【手続補正書】
【提出日】平成28年5月2日(2016.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ核酸の合成方法であって、
ａ）少なくとも第１および第２の相互プライマー結合領域を含む標的鋳型を提供する工程、
ｂ）第１および第２のセグメントを含む第１のプライマーを提供する工程であって、第１のセグメントが鋳型上の第１の相互プライマー結合領域と実質的に相補的であり、第２のセグメントがループを形成することができるように、第２のセグメントが、第１のプライマーの別の領域、または第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含み、ここに、第１のプライマーが第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域と実質的に相補的な第２のセグメントを含む場合、第１の相互プライマー結合領域はまた、第１のプライマーの第２のセグメントと実質的に同一の鋳型上の領域を含む、工程、
ｃ）第１のセグメントを含み、第２のセグメントを含んでもよい第２のプライマーを提供する工程であって、第１のセグメントが鋳型上の第２の相互プライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２の領域がループを形成することができるように、前記含まれてもよい第２のセグメントが、第２のプライマー中の別の領域または第２のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含み、ここに、第２のプライマーが第２のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域と実質的に相補的な第２のセグメントを含む場合、第２の相互プライマー結合領域はまた、第２のプライマーの第２のセグメントと実質的に同一の鋳型上の領域を含む、工程、
ｄ）第１および第２の相互プライマー結合領域の間の領域に結合することができる少なくとも１個のステムプライマーを提供する工程、ここに、前記少なくとも１個のステムプライマーが、
（ｉ）ポリ核酸上のプライマー結合部位に相補的であるプライマーであって、該プライマー結合部位に実質的に相補的なプライマー領域の３’または５’に５個未満のヌクレオチドを含む、単純プライマー、
（ｉｉ）第１および第２のセグメントを含むプライマーであって、第１のセグメントは、鋳型上のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２のセグメントは、第２のセグメントがループを形成することができるように、第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含む、ループ形成プライマー、
（ｉｉｉ）第１および第２のセグメントを含むプライマーであって、第１のセグメントは、鋳型上のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第２のセグメントは、該プライマーの別の領域に実質的に相補的な配列を含む、ヘアピンプライマー、
（ｉｖ）逆方向反復の間にリンカー配列を含有するヘアピンプライマーである、ループ提供プライマー、または
（ｖ）キメラプライマーである、工程
ｅ）ポリ核酸の合成を実施するために必要な試薬および条件を提供する工程、
ｆ）ポリ核酸の合成を実施する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１個のステムプライマーが、
（ｉ）単純プライマー；
（ｉｉ）第２のセグメントは、第１のプライマーの第１のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的であり、第２のセグメントがループを形成することができるように、標的鋳型中の領域と実質的に同一である配列を含む、ループ形成プライマー；
（ｉｉｉ）ヘアピンプライマー；または
（ｉｖ）ループ提供プライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１個のステムプライマーがキメラプライマーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
合成が、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、鋳型リプライミング増幅（ＴＲＡ）、自己伸長増幅（ＳＥＡ）およびＳＭａｒｔ増幅法（ＳＭＡＰ）からなる群から選択される核酸増幅技法を使用して実施される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域が２個以上のプライマーの結合部位を含み、ここに、該２個以上の結合部位が全て標的鋳型および／またはアンプリコンの同じ鎖上に位置していてもよく、または標的鋳型および／またはアンプリコンの異なる鎖上に位置していてもよい、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域に結合する前記２個以上のプライマーが、
（ａ）同じ種類であり、ここに、該２個以上のプライマーはループ形成プライマーであってもよく、または
（ｂ）異なる種類である、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）フォワードおよび／またはリバース相互プライマー結合領域に結合するプライマーがループ提供プライマー（ＬＰＰ）であり、および／または
（ｂ）フォワードおよびリバース相互プライマー結合部位が、ポリ核酸の合成がステムプライマー（複数可）の存在下においてのみ生じ得るように離れて位置する、
請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記（ａ）および（ｂ）であるか、または前記（ｂ）であり、試料中のメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）を検出するために使用され、例えば、ｍｅｃＡ遺伝子およびｏｒｆＸ配列を用いてＭＲＳＡが検出される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｄ）において、
（ｉ）１個のステムプライマーが使用されるか、または
（ｉｉ）同じ種類または異なる種類であってもよい２個以上のステムプライマーが使用される、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記（ｉｉ）において、工程（ｄ）において使用される前記２個以上のステムプライマーがアンプリコンの相互鎖またはアンプリコンの同じ鎖に結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステムプライマー（複数可）が、
（ａ）改変塩基を含有し、例えば、該改変塩基が、Ｎ４−メチルシトシン、イノシン、リボヌクレオチド、蛍光塩基、光分解塩基またはユニバーサル塩基からなる群から選択される、および／または
（ｂ）検出可能な部分で標識された核酸を含有し、例えば、該検出可能な部分が、蛍光標識、化学発光標識または電気化学的標識である、および／または
（ｃ）捕捉部分で標識された核酸を含有し、例えば、該捕捉部分がビオチンである、および／または
（ｄ）ニッカーゼ部位含有プライマー
である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記（ｂ）において、前記標識されたステムプライマーが、蛍光、化学発光または電気化学的レポーター系においてプローブとして使用される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）ポリ核酸の増幅が、遺伝子アレイ、ラテラルフローストリップ、電気泳動、質量分析および音波検出からなる群から選択される方法によって検出されるか、または
（ｂ）核酸の合成が、リアルタイム測定または終点測定を使用して検出される、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記（ｂ）において、ポリ核酸の増幅が、蛍光、生物発光、濁度または電気化学的測定からなる群から選択される検出系によって検出され、例えば、該核酸の合成がリアルタイムでの生物発光アッセイ（ＢＡＲＴ）レポーター系を使用して検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法であって、
（ａ）該方法が密封された容器中で実施されるか、または
（ｂ）生物の遺伝子コード中の特定のポリ核酸配列の存在を決定するための方法であるか、または
（ｃ）一塩基多型（ＳＮＰ）の検出のための方法であるか、または
（ｄ）診断用途で使用するための方法であるか、または
（ｅ）試料中の生物の検出または定量において使用するための方法であるか、または
（ｆ）遺伝子改変穀物を同定するため、遺伝子改変動物を同定するため、疾患状態を検出するため、治療による有害反応を予測するため、もしくは疾患状態感受性を予測するための方法。
【請求項１６】
前記（ｅ）において、前記生物が、
（ａ）微生物である、および／または
（ｂ）ウイルス、細菌、マイコプラズマおよび真菌からなる群から選択される微生物である、および／または
（ｃ）ここに、前記微生物は遺伝子改変生物（ＧＭＯ）であってもよい、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、少なくとも１個のステムプライマーを含むキットであって、さらに、熱安定性ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよび無機ピロリン酸（ＰＰｉ）をＡＴＰに変換する酵素および無機ピロリン酸（ＰＰｉ）をＡＴＰに変換する酵素に必要な任意の他の基質または補因子を含んでいてもよい、キット。