(57)【要約】  配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（ＮＹＩＩＨ）を有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ-Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ）を有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（ＳＧＰＹＡＷＦＤＴ）を有しており；例えばさらに配列に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含み、ＣＤＲ１’はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（ＲＡＳＱＮＩＧＴＳＩＱ）を有し、ＣＤＲ２’はアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ（ＳＳＳＥＳＩＳ）を有し、そしてＣＤＲ３’はアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ＱＱＳＮＴＷＰＦＴ）を有している少なくとも１つの抗原結合部位を含む分子。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（ＮＹＩＩＨ）を有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ-Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ）を有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（ＳＧＰＹＡＷＦＤＴ）を有している少なくとも１つの抗原結合部位を含む結合分子。
【請求項２】
ａ）配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（ＮＹＩＩＨ）を有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ-Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ）を有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（ＳＧＰＹＡＷＦＤＴ）を有している第１のドメイン；および
ｂ）配列に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含み、ＣＤＲ１’はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（ＲＡＳＱＮＩＧＴＳＩＱ）を有し、ＣＤＲ２’はアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ（ＳＳＳＥＳＩＳ）を有し、そしてＣＤＲ３’はアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ＱＱＳＮＴＷＰＦＴ）を有している第２ドメイン
を含む請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
キメラまたはヒト化結合分子である請求項１または２のいずれかに記載の結合分子。
【請求項４】
キメラまたはヒト化結合分子がキメラまたはヒト化モノクローナル抗体である請求項１から３のいずれかに記載の結合分子。
【請求項５】
１個以上のグリコシル化部位を含む請求項１から４のいずれかに記載の結合分子。
【請求項６】
グリコシル化部位がＮグリコシル化部位である請求項５に記載の結合分子。
【請求項７】
グリコシル化部位が可変領域に存在しない請求項１から６のいずれかに記載の結合分子。
【請求項８】
配列番号：１のポリペプチドおよび／または配列番号：２のポリペプチドを含む請求項１から７のいずれかに記載の結合分子。
【請求項９】
配列番号：３のポリペプチドおよび／または配列番号：４のポリペプチドを含む請求項１から７のいずれかに記載の結合分子。
【請求項１０】
キメラモノクローナル抗体である請求項８または９のいずれかに記載の結合分子。
【請求項１１】
配列番号：９もしくは配列番号：１０のポリペプチドおよび／または配列番号：７もしくは配列番号：８のポリペプチドを含むヒト化抗体である結合分子。
【請求項１２】
配列番号：３１もしくは配列番号：３２のポリペプチドおよび／または配列番号：７もしくは配列番号：８のポリペプチドを含むヒト化抗体である結合分子。
【請求項１３】
配列番号：９のポリペプチドおよび配列番号：７のポリペプチド、
配列番号：９のポリペプチドおよび配列番号：８のポリペプチド、
配列番号：１０のポリペプチドおよび配列番号：７のポリペプチド、
配列番号：１０のポリペプチドおよび配列番号：８のポリペプチド、
配列番号：３１のポリペプチドおよび配列番号：７のポリペプチド、
配列番号：３１のポリペプチドおよび配列番号：８のポリペプチド、
配列番号：３２のポリペプチドおよび配列番号：７のポリペプチド、または
配列番号：３２のポリペプチドおよび配列番号：８のポリペプチド、
を含むヒト化抗体である結合分子。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードする請求項１４に記載のポリヌクレオチド、ならびに／または請求項２に記載のＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
アミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（ＲＡＳＱＮＩＧＴＳＩＱ）を有する該ＣＤＲ１’、アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ（ＳＳＳＥＳＩＳ）を有するＣＤＲ２’、およびアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ＱＱＳＮＴＷＰＦＴ）を有するＣＤＲ３’によるＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号：５のポリヌクレオチドおよび／または配列番号：６のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号：７もしくは配列番号：８のポリペプチドおよび／または配列番号：９もしくは配列番号：１０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号：１１もしくは配列番号：１２のポリヌクレオチドおよび／または配列番号：１３もしくは１４のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号：７もしくは配列番号：８のポリペプチドおよび／または配列番号：３１もしくは配列番号：３２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号：３４もしくは配列番号：３５のポリヌクレオチドおよび／または配列番号：３３；配列番号：１４もしくは１３のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項１４から２１のいずれかに記載のポリヌクレオチド含む発現ベクター。
【請求項２３】
請求項１４から２１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現系であって、該発現系またはその一部が適合する宿主細胞に存在するとき、該発現系またはその一部が請求項１から１３のいずれかに記載のポリペプチドを生成することができるものである、発現系。
【請求項２４】
請求項１４から２１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現系であって、該発現系またはその一部が適合する宿主細胞に存在するとき、該発現系またはその一部が配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（ＮＹＩＩＨ）を有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ-Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ）を有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（ＳＧＰＹＡＷＦＤＴ）を有している少なくとも１つの抗原結合部位を含む結合分子を生成することができるものである、発現系。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の発現系を含む単離された宿主細胞。
【請求項２６】
薬剤として請求項１から１３のいずれかに記載の結合分子またはヒト化抗体の使用。
【請求項２７】
自己免疫疾患、移植片拒絶、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患および／もしくはアレルギーの処置ならびに／または予防における請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置および／または予防における請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
膵臓島細胞移植片拒絶の処置のための医薬品の調製における請求項１から１３のいずれかに記載の結合分子またはヒト化抗体の使用。
【請求項３０】
結合分子またはヒト化抗体が配列番号：３１もしくは配列番号：３２のポリペプチドおよび／または配列番号：７もしくは配列番号：８のポリペプチドを含む請求項２６から２９のいずれかに記載の使用。
【請求項３１】
少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤に随伴されて請求項１から１３のいずれかに記載の結合分子またはヒト化抗体を含む医薬組成物。
【請求項３２】
有効量の請求項１から１３のいずれかに記載の結合分子またはヒト化抗体をかかる処置および／または予防を必要とする対象に投与することを含む、自己免疫疾患、移植片拒絶、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患および／またはアレルギーに関連する疾患の処置および予防の方法。
【請求項３３】
有効量の請求項１から１３のいずれかに記載の結合分子またはヒト化抗体をかかる処置および／または予防を必要とする対象に投与することを含む乾癬の処置および／または予防の方法。
【請求項３４】
有効量の請求項１から１３のいずれかに記載の結合分子またはヒト化抗体をかかる処置および／または予防を必要とする対象に投与することを含む移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置および／または予防の方法。
【請求項３５】
有効量の請求項１から１３のいずれかに記載の結合分子またはヒト化抗体をかかる処置および／または予防を必要とする対象に投与することを含む膵臓島細胞移植拒絶に関連する疾患の処置および／または予防の方法。
【請求項３６】
結合分子またはヒト化抗体が配列番号：３１もしくは配列番号：３２のポリペプチドおよび／または配列番号：７もしくは配列番号：８のポリペプチドを含む請求項３２から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢの双方に関して結合特異性を有する結合分子の医薬品における使用。
【請求項３８】
結合分子がキメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
結合分子が解離定数（Ｋｄ）＜１５ｎＭでＣＤ４５ＲＯアイソフォームに結合する請求項３７または３８に記載の使用。
【請求項４０】
結合分子が解離定数（Ｋｄ）＜１５ｎＭでＣＤ４５ＲＢアイソフォームに結合する請求項３７から３８のいずれかに記載の使用。
【請求項４１】
ＣＤ４５分子のＡおよびＢエピトープを含むが、Ｃエピトープを含まない；および／もしくは
ＣＤ４５分子のＢエピトープを含むが、Ａを含まずそしてＣエピトープを含まない；
ＣＤ４５アイソフォーム；ならびに／または
ＣＤ４５分子のＡ、ＢまたはＣエピトープのいずれか１つを含まないアイソフォーム；
に結合分子が結合する請求項３７から４０のいずれかに記載の使用。
【請求項４２】
ＣＤ４５分子のＡ、ＢおよびＣエピトープの全てを含む；および／または
ＣＤ４５分子のＢおよびＣエピトープの双方を含むが、Ａエピトープを含まない；
ＣＤ４５アイソフォームに結合分子が結合する請求項３７から４１のいずれかに記載の使用。
【請求項４３】
結合分子がＰＥＥＲ細胞上のその標的エピトープに結合し、そしてここで該結合はＫｄ＜１５ｎＭである請求項３７から４２のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はＣＤ４５抗原アイソフォームに対する結合分子、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のような有機化合物、およびその使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
種々の疾患の処置における１つのアプローチは、病原性白血球の排除または不活性化および病原性免疫応答を不活性化するための寛容の誘導のための可能性を達成することである。器官、細胞および組織移植片拒絶ならびに種々の自己免疫疾患は一次的にはマクロファージおよび樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）により抗原ＭＨＣ複合体の形態で捕捉され、加工され、そしてヘルパーＴ細胞に提示される特異的抗原を認識することができるヘルパーＴ細胞により誘発されるＴ細胞媒介の免疫応答の結果である、すなわちヘルパーＴ細胞は特異的抗原を認識するときに刺激されてＩＬ−２のようなサイトカインを生成し、そしていくつかのサイトカイン受容体およびその他の活性化分子を発現または上方制御し、そして増殖すると考えられている。これらの活性化されたヘルパーＴ細胞には直接的または間接的に作用し得る、すなわちエフェクター細胞毒性Ｔ細胞またはＢ細胞を補助して選択された抗原を発現する細胞または組織を破壊し得るものがある。免疫応答が終了した後、成熟したクローン的に選択された細胞は記憶ヘルパーおよび記憶細胞毒性Ｔ細胞として残り、これは体内を循環し、そして抗原が再度現れた場合にそれを迅速に認識する。この応答を誘発する抗原が無害な環境抗原である場合、結果はアレルギーであり、抗原が外来抗原でないが、自己抗原である場合、自己免疫疾患に至り；抗原が移植された器官からの抗原である場合、結果は移植片拒絶である。
【０００３】
免疫系は非自己から自己を認識するために発達してきた。この特性により器官が病原体の日々の挑戦に曝された環境において生存することが可能になる。この非自己に関する特異性および自己に対する寛容は胸腺においてＴ細胞レパートリーの発達の間に、陽性および陰性選択の過程を通じて生じ、これはまた自己反応性Ｔ細胞の認識および排除をも含む。この型の寛容を中枢性寛容と称する。しかしながら、これらの自己反応性細胞にはこの選択機構を回避し、そして自己免疫疾患の発達に関する潜在的危険性を引き起こすものがある。末梢に回避した自己反応性Ｔ細胞を制御するために、免疫系は自己免疫性に対して保護を提供する末梢制御機構を有している。これらの機構は末梢性寛容の基礎である。
【０００４】
特異的ｍＡｂにより認識される細胞表面抗原は一般に代々の国際白血球分類研究会により割り当てられたＣＤ（分化抗原群）数により指定され、そしてＣＤ４５なる用語は本明細書では細胞表面白血球共通抗原ＣＤ４５を意味し；そしてその抗原に対するｍＡｂを本明細書では「抗ＣＤ４５」と称する。
【０００５】
白血球共通抗原に対する抗体（ＬＣＡ）すなわちＣＤ４５は抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）の主要な成分である。ＣＤ４５は膜貫通型チロシンホスファターゼのファミリーに属し、そして双方共に受容体相互作用に依存して細胞活性化の陽性および陰性の調節因子である。ＣＤ４５のホスファターゼ活性はＢおよびＴリンパ球の抗原受容体に随伴されるＳｒｃファミリーキナーゼの活性化に必要であるようだ(Trowbridge IS et al, Annu Rev Immunol. 1994;12:85-116)。したがって、Ｔ細胞活性化においてＣＤ４５はシグナル１に必須であり、そしてＣＤ４５欠乏細胞はＴＣＲ媒介の活性化事象において深刻な欠陥を有する。
【０００６】
ＣＤ４５抗原は膜貫通糖タンパク質を含む様々のアイソフォームで存在する。ＣＤ４５の異なるアイソフォームはＣＤ４５細胞外領域の一部をコードする３つの可変エクソンの選択的スプライシングから生じるその細胞外ドメイン構造において異なる(Streuli MF. et al, J. Exp. Med. 1987; 166:1548-1566)。ＣＤ４５の種々のアイソフォームは様々の細胞外ドメインを有するが、２つの相同な、高度に保存されたおよそ３００残基のホスファターゼドメインを有する同一の膜貫通および細胞質セグメントを有する。様々のアイソフォームの組み合わせはＴおよびＢリンパ球の亜集団において差次的に発現される(Thomas ML. et al, Immunol. Today 1988; 9:320-325)。モノクローナル抗体には様々のアイソフォーム全てに共通するエピトープを認識するものがあるが、選択的にスプライシングされたエクソン（Ａ、ＢまたはＣ）のうちのどれをそれらが認識するかに依存して限定的な（ＣＤ４５Ｒ）特性を有するｍＡｂもある。例えば、エクソンＡの生成物を認識するモノクローナル抗体は結果的にＣＤ４５ＲＡと称され、エクソンＢを含有する種々のアイソフォームを認識するものはＣＤ４５ＲＢと称されている(Beverley PCL et al, Immunol. Supp. 1988; I:3-5)。ＵＣＨＬ１のような抗体は、１８０ｋＤａのアイソフォームＣＤ４５ＲＯ（可変エクソンＡ、ＢまたはＣのいずれをも含まない）に選択的に結合し、これは活性化されたＴ細胞、記憶細胞および皮質胸腺細胞のサブセットに限定されるようであり、そしてＢ細胞上では検出されない(Terry LA et al, Immunol. 1988; 64:331-336)。
【０００７】
（図面の説明）
図１  「候補ｍＡｂ」による１次ＭＬＲの阻害は０.００１および１０μｇ／ｍｌの範囲で用量依存的であることを示している。「濃度」は「候補ｍＡｂ」の濃度である。
図２  配列番号：１５の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：１２（３９２１−４２７４）のヌクレオチド配列を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｇ１  ＨｕＡ６−ＶＨＱのプラスミドマップを示す。
図３  配列番号：１６の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：１１（３９２１−４２７４）のヌクレオチド配列を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｇ１  ＨｕＡ６−ＶＨＥのプラスミドマップを示す。
図４  配列番号：１７の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：１４（３９６４−４２８４）のヌクレオチド配列を有する軽鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｋ  ＨｕＡｂ−ＶＬ１ｈｕｍＶ１のプラスミドマップを示す。
図５  配列番号：１８の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：１３（３９２１−４２７４）のヌクレオチド配列を有する軽鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｋ  ＨｕＡｂ−ＶＬ１ｈｕｍＶ２のプラスミドマップを示す。
図６  配列番号：３６の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：３３のヌクレオチド配列を有する軽鎖を含む発現ベクターＬＣＶＬ１ＳＰ２０のプラスミドマップを示す。
図７  配列番号：３９の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：１３のヌクレオチド配列を有する軽鎖を含む発現ベクターＬＣＶＬ２ＳＰ２０のプラスミドマップを示す。
図８  配列番号：３７の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：３４のヌクレオチド配列を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＶＨＥＮ７３Ｄ  Ｓｐ２０のプラスミドマップを示す。
図９  配列番号：３８の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：３５のヌクレオチド配列を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＶＨＱＮ７３Ｄ  Ｓｐ２０のプラスミドマップを示す。
図１０  配列番号：４０の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：１１のヌクレオチド配列を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＶＨＥＳｐ２０のプラスミドマップを示す。
図１１  配列番号：４１の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：１２のヌクレオチド配列を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＶＨＱＳｐ２０のプラスミドマップを示す。
図１２  ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ２、ならびにＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１と一緒のＶＨＥ／ｈｕｍＶ１のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。
図１３  ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ２およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ１、ならびにＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１と一緒のＶＨＥ／ｈｕｍＶ２の陽イオン交換クロマトグラフィーを示す。
図１４  ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２およびＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の逆相クロマトグラフィーを示す。
【０００８】
（発明の説明）
今、本明細書にて以後「ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子」とも称するＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢに結合するポリペプチド配列を含む結合分子を見出した。本発明によるこれらの結合分子は免疫抑制を誘起し、１次Ｔ細胞応答を阻害し、そしてＴ細胞寛容を誘起し得る。さらに、本発明の結合分子は１次混合リンパ球培養反応（ＭＬＲ）を阻害する。ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子で処理した培養から誘導された細胞はまた２次ＭＬＲにおいてＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の不在時でさえ、２次ＭＬＲにおける増殖応答を低下させているのが好ましい。２次ＭＬＲにおけるかかる低下した増殖応答は寛容を誘起する本発明の結合分子の能力の指標である。加えて、本発明のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子はヒトＴリンパ球におけるアポトーシスを通じて細胞死を誘起することができ、特徴的なＴ調節細胞（Ｔｒｅｇ）表現型を有するＴ細胞の分化を支えることができ；そして／または未処理のＴ細胞の活性化を抑制することができるＴ調節細胞を誘起することができる。
【０００９】
さらにコントロール処置マウスと比較して、ヒトＰＢＭＣを注射した後に異種性ＧＶＨＤを経験している重篤な複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスへのＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子のインビボ投与は、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子処置マウスにおいて循環ヒトＴ細胞を依然検出できたとしても、マウスの生存を延長し得ることが見出されている。ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子はまたヒト同種移植片皮膚拒絶を媒介する炎症過程をも抑制し得る。加えてＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子はヒト同種移植片皮膚拒絶を媒介する炎症過程を抑制し得る、特にヒト皮膚を移植された、および単核脾細胞を正着されたＳＣＩＤマウスにおけるインビボヒト同種移植片皮膚拒絶を媒介する炎症過程を抑制し得ることが見出されている。そしてさらにＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は移植片浸潤を防御することにより、および白血球媒介のインビボ拒絶反応を阻害することによりヒト島同種移植片の生存延長に至り得ることが見出されている。
【００１０】
「ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子」とはＣＤ４５抗原のＣＤ４５ＲＢおよびＣＤ４５ＲＯアイソフォームに、単独でまたはその他の分子に随伴されてのいずれかで、特異的に結合することができる任意の分子を意味する。例えば特定のＣＤ４５アイソフォームを発現する細胞への分子の結合を可視化することができる蛍光顕微鏡もしくは細胞蛍光測定（ＦＡＣＳ）分析、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイと一緒にした直接的または間接的免疫蛍光のような任意の種類の結合アッセイを含む標準的な方法（定性的アッセイ）により結合反応を示すことができる。加えて、この分子の結合はこれらのアイソフォームを発現する細胞の機能の変化をもたらし得る。例えば、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の存在下または不在下で、１次または２次ＭＬＲの阻害を決定するための、および１次ＭＬＲ阻害における差異を決定するためのインビトロアッセイまたはバイオアッセイのように１次または２次合リンパ球培養反応（ＭＬＲ）の阻害を決定することができる。
【００１１】
これに代えて、例えばＭＬＲにおける細胞活性化の後、または破傷風トキソイドのような特異的抗原もしくはその他の抗原で、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）もしくは抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体もしくはホルボールエステルおよびＣａ２＋イオノフォアのような多クローン性刺激剤で刺激した後に、ＰＭＢＣまたはＴ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖、サイトカインの生成、細胞表面分子の発現の変化を測定することによってもインビトロ機能調節効果を決定することができる。刺激剤として同種細胞の代わりに前記で記載したもののような可溶性抗原または多クローン性刺激剤を用いる以外はＭＬＲに関して記載されるのと類似の様式で培養を準備する。３Ｈチミジンの取り込みにより前記で記載したようなＴ細胞増殖を測定するのが好ましい。
【００１２】
サイトカイン捕捉抗体を９６ウェルプレートの表面にコーティングし、培養物からの上澄を加え、そして室温で１時間インキュベートし、そして次に特定のサイトカインに特異的な検出抗体、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素に結合した第２段階の抗体、続いて対応する基質を加え、そしてプレートリーダーで吸光度を測定するサンドウィッチＥＬＩＳＡによりサイトカイン生成を測定するのが好ましい。標的細胞を特定の細胞表面分子に特異的な抗体で染色した後、細胞表面分子の変化を直接的または間接的免疫蛍光により測定できるのが好ましい。抗体を直接的に蛍光色素で標識するか、または蛍光標識された第１抗体に特異的な第２段階の抗体を用いることができるかのいずれかであり、そして細胞を細胞蛍光測定器で分析する。
【００１３】
本発明の結合分子はＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢの双方に関して結合特異性を有している（「ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子」）。
好ましくは、結合分子は解離常数（Ｋｄ）＜２０ｎＭで、好ましくはＫｄ＜１５ｎＭまたは＜１０ｎＭで、さらに好ましくはＫｄ＜５ｎＭでＣＤ４５ＲＯアイソフォームに結合する。好ましくは、結合分子はＫｄ＜５０ｎＭで、好ましくはＫｄ＜１５ｎＭまたは＜１０ｎＭで、さらに好ましくはＫｄ＜５ｎＭでＣＤ４５ＲＢアイソフォームに結合する。
【００１４】
さらに好ましい実施態様では、本発明の結合分子は
１）ＣＤ４５分子のＡおよびＢエピトープを含むが、Ｃエピトープを含まない；および／または
２）ＣＤ４５分子のＢエピトープを含むが、Ａを含まずそしてＣエピトープを含まない；および／または
３）ＣＤ４５分子のＡ、ＢまたはＣエピトープのいずれも含まない； 
であるこれらのＣＤ４５アイソフォームに結合する。
【００１５】
さらに好ましい実施態様では、本発明の結合分子は：
１）ＣＤ４５分子のＡ、ＢおよびＣエピトープの全て；および／または
２）ＣＤ４５分子のＢおよびＣエピトープの双方であるが、Ａエピトープでない；
を含むＣＤ４５アイソフォームに結合しない。
【００１６】
さらに好ましい実施態様では、本発明の結合分子はさらに：
１）記憶およびインビボ同種活性化された（alloactivated）Ｔ細胞を認識する；および／または
２）例えばＰＥＥＲ細胞のようなヒトＴ細胞上のその標的に結合する（ここで該結合は好ましくはＫｄ＜１５ｎＭ、さらに好ましくはＫｄ＜１０ｎＭ、もっとも好ましくはＫｄ＜５ｎＭである）；および／または
３）好ましくは約１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭまたは３０ｎＭ未満のＩＣ５０で、さらに好ましくは約１０ｎＭまたは５ｎＭのＩＣ５０で、最も好ましくは約０.５ｎＭまたはさらには０.１ｎＭのＩＣ５０でインビトロ同種活性化された（alloactivated）Ｔ細胞機能を阻害する；および／または
４）ヒトＴリンパ球におけるアポトーシスを通じて細胞死を誘起する；および／または
５）インビトロで同種抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘起する；および／または
６）有効量で投与されたときにヒトＰＢＭＣの注射によりＳＣＩＤマウスにおいて誘起された致死的異種移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を防御する；および／または
７）Ｔリンパ球、単球、幹細胞、ナチュラルキラー細胞および／または顆粒球に結合するが、血小板またはＢリンパ球には結合しない；および／または
８）特徴的なＴ調節細胞（Ｔｒｅｇ）表現型を有するＴ細胞の分化を支持する；および／または
９）未処理Ｔ細胞活性化を抑制することができるＴ調節細胞を誘起する；および／または
１０）ヒト同種移植片皮膚拒絶を媒介する炎症過程を抑制する、特にヒト皮膚を移植された、および単核脾細胞を正着されたＳＣＩＤマウスにおけるインビボヒト同種移植片皮膚拒絶を媒介する炎症過程を抑制する；および／または
１１）ｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルにおいてヒト島同種移植片生存を延長させる。
【００１７】
さらに好ましい実施態様では、本発明の結合分子はAversa et al., Cellular Immunology 158, 314-328 (1994)により記載されるようなモノクローナル抗体「Ａ６」と同一のエピトープに結合する。
前記した結合特性および生物学的活性のために、本発明のかかる結合分子は特に医薬品において、治療および／または予防のために有用である。本発明の結合分子が特に有用である疾患には、さらに以下で示すような、自己免疫疾患、移植片拒絶、皮膚炎、炎症性腸疾患および／またはアレルギーが挙げられる。
【００１８】
配列番号：１のポリペプチドおよび配列番号：２のポリペプチドを含む分子はＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子であることを見出した。また配列番号：１のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子における超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’をも見出し、ＣＤＲ１’はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（ＲＡＳＱＮＩＧＴＳＩＱ）（配列番号：１９）を有し、ＣＤＲ２’はアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ（ＳＳＳＥＳＩＳ）（配列番号：２０）を有し、そしてＣＤＲ３’はアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ＱＱＳＮＴＷＰＦＴ）（配列番号：２１）を有していた。
【００１９】
また配列番号：２のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子における超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を見出し、ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（ＮＹＩＩＨ）（配列番号：２２）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ-Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ）（配列番号：２３）を有し、そしてＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（ＳＧＰＹＡＷＦＤＴ）（配列番号：２４）を有していた。
【００２０】
ＣＤＲは本質的に抗原結合特性を決定する超可変領域とも称される３つの特異的な相補性決定領域である。これらのＣＤＲは例えば配列番号：１または配列番号：２の可変領域の一部であり、各々ここでＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ）、例えば定常領域と交替する。配列番号：１は本発明によるキメラ抗体の軽鎖、例えば配列番号：３の一部であり、そして配列番号：２は重鎖、例えば配列番号：４の一部である。重鎖のＣＤＲは随伴される軽鎖のＣＤＲと一緒に本質的に本発明の分子の抗原結合部位を構成する。軽鎖可変領域により為される結合のエネルギー論への寄与は、随伴される重鎖可変領域により為されるものに比較して小さく、そして単独の重鎖可変領域は独自で抗原結合活性を有していることが解っている。かかる分子は一般的に単一ドメイン抗体と称される。
【００２１】
１つの態様では、本発明は少なくとも１つの抗原結合部位、例えばＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を含み、配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む結合分子；および例えばその直接均等物（direct equivalent）を提供し、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（ＮＹＩＩＨ）（配列番号：２２）を有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ-Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ）（配列番号：２３）を有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（ＳＧＰＹＡＷＦＤＴ）（配列番号：２４）を有している。
【００２２】
別の態様では、本発明は
ａ）配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（ＮＹＩＩＨ）（配列番号：２２）を有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ-Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ）（配列番号：２３）を有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（ＳＧＰＹＡＷＦＤＴ）（配列番号：２４）を有している第１ドメイン；および
ｂ）配列に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含み、ＣＤＲ１’はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（ＲＡＳＱＮＩＧＴＳＩＱ）（配列番号：１９）を有し、ＣＤＲ２’はアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ（ＳＳＳＥＳＩＳ）（配列番号：２０）を有し、そしてＣＤＲ３’はアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ＱＱＳＮＴＷＰＦＴ）（配列番号：２１）を有している第２ドメイン；
を含む少なくとも１つの抗原結合部位、例えばＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を含む分子；および例えばその直接均等物を提供する。
【００２３】
好ましい実施態様では、配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む第１ドメインは免疫グロブリン重鎖であり、そして配列に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む第２ドメインは免疫グロブリン軽鎖である。
【００２４】
別の態様では、本発明は分子、例えば配列番号：１のポリペプチドおよび／または配列番号：２のポリペプチドを含む、好ましくは１つのドメインに配列番号：１のポリペプチドおよび別のドメインに配列番号：２のポリペプチドを含むＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子、例えばキメラモノクローナル抗体、ならびに別の態様では分子、例えば配列番号：３のポリペプチドおよび／または配列番号：４のポリペプチドを含む、好ましくは１つのドメインに配列番号：３のポリペプチドおよび別のドメインに配列番号：４のポリペプチドを含むＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子、例えばキメラモノクローナル抗体を提供する。
【００２５】
抗原結合部位が第１および第２ドメインの双方または配列番号：１もしくは配列番号：３の各々のポリペプチド、および配列番号：２もしくは配列番号：４の各々のポリペプチドを含む場合、これらは同一のポリペプチドに位置してよいか、または好ましくは各ドメインは異なる鎖に存在してよく、例えば第１ドメインは重鎖、例えば免疫グロブリン重鎖の一部、またはそのフラグメントであり、そして第２ドメインは軽鎖、例えば免疫グロブリン軽鎖の一部、またはそのフラグメントである。
【００２６】
さらに本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子が哺乳動物、例えばヒトの体内環境におけるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子であることを見出した。本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は、それゆえにモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と称され、ここで結合活性は主に前記で記載したようなＣＤＲ領域により決定され、例えば該ＣＤＲ領域は実質的にヒト起源であるフレームワーク、例えば定常領域のような結合特異性を有さないその他の分子に随伴される。
【００２７】
別の態様では、本発明はAversa et al., Cellular Immunology 158, 314-328 (1994)（Ａ６を特徴づける一節に関して出典明示により本明細書の一部とする）に記載されるようなモノクローナル抗体「Ａ６」ではないＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を提供する。
別の態様では、本発明はキメラ、ヒト化または完全なヒトモノクローナル抗体である本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を提供する。
【００２８】
ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の実例には、Ｂ細胞またはハイブリドーマにより生成されるような抗体および、またはその任意のフラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメントから誘導されるキメラまたはヒト化抗体、ならびに１本鎖または単一ドメイン抗体が挙げられる。１本鎖抗体は、通常１０から３０個のアミノ酸、好ましくは１５から２５個のアミノ酸からなるペプチドリンカーにより共有結合した抗体重鎖および軽鎖の可変領域からなる。したがって、かかる構造は重鎖および軽鎖の定常部分を含まず、そして小型のペプチドスペーサーは定常部分全体よりも抗原性が少ないはずであると考えられている。キメラ抗体とは重鎖および軽鎖の定常領域または双方がヒト起源であるが、重鎖および軽鎖双方の可変ドメインはヒト以外（例えばマウス）の起源であることを意味する。ヒト化抗体とは超可変領域（ＣＤＲ）がヒト以外（例えばマウス）の起源であるが、全てのまたは実質的に全てのその他の部分、例えば定常領域および可変領域の高度に保存された部分はヒト起源である抗体を意味する。しかしながらヒト化抗体は超可変領域に隣接する可変領域の部分にマウス配列の数個のアミノ酸を保持し得る。
【００２９】
超可変領域、すなわち本発明によるＣＤＲ’は任意の種類のフレームワーク領域、例えばヒト起源の軽鎖および重鎖の定常部分に随伴され得る。適当なフレームワーク領域は例えば「免疫学的に興味深いタンパク質配列」（Kabat, E.A. et al、米国国立衛生研究所、保健社会福祉省、公衆衛生局）に記載されている。好ましくはヒト重鎖の定常部分はサブタイプを含むＩｇＧ１型のものでよく、好ましくはヒト軽鎖の定常部分はκまたはλ型、さらに好ましくはκ型のものでよい。好ましくは該重鎖は多くて１個のグリコシル化部位を含み、最も好ましくはグリコシル化部位はＮ−グリコシル化部位であり、そして最も好ましくは１個のグリコシル化部位が重鎖の定常部分に位置する。最も好ましくはグリコシル化部位が可変領域に存在せず、好ましくはフレームワーク領域にグリコシル化部位が存在しない。
【００３０】
重鎖の好ましい定常部分は配列番号：４（前記で特記したＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’配列部分を含まない）のポリペプチドであり、そして軽鎖の好ましい定常部分は配列番号：３（前記で特記したＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列部分を含まない）のポリペプチドである。
【００３１】
また本発明によるＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む配列番号：７のアミノ酸または配列番号：８のアミノ酸の軽鎖可変領域ならびに／または本発明によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列番号：９もしくは配列番号：１０の重鎖可変領域を含むヒト化抗体をも見出した。また本発明によるＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む配列番号：７のアミノ酸もしくは配列番号：８のアミノ酸の軽鎖可変領域ならびに／または本発明によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列番号：３１もしくは配列番号：３２の重鎖可変領域を含むさらに別のヒト化抗体を提供する。
【００３２】
別の態様では本発明は配列番号：９または配列番号：１０のポリペプチドおよび配列番号：７または配列番号：８のポリペプチドを含むヒト化抗体を提供する。本発明のさらに別の態様は配列番号：３１または配列番号：３２のポリペプチドおよび配列番号：７または配列番号：８のポリペプチドを含むヒト化抗体である結合分子を提供する。
【００３３】
別の態様では本発明は：
（ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２のような）配列番号：９のポリペプチドおよび配列番号：７のポリペプチド、
（ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１のような）配列番号：９のポリペプチドおよび配列番号：８のポリペプチド、
（ＶＨＱ／ｈｕｍＶ２のような）配列番号：１０のポリペプチドおよび配列番号：７のポリペプチド、
（ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１のような）配列番号：１０のポリペプチドおよび配列番号：８のポリペプチド、
（ＶＨＥＮ７３Ｄ／ｈｕｍＶ２のような）配列番号：３１のポリペプチドおよび配列番号：７のポリペプチド、
（ＶＨＥＮ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１のような）配列番号：３１のポリペプチドおよび配列番号：８のポリペプチド、
（ＶＨＥＮ７３Ｄ／ｈｕｍＶ２のような）配列番号：３２のポリペプチドおよび配列番号：７のポリペプチド、または
（ＶＨＱＮ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１のような）配列番号：３２のポリペプチドおよび配列番号：８のポリペプチド、
を含むヒト化抗体を提供する。
【００３４】
例えば本明細書にて特記する配列、例えばＣＤＲ１（配列番号：２２）、ＣＤＲ２（配列番号：２３）、ＣＤＲ３（配列番号：２４）、ＣＤＲ１’（配列番号：１９）、ＣＤＲ２’（配列番号：２０）、ＣＤＲ３’（配列番号：２１）の、または配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：３１もしくは配列番号：３２の本発明によるポリペプチドは該（ポリ）ペプチド（配列）の直接均等物を含み；例えば該ポリペプチドの機能的誘導体を含む。該機能的誘導体は特記した配列の共有結合性修飾を含んでよく、そして／または該機能的誘導体は特記した配列のアミノ酸配列変種を含んでよい。
【００３５】
「ポリペプチド」は、特記しない場合、互いにペプチド結合により連結されたアミノ酸を含み、Ｎ末端で始まり、そしてＣ末端で終わるアミノ酸配列を有する任意のペプチドまたはタンパク質を含む。好ましくは本発明のポリペプチドはモノクローナル抗体であり、さらに好ましくはキメラ（Ｖ移植）またはヒト化（ＣＤＲ移植）モノクローナル抗体である。ヒト化（ＣＤＲ移植）モノクローナル抗体はさらにアクセプター抗体のフレームワーク（ＦＲ）配列に導入された別の変異を含んでも、または含まなくてもよい。好ましくはヒト化またはキメラ抗体は１個しかグリコシル化部位を含まない。最も好ましくは該１個のグリコシル化部位はＮグリコシル化部位である。最も好ましくはグリコシル化部位は可変領域に存在せず、そしてなおさらに好ましくはグリコシル化部位は重鎖の可変領域に存在せず、最も好ましくはグリコシル化部位はフレームワーク領域（ＦＲ’）に存在しない。
【００３６】
本明細書で用いるポリペプチドの機能的誘導体には、本発明のポリペプチドに共通する定性的生物学的活性を有する、すなわちＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢに結合する能力を有する分子が含まれる。機能的誘導体には本発明によるポリペプチドのフラグメントおよびペプチド類似体が含まれる。フラグメントは本発明による、例えば特記した配列のポリペプチド配列内の領域を含む。「誘導体」なる用語は本発明による、例えば特記した配列のポリペプチドのアミノ酸配列変種、および共有結合性修飾を定義するために用いられる。本発明による、例えば特記した配列のポリペプチドの機能的誘導体は、本発明による、例えば特記した配列のポリペプチドのアミノ酸配列と、好ましくは少なくとも約６５％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、なおさらに好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９５％の全体配列相同性を有し、そしてＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢに結合する能力を実質的に保持している。好ましくは機能的誘導体は少なくとも、配列番号：１のポリペプチドおよび／もしくは配列番号：２のポリペプチドを含む結合分子、配列番号：９もしくは配列番号：１０のポリペプチドおよび／または配列番号：７もしくは配列番号：８のポリペプチドを含むヒト化抗体、または配列番号：３１もしくは配列番号：３２のポリペプチドおよび／または配列番号：７もしくは配列番号：８のポリペプチドのヒト化抗体の結合親和性を有する。
【００３７】
「共有結合性修飾」は本発明による、例えば特記した配列のポリペプチド；またはそのフラグメントの有機タンパク質性または非タンパク質性誘導体化剤での修飾、異種性ポリペプチド配列への融合、および翻訳後修飾を含む。例えば特記した配列の共有結合性修飾されたポリペプチドは架橋によりＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢに依然結合する能力を有している。共有結合性修飾は従来、ターゲティングされたアミノ酸残基を選択された側または末端残基と反応できる有機誘導体化剤と反応させることにより、または選択された組換え宿主細胞で機能する翻訳後修飾の機構を利用することにより導入される。特定の翻訳後修飾は発現されたポリペプチドに及ぼす組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基はしばしば翻訳後に対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。これに代えて、これらの残基は穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。その他の翻訳後修飾にはプロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル、チロシンまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化が挙げられ、例えばT. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)を参照のこと。共有結合性修飾は例えば本発明による、例えば特記した配列のポリペプチドおよびそのアミノ酸配列変種を含むイムノアドヒージョンのような融合タンパク質、ならびに異種性シグナル配列へのＮ末端融合を含む。
【００３８】
元来のポリペプチドおよびその機能的誘導体に関する「相同性」は本明細書では、最大相同パーセントを達成するために必要により配列をアラインしそしてギャップを導入した後、対応する元来のポリペプチドの残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、そして保存置換を配列同一性の一部とは見なさない。ＮまたはＣ末端伸張も挿入も同一性または相同性を減じるとは解釈されない。アラインメントに関する方法およびコンピュータープログラムは周知である。「アミノ酸」とは全ての天然に存在するＬ−α−アミノ酸を意味し、そして例えばＤ−アミノ酸を含む。アミノ酸は周知である１文字または３文字いずれかの記号表示により識別される。
【００３９】
「アミノ酸配列変種」なる用語は本発明による、例えば特記した配列のポリペプチドに比較してアミノ酸配列にいくつかの差異を伴う分子を意味する。本発明による、例えば特記した配列のポリペプチドのアミノ酸配列変種は依然ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢに結合する能力を有している。置換変種は、本発明による、例えば特記した配列のポリペプチドにおいて少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、そして同一の位置でその場に挿入された異なるアミノ酸を有するものである。これらの置換は分子において１個のアミノ酸だけが置換されている単一か、または同一の分子に２個もしくはそれより多いアミノ酸が置換されている多重でよい。挿入変種は、本発明による、例えば特記した配列のポリペプチドにおいて特定の位置で、あるアミノ酸に直ぐ隣接して挿入された１つまたはそれより多いアミノ酸を有するものである。アミノ酸に直ぐに隣接するとはアミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかに連結されていることを意味する。欠失変種は本発明による、例えば特記した配列のポリペプチドにおいて１つまたはそれより多いアミノ酸が除去されているものである。通常欠失変種は分子の特定の領域で１または２個のアミノ酸が欠失している。
【００４０】
ＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードするＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＣＡＴＴＧＧＣＡＣＡＡＧＣＡＴＡＣＡＧＴＧ（配列番号：２５）；
ＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードするＴＴＣＴＴＣＴＧＡＧＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＧ（配列番号：２６）；
ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするＡＣＡＡＡＧＴＡＡＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＴＣＡＣＧＴＴ（配列番号：２７）；
ＣＤＲ１’のアミノ酸配列をコードするＴＴＡＴＡＴＴＡＴＣＣＡＣＴＧ（配列番号：２８）；
ＣＤＲ２’のアミノ酸配列をコードするＴＴＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＡＣＴＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧ（配列番号：２９）；
ＣＤＲ３’のアミノ酸配列をコードするＡＧＧＡＣＣＣＴＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＴＧＡＣＡＣＣＴＧ（配列番号：３０）；
配列番号：１のポリペプチドをコードする配列番号：５、すなわち本発明によるｍＡｂの軽鎖の可変領域；
配列番号：２のポリペプチドをコードする配列番号：６、すなわち本発明によるｍＡｂの重鎖の可変領域；
配列番号：９のポリペプチドをコードする配列番号：１１、すなわち本発明によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
配列番号：１０のポリペプチドをコードする配列番号：１２、すなわち本発明によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
配列番号：７のポリペプチドをコードする配列番号：１３、すなわち本発明によるＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む軽鎖可変領域；
配列番号：８のポリペプチドをコードする配列番号：１４、すなわち本発明によるＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む軽鎖可変領域；
配列番号：８のポリペプチドをコードする配列番号：３３、すなわち本発明によるＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む軽鎖可変領域；
配列番号：３１のポリペプチドをコードする配列番号：３４、すなわち本発明によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに
配列番号：３２のポリペプチドをコードする配列番号：３５、すなわち本発明によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
のポリヌクレオチド配列もまた見出された。
【００４１】
別の態様では本発明はＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子をコードする、例えば本発明によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、および／または好ましくはおよび、本発明によるＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する；ならびに
配列番号：５のポリヌクレオチドおよび／または、好ましくはおよび、配列番号：６のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；ならびに
例えば
配列番号：７のポリペプチドおよび配列番号：９のポリペプチド、
配列番号：７のポリペプチドおよび配列番号：１０のポリペプチド、
配列番号：８のポリペプチドおよび配列番号：９のポリペプチド、または
配列番号：８のポリペプチドおよび配列番号：１０のポリペプチド、
をコードする配列番号：７もしくは配列番号：８のポリペプチドおよび／または、好ましくはおよび、配列番号：９もしくは配列番号：１０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；ならびに
【００４２】
好ましくは
配列番号：１１のポリヌクレオチドおよび配列番号：１３のポリヌクレオチド、
配列番号：１１のポリヌクレオチドおよび配列番号：１４のポリヌクレオチド、
配列番号：１２のポリヌクレオチドおよび配列番号：１３のポリヌクレオチド、または
配列番号：１２のポリヌクレオチドおよび配列番号：１４のポリヌクレオチド、
を含む配列番号：１１もしくは配列番号：１２のポリヌクレオチドおよび／または、好ましくはおよび、配列番号：１３のポリヌクレオチドもしくは配列番号：１４のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；ならびに
【００４３】
例えば
配列番号：３１のポリペプチドおよび配列番号：７のポリペプチド、
配列番号：３１のポリペプチドおよび配列番号：８のポリペプチド、
配列番号：３２のポリペプチドおよび配列番号：７のポリペプチド、または
配列番号：３２のポリペプチドおよび配列番号：８のポリペプチド、
をコードする配列番号：３１もしくは配列番号：３２のポリペプチドおよび／または、好ましくはおよび、配列番号：７もしくは配列番号：８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
ならびに
【００４４】
配列番号：３４もしくは配列番号：３５のポリヌクレオチド、および／または、好ましくは配列番号：３３；配列番号：１４もしくは１３のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
配列番号：３４のポリペプチドおよび配列番号：３３のポリペプチド、
配列番号：３４のポリペプチドおよび配列番号：１４のポリペプチド、
配列番号：３４のポリペプチドおよび配列番号：１３のポリペプチド、
配列番号：３５のポリペプチドおよび配列番号：３３のポリペプチド、
配列番号：３５のポリペプチドおよび配列番号：１４のポリペプチド、または
配列番号：３５のポリペプチドおよび配列番号：１３のポリペプチド。
【００４５】
本明細書にて特記しない場合、「ポリヌクレオチド」は任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含み、これは未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡでよく、限定するものではないが１本鎖および２本鎖ＲＮＡならびに１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡを含む。
【００４６】
本発明によるポリヌクレオチド、例えば各々配列番号：５、配列番号：６、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：３３、配列番号：３４、もしくは配列番号：３５のポリヌクレオチドのような、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’または各々配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：３１もしくは配列番号：３２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドはその対立遺伝子変種および／またはその相補体を含み；例えば各々配列番号：５、配列番号：６、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：３３、配列番号：３４、または配列番号：３５のヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み；例えば各々配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：３１または配列番号：３２に少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードし、例えば該ポリペプチドの機能的誘導体、例えば各々配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：３１または配列番号：３２と少なくとも６５％の相同性を有する該機能的誘導体を含み、例えば該機能的誘導体は各々配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：３１または配列番号：３２の共有結合性修飾を含み、例えば該機能的誘導体は各々配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：３１または配列番号：３２のアミノ酸配列変種を含み、例えば各々配列番号：５、配列番号：６、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：３３、配列番号：３４、もしくは配列番号：３５は遺伝子コードの冗長（縮重）の結果である配列を含み、各々配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：３１もしくは配列番号：３２のポリペプチドをもまたコードするか、または各々配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：３１もしくは配列番号：３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸を伴うポリペプチドをコードする。好ましくは対立遺伝子変種または機能的誘導体は少なくとも、配列番号：１のポリペプチドおよび／もしくは配列番号：２のポリペプチドを含む結合分子、配列番号：９もしくは配列番号：１０のポリペプチドおよび／または配列番号：７もしくは配列番号：８のポリペプチドを含むヒト化抗体、または配列番号：３１もしくは配列番号：３２のポリペプチドおよび／または配列番号：７もしくは配列番号：８のポリペプチドのヒト化抗体の結合親和性を有する。
【００４７】
例えばキメラまたはヒト化抗体であるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を組換えＤＮＡ技術により生成することができる。したがって、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子をコードする１つまたはそれより多いＤＮＡ分子を構築し、適切な制御配列下に置き、そして適切なベクターにより発現させるために適当な宿主（生物体）に移すことができる。
【００４８】
別の態様では本発明は本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の単一の重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチド；および組換え手段による本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の生成のための本発明によるポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００４９】
ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を例えば本明細書にて提供する情報と一緒に、例えば超可変または可変領域のアミノ酸配列およびこれらの領域をコードするポリヌクレオチド配列の知識を用いて従来の方法と同じように得ることができる。可変ドメイン遺伝子を構築する方法は、例えば欧州特許第２３９４００号に記載されており、そして簡単には以下のように要約できる：いかなる特異性があってもｍＡｂの可変領域をコードする遺伝子をクローニングすることができる。フレームワークおよび超可変領域をコードするＤＮＡセグメントを決定し、そして超可変領域をコードするＤＮＡセグメントを除去する。２本鎖合成ＣＤＲカセットを本明細書にて特記するようなＣＤＲおよびＣＤＲ’配列に従ってＤＮＡ合成により調製する。これらのカセットは付着末端を提供するので、これらはヒト起源の望ましいフレームワークの接合部でライゲートできるようになる。１本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを、例えば従来の方法と同じように調製することができる。このように調製された本発明によるポリヌクレオチドを都合よく適切な発現ベクターに移すことができる。
【００５０】
適切な細胞系を例えば従来の方法によるのと同じように見出すことができる。例えば適当な（複数の）プロモーターを含む発現ベクターならびに重鎖および軽鎖定常部分をコードする遺伝子は公知であり、市販により入手可能である。適切な宿主は公知であるか、または例えば従来の方法によるのと同じように見出すことができ、そして細胞培養またはトランスジェニック動物を含む。
【００５１】
別の態様では本発明は本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子をコードする、例えば配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０または配列番号：４１の配列のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００５２】
別の態様では本発明は：
発現系またはその一部が適合する宿主細胞に存在する場合、該発現系またはその一部が本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を生成することができる、本発明によるポリヌクレオチドを含む該発現系；および
前記で定義したような発現系を含む単離された宿主細胞；
を提供する。
【００５３】
さらに本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子がインビトロＭＬＲにより決定されるように用量依存的な様式で１次同種免疫応答を阻害することを見出した。その結果により本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の存在下で同種活性化されている細胞は同種抗原に対するその応答性を低下させることが示される。これにより、本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子はエフェクター同種反応性Ｔ細胞に直接作用し、そしてその機能を調節することができることが確認される。加えて、観察された機能効果の特異性を評価するために１次ＭＬＲから誘導されたＴ細胞の機能特性が、特異的刺激細胞または第三者刺激剤を用いて２次ＭＬＲにおける再刺激実験においてさらに研究された。２次培養には抗体は加えられなかったが、本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子が存在する１次ＭＬＲから誘導された細胞は、続く特異的刺激細胞での最適な刺激に応答する能力において低下したことが見出された。阻害の特異性は本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子で処理した細胞の無関係の第三者供与体からの刺激細胞に正常に応答する能力により実証された。したがって１次ＭＬＲ培養から誘導されたＴ細胞を用いる再刺激実験により、本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子で同種活性化された細胞は元来の同種抗原に対して低応答性、すなわち寛容であることが示される。別の生物学的活性を実施例７、および９から１３にて記載する。
【００５４】
さらに本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子で予め処理された細胞における細胞増殖を外因性ＩＬ−２により救出することができることが見出された。これにより、本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子での同種活性Ｔ細胞の処理は寛容の状態を誘起することが示される。実際に、本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子で処理された細胞において観察された増殖応答性の低減はＴ細胞機能の低下によるものであり、そしてこれらの細胞は外因性ＩＬ−２に応答することができたが、これはこれらの細胞がアネルギー性の、真の不応答状態にあることを示している。この応答の特異性は、本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子で処理した細胞が無関係の供与体細胞をコントロール処理細胞のレベルまで正常に増殖させる能力により示された。
【００５５】
加えて、実験により本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子のＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢへの結合は免疫された提供者からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の特異的リコール抗原に対する記憶応答を阻害し得ることが示される。本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子のＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢへの結合はまた可溶性抗原に対する記憶応答をも阻害する。本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の、免疫された提供者からのＰＢＭＣにおける破傷風に対するリコール応答を阻害する能力により、本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子が記憶Ｔ細胞の活性化をターゲティングおよび調節できることが示される。例えばこれらのデータにより、本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は、同種反応性のおよび活性化されたＴ細胞を認識することに加えて、その機能を調節することができ、結果的にＴ細胞アネルギーの誘導に至ることが示される。この特性は自己抗原およびアレルゲンに対する、そして恐らく自己免疫疾患、アレルギーおよび慢性拒絶で認められるような同種抗原に対する進行中の免疫応答、ならびに記憶応答が疾病状態の維持において役割を果たす乾癬、炎症性腸疾患のような疾患の処置に重要であろう。自己抗原に対する記憶応答が疾患の維持に関して主要な役割を果たし得る自己免疫疾患におけるような疾患の状況において重要な特徴であると考えられている。
【００５６】
本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子がインビボで混合リンパ球培養反応（ＭＬＲ）におけるＴ細胞増殖応答を調節し得ることもまた見出された、すなわち本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は例えば致死的な異種移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の防御またはＳＣＩＤマウスモデルにおけるヒト同種移植片皮膚拒絶を媒介する炎症過程の抑制、またはｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルにおけるヒト島同種移植片生存の延長のようなインビボ試験における対応する阻害特性を有することが見出された。
【００５７】
したがって本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は免疫抑制性および寛容原性特性を有し得て、そして同種抗原、自己抗原、アレルゲンおよび細菌叢抗原に対するインビボおよびエキソビボ寛容誘導に有用であり得て、例えば本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は、例えば限定するものではないが、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、自己免疫性甲状腺炎、グレーブス病、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、多発性硬化症、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、自己免疫性胃炎、糸球体腎炎、限定するものではないが、例えば心臓、肺、複合心肺、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚もしくは角膜移植の受体の処置のための、器官および組織同種移植片および異種移植片拒絶のような移植片拒絶、骨髄移植の後のような移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、および／もしくは膵臓島細胞移植片拒絶のような自己免疫疾患を含み、ならびに／または乾癬、アレルギー性接触性皮膚炎を含むアトピー性および接触性皮膚炎のような皮膚炎、炎症性腸疾患および／もしくはアレルギー性喘息を含むアレルギーもまた含む疾患の処置および予防に有用であり得る。
別の態様では本発明は、本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の、例えば自己免疫疾患、移植片拒絶、例えば膵臓島移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患および／またはアレルギーの処置および予防における薬剤としての使用を提供する。
【００５８】
別の態様では本発明は、自己免疫疾患、移植片拒絶、例えば膵臓島移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患および／またはアレルギーに関連する疾患の処置および予防における医薬品の生成のための本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を提供する。
【００５９】
別の態様では本発明は、かかる処置および／または予防を必要とする対象に有効量の本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を例えば本発明による医薬組成物の形態で投与することを含む、自己免疫疾患、移植片拒絶、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患および／またはアレルギーに関連する疾患の処置および予防の方法を提供する。
【００６０】
本発明の１つの実施態様は、かかる処置および／または予防を必要とする対象に有効量の本発明による分子またはヒト化抗体を投与することを含む、島細胞移植片拒絶に関連する疾患、例えば島細胞移植片拒絶の処置および／または予防の方法を提供する。
【００６１】
好ましい実施態様では、薬剤として使用するための、医薬品を製造するための、または自己免疫疾患、移植片拒絶、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患および／またはアレルギーに関連する疾患の処置および／または予防の方法における該ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は配列番号：３１もしくは配列番号：３２のポリペプチドおよび／または配列番号：７もしくは配列番号：８のポリペプチドを含む。好ましくはＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は配列番号：３１のポリペプチドおよび配列番号：８のポリペプチドを含む。
【００６２】
ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の「有効量」は、直接的または間接的のいずれかで、自己免疫疾患、移植片拒絶、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患および／またはアレルギーの結果である１つまたはそれより多い徴候を低減させる、これらを患うものの生活の質を高める、かかる疾患を処置するのに必要なその他の薬物療法の用量を減少させる、別の薬物療法の効果を増強する、疾患の進行を遅延させる、および／または患者の生存を延長するような臨床結果を含む有益なまたは望ましい結果を起こすのに十分な量である。
【００６３】
有効量を１回またはそれより多い投与で投与することができ、そして別の薬物、化合物または医薬組成物と併用して達成してもしなくてもよい。したがって、「有効量」を、１つまたはそれより多い治療薬を投与する局面で考えることができ、そして１つまたはそれより多いその他の薬剤と併用して望ましい結果を達成し得るかまたは達成する場合、単一の薬剤を有効量で与えると考えることができる。
【００６４】
さらに例えば自己免疫疾患、移植片拒絶、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患および／またはアレルギーに関連する疾患の処置または予防のために本発明のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を単独で活性な成分として、または免疫調節投薬計画におけるその他の薬物またはその他の抗炎症剤と一緒に投与できることも提供される。例えば本発明のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子をカルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡ、シクロスポリンＧ、ＦＫ−５０６、ＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１；ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３６７５、ＡＰ２３８４１、ＴＡＦＡ−９３、バイオリムス−７もしくはバイオリムス−９；副腎皮質ステロイド；シクロホスファミド；アザチオプリン；メソトレキセート；Ｓ１Ｐ受容体アゴニスト、例えばＦＴＹ７２０もしくはその類似体；レフルノミドもしくはその類似体；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスペルグアリンもしくはその類似体；免疫抑制性モノクローナル抗体、例えば白血球受容体、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ２７、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）、ＯＸ４０、４−１ＢＢもしくはそのリガンド、例えばＣＤ１５４に対するモノクローナル抗体；またはその他の免疫調節化合物、例えばＣＴＬＡ４もしくはその変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部を有する組換え結合分子、例えばＣＴＬＡ４の少なくとも細胞外部分もしくは非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に連結されたその変異体、例えばＣＴＬＡ４ｌｇ（例えばＡＴＣＣ６８６２９に指定されている）もしくはその変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙ、もしくはその他の付着分子阻害剤、例えばｍＡｂもしくはＬＦＡ−１アンタゴニストを含む低分子量阻害剤、セレクチンアンタゴニストおよびＶＬＡ−４アンタゴニストと組み合わせて用いることができる。
【００６５】
単独のまたは他の薬物、化合物もしくは医薬組成物と併用した有効量の本発明のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を、注射を含む任意の従来の経路により、または時間をかけた漸次注入により投与することができる。投与は例えば経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、局所または経皮でよい。「同時投与」とは、経口投与時に例えば双方の化合物が同時に消化管に存在するように、一緒にまたは実質的に同時に、同一のベヒクルまたは別個のベヒクルのいずれかでの本発明の組成物の成分の投与を意味する。好ましくは化合物を固定された組み合わせで投与する。
【００６６】
別の態様では本発明は少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤に随伴される本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を含む医薬組成物を提供する。
本明細書で用いる「薬学的に許容される担体または希釈剤」なる用語は、ヒトを含む哺乳動物への投与に適当な１つまたはそれより多い適合した固体または液体充填剤、希釈剤、または封入物質を意味する。
【００６７】
「担体」なる用語は、適用を促すために活性成分と組み合わせる、天然または合成の有機または無機成分を意味する。
「薬学的に許容される」なる用語は、活性成分の生物学的活性の有効性と干渉しない無毒の材料を意味する。かかる製剤は通常薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合する担体、アジュバントおよびサイトカインのような免疫補助増強剤、ならびに場合によっては化学療法剤のようなその他の治療薬を含有する。
【００６８】
医薬品を用いる場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩を都合よく用いてその薬学的に許容される塩を調製することができ、そして本発明の範囲から排除されない。
医薬組成物は：酢酸の塩；クエン酸の塩；ホウ酸の塩；およびリン酸の塩を含む適当な緩衝剤を含有することができる。
医薬組成物はまた場合によっては：塩化ベンザルコニウム；クロロブタノール；パラベンおよびチメロサールのような適当な保存剤を含有することもできる。
【００６９】
対象に投与されるポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸の用量を種々のパラメーターに従って、とりわけ用いる投与の様式および対象の状態に従って選択することができる。その他の因子には望ましい処置期間が挙げられる。対象における応答が適用された最初の用量で不十分である場合には、患者の寛容が許容される程度まで高用量（または異なる、さらに局所化された分配経路による効果的な高量）を用いることができる。
【００７０】
医薬組成物を単位投与形態で都合よく提示することができ、そして薬学の分野で周知のいずれかの方法により調製することができる。全ての方法は、１つまたはそれより多い副成分を構成する担体に活性薬剤を随伴させる工程を含む。一般に、液体担体、微細に分割された固体担体、または双方に活性化合物を均一におよび十分に随伴させ、そして次に必要により生成物を成形することにより組成物を調製する。
【００７１】
経口投与に適当な組成物を、各々予め決定された量の活性化合物を含有するカプセル、錠剤、トローチ剤のような個々の単位として提示することができる。その他の組成物には水性液体またはシロップ、エリキシルまたはエマルジョンのような非水性液体の懸濁液が挙げられる。
【００７２】
非経口投与に適当な組成物はポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸の滅菌水性または非水性調製物を含むのが都合よく、これは受体の血液と等張であるのが好ましい。適当な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いて公知の方法に従ってこの製剤を処方することができる。滅菌注射用製剤はまた、無毒の非経口用に許容される希釈剤または溶媒中、例えば１,３−ブタンジオール溶液として、滅菌注射用溶液または懸濁液でよい。許容されるベヒクルおよび溶媒のうち、水、リンガー溶液、および等張塩化ナトリウム溶液を用いてよい。加えて、滅菌不揮発性油を溶媒または懸濁溶媒として用いるのが都合よい。この目的のために合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油を用いることができる。加えて、オレイン酸のような脂肪酸を注射用の製剤に用いることができる。経口、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に適当な担体処方をRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.に見出すことができる。
【００７３】
医薬組成物はさらに例えば活性な成分、限定するものではないが、例えば前記したような抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ１５４、抗ＣＤ１３４Ｌのようなその他の免疫調節抗体、または限定するものではないがｒＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ｒＯＸ４０（ＣＤ１３４）のような組換えタンパク質、または限定するものではないがシクロスポリンＡ、ＦＴＹ７２０、ＲＡＤ、ラパマイシン、ＦＫ５０６、１５−デオキシスペルグアリン、ステロイドのような抗炎症剤もしくは免疫調節化合物を含み得る。かかる医薬組成物は使用のための指示書、場合によっては成分化合物の投与のコンプライアンスを促すためのさらなる手段、例えばラベルまたは図面を伴って、本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子ならびに別個の単位投与形態の免疫調節薬および／または抗炎症剤を含むことができ、ここで好ましくは単位投与形態は相乗効果量の成分化合物の投与に適当である。本発明の組成物を自由な組み合わせとして投与できるか、または固定された組み合わせに処方することができる。化合物の絶対投与量を多くの因子、例えば個体、投与経路、望ましい期間、活性物質の放出速度、ならびに処置される状態の特性および重篤度に依存して変える。
【００７４】
単独でまたはその他の薬物と組み合わせて本発明のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子で処置される前記で概要を示したような疾患には、限定するものではないが、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、自己免疫性甲状腺炎、グレーブス病、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、多発性硬化症、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、自己免疫性胃炎、糸球体腎炎を含む自己免疫疾患；限定するものではないが、例えば心臓、肺、複合心肺、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚もしくは角膜移植の受体の処置のための器官および組織同種移植片および異種移植片拒絶を含む移植片拒絶、骨髄移植の後のような移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、および／もしくは膵臓島細胞移植片拒絶；乾癬；アレルギー性接触性皮膚炎を含むアトピー性および接触性皮膚炎のような皮膚炎；炎症性腸疾患ならびに／またはアレルギー性喘息を含むアレルギーが挙げられる。
【００７５】
（実施例）
以下の実施例を参照することにより本発明はさらに十分に理解されよう。しかしながらこれらは本発明の範囲を限定するとして解釈すべきではない。以下の実施例では全ての温度はセルシウス度である。
「候補ｍＡｂ」または「キメラ抗体」は、配列番号：３の軽鎖および配列番号：４の重鎖を含む本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子である。
【００７６】
「ヒト化抗体」は配列番号：８のポリペプチドおよび配列番号：９のポリペプチド（ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＥ／ＶＬ１またはＶＨＥ／ＶＬｈ）、配列番号：８のポリペプチドおよび配列番号：１０のポリペプチド（ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＱ／ＶＬ１またはＶＨＱ／ＶＬｈ）；配列番号：７のポリペプチドおよび配列番号：９のポリペプチド（ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＥ／ＶＬ２またはＶＨＥ／ＶＬｍ）；配列番号：７のポリペプチドおよび配列番号：１０のポリペプチド（ＶＨＱ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱ／ＶＬ２またはＶＨＱ／ＶＬｍ）；配列番号：８のポリペプチドおよび配列番号：３１のポリペプチド（ＶＨＥＮ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＥＮ７３Ｄ／ＶＬ１またはＶＨＥＮ７３Ｄ／ＶＬｈ）；配列番号：８のポリペプチドおよび配列番号：３２のポリペプチド（ＶＨＱＮ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＱＮ７３Ｄ／ＶＬ１またはＶＨＱＮ７３Ｄ／ＶＬｈ）；配列番号：７のポリペプチドおよび配列番号：３１のポリペプチド（ＶＨＥＮ７３Ｄ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＥＮ７３Ｄ／ＶＬ２またはＶＨＥＮ７３Ｄ／ＶＬｍ）；または配列番号：７のポリペプチドおよび配列番号：３２のポリペプチド（ＶＨＱＮ７３Ｄ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱＮ７３Ｄ／ＶＬ２またはＶＨＥＮ７３Ｄ／ＶＬｍ）を含む本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子である。
【００７７】
以下の略語を用いる：
ＡＰＣ          抗原提示細胞
ＣＥＸ          陽イオン交換クロマトグラフィー
ｃ．ｐ．ｍ．        分あたりのカウント数
ｄｈｆｒ        ジヒドロ葉酸リダクターゼ
ＥＤＴＡ          エチレンジニトリロ四酢酸
ＥＬＩＳＡ          酵素結合免疫吸着測定法 
ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ      エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型
ＦＡＣＳ          蛍光活性化細胞分類
Ｆｃ            結晶化可能フラグメント
Ｆ（ａｂ’）２      抗原結合性フラグメント；２価
ＦＩＴＣ          フルオレセインイソチオシアナート
ＦＢＳ            ウシ胎仔血清
ＧＶＨＤ            移植片対宿主病
ＨＣＭＶ          ヒトサイトメガロウイルスプロモーター
ＨＰＬＣ          高速液体クロマトグラフィー
ＩＦＮ−γ        インターフェロンガンマ
ＩｇＥ            免疫グロブリンアイソタイプＥ
ＩｇＧ            免疫グロブリンアイソタイプＧ
ＩＬ−２            インターロイキン−２
ＩＵ            国際単位
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ      マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型
ＭＬＲ            混合リンパ球培養反応
ＭＬＣ            混合リンパ球培養
ＭＰ１            ヘモフィラス・インフルエンザ由来のマトリックスプロテイン１
ＭＴＸ            メソトレキセート
ＰＢＳ            リン酸緩衝生理食塩水
ＰＢＬ            末梢血白血球
ＰＢＭＣ          末梢血単核球
ＰＣＲ            ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＰ            逆相クロマトグラフィー
ＳＥＣ          サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＣＩＤ          重症複合免疫不全
Ｔｒｅｇ          Ｔ調節細胞
ｘＧＶＨＤ            異種移植片対宿主病
【００７８】
実施例１：１次混合リンパ球培養反応（ＭＬＲ）
細胞
血液試料を健常ヒト提供者から入手する。Ficoll-Hypaque (Pharmacia LKB)上で遠心することにより全末梢血、白血球搬出またはバフィーコートからの白血球から公知の血液型であるが未知のＨＬＡ型である末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離する。ＭＬＲ実験では４０Ｇｙ照射の後、ＰＢＭＣを刺激細胞として直接用いることもある。ＣＤ２またはＣＤ３  Dynabeads (Dynal, Oslo, Norway)を用いることによりＴ細胞をＰＢＭＣから枯渇させる実験もある。ビーズおよび夾雑する細胞を磁場により除去する。照射の後、Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣを刺激細胞として用いる。
【００７９】
ＰＢＭＣ、ＣＤ３＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞をＭＬＲにおける応答細胞として用いる。異なる提供者からの細胞を刺激細胞に対して調製する。抗ＣＤ１６  ｍＡｂ（Zymed, CA）、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Dynabeads、抗ＣＤ１４  Dynabeads、ＣＤ１９  Dynabeadsを用いてＣＤ３＋Ｔ細胞を陰性選択により精製する。加えて、抗ＣＤ８  Dynabeadsを用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を精製する。FACScanまたはFACSCalibur (Becton Dickinson & Co., CA)により得られた細胞を分析し、そして得られた細胞の純度は＞７５％であった。１０％熱不活性化ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地に細胞を懸濁する。
【００８０】
試薬
キメラ抗ＣＤ４５Ｒ０／ＲＢ  ｍＡｂ「候補ｍＡｂ」およびアイソタイプ対応コントロールキメラ抗体をも作成する。ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）または組換えヒトＩＬ−１０に特異的なマウス（ヒト）コントロールＩｇＧ１抗体をBD Pharmingen (San Diego, CA)から購入する。抗ヒトＣＤ１５４  ｍＡｂ  ５ｃ８はLederman et al 1992による。
【００８１】
１次混合リンパ球培養反応（ＭＬＲ）
９６ウェル培養プレート（Costar, Cambridge, MA）の各ウェル中、示したｍＡＢの存在下またはＡｂの不在下で1×１０５個のＰＢＭＣまたは５×１０４個のＣＤ３＋もしくはＣＤ４＋細胞のアリコートを1×１０５個の照射ＰＢＭＣまたは５×１０４個のＴ細胞枯渇照射（５０Ｇｙ）ＰＢＭＣと混合する。最適な標的ＣＤ４５分子のインビトロ架橋を確実にするために、候補ｍＡｂに加えてＦｃ部分に特異的なヤギ抗マウスＩｇまたはヤギ抗ヒトＩｇのＦ（ａｂ’）２フラグメント（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）を１０μｇ／ｍｌで加える実験もある。混合した細胞を５％  ＣＯ２中３７℃で４または５日間培養し、そして最後の１６から２０時間の培養の間３Ｈ−チミジンと共に細胞をパルスすることにより増殖を決定する。前記したものに類似するが、以下：１）用いる培地は１０％  ＦＢＳおよび１％  ヒト血漿を含有するＥＸ−ＶＩＶＯ（Bio-Whittaker）を用いる；２）２次架橋工程として抗マウス全ＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）を用いる；３）刺激細胞の照射は６０Ｇｙである；は例外である実験もある。
【００８２】
「候補ｍＡｂ」またはコントロールキメラＩｇＧ１（１０μｇ／ｍｌ）の存在下、双方共に２次工程試薬、Ｆｃ部分に特異的なヤギ抗ヒトＩｇのＦ（ａｂ’）２フラグメント（１０μｇ／ｍｌ）を用いて１次ＭＬＲを実施する。「候補ｍＡｂ」による阻害パーセンテージをコントロールＩｇＧ１の存在下の細胞増殖と比較して算出する。結果を以下の表１に示す：
【００８３】
【表１】
2007529196.tif 000002
＊コントロール値とは有意に異なる（Ｐ＜０.００１）
【００８４】
表１で示し得るように本発明による候補ｍＡｂは１次ＭＬＲを阻害する。平均阻害効果は４つの異なる提供者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞で６０.８３±６.８３％であり、そして統計的に有意である。
「候補ｍＡｂ」による１次ＭＬＲの阻害は図１に示されるように「候補ｍＡｂ」の０.００１および１０μｇの範囲で用量依存的であることが示される。
【００８５】
「候補ｍＡｂ」による１次ＭＬＲの阻害に関するＩＣ５０は応答細胞として１提供者ＰＢＭＣを用いる３つの別個のＭＬＲ実験の結果から決定される。したがって、＃２２９および＃２１９提供者からの応答ＣＤ４＋Ｔ細胞および刺激剤としてＴ細胞を枯渇した照射ＰＢＭＣを「候補ｍＡｂ」またはコントロールキメラＡｂの存在下で１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇのＦ（ａｂ’）２フラグメントと混合する。実験を３回繰り返し、そしてコントロールＡｂの存在下のＴ細胞増殖と比較して、「候補ｍＡｂ」の存在下の増殖のパーセンテージを算出する。Origin（V. 6.0（登録商標））を用いてＩＣ５０値を決定する。細胞活性ＩＣ５０値は、算出して０.８７±０.３５ｎＭ（０.１３±０.０５２μｇ／ｍｌ）になる。
【００８６】
実施例２：２次ＭＬＲ
「候補ｍＡｂ」がＣＤ４＋Ｔ細胞の特異的同種抗原に対する非応答性を誘起するかどうかを評価するために、１次ＭＬＣの後に抗体を何ら存在させないで２次ＭＬＲを実施する。９６ウェル培養プレート中示した抗体の存在下で１０日間ＣＤ４＋Ｔ細胞を照射した同種刺激細胞（Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣ）と共に培養する（１次ＭＬＣ）。次いで細胞を収集し、Ficoll-Hypaqueグラジエント上に積層して死細胞を除去し、ＲＰＭＩで２回洗浄し、そして同一の刺激剤、第三者刺激細胞またはＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）で再刺激する。細胞を３日間培養し、そして３Ｈ−チミジンで最後の１６から２０時間の培養の間細胞をパルスすることにより増殖性応答を決定する。
【００８７】
具体的には、１０μｇ／ｍｌ「候補ｍＡｂ」、コントロールＩｇＧ１キメラＡｂおよびヤギ抗ヒトＩｇのＦ（ａｂ’）２フラグメントの存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を照射した同種刺激細胞（別の提供者から採取したＴ細胞枯渇ＰＢＭＣ）と共に培養する。１次ＭＬＲ増殖を５日に決定する。２次ＭＬＲのために応答および刺激細胞を「候補ｍＡｂ」の存在下１０日間培養し、次いで細胞を収集し、ＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄し、そして抗体を何ら存在させないで特異的刺激剤、第三者刺激剤またはＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）で再刺激する。細胞増殖を３日に決定する。結果を表２に示す：
【００８８】
【表２】
2007529196.tif 000003
＊コントロール値とは有意に異なる（ｐ＝＜０.００１、ｔ検定により決定、SigmaStat V.2.03）。＃ｐ＝＜０.０４６
【００８９】
低下した増殖が「候補ｍＡｂ」との処理の結果としての非応答性によるのかどうかを検定するために、１次ＭＬＲから誘導された細胞をＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）の存在下で培養する。ＩＬ−２の添加の結果、１次ＭＬＲにおいて「候補ｍＡｂ」で処理されたＴ細胞の増殖応答はＩｇＧ１コントロールＡｂにおいて観察されたものに類似するレベルまで救出される。これらのデータにより、「候補ｍＡｂ」で処理されたＴ細胞における２次応答の低下は、特異的刺激細胞に対して非応答性になる応答Ｔ細胞の機能的変化によるものであることが示される。
【００９０】
阻害パーセンテージを以下の式に従って算出する：
【数１】
2007529196.tif 000004
SigmaStat (Vers. 2.03)を用いて統計分析を実施する。
二元配置分散分析（two-way ＡＮＯＶＡ）に続いてDunnett法によりデータを分析する。全ての検定手順で確率＜０.０５を有意と考える。ｔ検定を用いる実験もある（SigmaStat V.2.03）。
【００９１】
実施例３：ＳＣＩＤマウスにおけるインビボ生存試験
ＳＬＩＤマウスにおけるｈｕ−ＰＢＬの生着
ＳＣＩＤマウスＣ.Ｂ１７/GbmsTac-Prkdcscid Lystbgマウス（Taconic, Germantown, NY）に、ヒト末梢血単核球（ＰＭＢＣ）を細胞移入から４週以内に＞９０％のマウスに致死的な異種移植片対宿主病（ｘＧｖＨＤ）を誘起するに十分な量で腹腔内注射する。かかる処置をされたＳＣＩＤマウスを以後ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスと称する。
【００９２】
ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスのＭａｂ処置
０日、ＰＢＭＣ注射後すぐ、３日、７日およびその後毎週の間隔でｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスを「候補ｍＡｂ」またはマウスもしくはキメラアイソタイプ対応ｍＡｂコントロールで処置する。ＭａｂをＰＢＳ１００μｌ中最終濃度５ｍｇ／ｋｇ体重で皮下に分配する。全てのコントロールマウスが死亡したときに処置を停止した。
【００９３】
処置結果の評価
この試験で「候補ｍＡｂ」の効果を評価するための主要な基準はｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの生存であった。Systat v9.01ソフトウェアの助けを借りて、ログランク検定（Mantel法）を用いる生存分析の統計学的方法により結果の有意性を評価する。生存分析の方法はノンパラメトリック検定であり、これは特定のマウスが依然生存しているかどうかを考慮するのみならず、その器官／細胞でのインビトロ分析の実施の要求のような処置／疾患に関係のない理由のために屠殺されたかどうかもまた考慮する。さらに評価するために肝臓、肺、腎臓および脾臓の生検を死亡したマウスから入手する。加えて、健康状態を間接的に推定するのにｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの重量測定を最初（細胞移植の前）および実験期間中（２日毎）に行う。各マウスから得られた体重対ＰＢＭＣ移入後日数の値を用いて線形回帰線を作成し、そして続いてノンパラメトリックMann-Whitney検定を用いてその勾配（コントロール対抗ＣＤ４５処置マウス）を比較した。
【００９４】
結果
マウスｍＡｂコントロールで処置した全てのｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスは肺、肝臓および脾臓でヒト白血球の浸潤があり、そして細胞移入後約２から３週以内に死亡した（４／４）。死亡はおそらくｘＧｖＨＤの結果である。コントロールｍＡｂ処置マウスはさらに直線的な様式で３週以内に約１０％以上体重が減少した。
【００９５】
「候補ｍＡｂ」で処置した全てのｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスは、３週後に「候補ｍＡｂ」処置を停止しても、何ら疾患の明白な徴候もなく４週以上生存した（４／４）。「候補ｍＡｂ」処置マウスは直線的な様式で４週以内に約５％まで体重が増加した。
【００９６】
実施例４：本発明の抗体の発現
配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：３１または配列番号：３２を含むヒト化抗体の発現
各々ヒト化軽鎖可変領域ｈｕｍＶ１（配列番号：８；図４および６）、ヒト化軽鎖可変領域ｈｕｍＶ２（配列番号：７；図５および７）、ヒト化重鎖可変領域ＶＨＥ（配列番号：９；図３および１０）、またはヒト化重鎖可変領域ＶＨＱ（配列番号：１０；図２および１１）、ヒト化重鎖可変領域ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ（配列番号：３１；図８）、またはヒト化重鎖可変領域ＶＨＱ−Ｎ７３Ｄ（配列番号：３２；図９）のアミノ酸配列をコードする対応するヌクレオチドを含む図２から１１に示すプラスミドマップによる発現ベクターを構築する。これらの発現ベクターは配列番号：１５および配列番号：４１（ＶＨＱ）、配列番号：１６および配列番号：４０（ＶＨＥ）、配列番号：１７および配列番号：３６（ｈｕｍＶ１）、配列番号：１８および配列番号：３９（ｈｕｍＶ２）、または配列番号：３７（ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ）および配列番号：３８（ＶＨＱ−Ｎ７３Ｄ）のＤＮＡ（ヌクレオチド）配列を有する。
【００９７】
ＣＯＳ細胞における発現のためのヒト化抗体重鎖および軽鎖発現ベクターの構築
バージョンＶＬｈおよびＶＬｍのためのヒトカッパ軽鎖発現ベクター
ヒトカッパアイソタイプの完全ヒト化軽鎖をコードする最終発現ベクターを構築するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩを用いて完全軽鎖可変領域（ＶＬｈおよびＶＬｍ）をコードするＤＮＡフラグメントをＶＬｈおよびＶＬｍ含有ＰＣＲスクリプトクローニングベクター（Stratagene）（ＶＬｍ領域）から切り取った。ゲル精製したフラグメントを、ヒト化抗ＩｇＥ抗体ＴＥＳＣ−２１（Kolbinger et al 1993）の構築の間に創られ、そして元はM. Bendig（MRC Collaborative Centre, London, UK）（Maeda et al. 1991）から入手したＣ２１−ＨＣＭＶカッパ発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。フェノール／クロロホルム抽出によりライゲーション生成物を精製し、そしてエレクトロポレーションコンピテントEpicurian Coli（登録商標） XL1-Blue 株（カタログ番号２００２２８、Stratagene）にエレクトロポレートした。ＬＢ／ａｍｐ寒天平板に３７℃で一晩蒔いた後、各１２コロニーを取り、BioRobot ９６００（Qiagen）を用いて３ｍｌ培養物からプラスミドＤＮＡを調製した。これは図でさらに記載するように、ヒト化抗体バージョンＶＬｈおよびＶＬｍ各々のための軽鎖発現ベクターを生じた。
【００９８】
ＶＨＱのためのヒトガンマ−１重鎖発現ベクター
ＶＨＱ発現ベクターの構築のために、段階的アプローチを採用した。最初にＶＨＱの完全な可変領域をKolbinger et al 1993（Protein Eng. 1993 Nov; 6(8):971-80）に記載されるような方法によってＰＣＲにより組み立て、そして同一の酵素を用いてＣ２１インサートが除去されているＣ２１−ＨＣＭＶ−ガンマ−１発現にサブクローニングした。完全可変領域を含有するＰＣＲスクリプトクローニングＶＨＱのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを次いで同一の酵素で切断した発現ベクターＣ２１−ＨＣＭＶ−ガンマ−１にサブクローニングした。これはヒト化抗体バージョンＶＨＱのための最終発現ベクターを生じた。
【００９９】
ＶＨＥのためのヒトガンマ−１重鎖発現ベクター
ヒト化抗ＩｇＥ抗体ＴＥＳＣ−２１の構築の間に創られた（Kolbinger et al. 1993）、およびまた元はM. Bendig (MRC Collaborative Centre, London, UK) (Maeda et al. 1991)から入手したＣ２１−ＨＣＭＶ−ガンマ−１発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位に、種々の領域をコードするＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限ＰＣＲフラグメントを直接ライゲートすることによりヒトガンマ−１アイソタイプの完全なヒト化重鎖をコードする最終ＶＨＥ発現ベクターの構築を達成した。
【０１００】
ＣＯＳ細胞における一過性発現
SuperFect（商標）トランスフェクション試薬（カタログ番号３０１３０５、Qiagen）を用いて以下のトランスフェクションプロトコルを１５０ｍｍ細胞培養皿中の付着ＣＯＳ細胞に適合させる。前記で記載した４つの異なる発現ベクターを細胞の一過性トランスフェクションに用いる。ヒト化抗体の発現のために、重鎖インサートを含有する２つのクローンの各々（各々ＶＨＥまたはＶＨＱ）を、軽鎖をコードする２つのクローンの各々（各々ｈｕｍＶ１またはｈｕｍＶ２）と共に、重鎖および軽鎖発現ベクターの全部で４つの異なる組み合わせ（ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ２）を細胞に同時トランスフェクトする。トランスフェクションの前に、アンピシリンの耐性遺伝子をコードする領域で切断する制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩでプラスミドを直線化する。トランスフェクションの前日に、新鮮培養培地３０ｍｌ中４×１０６ＣＯＳ細胞を１５０ｍｍ細胞培養皿に加える。この細胞密度での播種は一般に２４時間後に８０％細胞集密度を生じた。トランスフェクションの日に直線化した重鎖および軽鎖ＤＮＡ発現ベクターの４つの異なる組み合わせ（各１５μｇ）を血清および抗生物質を含まない新鮮培地全容量９００μｌに希釈する。次いでSuperFectトランスフェクション試薬１８０μｌをＤＮＡ溶液と完全に混合する。ＤＮＡ混合物を室温で１０分間インキュベートして複合体を形成させる。複合体形成を生じる間、成長培地をＣＯＳ細胞培養から除去し、そして細胞をＰＢＳで１回洗浄する。次に新鮮培養培地９ｍｌ（１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含有する）をトランスフェクション複合体が入った各反応チューブに加え、そして十分に混合する。最終調製物を即座に４つの培養物の各々に移してトランスフェクトさせ、そして穏やかに混合する。次いで細胞培養物をＤＮＡ複合体と共に３７℃および５％ＣＯ２で３時間インキュベートする。インキュベーションの後、トランスフェクション複合体を含有する培地を除去し、そして新鮮培養培地３０ｍｌで置換する。トランスフェクション後４８時間に培養上澄を収集する。
【０１０１】
培養上澄の濃度
ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析のために、重鎖および軽鎖プラスミドでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞から収集した培養上澄を以下のように濃縮する。Centriprep YM-50遠心分離器フィルター装置（カタログ番号４３１０、Millipore）に製造者により記載されるように各上澄１０ｍｌを加える。Centriprepフィルターを室温で３０００ｒｐｍで１０分間遠心する。次いで５分間のみの遠心を用い、そして濃度の漸進的変化を監視して、再度残りの上澄２０ｍｌで遠心工程を繰り返す。濃縮した上澄の中間体５００μｌを回収し、新しいMicrocon遠心分離器フィルター装置（カタログ番号４２４１２、Microcon）に移し、そして以下の製造者のプロトコルに従ってさらに濃縮する。室温で３０００ｒｐｍで２４分間を４回、６０００ｒｐｍで１０分間を１回、そして次に５分間を３回、濃縮した上澄を遠心し、いつも濃度の漸進的変化を監視する。達成した濃縮条件培地の最終容量は１００から１２０μｌであり、元の培養培地の２５０から３００倍の濃度に相当し、そして用時まで４℃で保存する。比較およびコントロールのためにトランスフェクトしていない細胞からの培養培地を前記したのと同一の遠心プロトコルを用いて同様に濃縮する。
【０１０２】
ヒト化抗ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ抗体を分泌する安定したＳｐ２／０骨髄腫トランスフェクタントの作成
マウス骨髄腫細胞系Ｓｐ２／０（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５８１）を前記したＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合ヒト化抗体の重鎖（ＶＨＥまたはＶＨＱ）および軽鎖（ｈｕｍＶ１またはｈｕｍＶ２）をコードするＣＨＯ発現ベクターと共にエレクトロポレートする。重鎖および軽鎖発現ベクターの４つの異なる組み合わせ（ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ２）を以下のプロトコルに従ってトランスフェクションに用いる：エレクトロポレーションキュベット（０.４ｃｍギャップ）中で各プラスミドのスーパーコイルＤＮＡ２０μｇをＤＭＥＭ／１０％  ＦＣＳ培養培地に懸濁した８×１０６個の生存Ｓｐ２／０細胞と混合する。BioRad GenePulser装置を用いるエレクトロポレーションの設定は１５００Ｖ、２５μＦである。エレクトロポレーションの後、細胞を培養培地（１０％  ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを補充したＤＥＭＥ）中２０時間培養する。２日に選択薬物Ｇ４１８（カタログ番号１０１３１−０１９、Gibco）を最終濃度１ｍｇ活性薬物／ｍｌまで加え、そして細胞を各ウェル２００μｌの９６ウェルプレートにウェルあたり約１０５セルで分配する。１０から１５日後、Ｇ４１８生存クローンをＧ４１８含有培地に広げる。コーティング抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ／Ｆｃ（カタログ番号１０９−００５−０９８、Jackson Labs）およびヒトカッパ軽鎖に対するペルオキシダーゼ結合抗体（カタログ番号Ａ−７１６４、Sigma）を用いて、これらのトランスフェクタントからのヒト化ｍＡｂの分泌をＥＬＩＳＡにより評価する。再度ＥＬＩＳＡを用いて、このアッセイで正のスコアであったトランスフェクタントを細胞あたり日あたりで生産性を比較するために選択する（以下を参照）。ウェルあたり１セルの播種密度を用いて、限界希釈により即座にサブクローニングするために各トランスフェクタントのもっともよいクローンを選択する。Ｇ４１８生存サブクローンの生産性を再度前記したように決定する。培養容量が１５０ｍｌに到達するまでサブクローンをＧ４１８含有選択培地に広げ、この段階でローラボトルに供給することになっているフラスコ中、Ｇ４１８を含まないで培養を続ける。
【０１０３】
最初のトランスフェクションおよび選択の後、安定したトランスフェクタントはＶＨＥ／ｈｕｍＶ１に関して２０.８％、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１に関して１１.５％、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２に関して１８.８％、およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ２に関して７.３％の頻度で９６ウェルプレートから生じる。２ラウンドのサブクローニングの後、最良の２個の生産体はＶＨＥ／ｈｕｍＶ１に関してはクローン１.３３.２５（３.８７ｐｇ／セル／日）およびクローン１.３３.２６（３.４３ｐｇ／セル／日）、そしてＶＨＱ／ｈｕｍＶ１に関してはクローン１２.１.４（１.１９ｐｇ／セル／日）およびクローン１２.１.２０（１.０５ｐｇ／セル／日）である。ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ１に関する安定したＳｐ２／０トランスフェクタントを続いて抗体生成および精製のために拡大する。
【０１０４】
固定された抗ヒトＩｇＧＦｃマトリックスおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いるアフィニティークロマトグラフィーの組み合わせにより、１０％ＦＣＳを含有する安定してトランスフェクトされたＳｐ２／０骨髄腫細胞系の上澄から抗体を精製する。必要によりActiclean Etoxカラム（Sterogene Bioseparations）を用いてエンドトキシンを除去する。
【０１０５】
Ｓｐ２／０細胞における発現のためのヒト化抗体重鎖および軽鎖発現ベクターの構築
バージョンＶＬｈおよびＶＬｍのためのヒトカッパ軽鎖発現ベクター：
ｈｕｍＶ１（＝ＶＬ１）またはｈｕｍＶ２（＝ＶＬ２）ｃＤＮＡをＰＣＲにより各々ＣＨＯ発現プラスミド配列番号：１７または配列番号：１８から、プライマーＨｕＣＤ４５ＬＣ−Ｍｌｕ（５’−ＡＡＡＡＣＧＣＧＴＴＧＴＧＡＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴ−３’；配列番号：４２）およびＨｕＣＤ４５ＬＣ−Ｈｉｎｄ（５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＧＡＡＣＧＴＧＡＡ−３’；配列番号：４３）を用いて増幅する。３２１ｂｐのＰＣＲフラグメント各々をＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして同一の酵素で消化した軽鎖発現ベクターｃｈＡ６ＨＣｋ．ｄｈｆｒに直接ライゲートする。得られたプラスミドを各々ＬＣＶＬ１Ｓｐ２０（配列番号：３６；図６）およびＬＣＶＬ２Ｓｐ２０（配列番号：３９；図７）と称する。次にＬＣＶＬ１Ｓｐ２０をＳｐ２／０細胞におけるヒト化ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１またはＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の発現に用い；次にＬＣＶＬ２Ｓｐ２０をＳｐ２／０細胞におけるヒト化ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ２またはＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ２の発現に用いることができる。
【０１０６】
ＶＨＱおよびＶＨＥのためのヒトガンマ−１重鎖発現ベクター
２つのヒト化ＶＨ  ｃＤＮＡ領域をＰＣＲにより各々組換えプラスミドＨＣＭＶ−Ｇ１  ＨｕＡ６−ＶＨＥ（配列番号：１６；図３）およびＨＣＭＶ−Ｇ１  ＨｕＡ６−ＶＨＱ（配列番号：１５；図２）からＰＣＲプライマーＨｕＣＤ４５ＨＣＥｕｐ（５’−ＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＡ−３’；配列番号：４４）またはＨｕＣＤ４５ＨＣＱｕｐ（５’−ＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＡ−３’；配列番号：４５）およびＨｕＣＤ４５ＨＣｌｏ（５’−ＡＡＡＴＣＣＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣ−３’；配列番号：４６）を用いて増幅する。ＰＣＲフラグメントの３’末端をＢｓｔＥＩＩで消化した。次いで各ＰＣＲフラグメントをＢｓｔＥＩＩおよび平滑末端カッターＨｉｎｃＩＩで切断した重鎖カセットベクターＨＣｃａｓｓＲＥＡＬにクローン化する。得られたプラスミドは最終発現ベクター構築物への中間体であり、そして各々ＨＣｃａｓｓＨＶＥＳＰ２０およびＨＣｃａｓｓＨＶＱＳＰ２０と称される。このサブクローニングはまた元来のベクターのＶＨ領域の双方に随伴されているリーダー配列を変化させる。古いリーダー配列のアミノ酸配列はＭＤＷＴＷＲＶＦＣＬＬＡＶＶＡＰＧＡＨＳ（配列番号：４７）であるが、これはサブクローニングの間にＭＡＷＶＷＴＬＰＦＬＭＡＡＡＱＳＶＱＡ（配列番号：４８）と置き換えられている。
【０１０７】
中間体ＨＣｃａｓｓＶＨＥＳＰ２０またはＨＣｃａｓｓＶＨＱＳＰ２０をＳｃａＩで消化し、そして続いてプラスミドをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。Ｉｇ重鎖プロモーターおよびＶＨ領域を含有する２.９ｋｂのフラグメントを精製し、そして重鎖発現構築物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した８.７ｋｂフラグメントとライゲートする。得られたプラスミドは各々ＨＣＶＨＥＳｐ２０（配列番号：４０；図１０）およびＨＣＶＨＱＳｐ２０（配列番号：４１；図１１）と称され；そしてＳｐ２／０細胞におけるヒト化ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１の発現に用いられる。
【０１０８】
ＶＨＥＮ７３Ｄのためのヒトガンマ−１重鎖発現ベクター
発現ベクターＨＣＶＨＥＳｐ２０（配列番号：４０；図１０）およびＨＣＶＨＱＳｐ２０（配列番号：４１；図１１）を鋳型として部位特異的変異誘発に用いてＮ７３Ｄ変異を達成する（ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の重鎖の７３位置のアミノ酸においてアスパラギンをアスパラギン酸に交換する）。この変異は推定上のＮ−グリコシル化部位を排除する。QuikChange（登録商標）Multi-Site Directed Mutagenesisキット(Stratagene）およびプライマーＣＤ４５Ｈ−Ｎ７３Ｄ（５’−ホスホＧＣＣＡＣＡＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣ−３’；配列番号：４９）を用いてキットマニュアルに従って変異誘発を実施する。得られた構築物ＨＣＶＨＥＮ７３ＤＳｐ２０およびＨＣＶＨＱＮ７３ＤＳｐ２０の配列を確認し、そして各々配列番号：３７および配列番号：３８、ならびに図８および９に開示する。ＨＣＶＨＥＮ７３ＤＳｐ２０（配列番号：３７）を軽鎖発現構築物ＬＣＶＬ１ＳＰ２０（配列番号：３６）と一緒にＳｐ２／０細胞におけるヒト化ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の発現に用いる。
【０１０９】
ヒト化抗ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ抗体ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１を分泌する安定したＳｐ２／０骨髄腫トランスフェクタントの作成
マウス骨髄腫細胞系Ｓｐ２／０  Ａｇ１４.１０をヒト化ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子ＶＨＥＮ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の重鎖（ＨＣＶＨＥＮ７３ＤＳｐ２０；配列番号：３７）および軽鎖（ＬＣＶＬ１ＳＰ２０；配列番号：３６）をコードするベクターと共にエレクトロポレートする。トランスフェクションのために、９５％以上の生存性を有する指数増殖期の細胞を用いる。細胞を冷ＴＦバッファー（２７２ｍＭ  スクロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７ｍＭ  リン酸バッファー、ｐＨ７.４）で２回洗浄し、そして細胞濃度をＴＦバッファーで２×１０７セル／ｍｌに調整する。細胞懸濁液０.８ｍｌを重鎖および軽鎖構築物各１５μｇと混合し、そして氷上に１０分間置く。Biorad Gene Pulser（２８０Ｖおよび２５μＦ）を用いてエレクトロポレーションにより５つのトランスフェクションを行う。エレクトロポレーションの後、細胞を氷上に１５分間置き、続いて冷培養培地（ＦＣＳ不含のＲＰＭＩ基盤の培地）５０ｍｌに移し、そして３７℃および５％  ＣＯ２で２日間インキュベートする。
【０１１０】
トランスフェクタントを選択するために、１.１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Geneticin, Gibco ロット３０６９４６４）の存在下、およそ２から３週間細胞を培養した。軽鎖構築物に位置するｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸リダクターゼ）増幅マーカーにより葉酸類似体メソトレキセート（ＭＴＸ）によるｄｈｆｒ遺伝子および導入遺伝子の増幅が可能になる。遺伝子増幅のために、Ｇ４１８耐性細胞を２００ｎＭ  ＭＴＸの存在下、２から３週間培養し、続いてＭＴＸ濃度をさらに１μＭに上げることにより異種性の細胞プールの増幅に至る。分析用プロテインＡ  ＨＰＬＣにより抗体濃度を決定する。ウェルあたり０.３セルの播種密度を用いて限界希釈によりクローニングのためにもっとも良好な生成プールを選択して高生産クローンを単離する。
【０１１１】
実施例５：ＥＬＩＳＡによる組換えヒトＩｇＧ発現の決定
ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ２の特徴付け
培養上澄に発現された組換えヒト抗体のＩｇＧ濃度を決定するために、サンドウィッチＥＬＩＳＡプロトコルを発展させ、そしてヒトＩｇＧを標準として用いて最適化した。平底９６ウェルマイクロタイタープレート（カタログ番号4−３９４５４、Nunc Immunoplate Maxisorp）をＰＢＳ中最終濃度０.５μｌ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（全分子、カタログ番号Ｉ１０１１、SIGMA）１００μｌで４℃で一晩コートする。次いでウェルを洗浄バッファー（０.０５％  Tween 20含有ＰＢＳ）で３回洗浄し、そしてブロッキングバッファー（ＰＢＳ中０.５％  ＢＳＡ）で３７℃で１.５時間遮断する。３回洗浄サイクルの後、抗体試料および標準ヒトＩｇＧ（カタログ番号Ｉ４５０６、SIGMA）をブロッキングバッファー中連続１.５倍希釈により調製する。希釈した試料または標準１００μｌを２検体ずつでコーティングしたプレートに移し、そして室温で１時間インキュベートする。インキュベーションの後、プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、そして続いてブロッキングバッファーで１／４０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧカッパ軽鎖（カタログ番号Ａ−７１６４、SIGMA）１００μｌと共に１時間インキュベートする。コントロールウェルにブロッキングバッファーまたは濃縮した通常の培養培地１００μｌを入れた。洗浄後、ＴＭＢペルオキシダーゼＥＩＡ基質キット（カタログ番号１７２−１０６７、Bio-Rad）を用いて製造者の指示書に従って試料中の結合ペルオキシダーゼおよび標準ウェルの比色定量を実施する。ペルオキシダーゼ混合物をウェルあたり１００μｌで加え、そして暗中室温で３０分間インキュベートする。１Ｍ  硫酸１００μｌの添加により比色反応を停止させ、そしてＥＬＩＳＡプレートリーダー（３３５０−ＵＶモデル、BioRad）を用いて各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで読む。
【０１１２】
ＩｇＧ標準曲線に関する相関係数０.９９８で、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞から得られた４つの異なる培養濃度（約２５０から３００倍濃縮）に関して以下の濃度を決定する：
ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１上澄＝８.２６μｇ／ｍｌ
ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２上澄＝６.２７μｇ／ｍｌ
ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１上澄＝５.３μｇ／ｍｌ
ＶＨＱ／ｈｕｍＶ２上澄＝５.５６μｇ／ｍｌ
【０１１３】
サイズ排除クロマトグラフィー分析（ＳＥＣ）
タンパク質含量、小型凝集（オリゴマー抗体）および恐らく副産物および分解産物のパーセンテージを決定するために、アフィニティー精製抗体ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ２をTSKgel Super ＳＷ３０００ＳＷＸＬでサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析する。ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ２に関するクロマトグラムにより主要なピークは分裂しており、そして分離は重鎖Ｅのプールに関してさらに顕著であることが示される（図１２）。結果により各試料に存在するＩｇＧ抗体に典型的な保持時間を有する少なくとも２つの分子が存在することが示唆される。
【０１１４】
還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ヒト化ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ２の還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析（グラジエントゲル、４から２０％  トリス−グリシンゲル、Novex）により、各試料の重鎖に相当するバンドより上にわずかに移動した、予測されないさらなるバンドの存在が示される。質量の差は２から４ｋＤａの範囲であると推定される。ウェスタンブロット分析により上位のバンドは抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）抗体により認識されることが示され、これはさらなるバンドが重鎖変種であることを示唆している。
【０１１５】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）
PolyCatAカラム（PolyLC Inc）を用いて電荷の異種性を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）により評価する。キメラｍＡｂは本質的にＣ末端リジン変種以外に電荷異種性を含まないが、全てのヒト化ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子、すなわちＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ２は電荷で非常に異種性であることが見出される。抗体の電荷異種性の共通する理由は抗体重鎖のＣ末端でのＬｙｓの存在／不在であり、これによりＣＥＸにおける３個のピークに至る。各クロマトグラムでの多数の可視ピーク（＞１０；図１３）は、少なくとも１つのさらなる修飾が４つのＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子全てに存在することを示している。
【０１１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ２のタンパク質プールで見出された２つの抗体種間の分子の差異を評価するために、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２を選択してさらに分析する。半調製用（semi-preparative）様式でＶＨＥ／ｈｕｍＶ２の２個のＳＥＣピークを収集し、そしてその純度を確認するためにＳＥＣにより再分析する。ＳＥＣにより収集した分画（分画１および分画２）を次に還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。約４９ｋＤａでの予測されないさらなるバンドの比率は２つ分画間で異なる。分画２はこのさらなる高いバンドをほとんど含まない。
【０１１７】
ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析
次にＳＥＣ分画Ｆ１、Ｆ２およびＶＨＥ／ｈｕｍＶ２のタンパク質プールをＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によりさらに分析する。タンパク質プールおよび分画２のスペクトログラムでは、同一の群のシグナルが観察される。約１４８,０００Ｄａの第１のシグナル群はタンパク質プールおよび分画２において見出され、分画１では検出されない。分画１では、約１５２,５００Ｄａの別の群のシグナルに加えて、（約１５０,３００Ｄａの）第２のシグナル群が検出される。約１５０,３２０Ｄａの第２のシグナル群は抗体形態で通常観察されるいずれとも相関し得なかった。これらの知見により、ＳＥＣの２個のピークおよび還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの２個の上位のバンドは予測されるタンパク質の変種に各々相当することが示唆される。
【０１１８】
逆相クロマトグラフィー
質量分析であまり複雑でないパターンを得るために、抗体鎖をさらに別個に分析する。分画を還元し、そしてアルキル化する。反応の完全性を確認するために、還元およびアルキル化した試料を逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー（SORBAX, Poroshell ３００ＳＢ−Ｃ８）により分析する。還元およびアルキル化の後、ピーク形状は還元のみの後とほぼ同一である。保持時間のシフトが観察される。ＳＥＣ分画１および分画２還元およびアルキル化試料で類似のパターンが得られる。ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２タンパク質プール試料、ＳＥＣ分画１およびＳＥＣ分画２（還元およびアルキル化）をＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析で分析する。いくつかの質量ピークを予測される抗体形態に割り当てることができる。同一の主要なピークは３つの試料全てで見出される（タンパク質プール、Ｆ１およびＦ２）が、その強度は分画２においては非常に低い（図１４）。
【０１１９】
重鎖変種の炭水化物分析
還元およびアルキル化した抗体を逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーカラムに中収支、そして重鎖変種に相当する２個のピークを収集する。次いでこれらのＲＰ分画化した抗体のオリゴ糖プロファイルを決定する。全ての試料で見出された予想されたＧ０およびＧ１オリゴ糖のうち、分画１のクロマトグラムでいくつかのその他のピークが検出される（これらのピークはわずかに分画２およびタンパク質プールのクロマトグラムにおいても検出される）。
【０１２０】
これらを考慮して、結果により、より大きな抗体種がさらなるグリコシル化を含有するが、典型的にはＳＰ２／０発現モノクローナル抗体では見出されず、これは質量差を説明していることを示唆している。炭水化物分析および質量分析により見出された大きな複合グリコシル化は抗体の定常領域の保存されたグリコシル化部位である可能性が極めて低いので、ヒト化抗体のアミノ酸配列のその他の可能性のある部位に関する検索が行われる。２つの重鎖変種の可変ドメインでＮ−グリコシル化（Ｎ−Ｘ−Ｓ）に可能性のある部位（Ｎ７３）を同定する。
【０１２１】
ＣＥＸによる調製用分画
プールＶＨＥ／ｈｕｍＶ１から精製された材料を用いてさらなる分析を実施する。材料の異種性を低減させるためにカルボキシペプチダーゼ−Ｂ処理でＣ末端リジンを除去する。ＳＰセファロース（Pharmacia）を用いる調製用陽イオン交換クロマトグラフィーによりＶＨＥ／ｈｕｍＶ１抗体を分画化する。カラムを２５ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６.０（＝バッファーＡ）で平衡にし、そして結合タンパク質をバッファーＡ中２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（＝バッファーＢ；０−６５％  Ｂのグラジエント）で溶出する。ＣＥＸを用いることにより分画の純度を分析する。収集した分画をＳＥＣカラムに再注入して２つの技術で得られた結果の間の相関を探す。クロマトグラムはＣＥＸのピークの最初の群が抗体のＳＥＣ分析のプレピークに相関し、ＣＥＸのピークの第２の群は、タンパク質プールのＳＥＣ分析では一緒に第１のピーク（または分画１）になり、そしてＣＥＸの最後のピークはＳＥＣで最後のピーク（または分画２）として溶出される事を示している。
【０１２２】
要するに、前記した結果（ＳＥＣ分画１および分画２に関するオリゴ糖プロファイル、脱カルボキシル化の後に得られたＣＥＸパターン、ＣＥＸで収集された分画に関して得られたＳＥＣパターン、質量分析）により複合オリゴ糖と共に抗体種が存在することが強く示唆され、これがａ）ＳＥＣにおいて二重ピークに至る質量異種性、およびｂ）ＣＥＸパターンに至る還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電荷異種性で観察された二重重鎖バンド、の原因となる。
【０１２３】
ＣＥＸ分画の分析的特徴付け
大きな抗体種はＣＥＸで先に溶出されるので（これらが正にあまり電荷していないことを示している）、調製用ＣＥＸにより得られた様々の分画でシアル酸（複合グリコシル化の成分であり、そして負に電荷している）の存在を測定する。シアル酸は様々な度合いで４つ全ての試料に存在する。見出されたシアル酸はＮ−グリコリルノイラミン酸形態である可能性が最も高い（Ｎ−アシルノイラミン酸標準と比較して短い保持時間に基づく）。別のＣＥＸ分画で非常に豊富であるのと対照的に、あるＣＥＸ分画でシアル酸の存在が非常に少ないということは、負に電荷した糖成分が質量／電荷異種性に寄与していることを強く示唆している。ＣＥＸ分画をＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析により分析する。
【０１２４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
また同一の分画を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。重鎖上位バンドはシアル酸を含有する複合オリゴ糖プロファイルを有する抗体の部分に相当すると結論づけることができる。重鎖下位バンドは従来のオリゴ糖プロファイルを表示する予測される抗体に相当する。
【０１２５】
パパイン消化ＣＥＸ分画のMono-Sカラムでの分離
重鎖の可変ドメインでの可能性のあるグリコシル化部位の使用を確実にするために、各ＣＥＸ分画約１ｍｇをパパインで処理して抗体のＦａｂおよびＦｃ部分を分離する。Mono-Sカラムで調製用クロマトグラフィーを実施する。収集した亜分画の各々をＲＰカラムに再注入してＦａｂおよび／またはＦｃドメインに関してその含量を同定する。次いで収集した亜分画の各々をＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析で分析する。得られた結果によりａ）重鎖Ｆｃ部分の保存されたグリコシル化部位は０個（Ｇ０）、１個（Ｇ１）または２個の末端（Ｇ２）ガラクトース単位を伴う二分岐オリゴ糖形態に占領されていること；ｂ）対照的に、不規則なグリコシル化部位（Ｎ７３）はＮ−グリコリルノイラミン酸を含有する複合オリゴ糖を担持することが示される。
【０１２６】
要するに、重鎖可変ドメインのアスパラギン残基Ｎ７３は部分的にＮ−グリコシル化されていることが見出される。これらの糖種はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーにより検出される質量異種性および電荷異種性を引き起こす。
【０１２７】
ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の特徴付け
ヒト化ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ２抗体の異種性を排除するために、重鎖の可変ドメインのＮ７３位置でアスパラギン残基をアスパラギン酸残基により置換する（実施例４参照）。次いでＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１をさらに分析する：
【０１２８】
サイズ排除クロマトグラフィー分析（ＳＥＣ）
前記で記載したようにＳＥＣを実施する。ＳＥＣにおいてＶＨＥ／ｈｕｍＶ１とＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１との間に明確な差異が観察される。ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１に関して得られた二重ピークと対照的に、ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１に関しては１つのピークしか得られない（図１２）。ＳＥＣによりおよそ０.２％の凝集物が定量される。
【０１２９】
還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
前記で概要を示したような還元条件下でＶＨＥ／ｈｕｍＶ２およびＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりさらに分析する。ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１に関しては予測される重鎖（ＨＣ）位置（約５０ｋＤａ）で１個バンドのみが可視である。ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１に関して観察されたＨＣバンドはＶＨＥ／ｈｕｍＶ２に関して観察された下位のダブレットのバンドに相当する。軽鎖バンドの位置は分析されたタンパク質に関して同一である。
【０１３０】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を前記で概要を示したように実施する。ＣＥＸの分析に関して得られた結果により、ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の電荷異種性はＶＨＥ／ｈｕｍＶ２の高い電荷異種性と比較してＣ末端リジン変種（３個ピーク）まで低減されることが示される（＞１０；図１３）。
【０１３１】
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ分析（質量分析）
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ分析（質量分析）により得られた重鎖および軽鎖に関して検出された質量はＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の配列から推定される予測される質量と密接に一致する。
【０１３２】
逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）
ＤＤＴで還元した後、２つのヒト化抗体ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２およびＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１を逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）により分析する。アスパラギンＮ７３での部分的グリコシル化のために、とりわけ軽鎖に相当するピーク（約１７.３分で）のうちＶＨＥ／ｈｕｍＶ２（約１８.５分で二重ピーク）に関して２つの「重鎖」が観察される。ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１に関しては、重鎖に関しては１つのピークしか観察されない（図１４）。
【０１３３】
実施例６：ＦＡＣＳ競合分析（結合親和性）
ヒトＴ細胞系ＰＥＥＲはその細胞表面にＣＤ４５抗原を発現するので、それをＦＡＣＳ分析のための標的細胞として選択する。ヒト化抗体上澄の結合親和性を分析するために、参照としてＦＩＴＣ標識キメラ抗体を用いて競合実験を実施し、そして精製されたマウス抗体の、およびキメラ抗体の阻害と比較する。ＦＥＥＲ細胞培養物を３０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、そして培地を除去する。細胞をＦＡＣＳバッファー（１％  ＦＢＳおよび０.１％  アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ）に懸濁し、そして９６ウェル丸底マイクロタイタープレートにウェルあたり１×１０５セルの密度で播種する。プレートを遠心し、そして上澄を捨てる。遮断研究のために、最初に各ウェルに２５μｌの濃縮したトランスフェクトしていない培地またはアイソタイプ対応コントロール抗体（陰性コントロール）、未標識マウス抗体またはキメラ抗体（陽性コントロール）および種々の組み合わせのヒト化抗体を含有する濃縮した上澄（試料）をテキストに示された濃度で加える。４℃で１時間インキュベートした後、遠心によりＰＥＥＲ細胞をＦＡＣＳバッファー２００μｌで洗浄する。続いて細胞をＦＡＣＳバッファー２５μｌ中最終濃度２０μｇ／ｍｌでＦＩＴＣに結合したキメラ抗体と共に４℃で１時間インキュベートする。細胞を洗浄し、そして生存細胞のゲーティングを可能にする２μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムを含有するＦＡＣＳバッファー３００μｌに再懸濁する。細胞調製物をフローサイトメーター（FACSCalibur, Becton Dickinson）で分析する。
【０１３４】
ＦＡＣＳ分析により、濃縮ヒト化抗体培養上澄による蛍光色素標識したキメラ抗体の用量依存的遮断が示される。アイソタイプ対応コントロール抗体ではキメラ抗体結合の用量依存的な遮断が認められず、これは種々のヒト化抗体の組み合わせによる遮断効果がエピトープ特異的であり、そしてエピトープ特異性はヒト化抗体過程の後にも保持されるようであることを示している。
【０１３５】
前記したＳＰ２／０トランスフェクタントまたはキメラ抗体（陽性コントロール）またはアイソタイプ対応コントロール抗体（陰性コントロール）からの希釈していない上澄を培養培地中２μｇ／ｍｌで１００μｌ中１.５×１０５個のＰＥＥＲ細胞と共に４℃で３０分間インキュベートする。次いでＦＩＴＣ標識したキメラ抗体を含有するＰＢＳ１００μｌを各試料に加え、そして４℃でさらに３０分間インキュベーションを続ける。洗浄後、細胞を１μｇ／ｍｌ  ７−アミノアクチノマイシンＤを含有するＦＡＣＳ−ＰＢＳに再懸濁し、そしてBecton Dickinson FACSCalibur装置およびCellQuest Proソフトウェアを用いてフローサイトメトリーにより分析する。生存細胞でゲーティングした、すなわち否定事象として７−アミノアクチノマイシンＤを用いた。
【０１３６】
ＦＡＣＳ分析により未標識ヒト化ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子、例えばＶＨＥ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ１はヒトＣＤ４５陽性Ｔ細胞系ＰＥＥＲに結合するためのＦＩＴＣ標識キメラ抗体と競合するが、アイソタイプ対応コントロール抗体は競合しないことが示される。
【０１３７】
ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の特異性
ヒト化ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１の修飾、すなわちＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の重鎖の７３位置のアミノ酸でのアスパラギンのアスパラギン酸への交換が同族エピトープとの反応性を修飾するかどうかを評価するために、ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１のＣＤ４５発現ヒトＴ細胞系ＰＥＥＲとの反応性を競合結合実験で分析する。
【０１３８】
ＰＥＥＲ細胞をＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１と、そのキメラの祖先と、または非結合性アイソタイプコントロールＩｇＧ抗体と共にインキュベートする。非結合性抗体を洗い流し、そして細胞を蛍光色素フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識キメラ抗ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ  ｍＡｂまたはＦＩＴＣ標識アイソタイプＩｇＧ１コントロール抗体とのインキュベーションに供する。洗浄後、細胞をフローサイトメトリー分析に供して、プレインキュベートしたＰＥＥＲ細胞に結合したＦＩＴＣ標識抗体の量を定量する：ＰＥＥＲ細胞培養物を標準重力（ｇ）の４００倍で１０分間遠心し、そして培地を除去する。細胞をＦＡＣＳバッファー（１容量／容量％  ＦＢＳ、０.１重量／容量％  ＥＤＴＡおよび０.１重量／容量％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）に再懸濁し、そして９６ウェルＶ底マイクロタイタープレートにウェルあたり１×１０５セルの細胞密度で播種する。プレートを遠心し、そして上澄を捨てる。細胞の各試料をキメラ抗ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢｍＡｂ、ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１またはＩｇＧ１コントロールＡｂのいずれか２０μｇ／ｍｌを含有するＦＡＣＳバッファー５０μｌ中４℃で３０分間インキュベートする。次に遠心によりＰＥＥＲ細胞をＦＡＣＳバッファー１５０μｌで２回洗浄する。続いて細胞をＦＩＴＣ結合キメラｍＡｂまたはＦＩＴＣ結合３Ｇ５コントロールＡｂのいずれか２０μｇ／ｍｌを含有するＦＡＣＳバッファー５０μｌ中４℃で３０分間インキュベートする。最後に細胞を洗浄し、そして分析の間の生存細胞の同定を可能にする７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を１μｇ／ｍｌで含有するＦＡＣＳバッファー２００μｌに再懸濁する。細胞調製物をFACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson）で分析する。
【０１３９】
蛍光シグナルの低減により未標識ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１および未標識キメラ抗ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢｍＡｂはＦＩＴＣ標識キメラ抗ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ  ｍＡｂのＣＤ４５発現ＰＥＥＲ細胞への結合を防御するが、ＩｇＧ１コントロール抗体は防御しないことが観察される。要するに、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１抗体のＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１への修飾はヒト化抗ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子のエピトープ特異性を変化しないことが見出される。
【０１４０】
ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１のヒトまたはカニクイザルＣＤ４５に関する親和性
ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１抗体のそのエピトープに関する親和性を決定するために、ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１のヒトＣＤ４５発現Ｔ細胞系ＰＥＥＲまたはカニクイザルＣＤ４５発現Ｔ細胞系ＨＳＣ−Ｆとの反応性をin Daley et al., 1995; J. Mol. Biol. 253:243に記載される手順に類似した競合結合実験で定量することができる。
【０１４１】
簡単には、種々の濃度の未標識競合抗体の存在下、ＰＥＥＲまたはＨＳＣ−ＦのＦＩＴＣ標識抗体との染色強度を用いて未標識抗体の親和性を算出する。さらに正確には、第１の工程で、ＦＩＴＣ標識マウス由来の抗ヒトＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子Ａ６（ｍＡ６）の濃度および蛍光色素標識化学量を測定する。次に、前記したＦＩＴＣ結合ｍＡ６  ｙｅｓ（マウス由来抗ｈｕＣＤ４５）の助けを借りて、そして分子標識の程度が既知である蛍光ビーズを用いてＰＥＥＲまたはＨＳＣ−Ｆ細胞系の表面上の標的分子、ＣＤ４５の濃度を決定する。細胞性ＣＤ４５受容体および既知のそのＦＩＴＣ結合リガンドの濃度で、ＦＩＴＣ結合ｍＡ６の細胞性ＣＤ４５受容体に対する親和性をＦＡＣＳ基盤の平衡滴定手順により決定する。最終的に未標識抗体ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の親和性を、ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の全濃度の関数として、ＦＩＴＣ蛍光の増加を測定する、ＰＥＥＲまたはＨＳＣ−Ｆ細胞上のＦＩＴＣ結合ｍＡ６との競合染色反応から決定する。１つの受容体に結合する２個の競合リガンドの混合物における結合平衡の代数的に明白な記載を表す三次方程式がプログラムOrigin 7.5に導入されている場合、再反復曲線適合分析でソフトウェアプログラムを用いてＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１に関する解離定数（Ｋｄ）値を算出する。
【０１４２】
１つの実験では、標的ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子に結合する２価抗体と過程すれば、ヒトＰＥＥＲ細胞性標的に関するＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の解離定数は２.４４±０.０７ｎＭと算出され、カニクイザルＨＳＣ−Ｆ細胞標的に関しては１.６７±０.００ｎＭと算出される。
【０１４３】
実施例７：ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合分子の生物学的活性
この研究では、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体は、多クローン的に活性化された１次ヒトＴ細胞の培養中に存在する場合、（ｉ）特徴的なＴｒｅｇ表現型を有するＴ細胞の分化を支持する、（ｉｉ）Ｔ細胞の活性化の後アポトーシスを防御または増強する、ならびに（ｉｉｉ）再刺激後のサブセット特異的抗原および受容体の発現に影響するかどうかに着目した。
【０１４４】
ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子キメラ抗体は多クローン的に活性化されたＴ細胞を増強する
１次Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔサブセットの混合物）をＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合分子キメラ抗体の存在下または不在下（＝コントロール）で抗ＣＤ３プラス抗ＣＤ２８ｍＡｂ（各々２００ｎｇ／ｍｌ）による活性化に供した。２日に過剰の抗体を洗浄により除去した。アポトーシスおよび壊死細胞により取り込まれるＤＮＡ染色色素として７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を用いて活性化の後の細胞死を測定する。結果により、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体の存在下でのＴ細胞の活性化が７−ＡＡＤ陽性の分画を、活性化後２日で２倍以上増加させたことが示される。７日に、７−ＡＡＤ陽性細胞の部分は再度ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体処理およびコントロール培養で類似した。
【０１４５】
ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体はＴ調節細胞（Ｔｒｅｇ）表現型を表示するがコントロールｍＡｂ処理Ｔ細胞は表示しない
ＣＤ２５および陰性調節タンパク質ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）の発現の増加はＴｒｅｇ細胞のマーカーである。ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体による１次および２次Ｔ細胞応答の機能抑制はＴｒｅｇ細胞の誘導によるのであろう。この問題を解決するために、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ｍＡｂによりＴ細胞を活性化し、そしてＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体または抗ＬＰＳコントロールｍＡｂの存在下で培養した。ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２５発現の時間経過により２次刺激の１日および３日後コントロールとＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合キメラ抗体処理Ｔ細胞との間に著明な差異が表され、これはＴｒｅｇ表現型を示している。
【０１４６】
細胞内ＣＴＬＡ−４発現はＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体の存在下で持続する
ＣＴＬＡ−４の実質的な量を細胞内でも見出すことができることが報告されている。したがって、表面ＣＴＬＡ−４染色に並行して細胞内ＣＴＬＡ−４発現を分析した。刺激後４日にＴ細胞培養間で中程度の差異が認められた。しかしながら培養の延長の後に、高レベルの細胞内ＣＴＬＡ−４がＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体処理Ｔ細胞においてのみ持続したが、コントロールＴ細胞では持続しなかった。
【０１４７】
ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体処理Ｔ細胞がＣＤ４およびＣＤ８に関して二重陽性になる
刺激後、Ｔ細胞はＣＤ２５、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド）およびその他のようないくつかの表面受容体の発現を誘起および上方制御する。対照的に、ＣＤ４またはＣＤ８の発現レベルは比較的一定に保たれると考えられる。活性化の後、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体処理Ｔ細胞におけるＣＤ４およびＣＤ８抗原の双方の強い増加が再現性よく観察されたが、コントロールＡｂ処理Ｔ細胞では観察されなかった。ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞集団の出現はＣＤ８＋サブセットでのＣＤ４、および逆にＣＤ４＋サブセットでのＣＤ８の上方制御によるものと思われる。これはコントロール培養において中程度に低いパーセンテージの二重陽性Ｔ細胞と対照的である。
【０１４８】
ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体処理Ｔ細胞によるＩＬ−２受容体アルファ鎖の発現は高いが、ベータ鎖の発現は非常に低い
Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ２５、ＩＬ−２受容体アルファ鎖に関して構成的に陽性であることが知られている。Ｔｒｅｇ細胞上の三量体ＩＬ−２受容体のその他のサブユニットの調節は知られていない。最近、例えばＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体の存在下または不在下で活性化し、そして増殖させたＴ細胞上のＩＬ−２受容体、ＣＤ１２２のベータ鎖の発現を比較した。結果により、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体処理Ｔ細胞はコントロール培養のＴ細胞と比較してＣＤ１２２を約１０倍低く発現することが示される。この差異はＴｒｅｇ細胞が増殖するためにＩＬ−２以外の因子を必要とすることを示し得る。
【０１４９】
実施例８：本発明の配列（本発明のＣＤＲ配列には下線を付してある）
配列番号：１
キメラ軽鎖のアミノ酸配列の一部
【表３】
2007529196.tif 000005
【０１５０】
配列番号：２
キメラ重鎖のアミノ酸配列の一部
【表４】
2007529196.tif 000006
【０１５１】
配列番号：３
キメラ軽鎖のアミノ酸配列
【表５】
2007529196.tif 000007
【０１５２】
配列番号：４
キメラ重鎖のアミノ酸配列
【表６】
2007529196.tif 000008
【０１５３】
配列番号：５
配列番号：１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
【表７】
2007529196.tif 000009
【０１５４】
配列番号：６
配列番号：２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
【表８】
2007529196.tif 000010
【０１５５】
配列番号：７
ｈｕｍＶ２（ｈｕｍＶ２＝ＶＬｍ）と称されるヒト化軽鎖のアミノ酸配列の一部
【表９】
2007529196.tif 000011
【０１５６】
配列番号：８
ｈｕｍＶ１（ｈｕｍＶ１＝ＶＬｈ）と称されるヒト化軽鎖のアミノ酸配列の一部
【表１０】
2007529196.tif 000012
【０１５７】
配列番号：９
ＶＨＥと称されるヒト化重鎖のアミノ酸配列の一部
【表１１】
2007529196.tif 000013
【０１５８】
配列番号：１０
ＶＨＱと称されるヒト化重鎖のアミノ酸配列の一部
【表１２】
2007529196.tif 000014
【０１５９】
配列番号：１１
配列番号：９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
【表１３】
2007529196.tif 000015
【０１６０】
配列番号：１２
配列番号：１０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
【表１４】
2007529196.tif 000016
【０１６１】
配列番号：１３
配列番号：７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
【表１５】
2007529196.tif 000017
【０１６２】
配列番号：１４
配列番号：８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
【表１６】
2007529196.tif 000018
【０１６３】
配列番号：１５
発現ベクターＨＣＭＶ−Ｇ１  ＨｕＡ６−ＶＨＱのヌクレオチド配列
（３９２１−４２７４からの配列番号：１２（ＶＨＱ）を含むヒト化重鎖発現ベクターの完全ＤＮＡ配列）
【表１７】
2007529196.tif 000019
【表１８】
2007529196.tif 000020
【表１９】
2007529196.tif 000021
【表２０】
2007529196.tif 000022
【表２１】
2007529196.tif 000023
【０１６４】
配列番号：１６
発現ベクターＨＣＭＶ−Ｇ１  ＨｕＡ６−ＶＨＥのヌクレオチド配列
（３９２１−４２７４からの配列番号：１１（ＶＨＥ）を含むヒト化重鎖発現ベクターの完全ＤＮＡ配列）
【表２２】
2007529196.tif 000024
【表２３】
2007529196.tif 000025
【表２４】
2007529196.tif 000026
【表２５】
2007529196.tif 000027
【表２６】
2007529196.tif 000028
【０１６５】
配列番号：１７
発現ベクターＨＣＭＶ−Ｋ  ＨｕＡｂ−ＶＬ１  ｈｕｍＶ１のヌクレオチド配列
（３９６４−４２８４からの配列番号：１４（ｈｕｍＶ１＝ＶＬｈ）を含むヒト化軽鎖発現ベクターの完全ＤＮＡ配列）
【表２７】
2007529196.tif 000029
【表２８】
2007529196.tif 000030
【表２９】
2007529196.tif 000031
【表３０】
2007529196.tif 000032
【表３１】
2007529196.tif 000033
【表３２】
2007529196.tif 000034
【０１６６】
配列番号：１８
発現ベクターＨＣＭＶ−Ｋ  ＨｕＡｂ−ＶＬ１  ｈｕｍＶ２のヌクレオチド配列
（３９２６−４２４６からの配列番号：１３（ｈｕｍＶ２＝ＶＬｍ）を含むヒト化軽鎖発現ベクターの完全ＤＮＡ配列）
【表３３】
2007529196.tif 000035
【表３４】
2007529196.tif 000036
【表３５】
2007529196.tif 000037
【表３６】
2007529196.tif 000038
【表３７】
2007529196.tif 000039
【表３８】
2007529196.tif 000040
【０１６７】
配列番号：３１
ＶＨＥ-Ｎ７３Ｄと称されるヒト化重鎖のアミノ酸配列の一部
【表３９】
2007529196.tif 000041
【０１６８】
配列番号：３２
ＶＨＱ-Ｎ７３Ｄと称されるヒト化重鎖のアミノ酸配列の一部
【表４０】
2007529196.tif 000042
【０１６９】
配列番号：３３
配列番号：８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
【表４１】
2007529196.tif 000043
【０１７０】
配列番号：３４
配列番号：３１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
【表４２】
2007529196.tif 000044
【０１７１】
配列番号：３５
配列番号：３２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
【表４３】
2007529196.tif 000045
【０１７２】
配列番号：３６
発現ベクターＬＣＶＬ１Ｓｐ２０のヌクレオチド配列
【表４４】
2007529196.tif 000046
【表４５】
2007529196.tif 000047
【表４６】
2007529196.tif 000048
【表４７】
2007529196.tif 000049
【表４８】
2007529196.tif 000050
【表４９】
2007529196.tif 000051
【０１７３】
配列番号：３７
発現ベクターＨＣＶＨＥＮ７３ＤＳｐ２０のヌクレオチド配列
【表５０】
2007529196.tif 000052
【表５１】
2007529196.tif 000053
【表５２】
2007529196.tif 000054
【表５３】
2007529196.tif 000055
【表５４】
2007529196.tif 000056
【表５５】
2007529196.tif 000057
【０１７４】
配列番号：３８
発現ベクターＨＣＶＨＱＮ７３ＤＳｐ２０のヌクレオチド配列
【表５６】
2007529196.tif 000058
【表５７】
2007529196.tif 000059
【表５８】
2007529196.tif 000060
【表５９】
2007529196.tif 000061
【表６０】
2007529196.tif 000062
【０１７５】
配列番号：３９
発現ベクターＬＣＶＬ２Ｓｐ２０のヌクレオチド配列
【表６１】
2007529196.tif 000063
【表６２】
2007529196.tif 000064
【表６３】
2007529196.tif 000065
【表６４】
2007529196.tif 000066
【表６５】
2007529196.tif 000067
【０１７６】
配列番号：４０
発現ベクターＨＣＶＨＥＳｐ２０のヌクレオチド配列
【表６６】
2007529196.tif 000068
【表６７】
2007529196.tif 000069
【表６８】
2007529196.tif 000070
【表６９】
2007529196.tif 000071
【表７０】
2007529196.tif 000072
【表７１】
2007529196.tif 000073
【０１７７】
配列番号：４１
発現ベクターＨＣＶＨＱＳｐ２０のヌクレオチド配列
【表７２】
2007529196.tif 000074
【表７３】
2007529196.tif 000075
【表７４】
2007529196.tif 000076
【表７５】
2007529196.tif 000077
【表７６】
2007529196.tif 000078
【表７７】
2007529196.tif 000079
【表７８】
2007529196.tif 000080
【０１７８】
実施例９：ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合ヒト化抗体のインビトロ効果
ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ１
キメラ抗体と比較してＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合ヒト化抗体ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ１の効果を決定するために、ひとＴ細胞においてアポトーシスを誘起する能力、およびヒトＴ細胞増殖を阻害する能力もまた分析する。
【０１７９】
細胞および試薬
既知の血液型を有するが、ＨＬＡ型は解らない健常ヒト提供者白血球搬出試料からFicoll-Hypaque（Pharmacia LKB）での遠心により末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離する。ＣＤ３コーティングした強磁性ビーズ（Miltenyi）を用いることにより、刺激剤として用いるＰＢＭＣは最初にＴおよびＮＫ細胞を枯渇させる。ビーズおよび夾雑する細胞を磁場により除去する。照射（５０Ｇｙ）の後、Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣを刺激細胞として用いる。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＭＬＲにおける応答細胞として用い、そしてＣＤ４Ｔ細胞陰性選択キット（Miltenyi）でＰＢＭＣから単離する。
FACScanまたはFACSCalibur (Becton Dickinson & Co., CA)により得られた細胞を分析し、そして得られた細胞の純度は＞７５％である。１０％  熱不活性化ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地に細胞を懸濁する。
【０１８０】
アポトーシスアッセイ
３人の健常ボランティア提供者のヒトＰＢＭＣをＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合キメラｍＡｂ、ヒト化抗体（ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ１）または抗ＬＰＳコントロールｍＡｂの存在下、成長培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％  ＦＣＳ）中一晩（＜１６時間）培養する。示す場合、架橋試薬、ヤギ抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ’）２フラグメント（カタログ番号１０９−００６−０９８、JacksonLab）を、試料の抗ＣＤ４５抗体濃度の２倍になるμｇ／ｍｌ濃度で含む。抗体試薬を導入した全ウェルのＰＢＳ濃度は全試料間で一定を保ち、すなわち架橋剤を含まない試料に関しては２０（容量／容量）％、または架橋剤を含む試料に関しては４０（容量／容量）％である。先の実験によりＰＢＳの量は読み出しに影響しないことが実証されている。
【０１８１】
抗体の存在下で一晩培養した後、試料をフローサイトメトリー分析に供し、そしてアポトーシスマーカーAnnexinV−ＦＩＴＣ（カタログ番号５５６４１９、BD/Pharmingen）およびＴ細胞マーカーＣＤ２−ＰＥ（カタログ番号５５６６０９、BD/Pharmingen）と共に染色する。Becton Dickinson FACSCalibur装置に試料を流し、そしてデータをCellQuest Proソフトウェアを用いて分析する。
【０１８２】
収集したデータから、ソフトウェアOrigin v7.0300を用いて曲線を適合させる。適合に用いた等式は：
【数２】
2007529196.tif 000081
（「シグモイドロジスティック」）
Ａ１：最終値（「共用」および「浮動」にセットしたフィットセッション用）
Ａ２：初期値（「共用」および「浮動」にセットしたフィットセッション用）
ｐ：検出力
Ｘ０：ＥＤ５０；ＩＣ５０（以下を参照）
【０１８３】
架橋剤の不在下ではＶＨＥ／ｈｕｍＶ１が最も有効であり、ＥＤ５０値は１４８±７１ｎＭで、次に３７７±２１９ｎＭのＶＨＱ／ｈｕｍＶ１が続く。ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合キメラ抗体はＥＤ５０値２４４０±１２０５ｎＭで、あまり有効でない。
【０１８４】
架橋抗血清の存在下ではＥＤ５０値は少なくとも２桁まで高効率の方にシフトする。加えて、架橋剤の存在により、非常に高い抗体濃度で高レベルのアポトーシスが可能になり、今や８０％にまで至るが、架橋剤の不在下ではアポトーシスが５０％までしか可能にならない。架橋剤の存在下では、曲線（抗体濃度／アポトーシス％）は２つのプラトーを有する二相性であり：第１のプラトーには低抗体濃度で到達し（〜５ｎＭ）、ここでアポトーシスレベルは架橋剤の存在下で得られる最大レベルに相当する。第２のプラトーには高低抗体濃度で到達し（〜５００ｎＭ）、そしてＴ細胞集団の７０−８０％内でアポトーシスが観察される。
ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合ヒト化ｍＡｂ双方は同等に有効であり、そして１次ヒトＴ細胞においてアポトーシスを誘起するその能力に関してはＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合キメラｍＡｂと比較してより良好または同等である。
【０１８５】
混合リンパ球培養反応
９６ウェル培養プレートの各ウェル中、様々の濃度のｍＡＢの存在下または不在下で1×１０５個のＰＢＭＣまたは５×１０４個のＣＤ４＋細胞を1×１０５個または５×１０４個ののＴ細胞枯渇照射（５０Ｇｙ）ＰＢＭＣと混合する。
混合した細胞を５日間培養し、そして培養の最後の１６から２０時間の間、細胞を３Ｈ−チミジンと共にパルスすることにより増殖を決定する。各抗体濃度でＭＬＲ阻害を実施例２に記載するように阻害パーセンテージとして表す。
漸増濃度のＶＨＥ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ１のＭＬＲに及ぼす影響を３つの応答体：刺激剤の組み合わせで評価する。全抗体は用量依存的な様式でＭＬＲを阻害する。ＩＣ５０値（前記を参照）はヒト化Ａｂ  ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１（７±７ｎＭ）およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ１（３９±５４ｎＭ）に関して類似している。双方のヒト化抗体はＭＬＲ阻害において親のキメラ抗体よりもさらに強力である（ＩＣ５０は３４７±４３４ｎＭ）。通常ＭＬＲ実験で見られるように、これらの実験では提供者変動性が高い。
【０１８６】
ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）でアポトーシスを誘起するＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の生物学的効果を検討するために、種々濃度のＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の存在下で標的ＰＢＭＣを一晩インキュベートし、そして続いてフローサイトメトリーによりアポトーシスマーカーAnnexinVの結合に関して分析し：ヒトＰＢＭＣを種々濃度のＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１、または別のヒト化ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子変種、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、もしくはキメラ抗ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ  ｍＡｂまたはアイソタイプＩｇＧ１コントロールｍＡｂのいずれかを含有する組織培養培地１ｍｌ中一晩インキュベートする。加えて、ヤギ抗ヒトＩｇ  Ｆｃの架橋Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを各ｍＡｂの２倍の質量濃度で加え、Ｆｃ受容体によりＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の架橋を疑似するが、これはインビボで生じ得る。翌日に標準重力（ｇ）の４００倍で１０分間遠心することにより細胞を洗浄し、そして培地を除去する。細胞をＦＡＣＳバッファー（１容量／容量％  ＦＢＳ、０.１重量／容量％  ＥＤＴＡおよび０.１重量／容量％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）に再懸濁し、そして９６ウェルＶ底マイクロタイタープレートにウェルあたり１×１０５セルの細胞密度で播種する。細胞の各試料を１００μｇ／ｍｌ  正常マウス血清を含有するＦＡＣＳバッファー５０μｌ中４℃で３０分間インキュベートして、細胞上の非特異的部位を遮断し、そしてフィコエリトリン（ＰＥ）結合ＣＤ２でヒトＴ細胞を同定する。遠心により２回洗浄した後、１：１００  容量／容量ＦＩＴＣ標識AnnexinVを含有するカルシウム依存的（calcium-proficient）AnnexinV染色バッファー（Vendor BD/Pharmingen、キット５５６４１９）１００μｌに細胞を再懸濁する。暗中室温で１５分間のインキュベーション時に７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を加え、最終濃度１μｇ／ｍｌにし、そしてFACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson）を用いて分析する。アポトーシスを誘起するための抗体効果のＥＤ５０値を、ソフトウェアOrigin 7.5を用いてシグモイド／ロジスティック曲線適合等式で抗体濃度の関数として誘起されるアポトーシスの量（＝AnnexinV−ＦＩＴＣ蛍光の強度）の分析から算出することができる。
【０１８７】
かかる分析時に全ての被験ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の二相性効果が観察される：低濃度の抗体で、３０％未満の低レベルのＴ細胞アポトーシスが見出される。ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１に関するこのレベルのアポトーシスに到達するためのＥＤ５０値は０.３１±０.１３ｎＭとして算出される。高濃度の抗体では、７０％までのＴ細胞でアポトーシスを誘起することができる。ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１に関して、この高レベルのアポトーシスに到達するためのＥＤ５０値は３５２±８３ｎＭとして算出される。要約すると、ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１はまたヒトＴ細胞においてアポトーシスを誘起し、これは架橋により増強され得ることが見出される。
【０１８８】
実施例１０：ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の特異性
キメラＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子
ＣＤ４５分子は全ての白血球において発現される。しかしながら、様々のＣＤ４５アイソフォームは種々の白血球サブセットにより発現される。ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体分子の白血球サブセット反応性を決定するために、ヒト白血球のサブセット特異的マーカーでの免疫蛍光標識および色素結合ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体での同時免疫蛍光標識を実施し、続いてフローサイトメトリー分析を実施する。
【０１８９】
簡単には、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ヒト血小板、ヒト末梢血好中球またはヒト骨髄由来造血幹細胞の新たに単離された調製物の特異的サブセットは、ＣＤ２（Ｔリンパ球）、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１９（Ｂリンパ球）、ＣＤ３４（幹細胞）、ＣＤ４２ａ（血小板）、ＣＤ５６（ナチュラルキラー細胞）またはＣＤ６６ｂ（顆粒球）に対するフィコエリトリン結合抗体と共にインキュベートすることにより同定される。ＦＩＴＣ標識キメラＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の同時結合はＴリンパ球、単球、幹細胞、ナチュラルキラー細胞および／または顆粒球で検出されるが、血小板またはＢリンパ球では検出されない。
【０１９０】
ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１
ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の白血球サブセット反応性を決定するために、ヒト白血球のサブセット特異的マーカーでの免疫蛍光標識および色素結合ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１での同時免疫蛍光標識を実施し、続いてフローサイトメトリー分析を実施する。
【０１９１】
簡単には、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）またはヒト末梢血好中球の新たに単離された調製物の特異的サブセットは、ＣＤ３、ＣＤ４，ＣＤ８（Ｔリンパ球）、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１６（ナチュラルキラー細胞および単球）、ＣＤ１９（Ｂリンパ球）またはＣＤ６６ｂ（顆粒球）に対するフィコエリトリン結合抗体と共にインキュベートしたときに同定される。ＦＩＴＣ標識ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の同時結合はＴリンパ球、単球、ナチュラルキラー細胞および顆粒球で検出されるが、Ｂリンパ球では検出されない。したがって、ＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１分子はヒトＢリンパ球とは反応しない。
【０１９２】
実施例１１：サプレッサーＴ細胞（Ｔ調節細胞）および機能的に無能なＴ細胞のインビトロ誘導
ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合キメラ抗体のサプレッサーＴ細胞を誘起する能力を実証するために、ヘモフィラス・インフルエンザの抗原マトリックスプロテイン１（ＭＰ１）と反応するＣＤ８＋Ｔ細胞系の作成の間、抗体を種々の濃度で含む。ＣＤ８＋ヒトリンパ球との、抗原と共にパルスしたＣＤ１４＋ヒト単球との同時培養を繰り返すことによりこれらの系を作成する。後に、ＣＤ１４＋単球をＭＰ１抗原提示細胞（ＡＰＣ）としてヒト白血球抗原−２陽性細胞系と置き換えることができる。ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合キメラ抗体を含む培養からのかかるＭＰ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を新たに単離したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞と混合し、そしてこの細胞の混合物をＡＰＣ上のＭＰ１抗原で刺激する場合、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の存在下での培養からのＣＤ８＋Ｔ細胞の添加により、抗体用量依存的様式でＩＦＮ−γ生成を低減させることができる。このＩＦＮ−γアッセイ培養の間、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合キメラ抗体は存在せず、これはＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ  ｍＡｂでの前処理が新たに単離されたＴ細胞の活性化を抑制することができるＣＤ８＋Ｔ細胞を誘起したことを示している。ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合キメラ抗体によるこのサプレッサーＴ調節細胞の誘導のために抗体は、無調節なおよび／または活性化されたＴ細胞集団は病理の原因となると考えられる疾患において有用であり得る。かかる疾患の実例には、自己免疫疾患、移植片拒絶、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患およびアレルギーが挙げられる。
【０１９３】
キメラＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の、さらなる刺激に対してＴ細胞低応答性（アネルギー）にする、すなわち機能的に無能化する能力を実証するために、前記で概要を示したように、ヘモフィラス・インフルエンザの抗原マトリックスプロテイン１（ＭＰ１）と反応するＣＤ８＋Ｔ細胞系の作成の間、抗体を含む。をＡＰＣにより提示されるＭＰ１抗原で（ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合キメラ抗体の前に暴露した）Ｔ細胞を活性化することにより無能を評価する。ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は培養には存在しない。ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合キメラ抗体に暴露していないＣＤ８＋Ｔ細胞は本来記載された刺激時にＩＦＮγを生成する。対照的に、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合キメラ抗体で前処理したＣＤ８＋Ｔ細胞は抗原刺激に応答してこのサイトカインの生成の不在までの著明な低減を示し、これはＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合キメラ抗体のヒトＴ細胞を機能的に無能化する能力を実証している。ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子によるこの機能的Ｔ細胞低応答性の誘導のために抗体を、活性化されたＴ細胞集団は病理の原因となると考えられる自己免疫疾患、移植片拒絶、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患またはアレルギーのような疾患において用いることができる。
【０１９４】
実施例１２：ＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚マウスにおけるインビボ研究
皮膚炎症におけるＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体の治療上の利点をＳＣＩＤマウスを用いて試験する。正常な個体からのヒト皮膚をＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚）に移植し、そしてヒト皮膚提供者に無関係なヒト個体から単離した単核白血球を養子移入することにより炎症過程を疑似する。
【０１９５】
ＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚マウス）におけるヒト成体皮膚の移植
完全表皮、真皮乳頭層および網状真皮の一部からなるヒト成体皮膚（West Hungarian Regional Tissue Bank; WHRTB, Gyorから入手）の２個の小片（１ｃｍ２）をＳＣＩＤマウスＣ.Ｂ  １７／GbmsTac-Prkdcscid Lystbgマウス（Taconic, Germantown, NY）左右上背部にマウス皮膚と置き換えて移植する。移植後５から６週間、移植片の品質をモニタリングし、そして移植に成功したマウス（ＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚マウス、一般的に＞８５％）をＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合キメラ抗体のインビボ試験のために選択する。
【０１９６】
ＳＣＩＤマウスにおけるヒト単核球の正着
細胞懸濁（５０メッシュサイズを装着した細胞解離ふるいを用いる）および標準的な密度勾配手順の後、単核白血球（Ｓｐｌ）をヒト成体脾臓生検（WHRTB, Gyor）から単離する。〜５×１０８ＳｐｌのアリコートをＲＰＭＩ−１０％  ＦＣＳ１.５ＭＬに再懸濁し、そしてＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚マウスに実験０日に腹腔内注射（ｉ.ｐ.）する。以前の実験でこれらのＳｐｌ数が細胞移入後４から６週内のマウス＞９０％で致死的な異種性ＧｖＨＤを誘起するのに十分であることが見出されている。
【０１９７】
ＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚マウスの抗体処置
ヒトＳｐｌで再構成したＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚マウスをＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体または抗ＬＰＳコントロールｍＡｂで０日、単核球注射直後、３日および７日、ならびにその後毎週の間隔で処置する。抗体をＰＢＳ１００μｌ中最終濃度１ｍｇ／ｋｇ体重（ｂ.ｗ.）で皮下（ｓ.ｃ.）に分配する。
【０１９８】
抗ＣＤ４５処置の評価
ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体の効果を移植したマウスの生存および皮膚移植片の拒絶のモニタリングにより評価する。Systat v10ソフトウェアの助けを借りて、ログランク検定（Mantel法）を用いる生存分析の統計学的方法により結果の有意性を評価する。実験の終わりに、組織学の目的で屠殺したマウスからヒト皮膚移植片ならびにマウスの肝臓、肺、腎臓および脾臓の生検を入手する。健康状態を間接的に推定するのに全マウスの体重測定を最初（細胞移入の前）および実験期間中（２日毎）に行う。各マウスから得られた体重対ＰＢＭＣ移入後日数の値を用いて線形回帰線を作成し、そして続いてノンパラメトリックMann-Whitney検定を用いてその勾配（コントロール対抗ＣＤ４５処置マウス）を比較する。
【０１９９】
結果
ヒト皮膚移植片はＳＣＩＤマウスにより非常に良好に寛容される。最初に移植片はケラチノサイト過剰増殖の期間を経験し、結果的に角化型痂皮の形成に至る。移植後約５週に、痂皮は移植片から剥がれ落ち、そして正常ヒト皮膚で観察される全ての特徴的な構造を含有する組織を露呈する。この過程の間にヒト皮膚移植片は隣接するマウス皮膚と融合し、そして下層のマウス組織と移植片をつなぐ新たに成長したヒト血管のネットワークを作成する。ＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚マウスに移入した循環ヒトＳｐｌ（実験０日、皮膚移植後およそ６週）は皮膚移植片に浸潤し、そしてヒト皮膚に発現された同種抗原分子を認識した後、乾癬性皮膚で生じる皮膚炎症過程と類似性を有し、そして完全に移植片を破壊する場合もある炎症応答が開始される。
【０２００】
これらのマウスのＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体での処置により炎症過程が抑制され、そしてヒト皮膚移植片の拒絶が防御される。対照的に、コントロール処置されたマウスから得られた試料は、多様な壊死の徴候を伴う大規模な浸潤および劇的な表皮の破壊を示す。この過程は肉眼で容易にモニタリングされ、そしてマウスの簡単な写真により立証される。
【０２０１】
同種ヒトＳｐｌを移入され、そしてコントロール抗ＬＰＳ  ｍＡｂで処置されたＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚マウスのうちの６匹は、単核球の移入後２３日に明らかに肉眼観察できる強い炎症応答を示す。全マウスは紅班、落屑および顕著な膿疱を含む相当な損傷を示す。対照的に、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体で処置した全マウスの皮膚移植片は正常な外観を有している。全マウスのヒト皮膚は実験の始めには同一の外見を有していたので、マウスの２群間の劇的な差異は特に抗体処置に起因する。この態様は、コントロール群が皮膚損傷を進行させ始める、細胞移入後２週まで変化しない。単核球移入後３４日に実験を終える。そのときまでに、コントロールマウスの１匹はすでに死亡し（３０日）、そしてその他の４匹は強力な異種ＧｖＨＤのために屠殺された（２７、２７、２７および３０日）。抗体コントロール処置マウスで観察された病理学的反応はまたこれらの動物の体重減少とも相関する。対照的に、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体処置群は全実験時間中健常な状態を示す。
【０２０２】
実施例１３：ヒト島細胞移植モデルにおけるＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体のインビボ活性
マウス
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌マウス（Charles River Laboratories, Calco, Italy）を特定病原体除去状態に維持する。尾静脈血中のグルコースレベルをGlucometer Eliteシステム（Bayer, Germany）を用いて定量する。ストレプトゾトシン（Sigma, St.Luis, MO）１８０ｍｇ／ｋｇの静脈内注射によりＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて糖尿病を誘起する。２回連続してグルコースの測定値が２５０ｍｇ／ｄｌより高くなった後、糖尿病の診断を下す。
【０２０３】
島調製物および移植
脳死多臓器提供者から膵臓を入手する。Bertuzzi et al., Diabetes, 1999, 48: 1971-8に記載される方法に従って島を単離する。１０％  ＦＣＳ、１％  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを補充したＭ１９９培地（Seromed Biochrom, Berlin, Germany）（完全培地）２５ｍｌの入った滅菌フラスコ中で精製した島を培養する。５％  ＣＯ２および９５％  加湿空気中、３０℃で島をインキュベートする。アベルチンの腹腔内注射でマウスを麻酔し、そしてDavalli A.M. et al., Diabetes, 1996, 45: 1161-7に記載されるようにヒト島の１５００  ＩＥのアリコートを受体糖尿病性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜の下に移植する。移植後、新たに単離した５０×１０６個のＰＢＭＣをＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに腹腔内注射する。
【０２０４】
移植したマウスの処置
Ｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＤ／ＳＣＩＤ移植したマウスを０、＋３および＋５日にＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体１ｍｇ／ｋｇでｓ.ｃ.処置する。コントロールマウスを生理食塩水溶液またはＩｇＧ精製ｍＡｂ（Vinci.Biochem, Italy）のいずれかで処置する。
【０２０５】
組織学的分析
ヒト島移植片を含有する腎臓の極をTissue Tek（Miles Lab., IN）中で急速凍結し、そして−７０℃で保存する。５μｍ厚の凍結切片をヒトインスリンまたはヒトＣＤ３に対するビオチン化ｍＡｂ、続いてストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体で染色する。ジアミノベンジジン（ＤＡＫＯ、Carpenteria, CA）を色素原として、そしてヘマトキシリンを対比染色として用いる。移植片のリンパ球浸潤をヘマトキシリンおよびエオシン染色した凍結切片で評価する。
【０２０６】
結果
ヒト島を移植した正常なＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは移植後１００日まで正常血糖を維持するが、ヒト島を移植したｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの平均拒絶時間は３５±１３日である。ヒト島を移植したｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの本発明のｍＡｂでの短期間処置はヒト島生存を有意に延長し、生存率は移植後６０日で＞７０％であり、そして１００日では５０％である。
【０２０７】
移植後１００日に実施したｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるヒト島移植片の組織学的分析により、コントロール受体マウスにおいてＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋陽性Ｔ細胞の多量の浸潤が示される。対照的に、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体で処置した受体マウスでは、ヒト細胞の浸潤が有意に低いことが観察される。インスリンに関する陽性染色により、コントロール受体マウスに比較して、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体で処置したｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＤ／ＳＣＩＤ受体マウスにおける移植片機能が実証される。島移植された、およびＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体で処置されたｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでは、コントロール受体マウスと比較してより低量のヒトＩＦＮ−γのが血清中で検出される。
【０２０８】
これらのデータにより、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合キメラ抗体での短期間処置は移植片浸潤を防御することにより、および白血球媒介のインビボ拒絶反応を阻害することによりヒト島同種移植片の生存延長に至ることが示される。
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】「候補ｍＡｂ」による１次ＭＬＲの阻害は０.００１および１０μｇ／ｍｌの範囲で用量依存的であることを示している。「濃度」は「候補ｍＡｂ」の濃度である。
【図２】配列番号：１５の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：１２（３９２１−４２７４）のヌクレオチド配列を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｇ１  ＨｕＡ６−ＶＨＱのプラスミドマップを示す。
【図３】配列番号：１６の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：１１（３９２１−４２７４）のヌクレオチド配列を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｇ１  ＨｕＡ６−ＶＨＥのプラスミドマップを示す。
【図４】配列番号：１７の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：１４（３９６４−４２８４）のヌクレオチド配列を有する軽鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｋ  ＨｕＡｂ−ＶＬ１ｈｕｍＶ１のプラスミドマップを示す。
【図５】配列番号：１８の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：１３（３９２１−４２７４）のヌクレオチド配列を有する軽鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｋ  ＨｕＡｂ−ＶＬ１ｈｕｍＶ２のプラスミドマップを示す。
【図６】配列番号：３６の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：３３のヌクレオチド配列を有する軽鎖を含む発現ベクターＬＣＶＬ１ＳＰ２０のプラスミドマップを示す。
【図７】配列番号：３９の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：１３のヌクレオチド配列を有する軽鎖を含む発現ベクターＬＣＶＬ２ＳＰ２０のプラスミドマップを示す。
【図８】配列番号：３７の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：３４のヌクレオチド配列を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＶＨＥＮ７３Ｄ  Ｓｐ２０のプラスミドマップを示す。
【図９】配列番号：３８の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：３５のヌクレオチド配列を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＶＨＱＮ７３Ｄ  Ｓｐ２０のプラスミドマップを示す。
【図１０】配列番号：４０の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：１１のヌクレオチド配列を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＶＨＥＳｐ２０のプラスミドマップを示す。
【図１１】配列番号：４１の完全発現ベクターヌクレオチド配列において配列番号：１２のヌクレオチド配列を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＶＨＱＳｐ２０のプラスミドマップを示す。
【図１２】ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ２、ならびにＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１と一緒のＶＨＥ／ｈｕｍＶ１のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。
【図１３】ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ２およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ１、ならびにＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１と一緒のＶＨＥ／ｈｕｍＶ２の陽イオン交換クロマトグラフィーを示す。
【図１４】ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２およびＶＨＥ−Ｎ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１の逆相クロマトグラフィーを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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