(57)【要約】腫瘍関連ペプチドの同定および定量方法を記載する。この方法では、第一に、ペプチドを取得するための少なくとも２種の異なる供給源（腫瘍性組織および健常組織）を提供し、同一元素の少なくとも２種の異なる安定同位体を使用して、異なる供給源由来のペプチドを、互いに別々に、同一の様式で化学修飾する。その後、クロマトグラフィーによる方法によってペプチドを単離し、ペプチドのアミノ酸配列を決定する。この場合、異なるサンプルの一つから化学修飾中の安定同位体を使用して生じる他のサンプルまで、同一の配列を有するペプチドの相対的な量比の決定を行う。さらにまた、本発明は、添付の配列表の配列番号１〜３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する腫瘍関連ペプチドであって、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子と結合能を有するペプチドに関する。さらにまた、本発明は、薬物の製造、および腫瘍性疾患および／または腺腫様疾患の処置に関する、前記ペプチドの使用に関する。さらにまた、少なくとも１種の前記ペプチドを含む医薬組成物を記載する。
2007519910.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、腫瘍関連ペプチドの同定および定量方法：
第一の組織または細胞サンプルを提供する段階、
第一のサンプルと重量または細胞数単位で同一の量を有する第二の組織または細胞サンプルを提供する段階、
第一および第二のサンプルからペプチドを取得する段階、
両サンプル由来のペプチドを、別々に、化学的に同一に修飾し、異なるサンプル由来のペプチドにおいて異なる物理的特性を創出する段階、
両サンプル由来の前記修飾ペプチドを混合する段階、
ペプチドのアミノ酸配列を決定する段階、および
同一の配列を有する両サンプル由来のペプチドの相対的な量比を、異なる物理的特性に基づいて決定する段階。
【請求項２】
同一元素の少なくとも２種の異なる安定同位体を使用して両サンプル由来のペプチドを化学修飾することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の段階を特徴とする、請求項１または２に記載の方法：
ａ）腫瘍性組織由来のサンプルおよび対応する健常組織由来のサンプルまたは相応にトランスフェクトまたは感染させたセルラインを提供する段階、この場合、両サンプルは重量または細胞数単位で同一の量を有する、
ｂ）腫瘍性組織由来のサンプルからペプチドを単離する段階、
ｃ）対応する健常組織由来のサンプルからペプチドを単離する段階、
ｄ）元素の周期律由来の元素の安定同位体を含有する化学基を用いて、段階（ｂ）で得られたペプチドを化学修飾する段階、
ｅ）段階ｄ）で使用された元素の周期律由来の元素の第二の安定同位体を含有する化学基を用いて、段階（ｃ）で得られたペプチドを化学修飾する段階、
ｆ）段階（ｄ）および（ｅ）から得られた化学修飾ペプチドを混合する段階、
ｇ）段階ｆ）から得られたペプチドをクロマトグラフィーによる方法によって分離する段階、
ｈ）段階（ｇ）由来の、同一のアミノ酸配列を有するペプチドおよび、同一のアミノ酸配列を有する化学修飾ペプチドの重量比を同定および決定する段階、
ｉ）段階（ｈ）から得られたデータに基づいて、治療用ワクチン中に組み合わせるのに適切な、好ましくは特に適切な腫瘍関連ペプチドを同定する段階。
【請求項４】
腫瘍関連ペプチドがＭＨＣクラスＩリガンドであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
段階ｄ）で重水素（２Ｄ）および段階ｅ）で通常の水素（１Ｈ）を安定同位体として使用することを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
段階ｇ）でペプチドのクロマトグラフィーによる分離をＨＰＬＣによって実施することを特徴とする、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
質量分析による分析によって段階ｈ）を実施することを特徴とする、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
元素の周期律由来の同一元素の少なくとも２種の異なる同位体に基づいて、同一のアミノ酸配列および同一の化学修飾を有する２種のペプチドの量比を決定するための質量分析による分析を実施することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
同一のアミノ酸配列および同一の化学修飾を有するが、同時に存在する同一元素の異なる同位体を有するペプチドに関して測定されるシグナルの相対的強度を使用して、該ペプチド間の相対的な定量比を算出することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
段階ｉ）で、腫瘍関連遺伝子および遺伝子産物の同定に適したデータベースを使用することを特徴とする、請求項３〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
段階ｈ）の後に、追加の段階を実施し、この段階で、同定および定量済みのペプチドに対する末梢性白血球、好ましくはＴリンパ球の反応性を検査することを特徴とする、請求項３〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
白血球によって合成されるサイトカインｍＲＮＡおよび／またはインターフェロンｍＲＮＡを測定することによって反応性の検査を行うことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗原提示分子およびペプチドから再構成された複合体を用いて末梢性Ｔリンパ球を活性化することによって反応性の検査を行うことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔリンパ球の活性化に使用される抗原提示分子とペプチドの複合体が表面上に固定されていることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗原提示分子とペプチドの複合体を固定するために使用される表面がポリスチロールからなることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抗原提示分子が化学反応によってビオチンとカップリングされ、使用される表面が化学反応によってストレプトアビジンでコーティングされているポリスチロールからできていることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法にしたがってペプチドを同定し、同定されたペプチドをインビトロまたはインビボで化学合成する、ペプチドの製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法にしたがって同定され、ならびに／あるいは請求項１７に記載の方法にしたがって製造されるペプチド。
【請求項１９】
添付の配列表の配列番号１〜３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する腫瘍関連ペプチドであって、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子と結合能を有するペプチド。
【請求項２０】
少なくとも１個のアミノ酸が類似の化学的特性を有する別のアミノ酸で置換されていることを特徴とする、請求項１８または１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
少なくとも１個の追加のアミノ酸がＮまたはＣ末端に存在することを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれかに記載のペプチド。
【請求項２２】
少なくとも１個のアミノ酸が欠失していることを特徴とする、請求項１８〜２１のいずれかに記載のペプチド。
【請求項２３】
少なくとも１個のアミノ酸が化学修飾されていることを特徴とする、請求項１８〜２２のいずれかに記載のペプチド。
【請求項２４】
腫瘍性疾患および／または腺腫様疾患を処置するための薬物の製造に関する、請求項１８〜２３のいずれかに記載の１種または数種のペプチドの使用。
【請求項２５】
腫瘍性疾患および／または腺腫様疾患を処置するための、請求項１８〜２３のいずれかに記載のペプチドの使用。
【請求項２６】
疾患が腎臓、肺、結腸、胃、膵臓、乳房、前立腺、卵巣および／または皮膚の癌であることを特徴とする、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項２７】
ペプチドをアジュバントとともに使用することを特徴とする、請求項２４〜２６のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
抗原提示細胞に結合しているペプチドを使用することを特徴とする、請求項２４〜２７のいずれかに記載の使用。
【請求項２９】
白血球、特にＴリンパ球を標識するための、請求項１８〜２３のいずれかに記載のペプチドの使用。
【請求項３０】
腫瘍性疾患の治療の進行を評価するための、請求項１８〜２３のいずれかに記載のペプチドの使用。
【請求項３１】
抗体を作製するための、請求項１８〜２３のいずれかに記載のペプチドの使用。
【請求項３２】
請求項１８〜２３のいずれかに記載の１種または数種のペプチドを含有する医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１８〜２３のいずれかに記載のペプチドをエンコードする核酸分子。
【請求項３４】
請求項３３に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３５】
請求項３３に記載の核酸分子を活用して、あるいは請求項３４に記載のベクターを用いて、請求項１８〜２３のいずれかに記載のペプチドを発現するように遺伝子改変された細胞。
【請求項３６】
腫瘍性疾患および／または腺腫様疾患を処置するための薬物の製造に関する、請求項３３の核酸分子および／または請求項３４のベクターおよび／または請求項３５の細胞の使用。
【請求項３７】
以下の段階を含む、ワクチンの製造方法：
ａ）請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を実施する段階、
ｂ）同定されたペプチドを製造する段階、および
ｃ）製造されたペプチドを製剤化してワクチンにする段階。
【請求項３８】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を実施し、ペプチドの存在および／または量比を診断マーカーとして使用する診断方法。
【請求項３９】
目的のタンパク質に対する免疫応答を誘発する、病的症状の処置方法であって、治療有効量の、請求項１８〜２３のいずれかに記載の少なくとも１種のペプチドを投与することを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項１８〜２３のいずれかに記載の少なくとも１種のペプチドのアミノ酸配列および／または請求項３３に記載の核酸分子の核酸配列を含有する電子記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍関連ペプチドの同定および定量方法および製造方法、およびそのように同定／定量／製造されたペプチドならびにその使用に関する。
【０００２】
これらのペプチドは、例えば、腫瘍性疾患の免疫療法に使用される。
【背景技術】
【０００３】
免疫系の構成要素による腫瘍関連抗原の認識は、免疫系による腫瘍細胞の排除に顕著な役割を果たす。この機構は、腫瘍細胞と健常細胞間に定性的または定量的な差異が存在するという必要条件に基づくものである。腫瘍を標的にする免疫系の応答を生じさせるためには、腫瘍細胞が、この腫瘍を排除するのに十分な免疫応答が生じる対象の抗原を発現する必要がある。
【０００４】
腫瘍の排除において特に大きな役割を果たすのは、ＣＤ８発現性の細胞障害性Ｔリンパ球（以下ＣＴＬ）である。ＣＴＬによるこのような免疫反応の誘発に関しては、外来タンパク質／ペプチドがこのＣＴＬに提示される必要がある。Ｔ細胞は、ペプチド断片である抗原を実際に認識するが、この認識はこれらがＭＨＣ分子（「主要組織適合複合体」）によって細胞表面で提示される場合に限る。これらのＭＨＣ分子はペプチド受容体であり、通常、細胞内でペプチドを結合して、それらを細胞表面に輸送する。Ｔ細胞は、このペプチドとＭＨＣ分子の複合体を認識できる。ヒトのＭＨＣ分子はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と称される。
【０００５】
従来、抗原特異的でＴ細胞ベースの免疫療法による癌性疾患の処置は功を奏することがわかっている。
【０００６】
腫瘍を標的にする特異的ＣＴＬ応答の誘発は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のＭＨＣクラスＩリガンドの同定に依存する。このような腫瘍関連抗原は、例えば変異遺伝子の産物である、悪性（悪性形質転換（maliciously transformed））細胞に排他的に存在し得る。他の重要な種類の腫瘍関連抗原は組織特異的構造、例えばメラノサイト分化抗原である。第三の種類の腫瘍関連抗原は、腫瘍において過剰発現されるタンパク質である。
【０００７】
治療用ワクチンの基礎をなすＴＡＡを同定および特徴付けするための方法は、一方で、患者中に既存のＣＴＬまたは抗体の刺激に基づく。この免疫学的アプローチは、同定遺伝子の遺伝子発現プロファイルの分析または質量分析による配列決定と併用される（van the Bruggen et al., 1991,「ヒトメラノーマで細胞溶解性Ｔリンパ球によって認識される抗原をエンコードする遺伝子（A gene encoding an antigen recognised by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma）」, Science 254:1643-1647, およびCox et al., 1994,「５種のメラノーマ特異的ヒト細胞障害性Ｔセルラインによって認識されるペプチドの同定（Identification of a peptide recognised by five melanoma-specific human cytotoxic T cell lines）」, Science 264:716-719を参照のこと）。腫瘍性および正常組織の転写プロファイルについての比較分析に基づくＴＡＡの同定方法は、例えば、通常のＤＮＡチップテクノロジーおよび、比較対象の組織サンプル由来のメッセンジャーＲＮＡをハイブリダイズさせる方法の使用である。
【０００８】
Celis et al., 1994,「初代培養および合成ペプチドエピトープを使用する正常なヒトにおける抗腫瘍細胞障害性Ｔリンパ球の誘導（Induction of anti-tumour cytotoxic T lymphocytes in normal humans using primary cultures and synthetic peptide epitopes）」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2105-2109では、ＴＡＡ由来のＭＨＣクラスＩリガンドの予測に基づく方法が使用された。この場合、これらの予測リガンドはＴ細胞エピトープであることが実験によって後に確認される。
【０００９】
患者由来のＴ細胞の入手可能性を必然的に必要とするこれらのストラテジーの不利益は、実験上の使用および培養が非常に複雑であることである。
【００１０】
Schirle et al., 2000,「Ｔ細胞に依存しない新規アプローチによる腫瘍関連ＭＨＣクラスＩリガンドの同定（Identification of tumour-associated MHC class I ligands by a novel T-cell independent approach）」, Eur. J. Immunol. 30:2216-2225では、Ｔ細胞に依存しない方法が記載される。この方法では、ＭＨＣクラスＩリガンドの予測を複合ペプチド混合物中の予測ペプチドリガンドの特異的検索と組み合わせ、この場合、該ペプチドの同定は、高感度キャピラリー液体クロマトグラフィーと質量分光法（mass-spectroscopy）の組み合わせ（ＬＣ−ＭＳ）によって行う。
【００１１】
Young et al., 2001,「腎上皮性新生物の発現プロファイリング：腫瘍分類法および分子マーカーの発見方法（Expression profiling of renal epithelial neoplasms: a method for tumour classification and discovery of molecular markers）」, Am. J. Pathol., 158:1639-1651では、ＤＮＡチップテクノロジーを使用する分析を活用して、単一の腫瘍から多数のＴＡＡを同定できることが示された。したがって、過剰に、選択的に、または排他的に発現されたタンパク質由来のＭＨＣクラスＩリガンドは、ＣＴＬベースの腫瘍の排除に関する標的候補である。Mathiassen et al., 2001,「ｍＲＮＡ発現プロファイルによって同定された腫瘍関連抗原は保護的な抗腫瘍免疫を誘発する（Tumour-associated antigens identified by mRNA expression profiling induce protective anti-tumour immunity）」, Eur. J. Immunol. 31:1239-1246では、モデル生物のマウスにおいて、遺伝子発現解析およびエピトープ予測の組み合わせを使用して、有効なワクチンを製造することが可能であることを示すことができた。
【００１２】
エピトープ予測の不利益は、少数のＴＡＡに関して、非常に多数のＭＨＣクラスＩリガンド候補がすでに決定され、そのうち大多数は、実際にはＭＨＣクラスＩ分子によって全く提示されず、そのせいで、現在の予測エピトープの大多数がＣＴＬベースの腫瘍の排除を誘発することができないことに基づく。
【００１３】
Weinschenk et al., 2002,「患者個別の抗腫瘍ワクチンの設計に関する総合的な機能的ゲノミクスアプローチ（Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines）」, Cancer Res. 62:5818-5827では、腫瘍のＭＨＣクラスＩリガンドを単離し、液体クロマトグラフィーおよび質量分光法によって分析し、これと遺伝子発現解析を１方法に組み合わせることによって、治療用ワクチンの選択に関する候補を選択的に決定できることが示される。遺伝子発現解析または質量分光法の単独使用とは異なる大きな利点は、ペプチドの複合混合物から免疫反応性ペプチドとして特に適切なＭＨＣクラスＩリガンドを決定することに基づく。この適切なリガンドは、それらがＭＨＣクラスＩ分子によって実際に提示され、ならびに腫瘍において排他的に、選択的に、または特に強く発現される遺伝子由来であることを理由に決定される。
【非特許文献１】van the Bruggen et al., 1991,「ヒトメラノーマで細胞溶解性Ｔリンパ球によって認識される抗原をエンコードする遺伝子（A gene encoding an antigen recognised by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma）」, Science 254:1643-1647
【非特許文献２】Cox et al., 1994,「５種のメラノーマ特異的ヒト細胞障害性Ｔセルラインによって認識されるペプチドの同定（Identification of a peptide recognised by five melanoma-specific human cytotoxic T cell lines）」, Science 264:716-719
【非特許文献３】Celis et al., 1994,「初代培養および合成ペプチドエピトープを使用する正常なヒトにおける抗腫瘍細胞障害性Ｔリンパ球の誘導（Induction of anti-tumour cytotoxic T lymphocytes in normal humans using primary cultures and synthetic peptide epitopes）」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2105-2109
【非特許文献４】Schirle et al., 2000,「Ｔ細胞に依存しない新規アプローチによる腫瘍関連ＭＨＣクラスＩリガンドの同定（Identification of tumour-associated MHC class I ligands by a novel T-cell independent approach）」, Eur. J. Immunol. 30:2216-2225
【非特許文献５】Young et al., 2001,「腎上皮性新生物の発現プロファイリング：腫瘍分類法および分子マーカーの発見方法（Expression profiling of renal epithelial neoplasms: a method for tumour classification and discovery of molecular markers）」, Am. J. Pathol., 158:1639-1651
【非特許文献６】Mathiassen et al., 2001,「ｍＲＮＡ発現プロファイルによって同定された腫瘍関連抗原は保護的な抗腫瘍免疫を誘発する（Tumour-associated antigens identified by mRNA expression profiling induce protective anti-tumour immunity）」, Eur. J. Immunol. 31:1239-1246
【非特許文献７】Weinschenk et al., 2002,「患者個別の抗腫瘍ワクチンの設計に関する総合的な機能的ゲノミクスアプローチ（Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines）」, Cancer Res. 62:5818-5827
【非特許文献８】Beardsley et al., 2002,「ＭＡＬＤＩ質量マッピング用のグアジネーション手順の最適化（Optimization of guadination procedures for MALDI mass mapping）」, Anal. Chem. 74:1884-1890
【非特許文献９】Munchbach et al., 2000,「フラグメンテーションを指揮する部分を有するペプチドのＮ末端を同位体で標識することによるタンパク質の定量および促進型デノボシークエンシング（Quantitation and facilitated de novo sequencing of proteins by isotopic N-terminal labelling of peptides with a fragmentation-directing moiety）」, Anal. Chem. 72:4047-4057
【非特許文献１０】Weinschenk et al., 2002,「患者個別の抗腫瘍ワクチンの設計に関する総合的な機能的ゲノミクスアプローチ（Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines）」, Cancer Res. 62:5818-5827
【非特許文献１１】Altman et al.,1996,「抗原特異的Ｔリンパ球の表現型分析（Phenotypic analysis of antigen-specific T-lymphocytes）」, Science 274:94-96
【非特許文献１２】Walter et al., 2003,「最新技術：検定済みＭＨＣ／抗ＣＤ２８コーティングミクロスフェア上でエクスパンドされたヒトＣＤ８Ｔ細胞のあらかじめ決定された結合活性（Cutting Edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated micro spheres）」, J. Immunol. 171:4974-4979
【非特許文献１３】A. Kibbe, 2000,「医薬賦形剤ハンドブック第３版（Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed.）」, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press
【非特許文献１４】Ribas et al., 2003,「癌ワクチンおよび細胞免疫療法における開発の現状（Current developments in cancer vaccines and cellular immunotherapy）」, J. Clin. Oncol. 21:2415-2432
【非特許文献１５】Methods Enzymol., 1986,「ハイブリドーマテクノロジーとモノクローナル抗体（Hybridoma technology and monoclonal antibodies）」, 121:1-947
【非特許文献１６】Tomlinson et al., 2000,「多価およびtopecificの抗体フラグメントの作製方法（Methods for generating multivalent and topecific antibody fragments）」, Methods Enzymol. 346:461-479
【非特許文献１７】Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154
【非特許文献１８】Schirle et al.,「Ｔ細胞に依存しない新規アプローチによる腫瘍関連ＭＨＣクラスＩリガンドの同定（Identification of tumour-associated MHC class I ligands by a novel T cell independent approach）」, 2000, European Journal of Immunology, 30:2216-2225
【非特許文献１９】Barnstable et al.,「Ａ群赤血球、ＨＬＡおよび他のヒト細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体の作製−遺伝子解析用の新規ツール（Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes, HLA and other human cell surface antigens - new tools for genetic analysis）」, 1978, Cell, 14:9-20
【非特許文献２０】Wang et al., 2001,「食道癌で過剰発現された完全長ヒトリボソームタンパク質Ｌ１５ｃＤＮＡのクローニングおよび特徴付け（Cloning and characterisation of full-length human ribosomal protein L15 cDNA which was over-expressed in oesophageal cancer）」, Gene 263:205-209
【非特許文献２１】Ougolkov et al., 2002,「発癌性ベータ−カテニンおよびＭＭＰ−７（マトリリシン）は末期臨床結腸癌において同時分離する（Oncogenic beta-catenin and MMP-7 (matrilysin) cosegregate in late-stage clinical colon cancer）」, Gastroenterology 122: 60-71
【非特許文献２２】Robbins et al., 1996,「変異ベータ−カテニン遺伝子は腫瘍浸潤性リンパ球によって認識されるメラノーマ特異的抗原をエンコードする（A mutated beta-catenin gene encodes a melanoma-specific antigen recognised by tumour-infiltrating lymphocytes）」, Journal of Experimental Medicine 183:1185-1192
【非特許文献２３】Trask et al., 1990,「正常および腫瘍由来の哺乳類上皮細胞を識別するマーカーとしてのケラチン（Keratins as markers that distinguish normal and tumour-derived mammary epithelial cells）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:2319-2323
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本出願の発明者らは、遺伝子発現解析と質量分光法の併用法の一つの不利益が、ＴＡＡのＭＨＣクラスＩリガンドを標的にするＣＴＬ応答を誘発するペプチドであって、腫瘍組織上で強く発現され、正常組織上で弱く発現されるペプチドが、確実には同定できないことに基づくことを今や理解している。したがって本発明の目的は、腫瘍組織上で非常に強く発現され、正常組織上で弱く発現されるＴＡＡのＭＨＣクラスＩリガンドを標的にするＣＴＬ応答を誘発する免疫反応性ペプチドを選択的にかつ単純な様式で同定できる新規方法を提供することである。
【００１５】
同定されたペプチドに関して、腫瘍組織と正常組織間の、または、相応にトランスフェクトまたは感染させた細胞とトランスフェクトまたは感染させていない細胞間の、ＭＨＣクラスＩ分子によって実際に提示されるペプチドの量比を決定すれば、この目的が達成されることを発明者らは理解している。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって、腫瘍関連ペプチドを同定および定量するための本発明の方法は以下の段階を含む：
第一の組織または細胞サンプルを提供する段階、
第一のサンプルと重量または細胞数単位で同一の量を有する第二の組織または細胞サンプルを提供する段階、
第一および第二のサンプルからペプチドを取得する段階、
両サンプル由来のペプチドを、別々に、化学的に同一に修飾し、異なるサンプル由来のペプチドにおいて異なる物理的特性を創出する段階、
両サンプル由来の前記修飾ペプチドを混合する段階、
ペプチドのアミノ酸配列を決定する段階、および
両サンプル由来の同一の配列を有するペプチドの量の相対比を、異なる物理的特性に基づいて決定する段階、
この場合、好ましくは、同一元素の少なくとも２種の異なる安定同位体を使用して両サンプル由来のペプチドを化学修飾する。
【００１７】
したがって、本発明の腫瘍関連ペプチドの同定および定量方法によって目的が達成される。この場合、第一に、ペプチドの取得に関して、重量または細胞数単位で同一の量の少なくとも２種の異なる供給源（腫瘍組織および正常組織または相応にトランスフェクトされたセルライン）を提供し、次いで同一元素の少なくとも２種の異なる安定同位体を使用することによって同一様式で、異なる供給源由来のペプチドを互いに別々に化学修飾し、次いで前記修飾ペプチドを混合し、その後、好ましくはクロマトグラフィーによる方法によって単離し、ペプチドのアミノ酸配列を決定し、この場合、異なるサンプル由来の同一の配列を有するペプチドの量の相対比についての相関の決定は、化学修飾に使用される安定同位体に基づいて行う。
【００１８】
これに関し、ペプチドの単離は、標準プロトコルにしたがって、例えば、ＨＬＡクラスＩ分子に特異的なモノクローナル抗体、例えばＷ６／３２を使用することによって行う。
【００１９】
両供給源由来の同一の量（組織の場合は重量）または細胞数の出発材料が使用されることを保証するために、例えば、腫瘍組織および正常組織の両方に存在するペプチドまたは他のマーカーを使用して追加的に標準化を実施できる。
【００２０】
さらにまた、本発明は、新規方法にしたがって同定されるペプチドおよび、添付の配列表の配列番号１〜３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する腫瘍関連ペプチドに関し、この場合、該ペプチドはヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に対する結合能を有する。
【００２１】
さらに本発明は、薬物の製造、および腫瘍性疾患および／または腺腫様疾患の処置に関する、前記ペプチドまたは前記ペプチドをエンコードする核酸分子の使用に関する。
【００２２】
腫瘍関連ペプチドを同定および定量するための本発明の方法は以下の段階を含む：
ａ）腫瘍性組織由来のサンプルおよび対応する健常組織由来のサンプルまたは相応にトランスフェクトまたは感染させたセルラインを提供する段階、この場合、両サンプルは重量または細胞数単位で同一の量を示す、
ｂ）腫瘍性組織由来のサンプルからペプチドを単離する段階、
ｃ）対応する健常組織由来のサンプルからペプチドを単離する段階、
ｄ）元素の周期律由来の元素の安定同位体（例えば重水素、２Ｄ）を含有する化学基を用いて、段階（ｂ）で得られたペプチドを化学修飾する段階、
ｅ）段階ｄ）で使用された元素の周期律由来の元素の第二の安定同位体（例えば通常の水素、１Ｈ）を含有する化学基を用いて、段階（ｃ）で得られたペプチドを化学修飾する段階、
ｆ）段階（ｄ）および（ｅ）から得られた化学修飾ペプチドを混合する段階、
ｇ）段階ｆ）から得られたペプチドをクロマトグラフィーによる方法によって分離する段階、
ｈ）段階（ｇ）由来の、同一のアミノ酸配列を有するペプチド、および同一のアミノ酸配列を有する化学修飾ペプチドの量比を同定および決定する段階、
ｉ）段階（ｈ）から得られたデータに基づいて、治療用ワクチン中に組み合わせるのに適切な、好ましくは特に適切な腫瘍関連ペプチドを同定する段階。
【発明の効果】
【００２３】
好ましくは質量分光法および差次的な化学修飾に基づく、腫瘍組織および正常組織間のペプチドの量比についての差異を決定するための方法によって、治療用ワクチンの組み立てに特に適したペプチドを同定できることを本発明者らは理解している。
【００２４】
したがって、本発明の方法を用いて、例えば個別の患者の個人向けの腫瘍関連ペプチドの混合物の個別の組み立てに適したペプチドを同定することが可能であり、この場合、このペプチドは患者の個別のニーズに一致する選択的ＣＴＬ応答を誘発できる。
【００２５】
本方法を−患者サンプルの入手後に−例えば大規模な実験室によって、系統的および効率的に実施でき、その実験室で、適切なペプチドの同定後に、その配列を処置の現場であるクリニックに送り、そこでペプチドを合成し、治療用ワクチンとして製剤化できる。とは言え、実験室では、前記同定を実施するとともに、各患者に適した腫瘍関連ペプチドの、製薬的に許容される製造、製剤化、および提供を行うことも可能である。
【００２６】
さらに、本方法の系統的および通常の使用により、ＭＨＣクラスＩリガンドとして頻繁に見出される適切な腫瘍関連ペプチドをプレ製剤化薬物の形式で商業的に開発することができる。
【００２７】
純粋なサービスの関連で、ならびに、単一の患者用ならびに適切な産業的範囲での製薬業界の企業による開発用の製造、製剤化、および提供と組み合わせて、この新規方法を使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
好ましい実施態様では、段階（ｂ）および（ｃ）で単離されるペプチドはＭＨＣクラスＩリガンドである。
【００２９】
ＭＨＣ分子に結合しているペプチドのみがＣＴＬ免疫反応を誘発できる。例えば、腫瘍で過剰発現される遺伝子由来であるが、ＭＨＣ分子に結合していないペプチドはＣＴＬ免疫反応を誘発しない。ゆえに、例えば、エピトープの予測によってのみ決定されたすべてのペプチドが免疫反応の誘発に実際に適しているわけではない。
【００３０】
好ましい別の実施態様では、ペプチドをＯ−メチルイソ尿素−ヘミサルファートと化学反応させることに基づくペプチドのリシン残基のε−アミノ基のグアジネーション（guadination）、およびペプチドを２Ｄ４−ニコチニル−アミノ−ヒドロキシ−スクシンイミド（２Ｄ４−ＮｉｃＮＨＳ）と化学反応させることに基づくα−アミノ基のニコチネーション（nicotination）を用いて段階（ｄ）を実施する。ペプチドのリシン残基のε−アミノ基のグアジネーションは、例えばBeardsley et al., 2002,「ＭＡＬＤＩ質量マッピング用のグアジネーション手順の最適化（Optimization of guadination procedures for MALDI mass mapping）」, Anal. Chem. 74:1884-1890に記載される。ペプチドのα−アミノ基のニコチネーションは、例えばMunchbach et al., 2000,「フラグメンテーションを指揮する部分を有するペプチドのＮ末端を同位体で標識することによるタンパク質の定量および促進型デノボシークエンシング（Quantitation and facilitated de novo sequencing of proteins by isotopic N-terminal labelling of peptides with a fragmentation-directing moiety）」, Anal. Chem. 72:4047-4057に記載される。
【００３１】
好ましい別の実施態様では、ペプチドをＯ−メチルイソ尿素−ヘミサルファートと化学反応させることに基づくペプチドのリシン残基のε−アミノ基のグアジネーション、およびペプチドを１Ｈ４−ニコチニル−アミノ−ヒドロキシ−スクシンイミド（１Ｈ４−ＮｉｃＮＨＳ）と化学反応させることに基づくα−アミノ基のニコチネーションを用いて段階（ｅ）を実施する。
【００３２】
好ましい別の実施態様では、段階（ｇ）および（ｈ）において、液体クロマトグラフィーと質量分光法の併用法を用いて分析を実施する。この技術を用いて、個別の化学修飾ペプチドを正確にかつ効率的に決定でき、この決定は高処理量で行うことができる。化学修飾ペプチドを決定するための質量分光法の使用は、例えばMunchbach et al., 2000,「フラグメンテーションを指揮する部分を有するペプチドのＮ末端を同位体で標識することによるタンパク質の定量および促進型デノボシークエンシング（Quantitation and facilitated de novo sequencing of proteins by isotopic N-terminal labelling of peptides with a fragmentation-directing moiety）」, Anal. Chem. 72:4047-4057に記載される。腫瘍性組織由来のペプチドの同定は、例えばWeinschenk et al., 2002,「患者個別の抗腫瘍ワクチンの設計に関する総合的な機能的ゲノミクスアプローチ（Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines）」, Cancer Res. 62:5818-5827に記載される。
【００３３】
別の好ましい実施態様では、段階（ｈ）の後に追加の段階を実施する。この段階では、段階（ｈ）によって規定されるペプチドに対する末梢血由来の白血球、好ましくはＴリンパ球の反応性を検査する。
【００３４】
好ましい実施態様では、段階（ｈ）によって規定されるペプチドに対する末梢性白血球の反応性は、白血球が生産するγ−インターフェロンｍＲＮＡおよび／またはサイトカインｍＲＮＡを測定することによって検査する。
【００３５】
γ−インターフェロンｍＲＮＡおよび／またはサイトカインｍＲＮＡの測定を使用して、ペプチド抗原に対する白血球、好ましくはＴリンパ球の比反応性を正確に決定することが可能である。両化合物は活性型Ｔリンパ球によって分泌される。この分泌は、細胞表面で提示され、ＭＨＣ分子に結合している各ペプチドによってＴリンパ球が活性化された後に生じる。この追加の段階により、すでに同定されたペプチドから、さらに選択的に候補を同定する機会が許容される。
【００３６】
別の好ましい本方法の実施態様では、段階（ｈ）の後に追加の段階を実施する。この段階では、特異的Ｔリンパ球の存在を判定する。
【００３７】
この方法を使用して、単離および同定されたペプチドに対するＴリンパ球が、患者中にすでに、大いに存在すること、およびどの程度まで存在するかを特異的に解明することが可能である。この段階を用いて、患者中に既存のＴリンパ球の対象であるペプチドのみを治療用ワクチンとして使用することが可能である。そしてこのペプチドを用いて、これらの特異的Ｔリンパ球を活性化できる。
【００３８】
別の好ましい方法では、特異的Ｔリンパ球の存在の判定は、ＭＨＣ分子および抗原ペプチドの再構成複合体を用いて白血球を標識することによって行う。
【００３９】
この方法では、いわゆるテトラマーテクノロジーを使用する。このような再構成複合体（「テトラマー」）の取得方法およびその使用は、例えばAltman et al.,1996,「抗原特異的Ｔリンパ球の表現型分析（Phenotypic analysis of antigen-specific T-lymphocytes）」, Science 274:94-96に記載される。
【００４０】
別の好ましい方法では、分子ＣＤ２８とともに合成表面に結合しているＭＨＣ分子および抗原ペプチドから再構成された複合体で患者の末梢血由来の特異的Ｔリンパ球を活性化する。この方法は、例えばWalter et al., 2003,「最新技術：検定済みＭＨＣ／抗ＣＤ２８コーティングミクロスフェア上でエクスパンドされたヒトＣＤ８Ｔ細胞のあらかじめ決定された結合活性（Cutting Edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated micro spheres）」, J. Immunol. 171:4974-4979に記載される。
【００４１】
別の側面では、本発明は、本発明の方法を使用して同定および／または製造される免疫反応性ペプチドに関する。
【００４２】
これらのペプチドを同定した後、インビトロまたはインビボで、選択的かつ特異的に製造、すなわち化学合成することができる。
【００４３】
その実行では、該ペプチドの免疫反応特性が消失することなく、少なくとも１個のアミノ酸を類似の化学的特性を有する別のアミノ酸で置換することができ、少なくとも１個の追加のアミノ酸をＮまたはＣ末端で存在させることができ、少なくとも１個のアミノ酸を欠失させることができ、ならびに／あるいは少なくとも１個のアミノ酸を化学修飾することができることが理解される。
【００４４】
さらにまた本発明は、本発明の方法によって同定および／または製造された一種またはそれ以上のペプチドを含有する医薬組成物に関する。
【００４５】
この組成物は、例えば非経口適用に、例えば皮下、皮内または筋肉内適用によって使用できる。そのためには、ペプチドを医薬用担体中に溶解または懸濁し、さらにまた組成物には、賦形剤、例えばバッファー、結合剤、組み立て剤（assembling agents）、等を含有させることができる。このような組成物中で使用できる賦形剤については、例えばA. Kibbe, 2000,「医薬賦形剤ハンドブック第３版（Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed.）」, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Pressに広範囲にわたって表記される。また、本ペプチドは、免疫刺激物質、例えばサイトカインとともに投与できる。ペプチドとともに適用できる免疫刺激物質については、例えばRibas et al., 2003,「癌ワクチンおよび細胞免疫療法における開発の現状（Current developments in cancer vaccines and cellular immunotherapy）」, J. Clin. Oncol. 21:2415-2432に広範囲にわたって表記される。
【００４６】
本発明にしたがって、腫瘍性疾患の処置および腫瘍性疾患の処置手段の製造に本ペプチドを使用できる。
【００４７】
処置対象の腫瘍性疾患には、腎臓、肺、結腸、胃、膵臓、乳房、前立腺、卵巣および／または皮膚の癌が含まれる。ここに列挙する腫瘍性疾患は典型例であることを意図するものとし、用途の範囲を限定しないものとする。
【００４８】
さらにまた、本ペプチドを使用して、腫瘍性疾患の治療の進行を評価することもできる。
【００４９】
さらに、本ペプチドを使用して、他のワクチン接種または治療において治療経過を評価することができる。ゆえに本発明のペプチドは、治療用にだけでなく、診断用にも使用できる。
【００５０】
別の実施態様では、本ペプチドを使用して抗体を作製する。
【００５１】
ポリクローナル抗体は、通常の様式で取得することができる。この取得は、動物にこのペプチドを注射して免疫化し、その後、免疫化動物の血液から免疫グロブリンを精製することによって行う。
【００５２】
モノクローナル抗体は、例えばMethods Enzymol., 1986,「ハイブリドーマテクノロジーとモノクローナル抗体（Hybridoma technology and monoclonal antibodies）」, 121:1-947に記載のような標準プロトコルにしたがって作製できる。
【００５３】
Topecificモノクローナル抗体は、例えばTomlinson et al., 2000,「多価およびtopecificの抗体フラグメントの作製方法（Methods for generating multivalent and topecific antibody fragments）」, Methods Enzymol. 346:461-479に記載のような標準プロトコルにしたがって作製できる。
【００５４】
別の側面では、本発明は、本発明の方法を使用して単離されたペプチドをエンコードする核酸分子に関する。
【００５５】
該核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってよく、場合に応じて、癌性疾患の免疫療法に同様に使用することができる。
【００５６】
また本発明では、本核酸分子をベクター中に存在させることができる。
【００５７】
さらにまた、本発明は、本発明にしたがって同定されたペプチドを生産するように本核酸分子で遺伝子改変されている細胞に関する。
【００５８】
さらにまた、本発明は、腫瘍関連ペプチドの製造方法であって、上記方法に基づいてペプチドを同定し、該同定ペプチドをインビトロまたはインビボで化学合成する方法に関する。
【００５９】
ペプチドの製造は、アミノ酸の化学反応、例えばMerrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154に記載のメリフィールドの方法によって行うことができる。
【００６０】
インビトロでは、例えば無細胞発現系でペプチドを製造でき、インビボでは、原核細胞および真核細胞でペプチドを製造できる。
【００６１】
本発明の好ましい実施態様は、以下の段階を含むワクチンの製造方法である：
（ａ）上記方法を実施する段階、
（ｂ）段階（ｉ）で同定された腫瘍関連ペプチドを製造する段階、および
（ｃ）段階（ｊ）で製造された腫瘍関連ペプチドを製剤化する段階。
【００６２】
さらにまた、本発明は、新規方法を実施し、ペプチドの存在および／または量比を診断マーカーとして使用する診断方法、目的のタンパク質に対する免疫応答を誘発し、この場合、新規方法によって発見された治療有効量の少なくとも１種のペプチドを投与する、病的症状の処置方法、ならびに本発明の少なくとも１種のペプチドのアミノ酸配列および／または本発明のペプチドをエンコードする核酸分子の核酸配列を含有する電子記憶媒体に関する。
【００６３】
上記特徴および以下でさらに説明される対象の特徴は、本明細書中で明示的に記載されるその組み合わせでだけでなく、本発明の範囲から逸脱することなく、他の組み合わせまたは単独でも使用できることが理解される。
【００６４】
以下、図面および実施例において本発明の実施態様を提供し、説明する。
【実施例１】
【００６５】
実験方法
患者サンプル
Universitatsklinikum der Universitat Tubingenの一般外科学科から、組織学的に確認された結腸癌を有する患者由来のサンプルを入手した。該患者（以下、ＣＣＡ１２９と称する）はＨＬＡクラスＩ型ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊６８、ＨＬＡ−Ｂ＊０８、ＨＬＡ−Ｂ＊４４を有した。
【００６６】
セルライン
Awellsセルラインを使用した（European Collection of Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, United Kingdom）。このセルラインはＨＬＡクラスＩ型ＨＬＡ−Ａ＊０２、ＨＬＡ−Ｂ＊４４を有する。
【００６７】
ケラチン１８でトランスフェクトされたセルライン
標準プロトコルにしたがって、ヒトケラチン１８のＤＮＡ配列でAwellsセルラインを安定にトランスフェクトした。そのために、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen, Karlsruhe, Germany）を使用して、ヒトケラチン１８をエンコードするｃＤＮＡをサブクローニングした。その後、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３−ＩｉのＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩの制限エンドヌクレアーゼ切断部位間で、Ｉｉ配列を有するフレームでクローニングを行った。Awells細胞のトランスフェクションは、エレクトロポレーションを用いて実施した。そして安定なトランスフェクタントを選択し、培養中で維持した。
【００６８】
ＨＬＡクラスＩ結合型ペプチドの単離
外科的除去後に液体窒素中でショック急速冷凍した組織サンプルを、Schirle et al.,「Ｔ細胞に依存しない新規アプローチによる腫瘍関連ＭＨＣクラスＩリガンドの同定（Identification of tumour-associated MHC class I ligands by a novel T cell independent approach）」, 2000, European Journal of Immunology, 30:2216-2225に既述のように処理した。標準プロトコルにしたがって、具体的にはＨＬＡクラスＩ分子に特異的なモノクローナル抗体Ｗ６／３２を使用してペプチドを単離した。Barnstable et al.,「Ａ群赤血球、ＨＬＡおよび他のヒト細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体の作製−遺伝子解析用の新規ツール（Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes, HLA and other human cell surface antigens - new tools for genetic analysis）」, 1978, Cell, 14:9-20には、この抗体の作製および使用が記載される。
【００６９】
ペプチドのアセチル化
１Ｈ６−アセチル−無水物または２Ｄ６−アセチル−無水物（メタノール中の５０容量％溶液）１０μｌを、５０（容量）％メタノール／水−混合物中のペプチド混合物（混合物中のペプチドの量：２ｎｍｏｌｅ〜２００ｐｍｏｌｅの範囲）１００μｌに加えた。化学反応を室温で１５分間行った。ギ酸１．１μｌを加えて反応を停止した。その後、両調製物から同一の容量をとり、混合した。
【００７０】
ペプチドのグアジネーション
クエン酸バッファー（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０）中の、腫瘍組織（ＣＣＡ１２９）、またはケラチン１８でトランスフェクトされたAwells細胞またはトランスフェクトされていないAwells細胞由来のペプチド混合物（混合物中のペプチドの量：２ｎｍｏｌｅ〜２００ｐｍｏｌｅの範囲）に、０．２５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、容量単位）を加え、その後、水酸化ナトリウム（１０Ｍ溶液）２００μｌで混合物のｐＨを１０．５に調節した。Ｏ−メチル−イソ尿素−ヘミサルファート溶液（水中２．５Ｍ）１ｍｌを加えた後、反応混合物を６５℃で１０分間インキュベートした（水浴）。ギ酸２００μｌを加えて反応を停止した。
【００７１】
グアジナート化ペプチドのニコチネーション
グアジネーションによって化学修飾した腫瘍組織（ＣＣＡ１２９）、またはケラチン１８でトランスフェクトされたAwells細胞またはトランスフェクトされていないAwells細胞由来のペプチド混合物を「逆相Ｃ−１８微小カラム」（Agilent Technologies hydrophobic XGSXB）タイプのクロマトグラフィーカラムに積載し、水０．５ｍｌで洗浄した。次いで、カラムの材料に結合しているペプチドをカラム上に残し、室温での化学反応によってニコチナート化した。この化学反応は、新たに調製した１Ｈ４−または２Ｄ４−ニコチニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−エステル（リン酸ナトリウムバッファー５０ｍＭ；ｐＨ８．５）１ｍｌをゆっくり加えることによって行った。その後、ペプチド混合物を積載したクロマトグラフィーカラムを通して、再度、新たに調製した１Ｈ４−または２Ｄ４−ニコチニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−エステル１ｍｌをゆっくりアプライした。次いで、カラムを通してヒドロキシルアミンをアプライして、ニコチニル基によるチロシン残基の望ましくない修飾を再度除去した。最後に、クロマトグラフィーカラムを水で洗浄した後、５０（容量）％アセトニトリル／水−混合物１００μｌを用いてカラムからペプチドを溶出させた。
【００７２】
オフライン高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるペプチド混合物の分離
本様式で化学修飾したペプチドの混合物を等モル比で混合し、減圧遠心分離によってその容量を約１００μｌに減らした。０．０８（容量）％ＴＦＡを含む水４００μｌを用いて前記減少した混合物を希釈した後、自動サンプル注入によって、SMART-HPLC-system（Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany）に取り付けられているμRP SC C2/C18, 100 mm x 2.1 mm（Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany）タイプの「逆相」クロマトグラフィーカラムに積載した。カラムの材料に結合しているペプチドのクロマトグラフィーによる分離および溶出では、２種の溶媒混合物ＡおよびＢからなる２成分勾配を使用した。溶媒混合物Ａは水中の０．１（容量）％ＴＦＡを含有した。溶媒混合物Ｂは水中の０．０８％ＴＦＡおよび８０％アセトニトリル（ともに容量単位）を含有した。２成分勾配は９０％溶媒混合物Ａおよび１０％溶媒混合物Ｂで出発し、４０％溶媒混合物Ａおよび６０％溶媒混合物Ｂの混合比までの線形過程をとった。各フラクションあたり１５０μｌの容量を有するフラクションに溶出液を回収した。クロマトグラフィーによって分離されたペプチドを質量分析によって評価する前に、回収されたフラクションを減圧遠心分離によって完全に乾燥し、その後、５０％メタノール、４９．９％水および０．１％ギ酸の混合物に再溶解した。
【００７３】
マイクロキャピラリー−液体クロマトグラフィー−質量分析
マイクロエレクトロスプレーイオン化源を備えたハイブリッド四重極型（quadropol）質量分析装置（「直交加速飛行時間型質量分析計（orthogonal acceleration time of flight mass spectrometer）」, Micromass, Manchester, United Kingdom）に取り付けられた逆相ＨＰＬＣ系（「reversed phase Ultimate HPLC System」, Dionex, Amsterdam, The Netherlands）を活用して、これらのペプチド混合物を分析した。この分析では、サンプル材料をまず脱塩し、サイズ３００μｍ ｘ ５ｍｍを有するＣ１８プレカラム（LC Packings, Amsterdam, the Netherlands）でプレ濃縮する。１００μｌシリンジ（1710 RNR, Hamilton）が取り付けられているシリンジポンプ（Harvard Apparatus, Inc.）を使用し、２μｌ／分の速度で溶媒およびサンプルを加えた。ペプチド混合物を積載したプレカラムを流動方向でシリカカラム（７５μｍ ｘ ２５０ｍｍ、Dionex, Amsterdam, The Netherlands）の前に配置する。このシリカカラムは「reversed phase Ultimate」-HPLC-systemに取り付けられていて、Ｃ１８逆相材料（C18-reversed-phase material）（５μｍ、Dionex, Amsterdam, The Netherlands）が積載されている。結合ペプチドの溶出では、２成分勾配を１２０分間アプライした。この勾配は１５％溶媒Ａ（水中の４ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ３．０）および８５％溶媒Ｂ（容量単位で８０％アセトニトリルおよび２０％水の混合物中の２ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ３．０）で出発し、４０％溶媒Ａおよび６０％溶媒Ｂの混合比に達した。Ultimate split-system（Dionex, Amsterdam, The Netherlands）によって、ペプチド溶出中のフロースルー速度を約３００μｌ／分に低下させた。金でコーティングされたガラスキャピラリー（PicoTip, New Objective, Cambridge/Massachusetts, U.S.A.）によってマイクロＥＳＩ源中に溶出液を導入した。「飛行時間」分析の積分時間（integration time）（ＴＯＦ分析計）を１秒に設定し、２分析間の保持時間は１／１０秒であった。重水素（２Ｄ）原子を有する化学修飾ペプチドと通常の水素（１Ｈ）原子を有する同一のアミノ酸配列に基づくペプチドの比を、ピーク（質量分析による分析から生成したシグナルの測定ピーク）の相対的な高さを比較することによって決定した。
【００７４】
アミノ酸配列を決定するためのペプチドのオンライン断片化（ＨＰＬＣ−ＭＳＭＳ）を実施した。この場合、「飛行時間」分析の積分時間（ＴＯＦ分析計）は４秒であり、２分析間の保持時間は１／１０秒であり、それ以外は上記のように実施した。処理中、［Ｍ＋Ｈ］＋および［Ｍ＋Ｈ］２＋イオンのオンライン断片化は、ＨＰＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣ−ＭＳＭＳ方式間で自動的に切り換えた。質量分析から得られたスペクトルを手動で分析した。ＭＡＳＣＯＴ（http://www.matrixscience.com）を使用し、データベースとしてＮＣＢＩｎｒおよびＥＳＴを使用した。
【００７５】
別の好ましい実施態様では、少ないサンプル容量に関して、マイクロＥＳＩ源へのサンプルの積載に関するフロースルーの割合をさらに低下させるため、ＨＰＬＣ系の代わりに金属でコーティングされたガラスキャピラリー（Proxeon, Odense, Denmark）を使用することもできる。それにより、２０ｎｌ／分〜５０ｎｌ／分の流動速度が可能になる。本実施態様では、重水素（２Ｄ）原子を有する化学修飾ペプチドと通常の水素（１Ｈ）原子を有する同一のアミノ酸配列に基づくペプチドの比を、ピーク（質量分析による分析から生成するシグナルの測定ピーク）の相対的な高さおよび数学的に積分されたピークの相対的な面積を比較することによって決定する。また、本実施態様では、ＨＰＬＣ−ＭＳＭＳ方式でのペプチドの断片化が可能である。この断片化は、［Ｍ＋Ｈ］＋イオン化断片に関しては３０〜６０ｅＶ、［Ｍ＋Ｈ］２＋イオン化断片に関しては２０〜３０ｅＶの衝突エネルギーで実施する。本実施態様では、飛行時間分析の積分時間（ＴＯＦ分析計）は１秒であり、２分析間に１／１０秒の保持時間を導入する。
【００７６】
結果
図１は、ＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドの差次的な決定および同定の一般的原理を説明する。本方法では、２種の異なる供給源由来のペプチドを反応性化学基で処理する。これは特定の水素種（軽水素：１Ｈ；重水素：２Ｄ）の有無に基づいて識別でき、分離に使用される異なる水素同位体によって達成される物理的特性が修飾ペプチドの化学的特性に関する検出可能な影響を有することはない。化学修飾によって生成したペプチド誘導体を一緒にし、すなわち混合し、あるいは集合させ、その一次アミノ酸配列に基づく、その疎水性または親水性に応じて、それぞれ、クロマトグラフィー（「オフライン」ＨＰＬＣまたは「オンライン」ＨＰＬＣ−ＭＳ）によって分離する。後の質量分析による分析によって測定される特定の質量／電荷シグナルのシグナル強度は、異なる供給源から取得された同一の一次アミノ酸配列に基づくペプチド間の量に関する相対比の指標である。データベースの使用とともにタンデム型ＭＳＭＳ法を使用すると、個別の事例で存在するペプチドのアミノ酸配列についての追加の情報が提供される。
【００７７】
ＭＨＣクラスＩリガンドのアセチル化は、ペプチドの高速かつ単純な化学修飾法である。合成ペプチド混合物を使用し、実験によって、ペプチドのアセチル化を最適化した。１５分の反応時間（上記）後にペプチドのアミノ末端は完全にアセチル化された。
【００７８】
２Ｄ６−および１Ｈ６−無水酢酸（acetanhydride）をアセチル化に使用して、ペプチドを差次的に定量することが可能である。
実施可能性を実証するために、ＭＧＡＲ細胞からＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドを上記のように取得し、同一容量の２つの部分サンプルに分離し、それぞれ２Ｄ６−および１Ｈ６−無水酢酸で上記のようにアセチル化した。化学反応の終了後、部分サンプルを等モル比で再混合し、２Ｄ３−および１Ｈ３−アセチル化ペプチド間の相対比を測定した。例として、図２は、アミノ酸配列EVNGLISMYを有するペプチドの２Ｄ３−および１Ｈ３−変種を示す（化学修飾を含まない分子量：１０４０．５Ｄａ）。ペプチドEVNGLISMYは「Ｕ５ ｓｎＲＮＰ特異的タンパク質」由来の断片である。測定されたEVNGLISMYの２Ｄ３−および１Ｈ３−変種間の相対比（２Ｄ３／１Ｈ３比）は１．０であった。同一ＭＧＡＲ細胞から溶出し、質量分析によって単一または２倍荷電イオンとして検出された１５種の追加のペプチドでは、相加平均の２Ｄ３／１Ｈ３比は１．０１であった。標準偏差（ＳＤ）は±０．１３であった（表１）。２種または数種の異なる供給源由来の同一のアミノ酸配列に基づくペプチドの相対的割合の決定が可能になることに加えて、さらに、ペプチドのアセチル化により、１Ｈ３−アセチル化ペプチドと比較して２Ｄ３−アセチル化ペプチドのｂシリーズイオンが３Ｄａ程度シフトするため、対応する質量分光写真の分析が単純化される（図２Ｃ）。一般にｂシリーズイオンとは、アミノ酸一次配列のアミノ末端に位置するアミノ酸残基を少なくとも含有する化学修飾ならびに無修飾ペプチドのイオン化断片である。ｂシリーズイオンとは対照的に、一般にｙシリーズイオンとは、アミノ酸一次配列のカルボキシ末端に位置するアミノ酸残基を少なくとも含有する化学修飾ならびに無修飾ペプチドのイオン化断片である。
【００７９】
ペプチドのアセチル化の不利益は、ペプチドのアミノ末端にアセチル残基を導入することによってイオン化すると、無変化のＮ末端を有するペプチドと比較して正電荷が失われる可能性があることである。一般に、複数の電荷を有するペプチドは、質量分析において単一荷電のものより良好に検出できることを理由に、アセチル化は感度の低下を招く。また、実施された実験では、追加的にリシン残基のε−アミノ基のアセチル化が生じ得ることが示された。このリシン残基のε−アミノ基のアセチル化によっても、イオン化に起因して、アセチル化で化学修飾されていないペプチドより少ない正電荷しか創出できないことになる。それにもかかわらず、付随する感度の低下は、使用対象である異なる供給源由来のペプチドの基礎をなす同一の一次アミノ酸配列に関して同一の程度に有効であり、したがって、同一の配列を有する、一方では２Ｄ３−、他方では１Ｈ３−アセチル化ペプチドの各シグナル間の内部比については、検出可能な影響がないことになる。
【００８０】
２Ｄ３−および１Ｈ３−アセチル化を使用する、結腸腫瘍の組織サンプルおよび該腫瘍の周囲の正常組織の組織サンプル由来のＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドの同定およびエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）に基づく質量分析による分析での該ＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドの相対量の比較。
結腸癌サンプル（ＣＣＡ１２９）のＭＨＣクラスＩ分子および該腫瘍の周囲の外科的に除去された正常組織サンプルのＭＨＣクラスＩ分子由来のペプチドを上記のように単離し、その後、２Ｄ３−（腫瘍）および１Ｈ３−（正常組織）アセチル化によって化学修飾した。マイクロボアＨＰＬＣによるクロマトグラフィーによって修飾ペプチドを分離した後、上記ナノＥＳＩ−ＭＳによって１９種のペプチドを同定した。これらの１９種のペプチドのうち、１７種に関して、腫瘍組織サンプルの特定ペプチドと、同一のアミノ酸配列に基づく正常組織サンプルのペプチド間の相対的な比較の量比を上記のように決定できた。ほとんどの同定ペプチドは、検査対象の両サンプル中において同様の量（１．０７〜２．４２の範囲の２Ｄ３／１Ｈ３比）で存在した。概して、正常組織サンプルと比較して腫瘍サンプル中には、１．７倍量のペプチドが存在した。２種のペプチドは腫瘍組織で過剰発現され、１種のペプチドは腫瘍において発現が低下していた。「studentのｔ検定」を使用して上記結果を統計学的に評価すると、２種の過剰発現ペプチドおよび１種の発現低下ペプチドのみが０．８７〜２．５６の９９．９９％信頼区間の外側に位置することが確認された。
【００８１】
腫瘍で過剰発現される２種のペプチドは、ヒトタンパク質であるリボソームタンパク質Ｌ２４およびベータ−カテニン由来であった。リボソームタンパク質Ｌ２４について腫瘍関連性に関するデータはほとんど存在しないが、リボソームタンパク質Ｌ２４に関連するリボソームタンパク質Ｌ１５については、Wang et al., 2001,「食道癌で過剰発現された完全長ヒトリボソームタンパク質Ｌ１５ｃＤＮＡのクローニングおよび特徴付け（Cloning and characterisation of full-length human ribosomal protein L15 cDNA which was over-expressed in oesophageal cancer）」, Gene 263:205-209によって食道癌の発生に関する役割が報告された。一方、ベータ−カテニンについては、トランス活性化によって他の発癌遺伝子、例えばマトリックス−メタロプロテイナーゼＭＭＰ−７のスイッチを入れる発癌遺伝子としての機能が、Ougolkov et al., 2002,「発癌性ベータ−カテニンおよびＭＭＰ−７（マトリリシン）は末期臨床結腸癌において同時分離する（Oncogenic beta-catenin and MMP-7 (matrilysin) cosegregate in late-stage clinical colon cancer）」, Gastroenterology 122: 60-71によって報告された。変異ベータ−カテニンペプチドは、ＣＤ８陽性、皮膚癌浸潤性Ｔ細胞のヒトＭＨＣアレルＨＬＡ−Ａ＊２４に関連する標的構造として、Robbins et al., 1996,「変異ベータ−カテニン遺伝子は腫瘍浸潤性リンパ球によって認識されるメラノーマ特異的抗原をエンコードする（A mutated beta-catenin gene encodes a melanoma-specific antigen recognised by tumour-infiltrating lymphocytes）」, Journal of Experimental Medicine 183:1185-1192によって報告された。
【００８２】
Ｏ−メチル−イソ尿素−ヘミサルファートおよびニコチニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（ＮｉｃＮＨＳ）によるペプチドの化学修飾後のＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドの改良された収率。
Ｏ−メチル−イソ尿素−ヘミサルファートによるペプチド中のリシン残基のε−アミノ基の一律グアジネーション、およびＮｉｃＮＨＳによるペプチドのα−アミノ基のニコチネーションの組み合わせに基づくペプチドの２通りの化学修飾法を、初めて新規に組み合わせたことによって、ペプチドのイオン化が明らかに改良された（図４）。化学修飾ペプチドの脱塩を単純化するために、Ｃ１８クロマトグラフィーカラムで上記のようにペプチドのニコチネーションを実施する。修飾ペプチドをヒドロキシルアミンで処理することによって、ニコチネーションに起因するチロシン残基の側鎖の望ましくない修飾をさらに除去することができた。例として、図４は、アミノ酸配列AETSYVKLを有するペプチドに基づいて、化学的に無修飾のペプチドの場合と同程度に良好にニコチナート化ペプチドが検出されるようにＮ末端のニコチネーションがイオン化に影響することを示す。
【００８３】
ペプチドのグアジネーションおよび２Ｄ４−／１Ｈ４−ニコチネーションに基づく、Awellsセルラインおよび、ヒトケラチン１８のｃＤＮＡを含有するプラスミドでトランスフェクトされたAwellsセルライン由来のＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドの同定および定量。
Trask et al., 1990,「正常および腫瘍由来の哺乳類上皮細胞を識別するマーカーとしてのケラチン（Keratins as markers that distinguish normal and tumour-derived mammary epithelial cells）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:2319-2323によって、ケラチンが腫瘍および健常組織間の識別用マーカーとして適していることが示された。ヒトケラチン１８由来の新規ＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドを同定するため、ならびに典型的な腫瘍抗原に基づく差次的な定量化を証明するために、トランスフェクトされていないAwellsセルライン（Awells）および所定のプラスミドでトランスフェクトされたAwellsセルライン（Awellsケラチン１８）からペプチドを単離した。その後、単離されたペプチド混合物を、それぞれグアジネーションおよび２Ｄ３−、および１Ｈ３−ニコチネーションによって上記のように化学修飾した。この化学修飾ペプチド混合物を混合し、上記ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって検査した。第二の実験をＭＳＭＳ方式で実施し、それにより、トータルで２７種の異なるペプチドのアミノ酸配列を決定できた。発見された全２７種のペプチドは、１０９１.６Ｄａの分子量を有する一種のペプチドを除き、トランスフェクト細胞ならびにトランスフェクトされていない細胞の両細胞において０．６４〜２．２８の信頼区間内に入る量で検出された（「studentのｔ検定」を使用する統計評価）。１０９１.６Ｄａの分子量を有するペプチドでは、ＭＳＭＳ分析によってアミノ酸配列RLASYLDRVが決定された。これはケラチン１８のアミノ酸配列の断片である。配列RLASYLDRVを有するペプチドの同定に至ったＭＳＭＳスペクトルを図３Ｄに示す。ペプチドRLASYLDRVでは、１Ｈ３−ニコチニル残基での一次配列の化学修飾に関連付けることができるシグナルが全く検出できなかった。この観察から、ケラチン１８がAwellsケラチン１８細胞で排他的に発現されたという仮説に至る。一方、２Ｄ３−ニコチニル残基を有するペプチドRLASYLDRVに関するシグナルは、バックグラウンドと比較して６倍高く現れた。
【００８４】
２種の水素同位体１Ｈおよび２Ｄを使用するペプチドのグアジネーションおよびニコチネーションの上記方法によって、２種またはそれ以上の異なる供給源由来の同一の配列を有するペプチド間の相対的な定量的差異を高速かつ正確に決定することが初めて可能になる。同一器官の腫瘍組織および正常組織のサンプルに関するペプチドのグアジネーションおよびニコチネーション方法の使用によって、あるいは発癌遺伝子または他の腫瘍関連遺伝子産物をエンコードする核酸であらかじめトランスフェクトされたセルラインに関する該方法の使用によって、癌治療用ワクチンの製造に特に適した腫瘍関連ペプチド抗原を決定できる。
【００８５】
表１〜３は上記結果をまとめ、表４は、同定ペプチドとタンパク質供給源の関連性を示し、さらに配列表由来の各配列番号を示す。配列表は本発明のペプチドを示す。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】本発明の腫瘍関連ペプチドの同定および定量方法の概要を示す；
【図２】（Ａ）無修飾および（Ｂ）１Ｈ３／２Ｄ３−アセチル化ペプチドの質量分光法による分析を示す。（Ｃ）例として、アミノ酸配列EVNGLISMYを有する無修飾ペプチドならびに１Ｈ３−アセチル化ペプチド、および２Ｄ３−アセチル化ペプチドを含有するペプチド混合物の質量分光法による分析；（Ｄ）は図２で使用される命名法を説明する；
【図３】２種の異なる供給源由来の抗原ペプチドの比較定量を示し、この場合、（Ａ）では、２種の組織サンプル（同一患者由来の結腸癌サンプル、健常組織サンプル）由来の３種の異なるペプチドの相対的な量比の質量分光法による分析を示す。結腸癌サンプルから単離されたペプチドを２Ｄ３−アセチル化した。健常組織サンプルから単離されたペプチドを１Ｈ３−アセチル化した。（Ｂ）は、１Ｈ４−ニコチナート化（nicotinated）／グアジナート化（guadinated）Awells細胞、およびケラチン１８でトランスフェクトされたAwells細胞、および２Ｄ４−ニコチナート化／グアジナート化Awells細胞由来の３種の異なるペプチドの質量分光法による分析を示す。（Ｃ）は、断片化に基づく、アミノ酸配列DAAHPTNVQRを有する１Ｈ３−アセチル化ペプチドおよびアミノ酸配列DAAHPTNVQRを有する２Ｄ３−アセチル化ペプチドのアミノ酸配列の決定を示す；
【図４】４種の異なる様式で化学修飾されたペプチドの収率を示す。アミノ酸配列AETSYVKVL、KLSLGLPGL、SLGLQLAKVおよびVLDPRGIYLを有する４種のペプチドを混合物中で等モル量で使用し、その後、３種の化学修飾ストラテジーを比較検査する目的で、アセチル化、またはアセチル化およびグアジナート化、またはグアジナート化およびニコチナート化した。参照ペプチドを修飾する化学反応の完了後に、最初に使用された無修飾ペプチドとこれらを混合し、次の分析段階での比較を可能にした。ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析（ナノＥＳＩ−ＭＳ）を用いて分析することによって比較評価を実施した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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