(57)【要約】本発明は、骨疾患を処置するか、または予防するための組成物および方法に関連する。特定の局面において、本発明は、骨標的化分子に結合した、β−アドレナリンアンタゴニストまたはβ−アドレナリンアゴニストを含有する組成物、ならびに本発明の組成物を投与することによって、哺乳動物において骨質量および／または骨成長を調節する方法を提供する。他の局面において、本発明は、β２−選択的アンタゴニストまたはβ２−選択的アゴニストを含有する組成物を投与することによって、哺乳動物において骨質量および／または骨成長を調節する方法を提供する。
2007537297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−アドレナリン作動因子を含有する結合体化した薬物であって、該β−アドレナリン作動因子は、骨芽細胞に対する該β−アドレナリン作動因子の局所送達および／または有効性を、β−アドレナリン作動因子単独に対して増加させるために骨を標的化する部分に結合する、結合体化した薬物。
【請求項２】
前記β−アドレナリン作動因子と前記骨を標的化する部分とが、共有結合している、請求項１に記載の結合体化した薬物。
【請求項３】
前記β−アドレナリン作動因子と前記骨を標的化する部分とが、非共有結合している、請求項１に記載の結合体化した薬物。
【請求項４】
アドレナリン拮抗作用から生じる望ましくない副作用に対して、β−アドレナリン作動因子単独の治療指数より少なくとも２倍高い該治療指数を有する、請求項１に記載の結合体化した薬物。
【請求項５】
骨代謝に作用する結合体化した薬物であって、該結合体化した薬物は、一般式（Ｉ）：
（Ａ）ｍ＊（Ｂ）ｎ
で表され、ここで：
Ａは、各存在に対し独立して、β−アドレナリン作動因子を表し；
Ｂは、各存在に対し独立して、骨を標的化する部分を表し；
ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１以上の整数を表し；そして
＊は、該β−アドレナリン作動因子Ａと該骨を標的化する部分Ｂとを結合する、共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用を示す、
骨代謝に作用する結合体化した薬物。
【請求項６】
前記Ａ部分と前記Ｂ部分との間の結合相互作用は、前記結合体化した薬物が骨に分布しそして／または局在化している生理学的状態下において、可逆的であるか、または代謝され、そして解離によってＡまたはＡのプロドラッグ形態を放出する、請求項５に記載の結合体化した薬物。
【請求項７】
前記Ａ部分と前記Ｂ部分との間の結合相互作用は、不可逆的であり、前記β−アドレナリン作動因子は、骨芽細胞に対してβ−アドレナリン作動活性を保持する、請求項５に記載の結合体化した薬物。
【請求項８】
一般式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ
で表される請求項５に記載の結合体化した薬物であって、ここでＡおよびＢは、上記のように定義され、そしてＬは適切に、ＡおよびＢの原子の間の共有結合であるか、ＡとＢとを連結する共有結合性リンカーであって、または該結合体化した薬物を形成する、結合体化した薬物。
【請求項９】
一般式（ＩＩＩ）：
Ａ：：Ｂ
で表される請求項５に記載の結合体化した薬物であって、ここでＡおよびＢは、上記のように定義され；そして：：は、適切な生理学的条件下で解離して標的化された骨芽細胞の近傍においてＡを放出する、ＡとＢとの間のイオン結合を表す、結合体化した薬物。
【請求項１０】
一般式（ＩＶ）：
［（Ａ−Ｌ’］ｎ［Ｂ−Ｌ’’］ｍ
で表される請求項５に記載の結合体化した薬物であって、ここで：
Ａ、Ｂ、ｎおよびｍは、上記のように定義され；そして
Ｌ’およびＬ’’は独立して、他の基と非共有結合して該薬物結合体を形成する、連結基を表す、
結合体化した薬物。
【請求項１１】
一般式（Ｖ）：
（Ａ）ｍ＊（Ｂ）ｎ（Ｔ）ｐ
で表される請求項５に記載の結合体化した薬物であって、ここで：
Ａ、Ｂ、ｎ、ｍおよび＊は、上記のように定義され；
Ｔは、β−アドレナリン作動因子以外の治療因子を表し；そして
ｐは、１以上の整数である、
結合体化した薬物。
【請求項１２】
前記β−アドレナリン作動因子は、β−アドレナリンアンタゴニストである、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の結合体化した薬物。
【請求項１３】
前記β−アドレナリンアンタゴニストは、β２−アドレナリン作動性レセプターの選択的アンタゴニストである、請求項１２に記載の結合体化した薬物。
【請求項１４】
前記β−アドレナリンアンタゴニストは、有機低分子、ペプチド、タンパク質、抗体、および炭水化物からなる群より選択される、請求項１２に記載の結合体化した薬物。
【請求項１５】
請求項１２に記載の結合体化した薬物であって、該結合体化した薬物は、以下の一般構造（ＶＩ）：
【化１】
2007537297.tif 000007
で表され、ここで：
Ｒ１は、−Ｌ−Ｂ、置換もしくは非置換の環状部分または脂肪族部分、あるいはＣ、Ｎ、およびＯから選択される１つ以上のヘテロ原子を含み得る単環構造ならびに多環構造を含む環状部分を表し；そして
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、−Ｌ−Ｂ、水素、または置換アルキルおよび非置換アルキルを表し；
Ｒ４は、−Ｌ−Ｂ、または水素を表し；
Ｌは適切に、共有結合または共有結合性リンカーであり；
Ｂは、骨を標的化する部分を表し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは−Ｌ−Ｂである、
結合体化した薬物。
【請求項１６】
請求項１２に記載の結合体化した薬物であって、該結合体化した薬物は、以下の一般構造（ＶＩＩ）：
【化２】
2007537297.tif 000008
ならびにその光学活性異性体および薬理学的に受容可能な塩で表され、ここで：
Ｒ’１は、−Ｌ−Ｂ；水素；ハロゲン；Ｃ１〜５アルキル；Ｃ２〜５アルケニル；構造Ｙ−Ｘ−Ｚ−を有する基であって、ここでＹが、フェニル基によって必要に応じて置換される直鎖Ｃ１〜４アルキルもしくは分枝鎖Ｃ１〜４アルキル、または１つ以上のハロゲン原子、ヒドロキシ、Ｃ１〜３アルキルもしくはＣ１〜３アルコキシで必要に応じて置換されるフェニルであり、Ｘが、酸素または硫黄であり、そしてＺが、メチルまたはエチルである、構造Ｙ−Ｘ−Ｚ−；構造Ｒ’’−ＨＮＣＯを有するカルバモイル基であって、ここでＲ’’が、Ｃ１〜５アルキルである、カルバモイル基；Ｃ１〜５シクロアルキル；Ｃ１〜４アルコキシ；フェニルまたは置換フェニルであって、ここで置換基が、１つ以上のハロゲン原子、Ｃ１〜３アルキルまたはＣ１〜３アルコキシルから選択される、フェニルまたは置換フェニル；フェニル−低級アルキルであって、ここで該フェニル部分が、置換されなくてもよく、または１つ以上のハロゲン原子、Ｃ１〜３アルキルもしくはＣ１〜３アルコキシルによって置換されてもよい、フェニル−低級アルキル；構造−Ｎ（−Ｒ’’２）Ｒ’’３を有するアミンであって、ここでＲ’’２が、水素、低級アルキルおよびヒドロキシ−置換低級アルキルを表し、Ｒ’’３が、水素、低級アルキル、ヒドロキシ−置換低級アルキルおよびフェニルを表すか、またはＲ’’２とＲ’’３とが、直接１つに連結されて、Ｒ’’２およびＲ’’３が結合する窒素と共に３員環〜７員環であって、該３員環〜７員環は、置換されないかもしくは、好ましくは、１つ以上の低級アルキルおよびヒドロキシ−低級アルキルによって置換される、３員環〜７員環を生じてもよく、あるいはＲ’’２とＲ’’３とが、酸素原子、窒素原子もしくは硫黄原子を介して連結されて、必要に応じて低級アルキルによって置換された５員環または６員環を形成してもよい、アミン；あるいはヘテロ原子として酸素、窒素もしくは硫黄を有する５員または６員の複素環式環、を表し；
Ｒ’２、Ｒ’３およびＲ’４は、それぞれ独立して、−Ｌ−Ｂまたは水素を表し；
Ｌは適切に、共有結合または共有結合性リンカーであり；
Ｂは、骨を標的化する部分を表し、
Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３およびＲ’４の少なくとも１つは、−Ｌ−Ｂである、
結合体化した薬物。
【請求項１７】
前記β−アドレナリンアンタゴニストは、Ａｃｃ  ９３６９、アセブトロール、アルプレノロール、ＡＭＯ−１４０、アモスラロール、アロチノロール、アテノロール、ベフノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブシンドロール、ブクモロール、ブニトロロール、ブノロール、ブプラノロール、ブトフィロロール、ブトキサミン、カプシノロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベディロール、セリプロロール、シクロプロロール、クロラノロール、ＣＰ−３３１６８４、ジアセトロール、ジレバロール、ジプラフェノン、エルセンチリド、エスモロール、エクサプロロール、ファリントロール、Ｆｒ−１７２５１６、ヒドロキシレボブノロール、ＩＣＩ  １１８５５１、インデノロール、ＩＰＳ  ３３９、イソキサプロロール、ＩＳＶ−２０８、Ｌ−６５３３２８、ラベトロール、レボブノロール、レボプロロール、ＬＭ−２６１６、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、ナドロール、ネビボロール、ニフェナロール、オクスプレノロール、パマトロール、ペンブトロール、ピンドロール、プラクトロール、プロシノロール、プロプラノロール、ＳＢ−２２６５５２、ソタロール、ＳＲ−５８８９４Ａ、ＳＲ−５９２３０Ａ、タゾロール、チエノキソロール、チモロール、チプレノール、トリプロロール、トプロール、ＴＺＣ−５６６５、ＵＫ−１７４５、Ｖｉｓｋｅｎｉｔ、キサモテロール、ＹＭ−４３０、およびそれらのプロドラッグのラセミ形態ならびに鏡像異性形態からなる群より選択される、請求項１２に記載の結合体化した薬物。
【請求項１８】
前記β−アドレナリン作動因子は、β−アドレナリンアゴニストである、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の結合体化した薬物。
【請求項１９】
前記骨を標的化する部分は、テトラサイクリン；カルセイン；ＤＨＥＡ；カルシトニン；ビスホスホネート；ジ−ホスホン酸、トリ−ホスホン酸、テトラ−ホスホン酸、テトラアミノホスホン酸のようなホスホン酸；ピロホスフェート；キレート剤；ホスフェート；アミノリン酸糖；エストロゲン；ペプチド；骨シアロタンパク質およびオステオポンチンならびに骨の無機質結合ドメインを有するタンパク質からなる群より選択される、請求項５〜１８のいずれか１項に記載の結合体化した薬物。
【請求項２０】
前記ビスホスホネートは、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、リセドロネート、ピリドロネート、パミドロネート、チルドロネートおよびゾレドロネートから選択される、請求項１９に記載の結合体化した薬物。
【請求項２１】
前記ペプチドは、酸性小ペプチドである、請求項１９に記載の結合体化した薬物。
【請求項２２】
前記酸性小ペプチドは、（Ａｓｐ）６または（Ｇｌｕ）６である、請求項２１に記載の結合体化した薬物。
【請求項２３】
前記ペプチドは、オステオネクチン、骨シアロタンパク質またはオステオポンチンのような骨の無機質相と結合する、請求項１９に記載の結合体化した薬物。
【請求項２４】
前記リンカーは、生理学的状態下で切断されて、骨芽細胞の近傍において前記β−アドレナリン作動因子が放出される、請求項８に記載の結合体化した薬物。
【請求項２５】
前記リンカーは、生理学的状態下で切断されて、骨芽細胞の近傍において前記β−アドレナリン作動因子が放出される、請求項２４に記載の結合体化した薬物。
【請求項２６】
前記リンカーは、二酸リンカー、またはその酸ハライドもしくは酸無水物である、請求項２５に記載の結合体化した薬物。
【請求項２７】
前記リンカーは、アミノ酸リンカーまたはペプチドリンカーである、請求項２４に記載の結合体化した薬物。
【請求項２８】
前記リンカーは、ジアミンである、請求項２４に記載の結合体化した薬物。
【請求項２９】
前記リンカーは、アミノアルコールである、請求項２４に記載の結合体化した薬物。
【請求項３０】
前記リンカーは、ヒドロキシアルキル酸である、請求項２４に記載の結合体化した薬物。
【請求項３１】
前記リンカーは、エステル、アミド、カルバメート、カルボネート、環状ケタール、チオエステル、チオアミド、チオカルバメート、チオカルボネート、キサンテート、チオール、チオエステル、およびリン酸エステルからなる群より選択される加水分解可能基を含む、請求項２４に記載の結合体化した薬物。
【請求項３２】
前記リンカーは、生理学的状態下において切断されず、そして前記β−アドレナリン作動因子は、前記結合体化した薬物形態においてその活性を保持する、請求項８に記載の結合体化した薬物。
【請求項３３】
哺乳動物において同化を促進する骨成長および／または骨密度を増加させるための方法であって、該方法が、哺乳動物に請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の結合体化した薬物の治療有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物は、対応する健康な骨の骨質量と比較して減少した骨質量によって特徴付けられる骨疾患を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法は、骨粗しょう症、骨減少症、パジェット病、骨軟化症、腎性骨形成異常症、歯周病、およびプロテーゼ周囲の骨溶解に関連する限局性骨損失から選択される骨疾患の、処置または防止の一部である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記骨粗しょう症は、閉経後骨粗しょう症、ステロイド誘導性の骨粗しょう症、男性の骨粗しょう症、疾患誘導性の骨粗しょう症、または特発性骨粗しょう症である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物は、性腺機能不全誘導性の骨損失によって特徴付けられる骨疾患を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記結合体化した薬物は、骨吸収を阻害する１種以上の他の因子と同時に投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記結合体化した薬物は、レプチンアンタゴニストと同時に投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
哺乳動物において同化を促進する骨形成を減少させるための方法であって、該方法は、該哺乳動物に請求項１８に記載の結合体化した薬物の治療有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項４１】
前記結合体化した薬物は、レプチン、レプチンアゴニスト、および脂質を低下させるスタチンからなる群より選択される１種以上の他の因子と同時に投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法は、骨化過剰症、大理石骨病、骨硬化症および骨軟骨症から選択される骨疾患の処置の一部である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記哺乳動物は、ヒト患者である、請求項３３〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
ヒト患者に使用するのに適切な形態で請求項１〜３２のいずれか１項に記載の結合体化した薬物を含み、そして骨疾患の処置または予防における該結合体化した薬物の適切な使用および副作用を説明する説明書ならびに／または表示を備える、パッケージ化された医薬品。
【請求項４５】
哺乳動物において同化を促進する骨成長および／または骨密度を増加させるための方法であって、該方法は、該動物に少なくとも１種のβ２−選択的アンタゴニストの治療有効量を投与する工程を包含する、方法
【請求項４６】
哺乳動物において同化を促進する骨形成を減少させるための方法であって、該方法は、該哺乳動物に少なくとも１種のβ２−選択的アゴニストの治療有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項４７】
哺乳動物において同化を促進する骨成長および／または骨密度を増加させるための医薬の製造における、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の結合体化した薬物の使用。
【請求項４８】
哺乳動物において同化を促進する骨形成を減少させるための医薬の製造における、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の結合体化した薬物の使用。
【請求項４９】
哺乳動物において同化を促進する骨成長および／または骨密度を増加させるための医薬の製造における、β２−選択的アンタゴニストの使用。
【請求項５０】
哺乳動物において同化を促進する骨形成を減少させるための医薬の製造における、β２−選択的アゴニストの使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
骨は、個体の一生を通じて、古い骨を除去し、そしてそれを新しい骨に置き換えて、絶えず自らを再構築する。この再構築プロセスは、２つの十分に定義された細胞のプロセスによって実行される。既存の骨の吸収は、破骨細胞によって媒介され、そして新規の骨形成は、骨芽細胞によって媒介される。再構築における不均衡は、骨粗しょう症（脆弱性の増大を生じる微小構造の（ｍｉｃｒｏａｒｃｈｉｔｅｃｈｔｕｒａｌ）変質を伴う低い骨質量によって特徴付けられる疾患）を生じる。具体的には、相対的に増加した骨のターンオーバーおよび骨芽細胞の活性を消費する破骨細胞の活性の増強が、骨粗しょう症の根底にある。これは、閉経後のエストロゲンの欠乏、薬物療法（例えば、糖質コルチコイド）、移植術および骨のターンオーバーに影響を与える他の非関連性の疾患を含む種々の因子によって引き起こされ得る。
【０００２】
骨粗しょう症は、世界中で２００万人にのぼる女性が発症し、そしてしばしば運動不能（ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ）、およびいくつかの場合には死亡を生じる。骨粗しょう症の生理学的特徴は、骨が骨折しやすくなる、低い骨質量である。骨粗しょう症ならびに骨および軟骨の他の疾患は、先進国において医療出費の大きな部分を占め、米国単独で、１４０億ＵＳドルが、骨粗しょう症の骨折の処置に毎年費やされる（非特許文献１）。骨粗しょう症に対する現在の処置は、主に、骨塩量の損失を遅延させるが、完全には覆さない。
【非特許文献１】Ｄｅｗｉｔｔ、「Ｎａｔｕｒｅ」、２００３年、第４２３号、ｐ．３１４−１５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、骨質量を増加させることによって骨疾患を処置する方法および組成物を有することが、所望される。このような方法および組成物は、本明細書中に提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、骨成長および骨密度を調節するための結合体化した薬物を提供する。一般に、本発明の化合物は、骨を標的化する部分と結合したβ−アドレナリン作動因子を含む結合体化した薬物であり、ここで骨を標的化する部分は、骨芽細胞に対するβ−アドレナリン作動因子の局所送達および／または有効性を、β−アドレナリン作動因子単独と比較して増大させる。
【０００５】
以下でより詳細に記載されるように、上記β−アドレナリン作動因子および骨を標的化する部分は、共有結合するか、または非共有結合し得る。
【０００６】
本発明の結合体のいくつかに対する１つの利益は、望ましくない副作用（例えば、身体の他の部分におけるアドレナリン拮抗作用またはアドレナリン亢進作用（ａｇｏｎｉｓｍ）から生じる影響）に対して、β−アドレナリン作動因子単独の治療指数より大きい治療指数を有することである。
【０００７】
特定の好ましい実施形態において、上記結合体化した薬物は、一般式（Ｉ）：
（Ａ）ｍ＊（Ｂ）ｎ
で表され、ここで：
Ａは、各存在に対し独立して、β−アドレナリン作動因子を表し；
Ｂは、各存在に対し独立して、骨を標的化する部分を表し；
ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１以上の整数を表し；そして
＊は、このβ−アドレナリン作動因子Ａとこの骨を標的化する部分Ｂとを結合する、共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用を示す。
【０００８】
特定の実施形態において、上記Ａ部分とＢ部分との間の結合相互作用は、結合体化した薬物が骨に分布しており、かつ／または局在化している生理学的状態下において、可逆的であり得るか、または代謝され得る（例えば、ＡまたはＡのプロドラッグ形態を放出する解離）。
【０００９】
他の実施形態において、上記Ａ部分とＢ部分との間の結合相互作用は、不可逆的である（例えば、前記β−アドレナリン作動因子は、この結合体化した形態において骨芽細胞に対してβ−アドレナリン作動活性を保持する）。
【００１０】
当業者は、本発明の結合体化した薬物は、上記β−アドレナリン作動因子がβ−アドレナリンアンタゴニストである実施形態、およびこのβ−アドレナリン作動因子がアゴニストである他の実施形態を含むことを理解する。
【００１１】
特定の実施形態において、本発明の結合体化した薬物は、哺乳動物（例えば、ヒト患者、愛玩動物（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｐｅｔ）および／または家畜）において同化を促進する（ａｎａｂｏｌｉｃ）骨成長および／または骨密度を増加させるための方法の一部として使用され得る。
【００１２】
他の実施形態において、本発明の結合体化した薬物は、哺乳動物（例えば、ヒト患者）、愛玩動物および／または家畜において同化を促進する骨形成を減少させるための方法の一部として使用され得る。
【００１３】
本発明のなお別の局面は、ヒト患者に使用するのに適切な形態で本発明の結合体化した薬物を含み、そして骨疾患の処置または予防におけるこの結合体化した薬物の適切な使用および副作用を説明する説明書ならびに／または表示を備える、パッケージ化された医薬品を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．概要）
本発明は、β−アドレナリンアンタゴニストおよびβ−アドレナリンアゴニスト（本明細書中で、集合的に「β−アドレナリン作動因子」）の骨標的化送達のための組成物、ならびに骨の密度および成長を調節するためにこのような組成物を使用する方法を特徴とする。一般的に、本発明の組成物は、、骨および他の骨芽細胞を含有する器官／区画へのβ−アドレナリン作動因子の分布および／または局在化を増強させる１つ以上の部分（本明細書中で、「骨を標的化する部分」）と（共有結合的にまたは非共有結合的に）結合したβ−アドレナリン作動因子を提供する。
【００１５】
本願において記載されるように、本発明者らは、骨芽細胞において、破骨細胞（ｏｓｔｅｃｌａｓｔ）の分化を助ける数種の遺伝子の発現を調節する能力によって、交感神経のシグナル伝達を、骨吸収の主要な調節因子として同定した。これまでの観察に加えてこの知見は、交感神経系（ＳＮＳ）が、最終的に骨損失をに寄与する骨の再構築の中心的な調節因子であることを示す。ＳＮＳによる骨吸収の再アップレギュレーションと一体となった骨形成のダウンレギュレーションは、骨再構築のための公知の生理学的な調節因子の全てに共通して独特である。これらの２つの機能は、常に同じ方向に同時に調節される必要はないこともまた、実証される。さらに、Ａｄｒｂ２遺伝子座のハプロ不全が骨再構築においてこのような深刻な帰結を有するという観察もまた、骨質量の制御における交感神経のシグナル伝達の重要性を際立たせる。
【００１６】
骨芽細胞がβ−アドレナリン作動性レセプターを発現すること、およびβ−アドレナリン作動因子が骨の密度および成長に影響し得ることは、これまでに記載されてきた。しかし、β−アドレナリン作動因子の全身投与は、種々の望ましくない副作用をもたらし得る。β−アドレナリンアンタゴニストは、例えば、気管支収縮、低血糖、心不全、およびＣＮＳ作用  （例えば、悪心、悪夢、不眠および抑うつ）、めまい、勃起不能もしくは勃起の維持の不能（インポテンス）、腕、手、脚、もしくは足の冷え（これらの領域に対する乏しい血流に起因する）、遅い心拍、息切れ、ならびに喘息を有する者における喘鳴を引き起こし得る。
【００１７】
これらの副作用は、いくつかの場合において、骨疾患の処置におけるβ−アドレナリン作動因子の潜在的な使用を制限し得る。
【００１８】
β−アドレナリン作動因子を骨に局在化させることによって、β−アドレナリン作動因子の本発明の骨標的性送達は、親のβ−アドレナリン作動因子の、有害かまたは所望されない効果を減少させ得る。また、相対的により高い用量が、このように骨に送達され得ることに起因して、処置のために必要とされるβ−アドレナリン作動因子の有効用量を減少させ得、さらに、所望されない副作用を減少させ得る。さらに、上記骨を標的化する部分は、それ自体が骨代謝（骨の吸収および形成を含む）に影響する因子であり得る。それらの実施形態において、β−アドレナリン作動因子と骨を標的化する部分との組み合わせは、相加効果または相乗効果を生じ得る。
【００１９】
さらに説明するために、本発明の骨標的化β−アドレナリン作動因子は、一般式（Ｉ）：
（Ａ）ｍ＊（Ｂ）ｎ
で表される結合体化した薬物を含み、ここで：
Ａは、各存在に対し独立して、β−アドレナリン作動因子（アゴニストまたはアンタゴニスト）を表し；
Ｂは、各存在に対し独立して、骨を標的化する部分を表し；
ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１以上の整数（好ましくは１〜６、およびより好ましくは１〜２）を表し；そして
＊は、このβ−アドレナリン作動因子Ａとこの骨を標的化する部分Ｂとを結合する、共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用を示す。
【００２０】
特定の実施形態において、Ａ部分とＢ部分との間の結合相互作用は、結合体化した薬物が骨および身体中の他の骨芽細胞を含む器官または部位に分布しており、かつ／または局在化している生理学的状態下において、可逆的であり得るか、または代謝され得る。それらの実施形態において、この解離は、ＡまたはＡのプロドラッグ形態を放出する。他の実施形態において、各β−アドレナリン作動因子が、骨芽細胞に対する効果に関して、結合体化した薬物形態である場合ですら、β−アドレナリン作動活性を保持する場合、このＡ部分とＢ部分との間の結合相互作用は、不可逆的である。
【００２１】
ｍが２以上であり、そして２つの異なるβ−アドレナリン作動因子が薬物結合体で提供される実施形態において、各々は、好ましくは同じ分類のβ−アドレナリン作動因子である（すなわち、各Ａは、アゴニストであるか、または各Ａは、アンタゴニストである）。
【００２２】
特定の好ましい実施形態において、上記結合体化した薬物は、一般式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ
で表され、ここでＡおよびＢは、上記のように定義され、そしてＬは適切に、ＡおよびＢの原子の間の共有結合であるか、またはＡとＢとを連結する共有結合性リンカーであって、この結合体化した薬物を形成する。
【００２３】
さらに説明するために以下でより詳細に記載されるが、上記リンカー基はアルキレン鎖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、ポリスクシニル無水物、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（エチレンイミン）、オリゴ糖、アミノ酸鎖、または任意の他の適切な連結であり得る。特定の実施形態において、このリンカー基は、それ自体、生理学的状態下において安定であり得る（例えば、アルキレン鎖）。
【００２４】
他の実施形態において、上記結合体化した薬物に使用されるリンカーは、例えば、酵素（例えば、この連結は、ペプチダーゼに対する基質であるペプチド配列を含む）によってか、または加水分解（例えば、この連結としては、エステル、アミド、カルバメート、カルボネート、環状ケタール、チオエステル、チオアミド、チオカルバメート、チオカルボネート、キサンテートおよびリン酸エステルから選択される１つ以上の加水分解可能な基が挙げられる）によって、生理学的状態下において代謝（分解）され得る。このように、リンカーＬは代謝されて、ＡまたはＡのプロドラッグ形態を放出するが、少なくともこの結合体が標的化された骨芽細胞の近くに送達されるまで、インタクトなままであるために十分に安定である。骨に特異的な治療剤の標的化された放出は、標的骨領域の条件下において選択的に不安定である、連結する結合または部分を選択することによって、達成され得る。単なる例として、酸に不安定なリンカーは、骨の低いｐＨ環境下において優先的に切断されるリンカーであり得る。例えば、このリンカーは、ｐＨ７と比較して、６または５より低いｐＨで、２倍、５倍、１０倍、１００倍または１０００倍も速い速度で加水分解を受けるリンカーであり得る。別の例として、この連結する結合または部分は、標的領域において選択的に活性な酵素によって酵素的に切断され得る。例えば、このリンカーは、ピロホスフェート分子であり得る。骨を標的化する部分が骨基質に結合した後、骨芽細胞によって分泌されるアルカリホスファターゼは、このピロホスフェート連結を切断し、標的化された骨芽細胞の近位にβ−アドレナリン作動因子を放出し得る。
【００２５】
他の実施形態において、このリンカーは、代謝されないが、このリンカーも骨を標的化する部分も、Ａのアドレナリン作動活性を大きく妨げない。
【００２６】
さらに他の実施形態において、上記薬物は、一般式（ＩＩＩ）：
Ａ：：Ｂ
で表され、ここでＡは、β−アドレナリン作動因子またはそのプロドラッグを表し；Ｂは、骨を標的化する部分を表し；そして：：は、適切な生理学的状態下で解離して標的化された骨芽細胞の近傍においてＡを放出する、ＡとＢとの間のイオン結合を表す。
【００２７】
なお他の実施形態において、骨を標的化する部分およびβ−アドレナリン作動因子は、リンカー対の非共有結合性相互作用を介して結合する。例えば、このリンカー対は、一般式（ＩＶ）：
［（Ａ−Ｌ’］ｎ［Ｂ−Ｌ’’］ｍ
で表され、ここで：
Ａ、Ｂ、ｎおよびｍは、上記のように定義され；そして
Ｌ’およびＬ’’は独立して、他の基と非共有結合してこの薬物結合体を形成する、連結基を表す。適切なＬ’／Ｌ’’対の例は、ビオチンおよびストレプトアビジンである。
【００２８】
別の治療剤と結合体化して多機能性（例えば、二機能性が挙げられる）薬物結合体を形成することもまた、所望され得る。例えば、この薬物結合体は、一般式（Ｖ）：
（Ａ）ｍ＊（Ｂ）ｎ（Ｔ）ｐ
で表され、ここで：
Ａ、Ｂ、ｎ、ｍおよび＊は、上記のように定義され；
Ｔは、β−アドレナリン作動因子以外の治療因子を表し；そして
ｐは、１以上の整数である。
【００２９】
例示的な治療剤において、Ｔとしては、エストロゲンまたはそれらの等価物、抗エストロゲン因子、カルシトニン、ビスホスホネート、カルシウム補給因子、コバラミン、百日咳毒素、ホウ素、ＤＨＥＡおよび他の骨成長因子（例えば、トランスホーミング増殖因子β、アクチビン、骨形態形成タンパク質、（ＨＧＨ）ヒト成長ホルモン、（ＥＧＦ）上皮成長因子、または（ＦＧＦ）線維芽細胞成長因子）が挙げられ得る。例えば、例示的な二機能性結合体は、骨にβ−アドレナリンアンタゴニストを送達する能力ならびに別の骨形成因子（例えば、エストロゲン）を有するものである。
【００３０】
好ましい実施形態において、本発明の結合体化した薬物は、骨の疾患または状態の処置において、β−アドレナリン作動因子そのものと比較して、より高い治療指数（ＴＩ）を有する。薬物の「治療指数」とは、治療剤が望ましくない効果を発揮する濃度  対  その治療剤が所望の効果を発揮する濃度の比をいう。より高い治療指数は、それがより広い安全域を提供する場合に好ましい。
【００３１】
上に記載されるように、β−アドレナリンアンタゴニストは、骨以外の部位において種々の有害な副作用を有することが公知であり、これらの副作用としては、例えば、気管支収縮、低血糖、心不全、およびＣＮＳ作用（例えば、悪心、悪夢、不眠および抑うつ）、めまい、勃起不能もしくは勃起の維持の不能（インポテンス）、腕、手、脚、もしくは足の冷え（これらの領域に対する乏しい血流に起因する）、遅い心拍、息切れ、ならびに喘息を有する者における喘鳴が挙げられる。
【００３２】
骨に対してβ−アドレナリンアンタゴニストを標的化することによって、本発明の結合体は、同一であるが結合体化されていないβ−アドレナリンアンタゴニストと比較して、より高いＴＩを有し得る。治療指数の増大は、以下のような投薬上の特徴に寄与し得る：（１）β−アドレナリンアンタゴニストを骨に特異的に送達することによって、患者の循環中のβ−アドレナリンアンタゴニストの濃度が効率的に減少し、身体の他の部分において有害作用の減少を生じる；そして／または（２）β−アドレナリンアンタゴニストの骨標的化送達は、治療的に有効な結果をもたらすβ−アドレナリンアンタゴニストの量を減少させ得る（すなわち、より低い用量（モル）のβ−アドレナリンアンタゴニストが投与される。
【００３３】
したがって、１つの実施形態において、少なくとも１つの望ましくない副作用に関して、本発明の組成物は、β−アドレナリン作動因子単独より少なくとも５倍大きく、そしてより好ましくは少なくとも１０倍、５０倍、１００倍または１０００倍も大きい、骨の密度または成長を調節する治療指数を有し得る。例えば、この結合体化した薬物の治療指数は、１つ以上の副作用に対してより高いものであり得、これらの副作用としては、例えば、悪心、悪夢、不眠および抑うつ、心不全、および／または  低血糖、めまい、勃起不能もしくは勃起の維持の不能（インポテンス）、腕、手、脚、もしくは足の冷え（これらの領域に対する乏しい血流に起因する）、遅い心拍、息切れ、ならびに喘息を有する者における喘鳴が挙げられる。
【００３４】
好ましい実施形態において、本発明の骨標的化β−アドレナリン作動因子は、β−アドレナリン作動因子単独より少なくとも２倍大きい（より好ましくは、少なくとも５倍、１０倍、または２０倍も大きい）治療指数を有する。β−アドレナリンアンタゴニストは、特に、喘息、慢性気管支炎もしくは肺気腫に罹患する患者、または悪化するかもしくは重篤な心不全を有する患者において使用され得る。
【００３５】
例示的な実施形態において、本発明の結合体化した薬物は、骨疾患（例えば、骨粗しょう症、若年性骨粗しょう症、骨形成不全症、高カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、溶骨性骨疾患、骨壊死、骨のパジェット病、慢性関節リウマチに起因する骨損失、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイドの処置、歯周部の骨損失、骨格転移（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、癌に起因する骨損失、加齢性の骨損失、骨減少症、および変形性関節疾患）の処置または防止、ならびに骨の修復または置換の促進が所望される場合（例えば、骨折、骨の欠損、形成外科手術、歯科移植および他の移植）において使用され得る。
【００３６】
特定の実施形態において、本発明は、選択的β２アゴニストおよび選択的β２アンタゴニストに関する組成物および方法を提供する。
【００３７】
（ＩＩ．定義）
アドレナリン作動性レセプターは、２つの広いクラス（α−アドレナリン作動性レセプターおよびβ−アドレナリン作動性レセプター）に分類されている内在性膜タンパク質である。両方の型のアドレナリン作動性レセプターは、カテコールアミンの結合によって末梢交感神経系の働きを媒介する。これらの化合物に対するアドレナリン作動性レセプターの結合親和性は、この分類の１つの基礎を形成する（αレセプターは、エピネフリンより強く、そして合成化合物イソプロテレノールよりずっと強く、ノルエピネフリンを結合する傾向にある）。これらホルモンの好ましい結合親和性は、βレセプターに関して逆である。多くの組織において、レセプターの活性化によって誘導されるこの機能的応答（例えば、平滑筋の収縮）は、βレセプター結合によって誘導される応答と反対である。
【００３８】
次に、αレセプターとβレセプターとの間の機能的区別は、種々の動物および組織の供給源由来のこれらのレセプターの薬理学的な特徴付けによって、さらに強調され、そして細分化（ｒｅｆｉｎｅ）された。結果として、α−アドレナリン作動性レセプターおよびβ−アドレナリン作動性レセプターは、α１サブタイプ、およびα２サブタイプならびにβ１サブタイプ、β２サブタイプ、およびβ３サブタイプへと、さらに細分化（ｓｕｂｄｉｖｉｄ）された。
【００３９】
用語「β−アドレナリンアンタゴニスト」および「βブロッカー」は、それぞれ、β−アドレナリン作動性レセプターに結合する因子、およびβ−アドレナリン作動性刺激の効果を阻害する因子をいう。
【００４０】
用語「選択的β２アンタゴニスト」は、β２−アドレナリン作動性レセプターに対して選択的であるβ−アドレナリン遮断活性を有する活性因子を意味する。
【００４１】
「アドレナリンアゴニスト」とは、アドレナリン作動性レセプターのシグナル伝達活性を、活性化するか、誘導するか、またはその他に増加させる因子をいう。アドレナリンアゴニストとしては、タンパク質、抗体、有機低分子または炭水化物が挙げられ得るが、これらに限定されない。β−アドレナリンアゴニストの例としては、カテコールアミンおよびカテコールアミンアナログ、イソプロテレノール、ドパミン、およびドブタミンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
用語「選択的β２アゴニスト」は、β２−アドレナリン作動性レセプターに対して選択的であるβ−アドレナリン作動性誘導活性を有する活性因子を意味する。
【００４３】
用語「骨疾患」とは、骨についての健康もしくは完全性の損失を生じるかまたはそれによって特徴付けられる、そして骨の密度、成長および／または形成の、望ましくないか、または所望されない増加ならびに減少を含む、任意の骨の疾患、障害または状態をいう。骨疾患としては、骨粗しょう症、骨減少症、欠陥のある骨形成または骨吸収、パジェット病、骨折（ｆｒａｃｔｕｒｅ）および骨折（ｂｒｏｋｅｎ  ｂｏｎｅ）、骨転移、大理石骨病、骨硬化症ならびに骨軟骨症が挙げられるが、これらに限定されない。β−アドレナリンアンタゴニストを組み込む薬物結合体の場合において、本発明に従って処置され得そして／または防止され得る例示的な骨疾患としては、対応する非疾患性の骨の骨質量と比較して減少した骨質量によって特徴付けられる骨疾患（例えば、骨粗しょう症、骨減少症およびパジェット病）が挙げられる。β−アドレナリンアゴニストを組み込む薬物結合体は、対応する非疾患性の骨の骨質量と比較して増加した骨質量によって特徴付けられる骨疾患を処置するために使用され得、そしてこの骨疾患としては、大理石骨病、骨硬化症および骨軟骨症が挙げられる。
【００４４】
本発明の薬物結合体は、骨疾患の予防および処置の両方に使用され得る。骨疾患の「予防」は、疾患の発症を予防するために、発病前に積極的に介入する工程を含む。骨疾患の「処置」は、疾患または状態を遅らせるか、疾患または状態の症状を寛解させるか、または疾患または状態を反転させるために、発病後に積極的に介入する工程を包含する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「と結合された（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）」または「結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」または「に対して結合された（ｂｏｕｎｄ  ｔｏ）」は、結合体の１つの成分の、別の成分に対する接着、連結、またはその他に拡散結合をいうことが意味される。β−アドレナリン作動因子と骨を標的化する部分との結合は、共有結合、水素結合、金属結合、ファンデルワールス力、イオン結合、疎水性もしくは親水性の力、吸着または吸収、錯体型の結合、またはそれらの任意の組み合わせを介するものであり得る。溶解力または分散力もまた、「と結合された」または「結合」または「に対して結合された」の意味の範囲内に企図され、ここでβ−アドレナリンアンタゴニスト部分は、溶解され、したがって溶媒によって溶媒和され得る。
【００４６】
用語「共有結合性リンカー」とは、直接的な結合、または２つ以上の不連続であり、そしてそうでなければ分離している薬学的に活性な部分の官能基を組み込み、そして連結する原子の群をいう。「可逆的」な共有結合性リンカーは、生理学的状態下において、（例えば、酵素活性、加水分解などによって）代謝されて、活性なβ−アドレナリン作動因子またはそのプロドラッグを生成するものである。好ましくは、この共有結合性リンカー部分は、実質的に直鎖状の部分であり、そして５０個以下の原子、およびよりさらに好ましくは２５個の原子、または１０個でさえある原子を含む。好ましいリンカーは、代謝されたときに、不連続であり、そして分離した化学的実体として薬学的に活性なβ−アドレナリン作動因子（またはそれらのプロドラッグ）を生成し、そして任意の副生物もまた生じる場合、このような副生物は、一般に、薬物結合体の投薬濃度において不活性である、リンカーである。
【００４７】
用語「ＥＤ５０」は、その最大限の応答または効果の５０％をもたらす薬物の用量を意味する。あるいは、この用量は、試験対象物または試験調製物の５０％の予め決定された応答をもたらす。
【００４８】
（ＩＩＩ．例示的なβ−アドレナリンアンタゴニスト）
本発明の骨標的化薬物結合体を形成するのに有用なβ−アドレナリンアンタゴニストおよびβ−アドレナリンアゴニストとしては、有機低分子、ペプチド、タンパク質、抗体、および炭水化物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、これらのβ−アドレナリン作動因子は、α−アドレナリン作動性レセプターと比較した場合にβ−アドレナリン作動性レセプターに対して選択的であり、そしてα−アドレナリン作動性レセプター活性において顕著な効果を有さない。
【００４９】
本発明のβ−アドレナリンアンタゴニスト結合体の例示的なクラスは、以下の一般構造（ＶＩ）：
【００５０】
【化３】
2007537297.tif 000003
で表される構造を有し、ここで：
Ｒ１は、−Ｌ−Ｂ、置換もしくは非置換の環状部分または脂肪族部分、あるいはＣ、Ｎ、およびＯから選択される１つ以上のヘテロ原子を含み得る単環構造ならびに多環構造を含む環状部分を表し；そして
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、−Ｌ−Ｂ、水素、または置換アルキルおよび非置換アルキルを表し；
Ｒ４は、−Ｌ−Ｂ、または水素を表し；
Ｌは適切に、共有結合または共有結合性リンカーであり；
Ｂは、骨を標的化する部分を表し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは、−Ｌ−Ｂである、
使用され得るβ−ブロッカーの別のクラスは、特定の４−（３−置換アミノ−２−ヒドロキシプロポキシ）−１，２，５−チアジアゾールである。本発明において有用な例示的なチアジアゾール結合体は、以下の一般構造（ＶＩＩ）：
【００５１】
【化４】
2007537297.tif 000004
で表される構造ならびにその光学活性異性体および薬理学的に受容可能な塩を有し、ここで：
Ｒ’１は、−Ｌ−Ｂ；水素；ハロゲン（好ましくは、塩素または臭素）；直鎖状または分枝状の鎖（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル（イソ−ブチル、第二級−ブチルまたは第三級−ブチル）およびアミル）のいずれかを有するＣ１〜５アルキル；Ｃ２〜５アルケニル（例えば、ビニル、アリル、メタリルなど）；構造Ｙ−Ｘ−Ｚ−を有する基であって、ここでＹが、フェニル基によって、必要に応じて置換される直鎖Ｃ１〜４アルキルもしくは分枝鎖Ｃ１〜４アルキル、または１つ以上のハロゲン原子（特に、塩素、臭素、フッ素）、ヒドロキシ、Ｃ１〜３アルキルもしくはＣ１〜３アルコキシで必要に応じて置換されるフェニルであり、Ｘが、酸素または硫黄であり、そしてＺが、メチルまたはエチルである、構造Ｙ−Ｘ−Ｚ−；構造Ｒ’’−ＨＮＣＯを有するカルバモイル基であって、ここでＲ’’が、Ｃ１〜５アルキルである、カルバモイル基；Ｃ１〜５シクロアルキル（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなど）；Ｃ１〜４アルコキシ（直鎖または分枝鎖のいずれかであり、そしてメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、およびペントキシを含む）；フェニルまたは置換フェニルであって、ここで置換基が、１つ以上のハロゲン原子（好ましくは、塩素またはフッ素）、Ｃ１〜３アルキルまたはＣ１〜３アルコキシルから選択される、フェニルまたは置換フェニル；フェニル−低級アルキルであって、ここでこのフェニル部分が、置換されないか、または１つ以上のハロゲン原子（好ましくは、塩素、フッ素、または臭素）、Ｃ１〜３アルキルもしくはＣ１〜３アルコキシルによって置換され得る、フェニル−低級アルキル；構造−Ｎ（−Ｒ’２）Ｒ’３を有するアミンであって、ここでＲ’２が、水素、低級アルキルおよびヒドロキシ−置換低級アルキルを表し、Ｒ’３が、水素、低級アルキル、ヒドロキシ−置換低級アルキルおよびフェニルを表すか、またはＲ’２とＲ’３とが、直接１つに連結されて、Ｒ’２およびＲ’３が結合する窒素を有する３員環〜７員環（例えば、アジリジニル基、アゼチジニル基、ピロリジニル基、ピペリジニル基、またはヘキサヒドロアゼピニル基を形成する）であって、この３員環〜７員環は、置換されないかもしくは、好ましくは、１つ以上の低級アルキルおよびヒドロキシ−低級アルキルによって置換される３員環〜７員環を生じるか、あるいはＲ’２とＲ’３とが、酸素原子、窒素原子もしくは硫黄原子を介して連結されて、必要に応じて低級アルキルによって置換された５員環または６員環（例えば、モルホリノ、ヘキサヒドロピリミジル、チアゾリジニル、ｐ−チアイニル（ｔｈｉａｉｉｎｙｌ）、ピペラジニルなど）を形成し得る、アミン；あるいはヘテロ原子として酸素、窒素もしくは硫黄を有する５員または６員の複素環式環（好ましくは、２−フリル、２−チエニルまたは３−チエニル、２−ピリル（ｐｙｒｒｙｌ）またはｏ−ピリジル、ｍ−ピリジルまたはｐ−ピリジル）を表し；
Ｒ’２、Ｒ’３およびＲ’４は、それぞれ独立して、−Ｌ−Ｂまたは水素を表し；
Ｌは適切に、共有結合または共有結合性リンカーであり；
Ｂは、骨を標的化する部分を表し、
Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３およびＲ’４の少なくとも１つは、−Ｌ−Ｂである。
【００５２】
骨標的化薬物結合体を形成するために使用される例示的なβ−アドレナリンアンタゴニストとしては、以下のラセミ形態ならびに鏡像異性形態が挙げられる：Ａｃｃ  ９３６９、アセブトロール、アルプレノロール、ＡＭＯ−１４０、アモスラロール、アロチノロール、アテノロール、ベフノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブシンドロール、ブクモロール、ブニトロロール、ブノロール、ブプラノロール、ブトフィロロール、ブトキサミン、カプシノロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベディロール  、セリプロロール、シクロプロロール、クロラノロール、ＣＰ−３３１６８４、ジアセトロール、ジレバロール、ジプラフェノン、エルセンチリド、エスモロール、エクサプロロール、ファリントロール、Ｆｒ−１７２５１６、ヒドロキシレボブノロール（Ｈｙｄｏｒｏｘｙｌｅｖｏｂｕｎｏｌｏｌ）、ＩＣＩ  １１８５５１、インデノロール、ＩＰＳ  ３３９、イソキサプロロール、ＩＳＶ−２０８、Ｌ−６５３３２８、ラベトロール（Ｌａｂｅｔｏｌｏｌ）、レボブノロール、レボプロロール（Ｌｅｖｏｐｒｏｌｏｌ）、ＬＭ−２６１６、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、ナドロール、ネビボロール、ニフェナロール、オクスプレノロール、パマトロール、ペンブトロール、ピンドロール、プラクトロール、プロシノロール、プロプラノロール、ＳＢ−２２６５５２、ソタロール、ＳＲ−５８８９４Ａ、ＳＲ−５９２３０Ａ、タゾロール、チエノキソロール、チモロール、チプレノール、トリプロロール、トプロール、ＴＺＣ−５６６５、ＵＫ−１７４５、Ｖｉｓｋｅｎｉｔ、キサモテロール、ＹＭ−４３０、など。
【００５３】
上記β−アドレナリンアンタゴニストは、それらの標的選択性に基づいて、さらに以下の２つの群に分けられ得る：（１）３つ全てのβレセプターを遮断する非選択的β−アドレナリンアンタゴニスト（例えば、プロプラノロール）；（２）βレセプターの１つのサブタイプを選択的にブロックする選択的β−アドレナリンアンタゴニスト。選択的β−アドレナリンアンタゴニストは、高用量にて選択性を失い得る。選択的β−アドレナリンアンタゴニストとしては、選択的β１アドレナリンアンタゴニスト（例えば、アテノロールおよびプラクトロール）、選択的β２アドレナリンアンタゴニスト（例えば、ブトキサミン）、および選択的β３アドレナリンアンタゴニストが挙げられる。本発明において使用されるβ−アドレナリンアンタゴニストは、これらの３つの群のいずれかに属し得る。しかし、特定の好ましい実施形態において、このβ−アドレナリンアンタゴニストは、β２アドレナリン作動性レセプターを選択的に阻害するものである。例示的な非選択的β−アドレナリンアンタゴニストとしては、ナドロール、プロプラノロール、サタロール（ｓｏｔａｌｏｌ）およびチモロールが挙げられる。本発明において使用するための安定な選択的β２アンタゴニスト活性を有する著しい数の化合物が、公知である。これらとしては、ブトキサミン、ＩＣＩ  １１８，５５１、Ｈ３５／２５、プレナルテロール（ｐｒｅｎａｌｔｅｒｏｌ）、種々の４−［２−ヒドロキシ−３−（イソプロピルアミノ）プロポキシ］ベンゾイミダゾールおよび５−［２−ヒドロキシ−３−（イソプロピルアミノ）プロポキシ］ベンゾイミダゾール、１−（ｔ−ブチル−アミノ−３−オール−２−プロピル）オキシミノ−９フルオレンおよび種々の２−（α−ヒドロキシアリールメチル）−３，３−ジメチルアジリジンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物の合成の方法、β２／β１の選択性の比、ならびに種々の生物学的特性および薬理学的特性は、公知であり、そして例えば、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８８、３２（９）、６５９−６６０；  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２２（２）、２１０−２１４（１９７９）；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２１（１）、６８−７２（１９７８）；  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０（１２）、（１９７７）；およびＢｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、６０（３）、３５７−３６２（１９７７）（これらの全ては、本明細書中で参考として援用される）に報告される。種々の他の選択的β２アドレナリンアンタゴニストは、米国特許第４，６２５，５８６号（この全体は、本明細書中に援用される）に記載される。
【００５４】
β２−アドレナリン作動性レセプターは、骨格筋および平滑筋、骨、軟骨、結合組織、腸、肺、気管支腺、肝臓ならびに膀胱中に主に見出される。β１−アドレナリン作動性レセプターは、心臓、血管および脂肪組織中に主に見出される。したがって、特定の好ましい実施形態において、β−アドレナリンアンタゴニストは、β１−レセプターと比較して、β２−レセプターに対する阻害および／または結合において、少なくとも１０倍より大きい効力を示す（すなわち、少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、５０倍または１００倍ものβ２／β１の選択性の比を有する）。β１レセプターおよびβ２レセプターに対する種々の活性因子の親和性は、β２レセプターの大多数を含む組織（例えば、ウサギ毛様体突起、ラット肝臓、ネコ脈絡叢またはネコ肺）、β１レセプターの大多数を含む組織（例えば、ネコおよびモルモットの心臓）、および混合物を含む組織（例えば、モルモット気管）を評価することによって決定され得る。これらの異なる型の組織に対する相対的な結合選択性を決定する方法は、Ｏ’ＤｏｎｎｅｌｌおよびＷａｎｓｔａｌｌ、Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏ．、３０８，１８３−１９０（１９７９）、Ｎａｔｈａｎｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０４、８４３−８４４（１９７９）、Ｎａｔｈａｎｓｏｎ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２６、１７９３−１７９９（１９８０）、Ｍｉｎｎｅｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１５，２１−３３（１９７９ａ）、およびＭｉｎｎｅｍａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２１１、５０２−５０８（１９７９）（これらの全ては、本明細書中で参考として援用される）に広範に開示される。
【００５５】
他の実施形態において、β−アドレナリンアンタゴニストの選択性は、他の組織ではなく骨における結合体の局在化および／または活性なアンタゴニストの限局的な放出の結果である。
【００５６】
（ＩＶ．例示的な骨標的化分子）
適切な骨標的化分子は、本発明の薬物結合体の構成成分として使用される場合、この結合体の少なくとも一部（具体的には、骨に送達される結合体のβ−アドレナリン作動因子）を生じるものである。言い換えると、適切な骨標的化分子は、治療剤と結合した場合、この薬剤の薬理学的効果の発揮を、骨（この場合においては、骨芽細胞）に対して優先的にもたらす。この標的化する分子は、標的選択性を示す化学的機能性を適切に含む、例えば、ホルモン（例えば、生物反応改変因子）および例えば、特異的な細胞表面抗原に対して必須の標的選択性を有する抗体（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）、または抗体フラグメントである。
【００５７】
本発明の骨標的化分子としては、テトラサイクリン、カルセイン、カルシトニン、ビスホスホネート、キレート剤、ホスフェート、ポリホスフェート、ピロホスフェート、ホスホネート、ジホスホネート、テトラホスホネート、ホスホナイト、イミドジホスフェート、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、アミノリン糖酸、エストロゲン、骨の無機質相に結合されることが公知であるペプチド（例えば、オステオネクチン、骨シアロタンパク質およびオステオポンチン）、骨の無機質結合ドメインを有するタンパク質（オステオカルシンおよびオステオカルシンペプチド）などが挙げられ得る。
【００５８】
本発明の骨標的化分子としてはまた、β−アドレナリン作動因子のためのキャリアとして機能し得る反復性の酸性アミノ酸のペプチドが挙げられ得る。適切な酸性小ペプチドの例としては、Ａｓｐオリゴペプチド、Ｇｌｕオリゴペプチド、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ（Ｇｌａ）オリゴペプチド、ならびにＡｓｐと、Ｇｌｕと、Ｇｌａとの組み合わせを含むペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。（Ａｓｐ）６または（Ｇｌｕ）６は、ＡｓｐオリゴペプチドおよびＧｌｕオリゴペプチドの例である。
【００５９】
上記骨標的化分子としてはまた、分子自身が骨吸収および骨形成の速度に影響を与える分子（例えば、ビスホスホネート、エストロゲンおよび他のステロイド（例えば、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）））が挙げられ得る。これらの骨標的化分子は、骨に対する親和性を有し得、そしてまた、骨成長の治療特性を有し得そして／または骨吸収もしくは骨形成におけるβ−アドレナリン作動因子との相乗効果または相加効果を生じ得る。このような分子の例は、ビスホスホネートおよびフッ化物である。
【００６０】
以下の節は、本発明の結合体化した薬物を形成するために使用されるいくつか骨標的化分子の、より詳細な説明を提供する。
【００６１】
（１．ビスホスホネート）
ビスホスホネートは、中心の胚炭素（ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃａｒｂｏｎ）に結合される２つのホスホネート基を含む合成化合物である。ビスホスホネートの２つの特徴は、それらを所望の骨標的化分子にする。第１に、ビスホスホネートは、骨に対する親和性を有する：それらは、骨組織によって骨選択的（ｏｓｔｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）に取り込まれる。いくつかのビスホスホネート化合物の使用に基づく骨のスキャニング剤が過去において使用されて、望ましい高解像度の骨スキャンが達成された（例えば、Ｋｅｌｌｙらに対する米国特許第４，８１０，４８６号を参照のこと）。第２に、ビスホスホネートは、骨疾患に対する有用な治療剤である。ビスホスホネートは、骨損失を阻害し得、破骨細胞の活性を妨害し、その結果、骨損失が減少するような様式で作用すると考えられる。ビスホスホネートは、パジェット病、骨粗しょう症、慢性関節リウマチ、および変形性関節症が挙げられる骨疾患の処置において有用である（例えば、Ｓｕｇｉｏｋａらに対する米国特許第５，４２８，１８１号を参照のこと）。
【００６２】
ビスホスホネートは、中心の胚炭素（ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃａｒｂｏｎ）に結合された２つのさらなる鎖（それぞれ、Ｒ−１およびＲ−２）を含む。２つの側鎖の有効性は、多くの置換体および異なる薬理学的特性を有する種々のアナログの開発を可能にする。その活性は、化合物の間で大きく異なり、最も新しいビスホスホネートは、エチドロネート（記載された最初のビスホスホネート）より５，０００倍〜１０，０００倍高い活性である。作用機構は、以下を含む：
ａ）破骨細胞の活性に対する直接の効果；
ｂ）破骨細胞の補充に対する直接および間接の効果（後者は、骨芽細胞の系統の細胞によって媒介され、そして破骨細胞の補充のインヒビターの産生に関与する）；および
ｃ）破骨細胞の生存のアポトーシスによる短縮。多量のビスホスホネートはまた、結晶成長の物理化学的な阻害によって鉱化を阻害し得る。Ｐ−−Ｃ−−Ｐを一緒に含むＲ−１構造は、主に、骨の無機質に対する結合およびビスホスホネートの物理化学的作用を担う。Ｒ−１におけるヒドロキシル基は、これらの作用のために最適な状態を提供する。Ｒ−２は、これらのビスホスホネートの抗吸収性（ａｎｔｉｒｅｓｏｒｐｔｉｖｅ）作用を担い、そしてこの分子のこの部分の小さな改変または立体構造上の制限は、抗吸収性の効力において際立った違いをもたらす。Ｒ−２中のアルキル鎖または環構造における窒素官能基の存在は、抗吸収性の効力およびビスホスホネートの骨吸収に対する特異性を大きく向上させ、そしてより新しく強力なビスホスホネートのほとんどは、それらの構造中に窒素を含む。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「ビスホスホネート（ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）」および「ビスホスホネート（ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）」は、ジホスホネート、ビホスホン酸、およびジホスホン酸、ならびにこれらの物質の塩および誘導体を包含することをも意味する。ビスホスホネートに関して、特定の命名法の使用は、特に明記されない限り、本発明の範囲を限定することを意味しない。本明細書中で有用なビスホスホネートの例としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：アレンドロン酸、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸、アレンドロネート（アレンドロン酸ナトリウムまたはアレンドロン酸一ナトリウム三水和物としても公知である）、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸一ナトリウム三水和物。アレンドロン酸およびアレンドロネートは、１９９０年５月１日に発行されたＫｉｅｃｚｙｋｏｗｓｋｉらに対する米国特許第４，９２２，００７号、および１９９１年５月２８日に発行されたＫｉｅｃｚｙｋｏｗｓｋｉに対する同第５，０１９，６５１号（これらの両方は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載される。シクロヘプチルアミノメチレン−１，１−ビスホスホン酸（ＹＭ  １７５、Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ（シマドロネート（ｃｉｍａｄｒｏｎａｔｅ）））は、１９９０年１１月１３日にに発行されたＩｓｏｍｕｒａらに対する米国特許第４，９７０，３３５号（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載され、１−ジクロロメチレン−１，１−ジホスホン酸（クロドロン酸）、およびその二ナトリウム塩（クロドロネート（ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）、ＰｒｏｃｔｅｒおよびＧａｍｂｌｅ）は、ベルギー特許第６７２，２０５号（１９６６）およびＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ  ３２、４１１１（１９６７）（これらの両方は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載される。１−ヒドロキシ（１−ピロリジニル）−プロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（ＥＢ−１０５３）。１−ヒドロキシエタン−Ｉ，Ｉ−ジホスホン酸（エチドロン酸）。１−ヒドロキシ（Ｎ−メチル−Ｎ−ペンチルアミノ）プロピリデン−１，Ｉビスホスホン酸（ＢＭ−２１０９５５、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（イバンドロネート）としても公知である）は、１９９０年５月２２日に発行された米国特許第４，９２７，８１４号（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載される。６−アミノ−１−ヒドロキシヘキシリデン−１，１−ビスホスホン酸（ネリドロネート）（ｎｅｎ’ｄｒｏｎａｔｅ）。３−（ジメチルアミノ）−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（オルパドロネート（ｏｌｐａｄｒｏｎａｔｅ））。３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン−Ｉ，Ｉ−ビスホスホン酸（パミドロネート）。［２−（２−ピリジニル）エチリデン］−Ｉ，Ｉ−ビスホスホン酸（ピリドロネート）は、米国特許第４，７６１，４０６号（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載される。１−ヒドロキシ（３−ピリジニル）−エチリデン−１，１−ビスホスホン酸（リセドロネート）、（４−クロロフェニル��チロメタン−Ｉ，Ｉ−ビスホスホン酸（ｄｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（チルドロネート）は、Ｂｒｅｌｉｅｒｅらに対する米国特許第４，８７６，２４８号（１９８９年１０月２４日）（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載される。１−ヒドロキシ（ＩＨ−イミダゾールイル）エチリデン−１，１−ビスホスホン酸（ゾレンドロネート（ｚｏｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ））。アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、リセドロネート、ピリドロネート（ｐｉｒｉｄｒｏｎａｔｅ）、パミドロネート、ゾレドロネート、それらの薬学的に受容可能な塩または薬学的に受容可能なエステル、およびそれらの混合物からなる群より選択されるビスホスホネートが、好ましい。アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート、それらの薬学的に受容可能な塩または薬学的に受容可能なエステル、およびそれらの混合物が、より好ましい。アレンドロネート、その薬学的に受容可能な塩およびその混合物が、より好ましい。アレンドロン酸一ナトリウム三水和物が、最も好ましい。他の実施形態において、他の好ましい塩は、イバンドロネートのナトリウム塩、およびリセドロン酸一ナトリウムヘミ−ペンタ水和物（すなわち、一ナトリウム塩の２．５水和物）である。ＷＯ０２／９８３５４（この内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００６４】
（２．フッ化物）
フッ化物は、二機能性の骨標的化分子の別の例である。フッ化物は、骨によって取り込まれ得、そして骨の無機質に対して（骨の構造および機能において）骨芽細胞のレベルにて二相性作用を発揮し得る。フッ化物は、単独かまたは抗吸収剤と組み合わせて、骨粗しょう症を処置するために使用されてきた。ＲｕｂｉｎおよびＢｉｌｅｚｉｋｉａｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．、３２：  ２８５−３０７；  Ｐａｋら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．６：２２９−３４。
【００６５】
本発明において使用されるフッ化物は、フッ化ナトリウムの形態であり得る。用語フッ化ナトリウムとは、全ての形態にあるフッ化ナトリウム（例えば、徐放性フッ化ナトリウム、持続放出型フッ化ナトリウム）をいう。持続放出型フッ化ナトリウムは、米国特許第４，９０４，４７８号（この開示は、本明細書によって参考として援用される）に開示される。フッ化ナトリウムの活性は、生物学的プロトコールにしたがって、当業者によって容易に測定される（例えば、Ｅｒｉｋｓｅｎ  Ｅ．Ｆ．ら、Ｂｏｎｅ  Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４、１〜７４ページ；Ｇｒｉｅｒ  Ｓ．Ｊ．ら、Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｄｕａｌ−Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｉｎｖ．Ｒａｄｉｏｌ．、１９９６，３１（１）：５０−６２；Ｗａｈｎｅｒ  Ｈ．Ｗ．およびＦｏｇｅｌｍａｎ  Ｉ．、Ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ：Ｄｕａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．、Ｍａｒｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ  Ｌｔｄ．、Ｌｏｎｄｏｎ  １９９４、１〜２９６ページを参照のこと）
（３．酸性小ペプチド）
本発明の骨標的化分子はまた、酸性小ペプチドであり得る。ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）（硬組織（例えば、骨および歯）のマトリックス中の主要な無機成分および構成物質）は、酸性小ペプチドが親和性を示し得る、標的化する骨組織中の特異的部位として機能し得る。
【００６６】
例えば、構造中に酸性アミノ酸（ＡｓｐまたはＧｌｕ）の反復性配列を有する数種の骨の非コラーゲン性タンパク質は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に対する親和性を有し、そしてヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に結合する傾向にある。オステオポンチンおよび骨シアロタンパク質（骨における２つの主要な非コラーゲン性タンパク質）は、それぞれ、Ａｓｐ反復性配列およびＧｌｕ反復性配列を有する。オステオポンチンおよび骨シアロタンパク質の両方は、ＨＡに対する強い親和性を有し、そしてＨＡに迅速に結合する。したがって、β−アドレナリンアンタゴニスト部分と、これらの非コラーゲン性タンパク質および他の非コラーゲン性タンパク質と結合するペプチドとを結合体化することは、ＨＡに対する結合したペプチドの親和性ゆえに、β−アドレナリンアンタゴニストの骨に対する標的性の治療的送達において有効であり得る。（Ａｓｐ）６の結合体化は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に対する（Ａｓｐ）６の高い親和性に起因して、特に有効な送達手段であり得るが、しかし、（Ｇｌｕ）６は、まさに有効であり得る。
【００６７】
ビスホスホネートの結合体化とは対照的に、ペプチドの結合体化において使用される酸性ペプチドは、吸収プロセスにおいて分解する傾向にあり、そして薬理学的効果を示さないかもしれない。ビスホスホネートの結合体化によって処置された組織は、いくつかのビホスホネート効果を示す傾向にある。ＵＳ  ２００３０１２９１９４（この内容は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【００６８】
（４．骨特異的タンパク質に対する抗体）
本発明の骨標的化分子はまた、抗体または抗体フラグメントであり得る。高特異性モノクローナル抗体は、当該分野において周知であるハイブリダイゼーション技術によって産生され得る。例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、２４５  Ｎａｔｕｒｅ  ４９５（１９７５）；および６  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１１（１９７６）（これらの両方は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。このような抗体は、通常、高度に特異的な反応性を有し得る。ポリクローナル抗体はまた、結合体の標的化分子成分として使用するのに適する。しかし、この標的化する部分が抗体である場合、その抗体は、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）であるのが最も適切である。選択されるモノクローナル抗体は、単一のエピトープに対して高度に特異的であり、本発明において骨標的化分子として特に有用であるモノクローナル抗体をなす。適切な抗体は、骨組織の特異的な細胞表面抗原を認識する。特異的な抗原に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を単離し、そして産生するための方法（例えば、選択された標的組織に対する抗体または特異的な標的タンパク質に対する抗体をも作製する工程）は、公知である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ、１９８９、§１８．３以下参照を参照のこと。
【００６９】
（５．金属イオン）
本発明の骨標的化分子はまた、金属イオンであり得る。特定の金属イオンは、骨を標的化することが公知であり、この金属イオンとしては、例えば、ストロンチウムイオンが挙げられる。この金属イオンは、β−アドレナリンアンタゴニスト部分に直接結合され得る。あるいは、この金属イオンは、リンカー（例えば、アミノ酸）を介してβ−アドレナリンアンタゴニスト部分に連結され得る。例えば、金属イオン−アミノ酸錯体は組織部位への送達を標的化し得ることが、開示されてきた。例えば、米国特許第４，８６３，８９８号；同第４，１７６，５６４号；および同第４，１７２，０７２号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。例えば、マグネシウム−リジン錯体は、骨を標的化することが示されてきた。このような錯体は、本明細書中で上に記載されたポリ酸性アミノ酸結合体に加えられる。この金属イオンは、適切には、二価のイオン（例えば、Ｓｒ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ２＋またはＭｏ２＋）であり得る。
【００７０】
（６．トレーサー）
本発明の骨標的化分子はまた、骨代謝を分析するために使用される公知のトレーサーであり得る。このようなトレース（ｔｒａｃｅ）としては、例えば、テクネチウム−９９ｍ、レニウム（ｒｅｎｉｕｍ）１８４、レニウム１８６の骨標的化複合体が挙げられる。１９７１年４月に、Ｇ．ＳｕｂｒａｍａｎｉａｎおよびＪ．Ｏ．ＭｃＭｅｅは、トリポリホスフェートの存在下において、塩化第一スズを伴う過テクネチウム酸ＴｃＯ４を減少させることによって調製された骨のスキャン剤を記載した（Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ、９９，１９２−ａ）。得られた標識複合体は、骨格の良好な取り込みを示したが、数種の不利益を受け、これらの不利益のうちで最も重要なものは、注射とスキャニングとの間の２４時間の遅れ（この結果、高レベルの放射能が、適切な画像を得るために必要とされた）、および加水分解に対するトリポリホスフェートの不安定性であった。より良いホスフェートベースの骨のスキャン剤およびホスホネートベースの骨のスキャン剤についての１９７０年代における集中的な調査は、多数の出版物および数種の市販製品をもたらした。最も幅広く使用される化合物は、メチレンジホスホネート（ＭＤＰ）、米国特許第４，０３２，６２５号の対象であるスズとテクネチウム−９９ｍとの複合体である。欧州特許出願第７６７６号の対象であるヒドロキシメチレンジホスホネート（ｄｉｐｈｏｓｐｌｉｏｎａｔｅ）（ＲＤＰ）、；およびＧｅｒｍａｎ  Ｏ．Ｓ．Ｎｏ．２７５５８７４に記載された１，１−ジホスホノプロパン−２，３−ジカルボン酸（ＤＰＤ）が、最近、市場に導入された。
【００７１】
したがって、特定の好ましい実施形態において、本発明の骨を標的化する部分は、有機性のジ−ホスホン酸、トリ−ホスホン酸、テトラ−ホスホン酸、テトラアミノホスホン酸、およびそれらの混合物からなる群より選択されるようなホスホン酸である。ジ−ホスホン酸の例としては、エチレンヒドロキシジホスホン酸（ＥＨＤＰ）、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰ）、およびアミノエチル−ジホスホン酸（ＡＤＥＰ）が挙げられる。トリホスホン酸の例としては、ニトリロトリ−メチレン−ホスホン酸（ＮＴＰ）およびアミノトリスメチレン−ホスホン酸（ＡＭＰ）が挙げられる。テトラ−ホスホン酸の例としては、エチレンジアミンテトラメチレン−ホスホン酸（ＥＤＴＭＰ）、ニトリロトリ−メチレンホスホン酸（ＮＴＭＰ）、テトラアザシクロ−ドデカンテトラメチレンホスホン酸（ＤＯＴＭＰ）、ジエチレン−トリアミンペンタンメチレン（ｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｔｎａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）ホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）が挙げられる。
【００７２】
テトラサイクリンおよびその誘導体は、骨との親和性を有するトレーサーの別の群である。それらは、全身投与後に骨を蛍光標識するために慣用的に使用され、鉱化した（ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ）組織に対する十分な親和性を示す。本発明において使用するための適切なテトラサイクリン誘導体としては、例えば、塩酸クロルテトラサイクリン、塩酸デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、メタサイクリンおよびオキシテトラサイクリンが挙げられる。
【００７３】
本発明の化合物の範囲内の骨を標的化する部分は、例えば、エタン−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸（ＥＨＤＰ）、ジクロロメタンジホスホン酸（Ｃｌ２ＭＤＰ）および３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ジホスホン酸（ＡＨＰＤＰ）のようなジホスホネートである。
【００７４】
（７．複素環式分子）
一連の小さい、５員の複素環式分子は、慣用的な薬物動態研究の間に、骨との高い親和性を有することが見出された。それらの構造については、Ｗｉｌｌｓｏｎら、Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、６：１０４３（１９９６）およびＷｉｌｌｓｏｎら、Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６：１０４７（１９９６）を参照のこと。エストロゲン製剤ヘキセストロールに対する選択された複素環式分子の結合体化は、骨との所望の親和性を有する結合体をもたらした。Ｗｉｌｌｓｏｎ、Ｉｄ。したがって、複素環式分子は、本発明において骨標的化分子として使用され得る。
【００７５】
（Ｖ．リンカー）
本発明に従ういくつかの実施形態において、上記β−アドレナリン作動因子および骨を標的化する部分は、例えば、各部分上の活性基を介して適切な共有結合性の連結を形成することによって互いに直接共有結合される。好ましいリンカーの官能基は、第一級アミンまたは第二級アミン、ヒドロキシル基、カルボキシル基またはチオール反応性基である。例えば、この部分上の酸性基（ａｃｉｄ  ｇｒｏｕｐ）は他の部分上のアミン、酸またはアルコールと縮合されて、対応するアミド、無水物またはエステルが、それぞれ形成され得る。
【００７６】
カルボン酸基、アミン基、およびヒドロキシル基に加えて、２つ以上の部分の間に連結を形成するための適切な他の活性基としては、スルホニル基、スルフヒドリル基、チオールならびにカルボン酸のハロゲン酸（ｈａｌｏｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体および酸無水物誘導体が挙げられる。
【００７７】
他の実施形態において、上記薬物結合体中のこれらの部分は、中間のリンカーを介して互いに共有結合的に連結され得る。このリンカーは、２つの活性基を有利に有し、これらのうちの一方は、β−アドレナリン作動因子上の活性基に対して補完的であり、そしてこれらのうちの他方は、骨を標的化する部分上の活性基に対して補完的である。例えば、このβ−アドレナリン作動因子および骨を標的化する部分が、両方とも遊離のヒドロキシル基を有する場合、このリンカーは、適切には、両方の化合物と反応して、これらの２つの残基の間にジエーテル連結を形成する二価酸である。カルボン酸基、アミン基、およびヒドロキシル基に加えて、薬学的に活性な部分の間に連結を形成するための他の適切な活性基としては、スルホニル基、スルフヒドリル基、ならびにカルボン酸のハロゲン酸誘導体および酸無水物誘導体が挙げられる。
【００７８】
適切なリンカーは、以下の表１に示される。
【００７９】
【表１】
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適切な二価酸リンカーとしては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、フタル酸、イソフタル酸、およびテレフタル酸が挙げられる。二価酸が挙げられる一方で、当業者は、特定の場合には、対応する酸ハライドまたは酸無水物（片側性または両側性のいずれか）がリンカー試薬として好ましいことを理解する。好ましい無水物は、無水コハク酸である。別の好ましい無水物は、無水マレイン酸である。他の無水物および／または酸ハライドは、良好な効果のために当業者によって利用され得る。
【００８０】
適切なアミノ酸としては、γ−酪酸、２−アミノ酢酸、３−アミノプロパン酸、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが挙げられる。やはり、適切なアミノ酸の酸性基は、リンカー基としてそれらを使用する前に、無水物形態または酸ハライド形態へと変換され得る。例示的なリンカーは、ポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸、またはＡおよび／またはＢの改変、およびその後の結合形成によって形成されるリンカー基である。
【００８１】
適切なジアミンとしては、１，２−ジアミノエタン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサンが挙げられる。
【００８２】
適切なアミノアルコールとしては、２−ヒドロキシ−１−アミノエタン、３−ヒドロキシ−１−アミノエタン、４−ヒドロキシ−１−アミノブタン、５−ヒドロキシ−１−アミノペンタン、６−ヒドロキシ−１−アミノヘキサンが挙げられる。
【００８３】
適切なヒドロキシアルキル酸としては、２−ヒドロキシ酢酸、３−ヒドロキシプロパン酸、４−ヒドロキシブタン酸、５−ヒドロキシペンタン酸、５−ヒドロキシヘキサン酸が挙げられる。
【００８４】
使用され得る連結の例としては、エステル、アミド、カルバメート、カルボネート、環状ケタール、チオエステル、チオアミド、チオカルバメート、チオカルボネート、キサンテート、チオール、チオエステル、およびリン酸エステルからなる群より選択される１種以上の加水分解性の基が挙げられる。
【００８５】
他の実施形態において、上記コルチコステロイドおよび他の薬学的に活性な部分は結合されて、塩を形成し得る。
【００８６】
さらに他の実施形態において、上記β−アドレナリン作動因子および骨を標的化する部分は、非共有結合の架橋リンカーによって結合される。例えば、骨標的化分子がモノクローナル抗体である場合、このリンカーは、適切には、当該分野において公知であるビオチン−アビジン方法論を使用するビオチン−アビジン連結であり得る。
【００８７】
アビジンは、補酵素ビオチンに対して高い親和性を有する。これは、種々の化合物に対する抗体の結合体化のために開発された、強力な、非共有結合性相互作用である。ビオチンまたはアビジンは、適切には、上記β−アドレナリン作動因子または上記抗体成分のいずれかとカップリングする。したがって、多数の異なるスキームが、β−アドレナリン作動因子と抗体とを連結するために可能である。例えば、ビオチンはこの抗体と適切に連結されて、ビオチン化抗体複合体を形成する一方で、アビジンはこのβ−アドレナリン作動因子と適切に連結されて、アビジンβ−アドレナリン作動因子複合体を形成する。その後、これら２つの複合体は反応して、抗体−ビオチン−アビジン−β−アドレナリン作動因子結合体を形成する。
【００８８】
（ＶＩ．骨の標的化についてのアッセイ）
本発明の結合体による骨の標的化の有効性は、当該分野において公知である任意の技術を使用して測定され得る。これは、骨に対する本発明の結合体の結合を測定することによってか、または本発明の組成物を投与した後の骨の状態を（機能的アッセイとして）モニタリングすることによって達成され得る。
【００８９】
骨に対する上記結合体の結合は、インビトロで測定され得る。具体的には、ヒドロキシアパタイト（骨の無機質成分）に対する本発明の結合体の結合は、ヒドロキシアパタイトによる処置の前後の、緩衝液中のこの結合体のＵＶスペクトルを測定することによって決定され得る。この測定を実施するための手順は、米国特許第６，２１４，８１２号（この内容は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。骨の標的化を評価するために使用され得る別の標準的なアッセイは、ヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィーアッセイ（例えば、ヒドロキシアパタイトカラム上の保持時間が、インビボで骨を標的化する可能性が高い薬剤を検出するために使用され得る）である。
【００９０】
あるいは、骨の標的化は、インビボで測定され得る。例えば、本発明の結合体の生物学的分布（ｂｉｏｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）は、この結合体と骨トレーサー（例えば、９９ｍＴｃが挙げられる）とを複合体化し、そしてこのトレーサーを追跡することによって、ラットにおいて測定され得る。具体的には、体重１６０〜１４０ｇの雄ラットは、尾静脈を介して静脈内に注射される。このような測定は、例えば、上述の米国特許第６，２１４，８１２号に記載される。
【００９１】
骨の状態は、当該分野において公知である任意の方法を使用してモニタリングされ得る。これらの方法としては、本発明の組成物を投与した後に患者から得た生物学的サンプル（例えば、血液、血漿、血清、尿、または骨）における、カルシウムレベルのモニタリング、骨質量または骨密度のモニタリング、骨のターンオーバーのモニタリング、骨吸収の変化のモニタリング、または骨の特性における変化のモニタリングが挙げられるが、これらに限定されない。血清カルシウムレベルは、例えば、原子吸収分光測光（Ｃａｌｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、１９：１２０８−１２１３（１９７３））、ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソンとのキレート化（Ｈａｒｏｌｄら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、４５：２９０−２９６（１９６６））によって測定されても、またはブタ膵臓α−アミラーゼオルトホスホリパーゼＤを使用して酵素的に測定（Ｋｉｍｕｒａら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４２：１２０２−１２０５（１９９６））されてもよい。血清カルシウムレベルをモニタリングする工程は、副甲状腺機能亢進症、腎不全、または悪性腫瘍に起因する高カルシウム血症に関連した骨の状態を有する患者において特に有用である。このような患者において、処置の過程にわたるカルシウムレベルの減少は、骨の状態が改善していることを示す。
【００９２】
骨形成は、骨のターンオーバーの１種以上の生化学的マーカー（オステオカルシン、骨特異的アルカリホスファターゼ、およびＩ型コラーゲンのＩ型Ｃ末端プロペプチド（ＣＩＣＰ）が挙げられる）のレベルを検出することによってモニタリングされ得る。例えば、オステオカルシンのレベルは、市販されているイムノアッセイ（例えば、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）もしくはＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｔｅｘ．）からの酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）キット、またはＰｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）もしくはＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｓｔｒｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）からの放射免疫測定キット）を使用して、血清サンプルにおいて検出され得る。あるいは、ウェスタンブロッティングが、使用され得る。オステオカルシンレベルをモニタリングする工程は、骨の状態（例えば、Ｉ型糖尿病から生じる骨粗しょう症を含む骨粗しょう症）を有する患者において特に有用である。例えば、ＰＴＨ過剰、性腺ホルモンの欠損、悪性腫瘍、または非活動によって引き起こされる骨の高いターンオーバーを有する骨粗しょう症患者において、この処置の過程にわたるオステオカルシンレベルの減少は、この骨の状態が改善していることを示す。骨特異的アルカリホスファターゼ活性は、市販されているイムノアッセイキット（例えば、ＡＬＫＰＨＡＳＥ−ＢＴＭイムノアッセイキット（Ｑｕｉｎｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を使用して血清サンプルにおいてモニタリングされ得る。ＣＩＣＰ（コラーゲン産生の生化学的な指標）は、Ｑｕｉｎｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）からのＥＬＩＳＡキットを使用して血清においてモニタリングされ得る。
【００９３】
骨吸収の変化は、架橋したコラーゲン（例えば、遊離のデオキシピリジノリンコラーゲン架橋および遊離のピリジノリンコラーゲン架橋）のレベルを測定することによってモニタリングされ得る。遊離のデオキシピリジノリンまたは遊離のピリジノリンは、市販されているキット（例えば、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＥＬＩＳＡ）を使用して尿サンプルにおいて測定され得る。この処置の過程にわたる遊離のデオキシピリジノリンまたは遊離のピリジノリンの量の減少は、この骨の状態が改善していることを示す。
【００９４】
骨質量および骨密度はまた、本発明の方法に従って処置された患者においてモニタリングされ得る。骨質量は、Ｘ線撮影画像化技術（例えば、二重光子吸収測定法）を使用して患者において測定され得る。骨密度は、定量的コンピューター断層法によって測定され得る。この処置の過程にわたる骨質量または骨密度の増加は、この骨の状態が、その患者において改善していることを示す。
【００９５】
（ＶＩＩ．組み合わせ）
本発明の薬物結合体は、例えば、同じ処方物または異なる処方物において、種々の他の薬物と一緒に同時に投与され得る。例えば、本発明のβ−アドレナリンアンタゴニスト結合体は、これらの結合体が骨吸収を阻害する他の因子（例えば、破骨細胞に対して作用する薬物）と組み合わせられる処置のレジメンの一部として使用され得る。骨吸収を阻害するために開発されている標的／薬物としては、ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫシステム、カテプシンＫインヒビター、ビトロネクチンレセプターアンタゴニスト、エストレン（ｅｓｔｒｅｎ）、インターロイキン−６とｇｐ１３０とのシステム、サイトカインならびに成長因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
本発明のβ−アドレナリンアンタゴニストと一緒に同時に投与され得る他の例示的な因子としては、チボロン（ｔｉｂｏｌｏｎｅ）、新規のＳＥＲＭ、アンドロゲン、成長ホルモン、インスリン様成長因子−１およびストロンチウムラネレート（ｓｔｏｎｔｉｕｍ  ｒａｎｅｌａｔｅ）が挙げられる。
【００９７】
本発明のβ−アドレナリンアゴニストと一緒に同時に投与され得る例示的な因子としては、骨形成を促進するもの（例えば、脂質を低下させるスタチンおよびＰＴＨのカルシウム溶解性放出（ｃａｌｃｉｌｙｔｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ））が挙げられる。
【００９８】
特定の好ましい実施形態において、組成物である本発明のβ−アドレナリン作動因子は、必要に応じて、レプチンアンタゴニストまたはレプチンアゴニストと一緒に同時に投与され得る。本明細書中で使用される場合、レプチンアンタゴニストとは、レプチンレセプターの活性化によって引き起こされる作用または効果を、中和するか、または妨害するか、またはそうでなければ減少させる因子をいう。このようなアンタゴニストとしては、レプチンを結合するか、またはレプチンレセプターを結合する化合物が挙げられ得る。このようなアンタゴニストとしてはまた、レプチンレセプターの出力（すなわち、レプチンＣ）レセプターに対するレプチンの結合後の、レプチンシグナル伝達経路における細胞内の工程（すなわち、レプチン／レプチンレセプターのシグナル伝達に影響を与える下流の事象）であり、この工程は、レセプター／リガンドの相互作用レベルにおいて生じない）を、中和するか、または妨害するか、またはそうでなければ減少させる化合物が挙げられ得る。レプチンアンタゴニストとしては、タンパク質、抗体、有機低分子または炭水化物（例えば、アセチルフェノール化合物、レプチンを特異的に結合する抗体、レプチンレセプターを特異的に結合する抗体、および可溶性レプチンレセプターのポリペプチド配列を含む化合物）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００９９】
レプチンアンタゴニストの例は、アセチルフェノールであり、これは、抗肥満（ａｎｔｉｏｂｅｓｉｔｙ）化合物および抗糖尿病性化合物として有用であることが公知である。アセチルフェノールは、上記レプチンレセプターのアンタゴニストであるので、これらは、レプチンレセプターに対するレプチンの結合を妨げる。したがって、本発明の教示を考慮して、この化合物は、骨質量の増加を効率的に引き起こす。レプチンアンタゴニストとして使用され得るアセチルフェノールの特定の構造については、米国特許第５，８５９，０５１号を参照のこと。
【０１００】
レプチンアンタゴニストとしてはまた、そのレセプターまたはその細胞外ドメインに対するレプチンの結合を、減少させるか、阻害するか、遮断するか、抑制するかまたは妨害する因子、または薬物；レプチンの産生または活性化を減少させるか、阻害するか、遮断するか、抑制するかまたは妨害する因子；レプチンの産生または合成を駆動するシグナルのアンタゴニストである因子、およびレプチンのそのレセプターへの到達を妨げる（例えば、レプチンの血液−脳関門の横断を妨げる）因子が挙げられ得る。このような因子は、レプチンとそのレセプターとの相互作用、もしくはレプチンの産生を阻害するか、または防止する任意の有機分子であり得る（例えば、米国特許第５，８６６，５４７号を参照のこと）。レプチンアンタゴニストとしては、レプチンに特異的に結合し、そしてその同族レセプターに対するレプチンの結合を妨げる、抗レプチン抗体、レセプター分子および誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、レプチンアゴニストとは、レプチンレセプターを誘発する作用または効果を活性化するか、誘導するか、またはそうでなければ増加させる因子をいう。このようなアゴニストとしては、レプチンを結合するか、またはレプチンレセプターを結合する化合物が挙げられ得る。このようなアゴニストとしてはまた、レプチンレセプターの出力（すなわち、レプチンレセプターに対するレプチンの結合後の、レプチンシグナル伝達経路における細胞内の工程（すなわち、レプチン／レプチンレセプターのシグナル伝達に影響を与える下流の事象）であり、この工程は、レセプター／リガンドの相互作用レベルにおいて生じない）を活性化するか、誘導するか、またはそうでなければ増加させる化合物が挙げられ得る。レプチンアゴニストとしては、タンパク質、抗体、有機低分子または炭水化物（例えば、レプチン、レプチンアナログ、およびレプチンに特異的に結合し、そしてレプチンを活性化する抗体）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１０２】
さらなるレプチンアンタゴニストおよびレプチンアゴニストは、米国特許第５，９７２，６２１号；同第５，８７４，５３５号；および同第５，９１２，１２３号（３つ全ての内容は、本明細書中に援用される）に見出され得る。
【０１０３】
（ＶＩＩＩ．骨疾患）
本発明に従ってβ−アドレナリンアンタゴニストを使用して処置され得、そして／または予防され得る骨疾患としては、骨損失の結果として、対応する非疾患性の骨の骨質量と比較して減少した骨質量によって特徴付けられる骨疾患が挙げられる。このような骨疾患としては、全身的な骨損失および限局的な骨損失の両方が挙げられる。用語「全身的な骨損失」は、多数の骨格の部位または骨格系全体における骨損失を意味する。用語「限局的な骨損失」は、１つ以上の特定の、限定された骨格の部位における骨損失を意味する。全身的な骨損失（ｂｏｓｓ  ｌｏｓｓ）は、多くの場合、骨粗しょう症に関連する。骨粗しょう症は、、エストロゲンの産生は、大きく損なわれている閉経後の女性において最も一般的である。しかし、骨粗しょう症はまた、ステロイド誘導性（以下の糖質コルチコイド療法と同じ）であり得、そして加齢に起因して男性において観察されている。骨粗しょう症は、例えば、慢性関節リウマチを含む疾患によって誘導され得る。骨粗しょう症は、例えば、糖質コルチコイド療法（上記のステロイド誘導性と同じ）を含む二次的な原因によって誘導され得るか、またはこれは、同定可能な原因を伴わずに起こり得る（すなわち、特発性骨粗しょう症）。本発明において、好ましい方法としては、骨粗しょう症のヒトにおける異常な骨吸収の処置または予防が挙げられる。限局的な骨損失は、歯周病、骨折、およびプロテーゼ周囲の骨溶解（言い換えると、骨吸収は、プロテーゼ移植物の近位において起こっている）に関連してきた。全身的な骨損失または限局的な骨損失は、非活動によって起こり得、これは、多くの場合、ベッドもしくは車椅子に拘束される者についてか、またはギブス包帯または牽引に固定された肢を有する者について問題となる。本発明の方法および組成物は、以下の状態または疾患状態を処置し、そして／または予防するために有用である：閉経後骨粗しょう症、ステロイド誘導性の骨粗しょう症、男性の骨粗しょう症、疾患誘導性の骨粗しょう症、特発性骨粗しょう症を含み得る骨粗しょう症；骨減少症、パジェット病；異常に増加した骨のターンオーバー、骨軟化症、腎性骨形成異常症、歯周病、骨折；およびプロテーゼ周囲の骨溶解に関連した限局的な骨損失。
【０１０４】
低い骨質量の疾患における決定的なパラメーターは、骨折しやすさ罹患性である。骨折しやすさは、直接的な基準であり得ないので、骨質量または骨塩量の測定値が、骨がどの程度骨折しやすいかの指標を提供する。低い骨質量と骨折しやすさの増大との間の相関関係が存在するが、ときとして、骨の形状および海綿質構造（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）におけるバリエーションに起因し得る不一致が存在する。一般的に、骨質量（または骨密度もしくは骨の体積）および骨の形状は、骨がどのように見えるのかの静的な像を得るために使用され、その状態から、骨の機械的特性（例えば、強度、剛性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）、および剛性（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ））が推測され、そして骨折のリスクについての予測が、当業者によって決定され得る。動物モデルにおいて、組織形態測定は、骨質量、骨の形状、および骨の形成の速度を分析するために役立つ。吸収の速度は、破骨細胞の数または表面積の計測が破骨細胞の活性を表わさないことに起因して、特徴付けることが困難である。しかし、多くの血清マーカーおよび尿マーカーが、利用可能になり、そして骨の分解産物を検出するために使用され得る。例えば、Ｂｉｏｈｅａｌｔｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製の骨吸収キットＯｓｔｅｏｍａｒｋ（登録商標）は、尿中の架橋型Ｎ−テロペプチド（ＮＴｘ）を測定する、これは、骨の分解（吸収）の間に血流中に放出される。骨の機械的特性（例えば、伸張、圧縮および屈曲における強さ、剛性、ならびに最大負荷が挙げられるが、これらに限定されない）は、直接測定され得る。骨質量および骨の形状は、単一光子吸収測定法および二重光子吸収測定法（ＳＰＡおよびＤＰＡ）、単一Ｘ線吸収測定法および二重Ｘ線吸収測定法（ＳＸＡおよびＤＸＡ）、定量的コンピューター断層法（ＱＣＴ）、超音波（ＵＳ）および核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）（例えば、Ｇｕｇｌｉｅｌｍｉら、１９９５、Ｅｕｒ  Ｒａｄｉｏｌ．５（２）：１２９−３９を参照のこと）などの方法（これらに限定されない）によって決定され得る。
【０１０５】
本発明の骨標的化β−アドレナリンアゴニストは、対応する非疾患性の骨の骨質量と比較して増加した骨質量によって特徴付けられる骨疾患の処置の一部として使用され得る。例示的な障害としては、大理石骨病、骨硬化症および骨軟骨症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
骨標的化β−アドレナリンアゴニストは、広汎性特発性骨増殖症（ｄｉｓｈ）（正常または異常な応力に曝される骨格の部位（一般的には、骨に結合する腱および靭帯）における過剰な骨形成によって特徴付けられる原因不明の障害）を処置するために使用され得る。脊椎は、介入の主な部位であるが、脊椎外の部位もまた、影響され得る。何人かの患者は、外科手術後かまたは共存性疾患（例えば、慢性関節リウマチ）に対する応答において骨形成を発症し得る。この疾患はまた、他の名称で公知であり、これらとしては、脊椎靱帯骨化症（ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ  ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ  ｌｉｇａｍｅｎｔｏｓａ）、脊椎炎性骨増殖症（ｓｐｏｎｄｙｌｏｓｉｓ  ｈｙｐｅｒｏｓｔｏｔｉｃａ）、老年性の強直性脊椎骨増殖症、フォレスティール病、変形性脊椎症および椎骨の骨増殖症が挙げられる。慢性関節リウマチおよびＤＩＳＨ（ＲＡ／ＤＩＳＨ）は、同じ患者において共存し得る。
【０１０７】
本発明の骨標的化β−アドレナリンアゴニストはまた、正常の骨から突出する塊（外骨腫）の形成を生じ得る骨化過剰症（骨の過剰な成長）の処置に使用され得る。この異常性は、多くの筋骨格障害において認められ得る。
【０１０８】
椎体の側面に沿った（ｆｌｏｗｉｎｇ）石灰化および骨化によって特徴付けられる骨化過剰症の広範囲におよぶ形態は、広汎性特発性骨増殖症（ＤＩＳＨ）において起きる。Ｘ線撮影における異常性は、ほとんど共通して脊柱胸部に観察される。この疾患において、石灰化および骨化は、椎柱の前面に放射線遮蔽物（ｒａｄｉｏｄｅｎｓｅ  ｓｈｉｅｌｄ）の存在を生じ得る。腱付着部症（ｅｎｔｈｅｓｏｐｈｙｔｅｓ）は、多くの場合、種々の骨表面上に認められる。
【０１０９】
頭蓋冠の骨化過剰症は、種々の病理学的状態において起こり、これらの状態としては、パジェット病、内前頭骨過骨症、前頭骨幹端異形成症（ｆｒｏｎｔｏｍｅｔａｐｈｙｓｅａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、繊維性骨異形成症、貧血、頭蓋骨骨幹異形成症（ｃｒａｎｉｏｄｉａｐｈｙｓｅａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）および骨格転移（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）が挙げられる。
【０１１０】
骨内膜骨化過剰症は、以下の３つの型を有する：ファン・ブッヘム症候群、硬化狭窄症およびワース（Ｗｏｒｔｈ）症候群。ファン・ブッヘム症候群において、下顎骨の重篤な拡大、脳神経の介入、突出した前額部および広がった鼻梁、管状骨における骨膜の突出物、骨硬化性でありかつ増大した肋骨および鎖骨、ならびに脊椎の増加した放射線濃度が、特徴である。硬化狭窄症において、患者は、大きすぎる身長および体重、特異な顔貌、両眼隔離症、聴覚障害、顔面神経麻痺、指の合指症、爪の欠損または異形成、および末節骨の橈屈を有し得る。Ｘ線写真において、頭蓋骨および下顎骨の進行性であり著しい骨化過剰症が、認められる。ワース症候群において、顎の拡張および口蓋の塊（口蓋隆起）の存在は、重要な臨床的徴候である。Ｘ線写真において、拡張または異常なモデリングを伴わない、管状骨における皮質の肥厚が、観察された。
【０１１１】
幼児皮質過骨症はまた、キャフィー疾患として公知であり、これは、軟組織の小結節、骨膜炎および骨化過剰症（ｈｙｐｅｒｏｓｔｏｓ）によって特徴付けられる。骨（下顎骨、鎖骨、肩甲骨、肋骨、管状骨）および隣接する筋膜、筋肉および結合組織が、影響を受ける。この疾患のほとんどの突出特徴（皮質過骨症）は、骨皮質に直接的に隣接する軟組織の腫脹として始まり、そして骨の正常な幅を、二倍または三倍にし得る。頭蓋骨または管状骨の破壊性の病変がまた、同定されてきた。
【０１１２】
胸肋鎖骨過形成症は、鎖骨、上部肋骨および胸骨の前方部分の、特有の骨の過成長および軟組織の骨化によって特徴付けられる。骨の過成長は、鎖骨下静脈の閉塞を生じ得る。主なＸ線写真における異常性は、胸壁および脊柱の前方上部において認められる。強直性脊椎炎、広汎性特発性骨増殖症または乾癬性脊椎炎の過成長に似た脊椎の過成長が、認められる。
【０１１３】
ビタミンＡ中毒およびイソトレチノインの長期使用はまた、骨格の骨化過剰症に関係してきた（ビタミンＡ過剰症を参照のこと）。
【０１１４】
骨化過剰症、骨髄炎および皮膚病変によって特徴付けられる障害の種々の群は、ＳＡＰＨＯ症候群と称されてきた。この用語はまた、胸肋鎖骨過形成症、関節−骨髄炎に関連した掌踵の膿疱症状、および関節−骨髄炎に関連した重症なざ瘡を包含する。骨硬化症は、
Ｘ線写真における異常性が顕著である。
【０１１５】
他の実施形態において、本発明の骨標的化β−アドレナリンアンタゴニストおよび骨標的化β−アドレナリンアゴニストは、プロテーゼへの骨の内殖を促進するか、または阻害するために使用され得る。
【０１１６】
さらに、骨標的化β−アドレナリンアゴニストは、癒合していない骨折の部位の癒合を容易にし、治癒していない創傷の治癒、および骨への歯科移植物の組み込みの促進を容易にするために、使用され得る。
【０１１７】
本発明はまた、骨質量に関連しない骨疾患を包含する。例えば、本発明は、無機質含量の変化、異常なマトリックス化合物（例えば、コラーゲン）、または限局的な異常な増殖の疾患を含むが、これらに限定されない。
【０１１８】
（ＩＸ．骨障害を処置する薬学的処方物および方法）
本発明の組成物は、その活性成分とこの因子の哺乳動物の身体における作用部位との接触を生じる任意の手段によって種々の骨疾患状態を阻害するために処方され、そして投与され得る。これらの組成物は、医薬品（個々の治療的活性成分、または治療的活性成分の組み合わせのいずれか）との組み合わせて使用するのに利用可能な任意の従来の手段によって投与され得る。それらは、単独で投与され得るが、一般的に、投与の経路の選択および標準的な薬学的実施に基づいて選択される薬学的キャリアと一緒に投与される。
【０１１９】
本発明に従って使用するための薬学的組成物は、１種以上の生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を使用して、従来の様式で処方され得る。本発明の治療用組成物は、投与の種々の経路のために処方され得、これらの経路としては、全身投与および局所投与（ｔｏｐｉｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、または局所投与（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。一般に、技術および処方は、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに見出され得る。全身投与のために、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注射が、好ましい。注射のために、本発明の治療用組成物は、液状溶液（好ましくは、生理学的に適合性の緩衝液（例えば、ハンク溶液またはリンガー溶液））中に処方され得る。さらに、この治療用組成物は、固体形態で処方され得、そして使用する直前に再度溶解されても、懸濁されてもよい。凍結乾燥形態もまた、含まれる。
【０１２０】
経口投与のために、この治療用組成物は、例えば、薬学的に受容可能な賦形剤（例えば、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（例えば、ラクトース、微結晶セルロース  またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）による従来の手段によって調製される錠剤またはカプセルの形態をとり得る。この錠剤は、当該分野において周知の方法によってコーティングされ得る。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁物の形態をとり得るか、またはこれらの調製物は、使用前の水もしくは他の適切なビヒクルによる構成のために乾燥製品として提供され得る。このような液体調製物は、薬学的に受容可能な添加剤（例えば、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化した食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、ａｔｉｏｎｄ油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画した植物油）；および保存料（例えば、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）と共に従来の手段によって調製され得る。これらの調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香料、着色料および甘味料を含み得る。
【０１２１】
経口投与のための調製物は、適切には、活性因子の徐放を与えるために処方され得る。経頬投与のために、この治療用組成物は、従来の様式で処方された錠剤またはロゼンジの形態をとり得る。吸入による投与のために、本発明に従って使用するための組成物は、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体）の使用によって、加圧されたパックまたは噴霧器からエアロゾル噴霧を与える形態で便利に提供され得る。加圧されたエアロゾルの場合において、この投薬単位は、測定された量を送達するための弁を提供することによって決定され得る。例えば、吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）または吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）において使用するためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、治療剤の混合粉末および適切な粉末ベース（例えば、ラクトースまたはデンプン）を含むように処方され得る。
【０１２２】
上記治療用組成物は、注射による（例えば、ボーラス注射または持続的注入による）非経口投与のために処方され得る。注射のための処方物は、単位投薬形態（例えば、添加された保存料を含むアンプルまたは複数用量容器）で提供され得る。これらの組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁物、溶液またはエマルションのような形態をとり得、そして処方用（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ）薬剤（例えば、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤）を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前の適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）による構成のために、粉末形態であり得る。
【０１２３】
これまでに記載された処方物に加えて、上記治療用組成物はまた、デポー調製物として処方され得る。このような長く作用する処方物は、移植物（例えば、皮下または筋肉内）によって投与されても、筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、これらの治療用組成物は、適切なポリマー物質もしくは（例えば、受容可能な油中のエマルションのような）適切な疎水性物質またはイオン交換樹脂と共に処方されても、あるいは噴霧可能な可溶性の誘導体（例えば、噴霧可能な可溶性の塩）として処方されてもよい。
【０１２４】
全身投与はまた、経粘膜的手段または経皮的手段によるものであり得る。経粘膜投与または経皮投与のために、障壁に浸透させるために適切である浸透剤が、この処方物中に使用される。一般に、このような浸透剤は、当該分野において公知であり、そしてこれらとしては、例えば、経粘膜投与に関して、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。さらに、界面活性剤は、浸透を容易にするために使用され得る。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤を使用して行われ得る。局所投与のために、本発明の組成物は、一般に当該分野において公知であるように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム中に処方される。洗浄溶液は、外傷または炎症を処置するために局所的に使用されて、治癒を促進し得る。経口投与のために、この治療用組成物は、従来の経口投与形態（例えば、カプセル、錠剤、およびトニック）中に処方される。
【０１２５】
所望される場合、上記治療用組成物は、その活性成分を含む１種以上の単位投薬形態を含み得る包装または分配デバイス中で提供され得る。この包装は、例えば、金属箔またはプラスチック箔（例えば、ブリスター包装）を備え得る。この包装または分配デバイスは、投与のための説明書によって達成され得る。
【０１２６】
本発明の組成物はまた、持続放出型処方物および／または時限（ｔｉｍｅｄ）放出型処方物として処方され得る。このような持続放出型処方物および／または時限放出型処方物は、当業者にとって周知である、持続放出の手段または送達デバイス（例えば、米国特許第３，８４５，７７０号；同第３，９１６，８９９号；同第３，５３６，８０９号；同第３，５９８，１２３号；同第４，００８，７１９号；同第４，７１０，３８４号；同第５，６７４，５３３号；同第５，０５９，５９５号；同第５，５９１，７６７号；同第５，１２０，５４８号；同第５，０７３，５４３号；同第５，６３９，４７６号；同第５，３５４，５５６号；および同第５，７３３，５６６号（これらの開示は、本明細書中に参考としてそれぞれ援用される）に記載されるもの）によって作製され得る。本発明の薬学的組成物は、例えば、所望の放出プロフィールを提供する、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、隔膜、浸透圧性のシステム、多層コーティング、微粒子、リポソーム、ミクロスフェアなど、またはそれらの組み合わせを種々の割合で使用して活性成分の１種以上の遅延放出または持続放出を提供するために使用され得る。当業者にとって公知である適切な持続放出型処方物（本明細書中に記載されるものが挙げられる）は、本発明の薬学的組成物と一緒に使用するために容易に選択され得る。したがって、持続放出に適応し、経口投与に適した単一単位投薬形態（例えば、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、カプレット、粉末などが挙げられるが、これらに限定されない）は、本発明に包含される。
【０１２７】
（Ｘ．投薬量）
投与される投薬量は、上記骨疾患の症状の寛解をもたらすのに十分な上記化合物の治療有効量であり、そして当然に、公知の要因（例えば、特定の活性成分の薬理学的特性ならびにその活性成分の投与の様式および経路；年齢、性別、レシピエントの健康および体重；症状の性質および程度；併用療法の種類、処置の頻度および所望される効果）に依存して変化する。
【０１２８】
本発明の治療用組成物の毒性および治療的有効性は、例えば、ＬＤ５０（５０％の集団において致死的な用量）およびＥＤ５０（５０％の集団において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比が、治療指数であり、そしてこれは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として示され得る。大きい治療指数を示す治療剤が、好ましい。毒性の副作用を示す治療用組成物は、使用され得るが、治療は、非感染性の細胞に対する潜在的な損傷を最小化し、それによって副作用を減少させるために、影響を受ける組織の部位をこのような治療剤に対して標的化する、送達システムを設計するように行われるべきである。
【０１２９】
これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおいて使用するための投薬量の範囲を処方するのに使用され得る。この投薬量は、好ましくは、ほとんど毒性を伴わないか、または全く毒性を伴わずに、ＥＤ５０を誘導する循環濃度の範囲内にある。この投薬量は、利用される投薬形態および利用される投与の経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用される任意の因子のために、この治療的に有効な用量は、最初に、細胞培養アッセイから見積もられ得る。用量は動物モデルにおいて処方されて、細胞培養物において決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の阻害または生化学的活性の阻害を達成する試験治療剤の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲を達成し得る。このような情報が使用されて、ヒトにおいて有用な用量が、より正確に決定され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０１３０】
低分子薬剤の適切な用量は当業者（例えば、医師）に公知である多くの要因に依存することが、理解される。この低分子の用量は、例えば、処置される被験体またはサンプルの実体、サイズ、および状態に依存して変化し、さらに、組成物が投与される経路、および適用可能な場合、開業医がこの低分子に有すること所望する本発明の核酸またはポリペプチドの効果に依存して変化する。例示的な用量としては、被験体またはサンプルの重さ１キログラムあたりのミリグラム量またはマイクログラム量（例えば、１キログラムあたり約１マイクログラム〜１キログラムあたり約５００ミリグラム、１キログラムあたり約１００マイクログラム〜１キログラムあたり約５ミリグラム、または１キログラムあたり約１マイクログラム〜１キログラムあたり約５０マイクログラム）の低分子が挙げられる。
【０１３１】
本明細書中に記載されるこれらの方法は、決して包括的ではなく、そしてさらに、特定の用途に適する方法は、当業者に明らかである。さらに、この組成物の有用量は、所望の効果を発揮することが公知である化合物に対する類似性によって、さらに近似され得る。
【０１３２】
本発明の局面の実施は、特に明記されない限り、当業者の能力範囲内である、生物細胞学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換えの生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の技術を利用し得る。このような技術は、文献において完全に説明される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ．Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）を参照のこと。本明細書中に列挙される全ての特許、特許出願および参考文献は、その全体が参考として援用される。
【実施例】
【０１３３】
ここで、本発明は、一般的に記載され、以下の実施例を参照することによってさらに容易に理解される。これらの実施例は、特定の実施形態および本発明の実施形態を単に例示する目的を含み、そして本発明を限定することを意図しない。
【０１３４】
交感神経系（ＳＮＳ）は、骨芽細胞による骨形成の、強力なインヒビターである。この機能を、ノルエピネフリンもエピネフリンも産生できないドパミンβ−ヒドロキシラーゼ（Ｄｂｈ）欠損マウスの分析によって、最初に明らかにした。しかし、これらの変異マウスは、骨再構築の交感神経による調節の許容度（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）、またはＳＮＳが骨再構築の間に有する他の役割のいずれかを隠し得る複合的な内分泌の異常性を示す。これは、本発明者らが過去においても、骨形成の交感神経による調節を研究するために薬理学的モデルに依存してきた理由である。ＳＮＳが骨再構築の他の局面を生理学的に調節するか否かに取り組むために、β−アドレナリン作動性レセプター（βＡＲ）を欠くマウスは、これらのマウスが緊張の低い交感神経の他のマウスモデルにおいて観察される内分泌の異常性のいずれをも隠さないことに起因して選択される実験モデルである（以下の表２を参照のこと）。
【０１３５】
【表２】
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β２ＡＲは、発現が骨芽細胞において検出され得る、シナプス後のみのβ−ＡＲである。この観察と一致して、サルブタモール（β２ＡＲ−選択的アゴニスト）による野生型（ＷＴ）骨芽細胞の処理は、ｃＡＭＰ産生を刺激したが、ドブタモール（ｄｏｂｕｔａｍｏｌ）（β１ＡＲ−選択的アゴニスト）による処理は、ｃＡＭＰ産生を刺激しなかった（図５、そしてデータは示さず）。したがって、本発明者らは、交感神経のシグナル伝達が、成体の動物において骨再構築に影響する方法を研究するためにＡｄｒｂ２−／−マウスを使用した。
【０１３６】
６月齢のＡｄｒｂ２−／−マウスの組織学的な分析は、野生型（ＷＴ）の同腹仔またはβＡＲを欠くマウスと比較して、両方の性別において骨質量の顕著な増加を明らかにした（図１ａ、そしてデータは示さず）。予想に反して、Ａｄｒｂ２−／−マウスにおいて観察された骨質量の増加は、おそらくＡｄｒｂ２−／−マウスがＤｂｈ−／−マウスを苦しめる内分泌の異常性を有さないことに起因して、Ｄｂｈ−／−マウスにおいて観察されたものよりかなり大きかった。組織形態計測的な分析は、Ａｄｒｂ２−／−マウスが、無機質の付加（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）速度、骨形成の速度、骨芽細胞の数および骨芽細胞によって覆われる表面の著しい増加によって定義されるような骨形成の増加を示すことを示した（図１ｂ）。Ａｄｒｂ２−／−マウスにおける骨吸収のかなりの減少の証明は、さらに予想外であった。これを、破骨細胞の分化における欠損の存在を示唆する、ＴＲＡＰ陽性の多核性破骨細胞によって覆われる表面の顕著な減少によって組織学的に示し、そして尿中のデオキシピリジノリン（ＤｐＤ）の排泄（破骨細胞の機能の信頼できる指標）の減少によって生化学的に示した（図１ｃ）。骨形成および骨吸収を反対方向に調節する交感神経のシグナル伝達の能力は、骨再構築の公知の生理学的な調節因子の間で独特である。これは、骨質量の交感神経による調節の重要性を強調し、そして骨吸収がどのようにして交感神経のシグナル伝達によって調節されるのかの研究に、本発明者らを導いた。
【０１３７】
第１に、本発明者らは、Ａｄｒｂ２の１つのコピーのみを欠くマウスを分析し、そしてプロプラノロール（投与がマウスにおける骨形成を上昇させるβ−アドレナリン作動性レセプターアンタゴニスト）によって処置したＷＴマウスと比較した。Ａｄｒｂ２の発現を、ＷＴ骨芽細胞、Ａｄｒｂ２−／−骨芽細胞およびＡｄｒｂ２＋／−骨芽細胞において最初にアッセイした。Ａｄｒｂ２＋／−マウス（同様にＡｄｒｂ２−／−）は、ＷＴマウスと比較して、骨質量の増加を示した（図１ａ）。これは、骨形成の増加および骨吸収の減少の両方に起因した（図１ｂおよび図１ｃ）。本発明者らの知見に対して、この高い骨質量は、Ａｄｒｂ２遺伝子座におけるハプロ不全の場合において、これまでに報告された表現型の唯一の結果である。Ａｄｒｂ２＋／−マウスの場合と異なり、ＷＴマウスのプロプラノロール処置は、任意の有意な様式で骨吸収に影響しなかった。この観察は、Ａｄｒｂ２の遺伝的な不活性化が、薬理学的アプローチによって明らかにすることができなかった骨再構築における交感神経のシグナル伝達の生理学的な機能を明らかにすることを確立する。
【０１３８】
次に、本発明者らは、交感神経のシグナル伝達が破骨細胞系統の細胞の分化または機能に直接影響するか否かに取り組んだ。第１の仮説を検証するために、本発明者らは、ＲＡＮＫ−ＬおよびＭ−ＣＳＦ（２種の強力な破骨細胞の分化因子）の存在下における骨髄マクロファージ（ＢＭＭｓ）の培養からの、ＴＲＡＰ陽性の多核性破骨細胞の産生を、バイオアッセイとして使用した。証明の２つの系統は、交感神経のシグナル伝達が破骨細胞の分化に直接影響しないことを示す。第１に、ＲＡＮＫ−ＬおよびＭ−ＣＳＦの限定的な用量によるＢＭＭの処理後に得られたＴＲＡＰ陽性の多核性破骨細胞の数は、試験したそれぞれの誘導性の用量にて、ＷＴ  ＢＭＭを使用したかＡｄｒｂ２−／−ＢＭＭを使用したかにかかわらず同様であり、ＢＭＭがＡｄｒｂ２の非存在下において正常に分化し得ることを示した（図２ａ）。第２に、ＢＭＭの破骨細胞への分化の間における培養培地へのイソプロテレノール（ｂＡＲ交感神経模倣薬）の添加は、最終的に得られたＴＲＡＰ陽性の多核性破骨細胞の数に影響しなかった（図２ｂ）。破骨細胞の機能をＡｄｒｂ２およびＩＳＯ処置ＷＴの分化した破骨細胞において正常に見出した。ＷＴ  ＢＢＭまたはＡｄｒｂ２  ＢＢＭを、ＭＣＳ−ＦおよびＲＡＮＫ−Ｌを用いて２日間分化させ、トリプシン処理し、そして象牙質切片上に２日間おいた。吸収のくぼみを、ヘマトキシリンによって染色し、そして吸収のくぼみ領域を、定量化した（データ示さず）。
【０１３９】
交感神経のシグナル伝達が、破骨細胞の機能に影響し得るか否かを試験するために、本発明者らは、イソプロテレノールによってＴＲＡＰ陽性の多核性破骨細胞を処理した。第１に、骨芽細胞を使用した場合に観察されたものと異なり、イソプロテレノール処理は、破骨細胞における有意なｃＡＭＰ産生を全く誘導しなかった（図２ｃ）。対照的に、カルシトニン（ＣＴ）（破骨細胞上にも存在する別のＧ共役タンパク質レセプターによってそのシグナルを伝達するホルモン）はまた、ｃＡＭＰ産生の強い刺激を誘導した。第２に、ＷＴ成熟破骨細胞のイソプロテレノール処置は、象牙質切片における骨を吸収する破骨細胞の能力を試験する場合、くぼみの形成に影響しなかった。
【０１４０】
破骨細胞の分化または機能に対する直接的な様式での影響に関する交感神経模倣薬の無効性は、交感神経のシグナル伝達が、骨芽細胞におけるシグナル伝達を介して骨吸収に影響するか否かの試験に、本発明者らを導いた。したがって、本発明者らは、マウス頭蓋冠から調製した、ＢＭＭと骨芽細胞との共培養を行った。このアッセイにおいて、１，２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ３による骨芽細胞の処理は、ＢＭＭのＴＲＡＰ陽性の多核性破骨細胞への分化を生じる。ＷＴ骨芽細胞およびＢＭＭをこの共培養アッセイにおいて使用した場合、この培養培地へのイソプロテレノールの添加は、ＴＲＡＰ陽性の多核性破骨細胞の数を有意に増加させた（図２ｄ）。同様に、イソプロテレノール処理は、ＷＴ  ＢＢＭではなくＡｄｒｂ２−／−ＷＴ  ＢＢＭをこの共培養において使用した場合に、破骨細胞の分化を増加させ、それによって交感神経のシグナル伝達が破骨細胞前駆体の分化に直接影響しないことを確認した。対照的に、イソプロテレノールは、Ａｄｒｂ２−／−骨芽細胞をＷＴ  ＢＭＭと一緒に共培養した場合、破骨細胞の分化を上昇させ得ず、これは、交感神経のシグナル伝達が、ｂ２ＡＲを介して破骨細胞の分化因子の骨芽細胞における発現を刺激することによって骨吸収を助けることを示唆する。
【０１４１】
この仮説を検証するために、本発明者らは、イソプロテレノールによる処理後に、破骨細胞の分化の公知である調節因子をコードする遺伝子の骨芽細胞における発現を分析した。ＷＴ骨芽細胞において、イソプロテレノールは、Ｒａｎｋ−ｌ（破骨細胞の分化に必要とされる分泌性分子をコードする遺伝子）の発現を２０倍近く増加させた（図２ｅ）。イソプロテレノールによるＲａｎｋ−ｌ発現の誘導は、Ａｄｒｂ２−／−骨芽細胞を使用した場合、検出されず、これは、ＳＮＳのこの機能が、骨芽細胞上のｂ２−アドレナリン作動性レセプターの存在を必要とすることを示す。イソプロテレノール処理はまた、Ｉｌ６（破骨細胞の分化を助けることが示されているサイトカイン）の発現を増加させた（図２ｆ）。イソプロテレノールのこれらの効果は、特異的であった（オステオプロテゲリン（Ｏｐｇ）（Ｍ−ＣＳＦまたは他の試験したインターロイキン（例えば、ＩＬ２またはＩＬＩα）のＲＡＮＫ−Ｌに対するデコイ（ｄｅｃｏｙ）レセプターをコードする遺伝子）の発現に影響しなかった）（データ示さず）。
【０１４２】
骨芽細胞のイソプロテレノール処理は、ｃＡＭＰ産生を増加させ、このことは、Ｒａｎｋ−ｌおよび／またはＩｌ６の発現がＣＲＥＢ（ｃＡＭＰシグナル伝達経路によって活性化される転写因子）（ｃＡＭＰ応答エレメントの結合）によって調節されるか否かの検証に、本発明者らを導いた。Ｒａｎｋ−ｌプロモーターおよびＩｌ６プロモーターの両方は、真正のＣＲＥＢ結合部位を含む。ホスホ−ＣＲＥＢ抗体を使用したクロマチン沈降（ＣｈＩＰ）アッセイにおいて、本発明者らは、ＣＲＥＢが、Ｒａｎｋ−ｌプロモーターおよびＩｌ６プロモーターに対して特異的に結合したこと示した。さらに、電気泳動移動度シフトアッセイにおいて、ホスホ−ＣＲＥＢに対する抗体は、イソプロテレノール処置骨芽細胞の核抽出物と、ＣＲＥＢ結合部位のオリゴヌクレオチドとのインキュベーションにおいて形成されるタンパク質−ＤＮＡ複合体をスーパーシフトさせた。イソプロテレノール処理が、Ｒａｎｋ−ｌおよびＩｌ６のプロモーターに対するＣＲＥＢ結合を介してＲａｎｋ−ｌおよびＩｌ６の発現を増加させるか否かを決定するために、本発明者らは、Ｒａｎｋ−ｌプロモーター−ルシフェラーゼ構築物を使用して、ＲＯＳ  １７／２．８骨芽細胞においてＤＮＡ同時形質転換実験を行った。総合して、これらの結果は、交感神経のシグナル伝達が、骨芽細胞において、シグナル伝達事象のカスケードを誘導し、ＣＲＥＢのリン酸化ならびにＲａｎｋ−ｌおよびＩｌ６（破骨細胞の分化に関与する２つの遺伝子）のプロモーターに対するその結合をもたらすことを示した（データ示さず）。
【０１４３】
これらの知見の生物学的関連性を決定するために、本発明者らは、２つの実験を行った
。第１に、本発明者らは、ＷＴマウスをイソプロテレノールによって３週間処置し、そしてこの処置期間の終点で、骨吸収パラメーターならびにＲａｎｋ−ｌおよびＩＬ６の骨発現を分析した。遺伝子発現分析は、Ｒａｎｋ−ｌおよびＩＬ６の骨における発現がインビトロで観察されたものよりも、より小さかったにもかかわらず、この処理がＲａｎｋ−ｌおよびＩＬ６の骨における発現を増加させたことを示した。一方、ＯＰＧは発現に影響されなかった（図３）。第２に、この生理学的な調節が、閉経後に発症する骨損失のような病理学的状態において有し得る役割を決定するために、本発明者らは、ＷＴマウスおよびＡｄｒｂ２−ｌ−マウスを１月齢にて卵巣切除し、そしてそれらのマウスを３ヵ月後に分析した。ＷＴマウスにおける卵巣切除は、骨吸収パラメーター（例えば、破骨細胞の表面およびＤｐＤの尿中排泄）の増加に起因して、骨質量の３０％の減少をもたらした（図４）。対照的に、破骨細胞の表面は、Ａｄｒｂ２−／−マウスにおいて卵巣摘出後に増加せず、Ｄｐｄの尿中排泄もまた、増加しなかった。これらのことは、交感神経の緊張の非存在下において、骨吸収が、卵巣摘出後にアップレギュレートされないかもしれないことを示した。骨吸収の任意の増加の欠如と一緒に持続した骨形成の増加は、Ａｄｒｂ２−／−マウスがＷＴマウスより高い骨質量を維持した理由を説明した。
【０１４４】
（参考としての援用）
本明細書中に示される全ての刊行物および特許は、あたかもそれぞれ個々の刊行物または特許が、具体的かつ個別に参考として援用されることが示されるように、それらの全体が本明細書に参考として援用される。
【０１４５】
本発明は、本発明を行い、そして使用する当業者のために、十分に詳細に記載され、そして説明されてきたが、種々の変更、改変、および改良は、本発明の精神および範囲から逸脱しないことが明らかであるべきである。
【０１４６】
当業者は、本発明が、その対象を実施し、そして記載された目的および利点、ならびにその中に固有である目的および利点を獲得するために、よく適応されることを容易に理解する。本明細書中に記載される方法および試薬は、代表的な好ましい実施形態であり、これらの実施形態は、例示であり、そして本発明の範囲に対する限定を意図しない。それらにおける改変および他の使用は、当業者に企図される。これらの改変は、本発明の精神の範囲内に包含され、そして添付の特許請求の範囲によって定義される。
【０１４７】
種々の置換および改変が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく本明細書中に開示された本発明に対してなされ得ることは、当業者にとって容易に理解可能である。
【０１４８】
本発明は、好ましい実施形態、必要に応じた工夫によって具体的に開示されてきたが、本明細書中に開示される概念の改変および変形は、このような改変および変形が、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の範囲内にあると見なされるように、当業者によって報告され得ることが、理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、Ａｄｒｂ２欠損によって誘導される増加した骨形成を示す。（ａ）椎骨切片のｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色。６月齢のＡｄｒｂ２−／−マウスおよびＡｄｒｂ２＋／−マウスは、野生型の同腹仔と比較して、組織の体積に対する骨の体積（ＢＶ／ＴＶ）の増加を示した。（ｂ）骨形成パラメーター。（骨形成速度（ＢＦＲ）、骨の表面に対する骨芽細胞の表面（ＯｂＳ／ＢＳ）および骨の周囲の長さに対する骨芽細胞の数（ＯｂＮｂ／ＢＰｍ））は、Ａｄｒｂ２−／−マウスおよびＡｄｒｂ２＋／−マウスにおいて増加した。（ｃ）骨吸収パラメーター。（骨の表面に対する破骨細胞の表面（ＯｃＳ／ＢＳ）、骨の周囲の長さに対する破骨細胞の数（ＯｃＮｂ／ＢＰｍ）およびデオキシピリジノリンの尿中排泄（ｄｐｄ））は、Ａｄｒｂ２−／−マウスおよびＡｄｒｂ２＋／−マウスにおいて減少した。対照的に、プロプラノロール（ＰＲＯ）処置の野生型マウスは、骨吸収パラメーターの有意な減少を示さない（ｎ＝８、＊：ｐ＜０．０５）。
【図２】図２は、ＳＮＳが骨芽細胞に作用して骨吸収を調節することを示す。（ａ）インビトロでの破骨細胞形成（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、Ａｄｒｂ２欠損に影響されない。ＢＢＭを、ＲＡＮＫ−ＬおよびＭＣＳ−Ｆの示された量によって分化させられ、そしてＴＲＡＰ＋破骨細胞の数を、５日後に計測した。（ｂ）インビトロでの破骨細胞の分化は、イソプロテレノール（ＩＳＯ）処置に影響されない。ＢＢＭは、１０μＭのＩＳＯと一緒にまたはこれなしで、ＭＣＳ−ＦおよびＲＡＮＫ−Ｌの存在下において分化させられ、そしてＴＲＡＰ＋破骨細胞の数は、５日後に計測された。（ｃ）ＩＳＯ処理は、成熟破骨細胞中のｃＡＭＰ産生を誘導しない。ＢＢＭを、ＭＣＳ−ＦおよびＲＡＮＫ−Ｌの存在下において分化させ、そしてＩＳＯ（１０μＭ）、ドブタミン（Ｄｏｂｕ、１０μＭ）またはカルシトニン（１００ｐｇ／ｍｌ）によって処理した。細胞内のｃＡＭＰ産生を、ＥＩＡによって測定した。（ｄ）ＩＳＯは、骨芽細胞におけるｂ２ＡＲの刺激を介して破骨細胞の分化を刺激した。骨芽細胞およびＢＭＭを、１０μＭのＩＳＯと一緒にまたはこれなしで、１，２５（ＯＨ）２−ビタミンＤ（１０〜８Ｍ）を用いて共培養し、そしてＴＲＡＰ＋破骨細胞の数を、４日後に計測した。（ｅ）ＩＳＯは、ｂ２ＡＲを介して骨芽細胞中のＲａｎｋ−ｌ発現を誘導した。（ｆ）ＩＳＯは、ｂ２ＡＲを介して骨芽細胞中のＩＬ６発現を誘導した。ＷＴ一次骨芽細胞およびＡｄｒｂ２一次骨芽細胞を、ＩＳＯ（１０μＭ）を用いて示された時間で処理し、そして遺伝子発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量した。（ｇ）Ｒａｎｋ−ｌプロモーターおよびＩＬ６プロモーターの構造の概略図。ボックスは、ＣＲＥＢ様コンセンサス結合部位を示す。
【図３】図３は、イソプロテレノール（ＩＳＯ）処置がＲＡＮＫ−ＬおよびＩＬ６の発現の増加を生じること示す
【図４】図４は、卵巣摘出誘導性の骨損失に対するｂ２−アドレナリン作動性レセプター欠損の保護効果示す。
【図５】図５は、イソプロテレノール（ＩＳＯ）および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は骨芽細胞中のｃＡＭＰ産生を刺激するが、ドブタモールは骨芽細胞中のｃＡＭＰ産生を刺激しないことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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