(57)【要約】  本発明は、完全長対応物よりも大きな安定性と均一性及び高い発現効率を示す、トランケート型生物活性ＡＤＡＭＴＳポリペプチド、特にヒアレクタナーゼ活性を有するもの、より特定するとアグリカナーゼ活性を有するものを提供する。本発明はまた、そのようなトランケート型生物活性ＡＤＡＭＴＳポリペプチドをコードする核酸分子及びトランケート型生物活性ＡＤＡＭＴＳポリペプチドを生産するための方法を提供する。加えて、本発明は、生物活性ＡＤＡＭＴＳポリペプチドを調節することができる化合物、特にアグリカナーゼ活性を阻害する化合物を特定するための方法を提供する。
2007535920.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質から複数のアミノ酸残基を欠失させることによって得られる単離又は組換えアグリカナーゼであって、前記完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質はシステインリッチドメインを含み、前記複数の欠失アミノ酸残基はシステインリッチドメインの実質的な部分を含み、前記完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質は完全長ＡＤＡＭＴＳ−４タンパク質ではない、前記単離又は組換えアグリカナーゼ。
【請求項２】
前記完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質が、システインリッチドメインに対してＮ末端側に位置するトロンボスポンジンＩ型反復配列、及び前記トロンボスポンジンＩ型反復配列に対してＣ末端側に位置する保存されたフェニルアラニン残基を含み、前記複数の欠失アミノ酸残基が、前記保存されたフェニルアラニン残基に対してＣ末端側に位置する全てのアミノ酸残基の実質的な部分を含む、請求項１に記載のアグリカナーゼ。
【請求項３】
前記保存されたフェニルアラニン残基が、トロンボスポンジンＩ型反復配列に対してＣ末端側に位置する最初の保存されたフェニルアラニン残基である、請求項２に記載のアグリカナーゼ。
【請求項４】
前記複数の欠失アミノ酸残基が、保存されたフェニルアラニン残基に対してＣ末端側に位置する全てのアミノ酸残基を含む、請求項３に記載のアグリカナーゼ。
【請求項５】
プロドメインの実質的な部分の欠失をさらに含む、請求項１に記載のアグリカナーゼ。
【請求項６】
前記完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質が、ＡＤＡＭＴＳ−７、ＡＤＡＭＴＳ−９、ＡＤＡＭＴＳ−１０、ＡＤＡＭＴＳ−１６及びＡＤＡＭＴＳ−１８から成る群より選択される、請求項１に記載のアグリカナーゼ。
【請求項７】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る、請求項１に記載のアグリカナーゼ。
【請求項８】
前記アミノ酸配列の変異体から成る、請求項９に記載のアグリカナーゼ。
【請求項９】
請求項１に記載のアグリカナーゼ及び前記アグリカナーゼに共有結合したポリペプチドを含む、単離又は組換えタンパク質。
【請求項１０】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８又は９のいずれか１項に記載のアグリカナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９のいずれか１項に記載のアグリカナーゼ又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む、キット又はアッセイ系。
【請求項１２】
（ａ）請求項１、２、３、４、５、６、７、８又は９のいずれか１項に記載のトランケート型アグリカナーゼを含む試料を、複数の試験化合物のうちの１つと接触させる工程；及び
（ｂ）前記接触させた試料の活性を、試験化合物と接触させていない対応するタンパク質試料の活性と比較する工程
を含み、活性の実質的な低下によりアグリカナーゼ活性の調節剤としての化合物を特定する、アグリカナーゼの活性を調節し得る化合物を特定する方法。
【請求項１３】
前記化合物が前記アグリカナーゼ活性を阻害する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が前記アグリカナーゼ活性を上昇させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８又は９のいずれか１項に記載のアグリカナーゼに特異的な抗体。
【請求項１６】
基本的に、触媒ドメイン、ディスインテグリンドメイン、及び完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質の中央トロンボスポンジンＩ型反復配列から成り、前記完全長ＡＤＡＭＴＳがＡＤＡＭＴＳ−４タンパク質ではない、単離又は組換えアグリカナーゼ。
【請求項１７】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８又は９のいずれかに記載の精製トランケート型アグリカナーゼを含有する組成物。
【請求項１８】
請求項１０に記載の核酸分子で形質転換した又は形質導入した宿主細胞。
【請求項１９】
（ａ）前記タンパク質が発現される条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を培養する工程；及び
（ｂ）細胞又は培地から前記タンパク質を回収し、精製する工程
を含む、精製トランケート型アグリカナーゼを生産する方法。
【請求項２０】
請求項１２に記載の方法により特定される化合物を投与することを含む、被験者における炎症状態の治療のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規トランケート型ＡＤＡＭＴＳポリペプチド、特にアグリカナーゼ活性を有するもの、並びにそのような新規ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。本発明はさらに、そのような新規トランケート型ＡＤＡＭＴＳポリペプチドを生産するための方法、並びにＡＤＡＭＴＳ阻害剤、特にアグリカナーゼ阻害剤を開発するためにそのような新規ポリペプチドを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＤＡＭ（「ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ」（a disintegrin and metalloproteinase））タンパク質は、高い配列相同性とドメイン構造を有する膜関連マルチドメイン亜鉛依存性メタロプロテアーゼのファミリーである。ディスインテグリン及びプロテアーゼドメインに加えて、ＡＤＡＭタンパク質は一般に、プロドメイン、システインリッチドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部ドメインを含む。ＡＤＡＭタンパク質は、接着タンパク質とプロテアーゼの両方の特徴を含むという点で細胞表面タンパク質の中で独特である（Kaushal and Shah, J. Clin. Invest. 105 : 1335 (2000)）。
【０００３】
最近、膜貫通ドメインと細胞質尾部ドメインを欠くＡＤＡＭファミリーの新しい成員が特定された。より重要なことに、これらの新しい成員は他のＡＤＡＭでは認められないユニークトロンボスポンジンＩ型反復配列（ＴＳＲ）を含む。これらのＡＤＡＭＴＳ（「トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ」（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs））タンパク質はまた、プロドメイン、メタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリンドメイン、システインリッチドメイン及びスペーサー領域を含み、また６個のシステインを含む３０−４０アミノ酸ペプチドであるＰＬＡＣドメインも含み得る。他のＡＤＡＭタンパク質と同様に、現在までに特定された全てのＡＤＡＭＴＳタンパク質は、プロテアーゼ活性のために必要なＺｎ2+イオンを配位する、触媒コンセンサス配列ＨＸＸＧＸＸＨＤを含む(Tang, Int. J. Biochem. Cell Biol. 445:223 (2001))。
【０００４】
今や２０以上を数えるＡＤＡＭＴＳファミリーの成員は全て、ディスインテグリンドメインの後に１個のＴＳＲを含む；この内部ＴＳＲはヘパリンに結合することが示された (Kuno et al., J. Biol. Chem. 272: 556 (1997))。ＡＤＡＭＴＳは、しかし、一部にはそれらがスペーサー領域の下流に含むＣ末端側ＴＳＲの数の相違によって、互いに区別することができる。例えばＡＤＡＭＴＳ−４はＣ末端側ＴＳＲを含まず、ＡＤＡＭＴＳ−５はＣ末端側ＴＳＲを含み、ＡＤＡＭＴＳ−１（並びにヒトホモログＭＥＴＨ１）及びＡＤＡＭＴＳ−１６は２個のＣ末端側ＴＳＲを含み、ＡＤＡＭＴＳ−１０及びＡＤＡＭＴＳ−１８は５個のＣ末端側ＴＳＲを含み、ＡＤＡＭＴＳ−９及びＡＤＡＭＴＳ−２０は１４個のＣ末端側ＴＳＲを含む。
【０００５】
ＡＤＡＭＴＳは様々な病的障害に関係付けられてきた。例えばＡＤＡＭＴＳ−２の突然変異は、ヒトにおけるエーレルス−ダンロー症候群及びウシにおける皮膚脆弱症を生じさせ（Colige et al., Am. J. Hum. Genet. 65:308 (1999) )、一方ＡＤＡＭＴＳ−１３（フォン・ビルブラント因子切断タンパク質としても知られる）の突然変異は血栓性血小板減少性紫斑病を生じさせる(Kokame et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 11902 (2002))。
【０００６】
最近になって、いくつかのＡＤＡＭＴＳは関節軟骨の炎症性疾患、例えば変形性関節症（ＯＡ）及び関節リウマチ（ＲＡ）を導く病態生理学的事象にも関係付けられた。ＡＤＡＭＴＳ−４及びＡＤＡＭＴＳ−５（後者はＡＤＡＭＴＳ−１１としても知られる）はもともと、負荷下で圧迫変形に耐える上での関節軟骨の機械的性質に寄与する、アグリカンの切断の役割を担うプロテアーゼとして特定された（それらは現在、それぞれアグリカナーゼ−１及びアグリカナーゼ−２と称される）（Tortorella et al., Science 284: 1664 (1999) ; Abbaszade et al., J. Biol. Chem. 274: 23443 (1999))。その後、ＡＤＡＭＴＳ−１もこの軟骨損傷性「アグリカナーゼ」活性を有することが示された (Rodriguez-Manzaneque et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 293: 501 (2002) )。また、これらのアグリカナーゼが、神経膠腫の侵襲性において役割を果たすと考えられる、脳濃縮ヒアルロン酸結合／ブレビカン切断活性を有することを示唆する証拠も存在する (Matthews et al., J. Biol. Chem. 275:22695 (2000))。アグリカナーゼは、アグリカン、ブレビカン及びバーシカンを含むヒアレクタンを切断するので、より一般的にはヒアレクタナーゼ（hyalectanases）と称される。
【０００７】
ＡＤＡＭＴＳアグリカナーゼは、アグリカンのＧ１球状ドメインのインターグローブドメイン内のアミノ酸Ｇｌｕ373−Ａｌａ374の間を切断し、それによって生じるＣ末端側アグリカンフラグメント上のＮ末端側ネオエピトープ（374ＡＲＧＳＶ）を露出させる (Tortorella et al. , Matrix Biol. 21:499 (2002) ; Westling et al., J. Biol. Chem. 277: 16059 (2002) ; Tortorella et al., J. Biol. Chem. 275: 18566 (2000) )。この374ＡＲＧＳＶアグリカンフラグメントは、炎症性関節疾患、関節損傷及びＯＡを有する患者からの滑液中で発見された(Malfait et al., J. Biol. Chem. 277: 22201 (2002) ; Lohmander et al., Arthritis Rheum. 36: 1214 (1993) ; Sandy et al. , J. Clin. Invest. 89: 1512 (1992) )。加えて、生じるＣ末端側ＮＩＴＥＧＥ373ネオエピトープを含むＮ末端側アグリカンフラグメントは、関節損傷、ＯＡ及びＲＡを有する患者からの関節軟骨中で発見された (Malfait et al., supra; Sandy and Verscharen, Biochem. J. 358: 615 (2001) ; Lark et al., J. Clin. Invest. 100: 93 (1997))。合成ＡＤＡＭＴＳ阻害剤によるアグリカナーゼ活性の阻害は、374ＡＲＧＳＶネオエピトープを含むアグリカンフラグメントの放出によって測定したとき、変形性関節症軟骨におけるアグリカン分解を防ぐことが示された (Malfait et al., supra)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＯＡやＲＡなどの様々な炎症性疾患への関与の故に、ＡＤＡＭＴＳアグリカナーゼの阻害剤、特に低分子阻害剤を特定する必要がある。そのためには、必要なスクリーニングアッセイ及び結晶化試験を実施するために大量の精製された均一なアグリカナーゼタンパク質が必要である。しかしながら、これらのタンパク質を大量に単離し、精製することは、これらの分子の不均一性、低発現及び低い安定性の故に困難であることが認められてきた。例えばアグリカナーゼ−１（ＡＤＡＭＴＳ−４）の組換え発現は、ポリペプチド内の様々な位置でのＣ末端切り取りのために成熟タンパク質よりも低い分子量を有するいくつかのアイソフォームを生じる (Flannery et al., J. Biol. Chem. 277: 42775 (2002) ; Gao et al., J. Biol. Chem. 277: 11034 (2002) )。加えて、天然アグリカナーゼ−１及び−２（ＡＤＡＭＴＳ−５）はどちらも、Ｃ末端切り取りを示す様々な低分子量形態で存在する (Tortorella et al., J. Biol. Chem. 275: 25791 (2000) ; Abbaszade, supra)。
【０００９】
その全体が参照してここに組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／００４４１９４  Ａ１号は、ＡＤＡＭＴＳ１８核酸分子及びそれによってコードされるポリペプチドに関する。
【００１０】
その全体が参照してここに組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／００５４１４９  Ａ１号は、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ分子、好ましくはトランケート型ＡＤＡＭＴＳ−４（アグリカナーゼ−１）及びＡＤＡＭＴＳ−５（アグリカナーゼ−２）核酸分子それによってコードされるポリペプチドに関する。同様に、その全体が参照してここに組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／０１４２８６３  Ａ１号は、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−４核酸分子及びそれによってコードされるポリペプチドに関する。
【００１１】
これまでに記述されたトランケート型ＡＤＡＭＴＳ分子は、概してＣ末端で切り取られている。他のＡＤＡＭＴＳ関連分子、特にＡＤＡＭＴＳアグリカナーゼの収率、安定性及び均一性を高めるために有用なトランケート型ＡＤＡＭＴＳ分子を特定する必要性が現在も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、完全長対応物よりも大きな安定性と均一性及び高い発現効率を示す、トランケート型生物活性ＡＤＡＭＴＳポリペプチド、特にヒアレクタナーゼ活性を有するもの、より特定するとアグリカナーゼ活性を有するものを提供する。１つの態様では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳは、システインリッチドメインの実質的な部分を欠く。好ましくはトランケート型ＡＤＡＭＴＳは、触媒ドメイン、ディスインテグリンドメイン及び中央トロンボスポンジンＩ型反復配列の実質的な部分を保持する。特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳポリペプチドは、保存されたＰｈｅの後のＣ末端の実質的な部分を欠き、さらに又は選択的にプロドメインを欠いてもよい。本発明はまた、そのようなトランケート型生物活性ＡＤＡＭＴＳポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。本発明はさらに、そのようなトランケート型生物活性ＡＤＡＭＴＳポリペプチドを生産するための方法、並びに生物活性ＡＤＡＭＴＳポリペプチドを調節することができる化合物、特にアグリカナーゼ活性を阻害する化合物を特定するための方法を提供する。
【００１３】
本発明の１つの態様では、完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質から複数のアミノ酸残基を欠失させることによって得られる単離又は組換えアグリカナーゼが提供され、前記完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質はシステインリッチドメインを含み、複数の欠失アミノ酸残基はシステインリッチドメインの実質的な部分を含み、完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質は完全長ＡＤＡＭＴＳ−４タンパク質ではない。
【００１４】
全ての図面は説明のために含まれるものであり、本発明を限定すると解釈されるべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質のトランケート型形態が、まだ生物活性を保持しながら、完全長対応物よりも大きな安定性とより高い発現レベルを有し、より均一であるという発見に基づく。それ自体で、本発明は、完全長形態の当該タンパク質よりも大きな安定性と高い発現レベルを有する、新規トランケート形態の生物活性ＡＤＡＭＴＳタンパク質、特にヒアレクタナーゼ活性を有するもの、より特定するとアグリカナーゼ活性を有するものを提供する。
【００１６】
好ましい実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ分子はＣ末端で切り取られており、ヒアレクタナーゼ活性、好ましくはアグリカナーゼ活性を保持する。もう１つの好ましい実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ分子は、図１及び図２に示す保存されたフェニルアラニン（Ｐｈｅ）の後にＣ末端の実質的な切り取りを含む。さらにもう１つの好ましい実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ分子はプロドメインの実質的な部分を欠き、ヒアレクタナーゼ活性、好ましくはアグリカナーゼ活性を保持する。特に好ましい実施形態では、システインリッチドメインの実質的な部分が、トランケート型ＡＤＡＭＴＳがヒアレクタナーゼ活性、より好ましくはアグリカナーゼ活性を保持するように、欠失している。
【００１７】
本発明の１つの態様では、ヒアレクタナーゼ活性、より好ましくはアグリカナーゼ活性を有するトランケート型ＡＤＡＭＴＳは、少なくともプロドメインを欠くトランケート型ＡＤＡＭＴＳである。そのようなトランケート型ＡＤＡＭＴＳ分子は、中でも、少なくともプロドメインを欠くＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５、ＡＤＡＭＴＳ−７、ＡＤＡＭＴＳ−９、ＡＤＡＭＴＳ−１０、ＡＤＡＭＴＳ−１６及びＡＤＡＭＴＳ−１８を含む。ヒアレクタナーゼ活性を有するこれらのトランケート型ＡＤＡＭＴＳ分子は、Ｃ末端切り取り、例えばＣ末端の保存されたＰｈｅでの切り取りをさらに含み得る。
【００１８】
本発明の１つの態様では、アグリカナーゼ活性を有するトランケート型ＡＤＡＭＴＳは、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−７である。１つの実施形態では、切り取りは、ＡＤＡＭＴＳ−７のシステインリッチ、スペーサー及び５つのＣ末端ＴＳＲドメインを欠失させる。完全長ＡＤＡＭＴＳ−７を配列番号１に示す（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５５０８７）。特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−７分子はプロドメインを欠き、配列番号２（図３ａ）に示すように、アミノ酸２３３−１６８６を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。もう１つの特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−７は保存されたＰｈｅの後のＣ末端を欠き、配列番号３（図３ｂ）に示すように、アミノ酸１−５９９を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。さらなる特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−７はタンパク質ドメイン及び保存されたＰｈｅの後のＣ末端を欠き、配列番号４（図３ｃ）に示すように、アミノ酸２３３−５９９を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。
【００１９】
本発明のもう１つの態様では、アグリカナーゼ活性を有するトランケート型ＡＤＡＭＴＳは、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−９である。完全長ＡＤＡＭＴＳ−９を配列番号５に示す（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ８９１０６）。１つの実施形態では、切り取りは、ＡＤＡＭＴＳ−９のシステインリッチ、スペーサー及び２つのＣ末端ＴＳＲドメインを欠失させる。特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−９はプロドメインを欠き、配列番号６（図４ａ）に示すように、アミノ酸２８８−１０７２を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。もう１つの特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−９は保存されたＰｈｅの後のＣ末端を欠き、配列番号７（図４ｂ）に示すように、アミノ酸１−６４９を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。さらなる実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−９は保存されたＰｈｅの後のＣ末端及びプロドメインを欠き、配列番号８（図４ｃ）に示すように、アミノ酸２８８−６４９を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。
【００２０】
本発明のさらなる態様では、アグリカナーゼ活性を有するトランケート型ＡＤＡＭＴＳは、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１０である。１つの実施形態では、切り取りは、ＡＤＡＭＴＳ−１０のシステインリッチ、スペーサー及び５つのＣ末端ＴＳＲドメインを欠失させる。完全長ＡＤＡＭＴＳ−１０を配列番号９に示す（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿１１２２１９）。特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１０はプロドメインを欠き、配列番号１０（図５ａ）に示すように、アミノ酸２３４−１１０３を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。もう１つの特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１０は保存されたＰｈｅの後のＣ末端を欠き、配列番号１１（図５ｂ）に示すように、アミノ酸１−６０８を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。もう１つの実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１０は保存されたＰｈｅの後のＣ末端及びプロドメインを欠き、配列番号１２（図５ｃ）に示すように、アミノ酸２３４−６０８を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。
【００２１】
本発明のもう１つの態様では、アグリカナーゼ活性を有するトランケート型ＡＤＡＭＴＳは、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１６である。１つの実施形態では、切り取りは、ＡＤＡＭＴＳ−１６のシステインリッチ、スペーサー及び２つのＣ末端ＴＳＲドメインを欠失させる。完全長ＡＤＡＭＴＳ−１６を配列番号１３に示す（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６２０６８７）。特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１６はプロドメインを欠き、配列番号１４（図６ａ）に示すように、アミノ酸２７９−１０７２を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。もう１つの特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１６は保存されたＰｈｅの後のＣ末端を欠き、配列番号１５（図６ｂ）に示すように、アミノ酸１−６４７を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。さらなる特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１６はプロドメイン及び保存されたＰｈｅの後のＣ末端を欠き、配列番号１６（図６ｃ）に示すように、アミノ酸２７９−６４７を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。
【００２２】
本発明のさらなる態様では、アグリカナーゼ活性を有するトランケート型ＡＤＡＭＴＳは、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１８である。１つの実施形態では、切り取りは、ＡＤＡＭＴＳ−１８のシステインリッチ、スペーサー及び５つのＣ末端ＴＳＲドメインを欠失させる。完全長ＡＤＡＭＴＳ−１８を配列番号１７に示す（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９５５３８７）。特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１８はプロドメインを欠き、配列番号１８（図７ａ）に示すように、アミノ酸２８５−１２２１を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。もう１つの特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１８は保存されたＰｈｅの後のＣ末端を欠き、配列番号１９（図７ｂ）に示すように、アミノ酸１−６５０を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。さらなる特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１８は、保存されたＰｈｅの後のＣ末端及びプロドメインを欠き、配列番号２０（図７ｃ）に示すように、アミノ酸２８５−６５０を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。
【００２３】
上述したタンパク質に加えて、ここで提供するトランケート型生物活性ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、配列番号２−４、６−８、１０−１２、１４−１６及び１８−２０に示すものに類似するが、そこに挿入、欠失又は置換が自然に導入された（すなわち対立遺伝子変異体）又は意図的に工作されたアミノ酸配列を有するものを含む。例えば機能的に類似するアミノ酸（例えば酸性、塩基性、分枝等）の間での数多くの保存的置換が、上述したトランケート型タンパク質の構造又は活性に有意の影響を及ぼすことなく実施できる。
【００２４】
１つの実施形態では、本発明のアグリカナーゼは、完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質からシステインリッチドメインの少なくとも実質的な部分を欠失させることによって入手し得る。例えば欠失は、限定を伴わずに、システインリッチドメインのアミノ酸残基の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を含み得る。他の領域又は付随ドメインからのアミノ酸残基も欠失させ得る。これらの他の領域又は付随ドメインは、例えばディスインテグリン様ドメイン、中央トロンボスポンジンＩ型反復配列、スペーサードメイン、何らかのＣ末端トロンボスポンジンＩ型反復配列、付随ドメインの間又は付随ドメインの後に位置する何らかの領域、シグナルペプチド及びプロドメインを含む。
【００２５】
もう１つの実施形態では、本発明のアグリカナーゼは、中央トロンボスポンジンＩ型反復配列の後の空間的に保存されたフェニルアラニン残基に対してＣ末端側に位置するアミノ酸残基の実質的な部分を完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質から欠失させることによって入手得し得る。ここで使用する、保存された残基は、ＡＤＡＭＴＳファミリー成員の少なくとも大部分によって共有される。例えば保存された残基は、全てのＡＤＡＭＴＳファミリー成員の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％によって共有され得る。保存された残基は、当技術分野で公知の様々な方法を用いて特定することができる。一例では、最初に種々のＡＤＡＭＴＳファミリー成員に関して最適配列アラインメントを作製する。この目的に適するアルゴリズムは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＳＡ、ＰＲＡＬＩＮＥ、ＤＩＡＬＩＧＮ、ＰＲＲＰ、ＳＡＧＡ及びＭＡＣＡＷを含むが、これらに限定されない。Mount,BIOINFORMATICS (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), p. 141参照。ＡＤＡＭＴＳファミリー成員の少なくとも大部分によって共有される保存された残基を特定することができる。保存された残基を特定するための他のアプローチも使用できる。
【００２６】
用いる欠失は、中央トロンボスポンジンＩ型反復配列の後の最初の保存されたフェニルアラニン残基に対してＣ末端側に位置するいかなる残基又は配列も包含し得る。例えば欠失アミノ酸残基は、システインリッチドメイン、スペーサードメイン、Ｃ末端トロンボスポンジンドメイン、又はその間又はその後に位置する何らかの領域から選択され得る。欠失残基は、１又はそれ以上のドメインからの残基を含み得る。ドメインの欠失は完全であるか又は部分的であり得る。
【００２７】
一例では、欠失は、最初の保存されたフェニルアラニン残基に対してＣ末端側に位置する全アミノ酸残基の少なくとも３０％を含む。例えば欠失は、保存されたフェニルアラニン残基に対してＣ末端側に位置する全てのアミノ酸残基の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％を含み得る。欠失残基は、１又はそれ以上の連続配列フラグメントを含み得る。各々の欠失配列フラグメントは、例えば２−５アミノ酸、５−１０アミノ酸、１０−２０アミノ酸、２０−３０アミノ酸、３０−５０アミノ酸、５０−１００アミノ酸、１００−１５０アミノ酸、１５０−２００アミノ酸、２００−２５０アミノ酸、２５０−３００アミノ酸、３００−３５０アミノ酸、３５０−４００アミノ酸、４００−４５０アミノ酸、４５０−５００アミノ酸又は５００アミノ酸以上を含み得る。加えて、欠失残基は非連続残基を含み得る。
【００２８】
さらにもう１つの実施形態では、本発明のアグリカナーゼが由来し得る完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、天然に生じる完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質である。天然に生じる完全長タンパク質は、選択的ＲＮＡスプライシングによって生成されるＡＤＡＭＴＳアイソフォームを含む。完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、シグナルペプチド又はプロドメインを含むプロタンパク質であり得る。完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質はまた、シグナルペプチド及びプロドメインを持たない成熟タンパク質であり得る。
【００２９】
もう１つの実施形態では、本発明のアグリカナーゼが由来し得る完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、天然に生じる完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質の変異体である。変異体のアミノ酸配列は、天然に生じるタンパク質のものと実質的に同一である。一例では、変異体のアミノ酸配列は、天然に生じるタンパク質と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上の全体的配列同一性又は類似性を有する。配列同一性又は類似性は、当技術分野で公知の様々な方法を用いて判定することができる。例えば配列同一性又は類似性は、標準整列アルゴリズム、例えばAltschul, et al., J. MOL. BIOL., 215:403-410 (1990)に述べられているＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Needleman, et al., J. MoL. BIOL., 48: 444-453 (1970)のアルゴリズム、Meyers, et al., COMPUT. APPL. BIOSCI., 4:11-17(1988) のアルゴリズム、及びドットマトリックス解析を用いて判定できる。適切な配列アラインメントプログラムは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（the National Center for Biotechnology Information）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）によって提供されるＢＬＡＳＴプログラム及びＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供されるＭｅｇＡｌｉｇｎを含むが、これらに限定されない。一例では、配列同一性又は類似性は、ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）プログラムＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム）を用いて決定される。プログラムによって割り当てられたデフォルト値を使用する（例えば配列の１つにおけるギャップ開始についてのペナルティーは１１であり、ギャップ伸長については８である）。類似アミノ酸は、ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスを用いて定義できる。
【００３０】
一例では、天然に生じるＡＤＡＭＴＳタンパク質及びその変異体は、１又はそれ以上の領域において実質的に同一であるが、他の領域では異なる。もう１つの例では、変異体は天然に生じるタンパク質の全体的ドメイン構造を保持する。さらにもう１つの例では、変異体は、天然に生じる配列内に少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を行うことによって作製される。置換は、保存的、非保存的又はその両方であり得る。本発明のアグリカナーゼは、シグナルペプチド又はプロドメインを含むプロタンパク質であり得る。本発明のアグリカナーゼはまた、シグナルペプチド及びプロドメインを持たない成熟タンパク質であり得る。
【００３１】
本発明のアグリカナーゼはまた、中央トロンボスポンジンＩ型反復配列の後の最初の連続フェニルアラニン残基に対してＮ末端側に位置する欠失を含み得る。例えばメタロプロテアーゼ触媒ドメイン、ディスインテグリン様ドメイン又は中央トロンボスポンジンＩ型反復配列内のある種の残基は、もとのタンパク質のアグリカナーゼ活性を排除せずに又は有意に変化させずに欠失させることができる。欠失残基は、アグリカン結合又はタンパク質分解作用に関与してもよく又は関与しなくてもよい。
【００３２】
本発明はまた、上述したアグリカナーゼの変異体を考慮する。これらの変異体は、以下で述べるアッセイを用いて容易に測定できるアグリカナーゼ活性を有する。タンパク質配列の変異体は、例えば対立遺伝子変異又は多型によって天然に生じるか、又は意図的に工作することができる。数多くの保存的アミノ酸置換が、タンパク質の構造又は生物活性を有意に変化させることなくタンパク質配列に導入できる。保存的アミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性又は両親媒性における類似性に基づいて実施できる。例えば保存的アミノ酸置換は、塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えばリシン（Ｌｙｓ又はＫ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）；酸性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）；無電荷極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）及びチロシン（Ｔｙｒ又はＹ）；及び非極性側差を有するアミノ酸、例えばアラニン（Ａｌａ又はＡ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）及びシステイン（Ｃｙｓ又はＣ）の間で実施し得る。他の例示的アミノ酸置換を表１に示す。
【表１】
2007535920.tif 000003
【００３３】
非天然に生じるアミノ酸残基を保存的置換のために使用することができる。これらのアミノ酸残基は、典型的には生物系における合成によってではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる。
【００３４】
加えて、アグリカナーゼ変異体は、分子の安定性を高めるためのアミノ酸置換を含み得る。例えばアグリカナーゼ分子の触媒ドメインの４１１位におけるＥからＱへの突然変異は、アグリカナーゼの安定性を高め、半減期を上昇させ得る。アグリカナーゼの他の領域内のアミノ酸突然変異も分子の安定性を高めるために使用できる。
【００３５】
他の望ましいアミノ酸置換（保存的又は非保存的）もアグリカナーゼ分子に導入し得る。例えばアグリカナーゼの生物活性にとって重要なアミノ酸残基を特定することができる。アグリカナーゼ活性を高める又は低下させることができる置換を、その後、選択することができる。
【００３６】
さらに、アグリカナーゼ変異体はグリコシル化部位の修飾を含み得る。これらの修飾は、Ｏ結合又はＮ結合グリコシル化部位を含み得る。例えばアスパラギン結合グリコシル化認識部位のアミノ酸残基を置換又は欠失させて、部分的グリコシル化又はグリコシル化の完全な排除を生じさせることができる。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は、典型的には適切な細胞グリコシル化酵素によって認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−トレオニン又はアスパラギン−Ｘ−セリンのいずれかであり得、Ｘは通常何らかのアミノ酸である。グリコシル化認識部位の第一又は第酸アミノ酸位置の一方又は両方における様々なアミノ酸置換又は欠失（又は第二位置におけるアミノ酸欠失）は、修飾トリペプチド配列における非グリコシル化をもたらし得る。加えて、アグリカナーゼ関連タンパク質の細菌発現も、グリコシル化部位を修飾しないまま残す場合でも、非グリコシル化タンパク質の生産を生じさせる。
【００３７】
アグリカナーゼ変異体はまた、もとのポリペプチドに他の修飾を組み込むことによっても作製できる。これらの修飾は、天然に生じる過程、例えば翻訳後修飾によって、又は人工的又は合成工程によって導入することができる。適切な修飾は、骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシ末端を含む、ポリペプチド内のいずれの場所でも起こり得る。同じ種類の修飾が、変異体内のいくつかの部位において同じか又は異なる度合で存在し得る。変異体はまた、多くの異なる種類の修飾を含み得る。本発明に適する例示的修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのトランスファー−ＲＮＡによって媒介されるタンパク質へのアミノ酸の付加、ユビキチン化、又はそれらの何らかの組合せを含むが、これらに限定されない。ポリペプチド変異体は、例えばユビキチン化の結果として、分枝していてもよく、又は分枝を伴って又は伴わずに、環状でもよい。
【００３８】
さらにもう１つの実施形態では、本発明のアグリカナーゼは、本発明に従って欠失させ得るアミノ酸残基を修飾することによって完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質から入手し得る。例示的修飾は、置換及び挿入を含むが、これらに限定されない。一例では、修飾は、その付随ドメイン又はフラグメントが完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質から欠失したとみなされるように、付随ドメイン又はフラグメントを実質的に形質転換する。もう１つの例では、形質転換ドメイン又はフラグメントは、もとのドメイン又はフラグメントと５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又は５％未満の配列同一性又は類似性を有する。さらなる例では、修飾は、中央トロンボスポンジンＩ型反復配列の後の最初の保存されたフェニルアラニン残基の後に少なくとも１つの配列の挿入を含む。挿入配列に対してＮ末端側に位置するドメインはアグリカナーゼ活性を保持し、それ故分離可能なアグリカナーゼ単位を構成する。
【００３９】
多くの実施形態では、本発明のアグリカナーゼは単離又は精製された形態である。一例では、本発明のアグリカナーゼ製剤は実質的に他のタンパク質を含まない。例えばアグリカナーゼ製剤は、重量比で８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％の他のタンパク質を含み得る。もう１つの例では、アグリカナーゼ製剤は、わずかな量でなければアグリカナーゼの使用目的を妨害する、わずかな量の夾雑物を含む。
【００４０】
本発明のアグリカナーゼはタンパク質分解活性を有し、好ましくはアグリカンのＩＧＤ内のＧｌｕ373−Ａｌａ374結合を切断する。一例では、本発明のアグリカナーゼは、アグリカナーゼが由来し得る完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質のアグリカナーゼ活性の実質的な部分を保持する。例えばアグリカナーゼは、完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質のアグリカナーゼ活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％を保持し得る。もう１つの例では、本発明のアグリカナーゼは、完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質よりも高いアグリカナーゼ活性を有する。さらにもう１つの実施形態では、完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質は検出可能なアグリカナーゼ活性を有さず、完全長タンパク質からの数多くのアミノ酸残基の欠失が修飾タンパク質にアグリカナーゼ活性を付与する。
【００４１】
本発明はまた、新規トランケート形態の生物活性ＡＤＡＭＴＳタンパク質、特にアグリカナーゼを有するものをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４２】
本発明の１つの態様では、ポリヌクレオチドはトランケート型ＡＤＡＭＴＳ−７をコードする。好ましくは、ポリヌクレオチドは、システインリッチ、スペーサー及び５つのＣ末端ＴＳＲドメインが欠失しているトランケート型ＡＤＡＭＴＳ−７分子をコードする。特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−７をコードするポリヌクレオチドは、プロドメインをコードする領域を欠き、配列番号２１に示すように、核酸６９９−５０５８を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。もう１つの実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−７をコードするポリヌクレオチドは、保存されたＰｈｅの後のＣ末端をコードする領域を欠き、配列番号２２に示すように、核酸１−１７９７を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。さらなる実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−７をコードするポリヌクレオチドは、プロドメイン及び保存されたＰｈｅの後のＣ末端の両方を欠き、配列番号２３に示すように、核酸６９９−１７９７を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。
【００４３】
本発明のもう１つの態様では、ポリヌクレオチドはトランケート型ＡＤＡＭＴＳ−９をコードする。好ましくは、ポリヌクレオチドは、システインリッチ、スペーサー及び２つのＣ末端ＴＳＲドメインが欠失しているトランケート型ＡＤＡＭＴＳ−９分子をコードする。特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−９をコードするポリヌクレオチドは、プロドメインを欠き、配列番号２４に示すように、ヌクレオチド８６４−３２１６を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。もう１つの実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−９をコードするポリヌクレオチドは、保存されたＰｈｅの後のＣ末端をコードする領域を欠き、配列番号２５に示すように、核酸１−１９４７を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。さらなる実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−９をコードするポリヌクレオチドは、プロドメイン及び保存されたＰｈｅの後のＣ末端の両方を欠き、配列番号２６に示すように、核酸８６４−１９４７を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。
【００４４】
本発明のさらなる態様では、ポリヌクレオチドはトランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１０をコードする。好ましくは、ポリヌクレオチドは、システインリッチ、スペーサー及び５つのＣ末端ＴＳＲドメインが欠失しているトランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１０分子をコードする。特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１０をコードするポリヌクレオチドは、プロドメインを欠き、配列番号２７に示すように、核酸７０２−３３０９を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。もう１つの実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１０をコードするポリヌクレオチドは、保存されたＰｈｅの後のＣ末端をコードする領域を欠き、配列番号２８に示すように、ヌクレオチド１−１８２４を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。さらなる実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１０をコードするポリヌクレオチドは、プロドメイン及び保存されたＰｈｅの後のＣ末端の両方をコードする領域を欠き、配列番号２９に示すように、ポリヌクレオチド７０２−１８２４を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。
【００４５】
本発明のもう１つの態様では、ポリヌクレオチドはトランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１６をコードする。好ましくは、ポリヌクレオチドは、システインリッチ、スペーサー及び５つのＣ末端ＴＳＲドメインが欠失しているトランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１６分子をコードする。特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１６をコードするポリヌクレオチドは、プロドメインを欠き、配列番号３０に示すように、核酸８３７−３２１６を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。もう１つの実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１６をコードするポリヌクレオチドは、保存されたＰｈｅの後のＣ末端をコードする領域を欠き、配列番号３１に示すように、ヌクレオチド１−１９４１を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。さらなる実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１６をコードするポリヌクレオチドは、プロドメイン及び保存されたＰｈｅの後のＣ末端の両方をコードする領域欠き、配列番号３２に示すように、ポリヌクレオチド８３７−１９４１を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。
【００４６】
本発明のもう１つの態様では、ポリヌクレオチドはトランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１８をコードする。好ましくは、ポリヌクレオチドは、システインリッチ、スペーサー及び５つのＣ末端ＴＳＲドメインが欠失しているトランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１８分子をコードする。特定実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１８をコードするポリヌクレオチドは、プロドメインを欠き、配列番号３３に示すように、核酸８５５−３６６３を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。もう１つの実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１８をコードするポリヌクレオチドは、保存されたＰｈｅの後のＣ末端をコードする領域を欠き、配列番号３４に示すように、ヌクレオチド１−１９５０を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。さらなる実施形態では、トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１８をコードするポリヌクレオチドは、プロドメイン及び保存されたＰｈｅの後のＣ末端の両方をコードする領域欠き、配列番号３５に示すように、ポリヌクレオチド８５５−１９５０を含む、基本的にそれらから成る又はそれらから成る。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドはまた、上記に示したものとコドン配列において異なるが、配列番号２−４、６−８、１０−１２、１４−１６及び１８−２０に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するもの（例えば周知の遺伝暗号の縮重のために）を含む。
【００４８】
上述したトランケート型生物活性ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドに加えて、本発明のポリヌクレオチドはまた、ストリンジェント（好ましくは高ストリンジェント）条件下で配列番号２１−３５に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズするものを含む。そのようなポリヌクレオチドは、配列番号２１−３５に示すポリヌクレオチドに類似するヌクレオチド配列を有するが、そこに挿入、欠失又は置換が自然に導入された（すなわち対立遺伝子変異体）又は意図的に工作されたものを含む。好ましくは、本発明の対立遺伝子変異体は、配列番号２１−３５に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも９５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも９９％の同一性）を有する。
【００４９】
ストリンジェント条件下で配列番号２１−３５に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドはまた、開示するポリヌクレオチドに相同な配列を有するものを含む。これらのホモログは、開示するポリヌクレオチド（及び翻訳されたポリペプチド）とは異なる種から単離される、又は同じ種内であるが、開示するポリヌクレオチド（及び翻訳されたポリペプチド）に有意の配列類似性を有する、ポリヌクレオチド（及び翻訳されたポリペプチド）である。好ましくは、ポリヌクレオチドホモログは、開示するポリヌクレオチドと少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも７５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性）を有し、哺乳動物種（より好ましくは霊長動物、最も好ましくはヒト）から単離される。
【００５０】
高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は当技術分野において周知である。様々なストリンジェンシー条件の例を以下の表２に示す。高ストリンジェント条件は、少なくとも例えば条件Ａ−Ｆと同程度にストリンジェントな条件である。ストリンジェント条件は、少なくとも例えば条件Ｇ−Ｌと同程度にストリンジェントである。及び低ストリンジェント条件は、少なくとも例えば条件Ｍ−Ｒと同程度にストリンジェントである。
【表２】
2007535920.tif 000004
【００５１】
表２において：
1ハイブリッド長は、ハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリダイズ領域に関して予想されるものである。ポリヌクレオチドを未知の配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするとき、ハイブリッド長は、ハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さであると仮定される。既知の配列のポリヌクレオチドをハイブリダイズするとき、ハイブリッド長は、ポリヌクレオチドの配列を整列し、最適配列相補性の領域を特定することによって決定できる。
2ハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液において、ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、及び１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）はＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）に置き換えることができる。洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後１５分間実施する。ＴB*−ＴR*：５０塩基対未満の長さと予想されるハイブリッドについてのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔm）よりも低い５−１０℃にすべきであり、Ｔmは以下の方程式に従って決定される。１８塩基対未満の長さのハイブリッドに関しては、Ｔm（０℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８から４９の間の塩基対の長さのハイブリッドに関しては、Ｔm（０℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ10Ｎａ+）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）［式中、Ｎは、ハイブリッド中の塩基の数であり、Ｎａ+は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣについてのＮａ+＝０．１６５Ｍ）］。
【００５２】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件の付加的な例は、参照してここに組み込まれる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Chs. 9 & 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)、及びAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Sects. 2.10 & 6.3-6.4, John Wiley & Sons, Inc. (1995) の中に述べられている。
【００５３】
本発明のアグリカナーゼをコードするポリヌクレオチドは様々な方法を用いて作製することができる。例えば本発明のアグリカナーゼについてのコード配列は、完全長ＡＤＡＭＴＳのｃＤＮＡ配列から１又はそれ以上の欠失によって誘導することができる。公表されている完全長ＡＤＡＭＴＳ  ｃＤＮＡ配列については、例えばTortorella, et al., SCIENCE, 284: 1664-1666 (1999); Hurskainen, et al., supra; Clark, et al., GENOMICS, 67: 343-350 (2000) ; and Cal, et al., GENE, 283: 49-62 (2002)参照。完全長ＡＤＡＭＴＳ  ｃＤＮＡ配列からの欠失は数多くの方法を用いて作製できる。
【００５４】
１つの実施形態では、ＰＣＲを介した反応を用いて２個の選択フラグメントの間に位置する配列の欠失を作製する。選択フラグメントを最初にＰＣＲ増幅し、次にインフレームで連結して、それによってその間に位置する配列を欠失させることができる。連結産物は、宿主細胞における発現のためにベクターにサブクローニングすることができる。もう１つの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳコード配列の所望部分だけをＰＣＲ増幅することによってトランケート型ＡＤＡＭＴＳを生産することができる。さらにもう１つの実施形態では、欠失は、ＡＤＡＭＴＳコード配列内の２つの天然に生じる又は遺伝的に工作された制限エンドヌクレアーゼ認識部位に基づく。所望制限部位は、何らかの伝統的な手段、例えば位置指定突然変異誘発によってＡＤＡＭＴＳコード配列内に導入することができる。２つの制限部位での切断及びその後のインフレーム連結によって２つの制限部位の間に位置する配列を欠失させる。他の欠失方法、例えばオリゴヌクレオチド指定「ループアウト」突然変異誘発、ＰＣＲオーバーラップ伸長、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる時間制御消化、メガプライマー法、逆ＰＣＲ又は自動ＤＮＡ合成も使用できる。
【００５５】
欠失はＡＤＡＭＴＳコード配列のいかなる領域にも導入することができる。修飾ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、２又はそれ以上の欠失によって完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質と異なり得る。欠失は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の同じドメイン内で又は異なるドメインにおいて起こり得る。
【００５６】
１つの実施形態では、欠失ライブラリーを作成する。欠失ライブラリーは、Ｎ末端、Ｃ末端又は内部欠失ＡＤＡＭＴＳタンパク質についてのコード配列を含み得る。このための例示的な方法は、Pues, et al., NUCLEIC ACIDS RES., 25:1303-1305 (1997)に述べられている。市販のキット、例えばＥＺ：：ＴＮプラスミドに基づく欠失装置（TN Plasmid-Based Deletion Machine）及びｐＷＥＢ：：ＴＮＣ（商標）欠失コスミドトランスポジションキット（Deletion Cosmid Transposition Kit）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）も、ＡＤＡＭＴＳ欠失ライブラリーを作成するために使用できる。欠失は、ＤＮＡ又はタンパク質配列決定によって確認できる。生物活性アグリカナーゼを生産する欠失を選択することができる。
【００５７】
もう１つの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳフラグメントを、フラグメントのコード配列内に突然変異を無作為に導入することによって欠失させる。このための適切な方法は、飽和突然変異誘発を含むが、これに限定されない。終結コドンを導入する場合、欠失は終結コドンの後に位置する全ての残基を含む。
【００５８】
上述したように、欠失は、欠失アミノ酸残基又はフラグメントが他の残基又はフラグメントによって置換される状況を含む。そのような置換は、当技術分野で公知の様々な方法を用いてコード配列レベルで容易に達成することができる。他の適切な方法も使用できる。従って、無作為に導入された突然変異が、コードされるポリペプチドフラグメントを実質的に形質転換するとき、フラグメントの欠失が作製され得る。
【００５９】
欠失の作製は完全長ＡＤＡＭＴＳ  ｃＤＮＡ配列の使用に限定されない。欠失はまた、発現配列タグ又は他の部分的又は不完全ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡ配列を用いて作製することもできる。加えて、本発明の修飾ＡＤＡＭＴＳを生産するためにゲノム配列が使用できる。さらに、スプライス受容部位又は供与部位又はＡＤＡＭＴＳコード配列内の他の機能性イントロン配列を修飾することによって欠失を実施することができる。
【００６０】
遺伝暗号の縮重又は他の変異を含む配列も使用できる。遺伝暗号の縮重の結果として同じポリペプチドをコードする多くのポリヌクレオチド変異体が存在する。これらのポリヌクレオチド変異体の一部は、もとのポリヌクレオチドに対して最小限の配列同一性を担持する。それでもやはり、本発明は、コドン使用頻度の相違の故に異なるポリヌクレオチドの使用を考慮する。
【００６１】
他のポリペプチドをコードする核酸配列をアグリカナーゼコード配列の５’又は３’末端にインフレーム融合することができる。これらの付加的なポリペプチドは、例えばペプチドタグ、酵素、リガンド／受容体結合タンパク質、抗体、又はそれらの何らかの組合せであり得る。
【００６２】
本発明のポリヌクレオチドは、インビボでの安定性を高めるように修飾することができる。可能な修飾は、５’又は３’末端のフランキング配列の付加；骨格のホスホジエステラーゼ結合に代わるホスホロチオエート又は２−ｏ−メチルの使用；非伝統的塩基、例えばイノシン、クエオシン及びワイブトシン、並びにアセチル−、メチル−、チオ−又は他の修飾形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの包含を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は他の発現可能な核酸分子であり得る。ポリペプチドは一本鎖又は二本鎖であり得る。
【００６４】
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のアグリカナーゼをコードする配列に作動可能に連結された５’又は３’非翻訳調節配列を含む発現ベクターである。もう１つの実施形態では、本発明のアグリカナーゼは、Ｃ末端タンパク質分解切断を受けずに発現ベクターから発現される。
【００６５】
発現ベクターは一般に、１又はそれ以上の選択マーカー及び１又はそれ以上の複製起点を含むが、当業者は、ある種の系においては選択マーカーは別個のベクター上で提供され得ること及び外来性ＤＮＡの複製は宿主細胞ゲノムへの組込みによって提供され得ることを認識する。発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択又は所望発現レベルなどの因子に依存する。プロモーター、エンハンサー、選択マーカー及び他のエレメントの選択は、当技術分野における通常技術レベル内の常套的設計事項である。多くのそのようなエレメントが文献に記述されており、市販の供給業者を通して入手可能である。
【００６６】
発現ベクターは、様々なソース、例えばプラスミド、ウイルス又はそれらの何らかの組合せに由来し得る。適切なウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス又はトガウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
【００６７】
１つの実施形態では、発現ベクターは、構成的又は誘導的プロモーターを有する大腸菌ベクターである。所望目的、例えば組換えタンパク質の発現又は溶解度を上昇させること又はその精製を助けることに役立つように、付加的なペプチドをコードする配列をアグリカナーゼコード配列に融合することができる。一例では、融合ペプチドは組換えタンパク質から切断可能である。この目的に適する発現ベクターは、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）及びｐＲＩＴＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含むが、これらに限定されない。
【００６８】
大腸菌における組換えタンパク質の発現を最大化するために様々な方法が使用できる。１つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解切断する能力に欠陥を有する宿主細菌を使用することである。もう１つの戦略は、各々のアミノ酸についての個々のコドンが大腸菌によって選択的に使用されるようにコード配列を変化させることである。
【００６９】
もう１つの実施形態では、発現ベクターは酵母発現ベクターである。例示的な酵母発現ベクターは、ｐＹｅｐＳｅｃｌ、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含むが、これらに限定されない。
【００７０】
さらにもう１つの実施形態では、発現ベクターは昆虫細胞発現ベクターである。一般的に使用される昆虫細胞発現ベクターは、バキュロウイルス発現ベクター、例えばｐＡｃ及びｐＶＬシリーズを含む。
【００７１】
さらにもう１つの実施形態では、発現ベクターは哺乳動物発現ベクターである。適切な哺乳動物発現ベクターは、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ、ｐＪＬ３、ｐＪＬ４、ｐＭＴ２ＣＸＭ及びｐＥＭＣ２β１を含むが、これらに限定されない。哺乳動物細胞において使用されるとき、発現制御配列はしばしばウイルス調節エレメントによって提供される。例えばポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス又はシミアンウイルス４０に由来するプロモーターが哺乳動物発現ベクターにおいて一般的に用いられる。
【００７２】
本発明の哺乳動物発現ベクターはまた、組織特異的調節エレメントを含み得る。適切な組織特異的プロモーターは、肝特異的プロモーター、リンパ系特異的プロモーター、Ｔ細胞特異的プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、膵特異的プロモーター及び乳腺特異的プロモーターを含むが、これらに限定されない。加えて、本発明は、発生的に調節されるプロモーター、例えばα−フェトプロテインプロモーターの使用を考慮する。ＡＤＡＭＴＳの発現は数多くの組織において及び様々な発生段階で検出されている。例えばノーザンブロット分析は、ＡＤＡＭＴＳ−９は成体心臓、胎盤及び骨格筋では高発現されるが、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、小腸及び末梢血白血球では低レベルから検出不能レベルであることを示した。Somerville, et al., J. BIOL. CHEM. , 278:9503-9513 (2003)参照。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、卵巣、膵臓、肺及び腎臓においてもＡＤＡＭＴＳ−９発現を検出した。発生の間、ＡＤＡＭＴＳ−９の発現は７日及び１７日齢マウス胚において高く、１１日及び１５日齢マウス胚ではより低い。同様に、ＡＤＡＭＴＳ−７は様々な組織において、例えば脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、骨格筋及び胎盤において検出された。Hurskainen, et al., supra参照。組織特異的又は発生的に調節されるプロモーターの使用は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質のより特異的な機能分析を可能にする。
【００７３】
さらにもう１つの実施形態では、発現ベクターは、アンチセンス方向のＡＤＡＭＴＳコード配列を含む。様々な細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の持続的発現を指令するために、アンチセンス方向のコード配列に作動可能に連結された調節配列を選択することができる。適切な調節配列は、ウイルスプロモーター又はエンハンサーを含む。調節配列はまた、アンチセンスＲＮＡの構成的又は組織特異的発現を指令するように選択することができる。
【００７４】
さらに、本発明は、多数の細胞型においてアグリカナーゼを発現するための調節可能発現系の使用を考慮する。この目的に適する系は、Ｔｅｔ−ｏｎ／ｏｆｆ系、エクジソン系、プロゲステロン系及びラパマイシン系を含むが、これらに限定されない。Ｔｅｔ−ｏｎ／ｏｆｆ系は、大腸菌Ｔｎ１０トランスポゾンのテトラサイクリン耐性オペロンに由来する２つの調節エレメントに基づく。前記系は２個の成分：調節因子プラスミド及びレポータープラスミド、を含む。調節因子プラスミドは、単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６活性化ドメインに融合した突然変異Ｔｅｔリプレッサー（ｒｔｅｔＲ）を含むハイブリッドタンパク質をコードする。レポータープラスミドは、レポーター遺伝子の発現を制御するｔｅｔ応答エレメント（ＴＲＥ）を含む。ｒｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合タンパク質はＴＲＥに結合し、それによってテトラサイクリンの存在下でレポーター遺伝子の転写を活性化する。Ｔｅｔ−ｏｎ／ｏｆｆ系は、様々なウイルスベクター、例えばレトロウイルス、アデノウイルス又はＡＡＶベクターに組み込むことができる。
【００７５】
エクジソン系は、ショウジョウバエ（Drosophila）の脱皮誘導系に基づく。前記系は、ヘテロ二量体核内受容体による遺伝子発現を活性化する、ショウジョウバエステロイドホルモンであるエクジソンの類似体、ムリステロンＡを使用する。ある実施形態では、誘導される発現レベルは、トランスフェクトされる細胞の生理学には有意の影響を及ぼさずに、基線レベルの少なくとも２００倍であり得る。
【００７６】
プロゲステロン系は、プロゲステロン受容体の作用に基づく。プロゲステロン受容体は核内／ステロイド受容体スーパーファミリーの成員である。そのホルモンリガンド（プロゲステロンなど）に結合したとき、受容体はプロゲステロン応答エレメントに結合し、それによって遺伝子転写を活性化する。プロゲステロン受容体の作用は、プロゲステロンアンタゴニストであるミフェプリストン（ＲＵ４８６）に結合することによってブロックされ得る。プロゲステロン受容体のＲＵ４８６結合ドメインを酵母ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン及びＨＳＶ  ＶＰ１６転写活性化ドメインに融合することによってキメラ転写因子を作製することができる。キメラ因子は、ＲＵ４８６の不在下では不活性である。ＲＵ４８６の添加は、しかし、立体配座変化を誘導し、次にキメラ因子を活性化して、ＧＡＬ４結合部位を含むプロモーターからの転写を可能にする。
【００７７】
ＣＩＤ系（「二量体化の化学的誘導物質（chemical inducers of dimerization）」としても知られるラパマイシン系は、ラパマイシンによって引き起こされる二量体化作用を利用する。ラパマイシンは、２つの細胞タンパク質、ＦＫＢＰ１２及びＦＲＡＰのヘテロ二量体化を誘導する。ラパマイシン系は２つのキメラタンパク質を用いる。第一キメラタンパク質は、ＤＮＡ応答エレメントに結合するＤＮＡ結合ドメインに融合するＦＫＢＰ１２を含む。第二キメラタンパク質は、転写活性化ドメインに融合するＦＲＡＰを含む。ラパマイシンの添加は２個のキメラタンパク質の二量体化を引き起こし、それによりＤＮＡ応答エレメントによって制御される遺伝子転写を活性化する。
【００７８】
本発明はまた、トランケート型生物活性ＡＤＡＭＴＳタンパク質、好ましくはアグリカナーゼ活性を有するものを生産するための方法を提供する。例えば発現調節配列の制御下で本発明のポリヌクレオチド（例えば配列番号２１−３５）によって形質転換又はトランスフェクトした適切な宿主細胞系を、トランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば配列番号２−４、６−８、１０−１２、１４−１６及び１８−２０）が生産される条件下で培養することができる。タンパク質を細胞又は培地から回収し、タンパク質が他のタンパク質を実質的に含まないように精製する。組換えタンパク質を発現し、精製するための一般的方法は当技術分野において周知である。
【００７９】
多くの細胞系が、トランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質のポリペプチドの組換え発現のための適切な宿主細胞として働き得る。哺乳動物宿主細胞系は、例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞、Ａ４３１細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、並びに一次組織及び一次外植片のインビトロ培養に由来する細胞株を含む。
【００８０】
トランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質はまた、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞及びショウジョウバエＳ２細胞においても組換え生産し得る。Ｓｆ９及びＳ２発現のための材料及び方法はキット形態で市販されている（例えばＭａｘＢａｃ（登録商標）キット及びＤＥＳ（登録商標）キット、それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。
【００８１】
あるいは、酵母などの下等真核生物又は原核生物においてトランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質を組換え生産することも可能である。潜在的に適する酵母株は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株及びカンジダ菌株を含む。潜在的に適する細菌株は、大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis）及びネズミチフス菌（Salmonella  typhimurium）を含む。トランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質を酵母又は細菌において作製する場合、機能性を獲得するために、例えば適切な部位のリン酸化又はグリコシル化によって、それらを修飾する必要があり得る。そのような共有結合は、周知の化学的又は酵素的方法を用いて達成し得る。
【００８２】
付加的なポリペプチドを本発明のアグリカナーゼのＮ又はＣ末端に融合することができる。融合タンパク質を作製するために様々な方法が使用可能である。融合ポリペプチドは、タンパク質精製、検出、固定化、折りたたみ、ターゲティング又は他の所望目的を容易にするために役立ち得る。融合ポリペプチドはまた、組換えタンパク質の発現、溶解度又は安定性を高めるのにも役立ち得る。１つの実施形態では、融合ポリペプチドはアグリカナーゼのタンパク質分解作用に有意の影響を及ぼさない。
【００８３】
融合タンパク質を作製するのに適する例示的ポリペプチドは、ペプチドタグ、酵素、抗体、受容体、リガンド／受容体結合タンパク質、又はそれらの何らかの組合せを含むが、これらに限定されない。ここで使用するとき、抗体は、例えばポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多特異性、非特異性、ヒト化、ヒト、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、突然変異、移植、又はインビトロ生成抗体であり得る。抗体はまた、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、又は抗原結合機能を保持する他の何らかの抗体フラグメントであり得る。
【００８４】
本発明に適するペプチドタグは、ポリヒスチジン又はポリヒスチジン−グリシンタグ、ＦＬＡＧエピトープタグ、ＫＴ３エピトープペプチド、フルーＨＡタグポリペプチド、ｃ−ｍｙｃタグ、単純ヘルペス糖タンパク質Ｄ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、ストレプトアビジンタグ、チューブリンエピトープペプチド、Ｔ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ、及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを含むが、これらに限定されない。これらのペプチドタグに対する抗体は容易に入手し得る。代表的抗体は、フルーＨＡタグポリペプチドに対する抗体１２ＣＡ５、及びｃ−ｍｙｃタグに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体を含む。
【００８５】
１つの実施形態では、融合ポリペプチドは、天然に生じるＡＤＡＭＴＳ配列と実質的でない配列同一性又は類似性を有する。例えば融合ポリペプチドは、天然に生じる完全長ＡＤＡＭＴＳタンパク質と８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又は５％未満の配列同一性又は類似性を有し得る。配列同一性又は類似性は、例えばＧＣＧ  ＢＥＳＴＦＩＴ（スミス−ウォーターマンアルゴリズム）を用いることによって決定できる。
【００８６】
１つの実施形態では、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）（ＩＢＡ）を本発明のアグリカナーゼのＣ末端に共有結合する。Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇは、例えばヌクレオチドＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＣＧＣＡＧＴＴＣＧＡＡＡＡＡＴＡＡ（配列番号３７）によってコードされるアミノ酸配列「ＷＳＨＰＱＦＥＫ」（配列番号３６のアミノ酸残基４−１１）を有する。ヌクレオチドＧＧＡＡＧＣＧＣＴＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＣＧＣＡＧＴＴＣＧＡＡＡＡＡＴＡＡ（配列番号３９）によってコードされるＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号３８）を与えるためのタグのアクセシビリティを高めるために、ペプチドリンカー（例えば「ＧＳＡ」）をタグとアグリカナーゼの間に付加することができる。
【００８７】
配列番号４０−４４は、Ｃ末端でＳｔｒｅｐ−ｔａｇに共有結合した、それぞれ修飾ＡＤＡＭＴＳ−７、−９、−１０、−１６及び−１８を含む例示的融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００８８】
タンパク質分解切断部位は、融合ポリペプチドとアグリカナーゼの間の接合部に導入することができる。切断部位は、組換えタンパク質の精製後に融合ポリペプチドからのアグリカナーゼの分離を可能にする。このための適切な切断酵素は、第Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼを含むが、これらに限定されない。
【００８９】
もう１つの実施形態では、２又はそれ以上のコピーの本発明のアグリカナーゼを同じタンパク質内に含める。そのような融合タンパク質は高いアグリカナーゼ活性を有し得る。
【００９０】
トランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質はまた、小さなエピトープで標識し、その後そのエピトープに対する特異性抗体を用いて特定又は精製することができる。好ましいエピトープは、イーストマン・コダック社（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）から市販されているＦＬＡＧ（商標）エピトープである。加えて、トランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーを用いた精製のために６ｘＨｉｓタグタンパク質として発現することができる。Ｈｉｓタグタンパク質発現のための材料及び方法はキット形態で市販されている（例えばＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）システム、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）。
【００９１】
トランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質はまた、公知の従来の化学合成によっても生産し得る。ポリペプチドを化学合成するための方法は当業者に周知である。そのような化学合成ポリペプチドは、天然の精製ポリペプチドと共通の生物学的性質を有すると考えられ、それ故天然ポリペプチドの生物活性又は免疫学的代用物として使用し得る。
【００９２】
ＡＤＡＭＴＳタンパク質（特にアグリカナーゼ）に対する抗体分子は、例えばＣｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ；Ｔｒｉｐｌｅ  Ｐｏｉｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｆｏｒｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＯＲ；及びＡｃｒｉｓ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｄｄｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販されている。そのような抗体は、それらが前記タンパク質の成熟Ｎ末端（非トランケート型タンパク質）に対して作製されたことを条件として、本発明のトランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質を認識するはずである。あるいは、本発明のトランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質を特異的に認識する抗体は、当業者に周知の方法によって生産し得る。
【００９３】
例えばポリクローナル血清及び抗体は、適切な被験者をトランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質で免疫することによって生産できる。免疫した被験者の抗体力価は、標準手法によって、例えば固定化マーカータンパク質を用いる酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）で経時的に観測し得る。所望する場合は、抗体分子を被験者又は培地から単離し、ＩｇＧ分画を得るために周知の手法によって、例えばプロテインＡ又はＧクロマトグラフィーによってさらに精製し得る。
【００９４】
トランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質を認識するモノクローナル抗体は、公知の方法に従ってハイブリドーマを生成することによって生産できる。このようにして形成されたハイブリドーマを、次に、前記タンパク質を特異的に認識する抗体を生産する１又はそれ以上のハイブリドーマを特定するために、標準方法、例えばＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングする。トランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質全体を免疫原として使用するか、あるいはこのタンパク質の抗原性ペプチドフラグメントを使用し得る。加えて、本発明のトランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質に対する組換え単一特異性抗体は、当業者に周知のキット及び方法を用いて生産することができる。
【００９５】
ひとたびタンパク質が精製されれば、標準手法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は免疫ブロット法を用いて分析し、確認することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、精製タンパク質を視覚化するためにクマシーブルー、銀又は他の適切な試薬で染色することができる。精製タンパク質は、タンパク質配列決定又は質量分析によってさらに分析することができる。一例では、対象タンパク質バンドを手操作によってＳＤＳ−ＰＡＧＥから切り出し、次に還元して、アルキル化し、トリプシン又はエンドペプチドプチダーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で消化する。消化は、自動ゲル内消化ロボットを用いてインサイチューで実施することができる。消化後、ペプチド抽出物を濃縮し、マイクロエレクトロスプレー逆相ＨＰＬＣによって分離することができる。ペプチド分析は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｑｕｅｓｔ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で実施できる。ＭＳ／ＭＳデータの自動解析は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓデータ解析パッケージ（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に組み込まれたＳＥＱＵＥＳＴコンピュータアルゴリズムを用いて実施することができる。
【００９６】
精製アグリカナーゼタンパク質はまた、ウエスタンブロットなどの免疫ブロット法を用いて分析又は確認することができる。１つの実施形態では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のタンパク質試料をニトロセルロース膜に移し、その後抗体によって検出する。一例では、修飾ＡＤＡＭＴＳに対するウサギ抗体、次にヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ及び化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を用いて精製アグリカナーゼを検出する。
【００９７】
さらにもう１つの実施形態では、無細胞転写及び翻訳系を用いてアグリカナーゼを発現する。適切な無細胞発現系は、コムギ胚芽抽出物、網状赤血球溶解産物又はＨｅＬａ核抽出物を含むが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明のトランケート型ＡＤＡＭＴＳは、好ましくはアグリカナーゼ活性を有する。数多くのアッセイが本発明のトランケート型ＡＤＡＭＴＳの生物活性の検出のために使用できる。例示的なアッセイは、蛍光ペプチドアッセイ、ネオエピトープウエスタンブロット法、アグリカンＥＬＩＳＡ及び活性測定法を含むが、これらに限定されない。最初の２つのアッセイは、アグリカンのＩＧＤ内のＧｌｕ373−Ａｌａ374結合の切断能力を検出するのに適する。
【００９９】
蛍光ペプチドアッセイでは、アグリカナーゼを、アグリカナーゼ切断部位のアミノ酸配列を含む合成ペプチドと共にインキュベートする。合成ペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかが蛍光物質で標識され、他方の末端は消光物質を含む。ペプチドの切断は蛍光物質と消光物質を分離し、それによって蛍光を惹起する。相対蛍光を用いて発現されるアグリカナーゼの相対活性を測定することができる。
【０１００】
ネオエピトープウエスタンブロット法では、アグリカナーゼを無傷アグリカンと共にインキュベートする。次に切断産物をいくつかの生化学的処理に供した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離する。生化学的処理は、例えば透析、コンドロイチナーゼ処理、凍結乾燥及び再構成を含む。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のタンパク質試料を膜（例えばニトロセルロース紙）に移し、ネオエピトープ特異的抗体で染色する。ネオエピトープ抗体は、アグリカンのタンパク質分解切断によって露出された新しいＮ又はＣ末端アミノ酸を特異的に認識する。前記抗体はもとの分子又は非切断分子上のそのようなエピトープには結合しない。適切なネオエピトープ特異的抗体は、ＭＡｂ  ＢＣ−１３、ＭＡｂ  ＢＣ−３及びＩ１９Ｃ抗体を含むが、これらに限定されない。例えばCaterson, et al., supra; 及びHashimoto, et al., FEBS  LETTERS, 494: 192-195 (2001)参照。切断されたアグリカンフラグメントは、アルカリホスファターゼ複合二次抗体及びニトロブルーテトラゾリウム色素原及びブロモクロロインドリル基リン酸質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を用いて視覚化することができる。バンドの相対密度は相対アグリカナーゼ活性の指標となる。
【０１０１】
アグリカンＥＬＩＳＡは、アグリカン分子における切断を検出するために使用できる。このアッセイでは、修飾タンパク質を、あらかじめプラスチックウエルに付着させておいた無傷アグリカンと共にインキュベートする。ウエルを洗浄し、次にアグリカンを検出する抗体と共にインキュベートする。ウエルを二次抗体で展開する。最初の量のアグリカンがウエル内に残存する場合、抗体染色は濃密である。アグリカンがアグリカナーゼによって消化される場合は、付着アグリカン分子がウエルから離れ、それによって抗体によるその後の染色は低下する。このアッセイは、修飾タンパク質がアグリカンを切断できるかどうかを検出することができる。修飾タンパク質の相対切断活性もこのアッセイを用いて測定できる。
【０１０２】
活性測定法も、アグリカナーゼの切断活性を評価するために使用できる。このアッセイでは、マイクロタイタープレートを最初にヒアルロン酸（ＩＣＮ）で、次にコンドロイチナーゼ処理したウシアグリカンで被覆する。コンドロイチナーゼは 生化学工業株式会社（Seikagaku Chemicals）から入手できる。発現された組換えアグリカナーゼを含む培地をアグリカン被覆プレートに添加する。ＩＧＤ内のＧｌｕ373−Ａｌａ374で切断されたアグリカンを洗い流す。残存する切断されていないアグリカンは、３Ｂ３抗体（ＩＣＮ）、次いで抗ＩｇＭ−ＨＲＰ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で検出することができる。例えば３，３’’，５，５’’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，ＢｉｏＦｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して最終的な発色が得られる。
【０１０３】
多くの実施形態において、本発明のアグリカナーゼは改善された安定性と高い発現を有する。これは大量のアグリカナーゼの単離を可能にし、それによってアグリカナーゼ阻害剤の開発を促進する。
【０１０４】
阻害剤は何らかの適切なスクリーニングアッセイを用いて開発することができる。典型的には、スクリーニング方法は、アグリカナーゼを対象化合物の存在下又は不在下でアグリカナーゼ基質と接触させることを含む。次に対象化合物の阻害作用を判定するためにアグリカナーゼの切断活性を測定する。例えばHashimoto, et al., supra 参照。１つの実施形態では、高流量工程又は化合物ライブラリーを用いて阻害剤をスクリーニングする。発現及び精製後、トランケート型生物活性ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ活性を調節することができる薬理物質又は先導化合物を特定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用し得る。例えば精製トランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質を含む試料を複数の試験化合物（例えば低分子量有機分子、生物学的物質）の１つと接触させ、試験化合物のいずれかが、１）ＡＤＡＭＴＳ活性の阻害因子を指示する、実質的に低いレベルのＡＤＡＭＴＳ活性；又は２）ＡＤＡＭＴＳ活性の活性化因子を指示する、実質的に高いレベルのＡＤＡＭＴＳ活性、を与えるかどうかを判定するために、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の活性（例えばヒアレクタナーゼ活性、アグリカナーゼ活性、α2−マクログロブリン切断活性）を、接触していないタンパク質又は異なる試験化合物と接触させたタンパク質の活性と比較することができる。
【０１０５】
好ましくは、精製トランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質はヒアレクタナーゼ活性、より好ましくはアグリカン切断活性を有し、ヒアレクタナーゼ及び／又はアグリカナーゼ活性の阻害剤を特定するための上記スクリーニングアッセイにおいて使用される。いくつかの選択的アグリカナーゼ阻害剤が同様のスクリーニングアッセイを用いて特定されている（例えばCherney et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12: 101 (2002) ; Yao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 13: 1297 (2003) ; Yao et al., J. Med. Chem. 44: 3347 (2001)参照）。アグリカナーゼ活性のためのアッセイは当技術分野において周知であり、アグリカン−ポリアクリルアミド粒子アッセイ（Vankemmelbeke et al., Eur. J. Biochem. 270: 2394 (2003) ）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによるアグリカンコアタンパク質フラグメントの検出(Hashimoto et al., FEBS Lett. 494: 192(2001))を含む。
【０１０６】
好ましくは、上述したアグリカナーゼ活性測定法は免疫測定法である。そのような免疫測定法は、トランケート型ＡＤＡＭＴＳタンパク質の酵素活性によって生産されるアグリカンネオエピトープを特異的に認識する（好ましくはアグリカン内のＧｌｕ373−Ａｌａ374位置で）抗体を利用する。そのような抗体、例えばＢＣ−３（Ｎ末端ネオエピトープ374ＡＲＧＳＶを認識する）及びＢＣ−１３（Ｃ末端ネオエピトープＩＴＥＧＥ373を認識する）は、当技術分野で周知であるか (Hughes et al., Biochem. J. 305: 799 (1995)) 又は当業者に周知の方法によって生産することができ、ウエスタンブロット法及びＥＬＩＳＡによってアグリカン切断産物を検出するために使用できる（例えばMiller et al., Anal. Biochem. 314: 260 (2003) ; Hughes et al., J. Biol. Chem. 272:20269 (1997)参照）。
【０１０７】
上述したスクリーニングアッセイによって特定される化合物（特にアグリカナーゼ活性を阻害するもの）は、当技術分野で公知の方法に従って製剤することができ、関節炎及び他の炎症性疾患の治療のために医薬組成物の形態でインビボ投与できる。前記医薬組成物は、関節内、経口、鼻、直腸、局所、舌下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、腹腔内及び経皮経路を含むが、これらに限定されない、当技術分野で周知の多くの経路によって投与し得る。有効成分に加えて、医薬組成物は、例えば賦形剤、剤皮及び当技術分野で周知の助剤を含む、製薬上許容される担体を含有し得る。
【０１０８】
阻害剤はまた、三次元構造解析又はコンピュータ支援薬物設計を用いて特定又は設計することができる。後者の方法は、アグリカナーゼ又はアグリカンの三次元構造に基づく阻害剤の結合部位の判定及び次に、アグリカナーゼ又はアグリカンの結合部位と反応性の分子の開発を必要とし得る。その後候補分子を阻害活性に関して検定する。プロテアーゼ阻害剤の開発に適する他の従来の方法も、アグリカナーゼ阻害剤を特定するために使用できる。
【０１０９】
アグリカナーゼ阻害剤は、例えばタンパク質、ペプチド、抗体、低分子量分子又は化合物であり得る。阻害剤は、アグリカナーゼのタンパク質分解活性の低下、減少又は排除を生じさせ得る。アグリカナーゼ活性の低下、減少又は排除は、上述したアッセイによって測定することができる。一例では、本発明の阻害剤は、アグリカナーゼ活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上低下させることができる。もう１つの例では、アグリカナーゼ阻害剤は、アグリカナーゼの酵素活性を特異的に低減又は排除するが、他のプロテアーゼ、例えばＭＭＰの活性は低減又は排除しない。さらにもう１つの実施形態では、アグリカナーゼ阻害剤は特定ＡＤＡＭＴＳタンパク質のアグリカナーゼ活性を低減又は排除するが、他のＡＤＡＭＴＳタンパク質の活性は低減又は排除しない。
【０１１０】
様々な疾患又は状態がアグリカンの分解によって特徴付けられる。本発明によって特定されるアグリカナーゼ阻害剤はこれらの疾患又は状態の治療において使用できる。アグリカナーゼ阻害剤を使用することによって治療できると考えられる疾患は、変形性関節症、癌、炎症性関節疾患、関節リウマチ、敗血症性関節炎、歯周病、角膜潰瘍、タンパク尿、じゅく状硬化斑の破裂からの冠状動脈血栓症、動脈瘤性大動脈疾患、炎症性腸疾患、クローン病、気腫、急性呼吸促進症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、脳及び造血器悪性疾患、骨粗しょう症、パーキンソン病、片頭痛、うつ病、末梢神経障害、ハンチントン病、多発性硬化症、眼血管新生、黄斑変性、大動脈瘤性心筋梗塞、自己免疫疾患、外傷性関節損傷後の変性性軟骨喪失、頭部外傷、栄養障害型表皮水疱症、脊髄損傷、急性及び慢性神経変性疾患、骨減少症、顎関節疾患、神経系の脱髄疾患、臓器移植毒性及び拒絶反応、悪液質、アレルギー、組織潰瘍、再狭窄、及び細胞外マトリックスの異常分解、アグリカナーゼ活性の変化又はアグリカナーゼレベルの変化によって特徴付けられる他の疾患を含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
ここで使用するとき、治療は、治療的処置又は予防的処置を包含する。治療を必要とするものとは、特定医学的疾患を既に有する個体並びに最終的に疾患を獲得する可能性のあるもの（すなわち予防的処置を必要とするもの）を含み得る。治療は、疾患の臨床症状を予防する又は改善するためにアグリカナーゼ活性又はアグリカナーゼのタンパク質レベルを調節し得る。阻害剤は、例えばアグリカナーゼとアグリカンの相互作用を妨げる、又はタンパク質分解活性を低減する又は排除することによって機能し得る。
【０１１２】
１つの実施形態では、本発明のアグリカナーゼ阻害剤を医薬組成物中で患者又は動物に投与する。医薬組成物は、患者又は動物を治療するのに十分な有効量の阻害剤を含む。医薬組成物はまた、製薬上許容される担体を含み得る。製薬上許容される担体は、医薬投与と適合性である、溶媒、可溶化剤、充填剤、安定剤、結合剤、吸収剤、基剤、緩衝剤、潤滑剤、制御放出ビヒクル、希釈剤、乳化剤、湿潤剤、潤滑剤、分散媒質、剤皮、抗菌剤又は抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等を含み得る。医薬活性物質のためのそのような媒質及び物質の使用は当技術分野において周知である。補助物質も組成物に組み込むことができる。
【０１１３】
医薬組成物は、その意図する投与経路と適合性であるように製剤し得る。投与経路の例は、非経口、静脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮、直腸、経粘膜、局所及び全身投与を含む。一例では、投与は移植片を使用することによって実施される。
【０１１４】
非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分を含み得る：無菌希釈剤、例えば注射用蒸留水、塩類溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン；プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は硫酸水素ナトリウム；キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩；及び張度の調整のための物質、例えば塩化ナトリウム又はデキストロース。ｐＨは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器又はガラス又はプラスチック製の複数回投与バイアルに封入することができる。
【０１１５】
医薬組成物は、アグリカナーゼ阻害剤が標的アグリカナーゼ活性を低減する又は排除するのに十分な量であるように患者又は動物に投与することができる。アグリカナーゼ阻害剤のための適切な治療用量は、例えば５ｍｇから１００ｍｇ、１５ｍｇから８５ｍｇ、３０ｍｇから７０ｍｇ又は４０ｍｇから６０ｍｇの範囲であり得る。５ｍｇ以下又は１００ｍｇ以上の用量も使用できる。阻害剤は１回用量又は複数回用量で投与することができる。用量は、例えば１日１回、週に１回又は月に１回などの間隔で投与できる。アグリカナーゼ阻害剤の投与のための用量スケジュールは、例えばそのアグリカナーゼ標的に対する阻害剤の親和性、阻害剤の半減期、及び患者の状態の重症度に基づいて調整することができる。１つの実施形態では、循環レベルを最大にするために、阻害剤をボーラス用量として投与する。もう１つの実施形態では、ボーラス投与後に持続注入を用いる。
【０１１６】
アグリカナーゼ化合物の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物モデルにおいて標準薬学手順によって測定することができる。例えばＬＤ50（個体群の５０％にとって致死的な用量）及びＥＤ50（個体群の５０％において治療上有効な用量）が測定できる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、ＬＤ50／ＥＤ50比として表わすことができる。一例では、大きな治療指数を示す阻害剤を選択する。
【０１１７】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を決定するときに使用できる。そのような化合物の用量は、ほとんどあるいは全く毒性を伴わずにＥＤ50を示す循環濃度の範囲内であり得る。用量は、用いる投与形態及び利用する投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。本発明に従って使用されるいかなる阻害剤に関しても、治療有効用量は、最初は細胞培養アッセイから評価することができる。用量は、細胞培養アッセイによって測定したときＩＣ50（すなわち症状の阻害を達成する試験阻害剤の最大半量濃度）を示す循環血漿中濃度範囲を達成するように動物モデルにおい決定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。特定用量の作用は適切なバイオアッセイによって観測することができる。適切なバイオアッセイの例は、ＤＮＡ複製アッセイ、転写ベースのアッセイ、ＧＤＦタンパク質／受容体結合アッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、前脂肪細胞の分化に基づくアッセイ、脂肪細胞におけるグルコース取込みに基づくアッセイ、及び免疫学的アッセイを含む。
【０１１８】
組成物の投与のための投与計画は、アグリカナーゼタンパク質の作用を変化させる様々な因子、病変の部位、疾患の重症度、患者の年齢、性別及び食事、炎症の重症度、投与の時間及び他の臨床因子に基づき、主治医によって決定され得る。一般に、全身又は注射による投与は最小限に有効な用量で開始し、明確な効果が認められるまであらかじめ選択された時間経過にわたって用量を増加する。その後、起こり得る有害作用を考慮しながら、対応する効果の上昇を生じるレベルに限定して用量の漸増を行う。最終組成物への他の既知の因子の添加も用量に影響を及ぼし得る。
【０１１９】
経過は、疾患進行の定期的評価によって観測することができる。経過は、例えばＸ線、ＭＲＩ又は他の画像診断法、滑液分析又は臨床検査によって観測できる。
【０１２０】
疾患がアグリカン又は他の細胞外マトリックスタンパク質の蓄積によって引き起こされる場合は、そのような欠陥を矯正するために疾患を患っているヒト又は動物に本発明のアグリカナーゼを導入することができる。そのようにして導入されるアグリカナーゼは、問題の細胞外マトリックスタンパク質に対してタンパク質分解的に活性であるはずである。ヒト又は動物に治療タンパク質を投与するための方法は当技術分野において周知である。適切な方法は上述したものを含む。加えて、遺伝子治療に基づくアプローチが使用できる。
【０１２１】
本発明のアグリカナーゼ阻害剤は、試料中のアグリカナーゼの存在又は不在を判定するため又はアグリカナーゼを定量するためのアッセイ及び検出方法において使用できる。アッセイ又は検出方法はインビボ又はインビトロであり得る。これらのタンパク質の存在又はレベルを疾患と相関付けることにより、当業者は関連疾患を診断する又はその重症度を判定することができる。ここで開示する阻害剤によって診断し得る疾患は上記に示されている。
【０１２２】
阻害剤が診断を目的とする場合は、リガンド群（例えばビオチン又は特異的結合パートナーを有する他の分子）又は検出マーカー群（例えば蛍光物質、発色物質、放射性原子、高電子密度試薬又は酵素）でそれらを修飾することが望ましいと考えられる。特異的結合パートナーを有する分子は、例えばビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、及び当技術分野で公知の数多くの受容体−リガンド対を含む。酵素は、典型的にはそれらの活性によって検出される。例えばホースラディッシュペルオキシダーゼは、分光光度計で測定可能な、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を青色色素に変換するその能力によって検出できる。
【０１２３】
上述した実施形態及び以下の実施例が限定ではなく例示として提供されることは了解されるべきである。本発明の範囲内での様々な変更及び修正は、ここでの説明から当業者には明白となる。
（実施例）
【実施例１】
【０１２４】
トランケート型ＡＤＡＭＴＳの構築
代表的な完全長ＡＤＡＭＴＳ−７、−９、−１０、−１６及び−１８タンパク質の全体的ドメイン構造を図１に示す。他の完全長ＡＤＡＭＴＳファミリー成員と同様に、ＡＤＡＭＴＳ−７、−９、−１０、−１６及び−１８は、シグナルペプチド（ＳＰ）、プロペプチド（Ｐｒｏ）、触媒ドメイン（Ｃａｔドメイン）、ディスインテグリン様ドメイン（Ｄｉｓｉｎｔ）、トロンボスポンジンＩ型反復配列（Ｔｓｐ）、システインリッチドメイン（Ｃｙｓ−ｒｉｃｈ）、スペーサードメイン（Ｓｐａｃｅｒ）、及び様々な数のカルボキシ末端トロンボスポンジン反復配列（Ｔ）を有する。ＡＤＡＭＴＳ−７はさらに、３番目と４番目のカルボキシ末端トロンボスポンジン反復配列の間に位置する付加的なスペーサードメインを含む。中央トロンボスポンジンＩ型反復配列の後の空間的に保存されたフェニルアラニン残基、ＡＤＡＭＴＳ−７についてはＰｈｅ599、ＡＤＡＭＴＳ−９についてはＰｈｅ649、ＡＤＡＭＴＳ−１０についてはＰｈｅ608、ＡＤＡＭＴＳ−１６についてはＰｈｅ647及びＡＤＡＭＴＳ−１８についてはＰｈｅ650を図１に示す。
【０１２５】
５つのトランケート型ＡＤＡＭＴＳ−７（Ａ７ＦＳ）、ＡＤＡＭＴＳ−９（Ａ９ＦＳ）、ＡＤＡＭＴＳ−１０（Ａ１０ＦＳ）、ＡＤＡＭＴＳ−１６（Ａ１６ＦＳ）及びＡＤＡＭＴＳ−１８（Ａ１８ＦＳ）タンパク質のドメイン構造を図２に示す。各々の切り取りは、保存されたフェニルアラニン残基に対してＣ末端側に位置する全てのアミノ酸残基の欠失を含む。タンパク質精製を助けるために各々のトランケート型ＡＤＡＭＴＳのＣ末端にＳｔｅｐタグを付加する。Ａ７ＦＳ、Ａ９ＦＳ、Ａ１０ＦＳ、Ａ１６ＦＳ及びＡ１８ＦＳのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４１−４５に示す。
【０１２６】
Ａ７ＦＳ、Ａ９ＦＳ、Ａ１０ＦＳ、Ａ１６ＦＳ及びＡ１８ＦＳについてのＤＮＡコード配列は、ＰＣＲを用いて作製することができる。ＰＣＲプライマーは、ヒトＡＤＡＭＴＳ−７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ１４０６７５）、ＡＤＡＭＴＳ−９（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２６１９１８）、ＡＤＡＭＴＳ−１０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿１１２２１９）、ＡＤＡＭＴＳ−１６（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６２０６８７）及びＡＤＡＭＴＳ−１８（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９５５３８７）の公表配列から設計できる。一例では、Ａ７ＦＳ又はＡ９ＦＳコード配列を、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて適切なヒトｃＤＮＡライブラリー（例えば心臓、骨格筋、腎臓又は膵臓ｃＤＮＡライブラリー）から増幅することができる。反応条件は製造者によって推奨されているものであり得る。ある種の場合には、反応条件は以下の例外を含む：使用するＧＣ融解物の量は５０μｌ反応につき１０μｌである。使用するＮｏｔＩ線状ライブラリーの量は０．２ｎｇ／μｌ反応である。及び使用する各々のオリゴの量は２ｐｍｏｌ／μｌ反応である。サイクリン条件は以下の通りである：９５℃、１分間、１サイクル。次に９５℃、１５秒間／６８℃、２分間から成る３０サイクル。
【０１２７】
ＰＣＲ増幅のための５’プライマーは、ＡＤＡＭＴＳ−７、−９、−１０、−１６及び−１８コード配列の開始コドン（ＡＴＧ）の上流にＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）及び修飾コザック配列（ＣＣＡＣＣ）を組み込み得る。ＰＣＲ増幅のための３’プライマーは、リンカー「ＧＳＡ」をコードする付加的な配列、Ｓｔｅｐタグ、終結コドン（例えばＴＡＡ）及びＮｏｔＩ部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）を組み込み得る。付加的な配列は、保存されたフェニルアラニン残基についてのコドンの下流に付加することができる。適切な大きさを有するＰＣＲ産物を単離し、次にＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化する。消化産物を、同じ制限部位を含む発現ベクターに連結する。クローン化したＰＣＲフラグメントは、それらの同一性を確認するための配列決定することができる。
【０１２８】
一例では、発現ベクターはＣＨＯ細胞発現ベクター、例えばその配列を配列番号８に示す、ｐＴｍｅｄベクターである。
【実施例２】
【０１２９】
トランケート型ＡＤＡＭＴＳの発現及び精製
Ａ７ＦＳ、Ａ９ＦＳ、Ａ１０ＦＳ、Ａ１６ＦＳ又はＡ１８ＦＳ配列を含むｐＴｍｅｄベクターを、リポフェクションのための製造者の推奨するプロトコールを用いて（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）ＣＨＯ／ＤＵＫＸ細胞にトランスフェクトした。０．０２μＭ  メトトレキセート中でクローンを選択した。コロニーを採取し、選択培地で培養しながら細胞系へと増殖させた。
【０１３０】
最も高いレベルの組換えタンパク質を発現する細胞系を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に複合した抗ストレプトアビジン抗体、次にＥＣＬ化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びオートラジオグラフィーを用いてウエスタンブロット法によってＣＨＯ順化培地中で組換えタンパク質を観測することによって選択した。
【０１３１】
限外ろ過とＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎカラム（ＩＢＡ）での親和性精製の組合せによって組換えタンパク質を精製した。ＣＨＯ順化培地を、１０，０００ＭＷＣＯフィルターを用いた限外ろ過によって約３５倍濃縮した。次に順化培地濃縮液をＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎアフィニティーカラムに適用した。製造者の推奨するプロトコールに従って洗浄緩衝液の多数のアリコートを適用することにより、カラムから非特異的結合タンパク質を除去した。デスチオビオチンの添加によって組換えタンパク質をカラムから溶出した。
【実施例３】
【０１３２】
Ａ７ＦＳ、Ａ９ＦＳ、Ａ１０ＦＳ、Ａ１６ＦＳ及びＡ１８ＦＳのアグリカナーゼ活性の検出
【０１３３】
ウシアグリカンを精製組換えタンパク質と共にインキュベートし、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画して、消化物をウエスタンブロット分析することによってアグリカナーゼ活性を検定した。ウエスタンブロットを、アグリカンのタンパク質分解によって生成されるネオエピトープ（すなわちＧｌｕ373−Ａｌａ374結合でのアグリカンの切断後の、〜７０ｋＤａ  Ｇ１担持産物のカルボキシル末端配列．．．ＮＩＴＥＧＥ373（配列番号９））を特異的に認識するＣ１モノクローナル抗体（Ｃ１  ＭＡｂ）でプローブした。ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にインキュベートすることによってＣ１  ＭＡｂを視覚化した。
【０１３４】
図８Ａ−８Ｅは、それぞれ組換えＡ７ＦＳタンパク質、Ａ９ＦＳタンパク質、Ａ１０ＦＳタンパク質、Ａ１６ＦＳタンパク質及びＡ１８ＦＳタンパク質でのウシアグリカン消化を示す。消化されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、その後ウエスタンブロット分析のためにナイロン膜に移した。陰性対照は、組換えタンパク質を含まないウシアグリカンである。陽性対照は、組換えアグリカナーゼ１タンパク質（ＡＤＡＭＴＳ−４）である。
【実施例４】
【０１３５】
Ｃ１  ＭＡｂの生産
【０１３６】
合成ペプチドＣＧＧＰＬＰＲＮＩＴＥＧＥ（配列番号４６）を担体タンパク質ＫＬＨに結合し、この複合体を標準ハイブリドーマテクノロジーによるモノクローナル抗体の生産のための免疫原として使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、完全フロイントアジュバント中の免疫原２０μｇによって皮下経路で免疫した。不完全フロイントアジュバント中のペプチドを用いて注射を２回反復した（週２回）。免疫マウスで試験採血を実施し、免疫ペプチド及びＡＤＡＭＴＳ−４で消化したウシ関節軟骨アグリカンの両方に対する反応性に関して血清をＥＬＩＳＡによって評価した (Flannery et al., supra)。ハイブリドーマ融合の３日前に、最も高い抗体力価を示すマウスにアジュバントなしの最終免疫を行った。このマウスから脾細胞を単離し、ＦＯ骨髄腫細胞（米国菌培養収集所、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）と融合して、ＨＡＴ選択培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で培養した。ハイブリドーマ培養上清を、ＥＬＩＳＡによってＫＬＨ及びＫＬＨ−ＣＧＧＰＬＰＲＮＩＴＥＧＥ抗原に対して、及びウエスタンブロット法によってＡＤＡＭＴＳ−４で消化したアグリカンに対してスクリーニングした。陽性ハイブリドーマクローンを、限界希釈によってサブクローニングのために選択した。Ｃ１  ＭＡｂと称する単一ハイブリドーマ細胞系を培養中で増殖させた。マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Mouse Monoclonal Antibody Isotyping kit）（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて抗体アイソタイプがＩｇＧ１（κ軽鎖）であると判定し、培地１リットルからのＩｇＧをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【実施例５】
【０１３７】
発現ベクター
【０１３８】
ｐ９１０２３（ｂ）の誘導体である、哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２  ＣＸＭも本発明において使用できる。ｐＭＴ２  ＣＸＭベクターは、テトラサイクリン耐性遺伝子の代わりにアンピシリン耐性遺伝子を含み、ｃＤＮＡクローンの挿入のためにＸｈｏＩ部位をさらに含むという点でｐ９１０２３（ｂ）と異なる。ｐＭＴ２  ＣＸＭの機能性エレメントは、アデノウイルスＶＡ遺伝子、ＳＶ４０複製起点（７２ｂｐのエンハンサーを含む）、アデノウイルス主要後期プロモーター（５’スプライス部位及びアデノウイルス後期ｍＲＮＡ上に存在するアデノウイルストリパータイト（tripartite）リーダー配列の大部分を含む）、３’スプライス受容部位、ＤＨＦＲ挿入物、ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位（ＳＶ４０）、及び大腸菌における増殖のために必要なｐＢＲ３２２配列を含む。
【０１３９】
プラスミドｐＭＴ２ＣＸＭは、アクセッション番号ＡＴＣＣ  ６７１２２の下に米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ（ＵＳＡ）に寄託された、ｐＭＴ２−ＶＭＦのＥｃｏＲＩ消化によって得られる。ＥｃｏＲＩ消化はｐＭＴ２−ＶＷＦ内に存在するｃＤＮＡ挿入物を切り出し、連結して、大腸菌ＨＢ１０１又はＤＨ−５をアンピシリン耐性に形質転換するために使用することができる線状形態のｐＭＴ２を生成する。プラスミドｐＭＴ２  ＤＮＡは従来の方法によって作製することができる。次にループアウトを用いて／突然変異誘発においてｐＭＴ２  ＣＸＭを構築する。これは、ＳＶ４０複製起点の近傍のＨｉｎｄＩＩＩ部位に関する塩基１０７５−１１４５及びｐＭＴ２のエンハンサー配列を除去する。加えて、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩの認識部位を含む配列を挿入する。ｐＭＴ２３と称されるｐＭＴ２ＣＸＭの誘導体は、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ及びＸｈｏＩの認識部位を含む。プラスミドｐＭＴ２  ＣＸＭ及びｐＭＴ２３  ＤＮＡは、従来の方法によって作製し得る。
【０１４０】
ｐＭＴ２１に由来するｐＥＭＣ２β１も本発明の実施に適し得る。ｐＭＴ２１は、ｐＭＴ２−ＶＷＦに由来するｐＭＴ２から誘導される。上述したように、ＥｃｏＲＩ消化はｐＭＴ−ＶＷＦ内に存在するｃＤＮＡ挿入物を切り出し、連結して大腸菌ＨＲ１０１又はＤＨ−５をアンピシリン耐性に形質転換するために使用することができる線状形態のｐＭＴ２を生成する。プラスミドｐＭＴ２  ＤＮＡは従来の方法によって作製することができる。
【０１４１】
ｐＭＴ２１は、以下の２つの修飾を通してｐＭＴ２から誘導される。第一に、ｃＤＮＡクローニングのためのＧ／Ｃ尾部からの一続きの１９Ｇ残基を含むＤＨＦＲ  ｃＤＮＡの５’非翻訳領域の７６ｂｐを欠失させる。この工程では、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位がＤＨＦＲのすぐ上流に挿入される。
【０１４２】
第二に、ＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩでの消化、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片による処理、及びＣｌａＩリンカー（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）への連結によってユニークＣｌａＩ部位を導入する。これはアデノウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ）領域から２５０ｂｐセグメントを欠失させるが、ＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子の発現又は機能には干渉しない。ｐＭＴ２１をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、ベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を誘導するために使用する。
【０１４３】
ＥＭＣＶリーダーの一部は、ｐＭＴ２−ＥＣＡＴ１からＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩでの消化によって得られ、２７５２ｂｐのフラグメントを生じる。このフラグメントをＴａｑＩで消化して、５０８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメントを生成し、それを低融点アガロースゲルでの電気泳動によって精製する。５’ＴａｑＩ突出末端及び３’ＸｈｏＩ突出末端を有する、６８ｂｐアダプター及びその相補鎖が合成される。
【０１４４】
アダプター配列は、ヌクレオチド７６３−８２７からのＥＭＣウイルスリーダー配列に対合する。それはまた、ＥＭＣウイルスリーダー内の１０位のＡＴＧをＡＴＴに変化させ、その後にはＸｈｏＩ部位が続く。ｐＭＴ２１  ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント、ＥＭＣウイルスＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメント、及び６８ｂｐオリゴヌクレオチドアダプターＴａｑＩ−ＸｈｏＩアダプターの三方向結合は、ベクターｐＥＭＣ２β１を生じる。
【０１４５】
このベクターは、ＳＶ４０複製起点及びエンハンサー、アデノウイルス主要後期プロモーター、アデノウイルストリパータイトリーダー配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小さなハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びアデノウイルスＶＡＩ遺伝子、ＤＨＦＲ及びβ−ラクタマーゼマーカー及びＥＭＣ配列を、哺乳動物細胞における所望ｃＤＮＡの高レベル発現を指令するための適切な関係で含む。
【０１４６】
ベクターの構築は、アグリカナーゼ関連ＤＮＡ配列の修飾を含み得る。例えばアグリカナーゼをコードするｃＤＮＡを、コード領域の５’及び３’末端上の非コードヌクレオチドを除去することによって修飾できる。欠失非コードヌクレオチドは、発現のために有益であることが公知の他の配列によって置換されてもよく又は置換されなくてもよい。これらのベクターを、本発明のアグリカナーゼの発現のために適切な宿主細胞に形質転換する。
【０１４７】
一例では、アグリカナーゼのコード配列に隣接する哺乳動物調節配列は、アグリカナーゼ分子の細胞内又は細胞外発現のための細菌ベクターを創製するために除去され又は細菌配列で置換される。コード配列はさらに操作することができる（例えば他の公知のリンカーに連結する、あるいは非コード配列を欠失させるか又は他の公知の手法によってその中のヌクレオチドを変化させることによって修飾する）。次に、当業者によって認識される手順を用いてアグリカナーゼコード配列を公知の細菌ベクターに挿入することができる。本発明のアグリカナーゼを発現するために細菌ベクターを細菌宿主細胞に形質転換することができる。細菌細胞においてアグリカナーゼタンパク質の細胞外発現を生じさせるための戦略については、欧州特許出願第１７７，３４３号参照。
【０１４８】
昆虫細胞における発現のための昆虫ベクターの構築に関しても同様の操作が実施できる（例えば欧州特許出願公開第１５５，４７６号に述べられている手順参照）。酵母ベクターも、酵母細胞における本発明のタンパク質の細胞内又は細胞外発現のために酵母調節配列を用いて構築することができる（例えばＰＣＴ国際公開広報第ＷＯ８６／００６３９号及び欧州特許出願第１２３，２８９号参照）。
【０１４９】
哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫宿主細胞系において高レベルのアグリカナーゼタンパク質を生産するための方法は、多数のコピーの異種アグリカナーゼ遺伝子を含む細胞の構築を含み得る。異種遺伝子を増幅可能マーカー、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子に連結することができ、それに関して高い遺伝子コピー数を含む細胞を、漸増濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ）中での増殖のために選択できる。このアプローチは多くの異なる細胞型に関して使用できる。
【０１５０】
例えば、その発現を可能にする他のプラスミド配列と作動可能に連結されたアグリカナーゼについてのＤＮＡ配列を含むプラスミド及びＤＨＦＲ発現プラスミド（例えばｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３）を、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、電気穿孔法又はプロプラスト融合を含む様々な方法によってＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−ＢＩＩ）に共導入することができる。ＤＨＦＲを発現する形質転換体を、透析したウシ胎仔血清を含むα培地での増殖のために選択し、その後漸増濃度のＭＴＸ中での増殖（例えば０．０２、０．２、１．０及び５μＭ  ＭＴＸ中での連続工程）による増幅のために選択する。形質転換体をクローン化し、生物活性アグリカナーゼ発現を上述したアッセイの少なくとも１つによって観測する。アグリカナーゼタンパク質発現はＭＴＸ耐性のレベル上昇と共に上昇するはずである。アグリカナーゼポリペプチドを、当技術分野で公知の標準手法、例えば35Ｓメチオニン又はシステインによるパルス標識及びポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて特性決定する。同様の手順に従って他のアグリカナーゼを生産することができる。
【実施例６】
【０１５１】
発現ベクターのトランスフェクション
一例として、本発明のアグリカナーゼヌクレオチド配列を発現ベクターｐＥＤ６にクローニングする。ＣＯＳ及びＣＨＯ  ＤＵＫＸ  Ｂ１１細胞(Urlaub and Chasin, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 77:4218-4220 (1980)) をリポフェクション（ＬＦ２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってアグリカナーゼ配列で一過性にトランスフェクトする（別個のＰＥＤ６プラスミド上のＰＡＣＥの±コトランスフェクション）。対象とする各々の分子について二重トランスフェクションを実施する：（ａ）活性測定用の順化培地を採集するための一方のトランスフェクションセット及び（ｂ）35Ｓメチオニン／システイン代謝標識のための他方のトランスフェクションセット。
【０１５２】
１日目に、活性測定用に採集するセット（ａ）のウエルで、培地を、１％熱不活化ウシ胎仔血清±１００μｇ／ｍｌヘパリンを添加したＤＭＥ（ＣＯＳ）又はα（ＣＨＯ）培地に変更する。４８時間後、活性測定のために順化培地を採集する。
【０１５３】
３日目に、セット（ｂ）の複製されたウエルを、１％熱不活化ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌヘパリン及び１００μＣｉ／ｍｌ 35Ｓメチオニン／システイン（Ｒｅｄｉｖｕｅ  Ｐｒｏ  ｍｉｘ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加したＭＥＭ（メチオニン不含／システイン不含）培地に変更する。３７℃で６時間のインキュベーション後、順化培地を採集し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動させる。オートラジオグラフィーによってタンパク質を視覚化することができる。
【０１５４】
本発明の上記説明は例示と説明を提供するものであり、網羅的であること又は本発明を開示されている厳密なものに限定することを意図しない。修正及び変法は、上記教示に従って可能であるか又は本発明の実施から獲得し得る。それ故、本発明の範囲は特許請求の範囲及びそれらの等価物によって規定されることが認識される。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、ＡＤＡＭＴＳ−７、−９、−１０、−１６及び−１８タンパク質のドメイン構造を図式的に示す。
【図２】図２は、修飾ＡＤＡＭＴＳ−７、−９、−１０、−１６及び−１８タンパク質のドメイン構造を図式的に示す。
【図３】図３は、（ａ）プロドメインを欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−７（配列番号２）；（ｂ）保存されたＰｈｅの後のＣ末端を欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−７（配列番号３）；（ｃ）プロドメインと保存されたＰｈｅの後のＣ末端の両方を欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−７（配列番号４）のアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、（ａ）プロドメインを欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−９（配列番号６）；（ｂ）保存されたＰｈｅの後のＣ末端を欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−９（配列番号７）；（ｃ）プロドメインと保存されたＰｈｅの後のＣ末端の両方を欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−９（配列番号８）のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、（ａ）プロドメインを欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−１０（配列番号１０）；（ｂ）保存されたＰｈｅの後のＣ末端を欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−１０（配列番号１１）；（ｃ）プロドメインと保存されたＰｈｅの後のＣ末端の両方を欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−１０（配列番号１２）のアミノ酸配列を示す。
【図６】図６は、（ａ）プロドメインを欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−１６（配列番号１４）；（ｂ）保存されたＰｈｅの後のＣ末端を欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−１６（配列番号１５）；（ｃ）プロドメインと保存されたＰｈｅの後のＣ末端の両方を欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−１６（配列番号１６）のアミノ酸配列を示す。
【図７】図７は、（ａ）プロドメインを欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−１８（配列番号１８）；（ｂ）保存されたＰｈｅの後のＣ末端を欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−１８（配列番号１９）；（ｃ）プロドメインと保存されたＰｈｅの後のＣ末端の両方を欠く修飾ＡＤＡＭＴＳ−１８（配列番号２０）のアミノ酸配列を示す。
【図８ａ】図８は、（ａ）トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−７を示す。
【図８ｂ】（ｂ）トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−９を示す。
【図８ｃ】（ｃ）トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１０を示す。
【図８ｄ】（ｄ）トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１６を示す。
【図８ｅ】（ｅ）トランケート型ＡＤＡＭＴＳ−１８と共にウシアグリカンをインキュベートした後のネオエピトープを含むアグリカンＧ１ドメインのウエスタンブロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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