(57)【要約】【解決手段】  第１結合要素と第２結合要素との間の結合の１つ以上の動態パラメータを決定する方法。この方法は、第１結合要素を複数のマイクロスポットにおいて表面に吸収させることを具備する。次に、第２結合要素が、マイクロスポットのそれぞれにおける第１結合要素に付与される。複数のマイクロスポットの中で、第１結合要素の表面度と第２結合要素の濃度との組み合わせには複数ある。次に、第１のマイクロスポット間の結合反応を示すデータが取得され、第１および第２結合要素間の結合の１つ以上の動態パラメータを取得できるように解析される。本発明は、また、この方法を実行するためのシステムを提供する。分子種を表面上のマイクロスポットにおいて局地化する方法、この方法によって形成されるプローブアレイも提供される。【選択図】      図１Ａ
2007510923.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１結合要素と第２結合要素との結合の１つ以上の動態パラメータを決定するための方法であって、
（ａ）前記第１結合要素を複数のマイクロスポットにおいて表面に吸収させること
（ｂ）前記マイクロスポットのそれぞれにおける前記第１結合要素に前記第２結合要素を付与すること、ここで複数のマイクロスポットの中で前記第１結合要素の表面密度と前記第２結合要素の密度の組み合わせには複数ある
（ｃ）前記複数のマイクロスポットのそれぞれにおける前記第１および第２結合要素間の結合反応を示すデータをバイオセンサ検出法によって取得すること
（ｄ）前記第１および第２結合要素間の結合の１つ以上の動態パラメータを取得できるように前記データを処理すること
を具備する。
【請求項２】
前記バイオセンサ検出法が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、臨界角度屈折率測定、全反射蛍光、全反射燐光、全反射光散乱、エバネセント波エリプソメトリ、ブルースター角反射率測定から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記検出法がＳＰＲであって、
前記複数のマイクロスポットのそれぞれにおける第１および第２結合要素間の結合反応を示す前記データが、ＳＰＲ共鳴角度、共鳴波長、反射率変化、位相変化から選択されたＳＰＲパラメータである、
請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の動態パラメータが、結合定数Ｋａ、解離定数Ｋｄ、親和性定数から選択される、請求項１、または２、または３の方法。
【請求項５】
前記第１結合要素をマイクロスポットにおいて吸収させることが、
（ａ）前記マイクロスポットにおいて前記表面を活性化すること
（ｂ）前記第１結合要素を前記マイクロスポットに吸収させること
（ｃ）前記マイクロスポットを非活性化すること
を具備する、請求項１乃至４のいずれか１項の方法。
【請求項６】
前記マイクロスポットを活性化させる工程が、化学的活性化物質を前記マイクロスポットに付与することを含む、請求項５の方法。
【請求項７】
前記化学的活性化物質を付与することが、
（ａ）前記マイクロスポットを含んだ領域の周囲に第１チャネルを形成すること
（ｂ）前記活性化物質を含んだ溶液を前記チャネル内に導入すること
（ｃ）余剰の活性化溶液を前記チャネルから除去すること
を具備する、請求項６の方法。
【請求項８】
前記分子種を前記マイクロスポットに吸収させる工程が、
（ａ）前記マイクロスポットを含んだ領域の周囲にチャネルを形成すること
（ｂ）前記分子種を含んだ溶液を前記チャネル内に導入すること
（ｃ）余剰の溶液を前記チャネルから除去すること
を含む、請求項５乃至７の方法。
【請求項９】
前記マイクロスポットを活性化する工程が、前記マイクロスポットの上方で電界を発生することを含む、請求項５の方法。
【請求項１０】
前記分子種が第１結合要素であって、
前記方法が、
（ａ）前記表面のマイクロスポットに含まれていない部分を非活性化すること
（ｂ）１つ以上の前記第１チャネルに垂直な１つ以上の第２チャネルを形成すること
（ｃ）各第２チャネルについて、第２結合要素を前記第２チャネル内に導入すること
をさらに具備する、請求項５、６、７の方法。
【請求項１１】
前記表面のマイクロスポットに含まれていない領域から参照データを取得することをさらに具備する、先行する請求項のいずれか１項の方法。
【請求項１２】
表面上の２つ以上のマイクロスポットのそれぞれにおいて、１つ以上の局地化領域のそれぞれについて分子種を局地化する方法であって、
（ａ）前記表面の局地化領域を活性化すること
（ｂ）前記局地化領域における１つ以上のマイクロスポットのそれぞれについて、分子種を前記マイクロスポットに吸収させること
（ｃ）前記局地化領域を随意的に非活性にすること
を具備する方法。
【請求項１３】
前記表面を活性化する工程が、
（ａ）前記局地化領域の周囲に第１チャネルを形成すること
（ｂ）活性化物質を含んだ溶液を前記チャネル内に導入すること
（ｃ）余剰の活性化溶液を前記チャネルから除去すること
を含む、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記マイクロスポットを活性化する工程が、前記マイクロスポットの上方に電界を発生することを含む、請求項１２の方法。
【請求項１５】
分子種を前記マイクロスポットに吸収させる工程が、
（ａ）前記局地化領域に垂直なチャネルを形成すること
（ｂ）前記分子種を含んだ溶液を前記チャネル内に導入すること
（ｃ）余剰な溶液を前記チャネルから除去すること
を含む、請求項１２の方法。
【請求項１６】
前記分子種が第１結合要素であり、
前記方法が、
（ａ）前記表面の局地化領域に含まれていない部分を非活性化すること
（ｂ）１つ以上の前記第１チャネルに垂直な１つ以上の第２チャネルを形成すること
（ｃ）第２チャネルのそれぞれについて、第２結合要素を前記第２チャネル内に導入すること
をさらに具備する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
請求項１２乃至１６のいずれか１項の方法によって形成されたプローブアレイ。
【請求項１８】
１つ以上のプローブ種と１つ以上のターゲット種間の複数の結合反応を同時に観察するシステムであって、
（ａ）表面と、
（ｂ）前記プローブ種がマイクロスポットに吸収されるように前記マイクロスポットにプローブ種を施し且つ前記表面に吸収された各プローブ種に対してターゲットを付与することが可能なアプリケータと、
（ｃ）前記表面からの反射光を受け取り且つ前記ターゲットの前記プローブへの前記結合を示す信号を生成する感光面と、
（ｄ）前記感光面によって生成された前記信号を受け取り且つ前記結合の動態解析を生成できるように前記信号を解析するよう構成されたプロセッサと、
を具備する。
【請求項１９】
前記信号が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、臨界角度反射率測定、全反射蛍光、全反射燐光、全反射光散乱、エバネセント波エリプソメトリ、ブルースター角反射率測定から選択される、請求項１８のシステム。
【請求項２０】
前記検出方法がＳＰＲであって、
前記複数のマイクロスポットのそれぞれにおける前記第１および第２結合要素間の結合反応を示す前記データが、ＳＰＲ共鳴角度、共鳴波長、反射率変化、位相変化から選択されたＳＰＲパラメータである、
請求項１９のシステム。
【請求項２１】
前記動態解析が、結合定数Ｋａ、解離定数Ｋｄ、親和性定数から選択された１つ以上の動態パラメータを取得することを具備する、請求項１８、または１９、または２０のシステム。
【請求項２２】
活性化可能領域が、前記領域の上方に電界を生成することによって活性化される、請求項１８乃至２２のいずれか１項のシステム。
【請求項２３】
活性化可能領域が、前記活性化可能領域に化学的活性剤を施すことによって活性化される、請求項１８乃至２２のいずれか１項のシステム。
【請求項２４】
プローブ種が前記表面に少なくとも２つの異なる濃度で吸収され且つターゲット種が前記プローブに少なくとも２つの異なる濃度で付与されるように適合された請求項１８乃至２２のいずれか１項のシステム。
【請求項２５】
前記プロセッサが、前記プローブの前記ターゲットへの結合の動態を示すパラメータを決定できるように前記信号を解析するよう構成されている、請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記プローブのターゲットへの結合の動態を示すパラメータが、結合定数または解離定数または親和性定数またはあらゆる他の定数または値である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
複数のマイクロチャネルを具備し、且つマイクロチャネル内を流れる流体が前記表面のある領域と接触して流れるように前記表面上に配置可能なフローセルを有する、請求項１７乃至２５のいずれか１項のシステム。
【請求項２８】
前記フローセルが、第１位置および第２位置に配置可能であって、
前記フローセルが前記第１位置にあるときの前記マイクロチャネルが前記フローセルが前記第２位置にあるときの前記マイクロチャネルに垂直である、
請求項２６のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレイフォーマット内の生体分子間の反応に関し、より詳しくは、バイオセンサを用いた、より詳しくは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のような光学的検出方法を用いた、そのようなシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノミクス、プロテオミクスおよびバイオインフォマティクスの新たな時代において、多数の蛋白質、新たな薬品のターゲットおよび小分子が、集中的に、高スループットな形で研究されている。ヒトゲノムの完全なマッピングは終了したが、ゲノミクスは蛋白質と他の分子との間の機能的な相互反応を含む、細胞の過程の完全な理解をもたらすことはできない。したがって、プロテオミクスが、ゲノミクスと細胞機能とを橋渡しする、今日の研究の最先端分野であるとみなされ得る。
【０００３】
生体分子（特に蛋白質）間の膨大な機能的相互作用を解析するための現在の技術的方法は、ウェルプレートに基づいた選別システム（例えば、ＥＬＩＳＡ）、細胞に基づいたアッセイ（assay）、可溶性反応物質選別（例えば、ラジオイミュノアッセイ）、および固層アッセイ（例えば、ＤＮＡチップ）を含む。今日、複数の生体分子相互反応（特に蛋白質）の動態（kinetic）をリアルタイムで且つラベリングが不要な観察することを可能にする高スループットな技術が、明らかに欠けている。
【０００４】
このような固層に基づいたアッセイの開発における現在の主な制限は、蛋白質の複雑さおよび可変性に起因する。ＤＡＮチップの生成に用いられるＤＮＡ分子と対照に、蛋白質は、より不安定で、概して水和し且つ活性構造および配合の状態で保たれていなければならない。また、蛋白質は化学的および物理的な変化（例えば温度）に対して非常に敏感である。最後に、固層動態解析に関しては、固定化された蛋白質の量および容量が、正確で完全な動態解析を実行するためには、既知でなければならない。
【０００５】
本明細書で用いられているように、文言「バイオセンサ」は、分子認識のための受容体表面と、この表面への結合を示す信号を生成するためのトランスデューサ（transducer）と、の組み合わせを意味する。
【０００６】
生体分子間での動態結合相互反応を測定するために様々な関連する光学的方法が用いられることができる。これらは、他のもののうち、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、全反射蛍光（ＴＩＲＦ）、エヴァネッセント波エリプソメトリを含んでいる。これらへの用途として、バイオセンサ、および主にＳＰＲを用いることが、本分野において知られている。動態結合反応は、本明細書において「プローブ」と称される第１分子種を含んでいる。プローブは、センサの表面に吸収され、次いで、本明細書において「ターゲット」と称される第２分子種を含んでいる溶液がセンサ表面へと吸収されたプローブ分子上へと流される。本分野および購入可能な装置において知られているように、標準的な動態結合相互反応測定は、以下の手順により記載される。
【０００７】
（１）化学的活性剤（例えば、ＥＤＣ／ＮＨＳ）を用いた固相表面の化学的活性、（２）化学的に活性化された表面上のプローブ分子の固定化、（３）１Ｍエタノールアミンのようなブロッカーで占有されていない活性化された基を洗浄およびブロック、（４）ターゲット分子の１濃度の付加、（５）適当な再生化学物質（例えば、５０ｍＭのＮａＯＨ、０．０５％のＳＤＳ）を用いたプローブの洗浄および再生、（６）他の濃度のターゲットの付加、（７）４〜６ステージを、毎回、異なるターゲット濃度として、少なくとも５回繰り返し。
【０００８】
本発明の一側面では、本発明は、結合反応の１つ以上の動態パラメータを得るために、本明細書において「ワンショットキネティック」（ＯＳＫ）と称される方法を提供する。以下に示すように、この方法は、プローブに対して有害であることが知られている再生ステージを必要とすることなく複数の結合反応を実行することを可能とする。
【０００９】
概して、プローブおよびターゲット分子間のあらゆる結合現象は、ＳＰＲ検出パラメータを変化させ得る。そして、これが、結合反応を観察するために後に用いられる。この、時間の経過に伴う検出パラメータの変化が用いられて、結合および解離定数率だけでなく親和性のような結合反応の特性が測定される。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が、この検出方法として用いられることが知られている。ＳＰＲ装置および方法は、プローブ層の光学的特性の変化に対して非常に敏感であり、比較的小さな刺激によって生成されたプローブ層の光学的特性の変化を検出するのに有用であることが証明されている。
【００１０】
ＳＰＲプローブ層は、複数の検体である「マイクロアレイ」として構成され得る。マイクロアレイでは、センサ表面上の別個の領域である「マイクロスポット」のそれぞれにおいて、ターゲット材料との相互反応のためのプローブ材料が吸収される。Berger et al.は、ターゲットのプローブへの結合を観察するために、プローブアレイを用意し、プローブアレイに対してターゲットを付与することを説明する（“Surface Plasmon Resonance Multi-sensing”, Anal. Chem. VOL. 70, February 1998, pp703-706）。
【００１１】
ＰＣＴ公報WO 02/055993は、センサ表面にプローブを結合させるために静電界および科学的架橋を用いることを開示する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、１つ以上のプローブと１つ以上のターゲットとの間の１つ以上の結合反応の動態パラメータを決定するためのシステムおよび方法を提供する。プローブおよびターゲットは、例えば、ペプチド、蛋白質、核酸、または多糖であり得る。プローブおよびターゲットは、同じ種であってよい。例えば、両方が蛋白質であってよい。または、プローブとターゲットは、異なる種であってもよい。例えば、プローブは核酸であり、一方で、ターゲットは蛋白質であり得る。
【００１３】
本発明のシステムは、バイオセンサにおける使用に適したあらゆる検出法を用いる。より具体的には、本発明のシステムは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のような、臨界角度屈折率測定（critical angle refractometry）、全反射蛍光（ＴＩＲＦ）、全反射燐光、全反射光散乱、エバネセント波エリプソメトリ、またはブルースター角反射率測定（reflectometry）等のエバネセント波現象に基づいた検出法を用いる。この検出方法は、複数の結合反応を同時に観測することを可能とする表面を用いる。この方法は、例えば、化学的表面活性剤を用いたマイクロ流体方法によって、または局地化された電界を用いて、センサ表面に異なる位置においてプローブを吸収させることを具備する。次いで、各ターゲットが、表面に吸収された各プローブに対して付与される。プローブとターゲットの各ペア間の結合反応は同時に観察される。
【００１４】
第１の視点では、本発明は、本明細書において「ワンショットキネティック」（ＯＳＫ）と称される、結合反応の動態パラメータを決定するためのシステムおよび方法を提供する。この方法は、再生ステージを必要とすることなく、またプローブにとって有害であることが知られている繰り返し実験を必要とすることなく、複数の結合反応を実行することを可能とする。本発明のこの方法の好適な実施形態では、１つのプローブ種が、ＳＰＲ表面のような表面上のマイクロスポットに、複数の条件下、例えば異なる濃度またはｐＨで、異なるプローブ密度を得るために、吸収される。幾つかの条件が、同じ密度の複製を得るために繰り返され得る。次いで、１つのターゲット種が、複数の濃度においてマイクロスポットに付与される。これにより、複数のプローブ密度およびターゲット濃度の組み合わせが得られる。複数の反応が、同時に観察され、結合反応を示す信号が得られ、これが解析されて結合の動態解析を行う。動態解析は、例えば、プローブのターゲットへの結合についての結合定数または解離定数または親和性定数を計算することを具備する。
【００１５】
第２の視点では、本発明は、本明細書において「アレイスクリーニング」と称される、多くの結合反応の解析を得られるように複数のプローブと１つ以上のターゲットとのの間の複数の結合反応を同時に観察する方法を提供する。本発明のこの視点の一実施形態において、ある特定のプローブ種が、各マイクロスポットにおける各プローブが他のマイクロスポット上のプローブと独立して選択されるように、複数のマイクロスポットの異なる１つにおいて表面に吸収される。次いで、ターゲット種が、各マイクロスポット内のプローブに付与される。複数のマイクロスポット内でターゲットがプローブに結合することが、同時に観察され、結合反応を示す信号が、結合の解析を提供するために解析される。この解析は、例えば、各マイクロスポットでの検出可能な相互反応が存在していることを判断すること、あるいは各マイクロスポットでのプローブのターゲットへの結合についての平衡定数を計算すること、あるいは結合の動態を決定すること、を具備する。
【００１６】
プローブは、表面の異なる位置において、例えばマイクロ流体方法を用いて局地化される。表面上のこの位置は、例えば化学的活性剤を用いて、または電界を印加することによって、または露光すること（光活性化）によって活性化され得る。局地化を達成するために、表面の特定の領域を覆う化学的薄膜を形成することが知られている。これは、多くの場合、結合層と称される。結合層は、化学薬品と接触、または電界を印加することによって、または露光（光活性化）によって化学的に活性化された異なる官能基を含む。
【００１７】
電界による活性化は、２つの主要的な方法で実行されることができる。それは、（Ａ）結合層中の官能基の電気化学的反応（還元または酸化）を引き起こすこと、（Ｂ）帯電した生体分子を表面に引き付けて局地化反応を促進するように電界を印加し、次いで表面においてプローブ分子の局地濃度を高めること、である。
【００１８】
蛋白質固定化のための最も一般的な結合層は、カルボキシル基を含んでいる。これらのカルボキシル基は、許容される化学的活性剤、一般に、水溶液中のＥＤＣ（１−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミド）に表面を晒すことによって活性化される。この結果、活性なＮＨＳエステルが形成される。活性化された表面が蛋白質溶液と接触すると、ＮＨＳエステルは、蛋白質のバックボーン上の求核基、主にアミノ基と十分に反応して、安定したアミド結合を形成する。このようにして、蛋白質の共有結合固定化が達成される。化学的活性の他の方法は、固定化の対照物に対して高い親和性を示す分子を付着させる、すなわちビオチン標識分子の固定化のためのアビジンまたはアビジン派生物質を付着させる、ことを含む。
【００１９】
本発明は、また、結合反応を観察するための本発明の方法において用いられるプローブアレイを用意するための方法を提供する。
【００２０】
以上より、第１の視点では、本発明が提供する、第１結合要素と第２結合要素との間の結合の１つ以上の動態パラメータを決定するための方法は、
（ａ）第１結合要素を複数の複数のマイクロスポットにおいて表面に吸収させること
（ｂ）各マイクロスポットにおける第１結合要素に第２結合要素を付与すること、ここで、複数のマイクロスポットの中で第１結合要素の表面密度と第２結合要素の密度の組み合わせには複数ある
（ｃ）複数のマイクロスポットのそれぞれにおける第１および第２結合要素間の結合反応を示すデータをバイオセンサ検出法によって取得すること、
（ｄ）第１および第２結合要素間の結合の１つ以上の動態パラメータを取得できるようにデータを処理すること
を具備する。
【００２１】
第２の視点では、本発明が提供する、表面上の２つ以上のマイクロスポットのそれぞれにおいて分子種を局地化するための方法は、１つ以上の局地化領域のそれぞれについて、
（ａ）表面の局地化領域を活性化すること
（ｂ）局地化領域における１つ以上のマイクロスポットのそれぞれについて、分子種をマイクロスポットに吸収させること
（ｃ）局地化領域を随意的に非活性にすること
を具備する。
【００２２】
第３の視点では、本発明は、本発明の方法によって生成されたプローブアレイを提供する。
【００２３】
本発明の第４の視点では、本発明が提供する、１つ以上のプローブ種と１つ以上のターゲット種との間の複数の結合反応を同時に観察するためのシステムは、
（ａ）表面と、
（ｂ）プローブ種がマイクロスポットに吸収されるようにマイクロスポットにプローブ種を施し且つ表面に吸収された各プローブ種に対してターゲットを付与することが可能なアプリケータと、
（ｃ）表面からの反射光を受け取り且つターゲットのプローブへの結合を示す信号を生成する感光面と、
（ｄ）感光面によって生成された信号を受け取り且つ結合の動態解析を生成できるように信号を解析するよう構成されたプロセッサと、
を具備する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明を理解し、また実際にどのように実行され得るのかを理解するために、好適な実施形態がただ非限定的である例を用いて、添付の図面を参照しながら説明される。
【００２５】
図１ａおよび図１ｂは、本発明の一視点の一実施形態に従った、複数の結合反応を同時に実行するためのシステム１０を概略的に示している。システム１０は、光源２６のアレイ２４と、センサ表面を有するプリズム３０と、を具備するＳＰＲ装置８０を含んでいる。光源２６は、本技術分野で既知のＳＰＲの使用に対して適切な波長で光を供給する。光アレイ２４は、光軸４８を有するレンズ４６によって概略的に象徴される光学系の焦点面に配置されている。レンズ４６は、各光源２６からの光を集め、これを平行な光線のビームへと軌道を変え、軌道を変えられた光をプリズム３０の「入力」プリズム表面５０に入射するように導く。コリメータ４６によって入力面５０に入射するように導かれた光は、プリズム３０に進入し、センサ表面３２に入射する。
【００２６】
ある１つの光源２６からセンサ表面３２に入射する全ての光は、センサ表面に実質的に同じ入射角で入射し、異なる光源２６からの光は異なる入射角でセンサ表面に入射する。ある１つの光源２６からの光がセンサ表面３２上のセンサ２６に入射する角度は、この光源のアレイ２４の軸に沿った位置、レンズ４６の焦点長さ、プリズム３０を形成する材料の反射係数によって決定される。ＳＰＲ装置８０は、「置き換え板（displacement plate）」（図示せぬ）を含んでいてもよい。置き換え板は透明の材料から構成され、光源アレイ２４とプリズム３０との間に配置されている。置き換え板の角度方向は、置き換え板の法線が、光軸４８に対して所望の角度を有するように設定される。
【００２７】
センサ表面３２に入射して反射された光は出力プリズム面５２を介してプリズムから退出し、カメラ５５によって集められ、イメージ化される。カメラ５５は、レンズ５３およびＣＣＤのような二次元感光面５４を有する。偏光器（図示せぬ）が、アレイ２４とプリズム３０との間、より好ましくはプリズム３０とカメラ５５との間に配置される。偏光器は、感光面５４が受け取った光を、それがセンサ表面３２に対して実質的に偏光のｐ成分のみを有するように、直線偏光する。
【００２８】
カメラ５５は、感光面５４上に形成されたイメージを示す信号５７を出力する。信号５７はプロセッサ５９に入力される。プロセッサ５９は、信号５７を保存するためのメモリを有する。プロセッサ５９は、後述のように信号を解析するよう構成されている。信号５７およびプロセッサによって実行された解析結果のうちの任意のものが、関連するディスプレイ水クリーン６５上に表示されてよい。
【００２９】
システム１０は、フローセル３４を含んでいる。フローセル３４は、センサ表面３２と接触し且つセンサ表面３２を横断するよう液体を流すためのｍ個のマイクロチャネル３６を有している。装置８０において、ｍ＝５個のマイクロチャネル３６ａ乃至３６ｅが示されている。これは、あくまで例であり、本発明の方法は、あらゆる数のｍ個のマイクロチャネルを有するフローセルを用いて実行されることが可能である。説明を明瞭にするために、フローセル３４の外観は破線により図示されており、マイクロチャネル３６等のフローセルの内部の要素の詳細は実線で示されている。各マイクロチャネル３６は、一端において入口（図１ａ、図１ｂの透視図においては見えない）を有し、他端において出口６１を有する。出口６１からは、マイクロチャネル内を流れる液体がマイクロチャネルより流れ出る。各入口は、ｍ個のマイクロチャネル３６のそれぞれに流体を独立して導入するために、適切なポンプ装置（図示せぬ）が独立して接続されるように適合されている。
【００３０】
システム１０において、フローセル３４は、ＳＰＲ表面上に２つの方向で搭載可能である。２つの方向の１つが図１ａに示されており、本明細書では「プローブ方向」と称される。第２の方向は、図１ｂに示されており、本明細書では「ターゲット方向」と称される。２つの方向のそれぞれにおいて、マイクロチャネルは、他方の方向におけるマイクロチャネルに対して垂直である。各マイクロチャネル３６は、センサ表面３２に面するマイクロチャネルの側面において、マイクロチャネル内でいずれかの方向で流れる流体がＳＰＲ表面に長方形領域で接触するように、開口している。図１ａに示すプローブ方向において、マイクロチャネル内を流れる流体は、センサ表面にそれぞれの長方形領域４２で接触する。長方形領域４２は、本明細書で「プローブ領域」（図１ｂを参照）と称する。図１ｂに示すターゲット方向において、マイクロチャネル内を流れる流体は、センサ表面にそれぞれの長方形領域４３で接触する。長方形領域４３は、本明細書で「ターゲット領域」（図１ａを参照）と称する。したがって、プローブ領域およびターゲット領域は、相互に垂直である。図１ａおよび図１ｂ内のシステム１０中の幾つかのマイクロチャネル３６の一部の領域は、プローブ領域とターゲット領域との交差点に形成されるマイクロスポット５８を示すために切り取られている。
【００３１】
図２は、本発明の一視点の他の実施形態に従った、複数の結合アッセイを同時に実施するためのシステム１１を概略的に示している。システム１１は、ＳＰＲ装置２０を含んでいる。ＳＰＲ装置２０は、図１に示すＳＰＲ装置と同じ複数の要素を含んでおり、同様の要素は、２つの図において同じ参照符号によって指し示されている。具体的には、ＳＰＲ装置８０は、光源２６のアレイ２４、センサ表面３２を有するプリズム３０、光軸４８を有するレンズ４６、ＣＣＤ等の二次元感光面５４、を具備する光学系を含んでいる。適切なＳＰＲ導体（図示せぬ）がセンサ表面上に形成されている。
【００３２】
システム１１は、フローセル３４を含んでいる。フローセル３４は、センサ表面３２と接触し且つセンサ表面３２を横断するよう液体を流すためのｍ個のマイクロチャネル３６を有している。装置８０において、ｍ＝５個のマイクロチャネル３６ａ乃至３６ｅが示されている。これは、あくまで例であり、本発明の方法は、あらゆる数のｍ個のマイクロチャネルを有するフローセルを用いて実行されることが可能である。説明を明瞭にするために、フローセル３４の外観は破線により図示されており、マイクロチャネル３６等のフローセルの内部の要素の詳細は実線で示されている。各マイクロチャネル３６は、一端において入口（図１ａ、図１ｂの透視図においては見えない）を有し、他端において出口６１を有する。出口６１からは、マイクロチャネル内を流れる液体がマイクロチャネルより流れ出る。各入口は、ｍ個のマイクロチャネル３６のそれぞれに流体を独立して導入するために、適切なポンプ装置（図示せぬ）が独立して接続されるように適合されている。
【００３３】
ＳＰＲ装置２０は、ｎ個の直線電極３３を有する。ｎ個の直線電極が用いられてｎ個の独立した活性化可能な領域が形成される。ｎ＝５個の直線電極３３ａ乃至３３ｂが図２において示されている。これは、あくまで例であり、本発明の方法は、あらゆる数の直線電極を有するＳＰＲ装置を用いて実行されることが可能である。
【００３４】
システム１１において、フローセル３４が、ｍ個のマイクロチャネルがｎ個の直線電極３３に垂直となるように、プリズム３０上に搭載される。各マイクロチャネル３６は、センサ表面３２に面するマイクロチャネルの側面において、マイクロチャネル内を流れる液体が各直線電極３３に、マイクロチャネルが直線電極と交差する領域に位置するマイクロスポット５８で接触するように、開口している。ｍ個のマイクロチャネルとｎ個の直線電極を有するＳＰＲ装置では、計ｍ×ｎ個のマイクロスポットが、ｍ個のマイクロチャネルがｎ個の直線電極と交差する領域のそれぞれに形成されている。図２のＳＰＲ装置２０内の幾つかのマイクロチャネル３６の一部は、マイクロスポット５８を示すために切り取られている。
【００３５】
各直線電極３３は、独立して、電源６０に接続されている。電源６０は、センサ表面３２に対して垂直の成分を有する電界を生成するように電源に接続された参照電極６２に対する電圧を、各直線電極３３に独立して供給するように制御可能とされている。この電界は、マイクロチャネルが直線電極と交差する領域において、マイクロチャネル３６の内腔を通過する。
【００３６】
図３は、本発明の方法の一実施形態に従った、表面７０上でプローブアレイを用意するための方法を概略的に示している。図３ａにおいて、表面７０上の第１表面領域７２ａが活性化される。表面領域を活性化することにより、プローブ分子が、表面領域に吸収されることが可能となる。そして、１つ以上のプローブ種７１が、活性化された第１表面領域７２に、第１表面領域７２の独立したマイクロスポットへと吸収される（図３ｂ）。図３ｂは、活性化された第１表面領域７２ａに６つのプローブ種７１ａ乃至７１ｆを施すことを概略的に示している。これは、あくまで例であり、本発明の方法は、第１表面領域に吸収されるあらゆる数のプローブ種７１を用いて実行されることが可能である。これにより、図３ｃに示すプローブアレイが生成される。図３ｃにおいて、各プローブ種は、異なるマイクロスポット７４に吸収される。図３ｃは、６つのマイクロスポット７４ａ乃至７４ｆを示している。このプローブ種は、全てが異なっていてもよいし、幾つかが、場合によっては濃度が異なる同じものであってもよい。
【００３７】
今度は、第１表面領域が非活性化され、第２表面領域７２ｂが活性化される。次いで、１つ以上のプローブ種が、第１表面領域７２ａについて上記したように、第２表面領域７２ｂ上の別個のマイクロスポットに吸収される。このプロセスは、プローブ種が表面領域７２のそれぞれの上のマイクロスポットに吸収されるまで、表面領域７２の異なる１つを毎回活性化しながら、繰り返される。これにより、図３ｄに示すプローブアレイが形成される。図３ｄにおいて、複数のプローブ種がマイクロスポット７５に吸収されている。図３ｄにおいて、６個の表面領域７２ａ乃至７２ｆが示されている。これは、あくまで例であり、本発明の方法は、第１表面領域に吸収されるあらゆる数の表面領域７２を用いて実行されることが可能である。図３ｄに示す例では、６個の表面領域７２のそれぞれの上において、６個のプローブ種が吸収された。これにより、図３ｄに示す３６個のマイクロスポットのアレイが形成される。異なる表面領域に吸収されたプローブ種は、最大３６個の異なるプローブ種が表面７０へと吸収されるように、異なっていてよい。
【００３８】
表面７０上にプローブアレイが用意された後、各表面領域について、ターゲット種が、マイクロスポットに吸収されたプローブ種に付与される。
【００３９】
次に、図３に示す、表面上にプローブアレイを用意する方法が、図１のシステム１０を参照して、実施される。この例では、ｍ2のプローブ種が、ＳＰＲ表面に、ｍ個のプローブ領域がｍ個のターゲット領域と交差するｍ2個（図１のＳＰＲ装置８０ではｍ2＝２５）の交差点に位置するｍ2個のマイクロスポット５８において吸収される。プローブ領域上にｍ2個のプローブの適切なマイクロアレイを用意するために、フローセル３４が、まず、一方向（図１ｂ）に配置され、第１表面領域４３ａを洗浄し且つ準備するために、バッファまたは水が、第１マイクロチャネル３６を貫くよう送り込まれる。次に、バッファまたは水の第１マイクロチャネル３６ａを介した流れが停止され、次いで、化学的表面活性剤が、第１表面領域４３ａを活性化するために第１マイクロチャネル３６ａを貫くよう流される。第1表面領域は、今や、活性化されている。
【００４０】
次に、フローセルは、図１ｂに示すターゲット方向から図１ａに示すプローブ方向へと９０度回転される。プローブ種を具備する適当な溶液が、ｍ個のマイクロチャネル３６のそれぞれの両端を貫くよう送り込まれる。ｍ個のプローブ種は、全てが異なっていてもよいし、幾つかが、場合によっては濃度が異なる同じものであってもよい。第１表面領域４３ａの活性化の結果、各プローブ種は第１表面領域４３ａに吸収され、他のｍ−１個の表面領域４３ｂ乃至４３ｅには吸収されない。これにより、プローブ種のそれぞれは、ｍ個のプローブ領域４２が第１表面領域５４ａと交差するｍ個の領域に位置するｍ個のマイクロスポット５８の異なる１つにおいて固定化される。プローブは、ｍ個のプローブ領域４２がｍ−１個の他の表面領域４３ｂ乃至４３ｅと交差する領域に位置するｍ×（ｍ−１）個のマイクロスポット５８において固定化されることが回避される。
【００４１】
プローブの固定化の間、固定化のプロセスおよび各マイクロスポット５８において固定化されるプローブ蛋白質の量は、センサ表面６４のＳＰＲずれ角（SPR angular）スキャンを本分野において既知のように実行することによって観察される。プローブの吸収の間に第１表面領域４３ａ上の各マイクロスポット５８において反射された各光源２６からの光に応じたＣＣＤ５４によって生成された信号５７は、プロセッサ５９に入力される。プロセッサ５９は、マイクロスポットについてのＳＰＲパラメータを決定できるように信号を解析するよう構成されている。ＳＰＲパラメータは、例えば、表面プラズモン共鳴を特徴付ける反射率および位相の変化、共鳴波長、またはＳＰＲ共鳴角度であり得る。プロセッサは、さらに、マイクロスポットにおいて固定化されたプローブの蓄積を観察するためにＳＰＲパラメータを解析するよう構成されている。他のｍ−１個の表面領域のマイクロスポットおよび交差領域でないプローブ表面の領域からの信号５７は、第１表面領域の交差領域からの信号を補正および標準化するためにプロセッサによって解析される。
【００４２】
マイクロチャネル内でのプローブ溶液の流れの停止の後、フローセルはターゲット方向（図１ｂ）へと９０度回転して元に戻され、表面活性化ブロッカーを含む溶液がマイクロチャネル３６を介して供給されて第１表面領域へのさらなる結合が防止される。
【００４３】
上記のプロセスは、ｍ個のプローブ領域とｍ個の表面領域との間のｍ2個の交差領域に位置するｍ2個もの異なるマイクロスポット５８のそれぞれにおいてプローブ種が固定化されるまで、ｍ個のプローブ溶液を用いて残るｍ−１個の表面領域４３ｂ乃至４３ａのそれぞれについて繰り返される。このように、各表面領域４３は、個別に活性化される。本明細書において用いられているように、「活性化可能領域」は、活性化された際に１つ以上のプローブ種と結合可能な領域を指すために用いられる。このように、本発明の方法によって、ｍ2個もの異なるプローブ種を具備するプローブマイクロアレイが、ＳＰＲデバイス８０のＳＰＲ表面上に形成され得る。
【００４４】
プローブマイクロアレイの用意に続いて、ターゲット種を含んだ溶液がターゲット方向を向いたフローセル内のｍ個のマイクロチャネル３６のそれぞれに流される。このｍ個のターゲット種は、全てが異なっていてもよいし、幾つかが、場合によっては濃度が異なる同じものであってもよい。よって、ｍ個のターゲット溶液のそれぞれについて、ターゲットが、ターゲットのターゲット領域がｍ個のプローブ領域と交差するｍ個の領域に位置するｍ個のマイクロスポット５８内のｍ個のプローブ種のそれぞれに対して付与される。マイクロチャネル内でターゲット分子が流れている間にｍ2個のマイクロスポット５８のそれぞれから反射された光源からの光に応じたＣＣＤ５４から供給された信号５７は、プロセッサ５９に入力される。プロセッサ５９は、各マイクロスポットにおけるプローブへのターゲットの結合を観察できるようにこれらの信号を解析するよう構成されている。よって、ｍ2個もの結合反応の全てが、ｍ2個もの異なるプローブ種とｍ個もの異なるターゲット種を含めて、同時に観察されることが可能となる。本分野において既知のように、参照表面は、用いられ、且つ「アクティブスポット」から得られるあらゆる信号から減ぜられなければならない。本発明の一視点では、また本方法の新規な結果であるが、スポット間の表面は、「インタースポット」と命名され、参照表面として用いられる。
【００４５】
図３に示す、表面上にプローブアレイを用意する方法が、図２のシステム１１を参照して説明される。この例では、ｍ×ｎ個のプローブ種は、ｍ個のマイクロチャネル３６がｎ個の直線電極３３と交差する領域に位置するｍ×ｎ個のマイクロスポット５８（図２のシステム１１においてｍ×ｎ＝２５）において、ＳＰＲ表面に吸収される。直線電極３３上にｍ×ｎ個のプローブの適当なマイクロアレイを用意するために、まずバッファまたは水がマイクロチャネル３６を貫くよう送り込まれてマイクロスポット５８においてプローブ分子を固定化するために直線電極を洗浄および準備する。次に、ｍ個のマイクロチャネルを介したバッファまたは水の流れは停止され、次に第１直線電極３３ａが上記したように活性化される。残りの直線電極は、全て、第１電極と反対の極性を持つ参照電極６２に対するある電位へと設定される。プローブ種を具備する適当な溶液が、ｍ個のマイクロチャネル３６を貫くよう送り込まれる。ｍ個のプローブ種は、全てが異なっていてもよいし、幾つかが、場合によっては濃度が異なる同じものであってもよい。第１直線電極３３ａの活性化およびマイクロチャネル内のｍ個のプローブ種上の電荷の結果、各プローブ種が第１直線電極３３ａに吸収され、他のｎ−１個の直線電極３３ｂ乃至３３ｅによって吸収されない。これにより、プローブ種のそれぞれは、ｍ個のマイクロチャネルが第１直線電極３３ａと交差するｍ個の領域に位置するｍ個のマイクロスポット５８の異なる１つにおいて固定化される。プローブが、実質的に、ｍ個のマイクロチャネルがｎ−１個の他の直線電極３３ｂ乃至３３ｅと交差する領域に位置するｍ×（ｎ−１）のマイクロスポット５８で固定化されることが回避される。
【００４６】
プローブの固定化の間、固定化のプロセスおよび各マイクロスポット５８で固定化されたプローブ蛋白質の量が、センサ表面６４のＳＰＲ角スキャンを本分野において既知のように実行することによって観察される。プローブの吸収の間に第１表面領域４３ａ上の各マイクロスポット５８において反射された各光源２６からの光に応じたＣＣＤ５４によって生成された信号５７は、プロセッサ５９に入力される。プロセッサ５９は、マイクロスポットについてのＳＰＲパラメータを決定できるように信号を解析するよう構成されている。プロセッサは、さらに、マイクロスポットにおいて固定化されたプローブの蓄積を観察できるよう構成されている。他のｎ−１個の直線電極３３ｂ乃至３３ｅのマイクロスポットおよび交差領域でないプローブ表面からの信号５７は、第１ターゲット領域の交差領域からの信号を集め、標準化するためにプロセッサにより解析される。
【００４７】
マイクロチャネル内のプローブ溶液の流れの停止の後、バッファまたは水が、マイクロチャネル３６を貫いて流されて結合していないプローブ蛋白質が除去される。
【００４８】
上記のプロセスは、ｍ個のマイクロチャネル３６とｎ個の直線電極３３との間のｍ×ｎ個の交差領域に位置するｍ×ｎ個もの異なるマイクロスポット５８のそれぞれにおいてプローブ種が固定化されるまで、ｍ個のプローブ溶液を用いて残りのｎ−１個の直線電極３３ｂ乃至３３ｅについて繰り返される。このように、本発明の方法によって、ｍ×ｎ個もの異なるプローブ種を具備するプローブマイクロアレイが、ＳＰＲ装置２０のＳＰＲ表面上に形成される。
【００４９】
プローブマイクロアレイの用意に続いて、ターゲット種を含んだ溶液を、ｍ個のマイクロチャネル３６のそれぞれに流される。ｍ個のターゲット種は、全てが異なっていてもよいし、幾つかが、場合によっては濃度が異なる同じものであってもよい。このように、ｍ個のターゲット溶液のそれぞれについて、ターゲットのマイクロチャネルがｎ個の直線電極と交差するｎ個の領域に位置するｎ個のマイクロスポット５８内のｎ個のプローブ種のそれぞれに対して付与される。マイクロチャネル内でターゲット分子が流れている間にｍ2個のマイクロスポット５８のそれぞれから反射された光源からの光に応じたＣＣＤ５４によって提供される信号５７は、プロセッサ５９に入力される。プロセッサ５９は、各マイクロスポットにおけるターゲットのプローブへの結合を観察するためにこれらの信号を解析するよう構成されている。よって、ｍ×ｎ個もの異なる結合反応の全てが、ｍ×ｎ個もの異なるプローブ種とｍ個もの異なるターゲット種を含めて、同時に観察されることが可能となる。好適な実施形態において、「インタースポット」称される表面の領域が、参照信号を提供する参照面として用いられる。
【００５０】
図４は、本発明の方法の他の実施形態（「ＯＳＫ」または「ワンショットキネティック」）に従った、表面８０上でプローブアレイを用意するための方法を示している。この実施形態は、プローブとターゲットの濃度の異なる組み合わせで、１つのプローブ種と１つのターゲット種が関わる結合アッセイを実行することが望まれている場合に用いられ得る。この実施形態では、ｍ個のプローブ領域８２が同時に活性化される。６個のプローブ領域８２ａ乃至８２ｆが図４ａに示されている。これは、あくまで例であり、本方法は、あらゆる数のプローブ領域を用いて実行されることが可能である。ｍ個のプローブ領域８２が活性化され、プローブがプローブ領域８２に吸収される。異なるプローブ濃度が各プローブ領域に吸収される。プローブ領域８２ｆの１つは、プローブは全く吸収されない参照領域として用いられ得る。
【００５１】
次に、図４ｂに示すように、ターゲットのｎ個の濃度がプローブアレイ（検体１乃至６として指し示される）に対して付与される。各濃度は、プローブ領域のそれぞれの上の異なるマイクロスポットに付与される。したがって、反応アッセイは、プローブおよびターゲット濃度のｍ×ｎ個の組み合わせの全てからなる。
【００５２】
次に、図４に示す、結合アッセイを実施する方法が、図１のシステム１０を参照して説明される。この実施形態は、プローブおよびターゲット濃度の異なる組み合わせの１つのプローブ種と１つのターゲット種が関わる結合アッセイを実施することが望まれる場合に用いられる。プローブ種が、異なる濃度で、ｍ個のプローブ領域のそれぞれに付される。このマイクロアレイを用意するために、フローセル３４がまずプローブ方向（図１ａ）に配置され、バッファまたは水が、マイクロチャネル３６を貫くよう送り込まれてｍ個のプローブ領域が洗浄され、用意される。次に、ｍ個のマイクロチャネル３６を貫くバッファまたは水の流れが停止され、フローシステム内に残留するバッファまたは水が抜き取られる。化学的表面活性剤の溶液が、ｍ個のプローブ領域４２を活性化するために、ｍ個のマイクロチャネル３６を貫くよう流される。表面活性剤は、例えば、ＥＤＣ／ＮＨＳであり得る。これで、ｍ個のプローブ領域が、活性化される。
【００５３】
プローブを具備する適当な溶液が、ｍ個のマイクロチャネル３６のそれぞれを貫くよう送り込まれる。この実施形態では、プローブは、異なるマイクロチャネルのそれぞれに異なる濃度で存在している。ターゲット領域４２の活性化の結果、各マイクロチャネル内のプローブ分子はマイクロチャネルと接しているｎ個のマイクロスポット５８に吸収される。
【００５４】
プローブの固定化の間、固定化のプロセスおよび各マイクロスポット５８において固定化されたプローブ蛋白質の量が、センサ表面６４のＳＰＲ角スキャンを本分野において既知のように実施することによって観察される。プローブの吸収の間に各プローブ領域４２において反射された各光源２６からの光に応じたＣＣＤ５４によって生成された信号５７は、プロセッサ５９に入力される。プロセッサ５９は、各プローブ領域４２についてのＳＰＲパラメータを決定できるように信号を解析するよう構成されている。プロセッサは、さらに、各プローブ領域４２上で固定化されたプローブの蓄積を観察できるようにＳＰＲパラメータを解析するよう構成されている。プローブ領域内でないＳＰＲ表面の信号５７領域は、プローブ領域からの信号を集め、標準化するためにプロセッサによって解析される。
【００５５】
マイクロチャネル内でのプローブ溶液の流れの停止の後、表面活性剤ブロッカーを含んだ溶液がマイクロチャネル内を貫くよう流されて分子がＳＰＲ表面にさらに結合することが防止される。表面活性剤ブロッカーは、例えば、エタノールアミンであり得る。
【００５６】
次に、フローセルは、プローブ方向からターゲット方向（図１ｂ）に９０度回転される。ターゲット種を含んでいる溶液が、フローセルのｍ個のマイクロチャネル３６のそれぞれの中に流される。この実施形態では、ターゲットは、異なるマイクロチャネル内に異なる濃度で存在する。よって、ｍ個のターゲット溶液のそれぞれについて、ターゲットは、ターゲット溶液がｍ個のプローブ領域と交差するｍ個の領域に位置するｍ個のマイクロスポット５８内のｍ個プローブ濃度種のそれぞれに対して付与される。ターゲット分子がマイクロチャネル内を流れている間にｍ2個のマイクロスポット５８のそれぞれから反射された各光源からの光に応じたＣＣＤ５４から供給された信号５７は、プロセッサ５９に入力される。プロセッサ５９は、各マイクロスポットにおけるターゲットのプローブへの結合を観察するためにこれらの信号を解析するよう構成されている。この実施形態では、ｍ2個もの異なるプローブ濃度およびターゲット濃度を含めて、ｍ2個の結合反応の全てが、同時に観察される。このことによって、あらゆる時点においても表面の再生を必要とすることなく、１回の結合アッセイにおいて動態解析のためにターゲットのプローブへの結合に関する動態データを収集することが可能となる。これは、反応が、毎回プローブとターゲット濃度の異なる組み合わせで連続して実行され、このことが連続する結合反応の間に表面の再生を必要とする、従来の方法と対照的である。
【００５７】
次に、図４に示す、結合アッセイを実施する方法が、図２のシステム１１を参照して説明される。プローブ種がｍ個のプローブ領域のそれぞれに異なる濃度で付され、ターゲットがｍ個のターゲット領域のそれぞれに異なる濃度で付される。このマイクロアレイを用意するために、フローセル３４が図２に示すように、マイクロチャネル３６をｎ個の直線電極３３に垂直にして、配置される。バッファまたは水が、まずマイクロチャネル３６を貫くように送り込まれてマイクロチャネルと接触しているＳＰＲ表面が洗浄され、用意される。次に、ｍ個のマイクロチャネルを貫くバッファまたは水の流れが停止され、ｎ個の直線電極３３が上記したように活性化される。プローブを具備する適当な溶液が、ｍ個のマイクロチャネル３６のそれぞれを貫くよう送り込まれる。この実施形態では、プローブは、異なるマイクロチャネルのそれぞれにおいて異なる濃度で存在している。直線電極３３の活性化およびマイクロチャネル内のプローブ上の電荷の結果、プローブ分子が直線電極３３に吸収される。プローブ分子は、これにより、マイクロチャネルがｎ個の直線電極と交差するｎ個の領域に位置するｎ個のマイクロスポット５８の異なる１つにおいて固定化される。
【００５８】
プローブの固定化の間、固定化のプロセスおよび各マイクロスポット５８において固定化されたプローブ蛋白質の量が、センサ表面６４のＳＰＲ角スキャンを本分野において既知のように実施することによって観察される。プローブの吸収の間に第１直線電極３３ａ上の各マイクロスポット５８において反射された光源２６からの光に応じたＣＣＤ５４によって生成された信号５７は、プロセッサ５９に入力される。プロセッサ５９は、マイクロスポットに関するＳＰＲパラメータを決定できるように信号を解析するよう構成されている。プロセッサは、さらに、各マイクロスポットにおいて固定化されたプローブの蓄積を観察できるようにＳＰＲパラメータを解析するよう構成されている。マイクロスポットでないプローブ表面の領域からの信号５７は、マイクロスポットからの信号を集め、標準化するためにプロセッサによって解析される。
【００５９】
マイクロチャネル内のプローブ溶液の流れの停止の後、バッファまたは水が、結合していないプローブ蛋白質を除去するためにマクロチャネル３６を貫くよう再度流される。
【００６０】
ＳＰＲ表面から今や除去されたフローセル３４およびｍ個のマイクロチャネルを有する第２フローセル（図示せぬ）は、ｎ個の直線電極３３のそれぞれの上を渡るマイクロチャネルを有するＳＰＲ表面上に配置される。ｍ＝ｎの場合、フローセル３４は、また、これを図２に示す方向からマイクロチャネル３６が直線電極３３上を渡る方向（図示せぬ）へと９０度回転することによって、第２フローセルとし用いられることができる。ターゲットを含んだ溶液が、ｎ個のマイクロチャネルのそれぞれの中に流される。この実施形態では、ターゲットは、異なるマイクロチャネルに異なる濃度で存在する。よって、ｎ個のターゲット溶液のそれぞれについて、ターゲットは、ターゲットマイクロチャネルがｍ個のプローブ領域と交差するｍ個の領域に位置するｍ個のマイクロスポット５８におけるｍ個のプローブ濃度のそれぞれに対して付与される。マイクロチャネル内のターゲット分子の流れの間にｎ×ｍ個のマイクロスポット５８のそれぞれから反射された光源からの光に応じたＣＣＤ５４によって供給された信号５７は、プロセッサ５９に入力される。プロセッサ５９は、各マイクロスポットにおけるターゲットのプローブへの結合を観察するためにこれらの信号を解析するよう構成されている。これによって、あらゆる時点においても表面の再生を必要とすることなく、１回の結合アッセイにおいて動態解析のためにターゲットのプローブへの結合に関する動態データを収集することが可能となる。これは、反応が、毎回プローブとターゲット濃度の異なる組み合わせで連続して実行され、このことが連続する結合反応の間に表面の再生を必要とする、従来の方法と対照的である。
【００６１】
例
例１
結合アッセイが、図１に示すシステム１０を用いて実行された。抗ＩＬ−４抗体（αＩＬ−４）が、この実験でプローブとして用いられ、システム１０の説明において上記したように、６個の長方形プローブ領域４２（図１を参照）のそれぞれのＳＰＲ表面上で固定化された。プローブ領域は、（ａ）乃至（ｆ）を付された。６個のプローブ領域、すなわわち「反応単位」（ＲＵ）内の抗体の密度は、表１に示されている。
【表１】
2007510923.tif 000003
【００６２】
ＩＬ−４が、この実験でターゲットとして用いられ、上記のように、５個のターゲット領域４３のそれぞれの中のαＩＬ−４に対して付与された。ターゲット領域は、１乃至５を付された。各ターゲット領域内のＩＬ−４の濃度は、表２に示されている。
【表２】
2007510923.tif 000004
【００６３】
よって、結合アッセイは、同時に実行された３０の結合反応を含んでいた。３０個のマイクロスポットにおけるＩＬ−４のαＩＬ−４への結合が、上記のように同時に観察された。この結合の結果は、図５に示されている。図５内の各グラフは、グラフに示されるプローブ領域内のＩＬ−４のαＩＬ−４への結合を示している。グラフ中の５本の曲線のそれぞれは、各グラフのプローブ領域と各曲線について特定されるターゲット領域との交点に位置するマイクロスポット内のＩＬ−４のαＩＬ−４への結合の結果を示している。各グラフにおいて矢印により示されている時刻において、結合していないＩＬ−４は洗浄により除去され、３０個のマイクロスポットにおけるＩＬ−４のαＩＬ−４からの結合の解離が、本発明の方法によって同時に観察された。プロセッサ６３は、グラフの抗体濃度におけるＩＬ−４のαＩＬ−４への結合の解離定数（Ｋｄ）と結合定数（Ｋａ）を得るために各グラフ中の曲線を解析するよう構成された。各グラフのＫａおよびＫｄは、図５のそれぞれにおいて示されている。これらから、親和性定数（ＫＤ）が、本分野で既知のように、導き出されることが可能である。
【００６４】
例２
６つの抗体プローブ（αＩｇＧ１、αＩｇＧ２ｂ、αＩｇＡ、αＩｇＧ２ａ、αＩｇＧ３）の抗原（Ｉｇ１、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）への結合が、図１のシステム１０を用いて研究された。プローブおよびターゲットの使用された濃度は、それぞれ表３、表４に示されている。得られた結合曲線は、図６に示されており、３０個の結合反応のそれぞれの結合反応は表５に示されている。
【表３】
2007510923.tif 000005
【表４】
2007510923.tif 000006
【表５】
2007510923.tif 000007
【００６５】
例３
５つのシトクロムーＰ４５０（ＣＹＰ）酵素プローブ（３Ａ４、２Ｃ１９、１Ａ２、２Ｃ９、２Ｄ６）の６個の異なるターゲット（ケトコナゾール、ニフェジピン、デキストロメトルファン、ジクロフェナク、サルファフェナゾール、プロプラノロール）への結合が、図１のシステム１０を用いて実施された。ターゲットは、濃度1,000、500、250、125、62.5、31.25、15.5、7.8μＭで付与された。親和性定数ＫＤが各反応について求められた。この結果は、図７および表６に示されている。
【表６】
2007510923.tif 000008
【００６６】
例４
表７は、図３に示す方法で用意された３６個の独立したマイクロスポット上での、図１のシステム１０を用いたウサギＩｇＧおよびヤギＩｇＧプローブの固定化を示している。各プローブ領域は順次活性化され、ウサギＩｇＧおよびヤギＩｇＧの６個のプローブが活性化されたプローブ領域に交互に吸収された。この結果、表７に示すように、３６個のマイクロスポット（各表面領域で６個）において３６の交互のプローブが固定化された。
【表７】
2007510923.tif 000009
【００６７】
次に、マウスの抗ウサギおよびマウスの抗ヤギ抗体ターゲットが、プローブアレイに対して付与された。表８は、このターゲット結合反応を示している。プローブアレイ上の３６個の独立して選択されたプローブが、対応するターゲットと反応し、３６個の異なり且つ独立した相互反応が実行され、（「チェッカーボード」パターンで）同時に観察されることが可能となった。
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の一実施形態に従った、複数の結合反応を実行するためのシステムを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の一実施形態に従った、複数の結合反応を実行するためのシステムを示す。
【図２】図２は、本発明の他の実施形態に従った、複数の結合反応を実行するためのシステムを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の一実施形態に従った、プローブアレイを用意するための方法を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の一実施形態に従った、プローブアレイを用意するための方法を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明の一実施形態に従った、プローブアレイを用意するための方法を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、本発明の一実施形態に従った、プローブアレイを用意するための方法を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の他の実施形態に従った、プローブアレイを用意するための方法を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の他の実施形態に従った、プローブアレイを用意するための方法を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明の方法によって得られたＩＬ−４ｍｐ抗ＩＬ−４抗体への結合カーブを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明の方法によって得られたＩＬ−４ｍｐ抗ＩＬ−４抗体への結合カーブを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、本発明の方法によって得られたＩＬ−４ｍｐ抗ＩＬ−４抗体への結合カーブを示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、本発明の方法によって得られたＩＬ−４ｍｐ抗ＩＬ−４抗体への結合カーブを示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、本発明の方法によって得られたＩＬ−４ｍｐ抗ＩＬ−４抗体への結合カーブを示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは、本発明の方法によって得られたＩＬ−４ｍｐ抗ＩＬ−４抗体への結合カーブを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、６つの抗体プローブに対する５つの抗原ターゲットの結合カーブを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、６つの抗体プローブに対する５つの抗原ターゲットの結合カーブを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、６つの抗体プローブに対する５つの抗原ターゲットの結合カーブを示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、６つの抗体プローブに対する５つの抗原ターゲットの結合カーブを示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、６つの抗体プローブに対する５つの抗原ターゲットの結合カーブを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、６つのＣＹＰ４５０酵素プローブに対する様々な化合物ターゲットの結合カーブを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、６つのＣＹＰ４５０酵素プローブに対する様々な化合物ターゲットの結合カーブを示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、６つのＣＹＰ４５０酵素プローブに対する様々な化合物ターゲットの結合カーブを示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、６つのＣＹＰ４５０酵素プローブに対する様々な化合物ターゲットの結合カーブを示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、６つのＣＹＰ４５０酵素プローブに対する様々な化合物ターゲットの結合カーブを示す。
【図７Ｆ】図７Ｆは、６つのＣＹＰ４５０酵素プローブに対する様々な化合物ターゲットの結合カーブを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2007510923.tif 000022
【図５Ｄ】
2007510923.tif 000023
【図５Ｅ】
2007510923.tif 000024
【図５Ｆ】
2007510923.tif 000025
【図６Ａ】
2007510923.tif 000026
【図６Ｂ】
2007510923.tif 000027
【図６Ｃ】
2007510923.tif 000028
【図６Ｄ】
2007510923.tif 000029
【図６Ｅ】
2007510923.tif 000030
【図７Ａ】
2007510923.tif 000031
【図７Ｂ】
2007510923.tif 000032
【図７Ｃ】
2007510923.tif 000033
【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
2007510923.tif 000035
【図７Ｆ】
2007510923.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月12日(2006.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１結合要素と第２結合要素との結合の１つ以上の動態パラメータを決定するための方法であって、
（ａ）前記第１結合要素を複数のマイクロスポットにおいて表面に吸収させること
（ｂ）前記マイクロスポットのそれぞれにおける前記第１結合要素に前記第２結合要素を付与すること、ここで複数のマイクロスポットの中で前記第１結合要素の表面密度と前記第２結合要素の密度の組み合わせには複数ある
（ｃ）前記複数のマイクロスポットのそれぞれにおける前記第１および第２結合要素間の結合反応を示すデータをバイオセンサ検出法によって取得すること
（ｄ）前記第１および第２結合要素間の結合の１つ以上の動態パラメータを取得できるように前記データを処理すること
を具備し、（ａ）前記第１結合要素を複数のマイクロスポットにおいて表面に吸収させることが、
（ａ）前記マイクロスポットにおいて前記表面を
（i）前記マイクロスポットを含んだ領域の周囲に第１チャネルを形成し
（ii）前記活性化物質を含んだ溶液を前記チャネル内に導入し
（iii）余剰の活性化溶液を前記チャネルから除去する
ことによって活性化すること
（ｂ）前記第１結合要素を前記マイクロスポットに吸収させること
（ｃ）前記マイクロスポットを非活性化すること
を具備する方法。
【請求項２】
前記バイオセンサ検出法が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、臨界角度屈折率測定、全反射蛍光、全反射燐光、全反射光散乱、エバネセント波エリプソメトリ、ブルースター角反射率測定から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記検出法がＳＰＲであって、
前記複数のマイクロスポットのそれぞれにおける第１および第２結合要素間の結合反応を示す前記データが、ＳＰＲ共鳴角度、共鳴波長、反射率変化、位相変化から選択されたＳＰＲパラメータである、
請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の動態パラメータが、結合定数Ｋａ、解離定数Ｋｄ、親和性定数から選択される、請求項１、または２、または３の方法。
【請求項５】
前記マイクロスポットに吸収させる工程が、
（ａ）前記マイクロスポットを含んだ領域の周囲にチャネルを形成すること
（ｂ）前記分子種を含んだ溶液を前記チャネル内に導入すること
（ｃ）余剰の溶液を前記チャネルから除去すること
を含む、請求項１の方法。
【請求項６】
前記マイクロスポットを活性化する工程が、前記マイクロスポットの上方で電界を発生することを含む、請求項１の方法。
【請求項７】
（ａ）前記表面のマイクロスポットに含まれていない部分を非活性化すること
（ｂ）１つ以上の前記第１チャネルに垂直な１つ以上の第２チャネルを形成すること
（ｃ）各第２チャネルについて、第２結合要素を前記第２チャネル内に導入すること
をさらに具備する、請求項１の方法。
【請求項８】
前記表面のマイクロスポットに含まれていない領域から参照データを取得することをさらに具備する、先行する請求項のいずれか１項の方法。
【請求項９】
表面上の２つ以上のマイクロスポットのそれぞれにおいて、１つ以上の局地化領域のそれぞれについて分子種を局地化する方法であって、
（ａ）前記表面の局地化領域を活性化すること
（ｂ）前記局地化領域における１つ以上のマイクロスポットのそれぞれについて、分子種を前記マイクロスポットに吸収させること
（ｃ）前記局地化領域を随意的に非活性にすること
を具備する方法。
【請求項１０】
前記表面を活性化する工程が、
（ａ）前記局地化領域の周囲に第１チャネルを形成すること
（ｂ）活性化物質を含んだ溶液を前記チャネル内に導入すること
（ｃ）余剰の活性化溶液を前記チャネルから除去すること
を含む、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記マイクロスポットを活性化する工程が、前記マイクロスポットの上方に電界を発生することを含む、請求項９の方法。
【請求項１２】
分子種を前記マイクロスポットに吸収させる工程が、
（ａ）前記局地化領域に垂直なチャネルを形成すること
（ｂ）前記分子種を含んだ溶液を前記チャネル内に導入すること
（ｃ）余剰な溶液を前記チャネルから除去すること
を含む、請求項９の方法。
【請求項１３】
前記分子種が第１結合要素であり、
前記方法が、
（ａ）前記表面の局地化領域に含まれていない部分を非活性化すること
（ｂ）１つ以上の前記第１チャネルに垂直な１つ以上の第２チャネルを形成すること
（ｃ）第２チャネルのそれぞれについて、第２結合要素を前記第２チャネル内に導入すること
をさらに具備する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
請求項９乃至１３のいずれか１項の方法によって形成されたプローブアレイ。
【国際調査報告】
2007510923.tif 000037
2007510923.tif 000038
2007510923.tif 000039
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2007510923.tif 000042
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