(57)【要約】  ウイルス感染の治療に使用するための医薬品の製造における、ＨＡＭＬＥＴ（腫瘍細胞に致死的なヒトα−ラクトアルブミン）、もしくはそれらの生物学的に活性な変異体、またはこれらのうちいずれかの生物学的に活性なフラグメントから選択される、α−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体の使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染の治療に使用するための医薬品の製造における、ＨＡＭＬＥＴまたはそれらの生物学的に活性な改変体、またはこれらのうちいずれかの生物学的に活性なフラグメントから選択されるα−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体の使用。
【請求項２】
ウイルス感染は、気道、胃腸のウイルス、免疫不全ウィルス、および脳またはその他の内部器官のウイルスの感染である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
生物学的に活性な複合体は、アポフォールディング状態であるα−ラクトアルブミンまたはα−ラクトアルブミンの変異体、またはこれらのうちいずれかのフラグメント、および該複合体を生物学的に活性な形態に安定化する補因子を含み、ただし、α−ラクトアルブミンまたはそれらの変異体のいずれのフラグメントも、α−ラクトアルブミンのαドメインとβドメインとの境界を形成する領域に相当する領域を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
補因子は、シスＣ１８：１：９またはＣ１８：１：１１脂肪酸、または類似の立体配置を有する異なる脂肪酸である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
生物学的に活性な複合体は、ＨＡＭＬＥＴを含み、該ＨＡＭＬＥＴは、ｐＨ４.６で沈殿した乳汁のカゼイン分画から単離すること、陰イオン交換とゲルクロマトグラフィーとの組み合わせ、またはα−ラクトアルブミンを、Ｃ１８：１脂肪酸を特徴とするヒトミルクカゼイン由来の補因子の存在下で、イオン交換クロマトグラフィーで処理することのいずれかによって入手可能である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
α−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体は、
（ｉ）シスＣ１８：１：９またはＣ１８：１：１１脂肪酸、または類似の立体配置を有する異なる脂肪酸；および
（ii）カルシウムイオンが除去されているα−ラクトアルブミン、またはカルシウムイオンが除去されているか、もしくは機能的なカルシウム結合部位を有さないα−ラクトアルブミンの変異体；またはこれらのうちいずれかのフラグメント（ただし、いずれのフラグメントも、α−ラクトアルブミンのαドメインとβドメインとの境界を形成する領域に相当する領域を含む）、
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
生物学的に活性な複合体は、カルシウムへの親和性が減少するか、または機能しなくなるように、カルシウム結合部位が改変されているα−ラクトアルブミンの変異体を含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
変異体は、ウシα−ラクトアルブミンのＫ７９、Ｄ８２、Ｄ８４、Ｄ８７およびＤ８８に相当するアミノ酸のいずれか１ヶ所に突然変異を有する、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
改変はＤ８７にあり、Ｄ８７ＡまたはＤ８７Ｎ変異を有するα−ラクトアルブミンの変異体を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
生物学的に活性な複合体は、α−ラクトアルブミンまたはそれらの変異体のフラグメントを含み、ここにおいて、該フラグメントは、天然型タンパク質のアミノ酸３４〜８６の全領域を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
α−ラクトアルブミンは、ヒトまたはウシα−ラクトアルブミン、またはこれらのうちいずれかの変異体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
α−ラクトアルブミンは、ヒトα−ラクトアルブミンである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
α−ラクトアルブミンは、Ｓ７０Ｒ突然変異を含む突然変異ウシα−ラクトアルブミンである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
ＨＡＭＬＥＴまたはそれらの生物学的に活性な改変体、またはこれらのうちいずれかの生物学的に活性なフラグメントから選択されるα−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体を、それを必要とする患者に投与することを含む、ウイルス感染を治療する方法。
【請求項１５】
粘膜表面におけるウイルス感染を治療するためであり、それを必要とする患者の該表面に、ＨＡＭＬＥＴまたはそれらの生物学的に活性な改変体、またはこれらのうちいずれかの生物学的に活性なフラグメントから選択されるα−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体を投与することを含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス感染の治療方法、およびウイルス感染を治療するための医薬品の製造における生物学的に活性な複合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＡＭＬＥＴ（腫瘍細胞に致死的なヒトα−ラクトアルブミン）（以前はＭＡＬとして知られていた）は、アルファ−ラクトアルブミン（また、α−ラクトアルブミンとも記載される）の活性なフォールディング変異体であり、これは、形質転換細胞においてアポトーシスを誘導するが健康な分化細胞には影響を与えない（Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，４２２１〜６）。ＨＡＭＬＥＴは、腫瘍細胞の表面に結合して、細胞質に転移して細胞核中に蓄積し、そこでＤＮＡ断片化を引き起こすことが示されている（Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，４２２１〜６）。例えばＥＰ−０７７６２１４では、乳汁（特にヒトの乳汁）から得られたこのタイプの生物学的に活性な複合体が、それらの抗菌剤としての使用と共に説明されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これまで、ＨＡＭＬＥＴを用いて報告されている研究で、形質転換細胞はインビトロでＨＡＭＬＥＴの作用を受けやすいことが示されており、これは、ＨＡＭＬＥＴがガン治療への適用を有することを示唆する（例えば、Ｃ．Ｓｖａｎｂｏｒｇ等．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，２００３，８８，１〜２９を参照）。また、抗菌作用を有し、特に、インビトロで試験した場合、ヒト気道上皮細胞への肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）やインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の付着を阻害することも見出されている（ＷＯ９６／０４９２９）。それとは逆に、ある種のウイルス、例えばアデノウイルスのいくつかのタイプは、インビトロで特定の細菌の付着を強化するようである（Ａ．Ｈａｋａｎｓｓｏｎ等．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，（１９９４）第６２巻，７：２７０７〜２７１４）。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本出願人は、ＨＡＭＬＥＴおよびこのタイプの複合体をウイルス感染の治療で用いると、意外なことに優れた結果が得られることを見出した。
【０００５】
本発明によれば、ウイルス感染の治療に使用するための医薬品の製造における、ＨＡＭＬＥＴまたはそれらの生物学的に活性な改変体、またはこれらのうちいずれかの生物学的に活性なフラグメントから選択されるα−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体の使用が提供される。
【０００６】
ＨＡＭＬＥＴまたはそれらの生物学的に活性な改変体の作用は、特定の細胞型を標的とし、このような細胞型には、これまで報告されている腫瘍細胞に加えて、ウイルスに感染した細胞も含まれるようである。
【０００７】
それゆえに、これらの複合体は、ウイルス感染の治療への適用を有すると予想される。所定時間で処理すると、ＨＡＭＬＥＴは、レトロウイルスのようなウイルスを含む細胞を、ウイルスが複製する機会を持つ前に死に至らしめる。結果として、ウイルスの蔓延が抑制される。
【０００８】
この方法で、ヒトおよび獣医学系ウイルスの両方を含む多様なウイルスを処理することが可能である。このようなウイルスの一覧を以下に示す。
【０００９】
１．マストアデノウイルス属、基準種（Type species）：ヒトアデノウイルス２、およびアビアデノウイルス属、基準種：トリアデノウイルス１およびアフリカ豚コレラ様ウイルスを含むアデノウイルス科。
２．アレナウイルス属、基準種：リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、およびアルテリウイルス属、基準種：ウマ動脈炎ウイルスを含むアレナウイルス科。
３．アストロウイルス属、基準種：ヒトアストロウイルス１を含むアストロウイルス科。
４．クアビルナウイルス属、基準種：伝染性膵臓壊死ウイルス、およびトリビルナウイルス属、基準種：伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスを含むビルナウイルス科。
５．ブニヤウイルス属、基準種：ブニヤンベラウイルス、ハンタウイルス属、基準種：ハンターンウイルス、ナイロウイルス属、基準種：ナイロビヒツジ病ウイルス、およびフレボウイルス属、基準種：サシチョウバエ熱シシリアンウイルスを含むブニヤウイルス科。
６．カリシウイルス属、基準種：ブタ水疱疹ウイルスを含むカリシウイルス科。
７．サーコウイルス属、基準種：ニワトリ貧血ウイルスを含むサーコウイルス科。
８．コロナウイルス属、基準種：鶏伝染性気管支炎ウイルス、トロウイルス属、基準種：ベルンウイルス（Ｂｅｒｎｅ  ｖｉｒｕｓ）、およびデルタウイルス属、基準種：肝炎デルタウイルスを含むロナウイルス科。
９．フィロウイルス科、例えば、フィロウイルス属、基準種：マールブルグウイルスを含むモノネガウイルス目。
１０．フラビウイルス属、基準種：黄熱病ウイルス、ペスチウイルス属、基準種：ウシ下痢ウイルス、および「Ｃ型肝炎様ウイルス」属、基準種：Ｃ型肝炎ウィルスを含むフラビウイルス科。
【００１０】
１１．オルソヘパドナウイルス属、基準種：Ｂ型肝炎ウィルス、およびトリヘパドナウイルス属、基準種：アヒルＢ型肝炎ウィルスを含むヘパドナウイルス科。
１２．アルファヘルペスウイルス、例えば、シンプレックスウイルス属、基準種：ヒトヘルペスウイルス１、ワリセロウイルス属、基準種：ヒトヘルペスウイルス３；およびそのベータヘルペスウイルス亜科、例えば、サイトメガロウイルス属、基準種：ヒトヘルペスウイルス５、ムロメガロウイルス（Ｍｕｒｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）属、基準種：マウスサイトメガロウイルス１、ロゼオロウイルス属、基準種：ヒトヘルペスウイルス６、さらに、ガンマヘルペスウイルス亜科、例えば、リンホクリプトウイルス属、基準種：ヒトヘルペスウイルス４、およびラジノウイルス（Ｒｈａｄｉｎｏｖｉｒｕｓ）属、基準種：アテライン（ａｔｅｌｉｎｅ）ヘルペスウイルス２を含むヘルペスウイルス科とその亜科。
１３．ラナウイルス属、基準種：カエルウイルス３、リンホシスティウイルス属、基準種：フラウンダーウイルス（ｆｌｏｕｎｄｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、および、「キンギョウイルス（Ｇｏｌｄｆｉｓｈ  ｖｉｒｕｓ）様のウイルス」属、基準種：キンギョウイルス１を含むイリドウイルス科。
１４．フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科を含むモノネガウイルス目。
１５．インフルエンザウイルスＡ、Ｂ属、基準種：インフルエンザＡウイルス、インフルエンザウイルスＣ属、基準種：インフルエンザＣウイルス、および「トゴト様ウイルス」属、基準種：トゴトウイルスを含むオルソミクソウイルス科。
【００１１】
１６．ポリオーマウイルス属、基準種：マウスポリオーマウイルス、およびパピローマウイルス属、基準種：ワタオノウサギ乳頭腫ウイルス（ｃｏｔｔｏｎｔａｉｌ  ｒａｂｂｉｔ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ショープ）を含むパポバウイルス科。
１７．パラミクソウイルス科、およびそのパラミクソウイルス亜科、例えば、パラミクソウイルス属、基準種：ヒトパラインフルエンザウイルス１、麻疹ウイルス属、基準種：麻疹ウイルス、ルブラウイルス属、基準種：流行性耳下腺炎ウイルス；およびニューモウイルス亜科、例えば、ニューモウイルス属、基準種：ヒト呼吸器合胞体ウイルスを含むモノネガウイルス目。
１８．パルボウイルス亜科、例えば、パルボウイルス属、基準種：マウス微小ウイルス、エリスロウイルス属、基準種：Ｂ１９ウイルス、およびディペンドウイルス属、基準種：アデノ随伴ウイルス２を含むパルボウイルス科。
１９．エンテロウイルス属、基準種：ポリオウイルス１、ライノウイルス属、基準種：ヒトライノウイルス１Ａ、ヘパトウイルス属、基準種：Ａ型肝炎ウィルス、カルジオウイルス属、基準種：脳心筋炎ウイルス、およびアフタウイルス属、基準種：口蹄疫ウイルスＯを含むピコルナウイルス科。
２０．コードポックスウイルス亜科、例えば、オルソポックスウイルス属、基準種：ワクシニアウイルス、パラポックスウイルス属、基準種：オルフウイルス、アビポックスウイルス属、基準種：鶏痘ウイルス、カプリポックスウイルス属、基準種：ヒツジ痘ウイルス、レポリポックスウイルス属、基準種：粘液腫ウイルス、スイポックスウイルス属、基準種：豚痘ウイルス、モラシポックスウイルス属、基準種：伝染性軟属腫ウイルス（Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ  ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ  ｖｉｒｕｓ）、およびヤタポックスウイルス属、基準種：ヤバサル腫瘍ウイルスを含むポックスウイルス科。
【００１２】
２１．オルトレオウイルス属、基準種：レオウイルス３、オルビウイルス属、基準種：ブルータングウイルス１、ロタウイルス属、基準種：サルロタウイルスＳＡ１１、コルティウイルス属、基準種：コロラドダニ熱ウイルス、およびアクアレオウイルス属、基準種：ゴールデン・シャイナー・ウイルス（ｇｏｌｄｅｎ  ｓｈｉｎｅｒ  ｖｉｒｕｓ）を含むレオウイルス科。
２２．「哺乳動物タイプＢレトロウイルス」属、基準種：マウス乳癌ウイルス、「哺乳動物タイプＣレトロウイルス」属、基準種：ネズミ白血病ウイルス、「鳥類のタイプＣレトロウイルス」属、基準種：トリ白血病ウイルス、「タイプＤレトロウイルス」属、基準種：メーソン−ファイザーサルウイルス（Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒ  ｍｏｎｋｅｙ  ｖｉｒｕｓ）、「ｂｌｖ−ｈｔｌｖレトロウイルス」属、基準種：ウシ白血病ウイルス、レンチウイルス属、基準種：ヒト免疫不全ウィルス１、およびスプーマウイルス属、基準種：ヒトスプーマウイルスを含むレトロウイルス科。
２３．ラブドウイルス科、例えば、ベシクロウイルス属、基準種：水疱性口内炎インディアナウイルス、リッサウイルス属、基準種：狂犬病ウイルス、およびエファメロウイルス属、基準種：ウシ流行熱を含むモノネガウイルス。
２４．ｄｓＤＮＡサテライト、および、ｓｓＲＮＡサテライトを含むサテライト。
２５．アルファウイルス属、基準種：シンドビスウイルス、およびルビウイルス属、基準種：風疹ウイルスを含むトガウイルス科。
【００１３】
上述の生物学的な複合体を用いて処理することが可能である具体的なウイルスとしては、気道のウイルス、胃腸のウイルス、免疫不全ウィルス、例えばヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、および脳のウイルス、例えばウイルス性髄膜炎、またはその他の内部器官のウイルスが挙げられる。
【００１４】
粘膜表面で見出される状態は、特性（例えばｐＨなど）に関して極めて独特なことがある。しかしながら、本発明の複合体は、これらの状態においても活性なままである。粘膜表面は、特に、鼻腔、口、喉、食道、肺、胃、結腸、膣および膀胱において見出される。本発明に従って処理が可能な具体的な粘膜表面としては、喉、肺、結腸、および膀胱表面が挙げられる。本発明は、特に、これらの領域に影響を与えるウイルス（例えばＨＳＶ）の治療に適用可能である。
【００１５】
本発明に従って処理することが可能な、気道の具体的なウイルスとしては、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザ、ライノウイルス、コロナウイルスが挙げられる。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「ＨＡＭＬＥＴ」は、α−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体を意味し、これは、ｐＨ４.６で沈殿した乳汁のカゼイン分画から単離すること、例えばＥＰ−Ａ−０７７６２１４で説明されているように陰イオン交換とゲルクロマトグラフィーとの組み合わせ、またはＷＯ９９／２６９７９で説明されているように、α−ラクトアルブミンを、Ｃ１８：１脂肪酸を特徴とするヒトミルクカゼイン由来の補因子の存在下で、イオン交換クロマトグラフィーで処理することのいずれかによって入手できる。
【００１７】
α−ラクトアルブミンは、様々な哺乳動物源由来のものが可能であり、このような哺乳動物源としては、ヒト、ウシ、ヒツジおよびヤギの乳汁が挙げられるが、好ましくはヒトまたはウシであり、および最も好ましくはヒトである。また、タンパク質の組換え型も使用可能である。
【００１８】
また、ヒトα−ラクトアルブミンのＨＡＭＬＥＴへの変換において、その他の試薬、具体的には脂質（例えばオレイン酸）が有用であることも見出されている。特に、これまで、ＨＡＭＬＥＴ生産には、オレイン酸（Ｃ１８：１：９シス）が必要であることが報告されている（Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，４２２１〜６）。さらに近年、その他の脂肪酸も同様の方法で補因子として作用する可能性があることが発見された。α−ラクトアルブミンのＨＡＭＬＥＴへの変換に最適な補因子は、９または１１位でシスコンフォメーションで二重結合を有するＣ１８：１脂肪酸である。
【００１９】
α−ラクトアルブミン残基は、４個のジスルフィド結合（６１〜７７；７３〜９１；２８〜１１１、および６〜１２０）によって連結された４個のαヘリックス（残基１〜３４、８６〜１２３）と逆平行βシート（残基３８〜８２）で構成される１４.２ｋＤａの球状タンパク質である（Ｋ．Ｒ．Ａｃｈａｒｙａ等（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２２１，５７１〜８１）。α−ラクトアルブミンの天然型のコンフォメーションは、Ａｓｐ８２、Ａｓｐ８７およびＡｓｐ８８の側鎖のカルボキシレート、Ｌｙｓ７９およびＡｓｐ８４のカルボニルの酸素、ならびに、２個の水分子が配位した高い親和性のＣａ2+結合部位によって定義される（Ｋ．Ｒ．Ａｃｈａｒｙａ等（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２２１，５７１〜８１）。上記タンパク質は、低いｐＨ、または強く結合したＣａ2+イオンを放出するキレート化剤の存在下に晒されると、ＨＡＭＬＥＴに見出されるいわゆるアポコンフォメーションをとる（Ｄ．Ａ．Ｄｏｌｇｉｋｈ等（１９８１）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１３６，３１１〜５；Ｋ．Ｋｕｗａｊｉｍａ，（１９９６）Ｆａｓｅｂ  Ｊ，１０，１０２〜０９）。
【００２０】
生物学的に活性な複合体を形成するために、α−ラクトアルブミンは、一般的に、立体配座の変化またはフォールディング変化、同様に、脂質補因子の存在の両方を必要とする。コンフォメーション変化は、適切には、α−ラクトアルブミンからカルシウムイオンを除去することによって実行される。好ましい実施形態において、これは、適切には、機能的なカルシウム結合部位を有さないα−ラクトアルブミンの変異体を用いて促進される。
【００２１】
このような変異体を含む生物学的に活性な複合体は、本明細書で用いられるようなＨＡＭＬＥＴの「改変体」という用語に包含される。しかしながら、本出願人は、機能的なカルシウム結合部位の存在および／またはカルシウムの存在は、一度形成されたら、複合体の安定性または生物活性に影響を与えないことを見出した。生物学的に活性な複合体は、活性を失うことなくカルシウムへの親和性を保持することを見出した。それゆえに、本発明の複合体は、カルシウムイオンをさらに含んでいてもよい。
【００２２】
従って、特に、本発明は、アポフォールディング状態であるα−ラクトアルブミンまたはα−ラクトアルブミンの変異体、またはこれらのうちいずれかのフラグメント、および前記複合体を生物学的に活性な形態に安定化する補因子を含み、ただし、α−ラクトアルブミンまたはそれらの変異体のいずれのフラグメントも、α−ラクトアルブミンのαドメインとβドメインとの境界を形成する領域に相当する領域を含む、生物学的に活性な複合体を用いる。
【００２３】
適切には、上記補因子は、シスＣ１８：１：９またはＣ１８：１：１１脂肪酸、または類似の立体配置を有する異なる脂肪酸である。
【００２４】
具体的な便利な実施形態において、本発明で用いられる生物学的に活性な複合体は、
（ｉ）シスＣ１８：１：９またはＣ１８：１：１１脂肪酸、または類似の立体配置を有する異なる脂肪酸；および
（ii）カルシウムイオンが除去されているα−ラクトアルブミン、またはカルシウムイオンが放出されているか、もしくは機能的なカルシウム結合部位を有さないα−ラクトアルブミンの変異体；またはこれらのうちいずれかのフラグメント（ただし、いずれのフラグメントも、α−ラクトアルブミンのαドメインとβドメインとの境界を形成する領域に相当する領域を含む）、
を含む。
【００２５】
本明細書で用いられるように、表現「変異体」は、基礎タンパク質、適切にはヒトまたはウシα−ラクトアルブミン（ただし、それらが誘導された塩基配列とは、配列中の１またはそれ以上のアミノ酸がその他のアミノ酸で置換されているという点で異なる）に相同なポリペプチドまたはタンパク質を意味する。アミノ酸置換は、アミノ酸が、概して類似の特性を有するが異なるアミノ酸で置換される場合、「保存的」であるとされる場合もある。非保存的置換は、アミノ酸が、異なるタイプのアミノ酸で置換される場合をいう。大まかに言えば、非保存的置換が少なければ少ないほど、ポリペプチドの生物活性を変化させる可能性が少ないと予想される。適切には、変異体は、少なくとも６０％同一であると予想され、好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは８０％または８５％、特に好ましくは、９０％、９５％もしくは９８％、またはそれを超える同一性を有する。
【００２６】
同一性の程度を決定する目的でアミノ酸配列を比較する場合、ＢＥＳＴＦＩＴやＧＡＰ（いずれも、ウィスコンシン・ジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ；ＧＣＧ）製のソフトウェアパッケージ）のようなプログラムがある。例えば、ＢＥＳＴＦＩＴは、２つの配列を比較して、最も類似したセグメントの最適なアライメントを作製する。ＧＡＰは、配列をそれらの全長に沿って並べさせることが可能であり、必要に応じていずれかの配列にスペースを挿入することによって、最適なアライメントを発見する。適切には、本発明に関して、配列の同一性を考察する場合、比較は、それらの全長にそった配列のアライメントによってなされる。
【００２７】
用語「それらのフラグメント」は、例えば完全なα−ラクトアルブミンのアミノ酸配列を含む複合体に類似した活性を有する複合体を形成すると予想される、所与のアミノ酸配列を有するあらゆる部分を意味する。フラグメントは、全長タンパク質由来の２以上の部分を一緒に含んでいてもよい。適切には、このような部分は、基礎配列からの、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含むと予想される。適切なフラグメントは、欠失突然変異体と予想され、適切には、長さが少なくとも２０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸を含む。これらは、上記タンパク質由来の小さい領域を含むか、または、これらの組み合わせを含む。
【００２８】
αドメインとβドメインとの境界を形成する領域は、ヒトα−ラクトアルブミンにおいては、構造中のアミノ酸３４〜３８、および、８２〜８６で定義される。従って、適切なフラグメントは、これらの領域を含むと予想され、好ましくは天然型タンパク質のアミノ酸３４〜８６の全領域を含む。
【００２９】
特に好ましい実施形態において、生物学的に活性な複合体は、カルシウムへの親和性が減少するか、または機能しなくなるように、カルシウム結合部位が改変されているα−ラクトアルブミンの変異体を含む。
【００３０】
ウシα−ラクトアルブミンにおいて、カルシウム結合部位には、残基Ｋ７９、Ｄ８２、Ｄ８４、Ｄ８７およびＤ８８が配位されていることが発見された。従って、非ウシα−ラクトアルブミンにおける、この部位またはそれと同等の部分の、例えば、１個またはそれ以上の酸性残基を除去することによる改変によって、その部位のカルシウム親和性を減少させることができ、または機能を完全に除去することもでき、さらに、このタイプの突然変異体は、本発明の好ましい側面である。
【００３１】
ウシα−ラクトアルブミンのＣａ2+結合部位は、３10へリックス、および２つのヘリックスを分離するショートターン領域を有するαへリックスからなる（Ａｃｈａｒｙａ  Ｋ．Ｒ．等（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２１，５７１〜５８１）。２個のジスルフィド架橋が側面にあり、このかなり硬い分子の一部を構成している。Ｃａ2+に配位している７個の酸素基のうち５個は、Ａｓｐ８２、８７および８８の側鎖のカルボキシレート、またはＬｙｓ７９およびＡｓｐ８４のカルボニル酸素が寄与している。２個の水分子は、残りの２個の酸素を供給する（Ａｃｈａｒｙａ  Ｋ．Ｒ．等（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２１，５７１〜５８１）。
【００３２】
これまで、８７位におけるアスパラギン酸のアラニンへの部位特異的変異誘発（Ｄ８７Ａ）が、強いカルシウム結合部位を不活性化し（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．等（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１１６４８〜１１６５４）、その突然変異タンパク質はアポコンフォメーションをとることが示されてきた。
【００３３】
それゆえに、特定の実施形態において、ウシα−ラクトアルブミンのタンパク質配列中のアミノ酸８７位におけるアスパラギン酸残基を、非酸性残基、そして特に非極性または非荷電性極性側鎖へ突然変異させる。
【００３４】
非極性側鎖としては、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、またはシステインが挙げられる。特に好ましい例は、アラニンである。非荷電性極性側鎖としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、またはチロシンが挙げられる。
【００３５】
突然変異タンパク質における構造的なひずみを最小化するために、Ｄ８７はまた、アスパラギン（Ｎ）で置換させており（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ  １４，７８５〜７８９）、これは、カルボキシラート基の非補償性の負電荷が欠失しているが、同じ側鎖体積と幾何学的配置を有する。この突然変異タンパク質（Ｄ８７Ｎ）は、低い親和性（Ｋ−Ca２×１０5Ｍ-1）でカルシウムと結合することが示されている（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ  １４，７８５〜７８９）。本発明のさらなる好ましい実施形態において、このような突然変異体は、生物学的に活性な複合体の構成要素を形成する。
【００３６】
従って、本発明の複合体に使用するための特に好ましい変異体は、α−ラクトアルブミンのＤ８７ＡとＤ８７Ｎ変異体、またはこの突然変異を含むフラグメントである。
【００３７】
分子のこの領域は、ウシα−ラクトアルブミンにおいて３個の塩基性アミノ酸のうち１個（Ｒ７０）が、Ｓ７０に変化しているため、１個の配位している側鎖が除外されているという点で、ウシタンパク質とヒトタンパク質とで異なる。それゆえに、本発明の複合体にウシα−ラクトアルブミンが用いられる場合、Ｓ７０Ｒ突然変異体を用いることが好ましい場合がある。
【００３８】
Ｃａ2+結合部位は、異なる種由来のα−ラクトアルブミンにおいて１００％保存されており（Ａｃｈａｒｙａ  Ｋ．Ｒ．等（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２１，５７１〜５８１）、そのタンパク質に関するこの機能の重要性が説明されている。そこには、５個の異なるアミノ酸と２個の水分子が配位されている。Ｄ８７の側鎖カルボキシラートは、Ｄ８８と共に、最初に、カルシウムイオンをカチオン結合領域にドッキングし、構造を安定化する内部水素結合を形成する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．等（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１１６４８〜１１６５４）。Ｄ８７またはＤ８８のいずれかの喪失は、Ｃａ2+結合を阻害し、部分的にフォールディングしていない状態で分子を安定にすることが示されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．等（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１１６４８〜１１６５４）。
【００３９】
さらに、ウシα−ラクトアルブミンのカルシウム結合部位に２個の異なる点突然変異を有する突然変異タンパク質を用いてもよい。例えば、８７位におけるアスパラギン酸のアラニンでの置換（Ｄ８７Ａ）は、カルシウム結合を完全に阻害し、タンパク質の三次構造を崩壊させることが発見されている。アスパラギン酸のアスパラギンの置換、すなわちタンパク質（Ｄ８７Ｎ）は、それでもなおカルシウムと結合するが、Ｄ８７Ａ突然変異体に関して述べられたほどではないが、親和性はより低く、三次構造の喪失を示す（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ  １４，７８５〜７８９）。これらの突然変異タンパク質は、両方のアミノ酸が同じ平均体積１２５Å3を有するために充填体積において最小の変化しか示さず、さらに、アスパラギンのカルボキシラート側鎖は、タンパク質にカルシウムを配位させるが、非効率的であった（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ１４，７８５〜７８９）。両方の突然変異タンパク質は、生理的温度でアポコンフォメーションで安定であったが、このコンフォメーション変化にもかかわらず、それらは生物学的に不活性であった。この結果から、アポコンフォメーションへのコンフォメーション変化単独では、生物活性を誘導するには不十分であることが実証される。
【００４０】
α−ラクトアルブミンの構造は、この技術分野で既知であり、本明細書で述べられた残基の正確なアミノ酸の番号付けは、例えば上記のＡｎｄｅｒｓｏｎ等、および上記のＰｅｒｍｙａｋｏｖ等で示された構造を参照することによって同定することができる。
【００４１】
本発明に従って製造された医薬品は、適切には、ウイルスに感染した特定の領域への局所投与に適した形態の医薬組成物である。
【００４２】
例えば、気道の感染のためには、本組成物は、吸入法または吹入法による投与に適したものが可能である。消化管の感染、特に胃の感染のウイルス感染を治療するためには、経口用組成物を用いてもよい。膣または結腸のようなその他の粘膜表面のウイルス感染の治療には、坐剤のような局所用製剤で治療してもよい。
【００４３】
希釈剤またはクリーム基剤と共に、タンパク質複合体のための乳化剤を適切に含む局所用液剤またはクリーム剤は、粘膜表面でのその他のウイルス感染への適用により適している場合がある。このような製剤は、その表面に直接塗布することができる。
【００４４】
加えて、このような局所用組成物は、皮膚のウイルス感染を治療するために塗布してもよい。
【００４５】
その他の例において、本組成物は、膀胱のウイルスを治療しようとする場合、膀胱への点滴注入に適した形態も可能である。
【００４６】
内部器官に影響を与えるその他のウイルス感染を、感染した領域への注入によって治療することが可能である。このような領域としては、脳、肝臓、腎臓、前立腺および卵巣が挙げられる。同様に、免疫不全ウィルスは、リンパ腺および骨髄のような免疫系に関与する器官に、本複合体を注入することによって治療が可能である。
【００４７】
本複合体は、適切には、還流強化送達（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ；ＣＥＤ）を用いて注入される。
【００４８】
本組成物は、一般的に既知の、製薬上許容できるキャリアー、充填剤および／または補助剤（ｅｘｐｅｄｉｅｎｔ）を含んでいてもよい。
【００４９】
例えば、膀胱またはその他の内部器官に点滴または注入される組成物は、活性物質の滅菌水または滅菌食塩水を含むことになる。
【００５０】
本発明に係る活性剤は、ウイルスに感染した細胞を攻撃し、恐らくアポトーシスによってそれらを死滅させるが、健康な細胞には害を及ぼさないであろう。結果として、ウイルスの蔓延を抑制することになる。
【００５１】
活性な化合物の１日用量は様々であり、通常の臨床実践に従って、治療しようとする患者、ウイルスの性質などに依存する。一般的な規則としては、少なくとも３日、好ましくは少なくとも５日の期間中、１日あたりの投与に２００ｍｇ〜１ｇ／用量の生物学的に活性な複合体が用いられる。
【００５２】
本発明のさらなる形態において、ＨＡＭＬＥＴまたはそれらの生物学的に活性な改変体、またはこれらのうちいずれかの生物学的に活性なフラグメントから選択されるα−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体を、それを必要とする患者に投与することを含む、ウイルス感染を治療する方法が提供される。
【００５３】
特に、本複合体は、ウイルスに感染した細胞に直接投与されることになる。例えば、粘膜表面のウイルス感染を治療するためには、本複合体は、前記表面に治療上有効な量で投与されることになる。
【００５４】
生物学的に活性な複合体の好ましい例は、上で説明した通りである。好ましくは、生物学的に活性な複合体は、局所用組成物（これも上述の通り）の形態で投与される。
【国際調査報告】
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