(57)【要約】  区画（１５，２０）を分離する選択的透過性膜（２５）を備えた多目的仕切付き細胞培養装置（１０）は、従来式装置に対して多くの特性を備えている。本装置は、回転しながら、又は静置した状態で、高密度細胞培養、共培養及び試料透析が行えるように構成される。また、本装置は、区画と区間との間を液体が絶えず移動可能に構成される。他の膜式細胞培養及び生体処理装置では見出されない多岐に亘る特性として、細胞能力の向上、細胞分泌生成能力の向上、細胞及び生成物のより高い密度、培地収容容積の増大、外因性成長因子使用量の最小限化、標準的な細胞培養器具及びプロトコルとの適合性、スケールアップ効率の増加、回転又は静置時に機能する能力、ポンプを要しない灌流能力及びより効率的な試料透析などが挙げられる。
2007510433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
装置ハウジングと、
半透膜から構成される基礎培地区画と、
細胞培養区画と、
基礎培地区画アクセスポートと、
細胞培養区画アクセスポートとを備え、
前記基礎培地区画は、前記細胞培養区画の全長よりも短くされている仕切装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を成長させ、細胞を処理し、試料を透析する装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
半透膜を備える装置は、細胞培養分野に様々な用途を有している。これらの用途として、高密度細胞培養、共培養、細胞感染及び試料透析などが挙げられる。しかしながら、既存の装置では、それらの効率及び有用性が制限されるといった欠点がある。
【０００３】
高密度細胞培養のための静置式膜装置が提案され、市販化されている。ウィルソンらの米国特許第５，６９３，５３７号に関連して、インテグラ・バイオサイエンシズ社からセルラインがフラスコの形態で製品化されており、１０，０００分子量をカットオフ（ＭＷＣＯ）する半透過性の透析膜により分離されて、二つの室に仕切られている。これらは使い易く、小規模での製造には有利である。しかし、これらの装置では、シート状の透析膜を利用しているため、効率良くスケールアップすることができない。細胞の数を増加させるには、透析膜の表面積を広くしなければならない。膜がシート状であるため、装置の設置面積が比較的大きくならざるを得ない。設置面積が大きな装置によれば、細菌培養器（インキュベータ）内の空間が効率良く使用できない。更に、透析膜の表面積が大きくなると、裂ける可能性が増大してしまう。別の欠点として、装置内に存在する培地の高さが制限されることがあり、装置内の増殖した細胞に栄養を供給するにはより多くの培地が必要とされ、そのため、装置の設置面積を増加させなければならない。フォーグラーによる米国特許第４，７４８，１２４号と、ベーダーによる米国特許第６，４６８，７９２号とには、仕切付きガス透過性装置が導入されている。フォーグラーの米国特許には、区画するための透析膜が開示される一方、ベーダーの米国特許では、多孔性の膜を利用している。しかしながら、これらは、前記のセルラインの場合と同様に、スケールアップの制限を受ける。
【０００４】
半透膜で装置を仕切ることによりローラーボトルを改良する試みが行なわれてきた。しかし、それらの試みには欠点があり、市場では、商業的な反響がほとんど得られなかった。その欠点としては、非標準的なローラー機構の必要性、ピペットとの連動不能性、接着性培養における一般的な材料との不適合性、及び装置内に存在可能な培地量が限られてスケールアップが制限される、といった点が挙げられる。
【０００５】
ファルケンベルグらによる米国特許第５，４４９，６１７号、及び米国特許第５，５７６，２１１号には、透析膜により仕切られたガス透過性ローラーボトルが記載されている。透析膜により栄養培地から細胞と細胞分泌生成物とを分離することによって、細胞、及び細胞分泌生成物の密度を増加させることができる。そのボトルに収容される培地の最大容積は３６０ｍｌであり、そのうちの６０ｍｌは細胞区画内に存在し、３００ｍｌは栄養区画内に存在する。そのスケールアップ性能は、３６０ｍｌの培地容量によって制限され、これにより、スケールアップするためには装置の数が多くなりすぎてしまう。また、付着表面積を備えないため、接着性培養には適していない。更に、透析膜はボトルの回転軸と垂直であるため、ボトルの直径を大きくしないと、透析膜の表面積を増大させることができない。これにより、質量の移動が制限されてしまう。
【０００６】
ファルケンベルグらの米国特許第５，６８６，３０１号には、米国特許第５，４４９，６１７号及び米国特許第５，５７６，２１１号に規定される装置を改良したものが記載されている。内部加圧による損傷を防止する折畳み式シースに関する特徴が開示されている。しかしながら、装置内に存在可能な培地の容積についてこれを改善することはできない。また、透析膜の制限された表面積について検討されていない。更に、接着性培養には適していない。
【０００７】
ビバサイエンス・サルトリアス・グループ社は、ファルケンベルクらの特許に関連してミニパームを製品化し、販売している。最大細胞区画構成部分は５０ｍｌであり、最大栄養構成部分は４００ｍｌである。つまり、市販の装置内に存在可能な最大培地容積は４５０ｍｌにすぎない。市販の小型装置、特注の回転器具の必要性、従来式実験室ピペットの使用不能性、細胞せん断の可能性、細胞の微視的観察の不能性及び接着性培養の適合性の欠如などが、従来式ボトルの代替物としてはその価値を制限している。
【０００８】
ナーゲルスらによる米国特許第５，７０２，９４５号に開示される装置では、接着性細胞の培養能力の向上によるミニパーム装置の改良が試みられている。一つの細胞付着マトリックスは、ガス透過性膜の内面において細胞培養区画内に備えられている。接着性培養は実現可能であるが、従来式ボトルと比べて、接着性細胞に対し狭い表面しか備えることができない。また、細胞集合性及び形態に関する微視的評価が受け入れられない。
【０００９】
一般に、共培養の用途が、コーニング社製のトランスウエル（登録商標）等の小型装置において実施されている。これらの装置は、非常に小規模な培養の場合にのみ相応しい。ムッシらの米国特許第５，５２７，７０５号では、仕切付きローラーボトルを使用した大規模な共培養の代替物が提供されている。このボトルは、同軸で、かつ同じ長さの２つの円筒形容器を介して仕切られ、内部容器は、外部容器内の中で心出しされている。微多孔性膜は、外部容器内に存在する細胞群から内部容器内に存在する細胞群を物理的に分離する。内部容器による外部容器内の接種物への妨害を阻止する方法についての討議又は指針は存在しない。一方、微多孔性膜が外部容器内の液体中を移動可能な容器間の推奨距離Ｄは、０．２５４ｍｍ（０．０１０）インチ〜約１．０１６ｍｍ（０．０４０インチ）である。従来式ローラーボトルについて推奨される接種容積は１７０〜２５５ｍｌであるが、微多孔性膜との接触が距離Ｄに応じて約１５ｍｌ〜８０ｍｌで発生するため、微多孔性膜による接種物への妨害が実質的に保証されている。あいにく、これらの比重は培地の比重に近いため、細胞が存在する培地への妨害が発生していると、細胞は播種するのにかなりの時間を要してしまうことが多い。従って、仕切付きローラーボトルが回転すると、接種物への妨害によって、細胞が外部容器の内面に適切に引き寄せられない虞がある。好ましくは、内部容器の第一端から第二端に延びる支持要素が距離Ｄを物理的に得るために使用されているが、接種物を更に妨害することになる。従って、共培養用のローラーボトルは、トランスウエル装置の優れた代替物として提供されたが、その形状によって、通常の接種過程が妨害されてしまう。
【００１０】
ベクタと静置標的細胞との間の接触頻度を増加させるため、微多孔性膜により仕切られた装置の使用法が、パルソンらの米国特許第５，８６６，４００号に記載されている。この方法は、一つの区画に細胞を保持するのに０．１μｍ〜約２．０μｍの微多孔性膜を利用しており、一方で、ベクタは貯留細胞を通過して移動し微多孔性膜を通過する。これにより、ブラウニアン運動を利用すると共に感染率を改善した方法と比べて、ベクタと細胞との間の接触量が増大した。感染率を更に増大させるため、ポンプを用いて細胞を含む区画内にベクタを再循環して戻すこともできる。しかしながら、ポンプの使用は、工程の複雑化を伴うことになる。
【００１１】
透析膜を利用する装置は、装置内に存在する試料の分子組成を変更するのに使用される。透析膜からなる容器内に試料を配置して、その容器を透析液を保持する第二容器内に浸漬することにより、溶液の最終的な組成が制御される。二つの形式の製品が市販されている。第一の形式は透析配管からなり、例えば、スペクトラム・ラブズ社から市販され、フラハティの米国特許第５，３２４，４２８号とエドレマンらの米国特許第５，７８３，０７５号とに記載されている。不都合な膜表面積と試料容積との比は固有のものである。第二の形式はカートリッジ様式であり、ピアス・ケミカル社から商品名スライド−Ａ−ライザ（登録商標）として市販されている（例えば、米国特許第５，５０３，７４１号参照）。この構成は、シリンジと針とを使用する必要があり、ピペットよりも好適な液体の取扱い方法ではない。これは、膜が平坦である必要もあるため、約１０ｍｌの試料容積のサイズに制限される。従って、これは、通常の透析液容器よりも速やかに大きくなる。更に、非支持式のシート膜は、大きくなるほど、破れやすくなることが予想される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
要約すると、種々の半透膜により仕切られた様々な装置が、高密度細胞培養、共培養、細胞処理及び試料透析用に使用される。しかし、これらの膜式装置は、それらの効率及び有用性を制限する固有の欠点を含む。高密度細胞培養を生成する膜式装置は、効率的なスケールアップに適した形状を備えていない。膜式ローラーボトル内で共培養のスケールアップを提供する試みは、トランスウエルや従来式ローラーボトル等と同じ方法で細胞を引き寄せることができない。装置を通過する膜性の流動を使用して感染率を増加させると、ベクタの再循環時にポンプが必要になるため複雑化してしまう。試料の透析に際し、透析配管では、表面積と試料容積との比が十分ではなく、スライド−Ａ−ライザ透析カートリッジは針の使用を必要とする。これらの欠点を克服する改良型の装置が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、従来の仕切付き細胞培養、共培養、細胞処理及び実験室試料透析装置よりも優れ、半透膜により仕切られた装置について複数の形式を開示することにある。この仕切装置は、回転又は静置している間、高密度な細胞培養が可能で、接種物を破砕することなく共培養が可能で、一方の区画から他方の区画へと液体を物理的に移動させ、実験室試料の透析をより効率的に行なえるように構成することができる。
【００１４】
本発明の一実施形態に従って、改良型高密度細胞培養装置を形成するため、基礎培地区画と細胞培養区画とが半透膜によって分離されている。この装置は、より多くの培地を保持すること、ピペットの使用を可能にすること、従来のローラーボトルで行なうように接着性細胞を付着させること、従来式のローラーボトルで行なわれる顕微鏡検査を可能にすること、及び標準ローラーラックを機能させることなどの多くの点で、従来の高密度ローラーボトルを改良するように構成することができる。新規の仕切装置の利点は、例えば、使い易さ、微視的評価、ピペットアクセス及び標準ローラーラックとの適合性といった従来式ボトルに固有の望ましい特徴を失うことなく、細胞及び細胞分泌生成物の濃度を増大させ、栄養供給期間の継続時間を延長し、従来式ローラーボトルに固有の無駄な空間量を最小限に抑えることを可能にする。また、この実施形態は、現行の実験室透析配管やカートリッジと比べて、実験室試料がより効率的に透析されるように構成することもできる。
【００１５】
本発明の別の実施形態に従い、改良された大規模共培養装置が形成される。この装置は、均質な細胞播種、微視的評価、ピペットアクセス及び標準ローラーラックとの適合性といった従来式ローラーボトルの望ましい属性を保持する基礎培地区画と細胞培養区画との間に幾何学的な間係をもたらすことにより、先行技術を改良したものである。
【００１６】
本発明の別の実施形態に従い、回転又は停止時に機能し得る改良型仕切装置が形成される。この新規の仕切付き細胞培養装置の利点として、回転又は非回転時に機能する能力がある。非回転位置のとき、培地容積に対するより高い半透膜表面積、より高い培地高さ及びスケールアップ効率の改良などを含む構成にすることにより、従来の非回転式仕切装置を改良したものである。
【００１７】
本発明の別の実施形態に従い、装置が回転する間、一方の区画から他方の区画へと液体が連続的に移動する。懸垂区画は、液体を通過させる半透膜に部分的に作製されている。懸垂区画は、その中心周りに周囲区画を回転させるようにして静止状態に維持されている。物理的特性によれば、周囲区画から培地を収集して、それをボトルの回転動作により懸垂区画に貯留する。培地は、半透膜を通じて周囲区画に戻される。
【００１８】
本発明の別の実施形態に従い、懸垂区画は、本装置内に存在している。本装置は、懸垂区画に動きを伝えて撹拌板の動作を真似るように回転され、設定されている。
なお、本出願は、本明細書にその全体が参照文献として組み込まれた２００３年１１月１０日に出願された米国仮出願第６０／５１９，６７６号の優先権を主張するものである。本発明は、一部、国立衛生研究所中小企業最新研究助成２Ｒ４４ＨＬ０６５９７７−０２「膜式ローラーボトル」に基づく米国政府の支援によって一部実施された。米国政府は、本発明に係る特定の権利を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
図１Ａは、仕切装置１０の断面図を示し、同装置は、従来式ローラーボトルと類似の方法で回転するときに細胞を培養するように構成されている。仕切付きボトル１０内には、基礎培地区画１５が存在している。細胞培養区画２０は、半透膜２５によって基礎培地区画１５から分離されている。キャップ５０は、仕切装置１０を汚染から保護する。図１Ｂは、図１ＡのＡ−Ａ断面図を示す。半透膜２５は、基礎培地区画１５の一部分を形成する。基礎培地区画１５内には、基礎培地３０が存在し、細胞培養区画２０内には、細胞培養培地３５が存在している。基礎培地３０と細胞培養培地３５との間の連通は、半透膜２５を介して生じる。このように、仕切装置１０を構成することにより、基礎培地区画１５内での培地の交換時に細胞及び細胞分泌生成物が細胞培養区画２０内に保持されるため、その装置を用いて、細胞培養区画２０内に細胞及び細胞分泌生成物を濃縮することができる。また、培養区画２０内で細胞が培養されるとき、及び基礎培地区画１５内で細胞が培養されるとき、仕切装置１０を共培養に使用することもできる。
【００２０】
半透膜２５の特性は、基礎培地３０と細胞培養培地３５との間を通過可能にすることを決定し、細胞培養区画２０内に保持されることを決定する。半透膜２５のどの特性が特定の細胞培養適用に望まれるかを記載する多くの情報源が利用されている。例えば、セルラインと称される製品は、１０，０００ＭＷＣＯ再生酢酸セルロース膜を利用しており、これは、高密度モノクローナル抗体の生成に非常に有効であることが証明されている。共培養が望まれる場合、半透膜は、物理的接触から細胞を分離するように機能するが、半透膜を通じて分泌生成物を行き来させるようにしている。微多孔性膜は、通常は、共培養用に使用されている。半透膜を適切に選択する際に指針となる情報源として、ウィルソンらによる‘５３７号特許、フォーグラーによる‘１２４号特許、ベーダーによる‘７９２号特許、ムッシらによる‘７０５号特許、ミリポア（マサチューセッツ州、ビレリカ）、スペクトラム・ラボラトリーズ株式会社（カルフォルニア州、ランコ  ドミンゲス）及びバイオベスト・インターナショナル（ミネソタ州、コーン・ラピード）などがある。
【００２１】
装置ハウジング４０は、任意の生物適合性材料からなる。好適な実施形態において、ハウジングは硬質であり、光学的に透明である。ポリスチレンは、フラスコ及びローラーボトルに使用される一般的な材料である。この装置ハウジングがポリスチレンから作製されると、従来式装置と同じ付着特性を示すことができる。これは、科学者が従来式フラスコ及びローラーボトルから仕切装置内へ培養の規模を変えるときに役立つかもしれない。好適な実施形態において、装置ハウジングは、回転し易くするため円筒形をなしている。一方、他の形状も可能である。例えば、メーダの米国特許第５，８６６，４１９号に記載された形状をその設計に容易に組み込むことができる。非円筒形の装置ハウジングを円筒形ハウジングに取付けて、非円筒形の装置ハウジングの形状をローラーラックに適合させることは、当業者にとって明らかである。好ましくは、基礎培地区画は、半透膜から装置ハウジングまでの距離がその周縁周りに均一となるように、装置ハウジングの形状と一致している。
【００２２】
当業者にとって明らかなように、隔壁、滅菌配管連結などを介して閉鎖系として仕切装置を構造化する多くの方法が存在している。しかし、従来式装置の簡素性を保持することが望まれるとき、ピペットを使えるようにすることが好都合である。図２Ａ及び図２Ｂは、ピペットにより仕切装置内に培地と細胞培養培地とを導入する方法を示す。図２Ａにおいて、ピペット６５は、基礎培地区画アクセスポート４５を介して基礎培地３０を基礎培地区画１５内に分配するために用いられる。図２Ｂにおいて、ピペット６５は、細胞培養区画アクセスポート６０を介して細胞と細胞培養培地３５とを細胞培養区画２０内に分配するために用いられる。
【００２３】
基礎培地区画は、適切な基質源と廃棄物吸込みとを備えるのに十分な基礎培地を保持する機能を果たしている。従って、一次設計の考慮事項として、所与の細胞培養の適用に要求される培地量が挙げられる。基礎培地の容積を大きくすれば、従来式装置に対して供給頻度を減らすことができる。例えば、従来式ローラーボトルに存在する３００ｍｌの基礎培地が３００×１０６細胞を養い、毎日交換する必要があれば、基礎培地区画内に６００ｍｌの基礎培地を加えることにより、供給日程を２日ごとに減らすことができる。細胞培養区画内に細胞と小容積の細胞培養培地とを配置し、比較的大容積の培地を基礎培地区画内に配置することによって、細胞密度を増やすことができる。例えば、３００×１０６個の細胞が従来式ローラーボトルの培地３００ｍｌ中に存在する場合、細胞培養区画内に細胞と１０ｍｌの細胞培養培地とを配置し、基礎培地区画内に３００ｍｌの基礎培地を配置することで、供給日程を変更しないで細胞密度を約３０倍に増加させることができる。
【００２４】
基礎培地区画に対する一つの設計要求は、半透膜を通過する静水圧差に関連している。基礎培地の高さが図１Ｂの実施形態で示すように、細胞培養培地の高さを超えるとき、膜を通過する静水圧差が発生することになる。従って、基礎培地区画から細胞培養区画内への液体の移動が容易に行われる。細胞培養区画内へと移動する液体が、例えば血清等の細胞培養培地中に存在し得る重要な物質を希釈しないように注意すべきである。この作用は、半透膜を適切に選択することによって制御することができる。因子としては、ＭＷＣＯ、材料、表面積及び膜の厚さが挙げられる。通常、微多孔性半透膜は、それ自体を通過する液体について、所定の静水圧差で限外ろ過性半透膜と比べてかなり速く移動させることができる。また、液体流束は表面積に比例する。この液体流束特性は、仕切装置を適切に設計する際、個別的な原則に基づいて評価する必要がある。例えば、我々は、基礎培地が半透膜よりも５０．８ｍｍ（２．０インチ）高く位置しているとき、表面積が３ｃｍ２であるＡＫＺＯノーベル社製の１０，０００ＭＷＣＯ再生セルロース膜は、５日間に亘って液体をほとんど移動させないことを認めた。一方、我々は、基礎培地が最初に半透膜よりも５０．８ｍｍ（２．０インチ）高く位置しているとき、表面積が３ｃｍ２であるヌクレオポア（登録商標）社製の０．４μｍの微多孔性膜は、５日間に亘って液高さが４４．４５ｍｍ（１．７５インチ）低下することも認めた。
【００２５】
基礎培地の高さは、基礎培地区画の外形により制御することができる。所定の培地容積に対して、長さを増加させるような基礎培地区画の構造化のみによって、培地の高さが減少することになる。従って、静水圧差は、基礎培地区画の外形によって減らすことができる。
【００２６】
また、細胞と細胞分泌生成物とが高密度で存在する場合のように細胞培養培地のタンパク質濃度が基礎培地に対して増加するとき、半透膜を通過する液体の移動についても生じることがある。次に、細胞培養培地の高い浸透圧は、半透膜を通過して基礎培地から液体を取り出す。これは、透析膜を介して仕切られる市販装置では一般的に行われている。プロトコルを調整して培養に及ぼす任意の不利益な作用を最小限にすることができる。例えば、血清が基礎培地ではなく、細胞培養培地に存在する適用において、セルラインの製品仕様書によれば、従来式装置で使用されるよりも血清濃度を約５％増加させることを示唆する。このように、透析膜を介した液体移動による血清の希釈は、低温保存からスケールアップされるときのように、細胞が直面する濃度よりも低くはならない。
【００２７】
好ましくは、基礎培地区画は、半透膜を最も有効に使用するように構造化されている。これは、仕切装置が回転するとき、基礎培地区画が回転するよう構成することにより、実現することができる。そうすることにより、半透膜がその全表面積に亘って湿潤になり、基礎培地と細胞培養培地との間の質量移動を増大させることができる。細胞が半透膜に付着し得る共培養の場合、そうすることにより、細胞が存在する表面積を増加させると共に、従来式ローラーボトルと類似の方法で付着細胞のガス交換を可能にする。
【００２８】
当業者にとって明らかなように、仕切装置が回転すると基礎培地区画も確実に回転する多くの設計方法が実現可能である。基礎培地区画は、装置ハウジングと同じ方向又は逆方向に回転することができる。例えば、基礎培地区画を装置ハウジングに物理的に連結すれば、同じ方向に回転することができる。物理的連結点は、細胞培養区画から液体を引き出すのを干渉しないように選択され、構成されるべきである。当業者にとって明らかなように、様々な方法によって、基礎培地区画が装置ハウジングと逆方向へ回転可能にすることができる。この場合、円筒形の基礎培地区画と装置ハウジングとが好ましい。基礎培地区画が装置ハウジングに物理的に取付けられるか否かに関係なく、逆回転は、基礎培地区画と装置ハウジングとの間に生じる摩擦力のみから得られる。基礎培地区画と装置ハウジングとの間の接触点の表面仕上げを変更することにより、摩擦を変更することができる。基礎培地区画と装置ハウジングとの間のギア式界面は、逆回転を得るための別の方法である。細胞培養培地が細胞培養区画の長さを中心に自由に移動しないように界面に注意を払うべきである。基礎培地区画がボトルハウジングに物理的に連結された状態で逆回転が望まれるなら、基礎培地区画を装置ハウジングと逆方向に回転可能にする任意の連結があれば十分であろう。例えば、無摩擦回転ユニオン継ぎ手は、一つの選択肢である。
【００２９】
基礎培地区画のさらに別の設計要求は、細胞培養区画の細胞培養培地との物理的接触に関連している。物理的接触は、細胞培養培地にムラを発生させ、接着性細胞が装置ハウジング上に沈着するといった影響を及ぼす虞があり、懸濁細胞培養の用途で細胞せん断を引き起こす虞がある。別の外形及び、それらの接種物及び細胞培養培地との接触の例を、図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃに示す。図３Ａにおいて、基礎培地区画１５Ａは、細胞培養区画２０Ａを通じて延びている。図３Ｂにおいて、基礎培地区画１５Ｂは、細胞培養区画２０Ｂを通じて延びているが、その外形は、半透膜２５が存在する場所以外の領域で基礎培地区画１５Ｂが細胞培養培地３５とは接触しないように設計されている。図３Ｃにおいて、基礎培地区画１５Ｃは、細胞培養区画２０Ｃを通じて延びており、図３Ａの構成より、装置ハウジング４０の下部から大きな距離をもって上昇されている。
【００３０】
接種物は、異なる方法で各構成の基礎培地区画に接触する。図３Ａでは、基礎培地区画１５Ａの全長に沿って細胞培養培地３５と接触する。図３Ｂにおいて、好ましくは、主に半透膜２５からなる基礎培地区画１５Ｂの全長の小部分に沿って細胞培養培地３５と接触する。図３Ｃにおいて、ボトルハウジング４０が回転すると、基礎培地区画１５Ｃは上昇した状態になるため、細胞培養培地３５と接触することはない。図３Ｃの構成を用いるとき、細胞培養培地３５から細胞が結実した後、半透膜２５を介して細胞培養培地を基礎培地に連通させて設置する二つの選択肢がある。最初の選択肢は、半透膜２５に接触するまでの間、細胞培養区画２０Ｃ内の細胞培養培地３５の容積を増加させることによる。第二の選択肢は、半透膜２５を細胞培養培地３５に接触させるため、図３Ｄに示すように、接種後に基礎培地区画１５Ｃを低下させることによる。この第二の選択肢は、第一選択肢よりもかなり小さい容積の細胞培養培地が細胞培養区画２０Ｃ内に存在することを可能にする。図３Ｄは、小容積の細胞培養培地３５が細胞培養区画２０Ｃ内に存在して、半透膜２５と接触し得るように再配置された基礎培地区画１５Ｃを示す。
【００３１】
細胞培養装置設計及び機械工学分野の専門家にとって明らかなように、基礎培地区画１５Ｃの位置の下方への移動は、様々な方法を用いて達成することができる。多種多様な機構が可能である。一つの技術として、図４Ａ〜図４Ｄに示すように、基礎培地区画を下方へ駆動するのに基礎培地の重量を使用することがある。記載される技術は、培地が基礎培地区画に添加されるとき、基礎培地区画を供給位置内へと自動的に移動することを可能にする。図４Ａ及び図４Ｄは、本目的を達成するある方法により構成された仕切装置３００を背後から見たときの斜視図を示す。図４Ｂは、図４Ａの仕切装置３００の背面図を示す。図４Ｃは、図４Ｄの仕切装置３００の背面図を示す。基礎培地区画１５Ｃは、無摩擦スロット３１１内に保持されている。無摩擦スロット３１１は、位置決めリング３０５に結合される連結棒３１０と一体化されている。図４Ｂに最もよく示すように、基礎培地区画１５Ｃは、接種物又は細胞培養培地を妨害しないように上昇されている。位置決めリング３０５は、装置ハウジング４０に無摩擦で接触している。釣合い錘３２０は、位置決めリング３０５に取付けられている。連結棒３１０は、釣合い錘３２０と直接対向して位置決めリング３０５に取付けられている。釣合い錘３２０は、基礎培地区画１５Ｃの重量よりも大きくされている。従って、釣合い錘３２０は、釣合い錘３２０が最低点になるまでの間、位置決めリング３０５を強制的に回転させ、連結棒３１０及び基礎培地区画１５Ｃをその直上に強制的に存在させる。重力は、基礎培地区画１５Ｃをスロット３１１によって許容される最低点まで落下させる。スロット３１１の寸法は、装置ハウジング４０に対して様々な所望の高さに基礎培地区画１５Ｃを設置できるように変更することができる。細胞を供給する必要があるとき、基礎培地区画１５Ｃへ基礎培地を添加することによって、基礎培地区画１５Ｃを細胞培養培地に接触させて自動的に配置する。基礎培地の重量のため、基礎培地区画１５Ｃの重量が増加して釣合い錘３２０の重量を超えたとき、基礎培地区画１５Ｃが中心を外れて移動するような任意の運動は、重力がそれを下位に配置することを可能にする。その運動は、ピペットを用いて基礎培地区画１５Ｃを極僅かに移動させることにより、仕切装置３００を層流フードからインキュベータへ運ぶ簡単な動作だけから、又は装置ハウジング４０に及ぼすローラー機構の作用から生じることができる。基礎培地区画１５Ｃが中心から外れると、レバーアームが形成されて、その重量が釣合い錘３２０に打ち勝ち、基礎培地区画１５Ｃができる限り最低点に位置するまでの間、無摩擦位置決めリング３０５は回転する。足部３１５は、装置ハウジング４０に接触する。足部３１５と装置ハウジング４０との間に適切な摩擦量を発生させることにより、基礎培地区画１５Ｃは、装置ハウジング４０と逆方向に回転させることができる。
【００３２】
基礎培地が基礎培地区画内部に存在可能に同基礎培地区画を構造化することは、多くの方法によって達成することができる。基礎培地の高さが基礎培地区画アクセスポートの高さよりも下方に位置すれば、培地区画アクセスポートは、単に開放口にすることができる。しかし、基礎培地が基礎培地区画アクセスポートよりも高い位置に存在することが望まれるなら、細胞培養区画内に基礎培地が流出しないようシールすることが必要とされる。図５Ａ及び図５Ｂは、基礎培地区画に基礎培地を保持するよう機能する基礎培地アクセスポートカバーを構成する方法の一例を示す。液体を取扱うピペット使用能力は、フラスコ及びローラーボトル等の従来式装置の簡素さを保持することが望まれる場合に、好都合になることがある。図５Ａ及び図５Ｂに示される構成は、ピペットをアクセス可能に適合されている。図５Ａにおいて、基礎培地区画アクセスポートカバー８０は、ピペット６５により開放され、コイルバネ８５は、本来の位置から強制的に押し出されて、基礎培地３０が基礎培地区画１５Ｄ内に導入される。ピペット６５が除去されると、コイルバネ８５は、基礎培地アクセスポートカバー８０を駆動して密封位置に復帰させる。これにより、仕切装置１０Ａが図５Ｂに示すようにその側面に配置されると、基礎培地区画が培地により完全に充填されて、培地３０を保持することが可能になる。
【００３３】
基礎培地区画が基礎培地アクセスポートカバーにより構成されると、輸送中又は使用中において、基礎培地区画内の圧力が増加することがある。通常は、輸送時、陸上輸送や空輸のときに直面する温度変化及び標高変化によりガスは膨張する。使用時、温度変化により培地からガスが除去され、その増大するガス容積により基礎培地区画が加圧される。基礎培地区画内に組み込まれた半透膜が十分要求を見たさなければ、圧力の増加によって、基礎培地区画の一体性が損なわれる虞がある。圧力の上昇時に、基礎培地区画を換気する多くの方法が存在することは、当業者にとって明らかである。例えば、傘型逆止弁かポペット弁を基礎培地区画内に組み込むことができる。
【００３４】
ピペットを用いて基礎培地区画から培地を除去するとき、垂直より水平に近い角度に仕切装置を配向することにより、流動フードにおける取り扱い性がより一層良くなる。仕切装置を垂直より水平に近い角度に配向することにより、基礎培地区画の低点にアクセスする一つの方法として、基礎培地区画内に導管を作ることがある。図６は、この目的を達成するための実施形態の断面を示す。ピペット６５は、ピペットインターフェース６６内に係合されて、基礎培地区画１５Ｅの下部からピペット６５に至る液体流路を形成する。ピペットインターフェース６６は、ピペット６５とシール部を形成するものの、好ましくは、ピペット６５が真空ポンプから離れないように、ピペット６５を容易に開放可能に構成すべきである。本明細書にその全体が組み込まれた同時係属米国出願第１０／４６０，８５０号と同時係属米国出願第６０／５１７，２８８号とは、この特徴に関する指針を与える情報源である。
【００３５】
半透膜は、液密方法で基礎培地区画に固定されるべきである。図７Ａ及び図７Ｂは、半透膜２５Ａが押し出されるときに半透膜２５Ａを基礎培地区画１５Ｆに付着する一つの構成を示す。図７Ｂは、図７Ａの細部Ａを拡大した図である。ガスケット９０は、基礎培地区画１５Ｆのハウジングと一体化され、半透膜２５Ａは、ガスケット９０の一面に亘り配置され、保持ワイヤ１００により液密方法によってガスケット９０に対し固定される。図７Ｃは、接着剤１１０により基礎培地区画１５Ｇに固定されたシート状の半透膜２５Ｂを示す。音波溶接等の半透膜を基礎培地区画に固定する多くの方法として、機械的圧搾、接着剤、埋め込み用樹脂が挙げられることは、当業者にとって明らかである。
【００３６】
細胞培養区画からの液体収集は、様々な方法により達成することができる。図８Ａは、ピペット６５の先端を装置ハウジング４０Ａの全長に沿って延びる溝６７に接触させる方法で同ピペット６５を配置する極めて簡素化された法を示す。溝６７は、細胞培養培地が貯留する場所と、ピペット６５の先端が配置される場所とを備えている。リム６９は、ボトルを滑らかに回転させるようにする。図８Ｂは、細胞培養培地３５を収集する別の方法を示す。仕切装置１０Ｂは、垂直な向きに配向されている。ピペット６５の先端は、基礎培地区画１５Ｈを通過して細胞培養区画２０Ｄ内に延びる導管１２０の内部に接続されている。導管１２０は、液密方法で基礎培地区画１５Ｈを通過させて、基礎培地３０の損失を抑止する。基礎培地区画１５Ｈは、細胞培養培地３５が導管１２０の先端に集合できるように、装置ハウジング壁４１から所定の距離だけ離れて配置されている。このように、ピペット６５に適用される真空は、導管１２０を通じてピペット６５内へと細胞培養培地３５を引き込む。この導管１２０の先端をピペット６５に対して密封すべきだが、ピペット６５を回収する際に、導管１２０内にピペット６５を嵌着させるよりも大きな力が作用しないようにすべきである。同時係属米国出願第１０／４６０，８５０号と同時係属米国出願第６０／５１７，２８８号とは、この特徴に関する指針を与える情報源である。
【００３７】
仕切装置が閉鎖系ではない場合、基礎培地区画及び／又は細胞培養区画内へのアクセスポートは、従来式ローラーボトルのキャップと同じ機能を有するキャップによって覆うことができる。緩み位置において、ガス交換を可能にし、汚染を防止する。閉鎖位置では、細胞培養区画内の環境が５％ＣＯ２の場合のようにガスを捕捉できるが、仕切装置は加温室において操作される。仕切装置が閉鎖系のように構造化されているなら、ガスを定期的に撒き散らして酸素とｐＨ管理とを提供するか、或いはガス交換が培養を十分に維持するように装置ハウジングの少なくとも一部をガス透過性にすることができる。同時係属米国出願第１０／９６１，８１４号は、ガス透過性装置ハウジングについての優れた参考資料を提供する。
【００３８】
接着性細胞培養では、細胞が付着する仕切装置内の表面積を、当業者にとって公知方法を用いて増大させることができる。指針源として、米国特許第３，９４１，６６１号、米国特許第４，３１７，８８６号、米国特許第４，８２４，７８７号、米国特許第４，８２９，００４号、米国特許第４，９１２，０５８号、米国特許第６，１３０，０８０号に記載されたものが挙げられる。
【００３９】
細胞培養培地をさらに混合することが望ましいとき、例えば、細胞培養培地の容積が極めて小さい場合があり得るように、半透膜の位置は細胞培養培地から離れており、及び／又は任意の別の理由のため、そのことを達成することができる。図９Ａは、仕切付きボトルが回転するとき、仕切付きボトルを上下に揺動する構成を示す。図９Ｂ及び図９Ｃは、異なる時点での図９Ａの断面図を示す。偏心器１４０は、装置ハウジング４０Ｂの端部に近接して設置されている。図９Ｂ及び図９Ｃに示すように、仕切付きボトル１０Ｃが回転すると、偏心器１４０は、装置ハウジング４０Ｂの端部を持ち上げたり下げたりするように作用する。このように、細胞培養培地３５は、繰り返し前後に揺動されて、それにより、形成し得るあらゆる濃度勾配が破壊される。望まれるなら、第二偏心器を装置ハウジングの反対側の端部に取付けて、より強い揺動を提供することができる。偏心器以外の形状を利用してもよく、例えば、点から突き出た単純形状の突起を用いてもよい。その突起がローラーラックのローラーを通過するときに、装置ハウジングは上昇することになる。ボトルの各端部に設けられる一つ以上の突起及び／又は複数の突起を用いることにより、振動をより強く作用させることができる。
【００４０】
また、仕切装置を使用することにより、実験室試料の透析のための効率的な装置を提供することができる。図１０は、この目的を達成するように構成された仕切装置１０Ｄの一例を示す。透析液区画４１５は、前述された基礎培地区画を形成するための方法のいずれかによって形成される。試料区画４２０は、細胞培養区画を形成するため、先に記載された方法のいずれかによって形成される。好適な実施形態において、半透膜２５ＣのＭＷＣＯは、１００，０００ダルトン未満であり、３，０００〜３０，０００ダルトンになることが多く、透析液区画４１５は、基礎培地アクセスポートカバーについて前述された構成の透析液区画アクセスポートカバー４８０を有し、仕切装置１０Ｄは、ローラーラック内で回転するように構成され、キャップ４５０は、試料４３５の偶発的な流出又は汚染を防止するように存在するであろう。使用時、透析液４３０は、透析液区画４１５内に配置され、試料４３５は、試料区画４２０内に配置されている。仕切装置１０Ｄは、所望の任意の速度でローラーラック内において回転される。追加の混合は、図９Ａ〜図９Ｃにおいて前述された技術を用いて行なうことができる。定期的に、透析液は除去されて、交換される。実験室試料を透析する別の方法及び装置と比較してこの実施形態の利点が多数あり、先行技術である米国特許第５，３２４，４２８号公報、米国特許第５，７８３，０７５号公報、米国特許第５，５０３，７４１号公報を再検討した後に最もよく理解することができる。より大きな試料容積は、試料容積に対する膜表面積の高い比によって処理され、撹拌棒は必要とされず、透析液容器内で装置を適切に指向する必要もなく、針は必要とされず、ピペットやアスピレータ等の標準的な実験室器具を用いて液体を容易に取扱うことができ、透析膜を透析液容器から除去する際に生じる透析膜からの液だれによる散乱が解消され、試料の無菌性を容易に維持でき、透析液であってもその無菌性に容易に維持することができる。
【００４１】
仕切装置は、回転せずに機能するように構成することができる。例えば、これは、細胞のせん断を減らした場合や、回転器具が利用できない場合などに、好都合になり得る。図１１Ａは、回転を要しない方法で構成された仕切装置１０Ｅの断面図を示す。ガス透過性底１５０は、仕切装置１０Ｅの底部によるガス交換を可能にする。ガス透過性材料は、細胞培養装置の設計者にとって公知なあらゆる材料であってもよい。同時係属米国出願第１０／９６１，８１４号は、指針を与えることができる多くの情報源の中の一つである。基礎培地区画１５Ｉは、ガス透過性底部１５０から所定の距離だけ離れて存在している。細胞培養区画２０Ｅは細胞培養培地３５を含み、基礎培地区画１５Ｉは基礎培地３０を含む。図１１Ｂは、回転位置で仕切装置１０Ｅが機能し得る方法を示す。どちらの区画へのアクセスも、前述した方法で行なうことができる。
【００４２】
非回転位置で機能するとき、細胞は、ガス透過性底１５０の近傍に存在するようになる。細胞培養培地３５は、半透膜２５Ｄを介して基礎培地３０と繋がっている。細胞培養培地３５の容積管理は、ガス透過性底１５０から及び装置ハウジング４０から基礎培地区画１５Ｉが存在する距離によって行なわれる。任意の所定の高さの細胞培養培地では、その距離が小さくなるほど、容積が減少し、それにより、濃度が高くなる。通例を超える高さに培地を配置して利得を得る能力は、同時係属米国出願第１０／９６１，８１４号に記載されている。
【００４３】
この構成の別の利点として、半透膜を通過する静水圧を平衡に保つ能力がある。細胞培養培地容積に対する基礎培地容積の高い比、しかも、基礎培地と細胞培養培地との間の高低差が小さい構成を容易に作製することができる。従って、濃度の利点と供給頻度の利点とが依然として存在するものの、半透膜を通過する静水圧駆動力は低下する。図１１Ａに示すように、細胞培養培地３５と基礎培地３０との高さは同等であり、半透膜２５Ｄを通過する静水圧が平衡に保たれている。容積の差は、多くの可能な幾何学的関係の一つを算出すれば容易に理解することができる。例えば、仕切装置が円筒形で、基礎培地区画１５Ｉはその片面が装置ハウジング４０Ｃから１０ｍｍ離れて存在し、ガス透過性底１５０から１０ｍｍ離れて存在し、細胞培地が１５ｍｍの高さに配置され、装置ハウジングの直径が１１ｃｍである場合、基礎培地容積は１１００ｍｌとなり、細胞培養培地容積は２９５ｍｌとなる。従って、細胞培養培地に対する基礎培地の比は約３．７になり、細胞と細胞分泌タンパク質は、供給日程に応じて約３．７倍を超えて増大するだろう。本明細書にその全体が組み込まれた同時係属米国出願第１０／９６１，８１４号は、培地の高さと、細胞成長及び分泌生成物に及ぼす影響とに関する指針を与える。
【００４４】
図１１Ｃ、図１１Ｄ及び図１１Ｅは、基礎培地容積に対する半透膜面積の比を変更して、質量移動又は静水圧駆動液体流束を変化させる方法を示す。図１１Ｃにおいて、基礎培地区画１５Ｊの底部は半透膜２５Ｅからなり、基礎培地３０の下部で、基礎培地３０を質量移動に晒している。図１１Ｄにおいて、基礎培地区画１５Ｋの底部及び側面は半透膜２５Ｆからなり、その底及び側面で、基礎培地３０を質量移動に晒しており、それにより、質量移動に利用可能な表面積を増大させることができる。図１１Ｅにおいて、培地区画１５Ｌの側面は半透膜２５Ｇからなり、その側面で基礎培地３０を質量移動に晒している。
【００４５】
半透膜の材料の種類に応じて、仕切装置が回転するか否かに関係なく、半透膜の外周を構造的に支持することが望まれるかもしれない。例えば、半透膜が膨らみ、装置ハウジングを強く押圧すると、細胞培養培地は物理的に遮られるか、半透膜の周縁への移動が阻止されるかもしれない。半透膜に対し装置ハウジングとの不都合な物理的接触をさせないようにすることは、糸目の粗い織りメッシュ等を用いた多くの方法によって達成することができる。構造支持体が半透膜の外周に備えられるなら、メッシュや他の物理的構造によって、半透膜の表面周囲に細胞培養培地を移動させつつ、細胞培養培地を半透膜にできるだけ多く接触可能にする必要がある。構造支持体を使用する前に、支持体無しの場合と比べて、任意の所定の支持体の効果を測定するため、質量移動の評価を行うべきである。基礎培地区画から細胞培養区画へのブドウ糖移動速度は、質量移動に及ぼす構造支持体の効果を測定する一つの方法として挙げられる。再生セルロ−ス等の親水性膜の場合、移動は、構造支持体無しの場合に適切になる。
【００４６】
図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ及び図１２Ｄは、一方の区画から他方の区画へと流体を物理的に輸送可能であって、ローラーボトルのように回転可能に構成された仕切装置を示す。仕切装置２００は、懸垂区画２１０を備え、その底部は、半透膜２３０から構成されている。周囲の区画２２０は、装置ハウジング２３５を介して境界が付けられている。懸垂区画２１０は、装置ハウジングが回転すると懸垂区画がその状態に維持されるように、装置ハウジング２３５と一体化されている。それは、軸受け、無摩擦一点取付け部品、回転式滑り継ぎ手等の使用を含む当業者にとって公知な多くの機械的取付け方法により実現される。キャップを取り外すと、アクセスポート２２５は、ピペットによる各区画へのアクセスを可能にする。操作時において、仕切装置２００が回転するとき、スコップ２４０は周囲区画２２０から液体を収集し、その液体を懸垂区画２１０へと送達する。図１２Ｂ、図１２Ｃ及び図１２Ｄは、図１２ＡのＡ−Ａ線から見たときの透視図であり、周囲区画２２０と懸垂区画２１０との間の液体輸送の際に生じる一連の事象を示す。図１２Ｂにおいて、培地２５０は、周囲区画２２０と懸垂区画２１０との内側に存在している。スコップ２４０は、周囲区画２２０内にある培地２５０の中に浸漬される。図１２Ｃにおいて、仕切装置２００は、回転矢印２６０で示すように反時計周りに回転する。スコップ２４０が培地２５０から上昇して、培地２５０により満たされる。図１２Ｄにおいて、仕切装置２００は、回転矢印２６０で示すように更に反時計周りに回転する。スコップ２４０は、懸垂区画２１０よりも上方に配置され、培地２５０が重力により流れ出すように配向される。培地２５０はスコップ２４０から落下し、懸垂区画２１０に流れ込む。また、培地２５０は、半透膜２３０を通過して進み、周囲区画２２０へと入り込む。スコップにより送達されて懸垂区画内に流れ込む培地の容積と、半透膜を介して懸垂区画内に存在する培地の量とのバランスを保つことにより、一方の区画から次の区画へと培地が絶えず移動する間、一定容積の培地が各区画内にそれぞれ保持される。使用するスコップの数、スコップの液体収容容積、回転速度、半透膜の透過率及び半透膜の表面積を変更することによって、上記のバランスを良好に保つことができる。好適な実施形態において、装置ハウジング２３５は、回転時において円滑に移動可能な円筒形をなし、また、液体流動が監視できるように光学的に透明である。
【００４７】
この構成は、様々な適用に対して大変役立つ。主な特性として、ポンプを必要とせずに、一つの区画から次の区画へと液体を絶えず移動させる能力がある。例えば、造血細胞の変換を行う場合、それらを通過するようにベクタを移動させることで、単純なブロウニアン運動よりも高い頻度で接触させることができる。造血細胞は、懸垂区画内に配置されるが、半透膜の特性は、懸垂区画内に細胞を保持する一方で、培地とベクタとを通過させるように選択することができる。スコップによりベクタが懸垂区画内に導入されると、ベクタが重力によって周囲区画の方へと進み、造血細胞と接触する。造血細胞を変換せず、かつ周囲区画に移動するベクタは、次に、スコップによって懸垂区画へ戻されて、細胞を変換する別の機会を待つ。この場合、懸垂区画内の培地は、完全に排出しないことが重要であり、そうしないと、細胞を死なせてしまう虞がある。
【００４８】
この構成が有用になる別の実施形態として、細胞分泌生成物や任意の外因性因子による各区画への灌流が望まれ場合や、共培養用が望まれる場合などが挙げられる。この場合、細胞は、懸垂区画及び周囲区画内に配置される。細胞を取り巻く液体は、周囲区画から懸垂区画へ絶えず移動し、再び戻る。
【００４９】
従来式培養装置の多くの適用では、それらが振動板上に設置されている。装置ハウジングが懸垂区画を中心に回転するときその状態に維持される懸垂区画を備えて仕切装置が構成される場合、振動板と類似の作用を発揮することができる。図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ及び図１３Ｄは、このような仕切装置の断面図を示す。図１３Ａ〜図１３Ｄは、仕切装置の回転時、懸垂区画と細胞培養培地とが通過するときの動作を示す。好ましくは、仕切装置は、標準的なローラーラック上で回転可能に構成されている。仕切装置１０Ｆは、懸垂区画２１０Ａと一体化されている。図１３Ａは、静止時の懸垂区画２１０Ａを示す。回転方向矢印２３６で示すように、装置ハウジング２３５Ａが懸垂区画２１０Ａを中心に回転するとき、装置ハウジング突起２７５は、懸垂区画突起２８０と接触して、図１３Ｂに最もよく示すように、懸垂区画をその静止位置から駆動する。その接触により、装置ハウジング突起２７５が懸垂区画突起２８０と接触しなくなるまでの間、装置ハウジング２３５Ａとの接触箇所であるピボット点を中心に、懸垂区画２１０Ａを強制的に回転させる。その時、懸垂区画２１０Ａは、図１３Ｃに最もよく示すように最初の位置を通過して揺れ戻る。重力が懸垂区画２１０Ａに力を及ぼすとき、図１３Ｄにおいて最もよく示すように、懸垂区画は静止するようになる。細胞培養培地３５の撹拌量は、回転速度、装置ハウジング突起と懸垂区画突起との間の接触期間、及び装置ハウジング突起数によって変更することができる。
【００５０】
ガス透過膜上での細胞培養が望まれる場合、図１３Ａ〜図１３Ｄに示す構成は、細胞の定期的な混合に有用なものとなる。この場合、半透膜２３０Ａの材料の選択は、その上方に存在する細胞へのガス移動を提供する能力に基づいて行われる。米国特許第５，６９３，５３７号は、ガス透過性膜の材料選択に指針を与える多くの情報源の内の一つである。同時係属米国出願第１０／９６１，８１４号には、細胞培養用のガス透過性装置を構造化する方法が記載されており、培養性能を最適化する懸垂区画２１０Ａの設計に適用される特殊な設計特性の指針を与える。
【実施例】
【００５１】
（実施例１）
細胞密度の増加及び血清使用量の減少について接着性細胞を含む仕切装置の評価
図１４に示す仕切装置試験装置５００を作製した。その装置ハウジングは、コーニング（登録商標）社製の８５０ｃｍ２ローラーボトルを改造して作製した。そのボトルの底部を取り除いて、装置ハウジング５４０を作製した。基礎培地区画５１５は、図示するように装置ハウジング５４０の先端部に配置した。装置の底部５４１を液密方法で取付け、それにより、組み立て手順が完了し、液密細胞培養区画５２０を作製した。半透膜５２５は、長さが２５．４ｍｍ（１．０インチ）、直径が１１１．７６ｍｍ（４．４インチ）の１４，０００ＭＷＣＯセルロース膜からなり、８９ｃｍ２の半透膜表面積を作製した。半透膜５２５は、２５．４ｍｍ（１インチ）当り１６ストランドで直径が０．５０８ｍｍ（０．０２０インチ）であるポリプロピレン糸製メッシュ５３０によって膨張を抑制するようにした。細胞付着に利用可能な装置ハウジング５４０の内部表面積は、基礎培地区画５１５と点検口５３５との間に存在する表面であって、約４９０ｃｍ２であった。
【００５２】
接着性ＣＨＯ細胞株、ＣＨＯ−ＡＣＥ００５の成長については、従来式ローラーボトルに対し、６個の仕切装置の試験装置５００によって評価した。高密度で細胞の成長を補助し、かつ血清の使用量を減少させる能力についてその評価を行った。仕切装置での高密度のときの細胞の成長を評価するため、培地容積と成長表面との比を従来式のコーニング社製の４９０ｃｍ２のローラーボトルの場合よりもかなり低く設定した。従来式のコーニングの４９０ｃｍ２ローラーボトルは、１１５ｍｌの培地を含有していたが、各仕切装置の試験装置５００は、細胞培養区画５２０に３０ｍｌしか含有していなかった。追加的な培地補助は、８５ｍｌであり、基礎培地区画５１５によって提供された。このように、全ての試験装置は、１１５ｍｌの総培地量を有しているが、従来式ボトルの１１５ｍｌに対して、仕切装置の試験装置５００では、３０ｍｌしか細胞と直接接触することはなかった。
【００５３】
仕切装置が血清の使用量を減らせるのなら、更なる有益性を得ることができる。こうした潜在的な有益性を評価するため、６個の仕切装置の試験装置５００の全てについて、細胞培養区画５２０に１０％の血清を有するようにした。３個の仕切装置の試験装置５００が基礎培地区画５１５に１０％血清を有し、３個の仕切装置の試験装置５００が基礎培地に血清を有しないようにした。
【００５４】
血清が補填された上記の装置の全てにＤＭＥＭ培地を使用した。３７℃、９５％ＲＨ及び５％ＣＯ２の条件下で、全ての装置を１ＲＰＭの回転速度で回転させた。
ＰＢＳでリンスし、トリプシン処理（０．２５％トリプシン、１ｍＭのＥＤＴＡ．４Ｎａ）を２回行うことによって、接着性細胞を収集した。細胞をトリパンブルーにより染色して生存率を確認し、血球計算板によって数えた。表１において、“細胞／ｍｌ”として同定された細胞密度を細胞培養培地のｍｌ当たりに換算して求めた。従って、仕切装置の各試験装置から回収された細胞の総量を３０ｍｌで割る一方、各ローラーボトルから回収された細胞の総量を１１５ｍｌで割った。全ての値の平均値を求めた。その結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
2007510433.tif 000003
表１によれば、細胞培養をより効率よく行う仕切装置の能力が明らかに示されている。血清使用量が１０倍を超えて低いにもかかわらず、培養されて生存する細胞数は妨害されなかった。更に、培地中の細胞濃度は約４倍に増加した。
（実施例２）
抗体密度の増加及び血清使用量の減少について懸濁細胞を含む仕切装置の評価
先に、実施例１に記載され、図１４に示す４個のγ照射仕切装置の試験装置５００を作製した。従来式ローラーボトルと比較して、分泌抗体密度、分泌抗体量を増加させ、血清を減らす仕切装置試験装置の能力を評価するために試験を行なった。
【００５６】
ＩｇＧモノクローナル抗体を分泌する２２×１０６個のマウスハイブリドーマ細胞を２５ｍｌの培地に懸濁し、各細胞培養区画５２０内に接種し、７５ｍｌの培地を各基礎培地区画５１５内に配置した。ＩｇＧモノクローナル抗体を分泌する２２×１０６個のマウスハイブリドーマ細胞を１００ｍｌの培地に懸濁し、従来式のコーニングの４９０ｃｍ２ローラーボトルの中に接種した。ブドウ糖消費量を毎日監視した。ＦＢＳ血清濃度は、従来式のコーニングの４９０ｃｍ２ローラーボトル及び２個の仕切装置試験装置５００の全ての培地に対して１０％であった。しかし、２個の仕切装置試験装置５００は、細胞培養区画５２０に１０％濃度でＦＢＳ血清を含有し、基礎培地区画５１５にはＦＢＳ血清が全く存在しなかった。３７℃、９５％ＲＨ及び５％ＣＯ２の条件下で、全ての装置を１ＲＰＭで回転させた。各細胞培養区画５２０と、ローラーボトルとから５日毎に試料を採取した。ＥＬＩＳＡを行い、抗体の生成を測定した。その結果を表２と表と３にそれぞれ示す。
【００５７】
【表２】
2007510433.tif 000004
表２は、各仕切装置試験装置５００では、従来式ローラーボトルと比べてＩｇＧモノクローナル抗体濃度を少なくとも１６倍に増加させたことを示している。
【００５８】
【表３】
2007510433.tif 000005
表３は、従来式ローラーボトル（ｎ＝２）と比較して、仕切装置試験装置５００（ｎ＝４）で生成された抗体総量が少なくとも５２％増加したことを示している（対応のないｔ検定解析によりｎ＝２，ｐ＜０．００１）。また、重要なことに、ＦＢＳ血清使用量が１３倍減少したことは、生成されたＩｇＧの総量に影響を及ぼさなかった（ｐ＜０．０５）。さらに、生成された抗体ｍｇ当りのブドウ糖の使用量は、少なくとも２８％減少しており、これは、培地のより効率的な使用を示唆している。要約すると、生成を増大させ、生成物を濃縮する仕切装置の能力により、下流側の処理で実質的なコスト低下がもたらされる。さらに、高価な血清の使用量を減らせば、培養工程のコストを減らすことができる。このように、仕切装置は、従来式ローラーボトルよりはるかに優れている。
（実施例３）
細胞密度の増加について懸濁細胞を含む仕切装置の評価
メッシュ５３０が無い以外は、図１４に示すような仕切付き試験装置を作製した。半透膜５２５は拘束されず、動作時には、膨潤から膨張して、装置ハウジング５４０と接触した。装置ハウジング５４０は、基礎培地区画５１５と点検口５３５との間にて約１７７．８０ｍｍ（７インチ）延び、約６００ｃｍ２の細胞培養に適した装置ハウジング表面積を形成した。
【００５９】
２個の仕切付き試験装置とＴ−１７５フラスコとの比較を細胞密度に基づいて行った。培地は、１０％のハイクロン・ウシ胎児血清と１％のギプコ・ペニシリン・ストレプトマイシンとを補充したハイクロン培地（カタログ番号ＳＨ３０３８２．０２）により構成された。培養条件は、３７℃、９５％Ｒ．Ｈ．及び５％ＣＯ２であった。全ての装置を１ＲＰＭで回転させた。２５ｍｌの培地中、２５×１０６個のマウスハイブリドーマ細胞を各細胞培養区画５２０に接種した。各基礎培地区画５１５は、１７０ｍｌの培地を受け入れた。２５ｍｌの同じ培地中、２５×１０６／ｍｌのマウスハイブリドーマ細胞をＴ−１７５フラスコに接種した。
【００６０】
細胞の生存を維持するのに必要なように、全ての試験装置に栄養を供給した。表４は、各装置で得られた最大生存細胞密度と最大生存細胞とを示す。
【００６１】
【表４】
2007510433.tif 000006
通常使用される組織培養フラスコと比べて細胞密度を増加させる仕切装置の能力が示された。細胞密度は、少なくとも約６００％増加した。
（実施例４）
細胞と細胞分泌タンパク質密度の増加とについて懸濁細胞を含む非回転式仕切装置の評価
非回転状態で機能する仕切装置の能力を評価するために試験を行なった。３個の非回転式仕切装置を作製した。各装置は、異なる半透膜表面積をそれぞれ備えている。これらの構成を従来式Ｔ−１７５フラスコと比べて評価した。モノクローナル抗体を得るマウスハイブリドーマ適用では、細胞密度に関して比較を行なった。
【００６２】
図１１Ｅ及び図１１Ｄに記載され、更に図１５Ａ及び図１５Ｂに示す方法によって、二つの形式の仕切付き試験装置を作製した。仕切付き試験装置は、以後、試験装置６００Ａと試験装置６００Ｂとしてそれぞれ識別されている。試験装置６００Ａ及び試験装置６００Ｂは、半透性の表面積について細胞培養培地との接触量が異なっていた。各試験装置について、装置ハウジングは、コーニングの８５０ｃｍ２ローラーボトルを改造して作製した。ボトルの底部は、装置ハウジング６４０を作製するため取り除いた。基礎培地区画６１５は、図示した場所に配置した。ガス透過性装置底６５０は、厚さが０．１０ｍｍ（０．００４インチ）のジメチルシリコーン９８ｃｍ２からなり、これを液密方法によって装置ハウジング６４０に取付け、それにより、液密細胞培養区画６２０を形成した。各装置の半透膜６２５は、１４，０００ＭＷＣＯセルロース膜により構成した。図１５Ａに示す試験装置６００は半透膜６２５を有し、それは、円筒形基礎培地区画６１５の周縁を含み、基礎培地区画６１５の底部からの高さが２５．４ｍｍ（１．０インチ）となるように延びている。図１５Ｂに示す試験装置１５Ｂは半透膜６２５を有し、それは、円筒形基礎培地区画６１５の周縁を含み、基礎培地区画６１５の底部からの高さが２５．４ｍｍ（１．０インチ）となるように延びると共に、基礎培地区画６１５の底部を備えている。仕切付き試験装置とＴ−１７５フラスコとの二つの形式を表５に要約する。
【００６３】
マウスハイブリドーマ細胞をハイクロン培地で培養した。細胞計数と生存率とを、標準的な血球計算板とトリパンブルー除去方法とを用いて監視した。“０日目”にハイブリドーマ細胞を各仕切装置に接種した。その結果を表５に示す。
【００６４】
【表５】
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これらの結果は、組織培養フラスコ等の従来式培養装置よりもかなり高い密度で細胞を培養する非回転式仕切装置の能力を示している。重要なことに、半透膜表面積の増加によって、装置の占有面積を増大させることなく、培養能力をより一層高めることができる。これにより、空間をより効率的に使用することができる。
【００６５】
本思想から逸脱することなく、多くの変更を行えることは、当業者にとって明らかである。従って、本発明の範囲は、例示及び記載した実施形態に制限されるものではない。むしろ、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物によって解釈されるべきである。本明細書にて引用した各出版物、特許、特許出願及び参考資料は、本明細書に参照として組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】ローラーボトルと同じ方法で回転するときに細胞を培養するように構成された仕切装置。
【図１Ｂ】ローラーボトルと同じ方法で回転するときに細胞を培養するように構成された仕切装置。
【図２Ａ】ピペットを用いて仕切装置内に培地及び細胞培養培地を導入する方法を示す図。
【図２Ｂ】ピペットを用いて仕切装置内に培地及び細胞培養培地を導入する方法を示す図。
【図３Ａ】基礎培地区画の外形を変更して接種物の妨害を最小限に抑える方法の例を示す図。
【図３Ｂ】基礎培地区画の外形を変更して接種物の妨害を最小限に抑える方法の例を示す図。
【図３Ｃ】基礎培地区画の外形を変更して接種物の妨害を最小限に抑える方法の例を示す図。
【図３Ｄ】基礎培地区画の外形を変更して接種物の妨害を最小限に抑える方法の例を示す図。
【図４Ａ】接種位置から供給位置へ基礎培地区画が移動する方法の一例を示す図。
【図４Ｂ】接種位置から供給位置へ基礎培地区画が移動する方法の一例を示す図。
【図４Ｃ】接種位置から供給位置へ基礎培地区画が移動する方法の一例を示す図。
【図４Ｄ】接種位置から供給位置へ基礎培地区画が移動する方法の一例を示す図。
【図５Ａ】基礎培地区画に基礎培地を保持する基礎培地アクセスポートカバーの作製法の一例を示す図。
【図５Ｂ】基礎培地区画に基礎培地を保持する基礎培地アクセスポートカバーの作製法の一例を示す図。
【図６】仕切装置が水平位置にあるときピペットによって基礎培地区画から基礎培地を収集するための構成を示す図。
【図７Ａ】液密方法で円筒形の半透膜を基礎培地区画と一体にする構成を示す図。
【図７Ｂ】液密方法で円筒形の半透膜を基礎培地区画と一体にする構成を示す図。
【図７Ｃ】液密方法で半透膜シートを基礎培地区画と一体にする構成を示す図。
【図８Ａ】細胞培養区画から液体を収集する種々の構成を示す図。
【図８Ｂ】細胞培養区画から液体を収集する種々の構成を示す図。
【図９Ａ】仕切装置の回転時に仕切装置を上下に揺り動かす構成を示す図。
【図９Ｂ】仕切装置の回転時に仕切装置を上下に揺り動かす構成を示す図。
【図９Ｃ】仕切装置の回転時に仕切装置を上下に揺り動かす構成を示す図。
【図１０】実験室試料の透析に好適な仕切装置の断面図。
【図１１Ａ】非回転時に機能する仕切装置の断面図。
【図１１Ｂ】回転時における図１１Ａの仕切装置の断面図。
【図１１Ｃ】半透膜表面積と細胞培養培地容積との比を変更して半透膜を通過する液体の流束を制御する非回転式仕切装置を構造化する方法を示す断面図。
【図１１Ｄ】半透膜表面積と細胞培養培地容積との比を変更して半透膜を通過する液体の流束を制御する非回転式仕切装置を構造化する方法を示す断面図。
【図１１Ｅ】半透膜表面積と細胞培養培地容積との比を変更して半透膜を通過する液体の流束を制御する非回転式仕切装置を構造化する方法を示す断面図。
【図１２Ａ】一方の区画から他方の区画へ流体を物理的に輸送可能な仕切装置を示す図。
【図１２Ｂ】その過程を示す図。
【図１２Ｃ】その過程を示す図。
【図１２Ｄ】その過程を示す図。
【図１３Ａ】撹拌板と類似した液体動作を生成するように移動可能な懸垂区画により構成された仕切装置。
【図１３Ｂ】撹拌板と類似した液体動作を得るように移動する懸垂区画により構成された仕切装置。
【図１３Ｃ】撹拌板と類似した液体動作を得るように移動する懸垂区画により構成された仕切装置。
【図１３Ｄ】撹拌板と類似した液体動作を得るように移動する懸垂区画により構成された仕切装置。
【図１４】実施例１、実施例２及び実施例３のデータの生成に使用される仕切装置の断面図。
【図１５Ａ】非回転位置で細胞を培養するように構成された実施例４の仕切装置を示す図。
【図１５Ｂ】非回転位置で細胞を培養するように構成された実施例４の仕切装置を示す図。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【国際調査報告】
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