(57)【要約】本発明は分子集合を検出するためのシステムに関する。特に、本発明は以下の構成からなる複数の成分の検出システムと関連がある：ｉ）．第１のタグが第１の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ源により活性化すると第１の波長の光を発する直接または間接的に第１のタグに連結する第１の相互作用している基からなる第１の媒介物、ｉｉ）．第１および第２の相互作用している基が関連し、第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより、第２の波長の光を発する第２の活性化されたタグを生じる場合、第２のタグは第１のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第２のタグに連結する第２の相互作用している基からなる第２の媒介物、ｉｉｉ）．第１のおよび第３の相互作用している基が関連し、第３の波長の光を発する第３の活性化されたタグを生じるため、第１のタグに適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、直接または間接的に第１の活性化されたタグからエネルギを受け入れることができる第３のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第３の媒介物、ｉｖ）．第１のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、および、ｖ）．前記発せられた光を検出する手段。
2007511226.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の成分の検出システムであって、：
ｉ）．第１のタグが第１の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源によって活性化する第１の波長の光を発する直接または間接的に第１のタグに連結する第１の相互作用する基からなる第１の媒介物、
ｉｉ）．前記第１および第２の相互作用している基が関連し、前記第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第２の波長の光を発する第２の活性化されたタグを生じる場合、第２のタグが前記第１のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第２のタグに連結する第２の相互作用している基からなる第２の媒介物、
ｉｉｉ）．前記第１および第３の相互作用している基が関連し、前記第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が、第３の波長の光を発する第３の活性化されたタグを生じるために存在する場合、直接または間接的に前記第１の活性化されたタグから前記エネルギを受け入れることができる第３のタグに連結する第３の相互作用している基からなる第３の媒介物、
ｉｖ）．前記第１のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、ｖ）．前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項２】
複数の成分の検出システムであって、：
ｉ）．第１のタグが第１の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源によって活性化する第１の波長の光を発する直接または間接的に第１のタグに連結する第１の相互作用する基からなる第１の媒介物、
ｉｉ）．前記第１および第２の相互作用している基が関連し、ｉ）における前記第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第２の波長の光を発する第２の活性化されたタグを生じる場合、ｉ）における第２のタグが前記第１のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第２のタグに連結する第２の相互作用している基からなる第２の媒介物、
ｉｉｉ）．前記第１の、第２および第３の相互作用している基が関連し、ｉ）における前記第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が、第３の波長の光を発する第３の活性化されたタグを生じるために存在するが、前記第１および第３の相互作用している基のみが関連する場合は前記第３のタグはｉ）における前記第１の活性化されたタグによって本質的に活性化されない場合、ｉｉ）における前記第２の活性化されたタグから、前記エネルギを受け入れることができる第３のタグに直接または間接的に連結する第３の相互に作用している基からなる第３の媒介物、
ｉｖ）．ｉ）における前記タグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、ｖ）．前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項３】
複数の成分の検出システムであって、：
ｉ）．第１のタグが第１の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源によって活性化する第１の波長の光を発する直接または間接的に第１のタグに連結する第１の相互作用する基からなる第１の媒介物、
ｉｉ）．前記第１および第２の相互作用している基が関連し、ｉ）における前記第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第２の波長の光を発する第２の活性化されたタグを生じる場合、ｉ）における第２のタグが前記第１のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第２のタグに連結する第２の相互作用している基からなる第２の媒介物、
ｉｉｉ）．前記第１のおよび第３の相互作用している基が関連し、ｉ）における前記第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、ｉ）における前記第１の活性化されたタグから、前記エネルギを受け入れることができ、前記第２および第３の相互作用している基が関連し、第３の波長の光を発する第３の活性化されたタグを生じるため、ｉｉ）における前記第２のタグのため適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、ｉｉ）の前記第二に活性化されたタグから、前記エネルギを受け入れることができる第３のタグに直接または間接的に連結する第３の相互作用している基からなる第３の媒介物、
ｉｖ）．ｉ）およびｉｉ）における前記タグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、ｖ）．前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項４】
複数の成分の検出システムであって、：
ｉ）．第１のタグが第１の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源によって活性化する第１の波長の光を発する直接または間接的に第１のタグに連結する第１の相互作用する基からなる第１の媒介物、
ｉｉ）．前記第１および第２の相互作用している基が関連し、ｉ）における前記第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第２の波長の光を発する第２の活性化されたタグを生じる場合、ｉ）における第２のタグが前記第１のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第２のタグに連結する第２の相互作用している基からなる第２の媒介物、
ｉｉｉ）．ａ）．前記第１および第３の相互作用している基が関連する場合、前記第１の活性化したタグおよび／またはｂ）．前記第２および第３に相互作用している基が関連する場合、第２の活性化したタグから前記エネルギを直接または間接的に受け入れることができ、前記第１および／または第２のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、それによって前記第１および／または第２の活性化されたタグからの前記光放射が減少する非蛍光性失活剤分子からなる第３のタグに連結する第３の相互作用している基からなる第３の媒介物、
ｉｖ）．ｉ）およびｉｉ）における前記タグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、ｖ）．前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項５】
複数の成分の検出システムであって、：
ｉ）．第１の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源により活性化すると、第１のタグは第１の波長の光を発する第１のタグに直接または間接的に連結する第１の相互作用している基からなる第１の媒介物、
ｉｉ）．第２の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源により活性化すると、第２のタグは第２の波長の光を発する第１のタグに直接または間接的に連結する第２の相互作用している基からなる第２の媒介物、
ｉｉｉ）．前記第１のおよび第３の相互作用している基が関連し、第３の波長の光を発する第３の活性化されたタグを生じるために前記第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、第３のタグが前記第１の活性化されたタグから前記エネルギを受け入れることができる第３のタグに直接または間接的に連結する第３の相互作用している基からなる第３の媒介物、
ｉｖ）．前記第２および第４の相互作用している基が関連し、第４の波長の光を発する第４の活性化されたタグを生じるため、前記第２のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、第４のタグが前記第２の活性化されたタグから前記エネルギを受け入れることができる直接または間接的に第４のタグに連結する第４の相互に作用している基から成っている第４の媒介物、
ｖ）．前記第１および第２のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
ｖｉ）．前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項６】
複数の成分の検出システムであって、：
ｉ）．第１の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源により活性化すると、第１のタグは第１の波長の光を発する第１のタグに直接または間接的に連結する第１の相互作用している基からなる第１の媒介物、
ｉｉ）．前記第１および第２の相互に作用している基が関連し、および前記第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第２の波長の光を発する第２の活性化されたタグを生じる場合、第２のタグは前記第１のタグから前記エネルギを受け入れることができる第２のタグに直接または間接的に連結する第２の相互作用している基からなる第２の媒介物、
ｉｉｉ）．前記第１のおよび１つまたはそれ以上のさらなる相互作用している基が関連し、１つまたはそれ以上のさらなる波長の光を発するため、前記第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が１つまたはそれ以上のさらなる活性化されたタグを生じるために存在し、ここにおいて、前記さらなる波長は、前記第１または第２の波長と異なる場合、前記第１の活性化されたタグから前記エネルギを受け入れることができる１つまたはそれ以上のさらなるタグに直接または間接的に連結する１つまたはそれ以上のさらなる相互作用している基からなる１つまたはそれ以上のさらなる媒介物、
ｉｖ）．前記第１のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、ｖ）．前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１つに記載のシステムであって、前記相互作用している基は、化合物、タンパク、タンパク・ドメイン、タンパク・ループ、タンパク末端、ペプチド、ホルモン、タンパク‐脂質複合体、脂質、炭水化物、炭水化物含有化合物、核酸、オリゴヌクレオチド、薬剤媒介物、薬剤ターゲット、抗体、抗原物質、ウイルス、バクテリアおよび細胞から構成される前記基から選択されるシステム。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか１つに記載のシステムであって、前記相互作用している基は、炭水化物、タンパク、薬剤、発色団、抗原、キレート化している化合物、分子識別複合体およびその連結からなる前記基から選択されるシステム。
【請求項９】
請求項７に記載のシステムであって、前記核酸分子が、一本鎖および二本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡ、不均一リボ核酸（異種核ＲＮＡ）を含むＲＮＡ、転移リボ核酸（運搬ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）からなるシステム。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１つに記載のシステムであって、外部刺激は、直接または間接的に相互作用している基の前記集合を調整するために適用されるシステム。
【請求項１１】
請求項１０に記載のシステムであって、前記外部刺激は、有機および無機分子、タンパク、核酸、炭水化物、脂質、配位子、薬剤化合物、作動体、拮抗体、逆作動体または化合物からなる試薬であるシステム。
【請求項１２】
請求項１０に記載のシステムであって、前記外部刺激は、温度、イオン強度またはｐＨを含む状態の変化であるシステム。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１つに記載のシステムであって、前記検出タグは、生物発光タンパク、蛍光タンパク、蛍光部分または非蛍光性失活剤からなる前記基から選択されるシステム。
【請求項１４】
請求項１３に記載のシステムであって、前記生物発光タンパクは、適切な基質がある場合には、ルシフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、ペルオキシダーゼまたは発光することができるいかなるタンパクからなる前記基から選択されるシステム。
【請求項１５】
請求項１３に記載のシステムであって、前記基から選択される前記蛍光タンパクは、緑の蛍光タンパク（ＧＦＰ）またはその変種、ＧＦＰ（ＢＦＰ）の青色の蛍光変種、ＧＦＰ（ＣＦＰ）のシアン蛍光変種、ＧＦＰ（ＹＦＰ）の黄色の蛍光変種、強化されたＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、強化されたＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、強化されたＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド、トパーズ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ｔ‐ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｄｉｍｅｒ２、ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）、ｍＲＦＰ１、ポシロポリン、ウミシイタケＧＦＰ、奇形ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、ｋａｅｄｅタンパクおよびキンドリング・タンパク、Ｂ‐フィコエリトリン、Ｒ‐フィコエリトリンおよびアロフィコシアニンを含むフィコビリタンパク質およびフィコビリタンパク質結合体、または、蛍光を発することができる他のいかなるタンパクから構成されるシステム。
【請求項１６】
請求項１３に記載のシステムであって、前記蛍光部分は、Ａｌｅｘａフルーア色素および派生物、Ｂｏｄｉｐｙ色素および派生物、Ｃｙ色素および派生物、フルオレセインおよび派生物、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光および発光のミクロスフィア、蛍光ナノクリスタル、マリーナブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、パシフィックブルー、オレゴングリーンおよび派生物、テトラメチルローダミンおよび派生物、ローダミンおよび派生物、テキサスレッドおよび派生物、希土類元素キレートまたはその化合またはその派生物、または蛍光特性を有する他のいかなる分子から構成される前記基から選択されるシステム。
【請求項１７】
請求項１３に記載のシステムであって、前記非蛍光性失活剤は、光を吸収し、蛍光および／または発光を抑える能力を有するダブシル、非蛍光性ポシロポリン、ＱＳＹ‐７、ＱＳＹ‐９、ＱＳＹ‐２１、ＱＳＹ‐３５、ＢＨＱ‐１、ＢＨＱ‐２およびＢＨＱ‐３、またはいかなる周知の非蛍光性発色団からなる前記基から選択されるシステム。
【請求項１８】
請求項１から６のいずれか１つに記載のシステムであって、前記活性化エネルギは、レーザー、水銀ランプ、キセノンランプ、およびハロゲン・ランプまたはいかなる発光デバイスを含む光源によって生成され、前記生成された光は、レーザー・ライン、バンドパスフィルタ、ショートパス・フィルタ、モノクロメータまたはスペクトルで前記発された光を制限するいかなる装置を含む適切な手段によって特定の波長または波長範囲に制限されるシステム。
【請求項１９】
請求項１から６のいずれか１つに記載のシステムであって、前記第１の活性化エネルギは、コエレンテラジンおよびルシフェリンまたはそこから導かれる派生物から構成される前記基から選ばれる適切な酵素基質から生成されるシステム。
【請求項２０】
請求項３に記載のシステムであって、前記第１の検出タグは順番に活性化され、前記第１、第２および第３の検出タグから発される前記光が検出され、そして前記第２の検出タグは活性化され、前記第２および第３の検出タグから発される前記光が検出されるシステム。
【請求項２１】
請求項１から６のいずれか１つに記載のシステムであって、前記第１の検出タグは順番に活性化され、前記第１および第２の検出タグから発される前記光が検出され、そして前記第２の検出タグは活性化され、前記第２の検出タグから発される前記光は検出されるシステム。
【請求項２２】
請求項１９および２０に記載のシステムであって、活性化および検出の前記順序は、時間的情報を生ずるため反復されるシステム。
【請求項２３】
請求項１から２１のいずれか１つに記載のシステムであって、前記相互作用している基およびタグは、融合タンパク質構成において符号化されるシステム。
【請求項２４】
融合タンパク質構造をコード化する請求項２２に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項２５】
請求項２３に記載の組換えＤＮＡからなる融合遺伝子。
【請求項２６】
請求項２２から２４のいずれか１つに記載の１つまたはそれ以上の融解タンパク質遺伝子に使用可能な状態で連結される促進剤からなるＤＮＡカセット。
【請求項２７】
請求項２５に記載の融合遺伝子からなるベクター。
【請求項２８】
請求項２６に記載のベクターによって一時的にまたは安定して変換またはトランスフェクションする宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２７に記載の宿主細胞であって、前記細胞は、人間、哺乳動物、昆虫、植物、細菌または酵母である宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２６に記載のベクターであって、前記遺伝子構造物は、構成する促進剤の制御下にあるベクター。
【請求項３１】
請求項２６に記載のベクターであって、前記遺伝子構造物は、誘導可能な促進剤の制御下にあるベクター。
【請求項３２】
請求項２９に記載のベクターであって、変換またはトランスフェクションする前記細胞は哺乳動物である場合、前記構成要素の促進剤は、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＥＦ‐１ａ、Ｔｋから構成される前記基から選択されるベクター。
【請求項３３】
請求項２９に記載のベクターであって、変換またはトランスフェクションする前記細胞は菌体である場合、前記構成要素の促進剤が、Ｔ７、ＡｒａＢＡＤ、ｔｒｃ、ｐＬ、ｔａｃおよびｌａｃからなる前記基から選択されるベクター。
【請求項３４】
請求項２９に記載のベクターであって、変換またはトランスフェクションする前記細胞はイースト細胞である場合、前記構成要素の促進剤が、ｎｍｔｌ、ｇａｌｌ、ｇａｌｌＯ、ＴＥＦ１、ＡＯＸ１、ＧＡＰおよびＡＤＨ１からなる前記基から選択されるベクター。
【請求項３５】
請求項２５に記載の融合遺伝子からなるウイルス。
【請求項３６】
請求項３５に記載の細菌によって感染する宿主細胞。
【請求項３７】
請求項１から２２のいずれか１つに記載の複数成分検出システムのアポトーシスに関するセンサーとしての使用であって、前記媒介物のうちの少なくとも１つは、カスパーゼ切断部位である使用。
【請求項３８】
請求項１から２２のいずれか１つに記載の複数成分検出システムのキナーゼ活性を検出するための使用であって、前記媒介物のうちの少なくとも１つは、リン酸化部位である使用。
【請求項３９】
細胞が固定されていないシステムにおけるエネルギ転移を検出するための請求項１から２２のいずれか１つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項４０】
請求項２４に記載の融合遺伝子を生体細胞に導入することによる宿主細胞における請求項１から２２のいずれか１つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項４１】
生体外または生体内でのタンパク‐タンパク相互作用をモニタするための請求項１から２２のいずれか１つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項４２】
生体外または生体内の酵素活性をモニタするための請求項１から２２のいずれか１つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項４３】
生体外または生体内の膜タンパク質間の相互作用をモニタするための請求項１から２２のいずれか１つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項４４】
生体外または生体内の膜タンパク質および非膜結合タンパク間の相互作用をモニタするための請求項１から２２のいずれか１つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項４５】
生体外または生体内のタンパク‐核酸相互作用をモニタするための請求項１から２２のいずれか１つに記載の複数成分検出システムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子集合を検出するためのシステムに関する。特に、本発明は複数の成分検出システムに関連があり、そこにおいて、２つまたはそれ以上の成分の分子集合が検出される。
【背景技術】
【０００２】
ポスト・ゲノム時代において、プロテオミクスはより重要になった。それは、セルにおいて発現されるゲノムによってコード化されるすべてのタンパクの確認、および、発現、相互作用および機能性を含むそれらの挙動の説明を含む。
【０００３】
タンパクは、セルにおいて単離して作用せず、むしろ安定性があるかまたは一時的な複合体であり、タンパク‐タンパク相互作用は、タンパク機能の鍵となる決定因子である。（アウアーバッハ他（２００２）、プロテオミクス、２、６１１‐６２３）さらに、タンパクおよびタンパク複合体は、デオキシリボ核酸、リボゾームリボ核酸および小型分子のように他の細胞成分と相互作用する。これらの相互作用に関係する個別のタンパク質類を解明かつ解剖することは、生物学的プロセスを理解するために重要である。
【０００４】
このために、多くの分析（アッセイ）技術は、生物相互作用の決定を援助するために長年にわたって開発されてきた。しかしながら、これらの技術の多くは、高スループット・スクリーニングに適さず、費用のかかる手順を含む。例えば、例えば免疫共沈降技術が、タンパク‐タンパク相互作用を確認するために長年用いられてきた；しかしながら、この技術は、自動操作または高スループット・スクリーニングに従わない。マススペクトル分析と結合した免疫共沈降のような他の技術は、（アンダーソン及びマン（２０００）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、（４８０、２５‐３１））薬剤スクリーニング・プログラムで使用するにはあまりに複雑で、時間がかかり、費用がかかる。表面プラスモン共振（ＳＰＲ）は、高感受性があり、生物相互作用を検出することができる正確な技術である。しかしながら、この技術は、センサー表面に固定される十分な量の精製された標的タンパク質を必要とし、分子の複雑な混合物においてそれと結合する配位子の識別におけるいかなる情報も生じない。
【０００５】
開発された他の技術は、高感受性があり、用途が広いが精製された状態において利用できる相互作用する分子を必要とするアルファスクリーンシステム（登録商標）、高スループット・スクリーニングにおいて有用であるが、多数の誤った結果を生じ、ダイナミックレンジが制限された蛍光偏光および蛍光異方性（ポープ他（１９９９）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  Ｔｏｄａｙ、４、３５０‐３６２）、および、広いダイナミックレンジを有するが、しかし、相互作用パートナー間の質量差は大きくなければならず、分析が複雑である蛍光相関分光法（ポープ他（１９９９）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  Ｔｏｄａｙ、４、３５０‐３６２）を含む。
【０００６】
さらに重要なことに、すべての上記の方法は、検出が試験管内でのみ発生するという大きな不都合を共有する。この人工の状態は、タンパクが多くの異なるパートナーと相互作用し、クロストークする細胞内生育環境を正確に反映するわけではない。また、相互作用はバッファ状態次第であり、不適当な状態の選択によって相互作用は、完全に破壊または初期化され、したがって、疑陽性および疑陰性の数および可能性を増加させる結果を生じる。
【０００７】
結果として、多くの検出システムは、‘生体内’でのタンパク‐タンパク相互作用を検出するために開発された。例えば、酵母２ハイブリッドシステム（フィールズおよびソング（１９８９）ＮＡＴＵＲＥ、３４０、２４５‐２４６）が、広く使われている。しかしながら、この技術は、生体酵母細胞の細胞核内部のタンパク‐タンパク相互作用の監視ができるだけである。それゆえに、哺乳動物の細胞に特定の膜タンパク質の重要な種類および翻訳後修飾は分析することができない。
【０００８】
蛍光共振エネルギ転移（ＦＲＥＴ）は、‘生体内’でのタンパク‐タンパク反応を検出することができる別の検出システムである（フォースター（１９４８）Ａｎｎ．Ｐｈｙｓ．２、５７‐７５）。この技術は、緑蛍光タンパク（ＧＦＰ）および異なる分光特性を有するその変異体のクローンがつくられた場合、生細胞の分析に特に魅力的であり、適用可能になった。これは、コード化しているＤＮＡの塩基配列を融合させることによって、いかなる標的タンパク質へのＧＦＰおよびその変種の遺伝子的結合を可能にした。（エイム他（１９９４）ＰＮＡＳ．ＵＳＡ．９１、１２５０１‐１２５０４）。酵母２ハイブリッドシステムと比較して、ＦＲＥＴは監視された相互作用が細胞内部のどこにでも発生することができる利点を有する。ＦＲＥＴは、いかなる細胞のタイプ（哺乳動物、酵母、細菌など）、または、無細胞系においても決定することができる。それは、蛍光分光学法、蛍光顕微鏡法および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって検出することができる。しかしながら、後述するように、ＦＲＥＴは一つの大きな欠点を有する、それは単一の相互作用を検出するためのみに用いることができるということである。
【０００９】
生物発光共振エネルギ転移（ＢＲＥＴ）は、生体内のタンパク‐タンパク相互作用／反応を研究するために開発された別の技術である（スー他（１９９９）、ＰＮＡＳ．ＵＳＡ、９６、１５１‐１５６；エイデン他（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂｏｌ．１３、４１５‐４２１）ＦＲＥＴに類似して、この技術は、検出が生細胞内で起こり、特定の細胞の仕切りに制限されない利点を有する。加えて、それはＦＲＥＴのいくつかの潜在的な制限を克服する：光がルシフェラーゼによって本質的に生成するので、検出システムは、共振エネルギ転移から生じる同等に弱い信号と強い励起光源とを区別する必要はない。さらに、細胞の蛍光および自己蛍光のフォトブリーチングは観察されない。
【００１０】
しかしながら、ＦＲＥＴの様に、ＢＲＥＴの大きな制限は、単一の、１対１の相互作用のみが検出できるということである。しかしながら、大部分のタンパクが１つ以上の潜在性結合パートナーを有することが広く認められる。他のものは２つまたはそれ以上のより大きい複合体において作用し、特定のタンパクの機能は、他のタンパクの複合体の存在に極めて依存する。したがって、単一の相互作用に注目することは、特定のタンパクの多数の機能の状況、特異性、および、交差反応性について言及するわけではない。
【００１１】
したがって、試験管内のおよび生体内の多数のタンパク‐タンパク集合を検出することができる複数の成分検出システムの必要がある。さらに重要なことに、スループットを増加させ、時間およびコストを減らすように同時に多数の集合を分析することができるシステム、および、複数の成分分子の付随物の一部としてタンパクおよび他の生物学上関連した分子を分析することができるシステムの必要がある。
【発明の開示】
【００１２】
発明者は、試験管内のおよび生体内の多数の相互作用を検出することができる一方、従来技術のシステムにおいて識別されるいくつかの問題を解決してまたは少なくとも軽減することができる複数の成分検出システムを開発した。
【００１３】
したがって、第１の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される：ｉ）．第１のタグが第１の作動タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第１の波長の光を発する、直接または間接的に第１のタグに連結する第１の相互作用している基からなる第１の媒介物、ｉｉ）．第１および第２の相互作用している基が関連し、第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第２の波長の光を発する第２の活性化タグをこのことにより生じる場合、第２のタグは第１のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第２のタグに連結する第２の相互作用している基からなる第２の媒介物、ｉｉｉ）．第１および第３の相互作用している基が関連し、第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第３の波長の光を発する第３の活性化タグをこのことにより生じる場合、直接または間接的に第１の活性化されたタグからエネルギを受け入れることができる第３のタグに連結する第３の相互作用している基からなる第３の媒介物、ｉｖ）．第１のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、および、ｖ）．前記発せられた光を検出する手段。
【００１４】
第２の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される：ｉ）．第１のタグが第１の作動タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第１の波長の光を発する、直接または間接的に第１のタグに連結する第１の相互作用している基からなる第１の媒介物、ｉｉ）．第１および第２の相互作用している基が関連し、ｉ）における第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第２の波長の光を発する第２の活性化タグをこのことにより生じる場合、第２のタグはｉ）における第１のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第２のタグに連結する第２の相互作用している基からなる第２の媒介物、ｉｉｉ）．第１、第２、および第３の相互作用している基が関連し、ｉ）の第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が第３の波長の光を発する第３の活性化されたタグを生じるために存在するが、第１のおよび第３の相互に作用している基だけが関連する場合、前記第３のタグはｉ）の第１の活性化されたタグによって本質的に活性化されない直接または間接的にｉｉ）の第２の活性化されたタグから、エネルギを受け入れることができる第３のタグに連結する第３の相互作用している基からなる第３の媒介物、ｉｖ）．ｉ）においてタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、および、ｖ）．前記発せられた光を検出する手段。
【００１５】
第３の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される：ｉ）．第１のタグが第１の作動タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第１の波長の光を発する、直接または間接的に第１のタグに連結する第１の相互作用している基からなる第１の媒介物、ｉｉ）．第１および第２の相互作用している基が関連し、ｉ）における第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第２の波長の光を発する第２の活性化タグをこのことにより生じる場合、第２のタグはｉ）における第１のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第２のタグに連結する第２の相互作用している基からなる第２の媒介物、ｉｉｉ）．第１および第３の相互作用している基が関連し、およびｉ）の第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、ｉｉ）において第２の活性化されたタグからのエネルギ受け入れる場合、および、第２および第３の相互に作用している基が関連し、第３の波長の光を発する第３の活性化されたタグを生じるためにｉｉ）において第２のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、直接または間接的にｉ）の第１の活性化されたタグから、エネルギを受け入れることができる第３のタグに連結する第３の相互作用している基からなる第３の媒介物、ｉｖ）．ｉ）およびｉｉ）においてタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、および、ｖ）．前記発された光を検出する手段。
【００１６】
第４の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される：ｉ）．第１のタグが第１の作動タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第１の波長の光を発する、直接または間接的に第１のタグに連結する第１の相互作用している基からなる第１の媒介物、ｉｉ）．第１および第２の相互作用している基が関連し、ｉ）における第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第２の波長の光を発する第２の活性化タグをこのことにより生じる場合、第２のタグはｉ）における第１のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第２のタグに連結する第２の相互作用している基からなる第２の媒介物、ｉｉｉ）．ａ）．第１および第３の相互作用している基が関連する場合、第１の活性化タグ；および／または、ｂ）．第２および第３の相互作用している基が関連し、そして第１および／または第２のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、それによって、第１および／または第２の活性化タグからの光放射は減少する場合、第２の活性化タグからエネルギを受け入れることができる非蛍光性失活剤分子からなる第３のタグに直接または間接的に連結する第３の相互作用している基からなる第３の媒介物、ｉｖ）．ｉ）およびｉｉ）のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、および、ｖ）．前記発された光を検出する手段。
【００１７】
第５の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される：ｉ）．第１のタグが第１の活性化タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第１の波長の光を発する、直接または間接的に第１のタグに連結する第１の相互作用している基からなる第１の媒介物、ｉｉ）．第２の活性化タグを生じる基質またはエネルギ源により活性化されると第２のタグは第２の波長の光を発する直接または間接的に第２のタグに連結する第２の相互作用している基、ｉｉｉ）．第１のおよび第３の相互作用している基が関連し、第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源は、第３の波長の光を発する第３の活性化タグを生じるために存在する場合、第３のタグが第１の活性化されたタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第３のタグに連結する第３の相互作用している基からなる第３の媒介物、ｉｖ）．第２および第４の相互作用している基が関連し、第２のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源は、第４の波長の光を発する第４の活性化タグを生じるために存在する場合、第４のタグが第２の活性化されたタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第４のタグに連結する第４の相互作用している基からなる第４の媒介物、ｖ）．第１および第２のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、およびｖｉ）．前記発された光を検出する手段。
【００１８】
第６の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される：ｉ）．第１のタグが第１の活性化タグを生じる基質またはエネルギー源によって活性化されると第１の波長の光を発する、直接または間接的に第１のタグに連結する第１の相互作用している基からなる第１の媒介物、ｉｉ）．第１および第２の相互に作用している基が関連し、第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第２の波長の光を発する第２の活性化タグをこのことにより生じる場合、第２のタグは第１のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第２のタグに連結する第２の相互作用している基からなる第２の媒介物、ｉｉｉ）．第１の１つまたはそれ以上のさらなる相互作用している基が関連し、および第１のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が、１つまたはそれ以上のさらなる波長の光を発する１つまたはそれ以上のさらなる活性化されたタグを生じるために存在し、ここにおいてさらなる波長は、第１または第２の波長とは異なる場合、第１の活性化タグからエネルギを受け入れることができる１つまたはそれ以上のさらなるタグに直接または間接的に連結する１つまたはそれ以上のさらなる相互作用している基からなる１つまたはそれ以上のさらなる媒介物、ｉｖ）．第１のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、およびｖ）．前記発された光を検出する手段。
【００１９】
実施例において、相互作用している基は、１つまたはそれ以上の他の相互作用している基と関連することができる。これらの集合は、同一の相互作用している基の間または異なる相互作用している基の間またはその組合せであってもよい。
【００２０】
好ましくは、相互作用している基は、化合物、タンパク、タンパク・ドメイン、タンパク・ループ、タンパク末端、ペプチド、ホルモン、脂質、炭水化物、核酸、オリゴヌクレオチド、薬剤媒介物、薬剤ターゲット、抗体、抗原物質、ウイルス、バクテリアおよび細胞、またはその集合またはその複合体、からなる基から選択されている。
【００２１】
相互作用している基が核酸分子である場合、核酸分子のいかなる形状も使われる。例えば、核酸分子は、ゲノム・デオキシ核酸（ＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リボゾームリボ核酸（ＲＮＡ）を含み、リボゾームリボ核酸は、異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）運搬ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小型妨害リボゾームリボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびそのハイブリッド分子を含む。
【００２２】
実施例において、外部刺激は、相互作用している基の集合および／または配座を直接または間接的に調整するために適用される。好ましくは、刺激はいかなる周知の分子、有機物または無機物、タンパクまたは非タンパク、配位子、抗体、酵素、核酸、炭水化物、脂質、薬剤化合物、作動体、拮抗体、逆作動体またはその化合物または複合体、または温度、イオン強度またはｐＨを含む状態の変化、を含む試薬である。
【００２３】
本発明によるタグは、赤外範囲に近いものから紫外線に近いものまでの光または吸収光を含むエネルギまたは、蛍光またはリン光を発することができるいかなる周知の分子、有機物または無機物、タンパクまたは非タンパク、またはその複合体であってもよい。好ましくは、タグは生物発光タンパク、蛍光タンパク、蛍光部分または非蛍光性失活剤である。
【００２４】
好ましくは、生物発光タンパクは、適切な基質がある場合には、ルシフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、ペルオキシダーゼ、または発光ができるいかなるタンパクからなる基から選択される。
【００２５】
好ましくは、蛍光タンパクは、緑の蛍光タンパク（ＧＦＰ）またはその変種、ＧＦＰ（ＢＦＰ）の青色の蛍光変種、ＧＦＰ（ＣＦＰ）のシアン蛍光変種、ＧＦＰ（ＹＦＰ）の黄色の蛍光変種、強化されたＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、強化されたＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、強化されたＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド、トパーズ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ｔ‐ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｄｉｍｅｒ２、ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）、ｍＲＦＰ１、ポシロポリン、ウミシイタケＧＦＰ、奇形ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、ｋａｅｄｅタンパクおよびキンドリング・タンパク、Ｂ‐フィコエリトリン、Ｒ‐フィコエリトリンおよびアロフィコシアニンを含むフィコビリタンパク質およびフィコビリタンパク質結合体、または蛍光またはリン光を発する他のいかなるタンパクからなる基から選ばれる。
【００２６】
蛍光部分は、いかなる周知の蛍光部分であってもよい。好ましくは、蛍光部分は、Ａｌｅｘａフルーア色素および派生物、Ｂｏｄｉｐｙ色素および派生物、Ｃｙ色素および派生物、フルオレセインおよび派生物、ウンベリフェロン、蛍光および発光のミクロスフィア、蛍光ナノクリスタル、マリーナブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、パシフィックブルー、オレゴングリーンおよび派生物、テトラメチルローダミンおよび派生物、ローダミンおよび派生物、テキサスレッドおよび派生物、希土類元素キレートまたはその化合またはその派生物、または蛍光特性を有する他のいかなる分子からなる基から選択される。
【００２７】
一実施例において、タグのうちの少なくとも１つは、非蛍光性失活剤である。非蛍光性失活剤は、光の吸収および蛍光および／または発光を抑える能力を有するいかなる周知の非蛍光性発色団であってもよい。非蛍光性失活剤はそれゆえに、いかなる周知のタンパク性のまたは非タンパク性の分子であってもよい。好ましくは、非蛍光性失活剤は、ダブシル、非蛍光性ポシロポリン、ＱＳＹ‐７、ＱＳＹ‐９、ＱＳＹ‐２１、ＱＳＹ‐３５、ＢＨＱ‐１、ＢＨＱ‐２およびＢＨＱ‐３からなる基から選択される。
【００２８】
タグおよび相互作用している基は、直接または間接的に連結される。好ましくは、直接のまたは間接的な連結は、２つの分子を連結する周知の共有結合または非共有結合手段でもある。より好ましくは、相互作用している基およびタグの直接のまたは間接的な連結は、化学的架橋、タンパクの化学修飾、アミノ酸の化学修飾、核酸の化学修飾、炭水化物の化学修飾、脂質または他のいかなる有機または無機分子の化学修飾、ビオチン‐アビジンを含む非共有結合の相互作用、抗原抗体または核酸ハイブリダイゼーションからなる基から選択される。
【００２９】
好ましい実施例では、相互作用している基およびタグは、同じポリペプチド鎖の部分である。例えば、タンパク性の相互作用している基およびタンパク性のタグの核酸分子のコード付けは、（ｉ）融解構造物の親和力純化のために使用されるペプチド配列のための配列コード付け；および／または（ｉｉ）真核細胞の細胞小器官仕切りに、融解構造物を導くペプチド配列のための配列コード付け、および／または（ｉｉｉ）、相互作用している基、タグおよび前記ペプチド（複数のペプチド）の融合タンパクを生じるために真核細胞薄膜の貫通を容易にするペプチド配列のための配列コード付けに、任意に融合する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
詳細に本発明を記載する前に、本発明は、本願明細書において開示される特に例証された生物発光または蛍光タンパク、分析または方法に制限されず、それは、もちろん変化すると理解される。本願明細書において用いられる専門用語は、発明の具体例のみを記載するためであり、それは添付の請求の範囲のみによって制限され、限定する意図を有さないとまた理解される。
【００３１】
本願明細書において引用したすべての出版物、特許および特許出願は、以前にまたは以後であるにせよ、それらの全部において本願明細書に引用したものとする。しかしながら、本願明細書において言及される出版物は、出版物において報告され、発明と関連して使われる手順、試薬およびベクターを記載しておよび開示するために引用される。発明が従来の発明によってこのような開示に先だつ権利がないという承認として本願明細書において解釈されるわけではない。
【００３２】
さらに本発明の実行は、特に明記しない限り、当業者の技術の範囲内で従来の分子生物学、化学および蛍光技術を使う。このような技術は当業者にとって周知であり、例えば以下の文献、コリガン、ダン、プロー、スパイカーおよびウィングフィールド「タンパク質科学の現行の手順」（１９９９）ＩおよびＩＩ（ジョン・ワイリー社）；およびベイリー、Ｊ．Ｅ．、および、オリス、Ｄ．Ｆ．）「生物化学工学の基本」マグロウヒル社、ニューヨーク、１９８６；ラコウィッツ、Ｊ．Ｒ．「蛍光分光学法の原理」ニューヨーク：蛍光技術総会の出版物（１９８３）において完全に説明される。
【００３３】
本願明細書および添付の請求の範囲において使われる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に命ずる以外は複数の参照を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば「タンパク」の参照は、複数のこのようなタンパクを含み、および、「検体」に対する参照は、１つまたはそれ以上の検体に対する参照である。別途定義されない限り、本願明細書において用いられる技術的および科学的な用語のすべては、一般に本発明が属している技術の当業者によってよく理解されているものと同じ意味を有する。本願明細書において記載されるものと類似または同等のいかなる材料および方法が本発明の実行または検査に使用されるが、好適な材料および方法は、次に記載される。
【００３４】
本発明は、多数の分子集合を検出するためのシステムに関連がある。本願明細書において使われる用語「分子集合」または「集合」は、いかなる周知の直接的または間接的な安定原子、または分子のレベル相互作用、またはそのいかなる連結を経て関連する相互作用するグループ２つまたはそれ以上の連結を参照する。ここで、相互作用は、例えば共有結合形成、イオン結合、水素結合、共座標結合または他のいかなる分子の結合相互作用のような結合相互作用、静電的相互作用、極性または疎水性の相互作用、または他のいかなる典型的または量子機械的な安定原子または分子の相互作用が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３５】
実施例において、分子集合は、１つまたはそれ以上の相互作用している基（ＩＧ）からなる１つまたはそれ以上の媒介物の間にあり、そこにおいて、ＩＧは、直接または間接的に１つまたはそれ以上タグの（「ＤＴ」）に連結する。本願明細書において使われる用語「媒介物」または「ＩＧ‐ＤＴ媒介物」、ＩＧおよびタグ「ＤＴ」間の複合体を参照する。すなわち、ＩＧは直接または間接的にＤＴに連結する。媒介物は、それらの純化を容易にする（ｉ）および／または、成熟核宿主細胞の細胞小器官仕切りに、それらをターゲットにする（ｉｉ）および／または、細胞を囲む培地に加えられた場合、それらが真核細胞の細胞膜を貫通することを可能にする（ｉｉｉ）化学基、ペプチド配列、タンパクまたは核酸分子を含むように設計または修正される。
【００３６】
実施例において、検出システムが多くの分子の集合を識別することができるという点で、媒介物は複数の媒介物であってもよい。しかしながら、他の実施例では、発明の検出システムは、本質的に第１、第２および第３の媒介物から構成されている。
【００３７】
したがって、用語「集合」も、付近に被結合タグを導く相互作用している基を含むいかなる相互作用または配座の変化を参照する。タグ間の遠位は好ましくは、１から１０ナノメートルの間の範囲である。ＩＧ‐ＤＴ媒介物間の直接の物理的な接触は必要とされず、１つまたはそれ以上の追加的な分子（複数）および／または１つまたはそれ以上の追加的な相互作用している基（複数）によって媒介される。
【００３８】
本願明細書において使われる用語「相互作用している基」または「ＩＧ」は、化合物、タンパク、タンパク・ドメイン、タンパク・ループ、タンパク‐末端、ペプチド、ホルモン、タンパク‐脂質複合体、脂質、炭水化物、炭水化物含有化合物、核酸、オリゴヌクレオチド、薬剤媒介物、薬剤ターゲット、抗体、抗原物質、ウイルス、バクテリアおよび細胞またはそのいかなる複合体を含む。本質的に、相互作用している基は１つまたはそれ以上の実在物と複合体を形成することができる実在物である。例えば、複合体を抗原により形成することができるという点で、本発明の文脈の抗体は、第１のＩＧである。ここにおいて、抗原は第２のＩＧ（下に示す）である。本発明のＩＧの別例は、複合体をリセプタで形成することができる配位子である。さらなる例は、その基質と酵素との相互作用である。加えて、ＩＧは同じ分子の部分であってもよい。したがって例えば、Ｇタンパク被結合リセプタの第３の細胞内ループは、第１のＩＧであり、同じリセプタのＣ末端は、リセプタが活性化または非活性化された場合、結び付く第２のＩＧであってもよい。
【００３９】
一実施例において、外部刺激は、直接または間接的に相互作用している基の集合および／または配座を調整するために適用される。本願明細書において使われる用語「刺激」は、いかなる周知の分子、有機物または無機物、タンパクまたは非タンパク、配位子、抗体、酵素、薬剤化合物、作動体、拮抗体、逆作動体、化合物またはその複合体も含む試薬を参照する。それはさらに温度、イオン強度またはｐＨを含む外部条件の変更を参照する。刺激は、直接または間接的に作用することができる。例えば、刺激が試薬である場合、それらは物理的に相互作用している基と結合する可能性があり、従ってそれらの集合の媒介となるまたは妨げる。これは例えば、リセプタの二量体化またはリセプタ内の配座の変化を生じる配位子であってもよい。間接的に作用する刺激の例は、ＩＧは細胞酵素によって修正される、例えばリン酸化され；修正は交替でＩＧの集合を変えるという結果を有する細胞内の信号送信経路を活性化する試薬または状態の変更である。
【００４０】
本願明細書において使われる用語「タグ」は、生物発光タンパク、蛍光タンパク、蛍光部分および非蛍光性失活剤を含む。要するに、あらゆる周知の分子、有機物または無機物、タンパクまたは非タンパク、またはその複合体は、光のようなエネルギを発する、または、赤外範囲に近い紫外線の光を吸収する、または、蛍光またはリン光を発することができる。
【００４１】
本願明細書において使われる用語「生物発光タンパク」は、発光を生成することができるいかなるタンパクを参照する。生物発光タンパクはバクテリア、菌類、昆虫および海洋生物において発見されたルシフェラーゼを含む。それらは、光放射（ヘイスティングズ（１９９６）Ｇｅｎｅ １７３、５‐１１）の下で特定の基質（ルシフェリンとして周知の）の酸化を触媒する。最も広く周知の基質は、刺胞動物、カイアシ、毛顎動物、クシクラゲ、十脚甲殻類、アミ、放散虫およびいくつかの魚分類群において発生するコエレンレラジンである（グリーアおよびシャーレイ（２００２）ルミネッセンス、１７，４３‐７４）。最も広く使われているルシフェラーゼのうちの２つは、以下の通りである：
（ｉ）ウミシイタケ・ルシフェラーゼ（Ｒ． レニフォルミスから）、基質としてコエレンレラジンを使用し、４８０ナノメートルで光を発する３５ｋＤａタンパク（ローレンツ他（１９９１）、ＰＮＡＳ． ＵＳＡ、８８,４４３８‐４４４２）；および、（ｉｉ） ホタル・ルシフェラーゼ（特異性ホタルから）、基質としてルシフェリンを使用し、５６０ナノメートルで光を発する６１ｋＤａタンパク（デウェット他（１９８７）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．２９８７,７２５‐７３７）。
【００４２】
近年、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（コペポーダから）が、生化学アッセイにおいて使われた（ヴェルハーゲン他（２００２）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ,７４：４３７８‐４３８５）。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼは、４７０ナノメートルの光放射において生じる高速反応でコエレンタラジンを酸化させる２０ｋＤａタンパクである。
【００４３】
一実施例において、基質がある限り、本発明で使用される生物発光タンパクは強い一定の光放射を呈する。生物発光タンパクがＩＧに連結するので、立体障害のためにＩＧ間の相互作用の阻害を妨げるため低分子量を有する生物発光タンパクの使用は好ましい。生物発光タンパクは、ＩＧ‐ＤＴ媒介物の容易な製造を容易にするために好ましくは単一のポリペプチド鎖から構成されている。また、生物発光タンパクは、被結合ＩＧの機能性を抑制してしまうオリゴマーまたは骨材を好ましくは形成しない。生物発光タンパク・ウミシイタケ・ルシフェラーゼ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼおよびホタル・ルシフェラーゼは、これらの基準のすべてまたは大部分を満たす。
【００４４】
本願明細書において使われる用語「基質」は、生物発光タンパクと共に発光を生成または吸収するために用いることができるいかなる分子をも参照する。
【００４５】
基質の選択は、生物発光タンパクによって生成される光の波長および輝度に影響を与える。ウミシイタケ・ルシフェラーゼでは例えば、コエレンテラジン類似体が利用でき、４１８および５１２ナノメートルの間での光放射を生じる（イノウエ他（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２３３、３４９‐３５３）。コエレンテラジン類似体（４００Ａ、『ディープブルーＣ』）は、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ（ＰＣＴ出願ＷＯ０１／４６６９１）で４００ナノメートルで光を発することが記載された。
【００４６】
本発明によって使用される基質は、好ましくは細胞透過性であり、細胞内生物発光タンパクに利用できるように細胞薄膜を通過することが可能である。コエレンテラジンおよび大部分のその派生物は、高浸透性の細胞であり（シモムラ他（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．３２６：２９７‐２９８）、一方、ルシフェリンは効率的に哺乳動物細胞の薄膜と交差しない。しかしながら、細胞膜を通過し、細胞酵素または紫外線光によって細胞原形質内部で放出される閉じ込められたルシフェリン化合物は開発された（ヤン他（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１５,８４８‐８５０）。
【００４７】
本願明細書において使われる用語「蛍光タンパク」、蛍光またはリン光を発することができるいかなるタンパクをも参照する。本発明において採用された、異なる多くの蛍光タンパクがある。例えば、分子および細胞生物学で最も広く使われている蛍光タンパクは、クラゲビクトリア（チェン（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７,５０９‐５４４）からの緑の蛍光タンパク（ＧＦＰ）およびその配列から導かれる変種である。『強化された』蛍光タンパク（例えばＥＧＦＰ）は、溶解性および蛍光を増加させ、タンパク質の折畳みを加速する点変異によって開発された（ゼルニッカ‐ゲッツ他（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１２４,１１３３‐１１３７）。位置６４におけるＰｈｅからＬｅｕへの点変異は３７℃でタンパクの安定度を増加させ、位置６５におけるＳｅｒからＴｈｒへの変異は、蛍光を増加させる結果を生じる（オカベ他（１９９７）ＦＥＢＳ会報、４０７,３１３‐３１９；クロンテック社、パロアルト、カリフォルニア）。クロンテックから市販されているＥＧＦＰは、人間化されたコドン利用を組み込み、それが哺乳類の転写機構に「より異種でなく」なるようにさせ、最大限の遺伝子形質発現を保証する。加えて、緑の蛍光タンパクのスペクトル特性は特定のアミノ酸の部位特異的突然変異によって変えられることができ、例えば、ＥＧＦＰの青（ＥＢＦＰ）、シアン（ＥＣＦＰ）および黄色の（ＥＹＦＰ）変異体が生じられた（チャンほか（２００２）Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、３,９０６‐９１８）。蛍光タンパクの重要な他の種類は、サンゴの生物種のイソギンチャク（ＤｓＲｅｄ）からの赤い蛍光タンパク（ＲＦＰ）（マッツほか（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７,９６９‐９７３）、およびシライトイソギンチャク（ＨｃＲｅｄ）（グルスカヤ他（２００１）、ＦＥＢＳ会報、５０７,１６‐２０））である。
【００４８】
好ましくは高い蛍光量子収率を有する蛍光タンパクが、本発明で使われる。
【００４９】
好ましくは、本発明で使用される蛍光タンパク質類の分子量は、ＩＧ間の立体障害を避けるのに十分小さくなくてはならない。
【００５０】
好ましくは、単量体のタンパクは、被結合ＩＧの機能との集合および干渉を避けるために用いられる。ＧＦＰは弱い二量体を形成する、しかし、二量化への傾向は二量体化インタフェース（ザカリア他（２００２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６,９１３‐９１６）の疎水性アミノ酸の突然変異によって最小化することができる。赤い蛍光タンパクＤｓＲｅｄは、必須の四量体タンパクである。最近、ＤｓＲｅｄを二量体タンパク（ｄｉｍｅｒ２）に再生するＤｓＲｅｄ配列の１７の点変異が記述された。二量体のサブユニットは、モノマーとして物理的に作用する縄でつながれた二量体（ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２））を形成するためにペプチド・リンカーを経て連結することができる。追加的な１６の点変異は、ｄｉｍｅｒ２を単量体の変種（ｍＲＦＰ１）に変換する（キャンベル他（２００２）ＰＮＡＳ． ＵＳＡ（９９,７８７７‐７８８２））。赤い蛍光タンパクＨｃＲｅｄは、二量体タンパクであって、モノマーとして蛍光を生じない。しかしながら、２つのサブユニットは、第２のＮ‐末端と第１のサブユニットのＣ末端を連結している短いペプチド・リンカーによって融合することができる。この融合タンパク質（ｔ‐ＨｃＲｅｄ）は、ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）に類似した単量体のユニットとして効果的に作用する（フラドコフ他（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．（３６８,１７‐２１））。
【００５１】
好ましくは、本発明によって使用される蛍光タンパクは、それらのフルオロフォア形成のため、短い成熟時間を呈する。これらの分子のフルオロフォアは、ポリペプチド鎖の特定の再配列によって形成される。このプロセスは、１時間未満から２４時間以上かかる（チャン他（２００２）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ３,９０６‐９１８）。遅い成熟過程が機能的なＤＴの有効度および濃縮を制限するので、迅速に成熟するタンパクの使用が好まれる。迅速に成熟する蛍光タンパクは、例えば緑の蛍光タンパクＥＧＦＰおよびその色の変種、および赤い蛍光タンパクｔ‐ｄｉｍｅｒ２およびｍＲＦＰ１である。遅く成熟するタンパクは、例えばＤｓＲｅｄおよびＨｃＲｅｄである。
【００５２】
「蛍光部分」または「複数の蛍光部分」は、本願明細書において取換可能に使われ、蛍光を生成することができる非タンパク性の分子を参照する。非タンパク性の蛍光分子は、他の分子に付着することができる通常小さい分子である。各々の非タンパク性の蛍光分子は、特定の分光特性を有する。本発明において使われることができる多くの異なる蛍光部分が存在する。非制限的な例は、ローダミン、ローダミン派生物、ダンシル、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン派生物、オレゴングリーン、テキサスレッド、Ａｌｅｘａフルーア色素およびＣｙ色素を含む。本発明に関する蛍光部分のきわめて魅力的な種類は、蛍光ナノクリスタルである（ブルーチェス他（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１,２０１３‐２０１６）。蛍光ナノクリスタルは強い蛍光を呈し、それらの蛍光発光は１０００ナノメートル以上の波長範囲サイズの結晶によって調整することができる。全てのナノクリスタルの励起は、それらの蛍光発光から独立している同じ波長で発生する。それゆえに、様々なナノクリスタルは、同じ光源または同じ生物発光タンパクまたは蛍光分子からのＲＥＴを経て励起させられることができる。
【００５３】
好ましくは、高い蛍光量子収率を有する蛍光部分が使われる。
【００５４】
新しいタイプの蛍光部分は、最近報告され、タンパク性および非タンパク性の両方の成分を含む（グリフィン他（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１,２６９‐２７２；アダムズ他（２００２）、Ｊ． Ａｍ．Ｃｈｅｍ．１２４,６０６３‐６０７６）。重ヒ素化合物テトラシステイン・システムは、標的タンパク質にペプチドを含む短いテトラシステインを融合させる。このペプチドは、安定性のある、蛍光複合体を細胞浸透性のある非蛍光性の重ヒ素化合物色素により形成する。色素の分子構造に従い、異なるフルオロフォアが得られる。
【００５５】
本願明細書において使われる用語「エネルギ源」は、特定のフルオロフォアを活性化することができるいかなるエネルギ源をも参照する。好ましい実施例では、エネルギ源は光である。光源の非制限的な例は、レーザー、水銀ランプまたはキセノンランプを含む。光源は、発された光を特定の波長または特定の範囲の波長に制限する手段をさらに有する。例えば、これはフィルタ・ホイールまたはフィルタ・スライドに取り付けられる適切なフィルタ、単一の波長の光を生じるのみであるモノクロメータまたはレーザーである。
【００５６】
用語「非蛍光性失活剤」は、それ自体が光を発することなく蛍光光を吸収することができるいかなる周知のタンパク性のまたは非タンパク性の分子をも参照する。非制限する例は、ダブシル、ＱＳＹ失活剤、ＢＨＱ失活剤および非蛍光性ポシロポリン色素タンパクである。
【００５７】
本発明に関して、生物発光、蛍光タンパクまたは蛍光部分は、特定の物理的な特性と同様に共振エネルギ転移（ＲＥＴ）のための適切なスペクトル特性を有しなければならない。必要な基質がある限り、それらの光放射は好ましくは強く、一定でなければならない。生物発光タンパクおよび／または蛍光部分が直接または間接的にＩＧに連結することができるので、立体障害によるＩＧ間の相互作用の阻害を妨げるため、小さい生物発光および蛍光タンパクを使用することは、最も望ましい。
【００５８】
本願明細書において使用される用語「直接または間接的に連結された」は、分析または検出することができる媒介物を形成するため、タグがＩＧに付着または関連することを意味する。連結の好適な方法は、ＩＧおよびＤＴの性質によって決定される。
【００５９】
生物発光または蛍光タンパクは、直接または間接的に（例えば、リンカー基を経て）適切なＩＧに（例えば、共有結合で）連結する。媒介物に生物発光または蛍光タンパクを連結する手段は、公知技術である。タンパク性のＩＧおよびタンパク性のＤＴを直接連結する方法の例は遺伝子の融解であり、ここにおいて、ＩＧおよび生物発光または蛍光タンパクをコード化している遺伝子は、単一のポリペプチド鎖を生じるために融合する。
【００６０】
直接的な連結方法の別の例は共役であり、ここにおいて、フルオロフォアとＩＧの連結には、例えばリガーゼ、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドリダクターゼ、特にペルオキシダーゼのような酵素を使用する。
【００６１】
蛍光部分および非タンパク性の、非蛍光失活剤は、タンパク性のＩＧへのそれらの取付けは、よりむずかしく、タンパク性のＩＧに遺伝的に融合することができるタンパク性の蛍光部分とは対照的に、生体細胞内部で発生させることができないという不都合を有する。非タンパク性の蛍光部分および非蛍光失活剤のＩＧへの直接の連結の例は、共有結合をＩＧの特定の化学基により形成することできる反作用基に共有結合される部分を含む。例は、システイン残基のＳＨ基に化学反応するヨードアセトアミドおよびマレイミド、およびリジン残基のＮＨ３+‐基に化学反応するスクシンイミドのエステル、カルボン酸およびスルフォニルクロリドである（イシイ他．（１９８６）、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ５０、７５‐８９；スタロス他（１９８６）、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５６、２２０‐２２２；ルフェーブル他．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎjｕｇ．Ｃｈｅｍ．７,４８２‐４８９）。
【００６２】
一般的に蛍光部分または非蛍光失活剤をＩＧに付着させる別の周知の方法は、蛍光部分をＩＧに移植すること、またはその合成の間、蛍光部分をＩＧに組み込むことを含む。標識をつけられたＩＧは、例えばリセプタまたは核酸に対する選択的な結合、特定の酵素の活性化または阻害、または生物学的製剤薄膜に組み込む能力のような標識を外されたＩＧの臨界特性を保持することは重要である。例えば、ジピロメテンボロン二フッ化色素、ローダミン、ローダミン派生物、テキサスレッド、ダンシル、ウンベリフェロンなどの利用できる様々な蛍光部分が存在する。使われる様々な標識化の再調査または信号生成システムについては、米国特許Ｎｏ．４，３９１，９０４を参照のこと。
【００６３】
蛍光部分または非蛍光性失活剤を例えばタンパクまたは核酸のようなＩＧに連結する間接的な方法の一つの例は、ビオチンを結合することができる、アビジンのようなタンパクへの蛍光部分または非蛍光性失活剤の共有結合形成を含む。ここにおいて、ビオチンは、ＩＧおよび蛍光部分または非蛍光性失活剤は、ビオチンおよびアビジン間の相互作用を経て間接的に一緒に連結されるようにＩＧに共有結合する。
【００６４】
ＩＧおよび生物発光または蛍光タンパクの連結の間接的な方法の他の例は、リンカー基を経たものである。リンカー基は、結合能力との干渉を避けるため、媒介物から生物発光または蛍光タンパクを隔てるためにスペーサとして機能することができる。リンカー基はまた、媒介物上の置換基の化学的な反応性を増加させるのに役立ち、したがって連結効率を増加させる。化学的な反応性の増加はまた、別の方法では可能でない媒介物または媒介物上の官能基の使用を容易にする。
【００６５】
ホモおよびヘテロの両方の二官能性または多官能性の様々な試薬がリンカー基として使われることは、（イリノイ州・ロックフォードのピアスケミカル社のカタログに記載されるように）当業者に明らかである。例えば、連結はアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化された炭水化物残基で生じる。このような方法論を記載している米国特許Ｎｏ．４，６７１，９５８のような多数の参照が存在する。
【００６６】
一実施例において、タンパク性のＤＴまたはタンパク性のＩＧは、当業者にとって周知の標準分子生物学技術による発現ベクトルにＤＴまたはＩＧをコード化するＤＮＡの塩基配列を挿入することによって組み換えられて生じる。ＤＮＡの塩基配列は、使用可能な状態で適切な転写または翻訳調整要素に連結される。ＤＮＡの発現の原因となる調整要素は、第１のポリペチドをコード化しているＤＮＡ配列の５’に位置するのみである。同様に、端部翻訳および転写終結信号に必要とされるストップコードンは、第２のポリペチドをコード化しているＤＮＡ配列の３’に存在するのみである。融合されたＤＴおよびＩＧのポリペチドは、適切な宿主において発現される。従来技術における当業者にとって公知の様々な発現ベクトルのいずれかが本発明の明確な組換え型ポリペチドに使われる。組換え型ポリペチドをコード化するＤＮＡ分子を含む発現ベクトルによって変換またはトランスフェクションされた適切な宿主細胞において、発現は達成される。適切な宿主細胞は、原核生物、酵母および高等真核細胞を含む。好ましくは、使われる宿主細胞は、大腸菌、酵母、または、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞系である。
【００６７】
別の実施例では、タンパク性のＩＧ‐ＤＴ媒介物は、融解構造物として組み換えられて生じる。本発明の融合タンパク質をコード化しているＤＮＡの配列は、適切な発現ベクトルにタンパク性のＤＴポリペチドおよびＩＧポリペチドをコード化する別々のＤＮＡの塩基配列を組み立てるために周知の組換えＤＮＡ技術を使用して構成される。第１のＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチド・リンカーの有無にかかわらず第２のＤＮＡ配列の５’末端に結紮されるので、両方の配列の解読枠は、ＤＴおよびＩＧの生物学的活性度を保持する単一の融合タンパク質への２つのＤＮＡ配列のｍＲＮＡの翻訳を許容するように同調している。融解構造物内のＤＴおよびＩＧの配向は、その機能または発現を増加させるために交換される。
【００６８】
ペプチド・リンカー配列は、各々のポリペチドがその第２および第３期構造に折り畳まれることを保証するために十分な距離によって、生物発光タンパクおよびＩＧポリペチドを分離するために使われる。このようなペプチド・リンカー配列は、公知である標準技術を用いて融合タンパク質に組み込まれる。適切なペプチド・リンカー配列は、以下の要因に基づいて選択される：（１）それらの可撓性の延長された配座を採用する能力；（２）生物発光タンパクまたはＩＧ上の機能的なエピトープと相互作用することができるそれらの二次構造を採用することの不能性；および、（３）ポリペチド機能的なエピトープと化学反応、または融合タンパク質の溶解性を減少させるかもしれない疎水性または充電される残基の欠如。好適なペプチド・リンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。他の中性に近いアミノ酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａもまた、リンカー配列において使われる。リンカーとして有効に使われるアミノ酸配列は、マラテア他（１９８５）Ｇｅｎｅ、４０、３９‐４６；マーフィー他（１９８６）ＰＮＡＳ． ＵＳＡ、８３,８２５８‐８２６２；米国特許Ｎｏ．４、９３５、２３３および４、７５１、１８０において開示されるものを含む。リンカー配列は、長さにおいて１から約５０のアミノ酸である。生物発光タンパクまたはＩＧが必須ではない機能的なドメインを分離しておよび立体障害を妨げるために用いることができるＮ末端アミノ酸領域を有する場合、ペプチド配列は必要とされない。
【００６９】
結紮されたＤＮＡ配列は、使用可能な状態で適切な転写または翻訳調整要素に連結される。ＤＮＡの発現の原因となる調整要素は、第１のポリペチドをコード化しているＤＮＡ配列の５’にのみ位置する。同様に、端部翻訳および転写終結信号に必要とされるストップコードンは、第２のポリペチドをコード化しているＤＮＡ配列の３’にのみ存在する。
【００７０】
一実施例において、組換え型ポリペチドをコード化している配列は、アフィニティークロマトグラフィを経て融解構造物の純化を容易にするペプチドをコード化する配列にさらに遺伝的に融合する。この例は、ヒスチジン・タグ、マルトース‐結合タンパク質タグ、セルロース‐結合タンパク質タグ、インテインタグ、Ｓ‐タグおよびＧＳＴタグを含む。
【００７１】
もう一つの実施例では、組換え型ポリペチドをコード化している配列は、成熟核宿主細胞のまたは周囲培地への分泌のための特定の細胞小器官仕切りへの融解構造物のターゲッティングを容易にするペプチドをコード化する配列に遺伝的に融合する。この例は、核局在化信号、ミトコンドリアインポート配列、小胞的な細網をターゲットにしたＫＤＥＬ配列、およびエクスポート信号を含む。
【００７２】
さらにもう一つの実施例において、組換え型ポリペチドをコード化している配列は、真核細胞薄膜の貫通、およびしたがって細胞への融解構造物の取込みを容易にするペプチドをコード化する配列に遺伝的に融合する。（シュワルツ他．（２０００）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２,１６２‐１６７）。この例は、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク、ペルペス単式ウイルスＶＰ２２およびカポジＦＧＦ‐４から導かれるペプチド配列を含む。
【００７３】
組換えの方法の代替として、ポリペチドおよびオリゴペプチドが化学的に合成することができる。このような方法は、一般的に固体アプローチを含むが、また、溶液ベースの化学反応および連結または固体および溶液アプローチの組合せを利用することができる。タンパクを合成するための固体物理方法論の例は、メリフィールド（１９６４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５、２１４９；およびホートン（１９８５）ＰＮＡＳ． ＵＳＡ．８２,５１３２によって記載される。
【００７４】
ＩＧが上記の通りのタグで標識がつけられるならば、それらは、それからそれに付着した１つまたはそれ以上のタグを有する１つまたはそれ以上の他のＩＧと作用することができる。
【００７５】
一実施例において、すべてのＩＧ‐ＤＴ媒介物は、タンパク性であり、適切な宿主細胞のＩＧ‐ＤＴ融解構造物を発現するために遺伝子の融解によって連結される。ＤＴの活性化および検出は、ＩＧの集合と同様に生体宿主細胞内部、内部の細胞オルガネラ、細胞膜内部、またはその表面で発生する。
【００７６】
他の実施例では、ＩＧ‐ＤＴ媒介物のサブセットは、タンパク性であり、適切な宿主細胞のＩＧ‐ＤＴ融解構造物を発現するため、遺伝子の融解により連結される。ＩＧ‐ＤＴ媒介物の他のサブセット、タンパク性、非タンパク性のまたはその組合せが、宿主細胞薄膜を貫通する任意の能力を有して宿主細胞に加えられる。ＤＴの活性化および検出は、ＩＧの集合と同様に生体宿主細胞内部、内部の細胞オルガネラ、細胞膜内部、またはその表面で発生する。
【００７７】
また別の実施例ではＩＧ−ＤＴ媒介物はそれらの性質および準備方法に関係なく適切な緩衝物質を含む溶液で提供される。ＩＧ−ＤＴ媒介物は細胞抽出物、細胞片又は合成混合物の一部であり、又は少なくとも純度約９０％であり、最も好ましくは少なくとも純度約９９％である。
純化は、アンモニウム硫酸塩沈降、アフィニティーカラム、イオン交換、および／またはサイズ排除および／または疎水的相互作用クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動法などを含む技術の標準的な手順で発生する。（スコープス（１９８２）タンパク純化、スプリンガー‐オーバーフラグ、Ｎ． Ｙ．、ドイツ、酵素学における方法ｖｏｌ．１８２：タンパク純化のガイドアカデミック・プレス社、ニューヨーク（１９９０）参照のこと）
【００７８】
本発明は、供給体および／または受容基分子であることができるＤＴの対の連結を含む。したがって、本発明によって使われることができるＤＴは、その物性に基づいて選ばれることができ、共振エネルギ転移（ＲＥＴ）術では周知のように、２つが選ばれるので、それらは、一緒にＲＥＴ対の供給体および受容基分子を構成する。ＲＥＴ対の内のＤＴの１つが生物発光タンパクである場合、ＲＥＴは生物発光ＲＥＴ（ＢＲＥＴ）として公知である。ＲＥＴ対を形成しているＤＴの両方がフルオロフォアである場合、生じるＲＥＴは蛍光ＲＥＴ（ＦＲＥＴ）として公知である。周知の適切な供給体および受容基対の例は、以下からなる：ウミシイタケ・ルシフェラーゼおよび黄色の蛍光タンパク；ウミシイタケ・ルシフェラーゼおよび緑の蛍光タンパク；シアン蛍光タンパクおよび黄色の蛍光タンパク；フルオレセインおよびテトラメチルローダミン；および５‐２'‐アミノエチル）アミノナフタレン‐１‐スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）およびフルオレセイン。
【００７９】
Ｒ．ハウグランド、蛍光プローブおよび調査用化学薬品のハンドブック（第６版、１９９５年）を一般に参照する。フルオロフォアの一方または両方は、緑の蛍光タンパクのような蛍光タンパクである可能性があり、試験化合物および蛍光タンパクの融合タンパク質を準備することにより、試験化合物がタンパクまたはペプチドである場合、それは、特にフルオロフォアとして蛍光タンパクを使うために都合が良い。
【００８０】
本発明は、多数のＲＥＴ信号の同時的な検出、および、選択されなければならない特定の分光特性と生物発光または蛍光部分の組合せを含む。異なる実施例によるこれらの生物発光または蛍光部分の組合せのための一般のスペクトル必要条件および例は、用途の例と同様に以下に記載される：
（ｉ）複合検出システム‐‘ＯＲ’アッセイ
【００８１】
一実施例において、第１の受容基タグ（ＤＴ１）の発光スペクトルは、第２のタグ（ＤＴ２）および次のタグ（ＤＴ３+）の励起スペクトルに十分に重なり、一方で、ＤＴ１、ＤＴ２およびＤＴ３の発光最大量は、それらの別々の検出（図１および表１参照）を可能にするために十分に異なる。
表１
適切な基質または励起光によるＤＴ１の活性化のアッセイのタイプおよび予想される信号
2007511226.tif 000003
＊  数は、このＤＴの増加した信号を示す。
【００８２】
ＤＴの適切な組合せの例は、ＥＧＦＰまたはＥＹＦＰ（ＤＴ２）およびＤｓＲｅｄ、ｄｉｍｅｒ２またはｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）（ＤＴ３）との組合せでＤＴ１として使用される（４６０‐４９０ナノメートルで発する）ウミシイタケ・ルシフェラーゼまたはＥＣＦＰである。ＤｓＲｅｄおよび二量体変種は５００ナノメートル以下の弱いものだけを吸収するにもかかわらず、それらは、驚くほど強いＲＥＴ受容基を形成する。代替的に、重ヒ素化合物色素ＦｌＡｓＨおよびＲｅＡｓＨが、ＤＴ２およびＤＴ３として使われる（アダムズ他（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４、６０６３‐６０７６）。ＤＴ２およびＤＴ３のための他の代替物は、ＥＧＦＰまたはＥＹＦＰおよびＤｓＲｅｄに類似したスペクトル特性を有する蛍光部分である。その例は、Ａｌｅｘａフルーア４８８、オレゴングリーン５１４およびＡｌｅｘａフルーア５４６を含む。ＤＴ２およびＤＴ３のためのさらにもう一つの代替物は、蛍光ナノクリスタルである。すべてのナノクリスタルは、それらの発光波長から独立して、５００ナノメートル以下で光を吸収し（ブルーチェス他（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１,２０１３‐２０１６）、それらをこの種のアッセイのために理想的なＲＥＴ受容基にする。
【００８３】
この実施例の変種は、ペアをなす相互作用、すなわちＩＧ１：ＩＧ２およびＩＧ３：ＩＧ４が可能であるＩＧを含む２つの独立した相互作用のモニタを可能にする。本実施例において、ＤＴ１は直接または間接的にＩＧ１およびＩＧ３に連結され、一方でＤＴ２がＩＧ２に、ＤＴ３がＩＧ４に連結される。ＤＴのスペクトルの必要条件は変わらず残る。
【００８４】
本発明の本実施例の用途の一つの例は、信号伝達経路のモニタである。大部分の細胞信号送信イベントは、相互作用し、細胞核における遺伝子転写を通常含む応答へのリセプタからの信号を中継するタンパクのネットワークを含む。ＩＧは、ＩＧ２およびＩＧ３間の信号リンクとして作用するＩＧ２およびＩＧ３またはＩＧ１に信号を中継しているＩＧ１との信号送信経路の成分である。ＩＧが導かれることができる分子の信号送信の例は、ｒａｓおよびｒａｆタンパク、プロテインキナーゼＣ、ＭＥＫタンパクなどである（ディキク他（１９９９）Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３０、３６９‐３８７；ガトキンド他（１９８８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１７,１３３１‐１３４２；ラトレル他（１９９９）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１,１７７‐１８３；ローゼンガルト他（１９９８）Ｊ． Ｃｅｌｌ ｐｈｙｓｉｏ． １７７,５０７‐５１７）。
【００８５】
別の例は、遺伝子形質発現の転写調整である。これらの複合体の多重たんぱく質‐ＤＮＡ複合体および組成物の転写因子行為は、それらの特異性および活性を決定する（ウォルベルガー他  （１９９９）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ．、２８、２９‐５６）。例えば、転写因子Ｆｏｓは、細胞識別、成長、外部刺激などにしたがって、転写因子Ｊｕｎ系統の異なる構成メンバでヘテロダイマを形成する（チネノブ他（２００１）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０,２４３８‐２４５２）。ＩＧは、選択的にこれらの重要な転写調節因子の状態および活性をモニタするＦｏｓおよびＪｕｎ系統から導かれることができる。
【００８６】
本発明の本実施例の用途のさらなる例は、細胞信号伝達カスケードの２つの異なる部分のモニタである。信号は、活性化されたリセプタから相互作用し、互いにタンパクを活性化または停止するカスケードを経てそれらの効果的細胞内部位まで中継される。都合よく特徴を描写された例は、ＭＡＰＫ／Ｅｒｋ経路である（コブ他（１９９９）Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｏｌ． ７１: ４７９‐５００；ルイス他（１９９８）Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７４,４９‐１３９）。ＭＡＰＫ／Ｅｒｋ信号送信カスケードは、リセプタ・チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）、インテグリンおよびイオンチャネルを含む成長および識別に関係している様々なリセプタによって活性化される。ＩＧの対は、カスケードの信号送信分子の異なる相互作用している対から導かれる。各々の相互作用している対は、特定の段の活性化を示している特定のＲＥＴ信号（ＤＴ１‐ＩＧ１：ＩＧ２‐ＤＴ２およびＤＴ１‐ＩＧ３：ＩＧ４‐ＤＴ３）を提供する。これは、カスケードの上流の段（例えば、ＳＯＳ‐Ｒａｓ）とさらに下流の段（例えば ＭＥＫ‐Ｅｒｋ）との同時的なモニタを可能にする。この種のアッセイは、２つの検出された段の間にあるカスケードの成分を識別するために有用である。高スループット・スクリーニングおよび薬剤発見において、それが、２つの検出された段間の分子を操作している薬剤の確認のために使われる。
【００８７】
別の例では、アッセイは通常のタンパク対変異体の機能性を区別するために用いられる。腫瘍形成における変異体が活性化された受容体タンパク質‐チロシンキナーゼ（ＰＴＫｓ）の役割は、確立している。リセプタＰＴＫの活性化の重要な原則は、配位子が媒介となった二量体化である。増加した証拠は、リセプタＰＴＫの腫瘍形成活性化は、構成要素の二量体化に導く突然変異および細胞質の触媒ドメインの活性化を通じて発生することを示す（ハンター他（１９９７）、Ｃｅｌｌ、８８,３３３‐３４６）。一つの例は、慢性骨髄単球性白血病においてｔ（５：１２）トランスロケーションによって生成されたＴｅｌ‐ＰＤＧＦｂリセプタ融解である。ＴｅｌのＮ末端部分、Ｅｔｓ系統転写因子は、二量体化および構成要素のＰＴＫ活性化において生じるＰＤＧＦｂリセプタＰＴＫ遺伝子の全体の細胞質のドメイン全体と結合される（ゴーラブ他（１９９４）Ｃｅｌｌ、７７,３０７‐３１６）。本発明において提供されるアッセイ・システムは、リセプタ成分からＩＧを導き、不完全（変異体）なもの、および野性‐タイプ（通常）リセプタＰＴＫの両方の活性をモニタする。したがって、高スループット・スクリーニングおよび薬剤発見化合物において、通常の受容体機能を妨害せずに変異体リセプタを特に目標として識別することができる。これは、第１の主要なスクリーニング段の間、高度に特殊な化合物の識別を可能にする。
【００８８】
さらにもう一つの例において、この種のアッセイは、高スループット・スクリーニングにおいて使用される化合物のための内蔵制御を提供するために用いられる。一般に特に標的タンパク質の機能よりむしろタンパク機能を妨害する化合物は、疑陽性信号を生じることは共通の問題である。本発明によって提供されるアッセイ・システムについては、共通の相互作用しているパートナーとともに２つの異なる分子の機能性、例えば２つの異なる相互作用、それらに共通の下流のエフェクタ・タンパクβ‐アレスチンから独立したＧＰＣＲは、モニタされる。それゆえに、目標とされた相互作用は、一つのＲＥＴの対（ＤＴ１‐ＩＧ１：ＩＧ２‐ＤＴ２）によってモニタされる。第２の、関連する相互作用は、並列に（ＤＴ１‐ＩＧ１：ＩＧ３‐ＤＴ３）モニタされる。第１の対にのみ効果を呈し、第２の対に効果を呈さない化合物は、ターゲット特有である。両方のターゲット上の効果を有する化合物は、特定ではない効果を経て作用する。
【００８９】
さらにもう一つの例において、この種のアッセイは、他のものでな特定の生命体のための物質中毒性、すなわち宿主以外の寄生生物を殺す物質を識別するために用いられる。極めて重要なタンパク‐タンパク相互作用は、寄生生物のタンパクから導かれるＩＧによってモニタされる。同時に、宿主生物から導かれるＩＧと同等の相互作用は、モニタされる。アッセイは、寄生生物および宿主のタンパクを区別することが可能である物質の識別を可能にする。
【００９０】
概して高いスループット・スクリーニングのために、この種のアッセイは、他方（ＩＧ１：ＩＧ３）でなく、一方の相互作用（例えば ＩＧ１：ＩＧ２）を特に抑制または開始する化合物を発見するために用いることができる。第１の相互作用によって、１つのみが薬剤の所望の効果である第２のものと異なる細胞効果が生じるのでこれは重要である。それゆえに、この種のアッセイは、高度に細胞効果のために特定の薬剤の発生を容易にする。また、２つの異なる相互作用および機能性が同時に選び出されるので、この種のアッセイはスループットを増加させるために用いる。これは、試薬、コストおよび時間の有意な節減を生じる。
【００９１】
上記の分子の相互作用の状況は、多数の細胞機能性において重要な役割を果たし、例において記載されるものに限られないことは当業者に明らかである。
（ｉｉ） 複合体分子の付随物のための単純な検出システム‐‘ＡＮＤ’アッセイ。
【００９２】
一実施例において、ＤＴ１の発光スペクトルは、ＤＴ３ではなくＤＴ２の励起スペクトルと十分に重なる。ＤＴ３の励起スペクトルは、十分にＤＴ２の発光スペクトルと重なり、一方でＤＴ１、ＤＴ２およびＤＴ３の発光最大量は、それらの別々の検出を可能にするために十分に異なる（図２および表１）。ＤＴの適切な組合せの例は、ＥＧＦＰまたはＥＹＦＰ（ＤＴ２）およびｍＲＦＰ１（ＤＴ３）と結合するＤＴ１として標準コエレンテラジン基質（４６０‐４８０ナノメートルで発する）を使用したウミシイタケ・ルシフェラーゼである。代替的に、ＤＴ２としてのＥＧＦＰまたはＥＹＦＰは、類似したスペクトル特性を有する重ヒ素化合物色素ＦｌＡｓＨまたは蛍光部分で置換される。その例は、Ａｌｅｘａフルーア４８８およびオレゴングリーン５１４を含む。赤の蛍光タンパクｍＲＦＰ１は、類似したスペクトル特性を有する他の蛍光タンパクまたは蛍光部分で置換される。
【００９３】
この実施例の用途の例は、薬剤ターゲットの重要な種類を表す核受容器の活性のモニタである。一般に、核受容器は、それらの配位子が結合すると二量体化し、そして転写を活性化または抑制するＤＮＡに結合する（ツァイ、Ｍ． Ｊ．およびオマリーＢ． Ｗ．（１９９４）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６３: ４５１‐４８６）。この発明によると、核受容器二量体のサブユニットは、核受容器複合体の結合部を含む二本鎖ＤＮＡ破片と同様にＤＴで標識をつけることができる。自然な配位子または合成化合物によるリセプタが活性化すると、三量体のタンパク‐ＤＮＡ複合体が形成され、ＤＴはその近くに導かれ、ＤＴ１の活性化は、付随物の形成、したがってリセプタの活性化を示すＤＴ３からの信号を生じる。代替的に、リセプタを活性化している配位子または化合物は、ＤＴにリンクすることができる。化合物が二量体化を誘発し、したがってリセプタを活性化する場合のみ、ＤＴ３からの信号が得られる。リセプタを活性化することのないリセプタ・サブユニットに結合するのみの望まれていない化合物は、それゆえに除外される。分子の相互作用を検出する現行のシステムでは、この区別は可能ではない。
【００９４】
一般に本発明の本実施例は、複合体分子の付随物上での形成に対する単純な答えが望まれ、部分的に形成された付随物についての情報は重要でない場合、有用である。この実施例および次の実施例の多くの用途が重複し、そのシステムが特定の用途の複雑度の必要とされたレベル次第で選択される。
【００９５】
上記の分子の相互作用の状況は、数多くの細胞機能性において重要な役割を果たし、例に記載されるものだけに限られないことは、当業者に明らかである。
（ｉｉｉ）  複合体分子の付随物のための検出システム‐‘組合せ’アッセイ。
【００９６】
もう一つの実施例では、ＤＴ１の発光スペクトルは、ＤＴ２およびＤＴ３の励起スペクトルと十分に重なり、一方で、ＤＴ３の励起スペクトルもまた十分にＤＴ２の発光スペクトルと重なる。したがって、ＤＴ１‐ＤＴ２、ＤＴ１‐ＤＴ３およびＤＴ２‐ＤＴ３は、すべて適切なＲＥＴ対（図３および表２）を形成する。前述の実施例とは対照的に、本実施例における検出は、適切な基質またはエネルギ源によってＤＴ１を順番に活性化し、ＤＴ１、ＤＴ２およびＤＴ３の発光を検出し、そして、適切なエネルギ源によりＤＴ２を活性化し、ＤＴ２およびＤＴ３の発光を検出することによって発生する。代替的に、ＲＥＴが発生する場合、ＤＴ３はＤＴ１およびＤＴ２の減少した信号において生じる非蛍光性失活剤であってもよい。個別の信号の不在、存在または強度の組み合わされた表示は、複合体分子の付随物（表２）の組成物上の正確な情報を提供する。
【００９７】
短い一本鎖のオリゴヌクレオチドにすべて連結される３つの蛍光部分を含むＦＲＥＴシステムは、最近報告された（トン他（２００１）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２３,１２９２３‐１２９２４；米国特許Ｎｏ．６，６２７，７４８；ホースティン他（２００３）Ｃｈｅｍｐｈｙｓｃｈｅｍ． ４,７４５‐７４８）。それらのＤＮＡ分子は、単一の蛍光部分だけから構成されるラベルとは別の新規な蛍光ラベルを有するプローブとして作用する。ＦＲＥＴは、両方の第１および第２のフルオロフォアから、第３のフルオロフォアから得られる信号を増加させる第３のフルオロフォアまで発生する。類似したシステムは、短い二本鎖ＤＮＡ分子内で配座の変化をモニタするために適用された（リュー他（２００２）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．１２４,１５２０８‐１５２１６）。本発明においてしかしながら、一連の活性化および検出イベントと組み合わさられる３つの異なる標識は、これらの従来技術システムによって可能でなかった分子の相互作用の複雑な動的なシステムを分析するために用いられる。
【００９８】
適切なＤＴの例は、ＤＴ１としてＥＣＦＰ、ＤＴ２としてＥＹＦＰ、およびＤＴ３としてｍＲＦＰ１を含む。代替的に、ＤＴのいずれかは、類似したスペクトル特性を有し、互いに適切なＲＥＴ対を形成する蛍光部分で置換される。上記例においてｍＲＦＰ１は、Ａｌｅｘａフルーア５５５によって置換され、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰと連動して使われることができる。
【００９９】
発明のこの実施例および前述の実施例の用途の一つの例は、サイトカイン受容体信号の分析である。サイトカイン受容体は、それらの配位子の結合によって活性化される場合、薄膜に結び付いたサブユニットのヘテロダイマを形成する。一つのサブユニットは、通常配位子に特定であり、一方で、他方は信号伝達の原因となり、他の配位子‐特定のサブユニットによって共有される。活性化されたリセプタは、信号トランスデューサおよび転写（ＳＴＡＴ）タンパクのアクティベータの類の細胞内タンパクと相互作用する（イシハラ他（２００２）、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１５９２、２８１‐２９６）。したがって、サイトカイン受容体信号は、分子を変換する信号のネットワーク、および、多くの重なり合い、冗長な機能性を有するリセプタ分子を含む。特定の効果を特定の分子またはリセプタの動作に帰するのは、多くの場合、難しい。ＩＧは、リセプタが活性化され、二量体化する場合、適切なＲＥＴ対（ＤＴ１‐ＩＧ１：ＩＧ２‐ＤＴ２）を形成しているリセプタ・サブユニットから導かれることができる。
表２
ＤＴとして非蛍光性失活剤、および、適切な基質または励起光によってＤＴの活性化の予想される信号を含むアッセイ。数はこのＤＴの増加した信号を示し、ダッシュは他のＤＴの減少された信号／活性化なしを示す。
2007511226.tif 000004
【０１００】
リセプタによってさらに特定の信号トランスデューサの活性化をモニタするため、第３のＩＧは信号変換タンパク（ＩＧ３‐ＤＴ３）から導かれる。この分子が活性化されたリセプタと相互作用する場合、合成したエネルギはＤＴ２からＤＴ３まで伝導され、特定の波長の光はＤＴ３から発し、ＤＴ２および／またはＤＴ１からの信号は抑えられる。この信号は、この特定のサイトカイン受容体による特定の経路の活性化のために特定である。同じサイトカイン受容体による他の経路の活性化は、受容体活性化のための信号を生ずるが、特定の信号送信経路ではない。他のサイトカイン受容体経由の同じ経路の活性化は、信号を提供しない。
【０１０１】
別の例は、ホモまたはヘテロダイマを形成するＧ‐タンパク被結合リセプタ（ＧＰＣＲ）の分析である。最近の研究は、ＧＰＣＲはモノマーとして作用するだけでなく、変えられた配位子結合、信号送信およびエンドサイトーシスを生じさせホモおよびヘテロダイマとして作用することを示した（リオス他（２０００） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ９２,７１‐８７）。特定のリセプタの作動体または拮抗体として作用する薬剤の効果は、それゆえにこのリセプタの結合パートナー次第である。特定のリセプタ二量体によって媒介される細胞の反応に、薬剤の効果を制限することは、望ましい。本発明によって提供されるシステムは、特定のＧＰＣＲ二量体の活性をモニタする。ＧＰＣＲそれ自体は、ＩＧとして作用し、ＤＴ（ＩＧ２‐ＤＴ２、ＩＧ３‐ＤＴ３）に付着される。配位子（例えばβ‐アレスチン）が結合すると、ＧＰＣＲと相互作用する分子から、第３のＩＧ（ＩＧ１‐ＤＴ１）は導かれる。検出システムは、リセプタ・ヘテロダイマの形成を検出するだけでなく、配位子または薬剤は、リセプタ・ヘテロダイマ、それぞれのホモダイマまたはその組合せを活性化（またはブロック）するかどうかを区別することができる。
【０１０２】
別の例は、遺伝子形質発現の転写調整である。多重たんぱく質‐ＤＮＡ複合体において作用する転写因子およびこれらの複合体の組成物は、それらの特異性および活性を決定する（ウォルベルガー他（１９９９） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ２８,２９‐５６）。例えば、転写因子Ｆｏｓは、Ｊｕｎ転写因子系統の構成メンバとともにヘテロダイマとして活性するのみである（チネノブ他（２００１）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０,２４３８‐２４５２）。Ｆｏｓ／Ｊｕｎ二量体は、数多くの遺伝子の転写を活性化または抑制することができる。複合体の特異性および活性は、ＥＴＳ転写因子、ＮＦ‐ＡＴまたはＳｍａｄタンパクのような二量体と相互作用している追加的なタンパクによって調整される（ワン他（１９９４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４,１１５３‐１１５９；ストラニック他（１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２,１６４５３‐１６４６５；チャン他（１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９４,９０９‐９１３）。ＩＧは、適切なＲＥＴ対（ＤＴ１‐ＩＧ１：ＩＧ２‐ＤＴ２を形成するＤＴに付着したＦｏｓおよびＪｕｎタンパクから導かれることができる。このＲＥＴ信号は、特定のＦｏｓ／Ｊｕｎ組合せの機能的な二量体を示す。第３のＩＧは、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ複合体と相互作用している転写調節因子から導かれる。このＩＧは、ＩＧ３がＩＧ１：ＩＧ２複合体と相互作用する場合、ＤＴ２から伝導される光を発するまたは抑える第３のＤＴ（ＩＧ３‐ＤＴ３）に付着される。この信号は、タンパクの特定の組合せを含む三量体の複合体の活性のために特定である。他の調節因子との相互作用によるＦｏｓ／Ｊｕｎの活性化、または、同じ調節因子との異なるＦｏｓ／Ｊｕｎ複合体の活性化は、異なる信号を生じる。
【０１０３】
別の例は、新規な抗ウイルス剤の発達である。ＨＩＶおよび他のウイルスのための治療の大きな問題は、これまで開発されてきたすべての薬剤に対し段階的に抵抗力をつけるようなウィルスタンパク質の点変異によるウイルスの適応力である。ウイルス性ライフサイクルにおける多数のイベントをターゲットにした治療は、それゆえにより功を奏し、異なる薬剤の混合物、いわゆる併用療法は、広い臨床における広い用途を発見された。有望な、新規な反レトロウイルスの薬剤は、ウイルス侵入機構インヒビターである（スター‐スピア他（２００２）Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｍｅｄ． ２２,６８１‐７０１）。ＨＩＶウイルス粒子の侵入機構は、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４またはウイルス菌株次第である２つの細胞レセプタを経て媒介とされる。ウイルス表面が変化すると、ウイルス‐ＣＤ４相互作用をブロックしているだけの抗体または薬剤は、迅速にそれらの効率を緩める。本発明によって提供されるシステムは、両方のリセプタに結合するウイルスの同時的な検出を可能にする。２つのリセプタさらにウイルス性表面タンパク質は、三量体の複合体が形成される場合、特定の信号を生じるＤＴで標識をつけることができる。したがって、両方のリセプタと結合するウィルスタンパク質の配座の変化に必要とされた相互作用または阻害の両方とも効率的にブロックする化合物は、識別することができる。２つの極めて重要な相互作用が同時に目標とされるので、抵抗力のあるウイルスの出現はありそうもない。
【０１０４】
別の例では、発明は組成物、配座、大きい、安定性のある分子複合体の構築または解離を分析するために用いられる。異なるＲＥＴ信号の有無は、複合体の構築および機能、または複合体中の配座の変化／動き、または複合体の成分を示す。複合体の例は、転写因子複合体、リボソーム、プロテアソーム、シャペロン、オリゴマー・リセプタ、イオンチャネルなどを含む。
【０１０５】
概して、高スループット・スクリーニングおよび薬剤発見のために、この種のアッセイは、特定の複数成分分子の付随物の範囲内で、その環境において分子の機能性を抑制または活性化している化合物を発見するために用いることができる。他の付随物内の同じ分子の機能性は、影響を受ける可能性はない。
【０１０６】
上記の分子の相互作用の状況は、数多くの細胞機能性において重要な役割を果たし、例に記載されるものに限られていないことは当業者に明らかである。
【０１０７】
本願明細書において使われる用語「発された光を検出する」は、量的方法において特定の波長の光子を検出することができるいかなる検出装置をも参照する。この例は、光電子倍増管またはＣＣＤカメラを含む。検出器は、検出された光を特定の波長または波長の特定の範囲に制限する手段をさらに備える。これは例えば、フィルタ・ホイールまたはフィルタ・スライドまたはモノクロメータに取り付けられたフィルタに適切である。
【０１０８】
一実施例において、第１のＤＴはこのＤＴに特定の励起光によって活性化され、このＤＴおよび他のＤＴによって発される光が検出される。それから、第２のＤＴは活性化され、このＤＴおよび他のＤＴの発光は検出などをされる。表２において要約されるように、これらの配列の表示によって提供される組み合わせられた情報は、ＩＧ間の集合の情報を提供する。活性化および検出のこの配列は、運動データを得るために時間間隔をおいて反復される。この検出のいかなる時間においても、配列物質は加えられ、または、ＩＧの集合に影響する状態は、変わる。
【０１０９】
もう一つの実施例では、適切な基質は、第１のＤＴの活性化のために加えられる。励起光がオフにされる、または、遮断される一方、このＤＴおよび他のＤＴの発光は検出される。それから、第２のＤＴの活性化に特定の励起光はオンにされ、このＤＴおよび他のＤＴの発光は検出される。運動データを得るために、光源はそれぞれオフおよびオンにされ、検出モードは発光および蛍光検出の間で絶えず切替えることができる。この検出のいかなる時間においても、配列物質は加えられ、または、ＩＧの集合に影響する状態は、変わる。
【０１１０】
さらにもう一つの実施例において、第１のＤＴのために適切な基質が加えられる。励起光がオフにされる、または、遮断される一方、このＤＴおよび他のＤＴの発光は検出される。この第１の基質が使い果たされ、第１のＤＴからの光放射が中断される場合、第２のＤＴに適切な第２の基質が加えられる。励起光がオフにされる、または、遮断される一方、このＤＴおよび他のＤＴの発光は検出される。この検出のいかなる時間においても、配列物質は加えられ、または、ＩＧの集合に影響する状態は、変わる。
【０１１１】
発明は、次に以下の非制限的な例のみを参照してさらに記載される。しかしながら、以下の例は例証のためのみであって、上記した発明の大部分における制限としての方法とは考えられないと理解されなければならない。特に、発明が特定のタグおよび相互作用している基の用途に関して詳述する一方、本願明細書における結果がこれらのタグまたは相互作用している基に限られていないことは、明確に理解されるべきである。
例１
タンパク性のＦＲＥＴ対の分析
【０１１２】
この発明のアッセイのため、ＲＥＴが発生しないように十分に分離されるＲＥＴ対および他のものを形成するように、十分なスペクトル重複を持つタグを有することは重要である。ＲＥＴの効率は、フェルスター半径Ｒ０によって記載することができる。Ｒ０はエネルギ転移が５０％有効である距離である。すなわち励起した供給体のＦＲＥＴによって非活性化する。Ｒ０の大きさは、供給体および受容基色素のスペクトル特性に大部分を依存している：
Ｒ０＝〔８．８×１０２３＊ｋ２＊ｎ‐４＊ＱＹＤ＊Ｊ（ラムダ）〕１／６  ｏＡ
【０１１３】
ここで、ｋ２は双極子方向係数（範囲０から４：２／３はランダムな配向）、ＱＹＤは受容基の非存在下で供給体の蛍光量子収率または生物発光タンパクの発光容量、ｎは屈折率（水は１．３３であり、温度、イオン強度次第である）、Ｊ（ラムダ）は整数のスペクトル重複である。
【０１１４】
ＲＥＴの効率を調整するため、高量子収率および十分なスペクトル重複（すなわち、Ｊ（ラムダ）が大きい）を有する色素の選択は、最も重要な可変部分である。この発明のアッセイは生体分子に適切な水の培地において発生し、それゆえに、屈折率ｎの変異はほとんどない。色素の幾何学的配向、すなわち双極子方向係数ｋ２は、大部分の状態において、ランダムに方位に合わせられた分子のための数値である２／３に近い。これは、ＤＴとして大きな蛍光タンパクの用途が回転の自由を制限するにもかかわらず、標識付けは、付着された相互作用している基と関連する多少自由な色素の回転を可能にする可撓性のリンカーおよびスペーシング基で起こるからである。
【０１１５】
したがって、既存の蛍光タンパクのスペクトル特性およびこの発明のＤＴとしてのそれらの用途が検査された。潜在性ＲＥＴを調査する相互作用のための単純なモデル系として、タンパク性のＤＴの融合タンパク質は、生成された。これは最も理想的である、永久的な相互作用であり、したがって、ＲＥＴが発生することができる大きさを定義するのに適する。７‐１８アミノ酸の長さを有したリンカーによって、ＤＴサブユニットは分離された。リンカー配列は最大の可撓性のため、大部分はセリンおよびグリシン残基を含んだ。これは、互いへのサブユニットの自由な回転を可能にし、好ましくない幾何学的配向によるＲＥＴ信号の減失を妨げた。
【０１１６】
ｍＲＦＰ１、ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰおよびＥＹＦＰの暗号配列は、以下のオリゴヌクレオチド（表３）：ｍＲＦＰ１‐ｆｗ／ｒｅ、テンプレート：ｐＲＳＥＴＢ‐ｍＲＥＰ１（キャンベル他（２００２）ＰＮＡＳ．ＵＳＡ、９９、７８７７‐７８８２）；ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）：ｍＲＦＰ１‐ｆｗ／ｔ ｄｉｍｅｒ２ （１２）‐ｒｅ、テンプレート：ｐＲＳＥＴＢ‐ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）（キャンベル他（２００２）ＰＮＡＳ．ＵＳＡ、９９、７８７７‐７８８２；ＥＧＦＰ‐Ｐ３‐ｆｗ／ｒｅ、テンプレート：ｐＥＣＦＰ‐Ｎ１（クロンテック）；ＥＧＦＰ‐Ｐ２‐ｆｗ／ｒｅ、テンプレート：でＰＣＲを経て増幅された：
表３
オリゴヌクレオチド配列
2007511226.tif 000005
【０１１７】
ｐＥＧＦＰ‐Ｎ１ （クロンテック）；ＥＧＦＰ‐Ｐ２‐ｆｗ／ｒｅ、テンプレートｐＥＹＦＰ‐Ｎ１（クロンテック）。図４で概説されるように、生成物の端部は適切な制限酵素によって切断され、ベクターｐＥＴＤｕｅｔ‐１にクローンをつくられた。必要であれば、ペプチド・スペーサをコード化して、オリゴヌクレオチド・リンカーは、サブユニットの間で挿入された。これは、以下の構造物を生じた：ｐＥＴ‐ｍＲＦＰ１、ｐＥＴ‐ｔ ｄｉｍｅｒ２ （１２）、ｐＥＴ‐ＥＣＦＰ、ｐＥＴ‐ＥＧＦＰ、ｐＥＴ‐ＥＹＦＰ ＥＣＦＰおよびｐＥＴ‐ｔ‐ｄｉｍｅｒ２（１２）‐１２‐ＥＣＦＰ。ここで、サブユニット間の数はリンカー（図４）の長さおよび位置を表す。
【０１１８】
大腸菌ロゼッタ細胞（ノバジェン）は、これらのプラスミドによって変換され、ＯＤ６００＝０．７に達するまで、１００ｍｌの培養液において３７℃で成長させた。合計０．５ｍＭのＩＰＴＧが加えられ、培養液は朝まで２０℃で撹拌器において培養された。細胞は、３５００ｘ ｇで３０分間の遠心沈殿法によって集められた。細胞ペレットの半分は、後に使用するため‐８０℃で冷凍された。もう半分は、製造業者の説明書にしたがって８００μｌ（マイクロリットル）のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬（ノバジェン）によって溶解された。タンパクは、製造業者の説明書にしたがって３００μｌ（マイクロリットル）のＨｉｓＭａｇ磁性ビーズ（ノバジェン）を用いてそれらのＮ末端Ｈｉｓ‐タグを経た純粋な溶菌液から精製された。タンパクのスペクトル特性は、ケアリー・エクリプス蛍光分光計（バリアン）によって決定された。
【０１１９】
ｍＲＦＰ１、ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰおよびＥＹＦＰのスペクトル特性およびスペクトル重複は、図５において示される。すべてのスペクトルは、それらの最大励起および発光（任意の値‘１’）に標準化された。ＥＣＦＰおよびＥＧＦＰは大きいスペクトル重複を示すが、それらの励起スペクトルの区別はほとんど示さない、一方、ｍＲＦＰ１励起は蛍光発光（図５ａ）との重複をほとんど有しない。特徴を描写されたＦＲＥＴ対ＥＣＦＰ‐ＥＹＦＰは、供給体発光および受容基励起間の有意な重複を示す、一方で供給体および受容基励起が十分に分離される。ＥＹＦＰまたｍＲＦＰ１励起とよく重なり、ＥＹＦＰおよびｍＲＦＰ１は適切なＲＥＴ対（図５ｂ）を形成することが可能であることを示唆する。発光最大量の大きい分離にもかかわらず、ＥＣＦＰおよびｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）は、驚くほど大きいスペクトル重複を示し、それは、ＥＣＦＰ‐ＥＹＦＰ対（図５ｃ）とは別のスペクトルである発光を有する適切なＲＥＴ対の潜在性形成を示す。
【０１２０】
次に、融合タンパク質のサブユニット間のＲＥＴが分析された（図６）。ＥＹＦＰ‐１２‐ＥＣＦＰおよびｔ‐ｄｉｍｅｒ２（１２）‐１２‐ＥＣＦＰ融合タンパク質は４４０ｎｍで励起され、発光は４６０および７００ｎｍの間でスキャンされた。同じスキャンは、ＥＹＦＰおよびｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）タンパクで実行された。さらなるスキャンは、融合タンパク質および蛍光タンパク・スペクトルからバックグラウンドとして減じられた空の孔で実行された。供給体フルオロフォアを励起しないより長い波長、すなわち、ＥＹＦＰには４９０ｎｍ、ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）には５４０ｎｍの励起光を使用して、それらの受容基フルオロフォア発光に標準化した後、ＥＹＦＰスペクトルをＥＹＦＰ‐１２‐ＥＣＦＰスペクトルから、ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）スペクトルをｔ‐ｄｉｍｅｒ２（１２）‐１２‐ＥＣＦＰスペクトルから減ずることによって、スペクトルは、光源による受容基フルオロフォアの直接の励起のための光放射のためにさらに修正された。最後に、修正されたＦＲＥＴスペクトルは、データ（図６）の比較を可能にするため、最大発光が４８０ｎｍのＥＣＦＰで任意の値‘１’に標準化された。有意なＦＲＥＴ信号は、受容基フルオロフォアとしてＥＹＦＰおよびｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）の両方で観察された。物理的に供給体ＤＴにより近いために１つの蛍光基のみがＲＥＴ信号にかなり関与する一方、ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）蛍光タンパクは、直接の励起バックグラウンド信号を２倍にする２つの蛍光基を効果的に含むのでこのことは注目に値する。それゆえに、ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）としての類似したスペクトル特性を有する純種の単量体の蛍光タンパクまたは非タンパクのフルオロフォアを用いて、検出システムはさらに改良することができた。
例２
タンパク性のＢＲＥＴ対の分析
【０１２１】
ＤＴとしての生物発光タンパクの使用は、発光に十分なスペクトル重複をもつ蛍光ＤＴを必要とする。生物発光タンパクＤＴとしてウミシイタケ・ルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、タンパク性のＤＴ ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）およびｍＲＦＰ１の間のＲＥＴへの潜在性が調査された。また、相互作用のための単純なモデル系として、Ｒｌｕｃおよびタンパク性のＤＴ間の融合タンパク質は、生成された。
【０１２２】
Ｒｌｕｃのための遺伝子は、以下のオリゴ、Ｒｌｕｃ‐Ｐ３‐ｆｗ／ｒｅ、テンプレートｐｈＲＬ‐ＣＭＶ（プロメガ）でＰＣＲを経て増幅された：適切な制限酵素を使用して、ＰＣＲ生成物は例１からのベクターにクローンをつくられ、構造物ｐＥＴ‐Ｒｌｕｃ、ｐＥＴ‐ＥＧＦＰ‐１５‐Ｒｌｕｃ、ｐＥＴ‐ＥＹＦＰ‐７ Ｒｌｕｃ、ｐＥＴ‐ｔ‐ｄｉｍｅｒ２（１２）‐１５‐ＲｌｕｃおよびｐＥＴ‐ｍＲＦＰ１‐１５‐Ｒｌｕｃを生じる。ここで、サブユニット間の数がリンカー（図４）の長さおよび位置を表す。
【０１２３】
実施例１にて説明されたように、タンパクは大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。発光スペクトルは、Ｒｌｕｃ（図７）のための基質としての５μＭのコエレンテラジンｈを加えた後、ケアリー・エクリプス発光分光計（バリアン）によって記録された。スペクトルは、それらの発光最大量（任意の数値‘１’）に標準化された。Ｒｌｕｃと比較して発生している追加的なピークは、ＲＥＴによるものであり、すべての受容基ＤＴと共に観察された。
【０１２４】
スペクトルから、ＲＥＴ比率（ＲＲ）は、ＲＥＴ（図８）のための度量衡単位として算出された。ＲＥＴ比率はまた距離の指標であり、ＤＴ間の配向である。比率は、次のように算出された：
【０１２５】
発光ピークは、この範囲内で発光数値を加えることによって、ＤＴの発光最大量に適用される１０‐２０ｎｍのウインドウにおいて一体化された。
【０１２６】
黄色および赤色のチャネルの単純なＲＥＴ比率（ＲＲ）は、算出された：
ＲＲＹ＝ｙｅｌｌｏｗ／ｂｌｕｅ
ＲＲＲ＝ｒｅｄ／ｂｌｕｅ
ここで、青色はＲｌｕｃ発光ピーク下のピーク面積であり、黄色はＥＧＦＰまたはＥＹＦＰ発光ピーク下のピーク面積であり、赤色はｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）またはｍＲＦＰ１発光ピーク下のピーク面積である。スペクトルが集積化の前に第１の（供給体）ＤＴ発光最大量に標準化される場合、受容基ＤＴ下のピーク面積の値、および、ＲＥＴ比率は、相関的な関係における用語の同一の結果を提供する。
【０１２７】
標準化されたＲＥＴ比率（ＲＲｎｏｒｍ）は、エネルギ供給体のみによって得られた信号のために修正された比率である。
ＲＲＹｎｏｒｍ＝ＲＲＹ‐ＲＲＹ０；ＲＲＹ０＝ｙｅｌｌｏｗ０／ｂｌｕｅ０
ＲＲＲｎｏｒｍ＝ＲＲＲ‐ＲＲＲ０；ＲＲＲ０＝ｒｅｄ０／ｂｌｕｅ０
ここで、ｂｌｕｅ０、ｙｅｌｌｏｗ０、および、ｒｅｄ０は、相互作用がない場合、第１の（供給体）ＤＴおよび他のＤＴを有するＲＥＴの同等のピーク下の領域である。
【０１２８】
結果（図８）は、標準ＥＹＦＰ受容基ＤＴより良好な信号対雑音比を達成する一方、ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）発光は、ＥＧＦＰまたはＥＹＦＰ発光のいずれからも驚くべきことによく区別されることを示した。ＥＧＦＰおよびＥＹＦＰは、ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）およびｍＲＦＰ１と同様に、明確に分離することができず、それぞれのチャネル間で有意な‘漏出現象’を示した。ｍＲＦＰ１発光がＥＧＦＰから１００ナノメートル分離されたにもかかわらず、Ｒｌｕｃが本質的にｍＲＦＰ１を活性化することができず、結果として、弱い赤い蛍光信号のみが検出されるので、信号分離はそれでも欠陥があった。
例３
非タンパク性のＢＲＥＴ対の分析
【０１２９】
ＤＴの選択は、タンパク性の分子に制限されない。スペクトル特性のより広い範囲で利用でき、それらの小型サイズにより付着された相互作用している基の機能性を妨害する可能性が減るので、ＤＴとして小型蛍光分子が多くの用途のための利点に提供する。生物相互作用のためのモデル系として、ビオチン基に対するタンパク・ストレプトアビジンの強い親和力が使用された。ストレプトアビジンは、多くの異なる小型分子蛍光色素を有する結合体として利用できる。
【０１３０】
ＡＴＰがある場合には、‘大腸菌酵素ビオチン・リガーゼ（ｂｉｒＡ）が、‘ａｖｉｔａｇ’と呼ばれる特定の１３‐アミノ酸ペプチド配列のリジン残基に対するビオチン基の付着の媒介となる（シャッツ（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１,１１３８‐１１４３）。ａｖｉｔａｇの暗号配列は、交雑されたオリゴヌクレオチドＡｖｉｔａｇＮ‐ｆｗ／ｒｅ（表３）からなるリンカーとして、構造物ｐＥＴ‐Ｒｌｕｃに挿入された。リンカーは、この構造物の位置１（図４）にクローンをつくられた。ビオチン・リガーゼのための暗号配列は、テンプレートとして大腸菌Ｔｏｐ１０株を使用してオリゴヌクレオチドｂｉｒＡ‐ｆｗ／ｒｅによって増幅された。ｂｉｒＡ遺伝子は、標的配列の量的ビオチン化のためにビオチン・リガーゼを共発現するため、構造物（図４）の位置４にクローンをつくられた。ビオチニル化されたＲｌｕｃタンパクの発現のために生じた構造物は、ｐＥＴ‐Ａｖｉ‐１５‐Ｒｌｕｃ／ｂｉｒＡと呼ばれた。
【０１３１】
例１にて説明されたように、タンパクは大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。タンパクのはっきりしない相互作用を妨げるため、ビオチン‐Ｒｌｕｃタンパク溶液にＢＳＡが２ｍｇ／ｍｌの終末濃度に加えられた。ストレプトアビジン結合体のほぼ等モル量が溶液に加えられ、Ｒｌｕｃ（図９）のための基質としての５コエレンテラジンｈの添加の後、ケアリー・エクリプス（バリアン）発光分光計で発光スペクトルが記録された。スペクトルは、それらの発光最大量（任意の値‘１’）に標準化された。
【０１３２】
すべての小型蛍光色素はＤＴとして適切であり、基質コエレンテラジンｈ（図９）がある場合には、ＲＥＴ信号を生じた。Ａｌｅｘａフルーア４８８は、Ｒｌｕｃ発光との最大のスペクトル重複を有して、したがって最も高いＲＥＴ信号を示した。驚くことに、しかしながら使用されるスペクトルで最も遠い色素であるＡｌｅｘａフルーア５９４は、類似したまたは、スペクトルでより重なり合う色素Ａｌｅｘａフルーア５５５およびＡｌｅｘａフルーア５６８よりも大きなＲＥＴ信号を生じた。非ビオチニル化されたＲｌｕｃが逆制御として使われ、類似した濃縮のストレプトアビジン結合体がある場合にはＲＥＴ信号を生じず、ビオチン‐ストレプトアビジン・モデル相互作用の特異性を確認した。
【０１３３】
この発明のアッセイの重要な側面は、それらが量的および感受性がある度量衡単位を生物相互作用に提供するということである。ストレプトアビジン結合体の系列希釈は、ビオチニル化されたＲｌｕｃさらに２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡによって培養された。５ μＭのコエレンテラジンｈを加えた後、発光スペクトルは記録され、ＲＥＴ比率は、それぞれの色素の発光最大量の集積化範囲を調整して実施例２からの方程式を使用して算出された。図１０は、オレゴングリーンおよびＡｌｅｘａフルーア５９４の両方の結合体を示し、ストレプトアビジン結合体濃度に関連づけられるＲＥＴ比率は検出システムが量的度量衡単位を相互作用に提供したことを証明する。Ｒｌｕｃ発光との小さいスペクトル重複にもかかわらず、Ａｌｅｘａフルーア５９４は、ビオチン‐ストレプトアビジン相互作用を検出する際、より多く重なり合うオレゴングリーンと同じように感受性があることはまた注目に値した。
例４
同時的な複合ＲＥＴ検出
【０１３４】
本発明によれば多数の生物相互作用が同時にかつ量的方法で（‘多重化で’）検出することができる。この可能性を調査するため、実施例２および３において使用されたモデル系は、それらの多重化能力を検査された。
【０１３５】
例２において、タンパク性のＤＴ、ＥＧＦＰおよびｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）は、それらの発光最大量間の十分なスペクトル解像度のために、多重の組合せの潜在性ＤＴと確認された。ＥＧＦＰ‐１５‐Ｒｌｕｃおよびｔ‐ｄｉｍｅｒ２（１２）‐１５‐Ｒｌｕｃ融合タンパク質の濃度は、類似した濃度に調整された。タンパク溶液は、段階を追って５：０、４：１・・・１：４、０：５の比率で混合された。Ｒｌｕｃ基質コエレンテラジンｈは５μＭの終末濃度に加えられ、発光スペクトルは記録された。ＲＥＴ比率は算出され、２つのチャネル（図１１ａ）のより容易な比較のため、最高値（任意の値‘１’）に標準化された。
【０１３６】
多重検出は、ビオチン‐ストレプトアビジン相互作用モデルを使用して、さらに検査された。ビオチニル化されたＲｌｕｃさらに２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡは、一つのチューブで等モル量のストレプトアビジン‐オレゴングリーン、分離したチューブでストレプトアビジン‐Ａｌｅｘａフルーア５９４と混合された。溶液は、５：０、４：１・・・１：４、０：５の比率で段階を追って混合された。Ｒｌｕｃ基質コエレンテラジンｈは５μＭの終末濃度に加えられ、発光スペクトルは記録された。ＲＥＴ比率は算出され、２つのチャネル（図１１ｂ）のより容易な比較のため、最高値（任意の値‘１’）に標準化された。
【０１３７】
両方の実験において、正確な多重化が達成された：両方のチャネルの信号は独立して検出され、異なる複合体および混合物内で相互作用に関する正確な情報を提供した。
【０１３８】
要約すると、この例は、本発明が様々な用途および実施例の生物相互作用の多重検出を可能にすることを証明する。これは、使用するモデルから独立し、かつ、ＤＴの性質から独立していることを示した。
例５
哺乳動物細胞の多重検出（１）
【０１３９】
Ｇタンパク被結合リセプタ（ＧＰＣＲｓ）の機能性の重要な側面は、ホモ二量体型複合体を形成するそれらの能力である。この例では、本発明のアッセイ・システムは、複数リセプタ‐リセプタ相互作用を検出するために検査された。リセプタが膜タンパク質であるので、それらの機能的な抽出および精製は、しばしば困難または不可能である。それゆえに、この発明のアッセイ・システムがまた、生体の哺乳動物細胞において使われた。
【０１４０】
オリゴヌクレオチドＭＣＳ‐ｌｉｎｋｅｒ‐ｆｗおよびＭＣＳ‐ｌｉｎｋｅｒ‐ｒｅ（表３）は交雑され、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（‐）（インビトロジェン）のＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限サイトにクローンをつくり、ベクターｐｃＤＮＡ‐ＭＣＳを生じる結果になった。リンカーは、翻訳開始部位およびオープンリーディングフレームの始まりと同様に、タンパクの高度発現に最適なコザック配列を提供した。
【０１４１】
実施例１にて説明したように、蛍光タンパクＥＣＦＰ、ＥＹＦＰおよびｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）をコード化している相補ＤＮＡは、オリゴ ＥＧＦＰ‐Ｐ１‐ｆｗ／ＥＣＦＰ‐Ｐ３‐ｒｃ（ＥＧＦＰまたはＥＹＦＰ）およびｍＲＦＰ‐ｆｗ／ｔ‐ｄｉｍｅｒ２（１２）‐Ｐ３‐ｒｅ（ｔ‐ｄｉｍｅｒ２（１２））を使用して、ＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ生成物は、ベクターｐｃＤＮＡ‐ＭＣＳ‐ＥＣＦＰ、ｐｃＤＮＡ‐ＭＣＳ‐ＥＹＦＰ、ｐｃＤＮＡ‐ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）を生じているプラスミドｐｃＤＮＡ‐ＭＣＳにクローンをつくられ、各々は哺乳動物細胞の蛍光タンパクを発現することができる。ＣＣＲ２リセプタをコード化している相補ＤＮＡは、オリゴＣＣＲ２‐ｆｗ／ＣＣＲ２‐ｒｅを用いてＰＣＲによって増幅された。相補ＤＮＡテンプレートは、ガスリー研究所（米国）で得られた。ＰＣＲ生成物は、蛍光タンパクを有するリセプタのＣ末端融解の発現構造物を組み立てるため、プラスミドｐｃＤＮＡ‐ＭＣＳ‐ＥＣＦＰ、ｐｃＤＮＡ‐ＭＣＳ‐ＥＹＦＰおよびｐｃＤＮＡ‐ＭＣＳ‐ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）へ蛍光タンパク５’のクローンをつくられた。ＴＲＨＲ ＧＰＣＲは、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＮｏｔＩを使用して、ｐｃＤＮＡ３‐ＴＲＨＲ／Ｒｌｕｃベクターから切除された（クルーガー他（２００１）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．, ２７６：１２７３６‐１２７４１））。この破片は、ｐｃＤＮＡ‐ＭＣＳ‐ＥＣＦＰ、ｐｃＤＮＡ‐ＭＣＥ‐ＥＹＦＰおよびｐｃＤＮＡ‐ＭＣＳ‐ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）ベクターにクローンをつくられた。結果として生じた最終のプラスミドは、ｐｃＤＮＡ‐ＣＣＲ２ ＥＣＦＰ、ｐｃＤＮＡ‐ＣＣＲ２ ＥＹＦＰ、ｐｃＤＮＡ‐ＣＣＲ２‐ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）、ｐｃＤＮＡ‐ＴＲＨＲ ＥＣＦＰ、ｐｃＤＮＡ‐ＴＲＨＲ ＥＹＦＰ、ｐｃＤＮＡ‐ＴＲＨＲ‐ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）と名付けられた。
【０１４２】
粘着性の哺乳動物細胞系Ｃｏｓ‐７ 細胞は、リセプタ融解構造物を発現するために用いられた。細胞は、標準培養条件の下で約６０％の合流密度に成長された。細胞は、製造業者の手順によってＧｅｎｅｊｕｉｃｅ（ノバジェン）トランスフェクション試薬を用いて、１つまたはいくつかの発現ベクトル組合せによってトランスフェクションされた。標準培養条件下での２日のインキュベーション後、細胞はトリプシン処理され、細胞懸濁液の濃度はＰＢＳにおいて約５００００の細胞に調整された。
【０１４３】
これらの細胞懸濁液は、バリアン・エクリプス蛍光分光計（バリアン）を用いて蛍光分光学法によって分析された。サンプルはＥＣＦＰの励起最大量の４４０ｎｍで励起され、蛍光発光は、４６０および７００ｎｍの間で記録された。受容基フルオロフォア（ＥＹＦＰまたはｔ‐ｄｉｍｅｒ２（１２））の直接の励起のための発光は、実施例１にて説明されたように、スペクトルから減じられた。修正スペクトルは、ＥＣＦＰ（任意の値‘１’）の発光最大量に、さらに標準化され、リセプタ‐ＥＣＦＰ融合タンパク質（図１２）のみを発現するサンプルに比較された。ホモダイマ形成は、両方のＲＥＴ対によって両方のリセプタのために検出された。ホモダイマ形成は、個別にまたは同時に検出することができた（図１２ｂ）。
【０１４４】
結果を数量化するため、例２にて説明されたように、スペクトルは一体化され、受容基ピークのピーク面積は算出された。図１３は、黄色および赤色のチャネルが多重システムのために必要に応じて独立して検出することができることを示す。それは、ＴＲＨＲホモダイマ複合体の範囲内で、相互作用はより強い、または、ＤＴはＣＣＲ２複合体と比較してより良好な配向に配置されることをさらに示す。より弱い相互作用にもかかわらず、ＣＣＲ２ホモダイマ相互作用は、ＲＥＴ受容基（図１３ａ）として、ＥＹＦＰまたはｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）を使用することにより容易に検出された。２つのホモダイマ相互作用が同時に検出された場合、絶対的な信号は各々の個別的な信号より低いが、バックグラウンド信号（図１３ｂ）よりは上であった。これは、３倍対二重共トランスフェクション細胞のより低い数において生じるここで使用される一時的なトランスフェクション・システムのためであった。
【０１４５】
要約すると、この例は、本発明に記載される検出システムが、生体哺乳動物細胞における膜タンパク質中の相互作用の量的、複合検出のために有用なアッセイを提供することを証明する。生体細胞の代わりに、薄膜調製または膜分画が膜タンパク質の分析のために使われることができるのは明らかである。
例６
哺乳動物細胞の多重検出（２）
【０１４６】
細胞信号は、薄膜に結合した細胞表面リセプタと細胞質のタンパクの相互作用を含む。ＧＰＣＲのため、細胞質のタンパクβ‐アレスチンン‐２との相互作用は、配位子による活性化の後、リセプタ除感作およびインターナリゼーションのための重要な役割を果たす。この例では、異なるリセプタの活性化は、リセプタβ‐アレスチンン‐２相互作用を検出するために多重アッセイ・システムにおいて検査された。これは、β‐アレスチンン‐２と相互作用するため、配位子結合後、リセプタが細胞キナーゼによって修正されなければならないので生体哺乳動物細胞において実行された。また、機能的な薄膜結合リセプタの単離は達成するのが困難である。
【０１４７】
Ｒｌｕｃ（Ｒｌｕｃ‐Ｂａｒｒ２）に融合するＮ‐末端のウシ属のβ‐アレスチンン‐２の発現のための構造物は、Ｂａｒｒ２‐ｆｗおよびＢａｒｒ２‐ｒｅプライマを用いてＰＣＲによってウシ属のβ‐アレスチンン‐２の暗号配列の増幅によって構成された。（テンプレート：ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）のウシ属のβ‐アレスチンン‐２を含む構造物。）使用された５’および３’のプライマは、制限酵素部位ＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩをそれぞれ含有した。Ｒｌｕｃのための暗号配列を含む第２のＰＣＲ生成物は、テンプレートとしてプラスミドｐＲＬ‐ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、プライマＲｌｕｃ‐ｆｗおよびＲｌｕｃ‐ｒｅでＲｌｕｃ相補ＤＮＡ配列を増幅されて生成された。この第２のＰＣＲ生成物は、５’および３’末端でＨｉｎｄＩＩおよびＥｃｏＲＶ制限部位をそれぞれ含有した。両方のＰＣＲ生成物は、それからｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ部位に、一緒にクローンをつくられた。Ｒｌｕｃ‐β‐アレスチンン‐２融合タンパク質の哺乳動物発現のために生じたプラスミドは、ｐｃＤＮＡ‐Ｒｌｕｃ Ｂａｒｒ２と名付けられた。
【０１４８】
哺乳類の細胞系Ｃｏ‐７は、ｐｃＤＮＡ‐Ｒｌｕｃ Ｂａｒｒ２、ｐｃＤＮＡ‐ＴＲＨＲ ＥＹＦＰおよびｐｃＤＮＡ‐ＣＣＲ２‐ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）、または、ｐｃＤＮＡ‐Ｒｌｕｃ‐Ｂａｒｒ２、ｐｃＤＮＡ‐ＴＲＨＲ‐ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）およびｐｃＤＮＡ‐ＣＣＲ２ ＥＹＦＰの３つのプラスミドによって同時にトランスフェクションされた。トランスフェクションは、製造業者の指示にしたがってＧｅｎｅｊｕｉｃｅ（ノバジェン）を使用して実行された。トランスフェクション後、細胞は標準状態の下で２日培養された。細胞はそれからトリプシン処理され、ＰＢＳの細胞懸濁液は５０μｌに５００００の細胞の濃度に調整された。
【０１４９】
配位子または配位子の組合せは、ＴＲＨには１μＭの終末濃度、ＭＣＰ１には０．１μＭ、ＴＲＨＲおよびＣＣＲ２リセプタのための固有の配位子がそれぞれサンプルに加えられた。配位子の添加の後、細胞はβ‐アレスチンン‐２リセプタ相互作用の発生が可能になるように１０分間、３７℃で培養された。コエレンテラジンｈ（分子プローブ）が５μＭの終末濃度にサンプルへ加えられた後、バリアン・エクリプス蛍光分光計（バリアン）は４００‐７００ｎｍ の間の範囲の発光スペクトルを記録するために用いられた。
【０１５０】
発光スペクトルは、リセプタおよびその配位子（図１４）にしたがい、またはそれに選択的な特定のβ‐アレスチンン‐２リセプタ相互作用を示した。両方の配位子が加えられる場合、両方のリセプタはβ‐アレスチンン‐２と関連し、両方のリセプタの同時的な活性化を示す。この結果は、標識がいずれのリセプタのいずれに付けられるかとは独立していて、ＥＹＦＰおよびｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）を交換しても本質的に同じ結果（図１４）を生じた。
【０１５１】
スペクトルはＥＹＦＰのピーク面積を一体化することによってさらに分析され、ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）発光は例２にて説明したように、ピークに達する。ピーク面積は、配位子（図１５）の存在を明確に表し、ＴＲＨＲおよびβ‐アレスチンン‐２間の相互作用がより強い、またはＣＣＲ２とのそれより良好な配向にあることをさらに示した。多重検出システムのために必要とされているように、両方の相互作用の独立した検出は達成された。
【０１５２】
全体に、この例は、動的な、誘導できるシステムにおける異なるタンパク‐タンパク相互作用の多重検出を証明する。関係するタンパクは薄膜に結合したリセプタから細胞質のタンパクまで変動し、検出は生体の哺乳動物細胞において発生することができる。
例７
分子の付随物の簡略化された検出
【０１５３】
中間体または他の部分的な付随物に関係なく、特定の複合体分子の付随物が形成される場合のみに信号を生じる単純な検出システムは、いくつかの用途のためにきわめて有用である。３つの成分の付随物内の相互作用のためのモデルとして３つのＤＴの融合タンパク質が分析された。
【０１５４】
ＥＧＦＰおよびＲｌｕｃの暗号配列は、以下のオリゴヌクレオチド（表３）でＰＣＲを経て増幅された：ＥＧＦＰ‐Ｐ２‐ｆｗ／ｒｅ、テンプレート：ｐＥＧＦＰ‐Ｎ１（クロンテック）；Ｒｌｕｃ‐Ｐ３‐ｆｗ／ｒｅ、テンプレートｐｈＲＬ‐ＣＭＶ（プロメガ）。生成物の端部は適切な制限酵素によって切断され、サブユニット間のペプチド・スペーサをコード化して、オリゴヌクレオチド・リンカーと共にベクターｐＥＴ‐ｍＲＦＰ１にクローンをつくられる。これは、以下の構造物を生じる結果になった：ＰＥＴ‐ＭＲＦＰ１、ＰＥＴ‐ＭＲＦＰ１ １２‐ＥＧＦＰおよびｐＥＴ‐ｍＲＦＰ１‐１２‐ＥＧＦＰ‐Ｒｌｕｃ（図４）。タンパクは、実施例１にて説明されたように、大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。
【０１５５】
ＥＧＦＰおよびｍＲＦＰ１間のＦＲＥＴは、４８０ｎｍの光でｍＲＦＰ１‐１２‐ＥＧＦＰ‐Ｒｌｕｃ融合タンパク質を励起することによって分析された。実施例１（図１６ａ）にて説明されたように、直接の励起が減じられたので、ＦＲＥＴ信号は、ｍＲＦＰ１発光の後検出された。次に、ｍＲＦＰ１‐１２‐ＥＧＦＰ‐Ｒｌｕｃの発光スペクトルは、５μＭのコエレンテラジンｈ（図１６ｂ）の添加の後、記録された。Ｒｌｕｃは、６００‐６５０ｎｍ間の赤色の蛍光の増加した活性化と同様、５１０ｎｍで緑色の蛍光の活性化で生じるｍＲＦＰ１を交替で活性化するＥＧＦＰを活性化した。ＥＧＦＰサブユニットを含まないｍＲＦＰ１‐１５‐Ｒｌｕｃ構造物と比較して、観察されたｍＲＦＰ１蛍光発光は、より高かった。
【０１５６】
総合すれば、これらの結果は、Ｒｌｕｃ（ＤＴ１）が活性化すると、付随物内に同時にＥＧＦＰ（ＤＴ２）が存在し、三量体の複合体の形成を示す場合、増加したｍＲＦＰ１（ＤＴ３）発光が検出されることを証明する。
例８
複合体分子の付随物の相互作用
【０１５７】
２つ以上の成分を含む複合体分子の付随物の分析は、付随物内での成分の可能な組合せのための異なった信号を生ずる検出システムを必要とする。３つの成分の付随物内の相互作用のための第１のモデルとして、３つのＤＴの融合タンパク質が分析された。
【０１５８】
ＥＣＦＰＥおよびＥＹＦＰの暗号配列は、以下のオリゴヌクレオチド（表３）でＰＣＲを経て増幅された：ＥＧＦＰ‐Ｐ２‐ｆｗ／ｒｅ、テンプレート：ｐＥＧＦＰ‐Ｎ１（クロンテック）；ＥＧＦＰ‐Ｐ２‐ｆｗ／ｒｅ, ｔｅｍｐｌａｔｅ: ｐＥＹＦＰ‐Ｎ１ （クロンテック）。生成物の端部は適切な制限酵素によって切断され、サブユニット間のペプチド・スペーサをコード化して、オリゴヌクレオチド・リンカーと共にベクターｐＥＴ‐ｍＲＦＰ１にクローンをつくられる。これは、以下の構造物を生じる結果になった：ｐＥＴ‐ｍＲＦＰ１‐１２‐ＥＹＦＰ, ｐＥＴ‐ｍＲＦＰ１‐１５‐ＥＣＦＰ ａｎｄ ｐＥＴ‐ ｍＲＦＰ１‐１２‐ＥＹＦＰ‐ＥＣＦＰ （図４）。タンパクは、実施例１にて説明されたように、大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。
【０１５９】
４４０ｎｍでのｍＲＦＰ‐１２‐ＥＹＦＰ‐ＥＣＦＰ構造物の励起は、ＲＥＴ（図１７ａ）のためにＥＹＦＰおよびｍＲＦＰ１と同様にＥＣＦＰからの発光において生じた。ｍＲＦＰ１‐１５‐ＥＣＦＰ構成物を用いてＥＹＦＰの非存在下で、ＲＥＴもＥＣＦＰからｍＲＦＰ１まで発生した。付随物においてＥＣＦＰの存在なしでは、ＥＹＦＰおよびｍＲＦＰ１は、４４０ｎｍ励起光（図１７ａ）によって、有意に活性化されなかった。励起光を４９０ｎｍに変え、活性化されたＥＹＦＰおよび生じたＲＥＴを構造物ｍＲＦＰ１‐１２‐ＥＹＦＰおよびｍＲＦＰ１‐１２‐ＥＹＦＰ‐ＥＣＦＰにおいてｍＲＦＰ１に変え、一方でｍＲＦＰ１およびｍＲＦＰ１‐１５‐ＥＣＦＰ（図１７ｂ）で観察されたように、ｍＲＦＰ１はＥＹＦＰの非存在下で有意に活性化されなかった。したがって、ＤＴ１（ＥＣＦＰ）およびＤＴ２（ＥＹＦＰ）の一連の活性化、および、すべてのＤＴの発光の検出は、分子付随物の組成物上の正確な情報を提供した。
【０１６０】
分子の複合体のための第２のモデル系として、タンパク融解の組合せと関連し、ビオチンおよびストレプトアビジン間の高い親和力相互作用が分析された。
【０１６１】
例３に類似して、ａｖｉｔａｇの暗号配列は、交雑されたオリゴヌクレオチドＡｖｉｔａｇＮ‐ｆｗ／ｒｅ（表３）からなるリンカーとして、構造物ｐＥＴ‐ＥＹＦＰ‐ＥＣＦＰに挿入された。リンカーは、この構造物の位置１（図４）にクローンをつくられた。ビオチン・リガーゼのための暗号配列は、テンプレートとして大腸菌Ｔｏｐ１０を用いてオリゴヌクレオチドｂｉｒＡ‐ｆｗ／ｒｅで増幅された。ｂｉｒＡ遺伝子は、標的タンパク質に付いたａｖｉｔａｇペプチド配列の量的ビオチン化のためのビオチン・リガーゼを共発現するため、構造物（図４）の位置４にクローンをつくられた。ビオチニル化されたＥＹＦＰ‐ＥＣＦＰ融合タンパク質の発現のために生じた構造物は、ｐＥＴ‐Ａｖｉ‐ＥＹＦＰ‐ＥＣＦＰ／ｂｉｒＡと呼ばれる。タンパクは、実施例１にて説明されたように、大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。
【０１６２】
Ａｌｅｘａフルーア５５５およびＡｌｅｘａフルーア５６８の結合体は、それらの励起スペクトルとしてＤＴ３ｓがＥＹＦＰおよびＥＣＦＰ（図１８ａ）の発光スペクトルとよく重なるように、検査された。ビオチニル化されたＥＹＦＰ‐ＥＣＦＰ融合タンパク質は、大体同等の量蛍光接合されたストレプトアビジンと混合された。制御として、ストレプトアビジン結合体の添加前にビオチニル化されたＥＹＦＰ‐ＥＣＦＰタンパクは、共役でない、非蛍光ストレプトアビジンで前もって培養された。したがって、融合タンパク質および蛍光ストレプトアビジン間の相互作用は、ブロックされた。混合物は４４０ｎｍで励起され、蛍光発光はスキャンされた。ＲＥＴは、ＥＹＦＰからＥＣＦＰに、さらにＡｌｅｘａフルーア５５５またはＡｌｅｘａフルーア５６８（図ｄ）に観察された。色素の直接の励起による光源によって、制御反作用においてＡｌｅｘａフルーア５５５の色素からいくつかの発光が存在した。この発光は、しかしながらＡｌｅｘａフルーア５５５‐ストレプトアビジン：ＥＹＦＰ‐ＥＣＦＰ付随物からの発光より有意に小さかった。励起光に対するより大きなスペクトル距離のため、Ａｌｅｘａフルーア５６８の色素の直接の励起は観察されなかった。同じサンプルが４９０ｎｍで励起された場合、色素‐ストレプトアビジン：ＥＹＦＰ‐ＥＣＦＰ相互作用が抑制された（図ｅ）時に部分的に（Ａｌｅｘａフルーア５５５）または完全に（Ａｌｅｘａフルーア５６８）遮断するＥＹＦＰおよびＡｌｅｘａフルーア５５５またはＡｌｅｘａフルーア５６８間のＲＥＴが観察された。
【０１６３】
次に、ＲＥＴ比率が図１８のｂ‐ｅのスペクトルから算出された。比率は、検出システムが分子の付随物内で正確に相互作用を決定するというさらなる証拠を提供した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ‐ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎのためのＲＥＴ比率：ＥＹＦＰ‐ＥＣＦＰ複合体は、この相互作用がブロックされた（図１９）場合の制御よりも有意に高かった。これは、ＥＹＦＰおよびＡｌｅｘａフルーア（４９０ｎｍの励起）間のＲＥＴと同様にＥＣＦＰおよびＡｌｅｘａフルーア（４４０ｎｍの励起）間のＲＥＴに観察された。Ａｌｅｘａフルーア５５５によって得られる比率は、Ａｌｅｘａフルーア５６８での比率と比較してより高かった。しかしながら、より大きなスペクトル分離、したがってより低いバックグラウンド信号によりダイナミックレンジおよび信号対雑音比は、Ａｌｅｘａフルーア５６８においてはより良好であった。
【０１６４】
総合すれば、この例は、ＤＴ１およびＤＴ２の一連の励起、および、ＤＴ１、ＤＴ２およびＤＴ３またはＤＴ２およびＤＴ３のそれぞれの光放射の検出と結合する３つの適切なＤＴは、複合体分子の付随物の組成物の正確な検出のためのシステムを表すことを証明する。
例９
哺乳動物細胞の複合体分子の付随物の検出
【０１６５】
Ｇタンパク被結合リセプタ（ＧＰＣＲ）の機能の重要な側面は、ホモおよびヘテロ・オリゴマー複合体を形成するそれらの能力である（例えば、クルーガー他（２００３）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．, ２４: ２５４‐２７８参照）。この例では、本発明のアッセイ・システムは、リセプタ‐リセプタ複合体の様々な組合せを検出するために検査された。この複合体の形成および次の検出は、生体の哺乳動物細胞の薄膜において発生した。
【０１６６】
蛍光タンパクｍＲＦＰ１をコード化している相補ＤＮＡは、例１にて説明されたように、オリゴｍＲＦＰ１‐ｆｗ／ｍＲＦＰ１‐Ｐ３‐ｒｅを使用してＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ生成物は、哺乳動物細胞の蛍光タンパクを発現するためにできたベクターにおいて生じたプラスミドｐｃＤＮＡ‐ＭＣＳ（例５）にクローンをつくられた。ｍＲＦＰ１でＣＣＲ２リセプタのＣ末端融解の発現構成物を組み立てるため、ＣＣＲ２相補ＤＮＡ配列（例５）を含むＰＣＲ生成物はｍＲＦＰ１の５’でプラスミドｐｃＤＮＡ‐ＭＣＳ‐ｍＲＦＰ１にクローンをつくった。生じている最終的なプラスミドは、ｐｃＤＮＡ‐ＣＣＲ２ ｍＲＦＰ１と名付けられた。加えて、実施例５からのプラスミドｐｃＤＮＡ‐ＣＣＲ２‐ＥＣＦＰおよびｐｃＤＮＡ‐ＣＣＲ２ ＥＹＦＰが、ここで使われた。
【０１６７】
Ｃｏ‐７細胞は、製造業者の手順に従い、例５に記載されたように、Ｇｅｎｅjｕｉｃｅ（ノバジェン）トランスフェクション試薬を使用して発現ベクトルの１つまたは組合せによってトランスフェクションされた。標準培養条件下の２日の培養後、細胞はトリプシン処理され、細胞懸濁液の濃度は５０μｌの ＰＢＳにおいて約５００００の細胞になるように調整された。
【０１６８】
これらの細胞懸濁液は、バリアン・エクリプス蛍光分光計（バリアン）を用いて蛍光分光学法によって分析された。まず、サンプルは４４０ｎｍで励起され、ＥＣＦＰの励起最大量および蛍光発光は４６０および７００ｎｍ間で記録された。それから、励起波長は４９０ｎｍに変えられ、ＥＹＦＰの励起最大量および蛍光発光は５００および７００ｎｍ間で記録された。実施例１にて説明されたように、すべてのスペクトルは光源による受容基フルオロフォアの直接励起のために修正された。スペクトルは、それらの発光最大量（任意の値‘１’）（図２０ａ（ｂ））に、さらに標準化された。これらのスペクトルは、また、実施例２（図２０ｃ）にて説明したように、それぞれの発光ピーク面積の集積化によって数量化された。
【０１６９】
ＲＥＴは、ＥＣＦＰ‐ＥＹＦＰおよびＥＣＦＰ‐ｍＲＦＰ１の間で観察されたが、発光ピークの増加によって示されたように、ｍＲＦＰ１はまたこの実験におけるＥＹＦＰの適切なエネルギ受容基であった。これは、また、バックグラウンド制御より上の信号増加を示すそれぞれのピーク領域の集積化によって確認された。したがって、システムは正確にすべての可能な二量体リセプタ複合体を検出することが可能であった：ＣＣＲ２‐ＥＣＦＰ／ＣＣＲ２ ＥＹＦＰ、ＣＣＲ２‐ＥＣＦＰ／ＣＣＲ２‐ｍＲＦＰ１およびＣＣＲ２‐ＥＹＦＰ／ＣＣＲ２／ｍＲＦＰ１。
【０１７０】
これは、実施例４‐６で図示される多重検出システムおよび実施例７に記載される単純な検出システムと異なり、前者は多数の相互作用を同時に検出し、後者は特に同時にすべての成分を含む複合体を同時に検出する。ここ（例８+９）で証明されたように、どちらもすべての起こりうる対の集合を検出することができない。
【０１７１】
要約すると、この例は、本発明が生体哺乳動物細胞における動的な、合成された分子集合を検出することができるシステムを提供することを証明する。これは、評判のとおり分析するのが困難である薄膜に結び付いたタンパク含むことができるが、明らかにそれに制限されることはない。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】複合相互作用アッセイの基礎をなしている原理を示す。
【０１７３】
【図２】分子の複合体が関連する簡略化された検出システムを示す。ＤＴ１およびＤＴ２が両方とも付随物に含まれる場合、ＤＴ３からの信号が検出されるだけである。
【０１７４】
【図３】分子の複合体が関連する検出システムの原理を示す。ＤＴ２がまたＤＴ３のエネルギ供給体である一方で、ＤＴ１はＤＴ２およびＤＴ３のためのエネルギ供給体である。ＤＴ２およびＤＴ３またはＤＴ３からの発光を検出する一方で、ＤＴ１およびＤＴ２の一連の励起はそれぞれ、付随物の動的な組成物上の情報を生ずる。
【０１７５】
【図４】融合タンパク質の構成を示し、ｐＥＴＤｕｅｔ‐１（ノバジェン）の多回クローニングサイトの概略図である。ＰＣＲ生成物は、４つの異なる部位へクローンをつくられたインフレームである。１２‐ｏｒ １８‐アミノ酸スペーサのためのオリゴヌクレオチド・リンカー符号化は、サブユニット１および２の間で挿入することができる。ベクターの多回クローニングサイトによってコード化されるオープンリーディングフレームは、サブユニット１および３間の１５‐アミノ酸スペーサおよびサブユニット２および３間の７‐アミノ酸スペーサを備える。
【０１７６】
【図５】タンパク性のＤＴのスペクトル特性を示す。ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰおよびｍＲＦＰ１ （ａ）の蛍光スペクトルは、ＥＣＦＰおよびＥＧＦＰ間の大きいスペクトル重複およびＥＣＦＰおよびｍＲＦＰ１間のいくつかの重複を示した。有意なスペクトル重複が、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰ、さらにはＥＹＦＰおよびｍＲＦＰ１（ｂ）の間にあった。ＥＣＦＰ発光は、驚くほど都合よくｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）励起（ｃ）と重なった。
【０１７７】
【図６】タンパク性のＤＴ間のＦＲＥＴを示す。４４０ｎｍで励起された場合、ＥＹＦＰ‐１２‐ＥＣＦＰ （ａ）およびｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）‐１２‐ＥＣＦＰ（ｂ）融合タンパク質は、共振エネルギ転移のために追加的な光を発した。スペクトルは供給体発光最高に標準化され、光源による受容基フルオロフォアの直接の励起からの発光は減じられた。
【０１７８】
【図７】ウミシイタケ・ルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、生物発光タンパクおよびタンパク性のＤＴ間のＲＥＴを示す：（ａ） ＤＴなし；（ｂ）ＥＧＦＰ；（ｃ） ＥＹＦＰ；（ｄ）ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）および（ｅ）ｍＲＦＰ１。スペクトルは、発光最大まで標準化された。
【０１７９】
【図８】様々な融合タンパク質のためのＲＥＴ比率を示す。示されているのはＥＧＦＰおよびＥＹＦＰチャネル（ａ）およびｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）およびｍＲＦＰ１チャネル（ｂ）のための比率である。良好な分離は、ＥＧＦＰ‐ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）およびＥＹＦＰ‐ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）の間で達成された、一方、ＥＧＦＰ‐ＥＹＦＰおよびｔ‐ｄｉｍｅｒ２（１２）‐ｍＲＦＰ１は、独立した、同時的な検出のためにはあまりにも近接している。ｍＲＦＰ１が都合よくＥＧＦＰおよびＥＹＦＰから分離されたにもかかわらず、それは、弱いＲＥＴ信号だけにおいて生じるＲｌｕｃにより本質的に活性化されなかった。
【０１８０】
【図９】非タンパク性のＤＴでのＲＥＴの分析を示す。ビオチニル化されたＲｌｕｃは、様々なストレプトアビジン結合体と混合された。発光スペクトルは黒色において示され、それぞれ、接合される色素の蛍光発光および励起スペクトルは、灰色の立体および破線のラインにおいて示される。以下の結合体が使われた：（ａ） Ａｌｅｘａフルーア４８８、（ｂ）オレゴングリーン、（ｃ） Ａｌｅｘａフルーア５５５、（ｄ）Ａｌｅｘａフルーア５６８および（ｅ）Ａｌｅｘａフルーア５９４。逆制御として、非ビオチニル化されたＲｌｕｃが使用され、ＲＥＴ信号を生じなかった（ｆ）。
【０１８１】
【図１０】非タンパク性のＤＴの濃度に依存するＲＥＴ比率を示す。異なる量のストレプトアビジン‐オレゴングリーンまたはストレプトアビジン‐Ａｌｅｘａフルーア５９４と混合されたビオチニル化されたＲｌｕｃを含む解法が分析された。濃度は、ストレプトアビジン結合なしで、等モル量のストレプトアビジンおよびビオチン‐Ｒｌｕｃから、ビオチン‐Ｒｌｕｃまで変動した。両方の結合体のために、ＲＥＴ比率は、最も低い濃縮でさえバックグラウンド比率より上であることがわかった。
【０１８２】
【図１１】試験管内の複合浸水検出を示す。ＥＧＦＰ‐１５‐Ｒｌｕｃ／ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）‐１５‐Ｒｌｕｃ （ａ）およびストレプトアビジン‐オレゴングリーン／ストレプトアビジン‐Ａｌｅｘａフルーア５９４（ｂ）の混合物が分析された。両方のモデルにおいて、２つのチャネルは、同時に分析され、独立して数量化することができた。２つのラベルのＲＥＴ比率は、第１の（供給体）ＤＴが第２のおよび／または第３のＤＴと相互作用する範囲を表した。
【０１８３】
【図１２】互いにＧ‐タンパク結合リセプタ（ＧＰＣＲｓ）の集合を決定するための細胞ベースのアッセイのスペクトルＦＲＥＴ検出を示す。ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰまたはｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）にＣ‐末端で融合したリセプタを使用して、ＣＣＲ２リセプタ（ａ）およびＴＲＨリセプタ（ｂ）間のホモ二量体化は、モニタされた。ホモダイマを形成した両方のリセプタはＲＥＴのためにＥＹＦＰまたはｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）発光の増加によって検出された。両方の信号は、減光装置の連結またはより大きいオリゴマー複合体（ｂ）の形成を表しているすべての３つの融解構造物がある場合には、同時に検出された。スペクトルは、最大４８０ナノメートルでＥＣＦＰ発光に標準化され、光源による受容基フルオロフォアの直接の励起からの発光は減じられた。
【０１８４】
【図１３】生体哺乳動物細胞のホモダイマ複合体のＧＰＣＲｓ間のＦＲＥＴの数値解析を示す。ＥＹＦＰおよびｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）のピーク面積は、蛍光発光スペクトル（図１２）の集積化によって算出された。ホモダイマ複合体は、受容基ＤＴのいずれかを使用してＣＣＲ２ （ａ）およびＴＲＨＲ（ｂ）のために検出された。低い同時トランスフェクション効率において生じる一時的なトランスフェクション・システムにより、３つのすべての融解構造物（ｂ）がある場合に得られた絶対停止信号は、それでもバックグラウンドより上ではあるが、低い。ＣＣＲ２リセプタ間の相互作用がより弱いまたは良好でない配座であっても、それは、容易に検出された。
【０１８５】
【図１４】細胞ベースであって、下流のエフェクタ・タンパクであるβ‐アレスチン‐２と異なるＧＰＣＲｓ間の配位子誘導相互作用の検出のための複合アッセイのスペクトル分析を示す。β‐アレスチン‐２、Ｒｌｕｃに融合するＮ‐末端は、適切な配位子の添加後、ＴＲＨＲおよびＣＣＲ２と相互作用する。ＴＲＨＲは、Ｃ‐末端でｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２） （ａ）に融合するＥＹＦＰおよびＣＣＲ２であり、その逆も同じ（ｂ）である。ＴＲＨの添加、ＴＲＨＲのために特定の配位子は、ＴＲＨＲに特定のＲＥＴである：β‐アレスチン‐２相互作用である。このリセプタを活性化したＭＣＰ１の添加、ＣＣＲ２のために特定の配位子は、β‐アレスチン‐２と共にそれぞれのＲＥＴ信号の増加において観察された。両方の配位子の添加により両方のリセプタを活性化させ、β‐アレスチン‐２と相互作用している両方のリセプタを生じ、したがって、２つのＲＥＴ信号は検出された。
【０１８６】
【図１５】下流のエフェクタ・タンパクであるβ‐アレスチン‐２と異なるＧＰＣＲｓ間の配位子誘導相互作用の検出のための複合アッセイの細胞ベースの数値解析を示す。図１４からの発光スペクトルは、ＥＹＦＰおよびｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２）ピークのピーク面積を決定するため一体化された。配位子の存在次第で、β‐アレスチン‐２：ＴＲＨＲおよびβ‐アレスチン‐２：ＣＣＲ２は、ＴＲＨＲ‐ＥＹＦＰおよびＣＣＲ２‐ｔ‐ｄｉｍｅｒ２ （１２） （ａ）のＣ‐末端の融解を使用し、またはその逆も同じく（ｂ）独立して検出された。
【０１８７】
【図１６】Ｒｌｕｃ、ＥＧＦＰおよびｍＲＦＰ１からなる融合タンパク質によって例証される複合体分子の付随物のための簡略化された検出システムを示す。ＲＥＴは、融合タンパク質が４８０ｎｍ （ａ）に励起された場合ＥＧＦＰおよびｍＲＦＰ１の間で観察された。６００‐６５０ｎｍ（ｂ）間のより高い発光によって示されたように、ＲｌｕｃからｍＲＦＰ１へのエネルギ転移は、ＥＧＦＰがある場合には、より高かった。
【０１８８】
【図１７】蛍光タンパクの融解によって例証される複合体分子の付随物のための検出システムを示す。ＥＣＦＰは、ＥＹＦＰおよびｍＲＦＰ１ （ａ）を活性化することが可能であり、ＥＹＦＰもｍＲＦＰｌ（ｂ）を活性化した。
【０１８９】
【図１８】タンパク性および非タンパク性の、小型分子色素の連結を使用している検出システムを示す。Ａｌｅｘａフルーア５５５およびＡｌｅｘａフルーア５６８の励起スペクトルは、都合よくＥＣＦＰおよびＥＹＦＰ （ａ）の発光スペクトルに重ねられた。このモデル系において、ＤＴ１およびＤＴ２は、ＥＣＦＰのビオチニル化された融合タンパク質および色素に接合されるストレプトアビジンと相互に作用するＥＹＦＰとして存在した。Ａｌｅｘａフルーア５５５は、ＥＣＦＰ（ｂ）およびＥＹＦＰ （ｃ）によって活性化された。制御として、ビオチン・ストレプトアビジン‐共役相互作用は、Ａｌｅｘａフルーア発光を非常に減少させた余分な複合していないストレプトアビジンを使用しているプレインキュベーションによってブロックされた。同じ効果は、よりブルーにシフトしたＡｌｅｘａフルーア５５５と比較して、より弱い信号とより良いスペクトル解像度を生じるＥＣＦＰ（ｄ）およびＥＹＦＰ（ｅ）によって活性化されたＡｌｅｘａフルーア５６８の結合体を使用して観察された。より大きなスペクトル解像度のため、光源による直接の励起のためのＡｌｅｘａフルーア５６８の発光は、また、複合していないストレプトアビジンを含む制御において減らされた。
【０１９０】
【図１９】スペクトル・ピークおよびＲＥＴ比率の計算の集積化によって、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰおよびＡｌｅｘａフルーア５５５（ａ）またはＡｌｅｘａフルーア５６８（ｂ）間のＦＲＥＴの数値解析を示す。バックグラウンドの上の信号は、ビオチン‐ストレプトアビジン相互作用と同様にＥＣＦＰ‐ＥＹＦＰ相互作用のために観察された。４４０ｎｍでの励起のＡｌｅｘａフルーアおよびＥＹＦＰ信号の存在は、４９０ｎｍでの励起のＡｌｅｘａフルーア信号の存在と同様に、すべてのＤＴを含む複合体が形成されたことを示す。
【０１９１】
【図２０】生体哺乳動物細胞の細胞膜に存在するタグを付けられたリセプタによって例証される複合体分子の付随物のための検出システムを示す。ＥＣＦＰが４４０ｎｍで励起状態であった場合、ＥＣＦＰからＥＹＦＰおよびＥＣＦＰからＥＣＦＰへのＲＥＴが観察され、ＣＣＲ２リセプタ（ａ）間のホモダイマ形成を示した。ＲＥＴはまた、ＥＹＦＰがさらに４９０ｎｍで励起状態であった場合、ＥＹＦＰおよびｍＲＦＰ１の間で観察され、ＣＣＲ２‐ＥＹＦＰの集合を示した。ピーク面積の数値解析は、信号の増加が分子集合（ｃ）を正確に反映することを示した。（略語）ＢＲＥＴ  生物発光共振エネルギ転移ＣＣＲ２  ケモカイン（ｃｃモチーフ）リセプタ２。ＤＴ  タグまたは検出タグ。ＤＴ‐ＩＧ  相互作用している基に付着されるタグまたは検出タグ。ＥＣＦＰ  ビクトリアグリーンの蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）の変種である強化されたシアン蛍光タンパク。ＥＧＦＰ  野生型ＧＦＰの赤にシフトされた変種である強化された緑の蛍光タンパク。ＥＹＦＰ  強化された黄色の蛍光タンパク。ＦＲＥＴ  蛍光共振エネルギ転移。ＧＰＣＲｓ  Ｇ‐タンパク被結合リセプタ。Ｈｉｓ（６）  ６つの連続的なヒスチジン残基からなるヒスチジン・タグ。ＩＧ  相互作用している基。ｍＲＦＰ１  単量体の赤い蛍光タンパク。ＲＥＴ  共振エネルギ転移。Ｒｌｕｃ  ウミシイタケ・ルシフェラーゼ。Ｔ７ｐｒｏｍ  Ｔ７促進剤配列。Ｔ７ｓｔｏｐ  Ｔ７ターミネータ配列。
【図１】
2007511226.tif 000006
【図２】
2007511226.tif 000007
【図３】
2007511226.tif 000008
【図４】
2007511226.tif 000009
【図５ａ】
2007511226.tif 000010
【図５ｂ】
2007511226.tif 000011
【図５ｃ】
2007511226.tif 000012
【図６ａ】
2007511226.tif 000013
【図６ｂ】
2007511226.tif 000014
【図７ａ】
2007511226.tif 000015
【図７ｂ】
2007511226.tif 000016
【図７ｃ】
2007511226.tif 000017
【図７ｄ】
2007511226.tif 000018
【図７ｅ】
2007511226.tif 000019
【図８ａ】
2007511226.tif 000020
【図８ｂ】
2007511226.tif 000021
【図９ａ】
2007511226.tif 000022
【図９ｂ】
2007511226.tif 000023
【図９ｃ】
2007511226.tif 000024
【図９ｄ】
2007511226.tif 000025
【図９ｅ】
2007511226.tif 000026
【図９ｆ】
2007511226.tif 000027
【図１０】
2007511226.tif 000028
【図１１ａ】
2007511226.tif 000029
【図１１ｂ】
2007511226.tif 000030
【図１２ａ】
2007511226.tif 000031
【図１２ｂ】
2007511226.tif 000032
【図１３ａ】
2007511226.tif 000033
【図１３ｂ】
2007511226.tif 000034
【図１４ａ】
2007511226.tif 000035
【図１４ｂ】
2007511226.tif 000036
【図１５ａ】
2007511226.tif 000037
【図１５ｂ】
2007511226.tif 000038
【図１６ａ】
2007511226.tif 000039
【図１６ｂ】
2007511226.tif 000040
【図１７ａ】
2007511226.tif 000041
【図１７ｂ】
2007511226.tif 000042
【図１８ａ】
2007511226.tif 000043
【図１８ｂ】
2007511226.tif 000044
【図１８ｃ】
2007511226.tif 000045
【図１８ｄ】
2007511226.tif 000046
【図１８ｅ】
2007511226.tif 000047
【図１９ａ】
2007511226.tif 000048
【図１９ｂ】
2007511226.tif 000049
【図２０ａ】
2007511226.tif 000050
【図２０ｂ】
2007511226.tif 000051
【図２０ｃ】
2007511226.tif 000052
【国際調査報告】
2007511226.tif 000053
2007511226.tif 000054
2007511226.tif 000055