(57)【要約】  ｇｐ１２０ＥｎｖからのＶ３ループ及びＨＩＶ  Ｔａｔを含む複合体は、新規エピトープを提供し、ＨＩＶによる感染を予防又は阻害するための免疫原性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１及び第２のペプチドを含む複合体において、前記第１のペプチドがｇｐ１２０のＶ３ループを含み、前記Ｖ３ループは前記第２のペプチド上の結合領域に連携するために利用でき、前記結合領域が配列番号１に記載の少なくとも残基２１〜４０及び４６〜６０、又は配列番号２に記載の残基３０１〜４１９と結合する能力をもつそれらのフラグメント、突然変異体若しくは変異体を含む、複合体。
【請求項２】
第１及び第２のペプチドを含む複合体において、前記第１のペプチドがｇｐ１２０のＶ３ループを含み、前記Ｖ３ループは前記第２のペプチド上の結合領域に連携するために利用でき、前記結合領域が配列番号１に記載の少なくとも残基２１〜４０及び４６〜６０を含む、複合体。
【請求項３】
第１及び第２のペプチドを含む複合体において、前記第１のペプチドがｇｐ１２０のＶ３ループを含み、前記Ｖ３ループは前記第２のペプチド上の結合領域に連携するために利用可能であり、前記結合領域はＴａｔに由来し、リー（Ｌｅｅ）、Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、第２７４号、９６１７〜９６２６頁に記載されたＣＣＲ５第２細胞外ループに対するモノクローナル抗体によって認識可能である、複合体。
【請求項４】
前記Ｔａｔ結合領域が、配列番号１に記載の少なくとも残基２１〜６０、又は配列番号２に記載の残基３０１〜４１９と結合する能力をもつそのフラグメント、突然変異体若しくは変異体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
生物学的に活性なＴａｔを用いて調製される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
前記Ｖ３ループを含む前記ペプチドが、Ｖ３ループに加えてＥｎｖの一部又は全部を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項７】
前記Ｖ３ループを含む前記ペプチドが、配列番号２に記載の配列全て、又は配列番号１に記載の残基２１〜６０からなるペプチドと結合する能力をもつそのフラグメント、変異体若しくは突然変異体を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
前記Ｖ３ループを含む前記ペプチドが、本質的にｇｐ１２０の前記Ｖ３ループ領域からなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
前記Ｖ３ループを含む前記ペプチドが、配列番号２に記載の少なくとも残基３０１〜４１９、又は配列番号１に記載の残基２１〜６０から成るペプチドと結合する能力をもつそのフラグメント、変異体若しくは突然変異体を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
一構成要素として、ｇｐ１６０の全部又は一部を有し、前記ｇｐ１６０がｇｐ１２０の少なくともＶ３ループを含みかつ少なくともｇｐ１２０のＶ２ループの大部分が欠失している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
一構成要素として、ΔＶ２Ｅｎｖを有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１２】
前記Ｖ３ループを含む前記ペプチドが、配列番号２で示されている少なくとも残基３０１〜４１９を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１３】
機能的Ｖ３ループを暴露するべくＥｎｖと相互作用する能力をもつ分子又は物質をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１４】
前記分子又は物質がＣＤ４又はそのフラグメント、突然変異体若しくは変異体である、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
さらにヘパラン硫酸を含み、さらに前記ヘパラン硫酸を結合する能力をもつ少なくとも１つの他の分子を任意に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１６】
インテグリン、塩基性線維芽細胞成長因子、ＣＤ２６、ＶＥＧＦ受容体及びケモカイン受容体から選択された物質をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１７】
前記Ｔａｔ結合領域が、ヒト細胞のプロテアソームをＴａｔに暴露することで生成可能なＴａｔのフラグメントに含まれている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１８】
前記Ｔａｔフラグメントが、Ｔａｔのシステイン、塩基性及びＲＧＤ領域を含むフラグメント；Ｔａｔのシステイン及び塩基性領域を含むフラグメント；Ｔａｔの塩基性及びＲＧＤ領域を含むフラグメント；及びＴａｔの塩基性領域を単独で含むフラグメントから選択される、請求項１７に記載の複合体。
【請求項１９】
前記ペプチドが架橋されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２０】
それに対する抗体を産生するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項２１】
モノクローナル細胞系を得るためのプロセスにおける、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記抗体が、未変性Ｔａｔ、ｇｐ１６０、ＣＤ４若しくはｇｐ１２０、ＣＣＲ５及びｇｐ１２０のＶ３ループ領域からなる群のいずれかを、前記群のその他のもののいずれかから単離する際に提示されたときに認識しないように選択され、但し請求項１〜１９のいずれか一項に記載の複合体と結合する能力は有している、請求項２１又は２２に記載の使用。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれか一項に従って得られた抗体。
【請求項２４】
ヒトに注射したときの有害な免疫反応を防止又は削減するようにヒト化されている、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
Ｔａｔを発現するウイルスの感染に対する予防的又は治療的受動免疫法における、請求項２３又は２４に記載の抗体の使用。
【請求項２６】
前記ウイルスがＨＩＶである、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
レシピエントが妊婦又は授乳期間中の母親である、請求項２５又は２６に記載の使用。
【請求項２８】
ワクチン接種のための免疫原としての請求項１〜１９のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項２９】
前記ウイルスがＨＩＶである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
注射に適したビヒクル内のペプチドの組合せとして提供される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項３１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の複合体の構成要素の少なくとも２つの別々の調製物を含むキット。
【請求項３２】
治療法における請求項１〜１９のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項３３】
ウイルス感染の治療又は予防のための薬剤の調整における請求項１〜１９のいずれか一項に記載の複合体の使用であって、感染性ウイルスがある分子を発現させ、該分子が該分子、ＣＤ４及びＣＣＲ５の間で三重複合体を形成する能力を有する、使用。
【請求項３４】
患者からの試料が前記複合体に対する抗体を含有するか否かを立証するための請求項１〜１９のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｇｐ１２０を発現するウイルスに対するワクチンの製造におけるｇｐ１２０  Ｖ３ループを含むタンパク質材料の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的細胞の膜に対するＨＩＶ吸着は、細胞受容体ＣＤ４とＨＩＶ  ｇｐ１２０の相互作用の際に起こる。この相互作用は、ｇｐ１２０内の立体配座遷移を誘発し、ｇｐ１２０  Ｖ３ループの暴露を導く。１つの提案されたモデルによれば、ｇｐ１２０  Ｖ３ループはそれ自体、ＨＩＶについての今日受容体として作用するその他の細胞表面分子と相互作用する。最も重要なＨＩＶ共受容体は、ケモカイン受容体ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４である。現在一般的には、Ｔ細胞系トロピック（ＴＣＬ−ｔｒｏｐｉｃ）ＨＩＶ株がＣＸＣＲ４を介してＴＣＬを感染させ、デュアルトロピック株が共受容体のいずれかを介して感染させるのに対して、マクロファージトロピック（Ｍ−ｔｒｏｐｉｃ）ＨＩＶ分離株は、ＣＣＲ５を介してマクロファージを感染させるということが受入れられている。
【０００３】
ＨＩＶについての共受容体とｇｐ１２０  Ｖ３ループの相互作用は、共受容体ＣＤ４とｇｐ１２０の間の三重複合体の形成を可能にし、それ自体ｇｐ４１の立体配座変化を導く。ｇｐ１２０と共に、ｇｐ４１はウイルス外被糖タンパク質複合体（Ｅｎｖ）を形成する。これらの立体配座変化は、細胞表面と相互作用しウイルス外皮と細胞膜の間の融合を導くｇｐ４１のＮ末端における融合配列の暴露のために必要であると考えられている。この段階的機序の経過中に、ｇｐ４１及びｇｐ１２０上の潜在エピトープは、ｇｐ１２０とＣＤ４の間の相互作用の結果として暴露される。これらのエピトープはそうでなければ隠されており、ｇｐ１２０の場合、共受容体と相互作用するｇｐ１２０の部分に対して向けられた抗体により認識される。
【０００４】
これらの潜在エピトープは、ワクチン接種及び受動免疫法を目的として熱心な研究の対象であり続けてきており、ｇｐ１２０  Ｖ３ループが共受容体の認識及び使用に関与しているという多数の証拠が存在している。特に、Ｖ３の点突然変異又は欠失は、共受容体の使用を廃止させるか又は変えるものとして立証されてきており、Ｖ３ペプチドはＣＸＣＲ４と相互作用するものとして証明され、又Ｖ３に対する抗体はｇｐ１２０−ＣＣＲ５結合を損なうか又は遮断する。従って、このモデルは一般に受入れられているものの、さまざまな考察事実から、特にマクロファージにおいて共受容体の利用に付加的な事象が関与するという概念が導かれてきた。
【０００５】
Ｔａｔは、感染後非常に早い時期に産生されるヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）と結びつけられ、かつウイルス遺伝子の発現、複製及び感染力にとって欠くことのできない調節タンパク質である（アルヤ（Ａｒｙａ）１９８５年；フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）１９８６年；チャン（Ｃｈａｎｇ）１９９５年）。ＨＩＶによるＴ細胞の急性感染の間、Ｔａｔは同様に、細胞外培地内で放出され、近隣の細胞によって取上げられ（フランケル（Ｆｒａｎｋｅｌ）１９８８年；エンソリ（Ｅｎｓｏｌｉ）１９９０年；エンソリ１９９３年；チャン１９９７年）、ここで濃度、立体配座状態及び細胞タイプに応じて、それはウイルスの感染力を増大させることができる。特定的に言うと、Ｔａｔの摂取は、感染細胞内でウイルス遺伝子発現及び複製を増大させることができ（フランケル１９８８年；エンソリ１９９３年；チャン１９９７年）、一方、未感染細胞内では、共受容体ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４の発現を増強させ、マクロファージ及びＴ−リンパ球トロピックＨＩＶ−１株の両方の伝染に有利に作用する（ホアン（Ｈｕａｎｇ）１９９８年；セッキエーロ（Ｓｅｃｃｈｉｅｒｏ）１９９９年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの発見事実と一貫して、Ｔａｔに対する免疫応答は、エイズ及びエイズ関連疾患の進行を制御する上に主要な役割を果たし、かつＳＨＩＶ感染からＴａｔ−ワクチン接種済みサルを防御することが示されてきた（カファーロ（Ｃａｆａｒｏ）ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ、１９９９年）。しかしながら、利用可能な研究に基づいて、ＨＩＶの吸着又は膜融合を媒介する分子事象におけるＴａｔの特異的役割が認識又は主張されたことはこれまで全くなかった。
【０００７】
国際公開第０１／５４７１９号パンフレットは、抗原の組合せがＳＨＩＶでの攻撃誘発に対しワクチン接種済みサルを防御する上で有効であるという考察事実に基づいて、野生型Ｅｎｖと合わせた、抗原ペプチドとして又は機能抗原、未活性化抗原、突然変異抗原の形での抗原としてのＴａｔ及び／又はＮｅｆの使用について開示している。抗原から記述対象の抗原形態への誘導体化が、これらをより完全かつ／又は安定したものにする。Ｔａｔ又はＮｅｆ、及びＥｎｖの間の複合体が形成されるという示唆は全て無い。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、我々は、Ｔａｔがｇｐ１２０  Ｖ３ループと相互作用し、分子（構造）及び機能レベルの両方でＣＣＲ５共受容体を模倣して、ＣＣＲ５−トロピックＨＩＶ株に対して、非常に少量のＣＣＲ５しか発現せずかつ不動化されたＴａｔの不在下で同じウイルス投入量での感染を受けないと思われる細胞標的を感染させる能力を付与することができる、ということを発見した。
【０００９】
かくして第１の態様では、第１及び第２のペプチドを含む複合体において、該第１のペプチドがｇｐ１２０のＶ３ループを含み、該Ｖ３ループは該第２のペプチド上の結合領域に連携するために利用可能であり、該結合領域がＴａｔに由来し、治療法中で使用するため、リー（Ｌｅｅ）、Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、第２７４号、９６１７〜９６２６頁によって記述されたＣＣＲ５第２細胞外ループに対して導かれたモノクローナル抗体によって認識可能である、複合体が提供されている。同定されたモノクローナル抗体は、ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のカタログ番号３６４６０Ｄから入手可能である。
【００１０】
１つの代替的態様においては、本発明は、第１及び第２のペプチドを含む複合体において、該第１のペプチドがｇｐ１２０のＶ３ループを含み、該Ｖ３ループは該第２のペプチド上の結合領域に連携するために利用でき、該結合領域が配列番号１の少なくとも残基２１〜４０及び４６〜６０又は２１〜６０、又は配列番号２の残基３０１〜４１９と結合する能力をもつそのフラグメント、突然変異体又は変異体を含む複合体を提供する。
【００１１】
好ましくは、結合領域は、配列番号１の少なくとも残基２１〜５８から成る。好ましくは、配列番号１の残基２１〜４８及び４６〜６０又は４６〜５８は適切なリンカーによって連結され、好ましくは、配列番号２の結合残基３０１〜４１９を結合する能力をもつような形で適切に位置づけされている。代替的には、ここでも又配列番号２の残基３０１〜４１９を結合する能力が保持されることを条件として、配列番号１の２１〜５８を含む単一の隣接ストレッチも同様に好まれる。
【００１２】
好ましくは、結合領域は配列番号１の少なくとも残基２１〜５８を含む。代替的には、結合領域が配列番号１の少なくとも残基２１〜４０及び４６〜５８を含むことも同様に好まれる。
【００１３】
該発明はさらに、第１及び第２のペプチドを含む複合体において、該第１のペプチドがｇｐ１２０のＶ３ループを含み、該Ｖ３ループは、該第２のペプチド上の結合領域に連携するために利用でき、該結合領域がＴａｔから誘導されかつ、療法における使用のため、特にワクチン内の一免疫原性構成要素として使用するため抗−ＣＣＲ５抗体により認識可能である、複合体をも提供している。
【００１４】
「ペプチド」という用語はここでは、中にペプチド又はペプチドミメティク結合を有しかつ糖残基といったような他のタイプの化合物を含むより大きな分子の一部を成し得る物質を意味するべく用いられている。一般的には、ペプチドが天然に発生するアミノ酸の大部分を含むことが好ましく、天然に発生するアミノ酸がペプチドの９０％超を形成することが特に好ましい。１つの好ましい実施形態においては、ペプチドは、任意にはいずれか又は両方の末端にある遮断基及び／又はグリコシド残基により置換される天然に発生するペプチドから成る。
【００１５】
Ｔａｔがｇｐ１２０のＶ３ループを結合させることができること、そしてさらにＶ３ループを結合させるＴａｔの領域が抗−ＣＣＲ５抗体により認識可能であることは、特に驚くべきことである。モノクローナル抗体の非常に高い特異性を考えると、ｇｐ１２０のＶ３ループに対するＴａｔの効果がＣＣＲ５のものと類似であるか又は同一である確率が非常に高い。実際我々は、細胞外Ｔａｔが事実上、少なくともＨＩＶ感染力に関するかぎりこの共受容体をきわめて少量しか発現しないＴ細胞に対するＣＣＲ５機能性を提供することができる、ということを立証してきた。
【００１６】
例えば国際公開０１／５４７１９号パンフレットに関しては、Ｔａｔ及びＥｎｖは一緒に投与され得るものの、ＥｎｖはＣＤ４により活性化されなかったことから、又、複合体が形成された後にしかアジュバントの添加又は複合体架橋を行わないといったようなＴａｔＶ３ループ相互作用の混乱の回避を目的とする特定の予防措置が講じられていないことから、Ｔａｔは調製中でＥｎｖのＶ３ループを結合させることができない。国際公開０１／５４７１９号パンフレットの場合には、ＥｎｖがＣＤ４により活性化される時には、もはやＥｎｖはＴａｔの近くに存在しておらず、かくして、合同投与から得られるべき唯一の利点はアジュバントとしてのＴａｔの既知の利点しかないということになる。本発明においては、Ｔａｔは、特にそれが存在する場合そのままの状態でアジュバントとして作用できるばかりでなく、Ｖ３ループとのその会合はＨＩＶ感染又は感染の蔓延に対する防御において有用な１つ以上の新規の抗原性エピトープを作り出すこともできる。
【００１７】
かくして、Ｍ−トロピックＨＩＶ株は当初マクロファージのみをターゲティングすることになるが、ひとたびＴａｔが放出されたならば、非常に少量のＣＣＲ５しか発現しないＴ細胞でさえ急速に感染を受ける可能性があり、このことが持続的感染を確立するのに必要なウイルスの巨大な蓄積を導き得る。
【００１８】
これを認識することにより、今やＴａｔ及びＥｎｖの少なくとも関連する部分の抗原性複合体を提供し、かくして予防又は治療のため個体内で免疫原性応答を刺激することが可能である。
【００１９】
かかる複合体は同様に、例えば一個体がＨＩＶに暴露された疑いがある場合などといったような受動免疫法における使用のための抗体を生成するためにも用いることができる。かかる抗体は、ヒトでの使用を目的として動物で発生させることができ、又同様に当該技術分野において周知の方法によって配列決定しヒト化させることもできる。
【００２０】
複合体及びそれらに対する抗体はＣＣＲ５−トロピックウイルス株に対し特に用いられるものの、１つのＴ細胞からもう１つのＴ細胞へのウイルスのＴａｔ媒介型蔓延を阻止、又さらには遮断するためにもＴＣＬ−トロピックに対して利用可能である。同様にして、デュアルトロピック株も同じくターゲティングできる。
【００２１】
ＴａｔによるＣＣＲ５の分子模倣のため、これらの複合体に対して生成された複合体及び抗体も同様に部分的にＣＣＲ５の中又はＣＣＲ５／Ｖ３ループ複合体の中に存在するエピトープを模倣するか又はこれに対し導かれ、受動免疫法において使用されるワクチン又は抗体の効能にさらに貢献することになる。
【００２２】
本発明の複合体は一般に、注射に適したビヒクル内での２つのペプチド種の組合せとして適切に提供され得る。該複合体を含有するビヒクルはその状態で保管することもでき、又そうでなければ、個々のペプチドの別々の調製物として及び／又は使用に先立ち組合わせるためのビヒクルとして提供されてもよい。
【００２３】
本発明の複合体は標準的に、互いに接触している２つのペプチド種を含むことになる。好ましいことではあるものの、２つの種が化学量論的量で存在する必要はなく、又、いずれかの種の大部分がもう一方の種に対し複合体化又は結合されている必要さえもない。必要とされるのは単に、２つの種の抗原性組合せが、それに対する免疫応答を刺激できるのに充分な量で存在するということだけである。
【００２４】
本発明の複合体は、単純にｇｐ１２０のＶ３ループとＴａｔ間の自然な相互作用だけに依存し得る。より弱い複合体も利用できるが、一般的にはその複合体を強化することの方が好ましい。この点に関して、例えばＴａｔタンパク質のシステイン到達領域と会合して発生しうるジスルフィド架橋を利用すること又は例えばＢＳ３架橋剤といったような当該技術分野において既知のものであるその他のタンパク質架橋技術を使用することが可能である。
【００２５】
複合体は単純にＴａｔ及びｇｐ１２０の関連部域を含むことができる。ｇｐ１２０の場合、Ｖ３ループ領域の全て又は実質的部分で充分であるが、分子ドッキングデータによって表わされているように、Ｖ３グループに近接する残基もインビボで関与しうる。Ｔａｔの場合には、Ｖ３グループとの結合にはアミノ酸１〜６１そして場合によってはアミノ酸７０までそしてそれ以降のアミノ酸も関与するものの、残基２１〜５８を利用することが特に有利であると思われる。Ｔａｔ配列のこのストレッチは、モノクローナル抗−ＣＣＲ５抗体に対して特に強く結合する。
【００２６】
本発明において一般に重要であると思われるＴａｔ分子の部分は、配列番号１を基準にして残基１、２、４、１６、１９〜２２、２５、２６、２９、３４、３５、４５〜４７、５１、５５、５７、５９、及び６１を含む。しかしながら、抗−ＣＣＲ５はＴａｔ（２１〜５８）ペプチドを強く認識し、又さほど強くではないが、Ｔａｔの塩基性領域を包含するＴａｔ（４６〜６０）ペプチドを認識する。残基２１〜５８のＴａｔのフラグメントは、タンパク質の２つの重要な機能的ドメインすなわちシステイン富有領域（２１〜４０）と塩基性領域（４６〜５８）を含むことが知られている。Ｔａｔ（２１〜５８）ペプチドは同様に、低ＣＣＲ５発現ＴＣＬに対するＨＩＶトロピズムのＴａｔ媒介型拡張に必要とされる最小限のペプチドであるが、２１〜４０すなわちシステイン富有領域はそうではない。これらのデータは、Ｔａｔシステイン富有領域がＣＣＲ５模倣のためのＴａｔの塩基性領域の最良の立体配座構造にとって必要とされるものであるということを強力に予測している。かくして、本発明で全長未満のＴａｔが利用される場合には、単一の組換え型ペプチド内で合わせて又はリンカー領域を介して接合された状態で両方共存在し、好ましくは同じく該発明の一部を形成しているべき少なくとも残基２１〜４０及び４６〜５８又は中間長のトランケートされたペプチドを伴う少なくとも残基２１〜５８又は２１〜６０を利用することが好ましい。上述の配列の突然変異体又は変異体が使用される場合には、これは、結果として得られるペプチドが、添付の実施例の中で記述されている検定に従って判定されるように天然に発生するｇｐ１２０のＶ３ループを結合する能力を有することを条件として、１つ以上の残基の欠失、挿入又は逆転により変動する可能性がある。保持すべき好ましい残基は、適宜以下のものである；１、２、４、１６、１９〜２２、２５、２６、２９、３４、３５、４５〜４７、５１、５５、５７、５９及び６１。
【００２７】
配列番号１は、Ｔａｔの全アミノ酸配列を示す。
【００２８】
担体ペプチド又はフレームワーク分子がＴａｔの関連部分が含み得ることがわかるであろうが、これはその他のエピトープを作り出す可能性があり、従って一般には追加のエピトープの創造が意図されていない場合好まれない。
【００２９】
Ｖ３ループを含むペプチドは、任意にはトランケートされかつ／又は欠失を伴うｇｐ１２０を含むか又はこれで構成されていてよく、そうでなければより大きな又はより小さな分子を含むこともできる。１つの好ましい実施形態においては、Ｖ３ループを含むペプチドはＥｎｖの一部又は全部を含むことができる。この点において、Ｅｎｖはその未変性形態において、ｇｐ１２０〜ｇｐ４１の間の融合タンパク質としてウイルスにより産生されるプロセシングを受けていないタンパク質であるものとして考えられ、ｇｐ１６０としても知られている。該ペプチドは、Ｅｎｖのフラグメントを含んでいてよく、本書で使用されるＥｎｖは、Ｅｎｖとそのフラグメントを意味するだけではなくＶ３ループを発現しているか又は発現する能力をもつあらゆるペプチドを意味する。参考として、ここではｇｐ１２０の完全な配列は配列番号２として提供されている。この文脈においては、ペプチドが単にＶ３ループ領域で構成され得、かつ本書の他の箇所で論述されている通り、１つ以上のＶ３ループを発現する又は暴露させる担体分子といったようなあらゆる中間分子で構成されていてもよいということがわかるだろう。
【００３０】
Ｅｎｖ分子又は複合体は、天然に発生するものであってよく、そうでなければ、それがなおもＶ３ループを含有することを条件として、それに対するあらゆる欠失又は変異でもあり得る。欠失突然変異体、例えばＶ２ループは欠如しているもののｇｐ４１の一部分を保持するΔＶ２Ｅｎｖ突然変異体が好ましい。この突然変異体は、Ｔａｔと組合わさった形で特に優れた結果を提供し、高い抗−Ｅｎｖ抗体力価を生み出すことがわかっている。
【００３１】
ΔＶ２Ｅｎｖは、Ｔａｔと１つの複合体を形成し、Ｔａｔに対する液性応答を抑制することなくＥｎｖに対する液性応答を増大させる。これとは対照的に、野生型Ｅｎｖは複合体を形成するもののＥｎｖに対する液性応答を増大させることなく、Ｔａｔに対する液体応答を抑制し、かくしてΔＶ２Ｅｎｖの使用が野生型Ｅｎｖに比べてより大きなＢ細胞レパートリを刺激することを実証している。
【００３２】
かくして、好ましい実施形態において、該発明の複合体はその構成要素としてΔＶ２Ｅｎｖを有する。
【００３３】
Ｅｎｖの領域を含むＶ３ループは好ましくは、配列番号２の少なくとも残基３０１〜４１２を含み、結果として得られるループが添付の実施例内の検定によって判定される通り配列番号１に示されているようなＴａｔを結合させる能力を有することを条件として、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入又は逆転といったようなあらゆる変異又は突然変異をその配列上に含み得る。より好ましくは、任意のＶ３ループ含有配列は、配列番号２に示されているように少なくとも残基３０１、３１６、３１７、３１８、３２１、３２２、３２４、３２５、３２７、３２８、３２９、３３１、３３２、４０５、４０７、４１２、４１６〜４１９を含む。しかしながら、配列番号２内のヌクレオチド２９９〜２３３を含むＶ３ループ自体も同様に該発明の目的である。
【００３４】
Ｔａｔは１つのアジュバントとして機能でき、抗原に対する細胞媒介型免疫応答を増大させ、Ｔｈ１表現型に向かっての免疫応答を二極化させる、ということが知られている（ファナーレス−ベラッシオ（Ｆａｎａｌｅｓ  Ｂｅｌａｓｉｏ）ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００２年；エンソリ、Ｂ．、国際公開第０３／００９８６７号パンフレット）。さらに、Ｔａｔは、プロテアソームによりそのプロセシングを改変させることにより抗原に対するＴｈ１応答を広くする（エンソリら、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／１１９５０号明細書）。この結果、通常亜優性である抗原性細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープに対する応答が誘発される（エンソリら、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／１１９５０号明細書）。
【００３５】
我々が発見したのは、これらのエピトープが影響を受けず、従ってＥｎｖと共にＴａｔを使用することにより亜優性エピトープ、さらにはＥｎｖのエピトープに対するよい広い応答が刺激されることだけでなく、その他の抗原を併せて投与できるということである。
【００３６】
より好ましくは、機能的Ｖ３ループを暴露するべくＥｎｖと相互作用する能力をもつあらゆる分子又は物質を、本発明において、例えば抗体産生を刺激する目的で有用に利用することができる。この場合、機能的Ｖ３ループは、添付の実施例の中で検定により判定されるように、配列番号１の中に示されている通りＴａｔを結合させる能力をもつ。
【００３７】
適切な例は、Ｅｎｖと相互作用した時点でＶ３ループの暴露をひき起こす能力をもつＣＤ４又はそのフラグメントである。同様に含まれるのは、ウイルス表面へのＴａｔの結合時点でＥｎｖ内に存在するＶ３ループの暴露を誘発することによって反応することになるウイルス粒子の外被構成要素及びそのフラグメントである。
【００３８】
Ｖ３ループは、細胞マトリクス及び細胞膜内に存在するヘパラン硫酸に対するＥｎｖの結合についての主要な決定基であることが知られている。同様に、Ｔａｔがその塩基性領域を通ってヘパラン硫酸に結合するということも知られている。従って、Ｔａｔ及びＥｎｖが１つの複合体を形成することが実証されてきた今、本発明はさらに、任意にはヘパラン硫酸を結合させるものとして知られかつ感染／炎症部位と結びつけられているその他の分子と合わせてさらにヘパラン硫酸を含む複合体まで拡張される。このようなさらなる分子は、例えば塩基性線維芽細胞成長因子を含むことができ、該複合体は基本的にワクチン接種用の免疫原としての使用向けである。
【００３９】
当該分野では、αｖβ３、α５β１、αｖβ５を含む細胞付着受容体でありかつ細胞内へのＴａｔの進入を媒介するインテグリンをＴａｔが結合させるということがわかっていることから、本発明はさらに、特にワクチン接種用の免疫原として使用するためのさらなる構成要素としてインテグリンを伴う該発明の複合体まで拡張される。本発明の中で使用するための複合体を形成する上で有用であるその他の分子には、Ｔａｔ又はＥｎｖのいずれか又は両方を結合させる分子及び物質が含まれ、かつＣＤ２６、ＶＥＧＦ受容体及びケモカイン受容体などが含まれ得る。
【００４０】
重要であるのは、複合体が、それにより発生させられる抗体がインビボでＴａｔ／Ｅｎｖ複合体を認識することになるような形で免疫応答を刺激するのに適しているということである。かくして、一般にｇｐ１２０  Ｖ３ループを結合させるためにＴａｔ配列の変異体を利用することが可能である一方で、Ｔａｔペプチド及びループの複合体の３次立体配置がインビボでＴａｔ又はＴａｔ２１〜５８とＥｎｖの間で形成された複合体のものと異なる場合、結果としての複合体に対して発生させられた抗体がインビボでＴａｔ又はＴａｔ２１〜５８とＥｎｖの複合体を認識しなくなる可能性がある。
【００４１】
かくして、抗体を発生させるため又はワクチン調製物における免疫原として利用される複合体は実質的にＴａｔの完全配列又は好ましくは少なくともＴａｔ２１〜５８を免疫学的に自然な立体配座で含んでいることが好ましい。この点において、Ｔａｔの免疫原性に影響を及ぼすことなく或る種のアミノ酸置換を行なうことが可能であるが、かかる置換はその他の形で結果としてのＴａｔの生物学的効能に影響を及ぼすかもしれない。例えばＴａｔとＶ３ループの間のより大きい結合を確実なものにするといった理由でかかる置換を行なうことが望ましい可能性があり、そうでなければかかる置換は、好ましい遺伝子工学的プロセスの結果として生じる可能性もある。
【００４２】
複合体形成のためには、Ｖ３ループが全体的Ｅｎｖ分子の一部分であることはさほど重要ではなく、適切な状況下では、それがＴａｔペプチドと複合体を形成できるような形で利用可能であることを条件として、このループを担体分子の中に提供することができる。特に、かかる担体分子が、さまざまなＴａｔタンパク質と多量体複合体を形成するべく２個以上のＶ３ループを発現し得ることがわかるだろう。
【００４３】
一般に、立体配座的にＶ３ループを暴露することを条件として、天然に発生するＥｎｖ又はその変異体又は工学処理されたその突然変異体といったような類似の又は関連するタンパク質を利用することが好ましい。この暴露は好ましくは構成要素が融合タンパク質として連結され得るような形でその他の２つのペプチド種の調製物に対して任意にはヘパラン硫酸を内含し得る、例えばＣＤ４又はＣＤ４のｇｐ１２０結合エピトープを添加することによって達成されるか、又は例えば化学的架橋してｇｐ１２０がかかる系内でＶ３ループを暴露できるようにすることによって達成される。
【００４４】
好ましい実施形態においては、本発明は、感染性ウイルスが自らとＣＤ４及びＣＣＲ５の間で三重複合体を形成する能力をもつ分子を発現するようにする、ウイルス感染の治療又は予防のために薬剤の調製における上述の通りの複合体の使用を提供している。
【００４５】
該複合体中で使用されるペプチドは、それらがなおも、上述の通りその所望の目的を実施することができるということを条件として、あらゆる従来の要領で誘導体化又は置換され得る。特に、ペプチドが短かい場合、Ｎ及び／又はＣ−末端は、例えばペプチダーゼの活動を阻害するべく化学的に遮断され得る。ペプチドが化学的に合成されるか又は半合成される場合、感受性の高い結合を攻撃に対する感受性の比較的低い部分と置換させることも望ましいかもしれない。一部のケースでは、ペプチド模倣基でペプチドの大きなトラクトを置換することが適切であるかもしれない。
【００４６】
該発明の好ましい複合体においては、第２のペプチドは、ＨＩＶ  Ｔａｔシステイン及び塩基性領域を含み、第１のペプチドは、ＨＩＶ  ＥｎｖのＶ３ループを含む。第２のペプチドは、ＨＩＶ  Ｔａｔフラグメント又はその誘導体を含んでいてよく、第１のペプチドはＨＩＶ  Ｅｎｖフラグメント又はその誘導体を含み得る。第２のペプチドはＨＩＶ  Ｔａｔペプチド又はエピトープを含んでいてよく、第１のペプチドはＨＩＶ  Ｅｎｖペプチド又はエピトープを含み得る。
【００４７】
好ましい実施形態においては、該発明の複合体は、ペプチド間に少なくとも１つの共有結合による連結を含む。該複合体は、例えばＨＩＶ１  Ｔａｔ、そのフラグメント又はその誘導体とＨＩＶ  Ｅｎｖ、そのフラグメント又はその誘導体の間の共有結合により連結されたキメラであってよい。
【００４８】
１つの好ましい複合体においては、第２のペプチド上の結合領域は、Ｔａｔのアミノ酸残基１〜６１又はその免疫学的等価物を含む。Ｔａｔ構成要素は転写活性化突然変異体であってよい。
【００４９】
好ましい複合体は、細胞及び細胞破片を実質的に含まないということがわかるだろう。
【００５０】
該発明はさらに、母から子又はＨＩＶ暴露個体間でのＨＩＶ伝染の予防又は阻害方法において、該母親又は個体に本書で定義されているような受動ワクチンを投与するステップを含む方法をも提供する。
【００５１】
一般に、この治療又は予防法のための標的ウイルスはＨＩＶ又はＨＴＬＶの株となるが、例えばＳＨＩＶといったような動物の株でもあり得る。
【００５２】
本発明の複合体に対する抗体は、標準的手段によって発生でき、適切なモノクローナル又はポリクローナル抗体（好ましくはモノクローナル）が生成され得る。このような抗体は、ＣＣＲ５、Ｔａｔ、Ｅｎｖ又はｇｐ１２０のＶ３ループ領域のいずれかをも個別に結合させる能力をもたないもののＴａｔ及びＥｎｖ又は共受容体とＥｎｖの複合体を結合させる能力を有する。かくして、結果として得られた抗体は、Ｔａｔ又は共受容体及びＥｎｖの複合体をインビボで結合及び遮断させかくして感染を予防又は阻害することができる。かかる抗体は必ずしも、複合体形成時に生成された新しいエピトープと相互作用することによって複合体の構成要素の両方又は全てを結合させ得ず、ＥｎｖとＴａｔの結合時点で暴露された潜在エピトープを単に結合させ得る。このようなエピトープはＴａｔ、Ｅｎｖ又さらにはＣＣＲ５上で発生でき、これは該発明の１つの利点を表わしている。
【００５３】
該発明の複合体に対する適切な抗体の調製においては、Ｔａｔ又はＥｎｖ上に通常存在するエピトープを結合させる抗体を、選択されたモノクローナル抗体又はポリクローナル調製物から個別に、Ｔａｔ、Ｅｎｖ又はｇｐ１２０のＶ３ループを結合させる抗体又は系統を削除するという単純な方法により除去し、かくしてその複合体内にのみ存在するエピトープを結合させるポリクローナル調製物又は抗体発現系統のみを残すことができる。
【００５４】
この要領で発生させられたモノクローナル抗体は、動物で発生させられた場合、当該技術分野で周知の方法によって適切にヒト化され得るということがわかるだろう。本発明は、本書に記述された複合体に特異的なポリクローナル、モノクローナル及びヒト化された抗体にまで拡張される。
【００５５】
該発明の複合体を含む活性ワクチンが、該発明の抗体を含む受動免疫法用の抗体調製物と同様に提供されており、かかるワクチンに適したビヒクルは、当該技術分野において周知であり、安定化剤、等張剤及び抗菌剤といったような適切な物質を含み得る。
【００５６】
複合体又は抗体を担持するビヒクルは、望まれる通り、希釈及び／又は活性化のため濃縮又は不活性の形態で保管され得る。適切なビヒクルは、生理食塩水又はその誘導体、又は当業者にとって直ちに明らかであるその他のものであり得、好ましくは注射可能な形態であり、そうでなければ注射可能な形態へと調合することができるものである。
【００５７】
複合体又は抗体の量は、免疫原又は興奮剤として役立つため又は適宜生物学的効果を有する又は高めるために充分なものとなる。
【００５８】
本発明は同様に、複合体自体にまで拡張される。かかる複合体の１つの使用は、患者由来の試料が該複合体に対する抗体を含有するか否かを立証するためのクロマトグラフィ技術にある。該複合体は、カラム内で使用するために担体上に固定させるといった、かかる技術におけるあらゆる従来の要領で使用可能であり、適切な検出用作用物質は例えばマーキングされた抗抗体である。
【００５９】
該発明の複合体はさらに、細胞をターゲティングするため及び例えばＨＩＶの細胞進入を妨害する薬物を同定するために使用可能である。細胞及び複合体を含みかつ感染用量のウイルスに付された培養を検定して例えば感染が発生したか又はどれほど発生したかを立証することができる。
【００６０】
かくして、Ｔａｔ−Ｖ３ループ複合体は、インビボＴａｔ−Ｖ３ループ相互作用を遮断又は結合させる能力をもつ防御抗体を誘発してその後の感染を中断させることによって、予防的又は治療的ワクチン接種のために使用可能な新規の抗原を提供する。抗体は同様にＣＣＲ５−Ｖ３ループ相互作用を遮断することもでき、該複合体を使用して、例えば母子伝染又は暴露された個体内での水平ＨＩＶ伝染を遮断するべく受動免疫法のための防御抗体を生成することが可能である。
【００６１】
好ましい実施形態においては、本発明は、Ｔａｔのシステイン富有及び塩基性領域とｇｐ１２０Ｖ３ループの相互作用の時点で生成される、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質とＨＩＶ外被タンパク質Ｅｎｖの間で形成された分子複合体を提供する。全Ｔａｔタンパク質、その突然変異体、そのフラグメント又は誘導体及びＨＩＶ外被タンパク質ｇｐ１６０、そのフラグメント又は誘導体を用いて得られた分子複合体が、ＨＩＶ／エイズに対する予防的又は治療的ワクチン接種のための抗原としてのそれらの使用と同様、好まれる。
【００６２】
好ましい複合体は、ＨＩＶ  Ｔａｔシステイン及び塩基性領域及びＨＩＶ  ＥｎｖのＶ３ループを含む。タンパク質は、Ｔａｔに暴露された細胞のプロテアソームによって差動的にプロセシングされることから（エンソリら、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／１１９５０号明細書）、もう１つの好ましい複合体は、Ｔａｔのシステイン、塩基性及びＲＧＤ領域、Ｔａｔのシステイン及び塩基性領域、Ｔａｔの塩基性及びＲＧＤ領域、又は塩基性領域単独を含有するフラグメントを含めた、Ｔａｔに暴露された細胞のプロテアソームによって生成されるＴａｔフラグメントを含む。もう１つのものは、ＨＩＶ  Ｔａｔフラグメント又はその誘導体及びＨＩＶ  Ｅｎｔフラグメント又はその誘導体を含み、さらにもう１つは、ＨＩＶ  Ｔａｔペプチド又はエピトープ及びＨＩＶ  Ｅｎｖペプチド又はエピトープを含む。
【００６３】
同様に好ましいのは、ＨＩＶ１  Ｔａｔ、そのフラグメント又は誘導体、とＨＩＶ  Ｅｎｖ、そのフラグメント又は誘導体の間の共有結合により連結されたキメラである。
【００６４】
１つの実施形態におけるＴａｔ構成要素は、転写活性化サイレント突然変異体、例えばＴａｔ−ｃｙｓ２２突然変異体であり得る。
【００６５】
これらの実施形態のＨＩＶは好ましくはＨＩＶ−１である。好ましいクレードはＨＩＶ−１クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＯである。該発明は、ＣＣＲ５−トロピック、ＣＸＣＲ４トロピック及びデュアルトロピック株にまで拡張されること、又任意の特異的ウイルス又はそのタイプ又はクラスに対する言及が該発明の全てのウイルス対象に同等に適用可能であることがわかるだろう。
【００６６】
該発明のワクチンは、母子間又はＨＩＶに暴露された個体間のＨＩＶ伝染の予防又は阻害において特に使用される。
【００６７】
本発明はさらに、以下の制限的な意味のない実施例により例示される。
【実施例】
【００６８】
実施例１
ｇｐ１２０Ｖ３ループとＨＩＶ−１Ｔａｔの分子相互作用
分子ドッキングモデルを用いてＨＩＶ−１  ｇｐ１２０Ｖ３ループに対するＨＩＶ−１Ｔａｔの結合を調査し、ここでＴａｔ（ＢＨ１０  ＨＩＶ株）をＥｎｖタンパク質（Ｂａ−Ｌ  ＨＩＶ株）のＶ３ループと相互作用させた。２００３年７月付けでタンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）（ベルマン（Ｂｅｒｍａｎ）Ｈ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２８号、２３５〜２４２頁、２０００年）に寄託されたＥｎｖタンパク質及びＴａｔタンパク質の入手可能な構造全てを鋳型として用いて、全ての構造モデルを計算した。ＣｌｕｓｔａｌＷ（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、Ｊ．Ｄ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２２号、４６７３〜４６８０頁、１９９４年）を用いてさまざまなタンパク質の配列を整列させ、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ６ｖ２（サリ（Ｓａｌｉ）、Ａ．及びブランデル（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ）、Ｔ．Ｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２３４号、７７９〜８１５頁、１９９３年）で構造モデルを生成した。計算された構造モデル全てをＡＭＢＥＲ−５（パールマン（Ｐｅａｒｌｍａｎ）Ｄ．Ａ．ら、ＡＭＢＥＲ５．０中、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、サンフランシスコ、１９９７年）でのエネルギー最少化を通して最適化した。次にこれらの構造モデルを用いて、プログラムＢＩＧＧＥＲ（パルマ（Ｐａｌｍａ）、Ｐ．Ｎ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．第３９号、３７２〜３８４頁、２０００年）でタンパク質−タンパク質アダクツを計算した。後者のプログラムは、タンパク質−タンパク質複合体を生成し、形状相補的でかつ無結合の（静電気及びファンデルワールス）相互作用に基づいてそれらを格付けする。
【００６９】
初期分子ドッキング計算は、単離されたＶ３ループ（ａ．ａ．２９７〜３３６）で行なわれ、３つの独特の相互作用領域によって特徴づけされる３つのタイプの低エネルギーアダクツを発生させた。これらのアダクツは、Ｖ３ループと相互作用する異なるＴａｔ残基によって特徴づけされるが、これとは対照的にＶ３ループは、残基Ｔｈｒ３００、Ａｒｇ３０１、Ａｌａ３３１、Ｈｉｓ３３２、Ａｓｎ３３４及びＶ３ループの３０６〜３２８セグメントの複数のアミノ酸が関与する単一の相互作用領域しか示さなかった。
【００７０】
Ｖ３ループを暴露するＨＩＶ−１  Ｂａｌｇｐ１２０の比較的大きいドメイン（２９１ａ．ａ．）とＴａｔの間の相互作用が次に計算された。Ｖ３ループの立体配座及びｇｐ１２０ドメインの残りの部分との関係におけるＶ３ループの相対的配向についての構造情報は全く利用可能でなかったため、Ｖ３ループについての柔軟性及びアクセス可能な立体配座の範囲がサンプリングされた。ループ立体配座の可変性は実際には、複合体幾何形状に対しかなり大きな効果を有し得る。立体配座サンプリングは、明示的溶媒中における長分子動力学シミュレーションを通して行なわれた。ドッキング計算を実施し、Ｔａｔが２つの最も異なるＶ３ループ立体配座とそれに加えた３つの中間立体配座を含めたＥｎｖタンパク質のｇｐ１２０の５つの異なる立体配座と相互作用できるようにした。
【００７１】
これらの計算により、Ｖ３ループ単独で実施された計算で発見されたアダクツの１つの中に発見されたものと基本的に同じであるＶ３ループが関与する領域内でＴａｔと相互作用するアダクツが同定された。従って、このアダクツは最も安定したものであると予測され、その立体配座を最適化するためそして（２つの分子の原子により産生された）完全な力場が有効である場合のその安定性を推定するため、分子力学（ＭＤ）計算に付された。計算は、Ｅｎｖタンパク質の酸化された（すなわちＶ３ループ上にジスルフィド架橋を伴う）状態及び還元状態の両方で実施され、アダクツが両方の酸化状態で同様に安定していることを示した。記述された手順で発見された相互作用モデルを妥当性検査し、タンパク質−タンパク質インタフェースを解析するために、プログラムＨａｄｄｏｃｋでのドッキング計算も同様に実施された。５つの最低のエネルギーのアダクツが、ＢＩＧＧＥＲ計算で発見されたモデルと同じ幾何形状を有することが発見された。
【００７２】
従ってこれらの計算全てが、独特の相互作用様式を指摘した。アダクツの最終的構造モデルはかなり安定していることが発見され、平均相互作用表面積は２２６０±１１２Å２であり平均タンパク質−タンパク質分子間エネルギーは−４１２±１４ｋｃａｌモル−１であった。相互作用エネルギーに対する最大の寄与は静電気寄与に起因し、平均エネルギーは、−３２５±１２ｋｃａｌモル−１であった。相互作用表面積には、Ｔａｔ上の残基１、２、４、１６、１９〜２２、２５、２６、２９、３４、３５、４５〜４７、５１、５５、５７、５９、６１及びＥｎｖ上の残基３０１、３１６、３１７、３１８、３２１、３２２、３２４、３２５、３２７、３２８、３２９、３３１、３３２、４０５、４０７、４１２、４１６〜４１９が関与している。
【００７３】
それぞれＴａｔ及びｇｐ１２０残基の間の３つの分子間塩架橋（Ａｓｐ５−Ａｒｇ３１６、Ｌｙｓ５０−Ｇｌｕ４０７及びＬｙｓ１９−Ａｓｐ３２７）は、さまざまなモデルの全ての中で、かつ分子力学シミュレーション中完全に保存されることがわかった。アダクツは、シミュレーション中に数が６から１１に変動するもののつねに共通相互作用領域の少なくとも１つの残基が関与している付加的な分子間水素結合によってさらに安定化させられることがわかった。アダクツの安定化に対するかなり大きな寄与も又、３０〜４０の疎水性相互作用によってもたらされるものと判定された。これらの相互作用のうちの２０〜３０がＶ３ループに属する残基によって促され、一方そのうち約２０がＴａｔの２０〜５９セグメントに属する残基により促された。
【００７４】
実施例２
ＴａｔはＥＬＩＳＡ検定内でｇｐ１２０Ｖ３ループを結合させる。
Ｔａｔが実際にインビトロでｇｐ１２０Ｖ３ループを結合するか否かを判定するため、酵素免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）試験を実施した。この目的のために、ＥＬＩＳＡ平板を、Ｖ３ループ全体を包含するペプチドでコーティングした後、担体ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）での大規模な遮断、多数回の洗浄ステップ及び生物活性Ｔａｔタンパク質又は対照としてのその緩衝液（ＰＢＳ−ＢＳＡ０．１％）での付加的なインキュベーションを行なった。（カファーロ（Ｃａｆａｒｏ）ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９９年；ファナーレス−ベラッシオら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００１年）。結合タンパク質の検出のための一次抗体としてモノクローナル抗−Ｖ３及びポリクローナル抗−Ｔａｔ抗体を使用した。
【００７５】
コーティングされていない（すなわちＢＳＡで遮断された）ウェルを抗−Ｔａｔ又は抗−Ｖ３抗体でのＥＬＩＳＡ検定において使用した場合、約０．１〜０．４ＯＤの範囲内のわずかな背景シグナルが検出された。結果は下表１に示されている。しかしながら、Ｖ３ペプチドでコーティングされたウェルをＴａｔと共にインキュベートした場合、該シグナルは約１光学密度（ＯＤ）まで増大した。これとは対照的に、緩衝液単独と共にインキュベートされたウェルは、背景レベル（コーティングされていないウェル）に匹敵するシグナルを生み出した。予想された通り、Ｖ３でコーティングされたウェルは、抗−Ｖ３抗体で高いＥＬＩＳＡシグナルを生み出した。これらの実験は、生物活性あるＴａｔがインビトロでｇｐ１２０Ｖ３ループに結合することを示しており、分子ドッキング計算で得られたデータを確認している。ウェルをＴａｔでコーティングし、増大する量のＶ３ループペプチドと共にコーティング済みのウェルをインキュベートすることによっても類似の結果が得られ、これは予想通り、固定化Ｔａｔに対するＶ３ループペプチドの用量依存型結合を示していた（表１−２）。
【００７６】
【表１】
2007535500.tif 000002
【００７７】
【表２】
2007535500.tif 000003
【００７８】
実施例３
ＴａｔはＣＣＲ５  ＨＩＶ共受容体に対して導かれた抗体により認識される。
ｇｐ１２０Ｖ３ループは、共受容体の選択及びＨＩＶ株による利用にとっての主要な決定因子であると思われることから、Ｖ３ペプチドを結合させるＴａｔの能力が共受容体分子のＴａｔによる模倣に起因するものであるか否かを判定するために実験が行なわれた。この目的で、ＥＬＩＳＡ検定において、Ｔａｔ又は特定のＴａｔ配列及び／又は構造的及び機能的ドメインから成るＴａｔペプチドを認識するか否かを判定するために、主要ＨＩＶ−１共受容体（ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４）（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））に対して導かれたモノクローナル抗体を使用した。これらのモノクローナル抗体は、ＨＩＶ−１共受容体上に存在する、立体配座エピトープを認識するものとして知られている（リー（Ｌｅｅ）、Ｂ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年；バリボー（Ｂａｒｉｂａｕｄ）Ｆ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００１年）。従って、これらの抗体にするＴａｔのあらゆる認識が、Ｔａｔが関連する共受容体と構造的類似性を共有しているということを表わすことになる。
【００７９】
ＥＬＩＳＡ平板は、未変性（ｎａｔｉｖｅ）Ｔａｔ又は以下のＴａｔペプチドのうちの１つ（これらのペプチドが基本的に対応する１つ以上の領域はカッコ内に入っている）のいずれかでコーティングされた：
Ｔａｔ（１〜２０）（Ｎ末端ドメイン）；
Ｔａｔ（２１〜４０）（システイン富有領域−転写活性化ドメイン）；
Ｔａｔ（３６〜５０）（コア領域）；
Ｔａｔ（４６〜６０）（塩基性領域−核内保留シグナル）；
Ｔａｔ（５６〜７０）（グルタミン富有領域）
Ｔａｔ（６５〜８０）（ＲＧＤ配列）；
Ｔａｔ（７３〜８６）（ＲＧＤ配列）；
Ｔａｔ（８３〜１０２）（Ｃ末端ドメイン）；及び
Ｔａｔ（２１〜５８）（システイン、コア及び塩基性領域）。
【００８０】
検出ステップ用として、モノクローナル抗−ＣＣＲ５又は抗ＣＸＣＲ４抗体を使用した。抗−ＣＣＲ５は、組換え型未変性Ｔａｔタンパク質、Ｔａｔ（２１〜５８）ペプチドそしてより低い効率でではあるがＴａｔ（４６〜６０）ペプチドを特異的に認識した。結果は下表２に示されている。これとは対照的に、ＣＸＣＲ４に対し導かれた抗体ではいかなる認識も観察されなかった。
【００８１】
【表３】
2007535500.tif 000004
【００８２】
これらの実験において使用された抗−ＣＣＲ５抗体は、ＣＣＲ５の第２の細胞外ループ（ＥＣＬ２）の中に存在する立体配座エピトープを認識し、ＨＩＶを中和するものとして知られている（リー、Ｂ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年）。さらに、ＲＣＬ２は、膜融合を導くＥｎｖの立体配座変更に関与するものとして知られている（リー、Ｂ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年）。かくして、これらのデータは、Ｔａｔ転写活性化ドメイン及び塩基性富有領域の両方を包含するＴａｔ配列が構造レベルで、ｇｐ１２０によるＣＣＲ５の認識の時点で細胞融合に関与するＣＣＲ５の一領域を模倣するということを表わしていた。
【００８３】
実施例４
抗−ＣＣＲ５抗体によるＣＣＲ５の認識には、未変性で生物活性を有するＴａｔが必要である。
以上の実施例３に記述されているデータは、ペプチド２１〜５８内に存在するＴａｔ配列が、ＣＣＲ５共受容体の立体配座エピトープを模倣するべく折畳み能力を有する。Ｔａｔの特定的立体配座が抗−ＣＣＲ５抗体による認識のために必要とされるか否かを判定するために、抗−ＣＣＲ５抗体により認識される未変性で生物活性あるＴａｔの能力を、その生物活性の大部分を排除するべく既知の手順に従って空気及び直射光にタンパク質を暴露することにより得られる酸化されたＴａｔ調製物と比較した（ファナーレス−ベァラッシオ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００１年）。この手順の結果、−ＳＨ基は酸化され、Ｔａｔ転写活性化ドメインの中に存在するシステイン残基により媒介されて分子内及び分子間ジスルフィド結合が形成されることになる。Ｔａｔの転写活性化特性はそれ自体、ＨＩＶ共受容体を含めた宿主遺伝子の発現を活性化するものとして知られている（ホアン、１９９８年；セッキエーロ、１９９９年）。しかしながら、Ｔａｔ転写活性化特性は、システイン２２がグリシンで置換されている転写活性化突然変異体（Ｔａｔ−ｃｙｓ２２）内では完全に破壊されている（カプート（Ｃａｐｕｔｏ）、Ａ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９６年）。それでも、このＴａｔ突然変異体はその免疫原性特性は無傷の状態に維持している（カッセーリ（Ｃａｓｅｌｌｉ）、Ｅ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９年）。かくして、Ｔａｔ−ｃｙｓ２２も同様にこの実験セットの中に含み入れられた。
【００８４】
ＥＬＩＳＡウェルを、未変性Ｔａｔ、酸化Ｔａｔ（ＴａｔＯＸ）、又はＴａｔ−ｃｙｓ２２でコーティングし、検出ステップでは抗−ＣＣＲ５、抗−ＣＸＣＲ４抗体を使用した。これらの実験は、該抗体が組換え型未変性Ｔａｔタンパク質及びＴａｔ−ｃｙｓ２２突然変異体を特異的に認識するものの酸化Ｔａｔタンパク質は認識しないということを示した。結果は下記の表３に示されている。これとは対照的に、対照として、ポリクローナル（ウサギ）抗−Ｔａｔ抗体は予想通り、類似の効率で全てのタンパク質を認識し、全てのウェルが同等にコーティングされることを実証した。
【００８５】
【表４】
2007535500.tif 000005
【００８６】
従ってこれらの実験は、Ｔａｔ転写活性化ドメイン、コア領域及び塩基性領域を包含するＴａｔ配列がＣＣＲ５上に存在する主要エピトープを模倣するべく折畳まれること、そして、Ｔａｔの転写活性化特性を排除する点突然変異がエピトープ形成と干渉しないことを示した。
【００８７】
実施例５
細胞外Ｔａｔは、ＨＩＶ−１によるＣＤ４＋感受性細胞の感染を増大させ、ＣＣＲ５低発現細胞系内でのＨＩＶ−１トロピズムを拡大させる。
ＴａｔがＣＣＲ５を模倣することによってＨＩＶ−１の進入を媒介し得るか否かを判定するため、ＴａｔがＣＣＲ５非依存型系の中へのＨＩＶの進入に対するＴａｔの効果を判定することが必要であった。この目的のため、ＣＸＣＲ４−トロピックＨＸＢｃ２ＨＩＶ分離株又はＣＣＲ５−トロピックＡＤＡ又はＹＵ２ＨＩＶ分離株の外被糖タンパク質でシュードタイプ化された、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポータ遺伝子をコードする複製欠損組換え型ＨＩＶ−１を用いて単一サイクル検定で、感染実験を実施した。これらの複製欠損ウイルス（ここでは、Ｒ４−トロピックＨＸＢｃ２／ＨＩＶ−ＣＡＴ又はＲ５トロピックＡＤＡ／又はＹＵ２／ＨＩＶ−ＣＡＴウィルスと呼ばれる）は、ＣＤ４／ＣＸＣＲ４又はＣＤ４／ＣＣＲ５を通して感受性細胞内に進入し、細胞ゲノム内にそのｃＤＮＡを組込み、レポータ遺伝子ＣＡＴを発現するが、後代を産生できない、すなわち、これらはウイルス産生の後続サイクルを通して細胞のさらなる感染を支援できない（ヘルセト（Ｈｅｌｓｅｔｈ）、Ｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９０年）。かくして、ＨＩＶ−ＣＡＴウイルスは、標的細胞の１ラウンド感染サイクルを生成し、ＣＡＴアセチル化レベルの定量化がＨＩＶ感染の効率の定量的評価を可能にする。
【００８８】
上述の実施例１〜４で得たデータに基づき、ＴａｔによるＣＣＲ５共受容体の分子模倣を原因として、ＴａｔがＨＩＶによる感染を補助し、ＨＩＶトロピズムを拡張させ、ＴＣＬにＲ５−トロピック（すなわち単球／マクロファージ−トロピック）ＨＩＶ株による感染に対する感受性を付与することができるか否かを判定するために実験を実施した。この目的で、Ｘ４−トロピックＨＸＢｃ２株又はＣＣＲ５−トロピックＡＤＡ又はＹＵ２株からの外被でシュードタイプ化されたＨＩＶ−ＣＡＴウイルスと共に予めインキュベートされたＴａｔコーティングしたウェルの上に、ＣＥＭｓｓ及びジャーカット細胞、ＣＤ４及びＣＸＣＲ４の両方を発現させるものの標準的なフローサイトメトリ又はウェスタンブロットによって検出可能な量でのタンパク質レベルでのＣＣＲ５発現が欠如している２つのＴＣＬ又はＣＤ４−陰性２９３細胞系を平板固定した。予想された通り、ＣＥＭｓｓ及びジャーカット細胞系は共に、ＨＸＢｃ２／ＨＩＶ−ＣＡＴで効率良く感染させられたが、一次ＨＩＶ−１受容体の欠如に起因してＣＤ４−陰性２９３細胞ではいかなる感染も検出されなかった。顕著にも、さらに、ＣＥＭｓｓ及びジャーカット細胞は両方共、Ｒ５トロピックＨＩＶ−１株による感染に対する耐性をもつものとして知られているにも関わらず、ＡＤＡ又はＹＵ２シュードタイプ化ＨＩＶ−ＣＡＴによっても高効率で感染を受けた。従ってこれらのデータは、固定化ＴａｔがＨＩＶ−１細胞のトロピズムを特異的ＣＣＲ５細胞外構造ドメインの分子模倣を通して増大させる能力、すなわちＣＣＲ５トロピック株に対してＴａｔの不在下では一貫して感染を受けないような少量のＣＣＲ５しか発現しないＴＣＬを感染させる能力を付与する能力を有するという望外の予測を確認した。
【００８９】
さらなる実験では、Ｒ５トロピックＡＤＡＣａｔウイルスによるＣＥＭｓｓ細胞の感染を補助するためにＴａｔ２１〜５８は充分であるがＴａｔ２１〜４０は充分でなく、このことはｇｐ１２０Ｖ３ループに対する結合を媒介するＴａｔの領域がＨＩＶ拡張型トロピズムに必要とされるものと同じであることを示している、ということが示された。
【００９０】
実施例６
抗−ＣＣＲ５抗体は低ＣＣＲ５発現細胞系のＴａｔ補助型感染を遮断するが、抗−ＣＸＣＲ４抗体は遮断しない。
固定化ＴａｔがＣＣＲ５を模倣することによってＲ５−トロピックＨＩＶ−１株の細胞トロピズムを拡張させるということをさらに実証するため、ＣＣＲ５を遮断する能力をもつ活性分子が同様にＣＣＲ５−陰性細胞のＴａｔ補助型感染を遮断する能力をも有するか否かを判定するべく実験を行なった。この目的で、Ｒ５−トロピックＡＤＡ／ＨＩＶ−ＣＡＴ単一感染ラウンド組換えウイルスを含有する細胞上清と共に予めインキュベートさせたＴａｔコーティング済みウェル上にＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ３に対して導かれた抗体の存在下で、ＣＤ４＋／ＣＣＲ５−（ＣＣＲ５ＲＴ−ＰＣＲ−陽性）ＣＥＭｓｓ細胞を平板固定させた。Ｔａｔ補助型感染は抗−ＣＣＲ５抗体によってほぼ完全に破壊されたが、一方、対照と比べて抗−ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ３抗体では感染力の減少は全く見られなかった。ＣＥＭｓｓ細胞はタンパク質レベルでＣＣＲ５−陰性であることから、これらのデータは、抗体の遮断活性が、実施例３及び実施例４に詳述されているように、ＣＣＲ５立体配座エピトープを模倣するＴａｔ構造モチーフを認識するそれらの能力に起因するものであるということを表わしている。さらにこれらのデータは、ＴａｔによるＣＣＲ５の分子模倣がＣＣＲ５−陰性細胞内へのＣＣＲ５−トロピックＨＩＶ−１株の進入にとって必要である、ということを確認した。
【００９１】
実施例７
ＴａｔとＥｎｖの間の複合体は新規の免疫原である。
Ｔａｔ／Ｅｎｖ複合体が新規の免疫原を表わしているか否かすなわち潜在エピトープが暴露されつつあったことを判定するため、Ｖ３ループを暴露するものとして知られているＴａｔ及びＥｎｖタンパク質の混合物；ＴａｔとＶ３ループペプチドの混合物；又は対照としての単一抗原でマウスを免疫化した。組合わせた状態の２つの抗原のＢ細胞エピトープ決定基レパートリは、新しいエピトープが生成され、潜在エピトープが暴露されかつ／又は予め存在するエピトープが複合体形成時点で隠されているために、単一の抗原についてのものと比べて異なるものになる、という予測に、これらの実験の論理的根拠は基づいている。従って一部の複合体は、生成された、暴露された又は隠されたＢ細胞エピトープ及び複合体の性質に応じて、Ｔａｔ及び／又はＥｎｖに対する液性応答の強度を広げるかつ／又は増大させるものと予測され、その他はその少なくとも一部分を狭くする／減少させるものと予測される。
【００９２】
３つのＥｎｖ分子、すなわちウイルス外被内に存在する３量体形態に比べ優れたＶ３ループ暴露のせいでＶ３ループに対するより強力な抗体応答を生成することが示されてきた野生型単量体ｇｐ１２０（野生型Ｅｎｖ）（フーツ（Ｆｏｕｔｓ）、ＴＲら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９７年；アール（Ｅａｒｌ）ＰＬら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９４年）、ｇｐ４１の一部分を保持ししかもＶ２ループ（ΔＶ２Ｅｎｖ）が欠如しておりかつＶ３ループを暴露するものとして知られているＥｎｖ分子の３量体ｇｐ１４０形態（スリヴァスタヴァ（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ）ＩＫら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３年、第７７巻：１１２４４〜１１２５９頁）；及びＶ３ループに対応する環状ペプチド、が選択された。選択されたＥｎｖ分子によるＶ３ループの暴露を確認するために、ポリクローナル抗−Ｖ３ループ血清に対する反応性についてＥＬＩＳＡにより単量体野生型Ｅｎｖ及び３量体ΔＶ２Ｅｎｖの両方をテストし、陽性の結果を得た。
【００９３】
第１の２治療群実験では、０日目、１４日目及び２８日目に、Ｔａｔ、野生型Ｅｎｖ、ΔＶ２Ｅｎｖ又は、Ｔａｔと野生型Ｅｎｖ又はＴａｔとΔＶ２Ｅｎｖ（アジュバントとしてミョウバンの存在下で）の組合せでマウスを免疫化した。３８日目に得たマウスの血清についてＥＬＩＳＡにより液性応答（ＩｇＧ力価）をテストした。抗−Ｅｎｖ  ＩｇＧ力価は、ΔＶ２Ｅｎｖ単独で免疫化したマウスに比べ組み合せたＴａｔ及びΔＶ２Ｅｎｖでワクチン接種したマウスで大幅に増大した。これとは対照的に、これらの力価は、組合わせた野生型Ｅｎｖ及びＴａｔ又は野生型Ｅｎｖ単独での免疫化を受けたマウスでは、同定度であった。さらに、Ｔａｔに対する抗体力価は、野生型Ｅｎｖとの組合せの時点で減少したが、ΔＶ２Ｅｎｖとの組合せの時点では減少しなかった。
【００９４】
これらのデータは、野生型Ｅｎｖ又はΔＶ２ＥｎｖとＴａｔの組合せの結果、新しいＢ細胞エピトープ決定基レパートリにより特徴づけされる新しい分子種（複合体）が形成される、ということを確認している。さらに、これらのデータは、Ｔａｔ／ΔＶ２Ｅｎｖ複合体が、対照的にワクチン接種時点で野生型Ｅｎｖにより抑制される高い抗−Ｔａｔ抗体力価の惹起を防御しながら、抗−Ｅｎｖ液性応答を大幅に増大させる能力をもつということを示している。単量体野生型ＥｎｖはＨＩＶ及び感染細胞により大量に削減されることから、これは、自然感染において抗−Ｔａｔ抗体の頻度が低いことと合致している（ブット（Ｂｕｔｔo）ら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、２００２年；レッツア（Ｒｅｚｚａ）ら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、近刊）。
【００９５】
マウスは同様にミョウバン中のＴａｔ、Ｖ３ループペプチド又はＴａｔとＶ３ループペプチドでの免疫化を受けた。指摘すべきことに、Ｖ３ループペプチド単独では免疫原性ではなく、抗体力価を全く又はぎりぎりしか惹起せず、一方、Ｔａｔ及びＶ３ループペプチドの組合せはＶ３ループに対する抗体力価を著しく増大させ、Ｔａｔに対する抗体力価には全く効果を及ぼさなかった。
【００９６】
かくして、これらのデータは、Ｔａｔ／Ｅｎｖ又はＴａｔ／Ｖ３ループ複合体が、より高くかつより新しい免疫応答を惹起する能力をもつ新規免疫原であることを実証している。特に、ΔＶ２Ｅｎｖ又はＶ３ループペプチドと合わせたＴａｔの複合体は、ＨＩＶ  Ｅｎｖに対するさらに優れた液性応答を誘発し、これらは、対応する単一の抗原又はＴａｔと野生型Ｅｎｖの間の複合体により惹起されるものに比べて異なっている。
【００９７】
実施例８
Ｔａｔ及びＥｎｖの複合体形成は、Ｅｎｖ上に存在する個々のエピトープの抗体認識を変更する。
Ｔａｔ／Ｅｎｖ複合体が、Ｅｎｖ分子単独での免疫化の時点で認識されるものと異なるＥｎｖエピトープに対して導かれた液性応答を誘発するか否かを判定するために、特異的線形Ｅｎｖ  Ｂ細胞エピトープに対する反応性を分析するべく、実施例７で記述された第１の免疫化プロトコルからの同じマウス由来の血清を使用した。このために、野生型Ｅｎｖ又はΔＶ２Ｅｎｖにかかる１５量体ペプチド（ＳＨＩＶ−１  ＳＦ１６２．Ｐ３）を混合して、３つの隣接する１５量体（すなわちＥｎｖ又はΔＶ２Ｅｎｖの４５個のアミノ酸を網羅するもの及び２つの隣接するペプチドの間の接合部に各々重複する３つの１５量体から成るペプチドプールを形成させた。
【００９８】
Ｔａｔと組合わされた野生型Ｅｎｖ又はΔＶ２Ｅｎｖで免疫化されたマウス由来の血清は、残基７７〜１３２の間に存在する、すなわちＨＩＶ−１Ｖ１ループの最初の１４のアミノ酸にかかる線形エピトープを認識した。これとは対照的に、これらのエピトープは、単一の抗原として使用されたＥｎｖ又はΔＶ２Ｅｎｖで免疫化されたマウス由来の血清によって認識されなかった。ΔＶ２Ｅｎｖ内のＶ２ループの欠失と一貫して、野生型ＥｎｖはＶ２ループに対し導かれた抗体を惹起し、Ｔａｔとの組合せの時点で反応性は大幅に増大した。これとは対照的に、野生型Ｅｎｖ単独での免疫化は、ＨＩＶ  ＳＦ１６２Ｅｎｖ中の残基２８〜８３にかかる領域に対する強い反応性を惹起し、これはＴａｔでの同時免疫化の時点で完全に失われた。従ってこれらのデータは、ＴａｔとＥｎｖ又はＤＶ２Ｅｎｖの間の相互作用が、複合体形成と一貫して、線形Ｅｎｖ／ΔＶ２Ｅｎｖエピトープを暴露／隠ぺいさせるということを表わしていた。
【００９９】
有意にも、ΔＶ２Ｅｎｖ単独ではなくΔＶ２Ｅｎｖに組合わされたＴａｔで免疫化されたマウス由来の血清は、ｇｐ４１のＮ及びＣらせんにかかる領域に対する強い反応性を示し、ＣＤ４に対するＥｎｖの結合、そして今度はＶ３ループのＣＣＲ５又はその他の共受容体に対する結合の時点で発生することがわかっておりしかも必要であってウイルス外皮と細胞膜の融合に先行することがわかっているｇｐ４１の立体配座修正を表わしていた。従ってこれらのデータは、Ｖ３ループに対するＴａｔの結合及びウイルス進入に必要とされるＥｎｖに対するＣＣＲ５の結合の模倣と一貫性をもつ。最も重要なことに、これらのデータは、ＴａｔとΔＶ２Ｅｎｖの間の複合体が、ＨＩＶｇｐ４１に対する抗体を誘発でき、かくしてウイルス感染力を中和しうるということを表わしている。
【０１００】
これらの線形ｇｐ４１エピトープは、ΔＶ２Ｅｎｖ単独で免疫化されたマウス由来の血清により認識されず、ＴａｔとΔＶ２Ｅｎｖの間の複合体が新規免疫原であることを表わしている。
【０１０１】
立体配座エピトープについては、エピトープ認識の類似の変化の確率が高い。
【０１０２】
実施例９
Ｔａｔ／ΔＶ２Ｅｎｖ又はＶ３ループペプチド複合体での免疫化の時点での抗−Ｅｎｖ抗体力価の増大は、Ｅｎｖに対するＴｈ２応答の増大ではなく複合体中に存在する新しくより強力なＢ細胞エピトープの形成に起因する。
Ｔ細胞によるインターロイキン４（ＩＬ−４）の産生といったようなＴヘルパー２型（Ｔｈ２）応答が抗原に対する液性応答を生成するための鍵であるというのは、当該技術分野において周知のことである。かくして、ΔＶ２Ｅｎｖ又はＶ３ループペプチドと組合わされたＴａｔでの免疫化により惹起された抗−Ｅｎｖ抗体力価の増大の少なくとも一部分は、複合体上の新しいエピトープの生成に加えて、Ｅｎｖに対するＴｈ２応答の増加及び／又は広がりによって説明がつくと思われる。従って我々は、Ｔｈ２応答に対するＴａｔ／ΔＶ２Ｅｎｖ複合体での免疫の効果について調査した。
【０１０３】
このために、ＴａｔとΔＶＡ２Ｅｎｖの組合せ又はΔＶ２Ｅｎｖ単独で免疫化されたマウス（プロトコルについては実施例７を参照のこと）を、ＩＬ−４  ＥＬＩＳＰＯＴ検定によりＥｎｖに対する抗原特異的細胞応答について査定した。この検定は、ＩＬ−４の産生を測定し、当該技術分野において抗原又はＴ細胞エピトープペプチドに対するＴｈ２応答を評価するために使用されている。ΔＶ２Ｅｎｖ分子全体にかかる（１１のアミノ酸が重複する）Ｅｎｖ１５量体を含有するペプチドのプールのマトリクスを用いて、抗−Ｅｎｖ細胞応答を査定した。これらの実験は、Ｔａｔと組合わされたΔＶ２Ｅｎｖでの免疫がΔＶ２Ｅｎｖ単独の場合と比べてＥｎｖに対するＴｈ２応答を増大も広げもしないものの同じＥｎｖエピトープに対して導かれたＴｈ２応答を惹起するということを示した。従って、これらのデータは、ΔＶ２Ｅｎｖ又はＶ３ループペプチドと組合わされたＴａｔでの免疫化の時点でのＥｎｖに対する抗体力価の増大が、複合体形成時点での新規でさらに強力なＢ細胞エピトープの生成／暴露に起因するものであるということを表わしている。
【０１０４】
実施例１０
Ｔａｔは、両方の抗原で同時免疫化されたマウスにおけるＥｎｖに対する細胞応答を広げる。
Ｔａｔがアジュバンドとして機能し抗原に対する細胞媒介免疫応答を増大させることができ、かつＴｈ１表現型に向かっての免疫応答を二極化する、ということがわかっている（ファナーレス−ベァラッシオら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００２年；エンソリ、Ｂ．、国際公開第０３／００９８６７号パンフレット）。さらにＴａｔは、プロテアソームによるそのプロセシングを改変することにより、抗原に対するＴｈ１応答を広げる（エンソリら、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／１１９５０号明細書）。この結果として、通常亜優性である抗原性細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープに対する応答が誘発されることになる（エンソリら、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／１１９５０号明細書）。
【０１０５】
１つの複合体の形に組合わされたＴａｔ及びＥｎｖでの免疫化がＴｈ１応答及びＴａｔによる２極化に対して及ぼす効果を調査するため、ＴａｔとΔＶ２Ｅｎｖの組合せ又はΔＶ２Ｅｎｖ単独で免疫化されたマウス由来の脾細胞によるγＩＦＮ（標準的Ｔｈ１サイトカイン）の産生を、（１１個のアミノ酸だけ重複している）Ｅｎｖ１５量体を含有するペプチドプールのマトリクスを用いて分析した（プロトコルについては実施例７を参照のこと）。抗−Ｅｎｖｇ−ＥＬＩＳＰＯＴＳは、ΔＶ２Ｅｎｖ単独で免疫化されたマウスに比べてＴａｔ＋ΔＶ２Ｅｎｖで免疫化されたマウスにおいて、より多数のペプチドプール及びエピトープ（示さず）に対するＥｎｖ特異的Ｔ細胞反応を表示した。これらのデータは、ΔＶ２Ｅｎｖと組合わされたＴａｔが、すでに野生型Ｅｎｖと組合わされたＴａｔについて示された通り、免疫化されたマウスにおけるＥｎｖに対するＴｈ１応答を広げる能力を維持する、ということを示している（エンソリら、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／１１９５０号明細書）。従って、Ｅｎｖ複合体は、有効な／中和性液性応答を誘発すると同時にＥｎｖに対するＣＴＬ応答を広げるための免疫原として使用可能である。
【配列表】
2007535500000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月20日(2006.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１及び第２のペプチドを含む複合体において、前記第１のペプチドがｇｐ１２０のＶ３ループを含み、前記Ｖ３ループは前記第２のペプチド上の結合領域に連携するために利用でき、前記結合領域が配列番号１に記載の少なくとも残基２１〜４０及び４６〜５８、又は配列番号２に記載の残基３０１〜４１９と結合する能力をもつそれらのフラグメント、突然変異体若しくは変異体を含む、複合体。
【請求項２】
第１及び第２のペプチドを含む複合体において、前記第１のペプチドがｇｐ１２０のＶ３ループを含み、前記Ｖ３ループは前記第２のペプチド上の結合領域に連携するために利用でき、前記結合領域がＴａｔから誘導され、前記結合領域はＴａｔに由来し、リー（Ｌｅｅ）、Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、第２７４号、９６１７〜９６２６頁に記載されたＣＣＲ５第２細胞外ループに対するモノクローナル抗体によって認識可能である、複合体。
【請求項３】
前記結合領域が配列番号１に記載の少なくとも残基２１〜５８、又は配列番号２に記載の残基３０１〜４１９と結合する能力をもつそのフラグメント、突然変異体若しくは変異体を含む、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
非酸化Ｔａｔを用いて調製される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
前記Ｖ３ループを含む前記ペプチドが、Ｖ３ループに加えてＥｎｖの一部又は全部を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
前記Ｖ３ループを含む前記ペプチドが、配列番号２に記載の配列全て、又は配列番号１に記載の残基２１〜５８からなるペプチドと結合する能力をもつそのフラグメント、変異体若しくは突然変異体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項７】
前記Ｖ３ループを含む前記ペプチドが、ｇｐ１２０の前記Ｖ３ループ領域からなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
前記Ｖ３ループを含む前記ペプチドが、配列番号２に記載の少なくとも残基３０１〜４１９、又は配列番号１に記載の残基２１〜５８からなるペプチドと結合する能力をもつそのフラグメント、変異体若しくは突然変異体を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
一構成要素として、ｇｐ１６０の全部又は一部を有し、前記ｇｐ１６０がｇｐ１２０の少なくともＶ３ループを含みかつ少なくともｇｐ１２０のＶ２ループの大部分が欠失している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
一構成要素として、ΔＶ２Ｅｎｖを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
前記Ｖ３ループを含む前記ペプチドが、配列番号２で示されている少なくとも残基３０１〜４１９を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１２】
機能的Ｖ３ループを暴露するべくＥｎｖと相互作用する能力をもつ分子又は物質をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１３】
前記分子又は物質がＣＤ４又はそのフラグメント、突然変異体若しくは変異体である、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
さらにヘパラン硫酸を含み、さらに前記ヘパラン硫酸を結合する能力をもつ少なくとも１つの他の分子を任意に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１５】
インテグリン、塩基性線維芽細胞成長因子、ＣＤ２６、ＶＥＧＦ受容体及びケモカイン受容体から選択された物質をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１６】
前記結合領域が、ヒト細胞のプロテアソームをＴａｔに暴露することで生成可能なＴａｔのフラグメントに含まれている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１７】
前記Ｔａｔフラグメントが、Ｔａｔのシステイン、塩基性及びＲＧＤ領域を含むフラグメント；Ｔａｔのシステイン及び塩基性領域を含むフラグメント；Ｔａｔの塩基性及びＲＧＤ領域を含むフラグメント；及びＴａｔの塩基性領域を単独で含むフラグメントから選択される、請求項１６に記載の複合体。
【請求項１８】
前記ペプチドが架橋されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１９】
それに対する抗体を生成するための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項２０】
モノクローナル細胞系を得るためのプロセスにおける、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記抗体は、未変性Ｔａｔ、ｇｐ１６０、ＣＤ４若しくはｇｐ１２０、ＣＣＲ５及びｇｐ１２０のＶ３ループ領域からなる群のエピトープであって、単離の際に該群の一つを抗原として使用することにより産生された抗体に認識されるエピトープをいずれも認識せず、請求項１から１９のいずれか一項に記載された複合体としてのみ認識するよう選択される、請求項１９または２０に記載の使用。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のプロセスによって得られた抗体。
【請求項２３】
ヒトに注射したときの有害な免疫反応を防止又は削減するようにヒト化されている、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
Ｔａｔを発現するウイルスの感染に対する予防的又は治療的受動免疫法における、請求項２２又は２３に記載の抗体の使用。
【請求項２５】
前記ウイルスがＨＩＶである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
レシピエントが妊婦又は授乳期間中の母親である、請求項２４又は２５に記載の使用。
【請求項２７】
ワクチン接種のための免疫原としての請求項１〜１８のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項２８】
前記ウイルスがＨＩＶである、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
注射に適したビヒクル内のペプチドの組合せとして提供される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項３０】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の複合体の構成要素の少なくとも２つの別々の調製物を含むキット。
【請求項３１】
治療法における請求項１〜１８のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項３２】
ウイルス感染の治療又は予防のための薬剤の調整における請求項１〜１８のいずれか一項に記載の複合体の使用であって、感染性ウイルスがある分子を発現させ、該分子が該分子、ＣＤ４及びＣＣＲ５間で三重複合体を形成する能力を有する、使用。
【請求項３３】
患者からの試料が前記複合体に対する抗体を含有するか否かを立証するための請求項１〜１８のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【国際調査報告】
2007535500.tif 000006
2007535500.tif 000007
2007535500.tif 000008
2007535500.tif 000009
2007535500.tif 000010