(57)【要約】【課題】デキストラン、澱粉、ムタン、イヌリン及びレバンを加水分解する活性を有するタンパク質、該タンパク質をエンコードする遺伝子、該タンパク質を発現する細胞、及びそれらの製造方法の提供。【解決手段】デキストラン、澱粉、ムタン、イヌリン及びレバンを加水分解する活性を有する、配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素、該酵素をエンコードする遺伝子、及び該遺伝子を発現する形質転換細胞を開示する。また、デキストラン、澱粉、ムタン、イヌリン及びレバンを分解することができる酵素の製造方法であって、細胞を培養すること、該細胞において前記酵素を発現させること、及び、前記酵素を精製することを含む方法も開示する。該酵素を含む組成物は、糖製造中におけるデキストラン又は多糖類混入物質の除去のために提供される。そのうような分解活性を有することにより、該酵素は、歯垢防止組成物及びマウスウォッシュを含むデンタルケア産業における種々の用途を見出すだけでなく、糖製造中におけるデキストラン又は多糖類不純物の除去において有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デキストラン、澱粉、ムタン、イヌリン及びレバンを加水分解する活性を有する、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、その誘導体又はそのフラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質、誘導体又はフラグメントをエンコードする配列番号２の遺伝子、その誘導体又はそのフラグメント。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子、誘導体又はフラグメントを発現する形質転換細胞。
【請求項４】
前記細胞が原核細胞又は真核細胞である請求項３に記載の形質転換細胞。
【請求項５】
前記細胞が、ＫＣＴＣ１０５７４ＢＰの受託番号で２００３年１２月２４日に寄託された大腸菌Ｂ１２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株である請求項３又は４に記載の形質転換細胞。
【請求項６】
デキストラン、澱粉、ムタン、イヌリン及びレバンを加水分解する活性を有する酵素の製造方法であって、
請求項３に記載の細胞を培養すること；
培養した細胞において前記酵素を発現させること；及び、
発現した酵素を精製すること
を含む方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法によって製造された酵素。
【請求項８】
請求項７に記載の酵素を含む組成物。
【請求項９】
糖製造中、デキストランを除去するために使用される請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
歯垢除去のために、又はマウスウォッシュとして使用される請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明分野
本発明は、デキストラン、澱粉、ムタン、イヌリン及びレバンを加水分解することができる酵素、その遺伝子、その発現細胞、及びその製造方法に関する。より詳細には、本発明は、歯垢の形成を抑制し、かつこれまでに形成された歯垢を分解する能力のため抗歯垢組成物又はマウスウォッシュにおいて有用であるだけではなく、デキストランを加水分解する優れた能力のため、糖製造中におけるデキストランの除去にもまた有用な酵素、該酵素をコードする遺伝子、該酵素を発現する細胞、及び該酵素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術の説明
歯垢は、歯に蓄積されたバイオフィルムであり、歯の表面に細菌が定着することにより生じる。歯垢の塊は、グルカン（不溶性グルカン）として既知の、またムタンとも呼ばれる細菌由来の細胞外多糖類からなり、そしてそれは定着を強化する。歯垢の乾燥重量の約２０％に達する該多糖類は、虫歯を引き起こす重要な要因として作用する。ストレプトコッカス  ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）によって製造されるグルカンの構造研究により、不溶性グルカンのグルコース部分は、主に、α−１，３−、α−１，４−及びα−１，６−Ｄ−グルコシド結合によって互いに結合していることが明らかになっている。それ故、効果的な歯垢の除去には、ムタン分解活性、澱粉分解活性及びデキストラン分解活性が必要となる。
【０００３】
従来、歯垢及び虫歯の形成の予防は、主に口内のストレプトコッカス  ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の成長の抑制に依存してきた。これに関連して、防腐剤又はフッ素等のＳ．ｍｕｔａｎｓの成長に対して活性を有する化合物が、歯磨き粉又はマウスウォッシュ等の口腔用製品中に含まれる。一般的な抗虫歯化合物であるフッ素は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの成長を抑制するが、歯のフッ素症（斑状歯［エナメル］の形成）並びに強い毒性及び大気汚染等の副作用を引き起こす。他の試みとしては、デキストラナーゼ等の酵素を用いた虫歯の予防が行われている。しかしながら、その効果はまだ立証されていない。
【０００４】
米国特許第５，７４１，７７３号明細書は、抗歯垢活性及び抗虫歯活性を有するグリコマクロペプチドを含む歯磨剤組成物を提供している。この慣用の技術は、虫歯を引き起こす細菌の成長を抑制することに関する。しかしながら、歯垢形成の防止又はこれまでに形成された歯垢の加水分解については、提案されていない。
【０００５】
本発明者らによる米国特許第６，４８５，９５３号明細書（韓国特許第１０−０３５８３７６号明細書に対応）は、歯垢形成の抑制及びこれまでに形成された歯垢の分解において、様々な構造の多糖類を加水分解することができるＤＸＡＭａｓｅの使用を提案している。様々な多糖類を分解することができる酵素に加えて、該酵素を産生する微生物（リポマイセス  スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ）ＫＦＣＣ−１１０７７株）及び該酵素を含む組成物もまた開示されている。
【０００６】
しかしながら、より効果的に歯垢の形成を抑制し、これまでに形成された歯垢を加水分解することができる新規な酵素への要求が依然として存在する。
【０００７】
韓国特許出願第１０−２００１−４８４４２号明細書において、本発明者らはまた、韓
国特許第１０−０３５８３７６号明細書の微生物（リポマイセス  スタルキー  ＫＦＣＣ−１１０７７株）によって製造される酵素、ＤＸＡＭａｓｅが高いデキストラン分解活性のためにデキストランの除去において有用であり得ることも示唆している。
【０００８】
それ故、糖製造中におけるデキストラン除去のために十分なデキストラン分解活性を有する新規酵素を開発することが当該技術において明らかに必要とされている。
【特許文献１】米国特許第５，７４１，７７３号明細書。
【特許文献２】米国特許第６，４８５，９５３号明細書（韓国特許第１０−０３５８３７６号明細書に対応）。
【特許文献３】韓国特許出願第１０−２００１−４８４４２号明細書。
【特許文献４】韓国特許第１０−０３５８３７６号明細書。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の概要
従って、本発明は、従来技術において起こる上記問題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、歯垢形成の予防及びこれまでに形成した歯垢の分解活性を有し、同様に、優れたデキストラン分解活性を有する新規酵素、及び該酵素をエンコードする遺伝子を提供することにある。
【００１０】
本発明の別の目的は、該遺伝子を有する株を提供することにある。
【００１１】
本発明の更なる目的は、該酵素及び該遺伝子の製造方法を提供することにある。
【００１２】
また、本発明のより更なる目的は、該酵素を含む産業的に有用な組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の１つの観点に従って、デキストラン、澱粉、ムタン、イヌリン及びレバンを加水分解する活性を有する、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、その誘導体又はそのフラグメントが提供される。
【００１４】
本発明の別の観点に従って、前記タンパク質、前記誘導体又は前記フラグメントをエンコードする配列番号２の遺伝子、その誘導体又はそのフラグメントが提供される。
【００１５】
本発明の更なる観点に従って、前記遺伝子を発現する形質転換細胞が提供される。
【００１６】
本発明のより更なる観点に従って、デキストラン、澱粉、ムタン、イヌリン及びレバンを加水分解する酵素の製造方法であって、
前記細胞を培養すること；
培養した細胞において前記酵素を発現させること；及び、
発現した酵素を精製すること
を含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の上記及び他の目的、特徴及び利点は、添付した図面と併せて、以下の詳細な説明からより明確に理解され得る：
【図１ａ】図１ａは、図１ｂと共に本発明に従ったリポマイセス  スタルキー（ＬＳＤ１）から得られたカルボヒドラーゼのアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をエンコードする２０５２ｂｐのヌクレオチド配列を示す（ここで、ベクター中のタンパク質をクローニングするためのＰＣＲプライマーには下線を付した。）；
【図１ｂ】図１ｂは、図１ａと共に本発明に従ったリポマイセス  スタルキー（ＬＳＤ１）から得られたカルボヒドラーゼのアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をエンコードする２０５２ｂｐのヌクレオチド配列を示す（ここで、ベクター中のタンパク質をクローニングするためのＰＣＲプライマーには下線を付した。）；
【図２】図２は、本発明のＬＳＤの活性及び安定性がｐＨ値に対してプロットされるところのグラフである；
【図３】図３は、本発明のＬＳＤの活性及び安定性が温度に対してプロットされるところのグラフである；
【図４】図４は、酵素の不活性化が行われる後及び前（それぞれレーン１ないし５及びレーン６ないし１０）の本発明のＬＳＤの酵素活性を示すＴＬＣ結果の写真であるが、ここで、マルトデキストリンの系列（レーンＭｎ）及びイソマルトデキストリンの系列（レーンＩＭｎ）と伴に、澱粉（レーン１及び６）、デキストラン（レーン２及び７）、ムタン（レーン３及び８）、レバン（レーン４及び９）及びイヌリン（レーン５及び１０）の試料は、酵素抽出物が該試料と反応された後に解析された；及び
【図５】図５は本発明の酵素のヒドロキシアパタイトへの結合能を、ペニシリウム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）デキストラナーゼの結合能と伴に示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
好ましい態様の説明
本発明のカルボヒドラーゼ（即ち、グリカナーゼ（ＬＳＤ））をコードする遺伝子の獲得は、デキストランを含む培地中でリポマイセス  スタルキーを培養し、及びこの微生物からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離することによって開始される。次ぎに、これまで知られたデキストラナーゼをコードする遺伝子において一般的なアミノ酸配列に関する情報に基づき、予期された保存領域を含むプライマーが構成され、その後、該プライマーを用いて、ＰＣＲが行われる。約１．１ｋｂの長さのＰＣＲ生成物が、完全なデキストラナーゼ遺伝子とするために、５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥにおいて使用される。ＰＣＲによって増幅させた後、Ｓ．セレビシエにおいて形質転換が行われるサッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ベクターｐＹＥＳ２においてクローン化される。形質転換が行われた細胞はブルーデキストラン及びガラクトースを含む培地中で育てられる。コロニーの周辺に青色の背景に対して透明なハロが形成されたコロニーが選択（Ｓ．セレビシエＩＮＶＳｃ１）され、Ｓ．セレビシエ形質転換体から、興味深い遺伝子を有する組み換えクローンが得られた（ｐＹＬＳＤ１）。
【００１９】
Ｌ．スタルキーは、デキストランを分解するエンドデキストラナーゼ（ＥＣ３．２．１．１１）及び澱粉を分解するα−アミラーゼを製造することが知られている。この微生物は、食品に適用されており、抗生物質又は他の有毒な代謝産物を産生することは今まで報告されていない。
【００２０】
細菌から得られるいくつかを除いて、微生物によって産生されるデキストラナーゼの大半は、誘導性酵素として知られる。リポマイセス  スタルキー  ＡＴＣＣ７４０５４株は、米国特許第５，２２９，２７７号明細書で最初に報告され、その特徴もまた開示されているところのデキストラナーゼ及びアミラーゼの両方を製造する。該明細書はまた、その菌株がスクロース及び澱粉から低分子量デキストランを産生することも報告している。該知見に基づいて、本発明者らは、デキストラン及び澱粉の両方を加水分解することができるＤＸＡＭａｓｅ酵素、該酵素を産生する微生物（リポマイセス  スタルキー  ＫＦＣＣ−１１０７７株と同定。）、及び該酵素を含む組成物に関する韓国特許第１０−０３５８３７６号明細書（２００２年１０月１１日）（米国特許第６，４８５，９５３号明細書（２００２年１１月２６日）に対応。）を得た。
【００２１】
本発明の遺伝子（ｌｓｄ１）から発現される酵素は、澱粉及びムタン（不溶性グルカン）、並びにデキストランを加水分解することができる。また、本発明に従ったグリカナーゼはデキストランを、主にグルコース、イソマルトース及びイソマルトトリオースに、少量の分岐したペンタオース類及びヘキサオース類の同時産生を伴って、分解することが発見された。
【００２２】
歯垢の構成物である、レバン型及びイヌリン型の両方のフルクタンは本発明に従ったグリカナーゼにより分解することができる。
【００２３】
従って、可溶性であれ不溶性であれ、グルカンの効果的な分解が本発明のグリカナーゼにより達成され得る。細菌の定着及びグルカンの凝集の阻害により歯垢の形成を予防でき、前に形成された歯垢を除去できるため、グリカナーゼは虫歯の予防において有用である。酵素が歯のエナメル成分に類似するヒドロキシアパタイトに結合するか否かの試験により提示されるように、グリカナーゼは歯の上に留まる能力を有することが推察される。
【００２４】
また、本発明は、グリカナーゼをコードする遺伝子を有する新規微生物に関する。サッカロマイセス  セレビシエ株である微生物は、２００３年１２月２４日に、ＫＣＴＣ１０５７４ＢＰの受託番号で、韓国、デジョン市、ユサン  グに所在の韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ＫＣＴＣ）に寄託された。
【００２５】
また、本発明はグリカナーゼの製造方法に関する。まず、クローンｐＹＬＳＤ１が細胞培養により増幅される。培養物から集菌した後、その細胞を、ガラスビーズを使用して崩壊させ、そこからグリカナーゼを単離した。ｐＹＬＳＤ１によりエンコードされるグリカナーゼはＬ．スタルキーＫＦＣＣ−１１０７７株のグリカナーゼと特性において実質的に同一である。
【００２６】
ＲＮＡ単離及びグリカナーゼ遺伝子選択のためのＤＮＡ供与体として使用されるリポマイセス  スタルキーＫＦＣＣ１１０７７株は、デキストラナーゼ及びアミラーゼ活性を有するグリカナーゼを産生する。
【００２７】
興味深いＤＮＡを提供するために、リポマイセス  スタルキーＫＦＣＣ１１０７７株が１％（ｗ／ｖ）デキストラン、１％（ｖ／ｖ）鉱液及び０．３％（ｗ／ｖ）酵母抽出物を含むＬＭＤ培地中で好気的に培養される。鉱液は２％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）のＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）のＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ及び０．１３％（ｗ／ｖ）のＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏを含む。本発明において、一般的なＤＮＡ操作及びＤＮＡ配列決定は、大腸菌（エシェリキア  コリ（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））ＤＨ５α及びｐＧＥＭ−Ｔイージー（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国）を用いて行われた。
【００２８】
ｐＹＬＳＤ１のための宿主細胞として、Ｓ．セレビシエＩＮＶＳｃ１が、グリカナーゼを発現するために、ＹＰＤ培地（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ペプトン２０ｇ／Ｌ及びグルコース２０ｇ／Ｌ）中で培養された。Ｓ．セレビシエ  培養のためのＹＰＤ培地は、合成デキストローゼ（ＳＤ）及び合成補体が補われた。
【００２９】
本発明の酵素を含む組成物は、抗−歯垢組成物、マウスウォッシュ、歯磨剤等を含む、様々な口腔ケア用製品において使用され得る。デキストラン及び澱粉等の多糖類を分解する能力によって、本発明の酵素はまた、糖製造中にデキストランを除去するために効果的に使用される。更に、本発明に従った酵素を含む組成物は、ガム、飲料、牛乳等の食品に適用され得、そしてそれらの成分は当業者によって容易に決定され得る。
【００３０】
本発明のより良い理解は、説明のために示されたものであり、本発明を制限するように解釈されるべきでない以下の実施例を通して得られ得る。
【実施例】
【００３１】
実施例１：Ｌ．スタルキーからのポリＡ＋ＲＮＡの単離
Ｌ．スタルキーはＬＭＤ培地に接種された。２８℃で３６時間培養（中間−指数増殖期）された後、培養物は６５００×ｇで遠心分離されて細胞ペレットを形成した。このペレットはＧＩＴ緩衝液（４Ｍグアニジンイソチオシトレート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．１％ＤＥＰＣ処理水中の０．５％ラウロイルサルコシル、０．１Ｍ
２−メルカプトエタノール）中に懸濁し、酸で洗浄されたガラスビーズ及び等量のフェノール（ｐＨ４．０）と混合された。混合物を２分間ボルテックスした後、遠心分離が実施された。上澄液へイソプロパノールを添加すると全ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）の沈殿が生じた。オリゴテックス樹脂（オリゴテックス（Ｏｒｉｇｏｔｅｘ）ｍＲＮＡキット、キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ））を用いてオリゴテックス−ｍＲＮＡ複合体を形成することにより、ｍＲＮＡを全ＲＮＡ標本から単離した。
【００３２】
実施例２：ＬＳＤ１のＲＴ−ＰＣＴ増幅
ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために、逆転写が、修飾オリゴ−ｄＴプライマーＴ１８ＮＮ（５´−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３´）の存在下、Ｌ．スタルキーから単離された全ＲＮＡの０．５ｇを用いて実施された。ファーストストランドｃＤＮＡの１０μＬがグリカナーゼをコードする塩基配列の部分を増幅するために使用された。１組の縮重プライマーＤＣ−Ｆ及びＤＣ−Ｒがデキストラナーゼにおいて公知の７つの保存領域を参照して構築された。プライマーＤＣ−Ｆ（５´−ＡＣＣＴＧＧＣＡ（Ｔ／Ｃ）ＡＧ（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ／Ｇ）（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）−３´）及びＤＣ−Ｒ（５´−Ｇ（Ｇ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ）（Ｔ／Ｇ）ＣＣ（Ｇ／Ｃ）ＡＣＣＴＧＣＴＴ（Ａ／Ｇ）ＴＡ−３´）の設計は、それぞれ、ペプチド配列ＴＷＷＨ（Ｄ／Ｎ）（Ｎ／Ｓ／Ｔ）（保存領域Ｉ）及びＹＫＱＶＧ（Ｓ／Ａ）（保存領域Ｖ）に基づく。これらのプライマーのセットを用い、ＰＣＲが約１．１ｋｂの想定されたグリカナーゼ遺伝子フラグメントを得るために行われた。ＰＣＲ生成物はＡｃｃＰｒｅｐ（登録商標）ゲル抽出キット（バイオニール（Ｂｉｏｎｅｅｒ）、韓国）を用いてアガロースゲルから精製され、続いて精製されたＤＮＡフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国）にライゲーションした。ＤＮＡ配列決定は韓国基礎科学資源研究所内で行われた。グリカナーゼの無傷の遺伝子得るために、１．１ｋｂのＤＮＡフラグメントに関する情報に基づいてＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）が行われた。この関連で、グリカナーゼをエンコードする全長ｃＤＮＡを可能にするために、５´−ＲＡＣＥ及び３´−ＲＡＣＥは、５´−ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ及び３´−ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ（どちらもタカラ（ＴａＫａＲａ）、日本）に依存した。５´−ＲＡＣＥを介して１８０ｂｐのＰＣＲ生成物が得られ、一方、３´−ＲＡＣＥは結果として９００ｂｐのＰＣＲ生成物を与えた。これにより、全長約２ｋｂのグリカナーゼ遺伝子（１ｓｄ１）が獲得された。
【００３３】
実施例３：グリカナーゼ遺伝子の塩基及びアミノ酸の配列決定
アルカリ溶解法によりプラスミドＤＮＡが塩基配列決定のために製造された。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  サイクル配列決定キット（パーキンエルマー株式会社、米国）を活用して、塩基配列決定は、９６００サーマルサイクラーＤＮＡ配列決定システム（モデル３７３−１８、アプライド  バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、米国）において達成された。塩基配列決定結果は図１、配列番号１及び２に示した。
グリカナーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは１８２４塩基対から成る読み取り枠を有することが見出された。該読み取り枠は、獲得された塩基配列のヌクレオチド配列部位
４２の開始コドン（ＡＴＧ）で開始し、ヌクレオチド配列部位１８６８の終止コドン（ＴＧＡ）で終了する。６０８アミノ酸残基から構成される、構造遺伝子に対応する想定されるタンパク質は、６７．６ｋＤａの分子量を有すると計算された。
【００３４】
実施例４：組み換えプラスミドｐＹＬＳＤ１の構築及びそれを用いるＳ．セレビシエの形質転換
Ｌ．スタルキーはＹＰＤ中で培養されて集菌され、シュバルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）及びカンター（Ｃａｎｔｏｒ）法に従って、ゲノムＤＮＡが単離された。
１対の合成プライマーＤＸ−Ｆ：５´−ＧＴＣＣＣＴＴＧＡＧＣＴＣＣＣＡＡＣ−３´（配列番号３）及びＤＸ−Ｒ：５´−ＴＣＡＡＣＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣ−３´（配列番号４）を用いて、ＰＣＲをＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの存在下、９４℃の変性温度で１分、５２℃のアニーリング温度で１分及び７２℃の延長温度で２分の３０周期で行なったが、その間、グリカナーゼ遺伝子（１ｓｄ１）に対応するＤＮＡフラグメントが鋳型としての役割を果たした。ＰＣＲ生成物は、形質転換が行われるｐＧＥＭ−Ｔイージーベクターとライゲートされた。形質転換細胞から調製されたプラスミドはＰＣＲ生成物を切除するためにＥｃｏＲＩで処理されたが、該生成物はその後、ｐＹＥＳ２ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）とライゲートされた。この関連で、該ベクターは自己ライゲーションの防止のために、ＥｃｏＲＩで事前に消化され、ＣＩＡＰで処理された。結果として得られた組み換えプラスミドのＳ．セレビシエ中への形質転換はエレクトロポレーション法で行われた。ＳＣ培地中で成長した形質転換体の選択は、誘導培地（２％ガラクトース、０．３％ブルーデキストラン、ウラシル欠損）を利用して行った。形質転換体で接種されたＳＣプレートが２ないし６日間３０℃で培養されると、組み換えプラスミドが固定された場合、デキストランの加水分解の結果として得られるハロがコロニーの周りに形成される。コロニーの周辺に青色の背景に対して透明なハロが形成されたコロニーが選択され、興味深い遺伝子を有するクローンはｐＹＬＳＤ１と命名された。
【００３５】
実施例５：グリカナーゼ遺伝子を発現する細菌の選択
上澄液中のクローンの活性を試験するためにガラクトース誘導が実施された。選択されたコロニーは、２％ガラクトース及び１％グルコースを含むＳＣ液体培地５０ｍＬ中に、ＯＤ６００＝１に到達するような量で接種され、続いて３０℃で７２時間培養された。細胞は遠心分離（５０００ｒｐｍ×５分）により集菌され、２０ｍＭ  クエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）５ｍＬ中に懸濁され、その後、細胞破壊が０．４５ｍｍガラスビーズ０．１ｇの存在下、３分間のボルテックスにより実施された。細胞溶解物は６０００ｒｐｍで２分間遠心分離され、その後、上澄液が注意深く回収された。上澄液は４℃でポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ＭＷ＝１５０，０００−２００，０００）と反応され、そこからグルコース、二糖類及びオリゴ糖類を除去するために濃縮量とした。ＰＥＧ濃縮物は２０ｍＬのクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に対して透析されて独自量となった。タンパク質活性を決定するための粗酵素抽出物として、前記透析溶液が等量の１％デキストラナーゼと混合された。反応の１６時間後、活性が測定された。
【００３６】
実施例６：酵素活性のアッセイ
酵素の減少値が銅−ビシンコニン酸法により決定された。それは、銅−ビシンコニン酸１００μＬが酵素溶液１００μＬに添加され、８０℃で３５分反応され、その後約１５分冷却される。吸収は５６０ｎｍにおいて測定された。グリカナーゼ酵素のデキストラナーゼ活性は、粗酵素抽出物が２％デキストラン緩衝液と３７℃で１５分反応された場合のイソマルトースの産生量の測定により決定された。デキストラナーゼ活性の１単位（ａ  ｕｎｉｔ）は、３７℃で１分間デキストランと反応する場合、イソマルトース１μｍｏｌが産生される酵素の量として定義される。
【００３７】
実施例７：グリカナーゼの最適なｐＨ及び温度及び安定性についてのアッセイ
１６時間のグリカナーゼとデキストランの反応後、ｐＨ４．１ないし７．７の範囲におけるデキストラナーゼ活性を測定することにより、該酵素のデキストラナーゼ活性を最適ｐＨを求めるためにアッセイした。ｐＨに対する該酵素の安定性は、該酵素が各緩衝液中、２２℃で３時間放置された後に決定された。
酵素の最適温度は、種々の温度（１０−６０℃）で１６時間放置された酵素の反応速度を計測することにより決定された。温度安定性の決定のために、酵素は種々の温度（１０−６０℃）で３時間放置された後に残存活性が測定された。
ＬＳＤ酵素は、ｐＨ５．５で最適のデキストラナーゼ活性を示し、ｐＨ５．０−５．７で最適活性の８０％以上を維持することが見出された（図２、表１）。
【表１】
2007519418.tif 000002
表１において、安定ｐＨとは、そのｐＨ範囲において酵素の残存活性が初期活性の８０％以上であることを意味する。
同様に、酵素は３７℃で最適活性を示し、３７℃より低い温度において初期活性の８０％以上を示した（図３、表２）。
【表２】
2007519418.tif 000003
表２において、安定温度範囲とは、その温度範囲において酵素の残存活性が初期活性の８０％以上であることを意味する。
【００３８】
実施例８：種々の基質におけるデキストラナーゼの分解活性
種々の基質における分解活性について粗酵素抽出物が試験された（図４）。グルカンに加えて、デキストラン、澱粉、レバン（β−２，６  結合Ｄ−フルクトースポリマー）、イヌリン（β−２，１結合Ｄ−フルクトースポリマー）、ムタン及び（α−１，３結合Ｄ−グルコースポリマー）を含む種々のポリマーの１％水溶液が加水分解活性試験のために調製された。酵素とデキストランの反応は、結果として分岐オリゴ糖の同時産生を伴って、０．１％グルコース、１９．３％イソマルトース、２４．２％イソマルトトリオース及び１７．０％イソマルトテトラオースを与えた。そのため、グリカナーゼはデキストランとの反応において、エンド−デキストラナーゼとして作用すると考えられる。グリカナーゼの存在下において、澱粉がグルコースへ殆ど完全に分解されることが見出された。
加えて、クローンｐＹＬＤＳ１から発現されたグリカナーゼは、種々のポリマーとの反応を介して加水分解活性についてアッセイされた。低くはあったが、グリカナーゼの加水分解活性は、ムタンのようなα−１，３−Ｄ−グルコシド結合ポリマーに対してだけでなく、イヌリンのようなβ−結合ポリマーに対しても検出された。グリカナーゼがデキストランに対する１００％と比較して澱粉において５４％、ムタンにおいて８％、レバンにおいて３％、イヌリンにおいて７％の加水分解活性を有することが測定された。
【表３】
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【００３９】
実施例９：ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）へのデキストラナーゼの結合
骨へ直接結合するそれらの能力が理由で、リン酸カルシウムセラミックが骨の代用品として一般に使用されている。そのうち、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）は、結晶学的な性質が歯に見られる自然発生的なアパタイトと類似しているため、人口骨及び歯における研究のために最も好適である。この理由のために、ＨＡが歯への酵素の結合能を試験するための材料として採用された。ＨＡ（バイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）ＨＴＰ、バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）研究所、リッチモンド  カナダ）は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）中に懸濁された。別途に、酵素もまた同様の緩衝液中に懸濁された。ＨＡ懸濁液の２００μＬが等量の酵素懸濁液と混合され、その後、混合物をＨＡに酵素が吸収されるように、６０分放置された。残存する遊離の酵素を洗い出した後、溶出が、それぞれが１ｍＭＮａＣｌを含む１０、５０、１００、２００、３００、４００及び５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で実施された。採集された後、酵素溶出画分はグリカナーゼ活性についてアッセイされた。
図５に見られるように、グリカナーゼは３００ｍＭヒドロキシアパタイトで溶出された。アパタイト中におけるグリカナーゼの残留は、ペニシリウム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）デキストラナーゼの残留よりも高いこともまた理解される。ひとまとめにして考えると、これらの結果は、グリカナーゼがヒドロキシアパタイトに強力に結合し、そのため歯中にとどまることができることを明らかにした。
【００４０】
前述のように、本発明のリポマイセススタルキー突然変異体から産生されたグリカナーゼは約７０ｋＤａの単独のタンパク質であるが、それはそのＰＣＲ生成物の塩基配列決定により解析されたように１８２４ｂｐヌクレオチドを含む読み取り枠を有することが見出された。構造遺伝子の想定されたタンパク質は約６７．６ｋＤａの分子量を有する６０８アミノ酸残基からなる。
グリカナーゼとデキストランの反応から結果として得られる最終生成物はエンド−デキストラナーゼの典型的な生成物に過ぎない。この興味深い酵素は、デキストランを、分岐した五糖類の同時産生を伴って、主にグルコース、イソマルトース、イソマルトトリオース及びイソマルトテトラオースに分解した。更に、該酵素は、α−１，３−Ｄ−グルコシド結合ポリマー、並びにレバンやイヌリンのようなβ−架橋フルクタンを含む種々の糖質への分解活性を示すことが見出された。
上述の分解活性を有し、そのため、本発明の酵素は、歯垢防止組成物及びマウスウォッシュを含むデンタルケア産業における種々の用途を見出しただけでなく、糖製造中におけるデキストラン又は多糖類不純物の除去において有用である。
本発明の好ましい態様は、説明目的のために開示されたものであるとはいえ、当業者ならば、添付した請求の範囲に開示される本発明の範囲及び精神から外れることなく、様々な変形、付加及び代替が可能であることを予期し得る。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年4月7日(2006.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
前記細胞が、ＫＣＴＣ１０５７４ＢＰの受託番号で２００３年１２月２４日に寄託されたサッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｐＹＬＳＤ１株である請求項３又は４に記載の形質転換細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
また、本発明は、グリカナーゼをコードする遺伝子を有する新規微生物に関する。サッカロマイセス  セレビシエｐＹＬＳＤ１株である微生物は、２００３年１２月２４日に、ＫＣＴＣ１０５７４ＢＰの受託番号で、韓国、デジョン市、ユサン  グに所在の韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ＫＣＴＣ）に寄託された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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