(57)【要約】【課題】ヒトサイトカインの生物活性をブロッキングするヒト抗体の高収率な産生方法。【解決方法】ＶＥＧＦ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＴＮＦα、ＴＧＦβの中から選択されるヒトサイトカインの活性を中和するＩｇＧアイソタイプのヒト天然抗体を活性成分として含み、この中和抗体が０．００６〜０．０５ｎｇの量のサイトカインによってインビトロで誘発される最大生物活性を少なくとも５０％抑制する医薬組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＴＮＦαおよびＴＧＦβの中から選択されるヒトサイトカインの活性を中和するＩｇＧアイソタイプのヒト天然抗体を活性成分として含み、この中和抗体がインビトロで上記サイトカインによって誘発される生物活性の最大値の少なくとも５０％を抑制する医薬組成物。
【請求項２】
上記中和ヒト抗体が、（ｉ）ＶＥＧＦ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＴＮＦαおよびＴＧＦβの中から選択される抗原蛋白分子と、（ｉｉ）担体蛋白分子とで構成され、抗原蛋白（ｉ）の４０％以下が担体蛋白分子（ｉｉ）に共有結合で結合している免疫原性蛋白ヘテロ複合体からなる安定な免疫原性産物で免疫化した個体からの血清またはＢ細胞から得たものである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
インビトロでのサイトカインの最大生物活性がそれぞれ下記によって誘発される請求項１または２に記載の医薬組成物：
（ｉ）０．５ｎｇのＶＥＧＦ
（ｉｉ）０．００６ｎｇのＩＦＮα
（ｉｉｉ）０．５ｎｇのＩＬ−４
【請求項４】
中和抗体がポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の中から選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ポリクローナル抗体が下記の中から選択される請求項４に記載の組成物：
（ｉ）ヒトサイトカインに対して免疫化したヒトの個体の血清から精製した抗体の全画分、
（ｉｉ）サイトカインの活性を中和する単一特異性ポリクローナル抗体の精製画分、
（ｉｉｉ）上記ポリクローナル抗体（ｉ）および（ｉｉ）から調製されたＦａｂまたはＦ（ａｂ）’2断片。
【請求項６】
モノクローナル抗体が下記の中から選択される請求項４に記載の組成物：
（ｉ）ヒトサイトカインに対して免疫化したヒトの個体からのＢ細胞（ａ）と、骨髄腫のような細胞系譜を産生する抗体の細胞（ｂ）との間の細胞融合から生じる細胞によって産生される抗体、
（ｉｉ）免疫化によって誘発され且つ免疫化した患者の血清中に存在する抗体を再現する免疫グロブリンをコード化するＤＮＡでトランスフェクトまたはトランスフォームした細胞によって産生される抗体であって、このＤＮＡはサイトカインに対して免疫化したヒトのＢ細胞のＤＮＡから予め単離されている抗体、
（ｉｉｉ）上記ポリクローナル抗体（ｉ）および（ｉｉ）から調製されたＦａｂまたはＦ（ａｂ）’2断片
（ｉｖ）ＳｃＦｖ断片。
【請求項７】
少なくとも一つの生理学的に許容される賦形剤をさらに含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
ＶＥＧＦ、ＩＦＮα、ＩＬ−４およびＴＧＦβの中から選択されるヒトサイトカインの生物活性を中和するヒト抗体を高収率に得る方法であって、
下記（ｉ）と（ｉｉ）：
（ｉ）個体の血清に含まれる免疫グロブリン、または、
（ｉｉ）個体のＢ細胞によって産生される免疫グロブリン
を精製する少なくとも（ａ）段階を含み、個体は、（ｉ）ＶＥＧＦ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＴＮＦαおよびＴＧＦβの中から選択される抗原蛋白分子と、（ｉｉ）担体蛋白分子とを組み合わせたもので構成される免疫原性蛋白ヘテロ複合体からなる安定な免疫原性産物で予めサイトカインに対して免疫化され、上記抗原蛋白（ｉ）の４０％以下が担体蛋白分子（ｉｉ）に共有結合で結合していることを特徴とする方法。
【請求項９】
上記（ａ）段階の最後に得られる免疫グロブリン画分からＧアイソタイプ免疫グロブリンを精製する（ｂ）段階をさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サイトカインの生物活性を中和するモノ特異性ポリクローナル抗体を得る追加の段階をさらに含む請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
サイトカインの生物活性を中和するＦ（ａｂ）またはＦ（ａｂ）’2断片を得る追加の段階をさらに含む請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
下記の追加の段階をさらに含む請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法：
ｉ）ハイブリドーマ系譜を得るために（ａ）段階の最後に得られるＢ細胞を骨髄腫からの細胞と融合させる段階と、
ｉｉ）これらのハイブリドーマによって産生された抗体を回収する段階。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦ抗体の癌治療用医薬組成物の製造での使用。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗ＩＦＮα抗体の免疫抑制状態の治療用の医薬組成物の製造での使用。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−４抗体のアレルギー治療用医薬組成物の製造での使用。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦα抗体の免疫抑制状態の治療用医薬組成物の製造での使用。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦβ抗体の、レトロウイルスによる感染の治療用または大腸癌、乳癌および前立腺癌の中から選択される癌の治療用医薬組成物の製造での使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカインの生物活性を抑制する中和抗体を含む組成物と、その製造方法と、その使用とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
サイトカイン（cytokines）は多くの細胞、例えばリンパ球、単球、樹状細胞、マスト細胞、線維芽細胞によって産生される、多くの組織に自己分泌効果、パラ分泌効果および内分泌効果を与える蛋白である。サイトカインは細胞の生存、増殖、分化および移動に影響する。
【０００３】
サイトカインはその活性によって大きく分類することができ、いくつかのサイトカインは直接または間接的な効果によって細胞障害性リンパ球またはＮＫ細胞（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５）の世代を介した細胞死の誘発において重要である。他のサイトカイン、例えばＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１３はアレルギー反応に関与し、いくつかのサイトカインは抗体産生の調節に必須であり（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）、他のサイトカインは炎症誘発性作用がある（ＩＬ−１、ＴＮＦα、ＩＦＮ−γ、ケモカイン）。さらに他のサイトカインは抗炎症性特性を有する（ＴＧＦ−β、ＩＬ−４、ＩＬ−１０）。
しかし、この分類は重要な重複性と多面発現とによって特徴付けられるサイトカインとその標的細胞との間の相互作用の複雑性を反映しておらず、アゴニストおよびアンタゴニスト効果を考慮していない。免疫系、特にサイトカインのこうした特徴はサイトカインをその機構、例えばブロックする抗体の介在等が全ての干渉にインビボで重要な効果を有することを示している。
【０００４】
これまでのワクチン療法戦略は抗原アグレッサー（微生物、細胞またはアレルゲン）にのみ焦点を合わせたもので、サイトカインの調節解除（deregulation）を克服しようとしたものではなかった。しかし、免疫防御から逃げる現象や炎症現象に関与するサイトカインの重要な役割等を考慮すると、サイトカインの活性またはその産生に作用して患者の体内でサイトカインを不活性化することが今日の目標であり、生物体はこれらサイトカインを効率的に相殺できる天然のアンタゴニストを有していないのでこの目標はなおさら求められている。抗サイトカイン抗体等は知られているが、この抗体はこの抗体を産生するＢ細胞が眠らされるため力価が低いことがわかっている。しかも、この天然抗体は低親和性（faible affinite）であり、対応するサイトカインの活性を中和しない。
【０００５】
特に、インシチュ（in situ）麻痺を誘発する宿主の細胞性免疫防御から逃れる現象は多くの癌で用いる戦略であり、生存に必要なものである。個体は感染等の攻撃に対して身を守ることができるので、この免疫抑制状態は最初は腫瘍位置に留まっているが、後期になると免疫抑制が拡大し、一般化し、転移の拡大し、癌患者の感染に対する脆弱性が高まり、化学療法や放射治療による効果が無くなる。すなわち、癌細胞の免疫系制御からの逃げは免疫系の麻痺（免疫抑制）に起因し、それによって正常に機能しなくなるためである。この免疫抑制は癌細胞またはその周囲の細胞によって産生される麻痺ファクター（サイトカインを含む）の役目をする。免疫系によるこの細胞の局所麻痺すなわち免疫抑制は癌細胞の主要な武器となり、それを用いて癌細胞は宿主の免疫系から逃げることができる。
【０００６】
インシチュ（in situ）麻痺を誘発して宿主の細胞免疫防御から逃げる上記の現象はＨＩＶによっても用いられる戦略である。ＡＩＤＳで観察される一般化された免疫抑制は抗原提示細胞、特に２型の樹状細胞（ＤＣ２）によるＩＦＮα過剰産生によって特徴付けられる。ＩＦＮαの免疫抑制活性は調節Ｔ細胞（抑制Ｔ細胞）によってＩＬ−１０サイトカインの産生を誘発する能力によるものである。
【０００７】
サイトカインの生物活性を抑制するための第１の戦略は患者に免疫原構成物を注射することからなる。Ｂ細胞による関連抗原、例えばサイトカインの認識を誘導するために種々の免疫原構成（constructions immunogenes）が開発されてきた。この免疫原構成法の第１の形は補助Ｔリンパ球（「ヘルパーＴ」細胞）によって認識される構造を有する担体分子上に関連抗原を共有結合させ、それに組織適合性主複合体（ＭＨＣ、Complexe Majeur d'Histocompatibilite）のクラスＩＩ分子と組み合わせ、補助Ｔリンパ球を活性化し、それによって種々のサイトカイン、特にＩｌ−２を産生し、このサイトカインによって関連抗原の特異Ｂ細胞クローンを活性化させるものである。活性化された関連抗原の特異Ｂ細胞は増殖し、関連抗原の特異抗体を産生する。この特異抗体が目的物である。この形の免疫原構成法では一般に関連抗原と担体分子との間に共有化学結合を構成し、精製し、未結合の産物を除去する工程後に、構造が定義された最終産物となる。
【０００８】
しかし、この免疫原構成法にはいくつか欠点がある。例えば、この免疫原構成物は注射の時間間隔が長く、標的にしたサイトカインに対する免疫応答が現れる。さらに、サイトカインが変質して免疫応答の強度または品質を損な場合には患者に抗サイトカイン免疫原構成物を効率的にワクチン接種することが不可能になる場合がある。すなわち、大規模な免疫抑制が認められる癌やＡＩＤＳの場合には免疫原性組成物の投与は疾患の初期、特に免疫抑制が過度に大きくなる前に行わなければ効果がない。
【０００９】
従って、当技術分野では免疫系が壊れた患者を治療できる抗サイトカイン抗体が要望されている。この抗体は免疫抑制、さらには炎症過程に関与するサイトカインに直接作用するものである。抗サイトカイン抗体による治療は免疫応答を少なくとも一時的に回復でき、従って、免疫原性組成物の投与前に用いることができる。
【００１０】
こうした抗サイトカイン抗体は既に知られている。例えば、下記文献には多くの細胞型によって産生されるサイトカインで且つ自己免疫疾患、感染または移植片拒絶におけるその役割が知られるＴＮＦαに特異的に結合するヒト抗体、特にヒト組換え抗体が開示されている。
【特許文献１】欧州特許出願第１，８２５，９３０号公報
【特許文献２】米国特許第６，５０９，０１５号明細書
【００１１】
下記文献にはヒトＩＬ−２に特異的に結合し且つそのインビボおよびインビトロ活性を中和するヒト抗体、好ましくは組換え体が開示されている。
【特許文献３】国際特許出願第ＷＯ  ００／５６７７２号公報
【００１２】
下記文献にはγインターフェロンに結合する薬剤、特に、γインターフェロンに選択的に結合し且つ関節リウマチまたはループスのような炎症疾患または自己免疫疾患の予防または治療に用いることができる抗体と抗原とに結合するドメインが開示されている。
【特許文献４】米国特許出願第２００３／００９９６４７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
サイトカインの上記の重要な役割から考えて、関連サイトカインに結合し且つその生物活性を少なくとも部分的に中和することができる新規な抗体組成物が強い要望がある。そうした組成物は高価でなく、製造が容易で、しかも、再現可能に合成できなくてはならない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の対象は、ＶＥＧＦ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＴＮＦαおよびＴＧＦβの中から選択されるヒトサイトカインの生物活性を中和するヒト抗体を高収率で得る方法にある。本発明方法は下記（ｉ）と（ｉｉ）：
（ｉ）個体の血清に含まれる免疫グロブリン、または、
（ｉｉ）個体のＢ細胞によって産生される免疫グロブリン
を精製する少なくとも（ａ）段階を含み、個体は、（ｉ）ＶＥＧＦ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＴＮＦαおよびＴＧＦβの中から選択される抗原蛋白分子と（ｉｉ）担体蛋白分子とを組み合わせたもので構成される免疫原性蛋白ヘテロ複合体からなる安定な免疫原性産物で予めサイトカインに対して免疫化され、上記抗原蛋白（ｉ）の４０％以下が担体蛋白分子（ｉｉ）に共有結合で結合していることを特徴とする。
【００１５】
本発明の他の対象は、免疫原構成で従来技術が直面している上記課題を解決することができ且つ公知の抗サイトカイン抗体組成物の代替物となる、抗サイトカインヒト天然抗体を活性成分として含む新規組成物にある。
【００１６】
活性成分として選択される中和ヒト天然抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、ポリクローナル抗体は下記の中から選択するのが好ましい：
（ｉ）ヒトサイトカインに対して免疫化したヒトの個体の血清から精製した抗体の全画分、
（ｉｉ）サイトカインの活性を中和する単一特異性ポリクローナル抗体の精製画分、
（ｉｉｉ）上記ポリクローナル抗体（ｉ）および（ｉｉ）から調製されたＦａｂまたはＦ（ａｂ）’2断片
【００１７】
モノクローナル抗体は下記の中から選択するのが好ましい：
（ｉ）ヒトサイトカインに対して免疫化したヒトの個体からのＢ細胞（ａ）と、骨髄腫のような細胞系譜を産生する抗体からの細胞（ｂ）との間の細胞融合で得られる細胞によって産生される抗体、
（ｉｉ）免疫化によって誘発され且つ免疫化した患者の血清中に存在する抗体を再現する免疫グロブリンをコード化するＤＮＡでトランスフェクトまたはトランスフォームした細胞によって産生される抗体であって、このＤＮＡがサイトカインに対して免疫化したヒトのＢ細胞のＤＮＡから予め単離される抗体、
（ｉｉｉ）上記ポリクローナル抗体（ｉ）および（ｉｉ）から調製されたＦａｂまたはＦ（ａｂ）’2断片、
（ｉｖ）ＳｃＦｖ断片。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明者は、サイトカインに対してヒト個体を免疫化することによって、従来技術が直面している細胞のスクリーニングおよび複雑な精製段階を必要としない、ヒトサイトカインの活性を中和する高い能力を有する新規なヒト抗体を産生できるということを見出した。ここで、サイトカインに対して免疫化されていない個体は自然にはサイトカインの活性を中和する抗体を有していないということを明確に理解しておく必要がある。
【００１９】
上記の抗サイトカイン抗体はサイトカインが関与する種々の病理学的状況で有用である。例えば、感染、自己免疫疾患、移植片拒絶およびアレルギーのような炎症反応に関連するほぼ全ての疾患が挙げられる。従って、本発明の抗体および抗体を含む組成物はこの種の障害を克服するのに有用であり、しかも、容易に得ることができる。
【００２０】
本発明の方法は、ＶＥＧＦ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＴＮＦαおよびＴＧＦβの中から選択されるヒトサイトカインの生物活性を中和するヒト抗体を高収率で得る方法であって、下記（ｉ）または（ｉｉ）：
（ｉ）個体の血清に含まれる免疫グロブリン、または、
（ｉｉ）個体のＢ細胞によって産生される免疫グロブリン
を精製する少なくとも（ａ）段階を含み、個体は、下記特許に開示された免疫原性産物で予めサイトカインに対して免疫化されている。
【特許文献５】フランス国特許出願第０２１１４５５号（２００２年９月１６日出願）
【００２１】
上記免疫原性産物は（ｉ）ＶＥＧＦ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＴＮＦαおよびＴＧＦβの中から選択される抗原蛋白分子と、（ｉｉ）担体蛋白分子とをくみあわせたもので構成され、抗原蛋白（ｉ）の４０％以下が担体蛋白分子（ｉｉ）に共有結合で結合した免疫原性蛋白ヘテロ複合体からなる安定な免疫原性産物である。
【００２２】
以下の説明ではＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＩＬ−４（インターロイキン４）、ＩＦＮα（インターフェロンα）、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）およびＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子）を同じ用語「関連サイトカイン」でよぶことがある。
【００２３】
上記抗体は「中和」抗体または「ブロッキング」抗体からなるのが好ましい。「中和」抗体または「ブロッキング」抗体とは、抗体が向けられるサイトカインが宿主生物にとって有害な生物活性を有する場合に、標的サイトカインと結合してこのようなサイトカインの生物活性をブロッキングする抗体、本発明が求める主たる対象と定義される。
【００２４】
本発明では、実施例に示すように、免疫化した個体における抗サイトカイン抗体の高い血清レベルによって関連サイトカインに対して個体が予め免疫化されていることを検出する。本発明では免疫化された全ての個体において関連サイトカインの有害な活性を中和するヒト天然抗体が得られたことが確認されている。
【００２５】
本発明の対象である抗サイトカインヒト天然抗体は高親和性抗体からなると本出願人は考えるが、この理論に縛られるものではない。換言すれば、本発明者によると、上記抗体とこの抗体が向けられる上記サイトカインとの間に形成された複合体は解離しないか、ほとんど解離せず、本明細書に定義された抗体を投与した個体における遊離サイトカインの血中濃度は大幅に低下する。
【００２６】
サイトカインに対する個体の免疫化は当業者に周知な任意の方法で行うことができる。配合、カルボキシアミド化、マレイミン化、酸素発泡による酸化のような物理的および／または化学的処理、または、遺伝子組換え、あるいは、アジュバントコンディショニングによって生物活性を予め７０％、９０％、さらには９５％に不活性化したサイトカインを個体に投与するのが好ましい。この処置はサイトカインを中和またはブロックする抗体を発生するのに十分な免疫原性特性を維持している。
【００２７】
上記特許文献５（フランス国特許出願第０２１１４５５号、２００２年９月１６日出願）に開示の免疫原性産物で免疫化したヒトから得られる抗体を産生するヒト血清またはヒトＢ細胞がさらに好ましい。この産物は（ｉ）ＶＥＧＦ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＴＮＦαおよびＴＧＦβの中から選択される抗原蛋白分子と（ｉｉ）担体蛋白分子とで構成され、抗原蛋白（ｉ）の４０％以下が担体蛋白分子（ｉｉ）に共有結合で結合している免疫原性蛋白ヘテロ複合体からなる安定な免疫原性産物である。
「抗原蛋白」とは本明細書では必要に応じて化学的に不活性化されたサイトカイン、または、長さが少なくとも１０個のアミノ酸残基のサイトカイン断片を意味し、これはヒトまたは動物、特に任意の哺乳類の宿主生物体からのＢリンパ球によって発現される抗原受容体によって特異的に認識することができ、この抗原蛋白は免疫原性産物に含まれた時にサイトカインを認識する抗体の産生を刺激する。
【００２８】
関連抗原蛋白は天然サイトカインのホモオリゴマーまたはホモポリマーおよび天然サイトカインのペプチド断片のホモオリゴマーまたはホモポリマーで構成することができる。関連抗原蛋白はさらに、天然サイトカイン中に初めから存在する複数の異なるペプチド断片を組み合わせたヘテロオリゴマーまたはヘテロポリマーにすることもできる。
【００２９】
本発明の免疫原性産物中に含まれる「担体蛋白分子」とは、アミノ酸の配列とは無関係に、鎖長が少なくとも１５のアミノ酸で且つ本発明の免疫原性産物を構成するヘテロ蛋白複合体を形成するために関連抗原の分子と一部が共有結合で結合されたときに関連抗原の多数の分子をＢリンパ球に与えることができる任意の蛋白またはペプチドを意味する。担体蛋白分子はＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）型であるのが好ましい。
【００３０】
免疫原性産物は関連サイトカインの活性を中和する抗体の産生を促進することができるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドをアジュバントとしてさらに含むのが好ましい。免疫応答を高めるために免疫原性組成物中でＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドをアジュバント化合物として用いることは下記の文献に記載されている。
【非特許文献１】ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．２０００
【非特許文献２】Ｇａｌｌｉｃｈａｎ  ＷＳ  ｅｔ  ａｌ．２００１
【非特許文献３】Ｅａｓｔｃｏｔｔ  ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．２００１
【００３１】
免疫化を誘発するための効率的なヘテロ複合体を含む安定な免疫原性産物の例としては、蛋白担体分子ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）と、ヒトインターフェロンα分子とを組み合わせたものが挙げられる。このようなヘテロ複合産物は以下、インターフェロンαＫＬＨとよぶ。本発明の好ましい免疫原性産物は、抗原蛋白(i)および蛋白担体分子（ｉｉ）がそれぞれ下記であるａ）〜ｅ）のヘテロ複合体を含む免疫原性産物の中から選択される：
ａ）（ｉ）ＶＥＧＦ、（ｉｉ）ＫＬＨ、
ｂ）（ｉ）インターフェロンα、（ｉｉ）ＫＬＨ、
ｃ）（ｉ）ＩＬ−４、（ｉｉ）ＫＬＨ、
ｄ）（ｉ）ＴＮＦα、（ｉｉ）ＫＬＨ、  
ｅ）（ｉ）ＴＧＦβ、（ｉｉ）ＫＬＨ。
【００３２】
本発明の免疫原性産物で共有結合によって結合された担体蛋白分子と関連抗原蛋白の割合（比率）は当業者が容易に確認できる。
例えば、本発明の免疫原性産物で共有結合によって担体蛋白分子と結合された関連抗原分子の比率は実施例１０に記載のプロトコルを用いて決定できる。
既に説明したように、蛋白担体分子ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）とヒトインターフェロンα分子との間にヘテロ複合体を含む免疫原性産物では、３％のインターフェロンα分子しか担体蛋白分子ＫＬＨと共有結合していない。
【００３３】
上記定義の免疫原性ヘテロ複合体を含む免疫原性産物は下記の段階に従って調製できる：
ａ）抗原蛋白（ｉ）と担体分子（ｉｉ）とを化学結合剤の存在下で（ｉ）：（ｉｉ）のモル比を５：１〜５０：１にして培養し、
ｂ）段階ａ）で得られた免疫原性ヘテロ複合体を含む免疫原性産物を回収する。
【００３４】
化学結合剤はグルタルアルデヒドであるのが好ましい。
本発明方法は段階ａ）の後かつヘテロ複合体の回収段階ｂ）の前に、ホルムアルデヒドによる免疫原性ヘテロ複合体の安定化段階を含むのがさらに好ましい。
化学結合剤としてグルタルアルデヒドを用いるときは、グルタルアルデヒドがカップリング反応媒体中に最終濃度で０．００２Ｍ〜０．０３Ｍ、好ましくは０．０２６Ｍの濃度で存在する。
【００３５】
グルタルアルデヒドとのカップリング反応は２０〜２５℃の温度で２０〜６０分、好ましくは３０分行うのが有利である。
カップリング段階後、過剰グルタルアルデヒドを例えばカットオフ閾値が３ｋＤａである透析膜を用いた透析によって除去する。透析段階はｐＨ７．６に調整された４℃の緩衝液中で行うのが有利である。
【００３６】
段階ａ）で調製した蛋白ヘテロ複合体を含む産物を安定化させるために、産物をホルムアルデヒド、例えば最終濃度が３ｍＭのホルムアルデヒドによって溶液中で処理することができる。安定化反応は１２〜４８時間、好ましくは２０〜３０時間、さらに好ましくは２４時間行うのが有利である。ホルムアルデヒドを用いる安定化反応はグリシン、好ましくは０．１Ｍ濃度のグリシンを２０〜２５℃の温度で１時間添加して止めるのが有利である。
【００３７】
過剰グルタルアルデヒドを除去する段階の後にＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを添加するのが好ましい。
上記定義の免疫原性ヘテロ複合体を含む免疫原性産物の調製方法は実施例１、２、３、４に示してある。
実施例には示されていないが、ヘテロ複合体ＴＧＦβ−ＫＬＨの調製は実施例１〜４に記載のプロトコルと同様なプロトコルに従って行うことができる。
【００３８】
一般に、本発明の中和ヒト天然抗体はインビトロで関連サイトカインの最大生物活性を少なくとも５０％中和する。
例えば、本発明者は一般に１０-3μｇ〜１０-2μｇの量の中和ヒト天然抗体で関連サイトカインの最大生物活性の少なくとも５０％のインビトロ抑制が得られることを見出した。
【００３９】
インビトロでの関連サイトカインの最大生物活性は下記（ｉ）〜（ｖ）によってそれぞれ誘発するのが好ましい：
（ｉ）ヒト臍静脈内皮細胞の最大増殖を引き起こす最小量のＶＥＧＦ、
（ｉｉ）水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）によるＭＤＢＫ細胞系譜からの細胞溶解の最大抑制を引き起こす最小量のＩＦＮα、
（ｉｉｉ）ＩＬ−４依存性のＴＦ−１細胞系譜の最大増殖を引き起こす最小量のＩＬ−４、
（ｉｖ）ＴＮＦα依存性のＬ９２９細胞系譜の最大増殖を引き起こす最小量のＴＮＦα、
（ｖ）ＴＧＦβ依存性のＮＲＫ４９Ｆ細胞系譜の最大増殖を引き起こす最小量のＴＧＦβ。
【００４０】
ＶＥＧＦ、ヒトＩＦＮα、ＩＬ−４およびＴＮＦαにおける生物活性アッセイは実施例５、６、７、８に記載の各プロトコルに従って行うことができる。ＴＧＦβ生物活性評価は、ＮＲＫ４９Ｆ線維芽細胞系譜を用いて上記のプロトコルと同様な方法で行うか、または、当業者に周知な方法に従って行うことができる。
【００４１】
上記の方法は（ａ）段階の最後に得られる免疫グロブリン画分からＧアイソタイプ免疫グロブリンを精製する（ｂ）段階を含むのが好ましい。
本発明方法は高レベルの抗体応答を得ることができ、さらに、関連サイトカインの活性を中和する抗体を産生するＢ細胞の高い循環比を得ることができるので特に有利である。
【００４２】
単離したＢリンパ球の集団を直接用いることができる。例えばこれらのＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合して抗サイトカインヒト天然抗体を産生することができ、複雑な精製プロセスを避けることができる。
本発明の方法によって、例えばＢ細胞の精製方法、例えばパニング、ナイロン結合抗体を入れたカラムによるフィルタリングまたはフローサイトメトリーソーティング（ＦＡＣＳ、登録商標）の使用を避けることができる。
【００４３】
免疫化した個体からＢ細胞を得ることは簡単である。第１の方法は多糖ポリマー（Ｆｉｃｏｌｌ、登録商標）とメトリザミドとの混合物、ヨウ素を含む密度の高い化合物から成る密度勾配遠心分離によって末梢血からＢリンパ球を単離する方法である。界面に赤血球から分離された大部分が多核細胞であるＢリンパ球集団が得られる。
【００４４】
免疫化した個体からＢ細胞を得るための別の方法は、Ｂリンパ球を組織、特に脾臓、胸腺、骨髄、リンパ節などのリンパ器官または口蓋扁桃のような粘膜に関連するリンパ組織から単離する方法である。
本発明方法は必要に応じてサイトカインの生物活性を中和するモノ特異性ポリクローナル抗体を得るための追加の段階をさらに含むことができる。
【００４５】
本発明方法はサイトカインの生物活性を中和するＦ（ａｂ）またはＦ（ａｂ）’2断片を得るための追加の段階をさらに含むことができる。
本発明方法はさらに、下記の追加の段階を含むことができる：
ｉ）ハイブリドーマ系譜を得るために、ａ）段階の最後に得られるＢ細胞を骨髄腫からの細胞と融合させる段階、および
ｉｉ）これらのハイブリドーマによって産生された抗体を回収する段階。
以下、全ての段階を医薬組成物と関連づけながら詳細に説明する。
【００４６】
本発明の別の対象は、ＶＥＧＦ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＴＮＦαおよびＴＧＦβの中から選択されるヒトサイトカインの活性を中和するヒト天然抗体のＩｇＧアイソタイプを活性成分として含み、この中和抗体がインビトロで上記サイトカインによって誘発される最大生物活性を少なくとも５０％抑制する医薬組成物にある。
【００４７】
上記のように、上記医薬組成物中に含まれる上記定義のヒト抗体は関連サイトカインに対して予め免疫化した個体から得られる血清またはＢ細胞である。
一般に、本発明のヒト天然抗体は０．００６〜０．５ｎｇの量の関連サイトカインによって誘発される生物活性の少なくとも５０％をインビトロで抑制する。
【００４８】
例えば、サイトカインを上記の所定量で用いた場合に、関連サイトカインの最大生物活性の少なくとも５０％のインビトロ抑制が、１０-3μｇ〜１０-2μｇの量の中和抗サイトカインヒト天然抗体で一般に得られることを本発明者は見出した。
【００４９】
サイトカインに対する個体の免疫化は当業者に周知な任意の方法で行うことができる。特に、ＩＦＮαの場合は、実施例９．１に記載の条件下でジメチルホルムアミドによって予め不活性化されたＩＦＮαの注射によるか、本発明の方法に関連して記載した技術と同じ技術によって行うことができる。
【００５０】
中和ヒト天然抗体は（ｉ）ＶＥＧＦ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＴＮＦαおよびＴＧＦβの中から選択される各抗原蛋白分子と（ｉｉ）担体蛋白分子とで構成され、抗原蛋白（ｉ）の４０％以下が担体蛋白分子（ｉｉ）に共有結合で結合している免疫原性蛋白ヘテロ複合体からなる安定な免疫原性産物で免疫化した個体からの血清またはＢ細胞から得るのが好ましい。
【００５１】
「天然抗体、anticorps naturels」とは、本明細書では、関連サイトカインに対して特異的に免疫化した個体によって自然に産生される抗体を意味し、この天然抗体は個体の血清に含まれるか、個体の活性化されたＢ細胞によって免疫化後に産生される。
ヘテロ複合体の定義、その獲得方法、抗原蛋白と担体蛋白との間の共有結合の割合の決定方法は本発明方法に関して記載した上記技術と同じ技術に従って行うことができる。
【００５２】
インビトロでのサイトカインの最大生物活性はそれぞれ下記によって誘発されるのが好ましい：
（ｉ）０．５ｎｇのＶＥＧＦ
（ｉｉ）０．００６ｎｇのＩＦＮα
（ｉｉｉ）０．５ｎｇのＩＬ−４
【００５３】
本発明の中和抗サイトカインヒト天然抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体からなる。
ポリクローナル抗体は下記の中から選択されるのが好ましい：
（ｉ）ヒトサイトカインに対して免疫化したヒトの個体の血清から精製した抗体の全画分、
（ｉｉ）サイトカインの活性を中和する単一特異性ポリクローナル抗体の精製画分、
（ｉｉｉ）上記ポリクローナル抗体（ｉ）および（ｉｉ）から調製されたＦａｂまたはＦ（ａｂ）’2断片。
【００５４】
ヒトサイトカインに対して免疫化したヒト個体の血清から精製した全画分（ｉ）の獲得は下記の段階を含むのが好ましい：
ａ）免疫原性組成物、好ましくは上記のような免疫原性組成物をヒト個体に注射する段階、
ｂ）投与した抗原の活性を中和する抗体を含むヒト個体の免疫血清を回収する段階、
ｃ）免疫血清から抗体画分を精製する段階。
【００５５】
上記方法の各段階について以下に詳細に示す。免疫血清の回収は当業者に周知の方法、例えば遠心分離による全血液サンプルからの血清の分離、免疫化した患者の免疫血清からの抗体画分の例えば親和クロマトグラフィーによる精製、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過、Ａ／Ｇ蛋白カラムを用いるクロマトグラフィ、親和クロマトグラフィ、または、免疫親和クロマトグラフィで行われる。
【００５６】
本発明に特に適した抗体精製の追加の段階は下記文献に開示されている。
【特許文献６】欧州特許出願第６６２，４８０号公報
【００５７】
この精製方法によって抗体混合物、特に（ｂ）段階で得られた免疫血清中の抗担体分子抗体を除去することができる。関連サイトカインの活性を中和するモノ特異性ポリクローナル抗体（ｉｉ）の精製画分は、関連サイトカイン上の抗原パターンをカラムに結合することによって、ヒトサイトカインに対して免疫化したヒト個体の免疫血清から精製された全抗体画分（ｉ）から親和クロマトグラフィによって得ることができる。
【００５８】
上記のポリクローナル抗体から、または、免疫血清または血漿からのＮ（ａｂ）’2断片の精製は下記文献に開示された方法に従って行うことができる。
【特許文献７】米国特許出願第２００２／０１６４３２７号明細書
【００５９】
この方法は血漿または血清をペプシンで消化する段階と、アルブミン、完全抗体を欠き、且つ、発熱物質をほぼ欠いたＦ（ａｂ）’2断片を得るまで精製および分離する段階とを含む。
Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）2画分の単離によって、免疫系からの他のエフェクタ分子と相互作用せずに関連サイトカインに結合できる等の特殊な利点を得ることができる。
Ｆ（ａｂ）断片も同様な方法で得ることができ、この方法は関連サイトカインに対して免疫化したヒト個体から得られる免疫血清、血漿またはポリクローナル抗体精製画分（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のパパインによる消化からなる。
【００６０】
変形例では抗体はモノクローナルであり、下記の中から選択される：
（ｉ）ヒトサイトカインに対して免疫化したヒトの個体からのＢ細胞（ａ）と、骨髄腫のような細胞系譜を産生する抗体の細胞（ｂ）との間の細胞融合から生じる細胞によって産生される抗体、
（ｉｉ）免疫化によって誘発され且つ免疫化した患者の血清中に存在する免疫グロブリンをコード化するＤＮＡでトランスフェクトまたはトランスフォームした細胞によって産生される抗体であって、ＤＮＡがサイトカインに対して免疫化したヒトのＢ細胞から得られるＤＮＡから予め単離されている抗体、
（ｉｉｉ）上記ポリクローナル抗体（ｉ）および（ｉｉ）から調製されたＦａｂまたはＦ（ａｂ）’2断片
（ｉｖ）ＳｃＦｖ断片
【００６１】
モノクローナル抗体（ｉ）は下記の方法に従って得ることができる：
第１段階はヒトサイトカインに対するヒト個体からＢリンパ球を単離することからなる。第１の方法では多糖ポリマー（Ｆｉｃｏｌｌ、登録商標）とメトリザミドとの混合物、ヨウ素を含む密度の高い化合物から成る密度勾配遠心分離によって末梢血からＢリンパ球を単離する。界面に赤血球から分離された単核細胞と、大部分を占める多核細胞との集団が得られる。次いでＢリンパ球集団は骨髄腫細胞と融合させることができ、また、パニング方法（すなわち、抗体で被覆された基質に結合してＢリンパ球の特異的接着を可能にする）によって任意段階として補足的に精製できる。この細胞はスチールウールを被覆したナイロン結合抗体を入れた、Ｂリンパ球を含む種々の細胞集団の溶離を可能にするカラムでフィルタリングすることもできる。
【００６２】
これらの技術は高純度の細胞集団を供給するＦＡＣＳ（登録商標）によるソーティングの前の予備段階となる。
別の方法はＢリンパ球を組織、特に脾臓、胸腺、骨髄、リンパ節などのリンパ器官または口蓋扁桃のような粘膜に関連するリンパ組織から単離することからなる。
【００６３】
局所免疫応答の場合には、リンパ球を免疫反応の部位で単離することができる。
こうして単離されたリンパ球を次いで菌糸細胞と融合し、次いで雑種細胞またはハイブリドーマをそれらの関連サイトカインとの親和性に従って選択する。次いで、所望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを同定し、継代培養によってクローン化する。関連サイトカインに対して高親和性抗体を産生するこのハイブリドーマによって産生された抗体はモノクローナル抗体画分（ｉ）からなる。
【００６４】
特定のタイプのＢリンパ球は限界希釈培養によって単離することもでき、骨髄腫細胞と融合する前に、関連サイトカインに結合するように産生される抗体の能力に従って選択される。
【００６５】
次いで、サイトカインに対する高親和性抗体を産生する能力によって選択されたＢリンパ球またはハイブリドーマから得られるＤＮＡを単離することができ、上記抗体のためのＤＮＡ配列コードを分子生物学で一般的な技術に従って増幅することができる。こうして増幅されたＤＮＡを次いで細胞に挿入することによって、選択されたＢリンパ球抗体の発現が可能になる。こうして産生された抗体は画分（ｉｉ）からなる。
【００６６】
Ｆ（ａｂ）またはＦ’（ａｂ）’2断片（ｉｉｉ）はポリクローナル抗体で説明したものと同じ酵素方法に従って単離できる。
ｓｃＦｖ断片（ｉｖ）または「一本鎖可変断片」は下記方法に従って合成できる。
【００６７】
重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインのためのＤＮＡコード配列は、Ｂリンパ球または上記のハイブリドーマから得られるＤＮＡから選択される。この選択は分子生物学で一般的な技術に従って特異プライマーを選択することによって行うことができる。次いで、このようなＤＮＡ配列を全体が可変ドメインに結合する合成ペプチドをコード化する配列で、発現ベクター内でクローン化する。
【００６８】
上記の発現ベクターを次いで宿主細胞に挿入する。抗体および抗体断片を発現するのに適した発現ベクターおよび宿主細胞の例を以下に挙げる。
ｓｃＦｖ断片の合成に極めて適した宿主細胞の例としては、下記文献に開示されているようなミラビリス変形菌からのＬ型細胞が挙げられる。
【非特許文献４】Ｒｉｐｐｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）
【００６９】
ｓｃＦｖ断片の合成によって、上記断片の寸法が小さいことによる特殊な利点、すなわち組織中に容易に拡散することができるという利点を得ることができる。
さらに、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ）’2断片をｓｃＦｖ断片で説明した方法に従って合成することもできる。
【００７０】
本発明の好ましい実施例ではないが、本発明の中和抗サイトカインヒト天然抗体を組換え抗体にすることができる。この実施例では、上記方法に従って選択されたＢリンパ球またはハイブリドーマから得られるＤＮＡ断片を修飾する。特に、これらの断片の関連サイトカインとの親和性を高めるために、上記抗体の可変ドメインのためのＤＮＡコード、特に重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのためのＤＮＡコードをランダムに突然変異させることができる。可変ドメインは、自然免疫応答中の抗体の親和性の成熟の原因である体細胞突然変異に類似の方法に従ってＣＤＲ３領域で突然変異させることもできる。インビトロでの親和性の成熟は、ＶＬおよびＶＨドメインを増幅して突然変異させるためにランダム突然変異を示すＣＤＲ３領域の相補プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって、ＶＬおよびＶＨドメインをコード化する配列を増幅することによって行うことができる。これらのドメインを次いで、関連サイトカインに結合する能力に従って新たに選別し、サイトカインとの親和性が最も強いドメインを選択する。次いで、ＶＬおよびＶＨドメインをコード化するＤＮＡを、これらの配列が得られる抗体の定常部をコード化する配列または他の任意の免疫グロブリンの定常部をコード化する配列に再挿入する。
【００７１】
こうして得られたＤＮＡ配列は完全組換え抗体またはｓｃＦｖ断片またはＶＨまたはＶドメインのためのコード配列であり、次いで、以下に例を挙げる発現ベクターおよび宿主細胞に導入される。
【００７２】
本発明の定義に含まれるその他の抗体は、ＶＬおよびＶＨドメインのためのｃＤＮＡコードを用いて調製できる、発現ファージライブラリを用いたスクリーニングによって得ることができる。これらのｃＤＮＡはヒトリンパ球から得られるｍＲＮＡから調製される。これらのライブラリの調製方法はそれ自体公知である。このような発現ファージライブラリの例としては、Ｐｈａｒｍａｃｉａから市販の「組換えファージ抗体系」が挙げられる。発現ファージライブラリの獲得およびスクリーニングの例は下記文献に記載されている。
【特許文献８】米国特許第５，２２３，４０９号明細書
【特許文献９】国際特許出願第ＷＯ９２／２０７９１号公報
【００７３】
本発明の好ましい実施例では、上記のような抗サイトカインヒトモノクローナル抗体は、類似のサイトカインに結合する特性を有するＶＨおよびＶＬドメインを選択するのに用いられる。この選択は例えばエピトープインプリンティング法または下記文献に開示された方法で行われる。この方法に従って用いられる抗体ライブラリはｓｃＦｖライブラリであるのが好ましい。
【特許文献１０】国際特許出願第ＷＯ９３／０６２１３号公報
【００７４】
ＶＨおよびＶＬドメインを選択した後、これらを混合し、次いで、選択されたサイトカインに結合するそれらの能力に従って選別する。ＶＨおよびＶＬドメイン対をコード化するＤＮＡ配列を、選択されたサイトカインとの親和性を高めるために、次いで、ランダムに突然変異させることができる。自然免疫応答中の抗体の親和性の成熟の原因である体細胞突然変異に類似の方法に従ってＣＤＲ３領域でＶＨおよびＶＬドメイン対を突然変異させることもできる。
【００７５】
インビトロ親和性の成熟はサイトカインに結合するその能力によって選択されたＢリンパ球のＤＮＡに関して以下で説明する方法に従って行うことができる。次いで、選択されたＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列は、例えば第１スクリーニング中に用いられたライブラリの型によって配列に差が生じるので、これらを生殖系列の対応するアミノ酸配列と比較することができる。この場合には、初期のアミノ酸配列を見つけるために、対応するＤＮＡ配列において復帰突然変異を行うのが有用である。
【００７６】
このような復帰突然変異は分子生物学で一般的な方法に従って行うことができ、それによって部位特異的突然変異誘発のような特異的突然変異を導入することができる。
このような選択の後で、関連抗原をコード化する核酸を通常の技術に従って発現ベクター中でクローン化することができる。核酸は本発明の定義に含まれる他の抗体を発生させることからなる追加の段階を行うこともできる。この段階は例えば、追加の定常部のような追加の免疫グロブリンドメインのためのコード配列の追加にすることができる。
【００７７】
組換え抗体または抗体画分をコード化するＤＮＡ配列、特にＶＨおよびＶＬドメインを、関連サイトカインに結合するその能力によって選択される組換え抗体を産生するために、適当な細胞系譜、例えばハイブリドーマの調製に用いられる骨髄腫細胞を産生する非抗体に導入することができる。
このＤＮＡ配列は以下で説明するような哺乳類の宿主細胞に導入される組換え発現ベクター中でクローン化することもできる。
【００７８】
好ましい宿主細胞はＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、骨髄腫細胞ＮＳＯ、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞である。これらの抗体をコード化する配列を含む発現ベクター、組換え抗体、および、抗体断片が宿主細胞に導入されると、これらの細胞はこれらの抗体またはこれらの断片が宿主細胞中で産生され、好ましくは宿主細胞が位置する培地に放出されるのに十分な長さの時間の間、培養される。次いで、標準蛋白精製法によって抗体を回収する。
【００７９】
医薬組成物および投与
本発明の組成物は抗体断片を含む上記抗サイトカインヒト天然抗体を中和する医薬組成物であるのが好ましい。特に、本発明の組成物は少なくとも一種の生理学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【００８０】
「生理学的に許容される賦形剤」とは例えば溶媒、分散媒、抗菌剤、抗真菌剤または等張に達することができる希釈剤である。本発明のこれら賦形剤の中では水、リン酸緩衝液、ブドウ糖、グリセロール、エタノールおよびこれらの化合物が挙げられる。この組成物には糖、多価アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトールまたは塩化ナトリウムのような等張剤をさらに添加するのが好ましいことが多い。この組成物は効率を高める乳化剤、防腐剤または緩衝液のような補助剤をさらに含んだり、本発明の組成物の使用時間を長くすることができる。
【００８１】
本発明組成物は種々の形態にすることができ、例えば、注射前に注入することを目的として液体または固体または半固体の投与量の形にすることができる。その他の形態としては例えば懸濁液、分散体、錠剤、粉末、リポソームまたは坐薬が考えられる。好ましい組成物は本明細書に開示した抗体以外の抗体をヒト受動ワクチン接種するためにある注射液と類似の注射液の形態で存在する。これらの組成物の好ましい投与方法は非経口経路（例えば皮下または筋肉内経路）または静脈内経路である。
【００８２】
本発明の組成物は通常の製造／保存条件で無菌且つ安定でなければならない。本発明組成物は溶液、 マイクロエマルジョン、分散体、リポソームやその他の構造にすることができる。無菌の注射用組成物の調製は活性成分、すなわち抗体または抗体断片を適当な量の溶媒やその他の上記の賦形剤に取り込み、次いで、濾過による滅菌によって行うことができる。
【００８３】
場合によって、本発明の組成物はサイトカインの活性を中和する上記のような第１のタイプの抗体と、例えばサイトカインの周知の受容体または標的に対する第２のタイプの抗体とを含むことも考えられる。
サイトカインの多面的な役割、特に炎症反応および感染反応での役割を考慮すると、本発明の組成物を炎症、感染、喘息または移植片拒絶あるいは自己免疫疾患の克服に関与する追加の活性成分と組み合わせるのが有利であろう。
【００８４】
本発明の抗体と組み合わせて用いることができる炎症を克服するための治療薬の例は下記の通り：
ブデソニド、副腎皮質ステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸塩、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ抑制剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化化合物、トロンボサン抑制剤Ｉｌ−１０受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体、抗ＩＬ−６モノクローナル抗体、エラスターゼ抑制剤、可溶な形態の１型補体受容体等。
【００８５】
本発明の抗体と組み合わせて用いることができる感染を克服するための治療薬の例は抗生物質、鉄キレート剤、脂質で再構成されたアポリポ蛋白１、ヒドロキサム酸（合成抗菌剤）である。
【００８６】
本発明の医薬組成物は「医薬上効率的な量」の本発明の抗体または抗体断片を含むことができる。「医薬上効率的な量」とは求められる治療結果に至ることができる投与量および十分な時間での効率的な量を意味する。この量は種々の要因、例えば治療患者の病理学的状態、性別、体重および年齢並びに患者に効果をもたらす上記抗体の能力によって変化する。このような量によって本発明の組成物での治療がもたらす利益よりも、副作用または毒作用が低くなる。
投与量は最適な応答が得られるように適合させることができる。例えば、医薬組成物は単一投与量または一定時間ごとに投与する複数投与量で投与できる。
【００８７】
本発明の使用
本発明組成物に含まれる抗体のサイトカインへの結合能力から、本発明抗体は親和クロマトグラフィ、「エリザ（ＥＬＩＳＡ）」型技術（酵素結合免疫吸着検定法）または「ＲＩＡ」（ラジオイムノアッセイ）のような通常の技術を用いてサイトカインをインビトロで検出するのに用いることができる。
【００８８】
従って、本発明はサンプル中のサイトカインを検出する方法に関する。この方法は本発明の上記組成物を分析すべきサンプルと接触させる段階と、抗体とサイトカインとの間に形成される複合物を検出する段階とを含む。
複合体の検出を容易にするために、検出可能な物質、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼのような酵素、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンのような補欠分子団、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、ローダミン、フィコエリトリンのような蛍光分子、または、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、または3Ｈのような放射性分子によって上記抗体を標識化することができる。
【００８９】
本発明はさらに、競合阻害を介した滴定によって未知の成分のサンプルにおけるサイトカインの存在および量を検出する方法に関する。この方法では本発明抗体と標識化した関連サイトカインとを用いる。
この定量方法では生物サンプル、本発明の標識化関連サイトカインおよび抗体を組み合わせ、次いで、抗体と結合する関連サイトカインの量を求める。サンプル中のサイトカインの量は本発明抗体と結合する関連サイトカインの量と逆相関である。
【００９０】
本発明はさらに、下記に関するものである：
（１）癌治療用医薬組成物の製造での抗ＶＥＧＦ抗体の使用。
（２）免疫抑制状態を治療するための医薬組成物の製造での抗ＩＦＮα抗体の使用。
（３）アレルギー治療用医薬組成物の製造での抗ＩＬ−４抗体の使用。
（４）免疫抑制状態を治療するための医薬組成物の製造での抗ＴＮＦα抗体の使用。
（５）レトロウイルスによる感染の治療または大腸癌、乳癌および前立腺癌から成る群の中から選択される癌の治療のための医薬組成物の製造での抗ＴＧＦβ抗体の使用。
【００９１】
本発明による治療方法
本発明組成物は抗サイトカインワクチン接種の枠組みの中で、通常のワクチン接種の予備段階として好ましく用いることができる。ストローマの免疫毒性作用を中和またはブロックすることと、抗原アグレッサーに対して適合された免疫反応を正常に展開できるようにすることが目標である。
【００９２】
従って、本発明のさらに他の対象は少なくとも下記の段階を含む治療方法にある：
（ｉ）本発明の組成物を患者に投与する段階、
（ｉｉ）抗原または抗原の化合物に対して求められる免疫応答を誘発する抗原または抗原の化合物を含む免疫原性組成物をこの患者に投与する段階。
上記の２つの段階によって患者の免疫応答を再構築することができ、その後、免疫崩壊の原因となる剤に対するワクチンを患者に接種する。
【実施例】
【００９３】
実施例１
ＫＬＨ−ヒト−ＶＥＧＦヘテロ複合体
このヘテロ複合体の主目的はヒトＶＥＧＦを中和する抗体の産生をワクチン接種患者の体内で誘発することにある。
０．５８ｍｇのＫＬＨ蛋白を０．５ｍｌのｐＨ８．５の１０ｍＭ燐酸緩衝液に溶解する。この溶液に同じ緩衝液１ｍｌに１ｍｇのヒトＶＥＧＦを溶解したものを添加する。こうして得られた混合物をグルタルアルデヒドを用いて最終濃度が０．０２６Ｍとなるように室温で３０分間処理する。次いで、過剰グルタルアルデヒドを２時間の透析を３回続けて除去する。各透析は透析膜中で４℃でカットオフ閾値３ｋＤａにしてｐＨ７．６の１０ｍＭ燐酸緩衝液２００ｍｌに対して行う。次に、混合物をホルムアルデヒドを用いて３３ｍＭの最終濃度で２４時間処理した後、最後に０．１Ｍのグリセリンを室温で１時間添加して反応を止める。混合物を前回行った透析と同じ条件下で透析する。
【００９４】
実施例２
ＫＬＨ-ＩＦＮαヘテロ複合体の調製
このコンジュゲートの主目的はヒトＩＦＮαを中和する抗体の産生をワクチン接種個体中で誘発することにある。
０．６２５ｍｇのＫＬＨ蛋白を０．６ｍｌのｐＨ８．５の１０ｍＭ燐酸緩衝液に溶解する。この溶液に、同じ緩衝液１ｍｌに１ｍｇのヒトＩＦＮαを溶解したものを添加する。こうして得られた蛋白混合物をグルタルアルデヒドを用いて０．０２６Ｍの最終濃度で室温で３０分間処理する。次いで、過剰グルタルアルデヒドを２時間の透析を３回続けて除去する。各透析は透析膜中で、ｐＨ７．６の１０ｍＭ燐酸緩衝液２００ｍｌに対して、カットオフ閾値３ｋＤａ、４℃で行う。次に、混合物をホルムアルデヒドを用いて３３ｍＭの最終濃度で４８時間処理した後、最終０．１Ｍのグリセリンを室温で１時間添加して反応を止める。最後に、前回行った透析と同じ条件下で混合物を透析する。
【００９５】
実施例３
ヒトＫＬＨ-ＩＬ−４ヘテロ複合体の調製
このヘテロ複合体の主目的はヒトＩＬ−４を中和する抗体の産生をワクチン接種個体中で誘発することにある。
1ｍｇのＫＬＨ蛋白を1ｍｌのｐＨ 8.5の10 ｍＭ燐酸緩衝液に溶解する。この溶液に、同じ緩衝液1ｍｌに1ｍｇのマウスＩＬ−４を溶解したものを添加する。こうして得られた蛋白混合物をグルタルアルデヒドを用いて0.026 Mの最終濃度で室温で30分間処理する。次いで、過剰グルタルアルデヒドを2時間の透析を3回続けて除去する。各透析は透析膜中で、ｐＨ 7.6の10 ｍＭ燐酸緩衝液200 ｍｌに対して、カットオフ閾値3 kDa、4°Cで行う。次に、混合物をホルムアルデヒドを用いて33ｍＭの最終濃度で24時間処理した後、最終0.1 Mのグリセリンを室温で１時間添加して反応を止める。最後に、前回行った透析と同じ条件下で混合物を透析する。
【００９６】
実施例４
マウスＫＬＨ-ＴＮＦαヘテロ複合体の調製
このコンジュゲートの主目的はマウスＴＮＦαを中和する抗体の産生をワクチン接種個体中で誘発することにある。
０．６２５ｍｇのＫＬＨ蛋白を０．６ｍｌのｐＨ８．５の10ｍＭ硼酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌに溶解する。この溶液に、同じ緩衝液1ｍｌに1ｍｇのヒトＩＦＮαを溶解したものを添加する。こうして得られた蛋白混合物をグルタルアルデヒドを用いて０．０２６Ｍの最終濃度で室温で４５分間処理する。過剰グルタルアルデヒドを次いで4時間の透析を3回続けて除去する。各透析は透析膜中で、ｐＨ７．６の１０ｍＭ １５０ｍＭ ＮａＣｌリン酸緩衝液２００ｍｌに対して、カットオフ閾値３ｋＤａ、４℃で行う。次いで、混合物をホルムアルデヒドを用いて３３ｍＭの最終濃度で４８時間処理した後、最終０．１Ｍのグリセリンを室温で１時間添加して反応を止める。最後に、前回行った透析と同じ条件下で混合物を透析する。
【００９７】
実施例５
ＶＥＧＦ生物活性アッセイ
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をミクロ培養プレートの平底ウエルで３０００細胞/ウエルの細胞密度で培養した。次いで、培養した内皮細胞に抗体の各希釈液を加える。細胞培養は５％ＣＯ2を含む湿った雰囲気中で３７℃で３日間連続して行った。培養終了１８時間前に０．５μＣｉのトリチウムチミジン/ウエルを加える。
中和した抗体はマウスＶＥＧＦが内皮細胞の増殖を誘発するのを防止し、中和していない抗体はこのような細胞の増殖を許す。
【００９８】
実施例６
ヒトＩＦＮα生物活性アッセイ
ＭＤＢＫ細胞をミクロ培養プレートの丸底ウエルで３５０，０００細胞/ウエルの密度で培養した。次いで、ＭＤＢＫ細胞にＩＦＮαの各希釈液を加える。５％ＣＯ2を含む湿った雰囲気中で３７℃で２０時間細胞培養した後、希釈液を除去し、細胞を洗浄し、次いで、１００ＬＤ50（５０％致死量）を含むＶＳＶウイルス１００μlを加える。ウイルス添加から１８時間後にウイルスの溶解作用を測定する。中和した抗体はＶＳＶが細胞を溶解するの可能にするが、中和していない抗体はこのような溶解を阻止する。
【００９９】
実施例７
ヒトＩＬ−４生物活性アッセイ
このアッセイはヒトＩＬ−４に依存して成長するヒト細胞系譜であるＴＦ−１細胞を用いる（下記文献参照）。
【非特許文献５】Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９８９．Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．１４０：３２３−３４
【０１００】
ＴＦ−１細胞はミクロ培養プレートの丸底ウエルで１００００細胞/ウエルの細胞密度で培養した。次いで、ＴＦ−１細胞に各希釈液を加える。細胞培養は５％ＣＯ2を含む湿った雰囲気中で３７℃で３日間連続して行った。培養終了４時間前に０．５μＣｉのトリチウムチミジン/ウエルを加える。
中和した抗体はヒトＩＬ−４がTF-1細胞の増殖を誘発するのを防止し、中和していない抗体はこのような細胞の増殖を許す。
【０１０１】
実施例８
ＴＮＦα生物活性アッセイ
Ｌ９２９細胞はミクロ培養プレートの平底ウエルで培養した。次いで、この細胞にＴＮＦαの各希釈液を加える。細胞培養は５％ＣＯ2を含む湿った雰囲気中で３７℃で３日間連続して行った。培養終了４時間前に５ｍｇ/ｍｌのＭＴＴを加える（ＭＴＴはＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ社で入手可能である）。
中和した抗体はＴＮＦαが内皮細胞の死を誘発するのを防止し、中和していない抗体に関してはその逆である。
【０１０２】
実施例９
本発明の抗体の生物活性と市販の中和抗体との比較
実施例９．１：ヒトにおける抗インターフェロンαポリクローナル抗体の産生
ジメチルホルムアミドによる化学処理で不活性化したヒトインターフェロンαを筋肉内径路で投与することによって志願者の個体群を免疫化した。各志願者個体に０、７、１４、２１日および４２日に７１０ｇの不活性化ＩＦＮαを注射した。
抗インターフェロンα抗体の産生曲線を時間の関数で求める。産生ピーク時（こうして発生した抗ＩＦＮα  ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンのレベルが約９．５μｇ／ｍｌであるとき）に、各ワクチン接種個体から２０ｍｌの血液サンプルを採取し、血清プールを調製した。血清プールの抗インターフェロンαの活性をＥＬＩＳＡで求めると、抗体力価は１２８，０００であることがわかった（０日が０．３００である希釈液の逆）。
３５％飽和で硫酸アンモニウム沈殿（（ＮＨ4）2ＳＯ4）によって血清プールの一部からＩｇＧ画分を単離した。透析後、こうして得られた収率８０％のＩＦＮα活性を中和するＩｇＧ抗体を含む溶液が示したＥＬＩＳＡの結果は５１２，０００であった。
抗インターフェロンα血清全体、および、この血清から得られるＩｇＧの中和効力（１ ＵＩのヒトインターフェロンαの生物活性を５０％抑制できる抗体の量）はそれぞれ、０．００４μｇおよび０．００１μｇであった。
【０１０３】
【表１】
2007533622.tif 000002
【０１０４】
［表１］は上述のように産生した抗インターフェロンαポリクローナル抗体の中和効力と、市販の抗体の中和効力とを比較したものである。上述のように産生した抗体で得られる中和効力はマウスモノクローナル抗体で得られる力価の約２００倍である。
【０１０５】
（１）ＩＦＮαに対するウサギポリクローナル抗体（PBL Biomedical Pharmaceutical社から参照番号Ｎ゜３１１００−１で入手可能）
（２）ＩＦＮαに対するヒツジポリクローナル抗体（PBL Biomedical Pharmaceutical社から製造番号Ｎ゜３１１３０−１で入手可能）
（３）ＩＦＮαに対するマウスモノクローナル抗体（PBL Biomedical Pharmaceutical社から製造番号Ｎ゜２１１０５−１で入手可能）
【０１０６】
実施例９．２
ヒト個体中での抗ＩＬ−４ポリクローナル抗体の産生
ＫＬＨ−ヒトＩＬ−４コンジュゲートを筋肉内投与することによって被験志願者を免疫化した。
ジメチルホルムアミドで化学的に不活性化した１２０μｇのヒトＩＬ−４を各被験者に０、２１、６０日に注射した。
抗ＩＬ−抗体の産生曲線を時間の関数で求めた。抗体合成のピーク時（こうして発生した抗ＩＬ−４  ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンのレベルが約１２μｇ／ｍｌであるとき）に、血液サンプルを採取し、抗ＩＬ−４血清を収集した。血清活性をＥＬＩＳＡで測定すると、抗体力価は５１２，０００であることがわかった（ＥＬＩＳＡ測定値が０．３００である血清希釈液の逆）。抗ＩＬ−４抗体を含むＩｇＧ画分を分離した後で、この画分をペプシンで消化し、且つ、Ｆ（ａｂ’）2抗体断片を収率６０％で収集した。ＥＬＩＳＡ活性を求めると、測定値は３１０，０００であった。抗ＩＬ−４血清全体の中和効力（０．５ｎｇのインターロイキン−４の活性を５０％抑制できる抗体の量）は０．０２μｇになるように、且つ、Ｆ（ａｂ’）2は０．１μｇになるように設定した。
【０１０７】
【表２】
2007533622.tif 000003
【０１０８】
［表２］は上述のように産生した抗ＩＬ−４ポリクローナル抗体の中和効力と、市販の抗体の中和効力とを比較したものである。上述のように産生した抗体で得られる抗体力価はマウスモノクローナル抗体で得られる抗体力価の約５０倍である。
【０１０９】
（１）ＩＬ−４に対するヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社から参照番号Ｎ゜ＡＦ−２０４−ＮＡで入手可能）
（２）ＩＬ−４に対するウサギポリクローナル抗体（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社から参照番号Ｎ゜５００−Ｐ２４で入手可能）
（３）ＩＬ−４に対するマウスポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社から参照番号Ｎ゜ＭＡＢ２０４で入手可能）
【０１１０】
実施例９．３
マウスにおける抗マウスＶＥＧＦポリクローナル抗体の産生
実施例７．１および７．２で述べた方法と同じ方法を用いた。ＫＬＨ−マウスＶＥＧＦヘテロ複合体を投与することによって２０匹のマウス群を免疫化した。ジメチルホルムアミドで化学的に活性化した２０μｇのＶＥＧＦを各マウスに０、７、１４、２１日および４２日に注射した。
抗ＶＥＧＦ抗体の産生曲線に関しては、応答のピーク時に全てのマウスから血液サンプルを採取し、抗ＶＥＧＦ血清のプールを調製した。
３５％飽和で（ＮＨ4）2ＳＯ4を用いた沈殿によってＩｇＧ画分を単離した。ＥＬＩＳＡ活性を求めると、２５６，０００であり、ＩｇＧ画分の中和活性（０．５ｎｇのマウスＶＥＧＦの活性を５０％抑制できる抗体の量）は０．０１２μｇであった。
【０１１１】
【表３】
2007533622.tif 000004
【０１１２】
［表３］は上述のように産生した抗マウスＶＥＧＦポリクローナル抗体の中和効力と、市販の抗ＶＥＧＦ抗体の中和効力とを比較したものである。
（１）ＶＥＧＦに対するヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社から参照番号ＡＦ−２９３−ＮＡで入手可能）
（２）ＶＥＧＦに対するウサギポリクローナル抗体（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社から製造番号Ｎ゜５００−Ｐ１０で入手可能）
（３）ＶＥＧＦに対するマウスポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社から参照番号Ｎ゜ＭＡＢ２９３で入手可能）
【０１１３】
実施例９．４
ヒトＩＦＮαに対する組換えモノクローナル抗体の産生
原料：
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は化学的に活性化されたヒトＩＦＮαで免疫化した被験者から得られる。
Ｂ９５−８細胞系譜の培養上澄みからエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を調製し、１０5ＴＤ50／ｍｌの濃度で用いた。
【０１１４】
培養：
ヒトＰＢＭＣをフィコール密度勾配で精製し、次いで、ウイルスに感染させた。ＥＢＶによってトランスフォームした細胞を次いで丸底の９６ウェルの培養プレート上で、２０％のウシ胎児血清ＳＶＦ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（培地）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて５×１０3−１０4／ｍｌの細胞濃度で培養した。培地を４日ごとに交換した。４〜６週の細胞培養後に、細胞を２４ウエルのプレートに移し、次いで、６ウエルの培養プレートに移した。次いで、培養上澄みをＥＬＩＳＡ技術で分析する。
【０１１５】
クローンを産生する抗ＩＦＮαモノクローナル抗体の選択
抗ＩＦＮα抗体を産生するクローンを選択し、細胞大量培養する。モノクローナル抗体をセファロース蛋白Ａカラム上で吸着することによって培養上澄みから精製した。こうして産生したモノクローナル抗体を吸着によって精製した。精製された抗ＩＦＮαモノクローナル抗体を含む溶液はモノクローナル抗体中の含有量が１ｍｇ／ｍｌであり、中和活性（１ ＵＩのＩＦＮαの活性を５０％抑制できる能力）すなわちＮＤ５０が少なくとも０．７μｇである。
抗体を産生するこれらのクローンは、本明細書に開示された当業者に周知なファージディスプレイ技術を用いることによって、ヒトＩＦＮαに対するヒトモノクローナル抗体を産生するための高親和性の高収率細胞原料である。
【０１１６】
【表４】
2007533622.tif 000005
【０１１７】
［表４］は上述のように産生したＩＦＮαモノクローナル抗体の中和効力と、市販の抗体の中和効力とを比較したものである。
上述のように産生した抗体で得られる抗体力価はマウスモノクローナル抗体で得られる抗体力価の約５０倍である。
【０１１８】
（１）ＩＦＮαに対するウサギポリクローナル抗体（ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社から参照番号Ｎ゜３１１００−１で入手可能）
（２）ＩＦＮαに対するヒツジポリクローナル抗体（ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社から参照番号Ｎ゜３１１３０−１で入手可能）
（３）ＩＦＮαに対するマウスモノクローナル抗体（ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社から製造番号Ｎ゜２１１０５−１で入手可能）
【０１１９】
実施例１０
担体蛋白分子（ＫＬＨ）と結合したサイトカインの割合の二重サンドイッチＥＬＩＳＡ技術による測定
担体蛋白分子（ＫＬＨ）と結合したサイトカインの割合を、担体蛋白に対して特異的な捕獲蛋白を用いた二重サンドイッチＥＬＩＳＡ技術によって決定した。
１０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ7.3の１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＰＢＳ）に希釈されたＫＬＨ（1ｍｇ/ｍｌ）に対して産生された１００μlのウマポリクローナル抗体をミクロタイタープレート（結合性が高いＣｏｓｔａｒ）のウェル中で３７℃で２時間結合させる。ＰＢＳ/０．１％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)中で3回洗浄した後、２％のＰＢＳを含むＰＢＳでウェルを飽和する。
【０１２０】
１時間３０分飽和した後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、次に、全く同一に２つずつ製造したへテロ複合体の希釈液(１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２および０．１５６μg/ｍｌ)をウェル中に添加する（１００μl/ウェル）。
２時間培養した後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄する。洗浄緩衝液中に存在する解離剤のＴｗｅｅｎで捕獲抗体に特異的に結合されたＫＬＨと共有結合で連結されていない分子を全て除去する。
次に、両方のヘテロ複合体希釈液を２つの異なる方法で処理する：
a)  第１セットはＫＬＨに対する抗体と一緒に培養する。
b)  第２セットはサイトカインに対する抗体と一緒に培養する。
【０１２１】
３７℃で１時間３０分培養後、ウェルを前回と同様に洗浄し、次に、第１の抗体の初期動物種に対する、ペルオキシダーゼと結合した二次抗体と一緒に培養する。37℃で1時間30分培養後、抗体を再度洗浄する。次いで、ペルオキシダーゼ、すなわちオルト−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）の支持体を添加して捕獲抗体に結合されたＫＬＨの存在およびＫＬＨに共有結合で連結されたサイトカインの存在を検出する。
捕獲抗体に結合されたＫＬＨの量、次いで、ＫＬＨに共有結合で連結されたサイトカインの量をＥＬＩＳＡで作成した較正曲線によって計算する。
こうしてＫＬＨに共有結合で連結されたサイトカインの割合が決定される。
【０１２２】
書誌参照
1)  Eastcott JW, Holmberg CJ, Dewhirst FE, Esch TR, Smith DJ,Taubman MA. (2001) Oligonucleotide containing CpG motifs enhances immune response to mucosally or systemically administered tetanus toxoid. Vaccine. 2001 Feb 8;19(13-14):1636-42.
2)  Gallichan WS, Woolstencroft RN, Guarasci 1, McCluskie MJ, Davis HL, Rosenthal KL. (2001) Intranasal immunization with CpG oligodeoxynucleotides as an adjuvant dramatically increases IgA and protection against herpes simplex virus-2 in the genital tract. J lmmunol.
2001 Mar 1;166(5):3451-7.
3)  Kitamura T, Tange T, Terasawa T, Chiba 5, Kuwaki T, Miyagawa K, Piao YF, Miyazono K, Urabe A, Takaku F.. (1989) Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL-3, or erythropoietin. J Cell Physiol Aug;140(2):323-34.
4)  McCluskie MJ, Weeratna RD, Davis HL (2000) Intranasal immunization of mice with CpG DNA induces strong systemic and mucosal responses that are influenced by other mucosal adjuvants and antigen distribution. Mol Med. Oct;6(10):867-77.
5)  Rippmann JF, Klein M, Hoischen C, Brocks B, Rettig WJ, Gumpert J, Pfizenmaier K, Mattes R, Moosmayer D. (1998) Procaryotic expression of single-chain variable-fragment (scFv) antibodies: secretion in L-form cells of Proteus mirabilis leads to active product and overcomes the limitations of periplasmic expression in Escherichia coli. AppI Environ Microbiol. 1998 Dec;64(12):4862-9.
【国際調査報告】
2007533622.tif 000006
2007533622.tif 000007
2007533622.tif 000008
2007533622.tif 000009
2007533622.tif 000010
2007533622.tif 000011
2007533622.tif 000012
2007533622.tif 000013
2007533622.tif 000014
2007533622.tif 000015
2007533622.tif 000016