(57)【要約】当該ペプチドのＣ末端にまたはそれに近接してプロリン残基またはプロリン誘導体を含む所与のペプチドまたはその誘導体を合成する方法を提供する。この方法は、（ａ）第一の樹脂上で、少なくとも３つの順次のアミノ酸残基またはそれらの誘導体からなる該ペプチドのＣ末端部分またはその誘導体を、選択したアミノ酸類、小型ペプチド類またはそれらの誘導体を順次にカップリングさせて合成する；（ｂ）このＣ末端部分を該第一の樹脂から切断する；（ｃ）該Ｃ末端部分を、ペプチド類の合成には概して好適ではあるが、当該ペプチドのＣ末端に位置するプロリン残基を有するペプチド類の形成には不適当な第二の樹脂に再結合させる；そして（ｄ）前記Ｃ末端部に選択されたアミノ酸類、小型ペプチド類または誘導体類をカップリングさせることを包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
当該ペプチドのＣ末端にまたはそれに近接してプロリン残基またはプロリン誘導体を含む所与のペプチドまたはその誘導体を合成する方法であって、下記の諸工程を包含する該方法。
（ａ）第一の樹脂上で、少なくとも３つの順次のアミノ酸残基またはそれらの誘導体からなる該ペプチドのＣ末端部分またはその誘導体を、選択したアミノ酸類、小型ペプチド類またはそれらの誘導体を順次にカップリングさせて合成する；該第一の樹脂は、該ペプチドのＣ末端にまたはそれに近接して位置するプロリン残基またはプロリン誘導体をもつペプチドの形成に適したものとする；
（ｂ）かくして得られたＣ末端部分を該第一の樹脂から切断する；
（ｃ）該Ｃ末端部分を、ペプチド類の合成には概して好適ではあるが、当該ペプチドのＣ末端にまたはそれに近接してプロリン残基またはプロリン誘導体をもつペプチド類の形成には不適当な第二の樹脂に再結合させる；
（ｄ）前記Ｃ末端部に選択されたアミノ酸類、小型ペプチド類または誘導体類をカップリングさせて、該所与のペプチドを得る。
【請求項２】
該ペプチドが長いペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該所与のペプチドが、そのＣ末端にまたはそれに近接してプロリン残基またはプロリン誘導体をもつケモカインである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該第一の樹脂を、環状ジペプチド、とりわけジケトピペラジン化合物の生成をもたらさないように選択する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該工程（ａ）および／または（ｂ）を、所定のアミノ酸残基類または誘導体類の逐次カップリングによって達成する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
Ｃ末端部分生成用の該第一の樹脂が塩化２−クロロトリチル樹脂である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該第二の樹脂が、ベンジルエステルリンカーをもつタイプの樹脂である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該第二の樹脂がＷａｎｇ樹脂である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該所与のペプチドが１５０アミノ酸残基に至るまでのものである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
当該切断工程を、緩和な酸処理、たとえばジクロロメタン中の２０％トリフルオロエタノールを用いて達成する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該Ｃ末端部分が完全に保護されていて、第二の樹脂に直接結合させることができる請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
４０残基までのペプチド類の化学合成は、現在では日常的作業として効率的であり、過去１０年間にわたる最近の進歩は、４０〜１５０残基の範囲内のペプチド類および小型タンパク質の合成に至っている。効率的な新規合成方法および合成に使用できるずらりと並んだ樹脂がこれに寄与してきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｓ．：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９５（１９７３），１３２８によって開発された特殊な一樹脂（図１参照）は、産業上の標準となっており、長いペプチド類の効率的合成に有効であることが証明されている。しかし、この樹脂には、Ｃ末端アミノ酸に関していくつかの問題がある。まず、この樹脂をシステインおよびヒスチジンの保護された誘導体でエステル化すると、かなりの程度のラセミ化が起るが、これは極めて望ましくないことである。さらに、プロリンの保護された誘導体によるエステル化はうまくいくが、さらなるアミノ酸残基を付加してジペプチドを形成させたのちに、問題に遭遇する。第三のアミノ酸のカップリングに備えてそのジペプチドを脱保護すると、遊離アミノ基をもつジペプチドエステルが生じるが、これがしばしば分子内環化して、図２に示した遊離の環状ジペプチド（ジケトピペラジン）を生じる。それによるジペプチドの損失は、多くの場合に定量的であり、Ｃ末端プロリンペプチド類の合成へのＷａｎｇ樹脂の使用を不適当なものとする。さらに、Ｃ末端から２番目の残基がプロリン残基またはその誘導体類のいずれかである場合にも、環化が起ることも示唆されている。
【０００４】
Ｃ末端プロリン含有ペプチド類の合成には、極めて酸に不安定な立体障害塩化２−クロロトリチル樹脂（図３参照）の使用が推奨されている（立体的嵩高さがジケトピペラジン形成を阻害するため）。
【０００５】
Ｃ末端残基の上記性質の故に２−クロロトリチル樹脂を用いて、中程度の長さのおよび長いペプチドを合成するための実験が行われた。中程度の長さのペプチド（約３０残基）は、Ｃ末端残基がシステインであるＨＮＰ−１であった。長いペプチドは、Ｃ末端残基がプロリンである７４アミノ酸ペプチドのモルモットエオタキシンであった。
【０００６】
両実験は不成功であった。両ペプチドとも低収率で得られ、鎖の組立てをモニターして、両場合ともカップリング効率が低いことが示された。Ｃ末端システインのラセミ化の問題を多少とも解決すると報告されている樹脂ローディング手順を用いてＷａｎｇ樹脂上でＨＮＰ−１ペプチドを合成したときの状況との比較により、鎖の組立ては優れており、クロロトリチル樹脂で得られる低い収率は、この樹脂のある性質のためであると判断された。
【０００７】
一つの仮説は、この樹脂が酸に対して極めて不安定であるために、鎖組立ての間に樹脂からペプチドが早々と開裂してしまうというものであった。本発明者らは、モルモットエオタキシンの鎖組立ての間の当該樹脂と酸種との接触を排除することを試みて、合成条件を種々変更したが、収率の向上は達成されなかった。別の仮説は、２−クロロトリチル樹脂の何らかの性質、たとえば膨潤性がそれを長いペプチド類の組立てに不適当かつ非効率的とするというものである。
【０００８】
このように、２−クロロトリチル樹脂は、比較的短い（たとえば＜２０残基）ペプチド類の合成にのみ適合しているように思われる。今回、２−クロロトリチル樹脂でのＣ末端プロリン含有ペプチドに関連する諸問題が、Ｗａｎｇ樹脂上で合成を実施するならば、多少とも解決されることが見出された。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、対象ペプチドのＣ末端またはそれに近接してプロリンまたはその誘導体のいずれかを含む所与のペプチドの合成方法に関するものである。この方法は、長いペプチド、たとえば少なくとも２０のアミノ酸残基をもつペプチド類あるいは塩化２−クロロトリチル樹脂上では合成に問題のあるペプチド類の合成に特に適している。
【００１０】
「近接して」なる表現は、プロリン残基がＣ末端から２番目の位置にあることを意味する。
【００１１】
「誘導体」なる表現は、種々の置換基の置換／付加によって対応するペプチド、アミノ酸またはアミノ酸残基と相違していてよいペプチド、アミノ酸またはアミノ酸残基を指す。タンパク質合成においては、保護基をもつあるいは標識またはタグとしてまたは他の所望の目的のために機能できるように修飾された修飾アミノ酸類を使用するのが普通である。たとえば、本発明の方法において、ヒドロキシプロリンまたは他のプロリン誘導体などのアミノ酸誘導体類を使用できた。
【００１２】
好ましい一実施態様では、本方法は下記の工程を包含する。
（ａ）第一の樹脂上で、少なくとも３つの順次のアミノ酸残基またはそれらの誘導体からなる該ペプチドのＣ末端部分またはその誘導体を、選択したアミノ酸類、小型ペプチド類またはそれらの誘導体を順次にカップリングさせて合成する；該第一の樹脂は、該ペプチドのＣ末端にまたはそれに近接して位置するプロリン残基またはプロリン誘導体をもつペプチドの形成に適したものとする；
（ｂ）かくして得られたＣ末端部分を該第一の樹脂から切断する；
（ｃ）該Ｃ末端部分を、ペプチド類の合成には概して好適ではあるが、当該ペプチドのＣ末端にまたはそれに近接して位置するプロリン残基またはプロリン誘導体をもつペプチド類の形成には不適当な第二の樹脂に再結合させる；
（ｄ）前記Ｃ末端部に選択されたアミノ酸類、小型ペプチド類または誘導体類をカップリングさせて、該所与のペプチドを得る。
【００１３】
本発明の方法を用いて任意の長さのペプチドを合成できるが、該方法は、少なくとも２０のアミノ酸残基を有するペプチド類、すなわち「長いペプチド類」の合成に特に適している。本方法は、約１５０までのアミノ酸残基を有するペプチド類に特に好適である。
【００１４】
本発明の方法は、他の方法では定量的に得ることが困難であったペプチド類の合成を可能にする。Ｃ末端プロリン残基をもち、本発明の方法を用いて得ることのできるかかるペプチド類のうちでも、ケモカイン類、とりわけヒトケモカインＩＰ−１０、ＢＬＣおよびＭＣＰ−２が特に重要である。
【００１５】
上記第一の樹脂は、環状ジペプチド類の生成、とりわけジケトピペラジン化合物の生成を惹起しないように選ぶのが有利である。
【００１６】
本発明方法の工程（ａ）および／または（ｂ）は、所定のアミノ酸残基、小型ペプチドまたはそれらの誘導体の逐次カップリングによって成し遂げればよい。これは、周知の標準的固相手順を用いて実施できる。これらの手順において、次に選択されたアミノ酸または小型ペプチドのα−アミノ基を保護基によって保護して、当該ペプチドのＣ末端部を支えている樹脂に、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などのカップリング剤とともに加える。次に、α−アミノ保護基を、ペプチド結合はそのままにしておく適当な塩基に暴露させることによって除去すれば、つぎに上記工程を反復することによって次のアミノ残基を付加させることができる。かかる手順は、たとえばＷ．Ｃ．ＣｈａｎとＰ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ：Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成、実用的アプローチ）、ＯＵＰ（オックスフォード大学出版局）、２０００年に詳述されている。
【００１７】
Ｃ末端部の形成のための好ましい第一の樹脂は、塩化２−クロロトリチル樹脂またはジケトピペラジンの形成を阻害または極小化する任意の類似の樹脂である。
【００１８】
本発明の方法で使用でき、長いペプチドの合成のための第二の樹脂として使用すべき好ましい樹脂は、ＳＡＳＲＩＮＴＭなる商標のもとに市販されているポリスチレン−コ−ジビニルベンゼンの４−（３−メトキシ−４−（ヒドロキシメチル）フェノキシメチル）誘導体などのベンジルエステルリンカーを有する樹脂である。特に好ましい樹脂は、Ｗａｎｇ樹脂として知られている４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂である。Ｗａｎｇ樹脂類は周知であり、広く入手可能である。
【００１９】
第一の樹脂からの切断工程は、緩和な酸処理を用いて、たとえばジクロロメタン中２０％トリフルオロエタノールを用いて、達成するのが有利である。これにより、完全に保護された（トリ）ペプチド部分を得ることができる。かくして、Ｃ末端部分が完全に保護された状態で提供され得るので、長いペプチドの合成に適した樹脂に直接にカップルさせることができる。それらの保護基は、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｎｓｃ（２−（４−ニトロフェニルスルホニル）エトキシカルボニル）またはｔ−Ｂｏｃ（第三級ブチルオキシカルボニル）ペプチド合成に通常使用される標準的保護基であってよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、対象ペプチドのＣ末端またはそれに近接してプロリンまたはその誘導体のいずれかを含む所与のペプチドを合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を、図面に関連して、ただし単なる例として、記述する。
【００２２】
Ｃ末端プロリン残基を含有するモルモット（ｇｐ）エオタキシンの合成が、この樹脂交換手法を用いて、精製およびジスルフィド結合形成の後に、全収率５ｍｇで達成された。２−クロロトリチル樹脂で実施した同規模の合成では、典型的には＜１ｍｇの全収率であることを考えれば、本発明の方法の利点はまったく明らかである。
【００２３】
ジケトピペラジン形成を起こし易いいかなるタンパク質／ペプチドも、ここに記載した戦略を用いて組立てることができる。Ｃ末端にまたはそれに隣接してプロリンまたはプロリン誘導体を含有するポリペプチド類またはタンパク質類は、組立ての間にジケトピペラジン形成を起こし易い。ここに記述したアプローチは、かかるペプチド類の合成のために極めて効果的であろう。
【００２４】
［２−クロロトリチル樹脂上でのｇｐエオタキシンの保護されたＣ末端トリペプチド（Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＣｌＴｒｔＲ）（１）の合成］
ＡＢＩ  ４３０Ａペプチド合成装置を用いてペプチド合成を行なった。反応器中で、Ｈ−Ｐｒｏ−２−クロロトリチル樹脂（１ｇ、０．４９ｍｍｏｌ／ｇ、ロット番号ＰｒＴ−２、Ｎａｎｋａｉ  Ｈｅｃｈｅｎｇ株式会社、中国）を用いた。Ｎｓｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（５０３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を、ＨＯＣｔ（４ｍｌ、１ｍｍｏｌ、ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（上海）社、中国）およびＤＩＣ（４ｍｌ、１ｍｍｏｌ、Ａｃｒｏｓ社）で１５分間活性化した後、反応器に移し、３０分間カップリングさせた。第二のカートリッジのＮｓｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを同様にして活性化し、最初の溶液を排出した後の樹脂に再度カップリングさせた。
【００２５】
樹脂上の未反応アミノ基を無水酢酸（ＤＭＦ中０．５Ｍ、１０ｍｌ）でキャッピングした後、デブロック溶液（ＤＭＦ中、１％ＤＢＵ、２０％ピペリジン）によりＮｓｃ基を除去した。
【００２６】
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ（３９７ｍｇ、１ｍｍｏｌ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を同様にして活性化し、３０分間樹脂にカップリングさせ、続いて、先と同じアミノ酸を再カップリングさせた。カップリング後、樹脂をＤＭＦで、次にＤＣＭで洗い、真空下で乾燥して、１．２１ｇの（１）を得た。
【００２７】
さらに１ｇの樹脂を用いて上記合成を反復して、首記の樹脂１．１８ｇを得た。両バッチの樹脂を合わせて、その後の作業に用いた。
【００２８】
［Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（２）の切断および単離］
ペプチド樹脂（１）を、トリフルオロエタノール（２０％）のＤＣＭ溶液（５０ｍｌ）中で６０分間撹拌した。樹脂が暗緑色になった。この溶液をろ過し、減圧下に蒸発させて、油状物を得て、これを冷ジエチルエーテル／ヘキサンを用いて粉末化した。溶媒を蒸発させ、新鮮なヘキサンを加えて、固体を生じさせ、これより溶媒を再度蒸発により除去した。白色固体（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を得た。マススペクトロメトリーエレクトロスプレー正イオンが、７２３．４に見出された。Ｃ３９Ｈ５４Ｎ４Ｏ９に対する予測は７２２．４ｋＤ。
【００２９】
［（２）をＷａｎｇ樹脂にカップリングさせてのＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｏ−Ｗａｎｇ樹脂（３）の生成］
保護されたトリペプチド（２）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を極小量（＜２ｍｌ）のＤＭＦに溶解させ、ＤＩＣ（８６μｌ、０．５５ｍｍｏｌ）を加えて活性化させ、１５分間超音波処理した。
【００３０】
Ｗａｎｇ樹脂（８００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ、ロット番号Ｗ−３４、Ｎａｎｋａｉ  Ｈｅｃｈｅｎｇ株式会社、中国）を極小量のＤＭＦ中で、ちょうど自由流動性となるまで膨潤させ、ジメチルアミノピリジン（結晶数個）を加えた。活性化ペプチド溶液（２）を加え、カップリング反応を４時間超音波処理下に実施した。この混合物を次にろ過し、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびジエチルエーテルで順次洗浄した。樹脂を真空下で乾燥して、最終収量１．０ｇを得た。この樹脂についてＦｍｏｃローディング試験を行なったところ、最終ローディングは０．１６２ｍｍｏｌ／ｇであった。イズミヤ試験を利用して、Ｗａｎｇ樹脂へのトリペプチドのローディングがラセミ化を伴っていないことが確認された。
【００３１】
［Ｗａｎｇ樹脂上でのｇｐエオタキシンの合成］
５００ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌの樹脂（３）を用いて、ｇｐエオタキシンの合成を行なった。１ｍｍｏｌのアミノ酸、ＨＯＣｔ（２ｍｌ、１ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（２ｍｌ、１ｍｍｏｌ）を用いて、ＡＢＩ合成装置で、標準的カップリングサイクルを順次実施した。ただし、
（ａ）つぎのアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ｔｒｔ）−ＯＨは、樹脂での先行キャッピング工程なしに、カップリングさせ、
（ｂ）Ｎ末端アミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨは、ＨＯＣｔの代わりに２ｍｍｏｌのＨＯＢｔを用いてカップリングさせた。
最終のＦｍｏｃ基は、精製用タグとして樹脂上に維持した。
【００３２】
［ｇｐエオタキシンの切断、精製および単離］
鎖組立ての後、Ｆｍｏｃ−ペプチドを、ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ／チオアニソール／ＴＦＡ（０．５／１．０／０．２／０．２／１０ｍｌ）により、０℃で、窒素下で４時間かけて切断した。ろ過して、樹脂を除去し、ペプチドを冷エーテル中へ沈殿させ、遠心分離した。これを、Ｇ５０セファデックスゲルろ過およびＨＰＬＣによって精製し、アミノ末端のＦｍｏｃ基を、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１）中２０％のピペリジンを用いてタンパク質から切断した。ＤＴＴを加えて、各Ｃｙｓ残基の側鎖を還元し、切断されたＦｍｏｃをゲルろ過により除去して、純粋な還元型ペプチドを得た。これを、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＧＳＨ／０．５ｍＭ  ＧＳＳＧ中でフォールディングさせ、ＨＰＬＣでモニターした。フォールディング（折りたたみ）の完了には、約１週間を要した。
【００３３】
折りたたまれたペプチドをＨＰＬＣによって精製して、純粋で、折りたたまれたペプチドを得た。（エレクトロスプレーマススペクトロメトリー；予測質量８３５６．９Ｄａ、実測値８３５３．９Ｄａ）。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】Ｗａｎｇ樹脂リンカーの分子構造を示す。
【図２】ジケトピペラジンの形成を示す。
【図３】塩化２−クロロトリチル樹脂リンカーの分子構造を示す。
【図１】
2007521316.tif 000002
【図２】
2007521316.tif 000003
【図３】
2007521316.tif 000004
【国際調査報告】
2007521316.tif 000005
2007521316.tif 000006
2007521316.tif 000007