(57)【要約】分泌された可溶性受容体及び生物学的活性ポリペプチドを三量体形態で生成するための方法及び組成物が記載される。この方法はリガンド結合ドメインまたは生物学的活性ポリペプチドと共に可溶性受容体をコード化するＤＮＡ鋳型を、共有結合された三量体を自己構築できるコラーゲンのＣ−プロペプチドをコード化するＤＮＡ配列と融合することを含む。生成した融合タンパク質は三量体性可溶性受容体類似体で分泌され、これはこれらの天然産出三量体性リガンドの生物学的活性の効果的な中和のために使われることができる。【選択図】図１Ａ
2007519611.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）三量体化されるポリペプチドにフレーム内で融合され、三量体化される第１ポリペプチドとは異種である自己三量体化されることができるポリペプチドにフレーム内で結合した、信号ペプチド配列をコード化する鋳型に結合された転写プロモーターを含むＤＮＡ作成物を作って；
（ｂ）前記ＤＮＡ作成物を真核生物細胞に導入し；
（ｃ）生理的条件下の好適な生長培地で宿主細胞を生長させて前記ＤＮＡ配列によりコード化されて三量体化された融合タンパク質の分泌を許し；及び
（ｄ）前記三量体化された融合タンパク質を宿主細胞から分離することを含む、分泌された三量体性融合タンパク質の製造方法。
【請求項２】
第１項において、三量体化されたポリペプチド融合物が同種三量体である方法。
【請求項３】
第１項において、三量体化ポリペプチド残基はプロ．α．１（Ｉ）、プロ．α．２（Ｉ）、プロ．α．１（ＩＩ）、プロ．α．１（ＩＩＩ）、プロ．α．１（Ｖ）、プロ．α．２（Ｖ）、プロ．α．１（ＸＩ）、プロ．α．２（ＸＩ）及びプロ．α．３（ＸＩ）で構成された群から選択される三量体に自己構築されることができるコラーゲンのＣ−末端部分を含む方法。
【請求項４】
（ａ）三量体化される非コラーゲンポリペプチドにフレーム内で連結され、自己三量体化されることができて、プロ．α．１（Ｉ）、プロ．α．２（Ｉ）、プロ．α．１（ＩＩ）、プロ．α．１（ＩＩＩ）、プロ．α．１（Ｖ）、プロ．α．２（Ｖ）、プロ．α．１（ＸＩ）、プロ．α．２（ＸＩ）及びプロ．α．３（ＸＩ）から選択されるコラーゲンのＣ−末端部分にフレーム内で連結された信号ペプチド配列で構成されたオープンリーディングフレームの転写を誘導するプロモーターを含む第１ＤＮＡ作成物を真核生物宿主細胞に導入して；
（ｂ）三量体化される第２非コラーゲンポリペプチドにフレーム内で連結され、自己三量体化されることができて、プロ．α．１（Ｉ）、プロ．α．２（Ｉ）、プロ．α．１（ＩＩ）、プロ．α．１（ＩＩＩ）、プロ．α．１（Ｖ）、プロ．α．２（Ｖ）、プロ．α．１（ＸＩ）、プロ．α．２（ＸＩ）及びプロ．α．３（ＸＩ）から選択されるコラーゲンの第２Ｃ−末端部分にフレーム内で連結された信号ペプチド配列で構成されたオープンリーディングフレームの転写を誘導するプロモーターを含む第２ＤＮＡ作成物を真核生物宿主細胞に導入して；
（ｃ）生理的条件下の好適な生長培地で宿主細胞を生長させて前記第１及び第２ＤＮＡ配列によりコード化されて三量体化された融合タンパク質の分泌を許し；及び
（ｄ）分泌された三量体性融合タンパク質を宿主細胞から分離することを含む、分泌された三量体性融合タンパク質の製造方法。
【請求項５】
（ａ）三量体化される非コラーゲンポリペプチドにフレーム内で連結され、自己三量体化されることができて、プロ．α．１（Ｉ）、プロ．α．２（Ｉ）、プロ．α．１（ＩＩ）、プロ．α．１（ＩＩＩ）、プロ．α．１（Ｖ）、プロ．α．２（Ｖ）、プロ．α．１（ＸＩ）、プロ．α．２（ＸＩ）及びプロ．α．３（ＸＩ）から選択されるコラーゲンのＣ−末端部分にフレーム内で連結された信号ペプチド配列で構成されたオープンリーディングフレームの転写を誘導するプロモーターを含む第１ＤＮＡ作成物を真核生物宿主細胞に導入して；
（ｂ）三量体化される第２非コラーゲンポリペプチドにフレーム内で連結され、自己三量体化されることができて、プロ．α．１（Ｉ）、プロ．α．２（Ｉ）、プロ．α．１（ＩＩ）、プロ．α．１（ＩＩＩ）、プロ．α．１（Ｖ）、プロ．α．２（Ｖ）、プロ．α．１（ＸＩ）、プロ．α．２（ＸＩ）及びプロ．α．３（ＸＩ）から選択されるコラーゲンの第２Ｃ−末端部分にフレーム内で連結された信号ペプチド配列で構成されたオープンリーディングフレームの転写を誘導するプロモーターを含む第２ＤＮＡ作成物を真核生物宿主細胞に導入して；
（ｃ）三量体化される第３非コラーゲンポリペプチドにフレーム内で連結され、自己三量体化されることができて、プロ．α．１（Ｉ）、プロ．α．２（Ｉ）、プロ．α．１（ＩＩ）、プロ．α．１（ＩＩＩ）、プロ．α．１（Ｖ）、プロ．α．２（Ｖ）、プロ．α．１（ＸＩ）、プロ．α．２（ＸＩ）及びプロ．α．３（ＸＩ）から選択されるコラーゲンの第３Ｃ−末端部分にフレーム内で連結された信号ペプチド配列で構成されたオープンリーディングフレームの転写を誘導するプロモーターを含む第３ＤＮＡ作成物を真核生物宿主細胞に導入して；
（ｄ）生理的条件下の好適な生長培地で宿主細胞を生長させて前記第１及び第２ＤＮＡ配列によりコード化されて三量体化された融合タンパク質の分泌を許し；及び
（ｅ）分泌された三量体性融合タンパク質を宿主細胞から分離することを含む、分泌された三量体性融合タンパク質の製造方法。
【請求項６】
第１項ないし第５項のうちいずれか一つの項において、信号ペプチド配列及び三量体化される非コラーゲンポリペプチドは同一天然分泌タンパク質から得たことである方法。
【請求項７】
第１項ないし第５項のうちいずれか一つの項において、信号ペプチド配列及び三量体化される非コラーゲンポリペプチドは２個の相異なる分泌タンパク質から選択された方法。
【請求項８】
第１項、第４項及び第５項のうちいずれか一つの項において、宿主真核生物細胞が真菌または昆虫細胞である方法。
【請求項９】
第１項、第４項及び第５項のうちいずれか一つの項において、前記宿主真核生物細胞が培養された哺乳動物細胞株である方法。
【請求項１０】
第１項ないし第５項のうちいずれか一つの項において、コラーゲンのＣ−末端部分はＣ−プロペプチドに結合されたコラーゲンの“グリシン反復体”三重螺旋領域を含む方法。
【請求項１１】
第１０項において、コラーゲンのＣ−末端部分は配列番号１−２により確認された方法。
【請求項１２】
第１項ないし第５項のうちいずれか一つの項において、コラーゲンの三量体化Ｃ−末端部分はコラーゲンのグリシン−反復体三重螺旋領域を持たなくてＣ−プロペプチドだけを含む方法。
【請求項１３】
第１０項ないし第１２項のうちいずれか一つの項において、コラーゲンの三量体化Ｃ−末端部分は突然変異されたりまたは欠失されたＢＭＰ−１プロテアーゼ認識配列を含むことによって融合タンパク質にプロテアーゼ分解に対する耐性を付与する方法。
【請求項１４】
第１２項または第１３項において、コラーゲンの三量体化Ｃ−末端部分は配列番号３−４により確認された方法。
【請求項１５】
第１項、第２項、第３項、第１０項ないし第１４項のうちいずれか一つの項による方法で生成されて配列番号９−１２により確認された可溶性三量体性人間ＴＮＦ−α受容体ＩＩ（ｐ７５）を含む融合タンパク質の組成物。
【請求項１６】
第１項、第２項、第３項、第１０項ないし第１４項のうちいずれか一つの項による方法で生成された融合タンパク質が配列番号１３−１６により確認された可溶性三量体性人間ＣＤ４である組成物。
【請求項１７】
第１項、第２項、第３項、第１０項ないし第１４項のうちいずれか一つの項による方法で生成された融合タンパク質の組成物が配列番号５−８により確認された可溶性三量体性可溶性人間の胎盤アルカリ性ホスファターゼである組成物。
【請求項１８】
コラーゲンのＣ−プロペプチドに結合された受容体のリガンド結合ドメインを含む３個のポリペプチド鎖を含み、ポリペプチド融合物の三量体化が生物学的活性増加をもたらす三量体化されたポリペプチド融合物。
【請求項１９】
第１５項により生成された三量体化された可溶性ＴＮＦ−α受容体ＩＩを用いてＴＮＦ−α生物学的活性を遮断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質発現方法、詳細には三量体（ｔｒｉｍｅｒｉｃ）可溶性受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のような分泌されて生物学的活性である三量体タンパク質の生成及び発現方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間のような多細胞生物において、細胞はいわゆる“信号伝達経路”により相互に疎通され、分泌されたリガンド（例えばサイトカイン、生長因子またはホルモン）はその細胞表面受容体に反応して受容体活性化をもたらす。受容体は、信号を下流に送るのに関与する細胞質ドメイン、中央トランスメンブレイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）領域、およびリガンド結合に関与する細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）で構成された膜タンパク質である。信号伝達は次のような３種の方法で実施することができる：分泌された信号の供給源及び受容体を発現する標的細胞の位置によって、周辺分泌（隣接細胞間と疎通）、自己分泌（自身との細胞疎通）及び内分泌（循環を介した遠く離れている細胞間の疎通）。遺伝子発現の活性化をはじめとする細胞膜下の一連の事件を開始させる受容体活性化に対する一般的なメカニズムの一つはサイトカインのようなポリペプチドリガンドが同種二量体（ｄｉｍｅｒ）または三量体（ｔｒｉｍｅｒ）のようなオリゴマー型で存在して、その単量体受容体が細胞外部表面に結合されれば受容体のオリゴマー化をもたらすものである。信号伝達経路は細菌またはウイルス感染のような外部損傷に反応するだけでなく正常細胞発達及び分化にも重要な役割をする。活性低下（例えばリガンドの不足）または過度な活性（例えば過剰なリガンド）のいずれかの形態である信号伝達経路の異常は関節炎、癌、ＡＩＤＳ及び糖尿病のような病理学的状態及び疾病の原因でもある。
【０００３】
これらの疾病を治療するための現在の方法のうちの一つは、リガンドを遮断するために細胞外リガンド結合ドメインだけで構成された可溶性受容体のような誘引（ｄｅｃｏｙ）受容体を用いることによって受容体の過度な活性化を克服するものである。このような戦略の最も顕著な例は、いまはアムジェン社の一部であるイミュネクス（Ｍｏｈｌｅｒなど、１９９３；Ｊａｃｏｂｓなど、１９９７）による二量体性可溶性ＴＮＦ−α受容体イミュノグロブリンＧ（ＩｇＧ）融合タンパク質であるエンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）の創製である。サイトカインのＴＮＦファミリーは感染または組織損傷に反応して体内で生じる主要な炎症誘発信号中の一つである。しかし、例えば感染や組織損傷の不在下でこれらサイトカインの非正常的生産は関節炎及び乾癬のような疾病の根本原因中の一つで明らかになった。自然的に、ＴＮＦ−α受容体は、対照的に同種三量体で存在するそのリガンド、すなわちＴＮＦ−αに結合する前に細胞表面上で単量体形態で存在する（Ｌｏｃｋｓｌｅｙなど、２００１）。したがって、ジスルフィド結合（Ｓｌｅｄｚｉｅｗｓｋｉなど、１９９２及び１９９８）を介して自然的に二量化されることができる免疫グロブリンＧ１のＦｃ領域と可溶性ＴＮＦ−α受容体の融合は二量体性可溶性ＴＮＦ−α受容体の分泌を許す（Ｍｏｈｌｅｒなど、１９９３；Ｊａｃｏｂｓなど、１９９７）。単量体性可溶性受容体と対照的に、二量体性ＴＮＦ−α受容体ＩＩ−Ｆｃ融合は同種三量体リガンドに対する親和性を顕著に増加させた。これは主要炎症誘発性サイトカインである構成的に増加されたＴＮＦ−αが重要な原因役割をする自己免疫疾病であるリウマチ性関節炎（ＲＡ）の治療においてその臨床的適用に対する分子的基礎を提供する。エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）はｐＭ範囲（ｎｇ／ｍＬ）のＫｉないしＴＮＦ−α（Ｍｏｈｌｅｒｅｍｄ、１９９３）を有することと明らかになっているが、ＲＡ患者が臨床的効果を得るためには、μg／ｍＬ水準換算で２５ｍｇの可溶性受容体皮下注射が週２回必要である（ｗｗｗ．ｅｎｂｒｅｌ．ｃｏｍ）。ＲＡ患者当たり周期的な多量のエンブレル消費は薬物供給に対する高費用だけでなく大きい苦痛をもたらして米国国内でだけ数百万の潜在的患者において薬物接近容易性を制限している。
【０００４】
強力な炎症誘発性サイトカインのＴＮＦ−αファミリー以外に、ＡＩＤＳを誘発するＨＩＶウイルスは私たちの体内のＣＤ−４陽性Ｔヘルパー細胞に入るために同種三量体性被膜タンパク質、ｇｐ１２０を利用する（Ｋｗｏｎｇなど、１９９８）。ＨＩＶ感染において最も先に生じる事件のうちの一つはｇｐ１２０がその受容体ＣＤ−４に結合されるのを含み、これはＴヘルパー細胞の細胞表面上で固有に発現される（Ｃｌａｐｈａｍなど、２００１）。単量体性可溶性ＣＤ−４は十余年間ＨＩＶ感染に対する強力な物質で明らかになったが（Ｃｌａｐｈａｍなど、１９８９）、その効能が実験室ＨＩＶ分離物にだけ限られることが明らかになるにつれ期待は薄まった（Ｄａａｒなど、１９９０）。実験室分離物とは違って、ＡＩＤＳ患者から得たＨＩＶ株はｇｐ１２０における配列変異によって単量体性可溶性ＣＤ−４に対する親和性がはるかに低いことに明かされた（Ｄａａｒなど、１９９０）。二量体性可溶性ＣＤ−４−Ｆｃ融合タンパク質が作られるが、これら誘引ＣＤ−４ＨＩＶ受容体はｇｐ１２０に対する低い親和性によって実験室でも臨床試験でもＡＩＤＳ患者から得た天然産出のＨＩＶに対しては抗ウイルス効果をほとんど示さなかった（Ｄａａｒなど、１９９０）。
【０００５】
明らかに、結合部位を完全に結合してサイトカインのＴＮＦファミリー及びＨＩＶ被膜タンパク質のような天然産出の同種三量体性リガンドに対する親和性がさらに高い、分泌された同種三量体性可溶性受容体または生物学的活性タンパク質の創製が強く要求されている。このような三量体性誘引受容体は理論的に三量体性リガンドに対して二量体性受容体に比べてはるかに高い親和性を有しなければならない。このような理性的に考案された可溶性三量体性受容体類似体は臨床的効果を顕著に向上させることができるだけでなく各患者に対する薬物注射の量または頻度を減らすことができた。免疫グロブリンＦｃのように治療的に使用可能になるように、所望する三量体性タンパク質残基は理想的には体内に多量に存在して效率的に自己三量体化できる天然分泌されたタンパク質の一部でなければならない。
【０００６】
コラーゲンは細胞外マトリックスの主要成分である繊維状タンパク質ファミリーである。これは哺乳動物で最も豊富なタンパク質であり、体内全体タンパク質のほぼ２５％を占める。コラーゲンは骨、筋、皮膚、角膜、軟骨、血液及び歯牙の形成に重要な構造的役割を担当する（Ｓｔｒｙｅｒ、１９８８）。原繊維性（ｆｉｂｒｉｌｌａｒ）形態のコラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＸＩはすべてプロコラーゲンと呼ばれる大型三量体性前駆体で合成され、数百個の“Ｇ−Ｘ−Ｙ”反復体（またはグリシン反復体）で構成される中央の連続された（ｕｎｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）三重螺旋ドメインは非コラーゲン性ドメイン（ＮＣ）、Ｎ−プロペプチド及びＣ−プロペプチドと隣接している（Ｓｔｒｙｅｒ、１９８８）。Ｃ−及びＮ−末端延長部は、非可溶性細胞マトリックスを形成する成熟タンパク質のコラーゲンフィブリル構築を誘発する事件である、プロコラーゲンの分泌時に、タンパク質分解的に処理される（Ｐｒｏｃｋｏｐなど、１９９８）。落ちたＩ形コラーゲンの三量体性Ｃ−プロペプチドは正常人の血液に１００−６００ｎｇ／ｍＬ濃度で発見され、子供がさらに多量を有しており、これは活発な骨形成を示すものである。
【０００７】
Ｉ、ＩＶ、Ｖ及びＸＩ形コラーゲンは主に２個のα−１鎖及び１個のα−２鎖で構成されたり（Ｉ、ＩＶ、Ｖ型）または３個の相異なるα鎖で構成（ＸＩ形）されて配列上相同性が高い異種三量体性（ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ）形態で構築される。ＩＩ及びＩＩＩ形コラーゲンはすべてα−１鎖の同種三量体である。最も豊富な形態のコラーゲンであるＩ形コラーゲンの場合、安定したα−１（Ｉ）同種三量体が形成され、相異なる組織で多様な量で存在する（Ａｌｖａｒｅｓなど、１９９９）。これらコラーゲンＣ−プロペプチド鎖の大部分は、細胞で単独に過発現されると、同種三量体で自己構築されることができる。Ｎ−プロペプチドドメインが先に合成されるが、三量体への分子構築はＣ−プロペプチドの登録組合（ｉｎ−ｒｅｇｉｓｔｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）により開始される。Ｃ−プロペプチド複合体は鎖内ジスルフィド結合形成により安定化されるが、好適な鎖登録のためのジスルフィド結合形成に対する必要性は明らかでない。グリシン反復体の三重螺旋は組み合わされたＣ−末端からジッパーのような方式でＮ−末端に延長される。このような知識を基礎にして再組合ＤＮＡ技術を利用して相異なるコラーゲン鎖のＣ−プロペプチドを交換することにより非天然類型のコラーゲンマトリックスを創製することに至った（Ｂｕｌｌｅｉｄなど、２００１）。サイトカイン及び生長因子のような非コラーゲン性タンパク質はプロ−コラーゲンまたは成熟コラーゲンのＮ−末端に融合されて新しいコラーゲンマトリックスを形成し、これは細胞マトリックスから非コラーゲン性タンパク質の遅い放出を許す（Ｔｏｍｉｔａなど、２００１）。しかし、上述した場合すべて、Ｃ−プロペプチドは再組合コラーゲンフィブリルが不溶性細胞マトリックスに構築される前に分解される必要がある。
【発明の開示】
【０００８】
本発明には分泌されたタンパク質で三量体性形態で製造される可溶性受容体または生物学的活性ポリペプチドが開示されている。本発明の本質はフレームのうちの可溶性受容体及び生物学的活性タンパク質を、自己三量体化されることができる原繊維性コラーゲンのＣ−プロペプチドドメインに、再組合技術を利用して融合させるものである。生成された融合タンパク質は、真核生物細胞で発現されれば、３個のＣ−プロペプチド間に形成された分子間ジスルフィド結合により共有結合的に強化された主に三量体性形態の可溶性タンパク質で分泌される。
【０００９】
本発明の一つの要旨で、
（ａ）三量体化される非コラーゲンポリペプチドにフレーム内で連結され、自己三量体化されることができるコラーゲンのＣ−末端部分にフレーム内で連結された信号ペプチド配列で構成されたオープンリーディングフレームの転写を誘導するプロモーターを含むＤＮＡ作成物を真核生物宿主細胞に導入して；
（ｂ）生理的条件下の好適な生長培地で宿主細胞を生長させて前記ＤＮＡ配列によりコード化されて三量体化された融合タンパク質の分泌を許し；また
（ｃ）分泌された三量体性融合タンパク質を宿主細胞から分離することを含む、分泌された三量体性融合タンパク質の製造方法が記載されている。
【００１０】
一つの具体例で、信号ペプチド配列は三量体化されるタンパク質の天然配列である。他の具体例で、信号ペプチド配列は三量体化されるタンパク質とは相異なる分泌されたタンパク質から得たことである。一つの具体例で、三量体化される非コラーゲンポリペプチドはリガンド結合ドメインで構成された可溶性受容体である。一つの具体例で、コラーゲンのＣ−末端部分はコラーゲンの三重螺旋領域を持たないＣ−プロペプチドである（配列番号：３−４）。異なる具体例で、Ｃ−末端コラーゲンは三量体化される非コラーゲン性タンパク質に対するリンカーでコラーゲンの三重螺旋領域の一部で構成される（配列番号：１−２）。異なる具体例で、コラーゲンのＣ−末端部分は突然変異されたまたは欠失されたＢＭＰ−１プロテアーゼ認識部位（配列番号：３−４）である。
【００１１】
本発明の一つの要旨で、
（ａ）三量体化される非コラーゲンポリペプチドにフレーム内で連結され、自己三量体化されることができて、プロ．α．１（Ｉ）、プロ．α．２（Ｉ）、プロ．α．１（ＩＩ）、プロ．α．１（ＩＩＩ）、プロ．α．１（Ｖ）、プロ．α．２（Ｖ）、プロ．α．１（ＸＩ）、プロ．α．２（ＸＩ）及びプロ．α．３（ＸＩ）から選択されるコラーゲンのＣ−末端部分にフレーム内で連結された信号ペプチド配列で構成されたオープンリーディングフレームの転写を誘導するプロモーターを含むＤＮＡ作成物を真核生物宿主細胞に導入して；
（ｂ）生理的条件下の好適な生長培地で宿主細胞を生長させて前記ＤＮＡ配列によりコード化されて三量体化された融合タンパク質の分泌を許し；また
（ｃ）分泌された三量体性融合タンパク質を宿主細胞から分離することを含む、分泌された三量体性融合タンパク質の製造方法が記載されている。
望ましい具体例で、三量体化される非コラーゲンポリペプチドは可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ（ｐ７５）（配列番号：９−１２）である。他の望ましい具体例で、三量体化される非コラーゲンポリペプチドはＨＩＶの共同受容体である可溶性ＣＤ−４（配列番号：１３−１６）である。他の望ましい具体例で、三量体化される非コラーゲンポリペプチドは胎盤分泌されたアルカリ性ホスファターゼである（配列番号：５−８）。
【００１２】
本発明の一介具体例で、
（ａ）三量体化される非コラーゲンポリペプチドにフレーム内で連結され、自己三量体化されることができて、プロ．α．１（Ｉ）、プロ．α．２（Ｉ）、プロ．α．１（ＩＩ）、プロ．α．１（ＩＩＩ）、プロ．α．１（Ｖ）、プロ．α．２（Ｖ）、プロ．α．１（ＸＩ）、プロ．α．２（ＸＩ）及びプロ．α．３（ＸＩ）から選択されるコラーゲンのＣ−末端部分にフレーム内で連結された信号ペプチド配列で構成されたオープンリーディングフレームの転写を誘導するプロモーターを含む第１ＤＮＡ作成物を真核生物宿主細胞に導入して；
（ｂ）三量体化される第２非コラーゲンポリペプチドにフレーム内で連結され、自己三量体化されることができて、プロ．α．１（Ｉ）、プロ．α．２（Ｉ）、プロ．α．１（ＩＩ）、プロ．α．１（ＩＩＩ）、プロ．α．１（Ｖ）、プロ．α．２（Ｖ）、プロ．α．１（ＸＩ）、プロ．α．２（ＸＩ）及びプロ．α．３（ＸＩ）から選択されるコラーゲンの第２Ｃ−末端部分に、フレーム内で連結された信号ペプチド配列で構成されたオープンリーディングフレームの転写を誘導するプロモーターを含む第２ＤＮＡ作成物を真核生物宿主細胞に導入して；
（ｃ）生理的条件下の好適な生長培地で宿主細胞を生長させて前記第１及び第２ＤＮＡ配列によりコード化されて三量体化された融合タンパク質の分泌を許し；また
（ｄ）分泌された三量体性融合タンパク質を宿主細胞から分離することを含む分泌された三量体性融合タンパク質の製造方法が記載されている。
【００１３】
本発明の一介具体例で、
（ａ）三量体化される非コラーゲンポリペプチドにフレーム内で連結され、自己三量体化されることができて、プロ．α．１（Ｉ）、プロ．α．２（Ｉ）、プロ．α．１（ＩＩ）、プロ．α．１（ＩＩＩ）、プロ．α．１（Ｖ）、プロ．α．２（Ｖ）、プロ．α．１（ＸＩ）、プロ．α．２（ＸＩ）及びプロ．α．３（ＸＩ）から選択されるコラーゲンのＣ−末端部分にフレーム内で連結された信号ペプチド配列で構成されたオープンリーディングフレームの転写を誘導するプロモーターを含む第１ＤＮＡ作成物を真核生物宿主細胞に導入して；
（ｂ）三量体化される第２非コラーゲンポリペプチドにフレーム内で連結され、自己三量体化されることができて、プロ．α．１（Ｉ）、プロ．α．２（Ｉ）、プロ．α．１（ＩＩ）、プロ．α．１（ＩＩＩ）、プロ．α．１（Ｖ）、プロ．α．２（Ｖ）、プロ．α．１（ＸＩ）、プロ．α．２（ＸＩ）及びプロ．α．３（ＸＩ）から選択されるコラーゲンの第２Ｃ−末端部分にフレーム内で連結された信号ペプチド配列で構成されたオープンリーディングフレームの転写を誘導するプロモーターを含む第２ＤＮＡ作成物を真核生物宿主細胞に導入して；
（ｃ）三量体化される第３非コラーゲンポリペプチドに、フレーム内で連結され、自己三量体化されることができて、プロ．α．１（Ｉ）、プロ．α．２（Ｉ）、プロ．α．１（ＩＩ）、プロ．α．１（ＩＩＩ）、プロ．α．１（Ｖ）、プロ．α．２（Ｖ）、プロ．α．１（ＸＩ）、プロ．α．２（ＸＩ）及びプロ．α．３（ＸＩ）から選択されるコラーゲンの第３Ｃ−末端部分にフレーム内で連結された信号ペプチド配列で構成されたオープンリーディングフレームの転写を誘導するプロモーターを含む第３ＤＮＡ作成物を真核生物宿主細胞に導入して；
（ｄ）生理的条件下の好適な生長培地で宿主細胞を生長させて前記第１及び第２ＤＮＡ配列によりコード化されて三量体化された融合タンパク質の分泌を許し；また
（ｅ）分泌された三量体性融合タンパク質を宿主細胞から分離することを含む分泌された三量体性融合タンパク質の製造方法が記載されている。
【００１４】
本発明の利点は次のようである：（１）コラーゲンは哺乳動物の体内で分泌される最も豊富なタンパク質で、体内の全体タンパク質のほぼ２５％を占める；（２）コラーゲンの主要形態は天然で三量体螺旋で生じて、これらの球形Ｃ−プロペプチドは三量体化開始に関与して；（３）成熟コラーゲンからタンパク質分解的に放出されたコラーゲンの三量体性Ｃ−プロペプチドは哺乳類の血液でマイクログラム／ｍＬ以下の量で天然に発見されて体内に毒性は知られていないで；（４）一定な三重螺旋領域は残基当たり２．９Åスペースを有するリンカーで含まれることができたり、三量体化されるタンパク質とコラーゲンのＣ−プロペプチド間の距離が最適の生物学的活性を達成するように調整されることができて；（５）プロコラーゲンのＣ−プロペプチドを切断するＢＭＰＩの認識部位は突然変異されたりまたは欠失されて三量体性融合タンパク質の破壊を防止し；（６）Ｃ−プロペプチドドメインは普遍的な親和性タグを提供するので、本発明によって創製された分泌された融合タンパク質の精製のために使われることができる。
【００１５】
分泌された二量体性融合タンパク質が創製されることができるＦｃタグ技術（Ｓｌｅｄｚｉｅｗｓｋｉなど、１９９２及び１９９８）と対照的に、本明細書に記載された発明は初めて可溶性三量体性融合タンパク質の創製と分泌を可能にする。同種三量体が三重対称であって同種二量体は二重対称であることを考慮する時、２個の明らかな構造的形態は理論的には決して完全に重なることができない（図１）。したがって、同種二量体性可溶性ＴＮＦ−Ｒ−Ｆｃ（例えばエンブレル）だけでなく可溶性ＣＤ４−Ｆｃ融合タンパク質も相応する同種三量体性リガンドＴＮＦ−α及びＨＩＶ  ｇｐ１２０それぞれに結合する最適のインターフェースを有することができないことである。対照的に、本発明によって創製された同種三量体性可溶性ＴＮＦ受容体及びＣＤ４は三価であって構造的に相応する同種三量体性リガンドに対して完全に結合することができる可能性を有する。したがって、これら三量体性可溶性受容体類似体はこれらの三量体性リガンドの生物学的活性を中和させるのにさらに効果的であることができる。本発明により、本発明の望ましい具体例に記載された三量体性可溶性ＴＮＦ−Ｒ及びＣＤ４のようなさらに効果的だが値はさらに低廉な薬物を容易にまた関節炎及びＡＩＤＳのような衰弱させる疾病を撲滅するために理性的に考案されることができる。三量体性可溶性ｇｐ１２０は本発明によって創製されることができて、ＨＩＶウイルスで発見される天然の三量体性ｇｐ１２０被膜タンパク質複合体をさらによく摸倣することができて以前に使われた非三量体性ｇｐ１２０と比較してはるかに効果的なワクチンで使われることができる。三量体性形態のキメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を本発明によって製造することができて、その抗原の中和で著しく増加された抗体親和力を与えることができた。
[配列目録の簡単な説明]
配列番号１：（９６３塩基）
Ｃ−プロペプチド人間コラーゲンα（Ｉ）Ｔ０構造物をコード化するヌクレオチド配列。このｃＤＮＡ作成物をｐＡＰｔａｇ２ベクターにクローニングしてＡＰコーディング領域を置換した。アンダーラインを引いた配列は相応するｐＴＲＩＭＥＲベクター作成時使われた制限酵素部位を意味する。濃く表示されたコドンはＴ０コーディング領域の開始及び終止コドンを意味する。
【００１６】
配列番号２：（３１１アミノ酸）
人間コラーゲンα（Ｉ）の予想されたＣ−プロペプチドＴ０タンパク質配列。アンダーラインを引いた配列はＣ−プロペプチドの“グリシン反復体”上流領域を意味する。赤色で表示されたアミノ酸配列はＢＭＰ−１プロテアーゼ認識部位を示す。
【００１７】
配列番号３：（７７１塩基）
人間コラーゲンα（Ｉ）Ｔ２作成物のＣ−プロペプチドをコード化するヌクレオチド配列。このｃＤＮＡをｐＡＰｔａｇ２ベクターにクローニングしてＡＰコーディング領域を置換した。アンダーラインを引いた配列は相応するｐＴＲＩＭＥＲベクター作成時使われた制限酵素部位を意味する。濃く表示されたコドンはＴ２コーディング領域の開始及び終止コドンを意味する。
【００１８】
配列番号４：（２４７アミノ酸）
人間コラーゲンα（Ｉ）の予想されたＣ−プロペプチドＴ２タンパク質配列。赤色で表示されたアミノ酸配列はＢＭＰ−１プロテアーゼ認識部位を示す。
【００１９】
配列番号５：（２４８７塩基）
人間α（Ｉ）コラーゲン（ＡＰ−Ｔ０）のＴ０  Ｃ−プロペプチドに融合された人間の胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）をコード化するヌクレオチド配列。アンダーラインを引いた配列はこの融合物作成に使われた制限部位を示す。配列の中央に示した融合部位を表示した制限部位はＢｇｌ  ＩＩである。
【００２０】
配列番号６：（８１９アミノ酸）
ＡＰ−Ｔ０融合タンパク質の予想されたタンパク質配列。青色で表示したアミノ酸残基は人間の胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）とα（Ｉ）コラーゲンＴ０ポリペプチド間の融合部位を示す。濃い色で表示したコドンは融合タンパク質の開始及び終止コドンを意味する。アンダーラインを引いた配列は人間α（Ｉ）コラーゲンのＣ−プロペプチドの“グリシン反復体”上流領域を意味する。赤色で表示したアミノ酸残基はＢＭＰ−１プロテアーゼ認識配列を意味する。
【００２１】
配列番号７：（２２９４塩基）
人間α（Ｉ）コラーゲン（ＡＰ−Ｔ２）のＴ２  Ｃ−プロペプチドに融合された人間の胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）をコード化するヌクレオチド配列。アンダーラインを引いた配列はこの融合物作成に使われた制限部位を示す。配列の中央に示した融合部位を表示した制限部位はＢｇｌ  ＩＩである。
【００２２】
配列番号８：（７５５アミノ酸）
ＡＰ−Ｔ２融合タンパク質の予想されたタンパク質配列。青色で表示したアミノ酸残基は人間の胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）とα（Ｉ）コラーゲンＴ２ポリペプチド間の融合部位を示す。赤色で表示したアミノ酸残基はＢＭＰ−１プロテアーゼ認識配列の位置を示す。
【００２３】
配列番号９：（１７３４塩基）
人間α（Ｉ）コラーゲン（ｓＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｔ０）のＴ０  Ｃ−プロペプチドに融合された人間の胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）をコード化するヌクレオチド配列。濃い色で表示した配列は融合タンパク質作成時に使われた制限部位を意味する。配列の中央に示した融合部位に示したアンダーラインを引いた配列はＢａｍＨＩ／Ｂｇｌ  ＩＩ結紮部である。
【００２４】
配列番号１０：（５６６アミノ酸）
人間可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｔ０融合物の予想されたタンパク質配列。青色で表示したアミノ酸残基は人間可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩとα（Ｉ）コラーゲンＴ０ポリペプチド間の融合部位を示す。アンダーラインを引いた配列は人間α（Ｉ）コラーゲンのＣ−プロペプチドの“グリシン反復体”上流領域を意味する。赤色で表示したアミノ酸残基はＢＭＰ−１プロテアーゼ認識配列を意味する。
【００２５】
配列番号１１：（１５４２塩基）
人間α（Ｉ）コラーゲン（ｓＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｔ２）のＴ２  Ｃ−プロペプチドに融合された人間可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩをコード化するヌクレオチド配列。濃い色で表示したコドンは融合タンパク質の開始及び終止コドンを意味する。配列の中央に示した融合部位を表示したアンダーラインを引いた配列はＢａｍＨＩ／Ｂｇｌ  ＩＩ結紮部である。
【００２６】
配列番号１２：（５０２アミノ酸）
人間可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｔ２融合物の予想されたタンパク質配列。青色で表示したアミノ酸残基は人間可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩとα（Ｉ）コラーゲンＴ２ポリペプチド間の融合部位を示す。赤色で表示したアミノ酸残基はＢＭＰ−１プロテアーゼ認識配列を意味する。
【００２７】
配列番号１３：（２１３９塩基）
人間α（Ｉ）コラーゲンのＴ０  Ｃ−プロペプチドに融合された人間可溶性ＣＤ４をコード化するヌクレオチド配列。アンダーラインを引いた配列は融合物作成に使われた制限部位を意味する。配列の中央に示した融合部位を表示したアンダーラインを引いた配列はＢｇｌ  ＩＩ部位である。
【００２８】
配列番号１４：（６９９アミノ酸）
人間可溶性ＣＤ４−Ｔ０融合物の予想されたタンパク質配列。青色で表示したアミノ酸残基は人間可溶性ＣＤ４とα（Ｉ）コラーゲンＴ０ポリペプチド間の融合部位を示す。アンダーラインを引いた配列は人間α（Ｉ）コラーゲンのＣ−プロペプチドの“グリシン反復体”上流領域を意味する。赤色で表示したアミノ酸残基はＢＭＰ−１プロテアーゼ認識配列を意味する。
【００２９】
配列番号１５：（１９４７塩基）
人間α（Ｉ）コラーゲンのＴ２  Ｃ−プロペプチドに融合された人間可溶性ＣＤ４をコード化するヌクレオチド配列。アンダーラインを引いた配列は融合物作成に使われた制限部位を意味する。配列の中央に示した融合部位を表示したアンダーラインを引いた配列はＢｇｌ  ＩＩ部位である。
【００３０】
配列番号１６：（６３５アミノ酸）
人間可溶性ＣＤ４−Ｔ２融合物の予想されたタンパク質配列。青色で表示したアミノ酸残基は人間可溶性ＣＤ４とα（Ｉ）コラーゲンＴ２ポリペプチド間の融合部位を示す。赤色で表示したアミノ酸残基はＢＭＰ−１プロテアーゼ認識配列を意味する。
【発明の詳細な説明】
【００３１】
本発明を説明する前に、本発明で用いられる特定用語の定義に対して説明することが理解に助けになることである。
【００３２】
ＤＮＡ作成物：一般的にプラスミドまたはウイルス性ベクター形態であり、天然的には存在しない方式で結合したＤＮＡ切片を含むように再組合ＤＮＡ技術を介して改変された単一鎖または二重鎖のＤＮＡ分子。ＤＮＡ作成物は目的する暗号化するタンパク質の発現及び／または分離を指示するのに必要な情報を含む。
【００３３】
信号ペプチド配列：細胞から成熟ポリペプチドまたはタンパク質の分泌を指示する作用をするアミノ酸配列。信号ペプチドは疎水性アミノ酸のコアを有することを特徴として細胞表面に分泌されたり固着される新しく合成されたタンパク質のアミノ末端で典型的に発見される。信号ペプチドは分泌する間成熟タンパク質から切断される。このような信号ペプチドはタンパク質分泌経路を通過するによって成熟タンパク質から信号ペプチドの分解を許す加工部位を含む。信号ペプチド配列は信号ペプチドなしに他のタンパク質のアミノ末端に連結されれば融合タンパク質の分泌を指示することができる。生長因子、ペプチドホルモン、サイトカイン、及び細胞表面受容体をはじめとする膜タンパク質のような大部分の分泌タンパク質は初期タンパク質で合成される時信号ペプチド配列を含む。
【００３４】
可溶性受容体：リガンドと結合することができる細胞表面受容体の一部または全部の細胞外ドメイン。一般的に、これは膜固定に必要な内部の疎水性アミノ酸配列を含まない。
【００３５】
コラーゲンのＣ−プロペプチド：三量体で自己構築されることができるコラーゲンのＣ−末端の球形であり非三重螺旋ドメイン。コラーゲンの三重螺旋領域と対照的に、Ｃ−プロペプチドはグリシン反復配列を含まないしまたコラーゲンフィブリル形成以前にコラーゲン分泌される時プロコラーゲン前駆体からタンパク質分解的に除去される。
【００３６】
グリシン反復体：アミノ酸配列に数百個の（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ反復体を含むコラーゲンの中央線形三重螺旋形成領域。これら反復体はＸ及び／またはＹ位置でプロリンが豊富である。Ｎ−及びＣ−プロペプチドを除去すれば、グリシン−反復体含有コラーゲン三重螺旋は高次元の不溶性コラーゲンフィブリルで構築されることができ、これは細胞マトリックスの主要成分を形成する。
【００３７】
ｃＤＮＡ：相補的ＤＮＡ、またはｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列。一般的にｃＤＮＡ配列はイントロン（非タンパク質コーディング）配列を含まない。
【００３８】
本発明以前のほとんどすべての治療抗体及びエンブレルのような可溶性受容体Ｆｃ融合タンパク質は二量体構造である（図１）。これら分子は、単量体対応物と比較する時、増加された親和性を有する標的抗原またはリガンドに結合されることと明らかになっているが、これらは構造的制限（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）によって、同種三量体性構造を有するこれらの標的に不完全に結合する。このような治療的に重要な三量体リガンドの例はサイトカインのｇｐ１２０  ＴＮＦファミリー及びＨＩＶ被膜タンパク質を含む。したがって、構造的観点で、標的三量体性リガンドまたは抗原に完全に結合することができる三量体性可溶性受容体または抗体を生成することができて（図１）、したがってそのリガンド作用を完全に遮断することが望ましいことである。このような三量体性可溶性受容体またはキメラ抗体は標的に対して最も高い親和性を有することと予想されるので、関節炎及びＡＩＤＳのような疾病を治療するのにさらに效果的に使われることができる。
【００３９】
本発明は三量体で自己構築されることができるコラーゲンのＣ−プロペプチドに融合させることにより、分泌された三量体性受容体及び生物学的活性タンパク質を生成する方法を開示する。本発明の利点は次のようである：（１）コラーゲンは体内で分泌された最も豊富なタンパク質で、体内全体タンパク質のほとんど２５％を占める；（２）コラーゲンの主要形態は天然で三量体螺旋で生じて、これらの球形Ｃ−プロペプチドは三量体化開始に関与して、三重螺旋形成時タンパク質分解的に分解されて；（３）可溶性三量体性Ｃ−プロペプチドは哺乳類の血液でマイクログラム／ｍＬ以下の量で天然に発見されて；（４）一定な三重螺旋領域はリンカーで含まれたり融合タンパク質の一部で除外されるので、三量体化されるタンパク質とコラーゲンのＣ−プロペプチド間の距離は最適の生物学的活性を達成するように調整されることができて；（５）プロコラーゲンのＣ−プロペプチドを切断するＢＭＰＩの認識部位は突然変異されたりまたは欠失されて三量体性融合タンパク質の破壊を防止し；（６）Ｃ−プロペプチドドメインは普遍的な親和性タグを提供するので、本発明によって創製された分泌された融合タンパク質の精製のために使われることができて；（７）自身の細胞表面受容体に結合されることのような他の生物学的作用を有することと公知されたＩｇＧ１  Ｆｃタグとは違って、コラーゲンのＣ−プロペプチドの公知された生物学的作用は隣接プロコラーゲンの三量体化を開始してまた不溶性細胞マトリックスに構築される前に溶解性プロコラーゲン三量体を維持することができることである。コラーゲンのＣ−プロペプチドのこのような独特の特性は固有な三量体化タグが毒性または免疫原性を持たないことを示唆するため、治療用のための理想的な候補になることができる。
【００４０】
分泌された三量体融合タンパク質の製造容易性を示すために、一部グリシン−反復三重螺旋領域（Ｔ０作成物、配列番号１−２）または突然変異されたＢＭＰ−１認識部位を有する非−グリシン反復体（Ｔ２作成物、配列番号３−４）を含む人間α１（Ｉ）の全体Ｃ−プロペプチドをコード化するｃＤＮＡ配列はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から購入したＥＳＴクローンを用いてＲＴ−ＰＣＲにより増幅させた。増幅されたｃＤＮＡはＢｇｌ  ＩＩ−ＸｂａＩ断片としてｐＡＰｔａｇ２哺乳動物発現ベクター（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒコポーレーション製造；Ｌｅｄｅｒなど、１９９６及び１９９８）にそれぞれクローニングされてＡＰコーディング領域を置換した（図２）。生成したベクターをｐＴＲＩＭＥＲ、バージョンＴ２及びＴ０と称する。このベクターは、固有なＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＢｇｌ  ＩＩ部位で、可溶性受容体または生物学的活性タンパク質をコード化するｃＤＮＡ鋳型の便利なフレーム内融合を許す。このような融合タンパク質は天然プロ−コラーゲンと同様にＣ末端に位置したコラーゲン三量体化タグを有する。
【００４１】
図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは従来の二量体性免疫グロブリンＦｃ融合と比較した本発明による方法の概略図である。
【００４２】
図１Ａは側面上昇図であって、図１Ｂは上面図であって、図示したようにリガンド無しまたはリガンド結合された形態のアムジェン社のエンブレルのような同種二量体性可溶性ｓＴＮＦ  ＲＩＩ受容体−Ｆｃ融合の構造的特徴を図示する。
【００４３】
１でラベリングされたドメインは可溶性ＴＮＡ−ＲＩＩを意味する。Ｆｃ（鎖内ジスルフィド結合（３）と共に２でラベリングされる）融合タンパク質は二量体構造である。二重対称を考慮する時、二量体性Ｆｃ融合タンパク質は二価であるので、理論的に三重対称を有するＴＮＦ−α（４でラベリングされる）のような同種三量体性リガンドに結合される最適構造を有しない。
【００４４】
図１Ｃは側面上昇図であってまた図１Ｄは上面図であって、三量体性可溶性ｓＴＮＦ  ＲＩＩ受容体−Ｃ−プロペプチド融合の構造的特徴を図示する。三重対称を考慮する時、ｓＴＮＦ  ＲＩＩ−三量体融合タンパク質は三価構造であるので、三量体性リガンドＴＮＦ−αに完全に結合することができる。自己三量体化されることができるコラーゲンのＣ−プロペプチドは鎖間ジスルフィド結合（３）によりラベリング（５）されている。
【００４５】
図２Ａ及び図２Ｂは分泌された三量体性融合タンパク質を製造するためのｐＴＲＩＭＥＲプラスミドベクターの構造を図示する。可溶性受容体−または生物学的活性ポリペプチド−コーディングｃＤＮＡは固有なＨｉｎｄ  ＩＩＩまたはＢｇｌ  ＩＩ部位にクローニングされて、三量体化のためのＣ−プロペプチド配列を含むα（Ｉ）コラーゲンに対してＣ−末端でフレーム内融合を許す。図２Ａ：ｐＴＲＩＭＥＲ（Ｔ０）構造物はＣ−プロペプチドのグリシン−反復体（ＧＸＹ）ｎ上流の一部を含む。図２Ｂ：ｐＴＲＩＭＥＲ（Ｔ２）は成熟したＢＭＰ−１プロテアーゼ認識部位を有するＣ−プロペプチドドメインだけを含む。
【００４６】
図３Ａ及び図３Ｂはジスルフィド結合で連結した三量体化コラーゲン融合タンパク質の発現及び分泌を図示する。
【００４７】
図３Ａはα（Ｉ）コラーゲンのＣ−プロペプチドに融合される時の人間の胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）の三量体化のウエスタンブロット分析である。ｐＴＲＩＭＥＲベクターでＡＰ単独またはＡＰ−Ｃ−プロペプチド融合をコード化する発現ベクターは一時的にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質感染される。４８時間後、指示されたような各形質感染された細胞の調節培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）（２０μＬ）を、還元剤（メルカプトエタノール）を含んだり含まない同じ体積２ＸＳＤＳサンプル緩衝液中で５分間沸かして、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離させた次に多重クローン抗体を用いてＡＰ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒコポーレーション製造）にウエスタンブロットにより分析する。分泌された６７  ｋＤａ  ＡＰ単独は分子間ジスルフィド結合を形成しない反面、分泌されたＡＰ−Ｔ０及びＡＰ−Ｔ２はジスルフィド結合で連結した三量体で效果的に構築される。
【００４８】
図３Ｂ．α（Ｉ）コラーゲンのＣ−プロペプチドに融合される時の人間の可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩの三量体化のウエスタンブロット分析。ｐＴＲＩＭＥＲベクターに表示されたようなＡＰ−Ｃ−プロペプチド融合（Ｔ２）（抗体特異性に対する陰性対照用）または人間可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｃ−プロペプチドを一時的にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質感染させる。４８時間後、指示されたような各形質感染された細胞の調節培地（２０μＬ）を、還元剤（メルカプトエタノール）を含んだり含まない同じ体積２ＸＳＤＳサンプル緩衝液中で５分間沸かして、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離させた次に人間ＴＮＦ−ＲＩＩ（クローン２２６、Ｒ  ＆  Ｄシーステムズインコーポレイテッド製造）に対する単一クローン抗体を用いてウエスタンブロットにより分析する。単一クローン抗体はジスルフィド結合を有する分泌されたＴＮＦ−ＲＩＩだけを認識することができる。可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｔ０及びＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｔ２融合はジスルフィド結合連結した三量体で效果的に構築される。
【００４９】
図４及び図５は人間ＴＮＦ−α媒介された細胞自殺に対する三量体性可溶性人間ＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｃプロペプチド融合タンパク質の強力な中和活性を示すバイオアッセイを図示する。
【００５０】
図４．ＴＮＦ−α敏感性ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中に１百万細胞／ｍＬで懸濁させた。１００μＬの細胞懸濁液を９６−ウェルマイクロタイタープレート内のウェルにプレーティングした。各ウェルに５００ｎｇ／ｍＬの濃度でアクチノマイシンＤを付加した次に三量体化可溶性人間ＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｔ２の存在下でまたは不在下で人間ＴＮＦ−αを５００ｐｇ／ｍｌ（Ｒ  ＆  Ｄシーステムズ製造）濃度で付加した。陰性対照用として、三量体性ＡＰ−Ｔ２をＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｔ２の代わりに付加した。組織培養培養器で１６時間の間培養した後、細胞の生存性は２０Ｘ倍率の反転顕微鏡または各ウェルに１０％（ｖ／ｖ）付加した細胞生存能指示剤染料、アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．）を用いて調査した。生存細胞は染料色を青色からピンク色へ変更することができる。三量体性可溶性人間ＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｔ２は強力な中和活性を示す反面ＴＮＦ−αはＴＮＦ−α媒介された細胞自殺から細胞を保護する。
【００５１】
図５．人間ＴＮＦ−αに対する三量体性可溶性人間ＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｔ２の中和活性の定量分析。この実験は図４Ａでのように実施した。アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）染料を付加して２時間後、各ウェルから指示されたような培養培地をＯＤ５７５で分析した。ＴＮＦ−αが付加されないウェル（１００％生存率）または中和剤なしにＴＮＦ−αが付加された（０％生存率）ウェルに対して判読を規準化した。
【実施例１】
【００５２】
本発明の実現可能性を示すために、天然の信号ペプチド配列をはじめとする人間の分泌された胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）をコード化するｃＤＮＡをｐＡＰｔａｇ４ベクター（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒコポーレーション；Ｌｅｄｅｒなど、１９９６及び１９９８）からＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｂｇｌ  ＩＩ断片に切断してｐＴＲＩＭＥＲ−Ｔ０及びｐＴＲＩＭＥＲ−Ｔ２ベクターの相応する部位にクローニングした。生成したＡＰ−コラーゲン融合作成物（配列番号５−８）は形質感染後ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒコポーレーション製造）で発現させた。ＡＰ−コラーゲン融合タンパク質の成功的な分泌は形質感染された細胞の調節培地を用いたＡＰ活性分析により容易に決定されることができる。形質感染された２日後ＡＰ活性は約１単位体／ｍＬ（または約１μg／ｍＬの融合タンパク質に相応）に到達した。融合タンパク質を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を得るために、ピューロマイシン−耐性ベクター、ｐＢａｂｅ−Ｐｕｒｏ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒコポーレーション製造）と共同感染後安定したクローンを選択した。ＡＰ活性を発現するクローンを生長させて融合タンパク質の長期間生産のために保存した。
【００５３】
ＡＰ−コラーゲン融合タンパク質がジスルフィド結合−連結三量体で構築されるのか決定するために、ＡＰ単独またはＡＰ−Ｔ０及びＡＰ−Ｔ２融合物を含む調節培地をβ−メルカプトエタノールを有しなかったり（非還元）または有する（還元）ＳＤＳサンプル緩衝液で沸かして抗−ＡＰ多重クローン抗体（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒコポーレーション製造）を用いてウエスタンブロットにより分析した。融合のないＡＰ単独は非還元及び還元条件下ですべて６７  ｋＤａバンドで現われて、これは分子間ジスルフィド結合の不足が予想されることと一致した（図３Ａ）。対照的に、分泌されたＡＰ−Ｔ０及びＡＰ−Ｔ２融合タンパク質は、還元条件下（９０−１００  ｋＤａ）と比較して、非還元条件下で３倍さらに大きい（約３００  ｋＤａ）ことに明らかになっており、これは両側融合タンパク質が完全に同種三量体で構築されることを示す（図３Ａ）。この結果は本発明の概念を実施するようにさせる。
【実施例２】
【００５４】
新しくて治療的に有効な生物学的作用が三量体性融合タンパク質により与えられることができることを証拠を提供するために、ＡＴＣＣから購入した相応するＥＳＴクローンを用いて三量体性人間可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ（ｐ７５）受容体を作成した。実施形態１に記載したように、全体リガンド結合領域は含むがトランスメンブレインドメインを含まない人間ＴＮＦ−ＲＩＩのＮ−末端領域をＢａｍＨＩ断片としてｐＴＲＩＭＥＲ−Ｔ０及びｐＴＲＩＭＥＲ−Ｔ２ベクター（配列番号９−１２）のＢｇｌ  ＩＩ部位にクローニングした。生成した融合作成物は形質感染後ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現された。実施形態１に記載したようにピューロマイシン共同選択により安定したクローンを得た。非還元及び還元条件下でウエスタンブロット分析を実施して、生成した可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ−コラーゲン融合タンパク質が実際に発現されて、分泌されて三量体形態で構築されたのかを決定した。予想したように、人間ＴＮＦ−ＲＩＩに対する単一クローン抗体（Ｒ  ＆  Ｄシーステムズインコーポレイテッドから入手したクローン２２）はＴ０及びＴ２融合ベクターにより２２０−２４０  ｋＤａバンドで発現された三量体性可溶性ＴＮＦ−融合タンパク質を明確に認識し、これは相応する単量体性融合タンパク質より約３倍以上さらに大きい（図３Ｂ）。ＴＮＦ−ＲＩＩ抗体は還元条件下で単量体性融合タンパク質を検出することができなく、これは抗体製造者により特定された特性と一致することである。抗体特異性に対する陰性対照用として、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞単独またはＡＰ−Ｔ２融合タンパク質を発現する細胞どれもＴＮＦ−ＲＩＩを発現しなかった（図３Ｂ）。
【００５５】
三量体性可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ受容体が三量体性リガンドＴＮＦ−αの強力な抑制剤なのかを決定するために、前で実質的に記載されたような（Ｍｏｈｌｅｒなど、１９９３）サイトカイン敏感性細胞株ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ（ＡＴＣＣ）を用いてＴＮＦ−αバイオアッセイ（ｂｉｏａｓｓａｙ）を実施した。図４に図示した結果は三量体性可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｃ−プロペプチド融合タンパク質がアクチノマイシンＤ（５００ｎｇ／ｍＬ）（シグマ製造）の存在下でＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞のＴＮＦ−αに媒介された細胞自殺を強く中和させることを明確に示した。人間ＴＮＦ−α（Ｒ  ＆  Ｄシーステムズ製造）が０．５ｎｇ／ｍＬで使われると、三量体性可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｔ２（無血清培地からまたは精製された形態）は約２ｎｇ／ｍＬまたは８ｘ１０−１２Ｍ（同種三量体で２４０  ｋＤａ分子量推定）の見かけＫｉ−５０（５０％抑制）を有した。ＴＮＦ−αに対する親和性は単量体性ＴＮＦ−ＲＩＩより４倍以上でありエンブレル（Ｍｏｈｌｅｒなど、１９９３）のような二量体性可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｆｃ融合物より１０−１００倍以上さらに高かった。
【００５６】
この重要な実施形態は本発明が治療用途を有することができる新規生物学的特性を有する三量体性融合タンパク質を作ることができるということを証明する。このような可溶性三量体性人間ＴＮＦ受容体は、ＲＡのような自動免疫疾病を治療するために市販される現在の二量体性可溶性ＴＮＦ受容体（例えばエンブレル）よりはるかに効果的に見える。三量体性ＴＮＦ受容体の顕著に増加された能力は各患者に毎週注射しなければならないＴＮＦ阻害薬の量を顕著に減少させることができながら、治療を改善させてまた患者の費用を顕著に減少させることができる。三量体性ＴＮＦ受容体の向上した能力は現在米国で約１００、０００名の患者治療要求だけを充足させることができる二量体性ＴＮＦ受容体生産での停滞（ボトルネック）問題を軽減させることである。
【実施例３】
【００５７】
ＡＩＤＳの原因であるＨＩＶウイルスは私たちの体内のＴリンパ球の特殊な系統を主に感染して破壊する。いわゆるＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＩＶの受容体であるＣＤ４と呼ばれる細胞表面タンパク質を発現する。ＨＩＶはＣＤ４に結合されるウイルス性被膜タンパク質ｇｐ１２０を有するＣＤ４＋細胞を認識する。明確に、ｇｐ１２０はウイルス表面上で巨大な同種三量体複合体で存在する反面、ＣＤ４は細胞表面上で単量体で存在する。ＨＩＶ感染に対する現在のモデルはＨＩＶをＣＤ４＋Ｔ細胞に完全に結合させ、ｇｐ１２０のすべての３個サブユニットがＣＤ４にそれぞれ結合すれば、ウイルスＲＮＡが細胞に入るために必要である。明確に、ＨＩＶ感染を中止するための直接的な戦略中の一つはウイルスを遮る（ｂｌｉｎｄ）ために可溶性ＣＤ４を用いることである。実際に、単量体性溶解性ＣＤ４及びＣＤ４−Ｆｃ融合物を用いるこのような方法は実験室分離物のＨＩＶ感染を中止させることに非常に効果的なことに明らかになった（Ｃｌａｐｈａｍなど、１９８９；Ｄａａｒなど、１９９０）。不幸にも、これら可溶性ＣＤ４は、単量体性及び二量体性可溶性ＣＤ４に対する親和性を低下させるｇｐ１２０のアミノ酸配列変形によって、ＡＩＤＳ患者で発見されたＨＩＶウイルス株感染を中止させることには効果が少なかった（Ｄａａｒなど、１９９０）。
【００５８】
ＨＩＶウイルスに対するｇｐ１２０変異体に対する可溶性ＣＤ４の親和性を顕著に増加させるために、理想的に可溶性ＣＤ４は三量体リガンドであるｇｐ１２０同種三量体と完全に結合するように三量体形態でなければならない。ＡＩＤＳ治療の主要問題中の一つはウイルスゲノムの突然変異率が非常に高くて耐薬品性をもたらす点である。したがって、ＨＩＶ逆転写酵素（例えばＡＺＴ）及びプロテアーゼのようなウイルス遺伝子を直接標的にする薬物はウイルス突然変異の結果によって效果がないと考えられる。対照的に、いくら突然変異されるにしても、ＨＩＶウイルスは細胞ＣＤ４受容体と反応して感染を開始する。したがって、高親和性可溶性ＣＤ４三量体は、ｇｐ１２０遺伝子でウイルス突然変異が三量体性可溶性ＣＤ４だけでなく細胞上のＣＤ４にも結合されることができないウイルスをもたらすため、ウイルス突然変異に兔疫性を持たなければならない。
【００５９】
このような三量体性可溶性ＣＤ４  ＨＩＶ受容体類似体を製造するために、天然の信号ペプチド配列を含んでトランスメンブレイン及び短い細胞質ドメインを排除しない全体人間可溶性ＣＤ４をコード化するｃＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入したＥＳＴクローンを用いて増幅させた。生成したｃＤＮＡはｐＴＲＩＭＥＲ−Ｔ０及びｐ−ＴＲＩＭＥＲ−Ｔ２発現ベクターの相応する部位にＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｂｇｌ  ＩＩ断片としてクローニングした。生成した可溶性ＣＤ４−コラーゲン融合作成物（配列番号１３−１６）は形質感染後ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒコポーレーション製造）で発現させた。融合タンパク質を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を得るために、ピューロマイシン−耐性ベクターであるｐＢａｂｅ−Ｐｕｒｏ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒコポーレーション製造）と共同形質感染させた後安定したクローンを選択した。融合タンパク質を発現するクローンを生長させて融合タンパク質の長期間生産のために保存した。
【００６０】
可溶性人間ＣＤ４−コラーゲン融合タンパク質がジスルフィド結合−連結三量体で構築されるのか決定するために、可溶性ＣＤ４−Ｔ０及びＣＤ４−Ｔ２融合物を含む調節培地を、β−メルカプトエタノールを有しなかったり（非還元）または有する（還元）ＳＤＳサンプル緩衝液で沸かして、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離してまた人間ＣＤ４に対する単一クローン抗体（Ｒ  ＆  Ｄシーステムズ製造）を用いたウエスタンブロットにより分析した。分泌された可溶性ＣＤ４−Ｔ０及びＣＤ４−Ｔ２融合タンパク質は、還元条件下（９０−１００  ｋＤａ）と比較して、非還元条件下で３倍さらに大きい（約３００  ｋＤａ）ことに現われ、これは両側融合タンパク質が完全に同種三量体で構築されることを示す（データ示さない）。これら三量体性可溶性ＣＤ４はｇｐ１２０結合及び抗−ＨＩＶ感染のために容易に試験されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】同種二量体性可溶性ｓＴＮＦ  ＲＩＩ受容体−Ｆｃ融合の構造的特徴を図示する側面上昇図である。
【図１Ｂ】同種二量体性可溶性ｓＴＮＦ  ＲＩＩ受容体−Ｆｃ融合の構造的特徴を図示する上面図である。
【図１Ｃ】三量体性可溶性ｓＴＮＦ  ＲＩＩ受容体−Ｃ−プロペプチド融合の構造的特徴を図示する側面上昇図である。
【図１Ｄ】三量体性可溶性ｓＴＮＦ  ＲＩＩ受容体−Ｃ−プロペプチド融合の構造的特徴を図示する上面図である。
【図２Ａ】分泌された三量体性融合タンパク質を製造するためのｐＴＲＩＭＥＲプラスミドベクターの構造を図示する。
【図２Ｂ】分泌された三量体性融合タンパク質を製造するためのｐＴＲＩＭＥＲプラスミドベクターの構造を図示する。
【図３Ａ】α（Ｉ）コラーゲンのＣ−プロペプチドに融合される時の人間の胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）の三量体化のウエスタンブロット分析である。
【図３Ｂ】α（Ｉ）コラーゲンのＣ−プロペプチドに融合される時の人間の可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩの三量体化のウエスタンブロット分析である。
【図４】人間ＴＮＦ−α媒介された細胞自殺に対する三量体性可溶性人間ＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｃプロペプチド融合タンパク質の強力な中和活性を示すバイオアッセイを図示する。
【図５】人間ＴＮＦ−αに対する三量体性可溶性人間ＴＮＦ−ＲＩＩ−Ｔ２の中和活性の定量分析である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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