(57)【要約】本発明は、改良されたオリゴマー化合物、とりわけ、オリゴヌクレオチド化合物、およびヒトにおいてＢｃｌ−２遺伝子の発現をモデュレートする方法を提供する。とりわけ、本発明は、長さが１０〜３０ヌクレオチドのオリゴマー化合物であって、ヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域に特異的にハイブリダイズすることのできる標的結合ドメインを含み、該標的結合ドメインが、式：5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'を有し、該標的結合ドメインが、ホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）によって連結された少なくとも２つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含むオリゴマー化合物に関する。とりわけ、該オリゴは優性にまたは完全にチオール化されている。本発明はまた、Ｂｃｌ−２遺伝子の発現と関連する様々な疾患、たとえば、癌の治療のためのそのようなオリゴマーまたはコンジュゲートまたはキメラの使用をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さが１０〜３０ヌクレオチドのオリゴマー化合物であって、ヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域に特異的にハイブリダイズすることのできる標的結合ドメインを含み、該標的結合ドメインが、式：
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
（式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す）を有し、該標的結合ドメインが、ホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）によって連結された少なくとも２つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含むオリゴマー化合物。
【請求項２】
標的結合ドメイン中の実質的な数のヌクレオチド結合がホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
オリゴマー化合物中の全てのヌクレオチド結合がホスホロチオエート基である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
標的結合ドメイン中のヌクレオ塩基の１０〜５０％がLNAヌクレオチドのヌクレオ塩基である、請求項１ないし３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
標的結合ドメインが、式：5'-[LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7-(DNA/RNA)]-3'を有する、請求項１ないし４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
標的結合ドメインが、式：5'-[(DNA/RNA)-LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7-(DNA/RNA)]-3'を有する、請求項１ないし４のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
標的結合ドメインが、式：5'-[(DNA/RNA)-LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7]-3'を有する、請求項１ないし４のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
標的結合ドメインが、式：5'-[LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7]-3'を有する、請求項１ないし４のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
標的結合ドメイン中のヌクレオ塩基の１０〜１００％がLNAアナログヌクレオチド（LNA*）のヌクレオ塩基である、請求項１ないし８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
標的結合ドメインが、２までの非相補的なヌクレオ塩基を例外として、それが特異的にハイブリダイズするヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域の部分に相補的である、請求項１ないし９のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
標的結合ドメインが、それが特異的にハイブリダイズするヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域の部分に相補的である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
標的結合ドメインが、SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 35, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, および52よりなる群から選ばれる、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
標的結合ドメインが、SEQ ID NO: 8である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
標的結合ドメインが、SEQ ID NO: 35である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
標的結合ドメインが、１〜２の非相補的なヌクレオ塩基を例外として、それが特異的にハイブリダイズするヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域の部分に相補的である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１６】
標的結合ドメインが、ＣＣＣＡＸＣＧＴサブ配列（式中、ＸはＧ（グアニン）ではない）を含む、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
標的結合ドメインが、SEQ ID NO: 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 53, 54および55よりなる群から選ばれる、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
標的結合ドメインが、SEQ ID NO: 15である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
標的結合ドメインが、SEQ ID NO: 29である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
請求項１ないし１９のいずれかに記載のオリゴマー化合物および該化合物に共有結合した少なくとも１の非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド残基を含むコンジュゲート。
【請求項２１】
請求項１ないし１９のいずれかに記載のオリゴマー化合物または請求項２０に記載のコンジュゲート、および薬理学的に許容しうる担体を含む医薬組成物。
【請求項２２】
化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物、細胞増殖抑制化合物、抗血管形成化合物、抗増殖化合物、アポトーシス促進化合物、シグナル伝達モデュレーター、およびキナーゼインヒビターよりなる群から選ばれたさらなる薬剤を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
医薬として使用するための請求項１ないし１９のいずれかに記載のオリゴマー化合物または請求項２０に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
癌疾患の治療のための医薬を製造するための請求項１ないし１９のいずれかに記載のオリゴマー化合物または請求項２０に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項２５】
ヒトＢｃｌ−２タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズした化合物を含む複合体であって、該化合物が、請求項１ないし１９のいずれかに記載のオリゴマー化合物または請求項２０に記載のコンジュゲートである、複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良されたオリゴマー化合物およびヒトにおいてＢｃｌ−２遺伝子の発現をモデュレートする方法に関する。詳細には、本発明は、長さが１０〜３０ヌクレオチド塩基のオリゴマー化合物に関し、該化合物は、ヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域に特異的にハイブリダイズすることのできる標的結合ドメインを含み、該標的結合ドメインは、ホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）によって連結された少なくとも２つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含む。
【０００２】
それゆえ、本発明は、ヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡに対して向けられ、ヒトＢｃｌ−２タンパク質の生合成をモデュレートすることのできるアンチセンスオリゴマー化合物に関する。本発明はさらに、そのようなオリゴマー化合物を含む医薬組成物、その使用およびそのようなオリゴマー化合物を用いた治療および診断方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトＢｃｌ−２は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）のプロセスと密接に関連するタンパク質である。アポトーシスは、発生、正常な細胞の代謝回転、およびホルモンにより誘発された組織萎縮に関与する、活動性の厳密に制御された生理プロセスである。プログラムされた細胞死の欠如は、癌、および他の過剰増殖性疾患（再狭窄、線維症、乾癬またはある種のアレルギー疾患など）において、とりわけ腫瘍の進行において重要な役割を果たしており、重要なことには、抗新生物治療プログラム、とりわけ標準化学療法化合物に対する耐性の臨床的問題に寄与している。大抵の正常な組織とは対照的に、小細胞肺癌（small cell lung cancer）（ＳＣＬＣ）や非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの悪性腫瘍では、Ｂｃｌ−２はしばしば同時発現される。
【０００４】
WO 95/08350は、アンチコード（anticode）オリゴマーおよびそれを用いたＢｃｌ−２遺伝子を発現する癌細胞の増殖を制御する方法を開示している。
【０００５】
Klasaら、Antisense & Nucleic Acid Drug Development 12: 1993-213 (2002) (概説)は、化合物オブリマーセンナトリウム（oblimersen sodium）（G3139）の生物学的作用およびアンチセンス薬剤としてのその可能性を検討している。この化合物は、構造：5'-d(P-チオ)TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT-3'を有する。Genta Incorporatedは、オブリマーセンナトリウム（G3139）とダカーバジン（dacarbazine）（DTIC）についてＦＤＡにＤＮＡを提出した。それは、転移黒色腫についての最も重要な化学療法としてDTIC単独に対するオブリマーセンナトリウム（G3139）とダカーバジン（DTIC）の各３週間毎の国際的で複数の医療機関にまたがるランダムなフェーズ３の研究に基づいていた。２００４年５月に、該研究が、G3139とDTICとの組み合わせからは生存利益を示すことができなかったことが報告された。組み合わせ部門（arm）は毒性の増大および副作用事象（AEs）による治療打ち切りを伴っており、DTIC単独部門での39人（10.8%）に対してG3139部門で副作用事象のために治療を打ち切った69人（18.6%）の患者を含んでいた。重篤な副作用事象（SAEs）の割合は、G3139部門で40%に対しDTIC部門で27%であった。これら２つの部門でのDTICの投与量は同じであったので、毒性の増大はG3139の添加によるものと思われた。生存は改善することなく、毒性は増大した。NDAはその後、取り止められた。しかしながら、二次終点（secondary endpoints）についてのスポンサーの分析は、DTICでの49日から組み合わせでの74日まで（25日の差違（p=0.0003, HR=0.73））の中央値から、進行しない生存（progression-free survival）において統計的に有意の利点を示している。スポンサーはまた、DTIC単独での6.8%に対して組み合わせでの11.7%（p=0.019）という応答率での有意の差異を報告した。オブリマーセンナトリウムが二次終点を達成したという事実は、それが転移黒色腫の治療に有効な化合物であることを示している。増大した毒性、一次終点の選択および全体的な臨床後遺症デザイン（overall clinical trail design）が、失敗に寄与した因子のすべてであった。
【０００６】
ヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの最初の６のコドンをターゲティングするオリゴヌクレオチドを含むLNAは、Jan Stenvang Jepsenにより抗弁された博士号論文で研究された（2003年５月、University of Copenhagen）。完全に修飾したLNAホスホジエステル（PO）配列、ホスホロジエステルヘッドマー（headmers）（5'末端でLNA/POおよび3'末端でDNA/PSホスホロチオエート）、完全にホスホロジエステルギャップマー（gapmers）（8, 10, 12, 14のギャップサイズ）およびギャップにチオール化のみを有するギャップマー（8, 10, 12, 14のギャップサイズ）を、異なるトランスフェクション剤でのインビトロ取り込みについて、およびＢｃｌ−２タンパク質のダウンレギュレーションについてアッセイした。取り込み研究をMCF-7細胞で行い、その結果を顕微鏡およびフローサイトメトリーにより分析した。すべての異なるPOおよびPO/PS含有構築物について同等に有効な送達が得られた。様々なLNA含有オリゴヌクレオチドおよび構築物が研究されたが、Stenvang Jepsenは、おそらくホスホロチオエート化が親和性の低下を引き起こすであろうため、および安定性の問題が認められなかったため、標的結合ドメイン（LNAフランクを含む）中の実質的な数のヌクレオチド結合がホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）であるLNA含有オリゴデオキシヌクレオチドギャップマーを開示または予期していなかった。
【０００７】
Friedenら（Nucleic Acid Research, 2003, Vol. 31, No. 21, 6365-6373）およびWO 2004/046160 A2は、インビトロ実験に基づきアンチセンスオリゴヌクレオチドのデザインに関する様々な考慮を開示している。
【０００８】
Fluiterら（Nucleic Acid Research, 2003, Vol. 3, 953-962）は、LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボ腫瘍増殖抑制および生体分布研究を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の点に鑑み、とりわけオブリマーセンナトリウム化合物に関連する効力に鑑み、Ｂｃｌ−２をダウンレギュレーションするための改良されたオリゴマー化合物に対する必要性が依然として存在する。そのような化合物は、分布およびＢｃｌ−２のダウンレギュレーションに関して適切なインビボプロフィルを有することによって、様々なＢｃｌ−２関連状態、とりわけ癌と関連する治療学的妥当性を有するのが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、今や、ギャップマー型のある種の新規なLNAオリゴヌクレオチド化合物が、オブリマーセンナトリウムに匹敵するかまたはより優れた生物学的作用を示すが、薬理学的に関連投与量で副作用事象がモニターされないことを見出した。
【００１１】
さらに詳細には、本発明者らは、長さが１０〜３０ヌクレオチドのオリゴマー化合物であって、ヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域に特異的にハイブリダイズすることのできる標的結合ドメインを含み、該標的結合ドメインが、式：
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
（式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す）を有し、該標的結合ドメイン中にホスホロチオエート基によって連結された少なくとも２つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含むオリゴマー化合物が、興味深い生物学的特性を有することを見出した。
【００１２】
発明の説明
上記のように、本発明者らは、長さが１０〜３０ヌクレオチドのオリゴマー化合物であって、ヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域に特異的にハイブリダイズすることのできる標的結合ドメインを含み、該標的結合ドメインが、式：
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
（式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す）を有し、該標的結合ドメイン中にホスホロチオエート基によって連結された少なくとも２つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含むオリゴマー化合物が、興味深い生物学的特性を有することを見出した。
【００１３】
一般に、本明細書で定めるオリゴマー化合物は、公知のオリゴマー化合物と比較して改善された特性を有すると考えられる。「改善された特性」との表現は、それによってオリゴマー化合物がそのホスホロチオエート対応物と比較してより良好なまたは等価な全体的性能を示す１またはそれ以上のパラメーターと理解される。
【００１４】
そのような改善されたパラメーターの例は、薬剤のより長い貯蔵寿命、標的に対するより高い結合定数（オリゴマー化合物またはｍＲＮＡ標的における当座の定数（interim complement））、細胞外および細胞内ヌクレアーゼに対する良好な耐性、作用様式における高い効力、より良好な表現型応答、より長い作用持続時間、より良好な化学物質感度、および改善された患者の便宜である。等価なパラメーターの例は、製造の容易さ、医薬製剤化の容易さ、組織分布、良好な安全性プロフィルである。
【００１５】
要約すると、本明細書に定めるオリゴマー化合物は、Ｂｃｌ−２ｍＲＮＡのダウンレギュレーションに関して、タンパク質のダウンレギュレーション（1nMから変化したＢｃｌ−２／Ｂａｘ比）に関して、および細胞増殖の抑制に関して、非常に低いナノモル範囲（5nM）のIC50値を示す。オブリマーセンおよびJepsenの化合物について観察されたもの（400nMで有意なレベルのダウンレギュレーションを認めることができる）より遙かに優れたレベルである。さらに、細胞死はアポトーシスの誘発と強い相関関係を有しており、示されたアポトーシスの誘発のレベルはオブリマーセンよりも遙かに優れている。さらに、本明細書に定めるオリゴマー化合物は、オブリマーセンと比べてラット血漿において実質的に増大した安定性、および組織において一層長い半減期を示す。繰り返された抗腫瘍応答が前立腺および黒色腫モデルにおいて観察された；1mg/Kg/日においてさえも応答。さらに、オブリマーセンについて文献に記載されている通常の投与量と比較して、該化合物のより低い頻度の投与量での抗腫瘍応答も観察された。ASAT、ALATの上昇などの薬理学的関連レベルでの副作用事象もまたモニターされなかった。本発明者らの知見は、Jepsenの構築物（機能的応答、安定性、組織中での半減期、インビボ応答、臨床化学または生体分布をアッセイしていない）を凌駕するものである。
【００１６】
本明細書において定めるヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの配列は、ジーンバンクデータベースにおいてM13994のアクセッション番号のもと、HUMBcl2Aとしてアクセスできる。本願との関連において、核酸、とりわけｍＲＮＡまたは対応のｃＤＮＡ配列の番号付けは、該アクセッション番号のもとに該データベースに含まれるヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの各番号付けに関する。対応ｃＤＮＡ配列は、とりわけｃＤＮＡ配列の塩基ＴをｍＲＮＡ配列中の塩基Ｕにより、またはその逆にて交換することにより、ｍＲＮＡ配列から導き出すことができる。
【００１７】
オリゴマー化合物
オリゴマー化合物は、それが標的結合ドメイン中にホスホロチオエート基によって連結された少なくとも２つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【００１８】
本明細書において「標的結合ドメイン」なる語は、特異的な標的配列、本明細書ではヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域に結合するオリゴマー化合物のドメイン（または、そのようなオリゴマー化合物）をいう。
【００１９】
一つの態様において、該標的結合ドメインは、ホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）によって連結された少なくとも２つのLNAヌクレオチドを含む。
【００２０】
他の態様において、該標的結合ドメインは、ホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）によって連結された少なくとも２つのLNAアナログヌクレオチドを含む。
【００２１】
本明細書において「オリゴマー化合物」なる語は、LNAオリゴヌクレオチド、すなわち、その中の１またはそれ以上の（または全ての）ヌクレオチドがLNAヌクレオチドまたはLNAヌクレオチド、とりわけ少なくとも２つのLNAヌクレオチドでの置換により修飾され、さらにLNAアナログヌクレオチドおよびヌクレオチド誘導体／アナログでさらに置換されていてよいリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）をいう。
【００２２】
「オリゴヌクレオチド」なる語は、天然に存在するヌクレオ塩基、糖およびインターヌクレオシド（骨格）結合からなるオリゴヌクレオチド、並びに天然に存在しない部分であって同様に機能するかまたは特異的な改良された機能を有するものを有するオリゴヌクレオチドを包含する。
【００２３】
本発明との関連において使用すべきオリゴマー化合物は、長さが１０〜３０ヌクレオチド、たとえば、１０〜２０などの１０〜２５、たとえば、１０〜１８、または１０〜１６、または１５〜１７ヌクレオチドである。
【００２４】
「の長さのヌクレオ塩基」なる語は、線状の相補的核酸分子にハイブリダイゼーションしたときのヌクレオ塩基の数、すなわち、オリゴマー化合物がハイブリダイズした領域の相補的核酸のヌクレオ塩基の全数としての長さをいう。それゆえ、オリゴマー化合物の長さは、ヌクレオ塩基の存在しない中間的なヌクレオチドを包含する。
【００２５】
一つの主要な態様において、本発明のオリゴマー化合物（LNAオリゴヌクレオチド）は少なくとも２つのLNAオリゴヌクレオチドを含む。
【００２６】
さらなる態様において、本発明のオリゴマー化合物（LNAオリゴヌクレオチド）は少なくとも２つのLNAアナログオリゴヌクレオチド、およびおそらく１またはそれ以上のLNAヌクレオチドを含む。
【００２７】
「少なくとも２つ」なる語は、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17等々の２よりも大きいかまたは２に等しい整数を含む。
【００２８】
「少なくとも１つ」なる語は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17等々の１よりも大きいかまたは１に等しい整数を含む。
【００２９】
ヌクレオシド、ヌクレオシドアナログ、SEQ ID NOなどについて使用する「ａ」なる語は、１またはそれ以上を意図するものである。とりわけ、「・・・よりなる群から選ばれた成員（ヌクレオシド、ヌクレオシドアナログ、SEQ ID NOなど）」なる表現は、言及した成員の１またはそれ以上が選択されてよいことを意図するものである。それゆえ、「Ａ、ＢおよびＣよりなる群から選ばれた成員」などの表現は、Ａ、ＢおよびＣの全ての組み合わせ、すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋ＣおよびＡ＋Ｂ＋Ｃを包含することを意図するものである。
【００３０】
「LNA」（Locked Nucleic Acid）（または「LNAオリゴヌクレオチド」）なる語は、LNAヌクレオチドおよびLNAヌクレオチドアナログとも言及する１またはそれ以上の２環式ヌクレオシドアナログを含むオリゴヌクレオチドをいう。
【００３１】
LNAオリゴヌクレオチド、LNAヌクレオチドおよびLNAアナログヌクレオチドは、一般に、WO 99/14226およびその後の出願、WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250およびPCT/DK02/00488（すべて参照のため本明細書中に引用する）に記載されている。
【００３２】
本願および特許請求の範囲との関連において、本発明者らは、「LNAヌクレオチド」と「LNAアナログヌクレオチド」とを区別する。「LNAヌクレオチド」は、式１：
【化１】
2007515175.tif 000002
で示されるヌクレオチドである。
【００３３】
そのようなLNAヌクレオチドは、しばしば、「β-D-オキシ-LNA」と称される。
【００３４】
式１中のＢはヌクレオ塩基を構成する。ヌクレオ塩基は、天然に存在するヌクレオ塩基並びに天然に存在しないヌクレオ塩基を含む。そのようなヌクレオ塩基の具体例は、アデニン、シトシン、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5-ブロモウラシル、5-プロピルウラシル、5-プロピニル-6-フルオロウラシル、5-メチルチアゾールウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、7-プロピン-7-デアザアデニン、7-プロピン-7-デアザグアニン、および2-クロロ-6-アミノプリンから選ばれる。Ｂの好ましい例は、アデニン、シトシン、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5-ブロモウラシル、5-プロピルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンである。
【００３５】
式１中のＺ＊は、インターヌクレオシド結合および末端基から選ばれ、式１中のＺは、先行するヌクレオチド／ヌクレオシドのインターヌクレオシド結合への結合および末端基から選ばれるが、ただし、当然のことながら、ＺおよびＺ＊の一方のみが末端基でありうる。
【００３６】
Ｚ＊の可能な意味としてのインターヌクレオシド結合は、引き続くヌクレオチド／ヌクレオシドへのインターヌクレオシド結合を意味する。インターヌクレオシド結合の例は、-O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-（式中、RHは、水素およびC1-4-アルキルから選ばれる）である。好ましいインターヌクレオシド結合は、-O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-、および-S-P(O)2-S-である。本発明の特別の特徴は、２つのLNAヌクレオチドが-O-P(O,S)-O-（ホスホロチオエート）基によって連結されていること、すなわち、インターヌクレオシド結合は好ましくはホスホロチオエート基であることである。
【００３７】
本発明の関連において、「C1-4-アルキル」なる語は、線状または分枝状の飽和炭化水素鎖であって、該鎖が、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチルおよびtert-ブチルなどの１〜４の炭素原子を有するものを意味することを意図するものである。
【００３８】
LNAヌクレオチドがオリゴマー化合物の5'-末端ヌクレオチドであるときは、Ｚ＊は末端基である；もしもLNAヌクレオチドがオリゴマー化合物の3'-末端ヌクレオチドであるなら、Ｚが末端基である。そのような末端基は、典型的に、水素原子、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Prot-O-、Act-O-、メルカプト、Prot-S-、Act-S-、C1-6-アルキルチオ、アミノ、Prot-N(RH)-、Act-N(RH)-、モノ-またはジ(C1-6-アルキル)アミノ、任意に置換されたC16-アルコキシ、任意に置換されたC16-アルキル、任意に置換されたC26-アルケニル、任意に置換されたC26-アルケニルオキシ、任意に置換されたC26-アルキニル、任意に置換されたC26-アルキニルオキシ、モノホスフェート、モノチオホスフェート、ジホスフェート、ジチオホスフェート、トリホスフェート、トリチオホスフェート、ＤＮＡインターカレート化剤、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート化剤、リポーター基、リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Prot-O-CH2-、Act-O-CH2-、アミノメチル、Prot-N(RH)-CH2-、Act-N(RH)-CH2-、カルボキシメチル、およびスルホノメチルから選ばれる（ここで、Protは、それぞれ、-OH、-SH、および-NH(RH)の保護基であり、Actは、それぞれ、-OH、-SH、および-NH(RH)の活性化基であり、RHは、水素原子およびC1-6-アルキルから選ばれる）。末端基の好ましい例は、水素原子、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Prot-O-、Act-O-、メルカプト、Prot-S-、Act-S-、C1-6-アルキルチオ、アミノ、Prot-N(RH)-、Act-N(RH)-、モノ-またはジ(C1-6-アルキル)アミノ、任意に置換されたC16-アルコキシ、任意に置換されたC16-アルキル、任意に置換されたモノホスフェート、モノチオホスフェート、ジホスフェート、ジチオホスフェート、トリホスフェート、およびトリチオホスフェートである（ここで、Protは、それぞれ、-OH、-SH、および-NH(RH)の保護基であり、Actは、それぞれ、-OH、-SH、および-NH(RH)の活性化基であり、RHは、水素原子およびC1-6-アルキルから選ばれる）。
【００３９】
ヒドロキシ（およびイオウ）置換基の保護基（Prot）は、置換されたトリチル、たとえば、4,4'-ジメトキシトリチルオキシ（DMT）、4-モノメトキシトリチルオキシ（MMT）、およびトリチルオキシ、任意に置換された9-(9-フェニル)キサンテニルオキシ（ピキシル）、任意に置換されたメトキシテトラヒドロピラニルオキシ（mthp）、シリルオキシ、たとえば、トリメチルシリルオキシ（TMS）、トリイソプロピルシリルオキシ（TIPS）、tert-ブチルジメチルシリルオキシ（TBDMS）、トリエチルシリルオキシ、およびフェニルジメチルシリルオキシ、tert-ブチルエーテル、アセタール（２つのヒドロキシ基を含む）、アシルオキシ、たとえば、アセチルまたはハロゲン置換アセチル、たとえば、クロロアセチルオキシまたはフルオロアセチルオキシ、イソブチリルオキシ、ピバロイルオキシ、ベンゾイルオキシおよび置換されたベンゾイル、メトキシメチルオキシ（MOM）、およびベンジルエーテルまたは置換されたベンジルエーテル、たとえば2,6-ジクロロベンジルオキシ（2,6-Cl2Bzl）を含む。好ましいヒドロキシ（およびイオウ）置換基の保護基（Prot）は、置換されたトリチル、たとえば、4,4'-ジメトキシトリチルオキシ（DMT）、4-モノメトキシトリチルオキシ（MMT）、任意に置換された9-(9-フェニル)キサンテニルオキシ（ピキシル）、任意に置換されたメトキシテトラヒドロピラニルオキシ（mthp）、シリルオキシ、たとえば、トリメチルシリルオキシ（TMS）、トリイソプロピルシリルオキシ（TIPS）、tert-ブチルジメチルシリルオキシ（TBDMS）、トリエチルシリルオキシ、およびフェニルジメチルシリルオキシ、tert-ブチルエーテル、アセタール（２つのヒドロキシ基を含む）、およびアシルオキシ、たとえば、アセチルを含む。
【００４０】
アミノおよびアミド基の保護基の具体例は、フルオレニルメトキシカルボニルアミノ（Fmoc）、tert-ブチルオキシカルボニルアミノ（BOC）、トリフルオロアセチルアミノ、アリルオキシカルボニルアミノ（alloc, AOC）、Zベンジルオキシカルボニルアミノ（Cbz）、置換されたベンジルオキシカルボニルアミノ、たとえば2-クロロベンジルオキシカルボニルアミノ（2-ClZ）、モノメトキシトリチルアミノ（MMT）、ジメトキシトリチルアミノ（DMT）、フタロイルアミノ、および9-(9-フェニル)キサンテニルアミノ（ピクシル）である。好ましい例は、フルオレニルメトキシカルボニルアミノ（Fmoc）、tert-ブチルオキシカルボニルアミノ（BOC）、トリフルオロアセチルアミノ、アリルオキシカルボニルアミノ（alloc, AOC）、モノメトキシトリチルアミノ（MMT）、ジメトキシトリチルアミノ（DMT）、フタロイルアミノである。
【００４１】
基「Act」は、さらにヌクレオチド、固相、タンパク質などにカップリングするための、それぞれ、-OH、-SH、および-NH(RH)の活性化基を示す。上記態様では、Actは活性化基を示す。そのような基は、たとえば、任意に置換されたO-ホスホルアミダイト、任意に置換されたO-ホスホトリエステル、任意に置換されたO-ホスホジエステル、任意に置換されたH-ホスホネート、および任意に置換されたO-ホスホネートから選ばれる。本発明の関連では、「ホスホルアミダイト」なる語は、式：-P(ORx)-N(Ry)2［式中、Rxは任意に置換されたアルキル基、たとえば、メチル、2-シアノエチル、またはベンジル、各Ryは任意に置換されたアルキル基、たとえば、エチルまたはイソプロピル、または基：-N(Ry)2 はモルホリノ基（-N(CH2CH2)2O）を形成する］で示される基を意味する。Rxは、好ましくは2-シアノエチルを表し、２つのRyは好ましくは同じであり、イソプロピルを表す。それゆえ、特に関連するホスホルアミダイトは、N,N-ジイソプロピル-O-(2-シアノエチル)ホスホルアミダイトである。
【００４２】
上記のように、オリゴマー化合物は、可能なら非LNAヌクレオチドとともに、LNAヌクレオチドを含む。そのようなヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡヌクレオチド）、リボヌクレオチド（ＲＮＡヌクレオチド）、ヌクレオチド誘導体、LNAアナログヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ（LNA以外）、およびPNA単位などが挙げられる。
【００４３】
ヌクレオチドアナログおよびヌクレオチド誘導体は、たとえば、Freier & Altmann (Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443)およびUhlmann (Curr. Opinion in Drug & Development (2000, 3(2): 293-213)に記載されている。スキーム１は、その選択された例である。
【００４４】
【化２】
2007515175.tif 000003
【００４５】
「LNAアナログヌクレオチド」なる語は、一般に、WO 99/14226およびその後の出願、WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250およびWO 2003/006475 (PCT/DK02/00488)（上記参照）に記載されているような２環式ヌクレオチドアナログをいうが、すでに記載した「LNAヌクレオチド」は除く。
【００４６】
好ましいLNAアナログヌクレオチドの特定の群の例は、式２：
【化３】
2007515175.tif 000004
で示されるものである。
【００４７】
式２において、XおよびYは、-O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -CH2-または-CH- (二重結合の一部である場合), -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-N(H)-, -CH2-N(R)-, -CH2-CH2-または-CH2-CH- (二重結合の一部である場合), -CH=CH-（式中、Rは水素原子およびC14-アルキルから選ばれる）から独立に選ばれる。非対称な基は、いずれの方向であってもよい。好ましい態様において、Xは酸素原子であり、Yは、-O-, -S-, -N(H)-, および-N(R)-から選ばれる（ただし、「LNAヌクレオチド」（X=OおよびY=O）は除かれる）。
【００４８】
本発明のオリゴマー化合物は、LNAヌクレオチドで定めたのと同じZおよびZ*基をさらに含んでいてよい。
【００４９】
式２において、４つのキラル中心を固定した配置で示してある。しかしながら、一般式２においてキラル中心が異なる配置にある化合物もまた本発明に包含される。それゆえ、式２における各キラル中心は、RまたはS配置のいずれかで存在しうる。R (rectus)およびS (sinister)の定義は、IUPAC 1974 Recommendations, セクションE, 基礎立体化学に記載されている：その規則は、Pure Appl. Chem. 45, 13-30, (1976)および「Nomenclature of organic Chemistry」、Pergamon、ニューヨーク、1979に見出すことができる。
【００５０】
「LNAアナログヌクレオチド」の特定の例は、式I, II, III, IV, V,およびVIによって示される：
【化４】
2007515175.tif 000005
【００５１】
一つの例は、「チオ-LNA」ヌクレオチド、すなわち、式I, III, IVまたはVIにおいてXの少なくとも１つが-S-または-CH2-S-から選ばれるLNAアナログヌクレオチドである。そのようなチオ-LNAは、それぞれ、ベータ-D-配置（IおよびIV）およびアルファ-L-配置（(IIIおよびVI）の両者であってよい。
【００５２】
他の例は、「アミノ-LNA」ヌクレオチド、すなわち、式I, III, IVまたはVIにおいてXの少なくとも１つが-N(H)-, -N(R)-, -CH2-N(H)-, -CH2-N(R)-（式中、Rは水素原子およびC1-4-アルキルから選ばれる）から選ばれるLNAアナログヌクレオチドである。そのようなアミノ-LNAは、それぞれ、ベータ-D-配置（IおよびIV）およびアルファ-L-配置（(IIIおよびVI）の両者であってよい。
【００５３】
さらなる例は、「エナ-LNA（ena-LNA）」、すなわち、IIまたはVにおいてXの少なくとも１つが-CH2-O-であるLNAアナログヌクレオチドである。
【化５】
2007515175.tif 000006
【００５４】
さらに別の態様において、オリゴマー化合物は、「アルファ-L-LNA」（すなわち、「α-L-LNA」）ヌクレオチド、すなわち、式IIIおよびVIに示すLNAヌクレオチドを含む。
【００５５】
このことから、LNAヌクレオチドアナログは、もし存在するなら、β-D-アミノ-LNA, β-D-チオ-LNAおよびα-L-オキシ-LNAから選ばれるのが好ましく、とりわけ全てのLNAヌクレオチドアナログが、もし存在するなら、α-L-オキシ-LNAである。
【００５６】
上記のように、本発明は、とりわけ、長さが１０〜３０ヌクレオチドのオリゴマー化合物であって、ヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域に特異的にハイブリダイズすることのできる標的結合ドメインを含み、該標的結合ドメインが、式：
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
（式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す）を有し、該標的結合ドメインが、ホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）によって連結された少なくとも２つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含むオリゴマー化合物に関する。
【００５７】
それゆえ、オリゴマー化合物は、長さが１０〜３０ヌクレオチド、たとえば、１０〜２０などの１０〜２５、たとえば、１０〜１８、または１０〜１６ヌクレオチドである。それゆえ、標的結合ドメインの長さは１８ヌクレオ塩基／ヌクレオチドまでである、なぜなら標的結合ドメインは、それが「特異的に結合する」領域よりも長くあってはならないからである。しかしながら、以下の記載から、オリゴマー化合物が１８ヌクレオチドの長さまたはそれよりも長いときであっても、標的結合ドメインは１８ヌクレオチドの長さである必要はないことが理解されるであろう。一例として、オリゴマー化合物が２０ヌクレオチドの長さであり、標的結合ドメインが１８、または１７、または１６等のヌクレオ塩基の長さであってよい。（標的結合ドメインの部分でないオリゴマー化合物のいずれのヌクレオチドも、標的ｍＲＮＡの特定領域の近傍にあるいずれのヌクレオチドと結合してよいことが理解されなければならない。）しかしながら、標的結合ドメインはオリゴマー化合物の主要な部分であるのが望ましい。最も好ましくは、標的結合ドメインはオリゴマー化合物の長さの９０％〜１００％を構成し、１８ヌクレオチドを超えない、すなわち、もしもオリゴマー化合物が１８ヌクレオチドまでの長さを有するなら、標的結合ドメインはその９０％〜１００％を構成し、もしもオリゴマー化合物が１９またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有するなら、標的結合ドメインは１６〜１８ヌクレオチド（１８ヌクレオチドの９０％〜１００％）の長さを有する。さらに好ましくは、標的結合ドメインはオリゴマー化合物全体を構成する。
【００５８】
本明細書において「ハイブリダイゼーション」は、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の水素結合（ワトソン−クリック結合、フーグスティーン結合、逆フーグスティーン結合などであってよい）を意味する。ワトソンおよびクリックは、約５０年前に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が２本の鎖から構成され、これらが２本の鎖中の向かい合った相補的ヌクレオ塩基間で形成された水素結合によりらせん配置で合わさっていることを示した。ＤＮＡで一般に見出される４つのヌクレオ塩基は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）であり、このうちＧヌクレオ塩基はＣと、Ａヌクレオ塩基はＴと対を形成する。ＲＮＡでは、ヌクレオ塩基チミンはヌクレオ塩基ウラシル（Ｕ）で置き換えられており、これはＴヌクレオ塩基と同様にＡと対を形成する。標準二本鎖形成に参画するヌクレオ塩基中の化学基はワトソン−クリックの外観を構成する。フーグスティーンは、数年後に、プリンヌクレオ塩基（ＧおよびＡ）がワトソン−クリックの外観に加えてフーグスティーンの外観を有し、二本鎖の外側から認識することができること、および水素結合によりピリミジンオリゴヌクレオチドに結合するのに用いることができ、それによって三本鎖らせん構造を形成することを示した。
【００５９】
「特異的にハイブリダイズすることができる」とは、該オリゴマー化合物が標的ｍＲＮＡに充分に強くかつ特異的に結合し、標的ｍＲＮＡの正常な機能の所望の妨害をもたらしながら非標的ｍＲＮＡの機能には影響を及ぼさずにおくことができることを意味する。関連するハイブリダイゼーションおよびそれによる機能の妨害は、通常、生理的条件、すなわち約３７℃で起こる。しかしながら、このことは、標的結合ドメイン中に１または２のミスマッチが存在することを排除するものではない。好ましくは、標的結合ドメインはミスマッチを含まないか、または多くとも１つのミスマッチを含む（下記を参照）。
【００６０】
本明細書において「標的ｍＲＮＡ」なる語は、ヒトＢｃｌ−２タンパク質をコードするヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡを意味する。
【００６１】
本明細書において「モデュレーション」なる語は、Ｂｃｌ−２タンパク質をコードするヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡへのオリゴマー化合物の結合によるヒトＢｃｌ−２遺伝子の発現の低減（たとえば、抑制）を意味する。
【００６２】
「特異的なハイブリダイゼーション」は、標的ｍＲＮＡの特定領域への標的結合ドメインの結合により得られる。標的結合ドメインは標的ｍＲＮＡの全１８ヌクレオチドの領域に結合する必要はないこと、とりわけ、オリゴマー化合物、それゆえ標的結合ドメインが１８未満のヌクレオ塩基の長さを有する場合にそのような必要はないことが理解されなければならない。しかしながら、標的結合ドメインは、標的ｍＲＮＡの特定領域の少なくとも１０ヌクレオ塩基の連なり、たとえば、１０〜１８、または１０〜１７、または１０〜１６、または１０〜１５、または１０〜１４ヌクレオ塩基の範囲の連なりに結合するのが好ましい。
【００６３】
標的結合ドメイン中の実質的な数のヌクレオチド結合（より正確にはヌクレオシド間の連結、すなわちインターヌクレオシド結合）がホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）であるのが一般的に好ましい。さらに好ましくは、ヌクレオチド結合の少なくとも７０％、たとえば、少なくとも８０％、または少なくとも８７％、または少なくとも９３％がホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）である。特別の態様においては、全てのヌクレオチド結合がホスホロチオエート基である。とりわけ、オリゴマー化合物中の全てのヌクレオチド結合がホスホロチオエート基である。
【００６４】
多くの態様において、標的結合ドメイン中のヌクレオ塩基の少なくとも３、たとえば、少なくとも３、少なくとも５または少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８がLNAヌクレオチドのヌクレオ塩基である。
【００６５】
表１中に特定した配列の多くと関連して好ましい態様において、標的結合ドメイン中のヌクレオ塩基の１０〜５０％がLNAヌクレオチドのヌクレオ塩基である。
【００６６】
幾つかの好ましいデザインにおいて、該標的結合ドメインの２つの5'-末端ヌクレオ塩基がLNAヌクレオチドのヌクレオ塩基である。
【００６７】
他の好ましいデザインにおいて、該標的結合ドメインの２つの5'-末端ヌクレオ塩基が、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドのヌクレオ塩基とそれに続くLNAヌクレオチドのヌクレオ塩基、とりわけ、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドとそれに続くLNAヌクレオチドの２つのヌクレオ塩基である。
【００６８】
さらに好ましいデザインにおいて、該標的結合ドメインの3'-末端ヌクレオ塩基がＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドのヌクレオ塩基である。
【００６９】
その変形において、該標的結合ドメインの２つの3'-末端ヌクレオ塩基がＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドのヌクレオ塩基とそれに続くLNAヌクレオチドのヌクレオ塩基である。
【００７０】
さらに別の好ましいデザインにおいて、該標的結合ドメインの２つの3'-末端ヌクレオ塩基がLNAヌクレオチドのヌクレオ塩基である。
【００７１】
オリゴマー化合物は、ギャップマーデザイン、たとえば、LNA/(非LNA)/LNAギャップマーデザインを有する標的結合ドメインを有する。上記で定義したギャップマー構築物の特別の変形は、以下から選ばれる式で示される標的結合ドメインである：
5'-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7]-3';
5'-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3';
5'-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7]-3';および
5'-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3'。
【００７２】
上記４つのタイプのギャップマーは、エキソヌクレアーゼによる5'-または3'-ＤＮＡ残基の開裂後に同じタイプの活性種、すなわち、5'-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7]-3'のタイプのギャップマーに導かれるであろうと考えられる（実施例１５参照）。それゆえ、SEQ ID NO: 15が特に好ましいギャップマー（および別個の化合物）であるため、SEQ ID NO: 29も同様に興味深いと考えられるということになる。同様に、SEQ ID NO: 8が特に好ましいギャップマー（および別個の化合物）であるため、SEQ ID NO: 35も同様に興味深いと考えられるということになる。
【００７３】
特別のデザインは、標的結合ドメインが式：5'-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3'、たとえば、5'-[(LNA/LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA/LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3'、とりわけ、5'-[(LNA/LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA/LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3'を有するものである。
【００７４】
「(LNA/LNA*)」なる表現は、該セグメント（すなわち、２〜７ヌクレオチドを含むセグメント）がLNAヌクレオチド、LNAアナログヌクレオチド、またはその両者を含んでいてよいことを意味する。同様の類推により、セグメント「(DNA/RNA/LNA*)」は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）およびLNAアナログヌクレオチド、およびそれらの組み合わせを含んでいてよいことを意味する。セグメント「(DNA/RNA)」は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、またはその両者を含んでいてよいことを意味する。
【００７５】
-(DNA/RNA/LNA*)4-14-サブセグメントはRNaseHを補充することができなければならないと考えられ、この理由により、このサブセグメントは、ＤＮＡヌクレオチドまたはα-L-LNAの形態のLNAアナログヌクレオチドからなる、とりわけＤＮＡヌクレオチドからなるのが好ましい。４〜１４ヌクレオ塩基の長さのサブセグメントとして定められているが、７〜１２ヌクレオ塩基の範囲、たとえば、１０〜１２ヌクレオ塩基の範囲、とりわけ１１ヌクレオ塩基の長さは特に有用なギャップマーに導くと考えられる（表１参照）。
【００７６】
それゆえ、さらに特別のデザインは、標的結合ドメインが式：5'-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3'、たとえば、5'-[(LNA/LNA*)2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA/LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3'、とりわけ、5'-[(LNA/LNA*)2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA/LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3'を有するものである。
【００７７】
さらに特別に興味深いデザインは、標的結合ドメインが式：5'-[LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7-(DNA/RNA)]-3'、たとえば、5'-[LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA/RNA)]-3'、とりわけ、5'-[LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(DNA/RNA)]-3'を有するものである。さらに別の特別に興味深いデザインは、標的結合ドメインが式：5'-[LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3'または5'-[LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3'または5'-[LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3'または5'-[LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3'、たとえば、5'-[LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3'または5'-[LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3'または5'-[LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3'または5'-[LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3'、とりわけ、5'-[LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3'または5'-[LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3'または5'-[LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3'または5'-[LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3'を有するものである。
【００７８】
他の態様において、標的結合ドメインは式：5'-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3'、とりわけ、式：5'-[(DNA/RNA)-LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7-(DNA/RNA)]-3'、たとえば、5'-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA/LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3'、とりわけ、式：5'-[(DNA/RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA/RNA)]-3'、または5'-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA/LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3'、とりわけ、式：5'-[(DNA/RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(DNA/RNA)]-3'を有する。さらに別の特別に興味深いデザインは、標的結合ドメインが式：5'-[(DNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3'または5'-[(DNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3'または5'-[(DNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3'または5'-[(DNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3'、たとえば、5'-[(DNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3'または5'-[(DNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3'または5'-[(DNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3'または5'-[(DNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3'、とりわけ、5'-[(DNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3'または5'-[(DNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3'または5'-[(DNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3'または5'-[(DNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3'を有するものである。
【００７９】
さらなる態様において、標的結合ドメインは式：5'-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7]-3'、とりわけ、式：5'-[(DNA/RNA)-LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7]-3'、たとえば、5'-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA/LNA*2-5]-3'、とりわけ、式：5'-[(DNA/RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3'、または5'-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA/LNA*2-4]-3'、とりわけ、式：5'-[(DNA/RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3'を有する。さらに別の特別に興味深いデザインは、標的結合ドメインが式：5'-[(DNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7]-3'または5'-[(DNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7]-3'、たとえば、5'-[(DNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3'または5'-[(DNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5]-3'、とりわけ、5'-[(DNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3'または5'-[(DNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3'または5'-[(RNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4]-3'を有するものである。
【００８０】
さらに別の態様において、標的結合ドメインは式：5'-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7]-3'、とりわけ、式：5'-[LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7]-3'、たとえば、5'-[(LNA/LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA/LNA*2-5]-3'、とりわけ、式：5'-[LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3'、または5'-[(LNA/LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA/LNA*2-4]-3'、とりわけ、式：5'-[LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3'を有する。さらに別の特別に興味深いデザインは、標的結合ドメインが式：5'-[LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7]-3'または5'-[LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7]-3'、たとえば、5'-[LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3'または5'-[LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5]-3'、とりわけ、5'-[LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3'または5'-[LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4]-3'を有するものである。
【００８１】
幾つかの態様において、オリゴマー化合物はまたLNAアナログヌクレオチド（本明細書で「LNA*」と称する）を含む。とりわけ、標的結合ドメイン中のヌクレオ塩基の１０〜１００％または０〜９０％、たとえば、１０〜５０％がLNAアナログヌクレオチド（LNA*）である。
【００８２】
その変形において、標的結合ドメインは式：5'-[(LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3'、とりわけ、5'-[LNA*2-7-(DNA)4-14-LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3'、たとえば、5'-[(LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3'、とりわけ、5'-[LNA*2-5-(DNA)7-12-LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3'、または5'-[(LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3'、とりわけ、5'-[LNA*2-4-(DNA)10-12-LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3'を有する。
【００８３】
上記のように、オリゴマー化合物は標的ｍＲＮＡの特定の領域に特異的にハイブリダイズすることができなければならない。さらに詳細には、標的結合ドメインは、２までの非相補的なヌクレオ塩基を例外として、それが特異的にハイブリダイズするヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域の部分に相補的である。
【００８４】
本発明との関連において、「相補的」なる語は、標的ｍＲＮＡの関連する領域のヌクレオチドと標的結合ドメインのヌクレオチドとの間で正確な塩基対を形成する能力をいう。たとえば、標的ｍＲＮＡのある位置でのヌクレオチドが標的結合ドメインのヌクレオチドと水素結合を形成することができるなら、該標的ｍＲＮＡと該標的結合ドメインとはその位置で互いに相補的であると考えられる。（ここでも、上記の記載から標的結合ドメインはヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの特定の領域、またはより短い断片に対応するものと理解されなければならない。）「非相補的なヌクレオ塩基」なる語は、当然、ある特定のヌクレオチドのヌクレオ塩基が「相補的」ではない情況をいう。
【００８５】
一つの態様において、標的結合ドメインは、それが特異的にハイブリダイズするヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域の部分に相補的である。
【００８６】
この態様内での好ましい化合物の例は、SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 (および35), 12, 13, 14, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, および52, とりわけSEQ ID NO: 8 (および35)よりなる群から選ばれた標的結合ドメインを含むものである。一つの変形において、標的結合ドメインはSEQ ID NO: 8である。他の変形において、標的結合ドメインはSEQ ID NO: 35である。
【００８７】
さらに好ましいのは、該化合物がSEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 (および35), 12, 13, 14, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, および52, とりわけSEQ ID NO: 8 (および35)よりなる群から選ばれるものである。一つの変形において、標的結合ドメインはSEQ ID NO: 8である。他の変形において、標的結合ドメインはSEQ ID NO: 35である。
【００８８】
他の態様において、標的結合ドメインは、１〜２の非相補的なヌクレオ塩基を例外として、とりわけ、１の非相補的なヌクレオ塩基を例外として、それが特異的にハイブリダイズするヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域の部分に相補的である。それゆえ、２までのミスマッチ（非相補的なヌクレオ塩基）は許容されるが、最もしばしば１のみのミスマッチが導入される。そのようなミスマッチは、もオリゴマー化合物のDNA/RNA/LNA*セグメント中に、たとえば、式：5'-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3'のセグメントを含む標的結合ドメインを含むDNA/RNA/LNA*セグメント中に存在する。
【００８９】
その一つの変形において、標的結合ドメインは、ＧＣＧＸＧＣＧＣサブ配列（式中、ＸはＴ（チミン）ではない）を含む。とりわけ、ＸはＣ（シトシン）であるか、またはＸはＡ（アデニン）であるか、またはＸはＧ（グアニン）である。
【００９０】
他の変形において、標的結合ドメインは、ＣＣＣＡＸＣＧＴサブ配列（式中、ＸはＧ（グアニン）ではない）を含む。とりわけ、ＸはＡ（アデニン）であるか、またはＸはＴ（チミン）であるか、またはＸはＣ（シトシン）である。
【００９１】
さらに別の他の変形において、標的結合ドメインは、ＣＡＧＸＧＴＧサブ配列（式中、ＸはＣ（シトシン）ではない）を含む。とりわけ、ＸはＡ（アデニン）であるか、またはＸはＴ（チミン）であるか、またはＸはＧ（グアニン）である。
【００９２】
さらに別の他の変形において、標的結合ドメインは、ＡＧＣＸＴＧＣサブ配列（式中、ＸはＧ（グアニン）ではない）を含む。とりわけ、ＸはＡ（アデニン）であるか、またはＸはＴ（チミン）であるか、またはＸはＣ（シトシン）である。
【００９３】
この態様内での好ましい化合物の例は、SEQ ID NO: 15 (および29), 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 53, 54および55, とりわけSEQ ID NO: 15 (および29)よりなる群から選ばれた標的結合ドメインを含むものである。一つの変形において、標的結合ドメインはSEQ ID NO: 15である。他の変形において、標的結合ドメインはSEQ ID NO: 29である。
【００９４】
さらに好ましいのは、該化合物がSEQ ID NOS: 15 (および29), 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 53, 54および55, in particular SEQ ID NO: 15 (および29)よりなる群から選ばれるものである。一つの変形において、標的結合ドメインはSEQ ID NO: 15である。他の変形において、標的結合ドメインはSEQ ID NO: 29である。
【００９５】
このことから、オリゴマー化合物SEQ ID NO: 8 (および35も)およびオリゴマー化合物SEQ ID NO: 15 (および29も)は、それぞれ、所望の生物学的作用に関してオブリマーセンナトリウム化合物（SEQ ID NO: 56；参照）に対して有意の利点を提供する（実施例参照）。
【００９６】
本発明者らは、7mg/kgのSEQ ID NO: 8を１４日間腹腔内投与し同じ投与量のSEQ ID NO: 56（参照）と比較したときに、黒色腫518A2 scidマウス異種移植モデルにおいて腫瘍重量の改善されたインビボ低減を示した（図１１参照）。SEQ ID NO: 8は、SEQ ID NO: 56（参照）よりも７倍低い投与量で投与したときに等価な抗腫瘍活性を示す。
【００９７】
図１３に、単一投与量の静脈内投与（25mg/kg）後のNMRIマウスからの肝臓および腎臓中のSEQ ID NOS: 15のレベルを示す。活性化合物SEQ ID NOS: 15の半減期（T1/2）は、肝臓および腎臓の両者で約３日であることが認められる。このことは、SEQ ID NOS: 15の最適生物学的投与量の投与計画が、連続注入および毎日の投与に比べて頻度が少なくてよいことを示唆している。
【００９８】
本発明者らはまた、前立腺PC3無胸腺ヌードマウス異種移植モデルにおいて食塩水対照と比較してSEQ ID NO: 15を使用して第７日目〜第１５日目に毎日または第８日目、第１１日目、第１３日目、第１５日目、第１８日目、第２０日目に投与した腫瘍容積の有効なインビボ低減をも示した（図７Ｄ参照）。化合物を10mg/kgにて１４日間腹腔内投与した。処置後さらに８日間、腫瘍の増殖をモニターした。
【００９９】
このことから、本発明のオリゴマー化合物は、Ｂｃｌ−２の分布およびダウンレギュレーションに関して適切なインビボプロフィルを有し、それによって様々なＢｃｌ−２関連状態、とりわけ癌と関連した治療学的重要性を有する。
【０１００】
オリゴマー化合物の調製
本発明のオリゴマー化合物は、実施例１および２、およびWO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO02/28875, WO 2002/094250, PCT/DK02/00488およびHerdewijn, P., Oligonucleotide Synthesis, Methods and Applications, pp 127-145, Humana Press, トトワ、ニュージャージー、2005の記載に従って調製することができる。それゆえ、本発明のオリゴマー化合物は、有機化学の当業者によく知られた核酸化学ほ重合方法を用いて製造することができる。一般に、ホスホルアミダイト法（S. L. BeaucageおよびR. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. BeaucageおよびR. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223）の標準重合サイクルを用いるが、たとえば、Ｈ−ホスホネート化学、ホスホトリエステル化学を用いることもできる。
【０１０１】
本発明の幾つかのモノマーでは、より長いカップリング時間、および／または新たな試薬での繰り返しカップリング、および／またはより高濃度のカップリング試薬を用いた。
【０１０２】
使用したホスホルアミダイトは、満足のいく>95%の段階カップリング収率でカップリングした。ホスフェートのチオール化は、ホスホロジエステルオリゴマーの合成に使用する通常の（たとえば、ヨウ素/ピリジン/H2O）酸化をADTT試薬（水素化キサンテン（アセトニトリル:ピリジン 9:1; v/v中に0.01M))を使用する酸化で置き換えることにより行う（Beaucageなどの他のチオール化試薬も含まれる）。ホスホロチオエートLNAオリゴマーは、段階カップリング収率>= 98%で効率的に合成された。
【０１０３】
β-D-アミノ-LNA, β-D-チオ-LNAオリゴヌクレオチド、α-L-LNAおよびβ-D-メチルアミノ-LNAオリゴヌクレオチドもまた、ホスホルアミダイト法を用いて段階カップリング収率≧ 98%で効率よく合成された。
【０１０４】
LNAオリゴマー化合物の精製は、使い捨ての逆相精製カートリッジおよび／または逆相ＨＰＬＣおよび／またはエタノールもしくはブタノールからの沈殿を用いて行った。毛管ゲル電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、およびＥＳＩ−ＭＳを用い、合成したオリゴヌクレオチドの純度を確認した。さらに、保護ヌクレオ塩基および5'-OH保護LNAが任意に固定された固相材料は、LNAヌクレオチドが3'末端に含まれるLNA含有オリゴマー化合物の合成のための材料として特に興味深い。この場合、固相材料は、好ましくはＣＰＧ、たとえば、容易に入手可能な（市販された）ＣＰＧ材料またはポリスチレンであり、当該特定の材料の供給者により言及された条件を用いて3'官能化された、任意に保護されたヌクレオ塩基および任意に5'-OH保護されたLNAが結合したものである。
【０１０５】
塩
本発明のオリゴマー化合物は、様々な薬理学的に許容しうる塩にて用いることができる。本明細書において、この語は、本明細書に記載の化合物の所望の生物学的活性を保持し、かつ最小の所望でない毒性作用を示す塩をいう。そのような塩の非制限的例は、有機アミノ酸、および金属カチオン、たとえば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどとの、またはアンモニア、N,N-ジベンジルエチレン-ジアミン, D-グルコサミン, テトラエチルアンモニウム, またはエチレンジアミンから生成するカチオンとの塩基付加塩；または（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせと生成することができる（たとえば、亜鉛タンニン酸塩など）。
【０１０６】
そのような塩は、たとえば、酸性基、たとえば、カルボキシル基、ホスホジエステル基またはホスホロチオエート基を有する本発明の化合物から生成され、たとえば、適当な塩基との塩である。これら塩としては、たとえば、元素周期表のIa族, Ib族, IIa族およびIIb族の金属由来の非毒性金属塩、とりわけ、アルカリ金属塩、たとえば、リチウム、ナトリウムまたはカリウム塩、またはアルカリ土類金属塩、たとえば、マグネシウム塩またはカルシウム塩が挙げられる。これら塩としては、さらに亜鉛およびアンモニウム塩、および適当な有機アミン、たとえば、非置換またはヒドロキシル置換されたモノ-、ジ-またはトリ-アルキルアミン、とりわけ、ジ-またはトリ-アルキルアミンと生成される塩、または第四級アンモニウム化合物、たとえば、N-メチル-N-エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、モノ-、ビス-またはトリス-(2-ヒドロキシ-低級アルキル)アミン、たとえば、モノ-、ビス-またはトリス-(2-ヒドロキシエチル)アミン、2-ヒドロキシ-tert-ブチルアミンまたはトリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン、N,N-ジ-低級アルキル-N-(ヒドロキシ-低級アルキル)アミン、たとえば、N,N-ジメチル-N-(2-ヒドロキシエチル)アミンまたはトリ-(2-ヒドロキシエチル)アミン、またはN-メチル-D-グルカミンと生成される塩、または第四級アンモニウム化合物と生成される塩、たとえば、テトラブチルアンモニウム塩が挙げられる。リチウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩またはカリウム塩が好ましく、ナトリウム塩が特に好ましい。
【０１０７】
塩基性の基、たとえば、アミノ基またはイミノ基を有する本発明による化合物は、たとえば、無機酸、たとえば、ハロゲン化水素酸、たとえば、塩酸、硫酸またはリン酸、または有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ酸またはホスホ酸またはＮ−置換スルファミン酸、たとえば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマール酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸（embonic acid）、ニコチン酸またはイソニコチン酸、およびさらにアミノ酸、たとえば、a-アミノ酸、およびメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシメタンスルホン酸、エタン−１,２−ジスルホン酸、ベンゼンジスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、２−または３−ホスホグリセリン酸、グルコースリン酸またはＮ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメート（cyclamates）の生成を伴う）または他の酸性有機化合物と酸付加塩を生成することができる。
【０１０８】
酸性基および塩基性基の両者を有する本発明による化合物はまた、内部塩を生成することができる。薬理学的に不適当な塩、たとえば、ピクリン酸塩または過塩素酸塩は、単離および精製に用いることができる。
【０１０９】
正しく使用したときに非毒性であり、治療目的に使用され、それゆえ好ましいのは薬理学的に許容しうる塩のみである。
【０１１０】
コンジュゲート
本発明のさらなる側面は、本明細書で定義した化合物を含むコンジュゲートに関し、該化合物には少なくとも１の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド残基が共有結合している。
【０１１１】
本発明との関連において、「コンジュゲート」なる語は、本明細書に記載するオリゴマー化合物（すなわち、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログの配列を含む化合物）が１またはそれ以上の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド残基に共有結合することによって生成する不均一分子を示すことを意図している。
【０１１２】
それゆえ、オリゴマー化合物は、オリゴマー化合物が二量体構造または樹木状構造に配置されるように、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質（たとえば、標的タンパク質の抗体）、巨大分子、低分子量薬剤、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー（たとえば、ポリエチレングリコール）、ミセル形成基、抗体、炭水化物、レセプター結合基、ステロイド、たとえば、コレステロール、ポリペプチド、インターカレート剤、たとえば、アクリジン誘導体、長鎖アルコール、デンドリマー（dendrimer）、リン脂質および他の親油性基またはそれらの組み合わせを含む非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド残基とコンジュゲートしまたはキメラを形成することができる。本発明の化合物またはコンジュゲートはまた、さらに、活性な薬剤、たとえば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤、化学療法化合物または抗生物質にコンジュゲートすることができる。
【０１１３】
このようにコンジュゲートすることで、本発明によるオリゴマー化合物の薬動力学的特性に関して有利な特性が付与される。とりわけ、このようにしてコンジュゲートすることは増大した細胞取り込みを達成する。
【０１１４】
一つの態様において、本発明のオリゴマー化合物はコンジュゲートを形成すべくリガンドに結合され、該リガンドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに比べて該コンジュゲートの細胞取り込みを増大させることを意図するものである。この結合は、末端位置の5'/3'-OHで行うことができるが、リガンドの結合はまた糖および／または塩基でも行うことができる。コンジュゲート／リガンドの例は、コレステロール残基（Soutschekら、Nature, 432, 173-178 (2004)）、二本鎖インターカレート剤、たとえば、アクリジン、ポリ−Ｌ−リシン、１またはそれ以上のホスホロモノチオエートなどのヌクレアーゼ耐性連結基での「末端キャッピング（end-capping）」、トランスフェリン複合体（Wagnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)）、葉酸誘導体（Lowら、米国特許第5,108,921号；Leamonら、Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5572 (1991)をも参照）などである。
【０１１５】
プロドラッグ
本発明の幾つかの態様において、オリゴマー化合物はプロドラッグの形態であってよい。オリゴヌクレオチドは実質的に負に荷電している。細胞膜の親油性の性質のため、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みは、中性または親油性の等価物に比べて低減している。この極性「妨害」は、プロドラッグアプローチ（たとえば、Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T., Antisense Research and Application. Springer-Verlag, ベルリン、ドイツ、vol. 131, pp. 103-140を参照）を使用することで回避することができる。このアプローチでは、オリゴマー化合物は、投与されたときに中性となるように保護された形態で調製される。これら保護基は、オリゴマー化合物が細胞によって取り込まれたときに除去されるような仕方にデザインされる。そのような保護基の例は、Ｓ−アセチルチオエチル（ＳＡＴＥ）またはＳ−ピバロイルチオエチル（ｔ−ブチル−ＳＡＴＥ）である。これら保護基はヌクレアーゼ耐性であり、細胞内で選択的に除去される。
【０１１６】
治療原理
当業者であれば、本発明のLNAオリゴマー化合物が、Ｂｃｌ−２関連疾患に対して多くの異なる原理により処置するのに用いることができ、これら原理が本発明の精神の範囲内に包含されるという事実を評価するであろう。
【０１１７】
たとえば、LNAオリゴマー化合物は、アンチセンスインヒビターとしてデザインすることができ、このアンチセンスインヒビターは、ｍＲＮＡレベルで介入することによって疾患惹起タンパク質の産生を妨害する一本鎖核酸である。また、LNAオリゴマー化合物は、イムノモデュレーターオリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）、リボザイムまたはオリゴザイムとしてデザインすることができ、これらは、標的結合ドメインに加えて、標的ｍＲＮＡを分解する触媒活性を含むか（リボザイム）または標的ｍＲＮＡを分解する内生酵素（RNase P）を補充する外部ガイド配列（external guide sequence；ＥＧＳ）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１１８】
同様に、LNAオリゴマー化合物は、ｓｉＲＮＡとしてもデザインすることができ、これは、未だ充分に理解されていない「アンチセンス様」メカニズムによって特定の内生または外来遺伝子を沈黙させるべく細胞により使用される小さな二本鎖ＲＮＡ分枝である。
【０１１９】
オリゴマー化合物はまた、アプタマー（およびシュピーゲルマー（spiegelmers）と呼ばれるその変形）としてもデザインすることができ、これは、分子内水素結合によって、その生物学的標的に高親和性および特異性で結合および阻止することを可能にする三次元構造を採用する核酸である。また、LNAオリゴマー化合物は、デコイ（Decoys）としてもデザインすることができ、これは、そのＤＮＡ結合部位を選択的に阻止することによって細胞の転写因子がその標的遺伝子をトランス活性化するのを妨害する小さな二本鎖核酸である。
【０１２０】
さらに、LNAオリゴマー化合物は、キメラプラスト（Chimeraplasts）としてデザインすることができ、これは、標的遺伝子配列に特異的に対合し変化させることのできる小さな一本鎖核酸である。それゆえ、この原理を利用するLNA含有オリゴマー化合物は、Ｂｃｌ−２遺伝子中の突然変異によって引き起こされたＢｃｌ−２関連疾患を治療するのに特に有用である。
【０１２１】
最後に、LNAオリゴマー化合物は、ＴＦＯ（三本鎖形成オリゴヌクレオチド）としてデザインすることができ、これは、二本鎖ＤＮＡに結合し、ＲＮＡ転写レベルでの介入により疾患惹起タンパク質の産生を妨害する核酸である。
【０１２２】
それによってLNAオリゴマー化合物が治療作用を奏することのできる上記原理を言及したように、本発明の標的はＢｃｌ−２ｍＲＮＡである。
【０１２３】
LNAオリゴマー化合物は、翻訳開始部位を含むヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの部分、すなわち、ヒトＢｃｌ−２タンパク質をコードするヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域にハイブリダイズする。
【０１２４】
当業者であれば、好ましいLNAオリゴマー化合物が、治療の特異性を維持できるように非関連遺伝子からの転写物とは共通しない配列のＢｃｌ−２ｍＲＮＡの部分にハイブリダイズするようなものであることを評価するであろう。
【０１２５】
本発明のオリゴマー化合物は、所望の臨床応答を提供できるように標的に充分に相補的になるようにデザインされる、たとえば、オリゴマー化合物は、所望の効果を与えるべく、その標的に充分な強度および特異性にて結合しなければならない。一つの態様において、該LNAオリゴマー化合物は、ヒトＢｃｌ−２タンパク質をコードしない他の特定の核酸をもモデュレートすべくデザインされる。
【０１２６】
本発明によるオリゴマー化合物は、分子間および分子内のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを回避するようにデザインされる。
【０１２７】
アンチセンス薬
本発明の一つの態様において、LNAオリゴマー化合物は、適当なアンチセンス薬として提供される。強力かつ安全なアンチセンス薬のデザインには、効能／有効性、親和性／特異性、生物学的流体中での安定性、細胞の取り込み、作用様式、薬動力学的特性および毒性などの様々なパラメーターの微調整が必要である。
【０１２８】
親和性／特異性：オキシメチレン２'−Ｏ,４'−Ｃ結合を有するLNA（β-D-オキシ-LNA）は、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的配列に対する先例のない結合特性を示す。同様に、アミノ−、チオ−およびα-L-オキシ-LNAなどのLNA誘導体は、相補的なＲＮＡおよびＤＮＡに対して先例のない親和性を示し、チオ−LNAの場合にはＲＮＡに対する親和性はβ-D-オキシ-LNAのものよりも高いほどである。
【０１２９】
これらの顕著なハイブリダイゼーション特性に加え、LNAヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドと、および2'-O-アルキル修飾ＲＮＡモノマーなどの他の核酸アナログと混合し、協同して作用することができる。そのようなものとして、本発明のオリゴヌクレオチドは、完全にβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドからなっていてよいし、またはＤＮＡ、ＲＮＡヌクレオチドまたは相補的な核酸アナログ（LNA誘導体、たとえば、アミノ−LNA，チオ−LNAおよびα-L-オキシ-LNAなどを含む）とのいずれかの組み合わせでβ-D-オキシ-LNAを含んでいてよい。ＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列に対するLNAの先例のない結合親和性およびそれがＤＮＡ、ＲＮＡと自由に混合する能力および最新の核酸アナログの範囲は、有効かつ安全なアンチセンス化合物の開発によって本発明により重要な結果をもたらす。さらに、LNAを含有するオリゴヌクレオチドは、優れた水溶性を示す。
【０１３０】
第一に、本発明の一つの態様において、それは薬理活性に必要な親和性を損なうことなくアンチセンスオリゴヌクレオチドの通常の長さの相当の短縮を可能にする（２０〜２５量体から、たとえば、１２〜１６量体へ）。オリゴヌクレオチドの固有の特異性はその長さとは逆の相関を有することから、そのような短縮は、そのＲＮＡ標的へのアンチセンス化合物の特異性を有意に増大させるであろう。本発明の一つの態様は、ヒトゲノムの配列が利用できその遺伝子の割り当てが迅速に発展していることから、標的ｍＲＮＡ中に可能な最も短い独特の配列を同定することである。
【０１３１】
本発明の他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのサイズを低減させるためのLNAの使用は、製造のプロセスおよびコストを有意に短縮させ、それゆえアンチセンス療法が様々な疾患のための商業的に競合しうる治療の企てとなる基礎を提供する。
【０１３２】
他の態様において、LNAの先例のない親和性は、オリゴマー化合物がその標的ｍＲＮＡにインビボでハイブリダイズする能力を有意に高め、それゆえ他の化学の情況と比べて、活性な化合物を同定するのに必要な時間および努力を有意に低減させるのに用いることができる。
【０１３３】
他の態様において、LNAの先例のない親和性は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を高め、それゆえ現在臨床試験で行われているものよりも一層好ましい治療範囲（therapeutic windows）を有する化合物の開発を可能とするのに用いることができる。
【０１３４】
アンチセンスインヒビターとしてデザインする場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に特異的かつ選択的に結合し、そのコグネイトタンパク質の発現をモデュレートする。好ましくは、そのようなモデュレーションは、正常な発現レベルに比べて少なくとも10%または20%の発現の抑制、さらに好ましくは正常な発現レベルに比べて少なくとも30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, または90%の抑制をもたらす。
【０１３５】
生物学的流体中での安定性：本発明の一つの態様は、標準ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド中にLNAヌクレオチドを導入して、その結果得られるオリゴマー化合物の生物学的流体中での安定性を、たとえば、ヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）に対する耐性の増大により増大させることを包含する。安定性の程度は、使用したLNAヌクレオチドの数、オリゴヌクレオチド中でのその位置および使用したLNAヌクレオチドのタイプに依存するであろう。ＤＮＡおよびホスホロチオエートと比べて、核酸分解に対してオリゴヌクレオチドを安定化させる能力の以下の順序を確立することができる：ＤＮＡ＜＜ホスホロチオエート〜オキシ−LNA＜α-L-LNA＜アミノ-LNA＜チオ-LNA。
【０１３６】
LNAは標準ＤＮＡ合成と両立でき、多くの最新の核酸アナログと自由に混合するという事実から、LNA-オリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性は、増大したヌクレアーゼ耐性を示す他のアナログを導入することにより、またはヌクレアーゼ耐性のインターヌクレオシド結合、たとえば、ホスホロモノチオエート、ホスホロジチオエート、およびメチルホスホネート結合などを利用することにより、本発明に従ってさらに高めることができる。
【０１３７】
作用様式：本発明によるアンチセンス化合物は、その治療学的作用を様々なメカニズムにより発揮することができ、これらの幾つかを同じ化合物で組み合わせることができる。一つのシナリオでは、オリゴヌクレオチドのその標的（プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）への結合は、該標的の適切な機能に必要な他の因子（タンパク質、他の核酸など）の結合を妨害するように作用する、すなわち、立体障害により作用する。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スプライシング、ポリアデニル化、細胞輸送、ＲＮＡ中のヌクレオシドの転写後修飾、５’末端のキャッピング、翻訳などに関与するトランス作用因子の認識および結合に重要なプレｍＲＮＡかｍＲＮＡのいずれかにおける配列モチーフに結合することができる。プレｍＲＮＡスプライシングの場合は、オリゴヌクレオチドとその標的との相互作用の結果は、所望でないタンパク質の発現の抑制、所望のタンパク質をコードする交互にスプライスされたｍＲＮＡの生成またはその両者である。
【０１３８】
他の態様において、オリゴヌクレオチドのその標的への結合は、リボソーム構造への物理的な阻止の生成により翻訳を不可能にする、すなわち、翻訳抑制（translational arrest）。
【０１３９】
さらに他の態様において、オリゴヌクレオチドのその標的への結合は、ＲＮＡがその適切な機能において重要な二次構造および高次構造をとる能力を妨害する、すなわち、構造的妨害。たとえば、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡにさらなる安定性を付与したり種々のタンパク質にとって必須の認識モチーフを採用するといった種々の機能において重要な役割を果たしているステム−ループ構造の生成を妨害することができる。
【０１４０】
さらに他の態様において、オリゴヌクレオチドの結合は、ｍＲＮＡを分解する細胞酵素を補充することによって、さらなる細胞代謝プロセスに対して標的を不活化する。たとえば、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分を分解するリボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）を補充する能力を有するヌクレオシドのセグメントを含んでいてよい。同様に、オリゴヌクレオチドは、二本鎖ＲＮアーゼ、たとえば、ＲＮアーゼIIIを補充するセグメントを含んでいてよく、または標的ｍＲＮＡを分解する内生酵素（ＲＮアーゼＰ）を補充する外部ガイド配列（ＥＧＳ）を含んでいてよい。また、オリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼ酵素活性を示す配列モチーフを含んでいてよく、またはハイブリダイゼーション事象により標的の近傍にもたらされたときに該標的のさらなる代謝活性を不可能にする残基をオリゴヌクレオチドに結合させることもできる。
【０１４１】
このようであるから、ギャップマーのギャップサイズ、すなわちサブセグメントは、４〜１４ヌクレオ塩基の長さを有すると定められるが、８〜１３ヌクレオ塩基の範囲、たとえば、１０〜１２ヌクレオ塩基、とりわけ１１ヌクレオ塩基の長さは特に有用なギャップマーに導く（表１参照）。
【０１４２】
薬動力学的特性
アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床的有効性は、その薬動力学的特性、たとえば、吸収、分布、細胞による取り込み、代謝および排泄に依存する。これらパラメーターは、今度は、オリゴヌクレオチドの基礎をなす化学およびサイズおよび三次元構造によって有意に左右される。
【０１４３】
上記で記載したように、本発明によるLNAは、単一ではなく幾つかの関連する化学であり、分子的には異なるものの全て相補的ＤＮＡおよびＲＮＡに対して驚くべき親和性を示す。それゆえ、LNA化学のファミリーは、LNAの高親和性を利用して活性な化合物のサイズをモデュレートするか、または種々のLNA化学を利用して活性な化合物の正確な分子組成をモデュレートして、本発明による調整された薬動力学的特性を有するオリゴの開発に特に適している。後者の場合、たとえばオキシ-LNAの代わりのアミノ-LNAの使用は、オリゴマー化合物の全体の電荷を変化させ、取り込みおよび分布の挙動に影響を及ぼすであろう。同様に、オキシ-LNAの代わりのチオ-LNAの使用は、オリゴヌクレオチドの親油性を増大させ、それゆえ、親油性の障壁、たとえば細胞膜を通過する能力に影響を及ぼすであろう。
【０１４４】
本発明によるLNAオリゴヌクレオチドの薬動力学的特性をモデュレートすることは、さらに、様々な異なる残基の結合によって達成することができる。たとえば、オリゴヌクレオチドが細胞膜を通過する能力は、たとえば、コレステロール残基、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質またはポリアミンなどの脂質残基をオリゴヌクレオチドに結合することにより高めることができる。同様に、LNAオリゴヌクレオチドの細胞中への取り込みは、膜中の分子と相互作用する残基をオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることにより高めることができ、これにより細胞質中への輸送が媒体される。
【０１４５】
薬力学的特性
薬力学的特性は、本発明により、オリゴマーの取り込みを改善し、生体安定性を促進し、たとえば、分解に対するオリゴマー耐性を促進し、および／または標的、たとえばｍＲＮＡ配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性の特異性および親和性を増大させる基を用いて高めることができる。
【０１４６】
毒理学
基本的にアンチセンスオリゴマーと関連して２つのタイプの毒性がある：配列依存的な毒性（標的結合ドメインが関与）および配列非依存的なクラス関連毒性。天然のＣｐＧ配列モチーフによる免疫促進と関連する論点を例外として、アンチセンスオリゴヌクレオチドの開発において最も顕著な毒性は、たとえば、オリゴヌクレオチドの化学および投与量、投与方法、投与頻度および投与期間と関連して、配列に依存的なものである。ホスホロチオエートクラスのオリゴヌクレオチドは、特によく特徴付けられており、多くの副作用、たとえば、補体の活性化、長くなったＰＴＴ（部分トロンボプラスチン時間）、血小板減少症、肝毒性（肝酵素の上昇）、脾腫および細網内皮細胞の過形成を示すことがわかっている。
【０１４７】
上記で記載したように、LNA化学のファミリーは、先例のない親和性、非常に高い生体安定性およびオリゴヌクレオチドの正確な分子組成をモデュレートする能力を提供する。本発明の一つの態様において、LNA含有化合物は、高い効能をわずかな（もしあっても）ホスホロチオエート結合と組み合わせ、それゆえ最新のアンチセンス化合物よりも優れた有効性および安全性を示すと思われるオリゴヌクレオチドの開発を可能にする。
【０１４８】
医薬組成物
上記に従い、本発明はまた、本明細書に記載のオリゴマー化合物またはコンジュゲートおよび薬理学的に許容しうる担体を含む医薬組成物にも関することが理解されなければならない。
【０１４９】
医薬組成物の製造の指針は、Alfonso R. Gennaroによる「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」および以下の記載に見出すことができる。
【０１５０】
薬理学的に許容しうる担体、たとえば、結合剤およびアジュバントは、医薬組成物の一部である。カプセル剤、錠剤および丸剤等は、たとえば、以下の化合物を含んでいてよい：結合剤として、微結晶セルロース、ガムまたはゼラチン；賦形剤として、デンプンまたはラクトース；滑沢剤としてステアリン酸塩；種々の甘味剤または香味剤。カプセル剤については、投与単位は脂肪油などの液体担体を含んでいてよい。同様に、糖衣または腸溶剤は投与単位の一部である。医薬組成物はまた、活性な医薬成分（オリゴマー化合物を含む）とミセルエマルジョンを形成する脂質とのエマルジョンであってもよい。
【０１５１】
本発明のオリゴマー化合物は、所望の作用を損なうことないいかなる物質とも、あるいは所望の作用を補う物質と混合することができる。これらには、他のヌクレオシド化合物を含む他の薬剤が含まれる。
【０１５２】
静脈内、皮下、または局所投与のためには、製剤は、滅菌希釈液、緩衝液、張性の調節剤および抗菌剤を含んでいてよい。活性化合物は、分解または生体からの即座の排除に対して保護する担体（徐放特性を有するインプラントまたはマイクロカプセルを含む）とともに調製することができる。静脈内投与のためには、好ましい担体は、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水である。
【０１５３】
好ましくは、オリゴマー化合物は、治療する患者に重篤な副作用を引き起こすことなく治療学的有効量を送達するに充分な量にて、薬理学的に許容しうる担体または希釈液中などの単位製剤に含有される。
【０１５４】
医薬組成物の好ましい態様において、オリゴマー化合物は、水性担体中、とりわけ、ｐＨを4.0-8.5の範囲に保持し、20-2000mMのイオン強度を有するようにする緩衝液を含む水性担体中で製剤化される。
【０１５５】
「水性担体」なる語は、当該医薬組成物が液体の形態にあること、および液体担体が主として水からなること、すなわち、該担体の少なくとも80% (w/w)、または少なくとも90% (w/w)、さらには少なくとも95% (w/w)でさえもが水からなることを意味する。他の液体成分、たとえば、エタノール、ＤＭＳＯ、エチレングリコールなども使用できる。
【０１５６】
水性担体は、ｐＨを4.0-8.5の範囲に保持するために緩衝液を含む。好ましくは、緩衝液はｐＨを5.0-8.0の範囲、たとえば、6.0-7.5の範囲に保持するであろう。
【０１５７】
医薬組成物のイオン強度／張性もまた重要である。それゆえ、典型的に、医薬組成物は、20-2000mMの範囲、たとえば、50-1500mMの範囲、または100-1000mMの範囲のイオン強度を有する。
【０１５８】
一つの態様において、液体医薬組成物は、本明細書に記載のオリゴマー化合物を水性担体中に含有し；そして、該水性担体は、ｐＨを4.0-8.5の範囲に保持し、20-2000mMのイオン強度を有するようにする緩衝液を含む。
【０１５９】
一つの態様において、液体医薬組成物は、コンジュゲートを水性担体中に含有し、該コンジュゲートは、本明細書に記載するオリゴマー化合物および該オリゴマー化合物に共有結合した少なくとも１の非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド残基からなる；そして、該水性担体は、ｐＨを4.0-8.5の範囲に保持し、20-2000mMのイオン強度を有するようにする緩衝液を含む。
【０１６０】
２つの態様において、オリゴマー化合物の標的結合ドメインは、好ましくは、SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 (および35), 12, 13, 14, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, および52よりなる群から選ばれたものであり、とりわけ、標的結合ドメインは、SEQ ID NO: 8 (および35)であるか、または、オリゴマー化合物の標的結合ドメインは、好ましくは、SEQ ID NOS: 15 (および29), 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 53, 54および55よりなる群から選ばれたものであり、とりわけ、標的結合ドメインは、SEQ ID NO: 15 (および29)である。
【０１６１】
上記のように、該化合物が、SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 (および35), 12, 13, 14, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51および52よりなる群から選ばれること、とりわけ、SEQ ID NO: 8 (および35)であること、または、該化合物が、SEQ ID NOS: 15 (および29), 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 53, 54および55よりなる群から選ばれること、とりわけ、SEQ ID NO: 15 (および29)であることが特に好ましい。
【０１６２】
さらなる態様において、医薬組成物はまた、化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物、細胞増殖抑制化合物、抗血管形成化合物、抗増殖化合物、アポトーシス促進（pro-apoptotic）化合物、シグナル伝達モデュレーター、およびキナーゼインヒビターよりなる群から選ばれたさらなる薬剤をも含む。
【０１６３】
特に興味深い変形において、さらなる薬剤は、少なくとも１の化学療法化合物である。そのような化学療法化合物の適当な例は、副腎皮質ステロイド、たとえば、プレドニゾロン、デキサメタゾンまたはデカドロン；アルトレタミン（altretamine）(ヘキサレン（hexalen）、ヘキサメチルメラミン（HMM))；アミフォスチン（amifostine）(エトール（ethyol）)；アミノグルテチミド（シタドレン（cytadren）)；アムサクリン（amsacrine）(M-AMSA)；アナストロゾール（anastrozole）(アリミデックス（arimidex）)；アンドロゲン、たとえば、テストステロン；アスパラギナーゼ（エルスパール（elspar）)；カルメット−ゲラン桿菌；ビカルタミド（bicalutamide）(カソデックス（casodex）)；ブレオマイシン（ブレノキサン（blenoxane）)；ブソルファン（busulfan）(ミレラン（myleran）)；カルボプラチン（carboplatin）(パラプラチン（paraplatin）)；カルムスチン（carmustine）(BCNU, BiCNU)；クロラムブシル（chlorambucil）(ロイケラン（leukeran）)；クロロデオキシアデノシン（2-CDA, クラドリビン（cladribine）, ロイスタチン（leustatin）)；シスプラチン（プラチノール)；シトシンアラビノシド（シタラビン（cytarabine)；デカルバジン（dacarbazine）(DTIC)；ダクチノマイシン（dactinomycin）(アクチノマイシン-D, コスメゲン（cosmegen）)；ダウノルビシン（セルビジン（cerubidine）)；ドセタキセル（docetaxel）(タキソテレ（taxotere）)；ドキソルビシン（アドリオマイシン)；エピルビシン（epirubicin）；エストラムスチン（estramustine）(emcyt)；エストロゲン、たとえば、ジエチルスチルベストロール（DES)；エトプシド（etopside）(VP-16, VePesid, エトポフォス（etopophos）)；フルダラビン（fludarabine）(フルダラ（fludara）)；フルタミド（flutamide）(ユーレキシン（eulexin）)；5-FUDR (フロキシリジン（floxuridine）)；5-フルオロウラシル（5-FU)；ゲムシタビン（gemcitabine）(ゲムザー（gemzar）)；ゴセレリン（goserelin）(ゾダレックス（zodalex）)；ヘルセプチン（herceptin）(trastuzumab)；ヒドロキシ尿素（ヒドレア（hydrea）)；イダルビシン（idarubicin）(イダマイシン（idamycin）)；イフォスファミド（ifosfamide）；IL-2 (プロロイキン（proleukin）, アルデスロイキン（aldesleukin）)；インターフェロンアルファ（イントロンＡ（intron A）, ロフェロンＡ（roferon A）)；イリノテカン（irinotecan）(カンプトサール（camptosar）)；ロイプロリド（leuprolide）(ルプロン（lupron）)；レバミソール（levamisole）(エルガミソール（ergamisole）)；ロムスチン（lomustine）(CCNU)；メクロラタミン（mechlorathamine）(ムスタルゲン（mustargen, ナイトロジェンマスタード)；メルファラン（melphalan）(アルケラン（alkeran）)；メルカプトプリン（プリネトール（purinethol）, 6-MP)；メトトレキセート（メキセート（mexate）)；マイトマイシン-C（ムタムシン（mutamucin）)；ミトキサントロン（mitoxantrone）(ノバントロン（novantrone）)；オクトレオチド（octreotide）(サンドロスタチン（sandostatin）)；ペントスタチン（pentostatin）(2-デオキシコホルマイシン, ニペント（nipent）)；プリカマイシン（plicamycin）(ミトラマイシン, ミトラシン（mithracin）)；プロロカルバジン（prorocarbazine）(マツレーン（matulane）)；ストレプトゾシン（streptozocin）；タモキシフィン（tamoxifin）(ノルバデックス（nolvadex）)；タキソール（パクリタキセル（paclitaxel）)；テニポシド（teniposide）(ブモン（vumon）, VM-26)；チオテ��（thiotepa）；トポテカン（topotecan）(ヒカムチン（hycamtin）)；トレチノイン（tretinoin）(ベサノイド（vesanoid）, 全-トランスレチノイン酸)；ビンブラスチン（バルバン（valban）；ビンクリスチン（オンコビン（oncovin）およびビノレルビン（vinorelbine）(ナベルビン（navelbine）)よりなる群から選ばれたものである。一つの態様において、化学療法化合物は、フルダラビンおよびタキサン、たとえば、タキソール、パクリタキセルおよびドセタキセルから選ばれ、とりわけ、フルダラビンである。
【０１６４】
一つの変形において、本発明は、（ａ）１またはそれ以上のオリゴマー化合物および（ｂ）非アンチセンスメカニズムにより機能する１またはそれ以上の他の化学療法化合物を含有する医薬組成物を提供する。本発明の化合物とともに用いる場合、そのような化学療法化合物は、個々に（たとえば、ミトラマイシンおよびオリゴヌクレオチド）、連続して（たとえば、ミトラマイシンおよびオリゴヌクレオチド、所定の期間の後に他の薬剤およびオリゴヌクレオチド）、または１またはそれ以上のそのような他の化学療法化合物と組み合わせてまたは放射線療法を組み合わせて使用することができる。上記で明記したものを含めて当業者に知られたあらゆる化学療法化合物が、本発明による化合物との併用処置として導入される。
【０１６５】
一つの変形において、本発明は、（ａ）１またはそれ以上のオリゴマー化合物および（ｂ）１またはそれ以上の抗体化合物を含有する医薬組成物を提供する。１またはそれ以上の化学療法化合物もこの組み合わせに加えることができる。
【０１６６】
一つの好ましい態様において、医薬組成物をフルダラビンおよびタキサン化合物から選ばれる化合物と組み合わせて投与する。
【０１６７】
「タキサン化合物」なる語は、パクリタキセル（タキソールR）、パクリタキセル誘導体、ドセタキセル、タキソテレ、修飾タキサン、およびタキソイドアナログを包含することを意図するものである。パクリタキセル（タキソールR）は、西洋イチイ、タキスス・ブレビフォリア（Taxus brevifolia）の樹皮から単離したジテルペンであり、タキサン環系を有する治療剤のクラスの代表である。パクリタキセルおよびそのアナログは、イチイの針状葉および小枝から得られる前駆体である10-デアセチルバッカチンIII（10-deacetylbaccatin III）からの部分合成により、および全合成により製造されている。Holtonら、J. Am. Chem. Soc. 116:1597-1601 (1994)およびNicolaouら、Nature 367:630 (1994)を参照。パクリタキセルは、臨床試験において幾つかのヒト腫瘍で効能が示されている。McGuireら、Ann. Int. Med. 111:237-279 (1989); Holmesら、J. Natl. Cancer Inst. 83:1797-1805 (1991); Kohnら、J. Natl. Cancer Inst. 86:18-24 (1994);およびKohnら、American Society for Clinical Oncology 12 (1993)を参照。修飾タキサンまたはタキソイドアナログは、修飾側鎖を有するタキサン環の化合物である。これらアナログの多くは、天然に存在するパクリタキセルに比べて改善された特性、たとえば、より大きな水溶性および安定性を有する。これらアナログは当業者に知られており、たとえば、米国特許第5,278,324号;同第5,272,171号;同第5,254,580号;同第5,250,683号;同第5,248,796号;および同第5,227,400号（その開示を参照のため本明細書中に引用する）に開示されている。パクリタキセルおよびタキソテレは、WO 93/18210, EP 0 253 739, EP 0 253 739, およびWO 92/09589（その開示を参照のため本明細書中に引用する）に記載の方法により製造することができる。特別の態様において、タキサン化合物はパクリタキセルまたはタキソテレである。
【０１６８】
該組成物中での化学療法化合物（たとえば、フルダラビンおよび／またはタキサン化合物）とオリゴマー化合物との重量比は、典型的に50:1から1:25の範囲、たとえば、25:1から1:25の範囲、または10:1から1:25の範囲、または1:1から1:25の範囲、または50:1から1:10の範囲、または1:1から1:50の範囲、または25:1から1:10の範囲である。
【０１６９】
一つの態様において、医薬組成物は、少なくとも１の化学療法化合物（たとえば、フルダラビンおよび／またはタキサン化合物）および本明細書に記載のオリゴマーを薬理学的に許容しうる担体中に含有し、その際、該組成物中での化学療法化合物とオリゴマー化合物との重量比は50:1から1:25の範囲である。
【０１７０】
他の態様において、医薬組成物は、少なくとも１の化学療法化合物（たとえば、フルダラビンおよび／またはタキサン化合物）およびコンジュゲートを薬理学的に許容しうる担体中に含有し、該コンジュゲートは、本明細書に記載するオリゴマー化合物および該オリゴマー化合物に共有結合した少なくとも１の非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド残基からなり、その際、該組成物中での化学療法化合物と該コンジュゲート中のオリゴマー化合物の部分との重量比は50:1から1:25の範囲である。この態様内での変形において、該少なくとも１の非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド残基は、化学療法化合物（たとえば、フルダラビンおよび／またはタキサン化合物）を含む。
【０１７１】
２つの態様において、オリゴマー化合物の標的結合ドメインは、好ましくは、SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 (および35), 12, 13, 14, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, および52よりなる群から選ばれたものであり、とりわけ、標的結合ドメインは、SEQ ID NO: 8 (および35)であるか、または、オリゴマー化合物の標的結合ドメインは、好ましくは、SEQ ID NOS: 15 (および29), 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 53, 54および55よりなる群から選ばれたものであり、とりわけ、標的結合ドメインは、SEQ ID NO: 15 (および29)である。
【０１７２】
上記のように、該化合物が、SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 (および35), 12, 13, 14, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51および52よりなる群から選ばれること、とりわけ、SEQ ID NO: 8 (および35)であること、または、該化合物が、SEQ ID NOS: 15 (および29), 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 53, 54および55よりなる群から選ばれること、とりわけ、SEQ ID NO: 15 (および29)であることが特に好ましい。
【０１７３】
本発明のオリゴマー化合物はまた、活性な薬剤、たとえば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤または抗生物質にコンジュゲートすることができる。
【０１７４】
抗炎症剤（非ステロイド抗炎症剤およびコルチコステロイドを含むが、これらに限られるものではない）、抗ウイルス剤、およびイムノモデュレーターをも本発明の組成物と組み合わせることができる。２またはそれ以上の組み合わせた化合物は、一緒に、または連続して使用できる。
【０１７５】
さらなる態様において、本発明の医薬組成物は、Ｂｃｌ−２をターゲティングする１またはそれ以上のオリゴマー化合物と第二の核酸標的にターゲティングする１またはそれ以上の別のアンチセンス化合物とを含有していてよい。２またはそれ以上の組み合わせた化合物は、一緒に、または連続して使用できる。
【０１７６】
さらに、オリゴマー化合物を含有する医薬は、放射線療法等と組み合わせて使用することができる。
【０１７７】
好ましい医薬組成物
一つの態様において、本発明の医薬組成物は、水性担体中に長さが１０〜３０ヌクレオ塩基のオリゴマー化合物を含有する液体医薬組成物であり、該オリゴマー化合物は、ヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域に特異的にハイブリダイズすることのできる標的結合ドメインを含み、該標的結合ドメインは、式：
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
（式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す）を有し、該標的結合ドメインは、ホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）によって連結された少なくとも２つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含み、該水性担体は、ｐＨを4.0-8.5の範囲に保持し、20-2000mMのイオン強度を有するようにする緩衝液を含む。
【０１７８】
他の態様において、本発明の医薬組成物は、水性担体中にコンジュゲートを含有する液体医薬組成物であり、該コンジュゲートは、長さが１０〜３０ヌクレオ塩基のオリゴマー化合物および該化合物に共有結合した少なくとも１の非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド残基からなり、該オリゴマー化合物は、ヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域に特異的にハイブリダイズすることのできる標的結合ドメインを含み、該標的結合ドメインは、式：
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
（式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す）を有し、該標的結合ドメインは、ホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）によって連結された少なくとも２つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含み、該水性担体は、ｐＨを4.0-8.5の範囲に保持し、20-2000mMのイオン強度を有するようにする緩衝液を含む。
【０１７９】
そのような組成物は、少なくとも１の化学療法化合物（たとえば、フルダラビンおよび／またはタキサン化合物）をさらに含有するのが好ましい。上記のように、該組成物中での化学療法化合物と該コンジュゲートのLNAオリゴヌクレオチド部分との重量比は50:1から1:25の範囲である。
【０１８０】
さらなる態様において、本発明の医薬組成物は、水性担体中に少なくとも１の化学療法化合物（たとえば、フルダラビンおよび／またはタキサン化合物）および長さが１０〜３０ヌクレオ塩基のオリゴマー化合物を含有する医薬組成物であり、該オリゴマー化合物は、ヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域に特異的にハイブリダイズすることのできる標的結合ドメインを含み、該標的結合ドメインは、式：
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
（式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す）を有し、該標的結合ドメインは、ホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）によって連結された少なくとも２つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含み、該組成物中での化学療法化合物と該LNAオリゴヌクレオチドとの重量比は50:1から1:25の範囲である。
【０１８１】
さらに他の態様において、本発明の医薬組成物は、薬理学的に許容しうる担体中に少なくとも１の化学療法化合物（たとえば、フルダラビンおよび／またはタキサン化合物）およびコンジュゲートを含有する医薬組成物であり、該コンジュゲートは、長さが１０〜３０ヌクレオ塩基のオリゴマー化合物および該化合物に共有結合した少なくとも１の非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド残基からなり、該オリゴマー化合物は、ヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域に特異的にハイブリダイズすることのできる標的結合ドメインを含み、該標的結合ドメインは、式：
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
（式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す）を有し、該標的結合ドメインは、ホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）によって連結された少なくとも２つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含み、該組成物中での化学療法化合物と該コンジュゲートの該LNAオリゴヌクレオチド部分との重量比は50:1から1:25の範囲である。
【０１８２】
適応症
Ｂｃｌ−２は、赤血球の増殖、細胞の増殖、イオン代謝、グルコースおよびエネルギー代謝、ｐＨ制御およびマトリックス代謝を含む多くの基本的な生物学的メカニズムに関与している。本発明の方法は、癌によって引き起こされる疾患に対する治療、維持治療または予防、とりわけ、Ｂｃｌ−２の発現と関連する癌、たとえば、乳、結腸、前立腺、膵臓、肺、肝臓、胸腺、腎臓、脳、精巣、胃、腸管、腸、脊髄、洞、膀胱、尿管、卵巣、頭および首、血液、皮膚、胃、または骨の癌の治療に用いるのが好ましい。
【０１８３】
本明細書に記載する本発明は、治療学的有効量のＢｃｌ−２モデュレーターであるオリゴマー化合物をヒトに投与することを含む、癌を予防、維持治療または治療する方法を包含する。本発明はさらに、Ｂｃｌ−２モデュレーターであるオリゴマー化合物の短期間の投与の使用を包含する。正常な非癌細胞は、特定の細胞型に特徴的な頻度で分裂する。細胞が癌状態にトランスフォームされると、制御されない細胞増殖および低減した細胞死をいう結果となり、それゆえ無差別の細胞分裂または細胞増殖が癌性細胞型の顕著な特徴となる。癌のタイプの例としては、これらに限られるものではないが、リンパ腫および白血病（たとえば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性白血病、たとえば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫）、結腸癌腫、直腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝癌、胆汁管癌、絨毛癌、頸部癌、精巣癌、肺癌腫、膀胱癌腫、骨髄腫、頭部および頸部の癌、脳癌、原発部位の不明な癌、新生物、末梢神経系の癌、中枢神経系の癌、様々な種類の腫瘍（たとえば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（lymphangioendotheliosarcoma）、滑液腫（synovioma）、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、小細胞肺癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫、神経芽腫、および網膜芽腫）、Ｈ鎖病、転移、または制御できないまたは異常な細胞増殖を特徴とするあらゆる疾患または障害が挙げられる。
【０１８４】
本発明の非ホジキンリンパ腫としては、これらに限られるものではないが、前駆体細胞リンパ腫、たとえば、リンパ芽球性リンパ腫（Ｔ細胞およびＢ細胞）；末梢Ｂ細胞新生物、たとえば、Ｂ−慢性リンパ性白血病（B-chronic lymphocytic leukaemia）および小リンパ球性リンパ腫、Ｂ−プロリンパ性白血病（B-prolymphocytic leukaemia）、リンパ性形質細胞性リンパ腫（Lymphoplasmacytic lymphoma）、マンテル細胞リンパ腫（Mantel Cell lymphoma）、濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴ型の結節外辺縁帯（Extranodal marginal zone）Ｂ細胞リンパ腫、結節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（Nodal marginal zone B-cell lymphoma）、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（Splenic marginal zone B-cell lymphoma）、ヘアリーセル白血病、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（Diffuse large B-cell lymphoma）、バーキット様リンパ腫を含むバーキットリンパ腫、形質細胞腫および形質細胞骨髄腫；末梢Ｔ細胞およびＮＫ細胞新生物、たとえば、Ｔ−プロリンパ性白血病（T-prolymphocytic leukaemia）、Ｔ細胞顆粒球性白血病、攻撃的ＮＫ細胞白血病、菌状息肉腫およびセザリー症候群、末梢Ｔ細胞リンパ腫、血管性免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、結節外ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（Extranodal NK/T cell lymphoma）（鼻および鼻型）、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾γδＴ細胞リンパ腫（Hepatosplenic γδ T-cell lymphoma）、皮下脂肪組炎型Ｔ細胞リンパ腫（Subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma）、未分化大細胞リンパ腫（Ｔ／ヌル細胞および原発性全身性型）、未分化大細胞リンパ腫（Ｔ／ヌル細胞、原発性皮下型）および成人Ｔ細胞リンパ腫および白血病（ＨＴＬＶ１＋）が挙げられる。
【０１８５】
現在のところ、特に臨床結果を達成できるのは、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病および非ホジキンリンパ腫、とりわけ、濾胞性リンパ腫およびびまん性大Ｂ細胞リンパ腫であると考えられている。
【０１８６】
「癌腫」なる語は、上皮由来の悪性腫瘍を指称することを意図するものである。上皮組織は、生体の内部および外部の生体表面を覆いまたは並んでいる。上皮組織の例は、皮膚および粘膜、および体腔や内部臓器（腸、膀胱、子宮など）に並んでいる漿膜である。上皮組織はまた、さらに深い組織層に延びて腺（粘液分泌腺など）を形成してよい。
【０１８７】
「肉腫」なる語は、結合組織、たとえば、軟骨、脂肪、筋肉、腱および骨から増殖する悪性腫瘍を指称することを意図するものである。
【０１８８】
「神経膠腫」なる語は、本明細書で使用する場合、グリア細胞に由来する悪性腫瘍を包含することを意図するものである。
【０１８９】
使用
本発明のオリゴマー化合物は、治療、維持治療および予防として利用することができる。研究においては、アンチセンスオリゴマー化合物は、細胞および実験動物においてＢｃｌ−２タンパク質の合成を特異的に抑制し、それによって標的の機能分析または治療介入のための標的としての有用性の評価を容易にするのに用いることができる。治療のためには、Ｂｃｌ−２の発現をモデュレートすることによって治療することのできる疾患または障害を罹患していることが疑われる動物またはヒト（とりわけ、ヒト）を、本発明によるアンチセンス化合物を投与することにより治療する。さらに、治療学的または予防学的有効量の１またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することにより、Ｂｃｌ−２の発現と関連する疾患または状態を罹患しているかまたは罹患しそうなことが疑われる動物、とりわけマウスおよびラットを治療し、およびヒトを治療する方法も提供される。
【０１９０】
本発明はさらに、細胞または組織中のＢｃｌ−２の発現をモデュレートする方法を提供し、該方法は、Ｂｃｌ−２の発現がモデュレートされるように、該細胞または組織を本明細書に記載のオリゴマー化合物またはコンジュゲート、とりわけ本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【０１９１】
さらに、本発明は、癌疾患に関与する遺伝子の発現をモデュレートする方法であって、該遺伝子または該遺伝子からのＲＮＡを本明細書に記載のオリゴマー化合物またはコンジュゲート、とりわけ、本明細書に記載の医薬組成物と接触させ、それによって遺伝子発現をモデュレートすることを含む方法を提供する。この遺伝子は、好ましくはヒトＢｃｌ−２遺伝子である。
【０１９２】
本発明の他の側面は、細胞のアポトーシスを誘発する方法であって、該細胞または該細胞からのＲＮＡを本明細書に記載のオリゴマー化合物またはコンジュゲート、とりわけ、本明細書に記載の医薬組成物と接触させ、それによって細胞のアポトーシスを誘発することを含む方法に関する。アポトーシスの誘発は、インビトロまたはインビボであってよい。誘発は、細胞アッセイにおいて、または組織試料内で、または生きた哺乳動物内で誘起することができる。
【０１９３】
本発明の他の側面は、細胞の増殖を妨害または低減する方法であって、該細胞または該細胞からのＲＮＡを本明細書に記載のオリゴマー化合物またはコンジュゲート、とりわけ、本明細書に記載の医薬組成物と接触させ、それによって細胞の増殖を妨害または低減することを含む方法に関する。増殖の妨害または低減は、インビトロまたはインビボであってよい。妨害は、細胞アッセイにおいて、または組織試料内で、または生きた哺乳動物内で誘起することができる。
【０１９４】
さらに、本発明は、癌疾患を罹患しているかまたは感受性の哺乳動物を治療する方法を提供し、該方法は、該哺乳動物に、治療学的有効量の本明細書に記載のオリゴマー化合物またはコンジュゲート、とりわけ本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。
【０１９５】
一つの態様において、治療は、化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物、細胞増殖抑制化合物、抗血管形成化合物、抗増殖化合物、アポトーシス促進化合物、シグナル伝達モデュレーター、抗体およびキナーゼインヒビターよりなる群から選ばれたさらなる薬剤の投与と組み合わせる。特別の変形において、さらなる薬剤は、少なくとも１の化学療法剤、とりわけ、１またはそれ以上の上記に記載した特定の化学療法剤である。
【０１９６】
本発明はまた、血管形成により引き起こされる疾患を罹患しているかまたは感受性の哺乳動物を治療する方法をも提供し、該方法は、該哺乳動物に、治療学的有効量の本明細書に記載のオリゴマー化合物またはコンジュゲート、とりわけ本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。
【０１９７】
さらに、本発明は、医薬として使用するための本明細書に記載のオリゴマー化合物を提供する。さらに詳細には、本発明は、癌疾患の治療のための医薬の製造のための本明細書に記載のオリゴマー化合物の使用を提供する。医薬は、上記に記載の医薬組成物の形態にあるのが好ましい。
【０１９８】
それゆえ、本発明のさらなる一つの側面は、癌疾患を罹患しているかまたは感受性の哺乳動物、とりわけヒトの治療のための医薬組成物の製造のための本明細書に記載のオリゴマー化合物の使用に関する。
【０１９９】
本発明のさらに別の側面は、癌疾患を罹患しているかまたは感受性の哺乳動物、とりわけヒトを治療する方法に関し、該方法は、該哺乳動物に、本明細書に記載のオリゴマー化合物を含有する第一の医薬組成物の１またはそれ以上の治療学的有効量を投与する工程を含む。
【０２００】
本発明のさらに別の側面は、癌疾患を罹患しているかまたは感受性の哺乳動物、とりわけヒトを治療する方法に関し、該方法は、該哺乳動物に、コンジュゲートを含有する第一の医薬組成物の１またはそれ以上の治療学的有効量を投与する工程を含み、該コンジュゲートは、オリゴマー化合物および該オリゴマー化合物に共有結合した少なくとも１の非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド残基からなる。
【０２０１】
上記後者の２つの側面の変形は、１またはそれ以上の化学療法化合物（たとえば、フルダラビンおよび／またはタキサン化合物）をLNAオリゴヌクレオチドと組み合わせて投与するものであり、とりわけ、該化学療法化合物が該LNAオリゴヌクレオチドを含有する第一の医薬組成物中に含まれるものである。
【０２０２】
上記後者の２つの側面の他の変形は、１またはそれ以上の化学療法化合物（たとえば、フルダラビンおよび／またはタキサン化合物）が、該LNAオリゴヌクレオチドを含有しない第二の医薬組成物中に含まれるものである。この場合、第一の医薬組成物および第二の医薬組成物は、同時に、または連続して投与してよい。
【０２０３】
さらに一般的には、医薬はさらに、化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物、細胞増殖抑制化合物、抗血管形成化合物、抗増殖化合物、アポトーシス促進化合物、シグナル伝達モデュレーター、およびキナーゼインヒビターよりなる群から選ばれたさらなる薬剤を含んでいてよい。特別の態様において、該さらなる薬剤は、少なくとも１の化学療法化合物、とりわけ、上記の特定の化学療法化合物の１またはそれ以上である。
【０２０４】
上記で言及した癌疾患は、上記でさらに詳細に記載したように、肺、乳、結腸、前立腺、膵臓、肺、肝臓、胸腺、腎臓、脳、精巣、胃、腸管、腸、脊髄、洞、膀胱、尿管、卵巣、頭および首、血液、または皮膚の癌である。
【０２０５】
さらに、本発明は、ヒトＢｃｌ−２タンパク質をコードするリボ核酸にハイブリダイズした化合物を含む複合体を提供し、該化合物は、本明細書に記載のオリゴマー化合物またはコンジュゲートである。そのような複合体は、標的、すなわちヒトＢｃｌ−２タンパク質をコードするリボ核酸を本明細書に記載のオリゴマー化合物またはコンジュゲートで処置した結果物であってよい。
【０２０６】
投与
本発明の医薬組成物は、局所あるいは全身処置が望まれるか否かおよび処置する領域に依存して多くの仕方で投与することができる。投与は、（ａ）経口、（ｂ）肺で行う、たとえば、粉末またはエアゾル剤の吸入（ネブライザーによるもの、気管内、鼻内を含む）、（ｃ）表皮、経皮、眼内および粘膜（膣および直腸送達を含む）を含む局所、または（ｄ）静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入、または頭蓋内（たとえば、くも膜下腔内または脳室内）投与を含む非経口であってよい。一つの態様において、オリゴマー化合物は、静脈内、腹腔内、経口、局所またはボーラス注射により投与し、または標的臓器に直接投与する。
【０２０７】
局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ剤、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、噴霧剤、坐剤、液剤および粉末薬が挙げられる。通常の製薬担体、水性、粉末または油性基剤、粘稠化剤などは必要または所望される。被覆コンドーム、グラブ（gloves）なども用いることができる。好ましい局所製剤としては、本発明のオリゴヌクレオチドが局所送達剤、たとえば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤および界面活性剤と混合されるものが挙げられる。経口投与のための組成物および製剤としては、これらに限られるものではないが、粉末薬または顆粒剤、ミクロ粒子、ナノ粒子、水もしくは非水媒体中の懸濁剤または水溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤（sachets）、錠剤またはミニ錠剤（minitablets）が挙げられる。非経口、くも膜下腔内または脳室内投与のための組成物および製剤としては、緩衝液、希釈液および他の適当な添加剤、たとえば、これらに限られるものではないが、透過促進剤、担体化合物および他の薬理学的に許容しうる担体または賦形剤を含んでいてよい滅菌水溶液が挙げられる。
【０２０８】
送達
本発明の医薬組成物としては、これらに限られるものではないが、液剤、懸濁剤、およびリポソーム含有製剤が挙げられる。これら組成物は、前もって生成した液体、自己懸濁化固体および自己懸濁化半固体を含む（これらに限られるものではない）様々な成分から調製できる。腫瘍組織への薬剤の送達は、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分枝鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子およびミクロスフェアを含む（これらに限られるものではない）担体媒体送達により促進することができる（Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27）。
【０２０９】
本発明の医薬製剤は、単位投与剤型にて都合よく提供することができ、製薬産業においてよく知られた常法に従って調製することができる。そのような常法は、活性成分を製薬担体または賦形剤と混合する工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または細かく分割した固体担体または両者と均一かつ密に混合することにより調製する。
【０２１０】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ、軟ゲルおよび坐剤などの（これらに限られるものではない）多くの可能な剤型に製剤化することができる。本発明の組成物はまた、水性、非水性または混合媒体中の懸濁剤としても製剤化することができる。水性懸濁剤は、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁剤の粘度を増大させる物質をさらに含んでいてよい。懸濁剤はまた、安定化剤をも含んでいてよい。
【０２１１】
投与量
投与量は、処置しようとする疾患状態の重篤度および応答性、および数日から数ヶ月、または治癒が有効となるかまたは疾患状態の縮減が達成されるまで持続する処置の経過に依存する。最適の投与スケジュールは、たとえば、併用処置、疾患および疾患状態および初期臨床徴候からの結果に依存するであろう。
【０２１２】
最適の投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な効力に依存して変わる。一般に、それは、インビトロおよびインビボ動物モデルで有効であると見出されたＥＣ５０に基づいて評価することができる。一般に、投与量は、体重１ｋｇ当たり０.０１μｇ〜１ｇであり、毎日、毎週、毎月または毎年１回またはそれ以上、あるいは２〜１０年に１回、または数時間から数ヶ月の間の連続注入により投与できる。投与の繰り返し頻度は、体液または組織中の薬剤の測定した残留時間および濃度に基づいて評価することができる。成功した処置後、患者に維持療法を受けさせて疾患状態の再発を防ぐのが望ましい。
【０２１３】
いかなる特定の理論に拘束されるものではないが、本発明による化学療法化合物とオリゴマー化合物との組み合わせ効果（および、おそらく相乗効果）は、化学療法化合物またはオリゴマー化合物または両者の投与量の低減を可能とするであろう。
【０２１４】
キット
本発明のさらなる側面は、
（ａ）本明細書に記載のオリゴマー化合物の１またはそれ以上の注射可能な溶液投与量を入れた第一のコンポーネント、および
（ｂ）１またはそれ以上の化学療法化合物（たとえば、フルダラビンおよび／またはタキサン化合物）の１またはそれ以上の注射可能な溶液を入れた第二のコンポーネント
を含み、その際、該組成物中での該少なくとも１のタキサン化合物と該少なくとも１のLNAオリゴヌクレオチドとの重量比が50:1から1:25の範囲であるキットに関する。
【０２１５】
好ましくは、オリゴマー化合物の注射可能な溶液は、上記に記載の医薬組成物である。
【０２１６】
実施例
実施例１：モノマー合成
LNAモノマー構築ブロックおよびその誘導体を、以下の刊行された方法およびその中で引用された文献に従って調製した：
WO 03/095467 A1
D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) LNAホスホルアミダイトの調製, Synthesis 6, 802-808
M. D. Sorensen, L. Kvaerno, T. Bryld, A. E. Hakansson, B. Verbeure, G. Gaubert, P. Herdewijn, J. Wengel (2002) α-L-リボ-配置Locked Nucleic Acid (α-l-LNA):合成および特性, J. Am. Chem. Soc., 124, 2164-2176.
S. K. Singh, R. Kumar, J. Wengel (1998) 新規なビシクロ[2.2.1]リボヌクレオチド: 2'-アミノ- および2'-チオ-LNAモノマーヌクレオシドの合成, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078-6079.
C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sorensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Synthesis of 2'-アミノ-LNAの合成:新規な戦略, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663.
D. S. Pedersen, T. Koch (2003) LNA (Locked Nucleic Acid)のアナログ 2'-チオ-LNAチミンおよび5-メチルシトシンホスホルアミダイトの合成, Synthesis, 受領。
【０２１７】
実施例２：オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを、Expedite 8900/MOSS合成機（Multiple Oligonucleotide Synthesis System）でのホスホルアミダイトアプローチを用い、1μモルまたは15μモルのスケールで合成した。より大きなスケールの合成にはAkta Oligo Pilotを用いた。合成の終了時（DMT-on）、水性アンモニアを室温で１〜２時間用いてオリゴヌクレオチドを固相支持体から開裂し、６５℃で４時間さらに脱保護した。オリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製した。ＤＭＴ基の除去後、ＡＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、およびＣＧＥによりオリゴヌクレオチドを特徴付け、分子量をＥＳＩ−ＭＳによりさらに確認した。詳細は以下を参照。
【０２１８】
LNA-固相支持体の調製：
LNAスクシニルヘミエステルの調製
5'-O-Dmt-3'-ヒドロキシ-LNAモノマー（500mg）、無水コハク酸（1.2当量）およびDMAP（1.2当量）をDCM（35mL）に溶解した。反応液を室温で一夜攪拌した。NaH2PO4 0.1M pH 5.5 (2×)および食塩水(1×)で抽出した後、有機層をさらに無水Na2SO4で乾燥させ、濾過および蒸発させた。ヘミエステルを95%の収率で得、さらに精製することなく用いた。
【０２１９】
LNA-支持体の調製
上記で調製したヘミエステル誘導体（90μモル）を最小量のDMFに溶解し、DIEAおよびpyBOP（90μモル）を加え、1分間攪拌した。この前活性化混合物をLCAA-CPG（500オングストローム、80-120メッシュサイズ、300mg）と手動合成機中で混合し、攪拌した。室温で1.5時間後、支持体を濾去し、DMF、DCMおよびMeOHで洗浄した。乾燥後、負荷を57μモル/gと決定した（Tom Brown, Dorcas J.S.Brown. Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis. In: F.Eckstein編、Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. オックスフォード: IRLプレス, 1991: 13-14を参照）。
【０２２０】
オリゴヌクレオチドの伸長
ホスホルアミダイト（A(bz), G(ibu), 5-メチル-C(bz))またはT-β-シアノ-エチル-ホスホルアミダイト）のカップリングを、アセトニトリル中の0.1Mの5'-O-DMT-保護アミダイトの溶液およびアクチベーターとしてアセトニトリル（0.25M）中のDCI（4,5ジシアノイミダゾール）を用いて行う。チオール化を、水素化キサンテン（アセトニトリル：ピリジン10%中に0.01M）を用いて行う。残りの試薬は、オリゴヌクレオチドの合成に典型的に使用するものである。供給者により提供されるプロトコールを都合よく最適化した。
【０２２１】
ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製：
カラム:Xterra RP18
流速：3mL/分
緩衝液：0.1M酢酸アンモニウム、pH8およびアセトニトリル
【０２２２】
略語
DMT：ジメトキシトリチル
DCI：4,5-ジシアノイミダゾール
DMAP：4-ジメチルアミノピリジン
DCM：ジクロロメタン
DMF：ジメチルホルムアミド
THF：テトラヒドロフラン
DIEA：N,N-ジイソプロピルエチルアミン
PyBOP：ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Bz：ベンゾイル
Ibu：イソブチリル
【０２２３】
オリゴヌクレオチドの大スケール合成：
大スケールでのオリゴヌクレオチドを、AKTAオリゴパイロットでのホスホルアミダイトアプローチを用いて200μモル〜1ミリモルのスケールで合成した。オリゴのDMT-OFF-合成後、その後のDEA-処理も合成機で行った。固相支持体からのオリゴヌクレオチドの開裂、および保護基の除去を、水性アンモニアでの５５℃での１２時間の処理により行った。ついで、オリゴヌクレオチドをAKTAパイロット上でのイオン交換（IEX）により精製した。脱塩を、SephadexTM G-25培地で行い、ついで凍結乾燥した。オリゴヌクレオチドをＩＥＸ−ＨＰＬＣ、ＣＧＥおよびＥＳＩ−ＭＳにより特徴付けた。
【０２２４】
ＤＮＡ-ホスホルアミダイト（A(bz), C(bz), G(ibu)および(T)）およびLNA-ホスホルアミダイト（(C(bz)および(T)）のカップリングを、アセトニトリル中の該アミダイトの0.2M溶液およびアクチベーターとして0.75M DCI（4,5ジシアノイミダゾール）を用いて行う。チオール化を、水素化キサンテン（アセトニトリル：ピリジン20%中に0.0175M）を用いて行う。残りの試薬は、オリゴヌクレオチドの合成に典型的に使用するものである。
【０２２５】
実施例３：オリゴマー化合物のデザイン
表１：本発明のオリゴマー化合物
本明細書において、オリゴマー化合物は特定の配列番号、たとえば、「SEQ ID NO: 15」により言及される。化合物「SEQ ID NO: 56」はまたオブリマーセンナトリウムとも呼ばれ、本明細書において参照化合物として用いられる。
【０２２６】
【表１】
2007515175.tif 000007
【表２】
2007515175.tif 000008
【０２２７】
表１において、大文字はLNAヌクレオチドを示し、上付きの「α」はLNAヌクレオチドがアルファ-L-LNAヌクレオチド（すなわち、LNAアナログヌクレオチド）であることを示し、下付きの「S」は隣接するヌクレオチドがホスホルアミダイト基により連結されていることを示す。LNA-Cモノマーはすべてメチル-Cである。
【０２２８】
実施例４：インビトロモデル：細胞培養
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の作用は、該標的核酸が測定可能なレベルで存在することを条件として、様々な細胞型のいずれにおいても試験することができる。標的は、内生的に、または該核酸をコードする核酸の一過性または安定なトランスフェクションにより発現させることができる。
【０２２９】
標的核酸の発現レベルは、たとえば、ノーザンブロット分析、定量的ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたは他の定量法を用いてルーチンに決定することができる。以下の細胞型が例示目的で提供されるが、選択した細胞型で標的が発現されることを条件として他の細胞型をルーチンに用いることができる。
【０２３０】
細胞を以下に記載する適当な培地で培養し、３７℃で95-98%の湿度および5%CO2に保持した。細胞を毎週2-3回、ルーチンに継代した。
【０２３１】
１５ＰＣ３：ヒト前立腺癌細胞株１５ＰＣ３は、F. Baas博士［Neurozintuigen Laboratory, AMC（オランダ）］の好意により提供され、DMEM (Sigma) + 10%ウシ胎仔血清 (FBS) + Glutamax I + ゲンタマイシン中で培養した。
【０２３２】
ＰＣ３：ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ３は、ＡＴＣＣから購入し、グルタミン (Gibco) + 10% FBS + ゲンタマイシンを添加したF12 Coon培地で培養した。
【０２３３】
518A2: ヒト黒色腫細胞株518A2は、B. Jansen博士［ウイーン大学、臨床薬理学部、分子薬理学、実験腫瘍学の部門］の好意により提供され、DMEM (Sigma) + 10%ウシ胎仔血清 (FBS) + Glutamax I + ゲンタマイシン中で培養した。
【０２３４】
実施例５：インビトロモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理
トランスフェクションビヒクルとしてカチオン性リポソーム製剤であるLipofectAMINE 2000 (Gibco)を用い、細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。
【０２３５】
細胞を12-ウエル細胞培養プレート（NUNC）に播種し、80-90%のコンフルエンスで処理した。使用したオリゴマー濃度は、0.2nMから100nMの最終濃度であった。オリゴマー-脂質複合体の調剤は、血清不含OptiMEM (Gibco)および500μlの全容量で10μg/ml LipofectAMINE 2000の最終脂質濃度を用い、本質的にDeanらの記載（Journal of Biological Chemistry 1994, 269, 16416-16424）に従って行った。
【０２３６】
細胞を３７℃で４時間インキュベーションしてトランスフェクションした。その後、トランスフェクション培地を除去し、血清含有培地を添加する前に細胞を洗浄した。細胞を０〜７２時間の範囲の様々な時間培養した。
【０２３７】
実施例６：インビトロモデル：ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡの単離
RNeasyミニキット（QiagenカタログNo. 74104）かまたはTrizol試薬（Life technologiesカタログNo. 15596)のいずれかを用い、全ＲＮＡを単離した。細胞株からのＲＮＡ単離の場合はRNeasyが好ましい方法であり、組織試料からの単離の場合はTrizolが好ましい方法である。
【０２３８】
Qiagen RNA OPF Robot - BIO Robot 3000を製造業者によって提供されるプロトコールに従って用い、全ＲＮＡを細胞株から単離した。
【０２３９】
組織試料をホモジナイズし、Trizol試薬を製造業者によって提供されるプロトコールに従って用いて全ＲＮＡを単離した。
【０２４０】
第一鎖の合成
OmniScript Reverse Transcriptaseキット（カタログ#205113, Qiagen）を製造業者の指示に従って用い、第一鎖の合成を行った。
【０２４１】
各試料について、0.5μgの全ＲＮＡをRNase不含H2Oで12μlに調節し、2μlのポリ(dT)12-18(2.5μg/ml)(Life Technologies, GibcoBRL,ロスキレ, DK)、2μlのdNTP混合物（各5mMのdNTP)、2μlの10×緩衝液RT、1μlのRNAguardIMRnase INHIBITOR（33.3U/ml)(カタログ#27-0816-01, Amersham Pharmacia Biotech,ヘルショルム, DK)および1μlのOmniScript Reverse Transcriptase（4U/μl）と混合し、ついで３７℃で６０分間インキュベートし、９３℃で５分間酵素を熱不活化した。
【０２４２】
実施例７：インビトロモデル：リアルタイムＰＣＲによるＢｃｌ−２発現のオリゴヌクレオチド抑制の分析
Ｂｃｌ−２発現のアンチセンスモデュレーションは、当該技術分野で知られた様々な仕方でアッセイすることができる。たとえば、Ｂｃｌ−２ｍＲＮＡレベルを、たとえば、ノーザンブロット分析または定量的ＰＣＲにより定量することができる。定量的ＰＣＲが現在のところ好ましい。ＲＮＡ分析は全細胞のＲＮＡまたはｍＲＮＡで行うことができる。
【０２４３】
ＲＮＡの単離およびノーザンブロット分析などのＲＮＡ分析の方法は当該技術分野でルーチンであり、たとえば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sonsに教示されている。
【０２４４】
定量的リアルタイム（ＰＣＲ）は、BioRAD Laboratoriesから利用できる市販のiQ Multi-Color Real Time PCR Detection Systemを用いて都合よく行うことができる。
【０２４５】
Ｂｃｌ−２ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲ分析
ｍＲＮＡレベルの定量を、iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System（BioRAD）を製造業者の指示に従って用いたリアルタイムの定量的ＰＣＲにより決定した。
【０２４６】
リアルタイム定量的ＰＣＲは、当該技術分野でよく知られた技術であり、たとえば、Heidら、Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994に教示されている。
【０２４７】
Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG 2x PCRマスター混合物をInvitrogenカタログ#11730から得た。プライマーおよびTaqManRプローブをMWG-Biotech AG,エベルスブルク、ドイツから得た。
【０２４８】
刊行された配列情報（ジーンバンク番号NM001168、本明細書においてSEQ ID NO: 1001として引用）を用い、ヒトＢｃｌ−２に対するプローブおよびプライマーをヒトＢｃｌ−２配列にハイブリダイズするようにデザインした。
【０２４９】
ヒトＢｃｌ−２のため、ＰＣＲプライマーは：
フォアウォードプライマー：5'catgtgtgtggagagcgtcaa3'（アッセイでの最終濃度；0.6μM)(SEQ ID NO: 62）
リバースプライマー：5'gccggttcaggtactcagtca3'（アッセイでの最終濃度；0.6μM)(SEQ ID NO: 63）
であり、ＰＣＲプローブは：
5'FAM-cctggtggacaacatcgccctgt-TAMRA 3'（アッセイでの最終濃度；0.1μM)(SEQ ID NO: 64）であった。
【０２５０】
グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）mRNA量を、試料調製物での偏差を正規化するための内生対照として用いた。
【０２５１】
ヒトGAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent（Applied BiosystemsカタログNo. 4310884E）を製造業者の指示に従って用い、ヒトGAPDHのmRNAの試料含量を定量した。
【０２５２】
リアルタイムＰＣＲ
上記で行った第一鎖合成からのｃＤＮＡを２〜２０倍に希釈し、リアルタイム定量的ＰＣＲにより分析した。プライマーおよびプローブを2×Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG（カタログ#11730, Invitrogen）と混合し、3.3μlのｃＤＮＡに添加して最終容量25μlとした。各試料を３つずつ分析した。目的のＲＮＡを発現する細胞株から精製した物質で調製したｃＤＮＡの２倍希釈のアッセイは、該アッセイの標準曲線を生成した。鋳型不在の対照にはｃＤＮＡの代わりに滅菌H2Oを用いた。ＰＣＲプログラム：５０℃で２分、９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒、６０℃で１分を４０サイクル。
【０２５３】
標的ｍＲＮＡ配列の相対量を、iCycler iQ Real-time Detection Systemソフトウエアを用い、計算した閾値サイクルから決定した（表２参照）。
【０２５４】
実施例８：インビトロ分析：Ｂｃｌ−２タンパク質レベルのウエスタンブロット分析
Ｂｃｌ−２のタンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット分析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）または蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）その他などの当該技術分野でよく知られた様々な仕方で定量することができる。Ｂｃｌ−２に対する抗体は同定でき、Upstate Biotechnologies（レイクプラシッド、米国）、Novus Biologicals（リットルトン、コロラド）、Santa Cruz Biotechnology（サンタクルス、カリフォルニア）、DAKO（グロストルップ、デンマーク）などの様々な入手先から得ることができ、あるいは通常の抗体製造法により調製することができる。ウエスタンブロッティング：
【０２５５】
Ｂｃｌ−２タンパク質レベルに対するＢｃｌ−２オリゴのインビトロでの作用をウエスタンブロッティングにより決定した。
【０２５６】
細胞を実施例５の記載に従ってトランスフェクションした。トランスフェクションの０〜７２時間後の範囲の時点で、細胞を回収し、プロテアーゼインヒビターカクテル錠剤（Roche）を添加した2.5%SDS、5mM DTTおよび6M尿素中で溶解した。全タンパク質濃度をBradford試薬を用いて測定した。150μgの全タンパク質を、MOPS緩衝液中の12%Bis-Trisゲルで泳動し、製造業者の推奨（Invitrogen）に従ってPVDFメンブレンにブロットした。ブロッキング緩衝液（Invitrogen）中で一夜インキュベートした後、メンブレンをモノクローナル抗Ｂｃｌ−２（DAKO）および抗Survivin抗体（Novus Biologicals 500-205 clone 60.11）または抗チューブリン抗体（NeoMarkers）とともに２時間インキュベートし、ついで二次抗体中で１時間インキュベートした。色素産生免疫検出キット（Invitrogen）を用いてＢｃｌ−２、Survivinまたはチューブリンを可視化した。別法として、メンブレンをＨＲＰコンジュゲートマウス免疫グロブリン（DAKO）とともにインキュベートし、ついでECL+ Plus試薬（Amersham）とともにインキュベートし、VersaDoc化学ルミネセンス検出系を用いて可視化した。図１、２Ａ、２Ｂおよび２Ｃを参照。図６は、Ｂｃｌ−２タンパク質に対するSEQ ID NO: 15の活性の持続時間を示す。表２は、10nMおよび10nM化合物濃度のゲルについての化学ルミネセンス値を示す（ゲルは示していない）。図２Ａは、同様の実験からの、しかし他の投与量（1nMおよび5nM）でのゲルを示す。
【０２５７】
表２
【表３】
2007515175.tif 000009
【０２５８】
実施例９：インビトロ分析：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたヒトＢｃｌ−２発現の抑制
本発明に従い、一連のオリゴヌクレオチドをヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡの特定の領域、すなわち、翻訳開始コドンの周辺の領域にハイブリダイズするようにデザインした。異なるデザインおよび長さのオリゴヌクレオチドを表１に示す。オリゴマー化合物を15PC3および518A2にトランスフェクションすることにより、オリゴマー化合物がこれら細胞株でＢｃｌ−２をノックダウンする能力を評価した。Ｂｃｌ−２転写物定常状態をリアルタイムＰＣＲによりモニターし、ＧＡＰＤＨ転写物定常状態レベルに正規化した。表３は、SEQ ID NO: 56（オブリマーセンナトリウム；完全に修飾したホスホロチオエート；参照）と比較して強力な一連の化合物を示す。
【０２５９】
表３：リアルタイムＰＣＲにより決定したＢｃｌ−２ｍＲＮＡ発現：15PC3または518A2細胞を表示した濃度のオリゴマー化合物でトランスフェクションし、２４時間のインキュベーションの後にＲＮＡを抽出した。モック処理に比べてダウンレギュレーションが示されている。
【表４】
2007515175.tif 000010
【０２６０】
実施例１０：LNAアンチセンスオリゴマー化合物によるアポトーシス誘発
トランスフェクションの前日に細胞をＤＭＥＭ中にて白色９６ウエルプレート（Nunc 136101）のウエル当たり12,000細胞の密度で播種した。翌日、細胞を前もって温めたOptiMEMで１回洗浄し、ついで5μg/mlのLipofectamine2000（In vitrogen）を含有する72μlのOptiMEMを添加した。OptiMEM中で希釈した18μgのオリゴヌクレオチドを添加する前に細胞を７分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、0.2nMから25nMの範囲であった。４時間処理した後、細胞をOptiMEMで洗浄し、血清を含有する50μlのＤＭＥＭを添加した。オリゴマー化合物で処理後、細胞をCO2インキュベーターから回収し室温で１５分間平衡化する前に指示した時間回復させた。等容量の高感度Caspase 3/7-GloTM Reagent（Promega）を９６ウエル中の細胞に直接添加し、プレートを６０分間インキュベートし、さらに１分間の遅延時間の後にThermo LabsystemsからのLuminoskan Ascent装置でルミネセンス（ルシフェラーゼ活性）を記録した。ルシフェラーゼ活性は、１秒当たりの相対光単位（Relative Light Units per seconds (RLU/s)）として測定する。データをAscentソフトウエア2.6で処理し、グラフをエクセルで作成した（図３Ａおよび３Ｂ参照）。
【０２６１】
アネキシンＶ−ＦＩＴＣフローサイトメトリー分析：トランスフェクションの１日前に0.4×106のHeLa細胞をT25フラスコに播種した。トランスフェクションの日に細胞を３７℃のOptiMEMで１回洗浄し、ついで5μg/mlのLipofectamine2000（In vitrogen）を含有する2.8mlのOptiMEMを添加した。OptiMEM中で最終オリゴヌクレオチド濃度5nMまたは25nMに希釈した700μlのオリゴヌクレオチドを添加する前に細胞を７分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドなしでトランスフェクションした細胞は対照とした。４時間処理した後、細胞をOptiMEMで洗浄し、3mlの培地を添加した。オリゴ処理後、細胞を回収（掻き取りにより）およびＰＢＳ中で２回洗浄する前に４８時間回復させた。0.2×106の細胞を5μlのアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよび10μlのプロピジウムヨーダイド（PI：10mg/ml）とともにインキュベートし、室温、暗所にて１５分間インキュベートした。
【０２６２】
精製組換えアネキシンＶ（アネキシンＶ−ＦＩＴＣの添加の前にアネキシンＶの結合を阻止する）とともにインキュベートしたトランスフェクション細胞を用いて染色の特異性および選択性を示した。さらに、TRAIL（Apo2L）誘発HeLA細胞（0.5μg/ml）を正の対照として用いた（データは示していない）（図３Ｃおよび３Ｄを参照）。
【０２６３】
実施例１１：増殖癌細胞におけるＢｃｌ−２のアンチセンスオリゴヌクレオチド抑制
トランスフェクションの前日に細胞をＤＭＥＭ中にて白色９６ウエルプレート（Nunc 136101）のウエル当たり12,000細胞の密度で播種した。翌日、細胞を前もって温めたOptiMEMで１回洗浄し、ついで5μg/mlのLipofectamine2000（In vitrogen）を含有する72μlのOptiMEMを添加した。OptiMEM中で希釈した18μgのオリゴヌクレオチドを添加する前に細胞を７分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、5nMから100nMの範囲であった。４時間処理した後、細胞をOptiMEMで洗浄し、血清を含有する100μlのＤＭＥＭを添加した。オリゴマー化合物で処理後、細胞を指示した時間回復させ、100μlのＤＭＥＭ当たり20μlのテトラゾリウム化合物［3-(4,5-ジメチル-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム, 内部塩；MTS]および電子カップリング試薬（フェナジンエトサルフェート；PES)(CellTiter 96R AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega）を添加して生きた細胞を測定した。生きた細胞をPowerwave（Biotek Instruments）中で490nmにて測定した。増殖速度（ΔOD/h）をオリゴマー化合物の濃度に対してプロットした（図４および５を参照）。
【０２６４】
実施例１２：インビボモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドの全身処理による、インビボで増殖したヒト異種移植ＰＣ−３腫瘍細胞の腫瘍増殖抑制
６週齢の雌Balb/c無胸腺ヌードマウスをM&B（デンマーク）から購入し、実験に入る前に少なくとも１週間慣らした。ヒト癌細胞、典型的に300μlのマトリゲル（BD Bioscience）中に浮遊させた3×106の細胞を脇腹に皮下注射した。二重異種移植モデルとして、２つの腫瘍を各脇腹に一つずつ移植した。腫瘍増殖が確立されたとき（典型的に腫瘍細胞の注射の５〜１２日後）、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを0.01〜20mg/kg/日にて30日まで、腹腔内（ＩＰ）投与経路で毎日、１日に２回、２日または３日に１回または毎週投与した。対照動物は、食塩水のみを同じ期間、同じ投与経路で投与した。各実験群は少なくとも５匹のマウスを含んでいた。抗腫瘍活性を、腫瘍容積により測定した腫瘍増殖の抑制によって評価した。腫瘍増殖は、２つの直交する直径を測定することにより定期的に追跡した。腫瘍容積は、Teicher BA, Tumour Models in Cancer Research. Humana Press, NJ, USA 2002, p. 596中の式に従って計算した：腫瘍容積（mm3）＝L×W2×0.5（式中、Lは最大直径を表し、WはLと直交する腫瘍直径である）。処理が終了したら動物を屠殺し、腫瘍重量を測定した。各群の平均腫瘍容積および重量をMann-Whitney検定を用いて比較した。分析はすべてWindows（登録商標）のSPSSバージョン11.0で行った。図７Ａ、７Ｂ、７Ｃおよび７Ｄを参照。
【０２６５】
実施例１３：インビボ分析：アンチセンスオリゴヌクレオチドの全身処理による、インビボで増殖したヒト異種移植ＰＣ−３におけるＢｃｌ−２の抑制
６週齢の雌Balb/c無胸腺ヌードマウスをM&B（デンマーク）から購入し、実験に入る前に少なくとも１週間慣らした。ヒト癌細胞、典型的に300μlのマトリゲル（BD Bioscience）中に浮遊させた3×106の細胞を脇腹に皮下注射した。二重異種移植モデルとして、２つの腫瘍を各脇腹に一つずつ移植した。腫瘍増殖が確立されたとき（典型的に腫瘍細胞の注射の５〜１２日後）、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを0.01〜20mg/kg/日にて30日まで、静脈内（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）投与経路で毎日、１日に２回、２日または３日に１回または毎週投与した。対照動物は、食塩水のみを同じ期間、同じ投与経路で投与した。各実験群は少なくとも５匹のマウスを含んでいた。処理が終了したら動物を麻酔し、腫瘍を切り出し、直ちに液体窒素中で凍結した。
【０２６６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがタンパク質レベルで抑制作用を有するか否かを測定するため、ウエスタンブロット分析を行った。モーター駆動ホモジナイザーを用い、腫瘍を溶解緩衝液（すなわち、20mM Tris-Cl［pH7.5］；2%Triton X-100；1/100vol. プロテアーゼインヒビターカクテルセットIII（Calbiochem)；1/100vol. プロテアーゼインヒビターカクテルセットII（Calbiochem)）中、４℃でホモジナイズした。500μlの溶解緩衝液を100mgの腫瘍組織当たりに添加した。マウス各群からの腫瘍溶解液をプールし、13.000gで５分間４℃で遠心分離して組織分解物を取り除いた。腫瘍抽出物のタンパク質濃度を、BCA Protein Assay Reagent Kit（Pierce、ロックフォード）を用いて決定した。
【０２６７】
タンパク質抽出物（50-100μg）を4-20%の勾配SDS-PAGEゲル上で分画し、PVDFメンブレンに移し、アミノブラック染色により可視化した。Ｂｃｌ−２の発現を、抗ヒトＢｃｌ−２抗体sc-509（Santa Cruz Biotechnology, Inc. サンタクルス、カリフォルニア、米国）または抗ヒトＢｃｌ−２（clone101, Zymed）とそれに引き続く西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヤギIgG（DAKO）を用いて検出した。免疫反応性をECL Plus（Amersham biotech）により検出し、Versadoc 5000 lite system（Bio-Rad）により定量化した。
【０２６８】
実施例１４：インビボ：518A2ヒト黒色腫異種移植したSCIDマウスにおいて試験した、現在臨床試験されているオブリマーセンナトリウム（SEQ ID NO: 56）と比較したLNA Ｂｃｌ−２オリゴマー
病原体フリーの雌C.B-17 scid/scid（SCID）マウス（4-6週齢、漏出性について試験）をHarlan & Winkelmann（ボルヘン、ドイツ）から得た。動物を層流ラック（laminar flow racks）中のマイクロアイソレーター（microisolator）ケージに収容し、オートクレーブ処理した食物および水を随意に与えた。SCIDマウスの左下腹脇腹に200μlのPBSに再浮遊させた1.5×107の518A2ヒト黒色腫細胞を皮下（s.c.）注射した。１０日後、全てのマウスは触知できる皮下腫瘍を発症し、処理群または対照群に対して無作為化し、処理を開始した。連続皮下投与のため、マウスを麻酔し、食塩水中のオリゴヌクレオチドまたはビヒクル対照としての食塩水を充填したミニ浸透ポンプ（Alzet 2002, Alza, Moutain View, カリフォルニア、米国）を傍脊髄ポケット（paraspinal pocket）に皮下移植した。
【０２６９】
抗腫瘍活性：SEQ ID NO: 56（参照）を、参照スケジュールとして7mg/kg/日の標準投与量にて１４日間、ミニ浸透ポンプにより皮下投与した。LNAオリゴマー化合物SEQ ID NO: 15を、7, 3.5, および1.75mg/kgにて連続皮下注入と同様に１４日間投与した。食塩水処理動物は対照として使用した。
【０２７０】
毛管測定による経時的腫瘍増殖および実験の終了時点での腫瘍重量が、決定すべき主要なパラメーターであった。
【０２７１】
1.75mg/kgでのSEQ ID NO: 15のデータを示す図８Ａ、８Ｂ、９、１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃを参照。増大した濃度（7および3.5mg/kg）は腫瘍重量または腫瘍容積のさらなる低減には導かず、SEQ ID NO: 15化合物が低濃度で用量応答曲線を有することを示していた。
【０２７２】
図１１は、1および7mg/kgでのSEQ ID NO: 8のデータおよび7mg/kgでのSEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 56のデータを示す。SEQ ID NO: 8化合物を投与したときに処理期間を通じて体重の低下は観察されず、対照も同様のパターンを示した。
【０２７３】
実施例１５：ラット血漿でのSEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 8の安定性
ラット血漿（NtacSD雄, Li-Heparine (Taconic, M&B)）中、３７℃、異なる時間アリコート：0, 4, 24および48時間での20μMのSEQ ID NO: 15の安定性。SEQ ID NO: 56はSEQ ID NO: 56（参照）に対応する。SEQ ID NOS: 20および16は、試験した他のオリゴヌクレオチドである。SEQ ID NO: 15のn-1, n-2 およびn-3（3'-末端から）に対応するオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 15の可能な消化断片の同定を可能とする対照とすべく含められた。市販のラダーもまた含まれていた（10および20merはPAGE上で視認できる）。（図１２Ａを参照）
【０２７４】
ラット血漿（NtacSD雄, Li-Heparine (Taconic, M&B)）中、３７℃、異なる時間アリコート：0, 4, 24および48時間での20μMのSEQ ID NO: 8の安定性。SEQ ID NO: 56はSEQ ID NO: 56（参照）に対応する。SEQ ID NOS: 9は、試験した他のオリゴヌクレオチドである。SEQ ID NO: 8のn-1, n-2 およびn-3（3'-末端から）に対応するオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 8の可能な消化断片の同定を可能とする対照とすべく含められた。市販のラダーもまた含まれていた（10および20merはPAGE上で視認できる）。（図１２Ｂを参照）
【０２７５】
オリゴヌクレオチド、たとえば、SEQ ID NO: 8およびSEQ ID NO: 15を、3'位でホスホルアミダイト結合により隣接するLNAに結合したＤＮＡを有するオリゴヌクレオチドとして合成した。この3'ＤＮＡ残基は、エキソヌクレアーゼにより開裂することができる。そその分解産物は、完全長の親分子に比べてヌクレアーゼ分解に対する耐性が実質的に増大した１ヌクレオチド短い（N-1）オリゴマー化合物（SEQ ID NO: 35）である。N-1化合物（たとえば、SEQ ID NO: 35）は、たとえば、SEQ ID NO: 8の場合、完全な活性を保持している（図２Ｃを参照）。
【０２７６】
実施例１６：肝臓および腎臓でのSEQ ID NO: 15の組織半減期分析
90匹のNMRI雌マウス（約30g）を５群に分け、25mg/kgのSPC 2996（10mL/kg, 2.5mg/ml）を30秒間、静脈内投与した。対照群は0.9%食塩水を投与した。ついで、各群を注射後30秒、6時間、24時間、48時間、72時間、および96時間に屠殺した。組織を採取し、後にＲＮＡに調製した。
【０２７７】
組織からのオリゴヌクレオチドの抽出
約100mgの組織を500μlの抽出緩衝液（0.5%Igepal CA-630, 25mM Tris pH 8.0, 25mM EDTA, 100mM NaCl；1mg/mlのRNAse Aを含有）中で機械的にホモジナイズし、３７℃で一夜インキュベートした。500mlに参照オリゴヌクレオチドを加え、1mlのフェノール-イソアミル-クロロホルム（25:1:24(v/v/v)）を加えて抽出した。水性相を新たなチューブに移し、再び抽出した。必要なら、抽出物を凍結乾燥した。
【０２７８】
組織試料から抽出したオリゴヌクレオチドのＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析
50μLの試料容量を、保護カラムDNAPac PA-100（2×50mm, Dionex）を備えたDNAPac PA-100（2×250mm, Dionex）カラムで分離した。カラムを４０℃に加熱した。流速は0.25mL/分であり、検出波長は260nmであった。移動相の勾配：Ａ：TRIS (20mM), EDTA (1mM) および過塩素酸ナトリウム（10mM）pH：7.6、Ｂ：TRIS (20mM), EDTA (1mM) および過塩素酸ナトリウム（1M）pH：7.6, (0-13分、Ａ：20%, Ｂ：20%；14-18分、Ａ：40%, Ｂ：60%；22-28分、Ａ：0%, Ｂ：100%；33-38分、Ａ：80%, Ｂ：20%)。
【０２７９】
図１３は、単一静脈内投与（25 mg/kg）後のNMRIマウスからの肝臓および腎臓でのSEQ ID NO: 15の組織半減期を示す。
【図面の簡単な説明】
【０２８０】
【図１】図１は、ウエスタンブロッティングにより分析した、LNAオリゴマー化合物でトランスフェクションした15PC3細胞におけるＢｃｌ−２のダウンレギュレーションを示す。SEQ ID NOS: 2, 4, 15, 21および24（表１参照）は、オブリマーセンナトリウム、すなわちSEQ ID NO: 56（参照）と比べてタンパク質レベルでの測定でＢｃｌ−２の一層強力なインヒビターであった。サービビンタンパク質は対照として用いた。
【０２８１】
【図２Ａ】図２Ａは、ウエスタンブロッティングにより分析し、化学ルミネセンス検出系により可視化した、LNAオリゴマー化合物でトランスフェクションした15PC3細胞におけるＢｃｌ−２のダウンレギュレーションを示す。SEQ ID NO: 2は、SEQ ID NO: 56（参照）と比べて有意に一層強力であった。サービビンタンパク質は対照として用いた。
【０２８２】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ウエスタンブロットを示す。518A2細胞を、それぞれ、5nMのSEQ ID NO: 56（参照）、SEQ ID NO: 8およびSEQ ID NO: 15でリポフェクチン処理した。タンパク質を４８時間観察した。この時間を通してSEQ ID NO: 15は活性なままである。グラフは、チューブリンに対して正規化したときのデータを示す。
【０２８３】
【図２Ｃ】図２Ｃは、ウエスタンブロットを示す。518A2細胞を、それぞれ、5nMのSEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 35（SEQ ID NO: 15のn-1、15量体バージョンである）でリポフェクチン処理した。タンパク質を４８時間観察した。SEQ ID NO: 35は、SEQ ID NO: 15と同じくらい強力であった。データをチューブリンに対して正規化した。
【０２８４】
【図３Ａ】図３Ａは、２４時間、４８時間および７２時間後の518A2細胞におけるLNA含有化合物によるカスパーゼ３／７の活性により測定したアポトーシスの誘発を示す。LNAオリゴヌクレオチドSEQ ID NOS: 2, 4, 12, 15, 21, 24および57は、SEQ ID NO: 56（参照）よりも有効にアポトーシスを誘発し、対応のシトシンメチル化化合物はSEQ ID NO: 59と称した。より遅い時点（たとえば、７２時間）でのより低いカスパーゼ３／７の値は、カスパーゼ３／７のより早い活性化でのアポトーシスによる細胞死のためである。それゆえ、最大活性化はモニタリングの時間の前に到達された。
【０２８５】
【図３Ｂ】図３Ｂは、１３時間、２４時間、４８時間および７２時間後の518A2細胞におけるLNA含有化合物によるカスパーゼ３／７の活性により測定したアポトーシスの誘発を示す。LNAオリゴヌクレオチドSEQ ID NOS: 8, 9, 15および16は、SEQ ID NO: 58（LNA含有の逆極性対照オリゴヌクレオチド）よりも有効にアポトーシスを誘発した。
【０２８６】
【図３Ｃ】図３Ｃは、アネキシンＶ−ＦＩＴＣフローサイトメトリー分析により測定した後期−アポトーシス細胞段階の誘発を示す。LNAオリゴヌクレオチド化合物SEQ ID NOS: 15で処理したＨｅＬａ細胞は、モックおよびSEQ ID NO: 56（参照）で処理した細胞に比べて一層「後期アポトーシス（late apoptotic）」または「障害を受けている（damaged）」として分類された。
【０２８７】
【図３Ｄ】図３Ｄは、5nMおよび12.5nMのSEQ ID NO: 8およびSEQ ID NO: 15での細胞の処理が、モック処理細胞に比べて、アネキシンＶ−ＦＩＴＣフローサイトメトリー分析により測定した初期および後期段階アポトーシスの誘発に導くことを示す。
【０２８８】
【図４】図４は、Ｂｃｌ−２ LNAオリゴマー化合物処理の４８時間後に測定した、増殖している癌細胞（MTSアッセイ）、518A2細胞におけるＢｃｌ−２の抑制を示す。SEQ ID NOS: 2, 4, 12, 15, 21, 24および57はすべて、SEQ ID NO: 56（参照）および対応のシトシンメチル化化合物であるSEQ ID NO: 59（参照）よりも有効にアポトーシスを誘発した。データをモック処理対照に対して調節した。実験１および実験２は、２つの別の実験を表す。
【０２８９】
【図５】図５は、Ｂｃｌ−２ LNAオリゴマー化合物処理の０〜４８時間後に測定した、増殖性癌細胞である518A2細胞でのＢｃｌ−２の抑制を示す。SEQ ID NOS: 2, 4, 12, 15, 21, 24および57はすべて、SEQ ID NO: 56（参照）および対応のシトシンメチル化化合物であるSEQ ID NO: 59（参照）よりも有効にアポトーシスを誘発した。データをモック処理対照に対して調節した。
【０２９０】
【図６】図６は、ウエスタンブロットを示す。518A2細胞を、それぞれ、10nMのSEQ ID NO: 56（参照）およびSEQ ID NO: 15でリポフェクチン処理した。タンパク質を２４時間、４８時間および７２時間観察した。この時間を通してSEQ ID NO: 15は活性なままである。タンパク質の半減期の長さゆえ、２４時間の時点でもＢｃｌ−２タンパク質は依然として可視できる。
【０２９１】
【図７Ａ】図７Ａは、前立腺PC3無胸腺ヌードマウス異種移植モデルにおいてSEQ ID NO: 56（参照）と比較してSEQ ID NO: 15を使用した腫瘍容積の有効なインビボ低減を示す。化合物を10mg/kgにて１４日間腹腔内投与した。正の対照として１４日間腹腔内投与した2mg/kgのマイトマイシンＣを使用した。処置後さらに８日間、腫瘍の増殖をモニターした。
【０２９２】
【図７Ｂ】図７Ｂは、前立腺PC3無胸腺ヌードマウス異種移植モデルにおいてSEQ ID NO: 15を投与したときに体重の有意の喪失がなかったことを示す。10mg/kgのSEQ ID NO: 56（参照）および2mg/kgの正の対照マイトマイシンＣも同様のパターンを示した。
【０２９３】
【図７Ｃ】図７Ｃは、前立腺PC3無胸腺ヌードマウス異種移植モデルにおいて食塩水対照と比較してSEQ ID NO: 8を使用した腫瘍容積の有効なインビボ低減を示す。化合物を10mg/kgにて１４日間腹腔内投与した（第５日目〜第１９日目）。
【０２９４】
【図７Ｄ】図７Ｄは、前立腺PC3無胸腺ヌードマウス異種移植モデルにおいて食塩水対照と比較してSEQ ID NO: 15を使用して第７日目〜第１５日目に毎日または第８日目、第１１日目、第１３日目、第１５日目、第１８日目、第２０日目に投与した腫瘍容積の有効なインビボ低減を示す。化合物を10mg/kgにて１４日間腹腔内投与した。処置後さらに８日間、腫瘍の増殖をモニターした。
【０２９５】
【図８Ａ】図８Ａは、４倍高投与量のSEQ ID NO: 56（参照）と比較した、黒色腫518A2 scidマウス異種移植モデルにおいて1.75mg/kgのSEQ ID NO: 15を１４日間腹腔内投与した腫瘍重量（ｇ）の匹敵するインビボ低減を示す。
【０２９６】
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａと同じ実験の結果を示すが、結果をグラムではなく腫瘍低減の％で表してある。
【０２９７】
【図９】図９は、４倍高投与量のSEQ ID NO: 56（参照）と比較した、黒色腫518A2 scidマウス異種移植モデルにおいて1.75mg/kgのSEQ ID NO: 15を１４日間腹腔内投与したときの腫瘍容積の匹敵するインビボ低減を示す。
【０２９８】
【図１０Ａ】図１０Ａは、食塩水対照と比較して、黒色腫518A2 scidマウス異種移植において1.75mg/kgのSEQ ID NO: 15を１４日間腹腔内投与したときに肝臓のサイズに増加のないことを示す。7mg/kgのSEQ ID NO: 56（参照）は肝臓サイズの増加を与えた。
【０２９９】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、食塩水対照と比較して、黒色腫518A2 scidマウス異種移植において1.75mg/kgのSEQ ID NO: 15を１４日間腹腔内投与したときに脾臓のサイズに増加のないことを示す。7mg/kgのSEQ ID NO: 56（参照）は脾臓サイズの増加を示した。このことは、SEQ ID NO: 15がSEQ ID NO: 56（参照）と比較して活性投与量でより低い毒性を有することを示す。
【０３００】
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、該処置が、食塩水対照および7mg/kgのSEQ ID NO: 56（参照）と比較して、黒色腫518A2 scidマウス異種移植において1.75mg/kgのSEQ ID NO: 15を１４日間腹腔内投与したときにマウス体重の喪失に導かないことを示す。このことは、SEQ ID NO: 15がSEQ ID NO: 56（参照）と比較して活性投与量でより低い毒性を有することを示す。
【０３０１】
【図１１】図１１は、7mg/kgのSEQ ID NO: 8を１４日間腹腔内投与し同じ投与量のSEQ ID NO: 56（参照）と比較したときの、黒色腫518A2 scidマウス異種移植モデルにおける腫瘍重量の改善されたインビボ低減を示す。SEQ ID NO: 8は、SEQ ID NO: 56（参照）よりも７倍低い投与量で投与したときに等価な抗腫瘍活性を示す。
【０３０２】
【図１２Ａ】図１２Ａは、SEQ ID NO: 56（参照）と比較した、ラット血漿（NtacSD雌、Li-ヘパリン（Taconic, M&B)）におけるSEQ ID NOS: 15, 16および20の増大した安定性を示す。これらオリゴヌクレオチドをそれぞれ２０μＭ濃度にて、０時間、４時間、２４時間および４８時間、３７℃でインキュベートした。試料中に存在する唯一の分解断片は、３’末端のＤＮＡ残基を欠くn-1対応オリゴヌクレオチド（１５量体）である。他の分解断片は、４８時間の消化後でさえも検出することができない。
【０３０３】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、SEQ ID NO: 56（参照）と比較して、SEQ ID NOS: 8および9がラットにおいて高い安定性を示すことを示す。これらオリゴヌクレオチドをそれぞれ２０μＭ濃度にて、０時間、４時間、２４時間および４８時間、３７℃でインキュベートした。試料中に存在する唯一の分解断片は、３’末端のＤＮＡ残基を欠くn-1対応オリゴヌクレオチド（１５量体）である。他の分解断片は、４８時間の消化後でさえも検出することができない。
【０３０４】
【図１３】図１３は、単一投与量の静脈内投与（25mg/kg）後のNMRIマウスからの肝臓および腎臓中のSEQ ID NOS: 15のレベルを示す。活性化合物SEQ ID NOS: 15の半減期（T1/2）は、肝臓および腎臓の両者で約３日であることが認められる。このことは、SEQ ID NOS: 15の最適生物学的投与量の投与計画が、連続注入および毎日の投与に比べて頻度が少なくてよいことを示唆している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年10月24日(2005.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
長さが１０〜３０ヌクレオチドのオリゴマー化合物であって、ヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡ（ジーンバンクデータベースにおけるHUMBcl2A（アクセッション番号M13994））の塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域に特異的にハイブリダイズすることのできる標的結合ドメインを含み、該標的結合ドメインが、式：
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
（式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す）を有し、該標的結合ドメインが、ホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）によって連結された少なくとも２つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含むオリゴマー化合物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
標的結合ドメイン中の少なくとも７０％のヌクレオチド結合がホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）である、請求項１に記載の化合物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
標的結合ドメインが、２までの非相補的なヌクレオ塩基を例外として、それが特異的にハイブリダイズするヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡ（ジーンバンクデータベースにおけるHUMBcl2A（アクセッション番号M13994））の塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域の部分に相補的である、請求項１ないし９のいずれかに記載の化合物。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
標的結合ドメインが、それが特異的にハイブリダイズするヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡ（ジーンバンクデータベースにおけるHUMBcl2A（アクセッション番号M13994））の塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域の部分に相補的である、請求項１０に記載の化合物。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１５】
標的結合ドメインが、１〜２の非相補的なヌクレオ塩基を例外として、それが特異的にハイブリダイズするヒトＢｃｌ−２ｍＲＮＡ（ジーンバンクデータベースにおけるHUMBcl2A（アクセッション番号M13994））の塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域の部分に相補的である、請求項１０に記載の化合物。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
「LNA」（Locked Nucleic Acid）（または「LNAオリゴヌクレオチド」）なる語は、LNAヌクレオチドおよびLNAアナログヌクレオチドとも言及する１またはそれ以上の２環式ヌクレオシドアナログを含むオリゴヌクレオチドをいう。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
さらに別の態様において、オリゴマー化合物は、「アルファ-L-LNA」（すなわち、「α-L-LNA」）ヌクレオチド、すなわち、式IIIおよびVIに示すLNAアナログヌクレオチドを含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
このことから、LNAアナログヌクレオチドは、もし存在するなら、β-D-アミノ-LNA, β-D-チオ-LNAおよびα-L-オキシ-LNAから選ばれるのが好ましく、とりわけ全てのLNAアナログヌクレオチドが、もし存在するなら、α-L-オキシ-LNAである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４８】
刊行された配列情報を用い、ヒトＢｃｌ−２に対するプローブおよびプライマーをヒトＢｃｌ−２配列にハイブリダイズするようにデザインした。
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月23日(2006.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007515175000001.app
【国際調査報告】
2007515175.tif 000062
2007515175.tif 000063
2007515175.tif 000064