(57)【要約】  組換えタンパク質を含む免疫原性組成物であって、該組換えタンパク質がボルデテラ  ＣｙａＡ又はその断片、及び腫瘍抗原に相当するペプチドを含む、免疫原性組成物が、がん処置として提供される。この免疫原性組成物による処置方法も提供される。ある態様では、治療組成物はメラノーマのための処置であり、そしてＨＬＡ*０２０１エピトープからのエピトープを含む。これらのエピトープは、Ｔｙｒ又はＧｎＴ−Ｖを含み、そして組換えタンパク質ＣｙａＡ−Ｅ５−Ｔｙｒ及びＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖ中に存在する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質を含む免疫原性組成物であって、該組換えタンパク質は、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその断片、及び腫瘍抗原に相当するペプチドを含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその断片と前記ペプチドが、遺伝子的に融合されているか又は化学的に互いに結合している、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
ボルデテラ  ＣｙａＡが脱毒素化されている、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
腫瘍がメラノーマである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
腫瘍抗原がＨＬＡ*０２０１エピトープである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ＨＬＡ*０２０１エピトープがＴｙｒ又はＧｎＴ−Ｖである、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
ＨＬＡ*０２０１エピトープが、チロシナーゼの領域３６９〜３７７である、請求項５又は６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
ＨＬＡ*０２０１エピトープが、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ遺伝子のイントロンに由来する、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
ＨＬＡ*０２０１エピトープがＹＭＤＧＴＭＳＱＶである、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
ＨＬＡ*０２０１エピトープがＶＬＰＤＶＦＩＲＣである、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
組換えタンパク質が、ＣｙａＡ−Ｅ５−Ｔｙｒ又はＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
組換えタンパク質が、１つより多くの腫瘍抗原を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
腫瘍抗原が同じであるか、又は少なくとも１つが他とは異なる、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
腫瘍抗原が、ＣｙａＡのいかなる許容される部位にも局在化される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
腫瘍抗原に対応するペプチドがフランキング領域を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
組成物が免疫治療として使用される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
ボルデテラ  ＣｙａＡが、Ｂ．ペルトゥッシス、Ｂ．パラペルトゥッシス又はＢ．ブロンキセプチカである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
組換えタンパク質を発現するベクターを含む免疫原性組成物であって、該組換えタンパク質が、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその断片、及び腫瘍抗原に相当するペプチドを含む、免疫原性組成物。
【請求項１９】
融合タンパク質をコードする核酸であって、該融合タンパク質は、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその領域及び請求項６〜１６のいずれか１項に記載のＴｙｒ又はＧｎＴＶエピトープを含む抗原であるペプチドを含む、核酸。
【請求項２０】
組換えタンパク質を発現するベクターであって、該組換えタンパク質は、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその断片及び、請求項６〜１６のいずれか１項に記載のＴｙｒ又はＧｎＴＶエピトープを含む腫瘍抗原に相当するペプチドを含む、ベクター。
【請求項２１】
受託番号Ｉ−３１１１の下にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍに寄託されたプラスミド。
【請求項２２】
受託番号Ｉ−２６７９の下にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍに寄託されたプラスミド。
【請求項２３】
（１）免疫原性組成物を患者に投与し、該免疫原性組成物は組換えタンパク質を含み、該組換えタンパク質は、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその断片、及び腫瘍抗原に相当するペプチドを含み、（２）患者においてＴ細胞応答を誘発させることを含む、がんを有する患者を処置する方法。
【請求項２４】
Ｔ細胞応答がＣＴＬ応答である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
がんがメラノーマである、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
腫瘍抗原がＨＬＡ*０２０１エピトープである、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ＨＬＡ*０２０１エピトープがＴｙｒ又はＧｎＴ−Ｖである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
組換えタンパク質が、ＣｙａＡ−Ｅ５−Ｔｙｒ又はＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖである、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
組換えタンパク質が、１つより多くの腫瘍抗原を含む、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
腫瘍抗原が、ＣｙａＡのいかなる許容できる部位にも局在化される、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
組換えタンパク質がフランキング領域を含む、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍抗原がＣｙａＡに化学的に結合している、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＣｙａＡが脱毒素化されている、請求項２３〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
（１）免疫原性組成物を患者に投与し、該免疫原性組成物は組換えタンパク質を発現するベクターを含み、該組換えタンパク質は、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその断片、及び腫瘍抗原に相当するペプチドを含み、（２）患者においてＴ細胞応答を誘発させることを含む、がんを有する患者を処置する方法。
【請求項３５】
Ｔ細胞応答がＣＴＬ応答である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
がんがメラノーマである、請求項３４又は３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
腫瘍抗原がＨＬＡ*０２０１エピトープである、請求項３４又は３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
ＨＬＡ*０２０１エピトープがＴｙｒ又はＧｎＴ−Ｖである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
組換えタンパク質が、ＣｙａＡ−Ｅ５−Ｔｙｒ又はＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖである、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
組換えタンパク質が１つより多くの腫瘍抗原を含む、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
腫瘍抗原が、ＣｙａＡのいかなる許容される部位にも局在化される、請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
組換えタンパク質がフランキング領域を含むように修飾されている、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
腫瘍抗原がＣｙａＡに遺伝子的に融合されている、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＣｙａＡが脱毒素化されている、請求項３４〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
がんの処置のため又はがんの処置用の薬物の製造のための、請求項1〜１８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍抗原に対するＴ細胞応答を誘発するボルデテラ（Bordetella）の組換えアデニル酸シクラーゼ毒素に関する。
【０００２】
発明の背景
本発明は、がんを処置するための組成物及び方法に関する。
【０００３】
多くの動物腫瘍モデルにおいて、Ｔ細胞は、腫瘍拒絶において重要な役割を演じる。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋腫瘍反応性Ｔ細胞により認識される種々の腫瘍抗原は、マウス及びヒト腫瘍の両方に関して同定された（１）。ＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）は特に興味深い。何故ならば、これらの細胞は腫瘍細胞を特異的に認識しそしてそれらを殺すからである。がん免疫治療における重要な目標は、腫瘍特異的ＣＴＬを活性化することである。
【０００４】
ヒトメラノーマ上のＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される抗原の研究により、種々の自己タンパク質に由来する突然変異していないペプチド又は突然変異したペプチドに対応するいくつかのＭＨＣ拘束性腫瘍エピトープが同定された（２）。これらのペプチドのいくつかは、突然変異していない鑑別タンパク質（nonmutated differentiation proteins）、例えば、チロシナーゼ、ＭｅｌａｎＡ／Ｍａｒｔ−１及びｇｐ１００に由来する。これらのタンパク質は、特に、大抵のメラノサイト／メラノーマにおいて特異的に発現されており、かくしてＨＬＡ拘束性エピトープは、関連した(relevant)ＨＬＡ分子を発現する患者からの大抵のメラノーマ細胞により提示される。故に、これらの抗原は、腫瘍エピトープに対する免疫感作に基づいている免疫治療ストラテジーの標的であることができる。
【０００５】
腫瘍細胞上に発現された他の抗原、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ（ＧｎＴ−Ｖ）をコードする遺伝子のイントロン配列に由来するペプチド、も挙げられている（３）。このイントロンは、メラノーマ細胞に特異的に発現されそしてメラノーマ細胞の約５０%に存在する。
【０００６】
ＩＦＡ（４）における遊離ペプチド、組換えウイルスベクター（５〜７）又は樹上細胞（８〜１１）を使用するプロトコールを含む、これらのエピトープに対する特異的抗腫瘍ＣＴＬ応答を誘発するようにデザインされた種々のワクチン接種プロトコールが開発された。ヒトワクチン接種へのこれらのアプローチの適用は、アジュバントの潜在的毒性により、ベクター由来のエピトープペプチドに対する応答に向けてのバイアスにより、又はそれらが労力を要する（インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）操作されるＤＣ）故に限定されている。
【０００７】
以前に、組換えプラスミドが、ボルデテラ属の種（Bordetella sp.）のアデニル酸シクラーゼ（ｃｙａＡ）及びＣｙａＡの許容される部位（permissive sites）に挿入された異種ＤＮＡの発現のために使用された。これらのプラスミド及び得られる組換えタンパク質は、免疫応答を誘発するために有用であった。誘発された免疫応答は、クラスＩ主要組織適合複合体（class I major histocompatibility complexes）を伴なうＣＤ８＋Ｔ細胞において並びにクラスＩＩ主要組織適合複合体を伴なうＣＤ４＋Ｔ細胞においてであった。（U.S.Patent Nos.5,503,829, 5,679,784及び5,935,580参照）。更に詳しくは、組換えタンパク質は、ＣＤ１１ｂ発現細胞、例えば、樹状細胞に送達されうる。(European Patent Application EP1 188446 A1,"Proteinaceous vectors for molecule delivery to CD11b expressing cells"及びU.S.Patent Application 387,486に対応するWO/2122169A2"Vectors for Molecule Delivery to CD11b Expressing Cells"及びEuropean Patent Application No.03291486.3,"Modified Bordetella Adenylate Cyclase Comprising or Lacking CD11b/CD18 Interaction Domain and Uses theirof".) EI-Azami-EI-Idrissi et al.,, 2003, Interaction of ボルデテラ  ペルトゥッシス Adenylate Cyclase with CD11b/CD18, J.Biol.Chem., vol.278, pp.38514-21参照。
【０００８】
免疫細胞及びＴ細胞応答に対する特異的標的化を可能とする新規な抗腫瘍処置に対する当該技術分野における要求がある。これらの新規なストラテジーは、腫瘍抗原に対する免疫応答の特異的増幅をもたらすべきである。
【０００９】
本発明の簡単な要約
本発明は、免疫応答を誘発する組換えＣｙａＡタンパク質を提供することにより当該技術分野における要求を達成するのを助ける。これらの応答は腫瘍抗原に向けて指向されうる。
【００１０】
本発明は、がんを処置及び免疫監視する新規な方法を提供する。
【００１１】
本発明は、組換えタンパク質を含む免疫原性組成物であって、該組換えタンパク質は、ボルデテラ  アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）及び腫瘍抗原に相当するペプチドを含む、免疫原性組成物を提供する。
【００１２】
本発明の態様は、（１）組換えタンパク質を含む免疫原性組成物を患者に投与し、該組換えタンパク質は、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその特異的断片、及び腫瘍抗原に相当するペプチドを含み、（２）患者において免疫応答、例えばＴ細胞応答を誘発させることを含む、がんを有する患者を処置する方法である。
【００１３】
本発明の態様は、（１）組換えタンパク質を発現するベクター含む免疫原性組成物を患者に投与し、該組換えタンパク質は、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその特異的断片、及び腫瘍抗原に相当するペプチドを含み、（２）患者においてＴ細胞応答を誘発させることを含む、がんを有する患者を処置する方法である。
【００１４】
Ｔ細胞応答は、ＣＴＬ応答又はＴヘルパー応答又はＣＴＬ及びＴヘルパー応答である。
【００１５】
本発明の態様では、腫瘍はメラノーマである。
【００１６】
本発明の他の態様では、腫瘍抗原はＨＬＡ*０２０１エピトープである。
【００１７】
本発明に包含されるのは、組換えタンパク質であり、この組換えタンパク質はＣｙａＡ−Ｅ５−Ｔｙｒ又はＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖである。
【００１８】
本発明の更なる態様では、組換えタンパク質は、１つより多くの腫瘍抗原を含む。特定の態様では、少なくとも１つの腫瘍抗原は他とは異なる。
【００１９】
腫瘍抗原は、ＣｙａＡのいかなる許容される部位（permissive sites）にも局在化される。
【００２０】
本発明の態様では、ＣｙａＡは、ボルデテラ  ペルトゥッシス（Bordetella pertussis）、ボルデテラ  パラペルトゥッシス（Bordetella parapertussis）、又はボルデテラ  ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）である。好ましい態様では、ＣｙａＡはボルデテラ  ペルトゥッシス（Bordetella pertussis）由来のものである。
【００２１】
本発明は、組換えタンパク質を含む免疫原性組成物であって、該組換えタンパク質は、ヒト及び動物細胞上のリガンドとして認識されるアデニル酸シクラーゼタンパク質の少なくとも１つの特異的断片、及び腫瘍抗原に対して特異的な少なくとも１つのエピトープを含む、免疫原性組成物も提供する。免疫原性組成物の組換えタンパク質において、ＣｙａＡ及び腫瘍抗原は、遺伝子的に融合され又は化学的に結合されることができる（ＰＣＴ／ＥＰＯ／１１３１５）。
【００２２】
更に、本発明は、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその特異的断片、及びＧｎＴＶエピトープを含む抗原に相当するペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。抗原は、ＣｙａＡタンパク質又はその特異的断片に融合されているか又は化学的に結合されている。
【００２３】
本発明は、融合タンパク質をコードする核酸配列であって、該融合タンパク質は、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその特異的断片、及びＧｎＴＶエピトープを含む抗原に相当するペプチドを含む、核酸配列も提供する。特定の態様では、該配列は、受託番号Ｉ−３１１１の下で２００３年１０月１６日C.N.C.M., Paris, Franceに寄託されたプラスミドに含まれる。
【００２４】
組換えタンパク質を発現するベクターであって、該組換えタンパク質が、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその特異的断片、及びＧｎＴＶエピトープを含む抗原に相当するペプチドを含む、ベクターも本発明に含まれる。特定の態様では、該ベクターは、受託番号Ｉ−３１１１の下で２００３年１０月１６日C.N.C.M., Paris, Franceに寄託された。
【００２５】
本発明は、組換えタンパク質を発現する宿主細胞であって、該組換えタンパク質は、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその特異的断片、及びＧｎＴＶエピトープを含む抗原に相当するペプチドを含む、宿主細胞を更に包含する。特定の態様では、宿主細胞は、受託番号Ｉ−３１１１の下で２００３年１０月１６日C.N.C.M., Paris, Franceに寄託されたベクターを発現する。
【００２６】
本発明は、融合タンパク質をコードする核酸配列であって、該融合タンパク質が、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその特異的断片、及びＴｙｒエピトープを含む抗原に相当するペプチドを含む、核酸配列も提供する。特定の態様では、該配列は、受託番号Ｉ−２６７９の下で２００１年５月３１日に、C.N.C.M., Paris, Franceに寄託されたプラスミドに含まれる。
【００２７】
本発明の他の態様は、組換えタンパク質を発現するベクターであって、該組換えタンパク質が、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその特異的断片、及びＴｙｒエピトープを含む抗原に相当するペプチドを含む、ベクターである。特定の態様では、該ベクターは、受託番号Ｉ−２６７９の下で２００１年５月３１日C.N.C.M., Paris, Franceに寄託された。
【００２８】
本発明は、更に、組換えタンパク質を発現する宿主細胞であって、該組換えタンパク質が、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその特異的断片、及びＴｙｒエピトープを含む抗原に相当するペプチドを含む、宿主細胞である。特定の態様では、宿主細胞は、受託番号Ｉ−２６７９の下で２００１年５月３１日C.N.C.M., Paris, Franceに寄託されたベクターを発現する。
【００２９】
好ましい態様の詳しい説明
形質細胞膜を横切って細胞質ゾル（そこで適当なプロセッシング及びＭＨＣクラスＩ分子との相互作用が起こりうる）中に抗原性エピトープを送達することができるバクテリア毒素に基づいて、ＣＴＬ活性化のための新規なアプローチが最近開発された。ボルデテラ  ペルトゥッシスのアデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）（Glasser, P., et al. 1988 ボルデテラ  ペルトゥッシス adenylate cyclase: the gene and the protein, Tokai J.Exp.Clin.Med., 13 Supp.: 239）は、その触媒ドメインを真核細胞の細胞質ゾルに送達する能力を有する（１２）。ＣｙａＡの触媒ドメインに挿入されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの送達は、細胞内プロセッシング及び抗原提示細胞（１３）の表面におけるＭＨＣクラスＩ分子によるエピトープの提示をもたらす。更に、ＣｙａＡは、αMβ2インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）に特異的に結合し（１４）、かくして、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣ亜集団を標的化し、これは一次免疫応答（１５）を非常に有効に誘発する（１５）。故に、ウイルスエピトープを有する組換えＣｙａＡ毒素によるマウスの免疫感作は、強いＣＴＬ応答の誘発及び致死的ウイルスチャレンジ(lethal viral challenge)に対する完全な保護をもたらす（１６）。
【００３０】
更に、単一のＣＴＬエピトープを有するＣｙａＡ毒素は、マウスにおける有効な保護及び治療抗腫瘍免疫も刺戟することができる（１７）。重要なことに、遺伝子的に脱毒素化されたＣｙａＡトキソイドは、保護抗ウイルス又は抗腫瘍免疫を誘発する性質を保持する（１７、１８）。かくして、ＣｙａＡは、マウスにおいて特異的免疫応答を誘発するのに安全で有効な非複製性ベクターであると思われる。しかしながら、ＣｙａＡを使用するがん免疫治療を精巧にするという観点で、ＣｙａＡに挿入されたヒト腫瘍エピトープが有効にプロセッシングされそしてヒトＭＨＣ分子と会合して提示されることを証明することは特に重要である。
【００３１】
本発明の１つの態様では、チロシナーゼ又はＧｎＴ−Ｖに由来するＨＬＡ*０２０１拘束性メラノーマエピトープを有する２つの組換えＣｙａＡを構築した。挿入されたエピトープに対するインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ＨＬＡ*０２０１拘束性ＣＴＬ応答を誘発するためのこれらの組換えＣｙａＡの効力及びヒト抗原提示細胞にこれらのエピトープを送達する能力は、下記の実施例で証明される。
【００３２】
ボルデテラ  ペルトゥッシスのＣｙａＡは、αMβ2インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）とのその特異的相互作用に続いてＣＤ１１ｂ＋樹状細胞の細胞質ゾルにＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達することができることが発見された。この送達は、ＣｙａＡに挿入されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの細胞内プロセッシング及びＭＨＣクラスＩ分子による提示をもたらす。実際に、単一ＣＴＬエピトープを有するＣｙａＡ毒素は、マウスにおいて有効な保護及び治療抗腫瘍免疫を誘発することができる。
【００３３】
これらの組換えＣｙａＡタンパク質は、アジュバントの一回の静脈内免疫感作の後ですら、ＨＬＡ*０２０１−トランスジェニックマウスにおける強い抗メラノーマＣＴＬ応答を誘発することが更に発見された。応答は、長く持続し、最後の注射の５ヶ月後という長い間検出される。
【００３４】
最後に、組換えＣｙａＡで処理されたヒト樹状細胞は、メラノーマエピトープをプロセッシングしそしてヒトＣＴＬクローンに有効に提示することが発見された。本発明の組換えＣｙａＡタンパク質は、ＣｙａＡに挿入された腫瘍エピトープが有効にプロセッシングされそしてヒトＭＨＣ分子と会合して提示されることを証明する。故に、ＣｙａＡは、ヒトにおいて抗腫瘍ＣＴＬを活性化させることができ、そしてがん免疫治療のための新規なファクターである。
【００３５】
本明細書で使用された、「免疫原性組成物」という用語は、免疫学的応答をもたらしそして治療処置、例えば、がんに対する処置と関連している組成物に関する。
【００３６】
本明細書で使用した「ボルデテラ  ＣｙａＡ」又は「ボルデテラ  アデニル酸シクラーゼ」という用語は、修飾されているか又はされていないＣｙａＡ又はその断片を包含する。修飾は、いくらかの内部アミノ酸の欠失を含むことができる。例えば、ＣｙａＡは、触媒活性を持たなくてもよいが、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体への特異的結合及び触媒ドメインのトランスロケーションのプロセスは影響を受けない。「ボルデテラ」という用語は、ボルデテラ属の種の病原体のアデニル酸シクラーゼタンパク質を指す。該病原体は、ボルデテラ  ペルトゥッシス、ボルデテラ  パラペルトゥッシス又はボルデテラ  ブロンキセプチカであることができる。
【００３７】
本明細書で使用された、「抗原」又は「エピトープ」という用語は、免疫応答を誘発することができるタンパク質を含むペプチドを指す。「異種」という用語は、ＣｙａＡタンパク質の免疫応答とは異なる免疫応答を誘発する、ＣｙａＡタンパク質に結合した抗原の性質を指す。異種抗原又はエピトープは、例えば、ＣｙａＡに融合されているか又はＣｙａＡに化学的に結合されていることができる。
【００３８】
本明細書で使用された「免疫原性」という用語は、哺乳動物、特にヒトにおける免疫応答を誘発することができるというタンパク質の特徴を指す。「免疫応答」という用語は、例えばＣＴＬ応答及び／又はＴヘルパー応答の如き免疫系の細胞により引起される多くの効果を指し、そして本発明に関しては、腫瘍特異的細胞傷害性リンパ球の活性化を含むが、それらに限定はされない。本明細書で使用された、「免疫治療」という用語は、免疫応答に頼る疾患の治療を指す。
【００３９】
本発明の組換えタンパク質又はベクターの他に、本発明の免疫原性組成物は、免疫応答の増加及びモジュレーションを可能とするためのアジュバント及び賦形剤を含むことができる。これらのアジュバントは性質において多様である。それらは、例えば、リポソーム、油相、例えば、フロイント型のアジュバントを含むことができ、このフロイント型のアジュバントは、一般に水性相とのエマルションの形態で一般に使用され、又はより普通には、水に不溶性無機塩を含むことができる。これらの無機塩は、例えば、水酸化アルミニウム、硫酸亜鉛、コロイド状水酸化鉄、リン酸カルシウム又は塩化カルシウムを含むことができる。水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）3）は、最も普通に使用されるアジュバントである。
【００４０】
本発明は、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその特異的断片及びペプチドｐＴｙｒ（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ）を含む組換えタンパク質も包含する。該ペプチドは、延長されたフランキング配列を含むことができる。ｐＴｙｒペプチドは、チロシナーゼの３６９〜３７７領域からのメラノーマＨＬＡ*０２０１拘束性エピトープに相当する。ヒトチロシナーゼのアミノ酸３６９〜３７７はＹＭＮＧＴＭＳＱＶであることに留意されたい。しかしながら、チロシナーゼの位置３７１（Ｎ）におけるＡｓｎ残基は、生きている細胞においてこのエピトープのＡｓｐ（Ｄ）に自然に脱アミド化され、その結果インビボでのＣＴＬクローンにより認識された真のエピトープは認識配列ＹＭＤＧＴＭＳＱＶである。
【００４１】
更に、ヒトチロシナーゼのアミノ酸３６０〜３８５の延長されたフランキング配列を有するエピトープは、ＳＳＭＨＮＡＬＨＩＹＭＮＧＴＭＳＱＶＱＧＳＡＮＤＰＩ（Ｎ３７１はＤに転換された）である。
【００４２】
ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ遺伝子に由来するエピトープは、ＶＬＰＤＶＦＩＲＣである（Y Guilloux, et al. A peptide recognized by human cytolytic T lymphocytes on HLA-A2 melanoma is encoded by an intron sequence of the N-acetylglucosaminyltransferase V gene, J.Exp.Med.1996 183: 1173-1183）。Ｇｎｔ−Ｖエピトープは、７４アミノ酸長さのポリペプチドをコードすることができるイントロン配列によりコードされる（H. sapiens DNA for exon encoding for N-acetylglucosaminyltransferase V; Accession #X91652）。更に、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶからの延長されたフランキング配列を有するエピトープは、ＭＶＬＰＤＶＦＩＲＣＶＶＦＣＬである。
【００４３】
本発明は、ボルデテラ  ＣｙａＡ又はその特異的断片及びペプチドｐＧｎＴ−Ｖ（ＶＬＰＤＶＦＩＲＣ）を含む組換え融合タンパク質も包含する。前記ペプチドは、延長されたフランキング配列を含むことができる。ペプチドｐＧｎＴ−Ｖは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ遺伝子のイントロンに由来するＨＬＡ*０２０１拘束性エピトープＮＡ１７−Ａに相当する。
【００４４】
本発明の１つの好ましい態様では、組換えタンパク質は、ＣｙａＡ−Ｔｙｒである。「ＣｙａＡ−Ｔｙｒ」という用語は、実施例１に記載のとおりに調製することができるＨＬＡ*０２０１のチロシナーゼメラノーマエピトープ及びボルデテラ  ペルトゥッシス  ＣｙａＡを含む融合タンパク質を意味する。「ＣｙａＡ−Ｅ５−Ｔｙｒ」という用語は、ＣｙａＡの触媒活性が遺伝子的に不活性化されたＣｙａＡ−Ｔｙｒタンパク質を指す。例えば、実施例１参照。
【００４５】
本発明の他の好ましい態様では、組換えタンパク質は、ＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖである。「ＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖ」という用語は、実施例１に記載のとおりに調製することができるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ遺伝子のイントロンに由来するＨＬＡ*０２０１のＮＡ１７−Ａメラノーマエピトープ及びボルデテラ  ペルトゥッシス  ＣｙａＡを含む融合タンパク質を意味する。「ＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖ」という用語は、ＣｙａＡの触媒活性が遺伝子的に不活性化されたＣｙａＡ−ＧｎＴ−Ｖタンパク質を指す。例えば、実施例1参照。
【００４６】
本発明の更に他の態様では、ＣｙａＡとｐＴｙｒ又はｐＧｎＴ−Ｖとの組換えタンパク質は、ＣｙａＡ−Ｔｙｒ、ＣｙａＡ−ＧｎＴ−Ｖ、ＣｙａＡ−Ｅ５−Ｔｙｒ又はＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖの構造から修飾される。これらの態様の修飾は、組換えタンパク質を含むペプチドを取り囲むアミノ酸の配列でありそして上記したフランキング領域の付加を含むことができる。これらのフランキング配列はプロセッシングを高めることができる。フランキング配列は、抗原を天然には取り囲んでいないが、抗原阻止細胞による抗原プロセッシングを特異的に高める配列であることもできる。
【００４７】
更に他の態様では、組換えタンパク質は、多重同一異種エピトープ(multiple identical heterologous epitopes)を含むことにより修飾されうる。例えば、上記したＴｙｒ又はＧｎＴ−Ｖエピトープ又は他のメラノーマエピトープ。
【００４８】
本発明の更なる態様では、組換えタンパク質は、アデニル酸シクラーゼタンパク質の少なくとも１つの特異的断片、例えば、ヒト及び動物細胞、例えば樹状細胞上のリガンドとして認識されるＣｙａＡ３７３〜１７０６領域又は１１６６〜１２８１領域（これらに限定はされない）及びがん抗原に対して特異的な少なくとも１つのエピトープ、例えば、ｐＴｙ又はＧｎＴ−Ｖ（これらに限定はされない）を含むことができる。
【００４９】
本発明の他の態様では、組換えタンパク質は、１つ以上の腫瘍抗原からの多重エピトープを含むことができる。
【００５０】
本発明の他の態様は、実施例に与えられたＣｙａＡの許容される部位とは異なるＣｙａＡの許容される部位を含む。本発明の試験で使用される組換えタンパク質の抗原部分は、ＣｙａＡアデニル酸シクラーゼタンパク質ＷＯ９３／２１３２４のいかなる許容される部位にも局在化されうる。更に、本発明は、組換えタンパク質におけるＣｙａＡアデニル酸シクラーゼの断片のみを利用する試験及び免疫原性組成物を包含する。（ＥＰＯ１３／２９１４８６．３参照）。
【００５１】
本明細書で使用された、「許容される部位」という用語はアデニル酸シクラーゼ毒素の所望の機能的性質に実質的に影響を与えることなく、即ち、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体に対する特異的結合に必要なドメインに影響を与えることなく、そして触媒ドメインのトランスロケーションのプロセスに影響を与えることなく異種ペプチドを有利に挿入することができる部位に関する。
【００５２】
ボルデテラ  ペルトゥッシス  アデニル酸シクラーゼの許容される部位は、残基１３７〜１３８（Ｖａｌ−Ａｌａ）、残基２２４〜２２５（Ａｒｇ〜Ａｌａ）、残基（２２８〜２２９（Ｇｌｕ〜Ａｌａ）、残基（２３５〜２３６（Ａｒｇ〜Ｇｌｕ）、及び残基（３１７〜３１８（Ｓｅｒ〜Ａｌａ）を含むが、それらに限定はされない。（Sebo et al., 1985参照）。下記の追加の許容される部位も本発明の態様に含まれる：残基１０７〜１０８（Ｇｌｙ〜Ｈｉｓ）、残基１３２〜１３３（Ｍｅｔ〜Ａｌａ）、残基２３２〜２３３（Ｇｌｙ〜Ｌｅｕ）及び３３５〜３３６（Ｇｌｙ〜Ｇｌｎ）及び３３６〜３３７。（一般に、Glaser et al., 1988 ボルデテラ  ペルトゥッシス adenylate cyclase: the gene and the protein, Tokai J. Exp. Clin. Med., 13 Suppl.: 239-52参照）。
【００５３】
本明細書で使用された、「アデニル酸シクラーゼタンパク質の特異的領域」又は「ＣｙａＡアデニル酸シクラーゼの断片」という用語は、タンパク質の腫瘍部分ではないところにあるいくらかのアミノ酸が欠失しており、そしてアデニル酸シクラーゼ毒素の所望の機能的性質が実質的に影響を受けていない、即ち、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体に対する特異的結合に必要なドメイン及び触媒ドメインのトランスロケーションのプロセスが影響を受けていない、タンパク質を含む前記タンパク質の断片に関する。
【００５４】
「腫瘍抗原」又は「がん抗原」という用語は、免疫応答を誘発しそして抗体又はＴ細胞と特異的に反応する腫瘍からのいかなる物質も指す。該物質は、細胞を形質転換して腫瘍を形成する自然発生的な又はウイルス由来のいかなる起源に由来していてもよい。このようなウイルスの例は、ＨＨＶ８、ＨＣＶ及びＨＢＶである。抗原又はエピトープは腫瘍細胞の表面に存在しなければならない。
【００５５】
本明細書で使用された、「抗原に対応するペプチド」という用語は、抗原、エピトープ又は、抗原提示細胞による抗原プロセッシングを特異的に高める天然に存在するか又は非天然に存在するフランキング領域によりフランキングされた(flanked)抗原若しくはエピトープを包含する。
【００５６】
「エピトープ」という用語は、免疫応答を誘発することができる抗原の最小ペプチド配列を指す。
【００５７】
「ペプチド」という用語は、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも６個のアミノ酸を含むアミド結合により連結された一連のアミノ酸を指す。
【００５８】
本発明の免疫原性組成物は、溶液中で、例えばＰＢＳ中で使用されうるがそれらに限定はされず又はアジュバント、例えば明礬と共に使用されうるが、それらに限定はされない。免疫原性組成物は、筋肉内に、皮下に、静脈内に又は皮内に投与することができる。免疫原性組成物は、０．５〜１０mg、好ましくは１〜５mg、１．５〜３mg又は更に好ましくは１．５０mgの量で投与することができる。これらの処置の効果は、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ又はＣＴＬ活性化アッセイ又は他の適切なイムノアッセイによりＩＦＮ−γのレベルをアッセイすることにより監視することができる。
【００５９】
刊行物、即ち、Vordermeier H.Martin et al(Infectin and Immunity, November 2004, p. 6255-2261) 及び Schlecht G, et al(The Journal of Immunology 2004, p.6089-6097)は、診断及び免疫監視のためのボルデテラ属の種（Bordetella sp）の組換えアデニル酸シクラーゼの使用を説明する。
【００６０】
ボルデテラ属の種のアデニル酸シクラーゼは、マウスにおいてＣＤ８＋Ｔリンパ球を特異的に刺戟して保護抗ウイルス及び抗腫瘍免疫をもたらすことができる新規な送達システムを代表する（１６，１７）。ＣｙａＡは、適応免疫(adaptive immunity)の誘発のための強力な非複製性のベクターでありそしてワクチンにおいて有用である。挿入されたエピトープをプロセッシングしそしてヒトＭＨＣ分子と会合させて提示することができるという、本発明に従う証明は、ヒトにおけるこのベクターの使用のための必須の先要件である。
【００６１】
ヒトＨＬＡ*０２０１クラスＩ分子を発現するヒトメラノーマエピトープが存在する組換えＣｙａＡを使用することにより、強い持続するメラノーマ特異的ＣＴＬ応答をＨＬＡトランスジェニックマウスにおいて誘発させることができる。同様な結果が、アデニル酸シクラーゼ活性を欠いた組み換え脱毒素化ＣｙａＡで得られた。ＣｙａＡは、インビボで特異的ＣＴＬ応答を誘発するのに有効なベクターを表す。何故ならば、アジュバントなしで１回の注射の後に、８０%より多くの免疫感作されたＨＨＤマウスがＣｙａＡに挿入されたチロシナーゼエピトープに応答したが、ＩＦＡの存在下にペプチド１００μgの１回の注射の後に、ＨＨＤマウスの２６%のみがこのエピトープに応答するからである（部分的に２６において）。更に、ヒトＤＣは、ヒトＣＴＬへの抗原性ペプチド提示のためのこれらの組換え分子を有効にプロセッシングすることが、驚くべきことに本発明に従って観察された。際立っていることに、組換えＣｙａＡ−Ｔｙｒは、チロシナーゼエピトープをＤＣに送達することにおいて合成ペプチドよりもはるかに有効であった。
【００６２】
組換えウイルスに基づく別の抗原送達システムは、通常、合成ペプチドよりも低いインビトロ提示有効性をもたらす。本発明に従うインビボ及びインビトロ実験からの驚くべき結果は、送達システムとしてのＣｙａＡのパワーを強調し、そして組換えＣｙａＡによる免疫感作後にヒトにおいてＣＴＬ応答が得られうること、かくしてこのベクターにより有効な免疫治療が達成されうることを示す。しかしながら、この研究で試験された２つの組換えＣｙａＡの免疫原性が全く異なっていた。実際に、ＨＨＤマウスにおける強いＣＴＬ応答は、アジュバントの不存在下にＣｙａＡ−Ｔｙｒの１回のみの腹腔内注射により誘発されたが、明礬の存在下で、特異的ＣＴＬ応答を発生させるのに、ＣｙａＡ−ＧｎＴ−Ｖの３回の腹腔内注射が必要であった。ＧｎＴ−Ｖメラノーマエピトープを送達するためのＣｙａＡ−ＧｎＴ−Ｖの弱い有効性がインビトロでも証明された。何故ならば、このベクターと共にインキュベーションされたヒトＤＣは、特異的抗チロシナーゼＣＴＬクローンを有効に刺戟したＣｙａＡ−Ｔｙｒと比較して抗ＧｎＴ−Ｖ−ＣＴＬクローンを不十分に刺激したからである。
【００６３】
この差は、ＣｙａＡ−ＧｎＴ−ＶにグラフトされたＧｎＴ−ＶペプチドがＣｙａＡ−Ｔｙｒに挿入されたチロシナーゼペプチドと比較して、不十分にプロセッシングされたということにより説明することができる。実際に、与えられたエピトープのフランキング領域は、成熟ペプチドのタンパク質分解による発生に影響を与えることが知られており（２７〜２９）、特にサブドミナント(subdominant)及び／又はクリプティック(cryptic)エピトープについて知られている（３０）。ゆえに、ＣｙａＡへのＧｎＴ−Ｖエピトープの分子関連の修飾はＡＰＣによるこのエピトープのプロセッシングの有効性を高めることができるということが予想される。反対に、ＣｙａＡ−Ｔｙｒにおけるチロシナーゼエピトープをフランキングする配列は、その有効なプロセッシングを可能とすると思われる。
【００６４】
更に、ＣｙａＡ−Ｔｙｒは、インビボでのＨＬＡ*０２０１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するのに非常に有効である。何故ならば、アジュバントなしの１回の静脈内免疫感作又は２回の腹腔内注射は、強い特異的ＣＴＬ応答を発生させるのに十分であったからである。これは、ＣｙａＡがＣＤ１１ｂ＋ＤＣ、一次応答を誘発するのに最も強力なＡＰＣを、これらの細胞により発現されるαMβ2インテグリンとのその相互作用の結果として、特異的に標的化するという事実により説明することができる（１４）。かくして、ＣｙａＡは、専門的ＡＰＣの細胞質ゾルＡｇクラスＩ提示経路に抗原を特異的に送達するという各別の性質を有する。
【００６５】
ＣｙａＡ組換えストラテジーの更なる改良も可能である。第一に、同じ組換え分子へのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの多重挿入は、既に成功的に達成されている。実際に、ＬＣＭＶエピトープを含む三つの異なるエピトープを有する組換えＣｙａＡによるマウスの免疫感作は、３つのエピトープの各々に対する特異的ＣＴＬ応答の誘発並びに致死的ＬＣＭＶチャレンジに対する保護をもたらす（３１）。多重メラノーマエピトープを有する脱毒素化されたＣｙａＡは、多重特異的ＣＴＬ応答を誘発するのに良好な代替手段を構成する。更に、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープペプチドの追加の挿入も可能である。確立された腫瘍の撲滅におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の関与は明らかに証明されたけれども（３２）、有効な抗腫瘍応答を誘発するのにＴヘルパー細胞も必要でありうる（３３〜３５）。組換えＣｙａＡは、ＭＨＣクラスＩＩプロセッシング経路にエピトープを送達することができ（３６）、そしてインビボで、特異的Ｔｈ1及びＣＴＬ応答の両方を誘発することができる（３７）。この特徴は、両方の種類のＴ細胞応答が、がん免疫治療に関して顕著に誘発されなければならないワクチン接種ストラテジーのために非常に興味深い。
【００６６】
プラスミドｐＴＲＡＣＥ５−ＧｎＴＶは、λファージＰｒプロモーターの制御下にボルデテラ  ペルトゥッシスからのｃｙａＣ及びｃｙａＡ遺伝子を発現する発現ベクターｐＴＲＡＣＧの誘導体である（ｐＴＲＣＡＧもまたアンピシリン抵抗選択性マーカー及び感熱性λリプレッサーＣｌ857を有する）。ｐＴＲＡＣＥ５−ＧｎＴＶにおいて、ｃｙａＡ遺伝子は、野生型ＣｙａＡのコドン１８８と１８９との間にジペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎの挿入（アデニル酸シクラーゼ活性の不活性化をもたらす）及びＣｙａＡのコドン２２４と２４０との間に挿入された下記のペプチド配列ＰＡＳＶＬＰＤＶＦＩＲＣＧＴをコードするＤＮＡ配列の挿入により修飾される。下線を付したペプチド（ＶＬＰＤＶＦＩＲＣ）は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ遺伝子に由来するＨＬＡ−Ａ２拘束性メラノーマエピトープＮＡ１７−Ａに相当する（G. Dadaglio, et al. (2003) Recombinant adenylate cyclse of ボルデテラ  ペルトゥッシス induces CTL responses against HLA-A2-restricted melanoma epitope.Int.Immuno.)。プラスミドＸＬ１／ｐＴＲＡＣＥ５−ＧｎＴＶは、受託番号Ｉ−３１１１で２００３年１０月１６日にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託された。
【００６７】
プラスミドｐＴＲＡＣＥ−５−Ｔｙｒｏｓ３６９は、λファージＰｒプロモーターの制御下にボルデテラ  ペルトゥッシスからのｃｙａＣ及びｃｙａＡ遺伝子を発現する発現ベクターｐＴＲＡＣＧの誘導体である（ｐＴＲＣＡＧもまたアンピシリン抵抗選択性マーカー及び感熱性λリプレッサーＣｌ857も有する）。ｐＴＲＡＣＥ５−Ｔｙｒｏｓ３６９において、ｃｙａＡ遺伝子は、野生型ＣｙａＡのコドン１８８と１８９との間にジペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎの挿入（アデニル酸シクラーゼ活性の不活性化をもたらす）及びＣｙａＡのコドン２２４と２４０との間に挿入された下記のペプチド配列ＰＡＳＹＭＤＧＴＭＳＱＶＧＴＲＡＲＬＫをコードするＤＮＡ配列の挿入により修飾される。下線を付したペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶは、チロシナーゼのアミノ酸配列３６９〜３７７に対応する。プラスミドＸＬ１／ｐＴＲＡＣＥ５−Ｔｙｒｏｓ３６９は、受託番号Ｉ−２６７９で２００１年５月３１日にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託された。
【００６８】
使用された略号は下記のとおりである：ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔリンパ球；ＤＣ：樹状細胞；ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞；ＣｙａＡ：ボルデテラ  ｓｐのアデニル酸シクラーゼ；Ｔｙｒ：チロシナーゼ；ＧｎＴ−Ｖ；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ；ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ＩＦＮ：インターフェロン；ｉ．ｐ：腹腔内；ｉ．ｖ：静脈内。
【００６９】
本発明は下記の実施例において更に詳細に説明されるであろう。
実施例１
物質及び方法
マウス。ＨＨＤマウスは、Ｈ−２Ｄb（Ｄ）のα３膜貫通及び細胞質ドメインに連結されたＨＬＡ*０２０１のα１（Ｈ）及びα２（Ｈ）ドメインを含むＨＨＤ導入遺伝子（該α１ドメインはβ２ミクログロブリンに連結されている）を発現するＨ−２Ｄ-／-β２ｍ-／-ダブルノックアウトマウスである。かくして、ＨＨＤマウスにより発現されたＭＨＣクラスＩ分子のみが、修飾されたＨＬＡ*０２０１分子である（１９）。ＨＨＤマウスを繁殖させそしてInstitute Pasteurの動物施設に収容した。
【００７０】
ペプチド。チロシナーゼの３６９〜３７７領域からのメラノーマＨＬＡ*０２０１拘束性エピトープに対応する合成ペプチドｐＴｙｒ（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ）（２０、２１）及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ遺伝子のイントロンに由来するＨＬＡ*０２０１拘束性エピトープＮＡ１７−Ａに対応するｐＧｎＴ−Ｖ（ＶＬＰＤＶＦＩＲＣ）（３）をＮｅｏｓｙｓｔｅｍ（Strasbourg, France）から購入した。
【００７１】
メラノーマエピトープを有する組換えボルデテラ  ペルトゥッシス  アデニル酸シクラーゼ毒素及びトキソイドの構築。組換えＣｙａＡ毒素、ＣｙａＡ−Ｔｙｒは、ＣｙａＡの残基２２４と２２５との間に遺伝子的に挿入された１４アミノ酸長さのポリペプチド配列（ＰＡＳＹＭＤＧＴＭＳＱＶＧＴ、アミノ酸に対する一文字コード）を有する。この配列は、チロシナーゼに由来するＨＬＡ*０２０１拘束性メラノーマエピトープ（アミノ酸３６９〜３７７、上記した下線を付した配列）の単一コピーを含有する。組換えＣｙａＡ毒素ＣｙａＡ−ＧｎＴ−Ｖは、同じ位置に１４アミノ酸長さの（ＰＡＳＶＬＰＤＶＦＩＲＣＧＴ）インサートを有しそしてＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ遺伝子に由来するＨＬＡ*０２０１拘束性メラノーマエピトープＮＡ１７−Ａ（上記した下線を付した）の単一コピーを含有する。
【００７２】
これらの組換え毒素は、指示されたポリペプチド配列をコードする適切な合成二本鎖オリゴヌクレオチドのＮｈｅＩ及びＫｐｎＩ制限部位間の挿入により修飾された、ｐＴＲＡＣＧプラスミド（２２）の誘導体である発現ベクターを使用することによりＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬＲ（Novagen）において産生された。標準プロトコールに従って行われたすべてのＤＮＡ操作のためにＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ(Stratagene)を使用した。以前に記載された通り（２３）、ＤＥＡＥ−セファロース及びフェニルセファロースクロマトグラフィーを含む２段階手順により封入体から均一性となるように組換えタンパク質を精製した。
【００７３】
組換え毒素ＣｙａＡ−Ｔｙｒ及びＣｙａＡ−ＧｎＴ−Ｖは酵素的に活性であり、したがつて細胞傷害性である。それぞれ、ＣｙａＡ−Ｔｙｒ及びＣｙａＡ−ＧｎＴ−Ｖの脱毒素化された変異体である、組換えトキソイドＣｙａＡ−Ｅ５−Ｔｙｒ及びＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖは酵素的に不活性である。それらは、触媒部位の重要な領域内にジペプチドの挿入の結果としてｃＡＭＰを合成することができない（２３）。ＣｙａＡ−Ｅ５−Ｔｙｒ及びＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖトキソイドは、ｐＴＲＡＣＥ５プラスミドの誘導体である発現ベクターを使用することによりＥ．ｃｏｌｉにより産生された：このプラスミドは、ｃｙａＡ  ＤＮＡ配列の５‘部分に位置したＥｃｏＲＶ部位におけるヘキサヌクレオチドＣＴＧＣＡＧの挿入により得られた。これは、ＣｙａＡのＡｓｐ１８８とＩｌｅ１８９との間にジペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎのインフレーム挿入(in-frame insertion)をもたらす。上記した同じ合成二本鎖オリゴヌクレオチドを、ｐＴＲＡＣＥ５のＮｈｅＩ及びＫｐｎＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＴＲＡＣ−Ｅ５−Ｔｙｒ及びｐＴＲＡＣ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖを創生した。組換えＣｙａＡ−Ｅ５−Ｔｙｒ及びＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖトキソイドを述べられたとおり（２３）均一となるように精製した。
【００７４】
すべての精製された組換え毒素及びトキソイドは、ＳＤＳゲル分析により判定して９０%より高い純度であった。毒素濃度は、１４２，０００M-1cm-1の分子吸光計数を使用して２８０nmでの吸収から分光法により決定した。
【００７５】
オリゴヌクレオチド合成及びＤＮＡ配列決定は、Genaxis(France)により行った。醗酵層での培養は、Institut Pasteurからの醗酵サービス施設(Service des Fermentations)により行った。
【００７６】
マウス免疫感作。６〜１０週齢の雌のＨＨＤを、明礬１mgの存在下又は不存在下にＣｙａＡ又はメラノーマエピトープを有する組換えＣｙａＡ５０μgの２１日間隔での２又は３回腹腔内注射により免疫感作させた。いくらかの実験では、マウスをＰＢＳ中の組換えＣｙａＡ５０μgの１回の静脈内注射により免疫感作させた。同じ条件で脱毒素化された組換えＣｙａＡ−Ｅ５を使用した。最後の注射の３又は５ヶ月後に脾臓を取り出す長く続く応答の分析を除いては、最後の注射の７日後に脾臓を外科的に取り出した。
【００７７】
インビトロ細胞傷害性アッセイ。免疫感作されたマウスからの脾臓細胞を、完全培地（１０%ウシ胎仔血清、５×１０-5M２−メルカプトエタノール、１００U/mlペニシリン、１００μg/mlストレプトマイシン及び２０mMＨｅｐｅｓを補充されたＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含有するＲＰＭＩ１６４０倍地）中で同系の照射されたナイーブ脾臓細胞(syngeneic irradiated naive spleen cells)の存在下にプライミングエピトープに対応するｐＴｙｒ又はＧｎＴ−Ｖペプチド１０μg/mlとインビトロで５日間刺激した。これらのエフェクター細胞の細胞傷害性活性を、標的細胞として関連したペプチド（relevant peptides)をロードされたＨＨＤトランスフェクションされたＴＡＰ-／-ＲＭＡ−Ｓ細胞（ＲＡＭ−Ｓ−ＨＨＤ）に関する４−ｈ51Ｃｒ放出アッセイで試験した。51Ｃｒ標識は下記のようになされた：細胞傷害性試験の１日前に、ＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞を、２０mMＨｅｐｅｓを補充された、７%ＣＯ2平衡化されたＲＰＭＩ１６４０倍地中で室温で一夜インキュベーションした。次いで、細胞を関連したペプチド２０μg/mlを伴い又は伴わずに室温で3時間インキュベーションし、1回洗浄し、そして１００μＣｉの51Ｃｒで３７℃で１時間放射性標識した。
【００７８】
種々のエフェクター対標的比を使用しそしてすべてのアッセイを二重に(in duplicate)行った。各ウエルの上清中に放出された放射能を測定した。特異的溶解の百分率は、１００×（実験放出−自然に起こる放出）／（最大放出−自然に起こる放出）として計算した。１０%トリトンＸ−１００を標的細胞に加えることにより最大放出を発生させ、そして自然に起こる放出は培地のみの中でインキュベーションされた標的細胞で得られた。マウスは、少なくとも２０%の特異的溶解が最も高いＥ／Ｔ比で観察されるとき応答者であると考えられた。結果を、グループ当たり応答者マウスの平均値±ＳＤとして表現する。無関係なペプチドでインビトロで刺激された免疫感作されたマウスからの脾臓細胞では、特異的ＣＴＬ活性は得られなかった。
【００７９】
ヒト樹状細胞。ヒト樹状細胞は下記のとおり接着性単球に由来した：末梢血単核細胞を、予めLymphoprep（Nycomed Pharma, Oslo, Norway）１５mlと２２００rpmで３０秒間遠心されたLeucosep管（Greiner, Frickenhausen, Germany）での遠心によりＨＬＡ*０２０１ヘモクロマトーシス患者ＬＢ２０５０から得られたバフィーコート（buffy coat）から単離した。これらの管を室温で２０分間２，２００rpmで遠心しそして血漿を含有する上部を捨てた。ＰＢＭＣを含有する中間相を回収しそして１mMＥＤＴＡを有する冷リン酸塩緩衝剤中で少なくとも３回洗浄して残りの血小板を除去した。次いでＰＢＭＣを、アミノ酸（Ｌ−アルギニン１１６μg/ml、Ｌ−アスパラギン３６μg/ml、Ｌ−グルタミン２１６μg/ml）、抗生物質及び１０%ウシ胎仔血清で補充されたＲＰＭＩ１６４０（以後培養培地と呼ぶ）中に２×１０6細胞／cm2の濃度で培養フラスコ中で１時間放置し接着させた。非接着性細胞をすて、接着性細胞を培地２０mlで注意深く２回洗浄しそして２００U/mlのヒトＩＬ−４及び７０ng/mlヒトＧＭ−ＣＳＦと共に培養培地中でインキュベーションした。２日目及び４日目に、培地５mlを除去しそしてＧＭ−ＣＳＦ７００ngを含有する１０mlを加えた。ＩＬ−４も、フラスコの全容積について２００U/mlで補充された。細胞を５日と７日の間に使用した。
【００８０】
ヒトＣＴＬクローン。チロシナーゼのＨＬＡ*０２０１拘束性Ｔｙｒエピトープ（位置３６９〜３７７）に対して指向されたＣＴＬクローンＩＶＳ−Ｂは以前に記載された（２４）。このクローンを、５０U/mlのヒトＩＬ−２、２μg/mlのｐＴｙｒペプチドでパルスされた、照射されたＨＬＡ*０２０１トランスフェクションされたＭＺ２−ＭＥＬメラノーマ細胞及びフィーダー細胞としての照射されたＬＧ２−ＥＢＶ細胞、により毎週刺激した。ＧｎＴ−Ｖに由来するＨＬＡ*０２０１拘束性エピトープに対して特異的なＣＴＬクローンＣＭＵ５７９  ６／３を、最近記載された方法（２５）に従って健常なドナーの血液から得た。簡単に言えば、ＰＢＭＣを、抗原性ペプチドｐＧｎＴ−Ｖ、ヒトＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−７で２週間刺激した。１３日目に、ＰＢＭＣを、ｐＧｎＴ−Ｖペプチドと共に折りたたまれたＨＬＡ*０２０１テトラマーで染色した。フローサイトメトリーを使用してテトラマーポジティブリンパ球をクローニングした。それらを、前記ペプチドでパルスされた、照射された同種ＨＬＡ*０２０１ポジティブＥＢＶ−形質転換されたＢ細胞、照射された同種ＰＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−７で２週間刺激し、次いで照射されたＨＬＡ*０２０１ポジティブペプチド−パルスされた同種腫瘍細胞及び照射された同種ＥＢＶ−Ｂ細胞による毎週の刺激により維持した。両ＣＴＬクローンを、ヒト血清１０%、アミノ酸及び抗生物質を補充されたＩｓｃｏｖｅの培地(iscove's medium)中に維持した。
【００８１】
ヒトＣＴＬクローンのインビトロ刺激アッセイ。刺激アッセイのために、１０，０００未熟樹状細胞をＸ−Ｖｉｖｏ１０培地(Whittaker Bioproducts, Walkersville,USA)
２５μl中でＵ底部マイクロプレート中に播種した。種々の濃度でＸ−Ｖｉｖｏ１０培地中に希釈されたＣｙａＡ調製物２５μlをウエルに加えた。３０分のインキュベーションの後に、対応するＣＴＬクローンを、これらの細胞（１０4抗チロシナーゼＣＴＬクローンＩＶＳ−Ｂ又は１０4抗ＧｎＴ−Ｖ  ＣＴＬクローンＣＭＵ５７９６／３を含有するＸ−ｖｉｖｏ培地７５μl）及びＩＬ−２（２５U/mlの最終濃度で）と共にインキュベーションした。上清を２０時間後に集めそしてそれらのＩＦＮ−γ含有率をＥＬＩＳＡ（Biosource International, Carmarillo, CA）により決定した。種々の脱毒素化された組換えトキソイドとインキュベーションされたＤＣのＣＴＬクローンを刺激する能力を制御するために、それらは、関連した抗原ペプチドを外因的にロードされ、関連したＣＴＬクローンと共にインキュベーションされそしてＩＦＮ−γの産生を同様に評価された（データは示されていない）。
【００８２】
実施例２
ＨＬＡ*０２０１拘束性メラノーマエピトープを有する組換えＣｙａＡによるＨＨＤトランスジェニックマウスの免疫感作によるメラノーマ特異的ＣＴＬ応答の誘発
ＣｙａＡ毒素がヒト腫瘍抗原に対する特異的ＣＴＬ応答を誘発することができるかどうかを決定するために、ＨＬＡ*０２０１拘束性ヒトメラノーマエピトープを有する２つの組換えＣｙａＡを構築した。第１の組換えＣｙａＡは、チロシナーゼ抗原からのエピトープ３６９〜３７７を発現し（ＣｙａＡ−Ｔｙｒ）、そして第２の組換えＣｙａＡは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶのイントロンに由来するエピトープＮＡ１７−Ａを発現する（ＣｙａＡ−ＧｎＴ−Ｖ）。インビボでこれらの２つのエピトープに対するＣＴＬを誘発する組換えＣｙａＡの能力をＨＨＤマウスで評価したが、このＨＨＤマウスは、ヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ*０２０１に対してトランスジェニックでありそして腫瘍ペプチドに対してＨＬＡ*０２０１拘束性ＣＴＬ応答を発生することが示された（２６）。ＨＨＤマウスは、明礬を伴う組換えＣｙａＡ５０μgの３回の腹腔内注射により免疫感作された。相当するペプチドによる脾臓細胞のインビトロ刺激の後に、ＨＨＤ―マウスと同じ導入遺伝子を発現する、ペプチド−パルスされたＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞を標的として使用する、クロム放出アッセイにおいてＣＴＬ応答を試験した。図１に示されたとおり、Ｔｙｒ又はＧｎＴ−Ｖエピトープを有する両組換え毒素は、関連したペプチドをロードされた標的細胞に対する強いＣＴＬ応答を誘発する。これらのＣＴＬ応答は、抗原特異的であった。何故ならば、ペプチドで感作された標的細胞のみが殺され、そして無関係のペプチドをロードされた標的細胞に対するＣＴＬ活性は検出されなかったからである（データは示されていない）。予想されるとおり、野生型ＣｙａＡで免疫感作されたマウスで有意なＣＴＬ活性は観察されなかったが、これは、特異的ＣＴＬ応答の誘発は、組換えＣｙａＡに挿入されたエピトープによるインビボプライミング（in vivo priming）を必要とすることを示す。
【００８３】
次いで、アジュバントとして明礬を伴うか又は伴わない種々の免疫感作プロトコール使用して、ＣｙａＡ−ＴｙｒによるＣＴＬ応答の誘発を分析した。図２Ａ及びＢに示されたとおり、ＣｙａＡ−Ｔｙｒの２回の腹腔内注射は、明礬の不存在下ですらチロシナーゼエピトープに対する特異的ＣＴＬ応答を誘発させるのに十分であった。静脈内経路を使用するアジュバントなしのＣｙａＡ−Ｔｙｒ５０μgの１回の注射の後にも、強い特異的ＣｙａＡ−Ｔｙｒ応答の誘発が観察された（図２Ｃ）。予想されるとおり、組換えＣｙａＡ−Ｔｙｒで免疫感作されたマウスからのペプチドパルスされた標的細胞及び脾臓細胞を使用するときにのみ、これらのＣＴＬ応答が観察されたが、これはこの応答の特異性を示している。これらの結果は、チロシナーゼメラノーマエピトープに対する特異的ＣＴＬ応答を誘発させるためのＣｙａＡ−Ｔｙｒの高い有効性を証明する。しかしながら、免疫感作の同様な条件（明礬を伴うか又は伴わないで２又は１回腹腔内注射）を使用して、組換え毒素ＣｙａＡ−ＧｎＴ−Ｖでは特異的ＣＴＬ応答は観察されなかったが、これは、この毒素がＣｙａＡ−Ｔｙｒよりも特異的ＣＴＬ応答を発生させるのに有効より少ないことを示す（データは示されていない）。しかしながら、静脈内経路により、ＣｙａＡ−ＧｎＴ−Ｖの１回の注射は強いＣＴＬ応答を誘発するのに十分であった（図２Ｅ）。
【００８４】
最後に、触媒部位へのジペプチドの挿入の後アデニル酸シクラーゼ活性を欠いたチロシナーゼ又はＧｎＴＶエピトープを有するＣｙａＡの遺伝子的に脱毒素化された突然変異体により誘発されたＣＴＬ応答を分析した。これらの脱毒素化された分子で免疫感作されたＨＨＤマウスは、対応するエピトープを有するＣｙａＡの毒性形態で免疫感作されたマウスの応答に匹敵しうる、チロシナーゼ及びＧｎＴ−Ｖエピトープの両方に対する特異的ＣＴＬ応答を発生させた（図２Ｄ、２Ｆ）。これらの結果は、ＨＬＡ*０２０１拘束性ＣＴＬ誘発は、触媒活性とは独立であることを示す。何故ならば、それはＢＡＬＢ／ＣにおけるＬＣＭＶからのウイルスエピトープについて明らかに証明されたからである（１８）。
【００８５】
実施例３
組換えＣｙａＡ−Ｔｙｒは長く続く記憶ＣＴＬ応答を誘発する
メラノーマエピトープを有する組換えＣｙａＡにより誘発されたＣＴＬ応答の持続を分析するために、ＨＨＤマウスは、明礬の存在下にＣｙａＡ−Ｔｙｒ５０μgの２回の腹腔内注射を受け取った。最後の注射の３ヶ月及び５ヶ月後に、免疫感作されたマウスからの脾臓細胞をペプチドｐＴｙｒで５日間にわたりインビトロで刺激し、次いでペプチドパルスされたＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ標的細胞に対するそれらの細胞傷害性活性を試験した。図３に示されたとおり、ＣｙａＡ−Ｔｙｒは、長く続く特異的ＣＴＬ応答を誘発した。何故ならば、特異的細胞傷害性活性は、すべてのマウスにおいて、最後の注射の３ヶ月後に検出されることができ、そして１つの動物においては５ヶ月後ですら検出されることができたからである。
【００８６】
実施例４
ＣｙａＡに挿入されたＨＬＡ*０２０１拘束性ペプチドは、ＨＬＡ*０２０１ヒトＤＣによりプロセッシングされそして提示される
組換えＣｙａＡによる特異的ＣＴＬ応答のインビボ誘発は、挿入されたエピトープがマウスＡＰＣにより有効にプロセッシングされそして提示されることを示す。しかしながら、ヒトＡＰＣもまたＣｙａＡに挿入されたこれらのＨＬＡ*０２０１拘束性エピトープをプロセッシングしそして提示することができることを証明することは重要である。ＤＣは一次Ｔ細胞応答を誘発させるのに最も重要なＡＰＣであるので、組換えＣｙａＡとインキュベーションされたＨＬＡ*０２０１＋ＤＣの、組換えＣｙａＡに挿入されたエピトープに対して特異的なヒトＣＴＬクローンを刺激する能力を決定した。これらの実験では、ヒトＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下にＨＬＡ*０２０１＋接着性ＰＢＭＣからインビトロで発生させた。次いで増加する用量のＣｙａＡ−Ｅ５−Ｔｙｒ、ＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖ又はコントロールＣｙａＡ−Ｅ５を加えそして抗原性ペプチドの提示を、処理されたＤＣの関連したＣＴＬを刺激する能力をＩＦＮ−γ産生アッセイにおいて測定することにより、評価した。
【００８７】
図４Ａに示されたとおり、ＣｙａＡ−Ｅ５−ＴｙｒとインキュベーションされたヒトＤＣは、チロシナーゼ特異的ＣＴＬクローンによるＩＦＮ−γの高い産生を誘発したが、これは、チロシナーゼエピトープが有効にプロセッシングされそしてＨＬＡ*０２０１分子と会合して提示されることを示す。この認識の特異性は、２つの無関係なＣＴＬクローンの刺激の欠如（データは示されていない）により及びコントロールのトキソイドＣｙａＡ−Ｅ５で処理されたＤＣによるチロシナーゼ特異的クローンの刺激の欠如（図４Ａ）により確証された。チロシナーゼエピトープの提示は、３０nMまでのＣｙａＡ−Ｔｙｒの用量に比例していた。これらの条件下に、処理されたＤＣの低い認識により及び外因的にロードされた合成ペプチドを提示するそれらの減少した能力（データは示されていない）により示されたとおり、より高い用量はＤＣに対して毒性であると思われた。
【００８８】
送達システムとしてＣｙａＡを使用する抗原提示の相対的有効性を評価するために、同様なＤＣに対してパルスされたチロシナーゼ合成ペプチドの滴定曲線も実行された。図４Ａに示されたとおり、ＣｙａＡ−Ｔｙｒは、ＤＣによるエピトープの提示を誘発するのに合成ペプチドよりも１０倍までより高く有効であった。
【００８９】
ＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−ＶとインキュベーションされたヒトＤＣは、ペプチドｐＧｎＴ−ＶとインキュベーションされたＤＣと比較して、ＧｎＴ−Ｖ特異的ＣＴＬクローンによるＩＦＮ−γの弱いが再現性のある産生を誘発した（図４Ｂ）。この結果は、ヒトＤＣが中程度の有効性ではあるとしても、ＣｙａＡに挿入されたＧｎＴ−Ｖエピトープを提示することができることを示す。
【００９０】
要約すると、これらの結果は、ヒトＤＣの、ＣｙａＡに挿入されたヒトエピトープをプロセッシングしそして提示する能力を明らかに証明する。
【００９１】
実施例５
応答を誘発しないＣｙａＡ毒素構築
エピトープｇｐ１００〜２８０を含みそしてＧＰ１００メラノーマ関連腫瘍抗原を形成した挿入された配列ＹＬＥＰＧＴＶＴＡを含むＣｙａＡ−Ｍｅｌ２１は、ＣＴＬ応答を含まない。同様に、エピトープＣＥＡ５７１〜５７９を含みそしてがん胎児性抗原からの挿入されたＹＬＳＧＡＮＬＮＬを有するＣｙａＡ−ＣＥＡ13は、ＣＴＬ応答を誘発しない。これらの毒素のいずれもＨＨＤマウスにおける挿入されたエピトープに特異的なＣＴＬ応答を誘発しない。更に、いくらかのヒト樹状細胞は、挿入されたエピトープＣｙａＡ−Ｍｅｌ２１（エピトープｇｐ１００〜２８０）をヒトＣＴＬクローンに提示することができない。ゆえに、この毒素は、多分ヒトにおいても有効ではない。これらの２つの毒素、ＣｙａＡ−Ｍｅｌ２１及びＣｙａＡ−ＣＥＡ１３は、ＣｙａＡ−Ｔｙｒ及びＣｙａＡ−ＧｎＴＶと同一であるが、挿入された配列においてのみ異なる。故に、エピトープのみが異なりそしてそれ故ＣｙａＡ−Ｔｙｒ及びＣｙａＡ−ＧＮＴＶに対する応答はエピトープ特異的である。
【００９２】
最後に、メラノーマタンパク質Ｍａｇｅ１０からの挿入された配列ＧＬＹＤＧＭＥＨＬを有するＭａｇｅ  Ａ１０／Ａ２エピトープを含むＣｙａＡ−Ｍａｇｅ毒素は、ＨＨＤマウスにおいて非常に良好なＣＴＬ応答を誘発するが、上記したプロトコールの下でヒトにおいて有効ではない。故に、マウスにおけるポジティブ応答は、必ずしもヒトにおけるポジティブな応答を示さない。一般に、ヒト応答はエピトープ及び種特異的である。
【００９３】
参考文献
下記の参考文献が本明細書で引用される。各参考文献の全体の開示は、本明細書で頼りとされそして本明細書に引用により組み込まれる。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ＨＬＡ*０２０１拘束性メラノーマエピトープを有する組換えＣｙａＡによるＣＴＬ応答のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）誘発を示す。ＨＨＤマウスは０、２１及び４２日目に１mg明礬の存在下に５０μgのコントロールＣｙａＡ毒素（●、○）又はメラノーマエピトープを有する組換えＣｙａＡ毒素（■、□）（Ａ、ＣｙａＡ−Ｔｙｒ；Ｂ，ＣｙａＡ−ＧｎＴ−Ｖ）の腹腔内注射を受け取った。最後の注射の７日後に、免疫マウスからの脾臓細胞を、照射された同系脾臓細胞の存在下に、プライミングペプチドｐＴｙｒ（Ａ）又はｐＧｎＴ−Ｖ（Ｂ）でインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で刺激した。これらのエフェクター細胞の細胞傷害性活性をそれぞれのペプチドでパルスされ（●、■）又は培地のみとインキュベーションされた（○、□）51Ｃｒ標識されたＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ標的細胞で測定した。データは二重(duplicates)の平均値を表す（ＳＤ＜１０%）。象限(quadrants)は、試験したマウスの数に対するポジティブマウスの数を表し、そして曲線は３つの実験からのグループ当たりの応答者マウスの平均値±ＳＤを表す。
【図２】免疫感作の種々の経路を使用するメラノーマエピトープを有する組換えＣｙａＡによるメラノーマ特異的ＣＴＬ応答の誘発を示す。パネルＡ及びＢ：ＨＨＤマウスを、１mg明礬の存在下に（Ａ）又は不存在下に（Ｂ）５０μgの野生型ＣｙａＡ（●、○）又は組換えＣｙａＡ−Ｔｙｒ（■、□）により０及び２１日目に腹腔内に２回免疫感作させた。パネルＣ及びＥ：ＨＨＤマウスをアジュバントの不存在下に５０μgのコントロール野生型ＣｙａＡ（●、○）又は組換えＣｙａＡ−Ｔｙｒ（■、□）又は組換えＣｙａＡ−ＧｎＴ−Ｖ（■、□）（Ｅ）により１回の静脈内注射により免疫感作させた。パネルＤ及びＦ：ＨＨＤマウスをアジュバントの不存在下に５０μgの脱毒素化されたＣｙａＡ−Ｅ５（●、○）又は脱毒素化された組換えＣｙａＡ−Ｅ５−Ｔｙｒ（■、□）（Ｄ）又は組換えＣｙａＡ−Ｅ−ＧｎＴＶ（■、□）（Ｆ）により１回の静脈内注射により免疫感作させた。最後の注射の７日後に、免疫マウスからの脾臓細胞を、照射された同系脾臓細胞の存在下に、プライミングペプチドでインビトロで刺激した。細胞傷害性活性を、プライミングペプチドでパルスされた（●、■）又は培地のみとインキュベーションされた（○、□）51Ｃｒ標識されたＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ標的細胞で測定した。結果は２〜４実験からの累積データを示す。象限は、試験したマウスの数に対するポジティブマウスの数を表し、そして曲線はグループ当たりの応答者マウスの平均値±ＳＤを表す。毒素及び脱毒素化されたＣｙａＡによる免疫感作後に得られた結果は、ｔ検定を使用して統計的に異ならない。
【図３】ＣｙａＡ−Ｔｙｒによるマウスの免疫感作は長く続く特異的記憶ＣＴＬ活性を誘発することを証明する。ＨＨＤマウスを、１mg明礬の存在下に５０μgの野生型ＣｙａＡ（●、○）又は組換えＣｙａＡ−Ｔｙｒ（■、□）により０及び２１日目に腹腔内に２回免疫感作させた。最後の注射の３ヶ月後（Ａ）又は５ヵ月後（Ｂ）に、脾臓を取り出し、そして特異的ＣＴＬ活性を、ペプチドｐＴｙｒでパルスされた（●、■）又は培地のみとインキュベーションされた（○、□）51Ｃｒ標識されたＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ標的細胞で、図１に記載のとおりにインビトロ刺激した後に測定した。象限は、試験したマウスの数に対するポジティブマウスの数を表す。曲線は、１つの実験からのグループ当たりの応答者マウスの平均値±ＳＤを表す。
【図４】組換えＣｙａＡ−Ｅ５−Ｔｙｒ又はＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖとインキュベーションされたヒト樹状（ＤＣ）細胞によるヒト特異的ＣＴＬクローンの刺激を示す。ＣｙａＡの細胞傷害性により、脱毒素化された組換えＣｙａＡのみをインビトロで試験した。ヒト単球由来の未熟ＨＬＡ*０２０１ＤＣを、ＣｙａＡ−Ｅ５（Ｏ）、組換えＣｙａＡ−Ｅ５−Ｔｙｒ（●）（Ａ）、ＣｙａＡ−Ｅ５−ＧｎＴ−Ｖ（●）（Ｂ）又は関連した抗原性ペプチド（▲）とインキュベーションし、そしてＡＰＣ（抗原提示細胞）として使用して抗チロシナーゼＣＴＬクローンＩＶＳ−Ｂ（Ａ）又は抗ＧｎＴ−Ｖ  ＣＴＬクローンＣＭＵ５７９  ６／３（Ｂ）を刺激した。ＣＴＬクローンによるＩＦＮ−γの分泌を、ＥＬＩＳＡにより評価した。結果は、二重ウエル(duplicate wells)からの上清中に放出されたＩＦＮ−γの平均濃度として表されそして３つの独立した実験を代表する。平均の標準誤差を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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