(57)【要約】炎症性疾患または関連する疾患の処置または防止に有用である免疫グロブリンおよびＴ細胞レパートリーの産生および改変に必要とされるタンパク質を標的化する外部ガイド配列（ＥＧＳ）が記載される。炎症性疾患または関連する疾患の処置のためのＥＧＳの投与に適した処方物が記載される。この処方物は、吸入を介して、注射を介して、または経口投与され得る。この処方物は、軟膏剤、ローション剤、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、散剤、顆粒剤、水剤、懸濁剤、カプセル剤、および錠剤の形態であり得る。薬学的に受容可能なキャリア中のＥＧＳの有効量を投与することによって炎症性疾患または関連する疾患を処置する方法もまた記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性疾患を処置するための、薬学的に受容可能なキャリア中のヌクレアーゼ耐性ＥＧＳ組成物。
【請求項２】
前記ＥＧＳは、ヌクレオチドのリボース部分の２’ＯＨ基において化学的に改変され、該改変は、２’−Ｏ−メチルの付加である、請求項１に記載のＥＧＳ組成物。
【請求項３】
前記ＥＧＳが、標的配列と塩基対形成して、ステムのような構造を形成する少なくとも７個のヌクレオチド、塩基対形成して、ｔＲＮＡ分子の一部に類似する二次構造および三次構造を形成するヌクレオチド、該ヌクレオチドに続く、標的配列と塩基対形成して、Ｄループのような構造を形成する少なくとも３個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＥＧＳ組成物。
【請求項４】
前記ＥＧＳが、ＩＬ−４レセプターα鎖、ＲＡＧ−１、アデノシン−１レセプター、ＩＬ−１３、ＣＤ４０、ＣＤ４０レセプター、Ｃ３ｄ補体レセプター、ＴＧＦβレセプター１、ＴＧＦ  βレセプター２、ＴＧＦ  β、ＴＧＦ  β転写因子、ＥＧＦレセプター、ＩＬ−１０レセプター、ＩＬ−１０、ＮＦκＢ転写因子ｐ６５、ＮＦκＢ転写因子ｐ５０、ＳＴＡＴ６、インフルエンザウイルスの伸長因子、インフルエンザウイルスヌクレオカプシド、インフルエンザウイルスの酸性ポリメラーゼ、およびインフルエンザウイルスの非構造タンパク質からなる群より選択される標的ｍＲＮＡの発現を阻害する、請求項１に記載のＥＧＳ組成物。
【請求項５】
前記薬学的に受容可能なキャリアが、軟膏剤、ローション剤、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、散剤、顆粒剤、水剤、懸濁剤、カプセル剤、および錠剤からなる群より選択される、請求項１に記載のＥＧＳ組成物。
【請求項６】
前記ＥＧＳは、吸入を介する投与、注射を介する投与、または経口投与のために処方される、請求項１に記載のＥＧＳ組成物。
【請求項７】
疾患または障害の１つ以上の症状を妨げるか、または軽減するＥＧＳの有効量を肺投与するための投薬形態であるヌクレアーゼ耐性ＥＧＳ組成物。
【請求項８】
炎症性疾患を処置する方法であって、該方法は、疾患または障害の１つ以上の症状を妨げるか、または軽減するために、薬学的に受容可能なキャリア中のヌクレアーゼ耐性ＥＧＳの有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項９】
前記ＥＧＳは、吸入を介して、注射を介して、または経口投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＩＬ−４レセプターα鎖、ＲＡＧ−１、アデノシンレセプター、およびＳＴＡＴ６からなる群より選択される標的ｍＲＮＡの発現を阻害する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬学的に受容可能なキャリアは、軟膏剤、ローション剤、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、散剤、顆粒剤、水剤、懸濁剤、カプセル剤、および錠剤からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患は、喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、湿疹、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３依存性の悪性腫瘍、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３依存性の自己免疫疾患、ウイルスのＩＬ−４依存性の複製によって引き起こされる疾患、ならびにアトピー性疾患からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｄｒｅｙｆｕｓによる米国仮特許出願番号第６０／５６６，９６８号（発明の名称「Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｅｘｔｅｒｎａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」、２００４年４月２９日出願）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（連邦政府委託研究に関する記載）
連邦政府は、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｄｒｅｙｆｕｓに対するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの助成金番号ＧＭ１９４２２の効力により、本明細書中に開示される発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、炎症性疾患および関連する疾患を処置するための内因性ＲＮＡｓｅｓに対する外部ガイド配列（ＥＧＳ）に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
アトピー性疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、アナフィラキシーおよび湿疹）は、環境要因と遺伝要因との間の複雑な相互作用によってもたらされる（非特許文献１および非特許文献２）。喘息および他のアトピー性疾患の危険性がある乳児は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の発現の増加および末梢の好酸球の数の増加を示し（非特許文献３）、このことは、ＴＨ２（Ｔヘルパー２）サイトカインであるインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）のようなサイトカインの発現の増加、ならびにＴＨ１（Ｔヘルパー１）サイトカインであるインターフェロンｇおよびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）のようなサイトカインの発現の相対的減少を反映する（非特許文献４）。
【０００５】
インフルエンザウイルスは、汎発性の株の場合には、既存のヘルスケアシステムを圧倒し得る公衆衛生上の問題として、ますます認識されるようになる。汎発性の株は、健康な免疫適格性の成人において死亡率および罹患率を引き起こし得る。汎発性インフルエンザの出現のパラダイムは、１９１８年の汎発であり、Ｈ１Ｎ５サブタイプの新規インフルエンザ株の出現に起因して発生し、ヒトの死亡率および罹患率が増加した（非特許文献５）。別のパラダイムは、アジアで広がるＨ５Ｎ１サブタイプの鳥インフルエンザの現在の発生であり、これは直接ヒトに感染し得、また、より代表的なヒト適合株と比較して著しく死亡率が増加する（非特許文献６）。インフルエンザウイルスの病原性は、迅速な変異というウイルスのストラテジーによって拡大され、この変異は、同時に感染した細胞中の株の間で独立して再度類別し得る複数のセグメントのウイルスゲノムによって助長される。
【０００６】
ウイルスのコートタンパク質上の異なる抗原決定基の迅速な出現は、ワクチンの標的の毎年の調整を要求し、そして慣習的なワクチンが不適当である年が存在することを確実にする。分子生物学が、ワクチンの生産に関するより迅速なストラテジーを提供する一方で、ある機会は、ワクチンによる保護が、宿主免疫系の増強またはワクチンもしくは宿主免疫応答に頼らない抗ウイルスストラテジーのいずれかによって不十分である個体に対する療法の開発のために存在する。汎発性の株の出現に関する問題は、インフルエンザに対する有効な療法の欠如および存在するワクチンストラテジーの制限を明らかにする。ワクチンは、幼い子供（ｖｅｒｙ  ｙｏｕｎｇ）および高齢者、または喘息または他の慢性呼吸器疾患を有する患者においてほとんど使用されないかもしれない（非特許文献７；非特許文献８；および非特許文献９）。不運なことに、これらは、ほぼ確実にインフルエンザ感染による死の危険性のある患者である。妊婦もまた、インフルエンザ感染の特定の危険にあるサブグループである。なぜなら、第一期における感染と感染に曝露された胎児の脳障害（精神分裂病または出生後に何年か経過してから明らかとなり得る他の神経学的異常を含む）との間に相関関係が存在するからである（非特許文献１０および非特許文献１１）。
【０００７】
現在のパラダイムは、アトピー性疾患が、乳児期または幼年期おいて刷り込まれるＴＨ２サイトカインの増加した発現およびＴＨ１サイトカインの相対的に減少した発現によるサイトカイン発現における不均衡から生じることを提唱する（非特許文献２）。このパラダイムの支持において、幼年期におけるサイトカインのバランスの回復で指向される療法は、アトピー性疾患を寛解させ得るか、または防ぎさえし得る（非特許文献１２および非特許文献１３）。喘息の危険にある小児に与えられた強力な抗ヒスタミン剤または他の抗炎症性薬物は、明らかに肥満細胞の脱顆粒によるヒスタミンおよびアレルギーを誘発する（ｐｒｏａｌｌｅｒｇｉｃ）サイトカインの放出を防ぐことによって、ＩｇＥ媒介性アレルギーを有する小児におけるその後の喘息の発生率を顕著に滞らせた（非特許文献１４；非特許文献１５；および非特許文献１６）。
【０００８】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３に対する細胞レセプターは、ＩＬ−４レセプターα鎖と称される共通のサブユニットを共有するが、ＩＬ−４レセプターα鎖と共有されるサブユニットは異なる（非特許文献１７および非特許文献１８）。レセプターの共有に起因して、ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、標的細胞に対してある程度共通の効果（ＩｇＥの合成および好酸球の生存の促進が挙げられる）を共有するが、他の標的細胞に対する異なる効果も共有する。例えば、ＩＬ−１３レセプターは、細胞内に発現され得るにもかかわらず、ＩＬ−４レセプターは、Ｔリンパ球の表面上に容易に検出され、ＩＬ−１３レセプターは、検出されない（非特許文献１９）。逆に、ＩＬ−１３発現は、肺における上皮組織構造および粘膜発現の変化を促進するが、ＩＬ−４発現は、これらを促進しないようである（非特許文献２０および非特許文献２１）。ヒトにおいて、共有されるＩＬ−４レセプターα鎖中の変異は、アトピー性疾患に関連するが、研究された全ての集団においてそうではない（非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８；および非特許文献２９）。マウスのモデルにおいて、ＩＬ−４レセプター共有ＩＬ−４レセプターａ鎖のノックアウトおよびＩＬ−４レセプター活性化ＳＴＡＴ−６シグナル伝達因子のノックアウトは、アレルギーの表現型をほぼ完全に排除するが、いくつかのアトピー性の応答は、長期のアレルギー刺激によって再発し得る（非特許文献１８；非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４；非特許文献３５；非特許文献３６；および非特許文献３７）。変異ＩＬ−４競合ペプチドアンタゴニストによるＩＬ−４／ＩＬ−１３レセプターの選択的遮断はまた、マウスにおけるアレルギー感作を遮断した（非特許文献３８）。
【０００９】
これらの知見は、アレルギー疾患を防ぐか、または処置する薬理学的干渉についての標的として、ＩＬ−４／ＩＬ−１３シグナル伝達経路の重要性を示す。ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方に必要とされる共有ＩＬ−４レセプターα鎖のノックアウトは、ＩｇＥ産生および喘息様の肺の病態の両方を排除し、このことは、喘息およびいくつかのアトピー性皮膚疾患におけるＩＬ−１３の固有の役割を示唆した（非特許文献２１；非特許文献３９；および非特許文献４０）。ＩＬ−４を結合し得る（しかし、ＩＬ−１３を結合しない）ヒト共有ＩＬ−４レセプターα鎖の可溶性フラグメントの最近の臨床試験は、重症の喘息患者においていくつかの有効性を示した（非特許文献４１）。重要なことに、ＩＬ−４機能の減少に関する悪影響は、これらのヒト被験体中の肺または全身において認められなかった。
【００１０】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３はまた、いくつかの細菌感染および寄生虫感染に対する全身性免疫に必要とされ（非特許文献２６；非特許文献４２；および非特許文献４３）、そしてレセプターの不活化は、標的化された組織における増加した感染を生じ得る。ＩＬ−４レセプターの多型性が、炎症性腸疾患に関連する場合（非特許文献４４）、肺または他の組織（例えば、消化管）のような特定の組織に対するＩＬ−４レセプターα鎖の標的化された不活化は、全身性免疫不全を防ぐのに有利であり得る。ＩＬ−４／ＩＬ−１３レセプターの損失は、マウスにおける全身自己免疫性糖尿病の発症を防止するので、ＩＬ−４レセプターα鎖の標的化された不活化を介する全身性免疫調節はまた、いくつかの状況下において有利であり得る（非特許文献４５および非特許文献４６；そしていくつかの腫瘍もまた、ＩＬ−４に対して応答性である（非特許文献４７；非特許文献４８；および非特許文献４９））。ＩＬ４はまた、単球／マクロファージ系統の初代細胞において、ＨＩＶ１複製を差次的に調節することを示した。ＴＨ１サイトカインに対するＩＬ４／ＩＬ１３（ＴＨ２サイトカイン）の不均衡は、ＨＩＶ−１、インフルエンザウイルス、およびエプスタイン−バーウイルスを含むウイルスの複製を促進すると考えられる。
【非特許文献１】Ｖｅｒｃｅｌｌｉら、「Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００１年、第１２４巻、ｐ．２０〜２４
【非特許文献２】ＰａｔｉｎｏおよびＭａｒｔｉｎｅｚ、「Ａｌｌｅｒｇｙ」、２００１年、第５６巻、ｐ．２７９〜２８６
【非特許文献３】Ｍａｒｔｉｎｅｚら、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」、１９９５年、第３３２巻、ｐ．１３３〜１３８
【非特許文献４】Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐら、「Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００１年、第１巻、ｐ．６９〜７５
【非特許文献５】Ｋａｓｈら、「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」、２００４年、第７８巻、第１７号、ｐ．９４９９〜９５１１
【非特許文献６】Ｎｇｕｙｅｎ−ＶａｎおよびＨａｍｐｓｏｎ、「Ｖａｃｃｉｎｅ」、２００３年、第２１巻、第１６号、ｐ．１７６２〜１７６８
【非特許文献７】Ｃｈｒｉｓｔｙら、「Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ」、２００４年、第８９巻、第８号、ｐ．７３４〜７３５
【非特許文献８】Ｔａｎら、「Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．」、２００３年、第１１５巻、第４号、ｐ．２７２〜２７７
【非特許文献９】Ｂｕｅｖｉｎｇら、「Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．」、２００３年、第１６９巻、第４号、ｐ．４８８〜４９３
【非特許文献１０】Ｂｒｏｗｎら、「Ａｒｃｈ．Ｇｅｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ」、２００４年、第６１巻、第８号、ｐ．７７４〜７８０
【非特許文献１１】Ｇｏｒｍａｎ、「Ｔｉｍｅ」、２００４年、第１６４号、第７号、ｐ．８０
【非特許文献１２】Ｋａｌｌｉｏｍａｋｉら、「Ｌａｎｃｅｔ」、２００１年、第３５７巻、ｐ．１０７６〜１０７９
【非特許文献１３】Ｍｕｒｃｈ、「Ｌａｎｃｅｔ」、２００１年、第３５７巻、ｐ．１０５７〜１０５９
【非特許文献１４】Ａｎｏｙｍｏｕｓ、「Ｐｅｄｉａｔｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、１９９８年、第９巻、ｐ．１１６〜１２４
【非特許文献１５】Ｍｏｌｌｅｒら、「Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００２年、第１０９巻、ｐ．２５１〜２５６
【非特許文献１６】ｄｅ  Ｌｏｎｇｕｅｖｉｌｌｅ、「Ｐｅｄｉａｔｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２０００年、第１１巻、補遺１３、ｐ．４１〜４４
【非特許文献１７】Ｋｅｅｇａｎら、「ＰＮＡＳ  ＵＳＡ」、１９９５年、第９２巻、ｐ．７６８１〜７６８５
【非特許文献１８】ＧｅｓｓｎｅｒおよびＲｏｌｌｉｎｇｈｏｆｆ、「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」、２０００年、第２０１巻、ｐ．２８５〜３０７
【非特許文献１９】Ｇｒａｂｅｒら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．」、１９９８年、第２８巻、ｐ．４２８６〜４２９８
【非特許文献２０】Ｋｕｐｅｒｍａｎら、「Ｎａｔ．Ｍｅｄ．」、２００２年、第８巻、ｐ．８８５〜８８９
【非特許文献２１】Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１９９８年、第２８２巻、ｐ．２２５８〜２２６１
【非特許文献２２】Ｈａｃｋｓｔｅｉｎら、「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ」、２００１年、第５３巻、ｐ．２６４〜２６９
【非特許文献２３】Ｈａｌｌ、「Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．」、２０００年、第１巻、ｐ．６〜８
【非特許文献２４】Ｈｅｒｓｈｅｙら、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」、１９９７年、第３３７巻、ｐ．１７２０〜１７２５
【非特許文献２５】Ｈｏｗａｒｄら、「Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．」、２００２年、第７０巻、ｐ．２３０〜２３６
【非特許文献２６】ＫａｒｐおよびＷｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ、「Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．」、２００１年、第３巻、ｐ．１０９〜１１９
【非特許文献２７】Ｍｉｔｓｕｙａｓｕら、「Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．」、１９９８年、第１９巻、ｐ．１１９〜１２０
【非特許文献２８】Ｏｌａｖｅｓｅｎら、「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｔｉｃｓ」、２０００年、第５１巻、ｐ．１〜７
【非特許文献２９】Ｒｉｓｍａら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００２年、第１６９巻、ｐ．１６０４〜１６１０
【非特許文献３０】Ｇｒｕｎｅｗａｌｄら、２００１年、「Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」、第１２５巻、ｐ．３２２〜８
【非特許文献３１】Ｎｅｌｍｓら、「Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」、１９９９年、第１７巻、ｐ．７０１〜３８
【非特許文献３２】Ｎｏｂｅｎ−Ｔｒａｕｔｈら、「Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ」、１９９７年、第９４巻、ｐ．１０８３８〜４３
【非特許文献３３】Ｎｏｂｅｎ−Ｔｒａｕｔｈら、「Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」、２００２年、第３２巻、ｐ．１４２８〜３３
【非特許文献３４】Ｑｕｅｌｌｅら、「Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」、１９９５年、第１５巻、ｐ．３３３６〜４３
【非特許文献３５】Ｓｈｉｍｏｄａら、「Ｎａｔｕｒｅ」、１９９６年、第３８０巻、ｐ．６３０〜３
【非特許文献３６】Ｓｏら、「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ」、２００２年、第５１８巻、ｐ．５３〜９
【非特許文献３７】Ｚｈｕら、「Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」、２００１年、第１６６巻、ｐ．７２７６〜８１
【非特許文献３８】Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００１年、第１６６巻、ｐ．５７９２〜５８００
【非特許文献３９】Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ、「Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．」、２０００年、第１巻、ｐ．１９〜２３
【非特許文献４０】Ｈｅｒｒｉｃｋら、「Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．」、２０００年、第１０５巻、ｐ．７６５〜７７５
【非特許文献４１】ＳｔｅｉｎｋｅおよびＢｏｒｉｓｈ、「Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．」、２００２年、第２巻、ｐ．６６〜７０
【非特許文献４２】Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄら、「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．」、２００１年、第６９巻、ｐ．２２８〜２３６
【非特許文献４３】Ｍｏｈｒｓら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、１９９９年、第１６２巻、ｐ．７３０２〜７３０８
【非特許文献４４】Ｋｌｅｉｎら、「Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．」、２００１年、第２巻、ｐ．２８７〜２８９
【非特許文献４５】ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＰａｕｌ、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００１年、第１３巻、ｐ．６８７〜６９８
【非特許文献４６】Ｒａｄｕら、「ＰＮＡＳ  ＵＳＡ」、２０００年、第９７巻、ｐ．１２７００〜１２７０４
【非特許文献４７】Ｓｔｒｏｍｅら、「Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」、２００２年、第８巻、ｐ．２８１〜２８６
【非特許文献４８】Ｅｓｓｎｅｒら、「Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｓｕｒｇ．」、２００１年、第５巻、ｐ．８１〜９０
【非特許文献４９】ｔｅｒａｂｅら、「Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２０００年、第１巻、ｐ．５１５〜５２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明は、呼吸器疾患、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３依存性の全身性疾患、ならびにウイルスに対する療法を提供するヌクレアーゼ耐性ＥＧＳを提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は、免疫グロブリンおよびＴ細胞レパートリーの産生および改変に必要とされるタンパク質を標的化するＥＧＳを提供することを目的とする。
【００１３】
さらに、本発明は、ウイルス複製を標的化するＥＧＳを提供することを目的とする。
【００１４】
さらに、本発明は、ＥＧＳを含む吸入のための処方物、ならびにこのような処方物を利用して炎症性疾患および関連する疾患を処置するための方法を提供することを目的とする。
【００１５】
さらに、本発明は、ＩＬ−４レセプターα鎖を不活化する処方物、およびそれを使用する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の概要）
ｍＲＮＡの部位特異的切断によって特定の遺伝子発現を標的化する外部ガイド配列（ＥＧＳ）と称されるＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡｉが、記載されてきた。ＥＧＳは、結合したｍＲＮＡを内因性リボヌクレアーゼ（例えば、細菌において広範に分布する細胞酵素ＲＮＡｓｅ  Ｐならびにヒトおよび他の哺乳動物におけるそのホモログ）に指向することによってＲＮＡ触媒またはリボザイムとして機能する。炎症性疾患または関連する疾患の処置または防止に有用である免疫グロブリンおよびＴ細胞レパートリーの産生および改変に必要とされるタンパク質を標的化するＥＧＳが、記載され、これらの処置または防止は、その疾患または障害の１つ以上の症状を妨げるか、または減少させることに基づく。喘息に関連するサイトカイン、サイトカインレセプター、または転写因子を標的とし、そしてインフルエンザウイルスを標的化するＥＧＳが、記載される。一実施形態において、ヒトインターロイキン（ＩＬ）−４レセプターα  ｍＲＮＡ（喘息および肺組織で発現されるアレルギー疾患の病因において重要なサイトカインレセプター）を標的化するＥＧＳが、記載される。別の実施形態において、転写シグナルトランスデューサー・活性化因子６（ＳＴＡＴ６）を標的化するＥＧＳが、記載され、ＳＴＡＴ６は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３によって開始されるシグナル伝達経路に関与する。別の実施形態において、アデノシンレセプターＡ１（Ａ１）を標的化するＥＧＳが、記載される。アデノシンは、種々の細胞の機能を調節し、そして生理学的ストレスの条件下で放出される多目的のシグナル分子である。アデノシンの作用は、レセプターの４つのサブタイプ（Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２ＢおよびＡ３）によって媒介される。Ａ１は、上皮細胞において発現されるアデノシンレセプターの主要な形態であり、喘息においてアップレギュレートされる。別の実施形態において、Ｂ細胞レセプターおよびＴ細胞レセプターの適切な形成ならびに機能に必須であるＲＡＧ−１  ＲＮＡを活性化する組換えを標的化するＥＧＳが、記載される。ＲＡＧ−１は、抗原レセプター遺伝子セグメントの構築プロセスの開始においてＲＡＧ−２と一緒にヘテロダイマーとして作用する。別の実施形態において、インフルエンザウイルスの遺伝子を標的化するＥＧＳが、記載される。
【００１７】
炎症性疾患または関連する疾患の処置のためのＥＧＳの投与に適切な処方物が、記載される。この処方物は、吸入を介して、注射を介して、経口投与されても、軟膏剤、ローション剤、クリーム、ゲル、滴剤（ｄｒｏｐ）、坐剤、スプレー剤、液剤、散剤、顆粒剤、水剤、懸濁剤、カプセル剤、および錠剤の形態であってもよい。この処方物は、標的化されたｍＲＮＡのレベルを数日間または数週間の間減少させる、肺の細胞外液におけるＥＧＳの１μＭ以下の最終濃度を達成するようにＥＧＳの有効量を含む。
【００１８】
薬学的に受容可能なキャリア中のＥＧＳの有効量を投与することによって炎症性疾患または関連する疾患を処置する方法もまた、記載される。好ましい実施形態において、この炎症性疾患は、喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、アトピー性皮膚疾患（例えば、湿疹）、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３依存性の悪性腫瘍、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３依存性の自己免疫疾患、ならびにアトピー性疾患である。別の好ましい実施形態において、この疾患は、インフルエンザウイルスまたはウイルス（例えば、ＨＩＶ−１およびエプスタイン−バーウイルス）のＩＬ−４依存性の複製によって生じる。
【００１９】
一実施形態において、ヌクレアーゼ耐性ＥＧＳは、喘息および他のアトピー性疾患における新規の療法として、ＥＧＳ関連性の呼吸可能アンチセンスオリゴヌクレオチド配列（ＥＧＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｓｐｉｒａｂｌｅ  Ａｎｔｉ−Ｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）またはＥＲＡＳＯＮＳといわれる触媒ＲＮＡオリゴヌクレオチドの肺送達のために処方される。これらのＥＧＳ、ならびに本明細書中に記載される小さいヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド配列および関連するＤＮＡ発現ベクターは、喘息および関連する呼吸器疾患の療法に有用であると予想される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
療法のために呼吸器疾患を標的化するＲＮＡ酵素が、記載される。同定されたＥＧＳ  （外部ガイド配列）と称されるＲＮＡ配列が記載され、ＲＮＡｓｅ  Ｐによって効率的に標的化されることが予想されるか、または実証される、インフルエンザウイルスのトランスクリプトソームおよび呼吸器のサイトカイン由来のｍＲＮＡの領域を標的化する。特定の標的としては、重要な保存されたインフルエンザ遺伝子および共有されるＩＬ４／ＩＬ１３の共通鎖２、ならびに他の重要な炎症性経路（たとえば、ＮＦ−κＢ、ＴＧＦ−β、アデノシンおよび補体レセプター）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
アンチセンス技術は、基礎研究用途および治療用途における使用のための遺伝子標的化アプローチを保証している。この遺伝子標的化因子としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンス触媒分子（リボザイムまたはＤＮＡ酵素）、または内因性ＲＮａｓｅｓ（例えば、ＲＮａｓｅ  ＬおよびＲＮａｓｅ  Ｐ）による分解のためにｍＲＮＡを標的化するさらなる（ガイド）配列（他に外部ガイド配列（ＥＧＳ）として公知である）を有するアンチセンス分子が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイムおよびアンチセンスホスホチオエート分子の、それらの標的ＲＮＡに対する結合が、インビボにおいて律速であり得ることが示された（Ｙｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、２３５２４−２３５３３（１９９８））。ＥＧＳは、他の遺伝子標的化因子を上回る数種の固有の特徴を有する。これらの分子による標的化は、触媒的であり得るＲＮＡの不可逆的な切断をもたらす。さらに、標的化アプローチは、標的ｍＲＮＡの分解のために細胞の内因性ＲＮａｓｅ  Ｐ（またはその等価物）を使用し、それによって細胞環境における標的化酵素の安定性および有効性を確保する。
【００２２】
（ＲＮＡｓｅ  Ｐ／ＥＧＳ技術）
リボヌクレアーゼＰ（ＲＮａｓｅ  Ｐ）は、全ての生物において見出されるリボヌクレオタンパク質複合体である。これは、細胞中で非常に活性であり、そして細胞の全ＲＮＡの約２％の割合を占める全てのｔＲＮＡの、５’末端の成熟に関与する。ヒトＲＮａｓｅ  Ｐは、少なくとも９個のポリペプチド、および１つのＲＮＡサブユニット（Ｈ１  ＲＮＡ）を有する。ＲＮａｓｅ  Ｐの固有の特徴の１つは、基質の配列よりもむしろ、構造を認識するという能力である。このことは、ＲＮａｓｅ  Ｐにインビボまたはインビトロで異なる天然の基質を加水分解させる。したがって、ｔＲＮＡ分子と似ている２つのＲＮＡ分子の複合体は、ＲＮａｓｅ  Ｐによって認識され得るか、または切断され得る。これらのＲＮＡ分子の１つは、外部ガイド配列（ＥＧＳ）と呼ばれる。ｍＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡとハイブリダイズし、そしてＲＮａｓｅ  Ｐを切断部位に指向するＥＧＳを使用することによって、ＲＮａｓｅ  Ｐによる切断のために標的化され得る。標的化された切断のためにヒトＲＮａｓｅ  Ｐを指向するように使用されるＥＧＳは、４分の３のｔＲＮＡ分子と似ており、そして２つの配列エレメントからなる：天然のｔＲＮＡ配列の部分であり、そしてＲＮａｓｅ  Ｐ認識に必要とされる、ｍＲＮＡ配列と相補的な標的化配列およびガイド配列。
【００２３】
標的  ｍＲＮＡと相補的なＥＧＳの領域は、一般的に、約２１ヌクレオチド〜２３ヌクレオチドの慣習的なアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの相補領域（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ  ｒｅｇｉｏｎ）より短い。これは、他のｍＲＮＡの関係のない（ｏｆｆ−ｓｉｔｅ）切断の可能性を減少させるべきである。ＥＧＳによって減少した関係のない切断もまた、ＲＮＡｉ（細胞中に導入された２２ヌクレオチドまたは２３ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドが内因性のＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＮＡ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＲＩＳＣ）による分解のための触媒として機能する、別の新しい標的化アプローチ（Ｐｌａｓｔｅｒｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１２６３−１２６５（２００２）））に対するＥＧＳの利点である。ＲＮＡｉまたは他のアンチセンス技術に対するＥＧＳの別の潜在的な利点は、常に全ての細胞中に存在する大量のＲＮＡｓｅ  Ｐの存在に起因する。ＲＮＡｉ発現に関して、ＲＩＳＣは、誘導される必要があり、全ての細胞型において誘導されないかもしれず、そして複数のｍＲＮＡ標的によって飽和される。当然に、これらの制限は、ＥＧＳに適用されないようである。
【００２４】
（ＲＮａｓｅ  Ｐ／ＥＧＳ技術の応用）
喘息および関連するアトピー性疾患に対する現在の療法は、有効であるが、いくつかの観点から不適当である。第１に、吸入因子（例えば、コルチコイド、および持続性βアゴニストまたはロイコトリエンアンタゴニスト）は、喘息の症状を遮断し得るが、これらの因子は、この疾患の進行またはその後の組織再構築を阻まない。ＩＬ４／１３および他の炎症性サイトカインを喘息の第一次予防として直接標的化するＥＧＳ療法が、記載される。第２に、既存の療法は、特に子供においてコンプライアンスの問題を生じる毎日か、またはより頻繁な投薬を必要とする。ＥＧＳ療法は、レセプターの発現および機能に対するＥＧＳの長期の効果に起因して１週間ベースであり得る。最後に、より長い作用の持続期間を有する、より新規の標的化された分子（例えば、抗ＩｇＥレセプターであるオマリズマブ（ｘｏｌａｉｒ））は、非常にコストが掛かり、そして投与、生成および保存するのが困難である。ＥＧＳは、は安定であり、素早く多量に調製されて、コストの削減および高いコスト効率をもたらし、そしてそれらの固有の化学的性質および活性の機構に起因して投与するのが容易である。ＥＧＳのコストは、既存の療法（例えば、１年毎に再設計される必要があるワクチンまたは予防のために毎日摂取される必要がある低分子）と比較して、最小限であると見積もられる。
【００２５】
ＥＧＳ標的化に特異的な分子標的（例えば、サイトカインレセプター）は、合理的かつ安価な設計原理および複数の分子標的を標的化する可能性という利点を有する。ＲＡＳＯＮＳと称される慣習的なアンチセンスＤＮＡ（ＮｙｃｅおよびＭｅｔｚｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：７２１−７２５（１９９７）；Ｓａｎｄｒａｓａｇｒａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１２：１７７−１８１（２００２）；ならびにＦｉｎｏｔｔｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：１２４７−１２６０（２００１））は、これらの疾患におけるサイトカイン発現を調節する試みにおいて導入された。触媒的なＲＮＡ外部ガイド配列（ＥＧＳ）（Ｇｏｐａｌａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：６７５９−６２（２００２）；Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３１３：４４２−５６（２０００）；Ｐｌｅｈｎ−Ｄｕｊｏｗｉｃｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５：７３２７−３２（１９９８）；およびＲｏｓｅｎｗａｓｓｅｒら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １５６：Ｓ１５２−５（１９９７））およびＲＮＡ干渉の最近見出された現象またはＲＮＡｉ（Ｐｌａｓｔｅｒｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１２６３−１２６５  （２００２））は、特定の標的ＲＮＡを不活化するために真核細胞中に導入される小さいＲＮＡ分子を利用する。ＩＬ−４レセプターα鎖の標的化された不活化は、単一の治療因子によってＩＬ−４とＩＬ−１３との合わせた病原効果を調節する手段を提供し得る。重要なことに、レセプター発現の排除は、自己分泌シグナル伝達および傍分泌シグナル伝達（細胞と、その細胞自体または細胞と密接する細胞との間のシグナル伝達）ならびに可溶性サイトカインの放出を介するシグナル伝達を調節する。
【００２６】
多くの分子の応用としては、アレルギー疾患および自己免疫疾患ならびに喘息に関する療法が挙げられ、これらは、これら分子が機能的なＩＬ−４レセプターα鎖のインビボの発現を減少させ得るという前提に基づく。これまでの研究は、標的化されたｍＲＮＡのＥＧＳベースのインビボでのＲＮＡ不活化が、ｍＲＮＡの翻訳の立体的遮断または内因性ＲＮＡｓｅ  ＨによってＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドの分解を引き起こすことのいずれかによる、異なる作用機構（ＮｙｃｅおよびＭｅｔｚｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：７２１−７２５（１９９７）ならびにＳａｎｄｒａｓａｇｒａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１２：１７７−１８１（２００２））を有する慣習的なアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドによる遺伝子の不活化（Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３１３：４４２−５６（２０００）およびＰｌｅｈｎ−Ｄｕｊｏｗｉｃｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５：７３２７−３２（１９９８））よりずっと有効であることを実証した。肺組織に対して効率的に送達される場合、吸入されたＥＧＳリボザイムは、広範に分布するＲＮＡｓｅ  Ｐおよび複数のラウンドのｍＲＮＡ切断を通して再循環する単一のＥＧＳの可能性のための共触媒として作用する能力に起因して、慣習的なアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドを上回る利点を有し得る。しかし、喘息および他のアトピー性  疾患の療法へのＥＧＳ技術の応用は、これまでに記載されなかった。
【００２７】
Ａｌｔｍａｎおよび共同研究者は、インフルエンザウイルスを使用して、呼吸器の病気がＲＮＡｓｅ  ＰおよびＥＧＳによって標的化され得ることを最初に示した（Ｐｌｅｈｎ−ＤｕｊｏｗｉｃｈおよびＡｌｔｍａｎ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：７３２７−７３３２（１９９８））。その後、Ｄｒｅｙｆｕｓら（本願の優先日より後に公開された）は、同様のストラテジーが共有されるＩＬ４／ＩＬ１３レセプター鎖を標的化し得ることを実証し、そして小さいヌクレアーゼ耐性ＥＧＳ配列による呼吸器の病気の吸入療法を提唱した（Ｄｒｅｙｆｕｓら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．４（８）：１０１５−１０２７（２００４））。多くのウイルス疾患経路および他の細胞遺伝子経路は、他の慢性的な病気（例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、肝炎、および癌）のための療法を生じるＥＧＳを使用して、ＲＮＡｓｅ  Ｐによって標的化された（ＲａｊおよびＬｉｕ、Ｇｅｎｅ  ３１３：５９−６９（２００３））。ＥＧＳは、これらが遺伝子発現の永続的な変更を生じないので、遺伝子治療ではないが、外来の核酸が遺伝子発現を一時的に変更するエピジェネティックな療法である。重要なことに、呼吸器疾患は、ＤＮＡベースまたはＲＮＡベースのいずれかの骨格を有する負に荷電した小さい核酸がキャリア分子を伴うか、またはこれを伴わない活性な状態で肺の上皮に自発的に取り込まれるので、核酸ベースのエピジェネティックな療法に関して理想的な標的である。
【００２８】
小さいヌクレアーゼ耐性ＥＧＳによる遺伝子の標的化は、遺伝子治療、またはＥＧＳを生成するウイルスベクターによる細胞の安定なトランスフェクションに対する必要性を取り除く。呼吸器疾患に対する画期的な療法としてのＥＧＳ技術の応用が、記載される。ＩＬ４／ＩＬ１３シグナル伝達は、ＩＬ４レセプター共通鎖を意味する共通のレセプター鎖を利用するので、ＩＬ４およびＩＬ１３の両方の排除は、本明細書中に記載される単一遺伝子標的化試薬によって可能であった。喘息および関連する呼吸器疾患の病因において重要であることが公知であるか、またはこのこと推定される、分子のｍＲＮＡ配列がスクリーニングされて、このｍＲＮＡの開始コドンの近傍に位置するＥＧＳ標的コンセンサスＧＮＮＮＮＮＵを含む標的が同定された（表１および表２を参照のこと）。
【００２９】
興味深いことに、いくつかの証拠は、インフルエンザ病原性の呼吸器ウイルスが、ウイルス感染とより慢性的な肺疾患との間の連関を提供する、ＴＨ１サイトカイン（例えば、インターフェロン）によって抑制されるよりもむしろ場合によっては増強される増加したＴＨ２サイトカイン（例えば、ＩＬ４およびＩＬ１３）によって、肺における喘息様の状態を誘導し得ることを示唆した（Ｕｍｅｔｓｕ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０（３）：２３２−２３４（２００４）およびＤａｈｌら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（３）：３３７−３４３（２００４））。したがって、呼吸器ウイルス性の病因は、ウイルス性の病因の両方の機構で指向される療法を示し、そしてそれに応答し得、そしてまた、喘息および関連するウイルス感染後の呼吸器の病気に対する新規のストラテジーを示唆し得る（Ｔｓｉｔｏｕｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（６）：３４８４−３４９１（２０００）ならびにＳｃｈｗａｒｚｅおよびＧｅｌｆａｎｄ、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒｅ．１９（２）：３４１−３４９（２００２））。
【００３０】
より最近、他の者は、ＲＮＡｉを意味する小さい二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドもまた、インビトロおよびインビボでインフルエンザの複製を遮断し得ることを示した（Ｇｅら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０１（２３）：８６７６−８６８１（２００４）；Ｔｏｍｐｋｉｎｓ、ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０１０（２３）：８６８２−８６８６（２００４）；およびＺｈｏｕら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５７７：３４５−３５０（２００４））。ＲＮＡｉの研究は、いくつかの理由から、ＥＧＳに関連する。第１に、ＲＮＡｉおよびＥＧＳは、両方とも、細胞の酵素（ＲＮＡｉの場合におけるＲＩＳＣ複合体、およびＥＧＳの場合におけるＲＮＡｓｅ  Ｐ）による分解のためにｍＲＮＡ標的を指向する小さいＲＮＡ分子の例である。これら内因性の酵素複合体の存在は、ｍＲＮＡの翻訳への立体的干渉または相対的に低い効力のＲＮＡｓｅ  Ｈに対するｍＲＮＡの標的化に依存する慣習的なアンチセンス療法と比較して、ｍＲＮＡ分解の効力を増加させる（Ｈｅａｓｍａｎ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２４３（２）：２０９−２１４（２００２））。これらの研究は、重要な指標である。なぜなら、これらは、核酸ベースのエピジェネティックな療法が有効であり得、そして安全で有り得ることを、重要な呼吸器疾患の動物モデルにおいて立証するからである。
【００３１】
ＥＧＳによるＲＮＡｓｅ  Ｐ標的化は、ＲＮＡｓｅ  Ｐ（複製する全ての細胞に必要とされる酵素は、特定の炎症性刺激（例えば、細胞中のウイルス感染）によってのみ誘導されるＲＩＳＣより豊富である）に起因して、ＲＮＡｉによるＲＩＳＣ標的化を上回る利点を有する（Ｐｌａｓｔｅｒｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１２６３−１２６５  （２００２））。いくつかの状況において細胞の炎症を刺激し得る二重鎖ＲＮＡまたは同様のＲＮＡｉとは異なり、ＥＧＳは、ＥＧＳの塩基対形成されないＴ−ループに起因して、細胞中への進入の際に一本鎖であり、そして標的ｍＲＮＡに結合したときでさえも最初の一本鎖のままである。ＲＮＡｉもまた、予測不能な、標的化以外の効果（例えば、ＲＩＳＣ複合体の抗ウイルス機能に関連した遺伝子サイレンシングまたは炎症反応）を有するようである。インフルエンザを含むいくつかのウイルスは、ＲＮＡｉを特異的に不活化するタンパク質をコードする。細胞に対するＲＮＡｉの炎症効果および非特異的効果が、いくつかの用途（例えば、汎発性インフルエンザの療法のため）における最終的な使用を妨げない場合、ＲＮＡｉの効果が細胞質中で生じつつ、ＥＧＳの効果が細胞核中で生じることに起因して、複数の遺伝子の標的化または増加したｍＲＮＡの排除を可能にするＲＮＡｉとＥＧＳとの間の相乗効果に対する可能性が存在する。
【００３２】
（Ｉ．外部ガイド配列）
ＥＧＳは、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の分子構造に類似する分子構造を形成するために、標的ｍＲＮＡと水素結合する機構によって塩基対形成するように設計される。その後、ＥＧＳ／ｍＲＮＡ標的は、ＲＮＡｓｅ  Ｐによって切断され、かつ不活化される。ＥＧＳは、この反応において消費されない代わりに、複数の周期の標的ｍＲＮＡの切断を通して触媒として再循環し、慣習的なアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドより効率的な標的の不活化を生じ得る。ＥＧＳは、遺伝子の標的化のための慣習的なアンチセンスＤＮＡの特異性とＲＮＡｓｅ  Ｐの触媒的効力とを兼ね備える。ＲＮＡｓｅ  Ｐが、前駆体転写物の切断によってトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をプロセッシングするために機能する場合、ＲＮＡｓｅ  Ｐは、全ての生きた真核細胞中に大量に存在する。
【００３３】
内因性ＲＮＡｓｅ  Ｐ（前駆体転写物由来の成熟トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を生成する広範に存在する細胞の酵素）による分解のために真核生物のｍＲＮＡを標的化する小さいＲＮＡ配列が、記載された（Ｇｏｐａｌａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：６７５９−６７６２（２００２）；Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−ＴａｋａｄａおよびＡｌｔｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３：４４２−４５６（２０００）；ならびにＰｌｅｈｎ−Ｄｕｊｏｗｉｃｈ  ａｎｄ  Ａｌｔｍａｎ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：７３２７−７３３２（１９９８））。外部ガイド配列（ＥＧＳ）と称される小さいＲＮＡが設計され得、この小さいＲＮＡは、ｔＲＮＡ分子が細胞のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）内に含まれる別のＲＮＡ配列との二分子複合体を形成する場合のｔＲＮＡ分子の特定の構造的特徴を模倣する（図１を参照のこと）。したがって、任意のｍＲＮＡは、原則として、ＥＧＳおよび共触媒として関与するＲＮＡｓｅ  Ｐの両方によって、ＲＮＡｓｅ  Ｐの基質として認識され得るが、結合工程および分解工程の複雑性に起因して、この反応の動態は、インビトロまたはインビボで予想するのが困難である（Ｇｏｐａｌａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：６７５９−６７６２（２００２）ならびにＧｕｅｒｒｉｅｒ−ＴａｋａｄａおよびＡｌｔｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３：４４２−４５６（２０００））。
【００３４】
ＥＧＳの設計は、ＲＮＡｓｅ  Ｐによって切断されるｍＲＮＡの一次配列ならびにこのｍＲＮＡ中のｍＲＮＡ配列の二次構造に関する両方の知識を要求する。ＥＧＳの配列は、標的化されるｍＲＮＡの一次配列と相補的である必要があり、そしてこのｍＲＮＡ中の配列は、ＥＧＳと結合するためにこのｍＲＮＡの二次構造内の一本鎖コンホメーションに曝される必要がある。標的ｍＲＮＡの二次構造は、コンピューターモデリングによって概算されても、ヌクレアーゼまたは当該分野において周知である他のＲＮＡ切断試薬を使用して実験的に決定されてもよい。この分析は、慣習的なＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび触媒ＲＮＡが挙げられる相補的オリゴヌクレオチドによる標的化に対して、ｍＲＮＡの領域を位置決めするのに有用であり得る。
【００３５】
ＲＮＡａｓｅ  Ｐは、２つの成分（ＲＮＡ成分およびタンパク質成分）を有するリボヌクレオタンパク質である。ＲＮＡａｓｅ  ＰのＲＮＡ成分は、全てのトランスファーＲＮＡの成熟５’末端を形成する触媒的分解を担う。ＲＮＡａｓｅ  Ｐは、試験された全ての生きた細胞について内因性である。ＲＮＡａｓｅ  Ｐによる基質の認識に対する研究の間、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮＡａｓｅ  Ｐが、正常なｔＲＮＡ構造の特定のドメイン（具体的に、ｔｈｅ  Ｄ、ＴψＣおよびアンチコドンのステムおよびループ）を欠く合成ｔＲＮＡ関連基質を切断し得ることが、見出された。細菌性ＲＮＡｓｅ  Ｐに関して、半回転のＲＮＡへリックスおよび３’近傍のＣＣＡ配列は、この反応を進行させるために十分な認識エレメントを含む。これら原理を使用して、任意のＲＮＡ配列は、切断されるＲＮＡ中の切断部位の３’のヌクレオチドと相補的であり、かつＮＣＣＡ（Ｎは任意のヌクレオチド）と相補的であるヌクレオチドを有する外部ガイド配列を使用することによって細菌性ＲＮＡａｓｅ  Ｐの基質へと変換され得る。
【００３６】
ＲＮＡのＲＮＡａｓｅ  Ｐ媒介性切断を促すためのＥＧＳはまた、Ｙｕａｎらの米国特許第５，６２４，８２４号、Ｔａｋｌｅらの同第６，６１０，４７８号、Ｙａｌｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＷＯ  ９３／２２４３４、Ｙａｌｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＷＯ  ９５／２４４８９、およびＩｎｎｏｖｉｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩｎｃのＷＯ  ９６／２１７３１に記載されるような真核生物系において使用するために開発された。本明細書中で使用される場合、「外部ガイド配列」および「ＥＧＳ」とは、標的ＲＮＡと組み合わせてＲＮＡａｓｅ  Ｐの基質を形成する任意のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログをいう。
【００３７】
ＲＮＡａｓｅ  Ｐによる切断を促すための外部ガイド配列は、標的ＲＮＡと相補的であり、かつｔＲＮＡ分子の部分に類似する二次構造および三次構造を形成する配列を含む（図１Ａを参照のこと）。真核生物（哺乳動物が挙げられる）において、ｔＲＮＡは、７３塩基対〜１５０塩基対の長さである遺伝子のファミリーによってコードされる。ｔＲＮＡは、クローバー葉構造として公知である４つの塩基対形成されたステムを有する二次構造をとる。このｔＲＮＡは、ステム、Ｄループ、可変ループ（Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐ）、ＴψＣループ、およびアンチコドンループを含む。一形態において、ＥＧＳは、意図された切断部位の３’の標的配列と塩基対形成して、ステムのような構造を形成する少なくとも７個のヌクレオチド、塩基対形成して、ＴψＣループ、可変ループおよびアンチコドンループに類似するステムおよびループ構造を形成するヌクレオチド、このヌクレオチドに続く、標的配列と塩基対形成して、Ｄループのような構造を形成する少なくとも３個のヌクレオチドを含む。
【００３８】
真核生物性ＲＮＡａｓｅ  Ｐのための好ましいガイド配列は、標的ＲＮＡ分子との複合体である場合、ｔＲＮＡのクローバー葉またはその部分の二次構造と似ている二次構造を形成する配列からなる。所望の二次構造は、ｔＲＮＡに似ている構造を形成するために慣習的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成スキームを使用して決定される。ＲＮＡｓｅ  Ｐは、配列ではなく構造を認識するので、水素結合領域の特定の配列は、形成されるべき所望の構造より重要でない。ＥＧＳおよびこの標的ＲＮＡ基質は、ＲＮＡａｓｅ  Ｐによる標的ＲＮＡの切断を生じるのに十分なｔＲＮＡの二次構造および三次構造の部分と似ているべきである。ＥＧＳの配列は、任意のｔＲＮＡに由来し得る。Ｔｈｅ多数のｔＲＮＡの配列および構造は、当業者に公知であり、そして少なくともｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｔＲＮＡｄｂ／に見出され得る。ＲＮＡｓｅ  ＰによるｔＲＮＡ分子の認識のためのコンセンサス配列は、ＧＮＮＮＮＮＵである。ｔＲＮＡのステムから得られる配列は、同定された標的ＲＮＡ配列と相補的であるように変更される。標的ＲＮＡは、コンセンサス配列のために当業者に周知である方法によってマッピングされる。このような技術としては、Ｔ１ヌクレアーゼによる標的ｍＲＮＡの消化が挙げられる。Ｔ１ヌクレアーゼによる消化は、溶液中に曝され、そして一本鎖であるグアニン（Ｇ）残基の後でＲＮＡを切断するが、ＲＮＡの二次構造中に埋め込まれるか、または二本鎖領域へと塩基対形成されるＧ残基の後で切断しない。この反応生成物は、ゲル電気泳動によるサイズ分画後にラダーを形成する。Ｔ１感受性部位は、暗いバンドとして検出され、ＲＮＡｓｅ  Ｐコンセンサス配列を同定するために標的ｍＲＮＡ配列と比較される。この標的ｍＲＮＡから得た相補配列は、ＥＧＳのために使用される。この相補的配列は、わずか７個のヌクレオチドからなり得るが、好ましくは、標的配列と塩基対形成し、そして好ましくは標的配列中の２つの対を形成していないヌクレオチド（好ましくは、ＵＵ）によって分離される２つの区分中に１１個のヌクレオチドを含み、ここでこの２つの区分は、切断のために標的化された部位の３’の配列と相補的である。
【００３９】
ＲＮＡａｓｅ  Ｐの触媒ＲＮＡがＥＧＳ／標的ＲＮＡ複合体と相互作用するのに必要とされるガイド配列の残りの部分は、本明細書中でＲＮＡａｓｅ  Ｐ結合配列といわれる。上記アンチコドンループおよび上記可変ループは、検出され得、そして上記ＴψＣループの配列は、このガイド配列の有用性を減少することなく変えられ得る。標的ＲＮＡ分子と結合する外部ガイド配列の例は、図１Ｃに示される。外部ガイド配列はまた、インビトロ進化技術（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を使用して得られ得る（Ｙｕａｎらの米国特許第５，６２４，８２４号およびＹａｌｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＷＯ  ９５／２４４８９を参照のこと）。
【００４０】
適切なＥＧＳとしては、インターロイキン−４レセプターα鎖を標的化するＥＧＳ、ｓｔａｔ−６転写因子（ＳＴＡＴ６）、アデノシン１レセプター（Ａ１）、および免疫グロブリンおよびＴ細胞レパートリーの産生および改変に全面的に必要とされるＲＡＧ−１リコンビナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ＩＬ−４レセプターα鎖遺伝子は、ブタ、ウマ、ヒツジ、マウス、およびヒトにおいてクローニングされた（Ｚａｒｌｅｎｇａら、Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１０１（３−４）：２２３−３４（２００４）、Ｓｏｌｂｅｒｇら、Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．９７（３−４）：１８７−１９４（２００４）、Ｈｉｌｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９３（１）：４９７−５０１（１９９６）、Ｍｏｓｌｅｙら、Ｃｅｌｌ  ５９（２）：３３５−３４８（１９８９）、およびＧａｌｉｚｚｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（７）：６６９−６７５（１９９０））。ＳＴＡＴ  ６遺伝子は、マウスおよびヒトにおいてクローニングされた（Ｑｕｅｌｌｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５（６）：３３３６−３３４３（１９９５）、Ａｒａｖａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８（３）：５５２−５５６（１９９９））。Ｒａｇ−１遺伝子は、マス、サンショウウオ、マウス、およびヒトにおいてクローニングされた（Ｚａａｒｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９（９）：４３８２−４３９４（１９９７）、ＨａｎｓｅｎおよびＫａａｔｔａｒｉ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４２（３）：１８８−１９５（１９９５）、Ｆｒｉｐｐｉａｔら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５２（３−４）：２６４−２７５（２００１）ならびにＳｃｈａｔｚら、Ｃｅｌｌ  ５９（６）：１０３５−１０４８（１９８９））。アデノシンレセプター遺伝子は、ヒト、イヌ、ヒツジ、ウサギ、マウス、およびモルモットを含む多くの種においてクローニングされた（ＲａｌｅｖｉｃおよびＢｕｒｎｓｔｏｃｋ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５０（３）：４１３−４９２（１９９８）に概説される）。好ましい実施形態において、ＥＧＳは、ＩＬ−４レセプターα鎖を標的化する。標的遺伝子の各々に関して、特定の標的化された配列の選択は、それぞれのｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンの近傍におけるこれら配列の位置およびＲＮＡｓｅ  Ｐによる切断に必要とされるＲＮＡｓｅ  ＰコンセンサスＧＮＮＮＮＮＵに対するマッチによって示唆された。これらの標的は全て、ヒトの喘息、他の肺疾患、および他の炎症性疾患に関与すると仮定され、そしてＥＧＳの吸入によって不活化され得る。
【００４１】
上記配列は、以下の通りである：
ＩＬレセプターα  ｍＲＮＡのＡＵＧに隣接する標的化配列
【００４２】
【化１】
2007535579.tif 000002
ＳＴＡＴ６  ｍＲＮＡのＡＵＧに隣接する標的化配列
【００４３】
【化２】
2007535579.tif 000003
。
【００４４】
合成オリゴヌクレオチド配列は、以下の通りであった：
【００４５】
【化３】
2007535579.tif 000004
アデノシンレセプターｍＲＮＡのＡＵＧに隣接する標的化配列
【００４６】
【化４】
2007535579.tif 000005
ＲＡＧ１  ｍＲＮＡのＡＵＧに隣接する標的化配列
【００４７】
【化５】
2007535579.tif 000006
。
【００４８】
適切なＥＧＳとしてはまた、表１および表２において列挙される標的配列から生成されるＥＧＳが挙げられるが、これらに限定されない。表１は、喘息サイトカイン、サイトカインレセプター、および関連遺伝子についての標的配列を列挙する。表２は、インフルエンザウイルスの遺伝子についての標的配列を列挙する。標的配列は、コンセンサスＧＮＮＮＮＮＵヌクレアーゼＳ１マッピングに対する一致によって同定されてインビボで確認された（ＩＬ４Ｒ  Ｅ、Ｇｌｕ  Ｅ）か、または標的ｍＲＮＡの開始コドンの近傍にあることおよびコンセンサスＧＮＮＮＮＮＵに対する一致によって同定された（他の標的配列）のいずれかであった。
【００４９】
喘息サイトカイン遺伝子ＩＬ−４、ＩＬ−１３共通レセプターα、およびＩＬ１３サイトカインおよび関連転写因子ＳＴＡＴ６は、コンセンサスに対する一致および既存の文献の検討（Ｄｒｅｙｆｕｓら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．４（８）：１０１５〜２７（２００４）；Ｂｏｒｉｓｈら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７（６）：９６３〜７０（２００１）；ＣｈｕおよびＰａｕｌ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：４８７〜５０２（１９９８）；Ｄｅｎｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１３８２３〜１３８２８（１９９８）；Ｇｒｕｎｉｇ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２（３）：３２９〜３１（２００３）；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２２５８〜２２６１（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：７２７６〜７２８１（２００１）；ならびにＺｈｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８（６）：２９５３〜６２（２００２））に基づいて、ＥＧＳ治療の候補として同定された。アデノシンはまた、複数のレセプター（特に、ＡＤＥ１レセプター）を介して作用して、ＥＧＳにより潜在的に標的化され得るポジティブフィードバックループにおいて、ＩＬ４およびＩＬ１３の転写を増加させる（Ｇｒｕｎｉｇ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２（３）：３２９〜３１（２００３）；Ｂｌｃｋｂｕｒｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２（３）：３３２〜３４４（２００３）；およびＲｙｚｈｏｖら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２（１２）：７７２６〜７７３３（２００４））。文献および遺伝子配列の検討によってまた、喘息およびアレルギーの病因においてＩＬ４およびＩＬ１３と一緒になって作用する他のＥＧＳ遺伝子標的が示された。そのＥＧＳ遺伝子標的としては、ＩＬ４／１３と協働してＩｇＥ合成の活性のために必要なｃｄ４０およびｃｄ４０リガンド（ＷａｒｒｅｎおよびＢｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：５６３７〜５６４６（１９９５）、ならびにＺｈｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３（１２）：７１４１〜７１４９（２００４））、ｃｄ３補体レセプター（ＫａｒｐおよびＷｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．３：１０９〜１１９（２００１）；Ｐａｒｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６９（６）：７２６〜７３２（２００４）；ならびにＴａｕｂｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６８（１１）：１３３３〜１３４１（２００３））、ならびにＮＦ−κＢ転写因子ｐ５０およびｐ６５（Ｄｅｓｍｅｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３（９）：５７６６〜５７７５（２００４）、Ｐｏｙｎｔｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３（１１）：７００３〜７００９（２００４）；およびＺｈｏｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２（１３）：２０５４〜２０６４（２００３））が挙げられる。
【００５０】
喘息の病因は、上記のようなＩＬ４およびＩＬ１３および関連分子によって媒介される急性炎症、ならびにさらなるサイトカイン（ＩＬ−１０、上皮増殖因子、およびＳＭＡＤ転写因子ファミリーを活性化するＴＧＦ−Ｂが挙げられる）によって媒介される持続的組織変化すなわち「リモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）」の両方を含む（Ｃｈｏｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：７８９〜８１５（２００４）；Ｅｌｉａｓ，Ｃｈｅｓｔ  １２６（２Ｓｕｐｐｌ．）：１１１Ｓ〜１１６Ｓ（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００（３）：３７７〜８９（２００４）；およびＬｅｅら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０（１０）：１０９５〜１０３（２００４））。従って、持続的炎症から生じるリモデリングは、これらの「リモデリング」シグナルおよび「リモデリング」レセプターに対する、ＥＧＳ標的であると予測される。喘息および他の炎症性肺疾患における肺炎症の新規な機構は、炎症経路を開始するためにＴ細胞応答およびＢ細胞応答の両方を必要とするＲＡＧ遺伝子（Ａｒｏｎｃａら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１４（６）：１４４１〜１４４８（２００４））の転写を介する、Ｔ細胞レセプター遺伝子編集（ｅｄｉｔｉｎｇ）の活性化であり得る。従って、ＲＡＧ遺伝子は、喘息および他の炎症性肺疾患における肺炎症を処置するためのＥＧＳ標的であると予測される。
【００５１】
（表１．喘息に関与するサイトカイン、サイトカインレセプター（Ｒ）、および転写因子（ＴＦ）についての、標的配列）
【００５２】
【表１−１】
2007535579.tif 000007
【００５３】
【表１−２】
2007535579.tif 000008
いくつかの標的配列についてのＡＵＧ配列が、太字で示され、ＧＮＮＮＮＮＵと一致する配列に、下線を付している。
【００５４】
Ａｌｔｍａｎおよび共同研究者らは、ＥＧＳは、１つまたは２つの保存された遺伝子に対して指向された場合にインフルエンザウイルス複製を不活化し得ることを、示した（Ｐｌｅｈｎ−ＤｕｊｏｗｉｃｈおよびＡｌｔｍａｎ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：７３２７〜７３３２（１９９８））。この研究は、小さいヌクレアーゼ耐性ＥＧＳ１に基づく呼吸疾患（例えば、喘息およびインフルエンザ）の治療を提唱しなかった。インフルエンザ治療のための吸入される小さいヌクレアーゼ耐性ＥＧＳは、その小さいヌクレアーゼ耐性ＥＧＳは肺組織によって選択的に取り込まれるという知見に起因して、レトロウイルスベクターからのＥＧＳの発現よりも有利である。インフルエンザウイルス複製を不活化するＥＧＳは、ＡＵＧ開始コドンの近傍にあるコンセンサスＧＮＮＮＮＮＵと一致する保存遺伝子を同定すること、およびＥＧＳ標的が、１９９８年および現在の両方で広まっているインフルエンザＨ１Ｎ１株と、現在広まっている非常に病原性のトリインフルエンザＨ５Ｎ１株由来の関連遺伝子との間で保存されているのを確認することによって、同定される。
【００５５】
（表２．インフルエンザウイルス遺伝子についての標的配列）
【００５６】
【表２】
2007535579.tif 000009
いくつかの標的配列についてのＡＵＧ配列は、太字で示されており、ＧＮＮＮＮＮＵと一致する配列に、下線を付している。Ｈ５Ｎ１ヒト（１９９８）とＨ５Ｎ１トリ（２００４）との間の差異が、斜体で示されている。
【００５７】
ヌクレアーゼ耐性ＥＧＳを作製するために、ＥＧＳのヌクレアーゼ耐性を、ＥＧＳがＲＮＡ標的の切断を誘導または触媒する生物学的機能を損なうことなく大きく増強する化学的改変が、なされる。例えば、ＥＧＳの塩基のうちの１つ以上は、当業者にとって周知の利用可能な核酸合成方法を使用して、２’メトキシリボヌクレオチドまたはホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドによって置換され得る。合成方法は、例えば、ＲｏｓｅｎｂｅｒｇらによるＰＣＴ  ＷＯ９３／０１２８６（スルフルチオエートオリゴヌクレオチドの合成）；Ａｇｒａｗａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７０７９〜７０８３（１９８８）；Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７４４８〜７７９４（１９８９）；Ｓｈａｗら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：７４７〜７５０（１９９１）（３’末端ホスホロアミデート改変を含む３’エキソヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの合成）によって、記載される。
【００５８】
オリゴヌクレオチドアナログの分解は、主に、３’−エキソヌクレアーゼが原因であり得る。当該分野で公知である種々の３’改変は、これらのアナログのヌクレアーゼ感受性を大いに減少させ得る（例えば、ＥＧＳ分子の３’末端ヒドロキシル基への遊離アミンの導入）。上記配列中のシトシンが、メチル化され得るか、またはインターカレート剤（例えば、アクリジン誘導体）が、５’末端リン酸に共有結合され得て、細胞内ヌクレアーゼに対する核酸分子の感受性を減少させ得る。
【００５９】
化学的改変としてはまた、ヌクレオチドのリボース部分の２’ＯＨ基（これは、種々野細胞内ヌクレアーゼおよび細胞外ヌクレアーゼの活性にとって重要であることが示されている）の改変が挙げられる。代表的な２’改変としては、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの合成（Ｐａｏｌｅｌｌａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：１９１３〜１９１９（１９９２）によって記載される）、および２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドおよび２’−アミノ−オリゴヌクレオチドの合成（Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４〜３１７（１９９１）ならびにＨｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈおよびＥｃｋｓｔａｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９０４〜１９０９（１９９２）によって記載される）が挙げられるが、これらに限定はされない。ＥＧＳ分子の部分はまた、デオキシリボヌクレオチドを含み得、これは、上記の重要な２'ＯＨ基を排除することによってヌクレアーゼ耐性を改善する。上記のようなヌクレアーゼ耐性ＥＧＳはまた、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）などの供給業者から得られ得る。
【００６０】
（ＩＩ．処方物）
小さいヌクレアーゼ耐性ＥＧＳは、１μＭのＥＧＳおよび１０μＭの脂質トランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎまたはＬｉｐｏｆｅｃｔａｓｅ）という濃度にて、脂質を保有するＴ２３膀胱癌組織培養細胞中に容易に取り込まれることが、示されている（Ｍａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．８：４１５〜４２６（１９９８））。これらのＥＧＳの取込みは、共焦点顕微鏡によって検出される５’−フルオレセイン化ＥＧＳを使用して、ほぼすべての細胞の細胞質および核の両方において観察された。標的化遺伝子発現の有意な減少が、観察される毒性がない状態でこの方法において示された。これらの研究は、改変型ＥＧＳはヒト疾患の標的化遺伝子治療のために使用され得ることを示した。上記処方物は、肺細胞外液（約１０ｃｃ〜約１５ｃｃ）中で最終ＥＧＳ濃度１μＭ以下に到達して、鼻内投与後の数日間〜数週間の間に標的化ｍＲＮＡレベルを減少するために有効な量のＥＧＳを含む。例えば、この範囲のＥＧＳ濃度は、０．０１μｍｏｌｅの鼻内滴注によって達成され得る。従来の喘息薬物と同様に、ＥＧＳは、郵送によって輸送され得、室温にて保存され得ることが認識されるが、従来の治療とは異なり、標的タンパク質合成の際の長期効果に起因して単回投与が数時間〜数週間までもの間治療効果を有することが予期される（Ｍａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（１）：５８〜６１（２０００）およびＭａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．８：４１５〜４２６（１９９８））。
【００６１】
Ｎｙｃｅらは、ＲＡＳＯＮＳ（呼吸可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（Ｒｅｓｐｉｒａｂｌｅ  Ａｎｔｉ−Ｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と呼ばれるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）が吸入された場合に、内因性界面活性剤（肺細胞により生成される脂質）に結合して、さらなるキャリア脂質を必要とすることなく肺細胞により取り込まれることを、示した（ＮｙｃｅおよびＭｅｔｚｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：７２１〜７２５（１９９７））。これらの知見は、肺に対して指向されたオリゴヌクレオチド治療が特に好ましく合理的であり、肺組織に対するこの治療の局所的影響または標的化された影響を介して、全身的な影響を伴うことなく肺における疾患を変化させ得ることを、示す。
【００６２】
治療目的のために、ＥＧＳ分子をコードするＤＮＡベクター（例えば、プラスミドＤＮＡベクターまたはレトロウイルスベクター）が、利用され得る。そのようなベクターを作製するための方法は、当業者にとって周知である（例えば、Ｙｕａｎらに対する米国特許第５，８６９，２４８号、Ｙｕａｎらに対する米国特許第５，７２８，５２１号、ＺｈａｎｇおよびＡｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：１０７７〜１０８３（２００４）；ならびにＰｌｅｈｎ−ＤｕｊｏｗｉｃｈおよびＡｌｔｍａｎ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：７３２７〜７３３２（１９９８）を参照のこと）。
【００６３】
上記ＥＧＳは、下記のように、薬学的に受容可能なキャリア中に処方され得る。上記ＥＧＳを含む処方物は、標的遺伝子の発現もしくは活性に関連する疾患、障害、またはその疾患の症状もしくは障害の症状を処置するために、有用である。より好ましくは、上記ＥＧＳを含む処方物は、ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３または上記のＥＧＳの他の標的の発現もしくは活性に関連する、疾患、障害、またはその疾患の症状もしくは障害の症状を処置するために有用である。複数のＥＧＳを含む処方物は、単一のＥＧＳを含む組成物と比較した場合に、改善された阻害効率を提供し得る。さらに、種々の標的に対して指向された複数のＥＧＳを含む処方物は、疾患またはその疾患を処置する場合に、改善さえた効力を提供し得る。上記の複数のＥＧＳは、同じ処方物中に含まれても、別個に処方されてもよい。個別に処方される場合、上記の別個ＥＧＳを含む処方物は、同じキャリアまたは異なるキャリアを含み得、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して投与され得る。さらに、個々のＥＧＳを含む処方物が、実質的に同時にか、連続的にか、またはその日もしくは処置期間全体を通して事前に設定した間隔で、投与され得る。
【００６４】
ＥＧＳは、適切な薬学的キャリア中にて、局所投与、局部投与、全身投与され得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９７５）は、代表的なキャリアおよび調製方法を開示する。ＥＧＳはまた、生分解性ポリマーから形成されるか、もしくは非生分解性ポリマーから形成されるか、またはタンパク質から形成されるか、または細胞に対して標的化するためのリポソームから形成される、適切な生体適合性マイクロカプセル、生体適合性微粒子、もしくは生体適合性ミクロスフェア中に封入され得る。そのような系は、当業者にとって周知であり、適切なＥＧＳとともに使用するために最適化され得る。
【００６５】
局所投与のための処方物としては、軟膏剤、ローション剤、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー剤、水剤、および散剤が挙げられ得る。従来の薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤、または油状基剤、増粘剤などが、必要であり得るか、または望ましいものであり得る。
【００６６】
上記処方物はまた、上記ＥＧＳが身体から急速に排泄されることを防ぐために封入され得る（例えば、徐放性処方物（移植物、および微小封入送達系が挙げられる））。生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が、使用され得る。そのような処方物の調製のための方法は、当業者にとって公知である。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む、感染細胞に対して標的化されたリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、当業者にとって公知の方法（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６３０９；および欧州特許公開ＥＰ  ００４３０７５に記載される）に従って使用され得る。
【００６７】
非経口投与のために処方物は、滅菌水溶液（これはまた、緩衝液、リポソーム、希釈剤、および他の適切な添加剤を含み得る）を含み得る。筋肉内使用、腹腔内使用、皮下使用、および静脈内使用のために、上記ＥＧＳを含む処方物は、一般的には、滅菌水溶液または水性懸濁物（適切なｐＨおよび等張性に対して緩衝化される）の状態で提供される。適切な水性ビヒクルとしては、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウムが挙げられる。好ましい実施形態において、そのキャリアは、水性緩衝液から排他的になる。この文脈において「排他的に（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ）」とは、標的遺伝子を発現する細胞におけるＥＧＳの取込みに影響を与え得るかまたはＥＧＳの取り込みを媒介し得る、何の補助剤も封入物質も存在しないことを意味する。そのような物質としては、例えば、上記のような、ミセル構造物（例えば、リポソームまたはキャプシド）が挙げられる。水性懸濁物は、懸濁剤（例えば、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ポロリドン、およびトラガカントゴム）および湿潤剤（例えば、レシチン）を含み得る。水性懸濁物のために適切な保存剤としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルおよびｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピルが挙げられる。
【００６８】
好ましい実施形態において、上記ＥＧＳは、肺送達のために処方される。気道は、大気と血流との間のガス交換に関与する構造である。肺は、そのガス交換が生じる肺胞で最終的に終端する、枝分かれ構造物である。肺胞の表面積は、呼吸系において最大であり、これは、薬物吸収が生じる場所である。肺胞は、線毛も粘液表層も有さない薄い上皮によって覆われており、界面活性剤であるリン脂質を分泌する（Ｊ．Ｓ．ＰａｔｔｏｎおよびＲ．Ｍ．Ｐｌａｔｚ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．８：１７９〜１９６（１９９２））。
【００６９】
気道は、上気道（中咽頭および咽頭を含む）を含み、その後に続く下気道（気管を含み、その後、気管支および細気管支に至る分岐が続く）を含む。上気道および下気道は、誘導気道と呼ばれる。その後、終末細気管支が、呼吸細気管支へと分割され、呼吸細気管支は、その後、最終的呼吸領域である肺胞すなわち肺深部に至る（Ｇｏｎｄａ，Ｉ．「Ａｒｓｏｓｏｌｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ」Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ６：２７３〜３１３（１９９０））。肺深部すなわち肺胞は、全身薬物送達のために吸入された治療エアロゾルの主要標的である。
【００７０】
低分子量薬物から構成される治療組成物の肺投与が、例えば、喘息を処置するためのβ−アンドロゲン作用性アンタゴニストについて観察されている。肺において活性な他の治療剤が、肺吸収を介して全身に投与されて標的化されている。鼻送達は、以下の理由によって、治療剤の投与のための有望な技術であると考えられる：鼻は、多数の微小絨毛によって上皮表面が覆われていることに起因して薬物吸収のために利用可能な大きな表面積を有する；上皮下層が非常に血管化されている；鼻からの静脈血が直接全身循環へと通り、従って肝臓における初回通過代謝による薬物損失を回避する；鼻送達は、比較的低い用量、比較的迅速な治療血液レベルの達成、比較的迅速な薬理学的活性の開始、比較的少ない副作用、高い１ｃｍ３当たりの総血流、多孔性内皮基底膜を提供する；鼻送達は、容易に利用可能である。従って、複合分子（例えば、ＥＧＳ）の鼻内送達は、多数の肺疾患の処置のための治療を提供し得る。
【００７１】
用語「エアロゾル」とは、本明細書中で使用される場合、噴霧剤を使用して調製されようとそうではなかろうと、微細粒子ミストの任意の調製物（これは、溶液中または懸濁物中に存在し得る）を指す。エアロゾルは、標準的技術（例えば、超音波処理または高圧処理）を使用して生成され得る。
【００７２】
肺処方物のためのキャリアは、乾燥粉末処方物用のキャリアと、溶液として投与するためのキャリアとに分類され得る。気道への治療剤送達のためのエアロゾルが、開発されている。例えば、Ａｄｊｅｉ，Ａ．およびＧａｒｒｅｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．７：５６５〜５６９（１９９０）；ならびにＺａｎｅｎ，Ｐ．およびＬａｍｍ，Ｊ．Ｗ．，Ｊ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１４：１１１〜１１５（１９９５）を参照のこと。上気道を介する投与のために、上記処方物は、緩衝化されているかまたは緩衝化されていない溶液（例えば、水または等張性生理食塩水）へと処方され得るか、または滴剤もしくはスプレーとして鼻内投与するための懸濁物として処方され得る。好ましくは、そのような溶液または懸濁物は、鼻分泌物に対して等張性であり、ほぼ同じｐＨ（例えば、約４．０〜約７．４、またはｐＨ６．０〜ｐＨ７．０の範囲内にある）である。緩衝液は、生理的に適合性であるべきである。緩衝液は、単に例としては、リン酸緩衝液が挙げられる。例えば、代表的な鼻鬱血除去剤は、ほぼｐＨ６．２に緩衝化されるものとして記載されている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｒｔｈｕｒ  Ｏｓｏｌ，ｐａｇｅ  １４４５（１９８０））。当業者は、鼻投与および／または上気道投与のための無害な水溶液についての、適切な生理食塩水含有量およびｐＨを容易に決定し得る。
【００７３】
別の実施形態において、低毒性の有機（すなわち、非水性）クラス３残留溶媒である溶媒（例えば、エタノール、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、エチルエーテル、およびプロパノール）が、上記の処方物のために使用され得る。上記溶媒は、その溶媒が上記処方物を容易にエアロゾル化する能力に基づいて選択される。上記溶媒は、上記ＥＧＳとは有害に反応すべきではない。上記ＥＧＳを溶解するかまたは上記ＥＧＳの懸濁物を形成する、適切な溶媒が使用されるべきである。懸濁物はまた、本明細書中では分散物とも呼ばれる。上記溶媒はさらに、上記溶液または懸濁物のエアロゾルの処方を可能にするために十分に揮発性であるべきである。さらなる溶媒またはエアロゾル化剤（例えば、フレオン）が、上記溶液または懸濁物の揮発性を増加することが望ましい場合には添加され得る。
【００７４】
乾燥脂質粉末は、その疎水性特徴が原因で、エタノール中に直接分散され得る。有機溶媒（例えば、クロロホルム）中に保存された脂質について、望ましい量の溶液が、バイアル中に配置され、そのクロロホルムは、窒素流下で蒸発させられて、ガラスバイアル表面に乾燥した薄膜が形成される。この薄膜は、エタノールで再構成された場合に容易に膨張する。上記有機溶媒中に上記脂質分子を完全に分散させるために、その懸濁物は、超音波処理される。脂質の非水性懸濁物がまた、再利用可能なＰＡＲＩ  ＬＣ  Ｊｅｔ＋ネブライザ（ＰＡＲＩ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｍｏｎｔｅｒｅｙ，ＣＡ）を使用して、無水エタノール中にて調製され得る。
【００７５】
薬物の肺送達のための多数の薬学的調製物が、開発されている。例えば、Ｅｖａｎｓらに対する米国特許第５，２３０，８８４号は、タンパク質およびペプチドの肺送達のための逆ミセルの使用を開示する。逆ミセルは、少量の水を非極性溶媒（例えば、ヘキサン）に添加して微小滴を形成することによって、形成される。この媒体において、界面活性剤（洗剤）は、その極性ヘッドが内側を向いてその極性ヘッドが水と接触するようにし、そして疎水性テールが外側を向く状態で、それ自体を方向付ける。水の極めて小さな液滴が、界面活性剤によって取り囲まれ、送達されるべきタンパク質が、その水相中に溶解される。
【００７６】
Ｊｏｈｎｓｏｎらに対する米国特許第５，６５４，００７号は、医薬粉末（例えば、タンパク質、核酸、ペプチドなど）を含む塊組成物を作製するための方法を開示し、この方法において、非水性溶媒結合液体（フルオロカーボン）が、微細粒子に結合して凝集した単位にするために使用される。上記の塊組成物は、５０ミクロン〜６００ミクロンの範囲の平均サイズを有し、これは、吸入による肺薬物送達において有用であるとされている。
【００７７】
これらの物質は、肺への処方物送達のために使用され得、これは、必要な場合には、正確な投与量の表面改質剤を望ましい速度で肺内部の好ましい位置へ送達するために改変される。
【００７８】
大きな粒径を有する乾燥粉末処方物（「ＤＰＦ」）は、改善された流動性特徴（例えば、比較的少ない凝集（Ｖｉｓｓｅｒ，Ｊ．，Ｐｏｗｄｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５８：１〜１０（１９８９））、比較的容易なエアロゾル化、および潜在的に比較的少ないファゴサイトーシス（Ｒｕｄｔ，Ｓ．およびＲ．Ｈ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２２：２６３〜２７２（１９９２）；Ｔａｂａｔａ，Ｙ．およびＹ．Ｉｋａｄａ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：８３７〜８５８（１９８８））を有する。吸入治療のための乾燥粉末エアロゾルは、主に５ミクロン未満の範囲内にある平均直径を備えて一般的に生成される（Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３：１０１〜１０５（１９９２）；およびＧｏｎｄａ，Ｉ．「Ｐｈｙｓｉｃｏ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １９９１，Ｇｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｄ．Ｊ．およびＫ．Ｋ．Ｍｉｄｈａ編，Ｍｅｄｐｈａｒｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ｐｐ．９５〜１１５，１９９２）が、好ましい範囲は、空力学的直径が１ミクロン〜１０ミクロンである。大きな「キャリア」粒子（薬物を含まない）は、数ある潜在的利益の中でも、効率的なエアロゾル化を達成するのを助けるために、治療エアロゾルとともに同時送達されている。Ｆｒｅｎｃｈ，Ｄ．Ｌ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｄ．Ａ．およびＮｉｖｅｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｊ．Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｓｃｉ．２７：７６９〜７８３（１９９６）。
【００７９】
ポリマー粒子は、シングルエマルジョン溶媒蒸発およびダブルエマルジョン溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出、溶媒蒸発、相分離、単純コアセルベーションおよび複合コアセルベーション、界面重合、および当業者にとって周知である他の方法を使用して、調製され得る。粒子は、当該分野で公知のミクロスフェアまたはマイクロカプセルを作製するための方法を使用して、作製され得る。好ましい製造方法は、噴霧乾燥および凍結乾燥により、これらの方法は、界面活性剤を含む溶液を使用すること、望ましい大きさの液滴を形成するように噴霧すること、およびその溶媒を除去することを包含する。
【００８０】
上記粒子は、気道の選択された領域（例えば、肺深部または上気道）への局所送達のために、適切な材料、表面の粗さ、直径、およびタップ密度にて製造され得る。例えば、比較的高い密度または大きな粒子が、上気道送達のために使用され得る。同様に、同じＥＧＳまたは異なるＥＧＳを備える、種々のサイズの粒子の混合物が、１回投与において肺の種々の領域を標的かするために投与され得る。
【００８１】
肺送達のための処方物としては、単層リン脂質リポソーム、リポソーム、またはリポソーム粒子が挙げられる。処方物および核酸を含むそのような処方物を作製するための方法は、当業者にとって周知である。リポソームは、種々の業者（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）が挙げられる）によって供給される、市販のリン脂質から形成される。そのリポソーム会合型ＥＧＳは、そのＥＧＳの溶液を、再構成された脂質商法と混合することによって調製される。一実施形態において、そのリポソームは、そのリポソームを標的細胞に対して指向させるために、その標的細胞の表面上のレセプターに対して特異的なリガンド分子を含み得る。
【００８２】
そのような処方物の毒性および治療効力は、細胞培養物または実験動物において、例えば、ＬＤ５０（その集団のうちの５０％に対して致死性である用量）およびＥＤ５０（その集団のうちの５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、これは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表され得る。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。
【００８３】
細胞培養アッセイから得られるデータおよび動物研究から得られるデータが、ヒトにおける使用のために一定の投与量範囲での処方において使用され得る。本発明の組成物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど有さないかまたは全く有さないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。その投与量は、使用される投与形態および使用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用される任意のＥＧＳについて、その治療的に有効な用量は、まず、細胞培養アッセイから評価され得る。用量は、細胞培養において決定した場合にＩＣ５０（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物濃度）を含む、ＥＧＳの循環血漿濃度を達成するように、動物モデルにおいて処方され得る。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【００８４】
上記で考察したように、ＥＧＳを個別または多重に投与することに加えて、上記ＥＧＳは、疾患の処置において有効な他の公知の因子と組み合わせて投与され得る。いずれにしても、投与する石は、当該分野で公知の効力の標準的尺度を使用して観察される結果に基づいて、ＥＧＳ投与の量および時期を調節し得る。
【００８５】
（ＩＩＩ．投与方法）
上記処方物は、当該分野で公知の任意の手段（経口経路または非経口経路（静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経皮投与、および気道（エアロゾル）投与）が挙げられるが、これらに限定されない）によって投与され得る。好ましい実施形態において、上記処方物は、吸入または鼻適用を介して、肺へと投与される。上記処方物は、処置または予防が必要な患者に対して投与される。上記処方物は、動物またはヒトに対して投与され得る。ＥＧＳの濃度は、肺流体中で約１μＭであるように決定される。これは、以前の研究が、インビトロでの遺伝子標的化のために最適であると示す（Ｍａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（１）：５８〜６１（２０００）。
【００８６】
肺投与のために、処方物は、計量式吸入器（「ＭＤＩ」）、ネブライザ、エアロゾル化器、または乾燥粉末吸入器を使用して、投与され得る。適切なデバイスは、市販されており、文献中に記載されている。
【００８７】
吸入されるエアロゾルは、局所的肺障害（喘息および嚢胞性線維症）の処置のために使用されており（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４０：１３１７〜１３２４（１９８９））、ペプチドおよびタンパク質の全身送達のための能力も有する（ＰａｔｔｏｎおよびＰｌａｔｚ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ８：１７９〜１９６（１９９２））。吸入治療の効力を改善するために、治療エアロゾル吸入器の設計に対しては、かなりの注意が注がれた。Ｔｉｍｓｉｎａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１０１：１〜１３（１９９５）およびＴａｎｓｅｙ，Ｉ．Ｐ．，Ｓｐｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍａｒｋｅｔ  ４：２６〜２９（１９９４）。
【００８８】
上記処方物は、単独でか、または呼吸系に投与するために適切な任意の薬学的キャリア中にて、投与され得る。送達は、いくつかの方法のうちの１つによって達成される。例えば、患者は、ＥＧＳの乾燥粉末を、溶媒と混合し得、その後、その混合物を噴霧し得る。予め噴霧された溶液を使用して、投与される投与量を調節し、生じ得る懸濁損失を回避することが、より適切であり得る。噴霧の後、エアロゾルを加圧して計量式吸入器（ＭＤＩ）を介してそのエアロゾルを投与することが、可能であり得る。ネブライザは、溶液または懸濁物から微細なミストを生成し、このミストが、患者によって吸入される。Ｌｌｏｙｄらに対する米国特許第５，７０９，２０２号に記載されるデバイスが、使用され得る。ＭＤＩは、代表的には、計量弁を備える加圧キャニスターを備え、このキャニスターには、上記の溶液または懸濁物と、噴霧剤とが充填される。上記溶媒自体が、噴霧剤として機能し得るか、または上記処方物が、噴霧剤（例えば、フレオン）と合わされ得る。上記処方物は、圧力下での放出に起因して、キャニスターから放出された場合に微細なミストである。上記噴霧剤および溶媒は、圧力減少に起因して、全体的にかまたは部分的に蒸発し得る。
【００８９】
上記処方物は、局所処置が望ましいかまたは全身処置が望ましいか、および処置されるべき領域に依存して、他の方法で投与され得る。投与は、局所的であっても、経口的であっても、吸入によっても、または非経口的であってもよい。上記処方物は、標的遺伝子の発現を阻害するために十分な投与量で投与される。上記処方物は、一日一回投与され得るか、またはＥＧＳが、一日中適切な間隔にて、２部分用量、３部分用量、４部分用量、５部分用量、６部分用量、またはそれ以上の部分用量として投与され得る。その場合、各部分用量中に含まれるＥＧＳは、局所一日量を達成するために、対応して小さくなければならない。その投与量単位はまた、数日間にわたる送達のために、例えば、数日間にわたってＥＧＳの徐放を提供する従来の徐放処方物を使用して、配合され得る。徐放処方物は、当該分野で周知である。この実施形態において、その投与量単位は、対応する一日量を含む。
【００９０】
当業者は、特定の要因が、被験体を有効に処置するために必要な投与量および時期に影響を与え得ることを認識し、その要因としては、その疾患もしくは障害の重篤度、以前の処置、被験体の全身の健康および／もしくは年齢、ならびに存在する他の疾患が挙げられるが、これらに限定されない。治療的に有効な量の組成物による被験体の処置は、１会の処置または一連の処置を含み得る。個々のＥＧＳについての有効投与量およびインビボ半減期の推測は、従来の方法論を使用してか、または本明細書中の他の箇所に記載されるような、適切な動物モデルを使用するインビボ試験に基づいて、なされ得る。
【００９１】
種々のヒト疾患の研究のための種々のマウスモデルが、存在する。アルブミン感作プロトコルが、マウスに関して開発されており、このプロトコルにおいて、喘息様病理が、腹腔内注射とその後に噴霧されるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とによって、マウス肺において誘導される。ドキシサイクリンのレベルにより調節される肺特異的Ｃｌａｒａ細胞プロモーターを使用してＩＬ−４もしくはＩＬ−１３または他のサイトカインのいずれかを過剰発現するトランスジェニックマウスが、ＩＬ−４依存性疾患および／またはＩｌ−１３依存性疾患を刺激するために使用され得る。マウスの貯蔵所は、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｈａｒｌａｎ，Ｍｕｔａｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ（ＭＭＲＲＣ），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ、およびｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｕｔａｎｔ  Ａｒｃｈｉｖｅにおいて見出され得る。そのようなモデルは、ＥＧＳのインビボ試験のため、および治療的に有効な用量を決定するために、使用され得る。０μＭ（ネガティブコントロール）、０．５μＭ、１μＭ、および１０μＭおよび５０μＭの濃度が、ＥＧＳが細胞によって取り込まれてマウス肺において機能的であるか否かを、共焦点顕微鏡を使用して決定するために十分である。評価されるべき変数としては、毒性効果の存在もしくは不在、ＥＧＳ取込みの証拠がある細胞型、脂質キャリア（例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｓｅ）に対する依存性、ならびにマウスインターロイキン４レセプター鎖を認識するモノクローナル抗体による細胞の同時染色もしくはインサイチュｃＤＮＡハイブリダイゼーションを使用する機能的効果が挙げられる。マウスは、噴霧吸入され、そして１時間から２４時間までに及ぶ処置後の一定時点において（１２時間が初期時点とされる）分析のために屠殺される。ＥＧＳによる治療後のこれらの動物における病理および適切なコントロールによる治療後のこれらの動物における病理は、死亡後に、マウスの肺および他の組織の染色を介して決定される。
【００９２】
処置の効力は、標的遺伝子ｍＲＮＡの量を測定すること（例えば、リアルタイムＰＣＲを使用する）または標的遺伝子ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの量を測定すること（例えば、ウェスタンブロット分析）によって、モニターされ得る。処置の効力はまた、処置されるべき疾患症状に対してＥＧＳが有する効果に関する当業者にとって公知の方法によって、決定され得る。
【００９３】
ＥＧＳは、インフルエンザの予防および処置のために、ヒト宿主または動物宿主に対して直接投与され得る。例えば、ＥＧＳは、汎流行性株に対する受動耐性を提供するために宿主家禽に対して給餌され得る。なぜなら、インフルエンザは、家禽の気道においてではなく消化管において複製するからである。また、ＥＧＳは、ＥＧＳの吸入治療に加えて、喘息および他の呼吸疾患の治療のための抗ウイルス剤および免疫調節剤の両方として動物およびヒトの両方に対して給餌するために、植物において発現され得る。小児におけるアトピー性疾患（例えば、湿疹）についての鍵となるＴＨ２サイトカイン（ＩＬ４およびＩＬ１３）を標的とする局所治療もまた、いわゆるアトピー進行（ａｔｏｐｉｃ  ｍａｒｃｈ）、すなわち、湿疹からアレルギー性関節炎から喘息への進行を、予防または遅延させ得る。インフルエンザウイルスについて予期される新興汎発流行病、ならびに喘息および関連するアトピー性疾患の新興汎発流行病は、ヒト呼吸疾患に対して、改良された技術を適用する独特な機会を提供する。
【００９４】
ＥＧＳはまた、ヒトにおける喘息の予防および治療のためにヒト宿主または動物宿主に対して直接投与され得る。この治療としては、小児におけるアトピー性疾患（例えば、湿疹）についての、鍵となるＴＨ２サイトカイン（ＩＬ４およびＩＬ１３）を標的とする局所治療が挙げられる。この局所治療は、いわゆるアトピー進行（ａｔｏｐｉｃ  ｍａｒｃｈ）、すなわち、湿疹からアレルギー性関節炎から喘息への進行を、予防または遅延させ得る。ＥＧＳの全身投与ではなく局所投与が、サイトカインシグナル伝達における影響を最小限にすることによって、治療指数を最大にする。同様に、ＴＨ２サイトカインに対して指向されるＥＧＳによるアレルギー性関節炎の初期鼻内局所治療が、危険がある小児または成人における喘息の発症を予防もしくは遅延させるために使用され得る。食物アレルギーまたは消化管のＴＨ２サイトカイン媒介性炎症疾患の治療は、炎症性サイトカインおよび炎症性レセプターに対するＥＧＳの経口投与を介して、使用され得る。
【００９５】
ＥＧＳおよび適切なコントロールが、喘息様炎症の低減におけるＥＧＳの効力および薬物動態学のモデルとして、生きているマウスの鼻通路中に吸入され得る。ＥＧＳの濃度は、肺流体中で約１μＭであると経験的に決定される。この濃度は、以前の研究が、インビトロ遺伝子標的化のために最適であることを示している。肺炎症および喘息様病理が、ＩＬ４およびＩＬ１３の構成的過剰発現に起因する喘息の実験的誘導モデルにおいて誘導され得、これらのマウスが取得され得る（Ｅｌｉａｓ，Ｃｈｅｓｔ  １２６（２  Ｓｕｐｐｌ．１１１Ｓ〜１１１６（２００４））。選択されたＲＮＡｉが、匹敵する標的（例えば、共通のＩＬ４／ＩＬ１３レセプターおよびＳｔａｔ６ｙ転写因子）に対して設計され、ＲＮＡｉオフ標的化（ｏｆｆ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）が、ＥＧＳと比較して決定される。癌、狼瘡、および糖尿病の傾向がある状態のマウスモデル、ならびに変化した病理状態（例えば、妊娠および他の呼吸ウイルス感染（例えば、ＲＳＶ（ＲＳウイルス））による感染、および腸寄生生物感染）のマウスモデルもまた、変化した代謝、組織分布、オフ標的化（ｏｆｆ  ｔｒａｇｅｔｉｎｇ）、または共存症状態により示される他の病理を探索するために、使用され得る。
【００９６】
ＩＬ４共通鎖を標的とするＥＧＳと同様に、ＳＴＡＴ−６を標的とするＥＧＳが、ＳＴＳ−６開始部位に近いことに基づいて設計される。このＳＴＡＴ−６開始部位は、他の標的においてＥＧＳに対して接近可能であること、および表１において示されるようなＥＧＳコンセンサスＧＮＮＮＮＮＵに対する一致が証明されている。器官特異的ｃＤＮＡライブラリーおよびマウスから得られた精製細胞タンパク質が、非特異的遺伝子標的化効果、Ｔｏｌｌレセプターを介する炎症、またはｐ５３／ｐ２１を介する細胞アポトーシス経路の活性化の証拠について、分析され得る。この分析は、オフ標的化効果の分析のための遺伝子チップ、関連遺伝子の特異的ＰＣＲ、ノーザンブロッティングおよび全タンパク質のウエスタンブロッティング、ならびに／または核タンパク質抽出物のＥＭＳＡの組み合わせを使用して、鍵となる調節タンパク質および転写因子（例えば、ｐ２１およびＮＦ−κＢ）の変化した発現もしくは機能について探索する。
【００９７】
事実上すべてのトランスクリプトームの転写レベルにおいてオフ標的化（ｏｆｆ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）効果を試験する遺伝子チップ全ゲノムスクリーニング（２０，０００個よりも多い発現配列タグおよびコントロール）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）は、容易に利用可能である。１００〜１５０種の炎症性サイトカインおよび炎症レセプターについての特異的遺伝子チップ（ＯｌｉｇｏＧＥＡｒｒａｙ，Ｓｕｐｅｒａｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＡ）、ならびにＲＮＡｉにより変化されることが公知である約２５０種の細胞アポトーシス遺伝子および発生遺伝子についての特異的遺伝子チップ（ＤｕａｌＣｈｉｐ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）が、利用可能である。注文作製式ＤＮＡチップもまた、設計され得る。ＥＧＳは、ＲＮＡｉまたは従来のアンチセンスＤＮＡによる匹敵する遺伝子標的化よりも、特異的効果が少なく、かつ非特異的炎症効果が少ないことが、予測される。この予測の理由は、１）ＥＧＳは、匹敵するＲＮＡｉよりも有意に小さいこと（代表的なヌクレアーゼ耐性ＥＧＳについて３２改変ＲＮＡヌクレオチドであるのに対して、ＲＮＡｉについては２１〜２３ヌクレオチド二本鎖＝４２〜４６全ヌクレオチドである）；２）ＥＧＳは、ＲＮＡｉよりも有意に二本鎖ＲＮＡが少ないこと（二本鎖ＲＮＡは、ｔｏｌｌ−３先天性免疫レセプターを誘発可能である）；３）ＥＧＳは、ＤＮＡベースのアンチセンス中に存在するＤＮＡ  ＣｐＧモチーフを有さない（このモチーフは、ｔｏｌｌ−９先天性免疫レセプターを誘発可能である）；４）ＥＧＳは、ＲＮＡｓｅ  Ｐの活性化に基づくこと（ＲＮＡｓｅ  Ｐは、ＲＮＡｉにより活性化されるＲＩＳＣおよび二本鎖ＲＮＡにより活性化されるＲＮＡｓｅとは対照的に、宿主抗ウイルス喉頭を誘導も調節もしないハウスキーピング酵素である）である。ＲＩＳＣおよびＲＮＡｓｅ  Ｈは、両方とも、ウイルス性炎症シグナルおよび他の炎症シグナルによって調節される共通リコンビナーゼ経路のメンバーである。
【００９８】
保持されるＥＧＳの安定性および定量的組織分布は、ＥＧＳの５’末端に特異的なプライマーとＥＧＳの３’末端に特異的なプライマーとを用いるＰＣＲを使用し、そしてＥＧＳ配列を使用するノーザンブロッティングを使用して、組織から回収されたＥＧＳの配列分析によって評価される。宿主ゲノム中へのＥＧＳの組み込みの証拠は、存在する場合には、ＥＧＳに特異的な第一のプライマーと、宿主の反復配列に特異的な第二のプライマーとを用いるゲノムＤＮＡのＰＣＲを使用し、そしてパルスフィールド電気泳動により分離され標識ＥＧＳによりプローブされる全染色体のサザンブロッティングを使用して、検出される。
【００９９】
ヒト上皮細胞株およびヒトリンパ芽球様細胞株が、抗喘息ＥＧＳ、選択されたＲＮＡｉ、および他の適切なコントロール分子でトランスフェクトされる。多数の特徴付けられたヒトＩＬ４応答性細胞上皮細胞株およびヒトＩＬ１３応答性細胞上皮細胞株（ＩＬ４／ＩＬ１３および他の炎症性サイトカインに対して応答性である）が、両方とも、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）およびＤｒ．Ｅｌｉａｓから入手可能である。一方、ＩＬ４および他のリンホカインに対して応答性であるヒトＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ芽球様細胞株およびＲａｍｏｓ  Ｂリンパ芽球様細胞株が、Ｄｒ．Ｆｕｌｅｉｈａｎの実験室から入手可能である。これらの実験は、Ｄｒ．ＦｕｌｅｉｈａｎおよびそのスタッフまたはＤｒ．Ｄｒｅｙｆｕｓによって、Ｄｒ．ＤｒｅｙｆｕｓとＤｒ．Ｆｕｌｅｉｈａｎとの間での進行中の学術的共同作業の一部として、Ｄｒ．Ｆｕｌｅｉｈａｎの実験室においてまず行われる。さらなる組織的協約が、Ｋｅｒｅｎを代表してＤｒ．Ｄｒｅｙｆｕｓと、Ｄｒ．Ｆｕｌｅｉｈａｎと、Ｙａｌｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓと、Ｋｅｒｅｎのスタッフ（Ｄｒ．Ｓｍｉｃｕｎを含む）と共同研究してこの研究を行うために必要な助成金および契約についてのＹａｌｅ  Ｏｆｆｉｃｅとによって交渉される。
【０１００】
ヒト細胞が、ｃＤＮＡの取得するために処理され、オフ標的化（ｏｆｆ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）の証拠が、遺伝子チップおよび当業者に公知の他の技術、ならびにタンパク質レベルでのヒト炎症性サイトカイン産生についての高感度培養ベースアッセイ（Ｅｌｉｓｐｏｔ，Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、決定される。トランスフェクションは、脂質キャリア（核酸による細胞の実験的トランスフェクションのために設計されるキャリア、ならびに肺におけるＥＧＳの取込みを模倣するための合成ヒト肺界面活性剤（Ｅｘｏｆｕｒｆ）のために設計されたキャリアの両方を含む）を使用する。ＥＧＳおよびＲＮＡｉの安定性は、ＥＧＳ特異的プライマーおよびＲＮＡｉ特異的プライマーを使用する定量的ＰＣＲと、他の技術（例えば、ＥＧＳ特異的ＲＮＡのノーザンブロッティング）とによって、決定される。  
【０１０１】
従って、ＥＧＳの安定性およびオフ標的化（ｏｆｆ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）は、未刺激のヒト上皮細胞およびヒト造血細胞のモデル、ならびにＩＬ４およびＩＬ１３および他の炎症性サイトカインによって誘導される炎症状態の細胞において、概算され得る。細胞生存度に対するＥＧＳの効果、アポトーシスに対するＥＧＳの効果、およびＥＧＳの安定性は、ＰＣＲ、ウイルス遺伝子発現のノーザンブロッティング定量およびウエスタンブロッティング定量、ならびに非炎症性細胞状態および炎症性細胞状態の両方における他の感度の良い尺度によって、これらのヒト細胞株において確立される。
【０１０２】
マウス研究のたまえに、マウスは、マウス喘息モデルにおけるアレルギー感作剤に対して暴露され、ＩＬ４／ＩＬ１３および他の喘息関連シグナル伝達分子をブロックすることが喘息様状態の発症をブロックするために十分であるか否かが決定される。マウス肺における造血細胞および非造血細胞に対する喘息およびＩＬ４／ＩＬ１３の影響についてのマウスモデルが、開発されており（Ｋｅｌｌｙ−Ｗｅｌｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２（７）：４５４５〜４５５５（２００４）、このモデルは、喘息炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ４／ＩＬ１３）を標的とするＥＧＳを研究するために使用され得る。
【０１０３】
（ＩＶ．処置されるべき疾患）
処方物は、炎症性疾患またはそれに関連する疾患の処置または予防の必要な患者に有効量で投与され、その疾患または障害の一種以上の症状を阻害するか、または低減する。この処方物は、動物またはヒトに投与され得る。本明細書中で一般的に使用される場合、本発明のＥＧＳの「有効量」は、上記化合物または治療剤を受けていない対応する被験体と比較して、炎症性疾患または関連する疾患の一種以上の症状を処置し得る量、炎症性疾患または関連する疾患の一種以上の症状の進行を逆転し得る量、炎症性疾患または関連する疾患の一種以上の症状の進行を停止し得る量、または上記化合物もしくは治療剤が投与された被験体における炎症性疾患または関連する疾患の一種以上の症状の発生を予防し得る量である。薬物の実際の有効量は、使用される特定の薬物またはそれらの組合せ、処方される特定の組成物、投与の様式、および年齢、体重、患者の状態、および処置される症状または状態の重篤度に従って変動し得る。特定の患者に対する投薬量は、従来の考慮事項を用いて（例えば、適切な従来の薬理学的プロトコルによって）当業者によって決定され得る。医師は、例えば、最初に比較的少ない用量を処方し得、後に適切な応答が得られるまでその
用量を増加し得る。好ましい実施形態において、炎症性疾患は、喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、湿疹などのアトピー性皮膚疾患、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３依存性悪性疾患、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３依存性自己免疫疾患、アトピー性疾患ならびにウイルス（例えば、ＨＩＶ−１ウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス）のＩＬ−４依存性複製によって引き起こされる疾患である。
【０１０４】
例えば、喘息などのアトピー性疾患、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、アナフィラキシーおよび湿疹は、環境要因と遺伝的要因との間の複合的相互作用から生じる（Ｖｅｒｃｅｌｌｉら、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：２０−２４（２００１）ならびに、ＰａｔｉｎｏおよびＭａｒｔｉｎｅｚ、Ａｌｌｅｒｇｙ  ５６：２７９−２８６（２００１））。喘息および他のアトピー性疾患の危険性のある乳児は、例えば、インターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、ＴＨ２（Ｔヘルパー２）と示されるサイトカインなどのサイトカイン類の発現の増加、ならびに例えば、インターフェロンｇおよびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＴＨ１（Ｔヘルパー１）と示されるサイトカインなどのサイトカイン類の比較的少ない発現を反映して（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：６９−７５（２００１））、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の発現の増加および末梢性好酸球の数の増加を示す（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３２：１３３−１３８（１９９５））。
【０１０５】
現在の典型例は、アトピー性疾患が、新生児期または小児期の早くに刷り込まれたＴＨ２サイトカインの高い発現およびＴＨ１サイトカインの比較的低い発現を伴うサイトカインの発現の不均衡から生じることを提唱する（ＰａｔｉｎｏおよびＭａｒｔｉｎｅｚ、Ａｌｌｅｒｇｙ  ５６：２７９−２８６（２００１））。この典型例を支持して、小児期の早くにおけるサイトカイン均衡の回復を指向する治療は、アトピー性疾患を改善し得、予防さえし得る（Ｋａｌｌｉｏｍａｋｉら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：１０７６−１０７９（２００１）およびＭｕｒｃｈ、Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：１０５７−１０５９（２００１））。喘息の危険性のある小児に与えられた強力な抗ヒスタミン薬または他の抗炎症性薬物は、ＩｇＥ媒介性アレルギーを有する小児におけるその後の喘息の発生を顕著に遅らせる。これは、明らかに肥満細胞の脱顆粒からのヒスタミンおよびアレルギー促進性サイトカインの放出を防止することによる（Ａｎｏｙｍｏｕｓ、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１１６−１２４（１９９８）；Ｍｏｌｌｅｒら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：２５１−２５６（２００２）；およびｄｅ  Ｌｏｎｇｕｅｖｉｌｌｅ、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１（補遺１３）：４１−４４（２０００））。
【０１０６】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３に対する細胞レセプターは、ＩＬ−４レセプターα鎖と称される共通のサブユニットを共有するが、ＩＬ−４レセプターα鎖を共有するサブユニットが異なる（Ｋｅｅｇａｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９２：７６８１−７６８５（１９９５）ならびにＧｅｓｓｎｅｒおよびＲｏｌｌｉｎｇｈｏｆｆ、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１：２８５−３０７（２０００））。レセプターを共有することに起因して、ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、標的細胞に対していくつかの共通の効果を共有する。その効果としてはＩｇＥ合成の促進および好酸球の生存の促進が挙げられるが、他の標的細胞に対しては異なる効果も有する。例えば、ＩＬ−４レセプターは、Ｔリンパ球の表面上で容易に検出されるが、ＩＬ−１３レセプターは、検出されない。しかし、それにも関わらず、ＩＬ−１３レセプターは、細胞内で発現され得る（Ｇｒａｂｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．２８：４２８６−４２９８（１９９８））。逆に、ＩＬ−１３の発現は、上皮組織の構造における変化および肺における粘液の発現を促進するようであるが、ＩＬ−４の発現は、促進しない（Ｋｕｐｅｒｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８８５−８８９（２００２）およびＷｉｌｌｓ−Ｋａｒｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２２５８−２２６１（１９９８））。ヒトにおいて、共有のＩＬ−４レセプターα鎖における変異は、アトピー性疾患と関連しているが、研究された全ての集団においてそうであるわけではない（Ｈａｃｋｓｔｅｉｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５３：２６４−２６９（２００１）；Ｈａｌｌ、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．１：６−８（２０００）；Ｈｅｒｓｈｅｙら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１７２０−１７２５（１９９７）；Ｈｏｗａｒｄら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７０：２３０−２３６（２００２）；ＫａｒｐおよびＷｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．３：１０９−１１９（２００１）；Ｍｉｔｓｕｙａｓｕら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：１１９−１２０（１９９８）；Ｏｌａｖｅｓｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｔｉｃｓ  ５１：１−７（２０００）；ならびにＲｉｓｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１６０４−１６１０（２００２））。マウスモデルにおいて、ＩＬ−４レセプターα鎖を共有するＩＬ−４レセプターのノックアウトおよびＳＴＡＴ−６シグナル伝達因子を活性化するＩＬ−４レセプターのノックアウトは、アレルギー性表現型をほぼ完全に排除するが、いくつかのアトピー性応答は、長期のアレルギー刺激で復活され得る（ＧｅｓｓｎｅｒおよびＲｏｌｌｉｎｇｈｏｆｆ、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１：２８５−３０７（２０００）；Ｇｒｕｎｅｗａｌｄら、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２５：３２２−８（２００１）；Ｎｅｌｍｓら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：７０１−３８（１９９９）；Ｎｏｂｅｎ−Ｔｒａｕｔｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１０８３８−４３（１９９７）；Ｎｏｂｅｎ−Ｔｒａｕｔｈら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏ  ｌ３２：１４２８−３３（２００２）；Ｑｕｅｌｌｅら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５：３３３６−４３（１９９５）；Ｓｈｉｍｏｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６３０−３（１９９６）；Ｓｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５１８：５３−９（２００２）；ならびにＺｈｕら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：７２７６−８１（２００１））。変異したＩＬ−４競合的ペプチドアンタゴニストによるＩＬ−４／ＩＬ−１３レセプターの選択的遮断はまた、マウスにおけるアレルギー性感作を遮断した（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５７９２−５８００（２００１））。
【０１０７】
これらの観察は、ＩＬ−４／ＩＬ−１３シグナル伝達経路の、アレルギー性疾患を予防または処置するための薬理学的介入の標的としての重要性を例証する。本出願は、触媒ＲＮＡと称される外部ガイド配列（ＥＧＳ）を使用してＩＬ−４およびＩＬ−１３に対するレセプターを不活性化することによりＩＬ−４媒介性遺伝子発現およびＩＬ−１３媒介性遺伝子発現を標的する戦略を記載する（Ｇｏｐａｌａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：６７５９−６２（２００２）；Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３１３：４４２−５６（２０００）；Ｐｌｅｈｎ−Ｄｕｊｏｗｉｃｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：７３２７−３２（１９９８）；およびＲｏｓｅｎｗａｓｓｅｒら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １５６：Ｓ１５２−５（１９９７））。ＥＧＳおよび最近発見されたＲＮＡ干渉の現象すなわちＲＮＡｉ（Ｐｌａｓｔｅｒｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１２６３−１２６５（２００２））は、低分子ＲＮＡを真核細胞に導入して特定の標的ＲＮＡを不活性化する。ＩＬ−４／ＩＬ−１３経路を標的する低分子触媒ＲＮＡは、以前に記載された内因性肺界面活性物質を、ＲＡＳＯＮＳと称される従来のアンチセンスＤＮＡと一緒に使用して、肺組織に選択的に導入され得る（ＮｙｃｅおよびＭｅｔｚｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：７２１−７２５（１９９７）；Ｓａｎｄｒａｓａｇｒａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１２：１７７−１８１（２００２）；ならびにＦｉｎｏｔｔｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：１２４７−１２６０（２００１））。ＩＬ−４レセプターα鎖の標的された不活性化は、ＩＬ−４とＩＬ−１３との合わせた病原性効果を、単一の治療剤で調節する手段を提供し得る。重要なことに、レセプター発現を排除することは、オートクラインシグナル伝達およびパラクラインシグナル伝達（細胞とその細胞自体またはそれに接触する細胞との間のシグナル伝達）ならびに可溶性のサイトカインの放出を介したシグナル伝達を調節する。
【０１０８】
アレルギー性疾患および自己免疫性疾患および喘息の治療における分子の適用の多くが、これらの分子を使用してインビボでの機能的なＩＬ−４レセプターα鎖の発現を減少させることに基づいている。ＩＬ−４およびＩＬ−１３が排除されたＩｇＥ産生および喘息様肺病理の両方に必要な共有されるＩＬ−４レセプターα鎖のノックアウトは、喘息およびいくつかのアトピー性皮膚疾患におけるＩＬ−１３の固有の役割を示唆する（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２２５８−２２６１（１９９８）；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．１：１９−２３（２０００）；ならびにＨｅｒｒｉｃｋら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：７６５−７７５（２０００））。ＩＬ−４に結合し得る（がＩＬ−１３に結合しない）ヒトに共有されるＩＬ−４レセプターα鎖の可溶性フラグメントの最近の臨床試行は、重篤な喘息患者においてある程度の効果を示した（ＳｔｅｉｎｋｅおよびＢｏｒｉｓｈ、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．２：６６−７０（２００２））。重要なことに、ＩＬ−４機能の喪失に関連する悪影響は、これらのヒト被験体の肺にも全身にも認められなかった。
【０１０９】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３はまたいくつかの細菌感染および寄生虫感染に対する全身性免疫に必要であり（ＫａｒｐおよびＷｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．３：１０９−１１９（２００１）；Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：２２８−２３６（２００１）；ならびにＭｏｈｒｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：７３０２−７３０８（１９９９））、レセプターの不活性化は、標的組織における感染の増加を生じ得る。特定の組織（例えば、肺またはＩＬ−４レセプターの多形性が炎症性腸疾患と関連している消化管などの他の組織（Ｋｌｅｉｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．２：２８７−２８９（２００１））に標的されたＩＬ−４レセプターα鎖の不活性化は、全身性免疫欠損を予防するのに有益であり得る。ＩＬ−４レセプターα鎖の標的した不活性化による全身性の免疫調節はまた、いくつかの状況下で有益であり得るが、これは、ＩＬ−４／ＩＬ−１３レセプターの喪失がマウスにおける全身性自己免疫性糖尿病の発症を予防し（ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＰａｕｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６８７−６９８（２００１）ならびにＲａｄｕら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：１２７００−１２７０４（２０００）、そしていくつかの腫瘍はまたＩＬ−４に応答性である（Ｓｔｒｏｍｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：２８１−２８６（２００２）；Ｅｓｓｎｅｒら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｓｕｒｇ．５：８１−９０（２００１）；およびｔｅｒａｂｅら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：５１５−５２０（２０００））からである。ＩＬ−４はまた、単球／マクロファージ系統の一次細胞におけるＨＩＶ１複製を差次的に調節することが示されている。ＴＨ１サイトカインに対するＩＬ４／ＩＬ−１３  ＴＨ２サイトカインの不均衡は、ＨＩＶ−１ウイルスおよびエプスタイン−バーウイルスを含むウイルスの複製を促進すると考えられている。
【０１１０】
一実施形態において、上記処方物は、アレルギー性鼻炎または喘息を有する患者に、局所的経鼻適用および／または吸入により投与される。別の実施形態において、この処方物は、食物アレルギーを有する患者に、注射または経口投与により投与され、その処方物は、腸の細胞により吸収される。別の実施形態において、この処方物は、例えば、湿疹などのアトピー性皮膚疾患を有する患者の皮膚に局所的に適用される。別の実施形態において、この処方物は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３依存性悪性疾患を有する患者の全身に投与される。別の実施形態において、この処方物は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３自己免疫疾患を有する患者の全身に投与される。別の実施形態において、この処方物は、ＲＡＧ遺伝子のＩＬ−４依存性発現に起因してＩＬ−４依存性レセプターエディティングを受ける細胞を標的することによって、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３自己免疫疾患を有する患者に投与される。別の実施形態において、この処方物は、ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１ウイルス、エプスタイン−バーウイルスおよびインフルエンザウイルス）のＩＬ−４依存性複製の処置のために患者に投与される。
【実施例】
【０１１１】
（実施例１．ＥＧＳ標的ヒトインターロイキン−４レセプターαのｍＲＮＡ）
低分子のヌクレアーゼ耐性のＥＧＳを、アレルギー性炎症に関連するヒトトランスクリプトームにおいて、保存された標的に対して設計する。プラスミドベクターに由来する、細胞において一過性に発現させたＥＧＳは、ヒトＩＬ４レセプター鎖がアレルギー性炎症に必要なＩＬ４Ｒａと名付けられたＩＬ１３レセプターとサブユニットを共有することを実証した。この実施例は、ＩＬ４Ｒａが、ＩＬ４Ｒａ開始部位（配列番号２）（ＡＵＧ開始コドンを斜体で示す）に近接する下線を引いた配列
【０１１２】
【化６】
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に結合する、細胞で発現したＥＧＳを用いて最も効果的に標的され得ること、およびＩＬ４Ｒａがインビボで標的され得ることを実証する。
【０１１３】
（材料および方法）
この研究で使用した制限酵素および他の酵素は、他に特定しない限り、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡから入手した。ＤＮＡ配列は、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨを用いて決定した。生化学材料は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手した。オリゴヌクレオチドは、Ｋｅｃｋ  ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｙａｌｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴにて合成した。放射性ヌクレオチドは、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手した。プラスミドを調製し、制限断片をＱｕｉａｇｅｎ試薬（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて単離した。
【０１１４】
（プライマー、標的配列およびオリゴヌクレオチド）
一次ヒトリンパ球からのｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの単離のために、ＩＬ−４ｒ５００１と示されるオリゴヌクレオチドプライマー（５’ａｇａｔｃａｇｇａｇｔｔｃｇａｇａｃｃ（配列番号１０４））およびＩＬ−４ｒ３００２（５’−ｇｔｔｔｔｃａｃｔｃｃａａａｔｇｔｔｇａｃ（配列番号１０５））と示されるオリゴヌクレオチドプライマーは、ヌクレオチド１７６にレセプタータンパク質の開始部位を含むＩＬ−４レセプターα鎖のヌクレオチド１３３〜６７６に及ぶ５４４ｂｐと予測されるフラグメントを規定する。ＩＬ−４レセプターα鎖配列内のＨｉｎｃＩＩ制限酵素部位は、クローニングしたＤＮＡフラグメントのさらなる分析を容易にするためのＩＬ−４ｒ３００２プライマーに含まれた（示したＩＬ−４ｒ３００２配列に下線を引いた）。
【０１１５】
５４４ｂｐのフラグメントを、一次ヒトリンパ球ｃＤＮＡからＰＣＲ（ＡｍｐｌｉＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）によって増幅した。このとき用いたハイブリダイゼーション温度は５６℃であり、３０回の増幅サイクルを行なった。増幅したＤＮＡを、トポイソメラーゼを用いて直接ベクターｐＣＲ２．１  ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングした。ｐＩＬ−４ｒ１と示されるプラスミド内のｃＤＮＡの全長を配列決定し、予測されるＩｌ−４ｒ配列に相当するｃＤＮＡを、ｐＣＲ２．１  ｔｏｐｏ．２．３のＴ７ポリメラーゼ転写部位に対してセンス向きに含むことを示した。
【０１１６】
（ｍＲＮＡ転写物のＴ１マッピング）
ｐＣＲ２．１ベクターＴ７ポリメラーゼの開始部位は、ｍＲＮＡ翻訳開始部位に及ぶｐＩＬ−４ｒ１のＩＬ−４レセプターα鎖ｍＲＮＡのセンス転写産物の一部を発現するように配置されている。予測される転写産物は、ｐＣＲ２．１ベクターリンカー由来のさらに７２のヌクレオチドの５’リーダー配列を含む。ＨｉｎｃＩＩで直線化したｐＩＬ−４ｒ１を、Ｔ７ポリメラーゼとともにインキュベートし、６１６ｎｔ（７２ｎｔのリーダー配列と５４４ｎｔのクローニングされたｍＲＮＡ）と予測されるｍＲＮＡを生じた。このＲＮＡをＲＮＡｓｅを含まないＤＮＡｓｅで処理し、ＤＮＡテンプレートを除去し、転写されたＲＮＡを子牛の腸のホスファターゼ（ＣＩＰ）で脱リン酸化した。加熱処理することによりＣＩＰを不活性化し、フェノール抽出およびエタノール沈殿によりＲＮＡをさらに精製した。次いで、ＲＮＡを再懸濁し、ｇ３２Ｐ標識したＡＴＰを使用してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’末端標識した。標識した全長ＲＮＡを６％調製ゲルを用いて精製し、サイズ標準としてＲＮＡの部分的塩基消化配列を使用してこれまでに記載されている（Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−ＴａｋａｄａおよびＡｌｔｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３：４４２−４５６（２０００）；ならびにＰｌｅｈｎ−ＤｕｊｏｗｉｃｈおよびＡｌｔｍａｎ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：７３２７−７３３２（１９９８））ようにＲＮＡｓｅ  Ｔ１で部分的に消化した。Ｔ１ヌクレアーゼ感受性部位を、部分消化産物のゲル電気泳動により同定した。標識したｍＲＮＡをＴ１ヌクレアーゼにより消化し、消化フラグメントを１２％配列決定ゲルおよび８％配列決定ゲルで分離した。この分析において、Ｔ１感受性部位は、その部位の末端の標識したｍＲＮＡの切断に起因して暗色のバンドとして検出される。配列には、Ｔ１感受性部位の局在化を可能にするＲＮＡのアルカリ分解により産生される一塩基増加が異なるフラグメントの配列が隣接する。Ｔ１感受性部位は、３’リンカー配列と５’ｍＲＮＡとの連結部に相当する。リンカー配列内の全てのＧ残基（移動性のベローズフラグメントＡ）は、Ｔ１に対して高度に感受性であった。Ｂと示されるＴ１感受性部位は、ＥＧＳ１により後に標的されるｍＲＮＡのＡＵＧ開始部位に近接するＧ残基に相当する。Ｃと示される全長（未消化）ｍＲＮＡは、８％ゲルの上部に現れる。
【０１１７】
候補ＥＧＳ配列を設計および合成するために、二つのＴ１ヌクレアーゼ感受性部位を、本文中に記載されるＥＧＳ１およびＥＧＳ２と名付けられたＥＧＳによる切断の標的としてさらに研究するために選択した。
【０１１８】
ＥＧＳ１およびＥＧＳ２を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、ＤＮＡテンプレートをクローニングした野生型チロシンｔＲＮＡ  ｃＤＮＡ（ｐＴｙｒ）をＰＣＲ増幅することにより作製した。オリゴヌクレオチドＥＧＳ  ５０１  ５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｃｔｇｃａｇａｇｃａａｇｃａｇａｃｔｃｔａａａｔｃ（配列番号９４）およびＥＧＳ３０１  ５’−ａａｇｃｔｔｔａａａａａｔｇｇｔｇｇｇｔｇｇｃｇａａｇｇａｔｔｃｇａａｃｃ（配列番号９５）を使用してＥＧＳ１テンプレートを作製し、ＥＧＳ５０２  ５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｃｔｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃａｇａｃｔｃｔａａａｔｃ（配列番号９６）およびＥＧＳ３０２  ５’−ａａｇｃｔｔｔａａａａａｔｇｇｔｇｔｃｃｔｇｃｇａａｇｇａｔｔｃｇａａｃｃ（配列番号９７）を使用してＥＧＳ２テンプレートを作製した。末端のホスフェート５’ホスフェートを、ＰＣＲの前にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してオリゴヌクレオチドに付加し、増幅産物の平滑末端クローニングを容易にした。ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＥｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｆａｉｌｓａｆｅ  ＰＣＲプレミックス緩衝液Ｈ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、３７℃のハイブリダイゼーション温度にて８回の増幅サイクルでＰＣＲを行い、その後７２℃のハイブリダイゼーション温度でさらに３０回のサイクルでＰＣＲを行なった。ゲル精製後、ＥＧＳ１およびＥＧＳ２を、平滑末端ライゲーションによりｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩ部位にサブクローニングし、ヌクレオチド配列を確認した。ＥＧＳ１テンプレートを含むプラスミドをｐＥＧＳ１．１と示し、ＥＧＳ２を含むプラスミドをｐＥＧＳ２．１と示した。Ｔ７ポリメラーゼによる転写の前に、これらのプラスミドを、ＥＧＳテンプレートの３’末端に位置するＤｒａＩ部位を切断する制限酵素ＤｒａＩを用いて直線化した。ＲＮＡｓｅを含まないＤＮＡｓｅによる消化によってＤＮＡテンプレートを取り除き、標的ＲＮＡとインキュベーションする前に３％エチジウムで染色したアガロースゲル上で可視化した場合に、分解していない予測されたサイズのＲＮＡ転写物が明らかになった。
【０１１９】
候補ＥＧＳによるｍＲＮＡ転写物のインビトロ切断アッセイのために、ｐＩＬ−４ｒ１．１を、５４４ｎｔのクローニングしたｃＤＮＡの内部部位で制限酵素Ｆｏｋ１により直線化し、ａｐ３２  ＡＴＰの存在下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼとともにインキュベートし、標識された３９９ｎｔの標的ＲＮＡを作製した。このａｐ３２ＡＴＰ標識した３９９ｎｔのＲＮＡは、７２のさらなるヌクレオチドのｐＣＲ２．１  ｔｏｐｏ  リーダー配列を有するＩＬ−４ｒ  ｍＲＮＡヌクレオチド１３３−４５９を含む。標的ＲＮＡを、６％調製配列決定ゲル上でゲル精製し、ＰＡ緩衝液中で精製したＥＧＳと一緒にインキュベートした（Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−ＴａｋａｄａおよびＡｌｔｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３１３：４４２−４５６（２０００）；ならびにＰｌｅｈｎ−ＤｕｊｏｗｉｃｈおよびＡｌｔｍａｎ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：７３２７−７３３２（１９９８））。ＲＮＡｓｅ  ＰをＤｒ．Ｓ．Ａｌｔｍａｎ、Ｙａｌｅ  ＭＣＤＢ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴから得た。ＥＧＳとのインキュベーション後、３０Ｖ標的ｍＲＮＡを６％配列決定ゲル上で分離し、固定し、乾燥し、オートラジオグラフィにより可視化した。
【０１２０】
全長ＥＧＳ１およびアンチコドンを欠失したヒトおよびマウスのＥＧＳ１のためのインビボ発現プラスミドの構築のために、ＥＧＳ配列をＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩを用いてｐＥＧＳ１．１から切り出し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ消化したプラスミドｐＭＵ６にライゲーションした。ｐＥＧＳ１．１は、全長ＥＧＳ１を含む。相補的（Ｓ）オリゴヌクレオチドおよびアンチセンス（Ａ）オリゴヌクレオチドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ消化したプラスミドｐＭＵ６にアニーリングした後、組み込まれたＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩの「粘着性の末端（ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ）」を含む二本鎖合成オリゴヌクレオチドの直接的ライゲーションにより、ｐｈＩＬ４Ｒｅ１．１、ｐｈＩＬ４Ｒｍｕｔｅ１．１、ｐｍＩＬ４Ｒｅ１．１およびｐｍＩＬ４Ｒｍｕｔｅ１．１と示される、ＥＧＳ様配列を含むが、アンチコドンループを含まないさらなるプラスミドを作製した。これらのプラスミドは、従来のアンチセンスＲＮＡ効果およびＩＬ−４プロモーターに対する二本鎖ＲＮＡの非特異的な効果の両方に役立った（Ｋｅｈｏｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７（５）：２４９６−２５１０（２００１））。これらのさらなるＥＧＳは、発現ベクターへのクローニングを容易にするように、アンチコドンループを欠失し（Ｄ．Ｈ．Ｄｒｅｙｆｕｓら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４  （２００４）  １０１５-１０２７）、全長ｐＥＧＳ１．１を作製するためにＰＣＲを用いた。他のＥＧＳからのアンチコドンループの欠失は、ＲＮＡｓｅ  Ｐの切断反応の特異性に作用することなくその効率を増加させることが見出されている。一方、Ｔループの変異は、ＲＮＡｓｅ  Ｐの切断を排除するが、従来のアンチセンスは、ＥＧＳ  ＲＮＡの発現に作用しないか、または非特異的に作用することが見出されている。全てのプラスミドヌクレオチド配列を、ｐＭＵ６へのクローニング後に確認した。
【０１２１】
ＥＧＳのインビボアッセイのために、インビボ研究で使用したＢリンパ芽球状細胞株を、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １０％  ＦＣＳで培養した。４５−２ｗ１１細胞は、機能的ヒトＩＬ−４レセプターα鎖ｍＲＮＡ発現プラスミドで安定にトランスフェクションしたｍ１２−４−１マウスリンパ芽球状細胞に由来し、マウスのＩＬ−４レセプターα鎖ｍＲＮＡおよびヒトのＩＬ−４レセプターα鎖ｍＲＮＡの両方の発現を、これらの細胞におけるＰＣＲによって確認した。ヒトＢリンパ芽球状ラモス細胞は、ヒトＩＬ−４に対して応答性であることがこれまでに示されている。各実験について、約１０５個の指数関数的に増殖する細胞を、９５０ＡＦ、１８６Ｖ、２５０Ｖでのエレクトロポレーションを用いてレポータープラスミドおよびＥＧＳをコードするプラスミドでトランスフェクトした。ヒトＩＬ４  ５’配列を含むヒトＩＬ４レポーター遺伝子を、プラスミドＰＧＬ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ）内のルシフェラーゼに融合した（Ｇｅｏｒａｓら、Ｂｌｏｏｄ  ９２：４５２９−４５３８（１９９８））。ＮＦｎＢルシフェラーゼレポーターは、ルシフェラーゼレポータープラスミドＰＧＬ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に融合した複数コピーのコンセンサス応答部位を含む。細胞をプラスミドで記載されるようにトランスフェクトし、３７℃にて４０分間インキュベートし、次いで、さらなる試薬イオノマイシン（５００ｎｍ）、ＰＭＡ（２５ｎｇ／Ａｌ）および／またはヒト  ＩＬ−４（１０ｎｇ／Ａｌ）を培地に添加し、細胞を３７℃にてさらに８時間インキュベートした。上清を除去した後細胞を凍結させ、製造業者に提案される条件を使用した単一または二重のルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のために約２．５×１０４細胞（トランスフェクトした全細胞の４分の１）を融解した。二重のルシフェラーゼアッセイを用いる実験のための細胞をまた、ＳＶ４０プロモーターの制御下でウミシイタケのルシフェラーゼを発現するｐＲＬ／ＳＶ４０の１０ｎｇでトランスフェクトした。二重のルシフェラーゼアッセイの結果も単一のルシフェラーゼアッセイの結果も同様であった。
【０１２２】
ルシフェラーゼのデータを、６０秒間の間隔にわたって測定した観察されたルシフェラーゼ活性からバックグラウンドを引くことにより任意のルシフェラーゼ単位として表した。グラフによる表示のために、ＮＦｎＢルシフェラーゼレポーターのルシフェラーゼ単位を、係数１０で割ってＩＬ−４レポーターの結果との比較を容易にした。示した各データ点を作成するために使用した４回の独立した実験にスチューデントのｔ検定を用いてデータを分析した。
【０１２３】
（結果）
（ヒトインターロイキン−４レセプターαのｍＲＮＡのＴ１ヌクレアーゼマッピング）
Ｔ１ヌクレアーゼによるレセプターｍＲＮＡの部分的な消化は、重要なｍＲＮＡ二次構造が、ｍＲＮＡの最初の数百のヌクレオチドに存在したことを示唆した（図２を参照のこと）。ＲＮＡｓｅ  Ｔ１は、溶液中に露出し、一本鎖であるＲＮＡのグアニン（Ｇ）残基の後ろでＲＮＡを切断するが、ＲＮＡの二次構造にうもれているか、二本鎖領域で塩基対形成しているＧ残基の後ろではＲＮＡを切断しない。
【０１２４】
部分的消化フラグメントは、反応産物のゲル電気泳動によるサイズ分画後、配列を形成し、その反応産物中で暗色のバンドは、標的ＲＮＡ中の開いた部位を表すが、バンドがないことは、二次構造に切断領域がないことを表す。感受性部位の実際のヌクレオチド位置を決定するために、存在する各ヌクレオチド位置を有する標的ＲＮＡを消化した塩基の配列を、標的ｍＲＮＡと一緒に電気泳動する。
【０１２５】
ヒトインターロイキン−４レセプターαのｍＲＮＡ内の多くのＧ残基は、Ｔ１に対して全く接近可能ではなかった。特に、ヒトインターロイキン−４レセプターαのｍＲＮＡ内のＴ１感受性部位は、相対的にｍＲＮＡ開始コドンに近接するｍＲＮＡの５’領域に集中していた（図２を参照のこと）。対照的に、標的ｍＲＮＡ５’領域に融合したｐＣＲ２．１リーダー内の全てのＧ残基が切断され、予測される二次構造を含まない合成配列について予測されるとおり暗色のバンドを形成した。ヒトインターロイキン−４レセプターαのｍＲＮＡの二次構造の機能的重要性は、調節因子の結合部位に相当する。
【０１２６】
（ヒトインターロイキン−４レセプターαのｍＲＮＡ内のＥＧＳ標的部位のインビトロ合成）
ヒトＩＬ−４ｒ  ｍＲＮＡのＴ１マッピングは、ｍＲＮＡが、ＲＮＡｓｅ  Ｔ１に接近可能であり、従って明らかに一本鎖構造であるＲＮＡｓｅ  ＰコンセンサスＧＮＮＮＮＮＵに適合する場合、開始部位の近くにいくつかの部位を明らかにした（図２を参照のこと）。ＥＧＳ１およびＥＧＳ２と示されるＥＧＳは、標準のワトソン−クリック塩基対形成に基づいてヒトインターロイキン−４レセプターαのｍＲＮＡに結合する場合（図３Ｂ）、ヒトｔＲＮＡに対する構造の類似する前駆体を形成するように設計された。ＥＧＳ５０１およびＥＧＳ３０１と示されるオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＥＧＳ１  ｃＤＮＡを作製し、ヒトチロシンｔＲＮＡ  ｃＤＮＡからオリゴヌクレオチドＥＧＳ５０２およびＥＧＳ３０２を使用してＰＣＲによりＥＧＳ２  ｃＤＮＡを作製した。ＥＧＳをインビトロで発現させるために、Ｔ７ポリメラーゼに対するプロモーターをＥＧＳ  ｃＤＮＡの５’領域に融合した。後のインビトロ発現ベクター内へのＥＧＳサブクローニングのために、Ｅ５０１および５０２には、ＰｓｔＩ部位を含み、Ｅ３０１および３０２には、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んだ（図３ｂを参照のこと）。ＥＧＳ３０１およびＥＧＳ３０２はまた、インビトロＴ７転写を終結させるために、ＥＧＳ  ｃＤＮＡの３’末端にプラスミドの平滑末端直線化のためのＤｒａＩ制限酵素部位を含んだ。改変されたＤｒａＩ部位はまた、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写終結部位と類似するので、インビボ研究においてターミネーター配列として役立ち得る。
【０１２７】
（ＲＮＡｓｅ  Ｐ依存性基質切断のインビトロアッセイにおけるＥＧＳの特徴付け）
ヒトインターロイキン−４レセプターαのｍＲＮＡの部位特異的切断に対するアッセイを、ｐＩＬ−４Ｒ．１から転写されたヒトインターロイキン−４レセプターαのｍＲＮＡの明確な３２Ｐ標識したフラグメントを末端標識し、精製することにより準備した。標識したｍＲＮＡフラグメントおよび精製したＥＧＳ  ＲＮＡを、以前に記載された条件（Ｐｌｅｈｎ−ＤｕｊｏｗｉｃｈおよびＡｌｔｍａｎ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：７３２７−７３３２（１９９８））下で精製したＲＮＡｓｅ  Ｐの存在下でインキュベートした。精製したヒトインターロイキン−４レセプターαの３９９ｎｔのｍＲＮＡ転写産物は、ＥＧＳ１の存在下でインビトロでの部位特異的ＲＮＡｓｅ  Ｐ媒介性切断を受け、それぞれ１１９ｎｔおよび２８０ｎｔと予測されるフラグメントを生じたことに注目した。ＲＮＡｓｅ  Ｐの活性のコントロールとして、ＴｓｕｐＳ１と示されるコントロール標識したｔＲＮＡをまた、同一条件下でＲＮＡｓｅ  Ｐと一緒にインキュベートし、８２ｎｔと２８ｎｔと予測されるフラグメントを生じた。ＲＮＡｓｅ  Ｐを含むＰＡ緩衝液中でのインキュベーション後、ＥＧＳ１によるＩＬ−４レセプターα鎖のｍＲＮＡの部位特異的切断を、ゲル電気泳動（６％  ポリアクリルアミド／８％  尿素配列決定ゲル）後の放射性標識したＲＮＡ基質を用いて示した。ＩＬ−４レセプターα鎖のｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡの１１９ｎｔの５’フラグメントは、定常濃度のＲＮＡｓｅ  Ｐと一緒にインキュベートする場合、標的ｍＲＮＡに対するＥＧＳ１のモル比の増加を伴って増加する。３’フラグメントはまた、バックグラウンドバンドを同時移動（ｃｏｍｍｉｇｒａｔｅ）させることによって一部不明瞭ではあるが明らかになる。
【０１２８】
ヒトインターロイキン−４レセプターαのｍＲＮＡの切断は、標的ＲＮＡに対するＥＧＳ１の最も低いモル比（１５：１の比）で明らかであった。切断は、ＥＧＳ１の濃度に依存し、約１０００：１のＥＧＳの標的に対する比で反応が明らかに飽和した。ＥＧＳ１のみでもＲＮＡｓｅのみでも標的の切断は、検出されなかった。
【０１２９】
ＥＧＳ２は、このアッセイの検出のレベルで示された全ての濃度にて標的の切断において完全に不活性であったが、ＥＧＳ２標的部位は両方とも標的のＴ１感受性領域内にあり（図２を参照のこと）ＥＧＳ２は理論上はＩＬ−４ｒ  ｍＲＮＡと塩基対形成してｔＲＮＡ様構造を形成し得る（図３ｂを参照のこと）。ＥＧＳ２配列のインビトロにおけるさらなる分析は、ＥＧＳ２が、標的ｍＲＮＡに加えてそれ自体と塩基対形成し得ることを示唆し、おそらくこのことがその不活性の原因である。
【０１３０】
インビボ研究のために、ＥＧＳ１配列を、ｐＥＧＳ１．１と示されるプラスミド内のｐＭＵと示されるポリメラーゼＩＩＩ発現プラスミドにクローニングした。ｐＥＧＳ１．１でトランスフェクトした細胞は、空のｐＭＵ６ベクターと同様のトランスフェクション効率を示し、トランスフェクトした細胞は、ＧＦＰ発現ベクターの同時トランスフェクションにより決定する場合、約５〜１０％の細胞で類似した量の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するので、毒性の証拠は示さなかった。５〜１０％の細胞のみが、トランスフェクトされたので、ＩＬ−４レセプターｍＲＮＡまたはそのタンパク質の発現における少しの変化も多くのトランスフェクトされていない細胞の存在に起因して安定な細胞を選別または構築することなく検出することが困難であることが明らかであった。細胞の選別または操作を伴わない、ＩＬ−４レセプター機能のルシフェラーゼベースのアッセイが考案されてきた。
【０１３１】
他の者は、ヒトＩＬ−４遺伝子がＩＬ−４／Ｓｔａｔ−６媒介性シグナル伝達によりネガティブに調節されることを実証した。ＩＬ−４遺伝子内の部位に結合するＩＬ−４活性化Ｓｔａｔ−６は、ＮＦ−ＡＴによる遺伝子のＩＬ−４非依存性活性化と競合する（Ｇｅｏｒａｓら、Ｂｌｏｏｄ  ９２：４５２９−４５３８  １９９８）。従って、ヒトＩＬ−４レセプター遺伝子由来のルシフェラーゼの発現は、ＩＬ−４レセプターＳｔａｔ−６の活性化の低減に対するＩＬ−４非依存性ＩＬ−４遺伝子発現マーカーの増加したＩＬ−４レセプターの機能的状態の基準としての役目を果たす。ＩＬ−４の基準として、応答性のヒトラモスリンパ芽球状細胞を、ＥＧＳ１またはコントロールプラスミドのどちらかでトランスフェクトし、４０時間インキュベートした後、さらに８時間の間イオノマイシンまたはＩＬ−４で細胞を刺激し、次いで、ルシフェラーゼ活性を測定した。最初の４０時間のインキュベーションの時間は、レセプターｍＲＮＡのＥＧＳ不活性化に起因して時間の経過によって生じるト予想されるレセプターの機能の低減を検出するために必要であった。図４ａに示されるように、ヒトラモス細胞にトランスフェクトされたＥＧＳ１関連配列は、ＥＧＳ配列が、ＩＬ−４レポーター遺伝子の転写を増加させたことを実証した。細胞のイオノマイシンの同時刺激により、ＥＧＳ１．１の全体的な用量依存性効果は類似していたが、その大きさは、刺激していない細胞より大きかった。
【０１３２】
ＩＬ−４ルシフェラーゼレポーターに対する効果が、ＲＮＡｓｅ  ＰおよびＥＧＳ内の特定の配列の両方に依存していたか否かを決定するために、ヒト標的ｍＲＮＡに相補的ではない変異Ｔループ配列またはマウス配列のどちらかを有するインビボ発現プラスミドを構築することが必要であった。
【０１３３】
ＥＧＳ  Ｔループの変異（Ｔｍｕｔと示される）は、発現された相補的ＲＮＡの従来のアンチセンス効果を変えることなくＲＮＡｓｅ  Ｐの活性を排除する。機能的Ｔループを有するマウス配列に対するＥＧＳの相補的配列を変化させることにより、Ｔループまたは他のベクターの配列の非特異的効果を制御する。図４ａに示されるように、ラモス細胞におけるＩＬ−４プロモーターの活性化は、一部ＲＮＡｓｅ  Ｐに依存し、ヒトインターロイキン−４レセプターαのｍＲＮＡ転写産物に相補的な特異的配列に完全に依存する。
【０１３４】
予想されるように、ＩＬ−４は、ラモス細胞におけるヒトＩＬ−４プロモーターの転写を減少させた（図４ａを参照のこと）。活性ヒトＩＬ−４レポーター遺伝子をトランスフェクトしたマウス２ｗ１１細胞は、ヒトＩＬ−４の存在下または非存在下の両方において同時トランスフェクトしたＥＧＳ１発現プラスミドの量の増加とともに、ＩＬ−４遺伝子発現が有意に増加したことを実証した（図４ｂを参照のこと）。同様の結果が、ラモス細胞、イオノマイシン刺激細胞またはイオノマイシンＰＭＡ刺激細胞において明らかであった。いくつかの実験において、細胞をまたＮＦ−ｎＢに対するレポーター遺伝子でトランスフェクトした。このＮＦ−ｎＢは、ＩＬ−４またはイオノマイシンによって直接的に調節されないルシフェラーゼレポーターであり、ＥＧＳの非特異的な効果が明らかになる程度を決定する（図４ｂを参照のこと）。ＥＧＳ−１同時トランスフェクションは、ＮＦ−κＢレポーターの活性化を遮断しなかったが、ＮＦ−ｎＢレポーター遺伝子の応答もＩＬ−４レポーター遺伝子の応答もこのアッセイでは、大部分ＩＬ−４非依存性であった（図４ｂを参照のこと）。
【０１３５】
インターロイキン−４レセプターαのｍＲＮＡを切断し得るＥＧＳを記載する。インビトロで発現したＥＧＳ１は、インビトロでのヒトＩＬ−４ｒ  ｍＲＮＡに対するｍＲＮＡの効率的なＲＮＡｓｅ  Ｐ媒介性切断を指向する。ｍＲＮＡのＲＮＡｓｅ  Ｐ媒介性部位特異的切断を触媒するＥＧＳ１の能力は、図３に示される構造に類似する構造が、ＥＧＳと標的ｍＲＮＡとの間に形成することを実証するが、これはこのような構造が存在する場合を除いては、ＲＮＡｓｅ  Ｐが切断しないためである。ＥＧＳ２が標的ｍＲＮＡをインビボで切断し得ないことは、ＥＧＳとｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｓｅ  Ｐとの間の塩基対形成が、ＥＧＳの活性がさらなるインビボまたはインビトロの分析をせずに仮定され得ない程度に十分に複雑であることを確証する。
【０１３６】
ＥＧＳ１のインビボ活性のさらなる支持は、ＥＧＳ１および関連する配列が、ＩＬ−４レポーター遺伝子に対するＲＮＡ  Ｐ依存性効果を引き起こし得るか否かを決定するための考案されたアッセイにおいて明らかであった。他の者がリンパ芽球状細胞におけるＩＬ−４媒介性シグナル伝達が、ＩＬ−４非依存性のＮＦ−ＡＴ依存性のＩＬ−４遺伝子の活性化を遮断することを実証したので、リンパ芽球状細胞における基底のＩＬ−４シグナル伝達の不活性化が、ＩＬ−４ルシフェラーゼ遺伝子のＩＬ−４非依存性転写の増加として明らかになったと仮定した。２つの独立したＩＬ−４応答性細胞株における結果は、基底のＩＬ−４レセプターシグナル伝達の不活性化から予測される結果と一致し、そしてレポーター遺伝子の発現の増加と一致しないＥＧＳの発現に起因して、細胞死のような非特異的な効果とは一致しなかった（図４Ａおよび図４Ｂを参照のこと）。これらの結果はまたインビボでは配列依存性であった。これは、標的した配列内のヒト由来の２つのヌクレオチドのみが異なるマウスインターロイキン−４レセプターαのｍＲＮＡ転写産物を標的するＥＧＳを明らかに有さなかったためである。
【０１３７】
これらの実験は、ＥＧＳ１および関連する配列がＩＬ−４シグナル伝達およびＩＬ−１３シグナル伝達を改変するための新規のクラスの試薬であることを実証する。ＥＧＳ１は、ｍＲＮＡのより有効な切断のために、例えば、ＥＧＳのｔＲＮＡ領域のアンチコドンループの欠失によって最適化され得る。ＥＧＳは、発現ベクターを用いる遺伝子治療によって、または短縮ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドを用いる後成治療によって真核細胞内で作製され得る。ＥＧＳ発現ベクターを用いた細胞の安定なトランスフェクションは、標的したｍＲＮＡの延長されおそらく調節された不活性化を生じ得るが、潜在的に細胞に腫瘍形成性の変化を引き起こし得る。小型のヌクレアーゼ耐性のオリゴヌクレオチドを用いた後成治療は、潜在的に腫瘍形成性の発現ベクターを必要とすることなくｍＲＮＡを標的化する利点を有する。
【０１３８】
（実施例２．ＥＧＳ標的インフルエンザウイルス）
小型のヌクレアーゼ耐性ＥＧＳを、インフルエンザトランスクリプトソーム内の保存された標的に対して設計した（表１に示す）。インフルエンザ伸長因子ＥＦ−１は、Ｅｆ−１開始部位（配列番号９３）（ＡＵＧ開始コドンを斜体で示す）に近接する下線を引いた配列
【０１３９】
【化７】
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に結合する、レトロウイルスベクターから発現されたＥＧＳを用いて最も効果的に標的され得ることが示されている（Ｐｌｅｈｎ−ＤｕｊｏｗｉｃｈおよびＡｌｔｍａｎ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：７３２７−７３３２（１９９８））。ＥＧＳ、ＥＧＳコントロールおよびフルオレセイン標識したＥＧＳは、置換した塩基を用いて、ヌクレアーゼによる消化に対して安定であり容易に細胞に侵入するように十分に小さくなるように設計され得る。少なくとも４つの保存されたインフルエンザ遺伝子中の複数の類似する標的が同定されている（表２を参照のこと）。１９９８年頃に流行したＨ１Ｎ１インフルエンザ株由来の遺伝子に記載されるインフルエンザ遺伝子標的と自然界で現在流行しているＨ１Ｎ１株と現在流行しているＨ５Ｎ１トリ汎発性の株との間には、標的部位の高度の保存が存在する。これらのデータは、急速に変異する外部ウイルスタンパク質を標的するワクチンとは対照的に、標的に対して有効なＥＧＳが長期間にわたる広範な種々のインフルエンザに対して有効であることを強く示唆する。
【０１４０】
器官特異的ｃＤＮＡライブラリーおよびマウスから得た精製細胞タンパク質を、非特異的遺伝子標的効果、トールレセプターを介した炎症またはｐ５３／ｐ２１を介した細胞アポトーシス経路の活性化の徴候について分析する。この分析は、重要な調節タンパク質ならびにｐ２１およびＮＦ−κＢのような転写因子の発現または機能の変化を探すために、オフターゲット（ｏｆｆ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）効果の分析のための遺伝子チップ、関連する遺伝子の特異的ＰＣＲ、全タンパク質および／または核タンパク質抽出物のＥＭＳＡのノーザンブロッティングおよびウエスタンブロッティングの組合せを使用する。ほぼ完全なトランスクリプトソーム（２０，０００より多い発現した配列タグおよびコントロール、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）の転写レベルに影響するオフターゲット効果を試験する遺伝子チップの全ゲノムのスクリーニングが容易に利用可能であり、当業者に周知である。１００〜１５０の炎症性サイトカインおよびレセプターに対して特異的な遺伝子チップ（ＯｌｉｇｏＧＥＡｒｒａｙ、Ｓｕｐｅｒａｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＡ）ならびに約２５０の細胞アポトーシスおよびＲＮＡｉ（ＤｕａｌＣｈｉｐ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により変化されていることが公知である開発した遺伝子が利用可能である。特別仕様のＤＮＡチップがまたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡによって設計され得、生産され得るか、または当業者に公知の他の技術によって生産され得る。
【０１４１】
保持されたＥＧＳの安定性および定量的組織分布を、ＥＧＳの５’末端および３’末端に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを使用して組織または細胞から回収したＥＧＳの配列分析によって評価する。ＥＧＳの宿主ゲノム内への組込みの証拠は、ＥＧＳに特異的な１つのプライマーおよび宿主の繰り返し配列に特異的な２番目のプライマーを用いるゲノムＤＮＡのＰＣＲ、ならびにパルスフィールド電気泳動により分離し、標識したＥＧＳによりプローブした全染色体のサザンブロッティングを用いて決定され得る。
【０１４２】
安定なヒト上皮細胞株およびリンパ芽球状細胞株は、当業者に公知の方法により抗インフルエンザＥＧＳおよび関連するコントロール分子でトランスフェクトされ得る。細胞は、ｃＤＮＡを得るために処理され、オフターゲットの証拠は、遺伝子チップおよび本明細書中に記載される他の技術ならびにタンパク質レベルでの炎症性サイトカイン産生についての高感受性の培養ベースのアッセイ（Ｅｌｉｓｐｏｔ、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用して決定される。トランスフェクションは、脂質キャリアを利用し得、そのキャリアとしては核酸による細胞の実験的トランスフェクションのために設計されたキャリア、および肺の中でのＥＧＳの取り込みを模倣するための合成ヒト肺界面活性物質（Ｅｘｏｓｕｒｆ）が挙げられる。ＥＧＳおよびＲＮＡｉの安定性は、ＥＧＳ特異的プライマーおよびＲＮＡｉ特異的プライマーを使用する定量的ＰＣＲによって決定される。
【０１４３】
ＩＬ−４／ＩＬ−１３および他の炎症性サイトカインに応答性である多数の特徴づけされたヒトＩＬ−４応答性細胞およびヒトＩＬ−１３応答性細胞の上皮細胞株は両方とも、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能である。ＩＬ−４に応答性であるヒトジャーカットヒトＴリンパ芽球腫細胞株およびラモスＢリンパ腫細胞株ならびに他のリンホカインがまた利用可能である。ＥＧＳの安定性およびオフターゲットは、ヒトの刺激していない上皮細胞および造血細胞の両方のモデルならびにＩＬ−４およびＩＬ−１３および例えば、インフルエンザ病因の危険性が増加していることが知られている喘息患者の肺に存在する他の炎症性サイトカインによって誘導される炎症状態にある細胞において近似され得る。ウイルス複製およびＥＧＳの安定性に対するＥＧＳの効果は、ウイルス遺伝子発現のＰＣＲ定量化、ノーザンブロッティング定量化およびウエスタンブロッティング定量化、ならびに当業者に公知の非炎症性細胞状態および炎症性細胞状態の両方における他の感受性測定により、これらのヒト細胞株において立証される。
【０１４４】
インビボ分析のために、ＥＧＳは、生理食塩水中で、鼻腔内に、マウスの鼻の通路に１μＭの肺内濃度を達成するための濃度の範囲で投与される。ＥＧＳは、最初にインフルエンザの擬似感染の存在下で投与され、ＥＧＳに起因する顕著な病理が明らかではない場合、マウスはＥＧＳに露出され、インフルエンザを同時感染される。致死、体重減少および回復のような結果を、インビボでのインフルエンザに対するＥＧＳの効力の指標として使用する。
【０１４５】
ＥＧＳおよび適切なコントロールは、共存症状態の存在下でＥＧＳの効果および薬物動態学のモデルとしての生きているマウスおよび他の動物の鼻の通路に滴下される。生理的な状態の変化した（例えば、他の呼吸性ウイルス感染症を感染している）マウスモデルは、代謝の変化、組織分布の変化、オフターゲットの変化または共存症状態により明らかになる他の病理を探索するために利用され得る。オフターゲットの証拠は、遺伝子チップおよびマウス細胞について記載される他の技術を使用して決定される。同様の実験は、ＲＮＡ酵素治療のこの代替的な標的におけるＥＧＳの代謝を決定するためのインフルエンザの野生の保有者である家禽（ニワトリまたは子ガモ）において行われ得る。ＲＮＡｉのオフターゲットの証拠は、ＥＧＳと比較するために決定される。
【０１４６】
マウスの肺における造血性細胞および非造血性細胞に対する喘息およびＩＬ４／ＩＬ１３の効果のモデルが記載されている（Ｋｅｌｌｙ−Ｗｅｌｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｕｎｏｌ．１７２（７）：４５４５−４５５５（２００４））。ＥＧＳを標的する喘息の炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ４／ＩＬ１３）がまた記載されている（Ｄｒｅｙｆｕｓら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．４（８）：１０１５−１０２７（２００４））。これらのモデルを使用して、インフルエンザの病因のいくつかがＩＬ−４およびＩＬ−１３を遮断するためのＥＧＳ治療により遮断され得るか否かを決定する。インフルエンザは、喘息および関連する炎症性肺疾患を有する患者には、特に危険である。インフルエンザの弱毒化した生きたワクチンは、喘息を罹患する患者には禁忌であり、喘息を罹患する患者は、従来の死滅させたワクチンで予防接種した後でさえ喘息の再燃を有し得る。
【０１４７】
アレルギー性炎症およびインフルエンザウイルスに対するヒトトランスクリプトソームを標的する小型のヌクレアーゼ耐性のＥＧＳが記載されている。マウスをアレルギー性感作の前後に標準的な（非流行性の）インフルエンザに暴露して、インフルエンザが他の呼吸器系ウイルスと同様にＩＬ−４／ＩＬ−１３によって媒介される病理のように喘息をひどくさせることを確認した（Ｕｍｅｔｓｕ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０（３）：２３２−２３４（２００４）およびＤａｈｌら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（３）：３３７−３４３（２００４））。これらのマウスモデルを使用すると、ＥＧＳ標的するＩＬ−４／１３は、これらの病原性の効果のいくつかを遮断するのに十分であると予測される。これらのマウスモデルはまた、ＩＬ−４／１３に対するＥＧＳおよびインフルエンザ遺伝子を用いた併用治療が、耐容性であり、有効であるか否かを決定するために使用され得、喘息および関連する呼吸器系疾患を有する患者においてインフルエンザに対するさらなる治療を提供する。作製される器官特異的組織サンプルは、さらなる分析のためにＥＧＳで処置した喘息のマウスのタンパク質ライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーを調製するために使用される。病理研究のための器官サンプルおよび組織サンプルの調製、ならびにｃＤＮＡライブラリーの調製のためのｍＲＮＡの抽出は、当業者に公知の方法を使用して行なわれる。
【０１４８】
ヒト研究のために、インフルエンザの予防および／または治療のためのＥＧＳが、男性および女性の健常な成体ヒト志願者に吸入または鼻洗浄により与えられる。ＥＧＳ投薬およびＥＧＳの薬物動態が、生理食塩水により誘導された痰由来の上皮細胞、ならびにインフルエンザおよび喘息のマウスモデルの両方において静脈切開により得られた造血細胞、ならびにヒト上皮細胞株およびリンパ芽球状細胞株の分析によりモニタリングされる。生理食塩水により誘導された痰により得られ、モニタリングされた一次上皮細胞を、インビトロでインフルエンザにより二次的に感染させ、一次ヒト細胞におけるＥＧＳの効力を確認する。肺の機能をモニタリングし、それらとしては、吐き出された一酸化窒素の研究ならびに従来の肺研究（例えば、ＥＧＳにより誘導される非特異的炎症のマーカーとして吸入されたメタコリンに対する気道の応答）が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１ａは、内因性ヒトチロシンｔＲＮＡの前駆体ＲＮＡ（配列番号９８）の構造および配列であり、矢印で示されるのは、ＲＮＡｓｅ  Ｐによる前駆体の切断部位である。図１ｂは、ＲＮＡｓｅ  Ｐによる切断に指向され得るストランド内の塩基対形成を伴わないコンセンサス５’ＧＮＮＮＮＮＵを含む標的ｍＲＮＡ（配列番号９９）である。図１ｃは、ｍＲＮＡ標的に対する結合を示す外部ガイド配列（ＥＧＳ）と称される構造を形成するＴループ、可変ループおよびアンチコドンループを含むｔＲＮＡ配列（配列番号１００）である。ＥＧＳは、相補的な５’領域および相補的な３’領域によって標的ＲＮＡに結合する相補的配列を含む。この標的ｍＲＮＡの予想される切断部位（矢印）が、示される。
【図２】図２は、ヒト共有ＩＬ−４レセプターα鎖のｍＲＮＡ（配列番号１０１）のＴ１ヌクレアーゼマッピングである。Ｔ１ヌクレアーゼ感受性のＧ残基は、下線を引く。ＩＬ−４レセプターａ鎖のオープンリーディングフレームの開始コドンは、太字で示される。ヌクレオチドの番号は、ｃＤＮＡ配列決定によって決定され、そしてこの研究において確認された全長ＲＮＡ中の位置に対応する。潜在的なＥＧＳの標的は、斜体で示され、ＥＧＳ１の標的およびＥＧＳ２の標的は、紫色の文字で示される。
【図３】図３ａは、ヒトＩＬ−４レセプターα鎖のｍＲＮＡ（配列番号１０３）に結合された５’相補領域および３’相補領域を有するＥＧＳ１（配列番号１０２）の推定される構造および切断部位である。これらの配列は、慣習的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成の法則に基づくが、この研究においてインビトロまたはインビボで起きることは、実証されなかった。図３ｂは、ＥＧＳ１のインビトロにおける転写のための鋳型を、ｐＴｙｒ（ヒト野生型チロシンｔＲＮＡのｃＤＮＡを含むプラスミド）からのＰＣＲによって生成するために使用されたオリゴヌクレオチドＥＧＳ５０１（配列番号９４）およびＥＧＳ３０１（配列番号９５）である。同様のオリゴヌクレオチドＥＧＳ５０２およびＥＧＳ３０２は、ＥＧＳ２の転写のための鋳型を生成するために使用された。
【図４】図４ａおよび図４ｂは、ヒトＲａｍｏｓ細胞およびマウス４５／２ｗ１１細胞が、同時トランスフェクトしたＥＧＳ１配列の存在下において、ＩＬ−４遺伝子のＲＮＡｓｅＰ依存性であり、かつＩＬ−４非依存性である活性化を示すことを示し、これは、ルシフェラーゼ単位として測定された。図４ａは、Ｒａｍｏｓ細胞において、ＩＬ−４転写の活性化が有意に増加したことを、示されるような機能的Ｔループ  対  変異Ｔループ（ヒトＥＧＳ配列ｐｈＩＬ４Ｒｅ１．１  対  変異したＴ−ループコントロールｐｈＩＬ４Ｒｍｕｔｅ１．１（Ｔｍｕｔと示される）によって示す（ｐ＜０．０５）。ＩＬ−４遺伝子レポーターの活性化は、配列がマッチしたヒトＥＧＳを同時トランスフェクトした、ｐｈＩＬ４Ｒｅ１．１またはミスマッチしたＴ−ループコントロールｐｈＩＬ４Ｒｍｕｔｅ１．１（Ｔｍｕｔと示される）のいずれか  対  ｐｍＩＬ４Ｒｅ１．１またはｐｍＩＬ４Ｒｍｕｔｅ１．１のいずれかを同時トランスフェクトしたミスマッチしたマウスコントロールと顕著に合致した（ｐ＜０．０５）。推定されるように、マッチしたＴループコントロールｐｈＩＬ４Ｒｍｕｔｅ１．１は、ＲＮＡｓｅ  Ｐの非存在下におけるいくつかの慣習的なアンチセンスＲＮＡ効果に起因する。イオノマイシンの添加後、ＩＬ−４レポーターの活性化は、同時トランスフェクトしたｐｈＩＬ４Ｒｅ１．１または変異したＴ−ループコントロールｐｈＩＬ４Ｒｍｕｔｅ１．１のいずれかと同様であった（ｐ＞０．０５）。ＩＬ−４遺伝子発現は、ＥＧＳ相同領域中の対応するヒト配列由来の２つのヌクレオチドにおいて相補領域の違いを含む、ｐｍＩＬ４Ｒｅ１．１またはｐｍＩＬ４Ｒｍｕｔｅ１．１のいずれかによるバックグラウンドを超えて検出できなかった。図４ｂは、４５／２ｗ１１細胞において、基礎的な転写が、全長ｐＥＧＳ１．１の同時トランスフェクトを伴う用量依存的な様式で増加したことを示した（１ｍｃｇ  ｐＥＧＳ１．１のトランスフェクトについてはＥと示され、そして０．５ｍｃｇ  ｐＥＧＳ１．１については０．５Ｅと示される）。ＮＦｌｕｃと示されるＮＦ−κＢレポーターは、ＩＬ４およびイオノマイシンの非特異的効果に対するコントロールのようないくつかの実験に含まれた（ＮＦ−κＢレポーターの結果は、１０  １の因子により、ＩＬ４レポーターに対して標準化されて示される）。ヒトＩＬ−４レポーターの発現の減少は、示されるように（ｐ＜０．０５）、ＥＧＳ１の非存在下におけるＩＬ−４の添加によって明らかであったが、その他に、ヒトＩＬ−４およびＮＦ−κＢレポーターの両方の転写は、ＥＧＳ１発現の存在下において、ＩＬ−４と無関係であった。
【図１】
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【図４】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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