(57)【要約】核酸の１以上の標的配列において１以上の単一ヌクレオチド多形を同定し、区別するための改良されたアッセイは、単一チューブ反応系において、３以上のプライマーを含み、そのうち２つは、１以上の第一のプライマーの３’末端が第二のプライマーの５’末端に隣接するように、ＳＮＰに近接する標的核酸配列に結合し、上記２つのプライマーは選択的に連結されて、次いで、第三のプライマーによって増幅されて、１以上の標的配列の相補性鎖を指数関数的に生じさせる。上記１以上の標的配列の他の鎖は、各々が異なるフルオロフォアで標識された１以上のハイブリダイズ可能なプローブによって指数関数的に増幅され、フルオロフォア標識ハイブリダイズ可能プローブは、標的核酸産物への取込みおよびその増幅までクエンチされる。
2007515956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的標的核酸配列を増幅するためのタイプの改良されたアッセイであって、ここに、該標的配列は目的の内部ＳＮＰを含み、該アッセイは、該標的配列と、それぞれ該標的配列の第一のセグメントおよび第二のセグメントに実質的に相補的である少なくとも一部分を有する連結可能な第一のプライマーおよび第二のプライマーと、該第一のプライマーおよび第二のプライマーのランダム配列セグメントに対する実質的に相補的である第三のプライマーとを含む制御温度反応混合物を用いるタイプの選択的連結および増幅方法であり、ここに、該改良は：
標的配列への結合の際に蛍光を発する二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに対する結合に特異的な色素を用いて増幅された標的配列を均質的に検出することを包含する、改良されたアッセイ。
【請求項２】
前記標的配列のＳＮＰに対して相補的なヌクレオチドが、前記第二のプライマーの５’末端に存在する、請求項１に記載の改良されたアッセイ。
【請求項３】
前記色素がＳＹＢＲ（登録商標）グリーンを含む、請求項１に記載の改良されたアッセイ。
【請求項４】
前記アッセイが、
連結された産物が、直線的に増幅された連結されてないプライマー産物を超える検出可能な指数関数的に増幅された標識配列を生じるような濃度にて第一のプライマーおよび第二のプライマーを使用する工程
をさらに包含する、請求項１に記載の改良されたアッセイ。
【請求項５】
前記アッセイが、
異なる融解曲線を有する増幅された標的配列を生じるように設計された複数の第一のプライマーおよび第二のプライマーを使用する工程；
融解温度（Ｔｍ）の差によって個々の増幅された標識配列を識別する工程
をさらに包含する、請求項１に記載の改良されたアッセイ。
【請求項６】
前記第一のプライマーおよび第二のプライマーが、前記ＳＮＰに隣接する標的配列における可変領域へのハイブリダイゼーションを可能にする縮重塩基対合位置を含む、請求項１に記載の改良されたアッセイ。
【請求項７】
特異的標的核酸配列を増幅するためのタイプの改良されたアッセイであって、ここに、該標的配列は目的の内部ＳＮＰを含み、該アッセイは、該標的配列と、それぞれ該標的配列の第一のセグメントおよび第二のセグメントに対して実質的に相補的である少なくとも一部分を有する連結可能な第一のプライマーおよび第二のプライマーと、該第一のプライマーおよび第二のプライマーのランダム配列セグメントに対する実質的に相補的である第三のプライマーとを含む温度制御可能な反応混合物を用いるタイプの選択的連結および増幅方法であり、ここに、該改良は：
該標的配列への結合の後に、該第一のプライマーと第二のプライマーとの間に形成された連結接合を横切ってのハイブリダイジングに対して特異的なプローブを用いて増幅された標的配列を検出することを包含し、ここに、該連結接合を横切ってのハイブリダイジングに対して特異的なプローブは分子ビーコンを含む、改良されたアッセイ。
【請求項８】
前記連結接合を横切ってのハイブリダイジングに対して特異的なプローブが、蛍光基および蛍光修飾基を有する、請求項７に記載の改良されたアッセイ。
【請求項９】
前記蛍光基が、前記プローブが前記連結接合を横切って結合されない場合に消光され、そして該蛍光基が、該プローブが該連結接合を横切って結合する場合に蛍光を発する、請求項８に記載の改良されたアッセイ。
【請求項１０】
特異的標的核酸配列を増幅するためのタイプの改良されたアッセイであって、ここに、該標的配列は目的の内部ＳＮＰを含み、該アッセイは、該標的配列と、それぞれ該標的配列の第一のセグメントおよび第二のセグメントに対して実質的に相補的な少なくとも一部分を有する連結可能な第一のプライマーおよび第二のプライマーと、該第一のプライマーおよび第二のプライマーのランダム配列セグメントに対して実質的に相補的である第三のプライマーとを含む温度制御可能反応混合物を用いるタイプの選択的連結および増幅方法であり、ここに、該改良は：
該標的配列の領域へのハイブリダイジングに対して特異的なプローブを用いて増幅された標的配列を検出することを包含し、ここに、該プローブは蛍光基および蛍光修飾基を含む、改良されたアッセイ。
【請求項１１】
前記プローブの伸長の際に、前記蛍光修飾基が切り出され、そして前記蛍光基が蛍光を発する、請求項１０に記載の改良されたアッセイ。
【請求項１２】
前記蛍光基が、二本鎖産物への取り込み前に消光され、そして二本鎖産物への取り込みの後に脱消光される、請求項７または１０に記載の改良されたアッセイ。
【請求項１３】
前記蛍光基が、前記プローブ中の配列が、二本鎖産物への取り込み前に該蛍光基を含有するプローブ中の相補的配列に結合して該蛍光基を消光するように、二本鎖産物への取り込み前に、二次構造によって消光される、請求項１２の改良されたアッセイ。
【請求項１４】
ナノリットルサンプリングアッセイであって、該アッセイは、
ａ）少なくとも１つの疎水性表面を有し、かつ親水性スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する第一のプラテン
を備え、
ここに、各スルーホールは、
ｉ）潜在的核酸標的配列の第一の末端において、第一のセグメントに対して実質的に相補的な３’末端の少なくとも一部分を有する第一のプライマー；および
ｉｉ）該潜在的核酸標的配列の第二の末端において、第二のセグメントに対して実質的に相補的な５’末端の少なくとも一部分を有する第二のプライマー；
を含み、
該第一のプライマーおよび第二のプライマーは、該潜在的核酸標的配列への結合に際に連結可能である、ナノリットルサンプリングアレイ。
【請求項１５】
請求項１４に記載のナノリットルサンプリングアッセイであって、さらに、
少なくとも１つの疎水性表面を有し、かつ親水性スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する第二のプラテン
を備え、
ここに、前記第一のプラテンおよび第二のプラテンは、各々のスルーホールが整列されるように固定して連結される、ナノリットルサンプリングアレイ。
【請求項１６】
整列したスルーホールの少なくとも１つの対が、第一のアッセイプロセスのための第一の試薬および第二のアッセイプロセスのための第二の試薬を含む、請求項１４に記載のナノリットルサンプリングアレイ。
【請求項１７】
前記アッセイプロセスの１つがＰＣＲ増幅である、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項１８】
前記アッセイプロセスの１つが、ＳＮＰを有する増幅された標的核酸配列の検出である、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項１９】
増幅された標的核酸配列の検出が、標的配列への結合の際に蛍光を発する二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡへの結合に対して特異的な色素を使用する工程を包含する、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項２０】
増幅された標的核酸配列の検出が、融解温度（Ｔｍ）の差によって個々の増幅された標的配列を識別する工程を包含する、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項２１】
増幅された標的核酸配列の検出が、該標的配列への結合の後に、前記第一のプライマーと第二のプライマーとの間に形成された連結接合を横切ってのハイブリダイジングに対して特異的なプローブを使用する工程を包含し、ここに、該プローブは蛍光基および蛍光修飾基を有する、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項２２】
増幅された標的核酸配列の検出が、該標的配列の領域へのハイブリダイジングに対して特異的な蛍光基および蛍光修飾基を含有するプローブを使用する工程を包含し、ここに、該プローブの伸長の際に、該蛍光修飾基が切り出され、そして該蛍光基が蛍光を発する、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項２３】
前記蛍光基が二本鎖産物への取り込み前に消光され、そして二本鎖産物への取り込み後に脱消光される、請求項２２に記載のアレイ。
【請求項２４】
前記蛍光基が、前記プローブ中の配列が、二本鎖産物への取り込み前に、該蛍光基を含有するプローブ中の相補的配列に結合して該蛍光基を消光するように、二本鎖産物への取り込み前に二次構造によって消光される、請求項２３に記載のアレイ。
【請求項２５】
前記プライマーが、乾燥によって試料スルーホールのコーティングの上、内、または下に結合され、該コーティングは生体適合性材料を含む、請求項１４〜２４のいずれかに記載のナノリットルサンプリングアレイ。
【請求項２６】
核酸の標的配列におけるＳＮＰを同定する方法であって、該方法は：
スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する第一の試料プラテンを提供する工程であって、各スルーホールは該標的配列の第一のセグメントに対して実質的に相補的な少なくとも一部分を有する第一のプライマーと、該標的配列の第二のセグメントに対して実質的に相補的な少なくとも一部分を有する第二のプライマーと、該第一のプライマーおよび第二のプライマーのランダム配列セグメントに対して実質的に相補的である第三のプライマーとを有し、該第二のプライマーの５’末端は、核酸標的配列の結合の後に該第一のプライマーの３’末端に連結可能である、工程；
目的のＳＮＰを有する核酸の標的配列を含有する試料を該アレイ中のスルーホールに導入する工程；
該アレイ中のスルーホールに試薬を導入する工程であって、該試薬は増幅を行うための試薬、連結を行うための試薬、および少なくとも４つの異なるヌクレオチド塩基を含む、工程；
第一のプライマーおよび第二のプライマーの連結を行って、連結産物を生じさせる工程；
該連結産物および標的配列の増幅を行う工程；
増幅された標的配列を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項２７】
連結を実行する工程および増幅を実行する工程が、リガーゼおよびポリメラーゼを添加し、続いて、アレイを制御温度条件に供する工程を包含する、請求項２６に記載の核酸の標的配列におけるＳＮＰを同定する方法。
【請求項２８】
検出する工程が、標的配列への結合の際に蛍光を発する二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡへの結合に対して特異的な色素を使用する工程を包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
検出する工程が、融解温度（Ｔｍ）の差によって個々の増幅された標的配列を識別する工程を包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
検出する工程が、前記標的配列への結合の後に、前記第一のプライマーと第二のプライマーとの間に形成された連結接合を横切ってのハイブリダイジングに対して特異的なプローブを使用する工程を包含し、ここに、該プローブは蛍光基および蛍光修飾基を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
検出する工程が、前記標的配列の領域へのハイブリダイジングに対して特異的な蛍光基および蛍光修飾基を含有するプローブを使用する工程を包含し、ここに、該プローブの伸長の際に、該蛍光修飾基が切り出され、そして該蛍光基が蛍光を発する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記蛍光基が二本鎖産物への取り込み前に消光され、そして二本鎖産物への取り込み後に脱消光される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記蛍光基が、前記プローブ中の配列が、二本鎖産物への取り込み前に、該蛍光基を含有するプローブ中の相補的配列に結合して該蛍光基を消光するように、二本鎖産物への取り込み前に二次構造によって消光される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
増幅された標的核酸配列の同定に用いるためのキットであって、該キットは、以下ａ）およびｂ）：
ａ）１つの疎水性表面を有し、かつ親水性スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する試料プラテンであって、
ここに、各試料プラテンのスルーホールは、少なくとも、
ｉ）潜在的核酸標的配列の第一のセグメントに対して実質的に相補的な少なくとも一部分を有する第一のプライマー；
ｉｉ）該潜在的核酸標的配列の第二のセグメントに対して実質的に相補的な少なくとも一部分を有する第二のプライマー
を含み、該第一のプライマーおよび第二のプライマーは該潜在的核酸標的配列への結合の際に連結可能である、試料プラテン、
ｂ）スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する試薬プラテンであって、
各試薬プラテンのスルーホールは、少なくとも、
ｉ）該第一のプライマーおよび第二のプライマーのランダム配列セグメントに対して実質的に相補的である第三のプライマー；
ｉｉ）少なくとも４つの異なるヌクレオチド塩基
ｉｉｉ）連結を行うための試薬；および
ｉｖ）蛍光色素
を含む、試薬プラテン、
を備え、
該試薬プラテンは、試薬成分および標的核酸試料の該試料プラテン中のプライマーへの送達を可能とする、試料プラテンに対応する構造的幾何学を有する、キット。
【請求項３５】
ＰＣＲ適合緩衝液もまた含まれる、請求項３４に記載の増幅された標的核酸配列の同定に用いるためのキット。
【請求項３６】
前記蛍光色素が、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩＩ、ＹＯＹＯ（登録商標）−１、ＴＯＴＯ（登録商標）−１、ＰＯＰＯ（登録商標）−３、または臭化エチジウムを含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
前記プライマーが乾燥によって試料スルーホールのコーティング上、内、または下に結合され、該コーティングは生体適合性材料を含む、請求項３４〜３６のいずれかに記載のキット。
【請求項３８】
特異的標的核酸配列を増幅するためのタイプの改良されたアッセイであって、ここに、該標的配列は目的の内部ＳＮＰを含み、該アッセイは、該標的配列と、それぞれ該標的配列の第一のセグメントおよび第二のセグメントに対して実質的に相補的な少なくとも一部分を有する連結可能な第一のプライマーおよび第二のプライマーと、該第一のプライマーおよび第二のプライマーのランダム配列セグメントに対して実質的に相補的である第三のプライマーとを含む制御温度反応混合物を用いるタイプの選択的連結および増幅方法であり、ここに、該改良が：
１以上の標的核酸配列の領域に対するハイブリダイジングに特異的な１以上のプローブを用いて、単一チューブ反応システムにおいて１以上の増幅された標的配列を検出すること
を包含し、ここに、該１以上のプローブの各々は、別個の蛍光基および蛍光修飾基を含有し、そしてここに、該１以上のプローブのハイブリダイゼーションは、該別個の蛍光基の蛍光をもたらす、改良されたアッセイ。
【請求項３９】
前記プローブの伸長の際に、前記蛍光修飾基が切り出され、そして該蛍光基が蛍光を発する、請求項３８に記載の改良されたアッセイ。
【請求項４０】
前記蛍光基が二本鎖産物への取り込み前に消光され、そして二本鎖産物への取り込み後に脱消光される、請求項３８に記載の改良されたアッセイ。
【請求項４１】
前記蛍光基が、前記プローブ中の配列が、二本鎖産物への取り込み前に、該蛍光基を含有するプローブ中の相補的配列に結合して該蛍光基を消光するように、二本鎖産物への取り込み前に二次構造によって消光される、請求項４０に記載の改良されたアッセイ。
【請求項４２】
前記１以上の標的核酸配列が２つであり、各々が目的の別個のＳＮＰを有する、請求項３８に記載の改良されたアッセイ。
【請求項４３】
前記１以上のハイブリダイズ可能なプローブが２つであり、各々が、別個のフルオロフォアおよび２つの標的核酸配列の各々にハイブリダイズし、それを増幅する、ユニークな配列を有する、請求項４２に記載の改良されたアッセイ。
【請求項４４】
前記１以上の標的核酸配列が３つであり、各々が目的の別個のＳＮＰを有する、請求項３８に記載の改良されたアッセイ。
【請求項４５】
前記１以上のハイブリダイズ可能なプローブが３つであり、各々が、別個のフルオロフォアおよび３つの標的核酸配列の各々にハイブリダイズし、それを増幅する、ユニークな配列を有する、請求項４４に記載の改良されたアッセイ。
【請求項４６】
前記１以上の標的核酸配列が４つであり、各々が目的の別個のＳＮＰを有する、請求項３８に記載の改良されたアッセイ。
【請求項４７】
前記１以上のハイブリダイズ可能プローブが４つであり、各々が、別個のフルオロフォアおよび４つの標的核酸配列の各々にハイブリダイズし、それを増幅する、ユニークな配列を有する、請求項４６に記載の改良されたアッセイ。
【請求項４８】
特異的標的核酸配列を増幅するためのタイプの改良されたアッセイであって、ここに、該標的配列は目的の内部ＳＮＰを含み、該アッセイは、該標的配列と、それぞれ該標的配列の第一のセグメントおよび第二のセグメントに対して実質的に相補的な少なくとも一部分を有する連結可能な第一のプライマーおよび第二のプライマーと、該第一のプライマーおよび第二のプライマーのランダム配列セグメントに対して実質的に相補的である第三のプライマーとを含む制御温度反応混合物を用いるタイプの選択的連結および増幅方法であり、ここに、該改良が：
１以上の第四のプライマーを用いる単一チューブ反応系において１以上の増幅された標的配列を検出することを包含し、各々は、蛍光基および蛍光修飾基を有し、そして各々は、１以上の標的核酸配列に対して連結された鋳型のユニークな領域に対して相補的であり、ここに、第四のプライマーの該１以上の標的核酸配列への取り込みおよびその増幅の際に、該別個の蛍光基の蛍光は、単一チューブ反応系における１以上の増幅された標的核酸配列の検出が得られるように起こる、改良されたアッセイ。
【請求項４９】
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを使用する工程をさらに包含する、請求項１、７、１０、２６または４８のいずれかに記載の改良されたアッセイ。
【請求項５０】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを使用する工程をさらに包含する、請求項１、７、１０、２６または４８いずれかに記載の改良されたアッセイ。
【請求項５１】
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを使用する工程をさらに包含する、請求項１、７、１０、２６または４８いずれかに記載の改良されたアッセイ。
【請求項５２】
前記別個の蛍光基が、Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲｅｄＴＭ、Ｙａｋｉｍａ  ＹｅｌｌｏｗＴＭを含み、前記蛍光修飾基が、ＥｃｌｉｐｓｅＴＭ非蛍光クエンチャー、ダブシル、または他の蛍光消光分子を含む、請求項７、１０、３８または４８いずれかに記載の改良されたアッセイ。
【請求項５３】
前記１以上の標的核酸配列が２つであり、各々が目的の別個のＳＮＰを有する、請求項４８の改良されたアッセイ。
【請求項５４】
前記１以上の第四のプライマーが２つであり、各々が、別個のフルオロフォアおよび２つの標的核酸配列の各々に取り込こまれ、それを増幅するユニークな配列を有する、請求項５３に記載の改良されたアッセイ。
【請求項５５】
前記１以上の標的核酸配列が３つであり、各々が目的の別個のＳＮＰを有する、請求項４８に記載の改良されたアッセイ。
【請求項５６】
前記１以上の第四のプライマーが３つであり、各々が、別個のフルオロフォアおよび３つの標的核酸配列の各々に取り込まれ、それを増幅するユニークな配列を有する、請求項５５に記載の改良されたアッセイ。
【請求項５７】
前記１以上の標的核酸配列が４つであり、各々が目的の別個のＳＮＰを有する、請求項４８に記載の改良されたアッセイ。
【請求項５８】
前記１以上の第四のプライマーが４つであり、各々が、別個のフルオロフォアおよび４つの標的核酸配列の各々に取り込まれ、それを増幅する、ユニークな配列を有する、請求項５７に記載の改良されたアッセイ。
【請求項５９】
ナノリットルサンプリングアッセイであって、
ａ）少なくとも１つの疎水性表面を有し、かつ親水性スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する第一のプラテン
を含み、
ここに、各第一のプラテンのスルーホールは、少なくとも、
ｉ）各々が、１以上の標的核酸配列の第一のセグメントに対して実施的に相補的な少なくとも一部分を有する、１以上の第一のプライマー；および
ｉｉ）該１以上の標的核酸配列の第二のセグメントに対して実質的に相補的な一部分を有する第二のプライマー
を含み、該第一のプライマーおよび第二のプライマーは、該１以上の標的核酸配列への結合の際に連結可能である、ナノリットルサンプリングアレイ。
【請求項６０】
請求項５９に記載のナノリットルサンプリングアレイであって、
少なくとも１つの疎水性表面を有し、かつ親水性の第二のプラテンのスルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する第二のプラテン
をさらに含み、ここに、前記第一のプラテンおよび第二のプラテンは、各々のスルーホールが整列されるように固定されて連結される、ナノリットルサンプリングアレイ。
【請求項６１】
整列されたスルーホールの少なくとも１つの対が、第一のアッセイプロセスのための第一の試薬および第二のアッセイプロセスのための第二の試薬を少なくとも含む、請求項５９に記載のナノリットルサンプリングアレイ。
【請求項６２】
前記アッセイプロセスの１つがＰＣＲ増幅である、請求項６１に記載のアレイ。
【請求項６３】
前記アッセイプロセスの１つが、各々がＳＮＰを有する、１以上の増幅された標的核酸配列の検出である、請求項６１に記載のアレイ。
【請求項６４】
１以上の増幅された標的核酸配列の検出が、前記１以上の標的配列の各々の領域へのハイブリダイジングに対して特異的な１以上のプローブを使用する工程を包含し、各プローブは別個の蛍光基および蛍光修飾基を含有し、ここに、該１以上のプローブの１以上の増幅された標的核酸配列への伸長の際に、該別個の蛍光修飾基の各々が切り出され、そして該別個の蛍光基が蛍光を発する、請求項６３に記載のアレイ。
【請求項６５】
１以上の増幅された標的核酸配列の検出が、前記１以上の標的配列の各々の領域へのハイブリダイジングに対して特異的な１以上のプローブを使用する工程を包含し、各プローブは別個の蛍光基および蛍光修飾基を含有し、ここに、該蛍光基は、二本鎖産物への取り込み前に消光され、そして二本鎖産物への取り込み後に脱消光される、請求項６３に記載のアレイ。
【請求項６６】
前記蛍光基は、前記プローブ中の配列が、二本鎖産物への取り込み前に、該蛍光基を含有するプローブ中の相補的配列に結合して該蛍光基を消光するように、二本鎖産物への取り込み前に二次構造によって消光される、請求項６５に記載のアレイ。
【請求項６７】
前記プライマーが、乾燥によって試料スルーホールのコーティングの上、内または下に結合され、該コーティングは生体適合性材料を含む、請求項５９〜６６のいずれかに記載のナノリットルサンプリングアレイ。
【請求項６８】
１以上の標的核酸配列中の１以上のＳＮＰを同定する方法であって、該方法は：
スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する第一の試料プラテンを提供する工程であって、各試料プラテンのスルーホールは少なくとも１以上の第一のプライマーと、該標的配列の第二のセグメントに対して実質的に相補的である少なくとも一部分を有する第二のプライマーと、該第二のプライマーのランダム配列セグメントに対して実質的に相補的である第三のプライマーとを含み、各第一のプライマーは該１以上の標的核酸配列の第一のセグメントに対して実質的に相補的である少なくとも一部分を有し、該第二のプライマーの５’末端は該１以上の標的核酸配列への結合後に該第一のプライマーの３’末端に連結可能である、工程；
各々が目的のＳＮＰを有する１以上の標的配列の核酸を含有する試料を、アレイ中の試料プラテンのスルーホールに導入する工程；
該アレイ中の試料プラテンのスルーホールに試薬を導入する工程であって、該試薬は増幅を行うための試薬、連結を行うための試薬、および少なくとも４つの異なるヌクレオチド塩基を含む、工程；
該第一のプライマーおよび第二のプライマーの連結を行って、連結産物を生じる工程；
該連結産物および１以上の標的配列の増幅を行う工程；ならびに
１以上の増幅された標的配列を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項６９】
連結を実行する工程および増幅を実行する工程が、リガーゼおよびポリメラーゼを加え、続いて、アレイを制御温度条件に供する工程を包含する、請求項６８に記載の核酸の標的配列中のＳＮＰを同定する方法。
【請求項７０】
アレイ中の前記試料プラテンのスルーホールへ試薬を導入する工程の前に、
１以上の標的核酸配列の領域へのハイブリダイジングに対して特異的な１以上のプローブを含有する試料を導入する工程、および、該１以上の標的配列を増幅する工程をさらに包含し、ここに、該１以上のプローブは、各々、別個の蛍光基および蛍光修飾基を含有する、請求項６８に記載の１以上のＳＮＰを同定する方法。
【請求項７１】
前記１以上のプローブの１以上の増幅された標的核酸配列への伸長の際に、前記別個の蛍光修飾基の各々が切り出され、そして前記別個の蛍光基が蛍光を発する、請求項７０に記載の１以上のＳＮＰを同定する方法。
【請求項７２】
前記蛍光基が二本鎖産物への取り込み前に消光され、そして二本鎖産物への取り込み後に脱消光される、請求項７０に記載の１以上のＳＮＰを同定する方法。
【請求項７３】
前記蛍光基が、前記プローブ中の配列が、二本鎖産物への取り込み前に、該蛍光基を含有するプローブ中の相補的配列に結合して該蛍光基を消光するように、二本鎖産物への取り込み前に二次構造によって消光される、請求項７２に記載の１以上のＳＮＰを同定するための方法。
【請求項７４】
１以上の標的核酸配列における１以上のＳＮＰを同定する工程が、１以上の増幅された標的核酸配列へ取り込まれる前記１以上の別個の蛍光基の異なる蛍光をモニタリングする工程を包含する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
ポリメラーゼが５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、請求項６８に記載の核酸の１以上の標的配列における１以上のＳＮＰを同定する方法。
【請求項７６】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを使用する工程をさらに包含する、請求項６８に記載の核酸の標的配列における１以上のＳＮＰを同定する方法。
【請求項７７】
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを使用する工程をさらに包含する、請求項６８に記載の１以上の標的核酸配列における１以上のＳＮＰを同定する方法。
【請求項７８】
前記１以上の標的核酸配列が２つであり、各々が目的の別個のＳＮＰを有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７９】
前記１以上のハイブリダイズ可能なプローブが２つであり、各々が、別個のフルオロフォアおよび２つの標的核酸配列の各々にハイブリダイズし、それを増幅するユニークな配列を有する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記１以上の標的核酸配列が３つであり、各々が目的の別個のＳＮＰを有する、請求項７０に記載の方法、
【請求項８１】
前記１以上のハイブリダイズ可能なプローブが３つであり、各々が、別個のフルオロフォアおよび３つの標的核酸配列の各々にハイブリダイズし、それを増幅するユニークな配列を有する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記１以上の標的核酸配列が４つであり、各々が目的の別個のＳＮＰを有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項８３】
前記１以上のハイブリダイズ可能なプローブが４つであり、各々が、別個のフルオロフォアおよび４つの標的核酸配列の各々にハイブリダイズし、それを増幅するユニークな配列を有する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
１以上の増幅された標的核酸配列の同定に用いるためのキットであって、該キットは、以下ａ）およびｂ）：
ａ）１つの疎水性表面を有し、そして親水性スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する試料プラテンであって、
ここに、各試料プラテンのスルーホールは、少なくとも、
ｉ）各々が、１以上の標的核酸配列の第一のセグメントに対して実質的に相補的な少なくとも一部分を有する、１以上の第一のプライマー、；
ｉｉ）該１以上の標的核酸配列の第二のセグメントに対して実質的に相補的な少なくとも一部分を有する第二のプライマー
を含有し、該１以上の第一のプライマーの３’末端は、該１以上の標的核酸配列への結合後に該第二のプライマーの５’末端に連結可能である、試料プラテン、
ｂ）スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する試薬プラテンであって、
各試薬プラテンのスルーホールは、少なくとも、
ｉ）該第二のプライマーのランダム配列セグメントに対して実質的に相補的である第三のプライマー；
ｉｉ）１以上の標的核酸配列の領域へのハイブリダイジング、および該１以上の標的配列の増幅に対して特異的な１以上のプローブであって、ここに、該１以上のプローブは、各々、別個の蛍光基および蛍光修飾基を含有する、１以上のプローブ；
ｉｉｉ）４つの異なるヌクレオチド塩基；
ｉｖ）リガーゼ；
を含有する、試薬プラテン
とを備え、該試薬プラテンは、試薬の成分および標的核酸試料を該試料プラテン中のプライマーに送達することを可能にする試料プラテンに対応する構造的幾何学を有する、キット。
【請求項８５】
ＰＣＲ適合緩衝液もまた含まれる、請求項８４に記載の増幅された標的核酸配列の同定に用いるためのキット。
【請求項８６】
前記プライマーが、乾燥によって試料スルーホールのコーティング上、内または下に結合され、該コーティングは生体適合性材料を含む、請求項８４または８５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み合わされた連結および増幅プロトコルに関連する核酸の標的配列を増幅し、同定するためのアッセイ、およびそのようなアッセイを行うためのナノリットルサンプリングアレイの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子的変動は、癌、多発性硬化症、自己免疫疾患、嚢胞性線維症および精神分裂病を含めた、多数の病気状態および病気に対する素因に益々関連付けられている。遺伝子的変動を迅速かつ安価に同定する能力は、そのような病気、およびこれらの病気に対する素因についての診断、危険性評価、および予後の決定を大いに促進する。
【０００３】
遺伝子的変動を同定するための１つの可能性は、その双方をここに引用して援用する、Ｂｈａｔｎａｇａｒらに対する特許文献１およびＴｏｄｄらに対する特許文献２に開示された選択的連結および増幅技術を組み合わせることを含む。双方の特許は少なくとも３つのプライマーの使用を開示し、そのうちの２つは、ハイブリダイゼーション後に連結させ、次いで延長させることができる標的核酸配列の１つの鎖の３’末端の隣接領域に相補的である。Ｔｏｄｄらにおいては、第三のプライマーは、（上流プライマーに連結される）下流プライマーの３’末端におけるランダム配列に対して相補的であって、第一のプライマーの５’末端のランダム配列と同一であるランダム配列である。Ｂｈａｔｎａｇａｒらにおいては、第三のプライマーは上流プライマーに対して相補的であり、また、標的配列の反対鎖に対しても相補的である。双方の場合において、増幅を起こさせるためには第三のプライマーの３’末端において相補性がなければならない。
【０００４】
熱−安定性ポリメラーゼを用いて標的核酸配列を増幅させ、連結および増幅両反応は同一反応混合物中で行うことができる。隣接プライマーの間の任意のギャップを存在させることができ、これはポリメラーゼによって満たされ、隣接プライマーの首尾よい連結を可能とすることができる。そのようなシステムは、標的核酸配列における遺伝子可変性の同定、および多数の対立遺伝子の同定を可能とする。
【特許文献１】米国特許第５，５９３，８４０号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２４５，５０５号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明の第一の実施形態において、特異的標的核酸配列を増幅させるためのタイプの改良されたアッセイが提供され、ここに、該標的配列は注目する内部ＳＮＰを含み、該アッセイは標的配列、各々、標的配列の第一および第二のセグメントに実質的に相補的な少なくとも部分を有する連結可能な第一および第二のプライマー、および第一および第二のプライマーのランダム配列セグメントに対して実質的に相補的である第三のプライマーを含む制御温度反応混合物を用いるタイプの選択的連結および増幅方法であり、ここに、該改良は：注目するＳＮＰを持つ標的核酸配列にハイブリダイズするように設計された２つのユニークなプローブを用いて核酸の１以上の標的配列における１以上のＳＮＰの間を単一チューブ反応系において区別することを含み、各ハイブリダイズ可能なプローブは増幅された標的核酸産物へのプローブの取り込みまでクエンチされる異なる蛍光タグを有する。
【０００６】
標的配列が標的配列の末端にあるのではない注目する１以上のＳＮＰを含む、特異的標的核酸配列を増幅するためのタイプの、改良されたアッセイのいくつかの実施形態において、該アッセイは標的配列、標的配列の第一の末端における第一のセグメントに対して実質的に相補的であるその３’末端の少なくとも部分を有する第一のプライマー、標的配列の第二の末端における第二のセグメントに対して実質的に相補的であるその５’末端の少なくとも部分を有する第二のプライマー、該第二のプライマーの５’末端は第一のプライマーの３’末端の２ないし４の塩基に隣接し、またはその中にあり、ここに、標的配列のＳＮＰに対して相補的なヌクレオチドは第一のプライマーの３’末端または第二のプライマーの５’末端いずれかに存在し、および第一のプライマーの３’末端におけるランダム配列セグメントに対して、および第一のプライマーの５’末端における実質的に同様な配列に対して実質的に相補的である第三のプライマー、少なくとも４つの異なるヌクレオチド塩基、熱安定性ポリメラーゼおよび熱安定性リガーゼを含む熱サイクル反応混合物を用いるタイプの選択的連結および増幅方法であり、ここに、該改良は注目するＳＮＰを持つ標的核酸配列にハイブリダイズするように設計された２つのユニークなプローブを用いて核酸の１以上の標的配列における１以上のＳＮＰの間を単一チューブ反応系において識別することを含み、各ハイブリダイズ可能なプローブは、増幅された標的核酸産物へのプローブの取り込みまでクエンチされる異なる蛍光タグを有する。第一の蛍光タグを持つ第一のハイブリダイズ可能なプローブは、第一のプライマーの３’末端にある注目する第一のＳＮＰを有する連結された第一のプライマー−第二のプライマー産物から第三のプライマーによって生じた第一の増幅された標的核酸にハイブリダイズするユニークなランダム配列を有し、第一のハイブリダイズ可能なプローブは、それにより、増幅された反対鎖標的核酸産物へ取り込まれて、第一の蛍光シグナルを与えるようになる。第二の蛍光タグを持つ第二のハイブリダイズ可能なプローブは、第一のプライマーの３’末端にある注目する第二のＳＮＰを有する異なる連結された第一のプライマー−第二のプライマー産物から第三のプライマーによって生じた第二の増幅された産物にハイブリダイズするユニークなランダム配列を有し、第二のハイブリダイズ可能なプローブは、それにより、増幅された反対鎖標的核酸産物へ取り込まれて、第二の蛍光シグナルを与えるようになる。
【０００７】
好ましい実施形態において、第一および第二のハイブリダイズ可能なプローブのランダム配列はユニークな配列であり、従って、増幅された標的核酸へのハイブリダイズ可能なプローブの各々の特異的取込みは、ハイブリダイズ可能なプローブが検出するように設計された注目する特定のＳＮＰを有する第一のプライマー−第二のプライマー産物の連結の後に優先的に起こる。増幅された産物へのハイブリダイズ可能なプローブの取込みに際して、蛍光が起こり、増幅された産物の検出を、非特異的バックグラウンド産物から識別可能とする。加えて、第三のプライマーのランダム配列もまた、そのような非特異的産物が注目するＳＮＰを有する増幅された産物の検出に干渉しない十分低いレベルまで、ヒトまたは他の種の染色体の存在下で生じ得る非特異的増幅産物を低下させるようにＰＣＲにつき最適化されたユニークな配列である。
【０００８】
別法として、２つのハイブリダイズ可能なプローブは蛍光タグを含まないが、注目する異なるＳＮＰを有する異なる連結産物を識別するように設計された単なるさらなるプライマーである。次いで、さらなるプライマーと同様な、さらなるハイブリダイズ可能なプローブを用いて注目するＳＮＰを持つ増幅された産物の検出がなされるが、増幅と干渉しないように開発される。これらのハイブリダイズ可能なプローブは蛍光タグを有し、あるいは別法として、各々は異なる蛍光タグを有し、増幅された産物へハイブリダイズするに際して、蛍光を発し、それにより、増幅された産物の検出を可能とする。
【０００９】
本発明のもう１つの実施形態において、特異的標的核酸配列を増幅するためのタイプの改良されたアッセイが提供され、ここに、該標的配列は標的配列の末端にはない注目するＳＮＰを含み、該アッセイは標的配列、標的配列の第一の末端における第一のセグメントに対して実質的に相補性であるその３’末端の少なくとも部分を有する第一のプライマー、標的配列の第二の末端における第二のセグメントに対して実質的に相補的であるその５’末端の少なくとも部分を有する第二のプライマー、該第二のプライマーの５’末端は第一のプライマーの３’末端に隣接しており、ここに、標的配列のＳＮＰに相補的なヌクレオチドは第一のプライマーの３’末端または第二のプライマーの５’末端いずれかに存在し、および第二のプライマーの３’末端におけるランダムな配列セグメントに対して、および第一のプライマーの５’末端における実質的に同様な配列に対して実質的に相補的である第三のプライマー、少なくとも４つの異なるヌクレオチド塩基、熱安定性ポリメラーゼ、および熱安定性リガーゼを含む熱サイクル反応混合物を用いるタイプの選択的連結および増幅方法であり、ここに、該改良は、標的配列への結合に際して蛍光を発する二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡへの結合に特異的な色素を用いて増幅された標的配列を均一に検出することを含む。好ましい実施形態において、第三のプライマーのランダム配列は、非特異的産物がヒトまたは他の種の染色体の存在下で生じないように、ＰＣＲにつき最適化されたユニークな配列である。いくつかの実施形態において、プライマーは、スルーホールへの適用の後にプライマーを乾燥することによってスルーホールの表面のワックス様コーティングのような生体適合性材料上に、内にまたは下に付着させることができ、ここに、該生体適合性材料は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）材料を含むことができる。
【００１０】
別法として、本発明によるアッセイは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く熱安定性ポリメラーゼ、または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く熱安定性ポリメラーゼ、または５’−３’および３’−５’両エキソヌクレアーゼを欠く熱安定性ポリメラーゼを用いることができる。５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く熱安定性ポリメラーゼの例はＳｔｏｆｆｅｌ断片、ＩｓｉｓＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｙｒａＴＭ  ｅｘｏ（−）、ＤＮＡポリメラーゼおよびＱ−ＢｉｏＴａｑＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。３’−５’エキソヌクレア−ゼ活性を欠く熱安定性ポリメラーゼの例はＴａｑポリメラーゼ、ＳｕｒｅＰｒｉｍｅＴＭポリメラーゼ、およびＱ−ＢｉｏＴａｑＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。５’−３’および３’−５’両エキソヌクレアーゼ活性を欠く熱安定性ポリメラーゼの例はＱ−ＢｉｏＴａｑＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼである。適当な色素はＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩおよびＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩＩ、ＹＯＹＯ（登録商標）−１、ＴＯＴＯ（登録商標）−１、ＰＯＰＯ（登録商標）−３、臭化エチジウム、または蛍光を用いて増幅された標的核酸配列の迅速な感受性検出を可能とするいずれかの他の色素を含む。
【００１１】
もう１つの実施形態において、少なくとも１つの疎水性表面を有し、かつ親水性スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する第一のプラテンを含むナノリットルサンプリングアレイが提供される。この特別な実施形態において、各スルーホールは、少なくとも、潜在的核酸標的配列の第一の末端における第一のセグメントに対して実質的に相補的であるその３’末端の少なくとも部分を有する第一のプライマー、および潜在的核酸標的配列の第二の末端における第二のセグメントに対して実質的に相補的であるその５’末端の少なくとも部分を有する第二のプライマーを含み、第二のプライマーの５’末端は、潜在的核酸標的配列への結合に際して、第一のプライマーの３’末端に隣接する。
【００１２】
加えて、該サンプリングアレイは、さらに、少なくとも１つの疎水性表面を有し、かつ親水性スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する第二のプラテンを含むことができ、ここに、該第一および第二のプラテンは、各々のスルーホールが整列するように固定してカップリングされる。
【００１３】
なおもう１つの実施形態において、核酸の標的配列においてＳＮＰを同定する方法が提供され、該方法は、スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する第一の試料プラテンを供し、各スルーホールは標的配列の第一の末端における第一のセグメントに対して実質的に相補的であるその３’末端の少なくとも部分を有する第一のプライマー、標的配列の第二の末端における第二のセグメントに対して実質的に相補的であるその５’末端の少なくとも部分を有する第二のプライマー、該第二のプライマーの５’末端は第一のプライマーの３’末端に隣接しており、および第二のプライマーの３’末端におけるランダム配列セグメントに対して、および第一のプライマーの５’末端に対して実質的に相補的である第三のプライマーを有し、注目するＳＮＰを有する核酸の標的配列を含有する試料を該アレイに導入し、試薬をアレイ中のスルーホールに導入し、該試薬は熱安定性ポリメラーゼ、熱安定性リガーゼ、および少なくとも４つの異なるヌクレオチド塩基を含み、アレイを熱サイクルに付し、次いで、増幅された標的配列を検出することを含む。好ましい実施形態においては、プライマー１および２は、５’プライマー（第一のプライマー）の３’末端、または３’プライマー（第二のプライマー）の５’末端のいずれかに位置した標的鎖ＳＮＰに対して可能なマッチを持つように設計される。第一および第二のプライマーが相互に対して隣接し、かつＳＮＰに近接する標的鎖にハイブリダイズすれば、もしプライマーの１つによってＳＮＰに対する成功したマッチがあった時にのみ、プライマーの連結が起こる。このようにして、連結が選択的であって、注目するＳＮＰを含む望まれる標的配列のそのように選択的な増幅も起こる。前記したように、いくつかの実施形態において、プライマーは、スルーホールへの適用の後にプライマーを乾燥することによって、スルーホールの表面のワックス様コーティングのような生体適合性材料上に、内にまたは下に付着させることができ、ここに、生体適合性材料が、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）材料を含むことができる。
【００１４】
加えて、核酸の標的配列におけるＳＮＰを同定する該方法は、加えて、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く熱安定性ポリメラーゼを用いて、次いで、標的核酸への結合に際して蛍光を発する二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡへの結合に対して特異的な色素を用いて増幅された標的配列を検出することを含むことができる。別法として、検出は、異なる融解曲線を持つ増幅された標的配列を生じさせて、融解温度（Ｔｍ）の差によって個々の増幅された標的配列を識別するように設計された第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いることを含むことができ、あるいは標的配列への結合の後に第一のプライマーおよび第二のプライマーの間で形成された連結接合を横切るハイブリダイジングに特異的なプローブを用いることを含むことができ、ここに、該連結接合を横切るハイブリダイジングに特異的なプローブは蛍光基および蛍光修飾基を有し、あるいは、蛍光基、および標的配列の領域に対するハイブリダイジングに特異的な蛍光修飾基を含有するプローブを用いることを含み、ここに、プローブの延長に際して、蛍光修飾基は切り出され、蛍光基は蛍光を発する。加えて、検出は、増幅された標的核酸配列におけるいずれかのユニークな配列に対するハイブリダイジングに特異的なプローブを用いてなすことができ、該プローブは、ハイブリダイゼーションに際して、蛍光を発し、増幅された標的核酸の検出を可能とするように、蛍光基および蛍光修飾基を有する。
【００１５】
検出の他の手段は、プライマー２のランダム配列にマッチする増幅プライマーの使用を含み、ここに、プライマーは、当該分野で公知のＬｕｘＴＭプライマーと同様に、ＰＣＲ産物に取り込まれる場合にのみ蛍光を発する蛍光基で標識される。そのような実施形態において、蛍光基は、取込みに先立って、プライマー／プローブにおける配列が蛍光基を含有するプライマー／プローブにおける相補的配列に結合し、蛍光基を消光するように、二本鎖産物への取り込みの前に第二の構造によって消光される。もう１つの実施形態において、プライマー１および２は、増幅された標的配列にハイブリダイズすると、プライマー１および２が連結され、増幅された後にのみ生成され、それらが蛍光を発するような、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）パートナーである。
【００１６】
なおもう１つの実施形態は、増幅された標的核酸配列の同定で用いられるキットを提供し、該キットは１つの疎水性表面を有し、かつ親水性スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する試料プラテンを含む。該キットのアレイにおいて、各スルーホールは、少なくとも、潜在的核酸標的配列の第一の末端における第一のセグメントに対して実質的に相補的であるその３’末端の少なくとも部分を有する第一のプライマー、および潜在的核酸標的配列の第二の末端における第二のセグメントに対して実質的に相補的なその５’末端の少なくとも部分を有する第二のプライマーを含み、第二のプライマーの５’末端は、潜在的核酸標的配列への結合に際して、第一のプライマーの３’末端に隣接している。該キットは、スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する試薬プラテンも含み、各スルーホールは、第二のプライマーの３’末端におけるランダム配列セグメントに対して、かつ第一のプライマーの５’末端における実質的に同様な配列に対して実質的に相補的である第三のプライマー、少なくとも４つの異なるヌクレオチド塩基、熱安定性ポリメラーゼおよび熱安定性リガーゼを含有する。この実施形態のキットにおいて、該試薬プラテンは試料プラテンに対応する構造的幾何学を有し、それにより、試薬成分および標的核酸試料の試料プラテン中のプライマーへの送達を可能とする。他の実施形態において、熱安定性ポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くことができる。
【００１７】
本発明のこれまでの特徴は、添付の図面を参照し、以下の詳細な記載を参照することによってより容易に理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（具体的な実施形態の詳細な説明）
定義。本明細書中および添付の請求の範囲で用いるように、以下の用語は、他の文脈が要求されない限り、示した意味を有すべきである。
【００１９】
「標的核酸」、「標的核酸配列」または「潜在的標的核酸配列」は、植物、動物、昆虫、微生物等からを含めた、いずれかの原核生物または真核生物ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。それは、単離され得るか、あるいは増幅すべき標的核酸配列に加えて、核酸配列を含有する試料に存在し得る。標的核酸配列は、標的配列のそれよりも長い核酸配列内に位置することができる。標的核酸配列は合成により、または酵素的に得ることができるか、あるいは当該分野で良く知られた方法によっていずれかの生物から単離することができる。核酸の特に有用な源は、生物の組織または血液試料、自己複製ベクターに存在する核酸、および細菌および真菌のようなウイルスおよび病原生物に由来する核酸に由来する。また、特に有用なのは、染色体再配列、挿入、欠失、トランスローケーションおよび他の突然変異によって引き起こされたもの、癌遺伝子によって引き起こされたもの、および癌に関連するもののような、病気状態に関連する標的核酸配列である。
【００２０】
「選択された」は、望まれる特徴を有する標的核酸配列を位置させ、プローブが標的核酸の適当なセグメントの周囲に構築されることを意味する。
【００２１】
「プローブ」または「プライマー」は、本明細書中において同一の意味、すなわち、一本鎖である核酸オリゴヌクレオチド配列を有する。用語オリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＴＮＡおよびＰＮＡを含む。
【００２２】
プローブまたはプライマーが、標的依存性連結または延長を可能とするような再生条件下で当該配列にハイブリダイズするならば、それは標的核酸配列に対して「実質的に相補的」である。再生は、二本鎖デュプレックス構造を形成するためのＡ−Ｘ（ここに、ＸはＴまたはＵである）およびＧ−Ｃ塩基の間の特異的塩基対合に依存する。従って、プライマー配列は、標的核酸配列の正確な配列を反映する必要はない。しかしながら、もし標的配列の正確なコピーが望まれれば、プライマーは正確な配列を反映すべきである。典型的には、「実質的に相補的な」プライマーは、標的核酸配列に対して相補的な少なくとも７０％以上の塩基を含有するであろう。より好ましくは、８０％以上の塩基が相補的であり、なおより好ましくは、９０％を超える塩基が相補的である。一般的には、プライマーは、連結または延長すべき末端における標的核酸配列にハイブリダイズして、標的依存性連結または延長を可能とすべきである。
【００２３】
プライマーはＲＮＡまたはＤＮＡであってよく、正常に取り込まれた塩基のアナログである、あるいは標識、または標識を付着させるのに適したリンカーアームを付着させることによって修飾されたある種の修飾された窒素性塩基を含有することができる。標的配列が未知である、あるいはそれが変性し得る位置においてはイノシンを用いることができる。オリゴヌクレオチドはプライマーの標的配列へのハイブリダイゼーションを可能とするのに、および増幅が進行するのを可能とするのに十分に長いべきである。それらは好ましくは１５ないし５０ヌクレオチド長、より好ましくは２０ないし４０ヌクレオチド長、なおより好ましくは２５ないし３５ヌクレオチド長である。プライマーのヌクレオチド配列は、含有量および長さ共に増幅すべき標的配列に依存して変化するであろう。
【００２４】
プライマーは、標的核酸配列に対する実質的に相補的な配列を含む１以上のオリゴヌクレオチドを含むことができると考えられる。したがって、より低いストリンジェント条件下では、オリゴヌクレオチドプライマーの各々は標的配列の同一セグメントにハイブリダイズするであろう。しかしながら、増大させるストリンジェントな条件下では、標的核酸配列に最も相補的なオリゴヌクレオチドプライマーのみがハイブリダイズするであろう。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、一般には、温度、溶媒、イオン強度および他のパラメーターに依存することが当業者に知られている。最も容易に制御されるパラメーターの１つは温度であり、選択的連結および増幅についての条件はＰＣＲ反応のそれと同様であるので、当業者であれば、望まれるストリンジェンシーのレベルを達成するのに必要な適当な条件を決定することができる。
【００２５】
本発明で用いるのに適したプライマーは、化学的または酵素的合成を含めた当該分野で知られたいずれかの方法から、あるいは非特異的核酸切断化学物質または酵素を用いるより大きな核酸の切断によって、あるいは部位特異的制限エンドヌクレアーゼを用いることによって誘導することができる。
【００２６】
本発明のリガーゼがプライマーを一緒に連結させるためには、用いるプライマーは好ましくはそれらの５’末端でリン酸化させる。これは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの使用を含めた、当該分野におけるいずれかの公知の方法によって達成することができる。プライマーは未標識または放射性標識ＡＴＰの存在下でリン酸化することができる。
【００２７】
用語「４つの異なるヌクレオチド塩基」は、文脈がＤＮＳである場合、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ），デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ），デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、およびデオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）を意味し、および文脈がＲＮＡである場合、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、およびグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を意味する。別法として、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ（デオキシイノシン三リン酸），ｒＩＴＰ（リボイノシン三リン酸）またはいずれかの他の修飾された塩基が該４つのヌクレオチド塩基のいずれかを置き換えることができ、あるいは反応混合物中において該４つのヌクレオチド塩基と一緒に含まれ、増幅された鎖に取り込むことができる。増幅工程は、少なくとも４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、または修飾されたヌクレオシド三リン酸の存在下で行って、ＤＮＡ鎖を生じさせ、あるいは４つのリボヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＤＴＰおよびＵＴＰ０）、または修飾されたリボヌクレオシド三リン酸の存在下で行って、プライマーの延長からＲＮＡ鎖を生じさせる。
【００２８】
用語「望まれる増幅された産物の適切な検出」は、競合する線状産物よりも望まれる増幅標的鎖の少なくとも２倍増加の検出を意味する。
【００２９】
用語「線状に増幅された産物を超えて検出可能な標的配列」は、標的配列が競合する線状に増幅された非連結プライマー産物のそれよりも少なくとも２倍で増幅されることを意味する。
【００３０】
本明細書中で用いるように、用語「ランダム配列」は、標的配列に無関係な、あるいは標的配列、またはテスト試料に存在することが予測されるであろう他の配列に結合しないように選択された配列を意味する。
【００３１】
本明細書中で用いるように、用語「生体適合性材料」は、該材料が、該生体適合性材料が存在する場合に、酵素反応のような生物学的プロセスが起こるのを妨げず、核酸および蛋白質のような生体分子の生物学的活性または必要な二次、三次または四次構造を排除せず、一般に、生物学的プロセスおよび分子と不適合ではないことを意味する。
【００３２】
本明細書中で用いるように、用語「核酸標的配列への結合に際して連結可能な第一および第二のプライマー」は、第一および第二のプライマーが、所望によりポリメラーゼ活性を加えてギャップを満たすことを含めた、ハイブリダイズした第一および第二のプライマーを適当な酵素的または非酵素的連結条件に付すと、第一および第二のプライマーが酵素的にまたは非酵素的に単一の連結された核酸産物に連結されるように、第二のプライマーの５’末端の約１−ないし４−ヌクレオチドギャップに隣接した、またはその内の第一のプライマーの３’末端を持つ潜在的標的核酸に結合することを意味する。
【００３３】
本明細書中で用いるように、用語「ポリメラーゼ」は、ポリメラーゼ、ヘリカーゼ、およびオリゴマーの合成を重合することができる他の蛋白質断片を含めたいずれのオリゴマー合成酵素を意味する。
【００３４】
本明細書中で用いる用語「制御温度反応混合物」は、サーモサイクル装置、等温装置、あるいは水、油および砂浴、インキュベーションチャンバー等のような温度−制御環境を含めた反応の温度制御を可能とすることが知られたいずれかの他の手段によって温度が制御されるいずれの反応混合物も意味する。
【００３５】
本発明による標的配列への結合に際して蛍光を発する二本鎖ＤＮＡへの結合に特異的な色素を用いて、増幅された標的配列の検出を通じて、標的配列の末端にはない単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を同定するための一般的なアッセイは後に記載し、図１ないし５に説明する。該アッセイは単一反応チャンバーまたは容器において、一連の反応チャンバーまたは容器において、親水性スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有するナノリットルサンプリングアレイにおいて、またはそのようなアレイおよび必要な試薬を含むキットにおいて行うことができる。検出は均一とすることができ、および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼ、または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼまたは双方のエキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを使用することができる。
【００３６】
アッセイは３つ（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）またはそれ以上（Ａ−Ｂ、Ｃ−Ｄ、Ｆ−Ｅ、Ｄ’）プライマーで行うことができ、単一標的における１以上のＳＮＰを同時に検出することが可能である。アッセイのいくつかのバージョンにおいて標的ヌクレオチドＳＮＰに対して相補的なヌクレオチドは第二のプライマーＰ２の５’末端においてまたはその近くに存在させる。他のバージョンにおいて、標的ヌクレオチドのＳＮＰに対して相補的なヌクレオチドは第一のプライマーＰ１の３’末端において、またはその近くに存在させる。他のバージョンにおいて、１を超える第一のプライマーおよび第二のプライマーがあり、これらの第一および第二のプライマーは、アッセイがそれらの個々のかつ区別されるＴｍのため個々の増幅された標的配列を識別できるように、異なる融解温度を有する増幅された標的配列を生じるように設計される。
【００３７】
アッセイは、ＳＮＰに隣接した標的配列における可変領域のハイブリダイゼーションを可能とする縮重塩基対合位置を含む第一および第二のプライマーで行うことができ、このようにして、アッセイの一般的柔軟性および利用性を拡大する。
【００３８】
各々、５’および３’連結プライマーに対応するプライマー１および２は標的配列に対して十分に相補的であるか、または部分的に相補的であり得る。プライマー３はプライマー１および／または２の末端に位置するランダム配列（ＲＳ）に相補的なジェネリックなプライマーである（図１および２参照）。プライマー１の３’末端およびプライマー２の５’末端は標的配列上で相互に直ぐに隣接してハイブリダイズすることができるか、あるいは分離、またはギャップまたはそれらの間で１以上のヌクレオチドでもって、標的配列にハイブリダイズすることができる（図１〜２、および４〜５参照）。プライマー１または２は、３’末端（Ｐ１）または５’末端（Ｐ２）においてまたはそれ近くに変種塩基を含んで、プライマーが標的配列中のＳＮＰＳに結合するのを可能とする（図１ないし２参照）。Ｐ１およびＰ２の間の酵素的または非酵素的連結、あるいは（いずれかのギャップを満たすための）連結に先立ってのポリメラーゼ延長を容易とするための、Ｐ２上の３’−ヒドロキシル基もある。加えて、Ｐ２の５’末端を修飾して、Ｐ１以外の断片への望ましくない連結を妨げることができる。
【００３９】
同様にＰ１の５’末端をリン酸化して、Ｐ２との連結を容易とし、Ｐ１の３’末端を修飾して、Ｐ２以外の断片への連結を妨げることができる。標的核酸の増幅を図１および２で説明する。必要であれば、プライマーＰ１およびＰ２の連結の選択的延長を可能とするように標的核酸およびプライマーを変性し、それをアニールするように温度を用いる。
【００４０】
一本鎖連結産物の検出は数個の戦略を用いて行われ、いくつかは、一本鎖増幅産物にハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブを用いて生じた、あるいは連結産物のセンスおよび非センス鎖双方の延長および増幅後に生じた二本鎖ＤＮＡへの結合に特異的な色素を使用する。他の検出戦略は、ハイブリダイズ可能なプローブに付着した分子ビーコンを使用する。そして、なお他の検出戦略はハイブリダイズ可能なプローブでのＦＲＥＴ対の使用を用いる。いくつかのアッセイにおいて、蛍光色素を単に反応混合物に加え、蛍光強度の変化をモニターして連結した産物を検出する。他のアッセイにおいて、連結産物に特異的な、かつ分子ビーコン、または蛍光基および蛍光修飾基も含有する連結産物の生成後に、ハイブリダイズ可能なプローブを加える。ハイブリダイズ可能なプローブを延長された連結産物に結合させることができ、残りは、増幅された産物へ延長されるまで蛍光修飾基によって消光され、その際、蛍光基は蛍光を発し、増幅された標的配列は検出され（図４参照）、あるいはハイブリダイズ可能なプローブは連結接合を横切るハイブリダイジングに特異的であり得、ここに、プローブはハイブリダイジング後まで再度消光される（図５参照）。図４で説明するアッセイにおいては、１以上のハイブリダイズ可能なプローブを用いることができ、各々は区別されるフルオロフォア、および１以上の標的核酸配列の各々にハイブリダイズし、それを増幅するユニークな配列を有し、それにより、多数のＳＮＰが単一チューブ反応系で検出されるのを可能とする。
【００４１】
また、アッセイのいずれかをナノリットルサンプリングアレイで行うこともできる。該ナノリットルアレイは、少なくとも１つの疎水性表面および親水性スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する１以上のプラテンを含むことができる。スルーホールの内部表面はワックス様ポリエチレングリコール材料、または他の生体適合性材料のような生体適合性材料で被覆することができる。プライマーはスルーホールに適用し、次いで、生体適合性材料コーティングの適用の前または後に乾燥し、それにより，プライマーを生体適合性材料の上、内、または下に付着させる。選択的連結および増幅アッセイで用いるプロセス用の標的核酸および試薬は、毛細管作用を用い、０．１ピコリットルないし１マイクロリットルの範囲である試料スルーホールの典型的容量にて、試料スルーホールに液体形態で負荷することができる。スルーホールの内部表面は親水性表面も有することができるか、あるいは多孔性親水性材料で被覆することができるか、あるいは前記したように、ＰＥＧのような生体適合性材料で被覆して、試料スルーホールの吸上げパワーを増強させ、液体試料を引きつけ、負荷を助けることができる。
【００４２】
アッセイを行うためのキットを調製することもでき、それは前記した１以上の試料プラテンを含み、プライマーはミクロ流体アレイの親水性試料スルーホール内に付着され、また、選択的連結および増幅アッセイで必要な試薬も含むことができる。次いで、標的核酸配列を所望であれば加えて、アッセイを行うことができる。もし既にキットが供されているのでなければ、連結および増幅反応を行うのに必要な酵素を標的核酸配列と共に加えることができる。
【実施例】
【００４３】
（実施例１  増幅された標的配列の均一検出）
増幅された標的配列の均一検出は、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に特異的な色素を用いて行うことができる。プライマーＰ１およびＰ２、各々、上流および下流プライマーは標的配列の増幅に参画せず、むしろ、ＳＮＰを含有する標的配列を同定することを担う。プライマーＰ１またはＰ２いずれかが標的配列中に注目するＳＮＰへのマッチを含む場合、Ｐ１およびＰ２の連結が起こり、次いで、プライマーＰ３、一般的延長プライマーがＰ１−Ｐ２産物を増幅させる。その結果、プライマー１および２の濃度は好ましくは最適化され、競合非標的配列の線状増幅のみが起こるように、標的配列の指数関数的増幅に干渉しないように調整される。用いることができるｄｓ−ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ特異的色素の例はＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩおよびＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩＩ、ＹＯＹＯ（登録商標）−１、ＴＯＴＯ（登録商標）−１、ＰＯＰＯ（登録商標）−３（ここに添付する添付書類Ａ参照）、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）、および所望の増幅された産物の検出の適切な感度および容易性を供するいずれかの他の色素を含む。
【００４４】
特別な実施形態において、所望により単一ヌクレオチド多形を含有する核酸の試料標的配列を少なくとも３つのプライマー、すなわち標的配列の第一の末端における第一のセグメントに対する実質的に相補的な３’末端部分を少なくとも有する第一の上流プライマー、標的配列の第二の末端における第二のセグメントに対して実質的に相補的であるその５’末端の部分を少なくとも有する第二の下流プライマー、該第二のプライマーの５’末端は第一のプライマーの３’末端に隣接しており、ここに、標的配列のＳＮＰに対して相補的なヌクレオチドは第一のプライマーの３’末端または第二のプライマーの５’末端のいずれかに存在し、および第二のプライマーの３’末端におけるランダム配列セグメントに対して、かつ第一のプライマーの５’末端における実質的に同様な配列に対して実質的に相補性である第三の一般的延長プライマーと混合する。加えて、少なくとも４つの異なるヌクレオチド塩基、熱安定性ポリメラーゼおよび熱安定性リガーゼを反応混合物に含ませ、熱安定性ポリメラーゼは、好ましくは、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片（ここに添付する添付書類Ｂ参照）のような、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くものである。５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く他の熱安定性ポリメラーゼの例はＩｓｉｓＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｙｒａＴＭ  ｅｘｏ（−）ＤＮＡポリメラーゼ、およびＱ−ＢｉｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む（ここに添付する添付書類Ｃ参照）。別法として、アッセイは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く熱安定性ポリメラーゼ、または５’−３’および３’−５’両エキソヌクレアーゼ活性を欠く熱安定性ポリメラーゼを用いることができる。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く熱安定性ポリメラーゼの例はＴａｑポリメラーゼ、ＳｕｒｅＰｒｉｍｅＴＭポリメラーゼ、およびＱ−ＢｉｏＴａｑＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（同上）を含む。５’−３’および３’−５’両エキソヌクレアーゼ活性を欠く熱安定性ポリメラーゼの例はＱ−ＢｉｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（同上）である。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩのようなｄｓ−ＤＮＡに特異的な、またはＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩＩのようなＲＮＡに特異的な色素の添加は、〜５２０ｎｍにおける色素結合核酸産物の蛍光発光をモニターすることによって、増幅された産物の検出を可能とする（ここに添付する添付書類Ｄ参照）。
【００４５】
図１−Ａで分かるように、標的核酸は標的配列内にＳＮＰを含有することができる。変性に際して、プライマー１（Ｐ１）およびプライマー２（Ｐ２）は、ＳＮＰに隣接する、標的配列の３’−５’鎖に結合する。Ｐ１の３’末端およびＰ２の５’末端の間には数個の（ほぼ２ないし４の）塩基のギャップがあってよく、あるいはギャップはなくてもよい。図１−Ｂ１においては、標的配列のＳＮＰに相補的な塩基はＰ１の３’末端におけるものである。別法として、標的配列のＳＮＰに相補的な塩基は、図１−Ｂ２に示されたようにＰ２の５’末端におけるものでよい。第三のプライマー（Ｐ３）は、Ｐ１およびＰ２の連結の後に、Ｐ３が連結されたプライマー産物に結合し、それを延長し、それにより、標的配列の相補的な鎖（５’−３’鎖）を増幅するように、Ｐ２の３’末端のランダム配列に対して相補的なランダム配列（ＲＳ）を含有する。先に議論したように、プライマーＰ３がプライマーＰ２に結合し、この配列を延長して、Ｐ２配列に基づいて線状産物を生じるように、競合反応が起こり得る。好ましくは、プライマーＰ１およびＰ２の濃度は、競合する線状反応を最小化するように調整される。図１−Ｃに示すように、未連結プライマーＰ１は標的配列の３’−５’鎖を延長する。
図２（Ａ−Ｅ）に示したもう１つの好ましい実施形態において、第一のプライマー（Ｐ１）もまた５’末端にランダム配列を有する。ＳＮＰに対する相補体を含むプライマー、その３’末端のＰ１また５’末端のＰ１いずれか（図１−Ｂ）が標的鎖（図２−Ｂ参照）に結合する場合、プライマー１およびＰ２は連結され、次いで、第三のプライマー（Ｐ３）は連結されたＰ１−Ｐ２産物の３’末端に結合し、（３’−５’）Ｐ３−増幅鎖を生じる（図２−Ｃ）。この時点で，プライマー−Ｐ３は、今や、（３’−５’）Ｐ３−増幅産物にも結合し、他の（５’−３’）増幅産物を生じる（図２−Ｄ参照）。双方の標的鎖は今や生成されており、指数関数的に増幅された標的配列を生じるように継続することができる（図２−Ｅ１および２−Ｅ２）。加えて、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ（ＳＧＩ）のような蛍光色素での検出は線状産物、すなわち、非指数関数的に生じたいずれかの産物のＴｍを超える温度にて行うことができ、それにより、線状産物に結合したいずれの色素からも競合するシグナルを除去する。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ、および二本鎖核酸に結合する他の色素はそれらのＴｍを超える核酸に結合しない。なぜならば、それらの上昇した温度では、核酸は変性するからである。図３のカーツーンで見られるように、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩのような色素は、蛍光の同時の大きな増大をもって、二本鎖増幅標的核酸に結合する。増幅された標的ｄｓ−核酸にインターカレーティングするようにＳＧＩが図３で示されているが、図３には、ｄｓ−核酸とのＳＧＩに対する結合の現実の構造または現実の態様いずれかを示唆することを意図するものはない。
【００４６】
別法として、１つの末端の蛍光基、および他の末端の蛍光消光基を有する分子ビーコンプローブの使用を用いることができる。この系においては、増幅された産物に結合するまで、分子ビーコンは消光されたままである（例えば、ここに添付する添付書類Ｅ参照）。なぜならば、分子プローブは、典型的には、プローブが標的増幅産物に結合し（ヘアピン構造を折畳み解除させ、消光基から蛍光基を分離する）まで、蛍光消光基に近接する蛍光基でのヘアピン立体配置にあるからである。本発明の実施形態に適した蛍光消光基の例は暗いクエンチャーダブシル（ｄａｂｃｙｌ）、およびＥｐｏｃｈからのＥｃｌｉｐｓｅＴＭＱｕｅｎｃｈｅｒ（同上）を含む。本発明に従って用いることができる適当な蛍光基の例はＥｐｏｃｈのＹｋｉｍａ  ＹｅｌｌｏｗＴＭおよびＲｅｄｍｏｎｄ  ＲｅｄＴＭ（同上）、およびその蛍光を適当に位置するクエンチャー分子に対して消光することができるいずれかの他の適当な蛍光色素を含む。
【００４７】
もう１つの実施形態において、リアルタイム増幅は、標的核酸の内部配列と相同であって、発蛍光性５’末端およびクエンチャー３’末端を有するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて測定することができる。ＰＣＲ増幅および延長の間に、クエンチャー分子は５’−エキソヌクレアーゼ活性によってプローブから除去され、プローブの３’末端のクエンチャー分子に近隣から蛍光レポーター分子を放出させ、それにより、増幅産物が生じるにつれ蛍光発光の増大を生じる（ここに添付する添付書類ＦおよびＧ参照）。この系においては、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが必要である。
【００４８】
もう１つの実施形態は、その１つがプライマー２のランダム配列にマッチする増幅プライマーの対の使用を含むリアルタイム増幅測定のための検出方法を利用する。該対におけるこれらのプライマーの１つを、当該分野で知られたＬｕｘＴＭプライマー（ここに添付する添付書類Ｈ参照）と同様に、ＰＣＲ産物に取り込まれた場合にのみ蛍光を発する蛍光基で標識する。そのような実施形態において、取り込みに先立って、プライマー／プローブにおける配列が蛍光基を含有するプライマー／プローブにおける相補的配列に結合し、蛍光基を消光するように、二本鎖産物への取り込みに先立って、蛍光基は第二の構造によって消光される。もう１つの実施形態において、プライマー１および２は、増幅された標的配列にハイブリダイズした場合に、プライマー１および２が連結され増幅された後にのみ、生成されて、それらが蛍光を発し（添付書類ＥまたはＡ参照）、かくして、増幅された標的配列の検出を可能とするようなＦＲＥＴパートナーである。好ましい実施形態において、蛍光検出はプライマーＰ１についてのＴｍ、またはプライマーＰ２についてのＴｍを超えて行われるか、別法として、双方のプライマーＰ１およびＰ２のＴｍを超えて行って、増幅された標的へのＰ１および／またはＰ２の可能なハイブリダイゼーションからのバックグラウンドシグナルを回避する。
【００４９】
もう１つの実施形態において、プライマーは、融解温度（Ｔｍ）の上昇または下降によって識別可能な標的核酸産物を指数関数的に増幅するように設計することができ、ここに、指数関数的に増幅された標的配列はＴｍの上昇によって示されるように安定化されるか、あるいは非連結プライマーから生じた線状に生じた非標的産物の融解温度に対するＴｍの下降によって示されるように脱安定化される。ランダム配列における、またはプライマーの他の箇所における変動を用いて、線状産物から融解温度によって識別可能なそのような指数関数的に増幅された標的核酸配列を生じさせることができる。
【００５０】
もう１つの実施形態において、第一および第二のプライマーの連結後に形成された連結接合を横切ってのハイブリダイジングに特異的なプローブを用いることができる。そのようプローブは１つの末端の蛍光レポーター基および他の末端の蛍光消光基にてのヘアピン立体配置を有することができ、それにより、プローブが連結接合を横切って結合しない場合には蛍光は起こらない。温度および／またはイオン強度のような反応条件を最適化することによって、ヘアピンは、連結接合を横切る結合によって安定化され、その際、蛍光が起こり、発光をモニターして増幅された産物を検出できよう。
【００５１】
（実施例２  ＳＮＰを識別するための単一チューブ反応系）
本発明の１つの好ましい実施形態は図４に示された単一チューブ反応系である。図１および２に示され、かつ実施例１にて前記で議論した実施形態と同様に、３プライマー系を利用して、核酸の標的配列における注目するＳＮＰを同定する。再度、注目するＳＮＰに近接する標的核酸に結合する上流プライマーおよび下流プライマーがある。上流プライマーの３’末端は下流プライマーの５’末端に直接隣接させることができるか、上流プライマーの３’末端および下流プライマーの５’末端の間には約１ないし４の間の塩基のギャップがあり得る。上流プライマーの３’末端または下流プライマーの５’末端のいずれかは、標的核酸における注目するＳＮＰに対する相補体を含むことができる。
【００５２】
しかしながら、図１および２に示された実施形態とは異なり、単一チューブ反応系は、同時の単一チューブ同定および注目する１以上の標的核酸配列における注目する１以上のＳＮＰの間の区別を可能とする。これは、上流プライマーおよび下流プライマー（連結する２つ）、および一般的延長プライマーのランダム配列領域の各々におけるユニークな配列を用いることによって達成される。図４Ａで見られるように、単一チューブ反応系は、第一の標的核酸セグメントにおける注目する第一のＳＮＰを同定する、ランダム配列Ａを持つ第一の上流プライマーＡ−Ｂ、および第二の標的核酸セグメントにおける注目する第二のＳＮＰを同定する、ランダム配列Ｆを持つ第二の上流プライマーＦ−Ｅ、および下流プライマーＣ−Ｄに存在するランダム配列Ｄに相補的なランダム配列Ｄ’を持つ一般的延長プライマーを含むことができ、ここに、Ｃは双方の標的核酸セグメントに共通する。
【００５３】
注目するＳＮＰを有する標的核酸の成功した同定およびそれへの結合に際して、上流プライマーＡ−Ｂおよび／またはＦ−Ｅは下流プライマーＣ−Ｄに連結され、連結産物Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄおよび／またはＦ−Ｅ−Ｃ−Ｄを生じる。もしギャップが上流プライマーの３’末端および下流プライマーの５’末端の間に存在すれば、該ギャップはポリメラーゼ活性によってまず満たされ、続いて連結され、連結産物を形成する。次いで、一般的延長プライマーＤ’によって双方の連結産物の延長が起こって、延長された産物Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｄ’およびＦ’−Ｅ’−Ｃ’−Ｄ’を生じる。
【００５４】
次に、フルオロフォア１を持つハイブリダイズ可能なプローブＡおよびフルオロフォア２を持つハイブリダイズ可能なプローブＦは、各々、延長された産物Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｄ’およびＦ’−Ｅ’−Ｃ’−Ｄ’にハイブリダイズし、それに続いて、その特定の蛍光タグを持つプローブの各々が増幅された産物（Ａ−Ｂ−Ｃ―ＤまたはＦ−Ｅ−Ｃ−Ｄ）に取り込まれ、フルオロフォア１またはフルオロフォア２または双方いずれかの蛍光をトリガーするように増幅が起こる。このようにして、増幅された産物への取り込みに際して２（またはそれ以上）のフルオロフォアの蛍光シグナルをモニターすることによって、１以上のＳＮＰを単一チューブ反応系において同定し、識別することができる。
【００５５】
もう１つの実施形態において、１以上の標的核酸セグメントにおける１以上のＳＮＰを同定し、識別するための代替単一チューブ反応系を図５Ａないし５Ｆに示す。図５Ａないし５Ｃは、上流プライマーＡ−ＢおよびＦ−Ｅ、下流プライマーＣ−Ｄ、および一般的延長プライマーＤ’が単一チューブ反応系に存在する点で、図４Ａないし４Ｃと同一である。再度、上流プライマーの３’末端は標的核酸における注目するＳＮＰに対する相補体を含有することができるか、あるいは下流プライマーの５’末端は標的核酸における注目するＳＮＰに対する相補体を含有することができ、標的核酸への結合に際して、２つのプライマーは隣接することができるか、あるいは上流プライマーの３’末端および下流プライマーの５’末端の間に約１ないし４の塩基のギャップを有することができ、これは、上流および下流プライマーの間の連結が起こり得る前にポリメラーゼによって満たされなければならない。
【００５６】
しかしながら、図５Ｄに示すように、代替単一チューブ反応系は、標的核酸を増幅するのにフルオロフォア１および２を持つハイブリダイズ可能なプローブＡおよびＦを用いず、むしろ、延長された産物Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｄ’およびＦ’−Ｅ’−Ｃ’−Ｄ’を増幅された標的核酸産物Ａ−Ｂ−Ｃ−ＤまたはＦ−Ｅ−Ｃ−Ｄへ増幅するのに正規のプライマーＡおよびＦを用いる。そのような系は、特定の標的核酸が、それらに結合したバルキーなフルオロフォアを有するハイブリダイズ可能なプローブで効果的に増幅されない場合に有利であろう。この代替単一チューブ反応系においては、増幅された標的核酸配列は、それらがより短くかつプライマーＡおよびＦ（または図４においては蛍光プローブＡおよびＦ）のアニーリング温度よりも低い温度にて溶解する二次構造を有する点で正規のプライマーＡおよびＦとは異なる、さらなる蛍光タグを有するハイブリダイズ可能プローブｈｙｂ−Ａおよびｈｙｂ−Ｆによって、増幅後に検出される。これは、延長された産物Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｄ’およびＦ’−Ｅ’−Ｃ’−Ｄ’の標的核酸産物Ａ−Ｂ−Ｃ−ＤまたはＦ−Ｅ−Ｃ−Ｄへの増幅において、ｈｙｂ−Ａおよびｈｙｂ−Ｆプローブおよび正規のプライマーＡおよびＦの間の効果的でない競合を可能とするが、競合する反応がフルオロフォア１および２の蛍光を測定するのに十分に起こるのを可能とし、それにより、増幅された標的核酸産物の検出および定量を可能とする。
【００５７】
標的核酸セグメントの双方に共通なセグメントＣ−Ｄにおける配列Ｄに対して相補的であるＤ’のような一般的延長プライマーの使用は前記し、図４および５に例示した単一チューブ反応系で便利ではあるが、それは必要とされない。単一チューブ反応系は１を超える延長プライマーを同時に用いてＡ−ＢおよびＦ−Ｅを持つ連結産物を作り出すのに適合させることもできると考えられる。第一のＳＮＰについての第一のプライマーＡ−Ｂ、および第二のＳＮＰについての第二のプライマーＥ−Ｆの選択性は選択的連結を保証し、さらなるプライマーでさえ連結すべきＣ−Ｘ産物を生じさせるのに用いられる。
【００５８】
注目するＳＮＰを有する標的核酸の成功した同定およびそれへの結合に際して、上流プライマーＡ−Ｂおよび／またはＦ−Ｅは、各々、下流プライマーＣ−ＧおよびＣ−Ｈに連結され、連結産物Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｇおよび／またはＦ−Ｅ−Ｃ−Ｈを生じる。もし上流プライマーの３’末端および下流プライマーの５’末端の間にギャップが存在すれば、該ギャップはポリメラーゼ活性によってまず満たされ、続いて、連結されて連結産物を形成する。次いで、延長プライマーＧ’およびＨ’によって双方の連結産物の延長が起こって、延長された産物Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｇ’およびＦ’−Ｅ’−Ｃ’−Ｈ’を生じさせることができる。
【００５９】
前記したように、ａ）増幅された産物への取り込みに際して２（またはそれ以上）のフルオロフォアの蛍光シグナルをモニターし、あるいはｂ）さらなる蛍光タグを有するハイブリダイズ可能プローブｈｙｂ−Ａおよびｈｙｂ−Ｆの使用によって、増幅後に蛍光シグナルを検出することによって、１以上のＳＮＰを単一チューブ反応系で同定し識別することができる。
【００６０】
（実施例３  ナノリットルサンプリングアレイ）
本発明のもう１つの実施形態はナノリットルサンプリングアレイを含む。先行技術における現在利用可能ないずれのアレイも用いることもできるが、共にここに引用して援用する２００３年１１月７日に出願された米国仮出願第６０／５１８，２４０号および２００４年１１月８日に出願された米国正規出願第１０／９８４，０２７号に記載されたのと同様な特定の用途のアレイは１つの好ましいアレイである。この特別な実施形態において、該アレイは、少なくとも１つの疎水性表面を有し、かつ親水性スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する第一のプラテンを含む。標的核酸配列を選択し、アレイを調製し、ここに、アレイにおける各スルーホールは、核酸標的配列の第一の末端における第一のセグメントに対して実施的に相補的であるその３’末端の少なくとも部分を有する第一のプライマー、および核酸標的配列の第二の末端における第二のセグメントに対して実質的に相補的であるその５’末端の少なくとも部分を有する第二のプライマーを少なくとも含み、該第二のプライマーの５’末端は、潜在的核酸標的配列への結合に際して第一のプライマーの３’末端に隣接している。図４は先行技術で知られたそのようなアレイを示す。アレイチップ１０は、典型的には、厚みが０．１ｍｍないし１０ｍｍ以上；例えば、厚みが０．３ないし１．５２ｍｍ、通常０．５ｍｍとすることができる。試料スルーホール１２の典型的な容量は０．１ピコリットルないし１マイクロリットルとすることができ、通常の容量は０．２ないし１００ナノリットルの範囲、例えば、約３５ナノリットルである。液体試料の毛細管作用または表面張力を用いて、試料スルーホール１２に負荷することができる。典型的なチップの寸法については、毛細管力は液体を所定の位置に保持するのに十分に強い。試料溶液を負荷したチップは空気中で揺り動かすことができ、試料を変位させることなく、中程度のスピードで遠心することさえできる。
【００６１】
試料スルーホール１２の吸上げパワーを増強するためには、レセプタクル内部壁４２の標的面積は、液体試料を引きつける親水性表面を有することができる。別法として、試料スルーホール１２は、液体試料を引きつける多孔性親水性材料を含むことができる。いくつかの実施形態において、アレイ中の試料スルーホールはポリエチレングリコールのような生体適合性材料で被覆することができ、プライマーは、スルーホールへの適用の後にプライマーを乾燥することによって、スルーホールの表面の生体適合性材料の上、内または下に付着させることができる。交差汚染（クロストーク）を防ぐためには、チップ１０の外部平面表面１４、および試料スルーホール１２の開口の周りの材料４０の層は疎水性材料のものとすることができる。かくして、各試料スルーホール１２は疎水性領域によっていずれかの末端に結合した内部親水性領域を有する。
【００６２】
試料スルーホール１２のスルーホール設計は、他のマイクロプレート構造に固有の捕獲された空気の問題を回避する。このアプローチは、疎水性および親水性パターニングと一緒になって、試料スルーホール１２の自己計量負荷を可能とする。自己負荷機能は、プレ負荷試薬でのアレイの製造を助け、また、水性試料材料と接触した場合にアレイがそれ自身を満たすのを助ける。
【００６３】
（実施例３  核酸の標的配列におけるＳＮＰを同定するための方法）
なおもう１つの実施形態は、核酸の標的配列における単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を同定する方法である。核酸の標的配列を同定し、２つのプライマーＰ１およびＰ２が標的核酸配列の１つの鎖上の内部に位置したＳＮＰに近接するように設計され、かつ熱的に安定なリガーゼで連結されるように設計されるように、プライマーを標準的な方法に従って調製する。プライマーＰ１およびＰ２は、さらに、標的配列におけるＳＮＰに相補的な塩基がＰ１の３’末端、またはＰ２の５’末端いずれかにあるように設計される。この特別な方法においては、ナノリットルサンプリングアレイが用いられる。該方法は、スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する第一のプラテンを供することを含み、ここに、アレイの各スルーホールは、標的配列の第一の末端における第一のセグメントに対して実質的に相補的であるその３’末端の少なくとも部分を有する第一のプライマー、および標的配列の第二の末端における第二のセグメントに対して実質的に相補的であるその５’末端の少なくとも部分を有する第二のプライマーを含む。標的配列への結合に際しては、第二のプライマーの５’末端は第一のプライマーの３’末端に隣接している。
【００６４】
該方法は、さらに、内部ＳＮＰを持つ標的核酸配列を含有する試料をアレイに導入し、次いで、試薬をアレイ中のスルーホールに導入することを含み、ここに、該試薬は、連結されたプライマーＰ１−Ｐ２産物を増幅することができるランダム配列を有する第三のプライマー、熱安定的ポリメラーゼ、熱安定的リガーゼ、および少なくとも４つの異なるヌクレオシド三リン酸を含む。該方法におけるさらなる工程は、アレイを、プライマー、標的核酸、および試薬と共に熱サイクルに付し、次いで、得られた増幅標的核酸配列を検出することを含む。所望により、熱安定性ポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くことができ、あるいはそれは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くことができ、あるいはそれは５’−３’および３’−５’両エキソヌクレアーゼ活性を欠くことができる。
【００６５】
また、検出工程は、増幅された標的配列への結合に際して蛍光を発する二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に特異的な色素の使用を含むことができる。適当な色素はＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩＩ、ＹＯＹＯ（登録商標）−１、ＴＯＴＯ（登録商標）−１、ＰＯＰＯ（登録商標）−３、ＥｔＢｒ、および蛍光発光による増幅された標的配列の低感度検出を供することができるいずれかの他の色素を含む。
【００６６】
別法として、検出は連結されたＰ１−Ｐ２プライマー産物の連結接合を横切ってのハイブリダイゼーションに特異的なプローブの添加を通じて起こることができ、ここに、そのようなプローブは、蛍光クエンチャーのような蛍光基および蛍光修飾基を含む。
【００６７】
もう１つの別の実施形態において、検出は、標的配列の領域へのハイブリダイジングに対して特異的な蛍光クエンチャーのような、蛍光基および蛍光修飾基を含むプローブの使用を含むことができる。この特別な実施形態において、蛍光修飾基はプローブの延長に際して切り出され、蛍光基はかくして蛍光を発し、増幅された産物の検出を可能とする。
【００６８】
本発明のさらなる実施形態は増幅された標的核酸配列の同定で用いるキットを含み、ここに、該キットは１つの疎水性表面を有し、かつ親水性スルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する試料プラテンを提供する。１つの特別なキットにおいて、各スルーホールは、潜在的核酸標的配列の第一の末端における第一のセグメントに対して実質的に相補的であるその３’末端の少なくとも部分を有する第一のプライマー、潜在的核酸標的配列の第二の末端における第二のセグメントに対して実質的に相補的であるその５’末端の少なくとも部分を有する第二のプライマー、該第二のプライマーの５’末端は、潜在的核酸標的配列への結合に際して第一のプライマーの３’末端に隣接し、およびスルーホールの高密度ミクロ流体アレイを有する試薬プラテン、各スルーホールは第二のプライマーの３’末端におけるランダム配列セグメントに対して、および第一のプライマーの５’末端における実質的に同様な配列に対して実質的に相補性である第三のプライマーを含み、少なくとも４つの異なるヌクレオチド塩基、熱安定性リガーゼおよび蛍光色素を含有する。この特別な実施形態において、試薬プラテンは、試薬成分および標的核酸試料の試料プラテン中のプライマーへの送達を可能とする試料プラテンに対応する構造幾何学を有する。キットのいくつかの実施形態において、プライマーは、スルーホールに適用される後にプライマーを乾燥することによって、スルーホールにおけるワックス様コーティングのような生体適合性材料上に、内または下に付着させることができ、ここに、生体適合性材料は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）材料を含むことができる。増幅された標的核酸配列の同定のための選択的連結および増幅を行うためには、ユーザーは、単に、標的核酸、熱安定性ポリメラーゼおよび、所望により、キットに備えた緩衝液を含有する試料をスルーホールに加えるであろう。
【００６９】
【化１】
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【００７０】
【化２】
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【００７１】
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【０１００】
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【０１０１】
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【０１０６】
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【０１０８】
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【０１１０】
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【０１１５】
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【０１１６】
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【０１１８】
【化５０】
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【０１１９】
【化５１】
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【０１２０】
【化５２】
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【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１−Ａは、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を持つ二本鎖標的核酸配列を示す。図１−Ｂ１は、ＳＮＰに隣接してハイブリダイズしたプライマー１および２と共に変性した３’−５’標的鎖、プライマー１の３’末端に位置するＳＮＰに対して相補的な塩基を示し、および連結したＰ１−Ｐ２産物の３’末端にハイブリダイズしたプライマー３のランダム配列（ＲＳ）を示す。図１−Ｂ２は、ＳＮＰに隣接してハイブリダイズしたプライマー１および２と共に変性した３’−５’標的鎖、プライマー２の５’末端に位置したＳＮＰに対して相補的な塩基を示し、および連結したＰ１−Ｐ２産物の３’末端にハイブリダイズしたプライマー３のランダム配列（ＲＳ）を示す。図１−Ｃは、未連結プライマーＰ１によって延長される変性した５’−３’標的核酸鎖を示す。
【図２】図２−Ａは、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を持つ二本鎖標的核酸配列を示す。図２−Ｂは、核酸の変性した標的鎖（３’−５’鎖）にハイブリダイズしたプライマーＰ１およびＰ２を示し、ここに、標的鎖におけるＳＮＰに対して相補的な塩基はＰ１の３’末端に存在し、プライマーＰ１およびＰ２の各々は、各々、それらの５’末端および３’末端においてランダム配列を含む。図２−Ｃは、プライマーＰ３によって増幅されてＰ３−増幅産物を生じる連結されたＰ１−Ｐ２産物を示す。図２−Ｄは、プライマーＰ３によって増幅されて、Ｐ２−増幅産物（３’−５’）を生じるＰ３−増幅産物を示す。図２−Ｅ１および、２−Ｅ２は、各々、Ｐ３−増幅産物（５’−３’）およびＰ３−増幅産物（３’−５’）の指数関数的増幅を示す。
【図３】図３は、二本鎖増幅標的核酸への色素ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ結合、および蛍光発光のカーツーンを示す。
【図４】図４−Ａは、上流プライマーＡ−Ｂ、下流プライマーＣ−Ｄ、および核酸の１以上の標的配列における１以上のＳＮＰの間を識別するための単一チューブ反応系における注目するＳＮＰを有する標的核酸での一般的延長プライマーＤ’を示し、該単一チューブ反応系は上流プライマーＦ−Ｅ、および注目する第二のＳＮＰを持つ第二の核酸標的も含む。図４−Ｂは、核酸の第一の標的配列における注目する第一のＳＮＰとで成功したマッチが起こる場合の、上流プライマーＡ−Ｂと下流プライマーＣ−Ｄとの連結を示し、また、同一チューブに存在する核酸の第二の標的配列における注目する第二のＳＮＰとで成功したマッチが起こる場合の、上流プライマーＦ−Ｅと下流プライマーＣ−Ｄとの連結も示す。図４−Ｃは、一般的延長プライマーＤ’による連結産物Ａ−Ｂ−Ｃ−ＤおおよびＦ−Ｅ−Ｃ−Ｄの延長を示す。図４−Ｄは、蛍光タグ１を持つハイブリダイズ可能なプローブＡを、延長された産物Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｄ’へのハイブリダイゼーション、および蛍光タグ２を持つハイブリダイズ可能なプローブＦの、延長された産物Ｆ’−Ｅ’−Ｃ’−Ｄ’へのハイブリダイゼーションを示す。図４−Ｅは、第一の増幅された産物におけるフルオロフォア１の蛍光のトリガーする、ハイブリダイズ可能なプローブＡによる注目する第一のＳＮＰを持つ第一の標的核酸の取込みおよび増幅、および第二の増幅された産物におけるフルオロフォア２の蛍光をトリガーする、ハイブリダイズ可能なプローブＦによる注目する第二のＳＮＰを持つ第二の標的核酸の取込みおよび増幅を示す。
【図５】図５Ａは、核酸の１以上の標的配列における１以上のＳＮＰの間を識別するための単一チューブ反応系における、上流プライマーＡ−Ｂ、下流プライマーＣ−Ｄ、および注目するＳＭＰを有する標的核酸との一般的延長プライマーＤ’を示し、該単一チューブ反応系は、図４の単一チューブ反応系の代替実施形態における、上流プライマーＦ−Ｅ、および注目するＳＮＰを持つ第二の核酸標的も含む。図５Ｂは、核酸の第一の標的配列における注目する第一のＳＮＰとで成功したマッチが起こる場合の、上流プライマーＡ−Ｂと下流プライマーＣ−Ｄとの連結を示し、また、同一チューブに存在する核酸の第二の標的配列における注目する第二のＳＮＰとで成功したマッチが起こる場合の、上流プライマーＦ−Ｅと、下流プライマーＣ−Ｄとの連結を示す。図５Ｃは、一般的延長プライマーＤ’による連結産物Ａ−Ｂ−Ｃ−ＤおよびＦ−Ｅ−Ｃ−Ｄの延長を示す。図５Ｄは、蛍光タグなしのプライマーＡの、延長された産物Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｄ’へのハイブリダイゼーション、および蛍光タグなしのプライマーＦの、延長された産物Ｆ’−Ｅ’−Ｃ’−Ｄ’−へのハイブリダイゼーションを示す。図５Ｅは、第一の増幅された産物を生じさせるための、プライマーＡによる注目する第一のＳＮＰを持つ第一の標的核酸の増幅、および第二の増幅された産物を生じさせるための，プライマーＦによる注目する第二のＳＮＰを持つ第二の標的核酸の増幅を示す。図５Ｆは、図５Ｅにおける増幅反応に対する競合反応を示し、ここに、注目する第一のＳＮＰを持つ第一の標的核酸の取込みおよび低効率生成はハイブリダイズ可能なプローブＡによって行われ、第一の産物におけるフルオロフォア１の蛍光をトリガーし、それにより、第一の増幅された標的核酸を検出可能とし、およびここに、注目する第二のＳＮＰを持つ第二の標的核酸の取込みおよび低効率生産はハイブリダイズ可能なプローブＦによって行われ、第二の産物におけるフルオロフォア２の蛍光をトリガーし、それにより、第二の増幅された標的核酸の同時検出を可能とする。
【図６】図６は、先行技術によるスルーホールの典型的な高密度試料アレイを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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