(57)【要約】   （１）供試化合物が、ＬＫＢ１のプロテインキナーゼ活性を修飾する、例えば促進するかどうかを判定する工程、および（２）ＬＫＢ１のプロテインキナーゼ活性を修飾する、例えば促進する化合物を選択する工程を含む、細胞内のＡＭＰＫ（ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ）またはＡＭＰＫサブファミリーメンバーの活性化またはリン酸化を修飾する、例えば促進する際に使用するための化合物を同定する方法。プロテインキナーゼの活性は、ＡＭＰＫもしくはＡＭＰＫサブファミリーメンバー、またはＡＭＰＫもしくはＡＭＰＫサブファミリーメンバーのＴ−ループ領域を包むペプチドを使用して、試験することができる。ＬＫＢ１は、調製物の中にあってもよいし、ＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５との複合体（これは、これらの補助タンパク質非存在下でのＬＫＢ１よりずっと大きなキナーゼ活性を有する）の中にあってもよい。ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５は組換え体であってもよい。ＡＭＰＫサブファミリーメンバーは、ＡＭＰＫα１、ＡＭＰＫα２、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２、ＳＩＫ、ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＭＡＲＫ１、ＭＡＲＫ２、ＭＡＲＫ３、ＭＡＲＫ４またはＭＥＬＫであり得る。【選択図】図２１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のＡＭＰＫ（ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ）またはＡＭＰＫサブファミリーメンバーの活性化またはリン酸化を修飾する、例えば促進する際に使用するための化合物を同定する方法であって、
（１）供試化合物が、ＬＫＢ１のプロテインキナーゼ活性を修飾する、例えば促進するかどうかを判定する工程と、
（２）ＬＫＢ１のプロテインキナーゼ活性を修飾する、例えば促進する化合物を選択する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記ＬＫＢ１が、ＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５とともに調製物の中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５が、組換え体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＬＫＢ１、ＳＴＲＤおよび組換えＭＯ２５を含む精製調製物。
【請求項５】
組換えＬＫＢ１を含む、請求項５に記載の調製物。
【請求項６】
組換えＳＴＲＡＤを含む、請求項４または５に記載の調製物。
【請求項７】
ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤ、および過剰発現または組換えＭＯ２５を発現することができる細胞。
【請求項８】
ＭＯ２５をコードする組換え核酸を含む、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
ＬＫＢ１をコードする組換え核酸を含む、請求項７または８に記載の細胞。
【請求項１０】
ＳＴＲＡＤをコードする組換え核酸を含む、請求項７から９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤおよび過剰発現または組換えＭＯ２５を含む細胞。
【請求項１２】
組換えＬＫＢ１を含む、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
組換えＳＴＲＡＤを含む、請求項１１または１２に記載の細胞。
【請求項１４】
請求項７から１０のいずれか一項に記載の細胞である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項３から６のいずれか一項に記載の調製物を製造するための方法であって、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の細胞から前記調製物を精製する工程を含む方法。
【請求項１６】
請求項１５の方法によって取得可能な調製物。
【請求項１７】
ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤ：ＭＯ２５の比率が、１：１：１である、請求項３から６及び１６のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１８】
前記ＬＫＢ１が、請求項３から６もしくは１７のいずれか一項に記載の調製物、または請求項１５の方法によって得られたもしくは取得可能な調製物、または請求項７から１４のいずれか一項に記載の細胞の中にある、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１９】
調製物が、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５を含む複合体を含む、請求項１から６及び１５から１８のいずれか一項に記載の調製物または方法。
【請求項２０】
細胞内ＬＫＢ１活性を修飾するための化合物を同定する方法であって、
（１）供試化合物が、請求項３から６、１６、１７及び１９のいずれか一項に記載の調製物もしくは複合体の、または請求項７から１４のいずれか一項に記載の細胞内の、ＬＫＢ１のプロテインキナーゼ活性を修飾するかどうかを判定する工程と、
（２）前記ＬＫＢ１プロテインキナーゼ活性を修飾する化合物を選択する工程とを含む、方法。
【請求項２１】
前記ＬＫＢ１プロテインキナーゼ活性が、ＡＭＰＫもしくはＡＭＰＫサブファミリーメンバーまたはそれらいずれかの断片を基質として使用して測定される、請求項１または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＬＫＢ１またはＬＫＢ１をコードする組換えポリヌクレオチド、ＳＴＲＡＤまたはＳＴＲＡＤをコードする組換えポリヌクレオチド、およびＭＯ２５またはＭＯ２５をコードする組換えポリヌクレオチドを含む、キット。
【請求項２３】
（１）ＡＭＰＫまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバー、あるいはＡＭＰＫもしくはＡＭＰＫサブファミリーメンバーまたはそれらの断片をコードする組換えポリヌクレオチドと、
（２）請求項２２に記載のキットまたは請求項３から６、１６、１７もしくは１９請求項１９のいずれか一項に記載の調製物もしくは複合体、または請求項７から１４のいずか一項に記載の細胞とを含む、キット。
【請求項２４】
（１）その細胞型がＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５を発現するものであるかどうかを判定する工程を含む、ＬＫＢ１を過剰発現させるための細胞型を選択する工程と、
（２）その選択された細胞型においてＬＫＢ１を過剰発現させる工程とを含む、ＬＫＢ１を過剰発現させる方法。
【請求項２５】
（１）請求項２４に記載の方法を用いて細胞内でＬＫＢ１を過剰発現させる工程と、
（２）その細胞からＬＫＢ１を調製する工程とを含む、ＬＫＢ１を調製する方法。
【請求項２６】
ＭＯ２５についての推定結合パートナーを同定する方法であって、（１）供試推定結合パートナーの少なくともＣ末端３アミノ酸のアミノ酸配列を提供する工程と、（２）Ｃ末端アミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｐｈｅを有する推定結合パートナーを選択する工程とを含む、方法。
【請求項２７】
選択された前記推定結合パートナーがＭＯ２５に結合することを判定する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＰＪＳ（ポイツ−ジェガース症候群）に関連した遺伝子差を同定する方法であって、
（１）ＰＪＳに罹患している少なくとも１人の患者においてＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５アイソフォームをコードする遺伝子の配列を調査する工程と、
（２）前記患者での配列とＰＪＳに罹患していない個体からの同等の配列との間の差を同定する工程とを含む、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法によってＰＪＳに関連したものとして同定された遺伝子差を、供試個体が有するかどうかを判定する工程を含む、個体がＰＪＳに罹患しやすいかどうかを判定する方法。
【請求項３０】
メトホルミンまたはフェンホルミンまたはＡＩＣＡリボシドに類似したメカニズムによってＡＭＰＫまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバーを活性化する化合物を同定する方法であって、請求項３から６、１６、１７及び１９のいずれか一項に記載の調製物もしくは複合体または請求項７から１４のいずれか一項に記載の細胞によるＡＭＰＫまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバーの活性化に対する供試化合物の作用を、ＡＭＰＫまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバーの活性化に対するメトフォルミンまたはフェンホルミンまたはＡＩＣＡリボシドの作用と比較し、類似した作用を有する化合物を選択する方法。
【請求項３１】
糖尿病または肥満を治療するための医薬品の製造における、ＡＭＰＫサブファミリーメンバーまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバーをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項３２】
ＡＭＰＫサブファミリーメンバーが、ＡＭＰＫα１またはＡＭＰＫα２ポリペプチドであるか、ＡＭＰＫα１またはＡＭＰＫα２ポリペプチドを含む、請求項１、２１及び３０のうちのいずれか一項に記載の方法、請求項２３に記載のキット、または請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
ＡＭＰＫサブファミリーメンバーが、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２、ＳＩＫ、ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＭＡＲＫ１、ＭＡＲＫ２、ＭＡＲＫ３、ＭＡＲＫ４またはＭＥＬＫポリペプチドであるか、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２、ＳＩＫ、ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＭＡＲＫ１、ＭＡＲＫ２、ＭＡＲＫ３、ＭＡＲＫ４またはＭＥＬＫポリペプチドを含む、請求項１、２１及び３０のいずれか一項に記載の方法、請求項２３に記載のキット、または請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
アミノ酸配列ＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹもしくはＦＧＮＦＹＫＳＧＥＰＬＳＴＷＣＧＳＰＰＹもしくはＬＳＮＭＭＳＤＧＥＦＬＲＴＳＣＧＳＰＮＹもしくはＭＡＳＬＱＶＧＤＳＬＬＥＴＳＣＧＳＰＨＹもしくはＦＳＮＥＦＴＶＧＧＫＬＤＴＦＣＧＳＰＰＹもしくはＡＫＰＫＧＮＫＤＹＨＬＱＴＣＣＧＳＬＡＹ；または下線が引かれている残基以外のいずれかの位置で一から四置換されている、および／もしくは下線が引かれている残基で保存的置換されている前記配列；または下線が引かれている残基を含む前記配列の少なくとも１０隣接残基を含む、ＬＫＢ１に対するペプチド基質。
【請求項３５】
アミノ酸配列ＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹまたはＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹＲＲＲまたはＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹまたはＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹＲＲＲまたはＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹまたはＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹＲＲＲまたはＦＧＮＦＹＫＳＧＥＰＬＳＴＷＣＧＳＰＰＹまたはＦＧＮＦＹＫＳＧＥＰＬＳＴＷＣＧＳＰＰＹＲＲＲまたはＬＳＮＭＭＳＤＧＥＦＬＲＴＳＣＧＳＰＮＹまたはＬＳＮＭＭＳＤＧＥＦＬＲＴＳＣＧＳＰＮＹＲＲＲまたはＭＡＳＬＱＶＧＤＳＬＬＥＴＳＣＧＳＰＨＹまたはＭＡＳＬＱＶＧＤＳＬＬＥＴＳＣＧＳＰＨＹＲＲＲまたはＦＳＮＥＦＴＶＧＧＫＬＤＴＦＣＧＳＰＰＹまたはＦＳＮＥＦＴＶＧＧＫＬＤＴＦＣＧＳＰＰＹＲＲＲまたはＡＫＰＫＧＮＫＤＹＨＬＱＴＣＣＧＳＬＡＹまたはＡＫＰＫＧＮＫＤＹＨＬＱＴＣＣＧＳＬＡＹＲＲＲのみからなる、ＬＫＢ１に対するペプチド基質。
【請求項３６】
アミノ酸配列ＭＶＡＧＬＴＬＧＫＧＰＥＳＰＤＧＤＶＳ（ヒトＢＲＳＫ１の残基１〜２０）、ＬＳＷＧＡＧＬＫＧＱＫＶＡＴＳＹＥＳＳＬ（ヒトＢＲＳＫ２の残基６５５〜６７４）、ＭＥＧＡＡＡＰＶＡＧＤＲＰＤＬＧＬＧＡＰＧ（ヒトＮＵＡＫ１の残基１〜２１）、ＴＤＣＱＥＶＴＡＴＹＲＱＡＬＲＶＣＳＫＬＴ（ヒトＮＵＡＫ２の残基６５３〜６７３）、ＭＶＭＡＤＧＰＲＨＬＱＲＧＰＶＲＶＧＦＹＤ（ヒトＱＩＫの残基１〜２１）、ＭＶＩＭＳＥＦＳＡＤＰＡＧＱＧＱＧＱＱＫ（ヒトＳＩＫの残基１〜２０）、ＧＤＣＥＭＥＤＬＭＰＣＳＬＧＴＦＶＬＶＱ（ヒトＳＩＫの残基７６５〜７８４）、ＴＤＩＬＬＳＹＫＨＰＥＶＳＦＳＭＥＱＡＧＶ（ヒトＱＳＫの残基１３４９〜１３６９）、ＳＧＴＳＩＡＦＫＮＩＡＳＫＩＡＮＥＬＫＬ（ヒトＭＡＲＫ１の残基７７６〜７９５）、ＭＳＳＲＴＶＬＡＰＧＮＤＲＮＳＤＴＨＧＴ（ヒトＭＡＲＫ４の残基１〜２０）、ＭＫＤＹＤＥＬＬＫＹＹＥＬＨＥＴＩＧＴＧ（ヒトＭＥＬＫの残基１〜２０）、ＣＴＳＰＰＤＳＦＬＤＤＨＨＬＴＲ（ラットＡＭＰＫα１の残基３４４〜３５８）、ＣＤＰＭＫＲＡＴＩＫＤＩＲＥ（ラットＡＭＰＫα１の残基２５２〜２６４）を有するペプチド抗原と反応する抗体。
【請求項３７】
ＡＭＰＫα１のＴｈｒ１７２に対応するＴ−ループトレオニン残基が、アラニン残基にまたはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基に突然変異されている、突然変異ＡＭＰＫサブファミリーメンバー。
【請求項３８】
ＡＭＰＫサブファミリーメンバーが、ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＱＩＫ、ＳＩＫまたはＭＥＬＫである、請求項３７に記載の突然変異ＡＭＰＫサブファミリーメンバー。
【請求項３９】
請求項３７または３８に記載の突然変異ＡＭＰＫサブファミリーメンバーをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインキナーゼおよびそれらの調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＬＫＢ１は、他のプロテインキナーゼと密接に関係がないＳｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼである（（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）に総説されている）。ＬＫＢ１における突然変異は、罹患者における多発性胃腸管過誤腫性ポリープならびに広範な良性および悪性腫瘍（Ｈｅｍｍｉｎｋｉ，１９９９）の発現と、多数の組織における悪性癌腫の発現の危険性の１５倍増加［２０、２１］を特徴とする、ポイツ−ジェガース癌症候群（ＰＪＳ）、常染色体優勢遺伝性疾患に関連付けられている（Ｈｅｍｍｉｎｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｊｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。今日までに、ＬＫＢ１遺伝子におけるほぼ１００の異なる突然変異が、ＰＪＳ患者において確認されており、それらのほとんどが、ＬＫＢ１の活性を損なうとみられている［２２］。マウスにおけるＬＫＢ１遺伝子の両方の対立遺伝子の欠失は、多発性欠損症から生じる妊娠中期胎児死亡率の原因となり（Ｙｌｉｋｏｒｋａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、これは、ＬＫＢ１が発育において欠くことのできない役割を果たすことを示している。重要なこととして、ＬＫＢ１異型接合マウスは、生育能力はあるが、胃腸管過誤腫を特徴とする（しかし、これらが単一機能不全に起因するのか、異型接合性の欠如に起因するのかは、議論を呼ぶところである）ＰＪＳ様疾患を発現する（［２２］に総説されている）。晩年期（例えば、週齢５０週より高齢）のこれらの動物は、ＬＫＢ１発現の欠如と関係があることが証明されている肝細胞癌などの悪性腫瘍も発現する（Ｂａｒｄｅｅｓｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｊｉｓｈａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｎａｋａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ．ａｌ．，２００２）。一定の癌細胞におけるＬＫＢ１の過剰発現は、ＬＫＢ１触媒活性に依存する（Ｔｉａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）Ｇ１細胞周期停止のため、成長抑制をもたらす。これは、ｐ５３依存性メカニズムによるｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の活性化によって媒介されるという説が出された（Ｔｉａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。考え合わせると、これらの発見は、ＬＫＢ１が、腫瘍サプレッサとして機能する可能性が高いことを強く示している。最近の研究は、ＬＫＢ１のＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｌｉａ）（Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，２００３）およびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）（Ｏｓｓｉｐｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）相同体が、細胞極性を調節すること、およびこの機能がヒトにおいて保存されるならば、ＰＪＳ患者における細胞極性の欠如が、過誤腫の発現の原因であり得ることを示している。ＬＫＢ１は、細胞内で過剰発現されるときには本質的に核であるが、低レベルのサイトゾルの局在もしばしば観察される（Ｋａｒｕｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｔｉａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。有意なこととして、それらの核から排除されるＬＫＢ１の突然変異体は、完全な成長抑制活性を保持し、これは、この酵素の細胞質内局在が、その腫瘍抑制機能にとって重要であるこ���を示唆している（Ｔｉａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＰＪＳ患者において見出されるＬＫＢ１の幾つかの突然変異形は、核内のみに局在し、細胞質内では検出できない（Ｂｏｕｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ；Ｔｉａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。これは、ＬＫＢ１の細胞質内局在が重要であることをさらに示唆している。
【０００３】
ＬＫＢ１がどのように調節されるのか、それがどうのように機能するのかについては、比較的ほとんど知られていない。ＬＫＢ１は、インビボでは多数の残基でリン酸化され、一定のリン酸化部位の突然変異は、細胞成長を抑制するＬＫＢ１の能力を妨げるが、これらのリン酸化事象がＬＫＢ１機能を調節するメカニズムは、まだ明確にされていない（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓａｐｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｓａｐｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ；Ｓａｐｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。その機能を調節することができるＬＫＢ１相互作用性タンパク質の同定にも、相当関心がもたれている。今日までに、多数のタンパク質、すなわちｐ５３腫瘍抑制タンパク質（Ｋａｒｕｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、クロマチンリモデリング複合体の一成分であるブラーマ関連遺伝子１タンパク質（Ｂｒｇ１）（Ｍａｒｉｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ＬＫＢ１相互作用性タンパク質−１（ＬＩＰ１）と呼ばれるタンパク質（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ならびにＣｄｃ３７およびＨＳｐ９０からなるキナーゼ特異的シャペロンの複合体（Ｂｏｕｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ）が、ＬＫＢ１に結合することが明らかにされた。ｐ５３へのＬＫＢ１の結合は、ｐ５３依存性細胞死の媒介に不可欠であることが提言され（Ｋａｒｕｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、これに対してＢｒｇ１へのＬＫＢ１の結合は、Ｂｒｇ１依存性細胞成長停止に必要であることが提言された（Ｍａｒｉｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＬＫＢ１とＬＩＰ１の相互作用は、ＬＫＢ１を細胞質内に固着させ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、一方、Ｃｄｃ３７およびＨＳｐ９０へのＬＫＢ１の結合は、ＬＫＢ１タンパク質を細胞内で安定させる（Ｂｏｕｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ）。
【０００４】
最近、本発明者らは、ＬＫＢ１が、ほぼ全てのプロテインキナーゼの機能に必要な重要な残基が欠けているため触媒活性がないＳＴＲＡＤα（ＳＴｅ２０−Ｒｅｌａｔｅｄ  ＡＤａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−α、ＳＴｅ２０関連アダプタータンパク質−α）と呼ばれるＳＴＥ２０関連偽キナーゼと会合することを明らかにした（Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。さらに、ＬＫＢ１は、その触媒ドメインによってＳＴＲＡＤαに結合し、この相互作用が、ＬＫＢ１インビボ活性ならびにＬＫＢ１細胞質内局在の促進を強化する（Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＬＫＢ１は、ｓｉＲＮＡアプローチを用いてＳＴＲＡＤαを枯渇させた細胞ではもはや細胞成長を抑制することができず、このことは、ＳＴＲＡＤαへのＬＫＢ１の結合が、その腫瘍抑制機能の媒介において重要な役割を果たすことを示唆している。ＳＴＲＡＤαは、ＬＫＢ１によってインビトロおよびインビボでリン酸化もされ、このことから、ＳＴＲＡＤαはこれまでに同定されたＬＫＢ１のための最初の生理学的基質となる（Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０００５】
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＡＭＰＫＫ）およびＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）は、細胞のエネルギー充足のセンサーとしての機能を果たすプロテインキナーゼカスケードの上流および下流成分である［１、２］。ＡＭＰＫは、アデニル化キナーゼによって触媒される反応（２ＡＤＰ←→ＡＴＰ＋ＡＤＰ）のため、常にＡＴＰ：ＡＤＰ比の低下を伴う細胞内５’−ＡＭＰの上昇によって活性化される。これは、低酸素、虚血、グルコース欠乏などの代謝性ストレス中に、ならびに骨格筋および心筋においては収縮または運動中に発生する［１−３］。これは、ＡＭＰＫの両方の触媒サブユニットアイソフォーム（ＡＭＰＫα１およびＡＭＰＫα２）に当てはまる。ストレスによって活性化されると、ＡＭＰＫは、グルコースおよび脂肪酸摂取、ならびにＡＴＰを生じさせるためのこれらの燃料の酸化的代謝のスイッチを入れると同時に、ＡＴＰを消費する生合成経路のスイッチを切る。この代謝のスイッチ切り替えは、代謝性酵素の直接リン酸化、および遺伝子発現に対する、より長期的な作用、両方によって達成される［１、２］。ＡＭＰＫは、細胞内ＡＴＰレベルの低下を伴わない未知のメカニズムにより、メトホルミン、最も広く用いられている糖尿病薬の一つによっても活性化される（しかし、高線量での、すなわち、成人において１日あたり２ｇより高い線量が必要）。ＡＴＰ枯渇とフェンホルミンの両方によるＡＭＰＫの活性化が、上流キナーゼによるそのＴ−ループ残基におけるＡＭＰＫ触媒性（α）サブユニット（ＡＭＰＫα１におけるＴｈｒ１７２）のリン酸化を必要とする。ＡＭＰＫは、代謝に対するその作用が最も周知であるが、最近の研究は、細胞成長および増殖も調節することを示唆している。第一に、このキナーゼの活性化は、延長因子−２のリン酸化を生じさせることにより［４］、およびｍＴＯＲ経路によってｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化を阻害することにより［５、６］、タンパク質合成を阻害する。第二に、種々の細胞においてプロアポトーシス作用［７−９］と抗アポトーシス作用［１０、１１］の両方を有する。第三に、サイクリンＡおよびＢ１などの増殖遺伝子をコードするｍＲＮＡの安定性を低下させる、細胞質内のＲＮＡ結合タンパク質ＨｕＲのレベルを低下させる［１２］。第四に、ｐ５３を安定させることによりＨｅｐＧ２細胞の増殖を阻害する［１３］。
【０００６】
本発明者らは、ＡＭＰＫをそのキナーゼドメインの活性化ループ内のＴｈｒ−１７２においてリン酸化することにより活性化する上流キナーゼ、ＡＭＰＫＫを、以前、ラットの肝臓から部分精製した［１４］。しかし、アミノ酸配列を得、その活性を被定義遺伝子産物として同定するために必要なだけの材料を精製することはできなかった。本発明者らは、哺乳動物キナーゼおよび酵母キナーゼを活性化する１１９の酵母プロテインキナーゼ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のコレクションの能力をアッセイすることにより、ＡＭＰＫのサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）相同体の上流のキナーゼについて調査した。このアプローチにより、可能性のある上流キナーゼとしてＥｌｍ１プロテインキナーゼが同定された［１５］。ツーハイブリッド分析によりＳｎｆ１と相互作用するプロテインキナーゼを分析することによって、シュミットらは、酵母における可能性のあるもう一つの上流キナーゼとしてＰａｋ１を同定した［１６］。一つだけキナーゼ遺伝子が欠失しているｅｌｍ１Δ株とｐａｋ１Δ株の両方が、ｓｎｆ１Δ株と同じ表現型を有した。しかし、Ｅｌｍ１およびＰａｋ１は、Ｔｏｓ３プロテインキナーゼとともに小さなサブファミリーを形成し、ならびにｓｎｆ１Δに類似した表現型を有するｅｌｍ１Δｐａｋ１Δｔｏｓ３Δ三重突然変異株は、これら３つのキナーゼのうちのいずれか１つの発現により野生型に戻る［１５］。これは、これら３つのプロテインキナーゼが、一部重複してＳＮＦ１複合体についての上流キナーゼとしての機能を果たす証拠となる。
【０００７】
ヒトゲノムによってコードされるＥｌｍ１、Ｐａｋ１およびＴｏｓ３の最も近い類縁体は、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼのβアイソフォーム（ＣａＭＫＫβ）である。本発明者らは、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣＡＭＫＩ）の活性化と比較するとかなり劣るが、ブタの脳から精製したＣａＭＫＫは無細胞アッセイにおいてＡＭＰＫを活性化できることを、以前、明らかにした。しかし、ラットの肝臓から、以前、精製されたＡＭＰＫＫは、カルモジュリン依存性ではなかった［１７］。ヒトにおけるＥｌｍ１／Ｐａｋ１／Ｔｏｓ３ファミリーとあまり密接に関係がない他の類縁体には、ＬＫＢ１（図１におけるアラインメント参照）があり、これは、上記のように、遺伝性疾患ポイツ−ジェガース症候群（ＰＪＳ）において突然変異した遺伝子として、当初、発見された５０ｋＤａのセリン／トレオニンキナーゼ［１８、１９］である。ＨｅＬａおよびＧ３６１（黒色腫）細胞を含む幾つかのヒト腫瘍細胞系統は、ＬＫＢ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を欠き、これらの細胞における野生型ＬＫＢ１の発現は、Ｇ１期における成長停止をもたらしたが、ＰＪＳ突然変異から単離された触媒的に不活性なまたは幾つかのＬＫＢ１突然変異体の発現は、細胞成長を停止させることができなかった［２３］。Ｇ３６１細胞におけるＬＫＢ１の発現によって誘導される成長停止は、サイクリンＤ１またはＥの共発現によって覆されることも報告されており、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の転写誘発と関係があり、およびｐ５３に依存することが証明された［２４］。考え合わせると、これらの結果は、ＬＫＢ１が、腫瘍サプレッサとしての機能を果たすこと、およびＬＫＢ１の触媒活性が、この機能に不可欠であることを示している。しかし、ＬＫＢ１がリン酸化して細胞成長の抑制を媒介する下流の基質（複数を含む）は、依然として不明である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、ＭＯ２５α（ＭＯｕｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２５−α、マウスタンパク質２５−α）をＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα複合体の新規成分として同定し、ＭＯ２５αが、細胞の細胞質内でのこの複合体の樹立ならびにＬＫＢ１触媒活性の強化に重要な役割を果たすことを立証する。ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αの各々について、ヒトゲノムにコードされた密接に関係があるアイソフォーム（ＳＴＲＡＤβおよびＭＯ２５β）も存在し、これらは、ＬＫＢ１と会合することもできる。本発明者らは、ＭＯ２５が、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ複合体の骨格成分として機能し得ることを証明する。ＳＴＲＡＤα［３０］およびＳＴＲＡＤβは、Ｓｔｅ２０プロテインキナーゼと関係があるが、活性プロテインキナーゼに期待される残基の幾つかが保存されず、従って、「偽キナーゼ」に分類される。ＭＯ２５αは、例えばＳＴＲＡＤαのＣ末端に（例えば）結合し、ＳＴＲＡＤαとＬＫＢ１の間の会合を安定させる。ＬＫＢ１とＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５の会合は、人工基質（ミエリン塩基性タンパク質）に対するキナーゼ活性を増加させ、その細胞質局在を強化する。この細胞質局在は、核局在シグナルを欠く突然変異体が、なお、細胞成長を抑制することができるので、以前にＬＫＢ１の腫瘍抑制機能に関連付けられている［２４］。
【０００９】
さらに、本発明者らは、２つの上流キナーゼ（ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２）のラット肝臓からの分離を記載する。ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２の両方が、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αと複合したＬＫＢ１を含有すること、ならびに両方の活性が、抗ＬＫＢ１抗体で免疫沈降することを明らかにする。さらに、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞から単離された内在性と組換え、両方のＬＫＢ１／ＳＴＲＡＤ／ＭＯ２５複合体が、αサブユニットのＴｈｒ−１７２のリン酸化によりＡＭＰＫを活性化する。本発明者らは、ＡＭＰＫをリン酸化および活性化するＬＫＢ１の能力が、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５サブユニットの存在により劇的に強化されることを証明する。これは、両サブユニットが、最大活性に不可欠であることを示唆している。最後に、他の細胞型においてＡＭＰＫを活性化する薬物（ＡＩＣＡリボシドおよびフェンホルミン）が、ＬＫＢ１を発現しないＨｅＬａ細胞ではＡＭＰＫを活性化しなかった。しかし、触媒不活性突然変異体ではなく野生型ＬＫＢ１の安定した発現より、これらの薬物によるＡＭＰＫの活性化は回復された。従って、本発明者らは、ＳＴＲＡＤとＭＯ２５の複合体でのＬＫＢ１が、ＡＭＰＫの生理学的活性化因子であることを明らかにする。今や、ＡＭＰＫの生理学的活性化を修飾する化合物を同定するためにスクリーンを行うことができるのである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第一の態様は、（１）供試化合物が、ＬＫＢ１のプロテインキナーゼ活性を修飾する、例えば促進するかどうかを判定する工程、および（２）ＬＫＢ１のプロテインキナーゼ活性を修飾する、例えば促進する化合物を選択する工程を含む、細胞内のＡＭＰＫ（ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ）またはＡＭＰＫサブファミリーメンバーの活性化またはリン酸化を修飾する、例えば促進する際に使用するための化合物を同定する方法を提供する。
【００１１】
本スクリーニング法において修飾／評価されるＬＫＢ１のプロテインキナーゼ活性は、（例えば、実施例において論じるような）ミエリン塩基性タンパク質などの非生理学的基質のリン酸化であってもよい。あるいは、本スクリーニング法において修飾／評価されるＬＫＢ１のプロテインキナーゼ活性は、さらに論じるように、ＡＭＰＫもしくはＡＭＰＫサブファミリーメンバーまたはそれらの断片のリン酸化であってもよい。ＡＭＰＫまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバーのリン酸化は、下でおよび実施例においてさらに論じるように、ＡＭＰＫまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバーの活性化またはリン酸化を測定することにより評価することができる。例えば、ＬＫＢ１に適切なペプチド基質は、実施例３および４において論じ、それらには、ＮＵＡＫ２  Ｔ−ループペプチド（ＬＫＢｔｉｄｅと呼ぶ）が挙げられる。ＡＭＰＫ活性化は、（例えば）、その発現がＡＭＰＫによって修飾されるレポーター遺伝子を使用して評価することができる。ＬＫＢプロテインキナーゼ活性の測定、および／またはＡＭＰＫもしくはＡＭＰＫサブファミリーメンバー（またはそれらの断片）のリン酸化もしくは活性化の測定に有用であり得る他の技法および試薬は、実施例、例えば実施例４で説明する。
【００１２】
プロテインキナーゼ活性は、特定の基質についてのＬＫＢ１（または、適切な場合には、ＡＭＫＰもしくはサブファミリーメンバー）のＶｍａｘまたはＫｍ（または両方）の変化によって増大または低下させることができる。例えば、活性は、Ｖｍａｘの増加またはＫｍの減少によって増大させることができる。ＬＫＢ１（または、適切な場合には、ＡＭＫＰもしくはサブファミリーメンバー）が活性化したのか、脱活性化したのかを判定するために、ＶｍａｘとＫｍ、両方の値を判定する必要がない場合もあることは、理解されるであろう。脱リン酸化（脱活性化）したＡＭＰＫまたはサブファミリーメンバーが、多少酵素活性を保持する場合もあることは、理解されるであろう。
【００１３】
活性は、所与の時間にリン酸化される基質の量として測定することができ、従って、活性の変化は、所与の時間にリン酸化される（例えば、単一濃度での）基質の量の変化として検出することができる。活性は、必要に応じて、少なくとも２、好ましくは５、１０、１５、２０、２５、３０または５０倍、増大または低下させることが好ましい。
【００１４】
基質（例えば、ＡＭＰＫ）の活性化に対する化合物の作用を、例えば、（１）ＬＫＢ１への基質の暴露後に、（２）ＬＫＢ１への基質の暴露前に、および／または（３）ＬＫＢ１に暴露せずに、化合物に暴露したときの基質の活性を測定することによって、判定することが必要な場合もあることは、理解されるであろう。
【００１５】
ＬＫＢ１の基質（またはＲＮＡそれ自体の生産）によって（直接または間接的に）調節されるプロモータから転写されたＲＮＡにコードされているタンパク質の発現を測定することができる。このタンパク質は、ＬＫＢ１の基質によって生理学的に調節されるもの、例えばＡＭＰＫまたはサブファミリーメンバーであってもよいし、当業者に周知のような「レポーター」タンパク質であってもよい（すなわち、組換え構築物を使用してもよい）。レポータータンパク質は、その活性を容易にアッセイすることができるもの、例えば、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼまたはルシフェラーゼであり得る（例えば、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）参照）。
【００１６】
例えば肝臓における、ＡＭＰＫ活性化は、糖新生の酵素（ホスフェノールピルベートカルボキシラーゼおよびグルコース−６−ホスファターゼ）の発現を減少させる；Lochhead et al 5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside mimics the effects of insulin on the expression of the 2 key gluconeogenic genes PEPCK and glucose-6-phosphatase. Diabetes. 2000 Jun; 49(6): 896-903; Yamauchi et al Adiponectin stimulates glucose utilization and fatty-acid oxidation by activating AMP-activated protein kinase.Nat Med.2002 Nov; 8(11): 1288-95参照。例えば肝臓において、ＡＭＰＫによりスイッチオフされる遺伝子のもう一つのクラスは、脂肪酸生合成の酵素（脂肪酸シンターゼおよびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ）をコードするものである；Woods et al Characterization of the role of AMP-activated protein kinase in the regulation of glucose-activated gene expression using constitutively active and dominant negative forms of the kinase.Mol Cell Biol.2000 Sep;20(18):6704-11参照。ＡＭＰＫ活性化は、次の４つの転写因子のレベルも低下させる：ステロール応答要素結合タンパク質−１Ｃ（Zhou et al Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action.J Clin Invest.2001 Oct;108(8):1167-74.);肝細胞核性因子-4α(Leclerc et al Hepatocyte nuclear factor-4alpha involved in type 1 maturity-onset diabetes of the young is a novel target of AMP-activated protein kinase.Diabetes.2001 Jul;50(7):1515-21);C/EBPαおよびPPAR-γ(Habinowski et al The effects of AICAR on adipocyte differentiation of 3T3-L1 cells.Biochem Biophys Res Commun.2001 Sep 7;286(5):852-6)。従って、このような遺伝子（またはこれらの遺伝子からの調節配列を組み込む組換え遺伝子）をレポーター遺伝子として使用することができる。
【００１７】
プロテインキナーゼ活性の修飾には、プロテインキナーゼ活性の阻害または増大が含まれる。
【００１８】
本発明の上記の態様について説明したように、ポリペプチドのリン酸化によってそれが発生し得る本発明の方法では、適切なリン酸供与体の存在が必要となり得ることは、理解されるであろう。適切なリン酸供与体は、当業者にはわかるであろう。それらには、実施例に記載するようなＡＴＰ、例えばマグネシウム塩としてのもの（ＭｇＡＴＰ）が挙げられる。
【００１９】
ＬＫＢ１は、好ましくは、ＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５とともに調製物の中にある。上述のように、ＬＫＢ１は、細胞内のこれらのポリペプチドとの複合体の中に存在すると考えられ、これらのポリペプチドの存在は、ＬＫＢ１活性を強化すると考えられる。ＬＫＢ１は（好ましくは、ＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５も）、例えば、ＬＫＢ１を（好ましくは、ＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５も）天然発現する細胞から精製することができるが、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５のうちの少なくとも１つが組換え体であるほうが好都合である場合もある。
【００２０】
用語「ＡＭＰＫ」は、上に示したように、当業者に周知である。本アッセイにおいて使用するＡＭＰＫ（または他の基質、例えばミエリン塩基性タンパク質）は、組換え体であってもよいし、非組換え体であってもよい。ＡＭＰＫは、細菌発現ＡＭＰＫα１触媒ドメイン（例えば、［４４］に記載されているようなもの）であってもよいし、［４５］および実施例２に記載されているものなどのヘテロトリマー複合体であってもよい。ＡＭＰＫは、天然ＡＭＰＫのアミノ酸配列を有していてもよいし、融合ポリペプチド（例えば、［４５］または実施例２に記載されているようなもの）であるか、融合ポリペプチドを含んでいてもよく、例えば実施例２に記載するような、ＬＫＢ１によるリン酸化または活性化を受ける能力を保持する天然ＡＭＰＫの断片または変異体であってもよい。従って、ＡＭＰＫは、完全長野生型ヒトα１触媒ドメインのトレオニン１７２に相当する位置にトレオニン（またはセリン）残基を保持するＡＭＰＫであることが好ましい。ＡＭＰＫは、Ｔｈｒ１７２がセリン以外の残基によって置換されている、例えばアラニンによって置換されている突然変異体ではないことが望ましい。Ｔｈｒ１７２残基およびこの残基、例えばこの残基のＣ末端およびＮ末端の少なくとも２、３、４、５、６または７つの残基、を含むＴ−ループ配列の少なくとも一部を含むＡＭＰＫから（またはＡＭＰＫサブファミリーメンバーから）誘導することができる断片が、本スクリーニング法での使用に適切な基質である。そのようなペプチド基質の一例を実施例３に記載する。
【００２１】
ヒトＡＭＰＫα１サブユニットの触媒ドメインについてのアクセッションＧＩ番号の例には、次のものが挙げられる。
>gi|5453964|ref|NP_006242.1| LocusLink info protein kinase,AMP-activated,alpha 1 catalytic subunit;AMPK alpha 1;Protein kinase,AMP-activated,catalytic,alpha-1 [Homo sapiens]
gi|20178277|sp|Q13131|AAK1_HUMAN   5’-AMP-activated protein kinase,catalytic alpha-1 chain(AMPK alpha-1 chain)
gi|4115829|dbj|BAA36547.1|  LocusLink info AMP-activated protein kinase alpha-1 [Homo sapiens]
【００２２】
ヒトＡＭＰＫα２サブユニットの触媒ドメインについてのアクセッションＧＩ番号の例には、次のものが挙げられる。
>gi|11493357|emb|CAC17574.1| dJ758N20.1(protein kinase,AMP-activated,alpha 2 catalytic subunit)[Homo sapiens]
>gi|5453966|ref|NP_006243.1| LocusLink info protein kinase,AMP-activated,alpha 2 catalytic subunit;protein kinase,AMP-activated [Homo sapiens]
【００２３】
同様に、用語「ＬＫＢ１」は、当業者に同様に周知である。本アッセイにおいて使用されるＬＫＢ１は、組換え体であってもよいし、非組換え体であってもよい。ＬＫＢ１は、細菌により発現されるものであってもよいが、例えば実施例１および２に記載するような、哺乳動物系で発現されるもの、ならびに／またはＳＴＲＡＤおよび／もしくはＭＯ２５と一緒に、好ましくは両方と一緒に発現されるものが好ましい。ＬＫＢ１は、天然ＬＫＢ１のアミノ酸配列を有していてもよいし、融合ポリペプチド（例えば、実施例に記載するものなど）であってもよく、例えば実施例２で説明するような、ＡＭＰＫを例えばＡＭＰＫのＴｈｒ１７２上でリン酸化または活性化する能力を保持する、天然ＬＫＢ１の断片または変異体であってもよい。従って、本ＬＫＢ１は、活性キナーゼドメインを保持するＬＫＢ１である。ＬＫＢ１の他の領域ではなく、無傷キナーゼドメインを含有するＬＫＢ１の断片が、有用であり得、ＬＫＢ１のこの領域は、プロテインキナーゼ活性を保持するためにおよびＳＴＲＡＤと相互作用するために十分である。本アッセイにおいて使用されるＬＫＢ１は、実施例に記載するようなキナーゼ失活型（ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ）突然変異体ではない。下記でさらに論じるように、ＬＫＢ１が、ＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５と相互作用する能力を保持することは好ましい。
【００２４】
ＬＫＢ１についてのアクセッション番号には、次のものが挙げられる：
AAC15742 Peutz-Jeghers syndrome protein [Homo sapiens]
gi|3063585|gb|AAC15742.1|[3063585]
Q15831 Serine/threonine protein kinase 11(Serine/threonine-protein kinase LKB1) gi|3024670|sp|Q15831|STKB_HUMAN[3024670]
NP_000446 serine/threonine protein kinase 11 [Homo sapiens]
gi|4507271|ref|NP_000446.1|[4507271]
【００２５】
本質的ではないが、ＬＫＢ１ポリペプチドが、残基Ｔｈｒ上での完全長ヒトＡＭＰＫα１の（好ましくは、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５の存在下での）リン酸化もしくはこの領域を含むペプチド基質のリン酸化またはミエリン塩基性タンパク質のリン酸化に関して、完全長ヒトＬＫＢ１の酵素活性の少なくとも３０％を有することが、特に好ましい。ＬＫＢ１ポリペプチドが、残基Ｔｈｒ１７２上での完全長ヒトＡＭＰＫα１の（好ましくは、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５の存在下での）リン酸化またはこの領域を含むペプチド基質でのリン酸化に関して、完全長ヒトＬＫＢ１の酵素活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％を有するならば、さらに好ましい。
【００２６】
同様に、用語「ＳＴＲＡＤ」または「ＭＯ２５」は、当業者に同様に周知であろう。例えば、ＳＴＲＡＤポリペプチド（ＳＴＲＡＤα）は、Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ（２００３）ＥＭＢＯ  Ｊ  ２２（１２），３０６２−３０７２およびＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３０８３０２に記載されている。ヒトＳＴＲＡＤαおよびＳＴＲＡＤβ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＭ１９１４３）配列を図１０に示す。ＭＯ２５ポリペプチドは、Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）；Ｋａｒｏｓ  ＆  Ｆｉｓｈｅｒ（１９９９）およびＮｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）、ならびに、例えば、アクセッション番号ＮＰ＿０５７３７３（ｈｕｍａｎ  ＭＯ２５α）およびＱ９Ｈ９Ｓ４（ｈｕｍａｎ  ＭＯ２５β）に記載されている。ＭＯ２５ポリペプチドのさらなる例は、図２に示されており、さらなるアクセッション番号は、「図の説明」で与える。ＭＯ２５は、このデータベースの他のタンパク質に対して配列相同性を有さないが、最近の研究は、アルマジロ反復ドメインと構造的な関連があることを示している（Ｍｉｌｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。本アッセイにおいて使用されるＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５は、組換え体であってもよいし、非組換え体であってもよい。ＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５は、細菌より発現されたものであってもよいが、例えば実施例１および２に記載するような、哺乳動物系で発現されるものおよび／またはＬＫＢ１と一緒に発現されるもののほうが好ましい。ＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５は、天然ＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５のアミノ酸配列を有してもよいし、融合ポリペプチド（例えば、実施例に記載するようなもの）であってもよく、ＳＴＲＡＤがＭＯ２５およびＬＫＢ１に結合する能力ならびにＭＯ２５がＳＴＲＡＤまたはＬＫＢ１とＳＴＲＡＤの複合体に結合する能力を保持する天然ＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５の断片または変異体であってもよい。ＭＯ２５の少なくともＣ末端は必要とされ得る。ＭＯ２５の長さ全体にわたる配列保存を考慮すると、完全長ＭＯ２５の使用が望ましいとも言える。ＳＴＲＡＤポリペプチドが、（ＭＯ２５を認識すると考えられる）Ｃ末端配列Ｔｒｐ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｐｈｅを有することは好ましいが、これは、本質的ではないと考えられる。ＭＯ２５が、これらの残基を欠くＳＴＲＡＤに、このＳＴＲＡＤがＬＫＢ１に結合しているとき、結合できるからである（実施例１参照）。ＳＴＲＡＤの偽キナーゼドメインが存在することも、これがＭＯ２５の結合に必要とされ得るので好ましい。例えば、ＳＴＲＡＤは、（トランケートされた偽キナーゼドメインを有し、ヒトＬＫＢ１またはＭＯ２５と相互作用しない）完全長ＳＴＲＡＤαのＣ末端８８アミノ酸に対応する残基を欠く断片ではないことが好ましい。完全長ＳＴＲＡＤの使用が望ましいとも言える。
【００２７】
例えばＳＴＲＡＤポリペプチドとの相互作用または結合に関して、例えば前記ポリペプチドの能力は、下記でさらに論じるように、タンパク質／タンパク質相互作用を検出／測定するいずれの方法によっても、測定することができる。適切な方法には、酵母ツーハイブリッド相互作用、共精製、ＥＬＩＳＡ、共免疫沈降、架橋試験、構造試験、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法および表面プラズモン共鳴法が挙げられる。従って、前記ＭＯ２５（例えば、ヒトＭＯ２５α）が、ＳＴＲＡＤポリペプチド（例えばヒトＳＴＲＡＤα）と結合または相互作用できると考えることができるのは、実施例１または実施例２に記載するような、ＥＬＩＳＡ、共免疫沈降もしくは表面プラズモン共鳴法により、または酵母ツーハイブリッド相互作用もしくは共精製法により、前記ＭＯ２５ポリペプチドと前記ＳＴＲＡＤポリペプチドの間の相互作用を検出することができる場合である。
【００２８】
この相互作用が、例えば国際公開公報第００／５６８６４号に記載されているような表面プラズモン共鳴法を用いて検出することができると好ましい。あるポリペプチドを供試表面上に固定化してもよく、例えば、それを、アミノ基によって、ＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐ  ＣＭ５（商標）に、その製造業者の説示に従ってカップリングさせることができ、またはビオチニル化ポリペプチドを、アビジン塗被ＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐ  ＳＡに結合させることができる。その後、他のポリペプチドを（例えば、０〜１．０μＭの間、１０μＭ〜１．０μＭの間、例えば２μＭの濃度で）その表面上に注入し、各場合の定常状態結合を判定する。これらの測定から、Ｋｄを決定することができる。その相互作用が、８μＭ未満、さらに好ましくは５μＭ、２μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭまたは１００ｎＭ未満、例えば約１５０ｎＭのＫｄを有することが好ましい。あるいは、ポリペプチドについてのＫｄを、前記固定化ポリペプチドとの競合で決定することができる。あるポリペプチド（例えば、０．５μＭの濃度のもの）を遊離ポリペプチド（例えば、０μＭ〜３μＭの間の濃度のもの）と混合し、その混合物を前記固定化ポリペプチド上に注入する。各場合の定常状態結合を判定し、そこから相互作用のＫｄを、チェン−プレスコット関係式を用いて決定することができる。あるいは、その相互作用を、表面に結合したタンパク質の質量によって測定される観測応答または相対観測応答によって表してもよい。
【００２９】
ポリペプチドの「変異体」に関していえば、本発明者らは、保存的または非保存的いずれかの、挿入、欠失および置換を含める。詳細には、本発明者らは、そのような変化により、プロテインキナーゼの活性または必要に応じて特定の結合パートナーに結合する能力が実質的に変化しないポリペプチドの変異体を含める。
【００３０】
「保存的置換」に関して言えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せが意図される。
【００３１】
本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の三文字または一文字アミノ酸コードおよび例外的に上記委員会によって定義された記号Ｚａａを使用する。詳細には、Ｘａａは、任意のアミノ酸を表す。少なくとも、本明細書で定義するコンセンサス配列に対応するアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であることが、好ましい。
【００３２】
ポリペプチド変異体が、該当ヒトポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％または７４％、さらにいっそう好ましくは少なくとも７５％、さらになおいっそう好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらに好ましくは、該当ヒトポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、さらにいっそう好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％または９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有すれば、特に好ましい。
【００３３】
プロテインキナーゼ変異体が、ヒトポリペプチドの触媒ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％または７４％、さらにいっそう好ましくは少なくとも７５％、さらになおいっそう好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらに好ましくは該当ヒトアミノ酸配列と少なくとも８３または８５％、さらにいっそう好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％または９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有すれば、さらにいっそう好ましい。
【００３４】
プロテインキナーゼ関連ポリペプチドの触媒ドメインは、例えば下記のように配列比較を用いて、当業者が容易に同定できることは理解されるであろう。プロテインキナーゼは、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｃｅｌｌ，８５，１４９−１５８  および  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｒａｄｚｉｏ−Ａｎｄｚｅｌｍ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２，３４５−３５５に総説されているように、保存触媒コアを示す。このコアは、折り重なって、主として逆平行βシートを含む小さなＮ末端ローブ、および大部分がα−へリックスである大きなＣ末端ローブになっている。
【００３５】
２ポリペプチド間の配列同一性は、適切なコンピュータプログラム、例えば、ウィスコンシン大学遺伝子電算処理グループ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）のＧＡＰプログラムを使用して決定してもよい。同一性は、配列が最適にアラインされているポリペプチドとの関連で計算されることは、理解されるであろう。
【００３６】
あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  プログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）を使用してアラインメントを行ってもよい。使用されるパラメータは次のとおりであり得る。
ファストペアワイズアラインメントパラメータ：Ｋ個組（ワード）サイズ；１、ウインドウサイズ；５、キャップペナルティ；３、対角線頂部の数；５．スコアリング方法：ｘパーセント。
マルチプルアラインメントパラメータ：ギャップオープンペナルティ；１０、ギャップエクステンションペナルティ；０．０５。
スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【００３７】
図２に示すＭＯ２５配列が、上で定義したＭＯ２５変異体の例であることは、理解されるであろう。
【００３８】
例えば完全長ヒトＡＭＰＫα１のＴｈｒ１７２に相当する残基は、配列間の整合を最大にするような方法で完全長ヒトＡＭＰＫα１のものを用いてポリペプチドの配列のアラインメントを行うことによって同定してもよい。このアラインメントは、目視検査によって行ってもよいし、および／または適切なコンピュータプログラム、例えば、そのポリペプチドの同一率も計算することができるであろうウィスコンシン大学遺伝子電算処理グループのＧＡＰプログラムを使用することによって行ってもよい。アラインプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  ＩＩ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，ＡＭ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，ＨＧ  ｅｄｓ）ｐｐ  ３６５−３８９，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ）。従って、このようにして同定される残基は、「等価残基」でもある。
【００３９】
ＡＭＰＫα１のトランケーション形の場合、またはアミノ酸の単純置換が起こった形態では、その「等価残基」を同定するのが容易であることは、理解されるであろう。
【００４０】
本スクリーニングにおいて使用されるポリペプチドは、（スプライス変異体を含む）天然対立遺伝子変異体を含む、哺乳類、好ましくはヒト（あるいは農業において、または家畜もしくはペットとして有用な種、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ）のものであることが好ましい。本スクリーニングにおいて使用されるポリペプチドは、ＧＳＴ部分を含んでいてもよいし、ビオチニル化されていてもよく、当業者に周知のように、または実施例１および２に記載するように、例えば６Ｈｉｓ、ＨＡ、ｍｙｃまたは他のエピトープタグで別様に標識されていてもよい。これは、その（それらの）ポリペプチドの精製および／または検出の際に有用であり得る。
【００４１】
前記化合物の効果は、異なる濃度のその化合物の存在下、例えば、その化合物が非存在であるか、例えば約１００μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．１μＭ、０．０１μＭおよび／または０．００１μＭの濃度で存在する状態で、ＬＫＢ１によるその基質ポリペプチドのリン酸化の速度または度合いを比較することによって判定することができる。
【００４２】
前記化合物は、ＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５とＬＫＢ１の相互作用の効果を模倣することができる。ＬＫＢ１に対するＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５の効果を模倣する化合物は、その基質ポリペプチド（例えば、ＡＭＰＫもしくはサブファミリーメンバーまたはそれらいずれかの断片）のリン酸化の速度または程度を増大させることができる。
【００４３】
「ＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５とＬＫＢ１の相互作用の効果を模倣する」とは、その化合物が、ＬＫＢ１に対して、例えばそのプロテインキナーゼ活性または安定性に対して、量的または質的効果を有する、すなわち、実施例１および２で論じるように、そのプロテインキナーゼに対する、例えばそのプロテインキナーゼ活性または安定性に対する、ＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５の効果と同じ効果を有することを意味する。例えば、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５は、ＬＫＢ１が、例えばＡＭＰＫまたはミエリン塩基性タンパク質をリン酸化する速度を上昇させると考えられ、ＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５の擬態は、ＬＫＢ１が、（ＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５非存在下で）、基質ポリペプチド、例えばＡＭＰＫをリン酸化する速度を上昇させることができる。
【００４４】
ＡＭＰＫサブファミリーは、実施例２で論じる（［４１］も参照）。これらには、以下のポリペプチドが挙げられる。
MELK(Heyer et al.,1999 Expression of Melk,a new protein kinase,during early mouse development.Dev Dyn,215,344-351;Heyer et al.,1997 New member of theSnf1/AMPK kinase family,Melk,is expressed in the mouse egg and preimplantation embryo.Mol Reprod Dev,47,148-156.)
QIK(Xia et al.,2000 The new serine-threonine kinase,Qik,is a target of the Qin oncogene.Biochem Biophys ResCommun,276,564-570)
SIK(Coyle et al.,2003 Sam68 enhances the cytoplasmic utilization of intron-containing RNA and is functionally regulated by the nuclear kinase Sik/BRK.Mol Cell Biol,23,92-103;Derry et al.,2003 Altered localization and activity of the intracellular tyrosine kinase BRK/Sik in prostate tumor cells.Oncogene,22,4212-4220;Derry et al.,2000 Sik(BRK)phosphorylates Sam68 in the nucleus and negatively regulates its RNA binding ability.Mol Cell Biol,20,6114-6126;Feldman et al.,2000 The salt-inducible kinase,SIK,is induced by depolarization in brain.J Neurochem,74,2227-2238;Horike et al.,2002 Roles of several domains identified in the primary structure of salt-inducible kinase(SIK).Endocr Res,28,291-294.;Lin et al.,2000 SIK(Salt-inducible kinase):regulation of ACTH-mediated steroidogenic gene expression and nuclear/cytosol redistribution.Endocr Res,26,995-1002.;Llor et al.,1999 BRK/Sik expression in the gastrointestinal tract and in colon tumors.Clin Cancer Res,5,1767-1777.;Vasioukhin and Tyner,1997 A role for the epithelial-cell-specific tyrosine kinase Sik during keratinocyte differentiation.Proc Natl Acad Sci U S A,94,14477-14482.;Wang et al.,1999 Cloning of a novel kinase(SIK)of the SNF1/AMPK family from high salt diet-treated rat adrenal.FEBS Lett,453,135-139)。
【００４５】
他のファミリーメンバーには、ＮｕａＫ１、ＮｕａＫ２、ＢｒｓＫ１、ＢｒｓＫ２およびＱＳＫが挙げられるが、これらについては殆ど知られていない。本発明者らは、ＬＫＢ１は、ＡＭＰＫサブファミリーの中のこれらの他のプロテインキナーゼをリン酸化および活性化することがきると考える。他のファミリーメンバー（このキナーゼ樹のうち、前述のファミリーメンバーに隣接する枝に位置するもの）には、ＭＡＲＫ１、ＭＡＲＫ２、ＭＡＲＫ３およびＭＡＲＫ４が挙げられる。例えば、Manning et al(2002)The protein kinase complement of the human genome Science 298,1912-1934参照。MARK3は、PARIAまたはC-TAK1としても知られている(Peng et al(1998)Cell Growth Differ 9,197-208;Spicer et al(2003)Oncogene 22,4752-4756)。
【００４６】
メトホルミンまたはその類似体は、これらのキナーゼのうちの一つの活性化により、ならびにＡＭＰＫにより、作用し続けることができる。このようなサブファミリーメンバーまたはその断片またはそのような断片の融合体（例えば、上記の、および実施例３で論じるような、Ｔ−ループペプチド）は、本発明の第一の態様のスクリーニング方法での使用に適切な基質であり得る。
【００４７】
本発明の方法により同定される化合物は、異なる基質、例えばＡＭＰＫサブファミリーの異なる天然メンバーを異なる程度までリン酸化するプロテインキナーゼの能力を修飾することができる。従って、ＡＭＰＫ活性の修飾に使用するための化合物をスクリーニングする際、ＡＭＰＫまたはその断片を基質として使用することは、本質的ではないが、好ましい。同様に、特定のＡＭＰＫサブファミリーメンバーの活性の修飾に使用するための化合物をスクリーニングする際、このサブファミリーメンバーまたはその断片を基質として使用することは、本質的ではないが好ましい。
【００４８】
本方法は、例えばＡＭＰＫまたはサブファミリーメンバーの活性化を促進する化合物の同定に有用である。ＡＭＰＫまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバーの活性化を誘発する化合物は、糖尿病および肥満の治療に有用であり得る。そのような化合物は、メトホルミンまたはその類似体の活性を模倣することができ、より高い効能の化合物であり得る。
【００４９】
ＬＫＢ１は、細胞成長および増殖を阻害する腫瘍サプレッサプロテインキナーゼでもある。本明細書に提示する結果は、ＬＫＢ１の腫瘍抑制機能が、ＬＫＢ１がＡＭＰＫおよび／または上に示した一つまたは複数のサブファミリーメンバーをリン酸化することならびにＡＭＰＫおよび／または上に示した一つまたは複数のサブファミリーメンバーの活性化を誘発することによって媒介され得ることを示している。従って、これらのポリペプチドは、新規腫瘍サプレッサプロテインキナーゼであり得、これらのプロテインキナーゼの一つまたは複数を活性化する化合物は、癌の治療に有用であり得る。
【００５０】
ＡＭＰＫまたはＡＭＰＫファミリーメンバーのリン酸化または活性化を促進する化合物は、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ−ＭＯ２５複合体を安定させることにより作用することができる。（上記のようなプロテインキナーゼ活性アッセイに基づく選択の前にまたは後にまたは代わりに）そのような安定化効果をスクリーニングすることは有用であり得る。例えば、そのようなスクリーニングは、例えば上記のような、分子相互作用を評価するための方法を使用して、複合体の形成または安定性に対する化合物の効果を評価することを含んでもよい。例えば、共免疫沈降または共精製法を使用してもよいし、レポーター／酵母ツーハイブリッド系を使用してもよい。複合体は、例えば、実施例１および２で説明するようなＬＫＢ１とＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５とが共発現される細胞からの材料において、（例えば、蛍光タンパク質、例えば緑色、青色または黄色蛍光タンパク質（当業者に周知のような、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）を使用する）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法を使用して検出することもできる。
【００５１】
上記化合物は、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５のうちの二つ以上の間の接触領域に、または付近に結合するものであってもよいし、別の領域に結合し、例えばその複合体を安定化（または脱安定化）する配座またはアロステリック変化を誘導するか、その形成を促進する（または阻害する）ものであってもよい。前記化合物は、ＬＫＢ１またはＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５に（または全体としてその複合体に）結合して、アロステリック効果によりＬＫＢ１プロテインキナーゼ活性を増大させることができる。このアロステリック効果は、ＬＫＢ１活性の天然調節に関与するアロステリック効果であり得る。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤおよび組換えＭＯ２５を含む精製調製物を提供する。この調製物は、組換えＬＫＢ１および／または組換えＳＴＲＡＤを含むことができる。この調製物は、本発明の第一の態様のアッセイにおいて有用であり得る。
【００５３】
「精製された」とは、その調製物が、形成されたものが存在する状態で、他の成分、例えば組換え細胞の他の成分から少なくとも部分的に分離されたことを意味する。使用することができる精製方法の例は実施例に記載する。
【００５４】
本調製物は、実質的に純粋であってよい。「実質的に純粋」に関していえば、本発明者らは、前記ポリペプチド（複数を含む）が、他のタンパク質を実質的に含まないことを意味する。従って、本発明者らは、タンパク質含量の少なくとも３０重量％を前記ポリペプチドとして含む、ならびにタンパク質含量の好ましくは少なくとも５０重量％、さらに好ましくは少なくとも７０重量％、さらにいっそう好ましくは少なくとも９０重量％および最も好ましくは少なくとも９５重量％が前記ポリペプチドである、あらゆる組成物を含める。
【００５５】
従って、本発明は、前記ポリペプチドおよび不純物を含む組成物も包含し、この場合の不純物は、その組成物の７０重量％未満、好ましくはその組成物の５０重量％未満、さらに好ましくはその組成物の３０重量％未満、さらにいっそう好ましくはその組成物の１０重量％未満、および最も好ましくはその組成物の５重量％未満を構成する。
【００５６】
本発明は、エクスビボで他の成分と併せたときに実質的に純粋である前記ポリペプチドも包含する。前記他の成分とは、前記ポリペプチドが見出される細胞において見出される全ての成分というわけではない。
【００５７】
本発明のさらなる態様は、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤおよび過剰発現または組換えＭＯ２５を発現することができる細胞を提供する。この細胞は、ＭＯ２５をコードする組換え核酸、および／またはＬＫＢ１をコードする組換え核酸、および／またはＳＴＲＡＤをコードする組換え核酸を含むことができる。この細胞は、例えば転写活性化因子の配列特異的ターゲッティング法を使用して、ＭＯ２５をコードする内在性配列からＭＯ２５を過剰発現することが可能であり得る。この細胞は、原核細胞であってもよいし、真核細胞であってもよい。例えば、真核細胞、例えば昆虫、酵母または哺乳動物細胞、例えばヒト細胞であってもよい。適切な細胞の例は、例えば実施例に記載する。
【００５８】
前記組換え核酸は、好ましくは、コードしたポリペプチドの発現に適切なものである。組換え核酸は、発現ベクターの形態であってもよい。所与のポリペプチドの発現に適切な組換えポリヌクレオチドは、当業者に周知であり、それらの例は、実施例１および２に記載する。
【００５９】
本発明のさらなる態様は、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤおよび過剰発現または組換えＭＯ２５を含む細胞を提供する。この細胞は、組換えＬＫＢ１および／または組換えＳＴＲＡＤを含むことができる。この細胞は、本発明の上述の態様の細胞であってもよい。この細胞は、ＭＯ２５を過剰発現するように、または組換えＭＯ２５を発現するように変性された等価細胞より少なくとも１．１、１．２、１．５、２、３、５、１０または２０倍多くＭＯ２５（または、必要に応じて、ＬＫＢ１もしくはＳＴＲＡＤ）を含むことができる。
【００６０】
「発現に適切な」とは、そのポリヌクレオチドが、ポリペプチド、例えばＲＮＡを形成するように翻訳することができるポリヌクレオチドであること、または本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（好ましくは、ＤＮＡである）が、プラスミドなどの発現ベクターに適切な配向で挿入されており、発現の読み取り枠を修正することを意味する。ポリヌクレオチドは、いずれかの所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結させることができ、そのような制御因子は、発現ベクターに組み込むことができる。
【００６１】
哺乳動物／真核細胞における複製に適切なベクターの特性は、当業者に周知であり、それらの例は、下記に与える。ベクターが、原核細胞と真核細胞の両方における複製に適切なことは、理解されよう。
【００６２】
ポリヌクレオチド、特にＤＮＡを、例えば相補性付着端により機能するようにベクターに結合する様々な方法が開発されている。適切な方法は、Sambrook et al(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NYに記載されている。
【００６３】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの変性に望ましい方法は、Saiki et al(1988)Science 239,487-491によって開示されているようなポリメラーゼ連鎖反応の使用である。この方法を使用して、例えば適切な制限部位において工学することにより適切なベクターにＤＮＡを導入することができ、または当分野において知られているような他の有用な方法でＤＮＡを変性することができる。
【００６４】
本方法において、酵素により増幅することができるＤＮＡは、２つの特異的プライマーに隣接し、増幅されたＤＮＡにこれらのプライマー自体が組み込まれることとなる。前記特異的プライマーは、当分野において知られている方法を用いる発現ベクターへのクローン化に使用することができる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有し得る。
【００６５】
その後、このＤＮＡ（または、レトロウイルスベクターの場合には、ＲＮＡ）を適切な宿主において発現させて、本発明の化合物を含むポリペプチドを生じさせる。このように、本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡを、本明細書にある技法を考慮して適切に修正した公知の技法に従って使用して、発現ベクターを構築することができ、その後、それを使用して、適切な宿主細胞を、本発明のポリペプチドを発現および生産するように形質転換する。このような技法には、１９８４年４月３日発行のＲｕｔｔｅｒらの米国特許第４，４４０，８５９号、１９８５年７月２３日発行のＷｅｉｓｓｍａｎの同第４，５３０，９０１号、１９８６年４月１５日発行のＣｒｏｗｌの同第４，５８２，８００号、１９８７年６月３０日発行のＭａｒｋらの同第４，６７７，０６３号、１９８７年７月７日発行のＧｏｅｄｄｅｌの同第４，６７８，７５１号、１９８７年１１月３日発行のＩｔａｋｕｒａらの同第４，７０４，３６２号、１９８７年１２月１日発行のＭｕｒｒａｙの同第４，７１０，４６３号１９８８年７月１２日発行のＴｏｏｌｅ，Ｊｒ．らの同第４，７５７，００６号１９８８年８月２３日発行のＧｏｅｄｄｅｌらの同第４，７６６，０７５号、および１９８９年３月７日発行のＳｔａｌｋｅｒらの同第４，８１０，６４８号に開示されているものが挙げられる。これらの特許は、全て、本明細書に参考として組み込まれている。
【００６６】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ（または、レトロウイルスベクターの場合には、ＲＮＡ）は、適切な宿主に導入するために、多種多様な他のＤＮＡ配列に接合することができる。この随伴ＤＮＡは、宿主の性質、宿主へのＤＮＡの導入の仕方、およびエピソームの維持または組込みが望まれるかどうかに依存する。
【００６７】
一般に、このＤＮＡは、プラスミドなどの発現ベクターに適切な配向で挿入され、発現の読み取り枠を修正する。必要な場合には、所望の宿主により認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列にそのＤＮＡを結合することができるが、そのような制御因子は、一般に発現ベクターで利用することができる。その後、そのベクターを標準的な技法によって宿主に導入する。一般に、全ての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。従って、形質転換された宿主細胞の選択が必要であろう。一つの選択法は、抗生物質抵抗性などのその形質転換細胞において選択可能な形質をコードするＤＮＡ配列を、いずれかの必要制御要素とともに発現ベクターに組み込むことを含む。あるいは、そのような選択可能な形質のための遺伝子が所望の宿主細胞を共形質転換するために使用される別のベクターにあってもよい。
【００６８】
次に、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞を、本明細書に開示する技法を考慮して、十分な時間、および当業者に知られている適切な条件下で培養してそのポリペプチドの発現を可能にし、その後、それを回収することができる。
【００６９】
多数の発現系が知られており、それらには、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、酵母（例えば、サッカロミセス−セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、糸状菌（例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞が挙げられる。
【００７０】
前記ベクターは、たとえそのベクターが、他の非原核細胞型における発現に使用しなければならなかったとしても、原核生物の繁殖のための原核生物レプリコン、例えばＣｏｌＥ１  ｏｒｉを含む。前記ベクターは、遺伝子の発現（転写および翻訳）を、それで形質転換される大腸菌などの細菌宿主細胞において検出することができる原核生物プロモータなどの適切なプロモータも含むことができる。
【００７１】
プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の発生を可能にするＤＮＡ配列によって形成される発現制御要素である。典型的な細菌宿主に適合可能なプロモータ配列を、典型的には本発明のＤＮＡセグメントの挿入に好都合な制限部位を含有するプラスミドベクターに備え付ける。
【００７２】
典型的な原核生物ベクタープラスミドは、Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国、カリフォルニア州、リッチモンド）から入手できるｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、ならびに米国、ニュージャージー州、ピスカタウェーのＰｈａｒｍａｃｉａから入手できるｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３である。
【００７３】
典型的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドは、米国、ニュージャージー州、ピスカタウェーのＰｈａｒｍａｃｉａから入手できるｐＳＶＬである。このベクターは、ＳＶ４０後期プロモータを使用してクローン化遺伝子を発現させ、その最高発現レベルは、ＣＯＳ−１細胞などのＴ抗原産出細胞において見出される。
【００７４】
誘導性哺乳動物発現ベクターの一例は、ｐＭＳＧであり、これもＰｈａｒｍａｃｉａから入手できる。このベクターは、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲ（長い末端反復）の糖質コルチコイド誘導性プロモータを使用して、クローン化遺伝子を発現させる。
【００７５】
有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、一般に、米国、ＣＡ  ９２０３７、ラ・ホーヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３，ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は、酵母組込み型プラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母動原体プラスミド（ＹＣｐ）である。
【００７６】
宿主細胞は、原核細胞であってもよいし、真核細胞であってもよい。細菌細胞は、好ましい原核宿主細胞であり、一般に、大腸菌株、例えば、米国、メリーランド州、ベセズダのＢｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から入手できる大腸菌株ＤＨ５および米国、メリーランド州、ロックヴィルの米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手できるＲＲ1などである（ＡＴＣＣ番号３１３４３）。好ましい真核宿主細胞には、酵母、昆虫および哺乳動物細胞、好ましくは、脊椎動物細胞、例えばマウス、ラット、サルまたはヒト線維芽細胞系統からのものが挙げられる。酵母宿主細胞には、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げられ、これらは、一般に、米国、ＣＡ  ９２０３７、ラ・ホーヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手できる。好ましい哺乳動物宿主細胞には、ヒト胎児腎２９３細胞（実施例１参照）；ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手できるＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３；およびＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手できるサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞であり、これらをバキュロウイルス発現ベクターでトランスフェクトすることができる。
【００７７】
ＤＮＡ構築物での適切な細胞宿主の形質転換は、周知の方法によって遂行することができ、一般に、これらの方法は、使用するベクターのタイプに依存する。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Cohen et al(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69,2110 および Sambrook et al(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NYを参照のこと。酵母細胞の形質転換は、Sherman et al(1986)Methods In Yeast Genetics,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NYに記載されている。Beggs(1978)Nature 275,104-109の方法も有用である。脊椎動物細胞に関して、そのような細胞のトランスフェクションに有用な試薬、例えばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、または米国、ＭＤ  ２０８７７、ゲーサーズバーグのＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．から入手できる。
【００７８】
エレクトロポレーションも、細胞の形質転換および／またはトランスフェクションに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞および脊椎動物細胞の形質転換について当分野において周知である。
【００７９】
例えば、本明細書に参考として組み込まれているLuchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646に記載されている方法によって、多数の細菌種を形質転換することができる。２５：ＦＤでｃｍあたり６２５０Ｖを使用する２．５  Ｘ  ＰＥＢに懸濁させたＤＮＡ−細胞混合物のエレクトロポレーション後、非常に多数の形質転換体が一貫して回収される。
【００８０】
エレクトロポレーションによる酵母の形質転換方法は、Becker & Guarente(1990)Methods Enzymol. 194, 182に開示されている。
【００８１】
形質転換に成功した細胞、すなわち、本発明のＤＮＡ構築物を含有する細胞は、周知の技法によって同定することができる。例えば、本発明の発現構築物の導入によって得られた細胞を成長させて、本発明のポリペプチドを生産する。細胞を回収し、溶解し、Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503またはBerent et al (1985) Biotech. 3, 208によって説明されたものなどの方法を用いてそれらのＤＮＡ内容をＤＮＡの存在について試験することができる。
【００８２】
組換えＤＮＡの存在についての直接アッセイに加えて、その組換えＤＮＡがタンパク質の発現を方向づけることができる場合には、成功した形質転換を、周知の免疫学的方法によって確認することができる。例えば、発現ベクターでの形質転換に成功した細胞は、適切な抗原性を示すタンパク質を生産する。形質転換されたと推測される細胞のサンプルを回収し、適切な抗体を使用してそのタンパク質についてアッセイする。
【００８３】
このように、形質転換宿主細胞それら自体に加えて、本発明は、栄養培地中の、それらの細胞の培養物、好ましくは単一クローン性（クローン的に均一な）培養物、または単一クローン性培養物由来の培養物も考慮している。
【００８４】
本発明の調製物を製造するための本発明の方法のさらなる態様は、本発明の細胞からその調製物を精製する工程を含む。宿主細胞の培養方法および組換えタンパク質の単離方法は、当分野において周知である。適切な精製法の例は実施例に記載する。例えば、当業者に周知であろうように、および実施例で説明するように、親和性試薬を使用する精製を助長するためにその調製物の一つまたは複数の成分を標識してもよい。例えば実施例に記載するような、クロマトグラフ法を使用してもよい。
【００８５】
本発明のさらなる態様は、本発明の上述の態様の方法によって得られるまたは得ることができる調製物を提供する。この調製物は、例えば、標識されたＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５を含むことができる。ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤ：ＭＯ２５の比率は、例えば実施例に記載するような技法を用いて測定すると、１：１：１であり得る。決定された比率が、その調製物を生じる際に使用される方法の詳細に依存して変化し得ることは、理解されるであろう。この調製物は、実施例に記載するように、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５を含む複合体を含むことができる。
【００８６】
本発明の第一の態様の方法は、本発明の第二の態様の調製物の形態のＬＫＢ１；または上に示したような方法によって得られるもしくは得ることができる調製物もしくは複合体の形態のＬＫＢ１；または本発明の細胞内のＬＫＢ１を用いて行うことができる。
【００８７】
上記ポリペプチドは、当分野において周知の方法ならびに下記および実施例１または２に記載するような方法によって、例えば、分子生物学的方法またはペプチド自動化学合成法を用いて作製することができる。
【００８８】
ペプチド模倣化合物も有用であることは、理解されるであろう。従って、「ポリペプチド」または「ペプチド」に関して言えば、本発明者らは、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって接続されている分子ばかりでなく、ペプチド結合が逆転している分子も含める。そのようなレトロ逆転ペプチド模倣体は、例えば、本明細書に参考として組み込まれているMeziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記載されているものなどの、当分野において知られている方法を使用して作製することができる。このアプローチは、主鎖に関わる変化を含有するが、副鎖の配向の変化は含有しない擬似ペプチドの作成を含む。Meziere et al (1997)は、少なくともＭＨＣクラスＩＩおよびヘルパーＴ細胞の応答については、これらの擬似ペプチドが有用であることを示している。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロ逆転ペプチドの方が、はるかに耐タンパク質分解性である。
【００８９】
同様に、このペプチド結合は、アミノ酸残基のＣα原子間の間隔を維持する適切なリンカー成分を使用すれば、全体的に分配することができる。そのリンカー成分が、ペプチド結合と同じ電荷分布および実質的に同じ二次元性を有すれば、特に好ましい。
【００９０】
そのペプチドは、エキソ形タンパク分解性消化（ｅｘｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を受けやすい性質を弱めることに役立つように、そのＮ末端またはＣ末端で好都合にブロックできることは、理解されるであろう。
【００９１】
従って、ＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５ポリペプチドが、ペプチド模倣化合物であり得ることは、理解されるであろう。
【００９２】
本発明のさらなる態様は、細胞内ＬＫＢ１活性を修飾するための化合物を同定する方法を提供するものであり、この方法は、（１）供試化合物が、本発明の上述のいずれかの態様に関連して定義した調製物または複合体または細胞のＬＫＢ１プロテインキナーゼの活性を修飾する（例えば増大させる）かどうかを判定する工程、および（２）前記ＬＫＢ１プロテインキナーゼ活性を修飾する化合物を選択する工程を含む。ＬＫＢ１プロテインキナーゼ活性は、例えばミエリン塩基性タンパク質を基質として使用して、あるいはＡＭＰＫもしくはＡＭＰＫサブファミリーメンバーまたはそれらの断片（上記の、および実施例３において論じるようなもの）を基質として使用して測定することができる。ＬＫＢ１プロテインキナーゼ活性を修飾する、例えば増大させる化合物は、医薬、例えば癌を治療するための医薬において有用であり得る。
【００９３】
この方法において同定される化合物は、それら自体、薬物として有用である場合もあり、またはより効能のある化合物を設計および合成するためのリード化合物を意味する場合もある。
【００９４】
前記化合物は、化合物を同定するための上記方法の各々のための薬物様化合物または薬物様化合物を開発するためのリード化合物である場合もある。前記方法が、当業者に周知のような、医薬化合物または薬物を開発する際のスクリーニングアッセイとして有用であり得ることは、理解されるであろう。
【００９５】
用語「薬物様化合物」は当業者に周知であり、ならびに医薬での、例えば医薬品中の活性成分としての、使用に適するようにすることができる特徴を有する化合物という意味を含む。従って、例えば、薬物様化合物は、有機化学の技法により、あまり好ましくないが分子生物学または生化学の技法により合成することができる分子であり得、好ましくは、５０００ダルトン未満であり得る小分子である。薬物様化合物は、特定のタンパク質（単数または複数）との選択的相互作用の特徴、ならびに生物利用可能であるおよび／または細胞膜を貫通することができる特徴を示すが、これらの等張が本質的でないことは、理解されるであろう。
【００９６】
用語「リード化合物」は、同様に、当業者に周知であり、ならびに化合物が、それ自体は（例えば、所定の標的に対して弱い効能しかないため、作用が非選択的であるため、不安定であるため、合成が難しいため、または生物学的利用能が劣るため）薬物としての使用に適さないが、より望ましい特性を有し得る他の化合物の設計の出発点となることができるという意味を含むことができる。
【００９７】
インビボでプロテインキナーゼの活性を修飾することができる化合物を同定することが望ましいことは、理解されるであろう。従って、この方法で使用される試薬および条件は、例えば前記ＬＫＢ１と例えばＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５ポリペプチドの間の相互作用が、ヒトＬＫＢ１とヒトＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５の間の相互作用と実質的に同じになるように選択され得ることは、理解されるであろう。その化合物は、ＬＫＢ１に結合することができるか、ＳＴＲＡＤもしくはＭＯ２５に結合することができることは、理解されるであろう。
【００９８】
本アッセイのスクリーニング方法において、またはプロテインキナーゼ、例えばＬＫＢ１、のプロテインキナーゼ活性を修飾する化合物の能力を測定することができる他のアッセイにおいて試験される化合物は、分子モデリング技術を使用して、例えばコンピュータ技術を使用して、選択されたおよび／または設計（修飾を含む）された化合物であり得る。その選択または設計された化合物を、（まだ合成されていない場合は）合成し、ＬＫＬＢ１に対するその効果、例えばそのプロテインキナーゼ活性に対する効果を試験することができる。その化合物は、本発明のスクリーニング方法で試験することができる。
【００９９】
高速処理操作が可能なスクリーニングアッセイが特に好ましいであろうことは、理解されるであろう。例には、説明した細胞ベースのアッセイ、およびタンパク質−タンパク質結合アッセイを挙げることができる。さらなる例は、当業者に周知のようなＳＰＡベースの（シンチレーション近接アッセイ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））システムである。ポリペプチド／ポリペプチド相互作用を検出する他の方法には、限外濾過とイオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法または他の物理的方法および分析方法が挙げられる。当業者に周知の例えば蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）法を使用してもよく、この方法では、２つの蛍光標識単位の結合を、それらが互いに極めて近接している場合、その蛍光標識の相互作用を測定することによって測定することができる。
【０１００】
本発明のさらなる態様は、本発明のスクリーニング方法によって同定されるまたは同定することができる化合物である。
【０１０１】
本発明のなお、さらなる態様は、医薬において使用するための本発明の化合物である。
【０１０２】
本化合物は、希釈剤および担体の標準的な無菌、非発熱性調合物中、あらゆる適切な方法で投与、通常は、非経口投与、例えば静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与または膀胱内投与することができる。本化合物は、局所投与することもできる。本化合物は、例えば注射により、限局的に投与することもできる。その治療は、一回の投薬からなる場合もあり、またはある期間にわたる複数回の投薬からなる場合もある。本化合物は、抗癌剤として有用であり得、または例えば糖尿病もしくは肥満の治療に有用であり得る。
【０１０３】
本発明の化合物は、単独で投与することができるが、一つまたは複数の許容できる担体とともに医薬調合物として与えるほうが好ましい。担体（複数を含む）は、本発明の化合物と相溶性であり、その受容者に対して有害でないという意味で「許容できる」ものでなければならない。典型的に、担体は、無菌であり発熱性物質を含有しない水または食塩水であろう。
【０１０４】
従って、本発明は、本発明のスクリーニング方法によって同定されるまたは同定することができる化合物および医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物も提供する。
【０１０５】
本発明のさらなる態様は、ＬＫＢ１またはＬＫＢ１をコードする組換えポリヌクレオチド、ＳＴＲＡＤまたはＳＴＲＡＤをコードする組換えポリヌクレオチドおよびＭＯ２５またはＭＯ２５をコードする組換えポリヌクレオチドを含むパーツのキットを提供する。本発明のさらなる態様は、（１）ＡＭＰＫもしくはＡＭＰＫサブファミリーメンバー、またはＡＭＰＫもしくはＡＭＰＫサブファミリーメンバー（上記のように、または実施例３において論じるようにこれらの断片を含む）をコードする組換えポリヌクレオチド、および（２）本発明の上述の態様に関連して定義したようなパーツのキット、または本発明の調製物もしくは複合体もしくは細胞を含む、パーツのキットを提供する。このようなキットは、例えば本発明の第一の態様のスクリーニング方法において有用であり得る調製物または複合体の形成に有用であり得る。前記組換えポリヌクレオチド（複数を含む）は、（例えば、上記のように）発現ベクターの中にあってもよいし、または（あまり望ましくないが）インビトロでの発現に有用であり得る。
【０１０６】
本発明のさらなる態様は、（１）その細胞型が、ＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５を発現するものであるかどうかを判定する工程を含む、ＬＫＢ１を過剰発現する細胞型を選択する工程、およびその選択された細胞型においてＬＫＢ１を過剰発現させる工程を含む、ＬＫＢ１を過剰発現させる方法を提供する。その細胞型がＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５を発現するかどうかを判定するための方法は、当業者に周知であり、そのような方法の例は実施例に記載する。あるいは、細胞型は、ＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５を発現することが既にわかっているものであってもよい。そのような細胞の例には、２９３、ＨｅＬａ、Ｇ３６１およびＲａｔ２細胞が挙げられる。ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αは、分析された殆どの細胞において良好なレベルで発現される。
【０１０７】
本発明のさらなる態様は、（１）本発明の上述の態様の方法を用いて細胞内でＬＫＢ１を過剰発現させる工程、および（２）その細胞からＬＫＢ１を調製する工程を含む、ＬＫＢ１の調製方法を提供する。これには、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５とともに調製物または複合体中にあるＬＫＢ１の調製が含まれる。ＬＫＢ１の調製に適切な方法は、実施例で説明する。
【０１０８】
ＬＫＢ１の過剰発現は、例えば真核細胞において、成長停止を導くことがある。従って、例えば実施例で説明するように一過性発現系を使用して、または当業者に周知であるように調節（誘導性）発現系を使用してＬＫＢ１を発現することが必要な場合もある。
【０１０９】
本発明のさらなる態様は、（１）供試推定結合パートナーの少なくともＣ末端３アミノ酸のアミノ酸配列を提供する工程、（２）Ｃ末端アミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｐｈｅを有する推定結合パートナーを選択する工程を含む、ＭＯ２５についての推定結合パートナーを同定する方法を提供する。この方法は、例えば上で示したような分子相互作用の評価方法を用いて、選択された推定結合パートナーがＭＯ２５に結合することを判定する工程をさらに含むことができる。モチーフＴｒｐ−Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｐｈｅが、ＭＯ２５とＳＴＲＡＤの間の相互作用に関与すると考えられる。
【０１１０】
本発明のさらなる態様は、（１）ＰＪＳ（ポイツ−ジェガース症候群）に罹患している少なくとも１人の患者においてＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５アイソフォームをコードする遺伝子の配列を調査する工程；（２）前記患者の配列とＰＪＳに罹患していない個体からの同等の配列の間の差を同定する工程を含む、ＰＪＳに関連した遺伝子差を同定する方法を提供する。ＬＫＢ１とＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５の関連ならびにＬＫＢ１欠失とＰＪＳの関連は、ＭＯ２５またはＳＴＲＡＤの欠損もＰＪＳに関与し得ることを示唆している。候補遺伝子における突然変異を同定する技法、および突然変異体が、疾病と関連しているのか、そのような関連がないのかを調査する技法は、当業者に周知であろう。
【０１１１】
本発明のさらなる態様は、個体がＰＪＳに罹患しやすいかどうかを判定するための方法を提供し、この方法は、供試個体が、本発明の上述の態様の方法によりＰＪＳと関連付けられると同定される遺伝子差を有するかどうかを判定する工程を含む。ＰＪＳに罹患している個体が、本発明の上述の態様の方法によりＰＪＳと関連付けられると同定された遺伝子差を有するかどうか判定して、如何なる治療が適するかを判定することも有用であり得る。例えば、ＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５の欠損を有すると判明した患者を、ＳＴＲＡＤもしくはＭＯ２５を使用して、またはＳＴＲＡＤもしくはＭＯ２５をその必要がある細胞内で発現させる遺伝子構築物を使用して、治療することができる。
【０１１２】
従って、本発明は、医薬において使用するためのＳＴＲＡＤもしくはＭＯ２５またはＳＴＲＡＤもしくはＭＯ２５をコードする組換えポリヌクレオチドを提供する。本発明のさらなる態様は、癌、ＰＪＳ、糖尿病または肥満を治療するための医薬品の製造におけるＳＴＲＡＤもしくはＭＯ２５またはＳＴＲＡＤもしくはＭＯ２５をコードする組換えポリヌクレオチドの使用を提供する。この組換えポリヌクレオチドは、当業者に周知のような遺伝子療法ベクター、例えばウイルス遺伝子療法ベクターの形態であってもよい。
【０１１３】
メトホルミンまたはフェンホルミンまたはＡＩＣＡリボシドに類似したメカニズムによってＡＭＰＫまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバーを活性化する化合物を同定するための本発明の方法の更なる態様では、本発明の調製物または複合体または細胞によるＡＭＰＫまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバーの活性化に対する供試化合物の効果を、ＡＭＰＫまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバーの活性化に対するメトホルミンまたはフェンホルミンまたはＡＩＣＡリボシドの効果と比較し、類似した効果を有する化合物を選択する。このような方法は、化合物がメトホルミンまたはフェンホルミンまたはＡＩＣＡリボシドより効能があるかどうかを判定する際に有用であり得る。
【０１１４】
本発明のさらなる態様は、糖尿病または肥満を治療するための医薬品の製造におけるＡＭＰＫサブファミリーメンバー（ＡＭＰＫ以外）またはＡＭＰＫサブファミリーメンバー（ＡＭＰＫ以外）をコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【０１１５】
本発明のさらなる態様は、アミノ酸配列ＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹ  もしくはＦＧＮＦＹＫＳＧＥＰＬＳＴＷＣＧＳＰＰＹもしくはＬＳＮＭＭＳＤＧＥＦＬＲＴＳＣＧＳＰＮＹもしくはＭＡＳＬＱＶＧＤＳＬＬＥＴＳＣＧＳＰＨＹもしくはＦＳＮＥＦＴＶＧＧＫＬＤＴＦＣＧＳＰＰＹもしくはＡＫＰＫＧＮＫＤＹＨＬＱＴＣＣＧＳＬＡＹ；または下線が引かれている残基以外のいずれかの位置で一から四置換されている、および／もしくは下線が引かれている残基で保存的置換されている前記配列；または下線が引かれている残基を含む前記配列の少なくとも１０の隣接残基を含む、ＬＫＢ１のためのペプチド基質を提供する。このペプチド基質は、典型的には約３０または２５未満の残基、例えば、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０の残基を有する。この範囲内で、長いペプチドほどＬＫＢ１複合体に対して良好な親和性を有し得るが、短いペプチドほど水性液への溶解性が良好であり得る。
【０１１６】
詳細には、ＬＫＢ１のためのペプチド基質はアミノ酸ＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹまたはＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹＲＲＲまたはＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹまたはＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹＲＲＲまたはＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹまたはＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹＲＲＲまたはＦＧＮＦＹＫＳＧＥＰＬＳＴＷＣＧＳＰＰＹまたはＦＧＮＦＹＫＳＧＥＰＬＳＴＷＣＧＳＰＰＹＲＲＲまたはＬＳＮＭＭＳＤＧＥＦＬＲＴＳＣＧＳＰＮＹまたはＬＳＮＭＭＳＤＧＥＦＬＲＴＳＣＧＳＰＮＹＲＲＲまたはＭＡＳＬＱＶＧＤＳＬＬＥＴＳＣＧＳＰＨＹまたはＭＡＳＬＱＶＧＤＳＬＬＥＴＳＣＧＳＰＨＹＲＲＲまたはＦＳＮＥＦＴＶＧＧＫＬＤＴＦＣＧＳＰＰＹまたはＦＳＮＥＦＴＶＧＧＫＬＤＴＦＣＧＳＰＰＹＲＲＲまたはＡＫＰＫＧＮＫＤＹＨＬＱＴＣＣＧＳＬＡＹまたはＡＫＰＫＧＮＫＤＹＨＬＱＴＣＣＧＳＬＡＹＲＲＲからなり得る。トリペプチドＲＲＲは、ｐ８１膜へのペプチドの固着に有用であり得、ならびに例えば別の支持体を使用する場合にはそれらを別の固着部分で置換してもよい。
【０１１７】
本発明のさらなる態様は、アミノ酸配列ＭＶＡＧＬＴＬＧＫＧＰＥＳＰＤＧＤＶＳ（ヒトＢＲＳＫ１の残基１〜２０）、ＬＳＷＧＡＧＬＫＧＱＫＶＡＴＳＹＥＳＳＬ（ヒトＢＲＳＫ２の残基６５５〜６７４）、ＭＥＧＡＡＡＰＶＡＧＤＲＰＤＬＧＬＧＡＰＧ（ヒトＮＵＡＫ１の残基１〜２１）、ＴＤＣＱＥＶＴＡＴＹＲＱＡＬＲＶＣＳＫＬＴ（ヒトＮＵＡＫ２の残基６５３〜６７３）、ＭＶＭＡＤＧＰＲＨＬＱＲＧＰＶＲＶＧＦＹＤ（ヒトＱＩＫの残基１〜２１）、ＭＶＩＭＳＥＦＳＡＤＰＡＧＱＧＱＧＱＱＫ（ヒトＳＩＫの残基１〜２０）、ＧＤＣＥＭＥＤＬＭＰＣＳＬＧＴＦＶＬＶＱ（ヒトＳＩＫの残基７６５〜７８４）、ＴＤＩＬＬＳＹＫＨＰＥＶＳＦＳＭＥＱＡＧＶ（ヒトＱＳＫの残基１３４９〜１３６９）、ＳＧＴＳＩＡＦＫＮＩＡＳＫＩＡＮＥＬＫＬ（ヒトＭＡＲＫ１の残基７７６〜７９５）、ＭＳＳＲＴＶＬＡＰＧＮＤＲＮＳＤＴＨＧＴ（ヒトＭＡＲＫ４の残基１〜２０）、ＭＫＤＹＤＥＬＬＫＹＹＥＬＨＥＴＩＧＴＧ（ヒトＭＥＬＫの残基１〜２０）、ＣＴＳＰＰＤＳＦＬＤＤＨＨＬＴＲ（ラットＡＭＰＫα１の残基３４４〜３５８）、またはＣＤＰＭＫＲＡＴＩＫＤＩＲＥ（ラットＡＭＰＫα１の残基２５２〜２６４）を有するペプチド抗原と反応性の抗体を提供する。このような抗体は、当業者に周知のように、所与のペプチドを免疫原として使用して産生することができる。例えばファージディスプレイ法を用いる、このような抗体の別の獲得法も当業者に周知である。
【０１１８】
用語「抗体」には、合成抗体、ならびに抗原結合部位を保持する全抗体の断片および変異体（例えば、上記のようなもの）が含まれる。この抗体は、単一クローン性抗体であってもよいが、多クローン性抗体調製物、その一部もしくは複数の部分（例えば、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２）または合成抗体もしくはその一部であってもよい。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は、全て、大腸菌において発現および分泌されうり、従って、大量の前記断片を容易に生産することができる。「ＳｃＦｖ分子」とは、ＶHおよびＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドによって結合されている分子を意味する。ＩｇＧクラスの抗体が好ましい。
【０１１９】
選択された抗体に適切な単一クローン性抗体は、上に示したように修正した、公知の技法、例えば、”Monoclonal Antibodies: A manual of techniques”, H. Zola (CRC Press, 1988)およびMonoclonal Hybridoma Antibodies:techniques and Applications, JGR Hurrell (CRC Press, 1982)に開示されている技法によって調製することができる。二重特異性抗体は、細胞融合によって、一価の断片の再会合によって、または全抗体の化学的架橋によって調製することができる。二重特異性抗体の調製方法は、Corvalen et al, (1987) Cancer Immunol.Immunother.24,127-132 and 133-137 and 138-143に開示されている。
【０１２０】
特異的結合部位を保持する抗体断片の合成に関係する技法の一般的な総説は、Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299において見出すことができる。
【０１２１】
本発明のさらなる態様は、ＡＭＰＫα１のＴｈｒ１７２に対応するＴ−ループトレオニン残基をアラニン残基にまたはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基に突然変異させる、突然変異ＡＭＰＫサブファミリーメンバーを提供する。本発明のさらなる態様は、ＡＭＰＫα１のＴｈｒ１７２に対応するＴ−ループトレオニン残基をアラニン残基にまたはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基に突然変異る、突然変異ＡＭＰＫサブファミリーメンバーをコードするポリヌクレオチドを提供する。組換えポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する本発明のこれらの態様に関連した教示、例えば、突然変異誘発を行う方法および組換えポリペプチドを発現させる方法であるような、ＡＭＰＫサブファミリーメンバーの配列についての参照は、上に示されている。適切な技法も当業者に知られている。突然変異ＡＭＰＫサブファミリーメンバーは、例えば、ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＱＩＫ、ＳＩＫまたはＭＥＬＫであり得る。
【０１２２】
本明細書において言及する出版書類は、本明細書に参考として組み込まれている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２３】
さて、以下の非限定的な図面および実施例に言及することにより、本発明をさらに説明する。
【０１２４】
図面の説明
図１．ＬＫＢ１とＭＯ２５αの会合。（Ａ）「材料および方法」において説明するように、対照親ＨｅＬａ細胞、またはＮ末端Ｆｌａｇエピトープ標識野生型（ＷＴ）ＬＫＢ１もしくはキナーゼ失活型（ＫＤ）ＬＫＢ１を安定的に発現するＨｅＬａ細胞由来の細胞溶解産物を、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２親和性アガロースカラムに通し、そのＦｌａｇペプチドでＬＫＢ１を溶離して、サンプルを濃縮した。それらのサンプルをポリアクリルアミドゲルでの電気泳動にかけ、コロイダルブルー染色に従ってタンパク質バンドを可視化した。ＷＴおよびＫＤ  ＬＫＢ１調製物に特有のタンパク質バンドを示す。（Ｂ）（Ａ）において示したように標識したコロイダルブルー染色バンドをそのゲルから切り出し、トリプシンでゲル中のそれらのタンパク質を消化し、それらの同一性をトリプシンペプチド質量スペクトルフィンガープリントによって決定した。ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αの同一性は、Ｑ−ＴＯＦ２質量分析器でのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ配列分析によって確認した。トリプシンペプチドの数、配列包括度のパーセンテージ、および同定された各タンパク質についてのＮＣＢＩ  ｇｉ番号を示す。（Ｃ）（Ａ）において精製されたサンプルを示されている抗体で免疫ブロットした。ＨｅＬａ細胞からのＬＫＢ１の２回の独立した精製後、同一の結果が得られた。
【０１２５】
図２．ＭＯ２５αおよびＭＯ２５βアイソフォームのアミノ酸配列および組織分布パターン。（Ａ）ヒトＭＯ２５α（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０５７３７３）およびＭＯ２５β（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｑ９Ｈ９Ｓ４）アイソフォームならびにＣ．エレガンスＭＯ２５α（ＮＣＢＩアクセッション番号ＣＡＢ１６４８６）およびＭＯ２５β（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿５０８６９１）およびショウジョウバエＭＯ２５（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ９１８９１）推定相同体のアミノ酸配列アラインメント。保存残基は、黒い囲い枠に入れ、相同残基には、灰色の陰をつけてある。配列アラインメントは、
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のＣＬＵＳＴＡＬＷおよびＢＯＸＳＨＡＤＥプログラムを使用し、標準的なパラメータを用いて行った。（Ｂ）ＭＯ２５α  ｃＤＮＡの３２Ｐ標識断片を使用して、示されているヒト組織から単離されたポリアデニル化ＲＮＡを含有するノーザンブロットをプローブした。その膜をオートラジオグラフィーに付し、そのＭＯ２５αプローブが、データベース分析からＭＯ２５αメッセージについて予測されたサイズと同じ４．２ｋｂメッセージにハイブリダイズするのを観察した。負荷対照として、そのノーザンブロットをβ−アクチンプローブでハイブリダイズした。（ＣおよびＤ）２０μｇの全細胞タンパク質を含有する示されているマウス組織（Ｃ）または細胞（Ｄ）抽出物を抗ＭＯ２５αおよび抗ＭＯ２５β抗体で免疫ブロットした。
【０１２６】
図３．内在性ＬＫＢ１はＭＯ２５αと会合している。（Ａ）プロテインＧ−セファロースに共有結合する抗ＬＫＢ１抗体１０μｇを使用して２ｍｇの示されている溶解産物からＬＫＢ１を免疫沈降させ、それらの免疫沈降物を示されている抗体で免疫ブロットした。対照として、プロテインＧ−セファロースと共有結合する免疫前ＩｇＧ抗体を用いて平行試験で免疫沈降も行った。各ゲルにおいて、２０μｇの全細胞溶解産物も平行して免疫ブロットした。（Ｂ）１５μｇのＭＯ２５α抗体を利用したこと以外は上記のとおりＭＯ２５αを免疫沈降させた。示されている結果は、一つの実験を三回繰り返した結果であり、同様の結果を得た。
【０１２７】
図４．ＭＯ２５αはＳＴＲＡＤによりＬＫＢ１と会合する。（Ａ）Ｍｙｃ−ＭＯ２５αとともに示されているＧＳＴ融合タンパク質の発現をコードするプラスミドで２９３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、そのＧＳＴ標識タンパク質を、「材料および方法」において説明するようにグルタチオン−セファロースを使用して細胞溶解産物から親和精製した。同様の量の精製ＧＳＴ−融合タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、抗Ｍｙｃ抗体で免疫ブロットして、共精製されたＭｙｃ−ＭＯ２５αを検出するか、抗ＧＳＴ抗体で免疫ブロットして、匹敵する量のＧＳＴ標識タンパク質が各レーンに存在することを確認した（上および中央のパネル）。親和精製前の５μｇの全細胞溶解産物も抗Ｍｙｃ抗体で免疫ブロットして、Ｍｙｃ−ＭＯ２５αが各コ・トランスフェクションにおいて同様のレベルで発現することを確認した（下のパネル）。（Ｂ）Ｎ末端ＧＳＴ標識ＬＫＢ１を、Ｆｌａｇ−ＳＴＲＡＤαの存在下または非存在下で２９３細胞において発現させ、上記のとおり精製した。精製されたタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、コロイダルブルー染色によって可視化した（上のパネル）。トリプシンペプチド質量スペクトルのフィンガープリントにより、４０ｋＤａの内在性タンパク質に対応する示されている弱いタンパク質バンド（＊印が付いているもの）を、（配列包括度３８％で）内在的に発現されたＭＯ２５αと同定した。それらの精製タンパク質は、示されている抗体での免疫ブロットも行った（下のパネル）。（Ｃ）ＧＳＴ−ＬＫＢ１をＦｌａｇ−ＳＴＲＡＤおよびＭｙｃ−ＭＯ２５αの示されているアイソフォームとともに２９３細胞において発現させ、コロイダルブルー染色によって可視化したタンパク質を示されている抗体で免疫ブロットしたこと以外、上記のとおり。全てのパネルについて、少なくとも３回の別の実験で同様の結果が得られた。
【０１２８】
図５．ＭＯ２５αおよびＳＴＲＡＤαは、細胞質内にＬＫＢ１を固着させる。Ｍｙｃ−ＭＯ２５α、Ｆｌａｇ−ＳＴＲＡＤαおよびＧＦＰ−ＬＫＢ１の発現をコードする示されている構築物で、Ｈｅｌａ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を４％（容量％）パラホルムアルデヒド中で固定し、抗ＭＯ２５α抗体で免疫染色して、ＭＯ２５αを検出し（ＴＲ抗ヒツジ二次抗体、レッドチャネル）、抗Ｆｌａｇ抗体で免疫染色して、ＳＴＲＡＤαを検出した（Ｃｙ５抗マウス二次抗体、ブルーチャネル）。ＧＦＰ−ＬＫＢ１の局在をＧＦＰ蛍光により直接可視化した（グリーンチャネル）。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化した。示されている細胞は、３回の別の実験で得られた代表画像である。スケールバーは、１０μｍに相当する。
【０１２９】
図６．ＭＯ２５αは、ＳＴＲＡＤαのＣ末端の３残基を認識する。（Ａ）Ｎ末端ＧＳＴ標識野生型ＳＴＲＡＤαまたはＳＴＲＡＤαの示されている突然変異体をＭｙｃ−ＭＯ２５αとともに２９３細胞において発現させ、トランスフェクションの３６時間後、それらのＳＴＲＡＤαタンパク質を、グルタチオン−セファロースを使用して細胞溶解産物から親和精製した。同様の量のそれらの精製タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、抗Ｍｙｃ抗体で免疫ブロットして、共精製されたＭｙｃ−ＭＯ２５αを検出するか、抗ＧＳＴ抗体で免疫ブロットして、匹敵する量のそれらのＧＳＴ標識タンパク質が各レーンに存在することを確認した（上および中央のレーン）。親和精製前の５μｇの全細胞溶解産物も抗Ｍｙｃ抗体で免疫ブロットして、Ｍｙｃ−ＭＯ２５αが各条件において同様のレベルで発現することを確認した（下のパネル）。（Ｂ）０．５ｍｇの示されている細胞溶解産物を、ストレプタビジン−セファロースに共役結合しているＣ末端１２残基ＳＴＲＡＤα（ＮＬＥＥＬＥＶＤＤＷＥＦ、ＳＴＲＡＤα−Ｃ１２と呼ぶ）または示した残基を個別的にＡｌａに突然変異させたこのペプチドの突然変異体のいずれかを含む５μｇのＮ末端ビオチニル化ペプチドとともにインキュベートした。それらのビーズの単離および洗浄後、それらのサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、抗ＭＯ２５α抗体で免疫ブロットした。（Ｃ）示されているペプチドへの細菌発現ＭＯ２５αの結合を、「材料および方法」において説明するように、表面プラズモン共鳴ＢｉａＣｏｒｅ分析によって分析した。一定のＭＯ２５α濃度範囲（６．２５−３２００ｎＭ）にわたって結合を分析し、定常状態結合での応答レベルをＭＯ２５α濃度のｌｏｇに対してプロットした。Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈソフトウェアを使用してデータを式［ｍ１  Ｘ  ｍ０／（ｍ０＋ｍ２）］に当てはめることによってＳＴＲＡＤα−Ｃ１２ペプチドについての推定Ｋｄが得られ、そのＫｄは、８５０ｎＭであると算定された。ＷＥＦ−Ｃ１２は、ＮＬＥＥＬＥＶＤＤＷＥＦに相当し、ＷＥＡ−Ｃ１２は、ＮＬＥＥＬＥＶＤＤＷＥＡに相当し、ＡＥＦ−Ｃ１２は、ＮＬＥＥＬＥＶＤＤＡＥＦに相当し、ＷＡＦ−Ｃ１２は、ＮＬＥＥＬＥＶＤＤＷＡＦに相当し、ＷＥＦ−Ｃ６は、ＶＤＤＷＥＦに相当する。
【０１３０】
図７．ＳＴＲＡＤαへのＬＫＢ１の結合は、ＭＯ２５αのための新規結合部位（複数を含む）を作る。示されている形態のＧＳＴ−ＳＴＲＡＤαを２９３細胞においてＭｙｃ−ＭＯ２５αおよび／または野生型Ｆｌａｇ−ＬＫＢ１もしくは単離ＬＫＢ１触媒ドメイン（ＬＫＢ１［４４−３４３］）とともに共発現させた。トランスフェクションの３６時間後、それらのＧＳＴ−ＳＴＲＡＤαタンパク質を親和精製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、抗Ｍｙｃ抗体で免疫ブロットして、Ｍｙｃ−ＭＯ２５αを検出するか、抗Ｆｌａｇ抗体で共精製Ｆｌａｇ−ＬＫＢ１およびＦｌａｇ−ＬＫＢ１［４４−３４３］を検出するか、抗ＧＳＴ抗体でＳＴＲＡＤα形を検出した（上のパネル）。親和性性前の５μｇの全細胞溶解産物も抗Ｍｙｃおよび抗Ｆｌａｇ抗体で免疫ブロットして、ＭＯ２５αおよびＬＫＢ１が各コ・トランスフェクションにおいて同様のレベルで発現されることを確認した（下のパネル）。３回の別の実験で同様の結果が得られた。
【０１３１】
図８．ＭＯ２５アイソフォームは、ＬＫＢ１０ＳＴＲＡＤα複合体を安定させる。（Ａ）３μｇのＦｌａｇ−ＳＴＲＡＤα構築物の存在下または非存在下、および示されている量のＭｙｃ−ＭＯ２５α構築物の存在下または非存在下、ＧＳＴ−ＬＫＢ１の発現をコードする３μｇのＤＮＡ構築物で２９３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、ＧＳＴ−ＬＫＢ１を細胞溶解産物から親和精製し、適切なエピトープ抗体で免疫ブロットして、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αを検出した。親和精製前の５μｇの全細胞溶解産物も、示されている抗体で免疫ブロットした（下のパネル）。（Ｂ）は、ＭＯ２５α構築物の代わりにＭＯ２５β構築物を利用したこと以外、上記のとおりに行った。３回の別の実験で同様の結果が得られた。
【０１３２】
図９．ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５アイソフォームとの会合によるＬＫＢ１の活性化。ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５の示されているアイソフォームをコードする構築物の存在下または非存在下、ＧＳＴ−ＬＫＢ１をコードする構築物で２９３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、ＧＳＴ−ＬＫＢ１を親和精製し、「方法および材料」において説明するようにＭＢＰの自己リン酸化およびリン酸基転位についてアッセイした。これらの反応物を電気泳動およびゲルオートラジオグラフィーに付した（上のパネル）。Ｔｈｒ６５でのＬＫＢ１によるＭＢＰのリン酸化も、この残基でＬＫＢ１によりリン酸化したＭＢＰを認識するリン酸特異的抗体（Ｔ６５−Ｐ）で免疫ブロットすることによってモニターした。各反応物は、適切なエピトープタグ抗体で免疫ブロットして、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５アイソフォームのレベルをモニターした。３回の別の実験で同様の結果が得られた。
【０１３３】
図１０．最も近いＳＴＥ２０−キナーゼ類縁体とＳＴＲＡＤアイソフォームのアミノ酸配列アラインメント。（Ａ）ヒトＳＴＲＡＤα（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＧ４８２６９）およびヒトＳＴＲＡＤβ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＭ１９１４３）とヒトＳＰＡＫ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＣ７２２３８）およびヒトＯＳＲ１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５１００）のアミノ酸配列アラインメント。保存残基は、黒い囲い枠に入れ、相同残基には、灰色の陰をつけてある。活性ＳＰＡＫおよびＯＳＲ１プロテインキナーゼ中に存在するが、ＳＴＲＡＤαおよびＳＴＲＡＤβ偽キナーゼを欠く触媒Ａｓｐ（サブドメインＶＩ）およびＡｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（サブドメインＶＩＩ）は、枠で囲い、アスタリスク印をつけてある。ＳＰＡＫおよびＯＳＲ１中のＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ配列に対応するＳＴＲＡＤαおよびＳＴＲＡＤβ中に存在するＣ末端Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅモチーフは、枠で囲い、三角印をつけてあり、ＳＴＲＡＤα中のＬＫＢ１リン酸化部位（Ｔｈｒ３２９およびＴｈｒ４１９）（Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）は、矢印をつけてある。配列アラインメントは、標準的なパラメータを用い、
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のＣＬＵＳＴＡＬＷおよびＢＯＸＳＨＡＤＥプログラムを使用して行った。
【０１３４】
図１１．ＭＯ２５アイソフォームは、ＳＴＲＡＤβの発現およびＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤβ複合体の形成を増加させる。（Ａ）３μｇのＦｌａｇ−ＳＴＲＡＤβ構築物の存在下または非存在下、および示されている量のＭｙｃ−ＭＯ２５α構築物の存在下または非存在下、ＧＳＴ−ＬＫＢ１の発現をコードする３μｇのＤＮＡ構築物で２９３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、ＧＳＴ−ＬＫＢ１を細胞溶解産物から親和精製し、適切なエピトープ抗体で免疫ブロットして、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤβおよびＭＯ２５αを検出した。親和精製前の５μｇの全細胞溶解産物も、示されている抗体で免疫ブロットした（下のパネル）。（Ｂ）は、ＭＯ２５α構築物の代わりにＭＯ２５β構築物を利用したこと以外、上記のとおりに行った。３回の別の実験において、およびｐＣＭＶ５ベクターの代わりにｐＥＢＧ−２ＴベクターでＳＴＲＡＤβをＧＳＴ−融合タンパク質として発現させたときも、同様の結果が得られた（データ表示なし）。
【０１３５】
図１２：酵母からのＴｏｓ３、Ｐａｋ１およびＥｌｍ１ならびにヒトからのＬＫＢ１およびＣａＭＫＫβ（β３変異体）のアミノ酸配列のアラインメント。ＧＣＨスイートからのＰＩＬＥＵＰ［４９］を使用してアラインメントを作成し、ＢＯＸＳＨＡＤＥ  ｖ３．２．１［５０］を使用してコンセンサス配列を決定し、着色を加えた。それらの配列の少なくとも半分において同一である残基を灰色に着色し、保存的変化も灰色にした。そのコンセンサス配列は、特定の位置の残基が全ての配列で同じである場合には大文字で、少なくとも半分が保存されている場合には小文字で表す。キナーゼドメインを含む保存中央領域（ＬＫＢ１に隣接する残基５０〜３１０）のみを示す。
【０１３６】
図１３：ラット肝臓抽出物から２つのＡＭＰＫＫを分離することができるが、両方が、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αと複合している。（Ａ）Ｑ−セファロースクロマトグラフィーによる、ＧＳＴ−ＡＭＰＫα１−触媒ドメインを活性化する２つの活性の分離。このグラフは、画分におけるＡＭＰＫＫ活性（白丸）、２８０ｎｍでの吸収（連続線）および溶離液における伝導性（破線）を示すものである。「ｘ」軸は、画分数（４．５ｍＬ画分）を表す。Ｂ、Ｃ、Ｄ：抗ＬＫＢ１（Ｂ）、抗ＳＴＲＡＤα（Ｃ）および抗ＭＯ２５α（Ｄ）を使用する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のカラム画分のブロットのプロービング（１レーンあたり１μＬ）。Ｅ、Ｆ、Ｇ：Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  ３０，０００  ＭＷＣＯ遠心濃縮装置を使用してフラクション２６〜３０を４．５ｍＬから２５０μＬに濃縮し、１レーンあたり２μＬを負荷した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルをニトロセルロースに転写し、その膜を抗ＬＫＢ１（Ｅ）、抗ＳＴＲＡＤα（Ｆ）および抗ＭＯ２５α（Ｇ）でプローブした。
【０１３７】
図１４：ＡＭＰＫＫ活性、ならびにＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αポリペプチドは、抗ＬＫＢ１抗体を使用してラット肝臓ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２から免疫沈降させることができる。（Ａ）上清からのＡＭＰＫＫ１活性の消耗。前述されている［５１］とおり、ヒツジ抗ヒトＬＫＢ１または免疫前対照免疫グロブリン（ＩｇＧ）をプロテインＧ−セファロースビーズに予め結合させて、ＤＭＰで架橋させたが、ビーズの最終洗浄は、１００ｍＭグリセリン（ｐＨ２．５）で行った。ビーズに結合した抗体（４０μＬ）をＡＭＰＫＫ１（０．０４ユニット）、ＡＭＰＫＫ２（０．０３ユニット）または組換えＧＳＴ−ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤα：ＭＯ２５α複合体（０．０６ユニット）のピーク画分とともに２０分間インキュベートし、ビーズを微量遠心機（１４，０００×ｇ、２分）で除去した。上清におけるＡＭＰＫＫ活性を判定した。これを対照ＩｇＧを使用して得られた値に対するパーセンテージとして表す。（Ｂ）（Ａ）の実験からのペレットを原体積に再懸濁させ、抗ＬＫＢ１抗体でのウエスタンブロッティングによりそれらの上清およびペレットのサンプルを分析した。組換えＬＫＢ１は、ＧＳＴタグのため、より大きな分子量で泳動する。（Ｃ）ＡＭＰＫＫ１、ＡＭＰＫＫ２および組換えＧＳＴ−ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５α複合体の量を０．４４、０．７０および１．４ユニットにそれぞれ増やし、活性を再懸濁ペレットにおいて判定したこと以外はＡのとおり。この実験では、活性の一部だけを沈降させるように抗体の量を制限した。（Ｄ）（Ｃ）の実験からのペレットを再懸濁させ、サンプルを抗ＬＫＢ１、抗ＳＴＲＡＤαおよび抗ＭＯ２５α抗体でのウエスタンブロッティングによって分析した。
【０１３８】
図１５：組換えＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ−ＭＯ２５複合体は、Ｔｈｒ−１７２でのリン酸化によりＡＭＰＫを効率的に活性化することができる。（１）：ＧＳＴ標識野生型ＬＫＢ１（ＷＴ、レーン１〜９）、またはキナーゼ失活型（Ｄ１９４Ａ、ＫＤ、レーン１０〜１３）ＬＫＢ１突然変異体、またはＧＳＴ単独（レーン１４）、ＦＬＡＧ標識ＳＴＲＡＤαまたはＳＴＲＡＤβ、およびｍｙｃ標識ＭＯ２５αまたはＭＯ２５βの示されている組合せを、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において共発現させ、グルタチオン−セファロースで精製して、ＧＳＴ−ＡＭＫα１触媒ドメインを活性化するそれらの能力を試験した（上のパネル）。各インキュベーションからのサンプルをウエスタンブロッティングによっても分析し、示されている抗体、（上から下へ）：抗ｐＴ１７２、抗ＡＭＰＫα１触媒ドメイン（ＧＳＴ−α１）、ＧＳＴ−ＬＫＢ１を検出するために抗ＧＳＴ、ＳＴＲＡＤαおよびＳＴＲＡＤβを検出するために抗ＦＬＡＧ、ならびにＭＯ２５αおよびＭＯ２５βを検出するために抗ｍｙｃ、を使用してプローブした。エピトープタグを考慮に入れて、全てのタンパク質が予想移動度で泳動した。下の三つのブロットは、ＧＳＴ−ＡＭＰＫα１触媒ドメインを欠くブランク反応物を用いて行った。ＧＳＴ−ＡＭＰＫα１触媒ドメインが、検出に何らかの干渉を生じるように見えたからである。（Ｂ）「方法」で説明するように［γ−３２］ＡＴＰを使用し、組換えＧＳＴ−ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤα：ＭＯ２５α複合体を使用して、野生型ＧＳＴ−α１触媒ドメイン（ＧＳＴ−α１−ＷＴ）またはＴ１７２Ａ突然変異体（ＧＳＴ−α１−Ｔ１７２Ａ）をリン酸化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって反応を分析した。矢印は、ＧＳＴ−ＬＫＢ１（これは自己リン酸化する）およびＧＳＴ−α１触媒ドメインの泳動を示している。
【０１３９】
図１６：ＡＭＰＫＫ１、ＡＭＰＫＫ２および組換えＧＳＴ−ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤα：ＭＯ２５α複合体によるヘテロトリマーＡＭＰＫ複合体の活性化およびリン酸化。ＭｇＡＴＰおよびＡＭＰＫＫ１（２．８または１．４ユニット／ｍＬ）、ＡＭＰＫＫ２（１０．３または５．１５ユニット／ｍＬ）またはＧＳＴ−ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤα：ＭＯ２５α（１４．３または７．２ユニット／ｍＬ）とともに１０分間インキュベートした組換えα１β１γ１またはα２β１γ１複合体およびＡＭＰＫの活性を判定した。そのα１β１γ１複合体が基質であるときには、それが容易には活性化されないことを予備実験が示したので、二倍の上流キナーゼを添加した。画像は、リン酸特異的抗ｐＴ１７２抗体（上のパネル）で、およびα１β１γ１またはα２β１γ１複合体の均一な負荷を証明するために抗α１抗体と抗α２抗体の混合物で、プローブしたウエスタンブロットのものである（タンパク質負荷が同じものについてでさえ、抗α２抗体が常に抗α１抗体より強いシグナルを与えることに注意すること）。
【０１４０】
図１７：内在性ＡＭＰＫＫ活性は、抗ＬＫＢ１抗体を使用して２９３細胞から免疫沈降させることができるが、活性は、それらが誘導性プロモータから（触媒不活性突然変異体ではなく）ＬＫＢ１を安定的に発現する場合にのみＨｅＬａ細胞から免疫沈降させることができる。トランスフェクトされていないＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（レーン１、２）由来、トランスフェクトされていないＨｅＬａ細胞（レーン３、４）由来、または誘導性プロモータから野生型（ＷＴ）ＬＫＢ１（レーン５、６）もしくはキナーゼ失活型（ＫＤ）ＬＫＢ１（Ｄ１９４Ａ）突然変異体（レーン７、８）を安定的に発現するＨｅＬａ細胞由来の０．５ｍｇの細胞抽出物から、ＬＫＢ１を免疫沈降させた。免疫沈降法は、抗ＬＫＢ１（レーン１、３、５、７）または免疫前対照免疫グロブリン（ＩｇＧ、レーン２、４、６、８）でのものであった。各免疫沈降物のサンプルを使用して、ＧＳＴ−ＡＭＰＫα１触媒ドメインの活性化をアッセイし、Ｔｈｒ−１７２のＧＳＴ−ＡＭＰＫα１触媒ドメインのリン酸化を分析し（中央のパネル）、ならびにＬＫＢ１の回収率を判定した（下のパネル）。各免疫沈降物のサンプルは、内在性ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αの存在について、適切な抗体で免疫ブロットもした。ＧＳＴ−ＡＭＰＫα１触媒ドメインをそれ自体で（添加なし）ＭｇＡＴＰとともにインキュベートしたときに得られた基礎活性も上のパネルに示す。
【０１４１】
図１８：ＬＫＢ１の発現による、ＨｅＬａ細胞においてＡＩＣＡリボシドおよびフェンホルミンがＡＭＰＫを活性化する能力の回復。対照ＨｅＬａ細胞（レーン１、２、３）、野生型（ＷＴ）ＬＫＢ１を発現しているＨｅＬａ細胞（レーン４、５、６）およびキナーゼ失活型（Ｄ１９４Ａ、ＫＤ）突然変異ＬＫＢ１を発現しているＨｅＬａ細胞（レーン７、８、９）を刺激せずに放置するか、２ｍＭ  ＡＩＣＡリボシドまたは１０ｍＭフェンホルミンで６０分間処理して溶解した。（Ａ）内在性ＡＭＰＫを細胞抽出物から免疫沈降させ、アッセイした。（Ｂ）Ｔｈｒ１７２でリン酸化されたＡＭＰＫα１または全ＡＭＰＫα１を認識する抗体でそれらの細胞溶解産物を免疫ブロットした。「材料および方法」の下記のようにＬＩ−ＣＯＲ  ＩＲ  Ｏｄｙｓｓｅｓｙ（商標）イメージャーを使用して、結果を分析した。それらを二つのシグナルの比として表す。（Ｃ）それらの細胞溶解産物をウエスタンブロッティングによって分析し、それらの膜をＳｅｒ−７９でリン酸化されたＡＣＣを認識する抗体またはストレプタビジンでプローブして、全ＡＭＰＫα１を判定した。（Ｂ）についてのようにＬＩ−ＣＯＲ  ＩＲイメージャーを使用して、結果を分析した。
【０１４２】
図１９：ＡＧＣサブファミリーキナーゼ（ＰＫＡαおよびＰＫＣα；これらは、ＬＫＢ１によって活性化されると考えられない）の活性化ループ配列とプロテインキナーゼのＡＭＰＫ／ＳＮＦ１サブファミリーのＴ−ループ残基の配列アラインメント。方法および説明は、図１において記載したとおりである。ＡＭＰＫのＴｈｒ１７２（「Ｐ」）に対応するトレオニン残基、および本文中で言及した他の残基を下向き矢印で示す。ＡＭＰＫのシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＡｔＳｎＲＫ１、ＳＮＦ１関連キナーゼ−１）相同体およびサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＳｃＳｎｆ１）相同体であるＡｔＳｎＲＫ１−α１、ＡｔＳｎＲＫ１−α２およびＳｃＳｎｆ１を除き、全ての配列はヒトからのものである。ヒト、シロイヌナズナおよびＳ．セレビジエ相同体、ならびにＰＫＡαおよびＰＫＣαキナーゼは、Ｔｈｒ−１７２に相当するトレオニン残基のリン酸化によって活性化されることが知られているが、他のＡＭＰＫサブファミリーメンバー（ＮｕａＫ１、ＮｕａＫ２、ＢｒｓＫ１、ＢｒｓＫ２、ＳＩＫ、ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＭＥＬＫ）がこの残基のリン酸化によって活性化されるかどうか、およびＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ−ＭＯ２５複合体が、このリン酸化を媒介することができるかどうかは、まだ確立されていない。
【０１４３】
図２０：ペプチド基質（ＡＭＰＫｔｉｄｅと呼ぶ）についてのＫｍおよびＶｍａｘ。アッセイ条件は、実施例３で説明する。
【０１４４】
図２１．ＬＫＢ１によるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性化。（Ａ）プロテインキナーゼのＡＭＰＫサブファミリーのデンドログラムおよびＴ−ループ配列（Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。同じ残基には黒い陰をつけ、保存配列は灰色にしてある。Ｔ−ループのＴｈｒおよびＳｅｒには、アスタリスクで示す。（Ｂ）示されているＡＭＰＫ関連キナーゼを、Ｍｇ２＋およびＡＴＰの存在下、野生型ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤ：ＭＯ２５（白四角）または触媒不活性ＬＫＢ１［Ｄ１９４Ａ］：ＳＴＲＡＤ：ＭＯ２５（白丸）複合体とともにインキュベートした。示されている時間で、それらＡＭＰＫ関連キナーゼの活性を、ＡＭＡＲＡペプチドを用いてアッセイした。結果を比活性として表す。示されている結果は、三重で行ったアッセイの平均±ＳＤであり、二つの独立した実験の代表である。エラーバーは、白四角のサイズより大きいときのみ示されている。
【０１４５】
図２２．ＬＫＢ１によるＡＭＰＫ関連キナーゼの効率的な活性化には、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５サブユニットが必要である。ＧＳＴ標識野生型ＬＫＢ１（ＷＴ、レーン１〜９）または触媒不活性（Ｄ１９４Ａ、レーン１０〜１３）ＬＫＢ１、またはＧＳＴ単独（レーン１４）、ＦＬＡＧ標識ＳＴＲＡＤαもしくはＳＴＲＡＤβ、およびｍｙｃ標識ＭＯ２５αもしくはＭＯ２５βの示されている組合せを、ＨＥＫ２９３細胞において共発現させ、グルタチオン−セファロースで精製した。それらの複合体をＡＭＰＫα１の触媒ドメインまたは示されているＡＭＰＫ関連キナーゼを活性化するそれらの能力について試験した。結果は、基質としてＡＭＡＲＡペプチドを利用して比活性として表す。示されている結果は、三重で行ったアッセイの平均±ＳＤであり、二つの独立した実験の代表である。各インキュベーションからのサンプルをウエスタンブロットによっても分析し、示されている抗体、（上から下へ）：ＬＫＢ１を検出するために抗ＧＳＴ；ＳＴＲＡＤαおよびＳＴＲＡＤβを検出するために抗ＦＬＡＧ；ならびにＭＯ２５αおよびＭＯ２５βを検出するために抗ｍｙｃ、を使用してプローブした。エピトープタグを考慮すると、全てのタンパク質が予想移動度で泳動した。
【０１４６】
図２３．Ｔ−ループＴｈｒは、ＡＭＰＫ関連キナーゼにおけるＬＫＢ１リン酸化の主要部位である。示されているＧＳＴ−ＡＭＰＫ関連キナーゼの野生型（ＷＴ）およびＴ−ループＴｈｒからＡｌａへの（Ｔｈｒ→Ａｌａ）突然変異体を、Ｍｇ２＋および［γ３２Ｐ］ＡＴＰの存在下、ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤ：ＭＯ２５複合体とともにインキュベートした。タンパク質基質のリン酸化は、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動およびそれに続く各基質に対応するクマシーブルー染色バンドのオートジオグラフィーによって判定した。各インキュベーションのアリコートを抗ＨＡ抗体でプローブするウエスタンブロッティングによっても分析して、野生型および突然変異ＡＭＰＫ関連キナーゼ（これらは、全て、ＨＡエピトープタグを有する）の等しい負荷を確認した。エピトープタグを考慮すると、全てのタンパク質が予想移動度で泳動した。３回の別の実験で同様の結果が得られた。
【０１４７】
図２４．ＬＫＢ１によるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性化に対するＴ−ループにおけるＴｈｒの突然変異の効果。示されている野生型（ＷＴ）ＡＭＰＫ関連キナーゼ、またはＴ−ループＴｈｒをＡｌａ（Ｔ／Ａ）またはＧｌｕ（Ｔ／Ｅ）に変えたこれらの酵素の突然変異体を、Ｍｇ２＋およびＡＴＰの存在下、野生型ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤ：ＭＯ２５が非存在の（−）または存在する（＋）状態でインキュベートした。３０分後、ＡＭＡＲＡペプチドを用いてそれらのＡＭＰＫ関連キナーゼをアッセイした。結果を比活性として表す。示されている結果は、三重で行ったアッセイの平均±ＳＤであり、二つの独立した実験の代表である。各インキュベーションのアリコートを抗ＨＡ抗体でプローブするウエスタンブロッティングによっても分析して、野生型および突然変異ＡＭＰＫ関連キナーゼ（これらは、全て、ＨＡ標識を有する）の等しい負荷を確認した。
【０１４８】
図２５．ＭＡＲＫキナーゼのリン酸化および活性化の分析。（Ａ）自己リン酸化できない触媒不活性ＭＡＲＫ３［Ｄ１９６Ａ］（ＫＩ）および示されている突然変異体をＬＫＢ１複合体とともに、３０分間、Ｍｇ２＋−［γ３２Ｐ］ＡＴＰとともにインキュベートし、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分離し、その後、オートラジオグラフィーに付した。それらの３２Ｐ標識ＭＡＲＫ３タンパク質をトリプシンで消化し、得られた３２Ｐ標識ペプチドをＣ１８カラムでのクロマトグラフィーに付した。３２Ｐ標識Ｔ−ループトリプシンペプチドを含有する画分（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＰＡおよびＰＢ）を示す。（Ｂ）それらのＰｅｐｔｉｄｅ  ＰＡおよびＰＢを固相配列決定法に付し、エドマン分解の各サイクル後に３２Ｐ放射活性を測定した。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析と併用で、各ペプチドにおいてリン酸化した部位を同定することができた。Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＰＡは、Ｔｈｒ２１１およびＳｅｒ２１５でリン酸化されたＭＡＲＫ３  Ｔ−ループペプチドを含み、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＰＢは、Ｔｒ２１１でリン酸化されたＭＡＲＫ３  Ｔ−ループペプチドを含む。（ＣからＦ）Ｔ−ループＴｈｒまたはＳｅｒをＡｌａ（Ｔ／Ａ、Ｓ／Ａ）またはＧｌｕ（Ｔ／Ｅ、Ｓ／Ｅ）のいずれかに突然変異させた、示されている野生型（ＷＴ）または突然変異形のＭＡＲＫキナーゼを、Ｍｇ２＋およびＡＴＰの存在下、野生型ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤ：ＭＯ２５が非存在の（−）または存在する（＋）状態でインキュベートした。３０分後、ＡＭＡＲＡペプチドを用いてそれらのＭＡＲＫキナーゼをアッセイした。結果を比活性として表す。各インキュベーションのアリコートを抗ＨＡ抗体でプローブするウエスタンブロッティングによっても分析して、野生型および突然変異ＭＡＲＫキナーゼ（これらは、全て、ＨＡエピトープタグを有する）の等しい負荷を確認した。示されている結果は、三重で行ったアッセイの平均±ＳＤであり、少なくとも二つの独立した実験の代表である。（Ｇ）ＭＡＲＫ４をＡにおけるようにＬＫＢ１複合体でリン酸化し、主３２Ｐ標識ペプチドを（Ｂ）におけるように固相エドマン配列決定法によって分析した。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析と併用で（図３０Ｃ）、このペプチドが、Ｔｈｒ残基のみでリン酸化したＭＡＲＫ４のＴ−ループを含むことを明らかにした。
【０１４９】
図２６．ＬＫＢ１のためのペプチド基質の同定。（Ａ）ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤ：ＭＯ２５複合体による示されているＴ−ループのリン酸化の反応速度分析を行った。各ペプチドのＴ−ループ  Ｔｈｒ残基は下線が引かれ、太字になっている。各Ｔ−ループペプチドのＣ末端に、ホスホセルロースｐ８１ペーパーにそれらを捕捉できるように、３個のＡｒｇ残基を付加させた。非線形回帰からＫｍおよびＶｍａｘ値を決定した。（Ｂ）ＬＫＢ１複合体によってリン酸化された各ペプチドのアリコートを固相エドマン配列決定法に付し、エドマン分解の各サイクル後に３２Ｐ放射活性を測定した。各ペプチドのわずかな割合が、Ｃ末端カルボキシル基ではなく内部のＡｓｐおよびＧｌｕ酸性残基によってＳｅｑｕｅｌｏｎアリールアミン膜にカップリングするようになることがある。これよって、幾つかのＡｓｐおよびＧｌｕ残基で観察される３２Ｐ放射活性の見掛けのわずかな放出が説明される。（Ｃ）図２２において用いられている、ＧＳＴ標識野生型ＬＫＢ１（ＷＴ、レーン１〜９）または触媒不活性（Ｄ１９４Ａ、レーン１０〜１３）ＬＫＢ１、またはＧＳＴ単独（レーン１４）、ＦＬＡＧ標識ＳＴＲＡＤαもしくはＳＴＲＡＤβ、およびｍｙｃ標識ＭＯ２５αもしくはＭＯ２５βの同じ組合せを、示されているペプチド（ペプチド濃度２００μＭ）をリン酸化するそれらの能力について試験した。結果は、そのアッセイに添加されたＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤ：ＭＯ２５のｍｇあたりの発生したペプチドキナーゼ活性として表す。示されている結果は、３回のアッセイの平均±ＳＤであり、少なくとも２つの独立した実験の代表である。
【０１５０】
図２７．ＬＫＢ１＋／＋およびＬＫＢ１−／−  ＭＥＦにおけるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性。ＬＫＢ１＋／＋またはＬＫＢ１−／−  ＭＥＦを未処理で放置するか（黒棒）か、１時間、１０ｍＭのフェンホルミンで刺激した（Ｐｈｅｎ、白棒）。ＡＭＰＫα１およびＡＭＰＫ関連キナーゼをそれらの細胞溶解産物から免疫沈降させ、「材料および方法」（実施例４）において説明するようにＡＭＡＲＡペプチドに対するインビトロキナーゼ活性を測定した。各サンプルにおける等しいキナーゼ発現を確認するために、細胞溶解産物（ＡＭＰＫα１、ＮＵＡＫ２、ＭＡＲＫ２／３およびＭＡＲＫ４）または免疫沈降タンパク質（ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＳＩＫおよびＭＡＲＫ１）をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析に付した。全てのＡＭＰＫ関連キナーゼが予想分子量で泳動した。ＡＭＰＫα１の場合、リン酸化したＴ−ループを認識するホスホＴｈｒ１７２抗体（Ｐ−ＡＭＰＫ）で、細胞溶解産物を免疫ブロットした。細胞溶解産物中ＬＫＢ１レベルの対照免疫ブロットもパネルＢに含まれている。示されている結果は、２〜４回のアッセイの平均＋ＳＤであり、少なくとも二つの独立した実験の代表である。
【０１５１】
図２８．ＡＩＣＡリボシドは、ＡＭＰＫ関連キナーゼを活性化しない。（Ａ）ＬＫＢ１＋／＋  ＭＥＦを未処理で放置するか、示されている濃度のフェンホルミン（Ｐｈｅｎ）で１時間刺激した。ＡＭＰＫα１／α２およびＬＫＢ１をそれらの細胞溶解産物から免疫沈降させ、「材料および方法」（実施例４）において説明するようにＡＭＡＲＡおよびＬＫＢｔｉｄｅペプチドそれぞれに対するインビトロキナーゼ活性を測定した。（Ｂ）各サンプルにおける等しいキナーゼ発現を確認するために、細胞溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび示されている抗体でのウエスタンブロット分析に付した。ホスホｐＴ１７２抗体（Ｐ−ＡＭＰＫ）は、ＡＭＰＫα１のリン酸化したＴ−ループを認識する。結果は、三重アッセイについての平均±ＳＤとして示し、二つの独立した実験の代表である。（Ｃ）ＬＫＢ１＋／＋  ＭＥＦを未処理で放置するか（黒棒）、２ｍＭのＡＩＣＡリボシドで１時間刺激した（ＡＩＣＡＲ、白棒）。ＡＭＰＫα１および示されているＡＭＰＫ関連キナーゼをそれらの細胞溶解産物から免疫沈降させ、「材料および方法」において説明するようにＡＭＡＲＡペプチドに対するインビトロキナーゼ活性を測定した。結果は、刺激していない細胞において観察された活性に対する％として表し、二つの独立した実験の平均＋ＳＥＭである。１００％は、以下の絶対活性に相当する：ＡＭＰＫα１；１３５ｍＵ／ｍｇ、ＮＵＡＫ２；０．２５ｍＵ／ｍｇ、ＱＩＫ；０．７６ｍＵ／ｍｇ、ＳＩＫ；２．７３ｍＵ／ｍｇ、ＭＡＲＫ１；０．１４ｍＵ／ｍｇ、ＭＡＲＫ２／３；３．５ｍＵ／ｍｇおよびＭＡＲＫ４；１．６ｍＵ／ｍｇ。（Ｄ）ＡＭＰＫの免疫ブロッティングをＡにおけるように行った。
【０１５２】
図２９．ＨｅＬａ細胞におけるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性。ＬＫＢ１発現を欠く対照ＨｅＬａ細胞（−）、または野生型ＬＫＢ１（ＷＴ）もしくはキナーゼ不活性ＬＫＢ１（ＫＩ）を安定的に発現するＨｅＬａ細胞を、未処理で放置するか（黒棒）、１０ｍＭのフェンホルミンで１時間刺激した（Ｐｈｅｎ、白棒）。ＡＭＰＫα１およびＡＭＰＫ関連キナーゼをそれらの細胞溶解産物から免疫沈降させ、「材料および方法」（実施例４）において説明するようにＡＭＡＲＡペプチドに対するインビトロキナーゼ活性を測定した。各サンプルにおける等しいキナーゼ発現を確認するために、細胞溶解産物（ＡＭＰＫα１、ＭＡＲＫ２／３およびＭＡＲＫ４）または免疫沈降タンパク質（ＮＵＡＫ２、ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＳＩＫおよびＭＡＲＫ１）をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析に付した。全てのＡＭＰＫ関連キナーゼが予想分子量で泳動した。ＡＭＰＫα１の場合、リン酸化したＴ−ループを認識するｐＴｈｒ１７２抗体（Ｐ−ＡＭＰＫ）で細胞溶解産物を免疫ブロットした。示されている結果は、２〜４回のアッセイの平均＋ＳＤであり、少なくとも二つの独立した実験の代表である。
【０１５３】
図３０．ＢＲＳＫ２、ＮＵＡＫ２およびＭＡＲＫ４およびＭＥＬＫのリン酸化の分析。（Ａ）自己リン酸化することができないＢＲＳＫ２［Ｄ１５９Ａ］およびＮＵＡＫ２［Ｄ１９３Ａ］の触媒不活性突然変異体を、ＬＫＢ１複合体とともに３０分間、Ｍｇ２＋−［γ３２Ｐ］ＡＴＰとともにインキュベートし、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分離し、その後オートラジオグラフィーに付した。それらの３２Ｐ標識タンパク質をトリプシンで消化し、得られたペプチドをＣ１８カラムでのクロマトグラフィーに付した。主３２Ｐ標識ペプチドを含有する画分に印をつけてある。（Ｂ）ペプチドＰ１、Ｐ２およびＰ３を固相配列決定法に付し、エドマン分解の各サイクル後に３２Ｐ放射活性を測定した。本発明者らは、「？」と示されているＮＵＡＫ２ペプチドの同一性は、判定することができなかった。（Ｃ）示されているペプチドを上記のように、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析によって分析した。推定アミノ酸配列およびリン酸化部位が、質量実測値および質量理論値とともに示されている。「ＭＡＲＫ４」と表示されているペプチドは、図２５Ｇに対する説明文に記載したようにＬＫＢ１によってリン酸化されたＭＡＲＫ４から誘導した。このペプチドは、Ｔｈｒ残基でのみリン酸化されたＭＡＲＫ４のＴ−ループモチーフを含む。「ＭＥＬＫ」と表示されているペプチドは、上記のように大腸菌から発現され精製された非表示ＭＥＬＫのトリプシン消化物から誘導される。このペプチドは、Ｔｈｒ残基でリン酸化されたＭＥＬＫのＴ−ループを含む。略記：ｍ、メチオニンスルホン；（ｐ）は、Ｔｒ残基がリン酸化される前を示す。
【実施例１】
【０１５４】
ＭＯ２５アイソフォームは、ＳＴＥ２０関連偽キナーゼＳＴＲＡＤα／βと相互作用し、それらの結合能を強化し、ＬＫＢ１腫瘍サプレッサを活性化して細胞質に局在させる
ＬＫＢ１プロテインキナーゼにおける突然変異は、遺伝性ポイツ−ジェガース癌症候群の原因となる。今日までの研究は、ＬＫＢ１が腫瘍抑制タンパク質として機能することを示しているが、ＬＫＢ１がどのように調節されるかについてはまだ殆どわかっていない。最近の研究によって、ＬＫＢ１は、ＳＴＲＡＤαと呼ばれるＳＴＥ２０関連、触媒不活性偽キナーゼとの相互作用によって活性化され得ること、この相互作用は、ＬＫＢ１が細胞成長を抑制するために必要であることが明らかになった。本実施例において、本発明者らは、多数の哺乳動物細胞から免疫沈降させた内在性ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα複合体が、ＭＯ２５αと呼ばれる同定不能の機能ドメインを含む未知の機能の４０−ｋＤａタンパク質とも会合していることを発見した。本発明者らは、ＭＯ２５αが、ＬＫＢ１に直接結合しないが、その代わり、ＳＴＲＡＤαとの相互作用によってＬＫＢ１と会合していることを実証する。ＭＯ２５αは、ＳＴＲＡＤα（Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ）の終端３残基を特異的に認識する。これらのアミノ酸の突然変異またはトランケーションが、ＳＴＲＡＤαとＭＯ２５αの相互作用を完全になくすからである。細胞内局在性の研究は、ＭＯ２５αおよびＳＴＲＡＤαが、細胞質性複合体を形成し、その結果、ＬＫＢ１を核から排除して細胞質内に固着させることを示している。細胞内でＳＴＲＡＤαと会合するＬＫＢ１の量は、ＭＯ２５αの過剰発現により著しく増大し、これは、ＭＯ２５αがインビボでのＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤαの複合体形成を増進することを示唆している。本発明者らは、ＬＫＢ１とＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αの会合が、ＬＫＢ１の触媒活性をほぼ１０倍刺激することも立証する。さらに、本発明者らは、ＳＴＲＡＤβと名づけたＳＴＲＡＤα（ＩＬＰＩＰまたはＰＡＰキナーゼとしても知られている）に密接に関係があるアイソフォーム、およびＭＯ２５βアイソフォームも、活性複合体中でＬＫＢ１を安定させることができる証拠を提供し、ならびにサブユニットが等モル量で存在するＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５アイソフォームに結合したＬＫＢ１のヘテロトリマー複合体を単離できることを実証する。本発明者らの結果は、ＭＯ２５が、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ複合体の骨格成分として機能し、ＳＴＲＡＤ偽キナーゼとの相互作用により媒介されるＬＫＢ１活性の調節および細胞内局在化において非常に重要な役割を果たすことを示している。
【０１５５】
結果
ＬＫＢ１複合体中のＭＯ２５αの同定
ＬＫＢ１と会合しているタンパク質を同定するために、本発明者らは、Ｆｌａｇ抗体を利用してＬＫＢ１会合タンパク質を容易に免疫精製することができるように、Ｎ末端Ｆｌａｇエピトープタグを有する低レベルの野生型または触媒不活性ＬＫＢ１のいずれかを安定して発現する、前述のＨｅＬａ細胞を利用した（Ｂｏｕｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ）。野生型ＬＫＢ１もしくはキナーゼ失活型ＬＫＢ１を発現する細胞由来、またはＬＫＢ１を発現しない対照親ＨｅＬａ細胞由来のＨｅＬａ細胞溶解産物の１００枚の１０ｃｍ皿から、Ｆｌａｇ−ＬＫＢ１を免疫精製した（「材料および方法」参照）。それらの調製物をポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に付し、コロイダルブルーで染色した（図１Ａ）。キナーゼ失活型ＬＫＢ１調製物のサンプルは、存在量がより低いタンパク質をより良好に可視化できるようにさらに濃縮もした。野生型ＬＫＢ１調製物とキナーゼ失活型ＬＫＢ１調製物の両方に存在するが、対照サンプルには非存在である幾つかのバンドが観察された（図１Ａ）。図１Ａに表示されているコロイダルブルー染色バンドの同一性をトリプシンペプチド質量スペクトルフィンガープリント作製手順によって立証し（図１Ｂ）、適切な抗体での免疫ブロッティングによって確認した（図１Ｃ）。Ｈｓｐ９０およびＣｄｃ３７シャペロンタンパク質（Ｂｏｕｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ）ならびにＳＴＲＡＤα（Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を含む、ＬＫＢ１と会合することが以前に立証されているタンパク質が検出された。加えて、ＭＯ２５αと同定された約４０ｋＤａのタンパク質を、野生型ＬＫＢ１とキナーゼ失活型ＬＫＢ１の両方とともに共免疫精製したが、これは対照精製には存在しなかった（図１Ａおよび図１Ｃ）。
【０１５６】
ＭＯ２５αは、マウス胚形成の初期卵割工程において発現される遺伝子として最初に同定され（Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、細胞機能が与えられていない高進化保存タンパク質タンパク質であることが証明された（Ｋａｒｏｓ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ，１９９９；Ｎｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。データベースの分析から、本発明者らは、ＭＯ２５αに密接に関係があるアイソフォームを同定し、これをＭＯ２５βと名づけた。両方のＭＯ２５アイソフォームとともにショウジョウバエおよびＣ．エレガンスにおけるそれらの推定相同体の配列アラインメントを図２Ａに示す。ノーザンブロット分析は、ＭＯ２５αがヒトの組織において広範に発現され、骨格筋における発現が最も高レベルであることを示した（図２Ｂ）。ＭＯ２５βと交叉反応しない、ＭＯ２５αタンパク質に対して産生された抗体を使用する免疫ブロット分析（図２ＣおよびＤ）およびＥＳＴデータベースの分析（表１）によって、ＭＯ２５αが多数の組織および細胞系統において発現されることを確認した。ノーザンブロット分析により有意なレベルのＭＯ２５β  ＲＮＡを検出することはできなかったが、ＭＯ２５αと交叉反応しない、ＭＯ２５βタンパク質に対して産生された抗体を使用する免疫ブロッティングは、試験した様々な組織および細胞系統においてＭＯ２５βも発現されることを示唆した（図２Ｄ）。これは、ＭＯ２５β  ＥＳＴ配列が、多数のヒト組織から同定された観察報告と一致する（表１）。しかし、ＭＯ２５βの発現は、肝臓、およびＨｅＬａ細胞を含む幾つかの細胞系統では検出されなかった（表２Ｄ）ので、ＭＯ２５αより限られており、これが、おそらく、これらの組織において発現されたＬＫＢ１とそれが共精製されなかった（図１）理由の説明となる。
【０１５７】
【表１−１】
2007530000.tif 000003
【０１５８】
【表１−２】
2007530000.tif 000004
【０１５９】
内在性ＭＯ２５αは、内在性ＬＫＢ１と複合した状態で存在する。次に、本発明者らは、２９３細胞（図３Ａ、左のパネル）またはＲａｔ−２細胞（図３Ａ、右のパネル）から内在性ＬＫＢ１を免疫沈降させ、その後、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αについて免疫ブロットした。これらの実験により、ＭＯ２５αならびにＳＴＲＡＤαは、ＬＫＢ１と共免疫沈降するが、免疫前ＩｇＧとはしないことが明らかになった。本発明者らは、２９３細胞（図３Ｂ、左のパネル）またはＲａｔ−２細胞（図３Ｂ、右のパネル）から内在性ＭＯ２５αも免疫沈降させ、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αの存在について免疫ブロットした（図３Ｂ）。内在性ＬＫＢ１およびＳＴＲＡＤαは、ＭＯ２５αと共免疫沈降したが、免疫前ＩｇＧとはしなかった。これは、これらのタンパク質が複合体を形成するという考えと一致する。
【０１６０】
ＭＯ２５は、ＬＫＢ１とよりむしろＳＴＲＡＤと相互作用する。
ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ複合体のいずれの成分がＭＯ２５αと相互作用するのかを確認するために、本発明者らは、ＭＯ２５αを発現している構築物、およびＮ末端グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）標識ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαまたは密接に関係があるＳＴＲＡＤβ偽キナーゼのいずれか、ならびにＣｄｃ３７（ＬＫＢ１に結合することが以前に証明された（Ｂｏｕｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ）シャペロン）で、２９３細胞をコ・トランスフェクトした。ＳＴＲＡＤαおよびＳＴＲＡＤβの配列アラインメントを図１０に示す。これらの両方が、触媒作用に必要とされるキナーゼドメイン内のサブドメインＶＩおよびＶＩＩにおいて同じ重要な保存残基を欠く。ＧＳＴ標識タンパク質を親和精製し、ＭＯ２５αについて免疫ブロットした（図４Ａ）。本発明者らは、ＭＯ２５αが、ＳＴＲＡＤαおよびＳＴＲＡＤβのみと相互作用し、ＬＫＢ１およびＣｄｃ３７とはしないことを発見した。
【０１６１】
次に、本発明者らは、ＳＴＲＡＤαの存在下または非存在下で２９３細胞において発現されたＬＫＢ１、および親和精製したＬＫＢ１のタンパク質組成物を、電気泳動およびコロイダルブルーでの染色に従って分析した。予想どおり、ＳＴＲＡＤαは、ＬＫＢ１と共精製された。しかし、加えて、約４０ｋＤａの内在性タンパク質に対応する弱い染色バンドが、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα複合体において観察され、これは複合していないＬＫＢ１調製物には存在しなかった。トリプシンペプチド質量スペクトルフィンガープリンティングにより、このタンパク質が内在性ＭＯ２５αに対応することが明らかになった。これを、抗ＭＯ２５α抗体での免疫ブロッティングによって確認した（図４Ｂ）。これはＭＯ２５αがＳＴＲＡＤαを介してＬＫＢ１と会合していることをさらに示唆するものだった。図４Ｃにおいて、本発明者らは、適切なコ・トランスフェクションを行うことにより、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αが等価等モル比で存在するヘテロトリマーＬＫＢ１複合体を精製できることを実証する。本発明者らは、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５β、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤβ−ＭＯ２５αおよびＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤβ―ＭＯ２５βの類似複合体を形成できることも実証する（図４Ｃ）。これは、ＳＴＲＡＤとＭＯ２５の両方のアイソフォームが、互いに、ならびにＬＫＢ１と結合できることを示している。
【０１６２】
ＭＯ２５αは、ＳＴＲＡＤαと協同してＬＫＢ１を細胞質に局在させる。
ＬＫＢ１の細胞質性画分は、Ｇ１細胞停止を誘導することが最近明らかにされた（Ｔｉａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。従って、本発明者らは、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αの複合体の形成がこれらのタンパク質の局在化にどのように影響するかを研究することに興味をもった。標識されたＭＯ２５α、ＳＴＲＡＤαおよびＬＫＢ１の組合せでＨｅＬａ細胞をトランスフェクトし、ＭＯ２５α、ＳＴＲＡＤαおよびＬＫＢ１タンパク質を同じ細胞内で独立して検出することができる共焦点蛍光顕微鏡によって細胞内でこれらのタンパク質を可視化した。それらだけで発現されたＭＯ２５α（図５Ａ）およびＳＴＲＡＤα（図５Ｅ）は、細胞質および核内の至るところに局在していた。しかし、興味をひくこととして、ＭＯ２５αおよびＳＴＲＡＤαが共発現されたとき、両方のタンパク質が細胞質に再び局在化され、核からは排除された（図５Ｇおよび５Ｈ）。ＣＯＳ細胞において以前に報告されたように、単独で発現されたＬＫＢ１は、主として核内にあり（図５Ｌ）、ＳＴＲＡＤαとの共発現が、ＬＫＢ１の有意な細胞質内局在化を促進するが、これらの条件下では有意なレベルのＬＫＢ１が、核内に残存していた（図５Ｏ）（Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。しかし、ＭＯ２５αとＳＴＲＡＤαの両方が存在する状態では、ＬＫＢ１は、本質的に細胞質内にしか局在せず、実質的に核からは排除された（図５Ｒ）。これらの観察は、ＭＯ２５αおよびＳＴＲＡＤαが、ＳＴＲＡＤα単独より有効にＬＫＢ１を細胞質内に固着する複合体を形成することを示している。
【０１６３】
ＭＯ２５αは、ＳＴＲＡＤαの終端３残基を認識する。
ＳＴＲＡＤα上のＭＯ２５αの結合部位を規定するために、ＳＴＲＡＤαの一連の欠失突然変異を、コ・トランスフェクション結合アッセイにおいて、ＭＯ２５αと相互作用するそれらの能力について試験した。興味をひくこととして、ＳＴＲＡＤαの終端３アミノ酸（Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ）のみの欠失により、ＳＴＲＡＤαへのＭＯ２５αの結合が完全になくなった。さらに、Ｃ末端Ｔｒｐ残基のＰｈｅへの突然変異も、ＳＴＲＡＤαへのＭＯ２５αの結合を非常に減少させた（図６Ａ）。本発明者らは、ストレプタビジン−セファロースに共役結合したＳＴＲＡＤαのＣ末端残基を含むビオチニル化ペプチドを利用して、３つの異なる哺乳動物細胞溶解産物から内在的に発現されたＭＯ２５αを親和精製することができるのかどうか試験した。本発明者らは、ＳＴＲＡＤαの終端６残基（データ表示なし；図６Ｃ）ではなくＣ末端１２残基（図６Ｂ）を含むペプチドが、試験した全ての細胞溶解産物から内在性ＭＯ２５αを効率的に精製することを発見した。ＳＴＲＡＤαペプチド上のＭＯ２５α結合部位をさらに明確に描写するために、そのペプチドの各残基を個々にＡｌａに突然変異させ、これがＭＯ２５αへの結合にどのように影響するかを検証する、アラニンスキャンを行った（図６Ｂ）。Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ残基がＭＯ２５α認識のために必要であることと一致して、ＳＴＲＡＤαペプチドのＣ末端におけるこれら３残基のいずれの突然変異も、３つの異なる細胞溶解産物においてＭＯ２５α結合を完全になくすか、非常に減少させたのに対し、他の残基の突然変異は、結合に影響を及ぼさないか、中等度の影響しか及ぼさなかった。これらの発見を、より定量的な表面プラズモン共鳴Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイにおいても確認した（図６Ｃ）。
【０１６４】
ＳＴＲＡＤαへのＬＫＢ１の結合は、ＭＯ２５αのための新規結合部位（複数を含む）を作る。
次に本発明者らは、ＧＳＴ−ＳＴＲＡＤαの完全長野生型および欠失突然変異体をＭＯ２５αおよびＬＫＢ１の存在下または非存在下で共発現させる、２９３細胞における共発現結合アッセイを用いて、ＬＫＢ１のＳＴＲＡＤαへの結合が、ＭＯ２５αとの相互作用にいかなる影響を及ぼすかを調査した。前の発見と一致して、Ｃ末端１２または４８残基を欠くＳＴＲＡＤα突然変異体は、ＬＫＢ１の非存在下でＭＯ２５αと結合しなかった（図７、パネル１）。しかし、興味をひくこととして、これらのＳＴＲＡＤα突然変異体をＬＫＢ１と共発現させたとき、ＭＯ２５αがそれらの精製複合体で回収された（図７、パネル２）。これは、ＳＴＲＡＤαへのＬＫＢ１の結合が、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα複合体内にＭＯ２５αのための追加の結合部位（複数を含む）を生じさせることを示している。本発明者らは、ＧＳＴ−ＳＴＲＡＤαプルダウンにおいて回収されたＬＫＢ１の量が、ＭＯ２５αの存在下では有意に高かったこと（図７、パネル２と３を比較）に一貫して気づいた。このことは、ＭＯ２５αが、ヘテロトリマーＬＫＢ１複合体の形成を安定させ得ることを示唆している。さらに、キナーゼドメイン（残基４４〜３４３）のみを含むＬＫＢ１の触媒性断片は、ＭＯ２５αの存在下でＳＴＲＡＤαとさらにずっと効率的に相互作用した（図７、パネル４と５を比較）。これらの観察は、ＳＴＲＡＤαおよび／またはＬＫＢ１上に追加のＭＯ２５α結合部位（複数を含む）を生じさせることにより、ＭＯ２５αがＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα複合体を安定させ得ることを示している。しかし、偽キナーゼドメインの一定領域がトランケートされているＣ末端８８残基を欠くＳＴＲＡＤαの突然変異体は、ＬＫＢ１またはＭＯ２５αと相互作用することが、これらのタンパク質を共発現させたとき、もはやできなかった（図７）。これは、第二のＭＯ２５α結合部位が、ＳＴＲＡＤαのＣ末端のほうに位置すること、またはＳＴＲＡＤαの８８のＣ末端残基のトランケーションによって破壊され得る偽キナーゼドメインの完全性が、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５αヘテロトリマー複合体の形成を可能にする際に必要であることを示唆している。
【０１６５】
ＭＯ２５がＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ複合体を安定させるさらなる証拠
ＭＯ２５αがＳＴＲＡＤαへのＬＫＢ１の結合を安定させることができるさらなる証拠を得るために、ＭＯ２５α  ＤＮＡ構築物が非存在の状態、または漸増量のＭＯ２５α  ＤＮＡ構築物が存在する状態で、ＬＫＢ１およびＳＴＲＡＤαを発現する構築物で２９３細胞をコ・トランスフェクトした。ＬＫＢ１を精製し、会合したＳＴＲＡＤαとＭＯ２５αのレベルを免疫ブロッティングによって測定した。対照として、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αの発現レベルも、ＬＫＢ１の親和精製前に、それらの細胞溶解産物において測定した。ＭＯ２５α非存在下では、中等度の量のＳＴＲＡＤαがＬＫＢ１と会合し、これは、ＭＯ２５αの発現を増加させることにより、線量依存的に著しく強化された（図８Ａ、上のパネル）。ＳＴＲＡＤαのＬＫＢ１との会合増加は、ＬＫＢ１またはＳＴＲＡＤαの発現増加のせいではなかった。これらは、ＭＯ２５αが非存在の状態または漸増量のＭＯ２５αが存在する状態で、細胞溶解産物において同様のレベルで発現されからである（図８、下のパネル）。ＭＯ２５βは、ＬＫＢ１とＳＴＲＡＤαの間の相互作用を同様に強化することができた（図８Ｂ）。
【０１６６】
本発明者らは、ＭＯ２５αおよびＭＯ２５βがＬＫＢ１のＳＴＲＡＤβへの結合をどのように安定させるのかも調査した（図１１）。ＭＯ２５の非存在下ではＬＫＢ１へのＳＴＲＡＤβの検出可能な会合は観察されなったのに対し、ＭＯ２５αまたはＭＯ２５βの共発現は、ＬＫＢ１に結合するＳＴＲＡＤβを線量依存的に増加させた。しかし、ＳＴＲＡＤαとは対照的に、２９３細胞におけるＳＴＲＡＤβ発現レベルは、ＭＯ２５アイソフォーム非存在下では低く、それらの存在下では有意に増加した。これは、ＭＯ２５アイソフォームの存在下でのＳＴＲＡＤβへのＬＫＢ１の結合増加の説明となり得る（捕捉図２）。ＳＴＲＡＤβを別個の発現ベクターからＧＳＴ融合タンパク質として発現させたとき、同様の結果が得られた（データ表示なし）。
【０１６７】
ＭＯ２５アイソフォームによるＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ複合体の安定化は活性増加と相関する。
ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤαまたはＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤβ複合体へのＭＯ２５αおよびＭＯ２５βの結合が、ＬＫＢ１活性にどのように影響するのかを判定するために、ＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５アイソフォームの存在下または非存在下、野生型ＧＳＴ−ＬＫＢ１で２９３細胞をトランスフェクトした。［γ３２Ｐ］ＡＴＰの存在下、自己リン酸化活性ならびにミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＬＫＢ１の非特異的外在性基質、のリン酸基転位を測定することによって、等量の親和精製ＧＳＴ−ＬＫＢ１の活性を評価した。本発明者らは、ＭＢＰの主ＬＫＢ１リン酸化部位（Ｔｈｒ６５）を認識するリン酸特異的抗体（Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を使用して、ＭＢＰのリン酸化もモニターした。異なるＬＫＢ１活性のアッセイにより、比較できる結果が得られた（図９）。ＳＴＲＡＤアイソフォーム非存在下、ＬＫＢ１は、低活性であり（図９、レーン１）、ならびに以前に明らかにされたように（Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ＳＴＲＡＤαとの共発現は、ＬＫＢ１活性の約４倍増加を誘導した（図９、レーン２）。ＳＴＲＡＤα、およびＭＯ２５αまたはＭＯ２５βのいずれかの存在下では、ＬＫＢ１活性が、さらに約２倍増加して、ＬＫＢ１は、単独で発現されたＬＫＢ１より約９倍活性となった（図９、レーン６または７）。ＬＫＢ１は、ＭＯ２５アイソフォーム存在下でのＳＴＲＡＤβによってのみ活性化された（図９、レーン３をレーン８および９と比較）。これは、ＭＯ２５非存在下ではＳＴＲＡＤβと殆ど会合しないという観察と一致する（図１１）。ＬＫＢ１が、ＳＴＲＡＤαをリン酸化することは以前に明らかにされており（Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、本発明者らは、ＳＴＲＡＤαとＬＫＢ１の会合のＭＯ２５媒介増加が、ＳＴＲＡＤαリン酸化増加をもたらすことを明らかにする（図９、レーン２をレーン６および７と比較）。ＳＴＲＡＤαとは対照的に、ＳＴＲＡＤβは、ＭＯ２５の存在下、ＬＫＢ１により有意にはリン酸化されなかった（図９、レーン８および９）。ＬＫＢ１は、Ｔｈｒ３２９およびＴｈｒ４１９でＳＴＲＡＤαをリン酸化する（Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）が、これらの部位は、ＳＴＲＡＤβでは保存されない（図１０）。これは、ＳＴＲＡＤβがＬＫＢ１によってリン酸化されない理由の説明となる。本発明者らは、触媒不活性ＬＫＢ１が、ＭＯ２５のいずれかのアイソフォームの存在下では両方のＳＴＲＡＤアイソフォームと会合できることも明らかにした。しかし、予想通り、それは自己リン酸化することができず、ＳＴＲＡＤαまたはＭＢＰをリン酸化することができない（図９、レーン１０〜１３）。
【０１６８】
考察
この研究の主な発見の一つは、予め何の機能も与えられていない、多くの真核生物種において見出される高保存ＭＯ２５αタンパク質が、インビボでＳＴＲＡＤαおよびＬＫＢ１との複合体で存在するという発見である。興味深いことに、ＬＫＢ１非存在下では、ＭＯ２５αは、Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ配列で存在するＳＴＲＡＤαの終端３アミノ酸を特異的に認識し、Ａｌａへのこれらの３残基のいずれの突然変異もＳＴＲＡＤαへのＭＯ２５αの結合を本質的に妨げた。これに関して、ＭＯ２５αは、ＰＤＺドメイン（これもそのタンパク質結合パートナーの最終Ｃ末端残基を認識する）に対して同様に機能する（Ｓｏｎｇｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。しかし、ＰＤＺドメインとＭＯ２５αの間に相同性はなく、本発明者らの知る限り、これまでに特性付けされた他のドメインは、この特性を有さない。ＳＴＲＡＤαおよびＳＴＲＡＤβのＣ末端非偽キナーゼドメインの約５０までの残基は、あまり保存されないが、有意なことに、両方がＴｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ配列で終わっており（図１０）、このことにより、ＳＴＲＡＤαおよびＳＴＲＡＤβが、おそらく、ＭＯ２５アイソフォームと特異的に相互作用するように進化したことが強調される。ＳＴＲＡＤαおよびＳＴＲＡＤβに最も密接に関係があるタンパク質は、ＳＰＡＫ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）およびＯＳＲ１（Ｔａｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）と呼ばれる活性ＳＴＥ２０メンバーキナーゼであり、これらは、プロテインキナーゼ触媒作用に必要な全ての残基を有し（図１０）、故に、活性酵素である。ＳＰＡＫもＯＳＲ１もＴｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ配列で終わっていないが、両方が、それらのＣ末端非触媒ドメインの同様の領域にＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ配列を有する（図１０）。この観察により、本発明者らは、ＳＴＲＡＤαのＣ末端Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ配列をＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅに突然変異させることを思いつき、これが、ＭＯ２５αがＳＴＲＡＤαに結合するのを妨げることを発見した（図６Ａ）。これにより、Ｔｒｐ残基、このタンパク質の末端から３個の残基の存在が、ＳＴＲＡＤαのＭＯ２５αへの結合に本質的であることがさらに強調され、このことは、ＭＯ２５αがＳＰＡＫおよびＯＳＲ１と相互作用しないであろうことを示唆している。
【０１６９】
本発明者らのデータは、ＭＯ２５αの重要な役割の一つが、ＬＫＢ１とＳＴＲＡＤαの間の相互作用を安定させることであることを示している。これは、細胞内でＬＫＢ１と会合しているＳＴＲＡＤαの量が、ＭＯ２５αの発現により有意に増す（図８）という観察に基づく。Ｃ末端Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ残基を欠くＳＴＲＡＤαが、ＬＫＢ１の存在下でＭＯ２５αと複合体を形成することができる（図７）という発見は、ＬＫＢ１とＳＴＲＡＤαの相互作用が、ＭＯ２５αのための新規結合部位（複数を含む）を生じさせることを示し、これにより、ＭＯ２５αがＬＫＢ１とＳＴＲＡＤαの会合をどうのように安定させるかを説明することができよう。本発明者らの発見により、その（それらの）追加のＭＯ２５α結合部位がＳＴＲＡＤαおよび／またはＬＫＢ１内に位置するかどうか識別することはできない。この論点に対処するには、この複合体の詳細な構造研究が必要であろう。本発明者らの観察は、ＭＯ２５αまたはＭＯ２５βが、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ複合体の骨格成分として機能することができるという考えと一致する。
【０１７０】
ＳＴＲＡＤαとＬＫＢ１の共発現が、インビトロでのＬＫＢ１活性を強化することは以前に明らかにされており（Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ここで、本発明者らは、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤとＭＯ２５アイソフォームの会合が、さらにＬＫＢ１活性を２倍強化することを明らかにした（図９）。これらの結果は、ＭＯ２５によるＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤαの安定化が、ＬＫＢ１の活性化を同伴することを示している。しかし、重要なこととして、標識されたＬＫＢ１およびＳＴＲＡＤαを過剰発現している哺乳動物２９３細胞から精製されたＬＫＢ１およびＳＴＲＡＤαの複合体は、有意なレベルの内在性ＭＯ２５αとも会合する（図４Ｂ）ことに留意しなければならない。従って、ＭＯ２５α非存在下でＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα複合体の活性を測定することは、哺乳動物細胞におけるこれらのタンパク質の発現により不可能となる。従って、ＭＯ２５αが完全に非存在の状態でのＬＫＢ１とＳＴＲＡＤαの会合が、どれほどＬＫＢ１活性に影響を及ぼすのか定量することができない。哺乳動物細胞における過剰発現ＳＴＲＡＤαと内在性ＭＯ２５αの会合の問題を克服するために、本発明者らは、大腸菌発現ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αを併用して、ＬＫＢ１を活性化することができる複合体を形成することができるかどうか判断することを試みた。しかし、このアプローチは、成功しなかった（ＪＢデータ表示なし）。これは、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αとＬＫＢ１の会合が、追加の因子を必要とし得る、および／またはこの複合体のインビボでの組立を必要とし得る複雑なプロセスであることを示している。本発明者らは、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５サブユニットが同様の化学量論比で存在するヘテロトリマー複合体（図４Ｃ）を哺乳動物細胞から単離することができた。これは、個々のサブユニットの互いに対する比較的高い親和性を示唆している。
【０１７１】
本発明者らは、ＭＯ２５αおよびＳＴＲＡＤαが、細胞内で単独で発現されたときには、両方とも細胞質および核に局在するが、共に発現されたときには、細胞質のみに局在し、核からは排除される（図５）ことも実証した。この観察の基礎をなす分子メカニズムは調査していない。ＭＯ２５αおよびＳＴＲＡＤαの相互作用が、核内局在化シグナルの遮蔽、新規核移出シグナルもしくは細胞質内固着モチーフの露出を導く可能性があり、またはＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５α複合体が、大きすぎて自由に核に転位することができない可能性がある。本発明者らがＨｅＬａ細胞において局在化の研究を行った条件下、ＬＫＢ１およびＳＴＲＡＤαの発現後に観察された核からの排除および細胞質内局在化は、ＭＯ２５αの存在下で著しく増進された（図５）ので、ＭＯ２５αがＳＴＲＡＤαと有意に協力して、ＬＫＢ１を細胞の細胞質内に局在させ、同時に核から排除することを発見した。ＣＯＳ細胞における以前の研究によっても、ＳＴＲＡＤαが細胞の細胞質内にＬＫＢ１を局在化し得ることは明らかにされている（Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。しかし、本発明者らのデータは、有意なレベルの内在性ＭＯ２５αがＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα複合体に結合するであろうということを示しているので（図４Ｂ）、内在性ＭＯ２５アイソフォームが、ＳＴＲＡＤαでコ・トランスフェクトされたときにはＬＫＢ１の細胞質内局在化の一因となり得ることを、除外することはできない。ＬＫＢ１の細胞質内局在化は、核に侵入することができないＬＫＢ１の突然変異体がなお細胞成長を抑制する（Ｔｉａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）ので、重要であり得る。細胞の細胞質内にＬＫＢ１を維持するためのさらなるメカニズムも存在し得る。ＬＩＰ１タンパク質とＬＫＢ１の相互作用は、ＬＫＢ１細胞質内局在化を誘導することが明らかにされた（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＬＩＰ１が、ヘテロトリマーＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ−ＭＯ２５複合体と相互作用できるかどうかはもう試験されているが、ＬＩＰ１が、ＬＫＢ１活性に影響を及ぼすという報告はされていない。ＬＫＢ１もそのＣ末端でプレニル化され（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓａｐｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、これが、細胞膜との相互作用を促進し得る。最近の研究は、ショウジョウバエＬＫＢ１相同体のプレニル化が、細胞極性を制御する際のＬＫＢ１と膜の会合に重要であることを示している（Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，２００３）。
【０１７２】
推定ＭＯ２５相同体は、哺乳動物、ショウジョウバエおよびＣ．エレガンスにおいて見出されるばかりでなく、分裂酵母（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿５９４６８５、ヒトＭＯ２５αとの同一性５１％）、出芽酵母（ＨＹＭ１、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ３２４６４、ヒトＭＯ２５αとの同一性３３％）および植物（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｑ９Ｍ０Ｍ４、ヒトＭＯ２５αとの同一性４３％）においても見出される。本発明者らが知る限り、ＨＹＭ１と呼ばれる推定出芽酵母ＭＯ２５相同体のみが調査されており、分極細胞成長および細胞分離の調節において重要な役割を果たすように見受けられる(Bidlingmaier et al., 2001; Dorland et al. ,2000; Jorgensen et al., 2002)。本発明者らが知る限り、ＬＫＢ１およびＳＴＲＡＤ相同体は、酵母では報告されておらず、従って、Ｃ．エレガンスおよびショウジョウバエにおいて極性を調節するＬＫＢ１と酵母において細胞極性を調節するＨＹＭ１との間につながりがあるのかどうか、明らかではない。
【０１７３】
ＭＯ２５が、ＬＫＢ１を調節する能力とは無関係な機能を有し得る可能性もある。ＭＯ２５は、ＳＴＲＡＤα／ＳＴＲＡＤβに類似したモチーフで終わる他のタンパク質と相互作用し、Ｔｒｐ−Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｐｈｅモチーフで終わるヒトタンパク質は、２０を超える。これらのいずれかがＭＯ２５アイソフォームと結合するのを調査することは、興味深いことであろう。ＳＴＲＡＤαおよびＳＴＲＡＤβが、ＬＫＢ１の調節以外の機能を有する可能性もある。これに関して、最近の研究は、２９３細胞におけるＳＴＲＡＤβの過剰発現が、ＪＮＫ経路の上流成分であるＸＩＡＰの過剰発現により活性化されるＪＮＫ経路の能力を強化することにより、アポトーシスを防ぐことを明らかにした（Ｓａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。さらに、別の研究において、ＳＴＲＡＤβの過剰発現が、ＪＮＫおよびｐ３８γＭＡＰキナーゼの活性化を導くことが報告された（Ｎｉｓｈｉｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＳＴＲＡＤβがＪＮＫ／ｐ３８γの活性化を強化するメカニズムは、これらの研究では定義されていない。ＬＫＢ１および／またはＭＯ２５がこれらのプロセスに関与するのかどうかを試験することは、興味深いことであろう。
【０１７４】
一定の家族において見出される有意な数の遺伝形ＰＪＳは、ＬＫＢ１遺伝子の突然変異を示さず（Ｂｕｃｈｅｔ−Ｐｏｙａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、これは、ＰＪＳのための第二の原因遺伝子座が存在することを示している。今日までの遺伝子分析は、ＬＩＰ１を含まず、ＬＫＢ１と相互作用することが報告された他のタンパク質がこれらの患者において突然変異した証拠は提供されていない（Ｂｕｃｈｅｔ−Ｐｏｙａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。この研究の結果は、ＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５アイソフォームをコードする遺伝子の突然変異が、ＬＫＢ１遺伝子が突然変異していないＰＪＳ家族のいずれかにおいて発生するかどうかを検証する価値があることを示している。
【０１７５】
結論として、本発明者らは、ＭＯ２５を、インビボでのＬＫＢ１複合体の新規成分と定義する。本発明の結果は、ＭＯ２５のアイソフォームが、ＬＫＢ１と触媒不活性ＳＴＲＡＤ偽キナーゼアイソフォームの相互作用を安定させるように機能することを示している。これは、ＬＫＢ１活性およびその細胞質内局在化を著しく強化する。ＬＫＢ１機能の調節におけるＭＯ２５およびＳＴＲＡＤ相同体の生理学的機能をさらに定義するためのさらなる研究では、これらの遺伝子を欠くマウスを発生させることも重要であろう。さらに活性な形態のＬＫＢ１ヘテロトリマー複合体を発現する能力は、新規ＬＫＢ１基質を探索するために生化学的アプローチを用いる機会ももたらす。
【０１７６】
材料。プロテアーゼ−阻害剤カクテル錠は、Ｒｏｃｈｅから入手した。ジメチルピメリミデードおよび抗Ｆｌａｇ  Ｍ２−アガロース親和性ゲルは、Ｓｉｇｍａから購入した。テトラサイクリン非含有ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、Ｐｅｒｂｉｏからのものであり、他の組織培養試薬は、特に明記しない限り、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒからのものであった。プレキャストＳＤＳ／４〜１２％および１０％ポリアクリルアミドＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルおよびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。センサーチップＳＡは、ＢｉａＣｏｒｅ  ＡＢ（英国、スティーヴェネッジ）からのものであった。［γ３２Ｐ］ＡＴＰ、グルタチオン−セファロース、プロテインＧ−セファロース、およびストレプタビジン−セファロース  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
【０１７７】
ペプチド。ビオチニル化ペプチドＳＴＲＡＤα−Ｃ１２（ビオチン−Ｃ６スペーサー−ＮＬＥＥＬＥＶＤＤＷＥＦ）およびＳＴＲＡＤα−Ｃ６（ビオチン−Ｃ６スペーサー−ＶＤＤＷＥＦ）（これらの配列は、それぞれ、ＳＴＲＡＤαの終端１２および６残基を含む）、Ｆｌａｇペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、ならびに抗体を産生させるために使用したペプチドは、Ｄｒ  Ｇ．Ｂｌｏｏｍｂｅｒｇ（英国、ブリストール大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｓｔｏｌ））によって合成された。各残基が個々にアラニンによって置換されている、ＳＴＲＡＤαの終端１２残基を含むビオチニル化ペプチドは、前述されている方法論（Ｌｉｚｃａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を用いて合成した。
【０１７８】
抗体。免疫ブロッティングのために使用したＬＫＢ１抗体は、前述されている（Ｓａｐｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）ように、マウスＬＫＢ１タンパク質に対して産生させた。この抗体は、ヒトＬＫＢ１タンパク質を効率的に免疫沈降させないので、本発明者らは、大腸菌においてＧＳＴ融合タンパク質として発現されたヒトＬＫＢ１タンパク質に対してヒツジにおいて抗体を産生させ、これは、ヒトおよびラットＬＫＢ１を効率的に免疫沈降させた。この抗体を本研究における全ての免疫沈降実験に使用した。抗ＭＯ２５αおよび抗ＭＯ２５β抗体は、下記のように、大腸菌において発現されたＭＯ２５αおよびＭＯ２５βヒトタンパク質に対してヒツジにおいて産生させた。ＬＫＢ１およびＭＯ２５抗体は、その抗体を産生させるために使用したタンパク質抗原に共有結合しているＣＨ−セファロースを用いて親和精製した。ＳＴＲＡＤαタンパク質を認識する単一クローン性抗体は、既に説明されている（Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。Ｔｈｒ６５でリン酸化されたＭＢＰを認識するリン酸特異的抗体（Ｔ６５−Ｐ）は、ウシＭＢＰの残基５８〜７２に対応するペプチドＧＨＨＡＡＲＴＴＨＹＧＳＬＰＱ（この場合、下線が引かれている残基は、ホスホトレオニンである）に対してヒツジにおいて産生させた。この抗体は、このリン酸化ペプチドに共有結合するＣＨ−セファロースを用いて親和精製し、その後、リン酸化していないペプチドに結合するＣＨ−セファロースのカラムに通した。後者のカラムに結合しなかった抗体を選択した。ＧＳＴおよびＦｌａｇエピトープタグを認識する単一クローン性抗体は、Ｓｉｇｍａから入手し、Ｍｙｃエピトープタグを認識する単一クローン性抗体は、Ｒｏｃｈｅから購入し、免疫ブロッティングに使用したホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した二次抗体は、Ｐｉｅｒｃｅから入手した。対照免疫沈降実験において使用した免疫前ＩｇＧは、プロテインＧ−セファロースを利用して免疫前血清から得た。
【０１７９】
一般方法および緩衝液。制限酵素消化、ＤＮＡライゲーションおよび他の組換えＤＮＡ手順は、標準的なプロトコルを用いて行った。トランスフェクションに用いたＤＮＡ構築物は、ＱｉａｇｅｎプラスミドＭｅｇａキットをその製造業者のプロトコルに従って使用して大腸菌ＤＨ５αから精製した。全てのＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ配列決定法により検証した。これは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ＤＮＡシーケンサでのDYEnamic ET terminator chemistry (Amersham Biosciences)を使用して、英国、スコットランドのダンディー大学、生命科学スクールのシーケンシンサービス(The Sequencing Service,School of Life Sciences, University of Dundee)によって行われた。溶解緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％（重量／容量）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭフッ化ナトリウム、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．２７Ｍスクロース、０．１％（容量／容量）２−メルカプトエタノールおよび「完全」プロテイナーゼ阻害剤カクテル（１錠／５０ｍＬ）を含有した。緩衝液Ａは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、および０．１％（容量／容量）２−メルカプトエタノールを含有した。ＳＤＳサンプル緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ６．８）、２％（重量／容量）ＳＤＳ、１０％（容量／容量）グリセロール、０．００５％（重量／容量）ブロモフェノールブルー、および１％（容量／容量）２−メルカプトエタノールを含有した。
【０１８０】
ＤＮＡ構築物。完全長野生型およびキナーゼ失活型マウスＬＫＢ１を発現する構築物は、前述されている(Sapkota et al., 2002a; Sapkota et al., 2002b; Sapkota et al.,2001)。Ｎ−末端Ｍｙｃ標識ＭＯ２５α  ｃＤＮＡを作製するために、テンプレートとしてＩＭＡＧＥ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＥＳＴ  クローン（ＩＭＡＧＥ  クローン  ４８２２３８８、ＩＣＢＩアクセッション番号ＢＧ７１９４５９）を使用し、プライマー：５’−ｇｇａｔｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇａｔｃｔｃｔｇａａｇａｇｇａｃｔｔｇｃｃｇｔｔｃｃｃｇｔｔｔｇｇｇａａｇｔｃｔｃａｃａａａｔ−３’および５’−ｇｇａｔｃｃｔｔａａｇｃｔｔｃｔｔｇｃｔｇａｇｃｔｇｇｔｃｔｃｔｔｃ−３’でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートし、ＢａｍＨ１−ＢａｍＨ１断片としてｐＥＢＧ−２Ｔ（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、ｐＣＭＶ５（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）およびｐＧＥＸ−６Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ベクターにサブクローン化した。Ｎ−末端Ｍｙｃ標識ＭＯ２５β  ｃＤＮＡを作製するために、テンプレートとしてＩＭＡＧＥ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＥＳＴ  クローン（ＩＭＡＧＥ  １９５８２１７、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＩ２５２２２３）を使用し、プライマー：５’−ｃａｃｃｇｇａｔｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇａｔｃｔｃｔｇａａｇａｇｇａｃｔｔｇｃｃｔｔｔｇｔｔｔａｇｔａａａｔｃａｃａｃａａａａａｔｃｃ−３’および５’−ｇｇａｔｃｃｔｃａａｇｇｇｇｃｃｇｔｔｔｔｃｔｔｃａａｇｔｃｔｃｇｇ−３’でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ  Ｇａｔｅｗａｙ中間ベクター（Ｉｎｂｔｒｏｇｅｎ）にライゲートし、Ｇａｔｅｗａｙ変性ｐＥＢＧ−２Ｔ、ｐＤＭＶ５およびｐＧＥＸ−６Ｔ発現ベクターに変換した。本発明者らが得たヒトＭＯ２５β  ＩＭＡＧＥクローンは、寄託配列（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｑ９Ｈ９Ｓ４）と比較して、１５３位においてＶａｌの代わりにＡｌａをコードすることに留意しなければならない。表１に列挙されている幾つかの非依存的ＭＯ２５β配列のヌクレオチド配列の配列分析は、これらの全てが１５３位にＡｌａを有することを示した。Ｆｌａｇ標識ＳＴＲＡＤαについての発現構築物を、テンプレートとしてヒトＳＴＲＡＤα  ｃＤＮＡを使用して、プライマー  ５’−ｇｇａｔｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｃｔａｃａａｇｇａｃｇａｃｇａｔｇａｃａａｇｔｃａｔｔｔｃｔｔｇｔａａｇｔａａａｃｃａｇａｇｃｇａａｔｃ−３’および５’−ｇｇａｔｃｃｔｃａｇａａｃｔｃｃｃａａｔｃｇｔｃｃａｃｃｔｃｃａｇｃｔ−３で、ＰＣＲ増幅した（Ｂａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、ＢａｍＨ１−Ｎｏｔ１断片としてｐＥＢＧ−２Ｔにサブクローン化するか、ＢａｍＨ１−ＸｂａｌとしてｐＣＭＶ５に挿入した。
【０１８１】
ＳＴＲＡＤβをクローン化するために、その全コード配列を協力して含む２つのＩＭＡＧＥ  ＥＳＴクローン（５３０１９３６および５５０１５４０）をテンプレートとして使用して、プライマー  ５’−ｇｇａｔｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｃｔａｃａａｇｇａｃｇａｃｇａｔｇａｃａａｇｔｃｔｃｔｔｔｔｇｇａｔｔｇｃｔｔｃｔｇｃａｃｔｔｃａａｇ−３’および５’−ｇｇａｔｃｃｃｔａｇａａｔｔｃｃｃａｇｔａｔｇａｇｔｃｔｔｔｔｔｃａｔｃ−３’を使用するＰＣＲにより、完全長ｆｌａｇ標識ＳＴＲＡＤβ  ｃＤＮＡを作製した。このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、ＢａｍＨ１−ＢａｍＨ１断片としてｐＥＢＧ−２ＴおよびｐＣＭＶ５ベクターにサブクローン化した。Ｎ末端Ｆｌａｇエピトープタグを有するマウスＬＫＢ１の触媒断片（残基４４〜３４３）を、プライマー：５’−ａｃｔａｇｔｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｃｔａｃａａｇｇａｃｇａｃｇａｔｇａｃａａｇａａｇｃｔｃａｔｃｇｇｃａａｇｔａｃｃｔｇａｔｇｇｇｇ−３’および５’−ａｃｔａｇｔｔｃａｇｔｃｃｔｃｃａｇｇｔａｇｇｇｃａｃｔａｃａｇｔｃａｔ−３’を使用してマウスＬＫＢ１  ｃＤＮＡ（Ｓａｐｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）からＰＣＲ増幅し、ＳｐｅＩ−ＳｐｅＩ断片としてｐＣＭＶ５ベクターにサブクローン化した。他のエピトープタグを有さないＧＦＰ標識ヒトＬＫＢ１の発現をコードする構築物は、前述されている（Ｂｏｕｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ）。Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、標準的な手順を用いて、特定部位の突然変異誘発を行った。示されている位置でＳＴＯＰコドンを導入することにより、欠失突然変異を生じさせた。
【０１８２】
細胞培養条件および細胞溶解。野生型またはキナーゼ失活型ＬＫＢ１を安定的に発現するＨｅＬａ細胞の作製は、前述されている（Ｓａｐｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ）。細胞は、１０％（容量／容量）テトラサイクリン非含有ＦＢＳを補足したイーグル最小必須培地中、１Ｘ可欠アミノ酸溶液、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ／ｍＬゼオシンおよび５μｇ／ｍＬブラスチシジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で培養した。ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３、胚線維芽細胞Ｒａｔ−２細胞、およびＨｅＬａ細胞を、１０％（容量／容量）ＦＢＳを補足したダルベッコ変性イーグル培地中で維持した。全ての実験について、細胞は、直径１０ｃｍの皿で培養し、０．５から１ｍＬの氷冷溶解緩衝液に溶解した。溶解産物は、４℃で１０分間、１４０００ｇでの遠心により浄化した。
【０１８３】
免疫ブロッティング。「図の説明」で示したタンパク質量を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセルロースに転写した。それらの膜を、１時間、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％（重量／容量）脱脂粉乳含有０．５％（容量／容量）Ｔｗｅｅｎ中で１時間ブロックした。次に、それらの膜を、１μｇ／ｍＬ抗体（ＬＫＢ１、ＭＯ２５αおよびＭＯ２５β抗体）または０．１μｇ／ｍＬ（ＳＴＲＡＤα抗体）を含有する同緩衝液中で８時間、４℃でインキュベートした。抗体Ｔ６５−Ｐでの免疫ブロッティングは、抗体を産生させるために使用した抗原に対応する非リン酸化ペプチドを１０μｇ／ｍＬの濃度でインキュベートしたこと以外、上記のように行った。ＧＳＴ、ＦｌａｇおよびＭｙｃ抗体での免疫ブロッティングは、脱脂粉乳の代わりに５％（重量／容量）ＢＳＡを使用したこと以外、０．５μｇ／ｍＬの抗体で上記のとおり行った。検出は、適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体および強化化学発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して行った。
【０１８４】
内在性ＬＫＢ１およびＭＯ２５αの免疫沈降。ジメチルピメリミデート架橋手順（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８）を用いて、ＬＫＢ１およびＭＯ２５α抗体を、プロテインＧ−セファロースに、抗体１ｍｇ対樹脂１ｍＬの比率で、共有結合させた。２ｍｇの全細胞タンパク質を含有する、溶解緩衝液から２−メルカプトエタノールを削除したこと以外は上で説明したとおりに作製した２９３細胞およびＲａｔ−２細胞の浄化分解産物を、４℃で１時間、振動台の上で、１０μＬのＬＫＢ１−プロテインＧ−セファロース結合体または１５μＬのＭＯ２５α−プロテインＧ−セファロース結合体とともにインキュベートした。それらの免疫沈降物を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１ｍＬの溶解緩衝液（２−メルカプトエタノール非含有）で二回洗浄し、緩衝液Ａ（２−メルカプトエタノール非含有）で二回洗浄した。次に、それらのビーズを２０μＬ量の緩衝液Ａに再び懸濁させ、これに２−メルカプトエタノールを欠く５μＬのＳＤＳサンプル緩衝液を添加した。それらのサンプルを電気泳動に付し、その後、上記のように、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αについて免疫ブロットした。
【０１８５】
２９３細胞におけるＧＳＴ融合タンパク質の発現および親和精製。変性リン酸カルシウム法（Ａｌｅｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）を用いて、直径１０ｃｍ皿の２９３細胞を３から１０μｇのｐＥＧＢ−２Ｔ構築物で一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、それらの細胞を溶解し、浄化した溶解産物を、溶解緩衝液中で予め平衡させたグルタチオン−セファロース（一皿の溶解産物あたり２５μＬ）とともに、１時間、回転台の上でインキュベートした。それらのビーズを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する溶解緩衝液で４回、緩衝液Ａで二回洗浄した。次に、免疫ブロット分析のために、それらのビーズをＳＤＳサンプル緩衝液に再び懸濁させ、この工程の後、７５μＬのスラリー最終量を得て、それらのサンプルを上で説明したとおり免疫ブロットした。プロテインキナーゼアッセイおよびゲル電気泳動のために、それらのビーズを、０．２７Ｍ  スクロースを含有する緩衝液Ａでさらに二回洗浄し、２０ｍＭのグルタチオンを含有する同緩衝液とともにインキュベートすることによりタンパク質を樹脂から溶離した。その後、０．４４μｍフィルタによる濾過によってそれらのビーズを除去し、溶離液をアリコートに分けて、−８０℃で保管した。
【０１８６】
大腸菌におけるＧＳＴ−ＭＯ２５アイソフォームの発現および精製。Ｎ末端ＧＳＴ標識ＭＯ２５αまたはＧＳＴ標識ＭＯ２５βをコードするｐＧＥＸ−６Ｔ構築物を、大腸菌ＢＬ２１細胞に形質転換させ、０．５リットルの培養物を、６００ｎｍでの吸収が約０．７になるまで、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ液体培地中、３７℃で成長させた。その後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを２５０μＭの濃度で添加して、タンパク質発現を誘導し、それらの細胞をさらに１６時間、２６℃で培養した。３０分間、５０００ｇでの遠心により細胞を回収し、２５ｍＬの溶解緩衝液に再び懸濁させた。１ラウンドの冷凍／解凍および１０回の１５秒サイクルの超音波処理によって溶解を完了させた。４℃で３０分間、２００００ｇでそれらの溶解産物を遠心し、上清を０．４４μｍフィルタによって濾過して、予め溶解緩衝液中で平衡させた１ｍＬのグルタチオン−セファロースとともに、１時間、回転台の上でインキュベートした。それらのビーズを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する溶解緩衝液で４回、緩衝液Ａで２回、および０．２７Ｍスクロースを含有する緩衝液Ａで２回洗浄した。樹脂からＭＯ２５アイソフォームを溶離するために、ＧＳＴ融合タンパク質のＮ末端ＧＳＴ標識を切断する１５μｇのＧＳＴ標識ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを添加した。その樹脂を、そのプロテアーゼとともに、回転台の上で、１６時間４℃でインキュベートし、溶離したＭＯ２５タンパク質を０．４４μｍフィルタによる濾過によって回収した。溶離したＭＯ２５アイソフォームを、０．２５ｍＬのグルタチオン−セファロースとともに、３０分間、４℃でさらにインキュベートして、一切の微量の切断されていないＧＳＴ融合タンパク質およびＧＳＴ−ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを除去した。１ｍｇの均質なＭＯ２５が、一般に単離され、液体窒素で急速冷凍した後、アリコートで、−８０℃で保管した。
【０１８７】
Ｆｌａｇ−ＬＫＢ１の精製および質量分析。前述のように（Ｂｏｕｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ）、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２−親和性アガロースゲルを使用して、野生型ＬＫＢ１もしくはキナーゼ失活型ＬＫＢ１を安定的に発現するＨｅＬａ細胞から、または対照ＨｅＬａ細胞から、Ｆｌａｇ−ＬＫＢ１を免疫精製した。各精製について、各ＨｅＬａ細胞系統の直径１０ｃｍ皿を１００使用し、０．４ｍＬの溶離親和精製ＬＫＢ１溶液を生じた。４０μＬの各サンプル（図１Ａ、レーン１〜３）をプレキャスト４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ、コロイダルブルーでゲルを染色し、撮影した。濃縮サンプルについては（図１Ａ、レーン４）、２５０μＬのＫＤ−ＬＫＢ１調製物をメタノール沈降させ、１ＸＳＤＳサンプル緩衝液に再び懸濁し、分析した。図１Ａに示したバンドを切り出し、前述のように（Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）トリプシンで洗浄し、消化した。マトリックスとしてα−シアノ桂皮酸を使用する、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ  Ｅｌｉｔｅ  ＳＴＲ質量分析器でのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により、トリプシンペプチドを分析した。反射モードでスペクトルを得て、内部較正し、トリプシンペプチドの質量を、ローカルサーバーで実行されるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ＵＣＳＦ、ＣＡ）のＭＳ−ＦＩＴプログラムを使用してＮＣＢＩｎｒおよびＳｗｉｓｓＰｏｒｔデータベースに対してスキャンした。ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αの同一性も、前述のように（Ｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）Ｑ−ＴＯＦ２質量分析装置でのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ配列分析によって確認した。
【０１８８】
ペプチドでのＭＯ２５αの親和精製。予めＰＢＳ中で平衡させたストレプタビジン−セファロースを、振動台の上で、３０分間、各ビオチニル化ペプチドとともに、ペプチド１μｇ対樹脂μＬの比率でインキュベートし、その後、それらのビーズをＰＢＳで二回洗浄して、一切の非結合ペプチドを除去した。示されている細胞溶解産物（０．５ｍｇ）を、振動台の上で、１時間、４℃で、ストレプタビジン−セファロースペプチド結合体（５μＬ）とともにインキュベートした。それらのビーズを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１ｍＬの溶解緩衝液で二回、１ｍＬの緩衝液Ａで二回洗浄し、その後、２０μＬ量の緩衝液Ａに再び懸濁させ、５μＬのＳＤＳサンプル緩衝液を添加した。その後、それらのサンプルを上で説明したように、電気泳動に付し、ＭＯ２５αについて免疫ブロットした。
【０１８９】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析。ＢｉａＣｏｒｅ  ３０００システム（英国、スティーヴェネッジのＢｉａＣｏｒｅ  ＡＢ）で結合を分析した。示されているビオチニル化ペプチドを、ストレプタビジン塗被センサーチップ（ＳＡ）（２０応答単位、ＲＵ）に結合させた。緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％（容量／容量）ポリソルベート−２０）中で予め透析した様々な濃度の細菌発現ＭＯ２５αを、固定されたペプチド上に３０μＬ／分の流量で注入した。各ペプチドとＭＯ２５αタンパク質の間の相互作用を、６．２５〜３２００ｎＭのＭＯ２５α濃度範囲にわたって分析し、定常状態結合を各濃度で判定した。各ペプチドからのＭＯ２５αの解離を１分間にわたってモニターした。注入と注入の間のセンサーチップ表面の再生は、５μＬの１０ｍＭ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣＬの注入を３回続けることによって行った。
【０１９０】
ＬＫＢ１自己リン酸化およびＭＢＰのリン酸化。２９３細胞からグルタチオン−セファロースで親和精製したＬＫＢ１の示されている複合体（図８）の野生型または触媒不活性ＧＳＴ−ＬＫＢ１の０．５μｇを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、０．５μＭ  ミクロシスチン−ＬＲおよび１００μＭ  ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を含有する３０μＬの反応混合物中、３．３μｇのウシＭＢＰの存在下でインキュベートした。４０分間、３０℃でインキュベートした後、８μＬのサンプル緩衝液の添加により反応を停止させた。３０μＬをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、その後、それを乾燥させ、オートラジオグラフィーによって分析して、ＬＫＢ１自己リン酸化、ＭＢＰおよびＳＴＲＡＤαのリン酸化を定量した。５μＬの各反応物を４５μＬの１  Ｘ  ＳＤＳサンプル緩衝液で希釈した。得られた溶液のうち、１０μＬを抗ＧＳＴ（ＬＫＢ１を認識する）抗体、抗Ｆｌａｇ（ＳＴＲＡＤαおよびＳＴＲＡＤβを認識する）抗体および抗Ｍｙｃ（ＭＯ２５αおよびＭＯ２５βを認識する）抗体での免疫ブロッティングに使用した。３０μＬのサンプルをＴ６５−Ｐ  ＭＢＰ抗体での免疫ブロッティングに使用した。
【０１９１】
局在化の研究。直径１０ｃｍ皿上を用いてカバーガラス（ｎｏ．１．５）上でＨｅＬａ細胞を集密度５０％まで培養し、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）をその製造業者のプロトコルに従って使用して、示されているｐＣＭＶ５構築物とともに野生型ＧＦＰ−ＬＫＢ１をコードする構築物の合計２μｇでトランスフェクトした。二つ一組の皿を各条件に使用した。それらの細胞を、トランスフェクションの２０時間後にＰＢＳで洗浄し、ＰＨＥＭ緩衝液（６０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ  ＥＧＴＡおよび２ｍＭ  硫酸マグネシウム、ｐＨ７．０））中４％（容量／容量）の新たに調製したパラホルムアルデヒド中で１０分間固定した。その後、それらの細胞をＰＢＳで二回洗浄し、ＰＢＳ中１％（容量％）のＮＰ４０で透過性にし、１０％正常ヤギ血清でブロックした。それらの細胞を、（Ｆｌａｇ標識ＳＴＲＡＤαを検出するために）抗ＭＯ２５α抗体と抗Ｆｌａｇ抗体の両方で免疫標識し、ＰＢＳ中で洗浄して、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ抗ヒツジＩｇＧおよびＣｙ５抗マウスＩｇＧ抗体で対比染色した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡を使用して、それらの細胞を撮像した。クロストークを回避するために、各チャネルを独立してスキャンした（マルチトラッキング）。
【０１９２】
ノーザンブロット分析。ヒトＭＯ２５αに対応するｃＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｎ．ＮＭ＿０１６２８９、ヌクレオチド残基１５５０から２５００）をＨｉ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用してランダムプライミングにより３２Ｐ標識した。このプローブは、Ｒａｐｉｄ−Ｈｙｂ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をその製造業者によって提供されたプロトコルに従って使用して、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰＴ１２００−１）をスクリーニングするために使用した。オートラジオグラフィー後、そのプローブを取り除き、その後、その製造業者によって提供されたβ−アクチンプローブでそのブロットを再び上記のようにハイブリダイズした。
【０１９３】
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【実施例２】
【０１９４】
ＬＫＢ１腫瘍サプレッサ、ＳＴＲＡＤα／βおよびＭＯ２５α／β間の複合は、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼカスケードにおける上流キナーゼである
【０１９５】
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）カスケードは、「代謝マスタースイッチ」としての機能を果たし、細胞増殖を抑制する、細胞内エネルギー変化のセンサーである。活性化には、同定されていない上流キナーゼ（ＡＭＰＫＫ）による活性化ループ（Ｔｈｒ−１７２）内でのリン酸化が必要である。最近、本発明者らは、明確な哺乳動物相同体を有さない、ＡＭＰＫの酵母相同体の上流で動作する３つの関連プロテインキナーゼを同定した。しかし、密接に関係がある哺乳動物キナーゼは、生理学的基質が同定されていないＬＫＢ１である。ＬＫＢ１は、腫瘍サプレッサとしての機能を果たし、ヒトポイツ−ジェガース症候群において突然変異される。本発明者らは、それが二つの補助サブユニット、ＳＴＲＡＤα／βおよびＭＯ２５α／β、との複合体として存在することを実施例１において明らかにした。
【０１９６】
本発明者らは、（ｉ）ラット肝臓から精製された二つのＡＭＰＫＫ活性が、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αを含有し、抗ＬＫＢ１抗体を使用して免疫沈降させることができること；（ｉｉ）ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤα／βおよびＭＯ２５α／βの内在性複合体と組換え複合体の両方が、Ｔｈｒ−１７２のリン酸化によりＡＭＰＫを活性化すること；（ｉｉｉ）完全活性には、触媒活性ＬＫＢ１およびＳＴＲＡＤαまたはＳＴＲＡＤβおよびＭＯ２５αまたはＭＯ２５βが、必要であること；（ｉｖ）薬物ＡＩＣＡリボシドおよびフェンホルミンは、（ＬＫＢ１を欠く）ＨｅＬａ細胞ではＡＭＰＫを活性化しないが、これは、これらの細胞において（触媒不活性ＬＫＢ１ではなく）野生型ＬＫＢ１を安定的に発現することにより回復され得ることを報告する。
【０１９７】
これらの結果は、ＬＫＢ１腫瘍サプレッサのための生理学的基質の最初の説明となり、それがＡＭＰＫの上流調節因子として機能することを示唆している。本発明者らの発見は、ポイツ−ジェガース症候群における腫瘍の形成が、ＬＫＢ１不活性化の結果としてのＡＭＰＫの活性化欠如に起因し得ることを示している。
【０１９８】
結果
ラット肝臓抽出物からの二つのＡＭＰＫＫの分離
ＡＭＰＫＫについての本発明者らの以前の精製プロトコル［１４］のＱ−セファロース工程における回収率を最適化するために異なる条件で実験するうちに、活性の二つのピークを分離することができることが判明した（図１３Ａ）。第二のピークは、元々精製されているＡＭＰＫＫに対応するように見えたため［１４］、本発明者らは、それをＡＭＰＫＫ１と呼び、そのカラムから溶出する第一のピークをＡＭＰＫＫ２と名づけた。図１３ＡにおけるＡＭＰＫＫアッセイは、ラットＡＭＰＫα１の触媒ドメインの細菌発現グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合体を基質として使用して行った。これは、ＡＭＰＫα１触媒ドメインが既に完全に脱リン酸化されており、従って細菌内で発現されたとき不活性であるため、以前に使用された天然ラット肝臓ＡＭＰＫへテロトリマー［１４］より好都合である。グルタチオン−Ｓ−セファロースビーズに結合した基質でこれらのアッセイを行うことも可能であり、それによって、別様に干渉する可能性があるＡＭＰＫＫ画分中のあらゆる内在性ＡＭＰＫを洗い落とすことができる。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２を大きな、しかし別サイズのタンパク質として溶離した。標準と比較することにより、ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２のストークス半径を、それぞれ５．２および５．７ｎｍと概算した。Ｃａ２＋およびカルモジュリンは、ＡＭＰＫＫ１も、ＡＭＰＫＫ２も刺激せず、ならびにＣａＭＫＫに対する抗体（図示なし）を使用していずれも免疫沈降されなかった。
【０１９９】
ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２は、両方とも、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αを含有する
これらの二つの画分のいずれかがＬＫＢ１を含有するかどうか検査するために、本発明者らは、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αに対する抗体を使用して、Ｑ−セファロースクロマトグラフィー全体にわたって画分のブロットをプローブした（図１３Ｂ〜Ｄ）。これは、ＡＭＰＫＫ２の活性が、画分１８−２２〜におけるＬＫＢ１の約５０ｋＤａポリペプチド（≒５０ｋＤａ）ならびにＳＴＲＡＤαのもの（≒４５／４８ｋＤａ）およびＭＯ２５αのもの（≒４０ｋＤａ）の存在と相関することを示した。ＳＴＲＡＤαは、以前に報告されたように［３０］二重項として検出された。この挙動の理由は不明である。本発明者らには、抗ＭＯ２５β抗体を使用して、これらの画分における正しい分子量のシグナルが一切得られなかった（図示なし）。これは、ＭＯ２５βアイソフォームがマウス肝臓では発現されないという本発明者らの観察（実施例１）と一致する。本発明者らは、ＡＭＰＫＫ１を含有する画分２７〜２９においてＬＫＢ１およびＳＴＲＡＤαについての弱いシグナルも得たが、この負荷ＭＯ２５αは、これらの画分における検出限界より下であった。しかし、ＡＭＰＫＫ１中のＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αの存在は、より高負荷量の画分２６〜３０を分析することにより確認した（図１２Ｅ〜Ｇ）。ＬＫＢ１ポリペプチドが、ＡＭＰＫＫ２と比較してＡＭＰＫＫ１においてわずかに速い移動度で泳動したことは興味深い発見であった。これは、図１３Ｂ（図１４Ｂおよび１４Ｄも参照）の検分により明白である。
【０２００】
ＡＭＰＫＫ活性は、ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２から免疫沈降させることができる
前免疫対照ＩｇＧではなく抗ＬＫＢ１抗体を使用して、本発明者らはＡＭＰＫＫ１とＡＭＰＫＫ２の両方からＡＭＰＫＫ活性を免疫沈降することができた。図１４Ａは、キナーゼキナーゼの量が制限され、抗体が過剰であった実験の結果を示し、ならびに抗ＬＫＢ１抗体で免疫沈降させることによりＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２を含有するピーク画分から活性の８０％より多くを除去することができた一方で、免疫前対照免疫グロブリンを使用すると活性は除去されなかったことを示している。本発明者らは、同条件下で組換えＧＳＴ標識ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５α複合体（次のセクション参照）のＡＭＰＫＫ活性の９５％より多くを除去することができた。ＡＭＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２画分の上清中に残存する少量の活性は、免疫沈降がこれらの場合、定量的でないことによって説明することができ、約２０％のＬＫＢ１ポリペプチドが、その上清中に残存していた（図１４Ｂ）。
【０２０１】
この実験では使用したＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２が少量であったため、それらのペレットをＡＭＰＫＫ活性および他のポリペプチドの存在について分析することが困難であることがわかった。従って、本発明者らは、より多くのキナーゼキナーゼおよびより少ない抗体（今は抗体の量を制限する）を用いてこの実験を繰り返し、それらのペレットのみ分析した。これは、組換えＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５α複合体から回収できたのとほぼ同量のＡＭＰＫＫ活性を、ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２を含有するピーク画分からのペレットにおいて回収することができたが、免疫前対照免疫グロブリンを使用すると活性は回収されなかったことを示した（図１４Ｃ）。ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２ペレットのウエスタンブロッティングは、それらがＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αを含有するが、ＡＭＰＫＫ１ペレットではＳＴＲＡＤα二重項が非常に弱いことを示した（図１４Ｄ）。
【０２０２】
組換えＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ−ＭＯ２５複合体は無細胞アッセイにおいてＡＭＰＫα１触媒ドメインを活性化する
ＬＫＢ１が独力でＡＭＰＫを活性するのかどうか、または補助サブユニットＳＴＲＡＤα／βおよびＭＯ２５α／βを必要とするのかどうかを試験するために、本発明者らは、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において、ＧＳＴ標識ＬＫＢ１、ＦＬＡＧ標識ＳＴＲＡＤα／βおよびｍｙｃ標識ＭＯ２５α／βを様々な組合せで発現させ、グルタチオン−セファロースを用いてそれらの複合体を精製した。本発明者らは、対照として、ＬＫＢ１のＧＳＴ標識キナーゼ不活性突然変異体（Ｄ１９４Ａ）、およびＧＳＴのみを発現するプラスミドも使用した。これらの精製複合体を、ＭｇＡＴＰの存在下でＡＭＰＫα１触媒ドメインとともにインキュベートし、その触媒ドメインの活性化ならびにＴｈｒ１７２のリン酸化（リン酸特異的抗ｐＴ１７２抗体使用）を測定した。図１５Ａは、ＬＫＢ１のみでは、ＧＳＴのみが存在する状態で観察された基礎活性より高く、ＡＭＰＫα１触媒ドメインの活性またはＴｈｒ１７２のリン酸化を有意に増加しなかったことを示している（レーン１と１４を比較）。これらのタンパク質はＳＴＲＡＤα／β非存在下ではＬＫＢ１と相互作用しないと予想された（実施例１）ＭＯ２５αまたはＭＯ２５βと共発現させたＬＫＢ１で、同じ結果が得られた（レーン４および５）。ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα複合体は、基礎値より高い、ＡＭＰＫα１触媒ドメインの小さいが有意な活性化およびＴｈｒ１７２リン酸化をもたらした（レーン１と２を比較）。しかし、ＡＭＰＫα１触媒ドメインの大きな活性化およびリン酸化を生じさせるためには、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαまたはＳＴＲＡＤβを含有するヘテロトリマー複合体およびＭＯ２５αまたはＭＯ２５βが必要であった（レーン６から９）。これらのヘテロトリマー複合体での活性化度は、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５α＞ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５β?ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤβ−ＭＯ２５α＞ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤβ−ＭＯ２５βの順であった。重要なこととして、ＡＭＰＫα１を活性化するＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ−ＭＯ２５複合体の能力は、ＳＴＲＡＤα／βおよびＭＯ２５α／βの様々な組合せとＬＫＢ１の触媒不活性突然変異体（Ｄ１９４Ａ）との複合体（レーン１０〜１３）が、ＡＭＰＫα１を活性化またはリン酸化することができなかったので、ＬＫＢ１触媒活性にもっぱら依存していた。野生型ＬＫＢ１のこれらの様々な複合体で得られる活性化度は、Ｔｈｒ−１７２のリン酸化とかなり相関していた。全ＡＭＰＫα１触媒ドメインに対する抗体（図１５ＡにおいてＧＳＴ−α１−ＫＤと表示されているもの）でのプローブにより、これらのサンプルにおける負荷が均一であることを確認した。図１５Ａの下の三つのパネルより、関連ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５サブユニットが、これらのサブユニットをコードするＤＮＡがコ・トランスフェクトされていた場合、ＬＫＢ１と共沈したことが確認される。ＳＴＲＡＤαをＭＯ２５αサブユニット非存在下でＬＫＢ１と共発現させたとき、ＬＫＢ１と共沈するＳＴＲＡＤαサブユニットの量は、減少した（レーン２および３）。これは、ＭＯ２５サブユニットの存在が、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ複合体を安定させるという前の発見（実施例１）と一致する。
【０２０３】
図１５Ｂは、Ｔｈｒ−１７２が、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５α複合体によってリン酸化されたＡＭＰＫα１触媒ドメイン上の唯一の部位であった証拠を提供するものである。［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下でこれら二つのタンパク質を一緒にインキュベートしたとき、野生型ＡＭＰＫα１触媒ドメインは、３２Ｐ標識されることとなったが、ＡＭＰＫα１触媒ドメインのＴｈｒ１７２→Ａｌａ突然変異体はならなかった。
【０２０４】
ＡＭＰＫＫ１、ＡＭＰＫＫ２および組換えＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ−ＭＯ２５複合体もヘテロトリマーＡＭＰＫ複合体を活性化する
この研究における大部分のＡＭＰＫＫアッセイは、ＡＭＰＫα１触媒ドメインを基質として使用して行ったが、図１６は、ＡＭＰＫＫ１、ＡＭＰＫＫ２および組換えＧＳＴ−ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤα：ＭＯ２５α複合体も、ヘテロトリマーＡＭＰＫ複合体を活性化したことを示している。ＡＭＰＫのα１、β１およびγ１またはα２、β１およびγ１サブユニットをコードするプラスミドをＣＣＬ１３細胞において共発現させ、それらのαサブユニット上のｍｙｃタグによって精製した。プロテインＧ−セファロースビーズに結合した組換えＡＭＰＫ複合体をＭｇＡＴＰおよびＡＭＰＫＫ１、ＡＭＰＫＫ２またはＧＳＴ−ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤα：ＭＯ２５αとともにインキュベートして、上流キナーゼを洗い落とし、ＡＭＰＫ複合体の活性を判定した。図１６は、α１β１γ１複合体とα２β１γ１複合体の両方が、三つの上流キナーゼ調製物全てによって活性化されたこと、ならびにこれが、それらのαサブユニット上のＴＨｒ−１７２のリン酸化と相関したこと（これについては、（α１とα２の両方のリン酸化Ｔｈｒ−１７２を認識する）抗ｐＴ１７２抗体を使用することにより証明した）を示している。抗α１および抗α２抗体を使用するブロットによって均一な負荷が確認される（タンパク質負荷が同じであるときでさえ、抗α１抗体より抗α２抗体での方が強いシグナルが、常に得られることに留意すること）。使用したＡＭＰＫＫ２の活性は、ＡＭＰＫα１触媒ドメインを活性化する能力という点で、ＡＭＰＫＫ１のものより３．５倍高く、ＧＳＴ−ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５αのものより３０％しか低くなかったが、ＡＭＰＫＫ２は、α１β１γ１複合体の活性化にはあまり有効でないように見えた。これらの違いは、α２β１γ１複合体を基質として使用するとあまり明らかでななかった。
【０２０５】
ＡＭＰＫを活性化する内在性ＬＫＢ１は、２９３細胞から免疫沈降させることができるが、ＨｅＬａ細胞からはできない。
図１７は、ＡＭＰＫα１触媒ドメインを活性化し、Ｔｈｒ−１７２をリン酸化する活性を、抗ＬＫＢ１抗体を使用して、トランスフェクトされていないＨＥＫ−２９３細胞から免疫沈降させることができる（レーン１）が、免疫前対照免疫グロブリンではできない（レーン２）を示している。前に報告したように［３０、実施例１］、内在性ＬＫＢ１の免疫沈降は、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αの共沈を生じさせる（レーン１）。さらなる対照として、本発明者らは、ＬＫＢ１ヌル細胞系統として正常なＨｅＬａ細胞を利用した。ＬＫＢ１がこれらの細胞では発現されないことがわかっているからである［２３］。これと一致して、抗ＬＫＢ１抗体を使用することにより、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αサブユニットまたはＡＭＰＫＫ活性は、同量のＨｅＬａ細胞抽出タンパク質から免疫沈降されなかった（レーン３）。しかし、ＡＭＰＫＫ活性およびＴｈｒ−１７２リン酸化、ならびに検出可能なＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αサブユニットが、野生型ＬＫＢ１を安定的に発現する［３２］ＨｅＬａ細胞からＬＫＢ１の免疫沈降後に回収された［３４］（レーン５）。ＬＫＢ１の触媒不活性突然変異体を発現する細胞では、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αポリペプチドが、抗ＬＫＢ１抗体を使用する免疫沈降によって回収されたが、ＡＭＰＫＫ活性はされなかった（レーン７）。ＬＫＢ１ポリペプチドは、２９３細胞において観察される内在性レベルと比較して大きな程度にＨｅＬａ細胞において過剰発現された（図１４、レーン１と５を比較）が、細胞中のＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αの量が、これらの細胞では限定的であることは明らかである。ＬＫＢ１を発現するＨｅＬａ細胞におけるＡＭＰＫＫ活性およびＴｈｒ−１７２リン酸化の量、同様にＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αの共沈殿の量は、ＬＫＢ１それ自体が過剰発現されたとしても、２９３細胞におけるものより低かった。野生型ＬＫＢ１を発現する２９３細胞およびＨｅＬａ細胞からの免疫沈降物におけるＡＭＰＫＫの活性は、ＬＫＢ１のレベルとよりも複合体中のＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αのレベルと相関した。これにより、ＬＫＢ１のＡＭＰＫＫ活性の強化におけるＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５の本質的な性質がさらに強調される。
【０２０６】
ＬＫＢ１の発現は、ＨｅＬａ細胞におけるＡＭＰＫの活性化を回復させる
本発明者らは、ＡＭＰＫは、ＨｅＬａ細胞において発現されるが、他の細胞型ではこのキナーゼを容易に活性化する薬物５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド（ＡＩＣＡ）リボシドおよびメトホルミン［３３、３４］によって活性化されないことを以前に発見した（未発表の結果）。ＨｅＬａ細胞は、ＬＫＢ１を発現しない［２３］ので、これが、この変則についての説明となる可能性がある。組換えＬＫＢ１の発現が、これらの薬物に応答するＨｅＬａ細胞の能力を回復させるかどうか試験するために、本発明者らは、野生型ＬＫＢ１を安定的に発現するＨｅＬａ細胞、またはその触媒不活性突然変異体［３２］、ならびにＬＫＢ１を発現しない対照ＨｅＬａ細胞系統を使用した。これらの実験において、本発明者らは、他の細胞型においてメトホルミンより容易に、且つ、強くＡＭＰＫを活性化することが判明したメトホルミンの近縁体であるフェンホルミンを使用した。図１８Ａは、ＡＩＣＡリボシドもフェンホルミンも、対照ＨｅＬａ細胞ではＡＭＰＫを活性化しなかったことを示している。しかし、キナーゼ不活性突然変異体ではなく、野生型ＬＫＢ１を発現する細胞では、ＡＩＣＡリボシドとフェンホルミンの両方が、ＡＭＰＫの頑強な活性化を生じさせた。これは、ＡＭＰＫαのＴｈｒ−１７２のリン酸化と相関し（これについては、抗ｐＴ１７２抗体でのプローブによって証明した（図１８Ｂ））、ならびにＡＭＰＫの下流標的、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）のリン酸化とも相関した（これについては、Ｓｅｒ−７９、そのタンパク質の主要ＡＭＰＫ部位に対するリン酸特異的抗体（抗ｐＡＣＣ）でのプローブによって証明した（図１８Ｃ））。興味深いことに、ＨｅＬａ細胞における野生型ＬＫＢ１の安定的な発現は、ＡＭＰＫα１発現の小さいが再現性のアップレギュレーション度、およびＡＣＣ発現の著しいダウンレギュレーションを生じさせた（図示なし）。これらのタンパク質の発現は、これらの細胞において均一でなかったため、それらのリン酸化状態を正確に定量するために本発明者らは抗ｐｔ１７２抗体および抗α１／α２抗体（Ｔｈｒ−１７２リン酸化および全ＡＭＰＫαを検出するため）か、抗ｐＡＣＣおよびアビジン（Ｓｅｒ−７９リン酸化および全ＡＣＣを検出するため）を使用して、溶解産物の個々のブロットを同時にプローブした。これらの二重標識プロトコルの各々において用いた二つのプロービング試薬を、異なる赤外線（ＩＲ）スペクトル領域で発光する異なる蛍光染料で標識し、ＩＲレーザースキャナーを使用してそれらの結果を二つの異なるチャンネルで定量した。図１８Ｂおよび１８Ｃに、全タンパク質について得られたシグナルに対するリン酸特異的抗体を使用して得られたシグナルの比率として結果を表す。この方法は、それらのタンパク質の発現の異なるレベルを補正し、ＡＭＰＫの活性化とＴｈｒ−１７２のリン酸化の間に良好な相関関係があることを示した。ＡＣＣのリン酸化とも相関関係があったが、この場合はＡＩＣＡリボシドの方がフェンホルミンより大きな効果を有するように見えた。
【０２０７】
考察
本発明者らの結果は、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ−ＭＯ２５複合体が、ＡＭＰＫに対して作用する主上流キナーゼ活性に相当することの強力な証拠となる。重要な証拠は、次のようにまとめることができる：
【０２０８】
１．脱リン酸化ＡＭＰＫを活性化する活性をラット肝臓抽出物から精製するための以前の１０年にわたる大いなる努力（［１４］およびそれに続く未発表の研究）の間、少なくとも使用したアッセイ条件下で、ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２以外のいかなる活性も検出されなかった。
【０２０９】
２．ＡＭＰＫＫ１とＡＭＰＫＫ２の両方が、ウエスタンブロッティングにより検出することができ、その活性と相関する、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αを含有した（図１３）。
【０２１０】
３．極めて重要なこととして、ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２画分がＡＭＰＫα１触媒ドメインを活性化する能力は、抗ＬＫＢ１抗体との免疫沈降によってほぼ完全に消去されたが、対照免疫グロブリンではされなかった。抗ＬＫＢ１免疫沈降物では、活性が、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αポリペプチドとともに検出されたが、対照免疫沈降物ではされなかった（図１４）。
【０２１１】
４．２９３細胞において発現されグルタチオン−セファロースで精製されたＧＳＴ−ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５の組換え複合体がＡＭＰＫα１触媒ドメインを効率的に活性化し、Ｔｈｒ−１７２をリン酸化したため、ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２におけるＡＭＰＫＫ活性は、抗ＬＫＢ１抗体と共沈した不純物ではなかった（図１５）。この活性は、触媒不活性ＬＫＢ１とＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５サブユニットから形成された複合体がＡＭＰＫを活性化またはリン酸化できなかったため、ＬＫＢ１触媒ドメインの完全性に依存していた。野生型ＡＭＰＫα１触媒ドメインは、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよびＧＳＴ−ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５α複合体を使用してリン酸化することができたがＴ１７２Ａ突然変異体はできなかったため、α１触媒ドメインのリン酸化はＴｈｒ−１７２で排他的に発生するように見えた。
【０２１２】
５．本書では殆どの実験を、細菌発現ＡＭＰＫα１触媒ドメインを基質として使用して行ったが、ＡＭＰＫＫ１、ＡＭＰＫＫ２および組換えＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５α複合体も、ヘテロトリマーＡＭＰＫ複合体（α１β１γ１およびα２β１γ１）を効率的に活性化し、αサブユニット上のＴｈｒ−１７２でそれらをリン酸化した（図１６）。
【０２１３】
６．ＨｅＬａ細胞は、ＬＫＢ１を発現せず（図１７）、従って、天然「ノックアウト」細胞系列に相当する。他の細胞型において異なるメカニズムによりＡＭＰＫを活性化する薬物ＡＩＣＡリボシドおよびフェンホルミン［３３、３４］は、ＨｅＬａ細胞ではＡＭＰＫを活性化しなかった。しかし、誘導プロモータからの（触媒不活性突然変異体ではなく）野生型ＬＫＢ１を発現したＤＮＡで安定的にトランスフェクトした細胞において、ＡＩＣＡリボシドおよびフェンホルミンがＡＭＰＫを活性化する能力、ＡＭＰＫαサブユニットのＴｈｒ−１７２をリン酸化する能力、および下流標的（ＡＣＣ）のリン酸化を生じさせるの能力は、回復された（図１８）。これらの細胞において、フェンホルミンは、ＡＩＣＡリボシドより大きくＡＭＰＫを活性化し、Ｔｈｒ−１７２をリン酸化したが、ＡＣＣのリン酸化については、逆もまた真であった。これについての理由はわからないが、一つの可能性は、これら二つの薬剤が、別の細胞内位置でＡＭＰＫの異なるプールを差別的に活性化しているということである。
【０２１４】
ＬＫＢ１ポリペプチドは、ＨｅＬａ細胞において過剰発現されたが、ＡＭＰＫ活性化の程度ならびにＬＫＢ１と共沈するＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αの量は、２９３細胞におけるより、実際には低かった（図１７）。これは、両方の補助サブユニットが、ＡＭＰＫを活性化するＬＫＢ１の能力を強化するために必要であること示すとともに、ＬＫＢ１からの活性が、２９３細胞と比較して過剰発現されていないことも示す図１５での発見を、強く支持している。ＨｅＬａ細胞における結果は、ＬＫＢ１およびその補助サブユニットが、両方とも、無傷細胞におけるＡＭＰＫの活性化に必要であり、十分であることを示唆している。しかし、正式には、それらはこの証拠とならない。ＡＭＰＫの上流で作用する他のキナーゼが存在する場合、これらもＨｅＬａ細胞では削除されると考えられるからである。ラット肝臓抽出物からのＡＭＰＫＫの精製に対する本発明者らの非常に多くの試みにより、ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２しかこれまでは検出されておらず、現在、これら両方が、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５α複合体を表すように見える。しかし、いずれのタンパク質精製プロトコルにおいても、活性の回復は定量的ではないので他の上流キナーゼを見落とした可能性を排除することはできない。本発明者らは、使用したアッセイ条件下で活性でなかったいかなる上流キナーゼも検出できなかったであろう。例えば、ＥＧＴＡの存在下でアッセイを行ったため、Ｃａ２＋依存性プロテインキナーゼは一切検出されなかったであろう。本発明者らは、ブタの脳からのＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）が、無細胞アッセイにおいてＡＭＰＫを活性化できることを既に明らかにした［１７］が、それは、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩの活性化でのほうがずっと有効で、またそれがインビボでＡＭＰＫをリン酸化する証拠はない。
【０２１５】
ＡＭＰＫＫ１とＡＭＰＫＫ２の両方が、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αを含有するようであり、従って、現時点では、何故それらがＱ−セファロースクロマトグラフィーで分離するのかは明らかでない。一つの興味深い違いは、ＡＭＰＫＫ１中のＬＫＢ１ポリペプチドは、ＡＭＰＫＫ２中のものより有意に速くＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動することであった（図１３および１４）。ＬＫＢ１は、８以下の部位でリン酸化されることがわかっており、Ｃ末端付近のＣｙｓ−４３３においてファルニシル化もされる［３４−３７］。従って、本発明者らは、移動度の違いが、共有結合修飾の違いに起因し得ると推測する。ＡＭＰＫＫ１とＡＭＰＫＫ２のもう一つの違いは、サイズ排除クロマトグラフィーによって概算されるそれらのストークス半径であった（それぞれ、５．７対５．２ｎｍ）。本発明者らは、以前、ＡＭＰＫＫ１についてのストークス半径を５．６ｎｍと概算し、これを、グリセロール濃度勾配遠沈法によって得られた８．５Ｓの沈降係数と併せることにより、分子量について１９５ｋＤａの推定値を得た［１４］。ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２が類似した形状を有すると仮定すれば、これによってＡＭＰＫＫ２については約１７５ｋＤａの分子量が得られ、それは、１４０ｋＤａの１：１：１  ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５αの計算分子量（共有結合修飾を計算していない）に相当近い。ＡＭＰＫＫ１がさらなる会合タンパク質を含有する可能性を排除することはできないが、ＡＭＰＫＫ１とＡＭＰＫＫ２の間の共有結合修飾の違いが、その複合体の形状、従ってストークス半径に影響を及ぼし得る可能性はある。サイズ排除クロマトグラフィーでのＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２の挙動と一致して、内在性ＬＫＢ１が、５０ｋＤａの見掛けの分子量を有する大腸菌において発現されたＬＫＢ１とは著しく対照的に、ゲル濾過において１５０〜２５０ｋＤａの見掛けの分子量で泳動することは、以前に明らにされている［３８］。本結果は、ＳＴＲＡＤサブユニットが、ＬＫＢ１のキナーゼ活性を刺激する［３０］、およびＭＯ２５が、おそらくＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ複合体を安定させることにより、その活性をさらに刺激するという、人工基質（ミエリン塩基性タンパク質）を使用した前の発見（実施例１）を、有望な生理学的基質を使用して確認するものである。ＳＴＲＡＤサブユニットも発現された場合を除き、組換えＬＫＢ１で得られたＡＭＰＫＫ活性はなく、その活性は、ＭＯ２５サブユニットの追加的存在により実質的に増加した（図１５）。ＬＫＢ１と共沈するＳＴＲＡＤαおよびＳＴＲＡＤβの量が、本発明者らの前の発見（実施例１）と一致してＭＯ２５αまたはＭＯ２５βの共発現によって大きく増したこと（図１５）も注目に値した。ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５サブユニットがＬＫＢ１を活性化する正確なメカニズムは、未だ不明であるが、これらの補助サブユニットは、キナーゼをさらに調節する余地をもたらす。ＬＫＢ１が、２つの異なる部位でＳＴＲＡＤαをリン酸化すること［３０］、およびＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αが、細胞質内にＬＫＢ１を保持する複合体を形成することは既にわかっている（実施例１）。ＡＭＰＫとその上流キナーゼの両方がヘテロトリマーであることに注目することも興味深い。
【０２１６】
ＡＭＰＫの活性化は、ＬＫＢ１の腫瘍サプレッサとしての機能を果たす能力ならびに細胞成長および増殖を阻止する能力の説明となる？  ＡＭＰＫが、生合成の一般的阻害剤であること［１、２］に加えて、それが細胞周期を通して進行を調節することができるという証拠もたまっているため、これは、確かにもっともらしく思える。例えば、ＡＭＰＫの活性化は、ｐ５３を安定化することによりＨｅｐＧ２細胞の増殖を抑制し［１３］、ならびに細胞質内のＲＮＡ結合タンパク質ＨｕＲのレベルを低下させて、サイクリックＡおよびＢ１をコードするｍＲＮＡの安定性を低下させる［１２］。興味深いことに、キナーゼを発現しないＧ３６１細胞におけるＬＫＢ１の発現は、ｐ２１の誘発を随伴しｐ５３に依存する、Ｇ１期における停止の原因となる［２３、２４］。
【０２１７】
もう一つの刺激的な可能性は、ＰＤＫ１が「ＡＧＣ」サブファミリーの多数のキナーゼの活性化ループ内のトレオニン残基をリン酸化する［３９］のと同じ方法で、ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ−ＭＯ２５複合体が、他のプロテインキナーゼについての上流キナーゼとしての機能も果たし得ることである。ヒトゲノムにコードされた５１８のヒトプロテインキナーゼの触媒ドメイン配列間の関係を示すデンドログラム［４０］は、ＡＭＰＫα１およびＡＭＰＫα２が、８の他のプロテインキナーゼ（ＮｕａＫ１、ＮｕａＫ２、ＢｒｓＫ１、ＢｒｓＫ２、ＳＩＫ、ＱＩＫ、ＱＳＫおよびＭＥＬＫ；詳細については［４１］参照）も含有する小さな副分枝上にあることを示し、前記プロテインキナーゼの殆どが、以前に研究されておらず、それらについて殆ど知られていない。これらのキナーゼの活性化ループ配列のアラインメントを、その近縁であるサイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの「ＡＧＣ」サブファミリー触媒Ｃαサブユニット（ＰＫＡα；これは自己リン酸化によってその活性化ループにおいてリン酸化され得る）のもの、およびＰＫＤ１による活性化ループにおけるリン酸化によって活性化される、プロテインキナーゼＣのαアイソフォーム（ＰＫＣα）のものとともに、図１９に示す。無細胞アッセイにおいてラット肝臓ＡＭＰＫＫにより活性化されることが、双方、証明されている、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＡｔＳｎＲＫ１α１、ＡｔＳｎＲＫα２）およびサッカロミセス‐セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＳｃＳｎｆ１）［４２、４３］の活性化ループ配列も図１９に含める。これらの配列の全てが、リン酸化の標的であるトレオニン残基のＣ末端側で良好に保存されるが、ＡＭＰＫ／Ｓｎｆ１サブファミリーは、不変「ＤＦＧ」モチーフとトレオニン残基の間のＮ末端側でのほうが高度に保存される。ＡＭＰＫ／ＳＮＦ１サブファミリーでは保存されるが、「ＡＧＣ」ファミリーではされない配列特性には、−３、−２および−８、−９位における疎水性残基のペアが挙げられる。ＮｕａＫ１およびＮｕａＫ２ならびにヒト、植物および酵母ＡＭＰＫ／ＳＮＦ１キナーゼも、−１２から−１０位に保存「ＬＳＮ」モチーフを有する。ＡＭＰＫサブファミリーのうちの他のヒトキナーゼが、相当する活性化ループトレオニン残基のリン酸化により活性化されるのかどうか、およびそれらもＬＫＢ１／ＳＴＲＡＤ／ＭＯ２５複合体についての下流標的であるのかどうかは、未だ判定されていない。もしそうであれば、これらの他のキナーゼが、ＬＫＢ１の腫瘍抑制機能の一部を媒介し得る。このサブファミリーにおける触媒ドメインは、密接に関係しているが、他の領域は、より可変的である傾向があるので、これらのキナーゼは、ＬＫＢ１／ＳＴＲＡＤ／ＭＯ２５複合体によるリン酸化による別のストレスまたは他の刺激によって活性化され得ること、およびこれらのキナーゼは一緒にＬＫＢ１によって誘発される多様な細胞作用を媒介することが推測される。それらが一部の共通の下流標的をＡＭＰＫと共有することも可能である。
【０２１８】
結論
本発明者らの結果は、無細胞アッセイと無傷細胞の両方において、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤα／βおよびＭＯ２５α／βの間の複合体が、活性化ループ内のＴｈｒ−１７２でのリン酸化によりＡＭＰＫを活性化する、長い間捜し求めてきた上流キナーゼの構成要素となる強力な証拠となる。ＡＭＰＫの生理学的活性化が、生合成の一般的阻害ならびにＧ１期におけるｐ５３依存性停止を生じさせることは既に知られているため、ＡＭＰＫのＬＫＢ１による活性化により、後者が腫瘍サプレッサとしての機能を果たす能力が少なくとも一部は説明され得る。ＬＫＢ１は、プロテインキナーゼのＡＭＰＫ／ＳＮＦ１サブファミリーの他のメンバーについての上流キナーゼとしても機能することができる。
【０２１９】
材料および方法
材料、タンパク質および抗体
プロテインＧ−セファロースおよび事前充填Ｑ−セファロースカラムは、英国のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈからのものであった。ＧＳＴ−ＡＭＰＫα１触媒ドメインは、前述のように［４４］大腸菌において発現させ精製した。ＡＭＰＫのα１およびα２サブユニットに対するヒツジ抗体［４５］、ヒトＬＫＢ１、ＭＯ２５αおよびＭＯ２５βに対するヒツジ抗体（実施例１）、ならびにＡＭＰＫαサブユニットのＴｈｒ−１７２部位に対するリン酸特異的抗体（抗ｐＴ１７２）［４６］は、前述されている。ＡＭＰＫα１触媒ドメインに対するヒツジ抗体は、抗ｐＴ１７２について説明されている方法［４６］を用いて、ペプチドＣＤＰＭＫＲＡＴｐＩＫＤＩＲＥ（システイン＋ラットα１の残基２５２〜２６４、Ｔｐ＝ホスホトレオニン）に対して産生させた。これは、リン酸特異的抗体として設計したが、細菌において発現されたＧＳＴ−ＡＭＰＫα１触媒ドメインを認識し、認識はプロテインホスファターゼ処置による影響を受けない。ＳＴＲＡＤαに対する単一クローン性抗体は、前述されている［３０］。他の材料およびタンパク質の供給源は、前述されている［１４］。
【０２２０】
酵素アッセイ
前述のように、ＡＭＰＫ［１４］およびＡＭＰＫＫ［３４］をアッセイし、単位を定義した。ＡＭＰＫアッセイのための細胞の急速溶解は、前述されている［４７］とおりであった。アッセイは、三重で行った。結果は、平均±標準偏差として表す。
【０２２１】
ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２の精製
ＡＭＰＫＫは、前述されている［１４］ように、ブルー・セファロース工程まで精製した。このカラムからのフロースルーを緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０％（重量／容量）グリセロール、０．０２％（重量／容量）Ｂｒｉｊ−３５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ベンズアミジン、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍＬ  大豆トリプシン阻害剤）での希釈により１６０ｍＭ  ＮａＣｌに調整し、緩衝液Ａ＋１６０ｍＭ  ＮａＣｌ中、３ｍＬ／分で、高性能Ｑ−セファロース  ＨｉＬｏａｄ  １６／１０カラムにかけた。そのカラムを、Ａ２８０が０．０５未満になるまで、緩衝液Ａ＋１６０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、その後、ＡＭＰＫＫ活性を、緩衝液Ａ中１６０〜４００ｍＭのＮａＣｌの線形勾配（１２０ｍＬ）で溶離した。
【０２２２】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞における組換えＬＫＢ１複合体の発現
実施例１で説明したように、ＧＳＴ標識ＬＫＢ１、ＦＬＡＧ標識ＳＴＲＡＤαまたはＳＴＲＡＤβ、およびｍｙｃ標識ＭＯ２５αまたはＭＯ２５βの様々な組合せを、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において発現させ、それらの複合体をグルタチオン−セファロースで精製した。
【０２２３】
［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを使用するＧＳＴ−α１触媒ドメインのリン酸化
野生型またはＴ１７２Ａ突然変異体いずれかのＧＳＴ−α１触媒ドメイン（５０μｇ／ｍＬ）［４４］を、ＧＳＴ−ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤα：ＭＯ２５α複合体（２０単位／ｍＬ）の存在下または非存在下で３０分間、３０℃で、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（２００μＭ；〜７５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）とともにインキュベートした。ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加により反応を停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってポリペプチドを分離して、乾燥させたゲルをオートラジオグラフィーに付した。
【０２２４】
組換えＡＭＰＫヘテロトリマーの調製
ｍｙｃ−α１、β１およびγ１をコードするプラスミドをＣＣＬ１３細胞において共発現させ［４５］、急速溶解法［４７］によって細胞を回収した。溶解産物を抗ｍｙｃ抗体で免疫沈降させ、５０ｍＭ  ＮａＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ジチオトレイトール、０．０２％（重量／容量）Ｂｒｉｊ−３５、ｐＨ７．５に再び懸濁させた。
【０２２５】
内在性ＬＫＢ１の免疫沈降
抗ヒト抗体およびプロテインＧ−セファロースを使用する内在性ＬＫＢ１の免疫沈降は、実施例１において説明している。キナーゼキナーゼアッセイは、ＡＭＰＫの免疫沈降アッセイについて前述のとおり［４７］、振盪インキュベータ内で、ＧＳＴ−α１触媒をメインを基質として使用して行った。
【０２２６】
ＬＫＢ１を発現するＨｅＬａ細胞
誘導性（Ｔｅｔ−ＯＮ）野生型またはキナーゼ不活性突然変異ＬＫＢ１を安定的に発現するＨｅＬａ細胞の作製、およびそれらの培養条件は、前述されている［３２］。
【０２２７】
タンパク質分析および電気泳動
タンパク質濃度は、ブラッドフォードの色素結合法［４８］を使用して判定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、プレキャスト３〜８％Ｔｒｉｓ−酢酸ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの分析以外は、ＭＯＰＳ緩衝系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、プレキャストＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４〜１２％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルを使用して遂行した。Ｘｃｅｌｌ  ＩＩ  Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）に転写した。
【０２２８】
赤外線撮像によるウエスタンブロットの検出
ＡＣＣのリン酸化を分析するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサンプルを分析し、ニトロセルロース（ＢｉｏＲａｄ）に転写して、０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＯｄｙｓｓｅｙ（商標）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液中で１時間インキュベートした。その後、抗ｐＡＣＣ抗体（ブロッキング緩衝液中、１．４６μｇ／ｍＬ）を添加し、１時間振盪させた。それらの膜を、ＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）０．５Ｍ  ＮａＣｌ）とＴｗｅｅｎ−２０（０．２％）で５分間、６回洗浄した。０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０および１μｇ／ｍＬ  ＩＲ色素６８０結合抗ヒツジＩｇＧ（オランダ、ライデンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）および１μｇ／ｍＬ  ＩＲ色素８００結合ストレプタビジン（ペンシルバニア州、フィラデルフィアのＲｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ．）を含有するブロッキング緩衝液にそれらの膜を浸漬し、光防護して１時間振盪させた。その後、膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．２％）を使用して５分間、６回、およびＰＢＳで５分間、１回洗浄した。Ｏｄｙｓｓｅｙ（商標）ＩＲ撮像装置を使用し、二つの異なるチャンネルでそれらの膜をスキャンし、結果をＯｄｙｓｓｅｙ（商標）ソフトウェアを使用して定量し、ストレプタビジンで得られたシグナルに対するｐＡＣＣ抗体で得られたシグナルの比率として表した。ＧＳＴ−α１触媒ドメインのリン酸化の分析は同様であったが、但し、４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを使用し、ならびにそれらの膜を製造業者の説示に従って、それぞれＩＲ色素６８０およびＩＲ色素８００を直接標識したヒツジ−抗ｐＴ１７２抗体および抗ＡＭＰＫα１触媒ドメイン抗体で１時間同時にプローブした。
【０２２９】
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【実施例３】
【０２３０】
ＬＫＢ１のためのペプチド基質
【０２３１】
ＬＫＢ１についてのキナーゼアッセイは、ペプチド基質を使用して、例えば、配列が、ＬＳＮＭＭＳＤＧＥＦＬＲＴＳＣＧＳＰＮＲＲＲ（Ｐ８１ペーパーに結合することができるようにＣ末端に３個のさらなるＡｒｇ残基を加えたヒトＡＭＰＫα−１残基１６３〜１８１）であるＡＭＰＫのＴ−ループペプチドを使用して行うことができる。
【０２３２】
アッセイは、次のように行うことができる。そのような基質ペプチドを使用する他のアッセイを、例えばハイスループット形式で用いることができる。この標準アッセイ（５０μＬ）は、次のものを含有した：０．３μｇの精製ＧＳＴ−ＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤα−ＭＯ２５α複合体、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％（容量％）２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．１ｍＭ［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（約２００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）およびＴ−ループペプチド（ＬＳＮＭＭＳＤＧＥＦＬＲＴＳＣＧＳＰＲＲＲ、１０〜２０００μＭ）。これらのアッセイを３０℃で３０分間行い、その後その反応混合物を１ｃｍ角のｐ８１ペーパー上にピペッティングすることにより停止させ、それを２５０ｍＬの５０ｍＭ  リン酸を６回取り替えて洗浄し（各洗浄２分）、その紙を２００ｍＬのアセトンで１回洗浄して乾燥させた。そのｐ８１ペーパーに結合した放射活性をチェレンコフ測定によって定量した。この活性の１単位は、１分あたり１ｎｍｏｌのペプチドをリン酸化を触媒する酵素の量である。
【０２３３】
ペプチドのＫｍは、１．８０±０．４８、およびＶｍａｘは、２３．４±３．５と概算された。
【実施例４】
【０２３４】
ＬＫＢ１によるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性化
【０２３５】
１２の他のプロテインキナーゼ（ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２、ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＳＩＫ、ＭＡＲＫ１、ＭＡＲＫ２、ＭＡＲＫ３、ＭＡＲＫ４およびＭＥＬＫ）は、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）と密接に関係があるものである。ここで、本発明者らは、ＬＫＢ１が、ＡＭＰＫサブファミリーの全メンバーのＴ−ループをリン酸化して、それらの活性を５０倍より大きく増大させることができることを実証する（ＭＥＬＫについては実証しない）。ＬＫＢ１触媒活性およびＭＯ２５およびＳＴＲＡＤの存在は、ＡＭＰＫ関連キナーゼ全ての活性化に必要である。ＬＫＢ１によりリン酸化されたＴ−ループＴｈｒのＡｌａへの突然変異は、活性化を妨げるが、Ｇｌｕへの突然変異は、活性形態の多数のＡＭＰＫ関連キナーゼを構成的に生産した。本発明者らは、ＬＫＢ１を発現する細胞における内在性ＮＵＡＫ２、ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＳＩＫ、ＭＡＲＫ１、ＭＡＲＫ２／３およびＭＡＲＫ４キナーゼの活性を測定するためのアッセイを開発し、これらを活用してこれらの酵素の活性がＬＫＢ１−／−線維芽細胞において、またはＬＫＢ１を発現しないＨｅＬａ細胞において著しく低減されることを明らかにした。興味深いことに、ＬＫＢ１活性も、いずれかのＡＭＰＫ関連キナーゼのものも、ＡＭＰＫのリン酸化および活性化を誘発する二つの薬物、フェンホルミンまたはＡＩＣＡリボシドによる刺激を受けない。本発明者らの結果は、ＬＫＢ１が、ＡＭＰＫ関連キナーゼならびにＡＭＰＫの活性化を調節するマスター上流プロテインキナーゼとして機能することを示している。それらの間で、これらのキナーゼは、腫瘍抑制機能を含むＬＫＢ１の生理的作用の一部を媒介し得る。
【０２３６】
ヒトキノームの検査は、ＡＭＰＫα１およびＡＭＰＫαと密接に関係がある１２のプロテインキナーゼ（ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＳＩＫ、ＭＡＲＫ１、ＭＡＲＫ２、ＭＡＲＫ３、ＭＡＲＫ４およびＭＥＬＫ）が存在することを示している（図２１ＡおよびＢ）。本発明者らが「ＡＭＰＫ関連キナーゼ」について用いるであろう命名法は、Ｍａｎｎｉｎｇら（Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）によって使用されたものに基づく。ＭＡＲＫ３は、ＰＡＲ１ＡまたはＣ−ＴＡＫ１としても知られており（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｓｐｉｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ＮＵＡＫ１はＡＲＫ５としても知られており（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ）、ＮＵＡＫ２はＳＮＡＲＫとしても知られており（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、およびＱＩＫはＳＩＫ２（Ｈｏｒｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）としても知られている。ＬＫＢ１によってリン酸化されるＡＭＰＫα１およびＡＭＰＫα２のＴ−ループＴｈｒ残基、およびその周囲の多数の残基がＡＭＰＫ関連キナーゼでは保存される（図２１ＡおよびＢ）。これは、ＬＫＢ１もＴ−ループＴｈｒ残基をリン酸化しうり、従って、ＰＤＫ１が関連ＡＧＣキナーゼ群の活性を調節する（Ａｌｅｓｓｉ，２００１）のと同じ方法で、ＡＭＰＫ関連キナーゼを調節し得ることを示している。ＭＡＲＫキナーゼは、細胞極性の制御において重要な役割を果たすことが報告されており、それらのＴ−ループＴｈｒ残基のリン酸化により調節されることが知られている（Ｌｒｅｗｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，２００３；Ｓｐｉｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。  ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）での研究は、当初、ＭＡＲＫ３がＬＫＢ１の上流にあり得ることを示していた（Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，２００３）が、哺乳動物細胞での最近の研究は、この結論に対して異議を唱えており、ＬＫＢ１が、ＭＡＲＫ３の上流にあり、その活性を制御することを示唆している（Ｓｐｉｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。残りのＡＭＰＫ関連酵素の調節の機能またはメカニズムについては殆どわかっていない。従って、この実施例では、ＡＭＰＫ関連キナーゼの活性の調節においてＬＫＢ１が果たす役割を調査しようと努めた。
【０２３７】
結果
ＬＫＢ１複合体によるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性化。本発明者らは、前記１２のＡＭＰＫ関連キナーゼ全ての完全長バージョンを大腸菌においてクローン化し発現させ、ならびにＬＫＢ１複合体によってリン酸化されない（ＪＭＬ、データ表示なし）ＡＭＰＫについてのＡＭＡＲＡ  ＡＭＰＫペプチド基質（Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）を利用して、これらの酵素についてのアッセイを開発した。大腸菌から精製されたＡＭＰＫ関連キナーゼの全てが、このペプチドをリン酸化し、約４０Ｕ／ｍｇの活性を有するＭＥＬＫを除き、１Ｕ／ｍｇ（１Ｕｎｉｔ＝１分あたりにリン酸化されたペプチド１ｎｍｏｌ）未満の低い基礎活性を有することが判明した（図２１）。それらのＡＭＰＫ関連キナーゼをＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤ：ＭＯ２５複合体およびＭｇＡＴＰとともにインキュベートした後、ＡＭＰＫ関連キナーゼの活性は、殆どまったく増加しなかったＭＥＬＫを除き、５０から２００倍増大した（図２１）。ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αと複合体を形成している触媒不活性ＬＫＢ１は、ＡＭＰＫ関連キナーゼの基礎活性を増加することができなかった。これは、ＬＫＢ１のキナーゼ活性が必要であったことを示唆している（図２１）。
【０２３８】
ＬＫＢ１によるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性化には、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５が必要である。ＬＫＢ１によるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性化を可能にする際のＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５の重要性を判定するために、２９３細胞においてＧＳＴ標識ＬＫＢ１、ＦＬＡＧ標識ＳＴＲＡＤα／βおよびｍｙｃ標識ＭＯ２５α／αを様々な組合せで発現させ、それらの複合体をグルタチオン−セファロースで親和精製した（図２２）。精製された複合体を、ＭｇＡＴＰの存在下で、ＡＭＰＫ関連キナーゼとともにインキュベートし、それらの活性化を測定した。ＬＫＢ１は独力ではいずれのＡＭＰＫ関連キナーゼも有意に活性化しなかった（図２２、レーン１と１４を比較）。ＭＯ２５αまたはＭＯ２５βと共発現させたＬＫＢ１で同じ結果が得られた（図２２、レーン４および５）。これは、これらのタンパク質がＳＴＲＡＤα／β非存在下ではＬＫＢ１と相互作用しない（実施例１；Ｂｏｕｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ）ので、予想通りであった。ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤα複合体は、小さな活性化をもたらした（図２２、レーン１と２を比較）が、大きな活性化を達成するためには、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαまたはＳＴＲＡＤβ、およびＭＯ２５αまたはＭＯ２５βを含有するヘテロトリマー複合体が必要であった（図２２、レーン６から９）。ＡＭＰＫα１について以前に報告されているように（図２２および実施例２；  Ｈａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、全てのＡＭＰＫ関連キナーゼは、ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤα：ＭＯ２５α複合体によって最も効率的に活性化されたが、異なるヘテロトリマー複合体の相対的な有効度は、基質によって変わった（図２２）。ＬＫＢ１の触媒不活性突然変異体を含有するヘテロトリマー複合体は、いずれの酵素も活性化することができなかった（図２２、レーン１０〜１３）。ＳＴＲＡＤアイソフォームをＭＯ２５非存在下でＬＫＢ１と共発現させたとき、ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤ複合体を安定させるためにはＭＯ２５が必要である（実施例１；Ｂｏｕｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ）ので、ＬＫＢ１と共沈するＳＴＲＡＤの量が著しく減少したこと（図２２、レーン２および３をレーン６および７と比較）に、留意しなければならない。
【０２３９】
ＬＫＢ１複合体は、その活性化ループにおいてＡＭＰＫ関連キナーゼをリン酸化する。ＬＫＢ１複合体が、その活性化ループ内のＴｈｒ１７２において特異的にＡＭＰＫα１をリン酸化することは以前に明らかにされているので、本発明者らは先ずＡＭＰＫ関連キナーゼにおけるそれに相当するＴ−ループ残基をＡｌａに突然変異させ、このことがＬＫＢ１複合体によるこれらの酵素のリン酸化にどのように影響するか試験した。本発明者らは、野生型ＡＭＰＫ関連キナーゼがＬＫＢ１複合体によってリン酸化されること、およびＴ−ループＴｈｒ残基のＡｌａへの突然変異がリン酸化を完全になくすか、有意に減少させることを実証した（図２３）。本発明者らは、ＬＫＢ１複合体によってインビトロでリン酸化された触媒不活性ＢＲＳＫ２およびＮＵＡＫ２突然変異体の詳細なリン酸化部位分析を行った（図３０）。３２Ｐ標識ＢＲＳＫ２およびＮＵＡＫ２タンパク質をトリプシンで消化し、得られたペプチドをＣ１８カラムでのクロマトグラフィーによって分離した。その主３２Ｐ標識ペプチドを、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析および固相エドマン配列決定法によって分析し、これによりこれらの酵素がそれらのＴ−ループＴｈｒ残基でリン酸化されることを実証した（図３０）。
【０２４０】
Ｔ−ループリン酸化は、ＡＭＰＫ関連キナーゼを活性化する。ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＳＩＫおよびＭＥＬＫのＴ−ループリン酸化がそれらの調節において果たす役割を研究するために、これらの酵素のＴ−ループＴｈｒ残基をＡｌａに突然変異させてリン酸化を防止するか、Ｇｌｕに突然変異させてリン酸化を模倣した。全ての場合、Ａｌａ突然変異体の基礎活性は低く、それらの活性はＬＫＢ１複合体とのインキュベーションによって増大されなかった（図２４）。対照的に、Ｇｌｕ突然変異体の基礎活性はＬＫＢ１によってリン酸化された野生型酵素のものと同様であり、ＬＫＢ１複合体およびＭｇＡＴＰとのインキュベーション後さらに増大しなかった（図２４）。ＭＥＬＫの場合、Ａｌａ突然変異体は低い活性を有し、Ｇｌｕ突然変異体は野生型酵素と同様の活性のものであった。これは、野生型ＭＥＬＫが、（他のＡＭＰＫ関連キナーゼのように）活性にＴ−ループリン酸化を必要とすることを示唆している。大腸菌において発現された野生型ＭＥＬＫは活性であるので、ＭＥＬＫはそれ自体Ｔ−ループＴｈｒ残基のリン酸化を触媒することができるのかもしれない。これと一致して、大腸菌において発現された野生型ＭＥＬＫのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦ分析により、Ｔ−ループが現実にリン酸化されることが立証された（図３０Ｃ）。
【０２４１】
ＬＫＢ１によるＭＡＲＫキナーゼのリン酸化および活性化。以前の研究は、ＭＡＲＫ３およびＭＡＲＫ３キナーゼがＴ−ループＴｈｒ残基でリン酸化されるのに加え、隣接Ｓｅｒ残基でもリン酸化されることを明らかにした（図２１ＡおよびＢ、ならびに（Ｄｒｅｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｔｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３））。ＬＫＢ１複合体によってリン酸化される触媒不活性ＭＡＲＫ３のペプチドマッピングは、Ｔ−ループ内のＴｈｒ２１１残基とＳｅｒ２１５残基の両方がリン酸化されることを明らかにした（図２５Ａ）。興味深いことに、触媒不活性ＭＡＲＫ３［Ｔ２１１Ａ］突然変異体は、ＬＫＢ１によってＳｅｒ２１５でリン酸化されなかったが、触媒不活性ＭＡＲＫ３［Ｓ２１５Ａ］突然変異体は、Ｔｈｒ２１１でなおリン酸化された（図２５Ａ）。本発明者らは、次に、Ｔ−ループＴｈｒまたはＳｅｒ残基の突然変異が、ＬＫＢ１複合体によるＭＡＲＫ３の活性化にどのように影響するのかを調査した（図２５Ｃ）。ＭＡＲＫ３［Ｔ２１１Ａ］突然変異体をＬＫＢ１複合体によって活性化することはできなかったが、ＭＡＲＫ３［Ｓ２１５Ａ］突然変異体は小程度に活性化された。ＭＡＲＫ３［Ｔ２１１Ｅ］突然変異体はＬＫＢ１によって活性化された野生型酵素の活性の約１５％しか有さず、ＬＫＢ１によってさらに活性化することはできなかった。ＭＡＲＫ３［Ｓ２１５Ｅ］突然変異体は、不活性でありＬＫＢ１によって活性化することができなかった（図２５Ｃ）。予想通り、ＭＡＲＫ１、ＭＡＲＫ２およびＭＡＲＫ４におけるＴ−ループＴｈｒからＡｌａへの突然変異が、ＬＫＢ１によるそれらの活性化を妨げる（図２５ＤからＦ）ことも判明した。ＭＡＲＫ１、ＭＡＲＫ２およびＭＡＲＫ３におけるＴ−ループＴｈｒ残基のＧｌｕへの突然変異はこれらの酵素の活性化をもたらさないか、ほんの小さな活性化をもたらした（図２５ＤからＦ）。対照的に、ＭＡＲＫ４における同等の突然変異は活性を大いに増大させた（図２５Ｆ）。ペプチドマッピング研究およびＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析により、ＬＫＢ１がＴｈｒ残基でのみＭＡＲＫ４  Ｔ−ループをリン酸化し、Ｓｅｒ残基ではしないことが実証された（図２５Ｇおよび図３０Ｃ）。
【０２４２】
ＬＫＢ１のためのペプチド基質の同定。本発明者らは、次に、ＡＭＰＫα１、ＢＲＳＫ２、ＮＵＡＫ２、ＳＩＫ、ＭＡＲＫ３およびＭＥＬＫの活性化ループを含むペプチドをＬＫＢ１複合体がリン酸化できるかどうか試験した。効率は異なるが、全てのペプチドはリン酸化された（図２６Ａ）。固相エドマン配列決定法により全てのペプチドがＬＫＢ１によりＴ−ループＴｈｒ残基で特異的にリン酸化されることが確認された（図２６Ｂ）。ＮＵＡＫ２のＴ−ループ由来の最適ペプチド基質は１５０μＭのＫｍ値でＬＫＢ１によりリン酸化され、ＡＭＰＫα１のＴ−ループ由来のペプチド（Ｋｍ、１．４ｍＭ）より良好な基質であった（図２６Ａ）。ＭＥＬＫペプチドは最も不良な基質であった。本発明者らは、Ｔ−ループペプチドを基質として用い、完全長タンパク質を使用して観察されるＬＫＢ１活性のパターンを反映させて、図２２において使用されている様々な組合せのＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤα／βおよびＭＯ２５α／β複合体もアッセイした（図２２と図２６を比較）。これらの結果は、Ｔ−ループペプチドを真正基質として利用して、容易な一工程アッセイでＬＫＢ１活性を測定できることを示している。このＮＵＡＫ２  Ｔ−ループペプチドを、ＬＫＢｔｉｄｅと名づけた。
【０２４３】
線維芽細胞でのＡＭＰＫ関連キナーゼの調節におけるＬＫＢ１の役割。無傷細胞でのＡＭＰＫ関連キナーゼの調節におけるＬＫＢ１の役割を調査するために、本発明者らは１２のＡＭＰＫ関連キナーゼにおける特異的配列に対してペプチド抗体を産生させた。活性形態のＡＭＰＫ関連キナーゼを免疫沈降させるこれらの抗体の能力をこれらのキナーゼが過剰発現し、活性であることがわかっている（データ表示なし）ＨＥＫ−２９３細胞溶解産物を利用してアッセイした。このアプローチを用いて、ＭＡＲＫ２およびＭＡＲＫ３を除く全てのＡＭＰＫ関連キナーゼを選択的に免疫沈降させる抗体を開発することができた。ＭＡＲＫ２およびＭＡＲＫ３の活性は、これら両方のキナーゼを免疫沈降させるが、ＭＡＲＫ１およびＭＡＲＫ４はさせない市販の抗体を使用してアッセイした（データ表示なし）。特異的抗体を使用して、ＬＫＢ１＋／＋マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）において内在的に発現されたＮＵＡＫ２、ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＳＩＫ、ＭＡＲＫ１、ＭＡＲＫ２／３およびＭＡＲＫ４を免疫沈降およびアッセイすることができた（図２７）。次に、ＬＫＢ１＋／＋  ＭＥＦから免疫沈降させたこれらのキナーゼの活性と、ＬＫＢ１−／−  ＭＥＦから免疫沈降させたこれらのキナーゼの活性を比較して、ＮＵＡＫ２、ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＳＩＫ、ＭＡＲＫ１およびＭＡＲＫ４の活性がＬＫＢ１−／−  ＭＥＦでは７倍から３５倍の間低下することが判明した（図２７）。ＭＡＲＫ２／３複合活性はＬＫＢ１−／−  ＭＥＦにおいて、約３倍低下した（図２７Ｇ）。免疫ブロッティングにより、ＬＫＢ１−／−細胞におけるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性低下はそれらの酵素の発現の減少に起因しないことが実証された。それらの酵素は、それらのノックアウト細胞中に同レベルでまたはわずかに低下したレベルで存在した。
【０２４４】
興味深いことに、またＡＭＰＫα１（図２７）とは対照的に、アッセイしたＡＭＰＫ関連キナーゼはフェンホルミンによる刺激を有意には受けなかった（図２７Ｂから２７Ｈ）。これは、フェンホルミンがＬＫＢ１を活性化することによりＡＭＰＫの活性化を誘発しないことを示唆していた。これと一致して、本発明者らは漸増線量のフェンホルミンがＡＭＰＫを漸進的に活性化する（およびＴｈｒ１７２のリン酸化を増加させる）が、ＬＫＢ１活性を刺激しないことを実証した（図２８Ａ）。薬物５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド（ＡＩＣＡ）リボシドは、吸収されて、ＡＭＰＫ系に対するＡＭＰの作用を模倣する一リン酸ＡＩＣＡリボシド（Ｃｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）にアデノシンキナーゼによって変換されることにより、無傷細胞においてＡＭＰＫを活性化した。ＡＩＣＡリボシドは、ＬＫＢ１＋／＋  ＭＥＦにおいてＡＭＰＫを活性化したが、いずれのＡＭＰＫ関連キナーゼも著しく活性化することはできなかった（図２８Ｂ）。
【０２４５】
ＬＫＢ１の発現はＨｅＬａ細胞において、ＡＭＰＫ関連キナーゼの活性化を回復させる。ＬＫＢ１がＡＭＰＫ関連キナーゼの上流調節因子としての機能を果たすさらなる遺伝学的証拠を得るために、本発明者らは、ＬＫＢ１を発現しないＨｅＬａ細胞におけるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性を、野生型ＬＫＢ１または触媒不活性ＬＫＢ１のいずれかを安定的に発現するＨｅＬａ細胞（実施例２；Ｈａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｓａｐｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）と比較した。ＬＫＢ１を発現しない対照ＨｅＬａ細胞、または触媒不活性ＬＫＢ１を発現する細胞において、ＮＵＡＫ２、ＱＩＫ、ＱＳＫおよびＳＩＫの活性は、野生型ＬＫＢ１を発現するＨｅＬａ細胞において観察されたものより２０から４０倍低かった（図２９Ｂから２９Ｅ）。対照ＨｅＬａ細胞におけるＭＡＲＫ１活性、ＭＡＲＫ２／３複合活性およびＭＡＲＫ４活性は、ＬＫＢ１を発現する細胞においてより、約〜２−３倍低かった（図２９Ｆから２９Ｈ）。ＡＭＰＫα１（図２９Ａ）とは対照的に、ＨｅＬａ細胞をフェンホルミンで刺激したとき、いずれのＡＭＰＫ関連キナーゼも有意には活性化されなかった（図２９Ｂから２９Ｈ）。
【０２４６】
考察
この実施例では、ＬＫＢ１が機能してプロテインキナーゼのＡＭＰＫ関連ファミリーの１２のメンバーのうち１１の活性を調節する証拠を提供する。無細胞系において、本発明者らは、ＭＥＬＫ以外の試験した全てのＡＭＰＫ関連キナーゼが、ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤ：ＭＯ２５複合体によるそれらのＴ−ループＴｈｒ残基のリン酸化後に５０倍を超えて活性化されることを立証した。ＭＥＬＫの場合、本発明者らの結果は、この酵素が、活性のためにＴ−ループリン酸化を必要とするが、独力でＴ−ループ残基をリン酸化することができないことを示している。本発明者らが知る限り、これは、ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＳＩＫならびにＭＥＬＫ酵素をリン酸化により活性化することができる、初めての証明である。Ｔ−ループＴｈｒ残基のＡｌａへの突然変異は、ＬＫＢ１複合体によるこれら全ての酵素の活性化を妨げたのに対し、Ｇｌｕへのその突然変異は、ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＳＩＫ、ＱＩＫ、ＱＳＫおよびＭＡＲＫ４を、ＬＫＢ１リン酸化形のこれらの酵素について観察されるものと同様の特異的活性に活性化するために十分であった（図２４）。この後者の発見は、細胞内に活性形のこれらの酵素を構成的に導入してそれらの細胞的役割を検査する、将来の過剰発現またはノックイン研究に活用できよう。
【０２４７】
以前の研究は、ＭＡＲＫ２およびＭＡＲＫ３が、Ｔ−ループＴｈｒ残基ならびに隣接Ｓｅｒ残基においてリン酸化されたことを示している（Ｄｒｅｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ＭＡＲＫ２／ＭＡＲＫ３においてリン酸化されたＴ−ループＳｅｒ残基は、ＡＭＰＫα１、ＡＭＰＫα２および全てのＡＭＰＫ関連キナーゼにおいて保存される（図２１ＡおよびＢ）が、少なくともＡＭＰＫα１については、この残基がインビボでリン酸化されるという証拠がない（Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ）。本発明者らの分析（図２５Ａおよび２５Ｂ）ならびに最近の研究（Ｔｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）についての本発明者らの解析により、ＭＡＲＫキナーゼのＴ−ループＴｈｒ残基のリン酸化は、このクラスのキナーゼの活性の調節において最も重大な役割を果たすことが明らかになった。ＬＫＢ１複合体は、ＴｈｒとＳｅｒ、両方のＴ−ループ残基において触媒不活性ＭＡＲＫ３突然変異体をリン酸化した（図２５Ａ）。しかし、単離ＭＡＲＫ３  Ｔ−ループペプチドは、Ｔｈｒ残基でしかＬＫＢ１によってリン酸化されなかった（図２６）。これは、このペプチドの主配列が、ＬＫＢ１がＳｅｒ残基をリン酸化できるようにするために十分でなかったことを意味する。ＭＡＲＫ３におけるＴ−ループＴｈｒ２１１のＡｌａへの突然変異が、ＬＫＢ１複合体によるＳｅｒ２１５のリン酸化を妨げたという発見は、Ｔｈｒ２１１のリン酸化がＳｅｒ２１５のリン酸化に必要であることを示唆している。ペプチドマッピング研究が、ＭＡＲＫ４がそのＴ−ループＴｈｒでしかＬＫＢ１によってリン酸化されないこと（図２５Ｇ）、およびＴ−ループＴｈｒのＧｌｕへの突然変異が他のＭＡＲＫアイソフォームについて観察されるよりずっと大きなレベルに活性を増大させること（図２５Ｆ）を示したので、ＭＡＲＫ４は、別様に異なって調節され得る。ＭＡＲＫ２については、ＧｌｕへのＴ−ループの突然変異が、その特異的活性を３倍増加することが以前に報告されており（Ｔｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、本発明者らは、この突然変異がＭＡＲＫ２の活性を２．２Ｕ／ｍｇから６．７Ｕ／ｍｇに増加させるという同様の発見をした（図２５Ｄ）。しかし、ＭＡＲＫ２を１０倍しか活性化しなかったＴＡＯ１（Ｔｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）とは対照的に、ＬＫＢ１複合体はＭＡＲＫ２の活性化を２００倍増加させた。これは、ＭＡＲＫ２  Ｔ−ループＴｈｒのＧｌｕへの突然変異がそのキナーゼを著しくは活性化しないことを立証している。
【０２４８】
ＡＭＰＫα１およびＡＭＰＫα２の活性化について観察されたように（Ｈａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５サブユニットの存在は、ＬＫＢ１が無細胞アッセイにおいて全てのＡＭＰＫ関連キナーゼを活性化するために不可欠であった。多くのプロテインキナーゼが、そのキナーゼと基質を一緒にする、触媒コアの外側にある、ドッキング部位と呼ばれる残基に依存する証拠は相当存在する。ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５サブユニットがＬＫＢ１との相互作用の助長および、従って、ＬＫＢ１によるリン酸化の助長に一定の役割を果たす可能性がある。ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤ：ＭＯ２５複合体が、ＬＫＢ１単独よりずっと速い速度で、ＡＭＰＫα１およびＡＭＰＫ関連キナーゼの短いＴ−ループペプチドをリン酸化するという発見は、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５サブユニットがＬＫＢ１を直接活性化することを示した。しかし、この結果は、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５が基質認識においても役割を果たす可能を排除するものではない。
【０２４９】
ＬＫＢ１−／−  ＭＥＦ、および／またはＬＫＢ１を欠くＨｅＬａ細胞を利用して、内在発現ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＱＩＫ、ＱＳＫおよびＳＩＫの活性が、ＬＫＢ＋／＋  ＭＥＦ、または野生型ＬＫＢ１を安定的に発現するＨｅＬａ細胞におけるより７から４０倍低いことを実証することができた。これは、ＬＫＢ１が、無傷細胞においてこれらの酵素の活性化における速度を制限する遺伝学的証拠となる。しかし、本発明者らのデータは、ＬＫＢ１に加えて、他のキナーゼが、インビボでＡＭＰＫ関連キナーゼの活性を調節することができる可能性を排除するものではない。最近、ＴＡＯ１キナーゼが、ＭＡＲＫ２のＴ−ループＴｈｒ残基をリン酸化してその活性化を生じさせる主活性として、ブタの脳から精製された（Ｔｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。過剰発現試験ではＴＡＯ１もＭＡＲＫ２を活性化した（Ｔｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）が、これまでのところ、ＴＡＯ１の欠如が、インビボでＭＡＲＫファミリーキナーゼの活性にどのように影響するかを示す遺伝学的証拠は、報告されていない。そのような証拠を得ることは、哺乳動物細胞が３つの密接に関係があるＴＡＯアイソフォームを有するので、難しいかもしれない（Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。特異的免疫沈降抗体の欠如は、本発明者らが、ＬＫＢ１の欠失がＭＡＲＫ２またはＭＡＲＫ３の個々の活性にどのように影響するのかを立証できなかったことを意味する。しかし、ＬＫＢ１−／−および対照ＨｅＬａ細胞におけるＭＡＲＫ２とＭＡＲＫ３の複合活性が実在するという発見は、ＴＡＯ１などの他のキナーゼが、これらの酵素の活性を調節し得ることを暗示している。ＬＫＢ１およびＴＡＯ１は、明らかなアミノ酸配列相同性を共有しておらず、ヒトキナーゼデンドログラムの別の領域にある（Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）ことに留意しなければならない。ＴＡＯ１は、キナーゼのＳＴＥ２０グループに属し、従って、ＳＴＲＡＤαおよびＳＴＲＡＤβと関係があるが、これが有意であるかどうかは、不明である。
【０２５０】
ＭＡＲＫ（ＭＡＰ／微小管親和性調節キナーゼ）ファミリーのキナーゼは、最も研究されているＡＭＰＫ関連キナーゼファミリーメンバーであり、細胞極性の樹立において重要な役割を果たすと考えられている。例えば、遺伝子研究は、ＭＡＲＫ相同体が、Ｃ．エレガンス接合体の分配（Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｋｅｍｐｈｕｅｓ，１９９５）およびショウジョウバエにおける胚子軸形成（Ｓｈｕｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｔｏｍａｎｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）を制御することを示している。ニューロン細胞において、ＭＡＲＫキナーゼは、ニューロン微小管付属タンパク質タウをリン酸化し、その結果、微小管を不安定にする（Ｄｒｅｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。興味深いことに、ＰＡＲ４と呼ばれる、Ｃ．エレガンスにおける哺乳動物ＬＫＢ１の対応因子（Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）は、Ｃ．エレガンス胚形成の第一周期中に細胞極性を樹立するために必要とされる母性発現ＰＡＲ（分割欠陥（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ））遺伝子ファミリーのメンバーとして、当初、同定された（Ｋｅｍｐｈｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。Ｃ．エレガンスＰＡＲ４をコードする遺伝子における母性致死突然変異は、細胞極性の幾つかの態様に影響を及ぼすことが明らかにされた（Ｍｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。これらは、ＭＡＲＫ３の相同体をコードするＰＡＲ１遺伝子が突然変異したＣ．エレガンスにおいて観察されるものに類似した表現型を導く（Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｋｅｍｐｈｕｅｓ，１９９５）。より最近では、ヒトＬＫＢ１のショウジョウバエ相同体（Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，２００３）およびアフリカツメガエル相同体（Ｏｓｓｉｐｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）の両方が、細胞極性の調節において重要な役割を果たすことが明らかにされた。当初、ショウジョウバエＬＫＢ１の過剰発現は、極性表現型のＰＡＲ１／ＭＡＲＫ３突然変異体を抑制するので、ショウジョウバエＬＫＢ１は、ＰＡＲ１／ＭＡＲＫ３の下流で機能すると提案された（Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，２００３）。しかし、ＬＫＢ１を発現しないＨｅＬａ細胞において、ＭＡＲＫ３は、脱リン酸化状態で存在し、ＬＫＢ１の再導入は、そのＴ−ループでのＭＡＲＫ３のリン酸化を促進することが判明した（Ｓｐｉｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、これはＬＫＢ１がＭＡＲＫ３の上流にあることを意味した。ショウジョウバエの研究と哺乳動物の研究の間の明らかな不一致を一致させる一つの説明は、ショウジョウバエＬＫＢ１の過剰発現が、他のＡＭＰＫ関連キナーゼの活性化により、極性表現型のＰＡＲ１／ＭＡＲＫ３突然変異体を抑制するならば、それらのキナーゼがＰＡＲ１／ＭＡＲＫ３機能の欠如を補うことができる可能性があるということであろう。
【０２５１】
他のＡＭＰＫ関連キナーゼ、すなわちＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＱＩＫ、ＱＳＫおよびＳＩＫ、の機能に関しては、もっとわずかしかわかっていない。他のグループによって行われたＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＱＩＫおよびＳＩＫの以前のノーザンブロッティング（下記参照）およびＥＳＴクローンの分析（表２）は、ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２およびＭＥＬＫ以外のＡＭＰＫ関連キナーゼが、多数の組織において発現される可能性が高いことを示した。ＢＲＳＫ１およびＢＲＳＫ２  ＥＳＴクローンは、主としてニューロン組織由来であり、様々なラット組織の免疫ブロット分析後、これらの酵素は、脳および低レベルで精巣においてしか検出されなかった（Ｋ．Ｓａｋａｍｏｔｏ、未発表の結果）。今日までに、ＭＥＬＫ（母性胚性ロイシンジッパーキナーゼ）は、哺乳動物胚形成中に発現され、最も強い発現が卵母細胞の成熟および着床前発育の間に検出されたことしか報告されていない（Ｈｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｈｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２およびＭＥＬＫに対して産生させた本発明者らの抗体は、それらの組換え酵素を容易に免疫沈降させたが、ＭＥＦまたはＨｅＬａ細胞においてそれらの活性を検出することはできなかった（ＯＧ、データ表示なし）。ＳＩＫ（塩誘導性キナーゼ）は、高塩食を与えられたラットの副腎から初めてクローン化された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＳＩＫ  ｍＲＮＡも、脳における膜の脱分極によって誘導されたものであり（Ｆｅｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、最近の研究は、ＳＩＫが細胞内で過剰発現されたとき、それがステロイド生成において一定の役割を果たし得ることを示している（Ｔａｋｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＱＩＫ（ＳＩＫ２とも呼ばれる）を発現するｍＲＮＡは、脂肪組織に最も大量に存在し、過剰発現の研究において、ＱＩＫは、ＡＭＰＫによってリン酸化されることが明らかにされた（Ｊａｋｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ラットＩＲＳ１におけるＳｅｒ７８９に相当する残基であるＳｅｒ７９４で、ヒトＩＲＳ１をリン酸化することが報告された（Ｈｏｒｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。他の過剰発現研究において、ＮＵＡＫ１（ＡＲＫ５）は、栄養飢餓を含む何らかの刺激によって誘発されるアポトーシスを抑制することが明らかにされた（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ）。さらに、Ａｋｔ／ＰＫＢは、ＮＵＡＫ１をその触媒ドメインの外側のＣ末端でリン酸化し、それがその酵素の三倍の活性化を導くと主張されている（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ）。ＮＵＡＫ２（ＳＮＡＲＫ）は、腎臓で最も多く発現され、伝えられるところによると、その活性は、細胞のグルコース飢餓によって刺激された（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ）。本発明者らが知る限り、ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２およびＱＳＫの役割に取り組んだ以前の研究はない。
【０２５２】
【表２】
2007530000.tif 000005
【０２５３】
明らかに、ＡＭＰＫ関連キナーゼの調節および機能のメカニズムをさらに特性付けるさらなる研究を行う必要がある。本発明者らの研究は、少なくとも、ＬＫＢ１を安定的に発現するＭＥＦおよびＨｅＬａ細胞において、ＡＭＰＫ関連キナーゼが、ＡＭＰＫとは対照的に、薬物フェンホルミンまたはＡＩＣＡリボシドに応答して活性化されなかったことを示している。これは、フェンホルミンおよびメトホルミンの有益な抗糖尿病作用が、ＡＭＰＫ関連キナーゼではなくＡＭＰＫの活性化により媒介され得ることを示唆している。ＡＭＰＫ関連キナーゼが、フェンホルミンまたはＡＩＣＡリボシドによって活性化されないという発見は、これらの治療が、ＬＫＢ１＋／＋  ＭＥＦ（図２８）においても、ＣＯＳ７細胞（Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ）においても、ＬＫＢ１を直接活性化しないという本発明者らの発見と一致する。さらなる研究では、ＡＭＰＫ関連キナーゼの活性化を引き起こす生理学的刺激を限定すること、およびＡＭＰＫのようなこれらの酵素が、それらの活性化を制御する調節サブユニットを有するかどうかの確証を得ることが、重要になろう。
【０２５４】
一定の家族において見出される有意な数の遺伝型ＰＪＳは、ＬＫＢ１遺伝子における突然変異を示さず（Ｂｕｃｈｅｔ−Ｐｏｙａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、これは、ＰＪＳについての第二の原因遺伝子座が存在することを示している。正常なＬＫＢ１タンパク質を発現するＰＪＳ家族が他のＡＭＰＫ関連キナーゼにおける突然変異を有するかどうかを探り出すことが、重要であることは、今や明らかである。
【０２５５】
結論として、本発明者らは、ＬＫＢ１が、ＡＭＰＫα１およびＡＭＰＫα２に加えて１１のＡＭＰＫ関連キナーゼを活性化するマスター上流プロテインキナーゼとして機能することを明らかにした。これらの酵素は、ＬＫＢ１に予め割り当てられた生理学的作用の一部を媒介する、ならびにこれらのキナーゼの一つまたは複数が、それら自体、腫瘍サプレッサとして機能し得る可能性がある。
【０２５６】
材料。プロテアーゼ−阻害剤カクテル錠および配列決定用トリプシンは、Ｒｏｃｈｅから入手した。Ｎ−オクチル−グルコシドは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍからのものであり、組織培養試薬は、Ｌｉｆｅ  Ｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのものであった。テトラサイクリン非含有ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、Ｐｅｒｂｉｏからのものであり、他の組織培養試薬は、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒからのものであった。プレキャスト４〜１２％および１０％ポリアクリルアミド  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ゲルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し、Ｐ８１ホスホセルロースペーパーは、Ｗｈａｔｍａｎからのものであり、フェンホルミンは、Ｓｉｇｍａから、およびＡＩＣＡリボシドは、ＴｏｒｏｎｔｏＸＸからのものであった。［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、グルタチオン−セファロース、プロテインＧ−セファロースは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。全てのペプチドは、ブリストール大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｓｔｏｌ）でＤｒ．Ｇｒａｈａｍ  Ｂｌｏｏｍｂｅｒｇによって合成された。
【０２５７】
抗体。以下の抗体をヒツジにおいて産生させ、適切なペプチド抗原を用いて親和精製した：ＢＲＳＫ１（ＭＶＡＧＬＴＬＧＫＧＰＥＳＰＤＧＤＶＳ、ヒトＢＲＳＫ１の残基１〜２０）、ＢＲＳＫ２（ＬＳＷＧＡＧＬＫＧＱＫＶＡＴＳＹＥＳＳＬ、ヒトＢＲＳＫ２の残基６５５〜６７４）、ＮＵＡＫ１（ＭＥＧＡＡＡＰＶＡＧＤＲＰＤＬＧＬＧＡＰＧ、ヒトＮＵＡＫ１の残基１〜２１）、ＮＵＡＫ２（ＴＤＣＱＥＶＴＡＴＹＲＱＡＬＲＶＣＳＫＬＴ、ヒトＮＵＡＫ２の残基６５３〜６７３）、ＱＩＫ（ＭＶＭＡＤＧＰＲＨＬＱＲＧＰＶＲＶＧＦＹＤ、ヒトＱＩＫの残基１〜２１）、ＳＩＫ（ＭＶＩＭＳＥＦＳＡＤＰＡＧＱＧＱＧＱＱＫ、ヒト細胞からの免疫沈降に使用されるヒトＳＩＫの残基１〜２０）、ＳＩＫ（ＧＤＣＥＭＥＤＬＭＰＣＳＬＧＴＦＶＬＶＱ、マウス細胞からの免疫沈降に使用されるヒトＳＩＫの残基７６５〜７８４）、ＱＳＫ（ＴＤＩＬＬＳＹＫＨＰＥＶＳＦＳＭＥＱＡＧＶ、ヒトＱＳＫの残基１３４９〜１３６９）、ＭＡＲＫ１（ＳＧＴＳＩＡＦＫＮＩＡＳＫＩＡＮＥＬＫＬ、ヒトＭＡＲＫ１の残基７７６〜７９５）、ＭＡＲＫ４（ＭＳＳＲＴＶＬＡＰＧＮＤＲＮＳＤＴＨＧＴ、ヒトＭＡＲＫ４の残基１〜２０）、ＭＥＬＫ（ＭＫＤＹＤＥＬＬＫＹＹＥＬＨＥＴＩＧＴＧ、ヒトＭＥＬＫの残基１〜２０）。図２７、２８Ｂおよび２９において用いられている特異的ＡＭＰＫα１抗体は、ペプチド（ＣＴＳＰＰＤＳＦＬＤＤＨＨＬＴＲ、ラットＡＭＰＫα１の残基３４４〜３５８）に対して産生させ、これに対して図２８Ａにおいて用いられているＡＭＰＫα１とＡＭＰＫα２の両方を認識する抗体は、ペプチド（ＣＤＰＭＫＲＡＴＩＫＤＩＲＥ、ラットＡＭＰＫα１の残基２５２〜２６４）に対して産生させた。本発明者らが産生させた抗ＭＡＲＫ２およびＭＡＲＫ３ペプチド抗体は、他のＭＡＲＫアイソフォームも免疫沈降させたので、特異的ではなかった。ヒトＭＡＲＫ３タンパク質に対して産生させた、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈからの抗ＭＡＲＫ３抗体（抗ｃ−ＴＡＫ  ＃０５−６８０）は、ＭＡＲＫ３と同様に効率的にＭＡＲＫ２を免疫沈降させるが、ＭＡＲＫ１およびＭＡＲＫ４は、免疫沈降させないことが判明した（データ表示なし）。Ｔ−ループ上のリン酸化されたＡＭＰＫを認識するリン酸特異的抗体を、前述のように（Ｓｕｇｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、ペプチド（ＫＦＬＲＴ（Ｐ）ＳＣＧＳＰＮＹＡ、ラットＡＭＰＫα１の残基１６８から１８０）に対して生じさせた。免疫ブロッティングに使用したＬＫＢ１抗体は、ヒツジにおいてマウスＬＫＢ１に対して産生させ（Ｓａｐｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、免疫沈降のためのものは、ヒツジにおいてヒトＬＫＢ１タンパク質に対して産生させた（Ｂｏｕｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＨＡエピトープタグを認識する単一クローン性抗体は、Ｒｏｃｈｅからのものであり、ＧＳＴおよびＦＬＡＧエピトープを認識する単一クローン性抗体は、Ｓｉｇｍａからのものであった。抗ｍｙｃ抗体は、２ｍＭ  グルタミンおよび１５％（容量／容量）ウシ胎仔血清を補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中で成長させたＭｙｃ１−９Ｅ１０ハイブリドーマ細胞から、培地の硫酸アンモニウム沈降によって作製した。免疫ブロッティン���に使用した、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した二次抗体は、Ｐｉｅｒｃｅから入手した。
【０２５８】
一般方法および緩衝液。制限酵素消化、ＤＮＡライゲーションおよび他の組換えＤＮＡ手順は、標準的なプロトコルを用いて行った。全ての突然変異誘発は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  特定部位突然変異誘発法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。トランスフェクションに使用したＤＮＡ構築物は、Ｑｉａｇｅｎ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  ｋｉｔをその製造業者のプロトコルに従って使用して、大腸菌ＤＨ５αから精製した。全てのＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ塩基配列決定によって検証し、これは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ＤＮＡシーケンサーでDYEnamic ET terminator chemistry (Amersham Biosciences)を使用して、英国、スコットランドのダンディー大学、生命科学スクールのシーケンシンサービス(The Sequencing Service,School of Life Sciences,University of Dundee)によって行われた。溶解緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％（重量／容量）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭ  フッ化ナトリウム、５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、０．２７Ｍ  スクロース、０．１％（容量／容量）２−メルカプトエタノールおよび「完全」プロテイナーゼ阻害剤カクテル（１錠／５０ｍＬ）を含有した。緩衝液Ａは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、および０．１％（容量／容量）２−メルカプトエタノールを含有した。ＳＤＳサンプル緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ６．８）、２％（重量／容量）ＳＤＳ、１０％（容量／容量）グリセロール、０．００５％（重量／容量）ブロモフェノールブルー、および１％（容量／容量）２−メルカプトエタノールを含有した。
【０２５９】
ＡＭＰＫ関連キナーゼのクローン化。
ＮＵＡＫ１。ヒトＮＵＡＫ１  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１４８４０）のコード領域を得るために、テンプレートとしての脳ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ならびにセンスプライマー５’−ａｃｔｇｃａｇｃｃｃｔｇｇａｇｃｃｃａｇｇａａｇｃ−３’およびアンチセンスプライマー５’−ｃｔａｇｔｔｇａｇｃｔｔｇｃｔｇｃａｇａｔｃｔｃｃａｇｃｇｃ−３’を使用してＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物はアミノ酸残基３１〜６６１からのＮＵＡＫ１のコード領域を含んでいた。その欠失Ｎ末端３１アミノ酸のｃＤＮＡを別のＰＣＲ反応の５’プライマーに組み込み、その後、センスプライマー５’−ａｃｔａｇｔｇｃｃａｃｃａｔｇｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃｇａａｇｇｇｇｃｃｇｃｃｇｃｇｃｃｔｇｔｇｇｃｇｇｇｇ−３’およびアンチセンスプライマー５−ｃｔａｇｔｔｇａｇｃｔｔｇｃｔｇｃａｇａｔｃｔｃｃａｇｃｇｃ−３’を使用してＰＣＲによりＨＡタグを追加した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートし、Ｓｐｅｌ−Ｎｏｔ１断片としてｐＥＢＧ２Ｔに（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、およびＥｃｏＲ１−ＥｃｏＲ１挿入物としてｐＧＥＸ６Ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ）発現ベクターにサブクローン化した。
【０２６０】
ＮＵＡＫ２。Ｎ末端ＨＡタグを有するＮＵＡＫ２  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿１１２２１４）のコード領域を、プライマー５’−  ａｃｔａｇｔｇｃｃａｃｃａｔｇｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃｇａｇｔｃｇｃｔｇｇｔｔｔｔｃｇｃｇｃｇｇｃｇｃｔｃｃ−３’および５’−  ｔｃａｇｇｔｇａｇｃｔｔｔｇａｇｃａｇａｃｃｃｔｃａｇｔｇｃｃｔｇ−３’で、ＩＭＡＧＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＥＳＴ  クローン６７１８９８２（ＮＣＢＩアクセッション番号ＣＡ４８７４９３）から、ＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、配列決定し、Ｓｐｅｌ−Ｓｐｅｌ断片としてｐＥＢＧ２Ｔに、およびＥｃｏＲ１−ＥｃｏＲ１挿入物としてｐＧＥＸ６Ｐ−１発現ベクターにサブクローン化した。
【０２６１】
ＱＩＫ。Ｎ末端ＨＡタグを有するヒトＱＩＫ  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＭ＿０４１３１４）のコード領域を、後続のベクターｐＧＥＸ６Ｐ−３およびｐＥＢＧ２Ｔそれぞれへのクローン化のためにセンスプライマー５’−ｇｃｇｔｃｇａｃｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃｇｔｃａｔｇｇｃｇｇａｔｇｇｃｃｃｇａｇ−３’  または５’−ｇｃａｃｔａｇｔｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃｇｔｃａｔｇｇｃｇｇａｔｇｇｃｃｃｇａｇ−３’、ならびにアンチセンスプライマー５’−ｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｔａａｔｔｃａｃｃａｇｇａｃａｔａｃｃｃｇｔｔｇｔｇ−３’を使用して、ＩＭＡＧＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＥＳＴ  クローン５４９５５４５（ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＭ７９９６３０）から増幅した。増幅ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、配列決定し、Ｓａｌ１−Ｎｏｔ１またはＳｐｅｌ−Ｎｏｔ１挿入物としてｐＧＥＸ６Ｐ−３またはｐＥＢＧ２Ｔにそれぞれサブクローン化した。
【０２６２】
ＳＩＫ。Ｎ末端ＨＡタグを有するヒトＳＩＫ  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１７３３５４）のコード領域を、プライマー５’−ｇｃｇｇａｔｃｃｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃｇｔｔａｔｃａｔｇｔｃｇｇａｇｔｔｃａｇｃｇｃｇｇ−３’および５’−ｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃａｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃａａａｃｇｔｇｃｃ−３’を使用して、ＩＭＡＧＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＥＳＴ  クローン４８３１０４９（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１７３３５４）から増幅した。そのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、配列決定し、ＢａｍＨ１−Ｎｏｔ１挿入物としてｐＧＥＸ６Ｐ−１およびｐＥＢＧ２Ｔにサブクローン化した。
【０２６３】
ＭＥＬＫ。Ｎ末端ＨＡタグを有するヒトＭＥＬＫ  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１４７９１）のコード領域を、プライマー５’−ｇｃｇｇａｔｃｃｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃａａａｇａｔｔａｔｇａｔｇａａｃｔｔｃｔｃａａａｔａｔｔａｔｇａａｔｔａｃａｔｇ−３’および５’−ｇｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｔａｃｃｔｔｇｃａｇｃｔａｇａｔａｇｇａｔｇｔｃｔｔｃｃ−３’  を使用して、ＩＭＡＧＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＥＳＴ  クローン４５７１３６（ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＣ０１４０３９）から増幅した。そのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、配列決定し、ＢａｍＨ１−Ｎｏｔ１挿入物としてｐＧＥＸ６Ｐ−１およびｐＥＢＧ２Ｔにサブクローン化した。
【０２６４】
ＢＲＳＫ１。ヒトＢＲＳＫ１  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０３２４３０）のコード領域のヌクレオチド６０〜１０１０を、プライマー１．５’−ｃｃａｃｃｃｃｃａｃｃｃａｃｃｃｃａｇｃａｃｇｃｃｃａａｔａｔｇｔｇｇｇｃｃｃｃｔａｔｃｇｇｃｔｇｇａｇａａｇａｃｇｃｔｇｇｇｃａａａｇｇ−３’および２．５’−ｃｇａｔｇｃａｇｃｃｔｃｔｃｇｃｇｇｔｃｃｃｔｇａａｇｃａｇｃ−３’を使用して、ＩＭＡＧＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍクローン６１５４７４９（ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＱ４３４５７１）から増幅した（ヌクレオチド６０〜１０６が、プライマー１によって追加される）。ＢＲＳＫ１のヌクレオチド９８０〜２３３７を、プライマー３．５’−ｇｃｔｇｃｔｔｃａｇｇｇａｃｃｇｃｇａｇａｇｇｃｔｇｃａｔｃｇ−３’および４．５’−ｔｃａｇｇｇｃａｇａｇｇｇｇｔｃｃｃｇｔｔｇｇｔｇｇｃｃ−３’を使用して、同じＥＳＴクローンから増幅した。各ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、配列決定した。ＥＳＴクローン中に存在するＢＲＳＫ１  ＮＭ＿０３２４３０配列と比較した単一ヌクレオチド差を、ＢＴＳＫ１の５’半分を含有するｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯクローンにおける特定部位突然変異誘発によって「補正」した。ＢＲＳＫ１の残りの５９の５’ヌクレオチドおよびＨＡタグを、センスプライマー５．５’−ｇｇｔｇｇｇｇｇｃｔｃｔｃｃｃｇｃｃｔａｃｃａｃｃｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｃｃａｃｃｃｃｃａｃｃｃａｃｃｃｃａｇｃａｃｇｃｃｃａａｔａｔｇ−３’および６．５’−ｇｇａｔｃｃｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃｔｃｇｔｃｃｇｇｇｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｔｇｇｇｇｇｃｔｃｔｃｃｃｇｃｃｔａｃｃ−３’を使用して、ＰＣＲにより、そのＢＲＳＫ１の５’の半分に追加した。最終ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、配列決定した。その後、テンプレートとしてＢＲＳＫ１の５’半分および３’半分、ならびにプライマー７．５’−ｇｃｇｇａｔｃｃｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃ−３’およびプライマー４を使用してオーバーラップＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、配列決定した。その後、Ｎ末端ＨＡタグを有する完全長ＢＲＳＫ１  ｃＤＮＡを、ＢａｍＨ１−ＢａｍＨ１挿入物としてｐＧＥＸ６Ｐ−１およびｐＥＢＧ２Ｔにサブクローン化した。
【０２６５】
ＢＲＳＫ２。ＨＡ標識ヒトＢＲＳＫ２  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ５３３８７８）のコード領域を、プライマー５’−ｇｇａｔｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃａｃａｔｃｇａｃｇｇｇｇａａｇｇａｃｇｇｃｇｇｃｇｃｇ−３’および５’−ｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃａｇａｇｇｃｔａｃｔｃｔｃｇｔａｇｃｔｇｇｔｇｇｃｃａｃｃｔｔｃｔｇｇｃｃｃｔｔａａｇｃｃｃａ−３’を使用して、ＩＭＡＧＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＥＳＴ  クローン６１４４６４０（ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＵ１９３２１８）から増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローン化し、配列決定し、ＢａｍＨ１−Ｎｏｔ１挿入物としてｐＥＢＧ２ＴおよびｐＧＥＸ６Ｐ−１ベクターにサブクローン化した。
【０２６６】
ＱＳＫ。ヒトＱＳＫ  ｃＤＮＡのコード領域のヌクレオチド５５〜６４０（データベース  
1142211345359_4
から得た配列（Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２））を、プライマー１．５’−ｇｇａｇｃｃｇｇｇｃｃｃｇｃｇｇｇｃｃｇｃｃｔｇｃｔｇｃｃｔｃｃｇｃｃｃｇｃｇｃｃｇｇｇｇｔｃｃｃｃａｇｃｃｇｃｃｃｃｃｇｃｔｇｃｃｇｔｇｔｃｃｃｃｔｇｃｇｇｃｃｇｇｃｃａｇｃｃｇ−３’および２．５’−ｔｇａａｇａｇｇｔｔａｃｔｇａａａｃｃａａａａｔｃｔｇｃｔａｔｔｔｔｇａｔａｔｔｃ−３’を使用して、ＩＭＡＧＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＥＳＴ  クローン４３９６９９５（ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＦ９８３２６８）から増幅した（ヌクレオチド５５〜１１０が、プライマー１によって追加される）。その後、残りの５４の５’ヌクレオチドおよびＨＡタグを、プライマー３．５’−ｇａｔｔａｃｇｃｃｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇａｇｃｔｇｇｃｇｇｇｇｃｔｇｃｃｇｇｇｇｃｃｇｇｇａｃｔｇｇｇｇｇａｇｃｃｇｇｇｃｃｃｇｃｇｇｇｃｃｇｃｃｔｇｃｔｇ−３’および４．５’−ｇｃｇｇａｔｃｃｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇ−３’を使用してＰＣＲにより追加した。最終ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、配列決定して、ｐＣＲ２．１  ＱＳＫクローン１を作製した。ＱＳＫのヌクレオチド６１０〜８６５を、プライマー５．５’−ａｔａｇｃａｇａｔｔｔｔｇｇｔｔｔｃａｇｔａａｃｃｔｃｔｔｃａｃｔｃｃｔｇｇｇｃａｇｃｔｇｃｔｇａａｇａｃｃｔｇｇｔｇｔｇｇｃａｇｃｃｃｔｃｃｃｔａｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃ−３’および６．５’−  ｃｔｇｔｇｇａｃａｔａａａａａａｔｇｇｇａｔｇｃｇｇａａｃｔｔｔｃｃ−３’を使用して、ＩＭＡＧＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＥＳＴ  クローン６２４７９３８（ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＱ６８５２１３）から増幅した（ヌクレオチド６１０〜６７４が、プライマー５によって追加される）。そのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、配列決定した。ＥＳＴクローン中に存在するＱＫＳオープンリーディングフレーム位置６９６における単一ヌクレオチド欠失を、特定部位突然変異誘発によって補正して、ｐＣＲ２．１  ＱＳＫクローン２を作製した。ｐＣＲ２．１  ＱＳＫクローン１および２からのＱＳＫ  ＰＣＲ産物を、プライマー４および６を使用するオーバーラップＰＣＲにインプットした。この産物（Ｎ末端ＨＡタグを有するＱＳＫヌクレオチド４〜８６５）をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、配列決定して、ｐＣＲ２．１  ＱＳＫクローン３を作製した。
【０２６７】
ＱＳＫヌクレオチド８３２〜４１１０を、プライマー７．５’−ｇｇａａａｇｔｔｃｃｇｃａｔｃｃｃａｔｔｔｔｔｔａｔｇｔｃｃａｃａｇ−３’および８．５’−ｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｃａｃｇｃｃｔｇｃｃｔｇｃｔｃｃａｔｇｃ−３’を使用して、ＩＭＡＧＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＥＳＴ  クローン３６０４４１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡ０１５７２６）から増幅した。そのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、配列決定して、ｐＣＲ２．１  ＱＳＫクローン４を作製した。ｐＣＲ２．１クローン３および４からのＱＳＫ  ＰＣＲ産物を、プライマー４および８を使用するオーバーラップＰＣＲにインプットして、Ｎ末端ＨＡタグを有する完全長ＱＳＫ  ｃＤＮＡを作製した。そのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、配列決定して、ｐＣＲ２．１  ＱＳＫクローン５を作製した。Ｎ末端ＨＡタグを有する完全長ＱＳＫを、ＢａｍＨ１−ＢａｍＨ１挿入物として、ｐＣＲ２．１  ＱＳＫからｐＧＥＸ６Ｐ−１およびｐＥＢＧ２Ｔベクターにサブクローン化した。ＱＳＫにおいてＴ−ループ突然変異を生じさせるために、ｐＣＲ２．１  ＱＳＫクローン３を用いて突然変異誘発を行い、その後、オーバーラップＰＣＲを行って、ＱＳＫの完全長突然変異形を作製した。そのオーバーラップＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯにライゲートし、配列決定し、ＢａｍＨ１−ＢａｍＨ１挿入物としてｐＧＥＸ６Ｐ−１およびｐＥＢＧ２Ｔにサブクローン化した。
【０２６８】
ＭＡＲＫ１。Ｎ末端ＨＡタグを有するヒトＭＡＲＫ１  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１８６５０）のコード領域のヌクレオチド４〜１０７８を、プライマー５’−ｇｃｇａａｔｔｃｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃｔｃｇｇｃｃｃｇｇａｃｇｃｃａｔｔｇｃ−３’および５’−  ｃａｔｃａｔａｃｔｔｃｔｇａｔｔｔａｔｔａａｇｇｃａｔｃａｔｔｔａｔｔｔｃ−３’を使用して、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリから増幅した。ＭＡＲＫ１のヌクレオチド１０４２〜２３８８を、プライマー５’−ｇａａａｔａａａｔｇａｔｇｃｃｔｔａａｔａａａｔｃａｇａａｇｔａｔｇａｔｇ−３’および５’−ｇａｇｔｃｇａｃｔｔａｃａｇｃｔｔａａｇｃｔｃａｔｔｔｇｃｔａｔｔｔｔｔｇａｔｇｃ−３’を使用して、ＩＭＡＧＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＥＳＴ  クローン４８１０９（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｈ１１８５０）から増幅した。増幅ＰＣＲ産物をオーバーラップＰＣＲにインプットして、完全長ＨＡ標識ＭＡＲＫ１  ｃＤＮＡを生じさせた。そのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯベクターにライゲートし、配列決定し、ＥｃｏＲ１−Ｓａｌ１としてｐＧＥＸ６Ｐ−１にサブクローン化した。完全長ＨＡ標識ＭＡＲＫ１を、後でＫｐｎ１−Ｎｏｔ１挿入物としてｐＥＢＧ２Ｔにクローン化するために、プライマー５’−ｇｃｇｇｔａｃｃｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃｔｃｇｇｃｃｃｇｇａｃｇｃｃａｔｔｇｃ−３’および５’−ｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｃａｇｃｔｔａａｇｃｔｃａｔｔｔｇｃｔａｔｔｔｔｔｇａｔｇｃ−３’を使用して、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ  ＭＡＲＫ１クローンから増幅した。
【０２６９】
ＭＡＲＫ２。ヒトＭＡＲＫ２  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４９５４）のコード配列を、後にそれぞれベクターｐＧＥＸ６Ｐ−３およびｐＥＢＧ２Ｔにクローン化するために、センスプライマー５’−ｇｃｇｔｃｇａｃｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃａｔｔｃｇｇｇｇｃｃｇｃａａｃｔｃａｇｃｃ−３’または５’−ｇｃａｃｔａｇｔｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃａｔｔｃｇｇｇｇｃｃｇｃａａｃｔｃａｇｃｃ−３’を、およびアンチセンスプライマー５’−ｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａａａｇｃｔｔｃａｇｃｔｃｇｔｔｇｇｃｔａｔｔｔｔｇｇ−３’を使用して、ＩＭＡＧＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＥＳＴ  クローン４５９１６８８（ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＧ４１９８７５）から増幅した。増幅ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯベクターにライゲートし、配列決定し、Ｓａｌ１−Ｎｏｔ１またはＳｐｅ１−Ｎｏｔ１挿入物として、それぞれ、ｐＧＥＸ６Ｐ−３またはｐＥＢＧ２Ｔベクターにサブクローン化した。
【０２７０】
ＭＡＲＫ３。Ｎ末端ＨＡタグを有するヒトＭＡＲＫ３  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２３７６）のコード配列を、プライマー５’−ｇｃｇｇｃｃｇｃａｇｃｃａｃｃａｔｇｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃｔｃｃａｃｔａｇｇａｃｃｃｃａｔｔｇｃｃａａｃｇｇｔｇａ−３’および５’−ｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｃａｇｃｔｔｔａｇｃｔｃａｔｔｇｇｃａａｔｔｔｔｇｇａａｇｃ−３’を使用して、ＩＭＡＧＥ  ＥＳＴ  ５１０４４６０（ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＩ２２３３２３）から増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローン化し、配列決定し、Ｎｏｔ１−Ｎｏｔ１挿入物としてｐＥＢＧ２ＴおよびｐＧＥＸ６Ｐ−２ベクターにサブクローン化した。
【０２７１】
ＭＡＲＫ４。ヒトＭＡＲＫ４  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＫ０７５２７２）の完全長コード領域を得るために、二つのＥＳＴクローンをＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。Ｎ末端ＨＡタグを有する第一の２２８アミノ酸を、プライマー１．５’−ａｇａｔｃｔｇｃｃａｃｃａｔｇｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｇｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｃｔｃｔｔｃｇｃｇｇａｃｇｇｔｇｃｔｇｇｃｃｃｃｇｇｇ−３’および２．５’−ｔｇｃｃｃｔｇａａａｃａｇｃｔｃｃｇｇｇｇｃｇｇｃ−３’を使用して、ＩＭＡＧＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＥＳＴ  クローン６３０１９０２（ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＱ７０９１３０）から増幅した。残りのコード領域は、プライマー３．５’−ｇｇｇａｔｃｇａａｇｃｔｇｇａｃａｃｇｔｔｃｔｇｃ−３’および４．５’−ｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃａｃａｃｔｃｃａｇｇｇｇａａｔｃｇｇａｇｃａｇｃｃｇｇｇｇ−３を使用して、ＩＭＡＧＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＥＳＴ  クローン５５０３２８１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＭ４６７１０７）から増幅した。得られたＰＣＲ産物は、プライマー１および４でのオーバーラップＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用した。そのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにライゲートし、配列決定し、その後、Ｂｇｌ２−Ｎｏｔ１挿入物としてｐＥＢＧ２ＴおよびｐＧＥＸ６Ｐ−１ベクターのＢａｍＨ１−Ｎｏｔ１部位にさらにサブクローン化した。
【０２７２】
他のＤＮＡ構築物。ｐＥＢＧ−２Ｔベクター内に野生型ＧＳＴ−ＬＫＢ１または触媒不活性ＧＳＴ−ＬＫＢ１［Ｄ１９４Ａ］をコードするＤＮＡ構築物、ｐＣＭＶ５ベクター内にＦＬＡＧ−ＳＴＲＡＤα、ＦＬＡＧ−ＳＴＲＡＤβ、ｍｙｃ−ＭＯ２５α、ｍｙｃ−ＭＯ２５βをコードするＤＮＡ構築物（実施例１；Ｂｏｕｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）またはｐＧＥＸベクター内にＡＭＰＫα１のキナーゼドメイン［残基１〜３０８］をコードするＤＮＡ構築物（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）は、前述されている。
【０２７３】
細胞培養、刺激および細胞溶解。野生型またはキナーゼ失活型ＬＫＢ１を安定的に発現するＨｅＬａ細胞の作製は、前述されている（Ｓａｐｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。１０％（容量／容量）テトラサイクリン非含有−ＦＢＳ、１  Ｘ  可欠アミノ酸溶液、１Ｘ  ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ／ｍＬ  ゼオシンおよび５μｇ／ｍＬ  ブラスチシジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足した最小必須イーグル培地中で細胞を培養した。Ｅ９．５胚からの不朽化ＬＫＢ１＋／＋およびＬＫＢ１−／−  ＭＥＦ細胞の生産および培養は、前述されている（実施例２；Ｈａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。１０％ＦＢＳを含有するダルベッコ変性イーグル培地中でヒト腎臓胚２９３細胞を培養した。直径１０ｃｍ皿を用いて１０％（容量／容量）血清中で培養した細胞を、未刺激で放置するか、１０ｍＭ  フェンホルミンまたは２ｍＭ  ＡＩＣＡリボシドで１時間刺激して、ＰＢＳですばやくすすいだあと、１ｍＬの氷冷溶解緩衝液に溶解した。ＭＥＦ細胞溶解産物を液体窒素で急速冷凍して、使用前に解凍し、４℃で３０分間、２３０００×ｇで遠心して、細胞破壊片を除去した。ＨｅＬａ細胞溶解産物を４℃で１５分間、１３０００ｒｐｍで直ちに遠心した。タンパク質濃度は、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いてブラッドフォード法により決定した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，１９７６）。
【０２７４】
免疫ブロッティング。全細胞溶解産物（１０〜５０μｇ）または免疫沈降タンパク質（１ｍｇの細胞溶解産物からのもの）をＳＤＳサンプル緩衝液中で加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロース膜に通電転写した。その後、膜を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ＴＢＳ）、０．５％（容量％）、１０％（質量％）脱脂乳含有０．５％（容量％）Ｔｗｅｅｎ中でブロックし、ＴＢＳ、０．５％（容量％）Ｔｗｅｅｎ、５％（質量％）脱脂乳および１μｇ／ｍＬの指示されている抗体中、４℃で、１６時間、プローブした。タンパク質の検出は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体および強化化学発光試薬（英国、リトルチャルホントのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して行った。
【０２７５】
大腸菌におけるＡＭＰＫ関連キナーゼの発現および精製。特に明記しない限り、完全長野生型または突然変異形のＧＳＴ−ＨＡ標識ＡＭＰＫ関連キナーゼまたはＧＳＴ−ＡＭＰＫα１［１−３０８］をコードするｐＧＥＸを、大腸菌ＢＬ２１細胞に形質転換した。１リットル培養物を、６００ｎｍでの吸収が０．８になるまで、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを含有するルリア液体培地中、３７℃で成長させた。１００μＭ  イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシドを添加し、それらの細胞をさらに１６時間、２６℃で培養した。野生型または突然変異体ＧＳＴ−ＨＡ標識ＱＳＫをコードするｐＧＥＸ構築物については、６００ｎｍでの吸収が１になるまで細胞を培養することによりタンパク質発現誘発を行い、その後、１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシドを添加し、それらの細胞をさらに１時間、３０℃で培養した。ペレット状の細胞を３５ｍＬの氷冷溶解緩衝液に再懸濁させ、１ラウンドの冷凍／解凍で溶解し、溶解産物を超音波処理して、ＤＮＡ断片にした。それらの溶解産物を３０分間、２０，０００×ｇで遠心し、それらの組換えタンパク質をグルタチオン−セファロースで親和精製し、２０ｍＭ  グルタチオンおよび０．２７Ｍ  スクロースを含有する緩衝液Ａ中で溶離した。
【０２７６】
２９３細胞におけるＡＭＰＫ関連キナーゼの発現および精製。２９３細胞の１２の直径１０ｃｍ皿を培養し、変性リン酸カルシウム法（Ａｌｅｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）を用いて、各皿を、野生型ＡＭＰＫ関連キナーゼをコードする５μｇのｐＥＢＧ−２Ｔ構築物でトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞を１ｍＬの氷冷溶解緩衝液に溶解し、それらの溶解産物をプールして、４℃で１０分間、１３，０００×ｇで遠心した。それらのＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオン−セファロースでの親和クロマトグラフィーによって精製し、２０ｍＭ  グルタチオンおよび０．２７Ｍ  スクロースを含有する緩衝液Ａ中で溶離した。
【０２７７】
２９３細胞におけるＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤ：ＭＯ２５複合体の発現および精製。ＧＳＴ標識ＬＫＢ１、ＦＬＡＧ標識ＳＴＲＡＤαまたはＳＴＲＡＤβ、およびＭｙｃ標識ＭＯ２５αまたはＭＯ２５βの種々の組合せを２９３細胞において発現させ、それらの複合体を前述のように（実施例１；Ｂｏｕｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、グルタチオン−セファロースで精製した。
【０２７８】
ＡＭＰＫ関連キナーゼの活性化の測定。ＡＭＰＫα１触媒サブユニットおよびＡＭＰＫ関連キナーゼを、ＬＫＢ１でリン酸化した後、次のように測定した。１〜２μｇのＡＭＰＫα１触媒ドメインまたはＡＭＰＫ関連キナーゼを、５ｍＭ  酢酸Ｍｇおよび０．１Ｍ  ＡＴＰを含有する緩衝液Ａ中、０．１〜１μｇの野生型の示されているＬＫＢ１複合体と共に、または伴わず、２０μＬの最終容量でインキュベートした。「図の説明」に示されている時間、３０℃でインキュベートした後、ＡＭＰＫα１触媒ドメインまたはＡＭＰＫ関連キナーゼ活性を、３０μＬの５ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．１ｍＭ  ［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ（３００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）および基質として２００μＭ  ＡＭＡＲＡペプチド（ＡＭＡＲＡＡＳＡＡＡＬＡＲＲＲ（Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５））を添加することによって判定した。５〜２０分間、３０℃でインキュベートした後、３２Ｐ−リン酸塩のそのペプチド基質への組み込みを、前述のように（Ａｌｅｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、その反応混合物をＰ８１ホスホセルロースペーパーに塗布し、リン酸中でそれらのペーパーを洗浄した後、シンチレーションカウンティングすることによって、判定した。１単位（Ｕ）の活性は、基質への１ｎｍｏｌの３２Ｐの組み込みを触媒する活性と定義した。そのアッセイの第二工程については、経時反応を行って、リン酸化の速度が時間に伴って直線的に生じるようにした。コンピュータプログラムＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（米国、サンディエゴのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用し、ミカエリス−メンテン関係式に従って、非線形回帰により、反応速度データを分析した。
【０２７９】
ＬＫＢ１複合体によりリン酸化されたＢＲＳＫ２、ＮＵＡＫ２およびＭＡＲＫ３の部位のマッピング。野生型および突然変異体ＡＭＰＫ関連キナーゼ（５μｇ）を、５ｍＭ  酢酸マグネシウムおよび１００μＭ［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ（５０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を含有する緩衝液Ａ中、１〜２ｇの野生型ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤα：ＭＯ２５βとともに、３０μＬの全反応容積で、３０分間、インキュベートした。３０分後、ＳＤＳを１％（重量／容量）の最終濃度まで、およびジチオトレイトールを１０ｍＭまで添加することによって反応を停止させ、１００℃で１分間加熱した。冷却後、４−ビニルピリジンを５０ｍＭの濃度まで添加し、それらのサンプルを振盪台の上に３０分間、室温で放置して、システイン残基をアルキル化し、その後、ＢｉｓＴｒｉｓ  ４〜１２％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に付した。それらのゲルをクマシーＲ２５０で染色し、オートラジオグラフィーにかけて、リン酸化したＡＭＰＫ関連キナーゼに対応するバンドを切り出し、小片に切断した。振動台の上で、１５分間、１ｍＬの次のもので順次洗浄した：水、水とアセトニトリルの１：１混合物、０．１Ｍ  重炭酸アンモニウム、０．２Ｍ  重炭酸アンモニウムとアセトニトリルの１：１混合物、そして最後にアセトニトリル。それらのゲル片を回転蒸発によって乾燥させ、０．１ｍＬの５０ｍＭ  重炭酸アンモニウム；１μｇのアルキル化トリプシンを含有する０．１％（質量％）ｎ−オクチル−グルコシド中で、インキュベートした。１６時間後、０．１ｍＬのアセトニトリルを添加し、その混合物を振盪台の上で１０分間、インキュベートした。上清を除去し、ゲル片を０．３ｍＬの５０ｍＭ  重炭酸アンモニウム、および０．１％（容量／容量）トリフルオロ酢酸中で、１０分間、さらに洗浄した。＞９０％の３２Ｐ放射活性を含有する併せた上清を、水中０．１％（容量％）トリフルオロ酢酸中で平衡させたＶｙｄａｃ  ２１８ＴＰ５２１５  Ｃ１８カラム（カリフォルニア州、ヘスペリアのＳｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｏｐ）でのクロマトグラフィーに付した。そのカラムを、０．２ｍＬ／分の流量での線形アセトニトリル濃度勾配（対角線）で展開させ、０．１ｍＬの画分を回収した。
【０２８０】
ホスホペプチド配列分析。単離したホスホペプチドを、５ｍｇ／ｍＬのαシアノ桂皮酸をマトリックスとして使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ）で分析した。  両方の反射および線形モードでスペクトルを得、可能性のあるホスホペプチドの配列を、選択質量でＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳを行うことによって確認した。親ホスホペプチドからのリン酸（Ｍ−９８  Ｄａ）の特徴的欠如、ならびにホスホセリンについてのデヒドロアラニン（−６９）またはホスホトレオニンについてのデヒドロアミノ酪酸（−８３）の天然欠如を利用して、リン酸化部位（複数を含む）の位置を指定した。全ての３２Ｐ標識ペプチドのリン酸化の部位を、前述のように（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｃｅ，２００２）、Ｓｅｑｕｅｌｏｎ−ＡＡ膜に結合したペプチドのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４９４Ａ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒでの固相エドマン分解により、決定した。
【０２８１】
ＭＥＬＫにおけるＴ−ループリン酸化部位の同定。大腸菌から発現され、精製されたＧＳＴ−ＭＥＬＫのトリプシン消化物を、３０％アセトニトリル（容量／容量）中０．２５Ｍの酢酸で酸性化し、２μＬ（沈降容積）のＰＨＯＳ−ｓｅｌｅｃｔ  Ｉｒｏｎ  ｃｈｅｌａｔｅ  ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）を添加した。そのサンプルを３０分間振盪し、ｍｉｃｒｏＣ１８  ＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で樹脂を回収し、３０％アセトニトリル（容量／容量）中０．２５Ｍの酢酸  ２５μＬで２回洗浄して、２５μＬの０．４Ｍ  ＮＨ４ＯＨで溶離した。その溶離液を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、Ｔ−ループホスホペプチドを同定し、ｍｓ／ｍｓによって配列決定した。
【０２８２】
内在性ＡＭＰＫおよびＡＭＰＫ関連キナーゼの免疫沈降およびアッセイ
０．１〜１ｍｇのＨｅｌａまたはＭＥＦ溶解産物タンパク質を、事前に５μＬのプロテインＧ−セファロースに結合させた５μｇの対応する抗体とともに、振盪台の上で１時間、４℃でインキュベートした。それらの免疫沈降物を、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する１ｍＬの溶解緩衝液で２回、および１ｍＬの緩衝液Ａで２回洗浄した。その後、ＡＭＡＲＡペプチドに対するホスホトランスフェラーゼ活性を、５０μＬの全アッセイ量で、上記のように測定した。
【０２８３】
ＬＫＢｔｉｄｅ基質を利用する内在性ＬＫＢ１の免疫沈降およびアッセイ。
０．１〜１ｍｇのＨｅｌａまたはＭＥＦ細胞溶解産物タンパク質を、５μｇのヒトＬＫＢ１抗体に結合した５μＬのプロテインＧ−セファロースとともに、振盪台の上で１時間、４℃でインキュベートした。それらの免疫沈降物を、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する１ｍＬの溶解緩衝液で２回、および１ｍＬの緩衝液Ａで２回洗浄した。その後、ＬＫＢｔｉｄｅペプチド（ＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹＲＲＲ、Ｐ８１ペーパーに結合することができるようにＣ末端に３個の追加Ａｒｇ残基を有するヒトＮＵＡＫ２の残基２４１〜２６０）に対するホスホトランスフェラーゼ活性を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％（容量％）２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．１ｍＭ  ［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（約２００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）および２００μＭ  ＬＫＢ１ｔｉｄｅペプチドからなる５０μＬの全アッセイ量で測定した。免疫沈降物が懸濁状態に保たれるように継続的に振盪しながら、３０℃でアッセイを行い、１０分後、４０μＬのその反応混合物をｐ８１膜に塗布することによって停止させた。そのｐ８１膜をリン酸中で洗浄し、組み込まれた放射活性を、ＭＡＰキナーゼについて前述のように（Ａｌｅｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、シンチレーションカウンティングによって測定した。
【０２８４】
試料と方法における参照文献
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【０２８５】
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【図面の簡単な説明】
【０２８６】
【図１】ＬＫＢ１とＭＯ２５αの会合。
【図１ａ】ＬＫＢ１とＭＯ２５αの会合。
【図２】ＭＯ２５αおよびＭＯ２５βアイソフォームのアミノ酸配列および組織分布パターン。
【図２ａ】ＭＯ２５αおよびＭＯ２５βアイソフォームのアミノ酸配列および組織分布パターン。
【図２ｂ】ＭＯ２５αおよびＭＯ２５βアイソフォームのアミノ酸配列および組織分布パターン。
【図３】内在性ＬＫＢ１はＭＯ２５αと会合している。
【図４】ＭＯ２５αはＳＴＲＡＤによりＬＫＢ１と会合する。
【図４ａ】ＭＯ２５αはＳＴＲＡＤによりＬＫＢ１と会合する。
【図５】ＭＯ２５αおよびＳＴＲＡＤαは、細胞質内にＬＫＢ１を固着させる。
【図５ａ】ＭＯ２５αおよびＳＴＲＡＤαは、細胞質内にＬＫＢ１を固着させる。
【図６】ＭＯ２５αは、ＳＴＲＡＤαのＣ末端の３残基を認識する。
【図６ａ】ＭＯ２５αは、ＳＴＲＡＤαのＣ末端の３残基を認識する。
【図７】ＳＴＲＡＤαへのＬＫＢ１の結合は、ＭＯ２５αのための新規結合部位（複数を含む）を作る。
【図８】ＭＯ２５アイソフォームは、ＬＫＢ１０ＳＴＲＡＤα複合体を安定させる。
【図９】ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５アイソフォームとの会合によるＬＫＢ１の活性化。
【図１０】最も近いＳＴＥ２０−キナーゼ類縁体とＳＴＲＡＤアイソフォームのアミノ酸配列。
【図１１】ＭＯ２５アイソフォームは、ＳＴＲＡＤβの発現およびＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤβ複合体の形成を増加させる。
【図１２】酵母からのＴｏｓ３、Ｐａｋ１およびＥｌｍ１ならびにヒトからのＬＫＢ１およびＣａＭＫＫβ（β３変異体）のアミノ酸配列のアラインメント。
【図１３】ラット肝臓抽出物から２つのＡＭＰＫＫを分離することができるが、両方が、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αと複合している。
【図１４】ＡＭＰＫＫ活性、ならびにＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤαおよびＭＯ２５αポリペプチドは、抗ＬＫＢ１抗体を使用してラット肝臓ＡＭＰＫＫ１およびＡＭＰＫＫ２から免疫沈降させることができる。
【図１５】組換えＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ−ＭＯ２５複合体は、Ｔｈｒ−１７２でのリン酸化によりＡＭＰＫを効率的に活性化することができる。
【図１５ａ】組換えＬＫＢ１−ＳＴＲＡＤ−ＭＯ２５複合体は、Ｔｈｒ−１７２でのリン酸化によりＡＭＰＫを効率的に活性化することができる。
【図１６】ＡＭＰＫＫ１、ＡＭＰＫＫ２および組換えＧＳＴ−ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤα：ＭＯ２５α複合体によるヘテロトリマーＡＭＰＫ複合体の活性化およびリン酸化。
【図１７】内在性ＡＭＰＫＫ活性は、抗ＬＫＢ１抗体を使用して２９３細胞から免疫沈降させることができるが、活性は、それらが誘導性プロモータから（触媒不活性突然変異体ではなく）ＬＫＢ１を安定的に発現する場合にのみＨｅＬａ細胞から免疫沈降させることができる。
【図１８】ＬＫＢ１の発現による、ＨｅＬａ細胞においてＡＩＣＡリボシドおよびフェンホルミンがＡＭＰＫを活性化する能力の回復。
【図１９】ＡＧＣサブファミリーキナーゼ（ＰＫＡαおよびＰＫＣα；これらは、ＬＫＢ１によって活性化されると考えられない）の活性化ループ配列とプロテインキナーゼのＡＭＰＫ／ＳＮＦ１サブファミリーのＴ−ループ残基の配列アラインメント。
【図２０】ペプチド基質（ＡＭＰＫｔｉｄｅと呼ぶ）についてのＫｍおよびＶｍａｘ。
【図２１】ＬＫＢ１によるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性化。
【図２１Ａ】ＬＫＢ１によるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性化。
【図２２】ＬＫＢ１によるＡＭＰＫ関連キナーゼの効率的な活性化には、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５サブユニットが必要である。
【図２３】Ｔ−ループＴｈｒは、ＡＭＰＫ関連キナーゼにおけるＬＫＢ１リン酸化の主要部位である。
【図２４】ＬＫＢ１によるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性化に対するＴ−ループにおけるＴｈｒの突然変異の効果。
【図２５】ＭＡＲＫキナーゼのリン酸化および活性化の分析。
【図２６】ＬＫＢ１のためのペプチド基質の同定。
【図２７】ＬＫＢ１＋／＋およびＬＫＢ１−／−  ＭＥＦにおけるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性。
【図２８】ＡＩＣＡリボシドは、ＡＭＰＫ関連キナーゼを活性化しない。
【図２９】ＨｅＬａ細胞におけるＡＭＰＫ関連キナーゼの活性。
【図３０】ＢＲＳＫ２、ＮＵＡＫ２およびＭＡＲＫ４およびＭＥＬＫのリン酸化の分析。
【図１】
2007530000.tif 000006
【図１ａ】
2007530000.tif 000007
【図２】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図４ａ】
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【図５】
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【図５ａ】
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【図６】
2007530000.tif 000016
【図６ａ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2007530000.tif 000021
【図１１】
2007530000.tif 000022
【図１２】
2007530000.tif 000023
【図１３】
2007530000.tif 000024
【図１４】
2007530000.tif 000025
【図１５】
2007530000.tif 000026
【図１５ａ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2007530000.tif 000032
【図２１】
2007530000.tif 000033
【図２１Ａ】
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【図２２】
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【図２３】
2007530000.tif 000036
【図２４】
2007530000.tif 000037
【図２５】
2007530000.tif 000038
【図２６】
2007530000.tif 000039
【図２７】
2007530000.tif 000040
【図２８】
2007530000.tif 000041
【図２９】
2007530000.tif 000042
【図３０】
2007530000.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月18日(2005.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のＡＭＰＫ（ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ）またはＡＭＰＫサブファミリーメンバーの活性化またはリン酸化を修飾する、例えば促進する際に使用するための化合物を同定する方法であって、
（１）供試化合物が、ＬＫＢ１のプロテインキナーゼ活性を修飾する、例えば促進するかどうかを判定する工程と、
（２）ＬＫＢ１のプロテインキナーゼ活性を修飾する、例えば促進する化合物を選択する工程とを含み、
前記ＬＫＢ１が、ＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５とともに調製物の中にある、方法。
【請求項２】
前記ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５が、組み換え核酸から発現された組換え体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＬＫＢ１、ＳＴＲＤおよび組み換え核酸から発現された組換えＭＯ２５を含む精製調製物。
【請求項４】
組み換え核酸から発現された組換えＬＫＢ１を含む、請求項４に記載の調製物。
【請求項５】
組み換え核酸から発現された組換えＳＴＲＡＤを含む、請求項３または４に記載の調製物。
【請求項６】
ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤ、および過剰発現または組み換え核酸から発現された組換えＭＯ２５を発現することができる細胞。
【請求項７】
ＭＯ２５をコードする組換え核酸を含む、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
ＬＫＢ１をコードする組換え核酸を含む、請求項６または７に記載の細胞。
【請求項９】
ＳＴＲＡＤをコードする組換え核酸を含む、請求項６から８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤ、および過剰発現または組み換え核酸から発現された組換えＭＯ２５を含む細胞。
【請求項１１】
組み換え核酸から発現された組換えＬＫＢ１を含む、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
組み換え核酸から発現された組換えＳＴＲＡＤを含む、請求項１０または１１に記載の細胞。
【請求項１３】
請求項６から９のいずれか一項に記載の細胞である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
請求項３から５のいずれか一項に記載の調製物を製造するための方法であって、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の細胞から前記調製物を精製する工程を含む方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法によって取得可能な調製物。
【請求項１６】
ＬＫＢ１：ＳＴＲＡＤ：ＭＯ２５の比率が、１：１：１である、請求項３から５及び１５のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１７】
前記ＬＫＢ１が、請求項３から５及び１６のいずれか一項に記載の調製物、または請求項１４の方法によって得られたもしくは取得可能な調製物、または請求項６から１３のいずれか一項に記載の細胞の中にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
調製物が、ＬＫＢ１、ＳＴＲＡＤおよびＭＯ２５を含む複合体を含む、請求項１から５及び１４から１７のいずれか一項に記載の調製物または方法。
【請求項１９】
細胞内ＬＫＢ１活性を修飾するための化合物を同定する方法であって、
（１）供試化合物が、請求項３から５、１５、１６及び１８のいずれか一項に記載の調製物もしくは複合体の、または請求項６から１３のいずれか一項に記載の細胞内の、ＬＫＢ１のプロテインキナーゼ活性を修飾するかどうかを判定する工程と、
（２）前記ＬＫＢ１プロテインキナーゼ活性を修飾する化合物を選択する工程とを含む、方法。
【請求項２０】
前記ＬＫＢ１プロテインキナーゼ活性が、ＡＭＰＫもしくはＡＭＰＫサブファミリーメンバーまたはそれらいずれかの断片を基質として使用して測定される、請求項１または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＬＫＢ１またはＬＫＢ１をコードする組換えポリヌクレオチドと、ＳＴＲＡＤまたはＳＴＲＡＤをコードする組換えポリヌクレオチドと、ＭＯ２５またはＭＯ２５をコードする組換えポリヌクレオチドとを含む、キット。
【請求項２２】
（１）ＡＭＰＫまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバー、あるいはＡＭＰＫもしくはＡＭＰＫサブファミリーメンバーまたはそれらの断片をコードする組換えポリヌクレオチドと、
（２）請求項２１に記載のキットまたは請求項３から５、１５、１６もしくは１８のいずれか一項に記載の調製物もしくは複合体、または請求項６から１３のいずか一項に記載の細胞とを含む、キット。
【請求項２３】
（１）その細胞型がＳＴＲＡＤおよび／またはＭＯ２５を発現するものであるかどうかを判定する工程を含む、ＬＫＢ１を過剰発現させるための細胞型を選択する工程と、
（２）その選択された細胞型においてＬＫＢ１を過剰発現させる工程とを含む、ＬＫＢ１を過剰発現させる方法。
【請求項２４】
（１）請求項２３に記載の方法を用いて細胞内でＬＫＢ１を過剰発現させる工程と、
（２）前記細胞からＬＫＢ１を調製する工程とを含む、ＬＫＢ１を調製する方法。
【請求項２５】
ＭＯ２５についての推定結合パートナーを同定する方法であって、
（１）供試推定結合パートナーの少なくともＣ末端３アミノ酸のアミノ酸配列を提供する工程と、
（２）Ｃ末端アミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｐｈｅを有する推定結合パートナーを選択する工程とを含む、方法。
【請求項２６】
選択された前記推定結合パートナーがＭＯ２５に結合することを判定する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＪＳ（ポイツ−ジェガース症候群）に関連した遺伝子差を同定する方法であって、
（１）ＰＪＳに罹患している少なくとも１人の患者においてＳＴＲＡＤまたはＭＯ２５アイソフォームをコードする遺伝子の配列を調査する工程と、
（２）前記患者での配列とＰＪＳに罹患していない個体からの同等の配列との間の差を同定する工程とを含む、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法によってＰＪＳに関連したものとして同定された遺伝子差を、供試個体が有するかどうかを判定する工程を含む、個体がＰＪＳに罹患しやすいかどうかを判定する方法。
【請求項２９】
メトホルミンまたはフェンホルミンまたはＡＩＣＡリボシドに類似したメカニズムによってＡＭＰＫまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバーを活性化する化合物を同定する方法であって、請求項３から５、１５、１６及び１８のいずれか一項に記載の調製物もしくは複合体または請求項６から１３のいずれか一項に記載の細胞によるＡＭＰＫまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバーの活性化に対する供試化合物の作用を、ＡＭＰＫまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバーの活性化に対するメトフォルミンまたはフェンホルミンまたはＡＩＣＡリボシドの作用と比較し、類似した作用を有する化合物を選択する方法。
【請求項３０】
糖尿病または肥満を治療するための医薬品の製造における、ＡＭＰＫサブファミリーメンバーまたはＡＭＰＫサブファミリーメンバーをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項３１】
ＡＭＰＫサブファミリーメンバーが、ＡＭＰＫα１またはＡＭＰＫα２ポリペプチドであるまたは、ＡＭＰＫα１もしくはＡＭＰＫα２ポリペプチドを含む、請求項１、２０及び２９のうちのいずれか一項に記載の方法、請求項２２に記載のキット、または請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
ＡＭＰＫサブファミリーメンバーが、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２、ＳＩＫ、ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＭＡＲＫ１、ＭＡＲＫ２、ＭＡＲＫ３、ＭＡＲＫ４またはＭＥＬＫポリペプチドであるか、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＢＲＳＫ１、ＢＲＳＫ２、ＳＩＫ、ＱＩＫ、ＱＳＫ、ＭＡＲＫ１、ＭＡＲＫ２、ＭＡＲＫ３、ＭＡＲＫ４またはＭＥＬＫポリペプチドを含む、請求項１、２０及び２９のいずれか一項に記載の方法、請求項２２に記載のキット、または請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
アミノ酸配列ＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹもしくはＦＧＮＦＹＫＳＧＥＰＬＳＴＷＣＧＳＰＰＹもしくはＬＳＮＭＭＳＤＧＥＦＬＲＴＳＣＧＳＰＮＹもしくはＭＡＳＬＱＶＧＤＳＬＬＥＴＳＣＧＳＰＨＹもしくはＦＳＮＥＦＴＶＧＧＫＬＤＴＦＣＧＳＰＰＹもしくはＡＫＰＫＧＮＫＤＹＨＬＱＴＣＣＧＳＬＡＹ；または下線が引かれている残基以外のいずれかの位置で１から４置換されている、および／もしくは下線が引かれている残基で保存的置換されている前記配列；または下線が引かれている残基を含む前記配列の少なくとも１０隣接残基を含む、ＬＫＢ１に対するペプチド基質。
【請求項３４】
アミノ酸配列ＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹ、またはＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹＲＲＲまたはＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹ、またはＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹＲＲＲ、またはＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹ、またはＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹＲＲＲ、またはＦＧＮＦＹＫＳＧＥＰＬＳＴＷＣＧＳＰＰＹ、またはＦＧＮＦＹＫＳＧＥＰＬＳＴＷＣＧＳＰＰＹＲＲＲ、またはＬＳＮＭＭＳＤＧＥＦＬＲＴＳＣＧＳＰＮＹ、またはＬＳＮＭＭＳＤＧＥＦＬＲＴＳＣＧＳＰＮＹＲＲＲ、またはＭＡＳＬＱＶＧＤＳＬＬＥＴＳＣＧＳＰＨＹ、またはＭＡＳＬＱＶＧＤＳＬＬＥＴＳＣＧＳＰＨＹＲＲＲ、またはＦＳＮＥＦＴＶＧＧＫＬＤＴＦＣＧＳＰＰＹ、またはＦＳＮＥＦＴＶＧＧＫＬＤＴＦＣＧＳＰＰＹＲＲＲ、またはＡＫＰＫＧＮＫＤＹＨＬＱＴＣＣＧＳＬＡＹ、またはＡＫＰＫＧＮＫＤＹＨＬＱＴＣＣＧＳＬＡＹＲＲＲのみからなる、ＬＫＢ１に対するペプチド基質。
【請求項３５】
アミノ酸配列ＭＶＡＧＬＴＬＧＫＧＰＥＳＰＤＧＤＶＳ（ヒトＢＲＳＫ１の残基１〜２０）、ＬＳＷＧＡＧＬＫＧＱＫＶＡＴＳＹＥＳＳＬ（ヒトＢＲＳＫ２の残基６５５〜６７４）、ＭＥＧＡＡＡＰＶＡＧＤＲＰＤＬＧＬＧＡＰＧ（ヒトＮＵＡＫ１の残基１〜２１）、ＴＤＣＱＥＶＴＡＴＹＲＱＡＬＲＶＣＳＫＬＴ（ヒトＮＵＡＫ２の残基６５３〜６７３）、ＭＶＭＡＤＧＰＲＨＬＱＲＧＰＶＲＶＧＦＹＤ（ヒトＱＩＫの残基１〜２１）、ＭＶＩＭＳＥＦＳＡＤＰＡＧＱＧＱＧＱＱＫ（ヒトＳＩＫの残基１〜２０）、ＧＤＣＥＭＥＤＬＭＰＣＳＬＧＴＦＶＬＶＱ（ヒトＳＩＫの残基７６５〜７８４）、ＴＤＩＬＬＳＹＫＨＰＥＶＳＦＳＭＥＱＡＧＶ（ヒトＱＳＫの残基１３４９〜１３６９）、ＳＧＴＳＩＡＦＫＮＩＡＳＫＩＡＮＥＬＫＬ（ヒトＭＡＲＫ１の残基７７６〜７９５）、ＭＳＳＲＴＶＬＡＰＧＮＤＲＮＳＤＴＨＧＴ（ヒトＭＡＲＫ４の残基１〜２０）、ＭＫＤＹＤＥＬＬＫＹＹＥＬＨＥＴＩＧＴＧ（ヒトＭＥＬＫの残基１〜２０）、ＣＴＳＰＰＤＳＦＬＤＤＨＨＬＴＲ（ラットＡＭＰＫα１の残基３４４〜３５８）、ＣＤＰＭＫＲＡＴＩＫＤＩＲＥ（ラットＡＭＰＫα１の残基２５２〜２６４）を有するペプチド抗原と反応する抗体。
【国際調査報告】
2007530000.tif 000044
2007530000.tif 000045
2007530000.tif 000046
2007530000.tif 000047
2007530000.tif 000048
2007530000.tif 000049
2007530000.tif 000050