(57)【要約】  本発明は、ウィルスのエンベロープタンパク質の膜ドメインの共発現のためのベクター、ならびに、これらのドメインのホモ-および/またはヘテロ-オリゴマーを産生する方法に関する。本ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製および維持のための少なくとも1つの領域；ベクターの翻訳方向に、連続して、第一のプロモーターに続いて、特に少なくとも2つの膜ドメインのうちの1つをコードする配列を含む第一のキメラタンパク質をコードする第一の配列からなる第一の領域；ベクターの翻訳方向に、連続して、第二のプロモーターに続いて、特に少なくとも2つの膜ドメインのうちの他方をコードする配列を含む第二のキメラタンパク質をコードする第二の配列からなる第二の領域を含む。  本発明は、C型肝炎の治療または予防用医薬品の製造のための特別な適用を見出した。
2007503804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウィルスエンベロープにおける機能的構造で相互作用する、ウィルスのエンベロープタンパク質の少なくとも2つの膜ドメインの共発現のためのベクターであり、
−宿主細胞における前記ベクターの複製および維持のための少なくとも1つの領域；
−ベクターの翻訳方向に、連続して、第一のプロモーターに続いて、第一のキメラタンパク質をコードする第一の配列からなる第一の領域であって、
前記第一のキメラタンパク質をコードする第一の配列が、ベクターの翻訳方向に、第一の可溶性タンパク質をコードする第一の配列、Asp-Proジペプチドをコードする配列および前記少なくとも2つの膜ドメインの1つをコードする配列からなる、第一の領域；
−ベクターの翻訳方向に、連続して、第二のプロモーターに続いて、第二のキメラタンパク質をコードする第二の配列からなる第二の領域であって、
前記第二のキメラタンパク質をコードする第二の配列が、ベクターの翻訳方向に、第二の可溶性タンパク質をコードする第二の配列、Asp-Proジペプチドをコードする配列および前記少なくとも2つの膜ドメインの他方をコードする配列からなる、第二の領域；
を含むことを特徴とするベクター。
【請求項２】
前記ウィルスが、C型肝炎ウィルス、AIDSウィルス、ヒトに対して病原性であるウィルス、および哺乳類に対して病原性であるウィルスから選択される、請求項1に記載のベクター。
【請求項３】
前記第一の領域および第二の領域がお互いに続く、請求項1に記載のベクター。
【請求項４】
前記第一の可溶性タンパク質および第二の可溶性タンパク質が、一致または異なっており、グルタチオンS-トランスフェラーゼおよびチオレドキシンから選択される、請求項1に記載のベクター。
【請求項５】
前記Asp-Proジペプチドをコードするヌクレオチド配列が、gacccgである、請求項1に記載のベクター。
【請求項６】
前記2つの膜ドメインの1つが、添付した配列表の配列番号2、配列番号10、配列番号12および配列番号14のペプチド配列から選択されるペプチド配列を有し、前記2つの膜ドメインの他方が、添付した配列表の配列番号16および配列番号22のペプチド配列から選択されるペプチド配列を有する、請求項1に記載のベクター。
【請求項７】
前記2つのドメインの1つが配列番号2であり、他方のドメインが配列番号16とは異なる、またはその逆である、請求項6に記載のベクター。
【請求項８】
前記ベクターが、配列番号23のプラスミドpEGXKTまたは配列番号35のプラスミドpET32a+から得られる、配列番号1から7のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９】
前記少なくとも2つの膜ドメインの1つをコードする配列が、添付した配列表の配列番号1、配列番号9、配列番号11および配列番号13の配列から選択されるヌクレオチド配列を有し、前記少なくとも2つの膜ドメインの他方をコードする他の配列が、添付した配列表の配列番号15および配列番号17の配列から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載のベクター。
【請求項１０】
前記2つのドメインの1つが配列番号1であり、他方のドメインが配列番号15とは異なる、またはその逆である、請求項9に記載のベクター。
【請求項１１】
前記第一のキメラタンパク質が、配列番号28、配列番号43、配列番号46、配列番号49および配列番号52の配列から選択される配列を有するタンパク質であり、前記第二のキメラタンパク質が、配列番号31、配列番号34、配列番号55および配列番号58の配列から選択される配列を有するタンパク質である、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記第一のキメラタンパク質が配列番号28の配列を有し、他方のキメラタンパク質が配列番号31とは異なる、またはその逆である、請求項11に記載のベクター。
【請求項１３】
前記ベクターが、添付した配列表の配列番号61、配列番号62、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74および配列番号75の配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項1から13のいずれか一項に記載のベクターで形質転換した原核細胞。
【請求項１５】
原核細胞がE. coli.である、請求項14に記載の原核細胞。
【請求項１６】
遺伝子組み換えによって、ウィルスエンベロープにおける機能的構造で相互作用する、ウィルスのエンベロープタンパク質の少なくとも2つの膜ドメインの混合物またはヘテロ-オリゴマー形態を産生する方法であって、以下の工程：
−宿主細胞を、請求項1に記載のベクターで形質転換する工程、
−前記ベクターに由来する少なくとも2つの膜ドメインの混合物またはヘテロ-オリゴマー形態を産生する培養条件下で、形質転換させた宿主細胞を培養する工程、および
−膜ドメインの前記混合物または前記ヘテロ-オリゴマーを単離する工程、
を含む方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞がE. coli.である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記ベクターが請求項6または7に記載のベクターである、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
前記ベクターが請求項8に記載のベクターである、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
前記ベクターが請求項9または10に記載のベクターである、請求項16に記載の方法。
【請求項２１】
前記ベクターが請求項11または12に記載のベクターである、請求項16に記載の方法。
【請求項２２】
前記ベクターが請求項13に記載のベクターである、請求項16に記載の方法。
【請求項２３】
添付した配列表の配列番号10、配列番号12、配列番号14および配列番号22から選択されるペプチド配列を有するタンパク質。
【請求項２４】
少なくとも1つの第一および第二のタンパク質からなるヘテロ-オリゴマーまたは混合物であって、前記第一のタンパク質が、添付した配列表の配列番号2、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号65、配列番号67および配列番号69から選択される配列を有し、前記第二のタンパク質が、添付した配列表の配列番号16、配列番号22、配列番号34および配列番号58から選択される、ヘテロ-オリゴマーまたは混合物。
【請求項２５】
医薬品の製造のための、請求項23に記載のタンパク質または請求項24に記載のヘテロ-オリゴマーもしくは混合物の使用。
【請求項２６】
C型肝炎の治療または予防において使用するための医薬品の製造のための、請求項23に記載のタンパク質または請求項24に記載のヘテロ-オリゴマーもしくは混合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウィルスのエンベロープタンパク質の膜ドメインの共発現のためのベクター、および、これらのドメインのホモ-および/またはヘテロ-オリゴマーを産生するための方法に関する。これらの膜ドメインは、ウィルスを、感染する標的細胞に固定することができるウィルスのエンベロープタンパク質のドメインである。
【０００２】
本発明のベクターは、例えば、C型肝炎ウィルスのエンベロープタンパク質のTME1およびTME2膜ドメインを共発現すること、ならびに、これらTME1およびTME2ドメインのホモ-および/またはヘテロ-オリゴマーを産生することができる。
【０００３】
本発明は、一般的に、ウィルスのエンベロープタンパク質の膜ドメインの様々な会合を、エンベロープタンパク質の構築の間に産生することができるベクターを提供する。
【０００４】
このベクターによって、例えば、ラージスケールで、ウィルスのエンベロープタンパク質の膜ドメインの様々な会合状態を妨げ、ウィルスの形成または標的宿主細胞へのウィルスの結合を妨げる可能性を有する化学または生物化合物（例えばペプチド）をテストすることができる。
【０００５】
それゆえ、本発明は、また、ウィルスのエンベロープタンパク質の膜ドメインの様々な会合状態の形成を妨げる化学または生物化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。
【０００６】
それゆえ、本発明は、特に、ウィルス感染の機構に関する研究において、ならびに、ウィルス感染に対抗する新規な活性成分の探索および開発において、多くの応用が見出される。
【０００７】
以下の記載においては、角括弧に挟まれた引用文献は、添付した参考文献リストを参照せよ。
【背景技術】
【０００８】
三次(3D)構造を求めることは、タンパク質の構造および機能の理解において、決定的に重要な工程である。このため、研究対象のタンパク質を十分量産生できることが必要であり、可能であれば、産生されるタンパク質は機能的な構造である必要がある。
【０００９】
この目的を達するために、非常に多大な努力と手段が過去に行われ、現在でも行われている。そして、その努力と手段は、ゲノムシークエンシングプラグラムからもたらされるデータの蓄積とともに、ますます活発になっている。
【００１０】
これに関連して、細菌は、科学界で広く使用されている産生の手段である。しかしながら、細菌でのタンパク質の過発現は、たびたび問題が生じる。具体的には、以下の2つの事象が最も一般的に考えられる：
−第一の場合は、最も一般的であるが、タンパク質が過剰産生し、インクルージョンボディの形態で凝集することである。これは、ポリトピック型タンパク質および/または分子量が大きいタンパク質と関連している。この場合、タンパク質のフォールディングのカイネティクスは、生合成での速度よりも明らかに遅い。このことによって、中心部に通常は埋め込まれているタンパク質の疎水性領域の、水溶性溶媒への曝露が促進され、不溶性の凝集の形成をもたらす非特異的な相互作用を生み出す。このフォールディングの無秩序さの程度に応じて、尿素またはグアニジンを用いた非ネイティブ条件下で、インクルージョンボディを可溶化/ほどくことができる。可溶化されたタンパク質を、その後に、限られた場合だけであるが、ネイティブな3Dフォールディングを得るように、透析または希釈などの様々な処理に供する。
−第二の場合は、発現によって様々な程度の毒性を生み出すことである。これには、宿主細胞が適合しようとする場合における発現産物の不足から、発現産物の毒性があまりにも高い場合における宿主細胞の死滅という様々な程度がある。このような場合は、極めて高い頻度で、最も一般的にはタンパク質または膜ドメインまたは膜タンパク質のドメイン（例えば、C型肝炎ウィルスのエンベロープタンパク質のドメイン[1]またはヒト免疫不全ウィルスのドメインなど[2]）で生じる。
【００１１】
宿主細胞の毒性に関する問題は、膜タンパク質、すなわち疎水性ドメインを有するタンパク質に本質的に存在する。現在、これらのタンパク質に対する興味は増している。まずは、様々なゲノムが構築されることによって、膜タンパク質が、これらのゲノムによってコードされている可能性のあるタンパク質の約30％に該当することが確かめられたことからわかるように、膜タンパク質は相対的に莫大であるからである。次に、膜タンパク質は、治療上の標的の70％を構成し、その変化によって多くの遺伝的疾患がもたらされるからである［4］。
【００１２】
それゆえ、このようなタンパク質またはその膜タンパク質の発現を可能にし、または、容易にする方法を開発することは必要不可欠である。
【００１３】
例えば、膜タンパク質の発現に対してより耐性を示す細菌種[5, 6]、または、Stratageneによって開発されたE. coli種BL21(DE3)pLysSのように発現メカニズムをより厳格に制御した細菌種のいずれかの開発に向けて、試みがなされている。しかしながら、特に膜アンカーに対応する疎水性ペプチドを発現する場合、これらの改良では、全ての場合において毒性現象を除外することができない。
【００１４】
利害関係が現在最も高い主要な医療状況の1つは、C型肝炎の治療である。C型肝炎は、特異的に肝細胞に感染するフラビウィルス科のC型肝炎ウィルス（HCV）によって引き起こされる[7]。HCVは、全世界を通して、1億7000万人が感染している。血清反応陽性者の75％が慢性感染をもたらすと見積もられている。このウィルスは、図1に示す、3033残基のポリタンパク質をコードする約9500塩基のポジティブRNAからなり[9]、このRNAは、発現後、内因性および外因性プロテアーゼによって切断され、10の異なるタンパク質をもたらす。そのうちの2つ（E1およびE2）は、グリコシル化され、ウィルスのエンベロープを形成する。
【００１５】
ウィルス成熟工程の間、E1およびE2タンパク質は会合し、機能がいまだに知られていないヘテロオリゴマーを形成する。E1およびE2は、それぞれ、外部ドメイン、および、文献[10]に開示されているように小胞体膜へタンパク質をアンカーさせる膜ドメインを形成する、疎水性アミノ酸が豊富なC末端領域からなる。外部ドメインおよび膜ドメインのそれぞれは[11]、オリゴマー形成現象に関与しており、ウィルスエンベロープの構築を調整する。TME1およびTME2膜ドメインは、E1およびE2タンパク質のオリゴマー形成工程に関与しているので、非常に可能性ある有用な治療標的である。
【００１６】
E. coliにおけるE1もしくはE2タンパク質の発現[12][13]、または、バキュロウィルスで感染させたsf9昆虫細胞におけるE1もしくはE2タンパク質の発現[14]のための様々な試みは、それらの発現によってもたらされる毒性のために、失敗している。この毒性は、その膜ドメインによって本質的に生じてしまう。このことは極めて高い頻度で生じる事象であり、最も一般的には膜タンパク質または膜タンパク質ドメイン（例えば、HCVのエンベロープタンパク質のドメイン[13]またはヒト免疫不全ウィルスのドメイン[14]など）で生じる。
【００１７】
今日まで、開発された遺伝子組み換えによる発現システムによっては、これらの膜タンパク質を産生することはできない。更にその上、膜断片（例えば、C型肝炎ウィルスTME1またはTME2断片）を得ることができる場合、これらのドメインを混合しても、ウィルスエンベロープにおいてこれらのタンパク質の天然の会合が再度生じることは絶対に無い。
【００１８】
それゆえ、ウィルスエンベロープにおける機能的な構造で協働する膜ドメインを産生するための、特に、ウィルスエンベロープの構築ならびに/またはウィルスの標的細胞への認識および/もしくは結合のためのシステムについての真に迫った必要性が存在する。また、このシステムは、産生されるドメインについて、ウィルスエンベロープの構築の間に、ならびに/または、ウィルスの標的細胞への認識および/もしくは結合のためのウィルスエンベロープの機能的形態で、様々な会合状態を再びもたらすことができることが望ましい。
【００１９】
このシステムは、例えば、ラージスケールで、膜ドメインの様々な会合状態を妨げ、ウィルスの形成および/またはウィルスによる標的宿主細胞の認識メカニズムを妨げる可能性を有する化学または生物化合物（例えばペプチド）をテストすることができる。
【非特許文献１】Ciccaglione A. R., Marcantonio C., Costanitino A., Equestre M., Geraci A. and Rapicetta M. (2000) Virus Genes 21, 223-226
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明によって達成される目的は、正確には、ウィルスエンベロープにおける機能的構造で、特に、ウィルスエンベロープの構築のための、ならびに/または、ウィルスの標的細胞への認識および/もしくは結合のための機能的形態で協働または相互作用する膜ドメインの共発現のためのシステムを供給することによって、従来技術の前記問題を解決し、前記必要性を満たすことである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明のシステムは、ウィルスエンベロープにおける機能的構造で協働するウィルスのエンベロープタンパク質の少なくとも2つの膜ドメインの共発現のためのベクターであり、前記システムは、
−宿主細胞におけるベクターの複製および維持のための少なくとも1つの領域；
−ベクターの翻訳方向に、連続して、第一のプロモーターに続いて、第一のキメラタンパク質をコードする第一の配列からなる第一の領域であって、
前記第一のキメラタンパク質をコードする第一の配列が、ベクターの翻訳方向に、第一の可溶性タンパク質をコードする第一の配列、Asp-Proジペプチドをコードする配列および前記少なくとも2つの膜ドメインの1つをコードする配列からなる、第一の領域；
−ベクターの翻訳方向に、連続して、第二のプロモーターに続いて、第二のキメラタンパク質をコードする第二の配列からなる第二の領域であって、
前記第二のキメラタンパク質をコードする第二の配列が、ベクターの翻訳方向に、第二の可溶性タンパク質をコードする第二の配列、Asp-Proジペプチドをコードする配列および前記少なくとも2つの膜ドメインの他方をコードする配列からなる、第二の領域；
を含むことを特徴とする。
【００２２】
用語「膜タンパク質ドメイン」または「膜ドメイン」は、特に標的細胞の膜へのアンカーリングの観点から疎水性である、ウィルスのエンベロープタンパク質部分を意味することを意図する。当然に、膜タンパク質であるタンパク質全体、または、非膜の親水性ドメインをも有する膜部分のタンパク質とすることができる。
【００２３】
本発明によれば、第一および第二の領域は隣接していることが有利であるが、ベクター内におけるこれら2つの領域のお互いの配置は、重要ではないと推測される。
【００２４】
本発明によれば、第一および第二の可溶性タンパク質は、一致または異なるものとすることができる。これらは、例えば、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）およびチオレドキシン（TrX）または他の任意の同等な可溶性タンパク質から選択することができる。GSTおよびTrXのペプチド配列は、例えば、それぞれ、添付した配列表の配列番号25および配列番号37である。GSTおよびTrXをコードするように本発明のベクターにおいて使用することができるGSTおよびTrXをコードするヌクレオチド配列は、例えば、それぞれ、添付した配列表の配列番号24および配列番号36である。
【００２５】
本発明によれば、Asp-Proジペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、gacccgまたは他の任意のこのジペプチドをコードするヌクレオチド配列とすることができる。
【００２６】
全く予期できなかったことに、それぞれの膜タンパク質のヌクレオチド配列の上流に位置する、Asp-Pro（一文字コードではDP）をコードする配列によって、宿主細胞で共発現させる膜タンパク質の毒性効果を無効化することができた。更にその上、本発明者は、全く驚くべきことに、それぞれの可溶性タンパク質とそれぞれの膜ペプチドの間に挿入されたAsp-Pro配列を有する、可溶性タンパク質（例えばグルタチオンS-トランスフェラーゼまたはチオレドキシン）とのC末端融合体として、膜ペプチドを本発明の共発現ベクターにおいて産生させた場合に、宿主中のタンパク質の毒性の無効化がより有効であることに着目した。
【００２７】
本発明のベクターによって、ウィルスエンベロープにおける機能的構造で協働する少なくとも2つの膜ドメインの、共発現としての過剰発現をもたらすことができる。これらは、宿主細胞中の膜タンパク質、特に、疎水性タンパク質、具体的には、宿主細胞の膜にアンカーリングすることができるタンパク質の疎水性ドメインに対応するか、またはこれを含むペプチドである。例えば、膜タンパク質または膜タンパク質ドメインとすることができる。例えば、ウィルス（例えばC型肝炎ウィルス、AIDSウィルスまたはヒトおよび一般的には哺乳類に対して病原性である他の任意のウィルス）のエンベロープタンパク質とすることができる。本発明においては、これらのエンベロープタンパク質は、その膜ドメイン、すなわちその疎水性ドメインへと短くすることができる。これは、表現「膜ドメイン」が意味することを意図するものである。本発明が対象とするウィルスは、実際には、ウィルスエンベロープの構築のための、ならびに/または、ウィルスの標的細胞への認識および/もしくは結合のための相互作用膜タンパク質を、その構造において有する全てのウィルスとすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
例えば、C型肝炎ウィルスのエンベロープタンパク質の場合、本願発明のベクターは、TME1およびTME2膜ドメインの共発現のためのベクターとすることができる。このベクターによって、特にウィルスRNAによってコードされているポリタンパク質の347-383および717-746断片に対応し、以下の配列：
【００２９】
【化１】
2007503804.tif 000003
【００３０】
を有する、前記TME1およびTME2ドメインを共発現させることができる。
【００３１】
それゆえ、本発明によれば、2つの膜ドメインの1つは、添付した配列表の配列番号2、配列番号10、配列番号12および配列番号14のペプチド配列から選択されるペプチド配列を有することができ、2つの膜ドメインの他方は、添付した配列表の配列番号16および配列番号22のペプチド配列から選択されるペプチド配列を有することができる。
【００３２】
添付した配列表の配列番号10、配列番号12および配列番号14のペプチド配列は、点変異を含むTME1（配列番号2）のペプチド配列に対応する。添付した配列表の配列番号22のペプチド配列は、2つの点変異を含むTME2（配列番号16）のペプチド配列に対応する。これらの点変異の役割を、本発明に従って以下に説明する。
【００３３】
本発明によれば、ベクター中においては、前記少なくとも2つの膜ドメインの1つをコードするヌクレオチド配列を、例えば、添付した配列表の配列番号1、配列番号9、配列番号11および配列番号13のヌクレオチド配列から選択することができ、前記少なくとも2つの膜ドメインの他方をコードするヌクレオチド配列を、添付した配列表の配列番号15および配列番号17のヌクレオチド配列から選択することができる。これらのヌクレオチド配列は、それぞれ、前記した配列番号2、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号22のペプチド配列をコードする。当業者は、これらのペプチドまたは変異したペプチドをコードする他のヌクレオチド配列を容易に求めることができるであろう。
【００３４】
TME1およびTME2ペプチドは、それぞれ、可溶性タンパク質のC末端融合体として、例えば、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合体および/またはチオレドキシン（TrX）との融合体として産生し、キメラ、例えば、GST-DP-TME1、GST-DP-TME2、TrX-DP-TME1およびTrX-DP-TME2を形成する。
【００３５】
例えば、本発明にベクターにおいては、第一のキメラタンパク質は、配列番号28、配列番号43、配列番号46、配列番号49および配列番号52の配列から選択される配列を有するタンパク質とすることができ、第二のキメラタンパク質は、配列番号31、配列番号34、配列番号55および配列番号58の配列から選択される配列を有するタンパク質とすることができる。前記と同じ理由で、特に共発現タンパク質のヘテロオリゴマーを有利に得るためには、第一のキメラタンパク質が配列番号28の配列を有する場合、他方のキメラタンパク質は配列番号31とは異なり、これは逆についても言える。
【００３６】
本発明のベクターから産生される膜タンパク質は、モノマー、ダイマー、トリマー、および、それほどではないにせよマルチマーの形態を形成し、これらは、時には、SDS存在下でのポリアクリルアミドゲル上での変性分離条件に十分耐えうるほど安定である。
【００３７】
本発明者は、予期しなかったことに、C型肝炎ウィルスのエンベロープのTME1およびTME2膜タンパク質について、これらのオリゴマー形態を安定化させる相互作用の力が何であろうと、
−TME1中の点変異G354Lおよび/またはG358L（TME1の354部位および/または358部位のグリシンをロイシンで置換）によって；および/または
−TME2中の点変異C731AおよびC733A（TME2の731部位および733部位のシステインをアラニンで置換）によって、
その相互作用の力を無効化できることを見出した。
【００３８】
本発明によれば、相互作用の力を無効化するために、ベクター中でTME1およびTME2の全ての変異を産生する必要は無い。本発明の共発現ベクターにおいては、TME1またはTME2のいずれかにおける変異で、この結果を得るには十分である。それゆえ、特別なヘテロ-オリゴマー形態を望むならば、好ましくは、2つのドメインの1つが配列番号2である場合は、他方のドメインは配列番号16とは異なり、これは逆についても言える。同じように、2つのドメインの1つが（TME1をコードしている）配列番号1の配列によってコードされている場合は、他方のコードドメインは（TME2をコードしている）配列番号15とは異なり、これは逆についても言える。それゆえ、本発明によって、変異の選択を介して、特定のヘテロ-オリゴマー形態を優先的に得ることができ、または、ホモ-もしくはヘテロ-オリゴマー形態を得ないこともできる。
【００３９】
例えば、本発明の特定の実施態様においては、ベクターは、キメラ[可溶性タンパク質-DP-TME1]をコードする領域、および、キメラ[可溶性タンパク質-DP-TME2]をコードする領域を統合することによって構築した。この共発現によって、第一に、独立した発現で観察されるホモ-オリゴマーの形成が可能となり（共発現なしの試み）、第二に、全く驚くべきことに、{[可溶性タンパク質-DP-TME1]1-[可溶性タンパク質-DP-TME2]1}へテロダイマーおよび{[可溶性タンパク質-DP-TME1]2-[可溶性タンパク質-DP-TME2]1}へテロトリマーの形成が可能となった。更にその上、TME2中に二重変異C731AおよびC733Aを有するベクターを使用することによって、本発明者は、ヘテロオリゴマー形態だけでなく、[TDPTME1]3トリマーも顕著に無効化することができた。
【００４０】
本発明によるTME1変異キメラタンパク質の例は、例えば、それぞれ、添付の配列表の配列番号64、配列番号66および配列番号68の配列のオリゴヌクレオチドによってコードされている、GST-DP-TME1_G354L（配列番号65）；GST-DP-TME1_G358L（配列番号67）；およびGST-DP-TME1_G354&358L（配列番号65）がある。
【００４１】
本発明によるTME2変異キメラタンパク質の例は、例えば、それぞれ、添付の配列表の配列番号33および配列番号57の配列のオリゴヌクレオチドによってコードされている、配列番号34のペプチド配列のGST-DP-TME2_G731&C733A、または、配列番号58のペプチド配列のTrX-DP-TME2_G731&C733Aがある。
【００４２】
本発明のベクターは、遺伝子組み換えに関する当業者に知られている任意のプラスミド（例えば、E. coliにおけるプラスミド）であって、宿主細胞内での複製のための領域およびプラスミドを維持するための領域、ならびに、前記したキメラタンパク質をコードする領域を挿入するための制限酵素部位を含むプラスミドから得ることができる。プラスミドは、特に、共発現のために導入される宿主細胞に従って選択される。
【００４３】
本発明のベクターは、有利には、添付した配列表の配列番号23の配列のプラスミドpGEXKT、または、添付した配列表の配列番号35の配列のプラスミドpET32a+から得ることができる。なぜならば、それらは、既に、可溶性タンパク質をコードする配列、すなわち、それぞれグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）をコードする配列およびチオレドキシン（TrX）をコードする配列を含むからである。
【００４４】
本発明のベクターにおいては、宿主細胞内での複製のための領域およびプラスミドを維持するための領域は、一般的に、膜タンパク質をコードする領域をクローニングするために選択されたプラスミド上には既に存在する。もしそうでなければ、挿入することができる。これらの領域は、当業者に知られている。
【００４５】
キメラタンパク質のコード配列の前方に位置するプロモーターは、これらの領域の転写を開始するためにRNAポリメラーゼが認識する必要があるDNA配列である。その後、転写は、この酵素の制御下で行われる。これらのプロモーターは、当業者に知られている。
【００４６】
共発現させる膜タンパク質をクローニングするために選択されたプラスミドから、本発明によるベクターを得るために、前記タンパク質をコードするヌクレオチドを利用する必要がある。このヌクレオチドは、それぞれのヌクレオチドの5’→3’の方向で上流に、DPジペプチドをコードするヌクレオチド配列、および可溶性タンパク質をコードするヌクレオチド配列の順番で結合している。当業者に知られている通常の遺伝子組み換え手法を使用することができる。簡単に言えば、選択されたプラスミドを特定の部位で切断することができる制限酵素を、共発現させる膜タンパク質をコードする領域をプラスミドへ挿入するために使用する。この膜タンパク質は、それぞれがDPジペプチドのコード配列を介して可溶性タンパク質のコード配列に結合している。使用することができる手法は、例えば[16]に記載されている。その後、本発明のベクターを得る。
【００４７】
例として、本発明のベクターは、添付した配列表の配列番号61または配列番号62のオリゴヌクレオチド配列のベクターとすることができる。これらのベクターで共発現させるキメラタンパク質は、それぞれ、GST-DP-TME2+TrX-DP-TME1（配列番号61）およびGST-DP-TME2_C731&C733A+TrX-DP-TME1（配列番号62）である。
【００４８】
更なる例として、本発明のベクターは、また、以下のキメラタンパク質をコードする以下のベクターの1つとすることができる：
−キメラタンパク質GST-DP-TME2+TrX-DP-TME1_G354L（配列番号31＋配列番号46）をコードする配列番号70のベクター；
−キメラタンパク質GST-DP-TME2+TrX-DP-TME1_G358L（配列番号31＋配列番号49）をコードする配列番号71のベクター；
−キメラタンパク質GST-DP-TME2+TrX-DP-TME1_G354&358L（配列番号31＋配列番号52）をコードする配列番号72のベクター；
−キメラタンパク質TrX-DP-TME1_G354L+GST-DP-TME2_C731&733A（配列番号46＋配列番号34）をコードする配列番号73のベクター；
−キメラタンパク質TrX-DP-TME1_G358L+GST-DP-TME2_C731&733A（配列番号49＋配列番号34）をコードする配列番号74のベクター；および
−キメラタンパク質TrX-DP-TME1_G354&358L+GST-DP-TME2_C731&733A（配列番号52＋配列番号34）をコードする配列番号75のベクター。
前記した様々なキメラタンパク質との他の可能な組み合わせ、例えばTrX-DP-TME2またはTrX-DP-TME2_C731&733Aとの組み合わせは、簡潔さということのみが理由で本明細書には記載されていないが、それらは、明らかに本発明に従うものである。
【００４９】
本発明のベクターによって、C型肝炎ウィルスのエンベロープのTME1およびTME2膜タンパク質を共発現させることができ、そして、ウィルスエンベロープの形成において存在するであろうこれらのタンパク質のホモ-およびヘテロ-オリゴマー形態を再生することができる。
【００５０】
本発明は、また、本発明による発現ベクターで形質転換した原核細胞に関する。本発明のベクターで形質転換した原核細胞は、好ましくは、ベクターがコードしている共発現させる膜タンパク質を過発現させることができる。それゆえ、本発明の発現ベクターを発現することができる任意の宿主細胞を使用することができる。例えば、E. coli、有利にはE. coli種BL21(DE3)pLysSとすることができる。
【００５１】
本発明は、また、遺伝子組み換えによって、ウィルスエンベロープにおける機能的構造で相互作用するウィルスのエンベロープタンパク質の少なくとも2つの膜ドメインの混合物またはヘテロ-オリゴマー形態を産生するための方法に関し、前記方法は、以下の工程：
−宿主細胞を、本発明による共発現ベクターで形質転換する工程、
−前記ベクターに由来する少なくとも2つの膜ドメインの混合物またはヘテロ-オリゴマー形態を産生する培養条件下で、形質転換させた宿主細胞を培養する工程、および
−前記混合物またはヘテロ-オリゴマーを単離する工程、
を含む。
【００５２】
使用することができる宿主細胞を前記する。使用することができるベクターも前記する。
【００５３】
本発明のプラスミドに基づく方法によって、ウィルスのエンベロープタンパク質、例えばC型肝炎ウィルスのエンベロープタンパク質のTME1およびTME2膜ドメインの少なくとも2つの1つもしくは複数のヘテロ-オリゴマー、または、混合物を産生することができる。実際に、産生される膜ドメイン間の相互作用（それゆえヘテロ-オリゴマーの形成を）を弱める、または無効化さえするような適切な点変異を導入することによって、本発明のプラスミドから、以下に示すような様々な応用に使用することができる変異ペプチドの混合物を得ることができる。
【００５４】
これらのヘテロ-オリゴマー形態またはこれらの混合物は、キメラタンパク質、または産生された膜タンパク質から、可溶性タンパク質およびDPジペプチドとは分離して形成することができる。実際に、産生されたキメラタンパク質を切断するための処理は、産生されたタンパク質を単離することからなる工程の間に行うことができる（例えば、DPジペプチドで融合タンパク質を切断する蟻酸を用いた手法）。更にその上、当業者に知られた任意の適切な方法によって、融合タンパク質からタンパク質サンプルを回収するために実施することができる。
【００５５】
この点において、本発明は、また、本発明のベクターを用いた本発明の方法によって得ることができる、ウィルスのエンベロープタンパク質の少なくとも2つの膜ドメインの混合物またはヘテロ-オリゴマーに関する。C型肝炎ウィルスの場合、例えば、添付した配列表の配列番号2、配列番号10、配列番号12および配列番号14から選択されるペプチド配列であって、変異または非変異TME1ペプチド配列に対応するペプチド配列を有する少なくとも1つのタンパク質、ならびに、添付した配列表の配列番号16および配列番号22から選択されるペプチド配列であって、変異または非変異TME2ペプチド配列に対応するペプチド配列を有する少なくとも1つのタンパク質の混合物またはヘテロ-オリゴマーとすることができる。
【００５６】
また、この点において、これらのタンパク質は異なる大きさを有しており、それゆえ、例えば電気泳動で分離することができることから、本発明は、また、これらの変異タンパク質または前記した混合物のうちのどちらかに関する。例えば、添付した配列表の配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号65、配列番号67および配列番号69の配列であって、変異TME1ペプチド配列に対応する配列；ならびに、添付した配列表の配列番号16、配列番号22、配列番号34および配列番号58の配列であって、変異TME2ペプチド配列に対応する配列から選択されるペプチド配列を有するタンパク質とすることができる。実際に、これらのタンパク質によって、ヘテロ-オリゴマーの形成を防ぎ、または除外することさえできる。
【００５７】
産生されたタンパク質は、当業者によって知られている一般的な手法によって、使用した手法が産生されたタンパク質のオリゴマー化を損なわないという条件で、宿主細胞から単離することができる。この分離のために使用することができる手法は、例えば、電気泳動および免疫検出方法である。
【００５８】
この画期的な手法において、発明者は、GSTとの融合体としての発現のためのベクターを使用して、これらのキメラのホモ-オリゴマー形態を確認した。その後、GSTをチオレドキシンで置換することによって、このシステムを置き換えたところ、同じオリゴマーを産生することができた。また、特定の変異が生じたならば、安定であるにもかかわらず後者が維持されないことを確認した。最終的に、このシステムは、キメラの同時発現を可能するのに適しており、完全に予期しなかったことに、第一に、ヘテロ-オリゴマーの存在を明らかにすることができ、第二に、変異によってその形成を制限することができることを示すことができた。
【００５９】
ウィルスの形成に、そして、ウィルスの産生の可能性およびウィルスの無効化の可能性にも必要不可欠であると考えられる、本発明のベクターに基づいて得られたエンベロープタンパク質の会合または混合物によって、新規の治療手段が供給される。
【００６０】
応用の第一の要素は、本明細書に記載した膜ドメインの共発現のためのベクターである。細菌での発現のために開発されたので、前記ベクターは大変容易に使用することができ、本明細書において同定するホモおよび/またはへテロ-オリゴマー形態を調整させることができる多くの化合物を迅速にテストすることができる。このシステムは、HCVに対する化学因子の開発を求める会社にとって非常に有用である。
【００６１】
例えば、本発明のベクターに基づいて得られる、これらのウィルスエンベロープタンパク質会合体、すなわちホモおよび/またはへテロ-オリゴマーは（変異を導入しても良いし、していなくとも良い）、前記会合体に対して特異的なモノクローナル抗体の産生に使用することができる。また、例えば、共発現させたタンパク質の1つのみ、または、複数に変異を導入することによって、これらのタンパク質の会合体は妨げられるか、減じる。
【００６２】
本発明は、また、ウィルスによって引き起こされる疾患の予防または治療において使用するための医薬品の産生のための、会合していても良いし、していなくとも良く（ヘテロ-オリゴマーおよび/またはホモ-オリゴマー）、変異を導入しても良いし、していなくとも良い膜タンパク質の使用、または、変異タンパク質および非変異タンパク質の混合物（例えば、変異もしくは非変異TME1およびTME2、または、この2つのタンパク質の1つのみが変異しているTME1およびTME2の混合物）の使用に関する。例えば、C型肝炎の治療についてである。
【００６３】
本発明のベクターに基づいて得られる膜ドメインの変異を導入した形態は、実際に、ドメインの相互作用力を減じさせる能力を有する。これらのペプチドは、それゆえ、エンベロープタンパク質の変異を導入していない形態と競合させ、それらの会合を妨げ、ウィルスの形成を阻害するのに使用することができる新規のタイプの阻害剤を構成する。また、その構造に基づく阻害剤を開発する基礎としての役割も有する。
【００６４】
本発明は、また、スクリーニング方法における、変異を導入しても良いし、していなくとも良い、会合した膜タンパク質（ヘテロ-オリゴマーおよび/またはホモ-オリゴマー）、例えば、2つのタンパク質の1つのみが、または、その両方が変異を導入されたTME1およびTME2の使用に関する。実際に、本発明に基づいて、これらのタンパク質の会合を妨げることができる、化学または生物化合物、例えばペプチドをテストすることができる。タンパク質の会合を妨げるとして同定された化学または生物化合物は、ウィルス感染に対抗するための新規の活性成分の開発に使用することができる可能性がある候補化合物である。
【００６５】
本発明によるベクターであって、前記した応用に適したベクター、特にC型肝炎に関連するベクターは、例えば、添付した配列表の配列番号61および62の配列のベクターである。
【００６６】
HCVに類似した他のウィルスについて知られていること、および、より徹底的に実証されているその形成サイクルによれば、エンベロープタンパク質は、中間において、様々な会合状態をとると考えられている。この理由は、ウィルスが、サイクルの各工程を可能とするように、これら様々な形態を利用するからである。例えば、ウィルス形成の最終段階に存在するE1E2形態は、しかしながら、感染時において宿主細胞へ融合/侵入できる形態ではない。この工程の間、ウィルスによって産生され、使用されるのは、E1のホモ-トリマー形態である。他の中間形態も存在すると予想され、このことは、本発明者が本発明を用いて発見したことである。
【００６７】
その他の知られている事象であって、発明者が本発明の分野を拡張したその他の事象としては、2つのエンベロープタンパク質の膜ドメインが、このオリゴマー化現象の主要部分を担っていることである。本発明者による本研究まで知られていなかったことは、産生することができるという条件で、2つのエンベロープタンパク質の全てのホモ-およびヘテロ-オリゴマー化状態を再び産生することができることである。
【００６８】
本発明は、これらの複合体の形成を妨害することができるならば、エンベロープの形成を防ぎ、それゆえウィルスの形成を結果として防ぐという根拠に基づく。これは、新規な治療方法である。このためには、これらのオリゴマーの形成を干渉することができる化合物をテストすることができるツールを有することが必要である。このことが、本発明が提案することである。
【００６９】
本発明が基づく考えは、ウィルスが、正確に形成サイクルの連続した段階を実行し、その後に宿主細胞の膜と融合するためには、様々な段階で2つのエンベロープタンパク質を会合しなければならないということである。これらの会合は、その2つのタンパク質のC末端膜ドメインによって部分的に生じ、および/または、安定化されている。これらの会合が妨害された場合、ウィルスの形成は様々な段階でブロックされ、このことによってウィルスの感染能力は制限または無効化するであろう。本発明を使用して選択された化合物は、この目的を達成することができるであろう。
【００７０】
本発明によって生み出されたツール（共発現ベクター）は、非常に単純に、これらのドメインが生じることができる様々な複合体の形態を、正確に産生することができるシステムである。バクテリアを使用し、そして、完全なタンパク質または外部ドメインを産生することを望むならば行うことが必要であるシステムとは異なり、高度な発現システムを必要とはしない。
【００７１】
細菌内での膜タンパク質の産生における困難さは、特に、Asp-Proジペプチドおよび可溶性タンパク質の会合に基づいて解決することができた。このような疎水性ドメインを産生すること、および、その様々な会合状態を得ることは、両方とも一般的なことではない。なぜならば、化学的に多量のペプチドを産生することはできるものの、疎水性ペプチドが関与すれば、従来技術におけるこのような方法の成功は制限され、その対応するヘテロ-オリゴマー形態をin vitroで産生することができないからである。
【００７２】
実際に、完全なエンベロープタンパク質に由来するか、C末端膜ドメインに由来するかに関わらず、各構成要素の独立した化学合成または生合成の後に、それらを溶液中で混ぜ合わせても、様々なヘテロ-オリゴマーを形成することはできない。
【００７３】
本願発明は、これらの障害を克服し、本発明のプラスミドに基づきヘテロ-オリゴマーとして会合したこれらのペプチドを産生するためのin vivo方法を提供する。本発明は、複合体の形成を、C末端膜ドメインTME1およびTME2によって産生された複合体の形成に制限し、その空間的なフォールディングは、完全なE1およびE2タンパク質の空間的なフォールディングよりも極めて単純であり、それゆえ、細菌などの生物システムにおいて満足に実施することができる。
【００７４】
以下に示す実施例は、本発明の応用を例示する。本発明者は、また、2つのドメインの1つに点変異を導入することによって、相互作用を制限することができることを示す。このことは、第一に、細菌内でのこれらのタンパク質の共産生は正確であり、観察される会合状態はこれらのペプチドの相互作用の固有の特性に対応することを示す。
【００７５】
本発明者によって、本発明を用いて、ウィルスの形成を妨げることができる可能性のある化学または生物因子をハイスループットでテストするための、適切であり相対的に非常に安価な手段が供給されるので、製薬産業にとっての有用性は明らかである。本発明に興味を示す会社は、これらのウィルスまたは膜タンパク質の阻害剤の開発を求めている製薬産業の会社である。
【００７６】
膜ドメインの会合および変異によるその調節の両方に関する、本発明によって開発された方法は（共発現、その後の点変異）、エンベロープウィルスによって引き起こされる病状だけでなく、特定の病状において重要な役割を担う任意のポリトピック型膜タンパク質に一般化することができる。1つの例としては、化学耐性現象において主要な役割を担うABCトランスポーターを対象とする場合であり、同じタイプの方法を用いて特異的な不活性因子の探索を行うことができる。
【００７７】
本発明の他の特徴および有用性は、図面および添付した配列表を参照した例示として、
以下の記載に現れるであろう。
【実施例】
【００７８】
（材料）
使用したオリゴヌクレオチドは、Laboratoires Eurobio, 07 Avenue de Scandinavie, 91953 Les Ulis Cedex B France, www. eurobio. fr.から購入した。ベクターは、Quagen, 3 avenue du Canada, LP 809, 91974 Courtaboeuf, Cedex, France, www. Giagen, com.のQuaprep kitを用いて調製した。DNA配列は、Applied Biosystems, 25 Avenue de la Baltique, B.P. 96, 91943 Courtaboeuf, Cedex, France, home. Appliedbiosystems. com.のABI Prism（登録商標）BigDye（商標）Terminator Cycle kitを用いてシークエンスを求めた。E. coli種BL21 Gold(DE3)pLysSおよびQuickChange mutagenesis systemは、Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA, www. Stratagene. Com.から購入した。DNA修飾および制限酵素は、New England Biolabs, 73 Knowl Piece Wilbury Way, Hitchin, Hertfordshire, SG4 0TY, England, UK, www. Neb. Com/neb.から購入した。タンパク質電気泳動および転写装置は、miniprotean 3であり、Molecular Analyst softwareおよび分子量マーカー“Precision Protein standards”および“Kaleidoscope prestained standards”は、Bio-Rad Laboratoires, Division Bio-Recherche, 3 Boulevard Raymond Poincare, 92430 Marnes la coquette, France, www. Bio-rad. com.から購入した。プラスミドpET32a+は、Novagen Inc, 601 Science Drive, Madison, WI 53711 USA, www. Novagen. Com.から購入した。文献[18]に記載されているプラスミドpGEXKTは、Prof. Dixon, Department of Biological Chemistry, University of Michigan Medical School, Ann Arbor 48109-0606, USAから求めた。抗-GST抗体GST(Z-5):sc-459は、Santa Cruz Biotechnology Inc., 2161 Delaware Avenue, Santa Cruz, California 95060, USAから購入した。抗-チオレドキシン抗体Anti-Thio(#R920-25)およびベクターpCRtopo2.1（登録商標）は、Invitrogen, SARL BP 96, Cergy Pontoise 95613.0 Franceから購入した。ECL chemiluminescence kitおよびLMW molecular weight markerは、Amersham Biosciences AB SE-751 84 Uppsala, Swedenから購入した。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗-マウス抗体（#M32107）は、TEBU-bio SA, 39, Rue de Houdan, 78612 Le Perray en Yvelines Cedex Franceから購入した。他の製品は、Sigma, L'Isle d'Abeau Chesnes- B.P. 701, 38297 Saint-Quentin Fallavier, France, www. Sigama-aldrich. com.から購入した。
【００７９】
（略語）
E. coli：Escherichia coli（大腸菌）。DP:アスパラギン酸-プロリン（Asp-Pro）ジペプチド。GST：グルタチオンS-トランスフェラーゼ。HCV：C型肝炎ウィルス。TME1およびTME2：HCVのE1およびE2エンベロープ糖タンパク質の膜ドメイン。PCR：ポリメラーゼ連鎖反応。LB（10gのトリプトン、5gの酵母抽出物、5ｇのNaCl、q.s. 1リットルのH2O）。Amp：アンピシリン。Kan：カナマイシン。OD：吸光度。LS：溶菌溶液（50mM Tris-HCl、pH 8.0、2.5nM EDTA、2% SDS、4M尿素、0.7M β-メルカプトエタノール）。IPTG：イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトシド。aa：アミノ酸。
【００８０】
図中：「ed」：外部ドメイン；「TM」：膜貫通ドメイン；「C」：カプシド；「E1」および「E2」：C型肝炎ウィルスのE1およびE2エンベロープタンパク質；「P7」：C型肝炎ウィルスのP7タンパク質；「Lmw」：低分子量マーカー；「G」：GST；「T」：TrX；「No induc.」：非誘導；「Ab-TrX」：TrXに対する抗体；および「Ab-GST」：GSTに対する抗体。
【００８１】
以下の実施例は、C型肝炎ウィルスのE1およびE2エンベロープタンパク質のTME1およびTME2膜ドメインについて実施した。
【００８２】
（実施例１：GST-DP-TME1およびGST-DP-TME2キメラの別々の発現）
図1に示すように、C型肝炎のエンベロープタンパク質の膜ドメイン、TME1およびTME2は、それぞれ、ウィルスRNAによってコードされているポリタンパク質の断片347-383（配列番号2）および717-746（配列番号16）に相当する。感染性の表現形を示す幾つかのHCVのRNA配列が存在する。TME1およびTME2を発現するのに使用されるものは、それぞれ、European Molecular Biology Laboratory(EMBL)のpublic sequence libraryにおける登録番号＃D00831および＃M67463を有する。
【００８３】
本実施例で使用するTME1およびTME2をコードするDNAは、それぞれ、配列番号1および配列番号15に対応するヌクレオチド配列を有する。
【００８４】
これらのDNAは、適切なオリゴヌクレオチドを用いてde novo合成した。コドンは、Sharp et al.[26]によって定量化された、細菌における最も高い使用頻度に従って選択した。それぞれの合成DNAは、2つの長鎖で重複したオリゴヌクレオチドのセット、TME1についてはOL11（配列番号76）およびOL12（配列番号77）、ならびに、TME2についてはOL21（配列番号79）およびOL22（配列番号80）を使用して調製した。
【００８５】
これらのDNAは、その後、2つの外側のオリゴヌクレオチド、TME1についてはOL17（配列番号78）およびOL16（配列番号39）、ならびに、TME2についてはOL27（配列番号81）およびOL26（配列番号40）を用いたハイブリダイゼーションによって、ポリメラーゼ連鎖反応方法（「PCR」と称する[27]）によって増幅し、その後、プラスミドpGEXKTへとサブクローニングした。
【００８６】
増幅させたDNAは、細菌プラスミドpCRtopo2.1（商標）へとクローニングし、配列を決定した。それらを切断し、その後、文献[17、18]に記載されたプロトコールに従って、PCR断片の5’および3’に最初に挿入したBamH IおよびEcoR I部位を利用してベクターpGEXKTへとサブクローニングした。
【００８７】
これらの膜ドメインは、各ドメインと各可溶性タンパク質の間に、化学的切断部位、すなわちDPを組み合わせることによって、GSTとのC末端融合体として産生される。このことによって、疎水性膜タンパク質に固有の毒性を減ずることができる
【００８８】
プラスミドpGEXKTに予め存在しているGSTのバージョンは、その配列の末端に、GSTと末端に結合するタンパク質との間に特定のフレキシブル性を付与する一連の5つのグリシン残基を組み込んでいる。
【００８９】
GST-DP-TME1およびGST-DP-TME2キメラの発現ができるように、得られたベクターpGEXKT-DP-TME1（配列番号26）およびpGEXKT-DP-TME2（配列番号29）を、BL21 Gold(DE3)pLysS細菌（B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal λ (DE3) [pLysS Camr]）へ組み込んだ。各特性を、以下の表1に示す。
【００９０】
この表において、アミノ酸は、一文字コードで示している。配列のナンバーリングは、由来タンパク質、GSTとウィルスポリタンパク質に基づいて行った。膜ドメインを示す部位は斜体で示す。
【００９１】
キメラの発現は、イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトシド（IPTG）によって誘導した。宿主細胞は、ゲノム中に、イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトシド（IPTG）誘導lacUV5プロモーターの制御下でT7ファージRNAポリメラーゼをコードする遺伝子のコピーを含むように改変した。この場合、細菌は、必要であるならば37℃以下の最適温度で培養する。発現を、培養液にIPTGを加えることによって誘導した。
【００９２】
【表１】
2007503804.tif 000004
【００９３】
産生したタンパク質は、その後、文献[19]に記載した方法で、「Laemmli」型条件において12%ポリアクリルアミドゲル上で移動させることによって分離し、クマシーブルーによって検出した。これらの条件において、添付した図2Aにおける結果によって、細菌タンパク質の中で、過剰産生され、予想サイズ(〜30kDa)に移動したGST-DP-TME1およびGST-DP-TME2キメラが観察された。
【００９４】
予期しなかったことに、GSTに対する抗体を用いてGSTキメラを特異的に明らかにするために、ウェスタンブロッティングによって電気泳動ゲルを処理したところ、図2Bに表されるように、GST-DP-TME1およびGST-DP-TME2キメラのダイマーおよびトリマー形態が見られた。
【００９５】
膜ドメインと融合させなかったGSTは、モノマーのままであり、このことは、オリゴマー化は疎水性領域が存在していることが原因であることを示唆している。同じように、膜ドメインの会合を制御する相互作用は、タンパク質がサンプル調製およびSDS-PGEによる移動（2% SDS、4M尿素、0.7Mβ-メルカプトエタノール、移動、図2の説明を参照）の間に与えられた極端な変性条件でも少なくとも部分的には耐えうるほど十分に強力である。
【００９６】
これらの第一の結果によって、TME1およびTME2膜ドメインのオリゴマー化特性が明らかになったが、このことを完全に確信することができるものではない。なぜならば、溶液中のGSTはダイマーであり、このことは、ドメインが一緒になることを促進することができることを示すからである。同じように、TME2は、疎水的環境によって酸化が促進され、次々とドメインの凝集を促進することができるシステインC731およびC733を含む。それゆえ、これらの可能性を評価するために、本発明者は、コンストラクトを新たなプラスミドに変更し、キメラ中のGSTをチオレドキシンで置き換えた。
【００９７】
（実施例２：チオレドキシン-DP-TME1およびチオレドキシン-DP-TME2の発現）
キメラ中のGSTのチオレドキシンでの置き換えは、発現プラスミドpET32a+（配列番号35）を用いて行なった。後者においては、チオレドキシンをコードする配列は、コードフレームで、タンパク質の検出および精製のために加えた短い3’領域に結合していた。
【００９８】
これらのエレメントは、本実験では使用せず、膜ドメインの挿入は、チオレドキシンをコードする領域のちょうど後ろ、この付加的な部分の上流に行なった。
【００９９】
挿入した断片（領域をコードする）は、ベクターpGEXKT-DP-TM1（配列番号26）およびpGEXKT-DP-TME2（配列番号29）を鋳型として使用し、以下のオリゴヌクレオチドセットをプライマーとして使用して、PCRによって生じさせた。
【０１００】
【化２】
2007503804.tif 000005
【０１０１】
上流オリゴヌクレオチドOL18は、EcoR V部位を結合しており、GSTをコードする遺伝子の末端領域に対応するpGEXKTの断片915-932とハイブリダイズする。下流オリゴヌクレオチドOL16またはOL26は、pGEXKTへとクローニングするために使用したものと同じである。pGEXKT-DP-TME1およびｐGEXKT-DP-TME2鋳型を使用したところ、それぞれの増幅断片は、pGEXKTによってコードされているGSTのC末端に存在する配列SDLSGGGGGLVPRGS（配列番号63）、その後にDP部位、膜ドメインを統合していた。
【０１０２】
プラスミドpET32aへの挿入は、5’位でのMsc I/EcoR V部位および3’位でのEcoR Iを介して行なった。増幅配列は、チオレドキシン配列の末端に、チオレドキシンをコードする遺伝子のフレームで挿入することができた。
【０１０３】
これらのコンストラクトに由来するベクターは、pET32a-TrX-DP-TME1（配列番号41）およびpET32a-TrX-DP-TME2（配列番号53）である。これらのベクターによって産生されるタンパク質は、TDPTME1（配列番号43）およびTDPTME2（配列番号55）である。その特性を、以下の表2にまとめる。
【０１０４】
この表において、アミノ酸は、一文字コードで示している。配列のナンバーリングは、由来タンパク質、GSTとウィルスポリタンパク質に基づいて行った。膜ドメインを示す部位は斜体で示す
【０１０５】
【表２】
2007503804.tif 000006
【０１０６】
チオレドキシン-SDLSGGGGGLVPRGS-DP(TME1またはTME2)キメラ（配列番号43または配列番号55）は、元のベクターがコードしているタンパク質よりも短かった。これは、直接チオレドキシンの後ろで挿入がなされたからであり、本願発明には関係の無いチオレドキシンの下流の付加的な部分が除外されたからである。
【０１０７】
チオレドキシンキメラの発現および産生したタンパク質の検出は、実施例1に示したように行なった。
【０１０８】
産生したタンパク質は、14% SDS-PAGEで分離し、その後、クマシーブルー染色または免疫検出によって検出した。
【０１０９】
図2Cによって、細菌タンパク質の中で、今回は明確に過剰産生し、予期されたサイズ（〜18kDa）に移動したTrX-DP-TME1およびTrx-DP-TME2キメラを見出すことができた。
【０１１０】
この結果によって、発現ベクターは、GST以外のタンパク質でも機能することが確認された。
【０１１１】
2つのタンパク質の過剰発現のレベルは、そのダイマー形態が（図2Cの2×検出レベルで）クマシーブルー染色したゲル上において可視化されているほどであった。
【０１１２】
図2Dで示す、ウェスタンブロッティング後に行なった免疫検出によって、モノマーおよびダイマーを可視化することができたが、トリマー形態も非常に明瞭に可視化することができた。
【０１１３】
チオレドキシンはダイマーを形成しないので、これらの結果は、オリゴマー化が、膜ドメインの存在が原因で生じたことを明確に示している。
【０１１４】
基本的な観点から、これらの結果は、TME1およびTME2のオリゴマー形態の存在を最初に実験的に求めたものである。
【０１１５】
（実施例３：膜ドメインに変異を導入したGSTおよびチオレドキシンキメラ形態の発現）
＜TME2における変異C731AおよびC733A＞
前記したように、TME2のシステイン残基の変異を行ない、GST-DP-TME2キメラのオリゴマーに及ぼす影響をテストした。
【０１１６】
添付の図4に示す長鎖オリゴヌクレオチドに由来する新規のDNA鎖を調製することによって、変異を行なった。生じた断片は、最初にプラスミドpGEXKTにクローン化して、GST-DP-TME2-C731&C733Aキメラ（配列番号34）を発現することができるベクターpGEXKT-DP-TME2_C731&C733A（配列番号32）を調製し、その後、実施例2で記載した方法を用いて、プラスミドpET32aへと置き換え、ベクターpET32a-DP-TME2_C731&C733A（配列番号56）を調製して、TDPTME2-C731&C733Aキメラ（配列番号58）を得た。
【０１１７】
C731AおよびC733Aの二箇所の変異を有するTME2ドメインをコードするDNA配列を、3’末端（下線）を介してハイブリダイズする長鎖オリゴヌクレオチドDPTME2C2A_S（配列番号18）およびDPTME2C2A_A（配列番号19）を使用したPCRによって、de novo合成した。外側のオリゴヌクレオチドGDPT2_S（配列番号20）およびGDPT2_A（配列番号20）を、ハイブリダイゼーション後の増幅を容易にするために使用した。得られたDANをBamH IおよびEcoR Iを用いて切断し、その後、プラスミドpGEXKT（配列番号23）に挿入した。得られたベクターpGEXKT-DP-TME2_C731&C733A（配列番号32）の配列は、シークエンシングによって確かめた。
【０１１８】
このコンストラクトから得られたベクターを、BL21 Gold(DE3)pLysS細菌に導入し、前記のように発現させた。
【０１１９】
発現したタンパク質は、クマシーブルー染色を行い（示さず）、そのウェスタンブロッティングを図3に示す。
【０１２０】
図3のパネルAにおいて、GST-DP-TME2-C731&C733Aキメラは、非変異形態と同程度で産生したことが明らかである。しかしながら、変異体は、ダイマーのレベルが極めて明らかに減少しており、トリマーのレベルは微量であった。図3のパネルBが示すように、同じ結果が、チオレドキシンをGSTと置き換えた場合にも得られた。
【０１２１】
これらの結果によって、第一に、ドメイン内での二重変異によって形成量が減少していることから、TME2を含むオリゴマーの形成は元に戻せないものではないということが示された。微量なオリゴマーがゲル上で可視化されていることから、恐らく変異を導入したドメインも、これらのオリゴマーを形成するのであろう；しかしながら、二重変異によって、SDS-PAGEによってもたらされる変性条件下において、モノマー状態を維持することを妨げる相互作用力を減じることができた。
【０１２２】
＜TME1における変異G354L、G358LおよびG354&G358L＞
同じように、本発明者は、TME1のオリゴマー化における変異の影響をテストした。
【０１２３】
残基354-358におけるアラニン残基の付加によって、E1-E2ヘテロダイマーの形成を減ずることを示す、文献[11]に開示されたOp De Beeck et al.による研究に基づいて、変異を入れる残基の選択を行なった。この領域は、「グリシン」モチーフGXXXGを含む。Engelmanによって文献[20]において記載されているように、このようなモチーフは、膜ドメインの会合に非常に重要である。なぜならば、4残基離れているモチーフの2つのグリシン残基が互いに空間的に下方に位置するα-ヘリックスとして、膜ドメインは、一般的に、組み合わされるからである。グリシン残基の側鎖は水素だけであるので、2つのグリシンの重なりによって生じた空いたスペースが、例えば、ロイシンなどの大きな疎水性残基によって埋められることができる。このことによって、ドメイン間の相互作用を増す埋め込みがもたらされる。それゆえ、この原理に従って、本発明者は、グリシン残基354および358を、独立しておよび一緒に、ロイシンと置換し、この現象における重要性を評価した。
【０１２４】
G354L、G358LおよびG354&358L変異は、ベクターpET32A-TrX-DP-TME1を鋳型として使用して、StratageneのQuickChange(商標)システムによって生じさせた。変異は、GSTキメラには導入しなかった。
【０１２５】
G354LおよびG358L変異を導入するのに使用したオリゴヌクレオチドのセットを以下に示す。
【０１２６】
【化３】
2007503804.tif 000007
【０１２７】
得られたベクターは、pET32A-TrX-DP-TME1_G354L（配列番号44）およびpET32A-TrX-DP-TME1_G358L（配列番号47）である。これらによって、TDPTME1-G354L（配列番号46）およびTDPTME1-G358L（配列番号49）キメラの発現が可能であった。
【０１２８】
鋳型としてベクターpET32A-TrX-DP-TME1_G354Lを、そして、以下のオリゴヌクレオチド（下線を引いた塩基が既に変異を導入したコドンに対応する）を使用して、二重変異を生じさせた。
【０１２９】
【化４】
2007503804.tif 000008
【０１３０】
得られたベクターは、TDPTME1-G354&G358Lキメラ（配列番号52）を生じるpET32A-TrX-DP-TME1_G354&G358L（配列番号50）であった。
【０１３１】
前記したように、これらのコンストラクトから得られたベクターを、BL21 Gold(DE3)pLysS細菌に導入し、キメラを発現させた。
【０１３２】
発現したタンパク質は、ウェスタンブロッティングによって明らかにした。結果を図3Cに示す。これらの結果により、非改変ドメインと比べて、354または358グリシン残基のロイシンとの置換によって、トリマーは明らかに減少し、ダイマーの量が僅かに減少したことが明らかになった。一方、2つのグリシン残基を同時に置換することによって、オリゴマーが完全に見えなくなった。
【０１３３】
それゆえ、グリシン残基は、TME1のオリゴマー化を促進するのに重要であり、この相互作用は、主に、グリシン残基が構成するユニットが原因である。なぜならば、完全な効果を得るためにはグリシン残基を一緒に除去する必要があるからである。
【０１３４】
これらの結果によって、2つのグリシン残基（本明細書で示した場合のように置換をしていない）を含む領域354-358におけるアラニン残基の付加によって、E1-E2ヘテロダイマーの形成を減ずることを示した文献[11]に記載されたOp De Beeckによる観察が補強された。これらの著者らによって記載されたE1-E2の発現は、これらの完全なタンパク質の発現のための天然の条件に極めて類似したワクシニアシステムにおいて行なった（完全なウィルスの発現のためのシステムは存在せず、また、その増殖のためのシステムも存在しない。ワクシニアシステムは、完全なE1およびE2エンベロープタンパク質の機能的発現のための、文献に記載された珍しいシステムの1つである）。
【０１３５】
それゆえ、少なくともこれらのタンパク質の膜ドメインについて、本発明の細菌発現ベクターにより、似たような効果を再び得ることができるという事実を発見したことは、特に有用である。
【０１３６】
それゆえ、この観点から、本発明のベクターは、ワクシニアシステムと同様に信頼に足り、使用に際してかなりシンプルであることは明らかである。
【０１３７】
（実施例4：GSTおよびチオレドキシンキメラの共発現）
既に述べたように、ウィルスを産生する如何なるシステムも存在せず、それゆえ、その形成をもたらす工程をフォローすることはできない。E1およびE2を共発現することができる少数のシステムは、使用するのが困難なままであり[28]、多量のタンパク質を産生することができない。
【０１３８】
本発明者は、これらのドメインの共発現のためのシステムを開発し、請求項に示した本発明に従って、このシステムによって、ウィルスの形成の間に存在するであろうキメラのヘテロ-オリゴマー形態を同定することができることを示した。
【０１３９】
このシステムを産生するために、チオレドキシン-DP-TME1キメラをコードする遺伝子およびそのT7プロモーターを含むベクターpET32a-TrX-DP-TME1を、最初に、以下のオリゴヌクレオチドのセットを使用してPCRによって（実施例1に示すように）増幅した。
【０１４０】
【化５】
2007503804.tif 000009
【０１４１】
実施例2に記載したコンストラクトである、発現ベクターpET32a-TrX-DP-TME1（配列番号41）に由来するDNAカセットは、フレーム内に、T7プロモーター、その後にオープンリーディング配列を含む。このオープンリーディング配列は、チオレドキシンをコードする遺伝子、その後にAsp-ProジペプチドをコードするDNA断片、E1のC末端膜ドメインに対応するMet347-Ala383領域を含む。対応するキメラタンパク質は、TDPTME1（配列番号43、実施例2を参照）である。
【０１４２】
オリゴヌクレオチドPET998-AlwNIは、チオレドキシンのためのT7プロモーターの上流である、pET32aの980-998断片とハイブリダイズするものである。AST1-AlwNIは、TME1をコードする遺伝子の3’領域とハイブリダイズするものである。
【０１４３】
PCR断片を、これらのオリゴヌクレオチドおよび鋳型としてのベクターpET32a-TrX-DP-TME1（配列番号41）を用いて調製した。その後に、プラスミドpCRtopo2.1（登録商標）へとサブクローニングし、シークエンシングを行なった。その後、EcoR I酵素を用いた制限酵素処理によって、プラスミドpCRtopo2.1から、プラスミド上に存在する、サブクローニングした断片の前後の数塩基に位置する2つの部位を取り出した。このようにして取り出した断片を、TME2をコードする遺伝子の下流に位置する、pGEXKT-DP-TME2およびpGEXKT-DP-TME2_C731&C733Aに存在する特徴的なEcoR I部位へと導入した（EcoR I部位の位置については、図5のパネルAを参照）。
【０１４４】
このようにして得られたベクターは、pGEXKT-DP-TME2+TrX-DP-TME1（配列番号61）およびpGEXKT-DP-TME2_C731&C733A+TrX-DP-TME1（配列番号62）であった。ベクターの例は、添付の図5のパネルAに示す。この図において、チオレドキシン-DP-TME1キメラをコードするカセットを挿入するのに使用したEcoR I部位を、文字Eで示す。得られたキメラタンパク質を、サイズに従って、ベクターの右側に図示する。
【０１４５】
ベクターpGEXKT-DP-TME1+TrX-DP-TME2を産生するレシプロカルコンストラクトは、本明細書に示さない。それらは、この後に示す結果と同じタイプの結果を示した。
【０１４６】
実施例1に記載のように、ポジティブクローンを培養し誘導した。キメラが発現し会合する場合は、様々な可能性のあるオリゴマーおよび得られる分子量を要約した下記の表4のような様々なヘテロオリゴマーが見られるであろう。
【０１４７】
【表３】
2007503804.tif 000010
【０１４８】
前記したように、これらのコンストラクトから得られたベクターを、BL21 Gold(DE3)pLysS細菌へと導入し、キメラを発現させた。
【０１４９】
発現後、細菌を、実施例1に記載したようにテストした。様々なキメラおよびそのオリゴマー形態を、抗-GST（図5、パネルB）および抗-チオレドキシン（図6、パネルA）抗体を使用して、前記の実施例に示したようにウェスタンブロッティングおよび免疫検出によって明らかにした。
【０１５０】
新たに形成したオリゴマーを見出すために、共発現アッセイを二回行なった。図5および6の解釈を助けるために、GST-DP-TME2およびTrX-DP-TME1（変異または非変異）キメラタンパク質を、観察されたホモ-およびヘテロ-オリゴマー形態が対応するであろうバンドを示すのに使用した図によって記号化した。使用した分子量マーカーは、「Precision Protein standards」である。
【０１５１】
図5のパネルBで示したように、産生したGSTキメラの可視化によって、第一に、30kDaに移動したモノマー形態GST-DP-TME2を検出することができた。このバンドは、TrX-DP-TME1キメラのみを含むウェルを除いて、全てのウェルで見られた。そして、このパネルの最初のウェルに、モノマー形態よりも分子量が大きいバンドが見られた。その移動度は、ヘテロダイマー{GST-DP-TME21+TrX-DP-TME11}に対応する分子量48kDaに一致していた。
【０１５２】
第二のウェルに見られるように、C731&C733A変異がTME2に存在することは、ヘテロダイマー種にとって大いに不利であった。最後に、移動度レベルがヘテロダイマー{GST-DP-TME2+TrX-DP-TME12}に対応することを示唆するバンドが見出された。この領域における低い分離度にも関わらず、66kDaのこのヘテロトリマーのゲル上の位置は、GST-DP-TME2-C731&C733A変異体のみが発現した第三のウェルにおいて微量に可視化された、66kDaのGST-DP-TME22ホモダイマーのゲル上の位置とは区別された。第二のウェルにおいて見られたように、TrX-DP-TME1がGST-DP-TME2-C731&C733A変異体と共発現した場合には、このヘテロダイマー形態は存在しなかった。
【０１５３】
抗-チオレドキシン抗体を用いた免疫検出を行なった場合、図6のパネルAで示される結果によって、ウェル1、2および3に見ることができるように、T-DP-TME1とGST-DP-TME2の共発現が、第一に、TrX-DP-TME1のモノマー、ダイマーおよびトリマー形態の形成をもたらしたことが示された。そして、両サイドにおいて、T-DP-TME13ホモトリマーを示す移動度の新たな形態が見られた。これらのタンパク質の分子量は、それぞれ48および66kDaである、ヘテロダイマー{GST-DP-TME21+T-DP-TME11}の分子量、およびヘテロダイマー{GST-DP-TME21+T-DP-TME12}の分子量と一致した。
【０１５４】
それゆえ、この結果によって、図5のパネルBの最初のウェルで示した抗-GST抗体を用いた結果が確認された。共発現アッセイを、T-DP-TME1キメラおよびGST-DP-TME2-C731&733A変異体を用いて行なった場合、図6のパネルAの第四および第五のウェルにおいて示すように、とりわけ、ヘテロ-オリゴマー形態はもはや形成されず、より予期されなかったことには、トリマー形態T-DP-TME13が特別には豊富ではなかったことが観察された。
【０１５５】
それゆえ、これらの結果によって、TME2におけるC731&C733A二重変異の存在によって、ヘテロ-オリゴマー形態が、消失するレベルまで弱められ、さらにより顕著なことに、TrX-DP-TME13トリマーの量も減少させることに寄与していることが明瞭に示された。
【０１５６】
前記の実施例に開示された実験から得られた第一の結論は、C型肝炎ウィルスエンベロープタンパク質のTME1およびTME2膜ドメインに融合させた、GSTまたはチオレドキシンなどの可溶性タンパク質の共発現によって、電気泳動の間に供される変性条件に耐えうるのに十分に安定である{GST-DP-TME21+TDPTME11}および{GST-DP-TME21+TDPTME12}などのヘテロ-オリゴマー種の形成がもたらされるということである。これは、これらの膜ドメインが独立してまたは一緒に発現した場合において、お互いに会合することができる能力を、実験的に実証した最初の例である。これらの実験は、E1およびE2タンパク質の膜外タンパク質である、外部ドメイン（図1の「ed」）が存在していない状態で実施したので、このことは、この会合現象における膜ドメインの必要不可欠な貢献を示している。
【０１５７】
これらの結果は、また、ホモダイマーの形成をもたらす相互作用の強さは、TME1およびTME2で均等ではないということを極めて明確に示している。このことは、TrX-DP-TME1のダイマーおよびトリマー種が、ヘテロ-オリゴマーが存在しているにもかかわらず常に正確に形成される一方で、GST-DP-TME2の場合は、同じ種が、ヘテロ-オリゴマーが原因で消失したことが示された共発現実験によって、特に明確である。
【０１５８】
このことによって、TME1およびTME2が、本来的に異なるオリゴマー化能力を有し、ウィルスの形成の間に、それぞれの役割における情報を付与しているという事実が強調される。実際に、共発現の間に形成され、SDS-PAGE上で可視化された最も豊富/安定な複合体は、(TrX-DP-TME1)2および(TrX-DP-TME1)3ホモ-オリゴマー、ならびに、{(GST-DP-TME2)1+(TrX-DP-TME1)1}および{(GST-DP-TME2)1+(TrX-DP-TME1)2}ヘテロ-オリゴマーであった。
【０１５９】
これらの種は、SDS-PAGEによる変性条件に耐え、それゆえ、恐らく、より生理学的条件下で、優れた複合体を形成できる。
【０１６０】
観察された全てのこれらの種が一緒に所属する、このような複合体の最も単純な組織化を、図6のパネルBで図示した。得られた形態は、GST-DP-TME2モノマーによって頂点が囲まれた、真ん中のTrX-DP-TME13トリマーからなる。この形態が、ウィルスの構造組織化の観点から、融合工程の直前に存在する、最も達成しやすいものであろう。文献[22]、[23]および[24]に開示されているように、類似の組織化が、ダニ媒介性脳炎ウィルスの場合に見出されている。
【０１６１】
（実施例5：膜ドメインの共発現システムの有効性、ならびに、膜ドメインのホモ-オリゴマー形態およびヘテロ-オリゴマー形態の安定性を損なうことができる化合物を発見およびテストするための使用）
前記した結果によって、本発明者が、細菌内で、C型肝炎ウィルスのエンベロープタンパク質の膜ドメインを共発現するためのシステムを発明したことを示した。
【０１６２】
本発明者が得たヘテロダイマー形態は、ワクシニアシステムにおいて共発現させた完全なE1およびE2タンパク質について以前に記載されたもの[11]に対応する。このことは、本発明のベクターが、この形態を産生することができることを示している。また、本発明のベクターは、以前には見出されていなかった{GST-DP-TME21+TrX-DP-TME12}ヘテロダイマー形態を産生できる。
【０１６３】
それゆえ、本発明のベクターは、エンベロープタンパク質の膜領域によってもたらされる相互作用を研究するための優れた選択肢であると考えられる。
【０１６４】
エンベロープタンパク質の相互作用が膜領域と関係しており、エンベロープタンパク質から得られる複合体がウィルスの形成にとって不可欠であるという事実から判断して、このシステムは、これらの複合体における相互作用を調節し、ウィルスに対抗するための主要な価値あるものとなりうるであろう化合物をテストすることができると考えられる。
【０１６５】
本発明のベクターの開発が、いったん行なわれると、このベクターは、使用することが非常に容易であり、費用はあまりかからず、例えばコンビナトリアルケミストリーのスケールにあったスケールで化合物をテストすることができる。
【０１６６】
本発明者によって行なわれたこの最初のアプローチとは独立して、本発明者は、また、変異させることによって生じさせることができる、複合体中の膜ドメインの相互作用の制限または除去が可能であることを示す第二のアプローチを提示する。
【０１６７】
最初に、本発明者は、グリシン354および358残基のロイシン残基への二重変異によって、図5Dのモデルによると、複合体の最も最終的な形態のエレメントであろうTME1トリマーの形成が除外されることを示した。第二に、本発明者は、システイン731および733の二重変異によって、TME1およびTME2ヘテロ-オリゴマーの形成が阻害されるだけでなく、TME1トリマーの形成も阻害されることを示した。
【０１６８】
それゆえ、これらの変異体を用いて、本発明者は、ウィルスの野生型の形態と潜在的に競合できる分子の2つの例を提供した。この観点から、これらの分子（ペプチド）は、ウィルスの形成を無効化することによってウィルスに対抗する優れた候補分子を構成し、そして、治療目的で、そのもの、または製品の形態でテストすることができる。
【０１６９】
[参考文献]
2007503804.tif 000011
2007503804.tif 000012
2007503804.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】HCVポリタンパク質の一部分、ならびに、TME1およびTME2エンベロープタンパク質のC末端膜ドメインのペプチド配列を図示する。
【図２】図2Aおよび図2C：それぞれ、得られたGST-DP-TME1およびGST-DP-TME2（パネルA）ならびにTrX-DP-TME1およびTrX-DP-TME2（パネルC）キメラの移動による分離およびクマシーブルー染色を示す2つの12%ポリアクリルアミドゲルの写真。  図2Bおよび2D： それぞれ、図2Aおよび2Cをウェスタンブロッティング（免疫検出）に供した電気泳動ゲルの写真。最初に、GST-DP-TME1およびGST-DP-TME2キメラのダイマーおよびトリマー形態を確認するために、GSTに対する抗体を用いてGSTキメラを特異的に検出し（パネルB）、次に、TrX-DP-TME1およびTrX-DP-TME2キメラのモノマー、ダイマーおよびトリマー形態を確認するために、TrXに対する抗体を用いてTrXキメラを特異的に検出した。
【図３】パネルA：GST-DP-TME2およびGST-DP-TME2_C731&C733Aキメラおよびそのオリゴマーを確認するための電気泳動ゲルの写真。  パネルB：TrX-DP-TME2およびTrX-DP-TME2_C731&C733Aキメラおよびそのオリゴマーを確認するための電気泳動ゲルの写真。  パネルC：TrX-DP-TME1、TrX-DP-TME1_G354L、TrX-DP-TME1_G358LおよびTrX-DP-TME1_G354&358Lキメラおよびそのオリゴマーを確認するための電気泳動ゲルの写真。
【図４】本発明のベクターを得るための、pGEXKTをクローニングするための変異および制限酵素部位の導入、ならびに、TME2-C731&733A断片の増幅のために産生したオリゴヌクレオチドを示す。
【図５】それぞれ、TME2およびTME1膜ドメインと融合させたGSTおよびチオレドキシンキメラの共発現、ならびに、TME2中のシステインの変異がホモ-およびヘテロ-オリゴマー化に及ぼす影響。  パネルA：本発明によるGST-DP-TME2およびTrX-DP-TME1キメラの共発現のためのベクターの例。  パネルB：GSTに対する抗体を用いた免疫検出によって、本発明のベクターpGEXKT-DP-TME2_C731&C733A、pGEXKT-DP-TME2+TrX-DP-TME1、pGEXKT-DP-TME2_C731&C733A+TrX-DP-TME1およびpET32a-TrX-DP-TME1で形質転換したBL21 Gold(DE3)ｐLysS細菌内における膜タンパク質の発現を確認するための、ウェスタンブロッティングゲルの写真。
【図６】それぞれ、TME2およびTME1膜ドメインと融合させたGSTおよびチオレドキシンキメラの共発現、ならびに、TME2中のシステインの変異がホモ-およびヘテロ-オリゴマー化に及ぼす影響。  パネルA：チオレドキシンに対する抗体を用いて行なった免疫検出以外は、図5のパネルBと同じ。  パネルB：本発明によるベクターによって得られたキメラタンパク質を使用したオリゴマーの組織化の図示。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2007503804.tif 000018
【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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