(57)【要約】本発明は、予防目的、診断目的、免疫治療目的、治療目的のためのインフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス抗原の生産のための、商用規模のプロセスに関する。本発明は、特に、インフルエンザワクチン生産のためのＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）由来の細胞株、および細胞培養ベースのプロセスを提供し、そして特にインフルエンザＡ型およびインフルエンザＢ型を含むヒトワクチンを提供する。
2007537760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）由来の細胞株であって、該ＭＤＣＫ由来細胞株の親のＭＤＣＫ細胞株よりもウイルス感染に対してより高い感受性を有することで特徴付けられる、細胞株。
【請求項２】
前記より高い感受性が、前記親細胞株において産生されるウイルス力価の少なくとも約１．２倍として定義される、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞株であって、ここで前記ウイルスが：インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、パポバウイルス、パラインフルエンザウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ワクシニアウイルス、コクサッキーウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群より選択される、細胞株。
【請求項４】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスまたはＲＳウイルスである、請求項３に記載の細胞株。
【請求項５】
前記インフルエンザウイルスがヒトインフルエンザウイルス株、ウマインフルエンザウイルス株、ブタインフルエンザウイルス株またはトリインフルエンザウイルス株を含む、請求項４に記載の細胞株。
【請求項６】
前記インフルエンザウイルスがヒトインフルエンザＡ型、ヒトインフルエンザＢ型、またはヒトインフルエンザＣ型から選択される、請求項５に記載の細胞株。
【請求項７】
前記インフルエンザウイルスがＡ型またはＢ型より選択される、請求項６に記載の細胞株。
【請求項８】
前記細胞株が、インフルエンザＡ型およびインフルエンザＢ型の両方に高感受性である、請求項７に記載の細胞株。
【請求項９】
非腫瘍形成性であることで特徴付けられる、ＭＤＣＫ由来の細胞株。
【請求項１０】
非腫瘍形成性であることで特徴付けられる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１１】
請求項１０に記載の細胞株であって、ここで前記非腫瘍形成性が、ヌードマウスにおいて、約３ヵ月後の観察での触知可能な小結節が存在しないこととして定義される、細胞株。
【請求項１２】
ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２の生物学的特性を有する、細胞株。
【請求項１３】
ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２として規定される、細胞株。
【請求項１４】
足場依存性であるとしてさらに特徴付けられる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１５】
予防目的、診断目的、免疫治療目的または治療目的のためのウイルス粒子またはウイルスタンパク質の製造のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞株の使用。
【請求項１６】
前記ウイルス粒子またはウイルスタンパク質が、ウイルス感染の予防のために使用されるワクチンの製造のために使用される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記ウイルス感染がインフルエンザウイルスによって引き起こされる、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記インフルエンザウイルスがヒトインフルエンザウイルス株、ウマインフルエンザウイルス株、ブタインフルエンザウイルス株またはトリインフルエンザウイルス株を含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記インフルエンザウイルスがヒトインフルエンザウイルスＡ型、ヒトインフルエンザウイルスＢ型、またはヒトインフルエンザウイルスＣ型から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記ウイルスがヒトインフルエンザＡ型またはヒトインフルエンザＢ型である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
インフルエンザウイルス感染の予防のためのワクチンの製造のために、ウイルス粒子またはウイルスタンパク質の産生が使用されるための、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２として規定される細胞株の、使用。
【請求項２２】
前記ウイルス感染がヒトインフルエンザウイルスＡ型またはヒトインフルエンザウイルスＢ型によって引き起こされる、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ウイルス感染がヒトインフルエンザウイルスＡ型およびヒトインフルエンザウイルスＢ型の両方によって引き起こされる、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
インフルエンザウイルス粒子またはインフルエンザウイルスタンパク質の産生のためのプロセスであって、以下：
ａ）該インフルエンザウイルスを複製可能であるＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞株を増殖させる工程；
ｂ）該細胞株にインフルエンザウイルス株を感染させる工程；および
ｃ）インキュベートして該ウイルスの複製を可能にする工程；および該複製されたウイルスを収集する工程
を包含する、プロセス。
【請求項２５】
ウイルス粒子または該ウイルス粒子由来のタンパク質を精製する工程をさらに包含する、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記ＭＤＣＫ細胞株がＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１２０４２の生物学的特性を有するとして規定される、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記ＭＤＣＫ細胞株がＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１２０４２として規定される、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記インフルエンザウイルスがヒトインフルエンザウイルス株、ウマインフルエンザウイルス株、ブタインフルエンザウイルス株またはトリインフルエンザウイルス株を含む、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２９】
前記ウイルスがヒトインフルエンザウイルスＡ型、ヒトインフルエンザウイルスＢ型、およびヒトインフルエンザウイルスＣ型からなる群より選択される、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項３０】
前記プロセスがバイオリアクターにおいて実施される、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項３１】
前記バイオリアクターが約５リットルのサイズである、請求項３０に記載のプロセス。
【請求項３２】
前記バイオリアクターが約５リットル〜５０００リットルのサイズである、請求項３０に記載のプロセス。
【請求項３３】
請求項２４に記載のプロセスであって、ここで、工程ａ）において、前記細胞がマイクロキャリア手段を含む培地中で増殖され、そして
工程ｂ）において、前記インキュベーションが灌流手段によって実施される、プロセス。
【請求項３４】
前記灌流手段が、前記収集においてマイクロキャリアの流出を避けるためにデカンターを備える、請求項３３に記載のプロセス。
【請求項３５】
前記マイクロキャリア手段が、約５ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌの濃度でマイクロキャリアビーズを含む、請求項３３に記載のプロセス。
【請求項３６】
前記マイクロキャリアビーズの濃度が約１０ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌの範囲にある、請求項３５に記載のプロセス。
【請求項３７】
前記マイクロキャリアビーズの濃度が約１５ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌの範囲にある、請求項３５に記載のプロセス。
【請求項３８】
前記灌流が、１日当たりバイオリアクターの約０．５〜４．０容量の速度で実施される、請求項３４に記載のプロセス。
【請求項３９】
請求項２４に記載のプロセスであって、ここで工程ｂ）において、前記インフルエンザウイルスが約１０：１〜１：１０１０の感染多重度で播種される、プロセス。
【請求項４０】
前記インフルエンザウイルスが、約１：１０〜１：１０８の感染多重度で播種される、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項４１】
前記インフルエンザウイルスが、約１：１０４〜１：１０７の感染多重度で播種される、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項４２】
前記インフルエンザウイルスが、約１：１０５〜１：１０６の感染多重度で播種される、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項４３】
請求項２４に記載のプロセスであって、ここで工程ａ）において、前記ＭＤＣＫ細胞株が約７日間増殖される、プロセス。
【請求項４４】
前記ＭＤＣＫ細胞株が、約３３℃〜４０℃の範囲の温度で増殖される、請求項４３に記載のプロセス。
【請求項４５】
前記ＭＤＣＫ細胞株が、約３６℃〜３８℃の範囲の温度で増殖される、請求項４３に記載のプロセス。
【請求項４６】
請求項２４に記載のプロセスであって、ここで工程ｂ）において、前記インフルエンザウイルスが約３０℃〜３７℃の温度で複製される、プロセス。
【請求項４７】
前記インフルエンザウイルスが約３２℃〜３４℃の温度で複製される、請求項４３に記載のプロセス。
【請求項４８】
前記インフルエンザウイルスが約３３℃の温度で複製される、請求項４３に記載のプロセス。
【請求項４９】
前記精製されたウイルス粒子またはウイルスタンパク質を使用して、インフルエンザウイルス感染を予防するためのワクチンを製造する、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項５０】
請求項４９のプロセスによって作製される、哺乳動物においてインフルエンザウイルス感染を予防するためのワクチン。
【請求項５１】
前記哺乳動物がヒトである、請求項５０に記載のワクチン。
【請求項５２】
請求項５０または５１に記載のワクチンを投与する工程を包含する、哺乳動物においてインフルエンザ感染を予防するための、方法。
【請求項５３】
請求項２４に従って単離された前記ウイルス粒子またはウイルスタンパク質を含み、保存剤と混合された、哺乳動物においてインフルエンザウイルス感染を予防するためのワクチン。
【請求項５４】
ワクチンを製造するための、請求項２４に記載のプロセスの、使用。
【請求項５５】
請求項２４に記載のプロセスであって、ここで前記精製されたウイルス粒子またはウイルスタンパク質を使用して、インフルエンザウイルス感染の検出のための診断キットを製造する、プロセス。
【請求項５６】
請求項２４に従って単離されたバルクのウイルス粒子またはウイルスタンパク質の、哺乳動物におけるインフルエンザウイルス感染の検出および診断のための、キットの製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年５月２０日に出願された米国特許仮出願第６０／５７２，６１２号の利益を主張する。この出願は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、予防目的、診断目的、免疫治療目的または治療目的のためのインフルエンザウイルスまたは抗原の製造のための商用規模のプロセスに関する。特に、本発明は、インフルエンザワクチン製造、そして特にインフルエンザＡ型およびインフルエンザＢ型を含むヒトワクチン製造のための、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）由来の細胞培養ベースのプロセスを提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
伝統的に、商用のインフルエンザワクチンは、胚含有の鶏卵においてワクチンウイルス種を増殖させることによって製造されている。このウイルスは、尿膜流体から収集され、そして処理されてワクチンを形成する。しかしながら、この手順は、大きな労力がかかり、そして卵当たりの収量が低いことを生じるという不利を有し、それらの要因は、流行期間の間に深刻な制限を提供する。従って、胚含有鶏卵の方法について、コスト、時間および収量の不利を克服する、インフルエンザワクチンの大規模製造のための必要性が存在する。
【０００４】
上記の代替的な方法は、インフルエンザ粒子またはウイルスタンパク質を製造するための細胞培養の使用を含む。
【０００５】
細胞培養を用いて製造されたインフルエンザワクチンは、卵において製造されたワクチンよりも安全であると考えられ、そして子供および成人により体験される、卵ベースのワクチンに対する過感受性を誘導しないはずである。このようなワクチンはまた、特に高齢者において、広範な種の野生株に対するよりよい保護を授けるはずである。なぜなら、ウイルス複製の忠実度は、卵におけるよりも細胞培養におけるほうがずっと大きいと考えられるからである（非特許文献１）。さらに、流行性および汎発性の場合において、卵の供給の制限に起因した、インフルエンザワクチンの現在可能である供給よりもより大きな供給が製造され得る。
【０００６】
インフルエンザウイルスＡ型およびインフルエンザウイルスＢ型の伝播は、種々の組織培養系において実証されており、その培養系としては、細片化された（ｍｉｎｃｅｄ）ニワトリ胚、ヒト胎児肺およびヒト胎児腎臓、サル腎臓およびウシ胎仔腎臓が挙げられる。
【０００７】
特に、イヌ腎臓（ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞は、インフルエンザウイルスの製造に関して有用であると示されているが、低収量であり、すなわち、ワクチン製造目的には不十分である。
【０００８】
イヌ腎臓細胞は、そもそも、Ｓ．Ｈ．ＭａｄｉｎおよびＮ．Ｂ．Ｄａｒｂｙによって、外観上正常である、成体のメスＣｏｃｋｅｒ  Ｓｐａｎｉｅｌの腎臓より１９５８年に誘導された（非特許文献２）。このＭＤＣＫ細胞株は、１９６４年にＡＴＣＣにより（番号ＣＣＬ３４の下で）受託され、そしていくつかのウイルス（水疱性口内炎ウイルス、ワクシニアウイルス、コサッキーウイルス、レオウイルス、およびアデノウイルスが挙げられる）の複製を可能にするとして同定された。
【０００９】
インフルエンザウイルスＢ型の連続伝播は、最初に、ＭＤＣＫ細胞株において、Ｇｒｅｅｎによって１９６２年に実証された（非特許文献３）。伝播は、連続する６回の組織培養の継代の各々における細胞変性効果およびヘマグルチニン（ＨＡ）（インフルエンザウイルスの主要な糖タンパク質）の存在によって、そして組織培養流体における卵感染力価によって、明らかであった。しかしながら、これらのデータは小規模に限定され、そしてワクチン目的のためのウイルス粒子の大規模生産を達成する手段もウイルスタンパク質の大規模生産を達成する手段も提供しない。Ｇａｕｓｈらは、ＭＤＣＫ細胞がまたインフルエンザＡ型の感染に感受性であることを１９６６年に実証した。しかしながら、この論文は、感染性のみを報告しており、そしてこの培地におけるウイルスの伝播の問題については取り組んでいなかった（非特許文献４）。
【００１０】
１９７５年に、Ｔｏｂｉｔａらは初めて、トリプシンを含むオーバーレイ培地において、構築されたＭＤＣＫ細胞株において、広範な種々のインフルエンザウイルスＡ型の増殖を記載した。これらウイルス伝播は、それらウイルスの以前の継代歴に関係なく十分に定義されるプラークを形成し、そしてＨＡポリペプチドを切断し、これによってインフルエンザウイルスの成熟を加速させることにトリプシンが寄与することを提案した。しかし、このトリプシンの使用がもたらす進歩にもかかわらず、寒天培地におけるウイルスの単離は、ウイルスの大量生産を達成する手段を提供しなかった。同参考文献において、またＭＤＣＫ細胞が、患者の喉洗浄物（ｔｈｒｏａｔ  ｗａｓｈｉｎｇ）からのインフルエンザウイルスＡ型の一次単離に関して首尾よく使用された。
【００１１】
続いて、Ｒｅｕｖｅｎｙらは、バッチ培養において、セルロースベースのマイクロキャリア上でのＭＤＣＫ細胞において、インフルエンザウイルスＡ型を増殖させた（非特許文献５）。得られたインフルエンザウイルスの力価は、胚含有卵において得られたものと同様にトリプシン含有培地中に存在した。
【００１２】
特許文献１（Ｂｒｏｗｎら）は、ウイルス培養の間にトリプシンのようなタンパク質加水分解酵素を培養物中に含むことによって、同じ液体培養物の逐次数の細胞中でのインフルエンザウイルスの複製のための方法を記載する。タンパク質分解酵素は、ＨＡを機能性にさせ、そしてこれによって既往の液体培養技術の１段階増殖サイクルに勝るために必要とされる。このことは、液体細胞培養物からの潜在的な「商用」インフルエンザワクチン製造の最初の記述である。しかしながら、現在、溶液中のトリプシンの存在が、ＭＤＣＫ細胞の特定の割合をそれらの固体支持体から浮遊させるという不利を有することが認められる。結果的に、この特許されたプロセスの潜在的な有用性にもかかわらず、トリプシンを要求することが、インフルエンザワクチンの商用生産に対する深刻な制限である。従って、インフルエンザワクチンの生産のための細胞培養ベースの商用プロセスのための必要性がさらに存在する。このことは、以下の記述によって支持される：非特許文献６。
【００１３】
また１９９５年に、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）は、その分野の専門家たちが、インフルエンザウイルスの生産のための細胞培養ベースのプロセスに関する近年の進展を評価するために会合した、１９９５年の夏に開催された議論を要約する摘要を発表した（非特許文献７）。この文書は、迅速にスケールアップの可能な、細胞培養物系において大量のインフルエンザワクチンの迅速な生産を達成するためのさらなる研究を奨励する。
【００１４】
研究目的に関して、細胞培養物中でのウイルスの増殖のため、ＭＤＣＫ細胞およびベロ（Ｖｅｒｏ）細胞が、いくつかのウイルスの良好な生産体であるとして最も頻繁に参照される。しかしながら、大規模生産目的のため、いくつかの要因（例えば、１つのウイルスまたは複数のウイルスに対する感受性、ウイルス力価の出来高（ｏｕｔｐｕｔ）、足場依存性、腫瘍形成性、など）が、別の細胞株の選択以上に特定の細胞株の選択に影響を与える。
【００１５】
ＭＤＣＫ細胞はいくつかのウイルス株に感受性であるが、結果的に乏しいウイルス力価により、大規模生産目的のためのこの細胞株の有用性が制限され得る。ＭＤＣＫ細胞株の特性は、いくつかの研究の課題であった。１９７０年に、Ｌｅｉｇｈｔｏｎら（非特許文献８）は、ＭＤＣＫ細胞が、コラーゲンでコーティングされたセルローススポンジ上での三次元的な組織培養の組織病理学的調製物において、乳頭状の腺癌の形態学的パターンを提示することを報告した。この細胞株の新生物性の特色（ｑｕａｌｉｔｙ）は、１１日齢または１２日齢のニワトリ胚に注入されるた細胞懸濁物が、脳転移の多くの病巣を形成する場合により実証された。
【００１６】
細胞株の腫瘍形成性の評価は、生物学的産物の製造における使用に対するその望ましさを評価するために重要である。米国食品医薬品局のＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈは、生物学的物品の製造のための基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）として細胞培養物を使用する場合に考慮する要点を発表した（非特許文献９を参照のこと）。このような要点の１つは、使用される細胞株の腫瘍形成性であり、そしてＦＤＡは、インビボ腫瘍形成性試験のためのガイドラインを考案した。これらのガイドラインは、とりわけ、ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）において、皮下経路または筋肉内経路により投与された細胞を試験することを指示する。
【特許文献１】米国特許第４，５００，５１３号明細書
【非特許文献１】Ｋａｔｚ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（１９８９）１６０：１９１
【非特許文献２】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（１９９２）第７版、ｐ２１
【非特許文献３】Ｇｒｅｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９６２）１３８：４２
【非特許文献４】Ｇａｕｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ，ａｎｄ  Ｍｅｄ．（１９６６）１２２：９３１
【非特許文献５】Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ（１９８２）５０：１１５
【非特許文献６】Ｋｏｄｉｈａｌｌｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９（８）：４８８８：「Ｅｍｂｒｙｏｎａｔｅｄ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｇｇｓ  ａｒｅ  ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ  ｔｈｅ  ｏｎｌｙ  ｈｏｓｔ  ｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｓｈｏｒｔ  ｔｉｍｅ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｔｏ  ｅｎｓｕｒｅ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｕｐｐｌｙ」
【非特許文献７】Ｂｕｌｌ．Ｗ．Ｈ．Ｏ．７３（４）：４３１，１９９５
【非特許文献８】ＬｅｉｇｈｔｏｎらＣａｎｃｅｒ（１９７０）２６：１０２２
【非特許文献９】Ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｕｓｅｄ  ｔｏ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ＦＤＡ（ＵＳＡ），１９９３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
従って、本発明は、インフルエンザウイルス粒子またはインフルエンザタンパク質の大規模生産のためのプロセスに関し、このプロセスは、以下の工程を包含する：
（ａ）上記インフルエンザウイルスを複製可能であるＭＤＣＫ細胞株を増殖させる工程；
（ｂ）このＭＤＣＫ細胞株にインフルエンザウイルス株を感染させ、そしてインキュベートしてそのウイルスの複製の可能にする工程；および
（ｃ）複製されたウイルスを収集し、ウイルス粒子またはそのタンパク質を精製する工程。
【００１８】
本発明は、ウイルス感染に高感受性であるＭＤＣＫ細胞株に由来し、そしてそれら由来の親細胞株よりも高いウイルス力価でインフルエンザウイルスを産生する細胞株を、さらに提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
１実施形態において、本発明のＭＤＣＫ由来の細胞株は、インフルエンザウイルスの多段階複製を可能にする。別の実施形態において、本発明のＭＤＣＫ細胞株は、足場依存性であり、かつ非腫瘍形成性である。
【００２０】
本発明は、ウイルス感染に超感受性であるＭＤＣＫクローンの誘導体を提供する。「超感受性」との記載は、少なくとも１つのウイルスに高感受性であり、これによって親ＭＤＣＫ細胞株よりもより高力価のウイルス粒子を産生するＭＤＣＫ由来の細胞株を示すために、使用される。この誘導化クローン（ＭＤＣＫ．５Ｆ１）は、番号ＣＲＬ−１２０４２の下で１９９６年２月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託された。１実施形態において、ＭＤＣＫ由来の本発明の細胞株は、ＦＤＡガイドラインに従って行われた試験において非腫瘍形成性であり、そしてこれによって予防目的、診断目的、免疫治療目的または治療目的のためのウイルスまたは抗原の調製における使用に適切であり得る。この細胞株は、混入する微生物の存在について試験されており、そしていずれも検出されていない。また、本発明に従って、ワクチン製造のためのインフルエンザウイルス粒子またはインフルエンザウイルスタンパク質の大規模生産のためのプロセスが提供される。
【００２１】
また、本発明の１局面に従って、インフルエンザワクチンの製造のためのインフルエンザウイルス粒子またはインフルエンザウイルスタンパク質の生産のための、大規模で細胞培養によるマイクロキャリアベースの商用プロセスが提供される。
【００２２】
本発明のプロセスは、インフルエンザウイルスの複数回の複製のためにＭＤＣＫ細胞株を使用して実施される。１実施形態において、本発明のプロセスにおいて使用されるＭＤＣＫ細胞株は、ＡＴＣＣ細胞株番号ＣＲＬ−１２０４２と同じ生物学的特性を有する。１実施形態において、本プロセスにおいて使用される細胞株は、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１２０４２の下で受託された、ＭＤＣＫ．５Ｆ１として本明細書中で称されるＭＤＣＫ細胞株のクローンである。
【００２３】
本発明のＭＤＣＫ由来の細胞株は、ウイルス感染に高感受性である。この文脈において、ウイルス感染に「高感受性である」とは、その細胞株が、少なくとも１つのウイルス種に対して親細胞株によって産生される力価よりも高い力価を産生し得ることを意味する。
【００２４】
１実施形態において、「高感受性」とは、親細胞株によって産生される力価よりも少なくとも約１．２倍の力価でウイルスを産生し得る細胞株として定義される。１実施形態において、より高感受性の細胞株は、３Ｂ５、５Ｆｌ、１Ｄ１１、５Ｈ１２、９Ｃ２、９Ｄ９、Ｐ７９、９Ｅ９、７Ｃ１およびＰ１２３からなる群より選択されるクローンである。
【００２５】
さらに１実施形態において、より高感受性とは、それらの同じウイルスに関して、親細胞株によって産生される力価の少なくとも２倍の力価で多数のウイルスを産生し得る細胞株として定義される。１実施形態において、このようなクローンは、３Ｂ５、５Ｆ１、５Ｈ１２、９Ｃ２、７Ｃ１およびＰ１２３からなる群より選択される。
【００２６】
１実施形態において、より高感受性とは、同じウイルスの２つの異なる株について、親のウイルス力価の少なくとも約２倍を産生し得るとして定義される。１実施形態において、このようなクローンは、ＲＳウイルスおよびインフルエンザＡ型およびインフルエンザＢ型に関して親のウイルス力価の２倍を産生し得る。１実施形態において、このようなクローンは、５Ｆ１および５Ｈ１２からなる群より選択される。
【００２７】
１実施形態において、細胞株は、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、パポバウイルス、パラインフルエンザウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ワクシニアウイルス、コクサッキーウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルスおよび他のウイルスからなる群より選択されるウイルスによって感染され得る。
【００２８】
１実施形態において、ウイルスは、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型およびインフルエンザＣ型；ＲＳウイルス；パポバウイルス；水疱性口内炎ウイルス（インド株）；コクサッキーウイルスＢ−５；レオウイルス２型およびレオウイルス３型；ならびにアデノウイルス４型およびアデノウイルス５型からなる群より選択される。
【００２９】
１実施形態において、ウイルスは、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型およびインフルエンザＣ型、ならびにＲＳウイルスからなる群より選択される。
【００３０】
１実施形態において、ウイルスは、ヒトインフルエンザ株、ウマインフルエンザ株、ブタインフルエンザ株またはトリインフルエンザ株から選択される。
【００３１】
１実施形態において、ウイルスは、ヒトインフルエンザＡ型、ヒトインフルエンザＢ型またはヒトインフルエンザＣ型から選択される。
【００３２】
１実施形態において、本発明の細胞株は、ヒトインフルエンザウイルスＡ型またはヒトインフルエンザウイルスＢ型によって感染され得る。
【００３３】
１実施形態において、本発明の細胞株は、ヒトインフルエンザＡ型およびヒトインフルエンザＢ型のの両方に感染され得る。
【００３４】
１実施形態において、本発明の細胞株は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パンクレアチン、パパイン、プロナーゼおよびカルボキシペプチダーゼのようなタンパク質分解酵素の添加によってインフルエンザウイルスの多段階複製を可能にする。１実施形態において、このような細胞株は、トリプシンの添加によってインフルエンザウイルスの多段階複製を可能にする。
【００３５】
あるいは、本発明の細胞株は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パンクレアチン、パパイン、プロナーゼおよびカルボキシペプチダーゼのようなタンパク質分解酵素の添加を必要とすることなく、インフルエンザウイルスの多段階複製を可能にする。１実施形態において、このような細胞株は、トリプシンの添加を必要とすることなくインフルエンザウイルスの多段階複製を可能にする。
【００３６】
どのウイルスまたはウイルス株がタンパク質分解酵素の使用を必要とし得るかは、当業者に明らかである。
【００３７】
本発明の細胞株を懸濁して培養し得るが、この細胞株を足場依存性様式で増殖させることが好ましい。１実施形態において、この細胞株はマイクロキャリアビーズ上で増殖し得、これによって高密度の細胞が細胞培養物中に得られることを可能にする。
【００３８】
１実施形態において、本発明のＭＤＣＫ由来の細胞株は、非腫瘍形成性である。１実施形態において、本発明の細胞株は、軟寒天中で最小限の効率（すなわち、１％未満の効率）で増殖する。１実施形態において、本発明の細胞株は、ヌードマウスにおいて、少なくとも３ヶ月間観察される場合、小結節を生じない。
【００３９】
本発明は、バルク量でウイルス粒子またはウイルスタンパク質の産生のために、本発明に従う細胞株の使用をさらに企図する。
【００４０】
このようなウイルス粒子またはタンパク質は、宿主におけるウイルス感染の予防のためのワクチンの製造において使用され得る。１実施形態において、この宿主は哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、ヒト種、ウマ種、ブタ種が挙げられる。別の実施形態において、この宿主はヒトである。さらなる実施形態において、この宿主はトリ種（例えば、ガチョウまたはニワトリ）である。
【００４１】
本発明のプロセスは、足場依存性ＭＤＣＫ細胞が培養物中で増殖する能力にトリプシンの存在が影響を与えない限り、トリプシンの存在下で実施されてもトリプシンの非存在下で実施されてもよい。１実施形態において、本プロセスは、約４μｇ／ｍｌ以下の濃度のトリプシンの存在下で実施される。あるいは、本プロセスはトリプシンの非存在下で実施される。
【００４２】
本明細書中に記載のプロセスは、ＲＳウイルスおよび種々のインフルエンザウイルス（例えば、ヒトインフルエンザウイルス株、ウマインフルエンザウイルス株、ブタインフルエンザウイルス株およびトリインフルエンザウイルス株）の産生のために意図される。１実施形態において、本明細書中に記載されるプロセスは、ヒトインフルエンザＡ型、ヒトインフルエンザＢ型、またはヒトインフルエンザＣ型の産生のために意図される。１実施形態において、本明細書中に記載されるプロセスは、ヒトインフルエンザＡ型またはヒトインフルエンザＢ型の産生のために意図される。１実施形態において、本明細書中に記載されるプロセスは、ヒトインフルエンザＡ型またはヒトインフルエンザＢ型のいずれかのウイルス型に感染され得るＭＤＣＫ細胞株を使用して、ヒトインフルエンザＡ型およびヒトインフルエンザＢ型の産生のために意図される。
【００４３】
本発明のプロセスは、１０６個のＭＤＣＫ細胞あたり４μｇ  ＨＡの範囲である収量を提供する。実施例９に記載されるように、本プロセスは１０６個のＭＤＣＫ細胞当たり４μｇ  ＨＡより多くの量のウイルスタンパク質を生じ、より具体的には１０６個の細胞当たり９μｇ  ＨＡの範囲で生じる。
【００４４】
「大規模プロセス」とは、多量のインフルエンザウイルスを製造するためのプロセスを意味する。このようなプロセスは、通常、培養フラスコとは対照的に、バイオリアクターにおいてなされる。このようなバイオリアクターは、（最終的な収量）／（必要とされる用量）に依存して変動性のサイズであり得る。例えば、このようなバイオリアクターは、約５リットルのサイズ（約４リットルの作業容量）であり得るか、または５０００リットルまでであり得る。無論、大規模な細胞培養ベースのワクチン製造の当業者に明らかであるように、全ての反応物、培地、栄養分、細胞濃度、マイクロキャリア濃度、灌流速度などは、そのバイオリアクターのサイズに従って調節され得る。
【００４５】
本発明のプロセスは、懸濁培養において実施され得るが、細胞濃度を上昇させる（そしてこれによってウイルス出来高を向上させる）ためにマイクロキャリア手段において実施されることが好ましい。例えば、デキストランポリマー（ＣｙｔｏｄｅｘＴＭ）として当該分野で通常公知の型のマイクロキャリアビーズが選択され得る。これらのマイクロキャリアは、約５ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌの範囲の濃度で使用され得る。１実施形態において、このマイクロキャリア濃度は、約１０ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌの範囲にある。１実施形態において、このマイクロキャリア濃度は、約１５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの範囲にある。
【００４６】
灌流手段は、プロセス中の細胞増殖およびウイルス複製の両方を最大にするように導入される。灌流は、同時に培養培地中の潜在的に毒性の副産物の蓄積を避ける手段を提供しながら、栄養分の一定の供給を可能にする。灌流を介して、栄養分の型および質量は、プロセスの種々の段階の間に変動され得る。例えば、血清は、増殖期の間に細胞に導入され得るが、理想的には、細胞の集密期（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）においてそしてウイルスの導入前に排除されるべきである。その灌流速度は、適切な栄養供給を提供するために、細胞増殖の間に徐々に上昇され得る。灌流はウイルス複製の間に継続される。
【００４７】
灌流速度は、プロセスの段階に依存して、１日当たりバイオリアクターの約０．５〜４倍容量の間で調節される。
【００４８】
灌流手段が、バイオリアクターに追加され得る。この灌流手段は、そのバイオリアクター中に培地を連続的に導入するための流入口手段、およびそのバイオリアクターから消費された培地を連続的に除去するための２つの出口手段を備え（これによってそのバイオリアクター中でマイクロキャリアの懸濁を介して培地の連続的な流動を形成する）、そしてその出口手段と一体化したデカンターを備える。本明細書中に記載されそして本発明のプロセスにおいて使用されるデカンターは、上記に提案されるような灌流手段を用い、１０ｇ／Ｌの過剰なマイクロキャリア濃度を使用して、上方へと移動しそしてその出口手段を通って抜け出るかまたはその出口手段を詰まらせるかのどちらかのマイクロキャリアの傾向によって細胞増殖が制限されることが認められる場合の、５Ｌ（３．７Ｌの作業容量）のバイオリアクターに対して具体的に設計された。従って、より高いマイクロキャリア濃度を達成するため、以下の、デカンター内で乱流形成を最小にし、そして懸濁の上方への流速よりも速いマイクロキャリアの沈降速度を達成する特徴を有するデカンターが、構築された。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態に従って、図１に示されるようなデカンター１０は、下側チャンバ１を備え、この下側チャンバ１はより大きな上側チャンバ２と放射状プレート３によって接続される。２つの出口手段４は、このデカンターの頂部において上側チャンバ２に取り付けられる。この下側チャンバ１および上側チャンバ２は、半円筒形状であり、そして同軸上に向けられる中央の円形空洞５を取り囲み、この中央の円形空間５は、このバイオリアクターの中央回転シャフト、および本発明のプロセスをモニタリングするためにこのバイオリアクター中に導入される種々のプローブを収容するように意図される。中実の金属壁は、このデカンターを完全にする。
【００５０】
図２は、上記の構成要素２、４および５の上正面図を示す。
【００５１】
図３は、デカンターの下側チャンバ１の下正面図を示す。下側チャンバ１は、規則正しく分配した複数の長手軸チャネル６を有し、この長手軸チャネル６は、円周方向に向けられる長手軸方向の区画７によって分離され、この長手軸チャネルは、そのデカンターの上側チャンバ２および放射状プレート３を介して互いに連絡している。１実施形態において、長手軸チャネル６は同一であり、そして各々は円形の断面を有する。さらに、複数の長手軸チャネル６は、同軸上に向けられた中央の円形空洞５の周りに規則正しく分配され、その周囲の長手軸チャネル６は、円周方向に向いた長手軸方向の区画７によって互いから分離されている。
【００５２】
灌流手段の出口手段は、感染の際に廃液レザバから収集レシピエントへと切り換えられる。連続的な収集は、複製が完了するまで（約４〜５日）生じる。
【００５３】
本発明のプロセスは、１０：１〜１：１０１０の間の感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）でのウイルスによってＭＤＣＫ細胞培養物を播種することによって実施される。１実施形態において、このプロセスは、１：１０〜１：１０８の間の感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）で実施される。１実施形態において、このプロセスは、約１：１０４〜１：１０７のＭ．Ｏ．Ｉにおいて実施される。１実施形態において、１：１０５〜１：１０６のＭ．Ｏ．Ｉにおいて実施される。
【００５４】
１実施形態において、本発明のプロセスにおけるＭＤＣＫ細胞の増殖は、温度約３３℃〜４０℃において約７日〜１０日間実施される。１実施形態において、このプロセスにおけるＭＤＣＫ細胞の増殖は温度約３６℃〜３８℃において、約７日間実施される。
【００５５】
１実施形態において、本プロセスにおけるＭＤＣＫ細胞の増殖は、温度約３７℃で約７日間実施される。１実施形態において、本発明のプロセスにおけるウイルス複製は、温度約３０℃〜３７℃において約４日〜６日間実施される。１実施形態において、このプロセスにおけるウイルス複製は、温度約３２℃〜約３４℃で約５日間実施される。１実施形態において、このプロセスにおけるウイルス複製は、温度約３３℃で実施される。
【００５６】
ウイルス粒子またはウイルスタンパク質は、以下の方法で精製される。ウイルス収集物の濾過の後に、ホルムアルデヒドを用いた濾過物の不活性化が続く。次いで、得られた不活性化ウイルス懸濁物は遠心分離され、そして富化されたウイルス画分は、ワクチン調製物における使用のために選択される。
【００５７】
本発明のワクチンを投与する工程を包含する、哺乳動物におけるインフルエンザ感染の予防のための方法もまた、提供される。
【００５８】
精製されたウイルス粒子またはタンパク質を使用してインフルエンザウイルス感染の検出のための診断キットを生産するプロセスもまた、提供される。
【００５９】
哺乳動物におけるインフルエンザウイルス感染の検出および診断のためのキットを生産するための、単離されたバルクのウイルス粒子またはウイルスタンパク質の使用もまた、提供される。
【００６０】
本発明者らのプロセスの使用の特定の例および選択されたヒトインフルエンザウイルスＡ型株およびヒトインフルエンザウイルスＢ型株の増幅は、以下に考察される。本発明の配置および構成要素において、本発明の本質および範囲から逸脱することもなく、その物質の利点の全てを損なうこともなく、種々の変更がなされ得ることは明らかであり、以下に記載される形態は、単なる好ましい実施形態または単なる例示的な実施形態である。
【実施例】
【００６１】
実施例１は、クローンＭＤＣＫ．５Ｆ１の誘導を記載する。実施例２は、ＭＤＣＫ．５Ｆ１細胞株の純度を検討する。実施例３は、トリプシン有りおよび無しでの、ＭＤＣＫ．５Ｆ１細胞株における、インフルエンザウイルスの増殖を示す。実施例４は、ＭＤＣＫ．５Ｆ１についての腫瘍形成能研究のまとめである。実施例５は、ＭＤＣＫ．５Ｆ１の細胞懸濁物による、胸腺欠損ヌードマウスの接種後の結果を議論する。実施例６は、プロセスの特定の実施形態の段階的な説明である。実施例７は、トリプシン有りでの親ＭＤＣＫ細胞とインフルエンザ株Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／ｌｌ／８７とを使用して実行されたアッセイの結果を記載する。実施例８は、トリプシン無しでのＭＤＣＫ．５Ｆ１細胞とインフルエンザ株Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／ｌｌ／８７とを使用して実行されたアッセイの結果を記載する。実施例９は、トリプシン無しでのＭＤＣＫ．５Ｆ１細胞とインフルエンザ株Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４とを使用して実行されたアッセイの結果を記載する。
【００６２】
（実施例１）
（クローンＭＤＣＫ．５Ｆ１の誘導）
ＭＤＣＫ細胞Ｎｏ．ＣＣＬ  ３４をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから取得した。このストックを、３．４×１０６細胞を含む１ｍｌアンプル中の凍結状態で受け取った。この細胞株は、５４回継代したものだった。
【００６３】
継代後、ＭＤＣＫ細胞を、６４回目の継代で回収し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含み、１：１の比でのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）および培地１９９からなる栄養培地（ＤＭＥＭ−１９９）中に希釈した。次に、各ウェルが細胞を１個未満受容するように、希釈した細胞懸濁物を９６ウェルプレートにアリコートし、溶液中の細胞の均一な分配とみなした。これらのプレートを、３７℃でＣＯ２インキュベーター中に置き、増殖について、これらのウェルをスコア付けするために、一週間の間隔において光学顕微鏡下で調べた。
【００６４】
クローンにおいて求めた特徴を、以下から選択した：
（１）ウイルス感染に対する、親株よりも高い感受性（すなわち、クローンが、親株より高いウイルスの力価を生成する）；
（２）１つより多いウイルスに対する、より高い感受性（一実施形態において、インフルエンザウイルスのいくつかの株に対する感受性）；
（３）タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）の添加の必要なく、インフルエンザウイルスの多段階の複製を可能にする能力；および、必要に応じて、
（４）足場依存性（すなわち、培養中でのより高い細胞の濃度を得るため）。
表１は、トリプシンの添加なしでの、インフルエンザウイルスＡ型およびインフルエンザウイルスＢ型による感染に対する、いくつかのクローンの感受性を示す。
【００６５】
【表１】
2007537760.tif 000003
「高感受性」を、ＴＣＩＤ５０により評価した場合に、少なくとも親細胞株の約１．２倍の感受性として定義した。クローン３Ｂ５、５Ｆ１、１Ｄ１１、５Ｈ１２、９Ｃ２、９Ｄ９、Ｐ７９、９Ｅ９、７Ｃ１およびＰ１２３を、感受性が高いとして同定した。クローン３Ｂ５、５Ｆ１、１Ｄ１１、５Ｈ１２、９Ｃ２、９Ｄ９、７Ｃ１およびＰ１２３を、親株の少なくとも２倍の感受性であるとして同定した。
クローン５Ｆ１および５Ｈ１２を、感受性が最も高い２クローンとして選択し、そして５Ｆ１を、ＭＤＣＫ．５Ｆ１として本明細書中で称される細胞株を樹立するために選択した。
【００６６】
細胞の世代数を、クローニングの時点において０として定義し、続く各々の細胞培養物における細胞の数え上げにより計算した。最初、マルチウェルプレート培養で培養物を継代し、最終的にプラスチック製フラスコに移した。
さらに、実験を、親ＭＤＣＫ細胞株およびＭＤＣＫ．５Ｆ１クローンの、ＲＳウイルスによる感染に対する感受性を測定するために、このウイルスを用いて実行した。ウイルス力価は、ＭＤＣＫ細胞株は、ＲＳウイルスの宿主Ｈｅｐ２細胞株よりも感染に対し、より非感受性であったが、ＭＤＣＫ．５Ｆ１クローンは、このウイルスによる感染に対し、親ＭＤＣＫ細胞株よりも約１０倍感受性が高かったことを示した。
【００６７】
（実施例２）
（ＭＤＣＫ．５Ｆ１のクローン性の決定）
選択された任意の特定のクローンのクローン性を決定するパラメータは、クローンが選択されたマルチウェルプレート上のパーセンテージ増殖である。選択された培養物が実際にクローンである可能性（すなわち、Ｐ（１））は、このパーセンテージから決定される（ＣｏｌｌｅｒおよびＣｏｌｌｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１２１、ｐｐ．４１２〜４１７（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）を参照のこと）。
【００６８】
５％のウェルが、このクローニングにおいて増殖を示したと仮定すると、細胞株ＭＤＣＫ．５Ｆ１が単一の細胞に由来する可能性は、≧９７．５％である。
【００６９】
２９９アンプルの親細胞バンク（Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）（ＭＣＢ）および２８３アンプルの製造者の作業用細胞バンク（Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）（ＷＣＢ）を、ＭＤＣＫ．５Ｆ１細胞株から調製した。これらのバンクを、Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅの方針上のカナダ国の指針にしたがって調製し、真菌因子、酵母因子、マイコプラズマ因子、細菌因子およびウイルス因子の形態での汚染について評価した。いかなる種類の汚染も見出さなかった。
【００７０】
持続可能かつ生存可能な培養物を、調製した細胞バンクから取得し、細胞株を、ＷＣＢよりも５０回集団倍化したものについての産物の産生の安定性、形態学、腫瘍形成能およびイソ酵素の特徴について試験した。これらの結果は、これらの特徴について安定である細胞株を示した。
【００７１】
（実施例３）
（トリプシンの添加有りおよびトリプシンの添加無しでの、ＭＤＣＫ．５Ｆ１クローンにおける、インフルエンザウイルスの増殖を示す実験）
トリプシンの存在下および非存在下において、クローンＭＤＣＫ．５Ｆ１の培養物中で、インフルエンザウイルスが複製する能力を決定するために、実験を実行した。インフルエンザ株Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ、インフルエンザ株Ａ／Ｔｅｘａｓおよびインフルエンザ株Ｂ／Ｈａｒｂｉｎを使用した３つの実験の結果を表２に示す。
【００７２】
【表２】
2007537760.tif 000004
これらの結果は、血球凝集（ＨＡ）力価の値により示されるように、トリプシン有りおよび無しで、インフルエンザが、細胞培養物中で複製される場合に実質的な違いが何もないことを明らかにする。
【００７３】
（実施例４）
（インビトロ腫瘍形成能研究のまとめ）
Ｆｕｒｅｓｚら（Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．ｖｏｌ．７０、ｐｐ．２３３〜２４３、Ｓ．Ｋａｒｇｅｌ編、Ｂａｓｅｌ、１９８９）により記載される方法にしたがって、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−１９９培地中の０．６％寒天の４ｍｌを、直径３５ｍｍのウェルを６つ備える組織培養皿内に固化させた。固化後、これらのウェルを、４２℃に維持された、０．３％  Ｗ／Ｖの非ゲル状の寒天と６０，０００細胞／ｍｌの細胞濃度とを含む３ｍｌの培地で重層した。プレートを、５％  ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。光学顕微鏡観察を、３日目、７日目、１０日目および１４日目に行った。コロニーは、軟寒天中に球状の群を形成する、４個以上の細胞からなった。パーセンテージ有効性を、プレートした細胞の総数で割った、計数された細胞コロニーの数の比により決定した。
【００７４】
【表３】
2007537760.tif 000005
表３の結果は、ＭＤＣＫ．５Ｆ１細胞株が、軟寒天において最低の有効性で増殖し、これが動物において非腫瘍形成性であり得ることの示唆を示す。この特性は、１８回継代後も維持され、この表現型が安定であることを示した。
【００７５】
非腫瘍形成能のこの所見をさらに支持するために、発明者らは、胸腺欠損ヌードマウスにおいて、ＭＤＣＫ．５Ｆ１細胞株の腫瘍形成の可能性を試験した。
【００７６】
（実施例５）
（ＭＤＣＫ．５Ｆ１クローンの細胞懸濁物の皮下接種後の、胸腺欠損ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスにおける腫瘍形成の評価）
胸腺欠損ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスは、外来物質に対する細胞媒介性の応答を確立できず、それゆえ同種異系の腫瘍細胞株および異種遺伝子型の腫瘍細胞株の増殖を補助する。このことは、接種物がインビボで新生物を形成する能力の評価を可能にする。
【００７７】
６週齢のヌードマウスを、約１×１０７細胞の試験物質（ＭＤＣＫ．５Ｆ１）により皮下接種し、８４日間臨床的に置き、そして検死した。ポジティブコントロールの細胞およびネガティブコントロールの細胞で接種したヌードマウスを、同様に処置した。接種部位（皮膚）、肺、肩甲骨のリンパ節および肉眼的病変を、加工、切り出し、染色し、そして顕微鏡で調べた。この実験のさらなる詳細は、以下に示される。
【００７８】
（試験物質およびコントロール物質の接種）
各ケージ内の全てのマウスを、同様に処置した。
【００７９】
各マウスを、以下に記載の０．２ｍｌの適切な接種物により、肩甲骨の間に皮下接種した。２２ゲージ針を、接種のために使用し、全てのマウスを、同じ日に接種した。
【００８０】
群１および群２：試験物質、ＭＤＣＫ．５Ｆ１（５×１０７細胞／ｍｌの濃度で）。
【００８１】
群３および群４：ポジティブコントロール（５×１０７細胞／ｍｌの濃度の１８Ｃ１−１０Ｔ細胞）。
【００８２】
群５および群６：ネガティブコントロール（１×１０７細胞／ｍｌの濃度のＳＨＥ細胞）。
【００８３】
全ての動物を、毎作業日（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｄａｙ）観察し、接種部位を、８４日目までの期間、週に二回触診した。
【００８４】
（結果）
（臨床所見）
全てのポジティブコントロールのマウスは、接種部位において、少なくとも一つの長さが１ｃｍより大きい大型の塊を有したので、これら全てを、接種後１４日目に、屠殺および検死した。
【００８５】
全てのネガティブコントロールのマウスを、接種後８４日目に、屠殺および検死した。
【００８６】
１０匹の試験物質（５Ｆ１）マウスのうち９匹を、接種後８４日目に、屠殺および検死した。進行していた接種部位の病変が退行し始めたので、１匹の５Ｆ１接種されたマウスを、接種後３３日目に、屠殺および検死した。この病変は、後に嚢胞であることが明らかになった。
【００８７】
（触診）
ポジティブコントロール物質により接種した１０匹のヌードマウスは、接種後１４日目までに、少なくとも一つの長さが１ｃｍより大きい触知可能な病変を有した。
【００８８】
１０匹のネガティブコントロール物質を接種したヌードマウスの接種部位において、小型の非進行性の病変が触知可能であった。これらの病変は、最初、接種後４日目に発覚し、観察期間の間、１０匹のネガティブコントロールのマウスのうち８匹において残存した。触診の結果を、表４にまとめる。
【００８９】
１０匹の５Ｆ１マウス全てが、接種後４日目までに病変を有した。１０匹の５Ｆ１マウスのうちの９匹において、これらの病変は、小さく、進行しなかった。接種後５６日目までに、試験物質のマウスのうち８匹において、触知可能な病変は存在しなかった。１匹の５Ｆ１を接種したマウスは、２５日目と２８日目との間に、大きさが顕著に進行し、そして接種後３２日目までに、大きさが顕著に減少した接種部位の病変を有した。この病変を、顕微鏡検査により、嚢胞として同定した（表６を参照のこと）。病変を示す他のマウスは、局在化した炎症を有した。
【００９０】
【表４】
2007537760.tif 000006
（肉眼的な検死所見）
処置に関連する肉眼的な検死所見を、表５にまとめる。
【００９１】
【表５】
2007537760.tif 000007
接種部位における塊を、全てのポジティブコントロールの動物において見出した。１０匹の５Ｆ１マウスのうち３匹、および１０匹のネガティブコントロールのマウスのうちの６匹において、接種部位に、塊または小結節を見出した。
【００９２】
（顕微鏡の所見）
目的の病変を、表６にまとめる。
【００９３】
【表６】
2007537760.tif 000008
新形成（線維肉腫）を、全てのポジティブコントロールのマウス中の接種部位において診断した。線維肉腫は、織り交ぜられたパターンを伴う、可変の密度の束で配置される紡錘細胞（ｓｐｉｎｄｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ）からなった。コラーゲンの沈着は、最小限であった。隣接する組織は新生物により圧迫されるが、ほとんど新生物により浸潤されなかった。
【００９４】
どのネガティブコントロールのマウスにおいても、新生物は診断されなかったが、骨様の増殖の病巣を、ネガティブコントロール物質のマウスのうちの２匹中の接種部位において確認した。これは、ネガティブコントロールとして、ＳＨＥ細胞の分化および増殖の選択を表すと考えられる。
【００９５】
どの５Ｆ１マウスにおいても、新生物は診断されなかったが、１匹のマウスにおいて嚢胞を確認し、他の１匹の５Ｆ１マウスにおいて病巣の亜急性の炎症を確認した。
【００９６】
（結論）
１０匹全てのポジティブコントロールのマウスの接種部位において、線維肉腫を診断した。
【００９７】
どのネガティブコントロールにおいても、どの試験物質のマウスにおいても、新生物は存在しなかった。
【００９８】
上記研究の条件下で、試験物質ＭＤＣＫ．５Ｆ１は、腫瘍形成性であるとはみなされない。
【００９９】
（実施例６）
（一般的な手順）
（ａ）細胞の増殖）
バイオリアクターに播種する前に、ＭＤＣＫ．５Ｆ１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１２０４２）細胞を、細胞の増殖のために、数回継代した。約５〜１０×１０６細胞を、３７℃の水浴で解凍し、栄養培地を含むポリスチレン製の細胞培養フラスコに移し、そして３７℃でインキュベートした。３〜４日後、細胞をこのフラスコから乖離し、５個の他のフラスコに播種するために使用した。次に、この５個のフラスコを、同様な様式で、２０個のフラスコに播種するために使用した。細胞増殖のために使用した栄養培地は、脱イオン水で調製された１：１の比でのダルベッコ変法イーグル培地および培地１９９であり、４．５ｇ／Ｌのグルコース、０．５８ｇ／Ｌのグルタミンおよび１ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを含んだ（ＤＭＥＭ−１９９）。この栄養培地に、１０％のγ線照射されたウシ胎児血清（Ｉ−ＦＢＳ）を補充した。細胞の継代のために、フラスコ内の細胞を乖離するために使用した溶液は、マグネシウムおよびカルシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）により調製した、０．０２％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む０．２５％トリプシン溶液であった。
【０１００】
２０個のフラスコ中の細胞を、３〜４日間増殖させ、トリプシン処理し、収集し、そして３〜５ｇ／Ｌのマイクロキャリアビーズを含む１０００ｍｌの攪拌フラスコ内の３つのマイクロキャリア細胞培養に播種するために使用した。攪拌フラスコを、約５０ｒｐｍに攪拌を維持しながら、３７℃でインキュベートした。細胞の増殖を、５〜７日間続け、その後、細胞を、マイクロキャリアからトリプシン処理し、５Ｌバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ｏｆ  Ｅｄｉｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．によるＣｅｌｌｉＧｅｎＴＭ）に播種するために使用した。
【０１０１】
マイクロキャリアからの細胞のトリプシン処理を、以下の方法で行った。マイクロキャリア細胞培養を、ＰＢＳおよび０．０２％ＥＤＴＡの溶液で２回洗浄した。二回目の細胞の洗浄後、約２００ｍｌのトリプシン溶液を、フラスコに注ぎ、攪拌しながら３７℃で約２０分間置いた。光学顕微鏡により決定される場合、細胞の乖離が完全になった後、細胞を、２％Ｉ−ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−１９９を使用して、遊離のマイクロキャリアから回収し、それからペレット化し、１０％Ｉ−ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−１９９中に再懸濁した。細胞の計数を実行し、適切な数（約１０１０個）の細胞をバイオリアクターに播種するために使用した。
【０１０２】
細胞培養のために使用された球状のビーズまたはマイクロキャリアは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（スウェーデン）により製造され、Ｃｙｔｏｄｅｘ  １の商品名の下に頒布される。Ｃｙｔｏｄｅｘ  １マイクロキャリアの濃度は、１．０３（ｇ／ｍｌ、０．９％ＮａＣｌ中で）であり、その大きさは、１３１μｍと２２０μｍとの間、１８０μｍの平均値で変動した。細胞増殖のためのおおよその表面積は、マイクロキャリア（乾燥重量）１ｇあたり４，５００ｃｍ２であり、マイクロキャリア１ｇは、約６．８×１０６個のマイクロキャリアを含んだ。
【０１０３】
（ｂ）バイオリアクター内での細胞の播種および増殖）
１５〜２５ｇ／Ｌの濃度のＣｙｔｏｄｅｘ  １  マイクロキャリアを、５Ｌバイオリアクター（３．７Ｌ作業用容量（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ））に導入した。バイオリアクターの播種を、以下のように実行した。先に調製した株（上記を参照のこと）から取得した約４×１０９〜１×１０１０個の細胞を、管状のガラス製のボトル内に配置した。２０ｇ／Ｌのマイクロキャリアの無菌溶液からの、５５．５〜９２．５ｇのマイクロキャリア（培養内の望ましい濃度に依存する）を、ＤＭＥＭ−１９９で二回すすぎ、そしてガラス製のボトル内の細胞に添加した。次に、このボトルを、１０％Ｉ−ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−１９９で満たし、３．７Ｌの最終容量にした。それから、このボトルの内容物（細胞、ＤＭＥＭ−１９９中のマイクロキャリア）を、バイオリアクター容器に注ぎ、中央シャフトを約２０ｒｐｍで回転させた。この容器を満たすにつれて、攪拌を５０ｒｐｍに上げ、温度を３７℃に調整し、溶存酸素量を５〜５０％の間の空気の飽和度に維持した。培養物のｐＨもまた、６．８〜７．４で維持した。マイクロキャリア細胞培養の灌流を、２．５％Ｉ−ＦＢＳと０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウムとを含むＤＭＥＭ−１９９を使用して、一日あたり０．５容量で１日目に開始した。細胞の増殖を、おおよそ７〜１０日間続け、灌流の流速を一日あたり２容量まで徐々に増加させた。
【０１０４】
（ｃ）ウイルス感染）
ウイルスをマイクロキャリア細胞培養に添加する前に、感染の日に、灌流を一日あたり４容量（血清を含まない）まで増加させ、温度を３３℃まで下げ、酸素の分圧を１５％の空気の飽和度に制御した。細胞のコンフルーエンシーおよびウイルス感染の直前（同じ日）において、培養培地を、血清を含まない同一の培養培地により置き換え、灌流速度を、７時間、一日あたり４容量まで増加させた。このことは、感染前に、培養物の血清含量を最小限のレベルまで下げることを確実にした。この期間後、灌流を停止し、ヒトインフルエンザウイルスＡ型またはヒトインフルエンザウイルスＢ型をマイクロキャリア細胞培養に導入した。１：１０〜１：１０８の範囲のＭ．Ｏ．Ｉ．を取得するために、バイオリアクターへの導入の前に、ウイルスを、栄養培地（６．５ｇグルコース／Ｌを含むＤＭＥＭ−１９９）により標準的に希釈した。次の日、細胞変性効果が完全になるまで、灌流を一日あたり２容量で維持した。ＭＤＣＫ細胞の完全な破壊を、代表的に５日以内に観察した。それから、インフルエンザウイルス懸濁物を含む溶出物を、収集し、当該分野において周知であるように、ワクチンを生成するために処理した。
【０１０５】
（ｄ）不活性化および精製）
一価のインフルエンザウイルスの精製を、以下の様式により実行した。バイオリアクターから集めたウイルス収集物（大体１５〜３０Ｌの間）を、大型の細胞残渣を除去するために、まず１．２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ  ＧＦ（登録商標）、長さ１０インチ、０．６ｍ２）を通して、清澄化した。次に、インフルエンザウイルスを含む、清澄化した懸濁物を、１６時間の、０．１２５％（Ｖ／Ｖ）ホルムアルデヒド（終濃度）の添加により不活性化した。それから、不活性化したウイルス懸濁物を、イオン交換、ＤＮＡａｓｅ処理およびゲル濾過により精製した。
【０１０６】
濃縮されたウイルス画分を選択し、それは、ワクチン調製において使用されるべき上等な材料と表した。次に、これらの画分をプールし、現在、国際機関により推奨される、１用量あたり、１株あたり１５μｇのＨＡの終濃度を与えるように希釈した。
【０１０７】
（ｅ）ワクチン調製）
ウイルスタンパク質を、ワクチンの各用量に対して１５μｇになるように希釈した。チメロサール（０．０１％）を、保存および安定化それぞれのために添加し、ワクチンを完成させた。
【０１０８】
標準的な三価ワクチンのために、３つの流行性の（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）株の各々の一価の用量が混合され得、上記の保存剤および安定化剤を添加され得る。
【０１０９】
他の公知の保存剤（例えば、アミノメチルプロパノール、ソルビン酸およびポリアミノプロピルビグアナイド（ｐｏｌｙａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｂｉｇｕａｎｉｄ）、硝酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、ホルムアルデヒドを含む２−フェノキシエタノール、フェノール、塩化ベンゼトニウムおよび２−フェノキシエタノール）は、ワクチン調製のために使用され得る。これらの保存剤の濃度は、産業基準に受容可能である必要がある。
【０１１０】
（実施例７）
（トリプシンの添加有りでの、株Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１１／８７による親細胞株の感染）
親株由来のＭＤＣＫ細胞を、ＣｅｌｌｉＧｅｎＴＭバイオリアクターにより増殖させた。バイオリアクターの作業用容量は３．７Ｌであり、マイクロキャリアの濃度は２５ｇ／Ｌであり、そして攪拌を５０ｒｐｍに設定した。７日目に、培養物を、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１１／８７と称されるヒトインフルエンザウイルスにより感染させた。Ｍ．Ｏ．Ｉ．は１：１３３，０００であり、２．５μｇ／ｍｌトリプシンを、ウイルス複製を増大させるために添加した。表７は、このアッセイに関するデータを示し、表８は、これらの結果をまとめる。ワクチンの収量は、１８Ｌの総収集容量に基づいて、ｌ５μｇ  ＨＡの一価の用量９，８２８、ならびに、７．３８μｇ  ＨＡ／ｍｌおよび９μｇ  ＨＡ／ｍｌの一元放射拡散（ＳＲＤ）アッセイ値であった（表８を参照のこと）。
【０１１１】
【表７】
2007537760.tif 000009
感染の時点での細胞の総数は、以下の方法により計算される：９．３４×１０６個のＭＤＣＫ細胞／ｍｌ×３７００ｍｌは、３４，５５８×１０６個の細胞に等しい。
【０１１２】
【表８】
2007537760.tif 000010
ＨＡの総量の計算は、以下の方法により決定される：９，８２８用量×ｌ５μｇ／用量＝１４７，４２０μｇ  総ＨＡ。３４５５８×１０６個の細胞で割った場合＝
１０６個のＭＤＣＫ細胞あたり、４．２６μｇ  ＨＡ。
【０１１３】
（実施例８）
（トリプシン無しでの、株Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１１／８７によるＭＤＣＫ．５Ｆ１クローンの感染）
クローンＭＤＣＫ．５Ｆ１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１２０４２）に由来する細胞を、２５ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度を含むＣｅｌｌｉＧｅｎＴＭバイオリアクターにより増殖させた。バイオリアクターの作業用容量は３．７Ｌであり、そして攪拌を５０〜５５ｒｐｍに設定した。７日目に、培養物を、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１１／８７と称されるヒトインフルエンザウイルスにより感染させた。ウイルスの増殖を増大させるためのトリプシンを、バイオリアクターに添加しなかった。Ｍ．Ｏ．Ｉ．は１：１３３，０００であり、アッセイは９．２μｇ  ＨＡ／ｍｌのＳＲＤ値を伴う３２Ｌを生成し、一価の用量１９，６２６をもたらした。表９は、このアッセイについてのデータをまとめ、表１０は、これらの結果を列挙する。
【０１１４】
【表９】
2007537760.tif 000011
感染の時点での細胞の総数は、以下の方法により計算される：１６．８×１０６個のＭＤＣＫ細胞／ｍｌ×３７００ｍｌは、６２，１６０×１０６個の細胞に等しい。
【０１１５】
【表１０】
2007537760.tif 000012
ＨＡの総量の計算は、以下の方法により決定される：１９，６２６用量×ｌ５μｇ／用量＝２９４，３９０μｇ  総ＨＡ。６２，１６０×１０６個の細胞で割った場合＝
１０６個のＭＤＣＫ細胞あたり、４．７３μｇ  ＨＡ。
【０１１６】
（実施例９）
（トリプシン無しでの、株Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４によるＭＤＣＫ．５Ｆ１クローンの感染）
クローンＭＤＣＫ．５Ｆ１に由来する細胞を、実施例３と同様だが、１５ｇ／Ｌのマイクロキャリア濃度を用いて増殖させた。８日目に、培養物を、Ｂ−Ｈａｒｂｉｎ／７／９４と称されるヒトインフルエンザウイルスにより感染させた。Ｍ．Ｏ．Ｉ．は１：１０，０００であった。ウイルス複製を促進させるためのトリプシンを添加しなかった。このアッセイからのデータおよび結果は、表１１および１２に再現される。収量は、３５Ｌの収集物に基づいて、３８，１５０用量、および１６．３５μｇ  ＨＡ／ｍｌのＳＲＤ値であった。
【０１１７】
【表１１】
2007537760.tif 000013
感染の時点での細胞の総数は、以下の方法により計算される：１６．７×１０６個のＭＤＣＫ細胞／ｍｌ×３７００ｍｌは、６１，７９０×１０６個の細胞に等しい。
【０１１８】
【表１２】
2007537760.tif 000014
ＨＡの総量の計算は、以下の方法により決定される：３８，１５０用量×ｌ５μｇ／用量＝５７２，２５０μｇ  総ＨＡ。６１，７９０×１０６個の細胞で割った場合＝
１０６個のＭＤＣＫ細胞あたり、９．２６μｇ  ＨＡ。
【０１１９】
もう一度繰り返すと、本発明のプロセスは、トリプシンの存在を必要とする先行技術のプロセスにより与えられる収量と同じか、またはそれより多い収量を与えることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、本発明の灌流手段において使用されるデカンターの前断面図である。
【図２】図２は、上記デカンターの上正面図である。
【図３】図３は、上記デカンターの下正面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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