(57)【要約】  本発明は、癌の診断、予後及び治療のための作用薬及び方法に関する。具体的には、本発明は、膜貫通スーパーファミリ・メンバ6 (TM4SF6)、シナプトフィジン様たんぱく質(SYPL)、ストマチン様2 (STOML2)、Ras−関連GTP−結合 たんぱく質 RAGA)、ヌクレオチド感受性クロリドチャンネル1A (CLNS1A)、プリオンたんぱく質(p27-30) (PRNP)、グアニンヌクレオチド結合たんぱく質ベータ2-様1 (GNB2L1)、グアニンヌクレオチド結合たんぱく質 4 (GNG4)、一体型膜たんぱく質 2B (ITM2B)、一体型膜たんぱく質 1 (ITM1)、膜貫通9 スーパーファミリ・メンバ 2 (TM9SF2)、アヘン受容体様1 たんぱく質 (OPRL1)、低密度リポたんぱく質受容体関連たんぱく質 4 (LRP4)、ヒト糸球体上皮たんぱく質 1(GLEPP1)、toll様受容体 3 (TLR3)、及び／又は透明帯糖たんぱく質 3A (ZP3)をコードする核酸及びアミノ酸配列の、 早期及び後期の両方の非ステロイド特異的癌の診断及び癌予後や、前記たんぱく質の遺伝子発現及び／又は生物学的活性を調節する作用薬のスクリーニングのための使用に関する。更に本発明は、ここで解説されたスクリーニング検定で同定される作用薬の使用、アンチセンスポリヌクレオチド配列のベクタ送達、及び、前記たんぱく質の抗体ターゲティングを含め、前記たんぱく質の遺伝子発現及び／又は生物学的活性を阻害するようにデザインされた生物学的技術に関する。具体的な実施態様では、前記たんぱく質はヒト由来である。
2007521015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TM4SF6、SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3、又はZP3 ポリペプチド及び／又はその断片から成る群より選択される少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質の異常な発現及び／又は変化した生物学的活性を特徴とする非ステロイド依存性癌の治療のための治療薬のスクリーニング法。
【請求項２】
ａ．  前記免疫原性膜たんぱく質のプロモータの制御下にあるレポータ・コンストラクトを、検査分子もしくは化合物、又は検査分子もしくは化合物のライブラリに、特異的結合及び／又は相互作用が可能な条件下で接触させるステップと、
ｂ．  前記レポータ・コンストラクトの発現レベルを検出するステップと
を含み、この場合、コントロールに比較したときの発現レベルの変化が、潜在的な治療活性の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ．  前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片を、検査分子もしくは化合物、又は検査分子もしくは化合物のライブラリに、特異的結合及び／又は相互作用が可能な条件下で接触させるステップと、
ｂ．  特異的結合及び／又は相互作用のレベルを検出するステップと
を含み、この場合、コントロールに比較したときの相互作用のレベルの変化が、潜在的な治療活性の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記治療薬が、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質の発現及び／又は生物学的活性を抑制する、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
検査分子もしくは化合物のライブラリが、DNA 及び／又はRNA分子、ペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト、モノクローナル抗体、免疫グロブリン、低分子薬物、薬学的作用薬及びこれらの組合せから成る群より選択される、請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の方法により同定された治療薬、又はその断片、誘導体もしくは相同体を含む、医薬組成物。
【請求項７】
薬学的に許容可能な担体を更に含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１乃至５のいずれかに記載の方法により同定された治療薬、又はその断片、誘導体もしくは相同体の、あるいは、前記治療薬又はその誘導体もしくは相同体を含有する及び／又は発現する送達複合体の、非ステロイド依存性癌を治療する医薬組成物の調製のための使用。
【請求項９】
標的細胞の増殖及び／又は分化又は細胞死を調節する目的で、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列を抑制する方法であって：
ａ． 請求項６乃至８のいずれかに記載の組成物、あるいは、請求項１乃至５のいずれかに記載の方法により同定された治療薬を含む組成物、を提供するステップと、
ｂ．（ａ）に記載の治療上有効量の前記組成物を前記標的細胞に接触させるステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
前記標的細胞が新生細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質の異常な発現及び／又は変化した生物学的活性を原因とする非ステロイド依存性癌を治療する方法であって、治療上有効量の、請求項６乃至８のいずれかに記載の医薬組成物、又は、請求項１乃至５のいずれかに記載の方法により同定された治療薬、を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１２】
前記治療薬が、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質又はその断片に相補的なアンチセンスポリヌクレオチド配列である、請求項９乃至１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記アンチセンスポリヌクレオチド配列の結合が、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質又はその断片をコードするmRNAの転写又は翻訳を、前記mRNAを発現するホスト細胞で変える上で有効である、請求項１０乃至１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記アンチセンスポリヌクレオチド配列がウィルス・ベクタから発現する、請求項１０乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ウィルス・ベクタが、ワクシニア・ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、又はこれらの組合せである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アンチセンスポリヌクレオチド配列が送達複合体中にある、請求項１８のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記送達複合体がステロール、脂質、ウィルスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質又はその断片を発現することを特徴とする非ステロイド依存性癌を治療する方法であって：
ａ．  一個又は複数の細胞を単離するステップと、
ｂ．  前記細胞を、請求項１２乃至１７のいずれかに記載されたアンチセンス分子に接触させるステップと、
ｃ．  前記細胞を、非ステロイド依存性癌に罹患した対象に送達するステップと
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１２乃至１７のいずれかに記載のアンチセンス分子の、あるいは、前記アンチセンス分子を発現及び／又は含有する細胞の、非ステロイド依存性癌を治療する医薬組成物の調製のための使用。
【請求項２０】
前記細胞が、治療しようとする対象を由来とする、請求項１８に記載の方法、又は、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
少なくとも一つの前記免疫原性膜たんぱく質、その断片、誘導体もしくは相同体の、あるいは、少なくとも一つの前記免疫原性膜たんぱく質、又はその断片、誘導体もしくは相同体を含有及び／又は発現する細胞の、対象のワクチン接種用の医薬組成物調製のための使用。
【請求項２２】
前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、又は、前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチドに、特異的に結合する作用薬をスクリーニングする方法であって：
ａ．  前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片を、検査分子もしくは化合物、又は検査分子もしくは化合物のライブラリに、特異的結合及び／又は相互作用が可能な条件下で接触させるステップと；
ｂ．  特異的結合及び／又は相互作用のレベルを検出するステップと
を含む、方法。
【請求項２３】
前記検査分子もしくは化合物のライブラリが、DNA 及び／又はRNA 分子、ペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト、モノクローナル抗体、免疫グロブリン、低分子、薬学的作用薬、及びこれらの組合せから成る群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、又は、前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチドに、特異的に結合する作用薬。
【請求項２５】
抗体、好ましくはモノクローナル抗体である、請求項２４に記載の作用薬。
【請求項２６】
付加的な部分を含む、請求項２４に記載の作用薬、又は、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
非ステロイド依存性癌の治療、診断又は観察用の医薬組成物調製のための、請求項２４乃至２６のいずれかに記載の作用薬又は抗体の使用。
【請求項２８】
前記非ステロイド依存性癌が、乳房、肺、胃腸管、前立腺、卵巣、子宮頚管、子宮内膜、膀胱、皮膚の癌、及び／又は、上皮組織から生ずる他の癌である、請求項１乃至２７のいずれかに記載の使用、方法、作用薬、又は医薬組成物。
【請求項２９】
前記非ステロイド依存性癌が、皮膚の癌、特に黒色腫又は結腸直腸癌である、請求項２８に記載の使用、方法、作用薬、又は医薬組成物。
【請求項３０】
対象に、非ステロイド依存性癌を発症するリスクがあるか、又は、有するかどうかを判定する方法であって：
ａ．  前記対象の試料中で、前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの量、又は、前記免疫原性膜ポリペプチドの量、を判定するステップと、
ｂ．  前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドの量を、健康な対象を表すコントロール量と比較するステップと
を含む、方法。
【請求項３１】
SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3、又は ZP3 ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の異常な発現により引き起こされる非ステロイド依存性癌を発症するリスクがある、又は、有する対象を特定するキットであって、前記対象の細胞試料中のSYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3、又はZP3をコードするポリヌクレオチド配列（それぞれX68194、AF190167、BC006433、X91788、M13667、BC000214、U31382、NM_021999、L38961、U81006、AF043906、U30185、AB011540、U20489、U88879、X56777）のレベルを測定する手段と、前記キットを用いるための指示とを含む、キット。
【請求項３２】
SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3、又はZP3 ポリペプチドの変化した生物学的活性が原因で引き起こされる非ステロイド依存性癌を発症するリスクがある、又は、有する対象を特定するキットであって、前記対象の細胞試料中のSYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3、又はZP3 ポリペプチドのレベルを測定する手段と、前記キットを用いるための指示とを含む、キット。
【請求項３３】
前記少なくとも一つの免疫原性膜ペプチドがヒト由来である、請求項１乃至３０のいずれかに記載の医薬組成物、方法、使用又はキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は癌の診断、予後及び治療のための作用薬及び方法に関する。具体的には、本発明は、早期及び後期の両方の非ステロイド特異的癌の診断、癌の予後のための膜貫通スーパーファミリ・メンバ6 (TM4SF6)、シナプトフィジン様たんぱく質
(SYPL)、ストマチン様 2 (STOML2)、Ras−関連GTP結合たんぱく質 RAGA)、ヌクレオチド感受性クロリドチャンネル1A (CLNS1A)、プリオンたんぱく質 (p27-30) (PRNP)、グアニンヌクレオチド結合たんぱく質ベータ2様1 (GNB2L1)、グアニンヌクレオチド結合たんぱく質 4 (GNG4)、一体型膜たんぱく質2B
(ITM2B)、一体型膜たんぱく質1 (ITM1)、膜貫通 9 スーパーファミリ・メンバ2 (TM9SF2)、アヘン受容体様1 たんぱく質 (OPRL1)、低密度リポたんぱく質受容体関連たんぱく質 4 (LRP4)、ヒト糸球体上皮たんぱく質 1
(GLEPP1)、toll様受容体 3 (TLR3)、及び／又は透明帯糖たんぱく質 3A (ZP3)をコードする核酸及びアミノ酸配列の使用や、前記たんぱく質の遺伝子発現及び／又は生物学的活性を調節する治療薬のスクリーニングに関する。更に本発明は、ここで解説されたスクリーニング検定で同定された作用薬の使用、アンチセンスポリヌクレオチド配列のベクタ送達、及び前記たんぱく質の抗体ターゲティングを含め、前記たんぱく質の遺伝子発現及び／又は生物学的活性を阻害するようにデザインされた生物学的技術に関する。具体的な実施態様では、当該のたんぱく質はヒト由来のものである。
【０００２】
発明の背景
いくつかの形の非ステロイド依存性癌の治療法の進歩にもかかわらず、癌はいまだに世界中で主たる死因である。この疾患を早期に検出できれば、完全な寛解の可能性がしばしば大きく増すため、適切な診断及び治療ツールの開発に関する研究の焦点分野として選択されている。世界中の診断企業が、それらに割り当てられた研究資金の多くを、このような早期検出ツールの開発に投資しており、その主な焦点を実質的な腫瘍の発生の前の癌の検出としている。更に、これらの企業は、腫瘍の外科的治療後の患者で何らかの癌の痕跡（例えば原発腫瘍の残遺物組織の形の、あるいは転移で起きた二次腫瘍の形の）を観察する方法を提供するために、術後分析のための検出ツールも開発中である。後者により、医師は、化学療法などの適した治療を外科的治療を補うために処方することができる。
【０００３】
患者の癌を検出するためには、大量の非ステロイド依存性癌細胞が癌部位に存在していなくては、医師は有効な診断を下せない。実際には、こうはいかない。検出可能な非ステロイド依存性癌細胞が少なすぎると、癌部位の理学的検査中の検出に限界がある。更に、癌部位が直接的な視覚的観察が不可能であるために、医師が明確な診断を下す手段がない場合もある。潜在的な二次腫瘍発生の場合には、腫瘍がどこに起きるかを予測することはできないため、視覚的な観察による二次腫瘍の検出は困難である。これらの問題を克服するためには、癌細胞を有する、又は生じつつある患者における癌関連たんぱく質検出に基づく感受性ある診断検査が開発されており、現在、市販のものを入手可能である。このような診断検査の例には、ヒトの原発性肝癌の特定（IZOTOP社、ハンガリー）のためのアルファ-フェトたんぱく質及奇形癌、胎児性癌高原（Abbot/Roche社、スイス）、栄養膜及び生殖細胞癌の検出用の絨毛性性腺刺激ホルモン（IZOTOP社、ハンガリー；カリフォルニア州BioCheck 社）、及び前立腺癌用の前立腺酸性ホスファターゼ又は前立腺特異抗原、がある。これらのマーカは多様な癌を検出するために用いられているが、これらのマーカの欠点は、早期癌ではなく進行癌の検出能にある。
【０００４】
更に、市販の検査が適用できるのは大変狭い範囲の非ステロイド依存性癌種であり、このような検査はしばしば、他の形の癌を検出することができないことになる。また更に、これらの検査の適用性が狭いことは、このような診断目的の場合、一人の患者に複数の検査を行わねばならない場合があることを意味する。複数の検査を行うことは高価であり、また多くの検査のうちの一つが偽陽性の検査結果を生じる危険性も高くなる。従って、その関係から、患者内のごく少数の癌細胞を検出できるだけでなく、胃腸管の癌など、幅広い非ステロイド依存性癌でこれらの細胞を検出することができる単一の診断検査が求められている。
【０００５】
理想的なマーカは、多種の形質転換細胞で遺伝子発現すると共に、癌検出の目的のために特異的かつ汎用可能なものであろう。加えて、診断や治療で用いることのできる抗体の作製が可能なように免疫原性でなくてはならない。理想的なマーカの更なる望ましい特徴は、当該ポリペプチドの少なくとも一部分に潜在的な診断用又は治療用分子が到達可能なように、形質転換細胞の細胞膜にそれが位置していることである。
【０００６】
今日までのところ、非ステロイド依存性癌への易罹患性を示す効果的な症状発現前の臨床兆候又は生物マーカが存在しないため、早期検出が、疾患の医学的管理において高い優先度を持っている。癌の早期に関する現在の治療戦略は、後期癌に対するそれによりも、高い治癒率を有するため、早期検出により患者の生存率を高めることができる。そのため、早期の発癌性組織に特異的分子マーカの同定は、発生中の癌の診断や予後の観察に役立つであろう。更に、このような分子マーカは、癌発生の早期に投与されたときに悪性の疾患に対して有効な治療を提供するであろう有効な治療薬を開発することを目的とした分子又は化合物のライブラリのスクリーニングにも用いることができよう。
【０００７】
本発明は、非ステロイド依存性癌の診断、予後及び／又は治療のための腫瘍特異的ポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供することにより、これらの課題に対処するものである。更に、これらのポリペプチド及びそれらの対応するポリヌクレオチド配列は、非ステロイド依存性癌のための治療薬を同定及び開発することを目的として、それらの生物学的活性及び／又は遺伝子発現を変化させる作用薬をスクリーニングするために用いられる。本発明は、免疫原性膜たんぱく質シナプトフィジン様たんぱく質 (SYPL)、ストマチン様2 (STOML2)、Ras−関連GTP結合たんぱく質RAGA)、ヌクレオチド感受性クロリドチャンネル 1A (CLNS1A)、プリオンたんぱく質 (p27-30) (PRNP)、グアニンヌクレオチド結合たんぱく質ベータ2-様1 (GNB2L1)、グアニンヌクレオチド結合たんぱく質 4 (GNG4)、一体型膜たんぱく質 2B (ITM2B)、一体型膜たんぱく質 1 (ITM1)、膜貫通 9 スーパーファミリ・メンバ2 (TM9SF2)、膜貫通スーパーファミリ・メンバ 6 (TM4SF6)、アヘン受容体様1 たんぱく質 (OPRL1)、低密度リポたんぱく質受容体関連たんぱく質 4 (LRP4)、ヒト糸球体上皮たんぱく質 1 (GLEPP1)、toll様受容体3 (TLR3)、及び／又は透明帯糖たんぱく質 3A
(ZP3)、前記たんぱく質、その誘導体及び／又は断片をコードする核酸配列（X68194、AF190167、BC006433、X91788、M13667、BC000214、U31382、NM_021999、L38961、U81006、AF043906、U30185、AB011540、U20489、U88879、X56777) 並びにアミノ酸配列（CAA48279、AAF091421、AAH06433、CAA62902、AAA19664、AAH00214、AAC50204、NP_068839、P46977、AAB38973、ACC64257、AAA84913、BAA32468、AAA82892、AAC34134）を提供する。
【０００８】
前記免疫原性膜たんぱく質は、例えば分化、細胞成長又はアポトーシスなどの癌関連プロセスに関与することが知られていないが、これらは、驚くべきことに、形質転換細胞上で高度に発現していることが見出された。このように、前記の免疫原性膜たんぱく質により、形質転換細胞の特異的特定及び標的決定が可能である。
【０００９】
発明の概要
概略的には、本発明は、膜貫通スーパーファミリ・メンバ
6 (TM4SF6)、 シナプトフィジン様たんぱく質
(SYPL)、ストマチン様 2 (STOML2)、Ras−関連GTP結合たんぱく質 RagA)、ヌクレオチド感受性クロリドチャンネル 1A (CLNS1A)、プリオンたんぱく質
(p27-30) (PRNP)、グアニンヌクレオチド結合たんぱく質ベータ2-様1 (GNB2L1)、グアニンヌクレオチド結合たんぱく質 4 (GNG4)、一体型膜たんぱく質 2B
(ITM2B)、一体型膜たんぱく質 1 (ITM1)、膜貫通9 スーパーファミリ・メンバ 2 (TM9SF2)、アヘン受容体様 1 たんぱく質 (OPRL1)、低密度リポたんぱく質受容体関連たんぱく質 4 (LRP4)、ヒト糸球体上皮たんぱく質 1
(GLEPP1)、toll様受容体 3 (TLR3)、及び／又は透明帯糖たんぱく質 3A (ZP3)から成る群より選択される免疫原性膜たんぱく質遺伝子のポリヌクレオチド配列（X68194、AF190167、BC006433、X91788、M13667、BC000214、U31382、NM_021999、L38961、U81006、AF043906、U30185、AB011540、U20489、U88879、X56777) 、それにコードされたたんぱく質のアミノ酸配列 (CAA48279、AAF091421、AAH06433、CAA62902、AAA19664、AAH00214、AAC50204、NP_068839、P46977、AAB38973、ACC64257、AAA84913、BAA32468、AAA82892、AAC34134)、それらの誘導体又は断片の、非ステロイド依存性癌の診断、予後及び治療のための使用に関する。具体的な実施態様では、前記のたんぱく質はヒト由来である。
【００１０】
本発明は、TM4SF6、SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3、又は ZP3ポリペプチド及び／又はその断片から選択される少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質の異常な発現及び／又は変化した生物学的活性を原因とする非ステロイド依存性癌の治療のための治療薬をスクリーニングする方法を提供するものである。
【００１１】
具体的には、本発明は、検査分子もしくは化合物のライブラリをスクリーニングすることで、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列の発現を特異的に調節する少なくとも一つの治療的分子又は化合物を特定する方法に関し、当該方法は、前記免疫原性膜遺伝子のプロモータの制御下にあるレポータ・コンストラクトを、検査分子もしくは化合物、又は検査分子もしくは化合物のライブラリに、特異的結合及び／又は相互作用が可能な条件下で接触させるステップと、前記レポータ・コンストラクトの発現レベルを検出するステップと（表１も参照されたい）を含む。コントロールに比較したときの発現レベルの変化が、潜在的な治療活性の指標となる。
【００１２】
【表１】
2007521015.tif 000003
【００１３】
更に本発明は、検査分子もしくは化合物のライブラリをスクリーニングすることで、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質（表１も参照されたい）に特異的に結合及び／又は相互作用する少なくとも一つの治療的分子又は化合物を特定する方法に関し、当該方法は、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片を、検査分子もしくは化合物、又は検査分子もしくは化合物のライブラリに、特異的結合及び／又は相互作用が可能な条件下で接触させるステップと、特異的結合及び／又は相互作用のレベルを検出するステップとを含む。コントロールに比較したときの結合及び／又は相互作用のレベルの変化が、潜在的な治療活性の指標となる。
【００１４】
前記の分子又は化合物のライブラリは、好ましくは、DNA 及び／又はRNA分子、ペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、好ましくはモノクローナル抗体、免疫グロブリン、低分子、及び薬学的作用薬から成る群より選択されるとよい。
【００１５】
哺乳動物、好ましくはヒトの対象、において、前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチドの異常な発現及び／又は生物学的活性を原因とする非ステロイド依存性癌を治療する方法も提供する。当該の方法は、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質に結合及び／又は相互作用する、あるいは、あるたんぱく質の発現レベル（mRNAレベル）を調節する、と特定された治療薬を含む組成物を提供するステップと、治療上有効量の前記組成物を哺乳動物の対象に投与するステップとを含む。本組成物は、更に、薬学的に許容可能な担体を含んでいてもよい。
【００１６】
本発明は、前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の異常な発現を原因とする非ステロイド依存性癌を治療する代替的な方法を提供するものであり、当該の方法は、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列に対して相補的なアンチセンスポリヌクレオチド配列を治療上有効量、ヒトの対象に投与するステップを含む。
【００１７】
代替的には、本発明により提供される、前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチドの異常な生物学的活性を原因とする非ステロイド依存性癌を治療する方法は、前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチド又はその断片に対して特異的な抗体を治療上有効量、ヒトの対象に投与するステップを含む。
【００１８】
本発明の更なる局面は、本発明のスクリーニング法で特定された検査分子又は化合物を標的細胞に投与するステップを含む、前記標的細胞の増殖、分化及び／又は細胞遊走を調節する方法である。好ましくは、前記標的細胞は新生細胞であるとよい。
【００１９】
本発明の実施態様の一つは、ある対象が、前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチドの異常な発現及び／又は生物学的活性により引き起こされる非ステロイド依存性癌を発症するリスクがあるかどうか、又は、該非ステロイド依存性癌を有するかどうかを判定する方法を提供するものであり、当該の方法は、前記対象の細胞試料中の、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列のレベル、及び／又は、前記たんぱく質自体のレベル、を測定する手段を含む。本発明は、前記の同じ実施態様の中で、キットを、上記の方法に基づいて前記キットを用いるための指示と一緒に提供する。
【００２０】
発明の詳細な説明
解説された特定の材料及び方法又は装置は多様であろうため、本発明はこれらに限定されないものと理解されたい。更に、ここで用いられた用語は、特定の実施態様を記述することのみを目的としたものであり、付属の請求の範囲によってのみ限定される、本発明の範囲を限定するものとしては意図されていないと理解されたい。
【００２１】
また、ここで、そして付属の請求項で用いられる場合の単数形「一つの（原語；”a”）」、「一つの（原語：“an”）」及び「その（原語；"the“）は、文脈から明らかにそうでない限り、複数形の言及を包含するものと留意されたい。従って、例えば「ホスト細胞」への言及は、このようなホスト細胞の過多も包含し、そして「抗体」への言及は、一つ以上の抗体や、当業で公知のその誘導体等への言及である。
【００２２】
他に定義しない限り、ここで用いられる全ての技術用語及び科学用語は、当業者が通常理解するものと同じ医味を有する。ここで具体的に解説されたものに匹敵するいずれの材料及び方法、又は装置も、本発明を実施又はテストするために用いることができるが、好適な装置、材料及び方法を以下に解説する。ここで言及された全ての公開文献は、文献で報告され、かつ、本発明の関係で用いてもよいであろう細胞株、プロトコル、試薬及びベクタを記述及び開示することを目的として引用されている。ここで、本発明が、先行発明の効力上、このような開示よりも先行するものとする権利はないとの承諾として決してみなされてはならない。
【００２３】
定義
用語「誘導体」とは、ポリペプチド配列、ポリヌクレオチド配列、又はアンチセンスポリヌクレオチド配列の修飾を言う。ポリペプチドは、化学的に修飾されて、本発明による免疫原性膜たんぱく質の生物学的活性を保持する（表１を参照されたい）。更に、このような修飾の結果、あるポリペプチドの生物学的活性の阻害が起きる場合もある。ペプチドの誘導体は、前記免疫原性膜たんぱく質をコードするアミノ酸配列に少なくとも60%、同一又は類似である（表１を参照されたい）。好適な誘導体は、本発明による免疫原性膜たんぱく質をコードするアミノ酸配列に対して少なくとも約65%、70%、そして更により好適には少なくとも80%、85%、90%、95%、又は 98%、同一又は類似のものである（表１を参照されたい）。
【００２４】
ある特に好適な実施態様では、前記免疫原性膜たんぱく質（表１を参照されたい）のアミノ酸配列に対して少なくとも65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%の全体的アミノ酸配列相同性、類似性又は同一性を有する誘導体を、本発明に従って用いる。
【００２５】
更に「誘導体」の定義に含まれるのは、対立遺伝子バリアントなど、一つ以上のヌクレオチドの置換、追加又は欠失分異なるような修飾されたポリヌクレオチド配列であり、従って、SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3、又はZP3 ポリペプチド（表１を参照されたい）をコードするポリヌクレオチドとは、遺伝暗号の縮重のために異なるような配列を含むであろう。
【００２６】
ある一つのポリペプチド中に、同じ種類の修飾が同じ又は異なる程度、複数の部位に存在する場合があることは理解されよう。更に、ある一つのポリペプチドが多くの種類の修飾を含むこともある。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノもしくはカルボキシル末端を含め、一個のポリペプチド中のどこでも起き得る。修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、GPI アンカーの形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、たんぱく質分解によるプロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、糖付加、脂質の結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化、水酸化及びADP-リボシル化、セレノイル化、硫酸化、トランスファRNAにより媒介されるアミノ酸のたんぱく質への追加、例えばアルギニル化、及びユビキチン化、がある。例えば PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton,
W. H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., Posttranslational
Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in
POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed.,
Academic Press, New York (1983) を参照されたい。ポリペプチドは分枝状でも、又は、分枝の有無に関係なく環状でもよい。環状の、分枝状の及び分枝状環状のポリペプチドは、翻訳後修飾という天然のプロセスの結果生じたものでも、完全に合成による方法で作製されたものでもよい。 
【００２７】
誘導体とは、例えばPEG、蛍光性、放射性、発光性又はりん光性の基を酵素、タグ、糖側鎖等へ結合させた結合体など、付加的な特性をもたらす化学基又は分子へのポリペプチド又はその断片の結合体もいう。
【００２８】
用語「断片」とは、少なくとも５個の連続したアミノ酸残基を含むと共に、好ましくは
本発明による免疫原性膜たんぱく質の生物学的活性を保持したポリペプチド配列の一部分や、あるいは、翻訳されたときに、例えば抗原性、又は構造ドメインの特徴など、前記膜たんぱく質のいくつかの機能的特徴を保持したポリペプチドを生じるようなポリペプチド配列を言う。
【００２９】
用語「生物学的活性」は、用語「生物学的に活性な」、「生物活性」又は「活性」と交換可能に用いられている場合があり、そしてここでの目的に関しては、本発明による免疫原性膜たんぱく質（その天然又は変性後のコンホメーションのいずれであるかに関係なく）、その誘導体又は断片が直接又は間接的に果たす免疫原性／抗原性のエフェクタ機能を意味する。 エフェクタ機能には、現在公知である、又は内在するに関係なく、他の分子のリン酸化（キナーゼ活性）又は活性化、分化の誘導、有糸分裂又は成長の促進活性、シグナル伝達、免疫調節、DNA調節機能等がある。抗原性機能には、天然で生じる、もしくは変性した、本発明による免疫原性膜たんぱく質、その誘導体もしくは断片に対して生じる抗体と交差反応することができるエピトープ又は抗原性部位の所持がある。従って、このようなたんぱく質の生物学的活性は、標的細胞のシグナリング経路中のアダプタ・たんぱく質としてそれが機能することであってもよい。このようなシグナリング経路は、例えば、細このような細胞の細胞分化、増殖及び／又は遊走を調節することができる。本発明による標的細胞は、上皮又は癌細胞であってよい。
【００３０】
文言「ヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド配列」又は「ポリヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又はそれらのいずれかの断片をいう。これらの文言は、更に、ゲノム又は合成由来の、一本鎖でも、又は二本鎖でもよいDNA又はRNAも言い、また、ペプチドポリヌクレオチド配列（PNA）に対して、又は、いずれかのDNA様又はRNA様物質に対して、センス鎖又はアンチセンス鎖を表す場合がある。
【００３１】
公知のように、ある特定のポリペプチドにとっての遺伝子は、ある個体のゲノム中に単一で存在したり、又は複数のコピーで存在したりする。このような重複遺伝子は同一であったり、あるいは、その全てが、それでも尚実質的に同じ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするような、ヌクレオチドの置換、追加又は欠失を含め、いくつかの修飾を有したり場合がある。文言「本発明の免疫原性膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列」は、従って、ある特定の個体内の一つ以上の遺伝子を言う場合がある。更に、ヌクレオチド配列中のいくつかの違いが、個々の生物間で存在する場合があり、対立遺伝子と呼ばれる。このような対立遺伝子の違いの結果、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列が違ったり、又は違わなかったりし、それでも尚、同じ生物学的活性を持つたんぱく質をコードしている場合がある。
【００３２】
用語「非ステロイド依存性癌」とは上皮細胞由来から生じる癌を言い、その中には、限定はしないが、乳癌、肺癌、胃腸管の癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、膀胱癌、皮膚癌、特に黒色腫及び／又は他の癌が含まれよう。本発明の文脈内で、上皮癌は、例えば前癌、早期及び／又は後期癌など、様々な病期のものであろう。癌はまた、様々な程度の異型度のものであってもよく、この場合の異型度とは、その癌が進行した組織学的分化の程度を言う。癌の病期及び意型度の指針は当業者に公知であり、アメリカン・ジョイント・コミッティー・オン・カンサーからの「Cancer Staging Handbook」に解説されている。 本発明の文脈に更に含まれる上皮癌は、上皮由来の新生物を言う場合がある。
【００３３】
用語「胃腸管の癌」とは、対象の胃腸管に関連する癌状態を言う。本発明の文脈内で、胃腸管の癌には、限定はしないが、食堂、胃、小腸、結腸、直腸、膵臓、肝臓、胆嚢、及び胆管の癌が含まれる。本発明の文脈内において、胃腸管の癌は、様々な病期や、様々な程度の異型度であってよい（アメリカン・ジョイント・コミッティー・オン・カンサーからの「Cancer Staging Handbook」を参照されたい）。
【００３４】
用語「新生物」は、文言「上皮の急性及び慢性の炎症」と交換可能に用いられている場合があり、新しく、かつ異常な成長、特に、成長が制御不能かつ進行性であるような組織の新成長を言う。
【００３５】
用語「生体試料」及び「検査試料」とは、いずれかの対象から単離されたあらゆる生物学的流体、排泄物、組織及び細胞を言う。本発明の文脈内において、このような試料には、限定はしないが、血液、血清、血漿、乳首吸引液、尿、精液、精液、精漿、前立腺液、排泄物、涙、唾液、汗、生検、腹水、脳脊髄液、乳汁、リンパ液、又は組織抽出試料が含まれる。
【００３６】
文言「検査分子又は化合物のライブラリ」は、ここでは、DNA分子、ペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト、モノクローナル抗体、免疫グロブリン及び／又は薬学的作用薬を含有するライブラリを包含するために用いられている。これらには、新しい又は既知の分子又は化合物が含まれよう。更に、ここで用いられる用語「モノクローナル抗体」及び「免疫グロブリン」には、それらの断片及び誘導体が含まれる。
【００３７】
「細胞」、「ホスト細胞」、「標的細胞」又は「組換えホスト細胞」はここでは交換可能に用いられる用語であり、形質転換した又はトランスフェクトされた、あるいは、外因性のポリヌクレオチド配列により形質転換又はトランスフェクション可能な、細胞を言う。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代又は潜在的な後代も言うと理解されている。突然変異又は環境の影響が原因で特定の改変が後の世代に起きることがあるため、このような後代は実際には親細胞と同一でないかも知れないが、それでも尚、ここで用いられるこの用語の範囲に含まれる。
【００３８】
「送達複合体」は、標的決定手段を意味するものとする（例えば、アンチセンスポリヌクレオチド配列、たんぱく質、ポリペプチド、又はペプチドの、標的細胞表面への高親和結合、及び／又は、標的細胞による細胞内取り込みの増加、につながる分子）。標的決定手段の例には：ステロール（例えばコレステロール）、脂質（例えば陽イオン性脂質、ビロゾーム又はリポソーム）、ウィルス（例えばアデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、又はレトロウィルス）がある。好適な複合体は、標的細胞による内部移行前に著しい解離が起きないようにin vivoで充分に安定なものである。しかしながら、前記の複合体は、当該のポリヌクレオチド、たんぱく質、ポリペプチド、又はペプチドが機能的な形で放出されるように、該細胞内の適した条件下で切断可能である。
【００３９】
用語「レポータ・コンストラクト」はここで、その生成物が容易に検定されるコーディング単位を提供するために別の配列にインフレームで連結された標的遺伝子を包含する。レポータ遺伝子の例には、限定はしないが、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光たんぱく質（GFP）、強化緑色蛍光たんぱく質（EGFP）、Ds-Red蛍光たんぱく質、遠赤蛍光たんぱく質（Hs-Red）、分泌性アルカリホスファターゼ（SEAP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ネオマイシン等がある。
【００４０】
「アンチセンスポリヌクレオチド配列」とは、少なくとも約10個のヌクレオチドから成るアンチセンス分子又は抗遺伝子物質を言う。いくつかの実施態様では、アンチセンスポリヌクレオチド配列は少なくとも 15、18、20、25、30、35、40、又は50個のヌクレオチドから成る。アンチセンスポリヌクレオチド配列は、mRNAの5'側非翻訳（UTR）領域（AUG翻訳開始コドンを含む、AUG翻訳開始コドンまで）、3'側UTR、又は、あるポリヌクレオチド配列の非コーディング領域に相補的である。あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列へのアンチセンスポリヌクレオチド配列の結合は、前記mRNAを発現するホスト細胞において前記mRNAの転写又は翻訳を変化させる上で有効である。本発明の文脈内において、アンチセンスポリヌクレオチド配列は、直線状でも、環状でも、あるいは三重へリックス形成性でもよいが、本発明による免疫原性膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列に対して相補的である（表１を参照されたい）。更に、アンチセンスポリヌクレオチド配列は、一本鎖又は二本鎖核酸でもよく（例えばモルホリノ、PNAs又はRNAi）、そしてａ）5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル) ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸 (v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸 メチルエステル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル) ウラシル、(acp3)w、及び2,6-ジアミノプリンから成る群より選択される少なくとも一つの修飾塩基部分；及び／又は、限定はしないが、 アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む群より選択され、あるいはペントース糖部部分を欠く、少なくとも一つの修飾糖部分、及び／又は ホスホロチオエート、ホスホールアミドチオエート、ホスホールアミデート、ホスホールジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、ホルムアセタール又はその類似体、やα-DNA、2'-O-メチル RNA、モルホリン骨格、ペプチド結合により連結された反復N−(2−アミノエチル)-グリシン単位（ペプチド核酸；PNAs）又はロックされた核酸（LNAs）から成る群より選択される少なくとも一つの修飾リン酸骨格を含む。代わりに、RNA干渉（RNAi）を利用して既知の機能のたんぱく質の発現を阻害する方法も、本発明に含まれる。より長いdsRNAのリボヌクレアーゼIII切断により生じる小さな干渉性（siRNAs）は、翻訳を阻害するために用いられるが、好ましくは20乃至25ヌクレオチド長であるとよい。更に、本発明は、既知の機能のたんぱく質の翻訳を阻害するためにRNA Lassos を用いる方法も包含する。
【００４１】
用語「アンタゴニスト」とは、ある実施態様では、本発明による免疫原性膜たんぱく質に結合したときに、このようなポリペプチドの生物学的活性を減少させる分子又は化合物を言う。このようなアンタゴニストは、たんぱく質のリガンド結合ドメインと相互作用することで、このたんぱく質のリガンドにより誘導される活性化を妨げるであろう。更にアンタゴニストは、上記の前記たんぱく質のいずれか一つと、別の分子との相互作用を、例えば二量体化ドメイン、スカフォード・ドメインなどの必須なたんぱく質対たんぱく質間の相互作用部位の立体障害となることで阻害するものでもよい。更に、アンタゴニストは、あるポリヌクレオチドの調節領域と相互作用することにより、前記免疫原性膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列の発現を減少させる及び／又は阻害するものでもよい。選択的には、アンタゴニストは、SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3、又はZP3 たんぱく質の下流に位置するか、あるいは前記たんぱく質と相互作用するたんぱく質の発現又は生物学的活性を阻害又は減少させる分子又は化合物であってよい。またアンタゴニストは、上記前記たんぱく質のいずれか一つの生物学的又は免疫学的活性の効果の量又は期間を減少させる分子又は化合物であってもよい。アンタゴニストには、たんぱく質、ポリヌクレオチド配列、糖質、抗体又はその断片、あるいはこれらの効果を果たす、いずれか他の分子が含まれよう。
【００４２】
用語「新生細胞」又は「新生組織」とは、著しい細胞変化（形質転換）を起こした、それぞれ細胞又は組織を言う。このような細胞変化は、特定の制御機序からの脱出、成長能の増加、細胞表面の変化、核型異常、正常から形態学的及び生化学的逸脱、及び、浸潤能、転移能及び致死能をもたらす他の属性となって現れる。
【００４３】
用語「抗体」とは、特定の抗原に結合して認識する、免疫グロブリン遺伝子に実質的にコードされたポリペプチド又はその断片を言う。抗体は、例えばインタクト免疫グロブリンとして存在するか、あるいは、ペプチダーゼ消化により生じる、数多くのよく特徴付けられた断片として存在する。全抗体を改変することで作製される、あるいは、組換えDNA技術を用いて合成される、抗体断片も本発明の文脈内に含まれる。たんぱく質及び他の生物学的に活性な分子の不均質な集団中で、抗体は、適した結合条件下にあれば、その特異的な抗原又はその断片と相互作用するであろう。この文脈で、本発明の範囲内で用いられる抗体は、SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3、又はZP3 たんぱく質に優先的に結合する。更に、抗体又はその断片が、当該抗体に付加的な特性をもたらす化学基又は分子に結合されているような抗体結合体も包含される。
【００４４】
治療薬のスクリーニング
本発明は、SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3、又は ZP3ポリペプチド及びこれらの断片から成る群より選択される少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質の異常な発現及び／又は生物学的活性を特徴とする非ステロイド依存性癌の治療用の治療薬をスクリーニングする方法を提供するものである。
【００４５】
本発明は、あるポリペプチド、その誘導体又は断片の生物学的活性を減少させる及び／又は阻害する、あるいは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の発現などに対して阻害効果を有する、候補、検査分子又は化合物、又は作用薬（例えばペプチド、ペプチド・ミメティック、低分子又は他の薬物）を同定するものである。
【００４６】
ポリヌクレオチド・レベルに対しては、このような方法は、例えば：
ａ．  前記免疫原性膜たんぱく質のプロモータの制御下にあるレポータ・コンストラクトを、検査分子もしくは化合物、又は検査分子もしくは化合物のライブラリに、特異的結合及び／又は相互作用が可能な条件下で接触させるステップと；
ｂ．  前記レポータ・コンストラクトの発現レベルを検出するステップと
を含み、この場合、コントロールに比較したときの発現レベルの変化が、潜在的な治療的活性の指標である。
【００４７】
通常、ある遺伝子のプロモータは開始コドンの上流に位置し、ヨーロピアン・バイオインフォマティクス・インスティテュートによりウェブ上で提供されるものなど、公知のアルゴリズムを用いて容易に同定することができる。
【００４８】
発現レベルは、例えば放射性もしくは他の標識の導入や、レポータが酵素である場合は酵素活性、あるいは定量的PCRなど、当業で公知の方法により、測定することができる。公知のレポータ分子には、例えばβ-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光たんぱく質（GFP）、強化緑色蛍光たんぱく質（EGFP）、Ds−Red 蛍光たんぱく質、赤外蛍光たんぱく質 (Hc-red)、分泌性アルカリホスファターゼ（SEAP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ (CAT)、ネオマイシン等がある。
【００４９】
たんぱく質レベルに対しては、このような方法は、例えば：
ａ．  前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片を、検査分子もしくは化合物、又は検査分子もしくは化合物のライブラリに、特異的結合及び／又は相互作用が可能な条件下で接触させるステップと；
ｂ．  特異的結合及び／又は相互作用のレベルを検出するステップと
を含み、この場合、コントロールに比較したときの相互作用レベルの変化が、潜在的な治療的活性の指標である。
【００５０】
ある実施態様では、当該のポリペプチドは、本発明による免疫原性膜たんぱく質の少なくとも一つの生物学的活性を有する。このようなポリペプチド、その誘導体又は断片と直接的又は間接的に相互作用することができるたんぱく質又はペプチドは、多様な方法により特定することができる。例えば、このような分子は、多種の結合検定法（酵母２ハイブリッド法に関するBemis et al. (1995) Methods Cell
Biol. 46, 139−151, Fields and Sternglanz (1994) Trends Genet. 10, 286-292, Topcu and Borden (2000) Pharm. Res. 17, 1049−1055；酵母３ハイブリッド法に関する Zhang et al. (1999) Methods Enzymol. 306, 93-113；GST プルダウンに関するPalmer et al. (1998) EMBO J. 17, 5037-5047 に記載されたGST プルダウン；及びScott
and Smith (1990) Science 249, 386−390に記載されたファージ・ディスプレイを参照されたい）に基づく方法を用いて特定することができる。
【００５１】
好適な実施態様では、TM4SF6、SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3、又は ZP3 ポリペプチドの生物学的活性は、上皮又は癌細胞など、特定の標的細胞の細胞分化、増殖及び／又は遊走の調節である。
【００５２】
ある実施態様では、本発明は、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片に結合する、相互作用する、又はその生物学的活性を調節する、検査分子又は化合物をスクリーニングする検定法を提供するものである。本発明による前記検査化合物は、生物学的ライブラリ、アプティアリ（原語：aptially）指定可能なパラレル固相もしくは液相ライブラリ、逆重畳積分を要する合成ライブラリ法、「ワン・ビーズ−ワン・コンパウンド」ライブラリ法、及びアフィニティ・クロマトグラフィ選抜法を用いた合成ライブラリ法を含め、当業で公知のコンビナトリアル・ライブラリ法の数多くのいずれを用いても、得ることができる。生物学的ライブラリ法はペプチド・ライブラリに限られるが、他の四つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマ、又は化合物の低分子ライブラリに応用することができる（Bindseil et al. (2001) Drug Discov.
Today 6, 840-847; Grabley et al. (2000) Ernst Schering Res. Found. Workshop. pp. 217−252; Houghten et al. (2000) Drug Discov. Today 5, 276−285; Rader, C. (2001) Drug Discov.
Today 6, 36−43）。
【００５３】
分子ライブラリの合成法の例は、例えばDeWitt et al. (1993) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90, 6909-6913; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,
11422-11426; Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37,
1233-1251; Gordon et al. (1994) J. Med. Chem. 37, 1385−1401など、当業に見ることができる。
【００５４】
化合物のライブラリは溶液中（例えばHoughten (1992) Biotechniques 13, 412−421）、又はビーズ上（Lam et al. (1991) Nature 354,
82-84）、チップ上（Fodor et al. (1993) Nature 364, 555-556）、細菌上（１９９３年６月に公開された米国特許第5,223,409号）、胞子上[米国特許第 5,571,698 号（１００６年１１月に公開された）；第5,403,484 号（１９９５年４月に公開された）；及び第5,223,409 号（１９９３年６月に公開された）]、プラスミド上（Cull et
al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
1865-1869）又はファージ上（Scott and Smith (1990) Science. 249, 386-390; Devlin et al. (1990) Science. 249, 404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,
6378−6382; Felici et al. (1991) J. Mol. Biol. 222, 301-310）に提供できよう。
【００５５】
ある好適な実施態様では、検査分子もしくは化合物のライブラリを、DNA 及び／又は RNA分子、ペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト、モノクローナル抗体、免疫グロブリン、低分子薬、薬学的物質及びそれらの断片及び／又は組合せから成る群より選択する。
【００５６】
本発明によれば、本発明の方法により同定された検査分子もしくは化合物は、好ましくは、本発明の少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質の遺伝子発現及び／又は生物学的活性の抑制能を示すとよい。
【００５７】
ある実施態様では、当該の検定は、細胞が生物学的に活性な免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片を発現するような細胞ベースの検定である。発現したポリペプチドを検査分子もしくは化合物に接触させ、この検査分子もしくは化合物の、当該ポリペプチドへの結合能又は相互作用能を判定する。当該の細胞は、限定はしないが例えば酵母細胞、無脊椎動物細胞（例えばＣ．エレガンス（原語：C. elegans））、昆虫細胞、硬骨魚類細胞、両生類細胞、又は哺乳動物由来の細胞などの真核細胞などであってよい。当該のポリペプチドに対する検査分子もしくは化合物の結合能又は相互作用能の判定は、例えばその検査分子もしくは化合物を放射性同位元素（例えば125I、35S、14C、又は3H）又は酵素（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼ）標識に結合させることで、この検査分子もしくは化合物の、生物学的に活性なポリペプチド、その誘導体もしくは断片への結合又は相互作用が、標識された分子もしくは化合物を複合体の状態で検出することにより、判定できるようにすることで、行うことができる。検査分子もしくは化合物の標識法、及び、膜結合型たんぱく質又は膜関連たんぱく質による標識法は、当業で公知である。
【００５８】
ある好適な実施態様では、当該の検定は、本発明の生物学的に活性な免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片を発現する細胞を、前記免疫原性膜たんぱく質に結合及び又は相互作用して検定混合物を形成する公知の分子もしくは化合物に接触させるステップと、前記検定工具物を検査分子もしくは化合物に接触させるステップと、前記検査分子もしくは化合物の、あるポリペプチドへの結合能又は相互作用能を判定するステップとを含み、この場合、前記検査分子もしくは化合物の、アルポリペプチドへの結合能又は相互作用能の判定は、コントロールに比較される。前記検査分子もしくは化合物の、本発明による免疫原性膜たんぱく質との結合能又は相互作用能の判定は、ある一個のポリペプチドをめぐる前記検査分子もしくは化合物と既知の標的分子もしくは化合物との間の競合的結合／阻害動態に基づく。同じ標的をめぐる二つの分子の競合的結合又は相互作用を検出する方法は当業者に公知である。
【００５９】
別の実施態様では、当該の検定は、本発明の生物学的に活性な免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片を発現する細胞を、検査分子もしくは化合物に接触させるステップと、前記検査分子もしくは化合物の、あるポリペプチドの生物学的活性の阻害能を判定するステップとを含む細胞ベースの検定である。これは、例えば前記膜たんぱく質が既知の標的分子に結合又は相互作用し続けるかどうか、あるいは、特定の細胞機能（例えばイオン・チャネリング）が損なわれたかどうかを判定することにより、達成することができる。例えば、標的分子は、細胞外シグナル、触媒活性を有する第二の細胞内たんぱく質、特定の遺伝子の転写を調節するたんぱく質、又は、たんぱく質翻訳を開始させるたんぱく質、のシグナル伝達を促すシグナル伝達経路の一成分であってよい。生物学的に活性な免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片の、標的分子への結合能又は相互作用能の判定は、その標的分子の活性を判定することによって、行うことができる。例えば、標的分子の活性は、当該標的の細胞内第二メッセンジャ[例えば細胞内 Ca2+、ジアシルグリセロール及びイノシトールトリホスフェート IP3]]の誘導を検出したり、適した基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出したり、例えばβ-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光たんぱく質 (GFP)、強化緑色蛍光たんぱく質 (EGFP)、Ds−Red蛍光たんぱく質、赤外蛍光たんぱく質
(Hc-red)、分泌性アルカリホスファターゼ (SEAP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ (CAT)、ネオマイシン等の検出可能なマーカをコードするポリヌクレオチドに作動的に連鎖させたレポータ遺伝子の（前記ポリペプチドに応答性だと思われる調節因子を介した）誘導を検出したり、あるいは、細胞分化、増殖又は遊走などの細胞応答を検出したりすることで、判定することができる。
【００６０】
更に別の実施態様では、本発明の検定は、本発明の生物学的に活性な免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片を、検査分子もしくは化合物に接触させるステップと、該検査分子もしくは化合物の、前記ポリペプチドのいずれか一つへの結合能又は相互作用能を判定するステップとを含む無細胞検定である。あるポリペプチドに対する検査分子もしくは化合物の結合又は相互作用は、上述した通りに直接又は間接的に判定することができる。ある好適な実施態様では、本検定は、前記ポリペプチドのいずれか一つを、ある免疫原性膜たんぱく質に結合又は相互作用する既知の標的分子もしくは化合物に接触させて、検定混合物を形成するステップを含む。この検定混合物を検査分子もしくは化合物に接触させるが、この検査分子もしくは化合物の、当該ポリペプチドとの相互作用能の判定は、前記ポリペプチドをめぐる該検査分子もしくは化合物と既知の分子もしくは化合物との競合的結合／阻害動態に基づく。標的が免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片である場合の、同じ標的をめぐる二つの分子の競合的結合、又は相互作用を検出する方法は、当業者に公知である。
【００６１】
別の実施態様では、当該の検定は、前記生物学的に活性な免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片を、検査分子もしくは化合物に接触させるステップと、この検査分子もしくは化合物の、前記ポリペプチドの活性阻害能を判定するステップとを含む、無細胞検定である。当該検査分子もしくは化合物の、あるポリペプチドの活性阻害能の判定は、例えば、直接的な結合の判定に関して上述した方法の一つにより、標的分子への当該ポリペプチドの結合能を判定するなどにより、行うことができる。代替的な実施態様では、当該の検査分子もしくは化合物の、前記ポリペプチドの活性調節能の判定を、前記ポリペプチドの、標的分子を更に調節する能力を判定することにより、行うことができる。
【００６２】
本発明の上記の検定法の実施態様においては、 本発明の免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片、あるいはその標的分子のいずれかを固定すると、複合体を形成していない形の一方又は両方のたんぱく質から、複合体を形成したものの分離を容易にしたり、検定の自動化に対応したりするために、好ましい場合がある。候補化合物の存在下及び非存在下における、検査分子もしくは化合物の、前記免疫原性膜たんぱく質との結合、あるいは、ある免疫原性膜たんぱく質の標的分子との相互作用は、反応物を含有することに適していればいずれの容器内でも達成することができる。このような容器の例には、マイクロタイタ・プレート、試験管、及びマイクロ遠心管がある。ある実施態様では、たんぱく質の一方又は両方をマトリックスに結合可能にするドメインを加えた融合たんぱく質を提供することができる。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合たんぱく質は、グルタチオン・セファロース・ビーズ（ミズーリ州セントルイス、Sigma Chemical社）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタ・プレート上に吸着させることができ、それを次に検査分子もしくは化合物と、非吸着性標的たんぱく質又は生物学的に活性な免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片のいずれかとに配合する。次にその混合物を、複合体形成を誘導する条件（例えば塩及びpHについて生理条件）下でインキュベートする。インキュベート後、該ビーズ又はマイクロタイタ・プレートを洗浄して未結合の成分を取り除き、複合体形成を、例えば上述したように直接又は間接的に測定する。代替的には、複合体をマトリックスから解離させ、前記ポリペプチドの結合又は活性のレベルを、標準的な技術を用いて判定することができる。
【００６３】
たんぱく質をマトリックス上に固定する他の技術も、本発明のスクリーニング検定で用いることができる。例えば、本発明の生物学的に活性な免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片、あるいはその標的分子を、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を用いて固定することができる。
【００６４】
別の実施態様では、前記免疫原性膜たんぱく質の発現の阻害物質が、細胞を候補分子又は化合物に接触させ、その細胞中の、選択されたmRNA又はたんぱく質[即ち、ポリヌクレオチドに対応するmRNA又はたんぱく質、あるいは生物学的に活性なポリペプチド]の発現を判定する方法で同定される。ある好適な実施態様では、当該細胞は動物細胞である。より好適には、当該細胞は、昆虫、魚類、両生類、マウス、ラット、又はヒトを由来とすることができる。候補分子又は化合物の存在下における選択されたmRNA又はたんぱく質の発現レベルを、候補分子又は化合物の非存在下における選択されたmRNA又はたんぱく質の発現レベルに比較する。次に、その候補分子又は化合物を、本発明の免疫原性膜たんぱく質の発現の阻害物質として、この比較に基づいて同定することができる。例えば、選択されたmRNA又はたんぱく質の発現が、候補分子又は化合物の存在下では、その非存在下よりも少ない（統計上有意に少ない）場合、その候補分子又は化合物の、その選択されたmRNA又はたんぱく質発現の阻害物質として同定する。細胞中での選択されたmRNA又はたんぱく質発現のレベルは、ここで解説された方法で判定することができる。
【００６５】
上記の検定で同定された検査分子又は化合物は、本発明の文脈内で、本発明の免疫原性膜たんぱく質の特異的治療薬としてみなされる。
【００６６】
別の実施態様では、前記治療薬は、本発明の免疫原性膜たんぱく質をコードする遺伝子のプロモータの制御下にあるレポータ・コンストラクトの発現レベルを、検査分子又は化合物の存在下又は非存在下で測定するレポータ検定を用いても、同定することができる。 前記免疫原性膜たんぱく質をコードする遺伝子のプロモータは、各々のcDNAを持つゲノム・ライブラリをスクリーニングすることにより単離することができ、該ゲノム・ライブラリはcDNAの5’末端を含有することが好ましい。次に、前記プロモータの一部分、典型的には20乃至約500塩基対長の一部分を、プラスミド中でレポータ遺伝子、例えばβ-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光たんぱく質 (GFP)、強化緑色蛍光たんぱく質 (EGFP)、Ds−Red蛍光たんぱく質、赤外蛍光たんぱく質
(Hc-red)、分泌性アルカリホスファターゼ (SEAP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ (CAT)、ネオマイシン遺伝子などの上流にクローニングする。次に、このレポータ・コンストラクトを哺乳動物細胞などの細胞内にトランスフェクトする。トランスフェクト後の細胞をマルチ・ウェル・プレートのウェルに配分し、多様な濃度の検査分子もしくは化合物をウェルに加える。数時間のインキュベート後、レポータ・コンストラクトの発現レベルを当業で公知の方法に従って判定する。検査分子もしくは化合物と一緒にインキュベートされたトランスフェクト細胞の、検査分子もしくは化合物なしでインキュベートされたトランスフェクト細胞に比較したときの、レポータ・コンストラクトの発現レベルの違いは、この検査分子もしくは化合物が、前記免疫原性膜たんぱく質をコードする遺伝子の発現を調節できること、従って治療薬であることを示すものであろう。
【００６７】
本発明の一実施態様では、前記治療薬を、非ステロイド依存性癌を治療するために用いることができるが、また、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、及び霊長類などの哺乳動物を含め、このような治療法を必要とする患者に応用できよう。しかし最も好適には、このような治療を必要とする前記患者がヒトであるとよい。
【００６８】
更に本発明は、標的細胞の増殖及び／又は分化又は細胞死の調節を目的とした、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列の抑制法を包含するものである。本抑制法は：
本発明の方法により同定された治療薬を含む組成物を提供するステップと
前記標的細胞に治療上有効量の前記組成物を接触させるステップと
を含む。
【００６９】
本発明の前記免疫原性膜たんぱく質に結合／相互作用することが既知の分子は、組換え（即ち、当該分子がアミノ酸性のものである場合）、化学的（即ち、核酸、化合物）、又は抗体の場合などのように生物学的に合成することができる。
【００７０】
本発明は、更に、上記のスクリーニング検定で同定された新規な作用薬と、ここで解説されたように非ステロイド依存性癌の治療におけるその使用とに関する。
【００７１】
非ステロイド依存性癌の治療
本発明のある実施態様においては、本発明の免疫原性膜たんぱく質の異常な遺伝子発現及び／又は生物学的活性が原因で起きる非ステロイド依存性癌を、本発明の方法により同定された治療薬で治療することができる。あるポリヌクレオチドの異常な遺伝子発現（表１を参照されたい）の結果、生物学的に活性な免疫原性膜たんぱく質のレベルが変化することがある。本発明の文脈内において、異常な遺伝子発現の結果としての前記膜たんぱく質のレベル増加が、対象における異常な細胞増殖、細胞分化、細胞遊走、腫瘍発生又は転移につながることがある。非ステロイド依存性癌又は異常な細胞増殖、細胞分化、細胞遊走、腫瘍発生又は転移を有すると特定された対象は、その各々の遺伝子の発現レベルを減少させる、あるいは、前記免疫原性膜たんぱく質の生物学的活性を阻害する、ことが示された本発明の治療薬を投与することにより、治療することができる。
【００７２】
更に本発明は、腫瘍の形成及び／又は発生を妨げる方法も提供する。例えば、腫瘍の発生の前には、過形成、メタプラシア、及び異形成などの前新生性病変などの特異的病変が存在することがある。本発明の文脈において、このような病変を上皮組織に見ることができる。従って、本発明は、本発明の前記免疫原性膜たんぱく質を治療的な量、前新生性病変を有する対象に投与するステップを含む、このような病変の新生性病変への発達を阻害する方法を提供するものである。
【００７３】
本発明のこの局面は、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法に関し、当該方法は、対象の免疫系が新生性疾患と闘えるように抗体及び／又はT細胞免疫応答を生じるために充分な本発明の膜たんぱく質又はその断片を哺乳動物に接種するステップを含む。本発明の更に別の局面は、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法に関するが、当該方法は、対象を疾患から防御する抗体を生じるこのような免疫応答を誘導するために、免疫原性膜たんぱく質を、前記たんぱく質のin vivoでの発現を命令するベクタを通じて送達するステップを含む。
【００７４】
本発明の更なる局面は、哺乳動物のホストに導入されたときに、その哺乳動物で受容体ポリペプチドに免疫応答を誘導する免疫学的／ワクチン調合物（組成物）に関する。この場合、前記組成物は、本発明の免疫原性膜たんぱく質又はその遺伝子を含む。更に本ワクチン調合物は適した担体を含んでいてもよい。膜たんぱく質は胃で分解されると思われるため、（皮下、筋肉内、静脈内、皮内等の注射を含め）それを非経口投与することが好ましい。非経口投与に適した調合物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び当該調合物をレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでいてもよい水性及び非水性の無菌の注射用溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含んでいてもよい水性及び非水性の無菌の懸濁液がある。本調合物を、例えば密封したアンプル及びバイアルなど、単位用量又は多用量容器に入れて提供してもよく、使用直前に無菌の液体の担体を加えるだけで済む凍結乾燥した状態で保存してもよい。本ワクチン調合物には、更に、水中油系及び当業で公知の他の系など、本調合物の免疫原性を高めるアジュバント系も含めてよい。投薬量は、ワクチンの特異的活性に依存し、また、慣例的な実験で容易に決定することができる。
【００７５】
本発明の文脈内において、治療的な量の、本発明の前記免疫原性膜たんぱく質治療薬であれば、前新生性病変が新生性病変に発達していくことを、最小限の副作用で有効に阻害するであろう。
【００７６】
本発明の別の実施態様では、対象のワクチン接種用の医薬組成物調製の際に、前記免疫原性膜たんぱく質、その断片、誘導体又は相同体の少なくとも一つを使用すること、あるいは、前記免疫原性膜たんぱく質、あるいはその断片、誘導体又は相同体の少なくとも一つを含有する及び／又は発現する細胞を使用すること、に関する。
【００７７】
ある好適な実施態様では、本発明は、上皮細胞の増殖、分化又は遊走を阻害する方法を提供するものであり、当該の方法は、腫瘍発生時など、上皮細胞が異常に高い増殖速度、異常な分化及び／又は遊走を示すような組織を、本発明の治療薬に接触させるステップを含む。非ステロイド依存性癌の発生の阻害は、本発明の検定で同定された治療薬の抗増殖、抗分化及び／又は抗遊走効果により予測される。
【００７８】
本発明の文脈内において、異常な増殖中、分化中又は遊走中の細胞は、乳房、肺、食道、胃、小腸、結腸、直腸、膵臓、肝臓、胆嚢、胆管、前立腺、卵巣、子宮頚管及び子宮内膜組織に存在する上皮細胞である。
【００７９】
本発明の前記免疫原性膜たんぱく質の異常な発現を原因とする非ステロイド依存性癌を治療するために用いてもよいアプローチの中には、例えば、アンチセンス、siRNA、及び／又は三重へリックス分子を用いて遺伝子発現をポリヌクレオチド・レベルで阻害するアプローチや、あるいは、本発明により提供された多様なスクリーニング法により同定された治療薬を用いるアプローチがある。更に、本発明によれば、あるポリペプチドに対して特異的な抗体を用いても、非ステロイド依存性癌を治療できよう。このような抗体は、本発明の免疫原性膜たんぱく質に特異的に結合することができ、従来技術における他の関連するポリペプチドに対する親和性よりも、本発明のポリペプチドに対して実質的に高い親和性を有する。
【００８０】
前記免疫原性膜たんぱく質を減少させる／阻害するとして同定された治療薬は、非ステロイド依存性癌を治療するために治療上有効量にして、対象に投与することができる。
【００８１】
更に本発明は、本発明の方法により同定された治療薬を含む医薬組成物も提供するものである。当初同定された治療薬を、例えばその活性、毒性、安定性、副作用あるいは物理的及び／又は化学的特性に関して当業で公知の方法により、更に最適化してもよい。従って、本発明のよる医薬組成物には、本発明の方法により同定された作用薬の断片、誘導体又は相同体を含めてもよい。
【００８２】
可溶型の免疫原性膜たんぱく質などのペプチド、並びにアゴニスト及びアンタゴニスト、ペプチド、抗体又は低分子を、適した薬学的な担体と組み合わせて調合してよい。このような調合物は、治療上有効量の当該ポリペプチド又は化合物と、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む、このような担体には、限定はしないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組合せ、がある。本調合物は、投与形態に適さねばならず、またその最適化は、充分、当業の技術水準範囲内である。本発明は、更に、本発明の前述の組成物の成分のうちの一つ以上で充填された一つ以上の容器を含む医薬用パック及びキットに関する。
【００８３】
本発明のポリペプチド及び他の化合物を単独で用いても、あるいは、治療用化合物などの他の化合物と併用してもよい。本医薬組成物の好適な形の全身投与には、注射、典型的には静脈内注射、がある。皮下、筋肉内、又は腹腔内などの他の注射経路も用いることができる。全身投与用の代替的手段には、胆汁酸塩又はフシジン酸又は他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘膜及び経皮投与がある。加えて、腸内用に、又は封入された調合物中に適切に調合されていれば、経口投与も可能であろう。これらの化合物の投与は、局所的であっても、及び／又は、軟膏剤、ペースト、ゲル等の形で局所化させてもよい。
【００８４】
必要な投薬量範囲は、分子の選択、投与経路、調合物の性質、対象の状態の性質、及び、担当医の判断に拠る。しかしながら、適した投薬量は、0.1乃至100μg/対象のkgの範囲内である。しかしながら、入手できる化合物が多種あり、また、多様な投与経路の効率に違いがあることを鑑みると、必要な投薬量には幅広い変更が必要であろうと予測される。例えば、経口投与には、静脈内注射による投与よりも高い投薬量が必要であろうと予測される。これらの投薬量レベルの違いは、当業で公知のように、最適化のための標準的な経験的慣例を用いて調節することができる。
【００８５】
治療で用いられるポリペプチドは、上述したように「遺伝子治療」としてしばしば言及される治療様式においては、対象内で内因的に生成させることもできる。従って、例えば対象由来の細胞を、ex vivoのポリペプチドをコードするように、レトロウィルス・プラスミド・ベクタを用いるなどしてDNA又はRNAなどで操作してもよい。その後この細胞を対象に導入する。
【００８６】
従って、本発明はまた、非ステロイド依存性癌の治療用の医薬組成物の調製に向けた、本発明による方法で同定された治療薬、又はその誘導体もしくはその相同体の使用、あるいは、前記治療薬又はその誘導体もしくは相同体を含有する、及び／又は、発現する送達複合体の使用、を提供するものである。
【００８７】
診断薬
本発明の別の局面は、本発明の免疫原性膜たんぱく質の発現を判定する診断検定、あるいは、ある個体が非ステロイド依存性癌に罹患しているかどうか、又は、このような免疫原性膜たんぱく質の異常な発現又は生物学的活性が原因で起きる非ステロイド依存性癌を発症するリスクがあるかどうかを判断するための、生体試料（例えば血液、血清、細胞、組織）の関係での前記膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド、に関する。更に本発明は、ある個体に、非ステロイド依存性癌を発症するリスクがあるかどうかを判定するための予後（又は予測的）検定も提供するものである。例えば、遺伝子発現のレベルを生体試料中で検定することで、あるたんぱく質が生体試料中で、標準に比較して高レベル、存在しているかどうかを判定することができる。このような検定を予後又は予測を目的として用いて、非ステロイド依存性癌の発症前に個体を予防的に治療することができる。
【００８８】
本発明の免疫原性膜たんぱく質又はそれをコードするポリヌクレオチドの存在又は非存在を生体試料中で検出する方法は、検査対象から生体試料を得るステップと、あるポリペプチド又はポリヌクレオチドの存在が直接標識されるように、前記生体試料を、あるポリペプチド又はポリヌクレオチド（例えばmRNA、ゲノムDNA）を検出することができる化合物又は作用薬に接触させるステップを含む。例には、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出や、DNAプローブを、蛍光標識されたストレプトアビジンでそれを検出できるようにビオチンで標識する末端標識がある。つまり、本発明の検出法を用いて、in vitroだけでなくin vivoで生体試料中のmRNA、たんぱく質、又はゲノムDNAを検出することができる。例えば、mRNAを検出する in vitro技術には、限定はしないが、ノーザン・ハイブリダイゼーション、in situ ハイブリダイゼーション、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR、下記の実施例を参照されたい）又は示差的ディスプレイがある。免疫原性膜たんぱく質を検出するin vitro技術には、限定はしないが、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、ウェスタン・ブロット、免疫沈降法、免疫蛍光法、又は、前記膜たんぱく質又はその断片に対して特異的な抗体を用いた組織アレイ分析（たんぱく質−発現プロファイリング）、がある。ゲノムDNAを検出するin vitro技術には、サザン・ハイブリダイゼーションがある。更に、前記免疫原性膜たんぱく質を検出する in vivo 技術には、あるポリペプチド又はその断片を狙った標識された抗体を対象に導入する方法がある。
【００８９】
ある実施態様では、当該の生体試料は、検査対象由来のたんぱく質を含有する。代替的には、当該の生体試料は、検査対象由来のmRNA、又は、検査対象由来のゲノムDNAを含有する。好適な生体試料には、限定はしないが、血液、血清、血漿、乳首吸引液、尿、精液、精液、精漿、前立腺液、排泄物、涙液、唾液、汗、生検、腹水、脳脊髄液、乳汁、リンパ液、又は、従来の手段により対象から単離された組織抽出試料がある。
【００９０】
別の実施態様では、本方法は、更に、コントロール対象からコントロール生体試料を得るステップと、前記ポリペプチド、あるいは前記ポリペプチドをコードするmRNA又はゲノムDNAの存在が前記検査試料中で検出されるように、前記コントロール試料を、前記ポリペプチド、あるいは前記ポリペプチドをコードするmRNA又はゲノムDNAを検出することができる化合物又は作用薬に接触させるステップと、前記コントロール試料中の前記ポリペプチド、あるいは前記ポリペプチドをコードするmRNA又はゲノムDNAの存在を、前記検査試料中の前記ポリペプチド、あるいは前記ポリペプチドをコードするmRNA又はゲノムDNAの存在と比較するステップとを含む。
【００９１】
更に別の実施態様では、前記免疫原性膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列を、例えば他の組織など、他の細胞種中の免疫原性膜たんぱく質の相同体や、他の哺乳動物生物由来の相同体を特定するおよび／またはクローニングするための使用に向けてデザインされたプローブ及びプライマ作製用のテンプレートとして用いる。
【００９２】
本発明の好適な実施態様では、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマを用いるが、この場合前記オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、前記免疫原性膜たんぱく質をコードするセンス又はアンチセンス配列の少なくとも約 15個、好ましくは約25個、より好ましくは約40個、50 個又は75 個の連続したヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の一領域を含む。例えば、前記膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列に基づくプライマを、PCR反応で用いて、特異的対立遺伝子などの相同体をクローニングすることができる。このようなプライマは、好ましくは、他の遺伝子に対して有意な相同性を持たない一領域中で選択されるとよい。同様に、前記配列に基づくプローブを用いて、同じ又は相同なたんぱく質をコードする転写産物又はゲノム配列を検出することができる。好適な実施態様では、 前記プローブは更に、それに付着させた、検出可能な標識分子団含み、例えばこの標識分子団は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、及び酵素コファクタから選択される。
【００９３】
更に、このようなプローブを、本発明の免疫原性膜たんぱく質を過剰発現する細胞又は組織を、例えばmRNAレベルを検出するなど、患者由来の細胞試料中のあるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のレベルを測定するなどにより、特定するための診断用検査キットの一部として用いることもできる。簡単に説明すると、特異的ヌクレオチドのプローブは、免疫原性膜たんぱく質の存在に関する、インタクト組織及び組織試料の組織学的スクリーニングを容易にする前記遺伝子（表１を参照されたい）から作製することができる。本発明の免疫原性膜たんぱく質のmRNAを狙った、又はゲノム配列を狙ったプローブの使用は、予測評価及び治療評価の両方に用いることができ、このとき、あるポリペプチドの発現又は存在は、例えば組織内の望ましくない細胞成長、異常な分化又は細胞遊走活性化の現れである。ここで解説された通りの免疫検定法と併用した場合、該オリゴヌクレオチド・プローブは、前記免疫原性膜たんぱく質の発現に関連した、癌の分子機序の決定を容易にするのに役立てることができる。更に、本発明の免疫原性膜たんぱく質の異常な発現（過剰発現）及び／又は生物学的活性により引き起こされるか、又は、このような異常な発現（過剰発現）及び／又は生物学的活性が寄与するような非ステロイド依存性癌を発症するリスクが、ある対象にあるかどうかを判断するキットも、本発明の範囲内にある。
【００９４】
ある好適な実施態様では、本方法を、ある対象に非ステロイド依存性癌が発症するリスクがあるかどうかを判断するために用いることができる。同じ実施態様で、本発明は、キットを、上記の方法に基づいて前記キットを用いるための指示と一緒に提供する。
【００９５】
アンチセンスポリヌクレオチド配列
本発明の更なる局面は、「アンチセンス」療法に関する。ここで用いられる場合の「アンチセンス」療法とは、本発明の免疫原性膜たんぱく質の発現を、例えば転写及び／又は翻訳を阻害するなどにより阻害するように、前記たんぱく質をコードする細胞内mRNA及び／又はゲノムDNAに細胞内条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）アンチセンスポリヌクレオチド配列又はその誘導体の投与又はin situ生成を言う。該結合は、古典的な塩基対相補性によるものでも、あるいは、例えばDNA二重鎖への結合の場合は、二重らせんの大溝内での特異的相互作用によるものでもよい。一般的に、「アンチセンス」療法とは、当業で一般に用いられる前記の技術範囲を言い、アンチセンスポリヌクレオチド配列の、その標的ポリヌクレオチド配列への特異的結合に依拠したあらゆる療法を包含する。
【００９６】
本発明のアンチセンス・コンストラクトは、例えば、細胞内で転写されたときに、本発明の免疫原性膜たんぱく質をコードする細胞内mRNAの少なくとも固有の部分に対して相補的なRNAを生じるような発現プラスミドなどとして、送達することができる。代替的には、当該のアンチセンス・コンストラクトは、ex vivoで作製され、 かつ、細胞内に導入されたときに前記膜たんぱく質遺伝子のmRNA及び／又はゲノム配列にハイブリダイズすることにより発現の阻害を引き起こすような核酸分子である。このようなアンチセンスポリヌクレオチド配列は、好ましくは、それらが、例えばエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼなどの内因性のヌクレアーゼに対して耐性であり、従ってin vivoで安定であるように、修飾されているとよい。アンチセンスポリヌクレオチド配列として用いる分子は、限定はしないが、DNAのホスホジアミデート、ホスホールアミデート、ホスホロチオエート及びメチルホスホネート類似体（Froehler et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 4831-4839; Hyrup and Nielsen (1996) Bioorg. Med. Chem. 4, 5-23; Sarin et al. (1988) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85, 7448−7451; Stein et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 3209-3221; Summerton J. (1999)
Biochim. Biophys. Acta 1489, 141-158;
Summerton and Weller (1997) Antisense polynucleotide sequences Drug Dev. 7, 187−195; Orum and Wengel (2001) Curr. Opin. Mol. Ther. 3, 239-243; Wahlestedt et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5633-5638）から成る群より選択される。加えて、「アンチセンス」療法で有用なアンチセンスポリヌクレオチド配列を構築するための一般的なアプローチがLetsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553−6556; Summerton and
Weller (1997) Antisense polynucleotide sequences Drug Dev. 7, 187−195; Froehler et al. (1988)
Nucleic Acids Res. 16, 4831−4839でレビューされている。
【００９７】
アンチセンス・アプローチは本発明の免疫原性膜たんぱく質をコードするmRNAに対して相補的なオリゴヌクレオチド（DNAもしくはRNAのいずれか、あるいはその誘導体）のデザインを含む。このアンチセンスポリヌクレオチド配列は、本発明の前記免疫原性膜たんぱく質のmRNA転写産物に結合して、翻訳を妨げるであろう。絶対的な相補性が好ましいが、必要な訳ではない。RNAの一部分に対して「相補的な」配列とは、ここで言及する場合、RNAにハイブリダイズして安定な二本鎖を形成するために充分な相補性を有する配列を意味する；二本鎖アンチセンスポリヌクレオチド配列の場合、従って、この二本鎖DNAの一本の鎖を検査してもよく、あるいは三重鎖形成を検定してもよい。ハイブリダイズ能は、相補性の程度と、アンチセンスポリヌクレオチド配列の長さの両方に依存するであろう。一般的に、ハイブリダイズさせるポリヌクレオチド配列が長い程、安定な二本鎖（又は該当する場合は三重鎖）を形成しながらも、RNAに対してそれが含有するであろうミス対合は多くなる。当業者であれば、ハイブリダイズ後の複合体の融解点を判定する標準的な手法を用いることにより、許容可能なミス対合の程度を確認することができる。
【００９８】
例えばAUG翻訳開始コドンを含む、このコドンまでの5’側UTRなど、mRNAの5’側末端に対して相補的なアンチセンスポリヌクレオチド配列であれば、翻訳を阻害する上で最も効率的に働くはずである。しかしながら、mRNAの3'側UTRに対して相補的な配列も、mRNAの翻訳を阻害する上で有効であることが最近、示された（Wagner,
R. (1994) Nature 372, 333−335）。従って、本発明の前記免疫原性膜たんぱく質をコードする遺伝子の5'側UTR、3'側UTR、又は非コーディング領域のいずれかに相補的なアンチセンスポリヌクレオチド配列を、内因性mRNAの翻訳を阻害するアンチセンス法で用いることができよう。mRNAの5'側UTRに相補的なアンチセンスポリヌクレオチド配列は、AUG開始コドン（例えば-20から+20までのヌクレオチドなど）の相補配列を含むはずである。mRNAコーディング領域に対して相補的なアンチセンスポリヌクレオチド配列は、より効率の低い翻訳阻害物質ではあるが、本発明に従って用いることができるかも知れない。本発明の前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質の5'側、3'側、又は非コーディング領域のいずれにハイブリダイズするようにデザインされていようとも、アンチセンスポリヌクレオチド配列は、少なくとも10ヌクレオチド長でなければならず、そして好ましくは15乃至約50ヌクレオチド長の範囲のポリヌクレオチド配列であるとよい。いくつかの実施態様では、アンチセンスポリヌクレオチド配列は、少なくとも 15ヌクレオチド長、少なくとも 18ヌクレオチド長、少なくとも 20ヌクレオチド長、少なくとも 25ヌクレオチド長、少なくとも 30 ヌクレオチド長、少なくとも 35ヌクレオチド長、少なくとも 40ヌクレオチド長、又は少なくとも 50ヌクレオチド長である。
【００９９】
標的配列の選択に関係なく、in
vitro研究をまず行って、当該アンチセンスポリヌクレオチド配列の遺伝子発現阻害能を定量しておくことが好ましい。これらの研究では、アンチセンスによる遺伝子阻害と、アンチセンスポリヌクレオチド配列の非特異的生物学的効果とを区別するコントロールを用いることが好ましい。更にこれらの研究では、 標的RNA又はたんぱく質のレベルを、内部コントロールRNA又はたんぱく質のそれと比較することが好ましい。加えて、アンチセンスポリヌクレオチド配列を用いて得られた結果を、コントロール配列を用いて得られたものと比較することが想到される。コントロールオリゴヌクレオチド配列が、検査アンチセンスポリヌクレオチド配列とほぼ同じ長さのものであることが好ましく、また、同様なヌクレオチドの組成、分子量及び融解温度を有していなくてはならない。しかし、これらのパラメータは、標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを妨げるのに必要な程度を超えて違ってはならない。このような配列は、センスのものでも、反転したものでも、あるいはスクランブル性のものでもよい。
【０１００】
当該のアンチセンスポリヌクレオチド配列は、DNA又はRNAでも、又はキメラ状混合物でも、又はこれらの誘導体でも、一本鎖又は二本鎖でも、又は三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドでもよい。アンチセンスポリヌクレオチド配列は、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーションを高めるためなど、塩基部分ででも、糖部分ででも、又はリン酸骨格ででも、修飾することができる。アンチセンスポリヌクレオチド配列には、ペプチド（例えばin vivoでホスト細胞受容体を標的にするためなど）、又は細胞膜の透過を容易にする作用物質（Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,
648-652; 1988年12月に公開されたPCT 公報No. WO 88/09810を参照されたい）又は血液脳関門（1989年11月に公開されたPCT 公報No. WO 89/10134を参照されたい）、ハイブリダイゼーションで惹起される切断剤（van der Krol et al. (1988)
Biotechniques 6, 958-976）又はインターカレート剤（Zon, G. (1988) Pharm. Res. 5, 539-549）など、他の付属基を含めてもよい。この目的のために、当該のアンチセンスポリヌクレオチド配列を、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションで惹起される架橋剤、輸送剤、惹起性切断剤等に結合させてもよい。例えば、エトキシル化ポリエチレニミン（EPEI）を用いたモルホリノ輸送促進のための特別な送達系が、2001年5月に公開されたMorcos らの米国特許第 6,228,392 号及びMorcos, P.A. (2001) Genesis 30, 94−102に解説されている。
【０１０１】
好ましくは、本発明に従って用いられるアンチセンスポリヌクレオチド分子が、RNAi、モルホリノ、PNAs、三重らせん形成性オリゴヌクレオチド、二本鎖及び一本鎖ポリヌクレオチド配列から成る群より選択されるとよい。
【０１０２】
アンチセンスポリヌクレオチド配列は、限定はしないが、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル) ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸 (v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸 メチルエステル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル) ウラシル、(acp3)w、及び2,6-ジアミノプリンを含む群より選択される少なくとも一つの修飾塩基部分を含んでいてもよい。
【０１０３】
更にアンチセンスポリヌクレオチド配列は、限定はしないがアラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む群から選択される少なくとも一つの修飾糖部分を含んでいてもよい。更に、ペントース糖部分を欠くアンチセンスポリヌクレオチド配列も、本発明の範囲内である。更に別の実施態様では、アンチセンスポリヌクレオチド配列は、ホスホロチオエート (Stein and Cohen (1989) In: Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of
Gene Expression. pp.97-117, J. Cohen, ed. (Boca Raton, FL: CRC Press, Inc.))、ホスホロチオエート、ホスホールアミドチオエート、ホスホールアミデート
(Froehler et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16,
4831-4839)、 ホスホールジアミデート、メチルホスホネート (Miller, P. (1989) In: Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene
Expression, pp.85−92)、アルキルホスホトリエステル (Miller, P. (1989) In:
Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression. pp.82-85)、ホルムアセタール又はその類似体や、α-DNA (Rayner et al. (1989)
In: Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression. pp.119-136, J.
Cohen, ed. (Boca Raton, FL: CRC Press, Inc.))、2'-O-メチル RNA (Shibahara et al.
(1989) Nucleic Acids Res. 17,
239-252)、モルホリン骨格 (Summerton and Weller
(1997) Antisense polynucleotide sequences Drug Dev. 7, 187−195)、ペプチド結合で連結された反復性N−(2−アミノエチル)−グリシン単位（ペプチド核酸；PNAs） (Hanvey et al. (1992)
Science 258, 1481−1485; Nielsen et al. (1993)
Anticancer Drug Des. 8, 53−63; Nielsen,
P.E. (2000) Curr. Opin. Mol. Ther. 2,
282−287)、又はロックされた核酸 (LNAs) (Kumar et al. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8, 2219−2222; Petersen et al. (2000) J. Mol. Recognit. 13, 44−53)から成る群より選択される少なくとも一つの修飾リン酸骨格を含む。
【０１０４】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、当業で公知の標準的な方法により合成できよう。例えば、ホスホロチオエート・オリゴマは Stein et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 3209−3021) の方法により合成できると思われ、そしてメチルホスホネート・オリゴマは 制御ポアガラスポリマ担体の使用により、調製することができる (Sarin et al. (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,
7448-7451)。モルホリノ・オリゴマは、Summerton 及びWellerの米国特許第5,217,866号（1993年6月に公開）及び第5,185,444 号（1993年2月）等の方法により合成できよう。
【０１０５】
更に、本発明の免疫原性膜たんぱく質の転写後発現を変更するためにRNA干渉（RNAi）の使用も本発明の範囲内である (Boutla et al. (2001) Curr.
Biol. 11, 1776−1780; Moss, E.G. (2001) Curr. Biol. 11, R772−R775; Bernstein
et al. (2001) RNA 7,
1509−1521)。RNAi は、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスであり、サイレントにされる遺伝子の配列に相同な二本鎖RNA（dsRNA）により開始される。配列特異的なメッセンジャRNA分解の媒介物質は、より長いdsRNAからリボヌクレアーゼIII切断により生じる小型干渉性RNAs （siRNAs）である。一般的には、siRNAsの長さは、20乃至25ヌクレオチドである (Elbashir et al. (2001) Nature 411,
494−498)。
【０１０６】
本発明の免疫原性膜たんぱく質をコードする遺伝子の発現を改変するために三重らせん形成性オリゴヌクレオチドも本発明の範囲内である。三重らせん形成は、ポリメラーゼ、転写因子、又は調節分子が結合するために充分、二重らせんが開放する能力を阻害するために用いられる。三重DNAを用いた最近の治療上の進歩が文献で解説されている（Gee,
J. E. et al. (1994) In: Huber, B. E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic
Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.）。
【０１０７】
更に、本発明は、既知の機能の特定のたんぱく質の翻訳を阻害するための環状RNA（即ちRNA Lasso）の使用も包含する。
【０１０８】
本発明の上記の実施態様の好適なアンチセンスポリヌクレオチド配列には、サイレンシング (RNAi) アンチセンスポリヌクレオチド、モルホリノ・オリゴマ（Summerton and
Weller (1999) Antisense polynucleotide sequences Drug Dev. 7, 187−195）、ペプチド核酸 (PNAs) (Egholm
et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114,
1895−1897) 及び／又はロックされた核酸 (LNAs) (Kumar et
al. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8,
2219−2222; Petersen et
al. (2000) J. Mol. Recognit. 13, 44−53)がある。
【０１０９】
具体的な実施態様では、アンチセンスポリヌクレオチド配列は、本発明の免疫原性膜たんぱく質を発現する細胞にin vivoで送達される。数多くの方法が、アンチセンスDNA又はRNAを細胞に送達するために開発されてきた；例えばアンチセンス分子を組織部位に直接注射することができ、あるいは、所望の細胞を標的とするようにデザインされた、修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド配列、例えば標的細胞表面上に発現した受容体又は抗原に特異的に結合するペプチド又は抗体に連結したアンチセンスなど、を、全身投与することができる。
【０１１０】
本発明のある好適な実施態様では、当該のアンチセンスポリヌクレオチド配列をウィルス・ベクタから発現させる。適したウィルスの例は、限定はしないが、ワクシニア・ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、又はこれらの組合せ、である。
【０１１１】
当該のアンチセンスポリヌクレオチド配列を、ステロール、脂質、ウィルス等の送達複合体中に含有させてもよい。また細胞も送達複合体として役立つであろう。このように、本発明は、一個又は複数の細胞を単離するステップと、前記細胞を本発明のアンチセンス分子に接触させるステップと、非ステロイド依存性癌に罹患した対象に前記細胞を送達するステップとを含む、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質又はその断片を発現することを特徴とする非ステロイド依存性癌を治療する方法を提供するものである。
【０１１２】
本発明のアンチセンス分子、又は、前記アンチセンス分子を発現する及び／又は含有する細胞は、非ステロイド依存性がんんの治療用の医薬組成物の調製にも用いることができる。好ましくは、前記細胞が、治療しようとする対象由来であるとよい。
【０１１３】
プローブ及びプライマ
本発明の文脈内で、本発明のヒト免疫原性膜たんぱく質（表１を参照されたい）をコードするポリヌクレオチド配列により、更に、他の組織由来など、他の細胞種における相同体や、他の哺乳動物生物由来の免疫原性膜たんぱく質相同体を同定及び／又はクローニングする際の使用に向けてデザインされたプローブ及びプライマの作製が可能になるであろう。
【０１１４】
本発明の方法に従ってプローブとして用いるのに好適なポリヌクレオチド配列には、本発明の免疫原性膜たんぱく質（表１を参照されたい）又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列由来の少なくとも約 15個、少なくとも約 30個、好ましくは少なくとも約 50個、より好ましくは少なくとも約100個、そしてより好ましくは少なくとも約 200個の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列がある。ある好適な実施態様では、前記ポリヌクレオチド配列の一部分は、前記膜たんぱく質遺伝子の完全なコーディング配列のいずれかのセグメントに相当する。代替的には、一部分は、例えば細胞外ドメインなど、ヒト免疫原性膜たんぱく質の保存されたモチーフ又はドメインをコードする特定のポリヌクレオチド配列であってよい。代替的には、一部分は、ヒト免疫原性膜たんぱく質の保存されたモチーフをコードするポリヌクレオチド配列同士の間に位置するポリヌクレオチド配列であってよい。
【０１１５】
更に本発明は、プローブ／プライマとして用いられるポリヌクレオチド配列分子（即ち、非コーディングポリヌクレオチド配列分子）に関し、このポリヌクレオチド配列分子は、少なくとも約 15個、18個、20個、25個、30個、40個、50個、100個、125個、150 個又は200 個のヌクレオチド又は塩基対を含むことができる。更に他の好適なポリヌクレオチド配列は、各cDNAの少なくとも約 300個、少なくとも約 350個、少なくとも約 400個、少なくとも約 450個、少なくとも約 500個、又は少なくとも約600個のヌクレオチドを含むものである。いくつかの実施態様では、本発明のポリヌクレオチド配列は、本発明の免疫原性膜たんぱく質（表１を参照されたい）をコードするポリヌクレオチド配列の5'側部分に相当する。
【０１１６】
更に本発明では、前記膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチドに対し、特に表１に示されたもの、及びその断片に対し、多様なストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチド配列も用いられる。ポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを促進する条件は当業者に公知である（Current Protocols in Molecular Biology (1989, John Wiley & Sons,
N.Y. 6.3.1-6.3.6; Jowett, T. (2001) Methods 23,
345−358を参照されたい)。
【０１１７】
ある好適な実施態様では、本発明は、更に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマも提供するものであり、前記オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、免疫原性膜たんぱく質（表１を参照されたい）又は天然で生じるその変異体をコードするポリヌクレオチド配列のセンス又はアンチセンス配列のうちの少なくとも約 15個、好ましくは約30個、より好ましくは約50個、100 個又は200 個の連続したヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列の一領域を含む。例えば、あるポリヌクレオチド配列に基づくプライマをPCR反応で用いて相同体をクローニングすることができる。このようなプライマは、好ましくは、他の遺伝子に対して有意な相同性を持たない領域中で選択されるとよい。同様に、当該の膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて、同じ又は相同なたんぱく質をコードする転写産物又はゲノム配列を検出することができる。好適な実施態様では、該プローブは、それに付着させた、検出可能な標識基を更に含み、例えばこの標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、及び酵素コファクタから選択される。
【０１１８】
このようなプローブを、例えばmRNAレベルを検出するなど、患者由来の細胞試料中で各ポリヌクレオチド配列（表１を参照されたい）のレベルを測定するなどにより、本発明の免疫原性膜たんぱく質を過剰発現する細胞又は組織を特定する診断用検査キットの一部として用いることもできる。当該のポリヌクレオチド配列を狙った、又は当該のゲノム配列を狙ったプローブの使用は、組織の望ましくない細胞死又は異常な分化などで現れるであろう遺伝子発現レベルの変化の予測的及び治療的評価の両方に用いることができる。更に、対象に、本発明の免疫原性膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列の過剰発現を原因とする非ステロイド依存性癌を発症するリスクがあるかどうかを判断するためのキットも、本発明の範囲内にある。前記キットには、更に、前記膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列に特異的なプローブ／プライマ、反応溶液、及び当該キットをどのように使用するかの指示が含まれよう。
【０１１９】
ベクタ
本発明の免疫原性膜たんぱく質又はポリヌクレオチド配列に対してアンタゴニストであるポリペプチド、ペプチド又はアンチセンスポリヌクレオチド配列をコードすると共に、少なくとも一つの転写調節配列に作動的に連鎖させたポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクタを、本発明の実施にあたって用いてもよい。調節配列は当業者には公知であり、内因性免疫原性膜たんぱく質の発現及び／又は生物学的活性を阻害するように特に選択される。このような調節配列はRodriguez and Chamberlin Eds. (1982) Promoters: Structure and function.
NY. Praeger; Khoury and Gruss (1983) Cell 33,
313−314に解説されている。ある実施態様では、前記の発現ベクタには、免疫原性膜たんぱく質遺伝子の発現を阻害することを目的として、アンチセンスポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列が含まれる。別の実施態様では、前記の発現ベクタは、前記免疫原性膜たんぱく質の生物学的活性を阻害するために用いることのできるポリペプチド又はペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含有する。このような発現ベクタは、遺伝子治療プロトコルの一部として用いることができる。従って、本発明の別の局面は、前記免疫原性膜たんぱく質の生物学的活性（例えば上皮又は癌細胞の分化）を失わせるアンタゴニストなポリペプチド、ペプチド又はアンチセンスポリヌクレオチドの in vivo、in vitro、又はex vivo でのトランスフェクション及び発現用の発現ベクタを特徴とする。これは、例えば、天然で生じる形の前記たんぱく質が過剰発現している場合や、組織分化を変える（例えば細胞形質転換や、癌細胞の分化又は増殖を阻害する）形のたんぱく質を送達する場合に望ましいであろう。
【０１２０】
ウィルス移入法に加え、非ウィルス法を用いても、動物の組織においてアンタゴニストなペプチド又はポリペプチドの発現を起こさせることができる。大半の非ウィルス的な遺伝子移入法は、巨大分子の取り込み及び細胞内輸送に哺乳動物細胞が用いる通常の機序に依拠する。好適な実施態様では、非ウィルス法によるターゲティング手段は、標的決定された細胞による、アンタゴニストであるペプチド又はポリペプチドをコードする遺伝子の取り込みのためのエンドサイトーシス経路に依拠する。この種類の標的決定手段の例には、リポソーム由来系、ポリ-リジン結合体、及び人工ウィルスエンベロープがある。
【０１２１】
抗体
本発明の免疫原性膜たんぱく質に対して生じる抗体は、ポリペプチド又はエピトープを担持する断片、類似体又は細胞を、動物、好ましくはヒト以外に、慣例的プロトコルを用いて投与することにより得ることができ、いずれのアイソタイプ（IgG、IgA、IgM、IgE等）のものであってもよい。抗体断片は、例えば特定のプロテアーゼによる消化など、当業で公知の従来技術により、作製できよう。このように、この用語には、特定のたんぱく質と選択的に反応することができる抗体分子の、たんぱく質分解により切断された、あるいは組換えにより調整された部分の、セグメントを包含する。このようなたんぱく質分解による、及び／又は、組換えによる、断片の例には、Fab、F(ab').sub.2、Fab'、Fv、及び、V[L] 及び／又は V[H] ドメインをペプチド・リンカにより連結して含有する一本鎖抗体（scFV）がある。前記のscFv's を共有結合又は非共有結合により連結して、二つ以上の結合部位を有する抗体を形成してもよい。本発明には、抗体及び組換え抗体のポリクローナル、モノクローナル、又は他の精製済み製剤が含まれる。
【０１２２】
モノクローナル抗体の調製のためには、継続的な細胞株培養により生じる抗体を提供すれば、いずれの技術も用いることができる。例には、ハイブリドーマ技術（Kohler, G. and Milstein, C., Nature
(1975) 256:495-497）、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor
et al., Immunology Today (1983) 4:72）及びEBV-ハイブリドーマ技術 (Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER
THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)がある。
【０１２３】
一本鎖抗体の作製技術（米国特許第4,946,778号に解説されている）を、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を作製するために適合させることもできる。更に、トランスジェニック・マウス、又は、他の哺乳動物を含む他の生物を用いて、ヒト化抗体を発現させてもよい。
【０１２４】
本発明の抗体は、単一特異的でも、二重特異的でも、三重特異的でも、又はより多重な特異性のものでもよい。本発明の免疫原性膜たんぱく質を狙った、癌の検出に有用な抗体を、別の抗体で検出してもよいが、あるいは同じ抗体で検出してもよい。代替的には、多重特異的な抗体は、同じたんぱく質上の異なるエピトープに対して異なる特異性を示してもよい。更に本発明には、本発明の免疫原性膜たんぱく質の配列に相補的な、又はハイブリダイズする一つ以上の核酸配列にコードされた、あるいは、前記膜たんぱく質をコードする核酸配列に相補的な、又は、ハイブリダイズする一つ以上の配列にコードされた、ポリペプチド分子に結合する抗体も包含される。
【０１２５】
癌の検出に有用な本発明の抗体は、更に、これらが結合する先のポリペプチド分子の活性のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用すると思われ、従って、癌の治療又は防止用の治療的分子として有用であろう。抗体を単独で用いなければならないということはなく、異種ポリペプチドを含む他のポリペプチドに、当該抗体ポリペプチド配列のN又はC末端で融合させることができる。例えば、本発明で有用な抗体に検出可能な標識を融合させて、標的ポリペプチドに結合したときのこの抗体の検出が容易なようにしてもよい。抗体ポリペプチドを検出可能に標識する方法は当業者に公知である。
【０１２６】
本発明で有用な抗体の作製にあたっては、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む多様なホストを、本発明の候補遺伝子のたんぱく質産物（又は、免疫学的特性を保持したそのいずれかの部分、断片、又はオリゴヌクレオチド）の注射で免疫してよい。ホスト種に応じて、免疫応答を高めるために多様なアジュバントを用いてもよい。このようなアジュバントには、限定はしないが、フロイント、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、及び、リゾレシチン、プルロニック（原語：pluronic）ポリオール、多価陰イオン、ペプチド、油性乳濁液、キーホール・リンペット・ホモシアニン、及びジニトロフェノールなどの界面活性物質がある。BCG（カルメット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム−パルブム（原語：Corynebacterium parvum ）は潜在的に有用なヒトアジュバントである。
【０１２７】
ポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体は、当業で公知の方法を用いて作製することができる。マウス、ハムスター、又はウサギなどの哺乳動物は、本発明の免疫原型の免疫原性膜たんぱく質、その断片、誘導体又はバリアント方で免疫することができる。このような分子に免疫原性をもたらす技術には、担体への結合、又は、当業で公知の他の技術がある。例えば、免疫原性分子を、上述したようにアジュバントの存在下で投与することができる。免疫化は、血漿又は血清中の抗体価の検出により観察することができる。抗原を当該の免疫原とした標準的な免疫検定法を用いて、抗体のレベル及び特異性を評価することができる。免疫処理後、血清を得、必要であれば、ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。
【０１２８】
キメラ抗体、即ち、非ヒト動物可変領域とヒト定常領域とを含み合わせた抗体分子も本発明の範囲内にある。キメラ抗体分子には、例えば、マウス、ラット、又は他の種の抗体由来の抗原結合ドメインが、ヒト定常領域と一緒に含まれる。標準的な方法を用いて、本発明の免疫原性膜たんぱく質を認識する免疫グロブリン可変領域を含有するキメラ抗体を作製できよう（例えば Morrison et al., 1985, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81: 6851; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452; 米国特許第4,816,567号；米国特許第4,816,397号を参照されたい）。
【０１２９】
分子タグを抗体などの結合化合物に共有結合により連結するためには、広汎な指針を文献に見ることができ、例えば Hermanson, Bioconjugate Techniques（ニューヨーク、アカデミック・プレス社刊、1996）等がある。 本発明の一局面においては、一つ以上の分子タグを、結合化合物上の一般的な反応基に直接又は間接的に付着させる。一般的な反応基には、アミン、チオール、カルボキシレート、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン等があり、市販の架橋剤により分子タグに結合させられよう。例えばHermanson (上に引用)；Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and
Research Products, Ninth Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 2002)。
【０１３０】
当業でよく理解されているように、抗体を、色源体、触媒、酵素、蛍光体、化学発光分子、ビオチン及び放射性同位体を含む群から選択される標識に結合させてよい。標識としての使用に適した数多くの酵素が、そのそれぞれを引用をもってここに援用することとする米国特許第4,366,241号、米国特許第4,843,000号及び米国特許第4,849,338号に開示されている。本発明において有用な、適した酵素標識には、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、グルコース・オキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素等がある。酵素標識は単独で用いてもよいが、溶液中で第二の酵素と組み合わせてもよい。治療を目的とした場合に好ましくは、当該の抗体を細胞毒部分に結合させるとよい。
【０１３１】
蛍光体は、フルオレセイン・イソチオシアネート
(FITC)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート
(TRITC)、アロフィコシアニン (APC)、テキサス・レッド(TR)、Cy5 又はR-フィコエリトリン (RPE)から成る群より選択されよう。有用な蛍光体の例は、例えば、引用をもってここに援用することとする米国特許第4,520,110号及び米国特許第
4,542,104号に見られよう。
【０１３２】
更に、一つ以上のプロドラッグに結合した抗体も本発明の範囲内にある。「プロドラッグ」とは、活性な薬物を放出するには体内での変換を要する、薬物分子の薬理学的に不活性な誘導体を言う。典型的には、プロドラッグは、さもなければ当該薬物の臨床上の有用性を制限しかねないような、薬学的及び／又は薬物動態に基づく親薬物に伴う問題を克服するようにデザインされる。
【０１３３】
また本発明の抗体を、光線感作物質に結合し、この光線感作物質に、特定の波長による処理に対する感受性を提供させてもよい。
【０１３４】
FDAの承認を受けた最初の光線感作物質はカナダのQLTフォト・セラピューティックス社製造のPhotofrinだった。もう一つの広く研究された光線感作物質はアミノレブリン酸である。臨床治験中の他の分子は、Pharmacia/Upjohn社におｙりPurlytinとして製造されているクロリン光線感作物質であるSnET2である。もう一つの分子は、Scotia Pharmaceuticals社によりFoscanとして製造されているメタテトラヒドロフェニルクロリンであるmTHPCである。 黄斑部変性は、ヘマトフォルフィリン誘導体である光線感作物質ベルテポリフィンを用いて阻害されてきた。光線感作物質として用いられるこれら及びいくつかの他の分子はStewart 及び共同研究者（Radiother
Oncol 1998; 48:233）及びDougherty 及び共同研究者（J Natl Cancer Inst 1998; 90:889）によりレビューされている。
【０１３５】
上記の抗体を、当該ポリペプチドを発現しているクローンを単離又は特定したり、アフィニティ・クロマトグラフィにより当該ポリペプチドを精製したりするために用いてもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドに対する抗体が、新生性疾患を治療又は診断するためにも用いられるとよい。
【０１３６】
本発明を更に以下の実施例で描写するが、以下の実施例を限定的なものとして決して捉えられてはならない。本出願全体を通じて引用された全引用文献（文献、発行済み特許、公開済み特許出願を含む）の内容を、引用をもってここに援用することを明示しておく。本発明の実施にあたっては、そうでないと明示しない限り、当業者に公知の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、及び免疫学の従来技術を用いることになるであろう。このような技術は文献に十二分に説明されている。
【０１３７】
実施例
実施例１．  結腸組織からのRNA単離及びcDNA標識法
多様な形の非ステロイド依存性癌、特に上皮細胞の新生性形質転換をもととする癌、の診断及び治療にとって、疾患特異的な分子マーカの同定が最も重要である。腫瘍組織と、健康な個体から単離されるものと間の分子ベースの違いの特性を成功させるための必須条件は、健康な組織及び腫瘍原性の組織の両方を由来とする単離上皮細胞中で示差的に調節されている遺伝子の相対的トランスクリプトーム解析である。
【０１３８】
この目的のために、様々な疾患病期の結腸癌患者から、遠位部位から採取された健康な結腸組織と一緒に、組織試料を採取した（試料セット）。組織試料は、コットブス （ドイツ、03048コットブス、カール−シエム−クリニクム−コットブス、チルギッヒェ・クリニク）、マグデブルグ（ドイツ、39120マルデブルグ、ライプツヒャー−ストラーセ、オットー−フォン−ゲルリッヒェ−クリニク）及びエルランゲン（ドイツ、91023エルランゲン、フリードリヒ−アレクサンダー−ウニベルシタット、チルギッヒェ・クリニク）の病院で様々な年齢の男性及び女性の患者から採集された。上皮細胞は、特許 WO98/43091「上皮細胞異常の診断」に解説された方法に従って単離された。
【０１３９】
この組織試料をまず、RNAlater（登録商標）（英国アンビオン）と一緒に１５分間、氷上でインキュベートすることにより調製した。インキュベート後、組織試料の大きさを（ほぼ1 mm）をメスを用いて減らし、300μMの鋼製メッシュを用いて機械的に分離した。分離後、細胞を50ml の1X PBS、50ml RNAlater（登録商標）(英国アンビオン)及び0.8 mM ベンズアミジン、3mM EDTA、5mg/100ml Leupeptin（登録商標） 及び 2mM Pefabloc（登録商標） (洗浄緩衝液)で洗浄し、４℃で１０分間、300gで遠心分離し、4mlの洗浄緩衝液中に懸濁させた。上皮細胞を周囲細胞から単離するために、この細胞懸濁液を、磁気ビーズに共有結合させた上皮細胞特異抗体（抗BerEP4）に接触させた。より具体的には、該細胞懸濁液を80μlの抗BerEP4
Dynabeads（登録商標） (ドイツ、Deutsche
Dynal GmbH社) と混合し、2−8℃の洗浄緩衝液中で３０分間、インキュベートした。上皮細胞を結合させたDynabeads（登録商標） を磁石（ドイツ、Deutsche Dynal GmbH社）を用いて採集し、氷上でアリクォートし、-80℃で保存した。
【０１４０】
全RNA は RNAeasy (ドイツ、Qiagen社)を用いてこのメーカの指示に従って単離された。RNAの品質は RNA 6000 Nano Lab Chips （パロ・アルト、Agilent社）及びAgilent社の 2100 バイオアナライザ・システムを用いて確認された。cDNAの標識及び清浄化に LabelStar（登録商標）キット（ドイツ、Qiagen社） を用いて、各組織試料を由来とする10μgの全RNA を逆転写させて、シアニン-3 (Cy−3) 及びシアニン-5 (Cy−5) で標識されたcDNA 標的を作製し、メーカの指示に従ってマイクロアレイ上での使用に向けて調製した。
【０１４１】
どの遺伝子が腫瘍対健康な組織試料で示差的に発現しているかを特定するために、各試料セットを、12000種を超える発現したヒト配列（ヒト−1 cDNA マイクロアレイ、米国Agilent
Technologies社）を含有するマイクロアレイを用いて分析した。非腫瘍組織から単離された上皮細胞由来のCy−3で標識した cDNAを、腫瘍組織から単離された上皮細胞由来のCy−5で標識したcDNAに混合し、マイクロアレイを65℃にして一晩、ハイブリダイズさせた（メーカの指示に従って、ヒト−1 cDNA マイクロアレイ・キット、米国Agilent
Technologies社）。ハイブリダイゼーションはすべて、フルオ（原語：fluor）逆転対にして行われた。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄して未結合の分子を取り除き、その後、それらの相補配列にハイブリダイズしたcDNAを、Agilent
Technologies社の二重レーザマイクロアレイ・スキャナ（米国、Agilent
Technologies）を用いてスキャンニングした。次に、Agilent
Technologies 社のフィーチャー・エクストラクション・ソフトウェア（バージョン A6.1.1）を用いて多様なチップの特徴（スポット）の位置を、マイクロアレイ上にアノテートされたコーディング配列と相関させた。更に、腫瘍及び健康組織におけるその各コーディング配列の発現レベルに関する情報を提供するために、該ソフトウェアを用いて、一本のチップの特徴のシグナル輝度を計算した（図１）。特徴抽出後、Rosetta Resolver システム（Rosetta
Inpharmatics.社、ワシントン州カークランド）を用いてデータ解析を行った。
【０１４２】
実施例２．Rosetta Resolver （Rosetta Inpharmatics.社、ワシントン州カークランド）を用いたデータ解析
細胞膜又は細胞膜関連たんぱく質をコードしている遺伝子の発現を、Rosetta Resolver プラットフォーム（Rosetta
Inpharmatics.社、ワシントン州カークランド）を用いて調べた。公に入手できるLocusLink データベース (NCBI)を用い、公知の細胞膜又は細胞膜関連たんぱく質をコードしている全遺伝子の遺伝子名及びデータベース識別子を抽出し、ヒト−1 cDNA マイクロアレイ（Agilent Technologies社、米国）上に特定されたそれらの対応する特徴に位置特定した。調査時、LocusLink
(NCBI)に登録されている1480種の公知の細胞膜又は細胞膜関連たんぱく質のうちで、 これらの遺伝子のうちの1147のコーディング配列が、用いられたcDNA アレイ上に存在した。これらの1147の遺伝子をRosetta Resolver（Agilent Technologies社、米国）内でバイオセットにして組合せ、１５個の結腸試料（腫瘍及び健康）におけるそれらの発現を分析した。特に興味あるたんぱく質コーディング遺伝子を、観察された示差的な遺伝子発現に基づいて特定し、このとき、正常対腫瘍組織における遺伝子発現の違い（倍の変化）は少なくとも1.5だった。更に、遺伝子発現測定値に関する大きな程度の信頼度を示しているたんぱく質コーディング遺伝子も考慮された。信頼度は、ある測定値に対する合計誤差を推定する特異的誤差モデル（Rosetta Resolverにより行われる）を用いて測定された。この特異的誤差モデルは、ランダムな誤りや、いずれかの説明のつかない定誤差を見込むものであり、帰無（統計学的）仮説に関する信頼度の尺度であるＰ値を計算する。上記の基準（Ｐ値が0.01）を満たし、その示差的発現が調査された患者試料のうちの３０％以上で見られた遺伝子のみを選抜した（表１）。
【０１４３】
実施例３．  診断を目的とした、患者における示差的遺伝子発現の検出
本発明の免疫原性膜たんぱく質の発現パターンは、リアルタイムの定量的RT（逆転写）-PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）（基準）により解析することができる。簡単に説明すると、対象となる組織（上皮細胞から単離された）の最小２０個の腫瘍及び非腫瘍のペア及び3乃至4個の異なる細胞株（検定内ばらつきのコントロール）を由来とする全RNA をランダム・ヘキサマを用いて三重にして逆転写させた後、SYBR グリーンI の存在下で、目的の配列に特異的な一対のプライマ・ペアを用いてリアルタイム定量的PCRで並行に増幅する。これらのプライマは、 Applied Biosystems社の Primer Express 2.0 ソフトウェアを用いてデザインされた；これらは混入DNAの検出を防ぐために一個のイントロンの端から端まで延びるはずであり、BLAST検索を行ったときに検出されるようにヒトゲノムのいずれか他の配列に相補的ではないはずである。データの正規化の内因性基準として（サンプル間のピペット操作のばらつき等の補正）28S rRNA を用いた。増幅と、新たに増幅された二本鎖の間にSYBRグリーンが挿入されたときに生じる蛍光シグナルのリアルタイム検出及び解析は、Applied Biosystems 社のABI Prism 7000 Sequence Detection System 及び関連するソフトウェア (v.
1.0) を用いて通常通りに行われた。各試料毎の数値は、通常、 Ct (閾値サイクル) 値、即ち、バックグラウンドのシグナルが固定した時点で、特定の閾値にわたって蛍光シグナルが最初に検出されるサイクル、で表される。適した標準曲線（Ct値、対、 一連の既知の全RNA試料希釈液から標的及び基準遺伝子を増幅して得られる量、の表）からの各Ct値の外挿は、特定の複製試料中の前記免疫原性膜たんぱく質遺伝子及び基準遺伝子の相対量を提供するであろう。この場合、比 [平均±SD]標的遺伝子/[平均±SD]基準遺伝子 は、特定の試料内の標的の量を正規化することとなり、試料間の比較が可能になる。このように、正規化後、各腫瘍中の前記免疫原性膜たんぱく質をコードする標的ポリペプチド配列の量を、対応する非腫瘍試料中の同じ標的の量に比較して、それが特定の試料で過剰又は低発現しているか、あるいは、その発現が変化しないかどうかを見る（表２を参照されたい）。最後に、全試料中のある標的の発現解析により、ある特定の腫瘍種における、その全体的又は部分的（及びどのような頻度の）過剰（又は不足）発現に関する情報が提供されるであろう。
【０１４４】
【表２】
2007521015.tif 000004
【０１４５】
癌の症例はすべて、本発明の免疫原性膜たんぱく質の少なくとも一つの、正常組織に対して腫瘍組織の少なくとも２倍を超えて高い発現により、特定された。加えて、図２は、TM4SF6 発現に基づく診断結果を示す。
【０１４６】
実施例４．  たんぱく質発現のアンチセンス抑制
本発明の前記免疫原性膜たんぱく質の遺伝子発現は、前記たんぱく質を過剰発現している細胞の腫瘍形成能を減らすために、特異的に下方調節することができる。この最近開発され、広く受け容れられた技術では、標的遺伝子のmRNAのコーディング配列に相補的であると共に特異的mRNA分解を惹起する短い (21bp) 合成の二本鎖RNA二重鎖（サイレンサ、siRNA）を用いる。多くの哺乳動物遺伝子が既に、siRNAの腫瘍細胞株へのトランスフェクションを用いて「ノックダウン」されており、その結果の表現型が解説されている。
【０１４７】
簡単に説明すると、上記のたんぱく質遺伝子（SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3、and ZP3）のそれぞれについて、それらの対応するmRNA上での様々な位置で、3乃至5個のsiRNAを、Dharmacon 社の「siDESIGN Center」ソフトウェアや、標的外での相同性を抑えるために付加的な BlastN2をHuman Unigene で用いて、デザインした。合成 siRNAは、Dharmacon 社又はMWG バイオテック社に注文した。様々なヒト腫瘍細胞株を三重にして（リポフェクタミン2000、Invitrogen社を用いて）50nM の各siRNA を連続３日間、トランスフェクトし、遺伝子ノックダウンについて一回目のトランスフェクションから４日後に分析した。遺伝子ノックダウンの分析は、定量的PCR 、又は、たんぱく質に対する抗体が入手可能な場合にはウェスタン・ブロット、のいずれかで行われる。
【０１４８】
図３は、RT-PCRで定量されたTM4SF6 特異的siRNA、SF1 及びSF2によるノックダウン結果を示す。
【０１４９】
効率的な遺伝子ノックダウンが、細胞増殖の低下に相当する場合、更なる表現型分析を、例えばアポトーシスに関する染色（アネキシンV）、細胞周期分析（RNAse 処理及びヨウ化プロピジウム染色を用いる）及び代謝活性検定（WST-1、Roche社）により行うことができる。選択的には、検定から非トランスフェクト細胞を除外するためには、これらの分析は、対応するsiRNA発現プラスミド（Ambion社のpSilencer 又はGenScript社のpRNA ）でG418（ネオマイシン）選択下で行われるであろう。本発明の免疫原性膜たんぱく質をコードする遺伝子の発現阻害は、アポトーシス、細胞周期停止及び／又は代謝活性低化を増加させるであろう。
【０１５０】
【表３】
2007521015.tif 000005
【０１５１】
実施例５．  本発明の免疫原性膜たんぱく質に特異的な抗体の同定
前記の実施例で解説された結果に少なくとも部分的に基づくと、治療薬は、前記面劇原性膜たんぱく質と相互作用し、従って、非ステロイド依存性癌を治療することができる。特異抗体は、ある一つの分子と相互作用する作用薬として広く用いられている。
【０１５２】
前記たんぱく質の可溶性の結合断片を、TM4SF6
をコードする遺伝子断片をE. coliで発現させることにより、調製した。
【０１５３】
TM4SF6のEC2-ループのクローニング：
目的のDNA配列を、pfu ポリメラーゼと、遺伝子TM4SF6の配列検証済みのクローンからのプライマEC2-a
(ggatccagacatgagattaagaac) 及びEC2-b
(aagcttattctgactctataatgg)とを用いて増幅した。そのPCR産物をベクタpCR2.1 内にTAクローニング法を用いてサブクローニングした。目的のDNA配列は、Qiagen社の細菌性発現プラスミドPQE-30に、制限酵素BamHI (プライマEC2-aで)及び Hind III (プライマEC2-bで) を用いてクローニングされ、発現プラスミドpQE-415-EC2ができた。配列検証後、ベクタをBL21 (DE3)中に形質転換した。
【０１５４】
TM4SF6 発現：
pQE-415-EC2 をBL21 (Amp.)で一晩培養したものを、30℃で、LB-NZ 培地 （5g NaCl、5g  酵母抽出物、10g NZ-アミン）で成長させ、翌朝、450ml
LB-NZ (11本のフラスコに) に（OD600 で0,05 - 0,1になるように）接種し、37°C でOD600 が0,5−0,6になるまで成長させた。
【０１５５】
この培養株を5mM (最終濃度) IPTGで誘導し、５乃至６時間後に細胞を回収し、3本の試験管にアリクォートし、20mM リン酸緩衝液、pH8、で洗浄し、−80°Cで更なる使用に向けて保存した。
【０１５６】
細胞抽出物の調製：
細胞を解凍し、30mlの 20mMリン酸緩衝液、pH8、を加え、リゾチームを最終濃度1mg/mlまで加え、その混合液を３０分間、氷上でやさしく振盪しながらインキュベートした後、尿素を最終濃度5Mになるまで加えた。音波破砕でDNAを破壊し、抽出物を25.000 rpm でMLA-80 超遠心分離ロータ を用いて３０分間、遠心分離した。
【０１５７】
AEKTA FPLCを用いたカラム・クロマトグラフィ：
１回目：上清をSigma社のNi-アガロース・カラムに入れた後、このカラムを5 カラム体積の100% 緩衝液 A1 （20mM リン酸Puffer pH8、 200mM NaCl、5M Harnstoff） で、そして次に5 カラム体積の緩衝液 B1
(20mM リン酸 Puffer pH8、200 NaCl、5M Harnstoff、1M イミダゾール)で洗浄した。当該たんぱく質を100% 緩衝液B1で溶出させた。
【０１５８】
２回目：レクロマトグラフィ（原語：rechromatography）のために、目的の画分を1:10 になるように緩衝液A2（20mM リン酸Puffer pH6,3、250 mM NaCl）を用いて希釈した。その新しいNi-アガロース・カラムを、0−30 % の勾配にした緩衝液B2 (20mM リン酸 Puffer pH6,3、250mM NaCl、1M イミダゾール) で１０カラム体積で洗浄した。当該のたんぱく質を100 % 緩衝液B2で溶出させた。
【０１５９】
資源Ｓを用いたクロマトグラフィ：2回目から採った目的の画分を1:20 になるように緩衝液 A3 (20mM MES、pH6) で希釈し、1ml Respurce S カラムに入れた。当該のたんぱく質を 0 −100 % の勾配にした緩衝液B3 （20mM MES、500mM NaCl、pH6で３０分間（流速 1ml/分）で溶出させた。
【０１６０】
図４は、精製済み画分のクーマシー・ブルーで染色後のSDS-PAGEを示す。
【０１６１】
加えて、ウサギを、表５に従ったいくつかのドメインに渡る合成ペプチドで免疫した：
【０１６２】
【表４】
2007521015.tif 000006
【０１６３】
KLHカップリング
100mgのキーホール・リンペット・ヘモシアニン(KLH) を2mlの水に溶解させ、2l の 0.1M リン酸ナトリウム、pH 7.8、に対して一晩、透析した。これは混入しているチオール又はアミノ化合物を取り除くためである。凝集物は、マイクロ遠心管で全速で１０分間、遠心分離することにより、取り除かれた。
【０１６４】
-NH2 カップリングには、5mgのペプチドをKLHの半分に加えた後、グルタルアルデヒドを0.1%の最終濃度まで加え、必要であればpHを7.8にNaOHを用いて調節した。インキュベーションは４℃で８乃至１２時間、やさしく回転させながらだった。
【０１６５】
一つまみのNaBH4を加えた後、混合液を８乃至１２時間、４℃でインキュベートした。-SHカップリングには、他方のアリクォートのKLHを室温まで暖めた。1/9 の体積のヨード酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（Sigma社）100mg/ml をDMSOに入れたものを加えた。１０分後、室温でKLH は少し濁ってくるであろう。それを、0.1M リン酸ナトリウム、pH 7.8、で平衡させたP-10カラムで精製した。KLH を含有する画分を色でプールし、5mgのペプチドを加え、少なくとも８時間、４℃でやさしく回転させながらインキュベートした。
【０１６６】
ウサギを、完全フロイント・アジュバントを最初の注射、そして不完全アジュバントを追加注射に用いつつ、０日目、１４日目、及び２８日目に450乃至600μgのKLH結合ペプチドで免疫した。
【０１６７】
抗体の精製
各ペプチドをAF-アミノ Toyopearl 650 Mにメーカの指示に従って結合させ、PBSでのバッチ・クロマトグラフィに用いた後、PBSで５回、洗浄した。マトリックスに特異的に結合した抗体を100 mM グリシン pH 2.5で溶出させた。
【０１６８】
精製済み抗体をPBS/ 0.01% アジ化ナトリウム/ 1% BSA/ 50% グリセロール中に−20°Cで保存した。
【０１６９】
実施例６：  組織切片の免疫組織化学
免疫組織化学法は当業で公知のin vitro 診断法である。以下のプロトコルを用いて、パラフィン包埋された組織切片を、TM4SF6についてEP03-415 抗体を用いて染色した。
プレ−インキュベーション：TBS/0.1%Triton −X-100 (30 分); rt
POX-阻害：3% H2O2 (10 分)
阻害：SEA-Block(10 min)
１回目の抗体インキュベーション：TBS/10% SEA-Block で1:200に希釈(30 分); rt
洗浄：TBS/0.05% Tween 20 (3x 10 分); rt
２回目の抗体及び顕色：En Vision、POD (DAKO社); 30 分; rt
DAB；5 分；rt  図５は、結腸癌及び黒色腫患者の免疫組織化学検査結果を示す。染色パターンにより、健康な、非形質転換組織と、癌細胞との区別ができ、このように、免疫組織化学法を、生検及び／又は外科的試料を用いて診断目的に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、結腸癌で上方調節されていることが見つかった遺伝子のヒート・マップを示す。横は、用いられたcDNAマイクロアレイ上で特定された個々の配列であり、縦は、個々の試料である。マトリックス中の各マスは一個の配列の発現レベルを表す。個々の遺伝子は、当該マイクロアレイ上で二つ以上の配列により表されている場合がある。図示した遺伝子は、言及した１５個の実験内で少なくとも30%の頻度で１．５倍を超えて上方調節されている。赤色のマスは、実験で言及された遺伝子の上方調節を示し、他方、緑色は下方調節を示す。黒色は提示した実験で言及された配列について、全く調節がないか、データがないことを示す。遺伝子グアニンヌクレオチド結合たんぱく質ガンマ4、一体膜たんぱく質 1、プリオンたんぱく質 (p27-30)、ストマチン様2及びシナプトフィジン様たんぱく質は、用いられたcDNA上の二つの点で表されており、従って、これらの遺伝子については二つのデータ・セットが示されている。
【図２】図２は、TM4SF6のQ-PCRによる結腸直腸癌の診断を示す。対にした非腫瘍（青色）及び腫瘍（赤色）試料の全RNAを、ランダム・ヘキサマで三重にして逆転写させた後、リアルタイム・定量的PCRにより、TM4SF6に特異的なプライマを用いて増幅した。増幅及び検出は、Applied Biosystems社の ABI PRISM 7000 配列検出システムと、蛍光染料としてSybrGreenを用いて行われた。TM4SF6 の発現を各試料中の18S rRNA に正規化した。最後に、各腫瘍毎の倍の発現を、対応する非腫瘍組織（上側）での発現に関して計算した。比較のために、対応するマイクロアレイ結果を示す（下側）。
【図３】図３は、二つの異なるsiRNAによるTM4SF6の効率的なノックダウンを示す。細胞に、50nM (DLD1 及びHelaS3) 又は25nM (SW480) の提示したsiRNAを２回又は３回、トランスフェクトし、最初のリポフェクションから４日後に回収した。RNAを抽出し、定量的PCR (Q-PCR) を、特異的プライマを用いて行った。18S又はアクチンを正規化に用いた。各柱は、少なくとも二重のQ-PCR反応の平均である。
【図４】図４は、精製済み画分のSDS-PAGEを示す。実施例５で解説した通りにTM4SF6 のEC2-ループをクローニングし、精製した。画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分離し、ゲルをクーマシー・ブルーで染色した。レーン1: １回目の泳動画分2、レーン2：１回目の泳動画分3、レーン3：２回目の泳動画分3、レーン4：資源S画分28、レーン 5: 分子質量標準 (サイズを下から上に向かって：10、15、25、35、45、55、70、100、130、180 kDa)。
【図５】図５は、TM4SF6抗体による免疫組織化学法を示す。免疫組織化学検査を実施例６で解説した手法を用いて行った。TM4SF6抗体は、正常な結腸組織（図５Ａ、上側左）及び新生性結腸細胞（図５Ｂ、下側右）間を明白に区別する。正常な組織は全く染色を示さない一方で、癌細胞は陽性である。染色は、異なる患者由来の結腸癌試料でも明白である（図５Ｂ）。TM4SF6の発現も黒色腫細胞で観察された（図５Ｃ）。
【図１】
2007521015.tif 000007
【図２】
2007521015.tif 000008
【図３】
2007521015.tif 000009
【図４】
2007521015.tif 000010
【図５】
2007521015.tif 000011
【図５Ｃ】
2007521015.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月26日(2006.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ZP3 及びLRP4ポリペプチド及び／又はその断片から成る群より選択される少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質の異常な発現及び／又は変化した生物学的活性を特徴とする非ステロイド依存性癌の治療のための治療薬のスクリーニング法。
【請求項２】
ａ．  前記免疫原性膜たんぱく質のプロモータの制御下にあるレポータ・コンストラクトを、検査分子もしくは化合物、又は検査分子もしくは化合物のライブラリに、特異的結合及び／又は相互作用が可能な条件下で接触させるステップと、
ｂ．  前記レポータ・コンストラクトの発現レベルを検出するステップと
を含み、この場合、コントロールに比較したときの発現レベルの変化が、潜在的な治療活性の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ．  前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片を、検査分子もしくは化合物、又は検査分子もしくは化合物のライブラリに、特異的結合及び／又は相互作用が可能な条件下で接触させるステップと、
ｂ．  特異的結合及び／又は相互作用のレベルを検出するステップと
を含み、この場合、コントロールに比較したときの相互作用のレベルの変化が、潜在的な治療活性の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記治療薬が、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質の発現及び／又は生物学的活性を抑制する、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
検査分子もしくは化合物のライブラリが、DNA 及び／又はRNA分子、ペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト、モノクローナル抗体、免疫グロブリン、低分子薬物、薬学的作用薬及びこれらの組合せから成る群より選択される、請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の方法により同定された治療薬、又はその断片、誘導体もしくは相同体を含む、医薬組成物。
【請求項７】
薬学的に許容可能な担体を更に含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１乃至５のいずれかに記載の方法により同定された治療薬、又はその断片、誘導体もしくは相同体の、あるいは、前記治療薬又はその誘導体もしくは相同体を含有する及び／又は発現する送達複合体の、非ステロイド依存性癌を治療する医薬組成物の調製のための使用。
【請求項９】
標的細胞の増殖及び／又は分化又は細胞死を調節する目的で、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列を抑制する方法であって：
ａ． 請求項６乃至８のいずれかに記載の組成物、あるいは、請求項１乃至５のいずれかに記載の方法により同定された治療薬を含む組成物、を提供するステップと、
ｂ．（ａ）に記載の治療上有効量の前記組成物を前記標的細胞に接触させるステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
前記標的細胞が新生細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質の異常な発現及び／又は変化した生物学的活性を原因とする非ステロイド依存性癌を治療する方法であって、治療上有効量の、請求項６乃至８のいずれかに記載の医薬組成物、又は、請求項１乃至５のいずれかに記載の方法により同定された治療薬、を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１２】
前記治療薬が、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質又はその断片に相補的なアンチセンスポリヌクレオチド配列である、請求項９乃至１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記アンチセンスポリヌクレオチド配列の結合が、前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質又はその断片をコードするmRNAの転写又は翻訳を、前記mRNAを発現するホスト細胞で変える上で有効である、請求項１０乃至１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記アンチセンスポリヌクレオチド配列がウィルス・ベクタから発現する、請求項１０乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ウィルス・ベクタが、ワクシニア・ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、又はこれらの組合せである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アンチセンスポリヌクレオチド配列が送達複合体中にある、請求項１８のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記送達複合体がステロール、脂質、ウィルスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質又はその断片を発現することを特徴とする非ステロイド依存性癌を治療する方法であって：
ａ．  一個又は複数の細胞を単離するステップと、
ｂ．  前記細胞を、請求項１２乃至１７のいずれかに記載されたアンチセンス分子に接触させるステップと、
ｃ．  前記細胞を、非ステロイド依存性癌に罹患した対象に送達するステップと
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１２乃至１７のいずれかに記載のアンチセンス分子の、あるいは、前記アンチセンス分子を発現及び／又は含有する細胞の、非ステロイド依存性癌を治療する医薬組成物の調製のための使用。
【請求項２０】
前記細胞が、治療しようとする対象を由来とする、請求項１８に記載の方法、又は、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
少なくとも一つの前記免疫原性膜たんぱく質、その断片、誘導体もしくは相同体の、あるいは、少なくとも一つの前記免疫原性膜たんぱく質、又はその断片、誘導体もしくは相同体を含有及び／又は発現する細胞の、対象のワクチン接種用の医薬組成物調製のための使用。
【請求項２２】
前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、又は、前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチドに、特異的に結合する作用薬をスクリーニングする方法であって：
ａ．  前記少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質、その誘導体又は断片を、検査分子もしくは化合物、又は検査分子もしくは化合物のライブラリに、特異的結合及び／又は相互作用が可能な条件下で接触させるステップと；
ｂ．  特異的結合及び／又は相互作用のレベルを検出するステップと
を含む、方法。
【請求項２３】
前記検査分子もしくは化合物のライブラリが、DNA 及び／又はRNA 分子、ペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト、モノクローナル抗体、免疫グロブリン、低分子、薬学的作用薬、及びこれらの組合せから成る群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、又は、前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチドに、特異的に結合する作用薬。
【請求項２５】
抗体、好ましくはモノクローナル抗体である、請求項２４に記載の作用薬。
【請求項２６】
付加的な部分を含む、請求項２４に記載の作用薬、又は、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
非ステロイド依存性癌の治療、診断又は観察用の医薬組成物調製のための、請求項２４乃至２６のいずれかに記載の作用薬又は抗体の使用。
【請求項２８】
前記非ステロイド依存性癌が、乳房、肺、胃腸管、前立腺、卵巣、子宮頚管、子宮内膜、膀胱、皮膚の癌、及び／又は、上皮組織から生ずる他の癌である、請求項１乃至２７のいずれかに記載の使用、方法、作用薬、又は医薬組成物。
【請求項２９】
前記非ステロイド依存性癌が、皮膚の癌、特に黒色腫又は結腸直腸癌である、請求項２８に記載の使用、方法、作用薬、又は医薬組成物。
【請求項３０】
対象に、非ステロイド依存性癌を発症するリスクがあるか、又は、有するかどうかを判定する方法であって：
ａ．  前記対象の試料中で、前記少なくとも一つの免疫原性膜ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの量、又は、前記免疫原性膜ポリペプチドの量、を判定するステップと、
ｂ．  前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドの量を、健康な対象を表すコントロール量と比較するステップと
を含む、方法。
【請求項３１】
ZP3
又はLRP4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の異常な発現により引き起こされる非ステロイド依存性癌を発症するリスクがある、又は、有する対象を特定するキットであって、前記対象の細胞試料中のZP3又はLRP4をコードするポリヌクレオチド配列（それぞれX56777又はAB011540）のレベルを測定する手段と、前記キットを用いるための指示とを含む、キット。
【請求項３２】
ZP3
又はLRP4ポリペプチドの変化した生物学的活性が原因で引き起こされる非ステロイド依存性癌を発症するリスクがある、又は、有する対象を特定するキットであって、前記対象の細胞試料中のZP3
又はLRP4ポリペプチドのレベルを測定する手段と、前記キットを用いるための指示とを含む、キット。
【請求項３３】
前記少なくとも一つの免疫原性膜ペプチドがヒト由来である、請求項１乃至３０のいずれかに記載の医薬組成物、方法、使用又はキット。
【請求項３４】
ZP3及びLRP4及び／又はその断片から成る群より選択される少なくとも一つの免疫原性膜たんぱく質の、非ステロイド依存性癌を治療又は診断するための医薬組成物調製のための使用。
【請求項３５】
ZP3及びLRP4及び／又はその断片から成る群より選択される少なくとも一つの免疫原性膜たんぱくに特異的な抗体を治療上有効量、投与するステップを含む、非ステロイド依存性が癌を治療又は診断する方法。
【国際調査報告】
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