(57)【要約】  哺乳動物細胞中のタンパク質、特に膜内在性タンパク質の発現レベルを変化させる物質を同定するための、ハイスループットアッセイ系および方法が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞でのタンパク質の表面発現レベルを変化させる物質を同定する方法であって、
ａ）前記タンパク質を発現させる、哺乳動物細胞を含有する第１の培地を調製するステップと、
ｂ）有効量の候補物質を、前記哺乳動物細胞を含有する第１の培地に添加するステップと、
ｃ）前記細胞を、前記候補物質の存在下で十分な時間、インキュベートするステップと、
ｄ）前記細胞を有効量の固定剤で処理するステップと、
ｅ）前記タンパク質に結合する、有効量の少なくとも１種の抗体を、前記哺乳動物細胞を含有する第１の培地に添加するステップと、
ｆ）前記候補物質を有する前記タンパク質に対する前記抗体の結合レベルを決定するステップとを含み、対照を基準にした前記結合レベルの変化は、候補物質が前記タンパク質の表面発現レベルを変化させることを示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
ステップ（ｅ）は、有効量の少なくとも１種の１次抗体を添加し、その後、有効量の少なくとも１種の２次抗体を添加することを含み、前記１次抗体は、前記タンパク質の少なくとも１つの細胞外抗原決定基に結合し、前記２次抗体は、前記第１の抗体に結合することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結合レベルは、蛍光、発光、放射能、吸光度、またはこれらの２種以上の組合せによって測定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質は、膜内在性タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの細胞外抗原決定基は、野生型抗原決定基を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの細胞外抗原決定基は、標識（ｔａｇ）を含有することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞外標識は、前記タンパク質の細胞外ドメインの少なくとも１部分で置き換えられることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞外標識は、前記タンパク質の細胞外ドメインに挿入されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞外標識は、ヘマグルチニン（ＨＡ）標識含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物細胞中のタンパク質の発現レベルを変化させる物質を同定する方法であって、
ａ）前記タンパク質を発現させる、哺乳動物細胞を含有する第１の培地を調製するステップと、
ｂ）有効量の候補物質を、前記哺乳動物細胞を含有する第１の培地に添加するステップと、
ｃ）前記細胞を、前記候補物質の存在下で十分な時間、インキュベートするステップと、
ｄ）前記細胞を、固定剤で処理した後、浸透剤で処理するステップと、
ｅ）前記タンパク質に結合する、有効量の少なくとも１種の抗体を、前記哺乳動物細胞を含有する第１の培地に添加するステップと、
ｆ）前記候補物質を有する前記タンパク質に対する前記抗体の結合レベルを決定するステップとを含み、対照を基準とした前記結合レベルの変化は、前記候補物質が前記タンパク質の発現レベルを変化させることを示すことを特徴とする方法。
【請求項１１】
ステップ（ｅ）は、有効量の少なくとも１種の１次抗体を添加し、その後、有効量の少なくとも１種の２次抗体を添加することを含み、前記１次抗体は、前記タンパク質の少なくとも１つの抗原決定基に結合し、前記２次抗体は、前記第１の抗体に結合することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合レベルは、蛍光、発光、放射能、吸光度、またはこれらの２種以上の組合せによって測定することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質は、膜内在性タンパク質であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの抗原決定基は、野生型抗原決定基を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの抗原決定基は、標識（ｔａｇ）を含有することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標識は、前記タンパク質のドメインの少なくとも１部分で置き換えられることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識は、前記タンパク質のドメインに挿入されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記標識は、ヘマグルチニン（ＨＡ）標識を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記１次抗体および／または前記２次抗体は、酵素に結合することを特徴とする請求項１または１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素は、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびこれらの２種以上の混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１または１０に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物細胞中の膜内在性タンパク質の発現レベルを変化させるペプチドを、同定する方法であって、
ａ）前記タンパク質を発現させる、哺乳動物細胞を含有する第１の培地を調製するステップと、
ｂ）レトロウイルス発現ライブラリーを、前記哺乳動物細胞を含有する第１の培地に添加するステップと、
ｃ）前記タンパク質の少なくとも１つの細胞外抗原決定基に結合する、有効量の少なくとも１種の抗体を、前記哺乳動物細胞を含有する第１の培地に添加するステップと、
ｄ）蛍光性標識付きの２次抗体を、前記培地に添加するステップと、
ｅ）蛍光に基づいて、前記哺乳動物細胞を選別するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記タンパク質は、イオンチャネルであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの抗原決定基は、野生型抗原決定基を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの抗原決定基は、標識を含有することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記標識は、前記タンパク質のドメインの少なくとも１部分で置き換えられることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標識は、前記タンパク質のドメインに挿入されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記標識は、ヘマグルチニン（ＨＡ）標識を含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記１次抗体および／または前記２次抗体は、酵素に結合することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記酵素は、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびこれらの２種以上の混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞外抗原決定基中の前記標識は、前記タンパク質上に存在する唯一の標識であることを特徴とする請求項６、１５、または２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質は、蛍光標識を含有することを特徴とする請求項１または１０に記載の方法。
【請求項３２】
前記標識は、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、および検出可能な特性を有する分子に選択的に結合するアミノ酸配列からなる群から選択されることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記標識は、前記タンパク質の細胞内ドメインの少なくとも１部分で置き換えられることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記標識は、前記タンパク質の細胞内ドメインに挿入されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞内ドメイン中の前記標識は、前記タンパク質に存在する唯一の標識であることを特徴とする請求項３３または３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞の内在性膜タンパク質に特に重点を置いて、細胞タンパク質の発現レベルを変化させる薬剤を同定するためのハイスループットアッセイ系および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
周囲環境に応答する能力と、細胞膜を通した分子の出入りの制御は、あらゆる哺乳動物細胞の基本的に重要な機能である。これらの機能は、その大部分が、細胞膜内に全体的にまたは部分的に存在する様々なタンパク質に起因する。
【０００３】
哺乳動物細胞の細胞膜は、イオンや小さい無機分子、ペプチド、タンパク質などの水溶性物質を、比較的透過させない。細胞に進入し、かつ／または細胞に影響を及ぼすには、そのような親水性物質を、細胞膜内に存在しまた少なくとも部分的に細胞表面から細胞外環境に曝されている少なくとも１種のタンパク質（例えば受容体、イオンチャネル、または輸送体）と、相互に作用させなければならない。対照的に、ステロイドなどの親油性物質は、細胞膜を通して細胞質へと直接拡散することができ、そこで、１種または複数種の目標とするタンパク質と相互に作用することができる。
【０００４】
外部刺激分子（例えばペプチド、あるいは有機または無機分子）が細胞表面タンパク質と相互に作用する場合、細胞からの２つの基本的な応答がある。すなわち、（ｉ）イオンまたは分子（または高分子）材料が、脂質二重層を通した輸送によって、細胞膜の外側から細胞内の細胞質へと伝達され（ｖｅｃｔｏｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ）、またその逆も同様になされ、かつ／または（ｉｉ）シグナルが、膜タンパク質の変化、例えば膜タンパク質の高次構造および／または膜タンパク質の凝集状態の変化によって、細胞質またはその内部のタンパク質へと伝達される。
【０００５】
細胞を横断するシグナルの伝達（シグナル伝達）は、細胞外物質（イオン、小分子、タンパク質）と、細胞膜内に存在するタンパク質の細胞外ドメインとの結合から始まる。この物質と、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインとの結合によって、タンパク質は、型を不活性型から活性型へと変化させる。次いでこの活性型は、触媒活性を刺激し、またはいくらか類似するそのような応答を刺激し、細胞分可溶成分の（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）シグナルを発生させる（これは、時には、細胞質内の１つまたは複数の２次メッセンジャー物質の形をとることがある）。
【０００６】
哺乳動物細胞におけるそのようなシグナル伝達には、２つの主なタイプがある。すなわち、（ｉ）膜貫通タンパク質は、その細胞分可溶成分ドメイン内にタンパク質キナーゼ活性を有することができ、その活性は、細胞外物質が膜貫通タンパク質と結合したときに活性化するものであり（次いでキナーゼは、それ自体の細胞質ドメインをリン酸化し、その結果、膜貫通タンパク質は別のタンパク質を会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）し活性化することができ、次々に細胞の細胞質内にあるその他のタンパク質および物質に作用する）、（ｉｉ）膜貫通タンパク質は、膜と会合しているＧタンパク質と相互に作用することができ、そのため、Ｇタンパク質に結合しているＧＤＰ（グアニン二リン酸）がＧＴＰに代わり、Ｇタンパク質が解離してモノマーおよびダイマー断片となり、その一方または両方が、次々に標的タンパク質に作用する（膜に会合することも多く、これにより、次いで、細胞質内にあるタンパク質である、さらに別の標的タンパク質への作用も引き起こされる）。
【０００７】
細胞膜を横断する材料の物理的伝達によって、イオン、小分子（糖やホルモンなど）、高分子（タンパク質や酵素など）などの広範な物質を、細胞に進入させかつ／または細胞から出すことが可能になる。そのような材料の伝達について、３つの主な経路が存在する。すなわち（ｉ）細胞膜内に存在するタンパク質は、ナトリウムやカリウム、塩素などのイオンの通過を可能にするチャネルを形成することができ、細胞外環境から膜を経て細胞質に入り、またはその逆も同様になされ、（ｉｉ）細胞膜内に存在するタンパク質は、膜の片側で、糖などの小分子に結合することができ、次いで膜の反対側で同じ分子を放出し、それによって、輸送体として動作することができ、（ｉｉｉ）細胞膜内に存在するタンパク質は、小分子に結合することができ、したがって内在化のプロセスが誘発され、結合されたタンパク質：分子の対が、細胞内取り込み（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって細胞内に持ち込まれる（ある時点で、タンパク質：分子の対は分離され、次いでタンパク質は、細胞表面に戻って別の小分子と相互に作用し、または分解することもある）。
【０００８】
これらタンパク質全ての一般的な特徴には、それらが比較的大きいサイズであること、細胞膜に広がる多数の疎水性領域、親水性の細胞外および／または細胞内ドメインが含まれる。
【０００９】
高分子物質の通過または輸送に関し、タンパク質は、リボソームから小胞体の膜への直接的な同時翻訳伝達（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）による分泌をもたらす経路を開始する。次いでこれらのタンパク質は、ゴルジ体に移送され、そこではタンパク質が、最終的に意図される目的に応じて分類され、細胞膜に向かって移動する。
【００１０】
より具体的には、タンパク質は、合成中に小胞体（ＥＲ）に進入し、少なくとも部分的に折り畳まれグリコシル化される。次いでタンパク質は、ゴルジ体のシス面（ｃｉｓ  ｆａｃｅ）に移送される［小胞体内に存在することになるタンパク質は、このとき小胞体（ＥＲ）に戻る］。タンパク質が、ゴルジ層板（Ｇｏｌｇｉ  ｓｔａｃｋｓ）を経てシスからトランスに移動するとき、さらなるグリコシル化が引き起こされる。特定のシグナルにより、一部のタンパク質はＥＲに戻され、一部のタンパク質はゴルジ内に維持され、一部のタンパク質は核内体（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）および水解小体（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）に輸送され、一部のタンパク質（細胞表面タンパク質）は、細胞膜に輸送されその内部に維持される。
【００１１】
細胞膜に輸送され、そこで維持されるこれらのタンパク質は、最も長く最も広範な輸送経路を辿り、小胞体の膜に進入し、引き続いて移行小胞（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、ゴルジ複合体、および分泌小胞の膜を経て移動した後に、その最終的な目標に到達する。これらのタンパク質の中には、能動的および受動的な輸送タンパク質と、細胞表面受容体とがある。
【００１２】
体腔の内側を覆う上皮細胞において、ＥＲの分類および分布メカニズムにより、細胞膜の個別の準部分（ｓｕｂｐａｒｔｓ）に種々のタンパク質が配置されていることは、輸送経路の複雑さを示している。例えば、腸上皮細胞で糖およびアミノ酸を輸送するタンパク質は、腸管腔に面する細胞膜の領域に分布される。主要組織適性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子および抗体に結合するポリＩｇ受容体は、身体の内面に面する側とは反対側の上皮細胞の、細胞膜のセグメントに行き着く。
【００１３】
以下に示すものは、いくつかの知られている細胞表面分子、受容体、および膜会合タンパク質の表である。
【００１４】
【表１−１】
2007529756.tif 000002
【００１５】
【表１−２】
2007529756.tif 000003
【００１６】
【表１−３】
2007529756.tif 000004
【００１７】
【表１−４】
2007529756.tif 000005
【００１８】
【表１−５】
2007529756.tif 000006
【００１９】
したがって、これらタンパク質の１種または複数の発現レベルを変化させる化合物の同定は、いくつかの異なる観点から、またいくつかの目標を想定すると、実に重要である。例えば、特定のタンパク質の発現レベルを変化させる化合物の同定は、新しい治療薬の発見に繋がる可能性がある。あるいは、そのような同定は、欠陥または障害の原因または経路の発見に繋がる可能性がある。このようにして、潜在的な治療介入に関するこれまでわかっていない多数の標的はもちろんのこと、完全に新しい研究領域が広がる。
【００２０】
さらに、これらタンパク質の１種または複数の発現レベルを変化させる化合物の同定は、タンパク質の発現レベルに直接または間接的に影響を及ぼす化合物を含むべきである。膜内在性タンパク質の発現レベルを変化させる化合物は、例えばタンパク質に直接結合し、輸送を阻害することによって、そのような影響を直接及ぼすことができる。あるいは、化合物は、例えば、細胞膜内の膜タンパク質の輸送および取込みを促進させるシャペロンの１種または複数に作用を及ぼすことによって、または標的膜タンパク質を劣化させるタンパク質に作用を及ぼすことによって、発現レベルを間接的に変化させることができる。
【００２１】
したがって当技術分野では、タンパク質、特に膜内在性タンパク質の、発現レベルを変化させるメカニズムはもとより、発現レベルを変化させる化合物を同定することができるアッセイが求められている。
【００２２】
【特許文献１】国際出願（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８３６８）
【特許文献２】米国特許第４８５７３００号明細書
【特許文献３】米国特許第５１０４６４０号明細書
【特許文献４】米国特許第５４２２２７７号明細書
【特許文献５】米国特許第５５９７６８８号明細書
【特許文献６】米国特許第５８２４４９５号明細書
【特許文献７】米国特許第６１９４１６５号明細書
【非特許文献１】StitesおよびTerr、Basic and Clinical Immunology、第7版(1991)
【非特許文献２】Maggio、Enzyme Immunoassay、CRC Press、Boca Raton、FL(1980)
【非特許文献３】Tijssen、Practice and TheoLy of Enzyme Immunoassays, in Laboratory Teelmiques in Biochemistry and Molecular Biology、Elsevier Science Publishers、B.V. Amsterdam(1985)
【非特許文献４】Bioconjng. Chem.、4:528-536(1993)
【非特許文献５】Adv. Mater.、3:388-391(1991)
【非特許文献６】Anal. Chem.、67:83-87(1995)
【非特許文献７】Biophys. Biochem. Res. Commun.、230:76-80(1997)
【非特許文献８】Langmuire 11:4048-4055(1995)
【非特許文献９】Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、35:317-320(1996)
【非特許文献１０】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4973-4941(1996)
【非特許文献１１】J. Struct. Biol.、113:117-123(1994)
【非特許文献１２】Anal. Chem.、68:490-497(1996)
【非特許文献１３】Ficker他、Am J Physiol. 2000; 279: H1748-H1756
【非特許文献１４】Ficker他、J Mol Cell Cardial. 2000; 32: 2327-2337
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
したがって本発明の目的は、タンパク質、特に心臓イオンチャネル（ｃａｒｄｉａｃ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）などの膜内在性タンパク質の、発現レベルを変化させる物質を同定するためのアッセイおよび方法を提供することである。そのような物質は、ケミカルライブラリーからの化合物またはＤＮＡライブラリーからのペプチドでよい。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
これらおよびその他の目的によれば、本発明の第１の実施形態は、哺乳動物細胞表面でのタンパク質の発現レベルを変化させる物質を、同定するための方法を対象とし、この方法は、ａ）対象のタンパク質を発現させる哺乳動物細胞を含有する培地を調製するステップと、ｂ）有効量の候補物質を添加するステップと、ｃ）この細胞を、候補物質の存在下で十分な時間、インキュベートするステップと、ｄ）この細胞を固定剤（ｆｉｘａｔｉｖｅ）で処理するステップと、ｅ）タンパク質に結合する、有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、ｆ）結合レベル決定するステップとを含み、この結合レベルの変化は、候補物質がタンパク質の発現レベルを変化させることを示している。
【００２５】
本発明の第２の実施形態は、哺乳動物細胞中のタンパク質の全発現レベルを変化させる物質を、同定するための方法を対象とし、この方法は、ａ）対象のタンパク質を発現させる哺乳動物細胞を含有する培地を調製するステップと、ｂ）有効量の候補物質を添加するステップと、ｃ）この細胞を、候補物質の存在下で十分な時間、インキュベートするステップと、ｄ）この細胞を固定剤で処理した後、浸透剤（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）で処理するステップと、ｅ）タンパク質に結合する、有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、ｆ）結合レベル決定するステップとを含み、この結合レベルの変化は、候補物質がタンパク質の発現レベルを変化させることを示している。
【００２６】
本発明の第３の実施形態は、哺乳動物細胞中のイオンチャネルを遮断する物質を、同定するための方法を対象とし、この方法は、（ｉ）上記本発明の第１の実施形態の方法を実施して、候補物質がイオンチャネルの発現レベルを変化させるかどうか決定するステップと、（ｉｉ）ウェスタンブロットアッセイを実施して、候補物質がイオンチャネルの成熟を変化させるかどうか決定するステップと、（ｉｉｉ）テール電流アッセイを実施して、候補物質がイオンチャネルの機能的作用を変化させるかどうか決定するステップとを含む。
【００２７】
本発明の追加の利点、目的、および特徴について、その一部を以下の記述で示し、一部は以下の事項を調査の上で当業者に明らかにされ、または本発明の実施から学ぶことができる。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘されるように実現し達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の好ましい実施形態は、膜イオンチャネルなどのタンパク質に結合し、それによって哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現を増加させまたは減少させる物質を、同定するためのアッセイ系および方法を含む。ある特に好ましい実施形態では、このアッセイおよび系は、タンパク質に結合し、それによってタンパク質の表面発現を変化させる物質の能力について、決定する。そのような表面発現の変化は、タンパク質の特定部位に結合する物質から、かつ／または細胞内輸送を低下させまたは改善しかつ／またはタンパク質を処理する物質から、もたらされる。さらに、そのような変化は、対象のタンパク質以外のタンパク質に結合し、それによってタンパク質の発現レベルを間接的に変化させる物質から得ることもできる。
【００２９】
適切な結合アッセイに関し、当業者に知られておりかつ利用可能である、広く様々な形式がある。本発明の、ある実施形態によれば、対象のタンパク質を発現する１つまたは複数の細胞を、適切な液体培地に供給し、１種または複数の候補化合物に曝すことができ、一方その他の実施形態では、該細胞を表面に固定することができる。同様に、本発明のさらに他の実施形態によれば、１種または複数の候補化合物を表面に固定化し、対象のタンパク質を発現させる１つまたは複数の細胞を含有する液体培地に曝すことができ、または候補化合物を、適切な液体培地中でインキュベートし、そこに対象のタンパク質を発現させる１つまたは複数の細胞を添加することができる。ラベルされる系で、結合を検出することが、より容易であることが多い（例えば、当業者に知られるように、蛍光、放射能、酵素、抗体などで、またこれらの組合せも含む）。候補化合物を、タンパク質を発現させる細胞に曝し、結合していない試薬を洗い落としまたはその他の方法で除去した後、標識された部分（すなわち、試験系の非標識成分に結合している）の存在について測定する。
【００３０】
文献（例えば、特許文献１参照）に記載されるようなアッセイ系を含め、様々な結合アッセイを実施するための方法が、当技術分野で知られているが、これらに限定されない。様々な参考文献は、競合結合アッセイおよび直接結合アッセイも含めたタンパク質結合アッセイの、様々な形式の概要を示している（例えば、非特許文献１、２、および３参照）。
【００３１】
本発明の特に好ましい実施形態は、タンパク質の活性を変化させることによって、かつ／または細胞内輸送かつ／またはその処理を変化させる（遮断または改善する）ことによって、対象のタンパク質の発現を増減させる化合物を同定するアッセイ系および方法を含む。
【００３２】
したがって、ある特に好ましい実施形態によれば、対象のタンパク質を発現させる１つまたは複数の細胞が、一般に適切な固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル、マイクロカード、当業者に知られている任意のその他同様の形式）に結合され、候補物質に混合され、それによって、対象のタンパク質の発現レベルの変化を観察するイムノアッセイが提供される。したがって、これらの好ましい実施形態によれば、アッセイ成分の１つまたは複数が、固体表面に結合される。
【００３３】
ある実施形態によれば、例えば対象のタンパク質が細胞表面で発現しない場合、浸透剤を使用することができる。そのような浸透剤は、抗体、特に標識された抗体の、細胞内への浸透を促進させることができる。
【００３４】
浸透剤は、好ましくは洗浄剤を含有し、より好ましくは陰イオン洗浄剤を含有する。適切な洗浄剤は、当業者に知られており入手可能である。適切な陰イオン洗浄剤の例示的な例には、例えば、デオキシコール酸ナトリウム、Ｎ−ラウリルサルコシド、およびドデシル硫酸ナトリウムが含まれる。
【００３５】
洗浄剤の濃度は、例えば、用いられる特定の洗浄剤に応じて変わることになり、当業者が経験的に決定することができる。適切な濃度は、０．００１％から１０％の間、例えば０．０１から５％の間にすることができる。
【００３６】
浸透剤は、トレハロースなどのオリゴ糖も含有することが好ましい。浸透剤中のオリゴ糖の濃度は、例えば、用いられる特定の洗浄剤およびオリゴ糖に応じて変わることになり、当業者が経験的に決定することができる。適切な濃度の例示的な例は、０．００１Ｍから１．０Ｍの範囲内であり、好ましくは０．０１Ｍから０．１Ｍの範囲内である。
【００３７】
浸透剤のｐＨは、研究される特定のタンパク質および用いられる細胞系に適切な、任意のレベルでよく、好ましくは一般に３から８の間である。適切なｐＨ（またはｐＨ範囲）は、当業者に知られており入手可能な１種または複数の適切な緩衝剤の添加によって、実現することができる。浸透緩衝剤は、好ましくはほぼ等張性であり、その等張性を調節するために、塩化ナトリウムなどの１種または複数の適切な物質を含有することができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、候補物質の結合により、対象のタンパク質の表面発現の変化を検出することができるアッセイ系を使用（当技術分野で知られるように）することができる。例えば、対象のタンパク質が膜イオンチャネルである場合、膜を横断するイオンの流れの変化を検出するためにパッチクランプアッセイを用いることができ、それによって、イオンチャネルの表面発現レベルの増加を示すことができる。
【００３９】
代替の実施形態では、当技術分野で知られるように、タンパク質の抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）に対して向けられた１つまたは複数の抗体の添加によりタンパク質を検出する、間接イムノアッセイ系を使用する。タンパク質が細胞表面で発現しない場合、細胞内への抗体の浸透が促進されるように、浸透剤を添加することが望ましいと考えられる。
【００４０】
本発明の方法で固体支持体を使用する場合、表面材料がアッセイ試薬に適合し、アッセイ成分の反応性を過度に変化させることなくその成分を表面に結合することが可能である限り、事実上どのような固体表面も適切である。当業者なら、いくつかの成分が固相アッセイでは低下した活性を示すが、これは一般に、活性が検出および／または定量に十分である限り、許容されるものであることが理解される。
【００４１】
適切な固体支持体には、材料または細胞を結合させることができるような、ガラスビーズや平面ガラス、制御された細孔ガラス、プラスチック多孔質プラスチック金属、または樹脂などの、任意の固体表面が含まれるが、これらに限定されない。当業者なら、いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される固体支持体を、官能基（例えばヒドロキシル、アミン、カルボキシル、エステル、およびスルフヒドリル）で誘導体化して、反応性部位にリンカー（ｌｉｎｋｅｒｓ）の結合、あるいは候補物質または他のアッセイ成分の直接結合をもたらすことができることが理解される。
【００４２】
アッセイ成分と固体支持体との接着は、直接的（すなわち、成分が固体表面に直接接触する）または間接的［すなわち物質および／または成分（例えば抗体）が支持体に結合し、その他のアッセイ成分は、固体支持体にというよりはむしろ、この物質または成分に結合する］にすることができる。いくつかの実施形態では、物質または成分を共有結合的に固定化し［例えば、タンパク様成分（ｐｒｏｔａｉｎａｃｅｏｕｓ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）を固定させるため、システインの単一の反応性チオール基を利用して（例えば、非特許文献４参照）固定化する］、あるいは、非共有結合的であるが、特異的に固定化する［たとえば、ポリヒスチジン融合タンパク質の結合のために、固定化された抗体またはその他特異的な結合タンパク質（例えば、非特許文献５、６参照）、あるいはビオチン／ストレプトアビジン系（例えば、非特許文献７参照）、あるいは金属−キレートラングミュア−ブロジェットフィルム（例えば、非特許文献８、９、１０、および１１参照）と、金属−キレート自己組織化単層（例えば、非特許文献１２参照）とを介して固定化する］。
【００４３】
いくつかの特に好ましい実施形態では、候補物質と、対象のタンパク質との結合を検出するために、当技術分野で一般に知られるような標準的な直接または間接的ＥＬＩＳＡ、ＩＦＡ、またはＲＩＡ法を使用する。いくつかの実施形態では、タンパク質の表面発現レベルの増大が、サンプル中で検出され、一方その他の実施形態では、表面発現の低下が検出される。したがって本発明の方法は、多数の要素の検出、同定、および特徴付けに適応可能であることが明らかである。
【００４４】
したがって、本発明の方法の、いくつかの特に好ましい実施形態では、捕獲用のモノクローナルまたはポリクローナル抗体（Ａａ捕獲抗体＠）と、結合した抗体−抗原複合体を検出するための２次抗体（Ａａレポーター抗体＠）とを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を使用することができる。
【００４５】
いくつかの好ましいＥＬＩＳＡ実施形態では、アルカリホスファターゼ結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を使用し、一方さらに別の好ましい実施形態では、セイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ結合体を使用する。さらに、特に増大した信号が望まれるアッセイ系では、アビジン／ビオチン系を使用してもよい。好ましい実施形態で使用される適切な酵素には、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびこれらの２種以上の混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明の、ある実施形態によれば、１つまたは複数の抗体を添加する前に、細胞を固定剤で処理することができる。そのような適切な固定剤は、当業者に知られておりかつ入手可能であり、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、グルテルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、アセトン、エタノール、およびアクロレインが含まれるが、これらに限定されない。文献を参照されたい（例えば、特許文献２、３、４、５、６、および７参照）。
【００４７】
固定剤の濃度は、例えば、用いられる特定の物質に応じて変わることになり、当業者が経験的に決定することができる。パラホルムアルデヒドの適切な濃度の例示的な例は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの適切な緩衝剤中４％であろう。
【００４８】
固定剤のｐＨは、研究される特定のタンパク質および用いられる細胞系に適した任意のレベルでよく、一般に６から８の間でよく、例えば約７であり、約７．２などである。適切なｐＨ（またはｐＨ範囲）は、当業者に知られておりかつ入手可能な１種または複数の適切な緩衝剤の添加によって、実現することができる。
【００４９】
したがって、本発明の１つの例示的な方法では、細胞外抗原決定基においてＨＡ標識（ＨＡ  ｔａｇ）を有するカリウムチャネルｈＥＲＧを過剰発現させる細胞系を、９６−ウェルマイクロプレートに置く（約４００００細胞／ウェル）。９６ウェルプレート（底面が透明な黒色プレート）には、ポリ−Ｄ−リジンをプレコートして、細胞とウェル底面との結合を促進させる。細胞を、ＤＥＭＥ／Ｆ１２に１０％ウシ胎児血清ＦＢＳを含有させ、これに抗生物質を加えたものからなる完全培地で平板培養する。平板培養してから約６時間後に培地を除去し、ウェルを、血清または抗体を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２で濯ぎ、試験物質（血清および抗生物質を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２中で希釈）を加えた。試験物質は、ＤＭＳＯに最もよく溶解し、アッセイにおけるＤＭＳＯの最終濃度は０．１％である。賦形薬対照（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ）も、０．１％のＤＭＳＯを含有する。プレートを、３７℃／５％ＣＯ２で一晩（約１６時間）インキュベートし、その後、表面発現アッセイを開始する。
【００５０】
表面発現アッセイは、卓上において、室温で実施することが好ましい。細胞を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で３回濯いだ後、新たに調製した氷冷の４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液によって固定した（ｐＨ７．２、２０分）。ｈＥＲＧ表面発現の決定では、細胞は浸透していない。固定剤を除去した後、細胞をＰＢＳで洗浄する。細胞上の非特異的結合部位は、３０分間、１％ヤギ血清／ＰＢＳ溶液（遮断緩衝液、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）と共にインキュベートすることによって、遮断される。遮断緩衝液を除去し、細胞を、遮断緩衝液で希釈したラット抗ＨＡ抗体（１次抗体）と共に２時間インキュベートした。１次抗体を除去した後、細胞を、１％ヤギ血清／ＰＢＳ溶液で３回洗浄する（１０分／洗浄）。ＨＲＰ結合ヤギ抗ラット抗体（２次抗体）を、遮断緩衝液中に希釈し、細胞と共に１時間インキュベートする。２次抗体カクテルは、工程成績表（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）の終わりでの細胞数を決定するために、蛍光ＤＮＡ結合色素（ＳＹＢＲグリーン）も含有している。インキュベーションの後、細胞をＰＢＳで３回洗浄する（１０分／洗浄）。蛍光を、マイクロプレート蛍光リーダで測定し、シグナルを、蛍光対細胞数の標準曲線と比較して、試験物質が毒性であるかどうか決定し、工程成績表中の細胞の損失を補正する。化学発光シグナルは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）により発生する。ＰＢＳをウェルから除去し、検出試薬を添加した。シグナルは、ＧｌｏＲｕｎｎｅｒ照度計によって即座に補捉される。
【００５１】
膜内在性タンパク質または任意の細胞内タンパク質の全細胞発現を検査するために、追加のステップを付加することができる。固定化の後、浸透剤（例えば洗浄剤）を使用して、抗体から細胞内タンパク質への接近を促進させることができる。
【００５２】
本発明の、第１の特に好ましい実施形態によれば、タンパク質、好ましくは哺乳動物細胞中のｈＥＲＧなどの膜内在性タンパク質の、表面発現レベルを変化させる、ペプチドやタンパク質、抗体、または化学薬品などの物質を同定するための方法が提供される。この方法は、ａ）対象のタンパク質を発現させる、哺乳動物細胞を含有する第１の培地を調製するステップと、ｂ）有効量の候補物質を添加するステップと、ｃ）この細胞を、候補物質の存在下で十分な時間、インキュベートするステップと、ｄ）タンパク質の少なくとも１つの細胞外抗原決定基に結合する、有効量の少なくとも１種の抗体を添加するステップと、ｅ）候補物質と共に細胞をインキュベートした後に、抗体とタンパク質の細胞外抗原決定基との結合レベル決定するステップとを含む。
【００５３】
対照を基準とした、候補物質存在下での結合レベルの増減のようないかなる変化も、この候補物質がタンパク質の表面発現レベルを変化させることを示している。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記ステップ（ｄ）は、有効量の少なくとも１種の１次抗体および有効量の少なくとも１種の２次抗体を添加することを含む。そのような実施形態によれば、１次抗体は、対象のタンパク質の少なくとも１つの細胞外抗原決定基に結合することが好ましい。そのような実施形態によれば、２次抗体は第１の抗体に結合することが、さらに好ましい。
【００５５】
１次抗体および／または２次抗体は、結合レベルの検出および決定が促進されるよう、酵素に結合することが好ましい。本発明の方法で使用される適切な酵素は、当業者に知られており入手可能である。適切な酵素の例示的な例には、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびこれらの２種以上の混合物が含まれるが、これらに限定するものではない。
【００５６】
対象のタンパク質の表面発現レベルの決定は、当業者に知られておりかつ利用可能な任意の方法および技法を使用して行うことができる。結合レベルは、蛍光、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）、放射能、吸光度、またはこれらの２種以上の組合せによって決定することが好ましい。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態によれば、膜タンパク質上で抗体が結合する細胞外抗原決定基は、好ましくは野生型抗原決定基であり、すなわち対象のタンパク質の、天然に生ずる形のものに、通常見出される細胞外抗原決定基である。
【００５８】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、膜タンパク質上の細胞外抗原決定基は、標識（ｔａｇ）を含有する。適切な標識は、当業者に知られており入手可能である。本発明の方法で使用される特に好ましい標識は、ヘマグルチニン（ＨＡ）標識である。この標識は、タンパク質の細胞外ドメインに挿入することができ、またはその細胞外ドメインの一部に置き換わることができる。
【００５９】
限定ではなく例示の目的で、本発明の好ましい実施形態では、膜貫通ドメインＳ１とＳ２の間のリンカー中で、ＨＡ標識などの細胞外標識が発現するように、ｈＥＲＧなどのイオンチャネルを設計する（そのような標識は、好ましくはチャネルの機能特性を変化させるべきではない）。この標識付きタンパク質を安定に発現させるＨＥＫ２９３細胞などの細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートなどの適切な容器に平板培養し、１種または複数の候補物質と共に、十分な時間、例えば一晩インキュベートする。次いで細胞を、ホルムアルデヒドなどで固定することが好ましいが、浸透させないことが好ましく、ＨＡ標識を認識する抗体を添加する。好ましくはセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素に結合した２次抗体を使用して、固定された細胞の表面に結合した抗ＨＡ抗体に結合させる。次いで細胞表面のシグナルを、化学発光反応混合（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ）などの任意の適切な方法により発生させることができ、そのレベルを、例えばマイクロタイタープレート照度計で測定することができる。対照細胞は、通常、水および／またはＤＭＳＯなど候補物質と併せて使用される任意の液体ビヒクルと共に、インキュベートする。
【００６０】
上記方法の、特により好ましい実施形態によれば、タンパク質表面発現は、インキュベータからマイクロタイタープレートを除去すること、および細胞を濡らしている媒体を除去することによって、アッセイする。ウェルを、ＰＢＳ（１００μｌ）で３回濯ぎ、次いでパラホルムアルデヒド（例えばＰＢＳ中４％、ｐＨ７．２、１００μｌ）で細胞を固定し、次いでＰＢＳで濯ぐ。細胞表面の非特異的結合部位は、例えば１％ヤギ血清／ＰＢＳ溶液（「遮断緩衝液」）と共に細胞をインキュベートすることによって、遮断することが好ましい。遮断緩衝液を除去した後、細胞を、遮断緩衝液中で、ラット抗ＨＡなどの１次抗体と共にインキュベートする。次いで１次抗体を除去し、細胞を洗浄する（例えば、遮断緩衝液で３回）。遮断緩衝液中のセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ラット・ヤギ抗体などの２次抗体を、添加する。次いで２次抗体を除去し、細胞を洗浄することが好ましい。
【００６１】
そのような実施形態によれば、化学発光シグナルは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）などの任意の適切な技法を使用して、発生させることができる。マイクロタイタープレートの各ウェルごとに、適切な量の試薬、例えば５０μｌを添加し、ＧｌｏＲｕｎｎｅｒ照度計（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ）を使用してデータを得る。
【００６２】
蛍光反応は、ウェル当たりの細胞数をモニタするために、任意選択で加えることができる。
【００６３】
本発明の、ある実施形態を用いることにより、膜内在性タンパク質の発現に影響を及ぼすペプチドを同定することができる。例えば、ヒトの心臓から生成されたレトロウイルス発現ライブラリーは、ＭＯＩ（感染多重度）が約１のとき、変異ｈＥＲＧ親細胞系に、安定に遺伝子を送り出すのに使用することができる。感染の２日後、生きた細胞を、ＨＡ特異的１次抗体でラベルした後、ＦＩＴＣ結合２次抗体でラベルする。蛍光細胞は、親細胞系と比べたときの、ｈＥＲＧタンパク質の細胞表面発現の増加について、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ）を用いて選別される。選別した細胞集団を数日間増殖させ、次いで上述の選択基準を適用して、２回目に再選別する。永久に変化した表面染色（ｓｕｒｆａｃｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を持つ細胞クローンを使用して、形質転換遺伝子を捕獲する。ＰＣＲ反応を、クローン部位に隣接するベクター特異的プライマーを使用して、ゲノムＤＮＡ上で行う。
【００６４】
違いを捜し出すため、表面発現が増大したＦＡＣＳ選別細胞からゲノムＤＮＡを分離し、さらに親クローンからも分離し、それをＰＣＲ反応における対照鋳型（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）として使用する。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングし、配列決定する。このスクリーンで分離したクローンを、一過性トランスフェンクションでの哺乳動物発現ベクターを使用する電気生理学的実験およびウェスタンブロット実験で、そのｈＥＲＧタンパク質の細胞表面発現の調節能力に関して試験する。したがって、生物発生、および形質転換受容性ｈＥＲＧタンパク質（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈＥＲＧ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を輸送する翻訳後処理に極めて重要な遺伝子を、同定することができる。
【００６５】
ＦＡＣＳ用に生きた細胞を免疫染色する基本的な手順は、文献（例えば、非特許文献１３および１４参照）に記載されている。ウイルス産生では、ＡｍｐｈｏＰａｃｋ−２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、１００ｍｍシャーレ上に５×１０６細胞の密度で平板培養する。４８時間後、プラスミドライブラリーＤＮＡ（Ｖｉｒａｐｏｔｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１０μｇを、製造業者（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が推奨するようにＦｕｇｅｎｅと混合し、血清の存在下で培養皿に添加する。レトロウイルスベクターＤＮＡには選択マーカーがないので、形質導入効率およびウイルス力価は、増強された緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を発現するウイルスが形質導入された対照プレート上の、蛍光細胞をモニタすることによって決定する。適度なレベルでＨＡ標識付きｈＥＲＧ  ＷＴ  Ｓ１ＨＡＳ２チャネルタンパク質を発現するＣＯＳ−７細胞（１０６）を、５〜１０ｍｌのＤＭＥＭに懸濁し、ＭＯＩ（感染多重度）が約１のときにウイルス上澄み液に感に置き換える。２日後、細胞を抗ＨＡ抗体でラベルし、その後、ＦＩＴＣ結合２次抗体（上記参照）でラベルし、蛍光活性化セルソータで選別する。親細胞系と比較したときに、表面蛍光の著しい変化を示す細胞を、まず１０日間増殖させ、次いで２回目の選別をする。ゲノムＤＮＡを、２度選別した細胞集団から分離し、ＰＣＲ反応を、ベクター特異的プライマーを使用して行って、ライブラリー挿入断片（ｌｉｂｒａｒｙ  ｉｎｓｅｒｔｓ）を捕捉する。
【００６６】
本発明について十分述べてきたが、当業者なら、本発明の範囲またはその任意の実施形態から逸脱することなく、広く均等な範囲の条件、配合、およびその他のパラメータを用いて本発明の方法を実施できることが、理解されよう。
【００６７】
本明細書で引用した全ての特許および刊行物は、その全体を参照により完全に、本明細書に援用される。任意の刊行物の引用は、その開示が出願日よりも前のものであるが、そのような刊行物が従来技術であること、または本発明が、先行発明によってそのような刊行物よりも先行する権利が与えられないことの承認と解釈すべきでない。
【国際調査報告】
2007529756.tif 000007