含むことができ、これは、特定の宿主細胞における機能的に結合したコード配列の転写のために、かつおそらくは翻訳のためにも必要な核酸配列のことを指す。転写および翻訳を司る制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターが、他の機能を果たす核酸配列を含んでもよく、それについては以下に述べる。
【００５６】
1．プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」とは、転写の開始および速度がそこで制御される、核酸配列の一領域である制御配列のことである。1つの具体的な態様において、プロモーターなどの制御配列は、内部で核酸配列が発現される組織の特異性を調節する。プロモーターまたは制御配列は、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子といった調節性のタンパク質および分子が結合しうる遺伝子エレメントを含んでもよい。「機能的に配置された」「機能的に結合した」「制御下にある」および「転写制御下にある」という語句は、プロモーターまたは他の制御配列が、その配列の転写開始および／または発現を制御する上で、核酸配列に対して正しい機能的な位置および／または向きにあることを意味する。プロモーターを、「エンハンサー」（これは、核酸配列の転写活性化にかかわるシス作用性調節配列のことを指す）とともに用いてもよく、そうでなくてもよい。
【００５７】
プロモーターは、コード性セグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する5'非コード配列を単離することによって入手しうるような、遺伝子または配列に自然下で付随するものでもよい。このようなプロモーターは「内因性」と称しうる。同様に、エンハンサーは、核酸配列に自然下で付随し、その配列の下流または上流に位置するものでもよい。または、コード性核酸セグメントを組換えプロモーターまたは異種プロモーター（これは天然の環境にある核酸配列には自然下では付随していないプロモーターのことを指す）の制御下に置くことにより、ある特定の利点が得られると考えられる。同じく、組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーとは、天然の環境にある核酸配列には自然下では付随していないエンハンサーのことを指す。このようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他のウイルスまたは原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然性」でないプロモーターまたはエンハンサー、すなわち異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび／または発現を変化させる変異を含むものが含まれうる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に作製することに加えて、組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術（PCR（商標）を含む）を本明細書に開示する組成物とともに用いて配列を作製することもできる（米国特許第4,683,202号、米国特許第5,928,906号を参照のこと。これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体といった非核性オルガネラの内部にある配列の転写および／または発現を導く制御配列を用いることも想定している。
【００５８】
当然ながら、発現用に選択した細胞種においてDNAセグメントの発現を有効に導くプロモーターおよび／またはエンハンサーを用いることが重要と考えられる。分子生物学の当業者は一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞種の組み合わせの使用について把握している（例えば、Sambrook et al.（1989）を参照のこと。これは参照として本明細書に組み入れられる）。用いるプロモーターは、構成的なもの、組織特異的なもの、誘導性のもの、および／または、組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模生産に有利であるような、導入したDNAセグメントの高レベルの発現を導く適切な条件下で有用なものでよい。プロモーターは異種性でも内因性でもよい。
【００５９】
組織特異的なプロモーターまたはエレメントの実体、ならびにそれらの活性を特徴づけるためのアッセイは当業者に周知である。治療用遺伝子産物の発現ターゲティングおよび／またはレベルの制御のために用いられる組織特異的プロモーターは、治療用ポリヌクレオチドの発現が所望の標的ではない組織と比較して関心対象の1つまたは複数の組織において発現が選好的に保たれる限り、野生型核酸配列、変異型核酸配列または合成核酸配列が含まれる。プロモーターなどの制御配列は、多数の領域が異なる源に由来する複合（composite）配列であってよい。合成制御配列はさらに、異なる内因性および／または合成プロモーターに源を発する少なくとも2つの別個の領域がそれでも治療用ポリヌクレオチドの発現を制御するように機能的に結合している場合、複合プロモーターとして定義することができる。1つの特定の態様において、組織特異性とは、非癌性組織と対比した癌性組織に対する特異性のことを指す。本明細書で用いる「癌性組織」という用語は、少なくとも1つの癌細胞を含む組織のことを指す。
【００６０】
a．乳癌組織特異的プロモーター
癌の遺伝子治療に現在用いられているプロモーターのほとんどは正常細胞および腫瘍細胞の両方において、強力ではあるが非選択的な活性を有する（例えば、CMVプロモーターおよびβ-アクチンプロモーター）。このため、本発明のいくつかの局面において、本発明では、例えばBikT33D、BikS35DおよびBik T33DS35D変異体などの変異型Bikを含む、治療用ポリヌクレオチドの発現を制御するための乳房組織特異的プロモーターが用いられる。これらのBik変異体は本明細書に記載されているが、その全体が本明細書に参照として組み入れられる、Mien-Chie Hung、Yan LiおよびYong Wenによる「変異型Bikの抗腫瘍効果（"Antitumor Effect of Mutant Bik"）」と題する米国非仮特許出願第10／816,698号にさらに詳細に提示されている。1つの特定の局面において、本発明の乳癌特異的プロモーターは、乳癌組織に対して特異的な治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドの発現を標的とする。
【００６１】
本発明の1つの特定の態様においては、トポイソメラーゼIIα（トポIIα）およびトランスフェリン受容体（TfR）乳癌特異的制御配列のいずれかを利用した複合プロモーターが用いられる。トポイソメラーゼIIα（トポIIα）およびトランスフェリン受容体（TfR）レベルは、例えばSAGE分析およびcDNAマイクロアレイを用いて明らかにされているように乳癌では上昇している。本発明者らは、トポIIαおよびTfRプロモーターの5'末端で、それぞれ90塩基対のセグメント（SEQ ID NO：12）および116塩基対のセグメント（SEQ ID NO：13）を、最小限必要な乳癌特異的制御配列として同定した。本明細書の実施例の項に記載されているように、プロモーター活性は、これらの2種の短いプロモーターをサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターエンハンサー配列（SEQ ID NO：11）などのエンハンサー配列と連結することによって増大した；これらのキメラプロモーターを本明細書ではそれぞれCT90およびCTR116と称する。完全なCT90プロモーターはSEQ ID NO：23に含まれ、完全なCTR116プロモーターはSEQ ID NO：24に含まれる。
【００６２】
乳癌細胞株および／または異種移植マウスモデルにおけるCT90およびCTR116のレポーターアッセイにより、これらの2種のプロモーターが強い活性を有するだけでなく、乳癌組織およびその内部の細胞に対する特異性も有することが示された。特定の態様において、細胞におけるCTR116のプロモーター活性は、固形腫瘍の内部で通常生じる低酸素条件下でさらに増大した。癌の遺伝子治療におけるその有用性を示すため、本発明者らは、アポトーシス遺伝子の発現を生じさせるためにCT90を用いてDNA構築物を作製した。細胞株にトランスフェクトした場合、この構築物は乳癌細胞を選択的に死滅させた。さらに、本発明者らは、例示的な非ウイルス送達系を用いた静脈内注射により、この構築物がマウスにおける乳房腫瘍異種移植片に対して抗腫瘍効果を有することを示した。このことは、CT90が、乳癌細胞において選択的に、変異型Bikなどの治療用遺伝子の発現を生じさせうることを示している。
【００６３】
腫瘍特異性に関して、現在の癌特異的プロモーターのほとんどがCMVプロモーターと比較して極めて弱い活性（例えば、Anderson et al., 2000；Katabi et al., 1999；Lu et al., 2002；Maeda et al., 2001）または不十分な腫瘍特異性（例えば、CMV増強GAPDH（Qiao et al., 2002）しか持たないことを考慮すれば、それらは臨床的に有用ではない。これとは対照的に、CT90プロモーターおよび低酸素により誘導されるCTR116プロモーターの活性はCMVプロモーターと同等（約0.5〜2倍）でありながら乳癌細胞に対して特異的である。したがって、本発明は、正常組織に対する毒性が低いか非毒性であるような治療のために乳癌細胞を標的とすることを目的として変異型Bikの発現を制御するための乳癌特異的プロモーターを含む。
【００６４】
b．膵癌組織特異的プロモーター
膵癌特異的プロモーターは、膵癌細胞を標的としながら、罹患していない膵臓非癌性細胞はそのままにしておくために有用である。本発明者らは、例としてBikT33D、BikS35DおよびBik T33DS35D変異体などの変異型Bikを含む、治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドの標的指向的発現のための強力かつ膵癌特異的なプロモーターを開発した。これらのBik変異体は、本明細書に記載されているが、Mien-Chie Hung、Yan LiおよびYong Wenによる「変異型Bikの抗腫瘍効果（"Antitumor Effect of Mutant Bik"）」と題する米国非仮特許出願第10／816,698号（その全体が本明細書に参照として組み入れられる）にさらに詳細に提示されている。
【００６５】
しかし、本発明者らは、膵癌特異的プロモーターを以下のようにして開発した。文献およびNational Canter for Biotechnology InformationのSeries Analysis of Gene Expressionデータベースに従い、本発明者らは、例えばコレシストキニンA受容体（CCKAR）、オーファンGタンパク質共役型受容体（RDC1）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（uPAR）、カルボキシペプチダーゼA1（CPA1）およびキモトリプシノーゲンB1（CTRB1）を含む、ヒト膵癌で過剰発現される遺伝子を標的とする一連のプロモーターの予備的なスクリーニングを行った。これらを、膵癌細胞ならびに不死化正常細胞におけるルシフェラーゼ活性により、ホタルルシフェラーゼ発現の制御に関してアッセイした。ヌクレオチド-726から＋1までの範囲にわたるCCKARプロモーター（SEQ ID NO：14）が、これらのプロモーターのうち最適な活性および特異性を有するものとして同定された。しかし、この最小限CCKARプロモーターの活性は、一般に用いられるCMVエンハンサー／プロモーターのものよりもはるかに弱かった。本発明者らはそこで、転写活性を強化するために、二段階転写増幅（TSTA）システム（Iyer et al., 2001；Zhang et al., 2002；Sato et al., 2003；およびそれらの中で引用された参考文献）と呼ばれる、例えばGAL4-VP16またはGAL4-VP2融合タンパク質を用いることにより、CCKARプロモーターを基にした一連の組換え複合物を作製した；RNAポリアデニル化シグナル、RNA排出、および／またはRNA翻訳を改変するために、ウッドチャック肝炎ウイルス（WPRE）の転写後調節エレメント（SEQ ID NO：15）を用いた。当業者は、「二段階転写増幅（TSTA）システム」という用語を、「二段階転写活性化（TSTA）システム」または「組換え転写活性化アプローチ」（Nettelbeck et al., 2000）と呼んでもよいことを認識している。1つの特定の局面においては、CCKAR-TSTA-WPRE（CTP）プロモーターが用いられ、このような複合プロモーターの一例はSEQ ID NO：20に含まれる。したがって、この分子組換えCTPプロモーターは、膵癌の遺伝子治療のために有効な治療手段として用いられる。
【００６６】
CCKARプロモーターの活性は、WPREおよびTSTAによってそれぞれ3.9倍および820倍に増大した。驚いたことに、TSTAおよびWPREの併用物に関して、CCAKAR-TSTA-WPRE（CTP）の活性は、厳密な膵癌特異性を保ちながら、PANC-1細胞ではCMVプロモーターと比較して0.7倍、AsPC-1細胞においてさえ2.8倍であった。さらに、CTPが全身送達後にインビボで高い活性および厳密な特異性を有するか否かを明らかにするために、AsPC-1細胞の皮下（s.c）または同所性（o.t）膵臓腫瘍を有するnu／nuヌードマウスに対して、CTP-LucまたはCMC-LucプラスミドDNA-DOTOP：Chol複合体を1日1回、3日間連続して尾静脈に注射し、非侵襲的なIVIS（商標）Imaging Systemを用いてインビボおよびエクスビボでの生物発光画像を入手した。生物発光画像はCMV-Luc注入マウスでは胸部（肺／心臓）に極めて鮮やかに認められたが、CTP-Luc注入マウスではほとんど捉えられなかった。ルミノメーターを用いて検出したルシフェラーゼの活性から、o.t.腫瘍およびs.c.腫瘍における活性がそれぞれ1.4倍および2.0倍に増大したことが示された。o.t.モデルでは、膵臓、肺、心臓、肝臓、脾臓および腎臓におけるCTPルシフェラーゼ発現レベルとCMVルシフェラーゼ発現レベルとの比は、それぞれ0.37、0.006、0.04、0.37、0.63および0.19であり、これは組織特異性の向上を示している。以上を総合すると、この分子組換えCTPプロモーターは、膵癌細胞における活性の点でCMVエンハンサー／プロモーターを上回るとともにその特異性をインビトロおよびインビボで保っており、それによって膵癌の遺伝子治療のための、より安全でより効果的な治療手段を提供する。
【００６７】
c．前立腺癌組織特異的プロモーター
変異型Bikを含む、治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドの発現を制御するために、前立腺癌特異的プロモーターを用いることができる。これらのBik変異体は本明細書に記載されているが、Mien-Chie Hung、Yan LiおよびYong Wenによる「変異型Bikの抗腫瘍効果（"Antitumor Effect of Mutant Bik"）」と題する米国非仮特許出願第10／816,698号（その全体が本明細書に参照として組み入れられる）にさらに詳細に提示されている。これらのプロモーターの活性はアンドロゲン依存的である。さまざまな病期に関して患者はアンドロゲン依存的（ADPC）であり、これは治療用遺伝子の発現を前立腺組織に向けるためにアンドロゲン応答性ベクターを用いることを可能にする。アンドロゲン受容体に応答する活発な前立腺特異的プロモーターは本発明者ら（Xie et al., Cancer Res 2001）および他のグループ（Zhang et al., Mol Endocrinol 2000）によって開発されているが、これらのアンドロゲン依存的プロモーターは、進行性前立腺癌の治療のための主な治療手段である去勢術またはアンドロゲン除去療法の後には活性が低下する可能性がある。これらのプロモーターを含む組成物によって治療された患者は、この種の治療法が奏功せずに、再発性のアンドロゲン非依存的前立腺癌（AIPC）で死亡する恐れがある。
【００６８】
本発明者らは、転移性および再発性のホルモン抵抗性前立腺癌を治療するためにADPCおよびAIPCの両方で活性があると考えられる、遺伝子治療のための新規なプロモーターを開発した。本明細書でATTPと称するプロモーターは、例えばARR2遺伝子由来のARR2調節エレメント（SEQ ID NO：17）などの、少なくとも1つの前立腺細胞特異的制御配列を含む。プロモーターはまた、少なくとも、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）の最小限プロモーター断片（hTERTp）（SEQ ID NO：18）が、例えばGAL4-VP16またはGAL4-VP2（GAL4-VP2の2つの例はSEQ ID NO：16またはSEQ ID NO：19に含まれる）融合タンパク質をコードする配列などの二段階転写増幅（TSTA）システムと機能的に結合したものを含んでもよい。治療用ポリヌクレオチドを、RNAポリアデニル化シグナル、RNA排出、および／またはRNA翻訳を改変するためのウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（WPRE）などの転写後制御配列と機能的に結合させてもよい。これらの調節配列は、ADPC細胞株およびAIPC細胞株の両方で効果がある。再発性前立腺癌のほとんどの症例でAR遺伝子が増幅されること、および／またはARが過剰発現されることを考慮すれば、この特定のプロモーターは、このシステムの活性がアンドロゲンによって刺激されるような態様に関する有効性指標を大きく改善する。特定の態様においては、TSTA-hTERT-ARR2エレメントおよびWPREエレメントが前立腺癌特異的制御配列として用いられ、これらは特定の態様においてSEQ ID NO：21に含まれる。
【００６９】
このプロモーターの作製に向けて、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）の最小限プロモーター断片（hTERTp）（SEQ ID NO：18）をLNCaP細胞のDNA抽出物からPCR増幅し、ルシフェラーゼレポーターシステムにおける活性に関して検討した。hTERTpはLNCaP細胞およびPC-3細胞の両方で活性があるが、その活性はCMVエンハンサー／プロモーターと比較して非常に弱い。そこで、hTERTpプロモーターを基にした一連の複合物を、転写活性を増強するための二段階転写増幅（TSTA）システムによるGAL4-VP16またはGAL4-VP2融合タンパク質、ならびにRNAポリアデニル化シグナル、RNA排出および／またはRNA翻訳を改変するためのウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（WPRE）を用いることによって組換え作製した。例示的なGAL4-VP2融合タンパク質は、SEQ ID NO：16またはSEQ ID NO：19を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【００７０】
WPREは活性を約2倍に上昇させた。驚いたことに、TSTAシステムは活性をLNCaP細胞におけるCMV活性の最大67％まで、PC-3細胞では90％まで高めることができた。TSTAシステムをWPREと併用した場合、活性はPC3ではCMVと同等であり、さらにLNCaP細胞では1.5倍の高さであった。これとは対照的に、その活性は肺線維芽細胞WI-38細胞では不顕性のままであった。このことは、hTERTp-TSTA-WPREシステムがADPC細胞株およびAIPC細胞株の両方で動作することを示している。再発性前立腺癌のほとんどの症例では、AR遺伝子が増幅される、および／またはARが過剰発現される。このため、特定の態様において、このシステムの活性をアンドロゲンによって刺激することができれば、これは有効性指標を大きく改善する。
【００７１】
この目標を実現するために、プラスミドARR2PB由来のARR2エレメント（SEQ ID NO：17）をphTERTp-TSTA-LucおよびphTERTp-TSTA-Luc-WPREのhTERTpプロモーターと融合させ、プラスミドpARR2.hTERTp-TSTA-LucおよびpARR2.hTERTp-TSTA-Luc-WPRE（ATTP-Luc）を作製した。予想された通り、ARR2.hTERTp-TSTA複合物およびARR2.hTERTp-TSTA-WPRE複合物の活性は、アンドロゲン依存的な様式で増大し、10nmのアンドロゲン類似体R1881の下で、LNCaP細胞ではCMVのそれと比べそれぞれ15倍および24倍大きくなり、PC-3細胞では有意な変化は認められなかった。
【００７２】
このように、本発明者らは、治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを、ADPCだけでなくAIPCへも標的化する、新規な前立腺癌特異的調節システムを開発した。
【００７３】
2．開始シグナルおよびリボソーム内部結合部位
コード配列の効率的な翻訳のために特定の開始シグナルが必要なこともある。これらのシグナルにはATG開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを与えることが必要なこともある。当業者は容易にこれを判断して必要なシグナルを用意することができると考えられる。挿入物全体を確実に翻訳させるためには開始コドンが所望のコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」になければならないことは周知である。外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然のものでも合成性でもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって高めうる。
【００７４】
本発明のいくつかの特定の態様においては、多遺伝子性または多シストロン性のメッセージを作製するためにリボソーム内部進入部位（IRES）エレメントが用いられる。IRESエレメントは、リボソームスキャニングモデルによる5'メチル化Cap依存的な翻訳を回避して、内部部位で翻訳を開始させることが可能である（Pelletier and Sonenberg, 1988）。IRESエレメントは、ピコルナウイルス科の2つのメンバー（ポリオウイルスおよび脳心筋炎ウイルス）のものが記載されており（Pelletier and Sonenberg, 1988）、哺乳動物メッセージ由来のIRESについても同様である（Macejak and Sarnow, 1991）。IRESエレメントは異種オープンリーディングフレームと連結することが可能である。IRESによって隔てられた複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写させ、多シストロン性メッセージを作製することができる。IRESエレメントの作用により、各オープンリーディングフレームをリボソームに接近させ、効率的な翻訳を行わせることが可能である。単一のプロモーター／エンハンサーを用いて複数の遺伝子を効率的に発現させ、単一のメッセージとして転写させることができる（米国特許第5,925,565号および第5,935,819号を参照のこと。これらは参照として本明細書に組み入れられる）。
【００７５】
3．マルチクローニング部位
ベクターはマルチクローニング部位（MCS）を含むことができ、これは多数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、その任意のものを標準的な組換え技術と併せて用いることでベクターを消化することができる（例えば、Carbonelli et al., 1999、Levenson et al., 1998およびCocea, 1997を参照のこと。これらは参照として本明細書に組み入れられる）。「制限酵素消化」とは、核酸分子の特定の部位のみに働く酵素による核酸分子の触媒性切断のことを指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は当業者に幅広く認識されている。しばしばベクターは、外因性配列をベクターと連結させるために、MCS内部に切れ目を入れる制限酵素による線状化または断片化を受ける。「連結（"Ligation"）」とは、2つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成させる工程のことを指す（この2つは互いに連続しても連続しなくてもよい）。制限酵素および連結反応に関する技法は、組換え技術の当業者には周知である。
【００７６】
4．スプライシング部位
転写された真核生物RNA分子の大部分はRNAスプライシングを受け、イントロンが一次転写物から除去される。真核生物ゲノム配列を含むベクターは、タンパク質発現用の転写物が正しいプロセシングを受けるためにスプライス供与部位および／またはスプライス受容部位を要することがある（例えば、Chandler et al., 1997を参照されたい。これは参照として本明細書に組み入れられる）。
【００７７】
5．ポリアデニル化シグナル
発現において、特に真核生物での発現においては、転写物の適切なポリアデニル化を行わせるためにポリアデニル化シグナルを含めることが一般的と考えられる。ポリアデニル化シグナルの性質は本発明を首尾良く実施するために特に重要ではないと考えられ、かつ／または、このような任意の配列を用いることができる。好ましい態様には、便利であり、かつ／またはさまざまな標的細胞でうまく働くことが知られている、SV40ポリアデニル化シグナルおよび／またはウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルが含まれる。発現カセットの一エレメントとして同じく考えられるものには、転写終結部位がある。これらのエレメントは、メッセージのレベルを高めるため、および／またはカセットから他の配列への読み過ごしを最小限に抑えるために役立つと考えられる。
【００７８】
6．複製起点
ベクターを宿主細胞内で増殖させるためには、複製がその部位で開始される特定の核酸配列である複製起点部位（しばしば「ori」と呼ばれる）を1つまたは複数含めるとよい。または、宿主細胞が酵母であれば、自律複製配列（ARS）を用いることもできる。
【００７９】
7．選択マーカーおよびスクリーニング用マーカー
本発明のいくつかの特定の態様において、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクターにマーカーを含めることにより、インビトロまたはインビボで同定しうる。このようなマーカーは、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする識別可能な変化を細胞に付与すると考えられる。一般に、選択マーカーとは、選択を可能にする性質を付与するもののことである。陽性選択マーカーとは、マーカーの存在によってその選択が可能になるものであり、一方、陰性選択マーカーとはその存在によってその選択が妨げられるもののことである。陽性選択マーカーの一例は薬剤耐性マーカーである。
【００８０】
通常、薬剤選択マーカーを含めることは形質転換体のクローニングおよび同定に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシンおよびヒスチジノールは有用な選択マーカーである。形質転換体を条件の実行に基づいて識別することを可能にする表現型を付与するマーカーのほかに、GFP（その基盤は比色分析である）などのスクリーニング用マーカーを含む別の種類のマーカーも想定している。または、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（tk）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）などのスクリーニング用酵素を用いることもできる。当業者には、免疫マーカーを用いる手法（おそらくFACS分析と組み合わせて）も公知であると考えられる。用いるマーカーの種類は、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現される限り、特に重要ではないと考えられる。選択マーカーおよびスクリーニング用マーカーのその他の例は当業者に周知である。
【００８１】
B．宿主細胞
本発明のプロモーターは、それらが特定のポリヌクレオチドの発現を調節する限り、あらゆる様式で用いることができる。それらは組織特異的発現のために有用であるものの、それらは本来はプロモーター／制御配列であり、このため、任意のポリヌクレオチドを発現させるために任意の細胞で用いることができる。
【００８２】
本明細書で用いる場合、「細胞」「細胞株」および「細胞培養物」という用語は互換的に用いうる。これらの用語はいずれも、その子孫、すなわち以降の任意およびすべての世代も含む。人為的または偶発的な変異のために、すべての子孫が同一でなくてもよいことは認識されている。異種核酸配列を発現させる文脈において、「宿主細胞」は真核細胞のことを指し、これにはベクターの複製および／またはベクターによりコードされる異種遺伝子の発現を行える形質転換可能な任意の細胞が含まれる。宿主細胞はベクターのレシピエントとして用いることができ、用いられてきた。宿主細胞は「トランスフェクトすること」または「形質転換を行うこと」ができ、これは外因性核酸を宿主細胞に移入または導入する工程のことを指す。形質転換細胞には、初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
【００８３】
宿主細胞は原核生物または真核生物のいずれに由来してもよく、それは所望の結果がベクターの発現であるか、それともベクターにコードされた核酸配列の部分または全体の発現であるかによる。さまざまな細胞株および培養物を宿主細胞として利用することができ、それらは生きた状態にある培養物および遺伝物質の保管機関であるAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手することができる。当業者はベクターの基本骨格および所望の結果に基づき、適した宿主を決定することができる。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多数のベクターの複製のために原核宿主細胞に導入することができる。ベクター複製および／または発現のための宿主細胞として用いられる細菌細胞には、DH5α、JM109およびKC8、ならびにさまざまな市販の細菌宿主、例えばSURE（登録商標）コンピテント細胞およびSolopack（商標）Gold細胞（Stratagene（登録商標）, La Jolla）が含まれる。または、大腸菌LE392株などの細菌細胞をファージウイルス用の宿主細胞として用いることも可能と考えられる。
【００８４】
ベクターの複製および／または発現のための真核宿主細胞の例には、HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、SaosおよびPC12が含まれる。さまざまな細胞種および生物由来の多くの宿主細胞を用いることができ、これらは当業者に公知であると考えられる。同様に、ウイルスベクターを真核宿主細胞または原核宿主細胞、特にベクターの複製または発現を許容するものと組み合わせて用いることもできる。
【００８５】
ある種のベクターには、原核細胞および真核細胞の両方での複製および／または発現を可能にする制御配列を用いうる。当業者は上記の宿主細胞のあらゆるものを、それを維持するとともにベクターの複製を許容しながらインキュベートする条件をさらに認識していると考えられる。また、ベクターの大規模生産、ならびにベクターによってコードされる核酸、およびその同族ポリペプチド、タンパク質またはペプチドの生産を可能にする技法および条件も、認識され、公知である。
【００８６】
C．発現系
以上に考察した組成物の少なくとも一部またはすべてを含む、多数の発現系が存在する。原核生物および／または真核生物を基にした系を、本発明とともに用いるために使用して、核酸配列、またはその同族ポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生させることができる。数多くのこのような系が、市販されており、広く入手可能である。本発明のプロモーターは組織特異的発現のために有用であるものの、それらは本来はプロモーター／制御配列であり、このため、任意のポリヌクレオチドを発現させるために任意の発現系で用いることができる。
【００８７】
昆虫細胞／バキュロウイルス系は、米国特許第5,871,986号、第4,879,236号（両方とも本明細書に参照として組み入れられる）に記載されたような、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現を生じることができ、これは例えば、MaxBac（登録商標）2.0の名称でInvitrogen（登録商標）から購入することができ、BacPack（商標）バキュロウイルス発現系はClontech（登録商標）から購入することができる。
【００８８】
発現系のその他の例には、Stratagene（登録商標）のComplete Control（商標）誘導性哺乳動物発現系（これは合成エクジソン誘導性受容体を含む）、またはStratagene（登録商標）の大腸菌発現系の1つであるpET発現系が含まれる。誘導性発現系のもう1つの例は、T-REX（商標）（テトラサイクリンにより調節される発現）系（全長CMVプロモーターを用いる誘導性哺乳動物発現系）を扱うInvitrogen（登録商標）から入手可能である。Invitrogen（登録商標）はまた、メタノール資化性酵母ピキア-メタノリカ（Pichia methanolica）における組換えタンパク質の高レベル産生のために設計された、ピキア-メタノリカ発現系と呼ばれる酵母発現系を提供している。ベクター（例えば、発現構築物など）を発現させる方法、核酸配列またはその同族ポリぺプチド、タンパク質またはペプチドを産生する方法は、当業者に公知である。
【００８９】
II．核酸組成物
本発明のある特定の態様においては、特定の配列が本発明のポリヌクレオチド構築物およびその使用法において用いられる。当業者は、これらの特異的配列を本明細書に提示した通りに厳密に用いうることを認識しているが、また別の態様において、本明細書に提示した例示的な配列に類似した配列は、組織特異的な癌調節配列のために少なくとも部分的には有用である。
【００９０】
本発明のある特定の態様は、組織特異的な調節性の核酸（これは「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に用いうる）に関する。また別の局面において、発現構築物核酸は、例えばSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18の核酸セグメント、またはその生物学的な機能的等価物を含む。
【００９１】
「核酸」という用語は当技術分野で周知である。本明細書で用いる場合、「核酸」とは一般に、核酸塩基を含むDNA、RNAまたはその誘導体もしくは類似体の分子（すなわち、鎖）のことを指すと考えられる。核酸塩基には、例えば、DNA（例えば、アデニン「A」、グアニン「G」、チミン「T」またはシトシン「C」）またはRNA（例えば、A、G、ウラシル「U」またはC）中に認められる、天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基が含まれる。「核酸」という用語は、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を、それぞれ「核酸」という用語の亜属として含む。「オリゴヌクレオチド」という用語は、約3〜約100核酸塩基長の分子のことを指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、約100核酸塩基長を上回る少なくとも1つの分子のことを指す。
【００９２】
これらの定義は一般に一本鎖分子のことを指すが、特定の態様においては、一本鎖分子と部分的、実質的または完全に相補的なもう1つの鎖も含む。したがって、核酸は、ある分子を含む特定の配列の1つまたは複数の相補鎖または「相補物」を含む、二本鎖分子または三本鎖分子も含みうる。本明細書で用いる場合、一本鎖核酸を接頭語「ss」によって、二本鎖核酸を接頭語「ds」によって、三本鎖核酸を接頭語「ts」によって表してもよい。
【００９３】
1．核酸塩基
本明細書で用いる場合、「核酸塩基」は複素環式塩基のことを指し、これには例えば、少なくとも1つの天然に存在する核酸（すなわち、DNAおよびRNA）中に認められる天然に存在する核酸塩基（すなわち、A、T、G、CまたはU）、ならびにこのような核酸塩基の天然に存在する、または天然には存在しない誘導体および類似体などがある。核酸塩基は一般に、天然に存在する核酸塩基の対合（例えば、AとTとの間、GとCとの間およびAとUとの間の水素結合）に置き換わるような様式で、少なくとも1つの天然に存在する核酸塩基と1つまたは複数の水素結合を形成する（「アニーリングする」または「ハイブリダイズする」）ことができる。
【００９４】
「プリン」および／または「ピリミジン」核酸塩基は、天然に存在するプリンおよび／またはピリミジン核酸塩基のほか、アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、チオールまたはアルキルチオール部分のうち1つまたは複数によって置換されたプリンまたはピリミジンを非制限的に含む、それらの誘導体および類似体も含む。好ましいアルキル（例えば、アルキル、カルボキシアルキル、その他）部分は、約1、約2、約3、約4、約5ないし約6個の炭素原子を含む。プリンまたはピリミジンのその他の非制限的な例には、デアザプリン、2,6-ジアミノプリン、5-フルオロウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、8-ブロモグアニン、8-クロログアニン、ブロモチミン、8-アミノグアニン、8-ヒドロキシグアニン、8-メチルグアニン、8-チオグアニン、アザグアニン、2-アミノプリン、5-エチルシトシン、5-メチルシトシン、5-ブロモウラシル、5-エチルウラシル、5-ヨードウラシル、5-クロロウラシル、5-プロピルウラシル、チオウラシル、2-メチルアデニン、メチルチオアデニン、N,N-ジメチルアデニン、アザアデニン、8-ブロモアデニン、8-ヒドロキシアデニン、6-ヒドロキシアミノプリン、6-チオプリン、4-(6-アミノヘキシル／シトシン）などが含まれる。
【００９５】
核酸塩基は、本明細書に記載された、または当業者に公知であるあらゆる化学的または天然の合成方法を用いて、ヌクレオシドまたはヌクレオチド中に含めることができる。
【００９６】
2．ヌクレオシド
本明細書で用いる場合、「ヌクレオシド」という用語は、核酸塩基が核酸塩基リンカー部分と共有結合したものを含む、個々の化学単位のことを指す。「核酸塩基リンカー部分」の非制限的な一例は、デオキシリボース、リボース、アラビノースを非制限的に含む、5つの炭素原子を含む糖（すなわち「五炭糖」）または五炭糖の誘導体もしくは類似体である。五炭糖の誘導体または類似体の非制限的な例には、2'-フルオロ-2'-デオキシリボース、または糖環内の酸素原子が炭素に置換された単素環式糖が含まれる。
【００９７】
核酸塩基リンカー部分に対する核酸塩基のさまざまな種類の共有結合が当技術分野では公知である。非制限的な例として、プリン（すなわち、AまたはG）または7-デアザプリン核酸塩基を含むヌクレオシドは典型的には、プリンまたは7-デアザプリンの9位を五炭糖の1'位と結合させる。もう1つの非制限的な例において、ピリミジン核酸塩基（すなわち、C、TまたはU）を含むヌクレオシドは典型的には、ピリミジンの1位を五炭糖の1'位と結合させる（Kornberg and Baker, 1992）。
【００９８】
3．ヌクレオチド
本明細書で用いる場合、「ヌクレオチド」とは、「骨格部分」をさらに含むヌクレオシドのことを指す。骨格部分は一般に、ヌクレオチドをヌクレオチドを含む別の分子と、または別のヌクレオチドと共有結合させて核酸を形成する。天然に存在するヌクレオチドにおける「骨格部分」は、典型的には、五炭糖と共有結合したリン部分を含む。骨格部分の結合は、典型的には、五炭糖の3'位または5'位のいずれかで起こる。しかし、他の種類の結合も当技術分野で公知であり、特にヌクレオチドが天然に存在する五炭糖またはリン部分の誘導体または類似体を含む場合には公知である。
【００９９】
4．核酸類似体
核酸は、天然に存在する核酸中に存在しうる核酸塩基、核酸塩基リンカー部分および／または骨格部分の誘導体または類似体を含んでもよく、すべてそれらから構成されてもよい。本明細書で用いる場合、「誘導体」とは、天然に存在する分子の化学的に修飾または改変された形態のことを指し、一方、「模倣物」または「類似体」という用語は、天然に存在する分子または部分と構造的に類似していてもそうでなくともよいが、類似の機能を有する分子のことを指す。本明細書で用いる場合、「部分（moiety）」とは一般に、相対的に大きい化学構造または分子構造の、相対的に小さい化学成分または分子成分のことを指す。核酸塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの類似体または誘導体は当技術分野で周知であり、記載されている（例えば、Scheit, 1980を参照のこと。これは参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１００】
五炭糖および／または骨格部分の誘導体または類似体を含むヌクレオシド、ヌクレオチドまたは核酸のその他の非制限的な例には、以下におけるものが含まれる：dsDNAと三重らせんを形成する、および／またはdsDNAの発現を妨げる、プリン誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第5,681,947号；特に蛍光核酸プローブとして用いるために、DNAまたはRNA中に認められるヌクレオシドの蛍光類似体を組み込んだ核酸を記載している米国特許第5,652,099号および第5,763,167号；向上したヌクレアーゼ安定性を有する、ピリミジン環上に置換のあるオリゴヌクレオチド類似体を記載している米国特許第5,614,617号；核酸検出に用いられる修飾された五炭糖（すなわち、修飾された2'-デオキシフラノシル部分）を有するオリゴヌクレオチド類似体を記載している米国特許第5,670,663号、第5,872,232号および第5,859,221号；ハイブリダイゼーションアッセイに用いうる、4'位が水素以外の置換基で置換された少なくとも1つの五炭糖部分を含むオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第5,446,137号；3'-5'ヌクレオチド間結合したデオキシリボヌクレオチドおよび2'-5'ヌクレオチド間結合したリボヌクレオチドの両方を有するオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第5,886,165号；ヌクレオチド間結合の3'位酸素が核酸のヌクレアーゼ抵抗性を高めるために炭素に置き換えられた修飾ヌクレオチド間結合を記載している米国特許第5,714,606号；ヌクレアーゼ抵抗性を高める1つまたは複数の5'メチレンホスフォネートヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第5,672,697号；ヌクレアーゼ安定性の向上および薬剤または検出部分を送達する能力を提供するためにオリゴヌクレオチドの2'炭素に対して薬剤または標識を含みうる置換基部分の結合を記載している米国特許第5,466,786号および第5,792,847号；細胞内取込みの向上、ヌクレアーゼに対する抵抗性および標的RNAに対するハイブリダイゼーションのために、隣接する五炭糖部分の4'位および3'位を結合させる2または3炭素骨格結合を有する米国特許第5,223,618号；核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用な、少なくとも1つのスルファメートまたはスルファミドヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第5,470,967号；ヌクレアーゼ抵抗性、細胞内取込みの向上およびRNA発現の調節のために用いられる、ホスホジエステル骨格部分が3つまたは4つの原子リンカー部分で置換されたオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第5,378,825号、第5,777,092号、第5,623,070号、第5,610,289号および第5,602,240号；その膜透過性および安定性を高めるためにオリゴヌクレオチドの2'-O位に結合した疎水性担体物質を記載している米国特許第5,858,988号；DNAまたはRNAに対するハイブリダイゼーション性の向上およびヌクレアーゼに対する安定性の向上を有する5'末端にアントラキノンが結合したオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第5,214,136号；ヌクレアーゼ抵抗性、結合親和性、およびRNアーゼHを活性化する能力の向上のためにDNAが2'-デオキシ-エリスロ-ペントフラノシルヌクレオチドを含む、PNA-DNA-PNAキメラを記載している米国特許第5,700,922号；ならびにDNAと結合してDNA-RNAハイブリッドを形成するRNAを記載している米国特許第5,708,154号。
【０１０１】
5．核酸の調製
核酸は、例えば化学合成、酵素的生成または生物的生産といった当業者に公知の任意の技法によって生産しうる。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非制限的な例には、リン酸トリエステル、亜リン酸塩もしくはホスホルアミダイト化学、および欧州特許第266,032号（参照として本明細書に組み入れられる）に記載されたような固相法を用いて、またはFroehler et al., 1986および米国特許第5,705,629号（それぞれ参照として本明細書に組み入れられる）に記載されたデオキシヌクレオシドH-ホスフォネート中間体を介して、インビトロ化学合成によって生産された核酸が含まれる。本発明の方法には、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドを用いることができる。オリゴヌクレオチド合成の種々多様な機構が、例えば、米国特許第4,659,774号、第4,816,571号、第5,141,813号、第5,264,566号、第4,959,463号、第5,428,148号、第5,554,744号、第5,574,146号、第5,602,244号に開示されており、これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる。
【０１０２】
酵素的に生成される核酸の非制限的な一例には、PCRTMなどの増幅反応（例えば、米国特許第4,683,202号および米国特許第4,682,195号を参照。これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）または米国特許第5,645,897号（参照として本明細書に組み入れられる）に記載されたオリゴヌクレオチドの合成において酵素により生成されるものが含まれる。生物的に生産される核酸の非制限的な例には、細菌内で複製される組換えDNAベクターのように、生きた細胞内で産生（すなわち、複製）される組換え核酸が含まれる（例えば、Sambrook et al. 1989を参照。これは参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１０３】
6．核酸の精製
核酸は、ポリアクリルアミドゲル、塩化セシウム密度勾配遠心法または当業者に公知の任意の他の手段（例えば、Sambrook et al., 1989を参照。これは参照として本明細書に組み入れられる）によって精製することができる。
【０１０４】
いくつかの特定の局面において、本発明は、単離された核酸である核酸に関する。本明細書で用いる場合、「単離された核酸」という用語は、1つまたは複数の細胞のゲノム核酸および転写された核酸の全体のうち大部分を含まないように単離されているか、またはさもなくば含まない核酸分子（例えば、RNA分子またはDNA分子）のことを指す。いくつかの特定の態様において、「単離された核酸」とは、例えば脂質またはタンパク質、低分子量生体分子などの高分子のような細胞成分またはインビトロ反応の成分の大部分を含まないように単離されているか、またはさもなくば含まない核酸のことを指す。
【０１０５】
7．核酸セグメント
いくつかの特定の態様において、核酸は核酸セグメントである。本明細書で用いる場合、「核酸セグメント」という用語は、核酸の比較的小さな断片のことである；例えば非制限的な例としては、所定の転写されたポリヌクレオチドに対する調節配列の一部のみを含むものなどである。
【０１０６】
8．核酸相補物
本発明はまた、本発明の核酸に対して相補的な核酸も含む。特定の態様において、本発明は、例えば、SEQ ID、NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17およびSEQ ID NO：18に示された配列に対して相補的な核酸または核酸セグメントを含む。核酸は、標準的なワトソン-クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型の結合相補性規則に従って別の核酸と塩基対を形成しうる場合、別の核酸に対して「相補物」または「相補的」である。本明細書で用いる場合、「別の核酸」は、別々の分子、または同一分子の空間的に隔てられた配列のことを指しうる。
【０１０７】
本明細書で用いる場合、「相補的」または「相補物」という用語は、全部よりは少ない核酸塩基が相手の核酸塩基と塩基対を形成しない場合でさえも、別の核酸鎖または二重鎖とハイブリダイズしうる、連続的核酸塩基または半連続的核酸塩基（例えば、1つまたは複数の核酸塩基部分が分子中に存在しない）の配列を含む核酸のことも指す。いくつかの特定の態様において、「相補的」な核酸には、核酸塩基配列の約70％、約71％、約72％、約73％、約74％、約75％、約76％、約77％、約77％、約78％、約79％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％〜約100％およびそれらの中で導き出せる任意の範囲がハイブリダイゼーション時に一本鎖または二本鎖核酸分子と塩基対を形成しうる配列が含まれる。いくつかの特定の態様において、「相補的」という用語は、当業者に理解されているであろうストリンジェントな条件下で別の核酸鎖または二重鎖とハイブリダイズしうる核酸のことを指す。
【０１０８】
いくつかの特定の態様において、「部分的に相補的」な核酸には、低ストリンジェンシー条件下で一本鎖もしくは二本鎖核酸とハイブリダイズしうる配列が含まれる、または核酸塩基配列の約70％未満がハイブリダイゼーション時に一本鎖もしくは二本鎖核酸分子と塩基対を形成しうる配列を含む。
【０１０９】
9．ハイブリダイゼーション
本明細書で用いる場合、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズしうる」という用語は、二本鎖もしくは三本鎖分子、または部分的に二本鎖もしくは三本鎖の性質を備えた分子を形成することを意味する。「アニールする」という用語は、本明細書で用いる場合、「ハイブリダイズする」と同義である。「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズしうる」という用語には、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」という用語、および「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」という用語を包含する。
【０１１０】
本明細書で用いる場合、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」とは、相補的配列を含む1つまたは複数の核酸鎖の間または内部でのハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダムな配列間のハイブリダイゼーションは不可能にするような条件のことである。ストリンジェントな条件は、核酸と標的鎖との間のミスマッチを、たとえあったとしても、ほとんど許容しない。このような条件は当業者に周知であり、高度の選択性を必要とする用途にとっては好ましい。非制限的な用途には、遺伝子もしくはその核酸セグメントといった核酸の単離、または少なくとも1つの特異的mRNA転写物もしくはその核酸セグメントの検出が含まれる。
【０１１１】
ストリンジェントな条件には、約50℃〜約70℃の温度での約0.02M〜約0.15M NaClによって与えられるような、低塩および／または高温の条件が含まれうる。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、一部には、特定の核酸の長さ、標的配列の長さおよび核酸塩基の内容、核酸の電荷組成、ならびにハイブリダイゼーション混合物におけるホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたは他の溶媒の存在または濃度によって決定されることは理解されている。
【０１１２】
また、ハイブリダイゼーションのためのこれらの範囲、組成および条件は、非制限的な例に過ぎないものとして記述されており、特定のハイブリダイゼーション反応のための所望のストリンジェンシーはしばしば、1つまたは複数の陽性または陰性対照との比較によって経験的に決定されることも理解されている。想定される用途によっては、標的配列に対して核酸のさまざまな度合いの選択性を実現するために、さまざまなハイブリダイゼーション条件を用いることが好ましい。1つの非制限的な例において、ストリンジェントな条件下で核酸とハイブリダイズしない関連した標的核酸の同定または単離は、低温および／または高イオン強度でのハイブリダイゼーションによって実現しうる。このような条件は「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、低ストリンジェンシーの非制限的な例には、約20℃〜約50℃の範囲の温度での約0.15M〜約0.9M NaClで行われるハイブリダイゼーションが含まれる。当然ながら、特定の用途に適合させるために低または高ストリンジェンシー条件をさらに変更することは、当業者の技能の範囲内にある。
【０１１３】
本発明の核酸は、配列自体の長さにかかわらず、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、制限酵素部位、マルチクローニング部位、コード性セグメントを非制限的に含む他の核酸配列と組み合わせて、1つまたは複数の核酸構築物を作り出すことができる。本明細書で用いる場合、「核酸構築物」とは人為的に操作または改変された核酸のことであり、これは一般に、人為的に構成された1つまたは複数の核酸配列を含む。
【０１１４】
1つの非制限的な例においては、例えば、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17またはSEQ ID NO：18に対して同一または相補的なヌクレオチドの連続鎖を含む、1つまたは複数の核酸構築物を調製することができる。核酸構築物の長さは、約3、約5、約8、約10〜約14、または約15、約20、約30、約40、約50、約100、約200、約500、約1,000、約2,000、約3,000、約5,000、約10,000、約15,000、約20,000、約30,000、約50,000、約100,000、約250,000、約500,000、約750,000〜約1,000,000ヌクレオチドであってよく、かつ、酵母人工染色体などの核酸構築物の到来が当業者に公知であることから、最大で染色体のサイズを含む（すべての中間の長さおよび中間の範囲も含む）より大きなサイズであってもよい。本明細書で用いる場合、「中間の長さ」および「中間の範囲」が、言及された値を含むまたはその間（すなわち、このような値を含めてのその間のすべての整数）である、任意の長さまたは範囲を意味することは直ちに理解されると考えられる。中間の長さの非制限的な例には、約11、約12、約13、約16、約17、約18、約19など；約21、約22、約23など；約31、約32など；約51、約52、約53など；約101、約102、約103など；約151、約152、約153など；約1,001、約1002など；約50,001、約50,002など；約750,001、約750,002など；約1,000,001、約1,000,002などが含まれる。中間の範囲の非制限的な例には、約3〜約32、約150〜約500,001、約3,032〜約7,145、約5,000〜約15,000、約20,007〜約1,000,003などが含まれる。
【０１１５】
例えば、「実質的にSEQ ID NO：12に示された配列」または「実質的にSEQ ID NO：13に示された配列」という用語は、SEQ ID NO：12およびSEQ ID NO：13の一部分に実質的に対応し、SEQ ID NO：12および／またはSEQ ID NO：13の各々のヌクレオチドとは同一でない、またはそれらの生物学的な機能的等価物である相対的に少数のヌクレオチドを有する配列のことを意味する。したがって、「実質的にSEQ ID NO：12に示された配列」または「実質的にSEQ ID NO：13に示された配列」には、SEQ ID NO：12および／またはSEQ ID NO：13に示された核酸配列の部分または全体を含む核酸、核酸セグメントおよび遺伝子が含まれる。
【０１１６】
「生物学的な機能的等価物」という用語は、当技術分野でよく理解されており、本明細書でさらに詳細に定義される。すなわち、例示的なSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17またはSEQ ID NO：18などの本明細書で言及した配列のヌクレオチドと同一であるかその機能的等価物であるヌクレオチドを約70％〜約80％；またはより好ましくは約81％〜約90％；またはさらにより好ましくは約91％〜約99％有する配列は、配列の生物活性が維持されている限り、それぞれ「実質的にSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17またはSEQ ID NO：18に示された」配列であると考えられる。
【０１１７】
いくつかの他の態様において、本発明は、その配列の内部に、実質的にSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17またはSEQ ID NO：18に示された核酸配列を含む、少なくとも1つの組換えベクターに関する。
【０１１８】
III．治療用ポリヌクレオチド
本発明に含まれる本発明の制御配列によって発現が制御される治療用ポリヌクレオチドは、それによってコードされる遺伝子産物が抗癌効果を生じる限り、任意の種類のものであってよい。抗癌効果には、少なくとも1つの癌細胞におけるアポトーシスを誘導すること、少なくとも1つの癌細胞の増殖を阻止すること、個体における癌の少なくとも1つの症状を緩和することなどが含まれる。特定の態様において、治療用ポリヌクレオチドは、米国特許出願第10／816,698号（その全体が参照として本明細書に組み入れられる）に記載されているBikT33D、BikS35DおよびBik T33DS35D変異体などを例示的に含む、変異型のBikをコードする。
【０１１９】
治療用ポリヌクレオチドは、当業者に公知であるか、または後に発見される任意の種類のものであってよい。特定の態様において、それらは細胞増殖の阻害因子、プログラム細胞死の調節因子、腫瘍抑制因子および／または細胞増殖の誘導因子のアンチセンス配列をコードする。治療用ポリヌクレオチドが短鎖干渉性RNAまたはアンチセンス配列をコードしてもよい。治療用ポリヌクレオチドの例には、例えば、TNFαもしくはp53をコードするもの、またはBik、p53、Bax、Bak、Bcl-x、Bad、Bim、Bok、Bid、Harakiri、Ad E1B、BadおよびICE-CED3プロテアーゼを非制限的に含むアポトーシス誘導因子をコードするものが含まれる。その他の例示的な治療用ポリヌクレオチドには、例えば、retinoblastoma、Blk、IL-12、IL-10、IFN-α、シトシンデアミナーゼ、GM-CSF、E1Aおよび他のアポトーシス促進タンパク質をコードするものが含まれる。変異型Bikのトレオニン33、セリン35またはその両方の箇所でアミノ酸置換をコードするポリヌクレオチドを利用してもよい。これらの態様の特定の局面において、変異型Bikポリペプチドのアミノ酸はアスパラギン酸によって置換されている。また別の特定の局面において、変異型Bikには1つまたは複数のリン酸化部位が欠損している。その他の治療用ポリヌクレオチドには、TNFαもしくはp53、またはBik、p53、Bax、Bak、Bcl-x、Bad、Bim、Bok、Bid、Harakiri、Ad E1B、BadおよびICE-CED3プロテアーゼを非制限的に含むアポトーシス誘導因子が含まれる。
【０１２０】
IV．核酸送達
組成物および／または治療薬に関する本発明の局面に対する一般的なアプローチは、特定および／または所望の変異型Bikタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする遺伝子構築物を細胞に与え、それによってそのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの所望の活性を生じさせることである。遺伝子構築物および／またはタンパク質を直接送達することも考えられるが、好ましい態様は、特定および所望のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸を細胞に与えることを含む。この供給の後に、細胞の転写および翻訳機構によってタンパク質性組成物が、発現構築物によって提供される任意のものとともに合成される。アンチセンス、リボザイムおよび他の阻害因子の提供においても、好ましい様式は構築物をコードする核酸を細胞に与えることである。
【０１２１】
本発明のいくつかの特定の態様において、遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノム中に安定的に組み込まれてもよい。さらに別の態様において、核酸は、DNAの別個のエピソーム性セグメントとして細胞内に安定的に維持されてもよい。このような核酸セグメントおよび「エピソーム」は、宿主細胞の周期に対して独立および同期した維持および複製を行うのに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞にいかにして送達されるか、および／または細胞内に核酸がいかにして保たれるかは、用いる発現構築物の種類による。
【０１２２】
A．ウイルスベクターを用いたDNA送達
ある種のウイルスは、受容体を介したエンドサイトーシスによって細胞に感染または進入し、宿主細胞ゲノムに組み込まれる、および／またはウイルス遺伝子を安定的および／または効率的に発現する能力があることから、外来性核酸を哺乳動物細胞に導入するための魅力のある候補となっている。本発明の好ましい遺伝子治療ベクターは一般にウイルスベクターであると考えられる。
【０１２３】
外来性遺伝物質を受容しうるある種のウイルスは、収容しうるヌクレオチドの数および／またはそれらが感染させる細胞の範囲に関しては制約があるものの、これらのウイルスは遺伝子発現を首尾良く行わせることが示されている。しかし、アデノウイルスはその遺伝物質を宿主ゲノムに組み入れることがなく、および／またはこのために遺伝子発現のために宿主複製を必要としないことから、迅速で効率的な異種遺伝子の発現のためには理想的に適している。複製能の欠損した感染性ウイルスを調製するための技法は当技術分野で周知である。
【０１２４】
当然ながら、ウイルス送達系の使用においては、ベクター構築物を受け取った細胞、動物および／または個体において望ましくない反応が引き起こされないように、欠陥のある干渉性ウイルス粒子ならびにエンドトキシンおよび他の発熱物質といった望ましくない混入物を実質的に含まないようにビリオンを十分に精製することが望まれると考えられる。好ましい精製手段は、塩化セシウム勾配遠心分離法などの浮遊密度勾配の使用を含む。
【０１２５】
1．アデノウイルスベクター
核酸の送達のためのある特定の方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターはゲノムDNAへの組込み能力が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによって得られる遺伝子導入の効率の高さによって補われる。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（a）構築物のパッケージングを支える、および（b）内部にクローニングされた組織特異的または細胞特異的な構築物を最終的に発現する、のに十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。
【０１２６】
この発現ベクターは、遺伝子組換え型のアデノウイルスを含む。36kbの線状二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスの遺伝子構成は知られているため、アデノウイルスDNAの大部分を最長7kbの外来性配列によって置き換えることが可能である（Grunhaus and Horwitz, 1992）。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスDNAはエピソーム的様式で複製しうるため、宿主細胞のアデノウイルス感染は染色体組込みを引き起こさず、遺伝毒性の恐れがない。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、かつ／または、多くの増幅後にもゲノム再配列が検出されていない。
【０１２７】
アデノウイルスは、ゲノムが中程度のサイズであり、操作が容易で、力価が高く、標的細胞の範囲が広く、および／または感染性が高いため、遺伝子導入ベクターとして用いるのに特に適している。このウイルスゲノムの両端は、ウイルスDNAの複製および／またはパッケージングのために必要なシスエレメントである100〜200塩基対の逆向き反復配列（ITR）を含む。ゲノムの初期（E）および／または後期（L）領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分かれる異なる転写単位を含む。E1領域（E1Aおよび／またはE1B）は、ウイルスゲノムおよび／または少数の細胞遺伝子の転写の調節の原因となるタンパク質をコードする。E2領域（E2Aおよび／またはE2B）の発現は、ウイルスDNAの複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現および／または宿主細胞遮断に関与する（Renan, 1990）。ウイルスキャプシドタンパク質の大半を含む、後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（MLP）によって生じる単一の主要転写物がかなりプロセシングされた後にようやく発現される。MLP（16.8m.u.に位置する）は感染の後期に特に効率的であり、および／または、このプロモーターから生じるmRNAのすべては、それらを翻訳のために好ましいmRNAとする5'-三部分リーダー（TPL）配列を有する。
【０１２８】
現在の1つの方式では、組換えアデノウイルスはシャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えによって作製される。2つのプロウイルスベクター間での組換えの恐れがあるため、この工程によって野生型アデノウイルスが生じる可能性がある。このため、個々のプラークからウイルスの単一のクローンを単離すること、および／またはそのゲノム構造を検討することが不可欠である。
【０１２９】
複製能が欠損している現在のアデノウイルスベクターの作製および／または増殖は、Ad5 DNA断片によってヒト胎児腎臓細胞から形質転換された、E1タンパク質（E1Aおよび／またはE1B；Graham et al., 1977）を構成的に発現する、293と命名された独特なヘルパー細胞株に依存している。E3領域はアデノウイルスゲノムに必須ではないため（Jones and Shenk, 1978）、現在のアデノウイルスベクターは、293細胞の援助の下で、外来性DNAをE1、D3およびその両方の領域に保有する（Graham and Prevec, 1991）。最近、E4領域に欠失を含むアデノウイルスベクターが記載されている（米国特許第5,670,488号。これは参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１３０】
事実上、アデノウイルスは野生型ゲノムの約105％をパッケージングすることができ（Ghosh-Choudhury et al., 1987）、約2kbの余分なDNAの収容能がある。E1および／またはE3領域で約5.5kbのDNAが置換可能なことと合わせて考えると、現在のアデノウイルスベクター最大収容能は7.5kb未満および／またはベクターの全長の約15％である。アデノウイルスウイルスゲノムの80％超がベクター骨格中に残っている。
【０１３１】
ヘルパー細胞株は、ヒト胎児腎臓細胞、筋細胞、造血細胞および他のヒト胎児間葉細胞および上皮細胞などのヒト細胞に由来してもよい。または、ヘルパー細胞が、ヒトアデノウイルスに対して許容性である他の哺乳動物種の細胞に由来してもよい。このような細胞には、例えば、ベロ細胞および他のサル胎児間葉細胞および／または上皮細胞が含まれる。上述したように、好ましいヘルパー細胞株は293である。
【０１３２】
最近、Racherら（1995）は、293細胞の培養および／またはアデノウイルスの増殖のための改良された方法を開示した。1つの方式では、培地100〜200mlを含む1リットルのシリコン表面処理攪拌フラスコ（Techne, Cambridge, UK）に個々の細胞を接種することにより、天然の細胞凝集物を増殖させた。40rpmで攪拌した後に、トリパンブルーを用いて細胞の生存度を評価した。もう1つの方式では、Fibra-Celマイクロキャリア（Bibby Sterlin, Stone, UK）（5g／l）を以下の通りに用いている。培地5ml中に再懸濁させた細胞接種物を250mlエルレンマイヤーフラスコ中の担体（50ml）に加えるか、および／または静置したままとし、1〜4時間にわたり時折攪拌する。続いて培地を新たな培地50mlと交換する、および／または振盪を開始する。ウイルス産生に関しては、細胞を集密度約80％まで増殖させ、その時点の後に培地を交換する（最終容積の25％まで）、および／またはアデノウイルスを0.05のMOIで添加する。培養物を一晩静置し、その後に容積を100％に増加させる、および／または振盪を開始してさらに72時間行う。
【０１３３】
アデノウイルスベクターが複製能欠損性であり、少なくとも条件的欠損性であるという要求条件以外のアデノウイルスベクターの性質が、本発明が首尾良く実施されるために不可欠であるとは考えられない。アデノウイルスは、公知である42種類の血清型およびサブグループA〜Fの任意のものであってよい。アデノウイルス5型サブグループCが、本発明に用いるための条件的複製能欠損アデノウイルスベクターを入手する目的には好ましい出発材料である。これは、アデノウイルス5型については、大量の生化学および遺伝学的な情報が公知であり、アデノウイルスをベクターとして用いるほとんどの構築物に歴史的に用いられてきたヒトアデノウイルスであるためである。
【０１３４】
上述したように、本発明による典型的なベクターは複製能欠損性であり、アデノウイルスE1領域を有しないと考えられる。このため、E1コード配列が除去された位置に形質転換用構築物を導入することが最も好都合であると考えられる。しかし、アデノウイルス配列の内部における構築物の挿入位置は本発明にとって特に重要ではない。関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、Karlssonら（1986）によって記載されたようにE3置換ベクター中の欠失したE3領域の代わりに挿入すること、およびヘルパー細胞株およびヘルパーウイルスがE4欠損を補完する箇所であるE4領域に挿入することもできる。
【０１３５】
アデノウイルスの増殖および／または操作は当業者に公知であり、ならびに／またはインビトロおよびインビボで幅広い宿主範囲を示す。このウイルスの群は高い力価、例えば1ml当たり109〜1011プラーク形成単位で入手することができ、それらは感染性が高い。アデノウイルスのライフサイクルは宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来性遺伝子はエピソーム性であり、このため、宿主細胞に対する遺伝毒性が低い。野生型アデノウイルスを用いたワクチン接種の研究では副作用は報告されておらず（Couch et al., 1963；Top et al., 1971）、このことはインビボ遺伝子導入ベクターとしてのそれらの安全性および／または治療能力を示している。
【０１３６】
アデノウイルスベクターは真核生物遺伝子発現（Levrero et al., 1991；Gomez-Foix et al., 1992）およびワクチン開発（Grunhaus and Horwitz, 1992；Graham and Prevec, 1992）に用いられている。最近、動物試験により、組換えアデノウイルスを遺伝子治療に用いうる可能性が示唆されている（Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991a；Stratford-Perricaudet et al., 1991b；Rich et al., 1993）。組換えアデノウイルスを種々の組織に投与している試験には、気管内点滴（Rosenfeld et al., 1991；Rosenfeld et al., 1992）、筋肉内注射（Ragot et al., 1993）、末梢静脈内注射（Herz and Gerard, 1993）および／または脳内への定位的接種（Le Gal La Salle et al., 1993）が含まれる。組換えアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（以下を参照）はいずれも、非分裂性のヒト初代細胞に感染させ、形質導入を行うことができる。
【０１３７】
2．AAVベクター
アデノ随伴ウイルス（AAV）は、組込み頻度が高い上に非分裂性細胞を感染させることが可能であり、そのため例えば組織培養下（Muzyczka, 1992）またはインビボの哺乳動物細胞への遺伝子の送達に有用であることから、本発明に用いるのに魅力のあるベクター系である。AAVが感染性を有する宿主の範囲は広い（Tratschin et al., 1984；Laughlin et al., 1986；Lebkowski et al., 1988；McLaughlin et al., 1988）。rAAVベクターの作製および使用に関する詳細は、米国特許第5,139,941号および／または米国特許第4,797,368号に記載されており、これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる。
【０１３８】
遺伝子送達におけるAAVの使用を示した研究には、LaFace et al.（1988）；Zhou et al.（1993）；Flotte et al.（1993）；およびWalsh et al.（1994）が含まれる。組換えAAVベクターは、マーカー遺伝子（Kaplitt et al., 1994；Lebkowski et al., 1988；Samulski et al., 1989；Yoder et al., 1994；Zhou et al., 1994；Hermonat and Muzyczka, 1984；Tratschin et al., 1985；McLaughlin et al., 1988）およびヒト疾患に関与する遺伝子（Flotte et al., 1992；Luo et al., 1994；Ohi et al., 1990；Walsh et al., 1994；Wei et al., 1994）のインビトロおよび／またはインビボでの形質導入のために首尾良く用いられている。最近、AAVベクターは、嚢胞性線維症の治療のための第I相ヒト臨床試験に対して承認された。
【０１３９】
AAVは、培養細胞における増殖性感染を起こすために別のウイルス（アデノウイルスおよびヘルペスウイルス科のメンバーのいずれか）との同時感染が必要という点で依存性パルボウイルスである（Muzyczka, 1992）。ヘルパーウイルスとの同時感染がなければ、野生型AAVゲノムはその両端を介してヒト第19番染色体に組み込まれ、そこでプロウイルスとして潜在的状態にある（Kotin et al., 1990；Samulski et al., 1991）。しかし、AAV Repタンパク質も同時に発現されていなければ、rAAVの組込みは第19番染色体には制限されない（Shelling and Smith, 1994）。AAVプロウイルスを有する細胞がヘルパーウイルスに多重感染した場合には、AAVゲノムは染色体および組換えプラスミドから「救出される」、および／または正常な増殖性感染が成立する（Samulski et al., 1989；McLaughlin et al., 1988；Kotin et al., 1990；Muzyczka, 1992）。
【０１４０】
典型的には、組換えAAV（rAAV）ウイルスは、2つのAAV末端反復配列に挟まれた関心対象の遺伝子を含むプラスミド（McLaughlin et al., 1988；Samulski et al., 1989；それぞれ参照として本明細書に組み入れられる）および／または末端反復配列を伴わずに野生型AAVコード配列を含む発現プラスミド、例えばpIM45（McCarty et al., 1991；これは参照として本明細書に組み入れられる）を同時感染させることによって作製される。AAVヘルパー機能のために必要なアデノウイルス遺伝子を有するアデノウイルスおよびプラスミドによる細胞の感染およびトランスフェクションも行われる。このような様式で作製されたrAAVウイルス株にはアデノウイルスが混入しており、それらはrAAV粒子から物理的に分離されなければならない（例えば、塩化セシウム密度勾配遠心法により）。または、AAVコード領域を含むアデノウイルスベクター、ならびにAAVコード性領域およびアデノウイルスヘルパー遺伝子の一部およびすべてを含む細胞株を用いることも可能と考えられる（Yang et al., 1994；Clark et al., 1995）。組み込まれたプロウイルスとしてrAAV DNAを有する細胞株を用いることもできる（Flotte et al., 1995）。
【０１４１】
3．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、自らの遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、多量の外来遺伝物質を運び、広範囲の種および細胞種を感染させるとともに、特殊な細胞系にパッケージングされる能力があるため、遺伝子送達ベクターとして有望である（Miller, 1992）。
【０１４２】
レトロウイルスは、感染細胞において逆転写のプロセスによってそのRNAを二本鎖DNAに変換する能力を特徴とする一本鎖RNAウイルスの一群である（Coffin, 1990）。続いて、その結果生じたDNAは細胞染色体にプロウイルスとして安定的に組み込まれる、および／またはウイルスタンパク質の合成を導く。組込みはレシピエント細胞および／またはその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持をもたらす。レトロウイルスゲノムは、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をそれぞれコードする、gag、polおよび／またはenvという3つの遺伝子を含む。gag遺伝子の上流に認められる配列は、ビリオンへのゲノムのパッケージングのためのシグナルを含む。ウイルスゲノムの5'末端および3'末端には2つの長い末端反復（LTR）配列が存在する。これらは強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組込みのためにも必要である（Coffin, 1990）。
【０１４３】
レトロウイルスベクターを構築するためには、関心対象の遺伝子をコードする核酸をウイルスゲノム中の特定のウイルス配列の位置に挿入して、複製能が欠損したウイルスを作製する。ビリオンを作製するためには、gag遺伝子、pol遺伝子およびenv遺伝子を含むがLTRおよびパッケージング成分は含まないパッケージング細胞系を構築する（Mann et al., 1983）。cDNAをレトロウイルスLTRおよびパッケージング配列とともに含む組換えプラスミドをこの細胞系に導入すると（例えば、リン酸カルシウム沈殿により）、パッケージング配列が組換えプラスミドのRNA転写物をウイルス粒子内にパッケージングし、それが続いて培地中に分泌される（Nicolas and Rubenstein, 1988；Temin, 1986；Mann et al., 1983）。続いて、組換えレトロウイルスを含む培地を収集し、任意で濃縮した上で、遺伝子導入のために用いる。レトロウイルスベクターは幅広いさまざまな細胞種を感染させることができる。しかし、組込みおよび安定的な発現には宿主細胞の分裂が必要である（Paskind et al., 1975）。
【０１４４】
欠損性レトロウイルスベクターの使用に伴う懸念は、パッケージング細胞中に野生型の複製能のあるウイルスが出現する恐れがあることである。これは、組換えウイルスによる元の配列が、宿主細胞ゲノム中に組み込まれたgag、poi、env配列の上流に挿入されるという組換え事象によって起こりうる。しかし、組換えの確率が大きく低下すると考えられる新たなパッケージング細胞株が現在は利用可能である（Markowitz et al., 1988；Hersdorffer et al., 1990）。
【０１４５】
第二世代のレトロウイルスベクターを用いる遺伝子送達が報告されている。Kasaharaら（1994）は、通常はマウス細胞しか感染させないモロニーマウス白血病ウイルスの組換え型を作製し、ウイルスがエリスロポエチン（EPO）受容体を保有するヒト細胞と特異的に結合してそれを感染させるようにエンベロープタンパク質を改変した。これは、新たな結合特異性を有するキメラタンパク質を作り出すためにEPO配列の一部分をエンベロープタンパク質に挿入することによって実現された。
【０１４６】
4．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターを、本発明における発現構築物として用いることもできる。ワクシニアウイルス（Ridgeway, 1988；Baichwal and Sugden, 1986；Coupar et al., 1988）、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターを用いることができる。それらは種々の哺乳動物細胞に魅力のある特徴をいくつか与える（Friedmann, 1989；Ridgeway, 1988；Baichwal and Sugden, 1986；Coupar et al., 1988；Horwich et al., 1990）。
【０１４７】
欠損性B型肝炎ウイルスが最近認められたことにより、さまざまなウイルス配列の構造-機能関連について新たな見通しが得られた。インビトロ試験により、このウイルスは、そのゲノムの最大80％の欠失にもかかわらず、ヘルパー依存的なパッケージングおよび逆転写の能力を保ちうることが示された（Horwich et al., 1990）。これにより、ゲノムの多くの部分を外来性遺伝物質に置き換えうることが示唆された。Changらは最近、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子を、アヒルB型肝炎ウイルスゲノム中のポリメラーゼ、表面および／またはプレ表面のコード配列に代わって導入した。それは野生型ウイルスとともにトリ肝癌細胞株に共トランスフェクトされた。高力価の組換えウイルスを含む培地が、初代子ガモ肝細胞を感染させるために用いられた。安定なCAT遺伝子の発現がトランスフェクション後少なくとも24日間にわたって検出された（Chang et al., 1991）。
【０１４８】
いくつかのさらなる態様において、遺伝子治療ベクターはHSVであると考えられる。HSVを魅力的なベクターとしている要因は、ゲノムのサイズおよび構成である。HSVは大型であるため、多数の遺伝子および発現カセットの組入れが、より小型の他のウイルス系よりも問題となりにくい。加えて、性能の異なる（時間的、強度など）種々のウイルス制御配列を利用することができ、そのため他の系よりも大きな程度で発現を制御することが可能である。また、このウイルスがスプライシングされるメッセージを比較的少数しか有しないことも利点であり、これは遺伝子操作をさらに容易にする。HSVは比較的操作しやすく、および／または高い力価となるまで増殖させることができる。したがって、送達は、十分なMOIを達成するのに必要な数量の点でも反復投与の必要性が少ないという点でもそれほど問題とならない。
【０１４９】
5．改変ウイルス
本発明のさらに別の態様において、送達しようとする核酸を、特異的結合リガンドを発現するように操作された感染性ウイルス内に収容することもできる。このため、ウイルス粒子は標的細胞の同族受容体と特異的に結合し、その内容物を細胞に送達すると考えられる。ウイルスエンベロープに対するラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づく、レトロウイルスベクターの特異的ターゲティングを可能にするように設計された新規なアプローチが開発された。この修飾により、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的感染が可能になる。
【０１５０】
レトロウイルスエンベロープタンパク質および／または特異的細胞受容体に対するビオチン化抗体を用いる、組換えレトロウイルスのターゲティングのためのもう1つのアプローチも開発されている。抗体はストレプトアビジンを用いることにより、ビオチン成分と結合された（Roux et al., 1989）。主要組織適合性複合体クラスI抗原およびクラスII抗原に対する抗体を用いて、著者らは、そのような表面抗原を有するさまざまなヒト細胞が同種指向性ウイルスにインビトロで感染することを示している（Roux et al., 1989）。
【０１５１】
B．DNA送達のその他の方法
本発明のさまざまな態様において、DNAは発現構築物として細胞に送達される。遺伝子構築物の発現を生じさせるためには、発現構築物は細胞内に送達されなければならない。本明細書に記載した通り、好ましい送達の機構はウイルス感染を介したものであり、この場合には発現構築物は感染性ウイルス粒子の内部に封入される。しかし、発現構築物の細胞内への移入のためのいくつかの非ウイルス的方法も本発明では想定している。本発明の1つの態様において、発現構築物が裸の組換えDNAおよび／またはプラスミドのみからなってもよい。構築物の移入は、細胞膜を物理的および／または化学的に透過化する、言及した方法の任意のものによって行うことができる。これらの技法のいくつかは、以下に考察するように、インビボおよび／またはエクスビボでの使用のために首尾良く適合化することができる。
【０１５２】
C．リポソームを介したトランスフェクション
本発明のさらにもう1つの態様では、発現構築物をリポソーム中に封入することができる。リポソームはリン脂質二分子膜および／または内部の水性媒質を特徴とする小胞状構造である。多重層リポソームは水性媒質によって隔てられた多数の脂質層を有する。それらはリン脂質を水溶液の範囲を超えて懸濁化すると自発的に形成される。脂質成分は自己再配列し、その後に閉鎖構造の形成、および／または脂質二分子層の間への水および／または溶解した溶質の封入が起こる（Ghosh and Bachhawat, 1991）。リポフェクタミン（Gibco BRL）と複合体を形成させた核酸も想定している。
【０１５３】
インビトロでのリポソームを介した核酸送達および外来性DNAの発現は非常に成功している（Nicolau and Sene, 1982；Fraley et al., 1979；Nicolau et al., 1987）。Wongら（1980）は、リポソームを介した外来性DNAの送達および／または発現を培養ニワトリ胚、HeLa細胞および肝癌細胞で実施しうることを示した。
【０１５４】
本発明のいくつかの特定の態様において、リポソームを血球凝集ウイルス（HVJ）と複合体化することもできる。これにより、リポソームに封入したDNAの細胞膜との融合が助長されること、および／または細胞への進入が促進されることが示されている（Kaneda et al., 1989）。また別の態様において、リポソームを核内非ヒストン性染色体タンパク質（HMG-1）と複合体化すること、および／または併せて用いることもできる（Kato et al., 1991）。さらに別の態様において、リポソームをHVJおよびHMG-1の両方と複合体化すること、および／または併せて用いることもできる。また別の態様において、送達媒体はリガンドおよびリポソームを含みうる。細菌プロモーターをDNA構築物中に用いる場合には、リポソームの内部に適切な細菌ポリメラーゼを含めることも望ましいと考えられる。
【０１５５】
本発明者らは、neu抑制遺伝子産物を、リポソームを介した遺伝子導入を用いて細胞内に導入しうると考えている。このような構築物をリポソームと組み合わせ、Nabel et al.（1990）によって記載されたように、カテーテルを介して直接導入することが提唱されている。これらの方法を採用することにより、静脈内注射を介して到達可能な肝細胞および脾細胞にとどまらず、neu抑制遺伝子産物をインビボの特異的部位で効率的に発現させることができる。したがって、本発明はDNA／リポソーム複合体として製剤化されたneu抑制遺伝子産物をコードするDNA構築物の組成物、およびこのような構築物を用いる方法も包含する。
【０１５６】
米国特許第5,641,484号に記載されているように、リポソームはHER2／neuを介した癌の治療に特によく適している。
【０１５７】
動物細胞に対するBikの効率的なトランスフェクション試薬である陽イオン性リポソームは、Gao et al.（1991）の方法を用いて調製することができる。Gaoらは、一段階で合成することができる新規な陽イオン性コレステロール誘導体を記載している。この脂質で作製されたリポソームは、試薬リポフェクチンを用いて作られたものよりもトランスフェクションの効率が高く、処置組織に対する毒性が低いことが報告されている。これらの脂質は、DC-Chol(「3□(N(N'N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイルコレステロール」）およびDOPE（「ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン」）の混合物である。これらのリポソームの作製における工程は以下の通りである。
【０１５８】
DC-Cholは、クロロギ酸コレステリルおよびN,N-ジメチルエチレンジアミンによる単純な反応によって合成される。クロロギ酸コレステリルの溶液（2.25g、5mlの無水クロロホルム中で5mmol）を、過剰量のN,N-ジメチルエチレンジアミン（2ml、3ml無水クロロホルム中で18.2mmol）に、0℃で滴下により添加する。蒸発による溶媒の除去後に、4℃の無水エタノール中での再結晶化によって残留物を精製して真空下で乾燥させる。収穫物はDC-Cholの白色粉末である。
【０１５９】
陽イオン性リポソームは、1.2μmolのDC-Cholおよび8.0μmolのDOPEをクロロホルム中で混合することによって調製される。続いてこの混合物を乾燥させ、真空乾燥させた上で、試験管内で1mlステロール 20mM Hepes緩衝液（pH 7.8）中に再懸濁させる。4℃で24時間水和させた後に、分散液を超音波処理器で5〜10分超音波処理して平均直径150〜200nmのリポソームを形成させる。
【０１６０】
リポソーム／DNA複合体を調製するために、本発明者らは以下の工程を用いる。トランスフェクトさせようとするDNAを、DMEM／F12培地中に、50μlのDMEM／F12に対して15μg DNAという比で入れる。続いて、DMEM／F12を用いてDC-Chol／DOPEリポソーム混合物を希釈し、100μlのリポソームに対して50μlのDMEZM／F12という比にする。続いて、DNA希釈物およびリポソーム希釈物を穏やかに混合し、37℃で10分間インキュベートする。インキュベーション後に、DNA／リポソーム複合体を直ちに注射に用いることができる。
【０１６１】
リポソームトランスフェクションは、例えば、ホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルセリン（PS）、コレステロール（Chol）、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、および／または3β-[N-(N'N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイルコレステロール（DC-Chol）、ならびに当業者に公知の他の脂質で構成されたリポソームを介したものでありうる。当業者は、本発明に有用と考えられる種々のリポソームトランスフェクション法があることを認識していると考えられる。これらの技法の中には、Nicolau et al., 1987、Nabel et al., 1990およびGao et al., 1991に記載されたものがある。1つの具体的な態様において、リポソームはDC-Cholを含む。より具体的には、本発明者らのリポソームは、好ましい態様の項に記載された様式で、Gao et al.（1991）の教示に従って調製されたDC-CholおよびDOPEを含む。本発明者らはまた、Vical, Inc.（San Diego, Calif.）からLipofectin（商標）という商標の下で市販されているものなどの、DOTMAで構成されたリポソームの有用性も予測している。
【０１６２】
リポソームは、トランスフェクトしようとする細胞と、種々の方法によって接触させることができる。細胞培養物では、リポソーム-DNA複合体を単純に細胞培養物の溶液中に分散させることができる。インビボでの適用のためには、リポソーム-DNA複合体を注入することが典型的である。静脈内注射は、DNA複合体の、例えば肝臓および脾臓へのリポソームを介した移入を可能にする。静脈内注射によっては到達不能な細胞内へのDNAのトランスフェクションを可能にするためには、リポソーム-DNA複合体を動物の体内の特定の場所に直接注入することが可能である。例えば、Nabelらは、動脈壁内へのカテーテルを介した注入を教示している。もう1つの例として、本発明者らはマウスへの遺伝子導入を行うために腹腔内注射を用いている。
【０１６３】
本発明はまた、リポソーム複合体を含む組成物も想定している。このリポソーム複合体は、脂質成分、および変異型のBikをコードする核酸をコードするDNAセグメントを含むと考えられる。リポソーム複合体中に用いられる変異型Bikをコードする核酸は、例えば、Bik-T145AまたはBik-T145Dをコードするものでありうる。
【０１６４】
リポソーム複合体を作製するために用いられる脂質は、以上に論じた脂質の任意のものでありうる。特に、DOTMA、DOPE、および／またはDC-Cholがリポソーム複合体のすべてまたは一部をなしてもよい。本発明者らは、DC-Cholを含む複合体を用いて著しい成果を上げている。1つの好ましい態様において、脂質はDC-CholおよびDOPEを含むと考えられる。DC-CholとDOPEとの任意の比に有用性があることが予想されるが、DC-Chol：DOPEの比を1：20〜20：1の間で含むものが特に有益であると予想される。本発明者らは、約1：10〜約1：5というDC-Chol：DOPEの比で調製されたリポソームが有用であることを見いだしている。
【０１６５】
1つの具体的な態様においては、Bik遺伝子構築物を受け取る細胞に不要なDNAを導入しないように、細胞の核でのBikの残留性を高めるために必要な最小領域が用いられる。制限酵素の使用といった当業者に周知の技法により、Bikの小領域の作製が可能になると考えられる。これらの領域がneuを阻害する能力は、実施例の項で報告したアッセイによって容易に判定することができる。
【０１６６】
本発明のいくつかの特定の態様において、リポソームを血球凝集ウイルス（HVJ）と複合体化させることもできる。これは細胞膜との融合を容易にし、リポソームに封入されたDNAの細胞内進入を促進することが示されている（Kaneda et al., 1989）。また別の態様において、リポソームを核内非ヒストン染色体タンパク質（HMG-1）と複合体化させること、またはそれとともに用いることもできる（Kato et al., 1991）。さらに別の態様において、リポソームをHVJおよびHMG-1の両方と複合体化させること、またはそれらとともに用いることもできる。このような発現構築物はインビトロおよびインビボでの核酸の移入および発現に用いられて奏功しているため、それらは本発明に対して適用可能である。細菌プロモーターをDNA構築物中に用いる場合には、リポソームの内部に適切な細菌ポリメラーゼを含めることも望ましいと考えられる。
【０１６７】
D．電気穿孔法
本発明のいくつかの特定の態様において、発現構築物は電気穿孔法によって細胞に導入される。電気穿孔法は、細胞および／またはDNAの懸濁液を高電圧放電に曝露させることを含む。
【０１６８】
電気穿孔法を用いた真核細胞のトランスフェクションは大いに成功している。この様式で、マウスのプレBリンパ球に対してヒトκ-免疫グロブリン遺伝子がトランスフェクトされており（Potter et al., 1984）、ラット肝細胞に対してクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子がトランスフェクトされている（Tur-Kaspa et al., 1986）。
【０１６９】
E．リン酸カルシウムおよび／またはDEAE-デキストラン
本発明の他の態様では、リン酸カルシウム沈殿を用いて細胞に発現構築物を導入する。この技法を用いて、ヒトKB細胞に対してアデノウイルス5 DNAがトランスフェクトされている（Graham and Van Der Eb, 1973）。同じくこの様式で、マウスL（A9）細胞、マウスC127細胞、CHO細胞、CV-1細胞、BHK細胞、NIH3T3細胞およびHeLa細胞に対してネオマイシンマーカー遺伝子がトランスフェクトされており（Chen and Okayama, 1987）、ラット肝細胞に対して種々のマーカー遺伝子がトランスフェクトされている（Rippe et al., 1990）。
【０１７０】
もう1つの態様において、DEAEデキストランを用いた後にポリエチレングリコールを用いることにより、発現構築物は細胞内に送達される。この様式で、レポータープラスミドがマウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入されている（Gopal, 1985）。
【０１７１】
F．微粒子銃法
裸のDNA発現構築物を細胞に移入するための本発明のもう1つの態様は、微粒子銃法を含みうる。この方法は、DNAをコーティングした微粒子を高速に加速し、細胞を死滅させずに細胞膜を貫通させ、および／または細胞内に入れることが可能なことに依拠している（Klein et al., 1987）。微粒子を加速するための装置はいくつか開発されている。このような装置の一つは、高電圧放電によって電流を発生させ、それを原動力とすることに依拠している（Yang et al., 1990）。用いられる微粒子は、タングステンおよび／または金のビーズといった生物的に不活性な物質からなる。
【０１７２】
G．直接的な微量注入および／または超音波ローディング
本発明のさらなる態様には、直接的な微量注入および／または超音波ローディングによる発現構築物の導入が含まれる。直接的な微量注入は、アフリカツメガエル卵母細胞に核酸構築物を導入するために用いられており（Harland and Weintraub, 1985）、および／またはLTK-線維芽細胞に超音波ローディングによってチミジンキナーゼ遺伝子がトランスフェクトされている（Fechheimer et al., 1987）。
【０１７３】
H．アデノウイルス補助によるトランスフェクション
本発明のいくつかの特定の態様において、発現構築物はアデノウイルス補助によるトランスフェクションを用いて細胞に導入される。アデノウイルスと組み合わせたシステムを用いて、細胞系におけるトランスフェクション効率の上昇が報告されている（Kelleher and Vos, 1994；Cotten et al, 1992；Curiel, 1994）。
【０１７４】
V．併用療法
本発明のプロモーターを含む構築物によってコードされる治療用遺伝子産物の有効性を高めるためには、これらの組成物を、過剰増殖性疾患の治療に有効な、抗癌薬などの他の薬剤と組み合わせることが望ましいと考えられる。「抗癌」薬は、例えば、癌細胞を死滅させること、癌細胞におけるアポトーシスを誘導すること、癌細胞の増殖速度を低下させること、転移の発生率および数を減少させること、腫瘍サイズを縮小させること、腫瘍増殖を抑制すること、腫瘍もしくは癌細胞の血液性供給を減少させること、癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進すること、癌の進行を防止または阻止すること、または癌を有する対象の寿命を延長させることにより、対象における癌に負の影響を及ぼすことができる。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞を死滅させるかその増殖を抑制するのに有効な併用量として提供されると考えられる。この工程は、細胞を発現構築物および薬剤または多数の因子と同時に接触させる段階を含みうる。これは、細胞を単一の組成物もしくは両方の薬剤を含む薬理学的配合物と接触させることにより、または細胞を、一方の組成物が発現構築物を含み、もう一方が第2の薬剤を含むという2つの異なる組成物もしくは配合物と同時に接触させることによって実現しうる。
【０１７５】
本発明の方法および組成物を用いた治療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、外科手術、ホルモン療法、または他のアポトーシス促進因子もしくは細胞周期調節因子を用いる別の遺伝子治療と組み合わせて用いることができる。本発明のプロモーターを用いる遺伝子治療および／または本発明の組成物および方法に加えての遺伝子治療には、細胞増殖の誘導因子；細胞増殖の誘導因子に対するアンチセンス配列；細胞増殖の阻害因子、例えばp53、p16、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1／PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27／pl6融合物、Bik／p27融合物、抗血栓性遺伝子（例えば、COX-1、TFPI）、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、血管新生に関与する遺伝子（例えば、VEGF、FGF、トロンボスポンジン、BAI-1、GDAIFまたはそれらの受容体）またはMCCなど；および／またはプログラム細胞死の調節因子、例えばBcl-2機能と拮抗し、細胞死を促進するものなど（例えば、Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri）を利用しうる。
【０１７６】
VI．医薬製剤
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤中に溶解または分散された形で、治療用遺伝子産物の発現を調節する本発明の制御配列を含む構築物の有効量、および1つの特定の態様においては1つまたは複数の付加的な作用因子を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、例えばヒトなどの動物に対して適切に投与した場合に、有害な、アレルギー性の、またはその他の不都合な反応を生じさせない、分子的実体および組成物のことを指す。治療用ポリヌクレオチドの発現を調節する本発明の制御配列およびいくつかの態様においては1つまたは複数の付加的な有効成分を含む薬学的組成物の調製は本開示に鑑みて当業者には周知であると考えられ、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第18版、Mack Printing Company, 1990に例示されている（これは参照として本明細書に組み入れられる）。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与の場合、製剤が、FDA Office of Biological Standardsで要求されているような、無菌性、発熱性、一般的安全性および純度に関する基準を満たす必要があることも理解されるであろう。
【０１７７】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」には、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化物質、保存料（例えば、抗菌薬、抗真菌薬）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存料、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、添加剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、着香料、色素などの物質ならびにそれらの組み合わせが含まれ、これらは当業者に周知であると考えられる（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第18版、Mack Printing Company, 1990, pp.1289-1329を参照されたい。これは参照として本明細書に組み入れられる）。従来の担体が有効成分と適合しない場合を除き、治療的または薬学的な組成物におけるその使用を想定している。1つの具体的な態様において、変異型Bik組成物はリポソーム中にある状態で投与される。
【０１７８】
組織特異的制御配列を含む治療用構築物は、それが固体、液体またはエアロゾルのうちいずれの形態で投与されるか、およびそれが注射などの投与経路にとって無菌状態である必要があるか否かに応じて、さまざまな種類の担体を含みうる。本発明は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸腔内、気管内、鼻内、硝子体内、腟内、直腸内、局所外用性、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜性、心膜内、臍帯内、眼内、経口性、局所外用性、局所性、エアロゾル使用、注射、注入、持続注入、標的細胞への直接的な局所潅流により、カテーテルにより、洗浄液により、クリーム剤中に、脂質組成物（例えば、リポソーム）中に、または他の方法もしくは以上の任意の組み合わせによって投与することができ、これは当業者に周知であると考えられる（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第18版、Mack Printing Company, 1990を参照されたい。これは参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１７９】
動物、患者に対して投与される本発明の組成物の実際の投与量は、体重、疾患の重症度、治療しようとする疾患の種類、過去または現在の治療的介入、患者の特発性疾患、および投与の経路などの身体的および生理的な要因によって決定しうる。投与を担当する医師は、いかなる場合にも、組成物中の有効成分の濃度および個々の対象に対する適切な投与量を決定すると考えられる。
【０１８０】
いくつかの特定の態様において、薬学的組成物は例えば、有効化合物を少なくとも約0.1％含みうる。また別の態様において、有効化合物は単位体の重量の約2％〜約75％、または例えば約25％〜約60％、およびそれらから導き出せる任意の範囲を構成しうる。別の非制限的な例において、1回の投与当たりの用量が、約1μg／kg／体重、約5μg／kg／体重、約10μg／kg／体重、約50μg／kg／体重、約100μg／kg／体重、約200μg／kg／体重、約350μg／kg／体重、約500μg／kg／体重、約1mg／kg／体重、約5mg／kg／体重、約10mg／kg／体重、約50mg／kg／体重、約100mg／kg／体重、約200mg／kg／体重、約350mg／kg／体重、約500mg／kg／体重、約1000mg／kg／体重またはそれ以上、およびそれらから導き出せる任意の範囲であってもよい。本明細書に列挙した数から導き出せる範囲の非制限的な例として、約5mg／kg／体重〜約100mg／kg／体重、約5μg／kg／体重〜約500mg／kg／体重などの範囲を、上記の数値に基づいて投与することができる。
【０１８１】
いかなる場合にも、組成物は、1つまたは複数の成分の酸化を遅らせるために種々の抗酸化物質を含みうる。さらに、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組み合わせを非制限的に含む、種々の抗菌薬および抗真菌薬などの保存料により、微生物の作用を防止することもできる。
【０１８２】
治療用構築物は、組成物中に遊離塩基、中性形態または塩の形態として配合することができる。薬学的に許容される塩には、タンパク質組成物の遊離アミノ基と形成されたものなどの酸付加塩、または塩酸もしくはリン酸などの無機酸、もしくは酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸などの有機酸と形成されたものが含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムもしくは水酸化鉄(III)などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインなどの有機塩基から生じるものでもよい。
【０１８３】
組成物が液体形態にある態様において、担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびそれらの組み合わせを非制限的に含む溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、レシチンなどのコーティング剤の使用により；液体ポリオールまたは脂質などの担体中への分散による必要な粒径の維持により；ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用により；またはこのような方法の組み合わせにより、維持することができる。多くの場合には、例えば糖、塩化ナトリウムまたはそれらの組み合わせなどの等張化剤を含めることが好ましいと考えられる。
【０１８４】
また別の態様において、点眼薬、点鼻液または点鼻スプレー、エアロゾルまたは吸入薬を本発明に用いることもできる。このような組成物は一般に標的組織型に対する適合性があるように設計される。非制限的な一例において、点鼻液は通常、小滴または噴霧薬として鼻腔内に投与するように設計された水性溶液である。点鼻液は、正常な線毛作用が維持されるように、多くの点で鼻汁分泌と類似するように調製される。すなわち、好ましい態様において、点鼻液は通常、等張性である、またはpHが約5.5〜約6.5に維持されるようにやや緩衝化される。さらに、眼用製剤に用いるものと同様の抗菌性保存料、薬物または適切な薬物安定化剤を、必要に応じて製剤中に組み入れることもできる。例えば、さまざまな市販の鼻用製剤が知られており、これには抗生物質または抗ヒスタミン薬などの薬物が含まれる。
【０１８５】
いくつかの特定の態様において、Bik変異体は、経口摂取などの経路による投与のために調製される。これらの態様において、固体組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤（例えば、硬ゼラチンカプセル剤または軟ゼラチンカプセル剤）、徐放性製剤、口腔内投与用組成物、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラート剤またはそれらの組み合わせを含みうる。経口投与用組成物を食事用の食品に直接組み入れることもできる。経口投与用の好ましい担体には、不活性希釈剤、吸収性の可食担体またはそれらの組み合わせが含まれうる。本発明のその他の面において、経口用組成物をシロップ剤またはエリキシル剤として調製することもできる。シロップ剤またはエリキシル剤は、例えば、少なくとも1つの有効物質、甘味剤、保存料、着香料、色素、保存料またはそれらの組み合わせを含みうる。
【０１８６】
いくつかの特定の好ましい態様において、経口投与用組成物は、1つまたは複数の結合剤、添加剤、崩壊剤、潤滑剤、着香料およびそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、組成物は以下のうち1つまたは複数を含みうる：結合剤、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチンまたはそれらの組み合わせ；添加剤、例えば、第二リン酸カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムといったもの、またはそれらの組み合わせ；崩壊剤、例えば、コーンスターチ、バレイショデンプン、アルギン酸またはそれらの組み合わせ；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；甘味剤、例えば、スクロース、ラクトース、サッカリンまたはそれらの組み合わせ；着香料、例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリーの風味物質、オレンジの風味物質など；または以上のものの組み合わせ。投薬単位剤形がカプセルである場合には、それは上記の種類の物質に加えて、液体担体などの担体を含みうる。種々の他の材料が、コーティング剤として、または別の様式で投薬単位の物理的形態を変化させるために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤をセラック、糖またはその両方でコーティングすることができる。
【０１８７】
その他の投与様式に適したほかの製剤には坐薬が含まれる。坐薬はさまざまな重量および形状の固体投与剤形であり、通常は薬用として、直腸、膣または尿道に挿入される。挿入後に坐薬は体腔液中に軟化、融解または溶解する。一般に、坐薬用の従来の担体には、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、坐薬は、例えば、有効成分を約0.5％〜約10％の範囲、好ましくは約1％〜約2％の範囲で含む混合物から構成されうる。
【０１８８】
滅菌注射液は、遺伝子改変細胞および／または有効化合物の必要量を、上に挙げた種々の他の成分（必要に応じて）とともに適切な溶媒中に組み入れた後に濾過滅菌を行うことによって調製される。一般に、分散液は、滅菌した種々の有効成分を、基本的な分散媒および／または他の成分を含む滅菌媒体中に組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液または乳濁液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分の粉末のほかに所望の付加的な成分があらかじめ滅菌濾過した液体媒質から得られる、真空乾燥法および凍結乾燥法である。液体媒質は、必要であれば適した緩衝化を行うべきであり、液体希釈剤は十分な食塩水またはグルコースとともに注入する前にまず等張化しておく。高度に濃縮された直接注入用の製剤も想定しており、この場合には極めて急速な浸透を行わせて小さな領域に高濃度の有効物質を送達するために、DMSOを溶媒として用いることが考えられる。
【０１８９】
組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定である上に、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存されなければならない。エンドトキシンによる汚染は、安全なレベルに最小限に、例えば、0.5ng／mgタンパク質未満に保たれる必要がある。
【０１９０】
特定の態様においては、組成物中に吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはそれらの組み合わせを用いることにより、注射用組成物の持続的な吸収を行わせることができる。
【０１９１】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含められる。当業者には、以下の実施例に開示される技法が、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって見いだされた技法であって、このためその実施のための好ましい態様を構成することが理解されるはずである。しかし、当業者は、本開示に鑑みて、開示された特定の態様に多くの変更を加えることができ、それでもなお本発明の精神および範囲を逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることも理解するはずである。
【０１９２】
実施例1
乳癌組織特異的な発現
化学療法（CT）および放射線療法などの現在の乳癌（BC）治療法は、腫瘍細胞に対する選択性が低く、正常組織に対する副作用がある。副作用を最小限に抑えるために、これらの治療法は一般に間欠的な様式で行われ、これによって正常細胞を治療サイクルの間に回復させる。しかし、回復期間中に、一部の生き残った癌細胞は遺伝子変異のために治療に対する耐性が強くなる。その結果、癌の再発または進行が起こる恐れがある。腫瘍を標的とする遺伝子治療は、腫瘍特異的なシグナル伝達経路に対して作用することにより、治療の副作用および耐性発生のリスクを最小限に抑える。本発明においては、例示的な治療用ポリヌクレオチドである変異型Bikの、乳癌を標的とする遺伝子治療のために乳癌特異的プロモーターが用いられる。
【０１９３】
乳癌の腫瘍発生および進行には一連の遺伝的変化が伴う。腫瘍で特異的に活性化される遺伝子は、治療の優れた標的である。第一段階として、本発明者らはcDNAマイクロアレイおよびSAGEによる公開データを収集して吟味し、表1に示したように、乳癌細胞で特異的にアップレギュレートされる6種の遺伝子を同定した。
【０１９４】
（表１）乳癌細胞で特異的にアップレギュレートされる遺伝子
2007535315.tif 000003
T／N、腫瘍細胞と正常細胞との遺伝子発現の比。PCI、予後相関指数。PCIが負の値であることは予後が悪いことを表す。負のPCIの最大値は-0.4である。
【０１９５】
それらのうち、トランスフェリン受容体（TR）、B-Myb、セルロプラスミンおよびトポイソメラーゼIIα（トポIIα）のプロモーターをルシフェラーゼレポーターベクター中にクローニングし、正常細胞株および癌細胞株によるレポーターアッセイを用いて検討した。トポIIαプロモーターおよびTRプロモーターが、正常乳房上皮184A1細胞と対比して乳癌細胞における活性が最も高かった。このため、本発明者らは、これらの2種のプロモーターにおける乳癌特異的シスエレメントに関してさらに追求した。
【０１９６】
トポIIαはDNAのトポロジー的変化を触媒し、複製、転写および染色体分離の際に生じるその張力を放出させる。これはまた、アントラサイクリン系薬剤（例えば、エトポシドおよびドキソルビシン）などのいくつかの抗癌薬の標的でもある。多くの研究により、トポIIαレベルは癌細胞のアントラサイクリン系薬剤に対する感受性と相関することが示されている。さらに、トポIIαは乳癌、脳腫瘍、肝癌などの予後マーカーとしては劣る。トポIIα発現の調節は厳密に細胞周期依存的である：そのmRNAレベルおよびプロモーター活性はGO／G1期には極めて低く、S期後期に上昇しはじめ、G2／M期にピークに達する。トポIIαは、5つの逆CCAATボックス（ICB）および2つのGCボックスを含む、TATAを伴わないプロモーターである。これは熱ショック、細胞周期段階およびp53によって調節される。NF-Y（CBFとしても公知）は、プロモーター中のICBと結合し、細胞周期におけるトポIIα転写のために必要である。以上を総合すると、これはトポIIαプロモーターが発癌シグナル伝達に応答することを示しており、いくつかの態様において、ICB部位およびそれらの結合因子はそのBC特異的活性に極めて重要な役割を果たしうると考えられる。
【０１９７】
本発明の1つの態様においては、トランスフェリン受容体が本発明のための複合プロモーター中に利用される。TRは鉄が結合したトランスフェリンと相互作用する膜受容体であり、細胞膜を介する鉄の輸送を促進する。TR mRNAレベルが高いことは、乳癌細胞の分化度の低さ、浸潤性の高さおよび増殖指数の高さと相関する。インビトロ試験により、TR mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが正常乳房細胞に影響を及ぼさずにヒト乳癌細胞の増殖を特異的に抑制しうることが示されており、このことはTRが乳癌発生に決定的な役割を果たすことを示している。mRNA安定性の調節が正常細胞におけるTR発現の主要な決定因子ではあるものの、多くの研究により、TR転写が増殖中の細胞で、およびいくつかの発癌シグナルによって高度に活性化されることが判明している。TRプロモーターのコア領域はTATAボックス、GCボックス、AP-1／CRE部位、および低酸素に応答するHREを含む。増殖、低酸素、鉄不足および分化のようなシグナルは、TRプロモーターのこのセグメントを活性化することができる。
【０１９８】
以下に示すように、本発明者らは、これらの例示的な乳癌特異的CT90およびCTR116プロモーターを、変異型Bikポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとともに、特定の態様においてはリポソーム中に含まれる状態で用いた。例示的なCT90作動性BikDD治療用ベクター（CT90-BikDD）は、インビトロでBC細胞を選択的に死滅させ、マウスモデルでは乳房腫瘍異種移植片の増殖を抑制した。以上を総合して、これらの結果から、CT90およびCTR116が、乳癌を標的とする遺伝子治療において変異型Bik遺伝子の発現を制御するために有用な、有効で強力な乳癌特異的プロモーターであることが示された。
【０１９９】
トポIIαプロモーター中のコアBC特異的セグメントの同定
乳癌特異性のために必要なシスエレメントを含む1つまたは複数のセグメントを同定するために、本発明者らは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、一連のトポIIαプロモーター欠失変異体を作製した。それぞれの変異型は1つから5つまでの範囲の異なる数のICB部位を含み、それをルシフェラーゼ発現ベクター中にサブクローニングした；続いて、これらのレポーター構築物を種々の細胞株に一過性にトランスフェクトし、それらのプロモーター活性をルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて調べた。580-bp（全長と呼ぶ）プロモーターは、すべての欠失変異体のうち最も活性が高く、乳癌細胞でほとんど活性化されていた（図1）。しかし、転写開始部位から90塩基対の範囲に及び、最初のICB部位を含む最も短いプロモーターセグメントは、最小限プロモーター活性を有し、依然として乳癌特異性を保っていた（図2）。この結果から、この90-bpセグメントがコア乳癌特異的エレメントを構成することが示された。
【０２００】
CMVエンハンサー配列によるトポIIαプロモーター活性の増強
すべてのトポIIαプロモーター欠失変異体の活性が、CMVプロモーター活性の10％未満という低さであった。臨床応用のためプロモーター活性を高めるために、本発明者らは、pCDNA3.1プラスミドからPCRによって例示的なCMVエンハンサー配列を入手し、それを全長および90-bpのトポIIαプロモーター欠失変異体の上流に直接連結した上で、それをルシフェラーゼレポーターベクター中にサブクローニングした。2種の例示的な複合プロモーターをそれぞれCT572およびCT90と称した。元のプロモーター欠失変異体と比べて、CT572およびCT90の活性は劇的に高まり、CMVプロモーターと同等となったが、依然としてその乳癌特異性は保っていた（図3）。CT90プロモーターはCT572よりもはるかに活性が高く、いくつかの細胞株ではCMVプロモーターとほぼ同じ強さであった（図3）。このため、CT90をインビボ検査に用いた。乳癌MDA-MB-231細胞をヌードマウスの乳房脂肪体に接種した。接種から4週後に、実験群の各マウスに50μgのリポソーム複合体化CT90-ルシフェラーゼベクターを尾静脈からの静脈内注射によって送達し、対照群のマウスにはCMVルシフェラーゼベクターを投与した。注射から48時間後にマウスを犠牲にし、腫瘍、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓および筋肉におけるプロモーター活性をルシフェラーゼアッセイによって調べた（図4）。腫瘍ではCT90の方がCMVプロモーターよりも活性が高かった。しかし、正常組織では、CT90の活性がCMVプロモーターよりもはるかに低かった。このことから、CT90プロモーターがインビボでBC特異的活性を有することが示された。
【０２０１】
CT90-BikDDの抗腫瘍効果
乳癌を標的とする遺伝子治療におけるCT90の特性を明らかにするために、CT90がBikDD発現を生じさせる治療用構築物を作製した（以後はこれをCT90-BikDDと呼ぶ）。この構築物をルシフェラーゼレポーターベクターとともに乳癌細胞株MDA-MB-231および468ならびに正常乳房上皮細胞株184A1に共トランスフェクトし、続いて細胞死滅効果をルシフェラーゼ生存度アッセイによって判定した。CMVプロモーター作動性BikDDベクター（CMV-BikDD）および空ベクターをそれぞれ陽性対照および陰性対照として用いた。CMV-BikDDは3種の細胞株のすべてをほぼ等しい程度で死滅させたが、CT90-BikDDは乳癌細胞を選好的に死滅させ（図5）、このことからCT90-BikDDの死滅効果が乳癌細胞に対して選択的であることが示された。このため、CT90は乳癌を標的とする遺伝子治療に有用である。
【０２０２】
次に、この乳癌を標的とする遺伝子治療の抗腫瘍効果をインビボで調べた。乳癌MDA-MB-231細胞を乳房脂肪体に接種してから1週後に、ヌードマウスに対して、リポソーム複合体化CT90-BikDD（治療群）、CMV-BikDD（陽性対照）およびCMV-PGL3（偽処置）または非処置対照としてのデキストロース緩衝液D5Wを週1回投与した。各マウスに15μgのリポソーム複合体化DNA構築物を週1回静脈内注射し、腫瘍サイズを定期的に測定した。CT90-BikDD群はCMV-BikDDまたはCMV-PGL3と比較してより優れた腫瘍抑制効果を示した（図6）。
【０２０３】
トランスフェリン受容体プロモーター中のコア乳癌特異的セグメントの同定
乳癌特異性のために必要なシスエレメントを含むセグメントを同定するために、一連のTRプロモーター欠失変異体（転写開始部位に対して1412-、1123-および193-bp上流）をPCRによって作製し、ルシフェラーゼ発現ベクター中にサブクローニングした。続いて、これらのレポーター構築物を上記の通りの種々の細胞株に一過性にトランスフェクトし、それらのプロモーター活性をルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて調べた。193-bpセグメント（転写開始部位に対して187bp上流）がインビトロで最も活性および乳癌特異性が高かった（図7）。
【０２０４】
CMVエンハンサー配列によるTRコアプロモーター活性の増強
コア乳癌特異的プロモーターの範囲を絞り込むために、TRプロモーターの193-bpセグメントの5'末端をさらに転写開始部位の116-bp上流で除去し、CT90に関して上述したようにCMVエンハンサー配列と連結した。本明細書では以後CTR116と呼ぶこの複合プロモーターをルシフェラーゼレポーターベクター中にサブクローニングし、細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクション後に細胞を正常酸素条件または低酸素条件（94％N2、5％CO2、1％O2を20時間）で処理し、CTR116のプロモーター活性をルシフェラーゼアッセイにより決定した。元の欠失変異体プロモーターと比べて、CTR116の活性は明らかに上昇したが、その乳癌特異性は保っていた。さらに、その活性を低酸素処理でさらに誘導してCMVプロモーターと同等にすることができる（図8）。これは、TRプロモーターの少なくとも一部が乳癌特異性を有し、CMVプロモーターエンハンサーが低酸素誘導と干渉することなくその活性を高めうることを初めて示したものである。
【０２０５】
本発明のさらなる態様においては、乳癌特異的な発現活性を保っているさらに小さなセグメントを同定するために、各々のCT90およびCTR116エレメントをさらに絞り込む。例えば、これらの各々の領域から欠失構築物を作製し、乳癌組織における発現を導く能力を維持しているより小さなセグメントを同定するためにそれらの組織特異性を調べることもできる。
【０２０６】
CT90プロモーターはCMVプロモーターからのものと同等なレベルでBikDDの発現を生じさせる
強力な活性を有し、全身性遺伝子治療に広く用いられているCMVプロモーターと同程度のレベルで遺伝子発現を誘導することに関するCT90プロモーターの活性の特性をさらに明らかにするために、CT90-BikDDまたはCMV-BikDD構築物を電気穿孔法によってMCF-7乳癌細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後に細胞を収集し、ウエスタンブロットのために溶解させた。図14に示されているように、CT90プロモーターからのBikDDタンパク質の発現レベルはCMVプロモーターからのものよりもやや高かった。この結果は、CT90プロモーターが乳癌細胞で強い活性を有することを示している。
【０２０７】
CT90-BikDDリポプレックスは同所性マウスモデルにおける乳房腫瘍増殖を選択的に抑制し、生存期間を延長させた
全身性に送達されたリポソーム複合体化CT90-BikDD（CT90-BikDDリポプレックス）がインビボで選択的なBikDD発現を導きうるか否かを明らかにするために、MDA-MB-231細胞（図15A）またはMDA-MB-468細胞（図15B）を雌性ヌードマウスの乳腺脂肪体に接種して乳房腫瘍を形成させた。続いて、各投与群のマウスを8匹として、腫瘍を有するマウスに対して、リポソームにより送達されるCT90-BikDD、CMV-BikDD、pGL3ベクター（偽処置）または非処置物（D5W）の投与を行った。対応する投与群のマウスに種々のDNA構築物のリポプレックスを週1回静脈内注射した。CT90-BikDD投与群およびCMV-BikDD投与群における腫瘍増殖は、偽処置群（pGL3）および非処置群（D5W）の両方の結果と比較して有意に抑制された（T検定でp＜0.05）（図15Aおよび15B）。図15に示されているように、CT90-BikDD群、CMV-BikDD群、pGL3群およびD5W群におけるマウスの平均生存期間は、それぞれ25.25±1.83週、23.25±1.74週、17.5±1.3週および16.25±0.98週であった。CT90-BikDD投与およびCMV-BikDD投与はいずれも、非処置群（D5W）または偽処置群（pGL3）と比較して、MDA-MB-231異種移植片を有するマウスに対して有意な生存上の便益を生じさせ、このことはCT90-BikDDがCMV-BikDDと同等な治療効果をもたらすことを示している（図16、下の図）。
【０２０８】
CT90-BikDDは抗腫瘍活性を有し、および正常組織における副作用は最小限である
本発明者らは続いて、CT90-lucおよびCMV-lucのインビボでの差異のある発現プロファイルが、CT90-BikDDおよびCMV-BikDDによっても反映されうるか否かをさらに調べた。この問題を取り扱うために、腫瘍および心臓におけるBikDD mRNAの発現をインサイチューハイブリダイゼーションによって検討した（図17）。CMV-BikDD処置マウスの心臓組織全体にわたる濃褐色の染色から、CMVプロモーターによるBikDDの発現レベルが極めて高いことが示された（図17A、左上図）。これに対して、CT90-BikDD投与は心臓組織において相対的に弱いBikDD発現を誘導した（図17A、右上図）。CT90-BikDD群およびCMV-BikDD群からの腫瘍標本の間に密度および発現レベルに関して有意差を検出することはできなかった（図17B）。センスBikDDを用いた陰性対照ではこれらの実験において褐色染色は認められず（図17Aおよび17B、下図）、このことはアンチセンス群における陽性シグナルがBikDD発現によって生じたことを示している。これらのデータは、全身性に投与されたCT90-BikDDリポプレックスが、乳房腫瘍において選択的なBikDD発現を導きうることを示している。重要なこととして、心臓などの正常臓器におけるBikDDの発現はCT90-BikDD処置マウスの方がCMV-BikDD処置マウスよりもはるかに低い。したがって、CMV-BikDDと比較してCT90-BikDDは同等な抗腫瘍活性を有し、正常組織でその発現によって誘導される副作用は最小限のものであると考えられる。
【０２０９】
ICB1は乳癌細胞で特異的にCdk2／サイクリンAによるトポIIαプロモーターの活性化を媒介する
乳癌細胞におけるトポIIαプロモーターの基礎活性を高めるために、1つの具体的な態様では、強力なエンハンサーをそれに結合させる。しかし、ある特定の局面では、トポIIαプロモーター中の一部の調節エレメントによる干渉の恐れがあるため、強力なエンハンサーを付加しても高い基礎活性が得られない可能性があり、乳癌特異性さえ失う可能性がある（以下図26参照）。乳癌細胞において特異性および高い基礎活性の両者を有するTSPを開発するために、本発明者らは、最小限の乳癌特異的エレメントをエンハンサーと結び付けるとより良い成果が得られる可能性があると推論した。このため、本発明者らはトポIIαプロモーター中の乳癌特異的エレメントの同定に着手した。この目的のために、本発明者らはまず、トポIIαプロモーターを活性化するための乳癌特異的シグナルについて調べ、続いてこのシグナル伝達を媒介するシスエレメントを探索した。トポIIα発現はS期にアップレギュレートされ、G2／M期にピークに達する（Woessner et al., 1991）。必須な細胞周期調節因子Cdk2はS期およびG2期に活性化されるため（Vermeulen et al., 2003）、本発明者らはトポIIαプロモーター活性がCdk2によってアップレギュレートされうるか否かについて探求した。この目的のために、トポIIαプロモーター活性に対するcdk2の調節性を、ドミナントネガティブCdk2変異体（Cdk2-dn）（van den Heuvel & Harlow, 1993）およびトポIIαプロモーターレポーター構築物を共トランスフェクトすることにより、レポーターアッセイで検討した。Cdk2-dnは、3種類の異なる乳癌細胞ではトポIIαプロモーター活性を抑制したが、正常乳房上皮細胞（184A1）、肺癌細胞（A549）および非悪性肝細胞（Chang肝細胞）（Castagnetta et al., 2003）では抑制しなかった（図25A）。Cdk2はG1後期およびS期にそれぞれサイクリンEおよびサイクリンAと会合するため、本発明者らはどちらがトポIIαプロモーターを活性化しうるかを調べた。サイクリンAの発現は乳癌細胞におけるトポIIαプロモーターの活性化を有意に誘導したが、他の細胞種ではそうではなかった（図25B）。これに対して、サイクリンEは乳癌細胞でトポIIαプロモーターに対して極めて弱い効果しか有しなかった（データ非提示）。これらのデータは、サイクリンA／Cdk2が乳癌特異的な様式でトポIIαプロモーターを活性化することを示唆している。
【０２１０】
以上の結果から判断して、トポIIαプロモーター中のサイクリンA／Cdk2応答性エレメントは乳癌特異的エレメントである可能性がある。このエレメントを同定するために、本発明者らは、3つ、1つおよび0個のICBをそれぞれ含む-182、-90、-60を含む、トポIIαプロモーターの一連の欠失変異体を作製した（図25C）（Adachi et al., 2000；Falck et al., 1999；Hochhauser et al., 1992）。サイクリンA活性化に対するそれらの応答を乳癌細胞株SK-BR3で調べた（図25D、左図）。サイクリンAは、全長プロモーターのほか、少なくとも1つのICBを有する、その-182および-90欠失変異体も活性化しうるが（図2Dの左図中の-572、-182および-90、p＜0.05）、ICBを欠く-60欠失変異体を活性化することはできない（図2Dの左図中の-60）。同様の結果が、これらの実験を他の2種類の乳癌細胞株MDA-MB-468およびMDA-MB-231で行った場合にも得られており（データ非提示）、このことはICBがサイクリンAシグナルを媒介するために重要と考えられることを示している。この点は、全長トポIIαプロモーター中のICB1の変異（図2C、一番下のもの）が、サイクリンAに対する応答のより大きな低下をもたらしたことからも裏づけられ（図2E、右図）、このことはトポIIαプロモーター中のICB1はサイクリンA／cdk2活性化に対する完全な応答のために必要であり、最小限の乳癌特異的エレメントと考えられることを示唆している。
【０２１１】
トポIIαプロモーターの乳癌特異性の媒介におけるICB1の役割を検証するために、ICB部位を1つしか含まないことから-90欠失変異体の活性を一群の細胞株で調べた。全長プロモーターと同様に、-90プロモーター活性はほとんどの乳癌細胞株で他の型の細胞よりも高く（図25E、上図）、このことはそれが乳癌特異性を保っていることを示している。しかし、-90プロモーターとCMVプロモーターとの活性比（-90／CMV）からは、同じく乳癌細胞における基礎活性の低さが示された（＜0.5％、図25Eの下図）。-90プロモーターでは他のほとんどの調節エレメントが除去されているため、乳癌でより高い基礎活性を有し、特異性を保っているものに組換え操作することが容易と思われる。
【０２１２】
CMVプロモーターのエンハンサー配列により増強されたCT90プロモーター、-90トポIIαプロモーターは、インビトロおよびインビボで乳癌細胞においてより強い特異的活性を有する
乳癌細胞における基礎活性を高めるために、本発明者らは、CMVプロモーターのエンハンサー配列（CMVエンハンサー）（Xu et al., 2001）を3種類のICB保有プロモーター：全長トポIIαプロモーター、ならびに、その-182および-90欠失変異体と連結した。これらの複合プロモーターをそれぞれCT572、CT182およびCT90と命名した（図26A）。興味深いことに、これらの複合プロモーターのうちCT90が、正常184A1細胞に比して乳癌細胞で最も高い活性を有する（図26B、レポーター活性は対数尺度で示されている）。さらに、乳癌細胞におけるCT90の活性はCMVプロモーターと同等である（図26C）。CT572およびCT182は乳癌細胞に対する特異性がCT90よりも低く（図26B）、それらの活性は極めて限定的な程度でしか増強せず（図26C）、このことはトポIIαプロモーター中のICB1以外のいくつかのエレメントがCMVエンハンサー活性と干渉する可能性を示唆している。
【０２１３】
CT90が全身性リポソーム遺伝子治療のために十分な特異性および活性を有するか否かを検証するために、本発明者らはさらにインビボでのその活性を調べた。CT90プロモーターまたはCMVプロモーター（それぞれCT90-lucおよびCMV-luc）によって作動するルシフェラーゼ構築物をDOTAP：Cholリポソームと複合体化させた上で、MDA-MB-231乳癌異種移植片を有するマウスに静脈内注射した。正常組織および腫瘍組織におけるプロモーター活性をレポーターアッセイにより決定した（図26Dの上図）。前述したように、陽イオン性リポソーム-DNA複合体を静脈内注射によって動物に投与すると、肺および心臓がリポソームの実質的な部分を取り込み、これらの2つの臓器でより高い遺伝子発現レベルが生じると考えられる（Barron, 1999；Li et al., 1998；Lu et al., 2002；Templeton et al., 1997）。同じように、CMV-lucからのレポーター活性の生体内分布も同様のパターンを示した：すなわち肺が最も高く、心臓および肝臓は2番目および3番目で、他のすべての組織はそれよりも低かった（図26D、上図）。このことはCMV-lucからのレポーター活性が本発明者らの動物モデルにおけるリポソームの遺伝子送達効率に相当することを示している。インビボでのCT90の特異性を評価するために、CT90とCMVプロモーターとの活性比（図26Dの下図におけるCT90／CMV）を算出することにより、種々の組織におけるリポソーム取込み効率を標準化した（Barron, 1999；Li et al., 1998；Lu et al., 2002；Templeton et al., 1997）。標準化されたCT90活性は腫瘍では高かったが、正常臓器でははるかに低く、特に主なリポソーム捕捉臓器である心臓、肺および肝臓でそうであった（図26D）。CMV-lucおよびCT90-lucの活性の同様の生体内分布はMDA-MB-468乳癌異種移植片を有する別のマウスでも観察された（データ非提示）。もう1つのリポソームであるSN（Li et al., 2003；Zou et al., 2002）をDNA構築物の送達に用いたところ、CT90はそれでも同様の腫瘍特異性を示した（データ非提示）。脾臓、腎臓および筋肉に対するリポソーム送達効率は肺、心臓および肝臓に対するそれよりもはるかに低いことを述べておく必要がある。このため、これらの実験では、後者3つの臓器における送達された遺伝子の発現は極めて低く、プロモーター活性の比較においては無視しうると思われる。遺伝子送達効率による影響を除外するためには、CMV-lucまたはCT90-lucをDOTAP：Cholリポソームにより、腫瘍内注射を用いてMDA-MB-231腫瘍保有マウスに送達する。CT90プロモーターによるルシフェラーゼ活性は、CMVプロモーターによるものよりも依然として腫瘍では高く、肺または心臓では低く（図26E）、このことはCT90がインビボでの腫瘍特異的プロモーターであることを示している。興味深いことに、インビボでのCT90の乳癌特異性および活性はインビトロのものよりも高い（図26Cおよび26D）。インビボのリポソーム送達がインビトロ送達と比べてプロモーター特異性を高めるというこのような現象は、他の研究でも観察されている（Lu et al., 2002）。これらの結果から、CT90が、遺伝子治療の状況における乳癌ターゲティングのために適したより強力な乳癌特異的プロモーターであることが示された。
【０２１４】
実施例2
膵癌特異的な発現
本発明者らは、変異型Bikポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を制御するために、膵癌特異的プロモーター配列を利用した。この目標に向けた例示的な方法および組成物を本実施例に記載する。
【０２１５】
細胞株
ヒト膵癌細胞株（PANC-1、CAPAN-1およびAsPC-1）、前立腺癌細胞株（LNCaPおよびPC-3）、不死化正常肺線維芽細胞（WI-38）および乳腺上皮（184A1）細胞は、American Type Culture Collection（ATCC, Rockville, MD）から入手した。不死化ヒト膵臓細胞E6E7は、Dr. Paul Chiao（University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Houston, TX）に寄贈いただいた。Chang肝細胞および卵巣癌細胞株SKOV3.ip1も用いた。PANC-1、CAPAN-1、AsPC-1、WI-38およびSKOV3.ip1およびChang肝細胞は、10％ウシ胎仔血清（FBS）、ペニシリン（100単位／ml）およびストレプトマイシン（100mg／ml）を加えたDMEM／F12培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）中で培養した。LNCaP細胞およびPC-3細胞は、10％（FBS）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えたRPMI 1640培地（Invitrogen）中で維持した。184A1細胞は完全乳腺上皮増殖培地（MEGM）（Cambrex, Walkerswille, MD）中で維持し、E6E7細胞は上皮増殖因子、下垂体エキスを加えたケラチノサイト-SFM（Invitrogen）において維持した。
【０２１６】
構築物
CCKARプロモーター（-726〜+1；プライマーCCKAR-p1およびCCKAR-p2）、uPARプロモーター（-812〜+1；プライマーuPAR-p1およびuPAR-p2）、RDC-1プロモーター（-881〜+1；プライマーRDC-p1およびRDC-p2）、CTRB1プロモーター（-946〜+1；プライマーCTRB1-p1およびCTRB1-p2）およびCPA1プロモーター（-1010〜+108；CPA1-p1およびCPA1-p2）は、表2に示したプライマーを用いたPANC-1ゲノムDNAのPCR増幅によって入手した。
【０２１７】
（表２）膵癌特異的プロモーターである可能性がある配列
2007535315.tif 000004
【０２１８】
これらのPCR断片をpCRII-TOPO（Invitrogen）中にサブクローニングして、pCRII-TOPO-CCKAR、pCRII-TOPO-uPAR、pCRII-TOPO-RDC1およびpCRII-TOPO-CTRBを作製した。PCR産物はすべてシークエンシングによって検証した。続いてプロモーター断片をpGL-3basic（Promega, Madison, WI）のKpnI／XhoI部位に挿入して、プラスミドpGL3-CCKAR-Luc、pGL3-uPAR-Luc、pGL3-RDC1-LucおよびpGL3-CTRB1-Lucを得た。CMVエンハンサー／プロモーターにより制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子プラスミドpCMV-Luc（CMVプロモーターをpGL-3ベクター中にクローニングしたものから構成される）。ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むプラスミドpRL-TKはPromegaから入手した。
【０２１９】
WPREエンハンサーの断片を、Asp718／SalI消化によってpGEM-3Z-WPRE（Dr. J. B Uney, University of Bristol, Bristol, UKより寄贈）から遊離させ、平滑末端連結によってpGL3-basicのSmalI部位に挿入して中間体pGL3-Luc-WPREを作製した。プラスミドpGL3-basicをXbaIで消化し、Klenowで平滑末端化して、中間体pGL3-LucWPREの平滑末端化したAsp718／SalI WPRE断片とアニーリングさせてpGL3-Luc-WPREを得た。pCRII-TOPO-CCKARのSpeI／XhoI平滑末端化CCKAR断片を、pGL3-Luc-WPREの平滑末端化NheI／XhoI部位中にサブクローニングし、pGL3-CCKAR-Luc-WPREを生じさせた。pCRII-TOPO-CCKARのHindIII／NotI平滑末端化CCKAR断片を、pGL3-TSTA-Luc（Dr. M. Carey, UCLA School of Medicine, LAより寄贈）（Zhang L, et al, Cancer Res2003）のMscI／NheI平滑末端化部位中にサブクローニングし、pGL3-CCKAR-TSTA-Luc-WPREを得た。最後に、NotI／BglIIで消化したpCRII-TOPO-CCKARのCCKAR断片をpGL3-CCKAR-TSTA-Luc-WPREの同一部位に挿入し、pGL3-CCKAR-TSTA-Luc-WPRE（pGL3-CTP-Luc）を作製した。
【０２２０】
トランスフェクション
トランスフェクションの16時間前に、細胞を12ウェルプレート中の上記の対応する培地中に集密度40〜50％で播き、37℃、5％CO2とした。細胞に対して、指定のプラスミドDNAを内部対照としてのpRL-TKとともに、DOTAP：Cholリポソーム（N. Templeton, Baylor College of Medicine, Houston, TXによる）を用い、推奨された方法に従ってトランスフェクトした。非発現性ベクターpGL3-basicを陰性対照として用いた。転写調節エレメントの活性を互いに比較するために、同じモル量のプラスミドDNAを用いた。
【０２２１】
膵癌の同所性動物モデルおよび全身性プラスミドDNA送達
6〜8週齡の無胸腺雌性BALB／c nu／nuマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）を異種移植片宿主として用いた。マウスはM.D. Anderson Cancer Centerの規則に準拠した特殊な無菌環境で飼育した。対数増殖期にあるAsPC-1細胞をトリプシン処理し、PBSで2回洗浄した。同所性モデルに関しては、マウスをAventin（Sigma）で麻酔し（Xie, Mol. Endocrinl 2004）、仰臥位に置いた。腹部を70％エタノールで清拭し、腹部中線上部に切開を加えた。膵臓を露出させ、その尾部にAsPC-1細胞の50μlアリコート（1×106個）を注入した。切開部を創傷クリップで閉鎖した。
【０２２２】
プラスミドDNA：リポソーム複合体は、以前の記載の通りに調製した（Templeton, Nat Biotech 1997）。手短に述べると、DNAおよびDOTOP：Chol保存液を別々に室温の5％デキストロース水溶液（D5W）中に希釈した。DNA溶液を等容積のリポソーム溶液の表面に急速に添加し、ピペッティングにより2回上下させて混合した。調製物は注射2時間前に新たに作製した。異所性モデルで腫瘍が約50mm3に達したヌードマウス、または同所性モデルで同じ時期のものに対して、50μgのDNAを含む100μlのDNA：リポソーム複合体を、29ゲージ針を用いて1日1回、3日連続して尾静脈に注入した。マウスのインビボでの画像化を注射後毎日行い、最後の注射から24時間後に犠牲にした。
【０２２３】
ルシフェラーゼアッセイ
一過性にトランスフェクトした細胞を溶解させ、TD 20／20ルミノメーター（Turner Designs, Sunnyvale, CA）を用い、Dual-Luciferase（登録商標）レポーターアッセイシステム（Promega, Madison, WI）を製造元のプロトコールに従って用いることにより、ルシフェラーゼ活性に関してアッセイした。2種のルシフェラーゼの比は、被験プラスミドのホタルルシフェラーゼ活性をpRL-TKのウミシイタケルシフェラーゼ活性で除したものと定義され、少なくとも4回繰り返した、3連のトランスフェクションの平均として表される。CMV活性の比と比較して、パーセンテージを提示した。
【０２２４】
組織由来のルシフェラーゼ活性をアッセイするためには、動物を安楽死させて解剖した。腫瘍ならびに膵臓、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、脳、腸、筋肉および卵巣などを含む他の臓器からの組織標本を切離し、1／100希釈したプロテインインヒビター混合物（Roche）を含む300μlのルシフェラーゼ溶解バッファー（Promega）中にて、PRO 250ホモジナイザー（Pro Scientific, Inc., Monore, CT）によりホモジナイズした。標本を8,000rpmで5分間遠心し、氷上に一時的に置いた。上清のルシフェラーゼ活性をLumat LB9507ルミノメーター（Berthod, Bad Wildbad, Germany）で測定し、界面活性剤適合性（DC）タンパク質アッセイシステム（Bio-Rad, Hercules, CA）をMRXマイクロプレートリーダー（Dynex technologies, Inc., Chantilly, VA）とともに用いてタンパク質濃度を決定した。発光の結果はタンパク質1ミリグラム当たりの相対光度単位（RLU）として報告される。
【０２２５】
生物発光データの画像化および定量
マウスをAventinで麻酔した。D-ルシフェリン（Xenogen, Alemeda, CA）（30mg／ml、PBS中）を150mg／kgマウス体重として腹腔内注射した。D-ルシフェリン注射から10分後に、遮光標本チャンバー（暗箱）上に装着した冷却CCDカメラ、カメラ制御装置、カメラ冷却システムおよびWindowsベースのコンピュータシステムからなるIVISTM Imaging System（Xenogen）を用いてマウスの画像化を行った。画像化パラメーターは比較分析用に保った。グレースケール反射画像および生物発光カラー画像を重ね合わせ、Living Imagingソフトウエアバージョン2.11（Xenogen）を用いて分析した。関心対象の領域（ROI）は、該当するシグナル強度領域上に手動で選択した。ROIの領域は一定に保ち、強度はROI内部の最大フォトン数として記録した（Xie et al., 2004）。いくつかの実験では、画像化の後に動物を安楽死させ、関心対象の臓器を摘出し、生物発光を伴わない黒い紙の上に並べて、30分以内にエクスビボ画像を記録した。
【０２２６】
図9Aは、膵臓特異的プロモーターの構築物を図示している。ヒトコレシストキニンA受容体（CCKAR）、オーファンGタンパク質共役型受容体（RDC1）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（uPAR）およびキモトリプシノーゲンB1（CTRB1）のプロモーター配列をPCR増幅して、レポータープラスミドpGL3-basis中にサブクローニングし、それによってホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現を調節した。細胞に対して、同程度のモル量のプラスミドDNAを内部対照pRL-TKとともに一過性に共トランスフェクトした。図9Bに示されているように、48時間後に2種のルシフェラーゼの比を測定し、ウミシイタケルシフェラーゼに対して標準化したRLU（倍数）として示した。
【０２２７】
所望のポリヌクレオチドの膵癌特異的発現
図10Aは、最小限CCKARプロモーター（WPREを伴うもの、もしくは伴わないもの）またはCCKAR／TSTA（WPREを伴うもの、もしくは伴わないもの）の制御下にある、またはCMVエンハンサー／プロモーターの制御下にあるホタル・ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む、CCKARを基にした、およびCMVを基にした構築物の概略図を図示している。Gal4VP2：VP2：重複HSV1 VP16前初期トランスアクチベータードメインは、GAL4 DNA結合ドメインと融合させた場合に高い活性化能を有する。G5E4T配列（SEQ ID NO：22）に関して、G5は、コンセンサスDNA結合部位の近傍に17bp GAL4 DNA結合部位の5つの縦列コピーを含む。E4Tは、開始部位を基準として-38〜+38までのアデノウイルスE4最小限プロモーターを含むE4TATAである。図10BはAsPC-1およびPANC-1膵癌細胞に一過性にトランスフェクトした構築物の活性を示している。細胞に対して、同程度のモル量のプラスミドDNAを内部対照pRL-TKとともに一過性に共トランスフェクトした。48時間後に、2種のルシフェラーゼの比を測定し、続いてCMV活性と比較してパーセンテージとして提示した。データは、4回の独立した実験の平均を表している；バー、SD。図10Cは、CCKARを基にしたプロモーター複合物の組織特異性を示している。他の癌細胞（LNCaP、PC-3、SKOV3.ip1、MDA-468）および不死化正常細胞（Chang肝細胞、WI-38、184A1およびE6E7細胞）に対して、内部対照pRL-TKを一過性に共トランスフェクトした。48時間後に2種のルシフェラーゼの比を測定し、AsPC-1における活性の比と比較してパーセンテージを提示した。
【０２２８】
CTP-LucおよびCMV-LucプラスミドDNAの全身送達後のAsPC細胞の同所性腫瘍モデルにおけるインビボでの導入遺伝子発現を図11に示している。図11Aは、マウスのインビボ画像を示している。皮下AsPC-1腫瘍を有するヌードマウスの尾静脈に、DNA（CTP-LucまたはCMV-Luc）：リポソーム複合体の形態にある50μgのDNAを1日1回、3日連続して注入した。最後の注射から24時間後にマウスを麻酔し、D-ルシフェリンの腹腔内注射から10分後にIVIS（商標）画像化システムを用いて5分間にわたり画像化した。マウスの代表的な画像が示されている。図11Bは、ルミノメーターを用いて定量して全タンパク質1mg当たりの相対ルシフェラーゼ単位として表した、組織抽出物におけるホタルルシフェラーゼ活性を示している。比は、CTPマウスのルシフェラーゼ活性のレベルをCMVマウスと比較することによって算出した。
【０２２９】
図18は、ヒトコレシストキニンA型受容体（CCKAR）プロモーターが膵癌特異的である可能性を示している。図18Aには、膵癌特異的プロモーターの候補となる構築物が示される。CCKAR、オーファンGタンパク質共役型受容体（RDC1）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（uPAR）およびキモトリプシノーゲンB1（CTRB1）をポリメラーゼ連鎖反応で増幅し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を作動させるレポータープラスミドpGL3basic中にサブクローニングした。図18Bでは、PANC-1細胞およびAsPC-1細胞に対して指定のプラスミドDNAおよびpRL-TKを一過性に共トランスフェクトした。48時間後に2種のルシフェラーゼの比を測定し、ウミシイタケルシフェラーゼ対照に対して標準化した相対光度単位（RLU）として示した。
【０２３０】
図19は、分子組換えコレシストキニンA型受容体（CCKAR）を基にしたプロモーターがさらに活性が高く、膵癌特異性を保っていることを示している。図19Aには、pGL3-CCKAR-Luc-WPRE（CCKAR-P-Luc）、pGL3-CCKAR-TSTA-Luc（CCKAR-T-Luc）およびpGL3-CCKAR-TSTA-Luc-WPRE（CTP-Luc）を含む、組換えCCKARを基にした構築物の概略図が示される。図19Bには、膵癌細胞におけるCCKARを基にしたプロモーターの活性が示される。AsPC-1、PANC-1およびPanO2細胞に対して、プラスミドDNAおよびpRL-TKを一過性に共トランスフェクトした。48時間後に、2種のルシフェラーゼの比を測定した。CMVプロモーターの活性との相対的なパーセンテージを示している。データは4回の独立した実験の平均を表している。図19Cには、CCKARを基にしたプロモーター複合物の組織特異性が示される。膵癌でない細胞株（LNCaP、PC-3、SKOV3.ip1、MDA-MB-468およびHeLa）および正常かつ不死化の細胞株（WI-38、184A1およびE6E7）に対して、指定のプラスミドおよびpRL-TKを一過性に共トランスフェクトした。48時間後に2種のルシフェラーゼの比を測定した。AsPC-1細胞における活性との相対的なパーセンテージを示している。
【０２３１】
図20は、コレシストキニンA型受容体（CCKAR）-二段階転写活性化（TSTA）-ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）の複合物であるCTPが、同所性動物モデルにおいて活発かつ膵癌特異的であることを示している。同所性AsPC-1腫瘍を有するヌードマウスに対して、50μgのDNAをDNA：リポソーム複合体の状態で尾静脈から連続3日間にわたり1日1回投与した。図20Aには、マウスのインビボ画像が示される。マウスに麻酔を施し、D-ルシフェリンの腹腔内注射から10分後にIVIS画像化システムを用いて5分間にわたり画像化した。図20Bには、ルシフェラーゼ発現の組織分布が示される。示した通りの腫瘍および臓器からの組織標本を切離し、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性に関して測定した。データは全タンパク質1mg当たりの相対ルシフェラーゼ単位として表した。
【０２３２】
図21は、CTPによって生じるBik変異体（BikDD）の発現が、膵癌細胞を効果的かつ特異的に死滅させることを提示している。図20Aには、pUK21骨格中にある発現構築物の概略図が示される。CMV-BikDD、pUK21-CMV-BikDD；CTP-BikDD、pUK21-CTP-BikDD。図20Bには、CMVまたはCTPによって生じたBikDDの死滅効果が提示されている。一群の膵癌細胞（AsPC-1、PANC-l、MDA-Panc28およびPanO2）、不死化ヒト膵臓上皮E6E7細胞に対して、2μgのpUK21（陰性対照）、pUK21-CMV-BikDD（陽性対照）またはpUK21-CTP-BikDDを、100ngのpGL3-CMV-Lucとともに共トランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後に、5ng／mlのD-ルシフェリンとの5分間のインキュベーションに続いて、ルシフェラーゼ活性をIVIS画像化システムを用いて2分間にわたり画像化した。代表的な画像が上側の図に示されている。陰性対照（100％として設定）と比較したシグナルのパーセンテージを算出した（下側の図）。
【０２３３】
本発明の特定の態様において、構築物は、これらの例示的な膵臓特異的プロモーターが変異型Bikをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合したものを含むように同様に作製され、その後に、本明細書に記載したものと類似の方法に基づき、膵癌治療を必要とする哺乳動物に導入される。送達様式、組成物の濃度などのパラメーターは当業者によって容易に最適化される。
【０２３４】
本発明のさらなる態様において、膵癌特異的エレメントは、膵癌特異的な発現活性を内部に保っているさらに小さなセグメントを同定するためにさらに絞り込まれる。例えば、これらの各々の領域から欠失構築物を作製し、膵癌組織における発現を導く能力を保っているものの内部で、より小さなセグメントを同定するためにそれらの組織特異性を調べる。
【０２３５】
実施例3
前立腺癌特異的な発現
本発明者らは、変異型Bikポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を制御するために、前立腺癌特異的プロモーター配列を利用した。この目標に向けた例示的な方法および組成物を本実施例に記載する。
【０２３６】
転移性および再発性のホルモン抵抗性前立腺癌に対する標的指向性遺伝子治療の開発
具体的な態様においては、アンドロゲン依存的およびアンドロゲン非依存的な様式で変異型Bikの発現を調節するプロモーターを利用する。当業者は、前立腺癌の遺伝子治療において、PSA（Greenberg, DeMayo et al., 1995；Spitzweg, Zhang et al., 1999；Latham, Searle et al., 2000；Wu, Matherly et al., 2001）、プロバシン（Greenberg, DeMayo et al., 1995；Zhang, Thomas et al., 2000；Wen, Giri et al., 2003）およびhK2（Xie, Zhao et al., 2001）のような前立腺特異的プロモーターが最近開発されていることを認識している。これらのプロモーターの活性はアンドロゲン依存的である。進行期にある転移性前立腺癌の患者に対しては、ホルモン除去が第一選択肢の治療法である。しかし、化学的去勢後には、副腎はアンドロゲンの代償性供給源として不活性型前駆体ステロイドであるデヒドロエピアンドロステロンおよびアンドロステンジオンを大量に分泌する（Denis, 1996）。さらに、ほとんどのアンドロゲン非依存的な前立腺腺癌細胞はAR発現をアップレギュレートし、ステロイド応答性が増大するかステロイド特異性が低下している変異型ARを選択し、またはAR活性を刺激しうる増殖因子シグナル伝達をアップレギュレートする（Feldman and Feldman, 2001）。さらに、この治療法に伴う重大な副作用のため、この治療法は、患者に黄体形成放出ホルモン作動薬を最長12カ月間行い、その後は腫瘍進行が始まるまで治療法を中止するという間欠的除去プロトコールの幅広い使用に至った（Bruchovsky, Klotz et al. 2000）。このため、さまざまな病期に関して患者はしばしばホルモン的に健全であり、前立腺組織に対する治療用遺伝子の発現を導くためにアンドロゲン応答性ベクターを用いることが可能である。
【０２３７】
アンドロゲン非依存的な前立腺癌（AIPC）は、増殖および生存のためのアンドロゲンに対する正常な依存性が欠けている治療不能な型の前立腺癌である。AIPCはアンドロゲン除去療法によって選択される（Feldman and Feldman, 2001）。正常前立腺に「潜在する」悪性のアンドロゲン非依存的およびAR非依存的な上皮幹細胞は治療によって選択されるようになると提唱されている。これらのAR変異のサブセットはリガンド結合ドメイン（LBD）にマッピングされており、エストロゲンもしくはヒドロコルチゾンなどの正規でないリガンド、またはフルタミドなどのアンドロゲン受容体拮抗薬さえも作動薬として挙動するように受容体の応答を改変することによって耐性を引き起こすことが提唱されている（Chen, Welsbie et al. 2004）。これらの条件下では、転移性および再発性のホルモン抵抗性前立腺癌を完全に根絶するために自殺性遺伝子治療におけるアンドロゲン非依存的なプロモーターを開発することが極めて重要である。
【０２３８】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）プロモーターは癌特異的である
過去数年にわたり、染色体の末端にあるテロメアDNAを維持する役割を担う酵素テロメラーゼ逆転写酵素は、それを癌に対する特効薬と結び付ける実験所見の主題であった。テロメアは、染色体末端を分解および末端間融合、再配列ならびに染色体喪失から守る必須の要素である。ヒト体細胞におけるテロメラーゼ活性の欠如は、従来のDNAポリメラーゼに線状DNA分子を完全には複製する能力がない結果として起こるテロメアDNAの損失に対する補償を妨げる。その結果起こるテロメアの短縮は細胞増殖の寿命および細胞老化を制限する。インビトロでの細胞不死化および腫瘍の進行はテロメラーゼの活性化と関連性があり、それに依存すると考えられる。
【０２３９】
さまざまな癌患者におけるテロメラーゼ活性に関しては文献に多くのものがある。例えば、一般にテロメラーゼ発現はヒト癌の80〜100％に認められるが、精子細胞または盛んに増殖中の細胞を除き、ほぼすべて正常細胞は陰性である。前立腺癌の場合には、前立腺癌の約84％およびヒト前立腺癌細胞株の100％がhTERT陽性である（Vasef, Ross et al. 1999）。最近、hTERTプロモーターは癌の遺伝子治療、さらには前立腺癌の遺伝子治療に用いられている（Gu, Andreeff et al. 2002；Kim, Kim et al. 2003；Irving, Wang et al. 2004）。
【０２４０】
二段階転写増幅（TSTA）は遺伝子発現を有意に増大させる
hTERTプロモーターは遺伝子治療の安全性および有効性を高める。しかし、非修飾hTERTプロモーターの活性は、一般的に用いられる組織非特異的ウイルスを基にしたプロモーター、例えばサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターなどのそれよりもよりもはるかに弱い（Cong, Wen et al. 1999；Gu, Andreeff et al. 2002；Komata, Kondo et al. 2002）。二段階転写増幅（活性化）（TSTA）アプローチと呼ばれる、GAL4-VP16融合タンパク質を用いる増幅アプローチの一つは、細胞プロモーターの転写活性を増強するために用いることができる可能性がある（Iyer, Wu et al. 2001；Zhang, Adams et al. 2002）。この系における第一段階は、GAL4-VP16融合タンパク質の組織特異的発現を含む。第二段階では、今度はGAL4-VP16が、最小プロモーター中のGAL4応答エレメントの制御下にある標的遺伝子の発現を生じさせる。TSTAの使用は、導入遺伝子発現のレベル増幅をもたらす可能性がある。
【０２４１】
WPREは有用なエンハンサーである
組織特異的プロモーターの活性を高めるために、本発明者らおよび他の者は、最小限の組織特異的プロモーターと融合させたCMVエンハンサーを用いている。活性は増大したものの、組織特異性は低下した（未発表および（Latham, Searle et al., 2000））。この問題を取り扱うために、本発明者らは、RNAポリアデニル化、RNA排出および／またはRNA翻訳の改変を伴う、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（WPRE）を利用した（Donello, Loeb et al., 1998）。WPREの増強は、非ウイルス性ベクターおよびウイルスベクターによる一過性発現の際（Loeb, Cordier et al., 1999；Glover, Bienemann et al. 2002）ならびに遺伝子が標的細胞のゲノムに安定的に組み込まれた場合の両方に起こり、組織特異性は損なわれなかった（Lipshutz, Titre et al. 2003）。標的遺伝子とポリ（A）配列との間にセンス向きでクローニングされたWPREは、WPREを用いない場合と比べ、インビトロでルシフェラーゼ発現を2〜7倍、インビボでは2〜50倍、賦活化した（Zufferey, Donello et al., 1999；Lipshutz, Titre et al., 2003）。さらに、長期的な導入遺伝子発現を、WPREを含むアデノウイルスベクターによって媒介することもできる（Glover, Bienemann et al., 2003）。したがって、WPREは、遺伝子治療において導入遺伝子の発現を増大および延長させるための有効なツールである。
【０２４２】
TSTAおよびWPREはhTERTプロモーターの活性を増強する
TSTAおよびWPREがhTERTプロモーターの活性を増強するか否かを明らかにするために、本発明者らはまず、TSTAおよびWPREを含むhTERTpを基にした一連のプロモーター複合物をサブクローニングした。hTERTp断片（ヌクレオチド-378〜+56）（Takakura, Kyo et al., 1999）をLNCaP細胞のDNA抽出物からPCR増幅した。hTERTp断片を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を作動させるためにpGL3-Basicプラスミド中にサブクローニングし、phTERTp-Lucを得た。続いてWPREをphTERTp-Luc-Luc中に挿入し、phTERTp-Luc-WPREを生じさせた。TSTAシステムを用いるために、hTBRTpをpTSTAプラスミドのPSAプロモーターの代わりに用い（Zhang, Johnson et al., 2003）、phTBRTp-TSTA-Lucを作製した。最後に、WPRE断片をphTERTp-TSTA-Lucに挿入することによってプラスミドphTERTp-TSTA-Luc-WPREを得た。
【０２４３】
ARR2と融合したhTERTpを基にしたプロモーターはアンドロゲンによって賦活されうる
さまざまなプロモーター複合物の活性を、同程度のモル量のプラスミドDNAを内部対照pRL-TKとともに一過性に共トランスフェクトしたAR陽性およびAR陰性の前立腺癌細胞ならびに正常ヒト内皮細胞（HUVEC）において調べた。エンハンサー／プロモーターを含まないpGL3-Basicを陰性対照用に用いた。48時間後に、2種のルシフェラーゼの比を測定し、続いてCMV活性と比較してパーセンテージとして提示した。
【０２４４】
詳細には、LNCaP細胞またはPC-3細胞に対して、同程度のモル量のプラスミドDNAを内部対照pRL-TKと共に、一過性に共トランスフェクトした。48時間後に、2種のルシフェラーゼの比を測定し、CMV活性と比較してパーセンテージとして提示した。データは4回の独立した実験の平均を表している；バー、SD。図12Cは、hTERTpを基にした複合物の組織特異性を示している。肺線維芽細胞WI-38に対して、指定のプラスミドおよび内部対照pRL-TKを一過性に共トランスフェクトした。48時間後に、2種のルシフェラーゼの比を測定した。パーセンテージはAsPC-1における活性の比と比較して提示した。
【０２４５】
図12に示されているように、hTERTpはLNCaP細胞およびPC-3細胞の両方で活性があるが、その活性はCMVエンハンサー／プロモーターと比べて極めて弱かった。しかし、WPREは活性を約2倍に増大させた。驚いたことに、TSTAシステムは活性をLNCaP細胞におけるCMV活性の最大67％まで、かつPC-3細胞では90％まで高めることができた。TSTAシステムをWPREと併用した場合、活性はPC3ではCMVと同等であり、さらにLNCaP細胞では1.5倍の高さですらあった。これとは対照的に、その活性はWI-38細胞では検出不能なままであった。
【０２４６】
再発性前立腺癌のほとんどの症例では、AR遺伝子が増幅される、および／またはARが過剰発現される（Visakorpi T, Nat Genet 1995（Chen, Welsbie et al. 2004））。このため、特定の態様において、このシステムの活性をアンドロゲンによって刺激することができれば、これは有効性指標も大きく改善するはずである。この目標を実現するために、プラスミドARR2PB（Zhang, Thomas et al. 2000；Xie, Zhao et al. 2001）由来のARR2エレメントをphTERTp-TSTA-LucおよびphTERTp-TSTA-Luc-WPREのhTERTpプロモーターと融合させ、プラスミドpARR2.hTERTp-TSTA-LucおよびpARR2.hTERTp-TSTA-Luc-WPREを作製した（図13A）。LNCaP細胞およびPC-3細胞に対して、同程度のモル量のプラスミドDNAを内部対照pRL-TKとともに一過性に共トランスフェクトし、チャコール／デキストラン処理FBSを含む培地中で、0.01、0.1、1および10nM濃度の非代謝性アンドロゲン類似体R1881を用いて2日間刺激した。その後、上記のように、2種のルシフェラーゼの比を測定し、CMV活性と比較してパーセンテージとして提示した。予想された通り、ARR2.hTERTp-TSTA複合物およびARR2.hTERTp-TSTA-WPRE複合物の活性はアンドロゲン依存的な様式で増大し、LNCaP細胞ではCMVよりも10倍の高さとなったが、PC-3細胞では有意な変化は認められなかった。
【０２４７】
本発明のさらなる態様においては、前立腺癌特異的な発現活性を保っているさらに小さなセグメントを同定するために、各々の前立腺癌特異的エレメントをさらに絞り込む。例えば、これらの各々の領域から欠失構築物を作製し、前立腺癌組織における発現を導く能力を維持しているより小さなセグメントを同定するためにそれらの組織特異性を調べることもできる。
【０２４８】
TSTAおよびWPREはhTERTプロモーターの活性を増強する
図22には、CMVプロモーターおよびhTERTpを基にしたプロモーター複合物の制御下にあるホタルルシフェラーゼ活性の比較が示される。図22Aは、レポーター構築物の概略図を示している。図22Bは、前立腺癌LNCaPおよびPC-3ならびに正常ヒト線維芽細胞WI-38細胞株に対して、レポータープラスミドDNAおよび内部対照ベクターpRL-TKを一過性に共トランスフェクトしたことを示している。48時間後に、2種のルシフェラーゼの比を測定した。示されているのは、CMVプロモーター（1に設定）との相対的なルシフェラーゼ活性（倍数）である。hTERTp活性はTSTAシステムによってLNCaP細胞およびPC-3細胞の両方で高まり、これはWPREによってさらに増強される（図22B）。TSTAおよびWPREとの併用では、hTERTp-TSTA-WPREの活性はPC-3細胞およびLNCaP細胞において、それぞれCMVプロモーターと同等またはその1.5倍の高さである。重要なことに、その活性はヒト正常肺線維芽細胞WI-38および後にさらに確認したマウスモデルの正常組織では不顕性のままである。
【０２４９】
シス作用性ARR2エレメントは、インビボでアンドロゲン刺激に応答したTSTAおよび／またはWPRE改変hTERTpをさらに増強する。ADPCからAIPCまでの再発性または転移性の前立腺癌のほとんどの症例では、AR遺伝子が増幅され、および／またはARが過剰発現され、それでもなおアンドロゲン（またはアンドロゲン類似体）と結合し、続いてアンドロゲン応答性エレメント（ARE）と結合して転写活性化をもたらしうる（Chen et al., 2004；Visakorpi et al., 1995）。この点に関して、プロモーターが、アンドロゲン（またはアンドロゲン類似体）／AR複合体と結合し、治療用遺伝子発現の賦活を導くAREを含むならば、治療指数は大きく改善されるはずである。
【０２５０】
この目標を実現するために、ARR2PB（Xie et al., 2001；Zhang et al., 2000）由来のARR2エレメント（アンドロゲン受容体応答性エレメント2）を、本発明者らが新たに構築した系におけるhTERTpの上流と融合させ、ATT-Luc（pGl3-ARR2.hTERTp-TSTA-Luc）およびATTP-Luc（pGl3-ARR2.hTERTp-TSTA-Luc-WPRE）を作製した（図23A）。ARR2PB-Luc（pGl3-ARR2PB-Luc）を対照として用い、CMV-Lucは参照用ツールとして用いた。細胞に対して構築物および内部対照ベクターpRL-TKを一過性に共トランスフェクトし、種々の濃度のアンドロゲン類似体R1881とともにインキュベートした。実際に、ATT複合物およびATTP複合物の活性はアンドロゲン依存的な様式で増大し、AR+ADPC LNCaP細胞ではCMVプロモーターと比べてそれぞれ15倍および25倍まで大きく、AR+AIPC LAPC-4細胞ではそれぞれ2.8倍および5.5倍まで大きくなった（図23B）。ARR2は、PC-3細胞およびLNCaP細胞におけるhTERTp-TSTAおよびhTERTp-TSTA-WPREの転写活性（図22Bおよび図23B）ならびに正常細胞におけるそれらの特異性（データ非提示）を妨げなかった。ATTPおよびATTと比較して、ARR2PBはAR+（LNCaPおよびLAPC-4）でははるかに活性が低く、AR-（PC-3およびDU145）細胞ではほとんど不活性であった（図23B）。このように、新たに作製したATTPおよびATTは、検討した4種すべての細胞株において高い活性があり、その活性はAR-AIPC（PC-3およびDU145）細胞ではCMVプロモーターのそれと同等でAR+ ADPC（LNCaP）細胞およびAR+ AIPC（LAPC-4）細胞でははるかに強く、重要なこととして正常細胞では不顕性のままであった。
【０２５１】
ATTPはインビボのADPCおよびAIPC異種移植片において活発である
ATTPの活性および特異性がインビボで維持されるか否かを明らかにするために、本発明者らは皮下LNCaPおよびPC-3異種移植片を有する雄性BABL／c nu／nuマウスモデルを確立した。LNCaPまたはPC-3腫瘍を有するマウスに対して、DNA：リポソーム複合体の形態にある50μgのpGL3-ATTP-LucおよびpGL3-CMV-Lucを1日1回、3日間連続して静脈内注射した。LNCaP腫瘍を有するマウスを、非侵襲性画像化システム（Xie et al., 2004）を用いて2分間にわたりインビボ画像化し、最後の注射から24時間後に犠牲にした。生物発光の画像化により、CMV-Lucを投与したマウスでは胸部（肺／心臓）に極めて鮮やかな光点が認められたが、ATTP-Lucを投与したマウスでは同じ領域にほとんど認められなかった（図24A）。光の源をさらに調べるために、マウスを生きた状態での画像化後に直ちに犠牲にし、それらの主要臓器をエクスビボで画像化するために切離した。本発明者らは、最も強くフォトンを発する臓器はCMV-Lucを投与したマウスの肺であり、一方、ATTP-Lucを投与したマウスの肺からのシグナルは検出不能であることを確かめた（図24B）。フォトン励起時間を延長することによってシグナル強度を高めるために、切離した腫瘍を続いて直ちに10分間画像化した。ATTP-Lucを投与したマウスからの腫瘍は、CMV-Lucを投与したマウスからのものよりもはるかに強いシグナルを生じた（P、0.002）（図24C）。インビボおよびエクスビボでの画像化の結果に一致して、CMV-Lucを投与したマウスの肺および心臓からのルシフェラーゼ活性は、ATTP-Lucを投与したマウスのそれよりも有意に高かった。これに対して、ATTP-Lucを投与したマウスの腫瘍からのルシフェラーゼ活性は、CMV-Lucを投与したマウスの腫瘍のそれの14.5倍の高さであった（P、0.004）（図24E）。癌特異的指数（腫瘍と肺との、ルシフェラーゼ活性の比）（Chen et al., 2004）は、LNCaP腫瘍モデルにおいて、ATTP-Lucについては14.3であり、これに対してCMV-Lucについては0.012であった。PC-3細胞はAR-という事実のため、ATTP-Lucを投与したPC-3腫瘍からのシグナルはLNCaP腫瘍からのものほど大きくはなかった。しかし、ATTP-Lucを投与したマウスのPC-3腫瘍からのシグナルは、CMV-Lucを投与したマウスのそれよりも依然として高く（図24D）、ATTP-Lucの癌特異的指数（3.9）はCMV-Lucのそれ（0.015）と比べ、やはりさらに優れている（データ非提示）。以上を総合すると、この「キメラ」ATTPは、AR-前立腺癌におけるCMVプロモーターのそれと少なくとも同等の効率で、AR+前立腺癌ではさらにより効率的に、関心対象の遺伝子を前立腺腫瘍（AR+およびAR-のいずれも）に導くことができ、一方、正常細胞ではほとんど全く発現しない。
【０２５２】
実施例4
癌特異的プロモーターのインビトロ試験
各々の治療用ポリヌクレオチドと機能的に結合した本発明のプロモーターを含む構築物をインビトロで試験する。例えば、制御配列を、いくつかの態様においては、配列が所望の組織または細胞において有効であることを示唆する以前に生成されたデータに基づいて選択する。また別の態様においては、有効性に関する事前の知識を持たずに制御配列を選択する。試験しようとする制御配列は、その発現および／または遺伝子産物を、例えば色調、光または蛍光を含むものによってモニターすることができるレポーター配列と機能的に結合している。レポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼまたはβ-ガラクトシダーゼが含まれる。転写または転写後制御配列、最小限プロモーターなどを含む、その他の任意の種類の制御配列を構築物に追加してもよい。続いて、試験しようとする構築物およびその1つまたは複数の適切な対照を所望の細胞に導入し、発現に関してアッセイする。特定の態様において、試験しようとする構築物は、所望の細胞またはそれが存在する組織において有効であることが当業者によって決定されるようなレベルで発現を生じる。
【０２５３】
実施例5
癌特異的プロモーターのインビボ試験
各々の治療用ポリヌクレオチドと機能的に結合した本発明のプロモーターを含む構築物は、その抗腫瘍活性と関連して、動物試験において試験される。構築物は、その抗腫瘍活性を試験するためにリポソームまたはプラスミドベクターもしくはウイルスベクターなどのようなベクターにより、ヌードマウスモデルに送達される。ひとたび抗腫瘍活性が示されれば、免疫適格マウスを用いて毒性の可能性についてさらに調べ、その後は臨床試験が行われる。
【０２５４】
1つの具体的な態様においては、治療用ポリヌクレオチドと機能的に結合した本発明のプロモーターを含む構築物の選好的な増殖抑制活性を、動物において試験する。例示のみとして手短に述べると、HER-2／neu過剰発現性乳癌細胞株（SKBR3およびMDA-MB361など）をヌードマウスの乳腺脂肪体に投与して、乳房異種移植片モデルを作製する。腫瘍が特定のサイズに達した時点で、本発明の構築物またはその対照を、リポソームなどの許容される担体との混合物としてマウスに静脈内注射する。これらの処置による腫瘍サイズおよび生存曲線を比較し、統計学的に分析する。1つの好ましい態様において、本発明のプロモーターを含む構築物は、野生型p21と比較して、腫瘍組織特異的に腫瘍組織の増殖を選好的に抑制する。
【０２５５】
実施例6
癌特異的プロモーターを用いる臨床検査
本実施例は、本発明の癌特異的プロモーターを単独で、または他の抗癌薬と組み合わせて含む構築物を用いる、ヒト治療プロトコールの開発に関する。本発明の癌特異的プロモーターを含む構築物を用いた抗癌薬治療は、さまざまな癌の臨床的治療において有用と考えられる。このような治療は、抗腫瘍療法、例えば、従来の化学療法レジメンに対して抵抗性であるような、乳癌、前立腺癌および膵癌をそれぞれ有する患者の治療において、特に有用なツールであると考えられる。
【０２５６】
患者の治療およびモニタリングを含む、臨床試験の実施に関するさまざまな要素は、当業者には本開示に鑑みて公知であると考えられる。以下の情報は、臨床試験における、本発明の癌特異的プロモーターを含む構築物の確立に用いるための一般的指針として提示される。
【０２５７】
臨床試験のために選択される、進行期にある転移性の乳癌、前立腺癌または膵癌を有する患者は、典型的には、癌を発症するリスクが高いか、現在は寛解期にある癌に対して以前治療を受けたか、または従来の治療法の少なくとも1つのクールが奏功しなかったと考えられる。1つの例示的な臨床的プロトコールにおいて、患者は胸腔内および／または腹腔内にテンコフカテーテルまたは他の適したデバイスの留置を受けており、胸腔／腹腔滲出液の連続サンプリングを受けている。典型的には、胸腔または腹腔の既知の小房形成がないこと、クレアチニンレベルが2mg／dl未満であること、ビリルビンレベルが2mg／dl未満であることの確認が望まれると考えられる。患者は正常な凝固プロファイルを示すべきである。
【０２５８】
本発明の癌特異的プロモーターを含む構築物および他の抗癌薬の投与に関しては、このようなデバイスがすでに以前の手術によって留置されている場合を除き、テンコフカテーテルまたは代替的なデバイスを胸腔内または腹腔内に留置する。胸水または腹水の試料を、ベースラインの細胞性、細胞学、LDH、ならびに体液における（CEA、CA15-3、CA125、PSA、p38（リン酸化型および非リン酸化型）、Akt（リン酸化型および非リン酸化型）および細胞内における（本発明の癌特異的プロモーターを含む構築物）適切なマーカーを評価しかつ記録しうるように採取することができる。
【０２５９】
同じ手順で、本発明の癌特異的プロモーターを含む構築物を単独で、他の抗癌薬と組み合わせて投与することもできる。投与は例えば、胸腔／腹腔内に、腫瘍内に直接的に、または全身性の様式であってよい。開始用量は約0.05mg／kg体重であってよい。グレード3を上回る毒性がなければ3例の患者を各用量レベルで治療する。薬剤に関連したグレード2の毒性が検出されるまで、100％の増分（0.5mg、1mg、2mg、4mg）で用量を漸増してもよい。その後は用量漸増を25％の増分で行うとよい。任意の患者に関して、本発明の癌特異的プロモーターを含む構築物のロットおよび抗癌薬のロットの総合エンドトキシンレベルが5EU／kgを上回るならば、投与する用量を6時間の間隔をおいた2回の注入に等分してもよい。
【０２６０】
本発明の癌特異的プロモーターおよび／または他の抗癌薬との配合物を含む構築物は、短い注入期間にわたって投与してもよく、または7〜21日の期間にわたって一定の注入速度で投与してもよい。本発明の癌特異的プロモーターを含む構築物の注入は単独で投与してもよく、または抗癌薬とともに投与してもよい。任意の用量レベルで投与される注入は、それぞれの後に生じる毒性に依存すると考えられる。このため、任意の単回注入の後、または一定速度での注入のある特定の時期にグレードIIの毒性に達した場合には、毒性が改善しなければそれ以後の投薬を控えるか、一定速度の注入を中止するべきである。本発明の癌特異的プロモーターを抗癌薬とともに含む構築物の用量の増加は、患者の約60％が任意のカテゴリーにおいて許容されないグレードIIIまたはIVの毒性を示すまで患者群に対して行われる。この値の2／3である用量を安全量として定義することが可能と考えられる。
【０２６１】
身体所見診察、腫瘍測定および臨床検査は、当然ながら、治療の前に、および以後約3〜4週間隔で行われるべきである。臨床検査には、CBC、分画血球数および血小板数、尿分析、SMA-12-100（肝機能および腎機能の検査）、凝固プロファイル、および、疾患の程度を判定するため、または既存の症状の原因を判定するための任意の他の適切な化学検査が含まれる。また、血清中の適切な生物学的マーカー、例えば、CEA、CA 15-3、p38（リン酸化型および非リン酸化型）およびAkt（リン酸化型および非リン酸化型）、p185などもモニターすべきである。
【０２６２】
疾患の経過をモニターするため、および抗腫瘍反応を評価するためには、患者を適切な腫瘍マーカーに関して4週毎に評価すべきであると企図され、最初に異常であれば、CBC、分画血球数および血小板数を週2回ずつ4週間評価する；その後は、骨髄抑制が観察されなければ週1回とする。患者に長期的な骨髄抑制がみられれば、汎血球減少症の原因としての骨髄腫瘍浸潤の可能性を排除するために骨髄検査が推奨される。凝固プロファイルは4週毎に入手するものとする。SMA-12-100は毎週実施するものとする。胸腔／腹腔滲出液は初回投与から72時間後に採取し、その後は最初の2クールは週1回、さらにその後は進行または試験中止まで4週毎に行う。細胞性、細胞学、LDH、ならびに体液における適切なマーカー（CEA、CA15-3、CA125、ki67およびアポトーシスを計測するためのTunelアッセイ、Akt）および細胞における適切なマーカー（Akt）を評価することもできる。測定可能な疾患が存在する場合には、腫瘍測定値を4週毎に記録すべきである。腫瘍反応を評価するために適切な放射線医学検査を8週毎に繰り返すべきである。スパイロメトリーおよびDLCOは、治療開始から4週後および8週後、ならびに試験参加終了時に繰り返し行うとよい。尿分析は4週毎に行うとよい。
【０２６３】
臨床的反応は許容される指標によって定義しうる。例えば、完全反応は、少なくとも1カ月にわたる、測定可能なすべての疾患の消失と定義することができる。部分的反応は、評価可能なすべての腫瘍結節の直交径の積の合計の50％もしくはそれ以上の減少、または少なくとも1カ月間、拡大を示す腫瘍部位がみられないことによって定義しうる。同様に、混在反応は、評価可能なすべての腫瘍結節の直交径の積の合計の50％もしくはそれ以上の減少がみられるが、1つまたは複数の部位の進行を伴うものと定義しうる。
【０２６４】
参考文献
本明細書で言及したすべての特許および刊行物は、本発明が属する当業者のレベルを示すものである。すべての特許および刊行物は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が参照として組み込まれるように特定的および個別に示されている場合と同程度に、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０２６５】
特許
米国特許第4,683,202号
米国特許第4,797,368号
米国特許第4,879,236号
米国特許第5,139,941号
米国特許第5,220,007号
米国特許第5,284,760号
米国特許第5,354,670号
米国特許第5,366,878号
米国特許第5,389,514号
米国特許第5,635,377号
米国特許第5,641,484号
米国特許第5,670,488号
米国特許第5,789,166号
米国特許第5,798,208号
米国特許第5,830,650号
米国特許第5,871,986号
米国特許第5,925,565号
米国特許第5,928,906号
米国特許第5,935,819号
【０２６６】
刊行物
2007535315.tif 000005
2007535315.tif 000006
2007535315.tif 000007
2007535315.tif 000008
2007535315.tif 000009
【０２６７】
本発明およびその利点を詳細に説明してきたが、添付する特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本明細書にはさまざまな変更、置き換えおよび改変を加えうることが理解されるべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載された工程、装置、製造元、物質組成、手段、方法および段階の特定の態様には限定されないことを意図している。当業者は本発明の開示内容から容易に理解するであろうが、本明細書中に記載された対応する態様と実質的に同じ機能を遂行する、または実質的に同じ結果を実現させる、現在存在するか後に開発されるであろう工程、装置、製造元、物質組成、手段、方法または段階を、本発明に従って利用することもできる。したがって、添付する特許請求の範囲は、それらの範囲内に、そのような工程、装置、製造元、物質組成、手段、方法または段階を含むことを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０２６８】
本発明のより完全な理解のために、ここで添付の図面にともに用いられる以下の説明に関して言及する。
【図１】正常乳房上皮細胞（184A1）、正常肝細胞（Chang肝細胞）、線維芽細胞（WI38）、肺癌細胞（A549）、膵癌細胞（CAPAN-1）、卵巣癌細胞（iP-1）および乳癌細胞（MD-MBA-231、MD-MBA-468、MD-MBA-453、SKBR3、T47D、MCF-7）を含む細胞株におけるルシフェラーゼレポーターアッセイによる全長（FL）トポIIαプロモーターの活性を示している。
【図２】図10に記載された細胞株におけるルシフェラーゼレポーターアッセイによる全長（FL）トポIIαプロモーターの活性を示している。
【図３】一過性トランスフェクションによる種々の細胞株におけるCT572とCT90とを比較したインビトロでのルシフェラーゼ発現を示しており、％は個々の細胞株におけるCMV-PGL3ベクターのルシフェラーゼ活性との比較を意味する。
【図４】MDA-MB-231腫瘍保有マウスの組織におけるCMVプロモーターと対比したCT90プロモーター活性（CT90／CMV）を示している。各組織におけるプロモーター活性は、本文中に記載したようにルシフェラーゼレポーターアッセイで測定した。
【図５】種々の細胞株におけるCT90BikDDおよびCMV-BikDDのインビトロ死滅アッセイを示している。Y軸の値は処置後の生細胞のパーセンテージを表している。
【図６】CT90-BikDD遺伝子治療のインビボ抗腫瘍効果を示している。乳癌細胞株MDA-MB-231をマウス1匹当たり2.5×106個接種し、マウスには、リポソームと複合体化させたCT0-BikDD、CMV-BikDD、空ベクターpGL3、または非処置対照としてのデキストロース緩衝液D5Wを週1回投与した。腫瘍サイズ（Y軸の値）は処置期間中に週2回測定し、図中に示している。X軸は処置日を示している。
【図７】各細胞株における、CMVプロモーター活性によって標準化したTR欠失変異体のプロモーター活性を示している。Y軸におけるパーセンテージは、個々の細胞株におけるCMVプロモーターに対するTfRプロモーターの比を表している。
【図８】正常酸素条件および低酸素条件下での乳癌細胞株における、CMVプロモーター活性によって標準化したCTR116のプロモーター活性を示している。Y軸におけるパーセンテージは、CMVプロモーター活性に対するTfR116の比を表している。
【図９】膵臓特異的プロモーターの構築物（図9A）およびその各々のルシフェラーゼアッセイ（図9B）を図示している。データは4回の独立した実験の結果を表している；バー、SD。
【図１０】図10Aは、最小限のCCKARプロモーター（WPREを伴うもの、もしくは伴わないもの）、またはCCKAR／TSTA（WPREを伴うもの、もしくは伴わないもの）の制御下にある、またはCMVエンハンサー／プロモーターの制御下にあるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む、CCKARを基にした、およびCMVを基にした構築物の概略図を図示している。図10Bは、AsPC-1およびPANC-1膵癌細胞中に一過性にトランスフェクトされた構築物の活性を示している。図10Cは、CCKARを基にしたプロモーター複合物の組織特異性を示している。データは4回の独立した実験の結果を表している；バー、SD。
【図１１】CTP-LucおよびCMV-LucプラスミドDNAの全身送達後のAsPC細胞の同所性腫瘍モデルにおけるインビボでの導入遺伝子発現を示している。図11Aは、マウスのインビボ画像を示している。マウスの代表的な画像が示されている。図11Bは、ルミノメーターを用いて定量し、全タンパク質のmg当たりの相対ルシフェラーゼ単位として表した、組織抽出物におけるホタルルシフェラーゼ活性を示している。比は、CTPマウスのルシフェラーゼ活性のレベルをCMVマウスに対して比較することによって算出した。
【図１２】CMVエンハンサー／プロモーターまたはhTERTpを基にしたプロモーター複合物の制御下でのホタルルシフェラーゼ活性の比較を示している。CMVエンハンサー／プロモーターまたはhTERTp（WPREを伴うもの、もしくは伴わないもの）、またはhTERTp／TSTA（WPREを伴うもの、もしくは伴わないもの）を含むホタルルシフェラーゼレポータープラスミド構築物を、LNCaP細胞（図12A）、PC-3前立腺癌細胞（図12B）またはWI38細胞（図12C）で検討した。データは4回の独立した実験の結果を表している；バー、SD。
【図１３】アンドロゲン応答性hTBRTpを基にしたプロモーター複合物の活性上昇を示している。図13Aは、アンドロゲン応答性エレメントARR2が、hTERTp-TSTA-LucまたはhTERTp-TSTA-Luc-WPRE複合物のhTERTpの上流に配置されたことを示している。ARR2PBによって作動するLucを対照とした。図13Bは、前立腺癌細胞におけるhTERTpを基にした複合物の活性を示している。データは4回の独立した実験の結果を表している；バー、SD。
【図１４】CT90プロモーターが、CMVプロモーターによるものと同等なレベルでBikDDの発現を生じさせることを提示している。MCF7細胞に対してCMV-BikDDおよびCT90-BikDDを電気穿孔法によってトランスフェクトした。24時間後に、各実験における細胞をウエスタンブロット法のために収集して溶解させた。
【図１５】遺伝子治療処置中の腫瘍増殖を示している。MDA-MB-231（15A）またはMDA-MB-468（15B）乳癌異種移植片を有するマウスに対して、CT90-BikDD、CMV-BikDD、空ベクターpGL3のリポプレックス15μg、または5％デキストロース水溶液を静脈内注射によって投与した。各投与群はマウス10匹ずつとした。マウスには8週間にわたり週1回（QW）投与し、腫瘍サイズを週2回測定した。
【図１６】MDA-MB-231乳房腫瘍保有マウスの生存度の記録を提示している。投与を第8週で中止し、マウスは施設の規則に定められた病的状態に達するまでは生存させておいた。各週に関する生存数を記録し、上の図に示している。カプラン-マイヤー分析およびログランク検定による平均生存期間および統計学的有意性を下の図に示している。N.S.、有意でない。
【図１７】インビボの乳癌細胞においてCT90-BikDDにより導かれたBikの選択的発現を示している。MDA-MB-468乳癌異種移植片を有するマウスに、CT90-BikDDまたはCMV-BikDDリポプレックスを注入した。マウスを注射72時間後に犠牲にし、腫瘍および心臓を摘出して固定した。BikDD mRNAの発現を検出するために、材料と方法の項に記載したように組織切片に対してインサイチューハイブリダイゼーションを行った。示されているのは心臓および腫瘍の代表的なスライドである。図17Aには、CMV-BikDDおよびCT90-BikDDを投与したマウスからの心臓組織におけるBikDD発現が示される（それぞれ左および右の図）。上の図における試料はアンチセンスBikDDプローブで染色されており、濃い褐色の色調は陽性シグナルを示している。下の図は、センスBikDDプローブで染色した陰性対照実験を示している。図17Bには、CMV-BikDDおよびCT90-BikDDを投与したマウスからの腫瘍組織におけるBikDD発現が示される（それぞれ左および右の図）。上の図における試料はアンチセンスBikDDプローブで染色されており、矢印は陽性細胞を表している。下の図は、センスBikDDプローブで染色した陰性対照実験を示している。図17Cでは、CT90プロモーターが、CMVプロモーターによるものと同等なレベルでBikDDの発現を生じさせている。MCF7細胞に対してCMV-BikDDおよびCT90-BikDDを電気穿孔法によってトランスフェクトした。24時間後に、各実験における細胞をウエスタンブロットのために収集して溶解させた。
【図１８】ヒトコレシストキニンA型受容体（CCKAR）プロモーターが膵癌特異的である可能性を示している。図18Aには、膵癌特異的プロモーターの候補となる構築物が示される。CCKAR、オーファンGタンパク質共役型受容体（RDC1）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（uPAR）およびキモトリプシノーゲンB1（CTRB1）をポリメラーゼ連鎖反応で増幅し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を動作させるレポータープラスミドpGL3-basic中にサブクローニングした。図18Bでは、PANC-1細胞およびAsPC-1細胞に対して指定のプラスミドDNAおよびpRL-TKを一過性に共トランスフェクトしている。48時間後に2種のルシフェラーゼの比を測定し、ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ対照に対して標準化した相対光度単位（RLU）として示した。データは4回の独立した実験の平均を表している。バー、SD。
【図１９】分子組換えコレシストキニンA型受容体（CCKAR）を基にしたプロモーターがさらに活性が高く、膵癌特異性を保っていることを示している。図19Aには、pGL3-CCKAR-Luc-WPRE（CCKAR-P-Luc）、pGL3-CCKAR-TSTA-Luc（CCKAR-T-Luc）およびpGL3-CCKAR-TSTA-Luc-WPRE（CTP-Luc）を含む、組換えCCKARを基にした構築物の概略図が示される。図19Bには、膵癌細胞におけるCCKARを基にしたプロモーターの活性が示される。AsPC-1、PANC-1およびPanO2細胞に対して、プラスミドDNAおよびpRL-TKを一過性に共トランスフェクトした。48時間後に、2種のルシフェラーゼの比を測定した。CMVプロモーターの活性との相対的なパーセンテージを示している。データは4回の独立した実験の平均を表している。図19Cには、CCKARを基にしたプロモーター複合物の組織特異性が示される。膵癌でない細胞株（LNCaP、PC-3、SKOV3.ip1、MDA-MB-468およびHeLa）および正常な不死化細胞株（WI-38、184A1およびE6E7）に対して、指定のプラスミドおよびpRL-TKを一過性に共トランスフェクトした。48時間後に2種のルシフェラーゼの比を測定した。AsPC-1細胞における活性との相対的なパーセンテージを示している。データは4回の独立した実験の平均を表している。RLU、相対光度単位。
【図２０】コレシストキニンA型受容体（CCKAR）-二段階転写活性化（TSTA）-ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）の複合物であるCTPが、同所性動物モデルにおいて活発かつ膵癌特異的であることを示している。同所性AsPC-1腫瘍を有するヌードマウスに対して、50μgのDNAをDNA：リポソーム複合体の状態で尾静脈から連続3日間にわたり1日1回投与した。図20Aには、マウスのインビボ画像が示される。マウスに麻酔を施し、D-ルシフェリンの腹腔内注射から10分後にIVIS画像化システムを用いて5分間にわたり画像化した。図20Bには、ルシフェラーゼ発現の組織分布が示される。示した通りの腫瘍および臓器からの組織標本を切離し、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性に関して測定した。データは全タンパク質mg当たりの相対ルシフェラーゼ単位として表した。CMV、pGL3-CMV-Luc；CTP、pGL3-CTP-Luc；バー、SD；RLU、相対光度単位；各群当たりマウスn＝4。
【図２１】CTPによって生じたBik変異体（BikDD）の発現が、膵癌細胞を効果的かつ特異的に死滅させることを示している。図21Aには、pUK21骨格中にある発現構築物の概略図が示される。CMV-BikDD、pUK21-CMV-BikDD；CTP-BikDD、pUK21-CTP-BikDD。図21Bには、CMVまたはCTPによって生じたBikDDの死滅効果が提示されている。一群の膵癌細胞（AsPC-1、PANC-1、MDA-Panc28およびPanO2）、不死化ヒト膵臓上皮E6E7細胞に対して、2μgのpUK21（陰性対照）、pUK21-CMV-BikDD（陽性対照）、またはpUK21-CTP-BikDDを100ngのpGL3-CMV-Lucとともに共トランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後に、5ng／mlのD-ルシフェリンとの5分間のインキュベーションに続いて、ルシフェラーゼ活性をIVIS画像化システムを用いて2分間にわたり画像化した。代表的な画像が上の図に示されている。陰性対照（100％として設定）と比較したシグナルのパーセンテージを算出した（下の図）。データは3回の独立した実験の平均を表している。1、pUK21；2、CMV-BikDD；3、CTP-BikDD；バー、SD。
【図２２】CMVプロモーターおよびhTBRTpを基にしたプロモーター複合物の制御下にあるホタルルシフェラーゼ活性の比較を示している。図22Aには、レポーター構築物の概略図が示される。図22Bには、前立腺癌LNCaPおよびPC-3、ならびに正常ヒト線維芽細胞WI-38細胞株に対して、レポータープラスミドDNAおよび内部対照ベクターpRL-TKを一過性に共トランスフェクトした。48時間後に、2種のルシフェラーゼの比を測定した。示されているのは、CMVプロモーター（1に設定）に対するルシフェラーゼ活性（倍数）である。
【図２３】シス作用性ARR2エレメントが、アンドロゲン刺激に応答したTSTAおよび／またはWPRE改変hTERTpをさらに増強することを示している。図23Aには、レポーター構築物の概略図が示される。図23Bでは、細胞に対して、レポータープラスミドDNAおよび内部対照ベクターpRL-TKを一過性に共トランスフェクトした。R1881とのインキュベーションの48時間後に、2種のルシフェラーゼの比を測定した。示されているのは、CMVプロモーターの活性（1に設定）に対するルシフェラーゼ活性（倍数）である。
【図２４】プラスミドDNAの全身送達後のLNCaPおよびPC-3異種移植片におけるインビボでのルシフェラーゼ発現を示している。皮下LNCaP腫瘍を有する雄性ヌードマウスに対して、DNA（CMV-LucまたはATTP-Luc）：リポソーム複合体を静脈内注射した。マウスに麻酔を施し、D-ルシフェリンの腹腔内注射後にIVIS（商標）画像化システムを用いて2分間にわたり画像化した。示した画像は最後の注射から24時間後である。図24Aでは、マウスをその後直ちに解剖し、エクスビボで2分間にわたり画像化した。図24Bでは、切離した腫瘍をその後直ちに10分間にわたり画像化した（図24C）。図24Dでは、PC-3腫瘍を有するマウスに対するCMV-LucまたはATTP-LucプラスミドDNAの全身送達後にエクスビボPC-3腫瘍を（Cと同様に）画像化した。定量的シグナルを提示した（右）。図24Eには、LNCaP腫瘍モデルにおけるルシフェラーゼ発現のインビボ生体内分布が示される。示した通りの腫瘍および臓器からの組織標本を切離し、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性に関して測定した。
【図２５】ICBが乳癌特異的シグナル伝達を媒介することを示している。図25Aでは、ドミナントネガティブCdk2変異体（Cdk2-dn）が乳癌細胞におけるトポIIαプロモーター活性をブロックした。対照ベクターまたはCdk2-dn発現ベクターをトポIIα-pGL3レポーターベクターとともに細胞に共トランスフェクトし、その後にトポIIαプロモーター活性を決定するためにルシフェラーゼアッセイを行った。Cdk2-dn群におけるトポIIαプロモーター活性と対照群におけるそれとの比を示した。用いた細胞株は上に記載されている。BC、乳癌細胞。図25Bでは、サイクリンAが乳癌細胞においてトポIIαプロモーターを活性化している。対照ベクターまたはサイクリンA（CCNA）発現ベクターをトポIIα-pGL3レポーターベクターとともにSKBR3細胞に共トランスフェクトし、その後にトポIIαプロモーター活性を決定するためにルシフェラーゼアッセイを行った。Cdk2-dn群におけるトポIIαプロモーター活性と対照群におけるそれとの比を示している。図25Cは、トポIIαプロモーター欠失変異体（-572、-182、-90、-60）およびICB1変異型トポIIαプロモーター（mICB1）のデザインを示す。丸付きx印、ICB1部位での変異。図25Dは、ICB1が乳癌細胞においてサイクリンA／cdk2シグナルによりトポIIαプロモーターの活性化を媒介し得ることを示す。左図、トポIIαプロモーター欠失変異体をサイクリンA発現ベクターまたは対照ベクターとともに種々の細胞株に共トランスフェクトし、それらの活性をルシフェラーゼアッセイにより決定した。サイクリンA群におけるプロモーター活性と対照群におけるそれとの比（CCNA／Ctrl）が示されている。右図、トポIIαプロモーターのICB1部位を材料と方法の項に記載した通りに測定した。ICB1変異型プロモーター（mICB1-T2A）をサイクリンA発現ベクターまたは対照ベクターとともに種々の細胞株に共トランスフェクトし、活性化を上記の通りに決定した。図25Eでは、トポIIαプロモーターの-90欠失変異体が乳癌特異的活性を保っている。上図、T2A90-pGL3を細胞株にトランスフェクトし、2種ルシフェラーゼアッセイを用いることによってそのプロモーター活性を決定した。BE、正常乳房上皮細胞；BC、乳癌細胞；LF、正常肺線維芽細胞；HC、正常肝細胞；PC、膵癌細胞；OC、卵巣癌細胞。下図、種々の細胞株におけるCMVプロモーターの活性に対するT2A-90プロモーター活性。各細胞株におけるT2A-90とCMVとのプロモーター活性の比（トポIIα／CMV）を図25Bに記載した通りに算出した。
【図２６】CMVプロモーターのエンハンサー配列が乳癌細胞において特異的に-90トポIIαプロモーター活性を増強することを示している。図26Aには、CT572、CT182およびCT90のデザインが提示されている。pCDNA3.1ベクターからのCMVプロモーターエンハンサー配列をPCR増幅し、pGL3レポーター構築物中のトポIIα-182または-90プロモーターの上流にクローニングして、融合プロモーターCT572、CT182およびCT90をそれぞれ形成させた。図26Bには、細胞株におけるCT572、CT182およびCT90の活性が示される。各細胞株におけるプロモーター活性は上記の通りに測定した。図26Cは、細胞株におけるCMVプロモーターに相対的なCT572、CT182およびCT90の活性を示している。各細胞株におけるCT572とCMVとの（CT572／CMV）、CT182とCMVとの（CT182／CMV）およびCT90とCMVとの（CT90／CMV）プロモーター活性の比は上記の通りに決定した。図26Dは、MDA-MB-231同所性乳癌異種移植片マウスモデルにおけるCT90インビボ活性を示している。リポソームと複合体化させた、CT90（CT90-luc）またはCMVプロモーター（CMV-luc）によって制御されるルシフェラーゼレポーター構築物を、腫瘍保有マウスに尾静脈注射によって注入した。注射48時間後にマウスを犠牲にして腫瘍および主要臓器を摘出した。上図、腫瘍および正常臓器におけるCMVおよびCT90プロモーターによるルシフェラーゼ活性の絶対値。下図、CT90プロモーターとCMVプロモーターとの活性比（CT90／CMV）。すべての値は図25Bに前述した通りに算出した。図26Eは、腫瘍内注射によるMDA-MB-231乳癌異種移植片マウスにおけるCT90活性を示している。DOTAP：Cholリポソームと複合体化させたCT90-lucまたはCMV-luc構築物を、マウスのMDA-MB-231腫瘍内に注入した。注射48時間後にマウスを犠牲にして腫瘍および主要臓器を摘出した。左図、腫瘍および正常臓器におけるCMVおよびCT90プロモーターによるルシフェラーゼ活性の絶対値。右図、CT90プロモーターとCMVプロモーターとの活性比（CT90／CMV）。すべての値は図25Bに前述した通りに算出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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