(57)【要約】  本発明は、式(I)〔式中、nは、0〜5の整数であり；Cycは、場合により置換されていてもよい単核もしくは多核の飽和もしくは不飽和の炭素環式もしくはヘテロ環式の環を表し、そしてR1は、ハロゲン、SH、OH、NO2、NR2R3、またはNR2R3R4+X-を表す（ここで、R2、R3、およびR4は、独立して、Hまたは低級アルキル基もしくは低級アルコキシ基を表し、そしてX-は、対イオンを表す）〕で示される光学活性アルカノール類の製造方法に関する。本発明においては、式(II)〔式中、n、Cyc、およびR1は、先に定義されるとおりである〕で示されるアルカノンを含む媒体中において、還元等価体の存在下で、デヒドロゲナーゼ、アルデヒドレダクターゼ、およびカルボニルレダクターゼよりなる群から選択される酵素(E)をインキュベートする。式(II)で示される化合物を式(I)で示される化合物に酵素的に還元し、酵素(E)を用いて犠牲アルコールを反応させて対応する犠牲ケトンにすることにより反応中に消費された還元等価体を再生し、少なくとも部分的に犠牲ケトンを反応媒体から除去し、次いでそのように生成された生成物(I)を単離する。2007535956.tif 000018
2007535956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I
【化１】
2007535956.tif 000014
〔式中、
nは、0〜5の整数であり；
Cycは、場合により置換されていてもよい単核もしくは多核の飽和もしくは不飽和の炭素環式もしくはヘテロ環式の環であり、そして
R1は、ハロゲン、SH、OH、NO2、NR2R3、またはNR2R3R4+X-である（ここで、R2、R3、およびR4は、互いに独立して、水素または低級アルキル基もしくは低級アルコキシ基であり、そしてX-は、対イオンである）〕
で示される光学活性アルカノール類の調製方法であって、式II
【化２】
2007535956.tif 000015
〔式中、n、Cyc、およびR1は、先に定義されるとおりである〕
で示されるアルカノンを含む媒体中において、還元等価体の存在下で、デヒドロゲナーゼ、アルデヒドレダクターゼ、およびカルボニルレダクターゼよりなる群から選択される酵素(E)をインキュベートすること、式IIで示される化合物は、酵素的に還元されて式Iで示される化合物を与え、かつ反応の過程で消費された該還元等価体は、該酵素(E)を用いて対応する犠牲ケトンを与えるように犠牲アルコールを反応させることにより再生されること、少なくとも部分的に該犠牲ケトンを反応媒体から除去すること、生成された生成物(I)を単離することを特徴とする上記方法。
【請求項２】
前記酵素(E)がアルコールデヒドロゲナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素(E)が、
(i) 配列番号2、または
(ii) 配列番号2と比較して、アミノ酸基の25%までが欠失、挿入、置換、またはそれらの組合せにより改変されており、かつ配列番号2の酵素活性の少なくとも50%が保持されている、
ポリペプチド配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
式III
【化３】
2007535956.tif 000016
〔式中、R1=ClまたはNHCH3〕
で示される1-(2-チエニル)-(S)プロパノールの誘導体を調製すべく、式IV
【化４】
2007535956.tif 000017
で示される1-(2-チエニル)プロパノンの誘導体を含む媒体中において、この化合物が酵素的に還元されて式IIIで示される化合物を与え、かつ生成された本質的にエナンチオマー的に純粋な生成物が単離されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素がAzoarcus属の微生物の酵素の中から選択される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記酵素が、配列番号1で示される核酸配列によりまたはその機能性等価体によりコードされる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
使用される前記犠牲アルコールが2-ペンタノールである、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
反応中に前記犠牲アルコールから生成された前記犠牲ケトンが、蒸留により前記反応媒体から少なくとも部分的に除去される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記犠牲ケトンが、反応中に蒸留により酵素反応器から除去される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
式IIで示される化合物を、Enterobacteriaceae、Pseudomonadaceae、Rhizobiaceae、Lactobacillaceae、Streptomycetaceae、Rhodococcaceae、およびNocardiaceae科(families)の細菌の中から選択される微生物の存在下で反応させる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が、請求項１〜３のいずれかの定義に従う酵素をコードする核酸構築物でトランスフォームされた組換え微生物である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
式IまたはIIIで示される化合物を調製するための、
(i) 配列番号2、または
(ii) 配列番号2と比較して、アミノ酸基の25%までが欠失、挿入、置換、またはそれらの組合せにより改変されており、かつ配列番号2の酵素活性の少なくとも50%が保持されている、
ポリペプチド配列を有する酵素(E)の使用。
【請求項１３】
デュロキセチンの調製方法における、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対応するケトン類を酵素的に還元することにより光学活性アルカノール類を調製する方法、とくに、(1S)-3-メチルアミノ-1-(2-チエニル)プロパン-1-オールおよび(1S)-3-クロロ-1-(2-チエニル)プロパン-1-オールの調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
(1S)-3-メチルアミノ-1-(2-チエニル)プロパン-1-オール(「デュロキセチン(Duloxetine)アルコール」)は、デュロキセチン合成のビルディングブロックである。デュロキセチン(登録商標)は、現在、承認段階にあり、鬱病および失禁の適応分野での使用が意図されている。
【０００３】
EP-B-0273658には、Mannich反応で2-アセチルチオフェンをホルムアルデヒドおよびジメチルアミンと反応させ、得られたMannich塩基のケト基を還元してラセミ体の(S)-3-N,N-ジメチルアミノ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールを与え、アルコール官能基をナフチルフルオライドでエーテル化し、最後にジメチルアミノ基をメチルアミノ官能基に変換することによりデュロキセチンに対応する塩基を調製する方法が記載されている。所望のナフチルエーテルエナンチオマーは、キラル出発原料を用いることにより、または光学活性酸を用いた塩もしくはキラル固定相を用いたクロマトグラフィーなどを介して最終生成物の段階でラセミ体を分割することにより、取得される。
【０００４】
US-5,362,886には、ケト基の還元後に得られたラセミ体プロパノールにS-マンデル酸を添加することを含む類似の方法が記載されている。この方法で得られたS-エナンチオマーのアルコールは、後続の反応段階で使用される。
【０００５】
同様に、EP-A-0457559には、EP-B-0273658のものに類似した方法が記載されている。この場合、Mannich塩基のケト基は、不斉還元系LAH-lcb(水素化リチウムアルミニウム[(2R,2S)-(-)-4-ジメチルアミノ-1,2-ジフェニル-3-メチル-2-ブタノール])を用いてS-エナンチオマー形のアルコールに還元される。この場合の欠点は、コストに加えて、数分間しか安定でないLAH-lcb還元系の感度である。
【０００６】
W. J. WheelerおよびF. Kuoは、Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, volume XXXVI, No. 3, pages 213 to 223にデュロキセチンの調製方法を記載している。この目的のために、DMPU(ジメチルプロピレンウレア)中の触媒量のベンジルクロロ-ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)の存在下においてStilleカップリングでチオフェン-2-カルボニルクロライドをビニルトリ-n-ブチルスタンナンと反応させて、式(V)
【化１】
2007535956.tif 000003
【０００７】
で示される1-(チエン-2-イル)-プロペノンを与え、続いて、これを塩化水素で処理することにより、式(VI)
【化２】
2007535956.tif 000004
【０００８】
で示される3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オンに変換する。次に、このようにして得られたクロロプロパノンをキラルオキサザボリリジン(oxazaborylidine)およびBH3により還元して、式(VII)
【化３】
2007535956.tif 000005
【０００９】
で示される(S)-3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールを与える。このようにして得られたアルコールを逐次的にヨウ化ナトリウムと反応させ、続いてメチルアミンと反応させて、(S)-3-メチルアミノ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールに変換する。水素化ナトリウム、1-フルオロナフタレン、および塩化水素との後続の逐次反応により、塩酸塩の形態のデュロキセチンを生成する。 
【化４】
2007535956.tif 000006
Hal=ハロゲン
【００１０】
T. Stillgerらは、Chemie Ingenieur Technik (74) pages 1035-1039, 2002に、エチル5-オキソヘキサノエートの酵素的エナンチオ選択的還元によりエチル(S)-5-ヒドロキシヘキサノエートを与えるための基質共役補因子再生方法を記載している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の概要：
したがって、本発明の目的は、3-メチルアミノ-1-(2-チエニル)プロパノンや3-クロロ-1-(2-チエニル)プロパノンのような置換アルカノン類を立体特異的に還元する方法を見いだすことであり、該反応方法は、安価かつ可能なかぎり定量的に生成物を製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的は、デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素(とくに、Azoarcus属の微生物から調製可能なもの)が同時補因子再生を含む上記反応を立体特異的に触媒しうるという驚くべき発見により達成された。
【００１３】
本発明は、第1に、式I
【化５】
2007535956.tif 000007
【００１４】
〔式中、
nは、0〜5の整数であり；
Cycは、場合により置換されていてもよい単核もしくは多核の飽和もしくは不飽和の炭素環式もしくはヘテロ環式の環であり、そして
R1は、ハロゲン、SH、OH、NO2、NR2R3、またはNR2R3R4+X-である（ここで、R2、R3、およびR4は、互いに独立して、水素または低級アルキル基もしくは低級アルコキシ基であり、そしてX-は、対イオンである）〕
で示される光学活性アルカノール類の調製方法に関し、該方法は、式II
【化６】
2007535956.tif 000008
【００１５】
〔式中、n、Cyc、およびR1は、先に定義されるとおりである〕
で示されるアルカノンを含む媒体中において、還元等価体の存在下で、デヒドロゲナーゼ、アルデヒドレダクターゼ、およびカルボニルレダクターゼよりなる群から選択される酵素(E)をインキュベートすること、式IIで示される化合物は、酵素的に還元されて式Iで示される化合物を与え、かつ反応の過程で消費された還元等価体は、酵素(E)を用いて対応する犠牲ケトンを与えるように犠牲アルコールを反応させることにより再生され、少なくとも部分的に該犠牲ケトンを反応媒体から除去すること、生成された生成物(I)を単離することを特徴とする。
【００１６】
本発明に係るとくに好適な酵素(E)は、アルド-ケトレダクターゼスーパーファミリーに属するアルド-ケトレダクターゼファミリーの酵素（K.M. Bohren, B. Bullock, B. Wermuth and K.H. Gabbay J. Biol. Chem. 1989, 264, 9547-9551）および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ/レダクターゼ[SDR]である。後者のグループの酵素については、たとえば、H. Joernvall, B. Persson, M. Krook, S. Atrian, R. Gonzalez-Duarte, J. Jeffery and D. Ghosh, Biochemistry, 1995, 34, pp. 6003-6013 または U. Oppermann, C. Filling, M. Hult, N. Shafqat, X.Q. Wu, M. Lindh, J. Shafqat, E. Nordling, Y. Kallberg, B. Persson and H. Jornvall, Chemico-Biological Interactions, 2003, 143, pp. 247-253に詳細に記載されている。 
記載されている前記クラスの酵素のうち、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼはとくに好適である。
【００１７】
本発明のとくに好適な実施形態は、上記の方法における酵素(E)の使用であり、ここで、Eは、
(i) 配列番号2、または
(ii) 配列番号2と比較して、アミノ酸基の25%までが欠失、挿入、置換、またはそれらの組合せにより改変されており、かつ配列番号2の酵素活性の少なくとも50%が保持されている、
ポリペプチド配列を有する。
【００１８】
とくに好ましい実施形態では、本方法は、式III
【化７】
2007535956.tif 000009
【００１９】
〔式中、R1=ClまたはNHCH3〕
で示される1-(2-チエニル)-(S)プロパノールの誘導体を調製するのに役立ち、この方法では、式IV
【化８】
2007535956.tif 000010
【００２０】
で示される1-(2-チエニル)プロパノンの誘導体を含む媒体中において、この化合物が酵素的に還元されて式IIIで示される化合物を与え、生成された本質的にエナンチオマー的に純粋な生成物が単離される。
【００２１】
好ましくは、Azoarcus属、Azonexus属、Azospira属、Azovibrio属、Dechloromonas属、Ferribacterium属、Petrobacter属、Propionivibrio属、Quadricoccus属、Rhodocyclus属、Sterolibacterium属、Thauera属、およびZoogloea属の微生物から調製可能なデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素が、この方法で使用される。 
とくに好ましいのは、Azoarcus属の種のデヒドロゲナーゼである。
【００２２】
Azoarcus sp EbN1フェニルエタノールデヒドロゲナーゼは、そのアミノ酸配列に基づいて、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ/レダクターゼ[SDR]に包含されうる。該グループの酵素については、たとえば、H.Joernvall, B.Persson, M.Krook, S.Atrian, R.Gonzalez-Duarte, J.Jeffery and D.Ghosh, Biochemistry, 1995, 34, pp. 6003-6013 または U.Oppermann, C.Filling, M.Hult, N.Shafqat, X.Q.Wu, M.Lindh, J.Shafqat, E.Nordling, Y.Kallberg, B.Persson and H.Jornvall, Chemico-Biological Interactions, 2003, 143, pp. 247-253に詳細に記載されている。SDRグループ内で、個々の代表例のアミノ酸配列は、互いに大幅に異なることもある。それにもかかわらず、特定のアミノ酸またはアミノ酸領域は、SDRグループ内で高度に保存されていることが知られている。C.Filling, K.D.Berndt, J.Benach, S.Knapp, T.Prozorovski, E.Nordling, R.Ladenstein, H.Jornvall and U.Oppermann, Journal of Biological Chemistry, 2002, 277, pp. 25677-25684には、重要な保存SDR領域が記載されている。
【００２３】
Azoarcus種の例は、Azoarcus anaerobius、Azoarcus buckelii、Azoarcus communis、Azoarcus evansii、Azoarcus indigens、Azoarcus toluclasticus、Azoarcus tolulyticus、Azoarcus toluvorans、Azoarcus sp.、Azoarcus sp. 22Lin、Azoarcus sp. BH72、Azoarcus sp. CC-11、Azoarcus sp. CIB、Azoarcus sp. CR23、Azoarcus sp. EB1、Azoarcus sp. EbN1、Azoarcus sp. FL05、Azoarcus sp. HA、Azoarcus sp. HxN1、Azoarcus sp. mXyN1、Azoarcus sp. PbN1、Azoarcus sp. PH002、Azoarcus sp. T、およびAzoarcus sp. ToN1である。 
とくに好ましくは、Azoarcus sp EbN1デヒドロゲナーゼを使用する。
【００２４】
本方法のとくに好ましい実施形態では、デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、配列番号2で示されるアミノ酸配列またはそれから誘導される配列（ただし、アミノ酸残基の25%まで、好ましくは20%まで、とくに好ましくは15%まで、特定的には10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが、欠失、置換、挿入、または欠失と置換と挿入との組合せにより改変されており、しかも配列番号2を基にして改変されたポリペプチド配列が、配列番号2の酵素活性の少なくとも50%、好ましくは65%、とくに好ましくは80%、特定的には90%超を保持する）を含む酵素の中から選択される。これに関連して、配列番号2の酵素活性とは、R1=Clのときの式(IV)で示されるケトンをエナンチオ選択的に還元して一般式(III)を有する(S)アルコールを与える能力を意味するものとする。酵素活性を決定するための厳密な条件を実施例3および4に記載する。
【００２５】
本発明に係る方法は、還元等価体、とくにNADHまたはNADPHを添加して行われる。反応中に消費された還元等価体は、反応条件下で酵素(E)により対応する犠牲ケトンに酸化される犠牲アルコール、好ましくは、イソプロパノール、2-ブタノール、2-ペンタノール、2-ヘキサノール、3-ヘキサノールを用いることにより、再生される。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、添加された犠牲アルコールは、消費された還元等価体を再生するためだけでなく、共溶媒としても使用される。好ましくは、水または水混和性溶媒よりなる一方の相と犠牲アルコールよりなる他方の相とを有する液体二相系中で実施する。好ましくは、犠牲アルコールとして2-ペンタノールを使用する。
【００２７】
還元等価体は、使用されるアルカノン(II)1モルあたり好ましくは0.001〜100mmol、とくに好ましくは0.01〜1mmolの還元等価体の量で使用される。
【００２８】
本発明に係る方法は、反応混合物から消費された還元等価体の再生中に犠牲アルコールの酸化により生成された犠牲ケトンを少なくとも部分的に除去することを含む。好ましくは、生成された犠牲ケトンを反応媒体から完全に除去する。これは、種々の方法により、たとえば、選択性膜を利用することによりまたは抽出法もしくは蒸留法により、達成可能である。好ましくは、蒸留によりケトンを除去する。蒸留によるケトンの除去は、通常、犠牲アルコールの一部およびときには追加的にさらに水性相の一部の除去をも伴う。これらの蒸留損失は、通常、さらなる犠牲アルコールおよび適切であればさらなる水を導入することによりバランスが保たれる。蒸留の速度は、反応体積を基準にして0.02%/min〜2%/min、好ましくは0.05%/min〜1%/minの範囲内である。反応器ジャケット温度は、内部反応器温度よりも5〜70ケルビン、好ましくは10〜40ケルビン高い。
【００２９】
蒸留は、1〜500mbar、好ましくは10〜200mbarの圧力範囲でとくに良好に行われる。
【００３０】
好ましい実施形態は、Enterobacteriaceae、Pseudomonadaceae、Rhizobiaceae、Lactobacillaceae、Streptomycetaceae、Rhodococcaceae、およびNocardiaceae科（families）の細菌の中から選択される微生物の存在下で、一般式II、たとえば式IVなどで示される化合物を反応させることを含む。該微生物は、とくに、先に定義されるようなデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸構築物でトランスフォームされた組換え微生物でありうる。
【００３１】
本発明は、とくに、
・デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を産生する微生物を天然源から単離するかまたは組換えにより作製することと、
・該微生物を増殖させることと、
・適切であれば、デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を該微生物から単離するか、または該酵素を含むタンパク質画分を調製することと、
・段階b)で得られた微生物または段階c)で得られた酵素を、式Iで示される化合物を含む媒体に移すことと、に関する。
【００３２】
本発明はさらに、先に定義されるようなポリペプチドをコードする配列を含むコード核酸配列に関する。
【００３３】
本発明はさらに、少なくとも1つの調節核酸配列に機能的に連結された先に定義されるようなコード核酸配列を含む発現カセットに関する。
【００３４】
本発明はさらに、少なくとも1つのそのような発現カセットを含む組換えベクターに関する。
【００３５】
本発明はまた、本発明に係る少なくとも1つのベクターでトランスフォームされた原核宿主または真核宿主に関する。
【００３６】
最後に、本発明は、式IまたはIIIで示される化合物を調製するための、先に定義されるようなデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素または該酵素を産生する微生物の使用と、たとえばデュロキセチン(式VIII)を調製するための、そのさらなる処理と、に関する。
【化９】
2007535956.tif 000011
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
発明の詳細な説明：
A. 一般的な用語および定義
とくに指定がないかぎり、以下の一般的な意味が適用される：
「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード、とくに、フルオロまたはクロロのことである。
【００３８】
「低級アルキル」とは、1〜6個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状のアルキル基、たとえば、メチル、エチル、イソプロピルもしくはn-プロピル、n-、iso-、sec-、もしくはtert-ブチル、n-ペンチルもしくは2-メチルブチル、n-ヘキシル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、2-エチルブチルのことである。
【００３９】
「低級アルケニル」とは、2〜6個の炭素原子を有する上記のアルキル基のモノ-もしくはポリ-、好ましくはモノ-もしくはジ-不飽和類似体のことであり、二重結合は、炭素鎖の任意の位置に存在しうる。
【００４０】
「低級アルコキシ」とは、以上のアルキル基の酸素末端類似体のことである。
【００４１】
「アリール」とは、単核もしくは多核の、好ましくは単核もしくは二核の、場合により置換されていてもよい芳香族基、とくに任意の環位置を介して結合されたフェニルまたはナフチル、たとえば1-もしくは2-ナフチルのことである。これらのアリール基は、適切であれば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ（先に定義されるとおり）、またはトリフルオロメチルの中から選択される1個または2個の同一のもしくは異なる置換基を保有しうる。
【００４２】
置換アルカノン類、(S)-アルカノール類、およびそれらの誘導体類
酵素触媒作用による本発明に従って利用可能なアルカノール類は、先の式(I)で示されるものである。ただし、
nは、0〜5の整数であり;
Cycは、場合により置換されていてもよい単核もしくは多核の飽和もしくは不飽和の炭素環式もしくはヘテロ環式の環であり、そして
R1は、ハロゲン、SH、OH、NO2、NR2R3、またはNR2R3R4+X-である（ここで、R2、R3、およびR4は、互いに独立して、水素または低級アルキル基もしくは低級アルコキシ基であり、そしてX-は、対イオンである）。
【００４３】
酵素的合成に使用される先の式IIで示されるアルカノン類は、それ自体公知の化合物でありかつ周知の有機合成を適用することにより入手可能な化合物である(たとえば、EP-A-0 273 658を参照されたい)。 
以上の化合物において、nは、好ましくは0、1、または2、とくに1である。
【００４４】
炭素環式およびヘテロ環式の基Cycの例として挙げられるのは、とくに、O、N、およびSの中から選択される4個までの、好ましくは1もしくは2個の同一のもしくは異なる環ヘテロ原子を有する単核もしくは二核の、好ましくは単核の基である：
これらの炭素環式もしくはヘテロ環式の環は、とくに3〜12個、好ましくは4、5、もしくは6個の環炭素原子を含む。例として挙げられうるのは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、それらのモノ不飽和もしくはポリ不飽和の類似体、たとえば、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプタジエニル；さらには、O、N、およびSの中から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜7員の飽和またはモノ不飽和もしくはポリ不飽和のヘテロ環式基であり、適切であれば、ヘテロ環は、他のヘテロ環または炭素環に縮合されうる。とくに挙げなければならないのは、ピロリジン、テトラヒドロフラン、ピペリジン、モルホリン、ピロール、フラン、チオフェン、ピラゾール、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピリジン、ピラン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、クマロン、インドール、およびキノリンから誘導されるヘテロ環式基である。
【００４５】
この場合、Cyc基は、任意の環位置を介して、好ましくは環炭素原子を介して、アルカノンまたはアルカノールに結合されうる。
【００４６】
好適なCyc基の例は、2-チエニル、3-チエニル；2-フラニル、3-フラニル；2-ピリジル、3-ピリジル、または4-ピリジル；2-チアゾリル、4-チアゾリル、または5-チアゾリル；4-メチル-2-チエニル、3-エチル-2-チエニル、2-メチル-3-チエニル、4-プロピル-3-チエニル、5-n-ブチル2-チエニル、4-メチル-3-チエニル、3-メチル-2-チエニル；3-クロロ-2-チエニル、4-ブロモ-3-チエニル、2-ヨード-3-チエニル、5-ヨード-3-チエニル、4-フルオロ-2-チエニル、2-ブロモ-3-チエニル、および4-クロロ-2-チエニルである。
【００４７】
Cyc基はさらに、モノもしくはポリ置換型、たとえば、モノもしくはジ置換型などでありうる。置換基は、好ましくは、環炭素原子上に位置する。好適な置換基の例は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルコキシ、-OH、-SH、-NO2、またはNR2R3であり、ここで、R2およびR3は、先に定義されるとおりであり、好ましくは、ハロゲンまたは低級アルキルである。
【００４８】
R1は、とくに、ハロゲン、NR2R3、またはNR2R3R4+X-であり、ここで、R2、R3、ならびにそれぞれR2、R3、およびR4は、互いに独立して、水素または低級アルキル基もしくは低級アルコキシ基であり、そしてX-は、対イオンであり、好ましくは、R2基、R3基、およびR4基のいずれかは、水素である。好適な対イオンの例は、酸付加塩を調製するときなどに生成されるような酸アニオンである。その例は、たとえば、本明細書で参照されるEP-A-0 273 658に記載されている。R1基の好ましい例は、とくに、フルオロまたはクロロ、およびNR2R3であり、ここで、R2およびR3は、同一であるかもしくは異なっており、水素、またはメチル、エチル、もしくはn-プロピルであり；R1は、とくに好ましくは、クロロまたは-NHメチルである。
【００４９】
C. デヒドロゲナーゼ活性を有する好適な酵素
デヒドロゲナーゼ活性を有する好ましい酵素は、配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む。
【００５０】
本発明は同様に、デヒドロゲナーゼ活性を有する特定的に開示された酵素の「機能性等価体」と、本発明に係る方法におけるこれらの使用と、を含む。
【００５１】
本発明の枠内では、特定的に開示された酵素の「機能性等価体」または類似体とは、これらの酵素と異なるが依然として基質特異性などのような所望の生物学的活性を有するポリペプチドのことである。したがって、「機能性等価体」とは、たとえば、3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オンを対応するSアルコールに還元しかつ配列番号2に挙げられるアミノ酸配列を有する酵素の活性の少なくとも50%、好ましくは60%、とくに好ましくは75%、なかでもとくに好ましくは90%を有する酵素を意味する。機能性等価体はまた、好ましくは、pH4〜10で安定であり、有利には、pH5〜8に最適pHさらには20℃〜80℃の範囲内に最適温度を有する。
【００５２】
本発明によれば、「機能性等価体」は、とくに、上記のアミノ酸配列の少なくとも1つの配列位置に特定的に挙げられたアミノ酸以外のアミノ酸を有するにもかかわらず上記の生物学的活性の1つを有する変異体を意味する。したがって、「機能性等価体」は、1つ以上のアミノ酸付加、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、および/またはアミノ酸逆位により取得可能な変異体を包含し、該改変は、本発明に係る特性プロファイルを有する変異体を生じるかぎり、任意の配列位置に出現しうる。機能性等価物はまた、とくに、変異体および不変ポリペプチドの反応性パターンが定性的に一致するときにも、すなわち、たとえば、同一の基質が異なる速度で変換されるときにも、存在する。
【００５３】
好適なアミノ酸置換の例は、以下の表に見いだしうる：
元の残基  置換の例
Ala      Ser
Arg      Lys
Asn      Gln；His
Asp      Glu
Cys      Ser
Gln      Asn
Glu      Asp
Gly      Pro
His      Asn；Gln
Ile      Leu；Val
Leu      Ile；Val
Lys      Arg；Gln；Glu
Met      Leu；Ile
Phe      Met；Leu；Tyr
Ser      Thr
Thr      Ser
Trp      Tyr
Tyr      Trp；Phe
Val      Ile；Leu
【００５４】
本発明によれば、「機能性等価体」はまた、とくに、上記のアミノ酸配列の少なくとも1つの配列位置に特定的に挙げられたアミノ酸以外のアミノ酸を有するがそれにもかかわらず上記の生物学的活性の1つを有する変異体を意味する。したがって、「機能性等価物」は、1つ以上のアミノ酸付加、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、および/またはアミノ酸逆位により取得可能な変異体を包含し、該改変は、本発明に係る特性プロファイルを有する変異体を生じるかぎり、任意の配列位置に出現しうる。機能性等価物はまた、とくに、変異体および不変ポリペプチドの反応性パターンが定性的に一致するときにも、すなわち、たとえば、同一の基質が異なる速度で変換されるときにも、存在する。
【００５５】
以上の意味の「機能性等価体」はまた、記載のポリペプチドの「前駆体」さらには該ポリペプチドの「機能性誘導体」および「塩」である。
【００５６】
これに関連して、「前駆体」とは、所望の生物学的活性を有するかもしくはを有していないポリペプチドの天然もしくは合成の前駆体である。
【００５７】
「塩」という表現は、本発明に係るタンパク質分子のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、それ自体公知の方法で調製可能であり、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄塩、および亜鉛塩のような無機塩、さらには有機塩基（たとえば、トリエタノールアミン、アルギニン、リシン、ピペリジンなどのようなアミン）との塩を包含しうる。本発明は同様に、酸付加塩、たとえば、塩酸または硫酸のような鉱酸との塩ならびに酢酸およびシュウ酸のような有機酸との塩に関する。
【００５８】
本発明に係るポリペプチドの「機能性誘導体」は同様に、官能性アミノ酸側基の位置またはそれらのN末端もしくはC末端の位置で公知の技術を用いて調製可能である。この種の誘導体は、たとえば、カルボン酸基の脂肪族エステル、カルボン酸基のアミド（このアミドは、アンモニアとのまたは第一級もしくは第二級アミンとの反応により取得可能である）；遊離アミノ基のN-アシル誘導体（この誘導体は、アシル基との反応により調製される）；または遊離ヒドロキシル基のO-アシル誘導体（この誘導体は、アシル基との反応により調製される）を包含する。
【００５９】
「機能性等価体」はまた、当然ながら、他の生物から入手可能なポリペプチドさらには天然に存在する変異体を包含する。たとえば、相同配列領域の部分は、配列比較により確認可能であり、等価な酵素は、本発明の特定のガイドラインに基づいて決定可能である。
【００６０】
「機能性等価体」は同様に、本発明に係るポリペプチドの断片、好ましくは個々のドメインまたは配列モチーフを包含し、該断片は、たとえば、所望の生物学的機能を有する。
【００６１】
「機能性等価体」はさらに、上記のポリペプチド配列のいずれかまたはそれから誘導される機能性等価体と、機能的にそれとは異なりかつN末端またはC末端に機能的に（すなわち、融合タンパク質部分の実質的な相互機能障害をなんら生じることなく）連結された少なくとも1つのさらなる異種配列と、を含有する融合タンパク質である。そのような異種配列の例は、たとえば、シグナルペプチドまたは酵素であるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
同様に本発明に包含される「機能性等価体」は、特定的に開示されたタンパク質の相同体である。該相同体は、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448に記載のアルゴリズムを用いて計算したときに、特定的に開示されたアミノ酸配列の1つに対して、少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、とくに少なくとも85%、たとえば、90%、95%、もしくは99%の相同性を有する。本発明に係る相同ポリペプチドの相同性パーセントは、とくに、本明細書に特定的に記載されるアミノ酸配列のいずれかの全長を基準にしたアミノ酸残基の同一性パーセントである。
【００６３】
タンパク質グリコシル化が起こる可能性のある場合、本発明に係る「機能性等価体」は、脱グリコシル化形またはグリコシル化形さらにはグリコシル化パターンを改変することにより取得可能な改変形の以上に記載のタイプのタンパク質を包含する。
【００６４】
本発明に係るタンパク質またはポリペプチドの相同体は、変異誘発により、たとえば、タンパク質の点変異またはトランケーションにより、生成可能である。
【００６５】
本発明に係るタンパク質の相同体は、たとえばトランケーション変異体のような変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより、同定可能である。たとえば、タンパク質変異体の多様化ライブラリーは、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘発により、たとえば、合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的連結により、作製可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のある相同体のライブラリーを作製するために使用しうる多数の方法が存在する。縮重遺伝子配列は、DNA合成機で化学合成可能であり、次に、合成遺伝子は、好適な発現ベクター中に連結可能である。遺伝子の縮重セットを使用することにより、可能性のあるタンパク質配列の所望のセットをコードする混合物としてすべての配列を調製することが可能である。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は、当業者に公知である(たとえば、Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477)。
【００６６】
点変異またはトランケーションにより作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための技術および選択された性質を有する遺伝子産物に関してcDNAライブラリーをスクリーニングするための技術は、先行技術でいくつか公知になっている。これらの技術は、本発明に係る相同体のコンビナトリアル変異誘発により作製された遺伝子ライブラリーを迅速にスクリーニングすべく適合化可能である。高スループット分析に供される大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も頻繁に利用される技術は、複製可能な発現ベクター中に遺伝子ライブラリーをクローニングすることと、得られたベクターライブラリーで適切な細胞をトランスフォームすることと、検出された産物の遺伝子をコードするベクターの単離を所望の活性の検出により容易に行えるようにする条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることと、を含む。ライブラリー中の機能性変異体の頻度を増大させる技術である反復的アンサンブル変異誘発(REM)は、相同体を同定するためにスクリーニング試験と組み合わせて使用可能である(Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331)。
【００６７】
D. デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列
本発明は、とくに、本発明に係るデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列(一本鎖および二本鎖のDNA配列およびRNA配列、たとえば、cDNA配列およびmRNA配列)に関する。好ましいのは、たとえば、配列番号2で示されるアミノ酸配列もしくはその特徴的部分配列をコードする核酸配列、または配列番号1で示される核酸配列もしくはその特徴的部分配列を含む核酸配列である。
【００６８】
本明細書中に挙げられる核酸配列はすべて、それ自体公知の方法でヌクレオチドビルディングブロックから化学合成することにより、たとえば、二重らせんの個々の重複する相補的核酸ビルディングブロックを断片縮合することにより、調製可能である。オリゴヌクレオチドは、たとえば、ホスホアミダイト法を用いる公知の方法で化学合成することが可能である(Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897)。合成オリゴヌクレオチドのアセンブリーおよびDNAポリメラーゼKlenow断片を用いるギャップの充填ならびに連結反応さらには一般的クローニング法については、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【００６９】
本発明はまた、先のポリペプチドおよびたとえば人工ヌクレオチド類似体を用いることにより入手可能なそれらの機能性等価体のいずれかをコードする核酸配列(一本鎖および二本鎖のDNA配列およびRNA配列、たとえば、cDNA配列およびmRNA配列)に関する。
【００７０】
本発明は、本発明に係るポリペプチドもしくはタンパク質またはそれらの生物学的活性断片をコードする単離された核酸分子と、本発明に係るコード核酸を同定または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーなどとして使用しうる核酸断片と、の両方に関する。
【００７１】
本発明に係る核酸分子はさらに、コード遺伝子領域の3'末端および/または5'末端の非翻訳配列を含みうる。
【００７２】
本発明はさらに、特定的に記載されるヌクレオチド配列に相補的な核酸分子またはその断片を包含する。
【００７３】
本発明に係るヌクレオチド配列を用いれば、他の細胞型および生物における相同配列の同定および/またはクローニングに使用しうるプローブおよびプライマーを作製することが可能になる。この種のプローブおよびプライマーは、通常、本発明に係る核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約12、好ましくは少なくとも約25、たとえば、約40、50、もしくは75連続ヌクレオチドに「ストリンジェント」条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む（以下を参照されたい）。
【００７４】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものであり、組換え技術を用いて調製された場合、他の細胞物質や培地を本質的に含まないもの、または化学合成された場合、化学前駆体や他の化学物質を含まないものでありうる。
【００７５】
本発明に係る核酸分子は、標準的な分子生物学的技術および本発明に基づいて提供される配列情報を用いて単離可能である。たとえば、cDNAは、特定的に開示された完全配列の1つまたはその断片をハイブリダイゼーションプローブとして用いることにより、かつ標準的なハイブリダイゼーション技術(たとえば、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されるような技術)を用いることにより、好適なcDNAライブラリーから単離可能である。それに加えて、開示された配列のいずれかまたはその断片を含む核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応およびこの配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて単離可能である。このようにして増幅された核酸は、好適なベクター中へのクローニングおよびDNA配列分析による特性付けが可能である。本発明に係るオリゴヌクレオチドはまた、標準的な合成により、たとえば、自動DNA合成機を用いて、調製可能である。
【００７６】
本発明に係る核酸配列は、原理的には、任意の生物から同定および単離しうる。有利には、本発明に係る核酸配列またはその相同体は、真菌、酵母、古細菌、または細菌から単離可能である。細菌として挙げられうるのは、グラム陰性およびグラム陽性の細菌である。本発明に係る核酸は、好ましくは、グラム陰性細菌から、有利には、α-プロテオバクテリア、β-プロテオバクテリア、またはγ-プロテオバクテリアから、とくに好ましくは、Burkholderiales目、Hydrogenophilales目、Methylophilales目、Neisseriales目、Nitrosomonadales目、Procabacteriales目、またはRhodocyclales目の細菌から、なかでもとくに好ましくは、Rhodocyclaceae科の細菌から、とりわけて好ましくは、Azoarcus属から、とりわけて好ましくは、Azoarcus anaerobius種、Azoarcus buckelii種、Azoarcus communis種、Azoarcus evansii種、Azoarcus原産種、Azoarcus toluclasticus種、Azoarcus tolulyticus種、Azoarcus toluvorans種、Azoarcus sp.、Azoarcus sp. 22Lin、Azoarcus sp. BH72、Azoarcus sp. CC-11、Azoarcus sp. CIB、Azoarcus sp. CR23、Azoarcus sp. EB1、Azoarcus sp. EbN1、Azoarcus sp. FL05、Azoarcus sp. HA、Azoarcus sp. HxN1、Azoarcus sp. mXyN1、Azoarcus sp. PbN1、Azoarcus sp. PH002、Azoarcus sp. T、およびAzoarcus sp. ToN1から、単離される。 
とくに好ましくは、Azoarcus sp EbN1に由来するデヒドロゲナーゼを使用する。
【００７７】
本発明に係る核酸配列は、たとえば、慣用的なハイブリダイゼーション法またはPCR技術を用いることにより、たとえば、ゲノムまたはcDNAのライブラリーを介して、他の生物から単離可能である。これらのDNA配列は、標準的条件下で本発明に係る配列にハイブリダイズする。有利には、ハイブリダイゼーションのために、たとえば活性部位の保存領域の短いオリゴヌクレオチドを使用する。この保存領域は、本発明に係るデヒドロゲナーゼとの比較を介して当業者に公知の方法で同定可能である。しかしながら、ハイブリダイゼーションのために、本発明に係る核酸のより長い断片または完全配列を使用することも可能である。該標準的条件は、利用される核酸（オリゴヌクレオチド、より長い断片、もしくは完全配列）に依存して、またはDNAもしくはRNAのいずれの核酸タイプをハイブリダイゼーションに使用するかに依存して、異なる。その例として、DNA:DNAハイブリッドの融解温度は、同一長さのDNA:RNAハイブリッドのものよりも約10℃低い。
【００７８】
核酸に依存して、標準的条件は、たとえば、42〜58℃の温度、0.1〜5×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.2)の濃度を有する水性緩衝溶液中、または追加的に50%ホルムアミドの存在下、たとえば、42℃、5×SSC中、50%ホルムアミドなどを意味する。有利には、DNA:DNAハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、0.1×SSCおよび約20℃〜45℃、好ましくは約30℃〜45℃の温度である。DNA:RNAハイブリッドでは、ハイブリダイゼーション条件は、有利には、0.1×SSCおよび約30℃〜55℃、好ましくは約45℃〜55℃の温度である。ハイブリダイゼーションに必要とされる温度は、たとえば、ホルムアミドの不在下における約100ヌクレオチドの長さおよび50%のG+C含有率を有する核酸に対して計算されている融解温度値である。DNAハイブリダイゼーションの実験条件は、専門家向けの遺伝学の教科書、たとえば、Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989などに記載されており、当業者に公知の式を用いて、たとえば、核酸の長さ、ハイブリッドのタイプ、またはG+C含有率の関数として、計算可能である。当業者であれば、次の教科書からハイブリダイゼーションに関するさらなる情報を取得可能である：Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。
【００７９】
本発明はまた、特定的に開示されたまたは演繹されうる核酸配列の誘導体に関する。 
かくして、本発明に係るさらなる核酸配列は、配列番号1から誘導可能であり、1個もしくは2個以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入、または欠失を有する点でそれとは異なるが、依然として所望の特性プロファイルを有するポリペプチドをコードする。
【００８０】
本発明はまた、「サイレント」変異を含む核酸配列または特定的に挙げられた配列を基にして特定の起源生物または宿主生物のコドン使用頻度に従って改変された核酸配列、さらには天然に存在するそれらの変異体、たとえば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体などを包含する。
【００８１】
本発明はまた、保存的ヌクレオチド置換(すなわち、対象となるアミノ酸が、同一の電荷、サイズ、極性、および/または溶解性を有するアミノ酸と置き換えられる)を介して取得可能な配列に関する。
【００８２】
本発明はまた、特定的に開示された核酸から配列多型を介して誘導される分子に関する。これらの遺伝的多型は、自然変異の結果として集団内の個体間に存在しうる。これらの自然変異により、通常、遺伝子のヌクレオチド配列は、1〜5%の変化を生じる。
【００８３】
本発明に係る核酸配列の誘導体は、たとえば、全配列領域にわたり、推定アミノ酸レベルで、少なくとも40%、好ましくは少なくとも60%、なかでもとくに好ましくは少なくとも80、85、90、93、95、もしくは98%相同である対立遺伝子変異体を意味する(アミノ酸レベルの相同性に関して、読者は、ポリペプチドに関する先の解説を参照しうる)。有利には、相同性は、配列のサブ領域でさらに高くなりうる。
【００８４】
さらに、誘導体はまた、本発明に係る核酸配列の相同体、たとえば、真菌性もしくは細菌性の相同体、コードおよび非コードDNA配列のトランケート配列、一本鎖DNAまたはRNAを意味する。その際、たとえば、指定の全DNA領域にわたり、DNAレベルで、少なくとも40%、好ましくは少なくとも60%、とくに好ましくは少なくとも70%、なかでもとくに好ましくは少なくとも80%相同である。
【００８５】
さらに、誘導体は、たとえば、プロモーターとの融合体を意味する。指定のヌクレオチド配列の上流に位置するプロモーターは、1つ以上のヌクレオチド置換、挿入、逆位、および/または欠失により改変されたものであってもよいが、プロモーターの機能および効力が損なわれてはならない。さらに、該プロモーターの効力をそれらの配列の改変により増大させることが可能であり、またはプロモーターをより活性なプロモーター（他の種の生物に由来するものを包含する）と完全に置き換えることが可能である。
【００８６】
誘導体また、遺伝子発現および/またはタンパク質発現を改変するために（好ましくは増大させるために）、開始コドンの-1〜-1000塩基上流または停止コドンの0〜1000塩基下流の領域が改変された変異体を意味する。
【００８７】
本発明はさらに、先に記載のコード配列に「ストリンジェント条件」下でハイブリダイズする核酸配列を包含する。ゲノムまたはcDNAのライブラリーをスクリーニングすることにより、これらのポリヌクレオチドを見いだし、適切であれば、好適なプライマーを用いてPCRによりそれから増幅し、次に、たとえば、好適なプローブを用いて単離することが可能である。それに加えて、本発明に係るポリヌクレオチドはまた、化学合成可能である。この性質は、実質的に相補的な配列にストリンジェント条件下で結合するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの能力を意味し、これらの条件下で非相補的パートナー間の非特異的結合が形成されることはない。この目的では、配列は、70〜100%、好ましくは90〜100%相補的でなければならない。特異的に互いに結合しうる相補的配列の性質は、たとえば、ノーザンもしくはサザンブロット技術において、またはPCRもしくはRT-PCRでプライマー結合のために、利用される。通常、少なくとも30塩基対長のオリゴヌクレオチドがこの目的で使用される。たとえば、ノーザンブロット技術では、ストリンジェント条件は、非特異的にハイブリダイズされたcDNAプローブまたはオリゴヌクレオチドを溶出させるための、50〜70℃、好ましくは60〜65℃の洗浄溶液、たとえば、0.1% SDSを含有する0.1×SSC緩衝液(20×SSC:3M NaCl、0.3Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)の使用を意味する。先に述べたように、その場合、互いに結合された状態を保持する核酸のみが、高度に相補的なものである。ストリンジェント条件の設定については、当業者に公知であり、たとえば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。
【００８８】
E. 本発明に係る構築物の実施形態
本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドをコードする核酸配列を調節核酸配列の遺伝子制御下に含む発現構築物と；さらにはこれらの発現構築物の少なくとも1つを含むベクターと；に関する。
【００８９】
本発明に係るそのような構築物は、好ましくは、特定のコード配列の5'上流のプロモーターおよび3'下流のターミネーター配列、さらには、適切であれば、いずれの場合もコード配列に機能的に連結されたさらなる慣用的調節エレメントを含む。
【００９０】
「機能的連結（operative linkage）」とは、各調節エレメントがコード配列の発現に必要とされるその機能を発揮しうるように、プロモーター、コード配列、ターミネーター、および適切であればさらなる調節エレメントを逐次的に配置することを意味する。機能的に連結可能な配列の例は、ターゲッティング配列、さらにはエンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどである。他の調節エレメントは、選択性マーカー、増幅シグナル、複製起点などを包含する。好適な調節配列については、たとえば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【００９１】
本発明に係る核酸構築物は、とくに、遺伝子の発現を調節する（たとえば増大させる）目的で本発明に係るデヒドロゲナーゼの遺伝子が1つ以上の調節シグナルに機能的に(operatively or functionally)連結されたものを意味する。
【００９２】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の自然調節が、実際の構造遺伝子の上流に依然として存在する可能性があり、適切であれば、自然調節が停止され遺伝子の発現が増大されるように遺伝子改変されていてもよい。しかしながら、核酸構築物はまた、より単純なデザインを有するものであってもよい。すなわち、追加の調節シグナルがコード配列の上流に挿入されておらずかつ天然プロモーターがその調節と共に除去されていないものであってもよい。この代わりに、天然調節配列は、もはやいかなる調節も存在せずに遺伝子の発現が増大されるように変異される。
【００９３】
好ましい核酸構築物は、有利には、プロモーターに機能的に連結されて核酸配列の発現を増大させうる1つ以上の先述のエンハンサー配列を含む。さらなる調節エレメントまたはターミネーターのような追加の有利な配列をDNA配列の3'末端に挿入してもよい。本発明に係る核酸は、1つ以上のコピーとして構築物中に存在しうる。構築物はまた、適切であれば、該構築物の選択を目的として、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性相補遺伝子のような追加のマーカーを含みうる。
【００９４】
本発明に係る方法に有利な調節配列は、たとえば、cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp, lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP (rhaPBAD)SP6、ラムダ-PR、またラムダ-PLプロモーターのようなプロモーター中に存在する。これらのプロモーターは、有利には、グラム陰性細菌で使用される。さらなる有利な調節配列は、たとえば、グラム陽性プロモーターamyおよびSPO2中に、酵母または真菌のプロモーターADC1、MFalpha 、AC、P 60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中に存在する。これに関連して、ピルビン酸デカルボキシラーゼおよびメタノールオキシダーゼのプロモーター、たとえば、ハンセヌラ由来のものもまた有利である。人工プロモーターを調節に使用することも可能である。
【００９５】
宿主生物における発現を目的として、核酸構築物は、有利には、たとえば、宿主において遺伝子を最適に発現させうるプラスミドまたはファージのようなベクターに挿入される。ベクターとは、プラスミドおよびファージに加えて、当業者に公知の任意の他のベクター、すなわち、たとえば、SV40、CMV、バキュロウイルス、およびアデノウイルスのようなウイルス、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、および線状もしくは環状のDNAを意味する。これらのベクターは、宿主生物において自律的に複製されうるか、または染色体により複製されうる。これらのベクターは、本発明のさらなる実施形態を構成する。好適なプラスミドの例は、E. coli中のpLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、lgt11、もしくはpBdCI、Streptomyces中のpIJ101、pIJ364、pIJ702、もしくはpIJ361、Bacillus中のpUB110、pC194、もしくはpBD214、Corynebacterium中のpSA77もしくはpAJ667、真菌中のpALS1、pIL2、もしくはpBB116、酵母中の2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13、もしくはpEMBLYe23、または植物中のpLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、もしくはpDH51である。該プラスミドは、可能性のあるプラスミドの中から少数を選択して示したものである。他のプラスミドは、当業者に公知であり、たとえば、書籍Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018)中に見いだしうる。
【００９６】
存在する他の遺伝子を発現させることを目的として、核酸構築物はまた、有利には、発現を増大させるための3'末端および/または5'末端の調節配列を含む。これらの配列は、選択される宿主生物および1つもしくは複数の遺伝子に応じて最適発現になるように選択される。
【００９７】
これらの調節配列は、遺伝子およびタンパク質の発現の特異的発現を可能にするように意図される。宿主生物に依存して、これは、たとえば、遺伝子が誘導後にかぎり発現もしくは過剰発現されるかまたはただちに発現および/もしくは過剰発現されることを意味しうる。
【００９８】
これに関連して、調節配列または調節因子は、好ましくは、ポジティブに影響を与えることにより、導入された遺伝子の発現を増大させうる。したがって、調節エレメントは、有利には、プロモーターおよび/またはエンハンサーのような強力な転写シグナルを用いることにより転写レベルで増強されうる。しかしながら、これに加えて、たとえば、mRNAの安定性を改良することにより翻訳を増強することも可能である。
【００９９】
ベクターのさらなる実施形態では、本発明に係る核酸構築物または本発明に係る核酸を含むベクターはまた、有利には、線状DNAの形態で微生物に導入され、非相同的または相同的な組換えを介して宿主生物のゲノムに組み込まれうる。この線状DNAは、プラスミドのような線状化ベクターで、または本発明に係る核酸構築物もしくは核酸のみで、構成されうる。
【０１００】
生物において異種遺伝子を最適に発現させうるように、生物において利用される特定のコドン使用頻度に従って核酸配列を改変することが有利である。コドン使用頻度は、対象となる生物に由来する他の既知の遺伝子をコンピューター解析することにより、容易に決定可能である。
【０１０１】
本発明に係る発現カセットは、好適なプロモーターを好適なコードヌクレオチド配列およびターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルに融合することにより、調製される。たとえば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and also in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載されるような一般的な組換えおよびクローニングの技術が、この目的で使用される。
【０１０２】
好適な宿主生物において発現を達成するために、組換え核酸構築物または遺伝子構築物は、有利には、宿主において遺伝子を最適に発現させうる宿主特異的ベクターに挿入される。ベクターは、当業者に周知であり、たとえば、"Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)に見いだされうる。
【０１０３】
F. 本発明に有用な宿主生物
本発明に係るベクターまたは構築物を用いて、たとえば、本発明に係る少なくとも1つのベクターでトランスフォームして本発明に係るポリペプチドの産生に使用しうる組換え微生物を調製することが可能である。有利には、本発明に係る上記の組換え構築物は、好適な宿主系に導入されて発現される。これに関連して、好ましくは、特定の発現系において該核酸を発現させるために、たとえば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどのような当業者に公知の熟知されたクローニング法およびトランスフェクション法が使用される。好適な系については、たとえば、Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Eds., Wiley Interscience, New York 1997, or Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
【０１０４】
本発明によれば、相同的組換え微生物を調製することも可能である。この目的では、適切であれば、本発明に係る配列を改変するために、たとえば、機能的に破壊するために、少なくとも1つのアミノ酸欠失、アミノ酸付加、またはアミノ酸置換が導入された本発明に係る遺伝子またはコード配列の少なくとも1つの断片を含むベクター（ノックアウトベクター）が調製される。導入された配列はまた、関連微生物に由来する相同体であってもよいし、またはたとえば、哺乳動物源、酵母源、もしくは昆虫源に由来するものであってもよい。他の選択肢として、相同的組換えに用いられるベクターは、内因性遺伝子が相同的組換えの際に変異されるかまたはそれ以外の形で改変されるが依然として機能性タンパク質をコードするように、デザインされていてもよい（たとえば、上流調節領域は、それにより内因性タンパク質の発現が改変されるように改変されていてもよい）。本発明に係る遺伝子の改変断片は、相同的組換えベクター中に存在する。相同的組換えに好適なベクターの構築については、たとえば、Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503に記載されている。
【０１０５】
本発明に係る核酸または核酸構築物に好適な組換え宿主生物は、原理的には、任意の原核生物または真核生物である。有利には、細菌、真菌、または酵母のような微生物が宿主生物として使用される。グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌、好ましくは、Enterobacteriaceae科、Pseudomonadaceae科、Rhizobiaceae科、Streptomycetaceae科、またはNocardiaceae科の細菌、とくに好ましくは、Escherichia属、Pseudomonas属、Streptomyces属、Nocardia属、Burkholderia属、Salmonella属、Agrobacterium属、またはRhodococcus属の細菌が有利に使用される。なかでもとくに好ましいのは、Escherichia coliの属および種である。それに加えて、さらなる有利な細菌は、アルファ-プロテオバクテリア、ベータ-プロテオバクテリア、またはガンマ-プロテオバクテリアの群に見いだされうる。
【０１０６】
これに関連して、本発明に係る1種もしくは複数種の宿主生物は、好ましくは、本発明に記載されかつ本発明に係るデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列、核酸構築物、またはベクターの少なくとも1つを含む。
【０１０７】
本発明に係る方法で使用される生物は、宿主生物に応じて当業者に公知の方法で増殖または培養される。通常、微生物は、通常は糖の形態の炭素源、通常は酵母抽出物のような有機窒素源または硫酸アンモニウムのような塩の形態の窒素源、痕跡元素、たとえば、鉄塩、マンガン塩、マグネシウム塩、および適切であればビタミンを含む液体培地中で、0℃〜100℃、好ましくは10℃〜60℃の温度で、酸素ガスを供給しながら、増殖される。これに関連して、栄養液のpHは、固定値に保持してもしなくてもよい。すなわち、培養中に調節してもしなくてもよい。培養は、バッチ方式、セミバッチ方式、または連続方式で行われうる。栄養素は、発酵の開始時に導入されうるか、または半連続方式もしくは連続方式で後続的に供給されうる。ケトンは、培養物に直接添加されうるか、または有利には培養後に添加されうる。酵素は、実施例に記載の方法を用いて生物から単離されうるか、または粗抽出物として反応に使用されうる。
【０１０８】
G. 本発明に係るポリペプチドの組換え調製
本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドまたはその機能性生物学的活性断片の組換え調製法に関する。この方法では、ポリペプチド産生微生物を培養し、適切であれば、ポリペプチドの発現を誘導し、そして該ポリペプチドを培養物から単離する。ポリペプチドはまた、所望により、この方法を用いて工業規模で産生可能である。
【０１０９】
組換え微生物は、公知の方法により培養および発酵を行うことが可能である。細菌は、たとえば、TB培地またはLB培地で、20〜40℃の温度で、かつ6〜9のpHで、増殖可能である。好適な培養条件については、たとえば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に詳細に記載されている。
【０１１０】
ポリペプチドが培地中に分泌されない場合、細胞を破壊して公知のタンパク質単離方法により溶解物から産物を取得する。所望に応じて、高周波超音波により、高圧により、たとえば、フレンチ圧力セルにより、浸透圧溶解により、界面活性剤、溶菌酵素、もしくは有機溶媒の作用により、ホモジナイザーを用いることにより、または列挙された方法の2つ以上の組合せにより、細胞を破壊することが可能である。
【０１１１】
ポリペプチドは、公知のクロマトグラフィー法、たとえば、分子ふるいクロマトグラフィー(ゲル濾過)、たとえば、Qセファロースクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィーを用いて、さらには他の慣用的方法、たとえば、限外濾過、結晶化、塩析、透析、およびネイティブゲル電気泳動を用いて、精製可能である。好適な方法については、たとえば、Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden [original title: The tools of biochemistry], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
【０１１２】
特定のヌクレオチド配列によりcDNAを伸長させて、精製を単純化するためなどに使用される改変ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを用いることにより、組換えタンパク質を単離することが有利なこともある。この種の好適な改変の例は、たとえば、ヘキサヒスチジンアンカーとして知られる改変のようにアンカーとして作用する「タグ」または抗体により抗原として認識されうるエピトープである（たとえば、Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Pressに記載されている）。これらのアンカーは、クロマトグラフィーカラムなどに充填されうるポリマーマトリックスなどのような固体担体に、もしくはマイクロタイタープレートに、または他の担体に、タンパク質を結合させるために使用することが可能である。
【０１１３】
それに加えて、これらのアンカーはまた、タンパク質を同定するために使用することも可能である。タンパク質はまた、該タンパク質を誘導体化すべく、蛍光染料、基質との反応の後で検出可能な反応生成物を生成する酵素マーカー、または放射性マーカーのような慣用的マーカーを、単独でまたはアンカーと組み合わせて用いることにより、同定することも可能である。
【０１１４】
H. (S)-アルカノール類を調製するための本発明に係る方法の実施
本発明に従って使用されるデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、遊離酵素または固定化酵素として本発明に係る方法で使用可能である。
【０１１５】
有利には、本発明に係る方法は、0℃〜95℃、好ましくは10℃〜85℃、とくに好ましくは15℃〜75℃の温度で実行される。
【０１１６】
本発明に係る方法では、有利には、pHは、pH4〜12、好ましくはpH4.5〜9、とくに好ましくはpH5〜8に保持される。
【０１１７】
本発明に係る方法では、エナンチオマー的純粋生成物もしくはキラル生成物または光学活性アルコールは、エナンチオマー富化を呈するエナンチオマーを意味する。好ましくは、本方法では、少なくとも70%ee、好ましくは少なくとも80%ee、とくに好ましくは少なくとも90%ee、なかでもとくに好ましくは少なくとも98%eeのエナンチオマー純度が達成される。
【０１１８】
本発明に係る核酸、核酸構築物、またはベクターを含む増殖細胞を本発明に係る方法で使用することが可能である。休止細胞または破壊細胞を使用することも可能である。破壊細胞とは、たとえば、溶媒などで処置することにより浸透性をもたせた細胞、または酵素で処理することにより、機械的処理(たとえば、フレンチプレス処理もしくは超音波処理)により、もしくは他の方法により、粉砕された細胞を意味する。このようにして得られた粗抽出物は、有利には本発明に係る方法に好適である。精製または部分精製された酵素を本方法に使用することも可能である。反応に有利に適用されうる固定化された微生物または酵素も、同様に好適である。
【０１１９】
遊離の生物または酵素は、本発明に係る方法で使用する場合、適宜上、抽出前に濾過または遠心分離などにより除去される。
【０１２０】
本発明に係る方法で生成される生成物、たとえば、(1S)-3-メチルアミノ-1-(2-チエニル)プロパン-1-オールは、有利には、抽出または蒸留を介して水性反応溶液から取得可能である。収率の増大を目的として、抽出を数回反復してもよい。好適な抽出剤の例は、トルエン、メチレンクロライド、ブチルアセテート、ジイソプロピルエーテル、ベンゼン、MTBE、またはエチルアセテートのような溶媒であるが、これらに限定されるものではない。他の選択肢として、本発明に係る方法で調製される生成物、たとえば、(1S)-3-メチルアミノ-1-(2-チエニル)-プロパン-1-オールは、有利には、抽出もしくは蒸留または/および結晶化により反応溶液の有機相から単離可能である。収率を増大させるために、抽出を数回反復してもよい。好適な抽出剤の例は、トルエン、メチレンクロライド、ブチルアセテート、ジイソプロピルエーテル、ベンゼン、MTBE、またはエチルアセテートのような溶媒であるが、これらに限定されるものではない。
【０１２１】
有機相を濃縮した後、通常、生成物は、良好な化学純度(すなわち、80%超の化学純度)で取得可能である。しかしながら、抽出後、生成物を含有する有機相を部分的に濃縮するにとどめて、生成物を結晶化させることも可能である。この目的では、溶液は、有利には、0℃〜10℃の温度に冷却される。結晶化はまた、有機溶液からまたは水溶液から直接行うことも可能である。新たに結晶化を行う目的で、同一のまたは異なる溶媒に結晶化生成物を再懸濁させて、再結晶することが可能である。必要であれば、少なくとも1回行われる後続の有利な結晶化により、生成物のエナンチオマー純度をさらに増大させることが可能である。
【０１２２】
記載のタイプの後処理により、反応に用いられる基質、たとえば、3-メチルアミノ-1-(2-チエニル)プロパン-1-オンを基準にして、60〜100%、好ましくは80〜100%、とくに好ましくは90〜100%の収率で、本発明に係る方法の生成物を単離することが可能である。単離された生成物は、>90%、好ましくは>95%、とくに好ましくは>98%の高い化学純度により特性付けられる。生成物はさらに、必要であれば、結晶化により有利にさらに増大されうる高いエナンチオマー純度を有する。
【０１２３】
本発明に係る方法は、バッチ方式、セミバッチ方式、または連続方式で操作可能である。
【０１２４】
本方法は、有利には、たとえば、Biotechnology, volume 3, 2nd edition, Rehm et al. Eds., (1993), とくにchapter IIに記載されるようなバイオリアクターで行うことが可能である。
【０１２５】
以上の説明および以下の実施例は、単に本発明を例示する役割を果たすにすぎない。本発明は同様に、当業者に自明な多数の可能性のある変更形態を包含する。
【０１２６】
本発明に係る方法の利点は、式(I)で示される光学活性アルカノールのとりわけ高い収率またはアルカノン(II)の実質的に定量的な変換である。
【実施例】
【０１２７】
実験の部：
実施例1：合成オリゴヌクレオチドによるAzoarcus sp EbN1フェニルエタノールデヒドロゲナーゼのクローニング。
【０１２８】
Azoarcus sp EbN1フェニルエタノールデヒドロゲナーゼの遺伝子の配列は、データベースに寄託されている(Genbank ID 25956124, 領域: 25073〜25822)。公知の方法に従って遺伝子を合成するために用いられたオリゴヌクレオチドは、フェニルエタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子の核酸配列から誘導されたものであった。表1は、該オリゴヌクレオチドのDNA配列をまとめたものである。図3は、Azoarcus sp EbN1フェニルエタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子全体に対する個々のオリゴヌクレオチドの位置を示している。合成遺伝子の調製方法については、たとえば、Y.P. Shi, P. Das, B. Holloway, V. Udhayakumar, J.E.Tongren, F. Candal, S. Biswas, R. Ahmad, S.E. Hasnain and A.A. Lal, Vaccine 2000, 18, pp. 2902-2914に報告されている。得られた配列は、既報の配列と同一である。
【０１２９】
PCR産物を制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびBamHIで消化し、それに合うように消化されたpDHE19.2ベクター(DE19848129)中にクローニングした。連結混合物をE.coli XL1 Blue (Stratagene)中にトランスフォームした。pDHEEbN1プラスミドをE.coli株TG10 pAgro4 pHSG575中にトランスフォームした(TG10: E.coli TG1(Stratagene)のRhaA-誘導体; pAgro4: Takeshita, S; Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto-Gotoh, T (1987) Gene 61, 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001), Mol. Microbiol. 40(2), 397-413)。
【０１３０】
組換えE. coliは、E. coli LU 11558と呼ばれる。
【表１】
2007535956.tif 000012
【０１３１】
実施例2：PCRによるAzoarcus sp EbN1フェニルエタノールデヒドロゲナーゼのクローニング
zoarcus sp EbN1フェニルエタノールデヒドロゲナーゼの遺伝子の配列は、データベースに寄託されている(Genbank ID 25956124, 領域25073〜25822)。フェニルエタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子の核酸配列からオリゴヌクレオチド(プライマーMKe0387およびMKe0388)を誘導し、次のようにPCR増幅によるデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングに使用した。
【表２】
2007535956.tif 000013
【０１３２】
等モル量(各130ng)のプライマーMKe0387およびMKe0388を混合した。PfuTurboポリメラーゼ(Roche Applied Science)および以下の温度勾配プログラムを用いて標準的Stratageneプロトコルに従ってPCRを行った：95℃5分間；95℃45秒間、55℃45秒間、および72℃1分間を30サイクル；72℃10分間；10℃使用時まで。アガロースゲル電気泳動(1.2%E-Gel, Invitrogen)およびカラムクロマトグラフィー(GFX kit, Amersham Pharmacia)によりPCR産物(約0.75kB)を単離し、次に、配列決定を行った(配列決定用プライマー: MKe0387およびMKe0388)。得られた配列は、既報の配列と同一である。PCR産物を制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびBamHIで消化し、それに合うように消化されたpDHE19.2ベクター(DE19848129)中にクローニングした。連結混合物をE.coli XL1 Blue (Stratagene)中にトランスフォームした。このようにして得られたプラスミドpDHEEbN1中のインサート(対応するクローンの配列決定を行うことによりインサートを明らかにした)は、配列番号1に示される核酸配列である。
【０１３３】
pDHEEbN1プラスミドをE.coli株TG10 pAgro4 pHSG575中にトランスフォームした(TG10: E.coli TG1(Stratagene)のRhaA-誘導体; pAgro4: Takeshita, S; Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto-Gotoh, T (1987) Gene 61, 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001), Mol. Microbiol. 40(2), 397-413)。 
前記組換えE. coliを、E. coli LU 11558と呼ぶこととする。
【０１３４】
実施例3：E.coli LU 11558の組換えフェニルエタノールデヒドロゲナーゼの提供
100mlエルレンマイヤーフラスコ(バッフル)に入っている20mlのLB-Amp/Spec/Cm(100μg/lアンピシリン; 100μg/lスペクチノマイシン; 20μg/lクロラムフェニコール), 0.1mM IPTG, 0.5g/lラムノース中、37℃でE.coli LU 11558を18時間増殖させ、5000*gで10分間遠心分離し、10mM TRIS*HCl, pH7.0で1回洗浄し、そして2mlの同一の緩衝液中に再懸濁させた。振動ミル(氷上で中間冷却しながら3×5min)で0.7mlのガラスビーズ(d=0.5mm)を用いてE.coli LU 11558細胞ペーストを破壊することにより、無細胞タンパク質粗抽出物を調製した。
【０１３５】
実施例4：E.coli LU 11558組換えデヒドロゲナーゼの活性の決定
いずれの場合も、100mlエルレンマイヤーフラスコ(バッフル)に入っている20mlのLBAmp/Spec/Cm (100μg/l Amp; 100mg/lSpec; 20μg/lCm) 0.1mM IPTG 0.5g/lラムノース中、37℃で6つのトランスフォーマントを18時間増殖させ、5000*gで10分間遠心分離し、10mM Tris/HCl pH7.0で1回洗浄し、そして2mlの同一の緩衝液中に再懸濁させた。50μl/mlグルコースDH、100mMグルコース、100mM NaCl、1mM NADH、1mM NADPHを含有する900μlの50mM MES pH6中で、かつ10mM 3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オンと共に、100mlの細胞懸濁液を振盪させながら20分間インキュベートした。実施例4と類似の方法で反応混合物を分析した。平均して、0.13mM 3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールが、培養物懸濁液の6.6U/lの活性に対応して生成された。振動ミル(氷上で中間冷却しながら3×5min)で0.7mlのガラスビーズ(d=0.5mm)を用いて細胞を破壊することにより取得された粗抽出物を含有する類似の反応混合物において、10.7U/lの活性に対応して0.21mM 3-クロロ1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールが測定された。培養時にラムノースを添加しない対照実験では、3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールは検出できなかった。
【０１３６】
実施例5：3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オンおよび3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールの分析
3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オンおよび3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールの濃度は、HPLCにより決定可能である。また、固定相および移動相の選択に応じて、濃度に加えてee値を決定することも可能である。
【０１３７】
a) アキラル分析
以下の系を用いて反応を定量した：
固定相：  Chromoltih SpeedROD RP18(50*4)、6μm、Merck (Darmstadt, Germany)、45℃に加熱
移動相：  溶出液A：  10mM KH2PO4、pH2.5
溶出液B：  アセトニトリル
勾配：  0〜0.5min、35%B；0.5〜1.0min 35〜80%B；1.0〜1.2min 80%B；1.2〜1.3min 80%〜35%B；1.3〜2.0min 35%B；
流量：  1.5ml/min
検出：  230および260nmでUV検出
保持時間：  3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オン：約1.6min
3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オール：約1.3min
基準物質を用いて検量系を作製し、それに基づいて未知サンプルの濃度を決定することが可能である。
【０１３８】
b) キラル分析
固定相：  Chiracel OD-H、250*4、6μm、Daicel、40℃に加熱
移動相：  溶出液A：  n-ヘキサン
溶出液B：  イソプロパノール
2.5% Bでアイソクラティック
流量：  1.0ml/min
検出：  230および260nmでUV検出
保持時間：  3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オン：  約9.5min
(1S)-3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オール：  約16.6min
(1R)-3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オール：  約18.3min
基準物質を用いて検量系を作製し、それに基づいて未知サンプルの濃度を決定することが可能である。
【０１３９】
実施例6：E.coli LU 11558組換えデヒドロゲナーゼの活性の決定
いずれの場合も、100mlエルレンマイヤーフラスコ(バッフル)に入っている20mlのLBAmp/Spec/Cm (100μg/l Amp; 50mg/lSpec; 10μg/lCm) 0.1mM IPTG 0.5g/lラムノース中、37℃でE.coli LU 11558の6つのトランスフォーマントを18時間増殖させ、5000*gで10分間遠心分離し、10mM Tris/HCl pH7.0で1回洗浄し、そして2mlの同一の緩衝液中に再懸濁させた。50μl/mlグルコースDH(例 ...)、100mMグルコース、100mM NaCl、1mM NADH、1mM NADPHを含有する900μlの50mM MES pH6中で、かつ10mM 3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オンと共に、100mlの細胞懸濁液を振盪させながら20分間インキュベートした。実施例4と類似の方法で反応混合物を分析した。平均して、0.13mM 3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールが、培養物懸濁液の6.6U/lの活性に対応して生成された。振動ミル(氷上で中間冷却しながら3×5min)で0.7mlのガラスビーズ(d=0.5mm)を用いて細胞を破壊することにより取得された粗抽出物を含有する類似の反応混合物において、10.7U/lの活性に対応して0.21mM 3-クロロ1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールが測定された。培養時にラムノースを添加しない対照実験では、3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールは検出できなかった。
【０１４０】
実施例7：2-ペンタノールと共にAzoarcus sp EbN1の組換えデヒドロゲナーゼを用いる(S)-3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールの調製
0.75L反応器に入れられた221mlの50mM KH2PO4および250mlの2-ペンタノール中の0.2mM NAD+および185mMの3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オン(12.5ml)と共に40℃(250rpm)でE.coli LU 11558の休止細胞(1〜20g/lバイオマス)を攪拌した。5M NaOHで滴定することにより、反応系をpH5.5に保持した。有機相において50〜350mMの濃度までのTACAをHPLC分析することにより、反応をモニターした。
【０１４１】
実施例8：2-ペンタノールと共にAzoarcus sp EbN1の組換えデヒドロゲナーゼを用いる(S)-3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールの調製
4L反応器に入れられた1432mlの50mM KH2PO4および2000mlの2-ペンタノール中の0.2mM NAD+および370mMの3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オン(200ml)と共に40℃(250rpm)でE.coli LU 11558の休止細胞(1〜20g/lバイオマス)を攪拌した。5M NaOHで滴定することにより、反応系をpH5.5に保持した。有機相において100〜650mMの濃度までのTACAをHPLC分析することにより、反応をモニターした。
【０１４２】
実施例9：2-ペンタノールと共にAzoarcus sp EbN1の組換えデヒドロゲナーゼを用いる(S)-3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールの調製
4L反応器に入れられた1432mlの50mM KH2PO4および2000mlの2-ペンタノール中の0.2mM NAD+および370mMの3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オン(200ml)と共に40℃(250rpm)でE.coli LU 11558の休止細胞(1〜20g/lバイオマス)を攪拌した。5M NaOHで滴定することにより、反応系をpH5.5に保持した。約85mbarの真空および50〜70℃のジャケット温度を適用した。2〜10ml/minの蒸留速度で取得された蒸留量の水および2-ペンタノールを反応中に連続的に再導入した。有機相において300〜700mMの濃度までのTACAをHPLC分析することにより、反応をモニターした。0〜30%の残分になるまで3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オンを反応させた。
【０１４３】
実施例10：2-ペンタノールと共にAzoarcus sp EbN1の組換えデヒドロゲナーゼを用いる(S)-3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールの調製
0.75L反応器に入れられた221mlの50mM KH2PO4および250mlの2-ペンタノール中の0.2mM NAD+および200mMの3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オン(12.5ml)と共に40℃(250rpm)でE.coli LU 11558の休止細胞(1〜20g/lバイオマス)を攪拌した。5M NaOHで滴定することにより、反応系をpH5.5に保持した。有機相において50〜320mMの濃度までのTACAをHPLC分析することにより、反応をモニターした。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】図１は、配列表の配列番号:1に示されるAzoarcus sp EbN1フェニルエタノールデヒドロゲナーゼの核酸配列 (Genbank ID 25956124, region:25073 to 25822)である。
【図２】図２は、配列表の配列番号:2に示されるAzoarcus sp EbN1フェニルエタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列 accession (Genbank protein ID CAD58337)である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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