(57)【要約】  Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上のＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）に結合する多量体化合物は、Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞の枯渇および／またはＴ細胞若しくはＮＫ細胞のアポトーシスを誘起するために使用されうる。該多量体化合物および本発明の方法は、例えば、Ｔ細胞の枯渇は、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶、およびアレルギー疾患などの症状における、過剰な若しくは望ましくないＴ細胞またはＮＫ細胞が媒介する免疫応答を制御するのに使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
過剰な若しくは望ましくないＴ細胞が媒介する免疫応答を特徴とする症状を有するかまたは当該症状を発症する危険性があると診断される個体を選択し；および
二つのポリペプチド鎖を含み、該ポリペプチド鎖がそれぞれ（ｉ）Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）と結合する結合ドメイン、および（ｉｉ）該ポリペプチド鎖が多量体化合物(multimeric compound)を形成するよう異種アミノ酸配列により結合されている異種アミノ酸配列を有する、該Ｔ細胞の表面上の少なくとも二つのＰＳＧＬ−１タンパク質に結合する該多量体化合物を、該固体に投与することを有し、この際、該Ｔ細胞の表面上の少なくとも二つのＰＳＧＬ−１タンパク質へ該多量体化合物が結合することによりＴ細胞の死をもたらすシグナル伝達経路を誘導し、それにより該個体においてＴ細胞が媒介する免疫応答を防止または抑制する、
該個体におけるＴ細胞が媒介する免疫応答の防止または抑制方法。
【請求項２】
該多量体化合物はホモ多量体化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該多量体化合物はヘテロ多量体化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該異種アミノ酸配列は細胞表面受容体結合ドメインを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該結合ドメインはＰ−セレクチン細胞外ドメインまたはそのＰＳＧＬ−１結合断片を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該結合ドメインはＥ−セレクチン細胞外ドメインまたはそのＰＳＧＬ−１結合断片を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該結合ドメインはＬ−セレクチン細胞外ドメインまたはそのＰＳＧＬ−１結合断片を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該結合ドメインは抗ＰＳＧＬ−１抗体の抗原結合ドメインまたはその断片を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該結合ドメインはファージディスプレーライブラリーから選択されるＰＳＧＬ−１結合ポリペプチドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該ポリペプチド鎖は異種アミノ酸配列により該多量体化合物を形成するよう共有結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該共有結合はジスルフィド結合である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該異種アミノ酸配列は免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、異種アミノ酸配列により該多量体化合物に結合しており、該Ｔ細胞表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘起する薬剤を該個体へ投与することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
炎症性疾患を有すると診断された個体を選択することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
自己免疫疾患を有すると診断された個体を選択することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
同種または異種移植を受けたかまたは当該移植を受ける予定の個体を選択することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
アレルギー疾患を有すると診断された個体を選択することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
Ｔ細胞性癌を有すると診断された個体を選択することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
該Ｔ細胞は活性化Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
該多量体化合物の投与前の個体から採取された第１の生体試料におけるＴ細胞数を検出し、および該多量体化合物の投与後の個体から採取された第２の生体試料におけるＴ細胞数と結果を比較することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
該多量体化合物の投与前の個体から採取された第１の生体試料におけるＴ細胞の生物活性を検出し、および該多量体化合物の投与後の個体から採取された第２の生体試料におけるＴ細胞の生物活性と結果を比較することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
該投与が、該個体における活性化Ｔ細胞の少なくとも１０％の枯渇をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
その細胞表面においてＰＳＧＬ−１を発現しているＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を供給し、
二つのポリペプチド鎖を含み、該ポリペプチド鎖がそれぞれ（ｉ）ＰＳＧＬ−１と結合する結合ドメイン、および（ｉｉ）該ポリペプチド鎖が多量体化合物を形成するよう異種アミノ酸配列により結合されている異種アミノ酸配列を有する、該Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上の少なくとも二つのＰＳＧＬ−１タンパク質に結合する該多量体化合物と該固体を接触させることを有し、この際、該Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上の少なくとも二つのＰＳＧＬ−１タンパク質へ該多量体化合物が結合することによりＴ細胞またはＮＫ細胞の死をもたらすシグナル伝達経路を誘導する、
Ｔ細胞またはＮＫ細胞の死を誘起する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
該多量体化合物はホモ多量体化合物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該多量体化合物はヘテロ多量体化合物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
該異種アミノ酸配列は細胞表面受容体結合ドメインを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
該結合ドメインはＰ−セレクチン細胞外ドメインまたはそのＰＳＧＬ−１結合断片を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
該結合ドメインはＥ−セレクチン細胞外ドメインまたはそのＰＳＧＬ−１結合断片を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
該結合ドメインはＬ−セレクチン細胞外ドメインまたはそのＰＳＧＬ−１結合断片を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
該結合ドメインは抗ＰＳＧＬ−１抗体の抗原結合ドメインまたはその断片を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
該結合ドメインはファージディスプレーライブラリーから選択されるＰＳＧＬ−１結合ポリペプチドを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
該ポリペプチド鎖は、異種アミノ酸配列により該多量体化合物を形成するよう共有結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
該共有結合はジスルフィド結合である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該異種アミノ酸配列は免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
さらに、異種アミノ酸配列により該多量体化合物に結合しており、該Ｔ細胞表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘起する薬剤と該多量体化合物を接触させることを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
活性化Ｔ細胞の死を誘起することを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
該多量体化合物との接触後、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の生存率を評価することを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
該多量体化合物との接触後、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の生物活性を評価することを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
二つのポリペプチド鎖を含み、該ポリペプチド鎖がそれぞれ（ｉ）ＰＳＧＬ−１と結合する結合ドメイン、および（ｉｉ）該ポリペプチド鎖が多量体化合物を形成するよう異種アミノ酸配列により結合されている異種アミノ酸配列を有し、該Ｔ細胞の表面上の少なくとも二つのＰＳＧＬ−１タンパク質へ結合することによりＴ細胞の死をもたらすシグナル伝達経路を誘導する、該Ｔ細胞の表面上の少なくとも二つのＰＳＧＬ−１タンパク質に結合する該多量体化合物；および
炎症、自己免疫、移植片拒絶、アレルギー症状、またはＴ細胞性癌を治療するための該多量体化合物の使用に関する説明書を有するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫応答を制御するための組成物および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
望ましくない免疫応答の制御は、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶、アレルギー疾患、およびＴ細胞で誘導される癌(T cell-derived cancer)などの病気の治療において重要な問題である。過度に攻撃的なＴ細胞の活性は、免疫抑制によるかまたは免疫トレランスの誘導によって制御されうる。トレランスは、免疫系が抗原に対して応答しなくなる状態として規定されるが、抗原に対する免疫応答を抑制する免疫抑制は、一般的に、薬剤の継続使用を必要とする。臓器移植では、Ｔ細胞はアロ抗原に対する免疫応答において不可欠な役割を果たす。現在の免疫抑制レジメは、一般的に、Ｔ細胞の重要な増殖因子である、ＩＬ−２の転写を遮断するか、またはＩＬ−２依存性の増殖を阻害する、コルチコステロイド、シクロスポリンまたはラパマイシンの使用を包含する。しかしながら、Ｔ細胞枯渇剤（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）として、またはサイトカインシグナル伝達若しくはＴ細胞の共刺激(co-stimulatory)経路の阻害剤（例えば、ＣＤ２５、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ１５２、ＣＴＬＡ４）としてのいずれかで作用する多くのモノクローナル抗体は、副作用または毒性を制限しつつ拒絶の発生を抑制するのに有効であることが示されている。これらの薬剤によっては、自己免疫疾患の治療および移植片生着期間の延長においてある程度成功していることが示されている。
【０００３】
アポトーシスは、免疫系の適切な機能、および望ましくない細胞を除去する主要な機構を維持するのに極めて重要であると広く考えられている(Kabelitz et al. Immunol. Today 14:338-340 (1993); Raff, Nature:356:397-399 (1992))。細胞の内側または外側から派生する様々なシグナルは、細胞の生存および死に影響を及ぼす。Ｆａｓ（または、ＣＤ９５、ＭＷ＝４３ｋＤ）、ＴＮＦＲ２（ＭＷ＝７５ｋＤ）、ＣＤ２（ＭＷ＝４５ｋＤ）およびＣＴＬＡ−４（ＭＷ＝３３ｋＤ）などのＴ細胞表面分子に対する抗体は、Ｔ細胞のアポトーシスを誘起する(Osborne, Curr. Opin. Immunol. 8:245-248 (1996); Lin et al. J. Immunol. 158:598-603 (1997); Zhang et al. Nature:377:348-350 (1995); Lai et al. Eur. J. Immunol. 25:3243-3248 (1995); Mollereau et al. J. Immunol. 156:3184-3190 (1996); Gribben et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:811-815 (1995))。望ましくないＴ細胞を制御するためにＦａｓおよびＴＮＦＲ２分子を使用する試みは、これら２分子が免疫細胞のみならず、肝臓などの幾つかの他の重要な器官系でも発現するという事実によって妨げられた。この発現パターンは、潜在的に、これらの２抗体の治療用途を制限する(Ogasawara et al. Nature 364:806-809 (1993); Pfeffer et al. Cell:73:457-467 (1993); Engelmann et al. J. Biological Chemistry 265:14497-14504 (1990))。
【０００４】
セレクチン、インテグリンおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーメンバーは、白血球および血小板と、それら自身または細胞外基質および血管内皮との相互作用において重要である、３種の主要な固着分子である(Springer, Nature 346:425(1990); Osborn, Cell 62:3 (1990); Hynes, Cell 69:11 (1992))。一つの細胞型上の固着分子は、しばしば異なる細胞型上に発現した他の固着分子と結合し、リガンド−受容体の対を形成する。
【０００５】
セレクチン系統群は、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２、ＣＤ６２Ｐ、ＧＭＰ１４０、およびＰＡＤＧＥＭとしても知られている）、Ｅ−セレクチン（ＥＬＡＭ−１およびＣＤ６２Ｅとしても知られている）、およびＬ−セレクチン（ＬＥＣＡＭ−１、Ｍｅｌ−１４、ＬＡＭ−１、およびＣＤ６２Ｌとしても知られている）を含む。該セレクチン類は、高度に類似しており、１２０のアミノ酸Ｎ−末端レクチンドメイン（120 amino acid N-terminal domain）、ＥＧＦ様ドメイン、補体調節タンパク質において認められるものと類似しているかなり多数のマルチプルショートコンセンサス反復（ＳＣＲ）ドメイン、その後に膜貫通ドメインおよび短い細胞質側末端で構成されている (Siegelman et al., Science 243:1165-1172 (1989); Laskey et al., Cell 56:1045-1055 (1989); Tedder et al., J. Exp. Med. 170:123-133 (1989); Johnson et al., Cell 56:1033-1044 (1989); Bevilancqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9238-9242 (1987), Bevilacqua et al., Science 243:1160-1165 (1989), Bevilacqua et al., J. Clin. Invest. 91:379-387 (1983), Camerini et al., Nature 280:496-498 (1989))。該セレクチン類は重複部分を有しているが、細胞表面の受容体に対し異なる特異性を有している(Bevilacqua et al., J. Clin. Invest. 91:379-387 (1993); Feize, Current Opinion in Struct. Biol. 3:701-710 (1993); Breg et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 184:1048-1055 (1992); Foxall et al., J. Cell Biol. 117:895-902 (1992); Larsen et al., J. Biol. Chem. 267:11104-11110 (1992); Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6224-6228 (1991))。
【０００６】
Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、およびＬ−セレクチンは、炎症の間、最初の白血球−内皮細胞および血小板−白血球の固着性の相互作用を媒介する(Bevilacqua et al., 1993, 前記)。全三種のセレクチンは、活性化された内皮と白血球の初期の“ローリング”相互作用に関与することが証明されている(von Andrian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7538-7542 (1992); Ley et al., Blood 77:2553-2555 (1991); Abassi et al., J. Clin. Invest. 92:2719-2730 (1993); Dore et al., Blood 82:1308-1316 (1993); Jones et al., Biophys. J. 65:1560-1569 (1993); Mayadas et al., Cell 74:541-554 (1993))。活性化型血小板および内皮細胞上に発現したＰ−セレクチンは、ほとんどの白血球上の細胞表面タンパク質に結合する(McEver et al., J. Biol. Chem. 250:9799-9804 (1984))。サイトカイン−活性化型内皮細胞上（例えば、６−８時間のＴＮＦ−αまたはＩＬ−１刺激の後）に発現したＥ−セレクチンは、ほとんどの白血球上の細胞表面タンパク質に結合する(McEver et al., J. Clin. Invest. 100:485-492 (1997); Bevilacqua et al., 1987, 前記; Bevilacqua et al., 1989, 前記)。ほとんどの白血球上に発現するＬ−セレクチンは、いくつかの内皮細胞上および他の白血球上の細胞表面タンパク質に結合する(Gallatin et al., Nature 304:30-34 (1983); Breg et al., Immunol. Rev. 108:5-18 (1989); Breg et al., J. Cell. Biol. 114:343-349 (1991), Hallman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 174:236-243 (1991); Smith et al., J. Clin. Invest. 87:609-618 (1991); Spertini et al., J. Immunol. 147:2565-2573 (1991))。全三種のセレクチンは、その発現が白血球、特にＴ細胞およびＮＫ細胞に大きく制限される細胞表面タンパク質、ＰＳＧＬ−１に結合することが示されている。ＰＳＧＬ−１の翻訳後修飾が、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、およびＬ−セレクチンへの結合のために必要とされる(McEver et al., J. Clin. Invest., 1997, 前記)。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約
本発明は、Ｔ細胞が、Ｔ細胞表面抗原Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）の関与によって枯渇されうるという知見および／またはアポトーシスを受けるよう誘導されうるという知見に基づくものである。Ｔ細胞の枯渇は、過剰な若しくは望ましくないＴ細胞が媒介する免疫応答または過剰な若しくは望ましくないＴ細胞の増殖に関連する症状の治療に特に有効でありうる。例えば、Ｔ細胞の枯渇は、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶、アレルギー疾患、および／またはＴ細胞で誘導される癌(T cell-derived cancer)に関連する望ましくないＴ細胞の活性または増殖の抑制または排除を生じさせうる。本発明は、ＰＳＧＬ−１機能の修飾因子に関するスクリーニング方法はもちろん、Ｔ細胞が媒介する免疫応答を防止または抑制するためのＰＳＧＬ−１機能の修飾因子の使用方法も包含する。
【０００８】
一態様においては、本発明は、個体においてＴ細胞が媒介する免疫応答の防止または抑制方法を特徴とする。本方法は、以下の段階を包含する：過剰な若しくは望ましくないＴ細胞が媒介する免疫応答を特徴とする症状を有するかまたは当該症状を発症する危険性があると診断される個体を選択すること；および該Ｔ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１への化合物の結合がＴ細胞の死をもたらすシグナル伝達経路を誘導し、それにより該個体におけるＴ細胞が媒介する免疫応答を防止または抑制する、該Ｔ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１に結合する化合物を、該個体に投与すること。
【０００９】
このような方法に使用される化合物としては、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。一例では、該化合物は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体である。一実施態様において、本方法は、モノクローナル抗体に結合し、該Ｔ細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘起する薬剤を投与するさらなる段階を包含する。
【００１０】
実施態様によっては、本方法は、Ｔ細胞の死をもたらすシグナル伝達経路を誘導する、該Ｔ細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の、架橋を誘起することを包含する。
【００１１】
実施態様によっては、本方法は以下の段階を包含する：（ｉ）過剰な若しくは望ましくないＴ細胞が媒介する免疫応答を特徴とする症状を有するかまたは当該症状を発症する危険性があると診断される個体を選択すること；および
（ｉｉ）二つのポリペプチド鎖を含み、該ポリペプチド鎖がそれぞれ（ａ）ＰＳＧＬ−１と結合する結合ドメイン、および（ｂ）該ポリペプチド鎖が多量体化合物(multimeric compound)を形成するよう異種アミノ酸配列により結合されている異種アミノ酸配列を有する、該Ｔ細胞の表面上の少なくとも二つのＰＳＧＬ−１タンパク質に結合する該多量体化合物を、該固体に投与することを有し、この際、該Ｔ細胞の表面上の少なくとも二つのＰＳＧＬ−１タンパク質へ該多量体化合物が結合することによりＴ細胞の死をもたらすシグナル伝達経路を誘導し、それにより該個体においてＴ細胞が媒介する免疫応答を防止または抑制すること。
【００１２】
該多量体化合物は、ホモ多量体化合物またはヘテロ多量体化合物であってもよい。該結合ドメインは、必要に応じて、Ｐ−セレクチン細胞外ドメイン若しくはそのＰＳＧＬ−１結合断片、Ｅ−セレクチン細胞外ドメイン若しくはそのＰＳＧＬ−１結合断片、Ｌ−セレクチン細胞外ドメイン若しくはそのＰＳＧＬ−１結合断片、抗ＰＳＧＬ−１抗体若しくはそのＰＳＧＬ−１結合断片、ファージディスプレーライブラリーから選択されるＰＳＧＬ−１結合ポリペプチド、または上記いずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００１３】
実施態様によっては、該多量体化合物は、抗ＰＳＧＬ−１抗体またはＰＳＧＬ−１に結合する抗体断片を含まない。
【００１４】
該異種アミノ酸配列は、必要に応じて、例えば、免疫グロブリン重鎖定常ドメインなどの細胞表面受容体結合ドメインを含んでいてもよい。実施態様によっては、該ポリペプチド鎖は、該多量体化合物を形成するよう異種アミノ酸配列により、例えば、ジスルフィド結合など、共有結合的に結合されている。
【００１５】
実施態様によっては、本方法は、異種アミノ酸配列により該多量体化合物に結合し、該Ｔ細胞表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘起する薬剤を該個体へ投与する付加的な段階を含んでいてもよい。
【００１６】
実施態様によっては、本明細書に記載の方法は、自己免疫疾患を有すると診断された個体を選択する段階を包含する。他の例において、本方法は、炎症性疾患を有すると診断された個体を選択する段階を包含する。他の例において、本方法は、同種または異種移植を受けたかまたは当該移植を受ける予定の個体を選択する段階を包含する。他の例において、本方法は、アレルギー疾患を有すると診断された個体を選択する段階を包含する。他の例において、本方法は、Ｔ細胞性癌を有すると診断された個体を選択する段階を包含する。
【００１７】
実施態様によっては、該Ｔ細胞は活性化Ｔ細胞である。一例では、該Ｔ細胞はＣＤ４＋  Ｔ細胞である。他の例では、Ｔ細胞はＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【００１８】
実施態様によっては、本方法は、該化合物（例えば、多量体化合物）の投与前に個体から採取した第１の生体試料におけるＴ細胞数を検出し、化合物（例えば、多量体化合物）の投与後の個体から採取した第２の生体試料におけるＴ細胞数と結果を比較する段階を包含する。
【００１９】
実施態様によっては、本方法は、化合物（例えば、多量体化合物）の投与前に個体から採取した第１の生体試料におけるＴ細胞の生物活性を検出し、化合物（例えば、多量体化合物）の投与後の個体から採取した第２の生体試料におけるＴ細胞の生物活性と結果を比較する段階を包含する。
【００２０】
実施態様によっては、該投与により、該個体の活性化Ｔ細胞の少なくとも１０％の枯渇をもたらす。実施態様によっては、該投与により、該個体の活性化Ｔ細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上の枯渇をもたらす。
【００２１】
実施態様によっては、抗体若しくはその抗原結合断片または多量体化合物は、抗体若しくはその抗原結合断片または多量体化合物に曝した後に個体の活性化Ｔ細胞の少なくとも１０％の死を誘起する。実施態様によっては、このような投与は、個体の活性化Ｔ細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上の死を誘起する。細胞の死は、抗体若しくはその抗原結合断片または多量体化合物に曝された後、例えば、１、２、３、４、５、６、７日、またはそれ以上の日数など、いずれの時間で測定されてもよい。
【００２２】
他の態様において、本発明は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の死の誘起方法を特徴とする。本方法は、以下の段階を包含する：その細胞表面上においてＰＳＧＬ−１を発現しているＴ細胞またはＮＫ細胞を供給すること；および該Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１に結合する化合物と該Ｔ細胞またはＮＫ細胞を接触させることを有し、この際、該Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１へ化合物が結合することによりＴ細胞またはＮＫ細胞の死をもたらすシグナル伝達経路を誘導すること。
【００２３】
このような方法に使用される化合物としては、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が含まれうる。一例では、該化合物は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体である。実施態様によっては、本方法は、モノクローナル抗体に結合し、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘起する薬剤とモノクローナル抗体を接触させる段階を包含する。
【００２４】
一実施態様において、本方法は以下の段階を包含する：（ｉ）その細胞表面上でＰＳＧＬ−１を発現しているＴ細胞またはＮＫ細胞を供給すること；および（ｉｉ）二つのポリペプチド鎖を含み、該ポリペプチド鎖がそれぞれ（ａ）ＰＳＧＬ−１と結合する結合ドメイン、および（ｂ）該ポリペプチド鎖が多量体化合物を形成するよう異種アミノ酸配列により結合されている異種アミノ酸配列を有する、該Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上の少なくとも二つのＰＳＧＬ−１タンパク質に結合する該多量体化合物と該固体を接触させることを有し、この際、該Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上の少なくとも二つのＰＳＧＬ−１タンパク質へ該多量体化合物が結合することにより該Ｔ細胞またはＮＫ細胞の死をもたらすシグナル伝達経路を誘導すること。
【００２５】
該多量体化合物は、ホモ多量体化合物またはヘテロ多量体化合物であってもよい。該結合ドメインは、必要に応じて、Ｐ−セレクチン細胞外ドメイン若しくはそのＰＳＧＬ−１結合断片、Ｅ−セレクチン細胞外ドメイン若しくはそのＰＳＧＬ−１結合断片、Ｌ−セレクチン細胞外ドメイン若しくはそのＰＳＧＬ−１結合断片、抗ＰＳＧＬ−１抗体若しくはそのＰＳＧＬ−１結合断片、ファージディスプレーライブラリーから選択されるＰＳＧＬ−１結合ポリペプチド、または上記いずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００２６】
該異種アミノ酸配列は、必要に応じて、例えば、免疫グロブリン重鎖定常ドメインなどの細胞表面受容体結合ドメインを含んでいてもよい。実施態様によっては、該ポリペプチド鎖は、該多量体化合物を形成する異種アミノ酸配列により、例えば、ジスルフィド結合など、共有結合的に結合されている。
【００２７】
実施態様によっては、本方法は、異種アミノ酸配列により該多量体化合物に結合し、該Ｔ細胞表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘起する薬剤を該個体へ投与する追加の段階を包含する。
【００２８】
実施態様によっては、本方法は、該Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘起し、該架橋が該Ｔ細胞またはＮＫ細胞の死をもたらすシグナル伝達経路を誘導する段階を包含する。
【００２９】
本明細書に記載の方法の実施態様によっては、該Ｔ細胞は活性化Ｔ細胞である。一例では、該Ｔ細胞はＣＤ４＋  Ｔ細胞である。他の例では、該Ｔ細胞はＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【００３０】
本明細書に記載の方法の実施態様によっては、本方法は、該化合物（例えば、多量体化合物）との接触後に該Ｔ細胞またはＮＫ細胞の生存率を評価する段階を包含する。
【００３１】
本明細書に記載の方法の実施態様によっては、本方法は、該化合物（例えば、多量体化合物）との接触後に該Ｔ細胞またはＮＫ細胞の生物活性を評価する段階を包含する。
【００３２】
実施態様によっては、本方法は、活性化Ｔ細胞の死を誘起することを包含する。
【００３３】
他の態様において、本発明は、ＰＳＧＬ−１機能の修飾因子のスクリーニング方法を特徴とする。本方法は以下の段階を包含する：細胞表面上でＰＳＧＬ−１を発現している細胞を供給すること；該細胞を試験物質と接触させること；および該細胞を試験物質と接触させた後の該細胞の生存率を測定し、該試験物質がＰＳＧＬ−１機能の修飾因子であるか否か判定すること。
【００３４】
一実施態様において、本方法は、該試験物質によって誘起される該細胞の死を検出することにより、該試験物質がＰＳＧＬ−１機能の修飾因子であるか否か判定する段階を包含する。
【００３５】
一実施態様において、該試験物質は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合する抗体またはこの抗原結合断片である。一例では、該試験物質は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体である。一実施態様において、本方法は、モノクローナル抗体を、モノクローナル抗体に結合し、細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘起する薬剤と接触させる段階を包含する。
【００３６】
一実施態様において、本方法は、細胞の死をもたらすシグナル伝達経路を誘導する、該細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の、架橋を誘起する段階を包含する。
【００３７】
一実施態様において、該Ｔ細胞は活性化Ｔ細胞である。一例では、該Ｔ細胞はＣＤ４＋  Ｔ細胞である。他の例では、該Ｔ細胞はＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【００３８】
一実施態様において、本方法は、大量の該試験物質を製造し、該試験物質を製薬上許容できる担体に配合する段階を包含する。
【００３９】
他の態様において、本発明は、該Ｔ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１へ化合物が結合することによりＴ細胞の死をもたらすシグナル伝達経路を誘導する、該Ｔ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１に結合する化合物；および炎症、自己免疫、移植片拒絶、アレルギー症状、またはＴ細胞性癌などの、過剰な若しくは望ましくないＴ細胞が媒介する免疫応答または過剰な若しくは望ましくないＴ細胞増殖に関連する症状を治療するための化合物の使用に関する説明書を含むキットを特徴とする。
【００４０】
一実施態様において、該キットは、（ｉ）二つのポリペプチド鎖を含み、該ポリペプチド鎖がそれぞれ（ａ）ＰＳＧＬ−１と結合する結合ドメイン、および（ｂ）該ポリペプチド鎖が多量体化合物を形成するよう異種アミノ酸配列により結合されている異種アミノ酸配列を有し、該Ｔ細胞の表面上の少なくとも二つのＰＳＧＬ−１タンパク質へ結合することによりＴ細胞の死をもたらすシグナル伝達経路を誘導する、該Ｔ細胞の表面上の少なくとも二つのＰＳＧＬ−１タンパク質に結合する該多量体化合物；および（ｉｉ）炎症、自己免疫、移植片拒絶、アレルギー症状、またはＴ細胞性癌などの、過剰な若しくは望ましくないＴ細胞が媒介する免疫応答または過剰な若しくは望ましくないＴ細胞増殖に関連する症状を治療するための化合物の使用に関する説明書を含む。
【００４１】
本発明の利点は、関連する望ましくないまたは有害な免疫応答を引き起こすことなく、Ｔ細胞を枯渇および／またはＴ細胞のアポトーシスを誘起できることである。例えば、実施態様によっては、本明細書に記載の個体への抗ＰＳＧＬ−１抗体または多量体化合物の投与により、ＩＬ−２またはＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインのレベルの望ましくない上昇は生じない。
【００４２】
本発明の他の利点は、Ｔ細胞のアポトーシスを誘起するアゴニスト組成物の使用によりＴ細胞の枯渇をもたらすことである。よって、本発明は、免疫受容体を結合し、該受容体により媒介される免疫の活性化を妨げることにより作用するアンタゴニスト組成物（例えば、拮抗性抗ＰＳＧＬ−１抗体または拮抗性の可溶性セレクチン断片）の使用によりもたらされる、受動的な免疫抑制よりむしろ、能動的な免疫抑制方法を提供する。
【００４３】
本発明の他の利点は、その発現が白血球、および特にＴ細胞およびＮＫ細胞にかなり限定される、細胞表面タンパク質、ＰＳＧＬ−１の標的化が可能であることである。したがって、本明細書中に記載の化合物は、肝臓細胞などの他の細胞型の有意なレベルのアポトーシスを誘起しない。生存を脅かす全身性サイトカイン応答を有意に誘起したりまた他の器官系に損傷を与えたりすることなく、選択的な枯渇を目的としたＴ細胞およびＮＫ細胞（移植片拒絶にかかわる重要なＣＤ３−細胞型）の標的化は、免疫抑制剤の望ましい特性である。
【００４４】
特記しない限り、本明細書中で使用される技術的および科学用語はすべて、本発明が属する分野における通常の知識を有するものによって一般的に理解されるのと同様の意味を有する。本明細書中の記載と同様または等価の方法および材料が本発明の実施または試験において使用可能であるが、好適な方法および材料を以下に説明する。本明細書中に記載のすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献が、そのまま文献として引用される。専門用語の不一致がある場合には、本明細書が制御するであろう。加えて、記載の材料および方法は、例示にすぎず、本発明を何ら制限するものではない。
【００４５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００４６】
図面の簡単な説明
図１は、いつ活性化Ｔ細胞が、ＴＡＢ４（抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体）が媒介するアポトーシスシグナルに対する感受性を得るかを調べた経時的な実験の結果を示すものである。
【００４７】
図２は、ＴＡＢ４抗体により認識される抗原の細胞表面のビオチン化および免疫沈降の結果を示すものである。
【００４８】
図３は、脾臓ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞、およびＮＫ細胞上のＰＳＧＬ−１抗原の発現を示すものである。
【００４９】
図４は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ４＋８＋、並びにＣＤ４−８−胸腺細胞上のＰＳＧＬ−１抗原の発現を示すものである。
【００５０】
図５は、レスポンダー(responder)としてのＴＡＢ４（またはハムスターＩｇ）で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスから単離された脾臓細胞およびスティミュレーター(stimulator)としてのＨ２ミスマッチＣ３Ｈ脾臓細胞を用いた混合リンパ球インキュベートで生産されたＩＬ−２レベルを示すものである。
【００５１】
図６は、（Ａ）ＴＡＢ４抗体で免疫沈降したタンパク質が市販の抗ＰＳＧＬ−１抗体により認識可能であることおよび（Ｂ）抗ＰＳＧＬ−１抗体でＴ細胞可溶産物を予め清澄化(preclearing)することで、ＴＡＢ４により認識されたタンパク質を枯渇できることを示すウェスタンブロット分析を示すものである。
【００５２】
図７は、Ｂａｌｂ／ｃマウスから皮膚移植を受け、抗ＰＳＧＬ−１抗体（黒塗りの菱形）または対照抗体（白抜きの四角）で処置したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける生存した移植片の割合（％）を示すものである。
【００５３】
図８は、活性化ヒト末梢血単核球を抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体で処置した後のアポトーシス性Ｔ細胞の割合（％）の経時変化を示すものである。
【００５４】
図９は、抗ＰＳＧＬ−１抗体（黒塗りの四角）または対照抗体（白抜きの四角）で処置した自己免疫性非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）オスマウスにおける糖尿病の発症率を示すものである。
【００５５】
図１０は、マウスＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、およびＬ−セレクチンのマウス活性化Ｔ細胞への結合を示すものである。
【００５６】
図１１Ａ−１１Ｃは、Ｅ−セレクチン（図１１Ａ）、Ｐ−セレクチン（図１１Ｂ）、およびＬ−セレクチン（図１１Ｃ）の多量体の形態(multimeric forms)によるマウス活性化Ｔ細胞のアポトーシスの誘起を示している。
【００５７】
図１２は、可溶性Ｐ−セレクチン−Ｆｃ融合タンパク質の架橋によるインビトロでのマウス活性化Ｔ細胞のアポトーシスの誘起を示している。
【００５８】
詳細な説明
本発明は、Ｔ細胞の表面上にあるＰＳＧＬ−１分子の機能を調節することによるＴ細胞活性の調節方法に関するものである。本明細書に記載のアゴニスト組成物とＰＳＧＬ−１の結合は、Ｔ細胞の枯渇を生じさせることおよび／またはＴ細胞がアポトーシスを受けるのを誘起することができる。したがって、これらのアゴニスト組成物は、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶、アレルギー症状、および／またはＴ細胞が誘導する癌などの免疫が関連する症状を制御するための治療剤として有用である。該アゴニスト組成物はまた、Ｔ細胞の存在または活性が望ましくない生体試料からＴ細胞を枯渇させるのにも有用である。
【００５９】
ＰＳＧＬ−１タンパク質
ＰＳＧＬ−１は、好中球、ＴおよびＢリンパ球、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および原始ヒトＣＤ３４造血前駆細胞で発現する細胞表面固着分子である。セクレチンと相互作用できることにより、ＰＳＧＬ−１は、内皮での白血球のローリング(rolling)および炎症組織への白血球の溢出を仲介する。Ｔ細胞のＥ−およびＰ−セクレチンへのＰＳＧＬ−１が仲介する結合、または移動は、特異に調節される。例えば、ＣＬＡ（皮膚リンパ球抗原）エピトープの出現は、記憶の移行(memory transition)に未経験である(naive)Ｔ細胞上で誘導されると考えられる。活性化ヘルパー１のみでなくヘルパー２Ｔ細胞も機能性ＰＳＧＬ−１を発現して、皮膚の炎症ドメインへの移動が可能になる。
【００６０】
ＰＳＧＬ−１は、Ｐ−セレクチンに結合するために、特異的にシアリル化され、フコシル化され、さらに硫酸化されなければならないシアロムチンである。ＰＳＧＬ−１分子は、そのＮ末端において異なる度合いのグリコシル化および硫酸化部位を特徴とするイソ型で存在する。休止抹消血ＴおよびＢ細胞、リンパ細胞系統およびインビトロの活性化抹消血Ｔ細胞は、同レベルのＰＳＧＬ−１を発現する。しかし、活性化Ｔ細胞のみが機能性形態のＰＳＧＬ−１を示し、Ｐ−セレクチンに貪欲に結合する。このような活性化依存性結合活性は、活性化Ｔ細胞でのアルファ（１，３）フコシルトランスフェラーゼの活性レベルの上昇によって示唆されるように、異なる翻訳後修飾の結果であると考えられる。ＰＳＧＬ−１イソ型はまた、Ｌ−セクレチンおよびＥ−セクレチンに対し異なる親和性を示す。例えば、ＣＬＡ陽性イソ型を示すヒトＴ細胞はＥ−およびＰ−セクレチンの双方に繋留し (tether)、回転できるが、ＣＬＡエピトープのないＰＳＧＬ−１を発現するＴ細胞はＰ−セレクチンにのみ結合する。さらに、Ｐ−セレクチンとＰＳＧＬ−１の結合は、硫酸化のための３つのチロシン残基およびグリコシル化のための１つのトレオニン残基を包含する末端デカペプチドの存在を条件とする。
【００６１】
ＰＳＧＬ−１タンパク質は、組み換え方法および／または生体材料からの天然のＰＳＧＬ−１タンパク質を単離することによって調製できる。組み換えＰＳＧＬ−１タンパク質は、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、原核または真核細胞で生産されうる。ＰＳＧＬ−１をコード化する核酸は、タンパク質の組み換え生産に使用可能である（例えば、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドをコード化する核酸の一例としてＧｅｎＢａｎｋＴＭ  受託番号ＮＭ＿００３００６を参照）。ＰＳＧＬ−１に対する抗体もまた公知であり、抗原の精製に使用可能である（例えば、Herron et al. (2000) Science Jun 2;288(5471):1653-56; WO 00/25808を参照）および／または本明細書に記載の方法に使用可能である。ＰＳＧＬ−１はさらに、以下に制限されるものではないが、Sako et al. (1993) Cell 75:1179; Vachino et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:21966; およびVeldman et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:16470などの参考文献に記載されている。
【００６２】
ＰＳＧＬ−１の組み換え生産では、ＰＳＧＬ−１およびその修飾アルファ（１，３）フコシルトランスフェラーゼ、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ、双方の同時発現が、ＰＳＧＬ−１の機能発現には必要であるかもしれない。加えてまたはこれに代わり、ＰＳＧＬ−１の組み換え生産は、プロペプチドを除去するためのＰＡＣＥをコード化する核酸および／またはチロシンスルホトランスフェラーゼをコード化する核酸との同時形質移入によりなしうるかもしれない。
【００６３】
抗ＰＳＧＬ−１抗体は、生体材料からのＰＳＧＬ−１抗原の単離および精製に使用可能である。例えば、個体由来のＴ細胞またはＴ細胞系統などのＰＳＧＬ−１タンパク質を発現する細胞型が、タンパク質源として使用されうる。精製したら、該タンパク質は本明細書に記載の様々な方法に使用されうる。例えば、精製ＰＳＧＬ−１タンパク質は、Ｔ細胞上のＰＳＧＬ−１機能の修飾因子のインビトロスクリーニングにまたは該タンパク質に対する抗体を調製するための免疫原として使用可能である。
【００６４】
抗ＰＳＧＬ−１抗体
ＰＳＧＬ−１ポリペプチド（またはその免疫原性断片または類似体）は、本発明の方法に有用な抗体の産生に使用可能である。上記の通り、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドまたはそのペプチド断片は、組み換え技術によって生産でき、また固相合成方法を用いて合成可能である。組み換えＰＳＧＬ−１ポリペプチドまたはそのペプチド断片は、抗ＰＳＧＬ−１抗体を生産するための免疫原として使用可能である。加えて、ＴＡＢ４モノクローナル抗体などの抗ＰＳＧＬ−１抗体は、次に抗ＰＳＧＬ−１抗体を生産するための免疫原として使用可能な、例えば、天然構造のＰＳＧＬ−１ポリペプチドなどのＰＳＧＬ−１ポリペプチドを精製するのに使用可能である。
【００６５】
本発明の抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、またはＰＳＧＬ−１ポリペプチドに特異的に結合するよう操作された抗体であってもよい。例えば、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドなどの特定の抗原に「特異的に結合する」抗体は、試料中において他の分子を実質的に認識または結合しないであろう。ゆえに、本発明はまた、ポリペプチドを試験化合物と接触させ、該ポリペプチドが試験化合物に結合するか否か決定することにより（例えば、該結合の直接的な検出、該ポリペプチドと該試験化合物の結合を阻害する競合分子の検出、および／またはアポトーシス誘起活性に関するアッセイを用いた結合の検出により）、本発明のポリペプチドに結合する試験化合物（例えば、抗体）を同定する方法を特徴とする。
【００６６】
通常、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドは、ＫＬＨなどの、担体タンパク質とカップリングさせ、アジュバントと混合し、そして宿主哺乳動物に注射されうる。次いで、該動物において生産された抗体は、ペプチド抗原アフィニティークロマトグラフィーによって精製されうる。
【００６７】
特に、様々な宿主動物が、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドまたはその抗原性断片の注射によって免疫化されうる。一般的に使用される宿主動物としては、ウサギ、マウス、モルモット、およびラットが挙げられる。免疫学的な応答の増加に使用可能な種々のアジュバントとしては、宿主の種に依存し、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、およびジニトロフェノールが挙げられる。潜在的に有用であるヒトアジュバントとしては、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム−パルヴムがある。ポリクローナル抗体は、免疫化した動物の血清中に含まれる抗体分子の異種集団である。
【００６８】
したがって、本発明に包含される抗体は、ポリクローナル抗体、さらにはモノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦａｂ発現ライブラリーを用いて生産された分子を包含する。
【００６９】
特定の抗原に対する抗体の同種集団である、モノクローナル抗体は、上記のＰＳＧＬ−１ポリペプチドおよび標準的なハイブリドーマ技術（例えば、Kohler et al., Nature 256:495 [1975]; Kohler et al., Eur J Immunol 6:511 [1976]; Kohler et al., Eur J Immunol 6:292 [1976]; Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y. [1981]などを参照）を用いて調製することができる。
【００７０】
特に、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)、および米国特許第４，３７６，１１０号に記載されているようなインキュベート物での連続細胞系統による抗体分子の生産を可能とするいずれかの技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al., Immunology Today 4:72 [1983]; Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 [1983])、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 [1983])により得られる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤなどのいずれかの免疫グロブリンクラスおよびそのサブクラスを有していてもよい。本発明のｍＡｂを生産するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボでインキュベートしてもよい。インビボにおいて高力価のｍＡｂを生産できることは、特に有用な生産方法である。
【００７１】
製造したら、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、ウェスタンブロットまたは、例えば、Ausubelらの上記文献に記載のような標準的な方法による免疫沈降分析により、特異的なＰＳＧＬ−１認識について試験される。ＰＳＧＬ−１を特異的に認識し、特異的に結合する抗体が本発明において有用である。例えば、ＣＤ３＋細胞などのＴ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１抗原に結合し、個体におけるＴ細胞の枯渇および／またはアポトーシスを誘起する抗ＰＳＧＬ−１抗体が特に有用である。
【００７２】
該抗体は、例えば、（例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶、アレルギー疾患、およびＴ細胞で誘導される癌などの症状に関連する、Ｔ細胞が媒介する免疫応答などの、望ましくない免疫応答を抑制または排除するための）治療レジメの一部として使用されうる。抗体はまた、候補化合物のＰＳＧＬ−１への結合能を測定するためのスクリーニングアッセイに使用されうる。
【００７３】
加えて、好適な生物活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と共に、好適な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生産のために開発された技術(Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 [1984]; Neuberger et al., Nature 312:604 [1984]; Takeda et al., Nature 314:452 [1984])が使用可能である。キメラ抗体は、マウスのモノクローナル抗体由来の可変ドメインおよびヒトの免疫グロブリン定常ドメインを有するものなどの、異なる部分が異なる動物種由来である分子である。
【００７４】
または、単鎖抗体の生産に関して記載の技術（米国特許第４，９４６，７７８号、第４，９４６，７７８号、および第４，７０４，６９２号）が、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドに対する単鎖抗体、またはその断片の生産に適用可能である。単鎖抗体は、単鎖のポリペプチドが得られるよう、アミノ酸架橋を介してＦｖドメインの重鎖および軽鎖を架橋することによって形成される。
【００７５】
特定のエピトープを認識し、結合する抗体断片は、既知の技術により産生可能である。例えば、このような断片としては、以下に制限されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって生産されうるＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって得られるＦａｂ断片が挙げられる。または、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築してもよい(Huse et al., Science 246:1275 [1989])。
【００７６】
抗体は、当該分野において既知の方法によりヒト化されてもよい。例えば、所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体を商業的にヒト化されうる(Scotgene, Scotland; Oxford Molecular, Palo Alto, Calif.)。形質転換動物で発現するものなどの、十分なヒト抗体もまた本発明の態様である(Green et al., Nature Genetics 7:13 [1994]; 並びに米国特許第５，５４５，８０６号および第５，５６９，８２５号)。
【００７７】
多量体化合物
Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１タンパク質に結合する多量体化合物は、該細胞におけるアポトーシスの誘起に使用されうる。該多量体化合物は少なくとも二つのポリペプチド鎖を含む。該ポリペプチド鎖はそれぞれ、（ｉ）ＰＳＧＬ−１に結合する結合ドメイン、および（ｉｉ）異種アミノ酸配列を有する。
【００７８】
概して、多量体化合物は、所定の細胞表面上の少なくとも二つの異なるＰＳＧＬ−１タンパク質に結合する。しかしながら、多量体化合物は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、またはそれ以上の異なるＰＳＧＬ−１結合ドメインを有するよう調合され得、それにより、該多量体化合物が、所定の細胞表面上の３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、またはそれ以上の異なるＰＳＧＬ−１タンパク質に結合するよう誘起する。
【００７９】
結合ドメインは、ＰＳＧＬ−１に結合する任意のアミノ酸配列（または、例えば、グリコシル化および／または硫酸化などの修飾を有する任意のアミノ酸配列）を有していてもよい。該結合ドメインは、天然のまたは非天然のアミノ酸配列のいずれにも対応しうる。例えば、結合ドメインは、セレクチン（例えば、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、またはＬ−セレクチン）のＰＳＧＬ−１結合ドメインを含みうる。セレクチンのＰＳＧＬ−１結合ドメインを含むポリペプチドは、必要に応じて、（ｉ）セレクチン（例えば、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、またはＬ−セレクチン）の細胞外ドメイン；（ｉｉ）セレクチン（例えば、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、またはＬ−セレクチン）のカルシウム依存性レクチンドメイン；または（ｉｉｉ）ＰＳＧＬ−１への結合を媒介するセレクチン（例えば、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、またはＬ−セレクチン）の細胞外ドメインの断片を含んでいてもよい。該天然のアミノ酸配列に加えて、一つ以上のアミノ酸変化を天然のＰＳＧＬ−１結合ドメインに導入して、ＰＳＧＬ−１結合機能を保持した非天然の配列を得てもよい。例えば、ポリペプチドＰＳＧＬ−１に結合しており、任意の（ｉ）セレクチン（例えば、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、またはＬ−セレクチン）の細胞外ドメイン；（ｉｉ）セレクチン（例えば、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、またはＬ−セレクチン）のカルシウム依存性レクチンドメイン；または（ｉｉｉ）ＰＳＧＬ−１への結合を媒介するセレクチン（例えば、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、またはＬ−セレクチン）の細胞外ドメインの断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％は同一である、アミノ酸配列を包含しうる。標準的な分子生物学的変異誘発の技術が、ＰＳＧＬ−１結合ドメインをコード化する核酸配列に変化を誘起するために使用されうる。次いで、修飾された結合ドメインは、例えば、固定化ＰＳＧＬ−１または細胞表面上のＰＳＧＬ−１などのＰＳＧＬ−１に対するその結合能力を評価されうる。また、結合ドメインは、抗ＰＳＧＬ−１抗体若しくはファージディスプレーライブラリーから選択されるポリペプチドのＰＳＧＬ−１結合ドメイン、またはＰＳＧＬ−１と結合しており、抗ＰＳＧＬ−１抗体若しくはファージディスプレーライブラリーから選択されるポリペプチドのＰＳＧＬ−１結合ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％は同一であるアミノ酸配列を包含しうる。
【００８０】
ＰＳＧＬ−１結合ドメインは、Ｐ−セレクチンのＰＳＧＬ−１結合断片に対応するアミノ酸配列を含みうる。そのようなアミノ酸配列を含む（本明細書に記載の多量体化合物の）ポリペプチド鎖の一例としては、以下の成分：（ｉ）ＣＤ３３シグナルペプチド（Ｍｅｔ１−Ａｌａ１６）；（ｉｉ）マウスＰ−セレクチン（細胞外ドメインのＴｒｐ４２−Ａｌａ７０９）；（ｉｉｉ）ＩＥＧＲＭＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；および（ｉｖ）ヒトＩｇＧ１（Ｐｒｏ１００−Ｌｙｓ３３０）、を含む組換え型のマウスＰ−セレクチン／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮより入手可能）が挙げられる。そのようなアミノ酸配列を包含するポリペプチド鎖の他の例としては、以下の成分：（ｉ）ヒトＰ−セレクチン（Ｍｅｔ１−Ａｌａ７７１、細胞外ドメイン）；（ｉｉ）ＩＥＧＲＭＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；および（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ１（Ｐｒｏ１００−Ｌｙｓ３３０）、を含む組換え型のヒトＰ−セレクチン／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮより入手可能）が挙げられる。
【００８１】
ＰＳＧＬ−１結合ドメインは、Ｅ−セレクチンのＰＳＧＬ−１結合断片に対応するアミノ酸配列を含みうる。そのようなアミノ酸配列を含む（本明細書に記載の多量体化合物の）ポリペプチド鎖の一例としては、以下の成分：（ｉ）マウスＥ−セレクチン（Ｍｅｔ１−Ｐｒｏ５５７、細胞外ドメイン）；（ｉｉ）ＩＥＧＲＭＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ１（Ｐｒｏ１００−Ｌｙｓ３３０）；および（ｉｖ）ＨＨＨＨＨＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、を含む組換え型のマウスＥ−セレクチン／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮより入手可能）が挙げられる。そのようなアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖の他の例としては、以下の成分：（ｉ）ヒトＥ−セレクチン（Ｍｅｔ１−Ｐｒｏ５５６、細胞外ドメイン）；（ｉｉ）ＩＥＧＲＭＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）；（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ１（Ｐｒｏ１００−Ｌｙｓ３３０）；および（ｉｖ）ＨＨＨＨＨＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、を含む組換え型のヒトＥ−セレクチン／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮより入手可能）が挙げられる。
【００８２】
ＰＳＧＬ−１結合ドメインは、Ｌ−セレクチンのＰＳＧＬ−１結合断片に対応するアミノ酸配列を含みうる。そのようなアミノ酸配列を含む（本明細書に記載の多量体化合物の）ポリペプチド鎖の一例としては、以下の成分：（ｉ）マウスＬ−セレクチン（Ｍｅｔ１−Ａｓｎ３３２、細胞外ドメイン）；（ｉｉ）ＩＥＧＲＭＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ１（Ｐｒｏ１００−Ｌｙｓ３３０）；および（ｉｖ）ＨＨＨＨＨＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、を含む組換え型のマウスＬ−セレクチン／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮより入手可能）が挙げられる。そのようなアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖の他の例としては、以下の成分：（ｉ）ヒトＬ−セレクチン（Ｍｅｔ１−Ａｓｎ３３２、細胞外ドメイン）；（ｉｉ）ＩＥＧＲＭＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）；（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ１（Ｐｒｏ１００−Ｌｙｓ３３０）；および（ｉｖ）ＨＨＨＨＨＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、を含む組換え型のヒトＬ−セレクチン／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮより入手可能）が挙げられる。
【００８３】
多量体化合物は、ホモ多量体化合物またはヘテロ多量体化合物として調合されうる。ホモ多量体化合物は同一のＰＳＧＬ−１結合ドメインを有するポリペプチド鎖のみを含む。例えば、ホモ多量体化合物は、Ｐ−セレクチンのＰＳＧＬ−１結合ドメイン断片を含むポリペプチド鎖を含みうる。ヘテロ多量体化合物は異なるＰＳＧＬ−１結合ドメインを有するポリペプチド鎖を含む。例えば、ヘテロ多量体化合物は、Ｐ−セレクチンのＰＳＧＬ−１結合ドメイン断片を含む第一のポリペプチド鎖およびＥ−セレクチンのＰＳＧＬ−１結合ドメイン断片を含む第二のポリペプチド鎖を含みうる。
【００８４】
異種アミノ酸配列は、任意のアミノ酸配列であってよい。しかしながら、本明細書に記載のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、天然のタンパク質の配列とは一致しない。異種アミノ酸配列は、該ポリペプチド鎖の結合を可能とする一つ以上のアミノ酸を含む。例えば、該一つ以上のアミノ酸は、例えば、ジスルフィド結合などにより、該ポリペプチド鎖に共有結合しうる。異種配列の一例としては、免疫グロブリン重鎖定常ドメインが挙げられる。二つのポリペプチド鎖のＦｃドメイン間のジスルフィド結合は、二量体化合物の形成をもたらしうる。
【００８５】
該ポリペプチド鎖の結合への貢献に加えて、該異種アミノ酸配列は、例えば、細胞表面の受容体結合ドメインなどの架橋結合ドメインをも含みうる。該結合ドメインへの薬剤の結合において、該ポリペプチド鎖およびそれらが結合する細胞表面ＰＳＧＬ−１タンパク質の架橋が結果として生じうる。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、Ｆｃ受容体結合ドメインを含む。例えば、架橋体（cross-linker）は、異種アミノ酸配列の架橋結合ドメインに特異的に結合する抗体（例えば、抗Ｆｃ抗体）でありうる。
【００８６】
ＰＳＧＬ−１機能を調節する化合物に関するスクリーニングアッセイ
本発明は、ＰＳＧＬ−１への結合に際しＴ細胞の枯渇および／またはＴ細胞のアポトーシスを誘起する化合物（しかし、当該化合物に限定されるものではない）を含むＰＳＧＬ−１（またはＰＳＧＬ−１のドメイン）と相互作用する化合物を同定する方法をも包含する。ＰＳＧＬ−１活性を調節する膜内外、細胞外、または細胞内タンパク質とのＰＳＧＬ−１の相互作用を調節する化合物およびＰＳＧＬ−１活性を調節する化合物も包含する。
【００８７】
本発明によりスクリーニングされうる化合物としては、以下に制限されるものではないが、本明細書に記載のように、ＰＳＧＬ−１に結合し、ＰＳＧＬ−１により媒介される生物学的機能を調節する、ペプチド、抗体およびその断片、並びに他の有機化合物が挙げられる。
【００８８】
このような化合物としては、以下に制限されるものではないが、例えば、以下に制限されるものではないが、ランダムペプチドライブラリーのもの；(Lam et al., Nature 354:82 [1991]; Houghten et al., Nature 354:84 [1991])などの、可溶性ペプチド、並びにＤ−および／またはＬ−体のアミノ酸から作製されるコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのもの、ホスホペプチド（以下に制限されるものではないが、ランダムまたは部分的に変性した定方向ホスホペプチドライブラリーのものを包含する；Songyang et al., Cell 72:767 [1993]）、抗体（以下に制限されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオ型、キメラまたは単鎖抗体、並びにＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦＡｂ発現ライブラリー断片、並びにそのエピトープ結合断片を包含する）、並びに有機または無機小分子が挙げられる。
【００８９】
本発明によりスクリーニングされうる他の分子としては、以下に制限されるものではないが、本明細書に記載のように、ＰＳＧＬ−１タンパク質の活性に影響を及ぼす有機小分子が挙げられる。
【００９０】
コンピュータモデリングおよび探索技術により、ＰＳＧＬ−１発現または活性を調節可能な、化合物の同定、または既に同定された化合物の改良が可能である。このような化合物または組成物が同定されている場合、活性部位またはドメインが同定される。一般的に、このような活性部位は、活性の天然の修飾因子に対する結合部位であってもよい。該活性部位は、例えば、ペプチドのアミノ酸配列、核酸のヌクレオチド配列、または関連する化合物若しくは組成物のその天然のリガンドとの複合体の研究などの当該分野において既知の方法を用いて同定しうる。後者の場合においては、化学的またはＸ線結晶方法が、その因子上のどこに修飾因子（または、リガンド）が見出されるかを知得することにより活性部位を見出すのに使用可能である。
【００９１】
結合を変化させうる化合物の設計および産生に関し参考文献を用い上述したが、ＰＳＧＬ−１タンパク質に結合し、Ｔ細胞の枯渇および／またはＴ細胞のアポトーシスを誘起する化合物に関する、天然産物または合成化学物質を含む既知化合物およびタンパク質を含む生物活性物質のライブラリーをスクリーニングしてもよい。
【００９２】
インビトロ系が、ＰＳＧＬ−１（または、ＰＳＧＬ−１のドメイン）と相互作用可能な化合物を同定するために設計されてもよい。同定される化合物は、例えば、本明細書に記載のように、Ｔ細胞活性を調節するのに有用であり、ゆえに、炎症、自己免疫、移植片拒絶、アレルギー疾患、またはＴ細胞性癌などの過剰な若しくは望ましくないＴ細胞が媒介する免疫応答または過剰な若しくは望ましくないＴ細胞増殖に関連する症状の治療に有用である。
【００９３】
ＰＳＧＬ−１に結合する化合物の同定に使用されるアッセイの原理は、２成分が相互作用し結合するのに十分な、従って、反応混合物中で除去および／または検出されうる複合体の形成に十分な条件および時間の下、ＰＳＧＬ−１（または、そのドメイン）および試験化合物の反応混合物を調製することを包含する。使用されるＰＳＧＬ−１種は、スクリーニングアッセイの目標に基づき異なりうる。場合によっては、アッセイ系（例えば、生成する複合体の標識化、単離など）において好適な異種タンパク質またはポリペプチドに融合したＰＳＧＬ−１のドメインに対応するペプチドを使用することが好ましい。
【００９４】
該スクリーニングアッセイは、様々な方法において行ないうる。例えば、このようなアッセイを行なう一つの方法としては、固相上にＰＳＧＬ−１タンパク質、ポリペプチド、ペプチド若しくは融合タンパク質または試験化合物を固着し、反応終了時に固相上に固着したＰＳＧＬ−１／試験化合物複合体を検出する方法が挙げられる。このような方法の一実施態様において、ＰＳＧＬ−１反応物は、固体表面に固着されていてもよく、固着しない試験化合物を、直接的または間接的に標識してもよい。
【００９５】
実際には、マイクロタイタープレートを、簡便に、固相として使用してもよい。固着した成分を、非共有または共有結合によって固定化してもよい。非共有結合は、固体表面をタンパク質の溶液で簡単に被覆し、乾燥することにより達成されてもよい。または、固定化されるタンパク質に特異的な、固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を、固体表面へのタンパク質の固着に使用してもよい。該表面は、予め調製され、貯蔵されていてもよい。
【００９６】
アッセイを行なうために、固定化されていない成分を、固着成分を包含する被覆表面に添加する。反応終了後、未反応成分を、形成された複合体が固体表面で固定化され続けるような条件下で（例えば、洗浄によって）除去する。固体表面上に固着した複合体の検出は、数多くの方法で達成しうる。事前に固定化されていない成分が予め標識されている場合には、表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。事前に固定化されていない成分が予め標識されていない場合には、間接的な標識を用いて；例えば、事前に固定化されていない成分に特異的な標識抗体を用いて（さらに、この抗体は、直接標識されていてもまたは標識された抗Ｉｇ抗体で間接的に標識されていてもよい）、表面上に固着した複合体を検出できる。
【００９７】
または、反応は液相で行なってもよく、反応生成物を未反応成分から分離し、例えば、溶液中に形成される複合体を固着するための、ＰＳＧＬ−１タンパク質、ポリペプチド、ペプチド若しくは融合タンパク質または試験化合物に特異的な固定化抗体、および固着した複合体を検出するための可能な複合体の他の成分に特異的な標識抗体を用いて、複合体を検出してもよい。
【００９８】
または、細胞によるアッセイを用いて、ＰＳＧＬ−１と相互作用する化合物を同定してもよい。この際には、ＰＳＧＬ−１を発現する細胞系統、またはＰＳＧＬ−１を発現するように遺伝子操作された細胞系統が使用可能である。細胞によるアッセイは、本明細書に記載のスクリーニングにより同定される化合物の機能的な効果を評価するのに特に有用である。例えば、化合物がＰＳＧＬ−１タンパク質への結合能に基づき同定されたら、次いで、該化合物について、例えば、インビトロ若しくはインビボのＴ細胞のアポトーシスの誘起能またはインビトロ若しくはインビボのＴ細胞の枯渇能を試験してもよい。
【００９９】
薬剤組成物
本発明の目的が個体における免疫応答を変化させることである場合には、例えば、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドに特異的に結合する、抗体、多量体化合物、小分子、または他の化合物を含む薬剤組成物も本発明の一態様である。好ましい例において、該化合物はＰＳＧＬ−１のアゴニストとして機能する。
【０１００】
本発明にしたがって使用される薬剤組成物は、一つ以上の生理学的に許容できる担体または賦形剤を用いて公知の方法で調合されうる。よって、該化合物並びにこれらの生理学上に許容できる塩および溶媒和化合物は、様々な投与経路による投与を目的として調合されてもよい。
【０１０１】
該化合物は、例えば、大量瞬時投与または連続輸液など注射による非経口投与用に調合してもよい。注射用の製剤形態は、保存剤を添加して、例えば、アンプルでまたはマルチドースコンテナなどの単位剤形(unit dosage form)で提供されてもよい。該組成物は、懸濁液、溶液または油性若しくは水性媒体におけるエマルジョンなどの形態をとっていてもよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの調合剤を含んでいてもよい。あるいは、活性成分は、使用前に、例えば、無菌かつ発熱物質を含まない水など適当な媒体と共に構成される粉末形態であってもよい。
【０１０２】
Ｔ細胞が媒介する免疫応答を制御する方法およびＴ細胞集団を枯渇する方法
本明細書に記載のスクリーニングアッセイにおいて記載したのと同様の化合物は、例えば、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドにより媒介される生物学的な機能の調節および／または過剰な若しくは望ましくない免疫応答、例えば、Ｔ細胞が媒介する免疫応答に関連する疾患の治療に有用でありうる。これらの化合物としては、以下に制限されるものではないが、Ｔ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１に結合し、Ｔ細胞の死をもたらすシグナル伝達経路を誘導する、ペプチド、抗体およびその断片、並びに他の有機化合物が挙げられる。本発明の方法は、必要に応じて、細胞表面上のＰＳＧＬ−１の架橋を誘起する架橋剤を添加することを包含していてもよい。本明細書に記載の化合物は、Ｔ細胞活性の枯渇または排除が望ましい場合に使用可能である。本発明の化合物で治療しうる特に有用な症状としては、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶、アレルギー疾患、およびＴ細胞で誘導される癌が挙げられる。
【０１０３】
本明細書に記載の抗ＰＳＧＬ−１化合物で治療しうる症状としては、以下に制限されるものではないが、真性糖尿病、関節炎（リウマチ様関節炎、若年性関節リウマチ、骨関節炎、および乾癬性関節炎を包含する）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を包含する）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚性紅斑性狼瘡、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ライ反転反応(leprosy reversal reactions)、ライ性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感覚神経性聴力損失、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴェンズ−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、間質性肺線維症、移植片対宿主疾患、骨髄移植、肝臓移植またはいずれかの器官若しくは組織の移植などの移植の症例（同種または異種組織を用いた移植を包含する）、アトピー性アレルギーなどのアレルギー、ＡＩＤＳ、並びに白血病および／またはリンパ腫などのＴ細胞新生物が挙げられる。
【０１０４】
本発明の方法は、インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞集団からＴ細胞を枯渇するのに使用可能である。例えば、個体由来の生体試料から、該試料を、本明細書に記載される抗ＰＳＧＬ−１化合物と、さらに必要に応じて架橋剤と共に、接触させることによって、インビトロでＴ細胞を枯渇することができる。本方法は、例えば、細胞集団中の非Ｔ細胞を強化させる点において、さらには細胞集団からＴ細胞活性を減少するかまたは排除する点において、有用でありうる。
【０１０５】
下記は、本発明の実施例である。下記実施例は、本発明の概念を制限するものでないと解される。
【０１０６】
実施例１：抗Ｔ細胞アポトーシス誘導タンパク質（「ＴＡＩＰ」）モノクローナル抗体の調製
ＴＡＩＰに特異的なモノクローナル抗体を、所望の抗体を分泌するハイブリドーマを生産するのにKohler and Milstein ((1976) European Journal of Immunology 6:511-519)の既知の細胞融合方法を適用することによって得た。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）活性化Ｂａｂ／ｃの脾臓Ｔ細胞を注射したハムスターからの抗体産生細胞を、ミエローマ細胞系と融合させて、抗体を分泌するハイブリドーマを形成した。これらの細胞の２集団は、ポリエチレングリコールで融合させ、得られた抗体産生細胞をクローニングして、標準的な組織インキュベート方法によって増殖させた。これらの方法にしたがって得られた一つのハイブリドーマは、インビトロでＴ細胞のアポトーシスを誘起しかつインビボでＴ細胞を枯渇することができる、ＴＡＢ４と称する、モノクローナル抗体を分泌した。ＴＡＢ４によって認識されるタンパク質を、Ｔ細胞のアポトーシス誘導タンパク質（ＴＡＩＰ）と称した。
【０１０７】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）およびＢＡＬＢ／ｃは、Jackson lab (Bar Harbor, ME)から購入した。シリアンハムスターは、Animal Core Facility, National Taiwan University Medical Collegeから購入した。
【０１０８】
ＴＡＢ４ハイブリドーマの濃縮インキュベート液上清を、２０，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を結合緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）で１：１の比で希釈した。プロテインＧカラム（約１ｍｌのベッドボリューム）を、３〜５ｍｌの結合緩衝液で３回洗浄した。透明なインキュベート液上清をプロテインＧカラムにのせ、流動液を集め、カラムに再度のせた。カラムを６〜１０ｍｌの結合緩衝液で洗浄し、結合した抗体を５ｍｌの溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．８）でカラムから溶出させた。各画分は１ｍｌの溶出された抗体を含み、各１ｍｌの画分を５０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５と混合することによって、溶出画分を中性のｐＨに調節した。抗体を包含する画分を溜め、各透析について３時間、２リットルのＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回透析した。抗体試料中のタンパク質濃度を、Bio-Rad Protein Assay (BIO-RAD, Hercules, CA)を用いてBradfordによって記載された方法で測定した。
【０１０９】
実施例２：マウス脾臓細胞懸濁液の調製並びにＴ細胞の活性化および強化
マウスの脾臓を、８ｍｌのハンクス液（ＨＢＳＳ）に浸漬し、滅菌したカバーガラスでゆるやかに細かく切り刻み、１５ｍｌの遠心管(Costar)に移し、さらに２００×ｇで５分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレットを、壁をゆるやかにたたくことによって残りの緩衝液に再懸濁した。混入した赤血球（ＲＢＣ）を、１ｍｌのＲＢＣ溶解緩衝液（０．６Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、０．１７Ｍ  Ｔｒｉｓ−ベース、ｐＨ  ７．６５）を添加することによって溶解した後、室温で２分間インキュベートし、９ｍｌのＨＢＳＳで迅速に急冷した。細胞を２００×ｇ、５分間でペレット化し、２回洗浄して、ＲＰＩＭインキュベート液に再懸濁した。混合物中の細胞の濃度および生存率を、血球計数器(Cambridge Scientific Inc.)およびトリパンブルー排除(Trypan blue exclusion）で測定した。
【０１１０】
脾臓細胞を、ＲＰＩＭ培地で３×１０６／ｍｌの最終濃度になるように調節し、コンカナバリンＡを２μｇ／ｍｌの最終濃度になるように加えて、Ｔ細胞を活性化した。細胞懸濁液を、集める前に、６ウェルのインキュベートプレート（５ｍｌ／ウェル）または１０ｃｍのインキュベート皿（１０ｍｌ／皿）に移し、３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間インキュベートした。活性化Ｔ細胞を包含する、活性化された脾臓細胞を、５ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁し、遠心管のパーコール溶液の５５％クッション５ｍｌの頂上に注意深くのせた。分離した層を乱さないように注意した。細胞を止めずに２５℃で１，９００×ｇで１３分間遠心した。強化された(enriched)Ｔ細胞を２層の界面から集め、ＨＢＳＳで２回洗浄し、実験用に用意した。
【０１１１】
実施例３：活性化Ｔ細胞のアポトーシス
活性化Ｔ細胞（実施例２参照）を、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を包含するＲＰＩＭ培地に５×１０５細胞／ｍｌの最終濃度になるように再懸濁し、表１に示される条件にしたがって、対照Ｉｇ、ＴＡＢ４、または抗ＣＤ３で処理した。
【０１１２】
【表１】
2007533618.tif 000002
【０１１３】
１８〜２４時間インキュベートした後、各インキュベート物のアポトーシスの程度を７−ＡＡＤアポトーシスアッセイを用いて測定した。処理した細胞を、ＦＡＣＳ管(Falcon)に移し、氷冷したＦＡＣＳ溶液（ＰＢＳにおける１％ウシ胎児血清、０．０５％アジ化ナトリウム）で２回洗浄し、４℃で２００×ｇでペレット化した。細胞を、１〜２×１０７細胞／ｍｌの最終濃度になるように氷冷したＦＡＣＳ溶液に再懸濁した。染色するために、０．１ｍｌの再懸濁された細胞を、２μｇ／ｍｌの最終濃度で７−ＡＡＤと混合した後、暗所で４℃で２０分間インキュベートした。最後に、染色された細胞を氷冷したＦＡＣＳ溶液で２回洗浄し、０．５ｍｌのＦＡＣＳ溶液に再懸濁して、ＢＤ  ＬＳＲフローサイトメーター(Beckton Dickison)で分析した。
【０１１４】
図１は、いつ活性化Ｔ細胞がＴＡＢ４（抗ＴＡＩＰ）が媒介するアポトーシスシグナルに対する感受性を得るかを調べた代表的な経時的な実験の結果を示すものである。マウスの脾細胞を、Ｃｏｎ−Ａで活性化し、ＩＬ−２含有培地に維持した。活性化Ｔ細胞を集め、再懸濁し、架橋体(cross-linker)としての抗ハムスターＩｇＧ抗体の存在下でＴＡＢ４モノクローナル抗体または対照のハムスターＩｇＧで攻撃した。ＴＡＩＰ架橋が低レベル（６．５％）のアポトーシス細胞死を誘起できたことが１日目で明らかであった。しかしながら、ＴＡＢ４で誘起されたアポトーシスの程度は、２日目で１７％から増加し、４日で５２％でピークとなり、６日目には４４％にまで減少した。対照のハムスターＩｇＧは、ＩＬ−２のみを投与したインキュベート物に比して、特異的なアポトーシスＴ細胞死を誘起しなかった。抗ＣＤ３（ポジティブコントロールとして）は、活性化してから４８時間後に３８％のＴ細胞のアポトーシスを誘起した（データ示さず）。
【０１１５】
実施例４：異なる組織におけるＴＡＩＰ抗原の発現
細胞を氷冷したＦＡＣＳ溶液（ＰＢＳにおける１％ウシ胎児血清、０．０５％アジ化ナトリウム）で２回洗浄し、ＦＡＣＳ管(Falcon)で４℃で２００×ｇで遠心した。細胞を、１×１０７細胞／ｍｌの最終濃度になるように氷冷したＦＡＣＳ溶液に再懸濁し、ＦＡＣＳ管(Falcon)中の再懸濁した細胞の０．１ｍｌのアリコートを各アッセイに使用した。表面を染色するために、２μｇ／ｍｌの最終濃度でＴＡＢモノクローナル抗体または対照のハムスターＩｇを細胞に添加し、混合物を暗所で４℃で３０分間インキュベートした。細胞を氷冷したＦＡＣＳ溶液で１回洗浄した後、（１）脾細胞では、１００μｌの氷冷したＦＡＣＳ溶液におけるサイクロム(cychrome)接合抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍｌ）、ＦＩＴＣ接合抗ハムスターＩｇ、およびＰＥ接合抗ＣＤ８／ＣＤ４／ＣＤ１９／ＣＤ１１ｂ／ｐａｎ−ＮＫ／Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ／Ｍａｃ−３抗体（２μｇ／ｍｌ）；並びに（２）胸腺細胞では、１００μｌの氷冷したＦＡＣＳ溶液におけるＦＩＴＣ接合抗ハムスターＩｇ、ＰＥ接合抗ＣＤ８抗体、およびサイクロム接合抗ＣＤ４抗体（２μｇ／ｍｌ）で、染色した。反応は、暗所で４℃で３０分間、行なった。最後に、染色細胞を氷冷したＦＡＣＳ溶液で２回洗浄し、１ｍｌのＦＡＣＳ溶液に再懸濁して、ＢＤ  ＬＳＲフローサイトメーター(Beckton Dickison)で分析した。
【０１１６】
図３および４は、脾細胞および胸腺細胞の様々なサブ集団でのＴＡＩＰ抗原の分布をＦＡＣＳ分析により示すものである。図３に示されるように、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞は、低いが検出可能な量のＴＡＩＰタンパク質を表面上に発現した。有意により高い量のＴＡＩＰタンパク質が、ＣＤ３＋  Ｔ細胞およびＮＫ細胞の画分で検出された。ほとんどのＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ４＋８＋  胸腺Ｔ細胞は、有意な量のＴＡＩＰタンパク質を発現した。これに対して、ＴＡＩＰタンパク質は、ＣＤ４−８−  胸腺Ｔ細胞の小集団でしか発現しなかった（図４）。
【０１１７】
脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、胃、腎臓、脾臓、および皮膚などの、Ｂ６およびＢａｌｂ／ｃマウスの組織を集め、室温で一晩、１０％ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンブロック中に包埋した。４μｍ厚の、組織切片を、Leica RM2135ミクロトームでパラフィンブロックから調製し、４５℃の水中に広げ、被覆スライドにのせた。スライドを３７℃で乾燥し、次の実験のために用意した。
【０１１８】
組織パラフィン切片を包含するスライドを脱ろうし、標準的なプロトコルにしたがってキシレン−１００％エタノールシリーズで乾燥し、最後に１００％エタノールに保持した。切片を、標準的なプロトコルにしたがって１００％エタノール−９０％エタノール−８５％エタノール−７０％エタノール−ＰＢＳの連続インキュベーションからさらに最後にＰＢＳ溶液にまでして再水和させた。以下の反応はすべて、給湿ボックスで行なった。非特異的な結合を、組織切片を遮断緩衝液（１％正常ヤギ血清）中で室温で１時間（または４℃で一晩）インキュベートすることによって遮断した。遮断緩衝液を除き、ＴＡＢ４または正常ハムスターＩｇ（１：２００希釈）を切片に加えて、インキュベーションをさらに室温で１時間（または４℃で一晩）続けた。切片を、各々５分間、ＰＢＳで２回洗浄して、一次抗体を除去し、１：２５０の希釈アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ハムスターＩｇと反応させ、室温で１時間インキュベートした。切片を、再度、各々５分間、ＰＢＳで２回洗浄して、抗体−酵素接合体を除去し、着色反応を、暗所でＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液で室温で３０分間発色させた。切片を再度ＰＢＳで洗浄し、過剰な酵素基質を除去し、ＰＢＳ−エタノール−キシレンシリーズで脱水し、顕微鏡検査にのせた。
【０１１９】
結果から、ＴＡＩＰタンパク質の発現は骨髄由来組織でのみ検出され試験され、残りの組織では検出されなかったことが示された。
【０１２０】
実施例５：ＴＡＩＰ抗原の細胞表面ビオチン化および免疫沈降
５×１０７ＲＬオス１またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、氷上で３０分間０．５ｍｇ／ｍｌスルホ−ＮＨＳ−ビオチン(Sulfo-NHS-biotin)(Pierce)を包含するＰＢＳ  １ｍｌ中で表面ビオチン化した。反応を、細胞を氷上で１０分間、０．５ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地(Life Technologies, Inc.)でインキュベートすることによって終了した。細胞を１ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地で１回および１ｍｌのリン酸緩衝液で２回洗浄した。
【０１２１】
標識された細胞を、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(complete protease inhibitor cocktail)(Roche)を包含する冷却溶解緩衝液（１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１６０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で５．０×１０７細胞／ｍｌの密度で１５分間溶解し、不溶材料を１０，０００×ｇで１０分間ペレット化した；これらおよびすべての次の段階は、４℃で行なわれた。免疫沈降では、溶解産物を、５０μｌの充填プロテインＧ−セファロース(Amersham Pharmacia Biotech)と共に３０分間予めインキュベートして、非特異的に結合するタンパク質を除去した。ビーズをペレット化し、上清のアリコート（定常的に５．０×１０７細胞に相当）を、１０μｇのｍＡｂ  ＴＡＢ４または正常なハムスター血清由来のＩｇＧが予めのせられた２０μｌのプロテインＧ−セファロースと共にインキュベートした。４℃で４時間インキュベートした後、樹脂を、洗浄緩衝液（０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  オボアルブミン）で４回、および４００ｍＭ  ＮａＣｌの代わりに２５０ｍＭを包含する、同様の洗浄緩衝液で２回洗浄した。ＴＡＢ４に特異的に結合するタンパク質を、５０μｌの１×ＳＤＳサンプル緩衝液で溶出した。溶出したタンパク質を、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜(Millipore)に移した。フィルターについて、ペルオキシダーゼ接合アビジン(PharMingen)でビオチン化されたタンパク質を分析し、化学発光試薬(NENTMLife Science Products)で発色させた。
【０１２２】
図２に示されるように、約１２０ｋＤの分子量を有するビオチン化された表面タンパク質が、ＲＬ１細胞（ＴＡＩＰ＋  Ｔ細胞）ではＴＡＢ４によっては同定されたが、３Ｔ３細胞（ＴＡＩＰ−  Ｔ細胞）では同定されなかった。これに対して、ハムスターの正常血清で被覆したプロテインＧセファロースは、この１２０ｋＤのタンパク質を抽出できなかった。これらの結果から、この１２０ｋＤのタンパク質はＴ細胞の細胞表面でモノクローナル抗体ＴＡＢ４によって認識される抗原であることが示唆される。
【０１２３】
実施例６：インビボでのＴ細胞の枯渇
インビボでのＴ細胞および他の細胞の集団へのＴＡＢ４の効果を試験するために、マウスに、３００μｇのＴＡＢ４または対照のハムスターＩｇを腹腔内に注射し、４日目に、脾細胞、胸腺細胞、および末梢血の単核細胞を全細胞計測のためにおよびＦＡＣＳによる細胞表面マーカーの分析のために集めた。
【０１２４】
ＦＡＣＳアッセイでは、細胞を、４℃で２０分間２％パラホルムアルデヒドで固定し、２回洗浄して、１×１０７細胞／ｍｌの最終濃度になるように氷冷したＦＡＣＳ溶液に再懸濁した。ＦＡＣＳ管(Falcon)中の再懸濁された細胞の１００μｌのアリコートを各アッセイに使用した。２μｇ／ｍｌの最終濃度のＴＡＢ４または対照のハムスターＩｇを細胞に添加して、混合物を暗所で４℃で３０分間、インキュベートした。細胞を氷冷したＦＡＣＳで１回洗浄し、（１）脾細胞では、１００μｌの氷冷したＦＡＣＳ溶液におけるサイクロム(cychrome)接合抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍｌ）、ＦＩＴＣ接合抗ハムスターＩｇおよびＰＥ接合抗ＣＤ８／ＣＤ４／ＣＤ１９／ＣＤ１１ｂ／ｐａｎ−ＮＫ／Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ／Ｍａｃ−３抗体（２μｇ／ｍｌ）；並びに（２）胸腺細胞では、１００μｌの氷冷したＦＡＣＳ溶液におけるＦＩＴＣ接合抗ハムスターＩｇ、ＰＥ接合抗ＣＤ８抗体、およびサイクロム接合抗ＣＤ４抗体（２μｇ／ｍｌ）と、反応させた。反応は、暗所で４℃で３０分間、行なった。最後に、染色した細胞を、氷冷したＦＡＣＳ溶液で２回洗浄し、１，０００μｌのＦＡＣＳ溶液中に再懸濁して、ＢＤ  ＬＳＲフローサイトメーター(Beckton Dickison)で分析した。
【０１２５】
注射してから４日後に、末梢血の白血球（ＰＢＬ）におけるＣＤ３＋  Ｔ細胞のパーセントは、対照マウスの３６．７％からＴＡＢ４で処置したマウスの４．１％にまで減少した（表２）。ＴＡＢ４処置により、脾細胞の全数は若干減少した。しかしながら、ＴＡＢ４処置マウスでは、ＣＤ３＋  Ｔ細胞の数が６２％減少し、ＮＫ細胞の数が５０％減少し、さらにＣＤ１９＋  Ｂ細胞の全数が若干増加した。ＴＡＢ４処置マウスから回収した胸腺細胞の全数は、対照で見られたレベルのたった４８％であった（５２％減少）。さらに、ＣＤ４＋  Ｔ細胞以外では、すべての他のＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＣＤ８＋、およびＣＤ４−ＣＤ８−  Ｔ細胞は減少し、この際、ＣＤ４＋ＣＤ８＋  サブ集団は最も顕著に影響を受けた（６４．７％減少）。
【０１２６】
【表２】
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【０１２７】
実施例７：抗ＴＡＩＰ抗体は、ＩＬ−２またはＴＮＦ−αの分泌を誘起しない
Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）に、３００μｇのＴＡＢ４または対照のハムスターＩｇを腹腔内に注射した。脾細胞を注射してから７日目に単離し、マイトマイシンＣ処置Ｃ３Ｈ（Ｈ−２ｋ）脾細胞（スティミュレーター(stimulator)として）を有するインキュベート物におけるレスポンダー(responder)として使用した。３日後、インキュベート物上清を集め、ＩＬ−２含量をＥＬＩＳＡセット(PharMingen)によって測定した。図５に示されるように、ＩＬ−２の生産は、対照マウスのものに比してＴＡＢ４処置マウス由来のレスポンダー細胞では抑制された。ＩＬ−２およびＴＮＦ−αの血漿レベルもまた分析したところ、対照およびＴＡＢ４処置マウスの血清ではＩＬ−２（またはＴＮＦ−α）のレベルに有意な差は認められなかった。ＩＬ−２の生産はＴ細胞の活性には重要であるので、これらの結果から、ＴＡＢ４などの、ＴＡＩＰに特異的な抗体は、Ｔ細胞を操作し、自己免疫疾患および移植片拒絶に関連するものなどの望ましくないＴ細胞が媒介する免疫応答を制御するのにインビボで使用可能であることが示される。
【０１２８】
実施例８：移植片拒絶を防止するための抗ＴＡＩＰ抗体の使用
８〜１２週齢のマウス（Jackson Laboratoryから得た）に、アセプロマジンマレエート(Acepromazin maleate)(Fermenta Animal Health Co., Kansas City, MO)で麻酔をかけた。皮膚移植前に、胸腺摘除されていないレシピエントＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）に、皮膚移植外科手術する７日前に、５００μｇのＴＡＢ４またはイソ型の対照抗体を腹腔内注射した。７日後、十分同種のミスマッチした(fully allogeneic mismatched)Ｂａｌｂ／ｃｊマウス（Ｈ−２ｄ）の皮膚の側腹部を、抗体で予め処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に移植した。移植してから７日目に、マウスに再度５００μｇのＴＡＢ４またはイソ型の対照抗体を注射した。マウスを移植片の移植後毎日モニターした。５０％のドナーの皮膚が壊死したら、その移植片は拒絶されたと考えた。移植片の生存率（％）を図７に示す（ｎ＝８）。データから、ＴＡＢ４抗体による処置は同種皮膚移植片の生存を延ばすことが示される。
【０１２９】
実施例９：ＰＳＧＬ−１としてのＴＡＩＰの同定
ＣＤ１６２とも称する、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）は、Ｔ細胞などの、白血球で発現する主要なＰ−セレクチンリガンドである(Sako et al. (1993) Cell 75:1179; Vachino et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:21966; Veldman et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:16470)。その分子量および二量体のなりやすさなどの、ＴＡＩＰの生化学的な特性から、ＴＡＢ４はＰＳＧＬ−１に類似する可能性が示唆された。これら２種の抗原の関係を調べるために、以下のように試験した：１）ＴＡＢ４によって沈降する抗原が市販の抗ＰＳＧＬ−１抗体によって認識できるかどうか；および２）抗ＰＳＧＬ−１抗体が細胞溶解産物からＴＡＢ４を枯渇できるかどうか。
【０１３０】
ＲＬオス１  Ｔ細胞を、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(complete protease inhibitor cocktail)を包含する溶解緩衝液（１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１６０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で１．０×１０８細胞/／ｍｌの密度で１時間溶解し、不溶材料を１０，０００×ｇで１０分間ペレット化した。これらおよびすべての次の段階は、４℃で行なわれた。５．０×１０７細胞に相当する溶解産物を、１０μｇの抗ＰＳＧＬ−１  ｍＡｂ（クローン２ＰＨ１、PharMingen, San Diego, CA）、抗ＴＡＩＰ  ｍＡｂ、ＴＡＢ４、または正常ハムスター血清由来のＩｇＧが予めのせられた２０μｌのプロテインＧ−セファロースと共にインキュベートした。４℃で４時間インキュベートした後、ビーズを洗浄緩衝液（０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  オボアルブミン）で４回、および４００ｍＭ  ＮａＣｌの代わりに２５０ｍＭを包含する、同様の洗浄緩衝液で２回洗浄した。結合タンパク質を、４０μｌの１×ＳＤＳサンプル緩衝液で溶出した。溶出したタンパク質を、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を、抗ＰＳＧＬ−１  ｍＡｂで免疫ブロットし、ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）によってさらには化学発光(Renaissance,NEN)によって出現させた。
【０１３１】
表面ビオチン化ＲＬオス１  Ｔ細胞を、溶解緩衝液中で１．０×１０８細胞／ｍｌの密度で溶解した。細胞抽出物を、４℃で一晩、４０μｌのプロテインＧ−セファロースに結合した抗体２０μｇと共にインキュベートした。枯渇を、抗ＰＳＧＬ−１  ｍＡｂ（２ＰＨ１）または対照のラットＩｇＧを用いて、ＴＡＢ４または対照の正常ハムスター血清を用いて行なった。枯渇した溶解産物について、さらにＴＡＢ４または抗ＰＳＧＬ−１  ｍＡｂで、それぞれ、免疫沈降を行なった。免疫沈降物を、６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、蛍光板間接撮影によって検出した。図６に示されるように、抗ＰＳＧＬ−１抗体はＴ細胞溶解産物からＴＡＩＰタンパク質を枯渇できる。加えて、抗ＴＡＩＰ抗体（ＴＡＢ４）で免疫沈降したタンパク質は、ウェスタン分析によって抗ＰＳＧＬ−１抗体によって認識されうる。
【０１３２】
実施例１０：抗ＰＳＧＬ−１抗体によるヒトＴ細胞におけるアポトーシスの誘起
ヒトＴ細胞のアポトーシスにおけるＰＳＧＬ−１によって果たされる役割を決定するために、経時的な実験を行ない、いつ活性化ヒトＴ細胞がＰＳＧＬ−１が媒介するアポトーシスシグナルに対する感受性を得るかを調べた。ヒトＴ細胞を、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）マイトジェンで刺激し、さらにＩＬ−２含有培地中に展開させた。活性化Ｔ細胞を集めた後、ＩＬ−２および架橋抗体の存在下、抗ＰＳＧＬ−１で攻撃した。
【０１３３】
ヒトの末梢血を、健常な成人から採取し、へパリン化し、フィコールパックプラス(Ficoll-Paque Plus)(Pharmacia Biotech)を用いて異なる密度に基づいた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を強化した。ＰＢＭＣを、１％ＰＨＡ(Life Technologies, GibcoBRL)で４８時間活性化した後、アッセイ期間中組換えヒトＩＬ−２（５ｎｇ／ｍｌ）中に維持した。抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体のアポトーシス誘導能を評価するために、活性化細胞を：（１）１μｇ／ｍｌの抗ＰＳＧＬ−１抗体クローンＫＰＬ−１(BD PharMingen)に架橋体(cross-linker)ウサギ抗マウスＩｇ（０．５μｇ／ｍｌ）(Jackson ImmunoResearch Laboratories)を加えたもの；（２）イソ型の対照精製マウスＩｇに架橋体ウサギ抗マウスＩｇを加えたもの；または（３）架橋体ウサギ抗マウスＩｇ単独で、処置した。６時間処置した後、初期のアポトーシス細胞のパーセントをＦＡＣＳによって測定し、抗アネクシンＶ(anti-Annexin V)(BD PharMingen)およびＰＩ(Sigma)で染色した。
【０１３４】
図８に示されるように、抗ＰＳＧＬ−１抗体に架橋体を加えたものを用いてＰＳＧＬ−１によって引き起こされたシグナル伝達(signaling)は、ＰＨＡ活性化ヒトＰＢＭＣ（主にＴ細胞）において有意なレベルのアポトーシスを引き起こした。アポトーシス細胞のパーセントは、抗ＰＳＧＬ−１処置インキュベート物において３日目の８．５％から８日目の２４％まで増加した。同位体マッチコントロール(isotopic-matched control)、または架橋抗体単独はいずれも、これらの細胞に効果がなかった。
【０１３５】
実施例１１：自己免疫疾患を治療するための抗ＰＳＧＬ−１アゴニスト抗体の使用
よく公認された自己免疫性糖尿病動物である、肥満でない糖尿病(non-obese diabetic)（ＮＯＤ）マウスを、標準的な条件下で飼育した。突発性糖尿病(spontaneous diabete)が約２０週齢のＮＯＤマウスで発症した。実験群では、マウスに、１４、１５および１７週齢のマウス当たり、３００μｇの抗ＰＳＧＬ−１抗体（ＴＡＢ４）を３回腹腔内投与した。同じ投与量の注射を２４および２６週齢でさらに２回与えた。対照群には、同じ投与量のハムスターＩｇを与えた。マウスを、１５週齢以降毎週２回メディ−テストグルコースストリップ(Medi-Test Glucose strip)(Macherey-Nagel, Germany)によって尿中グルコースをモニターした。２回の連続した測定で３００ｍｇ／ｄｌを超える非空腹時尿中グルコースレベルが糖尿病と考えた。
【０１３６】
図９に示されるように、ＴＡＢ４（抗ＰＳＧＬ−１）抗体処置によって、対照の抗体処置に比べて有意な保護が得られた。ゆえに、抗ＰＳＧＬ−１抗体による処置は、自己免疫Ｔ細胞の活性を抑制し、Ｉ型糖尿病の発症を遅延することができる。
【０１３７】
実施例１２：活性化Ｔ細胞へのＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、およびＬ−セレクチンの結合
セレクチン類（Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、およびＬ−セレクチン）の活性化Ｔ細胞への結合活性を測定するため、Ｃ５７ＢＬ／６から新しく調製した
脾細胞を活性化し、２、４、および６日目に収集した。活性化されていないＴ細胞（すなわち、０日目に新しく調製した脾細胞）も分析した。２日目の試料は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにおける、２μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）を用い、２日間、活性化された３×１０６細胞／ｍｌの脾細胞を含んでいた。生細胞をフィコール濃度勾配分離により単離した。Ｃｏｎ  Ａを用い３日間活性化し、さらに１日、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を包含するインキュベート液中に維持した細胞から４日目の試料を得た。Ｃｏｎ  Ａを用い３日間活性化し、さらに３日間、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を包含するインキュベート液中に維持した細胞から６日目の試料を得た。
【０１３８】
ＦＡＣＳ分析により該試料をアッセイするため、０、２、４および６日目から
ウェル当たり２×１０５の細胞を、二倍段階希釈法により、２０μｇ／ｍｌから０．１５６μｇ／ｍｌの濃度範囲において、ヒトＩｇＧ１（R&D System, Minneapolis, MN）のＦｃドメインに融合した、４０μｌ／ウェルのマウスＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、またはＬ−セレクチンを用い、４℃にて３０分間インキュベートした。該インキュベート後、細胞を、１×ＦＡＣＳｃａｎ緩衝液（Biochrom AG、Berlin社製の、カルシウムおよびマグネシウムイオンを含有しない１×ＰＢＳ並びに２％ＦＢＳ）を用いて洗浄した。試料を、９５μｌ／ウェルの抗Ｔｈｙ１．２および第二の試薬（Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PAより入手した、Ｆｃ断片に特異的であるＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧ）を用い、３．２５μｇ／ｍｌで、４℃にて３０分間さらにインキュベートし、次いで、１×ＦＡＣＳｃａｎ緩衝液を用いて洗浄した。
【０１３９】
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ分析の結果を図１０に示す。２０μｌ／ｍｌにおいて、Ｐ−セレクチンのマウス活性化Ｔ細胞への結合は徐々に増加し、２日目から４日目に最大になり６日目にはやや減少した。Ｅ−セレクチンの結合は、２日目から４日目に有意に上昇し、６日目にピークを維持した。Ｌ−セレクチンのマウス活性化Ｔ細胞への結合は明らかではなく、活性化期間、すなわち０から６日目を通じて変化しなかった。Ｌ−セレクチンでの観察結果は、Ｌ−セレクチンのそのリガンドへの明らかな低い結合能に起因したものである。同様の結果が、上記実験において、三種のセレクチンが低濃度である場合にも観察された。
【０１４０】
実施例１３：多量体形態のＥ−セレクチンおよびＰ−セレクチンは活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘起する
９６−ウェルプレート（ＮＵＮＣ）を、１×ＰＢＳにおける２０μｌ／ｍｌの抗ヒトＦｃＩｇ５０μｌで、４℃にて終夜、コーティングし、１％ＢＳＡを用い、３７℃にて２時間ブロックし、室温にて２時間、５０μｌのセレクチン−ヒトＦｃ融合物（０．０６３から５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。全実験段階において、各ウェルを、１×ＰＢＳを用い５回、徹底的に洗浄した。次いで、Ｃｏｎ  Ａを用い、４日間、事前に活性化した２×１０５個のＴ細胞を、各ウェルに添加し、４℃にて５分間、２００×ｇでのプレートの遠心分離の前に３７℃にて５時間インキュベートした。得られた活性化Ｔ細胞を包含するペレットを、アネキシンＶ−ビオチン接合体と共に、室温にて１５分間インキュベートし、次いで、アビジン接合体（希釈度１：５０００のＳＡ−β−ｇａｌ）と共に、３７℃にてさらに３０分間インキュベートした。いずれの結合反応においても、各ウェルを、アネキシンＶ結合緩衝液を用いて、三度洗浄した。１１０μｌのＺ−緩衝混合液（２０ｍｌのＺ−緩衝液に５４μｌの２−メルカプトエタノール）および３０μｌのＯＮＰＧ（０．０４ｇ／１０ｍｌ）を、４℃にて終夜インキュベートすることにより、発色が生じた。４２０ｎｍでの光学密度の読みを記録した。
【０１４１】
Ｃｏｎ−Ａ活性化Ｔ細胞のセレクチン誘起アポトーシスのレベルは、ヒトＩｇＧ１のＦｃと融合したＰ−セレクチン（図１１Ａ）またはＥ−セレクチン（図１１Ｂ）の濃度の増加（０．０６３μｌ／ｍｌから５μｌ／ｍｌ）に伴い増加した。ハムスター抗体ＴＡＢ４は活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘起し（実施例１参照）、該実験においてはポジティブコントロールとして使用した。ネガティブコントロールとしての、抗ヒトＦｃ、ヒトＩｇ（ＨＩｇ）、およびＢＳＡはアポトーシスを誘起しなかった。Ｌ−セレクチンが活性化Ｔ細胞には良好に結合しなかったのと一致して（実施例１２）、Ｌ−セレクチン  ヒトＦｃ融合タンパク質の存在下においては、何ら顕著なアポトーシスは認められなかった（図１１Ｃ）。  要約すると、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンのＰＳＧＬ−１結合断片およびヒトＦｃ断片を包含するプレート結合融合タンパク質(plate-bound fusion protein)は活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘起する。
【０１４２】
実施例１４：可溶性Ｐ−セレクチン−Ｆｃ融合物の架橋は活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘起する
マウスセレクチン類（Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、およびＬ−セレクチン）は、先に詳述したとおり、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合し、可溶な二量体の融合タンパク質を形成した。該可溶性セレクチンが活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘起しうるか否かを評価するため、プレート結合抗ヒトＦｃ  Ｉｇ(plate-bound anti-human Fc Ig)が省略されていることを除き、実施例１３にて詳述の実験を実施した。可溶な形態のＰ−セレクチン融合タンパク質（二量体）単独の存在下においては、無視可能かまたは低レベルの活性化Ｔ細胞のアポトーシスしか生じなかった（図１２）。しかしながら、架橋体（抗ヒトＦｃ）の添加により、該アポトーシス活性は大幅に増加し、プレート結合抗体(plate-bound antibody)の存在下において誘起されるのとほぼ同程度までに増加した。抗ヒトＦｃ、ヒトＩｇ（ＨＩｇ）、またはＢＳＡのいずれもアポトーシスを誘起しなかった。
【０１４３】
Ｅ−セレクチン−Ｆｃ融合タンパク質の場合においても、Ｐ−セレクチン−Ｆｃ融合タンパク質の場合と同様の結果が得られた。さらに、Ｌ−セレクチンのプレート結合体(plate-bound)（多量体の形態）の場合に得られた結果と一致して、可溶な形態のＬ−セレクチン融合タンパク質は活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘起しなかった。
【０１４４】
他の実施態様
本発明を詳細な説明と合わせて説明してきたが、前記説明は詳細に説明することを意図するものであり、本発明の概念を制限するものではないと解される。本発明の他の態様、利点、および修飾は、特許請求の範囲の概念に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】いつ活性化Ｔ細胞が、ＴＡＢ４（抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体）が媒介するアポトーシスシグナルに対する感受性を得るかを調べた経時的な実験の代表的結果を示すものである。
【図２】ＴＡＢ４抗体によって認識される抗原の細胞表面のビオチン化および免疫沈降の結果を示すものである。
【図３】脾臓ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞、およびＮＫ細胞上のＰＳＧＬ−１抗原の発現を示すものである。
【図４】ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ４＋８＋、およびＣＤ４−８−胸腺細胞上のＰＳＧＬ−１抗原の発現を示すものである。
【図５】レスポンダー(responder)としてのＴＡＢ４（またはハムスターＩｇ）で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスから単離された脾臓細胞およびスティミュレーター(stimulator)としてのＨ２ミスマッチＣ３Ｈ脾臓細胞を用いた混合リンパ球インキュベートで生産されたＩＬ−２レベルを示すものである。
【図６】（Ａ）ＴＡＢ４抗体で免疫沈降したタンパク質が市販の抗ＰＳＧＬ−１抗体により認識可能であることおよび（Ｂ）抗ＰＳＧＬ−１抗体でＴ細胞溶解産物を予め清澄化(preclearing)することで、ＴＡＢ４により認識されたタンパク質を枯渇できることを示すウェスタンブロット分析を示すものである。
【図７】Ｂａｌｂ／ｃマウスから皮膚移植を受け、抗ＰＳＧＬ−１抗体（黒塗りの菱形）または対照抗体（白抜きの四角）で処置したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける生存した移植片の割合（％）を示すものである。
【図８】活性化ヒト末梢血単核細胞を抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体で処置した後のアポトーシス性Ｔ細胞の割合（％）の経時変化を示すものである。
【図９】抗ＰＳＧＬ−１抗体（黒塗りの四角）または対照抗体（白抜きの四角）で処置した自己免疫性非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）オスマウスにおける糖尿病の発症率を示すものである。
【図１０】マウスＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、およびＬ−セレクチンのマウス活性化Ｔ細胞への結合を示すものである。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｃは、Ｅ−セレクチン（図１１Ａ）、Ｐ−セレクチン（図１１Ｂ）、およびＬ−セレクチン（図１１Ｃ）の多量体形態（multimeric forms）によるマウス活性化Ｔ細胞のアポトーシスの誘起を示している。
【図１２】可溶性Ｐ−セレクチン−Ｆｃ融合タンパク質の架橋によるインビトロでのマウス活性化Ｔ細胞のアポトーシスの誘起を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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