(57)【要約】本発明は、所定の大きさのＲＮＡ転写産物を産生可能な組換え転写ユニットを提供する。この組換え転写ユニットは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節配列を含み、それにより、この転写される領域の転写が、この調節配列によって制御される。この転写される領域は、ウイルス配列をコードする領域と、このウイルス配列をコードする領域の下流の非コード領域とを含み、ここで、この非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む。この組換え転写ユニットを使用する方法、およびこの組換え転写ユニットを含むベクターを含む細胞もまた、開示される。
2007537756.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の大きさのＲＮＡ転写産物を産生可能な組換え転写ユニットを調製する方法であって、該方法は、以下：
調節配列と転写される領域を含むヌクレオチド配列とを、該転写される領域の転写が該調節配列によって制御されるように作動可能に連結させる工程であって、ここで、該転写される領域は、ウイルス配列をコードする領域と該ウイルス配列をコードする該領域の下流の非コード領域とを含み、ここで、該非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、工程
を、包含する方法。
【請求項２】
前記非コード領域は、前記シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列の上流に切断シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記切断シグナルは、ポリアデニル化シグナル、一時休止部位、強力休止部位、終止部位、上流近位（ＮＵＥ）、または３’非翻訳配列である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、もしくはＳ４Ｖ０ポリＡ部位である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１より多い切断シグナルが使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記調節配列は、原核生物の調節配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記調節配列は、真核生物の調節配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたは延長因子（ＥＦ）プロモーターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルス配列は、ウイルスタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスタンパク質は、レンチウイルスによってコードされるタンパク質であるか、もしくはウイルスエンベロープタンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、もしくはｒｅｖ、またはＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、およびｒｅｖの任意の組み合わせである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルス配列は、抗ウイルス因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該抗ウイルス因子は、前記ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列の上流もしくは下流のどちらかにある、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ウイルス因子は、アンチセンス分子もしくはリボザイムである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記シス作動性リボザイムは、サテライトＲＮＡもしくはウイロイドＲＮＡに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記シス作動性リボザイムは、タバコ輪点ウイルスのサテライトＲＮＡに由来するか、もしくはアラビスモザイクウイルスのサテライトＲＮＡに由来する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
所定の大きさのＲＮＡ転写産物を産生可能な組換え転写ユニットを含む宿主細胞であって、該転写ユニットは、調節配列を含み、該調節配列は、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、該転写される領域の転写が該調節配列によって制御されるように作動可能に連結され、ここで、該転写される領域は、ウイルス配列をコードする領域と該ウイルス配列をコードする該領域の下流の非コード領域とを含み、ここで、該非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。
【請求項１７】
前記非コード領域は、前記シス作動性リボザイムをコードする前記ヌクレオチド配列の上流に切断シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
所定の大きさのＲＮＡ転写産物を産生可能な組換え転写ユニットであって、該転写ユニットは、ウイルス配列をコードする転写される領域と該ウイルス配列をコードする該領域の下流の非コード領域とを含むヌクレオチド配列に、作動可能に連結される調節配列を含み、ここで、該非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、組換え転写ユニット。
【請求項１９】
前記非コード領域は、前記シス作動性リボザイムをコードする前記ヌクレオチド配列の上流に終止切断シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１８に記載の組換え転写ユニット。
【請求項２０】
前記切断シグナルは、ポリアデニル化シグナル、休止部位、強力休止部位、上流近位（ＮＵＥ）、もしくは３’非翻訳配列である、請求項１９に記載の組換え転写ユニット。
【請求項２１】
前記ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、もしくはＳＶ４０ポリＡ部位である、請求項２０に記載の組換え転写ユニット。
【請求項２２】
１より多いシグナルが使用される、請求項２０に記載の組換え転写ユニット。
【請求項２３】
前記調節配列は、原核細胞調節配列である、請求項１８に記載の組換え転写ユニット。
【請求項２４】
前記調節配列は、真核細胞調節配列である、請求項１８に記載の組換え転写ユニット。
【請求項２５】
前記調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターもしくは延長因子（ＥＦ）プロモーターである、請求項２４に記載の組換え転写ユニット。
【請求項２６】
前記ウイルス配列は、ウイルスタンパク質である、請求項１８に記載の組換え転写ユニット。
【請求項２７】
前記ウイルスタンパク質は、レンチウイルスにコードされるタンパク質であるか、もしくはウイルスエンベロープタンパク質である、請求項２６に記載の組換え転写ユニット。
【請求項２８】
前記ウイルスタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、もしくはｒｅｖ、またはＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、およびｒｅｖの任意の組み合わせである、請求項２６に記載の組換え転写ユニット。
【請求項２９】
前記ウイルス配列は、ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に加えて、抗ウイルス因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該抗ウイルス因子は、該ウイルスタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列の上流もしくは下流のどちらかにある、請求項２８に記載の組換え転写ユニット。
【請求項３０】
前記抗ウイルス因子は、アンチセンス分子もしくはリボザイムである、請求項２９に記載の組換え転写ユニット。
【請求項３１】
前記シス作動性リボザイムは、サテライトＲＮＡもしくはウイロイドＲＮＡに由来する、請求項１８に記載の組換え転写ユニット。
【請求項３２】
前記シス作動性リボザイムは、タバコ輪点ウイルスのサテライトＲＮＡに由来するか、もしくはアラビスモザイクウイルスのサテライトＲＮＡに由来する、請求項３１に記載の組換え転写ユニット。
【請求項３３】
転写ユニットから産生されるＲＮＡ転写産物の大きさを限定する方法であって、該方法は、以下：
調節配列を含む転写ユニットの転写を誘導する工程であって、該調節配列は、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、該転写される領域の転写が該調節配列によって制御されるように作動可能に連結され、ここで、該転写される領域は、ウイルス配列をコードする領域と該ウイルス配列をコードする該領域の下流の非コード領域とを含み、ここで、該非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む工程
を包含し、ここで、該シス作動性リボザイムをコードする該配列が転写されて転写産物をシスで切断する条件下で、該転写ユニットは、該転写産物を産生する、方法。
【請求項３４】
前記非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードする前記ヌクレオチド配列の上流に切断シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記切断シグナルは、ポリアデニル化シグナル、一時休止部位、強力休止部位、終止部位、上流近位（ＮＵＥ）、または３’非翻訳配列である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、もしくはＳ４Ｖ０ポリＡ部位である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
１より多いシグナルが使用される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記調節配列は、原核生物の調節配列である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記調節配列は、真核生物の調節配列である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたは延長因子（ＥＦ）プロモーターである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ウイルス配列は、ウイルスタンパク質をコードする、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
前記ウイルスタンパク質は、レンチウイルスによってコードされるタンパク質であるか、もしくはウイルスエンベロープタンパク質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ウイルスタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、もしくはｒｅｖ、またはＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、およびｒｅｖの任意の組み合わせである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ウイルス配列は、ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に加えて、抗ウイルス因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該抗ウイルス因子は、該ウイルスタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列の上流もしくは下流のどちらかにある、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗ウイルス因子は、アンチセンス分子もしくはリボザイムである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記シス作動性リボザイムは、サテライトＲＮＡもしくはウイロイドＲＮＡに由来する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４７】
前記シス作動性リボザイムは、タバコ輪点ウイルスのサテライトＲＮＡに由来するか、もしくはアラビスモザイクウイルスのサテライトＲＮＡに由来する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
以下：
（ａ）所定の大きさの第１ＲＮＡ転写産物を産生可能な第１組換え転写ユニットであって、該第１転写ユニットは、第１プロモーターを含み、該第１プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、該転写される領域の転写が該第１プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、該転写される領域は、第１遺伝子をコードする領域と該第１遺伝子をコードする該領域の下流の第１非コード領域とを含み、ここで、該第１非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第１組換え転写ユニット；および
（ｂ）所定の大きさの第２ＲＮＡ転写産物を産生可能な第２組換え転写ユニットであって、該第２転写ユニットは、第２プロモーターを含み、該第２プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、該転写される領域の転写が該第２プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、該転写される領域は、第２遺伝子をコードする領域と該第２遺伝子をコードする該領域の下流の第２非コード領域とを含み、ここで、該第２非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第２組換え転写ユニット
を、含むベクター。
【請求項４９】
前記第１プロモーターおよび前記第２プロモーターが異なっている、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５０】
前記第１プロモーター非コード領域および前記第２プロモーター非コード領域は、同一であるかもしくは異なっているシス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５１】
前記第１遺伝子、前記第２遺伝子、もしくは該第１遺伝子および該第２遺伝子の両方は、自己のカルボキシ末端において切断シグナルを有する、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５２】
前記切断シグナルは、ポリアデニル化シグナル、一時休止部位、強力休止部位、終止部位、上流近位（ＮＵＥ）、または３’非翻訳配列である、請求項５１に記載のベクター。
【請求項５３】
１より多いシグナルが使用される、請求項５２に記載のベクター。
【請求項５４】
前記第１シス作動性リボザイムもしくは前記第２シス作動性リボザイム、または該第１シス作動性リボザイムおよび該第２シス作動性リボザイムの両方は、サテライトＲＮＡもしくはウイロイドＲＮＡに由来する、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５５】
前記シス作動性リボザイムは、タバコ輪点ウイルスのサテライトＲＮＡに由来するか、もしくはアラビスモザイクウイルスのサテライトＲＮＡに由来する、請求項５４に記載のベクター。
【請求項５６】
前記第１プロモーターは構成的であり、そして前記第２プロモーターは誘導性である、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５７】
前記第１遺伝子は、前記第２遺伝子とは異なる、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５８】
前記第１遺伝子は、ドミナントネガティブトランスジーンであり、そして前記第２遺伝子は、発現された場合に発現産物が該ドミナントネガティブトランスジーンを機能的遺伝子に変換させる遺伝子である、請求項５７に記載のベクター。
【請求項５９】
前記第１遺伝子は、前酵素であり、そして前記第２遺伝子の発現産物は、該前酵素を活性酵素に変換させる、請求項５７に記載のベクター。
【請求項６０】
前記第１遺伝子は、タンパク質をコードし、ここで該タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸がリン酸化を受けることが可能であり、そして前記第２遺伝子は、該タンパク質の該アミノ酸をリン酸化可能なキナーゼをコードする、請求項５７に記載のベクター。
【請求項６１】
前記第１遺伝子は、少なくとも１つのリン酸化アミノ酸を含む第１タンパク質をコードし、そして前記第２遺伝子は、該第１タンパク質の該アミノ酸を脱リン酸化可能であるタンパク質ホスファターゼをコードする、請求項５７に記載のベクター。
【請求項６２】
以下：
（ａ）所定の大きさの第１ＲＮＡ転写産物を産生可能な第１組換え転写ユニットであって、該第１転写ユニットは、第１プロモーターを含み、該第１プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、該転写される領域の転写が該第１プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、該転写される領域は、第１遺伝子をコードする領域と該第１遺伝子をコードする該領域の下流の第１非コード領域とを含み、ここで、該第１非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第１組換え転写ユニット；および
（ｂ）所定の大きさの第２ＲＮＡ転写産物を産生可能な第２組換え転写ユニットであって、該第２転写ユニットは、第２プロモーターを含み、該第２プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、該転写される領域の転写が該第２プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、該転写される領域は、第２遺伝子をコードする領域と該第２遺伝子をコードする該領域の下流の第２非コード領域とを含み、ここで、該第２非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第２組換え転写ユニット
を、含むベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６３】
前記第１遺伝子、前記第２遺伝子、もしくは該第１遺伝子および該第２遺伝子の両方は、自己のカルボキシ末端において切断シグナルを有する、請求項６２に記載の宿主細胞。
【請求項６４】
トランスジェニック動物を作成する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）所定の大きさの第１ＲＮＡ転写産物を産生可能な第１組換え転写ユニットであって、該第１転写ユニットは、第１プロモーターを含み、該第１プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、該転写される領域の転写が該第１プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、該転写される領域は、第１遺伝子をコードする領域と該第１遺伝子をコードする該領域の下流の第１非コード領域とを含み、ここで、該第１非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第１組換え転写ユニット；および
（ｂ）所定の大きさの第２ＲＮＡ転写産物を産生可能な第２組換え転写ユニットであって、該第２転写ユニットは、第２プロモーターを含み、該第２プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、該転写される領域の転写が該第２プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、該転写される領域は、第２遺伝子をコードする領域と該第２遺伝子をコードする該領域の下流の第２非コード領域とを含み、ここで、該第２非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第２組換え転写ユニット
を含むベクターを、該動物のゲノム中に挿入する工程を包含する、方法。
【請求項６５】
前記第１遺伝子、前記第２遺伝子、もしくは該第１遺伝子および該第２遺伝子の両方は、自己のカルボキシ末端において切断シグナルを有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ベクターは、前記動物の生殖細胞系列のゲノム中に挿入される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記ベクターは、前記動物の未受精卵もしくは受精卵のゲノム中に挿入される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記ベクターは、前記動物の胚のゲノム中に挿入される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記ベクターは、前記動物の子宮内に局在する細胞のゲノム中に挿入される、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
以下：
（ａ）所定の大きさの第１ＲＮＡ転写産物を産生可能な第１組換え転写ユニットであって、該第１転写ユニットは、第１プロモーターを含み、該第１プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、該転写される領域の転写が該第１プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、該転写される領域は、第１遺伝子をコードする領域と該第１遺伝子をコードする該領域の下流の第１非コード領域とを含み、ここで、該第１非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第１組換え転写ユニット；および
（ｂ）所定の大きさの第２ＲＮＡ転写産物を産生可能な第２組換え転写ユニットであって、該第２転写ユニットは、第２プロモーターを含み、該第２プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、該転写される領域の転写が該第２プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、該転写される領域は、第２遺伝子をコードする領域と該第２遺伝子をコードする該領域の下流の第２非コード領域とを含み、ここで、該第２非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第２組換え転写ユニット
を含むベクターを含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７１】
前記第１遺伝子、前記第２遺伝子、もしくは該第１遺伝子および該第２遺伝子の両方は、自己のカルボキシ末端において切断シグナルを有する、請求項７０に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７２】
以下：
（ａ）ペイロードと該ペイロードの転写を制御する第１プロモーターとをコードするヌクレオチド配列を含む第１ベクター；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）構造遺伝子と該構造遺伝子の転写を制御する第２プロモーターとをコードするヌクレオチド配列；および
（ｉｉ）非構造遺伝子と該非構造遺伝子の転写を制御する第３プロモーターとをコードするヌクレオチド配列
を含む第２ベクターであって、ここで、該構造遺伝子をコードする該ヌクレオチド配列と該非行性遺伝子をコードする該ヌクレオチド配列とは、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列によって分離される、第２ベクター
を含む、２ベクターレトロウイルス産生系。
【請求項７３】
前記第１プロモーター、前記第２プロモーター、および前記第３プロモーターは、同一であるかもしくは異なっている、請求項７２に記載のレトロウイルス産生系。
【請求項７４】
前記ペイロードは、アンチセンス分子、ＲＮＡデコイ、トランスドミナント変異体、毒素、ウイルス構造タンパク質を指向する単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムからなる群より選択される、請求項７２に記載のレトロウイルス産生系。
【請求項７５】
前記構造遺伝子は、ｇａｇ、ｇａｇ−ｐｏｌ前駆体、ｐｒｏ、逆転写酵素（ＲＴ）、インテグラーゼ（Ｉｎ）およびｅｎｖからなる群より選択される、請求項７２に記載のレトロウイルス産生系。
【請求項７６】
前記非構造遺伝子は、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｖｉｆからなる群より選択される、請求項７２に記載のレトロウイルス産生系。
【請求項７７】
以下：
（ａ）ペイロードと該ペイロードの転写を制御する第１プロモーターとをコードするヌクレオチド配列を含む第１ベクター；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）構造遺伝子と該構造遺伝子の転写を制御する第２プロモーターとをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）非構造遺伝子と該非構造遺伝子の転写を制御する第３プロモーターとをコードするヌクレオチド配列、および
（ｉｉｉ）エンベロープ遺伝子と該エンベロープ遺伝子の転写を制御する第４プロモーターとをコードするヌクレオチド配列
を含む第２ベクターであって、ここで、３つの該遺伝子をコードする該ヌクレオチド配列の各々は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列によって分離される、第２ベクター
を含む、２ベクターレトロウイルス産生系。
【請求項７８】
前記第１プロモーター、前記第２プロモーター、前記第３プロモーターおよび前記第４プロモーターは、同一であるかもしくは異なっている、請求項７７に記載のレトロウイルス産生系。
【請求項７９】
前記ペイロードは、アンチセンス分子、ＲＮＡデコイ、トランスドミナント変異体、毒素、ウイルス構造タンパク質を指向する単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムからなる群より選択される、請求項７７に記載のレトロウイルス産生系。
【請求項８０】
前記構造遺伝子は、ｇａｇ、ｇａｇ−ｐｏｌ前駆体、ｐｒｏ、逆転写酵素（ＲＴ）、インテグラーゼ（Ｉｎ）およびｅｎｖからなる群より選択される、請求項７７に記載のレトロウイルス産生系。
【請求項８１】
前記非構造遺伝子は、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｖｉｆからなる群より選択される、請求項７７に記載のレトロウイルス産生系。
【請求項８２】
レトロウイルスを産生する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ペイロードと該ペイロードの転写を制御する第１プロモーターとをコードするヌクレオチド配列を含む第１ベクター；ならびに
（ｂ）構造遺伝子と該構造遺伝子の転写を制御する第２プロモーターとをコードするヌクレオチド配列、および非構造遺伝子と該非構造遺伝子の転写を制御する第３プロモーターとをコードするヌクレオチド配列を含む、第２ベクターであって、ここで、該構造遺伝子をコードする該ヌクレオチド配列と該非構造遺伝子をコードする該ヌクレオチド配列とは、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列によって分離される、第２ベクター
を含む２ベクターレトロウイルス産生系と、細胞を接触させる工程を包含する、方法。
【請求項８３】
レトロウイルスを産生する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ペイロードと該ペイロードの転写を制御する第１プロモーターとをコードするヌクレオチド配列を含む第１ベクター；ならびに
（ｂ）構造遺伝子と該構造遺伝子の転写を制御する第２プロモーターとをコードするヌクレオチド配列、非構造遺伝子と該非構造遺伝子の転写を制御する第３プロモーターとをコードするヌクレオチド配列、およびエンベロープ遺伝子と該エンベロープ遺伝子の転写を制御する第４プロモーターとをコードするヌクレオチド配列を含む、第２ベクターであって、ここで、３つの該遺伝子をコードする該ヌクレオチド配列の各々は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列によって分離される、第２ベクター
を含む２ベクターレトロウイルス産生系と、細胞を接触させる工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許出願第１０／８４７，７２８号（２００４年５月１７日出願）に関連し、この米国出願は、本明細書中で完全に示されるように参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の分野内にある。より具体的には、自己切断して大きさを限定することが可能な転写産物を産生し得る組換えＤＮＡ構築物が提供され、従って、転写産物の含量が提供される。従って、本発明は、このような構築物の調製のための方法、ならびに、このような構築物を使用して所定の大きさの転写産物を産生するための方法を、提供する。本発明は、ポリアデニル化シグナル後の転写読み飛ばし（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）の範囲を限定するために、特に有利である。本発明は、任意の公知のヌクレオチド配列を転写しそして／または翻訳するために使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
ＤＮＡもしくはＲＮＡのプラスミドまたはベクターの環状の性質ゆえに、そして多くの場合プロモーターと転写されるヌクレオチド配列とを含む転写ユニットが１つより多くこのプラスミド上に存在するので、任意の１つのプロモーターに由来する転写は、所望されるよりも長いポリシストロン性（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）メッセンジャーＲＮＡを生じ得る可能性がある。プロモーターの下流のヌクレオチド配列が、例えばタンパク質をコードする場合、このタンパク質の発現レベルは、影響を受ける。さらに、不適当なメッセージは、複製コンピテントであるウイルスの産生のための潜在的な基質として（例えば、逆転写の間のＲＮＡベースの組換え事象を通して）寄与し得る。
【０００４】
従って、転写読み飛ばしが防止されるかもしくは減少するプラスミドの利用は、有利である。
【０００５】
転写読み飛ばしに関連する問題は、トランスジェニック動物を作製する際にしばしば起こる。トランスジェニック動物は、そのゲノム内に（１つもしくは複数の）遺伝子（この遺伝子の効果を研究することが意図される）を挿入されている。多くの場合、第１の遺伝子が発現され、次いで、第１の遺伝子に対して効果を有する第２の遺伝子が、異なる時点で発現される。遺伝子は、動物の細胞およびゲノム内への挿入を容易にするために、ベクター内に配置される。多くの場合、第１の遺伝子は、ベクター上で、第２の遺伝子の下流に配置される。第１の遺伝子は、そのヌクレオチド配列の一部として切断シグナルを有し得るが、多くの場合、第１遺伝子の転写の際、ＲＮＡポリメラーゼは、切断シグナルを読み飛ばし、そして第２遺伝子を転写する。この型の読み飛ばし転写が起こる場合、第１遺伝子および第２遺伝子の両方が転写され得、第２遺伝子の発現の非存在下で第１遺伝子の効果が研究されることが、妨げられ得る。
【０００６】
従って、第１遺伝子と第２遺伝子との間の読み飛ばし転写が防止されるプラスミドを作製することが、有利である。
【０００７】
最後に、大量のレトロウイルスベクターを、研究ツールならびに／または疾患予防ビヒクルおよび／もしくは疾患処置ビヒクルとしてこれらのベクターを利用する目的で、産生しようとする場合に、しばしば、収率の低さが生じる。これらの低い収率は、ウイルスをパッケージングするために所要である必要なヌクレオチド配列全てを含む３つの異なるベクターの間の、競合／干渉に起因し得る。３つの異なるベクターは、いずれか１つのベクターが全ての必要な構成成分を得て複製コンピテントであるベクターになることを妨げて、レトロウイルスを「食い止める（ｋｅｅｐ“ｉｎ  ｃｈｅｃｋ”）」ために使用される。さらに、多くの場合、３つの異なるベクターを作製することは、費用および時間がかかる。
【０００８】
従って、どちらのベクターも複製コンピテントベクターになり得ない２つのベクターのみを含む、レトロウイルスベクター産生系を得ることは、有利である。さらに、２プラスミド産生は、プラスミド産生費用を削減する（このことは、市場規模で重要であり得る）。２ベクター系を得るために、３つのベクターのうち２つに由来する構成成分は、１つのベクターに合わせられる。従って、１組の構成成分から（以前には異なるベクター上に分離されていた）別の１組の構成成分への読み飛ばしが存在しないことを確実にするための方法は、この２組の構成成分の間のリボザイムを不活性化することであり、それによって、機能上、２つの別個のプラスミドとして安全の面で有効に行動する一方で、２プラスミド産生系の費用および効力の利点を維持する、２つの転写ユニットを含む１つのプラスミドを作製する。従って、２プラスミド系は、例えばレトロウイルスベクターのより高い収率を生じ、そして３プラスミド系を維持する費用全体を削減する。
【０００９】
リボザイムは、触媒活性を含む小さいＲＮＡである。これらの小さなＲＮＡは、リボザイムの性質に依存して、４０ヌクレオチドから２６００ヌクレオチドまでの大きさの範囲におよぶ。リボザイムは、天然に存在し、タンパク質が形成される前の最古の酵素触媒化学反応であると考えられる。
【００１０】
シス作動性リボザイムおよびトランス作動性リボザイムが、存在する。シス作動性リボザイムは、その位置から隣接するか、近位であるか、もしくははるか遠くにある、標的ＲＮＡ上で作用し得る。ハンマーヘッド、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、ヘアピン、Ｖａｒｋｕｄサテライト（ＶＳ）、グループＩイントロンおよびグループＩＩイントロンは、種々の型のシス作動性リボザイムの例である（非特許文献１）。
【００１１】
リボザイム切断は、部位特異的であり、そして、標的領域の相補的塩基の間の水素結合によって媒介される。リボザイムの触媒ユニットは、標的ＲＮＡ骨格の破壊を引き起こす原子置換を促進することによって、切断を媒介する。
【００１２】
現在の知見によれば、リボザイムは、その天然の環境において不可逆的である。従って、リボザイムは、特徴的な部位における持続的な切断が可能である。
【非特許文献１】Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．およびＣｅｃｈ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ，第４１８巻，２００２年，ｐ．２２２−２２８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の開示）
本発明は、所定の大きさのＲＮＡ転写産物を産生する転写ユニットを作製する方法を提供する。この方法は、シス作動性リボザイムをコードする配列のこの転写ユニットの非コード領域への導入であって、このユニットのＲＮＡ分子への転写がリボザイムの産生を包含するような導入による、方法である。リボザイムの産生の際、このリボザイムはシスで作用してＲＮＡ転写産物を切断のためのリボザイム認識部位において切断し、ＲＮＡの大きさを限定する。従って、本発明は、転写されて、自己の大きさを限定するために自己切断することが可能であるＲＮＡ転写産物を産生し得る、組換えＤＮＡ構築物を提供する。この構築物は、転写産物の構成成分を制御して、転写読み飛ばしのような所望しない効果を調節可能にする能力を、提供する。
【００１４】
本発明の転写ユニットは、１以上のプロモーターのような転写を調節する配列、およびこのプロモーターの制御下で転写され得る配列を含む、組換えＤＮＡ構築物である。転写され得る配列は、目的のポリペプチドをコードしてもよく、または何らポリペプチドをコードしなくてもよい。この転写ユニットはまた、例えば、３’非翻訳配列、ポリアデニル化シグナル、休止部位（ｐａｕｓｅ  ｓｉｔｅ）、強力休止部位（ｓｔｒｏｎｇ  ｐａｕｓｅ  ｓｉｔｅ）、もしくは上流近位（ｎｅａｒ  ｕｐｓｔｒｅａｍ）（ＮＵＥ）配列のような、非コード配列をも含み得る。
【００１５】
本発明は、シス作動性リボザイムをコードする配列の（この配列のコード配列内もしくは非コード配列内への導入による）転写ユニット内への挿入を提供し、この挿入は、種々の手段によって達成され得る。この手段としては、調節配列に既に作動可能に連結されているコード配列内もしくは非コード配列内への挿入、または調節配列に対するコード配列もしくは非コード配列の作動可能な連結の前のコード配列内もしくは非コード配列内への挿入が、挙げられる。シス作動性リボザイムをコードする配列は、このリボザイムがこの転写ユニットの転写（ＲＮＡを産生する）の際に産生され得るように、このユニットの調節配列の下流すなわち３’に存在しさえすればよい。シス作動性リボザイムをコードする配列は、切断シグナル（例えば、真核生物転写ユニットの場合に存在するポリアデニル化シグナル）の下流にさえ存在し得る。しかし、本発明はまた、ポリアデニル化シグナルを含まない原核生物転写ユニットをも包含する。
【００１６】
本発明の構築物は、自然状態で天然に存在しない組換え体であると考えられ得る。好ましくは、シス作動性リボザイムをコードする配列は、このリボザイムが自然状態で通常見出されない、異種コード配列内もしくは異種非コード配列内へ導入される。
【００１７】
従って、本発明は、シス作動性リボザイムをコードする配列を使用し、種々のポリペプチドをコードするＲＮＡ転写産物の大きさを調節することを可能にする。本発明の１つの局面において、このポリペプチドは、ウイルス（例えば、レンチウイルスもしくはＨＩＶ）のポリペプチドである。本発明の別の局面において、このポリペプチドは、ウイルス複製および／またはウイルス増殖のために必須である（例えば、ウイルスエンベロープタンパク質）。しかし、本発明は、コードされるポリペプチドの型によって限定されない。実際、所望される場合、本発明は、何らポリペプチドをコードしない転写ユニットの場合に実施され得る。
【００１８】
同様に、本発明は、使用されるシス作動性リボザイムの供給源、個性、もしくは型によって限定されない。種々のこのようなリボザイムが使用され得、非限定の例としては、ハンマーヘッド、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピン、Ｖａｒｋｕｄサテライト、グループＩイントロン、およびグループＩＩイントロンが挙げられる。シス作動性リボザイムは、Ｄ．Ｂ．ＭｃＫａｙおよびＪ．Ｅ．Ｗｅｄｅｋｉｎｄ，Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ  ２６５−２８６（Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，Ｔ．Ｒ．Ｃｅｃｈ，Ｊ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ，編，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）において記載される。ヘアピンリボザイムおよびハンマーヘッドリボザイムは、Ｂｕｒｋｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，３０：１１１６−１１１９（２００２）において記載される。本発明の実施のために好ましいシス作動性リボザイムは、タバコ輪点ウイルスのサテライトＲＮＡのリボザイム（ｓＴｏｂＲＶ）である。タバコ輪点ウイルスのサテライトＲＮＡは、Ｈａｓｅｌｏｆｆ，Ｊ．およびＧｅｒｌａｃｈ，Ｗ．Ｌ．，Ｇｅｎｅ，８２：４３−５２（１９８９）において記載される。
【００１９】
本発明は、転写ユニットから産生されるＲＮＡ転写産物の大きさを限定する方法として、特に有利である。このように、このリボザイムは、ポリアデニル化シグナルのように、ＲＮＡ転写産物の切断をもたらし、それによってこのＲＮＡ転写産物の大きさを限定する点で、真核生物転写ユニットにおけるポリアデニル化シグナルに幾分機能的に類似する。これは、本発明の転写ユニットが、シス作動性リボザイムをコードする配列が転写される条件下に置かれる場合に、この転写ユニットにおいて起こる。このように、本発明は、原核生物転写ユニットにおいて、ポリアデニル化シグナル様切断機能を提供するために、使用され得る。
【００２０】
シス作動性リボザイムをコードする配列が、切断シグナル（例えば、ポリアデニル化シグナル）の下流にある場合、このポリアデニル化シグナルによって指向される切断は、このリボザイムをコードする配列の転写を防止し得る。しかし、このような場合、シス作動性リボザイムをコードする配列は、ポリアデニル化シグナルによって指向される切断が起こらない場合に切断を確実にする、転写ユニット内の二次切断シグナルとみなされ得る。
【００２１】
ＲＮＡ転写産物の大きさを限定する能力は、転写読み飛ばしが望ましくない多シストロン性（ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ＤＮＡ構築物の場合に、特に有利である。ＲＮＡ転写産物の大きさを限定する能力はまた、より長い転写産物が別の配列との組換えの可能性を増大する場合にも、有利である。
【００２２】
２以上の転写ユニットの間に配置される、リボザイムをコードするヌクレオチド配列の存在は、転写読み飛ばしを防止することにおいて有用である。さらにまた、１つの転写ユニットの末端に配置される、リボザイムをコードするヌクレオチド配列の存在は、このリボザイムが、転写ユニット内に存在する切断シグナルが適切に作用しない場合のバックアップとして作用し得る点で、有利である。
【００２３】
転写ユニットの分離のためのシス作動性リボザイムの１つの利点は、２プラスミドウイルスベクター系の安全性を、複製コンピテントなウイルスを生じる組換えの可能性を低減することによって改善することである。２ベクター系を得るために、３つのベクターのうちの２つの構成成分は、１つのベクターに合わせられる。従って、１組の構成成分から、以前は異なるベクター上に分離されていた別の１組の構成成分への転写の読み飛ばしが存在しないことを確実にする方法は、２組の構成成分の間にリボザイムを挿入することである。２ベクター系は、存在するベクターが１つ少ないことに起因して、ベクター間の干渉がより少なく、レトロウイルスベクターのより効率のよい産生をもたらす。
【００２４】
大規模の２プラスミドウイルスベクター産生は、３プラスミドベクター産生系よりも、費用が安く、より高いベクター力価を生じる。従って、シス作動性リボザイムの２プラスミドウイルスベクター産生系への組み込みは、製造において有意な利点を示し得る。
【００２５】
３プラスミドウイルスベクター産生において、ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）を含むベクターが１つのプラスミド（ベクタープラスミド）上に配置され、構造遺伝子が第２のプラスミド（ヘルパープラスミド）上に配置され、そして非構造遺伝子が第３のプラスミド（もう１つのヘルパープラスミド）上に配置される。あるいは、構造遺伝子および非構造遺伝子は、第２のプラスミド上に配置され、そしてエンベロープ遺伝子が、第３のプラスミド上に配置される。シス作動性リボザイムの第２のプラスミド上への組み込みは、１つのプラスミドが、１つの中で第２および第３のプラスミドとして作用することを、機能的に可能にする。従って、例えば構造遺伝子と非構造遺伝子との間へのシス作動性リボザイムの挿入により、読み飛ばし転写の危険性の防止を可能にするのみでなく、シス作動性リボザイムの組み込みは、２つのヘルパープラスミドが、１つのヘルパープラスミドに統合されることを可能にする。
【００２６】
具体的には、シス作動性リボザイムの組み込みは、リボザイムによって分離されるＲＮＡ転写産物の即座の切断をもたらす。このことは、ベクタープラスミドから転写されたＲＮＡとシスリボザイムを含むヘルパープラスミド由来のＲＮＡとの間の１つの組換え事象は、複製コンピテントなウイルスを生じ得ないことを確実にする。このような組換えは、逆転写のプロセスの間に、ポリメラーゼが、通常、粒子内にカプセル化されたＲＮＡの間をジャンプして、両ＲＮＡに由来する遺伝子を含む相補的ＤＮＡ配列を作製する際に、起こりやすい。従って、シス作動性リボザイムの１つのプラスミド内への組み込みであって、構造遺伝子と非構造遺伝子とを分ける組み込みは、３プラスミド系の安全性と同等の安全性を２プラスミド系に提供し、そして大規模における高い力価と低い産生コストとの利益を加えることを可能にする。
【００２７】
ペイロードは、例えば、アンチセンス分子、ＲＮＡデコイ、トランスドミナント変異体、毒素、ウイルス構造タンパク質を指向する単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、ｓｉＲＮＡもしくはリボザイムであり得る。
【００２８】
構造遺伝子は、例えば、ｇａｇ、ｇａｇ−ｐｏｌ前駆体、ｐｒｏ、逆転写酵素（ＲＴ）、インテグラーゼ（Ｉｎ）もしくはｅｎｖであり得る。非構造遺伝子は、例えば、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕもしくはｖｉｆであり得る。
【００２９】
シス作動性リボザイムのインビボの治療的使用は、細胞が、ヘルパープラスミドおよびベクタープラスミドによって同時に形質導入されることを可能にし、ゆえに、ヘルパープラスミド転写産物は誘導性であり、そして複製コンピテントウイルス産生の高い危険性を負うことなく、ベクタープラスミドの発現および増殖をもたらす。例えば、細胞は、ヘルパーＳＩＮベクターによって形質導入され得、このヘルパーＳＩＮベクターは、自身で複製することができないが、プロモーターによって特異的に活性化された場合、機能的ＬＴＲを含む動員可能なベクタープラスミドを増殖し得る。このヘルパーＳＩＮベクターは、シスリボザイムをコードする配列によって分離されている、必要な構造遺伝子および非構造遺伝子を含み得る。２つのヘルパープラスミドを用いた改善の、幾つかの理由が存在する。第１に、ヘルパープラスミド対ベクターの所定の標的比による標的細胞の形質導入は、３つのプラスミドの代わりに所定の２つのプラスミドが与えられる場合により容易に可能である。第２に、ヘルパー遺伝子が同じ誘導可能プロモーターの下で各々発現される場合に、ヘルパープラスミド発現の制御は、より容易に調節される。
【００３０】
抗ウイルスアンチセンスもしくは抗ベクターアンチセンス、または抗ウイルスリボザイムもしくは抗ベクターリボザイムもまた、ベクターパッケージング系のヘルパープラスミド成分において維持され得る。これは、複製コンピテントなレトロウイルス（ＲＣＬ）の産生の可能性を低減するための、ベクターパッケージングについての安全な機構として寄与し得る。抗ウイルス配列もしくは抗ベクター配列は、ベクターゲノム中に存在する配列に対して標的化されるが、別個の転写産物として発現されず、生産的なベクターパッケージングを細胞内で遮断することが可能である。抗ウイルス配列もしくは抗ベクター配列は、ベクター粒子中に通常見出されるベクターゲノムＲＮＡ二本鎖の代わりに、ヘルパープラスミドのコピーとベクターゲノムのコピーとを含むベクター粒子の増殖を遮断することが意図される。パッケージングシグナルを含まない適切な大きさの核酸配列の非特異的パッケージングは、以前に記載されており、低い頻度で起こることが公知である。従って、この設計は、レトロウイルス産生の安全性に、重要な意味を有し得る。
【００３１】
シス作動性リボザイムはまた、トランスジェニック動物（例えば、マウス）の作製を容易にし得る。上記と同様に、このシス作動性リボザイムは、マウスに導入されるトランスジェニック構築物の中で発現される転写産物を分離するために使用され得る。例えば、プラスミド中に、第１遺伝子の末端と第２遺伝子を転写するプロモーターとの間に挿入されたリボザイムの使用が、有利であり得る。非限定の例として、これは、研究のために発現される遺伝子が目的の遺伝子のドミナントネガティブである場合に、有用である。ドミナントネガティブトランスジーンを機能的遺伝子に変換し得る第２の遺伝子が、同じ転写産物上で発現される。転写産物の効率的な分離は、ドミナントネガティブ由来の変換性遺伝子内で読み飛ばしが起こる場合には表現型はマスクされるので、マウス表現型の首尾よい分析にとって重要である。休止部位、強力休止部位、およびポリＡシグナルは、歴史的に、この目的を達成するために使用されてきた。しかし、示された実施例において提供される結果は、これらの停止シグナルは、低レベルで起こる読み飛ばしを防止するために不十分であることを示す。従って、これらの部位に加えてのシス作動性リボザイムの使用、もしくはこれらの部位の代わりのシス作動性リボザイムの使用は、遺伝子機能を決定するためのトランスジェニックマウスの作製の際に、より高い成功を確実にし得る。
【００３２】
本発明の１つの局面は、所定の大きさのＲＮＡ転写産物を産生可能な組換え転写ユニットを調製する方法であって、この方法は、調節配列と転写される領域を含むヌクレオチド配列とを、この転写される領域の転写がこの調節配列によって制御されるように作動可能に連結させる工程であって、ここで、この転写される領域は、ウイルス配列をコードする領域とこのウイルス配列をコードする領域の下流の非コード領域とを含み、ここで、この非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む工程を、包含する。
【００３３】
上記非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードする上記ヌクレオチド配列の上流に、切断シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００３４】
上記ウイルス配列は、例えば、ウイルスタンパク質であってもよい。このウイルスタンパク質は、例えば、レンチウイルスによってコードされるタンパク質であってもよく、もしくはウイルスエンベロープタンパク質であってもよい。このウイルスタンパク質は、例えば、ＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、もしくはｒｅｖであってもよく、または、ＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、およびｒｅｖの任意の組み合わせであってもよい。
【００３５】
上記ウイルス配列は、抗ウイルス因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含み得、この抗ウイルス因子は、上記ウイルスタンパク質をコードする上記ヌクレオチド配列の上流もしくは下流のどちらかに存在する。この抗ウイルス因子は、例えば、アンチセンス分子もしくはリボザイムであり得る。
【００３６】
本発明の別の局面は、所定の大きさのＲＮＡ転写産物を産生可能な組換え転写ユニットを含む宿主細胞であって、この転写ユニットは、調節配列を含み、この調節配列は、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、この転写される領域の転写がこの調節配列によって制御されるように作動可能に連結され、ここで、この転写される領域は、ウイルス配列をコードする領域とこのウイルス配列をコードするこの領域の下流の非コード領域とを含み、ここで、この非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む。この非コード領域は、上記シス作動性リボザイムをコードする上記ヌクレオチド配列の上流に切断シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。
【００３７】
本発明のなお別の局面は、所定の大きさのＲＮＡ転写産物を産生可能な組換え転写ユニットであって、この転写ユニットは、ウイルス配列をコードする転写される領域とこのウイルス配列をコードするこの領域の下流の非コード領域とを含むヌクレオチド配列に、作動可能に連結される調節配列を含み、ここで、この非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む。この非コード領域は、上記シス作動性リボザイムをコードする上記ヌクレオチド配列の上流に切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を、さらに含み得る。
【００３８】
上記転写ユニット中の上記ウイルス配列は、例えば、ウイルスタンパク質であってもよい。このウイルスタンパク質は、例えば、レンチウイルスによってコードされるタンパク質であってもよく、もしくはウイルスエンベロープタンパク質であってもよい。このウイルスタンパク質は、例えば、ＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、もしくはｒｅｖであってもよく、または、ＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、およびｒｅｖの任意の組み合わせであってもよい。
【００３９】
上記ウイルス配列は、抗ウイルス因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含み得、この抗ウイルス因子は、上記ウイルスタンパク質をコードする上記ヌクレオチド配列の上流もしくは下流のどちらかに存在する。この抗ウイルス因子は、例えば、アンチセンス分子もしくはリボザイムであり得る。
【００４０】
本発明の別の局面は、転写ユニットから産生されるＲＮＡ転写産物の大きさを限定する方法であって、この方法は、調節配列を含む転写ユニットの転写を誘導する工程であって、この調節配列は、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、この転写される領域の転写がこの調節配列によって制御されるように作動可能に連結され、ここで、この転写される領域は、ウイルス配列をコードする領域とこのウイルス配列をコードするこの領域の下流の非コード領域とを含み、ここで、この非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む工程を包含し、ここで、このシス作動性リボザイムをコードするこの配列が転写されて転写産物をシスで切断する条件下で、この転写ユニットは、この転写産物を産生する。この非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードする上記ヌクレオチド配列の上流に切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を、さらに含み得る。
【００４１】
上記方法の上記ウイルス配列は、例えば、ウイルスタンパク質であってもよい。このウイルスタンパク質は、例えば、レンチウイルスによってコードされるタンパク質であってもよく、もしくはウイルスエンベロープタンパク質であってもよい。このウイルスタンパク質は、例えば、ＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、もしくはｒｅｖであってもよく、または、ＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、およびｒｅｖの任意の組み合わせであってもよい。
【００４２】
上記ウイルス配列は、抗ウイルス因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含み得、この抗ウイルス因子は、上記ウイルスタンパク質をコードする上記ヌクレオチド配列の上流もしくは下流のどちらかに存在する。この抗ウイルス因子は、例えば、アンチセンス分子もしくはリボザイムであり得る。
【００４３】
本発明の別の局面は、所定の大きさの第１ＲＮＡ転写産物を産生可能な第１組換え転写ユニットであって、この第１転写ユニットは、第１プロモーターを含み、この第１プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、この転写される領域の転写がこの第１プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、この転写される領域は、第１遺伝子をコードする領域とこの第１遺伝子をコードするこの領域の下流の第１非コード領域とを含み、ここで、この第１非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第１組換え転写ユニット、ならびに、所定の大きさの第２ＲＮＡ転写産物を産生可能な第２組換え転写ユニットであって、この第２転写ユニットは、第２プロモーターを含み、この第２プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、この転写される領域の転写がこの第２プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、この転写される領域は、第２遺伝子をコードする領域とこの第２遺伝子をコードするこの領域の下流の第２非コード領域とを含み、ここで、この第２非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第２組換え転写ユニットを、含むベクターである。さらに、第１遺伝子、第２遺伝子、もしくは第１遺伝子および第２遺伝子の両方は、自己のカルボキシ末端において切断シグナルを有し得る。
【００４４】
上記ベクターは、例えば、構成的である第１プロモーターおよび誘導性である第２プロモーターを有し得る。このベクターは、例えば、ドミナントネガティブトランスジーンである第１遺伝子、および発現された場合に発現産物がこのドミナントネガティブトランスジーンを機能的遺伝子に変換させる第２遺伝子を有し得る。この第１遺伝子は、例えば、前酵素であり得、そして第２遺伝子の発現産物は、この前酵素を活性酵素に変換させる。第１遺伝子は、例えば、タンパク質をコードし得、ここで、このタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸がリン酸化を受けることが可能であり、そして第２遺伝子は、このタンパク質のこのアミノ酸をリン酸化可能なキナーゼをコードし得る。あるいは、第１遺伝子は、少なくとも１つのリン酸化アミノ酸を含む第１タンパク質をコードし得、そして第２遺伝子は、この第１タンパク質の該アミノ酸を脱リン酸化可能であるタンパク質ホスファターゼをコードし得る。
【００４５】
本発明のなお別の局面は、所定の大きさの第１ＲＮＡ転写産物を産生可能な第１組換え転写ユニットであって、この第１転写ユニットは、第１プロモーターを含み、この第１プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、この転写される領域の転写がこの第１プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、この転写される領域は、第１遺伝子をコードする領域とこの第１遺伝子をコードするこの領域の下流の第１非コード領域とを含み、ここで、この第１非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第１組換え転写ユニット、ならびに、所定の大きさの第２ＲＮＡ転写産物を産生可能な第２組換え転写ユニットであって、この第２転写ユニットは、第２プロモーターを含み、この第２プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、この転写される領域の転写がこの第２プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、この転写される領域は、第２遺伝子をコードする領域とこの第２遺伝子をコードするこの領域の下流の第２非コード領域とを含み、ここで、この第２非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第２組換え転写ユニットを含む、ベクターを含む、宿主細胞である。さらに、第１遺伝子、第２遺伝子、もしくは第１遺伝子および第２遺伝子の両方は、自己のカルボキシ末端において切断シグナルを有し得る。
【００４６】
本発明の別の局面は、トランスジェニック動物を作成する方法であって、この方法は、所定の大きさの第１ＲＮＡ転写産物を産生可能な第１組換え転写ユニットであって、この第１転写ユニットは、第１プロモーターを含み、この第１プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、この転写される領域の転写がこの第１プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、この転写される領域は、第１遺伝子をコードする領域とこの第１遺伝子をコードするこの領域の下流の第１非コード領域とを含み、ここで、この第１非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第１組換え転写ユニット、ならびに、所定の大きさの第２ＲＮＡ転写産物を産生可能な第２組換え転写ユニットであって、この第２転写ユニットは、第２プロモーターを含み、この第２プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、この転写される領域の転写がこの第２プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、この転写される領域は、第２遺伝子をコードする領域とこの第２遺伝子をコードするこの領域の下流の第２非コード領域とを含み、ここで、この第２非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第２組換え転写ユニットを含むベクターを、この動物のゲノム中に挿入する工程を包含する。さらに、第１遺伝子、第２遺伝子、もしくは第１遺伝子および第２遺伝子の両方は、自己のカルボキシ末端において切断シグナルを有し得る。
【００４７】
上記方法の上記ベクターは、例えば、動物の生殖細胞系列のゲノム中に挿入されてもよく、動物の未受精卵もしくは受精卵のゲノム中に挿入されてもよく、動物の胚のゲノム中に挿入されてもよく、または上記動物の子宮内に局在する細胞のゲノム中に挿入されてもよい。
【００４８】
本発明の別の局面は、所定の大きさの第１ＲＮＡ転写産物を産生可能な第１組換え転写ユニットであって、この第１転写ユニットは、第１プロモーターを含み、この第１プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、この転写される領域の転写がこの第１プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、この転写される領域は、第１遺伝子をコードする領域とこの第１遺伝子をコードするこの領域の下流の第１非コード領域とを含み、ここで、この第１非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第１組換え転写ユニット、ならびに、所定の大きさの第２ＲＮＡ転写産物を産生可能な第２組換え転写ユニットであって、この第２転写ユニットは、第２プロモーターを含み、この第２プロモーターは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に、この転写される領域の転写がこの第２プロモーターによって制御されるように作動可能に連結され、ここで、この転写される領域は、第２遺伝子をコードする領域とこの第２遺伝子をコードするこの領域の下流の第２非コード領域とを含み、ここで、この第２非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、第２組換え転写ユニットを含むベクターを含む、トランスジェニック非ヒト動物である。さらに、第１遺伝子、第２遺伝子、もしくは第１遺伝子および第２遺伝子の両方は、自己のカルボキシ末端において切断シグナルを有し得る。
【００４９】
本発明のなお別の局面は、ペイロードとこのペイロードの転写を制御する第１プロモーターとをコードするヌクレオチド配列を含む第１ベクター、ならびに、構造遺伝子とこの構造遺伝子の転写を制御する第２プロモーターとをコードするヌクレオチド配列、および非構造遺伝子とこの非構造遺伝子の転写を制御する第３プロモーターとをコードするヌクレオチド配列を含む第２ベクターであって、ここで、この構造遺伝子をコードするこのヌクレオチド配列とこの非構造遺伝子をコードするこのヌクレオチド配列とは、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列によって分離される、第２ベクターを含む、２ベクターレトロウイルス産生系である。
【００５０】
本発明の別の局面は、ペイロードとこのペイロードの転写を制御する第１プロモーターとをコードするヌクレオチド配列を含む第１ベクター、ならびに、構造遺伝子とこの構造遺伝子の転写を制御する第２プロモーターとをコードするヌクレオチド配列、非構造遺伝子とこの非構造遺伝子の転写を制御する第３プロモーターとをコードするヌクレオチド配列、および、エンベロープ遺伝子とこのエンベロープ遺伝子の転写を制御する第４プロモーターとをコードするヌクレオチド配列を含む第２ベクターであって、ここで、３つのこの遺伝子をコードするこのヌクレオチド配列の各々は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列によって分離される、第２ベクターを含む、２ベクターレトロウイルス産生系である。
【００５１】
本発明のなお別の局面は、レトロウイルスを産生する方法であって、この方法は、ペイロードとこのペイロードの転写を制御する第１プロモーターとをコードするヌクレオチド配列を含む第１ベクター、ならびに、構造遺伝子とこの構造遺伝子の転写を制御する第２プロモーターとをコードするヌクレオチド配列、および非構造遺伝子とこの非構造遺伝子の転写を制御する第３プロモーターとをコードするヌクレオチド配列を含む、第２ベクターであって、ここで、この構造遺伝子をコードするこのヌクレオチド配列とこの非行性遺伝子をコードするこのヌクレオチド配列とは、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列によって分離される、第２ベクターを含む２ベクターレトロウイルス産生系と、細胞を接触させる工程を包含する。
【００５２】
本発明の別の局面は、レトロウイルスを産生する方法であって、この方法は、ペイロードとこのペイロードの転写を制御する第１プロモーターとをコードするヌクレオチド配列を含む第１ベクター、ならびに、構造遺伝子とこの構造遺伝子の転写を制御する第２プロモーターとをコードするヌクレオチド配列、非構造遺伝子とこの非構造遺伝子の転写を制御する第３プロモーターとをコードするヌクレオチド配列、およびエンベロープ遺伝子とこのエンベロープ遺伝子の転写を制御する第４プロモーターとをコードするヌクレオチド配列を含む、第２ベクターであって、ここで、３つのこの遺伝子をコードするこのヌクレオチド配列の各々は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列によって分離される、第２ベクターを含む２ベクターレトロウイルス産生系と、細胞を接触させる工程を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
（発明を実施する形態）
本発明の転写ユニットは、転写される領域を含むヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含み、それにより、この転写される領域の転写は、この調節配列によって制御される。この転写される領域は、ウイルス配列をコードする領域と、このウイルス配列をコードする領域の下流の非コード領域を含み、ここで、この非コード領域は、シス作動性リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５４】
実施例１は、転写ユニットの２つの非限定の例を提供する。転写ユニット１は、ＨＩＶ−１  ＧａｇＰｏｌ遺伝子およびＴａｔＲｅｖ遺伝子を含み、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ポリＡ）シグナルで終わる、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。リボザイムは、ベクター中でポリＡシグナルの直後に配置される。転写ユニット２は、ＶＳＶ−Ｇ遺伝子を含み、ＳＶ４０ポリＡ部位で終わる、延長因子（ＥＦ）プロモーターを含む。リボザイムは、所望される場合、ベクター中でポリＡシグナルの直後に配置され得る。
【００５５】
多くの型の転写ユニットが、作製され得る。当業者は、周知の方法を使用して、種々の型の転写ユニットを容易に構築し得る。例えば、任意のプロモーターおよび任意の配列もしくは遺伝子を含み、任意の終止シグナルを有する転写ユニットが、作製され得る。さらに、リボザイムは、次いで、終止シグナルの直後にベクターに付加され得る。例えば、細菌培養物中でタンパク質を産生するために転写ユニットが使用される場合、このユニットは、プロモーター、遺伝子、およびシスリボザイムを含む。
【００５６】
本発明の転写ユニットにおいて、その活性がシスリボザイム機能から独立する限り、任意のペプチドが、使用され得る。
【００５７】
多くのリボザイムの切断部位は、当該分野で周知である。当業者は、リボザイムを容易に選択することができ、そして本発明の転写ユニット内に容易に挿入することができる。
【００５８】
読み飛ばし転写を阻害する能力は、ＨＩＶ以外の他のウイルス系において使用され得る。具体的には、転写ユニットは、３つのプラスミドを使用するいかなるベクター産生も、２つのプラスミドに削減することができる。
【００５９】
（ウイルス粒子の産生）
本発明の構築物および細胞は、目的の特定のウイルス核酸を含む任意のウイルス粒子を産生するために必要な要素を提供するために設計され得る。ウイルス核酸は、複製欠損であり得、内因性「パッケージングシグナル」を除去もしくは欠失することなく、天然に存在するウイルスに由来し得る。さらに、ウイルス核酸は、ＨＩＶ−１に由来し得る。ＨＩＶ−１由来のウイルス核酸は、野生型株であるＨＩＶ−１分子クローンｐＮＬ４−３によって産生され得、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから入手可能である（また、Ａｄａｃｈｉ，ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５９，２８４−２９１（１９８６）を参照）。この細胞は、別個に細胞内に導入され得る、ウイルス核酸についての「パッケージングシグナル」としてみなされ得、使用され得る。なぜなら、これらは、ウイルス核酸を感染性ウイルス粒子にパッケージングするために必要な構成成分の全てを産生するからである。
【００６０】
パッケージング細胞は、ウイルス核酸が全ての他の構成成分を提供する場合、目的のコード配列から、少なくともウイルスエンベロープタンパク質、あるいはそれらの等価形態（例えば、変異体、融合体、もしくはそれらの短縮型）またはそれらの異種形態を発現し得る。エンベロープタンパク質の例は、天然形態のウイルス核酸に対して内因性である（すなわち、このウイルス核酸が由来するウイルスのパッケージングにおいて通常使用される）配列によってコードされるエンベロープタンパク質であるか、または、このウイルス核酸に対して異種である配列によってコードされるエンベロープタンパク質である。種々のエンベロープタンパク質は、本発明のこの局面の実施において発現され得、これらとしては、パッケージングされたウイルス粒子の標的細胞特異性を変えるタンパク質または偽型のウイルス粒子を生じる代替のエンベロープタンパク質が挙げられる。ＨＩＶ−１由来のウイルスタンパク質と共に使用するための異種エンベロープタンパク質の例としては、ＶＳＶ  Ｇタンパク質、ＭｏｋｏｌａウイルスＧタンパク質、およびＨＩＶ−２エンベロープタンパク質が挙げられる。
【００６１】
あるいは、細胞は、少なくともウイルスエンベロープタンパク質、およびパッケージングされるウイルス核酸由来のパッケージング構成成分の発現のために必要である１つもしくは１つより多いタンパク質を、提供し得る。非限定の例は、エンベロープタンパク質および同属のｔａｔタンパク質またはトランスで要求される１つもしくは１つより多い他のタンパク質の両方を、レトロウイルス核酸をパッケージングするために提供する細胞（例えば、ＨＩＶ−１由来のベクターをパッケージングするためにＶＳＶ  Ｇタンパク質およびＨＩＶ−１  ｔａｔタンパク質を提供する細胞）である。トランスで必要とされる更なるタンパク質の例としては、ｇａｇ配列、ｐｏｌ配列およびｒｅｖ配列によってコードされるタンパク質が挙げられる。
【００６２】
パッケージングされる目的のウイルス核酸は、１つまたは１つより多いウイルスアクセサリータンパク質配列（例えば、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、ＶｐｒもしくはＮｅｆ、またはこれらの組み合わせもしくはこれらのフラグメントであるが、これらに限定されない）を発現するかまたはコードする能力を欠損し得る。（このウイルスアクセサリータンパク質は、この核酸を病原性にするか、または病原性にする可能性がある。）これは、対応するコード配列の除去もしくはそれらの変異誘発によって、それらの発現を転写レベルもしくは翻訳レベルで防止することにより、達成され得る。このようなタンパク質は、（パッケージングに必要であるという範囲で）本発明の構築物を介するか、もしくはさらなる核酸構築物によって細胞をパッケージングすることにより、提供される。
【００６３】
（トランスジェニック動物の産生）
トランスジェニック動物を産生するための一般的手順は、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，ら，Ｃｅｌｌ，２７：２２３（１９８１）において記載される。
【００６４】
トランスジェニックの単細胞生物、植物および動物は、当業者に公知の幾つかの異なる方法によって容易に産生され得る。これらの改変生物は、ゲノム内に組み込まれたクローン化遺伝子の１以上のコピーを含む。
【００６５】
トランスジェニック技術は、遺伝子の正常なコピーを変異体生物に導入し、それにより変異によって規定される遺伝子に対応するクローン化ＤＮＡを同定するために使用され得る。また、この技術は、遺伝子発現のために必要な配列を研究するため、ヒト疾患のドミナント形態のマウスモデルを開発するため、植物を改変するため、および遺伝子によってコードされるタンパク質の構造とその機能との間の関連性を調べるために、使用される。
【００６６】
外来遺伝子もしくは内因性遺伝子の改変形態が、生物内に挿入され得る。これらの技術は、内因性遺伝子の置換、もしくは内因性遺伝子のさらなるコピーの組み込みをもたらし得る。このような導入された遺伝子は、トランスジーンと呼ばれる。これらのトランスジーンを保有する生物は、トランスジェニックと呼ばれる。トランスジーンは、生物の機能および種々の異なる方法における発生をを研究するために使用され得る。例えば、通常は発生の間の特定の時期および場所で発現される遺伝子が、異なる組織において異なる時期に発現されるようにインビトロで遺伝子操作され得、次いで、細胞および生物の帰結を評価するために、この動物内に再導入され得る。
【００６７】
トランスジェニック動物の産生は、変異誘発性クローン化遺伝子のための技術をインビトロで使用し、次いで、これらを真核生物細胞内に移動させる。多くの型の細胞が、培地からＤＮＡを取り込み得る。例えば、酵母細胞は、その厚い外壁を除去するために酵素で処理され得、得られたスフェロプラストは、培地に加えられたＤＮＡを取り込む。植物細胞もまた、スフェロプラストに変えられ得、このスフェロプラストは、培地からＤＮＡを取り込む。培養動物細胞は、特に、最初にカルシウムイオンでの処理によって高純度の沈殿物に変えられた場合、ＤＮＡを直接取り込む。ＤＮＡを酵母、植物細胞および動物細胞に導入するための別の一般的な方法は、エレクトロポレーションと呼ばれる。数千ボルトの短い電気ショックにかけられた細胞は、一時的にＤＮＡに対して透過性になる。おそらく、このショックは、束の間、細胞膜に穴を開け、この穴が再度封鎖される前に、ＤＮＡが細胞に入ることを可能にする。ＤＮＡはまた、培養細胞および発生中の胚の両方の核内に、直接的に注射され得る。
【００６８】
一旦外来ＤＮＡが宿主細胞内に入ったら、おそらく通常はＤＮＡ修復および組換えにおいて機能するであろう酵素が、外来ＤＮＡのフラグメントと宿主細胞の染色体とを繋げる。細胞の比較的小さい画分のみがＤＮＡを取り込むので、トランスジェニック細胞を同定するために、選択的技術が利用可能でなければならない。ほとんどの場合、外因性ＤＮＡは、選択可能なマーカー（例えば、薬物耐性）をコードする遺伝子を含む。導入されたＤＮＡは、部位特異性を示さない高度に可変的な様式で宿主ゲノム内に挿入し得るか、相同組換えによって内因性遺伝子を置換し得るか、またはエピソームと呼ばれる独立した付加的染色体ＤＮＡ分子として留まり得る。
【００６９】
トランスジェニック技術は、多くの実験用途ならびに農業的価値の可能性および治療的価値の可能性を有する。例えば、腫瘍原因遺伝子の優性に作用する対立遺伝子は、トランスジェニックマウスを産生するために使用され得、それによって、ガンを研究するための動物モデルを提供する。ショウジョウバエにおいて、トランスジーンは、多くの場合、ＤＮＡのクローン化セグメントが、変異によって規定される遺伝子に対応するか否かを決定するために使用される。クローン化ＤＮＡが、実際に目的の遺伝子である場合、次いで、これをトランスジーンとしてハエ変異体内に導入すると、この変異体を正常な表現型の個体に形質転換させる。トランスジェニック植物は、農業において市場的に価値があることがある。例えば、植物学者は、エチレン（果実成熟を促進する）の産生の低下を示すトランスジェニックトマトを開発している。これらのトランスジェニックトマトにおいて、成熟プロセスは遅延され、従って、貯蔵寿命が延びる。最後に、トランスジェニック技術は、ヒト遺伝病の遺伝子治療の成長著しい分野において、重要な要素である。
【００７０】
非相同部位における外因性ＤＮＡのマウスゲノムへの無作為組み込みの頻度は、非常に高い。この現象ゆえに、トランスジェニックマウスの産生は、非常に効率的かつ直接的なプロセスである。
【００７１】
トランスジェニックマウスを作製する一般的なプロセスは、以下である：目的の遺伝子を含む外来ＤＮＡが、マウス受精卵の２つの前核（親に与えられた雄性および雌性の一倍体核）のうちの１つの中に、これらが融合する前に注入される。注入されたこのＤＮＡは、二倍体の接合体の染色体内に無作為に組み込まれる可能性が高い。注入された卵は、次いで、養母（ｆｏｓｔｅｒ  ｍｏｔｈｅｒ）に移され、ここで、正常な細胞成長および分化が起こる。妊娠の約１０〜３０％が、全ての組織（生殖細胞を含む）中に外来ＤＮＡを等量（１細胞あたり２００コピーまで）で含む。これらのマウスの、正常に繁殖した、近親交配（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ）および戻し交配（親−子孫交配）の１０〜２０％は、このトランスジーンについての純粋なトランスジェニック系統ホモ接合体を、産生し得る。
【００７２】
正常な哺乳動物生物学の種々の局面を研究するために、トランスジェニックマウスの使用に関して、多くの研究が確立されている。これらの研究は、疾患プロセスについてさらに調べるためのモデル系を提供する。例えば、ガンの多くの形態は、その誤った調節活性に起因して優性な様式で作用する、正常な細胞性遺伝子によって促進される。これらの遺伝子を保有するトランスジェニックマウス（ｍｙｃと呼ばれる）は、正常に発生するが、高い頻度で腫瘍が形成される。トランスジーンを発現する少数の細胞のみが腫瘍を発生させるという観察は、腫瘍を形成させるためにさらなる遺伝的変化が必要であるモデルを支持する。これらのマウスは、これらの変化を同定するための重要なツールを提供する。
【００７３】
（リボザイムの切断機構）
リボザイムの一般的記載は、Ｆｅｄｏｒ，Ｍ．Ｊ．およびＷｅｓｔｈｏｆ，Ｅ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１０（４）：７０３−７０４（２００２）において見出され、そして種々の型のリボザイムの作用機構は、Ｔａｋａｇｉ，Ｙ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９（９）：１８１５−１８３４（２００１）において考察される。
【００７４】
グループＩイントロンは、介在性配列として最初に同定され、保存配列および二次構造要素に基づいて定義された。グループＩイントロンは、広範に分布しており、１０００近くのグループＩイントロンが、真核生物の核ゲノム、ミドコンドリアゲノムおよび葉緑体ゲノムにおいて、ユーバクテリウムにおいて、ならびにバクテリオファージにおいて、見出されている。グループＩＩイントロンもまた、介在性配列として同定され、保存配列および二次構造要素に基づいて定義された。グループＩＩイントロンもまた、広範に分布しており、約１００のグループＩＩイントロンが、真菌、原生生物および植物における小器官のｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡにおいて、ならびに細菌のｍＲＮＡにおいて、見出されている（Ｂｏｎｅｎ，Ｌ．，およびＶｏｇｅｌ，Ｊ．，ＴＲＥＮＤＳ  Ｇｅｎｅｔ．，１７：３２２（２００１））。
【００７５】
グループＩイントロンは、折りたたまれて活性部位を形成し、自らのＲＮＡスプライシングを媒介する。利用可能な６６のグループＩイントロンの組の間で保存される配列要素は、編集された。比較配列分析は、幾つかの保存された構造的特徴の予測をもたらした。これらの保存された特徴の有意性は、Ｃｅｃｈ，Ｔ．Ｒ．，Ｇｅｎｅ，７３（２）：２５９−２７１において考察される。さらに、グループＩイントロンの自己スプライシング性質に対する概説が、Ｃｅｃｈ，Ｔ．Ｒ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９：５４３−５６８（１９９０）において提供される。
【００７６】
グループＩＩイントロンは、ユーバクテリウムおよびユーバクテリウム由来の小器官ゲノムにおいて見出される。これらは、リボザイム活性を有し、この活性により、自らに隣接するエキソンのスプライシングを指向し、そして触媒する。グループＩＩイントロンのリボザイム構成成分の二次構造および公知の三次相互作用は、Ｍｉｃｈｅｌ，Ｆ．およびＦｅｒａｔ，Ｊ．Ｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４：４３５−４６１（１９９５）において考察される。
【００７７】
グループＩイントロンリボザイムおよびグループＩＩイントロンリボザイムの場合、可能性のある切断機構としては、エステル交換を介する自己切断もしくは自己スプライシング、および加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。このような反応は、単純な酸ベースの反応によって、もしくは求核置換によって、駆動され得る。グループＩＩイントロンは、Ｂｏｎｅｎ，Ｌ．およびＶｏｇｅｌ，Ｊ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．，１７（６）：３２２−３３１において記載される。
【００７８】
ハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイムの両方は、ＧＵＣ配列を含む任意の標的ＲＮＡを切断するように操作され得る。（Ｈａｓｅｌｏｆｆら，Ｎａｔｕｒｅ，３３４，５８５−５９１（１９８８）；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４，５８５（１９８７）；Ｈａｍｐｅｌら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，２９９−３０４（１９９０）；ならびにＳｙｍｏｎｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１，６４１−６７１（１９９２））。総括すると、ハンマーヘッドリボザイムは、２つの型の機能的ドメイン（２つのハイブリダイゼーションドメインによって隣接される保存的触媒ドメイン）を有する。このハイブリダイゼーションドメインは、ＧＵＣ配列の周りの配列に結合し、そして触媒ドメインは、ＲＮＡ標的のＧＵＣ配列に対して３’側を切断する（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７），前記；Ｈａｓｅｌｏｆｆら（１９８８），前記；およびＳｙｍｏｎｓ（１９９２），前記）。
【００７９】
ハンマーヘッドリボザイム自己切断の構造ベースに関するさらなる情報は、Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｂ．，ら，Ｃｅｌｌ，９２（５）：６６５−６７３（１９９８）において見出され得る。ヘアピンリボザイムの構造および機能、ならびにヘアピンリボザイムの触媒機構に関するさらなる情報は、Ｆｅｄｏｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９７（２）：２６９−２９１およびＦｅｄｏｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，３０：１１０９−１１１５（２００２）において見出され得る。
【００８０】
本発明の転写ユニットにおいて使用され得る２つのリボザイムは、タバコ輪点ウイルスのサテライトＲＮＡに由来するハンマーヘッドリボザイム（ｓＴｏｂＲＶ）である。ｓＴｏｂＲＶは、複製の間に自己触媒切断を受ける。（＋）鎖切断および（−）鎖切断に必要とされる配列は、決定されている（Ｈａｓｅｌｏｆｆ，Ｊ．およびＧｅｒｌａｃｈ，Ｗ．Ｌ．，Ｇｅｎｅ，８２：４３−５２（１９８９））。（＋）鎖の切断は、切断のための部位に隣接し、（他のサテライトＲＮＡおよびウイロイドＲＮＡにおいて見出されるドメインと同様の）「ハンマーヘッド」ドメインを形成する配列を必要とする。具体的には、（＋）鎖の切断は、ＧＵＣ配列の後で起こり、５’ヒドロキシル基を含む末端および２’，３’環状ホスホジエステル基を含む末端の産生をもたらす（Ｐｒｏｄｙ，Ｇ．Ａ．，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１：１５７７−１５８０（１９８６））。よく認識される二次構造モチーフが、ｓＴｏｂＲＶ（＋）鎖の切断の根底にあり、そしてこのモチーフは、この高度保存配列を、触媒に直接関与させる可能性が高い。（−）鎖の切断は、切断部位の１２ヌクレオチドの小さな領域、および分子の何処かに配置される５５ヌクレオチドの配列のみを必要とする。ｓＴｏｂＲＶ（−）鎖の切断に関連するＲＮＡ構造は、触媒において同様に役割を果たし、そして他の触媒ＲＮＡにおいて反復していることが見出されている、新規な構造モチーフを含む。
【００８１】
さらに、アラビスモザイクウイルス（ＡｒＭｖ）に関連する３００ヌクレオチドのサテライトＲＮＡの配列もまた、報告されている（Ｋａｐｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５４：３１８−３２５（１９８８））。ＡｒＭＶに関連するサテライトＲＮＡに由来するリボザイムもまた、本発明の転写ユニットにおいて使用され得る。ＡｒＭＶは、ＴｏｂＲＶおよびそのサテライトＲＮＡに関連するネポウイルスである。ｓＡｒＭＶは、ｓＴｏｂＲｖと５０％の配列類似性を共有する。保存配列の存在および可能性のある塩基対が、ｓＡｒＭＶ（＋）鎖切断に関連する可能性のあるドメインを同定するために使用された。切断に関与するドメインの構造およびヌクレオチドは、上述のＫａｐｅｒ，Ｊ．Ｍ．，らによって考察される。保存領域は、ｓＴｏｂＲＶ、ｓＡｒＭＶおよび他のサテライトＲＮＡならびにウイロイドＲＮＡの間に存在する。従って、他のサテライトＲＮＡおよびウイロイドＲＮＡに由来するリボザイムもまた、本発明の転写ユニットにおいて使用され得る。
【００８２】
（切断シグナル）
転写ユニットの非コード領域内に挿入され得る切断シグナルは、例えば、ポリアデニル化シグナル、休止部位、強力休止部位（ｓｔｒｏｎｇ  ｐａｕｓｅ  ｓｉｔｅ）、終止部位、上流近位（ＮＵＥ）、もしくは３’非翻訳配列である。
【００８３】
以下の転写開始ＲＮＡポリメラーゼが、一時的休止部位（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｐａｕｓｅ  ｓｉｔｅ）、休止部位、強力休止部位および終止部位と呼ばれる幾つかの位置で休止し得ることが公知である。この減少は、例えば、Ｌａｎｄｉｃｋ，Ｒ．，Ｃｅｌｌ，８８：７４１−７４４（１９９７），ならびにＲｅｅｄｅｒ，Ｒ．Ｈ．およびＬａｎｇ，Ｗ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２：１１−１５（１９９４）において記載される。
【００８４】
（調節配列およびコード配列）
有用な調節配列は、例えば、ウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）を含み得る。ＬＴＲは、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ、ＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの最初期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系もしくはＴＲＣ系、Ｔ７プロモーター（その発現はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって指向される）、λファージの主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素についてのプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーターなど（例えばＰｈｏ５）、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系のポリヒドロンプロモーター、ならびに、原核生物細胞もしくは真核生物細胞またはそのウイルスの遺伝子発現を制御することが公知である他の配列、ならびにそれらの種々の組み合わせである。適切な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のプロモーター）、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター）が挙げられる。
【００８５】
本発明の構築物（特に、これらの調節配列部分およびコード配列部分）は、その起源のウイルスの配列を含み得る。従って、（シスで作動する）ウイルス調節配列もしくはウイルス調節領域、ならびに（トランスで作動する）コード領域は、本発明の実施において使用され得る。シス作動性領域の例は、レトロウイルスのＴＡＲ因子およびＲＲＥ因子、ＩＮＳ（阻害配列もしくは不安定配列、ＣＲＳとも呼ばれる）因子であり、トランス作動性コード領域の例は、ｔａｔコード配列およびｒｅｖコード配列である。
【００８６】
例えば、目的のウイルス核酸に対して異種であるＲＲＥが、本発明のベクターにおいて使用され得る。適切なＲＲＥの例としては、ＨＩＶ−１由来核酸についてのＨＩＶ−２  ＲＲＥ、ＣＴＥ（マソン−ファイザーサルウイルスおよび他のレトロウイルスに由来する構成的輸送因子のような構成的輸送因子）、またはＰＲＥ（マーモット肝炎ウイルス由来の転写後調節因子のような転写後調節因子）が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＲＥは、翻訳のための核から細胞質へのＲＮＡの輸送を制御するＲＮＡ配列である。
【００８７】
宿主細胞における増殖および発現のために適切なベクターおよびプロモーターの選択は、周知の手順である。そしてベクター構築、ベクターの宿主内への導入、および宿主における増殖および発現のために必須の技術は、当業者にとって慣用的である。上で言及されない多くのプロモーターおよび他の制御配列が、本発明のこの局面における使用のために適し、周知であり、そして容易に使用され得ることが、当業者によって理解される。
【００８８】
（ベクター）
本発明において使用され得るベクターが、以下に記載される。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、それが結合されている別の核酸を輸送可能な核酸分子をいう。ベクターの１つの型は、エピソームであり、すなわち、付加的染色体複製が可能な核酸である。他のベクターは、自己複製可能であり、かつ、それが結合する核酸の発現が可能である。自らが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向することが可能なベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、発現ベクターの組換えＤＮＡ技術における有用性は、多くの場合、「プラスミド」（このベクター形態では染色体に結合しない、環状２本鎖ＤＮＡをいう）の形態である。本明細書中で、「プラスミド」および「ベクター」は、相互交換可能に使用される。さらに、本発明は、等価な機能に寄与しかつこの点に関して今後当該分野で公知になるベクターの他の形態を含むことを意図される。
【００８９】
ベクターは、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現のために使用され得る。一般に、このようなベクターは、宿主における発現のために効果的であるシス作動性制御領域を含み、この領域は、発現されるポリヌクレオチドに作動可能に連結される。適切なトランス作動性因子は、宿主によって供給されるか、補完性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）ベクターによって供給されるか、または、宿主内への導入の際にベクター自身によって供給される。
【００９０】
広範な種々のベクターが、本発明において使用され得る。このようなベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベクター、ウイルス由来のベクター、細菌プラスミドに由来するベクター、バクテリオファージに由来するベクター、酵母エピソームに由来するベクター、酵母染色体因子に由来するベクター、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、プソイド狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス）に由来するベクター、ならびにこれらの組み合わせに由来するベクター（例えば、プラスミド遺伝因子およびバクテリオファージ遺伝因子に由来するベクター、例えばコスミドおよびファージミド）が挙げられる。一般に、ポリヌクレオチドを宿主細胞において維持するか、増殖させるかもしくは発現するために適する任意のベクターが、使用され得る。
【００９１】
以下のベクターは、市販されており、例として提供される。ベクターの中で、細菌における使用のためのベクターは、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）である。利用可能な真核細胞ベクターは、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴｌ、およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）である。これらのベクターは、単に多くの市販されかつ周知であるベクター（本発明に従う使用のために当業者に利用可能である）の例示のために列挙される。例えば、宿主において、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの導入、維持、増殖、および／または発現のために適する任意の他のプラスミドもしくはベクターが、本発明の局面において使用され得る。
【００９２】
適切なＤＮＡ配列が、周知かつ慣用的な技術のうちの任意の技術によってベクター内に挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は、１以上の制限エンドヌクレアーゼによってＤＮＡ配列およびベクターを切断すること、次いで、ＤＮＡリガーゼを使用してこの制限フラグメントを結合することによって、ベクター内に統合される。使用され得る制限およびライゲーションのための手順は、当業者に周知かつ慣用的である。この点で適切な、および代替の技術を使用してベクターを構築するために適切な、やはり当業者に周知でありそして慣用的である手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（本明細書中他所で記載）において詳細に示される。
【００９３】
この配列は、ベクター中で適切な発現調節配列（例えば、ｍＲＮＡ転写を指向するプロモーターが挙げられる）に作動可能に連結される。
【００９４】
ベクターの選択および／設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現を所望されるタンパク質の型のような要因に依存し得ることが、理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、このコピー数を制御する能力、およびこのベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現もまた、考慮され得る。発現ベクターは、細胞をトランスフェクトし、それによって調節配列を複製して、タンパク質もしくはペプチド（本明細書中に記載の核酸によってコードされるタンパク質もしくはペプチドを含む）を産生するために使用され得る。
【００９５】
（細胞の遺伝子操作）
本発明の転写ユニットは、ベクター中に組み込まれそして／または細胞（例えば、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、霊長類細胞もしくはヒト細胞）内に導入され得る。本発明の構築物は、細胞ゲノム内に組み込まれ得るか、またはエピソーム構築物として維持され得る。本発明の構築物は、任意の順序で細胞内に導入され得る。導入の後、上記細胞中の構築物の存在は、この構築物をこの構築物中に配置された選択マーカーもしくは検出可能マーカーを介して検出することによって、確認され得る。
【００９６】
宿主細胞は、ポリヌクレオチドを組み込むように遺伝子操作され、そして本発明のポリペプチドを発現し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、感染、形質導入、トランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクションおよびリン酸カルシウム沈殿）、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、および形質転換の、周知の技術を使用して宿主細胞内に導入され得る。このポリペプチドは、単独で導入されてもよく、もしくは他のポリヌクレオチドと共に導入されてもよい。このような他のポリヌクレオチドは、独立して導入されても、同時導入されても、もしくは本発明のポリヌクレオチドと結合して導入されてもよい。
【００９７】
従って、例えば、本発明のポリペプチドは、選択可能マーカーをコードする別の別個のポリヌクレオチドと共に、同時トランスフェクションおよび例えば哺乳動物細胞における選択のための標準的技術を用いて、宿主細胞内にトランスフェクトされ得る。この場合、このポリヌクレオチドは、遺伝的に安定に宿主細胞ゲノム内に組み込まれる。
【００９８】
さらに、このポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択可能マーカーを含むベクターに結合され得る。このベクター構築物は、上述の技術によって宿主細胞内に導入され得る。一般に、プラスミドベクターは、沈殿（例えば、リン酸カルシウム沈殿）中のＤＮＡとして導入されるか、または荷電した脂質との複合体において導入される。エレクトロポレーションもまた、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するために使用され得る。ベクターがウイルスである場合、このベクターは、インビトロでパッケージングされ得るか、もしくはパッケージング細胞内に導入され得、そしてパッケージングされたウイルスは、細胞内に形質導入され得る。本発明の局面にしたがって、ポリヌクレオチドを作製するための広範な種々の技術、およびポリヌクレオチドを細胞内に導入するための広範な種々の技術が、当業者に周知であり、慣用的である。このような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（これらの技術を詳述する多くの研究室マニュアルの例である）において詳細に概説される。さらに、このベクターは、例えば、プラスミドベクター、一本鎖ファージベクター、二本鎖ファージベクター、一本鎖ＲＮＡウイルスベクター、二本鎖ＲＮＡウイルスベクター、一本鎖ＤＮＡウイルスベクターもしくは二本鎖ＤＮＡウイルスベクターであってもよい。このようなベクターは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）として、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞内に導入するための周知の技術により、細胞内に導入され得る。このベクターは、ファージベクターおよびウイルスベクターの場合、パッケージングされたウイルスもしくはカプセル化されたウイルスとして、感染およびトランスフェクションについての周知の技術によって、細胞内に導入され得る。ウイルスベクターは、複製コンピテントであっても、複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、補完性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）宿主細胞においてのみ起こる。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、「トランスフェクション」は、核酸（例えば、発現ベクター）の、レシピエント細胞への、核酸によって媒介される遺伝子移動による導入を意味する。「形質転換」は、本明細書中で使用される場合、外因性ＤＮＡもしくは外因性ＲＮＡの細胞性取り込みの結果として、細胞の遺伝子型が変化されるプロセスをいう。例えば、形質転換された細胞は、ポリペプチドの組換え形態を発現するか、または導入された遺伝子からアンチセンス発現が起こる場合、天然に存在する形態のタンパク質の発現が破壊される。
【０１００】
トランスフェクションは、一時的トランスフェクションもしくは安定的トランスフェクションのどちらであってもよい。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによって媒介されるトランスフェクション、カチオン性脂質によって媒介されるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染もしくは他の方法によって達成され得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアル（例えば、Ｄａｖｉｓ，ら，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））において記載される。
【０１０１】
（細胞もしくは宿主）
本明細書中で使用される場合、「細胞」もしくは「宿主」は、本発明の核酸構築物もしくは発現系が導入されそして発現される、対応する生存している生物をいう。「細胞」は、任意の細胞であり得、好ましくは、真核生物細胞である。この細胞は、細胞株の細胞であっても、または新規に単離された一次細胞であってもよく、そして本発明の核酸構築物の導入によって形質転換されても、または本発明の核酸構築物の導入と組み合わせて形質転換されてもよい。細胞株もしくは細胞培養物は、インビトロ培養を介して維持される細胞をいい、このインビトロ培養は、この細胞株もしくは細胞培養物が由来する親細胞と同一でない細胞のインビトロ培養であってもよい。細胞の非限定の例としては、真核生物細胞株、例えば、ＨｅＬａ、２９３、ＨＴ−１０８０、ＣＶ−１、ＴＥ６７１もしくは他のヒト細胞；Ｖｅｒｏ細胞；またはＤ１７細胞が、挙げられる。他の細胞としては、リンパ球（例えば、Ｔ細胞もしくはＢ細胞）、またはマクロファージ（例えば、単球マクロファージ）が挙げられ、あるいは、これらの細胞のいずれかの前駆体（例えば、造血幹細胞）である。本発明の実施のためのさらなる細胞としては、星状細胞、皮膚線維芽細胞、腸上皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、単球、ニューロン細胞（例えば、脳および目であるが、これらに限定されない）、肝細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、精子もしくは卵子を産生する細胞、間質細胞、粘膜細胞などが挙げられる。好ましくは、宿主細胞は、真核生物種、多細胞種（例えば、単細胞酵母細胞と対照的である）であり、そしてなおより好ましくは、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。
【０１０２】
細胞は、１つの存在であっても、または細胞の大きな収集物の一部であってもよい。このような「細胞の大きな収集物」は、例えば、細胞培養物（混合もしくは純粋）、組織（例えば、内皮組織、上皮組織、粘膜組織もしくは上述のＣＤ４欠損細胞を含む組織を含む他の組織）、器官（例えば、心臓、肺、肝臓、筋肉、胆嚢、膀胱、生殖腺、目および他の器官）、器官系（例えば、循環器系、呼吸器系、胃腸系、泌尿器系、神経系、外皮系もしくは他の器官系）、あるいは生物（例えば、鳥類、哺乳類など）を含む。好ましくは、器官／組織／細胞は、循環器系（例えば、心臓、血管ならびに白血球および赤血球を含む血液が挙げられるが、これらに限定されない）、呼吸器系（例えば、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、肺など）胃腸系（例えば、口、咽頭、食道、胃、腸、唾液腺、膵臓、肝臓、胆嚢などが挙げられる）、泌尿器系（例えば、腎臓、尿管、膀胱、尿道など）、神経系（例えば、脳および脊髄、ならびに目のような特殊感覚器官が挙げられるが、これらに限定されない）、ならびに外皮系（例えば、皮膚、上皮および皮下組織もしくは皮膚組織の細胞）の、器官／組織／細胞である。なおより好ましくは、細胞は、以下からなる群より選択される：心臓、血管、肺、肝臓、胆嚢、膀胱、および目の細胞。細胞は、正常細胞である必要はなく、疾患細胞であってもよい。このような疾患細胞は、腫瘍細胞、感染細胞、遺伝的に異常な細胞、または異常な組織の近位にあるかまたは異常な組織と接触している細胞（例えば、腫瘍血管上皮細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
（ウイルス）
「ウイルス」は、タンパク質および核酸からなる感染性因子であり、ウイルス核酸によって特異的にされたウイルス産物を産生するために、宿主細胞の遺伝子機構を使用する。本発明は、ウイルスコーディング配列の発現のような局面を含み、これは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に適用され得る。ＲＮＡウイルスは、原核生物に感染する群（例えば、バクテリオファージ）、ならびに多くの真核生物（哺乳動物、特にヒトを含む）に感染する群に分かれる。ほとんどのＲＮＡは、その遺伝子機構として一本鎖ＲＮＡを有するが、少なくとも１つのファミリーは、遺伝子機構として二本鎖ＲＮＡを有する。ＲＮＡウイルスは、３つの主な群に分かれる：ポジティブ鎖ウイルス、ネガティブ鎖ウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス。本発明に関連するＲＮＡウイルスとしては、シンドビス様ウイルス（例えば、トガウイルス科、ブロモウイルス属、ククモウイルス属、トバモウイルス属、イラルウイルス属、トブラウイルス属およびポテックスウイルス属）、ピコルナウイルス様ウイルス（例えば、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、コモウイルス属、ネポウイルス属、ポティウイルス属）、マイナス鎖ウイルス（例えば、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、およびアレナウイルス科）、二本鎖ウイルス（例えば、レオウイルス科およびビルナウイルス科）、フラビウイルス様ウイルス（例えば、フラビウイルス科およびペスチウイルス属）、レトロウイルス様ウイルス（例えば、レトロウイルス科）、コロナウイルス科、ならびに他のウイルス群（ノダウイルス属が挙げられるが、これに限定されない）が、挙げられる。本発明は、好ましくは、フラビノウイルス科のＲＮＡウイルスに適用され、より好ましくは、フィロウイルス属のウイルスに適用され、特に、マルブルクウイルスおよびエボラウイルスに適用される。フラビノウイルス科のウイルスは、フラビウイルス属のウイルス（たとえば、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、Ｒｏｃｉｏウイルス、ダニによって媒介されるウイルスなど）である。本発明は、好ましくは、ピコナウイルス科のウイルスに適用され、好ましくは、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＢＣ）、または非Ａもしくは非Ｂ型ウイルスに適用される。
【０１０４】
本発明に適用され得る別の好ましいＲＮＡウイルスは、レトロウイルス科（すなわち、レトロウイルス）のウイルスであり、特に、オンコウイルス亜科、スプマウイルス亜科、スプマウイルス属、レンチウイルス亜科、およびレンチウイルス属である。オンコウイルス亜科のＲＮＡウイルスは、望ましくは、１型ヒトＴリンパ指向性ウイルスもしくは２型ヒトＴリンパ指向性ウイルス（すなわち、ＨＴＬＶ−１もしくはＨＴＬＶ−２）、またはウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、鳥類白血病−肉腫ウイルス（すなわち、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、鳥類骨髄芽球症（ＡＭＶ）、鳥類赤芽球症（ＡＥＶ）、およびラウス関連ウイルス（ＲＡＶ；ＲＡＶ−０〜ＲＡＶ−５）、哺乳動物Ｃ型ウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭＳＶ）、エーベルソンマウス白血病ウイルス、（Ａ−ＭｕＬＶ）、ＡＫＲ−ＭｕＬＶ、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、サル肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ））、Ｂ型ウイルス（例えば、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ））、およびＤ型ウイルス（例えば、マソン−ファイザーウイルス（ＭＰＭＶ）および「ＳＡＩＤＳ」ウイルス類）である。レンチウイルス亜科のＲＮＡウイルスは、望ましくは、１型ヒト免疫不全ウイルスもしくは２型ヒト免疫不全ウイルス（すなわち、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２、ここで、ＨＩＶ−１は、以前にはリンパ節症関連ウイルス３（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連ウイルス（ＡＲＶ）と呼ばれた）、または、同定され、そしてＡＩＤＳもしくはＡＩＤＳ様疾患に関連付けられている、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２に関連する別のウイルスである。「ＨＩＶ」の頭文字もしくは「ヒト免疫不全ウイルス」は、本明細書中でＨＩＶウイルス類、ならびにＨＩＶ関連（ｒｅｌａｔｅｄ）ウイルス類およびＨＩＶ関連（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウイルス類を言及するために、総称的に使用される。さらに、レンチウイルス亜科のＲＮＡウイルスは、好ましくは、ビスナウイルス／マエディウイルス（例えば、ヒツジに感染する）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）である。本発明はまた、ＤＮＡウイルスにも適用され得る。好ましくは、ＤＮＡウイルスは、ヘルペスウイルス（例えば、エプスタイン−バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス）、アデノウイルス、パピローマウイルス、ワクシニアウイルスなどである。
【０１０５】
（３’）
用語「３’」（スリープライム）は、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの別の別の領域もしくは位置からの、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの３’（下流）の領域もしくは位置を総称する。
【０１０６】
（５’）
用語「５’」（ファイブプライム）は、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの別の別の領域もしくは位置からの、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの５’（上流）の領域もしくは位置を総称する。
【０１０７】
他に規定されない限り、全ての技術用語および科学用語は、本明細書中で、本発明の属する分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。
【０１０８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、対応する複数の言及を含む。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその派生語は、その包括的な意味において使用される；すなわち、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその派生語と等価である。
【０１１０】
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の技術範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えの従来技術を使用する。このような技術は、文献において完全に説明される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許第４，６８３，１９５号：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ，Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４号および第１５５号（Ｗｕら編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，編，１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）。
【０１１１】
以下の実施例は、当業者に完全な開示を提供し、本発明の実施方法および使用方法の説明を提供するために示され、本発明者らが考える本発明の範囲を限定することを意図されることはなく、また、以下の実施例が実施した実験の全てでありかつ実施した実験のみであることを表すように、本発明が意図されることもない。使用された数（例えば、量、温度など）に関して正確を期す努力がなされているが、ある程度の実験的な誤差および偏差は当然に存在する。他に示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度はセルシウス度であり、そして圧力は大気圧もしくは大気圧付近の圧力である。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
（パッケージングベクター構築物ＶＲＸ５７７におけるシス作動性リボザイムの構造）
パッケージングベクター構築物ＶＩＲＰＡＣ（ＶＲＸ１７０としても公知である）中に、２つの転写ユニットが存在する。１つは、ＨＩＶ−１のＧａｇＰｏｌおよびＴａｔＲｅｖを、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で発現し、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ポリＡ）シグナルの末端で終結する。他の転写ユニットは、ＶＳＶ−Ｇをコードし、これは、延長因子（ＥＦ）プロモーターによって駆動され、そしてＳＶ４０ポリＡ部位の末端で終結する。プラスミドの環状の性質に起因して、どちらかの転写ユニットは、ポリＡ部位を読み飛ばし、より長いポリシストロン性メッセンジャーＲＮＡを生じる可能性が高く、これは、逆転写の間のＲＮＡベースの組換え事象を通して、複製コンピテントなレンチウイルス（ＲＣＬ）の産生のための潜在的な基質として寄与し得る。読み飛ばしを防止するため、タバコ輪点ウイルスのサテライトＲＮＡのシスリボザイム（ｓＴｏｂＲＶ）（ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，１９８９）を含むフラグメント（シス−Ｒｚ）を、対応するポリＡ部位のすぐ下流のこれらの２つの転写ユニットの間に挿入した（図１）。転写読み飛ばしの事象においてのみ、リボザイムが作製され、次いで、リボザイムは、自らを図１の黒矢印で示した部分で切断可能であった。
【０１１３】
（実施例２）
（シス−Ｒｚのインビトロ活性）
転写停止因子を含むＶＲＸ１７０（−シス−ＲＺ）およびＶＲＸ５７７（＋シス−Ｒｚ）の１３００塩基の領域を、Ｔ７プロモーターを含むプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。次いで、得られたＤＮＡを、インビトロで転写した。２μｌの転写したＲＮＡ（約１μｇ／μｌの濃度）を、２μｌのＲＴ−ＰＣＲ緩衝液に加え、次いで、２μｌ（２μｇ）を、可視化のためにゲル上にロードした（図２）。切断は迅速に起こり、緩衝液中でのゲルローディングの前の５分間、１０分間、２０分間および６０分間のインキュベーションの間で、相違は観察されなかった。このデータは、シス−Ｒｚが非常に効率的に読み飛ばし転写物を阻害することを示す。
【０１１４】
（実施例３）
（パッケージングベクターとしてＶＲＸ５７７を用いた細胞の産生における、転写読み飛ばしの喪失）
転写読み飛ばしを、ウイルスベクターとシス−Ｒｚを含むヘルパー構築物（ＶＲＸ５７７）およびシス−Ｒｚを含まないヘルパー構築物（ＶＲＸ１７０）とで同時トランスフェクトした２９３Ｆ細胞において試験した。細胞性ＲＮＡを単離し、そしてＲＮＡ転写物を、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。転写物が１００％検出され得る時間におけるアッセイ感度は、１μｇの細胞性ＤＮＡあたり５０コピーの転写産物（１μｇの全細胞性ＲＮＡあたり１６７コピーと同等）である。転写読み飛ばしの検出についての実験設計のまとめに加え、ＰＣＲプライマー設計の概要を、図３に示す。ＶＲＸ１７０からインビトロ転写されたＲＮＡを、ポジティブコントロールおよび標準として使用した。転写ポリＡと休止部位とを結合させるために必須である細胞性因子が反応物中に存在しないので、ＶＲＸ１７０を用いたインビトロ転写の間の読み飛ばしを予測した。アッセイの検出の限界を統計的に決定するために、既知の量のポジティブコントロールＲＮＡを、３倍連続希釈系列で希釈し（図４）、そして実験を１３回繰り返して、感度の統計学的決定のために十分なデータ点を達成した。これらの結果に従い、９回の複製（または９μｇのＲＮＡ）中にポジティブな事象がない場合、１回の複製（または１μｇのＲＮＡ）あたり２３．１２コピー未満の読み飛ばしＲＮＡ転写産物しか存在せず、９５％を超える信頼限界である。
【０１１５】
上述のアッセイ感度において、読み飛ばし転写産物を、ヘルパー構築物としてＶＲＸ１７０を用いた２９３Ｆ細胞中で検出したが、ヘルパー構築物としてＶＲＸ５７７を用いた場合は検出しなかった（図５）。ベクターおよびＶＲＸ５７７で同時トランスフェクトした細胞からの細胞性ＲＮＡについて実施されたその後９回のアッセイにおいて読み飛ばしは存在しなかった。このことは、１μｇの細胞性ＲＮＡ中に２３．１２コピー未満の読み飛ばししか存在しないことを意味する（図６）。ＶＲＸ１７０とＶＲＸ５７７との間の相違はシス作動性リボザイムの付加のみであるので（図１を参照されたい）、リボザイムは、単独で読み飛ばし転写産物の防止を担うことが結論され得る。従って、シス作動性リボザイムの付加は、非常に有効な転写分離因子である。
【０１１６】
（実施例４）
（シス−Ｒｚの付加は、ヘルパー構築物のパッケージング機能に影響しない）
シス−Ｒｚの使用は、パッケージングの間、決して最終的ウイルスベクター産物に影響しない。何故なら、リボザイムは、ウイルスベクター中に配置されず、このヘルパー（ＶＲＸ５７７）におけるコード配列中に配置されないからである。これを実証するために、ＶＲＸ１７０またはＶＲＸ５７７のどちらかの存在下でパッケージングされたベクターの得られた力価を、比較した。簡潔にいうと、２９３Ｆ細胞を、ベクターおよびヘルパー構築物で同時トランスフェクトし、そして得られたベクター産物を、ｈｅｌａ−ｔａｔ細胞を形質導入するために使用した。ＤＮＡを、これらの細胞から単離し、そしてベクターコピー数（形質導入単位（ＴＵ））について、このベクター配列のＰＣＲ増幅によってアッセイした。ベクターパッケージングの効力の間に、相違は観察されなかった。このデータは、２つのヘルパー（ＶＲＸ５７７およびＶＲＸ１７０）の間の力価比較を表す、ＶＲＸ５７７を用いる場合に力価の再現性がより高い傾向を有する、少なくとも３回の実験の代表例である（図７）。
【０１１７】
本明細書中で引用した全ての参考文献（特許、特許出願および刊行物を含む）は、本明細書により、以前に具体的に援用されたか否かにかかわらず、その全体が参考として援用される。
【０１１８】
上記記載の引用は、上記が適切な先行技術であることを承認することを意図されない。これらの文書の日付に関する記載もしくは内容に関する表記は、この出願に利用可能である情報に基づいており、これらの文書の日付もしくは内容の正確さについてなんらの承認も構成しない。
【０１１９】
ここで、本発明を完全に説明したが、当業者は、広範な範囲のパラメーター、濃度および条件の範囲内で、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、かつ、過度の実験を要さずに、実施可能であることが理解される。
【０１２０】
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されているが、さらなる改変が可能であることが、理解される。この出願は、本発明に従う全てのバリエーション、使用もしくは適応を網羅することを意図し、一般に、本発明の原則および本開示からのこのような逸脱を包含することは、本発明が属する分野の公知かつ慣習的な実施の範囲内にあり、そして本明細書中で上記された本質的な特徴に適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】２つのＨＩＶベースのベクター（１つ（ｐＶＲＸ５７７）はタバコ輪点ウイルスのサテライトＲＮＡ由来のリボザイムを含み、そして１つ（ｐＶＲＸ１７０）はこれを含まない）についてのパッケージングプラスミドの概略図。挿入されたリボザイムの配列は、プラスミドの下に拡大される。そして、黒矢印は、切断部位を示す。プラスミド中で、このリボザイムの前に、ポリＡおよび転写休止部位が存在する。このような部位を入れることは、リボザイムの活性に必須ではない。
【図２】（Ａ）シス作動性リボザイムを含むウイルスパッケージングプラスミド（ＶＩＲＰＡＣ）ＲＮＡの読み飛ばしの図解およびリボザイム機能の検証。ネイティブのシス作動性リボザイムを有さないＶＩＲＰＡＣ（−シス−ＲＺ）の１３００塩基の領域（図２Ａの上）およびシス作動性リボザイムを有するＶＩＲＰＡＣ（＋シス−Ｒｚ）（図２Ａ下）を、Ｔ７プロモーターを含むプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。次いで、得られたＤＮＡを、インビトロで転写した。（Ｂ）約１μｇ／μｌの濃度における２μｌの転写されたＲＮＡに、２μｌのＲＴ−ＰＣＲ緩衝液を加え、次いで、２μｌ（２μｇ）を、検証のためにゲル上にローディングした。切断は迅速に起こり、緩衝液中でのゲルローディングの前の５分間、１０分間、２０分間および６０分間のインキュベーションの間で、相違は観察されなかった（データは示さず）。
【図３】シス作動性リボザイム、および転写読み飛ばしの検出のためのＰＣＲプライマーＡ、ＰＣＲプライマーＢ、およびＰＣＲプライマーＤの位置を含む、ヘルパー領域の図解。下に、アッセイ感度の決定のためのプロトコールを図示する図解を示す。レンチウイルスベクターの製造についてのプロセスもまた、示される。
【図４】ポジティブコントロールであるスパイク（ｓｐｉｋｅ）希釈系列から得られる逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ産物の可視化。細胞性のＲＮＡもしくはＤＮＡ  １μｇあたり、または１細胞あたりのスパイクしたＲＮＡコントロールの濃度は、各レーンの上に示される。
【図５】ヘルパー構築物における転写読み飛ばしの検出のためのＲＴ−ＰＣＲアッセイ。プライマー対Ａ／Ｂは、読み飛ばしなしでプラスミドＲＮＡを検出し、そしてプライマー対Ａ／Ｄは、読み飛ばしの事象においてのみ血漿ＲＮＡを検出する（図３における図解を参照）。このアッセイの感度は、細胞性ＲＮＡ  １μｇあたり４５コピーであり、そしてＶＲＸ１７０からインビトロ転写されたＲＮＡを、ポジティブコントロールおよび標準として使用した。コントロールＲＮＡの４５のスパイクされたコピーを反応物に添加した場合、１３回のアッセイの１００％において、メッセージが検出された。１５のスパイクされたコピーは、１３回のうち８回で検出され、そして１回の実験において、５コピーのスパイクが検出された。
【図６】シス作動性リボザイムを含むヘルパー構築物（ＶＲＸ５７７）におけるＲＴ−ＰＣＲによる転写読み飛ばしの検出なし。この実験を、図５において上で示した通りに正確に実施した。各実験は、２９３Ｆ細胞のＶＲＸ５７７およびＶＲＸ４９６による、独立したトランスフェクションを示す。各反応を、３連で実施した（ａ、ｂ、ｃ）。反応の感度は、細胞性ＲＮＡ１μｇあたり４５コピーであった。
【図７】シス作動性リボザイムの組み込みは、産生されるベクターの力価に影響しない。転写ユニットを分離するためにシス作動性リボザイムを含むヘルパープラスミド（ＶＲＸ５７７）およびシス作動性リボザイムを含まないヘルパープラスミド（ＶＲＸ１７０）を、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター（ＶＲＸ４９６）を、２９３Ｆ細胞におけるベクタープラスミドとヘルパープラスミドとの同時トランスフェクションによって産生するために、３連で使用した。２〜３日後、ベクターを含む上清を収集し、そしてＨｅＬａ−ｔａｔ細胞において滴定した。コントロールとして、細胞を、ベクターのみでトランスフェクトした。力価を、培地１ｍｌあたりの導入単位（ＴＵ）として左側に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年1月24日(2007.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007537756000001.app
【国際調査報告】
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