(57)【要約】  アクチノバシラス・プレウロニューモニー(Ap)、マンヘイミア・ヘモリティカ(Mh)及びパスツレラ・マルトシダ(Pm)を含む病気を引き起こす病原性の細菌分離株の範囲のリポ多糖に発現する保存された内側コアオリゴ糖エピトープが、開示されている。末端が露出した構造としての保存された内側コアオリゴ糖エピトープを専ら発現する突然変異菌株の構成が、三つの全ての微生物に共通の内側コアLPSの同定、生成及び分離を可能にした。さらに、関連するワクチン、保存されたLPS内側コアに対して仕立てられた抗体及び免疫原性の担体と結合したLPS内側コアを含む複合糖質も提供される。
2007537307.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変の外側コアオリゴ糖鎖エクステンションをふくまない保存されたジ−グルコシル−テトラ−ヘプトシル内側コア部分から基本的になる単離されたリポ多糖部分。
【請求項２】
式Ｉ（化１）のグルコシル−ヘプトシル内側コア部分：
（化１）
2007537307.tif 000058
｛式中、Glcは、グルコースであり；Hepは、ヘプトースであり；Rは、H又はホスホエタノールアミンであり；R”’は、H又はアクチノバシラス・プレウロニューモニーのO-抗原であり；Kdoは、３−デオキシ−D−マンノ−２−オクツロソン酸であり；Q１は、H又はα-Glcであり；Q２は、H、Kdo又は-P-R（ここで、Pは、ホスフェート、Rは、H又はホスホエタノールアミンである）であり；Q３は、H又は解毒化したリピドAであり；Q４は、H又は化２に示すとおりである。
（化２）
2007537307.tif 000059
ここで、R’及びR”は、各々、H又は、R’”がHでQ２が-P-R(ここで、RはH又はホスホエタノールアミンである)である場合には、Q１がα-Glcであることを条件に、オリゴ糖エクステンション｝から基本的になる単離されたリポ多糖部分。
【請求項３】
式Ia（化３）のグルコシル−ヘプトシル内側コア部分：
（化３）
2007537307.tif 000060
｛式中、Glcは、グルコースであり；Hepは、ヘプトースであり；Rは、H又はホスホエタノールアミンであり；R’及びR”は、各々、H又はオリゴ糖エクステンションであり；R”’は、H又はアクチノバシラス・プレウロニューモニーのO-抗原であり；Kdoは、３−デオキシ−D−マンノ−２−オクツロソン酸であり；Q1は、H又はα-Glc；Q２は、H、Kdo又は-P-R（ここで、Pは、ホスフェート、Rは、H又はホスホエタノールアミンである）であり；リピドAは、R”’がHでQ２が-P-R(ここで、RはH又はホスホエタノールアミンである)である場合には、Q１がα-Glcであることを条件に、解毒化されている｝から基本的になる単離されたリポ多糖部分。
【請求項４】
構造I（化４）の構造を有するジ−グルコシル−テトラ−ヘプトシル内側コア部分：
（化４）
2007537307.tif 000061
｛式中、Glcは、グルコースであり；Hepは、ヘプトースであり；Pは、ホスフェートであり；Rは、H又はホスホエタノールアミンであり；R’及びR”は、各々、H又はオリゴ糖エクステンションであり；R”’は、H又はアクチノバシラス・プレウロニューモニーのO-抗原であり；Kdoは、３−デオキシ−D−マンノ−２−オクツロソン酸であり；リピドAは、解毒化されている｝から基本的になる単離されたリポ多糖部分。
【請求項５】
構造II（化５）の構造を有するグルコシル−テトラーヘプトシル内側コア部分：
（化５）
2007537307.tif 000062
｛式中、Glcは、グルコースであり；Hepは、ヘプトースであり；Rは、H又はホスホエタノールアミンであり；R’及びR”は、各々、H又はオリゴ糖エクステンションであり；R”’は、H又はアクチノバシラス・プレウロニューモニーのO-抗原であり；Kdoは、３−デオキシ−D−マンノ−２−オクツロソン酸であり；リピドAは、解毒化されている｝から基本的になる単離されたリポ多糖部分。
【請求項６】
O-結合基が、内側コア部分の何れかの位置で置換されている請求項１〜５の何れか一つに記載のリポ多糖部分。
【請求項７】
薬学的に許容可能な担体とともに、請求項１〜６の何れか一つに記載のリポ多糖部分を含む薬剤組成物。
【請求項８】
薬学的に許容可能な担体が、免疫原性である請求項７に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
マンヘイミア・ヘモリティカ、アクチノバシラス・プレウロニューモニー及びパスツレラ・マルトシダに対して交差反応性であり、請求項１〜６の何れか一つに記載のリポ多糖部分内のエピトープと結合する機能抗体。
【請求項１０】
マンヘイミア・ヘモリティカ、アクチノバシラス・プレウロニューモニー及びパスツレラ・マルトシダに対して交差反応性の機能抗体の製造及び収集方法であって：
(a)  請求項１〜６の何れか一つに記載のリポ多糖部分に対する抗体を生じさせる工程と、
(b)  マンヘイミア・ヘモリティカ、アクチノバシラス・プレウロニューモニー及びパスツレラ・マルトシダ菌株の複数の菌株に対し、工程(a)によって生じた抗体を試験する工程と、
(c)  マンヘイミア・ヘモリティカ、アクチノバシラス・プレウロニューモニー及びパスツレラ・マルトシダの全ての菌株と交差反応性の抗体を選別する工程とを、
含む方法。
【請求項１１】
この保存された内側コア構造を有するパスツレラシー(pasteurellaceae)科からの細菌による感染によって引き起こされる病気の治療用薬剤の製造のための請求項７又は請求項８に記載の組成物の用法(use)。
【請求項１２】
この保存された内側コア構造を有するマンヘイミア、アクチノバシラス又はパスツレラ属からの細菌による感染によって引き起こされる病気の治療用薬剤の製造のための請求項７又は請求項８に記載の組成物の用法。
【請求項１３】
この保存された内側コア構造を有するマンヘイミア・ヘモリティカ、アクチノバシラス・プレウロニューモニー又はパスツレラ・マルトシダ種からの細菌による感染によって引き起こされる病気の治療用薬剤の製造のための請求項７又は請求項８に記載の組成物の用法。
【請求項１４】
病気が、ブタ繊維素出血壊死性胸膜肺炎(porcine fibrinohemorrhageic necrotizing pleuropneumonia)、家禽コレラ(avian fowl cholera)、ウシ出血性敗血症、ブタ萎縮性鼻炎、ヒツジ及びウシ肺炎型出血性敗血症(輸送熱)、及びヒツジ敗血症からなる群から選択されるものである請求項１１〜１３の何れか一つに記載の用法。
【請求項１５】
マンヘイミア・ヘモリティカ菌株A1 losB (IDAC 040505-1)。
【請求項１６】
パスツレラシー科からの細菌の菌株であって、毒性のポテンシャルが無く、保存された内側コア構造からのリポ多糖エピトープをもたらす細菌の菌株を含む弱毒化ワクチン。
【請求項１７】
前記細菌の菌株が、マンヘイミア、アクチノバシラス及びパスツレラ属から選択される請求項１６に記載の弱毒化ワクチン。
【請求項１８】
ロイコトキシン遺伝子内に突然変異を有するマンヘイミア・ヘモリティカ菌株A1 losBを含む弱毒化ワクチン。
【請求項１９】
構造I（化６）の構造を有する保存されたジ−グルコシル−テトラ−ヘプトシル内側コア部分：
（化６）
2007537307.tif 000063
｛式中、Glcは、グルコースであり；Hepは、ヘプトースであり；Pは、ホスフェートであり；Rは、H又はホスホエタノールアミンであり；R’及びR”は、各々、H又はオリゴ糖エクステンションであり；R”’は、H又はアクチノバシラス・プレウロニューモニーのO-抗原であり；Kdoは、３−デオキシ−D−マンノ−２−オクツロソン酸であり；リピドAは、解毒化されている｝から基本的になるリポ多糖部分の製造方法であって：
(a)  末端単位としてリポ多糖部分を与えるため、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が不活性化されたマンヘイミア・ヘモリティカ、アクチノバシラス・プレウロニューモニー又はパスツレラ・マルトシダ種からの突然変異株を単離する工程と、
(b)  工程(a)によって得られたマンヘイミア・ヘモリティカ、アクチノバシラス・プレウロニューモニー又はパスツレラ・マルトシダの突然変異菌株を、リポ多糖部分を発現するのに適した条件下で培養する工程と、
(c)  得られたリポ多糖部分を単離して特徴付けする工程と、
(d)  リポ多糖部分のリピドA部分を解毒化する工程とを、
含む方法。
【請求項２０】
構造I（化７）の構造を有する保存されたジ−グルコシル−テトラ−ヘプトシル内側コア部分：
（化７）
2007537307.tif 000064
｛式中、Glcは、グルコースであり；Hepは、ヘプトースであり；Pは、ホスフェートであり；Rは、H又はホスホエタノールアミンであり；R’及びR”は、各々、H又はオリゴ糖エクステンションであり；R”’は、Hであり；Kdoは、３−デオキシ−D−マンノ−２−オクツロソン酸であり；リピドAは、解毒化されている｝から基本的になるリポ多糖部分の製造方法であって：
(a)  不活性化されたlosB遺伝子を有するマンヘイミア・ヘモリティカ種からの突然変異菌株を単離する工程と、
(b)  工程(a)によって得られたマンヘイミア・ヘモリティカの突然変異菌株を、リポ多糖部分を発現するのに適した条件下で培養する工程と、
(c)  得られたリポ多糖部分を単離して特徴付けする工程と、
(d)  リポ多糖部分のリピドA部分を解毒化する工程とを、
含む方法。
【請求項２１】
構造I（化８）の構造を有する保存されたジ−グルコシル−テトラ−ヘプトシル内側コア部分：
（化８）
2007537307.tif 000065
｛式中、Glcは、グルコースであり；Hepは、ヘプトースであり；Pは、ホスフェートであり；Rは、H又はホスホエタノールアミンであり；R’及びR”は、各々、H又はオリゴ糖エクステンションであり；R”’は、H又はアクチノバシラス・プレウロニューモニーのO-抗原であり；Kdoは、３−デオキシ−D−マンノ−２−オクツロソン酸であり；リピドAは、解毒化されている｝から基本的になるリポ多糖部分の製造方法であって：
(a)  不活性化されたlbgA又はrfbP遺伝子を有するアクチノバシラス・プレウロニューモニー種血清型１菌株からの突然変異株を単離する工程と、
(b)  工程(a)によって得られたアクチノバシラス・プレウロニューモニーの突然変異菌株を、リポ多糖部分を発現するのに適した条件下で培養する工程と、
(c)  得られたリポ多糖部分を単離して特徴付けする工程と、
(d)  リポ多糖部分のリピドA部分を解毒化する工程とを、
含む方法。
【請求項２２】
構造I（化９）の構造を有する保存されたジ−グルコシル−テトラ−ヘプトシル内側コア部分：
（化９）
2007537307.tif 000066
｛式中、Glcは、グルコースであり；Hepは、ヘプトースであり；Pは、ホスフェートであり；Rは、H又はホスホエタノールアミンであり；R’及びR”は、各々、H又はオリゴ糖エクステンションであり；R”’は、Hであり；Kdoは、３−デオキシ−D−マンノ−２−オクツロソン酸であり；リピドAは、解毒化されている｝から基本的になるリポ多糖部分の製造方法であって：
(a)  不活性化されたPM0223又はPM1143遺伝子を有するパスツレラ・マルトシダ種菌株Pm70からの突然変異株を単離する工程と、
(b)  工程(a)によって得られたパスツレラ・マルトシダの突然変異菌株を、リポ多糖部分を発現するのに適した条件下で培養する工程と、
(c)  得られたリポ多糖部分を単離して特徴付けする工程と、
(d)  リポ多糖部分のリピドA部分を解毒化する工程とを、
含む方法。
【請求項２３】
請求項１〜６の何れか一つにおいて定義されたリポ多糖部分内のエピトープに結合するモノクローナル抗体。
【請求項２４】
リポ多糖部分を、前記内側コアリポ多糖部分内に含まれるエピトープに対して特異なモノクローナル抗体と接触させることにより、リポ多糖部分を同定する工程を、さらに含む請求項１９〜２２の何れか一つに記載の方法。
【請求項２５】
前記モノクローナル抗体が、請求項２３において定義されたものである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
免疫原性の担体に結合した請求項１〜６の何れか一つにおいて定義されたリポ多糖部分を含む複合糖質。
【請求項２７】
リポ多糖部分と免疫原性の担体が、リンカー分子を介して連結されている請求項２６に記載の複合糖質。
【請求項２８】
リンカー分子が、スクアラート、シスタミン、アジピン酸ジヒドラジド、ε−アミノヘキサン酸、クロロヘキサノールジメチルアセタール、D−グルクロノラクトン及びｐ−ニトロフェニルアミンからなる群から選択される請求項２６又は２７に記載の複合糖質。
【請求項２９】
担体が、解毒化した緑膿菌トキシンA、コレラ・トキシン／トキソイド、百日咳トキシン／トキソイド、ウェルシュ菌エキソトキシン／トキソイド、B型肝炎表面抗原、B型肝炎コア抗原、ロタウィルスVP 7タンパク、呼吸器合胞体ウィルスF及びGタンパク、ジフテリアトキソイドCRM197、破傷風トキソイドTT、ヒト血清アルブミン(HAS)、マンヘイミア・ヘモリティカ・ロイコトキシントキソイド、マンヘイミア・ヘモリティカPlpEリポタンパク、アクチノバシラス・プレウロニューモニーOmlA、マンヘイミア・ヘモリティカ又はアクチノバシラス・プレウロニューモニーTbpA及びB(伝達結合タンパク)、マンヘイミア・ヘモリティカ・シアログリコプロテアーゼ、Apx I〜IVからなる群から選択されたアクチノバシラス・プレウロニューモニーApxエキソトキソイド、アクチノバシラス・プレウロニューモニー又はパスツレラ・マルトシダPlp-40リポタンパク、パスツレラ・マルトシダOmp28メジャー外膜タンパク、パスツレラ・マルトシダ39ｋDa被膜タンパク、及びパスツレラ・マルトシダPlpB(39kDa交差防御性リポタンパク)からなる群から選択される請求項２６〜２８の何れか一つに記載の複合糖質。
【請求項３０】
請求項２６〜２９の何れか一つに記載の複合糖質と、アジュバントとを含むワクチン組成物。
【請求項３１】
ワクチンが、リポソーム、アーキオソーム、又はアーキオリピドからのものとして製剤されている請求項３０のワクチン組成物。
【請求項３２】
哺乳動物の免疫付与後のパスツレラシー科からの細菌の全細胞に対して交差反応性の抗血清を誘導する請求項３０又は３１記載のワクチン組成物。
【請求項３３】
請求項２６〜２９の何れか一つにおいて定義された複合糖質と、アジュバントとを含む多価ワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポ多糖体(LPS)の内側コアオリゴ糖部分の一以上のエピトープ(抗原決定基)を含む畜獣の病原菌リポ多糖体を指向するものである。本発明は、アクチノバシラス・プレウロニューモニー[Actinobacillus pleuropneumoniae(Ap)]、マンヘイミア・ヘモリティカ[Mannheimia haemolytica(Mh)]及びパスツレラ・マルトシダ[Pasteurella multocida(Pm)]を含むが、必ずしもこれらに限定されない病気を引き起こす分離株の範囲に亘る畜獣の病原菌のLPSに発現する保存されたエピトープを同定するものである。
【背景技術】
【０００２】
病原菌は、広い範囲のヒトを含む動物の集団における健康問題とともに、生産農家の業務における経済的損失の重大な原因である。
畜獣の病気に関与するもっとも一般的な病原菌のうちの三つが、マンヘイミア[パスツレラ(Pasteurella)]・ヘモリティカ(Mh)、アクチノバシラス・プレウロニューモニー(Ap)及びパスツレラ・マルトシダ(Pm)である。Mhは元来、ウシ及びヒツジの病原菌であり、Apは、ブタの病原菌であり、Pmは、家禽、畜牛及びブタを含む多種の病原菌であって、ヒトにおけるイヌやネコによる咬傷感染の病原因子でもある。まとめると、それらは、畜産業に対する大きな経済的損失に帰着する病気を引き起こす。
【０００３】
現在の診療実務は、バクテリン又は大ざっぱに修飾された生の菌株(crudely modified live strains)をワクチンとして使用することを伴うものである。斯かるアプローチは、有効性が不十分なので、完全には満足できるものではなく、重大な副作用がある。
【０００４】
現在のところ、これら三つの種Mh、Ap及びPmによって引き起こされる感染症に対する異種間にわたる防護を提供する入手可能なワクチンは一つもない。懸念される病原菌に対するワクチンを有することが、有用であろう。Mhによって引き起こされる病気に立ち向かうワクチンのアプローチは、いまだ、主としてバクテリンや生の弱毒化した菌株に、基づいている。生ワクチンのより最近のバージョンには、ノイラミダーゼ、ロイコトキシン、シアログリコプロテアーゼ、外膜及び未特性化タンパク質(outer membrane and uncharacterised proteins)などの分泌された又は抽出されたMh抗原が含まれる。非毒性ロイコトキシンを発現する変異株による免疫化が、子ウシ(calf)チャレンジ・モデルにおいて、なお、ある程度有毒であり、莢膜多糖とロイコトキシンの組み合わせが、防御免疫反応を作り出すことができなかったにもかかわらず、ロイコトキシンは、伝統的に主なサブユニット・ワクチン候補であった。対照的に、LPSは、白血球溶解活性を安定化させることを示しており、そのため、LPS及び無毒化したロイコトキシンに基づく共役ワクチン(conjugate vaccine)は、有望である[Li, J. and K. D. Clinkenbeard, 1999, Infect. Immun., 67: 2920-2927]。
【０００５】
現在のApによって引き起こされる病気に立ち向かうワクチンのアプローチは、生の弱毒化した菌株が、保護に必要な中和抗体をもたらす非常に不安定なApx毒を含んでいるため、生の弱毒化した菌株に基づいている。これらのApx毒は、Apに対する主なサブユニット・ワクチンの基礎を形成するが、部分的な臨床的保護をもたらすように思われるにすぎない。LPSのコアオリゴ糖(core OS)を含む付着因子が、改善されたワクチン候補として提案されている[Van Overbeke I., at al. 2003, J., Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health, 50: 289-293]。ブタのPm病を防止する現在のワクチンは、トキソイド及び皮膜(capsule)や外膜タンパクなどの菌体抗原からなっている。Pmは、パスツールによって、初めてニワトリに家禽コレラを引き起こすことが示されたものであり、これらの病気に対する保護のための現在の方策は、弱毒化したPm菌株を利用している。しかしながら、一般的に、この方策は、免疫反応が血清型に限定されたままであるため著しく限定され、他の血清型に対して交差保護(cross-protection)を与えることができない。しかし、PmのLPSは、免疫において感染に対する部分的な役割を果たしていることが示されている。
【０００６】
各々のこれらの微生物からのLPSが、サブユニットワクチンのデザインのための良好な候補であり得るということを示すかなりの証拠が累積している。LPSは、可視で、Mh及び食菌作用を促進させたA1LPSとしたモノクローナル抗体(mAbs)の表面上の主な抗原決定基であるが、生体外で殺菌を媒介する補体ではないことが示されている[Wilson, C. F., et al. 1992, Vet. Microbiol. 31: 161-168]。
【０００７】
Pmにおいては、リボソーム-LPSワクチンが、同種のPm菌株からの家禽コレラ病に対してニワトリを保護した[Phillips, M., and R. B. Rimler. 1984, Am. J. Vet. Res. 45:1785-1789]。加えて、LPS−タンパク質複合体を用いた免疫感作が、複合体の個々の成分を分離した場合には保護が与えられなかったが、同種菌株を用いて抗原投与(攻撃誘発)した場合には、マウスに対して100％の保護を与えた。PmのみからLPSとしたモノクローナル抗体は、マウスモデルにおいて部分的な保護を与え、それらは、オプソニン食菌作用を有する(opsonophagocytic)が、補体の存在下では殺菌作用がない。しかしながら、他の研究において、PmLPSとしたモノクローナル抗体(mAb)が、同種の抗原投与に対してマウスを完全に保護し、殺菌作用を有していた[Wijewardana, T. G., et al., 1990, J. Med. Microbiol. 33: 217-222]。A型からのLPSを模倣する抗イディオタイプワクチンが、同種の微生物を用いて抗原投与がなされた場合には、マウスモデルにおいて保護作用があった。
【０００８】
Apにおいて、LPS、より具体的にはLPSのコア領域が、バクテリアの付着能に関与していた。Ap血清型１LPSと結合したウシ血清アルブミン(BSA)の共役ワクチンが、異種の抗原投与ではなく同種の抗原投与をした後のマウスに対して保護作用があり、血清型５及び１からのスムース及びラフApLPSの両方の複合体が、Apの細胞壁の炭水化物部分が、ブタの免疫反応において重要な役割を果たしていることを示唆した[Fenwick, B., and B. I. Osburn, 1986, Infect. Immun. 54: 583-586]。
【０００９】
これに関連して、関心のある獣医学の微生物は、ワクチン候補と考えることのできる表面が露出した炭水化物部分を含んでいる。これらの炭水化物部分は、LPS及び莢膜多糖を含んでいる。莢膜多糖は、細菌表面に直接結合した数個の炭水化物残基の反復単位であるのに対し、LPSは、三つの領域、すなわち、LPS分子を脂肪酸残基を介して細菌表面に結合させるリピドA領域、リピドA領域を第三の領域に結合させる比較的保存されたオリゴ糖領域、及び可変多糖抗原(O抗原)、からなるものである。菌株間の莢膜及びO-抗原多糖の多様性が、通常、それらの同種の菌株のみにしか適用範囲を与えない能力のため、それらを経済的に実行可能なワクチン候補としては排除している。分子遺伝学、分子構造分析及び免疫化学における最近の進歩が、炭水派物構造をワクチン抗原候補として同定することを可能にする強力な道具をもたらした。
【００１０】
リポ多糖(LPS)は、Mh、Ap及びPmの必須で特徴的な表面が露出した抗原である。(先に論じたように、本明細書において用いるリポ多糖及びLPSの語は、短鎖リポ多糖及びリポオリゴ糖(LOS)を包含するものである)。Pm菌株は、多数のオリゴ糖エピトープのなかで広い高原多様性を示すことのできる低分子量LPSの不均一集団を発現するのに対し、Mh及びApの菌株は、低分子量LPSとO-抗原ポリマーを有する伝統的なLPSの両方を産生する。本願出願人が、本願明細書において記述したMh、Ap及びPmのLPS炭水化物構造体は、それらが、適正な態様で、例えば、タンパク複合体として宿主免疫系に投与された場合には、保護作用のある抗原のソースを提供することができる。遺伝子的に及び生理学的に安定で、菌株の範囲を越えて保存され、Mh、Ap及びPmの三つの種を越えて宿主浄化メカニズム(host clearance mechanisms)を利用できるオリゴ糖エピトープを有する予想外に表面が露出した炭水化物抗原が確認されたので、本願出願人の研究において、LPSがワクチン候補として有用であることが証明された。
【００１１】
Mh、Ap及びPmのLPS分子の炭水化物領域は、宿主免疫反応による認識のためのターゲットを提供する。構造の決定は、Mh、Ap及びPmのLPSの生物学及び細菌の病原性(bacterial virulence)におけるその役割を理解するのにきわめて重要である。Mh、Ap及びPmのLPSは、可変オリゴ糖部分及び膜固着リピドA成分及び、Mh及びApのある菌株の場合には、ポリマーO-抗原からなる分子の異種混合物を含んでいる。本願明細書に記載の実験に基づき、保存されたテトラヘプトシル−ジグルコシル内側コア部分からなるMh、Ap及びPｍのLPSについての構造モデルを開発した。この内側コア部分は、リン酸化されたケトデオキシオクトン酸残基(ketodeoxyoctonate residue)(Kdo)を介してリピドA成分に結合しており、これまで調べたところ、保存されており、どの菌株にも存在することが分かっている。
【００１２】
この構造分析から、三つの種にわたって絶対的に保存されている最大の構造は、以下の構造I（化１０）に示すものであることが明らかであった。
【００１３】
（化１０）
2007537307.tif 000003
ここで、Kdoは、３−デオキシ−D−マンノ(manno)−２−オクツロソン酸、Hepは、ヘプトース、Glcは、グルコース、Pは、ホスフェートであり、リピドAは、解毒化されている。
【００１４】
抗原をワクチンの開発に利用するためには、四つの必須の基準を満たさなければならない。すなわち、候補抗原の免疫原性エピトープは、
i) 遺伝学的に安定していること
ii) 種を越えて臨床的に関連する全ての菌株において保存されてこと
iii) (生体外及び生体内で)宿主免疫機構にアクセス可能であること、及び
iv) 生体内で防御抗体を誘発させることができること
が必要である。
【００１５】
本発明は、これらの基準のほとんどを満たすことが示された保存されたLPS炭水化物エピトープを同定した。
i)  遺伝学的安定性：保存された内側コアオリゴ糖の生合成に関与する遺伝子が、三つの細菌種のゲノム菌株(genome strains)(二つのPm菌株、一つのMh菌株及び二つのAp菌株)において確認された。これらの細菌種によって示されるいろいろな外側コアの変化(variations)に関与する遺伝子が、可変に存在することが分かり、これらのデータは、これらのゲノム菌株と各細菌種の追加の菌株に関する構造データによって裏付けられた。しかしながら、構造分析及び遺伝分析の双方が、内側コア構造は、内側コア生合成に関与することが知られている遺伝子の安定した存在によって構造的に保存されていることを示した(表A｛（化１１）（表１）｝参照)。
【００１６】
表A：畜獣の病原体の保存された内側コアLPSのグリコシルトランスフェラーゼ
（化１１）
2007537307.tif 000004
【００１７】
畜獣の病原体ゲノム菌株における保存された内側コアグリコシルトランスフェラーゼ
【表１】
2007537307.tif 000005
【００１８】
ii)  構造的保存：本願出願人によって現在まで研究されたどの菌株においても、このテトラヘプトシル−ジグルコシル部分は、以下の構造要素(構造II（化１２）)内に含まれていた。
（化１２）
2007537307.tif 000006
【００１９】
ここで、−Rは、H又はホスホエタノールアミン(PEtn)であり、Pは、ホスフェート、R’及びR”は、H又はオリゴ糖鎖エクステンションであって、β-D-Galp-(1-7)-D-α-D-Hepp-(1-6)を含まないのが好ましく、R’”は、Apにおける可変のO−抗原であり、Kdoは、３−デオキシ−D−マンノ(manno)−２−オクツロソン酸であり、リピドAは、解毒化されている。
【００２０】
（表Ｂ）
【表２】
2007537307.tif 000007
【００２１】
第一のヘプトース残基HepIは、コアオリゴ糖エクステンション(core oligosaccharide extension)が、全ての三つの種Ap、Mh及びPmにおいて、この残基から生じていることを示した唯一つのヘプトース残基である。外側コアエクステンションは、HepIV残基から、さらに延びている(elongates)。いずれの種においても、HepII及びHepIIIからは、コアオリゴ糖エクステンションは見られなかった。Ap血清型５におけるO-抗原エクステンションは、HepIII残基から生じていることが分かった[St. Michael, F. et al., 2004, Carbohydr. Res., 339: 1973-1984]。O-抗原のコアオリゴ糖(core OS)への結合位置は、Mhにおいては、示されていなかった。Pmには、抗原高分子反復単位は、見られなかった。突然変異体がO-抗原のないAp菌株に帰着するrfbP及びrfbUを含む四つの遺伝子が、Ap血清型１におけるO-抗原生合成に関与することが示された[Labrie, J. et al, 2002, J. Endotox. Res., 8: 27-38]。全ての三つの種の内側コアは、Pm菌株Pm70ではHepII残基の３位において、又は全ての種Ap、Mh及びPmではKdo-P残基において、さらにホスホエタノールアミン残基で置換することができる。Pmでは、少数集団(minor population)のLPSの糖型が、Kdo-P又はKdo-P-PEtn部分の代わりに、二つのKdo残基を産生し、第二のKdo残基の存在は、内部コアα-Glc残基が失われたことに付随するものである。外側コアの変化(variation)が、関心のある三つの種の種内及び種間の両方で観察された。Ap血清型１では、外側コアエクステンションが、NMRによって完全に構造的に特徴が示され、(1S)-GalaNAc-(1-4,6)-α-Gal-(1-3)-β-Galのオリゴ糖エクステンションの終端にあまり遭遇することのない開鎖のN-アセチルガラクトサミン構造を含んでいることが示された。この構造は、血清型９及び１１においても、質量分析法からも推測される。Ap血清型２では、HepIV残基が、４位においてβ-Glc残基によって、６位においてD,D-α-HepV残基によって二基置換されていることが分かった。Ap血清型５では、D,D-α-HepV残基のみが、HepIV残基を置換している。Ap血清型５に関して見られたものと類似の外側コアエクステンションが、Mhに見られた、この外側コアエクステンションでは、第二のD,D-α-HepV残基自体が、７位においてβ-Gal残基によって置換されている。Pmでは、二つの血清型１の菌株、VP161及びX73が、珍しい外側コアエクステンションをあらわした。この外側コアエクステンションにおいては、HepIV残基が、４位及び６位の二つの位置で、それ自体が３位においてホスホコリン部分によって一基置換されたβ-Gal残基によって対称的に置換されていたか、又はこの外側コアエクステンションが、ホスホコリン残基に加え、β-Gal残基の６位においてホスホエタノールアミン残基を産生した(X73)。ゲノムの塩基配列が特定された(genome sequenced)菌株Pm70についての他の研究が、もう一度、４位及び６位におけるHepIV残基の二基置換を示した。４位は、β-グルコース残基によって置換され、６位は、普通の五糖であるα-GalNAc-(1-3)-β-GalNAc-(1-3)-α-Gal-(1-4)-β-Gal-(1-4)-β-Glcによって置換されている。
【００２２】
iii)  アクセシビリティ：この内側コア構造は、これら三つの種に一貫して発現しているので、この内側コア構造のエピトープが、アクセシブルであり、外側コア、O-抗原及び他の細胞表面構造体の可変性にかかわりなく配座が保存されているかどうかを確認することが重要であった。これを実行するためには、保存された構造が末端構造として産生される必要であり、その目的で、この構造を露呈させる(expose)であろうグリコシルトランスフェラーゼがターゲットにされた。Pm菌株Pm70のLPS構造についての徹底的に精通した知識とともに、この菌株の全ゲノム塩基配列が入手可能であることが、Pm70のLPS構造の生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼの仮の同定を容易にした。他のゲノム塩基配列も、第二のPm菌株(P-3480)、二つのAp菌株(血清型１及び５)、及びMh菌株(血清型１)に関して、分かりつつあり、突然変異誘発のための標的遺伝子を特定するため、バイオインフォマティックスのアプローチが利用されている。Mh菌株A1が、この微生物に存在するO-抗原の量がApと比較して少なく、したがって、後続の免疫学的研究を妨げないため、突然変異誘発の研究に選択された。以下に示すように、候補のグリコシルトランスフェラーゼが、a)Mh菌株A1及びb)Ap血清型１の双方において、確認された。）
（化１３）
2007537307.tif 000008
【００２３】
Apにおいて、mini-Tn10トランスポゾン突然変異誘発によるコアオリゴ糖生合成に関与することが分かった二つの遺伝子の間に位置する軟性下疳菌(H. ducreyi)lbgAガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の相同染色体[Tullius, M. V. et al., 2002, Infect. Immun. 70: 2853-2861]が、確認された[Galarneau, C. at al., 2000, Pathogenesis, 1: 253-264]。Apにおいて隣接する遺伝子lbgBが、軟性下疳菌(Haemophilus ducreyi)からのD−グリセロ−D−マンノ−ヘプトシルトランスフェラーゼ(D-glycero-D-manno-heptosyltransferase)に対してかなりの相同性を示した。ApからのlbgB遺伝子配列を用いたMhゲノム塩基配列のブラスト分析(blast analysis)(Baylor College, Houston)が、Mhゲノム塩基配列におけるD−グリセロ−D−マンノ−ヘプトシルトランスフェラーゼに対する二つの隣接する相同染色体を明らかにした。確認された最も良いlbgB相同染色体を、第一のL−グリセロ−D−マンノ−ヘプトース(L-glycero-D-manno-heptose)残基(HepI)からのエクステンションにおける第一のD−グリセロ−D−マンノ−ヘプトース残基(HepIV)の付加に関与するD−グリセロ−D−マンノ−ヘプトシルトランスフェラーゼであると仮定した。したがって、我々は、我々がlosBと称する第二の相同染色体が、第二のD−グリセロ−D−マンノ−ヘプトース残基(HepV)の付加に関与するD−グリセロ−D−マンノ−ヘプトシルトランスフェラーゼであると仮定した。
【００２４】
標準的な分子生物学の技術を用いて、この遺伝子を突然変異させ、それによって生じた突然変異株由来のLPSを構造的に特徴を示して標的にした保存された内部コア構造が得られたことを示した(実施例７参照)。これらの畜獣の病原体の菌株の範囲を越えるこの内部コアLPS構造の保存及びアクセシビリティの程度を調べるため、モノクローナル抗体(mAbs)及びポリクローナル抗体(pAbs)を、この内部コアLPS構造にしたてた。LPSと三つの種Mh、Ap及びPmの各々の全細胞との両方と交差反応性のポリクローナル血清が得られた。一つの融合から、Mhの全細胞上に存在しているのと同様な内側コア立体配座に対して特異な四つのモノクローナル抗体(G3、G8、E8及びD8)が、得られた。次の融合から、Ap、Pm及びMhからの全ての関心のある菌株からのLPSと交差反応をすることのできる三つのモノクローナル抗体(3-4、3-5及び3-16)が得られ、これらの重要な畜獣の病原体の間で共有されている保存された交差反応性のLPSエピトープの潜在可能性(potential)を証明した。これらのモノクローナル抗体のうちの四つのモノクローナル抗体(G3、G8、3-5及び3-16)から、腹水をつくりあげ、全細胞ELISAによって検査した。全細胞ELISAは、これらのモノクローナル抗体によって認識されたLPSエピトープが、概してアクセス可能であることを示し、保存された内側コアエピトープが細胞表面にアクセス可能であることを実証した。さらに、モノクローナル抗体G3及びG8は、Mh感染のマウスモデルにおいて消極防護(passive protection)を促進し、生体内でのこの内側コア構造に対するアクセシビリティを例証した。
【００２５】
iv)機能的抗体(functional antibodies)：関心のある種のLPSと交差反応性の抗体を含むポリクローナル血清、並びにモノクローナル抗体G8及びG3が、Mh細胞の補体媒介の溶解を促進することができた。消極防護の研究が、定評のあるMh感染のマウスモデルで行われ、この研究は、Mhにおけるこの保存された内側コアLPSに対して特異なモノクローナル抗体(G3及びG8)の供給が、病気に抗して保護することができたことを示した。最終的に、保存された炭水化物構造を担体タンパク質ヒト血清アルブミン(HSA)と結合させた共役ワクチンを調整し、この複合体で免疫付与してつくりあげたマウス血清が、関心のある三つの種からのLPS及び全細胞と交差反応性であることが分かった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明は、畜獣の病原菌のリポ多糖(LPS)に由来の免疫に関与するB細胞活性化分子を与えるのに適したワクチン、ワクチン成分、及びそられの用法を提供するものであり、前記分子は、リポ多糖の内側コアオリゴ糖部分の一以上のエピトープを含んでいる。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本願明細書における開示は、アクチノバシラス・プレウロニューモニー[Actinobacillus pleuropneumoniae (AP)]、マンヘイミア・ヘモリティカ[Mannheimia haemolytica (Mh)]及びパスツレラ・マルトシダ[Pasteurella multocida (Pm)]を含むがこれらに限定されない病気を引き起こす分離株の範囲にわたる畜獣の病原菌のLPSに発現するエピトープを同定し、特徴を示すものである。
【００２８】
本願明細書において、ワクチンの製造に用いるのに適した定義されたサブユニット抗原が、同定されている。ワクチン候補の抗原は、ワクチン抗原に対する免疫反応が、次に生きた微生物(live organism)を標的にすることができるよう、自然の状態で、細菌の表面に露呈されるのが好ましい。
【００２９】
我々は、三つの微生物全てに共通する内側コアLPSを見出し、製造した。LPSは、これらの畜獣の病献体の各々に対する免疫において役割を果たすことが示された。LPS抗原が、立体配座保存されると、免疫反応が、同種及び異種の菌株を、そして実際に種を認識するであろう。
【００３０】
構造解析データが、三つの畜獣の病原菌の全てが、共通の保存された内側コアオリゴ糖(OS)構造を共有していることを示唆した。そのため、LPSベースのワクチンの可能性を探求することが決定された。このプロセスの第一のステップは、保存された内側コアオリゴ糖エピトープを、末端が露出した構造として、もっぱら発現する突然変異株の作製であった。この研究は、末端が露出した部分として保存された内側コアエピトープをもたらすため、Mh菌株A1からのα−1,6−D−グリセロ−D−マンノ−ヘプトシルトランスフェラーゼ(α-1,6-D-glycero-D-manno-heptosyltransferase)遺伝子に突然変異体を生じさせた。
【００３１】
三つの畜獣の病原体の菌株の範囲にわたるこの構造の保存とアクセシビリティの度合を調べるため、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を、この内側コアLPS構造にした。Ap、Pm及びMhからの関心のある全ての菌株からのLPSと交差反応することのできる三つのモノクローナル抗体を得て、これら三つの重要な畜獣の病原体の間で共有されている保存された交差反応性のLPSエピトープの可能性を立証した。
【００３２】
全細胞ELISA分析が、これらのLPSエピトープが全細胞上のモノクローナル抗体によって認識されたことを示し、内側コアエピトープが、細胞表面にアクセス可能であることを実証した。内側コアオリゴ糖を認識したモノクローナル抗体は、Mh細胞の補体が仲介する殺菌性の溶解を促進することができた。定評のあるMh感染のマウスモデルにおいて、消極防護の研究がなされ、この研究は、この保存された内側コアLPS構造に対して特異なモノクローナル抗体の供給が、病気に対して保護することができたことを示した。最終的に、保存された炭水化物構造を担体タンパクであるヒト血清アルブミン(HSA)に結合させる共役ワクチンが調製され、この複合体によって免疫付与をしたマウス血清が、関心のある三つの種と交差反応性があることが分かった。
【００３３】
一つの特徴において、本発明は、可変の外側コアオリゴ糖鎖エクステンションを含まない保存されたジ−グルコシル−テトラ−ヘプトシル内側コアを含むリポ多糖部分を提供する。
【００３４】
他の特徴において、本発明は、以下の構造II（化１４）の構造を有するジ−グルコシル−テトラ−ヘプトシル内側コア部分：
（化１４）
2007537307.tif 000009
｛式中、-Rは、H又はホスホエタノールアミン(PEtn)であり；Pは、ホスフェートであり；R’及びR”は、H又はオリゴ糖鎖エクステンション(好ましくはβ-D-Galp-(1-7)-D-α-D-Hepp-(1-6)を含まないオリゴ糖鎖エクステンション)であり；R”’は、Apにおける可変のO-抗原であり；Kdoは、３−デオキシ−D−マンノ−２−オクツロソン酸(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid)であり；リピドAは解毒化されている｝を含むリポ多糖部分を提供する。
【００３５】
他の特徴において、本発明は、Mh、Ap又はPmによって引き起こされる病気に対する保護を動物宿主に与えるための、上述のリポ多糖部分の何れかを含む免疫原性の組成物を提供する。
【００３６】
他の特徴において、本発明は、上述のリポ多糖部分の何れかを含む突然変異株を得るため、Mh、Ap又はPmにおけるリポ多糖の産生のためのLPS生合成経路における少なくとも一つの遺伝子の用法(use)を提供する。
【００３７】
他の特徴において、Mh、Ap又はPmに対する交差反応性の機能抗体を発現させるため、上述のリポ多糖部分の何れかを含む少なくとも一つの免疫原性エピトープの用法を提供する。
【００３８】
他の特徴において、本発明は、Mh、Ap又はPmに対して交差反応性であり、上述のリポ多糖部分の何れかによって発現する機能抗体を提供する。
【００３９】
他の特徴において、本発明は、Mh、Ap又はPmに対して交差反応性の機能抗体の製造方法であって：
(a)  上述のリポ多糖部分の何れかに対する抗体を生じさせる工程と、
(b)  複数のMh、Ap及びPm菌株に対し、斯かる抗体を試験する工程と、
(c)  交差反応性であるそれらの抗体を選別する工程とを、
含む方法を提供する。
【００４０】
他の特徴において、本発明は、Mh、Ap又はPmによる感染によって引き起こされる病気に対して宿主に免疫付与をする方法であって、免疫的に有効量の上述の免疫原性組成物を宿主に投与する工程を含む方法を提供する。
【００４１】
以下の保存された内側コアLPS構造が、Mh、Ap及びPmにおいて確認された。この構造は、全ての菌株に対して広い適用範囲をもたらすワクチン候補として有用である。三つの種全てが、この同一の構造単位を生成するという予想外の知見が、この一つの保存された構造に基づく多種用(multi-species)ワクチンの製造を可能にするものである。
【００４２】
（化１５）
2007537307.tif 000010
式中、-Rは、H又はホスホエタノールアミン(PEtn)であり；Pは、ホスフェートであり；R’及びR”は、H又はオリゴ糖鎖エクステンション(好ましくはβ-D-Galp-(1-7)-D-α-D-Hepp-(1-6)を含まないオリゴ糖鎖エクステンション)であり；R”’は、Apにおける可変のO-抗原であり；Kdoは、３−デオキシ−D−マンノ−２−オクツロソン酸(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid)であり；リピドAは解毒化されている。
【００４３】
各種におけるこれらの保存された構造の特徴を示すために行われた構造分析が、実施例(実施例１、Mh；実施例２、Ap；及び実施例３〜５、Pm)に詳述されている。実施例１は、パスツレラ・ヘモリティカ(マンヘイミア・ヘモリティカ)の血清型１LPSの構造分析を、記載している。実施例２は、Apの数種の血清型からのLPSの構造分析を記載しており、それにより、MhとApの内側コア分子の構造的同系性が、初めて確認された。実施例３は、Pmのゲノム株からのLPSの構造分析を記載しており、それにより、三つの種全ての内側コア分子の構造的保存が、初めて確認された。実施例４は、Pm菌株VP161のLPSの構造分析を、記載している。実施例５は、Pm菌株X73のコアオリゴ糖の構造分析を、記載している。実施例６は、PmのorfH遺伝子、HepIII〜HepIIヘプトシルトランスフェラーゼの確認を、記載している。実施例７は、畜獣の病原体特異の保存されたLPS構造を示すマンヘイミア・ヘモリティカのD−グリセロ−D−マンノ−ヘプトシルトランスフェラーゼ突然変異体の調製、及びこのLPS構造に対する抗体の発生と交差反応性を、記載している。実施例８は、保存された内側コアLPS分子を炭水化物部分として利用した複合糖質ワクチンの調製と研究を、記載している。実施例９は、内側コア特異のモノクローナル抗体とポリクローナル血清を用いて得られた細菌分析データを、記載している。実施例１０は、内側コア特異のモノクローナル抗体を用いて得られた消極防護実験データを、記載している。総合すると、これらの実施例は、これらの内側コアリポ多糖エピトープは、この内側コア構造を含むLPS分子を有する細菌種によって引き起こされる病気の予防のためのワクチン候補であることを示した。
【００４４】
莢膜多糖を含むワクチンが、同種の被包性細菌によって引き起こされるヒトの病気の予防に有効である。これらの炭水化物抗原は、T細胞依存性反応の欠如により、ヒトにおいては免疫原性が弱い。しかしながら、特定の多糖抗原を適当なタンパク担体と結合させることにより、炭水化物抗原の免疫原性を、多糖単独よりも大きく高めることができる。特定の莢膜多糖のｂ型インフルエンザ菌[type b H. influenzae (Hib)]、及びｃ型髄膜炎菌(type c Neisseria meningitides)、例えば、ProHiBit、MenCをベースにした複合糖質ワクチンは、侵入性Hib及び髄膜炎菌性疾患を抑えるのに功を奏することが既に証明されている。    
【００４５】
宿主への免疫付与後の所望の免疫反応を引き起こすための一般的な方策は、適当な態様で、保存された内側コアLPS分子を適当な担体分子に結合させることである。
【００４６】
免疫原性の担体タンパクは、破傷風トキシン／トキソイド、ジフテリアトキシン／トキソイド(CRM197)、解毒化した緑膿菌トキシンA、コレラトキシン／トキソイド、百日咳トキシン／トキソイド、ウェルシュ菌エキソトキシン／トキソイド、B型肝炎表面抗原、B型肝炎コア抗原、ロタウィルスVP 7タンパク、呼吸器合胞体ウィルスF及びGタンパク及び他の適当な担体からなる群から選択されるのが好ましい。
【００４７】
アジュバントは、フロイントアジュバント、ミョウバン、リビ(Ribi)及び他の何れかの薬学的に許容可能なアジュバントからなる群から選択されるのが好ましい。
【００４８】
本発明の一つの実施の形態において、保存された内側コアLPS分子を投与することを含む動物、魚又は鳥における病原菌に対する免疫を誘発させる又は高める方法が提供される。ある場合には、病原菌は、マンヘイミア、アクチノバシラス又はパスツレラの変種(variety)である。
【００４９】
ある場合には、病原菌は、関心のある獣医学的な微生物である。投与は、注射、粘膜への塗布、経皮投与、経口投与(適当にコーティングされているのが好ましい)などを含む適当な方法のいずれでもよい。ある場合には、内側コアLPS分子は、適当な担体分子と結合又は連合している。ある場合には、適当なアジュバントも使用される。ある場合には、内側コアLPSは、抗菌薬又は他の免疫刺激剤と併用される。ある場合には、保存された内側コアLPS分子は、構造Iの内側コアLPSである。ある場合には、保存された内側コアLPS分子は、構造IIで定義されているR及びR’の一方又は両方が無い構造II（化１６）の内側コアLPSである。ある場合には、保存された内側コアLPSは、以下a)〜f)のうちの少なくとも一つである。
【００５０】
（化１６）
2007537307.tif 000011
【００５１】
（化１７）
2007537307.tif 000012
さらに、Pは、ホスフェートである。
ある場合には、保存された内側コアLPSは、上記の分子a)〜f)の一つ以上の変異体又は開示された一般的構造(R及びR’は、あっても無くてもよい)(この構造において、一以上の末端の糖が、異性体として発生するか又は特定の異性体の形態を維持するよう変化させてある)のうちの一つの変異体である。
【００５２】
本発明の一つの実施の形態において、他のオリゴ糖との共有結合のない上記の抗原性のLPS由来のオリゴ糖が提供される。
【００５３】
本発明の一つの実施の形態において、保存された内側コアLPS分子又はタンパク及び／又はその変異体を、免疫原性の担体タンパクに結合することを含むワクチンの製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
実施例１：この実施例は、Can.J.Chem.80, 1715(2002)における発表の基礎をなすものである。マンヘイミア・ヘモリティカ血清型A1の研究。マンヘイミア・ヘモリティカのLPSの分析が、コアオリゴ糖主成分としてのHex3Hep5Kdoを明らかにした。これは、LPS試料の弱酸加水分解(１％HOAc、100℃、3時間)の結果として得られたオリゴ糖フラクションの1H NMR及びFAB-MS分析によって決定された。コアオリゴ糖は、それらのアルジトール酢酸(alditol acetate)及び２−ブチルグリコシド誘導体のGLC-MS分析によって決定された時に、主要フラクションにおいて、D-グルコース、D-ガラクトース、L-D-ヘプトース及びD-D-ヘプトースを2：1：3：2のモル比で含んでいることが分かった。D-Gal残基は、メチル化分析から末端非還元性部分であることが分かり、Hex2Hep5Kdoの組成を有していたコアオリゴ糖フラクションの主成分には存在しなかった。LPSにおけるKdoの存在は、熱量分析によって立証された。
【００５５】
マンヘイミア・ヘモリティカLPSを無水ヒドラジン続いて強アルカリで処理すると、水溶性のデシル化された(decylated)LPSオリゴ糖が生成した。デシル化されたLPS試料は、コア及びリピドAオリゴ糖部分を含む自然の(native)材料の損なわれていないバックボーンオリゴ糖の代表であった。これは、Hex3Hep5Kdo1HexN2(H2PO3)に相当する分子イオンを、主なオリゴ糖成分としてもたらしたエレクトロスプレーイオン化によって確認された(実験の項参照)。
【００５６】
プロトンスペクトル(図１)並びにHMQC及びCOSYスペクトル(図２)から、メチレンプロトン共鳴とともに、１０個のアノマー１H NMR共鳴が観察された。アノマー共鳴は、それらの1H NMR化学シフトの減る順にa〜jのラベルを付し、K3eq及びk3axを、Kdoのメチレンプロトンに割り当てた。b1、del及びj1アノマーピークの積分は、他のアノマーピークの積分よりも４０％少なく、試料における不均一性を確認した。h1の近くの4.91ppmにおけるダウンフィールド二重線が現われているh1においても或る不均一性があった。
【００５７】
標準的な等核及び異核2D-NMR分析に着手した。図２のCOSYスペクトルから、H-2共鳴の位置が分かった。残基ｂ、ｄ、ｅ、ｆ、及びJ1,2に関しては、小さく、マンノヘプトースの特徴を示していることが分かった、また、2D-TOCSYが、磁化をH-1からH-2過ぎまで移すのに用いることができなかったことが分かった。図３のHMQCスペクトルから、ヘプトース残基のH-2は、他の共鳴とオーバーラップして、2D-TOCSYを、これらの残基に関して分析するのが困難なものにしていた。2D-NOESYスペクトルも、特にb1、del共鳴に関して普通でなく大きい数のNOEを示した。また、アノマー領域において幾つかの共鳴のオーバーラップがあった。そのため、スペクトルの複雑さと試料の不均一性に起因して、標準的な2D法を用いては得ることのできない分光パラメータを抽出するのに1D選別法を用い、それにより、構造及び立体配座の分析の解決を可能にした。HMQCTOCSY及びHMBC実験も、完全な帰属特定、特にヘプトースユニットに関する完全な帰属特定を決定するのに非常に重要である。このアプローチを用いることにより、主なバックボーンオリゴ糖(A1)に関する1H及び13C NMR化学シフトについての完全な帰属特定が、可能であった(実施例１、表１)。
【００５８】
Kdo-GlcNII-GlcNIシーケンス及び部分的な帰属特定は、先の研究から知られており、ここでなされた帰属特定と一致している。残基a及びhに関する1D-TOCSYが、共鳴の帰属特定及びプロトン結合定数の測定を可能にした(図4a、4b)。ホスフェート基の位置が、先に行われた31P HMQC実験から、確認された。次いで、13C NMR化学シフトの帰属特定が、HMQC、HMQC-TOCSY及びHMBCスペクトルからなされた。この情報が、残基a及びhの、リピドA部分のα-D-GlcN及びβ-D-GlcNピラノシル(pyranosyl)ユニットとしての定義につながった。ほとんどのプロトン、31P及び13C NMR化学シフトが、同様の構造要素において先に報告されたものと同様であった。h1に関する1D-TOCSYにおいて、3.62ppmにおけるh’5ピークは、Kdo-(2-6)-β-D-GlcNIIグリコシド結合の加水分解に起因している。溶解して数ヶ月後、このグリコシド結合は、完全に加水分解され、3.82及び3.92ppmにおいて、h’5及びh”5が、それぞれ現れた。3.91ppmにおけるシャープなアノマーのしるしも、この二糖のh’1に起因していることが分かった。
【００５９】
Kdoに関して、H-4及びH-5共鳴が、H-3eqまたはH-3axの選択励起を伴う1D-TOCSY実験から、特定された。H-4共鳴は、31P HMQCによって確認されたC-4におけるホスフェート基に起因して、ダウンフィールドにシフトした。小さなJ5,6＜1Hｚが、H-5を越えるTOCSY移動(TOCSY transfer)を妨げた。しかしながら、KdoのX線構造にしたがい、強い核オーバーハウザー効果(NOE)が、図2cにおけるk4とk6との間に見られる。帰属特定を完了するため、1D NOESY-TOCSY(k4, k6)が用いられた(図4d)。後に示すように、HepI-(1-5)-Kdo結合に関して、KdoのC-5における置換の特色をよく示すdl-k7 NOEも見られた。このNOEを用いて、1D-NOESY-TOCSY(del, K7)(図4e)から検知されたKdo共鳴は、先の実験で見られたのと同じ化学シフト及び同様の多重項(multiplet)パターンがあり、Kdo 1H NMR帰属特定を確認した。次いで、Kdoに関する13C NMR帰属特定が、HMQCスペクトルから得られ、HMQC-TOCSYスペクトルから確認された。
【００６０】
残基iが、GlcIとして示す６−置換β−D−グルコースであると決定された。残基iに関するアノマー共鳴は、KdoのH-4共鳴とオーバーラップした。これら二つのオーバーラップする共鳴に関する1D-TOCSYにおいて、Kdoについての小さなJ5,6結合定数のため、残基iに関する共鳴を識別することができた(図4c)。H-6sまでの全ての共鳴を検知することができ、多重項の結合定数を測定することができた。そのβ-D立体配置のため、i1〜i3及びi1〜i5 NOEも、NOESYスペクトルにおいて観察された(図2及び図5f)。次いで、GlcIに関する13C NMR帰属特定が、HMQCスペクトルから得られ、HMQC-TOCSYスペクトルで確認された。末端グルコースの化学シフトとの比較から、C-6共鳴に関して、3.7ppmのグリコシド化ダウンフィールドシフトが見られ、その位置での置換を示した。C-5に関して、-2.2ppmのかなりのシフトも見られた。C-5−C-6結合についての回転異性体分布を、図5fにおいてi1〜i5 NOEに関して観察されたH-5多重項から、決定することができた。H-5多重項が、10Hｚの大きなJ4,5カップリングによって特徴付けられる(dominated)二重線(doublet)として現れるため、J5,6及びJ5,6’の両方が、小さな値＜2Hｚを有してるのが明らかであった。これは、H-6及びH-6’の両方が、溶解しているのが好ましいO6-C6-C5-O5=-60°回転異性体を有するH-5に対してゴーシュであることを示している。
【００６１】
残基cが、GlcIIとして示す末端α−D−グルコースであると決定された。c1に関する1D-TOCSY(図4f)から、H-5までの共鳴が検知され、測定されたプロトン結合定数に基づいて、残基cは、α−グルコースであることを示した。HMQCスペクトル及び末端グルコースモデル化合物の化学シフトとの比較から、全ての1H及び13C NMR帰属特定を完了することができた。
【００６２】
Galとして示す末端ガラクトースである残基jは、j1の1D-TOCSYから同定され、H-4までの共鳴が見られた(図4j)。小さなJ4,5結合定数を過ぎてH-5を確認するため、1D-TOCSY-NOESY(j1、j4)を行った(図4h)。HMQCスペクトル及び末端ガラクトースモデル化合物の化学シフトとの比較から、全ての1H及び13C NMR帰属特定を完了した。
【００６３】
ヘプトース残基を特定するため、モデル化合物を合成して正確な1H及び13C NMR化学シフト及びJH,H値を得た。これらは、化学シフトの比較によって末端ヘプトース単位を特定するのに極めて重要であった。また、グリコシド化をすると、置換された炭素の13C NMR共鳴は、かなりのダウンフィールドグリコシド化シフトを受ける。D−D−ヘプトース及びD−L−ヘプトースに関するプロトンスペクトルが、図6に示されている。溶液には、各化合物に関してαとβの両方の型が存在している。それらの1H NMRスペクトルが、1D-TOCSY実験を用いて特定された。正確な結合定数及び化学シフトを得るため、プロトンスペクトルのスピンシミュレーションを行った。シミュレートしたスペクトルを、図6に示す。シミュレートしたスペクトルは、観察したスペクトル、特にD−α−L−ヘプトースにおけるH-3-H-に関する強いカップリングを、正確に再現した（図6b）。13C NMR化学シフトを、HMQCを用いて特定した。ヘプトース単糖に関するこのNMRデータを、実施例１、表２に示す。L−D−ヘプトースの化学シフトは、D−L−ヘプトースの化学シフトと同じである。それらは互いに、鏡像異性体だからである。
【００６４】
A1における残基b、d、e、f及びgは、TOCSY実験における小さなJ1,2カップリングに起因するそれらの狭いアノマー共鳴及びH-1からH-2を越える磁化の移動の無いことから、ヘプトースとして確認された。ただ一つのH-1からの残基内(intra-residue)NOEは、H-2へのものであったので、A1における全てのヘプトースは、α−D立体配置を有していた(図2)。全てのヘプトース残基を特定するため,1D-TOCSY-TOCSY(H-1,H-2)を用いた。H-1からの第一のTOCSY工程は、磁化をH-2へと移動させるが、1.8Hｚという小さなJ1,2の値のため、さらなる移動は妨げられる。しかしながら、H-2における第二の工程は、3Hzというより大きなJ2,3の値のため、磁化をより高いスピンへとさらに移動させるであろう。しかしながら、L−D−ヘプトースに関しては、1.6Hzという小さなJ5,6値のため、磁化の移動はH-5で停止する。D−D−ヘプトースに関しては、3.2Hzという大きなJ5,6値のため、磁化の移動が妨げられにくい。しかしながら、緩和効果も磁化の移動を妨げることがあり、L−D−ヘプトースの同定の証明にH-5を越える移動が無いことを用いることはできない。
【００６５】
残基bは、HepIIとして示す2−置換L−α−D−ヘプトースであると決定された。1D-TOCSY-TOCSY(b1,b2)が、3.64及び3.9ppmにおいて共鳴を確認した(図7a)。3.64ppmにおける多重項パターンは、H-5共鳴を示すが、3.9ppmにおける多重項パターンは単糖で観察された強く結合したH-3及びH-4共鳴(図6b)に類似していた。H-6を確認するため、1D-TOCSY-TOCSY(b2,b5)を行った(図7b)。b2に関する第一のTOCSY工程では、a6共鳴も照射された(irradiated)が、第二の工程は、b5共鳴のみを選択した。B2からのNOEが、d2についての残基間(inter-residue)NOEとともに、b3及びb6について観察された。ひとたびb6の位置が分かると、H-7及びH-7’共鳴を特定するのにC-7-H-7s-C-6-H-6からのHMQC-TOCSYを用いた(図3b)。次いで、他の共鳴に関する帰属特定が、HMQCスペクトルから得られ、HMQC-TOCSY及びHMBCスペクトルから確認された(図3)。L−α−D−ヘプトースの化学シフトとの化学シフトの比較が、C-2に関する9ppmのダウンフィールドシフト及びC-2における置換を示すC-3に関する-0.8ppmのアップフィールドシフトを示した。C-4〜C-7化学シフトは、単糖の化学シフトの0.6ppm以内であった。
【００６６】
残基eは、HepIIIとして示す末端L−α−D−ヘプトースであると決定された。d1及びe1共鳴はオーバーラップしているが、これは、それらのH-2共鳴がオーバーラップしていないので、心配がない。1D-TOCSY-TOCSY(de1,e2)が、e3、e4及びe5スピンを確認した(図7c)。図5aのb1 NOEから、e5の共鳴も観察された。1D選択実験の高いデジタル分解能は、異なる実験の間の共鳴の正確な照合を、それらの多重項パターンの観察によって、可能にする。図5aにおいて、b1〜e7及びb1〜e7’NOEも見られた。後に分かるように、これらのNOEは、b1プロトンがe5並びにe7及びe7’プロトンと非常に接近していることに起因している。C-7-H-7s-C-6-H-6からのHMQC-TOCSYにおいて、H-6共鳴の位置が分かった。1H及び13C NMR帰属特定は、HMQC及びHMQCTOCSYによって完了した。残基eの1H及び13C NMR化学シフトは、L−α−D−ヘプトースの1H及び13C NMR化学シフトと類似していた。
【００６７】
残基dは、HepIとして示す3,4,6−三置換L−α−D−ヘプトースとして同定された。1D-TOCSY-TOCSY(de1,d2)は、4.17ppmにおける狭い多重項及び4.01ppmにおけるより広い多重項を確認した(図7d)。4.01ppm及び4.17ppm(d2)における多重項は、b1についての1D-NOEASYにおいても見られた(図5a)。4.17ppmにおける共鳴は、i1についての1D-NOESYにおいても見られた(図5f)。HMQCスペクトルにおいて、(δc,δh)(74.9,4.17)、(72.5,4.17)における二つの狭い交差ピーク(crosspeak)と(75.3,4.01)におけるより広い交差ピークが、確認された。  これらの交差ピークの間には、HMQC-TOCSY相関関係も見られた。実施例１、表２のα−D−ヘプトピラノース(heptopyranoses)の13C NMR化学シフトとの13C NMR化学シフトの比較から、(74.9,4.17)及び(75.3,4.01)における交差ピークは、13C NMRダウンフィールドグリコシド化シフトを受けたことが明らかであった。これら三つの交差ピークは、d3、d4又はd5からのものなので、C-5においてヘプトースの置換が起こりえないため、d5の交差ピークのみが大きなグリコシド化シフトを受けない。したがって、(72.5,4.17)における交差ピークは、(C-5,H-5)に帰するものとされた。(75.3,4.01)における交差ピークは、HMBC(d3,d1)及び(d3,b1)相関関係に基づき、(C-3,H-3)に帰するものとされた。したがって、(74.9,4.01)における交差ピークは、(d4,d1)として特定され、HMBC(d4,i1)相関関係及び(i1,d4)NOE(図3及び図5f)の観察と一致した。d6共鳴が、i1からの1D-NOESYから特定された。GlcI-(1-4)-HepI結合に関し、残基dがL−D−ヘプトースである場合にのみ、H-6に対する強いNOEが想定されるためである。d6共鳴は、c1に関する1D-NOESYについても観察された(図5b)。H-7及びH-7’共鳴は、HMQCTOCSY(C-7,H6)交差ピーク(図3)から及び1DNOESY-TOCSY(i1,d6)(図示せず)から位置が確認された。L−α−ヘプトースの化学シフトとの化学シフトの比較が、C-3、C-4及びC-6に関して、それぞれ3.9、7.9及び11.6ppmダウンフィールドグリコシド化シフトを示した。
【００６８】
以下に示すように、分岐ヘプトースの不均一性のため(図１)、4,6−二置換L−α−D−ヘプトース(d’)が存在するはずである。アノマー領域に関するHMQC及びCOSYスペクトルからは、H-1に関してもH-2に関しても、他の共鳴とのオーバーラップのため、離れたシグナルは、観察することができなかった。d’1のプロトン化学シフトは、d1に関する化学シフトと同じであり、d’2は、e2と類似の化学シフトがあったことが推測される。
【００６９】
残基ｇは、HepIVとして示す6−置換D−α−D−ヘプトースであると決定された。1D-TOCSY-TOCSY(g1,g2)が、g3、g4及びg5スピンを確認した(図7e)。3.94における多重項パターンは、H-5共鳴を示した。H-6を確認するため、1D-TOCSY-NOESY(g2,g5)を得た(図7f)。g2からのNOEが、i6についての推定の残基間NOEとともに、g3及びg6について観察された。g6がつきとめられると、H-7及びH-7’共鳴を特定するのに、C-7-H-7s-C-6-H-6(図3b)及び1D-NOESY-TOCSY(f1,g6)(図7g)からのHMQC-TOCSYが用いられた。次いで、他の共鳴についての帰属特定が、HMQCスペクトルから得られ、HMQC-TOCSYスペクトルを用いて確認された(図３)。1D-NOESY(f1)において、g6及びg5共鳴が見られた(図5d)。分子モデリングの研究(以下参照)から、NOE f1〜g5 NOEは、残基gがD−D−ヘプトースである場合にのみ可能である。D−α−D−ヘプトースの化学シフトとの化学シフトの比較が、C-6についての4.3ppmダウンフィールドシフトを示した。
【００７０】
残基ｆは、7−置換D−α−ヘプトースであると決定され、HepVとして示した。1D-TOCSY-TOCSY(f1,f2)は、f6までのスピンを確認し、残基ｆがD−D−ヘプトースであることを示した。f5多重項パターンは、極めてはっきりしていた。f6について開始した1D-TOCSYから、f7及びf7’共鳴が、同定された。次いで、13C NMRを、HMQCスペクトルから得て、HMQCTOCSYスペクトルを用いて確認した。α−D−D−ヘプトースの化学シフトとの化学シフトの比較が、C-7に関して8.8ppmダウンフィールドシフトを示した。f’と示す末端D−α−D−ヘプトースが、この結合部位における不均一性のため、検知されただけであった。1D-TOCSY-TOCSY(f1,f2)において見られるように、f’5及びf’6共鳴を、実施例１、表２におけるD−α−D−ヘプトースについてのHMQC及びHMQC-TOCSYスペクトルにおける交差ピークと類似の末端D−α−D−ヘプトースのHMQC及びHMQC-TOCSYにおける交差ピークに対応するHMQC及びHMQC-TOCSYにおける交差ピークとともに、検知することができた。
【００７１】
コアの八糖(octosaccharide)のシーケンスが、図5に示すアノマー共鳴に関する1D-NOESYスペクトルから、及びアノマープロトン共鳴のHMBCスペクトル(図3c)から確定された。残基間NOEも、図7b及び図7fの1D-TOCSY-NOESY実験において観察された。結果は、実施例１、表３にまとめ、構造を図1に示す。アノマー共鳴の積分(integration)及び新しい共鳴の経時的な出現から、不均一性の生じる結合部分を決定した。k(2-6)h結合及びb(1-3)d結合は、pH3の溶液において複数ヶ月かかって加水分解したが、j(1-7)f結合は安定していた。
【００７２】
普通でない大きな数の五つまでのシーケンシャル残基に亘る長い範囲のNOEが観察された。α−D糖に関して、H-1-H-2残基内NOEが、推測される。β−D−糖に関しては、H-1-H-3及びH-1-H-5残基内NOEが、推測される。(1-x)結合に関しては、H-1-C-1-O-1-C-x-H-xグリコシド間(interglycosidic)NOEが、推測される。H-x±1及びH-x±2についての二つの結合した糖の間の残基間アノマーNOEも、起こり得る。グリコシド結合の近傍でない他の残基間NOEは、実施例１、表３に掲げた長い範囲のNOEと見なす。
【００７３】
多数の長い範囲のNOEを説明するため、メトロポリス・モンテカルロ(MMC)法を用いて配座解析を行い、グリコシド結合角を変え、分子の多数の立体配座をサンプリングした。還元性末端位にKdoを有する内側コアオリゴ糖についてこの方法を用い、観察された長い範囲のNOEの全てが、e-b分岐〜g-i分岐に非常に近いことによって説明できることが分かった。HepI上の三つの分岐点によりもたらされる内側コア残基の限定のため、これらの長い範囲のNOEが可能であった。
【００７４】
計算から得た最小エネルギー配座異性体を、図8に示す。これらの座標(coordinates)から測定した種々のプロトン間距離を、実施例１、表３に示す。観察することができるように、ほとんどのNOEの発生が、短いプロトン間距離によって説明することができる。g1-b2及びg1-b3に関する長い範囲のNOEは、図8に描かれた分子モデルから得た距離と一致していない。(3,4,6)-HepI置換パターンに起因する制限はあるが、グリコシド結合については柔軟性があり、このことを考慮に入れなければならない。g1-b2及びg1-b3の距離に関して図9に示すように、観察されたNOEと一致する短いプロトン間距離を有する多数の立体配座をサンプリングする。同じ状況が、他の長い範囲及び残基間NOEに適用可能である。g1-b2及びg1-b3及びe1-i4についての長い範囲のNOEは、合計で6dfについて三つのグリコシド(φ,Ψ)角に関して可動性を有する四つの残基に亘るものである。五つの残基(e-b-d-i-g)に亘るe1-g2とe1-g3との間の長い範囲のNOEは、g(1-6)i結合についてのc-5−C-6結合に関するあり得る柔軟性を含まない、グリコシド角についての8dfにより多く起因して変化する。b1-e5、b1-e7及びb1-e7’は、e(1-2)bグリコシド結合についての可動性及び残基C-6-C-7についての回転に依存する。全ての場合において、短いプロトン間距離を有する多数の立体配座の発生は、観察された残基間の長い範囲のNOEと一致している。
【００７５】
本研究において、マンヘイミア・ヘモリティカA1のLPS分子のリピドA領域が、ビス−4,4’−リン酸化β−1,6と結合したD−グルコサミン二糖部分を含むことが立証された。この二糖に結合した脂肪酸アシル基の特質(nature)及びの置換パターンは、報告されたことがなかった。十分にアクリル化された(acrylated)LPS分子は、細菌細胞膜の最外リーフレットを形成し、膜の全体性を維持するのに不可欠である。この分子のグリコース(glycose)部分は、細菌細胞膜によって形成される平面から延びだして離れてゆくのが典型的である。LPSオリゴ糖部分は、病原性において重要であり、宿主免疫反応を引き出すのに関与する。このLPS分子のコアオリゴ糖及び膜付着リピドA部分の相対的大きさ及び配向の全体像を得るため、関連する微生物であるインフルエンザ菌において見られたリピドＡ脂肪酸置換パターンを用いて分子モデルを構成した。これは、図10に示されている。インフルエンザ菌リピドＡは、六つの脂肪酸アシル基を有しており、脂肪酸アシル基において、還元性グルコサミン残基のアミド基(C-2)及びC-3水酸基が、３−ヒドロキシテトラデカン酸によってアシル化されており、一方、非還元性残基のC-2’アミド基及びC-3’水酸基が、３−テトラデカノイルオキシテトラデカン酸によってアシル化されていると報告された。図10に見られるように、かなり強固な構造をなしている内側コアのため、グリコース部分が細菌細胞膜を形成するリピドA部分から突出している。より大きな可動性が、末端残基に関して、特に末端Gal残基に関して観察された。図2のNOESYスペクトルにおいて、この残基の高くなった可動性と合致して、アノマー共鳴に関するNOEは見られなかった。
【００７６】
幾つかのLPSのコア構造が、非常に枝分かれしていることが分かり、これが、内側コアに関する明瞭な立体配座に帰着しうる。先の研究において、モラクセラ・カタラリス(カタラリス菌：Moraxella catharrhalis)のLPSが、非常に珍しいアンチ配座異性体(anti conformer)が見られる普通でない立体配座をとっていることが分かった。このLPS分子における非常に枝分かれした3,4,6−三置換D−グルコース残基に関して、枝分かれしたグルコース単位へのβ-D-Glcp-(1-4)-DGlcp結合について180°に近い二面角(C-1’-O-1’-C-4-H-4)が検知された。
【００７７】
本研究の結果は、マンヘイミア・ヘモリティカ血清型A1のLPSコアオリゴ糖領域の構造の詳細な図を提供した。我々は先に、マンヘイミア・ヘモリティカLPSのオリゴ糖領域が、マウス、ヒツジ及びウシにおいて免疫原性であること、及び１２のマンヘイミア・ヘモリティカ血清型のうちの８つ(例えば、血清型A1、A5、A6、A7、A8、A12、A14及びA16)が、共通のコアオリゴ糖決定基(core oligosaccharide determinant)を分かち合っていることを示した。血清型A1及びA8からのコアオリゴ糖は、共通の基本構造の存在を証明するほとんど同一の1H NMRスペクトルを示している。本研究の結果に基づいて、マンヘイミア・ヘモリティカによって生成されたO-鎖を欠くLPSは、おそらくO-鎖の結合部位を与える残基である末端Gal単位を欠いていることが明らかである。マンヘイミア・ヘモリティカ血清型間のLPS構造の違いの理解が、マンヘイミア・ヘモリティカ・ウシパスツレラ症に対するワクチンに関する基礎をもたらすことができた。血清型A1は、この病気を引き起こす主な微生物であり、地球全体のウシの死の30％を占める。ワクチン製剤におけるこの微生物の病原性がより低い血清型又は抗原の使用が、有効な病気処理戦略を提供することができた。
【００７８】
実施例１のための実験
マンヘイミア・ヘモリティカからのLPSの調製
パスツレラ(マンヘイミア)・ヘモリティカ血清型A1(NRCC4212)を、カナダ、サスカチェワン州のサスカトゥーンの獣医学感染症機関[Veterinary Infectious Diseases Organization (VIDO)]から得た。先にセバーン(Severn)等のCarbohydr. Res. 240,277 (1993)に記載された高温含水フェノール法によって発酵槽で育成した培養菌からLPSを抽出し、精製した。
【００７９】
バックボーンオリゴ糖を与えるためのLPSの脱アシル化
ホルスト(Holst)等の脱アシル化の修飾(modification)手法によって、先にセバーン(severn)等のJ. Bacteriol. 178, 1731 (1996)に記載されたように、バックボーンオリゴ糖を調製した。周囲温度で無水ヒドラジンで試料(400mg)を処理(2ml、37℃、30分)することにより、LPSのリピドAからエステルの結合した脂肪酸を取り除いた。過剰のヒドラジンを、冷却した反応混合物(0℃)に三倍量の(three volumes)アセトンを加えることにより破壊した。沈殿したO-脱アシル化LPS生成物を、遠心分離(5000rpm、10分)によって単離し、アセトンで洗浄し、水から凍結乾燥した。N−アシル基の除去は、O-脱アシル化試料(200mg)を、KOH水溶液(4モル、10ml)中で100℃で20時間加熱することによって行なった。反応混合物を冷却し(0℃)、4モルHCｌで中和し、沈殿した脂肪酸を遠心分離(12000 x g、30分)によって取り除いた。上澄みを、500分子量カットオフ膜を有するアミコン(Amicon)濃淡電池(Amicon; YC05)内で濾過し、溶離液が塩化物イオンを含まなくなるまで(硝酸銀水溶液を用いて測定する)、脱イオン水で洗浄した。透析した材料を、凍結乾燥し、脱アシル化LPSを得た(約80mg)。オリゴ糖を、DEAE A-25を用いてアニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。バックボーンオリゴ糖画分(約50mg)は、陽イオンESI-質量分析(ESI-MS）でm/z 1124.8において二荷電イオンを、Hex3Hep5 Kdo HexN2(H2PO3)3 (M, 2246.9)の組成に対応する主要イオンとして示した。二荷電イオンのタンデム質量分析(MS-MS)は、m/z 500 (HexN2(H2PO3)2)及び801 (KdoHexN2(H2PO3)2)において、脱アシル化リピドA及びKdo-P置換単位にそれぞれ相当する特徴的なフラグメントを与えた。
【００８０】
D−グリセロ−L−マンノ−ヘプトース
アルカリ性メタノール中でのD−ガラクトースとニトロメタンとの縮合により、ヘプトースを調製した。脱イオン化生成物(融点158℃、収率21％)の水溶液から得られた結晶質1−デオキシ−1−ニトロ−D−グリセロ−L−マンノ−へプチトール(heptitol)を、そのナトリウム塩に変換した。希硫酸(35℃)で処理をし、次いで、Rexyn 101(H+)及びAmberlite A4(OH−)イオン交換樹脂で脱イオン化して直ぐに、溶液を凍結乾燥してヘプトースをシロップとして得た(収率80％)。生成物を、ブタン-1-オール−水（1:10 v/v）を溶離液として用いたセルロースカラムクロマトグラフィーによって、分別した。ヘプトースを含む画分を、減圧下で乾燥するまで濃縮した。[α]D−14°(c 0.2、水)を有するD−グリセロ−L−マンノ−ヘプトースは、ペーパークロマトグラフィーによって純粋であり、気-液クロマトグラフィー(GLC)に供したその還元され(NaBH4)てアセチル化された生成物は、真正のヘプタ−O−アセチル−D−グリセロ−L−マンノ−へプチトールのものに、保持時間において相当する一つのピークをもたらし、その純粋性を証明した。
【００８１】
D−グリセロ−D−マンノ−ヘプトース
D−アルトロースからD−アルトロースとニトロメタンとの縮合を経て調製され、1−デオキシ−1−ニトロ−D−グリセロ−D−マンノ−へプチトールを得た(融点109℃、。[α]D−7.0°(c 1.1, EtOH)、収率27％)。これのナトリウム塩水溶液を、0℃に保った20％(v/v)の硫酸に、攪拌しながらゆっくりと滴下すると、D−グリセロ−D−マンノ−ヘプトースに変換された。反応混合物を、飽和水酸化バリウム溶液で中和し、濾過し、Rexyn 101(H+)及びDuolite A4(OH−)イオン交換樹脂を通過させて残留したイオン性物質を除去し、濃縮してシロップとした(収率92％)。ペーパークロマトグラフィーによって示されたヘプトース生成物は、アルトロースと変化していない1−デオキシ−1−ニトロ−D−グリセロ−D−マンノ−へプチトール(約2〜3％)が在って純粋ではなかった。この生成物を、移動相としてブタン-1-オール−水(1:10 v/v)を用いたセルロースカラムクロマトグラフィーによって精製した。このD−グリセロ−D−マンノ−ヘプトースは、[α]D＋22°(c2、MeOH)を有していた。気-液クロマトグラフィー(GLC)に供した還元され(NaBH4)てアセチル化された試料が、真正のヘプタ−O−アセチル−D−グリセロ−D−マンノ−Dへプチトールに相当する一つのピークをもたらし、合成したヘプトースの同一性と純粋性を示した。
【００８２】
エレクトロスプレー質量分析
VG Quattro(英国、マンチェスター、マイクロマス)のエレクトロスプレーイオン源を備えた三連四重極質量分析計で、試料を分析した。バックボーンオリゴ糖を、0.5％の酢酸を含むアセトニトリル−水(約1:2 v/v)に、溶解させた。注入量は10μlであり、流量は毎分4mlに設定した。エレクトロスプレー先端電圧は、典型的に2.7kVであり、質量分析計は、10秒のスキャン時間でm/z 50〜2500を走査した。タンデム質量分析(MS-MS)実験のため、第一の四極子を用いて前駆イオンを選択し、RF専用の四重極セル内でアルゴンでのアルゴンを用いた衝突活性化によって生じたフラグメントイオンを、第三の四極子を走査することによって質量分析した。衝突エネルギーは、典型的に60eVであった(実験室基準枠)。
【００８３】
核磁気共鳴
標準的なソフトウェアを用いて、Bruker AMX 600、AMX 500、又はVarian Inova 600分光計でNMRスペクトルを得た。0.6mlの重水(D2O)に溶解した10mgの試料を含んだ全ての測定は、300K、pH3で行なわれた。測定は、先に行なわれたように(Cox、1996)、プロトンスペクトルの解像能を向上させるため、pH3で行なわれた。アセトンを、2.225ppmで1Hスペクトル用に、31.07ppmで13Cスペクトル用に、内部又は外部基準として用いた。オリゴ糖の全体の帰属特定のため、標準的な等核又は異核相関(correlated)2D技術：COSY、TOCSY、NOESY、三量子等核相関実験(triple quantum homonuclear correlated experiment)、HMQC、HMQC-TOCSY、HMBC及び31PHMQCが、使用された。ヘプトース単糖に関するスピンシミュレーションが、標準的なVarianソフトウェアを用いて行なわれた。正確な化学シフト及び結合定数が、スペクトルのピークリスティングからではなく、スピンシミュレーションを行うために用いたパラメータから、得られた。
【００８４】
残基帰属特定を完成するため、及びf残基間1H−1H核オーバーハウザー促進(nuclear Overhauser enhancements)を測定するため、選択的1D-TOCSY、1D-TOCSY-TOCSY、1D-TOCSY-NOESY、及び1D-NOESY-TOCSY実験を行なった。1D選択的シーケンスの使用を記述するために用いた用語は、1D EXP (スピン、ミキシングタイム)及び1D EXP1-EXP2(スピン1、ミキシングタイム；スピン2、ミキシングタイム)であり、ここで、EXP、EXP1、及びEXP2は、TOCSY又はNOESYの何れかを意味する。また、図において、選択した共鳴には、下線が付してある。二重に下線を付した共鳴は、この共鳴が第二の選択ステップとして選択されたことを意味する。図1に示すように、全ての残基が文字でラベルが付されており、スピンが原子番号でラベルが付されているので、a1は、残基aのH-1共鳴を示す。
【００８５】
AMX分光計で、半ガウス形パルス(half-Gaussian pulse)によって選択励起を行った。TOCSYに用いるミキシングタイムは、スピン系に依存する。スピン系を特定するのに、通常30分〜180分の範囲のミキシングタイム(スピンロックタイム)が用いられる。1D-NOESYのためのミキシングタイムは、分子とグリコシド結合の回りの内部運動との相関時間に依存する。NOESYのミキシングタイムは,150分〜400分の範囲内であった。末端Gal残基に関する残基間NOE(inter-residue NOE)を検知するため、500分のミキシングタイムで1D-ROESY実験を行った。二重選択的(doubly selective)実験に関して、緩和効果に起因する信号強度の損失を避けるため、選択パルスをできるだけ短く保った。各パートは、その時々で最適化されたものであった。1D-TOCSYは、およそ分単位で実施することができた。1D-NOESYは、NOEのマグニチュードに依存して分単位から時間単位かかった。幾つかの二重選択的実験は、最長12時間かかった。1D-TOCSY-TOCSY及び1D-TOCSY-NOESYは、最も効率的であった。試料が経時的に分解する(degraded)ので、幾つかの実験を、パルスフィールド勾配を利用したInova 600分光計で行った。
【００８６】
分子モデリング
先に記載のメトロポリス・モンテカルロ法[(Peters et al. Carbohydr. Res. 238,49 (1993)]を用いて配座解析を行った。PFOSポテンシャルを使用した。量子化学プログラムエクスチェンジ[Quantum Cemistry Program Exchange (QCPE)]から入手可能なMM3を使用して、単糖に関する最小化された座標(coordinates)を得た。各二糖の最小エネルギー立体配座を、出発の立体配座として用いた。還元末端のにおけるKdoから初めて、全体の構造まで、種々のオリゴ糖に関して計算を行った。内側コア八糖に関して、グリコシド結合について5°のステップ長さ及び1ｘ103Kの温度で、5ｘ104マクロムーブを用い、0.36のアクセプタンス比に帰着した。内側コア八糖のための分子モデルを、最小エネルギーの配座異性体を用いて作製した。各マクロムーブにおける保存された(saved)座標から、距離を抽出した。リピドA構造及びKdo結合に関する最小エネルギー配座異性体を用いて、リピドAを有する完全なLPSを生成させた。ドイツ、フライブルグ大学のE. KeelerによるSchaka197を用いて分子製図(molecular drawing)を行った。
【００８７】
（実施例１--表１）
【表３】
2007537307.tif 000013
【００８８】
（実施例１−表２）
【表４】
2007537307.tif 000014
【００８９】
（実施例１−表３）
【表５】
2007537307.tif 000015
【００９０】
実施例２：この実施例は、Carbohydr. Res. 339;1973 (2004)における発表の基礎をなすものである。
アクチノバシラス・プレウロニューモニーの血清型5a、b、2及び1の研究
カラムで分別したLPSの糖分析が、グルコース(Glc）、ガラクトース(Gal)、N−アセチル−グルコサミン(GlcNAc)、D−グリセロ−D−マンノ−ヘプトース(DD-Hep)、及びL―グリセロ−D−マンノ−ヘプトース(LD-Hep)が、それぞれ、ほぼ２：１．５：１：２：３の比であることを明らかにした。材料及び方法で説明したような、酸加水分解物のゲル濾過クロマトグラフィーによる分別をして、コアオリゴ糖(core OS)を精製し、コアオリゴ糖に富む比較的O-抗原のないフラクションを得て、糖分析に供した。この糖分析は、Glc、Gal、DD-Hep、及びLD-Hepが、それぞれ、２：１：２：３の比であることを明らかにした。血清型5bの莢膜多糖が、N−アセチル−D−グルコサミン及びケトースを含んでいるので、我々は、LPSには、莢膜(CPS)汚染があるのではないか、また、CPSにおけるケトシド結合のコアオリゴ糖を得るのに用いた酸加水分解条件に対する感受性のため、分別したコアオリゴ糖試料は、CPSを含まないのではないかと推測した。加えて、比較的少量の唯一のO-抗原残基であるガラクトースが、検査したフラクションは、もともとO-抗原エクステンションをあまり含まないコアオリゴ糖であったことを示唆した。
【００９１】
LPS-OHを調製し、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画した。低い割合のO-抗原を含む容積と一致する容積で溶離するフラクションを、CE-ES-MSによって分析した(実施例２、表１)。2Hex、5Hep、Kdo、及びリピドAの組成物と一致する2537原子質量単位(amu)の分子に相当する単純な質量スペクトルが、観察された。二荷電イオン、m/z 1268、に関するCE-MS/MS分析(データは示さず)が、m/z 951及びm/z 1584において二つの一荷電のピークをもたらし、O-脱アシル化リピドAの大きさが952原子質量単位であり、コアオリゴ糖の大きさが1584原子質量単位であることを確認した。O-脱アシル化リピドA種(952 amu)は、N−アシル化(3-OH C 14:0)グルコサミン残基の二糖からなっており、各残基は、ホスフェート分子で置換されている。分別したオリゴ糖試料のES-MS及びCE-ES-MS分析が、2Hex、5Hep及びKdoの組成物と一致する1505ダルトン(Da)の質量を示した(実施例２，表１)(図11)。後に溶離するコアオリゴ糖フラクションのCE-ES-MSスペクトルは、主要な糖型よりも高い1562.57原子質量単位の質量を有していた(実施例２、表１)。この質量は、髄膜炎菌及びインフルエンザ菌のLPSにおいて最近観察されたアミノ酸グリシンに相当する。CE-ES-MS/MS分析が、このグリシン残基を、Kdo分子からの第二のヘプトース残基上につきとめた(データは示さず)。
【００９２】
分子の結合パターンを決定するため、コアオリゴ糖についてのメチル化分析を行った。コアオリゴ糖単独に相当するフラクションについての分析が、ほぼ等モル量の末端Glc、6-置換Glc、末端DD-Hep、末端LD-Hep、6-置換DD-Hep、2-置換LD-Hep及び3,4,6-置換LDHepの存在を示した。オリゴ糖の、O-抗原を多く(predominantly)含むより先のフラクションの分析が、６-置換Gal(O-抗原成分)の存在を示し、O-抗原の結合パターンを確認した。このオリゴ糖の正確な位置及び結合パターンを明らかにするため、O-抗原がないためオリゴ糖に富むフラクションについてのNMR研究を行った(図12a)。オリゴ糖の1H共鳴の帰属特定を、COSY及びTOCSY実験によって実行した。
【００９３】
図13は、オリゴ糖における各残基のアノマー1H-共鳴からの一連の選択的1D-TOCSY実験を示している。NMR分析の間に、Ap 5aオリゴ糖が、マンヘイミア・ヘモリティカ・コアオリゴ糖の構造と構造的に関連があり、この1H NMRデータを参照することが、Ap 5aオリゴ糖スペクトルの帰属特定の助けになることが明らかになってきた(実施例２、表２)。
【００９４】
Ap 5aオリゴ糖の選択的スペクトルにおいて、ヘプトース残基[Hep I(図13a)、Hep II(図13b)、HepIII(図13c)、Hep IV(図13d)及びHep V(図13e)]から生じたスピン系が、マンノーピラノシル環系を示すそれらのスピン系の出現と結びつけられた5.11ppm(HepI)、5.70ppm(HepII)、5.17ppm（HepIII）、4.96ppm(HepIV)及び5.03ppm(HepV)におけるそれらのアノマー1H共鳴から容易に確認された。HepI及びHepIIのアノマープロトンに関して観察される不均一性は、酸加水分解によるKdo残基の転位に起因するものであった。5.21ppm(GlcII)におけるα−アノマー領域の残りの残基は、グルコ−ピラノース糖であると、そのスピン系の出現に基づいて、決定された(図13f)。スペクトルの低フィールド領域(4.45〜6.00ppm)におけるアノマー共鳴の残りは、それらのアノマー1H共鳴により、分解した残基の場合には、それらの高いJ1,2(約8Hz)結合定数により、全てβ-結合残基に帰するものであった。4.66ppm(Glc)における共鳴の一つが、スピン系の出現からグルコ−立体配置に帰属特定された(図13g)。4.49ppm(Gal I)での低フィールド領域における残りの共鳴は、TOCSY実験におけるH-4共鳴に特徴的なスピン系の出現からガラクト−ピラノシル残基に帰属特定された(図13h)。Kdoスピン系もこの実験で、4.48ppmにおけるKdoのH-6 1H共鳴も照射され、4.10ppm及び4.21ppmにおいて、それぞれ、H-4及びH-5 1H共鳴を示したので、アクセスされた(Gal Iに関するアノマー共鳴及びKdoに関するH-6共鳴は、オーバーラップしており、4.48におけるヒットは、両方の共鳴をヒットする)。しかしながら、Kdoのスピン系は、コアの加水分解によるKdo残基の転位と、おそらく重水素交換によるメチレンH-3プロトンの非常に低い強度レベルとに起因して、完全に決定するのが困難である。しかし、このスピン系はさらに、他の1D-TOCSY実験で、1.92ppmにおけるH-3アキシアルプロトンから特定され、2.08ppmにおけるエクアトリアルプロトン及び4.10ppmにおけるH-4プロトンに関する1H共鳴を示した(データは示さず)。
【００９５】
オリゴ糖におけるグリコシル残基のシーケンスは、隣り合うグリコシル残基のアノマープロトンとアグリコン(aglyconic)プロトンとの間の残基間1H-1H NOE測定から決定され、メチル化分析データを確認し、広げた。Ap5aオリゴ糖に関する結合パターンが、このようにして決定された(実施例２、表２)。したがって、プロトン対H-1とHep II H-2(図14a)及びHep II H-1とHep I H-3(図14b)の間の強いグリコシド転位(transglycosidic)NOE結合性の出現が、三つのLDヘプトース残基のシーケンスと結合位置を確定した。この結合パターンは、マンヘイミア・ヘモリティカ及びインフルエンザ菌からの内側コアオリゴ糖において共通に生じた。
【００９６】
さらに、アノマープロトンHep III H-1とHep II H-1との間の残基間NOEが、1,2-結合の確認をもたらした。GlcのH-1からのNOE結合性の試験が、Hep I H-4とHep I H-6に対する残基間NOEによってこのグルコース残基が、4位においてHep Iに結合していることを示した(図14c)。H-6に対する残基間NOEの出現は、4-置換ヘプトース残基に関して共通に生じるものである。Glc IのH-1とGlc IIのH-1との間の長い範囲のNOE結合性の発生は、α立体配置のグルコース残基(Glc II)は、マンヘイミア・ヘモリティカからのオリゴ糖に関して先に観察されたように、6位においてHep Iを置換していることを示唆した。Glc IIのH-1からのNOE結合性の試験が、Hep I H-6に対する残基間NOEによって、このグルコース残基が、6位においてHep Iに結合していることを確認した(図14d)。Glc Iと同様に、Glc IとGlc IIのアノマー1H共鳴の間に、長い範囲のNOE結合性が観察された。残存するヘプトース残基(Hep IV及びHep V)の結合位置が、以下のように推定された。
【００９７】
Hep IVのH-1からのNOE結合性の試験が、Glc I H-6及びH-6’に対する残基間NOEによって、このヘプトース残基が、6位においてGlc Iに結合していることを示した(図14e)。最後に、Hep V H-1〜Hep IV H-6のNOE結合性によって、Hep Vが、6位においてHep IVを置換していることが確認された(図14f)。加えて、血清型5aからのオリゴ糖のNMR分析が、O-鎖ガラクトース残基の結合位置を確認できるようにした。この目的に、ただ一つのガラクトース残基を含むフラクションを用いた。アノマー1H共鳴からのNOE結合性は、3.68ppm及び3.93ppmにおけるH-3及びH-5に対する残基内結合性(intra-cnnectivities)と3.93ppmに対する残基間結合性(inter-connectivity)を含んでいた(図15a)。
【００９８】
次いで、3.93ppmにおけるプロトン共鳴のスピン系を同定するため、選択1-D実験を用いた。TOCSYステップでの3.93ppmにおける共鳴の選択励起が後に続くNOESYステップでのGal IのH-1プロトンからのNOESY-TOCSY実験が、3.93ppmにおける共鳴の4.06ppmにおける共鳴に対する結合性を確認した(図15a)。150msのミキシングタイムを利用した5.16ppmにおけるHep III残基のアノマープロトン共鳴からの1-DTOCSY実験が、3.82ppmにおけるこのスピン系のH-4及びH-5プロトン共鳴を示した(図13c)。次いで、この共鳴は、4.06ppmにおけるHep III H-6共鳴を示したNOESYステップにおいて選択的に照射され、Hep III残基の7位を、O-鎖の結合位置として確認した(図15c)。確証的なデータが、13C-１H HMBC実験から得られた。この実験は、-CH2-基を示す13C-１H HSQCスペクトルにおける正のピーク(positive peak)として現れた3.93ppmにおけるプロトン共鳴と相関関係があることが13C-１H HSQC実験において分かった(図15e)70.3ppmにおける13C共鳴と相関関係のある4.48ppmにおけるO-鎖ガラクトース残基のアノマー１H共鳴からの交差ピークを同定し(図15d)、ヘプトース残基の7位をO-鎖の結合位置として確認した。この結論は、7-置換LD-Hep残基の存在を示したガラクトース残基を一つだけ含むフラクションについてのメチル化分析によって確認された。この過メチル化された酢酸アルジトール(permethylated alditol acetate)誘導体は、O-鎖のないコアオリゴ糖のメチル化分析では観察されなかった。
【００９９】
アクチノバシラス・プレウロニューモニー血清型5bの研究
血清型5bからのLPS、LPS-OH及びオリゴ糖の全ての分析は、血清型5aに関して説明した先の分析(実施例２，表１及び２；図12b)と、同じか非常に似ていた。
【０１００】
アクチノバシラス・プレウロニューモニー血清型2の研究
元のままの(intact)LPSの糖分析が、この材料におけるO-抗原及び莢膜多糖の存在と一致する約８：２：２：１：２：１：２の割合でのGlc、DD-Hep、LD-Hep、Rha、Gal、GlcNAc及びGalNAcの存在を示した。分別した酸加水分解物の糖分析が、O-抗原に富むフラクションと一致する約２：１：１：１の割合でのGlc、Rha、Gal及びGalNAcの早く溶離したフラクションにおける存在を示した。O-抗原の存在しない富化された後で溶出したフラクションは、このコアオリゴ糖フラクションからのO-抗原の不存在と一致する約３：２：３の割合でのGlc、DD-Hep及びLD-Hepのみの存在を示した。
【０１０１】
LPS-OHを調製し、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分別した。少ない割合のO-抗原を含むフラクションと一致する容積で溶離するフラクションを、陰イオンモードでのCE-ES-MSによって分析した(実施例２、表１)。ホスフェート残基の不存在と一致する80原子質量単位(amu)未満の質量を有すると示される少量の第二の分子を含む3Hex、5Hep、Kdo、P、リピドA-OHの組成物と一致する2700原子質量単位の分子に相当する単純な質量スペクトルが、観察された。三荷電の(triply charged)イオンm/z 899に関するCE-MS/MS分析(データは示さず)が、m/z 951において一荷電のピークをもたらし、2700 amuの質量の主要な分子に関するO-脱アシル化リピドAの大きさを952 amuと確認した。O-抗原が存在せず富化された(enriched)分別されたコアオリゴ糖試料のCE-ES-MS分析が、3Hex、5Hep、Kdoの組成物と一致する1667ダルトン(Da)の質量を示した(実施例２，表1)。したがって、質量分析が、血清型2のコアオリゴ糖が、血清型5a及び5bからのコアオリゴ糖よりも余分のグルコース残基を含んでいることを示した。
【０１０２】
O-抗原が存在せず富化されたコアオリゴ糖のメチル化分析が、約６：３：３：２：１：２：３：２の割合での末端Glc、6-置換Glc、末端DD-Hep、末端LD-Hep、2-置換DD-Hep、2-置換LD-Hep、4,6-二置換DD-Hep、及び3,4,6-三置換LD-Hepの存在を示した。血清型2及び5bのオリゴ糖に関するメチル化データの間の主な相違は、6-一置換DD-Hepの4,6-二置換DD-Hepによる置換であり、内部DD-Hepの4位を、余分のグルコース残基の結合位置として仮説的に特定した。血清型2と5bとの間のメチル化分析によって確認された末端グルコース残基の比も、血清型2のコアオリゴ糖における余分の末端グルコース残基の存在と一致している。
【０１０３】
1H NMRデータ(実施例２、表１、(図12c))が、質量分析及びメチル化分析を裏付け、血清型2のコアオリゴ糖は、余分の末端α-立体配置グルコース残基(Glc III)を確認した以外は血清型5bに関して分かったコアオリゴ糖と同じであることを確認した。NOEデータが、4.53ppmにおけるGlc IIIのアノマープロトンの1H共鳴から3.96ppmにおけるHep IVの4位の1H共鳴への残基間(inter)NOE結合性により、Hep IVの4位におけるGlc III残基の結合位置を明示した。NOE結合性が、4-置換ヘプトース残基に関して先に観察されたように、Hep IVの6位に対しても観察された。
【０１０４】
アクチノバシラス・プレウロニューモニー血清型1の研究
カラムで分別されたLPSの糖分析が、約１：３：１：０．５：１：３の割合でのRha、Glc、Gal、GlcNAc、DD-Hep及びLD-Hepの存在を示した。Rha及びGlcNAcの確認は、いくらかのO-抗原成分が、このフラクションになお存在することを示唆した。O-抗原が存在せず富化されたコアオリゴ糖の糖分析が、２：１．５：１：３の割合でのGlc、Gal、DD-Hep、及びLD-Hepの存在を示した。欠損なしの(full length)O-抗原を含むより早く溶出するフラクションに関する糖分析が、この血清型のO-抗原の公表された構造と合致する約２：１：１の割合でのRha、Glc及びGlcNAcの存在を示した。
【０１０５】
LPS-OHを調製し、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分別した。少ない割合のO-抗原を含むフラクションと一致する容積で溶離するフラクションを、陰イオンモードでのES-MS及びCE-ES-MSによって分析した(実施例２、表１)。ホスフェート残基の不存在と一致する余分のホスホエタノールアミン残基及び80原子質量単位(amu)未満の質量を有すると第三の分子の存在と一致する123amuより大きな質量を有すると示される少量の第二の分子を含む4Hex、HexNAc、4Hep、Kdo、P、リピドA-OHの組成物と一致する2874原子質量単位の分子に相当する単純な質量スペクトルが、観察された。三荷電の(triply charged)イオンm/z 957に関するCE-MS/MS分析(データは示さず)が、m/z 951において一荷電のピークをもたらし、2874 amuの質量の主要な分子及びコアオリゴ糖に相当するm/z 959における二荷電イオンに関するO-脱アシル化リピドAの大きさを952 amuと確認した。O-抗原が存在せず富化された(enriched)数個のコアオリゴ糖フラクションに関するCE-ES-MS分析が、4Hex、HexNAc、4Hep、Kdoの組成物と一致する1840ダルトン(Da)の質量を示した(実施例２，表1)。m/z 930における二荷電イオンに関する陽イオンモードでのCE-MS/MS分析が、以下のHexNAc m/z 204、Hex-Hex-HexNAc m/z 528、Hep-Hex-Hex-HexNAc m/z 720を含む血清型1コアオリゴ糖における残基の群の存在を示した(図16)。したがって、質量分析が、血清型1のコアオリゴ糖が、血清型5a及び5bからのコアオリゴ糖よりも少ない一つのDD-Hep残基を含むが、余分の2Hex及びHexNAc残基を含んでいることを示した。しかしながら、O-抗原が存在せず富化されたコアオリゴ糖の糖分析におけるHexNAcについての証拠のないことが、当初は混乱させるものであった。
【０１０６】
O-抗原が存在せず富化されたコアオリゴ糖に関するメチル化分析が、ほぼ等モル量の末端Glc、6-置換Glc、3-置換Gal、末端LD-Hep、4,6-二置換Gal、4-置換DD-Hep、2-置換LD-Hep及び3,4,6-三置換LD-Hepの存在を示した。またしても、HexNAc残基に関する何らの証拠がないことが、困惑させるものであった。
【０１０７】
したがって、質量分析、糖分析及びメチル化分析のデータは、血清型2、5a及び5bに関して観察された内側コア構造と合致しており、1H NMRのデータが、それらの推測を裏付けた(図12d)(実施例２、表１)。1H NMRのデータは、また、血清型2、5a及び5bからのコアオリゴ糖には存在していない余分のコアオリゴ糖残基の同定を可能にした。α-立体配置のガラクトース残基(Gal II)が、TOCSY実験におけるH-4 1H共鳴に対する特徴的なスピン系により、5.18ppmにおいて帰属特定された。β-立体配置のガラクトース残基(Gal I)が、そのアノマープロトンの1H共鳴により、また、その特徴的なスピン系の出現から、4.55ppmにおいて同定された。α-立体配置のN-アシルヘキソサミン残基(HexNAc)が、13C-1H HSQC実験における52.6ppmの13C化学シフトと相関関係のある4.34ppmにおけるそのH-2プロトンの1H共鳴により、4.88ppmにおいて帰属特定された(図17a)。13C化学シフトは、窒素置換された炭素原子と合致している。しかしながら、H-2プロトンを越えてこのHexNAc残基のスピン系にアクセスするのは、非常に困難であり、H-2プロトンの化学シフトは、かなり低フィールドのものであると思われた。残基間NOE結合性が、4.55ppmにおけるGal I残基のアノマープロトンと3.94ppmにおけるHep IVの4位との間の結合パターンを証明した。同様の態様で、5.18ppmにおけるGal IIのアノマープロトンと3.79ppmにおけるGal I残基の3位との間のNOE結合性が、この結合を証明した。しかしながら、4.88ppmにおけるHexNAc残基のアノマープロトンと4.25ppmにおけるGal IIの4位並びに4.12及び4.01ppmにおけるこの残基の6位との間の結合性が、紛らわしいにもかかわらずメチル化分析データと合致して、HexNAc残基が4位と6位の両方でGal II残基を置換していることを示唆した(図17c)。メチル化されたオリゴ糖のFAB-MSが、オリゴ糖のこの部分の糖の配列に対するさらなる洞察をもたらした。観察されたA型グリコシルオキソニウム一次イオン及び二次イオン(メタノールの喪失)のm/zは、以下の通りである：464→432(Hex, HexNAc)+、668→636(Hex2, HexNAc)+、916→884(Hex2, HexNAc, Hep)+、1120→1088(Hex3, HexNAc, Hep)+、1368(Hex3, HexNAc, Hep2)+、1572→1540(Hex4, HexNAc, Hep2)+及び1865→1833(Hex3, HexNAc, Hep4)+。このFABデータは、NOE及び陽イオンCE-ES-MS/MSデータと合致したが、末端HexNAc残基に関する証拠のないことが混乱させるものであった。しかし、糖分析及びメチル化分析のデータと一致していた。したがって、HexNAc残基に関する決定的なデータの欠如は、推定されたHexNAc残基の性質を特定し、血清型1からのコアオリゴ糖のこの領域に関する結合パターンを確認するための、より程度の高いNMRの研究を促した。
【０１０８】
30〜150msの範囲のミキシングタイムでの4.88ppmにおけるHexNAc残基のH-1 1H共鳴からの一連の選択1D実験が、4.34ppmにおけるH-2 1H共鳴並びに4.13ppmにおけるH-3及び3.36ppmにおけるH-4に帰属特定される弱いシグナルを示した。これらの推定を確認し、このHexNAc残基の帰属特定を完了するため、選択実験をさらに行った。3.36ppmにおけるH-4 1H共鳴から1-D TOCSY実験が得られ、H-2及びH-3帰属特定を確認し、それぞれ、3.93、3.66及び3.64ppmにおけるH-5及びH-6, 6’共鳴を同定した(図17d)。4.34ppmにおけるH-2 1H共鳴から1D NOESY実験が得られ、H-3及びH-4帰属特定を確認した(図17e)。3.36ppmにおけるH-4 1H共鳴から1D NOESY実験が得られ、H-2、H-3、H-5及びH-6, 6’帰属特定を確認した(図17f)。これらの実験から結合定数が決定され、J1,2 4.8 Hz、J2,3 1.0 Hz、J3,4 9.7 Hz、J4,5 1.4 Hz、J5,6 6.5 Hz、J5,6’ 6.5 Hz及びJ6,6’ -12 Hzであることが分かった。2D-13C-1H-HSQC NMRスペクトル(図17e)を行った。このスペクトルは、HexNAc分子のC-1位〜C-6位に関する13C化学シフトを、それぞれ、101.1ppm、52.6ppm、68.5ppm、70.0ppm、70.7ppm及び64.1ppmと同定した。このデータは、当初は混乱させるものであったが、社内の炭水化物データベースの検索が、プロテウス(Proteus)種からのコアオリゴ糖に存在する開鎖N-アセチルガラクトサミン残基に関する類似のデータのセットを確認した。開鎖残基の確認は、驚くべきものであったが、糖分析、メチル化分析及びFAB分析と合致した。斯かる残基は糖分析及びメチル化分析に用いられる加水分解条件に対して感受性が高く、FAB分析における末端残基に関するグリコシルオキソニウムの形成が、この残基の開鎖立体配置の形成を妨げるであろうからである。したがって、血清型1、2、5a及び5bからのコアオリゴ糖の構造分析が完結し、図18に示すような全ての菌株において保存された内側コア構造であって、この保存された構造を越えた異なるデコレーションを有する構造を同定した。
【０１０９】
コアタイプI、II、II及びIIに相当する血清型1、2、5a及び5bからのコアオリゴ糖の構造分析が、比較的保存された構造を明らかにした。各菌株に関して、Kdo残基と結合したL-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース残基の三糖からなる内側コアオリゴ糖は、同一であった。各血清型において、近位のヘプトース残基(HepI)が、3位においてL-グリセロD-マンノ-ヘプトース三糖の第二のL-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース残基(Hep II)によって、4位においてβ-グルコース残基(Glc I)によって、6位においてα-グルコース残基(Glc II)によって置換されている。各菌株において、D-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース(Hep IV)が、Glc I残基の6位に存在した。血清型2、5a及び5bでは、第二のD-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース(Hep V)が、6位においてHep IVを置換している。血清型2、5a及び5bの間のただ一つの違いは、血清型2にあるHep IV残基の4位に結合した余分のグルコース残基である。これらのオリゴ糖構造及びマンヘイミア・ヘモリティカ血清型A1からのオリゴ糖に関して先に分かったオリゴ糖構造の間には、際だった類似性があった。血清型5a、5bオリゴ糖構造とマンヘイミア・ヘモリティカ血清型A1コアオリゴ糖との間の唯一つの違いは、マンヘイミア・ヘモリティカに存在するHep Vにおける余分の末端ガラクトース残基がないことである。血清型1には、Hep V残基がなく、代わりにHep IVが、4位においてα-GalNAc-(1-4,6)-α-Gal-(1-3)-β-Gal-によって置換されており、ここで、HexNAc残基は、あまりない開鎖立体配置のものであった。血清型1におけるHep Iからの最初の三糖エクステンションとして同定された構造配列は、デュクレー菌菌株2665のLPSに関して先に分かったものと同一であるが、血清型1のLPSは、デュクレー菌に存在するDD-Hepに分断化された(interrupted)ラクト-N-ネオテトラオース構造と比較すると、Gal I残基を越える異なるエクステンションを有している。
【０１１０】
したがって、ApLPSの二つのコアタイプにSDS-PAGE観察についての構造的説明がなされた。コアタイプIIの血清型2、5a及び5bは、血清型2の余分のグルコース残基が違いであるだけで、非常に類似したLPS構造を有している。しかしながら、コアタイプIの血清型1は、DD-Hep残基を失っているが、二つのヘキソースと新規な開鎖HexNAc残基を得ていた。この新規な開鎖HexNAc残基が、他のコアタイプI血清型に存在するかどうか調査するため、血清型6、9及び11からのLPSを調べた。この開鎖HexNAcに関する証拠が、血清型9及び11におけるMS及びNMR研究(データは示さず)の両方によって見られたが、血清型6では見られなかった。コアタイプを類別するのに用いられているSDS-PAGEプロファイルのより綿密な検査が、血清型6が、二つのコアタイプのLPS移動(migration)パターンの両方を有することを示し、したがって、我々が調べた血清型6のみが、コアタイプIIプロファイルを有するということがあり得る。
【０１１１】
ApにおけるLPS生合成の遺伝子制御に関するデータは、ほとんど入手できない。ガラミュウ(Galameau)等による最近の論文が、トランスポゾン突然変異誘発の結果、Ap血清型1LPSのコアオリゴ糖領域の生合成に関与すると思われる三つの遺伝子を特定した。これらの遺伝子は、他のグリコシルトランスフェラーゼに対する相同性に基づき、グリコシルトランスフェラーゼとして仮説的に特定された。三つの遺伝子は、lbgB, α-1,6-DD-ヘプトシルトランスフェラーゼ、lbgA β-1,4-グリコシルトランスフェラーゼ及びヘキソース又はN-アセチル-ヘキソサミントランスフェラーゼであると仮定された。前者二つの遺伝子、lbgA,Bは、血清型1コアオリゴ糖においてここで特定された構造と合致しており、デュクレー菌LPSに存在するのと同じ遺伝子座配列(locus arrangement)を有している。リオー(Rioux)等による他の論文が、UTP-α-D-グルコース-1-ホスフェートウリジルトランスフェラーゼに関する構造遺伝子である遺伝子galUを同定した。血清型1 Ap galU突然変異株から分離されたLPSのSDS-PAGEは、コア-リピドA領域の変化した移動パターンを有しており、この突然変異株は、ブタ気管細胞に対する付着性が低く、ブタでは病原性が弱く、コアオリゴ糖領域の性質又は表示(presentation)における変化が、この動物の病原体の病原性に対する影響を持ちうることを示唆した。
【０１１２】
新規な開鎖HexNAc残基の同定は、興味深いものであった。この構造は、つい先ほど二つのプロテウス種において、最近シェワネラ・オネイデンシス(Shewanella oneidensis)において同定されているが、その重要性は知られていない。既存の文献に見られるように、ここで同定された開鎖残基は、隣接する残基を、4位及び6位において同時に二置換することが分かり、そのため、これは斯かる残基に関して共通の配列(arrangement)であり得た。    
【０１１３】
Hep Iからのオリゴ糖エクステンションにおけるDD-Hep残基の同定が、マンヘイミア・ヘモリティカ、デュクレー菌及び型の分類のできないインフルエンザ菌を含む幾つかの菌株に関して、先に観察されている。マンヘイミア・ヘモリティカでは、二つのDD-Hep残基が観察されたのに対し、デュクレー菌及びインフルエンザ菌では、一つだけのDD-Hep残基が観察された。Apにおいては、Hep Iからのオリゴ糖エクステンションに二つのDD-Hep残基を有する血清型2、5a及び5bと一つだけのDD-Hep残基を有する血清型1の両方のシナリオがある。トリ-LD-ヘプトシル内側コア基も、マンヘイミア・ヘモリティカ、デュクレー菌及びインフルエンザ菌において先に観察されている。Appの全ての菌株の研究に関してここで観察された3,4,6-三置換Hep I残基は、マンヘイミア・ヘモリティカLPSにおいて先に観察されているが、デュクレー菌LPSは、インフルエンザ菌においても見られたように、3,4-二置換Hep I残基のみを生成する。
【０１１４】
血清型5aにおけるHep III残基の7位の、O-抗原ガラクトース残基の結合位置としての特定は、興味深いものであり、三つの突然変異させた遺伝子調製物の予想された機能が、内側コアLD-ヘプトシル三糖単位の生合成を妨げず、したがって、O-抗原の結合に関する受容体が、なお突然変異体LPSコアオリゴ糖に存在しているであろうように、血清型1における三つの様々に先端が切断された(truncated)コアオリゴ糖突然変異体が、なおO-抗原を生成したという観察と合致した。
【０１１５】
この研究は、二つのコアタイプの代表であるApの幾つかの菌株のコアオリゴ糖領域を、構造的に特徴付け、保存された内側コア構造と新規な外側コア構成要素を同定した。この領域は、Apの付着性に関与すること、したがって、病原性に関係があることが知られている。したがって、この研究は、ApLPSのコアオリゴ糖領域の構造の、この微生物の潜在的な病原性との関連性についてのさらなる研究を、より好適に可能にするであろう。    
【０１１６】
材料及び方法−実施例２
培地及び成長条件
Ap血清型1(菌株4047)、2(菌株4226)、5a(菌株K17)及び5b(菌株L20)を、初めに37℃でチョコレート寒天プレート上で一晩成長させ、成長物(growths)を用いて、最終濃度が5ug/mlとなるまでβNAD(Sigma N-7400)を、最終濃度が5ug/mlとなるまでへミン(haemin)(Sigma H-2250)を、及び1%グルコース(10g)を添加した１リットルの脳-心臓浸出物(BHI)培地に接種した。次いで、培養物(cultures)を37℃、200rpmで6時間培養し、28リットルのNBS発酵槽内の23リットルのBHI培地(上記のように添加されている)に接種するのに用いた。次いで、培養物を、24リットル／分で曝気をし200rpmで攪拌しながら37℃で18時間成長させた。細胞を殺し(2%フェノール w/v、4時間)、シャープルズ(Sharples)連続遠心機を用いることによって収集した(約40g湿重量)。
【０１１７】
リポ多糖の分離と精製
血清型5a及び5bに関して、乾燥細胞塊を有機溶媒で洗浄後、リポ多糖(LPS)を、高温水／フェノール法(hot water/phenol method)によって乾燥細胞塊から分離した。水相を、水に対して透析し、凍結乾燥した。血清型2の場合には、LPSは、広く(extensively)透析したフェノール相から分離された。乾燥した試料を水に溶解させて1〜2％溶液(w/v)を調製し、37℃で6時間、デオキシリボヌクレアーゼI(DNase)(0.01 mg/ml)及びリボヌクレアーゼ(RNase)(0.01 mg/ml)で3時間、37℃で処理した後、プロテイナーゼK(0.01 mg/ml)で3時間処理した。透析し、乾燥した試料を水に溶解させて1％溶液を調製し、超遠心分離した(5時間、100,000 g)。LPSのペレットを再び水に溶解させ、凍結乾燥し、水を溶離液としてBio-Gel P-2のカラム(1cmｘ100cm)でゲル濾過により精製した。糖を含むフラクションをためて、凍結乾燥した。精製したLPSを、攪拌しながら37℃で1時間、無水ヒドラジンで処理をして、O-脱アシル化LPS(LPS-OH)を調製した。反応物を、氷浴で冷却し、冷たいアセトン(-70℃、5倍容積)を徐々に加えて余分のヒドラジンを破壊し、沈殿したLPS-OHを遠心分離によって分離した。次いで、試料を、上述のように、Bio-Gel P-2カラム内を流下させて精製した。精製したLPSを1％酢酸(10mg/ml、100℃、1.5時間)で処理をし、次いで遠心分離(5000g)によって不溶のリピドAを除去することにより、コアオリゴ糖(OS)を分離した。凍結乾燥したオリゴ糖を、Bio-Gel P-2カラム内を流下させてさらに精製し、個々のフラクションを凍結乾燥した。
【０１１８】
分析方法
GLC-MSによって、糖がそれらの酢酸アルジトール(alditol acetate)誘導体であると決定された。試料を、4モルのトリフルオロ酢酸を用いて100℃で4時間加水分解した。加水分解物を、水中で一晩還元し(NaBD4)、残留する酢酸ナトリウムを触媒として用い、100℃で2時間、無水酢酸でアセチル化した。GLC-MSは、30M DB-17キャピラリーカラム(180℃〜260℃、3.5℃／分)を備えており、MSは、Varian Saturn II質量分析計を用いて電子衝撃モードで行った。メチル化分析を、NaOH/DMSO/ヨウ化メチル手法によって実施し、上記のようにGLC-MSによって分析した。
【０１１９】
質量分析
ESI-MSを、VG Quattro質量分析計(英国、マンチェスター、マイクロマス)を用いて陰イオンモードで、0.5％の酢酸を含む25％水性アセトニトリルに試料を直接投入することにより行った。キャピラリー電気泳動(CE)-ESI-MSを、マイクロプレーインターフェイスを介してAPI 3000質量分析計(Perkin-Elmer/Sciex)に接続されたクリスタルモデル310(CE)計器(AYI Unicam)を用いて行った。鞘溶液(イソプロパノール-メタノール；2:1)を、1μl／分の流量で、低デッドボリュームT字管(low dead volume tee)(内径(i.d.)250μm、Chromatographic Specialties)に送った。使用前に、全ての水溶液を、0.45μmフィルター(Millipore)に通して濾過した。電気スプレーステンレス鋼ニードル(27ゲージ)を、低デッドボリュームT字管に衝合させて、鞘溶液をキャピラリーカラムの端に送れるようにした。5％のメタノールを含む10ｍM酢酸アンモニウム／水酸化アンモニウム脱イオン水溶液(pH9.0)を用いて、約90cmの長さの露出した溶融シリカキャピラリーで、分離を行った。注入部位において、20kVの電圧をかけるのが典型的である。キャピラリーの出口は、レーザープラー(laser puller)(Sutter Instruments)を用いて内径約15μmまで先細りになっていた。全質量走査(full-mass scan)モードで1 m/z単位のステップあたり3.0msの滞留時間で、質量スペクトルを得た。1 m/z単位のステップあたり1.0msの滞留時間で、MS/MSデータを得た。RF専用(RF-only)四極子衝突セル内での選択した前駆イオンの窒素との衝突活性化により生じたフラグメントイオンを、第三の四極子を走査することによって質量分析した。
【０１２０】
核磁気共鳴
5mm又は3mmの三重共鳴(1H、13C、31P)プローブを使用してVarian Inova 400、500及び600 MHｚ分光計で、NMR実験を行った。凍結乾燥した糖試料を、600μl(5mm)又は140μl(3mm)の99％D2Oに溶解させた。実験は、4.78ppmにおいてHOD(重水素置換したH2O)信号を抑制して、25℃で行った。アセトンのメチル共鳴を、1Hスペクトルに関しては2.225ppmでの、13Cスペクトルに関しては31.07ppmでの内部基準として用いた。Varian、COSY、TOCSY、NOESY、13C-1H HSQC、13C-1H HSQC-TOCSY及び13C-1H HMBCからの標準的な等核及び異核相関した2Dパルスシーケンスを、全体の帰属特定(general assignments)に用いた。全体の残基帰属特定及び1H-1H核オーバーハウザーエンハンスメントの決定をするため、Z-フィルターを用いた選択1D-TOCSY及び1D-NOESY実験、並びに1-D類似の3-D NOESY-TOCSY及びTOCSY-NOESY実験を行った。選択パルスのパルス幅は、30〜80 Hzであった。1D-TOCSY実験には、30〜150 msのミキシングタイムを用いた。１D-NOESY実験には、400〜800 msのミキシングタイムを用いた。
【０１２１】
以下に示す実施例２、表１において、O-deacはO-脱アシル化、Core OSは、コアオリゴ糖である。
（実施例２−表１）
【表６】
2007537307.tif 000016
【０１２２】
（実施例２−表１）
【表７】
2007537307.tif 000017
【０１２３】
（実施例２−表２）
【表８】
2007537307.tif 000018
【０１２４】
（実施例２−表２）
【表９】
2007537307.tif 000019
【０１２５】
（実施例２−表２）
【表１０】
2007537307.tif 000020
【０１２６】
（実施例２−表２）
【表１１】
2007537307.tif 000021
【０１２７】
（実施例２−表２）
【表１２】
2007537307.tif 000022
【０１２８】
a;  血清型5a由来の内側コアデータ；残基に関する文字名称は括弧内に示すとおりである。他の血清型内側コア残基からの化学シフトは、ほぼ同じである。
b;  血清型5a及び5bにおける置換されたHep III残基に関するデータ。
c;  血清型1及び2の末端Hep III残基に関するデータ。
d;  血清型11H-共鳴に関して、Glc H-6a及びH-6bは、それぞれ、4.15及び3.74 ppmである。
【０１２９】
実施例３  この実施例は、Glycobiology. 15; 323 (2005)における発表の基礎をなすものである。
パスツレラ・マルトシダ菌株Pm70の研究
精製したLPSの糖分析が、約４：２：３の割合のグルコース(Glc)、ガラクトース(Gal)及びL-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース(LD-Hep)を示した。少量のN-アセチル-グルコサミン(GlcNAc)及びN-アセチル-ガラクトサミン(GalNAc)も同定された。最近研究された他の畜獣の病原体(Brisson等、2002；St. Michael等、2004)と異なり、D-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース(DD-Hep)は、同定されなかった。コアオリゴ糖(OS)由来のブチル-グリコシドのGLC分析が、Glc、Gal及びGalNAc残基がそれらのD-異性体として存在していることを示した。
【０１３０】
O-脱アシル化LPS(LPS-OH)を調製し、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分別し、CE-MSにより分析した(実施例３、表１)。m/z 1132.93-及び1215.23-によって示される主要な種からの一つのPEtn残基の損失又は獲得と合致する少量のイオンを有するHexNAc2、Hep４、Hex6、PEtn、Kdo、P、リピドA-OHの組成物と合致する3525 amuの分子に対応するm/z 1173.8の一つの主要な三荷電のイオンに関して単純な質量スペクトルが、観察された。三荷電イオンm/z 1173.8に関するCE-MS/MS分析(データは示さず)が、m/z 951の一荷電ピーク及び m/z 1236.5の二荷電イオンをもたらし、O-脱アシル化リピドAの大きさを952 amuと、コアオリゴ糖の大きさを2475 amuと確認した。O-脱アシル化リピドA基礎種(basal species)(952 amu)は、N-アシル化(3-OH C 14:0)グルコサミン残基の二糖からなり、各残基は、ホスフェート分子で置換されている。興味深いことに、Kdoの獲得が付随するヘキソース及びホスフェート分子の損失に対応する少量の糖型が、m/z 1125.73- 1166.73-によって示され、Kdo-P又はKdo-Kdo配列の何れかを有する分子のKdo領域の二つの異なる配列の存在を示唆した(実施例３、表１)。一つ及び二つのKdo残基を含む糖型の類似の混合物が、KOHで処理をしたLPSのCE-MSスペクトルにおいて観察された(実施例３、表１)。分画したコアオリゴ糖試料のES-MS及びCE-MS分析が、HexNAc2、Hep4、Hex6、PEtn、Kdoの組成物と合致する2492ダルトン(Da)の質量を示した(実施例３、表１)(図19)。オリゴ糖分子における幾つかの官能基の位置についての情報を得るため、コアオリゴ糖に関する陽イオンモードでのCE-MS/MS分析を行った。m/z 1246.52+における二荷電イオンについてのMS/MS分析が、幾つかの生成イオンを示した(図20)。主要なものは、203.5+におけるHexNAc残基、及び407.5+における二つのHexNAc残基に相当する一荷電イオンであった。他の生成イオンも同定され、図20に示す組成物に対応していた。m/z 316のイオン(Hep-PEtn基に相当)に関する前駆イオン走査の結果、817.52+ (Hex3、Hep4、Kdo、PEtn)、898.52+ (Hex4、Hep4、Kdo、PEtn)、979.52+ (Hex5、Hep4、Kdo、PEtn)、1059.52+ (Hex6、Hep4、Kdo、PEtn)及び1263.52+ (HexNAc2、Hex6、Hep4、Kdo、PEtn)の二荷電水和イオンの同定により、コアオリゴ糖のPEtn部分が、内側コアのヘプトース残基(Hep)に位置特定された。m/z 407のイオン(HexNAc-HexNAc基に相当)に関する前駆イオン走査が、Hex3、HexNAc2の組成物に相当する893+の一荷電イオンを示した(データは示さず)。したがって、これら二つの前駆イオン実験は、3Hex及び2HexNAc残基の外側コアエクステンションを有するHex3、Hep4、Kdo、PEtnの内側コア組成物を示唆した。  
【０１３１】
コアオリゴ糖分子の結合パターンを決定するため、コアオリゴ糖に関するメチル化分析を行い、約２：１：１：１：１：１：１のモル比での末端Glc、6-置換Glc、4-置換Glc、4-置換Gal、3-置換Gal、末端LD-Hep及び4,6-二置換LD-Hepの存在を示し、より少量の末端Gal、2-置換LD-Hep、3,4-二置換LD-Hep、及び3,4,6-三置換LD-Hepも観察された。加えて、アクチノバシラス・プレウロニューモニー(Ap)血清型2からの過メチル化された酢酸アルジトール(permethylated alditol acetate)との比較により、4,6-二置換LD-Hep残基に関する保持時間が、4,6-二置換DD-Hep残基から変換し、帰属特定を確認し、PmのLPSにおけるDD-Hepの不存在と合致した。
【０１３２】
オリゴ糖の正確な位置と結合パターンを明らかにするため、最も解像された(most resolved)均質なスペクトルを提供するオリゴ糖フラクションと十分に脱アシル化された(KOH処理された)材料に関するNMR研究を行った(図22)。マンヘイミア・ヘモリティカ(Mh)及びApからの構造的に関連のあるコアオリゴ糖(Brisson等、2002；St. Michael等、2004)に関連して、オリゴ糖及びKOH処理したLPSの1H共鳴の帰属特定を、COSY及びTOCSY(図5a)実験により行った(実施例３、表２)。
【０１３３】
Pm70オリゴ糖及びKOH処理したLPSの1H-NMRスペクトルにおいて、ヘプトース残基（Hep I (E)、Hep II (F)、Hep III (G)、Hep IV (J)）から生じたスピン系は、マンノ-ピラノシル環系を示すそれらのスピン系の出現と結びつけられる5.10OS(オリゴ糖試料)／ 5.19KOH(KOH処理試料)(Hep I E)、5.87OS／5.74KOH (HepII F)、5.23OS&KOH (HepIII G)及び5.12OS&KOH (HepIV J) ppmにおけるそれらのアノマー1H共鳴から容易に同定された。酸加水分解のによって生じる隣接するKdo分子の種々の転位物(rearrangement products)の存在に起因するオリゴ糖試料におけるHep Iのアノマープロトンに関して不均一性が観察された(オリゴ糖試料における主要Hep I信号からの帰属特定は、詳述する)。ヘプトシル残基に関しては、H1及びH2共鳴の間の残基内NOEのみが生じたことから、α-立体配置が明らかであった。5.22OS&KOH ppm (Glc II, H)及び5.09OS／5.53KOH ppm (GalNAc II/GalN II, P)におけるα-アノマー領域における残りの残基のうちの二つが、それぞれ、グルコ-ピラノース糖及びガラクト-ピラノース糖であることが、それらのスピン系の出現に基づき決定した。5.09OS／5.53KOH ppmにおけるガラクト-立体配置の残基は、13C-1H HSQC実験における50.4OS／51.5KOH ppmの13C化学シフトと相関関係のある4.24OS／3.65KOH ppmにおけるそのH-2プロトンのその1H共鳴により、アミノ糖であると決定された。13C化学シフトは、窒素置換された炭素原子と合致していた。4.95OS／4.99KOH ppm(Gal II, N)においてα-アノマー領域における残りの残基は、ガラクト-ピラノース糖であると、TOCSY実験におけるH-4共鳴に対するその特徴的なスピン系の出現に基づき、決定された(図23)。スペクトルの低i-フィールド領域(4.45〜6.00 ppm)におけるアノマー共鳴の残りは、それらのアノマー1H共鳴の化学シフト及び、分解した(resolved)残基の場合には、それらの高いJ1,2(約8Hz)結合定数によって、β-結合した残基に帰せられるものであった。4.65OS&KOH ppm (Glc I, I)、4.70OS&KOH ppm (Glc III, K)及び4.69OS&KOH ppm (Glc IV, L)  における共鳴は、それらのスピン系の発生からグルコ-立体配置に帰属特定された。4.53OS&KOH ppm (Gal I, M)及び4.73OS／5.01KOH ppm(GalNAc I/GalN I, O)における低フィールド領域の残りの共鳴は、TOCSY実験におけるH-4共鳴に対する特徴的なスピン系の出現から、ガラクト-ピラノシル残基に帰属特定された。4.73OS／5.01KOH ppmにおけるガラクト-立体配置の残基は、13C-1H HSQC実験での51.9OS／53.1KOH ppmの13C化学シフトと相関関係のある4.12/3.53 ppmにおけるそのH-2プロトンのその1H共鳴により、アミノ糖であると決定された。13C化学シフトは、窒素置換された炭素原子と合致していた。PEtn部分のCH2プロトンに関するシグナルが、13C-1H HSQC実験での40.1及び62.2 ppmの特徴的な13C化学シフトとそれぞれ相関関係のある3.27及び4.16 ppmでオリゴ糖試料において観察された。加えて、アミノ糖のアセチル基に関して特徴的なシグナルが、13C-1H HSQC実験での22.4及び22.1 ppmの13C化学シフトとそれぞれ相関関係のある2.06及び2.04 ppmでオリゴ糖試料において観察された。
【０１３４】
オリゴ糖におけるグリコシル残基のシーケンスが、隣接するグリコシル残基に関するアノマープロトンとアグリコン(aglyconic)プロトントンとの間の残基間1H-1H NOE共鳴から決定され、メチル化分析データを確認し、その範囲を広げた。Pm70脱アシル化オリゴ糖に関する結合パターンを、このようにして決定した(図24)(実施例３、表２)。したがって、プロトン対Hep III (G) H-1とHep IIn (F) H-2、Hep II (F) H-1とHep I (E) H-3、及びHep I (E) H-1とKdo (C) H-5との間に強いグリコシド交換(transglycosidic)NOE結合性が生じたことは、これら三つのLD-ヘプトース残基のシーケンスと結合位置を、トリ-ヘプトシル部分であると証明した。
【０１３５】
この結合パターンは、インフルエンザ菌(Hi)及びMhからの内側コアオリゴ糖に普通に見られるものである(Cox等、2001a；Brisson等、2002)。さらに、アノマープロトンHep III (G) H-1とHep II (F) H-1との間の残基間NOEが、1,2-結合の確認をもたらした(Romanowska等、1988)。Glc I (I)からのNOE結合性の試験が、Hep I (E) H-4とHep I (E) H-6に対する残基間NOEにより、このグルコース残基が4位においてHep I (E)と結合していることを説明した。H-6に対する残基間NOEの発生は、4-置換ヘプトース残基に関して一般的に生じるものである(Backman等、1988)。
【０１３６】
Glc I (I)のH-1とGlc II (H)との間の長い範囲のNOE結合性の発生は、α-立体配置のグルコース残基(Glc II (H))が、Mｈ及びApの両方からのオリゴ糖に関して先に観察されたように(Brisson等、2002；St. Michael等、2004)、6位においてHep Iを置換していることを示唆した。Glc II (H)のH-1からのNOE結合性の試験が、Hep I (E) H-6に対する残基間NOEにより、このグルコース残基が、6位においてHep I (E)に結合していることを確認した。Glc I (I)と同様に、Glc I (I)とGlc II (H)のアノマー1H共鳴の間に長い範囲のNOE結合性が観察された。
【０１３７】
Hep IV (J)のH-1からのNOE結合性の試験が、Glc I (I) H-6a及びH-6bに対する残基間NOEにより、このヘプトース残基が、6位においてGlc I (I)に結合していることを示した。この内側コアグリコース構造は、Mh及びApに関して先に観察されていた。しかしながら、これら両方の場合には、Hep IV残基(J)は、D-グリセロ-D-マンノ立体配置のものであったのに対し、ここでは、Hep IV残基(J)は、L-グリセロ-D-マンノ立体配置が糖分析において同定されたただ一つの立体配置なので、L-グリセロ-D-マンノ立体配置のものであった。
【０１３８】
外側コア残基の結合パターンは、メチル化分析データとともにNOE結合性及び13C-1H-HMBCの証拠から推定された。4.70OS&KOH／4.69OS&KOH ppmにおけるアノマープロトン共鳴を有する二つのグルコ-立体配置の残基(K&L)は、メチル化分析で観察された4,6-二置換LD-ヘプトース残基と合致しAp血清型2において先に観察されたDD-HepIVの配列(arrangement)(St. Michael等、2004)と類似した、4.15OS&KOH及び4.31OS&KOH ppmにおけるHep IV残基(J)のH-4及びH-6プロトン共鳴に対するNOE間結合性(inter-NOE connectivities)を示した。
【０１３９】
1H-13C HMBC実験(図25)によって、Glc III (K)が4位においてHepIV (J)と結合し、Glc IV (L)が、6位においてHepIV (J)と結合していることを決定することができた。4.53OS&KOH ppmにおけるGal I (M)のアノマープロトン共鳴からGlc IV (L)のH-4プロトン共鳴へのNOE間結合性(inter-NOE connectivity)が、Gal I (M)が、4位においてGlc IV (L)を置換したことを示唆した。Gal II (N)のアノマープロトン共鳴からGal I (M)のH-4プロトン共鳴へのNOE間結合性(inter-NOE connectivity)が、Gal II (N)が、4位においてGal I (M)を置換したことを示唆し、二つの4-結合ヘキソース残基、すなわち、4-結合グルコース残基及び4-結合ガラクトース残基を解像した(resolved)メチル化分析データと合致した。GalNAc I/Gal N I (O)のアノマープロトン共鳴からGal II (N)のH-3プロトン共鳴へのNOE間結合性(inter-NOE connectivity)が、GalNAc I/GalN I (O)が、3位においてGal II (N)を置換したことを示唆し、3-結合ヘキソース残基を同定したメチル化分析により確認した。  
【０１４０】
最後に、GalNAc II/GalN II (P)のアノマープロトン共鳴からGalNAc I/Gal I (O)のH-3プロトン共鳴へのNOE間結合性(inter-NOE connectivity)が、GalNAc II/GalN II (P)が、3位においてGalNAc I/GalN I (O)を置換したことを示唆し、HexNAc-HexNAc二糖のMS/MSでの同定と合致した。Hep II (F)の3位のPEtn置換の位置としての確認が、オリゴ糖試料に関する31P-1H-HSQC及び31P-1H-HSQC-TOCSY実験から得られた。HSQC実験は、リン信号からHep II残基(F)の3位に帰属特定された4.41ppmにおけるプロトン共鳴への交差ピークを同定した。これは、それぞれ4.31及び5.78 ppmにおけるH-2及びH-1プロトン共鳴を示したHSQC-TOCSY実験(データは示さず)において確認され、範囲が広げられた。
【０１４１】
Hep I-Kdo-リピドA領域の結合(E-C-B-A)が、KOH処理をしたLPSについての分析から、L-α-D-Hep I-(1-5)-α-Kdo4P-(2-6)-β-GlcN4P-(1-6)-α-GlcN1Pとして確認された(実施例３、表２)。Kdoを含む二つのフラクションが、クロマトグラフィーによって分離され、MSによって同定されたが、NMR分析には十分な量が得られなかった。
【０１４２】
オリゴ糖構造についての徹底的な知識とともに、Pm菌株に関するゲノムシーケンスの入手が可能であること(May等、2001)が、類似のオリゴ糖構造を、構造的及び分類学的に関連する種にまとめるグリコシルトランスフェラーゼについての情報と結びつけて、Pm70の生合成に関する幾つかのグリコシルトランスフェラーゼ候補を同定可能にした(図26)。幾つかの推定的なヘプトシルトランスフェラーゼが、Pm70ゲノムシーケンスにおいて同定され、Hep III Tase PM1294、Hep II Tase PM1844、二つのHep I Tase PM1302及びPM1843並びにHep III Tase PM1144がそれらとして含まれていた。データベースにおけるこれらの遺伝子各々の最高の相同体を、実施例３、表３において詳述する。高度の相同性は、候補のPM遺伝子が、示された機能を有するであろうことを示唆している。
【０１４３】
先に、我々のグループと共同研究者は、PM1294は、他のPm菌株VP161におけるHep III Taseであることを示した(Harper等、2004)。Hep I (E)の6位にα-グルコース(H)を加える遺伝子は知られていないが、4位においてHep I (E)を置換するβ-グルコシルトランスフェラーゼに対する良好な相同体PM1306がある。Kdoトランスフェラーゼは、多数の優れた相同体によってPM1305として容易に同定されたが、Pmゲノムでは一つのKdoトランスフェラーゼ相同体しか同定されなかった。興味深いことに、Kdo (C)、Hep I (E)、Glc I (I)領域の生合成に関与する幾つかの遺伝子が、染色体のこの領域でクラスターになっている。
【０１４４】
外側コア領域に関する推定的なグリコシルトランスフェラーゼも、PM1138〜PM1144の範囲にわたる染色体の領域で、クラスターになっていると思われる。グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のこのクラスター化は、いつも観察されるわけではなく、実際、インフルエンザ菌(Hi)オリゴ糖に関するグリコシルトランスフェラーゼは、ゲノム全体にわたって自由にばらまかれている。推定的なグリコシルトランスフェラーゼの他の遺伝子座を、PｍゲノムのPM0506〜PM0512にわたる他の領域で見出すことができる。
【０１４５】
この遺伝子座は、Hi及びデュクレー菌(Hd)の両方からのいわゆるlsg遺伝子座と非常によく合っている。Hiオリゴ糖の生合成におけるこの遺伝子座の役割は、何らはっきりした役割が割り当てられることがなしに文献においてある程度の論考の題材であった(Phillips等、1996、2000；Cox等、2001b)。しかしながら、このPm70遺伝子座の真ん中は、Pm70ゲノムにおける三つのシアリルトランスフェラーゼ相同体(PM0188及びPM1174も含む)のうちの一つのシアリルトランスフェラーゼ相同体(PM0508)であり、Pm70のLPSが、適当な成長条件下でシアリル化され得るかどうかを知るため、構造研究が、我々の研究所で進行中である。活性化されたヌクレオチド糖供与体の生成のための候補遺伝子も、実施例３、表３に詳述する。
【０１４６】
考察
PmのPm70ゲノム菌株のオリゴ糖の構造分析が、関連する種Mｈ(Brisson等、2000)、Ap(St. Michael等、2004)、Hd(Schweda等、1994)及びHi(Cox等、2001a)に関して先に決定されたLPSコアオリゴ糖構造との類似性を有する構造を示した。各場合において、コアオリゴ糖は、Kdo残基に結合した同じに結合したトリ-ヘプトシル単位を含んでいる。興味深いことに、Pmでは、多くの場合、HepII残基の3位がPEtn残基で置換されているのに対し、Ap、Hd及びMhは、PEtn残基を含んでおらず、Hiは、Hep IIの6位においてPEtn残基を生成する。PmのHep I残基における置換パターンは、4-位及び6-位に二つのグルコース残基を有する畜獣の病原体Ap及びMhに関して見られるものと同じであるのに対し、HiにおけるHep I残基は、4-位において置換されているだけである。加えて、Hd及びHiの幾つかの菌株では、Hep Iの4-位におけるグルコース残基は、三つの畜獣の病原体では皆そろって6-位においてヘプトース残基で置換されている。しかしながら、Pm(及びHiの幾つかの菌株)では、グルコース残基を置換するヘプトース残基は、Ap、Hd、Mh及びHiの幾つかの菌株におけるD-グリセロ-D-マンノ立体配置のヘプトース残基に対して、L-グリセロ-D-マンノ立体配置のものである。このヘプトース残基の置換パターンは、これらの菌株の間でかなり変わっており、種々の菌株端の間の保存された内側コア構造が、オリゴ糖構造のこの位置(point)なのである。Pmでは、ヘプトース残基が、4-位及び6-位において二つのグルコース残基で二置換されており、このヘプトース残基が同じ位置で二置換されているAp血清型2と類似しているが、Ap血清型2においては、4-位ではグルコース残基ではなく他のヘプトース残基で置換されている。Mhも、4-位にさらなるD,D-ヘプトース残基を有しており、一方、Ap血清型1、Hd及びHiもこの第四のヘプトース残基からさらなるヘキソースエクステンションを有しているが、何れも、ここで観察された新規なGalNAc-GalNAc単位で終わるエクステンションを有していない。
【０１４７】
Pm70オリゴ糖構造に基づき、類似の特異性を有するグリコシルトランスフェラーゼに対する相同体が、Pm70ゲノムにおいて同定された。一つ又は二つのKdo残基の存在に依存する二つのLPS集団(populations)の新規な知見を考慮すると、Kdoトランスフェラーゼに対するただ一つの相同体が、Pmゲノムにおいて同定されたことに留意するのが興味深い。このことは、Kdoトランスフェラーゼの性質が、よく文書で立証されている、すなわち、同じKdoトランスフェラーゼが、Kdo残基をリピドAへと転位させ、第二のKdo残基を最初のKdo残基へと転位させることができるため、驚くにはあたらない。だが、PmLPSの新規な特徴は、一つ及び二つのKdo残基を有する集団の両方が同定されたことであり、これは、我々が知る限り、先に観察されていない。しかしながら、Hep I (E)〜Kdo (C)(α-1,5ヘプトシルトランスフェラーゼ)トランスフェラーゼに関して、二つの良好な相同体が、Pm70ゲノムにあることが観察された。
【０１４８】
一つのトランスフェラーゼが、LPS構造が一つのKdo残基を含むHiのHI 0261(OpsX)に対する最も高い相同性を有していた。第二のトランスフェラーゼが、LPS構造に二つのKdo残基を有するWaaC型の大腸菌(Escherichia coli)及び肺炎桿菌(Klebsiella pneumonie)に対する最も高い相同性を有していた。したがって、二つのHep Iトランスフェラーゼの同定は、Pm70LPSのKdo領域における二つの構造配列(structural arrangements)の存在と合致し、この微生物からのKdoトランスフェラーゼの調節(regulation)を理解することが、興味深いことになるであろう。
この研究は、Pmのゲノム菌株のコアオリゴ糖領域を特徴付け、コアオリゴ糖の完全な生合成のための推定的なグリコシルトランスフェラーゼを同定した。
【０１４９】
材料及び方法
培地及び成長条件
初めに、Pm菌株Pm70(NRCC No. 6232)を、37℃でチョコレート寒天プレート上で一晩成長させ、成長物(growths)を用いて、最終濃度が5ug/mlとなるまでβNAD(Sigma N-7400)を、最終濃度が5ug/mlとなるまでへミン(haemin)(Sigma H-2250)を、及び1%グルコース(10g)を添加した１リットルの脳-心臓浸出物(BHI)培地に接種した。次いで、培養物(cultures)を37℃、200rpmで6時間培養し、28リットルのNBS発酵槽内の24リットルのBHI培地(上記のように添加されている)に接種するのに用いた。次いで、培養物を、20%O2で飽和させ、24リットル／分で曝気をし200rpmで攪拌しながら37℃で18時間成長させた。ヒアルロニダーゼ(1g、Sigma)で処理をした後、細胞を殺し(2%フェノール w/v、4時間)、シャープルズ(Sharples)連続遠心機を用いることによって収集した(約240g湿重量)。
【０１５０】
リポ多糖の分離と精製
凍結乾燥した細胞塊(約70g)を有機溶媒で洗浄後(収量約50g)、高温水／フェノール(hot water/phenol method)(Westphal及びJann, 1965)によって10gの洗浄した凍結乾燥細胞塊から、リポ多糖(LPS)を分離した。水相を、水に対して透析し、凍結乾燥した。乾燥した試料を水に溶解させて1〜2％溶液(w/v)を調製し、37℃で6時間、デオキシリボヌクレアーゼI(DNase)(0.01 mg/ml)及びリボヌクレアーゼ(RNase)(0.01 mg/ml)で3時間、37℃で処理した後、プロテイナーゼK(0.01 mg/ml)で3時間処理した。透析し、乾燥した試料を水に溶解させて1％溶液を調製し、8Kの低速度スピンに続いて45Kで超遠心分離して全ての不溶物(124mg)を除去した。45Kのスピンから得られたLPSのペレットを再び水に溶解させ、凍結乾燥した(180mg)。精製したLPS(75mg)を、攪拌しながら37℃で1時間、無水ヒドラジンで処理をして、O-脱アシル化LPS(LPS-OH)を調製した。反応物を、氷浴で冷却し、冷たいアセトン(-70℃、5倍容積)を徐々に加えて余分のヒドラジンを破壊し、沈殿したLPS-OHを遠心分離によって分離した(60mg)。次いで、試料を、上述のように、Bio-Gel P-2カラム内を流下させて精製した。精製したLPS(100mg)を1％酢酸(10mg/ml、100℃、1.5時間)で処理をし、次いで遠心分離(5000g)によって不溶のリピドAを除去することにより、コアオリゴ糖(OS)を分離した。凍結乾燥したオリゴ糖(50mg)を、Bio-Gel P-2カラム内を流下させてさらに精製し、個々のフラクションを凍結乾燥した。LPS-OH(20mg)を4NのKOHで16時間125℃で処理をした後に中和することにより、十分に脱アシル化したLPSを分離し、先に説明したように、アニオン交換液体クロマトグラフィーによって分画した。
【０１５１】
分析方法
GLC-MS(Sawardeker等、1965)によって、糖がそれらの酢酸アルジトール(alditol acetate)誘導体であると決定された。試料を、4モルのトリフルオロ酢酸を用いて100℃で4時間加水分解し、次いで、水中で一晩還元し(NaBD4)、残留する酢酸ナトリウムを触媒として用い、100℃で2時間、無水酢酸でアセチル化した。GLC-MSは、30M DB-17キャピラリーカラム(180℃〜260℃、3.5℃／分)を備えており、MSは、Varian Saturn II質量分析計を用いて電子衝撃モードで行った。メチル化分析を、NaOH/DMSO/ヨウ化メチル手法(Ciucanu及びKerek、1994)によって実施し、上記のようにGLC-MSによって分析した。ブチルグリコシド誘導体のGLC分析(St. Michael等、2004)によって、絶対配置を決定した。
【０１５２】
質量分析
ESI-MSを、VG Quattro質量分析計(英国、マンチェスター、マイクロマス)を用いて陰イオンモードで、0.5％の酢酸を含む25％水性アセトニトリルに試料を直接投入することにより行った。キャピラリー電気泳動(CE)-MSを、マイクロスプレーインターフェイスを介してAPI 3000質量分析計(Applied Biosystem / Sciex, Concord, カナダ)に接続されたプリンス(Prince) CEシステム(Prince Technologies、オランダ)を用いて行った。鞘溶液(イソプロパノール-メタノール；2:1)を、1μl／分の流量で、低デッドボリュームT字管(low dead volume tee)(内径(i.d.)250μm、Chromatographic Specialties)に送った。使用前に、全ての水溶液を、0.45μmフィルター(Millipore)に通して濾過した。電気スプレーステンレス鋼ニードル(27ゲージ)を、低デッドボリュームT字管に衝合させて、鞘溶液をキャピラリーカラムの端に送れるようにした。5％のメタノールを含む10ｍM酢酸アンモニウム／水酸化アンモニウム脱イオン水溶液(pH9.0)を用いて、約90cmの長さの露出した溶融シリカキャピラリーで、分離を行った。注入部位では、20kVの電圧をかけるのが典型的である。キャピラリーの出口は、レーザープラー(laser puller)(Sutter Instruments)を用いて内径約15μmまで先細りになっていた。全質量走査(full-mass scan)モードで1 m/z単位のステップあたり3.0msの滞留時間で、質量スペクトルを得た。1 m/z単位のステップあたり1.0msの滞留時間で、MS/MSデータを得た。RF専用(RF-only)四極子衝突セル内での選択した前駆イオンの窒素との衝突活性化により生じたフラグメントイオンを、第三の四極子を走査することによって質量分析した。
【０１５３】
核磁気共鳴
5mm又は3mmの三重共鳴(1H、13C、31P)プローブを使用してVarian Inova 400、500及び600 MHｚ分光計で、NMR実験を行った。凍結乾燥した糖試料を、600μl(5mm)又は140μl(3mm)の99％D2Oに溶解させた。実験は、4.78ppmにおけるHOD(重水素置換したH2O)信号を抑制して、25℃で行った。アセトンのメチル共鳴を、1Hスペクトルに関しては2.225ppmでの、13Cスペクトルに関しては31.07ppmでの内部基準として用いた。Varian、COSY、TOCSY、NOESY、13C-1H HSQC、13C-1H HSQC-TOCSY及び13C-1H HMBCからの標準的な等核及び異核相関した2Dパルスシーケンスを、全体の帰属特定(general assignments)に用いた。Varian Inova 400分光計を用いて6時間、2D 1H-31P HSQC実験を行った。1D-HSQC実験のアレーを行うことによって、12Hzにおける結合定数を最適化した。F2 (1H)ディメンションにおける掃引幅は6.0 ppmであり、F1 (31P)ディメンションにおける掃引幅は、16.2 ppmであった。緩和遅延(relaxation delay)の間の水前飽和(water presaturation)は、1.5 sであり、t2における収集時間は0.21 sであり、増分(increment)あたり180 (HMQC)走査で、32の増分が得られた。80msのTOCSYミキシングタイムでのHSQC実験と同じパラメータを用い、Varian Inova 400分光計で8時間、2D 1H-31P HSQC-TOCSY実験を行った。
以下に示す実施例３、表１において、Core OSはコアオリゴ糖、O-deacはO-脱アシル化である。
【０１５４】
（実施例３−表１）
【表１３】
2007537307.tif 000023
【０１５５】
（実施例３−表２）
【表１４】
2007537307.tif 000024
【０１５６】
（実施例３−表２）
【表１５】
2007537307.tif 000025
【０１５７】
（実施例３−表２）
【表１６】
2007537307.tif 000026
【０１５８】
（実施例３−表２）
【表１７】
2007537307.tif 000027
【０１５９】
（実施例３−表３）
【表１８】
2007537307.tif 000028
【０１６０】
（実施例３−表３）
【表１９】
2007537307.tif 000029
【０１６１】
実施例４
この実施例は、Carbohydrate Research 340, 59(2005)における発表の基礎をなすものである。
パスツレラ・マルトシダ菌株VP161のリポ多糖の構造分析
この実施例では、パスツレラ・マルトシダ菌株VP161からのリポ多糖の構造を明らかにする。リポ多糖を種々の分解処置に供した。単糖及びメチル化分析、、NMR分光分析並びに質量分析によって、精製物の構造を確証した。これらの実験からの組み合わされたデータに基づいて、リポ多糖に関する以下の構造（化１８）を決定した。
【０１６２】
（化１８）
2007537307.tif 000030
ここで、ＮＭＲデータに基づいて、全ての糖がピラノース環型であり、Kdoが2-ケト-3-デオキシ-オクツロソン酸であり、L-α-D-HepがL-グリコ-D-マンノ-ヘプトースであり、PPEtnがピロホスホエタノールアミン(pyrophosphoethanolamine)であり、PChoがホスホコリンであることが分かった。興味深いことに、O-の十分に脱アシル化したLPSを調べると、分子のKdo領域の配列に可変性があることが明らかであった。Kdo-Kdo基を生成する糖型とともに、Kdo-P部分に関する糖型が分かった。さらに、Glc II残基が、二つのKdo残基が存在する時にではなく、Kdo-Pが生成された時に、Hep Iに結合し、立体障害又は適当でない受容体立体配置のいずれかによる生合成不適合を示唆した。LPSのKdo領域におけるこの変化は、ゲノム菌株Pm70を含む他の幾つかのパスツレラ・マルトシダ菌株においても観察された。
【０１６３】
パスツレラ・マルトシダ(Pm)は、食用動物及びヒトに重病を起こすグラム陰性菌で多種に対する(multi-species)病原体である。この細菌は、ニワトリ及び七面鳥の家禽コレラ、ウシの出血性敗血症、ブタの萎縮性鼻炎及びヒトのイヌ及びネコの咬傷感染の原因物質である。血清型群A及びBの皮膜並びにLPSを含む幾つかのPm病原因子が、先に特定されている。しかしながら、Pmから分離されたLPSの内毒素性に関して相容れない報告がある。血清型Bから分離されたLPS：二つの菌株が内毒素性であることが分かり、静脈投与されたLPSが、野牛の出血性敗血症の臨床的兆候を再現させることがあった。しかしながら、炎症反応及び微視的肝臓障害は哺乳類宿主に見られたものと同様であったが、七面鳥の雛が、Pmの血清型A菌株から分離されたLPSの致命的な影響に対して、比較的抵抗性があることが分かった。対称的に、ニワトリの胚及びマウスが、PmLPSの毒性の影響を非常に受けやすいことが分かった。
【０１６４】
Pm菌株は、LPSに対する抗体反応に基づき、ヘドルストン(Heddleston)血清型に分類される。一方、熱滅菌されたPmワクチンに対して仕立てた抗体は、主としてLPSに対して向けられ、同じ血清型の菌株に対して宿主を保護する。初期の研究が、高温フェノール／水法を用いて精製され、マウスとウサギに注入されたLPSが、弱い抗体反応を示し、Pm感染に対して保護しなかったが、同じLPSが、ニワトリに注入された場合には、病気に対して受容体を確実に保護する良好な抗体反応を誘発させたことを実証した。血清型A菌株からのLPSに対して仕立てたモノクローナル抗体が、殺菌性であり、同種の攻撃に対してマウスを完璧に保護することが示された。加えて、Pm LPSの血清型B菌株に対するオプソニンモノクローナル抗体が、Pm感染からマウスをある程度保護することが示された。
【０１６５】
変更を加えたLPS構造は、生体内で明らかにPmの生存能力を冒す。最近、各々遺伝子pm1294に一つのトランスポゾンが挿入されたPｍ菌株VP161の強く弱毒化された三つの突然変異体が、同定された(waaQPMと称す)。この遺伝子は、次いで、ヘプトシルトランスフェラーゼをコード化することを示された。この遺伝子の突然変異は、非常に先端の切断された(truncated)LPS構造をもたらした。さらに、Pm galE突然変異体が、先に構成され、LPSの構造分析は報告されていないが、マウスにおいて弱毒化された。Pm分離株は、莢膜抗原で敏感にした赤血球を用いた受身血球凝集反応試験を用いて、それらの莢膜抗原に基づいて、血清学的に５つの血清型グループA、B、D〜Fに分類される。各々よく研究されているグリコサミノグリカンの例である血清型A(ヒアルロン酸)、D(ヘパリン)及びF(コンドロイチン)の莢膜に関する構造の情報が入手可能である。菌株の同定のために体細胞(LPS)の分類を用いることもでき、二つの主なシステムが報告されている。ナミオカシステムは、試験管凝集反応試験に基づいており、１１の血清型を認識することができる。これに対し、ヘドルストン(Heddleston)システムは、ゲル拡散沈殿試験(gel diffusion precipitation testを用いており、１６の血清型を認識することができ、現在好まれている方法である。
【０１６６】
1981に、文字A、B、D、E及びFで特定されるカーター(Carter)莢膜型分類と、数字で特定されるヘドルストン体細胞型分類システムの両方を用いたパスツレラ・マルトシダ血清型の同定のための標準的なシステムが推奨された。Pmは、ポリマーO-抗原を有しないLPS分子、いわゆるラフLPSを発現する。最近、我々は、ラフLPS構造を示すゲノム菌株Pm70のLPS構造を分析した。最近のこの研究は、このLPSが、分子のKdo領域に変異(variation)を含んでいることも示唆した。この研究は、Pm LPS構造への更なる洞察を得るため、また、この菌株にもKdo領域における可変性があるかどうか調べるため、Pmの他の菌株：VP161、病原性の高い血清型A：１菌株について実施された。我々は、先にVP161におけるヘプトシルトランスフェラーゼ突然変異体のコアオリゴ糖を特徴付け、ここで我々は、LPS分子のKdo領域における新規な配列を含むLPSに関する全体構造を報告する。
【０１６７】
実験
培地及び成長条件
初めに、パスツレラ・マルトシダ菌株VP161を、37℃でチョコレート寒天プレート上で16時間成長させ、成長物(growth)を用いて、最終濃度が5ug/mlとなるまでβNAD(Sigma N-7400)を、最終濃度が5ug/mlとなるまでへミン(haemin)(Sigma H-2250)を、及び1%グルコース(10g)を添加した１リットルの脳-心臓浸出物(BHI)培地に接種した。次いで、培養物(cultures)を37℃、200rpmで6時間培養し、発酵槽に接種するのに用いた。次いで、パスツレラ・マルトシダ菌株VP161を、28リットルの発酵槽内の24リットルのBHIブロスにおいて、20％DOで飽和させて、37℃で18時間成長させた。シャープルズ(Sharples)の連続流遠心分離器を用いることにより細胞(約210g)を収集する前に、2％までフェノールを加えて細胞を殺し、フェノール添加の3時間後、1gのヒアルロニダーゼ(Roche Chemicals)を加えて一時間攪拌した。
【０１６８】
リポ多糖の分離、精製及び分解
パスツレラ・マルトシダの細胞(約210g：湿重量)を凍結乾燥し、約56gを得た。LPS抽出の効率を高めるため、凍結乾燥した細胞を、有機溶剤(1 x エタノール、2 x アセトン、2 x 石油エーテル(light petroleum ether))で洗浄し、脂質及び他の親油性成分を除去した。洗浄した細胞(10g〜約42g)を、高温フェノール／水法で抽出し、水相を合わせて流水に対して48時間透析した。保持物質を、凍結乾燥して約1.6gを得、2％の水溶液を作り、DNase及びRNaseで4時間37℃で処理した後、37℃で4時間プロテイナーゼK処理をした。透析によって小さなペプチドを除去した。凍結乾燥をした後、保持物質(約0.2g)を、2％の水溶液にし、8,000gで15分間遠心分離をした(約85mgの8Kペレットを得た)後、100,000gで5時間上澄みをさらに遠心分離した。ペレット(精製されたLPSを含んでいる)を、再び溶解させ、凍結乾燥した(約17mgを得た)。8Kペレット材料(約40mg)を、攪拌しながら37℃で1時間無水ヒドラジンで処理し、O-脱アシル化LPS(LPS-OH)を調製した。反応物を、氷浴で冷却し、徐々に低温のアセトン(-70℃、5倍量)を加えて余分のヒドラジンを破壊した。沈殿したLPS-OHを、遠心分離によって分離し、再び溶解させたペレットを凍結乾燥した(約35mg)。次いで、試料を、Bio-Gel P-2カラム内を流下させて精製し、個々のフラクションを凍結乾燥した。8Kペレット材料(約45mg)とLPS(約17mg)を別々に酢酸(10mg/ml、100℃、1.5時間)で処理、次いで、遠心分離(5,000ｘg)によって不溶のリピドAを除去することによって、コアオリゴ糖(OS)を分離した。次いで、8Kペレットからの凍結乾燥したオリゴ糖試料を、上記のようにBio-Gel P-2カラム内を流下させてさらに精製した。LPS-OHを4NのKOHで6時間、125℃で処理し、中和した後、アニオン交換液体クロマトグラフィーで分画することにより、十分に脱アシル化されたLPSを分離した。
【０１６９】
分析方法
GLC-MSによって、糖がそれらの酢酸アルジトール(alditol acetate)誘導体であると決定された。試料を、4モルのトリフルオロ酢酸を用いて100℃で4時間加水分解した。加水分解物を、水中で16時間還元し(NaBD4)、残留する酢酸ナトリウムを触媒として用い、100℃で2時間、無水酢酸でアセチル化した。GLC-MSは、30M DB-17キャピラリーカラム(180℃〜260℃、3.5℃／分)を備えており、MSは、Varian Saturn II質量分析計を用いて電子衝撃モードで行った。メチル化分析を、NaOH/DMSO/ヨウ化メチル手法によって実施し、GLC-MSによって分析した。ブチルグリコシド誘導体のGLC分析によって、絶対配置を決定した。
【０１７０】
質量分析
ESI-MSを、VG Quattro質量分析計(英国、マンチェスター、マイクロマス)を用いて陰イオンモードで、0.5％の酢酸を含む25％水性アセトニトリルに試料を直接投入することにより行った。キャピラリー電気泳動(CE)-MSを、マイクロスプレーインターフェイスを介してAPI 3000質量分析計(Applied Biosystem / Sciex, Concord, カナダ)に接続されたプリンス(Prince) CEシステム(Prince Technologies、オランダ)を用いて行った。鞘溶液(イソプロパノール-メタノール；2:1)を、1μl／分の流量で、低デッドボリュームT字管(low dead volume tee)(内径(i.d.)250μm、Chromatographic Specialties)に送った。使用前に、全ての水溶液を、0.45μmフィルター(Millipore)に通して濾過した。電気スプレーステンレス鋼ニードル(27ゲージ)を、低デッドボリュームT字管に衝合させて、鞘溶液をキャピラリーカラムの端に送れるようにした。5％のメタノールを含む10ｍM酢酸アンモニウム／水酸化アンモニウム脱イオン水溶液(pH9.0)を用いて、約90cmの長さの露出した溶融シリカキャピラリーで、分離を行った。注入部位においては、20kVの電圧をかけるのが典型的である。キャピラリーの出口は、レーザープラー(laser puller)(Sutter Instruments)を用いて内径約15μmまで先細りになっていた。全質量走査(full-mass scan)モードで1 m/z単位のステップあたり3.0msの滞留時間で、質量スペクトルを得た。1 m/z単位のステップあたり1.0msの滞留時間で、MS/MSデータを得た。RF専用(RF-only)四極子衝突セル内での選択した前駆イオンの窒素との衝突活性化により生じたフラグメントイオンを、第三の四極子を走査することによって質量分析した。
【０１７１】
核磁気共鳴
5mm又は3mmの三重共鳴(1H、13C、31P)プローブを使用してVarian Inova 400、500及び600 MHｚ分光計で、NMR実験を行った。凍結乾燥した糖試料を、600μl(5mm)又は140μl(3mm)の99％D2Oに溶解させた。実験は、4.78ppmにおけるHOD(重水素置換したH2O)信号を抑制して、25℃で行った。アセトンのメチル共鳴を、1Hスペクトルに関しては2.225ppmでの、13Cスペクトルに関しては31.07ppmでの内部基準として用いた。Varian、COSY、TOCSY、NOESY、13C-1H HSQC、13C-1H HSQC-TOCSY及び13C-1H HMBCからの標準的な等核及び異核相関した2Dパルスシーケンスを、全体の帰属特定(general assignments)に用いた。Varian Inova 200分光計を用いて、40ppmの掃引幅、20000の過渡応答(transients)及び1.6 sの収集時間で、1D 31P実験を行った。Varian Inova 400分光計を用いて6時間、2D 1H-31P HSQC実験を行った。1D-HSQC実験のアレーを行うことによって、10Hzにおける結合定数を最適化した。F2 (1H)ディメンションにおける掃引幅は6.0 ppmであり、F1 (31P)ディメンションにおける掃引幅は、16.2 ppmであった。緩和遅延(relaxation delay)の間の水前飽和(water presaturation)は、1.5 sであり、t2における収集時間は0.21 sであり、増分(increment)あたり180 (HMQC)走査で、32の増分が得られた。150msのTOCSYミキシングタイムでのHSQC実験と同じパラメータを用い、Varian Inova 400分光計で8時間、2D 1H-31P HSQC-TOCSY実験を行った。
【０１７２】
結果と分析
パスツレラ・マルトシダ菌株VP161の研究
精製したLPS及び8Kペレット材料の糖分析が、それぞれ約２：１：４の割合のグルコース(Glc)、ガラクトース(Gal)及びL-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース(LD-Hep)を示した。少量のN-アセチル-グルコサミン(GlcNAc)も同定された。コアオリゴ糖(OS)由来のブチル-グリコシドのGLC分析が、Glc及びGalがD-異性体であることを示した。
発酵槽で成長させた細胞のLPSからLPS-OHを調製し、CE-MSによって分析した(実施例４、表１)。最小分子に関する2PCho、4Hep、3Hex、2Kdo、リピドAの組成物に対応するm/z 992.0、999.0及び1040.0において、三荷電イオンが観察された。以下に示すように、より大きな糖型が、第二のKdo残基の代わりにホスフェート分子を、コアオリゴ糖にもう一つのヘキソースを有する分子に対応し、最も大きな糖型(m/z 1040.0)に関しては、さらに余分のPEtn残基をKdo-P上に有する分子に対応した。チョコレート寒天プレート上での成長後、m/z 1033.0及び1081.0の三荷電イオンから、さらに別の糖型が示された(実施例４、表１)。MS/MS分析が、糖型の混合物に二つの異なるリピドA-OH種が存在することを示した。MS/MSの結果、m/z 475.5及び951.5の二荷電及び一荷電イオンによって示される952 amuの分子量を有する主要種と、MS/MSの結果観察されたm/z 536.5の二荷電イオンによって分かる余分のPEtn残基を含む種である(図27c)。O-脱アシル化リピドA主要種(952 amu)は、N-アシル化(3-OH C 14:0)グルコサミン残基の二糖からなり、各残基は、ホスフェート分子で置換されている。より大きなリピドA種は、プレート上で成長させた細胞からのみ、m/z 1033.0、1040.0及び1081.0の三荷電イオンに関して観察された。加えて、m/z 219.5の一荷電イオンによって、m/z 1040.0及び1081.0の三荷電イオンに対応するP-PEtn部分についての証拠が、糖型についてのMS/MSの結果観察された(図27c)。このイオンは、m/z 992.0、999.0及び1033.0の三荷電イオンについてのMS/MSの結果では観察されなかった。さらに、MS/MS実験は、コアオリゴ糖分子の大きさを明らかにした。m/z 992.0における三荷電イオンに関して、m/z 1012.5の二荷電イオンによって示されるように、コアオリゴ糖は、2027 amuであった(図27a)。これは、2Kdo、2PCho、4Hep、3Hexの組成物に相当する。m/z 999.0における三荷電イオンに関しては、m/z 1023.5の二荷電イオンによって示されるように、コアオリゴ糖は、2049 amuであった(図27b)。これは、Kdo、P、2PCho、4Hep、4Hexの組成物に相当する。m/z 1040.0における三荷電イオンに関しては、コアオリゴ糖は、m/z 1084.5の二荷電イオンによって示されるように2172 amuにおいて観察され、又は余分のPEtn残基を有する主要なリピドA種に対応するm/z 536.5の二荷電イオンによって示されるように2049 amuであると推定された(図27c)。したがって、m/z 1040.0におけるこのイオンは、m/z 475.5及び536.5における二つのリピドA種に関する二つの特徴的な二荷電イオンによって証拠立てられるように、P-PEtn部分をKdoに又は余分のPEtnをリピドAに有する異性体糖型に相当する。よくあることであるが、MS/MS分析の際のKdoからのCO2の損失の証拠も、観察された。
【０１７３】
コアオリゴ糖だけ(LPS及び8Kペレット材料の両方に由来；同じスペクトルをもたらした)についてのMS分析が、実施例４、表１のm/z 902.0及び983.0における二荷電陰イオンに対応するm/z 903.0及び984.0における二荷電陽イオンからの異なるフラグメンテーションパターンを示し、近位のヘプトース残基〜Kdoにおけるヘキソースの存在又は不存在と合致した。m/z 903の二荷電イオンについてのMS/MS(図28a)が、Hep IにおけるHex残基の不存在と合致するフラグメンテーションパターンを示した。m/z 984の二荷電イオンについてのMS/MS(図28b)が、m/z 682.0における二荷電イオンが存在し、m/z 903.0のMS/MS(図28a)の結果では、この信号が存在しないが、m/z 697.0における二荷電イオンが存在することにより、前者のこのヘキソース残基がHep I残基上に位置している場合と比較して、より大きなオリゴ糖が、余分のヘキソースを有していることを示した。総合すれば、このデータは、VP161のLPSから生成された糖型(このうちの幾つかはホスフェート又はピロホスホエタノールアミン部分が結合した一つのKdo種を含む)及び二つのKdo分子を含む他の集団(population)の新規な混合物を示唆している。二つのKdo分子を含む種では、コアオリゴ糖の近位のヘプトース残基においてはヘキソース残基は存在せず、この配列の生合成が不可能であることを示唆した。
【０１７４】
PCho残基の位置も、これらの陽イオンモードでのMS/MS実験から決定された。m/z 424.5の二荷電イオンが、2PCho、2Hex、Hep、の組成物に相当することが分かり、その後のこの二荷電イオンについてのMS/MS/MSが、それぞれPCho-Hex及びPCho-Hex-Hepに相当するm/z 328.5及び520.5の一荷電イオンを示し、二つのPCho-Hex部分が、Hep残基に結合していることを示唆した(図28c)。
【０１７５】
分子の結合パターンを決定するため、O-脱アシル化LPS(LPS-OH)についてのメチル化分析を行い、約１：１：１：１：１のモル比での末端Glc、6-置換Glc、末端LD-Hep、2-置換LD-Hep及び4,6-二置換LD-Hepの存在を示し、より少量の末端Gal、3,4-二置換LD-Hep、3,4,6-三置換LD-Hepも観察された。加水分解で生じるリン酸化された糖の最適な解放を妨げるホスフェート残基を除去するHF処理に続いて、メチル化分析を繰り返し、このメチル化分析は、ここでは他成分の倍量のt-Gal残基を別にして、同じ割合での同じ糖を示し、PCho残基がGal糖を置換していたことを示唆した。
【０１７６】
オリゴ糖の正確な位置と結合パターンを明らかにするため、最も解像され均質なスペクトルをもたらすオリゴ糖フラクションに関するNMR研究を行った。パスツレラ・マルトシダ菌株Pm70並びに関連する種であるマンヘイミア・ヘモリティカ及びアクチノバシラス・プレウロニューモニーからの構造的に関連するコアオリゴ糖を参照したCOSY及びTOCSY実験により、オリゴ糖試料の1H共鳴の帰属特定がなされた(実施例４、表２)。内側コア残基(Hep IV(f/f’)まで)は、最近発表されたパスツレラ・マルトシダ菌株Pm70からの内側コアと同様に結合されており、実施例４、表２に掲げた帰属特定は、それと合致していた。
【０１７７】
しかしながら、VP161コアオリゴ糖におけるHep II (b)の3位には、PEtnがなかった。興味深いことに、コアオリゴ糖試料に関して、Hep I (a)におけるGlc残基(e)の存在又は不存在が、残りの内側コア残基に関する二セットのシグナルの同定につながった(図29)。4.64(d)及び4.51(d’) ppmにおけるGlcに関する二つのシグナルは、先に説明したように、Hel I (a)の4-位及び6-位に対するNOE結合性(NOE接触：NOE contact)によって同定された。
【０１７８】
しかしながら、4.51 ppmにおけるGlc II (e)及びGlc I残基(d’)のアノマープロトン共鳴の間のNOE間結合性(NOE間接触：inter-NOE contact)の不存在が、Glc IIが存在しない場合のこのGlc I残基(d’)に関するスピン系を同定した。反対に、Glc II (e)のアノマープロトン共鳴と4.64 ppmにおけるGlc I残基との間のNOE間結合性(NOE間接触：inter-NOE contact)が、Glc II (e)が存在する場合のこのGlc I残基(d)に関するスピン系を同定した(図29)。
【０１７９】
このアノマー間NOE結合性(アノマー間NOE接触：inter-anomeric NOE contact)、Pm70並びに関連する種であるマンヘイミア・ヘモリティカ及びアクチノバシラス・プレウロニューモニーのLPSにおいて先に観察されていた。そのようにして、Glc II (e)の存在又は不存在に基づいて、残りの内側コア残基を帰属特定することが可能であった。Hep IV (f/f’)におけるヘキソース残基の位置特定と同定は、明らかにすべきまま残っていた。MS分析が、両方のヘキソース残基がPChoで置換されており、両方ともHep IV (f/f’)を置換していることを示していた。
【０１８０】
HF処理後のメチル化分析で同定された増量したt-Galは、これと合致し、PChoを有するヘキソース残基は、両方ともGal糖であることを示唆した。二つのβ-立体配置のGal残基であるGal I、Gal IIが、それらの結合定数及びH-4に対して特徴的なスピン系により、それぞれ、4.70(g) ppm及び4.66(h) ppmでコアオリゴ糖試料において同定された。Hep IV (f/f’)におけるGal I (g)及びGal II (h)の結合位置は、Gal I残基(g)は、Hep IV (f)の4位に結合し、Gal II残基は、Hep IV (f/f’)の6位に結合していることを示したNOESY実験から推測された(図29)。
【０１８１】
これらの推測は、13C-1H-HMBC実験から確認され、この実験は、コアオリゴ糖における他の結合も確認した(図30)。二つのPCho残基の位置を特定するため、31P-1H-HSQC及び31P-1H-HSQC-TOCSY実験を行った。この実験は、先に帰属特定された各Gal糖の3位を、各PCho残基の結合の位置として同定した(図31)。これは、13C-1H-HMBC実験によって確認され、この実験は、低フィールド値(約78 ppm)において各Gal残基のC-3原子の化学シフトを同定し、リン酸化と合致した。
【０１８２】
分子のKdo領域における新規な配列をさらに探求するため、KOH処理の後、脱アシル化された試料を調査した。一つ又は二つのKdo残基を含む十分に脱アシル化されたLPSフラクションを分離するのは可能であった(図32a及び図32b)。図32bにおけるエクアトリアル及びアキシアルプロトンに関する二つのセットのシグナル(z3e,z3a及びz’3e,z’3a)と比較して、図32aにおけるKdoのH-3プロトンに関して一つのエクアトリアル及び一つのアキシアルシグナル(z3e及びz3a)のみが見られたので、一つ及び二つのKdo残基を含む糖型の存在が図32にはっきりと示された。一つのKdoを含む試料に関しては、全体の帰属特定が可能であったが、この糖型が少量しか得られなかったので。二つのKdoを含む試料に関しては、部分的な帰属特定のみが可能であり、強度のより低いスペクトルになった。しかしながら、二つのスペクトルのアノマー領域に基礎的試験が、図32aにおいてGlc II残基(e)に関するシグナルの存在をはっきりと示し(ここでは、一つのKdo残基のみが存在する)、図32bにおいては斯かるシグナルが存在しないこと(ここでは、二つのKdo残基が存在する)ことを、はっきりと示している。コアオリゴ糖データによって示されるように、Glc II残基の存在又は不存在は、幾つかの他のアノマープロトン共鳴、特にHep I (a)、Hep II (b)及びGlc I (d)シグナルの化学シフトに影響を有しており、内側コア分子の立体配置に対する影響と合致した。一つのKdoを含む糖型の帰属特定が、実施例４、表２に詳細に記載されており、これは、コアオリゴ糖試料に基づいて帰属特定を確認したものであり、この試料が一つのKdoを含む糖型に関してKdo-リピドA領域を含むと範囲を広げた。
【０１８３】
パスツレラ・マルトシダ(Pm)のVP161菌株のオリゴ糖の構造分析が、Pmのゲノム菌株Pm70及び関連する種であるマンヘイミア・ヘモリティカ(Mh)、アクチノバシラス・プレウロニューモニー(App)に関する先に決定されたLPSコアオリゴ糖構造との類似性及び相異を有する構造を示した。各々の場合において、コアオリゴ糖は、Kdo残基と結合した同様に結合したトリ-ヘプトシル単位を含んでいた。興味深いことに、Pm70では、Hep IIの3位が、多くの場合PEtn残基で置換されているのに対し、菌株VP161並びに関連する種であるApp及びMhでは、内側コアPEtn残基は観察されなかった。Hep IIのPEtnによる置換における変化を別にすると、二つのPm菌株及び関連する獣医学的種であるMh及びAppは、比較的保存された内側コア構造を共有している。Pmの内側コア構造における他の相異は、App及びMhでみられるD-グリセロ-D-マンノ立体配置のヘプトース残基と比較してHep IにおけるGlc残基からのエクステンションにおけるL-グリセロ-D-マンノ立体配置のヘプトース残基の同定と、明らかに分子のKdo領域の可変性に起因するPm内側コアにおけるGlc II残基の可変の存在だけである。このGlc II残基は、App及びMhの内側コアに化学量論的に存在した。この保存された内側コア領域を越えた異なるエクステンションが、VP161において観察され、それにより、Hep IV残基が、4-位及び6-位において二つのPCho-Gal部分により二置換されていることがわかった。我々の知る限りでは、この構造配列(structural arrangement)は、先に観察されていない。同じLPS分子中に二つのPCho残基があるのは希であり、型分類不能なHiキャリッジ(carriage)菌株11及び16が、斯かる配列の例を記録に残しているだけである。PCho残基の存在は、付着性におけるPChoに関する役割として、Pm微生物の病原性と結びつけることができ、呼吸器管におけるコロニー形成が記録に残っている。二つのPCho残基のない先端の切断された(truncated)LPS構造を呈した菌株VP161の突然変異体が、マウスモデル及びニワトリにおいて弱毒化された。他の著者による先の研究も、LPS構造の変化に起因しうるPmのgalE突然変異体血清型D菌株の病原性の低下を観察していた。しかしながら、VP161のLPS構造の最も興味を引く特徴は、Kdo領域で観察された変化であり、ここで、一つのKdo及び二つのKdoを含む糖型の両方が観察された。加えて、内側コア構造に対する衝撃(impact)、すなわち、Kdo領域の配列の可変性によって生じるHep IにおけるGlc IIの存在又は不存在は、興味深い。Glc IIのHep I残基への転位に関与するα-1,6-グルコシルトランスフェラーゼは、知られていない。LPSも一つのKdo及び二つのKdoを含む種の両方を有する集団を含んだ菌株Pm70のPmゲノムにおいて、Kdoトランスフェラーゼに対するただ一つの相同体が同定されたことに注目するのが興味深かった。Pmトランスフェラーゼの「二価性」に起因しうる何らかのシーケンスの違いを調べるため、又は、他の調節因子が、このこの可変性に関与しているかどうかを調べるため、Pm、App及びMhからのKdoトランスフェラーゼ遺伝子のシーケンスを比較することも興味深いことである。この研究は、第二のPm菌株のLPS構造を同定した。両方の菌株は、類似の内側コア構造を共有していたが、外側コアは可変であり、どちらも分子のKdo領域における興味深い変化を示し、その重要性は調査すべきものとして残っている。
以下に示す実施例４、表１において、Core OSはコアオリゴ糖である。
【０１８４】
（実施例４−表１）
【表２０】
2007537307.tif 000031
【０１８５】
（実施例４−表２）
【表２１】
2007537307.tif 000032
【０１８６】
（実施例４−表２）
【表２２】
2007537307.tif 000033
【０１８７】
（実施例４−表２）
【表２３】
2007537307.tif 000034
【０１８８】
（実施例４−表２）
【表２４】
2007537307.tif 000035
【０１８９】
（実施例４−表２）
【表２５】
2007537307.tif 000036
【０１９０】
実施例５：この実施例は、Carbohydrate Research 340, 1253 (2005)における発表の基礎をなすものである。
パスツレラ・マルトシダ菌株X73からのコアオリゴ糖の構造分析
この実施例において、パスツレラ・マルトシダ菌株X73からのリポ多糖のコアオリゴ糖領域の構造が、明らかにされた。リポ多糖を、種々の分解処置に供した。精製したオリゴ糖の構造が、単糖及びメチル化分析、NMR分光法及び質量分析によって立証された。以下の構造は、他のパスツレラ・マルトシダ菌株VP161からの最近同定されたオリゴ糖と類似しているが、末端ガラクトースのホスホエタノールアミン部分による余分の対称的な置換を有する構造（化１９）を示している。
（化１９）
2007537307.tif 000037
ここで、NMRデータに基づき、全ての糖はピラノース環型であることが分かり、Kdoは、2-ケト-3-デオキシ-オクツロソン酸であり、L,D-α-Hepは、L-グリセロ-D-マンノ-ヘプトースであり、PEtnは、ホスホエタノールアミンであり、PChoは、ホスホコリンである。
【０１９１】
パスツレラ・マルトシダ(Pm)は、グラム陰性菌であり、食用動物やヒトに重病を引き起こす多種に対する病原菌である。ゲノム菌株Pm70及病原性の血清型A:1菌株VP161のリポ多糖(LPS)についての構造分析が、可変の外側コアオリゴ糖構造を有する保存された内側コアオリゴ糖(OS)を明らかにした。この研究は、他の病原性の血清型A菌株X73についても行われ、精製されたLPS調製物の構造分析が、菌株VP161に関してみられたのと類似しているが、外側コアオリゴ糖に対する余分の対称的なリン酸化パターンを有するオリゴ糖構造を明らかにした。菌株X73からの精製されたLPS及び8Kペレット材料の糖分析が、糖であるグルコース(Glc)、ガラクトース(Gal)及びL-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース(LD-Hep)を、それぞれ約２：１：４の割合で含む菌株VP161と類似のプロファイルを明らかにした。O-脱アシル化LPS(LPS-OH)を、発酵槽で成長させた細胞から調製し、CE-MSにより分析した(実施例５、表１)。菌株VP161に関して観察されたものと類似の質量プロファイルが、観察されたが、VP161のLPS-OHからの最も顕著な種(m/z 999.0)と比較して、主要な種は、二つの余分のPEtn残基に対応するであろうm/z 1081.0の三荷電イオンであった。MS/MS分析が、全てのリピドA分子が、N-アシル化(3-OH C 14:0)グルコサミン残基であり、各残基は、m/z 475.5及び m/z 951.5の二荷電及び一荷電イオンによって示されるように、952 amuの分子量を有するホスフェート残基で置換されている。したがって、このMS/MS分析は、菌株X73における余分のPEtn残基は、LPS分子のコアオリゴ糖領域にあることを示し、コアオリゴ糖分子の予想質量が、実施例５、表１に示されている。
【０１９２】
コアオリゴ糖のみに関するMS分析が、LPS-OHデータから推測される組成と合致する一連のイオンを明らかにし、菌株VP161と比較して余分のPEtn残基の存在を示した。PEtn残基の位置が、陽イオンモードでのMS/MS実験から決定された。最も大きな糖型に対応するm/z 1108の二荷電イオンの分解(fragmentation)が、m/z 183.5+(PCho)、450.5+(PCho-Hex-PEtn)、547.52+(2PCho, 2PEtn, 2Hex, Hep)及び916.5(M-Kdo-Hex)を含む幾つかの生成イオンを生じさせた。m/z 547.52+における二荷電イオンは、二つのPEtn残基の存在と合致する246 amuの質量を有する糖型を示すので、菌株VP161でm/z 4242+において観察された二荷電イオンと比較すると、特に興味深いものであった。m/z 916.52+における二荷電イオンに関するMS/MS/MS分析が、図33aに示す生成イオンスペクトルを明らかにした。図33aに示す分解パターンが、PRtn残基を、Hep IV残基の末端Hex-PCho部分に位置特定することを可能にし、それに続くイオンm/z 450.5を分解するMS/MS/MS実験(図33b)が、このイオンが初めに推測したようにPCho-Hex-PRtn部分に相当することを示した。これらの推測を確認し、範囲を広げるため、両方のPEtn残基(MS(データは示さず)によって決定された)を含む分画したこあおり試料について、NMR実験を行った。二つの末端ガラクトース残基を別にして、全ての帰属特定は、菌株VP161からのコアオリゴ糖について得られた帰属特定と同じであった。ガラクトース残基のH-1及びH-2共鳴に関する化学シフトが、VP161試料に関して観察されたが、H-3及びH-4共鳴は、4.17及び4.12 ppmから、それぞれ、4.21及び4.17 ppmにわずかにダウンフィールドにシフトした。ガラクトース残基からのNOE間結合性(NOE間接触：inter-NOE contacts)は、先に観察されたとおりであったが、H-5残基に対するNOE内結合性(NOE内接触：intra-NOE contact)は、菌株VP161に関して3.80及び3.76 ppmであるのに対し、ここでは、3.94 ppmにおいて観察された(実施例５、表２)。二つのPEtn残基の位置を特定するため、31P-1H-HSQC実験を行い、この実験は、4.07 ppmにおける共鳴を、PEtn残基の結合の位置として特定した。続いての31P-1H-HSQC-TOCSY実験が、3.94 ppmにおいてガラクトース残基のH-5共鳴を同定した(図34)。4.07ppmのガラクトース残基のH-6共鳴としての帰属特定は、13C-1H-HMQC実験によって確認され、この実験は、リン酸化と合致する低フィールド値(約65ppm)における各Gal残基のC-6原子のダウンフィールド化学シフトを、-CH2部分に関する特徴的な正のピークとして同定した。最後に、13C-1H-HMQC-TOCSY実験が、C-6及びH-5共鳴の間(逆も同じ)の交差ピークを同定し、二つのガラクトース残基の6-位を、菌株X73コアオリゴ糖においてみられる余分の二つのPEtn部分の結合位置として確認した(図35)。  
【０１９３】
したがって、この研究は、第二の血清型A菌株のLPSからの類似のコアオリゴ糖構造を同定した。更なる研究が、この新規な末端構造が他の血清型に存在するかどうかを調べるため、LPS構造分析を、他の血清型にまで広げるであろう。６炭糖の6-位におけるPEtnの同定は、幾分珍しい。PEtnは、髄膜炎菌及びインフルエンザ菌の両方におけるヘプトース残基の6-位に普通に存在する。我々の研究室における最近の研究が、幾つかのインフルエンザ菌の菌株において、末端GalNAc残基の6-位におけるPEtnを同定し、最近のポスターも、ここで観察されたものと類似の化学シフトを有するシトロバクター(Citrabacter)sp. PCM1443(血清型O39)において、3-結合ガラクトース分子の6-位におけるPEtn残基を見出している。
【０１９４】
１．実験
１．１細菌の成長、LPSのフラクションの分離
パスツレラ・マルトシダ菌株X73(NRCC番号6235)を成長させ、分離した。簡単に言えば、パスツレラ・マルトシダの細胞(約210g：湿重量)を凍結乾燥し、約56gを得た。LPS抽出の効率を高めるため、凍結乾燥した細胞を、有機溶剤(1 x エタノール、2 x アセトン、2 x 石油エーテル(light petroleum ether))で洗浄し、脂質及び他の親油性成分を除去した。洗浄した細胞(10g〜約42g)を、高温フェノール／水法で抽出し、水相を合わせて流水に対して48時間透析した。保持物質を、凍結乾燥して約0.57gを得、2％の水溶液を作り、DNase及びRNaseで4時間37℃で処理した後、37℃で4時間プロテイナーゼK処理をした。透析によって小さなペプチドを除去した。凍結乾燥をした後、保持物質(約0.42g)を、2％の水溶液にし、8,000gで15分間遠心分離をした(約265mgの「8Kペレット」を得た)後、100,000gで5時間上澄みをさらに遠心分離した。ペレット(精製されたLPSを含んでいる)を、再び溶解させ、凍結乾燥した(約3mgを得た)。LPS-OH及びコアオリゴ糖を分離し、分画した。簡潔に言えば、8Kペレット材料(約15mg)及びLPS(約3mg)を、攪拌しながら37℃で1時間無水ヒドラジンで処理し、LPS(LPS-OH)を調製し、8K試料から約10mg及びLPSから約1mgを得た。8Kペレット材料(約115mg)を1％酢酸(10mg/ml、100℃、1.5時間)で処理し、次いで、遠心分離(5,000ｘg)によって不溶のリピドAを除去することによって、コアオリゴ糖を分離した。次いで、凍結乾燥した上澄みを、Bio-Gel P-2カラム内を流下させてさらに精製し、別々のフラクションを凍結乾燥して約40mgを得た。
【０１９５】
１．２分析方法
GLC-MSによって、糖が、それらの酢酸アルジトール(alditol acetate)誘導体として決定された。メチル化分析が、NaOH/DMSO/ヨウ化メチル手法によって実施され、GLC-MSによって分析された。
【０１９６】
１．３質量分析及びNMR分光法
全ての質量分析及びNMR実験は、上述のように行われた。
以下に示す実施例５、表１におけるCore OSはコアオリゴ糖である。
【０１９７】
（実施例５−表１）
【表２６】
2007537307.tif 000038
【０１９８】
（実施例５−表２）
【表２７】
2007537307.tif 000039
【０１９９】
実施例６：この実施例は、Infect. Immun. 72: 3436 (2004)における発表の基礎をなすものである。
パスツレラ・マルトシダのヘプトシルトランスフェラーゼ突然変異体が、先端の切断された(truncated)リポ多糖構造を作り出し、その病原性が弱毒化される。
パスツレラ・マルトシダVP161野生型LPSの分析が、インフルエンザ菌、デュクレー菌、髄膜炎菌、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)グラム陰性粘膜性(mucosal)病原体から分離されたリピドAに結合した短い非反復の多糖単位を有するLPSすなわちリポ多糖と類似の「ラフ」LPSを示した。パスツレラ・マルトシダLPSの内側コア構造は、インフルエンザ菌、マンヘイミア・ヘモリティカ及びデュクレー菌に関して説明したKdo残基を介してリピドAに結合したトリヘプトース単位を有する内側コア構造と類似している(図30)。AL251突然変異体では、waaQPMの不活性化が、内側コア領域において第三のヘプトース分子(Hep III)のない非常に先端の切断された(truncated)LPSの発現に帰着した。この突然変異体におけるLPSの最も豊富な糖型も、第一のヘプトースに対して遠位の全ての糖を欠いており、waaQPMの不活性化が、それ以上の糖の付加を妨げることを示唆した。したがって、第三のヘプトースの欠如に起因するLPS中間体における立体配置の変化が、次のトランスフェラーゼの活動を大いに妨げたということは、確からしい。
【０２００】
材料及び方法
細菌の菌株、プラスミド、培地及び成長条件
この研究で使用する細菌の菌株及びプラスミドを、実施例６、表１に示す。大腸菌を、ルリア・バーターニ(Luria-Bertani)ブロス中で、普通に成長させた。パスツレラ・マルトシダ菌株を、酵母エキス(3%)(英国、ベージングストーク、Oxoid)を補給した脳-心臓浸出物(BHI)又は栄養ブイヨン(NB)の何れかの中で成長させた。1.5％の寒天を添加して固形培地を得た。必要な場合には、培地に2.5μg/mlのテトラサイクリンを補給した。構造の研究のため、パスツレラ・マルトシダ菌株VP161及びAL251を、28リットルの発酵槽内で24リットルのBHIブロス中で、20％DOで飽和させて、37℃で18時間成長させた。シャープルズ(Sharples)の連続流遠心分離器を用いることにより細胞を収集する前に、2％までフェノールを加えて細胞を殺し、フェノール添加の3時間後、1gのヒアルロニダーゼ(Roche Chemicals)を加えて一時間攪拌した。
【０２０１】
トランスポゾン安定性の研究
パスツレラ・マルトシダAL251を、10mlの栄養ブイヨン(NB)中で成長させ、37℃で振とうした。約10、34及び58世代後、培養物の試料を採取し、適当に稀釈し、NB寒天上で平板培養させた。一晩培養させた後、100個のコロニーを、テトラサイクリンを補給した栄養ブイヨン(NB)に載せ付け(patched)、37℃で一晩培養した。トランスポゾン損失が、テトラサイクリン感受性のコロニーのパーセンテージとして表された。
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)
Laemmli, Nature 227, 680 (1970)において記載したように、SDS-PAGEを用いてBio-Radミニタンパク質ゲル装置で、LPSの分析を行った。次いで、銀染色によって、LPSを目に見えるようにした。
【０２０２】
DNAマニピュレーション
NEB(ビバリー(Beverly)、マサチューセッツ州(MA))又はRoche Diagnostics GmbH(マンハイム、ドイツ)から得た酵素を用い、製造者の指示にしたがって、制限消化(restriction digests)、連結反応及びポリメラーゼ反応を行った。プラスミドDNAを、アルカリ溶菌法を用いて調製し、Qiagenカラム(QIAGEN GmbH、ドイツ)を用いて又はPEG析出(PEG precipitation)(Ausubel, 1995)により精製した。CTAB法を用いて、ゲノムDNAを調製した。Taq DNAポリメラーゼ又はExpand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics)を用いてDNAのPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)増幅を行い、PCRの反応生成物をQiagen PCR Purification Kitを用いて精製した。本研究に用いたオリゴヌクレオチドを、実施例６、表１に掲げる。DNAシーケンスは、Model 373A DNA Sequencing System (Applied Biosystem)を用いて決定され、Sequencer Version 3.1.1(GenCodes, アンアーバー、ミシガン州)を用いて分析された。
【０２０３】
waaQPMのトランス相補正(trans complementation)において：
全体のwaaQPM遺伝子を、オリゴヌクレオチドBAP2146及びBAP2147を用いて、パスツレラ・マルトシダVP161ゲノムDNAから増幅された。増幅された1.1kbDNAフラグメントは、転写がパスツレラ・マルトシダtpiAプロモーターによって進められるよう、SalI及びBamHI-消化されたベクターpAL99に連結された(実施例６、表１)。正しい(correct)プラスミドが存在するので、大腸菌形質転換細胞をふるい分けし、pAL170と称する形質転換細胞を用いてパスツレラ・マルトシダAL251を形質転換させ、菌株AL298を生成した。対照として、別に、ベクターｐAL99を、AL251に形質転換させ、菌株AL438を生じさせた(実施例６、表１)。
【０２０４】
競合成長アッセイ
競合成長アッセイを、Harper文献(2003)に説明されているように行い、パスツレラ・マルトシダLPS突然変異体AL251及び相補された(complemented)突然変異体AL298の相対成長率を量化するのに用いた。(生体外又は生体内)生産培養物(output culture)から得たテトラサイクリン耐性コロニーのパーセンテージを、生産培養物から得たテトラサイクリンコロニーのパーセンテージで割ることによって、競合指数(CI)を決定した。生体内成長と生体外成長との間の違いを判定する相対競合指数(rCI)を、生体内競合指数(CI)を生体外競合指数(CI)で割ることにより決定した。突然変異体は、片側ｚ検定(p<0.05)を用いた統計分析によって決定されるようにrCI値が、有意に1.0よりも小さい場合に、弱毒化されたものとして同定される。
【０２０５】
病原性試験
10羽の市販で得た12週齢のレグホン雑種のニワトリのグループを、100μlを胸筋に注射することにより、二つの異なる用量でパスツレラ・マルトシダVP161又はAL251で感染させた。AL251で感染させた後、種々の時点で血液試料を取り、生存することができないとみなされたトリは、動物倫理要件(animal ethics requirements)に従って安楽死させた。血液試料は、ヘパリンを含むBHIで二倍に稀釈し、BHIプレート上で平板培養した。血液から分離されたパスツレラ・マルトシダコロニーを、NB寒天及びテトラサイクリンを含むNB寒天に貼り付けた(patched)。
【０２０６】
血清感受性アッセイ
パスツレラ・マルトシダ及び大腸菌の新鮮なニワトリ血清に対する感受性を、Chung等のInfect. Immun. 69, 2487 (2001)に記載されているように、決定した。
【０２０７】
LPSの精製
パスツレラ・マルトシダの細胞(210g、VP161；254ｇのAL251)を凍結乾燥し、56gのVP161及び52gのAL251を得た。LPS抽出の効率を高めるため、凍結乾燥した細胞を、有機溶剤で洗浄し、脂質及び他の親油性成分を除去した。洗浄した細胞(42g、VP161；50g、AL251)を、高温フェノール／水法で抽出し、水相を合わせて流水に対して48時間透析した。保持物質を、凍結乾燥し、2％の水溶液を作り、DNase及びRNaseで4時間37℃で処理した後、37℃で4時間プロテイナーゼK処理をした。透析によって小さなペプチドを除去した。凍結乾燥をした後、保持物質を、2％の水溶液にし、8,000gで15分間遠心分離をした後、100,000gで5時間上澄みをさらに遠心分離した。ペレット(精製されたLPSを含んでいる)を、再び溶解させ、凍結乾燥した。精製したLPSを1％酢酸(10mg/ml、100℃、1.5時間)で処理し、次いで、遠心分離(5,000ｘg)によって不溶のリピドAを除去することによって、コアオリゴ糖を分離した。
【０２０８】
分析方法
GLC-MSによって、糖がそれらの酢酸アルジトール(alditol acetate)誘導体であると決定された。LPSを、4モルのトリフルオロ酢酸を用いて100℃で4時間加水分解し、水中で一晩NaBD4で還元し、次いで、残留する酢酸ナトリウムを触媒として用い、100℃で2時間、無水酢酸でアセチル化した。GLC-MSは、30M DB-17キャピラリーカラム(180℃〜260℃、3.5℃／分)を備えており、MSは、Varian Saturn II質量分析計を用いて電子衝撃モードで行った。メチル化分析を、NaOH/DMSO/ヨウ化メチル手法によって実施し、上記のようにGLC-MSによって分析した。
【０２０９】
MS分析
キャピラリー電気泳動エレクトロスプレーイオン化MS(CE-ESI-MS)を、マイクロプレーインターフェイスを介してAPI 3000質量分析計(Perkin-Elmer/Sciex)に接続されたクリスタルモデル310キャピラリー電気泳動(CE)計器(AYI Unicam)を用いて行った。鞘溶液(イソプロパノール-メタノール；2:1)を、1μl／分の流量で、低デッドボリュームT字管(low dead volume tee)(内径(i.d.)250μm、Chromatographic Specialties)に送った。使用前に、全ての水溶液を、0.45μmフィルター(Millipore)に通して濾過した。
【０２１０】
核磁気共鳴
3mmの三重共鳴(1H、13C、31P)プローブを使用してVarian Inova 500 MHｚ分光計で、NMRスペクトルを得た。凍結乾燥した糖試料を、140μl(3mm)の99％D2Oに溶解させた。実験は、4.78ppmにおけるHOD(重水素置換したH2O)信号を抑制して、25℃で行った。アセトンのメチル共鳴を、1Hスペクトルに関しては2.225ppmでの、13Cスペクトルに関しては31.07ppmでの内部又は外部基準として用いた。Varian、COSY、TOCSY、NOESY、13C-1H HSQC、13C-1H HSQC-TOCSY及び13C-1H HMBCからの標準的な等核及び異核相関した2Dパルスシーケンスを、全体の帰属特定(general assignments)に用いた。
【０２１１】
結果
弱毒化されたパスツレラ・マルトシダSTM突然変異体が、機能性waaQPM遺伝子との相補性によって全長LPSに復元される先端が切断されたLPSを生成する。
マウス及びニワトリにおいて成長させるために弱毒化された突然変異体を同定するため、シグネチャー付与(signature-tagged)突然変異誘発(STM)を用いた。この先の分析の間、ニワトリ及びマウスにおいて弱毒化された突然変異体が(指定されたAL251)、同定された。この突然変異体のシーケンス分析が、推定的ヘプトシルトランスフェラーゼ、ヘプトースのLPSへの付加に関与するグリコシルトランスフェラーゼをコード化すると予測されている遺伝子waaQPM内への一つのトランスポゾン挿入を明らかにした。
【０２１２】
我々は、後に銀染色をするポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、AL251のLPSプロファイルを、その野生型親VP161及び相補された突然変異体AL298のLPSプロファイルと比較した。AL251からのLPSは、野生型LPSと比較して、ゲル内をより遠く移動し、突然変異体によって生成されたLPSが、かなり先端が切断されていることを示した(図36a)。さらに、相補された突然変異体AL298のLPSプロファイルは、野生型に関して観察されたものと同じであり、突然変異体AL251の完全な(intact) waaQPM遺伝子との相補性が、野生型LPSの合成を回復させることができることを示した(図36a)。
AL251のwaaQPM遺伝子との相補性は、また、生体内成長を野生型レベルにまで回復させる。AL251のwaaQPMとの相補性が、野生型LPSの産生を回復させたので、我々は、不活性化されたwaaQPMとの相補も、突然変異体AL251の生体内成長を野生型レベルにまで回復させるかどうかを確認しようとした。相補された突然変異体AL298を用いた初期の研究が、ひとたび相補(complementing)プラスミドpAL170に関する抗生物質選択が取り除かれると、このプラスミドのかなりの損失があることを示した(6時間後44%保持)。この理由で、先の研究が、ニワトリでは感染に12時間より長くかかるのと比較して、マウスから細菌を収集するのに要する感染時間がほんの6時間であることを実証したため、競合成長アッセイ用にニワトリの代わりにマウスを選んだ。三匹のマウスに、VP161と相補された菌株AL298の同じ混合物を注射した。対照として、二匹のマウスに、野生型VP161と対照菌株AL438(ベクターpAL99を有するAl251)の同じ混合物を注射した。相補された突然変異株AL298は、1.0の平均rCI値で野生型VP161と同等に競合(compete)することができたが、一方、対照菌株AL438は、先にマウスにおけるAL251に関して報告されたrCI値と類似して、平均rCI値が0.57(p=0.03)であった。これらの結果は、waaQPMが全長LPSの産生と感染中の正常な成長の両方に必要であることを証明している。
【０２１３】
パスツレラ・マルトシダwaaQPM突然変異体は、ニワトリに発病させることができない。菌株AL251が、ニワトリにおいて非常に低下した成長速度を示した。この突然変異体は、これらの宿主においてなお発病させることができるかどうかを確認するのが望まれた。ニワトリを、二つの異なる用量でVP161又はAL251の何れかで攻撃した(実施例６、表２)。野生型VP161で攻撃された全てのニワトリは、20時間以内で死亡した。これに対し、AL251で攻撃されたニワトリのほとんどは、初めの20時間は元気なままであったが、4日以内に全てのニワトリが接種され、用量にかかわらず、家禽コレラ感染で倒れた。病気の後期又は末期のAL251感染のニワトリの血液からパスツレラ・マルトシダを分離し、全ての分離したパスツレラ・マルトシダコロニーは、テトラサイクリン感受性であり、トランスポゾンは、もはや細菌内には存在しないことを示していることが分かった。回収したコロニーからのwaaQPMのシーケンス分析が、全ての場合にトランスポゾンが切除され、それにより、機能性waaQPM遺伝子を再構成していることを示した。興味深いことに、一つを除く全ての分離株に関して、シーケンス分析は、waaQPM内の二つのアミノ酸変化に帰着するトランスポゾン切除の位置におけるヌクレオチド置換の存在も明らかにした(アミノ酸88、89；それぞれ、Ser〜Leu及びAps〜Cys)。AL251で攻撃されたニワトリから回収したパスツレラ・マルトシダ分離株のLPSプロファイルは、全て野生型と同じであったので、これらのアミノ酸変化は、waaQPMの機能を損なわなかった(図36b)。総合すると、これらの結果は、AL251で接種したニワトリで観察された家禽コレラの遅発は、完全にAL251の野生型復帰突然変異体によるものであり、したがって、不活性化されたwaaQPMを有する菌株が発病させることができないことを示した。
【０２１４】
ニワトリにおけるwaaQPM突然変異体の弱毒化は、ニワトリの血清に対する高くなった感受性によるものではない。野生型パスツレラ・マルトシダ菌株VP161及びLPS突然変異体AL251の補体媒介致死 (complement-mediated killing)に対する相対的感受性を決定するため、各菌株及び対照菌株である大腸菌DH5αの中間対数期(mid-log phase)の細胞を、普通の又は熱処理をしたニワトリの血清中で、3時間培養した。野生型パスツレラ・マルトシダ菌株VP161は、熱処理をした血清中でも熱処理をしていない血清中でも同じ速度で成長することができ、この菌株は、他のパスツレラ・マルトシダ血清型A菌株に関して先に報告されているように、十分に血清抵抗性であることを示した。ニワトリ血清の細菌活性は、大腸菌対照菌株を用いて確認され、熱処理をした血清においては19倍増えたのに対し、熱処理をしていない血清では、その生存可能性が約9倍減少した。興味深いことに、突然変異体AL251に関しては、熱処理をした血清中での成長における160倍の増加、及び普通の血清中での同じ成長速度で、加熱した血清と普通の血清との間に成長における相異は観察されなかった。これらの結果は、ニワトリでLPS突然変異体に関して観察された弱毒化は、補体に対する高くなった感受性によるものではないことを示した。
【０２１５】
パスツレラ・マルトシダVP161及びAL251からのLPSの構造分析
親菌株VP161からのLPSの糖分析が、それぞれ２：１：１：３の割合のグルコース(Glc)、ガラクトース(Gal)、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)及びL-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース(LD-Hep)を示した。これに対し、突然変異株AL251からのLPSの糖分析が、１：３の割合のGlc及びLD-Hepのみを示し、Gal及びGlcNAcは、微量であった。GlcNAcの存在は、各LPS分子のリピドA領域における予想される二つの残基に加え、この血清型グループに関する残留量のヒアルロン酸莢膜によることは、あり得ることである。親VP161LPS由来のコアオリゴ糖試料のCE-ES-MS分析が、質量1805及び1967ダルトン(Da)の二つの糖型に相当する単純な質量スペクトルを示した(図37a)。小さい方の糖型は、2PCho、3Hex、4Hep、Kdoの組成物と合致し、ここで、Kdoは、ユニークなLPS糖である2-ケト-3-デオキシ-オクツロソン酸であり、PChoは、ホスフェート部分ホスホコリンである。大きい方の糖型は、余分のヘキソース種を含んでいる(実施例６、表３及び図37a)。突然変異体AL251のLPSのSDS-PAGE分析と合致して、突然変異体AL251のLPS由来のコアオリゴ糖試料のCE-ES-MS分析が、質量605ダルトン（Da）の非常に先端の切断された分子の単純な質量スペクトルを示した(実施例６、表３、図37b)。この質量は、2Hep、Kdoの組成物に相当する。余分のヘキソース残基(767 Da)と合致するより大きな糖型が、観察された。微量のより広範囲の(extended) 1448ダルトン(Da)の糖型(PCho、3Hep、3Hex、Kdo)が、観察されたが、十分な親の補体である4Hep残基を含む糖型は、観察されなかった(実施例６、表３)。突然変異株のコアオリゴ糖におけるトランケーション(切断)の性質を完全に特徴付けるるため、親及び突然変異体由来のコアオリゴ糖についての1H-NMR実験を行った。MSデータが、突然変異体のオリゴ糖では、Hep残基が失われたことを示唆し、アミノ酸相同性比較が、waaQPMがヘプトシルトランスフェラーゼであることを示唆いていたので、分子のヘプトース残基からの共鳴に細心の注意をはらった。1H-NMRスペクトルの検査が、コアオリゴ糖を得るために用いられる酸加水分解条件下でのKdo残基の再配列(転位)に起因してコアオリゴ糖に関してしばしば観察されるように、Kdoに最も近いヘプトース残基に関する幾分かの不均一性を示した(図38)。親菌株由来のコアオリゴ糖に関して、Hep IIアノマープロトンに関する化学シフトが、約5.7ppmにおいて同定され、この残基の2-置換と合致した(図38a)。しかしながら、AL251突然変異体オリゴ糖の1H-NMRスペクトル(図38b)では、Hep II残基に関するアノマー共鳴が、約0.5ppmアップフィールドにシフトし、この残基がもはや2-置換されていないことと合致した。H. somnus菌株に関して先に観察されたように、Hep II残基は、今や末端部分であり、H-4共鳴への化学シフトは、この帰属特定と合致した。突然変異の構造的性質に関する決定的な根拠が、2D NOESY実験から得られた(図39)。特徴的なNOEが、VP61コアオリゴ糖に関してHep III及びHep IIアノマープロトンの間で観察され(図39)、これは、HepIII及びHep II残基の間のα-1,2結合に関して特徴的なものである。AL251突然変異体コアオリゴ糖のNOESYスペクトルが、上述の特徴的なNOEがないので、Hep IIの2-置換がないことを確認し、突然変異体オリゴ糖には、もはやHep IIIは存在しないことを確認した。親オリゴ糖についてのHep II及びHep III残基、並びに突然変異体オリゴ糖についてのHep II残基に関���る化学シフト及びNOEデータが、実施例６、表４に要約されている。したがって、構造的な技術が、突然変異惹起(mutating)遺伝子waaQPMのLPS構造に対する影響は、Hep IIIのHep IIへの付加を妨げることであり、この機能は、コード化されたタンパク質の、既知のヘプトシルトランスフェラーゼに対する強い類似性と合致することを証明した。
【０２１６】
論考
最初にマウス及びニワトリにおいてSTMを用いて同定されたパスツレラ・マルトシダLPS突然変異体AL251は、予測されたヘプトシルトランスフェラーゼ遺伝子waaQPMおけるトランスポゾン挿入を有することが示され、ニワトリ及びマウスにおいて非常に弱毒化された。野生型VP161及びAL251からの細胞溶解物の銀染色したポリアクリルアミドゲルが、突然変異体からのLPSはかなり先端が切断されたことを示し(図36A)、LPS構造のコア領域におけるヘプトース分子の付加に関与するヘプトシルトランスフェラーゼをコード化するwaaQPMと合致した。
【０２１７】
パスツレラ・マルトシダPm70ゲノムの分析が、遺伝子waaQPMは、おそらく独立して転写され、したがって、先端が切断されたLPS構造及びニワトリ及びマウスにおける生体内成長の低下は、waaQPMの不活性化に直接起因し、下流遺伝子に対する極性効果に起因するものではないことを示した。これは、野生型waaQPM遺伝子のトランスへの導入は、LPS構造(図36A)及びマウスにおける成長の野生型レベルの両方を回復させたので、相補性によって確認された。
【０２１８】
LPS突然変異体AL251を用いたニワトリにおける病原性試験が、家禽コレラ症状の遅発につながり(実施例６、表２)、病気の症状を呈するニワトリから分離したパスツレラ・マルトシダがテトラサイクリン感受性であり、それらが、もはやトランスポゾンを担持していないことを示した。感染したトリから分離したパスツレラ・マルトシダDNAから得たヌクレオチドシーケンスが、遺伝子waaQPMは、損なわれておらず(intact)、ほとんどの場合、トランスポゾンが先に挿入されていた場所においてヌクレオチド塩基の変化を有しており、二つのアミノ酸変化に帰着することを確認した。AL251で攻撃されたニワトリから回収されたパスツレラ・マルトシダ分離株からのLPSは、それらが野生型LPS産生することを示し、waaQPM遺伝子は、アミノ酸変化にもかかわらず、作用を有する(functional)ことを確認した(図36B)。
【０２１９】
まとめると、これらのデータは、AL251を接種されたニワトリにおいて観察された感染は、トランスポゾン挿入を失っていた相当する(relevant)菌株にのみ起因していたことを示す。野生型パスツレラ・マルトシダ菌株VP161は、非常に病原性の高い微生物であり、50未満の細菌で、ニワトリに家禽コレラを発生させる。我々の観察は、AL251細胞からのトランスポゾン切除率を、最初の10世代後に(一晩の生体内成長)1%で、58世代後(データは示さず)に4%に上昇したのを測定した。この切除率は、試験の間に致命的な家禽コレラ感染を引き起こすのに十分な率でのニワトリにおける野生型復帰突然変異体の発生及び選択に帰着するであろう。したがって、waaQPMの安定した不活性化が、家禽コレラを生じさせることのできないパスツレラ・マルトシダ菌株に帰着するであろう。しかしながら、パスツレラ・マルトシダにおいては、定義された(defined)突然変異体を構成する信頼性のある方法は、未だ確立されていない。
【０２２０】
パスツレラ・マルトシダVP161野生型LPSの分析が、コアに結合した短い非反復の多糖単位を有するインフルエンザ菌、デュクレー菌、髄膜炎菌及び淋菌等のグラム陰性粘膜性病原体から分離したLPS又はリポオリゴ糖(LOS)と類似の「ラフ」LPSを示した。パスツレラ・マルトシダLPSの内側コア構造は、インフルエンザ菌、マンヘイミア・ヘモリティカ及びデュクレー菌に関して説明したKdo残基を介してリピドAに結合したトリヘプトース単位を有する内側コア構造と類似している(図39)。AL251突然変異体においては、waaQPMの不活性化が、内側コア領域において第三のヘプトース分子(Hep III)のないかなり先端が切断されたLPSの発現につながった(図37b)。この突然変異体において最も豊富な糖型も、第一のヘプトースに対して遠位の全ての糖がなく、waaQPMの不活性化が、さらなる糖の付加を妨げたことを示唆した(実施例６、表３)。したがって、多くの場合第三のヘプトースの欠如に起因するLPS中間体における立体配置の変化が、その後のトランスフェラーゼの活動を妨げたことは、確からしい。
【０２２１】
全長LPS分子の損失は、この突然変異体のマウス内で成長し、ニワトリにおいて病気を引き起こす能力を明らかに損なうものである。この弱毒化の特定の理由は、明らかではない。しかしながら、野生型パスツレラ・マルトシダVP161のLPSでは、二つのPCho基が同定されたのに対し、突然変異体AL251は、非常に少ない糖型においてただ一つのPCho基を含むだけであった(実施例６、表３)。VP161のLPSにおける一つよりも多いPCho残基の存在は、珍しく、PChoの付いたLPSを有する細菌は、LPS構造への結合の位置は様々であるが、通常一つの残基が結合しているだけである。
【０２２２】
ただ一つの他の細菌、型分類不能のインフルエンザ菌株が、LPSに結合した二つのPCho残基を有することが知られている。興味深いことに、血清型A七面鳥からの分離株PM70のLPSにはPCho基がなく、この菌株は、ニワトリには病原性ではない。
【０２２３】
PCho基は、インフルエンザ菌、アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)及びナイセリア種(Neisseria spp.)等の粘膜性病原体の表面のいろいろな細菌構造にしばしば結合し、血小板活性化受容体(PAF)に結合することにより、上皮及び内皮宿主細胞への付着及び侵入に重要な役割を果たす。LPSのPCho陽性(positive)糖型を有する型分類不能のインフルエンザ菌は、一連の情報伝達事象(signaling events)を介して、ヒトの気管支上皮細胞に付着し、侵入することができる。
【０２２４】
しかしながら、インフルエンザ菌及びナイセリア種の両方において、ヒトの上皮細胞への付着及び侵入には、LPSへのPChoの発現が必要であるが、その存在がある宿主ニッチにおいては、生存を減少させる。PChoを発現する菌株は、より血清感受性であり、血清感受性は、PChoのC反応性タンパク質への結合及びそれに続く補体系の活性化によって仲介されるからである。興味深いことに、本研究は、LPS突然変異体AL251が、ニワトリ血清における補体の細菌活性に対して、なお非常に抵抗性があることを証明し、細菌が十分な血清抵抗性を有するのに、全体の野生型LPS構造は必要ではないことを示した。これは、驚くにあたらない、パスツレラ・マルトシダ血清型A菌株の莢膜が、血清抵抗性を与えるからである。
【０２２５】
要するに、パスツレラ・マルトシダwaaQPM突然変異体が、ものすごく先端が切断されたLPSを発現させる。加えて、野生型パスツレラ・マルトシダLPS分子及びwaaQPM突然変異体分子の両方に関して、内側コア構造が決定され、LPSの内側コアへの第三のヘプトース残基の付加には、機能的waaQPM遺伝子が必要であることが証明された。斯くして、waaQPMが、ヘプトシルトランスフェラーゼIIIとして同定され、病原性試験により、その活性が、このパスツレラ・マルトシダ菌株の自然宿主であるニワトリにおける細菌病原性には必要であることが証明された。waaQPMの不活性化は、内側コアにおける第三のヘプトースの完全な不存在につながり、その結果、完全な野生型の糖型につながる。突然変異体LPSから同定された多くの糖型は、他のグラム陰性粘膜性病原体では細菌病原性において重要な役割をするPCho残基を有していない。
以下に示す実施例６の表のうち、表１におけるCore OSはコアオリゴ糖である。
【０２２６】
（実施例６−表１）
【表２８】
2007537307.tif 000040
【０２２７】
（実施例６−表２）
【表２９】
2007537307.tif 000041
【０２２８】
（実施例６−表３）
【表３０】
2007537307.tif 000042
【０２２９】
（実施例６−表４）
【表３１】
2007537307.tif 000043
【０２３０】
（実施例６−表４）
【表３２】
2007537307.tif 000044
【０２３１】
実施例７：畜獣の病原体特異の保存されたLPS構造を示すマンヘイミア・ヘモリティカのD-グリセロ-D-マンノ-ヘプトシルトランスフェラーゼ突然変異体の生産、及びこのLPS構造に対する抗体の開発と交差反応性
【０２３２】
畜獣の病原体であるマンヘイミア・ヘモリティカ、アクチノバシラス・プレウロニューモニー及びパスツレラ・マルトシダからのリポ多糖の先の構造的研究が、調査した全ての菌株に存在する保存された内側コアオリゴ糖構造を同定した。この内側コア構造のワクチンとしての可能性を調べるため、突然変異誘発の方策を採用し、マンヘイミア・ヘモリティカのD-グリセロ-D-マンノ-ヘプトシルトランスフェラーゼ遺伝子(losB)を分断(interrupt)した。この遺伝子は、保存された内側コアを越えた最初の残基であるD-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース残基の付加に関与する酵素をコード化し、その不活性化は、保存された内側コア構造がLPS分子の末端単位であることを明らかにした。続いての分析が、突然変異体LPSの構造を、以下の化２０のように決定し、トランスのlosBとの相補性が、こんどは、losB遺伝子がα-1,6-D-グリセロ-D-マンノ-ヘプトシルトランスフェラーゼをコード化することを確認した。
【０２３３】
（化２０）
2007537307.tif 000045
ポリクローナル及びモノクローナル抗体を、マウス内でこのLPS構造に仕立てた。これらは、三つの種、マンヘイミア・ヘモリティカ、アクチノバシラス・プレウロニューモニー及びパスツレラ・マルトシダの全てのLPS及び全細胞を認識することが分かった。  
【０２３４】
バクテリン又は粗変更した(crudely modified)生きた菌株が、実用されている伝統的なワクチンであるが、実地試験及び実験研究が、バクテリンは有効ではなく、実際にしばしば逆効果を生じさせることを、繰り返し示してきた。この研究は、有効で明確に定義されたサブユニットワクチンの必要性を述べようとするものである。ワクチン候補と考え得る抗体は、ワクチン抗体に対する免疫反応を得るよう、生きた微生物を次いで標的にするため、ほぼ確実に自然状態の細菌の表面に表示されなければならない。
【０２３５】
これに関連して、獣医学的微生物は、ワクチン候補として利用しうる表面に露出した炭水化物部分を含んでいる。炭水化物部分は、リポ多糖(LPS)と莢膜多糖である。莢膜多糖は、細菌の表面に直接結合した幾つかの炭水化物残基の反復単位であるのに対し、LPSは、脂肪酸残基を介して細菌表面にLPS分子を結合させるリピドA領域、リピドA領域を第三の領域に結合させる比較的保存されたコアオリゴ糖領域、及び可変の多糖抗原(O-抗原)の三つの領域からなっている。莢膜及びO-抗体多糖における菌株不均一性が、これらの構造を、それらの対象をもたらす能力が同種菌株に限られていること又は同じ構造をつくる菌株に限られていることに起因して、経済的に実現可能なワクチン候補としては除外するであろう。あるいは、もし保存されたコアLPS構造を同定することができたならば、この構造は、全ての菌株にわたる広い対象範囲をもたらすであろうワクチン候補としての有用性を有することができる。
【０２３６】
我々の研究所でのこれら三つの種のLPS構造の先の構造分析及び進行中の構造分析が、これまで調査したApp、Pm及びMhの全ての菌株における保存された内側コアLPS構造を同定した。この保存された内側コア単位の可能性を調べるには、外側コア生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼをコード化する遺伝子が分断される(disrupted)突然変異誘発策を採用することによって、この構造が末端残基であることを明らかにすることが必要である。よって、この突然変異の結果、保存された内側コア構造が、明らかにされる。
【０２３７】
この研究は、外側コアデコレーションにおける第一の生合成工程に関与するマンヘイミア・ヘモリティカからのヘプトシルトランスフェラーゼ遺伝子の同定、クローニング及び突然変異誘発を説明するものである。突然変異株からのLPSの後の構造分析が、LPSが適当に先端切断されたことを確認した。次いで、突然変異株は、保存されたLPS構造に対する抗体を調製するのに用いられ、それらの抗体は、三つの標的種の種間交差反応性についての試験を受けた。
【０２３８】
実験
細菌の菌株及び成長条件
Mh菌株A1 Sh217(S. Highlander、テキサス州、ヒューストンのベイラー医科大学)及びA1菌株O1A  ADRI(Perry Fleming、IBS)を、BHIプレート上で又はBHIブイヨンで、37℃で普通に培養した。大腸菌DH10B(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)を、組み換えプラスミドのクローニングと増殖に用い、適当な抗体(アンピシリン100μg／ml、クロラムフェニコール25μg／ml)を補給したLB培地上で成長させた。必要な場合には、マンヘイミア・ヘモリティカ菌株を、アンピシリン(50μg／ml)及びクロラムフェニコール(5μg／ml)を補給したBHI培地中で培養した。
【０２３９】
losB遺伝子への挿入を含む組み換えプラスミドの構成
フランキングプライマーを用いた菌株O1Aの染色体DNAからのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、losB遺伝子を増幅した。用いたプライマーは、losB-kpn 5’ ATATGGTACCTATCAGCGGTAGAGATTCTAAC及びlosB-xba 5’ TGCTCTAGACCGAACCTGCACCAAAAAGATTTAACGCであった。これらのプライマーは、2Kbフラグメントを増幅し、このフラグメントは、次いで、Kpn/Xba制限酵素による消化の後、pBluescript中にクローン化され、大腸菌DH10B中に電気穿孔法により導入された(electroporated)。次いで、このプラスミドを鋳型として用いた逆PCR を、losB構造遺伝子内のシーケンスに対応する以下のプライマー：5’CCGCTGCGAGAGATAAGTGGATACTTTATC-3’及び5’GACATTGGGATCTTTATTTAGATTTCAAACCGAC-3’に関して行い、生成物を、アガロースから切除し、Qiagenゲル抽出キットによって精製した。修飾されたクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ(Cat)カセット(plpCat)を、pNFplpcatからのPCRによって増幅し、生成物を、上記のPCR生成物に平滑末端連結させてpSK losB::catを調製した。組み換えプラスミドの制限酵素マッピング及び配列決定が、Catカセットが、losB遺伝子と同じ配向で、losB構造遺伝子に挿入されたことを確認した。
【０２４０】
losB菌株の選択
プラスミドpSK losB::catを、電気穿孔法によってMh細胞に導入した。手短に言えば、電気穿孔法に続いて、細胞を、直ちに1mlの予め暖めたBHIブイヨンに移し、37℃で1.5時間培養した。5mg/mlのクロラムフェニコールを含むBHI寒天上で平板培養することによって形質転換細胞を選択した。形質転換細胞が、もはやpSK losB::catプラスミドを収容していないことを確認するため、コロニーを、BHI/Ampプレート上でレプリカ培養し、アンピシリン感受性コロニーを、PCRによって調べた。二重組み換え(double recombination)後のlosB遺伝子の挿入失活が、PCRによって確認された。初期のクローニング実験に用いたlosB-Kpn及びlosB-Xbaの上流及び下流のシーケンス特異のプライマーが、CatカセットのlosB遺伝子の染色体複製物(chromosomal copy)への挿入を確認した。
【０２４１】
losB突然変異体のトランスlosB遺伝子との相補性
pSK losB(上記参照)からのlosB遺伝子の野生型複製物(wild type copy)を、Xba及びKpnを用いた制限酵素消化によって切除し、シャトルプラスミドpNF2176中にクローン化してpNF2176AalosBをつくった。次いで、このプラスミドを、電気穿孔法でMh losB突然変異体及びAmp/Catで選択した形質転換細胞に導入した。
【０２４２】
突然変異体LPSの特徴付け
標準的な技術により死んだ細胞からLPSを分離した。先に述べたように、糖分を行い、部分的にメチル化された酢酸アルジトールを、調製した。コアオリゴ糖及びO-脱アシル化LPS(LPS-OH)を、精製した。完全に脱アシル化したLPSを精製した。質量分析及び核磁気共鳴分光法を行った。
【０２４３】
抗体の調製
5匹の雌BALBマウスを、0日(D)、14日及び35日に、ホルマリンで殺してリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄したMh losBの0.5mlの108個の細胞で、腹腔内(ip)免疫付与した。42日(D42)に、各マウスの顔面静脈から少量の血液を抜いて試験瀉血を行い、それに由来する血清を、Mh losB及びMh wtに対する交差反応性に関して、ELISAによって調べた。54日(D54)に、各マウスは、反復腹腔内免疫付与を受け、マウスNo.2は、0.2mlの4 x 107個の細胞の静脈内(iv)注射も受けた。57日(D57)に、このマウスから脾臓を取り除き、この脾臓を骨髄腫細胞系と融合させた。この融合のための初期スクリーニング抗原(initial screening antigens)は、Mh losB及びMh wtからの精製したLPSであった。マウスNo.3及びNo.5の両方は、90日(D90)に、Mh losB全細胞(約108個)の腹腔内免疫付与で、追加免役された(boosted)。マウスNo.3は、134日(D134)の脾臓細胞融合に備えて、131日(D13１)に、腹腔内及び静脈内の両方でMh losB細胞を注入して追加免役され、マウスNo.5は、152日(D152)に、Pm菌株VP161からのホルマリンで殺した全細胞の腹腔内及び静脈内注射で追加免役され、155日(D155)に、脾臓細胞を融合させた。マウスNo.3及びNo.5融合のための初期スクリーニング抗原は、App血清型5a及びPm菌株VP161からの精製されたLPSであった。モノクローナル抗体の腹水を調製した。
【０２４４】
LPSのELISA
精製したよく特徴付けられた野生型及び突然変異体LPSを、固相間接ELISAに用い、モノクローナル抗体の結合特異性を決定した。
【０２４５】
全細胞のELISA
フェノールで殺した細胞を使用した。
【０２４６】
結果
候補のグリコシルトランスフェラーゼの同定
3つの関心のある種(Mh、App及びPm)からのLPSは、同じ内側コア構造をつくる(実施例7、表１)。この保存された内側コア構造の有用なワクチン候補としての可能性を調べるためには、この領域を越えた外側コアデコレーションを取り除く必要がある。これを促進するため、採用したアプローチは、外側コアデコレーションの第一のグリコースの付加に関与するグリコシルトランスフェラーゼを同定し、突然変異させることであった。突然変異誘発の研究に、Mhが選択された。この微生物に存在するO-抗原の量が、Appと比較して少なく、したがって、次の免疫の研究に差し障らないからである。ゲノム配列決定が、Pm菌株Pm70[24]に関しては、完了しており、Pm(菌株P-3480)、App(血清型1及び5b)及びMh(A1菌株)に関しては、進行中である。図41に示すように、App血清型1及びMh菌株A1の両方において、候補のグリコシルトランスフェラーゼが同定された。ガラミュー等(Galameau et al)は、Appにおいて、mini-Tn10トランスポゾン突然変異誘発によってコアオリゴ糖の生合成に関与することが分かった二つの遺伝子の間に位置するlbgA遺伝子を同定した。隣接する遺伝子lbgBは、デュクレー菌からのD-グリセロ-D-マンノ-ヘプトシルトランスフェラーゼに対してかなりの相同性を示した。AppからのlbgB遺伝子シーケンスを有するMhゲノムシーケンス(ヒューストンのBaylor College)のブラスト(blast)分析が、D-グリセロ-D-マンノ-ヘプトシルトランスフェラーゼに対する二つの隣接する相同体を明らかにした。同定された最良のlbgB相同体は、第一のL-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース残基からのエクステンションにおける第一のD-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース残基の付加に関与するD-グリセロ-D-マンノ-ヘプトシルトランスフェラーゼであると仮定され、したがって、我々は、losBと名付けた第二の相同体は、第二のD-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース残基の付加に関与するD-グリセロ-D-マンノ-ヘプトシルトランスフェラーゼであると仮定した。
【０２４７】
MhにおけるlosBの突然変異誘発
プラスミドpSK losB::catは、Mhにおいて複製することができず、自殺プラスミド(suicide plasmid)として作用する。Mhへの電気穿孔法による導入(5ugプラスミドDNA)後、136個のcatR形質転換細胞を得た。そのうちの104個は、ampSであった。これらのうちの二つを、さらなる研究のために選択した。どちらの突然変異体も、挿入部位をひとまとめにした(bracketed)プライマー(データは示さず)を用いたPCRによって、二重交差事象(double crossover event)を受けたことが確認された。LPS構造に関して観察された効果(下記参照)が、losBの不活性化に起因するものであることを保証するため、我々は、突然変異株を、シャトルベクターpNF2176上のトランスのlosBの野生型複製物と相補させた。
【０２４８】
losB突然変異体からのLPSの特徴付け
標準的な方法によって、LPSを分離した。精製したLPSの糖分析が、それぞれ約２：１：３の割合のグルコース(GLc)、D-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース(DD-Hep)、及びL-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース(LD-Hep)を示し、微量のN-アセチル-グルコサミン(GlcNAc)も観察された。この糖組成は、突然変異体LPSの予測された構造と合致し、さらに、突然変異させたlosB遺伝子は、相同性データから予測されたように、特定のヘプトシルトランスフェラーゼであり、突然変異体LPSに残る他の四つのヘプトース残基のようにヘプトース生合成に関与する遺伝子ではないことを示唆した。
【０２４９】
O-脱アシル化LPS(LPS-OH)を、標準的な方法で調製し、CE-MSによって分析した(実施例７、表２)。単純なMSスペクトルが観察され(図42a)、二荷電(1172.32-)、三荷電(781.33-)及び四荷電(585.84-)イオンが検察され、Hex2、Hep4、Kdo-P、リピドA-OHの組成と合致した。少量の荷電イオンも、すなわち、余分のKdo残基の存在とそれに伴うヘキソース、ヘプトース及びホスフェート部分の喪失に相当する二荷電(1065.32-)、三荷電(709.83-)及び四荷電(532.34-)イオンも、観察された。この挙動は、以前に、関連する畜獣の病原体であるパスツレラ・マルトシダにおいて、観察されている。コアオリゴ糖(core OS)を精製し、CE-MSによって同様に調べ(実施例７、表２)、Hex4、Hep2、Kdoの予測された組成と合致する一荷電(1312-)及び二荷電(655.62-)イオンのスペクトルをもたらした。突然変異体LPSの結合パターンが、突然変異誘発によっては変化しないことを証明するため、コアオリゴ糖に関してメチル化分析を行い、ほぼ等モル比の末端Glc、6-置換Glc、末端LD-Hep、末端DD-Hep、2-置換LD-Hep及び3,4,6-三置換LD-Hepの存在を明らかにし、もう一度、予測された突然変異体LPS構造と合致した。突然変異体LPSのコアオリゴ糖構造の最終確認が、完全に脱アシル化されたLPSについてのNMR実験から得られ、野生型LPSのスペクトル(図43)との比較により、末端のGal-Hep二糖が、突然変異体LPSには存在していないことが明らかであった。化学シフトの帰属特定(実施例７、表３)が、保存されたコアオリゴ糖の全ての結合は、野生型LPSのものと同じであることを明らかにし、したがって、所望の構造が得られた。相補された突然変異株からLPS-OHを得、CE-ES-MS分析が、余分のKdo残基を有する少量の糖型を有するwt LPS表現型を確認した(実施例７、表２、図42b)。
【０２５０】
抗体の調製
初回免疫(prime immunisation)及び追加免疫(boost immunisation)の後、Mh losB及びMh wtのLPSを認識する能力に関して、5匹のマウスからの血清を調べた(図44)。マウスNo.2が、wt菌株に対して最も高いIgG力価をもたらしたので、モノクローナル抗体を作るための最初の融合実験のために、このマウスを選んだ。Mh losBを認識した9個の安定したハイブリドーマを調製し、それらのMh、App及びPmからのwt LPSと交差反応する能力を調べた(図45)。しかしながら、どのモノクローナル抗体もApp及びPmからのLPSを認識することができず、モノクローナル抗体のうちの4個だけしか、Mh wt LPSを認識することがでなかった。42日(D42)からのポリクローナル血清の試験が、App血清型1からでなくApp血清型5a、Pm菌株VP161及びX73からの精製されたLPSを認識することのできる抗体が存在することを明らかにした(図46)。したがって、マウスNo.3に関して融合を行ったが、App血清型5a及びPm菌株VP161からの精製されたLPSを認識することのできるハイブリドーマは、同定されなかった。最後に、152日(D152)におけるポリクローナル血清の試験が、Mh losB及びwt、App血清型1及び5a並びにPm菌株VP161及びX73に対する交差反応性を明らかにしたので、Pm菌株VP161からの死んだ全細胞で最終追加免疫(final boost)をした後、マウスNo.5に関する融合を行った(図47)。14個のハイブリドーマを得た。Pm菌株VP161からの精製されたLPSのみを認識できた11個と、App血清型5a及びPm菌株VP161の両方からの精製されたLPSを認識できた3個である。次いで、これら3つの交差反応性のハイブリドーマは、App血清型1、Pm菌株X73並びにMh losB及びwt菌株からの精製されたLPSを認識することができることも分かり、11個のPm VP161を認識するハイブリドーマは、やはり、関連するPm菌株X73しか認識することができなかった(図48、実施例７、表４)。
【０２５１】
現在、畜獣の病原体であるMh、Pm及びAppによって引き起こされる病気と闘う有効なワクチンはない。Mhによって引き起こされる病気と闘うためのワクチンアプローチは、いまだに、バクテリン及び生の弱毒化した菌株に、主として基づいている。生ワクチンのより最近のバージョンは、ノイラミニダーゼ、ロイコトキシン(白血球毒素)、シアログリコプロテアーゼ(sialoglycoprotease)、外膜及び未同定のタンパク質などの分泌された又は抽出されたMh抗原を含んでいる。無毒のロイコトキシンを発現する突然変異株での免疫感作は、子ウシ攻撃モデルにおいて、なおある程度病原性であり、莢膜多糖と組み合わせたロイコトキシンは、防御免疫反応をもたらすことができないが、ロイコトキシンは、伝統的に主なサブユニットワクチン候補であった。一方、LPSは、白血球溶解活性(leukolytic activity)を安定化することが示され、そのため、LPSと無毒化したロイコトキシンとがベースの共役ワクチンが、有望な見込みを示す。
【０２５２】
Appによって引き起こされる病気と闘うための現在のワクチンアプローチは、生きた弱毒化した菌株に基づいている。それらの菌株が、保護に必要な中和抗体を誘導する非常に不安定なApx毒素を含んでいるためである。これらのApx毒素は、Appに対する主なサブユニットワクチンの基礎をなすものであるが、ある程度の臨床的保護をもたらすにすぎないように思われる。LPSのコアオリゴ糖を含む付着因子が、改良されたワクチン候補を提案してきた。
【０２５３】
ブタにおけるPm疾病を予防するための現在のワクチンは、トキソイドと莢膜及び外膜タンパク質等の体細胞抗原とからなっている。Pmは、パスツールによって初めて家禽コレラを含むことが示され、この病気に対する保護のための現在の方策は、弱毒化したPm菌株を利用するものである。しかしながら、一般的にこの方策は、免疫反応が血清型で限定されるので非常に制限され、他の血清型に対する交差保護をもたらすことができない。しかしながら、PmのLPSは、感染に対する免疫において部分的な役割を果たすことが示されてきた。
【０２５４】
これらの微生物各々からのLPSが、サブユニットワクチン設計のための良好な候補になりうることを示すかなりの証拠が、最近累積している。LPSは、可視のMhの表面上の主な抗原決定基であることが示され、A1LPSにしたモノクローナル抗体が、生体外の補体媒介の死滅でなく食作用を促進した。
【０２５５】
Pmにおいて、リボソーム-LPSワクチンが、同種のPm菌株からの家禽コレラ疾患に対してニワトリを保護した。加えて、LPS-タンパク質複合体による免疫感作が、同種の菌株で攻撃された場合には、マウスに対して100%の保護を与えたが、複合体の個々の成分に分けた場合には、保護をもたらさなかった。PmからのLPSとしたモノクローナル抗体が、マウスモデルにある程度の保護しか与えられず、それらのモノクローナル抗体は、オプソニンで食菌作用を高めた(opsonophagocytic)ものであるが、補体の存在下で殺菌性がなかった。しかしながら、他の研究において、PmLPSとしたモノクローナル抗体が、同種の攻撃に対してマウスを完全に保護し、殺菌性であった。A型からのLPSを模倣する抗イディオタイプワクチンが、マウスモデルにおいて、同種の微生物で攻撃された場合に、保護作用を有していた。
【０２５６】
Appにおいて、LPS、より具体的にはLPSのコア領域が、細菌の付着能力に関与していた。App血清型1のLPSと結合したBSAの共役ワクチンが、異種の攻撃ではなく同種の攻撃の後、マウスに対して保護作用があり、血清型5及び1からのスムース及びラフAppLPSの両方の複合体が、Appの細胞壁の炭水化物部分が、ブタの免疫反応において重要な役割を果たしていることを示唆した。
【０２５７】
その結果、我々は、この研究に着手し、三つの微生物の全てに共通する保存された先端が切断されたコアLPSを生産した。LPSが、これらの畜獣の病原体の各々に対する免疫において、役割を果たすことが示され、もしも保存されたLPS抗原を特定することができれば、同種菌株に対する保護反応を、おそらく異種菌株、実際に異種に広げることができる。このことと、これらの畜獣の病原体の全てが、共通の保存された内側コアオリゴ糖構造を分かち合っていることを示唆する構造分析データとを組み合わせて、LPSベースのワクチンの可能性を探求することが決定された。このプロセスにおける第一の段階は、末端が露出した構造としての保存された内側コアオリゴ糖エピトープを専ら発現する突然変異株の構成である。
【０２５８】
この研究は、末端が露出した部分としての保存された内側コアエピトープをもたらすため、Mh菌株A1からのα-1,6-D-グリセロ-D-マンノ-ヘプトシルトランスフェラーゼ遺伝子において突然変異体を生じさせた。突然変異誘発の方法は、Mhにおいては決して容易ではない。限られた数の先の研究が、aroA遺伝子、lpp遺伝子座、莢膜nmaAB遺伝子座、及びロイコトキシンlktCABD遺伝子クラスターにおいて突然変異体をつくった。電気穿孔法が、外来DNAをMh細胞に導入するのに効率的な手段であるのに対し、相同的組み換えによる外来DNAの染色体への導入は、困難で、圧倒的に主流である単一交差事象(single crossover events)が生じる状態で低い頻度で起こり、標的にした遺伝子の突然変異体及び機能的複製物の両方の存在に帰着する。Mhにおいて不安定なプラスミド(自殺プラスミド)が、幾人かの著者によって、このアプローチに用いられ、この現在の研究において成功裏にもちいられた。突然変異株からのLPSの構造分析が、予測されたLPS表現型を確認し、相補性実験が、観察された効果が、実際にこの遺伝子の不活性化によるものであることを確認した。トランスのlosB遺伝子の損なわれていない(intact)複製物の再導入が、LPS構造を、野生型のものに戻し、losB遺伝子が、α-1,6-D-グリセロ-D-マンノ-ヘプトシルトランスフェラーゼであることを確認した。これらの畜獣の病原体の菌株の範囲を交差したこの構造の保存の程度及びアクセシビリティを調べるため、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を、先端が切断された(truncated)LPS構造にした。App、Pm及びMhから、関心のある全ての菌株と交差反応することのできる三つのモノクローナル抗体を得、それにより、これらの重要な畜獣の病原体の間で分かち合われている保存された交差反応性のLPSエピトープの可能性を証明した。
以下に示す実施例７の表のうち、表２におけるO-deacはO-脱アシル化、Core OSはコアオリゴ糖である。
【０２５９】
（実施例７−表１）
【表３３】
2007537307.tif 000046
【０２６０】
（実施例７−表１）
【表３４】
2007537307.tif 000047
【０２６１】
（実施例７−表２）
【表３５】
2007537307.tif 000048
【０２６２】
（実施例７−表３）
【表３６】
2007537307.tif 000049
【０２６３】
（実施例７−表３）
【表３７】
2007537307.tif 000050
【０２６４】
（実施例７−表４）
【表３８】
2007537307.tif 000051
【０２６５】
実施例８：畜獣の病原体であるマンヘイミア・ヘモリティカ、アクチノバシラス・プレウロニューモニー及びパスツレラ・マルトシダによって引き起こされる病気を予防するためのLPSベースの複合糖質の立候補：共役化学及びマウスの免疫感作後の免疫反応の研究
複合糖質を調製するため、LPSを、以下のように誘導体化した。標的構造を生成するMh losB突然変異体からのLPS(145mg)及び8K材料(104.5mg)の両方を、4NのKOH(約10mg/ml)に溶解させ、125℃で30時間攪拌することによって脱アシル化した。溶液を、室温まで冷却し、無水酢酸で中和した。これは、この処理によって生じたアミノ基を再びN-アセチル化する役をした。沈殿した塩を、遠心分離(9k、15分)によって除去し、上澄みを、Sephadex G-25カラムに供し、溶離液としての水で溶離した。炭水化物-陽性の(carbohydrate-positive)フラクションをためて凍結乾燥し、約20〜25％の収率のKOH処理をしたLPS(25mgの8K、33.3mgのLPS)を得た。得られた材料を、0.1MのNaOH(10mg/ml)中で、室温で2時間処理することによって脱O-アセチル化し、水に入れてSephadex G-25カラムを用いて精製し、凍結乾燥して約20%の収率(20mgの8K、30mgのLPS)のKOH処理したLPSを得た。
【０２６６】
1H-NMR分光法及びES-MS分析によって品質管理を行った。MS分析が、KOH処理をしたLPS材料において幾分かの不均一性を示し、末端ヘプトース及びグルコース残基の可変性の喪失と合致した(図49)。
【０２６７】
脱リン酸化
LPS又は8K材料由来の得られた材料を、組み換え体アルカリ性ホスファターゼ(Roche)(約140単位/mg単位アルカリ性ホスファターゼ/mgKOH処理をしたLPS)を含むpH8.0の0.1MのNH4HCO3緩衝液に溶解させ(約10mg/ml)、37℃で約4時間攪拌することにより、化合させ脱リン酸化させた。溶液を100℃に5分間加熱し、冷却し、14Kで10分間遠心分離した。上澄みを、凍結乾燥した。
【０２６８】
得られた材料を、水に入れてSephadex G-25カラムを用いて脱塩し、凍結乾燥して約20%の収率(48mg)のKOH処理をしたアルカリ性ホスファターゼ処理をしたLPSを得た。1H-NMR及びCE-ES-MS分析によって品質管理を行い、KOH処理をしたLPSの脱リン酸化を確認した。
【０２６９】
アミノ化
結果として生じたアルデヒド官能基(aldehydo functional group)を、乾燥した炭水化物(48mg)を600μlのDMSOに溶解させ、4800μlの2モルNH4OAcのMeOH溶液及び1200μlのMeOHに溶解した120mgのNaCNBH3を、pH8.3、50℃で72時間加えることにより、アミノ化した。MeOHを、N2下で蒸発させ、生成物を、凍結乾燥し、水に入れてSephadex G-25カラムを用いて精製し、凍結乾燥して約10%(32mg)の収率のKOH処理し、アルカリ性ホスファターゼ処理し、アミノ化したLPSを得た。1H-NMR分析によって品質管理を行い、KOH処理をしたLPSのアミノ化を確認した。
【０２７０】
リンカー分子の結合
乾燥した炭水化物(32mg)を400μlのH2Oに溶解させ、4000μlのMeOH及び100μlのスクアラートを、pH8.2(トリエチルアミン(4μl)で調整)で2時間、室温で15分ごとにpHを監視しながら加えることによって、リンカー分子(スクアラート)を、結果として生じたアミノ基に結合させた。MeOHを、N2下で蒸発させ、生成物を、凍結乾燥しSephadex G-25カラムを用いて水中で精製し、凍結乾燥して約12%(30mg)の収率のKOH処理し、アルカリ性ホスファターゼ処理し、アミノ化し、スクアラートを結合させたLPSを得た。1H-及び13C-NMR並びにCE-ES-MS分析によって品質管理を行い、スクアラートリンカーの結合を確認した。しかしながら、MS分析が、材料の約50％だけがスクアラートリンカーを有していることを示唆した。
【０２７１】
タンパク質担体への結合
約20mgのHSAを、1mlの0.02Mホウ酸ナトリウム緩衝液中で、25倍モル過剰(25 x molar excess)のスクアラート結合炭水化物(30mg)と、室温で24時間、pH9.2で攪拌することにより、結合させた。炭水化物は、反応の開始時と約6時間後に加えた。24時間後、アリコートを採取し、MALDI-MS及び炭水化物特異のモノクローナル抗体G8を用いたウェスタンブロッティングを用いたSDS-PAGEによって検査した(図50)。最終の反応混合物を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(50mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム、10mMクエン酸ナトリウム、pH7.5)を用いてSepharose 6Bカラムを流下させて精製し、複合炭水化物のない分離を行った。生成物ピークに相当するフラクションを、アミコン製ウルトラ-15 10Kカットオフスピンカラム(Amicon ultra-15 10K cutoff spin column)で濃縮した。複合体の最終体積を、タンパク質に関してはBCAアッセイにより、炭水化物に関してはPhOH/H2SO4法によって定量し、炭水化物のタンパク質に対するモル比4.5：1を得た。また、最終の複合体を、1%AcOH中でのナノエレクトロスプレー質量分析により、担体タンパク質HSAと比較した。分析は、HSAに関する予測された分子量(図51a)及び担体タンパク質の可変のグリコシル化と合致する一連のピークを示した(図51b)。
【０２７２】
（化２１）
2007537307.tif 000052
【０２７３】
（化２２）
2007537307.tif 000053
【０２７４】
（化２３）
2007537307.tif 000054
【０２７５】
免疫感作
6〜8週齢の6匹のBALB/cマウスを、複合体で免疫感作し、6〜8週齢の3匹の雌BALB/cマウスを、対照として炭水化物とHSAの混合物で免疫感作した。全てのワクチンは、無菌のPBS溶液になっており、Ribiアジュバントにおける0.1ml皮下注射あたり10μgの炭水化物を投与した。
【０２７６】
マウスを、以下のスケジュールにしたがって免疫感作した。
0日(D0)      免疫前瀉血、及び初回注射
14日(D14)    第一回追加免疫
23日(D23)    試験瀉血
35日(D35)    第二回追加免疫
45日(D45)    マウスの最終瀉血
【０２７７】
23日の試験瀉血及び45日の最終瀉血が、Mh losB LPSに対するLPS ELISAによって示されたように、一匹のマウスNo.2が炭水化物抗原に対するIgG反応を示したことを明らかにした(図52及び53)。三回の免疫感作後のマウスNo.2からのポリクローナル血清を、その血清の三つの関心のある種と交差反応する能力に関して試験した。Ap、Mh及びPmのLPSと全細胞の両方が、このポリクローナル血清によって認識された(図54及び55)。しかしながら、髄膜炎菌の菌株L3galE及びL2galEからのLPS及び全細胞も、それぞれLPS及び全細胞のELISAにおいて認識された。この挙動は、末端ヘプトース及びヘキソース残基の可変製の喪失を生じさせた複合体の調製のためのKOH処理の間の炭水化物抗原の部分的分解によるものであった(図49参照)。これは、ポリクローナル血清V2の試験に用いられた髄膜炎菌性LPSの領域を模倣するエピトープを含む最終複合体におけるこの炭水化物抗原の部分に帰着し、この観察された交差反応性を生じさせる。しかしながら、この複合体血清による免疫感作から仕立てた血清は、畜獣の病原体であるAp、Pm及びMhからのLPS及び全細胞の両方を認識することができた。
【０２７８】
実施例９：保存された内側コアリポ多糖に対して特異なモノクローナル抗体を用いた殺菌能アッセイ
【０２７９】
Mhの全細胞を認識し(図56)、Mhの内側コアLPSに対して特異な抗体を含む(図57)140日(D140)のマウスNo.1からのポリクローナル血清と、モノクローナル抗体G3、G8、3-5及び3-16からの腹水(図58-61)とを、対照の腹水L2-16とともに、殺菌能アッセイのための血清源として用いた。このアッセイは、Sutherland A.D. 1988. Vet. Microbiol. 16: 263-271の方法にしたがって行った。手短に言えば、Mh細胞を、100mlのBHIブイヨンにおいて約5 x 103 cfu/mlの成長レベルに成長させた。10mlの培養物を用い、細胞を5000 x g、4℃でペレット化し、D-PBS(Ca及びMg[Gibco No. 14040-133]を含む)中で二度洗浄した。最終の細胞ペレットを、10mlのD-PBS中に再び懸濁させた。試験用血清及び腹水試料を、56℃で30分間、加熱して不活性化し、内因性の補体を破壊した。アッセイは、96穴-組織培養グレード-平底マイクロタイタープレート(NUNC)において三成分構成に(in triplicate)設定された。D-PBSで適当に稀釈した20μlの抗血清、次いで、細菌懸濁液(100μl)を、各穴に加え、プレートを室温(RT)で15分間培養した。補体(80μl、ウサギ乳児、No.Cl3441-S、Cedarlane)を各穴に加え、蓋をして37℃で30分間培養した。プレートを氷の上に置くことにより、反応を停止し、各穴からの三成分の試料(50μl)を、BHI寒天プレート上にのせて37℃で一晩平板培養した。細菌懸濁液のみを含む対照穴、細菌懸濁液と補体を含む対照穴、細菌懸濁液と適当に稀釈された抗体を含む対照穴も、各アッセイに含まれていた。
【０２８０】
細菌の成長を計数し、対照穴に対する死滅パーセンテージを計算した。
以下の表及び図62〜64から分かるように、モノクローナル抗体G3及びG8並びにポリクローナル血清は全て、Mh A1wt穴の補体媒介の溶菌を促進した。モノクローナル抗体3-5及び3-16からの腹水の失敗は、これらの血清の非常に低い力価によるものであった(作業稀釈(working dilution)；1：106に対して1：50)。
【０２８１】
（実施例９−表１）
【表３９】
2007537307.tif 000055
【０２８２】
（実施例９−表２）
【表４０】
2007537307.tif 000056
【０２８３】
モノクローナル抗体G3及びG8並びにポリクローナル血清が示した殺菌作用は、Mhにおける保存された内側コアLPSエピトープに対して特異な抗体が、生きたMh全細胞を認識することができ、生きたMh全細胞に対して機能的に活性であることを例証するものである。
【０２８４】
実施例１０：保存された内側コアリポ多糖に対して特異なモノクローナル抗体を用いた消極防護(passive protection)実験
Lopez et al.,1982. Can. J. Comp. Med. 46: 314-316の方法にしたがって、実験を行った。方法と変更は以下に記載のとおりである。
【０２８５】
マウス及び試薬
消極防護実験に用いるため、モノクローナル抗体の腹水からのIgGを、プロテインAカラムで精製し、無菌濾過した(図65)。
試験用モノクローナル抗体G3及びG8：G8、IgG2ｂ、3.8mg/ml；G3、IgG2a、4.7mg/ml
対照モノクローナル抗体：L2-16、IgG2ｂ、1.9mg/ml
Balb/cマウス：40匹、メス、6〜8週齢、Charles River Laboartories(CRL)より購入  5匹/グループ
マンヘイミア・ヘモリティカA1：7.5 x 107 cfu/マウス
【０２８６】
実験計画及びグループ：
【表４１】
2007537307.tif 000057
【０２８７】
i  全てのマウスが、感染後2日(Days Psot Infection 2)(Day 2)において、いろいろな程度の外皮の荒れ(rough coat)、脱水及び動きたがらない等の臨床的兆候を示した。しかしながら、グループC及びDのマウスは概して健康であり、グループF及びGのマウスは、外皮の荒れはあったものの、活動的なままであった。感染後3日(Day 3)において、グループA及びBのマウスは、激しく脱水して体重が減り、グループGのマウスも、中程度に病んでいた。
【０２８８】
ii  全てのマウスが、いろいろな程度の肺硬化(lung consolidation)を示したが、冒された領域を定量化する試みはしなかった。
【０２８９】
iii  グループ間の主な違いは、グループA、B及びEのマウスは、全体的に、それらの肺の中に、他のグループのマウスよりも多くの好中球を有しているように思われた。しかしながら、全てのマウスは、処置にかかわりなく、ある程度の肺炎症状を示した。
【０２９０】
iv  ++++：外皮の荒れ、中程度〜重度の体重の減少及び脱水、並びに動きたがらない；+++：外皮の荒れ、軽度〜中程度の体重の減少及び脱水を示したが、活動的なままである；++：外皮の荒れ、及び軽度の体重の減少；+：軽度の外皮の荒れ
【０２９１】
v  +++：中程度の広さの硬化(consolidation)；++：少ない広さの硬化
【０２９２】
vi  +++：中程度の気管支肺炎、血管周囲及び気管支周囲の領域における中くらいの数〜多数の好中球の存在及びリンパ系細胞の著しい浸潤がみられた；++：軽度〜中程度の気管支肺炎、血管周囲及び気管支周囲の領域における少数の好中球の存在及びリンパ系細胞の浸潤がみられた；+：軽度の気管支肺炎、血管周囲及び気管支周囲の領域における時折の好中球の存在及びリンパ系細胞の軽度の浸潤がみられた
【０２９３】
vii  臨床的症状を示したマウスの数
【０２９４】
このパイロット試験に基づいて、モノクローナル抗体処置、特にマンヘイミア・ヘモリティカを用いた生体外の予備培養(pre-incuvation)によるモノクローナル抗体処理が、臨床的症状及び感染したマウスの組織病理に対する中程度の効果を示したことが明らかである。
【０２９５】
図66は、対照マウスBからの中位の大きさの気管支の内腔(lumen)における中くらいの数の好中球の存在を示し、病因と一致したのに対し、図67は、図66のマウスと同時に殺されたグループCのマウスからの肺を示し、ある領域において少数のリンパ系細胞が存在した気管支肺炎の消散を示し、モノクローナル抗体G3とMh細胞との生体外の予備混合(pre-mixing)によってもたらされた、ある程度の保護と合致する。
【０２９６】
微生物の寄託
マンヘイミア・ヘモリティカ菌株A1losBの寄託を、IDACにおいて2005年5月4日に行った。寄託番号は、IDAC 040505-01である。
【図面の簡単な説明】
【０２９７】
【図１】重水(D2O)(300K、pH3)に溶解させたマンヘイミア・ヘモリティカ血清型１LPSからのコアオリゴ糖成分の600MHzでのプロトンNMRスペクトルである。HOD共鳴は、4.756ppmにおいてである。4.4ppmから上のアノマー領域における共鳴は、Kdoメチレン共鳴とともに、ラベルが付してある。また、A1として示された決定された構造及び残基の名称が、示されている。バックボーンオリゴ糖の部分的な切断(truncation)に起因する不均一性が、結合部位において点線矢印で示されている。このテキストにおいて、不均一性に起因するｆに関する微量成分が、ｆ’で示されている。HepI、HepII及びHepIIIは、D−D−ヘプトースである。他の残基は、D-立体配置を有している。
【図２】アノマー領域のHMQCスペクトル(a)、並びにアノマー環状領域のCOSY(b)及びNOESY(c)スペクトルを示すA1に関する2D NMRを示している。矢印は、k5の近くに見られるb2共鳴の位置を示している。
【図３】A1の異核 1H-13C 2D NMRスペクトルからの選択されたプロットを示している。(a)環状領域のHMQCスペクトルにおいて、ラベルを付すのが可能な幾つかの帰属特定(assignment)に、ラベルが付してある。(b)HMQC-TOSCYスペクトルにおいて、C7-H7s-C6-H6、 C4-H4-C5-H5 TOSCY相関関係及びB2に関する斯かる相関関係に、ラベルが付してある。(c)HMBCスペクトルにおいて、アノマープロトン共鳴に関するH1-C1-O1-Cxグリコシド間(interglycosidic)相関関係が、それらの共鳴の残基内相関関係とともに、示されている。
【図４】A1における非ヘプトース残基の帰属特定に関する1D選択実験、(a) 1D TOCSY (a1, 180ms); (b) 1D TOCSY (h1, 180ms); (c) 1D TOCSY (i1 k4, 180ms); (d) 1D NOESY-TOCSY (i1 k4, 400ms; k6 180ms); (e) 1D NOESY-TOCSY (de1, 400ms; g3 k7, 180ms); (f) 1D TOCSY (c1, 180ms); (g) 1D TOCSY (j1, 180ms);及び (h) 1D TOCSY-NOESY (j1, 180ms; j4, 400ms)を示す。不均一性に起因するf及びhについての微量成分は、それぞれ、f’及びh’で示す。付すことができる場合には、第一の選択ステップに関する共鳴には下線が付してあり、第二の選択ステップに関する共鳴には二重に下線が付してある。アノマー領域における選択した共鳴を、スペクトルの左側に示す。
【図５】A1における双極子相互作用を検知するための1D選択実験を示す。アノマー領域における共鳴のb1、c1、de1、f1、g1、i1/k4に関して200msのミキシングタイムの1D NOESYスペクトル及び、(a)〜(g)におけるj1に関しては1D ROESY (f1, 500ms)。選択したアノマー共鳴を、スペクトルの左側に示す。
【図６】ヘプトース単糖のプロトンスペクトルを示す。600MHz、D2O中、300KでのD-L-ヘプトースの分解能が高められたスペクトル(a)、並びにそのα型についての分解能が高められたスペクトル(b)及びβ型についての分解能が高められたスペクトル(c)。600MHz、D2O中、300KでのD-D-ヘプトースの分解能が高められたスペクトル(d)、並びにそのα型についてのスピンをシミュレートしたスペクトル(e)及びβ型についてのスピンをシミュレートしたスペクトル(f)。アノメリックス(anomerics)及びH-5βは、示されていない。H-3、H-4共鳴に関する強いカップリング及びH-5共鳴に関する実質的(virtual)カップリングが、(b)に関して正確に再現されていることに留意されたい。
【図７】A1におけるヘプトース残基の帰属特定のための1D選択実験を示す。 (a) b3、b4及びb5を検知するための1D TOCSY-TOCSY(b1, 75ms; b2, 75ms); (b) b5-b6及びb5-b3 NOEを検知するためのTOCSY-NOESY(b2, 150ms; b5, 400ms)。b(1-3)d結合に起因する強いb5-d2 NOEにも留意されたい; (c) e3, e4及びe5を検知するための1D TOCSY-TOCSY (de1, 75ms; e2 75ms); (d) d3、d4及びd5を検知するための1D TOCSY-TOCSY (de1, 75ms; d2, 75ms); (e) g3〜g5を検知するための1D TOCSY-TOCSY (g1, 90ms; g2 150ms); (f) g5-g6 NOE及びg5-g3 NOE及びg(1-6)I結合と一致するg5-i6 NOEを示す 1D TOCSY-NOESY (g2, 150ms; g5 400ms); (g) f(1-6)g結合と一致するf1-g6グリコシド間NOEからのg7共鳴を検知するための１D NOESY-TOCSY (f1, 400ms; g6 180ms); (h) H-6までのf及びf’共鳴を検知するための1D TOCSY-TOCSY (f1, 90ms; f2, 150ms)。f5及びf’5についての明瞭な多重項パターンに留意されたい; (i) 短いスピンロック時間のみによってf7共鳴を検知するための1D TOCSY (f6, 40ms)。付すことができる場合には、第一の選択ステップに関する共鳴には下線が付してあり、第二の選択ステップに関する共鳴には二重に下線が付してある。アノマー領域における選択した共鳴を、スペクトルの左側に示す。
【図８】A1の内側コア七糖のMMC計算から得られた最小エネルギー配座異性体の分子モデルを示す。酸素が、より大きな球として描かれており、ヒドロキシルプロトンが除かれている。関連するプロトンは、ラベルが付されている。e-b分岐がg-i分岐と非常に近いこと及び残基eの環外鎖が残基bのアノマープロトンと非常に近いことが、観察された長い範囲のNOEと一致することに留意されたい。L−D−ヘプトース(残基d、b、e)とD−D−ヘプトース(残基g)との間の環外鎖の方向における違いにも留意されたい。
【図９】プロトン間距離R対(vs.)それぞれ、(a)〜(g)におけるb1-e5、b1-e7、e1-i4、e1-g2、g1-b2、g1-b3に関するA1の内側コア七糖のMMC計算としてのマクロムーブの変化を示す。2〜4Åの範囲におけるプロトン間距離の存在(occurrence)は、観察された長い範囲のb-e、e-i及びe-g NOEと一致している。
【図１０】インフルエンザ菌からのLPSに関して報告された脂肪酸アシル置換パターンを有するリピドAを用いて作ったマンヘイミア・ヘモリティカA1のLPSの分子モデルを示す。リピドA部分は、Kdoをグレーに、ヘプトースを赤又は紫に、グルコースを緑に、ガラクトースをブルーに色をつけた。PO4基は、黄色である。ヒドロキシルプロトンは、除かれている。
【図１１】Ap血清型5aコアオリゴ糖の陰イオンエレクトロスプレー質量スペクトルである。
【図１２】Ap血清型a) 5a; b) 5b; c) 2; d) 1からのコアオリゴ糖の1H-NMRスペクトルのアノマー領域を示す。スペクトルは、D2O中、pH7.0、25℃で記録された。
【図１３】Ap血清型5a残基a) Hep I; b) Hep II; c) Hep III; d) Hep IV; e) Hep V; f) Glc II; g) Glc I; h) Gal Iからのコアオリゴ糖の選択1D-TOCSY NMRスペクトルの環状領域を示す。各残基の文字名称は、実施例２、表２に示す通りである。スペクトルは、ヘプトース残基については150ms、ヘキソースについては90msのミキシングタイムで、D2O中、pH7.0、25℃で記録された。
【図１４】Ap血清型5a残基a) Hep III; b) Hep II; c) Glc I; d) Glc II; e) Hep IV; f) Hep Vからのコアオリゴ糖の選択1D-NOESY NMRスペクトルの環状領域を示す。各残基の文字名称は、実施例２、表２に示す通りである。スペクトルは、400msのミキシングタイムで、D2O中、pH7.0、25℃で記録された。
【図１５】Ap血清型5aからのコアオリゴ糖のO-鎖Gal I残基の位置の決定である。a） Gal Iのアノマー1H共鳴からの1D-NOESY NMRスペクトル; b) NOESYステップにおけるGal I残基のアノマー1H共鳴から、及びTOCSYステップにおけるHep III残基のH-7 1H共鳴からの1D-NOESY-TOCSYスペクトル; c) TOCSYステップにおけるHep III残基のアノマー1H共鳴から、及びNOESYステップにおけるHep III残基のH-4/H-5 1H共鳴からの1D-TOCSY-NOESYスペクトル;d) Gal I及びGlc Iのアノマー1H共鳴からのHMBCを示す13C-1H-HMBC NMRスペクトルの領域; e) Hep IIIのH-7 1H共鳴、Hep VのH-2 1H共鳴及びHep IIのH-3 1H共鳴からの13C-交差ピークを示す13C-1H-HSQC NMRスペクトルの領域。スペクトルは、D2O中、pH7.0、25℃で記録された。
【図１６】Ap血清型１からのコアオリゴ糖の陽イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレー質量分析を示す。m/z 9302+からの生成イオンスペクトル。
【図１７】Ap血清型１からのコアオリゴ糖の開鎖N−アセチルガラクトサミンの同定である。a) Ap血清型１からのコアオリゴ糖の2D-13C-1H-HSQC NMRスペクトルの環状領域; b) Ap血清型１からのコアオリゴ糖の1H-NMRスペクトルの環状領域; c) GalNAc残基の1H共鳴からの1-D NOESYスペクトル; d) GalNAc残基のH-4 1H共鳴からの1-D TOCSYスペクトル; e) GalNAc残基のH-2 1H共鳴からの1-D NOESYスペクトル; f) HexNAc残基のH-4 1H共鳴からの1-D NOESYスペクトル。スペクトルは、D2O中、pH7.0、25℃で記録された。共鳴の帰属特定は、示すとおりである(i, GalNAc; j, Gal II)。
【図１８】Ap血清型1、2、5a及び5bからのコアオリゴ糖の具体例の構造表示である。血清型1について、Rは、α-GaloNAc-(1-4,6)-β-Gal II-(1-3)-β-Gal I、R’は、Hであり、ここで、oは、開鎖立体配置を示す。血清型2については、Rは、β-Glc III、R’は、D-α-D-Hep Vである。血清型5a及び5bについて、RはH、R’は、D-α-D-Hep Vである。
【図１９】パスツレラ・マルトシダ菌株Pm70コアオリゴ糖の陰イオンエレクトロスプレー質量分析を示す。
【図２０】m/z1246.52+のパスツレラ・マルトシダ菌株Pm70コアオリゴ糖の陽イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレー質量分析スペクトルである。
【図２１】m/z316+のパスツレラ・マルトシダ菌株Pm70コアオリゴ糖前駆イオンスキャンの陽イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレー質量分析スペクトルである。
【図２２】パスツレラ・マルトシダ菌株Pm70からの十分に脱アシル化されたLPSの１H-NMRスペクトルのアノマー領域を示す。スペクトルは、D2O中、pH7.0、25℃で記録された。残基は、実施例３、表２におけるようにラベルが付してある。
【図２３】パスツレラ・マルトシダ菌株Pm70からのコアオリゴ糖からのTOCSYスペクトルのアノマー領域の部分をしめす。スペクトルは、D2O中、25℃で記録された。
【図２４】パスツレラ・マルトシダ菌株Pm70からのコアオリゴ糖からのNOESYスペクトルのアノマー領域の部分を示す。スペクトルは、D2O中、25℃で記録された。
【図２５】パスツレラ・マルトシダ菌株Pm70からのコアオリゴ糖からの１H-１３C HMBC NMRスペクトルのアノマー領域を示す。挿入図は、N−アセチル−アミノ糖に関する診断信号を示すスペクトルの領域である。スペクトルは、D2O中、pH7、025℃で記録された。
【図２６】推定グリコシルトランスフェラーゼが示されたパスツレラ・マルトシダ菌株Pm70のコアオリゴ糖の構造を示す。
【図２７Ａ】Pm菌株VP161からのLPS-OHの陰イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレー質量分析スペクトルであり、 m/z 9923-からの生成イオンスペクトルを示す。
【図２７Ｂ】Pm菌株VP161からのLPS-OHの陰イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレー質量分析スペクトルであり、 m/z 9993-からの生成イオンスペクトルを示す。
【図２７Ｃ】Pm菌株VP161からのLPS-OHの陰イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレー質量分析スペクトルであり、 m/z 10403-からの生成イオンスペクトルを示す。
【図２８Ａ】Pm菌株VP161からのコアオリゴ糖の陽イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレー質量分析スペクトルであり、高オリフィス電圧(high orifice voltage)を利用した m/z 9032+からの生成イオンスペクトルを示す。
【図２８Ｂ】Pm菌株VP161からのコアオリゴ糖の陽イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレー質量分析スペクトルであり、高オリフィス電圧(high orifice voltage)を利用した m/z 9842+からの生成イオンスペクトルを示す。
【図２８Ｃ】Pm菌株VP161からのコアオリゴ糖の陽イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレー質量分析スペクトルであり、高オリフィス電圧(high orifice voltage)を利用した m/z 4242+からの生成イオンスペクトルを示す。
【図２９】Pm菌株VP161からのコアオリゴ糖の2D-NOESY NMRスペクトルの領域である。各残基の文字名称は、実施例４、表２に示すものと同様である。スペクトルは、400msのミキシングタイムで、D2O中、pH7、025℃で記録された。
【図３０】アノマー1H共鳴(下に文字があるもの：lower case letters)と環13C共鳴(上に文字があるもの：upper case letters)との間の相関関係を示すPm菌株VP161からのコアオリゴ糖の2D-13C-1H-HMBC NMRスペクトルの領域である。スペクトルは、D2O中、pH7、025℃で記録された。
【図３１】g-1〜g-4及びh-1〜h-4のラベルを付したガラクトース残基に関する31P-共鳴(ｘ軸)及び1H共鳴(y軸)、並びに塩素共鳴の間の相関関係を示すPm菌株VP161からのコアオリゴ糖の2D-31P-1H-HSQC-TOCSY NMRスペクトルの領域である。スペクトルは、D2O中、pH7、025℃で記録された。
【図３２】Pm菌株VP161からの十分に脱アシル化されたLPSの1H NMRスペクトルである。a) 一つのKdo残基を含む糖型; b) 二つのKdoを含む糖型。スペクトルは、D2O中、pH7、025℃で記録された。各残基の文字名称は、実施例４、表２に示すものと同様である。Gal I (g)及びGal II (h)のH-4共鳴に関する低フィールドシフトは、加水分解及びKOH処理の間のPCho残基の移動(migration)によるものである。
【図３３Ａ】Pm菌株X73からのコアオリゴ糖の陽イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレー質量分析スペクトルであり、高オリフィス電圧を利用したm/z 11082+からの生成イオンスペクトルを示す。
【図３３Ｂ】Pm菌株X73からのコアオリゴ糖の陽イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレー質量分析スペクトルであり、高オリフィス電圧を利用したm/z 451.5+からの生成イオンスペクトルを示す。
【図３４】PEtnとガラクトース残基との間の31P-1H結合(31P-1H coupling)に関して10Hzにおいて最適化されたミキシングタイムでの31P-共鳴(x-軸)と1H共鳴との間の相関関係を示すPm菌株X73からのコアオリゴ糖の2D-31P-1H-HMQC-TOCSY NMRスペクトルの領域を示す。スペクトルは、D2O中、pH7、025℃で記録された。
【図３５】ガラクトース残基のC-5、C-6、H-5及びH-6共鳴の間の相関関係を示す13C-共鳴(y-軸)と1H共鳴との間の相関関係を示すPm菌株X73からのコアオリゴ糖の2D-13C-1H-HSQC-TOCSY NMRスペクトルの領域を示す。スペクトルは、D2O中、pH7.0、25℃で記録された。
【図３６Ａ】SDS-PAGE及び全細胞溶解物の銀染色によるパスツレラ・マルトシダLPSの分析であり、 野生型VP161(レーン1); ヘプトシルトランスフェラーゼ突然変異体AL251(レーン2); 対照菌株(control strain)AL438(ベクタープラスミドpAL99を含むAL251)(レーン3);及び相補された(complemented)突然変異体菌株AL298(レーン4)からのパスツレラ・マルトシダLPSプロファイルの比較を示す。
【図３６Ｂ】SDS-PAGE及び全細胞溶解物の銀染色によるパスツレラ・マルトシダLPSの分析であり、ヘプトシルトランスフェラーゼ突然変異体AL251(レーン1); 野生型VP161(レーン2); 及びAL251を接種した三羽の別のニワトリから分離したパスツレラ・マルトシダ野生型復帰突然変異体(レーン3、4及び5)のパスツレラ・マルトシダのLPSプロファイルの比較を示す。
【図３７Ａ】パスツレラ・マルトシダのコアオリゴ糖の陰イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレー質量分析スペクトルであり、親菌株VP161からのコアオリゴ糖の二荷電領域を示す。
【図３７Ｂ】パスツレラ・マルトシダのコアオリゴ糖の陰イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレー質量分析スペクトルであり、突然変異体菌株AL251からのコアオリゴ糖の一荷電領域を示す。
【図３８】(A)パスツレラ・マルトシダ菌株VP161及び(B)パスツレラ・マルトシダ突然変異体菌株AL251のLPSに由来するコアオリゴ糖の1H NMRスペクトルの領域である。スペクトルは、25℃で記録され、2.225ppmにおける内部アセトンを基準とした。
【図３９】パスツレラ・マルトシダVP161コアオリゴ糖のNOESYスペクトルの領域である。NOE結合性は、示すとおりである。挿入図は、VP161からの内側コアオリゴ糖の構造である。スペクトルは、25℃で記録され、2.225ppmにおける内部アセトンを基準とした。
【図４０】(A)親菌株VP161及び(B)突然変異体菌株AL251からのパスツレラ・マルトシダの内側コアLPSの提案する構造であり、ここで、Rは、Glcを越えたオリゴ糖鎖エクステンションである。
【図４１Ａ】マンヘイミア・ヘモリティカ菌株A1からのコアオリゴ糖の構造図である。外側コアデコレーションにおける第一の段階に関与するグリコシルトランスフェラーゼが示されている。
【図４１Ｂ】アクチノバシラス・プレウロニューモニー血清型1からのコアオリゴ糖の構造図である。外側コアデコレーションにおける第一の段階に関与するグリコシルトランスフェラーゼが示されている。
【図４２Ａ】マンヘイミア・ヘモリティカ突然変異体菌株losBからのO-脱アシル化LPSの陰イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレーイオン化質量分析スペクトルである。
【図４２Ｂ】losB遺伝子を含むpNF2176AAlosBで相補された(complemented)トランスのマンヘイミア・ヘモリティカ突然変異体菌株losBからのO-脱アシル化LPSの陰イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレーイオン化質量分析スペクトルである。
【図４３】野生型のマンヘイミア・ヘモリティカ菌株A1及び突然変異体菌株losBからの完全に脱アシル化されたLPSの2D-TOCSY NMRの領域を示す。各残基の名称は、丸で囲ったlosB突然変異体菌株に存在しない外側コア残基に関して示したものと同様である。スペクトルは、400msのミキシングタイムで、D2O中、pH7.0、25℃で記録された。
【図４４】菌株Mh losB(▲)及びwt(■)からの精製されたLPSに対するマウスNo.1〜5からのD42ポリクローナル血清のELISA(OD405)を示す。マウスの指定は、図に示すとおりである。全ての血清の希釈は、図示のとおりである。
【図４５】菌株Mh losB及びwt、App血清型1及び5a並びにPm菌株VP161及びX73からのLPS並びにMh及びPm菌株からのLPS-OHに対する９個の内側コアLPSモノクローナル抗体のELISA(OD405)を示す。モノクローナル抗体の指定及び希釈は、図に示すとおりである。
【図４６】菌株Mh losB及びwt、App血清型1及び5a並びにPm菌株VP161及びX73からのLPSに対するマウス番号1、マウスNo.2+3、マウスNo.4及びマウスNo.5からのD42ポリクローナル血清のELISA(OD405)を示す。マウスの指定は、図に示すとおりである。全ての血清は、1：50の希釈で使用された。
【図４７】菌株Mh losB及びwt、App血清型1及び5a並びにPm菌株VP161及びX73からのLPSに対するマウスNo.5からのD152ポリクローナル血清のELISA(OD405)を示す。希釈は、図に示すとおりである。
【図４８】菌株Mh losB及びwt、Ap血清型1及び5a並びにPm菌株VP161及びX73からのLPSに対する二つの代表的な内側コアLPSモノクローナル抗体からの使用済みの(spent)上澄みのELISA(OD405)を示す。モノクローナル抗体の指定と稀釈は、図に示すとおりである。
【図４９】Mh losBのKOH処理をしたLPSの陰イオンキャピラリー電気泳動−エレクトロスプレー質量分析スペクトルである。
【図５０】Mh losB複合体のSDS-PAGE及びウェスタンブロット分析を示す。12.5％SDS-PAGEゲルを用いて行い、ブロットし、1：106の稀釈で用いた炭水化物に特異なモノクローナル抗体G8でふるい分けした。
【図５１Ａ】ヒト血清アルブミン(HSA)のCE-ES-MS分析を示す。
【図５１Ｂ】HSA-Mh losB複合糖質のCE-ES-MS分析を示す。
【図５２】菌株Mh losBからの精製したLPSに対するワクチン投与したマウス番号V1〜V5及び対照マウスC6、C8及びC9からのD23ポリクローナル血清のELISA(OD405)であり、免疫グロブリンG反応(IgG response)(▲)及び免疫グロブリンM(IgM)反応(■)についてスクリーニングした。マウスの特定は、図に示すとおりである。全ての血清の稀釈は、示すとおりである。
【図５３】菌株Mh losBからの精製したLPSに対するワクチン投与したマウス番号V1〜V5及び対照マウスC6、C8及びC9からのD45ポリクローナル血清のELISA(OD405)であり、免疫グロブリンG(IgG)反応(▲)及び免疫グロブリンM(IgM)反応(■)についてスクリーニングした。マウスの特定は、図に示すとおりである。全ての血清の稀釈は、示すとおりである。
【図５４】菌株Mh losB及びwt、Ap血清型1及び5a並びにPm菌株VP161及びX73からのLPSに対するポリクローナル血清V2(1：25稀釈)のELISA(OD405)である。
【図５５】菌株Mh losB及びwt、Ap血清型1及び5a並びにPm菌株VP161及びX73からの全細胞に対するポリクローナル血清V2(1：25稀釈)のELISA(OD405)である。
【図５６】菌株Mh losB及びwt、Ap血清型1及び5a並びにPm菌株VP161及びX73からの全細胞に対するポリクローナル血清Mh No.1(1：100稀釈)のELISA(OD405)である。
【図５７】菌株Mh losB及びwt、App血清型1及び5a並びにPm菌株VP161及びX73からのLPSに対するポリクローナル血清Mh No.1(1：100稀釈)のELISA(OD405)である。
【図５８】菌株Mh losB及びwtからのLPSに対するa)モノクローナル抗体G3及びb)モノクローナル抗体G８からの腹水のELISA(OD405)である。
【図５９】菌株Mh losB及びwt、App血清型1及び5a並びにPm菌株VP161、X73及びPm70からの全細胞に対するa)モノクローナル抗体G3及びb)モノクローナル抗体G8からの腹水のELISA(OD405)である。
【図６０】菌株Mh wt及びPm菌株VP161からのLPSに対するa)モノクローナル抗体3-5及びb)モノクローナル抗体3-16からの腹水のELISA(OD405)である。
【図６１】菌株Mh wt及びlosBt、App血清型1並びにPm菌株VP161、X73並びに髄膜炎菌菌株L2 galEからの全細胞に対するa)モノクローナル抗体3-5及びb)モノクローナル抗体3-16からの腹水のELISA(OD405)である。
【図６２】モノクローナル抗体G3及び対応するものであるが補体のない対照からの免疫血清の稀釈物を用いた血清の殺菌性検定、ここで、生存％＝[T30試験、平均コロニー形成単位(CFU)数／T30試験Mh単独、平均CFU数]ｘ100％。
【図６３】モノクローナル抗体G8及び対応するものであるが補体のない対照からの免疫血清の稀釈物を用いた血清の殺菌性検定、ここで、生存％＝[T30試験、平均コロニー形成単位(CFU)数／T30試験Mh単独、平均CFU数]ｘ100％。
【図６４】Mh losB全細胞(Mh番号D104)で免疫付与したマウス及び対応するものであるが補体のない対照を投与したマウスからのポリクローナル血清の稀釈物を用いた血清の殺菌性検定、ここで、生存％＝[T30試験、平均コロニー形成単位(CFU)数／T30試験Mh単独、平均CFU数]ｘ100％。
【図６５】Mh wt菌株からのLPSに対するカラム前及びカラム後の腹水のELISA(OD405)によって測定したa)モノクローナル抗体G3及びb)モノクローナル抗体G8腹水のプロテインAのカラム精製(column purification)。
【図６６】中くらいの大きさの気管支のルーメンにおける中程度の数の好中球の存在を示すdpi 3において殺されたグループBのマウスからの肺を示す。
【図６７】幾つかの場所における少数のリンパ球様細胞が存在する気管支肺炎の消散(resolution)を示すdpi 3において殺されたグループBのマウスからの肺を示す。
【図１】
2007537307.tif 000067
【図２】
2007537307.tif 000068
【図３】
2007537307.tif 000069
【図４】
2007537307.tif 000070
【図５】
2007537307.tif 000071
【図６】
2007537307.tif 000072
【図７】
2007537307.tif 000073
【図８】
2007537307.tif 000074
【図９】
2007537307.tif 000075
【図１０】
2007537307.tif 000076
【図１１】
2007537307.tif 000077
【図１２】
2007537307.tif 000078
【図１３】
2007537307.tif 000079
【図１４】
2007537307.tif 000080
【図１５】
2007537307.tif 000081
【図１６】
2007537307.tif 000082
【図１７】
2007537307.tif 000083
【図１８】
2007537307.tif 000084
【図１９】
2007537307.tif 000085
【図２０】
2007537307.tif 000086
【図２１】
2007537307.tif 000087
【図２２】
2007537307.tif 000088
【図２３】
2007537307.tif 000089
【図２４】
2007537307.tif 000090
【図２５】
2007537307.tif 000091
【図２６】
2007537307.tif 000092
【図２７Ａ】
2007537307.tif 000093
【図２７Ｂ】
2007537307.tif 000094
【図２７Ｃ】
2007537307.tif 000095
【図２８Ａ】
2007537307.tif 000096
【図２８Ｂ】
2007537307.tif 000097
【図２８Ｃ】
2007537307.tif 000098
【図２９】
2007537307.tif 000099
【図３０】
2007537307.tif 000100
【図３１】
2007537307.tif 000101
【図３２】
2007537307.tif 000102
【図３３Ａ】
2007537307.tif 000103
【図３３Ｂ】
2007537307.tif 000104
【図３４】
2007537307.tif 000105
【図３５】
2007537307.tif 000106
【図３６Ａ】
2007537307.tif 000107
【図３６Ｂ】
2007537307.tif 000108
【図３７Ａ】
2007537307.tif 000109
【図３７Ｂ】
2007537307.tif 000110
【図３８】
2007537307.tif 000111
【図３９】
2007537307.tif 000112
【図４０】
2007537307.tif 000113
【図４１Ａ】
2007537307.tif 000114
【図４１Ｂ】
2007537307.tif 000115
【図４２Ａ】
2007537307.tif 000116
【図４２Ｂ】
2007537307.tif 000117
【図４３】
2007537307.tif 000118
【図４４】
2007537307.tif 000119
【図４５】
2007537307.tif 000120
【図４６】
2007537307.tif 000121
【図４７】
2007537307.tif 000122
【図４８】
2007537307.tif 000123
【図４９】
2007537307.tif 000124
【図５０】
2007537307.tif 000125
【図５１Ａ】
2007537307.tif 000126
【図５１Ｂ】
2007537307.tif 000127
【図５２】
2007537307.tif 000128
【図５３】
2007537307.tif 000129
【図５４】
2007537307.tif 000130
【図５５】
2007537307.tif 000131
【図５６】
2007537307.tif 000132
【図５７】
2007537307.tif 000133
【図５８】
2007537307.tif 000134
【図５９】
2007537307.tif 000135
【図６０】
2007537307.tif 000136
【図６１】
2007537307.tif 000137
【図６２】
2007537307.tif 000138
【図６３】
2007537307.tif 000139
【図６４】
2007537307.tif 000140
【図６５】
2007537307.tif 000141
【図６６】
2007537307.tif 000142
【図６７】
2007537307.tif 000143
【配列表】
2007537307000001.xml
【国際調査報告】
2007537307.tif 000146
2007537307.tif 000147
2007537307.tif 000148
2007537307.tif 000149
2007537307.tif 000150