(57)【要約】抗腫瘍天然化合物ソルビシルラクトンＡ（ｓｏｒｂｉｃｉｌｌａｃｔｏｎｅ  Ａ）（２）およびその誘導体を大量に最適化して生産するための、真菌ペニシリウムクリソゲヌム、特にＫＩＰ３２０１株の改良された培養方法、およびその真菌バイオマスおよび培地から回収し精製するための最適化された方法が記載されている。【化１】2007519414.tif 000010さらに、ソルビシルラクトンＡ（２）の生物活性および化合物の遺伝毒性に関する研究が記載されている。
2007519414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソルビシルラクトンＡ（ｓｏｒｂｉｃｉｌｌａｃｔｏｎｅ  Ａ）またはその誘導体を生成する方法であって、
ａ）適切な増殖培地中、２０〜２５℃、２〜５％の塩濃度でペニシリウム属真菌を緻密表面菌糸体が形成されるまで培養するステップ、
ｂ）２８〜３５℃に温度を上げ、さらに５〜１０日間インキュベーションするステップ、
ｃ）培養液を菌糸体から分離するステップ
ｄ）ソルビシルラクトンＡおよびその誘導体を培地から抽出するステップ、および任意に、
ｅ）塩濃度を０．５〜１．５％に減少した新鮮培地を菌糸体の下に敷き、２８〜３５℃で３〜８日間インキュベーションするステップ、
ｆ）ステップｃ）とｄ）を繰り返すステップ、および任意に、
ｇ）ステップｅ）とｆ）を繰り返すステップ、および
ｈ）ソルビシルラクトンＡおよびその誘導体を培地および／または菌糸体から抽出するステップ、
の諸ステップを含む方法。
【請求項２】
真菌がペニシリウムクリソゲヌム、特にＫＩＰ３２０１株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異なる添加物、例えば、ピルビン酸塩、グルタミン酸塩、プロリン、酢酸塩、ソルビシリン、またはソルビシルラクトンＡの他の生合成前駆体などを適切な増殖培地に加えることができる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
生成がフラットベッド法で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
接種原が固形物結合形の真菌である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
真菌が結合する固形物が、浮遊可能な固形物、例えば、粒子またはポリスチレンフォーム球である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
表面菌糸体を安定化させるキャリアデバイスを培養容器に導入する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
キャリアデバイスがメッシュである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
培地から分離した真菌菌糸体から酢酸エチルを加えてソルビシルラクトンＡまたはその誘導体を抽出する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ソルビシルラクトンＡまたはその誘導体を培地から固体交換体に直接に結合し、この結合形態からさらに精製する、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
固体交換体が交換樹脂アンバーライトＸＡＤ−１６である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
結合したまま固体交換体を培地からろ過し、ソルビシルラクトンＡまたはその誘導体を有機溶媒で溶出する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
有機溶媒が、メタノール、エタノール、酢酸エチル、ヘプタン、またはアセトニトリルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ソルビシルラクトンＡまたはその誘導体を、粗抽出液から有機溶媒によって酸性抽出する、請求項１０から１３の一項に記載の方法。
【請求項１５】
粗抽出液をリン酸によってｐＨ２にし、続いて酢酸エチルによって抽出する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抽出液の精製が、ＦＣＰＣ（高速遠心分離分配クロマトグラフィー）によって行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ヘプタン、酢酸エチル、メタノール、および水に由来する溶媒群の混合液であって、１ｍｌ／Ｌの濃リン酸を６〜７ｍＬ／ｍｉｎの流量と回転数毎分１２００回転にて添加し、その上相を静止相として使用する溶媒混合液が使用される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抽出液の精製が、有機溶媒を使用しセファデックスＬＨ−２０でのゲルクロマトグラフィーによって行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ソルビシルラクトンＡをメタノールで溶出する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ソルビシルラクトン−Ａ−メチルエステルを生成する方法であって、
ａ）請求項１から１９に記載のソルビシルラクトンＡを生成する、
ｂ）メタノールに溶解したソルビシルラクトンＡを濃硫酸によって処理する、
ｃ）室温で６時間攪拌する、
ｄ）水を加える、
ｅ）酢酸エチルで抽出する、
ｆ）有機相を真空蒸発する、および
ｇ）製造用ＨＰＬＣにより残留物を精製する、
の諸ステップを含む方法。
【請求項２１】
医薬品を製造する方法であって、
ａ）請求項１〜１９に記載のソルビシルラクトンＡまたはその誘導体を生成する、および
ｂ）医薬的に受容可能な助剤および添加物を使用し医薬組成物を製剤化する、
の諸ステップを含む方法。
【請求項２２】
ソルビシルラクトンＡまたはその誘導体が、治療中に生体に０．３〜３０μｇ／ｍｌの濃度範囲で存在するような量で存在することを特徴とする、請求項２１に記載の医薬品を製造する方法。
【請求項２３】
疾患細胞における、特に腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発剤としてのソルビシルラクトンＡまたはその誘導体の使用。
【請求項２４】
白血病の治療におけるソルビシルラクトンＡまたはその誘導体の使用。
【請求項２５】
神経変性疾患の治療におけるソルビシルラクトンＡまたはその誘導体の使用。
【請求項２６】
細菌感染症および真菌感染症の治療におけるソルビシルラクトンＡまたはその誘導体の使用。
【請求項２７】
寄託番号ＤＳＭ１６１３７であるペニシリウム属クリソゲヌムＫＩＰ３２０１の真菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペニシリウムクリソゲヌム（Penicillium chrysogenum）、特にＫＩＰ３２０１株の培養による、生物活性化合物ソルビシルラクトンＡ（ｓｏｒｂｉｃｉｌｌａｃｔｏｎｅ  Ａ）およびその誘導体の最適化された生成方法に関する。本発明はさらに、培地および真菌バイオマスから多量のソルビシルラクトンＡおよびその誘導体を精製する方法、ならびに疾病および感染を治療するためのソルビシルラクトンＡの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
新規な生物活性化合物の探索は、主として以下の２経路で行われる。１つは生体系から活性天然化合物の単離、他方は自然物からの二次代謝産物に部分的に触発された新規な化合物の合成。これに関しては、アクセス困難で極端な生息場所にいる大型および小型の生物の代謝産物の検査が特に重要である。従って、例えば、海洋性真核生物、特に海綿は、生理活性物質の豊富な供給源の代表である（Sarma AS, Daum T, Mueller WEG (1993)『海生海綿からの二次代謝産物（Secondary metabolites from marine sponges.）』、Akademie gemeinnuetziger Wissenschaften zu Erfurt, Ullstein-Mosby Verlag, Berlin）。その理由は、この生物体の生活が定着方式ということにある。この生物体は、彼らの栄養物である浮遊粒子（藻類、細菌、または真菌）が水中で自分の場所に移送されて来るのを頼りにしている。しかし、これらの粒子は絶え間なく水流と共に回遊しているので、細菌または真菌に感染して生じる疾病の危険性が増大している。したがって、海綿は、そのような感染に対する防護のために生物活性二次代謝産物による効率的な防御機構に依存する。しかし、多くの場合、これらの物質の形成が海綿自体によるのか、または海綿に関連する多数の微生物の１つによるのかは不明のままである。従って、海綿中に生息するこれらの微生物を単離し、その代謝産物スペクトルを研究することは特に重要である。従って、その生物活性二次代謝産物を十分な量取得するために、これらの微生物の培養増殖を可能にする方法を開発することが研究の主たる目標である。
【０００３】
今日、海洋性真核生物中に生じている微生物の約５％しか培養できないと推定することができる。従って、その潜在能力は依然として大部分未開発であるとみなすことができる。新規な薬剤の供給源としてこれらの微生物を首尾よく継続的に使用可能にするためには、所望の代謝産物の生成を可能な限り増大する一方で、望ましくない副産物の形成を大きく阻害することを特徴とする培養方法を開発するのが重要である。
【０００４】
生物活性二次代謝産物を商業的に活用するための利用範囲は広く、神経変性疾患、細菌、ウイルス、および真菌感染症の治療から腫瘍治療に至る。
【０００５】
その際に強く追求されるのは、所定の腫瘍に対して高い特異性を示し、同時に、例えばウイルスによる日和見感染を低減する生理活性物質である。
【０００６】
近年、生理活性物質ソルビシルラクトンＡおよびその誘導体が、イルシニア（Ircinia）属の海洋性海綿から単離されたペニシリウム株から単離された（ドイツ国特許第１０２３８２５７．３号）。それによって、ソルビシルラクトンＡおよびその誘導体が、予想外の顕著な抗腫瘍特性および抗ウイルス特性、ならびに抗炎症特性を有することが見出された。現在まで、この物質およびその誘導体の生成のために使用する方法の規模拡大が今までのところ不可能であった。とはいえ、多量のソルビシルラクトンＡおよびその誘導体を確実に生成することは、例えば、癌や炎症などの疾患の治療における有望な使用に向けて早急に必要とされている。
【非特許文献１】Sarma AS, Daum T, Mueller WEG (1993)『海生海綿からの二次代謝産物（Secondary metabolites from marine sponges.）』、Akademie gemeinnuetziger Wissenschaften zu Erfurt, Ullstein-Mosby Verlag, Berlin
【特許文献１】ドイツ国特許第１０２３８２５７．３号
【非特許文献２】1998, Mech. Ageing Dev. 101:1-19
【非特許文献３】Freshney (1987)、「特定細胞型の培養（Culture of specific cell types.）」、『動物細胞培養（Culture of Animal Cells.）』、『基本技術マニュアル（A Manual of Basic Technique）』，A.R. Liss, New York, S. 257-288; Perovic et al. (1994) Eur. J. Pharmacol. (Mol. Pharmacol. Sec.) 288:27-33
【非特許文献４】Ushijima et al. (1995) Eur. J. Neurosci. 7:1353-9
【非特許文献５】Grynkiewicz et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:3440-50
【非特許文献６】(1985, J. Biol. Chem. 260:3440-50）
【非特許文献７】Sachs (1984) Angewandte Statistik. Springer, Berlin
【非特許文献８】Mueller et al., 1979, Cancer Res. 39:1102-1107
【非特許文献９】Bihari et al., 2002, Croatica Chemica Acta 75:793-804
【非特許文献１０】Batel et al.,1999, Anal. Biochem., 270:195-200
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、天然化合物ソルビシルラクトンＡおよびその誘導体の最適化された生成方法、培地および真菌バイオマスからのソルビシルラクトンＡおよびその誘導体の抽出方法、および多量のソルビシルラクトンＡおよびその誘導体を精製する方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、この目的は、最初に以下の諸ステップを含む方法の提供によって解決される：
ａ）適切な増殖培地中、２０〜２５℃、２〜５％の塩濃度でペニシリウム属真菌を緻密表面菌糸体が形成されるまで培養するステップ、
ｂ）２８〜３５℃に温度を上げ、さらに５〜１０日間インキュベーションするステップ、
ｃ）培養液を菌糸体から分離するステップ、および
ｄ）ソルビシルラクトンＡおよびその誘導体を培地から抽出するステップ、および任意に、
ｅ）塩濃度を０．５〜１．５％に減少した新鮮培地を菌糸体の下に敷き、２８〜３５℃で３〜８日間インキュベーションするステップ、
ｆ）ステップｃ）とｄ）を繰り返すステップ、および任意に、
ｇ）ステップｅ）とｆ）を繰り返すステップ、および
ｈ）ソルビシルラクトンＡおよびその誘導体を培地および／または菌糸体から抽出するステップ。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明により、このようにして、特定の条件下で真菌の培養が行われ、収量が増大し同時に生成速度が高められる方法がこれによって示される。従って、ソルビシルラクトンＡおよびその前駆体もしくは誘導体の増殖および生成は、培養条件を変更することによって制御され、かつ、例えば、ＮａＣｌの添加によって開始し刺激される。生成が特に促進される理由は、段階的過程で生成のための最適増殖条件および最適生成条件を、例えば、インキュベーション温度を、例えば、２０〜２５℃から２８〜３５℃に変化させることによって、および塩濃度を２〜５％から０．５〜１．５％に変化させることによって生成を連続的に実施するからである。他のインキュベーション温度では、ソルビシルラクトンＡの生成および／またはその誘導体の生成は皆無であるか、または少ししか見出されなかった。驚くべきことに、本発明の方法によってこのようにして多量のソルビシルラクトンＡおよびその誘導体が確実に提供される。
【００１０】
本発明によって好ましいのは、真菌ペニシリウムクリソゲヌム、特にＫＩＰ３２０１株が生成に使用される方法である。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、多様な基質および基質濃度、例えば、ピルビン酸塩、グルタミン酸塩、プロリン、酢酸塩を介して増殖培地を改変することにより、ソルビシルラクトンＡばかりでなく、ソルビシリンおよびソルビシルラクトンＡの他の生合成前駆体の収量が増大することを特徴とする方法が提示される。
【００１２】
好ましい実施形態によれば、ソルビシルラクトンＡおよびその誘導体の生成をフラットベッド法で行う方法が提示される。ソルビシルラクトンＡおよびその誘導体の生成は、適当な時点で細胞から液相分離することによって、かつ再度、新鮮培地が供給された細胞を生成に向けて刺激することによってさらに促進することができる。適当な時間は、例えば３〜１０日である。
【００１３】
好ましい接種原の型は、真菌が固形物に結合した形態であり、その原料は浮遊可能な固形物、例えば、粒子またはポリスチレンフォーム球上に用意されて接種される。
【００１４】
よりさらに好ましいのは、表面真菌菌糸体の沈殿が回避される方法である。これは、表面菌糸体を安定化させるキャリアデバイスを培養容器に組み込むことによって実現できる。その際に、キャリアデバイスの適当な形は、例えば、メッシュによって代表される。
【００１５】
好ましい方法は、生成したソルビシルラクトンＡおよびその誘導体を直ちに培地から固体交換体に結合できることを特徴とする。次いで、この結合形態からの精製を追加ステップにおいて行う。その際には、交換体からの溶出は、メタノール、エタノール、酢酸エチル、ヘプタン、またはアセトニトリルなどの有機溶媒によって行うことができる。この方式で、交換体から高度に濃縮された形でソルビシルラクトンＡおよびその誘導体を得ることができる。 
【００１６】
別の好ましい方法は、培地から分離した真菌菌糸体から生成したソルビシルラクトンＡおよびその誘導体を、有機溶媒の添加によって抽出することを特徴とする。その際には、酢酸エチルを使用するのが好ましい。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、粗抽出液をさらに抽出することを特徴とする方法が提示される。その際には、粗抽出液を酸性化することができ、続いてソルビシルラクトンＡおよびその誘導体を有機溶媒によって抽出することができる。その際には、酢酸エチルを使用することも好ましい。
【００１８】
高速遠心分離分配クロマトグラフィー（ＦＣＰＣ）によって、最適化された抽出液を精製するのがさらに有利である。さらに、ゲルクロマトグラフィー、例えば、セファデックスＬＨ−２０によって最適化された抽出液の精製が好ましい。その際には、ソルビシルラクトンＡおよびその誘導体を溶出するために異なる有機溶媒を使用することができる。
【００１９】
本発明の好ましい態様は、特徴としてソルビシルラクトンＡをソルビシルラクトン−Ａ−メチルエステルに誘導することを含む方法である。
【００２０】
ソルビシルラクトンＡでインキュベートした神経細胞は、Ｌ−グルタミン酸およびセロトニン（５−ＨＴ）を添加すると、細胞内カルシウム濃度の甚だしい減少が示されることが判明した。Ｌ−グルタミン酸およびセロトニンは、一連の神経変性疾患において神経伝達物質として病原学的に関与している。これらの特性のために、ソルビシルラクトンＡまたはその誘導体は、神経変性疾患およびそれに関連する複合症状の治療に使用できるはずである。
【００２１】
さらに、ソルビシルラクトンＡの遺伝毒性をＬ５１７８Ｙ−マウスリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７２２）で試験した。１、３、および１０μｇ／ｍＬのソルビシルラクトンＡと共にインキュベートした細胞では、ＤＮＡ鎖の切断が誘発されないことが判明した。それに反して、３０μｇ／ｍｌの濃度のソルビシルラクトンＡでのインキュベーション２４時間後にはＤＮＡ鎖切断部分の有意な増加が見られた。この特性のために、ソルビシルラクトンＡまたはその誘導体を白血病の治療に使用することが有利である。
【００２２】
さらに、ソルビシルラクトンＡは、１０および３０μｇ／ｍＬの濃度でのインキュベーション４時間後、Ｌ５１７８Ｙ細胞でアポトーシスを誘発する。これらの特性のために、ソルビシルラクトンＡまたはその誘導体を白血病の治療に使用するのが好ましい。
【００２３】
さらに、ソルビシルラクトンＡまたはその誘導体をウイルス感染症の治療に使用することができる。これに関する詳細は、ドイツ国特許第１０２３８２５７．３号の例に記載されている。
【００２４】
本発明の別の態様は、医薬組成物を生成する方法であって、ソルビシルラクトンＡまたはその誘導体を適当な医薬的に受容可能な補助化合物および添加物と共に製剤化することができる方法に関する。これに関して、好ましい医薬組成物では、ソルビシルラクトンＡまたはその誘導体は、治療中に０．３〜３０μｇ／ｍｌの濃度範囲が生体内に存在するような量で存在する。
【００２５】
本発明の別の態様は、ペニシリウム属クリソゲヌムＫＩＰ３２０１真菌株に関する。これは、２００４年１月１４日に、微生物および細胞培養物のドイツ国コレクション（the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）ＧｍｂＨに第ＤＳＭ１６１３７号で寄託された。
【００２６】
本発明に関連して、「誘導体」は、一般式１に由来し、例えば、Ｒ１〜Ｒ４およびＸもしくはＹに定義する異なる遊離基によって置換した化合物、およびこれらの化合物数種の混合物であり、この誘導体は、例えば、治療しようとする疾病および／または患者に関して、診断データ、または治療成果もしくは進行それぞれに関するデータを基礎に調製した「個別化」医療に加工することができる。誘導体はまた、ソルビシルラクトンＡのクラスに属する化合物であって、（見本として）ここに述べたものとは異なる（例えば）海洋生物から単離することができ化合物を意味する。
【化１】
2007519414.tif 000003
【００２７】
さて、以下に、添付図を参照して以下の実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例１】
【００２８】
ソルビシルラクトンＡの最適化生成のために塩含有培地で真菌ペニシリウムクリソゲヌムを培養
【００２９】
ソルビシルラクトンＡの生成を最適化するために、培養を行う塩含有量および温度がこの生物にとって異常に高いという点で、特に通常使用されているものとは異なる培地および培養条件を確立した。
【００３０】
標準的な条件下で作成されている胞子懸濁液が培養接種原として使用されており、最初にこの胞子を１．５％バクトアガーを含むWickerham培地と共に寒天プレート上にて室温で１４日間増殖させた。胞子を海水（３４‰）とグリセロールの溶液（２：１）に懸濁し、標準力価液に調整し、分割し、適当な分量で凍結し、−２０℃で保管した。大量培地を大規模に調製するための接種材料を調製するに当たり、粒子をオートクレーブ処理して滅菌し、培地を補充し、真菌胞子を接種した。１４日間２０℃でインキュベーション後、粒子を乾燥し、使用時まで室温で保管する。培地にこれらの胞子調製物を接種する。
【００３１】
生産には、以下の組成の改変型Wickerham培地：３ｇの酵母抽出液、６ｇの麦芽抽出液、５ｇのペプトン、１０ｇのグルコース、ＮａＣｌ２５ｇ／蒸留水１０００ｍＬを使用する。ｐＨは５．５に調整する。
【００３２】
充填高が４ｃｍになるまで培地を培養容器に加え、オートクレーブ（１２１℃で２０分）にかけ、冷却後、胞子懸濁液を接種し、緻密な表面菌糸体が形成されるまで２２℃で７日間インキュベートする。次いで、温度を３１℃に上げ、さらに７日間インキュベーションを続ける。次いで、生成したソルビシルラクトン（１）の主画分を含む培養液を菌糸体から分離し、さらに加工してその物質を回収する。菌糸体の下にわずかに変更した組成の同量の新鮮培地を再度敷く。上記の培地を使用するが、１Ｌにつき５ｇのＮａＣｌ、１５ｇのグルコースを含み、麦芽抽出液は含まない。添加の前には、培地を加温してインキュベーション温度にし、菌糸体を５日間インキュベートする。次いで、同じ手順を繰り返す。分離法にしたがってソルビシルラクトンＡ（１）を培養ブロスおよび菌糸体から抽出する。
【実施例２】
【００３３】
ソルビシルラクトンＡを真菌バイオマスから抽出
真菌菌糸体を目の細かいメッシュによって培地から分離し、バイオマス１ｇにつき酢酸エチル３ｍＬを補充し抽出する。抽出液をろ過し、回転エバポレーター中で濃縮する。さらに精製するまで、濃縮物をそれぞれ５℃または−２０℃で保管する。
【実施例３】
【００３４】
ソルビシルラクトンＡを培地から抽出
菌糸体から分離した培地に、１Ｌにつき１００ｇの交換樹脂、例えば、ＸＡＤ−１６を軽く攪拌しながら加える。培地から物質を搭載させた後、ＸＡＤ−１６をろ過し、メタノール／水（１：１）およびメタノールで抽出する。抽出液を回転エバポレーターで濃縮し、さらに精製するまでメタノール不含濃縮物をそれぞれ５℃または−２０℃で保管する。
【実施例４】
【００３５】
ＨＰＬＣ−ＵＶによるソルビシルラクトンＡの含有量の定量
含有量の定量は、０．４ｍＬ／分の流量でWaters製symmetry-C-18逆相カラムにより、ダイオードアレイ検出器を備える分析用ＨＰＬＣで行う（Ａ＝水＋０．０５％ＴＦＡ、およびＢ＝アセトニトリル＋０．０５％ＴＦＡとして、２０分で濃度勾配：８０％Ａ：２０％Ｂ〜２０％Ａ：８０％Ｂ）。ピーク領域の統合は３７０ｎｍの波長によって行う。ジヒドロソルビシルラクトンＡ（３）の吸収が、この波長では事実上ゼロであり、従って含有量の定量誤差が最小化するからである。粗抽出液の濃度の定量は、それぞれの抽出液をメタノール／水（１：１）混合物で約１５０倍に希釈することによって行われ、異なる精製ステップの抽出液では希釈は約１０倍である。粗抽出液および異なる精製ステップの個々の抽出液のソルビシルラクトンＡ（２）の含有量の定量は、ソルビシルラクトンＡ（２）を様々な濃度で含むメタノール溶液の試料の測定値から得た検量線を用いて行う。
【実施例５】
【００３６】
培地から得られた粗抽出液の精製
ペニシリウムクリソゲヌム真菌培養物の水性粗抽出液は、望ましくない副産物、例えば、メレアグリン（meleagrin）などを分離するために、酢酸エチルで中性下で抽出する。得られた酢酸エチル相は廃棄する。水相は、リン酸（ｐＨ＝２）で酸性化し酢酸エチルで徹底的に抽出する。ソルビシルラクトンＡは、実際、酸性抽出液の酢酸エチル相に定量的に移すことができる。真空濃縮後、得られた抽出液には、既に、その質量の５０％までの量のソルビシルラクトンＡが含まれている。
【実施例６】
【００３７】
高速遠心分離分配クロマトグラフィー（ＦＣＰＣ）による抽出液の更なる精製
抽出液の更なる精製は、追加の液体−液体クロマトグラフィーステップによって行う。その際には、新規な方法である、いわゆる高速遠心分離分配クロマトグラフィー（ＦＣＰＣ）を使用する。この方法では、一般的な液体−液体クロマトグラフィー法、例えば、高速向流クロマトグラフィー（ＨＳＣＣＣ）などと同様に、２相溶媒混合液を使用する。その際には、任意により、上相または下相を静止相として使用することができる。ＨＳＣＣＣとは対照的に、ＦＣＰＣはキャピラリーコイルを使用しないが、数百の分離チャンバを備えたローターを使用する。直接次々と配列したこれらのチャンバでは、抽出液に含まれている物質の分離は移動相と静止相の間で行われる。
【００３８】
分離中、系を急速回転（１２００〜１４００ｒｐｍ）にかける。その際には、一方で、流れの方向に従って所望する相をＦＣＰＣのローターに保持し、他方で両相の分離を遠心力によって促進する。これにより高速流が使用可能になり、それによって短時間で多量の物質の処理を行うことができる。所望する物質の２相間における分離係数Ｋは、０．７〜４．５の範囲であるべきである。Ｋが小さいと、この物質は急激溶出され過ぎて、従って全く分離されない。それに反して、Ｋが高いと、多量の抽出液を迅速に精製するには保持時間が長くなりすぎる。
【００３９】
ソルビシルラクトンＡの場合には、毎分６〜７ｍＬの流量でのヘプタン／酢酸エチル／メタノール／水（４２％／５８％／４２％／５８％）の溶媒混合液の使用、回転数１２００ｒｐｍ、および静止相として上相の使用が特に有利である。さらに、溶媒混合液１Ｌにつき濃リン酸１ｍｌを加える。２００ｍＬ−ＦＣＰＣローターを使用すると、一回につき抽出液１．５ｇまでの精製が可能である。これらの設定により、調製および洗浄時間を含め、分離一回につき９０分しか必要とされない。ソルビシルラクトン含有画分を有機溶媒から分離し、残りの水性酸性相を徹底的に酢酸エチルで抽出する。真空濃縮後、ソルビシルラクトンＡの質量−含有量が７０％までの抽出液を得ることができる。
【実施例７】
【００４０】
ゲルクロマトグラフィーによる純粋ソルビシルラクトンＡの回収
純粋ソルビシルラクトンＡ（２）の回収における最も困難なステップは、構造的に非常に類似するが、活性が５分の１の化合物ジヒドロソルビシルラクトンＡ（３）の分離である。
【化２】
2007519414.tif 000004
【化３】
2007519414.tif 000005
図１．ソルビシルラクトンＡ（２）およびジヒドロソルビシルラクトンＡ（３）の構造
【００４１】
両化合物は、ソルビル（sorbyl）側鎖のＣ−２'およびＣ−３'の飽和の等級が異なるにすぎないために、化合物混合物の分離中に利用することができる質量や極性などの分子物理的特性はほぼ同じである。とはいえ、溶出剤としてメタノールと共にセファデックス−ＬＨ−２０物質でのゲルクロマトグラフィーによって分離することができる。しかし、分子類似性が高いために、非常に長いカラム系（６ｍ以上）を使用する必要がある。ＭＰＬＣ系としてこのカラム系には、ポンプによって溶媒を供給する。溶出剤の流速は毎分約１０ｍＬである。その際には、両ラクトン２および３は互いに十分に分離し、３が速く溶出する。分離過程一回につき、アプライした被夾雑ソルビシルラクトンＡ（２）の約７０％を清浄画分として得ることができる。３が夾雑している混合画分は、セファデックスＬＨ−２０でのクロマトグラフィーを再スタートすることによって、問題なくさらに精製することができる。
【実施例８】
【００４２】
ＨＰＬＣ−ＵＶによる抽出液中のソルビシルラクトンＡ（２）およびジヒドロソルビシルラクトンＡ（３）の百分率比の定量
粗抽出液中のソルビシルラクトンＡ（２）およびジヒドロソルビシルラクトンＡ（３）の百分率比の定量には、最初に、抽出液試料をメタノール／水混合物で希釈する。ダイオードアレイ検出器を備える分析用ＨＰＬＣで均一溶媒条件下（水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝７０／３０／０．０５％）、Waters製symmetry-C-18逆相カラムにより流量０．４ｍＬ／ｍｉｎで試料を検査する。これにより、化合物のピーク領域の統合に適した分離がなされる。その際には、２２０ｎｍの波長における両ラクトン（２、３）の吸収はほぼ同一なので、２２０ｎｍの波長でピーク領域の統合を実施する。この方法は、ゲルクロマトグラフィーからの画分の純度の検査にも使用することができる。
【実施例９】
【００４３】
ＵＶ吸収実験によるゲルクロマトグラフィーからの画分の純度の定量
最終精製ステップからの画分の分析を促進するために、それを探究する方法はクロマトグラフィー法なしに行われるはずである。その際、それぞれの画分のＵＶ吸収を３００ｎｍおよび４３０ｎｍで記録し、純度の検査には、測定した両値の商を使用できることが判明した。望ましくない夾雑ジヒドロソルビシルラクトンＡ（３）は、ソルビシルラクトンＡ（２）より先に溶出し、ソルビシルラクトンＡ（２）と同様に、３００ｎｍで強く吸収されるが、４３０ｎｍの波長ではそれほど吸収されなかった。測定した両値の商が一定値に達すると、その結果、画分は純粋ソルビシルラクトンＡ（２）しか含まないことが想定される。これらの結果は、実施例８に記載した条件下での対照測定でも確認することができた。このようにして、全分離画分の分析に要する時間を、ＨＰＬＣ分析での数時間から、ほんの数分に減少させることができる。
【実施例１０】
【００４４】
ソルビシルラクトンＡ（２）をそのメチルエステル４へ誘導体化
ソルビシルラクトンＡ（２）をそのメチルエステル４へ誘導体化することは興味深かった。一方で、化合物は、例えば、血清中の濃度を定量するための内部標準として適切であり、他方で構造−活性相関の研究に適切であったからである。３０ｍｇのソルビシルラクトンＡ（２）を５ｍｌのメタノールに溶解し、２００μＬの濃硫酸を補った。室温で６時間攪拌した後、１００ｍＬの水を加え、混合物を１００ｍｌの酢酸エチルで二度抽出した。有機相を真空蒸発後、残留物を調製用ＨＰＬＣによって精製した。このようにして１８．６ｍｇの黄色非結晶物質が得られた。
【化４】
2007519414.tif 000006
【００４５】
ソルビシルラクトン−Ａ−メチルエステル（４）の物理的および分光学的データ
化合物は、非結晶黄色固体として存在する。
融解温度１６６〜１７０℃（ＴＨＦ）。
[α]D20＝−５５８°（ｃ＝０．２、メタノール中）。
ＣＤ（ｃ＝０．２、メタノール中）：Δε２０８  ＋１１．１、Δε２３１  −１２．６、Δε２７８  ＋１２．５、Δε３７０  −１３．０。
ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３３３３（ｂｒ．），２９３１（ｗ），１７８３（ｍ），１７３０（ｍ），１６８１（ｓ），１６１２（ｓ），１５５２（ｓ），１４４２（ｍ），１４１５（ｍ），１３８４（ｍ），１３５０（ｓ），１３１０（ｓ），１１９８（ｍ），１１７６（ｍ），１０６５（ｍ）ｃｍ−１。
ＭＳ（ＥＳＩ、陽性）：ｍ／ｚ４３２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００４６】
ＴＨＦ−ｄ８中のソルビシルラクトン−Ａ−メチルエステル（１）のＮＭＲデータ
【表１】
2007519414.tif 000007
【実施例１１】
【００４７】
ソルビシルラクトンＡの生物活性の検出
Ａ）測定
物質：Perovicら（1998, Mech. Ageing Dev. 101:1-19）に記載されているものと同じ物質を使用した。Molecular Probes（Leiden、オランダ国）からＦｕｒａ−２−アセトキシメチルエステル（Ｆｕｒａ−２−ＡＭ）；Sigma-Aldrich（Taufkirchen、ドイツ国）から４．５ｇ／Ｌグルコース含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ／ＨＧ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）、およびセロトニン（５−ＨＴ）；ならびにRoche Diagnostics（Mannheim、ドイツ国）から抗体、マウス抗神経フィラメント（６８ｋＤａ）およびマウス抗グリア繊維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）を入手した。バッチ：２２０８／２ａのソルビシルラクトンＡを使用した。
【００４８】
一次ニューロン：修正した手順に従い、１７〜１８日齢ラット胎仔脳から表層細胞培養を生成した［Freshney (1987)、「特定細胞型の培養（Culture of specific cell types.）」、『動物細胞培養（Culture of Animal Cells.）』、『基本技術マニュアル（A Manual of Basic Technique）』，A.R. Liss, New York, S. 257-288; Perovic et al. (1994) Eur. J. Pharmacol. (Mol. Pharmacol. Sec.) 288:27-33］。単離後、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋不含のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に大脳半球を入れ、続いて０．０２５％（ｗ／ｖ）トリプシンを使用（１０分、３７℃）し、神経細胞をＨＢＳＳ中で分離させた。蛋白質分解反応を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で停止させた。単一細胞懸濁液を遠心分離し、得られたペレットを４．５ｇ／Ｌグルコース含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ／ＨＧ）（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ｍＵ／Ｌインスリン、および１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ含有）に取り入れた。ポリ−Ｌ−リジン（５μｇ／ｍＬ、３００μｌ／ｃｍ２）を塗布したチャンバに細胞密度２．０×１０５細胞／ｃｍ２で細胞を播種した。２日後、ＤＭＥＭ／ＨＧ／１０％−ＦＣＳ培地を除去し、ＤＭＥＭ／ＨＧ／無血清培地と交換した。単離から２週間後、ニューロンのマーカーとして抗神経フィラメント（６８ｋＤａ）で、かつグリア細胞のマーカーとして抗ＧＦＡＰで免疫染色を行った。培養物には、ニューロンが８０％を超えて含まれており、残りの２０％はＧＦＡＰ陽性細胞、主としてアストロサイト（Ushijima et al. (1995) Eur. J. Neurosci. 7:1353-9）であった。ニューロンを空気９５％およびＣＯ２５％の雰囲気の中に３７℃で保持した。
【００４９】
ニューロンにＦｕｒａ−２−ＡＭを搭載：細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）を蛍光測定によって定量した。３４０および３８０ｎｍでのＣａ２＋の指標染料Ｆｕｒａ−２−ＡＭの吸収率比（Grynkiewicz et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:3440-50）を決定した。ニューロンには、ＤＭＥＭ／ＨＧ／無血清培地（１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを補充）中、３７℃で６０分間、６μＭ  Ｆｕｒａ−２−ＡＭを搭載した。インキュベーション後、細胞を培地で２回洗浄し、３７℃で４５分間さらにインキュベートした。このインキュベーション時間は、ニューロン（不活性Ｆｕｒａ−２−ＡＭ）に搭載し、アセトキシメチルエステル（活性Ｆｕｒａ−２）を加水分解するのに十分である。
【００５０】
カルシウム検量線：Grynkiewicz ら(1985, J. Biol. Chem. 260:3440-50）の方法に従ってカルシウム検量線を生成した。３４０および３８０ｎｍで各緩衝液の蛍光写真を得た。両蛍光スペクトル（３４０／３８０ｎｍ）から商を算出し、検量線を引いた。商（３４０／３８０ｎｍ［比の値］）１．０は２２８ｎＭ［Ｃａ２＋］ｉに相当する。
【００５１】
ニューロンのカルシウム濃度の変化：全実験設定では、最初に、細胞にＦｕｒａ−２−ＡＭを搭載し、続いて異なる物質（ロッケ液中：１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、５．６ｍＭ  ＫＣｌ、３．６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５．６ｍＭ  グルコース、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、ＣａＣｌ２不含）で刺激した。ソルビシルラクトンＡを１００％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、−２０℃で保存した。第１の設定では、ニューロンを０．１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ（対照）で５分間刺激し、１０分後、２００μＭ  Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）、２００μＭ  セロトニン（５−ＨＴ）、および２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を細胞に加えた。第２の設定では、事前に（１０μｇ／ｍＬ  ソルビシルラクトンＡで５分）インキュベートしたニューロンのカルシウム濃度に及ぼすＬ−Ｇｌｕ、５−ＨＴ、および２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２の作用を試験した。全実験では、［Ｃａ２＋］ｉ濃度を少なくとも２０〜２５分間測定した。
【００５２】
［Ｃａ２＋］ｉの定量では、４チャンバ系（Lab-Tek（登録商標）、Chamber Slide（商標）系、Nunc、Wiesbaden、ドイツ国）のポリ−Ｌ−リジンをコートしたホウケイ酸対物スライド上で細胞を培養した。蛍光測定は、アポクロマート反射光および蛍光対物ＵＡｐｏ４０Ｘ／３４０を備えた倒立ステージ顕微鏡（Olympus IX70）で実施した。１００Ｗのキセノンランプの前でコンピュータ制御の狭帯域干渉フィルタを用いて細胞に波長３４０および３８０ｎｍを交互に光照射した。さらに、３８０ｎｍで０．２５−ＮＤフィルタを使用した。蛍光発光を５１０ｎｍでＣＣＤカメラ（モデルＣ２４００−８７、Hamamatsu、Herrsching、ドイツ国）を用いて記録した。写真は、画像化システムArgus 50、Hamamatsuによりコンピュータを利用して、８ビット配列、２５６×２５６ピクセルとしてデジタル化した。３４０／３８０ｎｍの蛍光の商を、画像中の対の値を割ることによって算定した。
【００５３】
統計学：結果は、対応のある「スチューデントｔ検定」（Sachs (1984) Angewandte Statistik. Springer, Berlin）によって解析した。
【００５４】
Ｂ）結果
神経細胞の［Ｃａ２＋］ｉ濃度に対するソルビシルラクトンＡの作用：１０μｇ／ｍＬ  ソルビシルラクトンＡを加えても、神経細胞の［Ｃａ２＋］ｉに対してはほとんど効果がないことが示された。
【００５５】
ソルビシルラクトンＡの存在下または非存在下、神経細胞における［Ｃａ２＋］ｉ濃度に対するＬ−グルタミン酸の効果：２００μＭ  Ｌ−グルタミン酸および２．５ｍＭ  Ｃａ２＋を用いて細胞をインキュベーション（図１Ａ）したところ、１０分後に［Ｃａ２＋］ｉが強烈に上昇した。測定の終点で３４０ｎｍ／３８０ｎｍ値は、対照を１００％とすると、１．７１５±０．０８１（３０７．１％）も増加した。ニューロンを予め１０μｇ／ｍＬ  ソルビシルラクトンＡでインキュベーションしたところ、２００μＭ  Ｌ−Ｇｌｕおよび２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加した後の［Ｃａ２＋］ｉ濃度は減少した。［Ｃａ２＋］ｉ濃度のこの減少は有意であり、１０μｇ／ｍＬでは４６．７％であった（ｐ＜０．００１、図１Ａ）。
【００５６】
ソルビシルラクトンＡの存在下または非存在下、神経細胞における［Ｃａ２＋］ｉ濃度に対するセロトニンの効果：２００μＭ  セロトニン（５−ＨＴ）および２．５ｍＭ  Ｃａ２＋を細胞に加えると（図１Ｂ）、１０分後に［Ｃａ２＋］ｉが強烈に上昇した。３４０ｎｍ／３８０ｎｍ値は、対照を１００％とすると、０．９７１±０．１１２（２１９．９％）も増加した。  １０μｇ／ｍＬ  ソルビシルラクトンＡと共に事前にインキュベーションし、続いて２００μＭの５−ＨＴと共にインキュベーションしたところ、ニューロン中の遊離カルシウム濃度は有意に減少し、対照と比較して値は７７．６％低減した（図１Ｂ）。
【００５７】
Ｃ）結論
ソルビシルラクトンＡでインキュベートした細胞は、Ｌ−グルタミン酸およびセロトニン（５−ＨＴ）の添加後、細胞内カルシウム濃度が甚だしく減少することが判明した。神経伝達物質としてＬ−グルタミン酸およびセロトニンは、一連の神経変性疾患に病原学的に関与している。これらの特徴から、ソルビシルラクトンＡは、上に示したような疾患およびそれに関連する複合症状の治療に使用することができる。
【実施例１２】
【００５８】
ソルビシルラクトンＡの遺伝毒性の検出：「コメットアッセイ」
物質：Biozym（Hamburg、ドイツ国）から「通常溶融アガロース」（ＮＭＡ、カタログ番号８４００４１）および「低融点アガロース」（ＬＭＡ、カタログ番号８７００８１）；Ｆｌｕｋａ（Buchs SG、スイス国）からTriton x-100；Sigma-Aldrich（Taufkirchen、ドイツ国）からＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＳＯ、およびＥＤＴＡ；Roth（Karlsruhe、ドイツ国）からＮａＣｌおよびＴｒｉｓ；ならびにGibco（Karlsruhe、ドイツ国）からウシ胎仔血清（ＦＣＳ）をそれぞれ入手した。バッチ：２２０８／２ａのソルビシルラクトンＡを使用した。
【００５９】
細胞：ソルビシルラクトンＡの遺伝毒性をＬ５１７８Ｙマウスリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７２２）で試験した。（Mueller et al., 1979, Cancer Res. 39:1102-1107）に記載されている通り、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充し、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含むＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を培養した。接種原の濃度としては１０４個細胞／ｍＬを選択した。細胞を１、３、１０μｇ／ｍＬのソルビシルラクトンＡと共に４時間および２４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を「コメットアッセイ」で検査した。
【００６０】
アルカリ性での電気泳動：対物スライド（Superfrost）をアセトンで浄化した。１．０％「通常溶融アガロース」（ＮＭＡ）を１×ＰＢＳ中で加熱し、続いて約６００μｌのアガロースを対物スライド上に塗布した。対物スライドを５０℃で短時間（〜５分）乾燥し、終夜室温で保管した。次いで、０．７％「低融点アガロース」（ＬＭＡ）を蒸留水で調製した。対物スライドの第２層は２００μｌ  ＬＭＡから構成した。対物スライドを４℃で１０分間インキュベートした。第３層は、１０μｌの細胞懸濁液（７×１０４個細胞／ｍＬ）に６０μｌのＬＭＡを加えたものから構成した。ソルビシルラクトンＡと共にインキュベーション後、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、４℃、８００×ｇで５分間遠心分離した。細胞数を７×１０４個細胞／ｍＬに希釈した。塗布後、対物スライドを４℃で１０分間インキュベートした。細胞を溶解する前に、最後のＬＭＡ層（〜１００μｌ）を塗布した。細胞の溶解は、暗所で、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯと１％（ｖ／ｖ）Triton x-100を含む溶解液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝１０）中、４℃で１時間インキュベーションすることによって行った。対物スライドは、溶解液から電気泳動チャンバ中に直接移送し、電気泳動緩衝液（３０ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ１３．８）中で２０分間インキュベートした。電気泳動は、０．７５Ｖ／ｃｍ（〜３００ｍＡ）で一定に設定し、氷上で冷却しながら３０分間実施した。中和には、室温で対物スライドを５分間中和用緩衝液（４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で洗浄した後、５分間脱水した。９５％エタノールを用いて暗所で風乾した。対物スライドを６０μｌの臭化エチジウム溶液（２０μｇ／ｍＬ  蒸留水）で染色し撮影し解析した。値は、エクステントテールモーメント（Bihari et al., 2002, Croatica Chemica Acta 75:793-804；Mueller et al., 1979, Cancer Res. 39:1102-1107）として得られた。数が多ければ、細胞ＤＮＡの高度崩壊を指し示している。正常細胞では、約０の値が見受けられる。
【００６１】
結果：１、３、１０μｇ／ｍＬのソルビシルラクトンＡと共にＬ５１７８Ｙ細胞をインキュベーションすると、４時間後、エクステントテールモーメントは有意に変化しなかった（図２Ａ）。これらの濃度では、ソルビシルラクトンＡはＤＮＡ鎖の切断を誘発しない。ソルビシルラクトンＡと２４時間インキュベーションした後も、Ｌ５１７８Ｙ細胞ではエクステントテールモーメントの有意な変化は検出されなかった（図２Ｂ）。
【００６２】
結論：ソルビシルラクトンＡを１、３、および１０μｇ／ｍＬ添加した後、ソルビシルラクトンＡと共にインキュベートした細胞は、エクステントテールモーメントの有意な上昇を示さないことが判明した。
【実施例１３】
【００６３】
ソルビシルラクトンＡの遺伝毒性の検出：「高速マイクロアッセイ」
物質：Molecular Probes（Leiden、オランダ国）からPicoGreen；Sigma-Aldrich（Taufkirchen、ドイツ国）からＲＰＭＩ１６４０培地；Gibco（Karlsruhe、ドイツ国）からウシ胎仔血清（ＦＫＳ）、およびNunc（Wiesbaden、ドイツ国）から黒色マイクロタイタープレート（９６ウェルプレート）をそれぞれ入手した。バッチ：２２０８／２ａのソルビシルラクトンＡを使用した。
【００６４】
細胞：ソルビシルラクトンＡの遺伝毒性をＬ５１７８Ｙマウスリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７２２）で試験した。（Mueller et al., 1979, Cancer Res. 39:1102-1107）に記載されている通り、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を培養した。１０４個細胞／ｍＬを接種原濃度として選択した。１、３、１０、および３０μｇ／ｍｌのソルビシルラクトンＡ（１）と共に細胞を４時間および２４時間インキュベートした。インキュベーション後、「高速マイクロアッセイ」で細胞を検査した。
【００６５】
「高速マイクロアッセイ」：方法は、変法（Batel et al.,1999, Anal. Biochem., 270:195-200）に従って実施した。細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄した。遠心分離後、ペレットを１×ＰＢＳ中に取り入れて、１０４個細胞／ｍＬに希釈した。各２５μｌの細胞懸濁液（ウェル当たり約２．５×１０４個細胞）を黒色マイクロタイタープレート（９６ウェルプレート、Nunc、Wiesbaden）に予めピペットで取り入れた。２５μｌの１×ＰＢＳは対照である。次いで、PicoGreen（溶解液１ｍｌにつき２０μｌの濃度のPicoGreen）を含む溶解液（７Ｍ  尿素、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝１０．０）２５μｌをピペットで取ってマイクロタイタープレートに入れた。続いて、細胞を暗所にて室温で４０分間溶解した。インキュベーション後、新たに調製したアルカリ溶液を加えることによってＤＮＡの変性（巻き戻し）が生じる。これは、２０ｍＭのＥＤＴＡを２０ｍＬ、および２０ｍＭ  ＥＤＴＡ／１００ｍＭ  ＮａＯＨの３２ｍLをｐＨ値１２．３に調整して製造する。測定は、直ちにフルオロスキャンにて励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍで３〜５分毎に合計２０分行われた。結果は、「鎖切断因子」（ＳＳＦ）として示され、２０分の変性時間（巻き戻し時間）の後に以下の方程式によって算出された：ＳＳＦ＝ｌｏｇ（％ｄｓＤＮＡ試料／％ｄｓＤＮＡ対照）。
【００６６】
結果：Ｌ５１７８Ｙ細胞のＳＳＦ値に対するソルビシルラクトンＡの作用：１、３、１０、および３０μｇ／ｍｌのソルビシルラクトンＡを加えても、インキュベーション４時間後、Ｌ５１７８Ｙ細胞のＳＳＦ値に対してそれほど効果がないことが示された（図３Ａ）。
【００６７】
３〜３０μｇ／ｍＬ（ｐ＜０．００１）のソルビシルラクトンＡを加えると、２４時間後にＳＳＦ値の有意な上昇（ＤＮＡ鎖切断部分）が観察された（図３Ｂ）。１〜１０μｇ／ｍｌのソルビシルラクトンＡでＬ５１７８Ｙ細胞をインキュベーションすると、有意ではないが軽微なＳＳＦ値の上昇が示された。
【００６８】
結論：Ｌ５１７８Ｙ細胞中のソルビシルラクトンＡによって、濃度３０μｇ／ｍＬでのインキュベーションの２４時間後にＤＮＡ鎖の切断が誘発された。これらの特徴から、ソルビシルラクトンＡを白血病の治療に使用することができる。
【実施例１４】
【００６９】
ソルビシルラクトンＡによって誘発されたアポトーシスの検出（細胞死検出ＥＬＩＳＡ  ｐｌｕｓ）
物質：Sigma-Aldrich（Taufkirchen、ドイツ国）からＨｅｐｅｓで緩衝させたＲＰＭＩ１６４０培地；Gibco（Karlsruhe、ドイツ国）からウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、およびＲｏｃｈｅ（Mannheim、ドイツ国、カタログ番号１７７４４２５）から細胞死検出ＥＬＩＳＡ  ｐｌｕｓをそれぞれ入手した。バッチ：２２０８／２ａのソルビシルラクトンＡを使用した。
【００７０】
細胞のインキュベーションおよび調製：Ｌ５１７８Ｙマウスリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７２２））をカウントし、細胞数１０４個細胞／ｍＬに調整した。ソルビシルラクトン−Ａ保存液およびジヒドロソルビシルラクトン−Ａ保存液（１０ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ）を培地（１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ／Ｈｅｐｅｓ）で希釈して濃度６０、２０、および６μｇ／ｍＬにした。９６ウェル培養プレートに、１００μｌの細胞懸濁液（〜１０３個の細胞）を別々のジヒドロソルビシルラクトン−Ａ溶液およびソルビシルラクトン−Ａ溶液各１００μｌにピペットで入れた。ジヒドロソルビシルラクトンおよびソルビシルラクトンＡ不含ＲＰＭＩ１６４０培地を負の対照として使用した。終濃度は、３０、１０、および３μｇ／ｍＬ  ソルビシルラクトンＡおよびジヒドロソルビシルラクトンＡであった。各試料４並列設定を分析した。細胞を３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、培養プレートを室温にて２００×ｇ（〜１２００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離した。上清を慎重にピペットで取り、細胞はそれぞれ２００μｌの溶解緩衝液（Ｒｏｃｈｅ−Ｋｉｔ）で覆った。次いで、細胞を室温で３０分間溶解した。溶解後、培養プレートを再度、室温にて２００×ｇ（〜１２００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離した。
【００７１】
ＥＬＩＳＡ：Ｒｏｃｈｅ−Ｋｉｔのストレプトアビジン−ＥＬＩＳＡ−プレートから各２つの８ストリップウェルを使用した。細胞溶解物（上記参照）の上清２０μｌを各ウェルに加えた。その際に、３０または１０μｇ／ｍｌのソルビシルラクトンＡおよびジヒドロソルビシルラクトンＡを含む試料は４つの定量が組みとなる態様で搭載し、他は全て２つの定量が組みとなる態様で搭載した。これらの試料の他に、正の対照（ＤＮＡ−ヒストン−複合体）を加えた。次いで、８０μｌの免疫試薬を各ウェルに搭載した。この溶液は、インキュベーション緩衝液、抗ヒストン−ビオチン、および抗ＤＮＡ−ペルオキシダーゼから構成した。インキュベーション緩衝液はブランク値として使用した。ＥＬＩＳＡ−プレートを室温で２時間、振盪インキュベータ中でインキュベートした。次いで、上清を丁寧に除去し、ウェルをそれぞれ２５０μｌのインキュベーション緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、１００μｌのＡＢＴＳ−溶液を各「ウェル」に加えた。続いて、細胞を暗所にて室温で３０分間インキュベートした。測定は、４０５ｎｍの発光波長でマルチスキャンにて行った。
【００７２】
結果：４時間のインキュベーション後、３μｇ／ｍｌのソルビシルラクトンＡを細胞（表２）に添加してもアポトーシス細胞の増大はもたらされなかった。値９１．２％は、負の対照（＝１００％）の範囲である（表２）。
【００７３】
【表２】
2007519414.tif 000008
【００７４】
【表３】
2007519414.tif 000009
【００７５】
３、１０、および３０μｇ／ｍｌのジヒドロソルビシルラクトンＡを加えても、インキュベーション４時間後のＬ５１７８Ｙ細胞においてアポトーシスは誘発されなかった（表３）。値は６２〜６７％に減少し、対照領域の下であった。
【００７６】
結論：Ｌ５１７８Ｙ細胞中のソルビシルラクトンＡは、インキュベーション４時間後、１０および３０μｇ／ｍＬの濃度でアポトーシスを誘発する。これらの特徴から、ソルビシルラクトンＡを白血病の治療に使用することができる。選択した実験条件下で、ジヒドロソルビシルラクトンＡは、Ｌ５１７８Ｙ細胞でアポトーシスを誘発しなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】神経細胞の細胞内カルシウム濃度に及ぼすソルビシルラクトンＡの効果を示す図である。
【図１Ａ】２００μＭ  Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）および２．５ｍＭ  Ｃａ２＋によるニューロンの処理（●）を示す図である。他方、ニューロンを１０μｇ／ｍＬ  ソルビシルラクトンＡで処理（○）して５分予備インキュベートし、その後に２００μＭ  Ｌ−Ｇｌｕおよび２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を加えた（１０分の時点）。その動力学的変化を約２０分間継続して測定した。平均値（ｎ＝１９）および標準偏差（±ＳＥ）をそれぞれ算定した。
【図１Ｂ】２００μＭ  セロトニン（５−ＨＴ）および２．５ｍＭ  Ｃａ２＋でニューロンの処理（●）を示す図である。他方、ニューロンを１０μｇ／ｍＬ  ソルビシルラクトンＡで処理（○）して５分予備インキュベートし、その後に２００μＭ  ５−ＨＴおよび２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を加えた（１０分の時点）。その動力学的変化を約２０分間継続して測定した。平均値（ｎ＝２１）および標準偏差（±ＳＥ）をそれぞれ算定した。
【図２】１、３、１０μｇ／ｍＬのソルビシルラクトンＡと共にＬ５１７８Ｙ−マウスリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７２２）をインキュベーションした後の「コメットアッセイ」の結果を示す図である。
【図２Ａ】インキュベーション４時間後の結果を示す図である。
【図２Ｂ】インキュベーション２４時間後の結果を示す図である。平均値（Ａ：ｎ＝２５、Ｂ：ｎ＝２９）および標準偏差（±ＳＤ）をそれぞれ算定した。
【図３】１、３、１０、３０μｇ／ｍＬのソルビシルラクトンＡと共にＬ５１７８Ｙ−マウスリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７２２）をインキュベーションした後の「高速マイクロアッセイ」の結果を示す図である。
【図３Ａ】はインキュベーション４時間後の結果を示す図である。
【図３Ｂ】インキュベーション２４時間後の結果を示す図である。平均値（Ａ：ｎ＝５、Ｂ：ｎ＝７）および標準偏差（±ＳＤ）をそれぞれ算定した。
【図１】
2007519414.tif 000011
【図２】
2007519414.tif 000012
【図３】
2007519414.tif 000013
【国際調査報告】
2007519414.tif 000014
2007519414.tif 000015
2007519414.tif 000016
2007519414.tif 000017
2007519414.tif 000018
2007519414.tif 000019
2007519414.tif 000020
2007519414.tif 000021
2007519414.tif 000022
2007519414.tif 000023