(57)【要約】本発明は、所定の配列特異性に基づいて集団からポリヌクレオチドを分類するための方法を提供する。１つの局面において、本発明の方法は、所定の配列特性を有するポリヌクレオチドにアニーリングされたプライマーを伸長して、捕捉部分を有する所定のターミネーターを取り込む工程、伸長されたプライマーを有するポリヌクレオチドを、上記捕捉部分に特異的に結合する捕捉剤によって捕捉する工程、および上記捕捉されたポリヌクレオチドを、上記伸長されたプライマーから融解して、所定の配列特性を有するポリヌクレオチドのサブ集団を形成する工程によって実施される。別の局面において、本発明の方法は、タグ化されたポリヌクレオチドの集団に対して、サブ集団が選択された後に、そのサブ集団のメンバーがポリヌクレオチド上の特有のタグを使用して同時に分析され、分析情報を読出しのためのハイブリダイゼーションアレイに変換し得るように実施される。
2007521833.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の配列特性を有するポリヌクレオチドを分類する方法であって、該方法は、
所定の配列特性を有するポリヌクレオチドにアニーリングされたプライマーを伸長して、捕捉部分を有する所定のターミネーターを取り込む工程；
伸長されたプライマーを有するポリヌクレオチドを、該捕捉部分に特異的に結合する捕捉剤によって捕捉する工程；および
該捕捉されたポリヌクレオチドを、該伸長されたプライマーから融解する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
親集団の複雑性に満たない複雑性を有するポリヌクレオチドのサブ集団を作製する方法であって、該方法は、
親集団のポリヌクレオチドに対してプライマーをアニーリングして、プライマー−ポリヌクレオチド二重鎖を形成する工程；
該プライマーを伸長して、捕捉部分を有する所定のターミネーターを取り込む工程；
伸長されたプライマーを有する該プライマー−ポリヌクレオチド二重鎖を、該所定のターミネーターの捕捉部分を固相支持体に結合された捕捉剤に特異的に結合させることによって、該親集団から分離する工程；
該プライマー−ポリヌクレオチド二重鎖を融解して、該親集団の複雑性に満たない複雑性を有するポリヌクレオチドのサブ集団を形成する工程
を包含する、方法。
【請求項３】
親集団の複雑性に満たない所望の複雑性を有するポリヌクレオチドの集団を作製する方法であって、該方法は、
（ａ）親集団のポリヌクレオチドに対してプライマーをアニーリングして、プライマー−ポリヌクレオチド二重鎖を形成する工程；
（ｂ）該プライマーを伸長して、捕捉部分を有する所定のターミネーターを取り込む工程；
（ｃ）伸長されたプライマーを有する該プライマー−ポリヌクレオチド二重鎖を、該所定のターミネーターの捕捉部分を固相支持体に結合された捕捉剤に特異的に結合させることによって、該親集団から分離する工程；
（ｄ）該プライマー−ポリヌクレオチド二重鎖を融解して、該親集団の複雑性に満たない複雑性を有するポリヌクレオチドの選択された集団を形成する工程であって、該選択された集団は、次の工程のための親集団を形成する、工程；
（ｅ）該所望の複雑性の選択された集団が得られるまで、工程（ａ）から工程（ｅ）を繰り返す工程
を包含する、方法。
【請求項４】
前記融解する工程の後に、前記選択された集団を複製する工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ａ）から工程（ｄ）の各工程を繰り返す工程の間に、前記プライマーが、前記親集団または前記選択された集団の前記ポリヌクレオチド上の異なるプライマー結合部位に対してアニーリングする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）から工程（ｄ）の各連続的な工程を繰り返す工程の間に、前記異なるプライマー結合部位が、プライマー伸長方向に少なくとも１ヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドに沿って移動される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）から工程（ｄ）の各連続的な工程を繰り返す工程の間に、前記異なるプライマー結合部位が、前記ポリヌクレオチドの異なる非重複遺伝子座に存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記異なる非重複遺伝子座が、一塩基多型部位に隣接して、かつ該一塩基多型部位の上流に存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
組成物であって、該組成物は、
複数のゲノムフラグメントであって、該ゲノムフラグメントの各々は、異なるゲノムの同じ遺伝子座に由来し、そして異なるオリゴヌクレオチドタグが結合されており、各オリゴヌクレオチドタグは、同じ最小限にクロスハイブリダイズするセットから選択される、ゲノムフラグメント；および
複数の空間的に分離した領域を有する固相支持体であって、各空間的に分離した領域は、共有結合された該最小限にクロスハイブリダイズするセットからのタグ相補体を有する、固相支持体
を含む、組成物。
【請求項１０】
ゲノム集団中の所定の遺伝子座においてヌクレオチドの頻度を決定する方法であって、該方法は、
該集団の各ゲノムのフラグメントを別々に生成する工程；
各ゲノムに特有のオリゴヌクレオチドタグを結合させる工程；
該所定の遺伝子座を含む各ゲノムからフラグメントを選択する工程；
各特有のオリゴヌクレオチドタグから標識オリゴヌクレオチドタグを生成する工程であって、該標識オリゴヌクレオチドタグは、該所定の遺伝子座におけるヌクレオチドを示すシグナルを生成する、工程；および
それぞれのタグ相補体と特異的にハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドタグによって生成されたシグナルを検出することによって、該所定の遺伝子座においてヌクレオチドの頻度を決定する工程であって、該それぞれのタグ相補体は、１以上の固相支持体上の空間的に分離した領域に結合されている、工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、ポリヌクレオチドの複雑な集団を分析するための方法および組成物に関し、より具体的には、ポリヌクレオチドの集団をより複雑性の少ない１以上のサブ集団に分割するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
遺伝的研究の主要な目的は、ゲノム中のどのような配列バリエーションが複雑な特性に関連するか、特に、例えば、糖尿病、癌、高血圧症などの一般的疾患に対する感受性に関連するかを理解することである（例えば、非特許文献１）。ヒトゲノムの草案の配列は、バリエーションを評価するための有用性の高い参照を提供するが、見積もられた１千万以上の共通の一塩基多型（ＳＮＰ）、および他の多型（例えば、逆位、欠失、挿入など）が、健康状態および疾患状態をどのように決定するか、またはどのように影響するかを理解するための第１のステップに過ぎない。多くの強力な分析アプローチが、この問題に取り組むために開発されているが、実際的かつ確実にゲノムバリエーションと関連する特性に必要とされる、研究の型に対する適切な処理能力または柔軟性はないようである（例えば、非特許文献２）。例えば、罹患個体および非罹患個体の集団に由来する多くのセットの遺伝的マーカーが比較される特性関連研究が実施されることが望ましい。このような研究は、研究される特性もしくは疾患に関連する遺伝的マーカーおよび遺伝子の間の、非ランダムな分離、または連鎖不平衡に依存する。残念ながら、ヒトゲノムの領域間の連鎖不平衡の程度および分布は、十分には理解されていないが、現在、ヒトにおける首尾のよい特性関連研究は、少なくとも３００〜４００人の罹患個体と等しい数のコントロールとの集団において、１個体あたり３０〜５０，０００個のマーカーを測定することを必要とすると考えられている（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。
【０００３】
このようなゲノム全体の研究を扱うための１つのアプローチは、分析を単純化するために、分析されるゲノムに関して複雑性が低下したゲノムＤＮＡのサブセットを作製することである（例えば、非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；特許文献１（Ｗｅｉｓｓｍａｎら）；特許文献２（Ｓｉｂｓｏｎ）；特許文献３（Ｄｅｇａｕら））。残念なことに、これらの技術の大部分は、サブセットを作製するために、いくつかの形態のサブトラクション、配列破壊、または直接的もしくは間接的なサイズ選択に依存し、このことは、実行が困難であり、かつ感度が低下している。
【０００４】
上記の観点から、遺伝的分析の分野は、サブトラクション、または他の配列破壊工程を必要とせずに、複雑性の高いＤＮＡの集団（例えば、ゲノムの混合物）をより複雑性の低いサブセットに転換するための方法が利用可能なことによって、前進し得る。
【特許文献１】米国特許第６，５０６，５６２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７２８，５２４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８５８，６５６号明細書
【非特許文献１】Ｃｏｌｌｉｎｓら，「Ｎａｔｕｒｅ」，２００３年，第４２２巻：８３５−８４７
【非特許文献２】Ｓｙｖａｎｅｎ，「Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」，２００１年，第２巻：９３０−９４２
【非特許文献３】ＫｒｕｇｌｙａｋおよびＮｉｃｋｅｒｓｏｎ，「Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」，２００１年，第２７巻：２３４−２３６
【非特許文献４】Ｌａｉ，「Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，２００１年，第１１巻：９２７−９２９
【非特許文献５】ＲｉｓｃｈおよびＭｅｒｉｋａｎｇａｓ，「Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１９９６年，第２７３巻：１５１６−１５１７
【非特許文献６】ＣａｒｄｏｎおよびＢｅｌｌ，「Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」，２００１年，第２巻：９１−９９
【非特許文献７】Ｌｉｓｉｔｓｙｎら，「Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１９９３年，第２５９巻：９４６−９５１
【非特許文献８】Ｖｏｓら，「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，１９９５年，第２３巻：４４０７−４４１４
【非特許文献９】Ｄｏｎｇら，「Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，２００１年，第１１巻：１４１８−１４２４
【非特許文献１０】Ｊｏｒｄａｎら，「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」，２００２年，第９９巻：２９４２−２９４７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、所定の配列特性に基づいて、集団からポリヌクレオチドを分類するための方法および組成物を提供する。１つの局面において、本発明の方法は、以下の工程によって実施される：（ｉ）所定の配列特性を有するポリヌクレオチドにアニーリングされたプライマーを伸長して、捕捉部分を有する所定のターミネーターを取り込む工程、（ｉｉ）伸長されたプライマーを有するポリヌクレオチドを、上記捕捉部分に特異的に結合する捕捉剤によって捕捉する工程、および（ｉｉｉ）上記捕捉されたポリヌクレオチドを、上記伸長されたプライマーから融解して、所定の配列特性を有するポリヌクレオチドのサブ集団を形成する工程。
【０００６】
別の局面において、ポリヌクレオチドの集団は、ゲノムの集団由来のフラグメントを含み、ここで各ゲノム由来のフラグメントは、同じ特有のオリゴヌクレオチドタグが結合されている。この局面において、本発明は、ゲノム集団中の所定の遺伝子座においてヌクレオチドの頻度を決定する方法を含み、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）上記集団の各ゲノムのフラグメントを別々に生成する工程；（ｉｉ）各ゲノムに特有のオリゴヌクレオチドタグを結合させる工程；（ｉｉｉ）上記所定の遺伝子座を含む各ゲノムからフラグメントを選択する工程；（ｉｖ）各特有のオリゴヌクレオチドタグから標識オリゴヌクレオチドタグを生成する工程であって、上記標識オリゴヌクレオチドタグは、上記所定の遺伝子座のヌクレオチドを示すシグナルを生成する、工程；および（ｖ）それぞれのタグ相補体と特異的にハイブリダイズされる標識オリゴヌクレオチドタグによって生成されたシグナルを検出することによって、上記所定の遺伝子座においてヌクレオチドの頻度を決定する工程であって、それぞれのタグ相補体は、１以上の固相支持体上の空間的に分離した領域に結合されている、工程。
【０００７】
（定義）
タグ相補体を参照する際の「アドレス可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）」とは、タグ相補体のヌクレオチド配列、またはおそらく他の物理的特性もしくは化学的特性が、そのアドレスから決定され得る（すなわち、配列またはタグ相補体の他の特性と、タグ相補体が結合される固相支持体上の空間的位置または固相支持体の特性との間の１対１の対応）ことを意味する。好ましくは、タグ相補体のアドレスは、ある空間的な位置（例えば、タグ相補体のコピーを含む特定の領域の平面的な座標）である。しかし、タグ相補体は、例えば、微粒子のサイズ、形状、色、マイクロトランスポンダー（ｍｉｃｒｏ−ｔｒａｎｓｐｏｎｄｅｒ）の頻度などによって、他の方法でも、アドレス指定（ａｄｄｒｅｓｓ）され得る（例えば、Ｃｈａｎｄｌｅｒら，ＰＣＴ公報  ＷＯ  ９７／１４０２８）。
【０００８】
遺伝的遺伝子座、配列マーカー、またはヌクレオチドの部位を参照する際の「対立遺伝子頻度」とは、個体の集団に関する、そのような遺伝的遺伝子座における配列もしくはヌクレオチドの出現の頻度、またはそのような配列マーカーの出現の頻度を意味する。一部の文脈において、対立遺伝子頻度はまた、参照配列と同一ではないか、または参照配列に完全に相補的ではない配列の頻度をいうことができる。
【０００９】
「アンプリコン」とは、増幅反応の生成物を意味する。すなわち、アンプリコンとは、１以上の出発配列（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）から複製されるポリヌクレオチド（通常は二本鎖）の集団である。１以上の出発配列は、同じ配列の１以上のコピーであってもよいし、異なる配列の混合物であってもよい。アンプリコンは、クローニングベクターでの複製によってか、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６)による線形増幅によってか、または同様の技術によって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において作製され得る。
【００１０】
「分析物」とは、サンプル中の存在もしくは非存在、または量または濃度が、アッセイにおいて決定される、任意の分子（有機分子、無機分子、または生体分子を含む）を意味する。特に、生体分子分析物としては、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ゲノムフラグメント、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、タンパク質、抗体、酵素、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、および同様の化合物が挙げられる。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドタグを参照する際の「相補体」または「タグ相補体」は、オリゴヌクレオチドタグが特異的にハイブリダイズして完全にマッチした二重鎖または三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドをいう。特異的なハイブリダイゼーションが三重鎖を生じる実施形態において、このオリゴヌクレオチドタグは、二本鎖であるものか、または一本鎖であるかが選択され得る。従って、三重鎖が形成される場合、用語「相補体」とは、一本鎖オリゴヌクレオチドタグの二本鎖相補体または二本鎖オリゴヌクレオチドタグの一本鎖相補体のどちらも包含することを意味する。
【００１２】
二本鎖ポリヌクレオチドまたは一本鎖ポリヌクレオチドの集団を参照する際の「複雑性」とは、その集団中に存在する異なる種のポリヌクレオチドの数を意味する。ゲノムＤＮＡを参照する際の、関連する概念である「運動複雑性（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）」とは、非反復配列に存在する塩基対の総数を意味する。例えば、Ｗｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７−２５９（１９９１）；ＢｒｉｔｔｅｎおよびＤａｖｉｄｓｏｎ，第１章（Ｈａｍｅｓら（編）），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）。例えば、以下の集団は、示されたサイズおよび複雑性を有する：
【００１３】
【表１−１】
2007521833.tif 000003
【００１４】
【表１−２】
2007521833.tif 000004
ゲノムまたは標的ポリヌクレオチドを参照する際の「遺伝的遺伝子座」または「遺伝子座」とは、そのゲノムもしくは標的ポリヌクレオチドの連続的なサブ領域またはセグメントを意味する。本明細書中で使用される場合、遺伝的遺伝子座、または遺伝子座は、ゲノム中の遺伝子の位置または遺伝子の部分をいってもよいし、または、遺伝子内に存在するかどうか、もしくはその遺伝子に関連するかどうかによらないゲノム配列の任意の連続的な部分をいってもよい。好ましくは、遺伝的遺伝子座は、数十個（例えば、１０〜３０個）長のヌクレオチド〜数百個（例えば、１００〜３００個）長のヌクレオチド由来のゲノム配列の任意の部分をいう。
【００１５】
「ハプロタイプ」とは、１個の染色体上の連鎖する遺伝子座に見出される一連の対立遺伝子を意味する。より具体的には、ハプロタイプとは、ゲノムＤＮＡフラグメント中の所定の遺伝子座における一連の一塩基多型を意味する。
【００１６】
「ライゲーション」とは、テンプレート駆動反応において、２個以上の核酸（例えば、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド）の末端の間に共有結合または連結を形成することを意味する。この結合または連結の性質は広く異なり得、そしてライゲーションは、酵素的にでも化学的にでも実施され得る。本明細書中で使用される場合、ライゲーションは、通常酵素的に実施される。
【００１７】
「マイクロアレイ」は、平面状または微粒子の集合であり得、特異的なアドレス可能位置に、通常は共有結合的に固定（ｆｉｘｅｄ）または不動化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを備える固相支持体をいう。好ましくは、マイクロアレイは、核酸のアレイを備える平面状の表面を有する固相支持体であって、このアレイの各構成部材は、固定領域に不動化されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの同一コピーを含み、これらのコピーは、アレイの他の構成部材のコピーとは重複しない。代表的には、このオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖であり、既知の決定可能であるかまたはアドレス可能な位置で固相支持体に共有結合している。マイクロアレイ中で核酸を含む非重複領域の密度は、代表的には、１００／ｃｍ２を超え、そしてより好ましくは１０００／ｃｍ２を超える。マイクロアレイ技術は、以下の参考文献において概説されている：Ｓｃｈｅｎａ（編），Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２０００）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：４０４−４１０（１９９８）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，２１：１−６０（１９９９）。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオシド」は、例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載されるように天然のヌクレオシド（２’−デオキシ形態および２’−ヒドロキシ形態）を含む。ヌクレオシドを参照する際の「アナログ」は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０）などによって記載されるように、それらが特異的ハイブリダイゼーション可能な場合、改変塩基部分および／または改変糖部分を有する合成ヌクレオシドを含む。このようなアナログは、結合特性の増強、複雑性の低下、特異性の増加などのために設計された合成ヌクレオシドを含む。ハイブリダイゼーション特性またはヌクレアーゼ耐性特性を増強したアナログを含むポリヌクレオチドは、以下に記載されている：ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ（上記に引用されている）；Ｃｒｏｏｋｅら，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，６：８５５−８７０（１９９６）；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３４３−３５５（１９９５）など。二重鎖安定性を増強し得るポリヌクレオチドの例示的な型としては、オリゴヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホラミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）（本明細書中で「アミデート」といわれる）、ペプチド核酸（本明細書中で「ＰＮＡ」といわれる）、オリゴ−２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、Ｃ−５プロピニルピリミジンを含むポリヌクレオチド、および同様の化合物が挙げられる。このようなオリゴヌクレオチドは、市販されているか、または文献に記載された方法を使用して合成され得る。
【００１９】
二重鎖を参照する際の「完全にマッチした」とは、二重鎖を形成するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの鎖が、互いに二本鎖構造を形成し、その結果、各鎖中の全てのヌクレオチドが、もう一方の鎖のヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対となることを意味する。この用語はまた、使用され得るヌクレオチドアナログの対形成（例えば、デオキシイノシンと２−アミノプリン塩基など）を包含する。三重鎖を参照する際に、この用語は、その三重鎖が、完全にマッチした二重鎖と、その完全にマッチした二重鎖の塩基対とすべてのヌクレオチドがＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ結合する第３の鎖とからなることを意味する。逆に、タグとオリゴヌクレオチドとの間の二重鎖における「ミスマッチ」とは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ結合および／またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合および／または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ結合を形成しない二重鎖または三重鎖における、ヌクレオチドの対あるいは三つ組を意味する。
【００２０】
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、各々が、天然のヌクレオチドモノマーまたは改変されたヌクレオチドモノマーの直鎖状ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを形成するモノマーとしては、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、２’−デオキシ−３’−ホスホロチオネートヌクレオシド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられ、これらは、規則的なパターンのモノマー−モノマー相互作用（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の対形成、塩基スタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基対形成など）によって、天然のポリヌクレオチドに特異的に結合し得る。ポリヌクレオチドは、代表的に、例えば、５〜４０個の数個のモノマー単位から（この場合、これらは、通常「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる）、数百個のモノマー単位まで、サイズが変動する。ポリヌクレオチドが文字の配列（大文字または小文字）によって表される場合（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」）はいつでも、それらのヌクレオチドは、５’→３’の順に左から右に存在し、そして「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」はチミジンを示し、「Ｉ」はデオキシイノシンを示し、「Ｕ」はウリジンを示すことが理解される。他に記述しない限り、専門用語および原子番号付けの慣習は、ＳｔｒａｃｈａｎおよびＲｅａｄ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）に開示されたものに従う。通常は、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって結合された４種の天然のヌクレオシド（例えば、ＤＮＡについては、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン）を含む；しかし、これらはまた、非天然のヌクレオチドアナログ（例えば、改変された塩基、糖、またはヌクレオシド間結合が挙げられる）も含み得る。天然ヌクレオチドまたは非天然のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが使用され得る場合（例えば、酵素による処理が必要とされる場合）、通常天然のヌクレオチドのみからなるポリヌクレオチドが必要とされることは当業者には明らかである。同様に、酵素が、活性のために特異的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの基質（例えば、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖など）を要求する場合、そのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの基質に対する適切な組成物の選択は、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）、および同様の参考文献などの学術論文からのガイダンスを使用して、十分に当業者の知識の範囲内である。
【００２１】
「プライマー」とは、ポリヌクレオチドのテンプレートと二重鎖を形成する際に核酸合成の最初の地点として機能し、伸長した二重鎖が形成されるように、テンプレートに沿ってその３’末端から伸長され得る、天然でも合成でもよいオリゴヌクレオチドを意味する。伸長プロセスの間に付加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートのポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常は、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、１４〜３６個のヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【００２２】
「読出し」とは、数もしくは値に変換され得る、測定および／または検出される、パラメータを意味する。一部の文脈において、読出しは、このような収集されたデータまたは記録されたデータの実際の数値的な表示をいうことができる。例えば、マイクロアレイからの蛍光強度シグナルの読出しは、そのマイクロアレイの各ハイブリダイゼーション部位において作製されるシグナルのアドレスおよび蛍光強度である；従って、このような読出しは、種々の方法で、例えば、マイクロアレイの像として、表の数などととして、登録または保存され得る。
【００２３】
ポリヌクレオチドを参照する際の「配列決定（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）」または「ヌクレオチド配列の決定（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ａ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、そのポリヌクレオチドの部分的配列情報および完全配列情報の決定を包含する。すなわち、この用語は、標的ポリヌクレオチドにおける、配列比較、フィンガープリント、および標的ポリヌクレオチドに関する同様のレベルの情報、ならびに発現同定およびヌクレオシドの順序付け（通常は、各々のヌクレオシドの順序付け）を包含する。この用語はまた、標的ポリヌクレオチド内の４種の型のヌクレオチドのうちの１種、２種または３種の同定、順序付け、および位置の決定を包含する。例えば、いくつかの実施形態において、配列決定は、標的ポリヌクレオチド「ＣＡＴＣＧＣ・・・」内の単一の型のヌクレオチド（例えば、シトシン）の順序付けおよび位置を同定し、その配列が二進コードとして表される（例えば、「Ｃ−（非Ｃ）−（非Ｃ）−Ｃ−（非Ｃ）−Ｃ・・・」については、「１００１０１・・・」）ようにすることによって達成され得る。
【００２４】
「サイン配列（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、サイン中のヌクレオチドの順序付けが、集団においてポリヌクレオチドを同定するための十分な情報を含むポリヌクレオチドおよび配列の順序付けと同じになるようなポリヌクレオチドに由来するヌクレオチドの配列を意味する。サイン配列は、連続的なヌクレオチドのセグメント（例えば、ポリヌクレオチド「ａｃｇｔｃｇｇａａａｔｃ」の（ａ，ｃ，ｇ，ｔ，ｃ））からなってもよいし、１つおきのヌクレオチドの配列（例えば、ポリヌクレオチド「ａｃｇｔｃｇｇａａａｔｃ」の（ｃ，ｔ，ｇ，ａ，ａ，））からなってもよいし、ヌクレオチド変化の配列（例えば、ポリヌクレオチド「ａｃｇｔｃｇｇａａａｔｃ」の「ａ，ｃ，ｇ，ｔ，ｃ，ｇ，ａ，ｔ，ｃ」）からなってもよいし、または同様の配列からなってもよい。
【００２５】
ある分子と別の分子（例えば、標的分析物に対する結合化合物またはプローブ）との結合に関して「特異的」または「特異性」とは、他の分子に対するプローブの認識、その分子とプローブとの接触、またはその分子とプローブとの複合体形成が実質的に少ない状態の、プローブと標的との間の安定な複合体の認識、接触、および形成を意味する。一局面において、第１の分子の第２の分子との結合に関して「特異的」とは、第１の分子が反応物またはサンプル中で別の分子を認識し、その分子と複合体を形成する程度まで、第１の分子が、第２の分子との最大数の複合体を形成することを意味する。一局面において、この最大数とは、第１の分子によって形成されるすべてのこのような複合体のうちの少なくとも５０％である。一般に、特異的な結合事象に関与する分子は、その分子の表面または空洞内に、互いに結合する分子間で特異的な認識を生じる領域を有する。特異的な結合の例としては、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドの間での二重鎖または三重鎖の形成、レセプター−リガンド相互作用などが挙げられる。本明細書中で使用される場合、特異性または特異的結合に関して「接触」とは、２つの分子が、弱い非共有結合性化学的相互作用（例えば、ファンデルワールス力、水素結合、イオン性相互作用および疎水性相互作用など）が分子の相互作用を支配するのに十分に接近していることを意味する。本明細書中で使用される場合、２つ以上の分子に関して「安定な複合体」とは、このような分子が非共有結合的に連結した凝集体を、非凝集状態よりも、より熱力学的に好ましいアッセイ条件下で、例えば、特異的な結合によって形成することを意味する。
【００２６】
複数の蛍光標識に関して「スペクトル的に解像可能」とは、標識の蛍光発光バンドが十分に別個（すなわち、実質的に非重複）であることを意味する。これは、個々の標識が付着される分子タグが、標準的な光電子検出システムによって（例えば、帯域通過フィルタおよび光電子増倍管のシステムを利用することによって）個々の標識より生成される蛍光シグナルを基に区別され得る程に十分に別個であり、これらのシステムは、米国特許第４，２３０，５５８号、同第４，８１１，２１８号など、または、Ｗｈｅｅｌｅｓｓら、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５）中のｐ．２１〜７６に記載されるシステムによって例示される。
【００２７】
「ターミネーター」とは、ポリメラーゼ伸長反応によってプライマーに取り込まれ得るヌクレオチドを意味する。このヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマーに引き続き取り込まれること阻止し、そしてそれによって、ポリメラーゼを介した伸長を停止する。代表的なターミネーターは、３’−ヒドロキシル置換基を欠くヌクレオシド３リン酸であり、例えば、２’，３’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、および２’，３’―ジデオキシ−３’−ハロリボース（例えば、３’−デオキシ−３’―フルオロリボースまたは２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロリボースヌクレオシド）が挙げられる。あるいは、リボフラノースアナログは、ターミネーター中に使用され得る（例えば、２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、β−Ｄ−アラビノフラノシル、３’−デオキシ−β−Ｄ−アラビノフラノシル、３’−アルニノ−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボファラノシル、および２，３’―ジデオキシ−３’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）。種々のターミネーターは、以下の参考文献：Ｃｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：１６７１−１６８６（１９８４）；Ｃｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１８３：２７５−２７８（１９８５）；Ｉｚｕｔａら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１５：６８３−６９２（１９９６）；およびＫｒａｙｅｖｓｋｙら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，７：６１３−６１７（１９８８）において開示される。ヌクレオチドターミネーターはまた、可逆的なヌクレオチドターミネーターを含む（例えば、Ｍｅｔｚｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２（２０）：４２５９（１９９４）。特定の対象となるターミネーターは、捕捉部分（例えば、ビオチン、またはその誘導体）を有するターミネーターである（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｊｕ，米国特許第５，８７６，９３６号）。本明細書中で使用される場合、「所定のターミネーター」は、予め選択されたテンプレートのヌクレオチドとの塩基対であるターミネーターである。
【００２８】
スペーシングまたは分布に関して「均一な」とは、物体（例えば、配列マーカー）間のスペーシング、または事象が、指数関数的な確率変数によって近似され得ることを意味する（例えば、Ｒｏｓｓ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  Ｍｏｄｅｌｓ，第７版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００））。哺乳動物ゲノムにおける配列マーカーのスペーシングに関して、反復ＤＮＡ配列の有意な領域があり、この領域中ではゲノムＤＮＡのランダム配列モデルが保持されないことが理解される。配列マーカーのスペーシングに関して「均一な」とは、好ましくは、特有の配列領域（すなわち、ゲノムの非反復配列領域）におけるスペーシングをいう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、複雑性を減少したサブ集団を形成するために、所定の配列特性に基づいてポリヌクレオチドを分類するための方法を提供する。一局面において、このような分類方法は、一意的にタグ化されたポリヌクレオチド（例えば、ゲノムフラグメント）の集団を分析するために使用される。本発明に従る分類の反復工程の間またはその工程の終わりに、タグは、複製され得、標識され得、そして固相支持体（例えば、マイクロアレイ）とハイブリダイズされ得、ポリヌクレオチドからの配列情報の同時読出しを提供する。以下により完全に記載されるように、所定の配列特性としては、特定の遺伝子座にある特有の配列領域、一連の遺伝子座にある一連の一塩基多型（ＳＮＰ）などが挙げられるが、これらに限定はされない。一局面において、このような一意的にタグ化されたポリヌクレオチドの分類は、大量の並列処理（例えば、異なるゲノムから、何千ものゲノムＤＮＡフラグメントを同時に配列決定、遺伝子型決定、またはハプロタイプ決定すること）を可能とする。
【００３０】
本発明の複雑性を減らす方法の一局面は、図１Ａ〜１Ｃに例示される。（本明細書中で親集合として時折呼ばれる）ポリヌクレオチド（１００）の集合は、既知の配列領域を有する配列を含み、この配列領域は、プライマー結合部位（１０４）として使用され得、この部位は、１つ以上のＳＮＰを含み得る領域（１０２）のすぐ隣り（かつ、その領域のすぐ上流）にある。プライマー結合部位（１０４）は、それが存在するときはいつでも、同じ配列、または実質的に同じ配列を有する。すなわち、集合内のプライマー結合部位（１０４）の間で配列における差異が存在し得るが、この部位について選択されたプライマーは、実施される伸長方法（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ伸長）によって、アニールし、そして伸長されなければならない。プライマー結合部位（１０４）は、集合（１００）内のポリヌクテオチドの所定の配列特性の一例である。親集合（１００）はまた、プライマー結合部位（１０４）または多型領域（１０２）のいずれも含まないポリヌクレオチドを含む。一局面において、本発明は、プライマー結合部位（１０４）および多型領域（１０２）を有する集合（１００）から配列を単離する方法を提供する。これは、プライマー結合部位（１０４）を有するポリヌクテオチドにプライマー（１１２）がアニール（１１０）して、プライマー−ポリヌクレオチド二重鎖（１１３）を形成することにより、達成される。プライマー（１１２）がアニールされた後、プライマーは伸長され、補足部分を有する所定のターミネーターを取り込む。伸長は、ポリメラーゼ活性、化学的ライゲーションもしくは酵素的ライゲーション、または両方の組み合わせによってもたらされ得る。ターミネーターは取り込まれ、その結果、連続的な取り込み（または、少なくとも未制御の連続的な取り込み）が阻止される。
【００３１】
この伸長工程はまた、テンプレート核酸上でプライマーを伸長するプロセスを意味するために「テンプレート依存性伸長」と呼ばれ得る。このテンプレートは、伸長産物（すなわち、１つ以上のヌクレオチドを付加したプライマーを含むオリゴヌクレオチド）を生成する。つまりこれは、テンプレート核酸と相補的である。上述のように、テンプレート依存性伸長は、いくつかの方法（化学的ライゲーション、酵素的ライゲーション、酵素的重合などを含む）で実施され得る。酵素的伸長は、酵素的認識の必要性が反応の特異性を高めるので、好ましい。一局面において、このような伸長は、従来の反応においてポリメラーゼを使用して実施される。この場合、ＤＮＡポリメラーゼは、捕捉部分で標識された少なくとも１つのターミネーターが存在する下で、プライマー（１１２）を伸長する。その実施形態に依存して、１〜４つのターミネーターが存在し得る（その結果、４つの天然ヌクレオチドのうちのいずれか１つにおいてか、またはそのヌクレオチドの全てにおいてか、またはそのヌクレオチドの任意のサブセットにおいて、合成が止まる）。例えば、１つの捕捉部分（例えば、ビオチン）のみが利用される場合、伸長が、４つの別々の反応において生じ得る。この場合、各反応は、異なるターミネーター（例えば、ビオチン化ジデオキシアデノシン３リン酸、ビオチン化ジデオキシシチジン３リン酸など）を有する。他方では、４つの異なる捕捉部分が利用される場合、次いで、４つのターミネーターが、１つの反応において使用され得る。好ましくは、ターミネーターは、ジデオキシヌクレオシド３リン酸である。このようなターミネーターは、いくつかの異なる捕捉部分（例えば、ビオチン、フルオレセイン、ジニトロフェノール、ジコキシゲニンなど）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）で入手可能である。好ましくは、利用されるターミネーターは、ビオチン化ジデオキシヌクレオシド３リン酸（ビオチン−ｄｄＮＴＰ）である。その配列決定反応における使用は、Ｊｕら，米国特許第５，８７６，９３６号によって記載され、この特許文献は、本明細書中で参考として援用される。本発明の１局面において、４つの別々の反応が実施され、各反応は、４つのターミネーター（ビオチン−ｄｄＡＴＰ、ビオチン−ｄｄＣＴＰ、ビオチン−ｄｄＧＴＰ、またはビオチン−ｄｄＴＴＰ）のうちの１つのみを利用する。さらに好ましくは、このような反応において、捕捉部分を欠くｄｄＮＴＰがまた、誤った取り込みを最小化するために含まれる。
【００３２】
図１Ｂに例示されるように、プライマー（１１２）が伸長され、ビオチン化ジデオキシチミジン（１１８）を取り込む。その後、取り込まれたビオチンを有するプライマー−ポリヌクレオチド二重鎖が、捕捉剤で捕捉される。この捕捉剤とは、この図において、アビジン化（１２２）（または、ストレプトアビジン化）固体支持体（例えば、マイクロビーズ（１２０））である。捕捉されたポリヌクレオチド（１２６）は、分けられ、そしてポリヌクレオチドは、伸長されたプライマーから融解されて、親集合（１００）の複雑性よりも低い複雑性を有する集団（１３２）を形成する（１３０）。他の捕捉剤としては、抗体（特に、モノクローナル抗体）が挙げられ、これは、捕捉部分との特異的かつ強力な複合体を形成する。多くのこのような抗体が市販されており、ビオチン、フルオレセイン、ジニトロフェノール、ジコキシゲニン、ローダミンなどと特異的に結合する（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）。
【００３３】
本発明はまた、共通配列（すなわち、所定の配列特性）を有するポリヌクレオチドのサブセットを単離するために、所定の配列の重複プライマーのセットを使用する、連続的な選択を実施する方法を提供する。一例として、図１Ｄの集合（１４０）は、１つ以上の制限酵素を用いてゲノムＤＮＡまたは大きいＤＮＡを切断することによって形成され、その後に、アダプター（１４２および１４４）のライゲーションが続く。このライゲーションは、例えば、従来のＡＦＬＰ反応（本明細書中で参考として援用される、米国特許第６，０４５，９９４号）で実施され得る。プライマー（１４９）は伸長され、ポリヌクテオチド（１５１）とアニールされ（１４６）、そして伸長されて、（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって）ビオチン化（１５０）ジデオキシヌクレオチドＮ１（１４８）を取り込む。ストレプトアビジン化マイクロビーズ（１２０）で捕捉（１５２）した後、選択されたポリヌクテオチドは、伸長されなかったプライマー−ポリヌクレオチド二重鎖（例えば、プライマー−ポリヌクレオチド二重鎖（１４７））から分離され、そして集団（１５４）を生じるために溶解される。第２のプライマー（１５７）が選択され、その結果、プライマーがアニールする際に、プライマーは、テンプレートポリヌクレオチドの第１のヌクレオチドと塩基対を形成する。つまり、プライマーの配列が選択され、その結果、プライマーが結合部位とアニールする。この結合部位は、前のプライマーの結合部位に対して、ポリヌクレオチドへと１塩基分移動されるか、または１塩基分下流に移動される。つまり、一実施形態において、第２のプライマー（１５７）の３’におけるヌクレオチドのほとんどは、Ｎ１である。本発明にしたがって、プライマーが選択され得る。このプライマーは、１塩基より多い（例えば、２塩基）分だけ下流に移動されている結合部位を有する。第２のプライマー（１５７）は、第２のターミネーター（１５８）と一緒に伸長され、そして、選択された集団（１６４）を生じるのに適切な捕捉剤を有するマイクロビーズ（１６３）によって捕捉される。プライマーをアニールし、伸長し、捕捉し、そして融解する連続的なサイクルは、プライマーセットで実施され得る。このプライマーセットは、所定の制限酵素認識部位と隣接する領域にある同じ配列をすべてのポリヌクレオチドが有する、ポリヌクレオチドのサブ集団の分離を可能にする。好ましくは、各サイクルの後で、選択されたポリヌクレオチドは、次に続く反応のための材料の量を増加させるために増幅される。一局面において、増幅は、側方のアダプターのうちの１つと結合するプライマーと高いフィデリティーのＤＮＡポリメラーゼとを使用する、従来の線形増幅反応によって実施される。増幅サイクル数は、１〜１０の範囲内、およびより好ましくは、４〜８の範囲内であり得る。好ましくは、同じ増幅サイクル数が、伸長、捕捉、および融解の各サイクルにおいて実施される。
【００３４】
別の局面において、本発明は、プライマー結合部位として使用される既知の配列領域と隣接する、ＳＮＰ配列を含むハプロタイプを選択するための方法を包含する。例えば、図２Ａにおいて、ポリヌクレオチドの集団（２００）は、異なるゲノムの制限酵素フラグメントに対応し得る。このゲノムは、プライマー結合部位（２０１、２０３、２０５、および２０７）とそれぞれが隣接する多型座位（１〜４）を含む。集団（２００）を作る制限酵素フラグメントは、付着されたアダプター（２０９および２１３）有する。このアダプターは、以下により完全に記載されるように、オリゴヌクレオチドタグがそのフラグメントに付着される限り、同じであっても異なっていてもよい。ハプロタイプは、部位（２０１、２０３、２０５、および２０７）に特異的にアニールするプライマーを使用して、本発明に従い、連続的にポリヌクレオチドを選択することにより、混合された集団から選択される。例示されるように、プライマー（２１１）は、プライマー結合部位（２０１）にアニールし（２０２）、そして、ビオチン化ジデオキシシチジンターミネーター（２１０）と一緒に伸長される。なぜなら、遺伝子座１にて「Ｇ」を有するポリヌクレオチドが望ましいからである。従って、配列（２０４および２０８）は、上述のように、捕捉剤を有する固相支持体（２１８）を使用して、選択される（２１４）。選択されたポリヌクレオチド（２１６）は、融解され、そして次のプライマー（２２４）が、結合部位（２０３）とアニールされる（２２２）。プライマー（２２４）は、ビオチン化ジデオキシグアノシンターミネーター（２２８）と一緒に伸長される（２２６）。なぜなら、所望のハプロタイプの次のＳＮＰは、デオキシチジンであるからである。捕捉部分を有する固相支持体（２３４）は、反応に加えられ（２３２）、その結果、対応するポリヌクレオチドと一緒になった伸長されたプライマーが、選択される。このプロセスは、所望のハプロタイプを含むポリヌクレオチド（２７０）が、最終的に選択されるまで、残りの遺伝子座について繰り返される。
【００３５】
上述の選択方法は、本発明の別の局面において使用され得る。この場合、ポリヌクレオチドの集団は、特有のタグを有するゲノムを含む。この局面は、図１Ｆに例示される。ゲノム（１〜Ｎ）は、（例えば、従来の制限酵素反応において）別々にフラグメント化され（１８２）、本発明のアダプター（１８１および１８３）が付着されるフラグメント（１８０）を生成する。アダプターのうちの１つ（１８１または１８３）（このアダプターの例は以下に示される）は、本発明に従って合成されたタグを含み、そしてアダプターの両方（１８１および１８３）は、例えば、上述のように、上記フラグメントを操作するために必要な他の配列（例えば、プライマー結合部位および制限酵素部位）を含む。本発明の配列特異的に分類する方法を使用することで、各ゲノムからの所定の遺伝子座からのフラグメント（１８４）が、選択されかつ組み合わされて（１８６）、反応混合物を形成する。他の実施形態において、アダプター（１８１および１８３）を有するフラグメントは、選択の前に、結合され得る。反応混合物中の単離されたフラグメントは、ＳＮＰまたはハプロタイプなどを同定するための種々の技法によって、分析され得る（１８８）。その後、標識されたタグが生成され（１９０）、分析反応によって得られた情報を読出し装置へと伝える。この装置は、好ましくは、標識されたタグとマイクロアレイ（１９４）へのハイブリダイゼーションを含むか、または同等の装置である。マイクロアレイ（１９４）は、ゲノムフラグメントを標識するために使用されるすべてのタグについてのタグ相補体を、個々のハイブリダイゼーション部位に含む。従って、利用される分析反応が、各Ｎゲノムのうちの１つにおいて特定の遺伝子座（すなわち、ＳＮＰ）にあるヌクレオチドを同定する場合、そのゲノム集団におけるその遺伝座にあるＳＮＰ頻度は、同時に決定される。
【００３６】
事実上は、どのポリヌクレオチド集団（ゲノムフラグメント、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのライブラリー）も、本発明の方法（制限酵素による切断が挙げられる）によって分析され得る。好ましくは、本発明によって分析されるポリヌクレオチド集団は、配列が既知である生物体のゲノムである。このようなゲノムは、任意の生物体（植物、動物、細菌などを含む）からのゲノムであり得る。ゲノムＤＮＡが医学的または診断的な使用のために得られる場合、それは、広範に種々の供給源（組織生検、血液サンプル、羊膜細胞などを含む）から得られ得る。ゲノムＤＮＡは、例えば、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５２巻、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）などに記載されるような従来の技法によって、このような組織から抽出される。
【００３７】
（ハイブリダイゼーションタグ）
本発明の重要な特徴は、最小限にクロスハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセットから選択されたオリゴヌクレオチドから構成される（つまり、最小限にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドセットから選択されたオリゴヌクレオチドのサブユニット（すなわち「ワード（ｗｏｒｄ）」）からアセンブルされた）ハイブリダイゼーションタグの使用である。このような最小限にクロスハイブリダイズするセットの構成は、Ｂｒｅｎｎｅｒら、米国特許第５，８４６，７１９号、およびＢｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：１６５５−１６７０（２０００）において開示され、これらの参考文献は、参考として援用される。Ｂｒｅｎｎｅｒに従って、最小限にクロスハイブリダイズするセットのオリゴヌクレオチドセットの配列は、少なくとも２つのヌクレオチドのだけが異なる同じセットの他の一員すべての配列と異なる。従って、このようなセットの各一員は、ミスマッチが２つ未満の状態で、他の任意の一員の相補体と二重鎖（または三重鎖）を形成し得ない。好ましくは、最小限にクロスハイブリダイズする同じセットのタグおよびタグ相補体の完全にマッチした二重鎖は、ほぼ同じ安定性（特に、融解温度および／または乖離温度によって測定される場合）を有する。ハイブリダイゼーションタグの相補体は、本明細書中で「タグ相補体」と呼ばれ、これは、天然のヌクレオチド、または人工のヌクレオチドアナログを含み得る。ハイブリダイゼーションタグは、それらに対応するタグ相補体が使用される場合は、ハイブリダイゼーションの特異性または識別性を増強する手段を提供する。本明細書中に使用される場合、用語「最小限にクロスハイブリダイズするセット」はまた、２マーおよび３マーのセットを含み、その一員は、少なくとも１つのヌクレオチドだけ互いに異なる。
【００３８】
オリゴヌクレオチドのタグおよびタグ相補体の最小限にクロスハイブリダイズするセットは、所望のセットサイズおよびクロスハイブリダイゼーションの最小化が要求される程度（または別の言い方をすると、増強されるのに求められる特異性の程度）に依存して、組み合わせてかまたは独立してのいずれかで合成され得る。例えば、最小限にクロスハイブリダイズするセットは、独立して合成された１０マーの配列のセットから構成され得る。この配列は、Ｂｒｅｎｎｅｒらの国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９５１３に開示されるように構築された場合、少なくとも４ヌクレオチドだけ互いに異なり、このようなセットは、３３２の最大サイズを有する。あるいは、オリゴヌクレオチドタグの最小限にクロスハイブリダイズするセットはまた、それ自身が最小限にクロスハイブリダイズするセットから選択されるサブユニットから組み合わせてアセンブルされ得る。例えば、少なくとも３ヌクレオチドだけ互いに異なる最小限にクロスハイブリダイズする１２マーのセットは、それぞれが３ヌクレオチドだけ互いに異なる最小限にクロスハイブリダイズする４マーのセットから選択される３サブユニットを集めることによって合成され得る。このような実施形態は、９３（すなわち、７２９）の最大限にサイズ決めされた１２マーのセットを生じる。
【００３９】
組み合わせて合成される場合、ハイブリダイゼーションタグは、好ましくは、複数のサブユニットから構成され、各サブユニットは、２〜１０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドから構成され、この場合、各サブユニットは、最小限にクロスハイブリダイズする同じセットから選択される。このような実施形態において、利用可能なハイブリダイゼーションタグの数は、タグごとのサブユニットの数およびサブユニットの長さに依存する。
【００４０】
（コンマレス（ｃｏｍｍａ−ｌｅｓｓ）ハイブリダイゼーションタグ）
本発明の一局面において、オリゴヌクレオチドタグは、それの相補配列、または「抗タグ」とハイブリダイズされ、これらは、固相支持体（例えば、マイクロアレイ）と付着される。このような状況においては、タグの各ワード間かつ全ワード間で完全にマッチした二重鎖を形成する抗タグに非常に特異的なオリゴヌクレオチドタグ、および抗タグと最高でも弱い安定性の二重鎖しか形成しない（ここで、ワードは完全にはアライメントされない）オリゴヌクレオチドタグを利用することが望ましい。つまり、偽シグナルを避けるため、不完全にアライメントされた配置（例えば、完全なアライメントから１〜２塩基以上が移動された配置）において、ハイブリダイズされる場合に安定な二重鎖を形成しないワードセット（およびそれらから構築されたタグ）を選択することが望ましい。このような特質を有するワードセットは、いくつかの方法において構築され得る。この方法は、ワードの間に「コンマ」を挿入する工程、または上述の特質（すなわち、以下に議論されるような、いわゆる「コンマレス」タグをもたらす特質）を本質的に保有するワードを使用する工程を包含する。コンマを有するワードのタグは、上で引用されたいくつかの参考文献においてＢｒｅｎｎｅｒによって開示された、最小限にクロスハイブリダイズするワードセットから容易に構築される。コンマ含有（ｃｏｍｍａ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）タグまたはコンマレスタグのいずれも、本発明に使用され得るが；コンマレスタグは、それらが、完全なアライメントからのタグおよび抗タグが少し（例えば、１〜３ヌクレオチド）でも移動した後に形成された二重鎖において最大の不安程度を生じる場合に好ましく、これはまた時折、本明細書中で「相変化（ｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  ｐｈａｓｅ）」と呼ばれる。
【００４１】
上述のように、短いオリゴヌクレオチド「ワード」から組み合わせて合成されたタグにおいて、安定な二重鎖は、その「ワード」が完全にアライメントされなくとも、タグとその相補体との間で形成し得る。図３Ａに例示されるように、ワード（３０２〜３１２）から構成されるオリゴヌクレオチドタグ（３００）は、その相補体（３１４）を完全にアライメントし得、完全にマッチした二重鎖を形成する。しかし、タグ（３１８）が相補体（３１４）に対して１塩基以上だけ（またはアライメントから外れる）移動される（３１６）にもかかわらず、いくつかのワードの選択においては、安定な二重鎖（３１８）をまた形成する同じレパートリー中に他のタグが存在し得る。このような偽ペア形成の安定性は、完全にアライメントされたペア形成の安定性と非常に近い。このことは、正確にハイブリダイズされたタグと不正確にハイブリダイズされたタグとの間を区別することを困難にしている。
【００４２】
このような偽ハイブリダイゼーションは、タグおよびその相補体が、完全にアライメントされた配置から１塩基以上離れて移動されるときは常に、大量のミスマッチを有するタグを設計することよって解消され得る。上述のように、このような設計は、ワード間に「コンマ」を導入するか、または、完全なアライメントからの移動のいずれもが大量の安定性を破壊する（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ−ｄｅｓｔｒｏｙｉｎｇ）ミスマッチを導入する特質を本質的に有するワードを設計するかのいずれかにより、達成され得る。その最も単純な形成において、「コンマ」は、図３Ｂに例示されるような、タグのワード（３２２）の間に導入された１つ以上のヌクレオチド（３２０）であり得る。例えば、タグ（３２１）のコンマ（３２０）は、Ｇから構成されるが、一方でワード（３２２）は、Ａ、Ｔ、およびＣからのみ構成され得る。従って、完全にマッチした二重鎖を形成するためには、（ｉ）コンマはアライメントされなければならなく、かつ（ｉｉ）タグ（３２１）のワードは、それぞれ相補体（３２５）のワード（３２３）の相補体でなければならない。完全なアライメントが存在する場合、完全にマッチした二重鎖（３２４）が形成される。これらの条件が両方とも満たされない場合、次いで、二重鎖は何も形成されない。または形成（３２６）される場合は、二重鎖の安定性は、完全にアライメントされかつ完全にマッチしたタグ（３２４）の安定性よりも非常に低くなる。
【００４３】
「コンマ」はまた、図３Ｃに例示されるように、ワードの形態を取り得る。また一例として、タグ（３２２）の最後のワード（３３０）は、Ｇから構成され得る。一方で、内部のワード（３３４）は、Ａ、Ｃ、およびＴから構成され得る。これにより、タグ（３３２）およびその相補体（３３６）が正確にアライメントさせられる。上述のように完全なアライメント（３３８）がない場合、形成され得る任意の二重鎖（３４０）の安定性は、完全にアライメントされたタグおよびその相補体の安定性よりも非常に低くなる。
【００４４】
最終的に、コンマを含まないタグのレパートリーは、コンマを含むタグと同じ特質を有するワードから構築され得る。「コンマレス」特質を有するこのようなタグは、図３Ｄに例示される。つまり、タグと相補体との間の完全にマッチした二重鎖を形成するために、この２つは、完全にアライメントされなければならない。コンマレスタグのレパートリーのためのワードは、広範で種々の長さで構築されなければならない。例えば、このようなワードは、４〜１０ヌクレオチドの範囲の長さを有し得、そして天然ヌクレオチドまたは人工ヌクレオチドから構成され得る。一局面において、ワードは、結果として生じるタグが酵素によって操作されるときは常に、４つの天然ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ）から構成される。別の局面においてワードは、結果として生じるタグ（または抗タグ）が酵素によって処理されない場合、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＩからなる群より選択されるヌクレオチドから構築され得る。固相支持体上で合成された抗タグは、代表的には、酵素によって処理されたタグよりも、より広範な種々のヌクレオチドから構築され得る。本発明の一局面において、コンマレスタグは、以下のワードから構築され得る。
【００４５】
４つの天然塩基を二重項を考慮する。このような二重項のうちの４セットは、全部で１６セットあり、以下のように規定され得る。
【００４６】
【化１】
2007521833.tif 000005
各セットにおいて、４つすべてがそのセットの他のすべての一員と両方の位置において異なるが、４つの異なるセットが互いに比較される場合、１塩基は、他のセットの一員と共通である。例えば、セットＩにおいて、８つの異なるワードが、Ｉ−ＩＩの順番およびＩＩ−Ｉの順番で、セットＩからの二重項とセットＩＩからの二重項とを組み合わせることにより生成され得る。これらのセットの各々が、他の逆方向相補体である二重項を含むので、組合せは、どんなＩ−ＩＩ順の４塩基ワードも、ＩＩ−Ｉ順の４塩基ワードの逆方向相補体であるように、作られる。したがって、Ｉ−ＩＩ順のワードが以下（ＧＴＣＴ、ＴＧＴＣ、ＡＣＡＧ、およびＣＡＧＡ）のように選択され、次いで、ＩＩ−Ｉ順のワードは、以下のようにのみ規定され得る。
【００４７】
【化２】
2007521833.tif 000006
配置は、各セットの一員が同じセットの任意のメンバーから３塩基だけ異なるという制限を守っている。上のセットから、コンマレスタグ用のいくつかのワードセットが構築され得る。最初の２セットをみると、第１セットの各ワードの末端は「Ａ」であり、そして、第２セットの各ワードの末端は「Ｔ」であり、以下のように与えられる。
【００４８】
【化３】
2007521833.tif 000007
セットＩＩＩにおいては二重項は自己相補的なので、同じプロセスは上のセットＩＩＩおよびセットＩＶには機能しないが、さらなるワードセットは、Ｉ−ＩＩ順をＩＩ−Ｉ順へと転換しかつ逆の場合も同じように転換し、そして上のように塩基を加えることにより生成され得る。これは、以下を与える。
【００４９】
【化４】
2007521833.tif 000008
酵素的処理に使用されないタグ（例えば、固相支持体上で合成された抗タグ）については、デオキシノシンを利用する以下のセットが利用され得る。
【００５０】
【化５】
2007521833.tif 000009
コンマレスタグを構築するためのさらなるワードセットは、図４に列挙される。
【００５１】
（タグ相補体、ハイブリダイゼーションおよび読出し）
好ましくは、タグ相補体は、固相支持体（例えば、微細ビーズまたは単一支持体上の合成位置のアレイ上の特異的位置）の表面上で合成され、その結果、同一の配列の集団、または実質的に同一の配列の集団が、特異的領域において生成される。すなわち、各支持体の表面（ビーズの場合）、または各領域の表面（アレイの場合）は、特定の配列を有する１つの型のみのタグ相補体のコピーによって誘導体化される。このようなビーズまたは領域の集団は、それぞれに別個の配列を有するタグ相補体のレパートリーを含む。ハイブリダイゼーションタグ、タグ相補体、および合成タグに関して、本明細書中で使用される場合、用語「レパートリー」は、所定のセットまたは集団における種々のタグまたはタグ相補体の総数を意味する。
【００５２】
タグ相補体を含む固相支持体は、種々の形態（例えば、微粒子、単一の断片（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｉｅｃｅ）および平面状（例えば、スライドガラス））をとり得、そして種々の材料（例えば、ガラス、プラスチック、シリコン、ポリスチレンなど）から構成され得る。粒状の固相支持体としては、ミクロスフェア、特殊蛍光標識（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ  ｌａｂｅｌ）ミクロスフェア（例えば、Ｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９：６３１−６３５（２００１）；Ｋｅｔｔｍａｎら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、３３：２３４−２４３（１９９８））などが挙げられる。好ましくは、ハイブリダイゼーションタグは、それらを従来のマイクロアレイ上の、それらの相補的配列へハイブリダイズさせることにより検出される。このようなマイクロアレイは、例えば、フォトリソグラフィー光学法（ｐｈｏｔｏ−ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、Ｐｉｒｒｕｎｇら、米国特許第５，１４３，８５４号、Ｆｏｄｏｒら、米国特許第５，８００，９９２号；同第５，４４５，９３４号；および同第５，７４４，３０５号）；流路送達法（ｆｌｕｉｄ  ｃｈａｎｎｅｌ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：１６７５−１６７８および１６７９−１６８４（１９９２）；Ｍａｔｓｏｎら、米国特許第５，４２９，８０７号、ならびにＣｏａｓｓｉｎら、米国特許第５，５８３，２１１号および同第５，５５４，５０１号）；官能化オリゴヌクレオチドを使用したスポッティング法（例えば、Ｇｈｏｓｈら、米国特許第５，６６３，２４２号；およびＢａｈｌら、米国特許第５，２１５，８８２号）；小滴送達法（ｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、Ｃａｒｅｎら、米国特許第６，３２３，０４３号；Ｈｕｇｈｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９：３４２−３４７（２００１））などのような、いくつかの代替的技術によって製造され得る。空間的に指定可能（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）なオリゴヌクレオチドのマイクロアレイの合成を開示する上記特許は、本明細書中に参考として援用される。本発明で使用されるマイクロアレイは、５０〜５００，０００のハイブリダイゼーション部位；または１００〜２５０，０００のハイブリダイゼーション部位；または１００〜４０，０００のハイブリダイゼーション部位を含み；そして、好ましくは、それらは１００〜３２，０００のハイブリダイゼーション部位；または１００〜２０，０００のハイブリダイゼーション部位；または１００〜１０，０００のハイブリダイゼーション部位を含む。
【００５３】
マイクロアレイに標識されたオリゴヌクレオチドプローブを適用するための条件および材料を選択するための手引きは、文献（例えば、Ｗｅｔｍｕｒ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６：２２７−２５９（１９９１）；ＤｅＲｉｓｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８：６８０−６８６（１９９７）；Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０：１０７７−１０８２（１９９８）；Ｄｕｇｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１：１０−１４（１９９９）；Ｓｃｈｅｎａ（編）、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、２０００）；Ｈｕｇｈｅｓら（上記で引用）；Ｆａｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０：８５３−８６０（２０００）；などの参照）において見出され得る。これらの参照は、本明細書中に参考として援用される。代表的に、固相支持体へのハイブリダイゼーションタグの適用は、３つの工程：プレハイブリダイゼーション緩衝液で処理する工程、プローブを含んだハイブリダイゼーション緩衝液で処理する工程、およびストリンジェントな条件下で洗浄する工程を包含する。プレハイブリダイゼーション工程は、プローブの非特異的結合のための潜在的部位を抑制するために用いられる。好ましくは、プレハイブリダイゼーション緩衝液およびハイブリダイゼーション緩衝液は、約０．８Ｍ〜１．２Ｍの間の塩濃度、および約７．０と８．３との間のｐＨを有する。好ましくは、プレハイブリダイゼーション緩衝液は、１種以上のブロッキング因子（例えば、デンハート溶液、ヘパリン、フラグメント化された変性サケ精子ＤＮＡ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＳＤＳまたは他の界面活性剤など）を含む。例示的なプレハイブリダイゼーション緩衝液は、６×ＳＳＣ（または６×ＳＳＰＥ）、５×デンハート溶液、０．５％  ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの変性された、フラグメント化されたサケ精子ＤＮＡ、または等価な規定された配列の核酸を含む。別の例示的なプレハイブリダイゼーション緩衝液は、６×−ＳＳＰＥ−Ｔ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）、０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）および０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む。プレハイブリダイゼーション緩衝液およびハイブリダイゼーション緩衝液はまた、有機溶媒（例えば、ストリンジェンシーを制御するためのホルムアミド、塩基特異的効果を打ち消すための塩化テトラメチルアンモニウムなど）を含み得る。例示的なハイブリダイゼーション緩衝液は、ＳＳＰＥ−Ｔおよび上記所望の濃度の等ストリンジェンシー（ｉｓｏｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）プローブである。ハイブリダイゼーション後、結合されていない等ストリンジェンシープローブおよび非特異的に結合した等ストリンジェンシープローブは、ストリンジェントな条件下で、検出支持体を洗浄することによって取り除かれる。好ましくは、この洗浄溶液のストリンジェンシーは、温度、有機溶媒濃度、または塩濃度によって制御される。さらに好ましくは、洗浄条件のストリンジェンシーは、その洗浄溶液の塩濃度およびｐＨで、等ストリンジェンシープローブの融解温度よりも約２℃〜５℃低��なるように決定される。好ましくは、上記洗浄溶液の塩濃度は、約０．０１Ｍ〜０．１Ｍの間である。
【００５４】
マイクロアレイ上の標的にハイブリダイズした標識タグからの光学的シグナル（特に、蛍光シグナル）を測定するための機器は、以下の参照中に記載され、それらは、本明細書中に参考として援用される：Ｓｔｅｒｎら、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９５／２２０５８；Ｒｅｓｎｉｃｋら、米国特許第４，１２５，８２８号；Ｋａｒｎａｕｋｈｏｖら、米国特許第，３５４，１１４号；Ｔｒｕｌｓｏｎら、米国特許第５，５７８，８３２号；Ｐａｌｌａｓら、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／５３３００；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８：６３０−６３４（２０００）など。
【００５５】
タグ相補体が、微小ビーズに結合するか、または微小ビーズ上で合成される場合、多種多様の固相材料が本発明とともに使用され得、その固相材料としては、人工細孔ガラス（ＣＰＧ）製の微小ビーズ、高架橋ポリスチレン、アクリルコポリマー、セルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレインなどが挙げられる。これらは、以下の例示的な参照において開示される：Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第Ａ節、１１−１４７頁、第４４巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７６）；米国特許第４，６７８，８１４号；同４，４１３，０７０号；および同４，０４６；７２０号；ならびにＰｏｎ、第１９章、Ａｇｒａｗａｌ（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２０巻、（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１９９３）。微小ビーズ支持体としては、さらに、市販のヌクレオシド誘導体化ＣＰＧおよびポリスチレンビーズ（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手可能）；誘導体化磁性ビーズ；ポリエチレングリコールでグラフトされたポリスチレン（例えば、ＴｅｎｔａＧｅｌＴＭ、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）などが挙げられる。一般に、微小ビーズのサイズおよび形状は、重要でない；しかしながら、直径数μｍ（例えば、１μｍ〜２μｍ）〜直径数百μｍ（例えば２００μｍ〜１０００μｍ）の範囲のサイズの微小ビーズが好ましい。なぜなら、それらは、最小の試薬および試料の利用で、オリゴヌクレオチドタグの大きなレパートリーの構成および操作を容易にするからである。好ましくは、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｒｍｅｌ、ＩＮ）から入手可能なグリシド酸メタクリレート（ｇｌｙｃｉｄａｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（ＧＭＡ）ビーズが、本発明における微小ビーズとして使用される。このような微小ビーズは、種々のサイズで有用であり、そしてそれらは、タグおよび／またはタグ相補体の合成のための種々の連結基と一緒に利用可能である。
【００５６】
（ハイブリダイゼーションコード）
１つの局面において、本発明のハイブリダイゼーションコードは５塩基で構成され、そしてＢｒｅｎｎｅｒおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（上記で引用）中に記載される手順に類似した手順に従って、ハイブリダイゼーションタグ中にアセンブルされる。合成タグを使用して、固相支持体（例えば、マイクロアレイ）に結合する抗タグの補体として、ハイブリダイゼーションタグが構築される。このようなタグは、以下の形態（配列番号９）：
【００５７】
【化６】
2007521833.tif 000010
を有する。ここで、Ｈ１およびＨ２は、上記のようなハイブリダイゼーションタグのワード（ｗｏｒｄ）（例えば、４マーのワード）である。このようなワードは、実施形態に依存して長さを変更し得るが、一般には、２ヌクレオチド〜１０ヌクレオチドの範囲内の長さであるか；またはそれらは３ヌクレオチド〜６ヌクレオチドの範囲内の長さとなり得る。ワードの長さの選択における１つの因子は、それらが制限酵素（例えば、ＩＩ型制限酵素）によってプロセスされ得るか否かであり、制限酵素の認識特性および切断特性が配列の長さを決定し得る。上記の８ワードセットを使用して、６４もの二ワード（ｄｉ−ｗｏｒｄ）が構築され、慣習的なベクター中にクローニングされ、そしてその後ＰＣＲによってそのＤＮＡを得ることができる。ハイブリダイゼーション「ワード」の対を含んだこれらの試薬は、以下により完全に記載されるワード対変換アダプター（ｗｏｒｄ−ｐａｉｒ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ａｄａｐｔｏｒ）を形成するために使用される。
【００５８】
連続的にワードを付加することの原理は、以下の通りである。ワードが所定の位置に配置されれば、連続的にワードが付加されるはずである。前のワードは８つのワードのいずれかであり得るので、付加されるべき材料は、次の位置（これを「Ｈ２」と呼ぶ）において全ての可能性を有する必要性があり、そして８つのそのようなセットが存在する。したがって、上記Ｓｆａ  ＮＩ部位が切断された場合、本発明者らは、以下の末端：
【００５９】
【化７】
2007521833.tif 000011
を有する。ここで、「Ｚ１」は、付加されたワードのヌクレオチドであり、「Ｚ０」は、前のワードのヌクレオチドであり、そして「ｐ」は、リン酸基である。上記式（Ｉ）の二ワードをＦｏｋ  Ｉ部位で切断することによって新しいワードが付加され、以下（配列番号１０）：
【００６０】
【化８】
2007521833.tif 000012
が得られる。ここで、「Ｚ２」は、次のワードのヌクレオチドであり、そして上記「ＺＸ」は、全ての可能な切断生成物のヌクレオチドである。この切断生成物は、式（ＩＩ）の切断生成物の、全ての生じ得る末端に相補的な末端を含む。したがって、これらの２つの生成物のライゲーションは、上記タグの組み合わせ合成を可能にする。
【００６１】
（ポリヌクレオチドのタグ付け）
本発明の１つの局面において、ゲノム集団の各ゲノムの全てのフラグメントは、５ワードオリゴヌクレオチドタグの３２，７６８（＝８５）のレパートリーから選択される、ワードの１つの組み合わせを用いて標識される。一旦各ゲノムが唯一のタグを有すると、次いで、本発明の方法を使用して、共通配列フラグメント（例えば、特定の座に由来する制限フラグメント）が選択され得る。次いで、上記タグは、読出しのためのフラグメントに関する情報（例えば、特定の座でのヌクレオチドの同一性）を、ハイブリダイゼーションアレイへ伝達するために使用され得る。当業者は、５つのヌクレオチド各々の５つのワードオリゴヌクレオチドタグの選択およびコンマレスタグの使用には、あらゆる特定の適用の目的および制限に依存して変動し得る設計の選択であることを理解する。１つの実施形態において、上記レパートリーを構築するために、以下の８つのワードの、最もクロスハイブリダイゼーションしないセットが使用され得る。好ましくは、以下に記載されるように、各ワードは、オリゴヌクレオチドタグの構築を補助するためのさらなるエレメントとともに、プラスミド中にクローニングされる。
【００６２】
【化９】
2007521833.tif 000013
これらのワードを使用して、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（上記で引用）（これは、参考として援用される）中に記載されるように、別個のプラスミド中に６４の二ワードが調製される。
【００６３】
（Ａ．単一ワードライブラリーおよび計数アレイエレメント）
１つの実施形態において、単一ワードライブラリーは、１０塩基配列［Ｇ／Ｔ；Ｇ／Ｔ；Ａ／Ｔ］３Ｇ／Ｔを含み、ここで、「ｘ／Ｔ」は、特定の座での２種の塩基「ｘ」および「Ｔ」の等量の混合物である。このエレメントは、相補的配列のアレイ（すなわち、「計数」アレイ）に対する配列のコピーのハイブリダイゼーションによって計数されることを可能にする、１０２４（＝２１０）の異なる配列のレパートリーをコードする。本明細書中では、このエレメントは、「計数アレイ」エレメントまたは「ＣＡＲ」エレメントと呼ばれる。この実施形態において、各ゲノムの約３０のコピーがタグ付けされ、そしてそれぞれが、１つの特有の配列で標識される。したがって、このアレイに関して、任意の分類された分子が特有の配列を有することが見出された場合、それは複数の配列を有するはずであるゲノムの差異ではなく、そして恐らく、変更された分子をもたらすプロセスにおけるエラーを表す。しかしながら、留意すべきは、多量の任意のフラグメントが増幅され、それは計数アレイにおいて常に最初の配列を保持し、ＤＮＡの濃度は除いて濃度を保存することである。
【００６４】
以下の特徴を有するプラスミドを構築する：（ｉ）ＳａｐＩ部位を有さない、および（ｉｉ）以下の制限酵素認識部位の配列を有する。
【００６５】
【化１０】
2007521833.tif 000014
これらの部位は、それぞれ「ＧＧ」を有する。これらは、タグを欠き、上記セットのワードで構築される。次々に各々のワードの隣に、以下のエレメントの鎖が合成される（配列番号１１）：
【００６６】
【化１１】
2007521833.tif 000015
ここで、小ワードの「ｐ」は、リン酸基を表す。上記鎖のアニーリング後、上記エレメントは、ＡｐａＩおよびＢｓｐ  Ｅ１で切断することによって上記プラスミド中にクローニングされる。いくつかのプラスミドは、各ワードについて精選（ｐｉｃｋ）され、そしてそのクローンは、配列の正確さを調べるために配列決定され、後に、タグ構築物における使用のために、それらの１つが選択される。「計数」アレイのためのエレメントが合成され、そして後の増幅のために必要とされる二次プライマー結合部位もまた合成される。合成後、以下の構造が得られる（配列番号１２）：
【００６７】
【化１２】
2007521833.tif 000016
プライマー「５’−ＮＮＮＡＧＧＣＣＴ［Ｎ１５］ＧＧＧＡＣ」（配列番号１３）を使用して、上記配列を複製し、ＫｐｎＩおよびＢｓｐＥ１で切断し、そして各単一ワードプラスミド中にクローニングした。各々の１０４のクローンが単離され、上記計数アレイの全ての配列が上記ライブラリー中にあることが確認された。
【００６８】
この実施形態は、制限エンドヌクレアーゼの「↓ＧＡＴＣ」ファミリーで切断することによって生成されるフラグメントにタグを付着させるために計画された。これらの酵素は、いくつかの異なる長さのフラグメントの生成を可能にする：
【００６９】
【化１３】
2007521833.tif 000017
切断された場合、これらの全ては同じ末端、すなわち：
【００７０】
【化１４】
2007521833.tif 000018
を残す。ここで、「ｐ」は、リン酸基である。これに、１つのｄＧＴＰが充填（ｆｉｌｌ）され得、３塩基オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）：
【００７１】
【化１５】
2007521833.tif 000019
が得られる。このような充填後、以下の末端：
【００７２】
【化１６】
2007521833.tif 000020
を残すＳａｐＩ（上の下線部）で切断されたポリヌクレオチドまたはクローニングベクターにより、フラグメントの効率的かつ配向的なクローニングが可能となる。
【００７３】
最終構築物は、以下の構造：
【００７４】
【化１７】
2007521833.tif 000021
を有する。ここで、「Ｎ」は、任意に選択されるヌクレオチドであり、そして「ＣＡＲ」は、上記のような計数アレイエレメントである。
【００７５】
（Ｂ．ダブルワード（ｄｏｕｂｌｅ−ｗｏｒｄ）ライブラリー）
それぞれ、６４の生じ得る２つのワード（または「二ワード」）（プライマー結合部位に隣接した８つのワードライブラリー由来のワードの連続）のうちの１つを含む６４のベクターのライブラリーが、ここで開示される。次いで、このダブルワードライブラリーは、基本的に、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（上記で引用）中に記載されるように使用され、オリゴヌクレオチドタグが構築される。この実施形態において、第１の隣接プライマー結合部位は、上記で「プライマーＸ」として示され、他にＦｏｋＩ（５’−ＧＧＡＴＧ（９／１３））（これは「ＧＧ」を含み、したがって、いかなる上記のワードも切断し得ない）に対する認識部位を含む。
【００７６】
以下のベクターエレメントを、合成する（配列番号１４）：
【００７７】
【化１８】
2007521833.tif 000022
ここで、上記「ワード１」および「ワード２」は、ワード配列およびそれらのそれぞれの相補体の両方をいうことを理解する。上記フラグメントをアニーリングして二重鎖エレメントを形成した後、それをＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで消化したプラスミド中にクローニングする。取り込みの正確さを確実にするために、各「ダブルワード」ベクターのいくつかのクローンを選択し、そして配列決定する。二ワードのコピーは、ビオチン化Ｘプライマーおよび別のプライマーを使用して、ＰＣＲによって簡便に得ることができる。
【００７８】
（Ｃ．ゲノムのタグ付け）
約１ｎｇのヒトＤＮＡ（一倍体ゲノムの約３０コピー）を１Ｋｂの平均サイズのフラグメントを得るためにＢｓｔ  Ｙ１で消化し、その後上記のような３塩基末端を得るためにその末端をｄＧＴＰで充填する。
【００７９】
８つの単一ワードライブラリー（Ａ〜Ｈで標識される）を増幅し、ＳａｐＩで切断して以下の単一ワードフラグメントを得る：
【００８０】
【化１９】
2007521833.tif 000023
以下のように、１バッチで６４のゲノムをタグ付けする。６４の反応容器を８×８アレイ（ここで、各列（１〜８）は、Ａ〜Ｈで標識された８つの容器を含む）に配列する。各容器に異なるＢｓｔ  ＹＩで消化されたゲノムを添加し、その後、異なる単一ワードフラグメント（Ａ〜Ｈ）を各列中の容器１〜容器８に添加し、各列が以下の単一ワードフラグメントを有する、以下の反応容器のアレイを得る：
【００８１】
【化２０】
2007521833.tif 000024
この単一ワードフラグメントを、上記ゲノムフラグメントにライゲーションし、両端に単一ワードフラグメントを有するゲノムフラグメントを得る。一端のみに単一ワードフラグメントが存在するように、これらのフラグメントを以下の通りにプロセスする。第１に、各列中の容器毎からの反応構成物をプールし、８つの混合試料を得る。
【００８２】
【化２１】
2007521833.tif 000025
８つの容器の各々のＤＮＡを変性し、そしてプライマーＹ（ｐＡＧＧＣＣＴＮ１５ＧＧＧＡＣ）（配列番号１６）を添加し、以下のような単鎖の各々の３’タグ配列をプライム（ｐｒｉｍｅ）する（配列番号１７および配列番号１８）。
【００８３】
【化２２】
2007521833.tif 000026
５−Ｍｅ−ｄＣＴＰを使用して上記プライマーを伸長し、以下（配列番号１９および配列番号２０）：
【００８４】
【化２３】
2007521833.tif 000027
を得る。上記フラグメントの全てのＢｓｍＦ１部位を、上記タグの左側の部位を除いて、半メチル化（ｈａｌｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）によって保護する。上記フラグメントがＢｓｍＦ１で切断された場合、上記左側のタグは、以下を残して上記「ＧＡＴＣ」部位まで取り除かれる：
【００８５】
【化２４】
2007521833.tif 000028
上記「ＧＡＴＣ」オーバーハングをｄＧＴＰで充填し、そして配列決定のためのプライマー結合部位を含む以下のアダプター（配列番号２２）にライゲーションする：
【００８６】
【化２５】
2007521833.tif 000029
上の鎖におけるメチル化されたＣは左側の部位を保護する一方で、上記フラグメントの右側の部分を操作する。ワードを、以下のように添加する。第１に、下の鎖のＣを５−メチル−Ｃで置き換える。これを、上記フラグメントを変性し、ビオチン化プライマーＸ（５’−ビオチン−ＧＧＧＣＣＣＮ１０［Ｓｆａ  Ｎ１部位］  Ｎ５）とプライミングし、５−Ｍｅ−ＣＴＰを用いてコピーし、そしてアビジン化支持体を用いて上記鎖を取り除くことによって達成する。このフラグメントをＳｆａ  Ｎ１で切断することによって放出し、上記８つの容器の各々において、以下の配列：
【００８７】
【化２６】
2007521833.tif 000030
を得る。ここで、８つのワード全てがオーバーハング内に表され、そして「Ｗ」はワードまたはその補体のヌクレオチドを表す。次に、この二倍体ワードをプールし、ＦｏｋＩで切断し、次いで上記フラグメントにライゲーションし、次のワードを添加する。所望の数のワードがゲノムフラグメントに添加され、タグを完成するまでこのプロセスを継続する。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ】図１Ａは、共通の配列エレメントによる特定のフラグメントの選択を説明する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、共通の配列エレメントによる特定のフラグメントの選択を説明する。
【図１Ｃ】図１Ｃは、共通の配列エレメントによる特定のフラグメントの選択を説明する。
【図１Ｄ】図１Ｄは、共通の配列エレメントによる特定のフラグメントの選択を説明する。
【図１Ｅ】図１Ｅは、共通の配列エレメントによる特定のフラグメントの選択を説明する。
【図１Ｆ】図１Ｆは、共通の配列エレメントによる特定のフラグメントの選択を説明する。
【図２Ａ】図２Ａは、特定のハプロタイプを選択するための本発明の適用を説明する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、特定のハプロタイプを選択するための本発明の適用を説明する。
【図２Ｃ】図２Ｃは、特定のハプロタイプを選択するための本発明の適用を説明する。
【図２Ｄ】図２Ｄは、特定のハプロタイプを選択するための本発明の適用を説明する。
【図３Ａ】図３Ａは、「コンマ」を含むハイブリダイゼーションタグおよび「コンマレス」特性を有するハイブリダイゼーションタグを説明する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、「コンマ」を含むハイブリダイゼーションタグおよび「コンマレス」特性を有するハイブリダイゼーションタグを説明する。
【図３Ｃ】図３Ｃは、「コンマ」を含むハイブリダイゼーションタグおよび「コンマレス」特性を有するハイブリダイゼーションタグを説明する。
【図３Ｄ】図３Ｄは、「コンマ」を含むハイブリダイゼーションタグおよび「コンマレス」特性を有するハイブリダイゼーションタグを説明する。
【図４】図４は、各々がコンマの少ない特性を有する４つのワードからなる選択されたタグの融解温度を列挙する。
【図１Ａ】
2007521833.tif 000031
【図１Ｂ】
2007521833.tif 000032
【図１Ｃ】
2007521833.tif 000033
【図１Ｄ】
2007521833.tif 000034
【図１Ｅ】
2007521833.tif 000035
【図１Ｆ】
2007521833.tif 000036
【図２Ａ】
2007521833.tif 000037
【図２Ｂ】
2007521833.tif 000038
【図２Ｃ】
2007521833.tif 000039
【図２Ｄ】
2007521833.tif 000040
【図３Ａ】
2007521833.tif 000041
【図３Ｂ】
2007521833.tif 000042
【図３Ｃ】
2007521833.tif 000043
【図３Ｄ】
2007521833.tif 000044
【図４】
2007521833.tif 000045
【配列表】
2007521833000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年9月27日(2006.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007521833000001.app
【国際調査報告】
2007521833.tif 000053
2007521833.tif 000054