(57)【要約】  グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸（ＨＡ）は、幹細胞の運命を決定する幹細胞ニッチの構造に寄与する組織の細胞外マトリックスにとって不可欠な成分である。種々の病態を経験する対象や、病態を治療するために化学療法又は放射線療法などの種々の治療的介入を受ける対象において、ＨＡ濃度の低下が認められる。７５０，０００ダルトンを超える分子量を有するＨＡ（高分子量ＨＡ若しくはＨＭＷ  ＨＡ）を使用することで、ＨＡが部分的又は完全に消耗された組織の細胞外マトリックスが再構築されることについて述べる。より詳細には、本明細書では、局所組織に特異的な幹細胞の微小環境の回復における補助として対外の形態である高分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷ  ＨＡ）を使用することで、幹細胞移植若しくは他の治療の後に幹細胞の回復又は移植ひいては組織回復及びリモデリングが促進されることについて述べる。造血幹細胞に対するＨＭＷ  ＨＡの効果は、本発明において示される。重度の骨髄形成不全、及び５−フルオロウラシルによる治療に起因する汎血球減少を呈するマウスは、ＨＭＷ  ＨＡで治療された場合により早期に回復した。同様に、致死性の放射線療法後に造血幹細胞の移植を受けたマウスは、補助療法としてＨＭＷ  ＨＡで治療された際に、補助療法を施さない造血幹細胞の移植を受けた対照マウスと比較して末梢血細胞数の回復促進を示した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織又は器官におけるヒアルロン酸濃度の低下と関連する対象の病態を治療する方法であって、前記対象に７５０，０００ダルトンを超える分子量を有するヒアルロン酸又は薬剤として許容できるその塩の有効用量を投与すること含む方法。
【請求項２】
前記用量が０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記用量が１〜１０ｍｇ／ｋｇである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記用量が腹腔内、静脈内又は器官内に投与される、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸を担体に混合する、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記担体がリポソーム又は微粒子である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒアルロン酸が組織特異的な担体とコンジュゲートされる、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項８】
前記組織特異的な担体がＨＡ結合タンパク質とＦ（ａｂ）２又はＦ（ａｂ）フラグメントとの融合タンパク質を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
埋め込まれる又は移植される幹細胞の移植を改善するために対象を治療するための方法であって、前記対象に７５０，０００ダルトンを超える分子量を有するヒアルロン酸又は薬剤として許容できるその塩の有効用量を投与することを含む方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が全能性幹細胞、多能性幹細胞及び多分化能幹細胞から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記幹細胞が多分化能幹細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記多分化能幹細胞が全能性幹細胞又は多能性幹細胞の分化を引き起こすことによって得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多能性幹細胞が核移植法によって操作される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記多分化能幹細胞が造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、上皮幹細胞、内皮幹細胞、膵幹細胞、肝幹細胞及び成体幹細胞から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞が骨髄、末梢血、臍帯血、脳、膵臓、肝臓、粘膜組織、又は皮膚由来である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞が、死体の生存組織ドナーから単離される一次幹細胞、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件で培養される幹細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象に幹細胞を埋め込む又は移植することで病態を治療する、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒアルロン酸が前記幹細胞の埋め込み又は移植の前、それと同時又は後に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が幹細胞の移植に先立って治療を受ける、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記療法が細胞毒性療法である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記療法が化学療法、放射線療法又はホルモン療法である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記療法が切除療法である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記幹細胞が造血幹細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記療法が細胞毒性療法である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記療法が化学療法、放射線療法又はホルモン療法である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記療法が切除療法である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記用量が０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである、請求項９、１０、１１、１４、１７、１８又は１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記用量が１〜１０ｍｇ／ｋｇである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記用量が静脈内、腹腔内又は器官内に投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
間葉系幹細胞が造血幹細胞と同時投与される、請求項２３又は２６に記載の方法。
【請求項３１】
ヒアルロン酸の前記投与が治療後の造血を促進するためである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記用量が０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記用量が１〜１０ｍｇ／ｋｇである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記用量が静脈内、腹腔内又は器官内に投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ヒアルロン酸が投与される前記対象が、汎血球減少、好中球減少、血小板減少、貧血、リンパ球減少症又はそれらのいずれかの組合せ或いは準組合せからなる群から選択される状態を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記条件が治療又は疾患の結果である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療が細胞毒性療法である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記治療が化学療法、放射線療法又はホルモン療法である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記幹細胞が膵幹細胞であり、前記病態が糖尿病である、請求項１７に記載の方法。
【請求項４０】
前記用量が０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記用量が１〜１００ｍｇ／ｋｇである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記用量が静脈内若しくは器官内に投与される、請求項３９、４０又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記幹細胞が間葉系幹細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項４４】
前記病態が心臓障害である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記心臓障害は梗塞又は手術の結果である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記間葉系幹細胞が、骨／骨髄組織、軟骨組織、筋肉組織、腱組織又は脳組織から選択される組織に、直接又は静脈内に、或いは単独又は他の幹細胞と組み合わせて投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記用量が０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである、請求項４３、４４、４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記用量が１〜１０ｍｇ／ｋｇである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
骨髄機能障害を生じさせる薬剤又は放射線によって対象を治療する方法における、７５０，０００ダルトンを超える分子量を有するヒアルロン酸又は薬剤として許容できるその塩の有効量で骨髄機能障害を有する対象を治療することを含む改善。
【請求項５０】
幹細胞集団又は幹細胞の適切な機能を消耗させる病態又は治療の結果として、幹細胞集団の消耗を有する対象における幹細胞数とその機能の回復を改善するための方法であって、前記患者に７５０，０００ダルトンを超える分子量を有するヒアルロン酸又は薬剤として許容できるその塩の有効量を投与することを含む方法。
【請求項５１】
前記幹細胞が多分化能幹細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記多分化能幹細胞が、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、上皮幹細胞、内皮幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞及び成体幹細胞からなる群のメンバーである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記多分化能幹細胞が全能性幹細胞又は多能性幹細胞の分化を引き起こすことによって得られる、請求項５１又は５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記多能性幹細胞が核移植法によって操作される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記幹細胞が治療によって消耗する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記幹細胞集団が造血幹細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記治療が細胞毒性療法である、請求項５５又は５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記治療が化学療法、放射線療法又はホルモン療法である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記用量が０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである、請求項５０、５１又は５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記用量が１〜１０ｍｇ／ｋｇである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ヒアルロン酸が、幹細胞及び委任前駆細胞の増殖における正若しくは負の調節因子から選択される薬剤の有効量と共に投与される、請求項１、９、１１、５１又は５２に記載の方法。
【請求項６２】
前記ヒアルロン酸がケモカインの有効量で投与される、請求項１、９、１１、５１、又は５２に記載の方法。
【請求項６３】
前記ケモカインがＳＤＦ−ｌである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ヒアルロン酸が、組織特異的な細胞表面抗原に向けられるＦ（ａｂ）２若しくはＦ（ａｂ）フラグメントに融合されたＨＡ結合タンパク質からなる融合タンパク質である組織特異的な担体とコンジュゲートされた形態で用いられる、請求項１、９、１１、５１又は５２に記載の方法。
【請求項６５】
前記幹細胞が神経幹細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項６６】
前記神経幹細胞が中枢神経系及び末梢神経系の疾患を治療するために埋め込まれる又は移植される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記幹細胞が肝臓疾患を治療するための肝幹細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項６８】
前記病態が老化の結果である、請求項１、１７及び６４に記載の方法。
【請求項６９】
多能性幹細胞又は多分化能幹細胞の培養のための方法において、培地内に７５０，０００ダルトンを超える分子量を有するヒアルロン酸を含む改善。
【請求項７０】
前記培養条件が線維芽細胞又は間質細胞の支持細胞層を用いる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記幹細胞が多能性幹細胞であり、前記培地がＬＩＦを含有する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記幹細胞が線維芽細胞又は間質細胞の支持細胞層を用いる培地内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、前記培地が７５０，０００ダルトンを超える分子量を有するヒアルロン酸を含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項７３】
前記幹細胞が、ＬＩＦ及び７５０，０００ダルトンを超える分子量を有するヒアルロン酸を含有する培地内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される多能性幹細胞である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全能性、多能性及び多分化能幹細胞（ＳＣ）の移植又は埋め込みに関与する医学的治療プロトコルに関する。別の局面において、ＳＣの組織の構造及び機能にとって必要で、かつ病態の進展又は治療の結果として損傷を受ける細胞外マトリックスを再構築するための治療プロトコルに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類生物の組織及び器官は、種々の系統の成熟機能細胞によって構築される。成熟細胞は、常に特異的な機能に忠実な末期分化細胞である。これらの成熟細胞は寿命が限られているため、対応する組織特異的な幹細胞によって常に補充される必要がある。生物医学の知見における現段階によると、幹細胞には主に３種類が存在する。すなわち、全能性（胎座及び胚の両方を生成するＳＣ）、多能性（すべての胚系統を生成するが胎座を生成しないＳＣ）及び多分化能（特異的な器官及び組織に対して細胞を提供するＳＣ）である。過去１０年間、一部の組織及び器官に特異的な多分化能幹細胞は、単離され、かつ特徴づけられている。たとえば、造血幹細胞は、血球（赤血球、血小板、リンパ球、単球など）を担い、間葉系幹細胞は、結合組織（間質細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞など）を生成し、そして神経幹細胞は、脳を構築する。他の多分化能を有する幹細胞として、成体幹細胞、膵幹細胞、上皮幹細胞、内皮幹細胞などが挙げられる。
【０００３】
幹細胞研究から生じる最近の開発により、幹細胞の既に実証済みで理論的な応用に多大な関心が寄せられ、多岐にわたる病状の治療が行われている。たとえば、細胞毒性に対する外科的化学療法及び放射線療法と組み合わせて、造血幹細胞は既に種々の白血病及びリンパ腫の治療に用いられて奏功している。鼻孔組織由来の埋め込まれる神経幹細胞を用い、機能回復を目的に切断された脊髄の治療が行われており、切断という大事に至ることなく少なくとも部分的な機能回復という形で一定の成績を収めている。またパーキンソン病、脳卒中及びアルツハイマー病を治療するのに、神経幹細胞の埋め込みを用いることが提案されている。他の応用も同様で、たとえば死体における前脳の脳室下帯や歯状回の顆粒細胞下帯由来の細胞といった種々の供給源由来の神経幹細胞を用いることが提案されている。
【０００４】
間葉系幹細胞が梗塞に起因し、かつ心臓手術後に損傷を受けた心臓組織に埋め込まれてしまうと、心臓機能が実質的に回復することが認められている。間葉系幹細胞のために提案された応用において、骨、軟骨及び腱の部分的回復又は再生を亢進させ、骨髄破壊的な治療後に造血幹細胞の移植を促進し、さらに骨形成不全症、骨粗鬆症、変形性関節症＃骨関節炎、ひざ関節半月板切除術、及び筋ジストロフィーを治療するために、その使用を言及することが可能である。
【０００５】
糖尿病のマウス株において膵幹細胞の移植に関与する室内実験によって、マウスの糖尿病の病状は緩和されている。このことにより、膵幹細胞移植はヒトにおける糖尿病の有効な治療でありうることが強く示唆される。
【０００６】
治療効果を得るための幹細胞の移植又は埋め込みが奏功するか否かは多くの因子に左右され、補助療法を用いることでこれらの方法の成績が改善されることは知られている。たとえば、種々の可溶性因子、サイトカイン及びインターロイキンが造血幹細胞移植において用いられるが奏功の程度はさまざまであり、好ましくない副作用が付随することが多い。したがって、幹細胞の移植及び埋め込み方法を用いた追加的な補助療法に対する実質的需要が存在することで、該方法を用いて得られる結果が改善され、好ましくない副作用の発生率が低下する。
【０００７】
ＳＣは、哺乳類生物の極めて少ない集団（０．０１％未満）を構成する。しかしながら、この細胞数は、数十億個の新たな成熟細胞を一生を通じて常に生成するのに十分である。体内において他のあらゆる前駆細胞からＳＣを識別するＳＣが有する主要な特徴は、１）自己再生能、及び２）多分化能である。自己再生は、分化を経ることもなく複数回の分裂を経ることで、幹細胞プールの維持能力を保持するというＳＣの能力として定義できる。多分化能は、種々の系統、たとえば種々の細胞種に分化するＳＣの能力である。分化時には、ＳＣはその「幹細胞性」を失う。すなわちＳＣは、死すべき運命を有する成熟した末期分化細胞になったのである。一旦ＳＣは分化経路を選択していると、再びＳＣになることは不可能であると考えられている。ＳＣに関する挙動の選択（自己再生、増殖、又は分化）は、生理的かつ病態生理学的要求に応答してその微小環境ニッチよって提供される複数のシグナルによって調節される（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ  Ｒ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ（１９８３年）３７：３７５〜３８０頁）。骨髄、脳、膵臓などの種々の器官に対するこれらの微小環境構造については記述されている。上記ニッチにおける細胞構成は極めて不均一であり、種々の起源を有する細胞からなる（Ｍｉｎｇｕｅｌｌ  ＪＪら、Ｂｒａｚ  Ｊｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００年）３３：８８１〜８８７頁；Ｂｉａｎｃｏ  Ｐ．Ｒｏｂｅｙ  ＰＧ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ（２０００年）１０５：１６６３〜１６６８頁において概説）。過去１０年間で、微小環境ニッチの細胞によって提供される調節シグナルを媒介する分子機構の理解は、かなり進んでいる（Ｈｅｃｋｎｅｙ  ＪＡら、ＰＮＡＳ（２００２年）９９：１３０６１〜１３０６６頁）。可溶性や細胞表面の関連因子及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子は、ニッチを構成しニッチの高度に複雑な構造に寄与する細胞によって生成される（Ｇｕｐｔａ  Ｐら、Ｂｌｏｏｄ（１９９８年）；９２：４６４１〜４６５１頁、またＶｅｒｆａｉｌｌｉｅ  Ｃ．Ｂｌｏｏｄ（１９９８年）；９２：２６０９〜２６１２頁；Ｃｈａｂａｎｎｏｎ  Ｃ及びＴｏｒｏｋ−Ｓｔｏｒｂ  Ｂ．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２年）１７７：１２３〜１３６頁；Ｋｌｅｉｎ  Ｇ．Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ（１９９５年）５１：９１４〜９２６頁において概説）。ニッチの細胞構成が組織特異的である一方、細胞外マトリックス分子（ＥＣＭ）はすべてのニッチに共通の特徴を示す。コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヘモネクチン（ｈｅｍｏｎｅｃｔｉｎ）などのＥＣＭ成分は、組織の調節ネットワークに関与することが示される一方、ＨＡを含む極めて多数の他のＥＣＭ分子の役割はいまだ完全に理解されていない。
【０００８】
任意の特定の理論に縛られたくない一方で、ＨＡは組織恒常性に必須のＥＣＭ成分であるというのが本発明者の考えである。重要なことには、ＨＡに対する主要な受容体であるＣＤ４４は、造血幹細胞、神経幹細胞、及び間葉系幹細胞を含むがこれらに限定されない幹細胞の表面上に発現される。さらに、これらの幹細胞は、ＨＡの結合能を実証する（Ｋｂａｌｄｏｙａｎｉｄｉ、未発表の知見）。したがって、本発明者はＨＡが微小環境ニッチを構築するのに必要であり、ＳＣが自己再生し、増殖し、そして分化する能力を最適に支持すると考えている。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ファミリーのメンバーであるＨＡは、二糖類のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｇ１ｃＮＡｃ）及びＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）の複数コピーを含有する大きく負に帯電したポリマーである。ＨＡは、哺乳類生物のすべての器官、組織及び体液に認められる。ＨＡは塩と水に結合することにより、細胞外空間を膨張させ、維持すると当初は考えられた。後発研究では、ＨＡは、アグレカン、バーシカン、ニューロカンなどの種々の細胞外分子と相互作用することによって局所的なＥＣＭの構築に関与することが実証された（ＦｒａｓｅｒＪら、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．（１９９７年）２４２：２７〜３３頁）。ＨＡに結合する受容体の同定により、ＨＡは最終的に細胞の挙動に影響を与える特異的な受容体−リガンド相互作用に関与することが実証された。したがって、ＨＡは細胞増殖（Ｂｒｅｃｈｔ、Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９８６年）２３９：４４５〜４５０頁；Ｈａｍａｎｎ、ＫＪ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５年）１５４：４０７３〜４０８０頁）、遊走（Ａｎｄｒｅｕｔｔｉ、Ｄ．ら、Ｊ．Ｓｕｂｍｉｃｒｏｓｃ．Ｃｙｔｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９９年）３１：１７３〜１７７頁）、サイトカイン生成（Ｎｏｂｌｅ、Ｐ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９３年）９１：２３６８〜２３７７頁；Ｈｏｄｇｅ−Ｄｕｆｏｕｒ、Ｊ．ら、ＩＩｍｍｕｎ．（１９９７年）１５９：２４９２〜２５００頁；Ｋｈａｌｄｏｙａｎｉｄｉ、Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ．（１９９９年）９４：９４０〜９４９頁）、及び接着分子の発現（Ｏｅｒｔｌｉ、Ｂ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８年）１６１：３４３１〜３４３７頁）を含む、複数の細胞機能の調節に関与することが明らかになった。
【０００９】
正常細胞や腫瘍生物学におけるＨＡの関与が一般に認識されている一方、ＳＣを支持する微小環境ニッチの構築に対するＨＡの寄与についてはほとんど知られていない。例として造血系を用いることで、ＨＡは骨髄のＥＣＭの受動的構成因子ではないが、造血にとって必要かつ特異的なシグナルを誘導する分子であることを本発明者らは先に報告している（Ｋｈａｌｄｏｙａｎｉｄｉ  Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ（１９９９年）９４：９４０〜９４９頁）。特に、骨髄培養のヒアルロニダーゼ（ＨＡ’ａｓｅ）処理により、リンパ球生成及び骨髄造血が阻害されるどころか予防される一方、骨髄培養へのＨＡの添加によってリンパ球生成及び骨髄造血が亢進される。ＨＡは、造血幹細胞の委任以前に決定的段階を調節し、ＳＣの維持及び自己再生にとって必要であるようにみられる。他の組織及び器官については、脳内のニューロン周囲の微小環境中の中枢神経系（ＣＮＳ）（Ｇｉａｒａｒｄら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９２年；２４：２１〜４頁）、及び成長する神経の髄鞘形成にとって必要とされる末梢神経系（Ｓｅｃｋｅｌら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  １９９５年；４０：３１８〜２４頁）においてＨＡが認められた。ＨＡはまた、インスリン分泌を支持するのに膵臓ランゲルハンス島における微小環境にとって必須であることが示された（Ｖｅｌｔｅｎら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９９９年；２０：２１６１〜７頁）。ＨＡシンターゼ−２のノックアウトマウスは子宮内で胚として生存しないため、ＨＡは多能性幹細胞にとって必要であるようにみられる（Ｃａｍｅｎｉｓｃｈら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００年；１０６：３４９〜６０頁）。
【００１０】
ＨＡは、多数の細胞機能にとって必須であるが不安定な分子である。全身放射線療法によって、脾臓や骨髄内を含む組織内でのＨＡ量は著しく低下する（Ｎｏｏｒｄｅｇｒａａｆ、Ｅ．Ｍ．ら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９８１年）９：３２６〜３３１頁）。ＨＡの分解又はその合成及び蓄積に関する変化は、ＵＶ放射線療法（Ｋｏｓｈｉｓｈｉ、Ｉ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９９年）１４２８：３２７〜３３３頁；Ｓｃｈｍｕｔ、Ｏ．、Ａｎｓａｒｉ、及びＡ．Ｎ．、Ｆａｕｌｂｏｍ、Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ．Ｒｅｒ．（１９９４年）２６：３４０〜３４３頁）、又は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（Ｙｏｕｎｇ、Ａ．Ｖ．ら、Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．（１９９４年）９：５１５〜５２３頁；Ｍａｔｒｏｓｏｖａ  Ｖ．ら、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ（２００４年）近刊）、ヒドロコルチゾン又は他の化学物質（Ｙａｒｏｎ、Ｍ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．（１９７７年）２０：７０２〜７０８頁）の投与など、種々の他の因子によって誘導可能である。組織内の少量のＨＡは、上記治療の結果として減少することに加え、ホルモン不均衡（Ｄ’ａｖｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９７年；３２４：７５３〜６０頁；Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ−Ｓｃｈｎｕｒら、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ１９９７年；６４：５３９〜４３頁）、硬化症（Ｂｏｄｏら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９５年：４１：１０３９〜４９頁）、老化（Ｌａｍｂｅｒｇら、Ｊ．ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９８６年；８６：６５９〜６７頁；Ｍａｔｕｏｋａら、Ａｇｉｎｇ  １９８９年；１：４７〜５４頁；Ｓｃｈａｃｈｔｓｃｈａｂｅｌら、Ｚ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．１９９４年；２７：１７７〜８１頁）などの病理発生と関連する可能性がある。したがって、疾患及び治療に誘導される組織内ＨＡ量の変化によって微小環境の恒常性に不均衡が生じることから組織特異的な幹細胞の機能が影響を受け、病理発生が悪化する。
【００１１】
ＨＡは、ＳＣの微小環境における特異的な受容体によって媒介される機能調節の提供に加え、塩と水に結合し、かつ成長因子を提示することによる三次元のニッチ構築にとって必須である。組織内ＨＡ量の低下を誘導する治療的介入により、ニッチの物理化学的構造が変化する可能性もあるようにみられる。たとえば、５−ＦＵ（化学療法で用いられる薬剤）に誘発される骨髄形成不全とその投与は、細胞表面に関連するＨＡの濃度低下と相関し（ＭａｔｒｏｓｏｖａＶ．ら、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ、近刊）、骨髄の類洞外部において陰圧の血管外圧を招く（Ｎａｒｎｙａｎら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９４年；２２：１４２〜１４８頁）。
【００１２】
種々の病態又は治療の結果、幹細胞、前駆細胞、成熟細胞、微小環境細胞などの細胞によってＨＡ受容体が脱落する、又はその遺伝子発現が下方制御される可能性がある（Ｍａｔｒｏｓｏｖａら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００４年、近刊）。これらの変化は、細胞表面に関連するＨＡ濃度の低下を招き、また続発症の発症に寄与する可能性がある。したがって、選択される組織と器官において、幹細胞、前駆細胞、成熟細胞及び微小環境細胞の細胞表面に対する内因性又は体外からのＨＡの固着を促進する治療に改善がもたらされることは重要である。
【００１３】
化学療法は、多種多様な悪性腫瘍の治療及び治癒を目的として、単独で又は放射線療法と併用させて用いられる。化学療法の最も望ましくない結果は、重度の骨髄無形成及び汎血球減少である。この主な理由は、化学療法薬が迅速に分化する癌細胞に限らず循環する造血前駆細胞のプールも除去することである。成熟血球は寿命が限られているため、次々にＳＣを起源にもつ委任されて活発に増殖する前駆細胞によって常に補充されなければならない。したがって、化学療法に続く成熟血球の回復は長期間を要し、一般に汎血球減少を伴う。明らかに、この長期間にわたる造血回復により、患者は感染症、出血及び低酸素状態という極めてリスクが高い状態並びに移植後の病院環境に付随する重篤で死亡を含む予後状態に置かれる。
【００１４】
増殖におけるＳＣの関与は厳格に調節され、この複雑な過程はサイトカイン及びインターロイキンを含む多種の可溶性因子によって制御される。ＳＣの増殖を媒介する可溶性因子は明らかな特徴を示し、２つのグループに分かれる。すなわち、ＳＣの増殖の正の調節因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、インターロイキン（ＩＬ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ））及び負の調節因子（ＴＧＦ−β、ＴＮＦα、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、インターフェロンなど）である。特に化学療法、放射線療法又は化学放射線療法に続く生理的な要求という条件下で、骨髄において幹細胞の消耗を予防し、増殖細胞と休止細胞との正しい比率を維持するために、正と負の調節因子間の正確な均衡を維持することは極めて重要である。
【００１５】
組換え造血成長因子の使用により、サイトカイン療法の発展が促進されている。したがって、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦを用いることで、癌患者において化学療法に続発する好中球減少の期間が短縮される。Ｅｐｏは、適切な設定で使用される場合、化学療法に続発する貧血を改善し、同患者における赤血球輸血の必要性を低下させる。しかしながら、患者及びマウスでは、一部のサイトカイン、特にＧ−ＣＳＦによって、一貫して重度の血小板減少症が発症する（Ｍｏｍｉｎ、Ｆ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＡＳＣＯ．（１９９２年）１１：２９４頁（Ａｂｓｔｒ．）；Ｓｃｈｅｄｉｎｇ、Ｓ．ら、Ｂｒｉｔ．Ｊ  Ｈａｅｒｎａｔｏｌ．（１９９４年）８８：６９９〜７０５頁）。したがって、Ｇ−ＣＳＦの「系統競合」効果により、高毒性や免疫原活性以外では、患者は出血リスクが増加した状態に置かれる。さらに、成長因子の利用に関する最も重要な懸念の１つは、特に化学療法サイクルの反復と相まって幹細胞が消耗する可能性がある点である。成長因子の投与により、委任前駆細胞分画が膨張するだけではなく、増殖状態に入る休止期の多分化能幹細胞数が増加するに至る。同サイクルにおける通常休止状態のＳＣが関与することによって、それらは増殖に依存する化学療法の治療単位の反復の際に大幅に減少するというリスクが亢進した状態に置かれる（Ｍｏｏｒｅ  Ｍ、Ｂｌｏｏｄ．（１９９２年）８０（１）：３〜７頁で概説）。休止状態の幹細胞が増殖状態に入ることを妨げる分子機構を同定することは、特に増殖に依存する化学療法サイクル反復の利用の観点でいえば臨床応用にとって相当な可能性を秘めている。
【００１６】
したがって、化学療法後に造血の回復を改善するのに新たな手法に対する要望が存在することが明確になっている。
【００１７】
化学及び放射線療法の続発症を緩和するために病院で用いられるもう１つの手法は、幹細胞移植である。造血幹細胞の移植は、一般に高用量の化学療法及び全身放射線療法に続く造血の回復を促進するのに用いられる。幹細胞移植の効率は、移植後の末梢血液細胞の回復に関する力学によって影響を受ける。幹細胞移植の有効性は、静脈内に注入されたＳＣのホーミングする能力に依存している。本明細書で用いられるように、造血幹細胞のホーミングは、骨髄造血ニッチを見出し、その範囲内に沈積し、子孫を生成する造血幹細胞の能力として定義される（Ｔａｖａｓｏｌｌｉ  Ｍ、Ｈａｒｄｙ  Ｃ．（１９９０年）Ｂｌｏｏｄ７６（６）：１０５９〜１０７０頁；Ｈａｒｄｙ  Ｃ、Ｍｉｎｇｕｅｌｌ  Ｊ．（１９９３年）Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ７（ｌ）：３３３〜３４１頁；Ｈａｒｄｙ  Ｃ、Ｍｅｇａｓｏｎ  Ｇ．（１９９６年）Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ１４：１７〜２７頁）。したがって、ホーミングは２つの主要な段階に分かれる。すなわち、血管外遊出とそれに続く骨髄の播種である。この定義によると、骨髄の類洞の内皮上に束縛されるＳＣは、いまだホーミングした細胞として考えられない。同様に、生理的な要求の条件下で適切な造血ニッチに到達しないで子孫を生成していない血管外遊出されるＳＣもまたホーミングした細胞として見なすこともできない。血管外遊出は、ＳＣのホーミングにおける多段階を有する第１の段階であり、生理的流れの条件下で骨髄血管内皮とのＳＣの相互作用に関与し、細胞のつなぎとめ（たとえば回転）、内皮細胞の管腔表面への接着、内皮を貫通する漏出（たとえば移動）などを含む。「ホーミングプログラム」を完了させる播種段階では、血管外遊出されるＳＣは、それ自体の酵素活性を用いる又は周囲の細胞における該活性を誘導することにより、骨髄ＥＣＭを介して移動できなければならない。最後に、ｈｏｍｅｄ細胞は、（ｉ）造血支持因子を生成する適切な微小環境を見出し、（ｉｉ）増殖及び自己再生によって応答しなければならない（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ、Ｃ．Ｂｌｏｏｄ．（１９９８年）９２：２６０９〜２６１２頁；Ｔｕｒｎｅｒ、Ｍ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．（１９９４年）１２：２２〜２９頁；Ｑｕｅｓｅｎｂｅｒｒｙ、Ｐ．及びＢｅｃｋｅｒ、Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９９８年）９５：１５１５５〜１５１５７頁；Ｈａｒｄｙ、Ｃ．、Ｍｅｇａｓｏｎ、Ｇ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．（１９９６年）１４：１７〜２７頁；Ｔａｖａｓｓｏｌｉ、Ｍ．、Ｈａｒｄｙ、Ｃ．Ｂｌｏｏｄ．（１９９０年）７６：１０５９〜１０７０頁）。
【００１８】
特に着目すべきことは、造血幹細胞のその微小環境すなわち骨髄内の接着の促進に関与する造血幹細胞のホーミング／移植、その増殖及び自己再生は、固着されたＳＣの分泌及び骨髄から末梢血系に至るその遊走刺激に関与するＳＣの可動化とは区別されるべきである。したがって、ＳＣのホーミング／移植は、ＳＣの可動化とは相反するものである。
【００１９】
指示されるＳＣの遊走を媒介する分子機構についてほとんど未知である一方、ＳＣのホーミングを理解するための基本は過去１０年間で創出されている。ここでは、ＳＤＦ−１などのケモカインと、Ｐ及びＢセレクチン、ＶＣＡＭ−ｌ、α４β１及びα４β７インテグリン、並びにＣＤ４４などの細胞表面分子とを含む種々の分子が関与している（Ｋｈａｌｄｏｙａｎｉｄｉら、Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．１９９６年；６０：５７９〜９２頁；Ｆｒｅｎｅｔｔｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９８年；９５：１４４２３〜１４４２８頁；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９１年；３５２：４３８頁；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９５年；９２：９６４７頁）。ＣＤ４４は元来はリンパ球の高血管内皮細静脈に対する結合にとって必要なホーミング分子として示された（Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６年；２３３：５５６〜５５８頁）。ＣＤ４４は、セレクチンに加え、活性化リンパ球の一次内皮細胞上での回転を媒介できることが判明している（ＤｅＧｒｅｎｄｌｅｌｅら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９６年；１８３：１１１９〜１１３０頁）。またＣＤ４４は、骨髄ＥＣＭの重要成分であるＨＡ及びフィブロネクチンに対するリンパ球及び造血前駆細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの接着を媒介することが実証されている（Ｌｅｇｒａｓら、Ｂｌｏｏｄ  １９９７年；８９（６）：１９０５〜１９１４頁；Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅら、Ｂｌｏｏｄ  １９９４年；８４（６）：１８０２〜１８１１頁）。最後に、ＣＤ４４の細胞質部分はアンキリンなどの細胞骨格タンパク質に特異的に結合し、ＣＤ４４変異体アイソフォームは、活性型ＭＭＰ−９に密接に関連している。このことは、ＣＤ４４は細胞外空間においてＳＣの遊走に関与する場合があることを示唆している（Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ１９９８年；７６（１）：２０６〜２１５頁）。
【００２０】
本発明者らは、これらの所見を踏まえて、ＨＡが結合するのを遮断するＣＤ４４に特異的な抗体によって骨髄細胞を前処理する結果、致死的に放射線を照射されたレシピエントの骨髄を再増殖する場合の造血幹細胞の能力が低下することを先に実証している。このことはＣＤ４４が造血幹細胞のホーミングと相互作用する可能性があることを示唆している。さらに、本発明者らは、ＣＤ４４は初期造血幹細胞−間質細胞間の相互作用を調節することから、造血幹細胞の播種に関与する可能性があることを先に実証していた（Ｋｈａｌｄｏｙａｎｉｄｉ、Ｓ．ら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｉ．（１９９６年）６０：５７９〜５９２頁）。したがって、ＣＤ４４／ＨＡ経路は、幹細胞−間質細胞間及び幹細胞−内皮細胞間の相互作用の調節にとって重要であることから、ＳＣのホーミング／移植の調節に寄与すると本発明者は考えている。
【００２１】
全身放射線療法はＨＡの分解を招く。さらに、致死的に放射線を照射された骨髄の同系の骨髄細胞を用いた再構築は、再構築されないマウスと比較して、骨髄及び脾臓でのＧＡＧ濃度における二次的な再発を招く。再構築マウスにおいてＨＡの検出可能量が顕著に認められなかった一方、再構築されないマウスにおいてＨＡの遅々とした回復が認められた（Ｎｏｏｒｄｅｇｒａａｆ  Ｅ．Ｍ．ら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９８１年）９：３２６〜３３１頁）。さらに、放射線療法は、正常な造血に必須でありうるＧＡＧの硫酸処理に対する硫酸非処理の比に影響を及ぼすことが判明した。したがって、細胞の放射線照射及び注入に起因するＨＡ量の低下は、移植幹細胞のホーミング／移植と干渉する可能性がある。
【００２２】
移植幹細胞は、末期分化した機能的活性のある成熟血球のプールを補充するため、放射線照射された骨髄を再増殖し、委任造血前駆細胞を生成する必要がある。したがって、造血幹細胞の移植後の成熟血球集団の回復は、長期間を要し、一般に汎血球減少を伴う。移植後患者において委任前駆細胞のプールの増殖及び膨張を促進するのに、特定のＧＭ−ＣＳＦにおいて成長因子が用いられる。しかしながら、前駆細胞の増殖刺激に加え、ＧＭ−ＣＳＦは骨髄から末梢血にかけて造血幹細胞を可動化する。これらの細胞が可動化の際に成長因子に鋭敏になる結果として、ＧＭ−ＣＳＦのこの効果は、多分化能幹細胞による長期にわたる再構築に対して負の影響を与える。これら及び骨痛、筋肉痛、発熱、紅斑などのＧＭ−ＣＳＦの他の副作用を考慮すると、ＧＭ−ＣＳＦの使用は望ましくない。ＧＭ−ＣＳＦと同様に、低分子量（ＬＭＷ）のＨＡ（分子量＜７５０，０００ダルトン）は、組織から末梢までの成熟及び前駆細胞の造血細胞を含むＳＣの可動化に対する能力を示す（カナダ出願特許２，１９９，７５６号）。したがって、ＬＭＷ  ＨＡ及び高分子量（ＨＭＷ）ＨＡは、関連受容体に対する種々の親和力の結果と同様に、種々の生物学的機能を有することが明らかになっている。ＬＭＷ  ＨＡが可動化剤として作用する一方、ＨＭＷ  ＨＡが組織に恒常性平衡をもたらすことを本発明者は認めた。したがって、ＨＭＷ  ＨＡと比較した場合のＬＭＷ  ＨＡの非常に異なる機能により、化学療法後及び移植後の臨床環境においてＬＭＷ  ＨＡの使用は不適当になる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
したがって、本発明の目的は、化学療法後及び移植後の組織回復を刺激するためのＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＥｐｏの使用に対する代替案又は補完案を提供することである。
【００２４】
したがって、本発明の目的は、化学療法及び放射線療法によって誘導される続発症に対する改善された治療を提供することである。
【００２５】
本発明の目的は、ＳＣを消耗する治療後におけるＳＣの移植に対して改善された方法を提供することである。
【００２６】
発明の要旨
本発明は、対象に対する有効用量の高分子量ＨＡの投与を含む、組織及び器官におけるＨＡ濃度の低下に関連する病態を治療するための方法を提供する。
【００２７】
高分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷ  ＨＡ）
本発明の実施において用いられるＨＭＷ  ＨＡは、７５０，０００ダルトンより大きい平均分子量を有し、天然資源からの精製又は合成化学物質又は組換え方法を利用した生成など、任意の適切な供給源から入手可能である。またＨＭＷ  ＨＡは、薬剤として許容できる塩の形態で投与される場合がある。たとえば、それは塩化ナトリウムとして投与できる。本発明者は、高分子量ＨＡ（＞７５０．０００ダルトン）の使用によって内因性幹細胞の回復又は移植される若しくは埋め込まれるＳＣの移植が促進されることから、幹細胞移植及び他の治療の後に組織が回復し、かつリモデリングが生じることを認めている。この結果の特に驚くべきことは、低分子量ＨＡ（７５０，０００未満の平均分子量を有するＨＡ）は細胞の移植に対して逆効果を有することが認められている点である。すなわち、それは成熟細胞及びＳＣの可動化を誘導する。本発明では５０，０００ダルトンより大きい分子量を有するＨＡ又はその薬剤として許容できる塩も用いられる。たとえば、１，０００，０００ダルトン以上又は２，０００，０００ダルトン以上又は３，０００，０００ダルトン以上の平均分子量を有するＨＡが使用できる。
【００２８】
高分子量ＨＡは、好ましくは投与前に、通常の生理塩水又は他の任意の生理学的に許容できる水性の注入可能な希釈剤などの水性担体中に溶解される。他の賦形剤は、生理学的に許容できる限り、緩衝液、防腐剤などを含む場合がある。ＨＡ溶液の濃度は、周知の薬理学的原理に基づいて調節できるが、５〜５００μｇ／ｍｌであってもよい。
【００２９】
特定の理論に束縛されることは望まないが、ＨＭＷ  ＨＡを用いて得られる可能性がある薬効は１つ又は複数の以下の項目に起因するというのが本発明者の考えである。
−ＳＣに支持的な可溶性因子を生成するための微小環境ニッチの細胞の刺激
−ＳＣの自己再生並びに委任前駆細胞の増殖及び分化を支持する細胞表面因子を発現するためのＳＣの微小環境ニッチの細胞の刺激
−組織特異的なＥＣＭ成分を生成するための幹細胞の微小環境ニッチの刺激
−抗アポトーシス因子を生成するためのＳＣの微小環境ニッチの刺激
−ＳＣの増殖及び自己再生のためのＳＣへの直接シグナルの供給
−委任前駆細胞の増殖のための同細胞への直接シグナルの供給
−成長因子及びサイトカインの隔離と提示
−ＳＣの消耗がない委任前駆細胞の増殖を刺激する内因性の生物学的活性の発現及び生成の誘導
−組織及び器官内でのＳＣの沈積のための条件の提供
−疾患又は治療に誘導されるＨＡ受容体の発現低下という条件下における細胞外空間及び圧力を維持するためのＨＡの固着
−任意の起点における細胞遊走の指示
−ＳＣのホーミング及び移植を媒介する酵素学的特性を伴う内因性の生物学的活性の発現及び生成の誘導
−移植幹細胞の血管外遊出の促進
−静脈内注入されたＳＣを含む骨髄の播種／移植の促進
−幹細胞−内皮細胞間及び幹細胞−微小環境細胞間の相互作用を媒介する接着分子発現の誘導
−化学療法及び放射線療法を含む（がこれらに限定されない）治療的介入後における細胞外部位の容量及び圧力の維持
【課題を解決するための手段】
【００３０】
治療条件
本発明は、たとえば薬剤又は紫外線、Ｘ線などの種類の放射線の使用に関与する治療的介入によって損傷を受けた骨髄、脳、膵臓、肝臓、皮膚を含む（がこれらに限定されない）多種多様な組織及び器官におけるＳＣの微小環境を改善／治療するための方法を提供する。
【００３１】
また本発明は、疾患又は病態の病理発生によって損傷を受けた骨髄、脳、膵臓、心臓、肝臓、皮膚などの組織や器官における内因性幹細胞及び移植幹細胞或いは埋め込まれる幹細胞の微小環境を改善する／治療するための方法を提供する。上記病理発生の例として、変性疾患、原発性又は続発性の内分泌障害、老化、ＨＡ合成の病変、心臓発作などが挙げられる。
【００３２】
したがって、本発明の実施は、ある種の病態又は治療の結果として正常より低下した（＞１０％の低下）ＨＡ濃度を示す任意の患者の治療に幅広く適用可能である。
【００３３】
また本発明は、病理学的に発現したＣＤ４４やＲＨＡＭＭ（遺伝子発現の脱落又は特異的な下方制御に起因する低下した細胞表面における発現）などのＨＡ受容体によって損傷を受けた組織及び器官（骨髄、脳、膵臓、肝臓、皮膚など）におけるＳＣの微小環境を改善する／治療するための方法を提供する。
【００３４】
それは治療によって誘導される骨髄無形成／形成不全に罹患する患者の治療において特に有用である。これは、たとえば骨髄の抑制若しくは除去に至ることが知られているプレドニゾン又は他の治療を用いた化学療法、放射線療法、ホルモン療法の後に引き起こされる場合がある。
【００３５】
また本発明は、水性希釈剤中にＨＭＷ  ＨＡ若しくは薬剤として許容できるその塩を含有する治療量の組成物を末梢血、器官内又は腹腔内に投与することを含む、体外からの移植幹細胞の移植を促進するための方法を含む。
【００３６】
したがって、本発明は、たとえば造血幹細胞（ＨＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、上皮幹細胞（ＥｐＳＣ）、内皮幹細胞（ＥｎＳＣ）、肝幹細胞（ＨｅＳＣ）、膵幹細胞（ＰＳＣ）、臍帯血幹細胞及び成体幹細胞（ＡＳＣ）といった多分化能幹細胞、多能性幹細胞、並びに全能性幹細胞を含む、内因性幹細胞又は移植幹細胞の機能回復を促進するための高分子量ＨＡの使用を含む。より詳細には、本発明はＳＣにおける自己再生及び多分化能といった「幹細胞性」特性、増殖及び分化に対する能力の回復を含む埋め込み／移植後の幹細胞移植を促進するためのＨＭＷ  ＨＡの使用に関する。一部の症例では、２種類以上の幹細胞は、同時に移植又は埋め込みできる。たとえば、ＭＳＣは、ＨＳＣの移植を支持するためにＨＳＣとともに埋め込み可能である。
【００３７】
埋め込み又は移植を目的に本発明において有用な幹細胞は、骨髄、末梢血、臍帯血、脳細胞、膵細胞、肝細胞若しくは皮膚細胞、粘膜組織由来など、任意の適切な供給源から当該技術で周知の単離方法によって入手できる。これらの細胞は、生体ドナー若しくは死体の組織から、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された幹細胞から入手できる。また有用な多分化能幹細胞は、全能性若しくは多能性の幹細胞の分化を誘導することにより、又は対応する幹細胞系から入手できる。さらに本発明に有用な幹細胞は、核移植法によって入手できる。この処理は、多能性の細胞の核を胚盤胞から除去してから幹細胞の埋め込み又は移植が意図されたレシピエントの成体細胞から核が抽出された除核細胞へ導入することに関与する。
【００３８】
多能性幹細胞又は多分化能幹細胞の集団は、埋め込み若しくは移植に先立ち、又は当該技術で既知の培養方法を用いた他の目的のために、膨張し分化できる。上記処理では、線維芽細胞又は間質細胞を含有する支持細胞層を伴う幹細胞の共培養について言及できる。また多能性の幹細胞は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下で培養できる。本発明の１つの実施形態において、支持細胞層若しくはＬＩＦを含有する多能性幹細胞の培養中に又はサイトカインと成長因子のカクテルを含有する多分化能幹細胞の培養中に高分子量ヒアルロン酸を含めることができる。
【００３９】
本発明の有用性を実証するために、造血幹細胞及び造血系を用いた実験が実施されており、その結果は本明細書の実施例として述べられている。高分子量ＨＡは、化学療法（５−ＦＵ注入）後の骨髄における造血の回復を促進し、骨髄形成不全の期間を短縮することが認められた。造血幹細胞及び前駆細胞の数の上昇が高分子量ＨＡで治療されたマウスの骨髄において認められた。さらに、有糸分裂における細胞数の上昇が高い増殖率を示すことが認められた。高分子量ＨＡによる骨髄造血に関する議論の末、対照動物と比較して、リンパ球、好中球、単球、血小板、巨核球や赤血球などの成熟した機能活性のある末期分化した末梢血液細胞の数がより増加するに至った。したがって、高分子量ＨＡの投与が５−ＦＵに誘導される骨髄形成不全や汎血球減少に対抗するのに有効であることが判明した。このことは高分子量ＨＡが造血幹細胞にとって必須の骨髄における微小環境に実質的に寄与し、造血の回復が加速されることを示唆している。本発明者は、高分子量ＨＡは、ＳＣの増殖、分化及び自己再生に関する可溶性及び膜関連調節因子のバランスのとれた生成を誘導すると考えている。したがって、高分子量ＨＡによって誘導される正確な因子の組成物は、バランスのよい成熟細胞の生成を維持し、系統競合を回避し、ＳＣの減少／消耗を予防するのに役立つと考えられる。
【００４０】
本発明は、高分子量ＨＡが化学療法によってマウスにおける攪乱した造血を有意に改善することも実証することから、治療によって誘発される骨髄形成不全及び無形成に対する適切な治療法である。高分子量ＨＡを使用する結果、化学療法を受ける患者の予後が改善され、その回復が早まることになる。
【００４１】
全身放射線療法及び骨髄細胞移植のいずれもが骨髄中のＨＡ量を著しく低下させることから（Ｎｏｏｒｄｅｇｒａａｆら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９８１年；９：３２６〜３３１頁）、本発明者らは、致死性の放射線療法（０．８５Ｇｙ／ｈの線量率における１５．２５Ｇｙのγ線）後に骨髄移植を施した後における幹細胞移植に対する体外からの高分子量ＨＡの効果について検討した。対照群における白血球（ＷＢＣ）数が低値を維持した一方、１３日目に高分子量ＨＡのレシピエントにおいて白血球数の完全な回復が認められた。さらに、高分子量ＨＡで治療されたマウスの末梢血における血小板（ＰＬＴ）及び赤血球（ＲＢＣ）の回復が監視された。骨髄における解析によってＨＡ治療群において成熟細胞数及びその前駆細胞の増加が示されたことから、ＨＡ治療群における末梢血液細胞数の回復の亢進は移植幹細胞の移植が促進された結果である。
【００４２】
これらの知見は、高分子量ＨＡが骨髄において必須の微小環境の回復及び／又は維持に役立ち、ＳＣのホーミング及び移植を促進することを実証する。
【００４３】
全体的に見れば、本明細書で提示される結果は、化学療法及び全身放射線療法及び他の治療によって組織や器官の損傷が誘発された後に、骨髄の回復を改善することを意図した臨床血液学における高分子量ＨＡの有用性について実証する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
投与法
本発明の高分子量ＨＡ組成物は、水溶液として投与可能であり、又は特に任意の組織／器官に対して標的とされるリポソーム若しくは微粒子などの担体に混合され、かつこれら担体の懸濁液として投与される場合がある。上記標的の担体は本明細書に記載される。
【００４５】
注入される高分子量ＨＡのより組織特異的な送達を確実にするため、同ＨＡはたとえば高分子量ＨＡを指示するのに望ましい任意の種類のＳＣ、間質細胞、内皮細胞又は他の細胞種といった特定の組織を標的にする担体とコンジュゲートできる。適切な組織特異的な担体は、たとえばＨＡと結合するタンパク質及び抗体（特にＩｇＧ）又は抗体フラグメントからなる標的組織に特異的な融合タンパク質でありうる。適切な抗体フラグメントとして、たとえばＦ（ａｂ）’及びＦ（ａｂ）２’フラグメントが挙げられる。ＨＡ受容体の欠損と関連する病態を治療する際、上記標的に特異的な担体の使用によって注入されるＨＡにおける固着が改善できることになる。
【００４６】
高分子量ＨＡの医薬品組成物は、腹腔内、静脈内、又は器官内に投与できる。
【００４７】
高分子量ＨＡの組成物は、対象においてＨＡが低濃度であることが認識された後にはいつでも投与できる。
【００４８】
いくつかの応用では、たとえば、幹細胞を消耗しても除去しないという条件下で、５−ＦＵなどの薬剤による化学療法を実施した後に、高分子量ＨＡ組成物の単独投与が可能である。また高分子量ＨＡの組成物は、埋め込み又は移植に先立ち、ＳＣの懸濁液、或いはさらに言えば任意の他の細胞種の懸濁液と結合できる。
【００４９】
別の実施形態において、高分子量ＨＡの組成物は、埋め込み又は移植に先立ち、たとえば幹細胞懸濁液といった細胞懸濁液によって予備培養できる。さらに他の実施形態では、高分子量ＨＡは、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、Ｅｐｏ及びＴｐｏ、インターロイキン、幹細胞因子、ｆｌｔ−３リガンド、又はＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、インターフェロンなどの幹細胞増殖の負の調節因子、並びに上記治療で用いられる他の薬剤の投与に関与する治療と連携して投与可能である。
【００５０】
高分子量ＨＡ組成物は、高分子量ＨＡ治療又は低濃度のＨＡによる緩和が推測される症状を対象が呈し続けるかぎり、単回若しくは複数回投与も可能である。移植細胞又は埋め込み細胞と連携して用いられる場合、ＳＣなどの細胞の懸濁液による治療の前後若しくは治療と同時に投与可能である。
【００５１】
有効な薬用量に相当する特定用途に対する各用量を対象に投与する場合の高分子量ＨＡの総量は、当該技術によって容易に決定できる。本発明の好ましい実施形態において、同用量は０．１〜１００ｍｇ／ｋｇにおける任意の用量、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇにおける任意の用量の場合がある。「薬用量」という用語は、組成物が投与される対象においてＨＡ濃度の観測可能な上昇に至るための必要量を示すことが意図されている。したがって、「薬用量」を示す精密な量は、投与後、及び治療的有効量の投与に至るまでの複数回投与におけるＨＡ濃度の監視に基づいて容易に決定できる。
【実施例】
【００５２】
図面の詳細な説明
（実施例１）
図１は、５−ＦＵ投与後での末梢血液細胞の回復に対するＨＭＷ  ＨＡの効果を例示する。マウスを対象に５−ＦＵを１５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に注入した。白血球（ＷＢＣ）数、赤血球（ＲＢＣ）数、血小板（ＰＬＴ）数、ヘモグロビン（ＨＧＢ）及びヘマトクリット（ＨＣＴ）を、２週間にわたり毎日監視した。予想通り、５−ＦＵによるマウスの治療によって、重度の骨髄形成不全及び汎血球減少が誘発された。ＷＢＣ数及びＰＬＴ数は、５−ＦＵ投与前の８．４±１．５×１０６／ｍｌ及び６７８．４±８２×１０６／ｍｌから７日後の２．５２±０．５×１０６／ｍｌ及び３８８±５０×１０６／ｍｌに各々低下した（図１Ａ、Ｂ）。骨髄中単核球の総数は、５−ＦＵ投与前の１５．３±２．２×１０６／大腿骨から投与７日後の５．００±０．６５×１０６／大腿骨に低下した（図２Ａ）。５−ＦＵ投与１４日後には、すべてのパラメータが正常値に回復した。高分子量５−ＦＵで攪乱した造血に対するＨＡの効果を測定するため、５−ＦＵで治療される（０日目）マウスに、１００μｇ／マウスのＨＭＷ  ＨＡを４日、６日、１０日、及び１３日目に投与した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ由来、ＰＢＳ中で０．０５％溶液として平均分子量７５０，０００〜２，０００，０００ダルトン）。動物の対照群に、２００μｌ  ＰＢＳの注入を伴う治療を行った。ＨＡ及びＰＢＳで治療されるマウス由来の末梢血を毎日収集し、ＷＢＣ数、ＲＢＣ数、ＰＬＴ数、ＨＧＢ、及びＨＣＴの測定を行った。ＨＡで治療されるマウスにおけるＷＢＣ数は、対照のＰＢＳによる治療群と比較して５日目から有意に高め（２〜２．５倍）であった（図１Ａ）。ＷＢＣ回復に対する高分子量ＨＡの用量依存効果を実証するため、マウスに種々の用量（０〜１０００μｇ／マウス）のＨＭＷ  ＨＡを投与し、７日目に末梢血試料において白血球数の評価を行った。高分子量ＨＡの最も有効な濃度は、１００μｇ／マウス（すなわち３ｍｇ／ｋｇ）であることが認められた。ＨＡで治療されるマウスにおけるＰＬＴ数は５日目から増加し、８日目には１．７倍に上昇した（図１Ｂ）。２週目からＨＡによる治療群で認められるパラメータは、５−ＦＵによる治療前の正常マウスにおけるそれに相当する。したがって、高分子量ＨＡの投与により、マウスは５−ＦＵによって誘発される白血球減少及び血小板減少から救済された。
【００５３】
成熟血球は、造血前駆細胞の増殖及び分化の産物であることから、本発明者らは次に、５−ＦＵによる治療マウスにおいて骨髄造血に対する高分子量ＨＡの効果について検討した。５−ＦＵによって治療されたマウス（０日）に、ＰＢＳ又は１００μｇ／マウスのＨＭＷ  ＨＡ（ＰＢＳ中で０．０５％溶液として）を４日、６日、１０日、及び１３日目に投与した。骨髄細胞を７日、１４日、２１日、及び２８日目に採取した。ＨＡで治療されるマウスでは、７日目に全骨髄細胞数がＰＢＳで治療されるマウスと比較して３．５倍多かった（図２Ａ）。高分子ＨＡの種々の造血系統に対する効果を評価するために、以下のように骨髄細胞の形態素解析を実施した。骨髄細胞試料をメタノール中でスライドグラス上に−２０℃で２０分間固定し、室温で乾燥させ、フィリプソン（Ｆｉｌｉｐｓｏｎ）色素（９６％エタノール中で２５％のギムザ色素）とともにスライドを１５分間インキュベートし、広範囲に蒸留水（ｐＨ７．０）で洗浄し、乾燥させ、そしてカバースリップで蓋をした。顕微鏡下でのスライドの測定により、５−ＦＵ投与後に高分子量ＨＡ治療を受けたマウスでは骨髄における成熟した脊髄及びリンパの因子数が増加したことを示した（表１）。
【表１】
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【００５４】
興味深いことに、高分子量ＨＡで治療される動物は、対照（０．３／１００）と比較して、有糸分裂（１．７／１００）時にも骨髄細胞数の増加を示した。これらのデータは、ＨＡで治療されるマウスの骨髄において増殖型前駆細胞数がより多いことを示唆している。この仮定を考察するため、骨髄細胞をメチルセルロース中で培養し、増殖系統の委任前駆細胞数を評価した。骨髄細胞を採取し、３０％ＦＣＳ、１％ＢＳＡ、１０４Ｍ２−メルカプトエタノール、２ｍＭＬ−グルタミン（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）を含有する半固体メチルセルロース中の２４ウェルプレートに１×１０４細胞／ｍｌの濃度で置いた。インターロイキン−３の供給源としてＷＥＨＩ−３Ｂ由来の条件培地を添加した（１５容量％）。培地を５％ＣＯ２の湿気のある空気中で３７℃でインキュベートした。２０個を上回る数の細胞を含有するコロニー（ｔｈｅｎはｔｈａｎのミス）を培養の７日後に倒立顕微鏡下でカウントした。赤血球のバースト形成単位（ＢＦＵ−ｅ）を培養するために、エリスロポエチン  １０Ｕ／ｍｌ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）を添加した。少なくとも５００細胞を含有するコロニーを１４日後にカウントした。対照と比較して、高分子量ＨＡで治療されるマウスでは、脊髄前駆細胞数は２．９倍多く、初期の赤血球の前駆細胞数は２１．５倍多かった（図２Ｂ）。ＨＡで治療されるマウスの骨髄における巨核球数は３．７倍の増加を示した。次に本発明者は、高分子量ＨＡの刺激が、長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイを用いて測定されるより初期の前駆細胞に対する損傷を犠牲にして委任前駆細胞のプールに利益をもたらすかどうかを検討した。高分子量ＨＡによって治療されるマウスの骨髄におけるＬＴＣ−ＩＣ数を限界希釈アッセイを用いて評価した。本発明者らは、５ＦＵ／ＨＡマウスに対する５ＦＵ／ＰＢＳマウスの骨髄において、ＬＴＣ−ＩＣ数の増加における傾向を監視した。その差異は統計的に有意ではなかった（ｐ＞０．ｌ）が、ＬＴＣ−ＩＣ数が対照における１４．８±９．６／大腿骨からＨＡによる治療動物における３０．６±１３．３／大腿骨に上昇した（図２Ｃ）。これらの知見は、ＨＡで治療されるマウスの骨髄における成熟細胞数及び委任前駆細胞数の増加によってＬＴＣ−ＩＣによる測定としてより初期の幹細胞プールが消耗に至らないことを示唆する。このように、ＨＡは５−ＦＵによって傷害されていた骨髄造血の活性を促進した。
【００５５】
健常な個人における造血細胞に対するＬＭＷ  ＨＡ（＜７５０，０００ダルトン）の可動化の効果は実証されているため（Ｌ．Ｐｉｌａｒｓｋｉ、カナダ出願特許２，１９９，７５６号）、本発明者らはさらに、５−ＦＵによる治療マウスにおける細胞の可動化に対するＨＭＷ  ＨＡの効果を試験した。マウスに１５０ｍｇ／ｋｇ  ５ＦＵを投与後、４日目にＨＭＷ  ＨＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、平均のモル、重量７５０，０００〜２，０００，０００ダルトン、ＰＢＳ中で０．０５％溶液として）又はＰＢＳ注入（１群当たりマウス３匹）を施した。ＨＡを注入してから１２時間及び２４時間後にマウスを殺害し、末梢血（ＰＢ）又は骨髄（ＢＭ）細胞を採取し、フローサイトメーターで解析した。各試料を１０４の総イベント率（１００％）に対して測定した。大きさ（Ｘ−平均として）、粒度（Ｙ−平均として）及び各細胞集団に対する全細胞の割合を評価し、平均±ＳＤとして示した。ＦＡＣＳ解析によると、１２時間後（データは示さない）も２４時間後（図３）も、末梢血又は骨髄における細胞集団の組成物は変化を受けなかったことが示された。したがって、５ＦＵによる治療マウスにおいてＨＭＷ  ＨＡは、骨髄から末梢血への細胞の可動化を誘導しないという結論が得られた。本発明者らは、この観察に対するいくつかの可能性のある理由、すなわち、１．化学療法はＨＡ受容体の発現に影響を与える結果、ＨＡ治療に対する可動化の応答が傷害される可能性がある点、２．化学療法は骨髄の形成不全を誘導し、したがって検出可能な可動化に対する細胞資源を除去する点、３．ＨＭＷ  ＨＡ及びＬＭＷ  ＨＡは種々のＨＡ受容体／アイソフォームを標的にすることによって種々の生物学的機能を有する可能性がある点を推測する。
【表２】
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【００５６】
本発明者らは、高分子量ＨＡは造血前駆細胞の増殖を直接に促進しないことを先に実証している（Ｋｈａｌｄｏｙａｎｉｄｉ、Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ．（１９９９年）９４：９４０〜９４９頁）。その後の研究によって、高分子量ＨＡは骨髄造血微小環境の細胞によって造血を支持するサイトカインＩＬ−１及びＩＬ−６の生成を上方制御することが実証された。しかしながら、抗体を中和するＩＬ−１及びＩＬ−６による実験により、ＩＬ−１及びｌＬ−６に加え、他の造血を支持する可溶性因子がＨＡに刺激される造血微小環境によって生成されることが示唆された。ＨＡの効果を媒介する他の分子を同定するために、本発明者はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のチップ技術を用いて遺伝子発現のプロファイリングを実施した。マウスに１日目に１５０ｍｇ／ｋｇ  ５ＦＵを投与してから４日目に１００μｇ  ＨＭＷ  ＨＡを注入した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、平均のモル、重量７５０，０００〜２，０００，０００ダルトン、ＰＢＳ中で０．０５％溶液として）。２４時間後、動物を殺害し、骨髄を採取し、ＱｉａｇｅｎＲＮＡ単離キットを用いて全ＲＮＡを単離した。メーカの推奨（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、アラメダ）に従ってプローブ調製及びチップ・ハイブリダイゼーションを実施した。分化して発現される遺伝子をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータマイニングツール・ソフトウェアによって解析した。このｌｏｇに変換されたグラフでは、１０，０００個を超える遺伝子に対するハイブリダイゼーションシグナルをプロットする。対照試料（５ＦＵ／ＰＢＳ）（Ｘ軸）から得られるハイブリダイゼーションシグナルを高分子量ＨＡ（５ＦＵ／ＨＡ）（Ｙ軸）で治療されたマウス由来の試料と比較する。試料において統計的に有意に検出された遺伝子をより強いハイブリダイゼーション強度にて黒点で示す（データトレンドの右上）。検出されない遺伝子を灰色の点で示す。プロットにおける主要なトレンドからずれる点は、２つの試料間で分化して発現される。本発明者らは、対照マウス（５ＦＵ／ＰＢＳ）に対してＨＡで治療されるマウス（５ＦＵ／ＨＡ）の骨髄において高度に有意に分化して発現されるものとして称される、合計１７９個の遺伝子を同定した。別々に治療されるマウスからの複製により、ほぼ完全に一致するデータが得られた（図４）。分化して発現される遺伝子は、以下のようにグループ分けできると考えられる。すなわち、（１）転写調節、ホルモン受容体及びＤＮＡ複製因子（２）シグナル形質導入カスケード調節因子、（３）アポトーシス調節、（４）遊走を媒介する酵素（５）細胞表面関連分子、（６）可溶性因子である。全体として、本結果は、ＨＡが微小環境の生物学的活性成分であり、遺伝子発現と幹細胞の挙動を媒介するその産物の調節に関与することを示唆する。
【００５７】
（実施例２）
全身放射線療法は、脾臓及び骨髄においてＨＡを含むＧＡＧ量を著しく低下させる。さらに、骨髄細胞の移植を行うと、造血組織においてＨＡ濃度の二次的な再発を招く。したがって、本発明者らは全身放射線療法を経てから骨髄移植を実施した後に、末梢血及び骨髄細胞の回復に対するＨＭＷ  ＨＡの効果を検討した。レシピエントマウスに致死的に（０．８５Ｇｙ／ｈの線量率で１５．２５Ｇｙ）放射線を照射し、内因性の骨髄造血を排除した。５−ＦＵ（１５０ｍｇ／ｋｇ体重）で予め処理されたドナーマウスからＨＳＰＣを得て増殖する委任前駆細胞プールを除去し、放射線療法の２４時間後にレシピエントマウスに移植した（１０４細胞／マウス）。レシピエントマウスに２００μｌ／マウスＰＢＳ（対照群）又は高分子量ＨＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、平均のモル、重量７５０，０００〜２，０００，０００ダルトン、ＰＢＳ中で０．０５％溶液として）の１００μｌ／マウスを移植の４日、６日、１０日、及び１３日後に投与した。毎日末梢におけるＷＢＣ数を測定した。対照と比較して、１１日目（ｐ＜０．０１）に高分子量ＨＡで治療されたマウスの末梢血においてＷＢＣ数の有意な上昇を検出した。対照群におけるＷＢＣ数が低値を維持する一方で、１３日目にＨＡによって治療されたレシピエントにおいて白血球数の完全な回復が認められた（図５Ａ）。さらに、ＨＡで治療されたマウスの末梢血におけるＰＬＴ及びＲＢＣの回復促進について監視した。ＨＡによる治療群においてＰＬＴ数及びＲＢＣ数がそれぞれ３倍及び２倍上昇した。パーセントの上昇としてＰＬＴ及びＲＢＣのレベルが示される。この場合、ＰＢＳが投与される対照群からの数を１００％とする（図５Ｂ及び５Ｃ）。ＲＢＣ数の上昇は、対照マウスと比較して、高分子量ＨＡが投与されたマウスにおいてＨＣＴ値及びＨＧＢ値がより大きいことと相関した。
【００５８】
高分子量ＨＡによって治療されるマウスにおける末梢血液細胞数の回復促進が移植されるＨＳＰＣの移植の促進の結果であることを実証するために、本発明者らはさらに骨髄における造血活性を評価した。ＨＳＰＣ移植の７日後、骨髄を採取し測定した。骨髄の形態素解析によって、高分子量ＨＡによる治療群における芽細胞の総数がＰＢＳで治療される対照群の場合と比べて１０倍多い（図６Ａ）ことが明らかになった。さらに、ＨＡで治療されるマウスの骨髄では、対照（図６Ｂ）と比較し、赤芽球数では３倍の上昇（図６Ａ）及び巨核球数では１８．８倍の上昇が認められた。巨核球数の上昇は、ＨＡで治療されるマウスの骨髄における血小板数の上昇と相関した。すなわち、これらのマウスの血小板数は２０±１．５／フィールドであり、対照群においては４±０．２／フィールドを維持した。
【００５９】
このように、本発明者らは、ＨＡがＳＣの移植とその後の組織回復／リモデリングに対するより好ましい条件を提供することを実証している。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】化学療法後のマウスにおける骨髄の造血の回復に関するＨＭＷ  ＨＡの効果を実証するために設計された実験の結果を示す図である。
【図２】化学療法後のマウスにおける骨髄の造血の回復に関するＨＭＷ  ＨＡの効果を実証するために設計された実験の結果を示す図である。
【図３】化学療法後のマウスにおける骨髄の造血の回復に関するＨＭＷ  ＨＡの効果を実証するために設計された実験の結果を示す図である。
【図４】化学療法後のマウスにおける骨髄の造血の回復に関するＨＭＷ  ＨＡの効果を実証するために設計された実験の結果を示す図である。
【図５】致死性の放射線療法後における造血幹細胞の移植及び造血組織回復に関するＨＭＷ  ＨＡの効果を実証するために設計された実験の結果を示す図である。
【図６】致死性の放射線療法後における造血幹細胞の移植及び造血組織回復に関するＨＭＷ  ＨＡの効果を実証するために設計された実験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年1月4日(2006.1.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
健常な個人における造血細胞に対するＬＭＷ  ＨＡ（＜７５０，０００ダルトン）の可動化の効果は実証されているため（Ｌ．Ｐｉｌａｒｓｋｉ、カナダ出願特許２，１９９，７５６号）、本発明者らはさらに、５−ＦＵによる治療マウスにおける細胞の可動化に対するＨＭＷ  ＨＡの効果を試験した。マウスに１５０ｍｇ／ｋｇ  ５ＦＵを投与後、４日目にＨＭＷ  ＨＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、平均のモル、重量７５０，０００〜２，０００，０００ダルトン、ＰＢＳ中で０．０５％溶液として）又はＰＢＳ注入（１群当たりマウス３匹）を施した。ＨＡを注入してから１２時間及び２４時間後にマウスを殺害し、末梢血（ＰＢ）又は骨髄（ＢＭ）細胞を採取し、フローサイトメーターで解析した。各試料を１０４の総イベント率（１００％）に対して測定した。大きさ（Ｘ−平均として）、粒度（Ｙ−平均として）及び各細胞集団に対する全細胞の割合を評価し、平均±ＳＤとして示した（表２および図３参照）。ＦＡＣＳ解析によると、１２時間後（データは示さない）も２４時間後（図３）も、末梢血又は骨髄における細胞集団の組成物は変化を受けなかったことが示された。したがって、５ＦＵによる治療マウスにおいてＨＭＷ  ＨＡは、骨髄から末梢血への細胞の可動化を誘導しないという結論が得られた。本発明者らは、この観察に対するいくつかの可能性のある理由、すなわち、１．化学療法はＨＡ受容体の発現に影響を与える結果、ＨＡ治療に対する可動化の応答が傷害される可能性がある点、２．化学療法は骨髄の形成不全を誘導し、したがって検出可能な可動化に対する細胞資源を除去する点、３．ＨＭＷ  ＨＡ及びＬＭＷ  ＨＡは種々のＨＡ受容体／アイソフォームを標的にすることによって種々の生物学的機能を有する可能性がある点を推測する。
【表２】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月7日(2007.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織又は器官におけるヒアルロン酸濃度の低下と関連する対象の病態を治療するための医薬組成物であって、７５０，０００ダルトンを超える分子量を有するヒアルロン酸又は薬剤として許容できるその塩の有効用量を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２】
前記用量が０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記用量が１〜１０ｍｇ／ｋｇである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記用量が腹腔内、静脈内又は器官内に投与される、請求項１、２、又は３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸を担体に混合する、請求項１、２、又は３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記担体がリポソーム又は微粒子である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ヒアルロン酸が組織特異的な担体とコンジュゲートされる、請求項１、２、又は３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記組織特異的な担体がＨＡ結合タンパク質とＦ（ａｂ）２又はＦ（ａｂ）フラグメントとの融合タンパク質を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
埋め込まれる又は移植される幹細胞の移植を改善するために対象を治療するための医薬組成物であって、７５０，０００ダルトンを超える分子量を有するヒアルロン酸又は薬剤として許容できるその塩の有効用量を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１０】
前記幹細胞が全能性幹細胞、多能性幹細胞及び多分化能幹細胞から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記幹細胞が多分化能幹細胞である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記多分化能幹細胞が全能性幹細胞又は多能性幹細胞の分化を引き起こすことによって得られる、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記多能性幹細胞が核移植法によって操作される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記多分化能幹細胞が造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、上皮幹細胞、内皮幹細胞、膵幹細胞、肝幹細胞及び成体幹細胞から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記幹細胞が骨髄、末梢血、臍帯血、脳、膵臓、肝臓、粘膜組織、又は皮膚由来である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記幹細胞が、死体の生存組織ドナーから単離される一次幹細胞、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件で培養される幹細胞である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記対象に幹細胞を埋め込む又は移植することで病態を治療するための、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ヒアルロン酸が前記幹細胞の埋め込み又は移植の前、それと同時又は後に投与されるための、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記対象が幹細胞の移植に先立って治療を受けるものである、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記療法が細胞毒性療法である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記療法が化学療法、放射線療法又はホルモン療法である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記療法が切除療法である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
骨髄機能障害を生じさせる薬剤又は放射線によって対象を治療する方法における、骨髄機能障害を有する対象を治療するための医薬組成物であって、７５０，０００ダルトンを超える分子量を有するヒアルロン酸又は薬剤として許容できるその塩の有効量を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２４】
幹細胞集団又は幹細胞の適切な機能を消耗させる病態又は治療の結果として、幹細胞集団の消耗を有する対象における幹細胞数とその機能の回復を改善するための医薬組成物であって、７５０，０００ダルトンを超える分子量を有するヒアルロン酸又は薬剤として許容できるその塩の有効量を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２５】
多能性幹細胞又は多分化能幹細胞の培養のための方法において、培地内に７５０，０００ダルトンを超える分子量を有するヒアルロン酸を含む改善された該方法。
【請求項２６】
前記培養条件が線維芽細胞又は間質細胞の支持細胞層を用いる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記幹細胞が多能性幹細胞であり、前記培地がＬＩＦを含有する、請求項２５に記載の方法。