【手続補正書】
【提出日】平成27年12月24日(2015.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程：
ａ）前記被検試料に、微生物の核酸の核酸増幅法による増幅を、死細胞に選択的に阻害する薬剤を添加する工程、
ｂ）微生物の細胞の透過性を高める処理を行う工程、
ｃ）被検試料中の微生物の核酸のターゲット領域を、細胞からの核酸の抽出を行わずに、鎖置換型核酸伸長酵素を用いた等温核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｄ）増幅産物を解析する工程、
を含み、前記微生物の細胞の透過性を高める処理は、それによって細胞からの核酸の抽出を行わずに、生細胞に選択的な核酸増幅を可能にする処理である、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１８】
鎖置換型核酸伸長酵素を用いた等温核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
１）微生物の核酸の核酸増幅法による増幅を、死細胞に選択的に阻害する薬剤、
２）下記組成の反応液を調製するための試薬、
Tris-HCl(pH7〜9)            10mM〜25mM
KCl                         5mM〜15mM
MgSO4                       5mM〜40mM
界面活性剤                  0.1%〜0.4%
ベタイン                    0.5M〜1M
dNTPs                       各1mM〜1.5mM
３）検出対象の微生物の核酸のターゲット領域を等温核酸増幅法により増幅するためのプライマー。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３０】
被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程：
ａ）前記被検試料に、微生物の核酸の核酸増幅法による増幅を、死細胞に選択的に阻害する薬剤を添加する工程、
ｃ）被検試料中の微生物の核酸のターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及びｄ）増幅産物を解析する工程、
を含む方法において、工程ａ）を蛋白質、糖類、脂質、及び酵母エキスからなる群から選択される成分を０．５〜１０％含む細胞懸濁液中で行うことを特徴とする方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
核酸を増幅する手法として、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて遺伝子増幅反応を等温で進行させる方法（LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification）法）が開発されている（特許文献５）。この方法は、４種類のプライマーを用い、それらのうち２種類のインナープライマーは、それらの３’と５’側で標的核酸配列中の異なる２領域を認識し、５’側の配列はその３’側からの伸長反応で合成した相補鎖領域内にアニールするよう設計される。増幅反応は、これらのインナープライマーと、インナープライマーを起点に合成されたＤＮＡ鎖を鋳型ＤＮＡから一本鎖として剥がすために用いられる２種類のアウタープライマーにより生成する、ステムループ構造を持つダンベル型の構造を起点とし、自己伸長反応と鎖置換合成反応を繰り返すことで、進行する。この方法では、増幅反応は等温（60〜65°C）で行われる。
また、ダンベル構造の5'末端側のループの一本鎖部分に相補的な配列を持つ２種類のループプライマーを用いることにより、ＤＮＡ合成の起点を増やし、反応時間を短縮することが可能となる（特許文献６）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
すなわち本発明は、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程：
ａ）前記被検試料に、微生物の核酸の核酸増幅法による増幅を、死細胞に選択的に阻害する薬剤を添加する工程、
ｂ）微生物の細胞の透過性を高める処理を行う工程、
ｃ）被検試料中の微生物の核酸のターゲット領域を、細胞からの核酸の抽出を行わずに、鎖置換型核酸伸長酵素を用いた等温核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｄ）増幅産物を解析する工程、
を含み、前記微生物の細胞の透過性を高める処理は、それによって細胞からの核酸の抽出を行わずに、生細胞に選択的な核酸増幅を可能にする処理である、方法を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
また、本発明は、鎖置換型核酸伸長酵素を用いた等温核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記の要素を含むキットを提供する：
１）微生物の核酸の核酸増幅法による増幅を、死細胞に選択的に阻害する薬剤、
２）下記組成の反応液を調製するための試薬、
Tris-HCl(pH7〜9)            10mM〜25mM
KCl                         5mM〜15mM
MgSO4                       5mM〜40mM
界面活性剤                  0.1%〜0.4%
ベタイン                    0.5M〜1M
dNTPs                       各1mM〜1.5mM
３）検出対象の微生物の核酸のターゲット領域を等温核酸増幅法により増幅するためのプライマー。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
また本発明は、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程：
ａ）前記被検試料に、微生物の核酸の核酸増幅法による増幅を、死細胞に選択的に阻害する薬剤を添加する工程、
ｃ）被検試料中の微生物の核酸のターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及びｄ）増幅産物を解析する工程、
を含む方法において、工程ａ）を蛋白質、糖類、脂質、及び酵母エキスからなる群から選択される成分を０．５〜１０質量％含む細胞懸濁液中で行うことを特徴とする方法を提供する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明の方法によれば、簡便に、微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出することができる。本発明により、核酸増幅法による簡易かつ迅速な食品及び生体試料、拭き取り試料、工業用水、環境用水、排水等の環境中の微生物の生細胞・損傷細胞・死細胞の判別が可能となる。本発明の方法及びキットは、自主検査に応用可能であり、経済性にも優れている。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程：
ａ）前記被検試料に、微生物の核酸の核酸増幅法による増幅を、死細胞に選択的に阻害する薬剤を添加する工程、
ｂ）微生物の細胞の透過性を高める処理を行う工程、
ｃ）被検試料中の微生物の核酸のターゲット領域を、細胞からの核酸の抽出を行わずに、鎖置換型核酸伸長酵素を用いた等温核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｄ）増幅産物を解析する工程、
を含む。前記微生物の細胞の透過性を高める処理は、それによって細胞からの核酸の抽出を行わずに、生細胞に選択的な核酸増幅を可能にする処理である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
また、生体試料としては、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料、胸水試料、喀痰試料、糞便試料、鼻腔粘液試料、喉頭粘液試料、胃洗浄液試料、膿汁試料、皮膚粘膜試料、口腔粘液試料、呼吸器粘膜試料、消化器粘膜試料、眼結膜試料、胎盤試料、生殖細胞試料、産道試料、母乳試料、唾液試料、嘔吐物、又は水疱内容物等が例示される。
さらに、環境用水としては、市水、地下水、河川水、又は雨水等が例示される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
特に、食品衛生検査や臨床検査において、穏和な加熱処理や抗生物質投与により、損傷細胞の状態を呈した細菌の検出が注目されており、本発明は、生細胞の検出のみならず、生細胞と死細胞及び/又は損傷細胞との識別も可能な微生物の検出方法を提供するものである。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
本発明において、「生細胞の検出」とは、被検試料中の生細胞の有無の判別及び生細胞の量の決定のいずれをも含む。また、生細胞の量とは、絶対的な量に限られず、対照試料に対する相対的な量であってもよい。また、「生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する」とは、死細胞及び／又は損傷細胞に比べて選択的に検出することを意味する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
先の薬剤処理と、それ以降の薬剤処理との間で、未反応の薬剤を除去する工程を追加してもよい。薬剤を除去する方法としては、被検試料を遠心分離して、微生物を含む沈殿と薬剤を含む上清とを分離し、上清を除去する方法が挙げられる。この場合、薬剤を除去した後、適宜、洗浄剤で微生物を洗浄する工程を追加することも可能である。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
以上のことから、工程ｂ）は、好ましくは細胞の形態を保ちつつ、等温核酸増幅反応に必要な試薬を微生物の細胞内に透過させるための工程と言い換えることができる。すなわち、「細胞の透過性」（transparency of cell）とは、等温核酸増幅反応に必要な試薬が生物の細胞内に透過する性質（permeability）を意味する。微生物の細胞の透過性を高める処理は、微生物の細胞壁及び／又は細胞膜を穿孔する処理、又は、細胞壁及び／又は細胞膜の構造を緩める処理であってもよい。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
（３）工程ｃ）
続いて、被検試料中の微生物の核酸のターゲット領域を、細胞からの核酸の抽出を行わずに、鎖置換型核酸伸長酵素を用いた等温核酸増幅法により増幅する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
また、等温核酸増幅法のうちＲＮＡをターゲットとする方法としては、逆転写酵素によりコンプリメンタリＤＮＡ（cDNA）を合成し、さらに逆転写酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性により二本鎖ＤＮＡを合成し、最終的にＲＮＡポリメラーゼにより、ＲＮＡの特異的領域のみを増幅するＴＲＣ法（Nakaguchi, Y. et al., J. Clin. Microbiol., 42(9):4284-4292, 2004）が例示される。ＴＲＣ法では、増幅産物はＲＮＡである。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
＜２＞本発明のキット
本は発明のキットは、鎖置換型核酸伸長酵素を用いた等温核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記の要素を含む。
１）微生物の核酸の核酸増幅法による増幅を、死細胞に選択的に阻害する薬剤、
２）下記組成の反応液を調製するための試薬、
Tris-HCl(pH7〜9)            10mM〜25mM
KCl                         5mM〜15mM
MgSO4                       5mM〜40mM
界面活性剤                  0.1%〜0.4%
ベタイン                    0.5M〜1M
dNTPs                       各1mM〜1.5mM
鎖置換型核酸伸長酵素        0.2〜0.6U/μl
３）検出対象の微生物の核酸のターゲット領域を等温核酸増幅法により増幅するためのプライマー。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
すなわち、本発明は、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程：
ａ）前記被検試料に、微生物の核酸の核酸増幅法による増幅を、死細胞に選択的に阻害する薬剤を添加する工程、
ｃ）被検試料中の微生物の核酸のターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及びｄ）増幅産物を解析する工程、
を含む方法において、工程ａ）を酵母エキスを０．５％〜１０％含む細胞懸濁液中で行うことを特徴とする方法を提供する。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
【表４】
2015139434.tif 000001
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
まず、対照群（コントロール）となる基本マスターミックス組成を表５に示す。この基本マスターミックスは、栄研化学  レジオネラ検出試薬キットEの基本組成に、このキットの添付文書に従いカルセインを添加したものであるが、反応容量を1/2にスケールダウンさせ、11 μlのマスターミックスに2.5 μl相当のDNA溶液を鋳型として添加した反応系である。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
前記全ての遺伝子情報を一列に並べ、ClustalWにより各遺伝子領域を解析し、前記全ての属で一致した塩基、及び、一つでも完全一致性が保たれなかった塩基を同定し、各微生
物の16S rRNA遺伝子領域中の保存領域とバリアント領域を解析した。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２３】
表２４によれば、対照群に相当する生理食塩水にけん濁させたレジオネラ生細胞は、細胞濃度2.4 log cfu/ml（107希釈）、及び、3.4 log cfu/ml（106希釈）では、陰性と判定される結果となったが、7.4 log cfu/ml（102倍希釈）では、EMA処理後でも陽性と判定された。したがって、細胞濃度が高ければ、生理食塩水懸濁液でEMA処理した場合でも、生細胞・死細胞の識別が可能であることが示された。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
尚、Y-SWとYS-SWの死細胞の各結果を比較することにより、SR110（ACES/水酸化カリウムバッファー、ピロリン酸第二鉄、L-システイン塩酸塩、α-ケトグルタル酸）という本来レジオネラ生細胞の発育にとって必須の成分が、EMAのレジオネラ死細胞への透過を阻害するか、又はそれらの成分がプラスチャージを帯びているEMAと結合しEMAを不活性化させた可能性が示唆される。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
７−１）試験方法
Legionella pneumophila ATCC33153株をBCYEα培地にて37℃、2日培養したコロニーを釣菌し、滅菌した1%  Bacto Yeast Extract水溶液（Y-SW）にけん濁させ、8.9 log cfu/mlの生細胞けん濁液を調製した。その後、Y-SWにて102倍希釈けん濁液を調製し、10分煮沸して死細胞けん濁液を調製した。また、前記8.9 log cfu/mlの生細胞けん濁液の102〜108倍希釈けん濁液をY-SWにより調製した。
上記の各生細胞懸濁液及び死細胞けん濁液1 mlを試験検体とし、EMA 25〜35 μg/mlの終濃度にて計3回の多段階EMA処理（１回目EMA処理 遮光下氷上35 μg/ml 15分、２回目EMA処理30 μg/ml 15分、３回目EMA処理 25 μg/ml 10分）を行った。各EMA処理後の可視光照射は10分とした。また、それぞれの検体に対し未処理群も用意した。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３５】
表２５及び表２６における記号は以下のとおりである。
a) L. pneumophila ATCC33153のY-SW、又は生理食塩水けん濁液(8.9 ±0.31 log cells/ml)
b) L. pneumophila ATCC33153の死細胞懸濁液（6.9 ±0.31 log cells/ml）、又は、8.9 log cells/mlの生細胞けん濁液をY-SW、もしくは、生理食塩水により102倍希釈し生細胞
けん濁液。
c) LAMP増幅は２回実施し、Ct値（サイクル数、又はmin）をMean±SD (n = 2)として記載する。
d) ２回の結果がLAMP未増幅（陰性）を示す。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
〔実施例８〕多段階EMA処理−ダイレクトLAMP法によるレジオネラ生細胞の一斉検出
本実施例では、ダイレクトLAMP法による様々なレジオネラ菌の生細胞の検出限界を検討した。