(57)【要約】  本発明は、胚性幹細胞から誘導された間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションを製造する方法に関する。また、種々の形態学的因子及び細胞特異的マーカーによって特徴付けられる種々の特定の細胞形へと分化できる、間葉性幹細胞の均一なポピュレーションも開示される。この開示において記載される組成物及び方法は、種々の商業的に重要な診断、薬物スクリーニング、及び治療的応用のために有用である。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞から誘導された間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションを製造する方法であって、
ａ）前記胚性幹細胞を、胚様体形成に資する条件下で培養する工程、
ｂ）前記胚様体を、間葉特異的培地中で増殖させる工程、
ｃ）前記胚様体を消化して、中胚葉細胞を形成する工程、
ｄ）前記中胚葉細胞を、間葉特異的培地の存在下で培養して、間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションを形成する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
更に、
ｅ）前記間葉性幹細胞を、骨形成培地の存在下で増殖させて、骨前駆体細胞のサブポピュレーションを製造する工程、及び
ｆ）前記骨前駆体細胞のサブポピュレーションを、シーケンス特異的方法で骨芽細胞分化剤に露出させて、骨前駆体細胞の実質的に均一なポピュレーションを形成する工程、
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記間葉特異的培地が、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商品名）基礎培地である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記間葉性幹細胞が紡錘形状の形態を示す請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記間葉特異的培地が１，２５（ＯＨ）2Ｄ3を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記骨芽細胞分化剤が、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3、デキサメタゾン、レチノイン酸、アスコルビン酸、及びβ−グリセロリン酸からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記骨前駆体細胞のポピュレーションに骨芽細胞分化剤を添加するシーケンス特異的方法が、該細胞を、有効量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3、デキサメタゾン、レチノイン酸、又はそれらの組み合わせで処理することと、続いて、有効量のアスコルビン酸及びβ−グリセロホスフェートを添加することとを含んでなる請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記胚性幹細胞培養体がヒトから誘導される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションが、少なくとも６０％の間葉性幹細胞を含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションが、少なくとも９０％の間葉性幹細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記骨前駆体細胞が、前骨芽細胞及び骨芽細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも６０％の間葉性幹細胞を含んでなる、単離された実質的に均一な細胞ポピュレーション。
【請求項１３】
少なくとも９０％の間葉性幹細胞を含んでなる請求項１２に記載の単離された細胞ポピュレーション。
【請求項１４】
前記間葉性幹細胞が紡錘形状の形態を示す請求項１１に記載の細胞ポピュレーション。
【請求項１５】
前記間葉性幹細胞が更に、少なくとも８０％の前骨芽細胞及び骨芽細胞を有する骨前駆体細胞のサブポピュレーションへと分化する請求項１１に記載の細胞ポピュレーション。
【請求項１６】
前骨芽細胞及び骨芽細胞が、オステオポンチン、オステオネクチン及びオステオカルシンからなる群から選択される、骨芽細胞特異的遺伝子マーカーの発現によって特徴付けられる請求項１４に記載の細胞ポピュレーション。
【請求項１７】
前記細胞は、Ｃｂｆａ−１、Ｍｓｘ２、及びＤｌｘ５からなる群から選択される初期転写因子の発現によって特徴付けられる請求項１４に記載の細胞ポピュレーション。
【請求項１８】
胚性幹細胞から誘導された間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションを製造する方法であって、
（ａ）ヒト胚性幹細胞を誘導して、胚様体を形成する工程、
（ｂ）前記胚様体由来の細胞を、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の存在下で培養して、間葉特異的培地を作製する工程、
（ｃ）前記間葉特異的培地中で増殖する細胞を回収する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記誘導する工程が１０日〜１２日を必要とし、前記培養する工程及び回収する工程が合計で１０日未満を必要とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記間葉特異的培地が、更に血清を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
更に、前記細胞を１，２５（ＯＨ）2Ｄ3を含有する培地中で培養して、骨形成細胞への分化を促進する工程を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ヒト胚性幹細胞から骨形成細胞に至るための期間が、３４日未満である請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ヒト骨形成細胞を形成する方法であって、
（ａ）ヒト胚性幹細胞を間葉性幹細胞へと培養する工程、
（ｂ）前記間葉性幹細胞を誘導して骨形成細胞へと分化させる工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記ヒト胚性幹細胞を間葉性幹細胞へと培養する工程が、前記ヒト胚性幹細胞を培養して胚様体を形成する工程、次いで、該胚様体由来の細胞を１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の存在下で培養する工程を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヒト胚性幹細胞を間葉性幹細胞へと培養する工程が、前記胚性幹細胞をそれらが胚様体を形成するように培養し、該胚様体を間葉特異的培地中で増殖させ、該胚様体を消化し、得られた細胞を間葉特異的培地の存在下で培養して、間葉性幹細胞の培養体を形成することによって行われる請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
この出願は、その全体を本明細書の一部として援用する２００４年５月７日に提出された米国仮出願第６０／５６９，５００号の利益を主張するものである。
【０００２】
（合衆国により援助された研究又は開発に関する陳述）
適用なし。
【０００３】
（発明の背景）
胚性幹細胞は、細胞培養において増殖できると共に、種々の限定された系統の細胞ポピュレーションに向けて分化できる多分化能細胞である（Odorico et al., (2001) Stem Cells 19: 193-204）。従って、ヒト胚性幹細胞は、独特の機能を行う非常に特殊な細胞型をもたらす種々の系統限定された経路へとコミットされ、分化することができる。中胚葉起源の多分化能幹細胞は、発生に際して、骨、軟骨、腱、筋肉、及び脂肪を生じる（Minguell et al., (2001) Exp. Biol. Med. 226: 507-520）。出生後、これら同じ細胞は間葉性幹細胞（ＭＳＣｓ）と称され、骨髄の中に比較的豊富に見出される。ＭＳＣｓは、定義により自己再生特性を保持しているので、それらを単離し、培養で増殖させることができる。研究者は、これら細胞の静脈注射により、種々の組織において、加齢又は疾患の結果として欠乏した特定の幹細胞前駆体のレベルを修復できる、長期に亘って持続する前駆体細胞の存在がもたらされることを見出した。従って、ＭＳＣｓは、遺伝子治療のための可能性ある機構を提示する（Bianco et al., (2001) Stem Cells 19: 180-192）。更に重要なこととして、種々の動物モデル系におけるこれら細胞の移植は、局在化した部位におけるこれら細胞の分化、並びにその後の筋肉、腱、軟骨及び骨等の組織の再生を導くことが見出された。
【０００４】
培養において増殖することができ、潜在的な骨再生、骨治癒及び骨折修復のために局部的に利用できる多分化能幹細胞の一つの供給源は、骨髄由来のＭＳＣｓである（Bruder et al., (1994) J. Cell Biochem. 56: 283-294）。骨髄由来のＭＳＣsを使用した特性の研究は、動物モデルにおいて行われてきたが、おそらくはＭＳＣsの使用における幾つかの固有の制限のため、ヒトでは行われてこなかった。例えば、これら細胞をインビトロで増殖する能力にもかかわらず、ＭＳＣｓは骨髄に見られる稀な細胞サブポピュレーションに相当する。従って、骨髄由来のＭＳＣｓは徹底的な精製を必要とする。
【０００５】
このＭＳＣｓポピュレーションを使用するときに遭遇する他の制限は、それらが顕著に不均一なことである。例えば、細胞増殖能力の広範な可変性が存在し、幾つかは無数の細胞分裂を受ける能力を示すのに対して、他のものは遥かに低い能力を有する（Minguell et al., (2001)）。増殖されたＭＳＣポピュレーションもまた、老化及びアポトーシスの特徴を示す可能性がある。これら細胞の他の制限は、それらが由来するヒト起源の可変性から生じるものである。例えば、骨髄ポピュレーション由来のＭＳＣポピュレーションは、ドナーの性別、年齢及び生理学的条件などの種々の因子によって影響される。
【０００６】
おそらく固有の制限が少ないＭＳＣｓの別の供給源は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であると思われる。ＥＳ細胞は、現在では、齧歯類、霊長類及びヒトを含む様々な種から日常的に調製されている。最近、ヒトＥＳ細胞の安定な培養物を単離する技術が、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８４３，７８０号、及びJ. Thomson et al., (1998) Science 282: 1145-1147に記載されている。
【０００７】
一般には、ＥＳ細胞は高度に均一であり、自己再生能を示し、身体内において何れかの機能的細胞へと分化する能力を有している。この自己再生能力は、適切な条件下において、細胞培養で無制限に増殖する能力を備えた長期増殖能力を導くことができる。更に、ヒトＥＳ細胞が方向性なしに分化されると、複数の異なる組織型のためのマーカーを発現する不均一な細胞ポピュレーションが得られる（WO01/51616; Shamblott et al. , (2001) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 98: 113）。これらの特徴により、これら細胞は、治療的有用性をもった細胞を製造するための独特の均一な出発ポピュレーションとなる。
【０００８】
当該分野の研究者によって、多くの細胞系統へと増殖及び分化させ、齧歯類モデルにおける欠乏した細胞ポピュレーションを復元するために、マウスＥＳ細胞を使用する努力が行われてきた。詳細には、マウスＥＳ細胞を増殖させて、胚様体の形成を介して骨芽細胞マーカー遺伝子を発現でき、且つインビトロで石灰化された骨を形成できる細胞へと分化させる（Dani et al., (1997) J. Cell Sci.110:1279-85）。
【０００９】
また、他の研究者は、骨髄由来のヒト間葉性幹細胞の、骨、軟骨、腱、靭帯、及び皮膚のような１以上の結合組織型細胞への分化を報告している（米国特許第５，４８６，３５９号参照）。間葉性幹細胞を、国際特許公開ＷＯ９７／４０１３４に開示されたようなセラミック材料又は再吸収性バイオポリマーと組合せて使用することにより、骨を再生及び増強するための他のシステムが提案されてきた。
【００１０】
更に、多能性幹細胞ポピュレーションがヒト胚盤胞から単離されており、これは３０％の細胞が間葉性細胞であり、且つオステオネクチン又はオステオカルシンの発現によって同定することができる（米国出願公開番号２００３００３６１９４参照）。しかし、我々の知るところでは、これらＥＳ細胞由来のポピュレーションは均一なＭＳＣポピュレーションではなく、インビボにおいて骨形成を効果的に増大させていない。従って、治療目的、又は特定の細胞型をインビトロで研究するために、ヒトＥＳ細胞を使用することにおける顕著な困難性は、特性が相対的に均一な実質的なサブポピュレーションを含む細胞ポピュレーションを得ることであった。
【００１１】
上記で概説した刊行物は何れも、ヒトＥＳ細胞から間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションを誘導するための方法を教示せず、又は示唆していないことが注目される。また、当該技術において例示された何れかの細胞ポピュレーションが、骨修復に使用するための治療用組成物として大量販売するための十分な量で製造できるかはどうか不明である。従って、ヒトの健康及び疾患の管理においてヒト胚性幹細胞の能力を実現するためには、ヒトＥＳ細胞から、治療的に重要な組織型を製造するための実質的に均一なポピュレーションを、効率的に単離するための新規な方法を開発することが有用であろう。
【００１２】
（発明の概要）
本発明は、広義には、胚性幹細胞から誘導された間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションを製造する方法として要約される。この間葉性幹細胞のポピュレーションは更に、種々の形態学的因子及び細胞特異的マーカによって特徴付けられる、種々の特別な細胞型へと分化することができる。
【００１３】
詳細に言えば、一つの側面において、本発明は、胚性幹細胞から誘導された間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションの形成を選択的に促進するための、簡単な方法を提供する。これは、胚様体の形成に資する条件下で、胚性幹細胞を培養することによって行われる。該胚様体は、間葉特異的培地中で繁殖され、消化されて中胚葉細胞を形成する。この中胚葉細胞は、間葉特異的培地中で更に培養されて、間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションを形成する。
【００１４】
関連の側面において、間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションは、前骨芽細胞及び骨芽細胞を含む骨前駆体細胞のサブポピュレーションを生じさせるために、有効量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の存在下で更に増殖される。
【００１５】
この側面において、骨芽細胞の可能性を有する間葉性幹細胞は、有効量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3、デキサメタゾン、レチノイン酸、又はそれらの組合せの存在下で更に培養され、続いて有効量のアスコルビン酸及びβ−グリセロホスフェートを添加して、ＭＳＣｓの前骨芽細胞及び骨芽細胞への分化が促進される。
【００１６】
更にもう一つの側面において、本発明は、胚性幹細胞から誘導された間葉性幹細胞の均一なポピュレーションを提供する。
【００１７】
この側面において、該均一なポピュレーションは、６０％以上、好ましくは９０％以上の、紡錘体形状の形態学を示す間葉性幹細胞で構成される。
【００１８】
この側面において、均一な細胞ポピュレーションは、前骨芽細胞及び骨芽細胞を含む骨前駆体細胞の形成を選択的に促進するために、更に、有効量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の存在下で培養されてよい。
【００１９】
この側面において、前骨芽細胞及び骨芽細胞はマトリックスタンパク質を分泌し、石灰化を受ける。
【００２０】
この側面において、前骨芽細胞又は骨芽細胞は、Ｃｂｆａ−１、Ｍｓｘ２、及びＤｌｘ５（これらに限定ない）のような初期転写因子の発現によって特徴付けられる。
【００２１】
また、この側面において、前骨芽細胞又は骨芽細胞は、オステオポンチン、オステオネクチン、及びオステオカルシン（これらに限定されない）のような骨芽細胞特異的遺伝子の発現によって特徴付けられる。
【００２２】
他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術の当業者が共通に理解しているのと同じ意味を有する。本発明を実施又は試験するために適切な方法及び材料を以下に説明するが、ここに記載したものと類似又は均等な、当該技術で周知の他の方法及び材料もまた使用することができる。
【００２３】
本発明の他の目的、利点及び特徴は、添付の図面と共に読まれる以下の説明から明らかになるであろう。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、胚性幹細胞から誘導された、間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションが得られるとの発見に基づいている。この間葉性幹細胞のポピュレーションは、種々の形態学的因子及び細胞特異的マーカーで特徴付けられる種々の特殊な細胞型へと、更に分化することができる。
【００２５】
広義には、本発明は、胚性幹細胞から誘導された間葉性幹細胞の、実質的に均一なポピュレーション形成を選択的に促進するための単純化された方法を提供する。これは、胚様体の形成を指令する条件下で、胚性幹細胞を培養することによって行われる。該胚様体は、間葉特異的培地中で増殖され、消化されて中胚葉細胞を形成する。該中胚葉細胞は、間葉特異的培地中で更に培養されて、間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションを形成する。
【００２６】
関連の実施形態において、間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションは、有効量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の存在下で更に増殖されて、前骨芽細胞及び骨芽細胞を含む骨前駆体細胞のサブポピュレーションを生じる。これらの細胞は石灰化する能力を有し、従って骨を形成する能力を有する。
【００２７】
関連の実施形態において、当該方法は、ＥＳ細胞又は中胚葉細胞から誘導された胚様体を１，２５（ＯＨ）2Ｄ3で直接処理し、間葉性幹細胞の形成を容易にすることによって更に単純化することができる。胚様体を１，２５（ＯＨ）2Ｄ3で直接処理することにより、比較的均一で、且つ９０％を超える細胞が間葉性幹細胞であるような間葉性幹細胞培養体を、比較的迅速且つ便利なプロトコールで作製することが可能になる。通常、ヒトＥＳ細胞を胚様体に培養するためには約１０〜１２日を要する。次いで、この新しい方法を使用して胚様体から均一なヒトＭＳＣ培養体にするためには、１０日未満、典型的には６〜８日を要するに過ぎない。この方法の効率を、ＭＳＣｓを誘導して骨形成性骨芽細胞にするための以下で述べる方法（７〜１４日を要する）と組み合わせれば、３４日未満でヒトＥＳ細胞を骨形成性骨芽細胞にし、また２３日の培養で分化及び石灰化を達成することが可能である。
【００２８】
特定の実施形態において、本発明は、前骨芽細胞及び骨芽細胞の実質的に均一なポピュレーションを製造するための方法を提供する。ヒトＥＳ細胞を培養して胚様体にし、次いで、上記で説明した間葉性幹細胞の最適増殖に有利な間葉特異性培地の存在下で培養して、ＭＳＣｓの均一なポピュレーションを形成する。該ＭＳＣポピュレーションは、更に骨形成培地中で培養され、ここでは有効量の骨芽細胞分化剤が、シーケンス特異的方法で培地中に導入される。これは、最初に１，２５（ＯＨ）2Ｄ3、デキサメタゾン、レチノイン酸、又はそれらの組み合わせを導入し、続いてアスコルビン酸及びβ−グリセロホスフェートを添加することによって行われる。これにより、ＭＳＣｓは骨形成細胞の遺伝子マーカーを発現し、且つその細胞形態学的特徴を示す実質的に均一なポピュレーションへの分化が促進される。従って、本発明の方法により製造された細胞の顕著に均一且つ機能的性質は、（１）骨のターンオーバー及び修復に関与するｈＭＳＣｓを調製及び特徴付けするため；（２）新規な治療モデルを開発するため；及び（３）間葉組織をインビトロで研究するためのツールとして、それらを価値あるものにする。
【００２９】
もう一つの実施形態において、本発明は、ヒト胚性幹細胞から誘導された間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションを提供する。該均一なポピュレーションは、６０％以上、好ましくは９０％以上の円錐形状の形態学を示す間葉性幹細胞で構成される。ＭＳＣポピュレーションは、前骨芽細胞及び骨芽細胞を含む骨前駆体細胞の形成を選択的に促進するために、有効量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の存在下で更に培養されてよい。この前骨芽細胞及び骨芽細胞はマトリックスタンパク質を分泌し、石灰化を生じる。また、この前骨芽細胞又は骨芽細胞は、Ｃｂｆａ−１、Ｍｓｘ２、及びＤｌｘ５（これらに限定ない）のような初期転写因子の発現により特徴付けられる。これらの細胞は、オステオポンチン、オステオネクチン、及びオステオカルシン（これらに限定されない）のような骨芽細胞特異的遺伝子の発現によって特徴付けられる。
【００３０】
一般に、ここで使用する「間葉性幹細胞」又は「ＭＳＣｓ」の用語は、胚性幹細胞から誘導された細胞のポピュレーションを意味する。ＭＳＣｓは中胚葉から直接生じ、また、間葉組織（例えば骨芽細胞由来の骨）、歯組織、軟骨、腱、骨髄間質の細胞を形成するようにコミットされた部分的に分化した細胞又は増殖性前駆体細胞の何れかである。この用語の中には、分化した（有糸分裂後の）細胞、及び骨前駆体細胞のような更にコミットされた複製能力のある細胞のような間葉性幹細胞が含められる。
【００３１】
ＭＳＣｓは、異なる方法で、増殖及び分化するように誘導することができる。ＭＳＣｓは、望ましい細胞表現型の増殖を指令する適切な物質でコートされた基体上で培養することができ、或いは、ＭＳＣｓは、増殖を誘導する種々の成分を含有する培地中で培養することができる。例えば、本発明に従えば、ＭＳＣｓは間葉特異的培地中で培養されてよい。ここで使用する「間葉特異的培地」の用語は、ヒト間葉性幹細胞のためのＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標名）基礎培地及び１０％ＦＢＳを含有する培地を意味する。ＭｃＣｏｙのベース、特に２．０ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＭｃＣｏｙの５Ａ培地（改変型）で作製されるこの培地は、ヒト間葉性幹細胞の増殖及び分化のために不可欠に使用される。ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標名）基礎培地の成分が製造業者によって開示されているわけではないが、出願人は、以下のものが適切な成分の非限定的リストであると考えている：即ち、非必須アミノ酸、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、Ｌ−グルタミン、炭酸水素ナトリウム、及びビタミンＢ12である。従って、上記の成分を含有するＭｃＣｏｙのベース以外の他の培地もまた、ＭＳＣ分化を促進するために利用できることが想定される。我々は、他の間葉特異的培地も同様に作用することを立証するために、グルタミン及びヌクレオシドを添加したαＭＥＭ培地（Ｅａｒｌの培地）についても試験したが、それはＭｅｓｅｎＣｕｌｔ培地と同様に作用した。もう一つの有用な間葉特異的培地は、グルコース及びグルタミンを含むＤＭＥＭ培地であるが、それは僅かに減少した胚様体の収量を導くかもしれない。種々の製造業者から得られる特徴付けされ又は定義された血清製品も同様に、下記の培地における予め試験された血清の代りに使用することができる。
【００３２】
更に、ヒト間葉細胞の増殖を最適化するために、ｈＭＳＣｓの最適な増殖について予め試験されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Stem Cell Technologies社、Vancouver、Canada）を、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標名）基礎培地に添加してもよい。製造業者はＦＢＳの成分を開示していないが、出願人は、以下がＭＳＣｓの増殖に影響し得る適切な成分の非限定的リストであると信じる：トランスフェリン、サイトカイン／増殖因子、例えばインスリン成長因子（ＩＧＦｓ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰｓ：ＢＭＰ２、４、７、９及び１２を含むが、これらに限定されない）。これらの成分は、ヒト間葉細胞増殖を最適に開始及び維持するその能力について、予め試験及び選別された。
【００３３】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標名）、ラミニン、コラーゲン（特にＩ型コラーゲン）、グリコサミノグリカン、オステオカルシン、及びオステオネクチンは全て、それら自身としても、またそれらの種々の組合せとしても、細胞外マトリックスとして適し得ることが想定される。また、ゲル誘導されたガラス、シリカゲル、及びゾル／ゲル誘導されたチタニアは、骨芽細胞系統の細胞を増殖するために潜在的に適している（Saravanapavan et al.,(2001) J. BiomedMater. Res. 54:608； Dieudonne et al., (2002) Biomaterials 34:3041）。
【００３４】
更に、本発明の方法により製造されたＭＳＣｓは、多くの表現型基準に従って特徴付けされてよい。例えば、比較的未分化の間葉細胞は、丸ないし卵形の核を備えた、それらの特徴的な単核の卵形、星形、又は紡錘形によって認識することができる。この卵形の細長い核は、典型的には、顕著な核小体、異種染色体、及び真正染色体を有する。これらの細胞は、少ししか細胞質をもたないが、外核から伸びるように見える多くの細い突起を有している。ＭＳＣｓは、典型的には、下記マーカー：ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ）、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＧＡＴＡ−４、及びアルカリホスファターゼのうちの一つ、二つ、又は三つ以上を染色するが、造血系統の細胞マーカー（ＣＤ１４又はＣＤ４５）については陰性であると思われる。ＭＳＣｓはまた、マーカーとしてＳＴＲＯ−１を発現するかもしれない。
【００３５】
また、ここで用いる「分化する」又は「分化した」の用語は、比較されている細胞よりも、発生経路又は系統を更に下流へと進化した細胞を意味する。多能性の胚性幹細胞は、系統限定的な前駆体細胞（例えば間葉性幹細胞）へと分化することができ、次いでこれは前記経路を更に下流へ下った他の型の前駆体細胞へと分化し、更には最終段階の分化細胞へと分化することができ、この最終分化細胞は一定の組織型（例えば骨）において特徴的な役割を果たし、また更に増殖する能力を保持してもよく、保持しなくてもよい。ここで用いる骨前駆体細胞の用語は、「前骨芽細胞」及び「骨芽細胞」を意味する。これらの骨前駆体細胞は、ｈＭＳＣ系統に沿って更に成熟した細胞である。これらの細胞は、限定されるものではないが、Ｃｂｆａ−１、Ｍｓｘ２、及びＤｌｘ５のような初期転写因子の発現、並びにオステオポンチン、オステオネクチン及びオステオカルシン（これらに限定されない）のような骨芽細胞特異的遺伝子の発現によって特徴付けられる。骨芽細胞分化剤の作用モードに対しては、如何なる限定をも課すものではない。例えば、該薬剤は、表現型、における変化を誘導又は補助し、特定の表現型を持った細胞の増殖を促進し、又は他の増殖を遅延させ、又は未知の機構を介して他の薬剤と協奏的に作用することにより、分化を促進してよい。
【００３６】
適切な骨芽細胞分化剤の一般的な例は、限定されるものではないが、下記の一般的化合物の１以上を含んでよい：（１）ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７で例示される骨形態発生タンパク質；（２）ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３及びそれらの類似体、並びにＴＧＦ−β受容体に結合するＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーで例示されるＴＧＦ−β；及び（３）ビタミンＤ受容体のリガンド。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3が例示される。また、他の既知のビタミンＤ3類似体も適している（例えば、Tsugawa et al., (2000) Biol. Pharm. Bull. 23:66参照）。
【００３７】
しかし、最も好ましくは、本発明の骨芽細胞分化剤は、以下の非制限的化合物、及びこれらのそれぞれの濃度範囲を含むものである：アスコルビン酸（５０〜１００ｇ／ｍＬ）及びβ−グリセロホスフェート（１〜１０ｍＭ）に加えて、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3（１０-10〜１０-7Ｍ）、デキサメタゾン（１０-9〜１０-7Ｍ）、レチノイン酸（１０-9〜１０-5Ｍ）。これらの薬剤は、実質的に均一な骨前駆体細胞ポピュレーションへのＭＳＣｓの分化を促進させるために、有効量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3、デキサメタゾン、レチノイン酸、又はそれらの組み合わせを培地に添加し、続いてアスコルビン酸及びβ−グリセロホスフェートを添加することにより、シーケンス特異的な方法で間葉特異的培地に供給される。これらの有機化合物は、一般に、局部的な骨微小環境を擬態するために使用される。出願人は、後述の実施例に与えられた特定濃度の骨芽細胞分化剤の知識を用いれば、当業者は、何が骨芽細胞分化剤にとっての「有効量」又は最適濃度範囲を構成するかを容易に決定できるであろうことを指摘しておく。
【００３８】
更に、これら因子の何れかの受容体に対して特異的な抗体は、列記した因子の代りに（又はそれに加えて）使用できる機能的に等価なリガンドであることが理解される。使用してよい他の添加剤には次のものが含まれる：他のモルホゲン、例えば塩基性ＦＧＦのような繊維芽細胞増殖因子；糖質コルチコイド；デキサメタゾン、又は他の小分子骨芽細胞成熟因子；コラーゲン合成の際に生じるプロリンヒドロキシル化のための共因子であるアスコルビン酸（又はアスコルビン酸−２−ホスフェートのようなその類似体）；β−グリセロホスフェート、又は石灰化プロセスの際のアルカリホスファターゼの他の基質。
【００３９】
骨前駆体細胞は、次の特徴のうち、典型的には少なくとも一つの特徴、典型的には少なくとも３〜５の特徴を有するであろうことを、当業者は理解するであろう：１）約１．０５０ｇｃｍ-3〜約１．０９０ｇｃｍ-3の密度；２）オステオネクチン（骨芽細胞及び前駆体において陽性）及び以下に記載する関連の骨芽細胞転写因子について陽性；３）オステオカルシン（成熟骨芽細胞に特異的）について陽性；４）約８〜約７０ミクロンの細胞直径；５）立方体形状；６）特にＢＭＰの存在に応答して上方調節されるアルカリホスファターゼの産生；７）Ｉ型コラーゲン（プロコラーゲン）又はビメンチンについて陽性；８）他の骨芽細胞特異的マーカー、例えばＢＭＰ受容体、ＰＴＨ受容体、又はＣＤ１０５（エンドグリン）について陽性；９）外部環境を石灰化し、又はカルシウムを含有する細胞外マトリックスを合成する能力の証拠。
【００４０】
骨前駆体細胞の均一なポピュレーションの機能を決定するためには、組織特異的遺伝子産物のｍＲＮＡレベルでの発現を、ノーザンブロット分析、ドット／ブロットハイブリダイゼーション分析、又は標準の増幅法において配列特異的プライマーを使用した逆転写酵素で開始されるポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出すればよい。例えば、一般的技術の詳細については米国特許第５，８４３，７８０号、骨芽細胞特異的ＰＣＲプライマーについては、国際特許公開ＷＯ９９／３９７２４を参照されたい。 この開示において列記した他のマーカーの配列データは、ＧｅｎＢａｎｋ（ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ）のような公的データベースから入手することができる。ｍＲＮＡレベルでの発現は、一般に、この開示において説明したアッセイの何れか一つに従って「検出可能」であり、細胞サンプルに対してアッセイを実行することにより、明瞭に識別可能なハイブリダイゼーション産物もしくは増幅産物が生じる。タンパク質もしくはｍＲＮＡのレベルで検出された組織特異的マーカーの発現は、該レベルがコントロール細胞（例えば未分化のＭＳＣポピュレーション、又は他の未関連の細胞型）の場合の少なくとも２倍、好ましくは１０倍又は５０倍よりも多いときは陽性とみなされる。
【００４１】
培養及び細胞分離の条件を、特定の成分を含め、排除し、又は置換するように調節することは、この種類の発明にとっては通常予測される日常的な最適化の問題であり、特許請求の範囲の精神を逸脱するものではない。
以下の実施例は、本発明の更なる非制限的例示として提供されるものである。
【実施例】
【００４２】
明示的にそれ以外のことが指定されない限り、本発明の方法は、子孫細胞の何れかの型に対する限定なしに、適切には間葉性幹細胞に分化できるヒトＥＳ細胞株に対して実施することができる。
【００４３】
＜胚様体を培養するためのＥＳ細胞の消化＞
この実施形態では、Ｈ９細胞株のようなヒトＥＳ細胞株を、ＷｉＣｅｌｌ研究所（マジソン、ウイスコンシン州）から入手した。出願人は、このＨ９細胞株がＮＩＨヒト胚性幹細胞登録機関に登録されており、フェデラルファンドに適することに注目する。それは、本発明の方法を実施する際に、Ｈ１細胞株及びＨ１１細胞株のような他のヒトＥＳ細胞が使用可能であろうことを包含するものである。ヒトＥＳ細胞は、７．５×１０4ＭＥＦｓの層上で、６ウエルのプレート（Ｎｕｎｃ／Ｃｏｓｔａｒ社、カタログ番号07-200-83）において培養され、維持された。詳細には、Ｈ９細胞株は、それらが増殖し続けるが分化を受けないことを確認するために、２０％ＫＯ血清代用物（Invitrogen社、Carlsbad, CA）を補充された８０％ＤＭＥＦ−Ｆ１２培地中の、マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）層上で培養された。ＭＳＣ製造のプロセスを開始するために、ＥＳ細胞を、胚様体（ＥＢｓ）の形成を介して、インビトロで天然の増殖及び分化のプロセスを受けさせた（Odorico, et al. , (2201) Stem Cells 19: 193-204）。また、本発明の範囲内には、胚様体を形成する必要なしに、フィーダーなしで、ヒト幹細胞を効果的に培養する別の技術も包含される。
【００４４】
胚様体は、プレコートされたＴ−２５フラスコ内でルーチンに培養される。このフラスコのポリＨＥＭＥ溶液でのプレコーティングは、ＥＢｓの付着及び分化を最小化するために不可欠である。或いは、ＥＢｓの付着及び分化は、フラスコを、インキュベータの中に適合できる軌道震盪機（例えば、 Orbitron Rotator II, Model # 260250 by Boekel Scientific, PA）に配置することによって最小化することができる。Ｔ２５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ／Ｂｅｃｔｏｎ・Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、未処理ポリスチレン倍表表面、カタログ番号３５３００９）、又はＧｒｅｉｎｅｒ・Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、即ち、フィルターキャップを備えたＴ２５フラスコ（ＩＳＣ  Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ社、カタログ番号Ｔ−３００２−２）を、ポリＨＥＭＥ（ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｐ３９３２）で前コートした。２％ポリＨＥＭＥ溶液は、１ｇのポリＨＥＭＥを、５０ｍＬのエタノール：アセトン＝１：１（各２５ｍＬ）の中に溶解することによって調製した。ポリＨＥＭＥは、３７℃で震盪したときには更に迅速に溶解する。ポリＨＥＭＥ溶液（２ｍＬ）を、滅菌フード中で各Ｔ２５フラスコに加えた。全体の培養表面の完全な被覆を保証するために、該フラスコは全ての表面上で傾けられた（各表面について５分）。次いで、該溶液は吸引排出され、該フラスコはフード（生物学的な安全キャビネット）の中で３０〜６０分間乾燥された。
【００４５】
ｈＥＳ細胞からＥＢｓを調製するために、真空吸引を使用して各ウエルから培地を穏やかに吸引し、１ｍＬの新鮮に作製されたディスパーゼ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）を各ウエルに加えた。ディスパーゼ溶液は、ディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号１７１０４−０１９）を、血清なしの培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号１１３３０−０３２、又はＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商品名）、Ｓｔｅｍ・Ｃｅｌｌ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号０５４０１）中に溶解することにより作製した。次いで、３７℃で３０分間、細胞をインキュベータに戻した。培養プレート上のコロニーを顕微鏡下で試験した。５０％を超えるコロニーが脱離し、またそれ以外のものは部分的に脱離し、又は丸みを帯びた又はロールされた縁部を示したときには、細胞は移動のための準備ができたと看做した。全てのウエルを穏やかに濯いで、緩く付着したコロニーを脱離させ、必要であれば、付着したコロニーを５ｍＬのガラスピペット（Ｆｉｓｈｅｒ・Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号１３−６７８−２７Ｅ）の先端で穏やかに擦り落した。５０％よりも少ないコロニーしか脱離されなかったときは、インキュベーション時間を更に１５〜３０分延長する（しかし、１時間を超えない）。
【００４６】
全てのコロニー／細胞凝集塊を、ディスパーゼ溶液と共に１５ｍＬの円錐管に移し（６ウエルプレート当り１管）、コロニーを重力で沈降させるのではなく、５００ｒｐｍで８分間遠心分離した。ディスパーゼ溶液を吸引により除去し、細胞を、各管の中の１０ｍＬの間葉特異的培地の中に再懸濁させた。間葉特異的培地は、ｈＭＳＣｓについて予め試験された１０％ＦＢＳと共に、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標名）培地を含んでいる（Ｓｔｅｍ・Ｃｅｌｌ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号０６４７２）。予めコートされたＴ２５フラスコは、該フラスコの中に細胞を再懸濁させる直前に、間葉特異的培地で２回（各５ｍＬ）の濯ぎ／洗浄を行った。各フラスコには、８ｍＬの間葉特異的培地を添加し、続いて２ｍＬの細胞懸濁駅を加え（穏やかで且つ完全な混合の後）、２〜６ウエルのプレートから合計１０個のフラスコが生じた。試験された他の間葉特異的培地には、グルタミン及びヌクレオシドを添加したαＭＥＭ培地（Ｅａｒｌの培地）、並びにグルコース及びグルタミンを添加したＤＭＥＭ培地が含まれる。
【００４７】
＜胚様体の維持＞
次いで、全てのフラスコをインキュベータに戻した。胚様体（ＥＢｓ）の発生を、顕微鏡試験によって毎日モニターした。完全な培地交換は、２日毎に全てのフラスコについて実施した。軌道型震盪機が入手可能でなければ、フラスコの底／縁へのＥｂｓの沈降及び付着を防止するために、少なくとも１日に２〜３回はフラスコの側部をタッピングすることによりフラスコを震盪し、培地を撹拌した。殆どのＥＢｓは、典型的には培養の７〜８日後にフラスコに付着する傾向を示す。ＥＢｓの付着を防止することは殆ど不可能であるが、それは上記方法を用いて最小化することができる。一定のフラスコがその底／縁に１０を超える付着したＥＢｓを含むことが分かったら、ＥＢｓを、該フラスコから新しい前コートされたフラスコに移す。ＥＢｓのための合計インキュベーション時間は、１０日〜１２日である。
【００４８】
＜胚様体の消化＞
ＥＢｓを１０〜１２日の間培養した後に、顕微鏡試験によって、各フラスコ内における種々のサイズ及び形状の４０％以上のＥＢｓが明らかになった。この時点で、各フラスコ内の全てのＥＢｓを、培地（フラスコ当り約１０ｍＬ）と共に、１５ｍＬの円錐管の中に回収した。全ての１０ｍＬ管を、５００ｒｐｍで８分間遠心分離した。上清を穏やかに吸引し、ＥＢｓを３７℃の水浴中で１時間、２ｍＬの０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号２５３００−０５４）及び２％ニワトリ血清の中に再懸濁させた。それらの最適な消化を容易にするために、ＥＢｓは、１０ｍＬのガラスピペッタ（Ｆｉｓｈｅｒ・Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号１３−６７８−２７Ｆ）を使用して１時間、１５〜２０分毎に穏やかにピペッティングすることにより再懸濁された。
【００４９】
ＥＢｓの１時間の消化の後に、５ｍＬの間葉特異的培地を各々の管に添加し、これらの管を５００ｒｐｍで８〜１０分間遠心分離した。上清を吸引し、更に５ｍＬの間葉特異的培地を添加した。細胞を完全に再懸濁させ、部分的に消化された、又は未消化のＥＢｓをバラバラにするために、細胞を、１０ｃｃのシリンジ（ＢＤ社、カタログ番号３０９６０４）を使用して２３ゲージの針（ＢＤ社、カタログ番号３０５１２４）の中を穏やかに通過させた。次いで、全体の細胞懸濁液を、７０ミクロンの細胞ストレーナ（Ｆａｌｃｏｎ／ＢＤ社、カタログ番号３５２３５０）を通過させて、破片を除去した。
【００５０】
次いで、トリパンブルー色素排除技術を使用して細胞を計数し、細胞の生存率を評価した（Freshney, R. I., (1994) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 3rd Ed. Wiley-Liss. New York. USA参照）。この技術は慣用的な細胞生存試験であり、細胞懸濁液中における生存細胞のパーセンテージを測定するものである。これは一般的に色素排除染色によって達成され、完全な膜を備えた細胞は色素を排除できるのに対して、完全な膜をもたない細胞はこの着色剤を取込む。排除染色に使用される色素は、通常はトリパンブルーであるが、エリスロシン及びナフタレンブラックもまた適切な色素である。細胞数は、ＥＢｓの品質及びサイズに応じて、典型的には２〜８×１０6（合計）の範囲である。
【００５１】
＜中胚葉起源の細胞を培養する＞
合計細胞数を決定した後、該細胞を、間葉特異的培地、又は８０％ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標名）培地、又は１０％間葉性幹細胞刺激サプリメント（ＭＳＣＳＳ）（Ｓｔｅｍ・Ｃｅｌｌ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号０５４０２）及びｈＭＳＣｓについて予め試験された１０％ＦＢＳを含有するもう一つの培地中で、ウエル当り且つ１ｍＬ当り１×１０5又は５×１０5細胞の集密度において、６ウエルプレート上で培養した。或いは、ＭＳＣＳＳはかなりの血清で構成されているので、１０％ＭＳＣＳＳ及び１０％ＦＢＳは、２０％ＦＢＳで単純に置換され得ると想定される。早期ＭＳＣｓの性質には、紡錘形状の形態学、高い増殖能及びここに記載した多くの遺伝子マーカーの発現を維持する能力が含まれることが知られている。ウエルの顕微鏡試験によって、二つの異なるサブポピュレーションの細胞が明らかにされた。一つの細胞型は、長く且つ細身の紡錘形状の細胞であり、他の型は、中心に幾つかの核を備えた多角形であった。ウエルの中の細胞が約８０％集密に達したときに、細胞は標準の細胞培養技術を使用してトリプシン処理され、１００ｍｍの組織培養皿の中に播種された。典型的には、６ウエルプレートの２〜３ウエルから回収された細胞を合体させて、単一の１００ｍｍ組織培養皿の中（Ｍｉｄｗｅｓｔ・Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号ＴＰ９３１００）で培養することができる。
【００５２】
＜前間葉性及び間葉性幹細胞の培養及び増殖＞
間葉系統へとコミットされたポピュレーションを選別するために、上記プロセスにより得た細胞を、先ず間葉特異的培地中でほぼ集密にまで培養した。次いで細胞を分割し、新しい１００ｍｍ皿に移し、追加の３継代について、間葉特異的培地、又は８０％ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標名）培地、１０％ＭＳＣＳＳ、ｈＭＳＣのために予め試験された１０％ＦＢＳ中で培養された。細胞の顕微鏡試験によって、このポピュレーションの約８０％が紡錘形状の間葉性幹細胞の形態学を示すことが明らかになった。出願人は、反復実験において、１００ｍｍ皿の中で増殖されたこれら継代の幾つかは、標準の細胞培養技術を使用して処理され、凍結されたことを指摘しておく。また、これら細胞の幾つかの瓶が冷凍保存され、液体窒素の下でヒトＭＳＣｓの供給源として保存された。
【００５３】
出願人は、作用機構に関して、本発明において利用された培養条件が、骨芽細胞表現形を取るようにヒトＥＳ細胞を誘導するかどうか、それらがこの型の細胞の増殖を促進するかどうか、又はそれらが他の細胞形の増殖を阻害するかどうかは知られていないことを詩的しておく。実際に、これら機構の幾つかが協奏的に作用して、所望の型の細胞を豊富にすることは十分に可能である。勿論、骨芽細胞系統の細胞の豊富化を生じる原因である機構は興味深いものではあるが、本発明を実施するためには、該機構を理解することは必要ではない。
【００５４】
＜前骨芽細胞及び骨芽細胞の培養及び増殖＞
紡錘形状の間葉形幹細胞の形態学を示す細胞ポピュレーションの骨芽細胞にアクセスするために、細胞は、ヒト骨形成細胞のための９０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び１０％ＦＢＳの１ｍＬ当り１ウエル当り５×１０5細胞で、６−ウエルプレートに蒔かれた（Ｓｔｅｍ・Ｃｅｌｌ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号０６４７４）。細胞は、毎２〜３日間隔で完全に培地を交換しながら、一般には１８日〜２１日培養された。しかし、更に大きな骨結節が望ましいときには、培養は更に長時間継続させてもよい。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態においては、細胞を、最初は骨芽細胞分化剤の存在下で１８日〜２１日間培養して、骨芽細胞へのＭＳＣの分化を促進させた。該細胞は、２〜３日ごとに培地を交換しながら、「ホルモン」で予め８〜１２日間馴らされた。ここで用いる「ホルモン」の用語は、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3単独（１０-10〜１０-7Ｍ）、或いはデキサメタゾン（１０-9〜１０-7Ｍ）もしくはレチノイン酸（１０-9〜１０-5Ｍ）又はその両方を伴うものである。細胞がホルモンを用いて適切に予め馴らされた後に、少なくとも追加の８日、又は骨芽細胞形成が観察されるまでは、２〜３日毎に、「骨石灰化因子」が培養物中に導入された。ここで使用する「骨石灰化因子」の用語は、アスコルビン酸（５０〜１００μｇ／ｍＬ）、β−グリセロホスフェート（１〜１０ｍＭ）又はその両者を意味する。
【００５６】
最も好ましくは、培養中の間葉性幹細胞は、細胞を予備馴らしするために、１×１０-8Ｍの１，２５（ＯＨ）2Ｄ3、１×１０-7Ｍのデキサメタゾン及び１×１０-7Ｍのレチノイン酸を用いて、最初の９日間、２〜３日毎に「ホルモン」で連続的に処理される。これらの所期ホルモン処理の後に、２〜３日毎に、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）及びβ−グリセロホスフェート（１０ｍＭ）で４回の連続的処理を行い、ＭＳＣｓの骨芽細胞への分化を促した。これらの化合物は、局部的な骨微小環境を擬態するために使用された。次いで、骨芽細胞表現型及び骨芽細胞ポピュレーションの機能を、下記で述べるようにして試験した。
【００５７】
なお、種々の濃度のホルモンを単独で、又は骨石灰化因子を単独で、又はホルモン及び骨石灰化因子を組合せて使用して、骨芽細胞の形成を促進することが可能であるかもしれないが、出願人は、上記で述べたホルモンとその後の骨石灰化因子の組合せが、幹細胞を骨芽細胞骨結節へ分化させる最も効率的な方法を提供することを見出した。
【００５８】
更に、ビタミンＤ3に加えて、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の非常に強力かつ非常に有効な多くの類似体及び構造的擬似物が最近開発されている（Shevde et al., (2002) PNAS 99: 13487-13491参照）。これらの１，２５（ＯＨ）2Ｄ3類似体は、ビタミンＤ3の活性代謝物の代替物として、又はこれに追加して使用し得ることが想定される。
【００５９】
＜間葉性幹細胞の単純化された培養及び増殖＞
胚性幹細胞から間葉性幹細胞の均一なポピュレーションを製造するための上記で述べた方法に加えて、出願人は、ＭＳＣｓを製造するための更に簡素化された効率的な別の方法を開発した。この代替アプローチは、２０％ＫＯ血清置換物を補充した８０％ＤＭＥＭ−Ｆ１２中のマウスフィーダー層上において、ＥＳ細胞を６ウエルプレート中で培養することにより行われた。全てのウエルから培地を穏やかに吸引し、０．５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼ（血清なしのＤＭＥＦ／Ｆ１２又はＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標名）中）を、ウエル当たり１ｍＬで各ウエルに添加した。これらの細胞をインキュベータに戻し、２０分後にチェックした。ＥＳ細胞コロニーの５０％超が脱離されたか、又は「ロールされた縁部」を示したときには、細胞を各ウエルから穏やかにピペットで吸引し、１５ｍＬの円錐管へ移した。該細胞を３分間だけ重力により沈降させ、次いで１分間、１０００ｒｐｍで穏やかに遠心した。ディスパーゼを吸引除去し、細胞を適切な培地、例えばｈＭＳＣｓについて予め試験された１０％ＦＢＳを補充したＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標名）を含む間葉特異的培地のような培地で、１回洗浄した。次いで、細胞を８〜１０ｍＬの間葉特異的培地中に再懸濁し、ポリＨＥＭＥ陽液（これはＥＢｓのフラスコ底への付着を防止して該細胞の分化を防止する）で予めコートされたＴ−２５フラスコに移した。フラスコをポリＨＥＭＥでコートすることに加えて、該細胞を含むフラスコを上記で述べた震盪機プラットホーム上に載置し、ＥＢ発生の全期間に亘って揺動させた。ＥＢｓを発生させながら、１０〜１４日間、該培地をほぼ２日毎に交換した。１０〜１４日後にＥＢｓを消化し、再播種して、間葉性の特徴が支配的な細胞のポピュレーションを得た。これは、間葉性幹細胞の増殖を育成する間葉特異的な培地、及び血清を使用することにより行われた。これは、適切な条件下で軟骨細胞、脂肪細胞、及び骨前駆体細胞を形成する能力を有もった３〜４の細胞形の混合ポピュレーションであった。２日間培養した後に、１０-8Ｍの１，２５（ＯＨ）2Ｄ3を細胞に加えて、骨前駆体細胞の形成を促進した。
【００６０】
１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の存在下で２〜４日培養した後に培地の完全交換を行い、この培地に１０-8Ｍの１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の２回目の投与量を加えた。なお、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3に加えて、又はその代替物としてＢＭＰ−２を使用することができるが、ＢＭＰ−２は１，２５（ＯＨ）2Ｄ3と同様には作用しなかった。
【００６１】
更に２〜４日の培養の後、培地の完全な交換と共に、第一の投与量の石灰化化合物（アスコルビン酸及びβ−グリセロホスフェート）を細胞に加えた。この石灰化化合物での処理を、２〜４日の培養後に繰返した。更に３〜５日の培養後に、処理された細胞をフォンコッサ（ｖｏｎ・Ｋｏｓｓａ）の染色技術を使用して染色し、骨形成を検出した。
【００６２】
更にもう一つの実施形態では、ＥＳ細胞から誘導された胚様体を有効量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3で処理することにより、間葉性幹細胞の実質的に均一なポピュレーションを選択的に形成してよいことが想定される。これらの実験において、ＥＢｓを上記のようにして形成させた。先に述べた通り、ＥＢｓは１０〜１２日間培養物中に残った。第６〜９日に、培地を完全に交換すると共に、ＥＢｓを有効量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3で処理した。次いで、上記で述べたようにしてＥＢｓを消化し、培養した。
【００６３】
これらの単純化された方法は、ＭＳＣｓを作製するプロセスの初期段階において細胞を１，２５（ＯＨ）2Ｄ3で処理し、そのような細胞を製造するのに要する時間を１〜２週間省略することによって、より迅速にＭＳＣｓの均一なポピュレーションを製造する能力を研究者に与える。胚様体から９０％ヒト間葉性幹細胞過剰の培養物に至るための時間が、１０日未満、更には６日まで短縮された。ＥＳ細胞から胚様体を培養するには、通常は１０〜１２日を要する。これら二つの時間に、７〜１４日でＭＳＣｓから骨形成性の骨芽細胞へと培養できる上記で述べた骨芽細胞培養技術を組合せると、ヒトＥＳ細胞から分化された骨形成細胞へと進化させるために要する合計時間は、２３〜３４日である。これらの単純化された方法により、高い増殖能を備えた比較的純粋な間葉性幹細胞ポピュレーション、及び骨形成性骨芽細胞の連続的な供給源を、比較的短期間で作製することができる。これら細胞型の他の確立された供給源はヒト骨髄ドナーであり、これは供与される材料の量及び入手可能性を制限する。更に、ヒト骨髄は非常に少ないパーセンテージの間葉性幹細胞しか含んでおらず、またドナーの年齢がこれら細胞の増殖能力に影響する。移植の目的で細胞を増殖させる際には、時間の問題が不可欠であることが周知であり、従って、ここに記載した方法は、生命の保全をもたらすＭＳＣｓを得るために必要な時間を改善するものである。
【００６４】
＜骨芽細胞の機能性の決定＞
ｈＥＳ細胞由来の間葉性幹細胞の骨芽細胞表現型への分化を促進するための、種々の因子が知られていることは一般に理解されている。これら因子には、ＢＭＰ−４のような骨原性の骨形態形成タンパク質、ならびにレチノイン酸、グルココルチコイド、ＴＧＦβ１、インターロイキン６、レプチン及び１，２５（ＯＨ）2Ｄ3を含む該因子を調節する化合物が含まれる。これらステロイドホルモン、成長因子及びペプチドホルモンの分子的作用は、ＭＳＣｓが系統進化を受けるときに適時に発現される一連の転写因子によって媒介される。これら骨芽細胞特異的な転写因子の幾つかには、初期因子Ｃｂｆａｌ、Ｄｌｘ５、及びＭｓｘ２、並びに最も成熟した細胞形に見られるオステオポンチン（ＯＰＮ）、オステオネクチン及びオステオカルシンのような骨芽細胞特異的遺伝子の発現が含まれる（Silva, et al., (2003) Stem Cells 21: 661-9参照）。
【００６５】
ここで用いる「Ｃｂｆａ−１」の用語はＣｂｆａ−１転写因子を意味し、これは骨特異的タンパク質のアクチベータであるオステオカルシンと思われ、且つ単一の骨芽細胞のレベルで細胞外マトリックスの合成を調節できるものである（Ducy, P. et al., (1997) Cell 89: 747-754）。
【００６６】
ここで用いる「Ｄｌｘ５」及び「Ｍｓｘ２」の用語は、骨芽細胞を転写的に調節するホメオドメインタンパク質を意味する。これら二つのホメオドメインタンパク質は、機能的に相互作用して、オステオカルシンプロモータを調節することができる。おそらく、骨芽細胞に最も特徴的なのは、骨芽細胞自身によって主に産生される非コラーゲンマトリックスタンパク質であるオステオカルシンの発現である。このタンパク質は、骨芽細胞の骨調節機能に不可欠である。オステオカルシンは、石灰化を受けている骨及び歯において発現される本質的に小さいカルシウム結合性タンパク質である。
【００６７】
ここで用いる「オステオポンチン」の用語は、骨芽細胞又は破骨細胞の付着を介して、初期骨マトリックスの組織化及び石灰化に影響することができる、或る形態のオステオポンチン又はその断片を意味する。
【００６８】
ここで用いる「オステオネクチン」の用語は、骨を発生させる非コラーゲン性のカルシウム結合性糖タンパク質を意味する。それは、コラーゲンを骨マトリックス中のミネラルに結合させる。
【００６９】
更に、ＭＳＣ状態の単一のマーカーが同定されており、同様に、上記で述べたマーカーは何れもこの細胞型にとって決定的ではないことが注目される。何故なら、それらの発現は幾分広く、また分化程度の高い細胞だけでなくコミット程度の低い子孫にも見ることができるからである。これは、おそらくはＭＳＣの性質を示している。しかし、ＥＳ細胞の決定的な幾つかのマーカーが同定されており、従って、これらは多能性の分化能力を備えた幹細胞からの進化の程度を評価することを可能にする。未分化のｈＥＳはまた、典型的には、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるＯｃｔ−４及びＴＥＲＴを発現する。更に、顕微鏡下において、ＥＳ細胞は、高い核／細胞質比、顕著な核小体、及び細胞接合の識別性が低いコンパクトなコロニー形成を有するように見える。霊長類ＥＳ細胞は、１以上の段階特異的な胎児抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と命名された抗体を使用して検出可能なマーカーを発現する可能性がある（Thomson et al., (1998) Science 282:1145）。ｈＥＳ細胞のインビトロでの分化は、典型的にはこれらマーカーの喪失（もし存在すれば）、及びＳＳＥＡ−１の増大した発現をもたらす。
【００７０】
発生の種々の段階でＥＳ細胞の増大及び分化をモニターするために、種々の遺伝子マーカーの発現を試験するための実験を行った。即ち、本発明に従って、図１は、ｈＥＳ細胞、ＥＢｓ及び培養されたＭＳＣｓにおける、遺伝子特異的マーカーの分析を示している。この実験では、種々の遺伝子マーカー（即ち、Ｏｃｔ４、Ｃｂｆａｌ、ＯＮ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、Ｄ１ｘ５、Ｍｓｘ２、ＣＭＰ及びＢＳＰ）が試験された。予期されたように、ＥＢｓ並びにＭＳＣｓ１及び２において、ＥＳ細胞マーカーＯｃｔ４及びＢＭＰ７の発現に劇的な低下が観察される。また、ＭＳＣｓ２ポピュレーションにおいて、マトリックスタンパク質であるオステオネクチン（ＯＮ）、並びに骨芽細胞特異的分化因子であるＣｂｆａｌ、Ｍｓｘ２及びＤ１ｘ５の増大した発現が観察される。Ｄ１ｘ５は、最も成熟したＭＳＣｓ及び前骨芽細胞においてのみ発現されることが知られている。これらのデータは、骨芽細胞表現型に向けた進化を示している。
【００７１】
本発明の骨芽細胞表現型を特徴付けするために使用される一つの方法は、Ｃｂｆａｌ、Ｍｓｘ２、Ｄ１ｘ５、オステオポンチン（ＯＰＮ）、オステオネクチン、及びオステオカルシンのような遺伝子マーカーの、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルでの発現によるものであった。これら骨芽細胞関連遺伝子マーカーは、機能においては変動するが、一般に骨特異的タンパク質の転写調節に関与しており、初期の骨マトリックスの組織化及び石灰化に影響を及ぼす。図２に示すように、オステオカルシンの発現に影響を及ぼし、これを調節するためには、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3のみが不可欠であるように見える。従って、このタンパク質のｍＲＮＡの出現には、該ホルモンの存在が決定的に重要である。これらデータの全てが、これらｈＥＳから誘導された細胞の骨芽細胞としての真正性を強力に支持している。マウスＥＳ細胞又は骨髄から誘導された、マウス及びヒトの間葉性幹細胞において骨芽細胞分化因子として作用することが共通して知られているレチノイン酸又はデキサメタゾンのような多くの因子が、ｈＥＳ細胞においてオステオカルシン（骨芽細胞分化の特徴遺伝子）の発現を誘導できなかったことに注目することは興味深いものである。
【００７２】
骨芽細胞表現型を特徴付けするために使用したもう一つの方法は、標準のフォン・コッサ染色技術である（Shevde, et al., (2001) Cleft Palate Craniofac J. 38: 606-14）。この染色技術は、骨結節を形成するＭＳＣｓの能力をい評価するために使用された。図３は、ｈＥＳ細胞から誘導された骨芽細胞における、インビトロでの骨結節形成を示している。簡単に説明すると、細胞を洗浄し、フォン・コッサ法を使用して、燐酸カルシウム沈着の存在を染色した。形成された石灰化領域の数を、骨芽細胞コロニーの存在の指標とした。インビトロでの骨結節形成に加えて、出願人はまた、これら骨前駆体細胞をマウス及び霊長類のような動物の中に導入して、インビボでの骨形成を促進できると想定している。
【００７３】
本発明を実施する際に使用できる、更にもう一つの決定的な骨芽細胞系統に限定されたアッセイには、コロニー形成ユニット骨芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）アッセイが含まれる。これは、ＭＳＣｓの定量のための十分に確立された方法である。
【００７４】
＜ｈＥＳ細胞から誘導された間葉性幹細胞のインビボ分化＞
間葉性幹細胞の増殖を支持するＭｅｓｅｎｃｕｔ培地及び予め選択された血清を使用し、上記で説明したプロトコールに従って、間葉性幹細胞を培養した。ＭＳＣｓのポピュレーションを増やすために、細胞を１０ｃｍの皿の中で培養した。一つのインビボ実験のために、最小限で２５個の皿が必要とされた。また、細胞（即ち、骨前駆体細胞）を回収する１日前に、完全な培地交換を行った。
【００７５】
全ての培養皿からの細胞をトリプシン処理し、回収し、血球計数器を使用して計数した。計数した後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、各スポット注射のために１００μＬのＰＢＳ中に際懸濁させた。一般に、各注射のために約１．６２×１０6細胞／２００μＬを使用した。次いで、この細胞懸濁液に１００μＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標名；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を混合し、注射のときまで氷上に維持した。
【００７６】
４〜５週齢の胸腺欠損ヌードマウス（雌、Ｈａｒｌａｎｄ）を、インビボ実験のために使用した。これらのマウスを、コントロール群及び実験群に分けた。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標名）中の細胞懸濁液（２００μＬ）を、マウスの背側表面（背中）の二つの別々の位置に皮下注射した。同様に、コントロールマウスにも、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標名）中の同数のｈＥＳ細胞を注射した。これらのマウスを、体重減少、運動不能、注射部位での潰瘍等の、望ましくない／予測しない何らかの変化について毎日観察した。また、規則的な間隔でマウスの写真を撮り、小結節の成長を綿密にモニターした。図６及び図７は、これらマウスから撮った写真である。
【００７７】
小結節が目的とした大きさに達したら、マウスを安楽死させ、小結節を取出した。次いで、この小結節を半分に切断し、１０％緩衝ホルマリン中で固定した。組織学的切片（４〜６ミクロン）を作製し、該小結節中の軟骨及び骨の存在を決定するために、ヘマトキシリン及びエオシンを使用して染色した。
【００７８】
皮下骨小結節の一連の切片の組織学的評価によって、繊維性結合組織に封入された大きな軟骨領域が示された。幾つかの軟骨領域は、軟骨内骨形成の特徴である肥大軟骨細胞内の石灰化マトリックスの存在で見たときに、骨形成の証拠を示した。該切片はまた、当該結節内における成功裏の血管新生プロセスを示す微小毛細管の存在を示した。インビボ実験の結果は、間葉性幹細胞及びヒトＥＳ細胞から誘導された前骨芽細胞が骨形成能力を有しており、且つインビトロ及びインビボの両方で骨を形成できることを示している。
【００７９】
更にもう一つの実施形態においては、上記で説明した細胞が、骨伝導性微細結晶性足場環境内で皮下的に移植できることが想定される。この方法において、上記方法からの間葉性幹細胞又は前骨芽細胞は、滅菌され且つ予め湿潤化された適切な培地中の多孔質足場（１．５〜２．０×１０-6細胞／足場）に播種され、最適な細部結合を可能にするために１２時間インキュベートされる。適切な多孔質足場には、コラリン・ヒドロキシアパタイト及びリン酸三カルシウムの円筒状足場（３ｍｍ×２ｍｍ；バークレー・バイオマテリアル社）が含まれる。これらの播種された足場は、次いで４〜５週齢の胸腺欠損ヌードマウスの背部皮膚領域下の皮下に移植される（マウス当り２〜４部位）。播種されなかった足場は、斯かる実験におけるコントロールとして働くことができる。４週間後に、マウスは骨密度分析を受け、その後にマウスは屠殺され、足場が除去される。この足場は、固定及び分析できる骨結節を有していないであろう。骨伝導環境は、間葉性幹細胞系統並びに他の生殖層の細胞の両者において、他の細胞型の増殖を抑制するであろう。この実験は、ヒトＥＳ細胞から発生されたヒトＭＳＣｓが、最終的にインビボでのヒト骨形成に使用するために十分であることを立証することを目的としたものである。
【００８０】
＜発明の適用可能性＞
骨形成能を備えたヒト間葉性幹細胞（ＭＳＣｓ）は、種々の医学分野及び歯科分野に応用可能な生物学的材料の価値ある供給源である。例えば、本発明の実質的に均一な細胞ポピュレーションは、骨格組織の再生又は修復のための治療能力を備えたヒト骨芽細胞の、再生可能及び更新可能な供給源を提供するために利用することができると想定される。これら細胞は、新たな骨成長を促進し、骨折の治癒を亢進及び加速させ、骨移植を容易にし、又は歯科及び骨格補綴装置を固定及び強化するための組織加工において使用できることが含まれる。ＭＳＣｓはまた、遺伝子治療のための組換え遺伝子のターゲッティングされた送達を実現するための、可能性のある方法を提供する。従って、これら細胞ポピュレーションは、多くの重要な研究、開発、及び商業的目的のために使用することができる。
【００８１】
更に、本発明の細胞は、他の祖先細胞由来の細胞、又は骨芽細胞由来の最終段階の細胞、又は何れか他の発生経路に由来する細胞内で優先的に発現されるｃＤＮＡによる汚染が比較的少ないｃＤＮＡライブラリーを調製するために使用することができる。
【００８２】
本発明の分化された細胞はまた、間葉性細胞、骨芽細胞及び中間前駆体のマーカーに対して特異的な、抗体を調製するためにも使用することができる。ポリクローナル抗体は、免疫原性の形態の本発明の細胞を、脊椎動物に注射することによって調製することができる。モノクローナル抗体の製造は、標準的な参照文献、例えば米国特許第４，４９１，６３２号、同第４，４７２，５００号、及び同第４，４４４，８８７号、並びにMethods in Enzymology 73B:3 (1981)に記載されている。また、特定の抗体分子は、標的抗原をもった免疫担当細胞又はウイルス粒子のライブラリーに接触させ、陽性選択されたクローンを増殖させることによっても製造することができる。Marks et al., (1996) New Eng. J. Med. 335:730、及び McGuiness et al., (1996) Nature Biotechnol. 14:1449参照。更に別の方法は、ＥＰ特許出願１，０９４，１０８Ａに記載されているように、ランダムなＤＮＡ断片を抗体コード領域に再アセンブリーすることである。
【００８３】
更に、本発明の他の応用は、実質的に均一な骨芽細胞ポピュレーションを使用して、斯かる細胞の特徴に影響する因子（例えば溶媒、小分子薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド）又は環境的受験のスクリーニングを容易にすることに関するものであることが想定される。例えば、医薬化合物を、筋骨格組織の維持又は修復に対するそれらの影響について試験することができるであろう。一例において、本発明の細胞ポピュレーションは、カルシウム沈着に影響する能力について、種々の因子をスクリーニングするために使用されてよい。例えば、カルシウム沈着に対するこのような作用を有する化合物について、ビタミンＤライブラリーをスクリーニングすることができるであろう。スクリーニングが行われ得るのは、該化合物が細胞に対する薬理学的効果を有するように設計されるから、又は何れかの効果を有するように設計された化合物がこの組織型の細胞に対して意図しない副作用を有し得るからである。このスクリーニングは、本発明の前駆体細胞又は最終的に分化した細胞の何れかを使用して行うことができる。
【００８４】
同様に、本発明の実質的に均一な骨芽細胞ポピュレーションについては、組織維持を高めるため、何れかの認知された必要性、例えば代謝機能における先天的エラー、疾患状態の影響、又は顕著な外傷の結果について筋骨格組織を修復するための、種々の治療的使用も想定される。
【００８５】
以上、理解の明瞭さのために、例示及び実施例により本発明を幾分詳細に説明してきたが、本発明の一定の改変は当業者が行う日常的な最適化の範囲であり、本発明の精神を逸脱することなく実施することができ、従って特許請求の範囲の範囲内に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、ｈＥＳ細胞、消化されたＥＢｓ、及び二つの別々の培地及び血清（ＭＳＣｓ１及びＭＳＣｓ２）中に培養された細胞から単離された、ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を描いている。
【図２】図２は、骨芽細胞分化剤の存在下で培養されたｈＥＳ細胞から誘導された、骨芽細胞における遺伝子発現を示すもう一つのＲＴ−ＰＣＲ分析を描いている。
【図３】図３は、リン酸カルシウム同時沈降により特徴付けられる骨結節形成を解明するために、Ｖｏｎ・Ｋｏｓｓａ技術を使用して染色された培養物中のｈＥＳ細胞から誘導された骨芽細胞を示している。
【図４】図４のＡ〜Ｄは、ヌードマウスに発生した結節の組織学的評価を示す写真を示している：（Ａ）は、軟骨結節の大きな領域を示し（１０Ｘ）；（Ｂ）は、軟骨内骨形成の証拠を示し（１０Ｘ）；（Ｃ）は、骨に生め込まれた肥大軟骨細胞を示し（２０Ｘ）；また（Ｄ）は、肥大軟骨細胞及びマトリックスを備えた軟骨を示している（４０Ｘ）。
【図５】図５のＡ〜Ｄは、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3処理されたＭＳＣｓについてのインビトロ骨結節形成を示す写真である：（Ａ）は対照を示し；（Ｂ）はＢＭＰ２処理された細胞を示し；（Ｃ）は１，２５（ＯＨ）2Ｄ3処理された細胞を示し；（Ｄ）は、ＢＭＰ２及び１，２５（ＯＨ）2Ｄ3処理された細胞を示す。
【図６】図６は、ＭＳＣｓの皮下注射の１週間後のヌードマウスの写真を示している。図６上段のパネルは対照群のマウスを表し、下段のパネルは実験群のマウスを示している。
【図７】図７は、１週〜８週のヌードマウスにおける結節成長の進行表す写真を示している。結節成長の期間に亘って、不快感、痛み、又は体重ロスは観察されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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