(57)【要約】  本発明は、ケトグロニシゲニウム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ）属に属する微生物を使用する、例えば、Ｌ−ソルボソンのような基質からビタミンＣを産生する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケトグロニシゲニウム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ）属に属する微生物を使用して、培地において基質をビタミンＣに変換することを含んでなる、ビタミンＣを産生する方法。
【請求項２】
前記基質は、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、Ｌ−グロースおよびＬ−グロノ−γ−ラクトンよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応混合物においてケトグロニシゲニウム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ）属に属する微生物と基質とを接触させ、前記反応混合物からビタミンＣを単離および精製することを含んでなる、ビタミンＣを産生する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
反応混合物においてケトグロニシゲニウム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ）属に属する微生物とＬ−ソルボソンとを接触させ、前記反応混合物からビタミンＣを単離および精製することを含んでなる、Ｌ−ソルボソンからビタミンＣを産生する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物は、ケトグロニシゲニウム・ロバスタム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｒｏｂｕｓｔｕｍ）、ケトグロニシゲニウム・ブルガレ（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）またはそれらの変異体から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物は、ケトグロニシゲニウム・ロバスタム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｒｏｂｕｓｔｕｍ）ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６２７、ケトグロニシゲニウム・ブルガレ（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３５、ケトグロニシゲニウム・ブルガレ（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３６およびケトグロニシゲニウム・ブルガレ（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３７よりなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、約４．０〜約９．０のｐＨおよび約１３〜約３６℃の温度で行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、約５．０〜約８．０のｐＨおよび約１８〜約３３℃の温度で行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、約２〜約１２０ｍｇ／ｍｌのＬ−ソルボソン濃度で行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法は、約４〜約１００ｍｇ／ｍｌのＬ−ソルボソン濃度で行われる、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）の微生物産生に関する。
【０００２】
ヒトの極めて重要かつ独立な栄養因子の１つであるビタミンＣは、技術的に確立された方法として周知であるいわゆる「ライヒシュタイン（Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ）法」によって商業的に産生されている。しかし、この方法は、多くの複雑な工程を含んでなり、全収量のいずれの改善も達成が困難である。従って、工程数の減少および／または全収量の改善を考慮する多くの提案が存在する。
【０００３】
本発明は、ケトグロニシゲニウム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ）属に属する微生物を使用して、培地において基質をビタミンＣに変換することを含んでなる、ビタミンＣを産生する方法を提供する。
【０００４】
基質のビタミンＣへの変化とは、ビタミンＣを生じる基質の変換がケトグロニシゲニウム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ）属に属する微生物によって実施され、即ち、基質が直接ビタミンＣに変換され得ることを意味する。前記微生物は、上記の規定されるような基質からのそのような変化を可能にする、例えば、微生物と基質とを直接接触させる条件下で培養される。微生物は、例えば、休止細胞、アセトン処理細胞、凍結乾燥細胞、固定化された細胞などの形態で、基質に直接作用させるために使用することができる。微生物のためのインキュベーション技術に関する方法として公知の任意の手段自体は、通気の使用、好ましくは、撹拌型液内発酵槽を介して適応することができる。反応を行うための好適な細胞濃度は、１ｍｌあたり約１０ｍｇ〜約７００ｍｇの湿細胞、より好ましくは、１ｍｌあたり約３０ｍｇ〜約５００ｍｇの湿細胞の範囲である。
【０００５】
本明細書において使用される培地は、ビタミンＣを産生する任意の適切な培地であり得る。典型的に、培地は、例えば、塩、基質、および所定のｐＨを含んでなる水性培地である。
【０００６】
例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、Ｌ−グロースまたはＬ−グロノ−γ−ラクトンのような炭素源を基質として使用することができる。好ましくは、基質は、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボースまたはＬ−ソルボソンから選択され、より好ましくは、Ｌ−ソルボソンである。
【０００７】
ケトグロニシゲニウム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ）属に属する適切な微生物は、例えば、ケトグロニシゲニウム・ロバスタム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｒｏｂｕｓｔｕｍ）、ケトグロニシゲニウム・ブルガレ（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）または本発明について基質のビタミンＣへの変換が可能であるそれらの変異体から選択され得る。本発明の一態様では、ケトグロニシゲニウム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ）属に属する微生物は、ケトグロニシゲニウム・ロバスタム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｒｏｂｕｓｔｕｍ）、ケトグロニシゲニウム・ブルガレ（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）またはそれらの変異体から選択され、ケトグロニシゲニウム・ブルガレ（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）ＤＳＭ４０２５またはその変異体は含まない。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、反応混合物においてケトグロニシゲニウム・ロバスタム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｒｏｂｕｓｔｕｍ）、ケトグロニシゲニウム・ブルガレ（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）またはそれらの変異体から選択される微生物とＬ−ソルボソンとを接触させ、反応混合物からビタミンＣを単離および精製することを含んでなる、Ｌ−ソルボソンからのビタミンＣを産生する方法を提供する。
【０００９】
微生物「ケトグロニシゲニウム・ロバスタム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｒｏｂｕｓｔｕｍ）」および「ケトグロニシゲニウム・ブルガレ（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）」はまた、ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓによって規定されるような同じ生理学的特性を有するそのような種のシノニムまたはバソニムを含むことが理解される。
【００１０】
本明細書において使用する上記の微生物の「変異体」とは、本発明の方法によって提供されるような、例えば、Ｌ−ソルボソンのような基質のビタミンＣへの変換が可能であるそれらのゲノム配列において改変される微生物を指す。変異体は、例えば、化学およびＵＶ変異誘発、続いて、所望される表現型のスクリーニングまたは選択、微生物のゲノムにおける遺伝子の無傷な（ｉｎｔａｃｔ）相応物を置き換えるために使用される組換え技術、一重および二重交差組換え、および他の周知の技術によるインビトロでの機能不全遺伝子の構築を含む任意の簡便な手段によって得ることができる。サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）、ならびにハーウッド（Ｈａｒｗｏｏｄ）およびカッティング（Ｃｕｔｔｉｎｇ）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９０年）、２７〜７４頁を参照のこと。適切な変異原として、紫外線、Ｘ線、ガンマ線およびナイトロジェンマスタードまたはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアジニンのような化学変異原が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、変異体は、目的のために当業者に周知である任意の方法自体において、自発変異によって生じるクローンを単離することによって、得ることができる。
【００１１】
好適な実施形態では、本発明の方法ために使用されるような微生物は、Ｋ．ロバスタム（Ｋ．ｒｏｂｕｓｔｕｍ）ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６２７、Ｋ．ブルガレ（Ｋ．ｖｕｌｇａｒｅ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３５、Ｋ．ブルガレ（Ｋ．ｖｕｌｇａｒｅ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３６、Ｋ．ブルガレ（Ｋ．ｖｕｌｇａｒｅ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３７Ｎおよびそれらのそれぞれの変異体よりなる群から選択される。
【００１２】
Ｋ．ロバスタム（Ｋ．ｒｏｂｕｓｔｕｍ）ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６２７については、米国特許第５，８３４，２３１号明細書に記載されている。Ｋ．ブルガレ（Ｋ．ｖｕｌｇａｒｅ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３５、Ｋ．ブルガレ（Ｋ．ｖｕｌｇａｒｅ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３６およびＫ．ブルガレ（Ｋ．ｖｕｌｇａｒｅ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３７Ｎ株については、米国特許第６，３１６，２３１Ｂ１号明細書に記載されている。これらの株は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、イリノイ州６１６０４、米国から公的に利用可能である。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、反応混合物においてケトグロニシゲニウム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ）属に属する微生物とＬ−ソルボソンとを接触させ、反応混合物からビタミンＣを単離および精製することを含んでなる、ビタミンＣを産生する方法を提供する。
【００１４】
本明細書において使用される「反応混合物において微生物とＬ−ソルボソンとを接触させること」は、Ｌ−ソルボソンを含有する培地における微生物の培養を含む。微生物は、例えば、休止細胞、アセトン処理細胞、凍結乾燥細胞、固定化された細胞などの形態で、基質、例えば、Ｌ−ソルボソンに直接作用させるために使用することができる。微生物のためのインキュベーション技術関する方法として公知の任意の手段自体は、通気の使用、好ましくは、撹拌型液内発酵槽を介して適応することができる。反応を行うための好適な細胞濃度は、１ｍｌあたり約１０ｍｇ〜約７００ｍｇの湿細胞、より好ましくは、１ｍｌあたり約３０ｍｇ〜約５００ｍｇの湿細胞の範囲である。
【００１５】
適切な「反応混合物」は、水または微生物の培養の分野において公知の任意の栄養培地であり得る。そのような栄養培地は、微生物によって利用され得る炭素源、窒素源および他の無機塩を含む。微生物のより良好な増殖のために一般的に使用される多様な栄養物質は、培地に適切に含まれ得る。
【００１６】
同化可能な炭素源としてのそのような栄養素の例として、グリセロール、Ｄ−マンニトール、エリトリトール、リビトール、キシリトール、アラビトール、イノシトール、ズルシトール、Ｄ−リボース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−グルコースおよびスクロースが挙げられるが、これらに限定されない。有機物質のような消化可能な窒素源の例として、ペプトン、酵母抽出物、パン酵母、尿素、アミノ酸およびコーンスティープリカーが挙げられるが、これらに限定されない。多様な無機物質を、窒素源、例えば、硝酸塩およびアンモニウム塩として使用することができる。さらに、培養培地は、通常、無機塩、例えば、硫酸マグネシウム、リン酸カリウムおよび炭酸カルシウムを含有する。
【００１７】
本発明の微生物の培養は、約４．０〜約９．０のｐＨで行うことができ、ここで、約５．０〜約８．０のｐＨが好適に維持され得る。培養期間は、使用すべきｐＨ、温度および栄養培地に依存して変動し、好ましくは、約１〜５日間、最も好ましくは約１〜３日間である。本発明の方法を行うための好適な温度は、約１３〜約３６℃、より好ましくは、約１８〜約３３℃の温度である。
【００１８】
一実施形態では、本発明の方法は、約４．０〜約９．０のｐＨおよび約１３〜約３６℃の温度で行われる。好ましくは、約５．０〜約８．０のｐＨおよび約１８〜約３３℃の温度が、本方法を行うために使用される。
【００１９】
例えば、Ｌ−ソルボソンのような基質の濃度は反応条件によって変動し得るが、反応は、約２〜約１２０ｍｇ／ｍｌの基質濃度、より好ましくは、約４〜約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で好適に行われる。一実施形態では、本発明の方法は、約２〜約１２０ｍｇ／ｍｌのＬ−ソルボソン濃度、より好ましくは、約４〜約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で行われる。
【００２０】
このようにして反応混合物において産生され、蓄積されたビタミンＣは、産物の特性を適切に利用した任意の従来の方法自体によって分離および精製することができ、それは、遊離酸またはナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウムなどの塩として分離することができる。
【００２１】
具体的には、分離は、次の工程：塩の形成、産物と溶媒間の溶解度、吸収および分配係数のような周囲の不純物との間の特性の差異を使用すること、例えば、イオン交換樹脂に対する吸着の任意の適切な組み合わせまたは反復によって実施することができる。これらの手順のいずれかは、単独または組み合わせで、産物を単離するための簡便な手段を構成する。このようにして得られた産物は、従来の様式、例えば、再結晶またはクロマトグラフィーでさらに精製することができる。
【００２２】
本発明に従えば、それは、例えば、Ｌ−ソルボソンのような基質からのビタミンＣの産生を目的とした一工程の経路をもたらすため、工程の数を減少することに関する改善は極めて重要である。
【００２３】
以下の実施例では、本発明の目的をさらに詳細に例示する。
【００２４】
実施例１：休止細胞系によるＬ−ソルボソンからのビタミンＣの産生
Ｋ．ロバスタム（Ｋ．ｒｏｂｕｓｔｕｍ）ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６２７ならびにＫ．ブルガレ（Ｋ．ｖｕｌｇａｒｅ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３５、ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３６およびＮＲＲＬ  Ｂ−３００３７Ｎ株を、Ｔｒｉｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ（ディフコ  ベクトン・ディッキンソン株式会社（Ｄｉｆｃｏ，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｓｐａｒｋｓ、メリーランド州、米国）上、３０℃で３日間、培養した。細胞をプレートから回収し、１ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、同緩衝液で２回洗浄した。細胞懸濁液の６００ｎｍでの光学密度は、ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６２７、ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３５、ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３６およびＮＲＲＬ  Ｂ−３００３７についてそれぞれ１２．２、１２．５、１６．２および１１．２であった。これらの数は、それぞれ、１ｍｌあたり３１．７、３２．５、４２．１および２９．１ｍｇの湿細胞重量に対応する。
【００２５】
反応混合物（試験管中５ｍｌ）は、０．９ｍｌの細胞懸濁液および５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中０．１ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−ソルボソンを含有した。反応は、細胞懸濁液の添加によって開始した。反応混合物を、往復振盪機上で３０℃および１８０ｒｐｍ、３時間、インキュベートした。反応後、反応混合物を、８，０００×ｇで１０分間、遠心分離し、上清を得た。上清中のビタミンＣ含有量をＨＰＬＣで測定した：
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰｏｌｙａｍｉｎｅＩＩ（１５０×４．６ｍｍ内径）、ＹＭＣ  社（Ｃｏ．Ｌｔｄ）、京都、日本、
溶出：５０ｍＭ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４／アセトニトリル＝３０／７０
流速：１ｍｌ／分
検出：２５０ｎｍでのＵＶ吸収
【００２６】
上記ＨＰＬＣ条件下でのビタミンＣの保持時間は７．７分間であった。このＨＰＬＣ分析により、すべての試験した株による反応産物がビタミンＣであることを確認した。
【００２７】
表１は、ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６２７、ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３５、ＮＲＲＬ  Ｂ−３００３６およびＮＲＲＬ  Ｂ−３００３７Ｎ株によって産生されたビタミンＣの量を示す。
【００２８】
【表１】
2007519406.tif 000002
【国際調査報告】
2007519406.tif 000003
2007519406.tif 000004
2007519406.tif 000005