(57)【要約】  望ましい性の子をもうける可能性を高めるために、望ましい性の型の精子細胞の相対数を増加させるように、精液の試料を処置する方法が記載される。所定時間の後、精液の試料を、望ましい性の子又は胎児をもうけるよう、少なくとも精液の一部分の相対的能力を増加するように処置する。処置は、好ましくは、精子細胞を、選択された性の型の精子細胞に優先的に効果をもたらすような薬剤と接触させることを含む。ある好ましい態様において、精液は、二つの成分に分離される。第一の成分は、望ましくない性の型の精子よりも望ましい性の型の精子の数が多く、そして、第二の成分は、望ましい性の型の精子に比べて望ましくない性の型の精子の数が多い。一態様において、分離工程は、精子細胞をＫｏｏ抗体で標識し、そして標識された細胞の割合を測定することによって決定できる、点状パターンを所定の割合の精子細胞が示した後に、実施される。別の態様において、分離工程は、Ｋｏｏ陽性細胞の割合に対して、ＦＩＳＨによって測定される雌性細胞の割合をプロットすることにより得られる曲線の最大の位置を定め、雌性細胞の最大割合となる時間を測定し、そして雌性細胞の最大割合となる時間の前の約１時間以内に次の工程を開始することにより決定される時間の後に、実施される。更に別の態様において、分離ステップは、射精された精液を採取した後、約２時間から約２４時間待って、実施される。好ましくは、分離工程において、精子を、望ましくない性の型の精子が優先的に結合できる細胞結合剤と接触させ、そして望ましくない性の型の精子と優先的に結合する細胞結合剤を、非結合精子から分離する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精液の試料を、所定の温度で少なくとも所定の時間保持し、その後、望ましい性の子又は胎児をもうけることができるように少なくとも精液の一部分の相対的な能力を高めるように処置することを含んで成る、選択された性の子又は胎児をもうける可能性が増加するように、精子細胞を含有する精液の試料を選択された性の精子細胞の相対数を増加させるように処置する方法。
【請求項２】
処置する工程が、精子細胞を、選択された性の精子細胞を優先的にもたらす薬剤と接触させることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
精子細胞をＫｏｏ抗体で標識し、標識された細胞の割合を測定することによって決定できる点状パターンを所定の割合の精子細胞が示した後に、選択されない性の精子よりも選択される性の精子の数が多い第一の成分と、選択された性の精子に較べて選択されない性の精子の数が多い第二の成分とを含む二つの成分に、精液を分離することを含んで成る、選択された性の子又は胎児をもうける可能性が増加するように、選択された性の精子細胞の相対数を増加させるように精液の試料を処置する方法。
【請求項４】
分離工程が、
精子を細胞結合剤に優先的に接触させ、
選択されていない性の精子を細胞結合剤に優先的に結合させ、そして
選択されていない性の精子を優先的に結合た細胞結合剤を結合しなかった精子から分離し、
それによって前記第一成分を提供する
ことを含んで成る、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第一成分が、Ｙ染色体よりもＸ染色体を持つ精子を多く含み、第二成分が、Ｘ染色体よりもＹ染色体を持つ精子を多く含むものである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
２０％の精子細胞が点状パターンを示した後に分離工程を実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
更に、分離工程を実施する前に精液を冷却することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
更に、精液を採取してから直ちに精液を冷却することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
精液を少なくとも約１６℃まで冷却する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
精液を少なくとも約１２℃まで冷却する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
精子細胞をＫｏｏ抗体で標識することによって決定できる点状パターンを所定の割合の精子細胞が示した後に、選択されていない性の精子よりも選択された性の精子の数が多い第一成分と、選択された性の精子に較べて選択されていない性の精子の数が多い第二成分とを含む二つの成分に哺乳動物種の精子細胞を含有する精液を分離すること、及び哺乳動物種の卵子を第一成分で受精させることを含んで成る、選択された性を有する哺乳動物種の子又は胎児をもうける確率を増加させる方法。
【請求項１２】
分離工程が、
精子を細胞結合剤に優先的に接触させ、
選択されていない性の精子を細胞結合剤と優先的に結合させ、そして
選択されていない性の精子を優先的に結合した結合剤を結合しなかった精子から分離し、
それによって前記第一成分を提供する、
ことを含んで成る、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第一成分が、Ｙ染色体よりもＸ染色体を持つ精子を多く含み、第二成分が、Ｘ染色体よりもＹ染色体を持つ精子を多く含むものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
２０％の精子細胞が点状パターンを示した後に分離工程を実施する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
更に、分離工程を実施する前に精液を冷却することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
更に、精液を採取してから直ちに精液を冷却することを含む、請求項に記載の方法。
【請求項１７】
精液を少なくとも約１６℃まで冷却する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
精液を少なくとも約１２℃まで冷却する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
第一成分が、Ｘ染色体を有する生存精子を３分の２、及びＹ染色体を有する生存精子を３分の１含有している、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
複数の卵子を受精させるために処置した精液を使用した場合、雌性の仔牛が雄性の仔牛よりも２倍も多く生まれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
精液を所定の温度に冷却すること、
精子細胞をＫｏｏ抗体で標識することによって決定できる点状パターンを所定の割合の細胞が提示するまで待つこと、
選択された細胞の集団に優先的に結合するように、細胞結合剤が選択された細胞に結合するのに充分な時間、試料を細胞結合剤と接触させること、そして
選択された細胞及び細胞結合剤を分離して、選択されていない細胞を含有する処置された試料を提供すること、
を含んで成る、精液の試料から選択された細胞集団を分離する方法。
【請求項２２】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約１０％多くなっている細胞集団を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約２０％多くなっている細胞集団を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約５０％多くなっている細胞集団を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約１００％多くなっている細胞集団を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
細胞結合剤が０．１から２ミクロンの直径を有するビーズ支持体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
選択された細胞集団における細胞の数が、約１×１０５細胞／ｍｌを超える、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２１に記載の方法に従って精子の集団を含有する精液を得ること及び精子の集団を含有する処置した試料で哺乳動物を授精させることを含んで成る授精方法。
【請求項２９】
哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ及びネコから成る群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
精液を少なくとも約１６℃まで冷却する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
精液を少なくとも約１２℃まで冷却する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
細胞の集団を含有する精液の試料を所定の温度に冷却すること、
精子細胞をＫｏｏ抗体で標識することによって決定できる点状パターンを所定の割合の細胞が示すまで待つこと、
細胞の選択された集団に優先的に結合するように、細胞結合剤が選択された細胞に結合するのに充分な時間、試料を細胞結合剤と接触させること、
選択された細胞及び細胞結合剤を分離して、選択されていない細胞を含有する処置された試料を提供すること、そして
少なくとも処置された試料の一部を哺乳動物の雌の生殖器官に投与すること、
を含んで成る、所定の性の哺乳動物の子又は胎児の割合を増加させる方法。
【請求項３３】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約１０％多くなっている細胞集団を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約２０％多くなっている細胞集団を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約５０％多くなっている細胞集団を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約１００％多くなっている細胞集団を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
細胞結合剤が０．１から２ミクロンの直径を有するビーズ支持体を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
選択された細胞集団における細胞の数が、約１×１０５細胞／ｍｌを超える、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ及びネコから成る群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
精液を少なくとも約１６℃まで冷却する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
精液を少なくとも約１２℃まで冷却する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
射精された精液を得ること、
射精された精液を所定の温度に冷却すること、
射精された精液の採取後、約２時間から約２４時間待つこと、そして
射精された精液を分画して、選択された細胞の集団を得ること、
を含んで成る、射精された精液を分画する方法。
【請求項４３】
選択された細胞の集団が、Ｙ染色体よりもＸ染色体を持つ精子を多く含み、第二成分が、Ｘ染色体よりもＹ染色体を持つ精子を多く含むものである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
分画工程が、
射精された精液を細胞結合剤と接触させ、
選択されていない性の精子を細胞結合剤と優先的に結合させ、そして
選択されていない性の精子を優先的に結合した結合剤を結合しなかった精子から分離し、
それによって選択された細胞の集団を提供する、
ことを含んで成る、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法に従って選択された細胞の集団を得ること及び選択された細胞の集団で哺乳動物を授精させることを含んで成る授精方法。
【請求項４６】
哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ及びネコから成る群から選択されたものである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
精液を少なくとも約１６℃まで冷却する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
精液を少なくとも約１２℃まで冷却する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
分画工程が、射精された精液の採取の約２時間から約１２時間後に実施される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
分画工程が、射精された精液の採取の約４時間から約８時間後に実施される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
分画工程が、射精された精液の採取の約６時間後に実施される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
精液を少なくとも約１６℃まで冷却する、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
精液を少なくとも約１２℃まで冷却する、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項４２に記載の方法に従って精子の集団を含有する精液を得ること及び選択された細胞の集団で哺乳動物を授精させることを含んで成る授精方法。
【請求項５５】
哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ及びネコから成る群から選択されたものである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
精液を少なくとも約１６℃まで冷却する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
精液を少なくとも約１２℃まで冷却する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
分画工程が、
射精された精液を細胞結合剤と共にインキュベートする、
選択されていない性の精子を細胞結合剤と優先的に結合させる、そして
選択されていない性の精子を優先的に結合した結合剤を結合しなかった精子から分離する、
それによって、選択された細胞の集団及び選択されていない性の精子に優先的に結合する物質を含んだ表面処理物質を有するビーズを含む細胞結合剤を提供する、
ことを含んで成る、請求項４２に記載の方法。
【請求項５９】
分画工程が、
射精された精液と細胞結合剤の混合物をインキュベートする、
選択されていない性の精子を細胞結合剤と優先的に結合させる、
細胞結合剤と結合できる、ビーズを混合物に加える、
細胞結合剤に結合するように、ビーズを混合物と共にインキュベートする、そして
ビーズ及び細胞結合剤を分離する、
それによって選択されていない性の精子を混合物から優先的に除き、選択されている性の精子を優先的に残す、
ことを含んで成る、請求項４２に記載の方法。
【請求項６０】
Ｋｏｏ陽性細胞の割合に対してＦＩＳＨによって測定される雌性細胞の割合をプロットすることにより得られる曲線の最大の位置を定め、雌性細胞の最大割合となる時間を測定し、そして雌性細胞の最大割合となる時間の前の約１時間以内に分離工程を開始することにより決定される時間帯において、好ましくない性の精子よりも好ましい性の精子の数が多い第一の成分と、好ましい性の精子に較べて好ましくない性の精子の数が多い第二の成分とを含む二つの成分に、分離することを含んで成る、選択された性の子又は胎児をもうける可能性が増加するように、好ましい性の精子細胞の相対数を増加させるように精子細胞を含有する精液の試料を処置する方法。
【請求項６１】
分離工程が、
精子を細胞結合剤と接触させる、
好ましくない性の精子を細胞結合剤に優先的に結合させる、そして
選択されていない性の精子を優先的に結合した結合剤を結合しなかった精子から分離する、
それによって、前記第一成分を提供する
ことを含んで成る、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
第一成分が、Ｙ染色体よりもＸ染色体を持つ精子を多く含み、第二成分が、Ｘ染色体よりもＹ染色体を持つ精子を多く含むものである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
更に、分離工程を実施する前に精液を冷却することを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
更に、精液を採取してから直ちに精液を冷却することを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
精液を少なくとも約１６℃まで冷却する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
精液を少なくとも約１２℃まで冷却する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
哺乳動物種の精子細胞を含有する精液を、Ｋｏｏ陽性細胞の割合に対してＦＩＳＨによって測定される雌性細胞の割合をプロットすることにより得られる曲線の最大の位置を定め、雌性細胞の最大割合となる時間を測定し、そして雌性細胞の最大割合となる時間の前の約１時間以内に分離工程を開始することにより決定される時間帯において、好ましくない性の精子よりも好ましい性の精子の数が多い第一成分と、好ましい性の精子に較べて好ましくない性の精子の数が多い第二成分とを含む二つの成分に分離することを含んで成る、好ましい性を有する哺乳動物種の子又は胎児をもうける確率を増加させる方法。
【請求項６８】
分離工程が、
精子を細胞結合剤と接触させる、
好ましくない性の精子を細胞結合剤に優先的に結合させる、そして
選択されていない性の精子を優先的に結合した結合剤を結合しなかった精子から分離する、
それによって、前記第一成分を提供する、
ことを含んで成る、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
第一成分が、Ｙ染色体よりもＸ染色体を持つ精子を多く含み、第二成分が、Ｘ染色体よりもＹ染色体を持つ精子を多く含むものである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
更に、分離工程を実施する前に精液を冷却することを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
更に、精液を採取してから直ちに精液を冷却することを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
精液を約１２℃まで冷却する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
第一成分が、Ｘ染色体を有する生存精子を３分の２及びＹ染色体を有する生存精子を３分の１含有している、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
複数の卵子を受精させるために処置した精液を使用した場合、雌性の仔牛が雄性の仔牛よりも２倍も多く生まれる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７５】
精液を所定の温度に冷却すること、
Ｋｏｏ陽性細胞の割合に対して、ＦＩＳＨによって測定される雌性細胞の割合をプロットすることにより得られる曲線の最大の位置を定め、雌性細胞の最大割合となる時間を測定し、そして雌性細胞の最大割合となる時間の前の約１時間以内に分離工程を開始することにより決定される時間を待つこと、
細胞結合剤が選択された細胞に結合するのに充分な時間、試料を細胞結合剤と接触させて、細胞の選択された集団に優先的に結合させること、そして
選択された細胞と細胞結合剤を分離して、選択されない細胞を含有する処置された試料を提供すること、
を含んで成る、精液の試料から選択された細胞集団を分離する方法。
【請求項７６】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約１０％多くなっている細胞集団を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約２０％多くなっている細胞集団を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約５０％多くなっている細胞集団を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約１００％多くなっている細胞集団を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
細胞結合剤が０．１から２ミクロンの直径を有するビーズ支持体を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
選択された細胞集団における細胞の数が、約１×１０５細胞／ｍｌを超えるものである、請求項７５の方法。
【請求項８２】
請求項７５に記載の方法に従って精子の集団を含有する精液を得ること及び精子の集団を含有する処置した試料で哺乳動物を授精させることを含んで成る授精方法。
【請求項８３】
哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ及びネコから成る群から選択されたものである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
精液を少なくとも約１６℃まで冷却する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
精液を少なくとも約１２℃まで冷却する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
細胞の集団を含有する精液の試料を所定の温度に冷却すること、
Ｋｏｏ陽性細胞に対して、ＦＩＳＨによって測定される雌性細胞の割合をプロットすることにより得られる曲線の最大の位置を定め、雌性細胞の最大割合となる時間を測定し、そして雌性細胞の最大割合となる時間の前の約１時間以内に分離工程を開始することにより決定される時間を待つこと、
細胞結合剤が選択された細胞に結合するのに充分な時間、試料を細胞結合剤と接触させて、細胞の選択された集団に優先的に結合させること、
選択された細胞と細胞結合剤を分離して、選択されない細胞を含有する処置された試料を提供すること、そして
少なくとも処置された試料の一部を、雌性の哺乳動物の生殖器官に投与すること、
を含んで成る、所定の性の哺乳動物の子又は胎児の割合を増加させる方法。
【請求項８７】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約１０％多くなっている細胞集団を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約２０％多くなっている細胞集団を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約５０％多くなっている細胞集団を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
処置された試料が、好ましい性の型を表す細胞の第一の数が好ましくない性の型を表す細胞の第二の数よりも少なくとも約１００％多くなっている細胞集団を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
細胞結合剤が０．１から２ミクロンの直径を有するビーズ支持体を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
選択された細胞集団における細胞の数が、約１×１０５細胞／ｍｌを超える、請求項８６に記載の方法。
【請求項９３】
哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ及びネコから成る群から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９４】
精液を少なくとも約１６℃まで冷却する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
精液を少なくとも約１２℃まで冷却する、請求項９３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択された性の子又は胎児を得る確率を高める方法に関する。更に詳しくは、本発明は、雌雄の別に基づいた精子の分離が優先的に選択される時間帯(a window of time)に精子を処置することにより、一方の性を決定するＤＮＡを持つ精子からもう一方の性を決定するＤＮＡを持つ精子を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
農業経営者や他の畜産業者は、選択された性の子又は胎児を得る確率を高める要望を長期間認識している。哺乳動物においては、雄性の配偶子又は精子が胎児の性を制御している。各々の精子は、Ｘ型又はＹ型の性決定染色体のいずれかを含有している。Ｘ染色体の精子は、卵母細胞に授精した後、雌性の子又は胎児を産生し、Ｙ染色体の精子は、受精後雄性の子又は胎児を産生する。Ｘ染色体を持つ精子細胞、又はＹ染色体を持つ精子細胞の割合を増加させ、そしてこれにより、雌性又は雄性の子又は胎児を得る、より大きな可能性を実現する方法が提案されている。
【０００３】
以前の方法は、例えば、密度沈降法に基づく方法を包含している（例えば、Brandriff, B. F. et al., "Sex Chromosome Ratios Determined by Karyotypic Analysis in Albumin-Isolated Human Sperm”（アルブミンを分離したヒト精子における核型分類分析により決定された性染色体比）, Fertil. Steril., 46, pp.678-685 (1986)を参照されたい）。米国特許第３，６８７，８０６号（Van Den Bovenkamp）は、Ｘ型を持つ精子又はＹ型を持つ精子と反応する抗体を使用し、結合した抗体を影響されなかった抗体から分離する凝集工程を利用することによって哺乳動物の子又は胎児の性を制御する免疫学的方法を開示している。
【０００４】
米国特許第４，０８３，９５７号（Lang）は、雌雄の別に連関する電荷によって、精子の集団を異なる画分に分離することによる、動物（ヒトを包含する）の子又は胎児における性比の変更方法を開示している。精子の選択された部分とは逆の電荷の静電荷を帯びた物質と精子を会合させることによって、望まない性の性決定形質を有する部分を引き寄せ、そしてこれによりその部分を単離するようにし、又は卵子の受精を不利にすることで分離を行う。電荷を持つ物質の選択、ｐＨ及びその粒子サイズの調節、及び電荷を持つ物質及び精子の両方の荷電性に影響を及ぼす周辺媒体の制御が考慮されている。Langは、雄性又は雌性を持つ遺伝物質のそれぞれを持つ精子が異なった静電荷、通常は雄性では負であり雌性では正、を有していることを教示しており、この教示を、電荷を持つ物質を有する雄性及び雌性の精子の分離に利用している。
【０００５】
米国特許第４，１９１，７４９号（Bryant）は、雄性決定精子に選択的に結合するが、雌性決定精子は結合せずに上清に残る、固相免疫吸収物質に結合する雄性特異性抗体を用いることにより、いずれかの性の哺乳動物の子又は胎児の割合を増加させる方法を開示している。
【０００６】
米国特許第５，０２１，２４４号（Spaulding）は、性関連膜タンパク質及びそのようなタンパク質に特異的な抗体を用いて、Ｘ型又はＹ型精子に富んだ亜集団を産生する特定の精子集団のＤＮＡ含有に基づいた生細胞を選別する方法を開示している。
【０００７】
米国特許第５，５１４，５３７号（Chandler）は、哺乳動物の精子を、Ｘ染色体を持つ精子に富んだ分画、及びＹ染色体を持つ精子に富んだ分画に、性により機械的に選別する方法及び装置を開示している。それらのＤＮＡ含量が異なっているので、Ｙ染色体の精子は、Ｘ染色体の精子よりも平均して幾分か少ない。カラムは二つのサイズのビーズがパックされている。小さいビーズのサイズは、平均して、Ｙ染色体精子が小ビーズ間の隙間に容易に合うように、Ｘ染色体精子は、平均して、それらの隙間に容易には合わないように選択されている。大きい方のビーズのサイズは、小さいビーズが大きいビーズ間の隙間に容易には合わないように選択されている。精子を含有する液体試料は、液体が最初に大きなビーズに遭遇し、次いで小さなビーズに遭遇するようにカラムを通して流される。大きいビーズではＸ染色体精子に富んだ分画を、そして小さいビーズではＹ染色体精子に富んだ分画を生成させるように、篩（ふるい）として作用する。
【０００８】
しかしながら、これらの先行技術の方法は、しばしば、Ｘ型及びＹ型精子の分離が不十分であり、しばしば精子を損傷し、そしてこれによりその運動性及び受精成功率を減少させている。
【０００９】
譲渡による自社所有の米国特許第６，１５３，３７３号及び第６，４８９，０９２号においては、精子の分離に磁性粒子に結合した抗体を使用する、哺乳動物の子又は胎児の性決定の改善された方法が提供されている。これらの方法は、精子の集団の穏やかな分離を提供するために磁気分離を使用している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それ故に、雌性又は雄性の子又は胎児に対して良好な受精、及び良好な雌雄の別の偏りの両方を得るための、Ｙ染色体を持つ精子からＸ染色体を持つ精子を分離する、又は精子試料のＸ染色体を持つ精子若しくはＹ染色体を持つ精子を高い割合にする、新しい方法に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、望ましい性の子又は胎児をもうける可能性が増加するように処置する試料において、望ましい精子の性の相対数を増加させるように精液の試料を処置する方法を提供する。それ故、本発明に従って、精液の試料は、所定の時間の後、望ましい性の子又は胎児をもうけるよう少なくとも精液の一部分の相対能力を増加するよう処置される。処置は好ましくは、精子細胞を、選択された性の精子細胞を優先的にもたらす薬剤と接触させることを含む。
【００１２】
本発明のある種の好ましい態様において、精液の試料の処置は、試料を、Ｙ染色体を持つ精子と比較してＸ染色体を持つ精子の数を多く有する第一成分と、Ｘ染色体を持つ精子と比較してＹ染色体を持つ精子の数を多く有する第二成分に、分画することを包含する。特定の応用によっては、いずれかの成分は、望ましい精子の性の相対的数を増加することができる。
【００１３】
本発明者等は、Ｙ染色体を持つ精子が、Ｘ染色体を持つ精子よりも大きな割合で細胞結合剤に接着する又は結合する能力を発現する、性分離の時間帯（sexing window）ともいうべき期間があることを発見した。この時間帯の間に、精子が細胞結合剤で処理されると、Ｙ染色体を持つ精子は、細胞結合剤に優先的に接着又は結合するであろうが、Ｘ染色体を持つ精子は液中に優先的に残るであろう。それ故、優先的にＹ染色体を持つ精子に結合した細胞結合剤を分離すると、Ｘ染色体を持つ精子をより高い割合で優先的に残して、Ｙ染色体を持つ精子を除くことになる、これにより、好適な受精力のある哺乳動物に導入するとき、雌性の子又は胎児を産生するための非結合精子を残存させて偏らせることになる。
【００１４】
本発明のある種の態様において、この時間帯は、精子上の「粘着性のあるパッチ」の出現に基づくものであると定義することができる。雌雄の別の偏りは、精子細胞上の「粘着性のあるパッチ」の出現に関連づけられることが見出されている。
【００１５】
この時間帯は、充分な数の精子細胞が粘着性のあるパッチを示す場合に開始し、その結果分離により充分な量のＹ染色体を持つ精子を優先的に除去し、残っている非結合精子がＸ染色体を持つ望ましいレベルの精子細胞に偏る。その時間帯は、充分な数の精子細胞が粘着性のあるパッチを示し、その結果分離しても、もはや望ましいレベルの偏りを提供することができない場合に閉じる。
【００１６】
本発明のある好ましい態様において、上記時間帯は、精子をＫｏｏ抗体で標識することによって測定した場合、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３０％の精子細胞上に粘着性のあるパッチが出現すると開始する。上記時間帯は、精子をＫｏｏ抗体で標識することによって測定した場合、４０％を超える、好ましく３５％を超える精子細胞が粘着性のあるパッチを有するとき閉じる。この時間帯の間に精子細胞を分離する処理は、Ｙ染色体を持つ精子と比較してＸ染色体を持つ精子の数が多い液体中で結合しないで残っている第１成分と、Ｘ染色体を持つ精子と比較してＹ染色体を持つ精子の数が多い細胞結合剤に結合した第２成分とを提供する。
【００１７】
本発明の別の態様において、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって測定される、Ｋｏｏ陽性細胞に対する雌性細胞の割合をプロットすることにより得られる曲線の最大の位置を定め、雌性細胞が最大の割合になる時間を測定し、そして雌性細胞が最大の割合となる前の約１時間以内に分離工程を開始するものとして、分離又は性分離のための時間帯が決定される。
【００１８】
本発明の更に別の態様において、時間帯は精子の採取からの時間によって決定される。一般的に、時間帯は、精子の採取後の約２から約２４時間、好ましくは約２から１２時間、より好ましくは約４から約８時間である。特に、精子が約１２℃まで速やかに冷却されるとき、精子の採取後約６時間で分離が実施される。
【００１９】
この時間帯の開始及び閉止は、種々の因子によって影響され得る。例えば、効果的な分離を提供するように時間帯の開始を待つために、精液の採取後室温よりも低い温度に冷却すると、ＦＩＳＨで決定される最大の雌雄の別の偏りを得るための待機時間を増加することができる。しかしながら、温度が上がった状態で精液を保つと、最大の雌雄の別の偏りへの待機時間を遅くすることができる。本発明のある種の態様において、約１２℃に精液を速やかに冷却することにより、採取後約６時間で効果的な分離を行うことが可能となる。冷却は、室温に保持するのと比較して達成できる最大の雌雄の別の偏りを増加させる傾向がある。しかし、高い温度に精液を保持すると、達成し得る雌雄の別の偏りの程度を小さくすることができる。そのような因子の変化は、時間帯の幅、即ち、時間帯が開いている間の期間に影響し、この期間が高温ではより短く、低温ではより長くなる。
【００２０】
本発明は、更に、精液を所定の温度に冷却すること、性分離の時間帯が開始する所定の時間まで待つこと、細胞結合剤が選択された細胞に結合するのに充分な時間、試料を選択された細胞集団に優先的に結合するように細胞結合剤と接触させること、そして、選択された細胞と細胞結合剤を分離して、選択されない細胞を含有する処置された試料を提供すること、を含んで成る、精液の試料から選択された細胞集団を分離する方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、精液の試料から選択された精子を除き、最初の射精された精液におけるよりも、選択された又は好ましい性染色体を高い割合で有している精子を含む処置された試料を提供する方法を提供するものである。望ましい方法は、以下の工程を包含する：射精された精液を採取すること、精液を選択された温度に冷却すること、選択された時間の後、精液を好ましくない性染色体を持つ精子と優先的選択的に結合する細胞結合剤と接触させること、結合した好ましくない性染色体を持つ精子が結合した細胞結合剤を残った液体から分離すること、そしてこれにより、最初の射精された精液に比べた場合、好ましい性染色体を持つ精子の割合が高いものを含有する液体を提供する。この選択された時間は、例えば、精子に対する粘着性のあるパッチの出現、又は本明細書でより詳細に考察されるような、これに代わる判断基準、に基づくものである。一般的に、射精された精液は、速やかに少なくとも室温まで、好ましくは少なくとも約２０℃まで、より好ましくは少なくとも約１６℃まで、そしてさらにより好ましくは少なくとも約１２℃まで冷却される。
【００２２】
それ故、本発明は、又、望ましい又は好ましい性の子又は胎児を産出する確率を増加させる方法を提供する。例えば、もし雄牛の精液を、Ｘ染色体を持つ生存精子を３分の２及びＹ染色体を持つ生存精子を３分の１含有する、偏るように処置した精液に処置するならば、処置された精液を雌牛を妊娠させるために使用した場合、雄性の仔牛よりも２倍多い雌性の仔牛が生まれることが期待できる。望ましい又は好ましい性は、適用によって変化し得る。又、選択された精子細胞は、適用次第で結合した細胞又は結合していない細胞のいずれかにすることができる。それ故、「好ましい」若しくは「望ましい」又は「選択された」というような用語の使用は、相対的なものである。
【００２３】
本発明のある種の好ましい態様において、分離又は分画工程は、射精された精液を細胞結合剤とインキュベートすること、好ましくない性の精子を細胞結合剤と優先的に結合するようにすること、そして、細胞結合剤が優先的に結合している好ましくない性の精子を、結合していない精子から分離すること、これにより選択された細胞の集団を提供することを含み、細胞結合剤は好ましくない性の精子に優先的に結合する物質を含む表面処理をしたビーズを含む。
【００２４】
本発明の別の好ましい態様において、分離又は分画工程は、射精された精液の混合物を細胞結合剤とインキュベートすること、好ましくない性の精子を細胞結合剤と優先的に結合するようにすること、細胞結合剤と結合できるビーズを混合物に加えること、ビーズを細胞結合剤に結合するように、混合物とビーズをインキュベートすること、そして、ビーズ及び細胞結合剤を分離すること、そしてこれにより好ましくない性の精子を混合物から優先的に除き、好ましい性の精子を優先的に残すことを含む。
【００２５】
本明細書で使用されるように、「Ｋｏｏ抗体」という用語は、Koo, G. C.らの「ヒトのＨ−Ｙ型分類のためのモノクローナル抗ＨＹ抗体の応用(Application of Monoclonal Anti-HY antibody for Human H-Y Typing)」,「Human Genetics, 1981, pp.64-67, vol. 57, Springer-Verlag」により記載された手順によって調製される抗体を意味する。Ｋｏｏ抗体は、好ましくは、「American Type Culture Collection」から入手可能なハイブリドーマＨＢ９０７０又はＨＢ９０７１から得られる。
【００２６】
本明細書で使用されるように、「Ｋｏｏ陽性細胞」という用語は、標準免疫細胞化学（ＩＣＣ）のプロトコールにおいて、処理の後に顕微鏡的に試験されるＫｏｏ抗体で標識された細胞を意味する。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「Ｘ型を持つ精子」及び「Ｘ型精子」という用語は、Ｘ染色体を持つ精子の短縮表示として使用される。同様に、用語「Ｙ型を持つ精子」及び「Ｙ型精子」は、Ｙ染色体を持つ精子の短縮表示として使用される。
【００２８】
本明細書で使用されるように、「粘着性のあるパッチ」という用語は、免疫細胞化学の後、例えば４００倍の倍率で（１０倍の接眼レンズ、４０倍の対物レンズ）、顕微鏡下に観察されるように精子頭部の上部に蛍光点状パターンが出現することをいう。粘着性のあるパッチを持つ精子細胞の割合は、以下のようにして決定される。洗滌した精子の細胞表面は、一次精子細胞抗体と結合しており、次いで、一次抗体は、蛍光標識の第二抗体に結合する。顕微鏡観察者は、次いで、顕微鏡下に染色されたパターンで精子を計測する。一次抗体としてＫｏｏを使用して、精子は、丁度 Wassarman が卵子結合タンパク質について描写したのと類似の様式で、前部先体膜上に点状パターンに染まる（Paul M. Wassarman, Scientific American (1988), December, p. 83）。Ｋｏｏ染色を示す精子細胞の数は時間と共に増加し、このように、Ｋｏｏ抗体と反応する集団の精子の割合の多い少ないによって、時間帯を決定することが可能となる。それ故、点状パターンは、Ｋｏｏ抗体を用いて検出され、可視化することができる。
【００２９】
例えば、約１２から１６℃の範囲の温度で、ほんの僅かな雄牛の精子が、新しく採取された試料ではＫｏｏ陽性であるが、一般的に品質のよい射精された精液では採取後約６時間で少なくとも約３０％は陽性であり、採取後２４時間までには大部分、むしろ殆ど全ての精子が、Ｋｏｏ陽性となる。温度は、Ｋｏｏ染色に対して、染色が出現する時及びどの程度染色が出現するかの両者に、大きな影響を有しているようである。染色を損なう又は染色が過ぎて普遍的な比率（違いが分からない状態）となる温度条件は、効果的な性分離（即ち、望ましい雌雄の別の偏り）ができない実験で示される条件である。別の精子細胞抗体も、又、我々の初期の実験で多くの抗体がＫｏｏと同じパターン及び時間枠で染色することを示したので、この仕事のための一次抗体として使用することができる。しかしながら、時間帯の定義は、別の抗体を使用するときには変更となる。時間帯の定義はまた、異なった種の精子を使用するときにも変更となる。いずれにせよ、時間帯は、本明細書に記載し、説明したような単純な試験を行うことによって決定することができる。この染色手順はまた、哺乳動物の精液（例えば、射精された精液）の採取及び取り扱いについての他の条件が変化するときには、時間帯の開始、時間幅、効果の高さに対するこれらの条件の効果を決定するための、時間帯を定義するのにも使用できる。
【００３０】
本発明の好ましい態様において、精液を時間ゼロで採取して、その精液の温度を約３０分以内に１２℃に下げ、そして望ましい性染色体を持つ精子細胞のより高い濃度を有する液体を提供するように約６時間後に処理される。
（発明の詳細な説明）
【００３１】
本発明は、飼育場で一般に用いられる標準的なＡＩ技術を使用して哺乳動物の卵子、例えば多産系牛の卵子、を授精するのに適している（又は生存する）Ｘ型及びＹ型を持つ精子の分離方法を提供する。上記のように、分離の公知方法は精子の完全性、即ち、それらの運動性及び受精させる能力、をしばしば損なう、そのため、そのような先行技術により分離された精子を利用する受精は、卵子が放出される卵巣に接続している子宮角への高子宮角(high uterine horn)授精による低濃度の精子投与の導入に加えて、インビトロ受精（ＩＶＦ）又は排卵部位を決定するために発情中の雌牛に行う超音波検査のような複雑な技術を必要とする。作業中の酪農用家畜の群れを有する飼育場に於いて、これらの方法を用いるのには無理がある。本発明の方法は、牛及び羊、並びに犬、猫、馬、豚、その他の種のような種々の家畜を含む種々の哺乳動物種からのＸ型及びＹ型精子を分離するために利用することができる。本方法はまた、人へも応用することができる。
【００３２】
本発明によって、Ｘ型及びＹ型精子の自然の集団を含有する精子の試料を、望ましい性を産生できる精子に関して偏らせたＸ型又はＹ型に富んだ精子の小集団をつくるように処置することができる。即ち、授精に機能した精子の数を雌雄の別を偏らせて、望ましい性染色体を持つ精子の数を自然の（即ち、非処理の）精液に関して有意に増加させる。「有意に増加させる」という語句によって、例えば、人工授精に利用するとき、Ｘ型精子に富んだ処置された精液試料の使用で、少なくとも約５５％が雌性の子又は胎児、好ましくは、少なくとも約６０％が雌性の子又は胎児、及び、更により好ましくは、少なくとも約６５％が雌性の子又は胎児を産生することができることを、本発明者等は意味する。
【００３３】
Ｘ型又はＹ型精子の優先的な分離は、性分離の時間帯に精子細胞を処置することによって実施される。本発明の好ましい態様において、精子細胞は、性分離の時間帯に精子細胞結合剤で処置され、ここで、Ｙ型精子は精子細胞結合剤に優先的に結合し、結合していない精子から精子細胞結合剤と共に除去される。結合していない精子は、次いで、受精能力のある雌性の哺乳動物を授精させるか、或いは、インビトロで適した哺乳動物の卵子を授精させるのに使用される。
【００３４】
好ましい精子細胞結合剤は、粘着性のあるパッチを有する精子が結合する物質で被覆されたビーズを含む。ビーズを被覆するのに好適な物質は、抗体、タンパク質、荷電した及び非荷電の分子を包含する。そのような物質の例としては、レクチン、ＩｇＭ、ＩｇＧ、これら精子を結合する明確でないＰｒＡ、ジエチルトリアミン、グリシン、ポリリジン、１−（３−アミノプロピル）−２−ピペコリン、３−アミノプロピルホスホン酸、３−アミノプロパンスルホン酸、ＤＬ−ホモシステイン酸、シアノアセチルウレア、フマル酸３−アミノプロピオニトリル、メルカプトコハク酸、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩、３−メルカプトプロピオン酸、２−（アミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド塩酸塩、２−（ジメチルアミノ）エタンチオール塩酸塩、セリノール、ペンタエチレンヘキサミン、ｎ−イソプロピル−１，３−プロパンジアミン、エチルアミン、２−（エチルチオ）エチルアミン塩酸塩、３−メルカプト−１−プロパノール、３−メルカプト−１，２−プロパンジオール等を包含する。そのような物質は、当業者に公知の方法を用いてビーズに結合される。ビーズは、金属、ガラス又は高分子材料で形成することができる。ビーズの周知の例としては、セファデックス及びセファロース等の商標名で販売されているものが挙げられる。特に、好ましいものは、磁性ビーズ、例えば、磁界を使用することによって液体媒体から分離することができるような磁性材料を含有したビーズ（例えば、磁性粒子又は磁性コア）である。有用な磁性ビーズは、「VICAM (Watertown, MA)」によって販売されているものである。
【００３５】
精子細胞からのＸ型又はＹ型特異的タンパク質に結合する抗体もまた、本発明による分離に使用することができる。これらの抗体は、いかなる型の抗体（ＩｇＧ及びＩｇＭを含めて）であってもよく、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかであってもよい。もしポリクローナル抗体が使用されるなら、そ
のような抗体は、それ自体公知の手順に従って製造することができる。例えば、Hurn, B.A.らの「Meth. in Enzymology, Ed. Van Vanakis, H. and Langone, J., pp. 104-142 (1980)」に記載のような手順を使用することができる。
【００３６】
所望により、モノクローナル抗体を利用することができ、Milstein と Kohler の「Nature (1975), 256, pp. 495-497」に記載されたような、それ自体公知の方法に従って製造することができる。この基本的な手順は、免疫性物質を動物、通常はマウス、に注射することを包含する。免疫原に対する抗体産生に適した時間の後、マウスを犠牲にする。細胞を脾臓から除き、骨髄腫細胞と融合させる。この融合から得たハイブリドーマ細胞は、インビトロで再生することができ、各々が、一つの特異的抗体の遺伝情報を発現している。それ故、一つのハイブリドーマ融合から産生された抗体は、高い特異性を有する傾向がある。
【００３７】
個々のハイブリドーマ細胞株から培養した細胞は、望ましい標的抗原決定基に対する抗体の産生のためにスクリーニングすることができる。標的抗原に陽性のこれらハイブリドーマは、望ましいレベルの親和性を有するものを同定するために更にスクリーニングすることができる。これら全ての特徴を表すモノクローナル抗体は、アッセイ条件が抗体結合特性又は親和性を変更するかどうかを決定するため、及び可能性のある汚染抗原に交差反応性を有するものを排除するために、実際のアッセイ条件を用いてスクリーニングすることができる。
【００３８】
本発明のある種の態様において、好ましい抗体は、例えば、Ｈ−Ｙ抗原への結合が明確な抗体のような、Ｙ型精子に特異的であり、且つ、Ｙ型精子に結合するものである。そのような抗体は、例えば、米国特許第４，６８０，２５８号（Hammerlingら）に記載された手順によって製造することができる。
【００３９】
本発明の実施に有用な細胞結合剤は、提案された細胞結合剤とＩＣＣを実施することによって、即ち、細胞結合剤が蛍光標識を有する場合、結合された小集団中の細胞が蛍光を発することにより示されるように、精子の小集団がその細胞結合剤に結合しているかどうかを見ることで、判定することができる。この方法は、例えば、レクチンを包含する一般的な抗体及びタンパク質を評価するのに有用である。この方法は、又、機能を喪失しないで、又は獲得しないで標識することができる限り、或いはそれらに対する標識第２抗体が得られる限り、分離剤としての高分子をスクリーニングするのによい。例えば、ビーズ上のスルフォン酸塩ターミネーターのような小さい種については、有用な細胞結合剤は、望ましい構造の（即ち、望ましい被覆又は表面に結合した試薬を有している）ビーズが作られており、そして、その結果、インキュベーション及び捕捉の後に、ビーズが上清から精子の小集団を（完全に取り除くか、全く取り除かないか、ではなくて）取り除くかどうかを決める、スクリーニング手順によって最もうまく判定される。それで、上清中に残存する精子が、遺伝子的方法（例えばＦＩＳＨ）でのアッセイによって雌雄の別が偏っているかどうかを決定する。
【００４０】
Ｘ型又はＹ型精子のいずれかに特異的な抗体は、ビーズ上に固定化することができる。これらのビーズは、プラスチックビーズか磁性ビーズであり得る。本発明のある種の態様の実施において有用なビーズは、プラスチックビーズ、例えば、セファロース（登録商標）６ＭＢ、又はその他のビーズであり、それらは、例えば、分離又は精製工程で沈殿する、又は磁界によって捕捉されるように、上清から物理的に分離されるのに充分な大きさである。プラスチックビーズが利用される場合、それに結合した抗体を有するビーズが精子試料に混合され、次いで、例えば、容器の底に沈殿するように、原液から分離される。この工程は、所望により、性染色体による精子の分離の完全さを増すように繰り返すことができる。分離を容易にするために、遠心力又は磁界等を使用することができる。望ましい精子を損傷又は無能力にするような過剰の力を避けるために、注意を要する。
【００４１】
もし磁性ビーズを使用する場合、ビーズは、好ましくは、固定化マトリックスを表す磁性粒子のミクロスフィアである。本発明のある態様において、直径で０．１から２ミクロンを有する磁性ビーズが、精子の運動性及び受精能を傷害せずに望ましい精子の種を分離するために、特に有用であり得る。特に有用な磁性ビーズは、例えば、米国特許第５，０７１，０７６号、同５，１０８，９３３、同４，７９５，６９８、及びＰＣＴ特許公開ＷＯ９１／０９６７８に記載されている。これらの特許に記載されている手順によると、好ましいビーズは、０．１から０．５ミクロンの直径で、調製することができる。
【００４２】
抗体は、それ自体公知の手順によってビーズに結合することができる。一般的に、連結化合物は、ビーズの製造中にビーズに取り付けられる。抗体がビーズに結合した後、ビーズは、付着した抗体のみが残るように洗滌される。当業者に公知の更なる手順は、例えば、米国特許第４，０１８，８８６号、米国特許第３，９７０，５１８号、米国特許第４，８５５，０４５号、及び米国特許第４，２３０，６８５号に記載されている。プロテインＡは、抗体の結合の有効性を大きく増加する好ましい連結化合物である。（Forsgren et al. (1977), J. Immunol. 99:19を参照されたい。この開示を参照して本明細書に取り込む）。プロテインＡは、ＩｇＧサブクラス抗体のＦｃ部分に結合することによって、これら抗体のＦａｂ部分を延長し、提示する。結果として抗体の正確な配位及び粒子からの伸張は、結合した抗体とそれらの標的の間の非常に効率的な相互関係を導くことになる。
【００４３】
プロテインＡの磁性粒子への結合の方法は、公知の科学文献を通して利用できる、及び記載されているいくつかの方法のいずれかによって進めることができる。そのような手順の一つにおいて、約１マイクロメーターの直径の磁性酸化鉄粒子が、先ず３−アミノプロピルトリエトキシシラン、次いでグルタルアルデヒドとの反応によって化学的に誘導体化される。誘導体化された磁性粒子は、プロテインＡと混合され、その結果、プロテインＡが共有結合している磁性粒子が生じる。抗体は、次いで、プロテインＡの磁性粒子に加えられ、短時間のインキュベーションの後に、プロテインＡ−抗体複合体が形成する。（Weetall, H. H. (1976), Meth. In Enzymol. 44:134-48を参照されたい）。
【００４４】
本発明の一態様において、磁気分離器が試験試料の異なった成分の磁気的分離に使用される。一般的に、試験試料は、磁気成分と非磁気成分の混合物として調製することができる。例えば、性分離の時間帯に、被覆された磁性ビーズが、Ｙ型精子に優先的に結合する精子細胞結合剤として使用することができる。磁性成分は、磁界の適用によって混合物内での操作又は制御することができる。それ故、例えば、望ましい性の子又は胎児を産生する目的で哺乳動物の人工授精に使用するため、使用者が、望ましい性質（又は複数の性質）の成分の一つ又は両方を選択できるように、磁性成分を非磁気成分から分離することができる。
【００４５】
磁気分離器は、磁気成分を非磁気成分から分離するための磁界を提供する磁石を用いている。磁石は、磁気成分を非磁気成分から離して、分離器の望ましい領域へ移動する制御をするよう構成される。一度分離されると、非磁気成分は、非磁気成分及び磁気成分の再混合が最小である、磁気成分から実質的に分離されて、磁気分離器から容易に除去することができる。
【００４６】
磁気分離器は、試験試料保持用の容器を受けるように設定されている容器受け部を含むことができる。磁石は、容器内の試験試料に作用させるために、分離器の容器受け部内に外部磁界を産生するように分離器内に配置されている。各々の試験試料を同じ磁界下に置くために、磁石に対して容器受け部内の所定の位置に容器を位置するよう、ガイドを設けることができる。一つ又はそれ以上の固定装置が、容器を磁石に対して相対的に望ましい位置に保持するように設けることができる。
【００４７】
分離器は、望ましい磁界を産生するために、容器受け部の辺りの所定の場所に位置されている、１つ又はそれ以上の磁石を含むことができる。例えば、分離器は、一対の磁石が、容器受け部の反対側、およそ１８０°離れて位置している、双極子配置を利用することができる。しかしながら、３つ又は４つ（四極子）の等間隔の磁石又は複数の非等間隔の磁石のような、いかなる適した磁石の配置も、望ましい効果を出すために分離機内に取り込んでよい。各磁石は、どのような適した磁性材料から形成された棒磁石であってもよい。又、別の適した磁力源又は電磁石のような発生器も、磁石用に利用することができる。
【００４８】
磁気分離器は、試験試料を分離中磁界内に保持し、非磁性成分を一度分離されると取り除くことができるように形作られた容器を含むことができる。この点に関して、容器は、試験試料を受ける注入口、及び非磁性成分が分離後に放出される出口を有することができる。出口は、便利な位置に設けてよいが、好ましくは、重力による容器からの流れができるように容器の低位置に設けてもよい。更に、非磁性成分は、ポンプのような適した装置を使用して容器から除去することができる。
【００４９】
調節器は、容器からの非磁性粒子の流れを調節するために容器の出口に連結することができる。調節器は、例えば栓のようなクランプ又はバルブを含む、出口からの流れを調節するのに適した装置である。
【００５０】
磁性分離器は、磁性成分又は非磁性成分の相対的に高濃度の試験試料を分離するために特に適している。これに関して、試験試料は、成分の分離ができるように充分な期間、容器によって磁界内に保持していてもよい。一度分離されると、調節器は、制御された速度で容器から非磁性成分を放出するよう作動することができ、そして磁性成分が再混合し、非磁性成分と一緒に容器から引き出される可能性を減少させる。
【００５１】
磁性分離器は、容器から放出される非磁性成分を捕捉するための器を受けるよう形作られた、器受け部の上方に容器受け部を支持する基部を含むことができる。
【００５２】
非磁性成分の放出前に試験試料の適正な分離を確実にするため、使用者が分離量を可視的にモニターすることができるように、容器は窓を含む、又は透明な材料で形成することができる。一度試験試料が分離されると、磁性成分が非磁性成分と一緒に容器から不注意に放出される可能性を減少させるために、使用者は、非磁性成分が容器から取り出される試験試料をモニターすることもできる。
【００５３】
特に有用な磁性分離器は、２００３年１月１６日出願で本出願と同一出願人による同時係属出願、第１０／３４６，５７６号に記載されており、同開示は参照することにより本明細書にとり入れられている。
【００５４】
本発明の一態様において、本方法は、性分離の時間帯にある生物試料と磁性細胞結合剤（例えば、磁性ビーズに固定化された細胞結合剤）とを接触させる工程を含み、この磁性細胞結合剤は、望ましい精子の集団に優先的に結合して生物試料の磁性成分を形成する。その後、生物試料の磁性成分を非磁性成分から分離するために、結合した精子を有する結合剤に磁界（例えば、磁性分離装置を使用して）が適用される。そして、生体液性試料の磁性成分から細胞の非結合集団を分離するために、生物試料の非磁性成分が容器から除去される。一般的に、容器から非磁性成分の除去は、非磁性成分を容器の底からの排液によって行われる。
【００５５】
細胞結合剤は、それを生物試料に加えるとき、磁性粒子に連結するか又は磁性粒子に連結しないかのいずれかである分子又は成分であり得る。連結していない細胞結合剤が使用されるとき、細胞結合剤は、細胞の選択された集団を結合するのに充分な時間、生物試料と接触させられる。連結化合物を含有する磁性粒子を、次に加えて、（細胞を結合した）細胞結合剤を磁性粒子と結合させる。例えば、連結化合物は、細胞結合剤分子に対する抗体であってもよい。連結化合物（又は「連結剤」）と細胞結合剤の種々の組合せは、当業者に周知の抗体及び二重抗体試験からよく知られている。
【００５６】
好ましくは、容器からの非磁性成分の除去は、容器の底部から非磁性成分を排液することによって実施される。吸引によりこれら成分を除去することより、容器から非磁性成分を排液することの重要な特徴は、吸引が渦巻き及びその他の乱流運動を生成して液体を混合する傾向があることである。細胞分離の方法において、特に適用された磁界が容器の壁に対して磁性化した成分を、必ずしも不動に保持するとは限らないので、乱流液体運動を最小に保持することが重要である。好ましくは、これは試料成分の再混合を制限する層流を用いて、容器の底から液体を除去することで達成される。それ故、好ましい態様において、選択された細胞の集団を磁気的に保持された細胞から分離する工程は、重力によって容器から排液することにより実施される。ポンプ又は調整された圧力によるような、容器を排液する別の方法も又使用することができる。一般的な応用において、排液の工程は、容器からの非磁性成分の流れを調整するバルブ又は栓を開いたり、状況に応じて閉じたりすることによって調整される。もしポンプが使用されるなら、分離容器の排液管に付属したポンプの操作を調整することにより同じ効果を得るであろう。
【００５７】
細胞分離を妨害しないで容器から、細胞の選択された集団を除去する別の方法は、精子に不活性な高密度液（即ち、除去される非磁性成分よりも高密度）を容器中にポンピングして、容器から生物試料の非磁性成分を置き換えることを包含する。この方法を使って、非磁性成分は、底部から排液することよりも、容器の上部から除去することができる。
【００５８】
磁性分離器の使用の特徴は、分離された細胞の集団が殆んど無駄なく分離された後、装置から回収できることである。例えば、本発明の一態様において、性分離の時間帯に磁性粒子に優先的にＹ型を持つ精子が結合することによって精子細胞を分画することができる。このように、磁性分離器は粒子に結合したＹ型を持つ精子を「引き付け」、Ｘ型を持つ精子（生体試料の非磁性成分）を磁性分離器から排出させることができる。磁性分離器は、好ましくは、分離容器から除去される非磁性成分の少量の外は全てが除去されるように構成され、望ましい細胞の集団が回収されるのを確実にするため、後に少量が残される。分液操作中、これは分液漏斗で底の液相を除去するのと類似している。非磁性成分を除去した後、少量の非磁性成分（分離漏斗での２相の間の界面に似たものを）が除かれる。これによって、分離容器中の磁性成分、即ち、細胞結合剤（例えば、抗体に連結した又は被覆されたビーズ）に結合された細胞が残る。これらの結合された精子細胞も、又、回収することができ、それ故、精子の二つの集団（即ちＸ型及びＹ型を持つ精子）の分離及び単離ができる。磁性成分の回収は、磁性分離器から分離容器を外し、容器から排出することにより容易に実施される。結合の反転は、ある種のクロマトグラフィー又は抗体−抗原反応と同様に達成される。
【００５９】
本分離方法は、細胞を更に精製するために細胞の単一集団につき連続して繰り返すことができ（例えば、同じ結合剤か、細胞又はそれらの小集団も認識する異なった結合剤を使用して）、又は、細胞のいくつかの異なった集団を回収するために、細胞の異なった集団に結合する細胞結合剤分子を使用して、細胞の混合集団に対して連続して繰り返すことができる。
【００６０】
結合剤は、分離の進行中に結合を保持するような、充分な親和性及び／又は結合力で細胞と結合するどのような種類のものでもよい。例示的な結合剤分子は、抗体、レクチン分子、ファージディスプレイ分子（又は他のコンビナトリアル結合分子）、細胞表面分子の結合パートナー（例えば、ＣＤ４−ＣＤ４受容体のようなリガンド−受容体対の一つ、炭水化物又は炭水化物含有分子（糖タンパク質のような）及び細胞表面の炭水化物受容体）等を包含する。
【００６１】
当業者によく知られているように、抗体分子の一部分である、パラトープが、そのエピトープに対する抗体の結合に関与する（一般的に、Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford を参照されたい）。抗体の抗原結合部位内に、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、及びパラトープの三次元構造を維持する枠組み構造領域（ＦＲｓ）がある（一般的に、Clark, 1986; Roitt, 1991を参照されたい）。哺乳動物の抗体の非ＣＤＲ領域は、元の抗体のエピトープ特異性が保持されて間、同種又は異種特異性抗体の類似の領域で置換できることは、今や、当該技術分野では十分立証されている。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号及び第５，８５９，２０５号を参照されたい。
【００６２】
従って、本発明の実施において有用な細胞結合剤は、ポリペプチド、炭水化物、脂質、及びこれらの組合せを含む、細胞表面分子に特異的に結合する多くのサイズ及び型のポリペプチドを包含することができる。これらのポリペプチドは、抗体技術以外の供給源から誘導することもできる。例えば、そのようなポリペプチド結合剤は、固定化形態で、又はファージディスプレイライブラリーとして、溶液で容易に調製することができる、変性ペプチドライブラリーによって提供することができる。コンビナトリアルライブラリーも、又、１つ又はそれ以上のアミノ酸を含有するペプチドから合成することができる。ライブラリーは、更にペプチド及び非ペプチド合成成分からも合成することができる。
【００６３】
ファージディスプレイ法は本発明の実施において有用な結合ペプチドを同定するのに特に有効である。簡潔にいえば、通常の手順を用いて４から約８０アミノ酸残基の挿入断片を表示するファージ・ライブラリー（例えば、ｍｌ３、ｆｄ、又はλファージを使用して）を作製する。挿入断片は、例えば、完全に変性した、又は偏った配列で示される。次いで、磁性分離器装置を使用して分離される特定の細胞型に結合するファージを持つ挿入断片を選択することができる。このプロセスは、特定の細胞型に結合するファージの再選択を数サイクル繰り返すことができる。繰り返し実施することにより、ファージを持つ特定の配列が高い割合になる。ＤＮＡ配列分析を、発現ポリペプチドの配列を同定するために行うことができる。特定の細胞型に結合する配列の最小直線成分を決定することができる。最小直線成分の一部又は全部を含有する挿入断片と、これに加えて、その上流又は下流の１つ又はそれ以上の付加的な変性残基とを含有する、偏ったライブラリーを用いる手順を繰り返すことができる。酵母のツーハイブリッドスクリーニング法を、特定の細胞型に結合するポリペプチドを同定するのに使用することもできる。
【００６４】
好ましい態様において、抗体及び他の細胞結合剤分子を、当業者に周知である手順を用いて、粒子（例えば、ビーズ又は好ましくは磁性ビーズ）に結合することができる。抗体及び他の細胞結合剤分子を、粒子に直接共有結合的に連結することができ、又は中間の連結化合物を通して粒子に付けることができる。連結化合物は、ビーズの製造中にビーズに付けることができる。精子用の抗体又は他の細胞結合剤は、連結化合物によってビーズに結合される。例えば、好ましい磁性ビーズは、ビーズ（約１ｍｇ鉄／ｍｌ）を精製した抗体（約１ｍｇ／ｍｌタンパク質）と混合することによって調製することができる。抗体がビーズに結合した後、接着した抗体のみが残るようにビーズを洗滌する。当業者に知られた更なる手順は、例えば、米国特許第４，０１８，８８６号、米国特許第３，９７０，５１８号、米国特許第４，８５５，０４５号及び米国特許第４，２３０，６８５号に記載されている。
【００６５】
抗体に対する中間連結化合物の例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、及び、抗Ｆｃ抗体、抗ＩｇＧ抗体又は抗ＩｇＭ抗体のような抗体を含む、抗体、レクチン、受容体等を特異的に結合するその他のタンパク質、を包含する。プロテインＡは、捕捉の効果を大きく増加する好ましい連結化合物である（Forsgren et al., (1977) J. Immunol. 99: 19；これは、特に必要としない限り、全体として冗長である。）
【００６６】
ビーズへのプロテインＡの付着方法は、当業者に周知である数種の方法のいずれかによって進めることができる。そのような一つの手順において、約１マイクロメートルの直径の磁性酸化鉄粒子は、先ず、３−アミノプロピルトリエトキシシランと、次いでグルタルアルデヒドとの反応により化学的に誘導体化される。誘導体化磁性粒子は、次に、プロテインＡと混合され、プロテインＡが共有結合的に付着した磁性粒子となる。抗体が、次に、プロテインＡの磁性粒子に加えられ、短時間のインキュベーションの後、プロテインＡ−抗体複合体が形成する（Weetall, H. H. (1976), Meth. Enzymol. 44:134-48を参照されたい）。
【００６７】
本発明の実施において有用な磁性粒子は、好ましくは非多孔性磁性粒子である。好ましくは、ビーズの直径は、約１０ミクロン未満、より好ましくは約５ミクロン未満である。細胞の望ましい集団の最適な回収を提供する特定のビーズ磁性粒子は、本発明の方法を実施するのに使用されるであろう特定の磁性分離器を使用して、異なったサイズ及び性質のビーズを試験することにより、当業者によって選択することができる。特に好ましい態様において、磁性ビーズは、０．１から２ミクロンの直径を有し、より好ましくは０．１から０．５ミクロンの直径を有する。付加的に有用な磁性ビーズは、例えば、米国特許第５，０７１，０７６号、米国特許第５，１０８，９３３号、米国特許第４，７９５，６９８号、及びＰＣＴ特許公開ＷＯ９１／０９６７８に記載されている。
【００６８】
本発明のある種の態様に従って、磁気装置を使用する細胞分離の方法は、生体試料が、約１×１０５超の細胞、約１×１０６超の細胞、約１×１０７超の細胞、約１×１０８超の細胞、約１×１０９超の細胞、又はそれより多くの細胞を含有する場合のような、細胞の大きな集団を分離するのに、特に有用である。
【００６９】
多数の細胞を（効率よく、迅速に、そしてそれらの完全性を保持する方法で）分離する能力は、複数の射精された精液を多くの授精操作に提供するために処理しなければならない、人工授精への適用（特に農業での使用）のために、経済的な細胞の分離を可能にする。このように、動物の射精された精子から一つの性に優先的に限定した精子を分離するには、磁性分離装置の使用が推奨される。多数の細胞を効率的に分離する能力はまた、望ましい型の精子の何れも廃棄することなく、全部の射精された精子の分離を可能とする。それ故、望ましい精子の一部が処理手順中に廃棄されたり無駄にされたりする既存の方法とは対照的に、全ての射精された精子を効率よく使用することができる。
【００７０】
磁性分離器を使用する、効率的で穏やかな細胞分離は、磁性分離器を使用して得られた精子の集団を哺乳動物の授精に使用する人工授精の方法の機会を提供する。当業者に周知である人工授精の標準的方法を、標準的な希釈組成物（例えば、卵黄及び種々の他の組成物を包含する）と分離した精子を組合せること、分離した精子をストローに包装し所望により凍結し貯蔵すること、そして分離した精子で動物を授精すること、を含めて使用することができる。受精能力のある哺乳動物を粒子に結合した精子細胞で授精することによって、磁性粒子から更に精製しない分離方法での磁性成分、つまり、磁性粒子に結合する選択された細胞集団を使用することが可能である。
【００７１】
それ故、本発明は、雌雄いずれかの哺乳動物の子又は胎児の割合を増加させる方法を提供するものである。本発明の方法は、本明細書に記載されている方法を実施することによって、雌性、雄性の両方を決定する精子を含有する生物試料から、１つの性を決定する精子を優先的に分離することを含む。１つの性に優先的に決定する精子が、もう一方の性に優先的に決定する精子を含む残りの生体液の試料から一度分離されると、分離された精子のどちらか一方の集団を雌性の動物、好ましくは哺乳動物、の生殖器官に、好ましくは人工授精技術を使用して、投与することができる。雌性の動物の生殖器官に精子を投与する前に、単離及び分離された精子を洗滌する更なる工程も、又、実施することができる。本発明で使用される「哺乳動物」には、牛、羊、豚、山羊、馬、犬、猫、霊長類又はその他の哺乳動物が含まれる。
【００７２】
性分離の間に精子の完全性の消失による制約がなければ、人工授精技術は、「高用量」か「低用量」方法のいずれにおいても使うことができる（人工授精に使用する精子の相対量を反映して、本発明の方法は何れの量の精子でも（即ち、高用量及び低用量方法の両者を包含して）適用可能である）。本発明の方法を使用して分離された精子を使用する、本方法のある態様において、比較的高用量が使用され、例えば約１千万超の細胞が授精に使用される。これらの態様において、投与される精子の数は、好ましくは、少なくとも約２千万、より好ましくは少なくとも約３千万、なおより好ましくは少なくとも約４千万、及び更により好ましくは少なくとも約５千万である。本発明の方法を使用して分離された精子を使用する本方法の別の態様において、比較的低用量が使用され、例えば、１千万細胞未満が授精に使用される。これら後者の態様において、投与される精子の数は、好ましくは約５百万未満、より好ましくは約百万未満、及びなおより好ましくは約５０万未満である。
【００７３】
細胞ロスが少なく多量の細胞を効率的、且つ穏やかに分離することができるので、磁性分離器の使用は、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）のような現行の細胞分離方法の使用では達成し得ない単一のプロセスで、哺乳動物の射精された精子全てを分画できることを提供する。ＦＡＣＳは、一般的に、投入された細胞の９０％を超えて排除し、そして選別された細胞に損傷を与える。細胞ロスが少なく、細胞の完全性の保護して、多量の細胞を分離できる本発明の方法は、多くの射精された精子を処理する人工授精操作及び他の組織に利点がある。射精された精子全てを分画できることは、個々の集団のためにのみ精子を分離するであろう、より小さい組織及び個々の農業経営者に対しても有利である。
【００７４】
本発明の好ましい態様において、射精された精子全てを分画するために、結合剤で被覆された磁性粒子と結合させて、次いで、上に記載したように磁性分離器を使用して分離させる。ある態様における射精された精子は、分離された成分中での望ましい性の少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも６０％、及びより好ましくは少なくとも６５％を提供する有効性をもって分画される。
【００７５】
射精された精子の分画に次いで、動物（好ましくは哺乳動物）を、優先的に一つの性に決定する精子の集団で授精させることができる。磁性分離器を使用した分画及び細胞分離の方法は、精子のように容易に損傷される細胞に対して穏やかで効率的で効果的であるので、本方法を用いて単離された殆どの細胞は、未分画の細胞に比較してそれらの活性を保持している。精子に対するこのことは、分画された細胞で授精された動物の受胎率が、未分画の細胞を使用した場合と同様のレベルに維持されることを意味している。それにひきかえ、細胞分離の先行方法は、レーザー光及び色素分子（ＦＡＣＳ）、剪断力等への曝露を含む厳しい条件を使用するので、精子の運動性及び受精能力に、しばしば障害を生じさせ、そのため、そのように分離された精子を利用する受精は、複雑かつ高価な技術を必要とし、受胎の効率を低下させる。更に、そのような技術は、飼育場での使用に適していない。それ故、本発明の好ましい態様に従って、磁性分離器を使用して、標準的授精手順において使用される精子を分離すると、授精の結果として得られる子又は胎児の受胎率は、好ましい態様において、未分画の精子を使用して得られた受胎率の少なくとも約５０％である。より好ましい態様において、受胎率はより高く、未分画の精子を使用した受胎率に接近する（例えば、未分画の精子を使用して得られた受胎率の少なくとも約７０％、８０％、９０％、又は９５％）。これらの方法は、それ故、ＩＶＦ、胎仔移植又はその他の高価な手順を使用することなく、哺乳動物の子又は胎児における雌雄の別の偏りを産生するのに有用である。
【００７６】
本発明の好ましい態様に従って磁性分離器を使用する分離の別の特徴は、多量の細胞を迅速に分画できることであり、それは生物活性をできるだけ保持しなければならない細胞の分離に特に有用である。例えば、射精された精子全てを約２時間未満で分画することができる。好ましくは、射精された精子全てが、約１時間未満で分画される。このことは、多量の細胞を処理するのに長時間を要し、低収率であり（例えば、１日当たり約７〜１０ストロー）、そしてこれにより、分画を待つ迄の長い時間及び長い保持時間の間、色素化合物に細胞が曝露される、というＦＡＣＳ法と対比することができる。短時間で射精された精子を処理できることは、本発明に従って性分離の時間帯での大量処理を容易にする。
【００７７】
本明細書に記載された好ましい方法に従って磁性分離器を使用することにより、哺乳動物の精子を、速やかに、精子の資質を実質的に損なうことなく、分画することができる。資質には、運動性、進行運動性、運動の等級、先体の完全性、解凍直後及び解凍後のインキュベートした場合の運動性及び形態を包含されるが、これらに限定されるものではない。それ故、これらの方法を使用した分画した精子の資質は、未処理の精子の少なくとも約５０％である。好ましくは、分画された精子の機能性は、未処理の精子の少なくとも約６０％、未処理の精子の少なくとも約７０％、未処理の精子の少なくとも約８０％であり、又は未処理の精子の少なくとも約９０％である。より好ましくは、分画された精子の品質は、未処理の精子の少なくとも約９５％であり、なおより好ましくは、未処理の精子の少なくとも約９７％であり、その上更により好ましくは、未処理の精子の少なくとも約９８％であり、そして最も好ましくは、未処理の精子の少なくとも約９９％である。未処理の精子と較べ上記の資質レベルを有する、一つの性に優先的に決定することが可能な、分画された精子の集団が提供される。
【００７８】
それ故、性分離の時間帯において射精された精子を分画する方法としては、種々の公知の分離技術のいずれも使用することができる、しかし、磁性分離技術を使用するのが好ましい。それ故に、本発明は、高品質で望ましい雌雄の子又は胎児を産生するための偏りを有する分離された精子の集団、そのような精子の集団を使用する人工受精方法、及び本明細書により完全に記載されるその他の方法及び産物を提供する。
【００７９】
本発明は、更に以下の実施例で説明される。以下の実施例において、以下の方法、手順及び培養液が使用される。成熟したウシ卵母細胞は「Trans Ova Genetics  (2938380th  St., Sioux Center, IA 51250)」から購入した。
【００８０】
（基本手順）
手順１．精子処置手順（遊泳上昇（Swimming up）法）
１．２つの凍結精液ストロー０．２５ｍｌ（分画したもの又は未分画のもの）を１０秒間、３７℃で解凍した。
２．解凍した精液の５本の１００μｌアリコートを、無脂肪酸ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Sigma）６ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及びゲンタマイシン５０μｌ／ｍｌ、を含有する改変Tyrodeアルブミン乳糖培養液（ｍＴＡＬＰ）の１ｍｌアリコート下１２×７５ｍｍのポリプロピレン製丸底チューブ中に積層した。
３．３８．５℃で１時間インキュベーションした後、各チューブからの培養液上部８００μｌ（遊泳上昇（swim up）した精子を含有する）をとり、１５ｍｌの円錐遠心管にプールした。
４．遊泳上昇した精子を遊泳上昇培養液(swim up medium)で最終容積１０ｍｌに希釈し、２０００ｒｐｍ（９００×ｇ）で、１０分間遠心分離し、上清を捨てた。
５．精子ペレットを遊泳上昇培養液で１０ｍｌに希釈し、再度２０００ｒｐｍ（９００×ｇ）で１０分間遠心分離し、精子ペレット１００μｌを単離した。
６．ペレット中の精子の濃縮物を測定し、試料を受精培養液で１×１０６精子／ｍｌに希釈した。
【００８１】
手順２．インビトロでの受精（ＩＶＦ）
１．３５×１０ｍｍの細胞培養皿中に（上記工程６からの）１×１０６精子／ｍｌを含有する受精培養液を使用して５０μｌの受精液滴を作製する。
２．成熟卵母細胞を洗滌培養液で３回洗滌し、１０個の洗滌した卵母細胞を、上記受精液滴の各々に移す。
３．５％ＣＯ２環境下、３８．５℃にてのインキュベーター中に細胞培養皿を置く。
【００８２】
手順３．受精した卵母細胞のインビトロでの培養
１．３５×１０ｍｍの細胞培養皿中に発生培養液Ｉを用いて５０μｌ液滴を作製した。受精した卵母細胞を発生培養液Ｉで洗滌し、発生培養液Ｉの５０μｌ液滴を含有するこれらの皿に移した。卵を含有する分離された液滴を完全に覆うように、ミネラルオイルを加えた。
２．５日後、発生培養液Ｉを、元の培養液の半分を吸引し、新鮮な培養液を加えることによって、発生培養液ＩＩで置換した。
３．受精後、第８日に、胚盤胞、桑実胚、及び発生停止８〜１６細胞胎仔（胚）を包含する、異なった胎仔形成期のものを性分離用に集めた。
【００８３】
手順４．胎仔の性分離
胎仔の性分離は、若干修正した、「Journal of Reproduction and Fertility (1993) 98:335-340」に記載されたように胎仔ＰＣＲプロトコールを使用して実施した。
全ての胎仔（８細胞から孵化胚盤胞期）を、インビトロ受精法（ＩＶＦ）によって産生した。少数の胎仔細胞をこれらの胎仔から抽出し、５μｌの溶解バッファー（２％の２−メルカプトエタノール；０．０１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；１０ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．３；プロテイナーゼＫ，２２２μｇ８ｍｌ）を含有する２５０μｌのＰＣＲチューブに入れる。全ての胎仔細胞を５５℃で２時間溶解し、プロテイナーゼＫを９８℃で１０分間不活化した。そして、試料をＰＣＲによる性分離を実施する状態にした。
【００８４】
第１回ＰＣＲは、ＺＦＸ及びＺＦＹ遺伝子の両者に相補性を有するプライマーを使用して行った。
（フォーワードプライマー：ＡＴＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＡＧＣＴ）
（リバースプライマー    ：ＧＣＡＣＴＴＣＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴ）；
対立遺伝子特異的プライマーを用いてＺＦＸ又はＺＦＹ遺伝子を特異的に増幅するために、ネステッドＰＣＲが使用される：
ＺＦＸ用：
フォーワードプライマー：ＧＡＣＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＧＴＧＴＴＡＣＴＧ
リバースプライマー    ：ＡＡＴＧＴＣＡＣＡＣＴＴＧＡＡＴＣＧＣＡＴＣ
ＺＦＹ用：
フォーワードプライマー：ＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＡＡＴＧＴＡＴＡＡＣ
リバースプライマー  ：ＣＴＧＡＣＡＡＡＡＧＧＴＧＧＣＧＡＴＴＴＴＣＡ
【００８５】
ネステッドＰＣＲに使用されるプライマーは、ＺＦＸ又はＺＦＹ遺伝子のいずれかの非オーバーラップ領域を増幅するため、及び２４７塩基対（ｂｐ）（ＺＦＸ）及び１６７ｂｐ（ＺＦＹ）産物を生成するためであった。ＰＣＲ反応は、５０μｌの反応容積中に１×ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｇｏｌｄバッファー（１５ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０；５０ｍＭのＫＣｌ）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰに対し４５μＭのｄＮＴＰ、各プライマーの２５０ｎＭ及びＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Applied Systems, NJ）から構成されていた。
【００８６】
第１回ＰＣＲは、９４℃にて１０分間のｈｏｔ−ｓｔａｒｔ法によって行い、９４℃にて1分間の変性、５５℃にて１分間のアニーリング、及び７２℃にて１分間の伸張を５サイクル実施し、次いで９４℃にて２０秒の変性、５５℃にて２０秒のアニーリング、７２℃にて３０秒の伸張を２５サイクル実施し、そして７２℃にて１０分間の最終伸張を実施した。第１回ＰＣＲ産物の２μｌをネステッドＰＣＲに使用し、ＺＦＸ及びＺＦＹを別のチューブで増幅し、サイクリングプロトコールを異なったアニーリング温度で２ステージで実施した。最初の５ＰＣＲサイクルのアニーリング温度は５２℃で、残り２５ＰＣＡサイクルは６０℃である。ネステッドＰＣＲも又、９４℃にて１０分間のｈｏｔ−ｓｔａｒｔで行い、総計３０回の三相サイクルで、９４℃にて１分間の変性、上記の温度で４５秒間のアニーリング、７２℃にて１分間の伸張、及び５分間の最終伸張を実施した。
【００８７】
増幅の後、ＰＣＲ産物の７μｌをローディングバッファ（２０％のＦｉｃｏｌｌ４００；１％のＳＤＳ及び０．１ＭのＮａ２ＥＤＴＡ中０．２５％キシレンシアノール、ｐＨ＝８）の２μｌと混合し、臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）を含有する１．５％（Ｗ／Ｖ）のＮｕＳｉｅｖｅ（登録商標）アガロースゲルに負荷し、８２Ｖにて４５分間電気泳動することによってトリス酢酸ＥＤＴＡバッファで分割し、カメラ付きのＵＶトランスイルミネーターによって可視化した。
【００８８】
手順５．Ｓ−ビーズ精液の性分離プロトコール（１．０ｍｌ；Ｓ−磁性ビーズを使用した分離）
Ｉ．精子細胞の調製
１．射精された精子を集め、直ちに原料の射精された精子を清潔な１５ｍｌのプラスチックディスポーザブル遠心チューブに移す。試料を含有したチューブを、３２℃に暖めた２００ｍｌの温水を含有する２５０ｍｌビーカーに置き、そして直ちにビーカーを１２℃に設定した冷却槽に入れる。射精された精子を実際の射精後できるだけ速やかに冷却を始めることが好ましい。射精後２分を越えて冷却を開始すると、性分離の結果に悪影響を及ぼす。
２．データシートのライン９上に使用した射精された精子の容積を記録し、初期細胞数を決める（この方法は、原料の射精された精子試料１．０ｍｌ用である）。
データシートのライン１２上に射精された精子の初期細胞数を記録する。
原料の射精された精子の運動性（％）を決め、データシートのライン１１上に入れる。
【００８９】
３．精液試料の残りを通常の処理のようにして伸展し、包装する。包装の後に、ＦＩＳＨ分析用に使用するための対照ストローを直ちに調製する。対照として伸展された射精された精子の容積をデータシートのライン１０上に記録する。
４．使用した射精された精子の容積（ライン９）に初期細胞数（ライン１２）をかけることによって総初期細胞を計算し、結果をライン１３に入れる。
５．第ＩＩ項を続ける前に、精液試料を１２℃に６時間冷却する（０時間＝射精時間）。
【００９０】
ＩＩ．細胞の洗滌
１．６時間の冷却工程の後に、試料１．０ｍｌを清潔な円錐チューブに移し、チューブの側面の印を使って、室温（一般的に、約１５℃から約３０℃、好ましくは約２０から２５℃）でＰＢＳにて４ｍｌまで試料を希釈する。チューブを優しく反転して混合する。
２．試料を、９００×ｇで室温にて１０分間の遠心分離により、精子をペレットにする。注意深く吸引し、上清を捨てる。ペレットを損傷しないようにして上清をできるだけ除去する。精子ペレットは非常に柔らかであり、できるだけ１．０ｍｌの液体を吸引後チューブに残すようにする。遠心チューブの側面の計数印を使って、ＰＢＳで４ｍｌまでペレットを再懸濁する。
３．室温にて１０分間の遠心分離（９００×ｇ）により、精子の２度目のペレット化を行う。注意深く吸引し、上清を捨てる。遠心チューブの側面の計数印を使って、ＰＢＳを加えることによって、３ｍｌの最終容積までペレットを再懸濁する。
【００９１】
ＩＩＩ．捕捉及び分離
１．Ｓ−磁性ビーズ（表面改変ビーズ、このものは、例えば、スルフォン酸塩処理表面を有する磁性ビーズ；又は別の望ましい表面処理を有するビーズ、を包含する）の１．０ｍｌ（濃度はＰＢＳ中１．０ｍｇ鉄／ｍｌ）を、４ｍｌのクリオバイアル(Cryovial)に移し、クリオバイアル磁性分離器で５分間にバイアルの側面に、磁性ビーズが移動するようにする（表面改変磁性ビーズ、バイアル及び磁性分離器は、Ｖｉｃａｍ（Watertown, MA）から入手可能である。）。磁性分離器で５分後、上清は澄明でなければならない。上清を除去し、ビーズをＰＢＳ１．０ｍｌで再懸濁する。総計２回の洗滌の２度目のＳ−磁性ビーズの分離及び再懸濁を繰り返す。２度目の洗滌後、激しく渦巻くように混合して磁性ビーズを完全に再懸濁する。
【００９２】
２．洗滌した再懸濁ビーズ６００μｌを直接、第ＩＩ項の工程３で調製した洗滌細胞懸濁液に加え、チューブを優しく反転することによって完全に混合する。
３．回転器（Cole Farmer Roto-Torque Model 7637 又は同等品）上で、４ｒｐｍで室温にて３０分間、細胞／ビーズ反応混合物をインキュベートする。
４．細胞／ビーズ反応混合物を３０分間インキュベートした後、細胞／ビーズ反応混合物をクリオバイアル磁性分離器に設置した４ｍｌのクリオバイアルに移し、磁性ビーズをバイアルの側面に、１０分間、引きつけるようにする。
【００９３】
５．ビーズ結合細胞を１０分間クリオバイアルの側面に引きつけた後、バイアルを磁性分離器に固定したままクリオバイアルから上清を注意深く吸引する。試料を注意深く吸引することで、採取した磁性ビーズペレットの移動及び再分散を最小化できるであろう。溶液のビーズ結合部分のいずれも採取しないこと。
６．通常の凍結処理に従って採取した試料を伸展し凍結する。
【００９４】
上記の手順及び下記の実施例で使用された磁性ビーズは、ＶＩＣＡＭ (Watertown, MA)から入手した。ビーズは、又、当業者に周知の技術によって製造することができる。
【００９５】
磁性ビーズが使用されるとき、ビーズは、好ましくは、固定化マトリックスを表す磁性粒子のマイクロスフェアである。直径が０．１から２ミクロンを有する磁性ビーズは、精子の運動性及び受精能力を損傷しないで望ましい型の精子を分離するのに特に有用であることが見出された。特に有用な磁性ビーズは、例えば、米国特許第５，０７１，０７６号、米国特許第５，１０８，９３３号、米国特許第４，７９５，６９８号、及びＰＣＴ特許公開ＷＯ９１／０９６７８に記載されている。これらの特許に記載されている手順に従って、ビーズは、特に直径０．１から０．５ミクロンを有するように製造することができる。
【００９６】
抗体は、それ自体当業者に公知である手順によってビーズに結合される。一般的に、連結化合物は、ビーズ製造中に磁性ビーズに付着される。好ましい連結化合物はプロテインＡである。ビーズ上に、（マウスＩｇＭに対するＩｇＧ抗体のような）抗体が、好ましくは、ＰＢＳ中で約１ｍｇ鉄／ｍｌのビーズを、製造者の仕様書のように再構成された精製抗体（１ｍｇ／ｍｌタンパク質）と混合することによって、結合される。抗体がビーズに結合した後、ビーズを、付着した抗体のみが残るように洗滌される。当業者に知られた更なる手順は、例えば、米国特許第４，０１８，８８６号、米国特許第３，９７０，５１８号、米国特許第４，８５５，０４５号、及び米国特許第４，２３０，６８５号に記載されている。プロテインＡは、付着した抗体による捕捉の有効性を大きく増加するので、好ましい連結化合物である（Forsgren et al. (1977), J. Immunol. 99:19）。プロテインＡは、ＩｇＧサブクラス抗体のＦｃ部分に結合し、それでこれら抗体のＦａｂ部分を伸展し、提示する。結果として抗体の正しい配位及び粒子から離れる伸展は、結合した抗体とそれらの標的の間の非常に効果的な相互関係を導くことになる。
【００９７】
プロテインＡの磁性粒子への結合方法は、公知の科学文献を通して得られるいくつかの方法のいずれかによって進めることができる。そのような手順の一つに、約１マイクロメーター直径の磁性酸化鉄粒子が、先ず３−アミノプロピルトリエトキシシラン、次いでグルタルアルデヒドとの反応によって化学的に誘導体化される。誘導体化された磁性粒子は、プロテインＡと混合され、その結果として、プロテインＡが共有結合している磁性粒子が生じる。抗体は、次いで、プロテインＡ磁性粒子に加えられ、短時間のインキュベーションの後に、プロテインＡ−抗体複合体が形成する（Weetall, H. H. (1976), Meth. In Enzymol. 44: 134-48）。
【００９８】
更なる実施例において、Ｋｏｏビーズをつくるために、ＶＩＣＡＭ磁性ビーズが、１ｍｇ鉄／ｍｌの１ｍｌ粒子濃度で、製造者の指示書（Bethy Laboratories, Montgomery, TX）により再構成された１ｍｇ／ｍｌのウサギ抗マウスＩｇＭ抗体１ｍｌと混合された。この混合物を、約４ｒｐｍでRoto-Torque Model 7637-01 (Cole-Parmer Instrument Company, Chicago, IL)で２時間回転した。ビーズを上に記載したラックを使用して５分間磁気的に捕捉し、２ｍｌのＰＢＳで４回洗滌した。ビーズを２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、その時点で、それらを２ｍｌのＫｏｏ抗体ＨＢ９０７０（腹水から約２ｍｇＩｇＭ／ｍｌにて）と混合し、記載したように４ｒｐｍで２時間回転した。ビーズを、次いで、磁気的に捕捉し、４ｍｌのＰＢＳで４回洗滌し、２ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。
【００９９】
手順６．精液の性分離を追跡して捕捉するプロトコール
Ｉ．精子細胞の調製
１．射精された精子を集め、直ちに原料の射精された精子を清潔な１５ｍｌのプラスチックディスポーザブル遠心チューブに移す。試料を含有したチューブを、３２℃に暖めた２００ｍｌの温水を含有する２５０ｍｌビーカーに置き、そして直ちにビーカーを１２℃に設定した冷却槽に入れる。
注意：射精された精子は、実際の射精後できるだけ速やかに冷却を始めなければならない。いかなる事情があっても、冷却の開始は射精後２分を越えてはならない。冷却工程の遅れは、分離の失敗をもたらすであろう。
２．第ＩＩ項を続ける前に、精液試料を１２℃に６時間冷却する（０時間＝射精時間）。
【０１００】
ＩＩ．細胞の洗滌
１．６時間の冷却工程の後に、試料１．０ｍｌを清潔な円錐チューブに移し、チューブの側面の印を使って、ＰＢＳにて４ｍｌまで試料を希釈する。チューブを優しく反転して混合する。
２．試料を、９００×ｇで室温にて１０分間の遠心分離により、精子をペレットにする。注意深く吸引し、上清を捨てる。ペレットを損傷しないようにして上清をできるだけ除去する。精子ペレットは非常に柔らかであり、できるだけ１．０ｍｌの液体を吸引後チューブに残すようにする。遠心チューブの側面の計数印を使って、ＰＢＳで４ｍｌまでペレットを再懸濁する。
３．室温にて１０分間の遠心分離（９００×ｇ）により、精子の２度目のペレット化を行う。注意深く吸引し、上清を捨てる。遠心チューブの側面の計数印を使って、ＰＢＳの３ｍｌにペレットを再懸濁する。
【０１０１】
ＩＩＩ．精子細胞の一次抗体標識
１．第ＩＩ項で調製した精子細胞のｍｌ量の各々に、性分離用の一次抗体（Ｋｏｏ抗体のような）の２．０ｍｇ／ｍｌ溶液の３０μｌを加える。例えば、第ＩＩＩ項工程３で調製した洗滌細胞懸濁液３．０ｍｌに対して、性分離用の一次抗体９０μｌを加える。
２．回転器（Cole Farmer Roto-Torque Model 7637 又は同等品）上で、４ｒｐｍで室温にて３０分間、抗体反応をインキュベートする。
３．インキュベーションに続いて、９００×ｇで１０分間遠心分離することで試料を洗滌し、精子細胞をペレット化する。ピペットを用いて、上清を試料から吸引する。ペレットを損傷しないようにして、できるだけ上清の多くを除く。精液ペレットは、非常に柔らかいので、吸引後チューブに液体１．０ｍｌだけ残るようにする。
４．遠心チューブの側面の計数印を用いてＰＢＳ３．０ｍｌに細胞ペレットを再懸濁する。
【０１０２】
ＩＶ．捕捉及び分離
１．架橋結合ビーズ（このものはビーズ上のプロテインＡに結合したウサギ抗マウスＩｇＭを用いて、以下に記載する手順７によって調製することができる）６００μｌ（１．２ｍｇ）を４ｍｌのクリオバイアルに移し、クリオバイアル磁性分離器で５分間、磁性ビーズをクリオバイアルの側面に引き出す。磁性分離器中で５分後には、上清は澄明でなければならない。上清を除去し、ビーズをＰＢＳ６００μｌで再懸濁する。磁性ビーズペレットを激しく渦巻くように混合して完全に再懸濁する。
２．再懸濁ビーズの６００μｌを第ＩＩＩ項の工程４で調製した洗滌した抗体標識細胞懸濁液に直接加え、チューブを優しく反転することによって完全に混合する。
３．回転器（Cole Farmer Roto-Torque Model 7637 又は同等品）上で、４ｒｐｍで室温にて３０分間、細胞／ビーズ反応混合物をインキュベートする。
【０１０３】
４．細胞／ビーズ反応混合物を３０分間インキュベートした後、細胞／ビーズ反応混合物をクリオバイアル分離器に設置した４ｍｌのクリオバイアルに移し、ビーズをクリオバイアルの側面に、１０分間、引きつけるようにする。
５．ビーズ結合細胞を１０分間分離室の側面に引きつけた後、チューブをクリオバイアル磁性分離器に固定したまま採取チューブから上清を注意深く吸引する。ビーズの濃いバンドが４ｍｌのクリオバイアルの底に向かって移動を始めるまで試料を集める。溶液のビーズ結合部分のいずれも採取しないこと。クリオバイアルの底にビーズ／細胞溶液のおよそ３００から４００μｌが残るのは正常である。
【０１０４】
手順７．ビーズへの架橋結合
１．プロテインＡ磁性ビーズ（ＶＩＣＡＭ（Watertown, MA）から入手）の１０ｍｌチューブを１５ｍｌの磁性分離器に５分間置き、ビーズをチューブの壁に引き寄せる。
２．チューブが磁界中に残っているうちに、チューブから澄明な上清を吸引する。
３．磁性ビーズを含有するチューブを１５ｍｌ磁性分離器から取り除き、ビーズをＰＢＳ１０ｍｌに完全に再懸濁する。
【０１０５】
４．総計２回の磁性ビーズの洗滌を行うために工程１及び２の二回目を繰り返す。
５．二回目の磁性ビーズを引きよせた後、ＰＢＳ１０ｍｌにビーズを再懸濁する。激しく渦巻くように混合してチューブの側面からビーズを完全に分散する。ビーズの濃度は１．０ｍｇ／ｍｌである。
６．架橋抗体５．０ｍｇ（１．０ｍｌ）を洗滌ビーズに加え、チューブを優しく反転しながら混合する。
７．回転器（Cole Farmer Roto-Torque Model 7637 又は同等品）上で、４ｒｐｍで室温にて２時間、結合反応をインキュベートする。
８．２時間のインキュベーション後、チューブを回転器から取り除き、キャップを外し、１５ｍｌの磁性分離器中に５分間置いて、ビーズをチューブの側面に引き寄せる。
【０１０６】
９．チューブが磁界の中に残っている間に、チューブから澄明な上清を吸引する。
１０．磁性ビーズを含有するチューブを１５ｍｌの分離器から取り除き、ビーズをＰＢＳ１０ｍｌに完全に再懸濁する。
１１．全部で５回の磁性ビーズの洗滌のために、工程４、５、６を更に４回繰り返す。
１２．５回目の磁性ビーズの洗滌に続いて、チューブを磁性分離器から外し、ビーズをＰＢＳ１０ｍｌに再懸濁する。ビーズを、激しく渦巻くように混合してチューブの側面からビーズを分散する。ビーズ濃度は、ここで１．０ｍｇ／ｍｌである。
１３．ビーズを４℃で保存する。ビーズは少なくとも１週間安定である。
【０１０７】
手順及び実施例で使用される培養液
Ｉ．リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）培養液、    ｐＨ７．５
二塩基性リン酸ナトリウム７水和物        ２．６８ｇ
ＮａＣｌ                                ８．７７ｇ
蒸留水                                  １０００ｍｌ（最終容積）
希塩酸又は希苛性ソーダを滴下してｐＨ７．５±０．０５に調節する。
使用前に０．２２μｍのフィルターをとおして濾過する。
【０１０８】
ＩＩ．ウシ卵母細胞のインビトロ成熟及び受精用基礎培養液
ＴＬ−Ｈｅｐｅａ（ＴＬＨ）培養液                １０００ｍｌ
ＮａＣｌ                                      ６．６６００ｇ
ＫＣｌ                                        ０．２４００ｇ
ＮａＨＣＯ３                                  ０．１６８０ｇ
ＮａＨ２ＰＯ４                                ０．０４０８ｇ
ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ                            ０．３０００ｇ
ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ                            ０．１０００ｇ
Ｈｅｐｅｓ                                    ２．４０００ｇ
フェノールレッド                              ０．０１００ｇ
乳酸ナトリウム（６０％シロップ）              １４６０μｌ
ｐＨ：７．２〜７．４（１Ｎ  ＮａＯＨで調節）
浸透圧: ２５５〜２６５ｍＯＳＭ
ＴＬ−保存培養液                                １０００ｍｌ
ＮａＣｌ                                      ６．６６００ｇ
ＫＣｌ                                        ０．２３５０ｇ
ＮａＨＣＯ３                                  ２．１０４０ｇ
ＮａＨ２ＰＯ４                                ０．０４１０ｇ
ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ                            ０．３０００ｇ
ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ                            ０．１０００ｇ
Ｈｅｐｅｓ                                    ２．４０００ｇ
フェノールレッド                              ０．０１００ｇ
乳酸ナトリウム（６０％シロップ）              １４６０μｌ
インキュベーター中で、ｐＨをＣＯ２によって調節する
浸透圧:２８０〜３００ｍＯＳＭ
ＴＬ−精子保存培養液                            １０００ｍｌ  
ＮａＣｌ                                      ５．８２００ｇ
ＫＣｌ                                        ０．２３００ｇ
ＮａＨＣＯ３                                  ２．０９００ｇ
ＮａＨ２ＰＯ４                                ０．０３５０ｇ
ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ                            ０．２９００ｇ
ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ                            ０．３１００ｇ
Ｈｅｐｅｓ                                    ２．３８００ｇ
フェノールレッド                              ０．０１００ｇ
乳酸ナトリウム（６０％シロップ）              ３１５３μｌ  
ｐＨ：７．２〜７．４（１Ｎ  ＮａＯＨで調節）
浸透圧:２８０〜３００ｍＯＳＭ
【０１０９】
ＩＩＩ．ＩＶＭ（インビトロ成熟）用培養液
成熟培養液
１０ｍｌ
ＴＣＭ−１９９イーグル塩                      ８．７ｍｌ
１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）                １．０ｍｌ
ＦＳＨストック                                １００μｌ
ＬＨストック                                  １００μｌ
又はＨＭＧ（ＦＳＨ及びＬＨの代わり）          １００μｌ
ピルビン酸ナトリウムストック                  １０μｌ
ゲンタマイシンストック                        １０μｌ
エストラジオール−１７β
成熟用卵母細胞洗滌培養液
３０ｍｌ
ＴＬＨ培養液                                  ２７ｍｌ
ＦＣＳ                                        ３ｍｌ
ピルビン酸ナトリウムストック                  ３００μｌ
ゲンタマイシンストック                        ３０μｌ
【０１１０】
ＩＶ．ＩＶＦ用培養液
遊泳上昇（ｓｗｉｍ ｕｐ）培養液
３０ｍｌ
ＴＬ−精子培養液                              ３０ｍｌ
ＢＳＡ（分画Ｖ）                              １８０ｍｇ
ピルビン酸ナトリウムストック                  １００μｌ
ゲンタマイシンストック                        ３０μｌ
受精培養液
１０ｍｌ
ＴＬ−ストック培養液                          １０ｍｌ
ＢＳＡ（分画Ｖ）                              ６０ｍｇ
ピルビン酸ナトリウムストック                  １００μｌ
ゲンタマイシンストック                        １０μｌ
ヘパリンストック                              ２０μｌ
受精用卵母細胞洗滌培養液
３０ｍｌ
ＴＬＨ培養液                                  ３０ｍｌ
ＢＳＡ（分画Ｖ）                              ９０ｍｇ
ピルビン酸ナトリウム                          ３００μｌ
ゲンタマイシンストック                        ３０μｌ
【０１１１】
Ｖ．ＩＶＣ用培養液  
基本培養液：ＢＥＣＭ（ウシ胎仔培養液）
１０００ｍｌ
８９ｍＭ            ＮａＣｌ                  ５．２０００ｇ
３．２ｍＭ          ＫＣｌ                    ０．２３８６ｇ
２．０ｍＭ          ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ        ０．２９４０ｇ
０．５ｍｍ          ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ        ０．１０１６ｇ
２５ｍＭ            ＮａＨＣＯ３              ２．１０００ｇ
０．３５ｍＭ        ＮａＨ２ＰＯ４            ０．０４８３ｇ
１．０ｍｍ          グルタミン                ０．１４６０ｇ
０．５ｍｍ          ピルビン酸ナトリウム      ０．０５５０ｇ
１０ｍｍ            乳酸ナトリウム            １４３７．１８μｌ
ＢＭＥアミノ酸（１００×）１％
ＭＥＭアミノ酸（１００×）１％
フェノールレッド溶液      １０００μｌ
ｐＨ：７．２〜７．４（１Ｎ  ＮａＯＨで調節）
発生培養液Ｉ（授精後５日間用）
１０ｍｌ
ＢＥＣＭ                                      １０ｍｌ
ＢＳＡ（脂肪酸を含有しない）                  ３０ｍｇ
ゲンタマイシン                                １０μｌ
発生培養液ＩＩ（授精後５日から用）
１０ｍｌ
ＢＥＣＭ                                      ９ｍｌ
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）                  １ｍｌ
ゲンタマイシン                                １０μｌ
【実施例１】
【０１１２】
雄牛精液のＩＣＣ分離の経時変化
４つのタイムスタディ（試料１〜４）を以下に記載の方法で行った。
試料１は、卓上で、室温、実際には２８℃、に冷却した。試料２〜４は、それぞれ、４℃、１２℃、及び１６℃に、循環する水槽を用いて冷却した。
Ｓビーズ（VICAM, Watertown, MA）を用いて１．０ｍｌの分離をｔ＝０、２、４、６、８、１２及び２４時間で実施した。各時間での洗滌細胞試料を、即時ＩＣＣ分析用にＫｏｏＡｂで標識した。冷凍対照及び最終の性分離した試料をＦＩＳＨ分析用に保存した。各温度点で、射精された精子を１５ｍｌの円錐遠心チューブに採取した。チューブを直ちに３２℃の水２００ｍｌを含有する２５０ｍｌビーカーに移した。このビーカーを直ちに望ましい温度の水槽に入れて、冷却し、２４時間にわたって試料採取し、上記手順５に記載のように分離を行った。１．０ｍｌの試料を射精後ｔ＝０、２、４、６、８、１２及び２４時間に採取し、１．０ｍｌ分離プロトコール（上記の手順５）に記載のように分離した。
【０１１３】
試料（各時間点で１試料）のＩＣＣ標識は、２回洗滌した精液試料１００μｌで、これにＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭのＮａＣｌ）１５０μｌを加え、Ｋｏｏ抗体（ＰＢＳ中に１．０ｍｇ／ｍｌのＫｏｏ）６μｌで標識した。試料を室温（２８℃）にて３０分間、時々撹拌しつつインキュベートした。インキュベーションに続いて、試料にＰＢＳ１ｍｌを加えて希釈し、室温にて９００×ｇで１０分間遠心分離してペレット化した。洗滌したペレットをＰＢＳで２５０μｌに再懸濁し、蛍光標識ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＭ  １２μｌを加えた。この反応混合を、暗所で室温にて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、試料にＰＢＳ１．０ｍｌを加えて希釈し、蛍光顕微鏡及び適した励起フィルター及び吸収フィルターを使用して、直ちにＩＣＣ陽性細胞の値（％）を求めた。
【０１１４】
これらの実験結果は、表１に示す。そこでは、４つの温度に対する各時間点でのＩＣＣ陽性細胞を示している。各時間設定のデータは、一回に射精された精子を使用して得たものである。図１は、異なった温度での時間に応じたＩＣＣ陽性の精子細胞の割合の増加を図示している。
【０１１５】
【表１】
2007521800.tif 000002
【０１１６】
４つの温度の各々が、インキュベーション時間が増加するとＩＣＣ陽性細胞の総割合が増加することを示している。そのデータは図２にプロットされている。４℃（●）と１２℃（■）における曲線の間、又は１６℃（▲）と２８℃（ｘ）における曲線の間には相異は小さいように見える。表２に示すように、ＦＩＳＨデータは、これらの曲線で、性分離の時間帯が、これらの異なった温度条件で現れることを示すために使用される。ＦＩＳＨ手順用に、プローブは、英国、Cambio社から入手し、その推奨プロトコールに従った。
【０１１７】
【表２】
2007521800.tif 000003
【０１１８】
これらの実験の過程において、実際の遠心分離、洗滌、標識及び分離の各工程は、この場合２８℃である、室温で卓上で完遂されたことを注目すべきである。即ち、室温は、原料の射精された精子が、指示された温度で指示された時間にインキュベートされるとすぐに処理された温度である。
【０１１９】
図２〜４は、表２のデータに対してプロットした表１のデータのグラフである。これらのグラフは、性分離の時間帯の開始及び閉止、即ち、雌性に偏るようにするため、雌性の細胞から雌性の細胞を優先的に分離するよう細胞を処置することを例証している。
【０１２０】
二つの冷却していない遠心分離器が、これらの実験に使用された。
この実験は、部分的に繰り返され、そしてこれにより以下の表３及び４に示すデータが得られた。この繰り返された実験において、室温は２１℃であった。
【０１２１】
【表３】
2007521800.tif 000004
【０１２２】
【表４】
2007521800.tif 000005
【０１２３】
図５及び６は、室温が２８℃（◆）及び２１℃（＋）である時の集めたデータを比較したグラフを示す。
【実施例２】
【０１２４】
性分離の時間帯の再現性
上に記載したようにして、１０の射精された精子を精液の性分離のプロトコール（プロトコール５）によって処理した（各々の射精された精子は、１．０ｍｌのアリコートに分割し、所定の温度からの性分離した試料は、磁気分離工程の後にプールした）。分離処理が完了した後、各々の射精された精子は、卵黄クエン酸増量剤で伸展し、工業標準法を用いて凍結した。ＦＩＳＨ分析を、各試料で達成された雌性の偏りを判定するために実施された。表５に、凍結精液試料の資質アセスメントからのデータを示す。液体窒素下に４日間貯蔵された精液を温水バスで解凍し、精液の資質をすぐに運動性（％）及び前進運動性（前進運動性は、１＝貧弱、から５＝優秀まで記載する）について、評価した。精液は、次いで、暖かいテーブル上で４時間インキュベートし、再評価した。試料を１２℃にて６時間インキュベートした後のこの時点で、対照試料を除き、伸展し、凍結した。性分離した試料は、記載したようにして処理した射精された精子の残りであった。解凍後の運動性を以下のようにして記録した：表５の第１行の雄牛Ｃｏｏｌ  Ｃａｔに見ることができる７０−４のようなスコアについては、７０は解凍後の運動性のある精子の割合（％）であり、４は解凍後の運動性につき、スケール１（貧弱）から５（優秀）における、等級である。
【０１２５】
【表５】
2007521800.tif 000006
【実施例３】
【０１２６】
Ｓビーズ法と抗体追跡捕捉法に於ける性分離の比較
（６時間の後、１２℃でインキュベーション）
人工膣を用いて雄牛から単一射精された精子を採取し、試料を直ちに１２℃（手順５に記載したように）に冷却し、この温度で６時間保持した。１２℃での６時間インキュベーション後、原料の射精された精子を３つの分画に分け、以下のように処理した。
【０１２７】
分画１は、対照として直ちに伸展し、更なる処理をせず冷凍した。
分画２は、上記の手順６に記載したようにして追跡捕捉法で、Ｋｏｏ抗体を使用して性分離を実施した。
分画３は、上記の手順５に記載したようにして、Ｓビーズ法を使用して性分離を実施した。
【０１２８】
対照及び性分離した分画のＦＩＳＨ分析の結果を表６に示す。対照の分画は、予測通り５０％の雌性の比率を示したが、Ｋｏｏ抗体で選択した集団及びＳビーズで選択した集団は、遺伝子アッセイで５６．２％の雌性細胞への高められた偏りを示し、生物学的検定法で評価したとすれば（例えば、ＩＶＦ）、偏りは、概算で５％ばかり性分離した試料において高くなることが予測され、その場合、対照は約５０％であろうし、性分離した試料は約６１％の雌性であろう。
【０１２９】
【表６】
2007521800.tif 000007
【実施例４】
【０１３０】
処置した精液を授精した雌牛の妊娠
種牛のラインアップの雄牛からの精液試料（射精された精子）を集め、精液を上に記載したように、本発明に合致した手順を用いて、Ｋｏｏ抗体及びビーズで処置した。処置した精液を過剰排卵したことのある雌牛に授精するのに使用した。胎仔を雌牛から取り出し、上に記載したようにして、性分離に特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法を使用して、或いは、いくつかの胎仔の性分離を実施する商業試験所（ＥｍＴｒａｎ）で採用されている市販の方法にしたがって、性分離を実施した。処置した精液で授精した過剰排卵の雌牛からの胎仔の雌雄の別を表７に示す。
【０１３１】
【表７】
2007521800.tif 000008
１つの試験は、受精が非常に貧弱で試験が継続できなかったので、中止された。（データは示さない）
【実施例５】
【０１３２】
スコットランドの雄牛
スコットランドの種牛のラインアップの雄牛からの精液試料（射精された精子）を集め、精液を上に記載したように、本発明に合致した手順を用いて、Ｋｏｏ抗体及びビーズで処置した。処置した精液の試料を、処置前及び処置後に採取された各雄牛からの試料の、Ｘ型及びＹ型を持つ精子の遺伝子的割合を決定するために、Ｘ型及びＹ型プローブ用の異なった色標識を用いて、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）によって分析した。二重色彩プローブでのＦＩＳＨ分析によって判定された、精子の細胞数及び雌雄の別比率を雄牛の射精された精子を２つに分けた処理及び非処理で、表８に示す。
【０１３３】
【表８】
2007521800.tif 000009
【実施例６】
【０１３４】
アイルランドの雄牛
種牛のラインアップの雄牛からの精液を処置し、稼働中の酪農場の雌牛及び仔を産んでいない若い雌牛の両者を授精させるのに使用した。最初の反復率（妊娠の欠如による再授精が必要なもの）は、対照雌牛（総数５５頭）では２４％で、処置された精液を受けた雌牛（総数６６頭）では２６％であり、若い未経産の雌牛と同様に、妊娠がより困難である雌牛でも良好な受精率を示した。別の性分離の方法が用もちいられていた伝統的な妊娠方法は、酪農場では役に立たないほどのレベルの低いものであったので、性分離の精液での試験の結果は異例なものであった。処置した精液を用いた、この試験現場に於ける仔牛の雌雄の別を表９に示す。雌牛誕生の割合の増加は＋１６％であり、もし対照で雌誕生が５０％であったなら、雌への偏りは６６％に相当し、基本的には、雄牛１頭に対し雌牛２頭が誕生する割合である。雌誕生の平均は、５０％未満で、実際には４２％であるが、性を偏らせた試料では、正常分娩の仔牛のうち５７％が雌であり、奇形は観察されていない。
【０１３５】
【表９】
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【実施例７】
【０１３６】
インビトロ受精中に生じた胎仔の雌雄の別の偏り
精液を指定した雄牛から採取した。Katahdin以外の全ての雄牛は、稼働中の酪農用家畜の群れにおいて、雌牛及び仔を産んでいない若い雌牛の人工授精用に使用する遺伝的に優れた保証付き雄牛からの精液を生産しているＡＩ社の種牛のラインアップからのものであった。Katahdinを除いた全ての雄牛からの精液を集め、ＡＩ社で分画した。ここでは分画は、採取後１時間未満に、室温で実施された。Katahdinからの精液は、飼育場では分画することができないので、採取品を冷蔵下に輸送し、採取の約６時間後に分画された（この精液を、性分離時間帯の最適な時間／温度の組合せで届ける）。分画は、上記の手順６のプロトコールを用いて実施された。対照の精液は、上記の手順５のＩ項に記載されたようにして調製された。精液を凍結し、インビトロ受精中に使用するようにストローに包装した。受精は、上記、手順２及び３に記載したようにして実施された。胎仔を得て、各胎仔の部分を、上記手順４に記載したようにして、雌雄の別を決定するためにＰＣＲ分析処理した。性分離した精液及び対照の精液でインビトロ受精によって生じた、胎仔の雌雄の別の偏りを、表１０に示す。
【０１３７】
【表１０】
2007521800.tif 000011
【実施例８】
【０１３８】
Ｋｏｏ抗体とヒト精子の反応性
ヒト精子を収集し、上に記載したようにして免疫化学を行った。ヒト精子は、標準的な臨床的スクリーニングにより、ヒト免疫不全ウイルス及びＢ型肝炎ウイルスに陰性なドナーからの得たものであった。精液は採取の数時間以内に室温で処理された。この実験では、精子懸濁液を１ｍｌのＰＢＳに原料の射精された精子２００μｌを希釈することにより調製し、これにより細胞数４×１０６／ｍｌとなった。懸濁液２５０μｌを１．５ｍｌエッペンドルフ遠心チューブに入れ、腹水（腹水を得るための標準方法により商業研究所で製造された、腹水として抗体濃度約２ｍｇ／ｍｌ）から得た、ハイブリドーマＨＢ９０７０又はＨＢ９０７１からの抗体のいずれか２５μｌと混合した。混合物を、室温で３０分間インキュベートした。それを低速（約９００×ｇ）で１０分間遠心分離し、上清を捨てた。リン酸緩衝生理食塩水（チメロサールを削除した以外は、標準処方）３００μｌを加え、ＦＩＴＣ結合第２抗体（ヤギ抗マウスＩｇＭは、「ICN/Cappel（Aurora, OH）」から調達する）２０μｌを加え、暗所で室温にて２０分間インキュベートし、９００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、ＰＢＳ３００μｌを加え細胞を洗滌した。更に９００×ｇ、１０分間遠心分離の後、上清を捨て、細胞を顕微鏡を使用して蛍光を点数付けした、ここでは、時間経過と共にＫｏｏ陽性の程度を、精子が採取後直ぐに曝露された温度の関数として測定した。ＦＩＴＣフィルターをこの実験に使用した。ヒト精子のＫｏｏ抗体との反応性は、表１１に示すが、それにより、我々が他の種で見出したように、ヒト精子の小集団はＫｏｏ抗体と反応することができるということを確認した。
【０１３９】
【表１１】
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【実施例９】
【０１４０】
ブタ精子とＫｏｏ抗体の反応性
Aftershockという名のヨークシャーホワイト由来のブタ精子を収集し、原料精液としてクーラーに入れ実験所に輸送し、そこで処理した。処理は、採取後数時間内から、採取後２４時間まで、各種の実験において変動した。この実験で使用した射精された精子は、１６０×１０６細胞／ｍｌを含有する５０ｍｌからなるものであった。ＩＣＣ用に、ＢＴＳバッファー（「Beltsville Thawing Solution」, Minitube of Americaで販売）１ｍｌ中１０×１０６細胞をＫｏｏＨＢ９０７１抗体と混合した。抗体は、１３．５μｇ／ｍｌで貯蔵されていたもので、この実験のために抗体１０μｌを１３９μｌに希釈し、この抗体希釈物２５μｌを精子と混合するために使用した。この混合物を、４℃にて一晩貯蔵した。次の日、精子を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することで洗滌し、ＢＴＳ４００μｌを加えて、製造者の指示書に従って再構成したＦＩＴＣウサギ抗マウスＩｇＭ（Ｐｉｅｒｃｅ）１０μｌを含有するようにした。細胞は顕微鏡下で検査した。ブタ精子のＫｏｏ抗体との反応性は、表１２に示される。
【０１４１】
【表１２】
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【実施例１０】
【０１４２】
マウス精子とＫｏｏ抗体の反応性
Ｋｏｏモノクローナル抗体は、ヒト及びブタの精子と同様にマウス精子の細胞の小集団にのみ、性分離剤として必要とされる機能を示す。Ａｌｉらの方法（Archives of Andrology, 24:235-45 (1990)）に従って溶液中で免疫細胞化学を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの輸精管及び副睾丸から採取された洗滌マウス精子に対して行った。表１３の結果は、２つの独立した実験の平均として報告されるものであり、マウス精子のＫｏｏ陽性度を示している。
【０１４３】
【表１３】
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【０１４４】
Ｋｏｏ反応性マウス精子は、精子をＫｏｏ抗体で被覆した磁性ビーズと混合し、ビーズを磁石で捕捉することによって溶液からきれいにすることができる。容積３００μｌ中に約１００万個の精子の精子懸濁液を、ビーズなし、Ｋｏｏビーズ又は抗サルモネラビーズ（VICAM, Watertown, MA）の何れかに、小回転器（直径約２０ｃｍ）で約２ｒｐｍにて３０分間ゆっくり回転して曝露した。ビーズは、１精子に対し約５ビーズの比率で加えた。磁気捕捉を、希土類磁石（VICAM, Watertown, MA）を使用して開放捕捉によって、１５分間実施した。溶液中に残存する精子に対する免疫細胞化学を実施した。表１４の結果は、各実験条件につき２つの独立した実験の平均として提示されており、Ｋｏｏ陽性マウス精子を上清から分離することができることを示している。
【０１４５】
【表１４】
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【実施例１１】
【０１４６】
処理精子により産生されたマウスＩＶＦ胎仔の雌雄の別
処理精子でマウス卵子のインビトロ受精は、優先的に雌性胎仔を産生する。マウス精子を単離し、上に記載したようにして、本発明に合致した手順によって性分離用のビーズで処置した。懸濁液中に残存する精子をＫｏｏ抗体に対する反応性を評価し、胚盤胞の段階まで培養する。コルヒチンを加え、染色体の押しつぶし標本を作製し、核型分類をする。雄性胎仔と雌性胎仔は受精から胚盤胞の段階（実験１）まで細胞分裂の類似した比率を有していることを仮定すると、総染色体に対するＹ染色体の比率は、胎仔細胞の雌雄の比を直接反映している。幾人かの科学者によって提案されてきたように、もし、雄性細胞がより早く分裂するなら、このアッセイは、控えめな結果を作り出すであろうし、雌性への偏りを過小に報告することになるであろう。別に（実験２〜４）、別々の容器中の個々の卵子が受精され、胚盤胞の段階まで増殖され、染色体の押しつぶし標本が、核型分類用に作られた。このアッセイでは、もし雄性細胞と雌性細胞のどちらかで存在するなら、細胞分裂の異なる速度の影響はないはずであるが、点数付けすることのできる胎仔の数は極端に限定されることになる。表１５は、処置した精子によって産生されたマウスＩＶＦ胎仔の雌雄の別を報告するものである。
【０１４７】
【表１５】
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【実施例１２】
【０１４８】
磁性分離器を使用した精子の分離
共沈殿法により作られ、そしてプロテインＡで被覆された磁性ビーズを使用した。ビーズを過剰のウサギ抗マウスＩｇＭ抗体に２時間結合し、磁気によって５回洗滌し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。磁気洗滌は、磁性ビーズの懸濁液をチューブの壁にビーズを引き寄せるように双極子磁性分離器中に５分間設置すること、チューブから澄明な上清を吸引すること、そして磁性ビーズをＰＢＳ１０ｍｌに再懸濁すること、によって実施された。
【０１４９】
新しく採取された雄牛の射精された精子のアリコート（７９０μｌ）をＰＢＳで８．０ｍｌに希釈し、その後９００×ｇで１０分間の遠心分離及びＰＢＳ中への再懸濁によるペレット化での洗浄を２回実施した。
【０１５０】
洗滌した細胞を、ＰＢＳ６．０ｍｌに再懸濁し、性分離用の一次抗体３６０μｇを加えた（Koo et al., Hum. Genet. 58 (1): 18-20, 1981；米国特許第４，６８０，２５８, Hammerlingら）。試料を、室温にて３０分間穏やかに混合して結合させた。結合した細胞を、９００×ｇで１０分間の遠心分離によりペッレット化することによって１回洗滌した。
【０１５１】
洗滌した細胞を、ＰＢＳ６．０ｍｌに再懸濁し、ウサギ抗マウスＩｇＭ結合磁性ビーズ１．２ｍｌを加え、溶液を０．２ｍｇビーズ／ｍｌ溶液、とした。試料を室温にて３０分間穏やかに混合して結合させた。
【０１５２】
次に、試料を磁性分離器に設置し、ビーズを１０分間磁界中で捕捉した。雌性細胞（Ｘ染色体を持つ精子）を、ストップコックを開き、制御された流れで装置の底から排出することによって、回収した。
【０１５３】
次いで、磁性分離器装置から流出した細胞数及び細胞の運動性を測定することによって、細胞を特徴付けた。磁性分離器装置での処理前及び処理後の細胞数及び運動性の要約は、以下の表１６に提供される。
【０１５４】
【表１６】
2007521800.tif 000017
【０１５５】
集めた細胞は、その後、卵黄増量剤を用いて伸展された。使用することのできる市販の増量剤は、例えば、Ｂｉｌａｄｙｌ（登録商標）、Ｔｒｉｌａｄｙｌ（登録商標）及びＢｉｏｃｉｐｈｏｓ  Ｐｌｕｓ（登録商標）を包含する。細胞は、次いで、ストローに移され、標準の凍結技術を使用して凍結された。
【０１５６】
凍結ストローは、凍結後約２ヵ月で解凍され、インビトロ受精を経て、１０９の胎仔を産生するのに使用された。
【０１５７】
各々の胎仔の雌雄の別は、上に記載されたように、Ｘ及びＹ染色体それぞれのＺＦＸ及びＺＦＹ領域の、ＰＣＲ増幅を用いた性分離によって判断された。又、Kirkpatrick 及び Monsonの「J. Reprod. Fertil. 98:335-340 (1993)」を参照されたい。
【０１５８】
全ての胎仔（８細胞期から透明帯が溶解した胚盤胞の段階まで）は、インビトロ受精（ＩＶＦ）によって産生された。ほんの少数の胎仔細胞がこれらの胎仔から抽出され、溶解バッファ（２％の２−メルカプトエタノール、０．０１％のＳＤＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリスｐＨ８．３、プロテイナーゼＫ、２２２μｇ／ｍｌ）５μｌを含有する２５０μｌのＰＣＲチューブに入れられた。全ての胎仔細胞を５５℃にて２時間で溶解し、プロテイナーゼＫを９８℃にて１０分間で不活化した。次いで、試料は、上に記載したように、ＰＣＲ胎仔の性分離を実施できる状態になった。
【０１５９】
ＩＶＦ胎仔のＰＣＲ雌雄の決定の結果は、８５の雌性胎仔及び２４の雄性胎仔で、雌性が７８％支持されるという明らかな雌雄の偏りがあることが示された。
【０１６０】
本発明は、その好ましい態様を含めて詳細に記載された。しかしながら、本発明の範囲内で変更及び改良を加えることは、当業者であれば通常のことである。上の記載は、例示的なものであり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物によってのみ特徴付けられるものである。
【０１６１】
本明細書により上記に開示された全ての特許及び参考文献は、参照してその全てを本明細書に取り込む。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１は、異なった温度における時間の関数としての精子細胞ＩＣＣ陽性の割合の増加を図示したグラフである。
【図２】図２は、４℃におけるＩＣＣによるＫｏｏ抗体での陽性細胞（％）対ＦＩＳＨによって測定された雌性細胞（％）のグラフである。
【図３】図３は、１２℃におけるＩＣＣによるＫｏｏ抗体での陽性細胞（％）対ＦＩＳＨによって測定された雌性細胞（％）のグラフである。
【図４】図４は、２８℃におけるＩＣＣによるＫｏｏ抗体での陽性細胞（％）対ＦＩＳＨによって測定された雌性細胞（％）のグラフである。
【図５】図５は、４℃で二つの異なった時間に集めたデータを比較した、ＩＣＣによるＫｏｏ抗体での陽性細胞（％）対ＦＩＳＨによって測定された雌性細胞（％）のグラフである。
【図６】図６は、１２℃で二つの異なった時間に集めたデータを比較した、ＩＣＣによるＫｏｏ抗体での陽性細胞（％）対ＦＩＳＨによって測定された雌性細胞（％）のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007521800.tif 000025
2007521800.tif 000026
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