(57)【要約】  ＳＩＲ２の塩基交換を脱アセチル化よりも阻害し、これゆえＳＩＲ２脱アセチル化活性を促進させる化合物が開示される。ＳＩＲ２脱アセチル化活性を促進させ、微生物の寿命を延ばす該化合物を使用する方法も、開示される。ＳＩＲ２脱アセチル化活性を促進させ、微生物の寿命を延ばす化合物を求めてスクリーニングする方法が、更に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に許容可能な賦形剤中にあって、ＳＩＲ２酵素による脱アセチル化よりも塩基交換を阻害し、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、および式Ｖからなる群から選択され、ここで式Ｉが構造１〜８：
【化１】
2007535475.tif 000017
のうちの１つを有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｍｅ、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＦ３、もしくはＭｅであり；Ｘが、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；Ｙが、Ｎ、Ｏ、もしくはＳであり；Ｙ＝ＳもしくはＯの場合、対応するＲは定められず；式ＩＩが構造９〜１８：
【化２】
2007535475.tif 000018
のうちの１つを有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｍｅ、もしくはＣＦ３であり；Ｘが、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；Ｒ５が、Ｍｅ、ＣＦ３、Ｏ、もしくはＮＨ２であり；式ＩＩはニコチンアミドでなく；式ＩＩＩが構造１９もしくは２０：
【化３】
2007535475.tif 000019
のうちの１つを有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｍｅ、もしくはＣＦ３であり；Ｘが、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；式ＩＶが構造２１もしくは２２：
【化４】
2007535475.tif 000020
のうちの１つを有し、式中の環が、０、１、もしくは２つの２重結合を含んでもよく；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｍｅ、もしくはＣＦ３であり；Ｘが、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；Ｙが、Ｎ、Ｏ、もしくはＳであり；式Ｖが構造２３もしくは２４：
【化５】
2007535475.tif 000021
のうちの１つを有し、式中の環が、０もしくは１つの２重結合を含んでもよく；Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｍｅ、もしくはＣＦ３であり；Ｘが、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；Ｙが、Ｎ、Ｏ、もしくはＳである、化合物。
【請求項２】
前記化合物が式Ｉを有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が式ＩＩを有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が式ＩＩＩを有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が式ＩＶを有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物が式Ｖを有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
前記化合物が、構造１、２、６、２１、２２、２３、および２４（ここで、ＸがＣＯＮＨ２であり、ＹがＮである）；構造９（ここで、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがＦであり、ＸがＣＯＮＨ２である）；構造１１（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が独立にＨもしくはＦであり、ＸがＣＯＮＨ２である）；ならびに構造１９および２０（ここで、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つがＦであり、ＸがＣＯＮＨ２である）からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物が、構造１および２（ここで、Ｒ２がＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４がＨである）；構造６（ここで、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４がＨであり、Ｒ２がＣＨ３もしくはＨである）；構造９（ここで、Ｒ１がＦであり、Ｒ２〜Ｒ４がＨであり、ＸがＣＯＮＨ２である）（２−フルオロニコチンアミド）；ならびに構造１１（ここで、Ｒ１〜Ｒ４がＨであり、ＸがＣＯＮＨ２である）（イソニコチンアミド）からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
前記化合物がフルオロニコチンアミドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
前記化合物が２−フルオロニコチンアミドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
前記化合物がイソニコチンアミドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
医薬的に許容可能な前記賦形剤が更に、請求項１に記載の第２の化合物を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
ＳＩＲ２酵素によるアセチル化ペプチドの脱アセチル化よりも塩基交換を阻害する方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物を、ＳＩＲ２酵素、ＮＡＤ＋、およびアセチル化ペプチドと組み合わせることを含む方法。
【請求項１４】
ＳＩＲ２酵素が、原核生物もしくは古細菌由来である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＳＩＲ２酵素が、真核生物由来である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記真核生物が哺乳類である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳類のＳＩＲ２酵素がＳＩＲ２αである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳類がヒトである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヒトのＳＩＲ２酵素が、ＳＩＲ２Ａ、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ２ｐ、ＳＩＲＴ１ｐ、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、およびＳＩＲＴ７からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＳＩＲ２酵素、ＮＡＤ＋、およびアセチル化ペプチドが、生存細胞外の反応混合物中で前記化合物と組み合わされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
ＳＩＲ２酵素が生存細胞中にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記生存細胞が真核細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生存細胞が哺乳類細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳類細胞が生存哺乳類中にある、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳類がマウスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳類がヒトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
生存細胞中でのＳＩＲ２酵素によるタンパク脱アセチル化を増強させる方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物と、該細胞を組み合わせることを含む方法。
【請求項２８】
前記細胞が古細菌細胞もしくは原核細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が真核細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳類細胞がマウスの細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳類細胞がヒトの細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が培養中にある、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が生存微生物の一部である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
ＳＩＲ２酵素の脱アセチル化活性を上昇させる方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物を、ＳＩＲ２酵素、ＮＡＤ＋、およびＳＩＲ２アセチル化ペプチド基質と組み合わせることを含む方法。
【請求項３６】
ＳＩＲ２酵素が、原核生物もしくは古細菌由来である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＳＩＲ２酵素が、真核生物由来である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記真核生物が哺乳類である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳類のＳＩＲ２酵素がＳＩＲ２αである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記哺乳類がヒトである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヒトのＳＩＲ２酵素が、ＳＩＲ２Ａ、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ２ｐ、ＳＩＲＴ１ｐ、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、およびＳＩＲＴ７からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＳＩＲ２酵素、ＮＡＤ＋、およびアセチル化ペプチドが、生存細胞外の反応混合物中で組み合わされる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
ＳＩＲ２酵素が生存細胞中にある、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が生存微生物の一部である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＳＩＲ２酵素によるアセチル化ペプチドの脱アセチル化よりも塩基交換を阻害する方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物を使用して、ＳＩＲ２の酵素部位から、ニコチンアミドを追い出すことを含む方法。
【請求項４６】
ＳＩＲ２の脱アセチル化活性を上昇させる能力に関して、テスト化合物をスクリーニングする方法であって、テスト化合物を、反応混合物中、ＳＩＲ２酵素、ＮＡＤ＋、およびＳＩＲ２アセチル化ペプチド基質と組み合わせること、ならびに、該化合物が脱アセチル化よりも塩基交換を妨げるかどうか決定することを含む方法。
【請求項４７】
前記決定が、放射能標識ニコチンアミドを使用してなされる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記テスト化合物が、請求項１に記載の構造１〜２４のうちの１つを有する、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年７月２日出願の米国仮出願第６０／４８４，３２１号の利益を請求する。
【０００２】
連邦協賛研究開発に関する陳述
米国政府は、本発明における支払い済みのライセンス、および、ＮＩＨにより表彰された承認第ＡＩ３４３４２号の支払いにより与えられるような合理的な状況に関して、本特許権者が他者にライセンス付与するよう要求する限られた環境下での権利を有する。
【０００３】
（１）本発明分野
本発明は一般的に、酵素活性を上昇させる方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、ＳＩＲ２脱アセチル化活性を上昇させるのに有用な方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００４】
（２）関連技術文献の引用の記載
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【０００５】
沈黙（サイレンシング）情報制御因子（ＳＩＲ２）酵素は sirtuin としても知られ、ＮＡＤ＋依存性のタンパク脱アセチル化酵素の新たに分類されたファミリーを打ち立て、これは基質として代謝的に価値あるＮＡＤ＋を用い、タンパク＋基質（protein-co-substrates）のアセチルリジン側鎖を、無修飾リジン側鎖へと変換する（Ｌａｎｄｒｙら、２０００年；Ｉｍａｉら、２０００年）。イースト菌のＳＩＲ２タンパクは本来、遺伝子沈黙化（silencing, サイレンシング）の制御補因子として同定され、ＳＩＲ複合体と呼ばれるタンパクモジュール中のクロマチンに局在している。ＳＩＲ複合体内で、これらの酵素はクロマチン構造を制御すると信じられており（Ｓｍｉｔｈら、２０００年；ＲｉｎｅおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８７年）、これはＨ３およびＨ４ヒストンＮ末尾における少ないアセチル化の獲得および維持による（Ｒｕｓｃｈｅら、２００３年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年；Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎら、１９９３年）。潜在的なＤＮＡ抑制機構の一部としての、遺伝子情報制御におけるこれら酵素の役割は、細胞に対するそれらの重要性を増す。実際、ＳＩＲ２酵素は、生命の全防御に亘り広く分布しており（Ｂｒａｃｈｍａｎｎら、１９９５年；Ｓｍｉｔｈら、２０００年）、寿命の制御（Ｌｉｎら、２０００年；ＴｉｓｓｅｎｂａｕｍおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、２０００年）および遺伝子安定性（Ｂｒａｃｈｍａｎｎら、１９９５年）における役割を持っているように見える。例えば、ＳＩＲ２は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｌｉｎら、２０００年）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（ＴｉｓｓｅｎｂａｕｍおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、２０００年）において、カロリー制限により引き起こされる寿命の延びに必須であると同定されており、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（Ａｓｔｒｏｍら、２００３年）において、寿命に影響を与える。寿命の延びは、カロリー制限中のＳＩＲ２活性上昇により引き起こされるが、これは更なるＳＩＲ２遺伝子のコピーが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｌｉｎら、２０００年）およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（ＴｉｓｓｅｎｂａｕｍおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、２０００年）において、長寿化した表現型を与えるからである。カロリー制限は、霊長類を包含する動物においても、長寿化した寿命という利益を与えるので（Ｌｉｎら、２０００年）、上昇したＳＩＲ２活性は動物において、長寿化した寿命にまで至ることが多い。
【０００６】
カロリー制限によりＳＩＲ２が活性化されるメカニズムはよく分からないが、上昇したＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比もしくは上昇したＮＡＤ＋濃度が示唆されている（ＬｉｎおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、２００２年；Ｃａｍｐｉｓｉ、２０００年）。ＳＩＲ２活性の制御におけるニコチンアミドおよびＰＮＣ１遺伝子に関する役割も、実証されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年；Ｂｉｔｔｅｒｍａｎら、２００２年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００２年）。ＰＮＣ１は、ニコチンアミドを脱アミド化してニコチン酸を形成させ、ＳＩＲ２産物としてＮＡＤ＋代謝経路において形成されたニコチンアミドの濃度を低下させることができる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年；Ｂｉｔｔｅｒｍａｎら、２００２年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００２年）。ＰＮＣ１は、幾つかのストレス条件（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００２年；Ｓｉｎｃｌａｉｒ、２００２年）下に過剰発現され、イースト菌を長寿命化させ、このことは上昇したＰＮＣ１活性が、ニコチンアミドによる阻害を抑制することにより、ＳＩＲ作用を上昇させることを意味している。ニコチンアミドはＳＩＲ酵素活性の潜在的阻害剤であり（Ｂｉｔｔｅｒｍａｎら、２００２年；Ｌａｎｄｒｙら、２０００年）、ＳＩＲ酵素による塩基交換の基質としても働く（Ｌａｎｄｒｙら、２０００年；Ｍｉｎら、２００１年；Ｓａｕｖｅら、２００１年）。ニコチンアミドでの塩基交換、ニコチンアミドによる阻害、およびＳＩＲ２の反応メカニズムの間の関係は定かでないが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＩＲ２制御の基礎となっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＳＩＲ２の反応メカニズムの更なる特徴付けが、その脱アセチル化反応が促進され得る道筋を決定するのを補助するのに必要とされている。本発明はその必要性を満たし、さもなくば阻害する量であるニコチンアミド存在下にその脱アセチル化反応を促進する種々の化合物を同定する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、ＳＩＲ２の脱アセチル化反応が、脱アセチル化よりも塩基交換を阻害する化合物により促進され得るとの発見に基づいている。該化合物は、該塩基交換反応に参画することなく、ＳＩＲ２の酵素部位からニコチンアミドを追い出すと思われる。
【０００９】
これゆえ、幾つかの実施形態において、本発明は、医薬的に許容可能な賦形剤中、Ｓｉｒ２酵素による脱アセチル化よりも塩基交換を阻害する化合物に関する。これらの実施形態では、該化合物は、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、および式Ｖのうちの１つの化学構造を有し、ここで式Ｉは、構造１〜８：
【００１０】
【化１】
2007535475.tif 000002
【００１１】
のうちの１つを有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｍｅ、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＦ３、もしくはＭｅであり；Ｘが、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；Ｙが、Ｎ、Ｏ、もしくはＳであり；Ｙ＝ＳもしくはＯの場合、対応するＲは定められず；式ＩＩが構造９〜１８：
【００１２】
【化２】
2007535475.tif 000003
【００１３】
のうちの１つを有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｍｅ、もしくはＣＦ３であり；Ｘが、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；Ｒ５が、Ｍｅ、ＣＦ３、Ｏ、もしくはＮＨ２であり；式ＩＩはニコチンアミドでなく；式ＩＩＩが構造１９もしくは２０：
【００１４】
【化３】
2007535475.tif 000004
【００１５】
のうちの１つを有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｍｅ、もしくはＣＦ３であり；Ｘが、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；式ＩＶが構造２１もしくは２２：
【００１６】
【化４】
2007535475.tif 000005
【００１７】
のうちの１つを有し、式中の環が、０、１、もしくは２つの２重結合を含んでもよく；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｍｅ、もしくはＣＦ３であり；Ｘが、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；Ｙが、Ｎ、Ｏ、もしくはＳであり；式Ｖが構造２３もしくは２４：
【００１８】
【化５】
2007535475.tif 000006
【００１９】
のうちの１つを有し、式中の環が、０もしくは１つの２重結合を含んでもよく；Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｍｅ、もしくはＣＦ３であり；Ｘが、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；Ｙが、Ｎ、Ｏ、もしくはＳである。
【００２０】
他の実施形態では、本発明は、Ｓｉｒ２酵素によるアセチル化ペプチドの脱アセチル化よりも、塩基交換を阻害する方法に関する。該方法は、化合物を、Ｓｉｒ２酵素、ＮＡＤ＋、およびアセチル化ペプチドと組み合わせることを含む。これらの方法では、該化合物は、上記した化合物の１つである。
【００２１】
本発明は加えて、生物の寿命を延ばす方法に関する。該方法は、生物を、上記化合物のうちの１種で処理することを含む。
【００２２】
更なる実施形態では、本発明は、生きている細胞（生存細胞）におけるＳｉｒ２酵素によるタンパク脱アセチル化を増強させる方法に関する。該方法は、該細胞を、上記化合物のうちの１種と組み合わせることを含む。
【００２３】
本発明は更に、Ｓｉｒ２酵素の脱アセチル化活性を上昇させる方法に関する。該方法は、上記化合物のうちの１種を、Ｓｉｒ２酵素、ＮＡＤ＋、およびＳｉｒ２アセチル化ペプチド基質と組み合わせることを含む。
【００２４】
他の実施形態では、本発明は、Ｓｉｒ２酵素によるアセチル化ペプチドの脱アセチル化よりも、塩基交換を阻害する方法に関する。該方法は、上記化合物のうちの１種を使用して、Ｓｉｒ２酵素部位から、ニコチンアミドを追い出すことを含む。
【００２５】
本発明はまた、Ｓｉｒ２脱アセチル化活性を上昇させる能力に関して、テスト化合物をスクリーニングする方法にも関する。該方法は、テスト化合物を、Ｓｉｒ２酵素、ＮＡＤ＋、およびＳｉｒ２アセチル化ペプチド基質と、反応混合物中組み合わせ、該化合物が脱アセチル化よりも塩基交換を妨げるかどうかを決定することを含む。
【００２６】
加えて、本発明は、生物の寿命を延ばす能力に関して、テスト化合物をスクリーニングする方法に関する。該方法は、テスト化合物を、Ｓｉｒ２酵素、ＮＡＤ＋、およびＳｉｒ２アセチル化ペプチド基質と、反応混合物中組み合わせ、該化合物が脱アセチル化よりも塩基交換を妨げるかどうかを決定することを含む。
【００２７】
更なる実施形態では、本発明は、細胞において、化合物がＳＩＲ酵素の脱アセチル化活性を上昇させるかどうかを決定する方法に関する。該方法は、レポーター・ジーン（レポーター遺伝子）発現を、該化合物に晒されない時の細胞および該化合物に晒される時の該細胞間で比較することを含み、ここで、該レポーター・ジーンは、該細胞中の染色体の遺伝子座に取り込まれており、該細胞はＳＩＲ酵素による転写時のサイレンシングに付され、該化合物に晒された該細胞中の該レポーター・ジーン発現の減少が、該化合物が該細胞中のＳＩＲの脱アセチル化活性を上昇させることを指し示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、ＳＩＲ２による塩基交換が、脱アセチル化よりも阻害され得るとの発見に基づいている。脱アセチル化よりも塩基交換を阻害する化合物も、同定されている。これらの化合物は、脱アセチル化において、全体として増強を促進し、これゆえ効果的に、ＳＩＲ２の脱アセチル化活性を上昇させる。
【００２９】
これゆえ、幾つかの実施形態では、本発明は、ＳＩＲ２酵素による脱アセチル化よりも、塩基交換を阻害する化合物に関する。如何なる特定のメカニズムにも限定されず、該化合物は、ＳＩＲ２活性部位からニコチンアミドを追い出すことにより、塩基交換を阻害すると考えられる。これゆえ、好ましい化合物は、ニコチンアミドに似た構造的特徴を持っており、例えば以下の構造、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、および式Ｖであり、ここで式Ｉが構造１〜８：
【００３０】
【化６】
2007535475.tif 000007
【００３１】
のうちの１つを有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｍｅ、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＦ３、もしくはＭｅであり；Ｘが、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；Ｙが、Ｎ、Ｏ、もしくはＳであり；Ｙ＝ＳもしくはＯの場合、対応するＲは定められず；式ＩＩが構造９〜１８：
【００３２】
【化７】
2007535475.tif 000008
【００３３】
のうちの１つを有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｍｅ、もしくはＣＦ３であり；Ｘが、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；Ｒ５が、Ｍｅ、ＣＦ３、Ｏ、もしくはＮＨ２であり；式ＩＩはニコチンアミドでなく；式ＩＩＩが構造１９もしくは２０：
【００３４】
【化８】
2007535475.tif 000009
【００３５】
のうちの１つを有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｍｅ、もしくはＣＦ３であり；Ｘが、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；式ＩＶが構造２１もしくは２２：
【００３６】
【化９】
2007535475.tif 000010
【００３７】
のうちの１つを有し、式中の環が、０、１、もしくは２つの２重結合を含んでもよく；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｍｅ、もしくはＣＦ３であり；Ｘが、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；Ｙが、Ｎ、Ｏ、もしくはＳであり；式Ｖが構造２３もしくは２４：
【００３８】
【化１０】
2007535475.tif 000011
【００３９】
のうちの１つを有し、式中の環が、０もしくは１つの２重結合を含んでもよく；Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｍｅ、もしくはＣＦ３であり；Ｘが、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨ２ＮＨ２であり；Ｙが、Ｎ、Ｏ、もしくはＳである。
【００４０】
好ましくは、該化合物が、構造１、２、６、２１、２２、２３、もしくは２４（ここで、ＸがＣＯＮＨ２であり、ＹがＮである）；構造９（ここで、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがＦであり、ＸがＣＯＮＨ２である）；構造１１（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が独立にＨもしくはＦであり、ＸがＣＯＮＨ２である）；または構造１９および２０（ここで、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つがＦであり、ＸがＣＯＮＨ２である）のうちの１つを有している。
【００４１】
より好ましくは、該化合物が、構造１もしくは２（ここで、Ｒ２がＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４がＨである）；構造６（ここで、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４がＨであり、Ｒ２がＣＨ３もしくはＨである）；構造９（ここで、Ｒ１がＦであり、Ｒ２〜Ｒ４がＨであり、ＸがＣＯＮＨ２である。２−フルオロニコチンアミド）；その他のフルオロニコチンアミド；または構造１１（ここで、Ｒ１〜Ｒ４がＨであり、ＸがＣＯＮＨ２である。イソニコチンアミド）のうちの１つを有している。実施例１は、イソニコチンアミドが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＩＲ２ｐ酵素の脱アセチル化よりも、塩基交換を阻害することを示すデータを与え；実施例３は、２−フルオロニコチンアミドが、イースト菌および古細菌のＳＩＲ２酵素の脱アセチル化よりも、塩基交換を阻害することを示すデータを与える。最も好ましい実施形態では、該化合物がイソニコチンアミド、または、２−フルオロニコチンアミドのようなフルオロニコチンアミドである。
【００４２】
脱アセチル化よりもＳＩＲ２塩基交換を阻害する化合物は、ＳＩＲ２の脱アセチル化活性を上昇させる種々の方法において、使用され得る。幾つかの実施形態では、本発明は、ＳＩＲ２酵素によるアセチル化ペプチドの脱アセチル化よりも、塩基交換を阻害する方法に関する。該方法（複数）は、ＳＩＲ２酵素、ＮＡＤ＋、およびアセチル化ペプチドを、脱アセチル化よりもＳＩＲ２塩基交換を阻害する化合物と組み合わせることを含む。好ましくは、該化合物が、式Ｉもしくは式ＩＩの上記した化合物の１種であり、ここで最も好ましい化合物は、上記同様である。
【００４３】
これらの方法は、ＳＩＲ２の基質である如何なるアセチル化ペプチドの脱アセチル化よりも、塩基交換を阻害するのに有用であると期待される。知られているように、ＳＩＲ２は、少なくとも２アミノ酸の如何なるペプチドをも脱アセチル化できるが、但し、該ペプチドが、そのεアミノ部分においてアセチル化されたリジン残基を持っており、これは、ｐ５３、ヒストン、および小ペプチドを包含する（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ０２／３７３６４およびその中で引用された文献参照）。
【００４４】
ＳＩＲ２酵素は、原核生物、古細菌、もしくは真核生物（哺乳類も包含）源も包含する如何なる種由来でもあり得る。これらの方法に有用なＳＩＲ２酵素の非限定例は、Ｓｉｒ２Ａｆ２（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、Ｓｉｒ２Ｔｍ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、ｃｏｂＢ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｉｒ２ｐ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＳＩＲ２α（マウス）、ならびに、ＳＩＲ２Ａ、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ２ｐ、およびＳＩＲＴ１ｐ（ヒト）である。
【００４５】
幾つかの実施形態では、本方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて実施され、つまり、ＳＩＲ２酵素、ＮＡＤ＋、および前記アセチル化ペプチドが、生存細胞外側の反応混合物中、組み合わされる。
【００４６】
他の実施形態では、本方法は、生存細胞において実施され、例えば、該化合物を、ＳＩＲ２酵素、ＮＡＤ＋、および前記アセチル化ペプチドをも有する生存細胞へと加えることによる。これらのｉｎ  ｖｉｖｏの実施形態では、ＳＩＲ２酵素は該細胞にとって内因性であってもよく、あるいは、例えば該細胞を、当業界において既知のいずれかの方法によって、ＳＩＲ２酵素をコード化する核酸配列を含む発現ベクターを用いてトランスフェクションすることにより、導入されてもよい。該生存細胞は、古細菌細胞、原核細胞、もしくは真核細胞であってもよく、哺乳類細胞を包含する。これらのｉｎ  ｖｉｖｏの実施形態の幾つかの態様では、該細胞は生きている（生存）多細胞生物、例えばマウスもしくはヒトのような哺乳類の一部である。
【００４７】
ＳＩＲ２脱アセチル化活性の上昇は、広範な種々の生物の寿命の長寿命化と関連している（Ｌｉｎら、２０００年）ので、生物におけるＳＩＲ２脱アセチル化有効活性を上昇させる方法が、当該生物の寿命を延ばすと期待される。
【００４８】
本発明はこれゆえ、生物の寿命を延ばす方法に関する。本方法は生物を、脱アセチル化よりもＳＩＲによる塩基交換を阻害する化合物を用いて処理することを含む。好ましい化合物および最も好ましい化合物は式Ｉもしくは式ＩＩであり、上記したとおりである。
【００４９】
前記したｉｎ  ｖｉｖｏの実施形態のように、前記生物において標的とされるＳＩＲ２酵素は、内因性ＳＩＲ２であってもよく、あるいはそれは、該生物中へとトランスフェクションされてもよく、該生物が組み換えＳＩＲ２を発現するようにされる。やはり前記したｉｎ  ｖｉｖｏの実施形態のように、該生物は、如何なる原核生物、古細菌、もしくは真核生物であってもよく、菌（例えばイースト菌）、昆虫（例えばミバエ）、またはマウスもしくはヒトのような哺乳類も包含する。
【００５０】
関連実施形態では、本発明は、生存細胞において、ＳＩＲ２酵素によるタンパク脱アセチル化を増強させる方法にも関する。本方法は、脱アセチル化よりもＳＩＲ２による塩基交換を阻害する化合物と、該細胞を組み合わせることを含む。好ましい該化合物は前に論じたとおりであり、つまり、上記したとおりの式Ｉおよび式ＩＩのものである。やはり前の実施形態のように、該細胞は、原核生物細胞、古細菌細胞、もしくは真核生物細胞であってもよく、例えばイースト菌細胞または哺乳類細胞であってもよく、マウスもしくはヒトからの細胞も包含する。該細胞はまた、培養中のものであってもよく、あるいは、生存多細胞生物の一部としてでもよい。
【００５１】
他の関連実施形態では、本発明は加えて、ＳＩＲ２酵素の脱アセチル化活性を上昇させる方法に関する。本方法は、脱アセチル化よりもＳＩＲ２による塩基交換を阻害する化合物と、ＳＩＲ２酵素、ＮＡＤ＋、およびＳＩＲ２アセチル化ペプチド基質を組み合わせることを含む。前記した実施形態のように、好ましい該化合物は、上記したとおりの式Ｉおよび式ＩＩのものである。該酵素は如何なる既知のＳＩＲ２であってもよく、原核生物のＳＩＲ２、古細菌のＳＩＲ２、もしくは真核生物のＳＩＲ２であってもよく、マウスＳＩＲ２α、ならびに、ヒトＳｉｒ２Ａ、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ２ｐ、およびＳＩＲＴ１ｐのようなものである。やはり前の実施形態のように、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、つまり生存細胞外の反応混合物中、あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、つまりＳＩＲ２酵素が生存細胞中にある場合、実施され得る。後者の実施形態では、前に論じた実施形態に類似して、該細胞は生存生物の一部であってもよい。
【００５２】
関連実施形態では、本発明は、ＳＩＲ２酵素によるアセチル化ペプチドの脱アセチル化よりも塩基交換を阻害する方法に関する。本方法は、ＳＩＲ２酵素部位からニコチンアミドを追い出すことを含み、好ましくは、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物を使用する。式Ｉおよび式ＩＩの化合物が、ＳＩＲ２酵素部位からニコチンアミドを追い出すことにより、脱アセチル化よりもＳＩＲ２による塩基交換を阻害すると考えられるので、この方法は全体的に、前記した方法に類似しており、前記した方法のように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの実施形態を包含し、如何なるＳＩＲ２酵素を用いてもよく、好ましい同じ化合物を用いてもよい。
【００５３】
脱アセチル化よりもＳＩＲ２による塩基交換を阻害する化合物が利用できるとの知見は、ＳＩＲ２脱アセチル化活性を上昇させる能力に関して、テスト化合物をスクリーニングする方法を示唆する。これゆえ、本発明は、ＳＩＲ２脱アセチル化活性を上昇させる能力に関して、テスト化合物をスクリーニングする方法にも関する。本方法は、該テスト化合物を、ＳＩＲ２酵素、ＮＡＤ＋、およびＳＩＲ２アセチル化ペプチド基質と、反応混合物中組み合わせること、ならびに、該化合物が、脱アセチル化よりも塩基交換を妨げるかどうかを決定することを含む。本方法は好ましくは、例えば実施例１に記載の方法により、放射能標識ニコチンアミドを使用して実施される。これらの方法は、ＳＩＲ２脱アセチル化活性の上昇の相対効率に関して、種々の化合物、例えば、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、および式Ｖのものを、定量的に比較するのに使用され得ると理解されるはずである。
【００５４】
長寿命化におけるＳＩＲ２脱アセチル化活性の効果に基づき、直前に記載のスクリーニング方法は、寿命を延ばす能力に関して化合物をスクリーニングするのにも有用である。これゆえ、本発明は、生物の寿命を延ばす能力に関して、テスト化合物をスクリーニングする方法にも関する。本方法は、該テスト化合物を、ＳＩＲ２酵素、ＮＡＤ＋、およびＳＩＲ２アセチル化ペプチド基質と、反応混合物中組み合わせること、ならびに、該化合物が、脱アセチル化よりもＳＩＲ２による塩基交換を妨げるかどうかを決定することを含む。
【００５５】
これらの方法では、ＳＩＲ２酵素は、好ましくは当該生物由来である。該生物は、原核生物、古細菌、もしくは真核生物であってもよく、例えばイースト菌細胞もしくは哺乳類細胞であって、マウスもしくはヒトも包含する。本方法は、脱アセチル化に対するＳＩＲ２による塩基交換の阻害における、各化合物の相対的な効果を定量的に求めることにより、寿命における種々の化合物の相対的な効果を求めるのに使用され得る。これゆえ、本方法は、例えば式Ｉおよび式ＩＩの種々の化合物の、寿命への相対的な効果を評価するのに使用され得るものである。
【００５６】
本発明の化合物は、マウスおよびヒトのような哺乳類も包含する動物を処理するための上記した種々の方法において有用であるので、それらの化合物が医薬組成物として有用であることが理解されるはずである。これゆえ、本発明は、医薬的に許容可能な賦形剤中、脱アセチル化よりもＳＩＲ２による塩基交換を阻害する化合物を含む組成物にも関する。該化合物は好ましくは、上記した種々の式Ｉおよび式ＩＩのものであり、より好ましくは、式Ｉおよび式ＩＩの種々の好ましいものの実施形態である。
【００５７】
動物を処理することを含んでいる前記した方法では、該化合物の医薬組成物が、限定なく、経口投与、非経口投与（例えば、筋膜上、嚢内、皮内、真皮内、筋肉内、眼窩内、腹腔内、髄腔内、胸腔内、血管内、静脈内、実質性、もしくは皮下投与）、経皮投与、および浸透圧ポンプによる投与を包含する既知の手順により、ヒトもしくは動物被験体へと投与されてよい。好ましくは、本発明の医薬組成物は、経口投与される。
【００５８】
経口投与に関して、該化合物が、固体もしくは液体調製品、例えば、カプセル、錠剤（タブレット）、粉末、顆粒、分散物、溶液、および懸濁として処方されてもよい。このような調製品は、ここに挙げられていないその他の経口投薬形態同様、当業界においてよく知られている。好ましい実施形態では、本発明の化合物は、結合剤（バインダー）、崩壊剤、および滑剤と一緒に、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびコーンスターチのような従来の錠剤ベースと共に、錠剤とされる。これらの賦形剤は、当業界においてよく知られている。本処方は、結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、もしくはゼラチンのような結合剤と共に、提供されてもよい。加えて、本処方は、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、もしくはカルボキシメチルセルロースナトリウムのような崩壊剤と共に、提供されてもよい。本処方はまた、二塩基性無水リン酸カルシウムもしくはグリコール酸ナトリウムスターチと共に、提供されてもよい。最後に、本処方は、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような滑剤と共に、提供されてもよい。着色料および香料のような他の成分も、包含されてよい。本発明における使用のための液体形態は、医薬的に許容可能な界面活性剤もしくは懸濁剤のような他の物質と共にもしくは伴わずに、水およびエタノールのような担体を包含する。
【００５９】
非経口投与（つまり、消化管以外の経路での注入による投与）に関して、該化合物が、好ましくは被験体の血液と等張である無菌水溶液と組み合わされてよい。このような処方は、塩化ナトリウム、グリシン、および同様なもののような生理学的に相容れる物質を含有し、生理学的条件と相容れる緩衝化ｐＨを有する水中に、固体活性成分を溶解させて水溶液を調製し、該溶液を無菌化することにより、調製されてもよい。該処方は、封入アンプルもしくはバイアルのような、単位用量もしくは多用量容器中に、提供されてもよい。該処方は、限定なく、筋膜上、嚢内、皮内、真皮内、筋肉内、眼窩内、腹腔内、髄腔内、胸腔内、血管内、静脈内、実質性、もしくは皮下注入を包含する如何なる様式の注入によっても、供給されてよい。
【００６０】
真皮を通しての投与に関して、該化合物は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、Ｎ−メチルピロリドン、および同様なもののような、皮膚浸透促進剤と組み合わされてもよく、これらは、該化合物に対する皮膚の透過性を上昇させ、該化合物が皮膚を通して血流中へと浸透するのを可能にする。該化合物／促進剤組成物はまた更に、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン／ビニル酢酸、ポリビニルピロリドン、および同様なもののようなポリマー物質と組み合わされてもよく、ゲル形態の組成物を与え、これは塩化メチレン（ジクロロメタン）のような溶媒中に溶解され、所望の粘度にまでエバポレーションされ、次いで背後を支える材料へと適用されてパッチを与えてもよい。該化合物は、被験体の疾患もしくは病状が局在している部位もしくはその近傍の真皮を通して投与されてもよい。あるいは、該化合物は、全身投与を達成するために、影響を被っている領域以外の部位の真皮を通して投与されてもよい。
【００６１】
本発明の化合物はまた、浸透圧小ポンプもしくはその他の時間放出装置から、放出もしくは供給されてもよい。構成要素としての浸透圧小ポンプからの放出速度は、その放出口中に置かれた微小孔性即応ゲルを用いて調節されてもよい。浸透圧小ポンプは、該化合物の放出制御、つまり標的化供給に有用であるものである。
【００６２】
本発明者らは、ＳＩＲ２および関連酵素（ＳＩＲ酵素）におけるようなｉｎ  ｖｉｖｏでの転写サイレンシングを引き起こす脱アセチル化酵素活性に関して、新規なアッセイをも開発した。該アッセイは、ＳＩＲの転写サイレンシングに付される細胞中の染色体の遺伝子座において統合されたレポーター・ジーンを有する細胞を使用する。該化合物が該細胞と組み合わされ、該レポーター・ジーン活性が求められる。該化合物に晒された該細胞中でのレポーター・ジーン活性の減少が、該化合物がＳＩＲ脱アセチル化酵素活性の上昇を引き起こすことを指し示す一方、該化合物に晒された該細胞中でのレポーター・ジーン活性の上昇が、該化合物がＳＩＲ脱アセチル化酵素活性の減少を引き起こすことを指し示す。該アッセイは実施例２に例示され、そこでは、ＳＩＲ２の標的遺伝子座中へと統合された選択可能なマーカーであるレポーター・ジーンを有する遺伝子導入イースト菌中の内因性ＳＩＲ２の活性が求められる。Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒら、２００１年も参照。実施例２は、ポジティブに選択可能であるかネガティブに選択可能であるマーカーが使用されるかに依って、上昇したＳＩＲ２の脱アセチル化酵素活性が、イースト菌のコロニーの成長を促進もしくは抑制し得るアッセイを実証する。
【００６３】
これゆえ、更なる実施形態では、本発明は、細胞において、化合物がＳＩＲ酵素の脱アセチル化活性に影響を及ぼすかどうかを決定する方法に関する。該方法は、該化合物に晒されない時の該細胞と、該化合物に晒される時の該細胞との間での、レポーター・ジーン発現を比較することを含み、ここでは、該レポーター・ジーンは、ＳＩＲ酵素による転写のサイレンシングに付される該細胞中の染色体の遺伝子座において統合されており、該レポーター・ジーン発現の減少が、該細胞中でのＳＩＲ脱アセチル化活性を指し示す。
【００６４】
これらの方法は、如何なる特定の細胞にも限定されず、ＳＩＲ酵素による転写サイレンシングに付される細胞中の染色体の遺伝子座において統合されているレポーター・ジーンを有する如何なる真核細胞、原核細胞、もしくは古細菌細胞を用いても使用され得、または、特徴的なものを持つよう構築され得る。好ましい実施形態では、該細胞は、実施例２において用いられたようなイースト菌細胞である。
【００６５】
該レポーター・ジーンは、ＳＩＲ酵素による転写サイレンシングに付される如何なる遺伝子座、例えば実施例２におけるような細胞の例えばテロメア、ｒＤＮＡの並び、もしくは成熟して沈黙化したタイプの遺伝子座においても、利用され得る。
【００６６】
これらの方法はまた、如何なる特定のレポーター・ジーンの使用にも限定されない。該レポーター・ジーンは、例えば該レポーター・ジーン産物として緑色蛍光タンパクもしくは過酸化酵素を使用することにより、例えば該レポーター・ジーン産物の抗原もしくはエピトープのイムノアッセイにより、または、色もしくは蛍光の増加の観察もしくはスペクトル光測定により、検出可能とされてもよい。これらの実施形態は、特定の化合物を用いて処理された細胞と、処理されなかったかまたはポジティブもしくはネガティブ・コントロール化合物を用いて処理された細胞との間での、転写サイレンシングの差の定量的もしくは半定量的測定に与する。これゆえ、（該テスト化合物）対（他の化合物）の相対的な有効性を求めることができる。
【００６７】
他の実施形態では、該レポーター・ジーンは、選択可能なマーカーである。非限定例には、実施例２におけるような、ＡＤＥ２遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、もしくはＴＲＰ１遺伝子が包含され、そこでは、細胞のコロニーの成長が、活性化合物を同定するための該マーカーとして利用され得る。
【００６８】
これらの方法において利用されるＳＩＲ酵素は細胞中に天然にあり得るか、または、遺伝子導入ＳＩＲ酵素が細胞中へと遺伝子操作され得、例えば、哺乳類（例えばヒト）を遺伝子操作するか、または、キメラＳＩＲ酵素が遺伝子導入され、イースト菌細胞において発現される。例えば、Ｓｈｅｒｍａｎら（１９９９年）およびＨｏｗｉｔｚら（２００３年）参照。
【００６９】
これらの方法は、ＳＩＲ２α、ＳＩＲ２Ａ、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ２ｐ、ＳＩＲＴ１ｐ、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、およびＳＩＲＴ７を包含する、今既知もしくは後に発見される如何なるＳＩＲ酵素を用いても、使用され得る。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態が、以下の実施例において記載される。本請求項の範囲内の、本明細書における他の実施形態が、本明細書において開示されるとおりの本発明の明細書もしくは実施を考慮することにより、当業者には明らかである。以下の実施例と一緒に、本明細書は例示的であるとのみ考慮され、本発明の範囲および思想が本請求項により指し示されよう意図され、以下に実施例を伴う。
【実施例】
【００７１】
実施例１．ニコチンアミドによるＳＩＲ２制御は、塩基交換と脱アセチル化の化学との間でのスウィッチングから結果もたらされる
本実施例の要約
イースト菌における寿命の制御および遺伝子のサイレンシング阻害は、ＳＩＲ２酵素へのニコチンアミドの効果と結び付けられて考えられるようになってきた。ＳＩＲ２酵素はＮＡＤ＋依存タンパク脱アセチル化酵素であり、脱アセチル化されたタンパク、ニコチンアミド、および２’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰＲを形成させることにより、遺伝子発現に影響を与える。ニコチンアミドは塩基交換基質であり、生物学的に効果的な阻害剤である。該塩基交換反応の特徴付けにより、脱アセチル化と塩基交換との間でのスウィッチングによりニコチンアミドがＳＩＲ２を制御することが、明らかにされる。ニコチンアミドによるスウィッチングが、Ａｒｃｈｅａｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ＡＦ２）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＳＩＲ２ｐ）、およびマウス（ＳＩＲ２α）からのＳＩＲ２酵素に関して、定量される。脱アセチル化の阻害は、マウスＳＩＲ２αに関して最も効果的であったが、これは、この制御メカニズムの種依存的発達を示唆した。ＳＩＲ２は、ＡＤＰＲと、アセチルリジンを有するそのタンパク基質のアセチル酸素との間で、比較的安定な共有結合中間体を形成すると提案されている。この中間体の寿命の間、ニコチンアミドによる触媒部位の占有が、該共有結合複合体の運命を決定する。マウス、イースト菌、およびバクテリアのＳＩＲ２に関して、そのニコチンアミド部位の飽和がそれぞれ、該中間体の９５％、６５％、および２１％を、アセチル化タンパクへと戻させる。脱アセチル化に与される該中間体の分け合いは、ニコチンアミドと、それと反対の立体化学面にある隣の２’−水酸基との間での競合から結果もたらされる。ニコチンアミドによるスウィッチングが、以前に提案されたＳＩＲ２の触媒メカニズム、および、１’−Ｏ−ペプチジル−ＡＤＰＲ・ＳＩＲ２中間体の存在を裏付ける。これらの知見は、脱アセチル化ではなく、化学交換の阻害によって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＳＩＲ２酵素触媒活性を上昇させるというストラテジー（戦略）を示唆する。
【００７２】
はじめに
ＳＩＲ２は、さもなくば化学的に単純なＮ−脱アセチル化酵素反応に、ＮＡＤ＋およびニコチンアミドを巻き込んだ触媒的に複雑なメカニズムを進化させてきた。ペプチド基質との反応は、アセチルエステル（酢酸エステル）代謝物２’−および３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰＲ（Ｓａｕｖｅら、２００１年；ＪａｃｋｓｏｎおよびＤｅｎｕ、２０００年）、ニコチンアミド、および脱アセチル化されたリジン側鎖を生成させる。塩基交換と脱アセチル化反応とを一体化させる該化学的メカニズムは、活性部位からニコチンアミドを放出させる共有結合１’−Ｏ−ペプチジルアミデート−ＡＤＰＲ中間体に依る（Ｓａｕｖｅら、２００１年）。この中間体は、上昇した濃度のニコチンアミド存在下（スキーム１Ａ）、ＮＡＤ＋の再生を可能にするのに充分安定である。このメカニズムは、該塩基交換反応を可能にするタンパクアセチルリジン基質に対しての必要性を説明し、活性部位の変異生成研究、放射性同位元素による標識、およびＸ線結晶から報告される信頼できる情報（Ｍｉｎら、２００１年；Ｓａｕｖｅら、２００１年；ＪａｃｋｓｏｎおよびＤｅｎｕ、２００２年）全てに整合する。
【００７３】
ここに我々は、Ａｒｃｈｅａｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ＡＦ２）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＳＩＲ２ｐ）、およびマウス（ＳＩＲ２α）からのＳＩＲ２酵素に関して、その塩基交換および阻害速度論を特徴付けする。これらの結果は、塩基交換およびニコチンアミド阻害両方が、単一酵素中間体の化学的反応性の結果であることを確立する。興味深いことに、イースト菌のニコチンアミド阻害およびバクテリア酵素の脱アセチル化は、上昇したニコチンアミド濃度では不完全である。３種の酵素全てに関する阻害パターンは、ある反応メカニズムにより説明可能であり、ここでは塩基交換および脱アセチル化が、ＳＩＲ２ペプチジルＡＤＰＲ中間体の二股の反応性から発する競合的化学プロセスである。この解釈は、該化学メカニズム、反応配位エネルギー論、およびＳＩＲ２酵素制御へ、新たな見方を与える。ＳＩＲ２の脱アセチル化触媒活性を上昇させる戦略は、この新規なメカニズムから明らかである。
【００７４】
結果
ニコチンアミド交換および阻害の速度論
幾つかのＳＩＲ２酵素は、アセチルリジンを有するタンパクもしくはペプチド基質存在下、放射標識ニコチンアミドのＮＡＤ＋への化学的交換を触媒すると示されている（Ｌａｎｄｒｙら、２０００年；Ｍｉｎら、２００１年；Ｓａｕｖｅら、２００１年）。しかしながら、塩基交換の速度論的および化学的メカニズムは、報告されていない。ＳＩＲ２により触媒される交換の速度が、飽和ＮＡＤ＋およびペプチド基質を用いて、［カルボニル−１４Ｃ］ニコチンアミドの関数として測定された（Ｓａｕｖｅら、２００１年）。ＡＦ２、マウス、およびイースト菌ＳＩＲ２酵素に関するニコチンアミド塩基交換に関するＫｍ値がそれぞれ、３６μＭ、１２７μＭ、および１６０μＭと求められた（図１および表１）。
【００７５】
【表１】
2007535475.tif 000012
【００７６】
同じ実験中、混合物中のＡＤＰＲおよび３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰＲ産物が、塩基交換反応に比較した脱アセチル化反応の速度を比較するために測定された。これらの化合物の産生は化学量論的にリジンの脱アセチル化とリンクしており、脱アセチル化を定量するのに使用され得る（Ｓａｕｖｅら、２００１年；ＪａｃｋｓｏｎおよびＤｅｎｕ、２００２年；Ｔａｎｎｅｒら、２０００年；ＴａｎｎｙおよびＭｏａｚｅｄ、２００１年）。脱アセチル化の速度は、阻害されない場合の速度の％として表され、ニコチンアミド濃度の関数としてプロットされる（図２）。ニコチンアミド濃度が上昇するに連れ、産物形成速度は減少したが、ニコチンアミドはバクテリアおよびイースト菌の酵素に関して完全な阻害を惹起しなかった（図２Ａ）。それぞれ阻害されない場合の約７９％および３５％の速度が、ｍＭ（オーダー）のニコチンアミド濃度において保たれた。マウスの酵素に関しては、＞９５％の阻害が、高いニコチンアミド濃度において発生した（図２Ａ）。Ｄｉｘｏｎプロット（１／ν対［Ｉ］）は、ＡＦ２およびイースト菌の酵素に関しては双曲線であったが、マウスの酵素に関しては直線であった（図２Ｂ，Ｃ）。これら３種の酵素に関するＮＡＤ＋に関するＫｍは、これらの条件に関して１００〜２００μＭの範囲中である。２ｍＭまでのニコチンアミド濃度の上昇は、これら３種の酵素のいずれに関しても、脱アセチル化もしくは交換速度に関するプラトー（高止まり、踊り場）を変えるものではなく（データ示さず；誤差±５％）、ＮＡＤ＋結合に関してのニコチンアミドの競合が８ｍＭ過剰であることを実証した。
【００７７】
バクテリアおよびイースト菌の酵素のニコチンアミド阻害は、単一の結合部位における非競合的相互作用に一致しており、解離定数Ｋｉを有していた。分画毎の阻害は、該部位の飽和により発生し、曲線ν対Ｉについてν＝ｋｃａｔ−ｋｐ（［Ｉ］／Ｋｉ＋［Ｉ］）として、曲線１／ν対Ｉについて１／ν＝１／ｋｃａｔ−ｋｐ（［Ｉ］／Ｋｉ＋［Ｉ］）として表され、ここで、νは脱アセチル化速度であり、［Ｉ］はニコチンアミド濃度であり、ｋｐは該部位が飽和される場合の該脱アセチル化反応が減少するまでの伸展であり、ｋｃａｔは阻害剤が存在しない場合の飽和ＮＡＤ＋およびペプチドにおける脱アセチル化反応速度である。［Ｉ］＞＞Ｋｉの場合、曲線ν対Ｉは漸次、ｋｉｎｈ値＝ｋｃａｔ−ｋｐに近づく（図２）。ｋｉｎｈ値は、ニコチンアミド飽和時に残った脱アセチル化速度であり、表１に与えられる。Ｋｉの決定は各酵素に関して、Ｋｍ（交換）との比較を可能にする。これらの値は実験誤差内であり、１つの部位が、脱アセチル化および塩基交換の阻害を司ることを指し示している（表１）。
【００７８】
交換／アセチル（基）転移に関する種による特異性
各酵素に関しての、ｋｃａｔ（交換）と対応するｋｃａｔ（脱アセチル化）との比較（表１）は、これらのパラメーターが酵素特異的であることを明らかにするものである。バクテリアの酵素に関しては、ｋｃａｔ（交換）の測定値は、ｋｃａｔ（脱アセチル化）より５．１倍遅い。対照的に、イースト菌およびマウスの酵素に関してはそれぞれ、ｋｃａｔ（交換）の値は、ｋｃａｔ（脱アセチル化）の値を３．５および１１倍超過する。交換対脱アセチル化という効率は阻害を占うものであり、これゆえ、バクテリアの酵素はニコチンアミドにより中程度に阻害され、マウスの酵素が最も阻害される（図２Ａ〜Ｃ）。この関係は、これら３種の酵素に関して、ｋｐ／ｋｃａｔ（脱アセチル化）対ｋｃａｔ（交換）／（ｋｃａｔ（脱アセチル化）＋ｋｃａｔ（交換））の比のプロットとして要約される（図３）。この直線に近い関係は、交換および脱アセチル化がそれぞれ速度定数ｋ４およびｋ５に従って、共通中間体に関して競合するとの提案により裏付けられる（スキーム１）。脱アセチル化速度はニコチンアミドなしで最大であり、その存在が該中間体のミカエリス複合体への化学的逆行を引き起こす。
【００７９】
塩基交換反応の阻害
脱アセチル化と交換との間でのニコチンアミド・スウィッチは、交換の基質として不活性なニコチンアミド・アナログ（類似体）が有意に脱アセチル化を阻害しないことを予見させるが、これは、それらが化学的にＡＤＰＲ−ペプチジル中間体を捕捉できないからである（スキーム１）。表２のニコチンアミド・アナログは５ｍＭの濃度において、バクテリアもしくはイースト菌の酵素に関してはＳＩＲ２による脱アセチル化を阻害せず、マウスの酵素の中程度の阻害のみ観察された。テストされた化合物のいずれもが、ニコチンアミドの飽和濃度において、イースト菌の酵素に関してはＳＩＲ２による塩基交換の有効な阻害剤ではなかった（表２）。３５Ｍの［カルボニル−１４Ｃ］ニコチンアミドおよび４２ｍＭのイソニコチンアミド存在下にイースト菌のＳＩＲ２による脱アセチル化および塩基交換が実施される特殊な条件は、交換速度の４０％の減少と、対応して脱アセチル化速度の５％の減少を与えた（表２）。
【００８０】
【表２】
2007535475.tif 000013
【００８１】
中間体形成および中間体分解の速度定数
マウスおよびイースト菌の酵素に関して、スキーム１に定義された速度定数ｋ３、ｋ４、およびｋ５は、もっともな仮定を用いて得られる。これらの酵素に関して、少なくとも３倍ｋｃａｔ（交換）＞ｋｃａｔ（脱アセチル化）である。それらは共通の速度定数ｋ３を共有するので、少なくとも３倍ｋ３＞ｋ５およびｋ４＞ｋ５である。これゆえ、我々は、ｋ５＝ｋｃａｔ（脱アセチル化）を仮定する。ｋ４／ｋ５＝ｋｃａｔ（交換）／ｋｉｎｔ（ここで、ｋｉｎｔとは、残った脱アセチル化速度である）という関係は、前記した２つの競合速度の比を反映し、ＡＤＰＲ中間体を消失させる。これらの比は、マウス、イースト菌、およびバクテリアの酵素に関する阻害に関してそれぞれ、２２０、９．８、および０．２５である。ｋ５を使用したｋ４の算出は、ｋ３が、マウスおよびイースト菌の酵素に関する交換に限定的な速度であると決定するものである。これゆえ、最終的な速度は、ｋ３＝ｋｉｎｈ＋ｋｃａｔ（交換）と概算され得る。これらの単純な仮定は、交換速度ｋｃａｔ（交換）、脱アセチル化速度ｋｃａｔ（脱アセチル化）、および残った速度ｋｉｎｈの定量を可能にする（表３）。これらの仮定はＫｍ（交換）＝Ｋｉであると予見し、実験的に観測されたとおりである。ペプチドおよびＮＡＤ＋に関して飽和条件および平衡結合を仮定して算出された速度は、観測された実験値の２０％内に収まる。
【００８２】
【表３】
2007535475.tif 000014
【００８３】
議論
ＳＩＲ２の生物学
ＳＩＲ２酵素は、中心的な代謝物ＮＡＤ＋を使用して、アセチルリジン基により修飾され制御されるタンパクを脱アセチル化する。ＳＩＲ２タンパクに関して同定されている標的は、Ｈ３およびＨ４ヒストンＮ末尾（Ｌａｎｄｒｙら、２０００年；Ｉｍａｉら、２０００年）、ｐ５３（Ｓａｕｖｅら、２００１年；Ｖａｚｉｒｉら、２００１年；Ｌｕｏら、２００１年）、チューブリン（微小管、Ｎｏｒｔｈら、２００３年）、バクテリアのアシルＣｏＡ合成酵素（Ｓｔａｒａｉら、２００３年）、およびバクテリアのＤＮＡ結合タンパクＡｌｂａ（Ｂｅｌｌら、２００２年）を包含する。ＳＩＲ２酵素は、細胞の全体的な代謝状態に敏感であり、これに従って活性が調整されると提案されている。原則的に、該酵素は基質としてＮＡＤ＋を利用するので、それは細胞内ＮＡＤ＋濃度の変化により調節され得る（ＬｉｎおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、２００２年；Ｃａｍｐｉｓｉ、２０００年）。あるいは、ＮＡＤ＋代謝物たるニコチンアミドはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＳＩＲ２の生化学的機能を調節し得る。イースト菌における最近の生物学の研究（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年；Ｂｉｔｔｅｒｍａｎら、２００２年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００２年）は、この見方を裏付ける。ニコチンアミドは、ＮＡＤ＋代謝産物、ＳＩＲ２による反応生成物、塩基交換の基質（Ｌａｎｄｒｙら、２０００年；Ｍｉｎら、２００１年；Ｓａｕｖｅら、２００１年）、およびＳＩＲ２酵素反応阻害剤（Ｂｉｔｔｅｒｍａｎら、２００２年；Ｌａｎｄｒｙら、２０００年）である。スキーム１中のＳＩＲ２による触媒反応メカニズムによれば、交換と脱アセチル化反応との間で分かれるＡＤＰＲ中間体の酵素を交換が枯渇させるので、塩基交換触媒反応は、ＳＩＲ２による脱アセチル化の阻害を引き起こすはずである。
【００８４】
共有結合中間体の性質
ＡＤＰＲ中間体は、アセチルリジン基質のアシル酸素のＡＤＰ−リボシル化により形成され、１８Ｏを用いた研究が、Ｃ１’−Ｏ結合が該アシル酸素とＮＡＤ＋との間で形成されることを確認している（Ｓａｕｖｅら、２００１年）。この中間体は化学的には異常であるが、オキサカルベニウムイオン遷移状態の求電子性が、該アセチルペプチドの弱い求核性のアミドを捕捉するのに充分であるので、それが形成し得る。ＡＤＰ−リボシル転移反応の遷移状態の解析が、該遷移状態での弱い求核性の参画がこれらの反応の一般的な特徴であること、ならびに、ＡＤＰ−リボシルカチオンが、求核剤に関して無差別であることを示唆する（ＢｅｒｔｉおよびＳｃｈｒａｍｍ、１９９７年；ＳｃｈｅｕｒｉｎｇおよびＳｃｈｒａｍｍ、１９９７年）。加えて、グリコシルアミデートは、グリコシル転移酵素の反応における反応中間体であり、ここではそれらは可逆的に、反応中間体として形成し得る（Ｋｎａｐｐら、１９９６年；ＺｅｃｈｅｌおよびＷｉｔｈｅｒｓ、２０００年）。酵素に結合した中間体は充分な化学反応性を持ち、逆行して、ニコチンアミド存在下にＮＡＤ＋を再形成する。この交換反応は、試されている全てのＳＩＲ２酵素に対して一般的である（Ｌａｎｄｒｙら、２０００年；Ｍｉｎら、２００１年）。該中間体はまた、そのアミド体を活性化して結果的に得られる脱アセチル化産物、２’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰＲ、および脱アセチル化されたリジン基質を形成させる（Ｓａｕｖｅら、２００１年）。
【００８５】
単一部位でのニコチンアミドの作用
ニコチンアミドによる飽和は、試された濃度では、ＮＡＤ＋ともペプチドとも結合することに関しては競合せず、以前の報告と一致した（Ｂｉｔｔｅｒｍａｎら、２００２年）。ニコチンアミド２ｍＭでの、塩基交換反応のニコチンアミドによる阻害の欠如およびこれら３種の酵素を用いたＮＡＤ＋に関するＫｍ値（１００〜２００μＭ）に基づくと、ニコチンアミドとＮＡＤ＋との間の競合に関するＫｉは、８ｍＭ過剰である。ニコチンアミドによる脱アセチル化の阻害は全体的に、ＮＡＤ＋およびアセチル（化）タンパクを再形成させる前記共有結合中間体との塩基の相互作用により、説明される。異常だが、塩基の逆行は、ＡＤＰ−リボシル転移酵素／環化酵素ＣＤ３８に関するニコチンアミド交換に関する飽和速度論により導き出される（Ｓａｕｖｅら、１９９８年）。
【００８６】
ニコチンアミドによる種依存的阻害
イースト菌およびバクテリアのＳＩＲ２は、＞１０Ｋｉのニコチンアミド濃度でさえ、ニコチンアミドによる部分阻害を示す（データ示さず）。脱アセチル化速度は２１％および６５％抑えられたが、マウスの酵素は１６０μＭのＫｉ値で、ニコチンアミドにより９５％阻害された。脱アセチル化を弱め、交換を上昇させるニコチンアミドに関する単一部位での速い交換による結合モデルは、全実験データと一貫している。マウスＳＩＲ２が最も阻害されるとの観察は、哺乳類酵素がニコチンアミドによる強力な制御に付されるかも知れないことを示唆する。
【００８７】
ニコチンアミドによる部分対完全阻害のメカニズム
たとえニコチンアミド部位が飽和されても、中間体が生成物へと向かって前向きに反応する場合、前記した共有結合ＳＩＲ２メカニズムにおいて部分阻害が発生し得る。ＣＤ３８により触媒される関連するニコチンアミド交換および環化反応において、環化の完全な阻害がニコチンアミド飽和時に発生するが、これは、該共有結合ＡＤＰＲ−Ｇｌｕ中間体が、ニコチンアミドが該部位を離れるまで環化できないからである（Ｓａｕｖｅら、１９９８年；Ｓａｕｖｅら、２０００年）。ＣＤ３８に関しては、該中間体はそのβ面でのみ反応し、ニコチンアミドが他の求核剤への接近をブロックする（塞ぐ）一方、ＳＩＲ２中間体においては、αおよびβ両面で反応が起きる。
【００８８】
ＳＩＲ２中間体の化学的参画
ＳＩＲ２−ＡＤＰＲ中間体の２種類の活性は、ニコチンアミド飽和時でさえ、共通の中間体から塩基交換および脱アセチル化化学両方を触媒する酵素の能力により、実証される。交換と脱アセチル化反応との間の反応性は、ニコチンアミドが結合した場合、速度定数ｋ４（交換）とｋ５（生成物形成）とに従って生じる。この競合は、該中間体を進行および逆行に分配し、脱アセチル化の部分阻害を与える（図２Ａ，Ｂ）。該脱アセチル化および交換反応の独立性は、交換がβ表面におけるプロセスであることを確立する一方、脱アセチル化はα表面におけるプロセスである（図５−スキーム１Ｂ）。１８Ｏによる研究が、Ｃ１’でのβ面においては水が攻撃しないことを確立する一方、そのアシル（基の）カルボニル炭素の攻撃により、α面においては求核剤として作用する（スキーム１Ｃ；Ｓａｕｖｅら、２００１年）。原則的に、これら２つの立体表面により分け隔てられた化学プロセスは、お互いの立体独立性の中で作用し得、競合して該酵素上の中間体を枯渇させ得る。
【００８９】
ニコチンアミド分配比は、該中間体のβ対α表面における化学の相対比により、制御される。分画阻害プロット対ｋｃａｔ（交換）／ｋｃａｔ（脱アセチル化）比は、ニコチンアミド阻害が該比に強く相関していることを示す（図３）。該交換および脱アセチル化反応は、該中間体形成ステップのｋ３を分け合い、交換についてはｋ４、脱アセチル化についてはｋ５として定義される化学プロセスにより、該比が求められる（スキーム１Ｃ）。ｋ４もｋ５も両方遅いので、中間体の速い反応性はニコチンアミドによる不完全阻害の原因にはなりにくい。該中間体からの交換速度は、イースト菌およびマウスの酵素における脱アセチル化のステップよりも速く、典型的な酵素結合ステップに対して相対的に遅い。これゆえ、該活性中間体に関する別個の２表面競合は、ニコチンアミド阻害のもっともらしいメカニズムである。このモデルの予測は、ニコチンアミド類似体が、それらの塩基交換という挙動により、ＳＩＲ２酵素を阻害することである。ニコチンアミド類似体は、脱アセチル化の劣った阻害剤であり、塩基交換基質ではない（表２）。例外はマウスの酵素であり、この場合、４５％までの脱アセチル化速度の減少が観測される。イースト菌の酵素に関して、これらの誘導体もニコチンアミド塩基交換の劣った阻害剤であり、該中間体もしくは当該酵素のａｐｏ形態への貧弱な結合を示唆している。
【００９０】
脱アセチル化／交換比を変える
脱アセチル化／交換比の操作に関する概念の証明として、低いニコチンアミド濃度および上昇したイソニコチンアミド濃度は、交換対コントロール（比）の４０％の減少に至ったが、脱アセチル化においては僅か５％の減少であった（表２）。これゆえ、塩基交換は、脱アセチル化を凌駕して、優先的に阻害され得る。この結果は、該中間体の化学プロセスの独立性と一貫性がある。イソニコチンアミドおよびニコチンアミドの競合的結合は結果的に、脱アセチル化（α面）には殆ど効果を有さず、塩基交換（β面）の減少を与える。
【００９１】
ＳＩＲ２に関する反応配位ダイヤグラム
反応配位ダイヤグラムは、ＳＩＲ２による触媒化および阻害のエネルギー・モデルを例示するものである（図４）。マウスおよびイースト菌の酵素に関する反応配位は、ＡＤＰＲ中間体が、これらＳＩＲ２酵素の遅い触媒速度特性を説明する大きなエネルギー障壁により、孤立していることを示す。これらの障壁は、安定な該中間体ならびに基質と生成物との結合ステップの平衡化を実証する。バクテリアの場合、該中間体のエネルギーは確認され得なかった。ニコチンアミドによる僅かな阻害は、障壁高さの調節、第１中間体における平衡効果、あるいは両者であることがある。脱アセチル化速度が不変であれば、該中間体のエネルギーを上昇させると、ニコチンアミドによる逆行に対する該酵素中間体の感受性を増加させる。マウスおよびイースト菌の酵素を阻害するニコチンアミドの能力の違いは、ＡＤＰＲ中間体、そのミカエリス複合体、および生成物間の障壁によるものである。マウスの酵素に関して、その平衡定数はそのミカエリス複合体にとって好ましいものであり、ニコチンアミドによる阻害は＞９５％であった（表３）。イースト菌の酵素に関して、この平衡値は０．４８であり、ｍＭ（オーダー）のニコチンアミドによる阻害は、阻害なしの場合の速度の６５％であった（表３）。ニコチンアミド濃度が低い場合、該中間体の不安定化は触媒効率を毀損しないと思われるが、これは該中間体が、該酵素からのニコチンアミドの解離により、捕捉されるからである。
【００９２】
結論
ここに表示されるＳＩＲ２による触媒メカニズムは、ニコチンアミドによる阻害を、ペプチジルＡＤＰＲ中間体のその化学的な攻撃の結末であると解釈する。このデータは、ＳＩＲ２による塩基交換および脱アセチル化に関して提唱された反応メカニズム（Ｓａｕｖｅら、２００１年）を用いて、完全に解析され得る。これらの知見は、細胞でのＳＩＲ２の活性を上昇させる化学的手段を示唆する。ニコチンアミドの分解が、阻害からＳＩＲ２を解放する道として示唆されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年）。あるいは、塩基交換を阻害できるが脱アセチル化を阻害できないニコチンアミド類似体が、ＳＩＲ２のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性化を引き起こすと思われ、現在調査中である。
【００９３】
方法および材料
イースト菌のＳＩＲ２ｐが、Ｇｕａｒｅｎｔｅ研究室の好意により提供されたプラスミドから発現された（Ｉｍａｉら、２０００年）。バクテリアのＳＩＲ２Ａｆ２が、Ｗｏｌｂｅｒｇｅｒ研究室の好意により提供されたプラスミドから発現された（Ｓｍｉｔｈら、２０００年）。マウスのＳＩＲ２酵素が、精製された形態で、Ｕｐｓｔａｔｅグループから入手された。逆相ＨＰＬＣが、Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  ６００ポンプ、７１７オート・サンプラー、および２波長２４８６検出器上で実施された。ｐ５３ペプチドが、市販品から入手された。
【００９４】
ＳＩＲ２による交換および脱アセチル化のアッセイ
３００μＭのＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫ（ＫＡｃ）ＬＭＦＫＴＥＧペプチドを含有するｐＨ７．８の５０ｍＭのリン酸カリウムと、選択された濃度（０、１０、２０、３０、４５、６０、８０、９０、１２５、２５０、３６０、６００、１２００）の６０μＣｉ／モルの［カルボニル−１４Ｃ］ニコチンアミドを含有する６００ＭのＮＡＤ＋との反応混合物５０μＬが、濃縮酵素１μＬ添加として添加された１μＭのＳＩＲ２酵素と共に反応された。２時間後、１０μＬが、０、３０、６０、９０、および１２０分において分取された。各分取は、ｐＨ５．０の５０μＬの５０ｍＭ酢酸アンモニウムと組み合わされてクウェンチされ（反応を止め）、脱アセチル化産物およびＮＡＤ＋に関して、ＨＰＬＣによりアッセイされた。準分取用のＷａｔｅｒｓＣ−１８カラム上（流速２．０ｍＬ／分）、溶出液としてｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸アンモニウムを使用して、そのクロマトグラム（２６０ｎｍ）が得られた。ＡＤＰＲおよび３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰＲに関するピークが、積分により定量化された。ＮＡＤ＋に関するピークが収集され、放射能が計数された。速度対ニコチンアミド濃度のプロットは、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈの曲線適合性を有する曲線ν＝ｋｃａｔ［Ｓ］／（［Ｓ］＋Ｋｍ）を使用して、適合された。脱アセチル化速度対ニコチンアミドのプロットは、テキスト中に記載された式に適合された。２ｍＭのニコチンアミドを用いた実験は、ＳＩＲ２酵素による脱アセチル化および交換活性におけるこの濃度効果を確認した。
【００９５】
ニコチンアミドのアイソスターを用いた脱アセチル化阻害
反応は上記のとおりだったが、塩基反応は、５ｍＭのピラジンアミド、イソニコチンアミド、チオニコチンアミド、もしくはベンズアミドを含有した。反応は３７℃において、イースト菌の酵素およびＡＦ２に関して２時間、マウスの酵素に関して３時間実施され、ｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸アンモニウム８０μＬの添加により、クウェンチされた。生成物の形成は、ＨＰＬＣにより定量された。ＣＤ３８は、チオニコチンアミド−ＮＡＤ＋を合成した。速度は、添加されるべき塩基を欠いたコントロールと比較された。
【００９６】
実施例２．
ニコチンアミドによる阻害からの解放による、Ｓｉｒ２依存性転写サイレンシングの、化学的活性化
実施例の要約
小分子エフェクターによる酵素活性のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性化は、稀である。Ｓｉｒ２の通常でないメカニズム（Ｉｍａｉら、２０００年；Ｌａｎｄｒｙら、２０００年；Ｓｍｉｔｈら、２０００年；Ｓａｕｖｅら、２００１年）および制御特性（Ｌｉｎら、２０００年；Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎら、２００２年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００２年；Ｓａｎｄｍｅｉｅｒら、２００２年；Ｂｉｔｔｅｒｍａｎら、２００２年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年；Ｌｉｎら、２００４年；Ｌｉｎら、２００３年）は、転写サイレンシングのｉｎ  ｖｉｖｏでの活性化を達成する小分子の接近を示唆する（Ｒｕｓｃｈｅら、２００３年）。Ｓｉｒ２によるＮＡＤ＋依存性タンパク脱アセチル化は、ＡＤＰ−リボシル−イミデート中間体を含んでいる（Ｓａｕｖｅら、２００１年）。ニコチンアミドは、この中間体の化学的枯渇により、Ｓｉｒ２脱アセチル化酵素活性を阻害するが（ＳａｕｖｅおよびＳｃｈｒａｍｍ、２００３年；Ｊａｃｋｓｏｎら、２００３年）、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳｉｒ２のニコチンアミド阻害の重要性が議論される（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年；Ｌｉｎら、２００４年；Ｌｉｎら、２００３年）。我々は、Ｓｉｒ２の触媒活性のニコチンアミドによる阻害が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではイソニコチンアミドにより拮抗され、Ｓｉｒ２の脱アセチル化活性の上昇に至ることを実証する。更に、イソニコチンアミドは実質的に、Ｓｉｒ２により制御される遺伝子座における転写のサイレンシングを上昇させる。これらの研究は、小分子アゴニストがＳｉｒ２のニコチンアミドによる阻害を救済し、ニコチンアミドがＳｉｒ２の外因性制御因子であるとの生化学的証拠を与え得ることを実証する。
【００９７】
結果および考察
イースト菌のＳｉｒ２は、ＮＡＤ＋を使用するクラスＩＩＩヒストン脱アセチル化酵素であって、クロマチンにおいて、ヒストンＨ３およびＨ４のＮ末尾のアセチルリジン残基を脱アセチル化する（Ｉｍａｉら、２０００年；Ｌａｎｄｒｙら、２０００年；Ｓｍｉｔｈら、２０００年）。Ｓｉｒ２の機能は、ヘテロクロマチンの形成および拡大に、ならびに、サイレンシングされて成熟したタイプのその遺伝子座、テロメア、およびその繰り返しｒＤＮＡにおける転写のサイレンシングに必要である（Ｒｕｓｃｈｅら、２００３年）。ＳＩＲ２遺伝子投与量を増やすと、転写のサイレンシングおよびゲノムの安定性が増し、イースト菌の複製生活環の延長に至る（Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎら、１９９９年）。カロリー制限および高浸透圧も、Ｓｉｒ２依存性経路を通して、イースト菌の寿命を延ばす（Ｌｉｎら、２０００年；Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎら、２００２年）。これらの刺激は、Ｓｉｒ２タンパク濃度を上昇させることなく、Ｓｉｒ２触媒活性を上向かせる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００２年）。しかしながら、上向かせるメカニズムおよびＳｉｒ２活性の外因性制御因子（単数もしくは複数）は、議論が尽きないままである。ニコチンアミド（Ｂｉｔｔｅｒｍａｎら、２００２年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年）、ＮＡＤＨ（Ｌｉｎら、２００４年）、およびＮＡＤ＋（Ｉｍａｉら、２０００年；Ｌａｎｄｒｙら、２０００年；Ｓｍｉｔｈら、２０００年；Ｌｉｎら、２０００年）が各々、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳｉｒ２触媒反応の原則的な制御因子として提案されている。細胞ストレスは、Ｓｉｒ２制御因子濃度を低下させると思われている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年；Ｌｉｎら、２００４年；Ｌｉｎら、２００３年）。カロリー制限は、イースト菌から霊長類までの生物の寿命を延ばし、ｓｉｒｔｕｉｎは、多細胞真核生物の寿命および細胞生存率に影響を及ぼすので（ＴｉｓｓｅｎｂａｕｍおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、２０００年；Ｖａｚｉｒｉら、２００１年；Ｌｕｏら、２００１年）、Ｓｉｒ２制御の問題は現在、Ｓｉｒ２生物学の最前線にある（ＨｅｋｉｍｉおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、２００３年）。ニコチンアミド阻害に基づいてＳｉｒ２制御を理解することは、遺伝子的方法から独立した、ｓｉｒｔｕｉｎ機能の単刀直入な調節を与えるＳｉｒ２活性の化学的制御のためのストラテジーを開発するのに使用され得る。
【００９８】
Ｓｉｒ２による脱アセチル化化学は、ニコチンアミド、リジンのアミノ基、およびその通常でない代謝物２’−Ｏ−アセチルＡＤＰＲ（Ｓａｕｖｅら、２００１年）を与える（図６ａ）。その触媒メカニズムは、長寿命のペプチジルイミデート中間体の形成により、開始される。ニコチンアミドは、該イミデート＋酵素複合体との結合平衡に到達し、所謂塩基交換反応において反応して、アセチルリジンおよびＮＡＤ＋を再生し得る（ＳａｕｖｅおよびＳｃｈｒａｍｍ、２００３年；Ｊａｃｋｓｏｎら、２００３年。図６ａ、ｋ４）。この反応は、ニコチンアミドによる脱アセチル化阻害を引き起こす通常の定常状態の回転の間に、該イミデート中間体を枯渇させる（ＳａｕｖｅおよびＳｃｈｒａｍｍ、２００３年；Ｊａｃｋｓｏｎら、２００３年）。これらの知見は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのニコチンアミド濃度変化が、Ｓｉｒ２機能を制御し得るとの提案に一致する（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年；Ｇａｌｌｏら、２００４年）。ニコチンアミドによるＳｉｒ２の不完全な阻害は、ニコチンアミドとリボース環の２’−ヒドロキシル基とが独立に、該ペプチジルイミデートと反応するというメカニズムを裏付ける（図７ｂ。ＳａｕｖｅおよびＳｃｈｒａｍｍ、２００３年）。ヒストンＨ４のＮ末端ペプチドの脱アセチル化はニコチンアミドにより阻害され（Ｋｉ＝１００μＭ）、阻害を受けない速度の１９％まで漸次減少する。この限界は、塩基交換と脱アセチル化反応との間での該イミデート＋酵素複合体の分配を樹立し、速度定数ｋ４とｋ５との比により記述される（図１ａ。ＳａｕｖｅおよびＳｃｈｒａｍｍ、２００３年）。これゆえ、Ｓｉｒ２の化学的メカニズムは、そのニコチンアミド部位において結合した非反応性ニコチンアミド・アイソスターが選択的に塩基交換を妨げ、これにより脱アセチル化速度を上昇させるものと予見させる（図６ｂ。ＳａｕｖｅおよびＳｃｈｒａｍｍ、２００３年）。
【００９９】
この予見を評価するために、我々は、塩基交換速度および脱アセチル化速度への、イソニコチンアミドの効果を実証した。イソニコチンアミドは、Ｖｍａｘに有意な影響を与えることなく、塩基交換に関しての見かけのＫｍ値を増加させたが（図７ａ）、これは、ニコチンアミド結合への特異的競合的効果と、ＮＡＤ＋およびペプチド結合への非競合的効果とに整合する（図６ｃ）。イソニコチンアミドに関するＫｉは、これらの曲線に基づいて６０ｍＭである。１００ｍＭまでのイソニコチンアミド濃度は塩基交換を阻害するが、ニコチンアミド非存在下には、脱アセチル化速度に実質的な影響を与えない（図７ｂ）。ニコチンアミドは、イソニコチンアミド０ｍＭにおいて、Ｋｉ（脱アセチル化）とＫｍ（交換）との間で良好な一致を見ながら（ＳａｕｖｅおよびＳｃｈｒａｍｍ、２００３年）、脱アセチル化を阻害する（図７ｂ）。イソニコチンアミドは脱アセチル化を阻害しないが、競合的に塩基交換を阻害するので、イソニコチンアミドは、脱アセチル化のニコチンアミドによる阻害のアンタゴニストとして作動すると予見される。従って、ニコチンアミドに関するＫｉ（脱アセチル化）値は、イソニコチンアミド濃度と共に上昇した（図７ｂ）。これゆえ、イソニコチンアミドは直接、当該塩基交換反応において、ニコチンアミドとの競合的阻害により、ニコチンアミドによる脱アセチル化阻害のアンタゴニストとして作動する。
【０１００】
生理学的ニコチンアミド濃度は、５０〜４００μＭであると推定されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年）。１００μＭ程度の低濃度では、細胞中のＮＡＤ＋濃度から独立して、Ｓｉｒ２触媒反応を阻害すると予見される（Ｂｉｔｔｅｒｍａｎら、２００２年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年）。我々は、１２５μＭの［カルボニル−１４Ｃ］ニコチンアミド存在下、塩基交換および脱アセチル化活性へのイソニコチンアミド濃度の効果を検証した。塩基交換は、イソニコチンアミド濃度が上昇するに連れ阻害される。逆に、脱アセチル化活性は、同じイソニコチンアミド濃度範囲に亘り、４５％も阻害される（図７ｃ）。これらの条件下での塩基交換の阻害および脱アセチル化の活性化は、ニコチンアミドによるＳｉｒ２機能の制御が、前記イミデート＋酵素中間体に結合しているイソニコチンアミドにより解放され得ることを示唆する（図１）。
【０１０１】
外因性では通常濃度のニコチンアミドがｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＳｉｒ２機能を阻害するならば（図６ｃ）、イソニコチンアミドがＳｉｒ２により制御される遺伝子座での遺伝子のサイレンシングを増強させると予期される。我々は、Ｓｉｒ２依存性転写サイレンシングに付される染色体の遺伝子座各々に統合されたレポーター・ジーンの発現への、イソニコチンアミドの効果を検証した。テロメアのＵＲＡ３遺伝子（ＴＥＬ−ＶＩＩＬ−ＵＲＡ３）のサイレンシングは、５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）に対する耐性を与える。イソニコチンアミドは、該テロメアＵＲＡ３遺伝子のサイレンシングを増強させ、ＦＯＡ含有培地でのコロニー成長の約１０倍の増加により指し示されるとおりであった（図８ａ）。特記すべきは、イソニコチンアミドは、非選択培地でのコロニー生存数への効果を全く有さなかった。前記した競合的結合メカニズム（図６）と一致して、ニコチンアミド含有培地（サイレンシングを阻害する、Ｂｉｔｔｅｒｍａｎら、２００２年）へのイソニコチンアミドの添加は、中間的成長表現型を生成させた（図８ａ）。このテロメアのレポーター・ジーンへのイソニコチンアミドの増強されたサイレンシング効果は、ヒストンＨ３の７９番リジンのメチル化において不完全であるｄｏｔ１Δ株において特に、発揮された（＞１０３倍）。この株では、サイレンシングは、そのテロメアからのＳｉｒタンパクの分散により抑制される（ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎら、２００２年）。これゆえ、ｄｏｔ１Δ株においてイソニコチンアミドにより引き起こされた、テロメアの増強されたサイレンシングは、この効果のＳｉｒ２特異性を実証するものである。これらの株（ＴＥＬ−ＶＲにおいて統合されたＡＤＥ２）における第２のテロメア・マーカーのサイレンシングも、イソニコチンアミドにより増強される（データ示さず）。
【０１０２】
成熟してサイレンシング化されたタイプの遺伝子座でのＳｉｒ２活性へのイソニコチンアミドの効果は、トリプトファンを欠いている培地での成長により、ＨＭＲ：：ＴＲＰ１株において測定された（図８ｂ）。ＴＲＰ１のサイレンシングは、Ｔｒｐ−培地での成長を抑制する。イソニコチンアミドの、Ｓｉｒ２活性を上昇させる能力に整合して、Ｔｒｐ−培地での成長は、この化合物を欠いている培地に比較して、有意に（１０３〜１０４倍）抑制された。逆に、ニコチンアミドにより引き起こされるサイレンシングの減少は結果的に、Ｔｒｐ−培地での成長の促進に繋がった。いずれの化合物も、遺伝子的に同系列のｓｉｒ２Δ株の成長表現型を変化させなかった。これゆえ、テロメア遺伝子座において実証されたとおり（図８ａ）、ニコチンアミドおよびイソニコチンアミドの効果は、これらのアッセイ条件下では、Ｓｉｒ２に関して特異的である。イソニコチンアミドはまた、ＨＭＬにおいてもＳｉｒ２活性を上昇させた。ＦＯＡ含有培地、ＨＭＲ：：ＵＲＡ３株、ＵＣＣ３５１５、およびＵＣＣ４５７４（Ｓｉｎｇｅｒら、１９９８年）を使用して測定された（データ示さず）。
【０１０３】
Ｓｉｒ２はまた、核小体（仁）へと局在化し、ここで、そのｒＤＮＡ上で、特殊化されたクロマチン構造を行き渡されるよう機能する（Ｒｕｓｃｈｅら、２００３年）。該ｒＤＮＡの並び中へと挿入された、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写された遺伝子のサイレンシングは、ＳＩＲ２遺伝子投与量に鋭敏であり（Ｓｍｉｔｈら、１９９８年；Ｆｒｉｔｚｅら、１９９７年）、ニコチンアミドにより減少される（Ｂｉｔｔｅｒｍａｎら、２００２年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年；Ｇａｌｌｏら、２００４年）。ＦＯＡに対するＲＤＮ１：：ＵＲＡ３株の耐性は、イソニコチンアミドが該ｒＤＮＡ遺伝子座でのサイレンシングを増強させることを示唆する（図８ｃ）。これゆえ、イソニコチンアミドは、３種類全タイプのサイレンシング化された遺伝子座において、ｉｎ  ｖｉｖｏでＳｉｒ２活性を上昇させる。更に、該テロメア遺伝子座およびＨＭ遺伝子座に関して、イソニコチンアミドの効果が、ポジティブおよびネガティブ両方の選択アッセイにおいて、多重にレポーター・ジーンを使用して実証された。
【０１０４】
ＰＮＣ１によりコード化されるニコチンアミダーゼの発現増強が、種々のストレス条件に対する応答において観察されており（Ｓｍｉｔｈら、１９９８年参照）、カロリー制限された細胞において起きると提案されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年）。ＰＮＣ１の過剰発現は、Ｓｉｒ２依存的サイレンシングを増強し、寿命を延ばし、これらのプロセスにおける外因性ニコチンアミドの阻害的効果を抑え得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００３年；Ｇａｌｌｏら、２００４年）。増強されたイソニコチンアミドによるサイレンシングが、Ｓｉｒ２への直接の効果（図６ｂ）よりむしろ、ＰＮＣ１誘導から生じたのかどうか述べるために、我々は、ｐｎｃｌΔ株におけるイソニコチンアミド効果を検証した。他の研究（Ｓａｎｄｍｅｉｅｒら、２００２年；Ｇａｌｌｏら、２００４年）と一致して、ＰＮＣ１の欠損は、テロメアＵＲＡ３遺伝子において、サイレンシング不全を発生させる（ＴＥＬ−ＶＲ−ＵＲＡ３、図９）。この不全は容易に、イソニコチンアミド添加により覆され、ＦＯＡ含有培地でのコロニー成長の増大発揮（＞１０４倍）により指し示されるとおりであった（図９）。同様に、ｐｎｃｌΔ株におけるＨＭＲ遺伝子座（ＨＭＲ：：ＴＲＰ１）でのサイレンシングは、イソニコチンアミドにより強く増強され、Ｔｒｐ−培地での成長の劇的な抑制（１０３倍）を生み出した（図９）。期待どおり、これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳｉｒ２活性のイソニコチンアミドによる活性化が、Ｐｎｃ１から独立していることを実証する。
【０１０５】
前記したＮＡＤ＋救出経路において、Ｐｎｃ１によるニコチンアミドの脱アミド化はニコチン酸を生成させ、これは、ＮＰＴ１遺伝子産物により、対応するモノヌクレオチドへと変換される。ＮＰＴ１欠損は２〜３倍、細胞内ＮＡＤ＋濃度を低下させ、転写サイレンシングを弱め、カロリー制限による寿命の延びを廃する（Ｓｍｉｔｈら、２０００年；Ｓａｎｄｍｅｉｅｒら、２００２年；Ｌｉｎら、２００４年）。にもかかわらず、イソニコチンアミドは、ｎｐｔｌΔ株において、テロメアのレポーター・ジーン発現を増強させる（図９）。これゆえ、Ｓｉｒ２のイソニコチンアミドによる活性化はＮｐｔ１に依存しておらず、減少した濃度のＮＡＤ＋にかかわらず発生する。鍵を握るＮＡＤ＋救出酵素存在下および非存在下において（図８および９）転写サイレンシングを増強させるイソニコチンアミドの能力が、ニコチンアミド塩基交換にアンタゴニストとして作動するその作用のメカニズムの知識（図６および７）と一緒に、通常細胞条件下、Ｓｉｒ２脱アセチル化酵素活性の外因性エフェクターとしてのニコチンアミドに関しての積極的な証拠を与える。
【０１０６】
Ｓｉｒ２により触媒される脱アセチル化の普通でないメカニズムは、化学的介入への唯一の機会を許容し、その酵素活性を増強させる。ポリフェノール化合物は、その脱アセチル化基質とＮＡＤ＋との両方に関するミカエリス定数の変更により、Ｓｉｒ２脱アセチル化活性を上昇させると提案されている（Ｈｏｗｉｔｚら、２００３年）。対照的に、Ｓｉｒ２脱アセチル化酵素活性のニコチンアミドによる阻害およびイソニコチンアミドによる活性化は、基質の結合にもＮＡＤ＋の結合にも影響を及ぼすことなく、脱アセチル化産物へと向かって進むイミデート＋酵素複合体の割合を変えることにより、達成される（図６ｃおよび７。ＳａｕｖｅおよびＳｃｈｒａｍｍ、２００３年）。これらの知見はＳｉｒ２のメカニズム的に区別できる小分子活性化剤の組み合わせが更に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて脱アセチル化酵素活性を上昇させることがあることを示唆する。最終的に、我々は、イソニコチンアミドおよびメカニズム的に同様なＳｉｒ２活性化剤が、哺乳類ｓｉｒｔｕｉｎの特に有効なアゴニストたり得ることを記すが、これはニコチンアミドにより、イースト菌のＳｉｒ２酵素よりも潜在的に阻害される（ＳａｕｖｅおよびＳｃｈｒａｍｍ、２００３年）。
【０１０７】
実施例３．２−フルオロニコチンアミドは、塩基交換を阻害することにより、Ｓｉｒ２による脱アセチル化を増強させる
２−フルオロニコチンアミドの合成は、市販の２−フルオロ−３−メチルピリジンから、報告されている方法（Ｍｉｎｏｒら、１９４９年）と同一のルートにより、達成された。簡潔には、該フルオロメチルピリジンが６酸化当量の過マンガン酸カリウム存在下に熱せられ、その結果得られるフルオロニコチン酸が濾過により単離された。その酸クロリドの引き続いての調製およびアンモニア処理が、良好な収率で、所望の化合物を与えた。この材料は、ＮＭＲスペクトルおよびＵＶ／可視光スペクトルにより、構造的に確認された。純度は、逆相ＨＰＬＣにより確認された。
【０１０８】
【化１１】
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【０１０９】
イースト菌および古細菌由来のＳｉｒ２酵素により触媒される塩基交換反応および脱アセチル化しない反応の選択的阻害剤としてのこの化合物の使用が、記載される。前記したとおり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳｉｒ２触媒反応の活性化剤として振る舞う化合物の能力は、Ｓｉｒ２触媒反応のニコチンアミドによる阻害を緩和するその能力に依存する。本願において特徴付けられる作業は、塩基交換および脱アセチル化化学両方に関して応答性の中間体の化学的枯渇を経由して、ニコチンアミドによる阻害が起きることを示す。これゆえ、脱アセチル化および塩基交換活性両方を同時にモニターするアッセイが、可能性ある活性化剤と考えられる小分子による選択的阻害に関してアッセイするのに使用された。
【０１１０】
我々は好ましいＨＰＬＣアッセイを選び、ここでは、３５μＭの［カルボニル−１４Ｃ］ニコチンアミドが、ｐＨ７．０の５０μＬの５０ｍＭリン酸カリウム中、１μｇのＳｉｒ２酵素、３００μＭのヒストンＨ４基質、および６００μＭのＮＡＤ＋と共にインキュベートされた。各溶液も、種々の量の２−フルオロニコチンアミドを、この化合物濃度０、５、１０、２０、４０、および８０ｍＭで含有した。反応剤の３０分間のインキュベート後、該反応は、ｐＨ５．０の２００ｍＬの５０ｍＭ酢酸アンモニウムの添加により止められ、次いで、２５０μＬの全該溶液が、ＮＡＤ由来もしくはニコチンアミド由来の全化合物の分離に関して、Ｃ−１８準分取用カラム上へと注入された。脱アセチル化は、反応混合物中のＡＡＤＰＲおよびＡＤＰＲに関するピークの積分により、アッセイされた。塩基交換反応は、ニコチンアミドおよびＮＡＤの該ピークの収集によりアッセイされ、別個にその分画のシンチレーション計数を伴って、回収された放射活性を定量した。初期速度条件を確実にするために、該ＮＡＤ放射活性は、ニコチンアミドの該ピーク中の全放射活性の１０％以下とされた。表４は、その結果を示す。
【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
塩基交換阻害曲線およびこれに対応する脱アセチル化に関して求められた速度値から、我々は、２−フルオロニコチンアミドが選択的に塩基交換のみを阻害し、脱アセチル化を阻害しないことを確認したが、これはＳｉｒ２の生物学的活性化剤に関して提案されたとおりである。これらのデータはまた、そのニコチンアミド環へのフルオロ置換基の導入による該ニコチンアミド環窒素の反応性の減弱が、天然の阻害性リガンドであるニコチンアミドの追い出しを引き起こすことを確認するものであり、この化合物はニコチンアミドのように振る舞って脱アセチル化を阻害することがない。フルオロニコチンアミドのこの特性は、ニコチンアミドによるＳｉｒ２阻害の化学的性質と一貫性がある。これゆえ、この研究から、塩基交換触媒反応に応答性の共有結合中間体との化学的反応性の消失が原因でニコチンアミドの結合を防ぐことができるニコチンアミドに似ている小分子をも活性化剤が包含することが、明らかである。
【０１１３】
上記観点から、本発明の幾つかの利点が達成され、他の利点が獲得されることが、理解される。
【０１１４】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記方法および組成物において、種々の変更がなされ得るので、上記に含まれ添付図面に示される全事項が、例示的なものとして、限定的な意味合いではなく解釈されるものと意図される。
【０１１５】
この明細書において引用される全文献が、本明細書において援用される。本明細書における文献についての議論は、本著者によりなされた主張を要約することのみ意図され、如何なる文献も、先行技術を構成するとの認識はなされない。出願人は、これら引用文献の精確さおよび適切さに挑む権利を留保する。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、代表的なＳＩＲ２酵素に関するその交換反応速度対ニコチンアミド濃度を求めるためのグラフを示す。酵素の起源は：パネルＡはバクテリアのもの、パネルＢはイースト菌のもの、パネルＣはマウスのもの。（グラフの）線は、ミカエリス−メンテン式に沿うようにされる。
【図２】図２は、バクテリア、イースト菌、およびマウスのＳＩＲ２酵素の脱アセチル化速度を、ニコチンアミド濃度の関数として求めるためのグラフを示す。（グラフの）線は、本文中で定義されたとおりの式ν＝ｋｃａｔ−ｋｐ（［Ｉ］／Ｋｉ＋［Ｉ］）に沿うようにされた。脱アセチル化の残存速度は、そのプラトー（高値一定）である（パネルＡ）。イースト菌の酵素およびＡＦ２酵素（パネルＢ）ならびにマウスの酵素（パネルＣ）に関する、脱アセチル化速度のＤｉｘｏｎプロット（１／ν対［Ｉ］）。実験データは、１次式（パネルＣ）にもしくは本文中で定義されたとおりに沿うようにされた。
【図３】図３は、ニコチンアミド（結合）部位飽和時のこれら３酵素に関する分画阻害と分画交換との相関グラフを示す。
【図４】図４は、該バクテリア、イースト菌、およびマウスの酵素のｋ３、ｋ４、およびｋ５値に基づいた、ＳＩＲ２反応に関する反応座標のグラフを示す（表３）。該バクテリアの酵素に関しては相対的な障壁高さだけが知られており、その中間体の相対エネルギーは求められていない。結合の様子は示されていない。ΔＧＭ＝ΔＧＭ（中間体）−ΔＧＭ（ミカエリス）；ΔＧＹ＝ΔＧＹ（中間体）−ΔＧＹ（ミカエリス）；ΔΔＧＭ＝ΔＧＭ（山２）−ΔＧＭ（山１）；ΔΔＧＹ＝ΔＧＹ（山２）−ΔＧＹ（山１）；ΔΔＧＢ＝ΔＧＢ（山１）−ΔＧＢ（山２）。
【図５】図５は、スキーム１を示し、これは、アセチル化ペプチドとのＳＩＲ２の反応の態様を描くものである。パネルＡは、ＳＩＲ２の脱アセチル化反応に関する、簡略化された反応スキームである。パネルＢは、ＳＩＲ２−ＡＤＰＲ−ペプチジル中間体への競合的求核攻撃が両方の立体化学面から起きることを示すダイヤグラムである。そのリボース環の上面がβ面とされ、Ｃ１’におけるニコチンアミドによる求核攻撃が、β−ＮＡＤ＋の再形成へと至る。この糖（リボース）の下面がα面とされ、同面からその水酸基がそのα−アミデート基を攻撃し、脱アセチル化産物を生成させる。これら２とおりの競合する求核攻撃に関する速度定数が、交換に関してｋ４、脱アセチル化に関してｋ５として示される。パネルＣは、飽和ニコチンアミド濃度での、ＳＩＲ２中間体の反応を示す（結合ステップは略）。
【図６】図６は、ＳＩＲ２により触媒される塩基交換および脱アセチル化反応におけるＡＤＰ−リボシル中間体の反応性の、スキーム表示である。パネルａに示されるとおり、ニコチンアミド（ＮＡＭ）および２’−水酸基による攻撃が、このリボース部分の反対面上で起き、塩基交換と脱アセチル化との間での化学的競合に至る。ニコチンアミドによる脱アセチル化の阻害は、このイミデート中間体の可逆性からもたらされる。パネルｂは、ニコチンアミド結合部位での、イソニコチンアミド（ＩＮＡＭ）の、リガンドとしての提案された作用を示す。塩基交換が不可能であるのは、その窒素原子が反応しない位置にあるからである。効率的な脱アセチル化は、該脱アセチル化および塩基交換反応の化学的独立性に起因する。パネルｃは、イソニコチンアミド存在下でのイースト菌細胞内部でのＮＡＤ＋およびＳｉｒ２とのアセチル化ヒストン（活性クロマチン）の反応に関するスキームを示す。外因性ニコチンアミド濃度は、ＡＤＰＲ−イミデートに関して、その（対応する）外因性リガンドと競合する。ＩＮＡＭ複合体は、反応して基質を再形成することができない。ＩＮＡＭは、脱アセチル化ヒストン（サイレント・クロマチン）および２’−ＡＡＤＰＲを形成する反応を阻害しない。
【図７】図７のグラフは、Ｓｉｒ２により触媒される交換速度およびＨ４Ｎ−末ペプチドの脱アセチル化速度の実験測定値を示しており、［カルボニル１４Ｃ］ニコチンアミド濃度の関数として測定されている。パネルａは、異なる濃度のイソニコチンアミド下に測定されたニコチンアミド塩基交換速度を示す。交換に関する見かけのＫｍの上昇は、ニコチンアミド結合とのイソニコチンアミドによる競合阻害による。イソニコチンアミド濃度は、０、６０、および１００ｍＭであり、Ｋｍ値はそれぞれ、１２０、１９０、および２５０μＭである（そのミカエリス−メンテン式へのこれらの最適点から求めた場合）。パネルｂは、パネルａにおいて使用されたのと同じ濃度のイソニコチンアミドを含有する反応における、１４Ｃ−ニコチンアミド濃度の関数として測定された脱アセチル化速度を示す。阻害曲線は、部分阻害に関して該式へと適合される：相対速度＝１−ｆ（［Ｉ］／（Ｋｉ＋［Ｉ］））であり、ここで相対速度は、これに対応する無阻害速度に基づき１目盛り上に定義される。定数ｆは、ニコチンアミドの飽和により得られる分画阻害である。［Ｉ］はニコチンアミド濃度であり、Ｋｉは見かけのニコチンアミド阻害定数である（ＳａｕｖｅおよびＳｃｈｒａｍｍ、２００３年）。０、６０、および１００ｍＭのイソニコチンアミドに関するＫｉ値１００、１８０、および３３０μＭは、ニコチンアミド、脱アセチル化阻害剤、およびイソニコチンアミド（阻害剤ではない）間の結合における競合を反映する。パネルｃは、固定された生理学的に関連する濃度のニコチンアミド（１２５μＭ）下、イソニコチンアミド濃度の関数として測定された塩基交換および脱アセチル化速度を示すが、これはＳｉｒ２により触媒される脱アセチル化に関して阻害的である（Ｋｉ＝１００μＭ）。測定は、基質としてＨ４Ｎ−末ペプチド（ＡＧＧ（ＡｃＫ）ＧＧ（ＡｃＫ）ＧＭＧ（ＡｃＫ）ＶＧＡ（ＡｃＫ）ＲＨＳＣ、Ｉｍａｉら、２０００年）を用いて、ＳａｕｖｅおよびＳｃｈｒａｍｍ（２００３年）に記載の方法により、実施された。
【図８】図８は、イソニコチンアミドがＳｉｒ２により制御される遺伝子座におけるサイレンシングを上昇させることを実証している実験結果の写真である。イースト菌株の１０倍稀釈系列が、コントロール（ＹＰＤ）もしくは選択培地（ｖａｎＬｅｅｕｗｅｎおよびＧｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ、２００２年）上へと播種された。これらの写真は、インキュベートの２〜３日後に撮影された。テスト培地は、２５ｍＭのイソニコチンアミド、５ｍＭのニコチンアミド、もしくは両化合物を含有した。パネルａは、テロメアＶＩＩＬでのサイレンシングを示し、ＵＲＡ３発現によりモニターされ、ＦＯＡ含有培地上での生菌数の増加に至る。同系遺伝子株ＵＣＣ４５６２（ＤＯＴ１）およびＵＣＣ４５５４（ｄｏｔ１Δ）（Ｓｉｎｇｅｒら、１９９８年）が、各パネルに示される（それぞれ、上段および下段）。パネルｂは、ＨＭＲ遺伝子座でのサイレンシングが、ＴＲＰ１発現により検出され、トリプトファン欠損培地上での生菌数の減少に至ったことを示す。株ＣＣＦＹ１００２８（上段）の表現型が、同系遺伝子ｓｉｒ２誘導体（下段）と比較される。このｓｉｒ２欠損株は、ＮａｔＭＸ選択マーカー（Ｔｏｎｇら、２００４年）を使用して、ＰＣＲによる遺伝子破壊により創り出された。パネルｃは、株ＪＳＳ１２５（Ｓ３）３０のｒＤＮＡ遺伝子座におけるＵＲＡ３発現のサイレンシングが、ＦＯＡ含有培地上でアッセイされた模様を示す。
【図９】図９は、イソニコチンアミドによるサイレンシングの活性化はＰＮＣ１もしくはＮＰＴ１を必要としないことを実証する実験結果の写真である。株ＣＣＦＹ１００ならびにｎｐｔ１およびｐｎｃ１同系遺伝子誘導体の１０倍稀釈系列が、２５ｍＭのイソニコチンアミド有り無しで、ＹＰＤもしくは選択培地上へと播かれた。これら欠損株が、Ｎａｔ−ＭＸ選択マーカーを使用して、ＰＣＲ媒介遺伝子破壊により創り出された（Ｔｏｎｇら、２００４年）。ＴＥＬ−ＶＲ：：ＵＲＡ３におけるサイレンシングが、ＦＯＡ含有培地上での生菌数により報告され、ＨＭＲ：：ＴＲＰ１が，トリプトファン欠乏培地上での成長抑制により検出される。
【図１０】図１０は、古細菌の酵素およびイースト菌の酵素により触媒される塩基交換阻害を、２−フルオロニコチンアミド濃度の関数として示す。その曲線は、式：１００−１００×（［Ｉ］／（［Ｉ］＋Ｋｉ））＝％速度  を使用して、各点へと最適化される。［Ｉ］が阻害剤濃度であるとすると、Ｋｉは該阻害剤の結合定数である。これらの曲線は、Ｓｉｒ２ｐ（イースト菌）に関して２０ｍＭの結合定数を、Ａｆ２Ｓｉｒ２（古細菌）に関して４３ｍＭの結合定数を与える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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