(57)【要約】本発明は、ガラクトマンナンを実質的には含まないかまたは低いレベルのガラクトマンナンを含む、Ｚｏｓｙｎ（登録商標）の薬学的組成物に関する。本発明は、上記薬学的組成物を調製するためのプロセスに関する。本発明は、予め混合されたピペラシリンまたはピペラシリン−タゾバクタムの新規な薬学的組成物を当該分野に提供する。この薬学的組成物は、ガラクトマンナンの存在を回避し、非経口投与による細菌感染の処置または制御のために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的組成物であって、
（ａ）有効量のピペラシリンもしくはその薬学的に受容可能な塩、
（ｂ）有効量のタゾバクタムもしくはその薬学的に受容可能な塩
を含み、
ガラクトマンナンもその薬学的に受容可能な塩も実質的には含まない、
薬学的組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、前記ピペラシリンは、ピペラシリンナトリウムである、薬学的組成物。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の薬学的組成物であって、前記タゾバクタムは、タゾバクタムナトリウムである、薬学的組成物。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のうちのいずれか１項に記載の薬学的組成物であって、該組成物は、凍結乾燥粉末である、薬学的組成物。
【請求項５】
哺乳動物における細菌感染の処置または制御のための方法であって、該方法は、
該哺乳動物に対して、治療上有効な量の請求項１に記載の薬学的組成物を投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
ガラクトマンナンを実質的には含まない凍結乾燥薬学的組成物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、
ａ）ピペラシリンおよびタゾバクタムを水性溶媒中に溶解して溶液を形成し、そのｐＨを約６．５に調整する工程；
ｂ）該溶液をカットオフフィルタに通して濾過する工程；
ｃ）濾液を収集する工程；
ｄ）該濾液を、凍結乾燥機中にて−３５℃未満の温度まで冷却する工程；
ｅ）該凍結乾燥機を圧力約３００μＭ  Ｈｇ（水銀μｍ）（４０パスカル）まで排気し、該凍結乾燥機を約＋５℃まで加熱する工程；
ｆ）該温度および圧力を、該水性溶媒から水を除去するために充分な時間維持して、凍結乾燥固体を形成する工程；
ｇ）該凍結乾燥固体を、約＋４５℃にて乾燥する工程；
を包含する、プロセス。
【請求項７】
請求項６に記載の薬学的組成物であって、前記カットオフフィルタは、約３ｋＤ分子量〜約１０ｋＤ分子量である、薬学的組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の薬学的組成物であって、前記カットオフフィルタは、約３ｋＤ分子量である、薬学的組成物。
【請求項９】
請求項６に記載の薬学的組成物であって、前記カットオフフィルタは、約５ｋＤ分子量である、薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項６に記載の薬学的組成物であって、前記収集された濾液の実験サンプルの指標は０．５未満である、薬学的組成物。
【請求項１１】
哺乳動物に投与する前に適合性再構成希釈剤を添加することによって再構成され得る粉末形態の薬学的組成物、または融解された場合に哺乳動物に投与する前に適合性希釈剤で希釈され得る凍結組成物の形態の薬学的組成物を製造するためのプロセスであって、該プロセスは、
ガラクトマンナンを実質的には含まない溶液を凍結または凍結乾燥する工程であって、該溶液は、（ａ）有効量のピペラシリンもしくはその薬学的に受容可能な塩、（ｂ）有効量のタゾバクタムもしくはその薬学的に受容可能な塩を水性ビヒクル中に含む、工程；
を包含する、プロセス。
【請求項１２】
薬学的組成物であって、
有効量のピペラシリンもしくはその薬学的に受容可能な塩、
を含み、
ガラクトマンナンもその薬学的に受容可能な塩も実質的には含まない、
薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の薬学的組成物であって、前記ピペラシリンは、ピペラシリンナトリウムである、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ガラクトマンナンを実質的には含まない、Ｚｏｓｙｎ（登録商標）の薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｚｏｓｙｎ（登録商標）は、米国における抗生物質市販製品であり、多くの外国においてはＴａｚｏｃｉｎ商標であり、ピペラシリンナトリウムおよびタゾバクタムナトリウムを含む。この製品は、特許文献１に開示される。特許文献２および特許文献３は、凍結乾燥形態のピペラシリンを開示する。
【０００３】
Ｚｏｓｙｎ（登録商標）は、中程度の感染症〜重篤な感染症の処置において使用される抗生物質である。特に、Ｚｏｓｙｎ（登録商標）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに起因する院内肺炎のような状態においてピペラシリン耐性、ピペラシリン／タゾバクタム感受性β−ラクタマーゼ産生微生物株によって引き起こされる中程度の感染症〜重篤な感染症の処置において；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに起因する腹腔内感染（特に、虫垂炎（破裂または膿瘍と併発する）および腹膜炎、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに起因する皮膚感染症および皮膚構造感染症（蜂巣炎、皮膚膿瘍、および虚血性脚感染症／糖尿病性脚感染症を含む）の処置において；ならびに婦人科感染症（特に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに起因する分娩後子宮内膜炎または骨盤炎症疾患）の処置において、使用される。これらの感染症の深刻さは、容易に利用可能で信頼に足る処置についての必要性を強調する。
【０００４】
医薬は、乳濁物、懸濁物、または溶液へと処方されるだけではなく、使用前に再構成されるべき凍結乾燥形態へも処方される。有利なことには、凍結乾燥調製物は、安定であり、保存され得、そして容易に再構成される。さらに、凍結乾燥調製物は、滅菌状態でかつ不溶性物質を本質的に含まない状態にて維持され得る。
【０００５】
Ｚｏｓｙｎ（登録商標）は、静脈内投与前に適合性再構成希釈剤を添加することにより再構成される粉末（凍結乾燥製品）として入手可能である。Ｚｏｓｙｎ（登録商標）は、真菌細胞壁に由来する炭化水素ポリマーでありかつ発酵プロセスにおいて形成される、微量のガラクトマンナンを含むことが見出されている。ガラクトマンナンの存在は、侵襲性アスペルギルス症（ＩＡ）についての特定の診断試験を妨害して擬陽性を与えることが示されている。存在はするが、ガラクトマンナンは、患者に対して健康上のリスクを増加することはない。
【特許文献１】米国特許第４，５６２，０７３号明細書
【特許文献２】米国特許第４，４７７，４５２号明細書
【特許文献３】米国特許第４，５３４，９７７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｚｏｓｙｎ（登録商標）の薬学的組成物中にガラクトマンナンが存在することの不利点が、本発明によって克服される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
Ｚｏｓｙｎ（登録商標）は、微量のガラクトマンナン（真菌細胞壁由来の炭水化物ポリマーである）を含むことが見出されている。しかし、存在はするが、ガラクトマンナンは、患者に対して健康上のリスクを増加することはない。
【０００８】
侵襲性アスペルギルス症（ＩＡ）は、免疫無防備状態の患者において最も頻繁に観察される致死性真菌感染である。血清中に循環アスペルギルスガラクトマンナン抗原が存在することは、侵襲性アスペルギルス症（ＩＡ）（致死性真菌感染である）の指標である。免疫無防備状態の患者は、頻繁に、細菌感染を防止するための予防的Ｚｏｓｙｎ（登録商標）処置に供される。患者における侵襲性アスペルギルス症の診断は、しばしば、アスペルギルスガラクトマンナンの存在を検出することによって血清学的方法に基づいてなされる。しかし、Ｚｏｓｙｎ（登録商標）中に微量のガラクトマンナンが存在することは、特定の診断キットを使用した場合には、ＩＡについて擬陽性試験結果をもたらす。Ｚｏｓｙｎ（登録商標）からガラクトマンナンを除去することは、そのキットを使用する場合にＩＡについての擬陽性診断試験結果をもたらす可能性を排除または減少するという利点を有する。
【０００９】
本発明は、予め混合されたピペラシリンまたはピペラシリン−タゾバクタムの新規な薬学的組成物を当該分野に提供する。この薬学的組成物は、ガラクトマンナンの存在を回避し、非経口投与による細菌感染の処置または制御のために有用である。この組成物は、（ａ）有効量のピペラシリンもしくはその薬学的に受容可能な塩（通常は、ピペラシリンナトリウムとして）、および（ｂ）有効量のタゾバクタムもしくはその薬学的に受容可能な塩（通常は、タゾバクタムナトリウムとして）を含む。本発明の薬学的組成物は、（Ａ）非経口投与前に適合性再構成希釈剤を添加することによって再構成され得る粉末形態であっても、（Ｂ）非経口投与に使用する準備ができている形態であっても、（Ｃ）融解され得、かつ非経口投与に使用する準備ができている、凍結形態であってもよい。本発明の組成物は、ガラクトマンナンを実質的には含まない状態で提供される。
【００１０】
本発明は、さらに、ガラクトマンナンを実質的には含まない凍結乾燥薬学的組成物を調製するためのプロセスを包含する。このプロセスは、
ａ）ピペラシリンおよびタゾバクタムを水性溶媒中に溶解して溶液を形成し、そのｐＨを約６．５に調整する工程；
ｂ）上記溶液をカットオフフィルタに通して濾過する工程；
ｃ）濾液を収集する工程；
ｄ）上記濾液を、凍結乾燥機中にて−３５℃未満の温度まで冷却する工程；
ｅ）上記凍結乾燥機を圧力約３００μＭ  Ｈｇ（水銀μｍ）（４０パスカル）まで排気し、上記凍結乾燥機を約＋５℃まで加熱する工程；
ｆ）上記温度および圧力を、上記水性溶媒から水を除去するために充分な時間維持して、凍結乾燥固体を形成する工程；
ｇ）上記凍結乾燥固体を、約＋４５℃にて乾燥する工程；
を包含する。
【００１１】
本発明はまた、哺乳動物に投与する前に適合性再構成希釈剤を添加することによって再構成され得る粉末形態の薬学的組成物、または融解された場合に哺乳動物に投与する前に適合性希釈剤で希釈され得る凍結組成物の形態の薬学的組成物を製造するためのプロセスを包含し、このプロセスは、ガラクトマンナンを実質的には含まない溶液を凍結または凍結乾燥する工程であって、上記溶液は、（ａ）有効量のピペラシリンもしくはその薬学的に受容可能な塩、（ｂ）有効量のタゾバクタムもしくはその薬学的に受容可能な塩を水性ビヒクル中に含む、工程；を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（好ましい実施形態の説明）
本発明の組成物は、他の形態の投与用ピペラシリンおよび投与用ピペラシリン−タゾバクタムを超える利点を提供する。特に、本発明は、ガラクトマンナンを実質的には含まない組成物を提供する。Ｚｏｓｙｎ（登録商標）の組成物中にガラクトマンナンが存在しない場合、侵襲性アスペルギルス症の決定のために使用される抗体試験の妨害および擬陽性試験結果が存在しない。このガラクトマンナンを除去または減少することにとって重要なのは、約３ｋＤ分子量（ｍｗ）〜約１０ｋＤ分子量（ｍｗ）の適切なカットオフフィルタを使用することである。このガラクトマンナンは、そのフィルタ上に収集される。ピペラシリンまたはピペラシリン−タゾバクタムは、このフィルタを通過し、そして収集された濾液中に存在する。好ましいのは、約３ｋＤの分子量カットオフフィルタである。より好ましいのは、約５ｋＤのカットオフフィルタである。
【００１３】
ガラクトマンナンの除去または減少は、以下の様式で進行する：約１０ｍｇ／ｍｌのＺｏｓｙｎ（登録商標）水溶液が、調製される。この溶液は、一連の微量遠心分離機フィルタデバイス（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用され、それらのフィルタは、１０，０００×ｇにて遠心分離される。この手順により、この溶液が限外濾過膜に通される。溶質が、分子量に基づいてこの膜によって分離される。低分子量物質（例えば、ピペラシリンおよびタゾバクタム）は、限外濾過膜を通過し（濾液）、一方、その膜のカットオフよりも大きい分子量を有する物質は、そのフィルタによって効率的に保持される（保持液）。ガラクトマンナンは、２５，０００〜７５，０００という高い分子量を有すると報告されている；ピペラシリンおよびタゾバクタムは、＜１０００という低分子量を有する。ガラクトマンナンを含むＺｏｓｙｎ（登録商標）の溶液が３０００ｍｗカットオフフィルタに適用されて遠心分離された場合、そのガラクトマンナンは、保持液（Ｒ）中に見出される。その濾液（Ｆ）は、ピペラシリン成分およびタゾバクタム成分を含み、その濾液は、ガラクトマンナンについて試験して陰性である。同様の結果が、５ｋＤ膜を用いて見出される。１０ｋＤカットオフフィルタを使用して見出される結果は、少量のガラクトマンナンがその濾液中にて見出されることを示す。重要なことは、出発物質と比較した場合に、濾液中のピペラシリンおよびタゾバクタムの強度喪失がないことである。代表的な実験において、このプロセスの後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った場合、以下の結果が限外濾過後に得られる：
１．  Ｚｏｓｙｎ（登録商標）
タゾバクタム回収−１００．３％
ピペラシリン一水和物−９９．０％
２．  ピペラシリン−１００．１％
３．  アンピシリン−９９．８％。
【００１４】
このプロセスは、市販の限外濾過（ＵＦ）デバイスおよび限外濾過膜を使用して、商業的操作のための生産規模に容易に適合される。
【００１５】
ガラクトマンナンは、限外濾過によってＺｏｓｙｎ（登録商標）溶液から効率的に除去され得る。研究によって、適切な分子量カットオフ膜フィルタを通して濾過すると、高分子量ガラクトマンナンが、低分子量Ｚｏｓｙｎ（登録商標）成分から分離することが示されている。ガラクトマンナンのさらなる除去、ならびにピペラシリンおよびタゾバクタムの回収増加は、カットオフ限外濾過の一部として膜フィルタを用いるダイアフィルトレーションを使用して、商業的操作においてさらに達成され得る。ダイアフィルトレーションにおける膜フィルタは、ガラクトマンナンを保持し、Ｚｏｓｙｎ（登録商標）成分が通過して濾液中にて収集されるのを可能にする。ガラクトマンナンはまた、６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）から除去され得、アンピシリンが、適切な膜フィルタによって除去され得る。
【００１６】
（実験プロトコル）
（表題：ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｐｌａｔｅｌｉａ（登録商標）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ＥＩＡ法を使用する、ガラクトマンナンの存在についてのＺｏｓｙｎ（登録商標）、活性薬剤成分（ＡＰＩ）および他の抗生物質の評価）
（１．目的）
このプロトコルの目的は、種々のロットのＺｏｓｙｎ（登録商標）、ＡＰＩおよび他の抗生物質を、ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｐｌａｔｅｌｉａ（登録商標）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ＥＩＡキットを使用してガラクトマンナン抗原の存在について評価するための、実験設計を記載することである。
【００１７】
（２．材料および装置）
（２．１．サンプルおよび試薬）
（１．サンプル）
Ｚｏｓｙｎ（登録商標）  ２．２５０ｇ／バイアル
Ｚｏｓｙｎ（登録商標）  ４．５ｇ／バイアル
Ｔａｚｏｘｉｌ  ４．５ｇ（ジェネリックＺｏｓｙｎ（登録商標））（ブラジル製）
Ｔａｚａｃ  ４．５ｇ（ジェネリックＺｏｓｙｎ（登録商標））（インド製）
Ｐｉｐｅｒａｃｉｌｉｎａ  Ｔａｚｏｂａｃｔａｍ  ４．５ｇ（ジェネリックＺｏｓｙｎ（登録商標））Ｒｉｃｈｅｔ（アルゼンチン製）
他の製品が、ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｐｌａｔｅｌｉａ（登録商標）Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ  ＥＩＡ診断キットにおけるその応答を評価するためにこのプロトコル中に含まれる。
【００１８】
２．Ｐｌａｔｅｌｉａ（登録商標）Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ  ＥＩＡ（ＢｉＯ−ＲＡＤ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）、Ｎｏ．６２７９３（９６  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ）またはＮｏ．６２７９４（４８０  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ）。
【００１９】
（２．２．装置）
１．  マイクロプレートリーダー：Ｄｙｎｅｘ  ＭＲＸ  ＥＬＩＳＡプレートリーダー
２．  Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  ＩＩ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｗａｓｈｅｒ／Ａｓｐｉｒａｔｏｒ（Ｄｙｎｅｘ）
３．  バイオセーフティキャビネット
４．  沸騰水浴
５．  インキュベーター
６．  ボルテックス攪拌機
７．  滅菌チューブ、滅菌グローブ、および滅菌ピペットチップ
８．  マイクロピペット。
【００２０】
（３．環境コントロール）
試薬、サンプル、およびサンプル希釈物の調製は、バイオセーフティキャビネット中にて無菌条件下で行う。
【００２１】
（４．試験部位）
Ｚｏｓｙｎ（登録商標）
実験は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｐｅａｒｌ  Ｒｉｖｅｒ，ＮＹにて行った。
【００２２】
（５．アッセイの原理および手順）
（５．１．アッセイ原理）
Ｐｌａｔｅｌｉａ（登録商標）Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ  ＥＩＡは、ヒト血清中のガラクトマンナン検出のために使用される一段階免疫酵素的サンドイッチマイクロプレートアッセイである。ラットモノクローナル抗体ＥＢＡ−２が、その抗原を捕捉するために使用され、その後、ペルオキシダーゼ結合体化抗体を使用して検出される。そのサンプルの吸光度値が、「カットオフ」コントロールの吸光度値と比較され、それによってガラクトマンナンの指標／相対濃度が決定される。
【００２３】
（５．２．手順）
ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｐｌａｔｅｌｉａ（登録商標）Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ  ＥＩＡキットのユーザーマニュアルを、試薬調製、ステップバイステップアッセイ手順、ならびに試薬およびサンプルの取り扱いに関する安全性指示について参照する。
サンプル調製：注射用水（ＷＦＩ）（ＵＳＰ（米国薬局方）グレード）または他の任意の適切な希釈剤中にて再構成し、望ましい濃度にて希釈物を生成する。
そのサンプルの希釈物は、進行中の実験の結果に基づいて変更され得る。
【００２４】
（６．実験設計）
（６．１．製品評価）
（１．Ｚｏｓｙｎ（登録商標）の評価）
注射用水（ＷＦＩ）／リン酸緩衝化生理食塩水または他の適切なマトリックス中にて望ましい濃度のＺｏｓｙｎ（登録商標）バイアルを、分析する。
【００２５】
（２．活性薬剤成分（ＡＰＩ）の評価）
ピペラシリンおよびタゾバクタム、ならびに任意の他の利用可能な成分のバイアルを、注射用水（ＷＦＩ）／リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で分析する。
【００２６】
（３．ジェネリックＺｏｓｙｎ（登録商標）および他の抗生物質）
他の利用可能なジェネリックＺｏｓｙｎ（登録商標）／抗生物質を、ＷＦＩ／ＰＢＳ中にて望ましい濃度で分析する。
【００２７】
（６．２．濾過研究）
（Ｚｏｓｙｎ（登録商標））
１．  再構成されたサンプルを、適切な分子量のカットオフスピンフィルタを使用して濾過し、その濾液を望ましい濃度で試験する。適切な場合、濾過能力に関して他の研究を評価する。
【００２８】
（３．合格基準）
（カットオフコントロール）  各（２）カットオフコントロール血清ウェルの光学密度（ＯＤ）４５０は、０．３と０．８との間になければならない。個々の値各々は、本明細書に従うべきである。
【００２９】
（平均カットオフ）
コントロールは、２つのウェルの読み取り値の平均である（ＢＩＯ−ＲＡＤキットの指示書を参照のこと）。
【００３０】
（ポジティブコントロール）：ポジティブコントロール血清の指標は、２よりも大きくなければならない。
【００３１】
（ネガティブコントロール）：ネガティブコントロールの指標は、４未満でなければならない。これらのコントロールのうちのいずれかがこの基準を満たさない場合、そのアッセイは、無効となる。実験サンプルの指標を決定するために、試験サンプルの吸光度（ＯＤ４５０）を、平均カットオフコントロールで除算する。０．５よりも大きな指標は、陽性の結果と見なされる。０．５未満の指標は、陰性の結果と見なされる。
【００３２】
（４．基準）
Ｐｌａｔｅｌｉａ（登録商標）Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ  ＥＩＡマニュアル（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）
Ｉ＝ＯＤポジティブコントロール（Ｒ５）＞２
平均カットオフコントロールＯＤ
Ｉ＝ＯＤネガティブコントロール（Ｒ３）＜０．４
平均カットオフコントロールＯＤ          。
【００３３】
（高速液体クロマトグラフィーによる水性サンプル中のＺｏｓｙｎ（登録商標）（ピペラシリン／タゾバクタム）の強度および識別）
（１．方法の概要）
Ｚｏｓｙｎ（登録商標）のサンプルの一部を溶解させ、希釈溶媒で希釈し、次いで、逆相カラムでクロマトグラフする（ＵＳＰ  ２３  ＮＦ１８、Ｖｏｌ．２５、ｐ．７４９７、Ｓｕｐｐ．６、ｐ．３７２２）。ピペラシリンおよびタゾバクタムの強度を、サンプル調製物のクロマトグラムにおける相対ピーク応答と、同時に得られる標準物質のクロマトグラムの相対ピーク応答とを比較することによって決定する。ペピラシリンおよびタゾバクタムを、サンプル調製物のクロマトグラムにおけるそれぞれのピークの保持時間を、標準調製物のクロマトグラムにおけるそれぞれのピークの保持時間と比較することによって同定する。ピペラシリンについてこの方法の報告限界値（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｌｉｍｉｔ）は、注入される溶液１ｍＬに対して０．１６μｇである。タゾバクタムについてこの方法の報告限界値は、注入される溶液１ｍＬに対して０．０７７μｇである。
【００３４】
（２．専用の装置）
クロマトグラフィーカラム  −  長さ約２５ｃｍ、内径約４．６ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）（５μｍサイズの粒子）が充填される。
注：長さ１５０ｍｍ〜３００ｍｍのカラムは、システムの適合性要件を満たすという条件で使用され得る。
ポンプ  −  ５０００ｐｓｉまでの圧力で作動し得る一定流量ポンプ。
検出器  −  ２２０ｎｍにて約１．０の吸光度単位フルスケール（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｕｎｉｔ  ｆｕｌｌ  ｓｃａｌｅ）の感度で作動し得る紫外分光光度検出器。
注入器  −  再現性のある注入および５℃のサンプルトレイ温度を維持し得る任意の手動注入器または自動注入器。
積分器  −  電子積分器が好ましい。
記録器  −  必要に応じて。検出器の作動出力電圧に適合する記録デバイス。
メンブランフィルタ  −  孔径０．４５μｍ、Ｎｙｌｏｎ−６６メンブランフィルタ。
カラム温度制御器  −  ３０℃のカラム温度を維持し得るもの。
【００３５】
（３．試薬および材料）
メタノール  −  ＨＰＬＣグレード。
リン酸ナトリウム、一塩基性  −  （ＮａＨ２ＰＯ４）試薬グレード。
テトラブチル水酸化アンモニウム  ０．４Ｍ  −  試薬グレード。
リン酸  −  ８５％、試薬グレード。
水  −  ＨＰＬＣに適切なもの。
０．２Ｍ  リン酸一ナトリウム緩衝溶液  −  ２７．６ｇのリン酸一ナトリウムを秤量し、水で１Ｌに希釈する。
２０％リン酸溶液  −  ２３．５ｍＬの８５％リン酸を水で１００ｍＬに希釈し、混合する。
２％リン酸溶液  −  ２．４ｍＬの８５％リン酸を水で１００ｍＬに希釈し、混合する。
希釈溶媒  −  移動相。
移動相  −  ４４７ｍＬの水を量り、１００ｍＬの０．２Ｍリン酸一ナトリウム緩衝溶液を添加し、３．０ｍＬのテトラブチル水酸化アンモニウムをピペットで取り、４５０ｍＬのメタノールを添加する。混合する。室温まで冷却する。２０％リン酸溶液を用いてその溶液のｐＨを約５．６に調整し、次いで、２％リン酸溶液を用いて５．５０±０．０２に調整する。必要に応じて、０．４５μｍの孔径のメンブランフィルタで濾過する。必要に応じて脱気する。
ピペラシリン基準標準物質（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ）  −  既知の強度を有するもの（Ｓ）。
タゾバクタム基準標準物質  −  既知の強度を有するもの（Ｓ）。
【００３６】
（４．機器の準備）
１．  検出器の波長を２２０ｎｍに、そして感度を約１．０の吸光度単位フルスケールに設定する。（感度の設定は、使用される装置に依存して変動し得る）。
２．  流速を１分あたり０．８ｍＬに設定する（１分あたり０．５ｍＬ〜１．２ｍＬが許容される）。
３．  カラム温度制御器を３０℃に設定する。
４．  注入器／自動サンプル採取器温度制御器を５℃に設定する。
５．  安定なベースラインが得られるまで、移動相をカラムにポンピングする（通常は、約１５×カラム容積）。
【００３７】
（５．標準物質の調製）
１．  約２４ｍｇのタゾバクタム基準標準物質および２０ｍｇのピペラシリン基準標準物質を、２つの別々の５０ｍｌメスフラスコに正確に秤量する。
２．  この標準物質を数滴のメタノールで溶解させ（必要に応じて超音波処理する）、タゾバクタムを希釈溶媒で容量まで希釈する。これは、タゾバクタム標準物質のストック溶液である。
３．  ５．０ｍＬのタゾバクタム標準物質のストック溶液をピペットでピペラシリンフラスコに取る。希釈溶媒で容量まで希釈し、混合する。これは、ピペラシリン／タゾバクタム標準調製物である。（それぞれ、約４００μｇ／ｍＬおよび約４８μｇ／ｍＬ）。これらは、一点標準計算（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｉｎｔ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）用である。
４．  （この工程は、ビヒクル／コントロールサンプルがアッセイされる場合のみ必要とされる）。２．０ｍＬのピペラシリン／タゾバクタム（４００／４８μｇ／ｍＬ）標準調製物をピペットで１００ｍＬメスフラスコに取り、希釈溶媒で容量まで希釈する。２．０ｍＬのこの溶液をピペットで各々１００ｍＬおよび２５ｍＬのメスフラスコに取り、希釈溶媒で容量まで希釈する。これらは、それぞれ、ピペラシリンおよびタゾバクタムについての報告限界標準調製物である（１番目の溶液について約０．１６μｇ／ｍＬのピペラシリン、および２番目の溶液について約０．０７７μｇ／ｍＬのタゾバクタム）。これらの調製物の各々について、適切な濃度（ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）のみが使用される。
注１：ピペラシリンについての線形性は、１００μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬで確立されている。タゾバクタムについての線形性は、１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬで確立されている。任意の連続希釈物が調整され、それゆえ線形領域内に標準調製物濃度が得られるという条件で、比例してより少ないかまたはより多い標準重量が取られ得る。このことがなされる場合、計算のために適切な調整がなされなければならない。
注２：最終希釈物および注入された濃縮物が線形領域内にあるという条件で、他の希釈スキームが可能である。このことがなされる場合、計算のために適切な調整がなされなければならない。
【００３８】
（６．サンプルの調製）
要求されるサンプル濃度に基づいて、希釈溶媒中で必要な希釈を行って、ピペラシリンおよびタゾバクタムについて単一標準濃度（それぞれ、約４００μｇ／ｍＬおよび４８μｇ／ｍＬ）付近のサンプル溶液濃度を得る。予め量った典型的な±２ｍＬのサンプルについて、全サンプルを定量的に移す。バイアル、バイアルのキャップ、およびバイアルの首の外側をリンスし、そのリンス液を希釈フラスコに加える。
【００３９】
必要な場合、リンスしている間サンプルバイアルをボルテックスして、サンプルのすべてを取り出す。希釈溶媒で容量まで希釈し、十分に混合する。任意の連続希釈もまた、希釈溶媒中でなされるべきである。サンプルは、注入される前の時間を最小限にするために一度に処理されるべきである。
注１：典型的でないサンプルは、代替的な調製手順を必要とし得る。例えば、サンプル容積またはサンプル濃度は、アリコートが取られることを必要とし得る。
注２：ピペラシリンについて、ビヒクル／コントロールサンプルを典型的な２ｍＬサンプルに対して２：１０に希釈する。タゾバクタムについて、そのサンプルをさらに２：１０に希釈する。
【００４０】
サンプルが予め秤量される場合、最初のサンプル容量は、以下のとおりに濃度を用いて計算されるべきである：
サンプル容積（ｍＬ）＝サンプル質量（ｇ）／密度（ｇ／ｍＬ）
。
【００４１】
（７．システムの適合）
１．  安定なベースラインが得られた後、１０μＬのピペラシリン／タゾバクタム標準調製物を３回注入し、ピペラシリン／タゾバクタム基準標準物質のクロマトグラムを得る。これらの注入は、システムの適合および計算のために使用される。
２．  ピペラシリンの利用率（ｋ’）を計算する。利用率は３．５以上でなければならない。そうでない場合、新しい移動相を調製するかまたはカラムを交換する。
注：ｔａ値（保持されないピークの保持時間）は、カラム容積の６０パーセントをｍＬ／分単位の流速で除算することによって見積もられ得る。指定のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラムについて、ｔａの見積りは、２．５ｍＬ／（ｍＬ／分単位の流速）である。
３．  ＵＳＰで指示されるように、カラムテーリング係数（Ｔ）を計算する。カラムテーリング係数は、１．５未満でなければならない。１．５より大きい場合、クロマトグラフィーシステムを修復し、そして／またはカラムを交換する。
４．  ＵＳＰで指示されるように、理論段（Ｎ）を計算する。Ｎの値は、３０００以上でなければならない。３０００より小さい場合、流速を許容範囲内に小さくし、カラムを交換し、そして／またはクロマトグラフィーシステムを修復する。
５．ピペラシリンの３回の反復注入についてＲＳＤを計算する。ＲＳＤは２．０％未満でなければならない。
【００４２】
（８．手順）
（Ａ．強度）
１．  （この工程は、ビヒクル／コントロールサンプルがアッセイされる場合にのみ必要とされる）。アッセイ中のある時点で、１０μＬの希釈溶媒を注入して、ブランクのクロマトグラムを得る。
１０μＬのサンプル調製物および報告限界標準調製物を注入し、目的のピークの保持時間において応答を得る。
２．  １０μＬのサンプル調製物を注入し、目的のピークの応答を得る。
【００４３】
（Ｂ．同定）
１．  各々１０μＬのピペラシリン／タゾバクタムを注入し、それぞれのピークの保持時間を得る。
２．  １０μＬのサンプル調製物を注入し、それぞれのピークの保持時間を得る。
【００４４】
（９．計算）
（Ａ．強度）
１．  以下の等式から標準調製物のピペラシリン／タゾバクタム濃度を計算する：
ピペラシリンのｍｇ／ｍｌ＝（Ｗｒ）（Ｓ）／（５０）
タゾバクタムのｍｇ／ｍｌ＝（Ｗｒ）（Ｓ）（Ｖ１）／（５０）（Ｖ２）
ここで、
Ｗｒ＝それぞれの基準標準物質の重量、ｍｇ
Ｓ＝それぞれの基準標準物質の強度、小数
Ｖ１＝標準調製物を生成するために使用される標準物質ストック溶液の容積、ｍＬ
５０＝標準物質ストック溶液または標準調製物の容積、ｍＬ
Ｖ２＝標準調製物の容積、ｍＬ
である。
２．  ピペラシリンおよびタゾバクタムについて：
以下の等式から強度を計算する：
ピペラシリンまたはタゾバクタムのｍｇ／ｍＬ＝（Ｃｓ）（ＲｓｐＩ）（ＤｓｐＩ）／（Ｒｓｔｄ）
ここで、
Ｃｓ＝上の１からのそれぞれの標準物質の濃度、ｍｇ／ｍＬ
ＲｓｐＩ＝サンプル調製物に対する応答
ＤｓｐＩ＝サンプル調製物に対する希釈係数
Ｒｓｔｄ＝それぞれの標準調製物に対する平均応答
である。
【００４５】
（Ｂ．同定）
１．  サンプル調製物のクロマトグラムにおけるそれぞれのピークの相対保持値（Ｒｒ）を、以下の式（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を用いて計算する：
Ｒｒ＝サンプルのクロマトグラムからのそれぞれのピークのＲｔ／標準物質のクロマトグラムからのそれぞれのピークのＲｔ
ここで、
Ｒｔ＝保持時間、分
である。
２．  Ｒｒが１．０±０．０５である場合、陽性としての同定を報告し、他の場合は、陰性としての同定を報告する。
【００４６】
（１０．報告限界値）
本発明の方法について、ピペラシリンに対する報告限界値は、注入される溶液１ｍＬに対して０．１６μｇである。これは、２ｍＬから１０ｍＬに希釈された２ｍＬのビヒクル／コントロールサンプル１ｍＬに対して０．８μｇである。本発明の方法について、タゾバクタムに対する報告限界値は、注入される溶液１ｍＬに対して０．０７７μｇである。これは、２ｍＬ〜１０ｍＬに希釈され、再度２ｍＬから１０ｍＬに希釈された２ｍＬのビヒクル／コントロールサンプル１ｍＬに対して１．９２μｇである。
【００４７】
（濾過研究）
Ｚｏｓｙｎ（登録商標）（代表的な市販のサンプル）を水に１００ｍｇ／ｍｌで溶解させる。ピペラシリンを飽和炭酸水素ナトリウムに１００ｍｇ／ｍｌで溶解させる。Ｚｏｓｙｎ（登録商標）およびピペラシリンをＵＳＰ水を用いて１０ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌに希釈する。１０ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌのＺｏｓｙｎ（登録商標）（３００μｌ）ならびにピペラシリンを、１０ｋＤまたは３ｋＤの分子量のカットオフフィルタを備えるナノセップ（ｎａｎｏｓｅｐ）スピンデバイスに移す。サンプルをエッペンドルフ遠心分離機に置き、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。遠心分離の最後に、サンプルをパススルーしたものに回収した。ナノセップスピンデバイスの上部に残ったガラクトマンナンを、アッセイのために２００μｌ水で再懸濁させる。代表的な結果を以下の実施例１〜４に示す。ガラクトマンナンについての光学密度（ＯＤ）を各々の実施例に対して示し、同様に実験サンプルの決定された指標を示す。
結果：
Ｎｅｇ．ＣＴＬ：０．０７８、指標＝０．１４
Ｃ−Ｏ  ＴＬ：０．５３４、０．５５４、平均光学密度（ＯＤ）＝０．５４４
Ｐｏｓ  ＣＴＬ：２．００９、指標３．６９。
【００４８】
（実施例１  １０Ｋ（１０ｋＤ）フィルタ）
【００４９】
【表１】
2007519747.tif 000002
（実施例２  ３Ｋ（３ｋＤ）フィルタ）
【００５０】
【表２】
2007519747.tif 000003
（実施例３  １０Ｋ（１０ｋＤ）フィルタ）
【００５１】
【表３】
2007519747.tif 000004
（実施例４  ３Ｋ（３ｋＤ）フィルタ）
【００５２】
【表４】
2007519747.tif 000005
（実施例５）
実験の活動（ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、以下から構成された：（１）１０Ｌのバッチサイズを使用して、ＺＯＳＹＮ（登録商標）バルク生成物を処方すること、（２）少なくとも５μｍの空隙サイズを有するフィルタを通して、バルク溶液を濾過すること、および（３）限外濾過／ダイアフィルトレーション技術により、このバルク溶液からガラクトマンナン内容物を取り除くこと。サンプリング手順は、１０倍（１０Ｘ）までの濃度のバルク溶液の限外濾過処理および６つのダイアフィルトレーション（６ＤＶ）手順の間に行なった。
【００５３】
（バルク処方）
Ｚｏｓｙｎ（登録商標）バルク生成物の開発中のバッチのバルク溶液を、２５０ｍｇ／ｍＬ  ピペラシリンおよび３１．２５ｍｇ／ｍＬ  タゾバクタムの濃度（ピペラシリンの２％過剰）にて処方して、反応を完了させた。ピペラシリン一水和物（ＰＭＨ）原材料（ロット番号２００００８４７４２、ガラクトマンナン（ＧＭ）に対して陽性であると（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＰｌａｔｅｌｉａＴＭ  ＥＩＡキットを用いて）試験済み）を、この研究に使用した。炭酸水素ナトリウム（制限試薬）を、化学量論ベースで添加した。総バッチサイズは、１０Ｌであった。重量データを、原材料表にまとめる。バルク処方を、予想通りに十分に実施した。プロトコルの目的のために、生成物であるバルク溶液は、最終容量（Ｑｓ）までにしなかった。溶液が、６．０のｐＨに達したので、反応が完了したものとみなした（許容可能なｐＨ限界は、６．８以下である）。約８リットル（８Ｌ）のバルク生成物の容量を、ｑｓまでに得た。この研究の目的のために、生成物であるバルク溶液は、最終容量までにしなかった。原材料表は、実験バッチの製造のために使用した異なる処方物の成分をまとめる。
【００５４】
【表５】
2007519747.tif 000006
（濾過）
一旦反応が完了し、そして、１０Ｌの最終容量に到達する前に、バルク生成物を、０．２μｍの空隙サイズのナイロンメンブレンフィルタ（ＣＵＮＯ（登録商標）ＬｉｆｅＡＳＳＵＲＥＴＭカプセル）を通して濾過した。
【００５５】
（限外濾過／ダイアフィルトレーション手順）
限外濾過（ＵＦ）による濾過手順を、５ｋＤのＯｍｅｇａ（登録商標）膜（品番ＯＳ００５Ｇ０２）を使用することによって行なった。ＧＭの除去効率が、１ｋＤ、３ｋＤおよび１０ｋＤの膜よりも大きいので、上記の膜サイズを選択した。
【００５６】
総容量６ＬのＺＯＳＹＮ（登録商標）バルク溶液を使用して、濾過システムの作動効率（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を評価した。ＵＦシステムを、３７ｐｓｉの供給圧（４２ｐｓｉ、最大圧）および、３５ｐｓｉの保持圧（３９ｐｓｉ、最大圧）で作動した。限外濾過の間、透過プールのサンプルを、２×、４×、８×および１０×の濃度で採取した。一旦１０×濃度が達成されると、表Ａに示すように、ピペラシリンについて９６％、そしてタゾバクタムについて８６％の回収率が達成された。
【００５７】
その後、ダイアフィルトレーションによる濾過手順を、６つのダイアフィルトレーション容量（２ＤＶ、４ＤＶ、５ＤＶおよび６ＤＶ）を完了することにより、実行した。回収したデータは、表Ｂに示されるように、４つのダイアフィルトレーション容量（４ＤＶ）の後、ピペラシリンおよびタゾバクタムの両方について、１００％の収率が得られることを実証した。
【００５８】
【表６】
2007519747.tif 000007
【００５９】
【表７】
2007519747.tif 000008
同時に、ＧＭ検出試験を、表Ａおよび表Ｂに含まれる各サンプルについて行なった。ＧＭ検出試験について得られた結果を、表Ｃに示す。
【００６０】
【表８】
2007519747.tif 000009
【００６１】
【表９】
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透過プールのサンプルは、ガラクトマンナンについて陰性の結果を与えた。全ての試験結果は、十分に確立された規格の範囲内であった。
【国際調査報告】
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