(57)【要約】本発明は、リン酸化Ａｕｒｏｒａ−Ａキナーゼ断片単独およびヒトＴＰＸ２のアミノ酸残基１−４３リガンドと複合体になったリン酸化Ａｕｒｏｒａ−Ａキナーゼ断片の結晶に関する。本発明はまた、Ａｕｒｏｒａ−Ａキナーゼに結合するリガンド、特にＡｕｒｏｒａ−Ａキナーゼに結合するアロステリック阻害剤の設計及び選択方法並びにその使用に関する。さらに、本発明は、インデンおよびインドール誘導体に関する。本発明は、リン酸化Ａｕｒｏｒａ−Ａキナーゼ単独およびヒトＴＰＸ２のアミノ酸残基１−４３リガンドと複合体になったリン酸化Ａｕｒｏｒａ−Ａキナーゼの結晶に関する。本発明はまた、Ａｕｒｏｒａ−Ａキナーゼに結合するリガンドの設計及び選択方法に関する。さらに、本発明は、インデンおよびインドール誘導体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＰＸ２のアミノ酸残基１−４３と複合体となったアミノ酸残基１２２−４０３を含むリン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａキナーゼ断片の結晶であって、少なくとも３オングストロームの分解能で回折されその単位格子ディメンションの５％以内の結晶安定性を有する結晶。
【請求項２】
表Ｂに示したような座標を有する請求項１に記載の結晶。
【請求項３】
前記結晶が斜方晶系空間群Ｐ２1２1２1に属しかつオングストロームでの単位格子ディメンション：ａ＝５９．６３±５％、b＝８１．７２±５％、c＝８３．０５±５％を有する請求項１または２に記載の結晶。
【請求項４】
表ＢによるＡｕｒｏｒａ−Ａアミノ酸Ｑ１２７、Ｗ１２８、Ｒ１２６、Ｌ１５９、Ｆ１５７、Ｅ１７０、Ｌ１６９、Ｖ２０６、Ｙ１９９、Ｈ１８７、Ｒ１７９、Ｌ１７８、Ｖ１８２、Ｙ１９９、Ｌ１８８、Ｉ１８４、Ｖ２５２、Ｋ２５０、Ｐ２８２、Ｈ２８０の構造座標によって特定されるＡｕｒｏｒａ−Ａリガンド結合部位を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項５】
表ＢによるＡｕｒｏｒａ−Ａアミノ酸Ｑ１２７、Ｗ１２８、Ｒ１２６、Ｌ１５９、Ｆ１５７、Ｅ１７０、Ｌ１６９、Ｖ２０６、Ｙ１９９、Ｈ１８７、Ｒ１７９、Ｌ１７８、Ｖ１８２、Ｙ１９９、Ｌ１８８、Ｉ１８４、Ｖ２５２、Ｋ２５０、Ｐ２８２、Ｈ２８０の構造座標によって特定されるＡｕｒｏｒａ−Ａリガンド結合部位の少なくとも部分を含む分子または分子複合体、またはその変異体またはホモログ。
【請求項６】
機械可読データによりエンコードされたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体であって、該データが、表ＢによるヒトＴＰＸ２のアミノ酸残基１−４３と複合体となったリン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａキナーゼまたは該複合体のホモログの構造座標により規定され、該ホモログが３．０オングストローム以下の複合体骨格原子からの標準偏差を有する骨格原子を含む機械可読データ記憶媒体。
【請求項７】
ＡＲ修飾剤のためのＡｕｒｏｒａ−Ａまたはそのホモログまたは変異体における結合部位であって、リガンドの部分が、表ＢによるＡｕｒｏｒａ−Ａの残基Ｑ１２７、Ｗ１２８、Ｒ１２６、Ｌ１５９、Ｆ１５７、Ｅ１７０、Ｌ１６９、Ｖ２０６、Ｙ１９９、Ｈ１８７、Ｒ１７９、Ｌ１７８、Ｖ１８２、Ｙ１９９、Ｌ１８８、Ｉ１８４、Ｖ２５２、Ｋ２５０、Ｐ２８２、Ｈ２８０のいかなる部分またはその全てとファンデルワールス接触または水素結合接触をしている結合部位。
【請求項８】
ホモログまたは変異体が表ＢによるＡｕｒｏｒａ−Ａの残基Ｑ１２７、Ｗ１２８、Ｒ１２６、Ｌ１５９、Ｆ１５７、Ｅ１７０、Ｌ１６９、Ｖ２０６、Ｙ１９９、Ｈ１８７、Ｒ１７９、Ｌ１７８、Ｖ１８２、Ｙ１９９、Ｌ１８８、Ｉ１８４、Ｖ２５２、Ｋ２５０、Ｐ２８２、Ｈ２８０に対して２５％−９５％の同一性を有している請求項７に記載の結合部位。
【請求項９】
Ａｕｒｏｒａ−Ａキナーゼ活性を修飾する化合物を同定する方法であって、以下の工程のいずれか１を含む方法。
：
ａ）表Ｂによる構造座標により規定されるＡｕｒｏｒａ−Ａ結合部位に空間的に適合する試験化合物をモデル化する；
ｂ）構造および化学的特徴を同定するため請求項７に記載の構造座標または結合部位を使用する；
ｃ）同定した構造または化学的特徴を用いて潜在的Ａｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤として化合物を設計または選択する；
ｄ）３次元構造モデルまたはリガンド結合部位を用いて潜在的Ａｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤として化合物を設計または選択する；
ｅ）潜在的Ａｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤を合成する；
ｆ）試験化合物のＡｕｒｏｒａ−Ａへの結合を特徴とするアッセイにおいて潜在的Ａｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤をスクリーニングする；
ｇ）表ＢによるＡｕｒｏｒａ−ＡのＱ１２７、Ｗ１２８、Ｒ１２６、Ｌ１５９、Ｆ１５７、Ｅ１７０、Ｌ１６９、Ｖ２０６、Ｙ１９９、Ｈ１８７、Ｒ１７９、Ｌ１７８、Ｖ１８２、Ｙ１９９、Ｌ１８８、Ｉ１８４、Ｖ２５２、Ｋ２５０、Ｐ２８２、Ｈ２８０から構成される群から選択したＡｕｒｏｒａ−Ａ由来の１または複数のアミノ酸を修飾するかまたは置換する。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法により同定されるＡｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤。
【請求項１１】
Ａｕｒｏｒａ−Ａのアロステリック阻害剤で、少なくともその一部が表ＢによるＡｕｒｏｒａ−Ａの残基Ｑ１２７、Ｗ１２８、Ｒ１２６、Ｌ１５９、Ｆ１５７、Ｅ１７０、Ｌ１６９、Ｖ２０６、Ｙ１９９、Ｈ１８７、Ｒ１７９、Ｌ１７８、Ｖ１８２、Ｙ１９９、Ｌ１８８、Ｉ１８４、Ｖ２５２、Ｋ２５０、Ｐ２８２、Ｈ２８０の一部または全てに結合する。
【請求項１２】
結合がファンデルワールス接触または水素結合接触である請求項１１に記載のアロステリック阻害剤。
【請求項１３】
式（Ｉ）のインドールおよびインデン誘導体（ここで、
Ｒ1は水素、アルキレン−ＣＯＲ11、アルキレン−ＮＨＲ8、アルキレン−ＯＲ8、またはアルキレン−ＳＲ8を示し；
Ｒ2は水素、アルキレン−ＣＯＲ11、アルキレン−ＮＨＲ8、アルキレン−ＯＲ8、またはアルキレン−ＳＲ8を示し；
Ｒ3は水素、アルキル、アルキレン−Ｒ9、アルケニレン−Ｒ9、アルキニレン−Ｒ9、またはアリレン−Ｒ9を示し；
Ｒ4は水素を示し；
Ｒ5は水素、アルキル、ＯＲ10、ＮＨＲ10、ＳＲ10、アルキレン−Ｒ10、アルケニレン−Ｒ10、アルキニレン−Ｒ10、またはアリレン−Ｒ10を示し；
Ｒ6は水素、アルキル、ＯＲ10、ＮＨＲ10、ＳＲ10、アルキレン−Ｒ10、アルケニレン−Ｒ10、アルキニレン−Ｒ10、またはアリレン−Ｒ10を示し；
Ｒ7は水素を示し；
Ｒ8は水素、ＣＯ−アルキル、（ａａ）mａｓｐ（ａａ）n、（ａａ）mｇｌｕ（ａａ）n、または（ａａ）mｃｙｓ（ａａ）n、または適宜置換されたアルキル、アリルまたはヘテロアリルを示し；
Ｒ9はＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）2、Ｎ+（アルキル）3、適宜置換されたアリルまたは適宜置換されたヘテロアリルを示し；
Ｒ10は、水素、または置換されていてもよい単環または２環の飽和、部分不飽和または芳香族、脂環式または複素環ラジカルを示し；
Ｒ11は、水素、アルキルまたはハロアルキルを示し；
Ｘは窒素原子またはＣＨを示し；
ａａは、アミノ酸ラジカルを示し；および
ｎはゼロまたは１乃至１０の整数で；
ｍは、ゼロまたは１乃至１０の整数であるが、ここで、Ｒ1とＲ2は両者ともに水素であるということはなく、Ｒ5とＲ6は両者ともに水素であるということがない）、およびその光学異性体、生理学的に許容される塩、誘導体およびプロドラッグ。
【化１】
2007511201.tif 000018
【請求項１４】
式（Ｉ）のインドールおよびインデン誘導体（ここで、
Ｒ1は水素、アルキレン−ＮＨＲ8、アルキレン−ＯＲ8、またはアルキレン−ＳＲ8を示し；
Ｒ2は水素、アルキレン−ＮＨＲ8、アルキレン−ＯＲ8、またはアルキレン−ＳＲ8を示し；
Ｒ3は水素、アルキル、アルキレン−Ｒ9、アルケニレン−Ｒ9、アルキニレン−Ｒ9、またはアリレン−Ｒ9を示し；
Ｒ4は水素を示し；
Ｒ5は水素、アルキル、ＯＲ10、ＮＨＲ10、ＳＲ10、アルキレン−Ｒ10、アルケニレン−Ｒ10、アルキニレン−Ｒ10、またはアリレン−Ｒ10を示し；
Ｒ6は水素、アルキル、ＯＲ10、ＮＨＲ10、ＳＲ10、アルキレン−Ｒ10、アルケニレン−Ｒ10、アルキニレン−Ｒ10、またはアリレン−Ｒ10を示し；
Ｒ7は水素を示し；
Ｒ8は水素、ＣＯ−アルキル、（ａａ）mａｓｐ（ａａ）n、（ａａ）mｇｌｕ（ａａ）n、（ａａ）mｃｙｓ（ａａ）nを示し；
Ｒ9はＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）2、Ｎ+（アルキル）3、アリルまたはヘテロアリルを示し；
Ｒ10は、水素、アリルまたは置換アリルを示し；
Ｘは窒素原子またはＣＨを示し；
ａａは、アミノ酸ラジカルを示し；および
ｎはゼロまたは１乃至１０の整数で；
ｍは、ゼロまたは１乃至１０の整数であるが、ここで、Ｒ1とＲ2は両者ともに水素であるということはなく、Ｒ5とＲ6は両者ともに水素であるということがない）、およびその光学異性体、生理学的に許容される塩、誘導体およびプロドラッグ。
【化２】
2007511201.tif 000019
【請求項１５】
残基Ｒ1およびＲ2の一つ、好ましくは残基Ｒ2が水素であり、他方、好ましくはＲ1がアルキレン−ＮＨＲ8を示す請求項１３または１４に記載の化合物。
【請求項１６】
残基Ｒ1およびＲ2の一つ、好ましくは残基Ｒ2が水素であり、他方、好ましくはＲ1がアルキレン−ＯＲ8を示す請求項１３または１４に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ8が水素である請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
残基Ｒ1およびＲ2の一つ、好ましくは残基Ｒ2が水素であり、他方、好ましくはＲ1がアルキレン−ＣＯＲ11を示す請求項１３または１４に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ11が水素、メチルまたはトリフルオロメチルである請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ8が式（ＩＩ）（ここで、
ａａは、アミノ酸ラジカルを示し；および
ｎはゼロまたは１乃至１０の整数で；
ｍは、ゼロまたは１乃至１０の整数である）のラジカルである請求項１３または１４記載の化合物。
【化３】
2007511201.tif 000020
【請求項２１】
Ｒ3が式（ＩＶ）のラジカルである請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の化合物。
【化４】
2007511201.tif 000021
【請求項２２】
Ｒ5および／またはＲ6がＯＲ10を示し、Ｒ10が請求項１３または１４に記載のとおりである請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２３】
請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の化合物であって、Ｒ10は、ヒドロキシ、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＣＨ2ＰＯ3Ｈ2、−ＣＦ2ＰＯ3Ｈ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）2、−ＯＰＯ3（Ｒ11）2、−ＣＨ2ＯＰＯ3（Ｒ11）2、−ＣＦ2ＰＯ3（Ｒ11）2、−ＣＯＯＲ11、および−ＣＨ（ＣＯＯＲ11）2から構成される群からそれぞれ独立して選択される１、２または３個の置換基で置換できるアリルであり、ここで、Ｒ11は、インビボで切断可能なラジカルである。
【請求項２４】
Ｒ11が、アルキル、ＣＨ2ＯＣＯ−アルキルおよびＣ2Ｈ4−Ｓ−ＣＯ−アルキルを示す請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ5および／またはＲ6が式（Ｖ）のラジカルである請求項２３または２４に記載の化合物。
【化５】
2007511201.tif 000022
【請求項２６】
Ｒ5および／またはＲ6が、式（ＶＩ）のラジカルである請求項２３に記載の化合物。
【化６】
2007511201.tif 000023
【請求項２７】
式（Ｉａ）（ここで、Ｒ1、Ｒ3およびＲ6は請求項１３〜２６のいずれか１項に記載のとおりである）を有する請求項１３または１４記載の化合物。
【化７】
2007511201.tif 000024
【請求項２８】
式（１５）（ここで、ａａ、ｎおよびｍが、請求項１３または１４に記載のとおりである）のインドール誘導体およびその光学異性体および生理学的に許容される塩。
【化８】
2007511201.tif 000025
【請求項２９】
式（１４）のインドール誘導体。
【化９】
2007511201.tif 000026
【請求項３０】
式（１２）のインドール誘導体。
【化１０】
2007511201.tif 000027
【請求項３１】
式（７）のインドール誘導体。
【化１１】
2007511201.tif 000028
【請求項３２】
治療に使用するための、請求項１０に記載のＡｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤、請求項１１または１２に記載のアロステリック阻害剤または請求項１３〜３１のいずれか１項に記載のインドールまたはインデン誘導体。
【請求項３３】
請求項１０に記載の少なくとも１種のＡｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤、請求項１１または１２記載の少なくとも１種のアロステリック阻害剤または請求項１３〜３１のいずれか１項に記載の少なくとも１種のインドールまたはインデン誘導体を含み、適宜薬剤学的に許容される賦形剤と組み合わせた薬剤組成物。
【請求項３４】
請求項１０に記載のＡｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤、請求項１１または１２記載のアロステリック阻害剤または請求項１３〜３１のいずれか１項に記載のインドールまたはインデン誘導体の癌治療用医薬の製造のための使用。
【請求項３５】
癌が乳癌または結腸癌である請求項３４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸化ＡＵＲＯＲＡ−Ａキナーゼ断片単独およびヒトＴＰＸ２のアミノ酸残基１−４３リガンドと複合体になったリン酸化ＡＵＲＯＲＡ−Ａキナーゼ断片の結晶に関する。本発明はまた、ＡＵＲＯＲＡ−Ａキナーゼに結合するリガンド、特にＡＵＲＯＲＡ−Ａキナーゼに結合するアロステリック阻害剤の設計及び選択方法に関する。さらに、本発明は、あるインデンおよびインドール誘導体に関する。
【０００２】
真核細胞は、有糸分裂の始めにおいて劇的な再編成を受ける。核膜が壊れ、微小管はクロマチン周囲で姉妹染色分体の分離作業を行う双極子紡錘体構造に再編成される。クロマチンは、クロマチン周囲でＧＴＰ結合形態として凝縮されている低分子量Ｒａｓ様ＧＴＰアーゼであるＲａｎを介して紡錘体集合機構にシグナルを送る。紡錘体中におけるＲａｎ機能は、核細胞質輸送におけるその役割に関連している。ＲａｎＧＴＰは、間期において、核へのその移入を媒介する輸送因子からＴＰＸ２およびＮｕＭＡのような重要な紡錘体因子を放出する。核膜破壊後、クロマチン近辺における遊離ＴＰＸ２の存在が微小管の核形成を行い、その後、それらが、微小管モーターにより紡錘体に編成されると考えられている。さらに、ＴＰＸ２は、必須の有糸分裂キナーゼであるＡｕｒｏｒａ−Ａを紡錘体微小管に限局させる（非特許文献１）。
【０００３】
ＡＵＲＯＲＡキナーゼは、有糸分裂を介して細胞が前進するに伴いその局在と活性が詳細に振り付けられているセリン−スレオニンプロテインキナーゼファミリーを構成している。ＡＵＲＯＲＡ−Ａは、染色体分離と細胞質分裂に関連する細胞周期制御セリン−スレオニンキナーゼである（非特許文献２）。ＡＵＲＯＲＡ−Ａは、細胞周期進行に大きな役割を果たし、また、発癌遺伝子としても記載されてきた。ＡＵＲＯＲＡ−Ａは、腫瘍で頻繁に増幅される染色体領域にマッピングされている（非特許文献３）。ＡＵＲＯＲＡ−Ａは、さまざまな腫瘍において特に乳癌および結腸癌において過剰発現されるが、正常組織での発現は制限されている（非特許文献４；非特許文献５）。活性Ａｕｒｏｒａ−Ａの過剰発現はラット線維芽細胞を形質転換し、その結果、該ラット線維芽細胞はヌードマウスにおいて腫瘍を増殖できるようになる。一方、不活性変異体は、発癌性の形質転換を起こすことができない。Ａｕｒｏｒａ−Ａは、発癌性プロテインキナーゼとして、癌療法に有用であるかもしれない特異的阻害剤の開発におけるターゲットである。細胞分裂および癌展望の両者についてのＡｕｒｏｒａ−Ａの重要性にもかかわらず、現時点では、その下流ターゲットおよび活性化／不活性化メカニズムについてほとんど知られていない。
【０００４】
数種の因子が、セリン／スレオニンキナーゼの活性に寄与している。これらには、活性部位残基の適切な配置と基質結合部位（“活性化セグメント”）の正確な編成が含まれる。活性化セグメント内におけるスレオニン残基のリン酸化には、キナーゼ活性を惹起することがしばしば必要になり、Ａｕｒｏｒａ−Ａも例外ではない。Ａｕｒｏｒａ−Ａ活性化セグメントにおけるスレオニン（Ｔｈｒ２８８Aur、ヒトでの番号）のリン酸化は、インビボで上流キナーゼにより触媒されているかまたはＡｕｒｏｒａ−Ａそれ自体によって触媒されているかは不明であるが、活性に非常に重要である（非特許文献２）。ｃ−ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ｃＡＰＫ）の構造研究では、対応するスレオニン残基（Ｔｈｒ１９７cAPK）がリン酸化されると、活性化セグメントが活性構造になることが明らかにされている。サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫｓ）は同等のスレオニン（Ｔｈｒ１６０CDK）のリン酸化ばかりでなく、パートナータンパク質サイクリン−Ａの結合を完全活性化に必要とする。Ａｕｒｏｒａ−Ａもまた、同様の機構に依存しているのであろう。最近、脊椎動物においてＡｕｒｏｒａ−Ａがパートナータンパク質であるＴＰＸ２と相互作用することで、当該キナーゼが強く活性化されることが報告された。ＴＰＸ２結合により、Ａｕｒｏｒａ−Ａのインビトロ自動リン酸化活性が増大し、脱リン酸化が阻害される（非特許文献１）。
【０００５】
種々のキナーゼに特異的なＡＴＰ競合性阻害剤が、癌治療における治療剤として用いられている（非特許文献６）。現在ＡＴＰ結合部位は、キナーゼ阻害剤の設計では最も一般的なターゲットであるが、キナーゼ活性部位が類似しており周辺アミノ酸残基がわずかしか違わないこのような阻害剤の選択性を得ることは難しい（非特許文献７）。
【０００６】
これまでに、非リン酸化Ａｕｒｏｒａ−Ａの構造が報告されている（非特許文献７；非特許文献８）。さらに、ＷＯ  ０３／０３１６０６は、ＡＴＰ類似体であるＡＴＰ−ＰＮＰとの複合体になっているＡｕｒｏｒａ−Ａのキナーゼ触媒ドメインの３次元結晶構造と、合成阻害剤との複合体となっているＡｕｒｏｒａ−Ａのキナーゼ触媒ドメインの３次元結晶構造を記載している。Ａｕｒｏｒａ−Ａは、プロテインキナーゼの典型的３次元構造を有しており、その活性部位は、Ｎ末端およびＣ末端葉状構造（ローブ）の間に位置している。ＡＴＰ結合には、全てのキナーゼで保存されているアミノ酸残基が関係している。精力的な構造研究により、活性状態にあるキナーゼが全て類似の構造枠組みを取り、類似立体構造の“活性化セグメント”が、基質結合能力を有していることが明らかになっている（非特許文献９）。しかし、それらは、活性形状を取るための分子メカニズムが異なっている。Ａｂｌキナーゼの場合、活性化メカニズムのわずかの違いが、白血病治療薬であるＡｂｌ特異的阻害剤Ｇｌｅｅｖｅｃの開発に利用されてきた（非特許文献１０）。
【０００７】
Ａｕｒｏｒａ−Ａの場合、リン酸化と特異的活性化剤であるタンパク質ＴＰＸ２の結合の両者により活性化が行われる（非特許文献１１）。この活性剤結合部位をブロックすることで、このキナーゼを特異的に下方制御する手段が提供されるであろう。
【非特許文献１】Ｋｕｆｅｒ，Ｔ．Ａ．，Ｓｉｌｌｊｅ，Ｈ．Ｈ．,Ｋｏｒｎｅｒ，Ｒ．,Ｇｒｕｓｓ，Ｏ．Ｊ．,Ｍｅｒａｌｄｉ,Ｐ．,およびＮｉｇｇ,Ｅ．Ａ．（２００２）。ヒトＴＰＸ２が、紡錘体にＡｕｒｏｒａ−Ａキナーゼを標的化させるために必要である  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５８,６１７−６２３
【非特許文献２】Ｂｉｓｃｈｏｆｆ,Ｊ．Ｒ．およびＰｌｏｗｍａｎ,Ｇ．Ｄ．（１９９９）。Ａｕｒｏｒａ／ｌｐｌ１ｐキナーゼファミリー：染色体分離と細胞質分離の制御因子。Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９,４５４−４５９
【非特許文献３】Ｄｕｔｅｒｔｒｅ,Ｓ．ら（２００２）中心体機能におけるＡｕｒｏｒａ  Ａの役割について。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２１,６１７５−６１８３
【非特許文献４】Ｓｅｎ,Ｓ．ら（１９９７）染色体２０ｑ１３上の遺伝子ＢＴＡＫをコードする推定セリン／スレオニンキナーゼがヒト乳癌細胞株で増幅され過剰発現される。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４、２１９５−２２００
【非特許文献５】Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｒ．ら（１９９８）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｕｒｏｒａキナーゼのホモログは発癌性を示しヒト直腸癌で増幅される。ＥＭＢＯ  Ｊ．１７，３０５２−３０６５
【非特許文献６】Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，Ｃ．ら（２０００）。プロテインキナーゼのＡＴＰ部位特異的競合性および不可逆性阻害剤。Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２０，２８−５７
【非特許文献７】Ｃｈｅｅｔｈａｍ，Ｇ．Ｍ．Ｔ．ら（２００２）。発癌性セリン−スレオニンキナーゼであるＡｕｒｏｒａ−２の結晶構造。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，４２４１９−４２４２２
【非特許文献８】Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．ら（２００２）。癌関連Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＦＡＫ、およびＥｐｈＡ２プロテインキナーゼのナノボリューム結晶学による構造。Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １０、１６５９−１６６７
【非特許文献９】Ｈｕｓｅ，Ｍ．およびＫｕｒｉｙａｎ，Ｊ．（２００２）。プロテインキナーゼの立体構造可塑性。Ｃｅｌｌ  １０９，２７５−２８２
【非特許文献１０】Ｃａｐｄｅｖｉｌｌｅ，Ｒ．ら（２００２）。合理的に開発された標的化抗癌剤Ｇｌｉｖｅｃ（ＳＴｌ５７１、イマチニブ）。Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１，４９３−５０２
【非特許文献１１】Ｅｙｅｒｓ，Ｐ．Ａ．ら（２００３）。プロテインキナーゼＡｕｒｏｒａ−Ａ活性化の新しい機構。Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１３，６９１−６９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらに鑑み、本発明の目的は、Ａｕｒｏｒａ−Ａ  ＴＰＸ２結合部位の構造を解明し、Ａｕｒｏｒａ−Ａに結合し好ましくはＡｕｒｏｒａ−Ａ活性を修飾する化合物を同定する手段を提供すること、および、このような化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、（ａ）リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａキナーゼ断片単独（アミノ酸残基１２２−４０３；以下、Ａｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）と称する）の結晶、および（ｂ）前記リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａキナーゼ断片のリガンドとの複合体すなわちＡｕｒｏｒａ−Ａリガンド複合体となっている結晶に関する。このＡｕｒｏｒａ−ＡリガンドはＴＰＸ２の断片であり、該断片はＴＰＸ２の最小活性化ドメインである。このＴＰＸ２の最小活性化ドメインは、ヒトＴＰＸ２のアミノ酸残基１−４３で構成されており、以下、ＴＰＸ２（１−４３）と称する。
【００１０】
本発明は、リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標を提供する。完全な座標を表Ａに示す。
【００１１】
本発明はまた、リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標を提供する。完全な座標を表Ｂに示す。
【００１２】
本発明はまた、Ａｕｒｏｒａ−Ａ  ＴＰＸ２結合ドメインに対して少なくとも一部の構造的に類似の特性を含む分子または分子複合体の３次元構造の少なくとも一部を決定するための方法を記載している。これらの分子類または分子複合体類は、表ＢによるＡｕｒｏｒａ−Ａアミノ酸、Ｑ１２７、Ｗ１２８、Ｒ１２６、Ｌ１５９、Ｆ１５７、Ｅ１７０、Ｌ１６９、Ｖ２０６、Ｙ１９９、Ｈ１８７、Ｒ１７９、Ｌ１７８、Ｖ１８２、Ｙ１９９、Ｌ１８８、Ｉ１８４、Ｖ２５２、Ｋ２５０、Ｐ２８２、Ｈ２８０の構造座標によって特定されるリガンド結合部位の少なくとも一部を含むか、またはその変異体またはホモログを含むことが好ましい。本文で用いた番号付け方法は、ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａのタンパク質配列を称している。
【００１３】
本発明はまた、表Ａによるリン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼまたはそのホモログまたは表Ｂによるリン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標によって規定される機械可読データでエンコードされたデータ記憶材料を含む機械で可読なデータ記憶媒体を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、ＴＰＸ２のようなＡｕｒｏｒａ−Ａリガンドまたはその断片類のためのＡｕｒｏｒａ−Ａ中結合部位、ならびに、さらにＡｕｒｏｒａ−Ａリガンド特にＡｕｒｏｒａ−Ａのアゴニスト、部分アゴニスト、拮抗剤、部分拮抗剤を含むＡｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤を、本文に開示の結晶構造の情報を用いて設計または選択するための方法を提供する。
【００１５】
本発明は、さらに、Ａｕｒｏｒａ−Ａのアロステリック阻害剤を提供し、ここで、前記阻害剤の少なくとも一部が表ＢのＡｕｒｏｒａ−Ａ残基のＱ１２７、Ｗ１２８、Ｒ１２６、Ｌ１５９、Ｆ１５７、Ｅ１７０、Ｌ１６９、Ｖ２０６、Ｙ１９９、Ｈ１８７、Ｒ１７９、Ｌ１７８、Ｖ１８２、Ｙ１９９、Ｌ１８８、Ｉ１８４、Ｖ２５２、Ｋ２５０、Ｐ２８２、Ｈ２８０の一部あるいは全てに結合する。
【００１６】
本発明は特に、式（Ｉ）のインドールおよびインデン誘導体に関し、（ここで、
Ｒ1は水素、アルキレン−ＣＯＲ11、アルキレン−ＮＨＲ8、アルキレン−ＯＲ8、またはアルキレン−ＳＲ8を示し；
Ｒ2は水素、アルキレン−ＣＯＲ11、アルキレン−ＮＨＲ8、アルキレン−ＯＲ8、またはアルキレン−ＳＲ8を示し；
Ｒ3は水素、アルキル、アルキレン−Ｒ9、アルケニレン−Ｒ9、アルキニレン−Ｒ9、またはアリレン−Ｒ9を示し；
Ｒ4は水素を示し；
Ｒ5は水素、アルキル、ＯＲ10、ＮＨＲ10、ＳＲ10、アルキレン−Ｒ10、アルケニレン−Ｒ10、アルキニレン−Ｒ10、またはアリレン−Ｒ10を示し；
Ｒ6は水素、アルキル、ＯＲ10、ＮＨＲ10、ＳＲ10、アルキレン−Ｒ10、アルケニレン−Ｒ10、アルキニレン−Ｒ10、またはアリレン−Ｒ10を示し；
Ｒ7は水素を示し；
Ｒ8は水素、ＣＯ−アルキル、（ａａ）mａｓｐ（ａａ）n、（ａａ）mｇｌｕ（ａａ）n、（ａａ）mｃｙｓ（ａａ）n、または適宜置換されたアルキル、アリルまたはヘテロアリルを示し；
Ｒ9はＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）2、Ｎ+（アルキル）3、適宜置換されたアリルまたは適宜置換されたヘテロアリルを示し；
Ｒ10は、水素、または置換されていてもよい単環または２環の飽和、部分不飽和または芳香族、脂環式または複素環ラジカルを示し；
Ｒ11は、水素、アルキルまたはハロアルキルを示し；
Ｘは窒素原子またはＣＨを示し；
ａａは、アミノ酸ラジカルを示し；および
ｎはゼロまたは１乃至１０の整数で；
ｍは、ゼロまたは１乃至１０の整数であるが、ここで、Ｒ1とＲ2は両者ともに水素であるということはなくＲ5とＲ6は両者ともに水素であるということがない）、およびその光学異性体、生理学的に許容される塩、誘導体およびプロドラッグに関する。
【００１７】
【化１２】
2007511201.tif 000002
【００１８】
本発明はまた、前記インドールおよびインデン誘導体のようなＡｕｒｏｒａ−Ａリガンドを含む薬剤組成物、および治療、特に癌治療におけるインドールおよびインデン誘導体のようなＡｕｒｏｒａ−Ａリガンドの用途に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
Ｘ線結晶法を用いて、リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）単独の２．７５オングストローム分解能による結晶構造およびＴＰＸ２の最小活性化ドメインとの複合体となったリン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）単独の２．５オングストローム分解能による結晶構造が決定されており、Ａｕｒｏｒａ−ＡのＴＰＸ２媒介活性化の特異的部位は見出されている。ＴＰＸ２は前記キナーゼ上で２つの部位で結合する。ＴＰＸ２の一つのストレッチ（残基８−１９）は、前記キナーゼのＮ末端葉状構造（ローブ）に結合し、別のストレッチ（３１−３８）は、リン酸化された活性化セグメントにおいて前記２個のローブの間で結合し、基質結合に当該ストレッチを配置している。前記キナーゼのＮ末端ローブに局在するＴＰＸ２結合部位は、Ａｕｒｏｒａ−特異的残基により形成された拡張表面溝から構成されている。前記溝は２個のポケットから構成されており、一つは、残基Ｅ１７０、Ｌ１６９、Ｖ２０６、Ｒ１７９、Ｌ１７８、Ｖ１８２、Ｙ１９９から構成され、もう一つは、残基Ｑ１２７、Ｗ１２８、Ｒ１２６、Ｌ１５９およびＦ１５７により構成されている。前記２個のポケットは、一方でＴＰＸ２の疎水性側鎖であるＹ８、Ｙ１０、Ａ１２およびＰ１３により占められており、他方ではＦ１６、Ｉ１７およびＦ１９により占められている。この構造と生化学的データから、このＴＰＸ２ストレッチの結合がＡｕｒｏｒａ−Ａの活性化に必要であるが十分ではなく、下流のＴＰＸ２ストレッチが十分なアフィニティで結合して活性化が達成される。小分子の阻害剤がＡｕｒｏｒａ−ＡのＮ末端ローブ上のＴＰＸ２認識溝に結合すると、その特異的活性化機構を阻害することにより当該キナーゼの活性を低下させるであろう。
【００２０】
本文に記載のＡｕｒｏｒａ−ＡキナーゼとＴＰＸ２タンパク質には、それぞれ天然のＡｕｒｏｒａ−ＡキナーゼとＴＰＸ２タンパク質の活性を有するいかなるポリペプチドも包含される。本文に記載のＡｕｒｏｒａ−ＡとＴＰＸ２は、全ての脊椎動物およびラット、マウス、ブタ、ヤギ、ウマ、モルモット、ウサギ、サル、オランウータンおよびヒトのような哺乳類形状が含まれる。この用語には、また、アミノ酸欠失、置換および付加を有することにより天然のＡｕｒｏｒａ−ＡキナーゼとＴＰＸ２タンパク質形状とは異なるがそれぞれＡｕｒｏｒａ−ＡキナーゼとＴＰＸ２タンパク質の活性を保持しているポリペプチドが含まれる。特定のＡｕｒｏｒａ−Ａ配列を図２Ｅに示し、特定のＴＰＸ２配列を図２Ｄに示した。本発明によれば、ヒト配列が好ましい。
【００２１】
本発明の結晶構造は、それぞれ表ＡとＢに示した座標の、好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくはその全てを含む。
【００２２】
本発明のリン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの結晶は、下記のオングストロームによる単位格子ディメンションを有している：ａ＝８１．１８±５％；ｂ＝８１．１８±５％；ｃ＝１６９．６２±５％で空間群Ｐ６1２２。
【００２３】
本発明のリン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼ／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の結晶は、下記のオングストロームによる単位格子ディメンションを有している：ａ＝５９．６３±５％；ｂ＝８１．７２±５％；ｃ＝８３．０５±５％で斜方晶系空間群Ｐ２1２1２1。
【００２４】
本発明のリン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼおよび本発明のリン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼ／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の３次元構造は、それぞれ表ＡおよびＢに示した構造座標セットにより規定される。用語“構造座標”とは、結晶状タンパク質またはタンパク質複合体の原子（分散中心）によりＸ線単色ビームを回折させて得られるパターンに関連した数式から誘導するデカルト座標を称する。回折データを用いて前記結晶の繰り返し単位の電子密度マップを計算する。次にこの電子密度マップを用いて前記複合体の各原子の位置を確定する。
【００２５】
当業者は、キナーゼ、またはキナーゼ／リガンド複合体またはその断片の構造座標セットが３次元における形状を規定する点の相対的セットであることを理解するであろう。したがって、全く異なる座標セットも同様のまたは同一の形状を規定できるであろう。さらに、各座標をわずかに変化させても全体の形状にはほとんど効果はないであろう。
【００２６】
上記に述べた座標の変化は、構造座標を数学的に操作するゆえに起こりうる。たとえば、表Ａに示した構造座標は、構造座標の結晶学的並べ替え、構造座標の分割；前記構造座標セットへの整数付加または引き算、構造座標の反転または上記の全ての組み合わせにより操作することができるであろう。
【００２７】
これとは別に、アミノ酸の変異、付加、置換、および／または欠失または結晶を構成する成分のいずれかにおける他の変化による結晶構造の修飾も、構造座標における変化を説明できるであろう。もしこのような変化が元々の座標に比較して許容される標準誤差範囲であるならば、結果として生じる３次元形状も同一のものと見なされる。
【００２８】
したがって、様々なコンピュータ解析が、分子または分子複合体またはその部分が上記キナーゼまたはキナーゼ／リガンド複合体の全てまたは部分に十分に類似しているかどうかを決定するために必要である。このような解析は、モレキュラーシミラリティ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）アプリケーションＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）４．１版のような現行のソフトウェアアプリケーションと付属の使用者手引きに記載されているようにして、実施できる。
【００２９】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙアプリケーションにより、異なる構造、同一構造の異なる立体構造、および同一構造の異なる部分の比較が可能となる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙで構造比較に用いる操作は、１）比較する構造をロードする；２）これらの構造における原子当量の定義；３）適合操作を行う；および４）結果の解析である。
【００３０】
各構造は、名前で同定する。一つの構造は、ターゲット（すなわち、固定構造）として同定する；残りの全ての構造は、作動構造（すなわち、動的構造）である。ＱＵＡＮＴＡ内部の原子当量は使用者の入力で規定されるので、本発明の目的のために、等価原子は、比較する二つの構造で保存された残基全てについてタンパク質骨格原子（Ｎ、ＣおよびＯ）として定義される。また、厳密な適合操作のみを考慮する。
【００３１】
厳密な適合方法を用いて作動構造の形を変えて回転させ、標的構造との最適適合を得る。適合操作は、特定等価原子ペアについての適合の差の二乗平均平方根が絶対的最小となるように作動構造に適用する最適変形および回転を計算するアルゴリズムを用いる。この数をオングストロームで示したものが、ＱＵＡＮＴＡにより報告される。
【００３２】
本発明の目的のため、表Ａまたは表Ｂに示した構造座標で示される関連骨格原子上に重ねた時１．５オングストローム未満の保存残基骨格原子（Ｎ、Ｃ、Ｏ）標準偏差を有するいかなる分子または分子複合体も同一と見なす。さらに好ましくは、前記標準偏差は、１．０オングストローム未満である。本発明の好ましい態様において、前記分子または分子複合体は、表ＢのＡｕｒｏｒａ−Ａアミノ酸Ｑ１２７、Ｗ１２８、Ｒ１２６、Ｌ１５９、Ｆ１５７、Ｅ１７０、Ｌ１６９、Ｖ２０６、Ｙ１９９、Ｈ１８７、Ｒ１７９、Ｌ１７８、Ｖ１８２、Ｙ１９９、Ｌ１８８、Ｉ１８４、Ｖ２５２、Ｋ２５０、Ｐ２８２、Ｈ２８０の構造座標により規定されるリガンド結合部位部分を少なくとも含むか、または前記分子または分子複合体の変異体またはホモログを含む。表ＢのＡｕｒｏｒａ−Ａアミノ酸Ｙ１９９、Ｌ１７８、Ｗ１２８、Ｈ１８７、Ｌ１８８、Ｉ１８４の構造座標により規定されるリガンド結合部位の全てまたはいかなる部分をも含む分子または分子複合体または前記分子または分子複合体の変異体またはホモログが、さらに好ましい。
【００３３】
用語“複合体”または“分子複合体”とは、化学的全体または化合物に共有結合または非共有結合しているＡｕｒｏｒａ−ＡまたはＡｕｒｏｒａ−Ａの変異体またはホモログを意味する。
【００３４】
本発明の目的のため、“少なくともその部分”とは、これらの構造座標により規定されるリガンド結合部位の全てまたはいかなる部分をも意味する。
【００３５】
本文で使用した“変異体またはホモログ”とは、Ａｕｒｏｒａ−ＡまたはＴＰＸ２に対して類似構造および／または配列を有する分子または分子複合体を意味する。“類似構造”とは、１．５オングストローム以内の前記Ａｕｒｏｒａ−ＡまたはＴＰＸ２アミノ酸の骨格原子からの標準偏差を有する結合ポケットまたは結合ドメインを有する変異体またはホモログを意味する。“類似配列”とは、少なくとも３０個、好ましくは少なくとも５０個、特に少なくとも１００個および特に少なくとも２００個の連続アミノ酸のアミノ酸配列にわたってＡｕｒｏｒａ−ＡまたはＴＰＸ２と３０％またはさらに好ましくはには７５％の同一性を有する変異体またはホモログを意味する。
【００３６】
用語“標準偏差”とは、平均からの偏差の二乗の算術平均の平方根を意味する。これは傾向または対象からの偏差または変動を表す方法である。本発明の目的のため、“標準偏差”は、本文に記載の構造座標により規定されるような前記複合体のＡｕｒｏｒａ−Ａ断片骨格の関連部分からのタンパク質またはタンパク質複合体骨格変異を規定する。
【００３７】
タンパク質結晶の構造座標がいったん決まると、それらは、他の結晶構造解明に有用である。
【００３８】
したがって本発明によれば、キナーゼ／リガンド複合体のキナーゼまたはその部分の構造座標を機械可読記憶媒体に保存する。このようなデータは、薬物運搬およびタンパク質結晶のＸ線結晶解析のようなさまざまな目的に使用できる。
【００３９】
したがって、本発明の態様において、表Ａに示した構造座標および／または表Ｂに示した構造座標によりエンコードされるデータ記憶材料を含む機械機械可読データ記憶媒体が提供される。
【００４０】
本発明により初めて、Ａｕｒｏｒａ−Ａまたはそのいかなる部分にも結合できる阻害性および刺激性化合物を含む化学物質を設計、選択および合成する構造ベースまたは合理的な薬物設計技術が使用できるようになる。
【００４１】
本発明により可能になった特に有用な薬物設計技術の一つは、反復薬物設計である。反復薬物設計は、タンパク質／化合物複合体の連続セットの３次元構造を決定し評価することにより、タンパク質と化合物の結合を最適化する方法である。
【００４２】
当業者は、天然リガンドまたは基質とそれらが対応するキナーゼまたは酵素の結合ポケットとの会合が、多くの生物学的機構の基本になっていることを理解するであろう。本文で使用した用語“結合ポケット”とは、形状の結果として、別の化学物質または化合物に優先的に会合する分子または分子複合体領域を示す。同様に、多くの薬物は、キナーゼおよび酵素の結合ポケットとの会合を介してその生物学的効果を発揮する。このような会合は、結合ポケットの全てまたはいかなる部分とも起こりうる。このような会合を理解することで、その標的キナーゼとのより好ましい会合を有し、その結果改良された生物学的効果を有する薬物設計につながるであろう。したがって、この情報は、Ａｕｒｏｒａ−Ａキナーゼの例えば阻害剤のような潜在的リガンドまたは修飾剤の設計において有用である。
【００４３】
用語“との会合”とは、化学物質または化合物、またはその部分の間の近さという条件を称する。該会合は、非共有結合でもよく、その場合は水素結合またはファンデルワールス力または静電的相互作用によりエネルギー的には並列が望ましく、または共有結合である。
【００４４】
反復薬物設計では、一連のタンパク質／化合物複合体結晶が得られ、その後、核複合体の３次元構造を解明する。このようなアプローチにより、各複合体のタンパク質と化合物の会合についての洞察が得られる。このことは、阻害活性を有する化合物を選択すること、新規タンパク質／化合物複合体の結晶を得ること、該複合体の３次元構造を解明すること、および新規タンパク質／化合物複合体と既に解明されたタンパク質／化合物複合体の結合を比較することによって達成する。化合物における変化がどのように前記タンパク質／化合物結合に影響を及ぼしたかを観察することによって、これらの結合を最適化することもできる。
【００４５】
場合によっては、反復薬物設計は、連続的なタンパク質−化合物複合体を形成することおよび次に各新規複合体を結晶化することによって実施する。これとは別に、前形成タンパク質結晶を化合物存在下で浸漬し、それによってタンパク質／化合物複合体を形成させ、各タンパク質／化合物複合体を結晶化させる必要性を回避する。
【００４６】
本文で使用したように、用語“浸漬”とは、結晶を問題の化合物を含む溶液に移すプロセスを称する。
【００４７】
表Ａと表Ｂに示した構造座標を用いて、別の結晶化分子または分子複合体についての構造情報を得る助けとすることもできる。このことは、分子再配置を含むいくつの周知技術のいかなるものによっても達成することができる。
【００４８】
表Ａおよび表Ｂに示した構造座標を、Ａｕｒｏｒａ−Ａに構造的に類似する特徴を少なくとも含む分子または分子複合体の３次元構造の少なくとも一部を決定するために使用できる。特に、別の結晶化分子または分子複合体についての構造情報を得ることもできる。このことは、分子再配置を含むいくつの周知技術のいかなるものによっても達成することができる。
【００４９】
したがって、別の態様において、本発明は、分子再配置を利用して構造が未知の結晶化分子複合体についての構造情報を得る方法を提供し、
ａ）前記結晶化分子複合体からＸ線回折パターンを作製すること；
ｂ）表Ａおよび表Ｂに示した構造座標の少なくとも一部をＸ線回折パターンに適用し、構造が未知の分子複合体の３次元電子密度マップを作製すること；および
ｃ）表Ａおよび表Ｂに示した構造座標の全てまたは一部を用いてＡｕｒｏｒａ−Ａまたは他のいかなるキナーゼリガンド結合ドメインの相同性モデルを作製すること、を含む。
【００５０】
好ましくは、結晶化分子複合体は、この発明の結晶を溶液に浸漬することによって得られる。
【００５１】
分子再配置は、未知構造のために相の正確な推定を提供する。相は、直接求めることができない結晶構造解明に用いた等式における因子である。相について分子再配置以外の方法により正確な値を得ることは、近似と再計算の反復サイクルを必要とし、かつ結晶構造解明を非常に妨害する時間を浪費するプロセスである。しかし、少なくとも相同部分を含むタンパク質の結晶構造が解明されると、この公知構造からの相により、未知構造についての相の満足できる推定値が得られる。
【００５２】
したがって、この方法では、構造未知の分子または分子複合体結晶の観察されたＸ線回折パターンを最適に説明するために、未知分子または分子複合体結晶の単位格子内部に表ＢによるＡｕｒｏｒａ−Ａリガンド複合体の関連部分を配向させ位置決めすることによって、構造座標が未知の分子または分子複合体の予備モデルを作製することが必要になる。次に、このモデルから相を計算でき、観察したＸ線回折パターン高さと組み合わせて、座標が未知である構造の電子密度マップを作製できる。次にこれを、あらゆる周知のモデル構築および構造再計算技術に供して、未知結晶化分子または分子複合体の最終的な正確な構造が提供される〔Ｅ．Ｌａｔｔｍａｎ，“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ” ，ｉｎ  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１５、ｐｐ．５５−７７（１９８５）；Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｓｍａｎｎ編著，“Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ” ，Ｉｎｔ．  Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｓｅｔ．，Ｎｏ．１３、Ｇｏｒｄｏｎ＆Ｂｒｅａｃｈ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７２）〕。
【００５３】
全ての結晶化分子または分子複合体、または変異体、またはＡｕｒｏｒａ−Ａリガンド複合体のいかなる部分にも十分に相同なホモログのいかなる部分の構造も、この方法により解明できる。
【００５４】
構造座標は、また、様々な化学物質と共複合体化されたＡｕｒｏｒａ−Ａリガンドの結晶についての構造解明に有用である。このアプローチにより、例えば阻害剤のような候補Ａｕｒｏｒａ−Ａ修飾物質と前記複合体との相互作用を含めて化学物質間の相互作用のために最適部位を決定できる。たとえば、異なるタイプの溶媒に曝した結晶から得た高分解能Ｘ線回折データにより、各タイプの溶媒分子がどこに存在するか決定できる。これらの部位に緊密に結合する小分子を次に設計合成し、例えば阻害活性のようなそれらのＡｕｒｏｒａ−Ａ修飾を試験する。
【００５５】
上記に述べた複合体全てを、周知のＸ線回折技術を用いて研究でき、１．５−３オングストローム分解能Ｘ線データに対してＸ−ＰＬＯＲのようなコンピュータソフトウェアを用いて約０．２０以下のＲ値に絞り込むこともできる〔Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社により配布；例えばＢｌｕｎｄｅｌｌ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ同上を参照；Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１４巻および１１５巻，Ｈ．Ｗ．Ｗｙｃｋｏｆｆら編著，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）〕。したがって、この情報を用いてＡｕｒｏｒａ−Ａアゴニスト、部分アゴニスト、拮抗剤、部分拮抗剤を最適化でき、さらに重要なことには、新規のＡｕｒｏｒａ−Ａアゴニスト／拮抗剤を設計できる。
【００５６】
したがって、本発明はさらに、Ａｕｒｏｒａ−Ａリガンドの一部が、Ａｕｒｏｒａ−Ａの下記の残基：Ｙ１９９、Ｌ１７８、Ｗ１２８、Ｌ１５９、Ｈ１８７、Ｌ１８８、Ｉ１８４の少なくとも一つとファンデルワールス力で接触しているか水素結合で接触しているＡｕｒｏｒａ−Ａリガンドについて、Ａｕｒｏｒａ−Ａ中の結合部位に関する。
【００５７】
本発明の目的のため、Ａｕｒｏｒａ−Ａ結合部位とはまた、その変異体またはホモログを意味する。好ましい態様において、前記変異体またはホモログは、Ａｕｒｏｒａ−Ａ結合部位の残基Ｑ１２７、Ｗ１２８、Ｒ１２６、Ｌ１５９、Ｆ１５７、Ｅ１７０、Ｌ１６９、Ｖ２０６、Ｙ１９９、Ｈ１８７、Ｒ１７９、Ｌ１７８、Ｖ１８２、Ｙ１９９、Ｌ１８８、Ｉ１８４、Ｖ２５２、Ｋ２５０、Ｐ２８２、Ｈ２８０に対して、少なくとも２５％の同一性、さらに好ましくは５０％の同一性、さらに好ましくは７５％の同一性、最も好ましくは９５％の同一性を有している。
【００５８】
本発明はまた、機械可読データによりエンコードされるデータ記憶材料を含む機械可読記憶媒体に関し、前記データは、表ＢのＡｕｒｏｒａ−Ａリガンド複合体または前記複合体のホモログの構造座標により規定され、前記ホモログは、前記複合体の骨格原子から３．０オングストローム以下、好ましくは２．０オングストローム以下の標準偏差を有する骨格原子を含む。
【００５９】
本発明はまた、キナーゼまたはキナーゼリガンド複合体の結晶に基づくＡｕｒｏｒａ−Ａキナーゼの３次元モデルを用いた計算法を提供する。一般的に、Ａｕｒｏｒａ−Ａリガンドを設計する計算法により、Ａｕｒｏｒａ−Ａのどのアミノ酸またはアミノ酸類がリガンドの化学的部分（少なくとも１個）と相互作用するかを、結合リガンドを有するＡｕｒｏｒａ−Ａキナーゼを含む結晶化タンパク質の３次元モデルを用いてさらに前記化学的部分の化学的修飾部分（少なくとも１個）を選択し、相互作用アミノ酸と天然リガンドすなわちＴＰＸ２またはその断片上の対応する化学的部分との相互作用に比較して、相互作用アミノ酸と第２化学的部分との相互作用を増大させるかまたは減少させる構造を有する第２化学的部分を作製することにより、決定する。
【００６０】
本発明の計算法は、このような結晶および３次元構造情報を用いてキナーゼ合成リガンドを設計し、前記キナーゼの立体構造変化を修飾する合成リガンドを作製するためである。これらの計算法は特に、前記キナーゼに対するアゴニスト、部分アゴニスト、拮抗剤または部分拮抗剤を設計する際に有用であり、ここで、前記アゴニスト、部分アゴニスト、拮抗剤または部分拮抗剤は、天然リガンド、またはアゴニストのような天然リガンドを模倣する他のリガンドについて観察される、活性化ドメインの正常な配位を防止することのような、そのターゲットの一つに及ぼすキナーゼの影響を変えるリガンド誘発分子イベントのいくつかのいずれか一つを防止する拡張部分を有している。本文に述べたように、前記キナーゼの合成リガンドは、様々な医療条件下でキナーゼ活性修飾に有用であろう。
【００６１】
Ａｕｒｏｒａ−Ａは、下記のような様々なセグメントを含むことが知られている：１）アミノ末端リガンド結合部位；および２）Ａｕｒｏｒａ−Ａ活性化セグメント。
【００６２】
このモジュール方式により、各タンパク質の異なるセグメントおよび部位が別々に異なる機能を達成できるようになるが、ただし、前記セグメントおよび部位は互いに影響しあう。
【００６３】
Ａｕｒｏｒａ−ＡのＮ末端ローブ中にＴＰＸ２結合部位を作ることは、この発癌性キナーゼの活性化防止およびそれを特異的にブロックするという利点を有している。Ａｕｒｏｒａ−Ａ特異的阻害剤は、特に乳癌および結腸癌の重要な癌治療剤であろう。
【００６４】
本文に述べたポリペプチド（例えばＡｕｒｏｒａ−Ａ、ＴＰＸ２等）は、固相、液相および併用固相／液相合成のような合成方法；適宜部位特異的変異法と組み合わせたｃＤＮＡクローニングを含む組換えＤＮＡ法；および／または、適宜酵素切断方法と組み合わせてＡｕｒｏｒａ−ＡおよびＴＰＸ２の天然形状断片を作製する天然物精製方法のような周知のいかなる方法によっても産生できる。前記ペプチドを発現させ、結晶化させ、その３次元構造を、結合リガンドにより（同一キナーゼまたは異なるキナーゼまたはその組み合わせの結晶データを用いて）決定し、計算法を用いて、そのリガンド結合部位に対してリガンド、特にＡｕｒｏｒａ−Ａの活性化セグメントを配向させる拡張部分を含むリガンドを設計する。
【００６５】
典型的には、Ａｕｒｏｒａ−ＡおよびＴＰＸ２ならびにその断片を均一になるまで精製し、結晶化させる。
【００６６】
Ａｕｒｏｒａ−Ａの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析および疎水性ＨＰＬＣにより測定する。結晶化用に精製したＡｕｒｏｒａ−Ａは、少なくとも９７．５％純粋または９７．５％を示し、好ましくは少なくとも９９．０％純粋または９９．０％純粋を示し、さらに好ましくは少なくとも９９．５％純粋または９９．５％純粋であるべきである。
【００６７】
リガンド結合していないキナーゼの当初の精製は、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびヘパリンアフィニティークロマトグラフィーのような従来の技術により得ることができる。
【００６８】
Ａｕｒｏｒａ−Ａの改良結晶のために高精製を達成するため、アニオン交換または疎水性相互作用カラムのような電荷に応じてキナーゼを分離するカラムを用いてキナーゼをリガンドシフト精製し、次に溶出したキナーゼにリガンド特にアゴニストまたは部分アゴニストを結合させるのが好ましい。前記リガンドは、同一カラムでサイドクロマトグラフィを行うと、リガンドを付加していないキナーゼによりオリジナルカラムで除去されるリガンド付けキナーゼの位置で溶出するようにキナーゼ表面電荷に変化を誘発する。通常飽和する濃度のリガンドを前記カラムで用い、タンパク質をカラムに通す前にこのタンパク質を前記リガンドと前インキュベーションする。
【００６９】
さらに最近開発された方法では、アミノ末端上のようなタンパク質末端上に配置したヒスチジンによるような“タグ”を工学的に作製し、次に精製のためにニッケル錯体化カラムを用いることが必要である、本文で参考として引用したＪａｎｋｎｅｃｈｔ  Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ８８：８９７２−８９７６（１９９１）。
【００７０】
典型的には、精製したＡｕｒｏｒａ−Ａを、タンパク質の一体性を保持する温度で飽和濃度のリガンドで平衡にする。リガンド平衡は、２乃至３７°Ｃで達成できるが、前記キナーゼは、２−２０°Ｃ範囲でより安定な傾向がある。
【００７１】
好ましくは、結晶は、ハンギングおよび／またはシッティングドロップ方法で作製される。
【００７２】
制御温度調節は、結晶安定性と品質を改良するために望ましい。４乃至２５℃の温度が通常用いられ、ある範囲の温度にわたって結晶化を試験するのがしばしば好ましい。１８乃至２５℃、さらに好ましくは２０乃至２３℃および最も好ましくは２２℃の結晶化温度を用いるのが好ましい。
【００７３】
本発明のＡｕｒｏｒａ−Ａリガンドは、Ａｕｒｏｒａ−Ａのリガンドとして作用可能ないかなるペプチド、模倣ペプチドまたは非ペプチドであり、小型の有機分子も含む。好ましい態様において、Ａｕｒｏｒａ−Ａリガンドは、Ａｕｒｏｒａ−Ａ調節因子である。“Ａｕｒｏｒａ−Ａ調節因子”とは、Ａｕｒｏｒａ−Ａキナーゼのアゴニストまたは活性化因子、部分アゴニストまたは部分活性化因子、拮抗または阻害剤、または部分拮抗剤または部分阻害剤である。
【００７４】
アゴニストまたは部分アゴニストは、キナーゼ中においてそのターゲットの一つに影響を及ぼすことができるようにそれらを活性立体構造にする変化を誘発する。キナーゼ立体構造には様々なリガンド誘発変化がありうる。
【００７５】
拮抗剤または部分拮抗剤はキナーゼに結合するが、キナーゼの標的に影響を及ぼす性質または生理的なテルクラム（ｔｅｌｃｒａｍ）立体構造を変える立体構造変化を誘発できない。拮抗剤または部分拮抗剤の結合はまた前記結合をブロックでき、したがって、アゴニストまたは部分アゴニストの作用をブロックできる。
【００７６】
部分アゴニストまたは部分拮抗剤はキナーゼに結合し、前記キナーゼ中においてそれぞれアゴニストまたは拮抗剤によって誘発される変化の一部のみを誘発する。その差異は、質的であるかまたは量的でありうる。したがって、部分アゴニストまたは部分拮抗剤は、それぞれアゴニストまたは拮抗剤によって誘発される立体構造変化の一部を誘発できるが、他のものは誘発できなく、それは、ある変化を限定的に誘発できるのみである。
【００７７】
本文で述べたように、リガンドが付加されていないキナーゼは、不活性であるか、ある程度活性を有するか、またはリン酸化活性を有する構造となっている。アゴニストリガンド結合によりキナーゼ中の立体構造変化を誘発し、キナーゼがより活性化するかおよび／または不活性化、特に脱リン酸化されないようにする。
【００７８】
特定の態様によれば、本発明は、Ａｕｒｏｒａ−Ａのアロステリック阻害剤に関する。このようなアロステリック阻害剤がＡｕｒｏｒａ−Ａに結合すると、キナーゼの立体構造変化が起こり、それにより、好ましくはその活性化機構をブロックすることにより前記キナーゼ活性を低下させる。本発明によるアロステリック阻害剤の好ましい結合部位は、本文に述べたようにＴＰＸ２がＡｕｒｏｒａ−Ａに結合するＴＰＸ２認識溝である。
【００７９】
結果として、Ａｕｒｏｒａ−Ａの結合部位とＴＰＸ２結合部位との結合または接触を安定化させる、リガンドから伸びる化学的部分（またはそれ以上）を設計できる。典型的には、このような化学的部分は、リガンド上の分子認識ドメインを通りすぎそれを離れて伸び、通常、埋没しているリガンドの結合空洞を通り過ぎる。
【００８０】
キナーゼによるリガンド結合はダイナミックプロセスを示し、変化した立体構造を誘発することによってキナーゼ機能を制御する。
【００８１】
リガンド付加Ａｕｒｏｒａ−Ａキナーゼの３次元構造を新規Ａｕｒｏｒａ−Ａ合成リガンド開発に用いることができる。さらに、Ａｕｒｏｒａ−Ａは、全体として本文で参考として引用したＥＰ  ３３５  ６２８、米国特許５、４６３、５６４に開示されたもののような、３次元構造解明と組み合わせ化学を含む現代的方法に非常に適している。本発明の実施において結晶学データを使用するコンピュータプログラムにより、Ａｕｒｏｒａ−Ａに対するリガンドの合理的設計が可能になる。ＲＡＳＭＯＬのようなプログラムを、本発明を実施して得られる結晶の原子座標とともに用いることができるかまたは３次元モデルを作成しおよび／またはリガンド結合に関与している構造を決定することによって、本発明の実施に用いることができる。ＩＮＳＩＧＨＴおよびＧＲＡＳＰのようなコンピュータプログラムによりさらに操作でき、新規構造を導入する能力を可能とする。さらに、高い処理能力の結合と生物活性アッセイを、精製した組み換えタンパク質と本文に述べかつ当該技術で公知の現代的アッセイを用いてリガンド構造をさらに改良しそれによって活性を改良するために開発できる。
【００８２】
通常、Ａｕｒｏｒａ−Ａ合成リガンド設計の計算法は、２工程を含む：
１）Ａｕｒｏｒａ−Ａのどのアミノ酸またはアミノ酸は、リガンドの第１化学的部分（少なくとも１個）と相互作用するか、結合リガンドを有するＡｕｒｏｒａ−Ａを含む結晶化タンパク質の３次元モデルを用いて決定すること；および
２）第１化学的部分の化学的修飾物（少なくとも１個）を選択して相互作用性アミノ酸と第１化学的部分の相互作用に比較して、相互作用性アミノ酸と第２化学的部分との相互作用を低下させるかまたは増大させる構造を有する第２化学的部分を作製すること、
である。
【００８３】
好ましくは、前記方法は、前記３次元モデルを、同形リガンド誘導体を比較して改良されたフェーシングをもたらすように作製し、実行する。前記方法が、前記第１化学的部分の化学修飾後の前記相互作用性アミノ酸と前記リガンドの相互作用変化を決定すること、特に前記３次元モデルが、同一形態リガンド誘導体を比較して改良されたフェーシングをもたらすように作製されるのがさらに好ましい。また、前記選択で、相互作用性アミノ酸Ｙ１９９、Ｌ１７８、Ｗ１２８、Ｌ１５９、Ｈ１８７、Ｌ１８８、Ｉ１８４の少なくとも一つと相互作用する前記第１化学的部分を用いるのが好ましい。
【００８４】
本文に示したように、相互作用性アミノ酸が前記リガンドとの接触を形成し、この相互作用性アミノ酸の原子中心は、通常、リガンド原子中心から２乃至４オングストローム離れている。通常、これらの距離はコンピュータで決めるが、しかし、３次元モデルがいったん作製されると手動でも距離を決定できる。３次元モデルの立体化学図については、Ｗａｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３７８（６５５８）：６７０−６９７（１９９５）も参照のこと。さらに、リガンド原子と相互作用するアミノ酸の原子は、３乃至４オングストローム離れているのが通常である。本発明は、工程１と２を繰り返しリガンド結合部位へのリガンドの適合を改良させ、アゴニスト、部分アゴニスト、拮抗剤または部分拮抗剤のようなよりすぐれたリガンドを決めることにより実施できる。
【００８５】
Ａｕｒｏｒａ−Ａの３次元モデルは２次元で表し、どのアミノ酸がリガンドに接触するかを決めることおよび化学修飾のためのリガンド位置を選択すること、ならびに、化学修飾前に比較して特定アミノ酸との相互作用を変化させる。化学修飾は、コンピュータを用いて３次元モデルの２次元表示を用いて手動でまたは前記リガンドを化学合成することによって、行うこともできる。前記リガンドはまた、リガンド化学修飾後に遠隔アミノ酸（ｄｉｓｔａｎｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）と相互作用でき、新しいリガンドを創生できる。遠隔アミノ酸は、通常、化学修飾前はリガンドと接触していない。化学修飾がリガンド構造を変化させ、前記リガンドから通常少なくとも４．５オングストローム離れた遠隔アミノ酸と相互作用する新規リガンドを作成するが、ここで好ましくは、前記第１化学的部分が遠隔アミノ酸から６乃至１２オングストローム離れている。しばしば、遠隔アミノ酸は、リガンドのための結合空洞表面をおおわずリガンドから余りに離れているので、ポケットすなわち結合空洞の部分となることができない。リガンド結合部位のアミノ酸とリガンド原子の相互作用は、天然に指摘されているいかなる力でもまたは誘引力でも行われる。通常、アミノ酸原子とリガンドの相互作用は、水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用または双極子相互作用の結果であろう。疎水性相互作用の場合、アミノ酸とリガンドのそれ自体の相互作用ではなく、むしろ、水または他の親水性基の疎水性表面からの反発の一部ではあるのが通常の結果である。リガンド結合部位とリガンドの相互作用の低下または増大は、コンピュータでまたは当該技術で公知の熱動態または力学方法を用いて結合エネルギーを計算するかまたは試験することによって、決定できる。
【００８６】
化学修飾物は、しばしば、リガンド結合部位のアミノ酸原子とリガンド原子の相互作用を増大させるかまたは低下させるであろう。立体阻害は、リガンド結合空洞と活性化セグメントの相互作用を変化させる通常の手段であろう。
【００８７】
本発明はまた、キナーゼ活性を修飾する化合物を同定する方法を提供する。様々な方法またはその組み合わせを用いて、これらの化合物を同定できる。例えば、表Ｂの構造座標によって規定されるかまたはＡｕｒｏｒａ−Ａの３次元構造モデル、変異Ａｕｒｏｒａ−ＡまたはＡｕｒｏｒａ−Ａホモログまたはその部分を用いて、Ａｕｒｏｒａ−Ａリガンド結合部位に空間的に適合する試験化合物をモデル化できる。リガンド結合部位の構造座標、特にアミノ酸Ｑ１２７、Ｗ１２８、Ｒ１２６、Ｌ１５９、Ｆ１５７、Ｅ１７０、Ｌ１６９、Ｖ２０６、Ｙ１９９、Ｈ１８７、Ｒ１７９、Ｌ１７８、Ｖ１８２、Ｙ１９９、Ｌ１８８、Ｉ１８４、Ｖ２５２、Ｋ２５０、Ｐ２８２、Ｈ２８０を用いて、構造的および化学的特徴を同定できる。同定した構造的または化学的特徴を次に用いて、化合物をＡｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤として設計または選択できる。構造的および化学的特徴とは、ファンデルワールス相互作用、水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水性結合相互作用、疎水性相互作用および双極子相互作用を含むがそれらに限定されない。これとは別にまたはこれに関連して、３次元構造モデルまたはリガンド結合部位を用いて、Ａｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤として可能な化合物を設計または選択できる。潜在的Ａｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤として同定した化合物を次に合成し、Ａｕｒｏｒａ−Ａへの試験化合物結合を特徴とするアッセイにおいてスクリーニングする。
【００８８】
潜在的Ａｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤スクリーニングにおいて有用なアッセイ例には、たとえば、本文に述べたようなヒストンＨ３のリン酸化に基づくインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）スクリーニング、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイおよび高処理能力アッセイが含まれるがこれらに限定されない（Ｃｒｏｓｉｏ、Ｃ．，Ｆｉｍｉａ、Ｇ．Ｍ．，Ｌｏｕｒｙ，Ｒ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｏｋａｎｏ，Ｙ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｓｅｎ，Ｓ．，Ａｌｌｉｓ，Ｃ．Ｄ．，およびＳａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ，Ｐ．（２００２）。Ｍｉｔｏｔｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３：ｓｐａｔｉｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ａｕｒｏｒａ  ｋｉｎａｓｅｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２２，８７４−８８５）．
【００８９】
本発明の好ましい方法は、キナーゼ拮抗剤とキナーゼアゴニストを設計する計算法として記載でき、
１）Ａｕｒｏｒａ−Ａを含む結晶化タンパク質の３次元モデルを用いて前記アゴニストの分子認識部位構造を決定すること、および
２）前記アゴニストの結合部位を越えかつＡｕｒｏｒａ−Ａ生物機能に重要な少なくとも一つのタンパク質部位の方向に伸びるリガンド構造を付与する前記アゴニストの少なくとも１個の化学修飾物を選択すること、
を含む。
【００９０】
本発明の別の好ましい方法は、キナーゼスーパーアゴニストまたは拮抗剤のような選択的キナーゼ修飾剤を設計する計算法として記載でき、
１）結合リガンドを有するＡｕｒｏｒａ−Ａを含む結晶化タンパク質の３次元モデルを用いて前記リガンドの少なくとも１個の第１化学的部分と相互作用するＡｕｒｏｒａ−Ａの少なくとも１個の相互作用性アミノ酸を決定すること、および
２）前記相互作用性アミノ酸と前記第１化学的部分との相互作用に比較して、前記相互作用性アミノ酸と前記第２化学的部分との相互作用を低下または増大させる構造を有する第２化学的部分を作製するように、前記第１化学的部分の少なくとも１個の化学修飾を選択すること、
を含む。
【００９１】
しかし、この開示により当業者には明らかであであるだろうが、他の構造に基づく設計方法を用いることもできる。様々なコンピュータ構造に基づく設計方法が当該技術で開示されている。
【００９２】
例えば、いくつかのコンピュータモデル化システムが利用可能であり、Ａｕｒｏｒａ−Ａの配列とＡｕｒｏｒａ−Ａ構造（すなわち、Ａｕｒｏｒａ−Ａの原子座標および／または活性部位の原子座標、結合および二平面角、および表Ａおよび表Ｂに示したような活性部位原子間の距離）を入力できる。このコンピュータシステムで次に、潜在的Ａｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤が結合して潜在的修飾剤の相補性構造の詳細を決定できる部位の構造詳細を作製する。こうしたモデル化システムの設計は、通常、Ａｕｒｏｒａ−Ａと物理的および構造的に結合可能な化合物に基づいている。さらに、前記化合物は、Ａｕｒｏｒａ−Ａとその結合を可能にする立体構造を取ることができなければならない。いくつかのモデル化システムでは、実際の合成と試験の前に、潜在的Ａｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤の潜在的阻害または結合効果を推定する。
【００９３】
Ａｕｒｏｒａ−Ａとの結合能力を化学的部分または断片についてスクリーニングする方法もまた、周知である。しばしば、これらの方法は、コンピュータスクリーン上で活性部位を視覚的に見ることで始まる。選択した断片または化学的部分を次に、Ａｕｒｏｒａ−Ａとともに配置する。ＱＵＡＮＴＡおよびＳＹＢＹＬのようなソフトウェアを用いてドッキングを行い、その後、ＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲのような標準的分子メカニックフォースフィールドによりエネルギー最小化と分子力学を行う。本発明に有用な化学断片または化学的部分の選択を助けるコンピュータプログラムの例には、ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｐ．Ｊ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８５  ２８：８４９−８５７），ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．およびＯｌｓｅｎ，Ａ．Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９０  ８：１９５−２０２）およびＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｓら  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １９８２  １６１：２６９−２８８）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
好ましい化学的部分または断片を選択し、それらの互いの関係とＡｕｒｏｒａ−Ａとの関係を視覚化し、部分または断片を単一の潜在的修飾剤として組み立てることができる。
【００９５】
それぞれの化学的部分を組み立てる上で有用なプログラムとして、これに限定されないがＣＡＶＥＡＴ（Ｂａｒｔｌｅｔｔら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｏｙａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７８，１８２−１９６（１９８９）および３Ｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｙ．Ｃ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９２  ３５：２１４５−２１５４）が挙げられる。
【００９６】
これとは別に、空活性部位または適宜公知阻害剤の一部を含めて用いて、デノボで化合物を設計することもできる。このタイプの設計方法として、これに限定されないが、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ  Ｈ−Ｊ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ  １９９２  ６：６１−７８）およびＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．ＭＯ）が挙げられる。
【００９７】
好ましいリガンドの例は、上記の式（Ｉ）のインドールおよびインデン誘導体およびその光学異性体、生理学的に許容される塩、その誘導体およびプロドラッグ中に見出される。
【００９８】
これらには、特に式（Ｉ）のインドールおよびインデン誘導体が含まれ、ここで、
Ｒ1は水素、アルキレン−ＮＨＲ8、アルキレン−ＯＲ8、またはアルキレン−ＳＲ8を示し；
Ｒ2は水素、アルキレン−ＮＨＲ8、アルキレン−ＯＲ8、またはアルキレン−ＳＲ8を示し；
Ｒ3は水素、アルキル、アルキレン−Ｒ9、アルケニレン−Ｒ9、アルキニレン−Ｒ9、またはアリレン−Ｒ9を示し；
Ｒ4は水素を示し；
Ｒ5は水素、アルキル、ＯＲ10、ＮＨＲ10、ＳＲ10、アルキレン−Ｒ10、アルケニレン−Ｒ10、アルキニレン−Ｒ10、またはアリレン−Ｒ10を示し；
Ｒ6は水素、アルキル、ＯＲ10、ＮＨＲ10、ＳＲ10、アルキレン−Ｒ10、アルケニレン−Ｒ10、アルキニレン−Ｒ10、またはアリレン−Ｒ10を示し；
Ｒ7は水素を示し；
Ｒ8は水素、ＣＯ−アルキル、（ａａ）mａｓｐ（ａａ）n、（ａａ）mｇｌｕ（ａａ）n、（ａａ）mｃｙｓ（ａａ）nを示し；
Ｒ9はＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）2、Ｎ+（アルキル）3、アリルまたはヘテロアリルを示し；
Ｒ10は、水素、アリルまたは置換アリルを示し；
Ｘは窒素原子またはＣＨを示し；
ａａは、アミノ酸ラジカルを示し；および
ｎはゼロまたは１乃至１０の整数で；
ｍは、ゼロまたは１乃至１０の整数であるが、ここで、Ｒ1とＲ2は両者ともに水素であるということはなくＲ5とＲ6は両者ともに水素であるということがない）、およびその光学異性体、生理学的に許容される塩およびプロドラッグに関する。
【００９９】
この場合の生理学的に許容される塩は、酸添加または塩基添加塩であることができる。
【０１００】
酸添加塩について、塩酸、硫酸、硝酸またはリン酸のような無機酸または有機酸、特に例えば酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、マンデル酸、アスコルビン酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸のようなカルボン酸またはメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびトルエンスルホン酸のようなスルホン酸が用いられる。
【０１０１】
塩基添加塩には、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのような無機塩基またはモノ−、ジ−またはトリエタノールアミンのような有機塩基との式（Ｉ）との化合物の塩が含まれる。
【０１０２】
式Ｉの化合物のプロドラッグは、例えば、アルキル、ピバロイルオキシメチル、アセトキシメチル、フタリジル、インデニルおよびメトキシメチルエステルのような生理的に容易に加水分解可能なエステルである。
【０１０３】
式Ｉの化合物の誘導体は、例えば、アミノ基およびカルボキシル基のような官能基が周知の保護基を有している化合物である。
【０１０４】
もし本発明の化合物が非対称中心を有しているならば、ラセミ化合物および光学異性体も、混合物としてまたは純粋な形状（鏡像体、ジアステレオマー）で含まれる。
【０１０５】
用語“アルキル”およびアルコキシ、アルキルチオおよびアルコキシカルボニルのアルキル部分は、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5、ｎ−プロピル、ＣＨ（ＣＨ3）2、ｎ−ブチル、ＣＨ（ＣＨ3）−Ｃ2Ｈ5、イソブチル、Ｃ（ＣＨ3）3、ｎ−ペンチルまたはｎ−ヘキシル、特にＣＨ3、Ｃ2Ｈ5またはＣＨ（ＣＨ3）2のような直鎖または分枝アルキル基を含み、好ましくは、−もし他に断りがなければ−１乃至８個、特に１乃至６個、特に好ましくは１乃至４個の炭素原子を有する。
【０１０６】
用語“ハロアルキル”およびハロアルコキシのハロアルキル部分は、１乃至４個の炭素原子、好ましくは１または２個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキル基を含み、これらの基中の水素原子は、上記に述べたようなハロゲン原子によって部分的にまたは完全に置換でき、例えば、クロロメチル、ブロモメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロフルオロメチル、ジクロロフルオロメチル、クロロジフルオロメチル、１−クロロエチル、１−ブロモエチル、１−フルオロエチル、２−フルオロエチル、２、２−ジフルオロエチル、２、２、２−トリフルオロエチル、２−クロロ−２−フルオロエチル、２−クロロ−２、２−ジフルオロエチル、２、２−ジクロロ−２−フルオロエチル、２、２、２−トリクロロエチルおよびペンタフルオロエチルのようなＣ1−Ｃ2−ハロアルキルである。さらに好ましくは、過ハロゲン化Ｃ1−Ｃ2−ハロアルキルラジカル、特にトリフルオロメチルおよびペンタフルオロエチルである。
【０１０７】
用語“アルキレン”は、好ましくは、−もし他に断りがなければ−１乃至８個、特に１乃至６個、特に好ましくは１乃至４個の炭素原子を有するメチレンおよびエチレンのような直鎖または分枝アルキレン基を含む。
【０１０８】
用語“アルケニレン”は、好ましくは、−もし他に断りがなければ−２乃至８個、特に２乃至６個、特に好ましくは２乃至４個の炭素原子を有するエテニレンのような直鎖または分枝鎖の、モノ−またはポリ不飽和アルキレン基を含む。
【０１０９】
用語“アルキニレン”は、好ましくは、−もし他に断りがなければ−２乃至８個、特に２乃至６個、特に好ましくは２乃至４個の炭素原子を有するエチニレンのような直鎖または分枝鎖の、モノ−またはポリ不飽和アルキレン基を含む。
【０１１０】
用語“シクロアルキル”は、好ましくは５乃至１４個、特に５乃至８個の炭素原子を有する一またはニ環式炭化水素ラジカルを含み、特に、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロへプチルおよびシクロオクチルを示す。
【０１１１】
用語“シクロアルケニル”は、好ましくは５乃至１４個、特に５乃至８個の炭素原子を有する一またはニ環式の、不飽和炭化水素ラジカルを含み、特に、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニルおよびシクロオクテニルを示す。
【０１１２】
“アリル”とは、特に、一またはニ環式芳香族ラジカルを示し、好ましくは、５乃至１４個、特に５または６個の炭素原子を有し、特に、ナフチル、インデニル、および特にフェニルを示す。
【０１１３】
“ヘテロアリル”とは、特に、一またはニ環式ヘテロ芳香族ラジカルを示し、好ましくは、５乃至１４個、特に５または６個の環原子を有しかつＯ、ＮおよびＳからなる群からそれぞれ独立して選択した１、２または３個のヘテロ原子を含む。特別の態様によれば、ニ環式ラジカルは、ベンゾ融合している５−または６員環へテロ芳香族ラジカルを含む。ヘテロアリルには窒素含有ラジカルが含まれ、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピラジニル、インドリル、キノリニル、特にピリジル、ピリミジルおよびイソキノリニルであり、さらにトリアゾリルおよびテトラゾリルのような窒素含有ラジカル；チエニル、ベンゾチエニル、フラニルおよび特にベンゾフラニルのような酸素原子または硫黄原子を含むラジカル；チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、イソキサゾリルおよびオキサゾリルのような２個以上の異なるヘテロ原子を含むラジカルが含まれる。好ましい芳香族複素環ラジカルは、ピリジルおよびインドリルである。
【０１１４】
“飽和および部分−好ましくはモノ−不飽和複素環ラジカル”は特に、Ｏ、ＮおよびＳからなる群からそれぞれ独立して選択した１、２または３個のヘテロ原子を含む５−乃至７員環へテロ脂肪族環を含む。例として、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、５−ピラゾリジニル、２−ピロリジン−２−イル、２−ピロリジン−３−イル、３−ピロリジン−２−イル、３−ピロリジン−３−イル、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、ピリジン（１、２−ジヒドロ）−２−オン−１−イル、２−ピペラジニル、モルホリン−４−イルおよびチオモルホリン−４−イルが挙げられる。
【０１１５】
置換アリルまたはヘテロアリルラジカルは特に、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ4−アルキル、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシ、Ｃ1−Ｃ4−アルキルチオ、Ｃ1−Ｃ4−ハロアルキル、Ｃ1−Ｃ4−ハロアルコキシおよびＣ1−Ｃ4−アルコキシカルボニルからなる群から独立して選択した１、２または３個の置換基を有するものを含む。
【０１１６】
用語“アリレン”は、好ましくはナフチレンを示し、特に、１、４−フェニレンのようなフェニレンである。
【０１１７】
好ましい態様によれば、残基Ｒ1およびＲ2の一つ、好ましくは残基Ｒ2が水素であり、一方、、好ましくはＲ1が水素とは異なる意味を有している。この文脈において、アルキレンラジカルは、好ましくは、インドールまたはインデン部分をアミノ、オキシまたはチオ部分（−ＮＨＲ8、−ＯＲ8または−ＳＲ8）に連結する比較的短い主鎖を含む。したがって、好ましいアルキレンラジカルの主鎖は、１乃至３個の炭素原子を含む。前記アルキレンラジカルは、分枝状であってもよい。直鎖アルキレンラジカルが好ましい。アルキレンラジカルの具体例として、メチレン、エチ−１、１−イレン、プロプ−１、１−イレンおよびプロプ−２、２−イレンが挙げられ、メチレンが好ましい。
【０１１８】
特に好ましい態様によれば、残基Ｒ1およびＲ2の一つ、好ましくは残基Ｒ2が水素であり、他方好ましくはＲ1がアルキレン−ＮＨＲ8を示す。
【０１１９】
さらに好ましい態様によれば、残基Ｒ1およびＲ2の一つ、好ましくは残基Ｒ2が水素であり、他方好ましくはＲ1がアルキレン−ＯＲ8を示す。
【０１２０】
Ｒ8は好ましくは、残基Ｒ1および／またはＲ2内でアミド、エステルまたはチオエステル結合を形成するため、アシルラジカルを示す。残基Ｒ8は、好ましくは、アスパルテート（ａｓｐ）、グルタメート（ｇｌｕ）、およびシステイン（ｃｙｓ）からなる群から選択したアミノ酸を示し、すなわち、ｎおよびｍは、ゼロを示し、または、アスパルテート、グルタメートまたはシステインにより連結されたペプチド、すなわちａａはアミノ酸ラジカルを示し、ｎおよびｍの少なくとも一つが１以上の整数を示し、ここでアミノ酸ラジカルは同一であっても異なることもできる。前記アスパルテート、グルタメートおよびシステインラジカルは、それらの官能基のいずれかによりアルキレンラジカルに結合させることができる。アスパルテートおよびグルタメートラジカルは、好ましくは、そのカルボキシル基のいずれかにより結合でき、アスパルテートのβカルボキシ官能基およびグルタメートのγカルボキシ官能基が好ましい。システインラジカルは、好ましくは側鎖チオ官能基により結合している。したがって、アミノ酸ラジカルａａは、アスパルテート、グルタメートまたはシステインラジカルの残りの官能基によりアルキレン基に結合する。好ましい態様によれば、残りの官能基は、αアミノ基およびαカルボキシ基を示し、一つまたは両者ともにアミノ酸ラジカルａａに結合できる。この態様によれば、連結するアスパルテート、グルタメートまたはシステインラジカルは、それ自体、前記アスパルテート、グルタメートまたはシステインラジカルの側鎖によりアルキレン残基に連結しているペプチド鎖の一部である。ｎおよびｍがともにゼロである場合、アスパルテート、グルタメートまたはシステインラジカルの残りの官能基を、例えば、ペプチド合成からの対応する保護基として周知の基により誘導体とすることができる。これらには、αアミノ基についてアセチル基のようなアミド形成アシル基またはαカルボキシ基についてメチル基のようなエステル形成アルキル基が含まれる。同様に、いかなるアミノ酸ａａの残りの官能基も（ｍおよび／またはｎがゼロでない場合）同様に誘導体とすることができる。このような好ましい残基Ｒ8の具体例は、式（ＩＩ）のラジカルである。ここで、ａａは、アミノ酸ラジカルを示し；
ｎは、ゼロまたは１乃至１０の整数であり；および
ｍは、ゼロまたは１乃至１０の整数である。
【０１２１】
【化１３】
2007511201.tif 000003
【０１２２】
このような好ましい残基Ｒ１および／またはＲ２の具体例は、したがって、式（ＩＩＩ）のラジカルを示す。ここで、ａａは、アミノ酸ラジカルを示し；
ｎは、ゼロまたは１乃至１０の整数であり；および
ｍは、ゼロまたは１乃至１０の整数である。  
【０１２３】
【化１４】
2007511201.tif 000004
【０１２４】
前記アミノ酸ラジカルａａはいかなるアミノ酸であってもよい。好ましくは、前記アミノ酸ラジカルは、−連結するアミノ酸とともに−Ａｕｒｏｒａ−Ａに結合するＴＰＸ２の部分を模倣するように選択される。前記ＴＰＸ２部分は、特に、残基７乃至２１、好ましくは８乃至１９（図３Ｃと比較）またはその断片からのアミノ酸配列を含む部分である。したがって、適切なペプチドは、配列Ｔｙｒ−Ｘａａ１−Ｔｙｒ−Ｘａａ２−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｐｈｅ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｐｈｅまたはその部分を有することができ、ここで、Ｘａａ１−６は、いかなるアミノ酸ラジカルであることもできる。Ｘａａ１は好ましくは、セリンラジカルまたは類似のアミノ酸である。Ｘａａ２は、好ましくは、アスパルテートラジカルまたは類似のアミノ酸である。Ｘａａ３は好ましくは、セリンラジカルまたは類似アミノ酸である。Ｘａａ４は、好ましくは、アスパラギン酸ラジカルまたは類似アミノ酸である。Ｘａａ５は、好ましくは、イソロイシンラジカルまたは類似アミノ酸である。Ｘａａ６は好ましくは、アスパラギンラジカルまたは類似アミノ酸である。特に好ましい部分は、配列Ｔｙｒ−Ｘａａ１−Ｔｙｒ−Ｘａａ２−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｐｈｅである。類似アミノ酸とは、それが類似しているアミノ酸に置換するとペプチド構造が保存的に変化することになると考えられているアミノ酸を意味する。例えば、アスパラギン酸塩は、グルタミン酸塩に類似している。前記ペプチドは好ましくは、長さ３乃至１５、さらに好ましくは４乃至１０および有益には５乃至８個のアミノ酸を有し、ｎ＋ｍの合計はしたがって、２乃至１４、さらに好ましくは３乃至９および有益には４乃至７をそれぞれ有している。
【０１２５】
さらに好ましい態様によれば、特にＲ2がアルキレン−ＯＲ8またはアルキレン−ＳＲ8である場合、Ｒ8は水素を示す。
【０１２６】
別の態様によれば、Ｒ2がアルキレン−ＮＨＲ8である場合、Ｒ8は、アルキル、アリルまたはヘテロアリルを示す。
【０１２７】
別の態様によれば、残基Ｒ1およびＲ2の一つ、好ましくは残基Ｒ2が水素であり、他方、好ましくはＲ1が水素、Ｃ1−Ｃ4−アルキル（好適にメチル）またはＣ1−Ｃ4−ハロアルキル（好ましくはトリフルオロメチル）を示す。
【０１２８】
Ｒ3は好ましくは、水素とは異なるラジカルを示し、有益には、アルキレン−Ｒ9、アルケニレン−Ｒ9またはアルキニレン−Ｒ9を示す。この文脈において、残基Ｒ9にインデンまたはインドール部分を連結する主鎖は、好ましくは比較的長い。したがって、アルキレンラジカル、アルケニレンラジカルまたはアリキニレンラジカルの主鎖は、例えば４個である３乃至８個の炭素原子を有している。前記アルキレンラジカル、アルケニレンラジカルまたはアリキニレンラジカルは分枝状であってもよい。直鎖ラジカルが好ましい。前記ラジカルの具体例として、プロプ−１、３−イレン、ブチ−１、４−イレン、ペント−１、５−イレン、およびヘキセ−１、６−イレンが挙げられるが、ブチ−１、４−イレンが好ましい。
【０１２９】
Ｒ9は好ましくは、アリルまたはヘテロアリルを示す。アリルおよびヘテロアリルラジカルの具体例として、フェニル、ナフチル、インデニル、ピリジル、およびインドリルが挙げられ、例えば、ピリジ−２−イルのようなピリジルが好ましい。アリルおよびヘテロアリルラジカルの別の具体例として、イミダゾリル、トリアゾリルおよびテトラゾリルが挙げられる。Ｒ9はまた、置換アリルまたはヘテロアリルを示すこともできる。
【０１３０】
このような好ましい残基Ｒ3の具体例は、式（ＩＶ）のラジカルである。
【０１３１】
【化１５】
2007511201.tif 000005
【０１３２】
残基Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は全て水素であることもできるが、前記残基の少なくとも一つ、特にＲ6は水素と異なっているのが好ましい。
【０１３３】
Ｒ5および／またはＲ6は好ましくは、ＯＲ10、ＮＨＲ10、ＳＲ10、またはアルキレン−Ｒ10を示す。この文脈において、アルキレンラジカルに関して好ましい態様は、残基Ｒ1およびＲ2と関連させて述べたようなものである。
【０１３４】
Ｒ10は好ましくは、アリルまたは置換アリルを示す。この文脈において、アリルは、好ましくはフェニルである。置換アリルは、通常、同一または異なっていてもよい１、２または３個の置換基を含み、１置換が好ましい。前記置換基は、好ましくは、ヒドロキシ、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＣＨ2ＰＯ3Ｈ2、−ＣＦ2ＰＯ3Ｈ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）2、−ＯＰＯ3（Ｒ11）2、−ＣＨ2ＯＰＯ3（Ｒ11）2、−ＣＦ2ＰＯ3（Ｒ11）2、−ＣＯＯＲ11、および−ＣＨ（ＣＯＯＲ11）2から構成される群から選択され、ここで、Ｒ11は、インビボで切断可能なラジカルを示し、カルボン酸エステル、リン酸およびホスホン酸エステルをそれぞれカルボキシレート、ホスフェートまたはホスホネートに変換する。Ｒ11残基の適切な例は、アルキル、ＣＨ2ＯＣＯ−アルキルおよびＣ2Ｈ4−Ｓ−ＣＯ−アルキルである。特に好ましい置換基は、−ＯＰＯ3Ｈ2、−ＣＨ2ＰＯ3Ｈ2、−ＣＦ2ＰＯ3Ｈ2、−ＯＰＯ3（Ｒ11）2、−ＣＨ2ＯＰＯ3（Ｒ11）2および−ＣＦ2ＰＯ3（Ｒ11）2から構成される群から選択される。Ｒ11残基の好ましい例は、−ＣＨ2ＯＣＯ−アルキルを示し、アルキルは、直鎖または分枝鎖を示し、例えばメチルのような１乃至６個の炭素原子を有している。これとは別に、ヒドロキシは、特に好ましい置換基である。さらに置換基には、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ1−Ｃ4−アルキル、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシ、Ｃ1−Ｃ4−アルキルチオ、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニルを含む。
【０１３５】
Ｒ10はまた、上述のアリルまたは置換アリルラジカルに類似している部分であることもできる。例えば、Ｒ10は、置換できる飽和、部分不飽和または芳香族、脂環式または複素環式ラジカルのような環状部分であることができる。これらの環状部分には、特に、ヘテロアリル、シクロアルキル、シクロアルキレニル、飽和へテロ環およびモノ不飽和へテロ環ラジカルが含まれ、ここで、前記へテロ環ラジカルには好ましくは、５員乃至７員を示しＯ、ＮおよびＳから構成される群から選択される１または２個のヘテロ原子が含まれる。前記置換基には、好ましくは、アリルラジカルのためのものが含まれる。
【０１３６】
このような好ましい残基Ｒ5および／またはＲ6の具体例は、式（Ｖ）のラジカルである。
【０１３７】
【化１６】
2007511201.tif 000006
【０１３８】
このような好ましい残基Ｒ５および／またはＲ６の具体例は、式（ＶＩ）のラジカルである。
【０１３９】
【化１７】
2007511201.tif 000007
【０１４０】
具体的態様によれば、本発明は、式（Ｉａ）のインドール誘導体、（ここで、
Ｒ1、Ｒ3およびＲ6は上記のとおりである）、およびその光学異性体、生理学的に許容される塩およびプロドラッグに関する。
【０１４１】
【化１８】
2007511201.tif 000008
【０１４２】
本発明の好ましいインドール誘導体は、式（１５）を有し、ここで、ａａ、ｎおよびｍは、上記のとおりである。
【０１４３】
【化１９】
2007511201.tif 000009
【０１４４】
本発明のさらに好ましいインドール誘導体は、式（１４）を有する。
【０１４５】
【化２０】
2007511201.tif 000010
【０１４６】
本発明のさらに好ましいインドール誘導体は、式（１２）を有する。
【０１４７】
【化２１】
2007511201.tif 000011
【０１４８】
本発明のさらに好ましいインドール誘導体は、式（７）を有する。
【０１４９】
【化２２】
2007511201.tif 000012
【０１５０】
式（Ｉ）のインデンおよびインドール誘導体は、当業者に周知の方法によって調製できる。
【０１５１】
例えば、上記３−ヒドロキシメチルインドール化合物（７）は、（ｉ）５−ベンジルオキシインドールのＮＨ基を１、３−ジブロモプロパンによりアルキル化すること；（ｉｉ）触媒的水素添加分解によりベンジル保護基を除去すること；（ｉｉｉ）前記ヒドロキシ基を、ベンジル保護ｐ−ヒドロキシフェニルボロン酸と反応させること；（ｉｖ）前記３‘−ブロマインを２−メチルピリジンと反応させること；（ｖ）アルデヒド基をインドール核の３位に導入すること；および（ｖｉ）前記アルデヒドを水素添加分解によりヒドロキシメチル基に変換することにより得ることができる。
【０１５２】
さらに、上記３−Ｎ−アスパルチルアミノメチル−５−Ｏ−ｐ−ヒドロキシフェニル−１−Ｎ−（４−ピリジルブチル）−インドール（１２）は、（ｉ）上記工程（ｖ）からのアルデヒドをヒドロキシルアミンと反応させ、対応するオキシムにすること；（ｉｉ）前記オキシムを還元すること；（ｉｉｉ）前記アミノメチル基をＮ−アセチルアスパルチルメチルエステルと反応させること；および（ｉｖ）前記ベンチル保護基を触媒的水素添加分解により除去することにより得ることができる。
【０１５３】
さらに、上記３−Ｎ−アスパルチルアミノメチル  ５−Ｏ−ｐ−ヒドロキシフェニル−１−Ｎ−（４−ピリジルブチル）−インドールホスフェート（１４）は、ジベンチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイトを用いて化合物（１２）をリン酸化し、次に触媒的水素添加分解してベンチル保護基を除去することにより得ることができる。
【０１５４】
さらに、別のアミノ酸を、周知のペプチド化学を用いてＮ、Ｏ−保護アスパルチル基に容易に結合させることができる。この目的のため、アミノ−および／またはカルボキシ保護基は、それ自体公知の方法で除去し、適切なアミノ酸誘導体と反応させるが、それらは通常、それ自体必要に応じて保護されている。固相および溶液合成の両者を用いることができる。
【０１５５】
本発明はさらに、特に乳癌および結腸癌である癌治療方法に関連し、有効量の本文に述べたようなインドールおよびインデン誘導体のようなＡｕｒｏｒａ−Ａ修飾剤を投与すること、好ましくは、本発明のコンピュータプロセスで同定した拮抗剤または部分拮抗剤を投与することを含む。
【０１５６】
本発明の化合物は、したがって、Ａｕｒｏｒａ−ＡとＴＰＸ２との相互作用が疾患の形成または進行に関与している疾患の治療に適している。特に、本発明の化合物は、癌治療に使用できる。
【０１５７】
本発明の化合物は、それぞれの治療有効化合物としてまたは他の治療有効化合物との混合物として投与することができる：それらは、それ自体で投与できるが、通常、それらは、薬剤組成物の形状で、すなわち有効化合物と薬学的に許容される賦形剤、特に賦形剤または希釈剤および／または添加物との混合物として投与される。前記化合物または組成物は、例えば経口的にまたは直腸的に腸経由で、または例えば、皮下、静脈内または筋肉内のように非経口で投与できる。
【０１５８】
前記薬剤組成物の性質および薬剤担体または希釈剤の性質は、希望の投与方法に依存する。経口組成物は、例えば、錠剤またはカプセルとして存在でき、結合剤（例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、トラガントまたはポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば、乳糖、砂糖、トウモロコシでんぷん、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン）、滑択剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、でんぷん）または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような通常の賦形剤を含むことができる。経口液体処方は、水性または油性懸濁剤、溶液、乳剤、シロップ、エレキシルまたはスプレー等として存在でき、または、水または別の適切な担体により再構成するための乾燥粉末として存在できる。このタイプの液体処方は、例えば、懸濁剤、芳香剤、希釈剤または乳化剤のような通常の添加物を含むことができる。非経口投与のため、通常の薬剤担体を有する溶液または懸濁剤を使用できる。
【０１５９】
下記の実施例は本発明を例示するためであり、それを限定するものとみなしてはならない。
【実施例】
【０１６０】
実験操作
タンパク質および抗体調製
Ａｕｒｏｒａ△ＮをｐＥＴＭ１１（残基１２２−４０３、野生型およびＤ２７４Ｎ）にクローニングし、ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  ＲＩＬ  Ｅ．Ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で発現させ、ＴＡＬＯＮレジン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により製造業者の指示書を用いて精製した。Ａｕｒｏｒａ△ＮをＴＥＶプロテアーゼで処理してＨｉｓタグを除去後、ＴＡＬＯＮカラムを通しＴＥＶを除去し、次にサイズ排除クロマトグラフィで均質になるまで精製した。ヒトおよびＸｅｎｏｐｕｓ  ＧＳＴ  ＴＰＸ２断片をＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた。ＴＰＸ２タンパク質は、グルタチオンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製した。Ａｕｒｏｒａ△Ｎ−ＴＰＸ２複合体を形成させるため、ＧＳＴ  ＴＰＸ２を発現するＥ．ｃｏｌｉの細胞溶解物を、グルタチオンセファロースカラムを通し、洗浄後、精製Ａｕｒｏｒａ△Ｎを同一カラムに通した。カラムレジンをＴＥＶプロテアーゼとインキュベーションし、前記複合体を溶出させ、さらに、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。
【０１６１】
全長ＴＰＸ２に対するポリクローナル抗体を、細菌発現ＧＳＴ  ＴＰＸ２（Ｗｉｔｔｍａｎｎら、２０００）によりウサギで産生させ、アフィニティにより精製した。１Ｃ１モノクローナル抗Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ａｕｒｏｒａ−Ａは、Ｇｉｅｔ  Ｒ，Ｕｚｂｅｋｏｖ，Ｒ，Ｃｕｂｉｚｏｌｌｅｓ  Ｆ，Ｌｅ  Ｇｕｅｌｌｅｃ  Ｋ，Ｐｒｉｇｅｎｔ  Ｃ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４，１５００５−１３に記載されている。前記ポリクローナル抗ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａは、細菌発現全長ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａをウサギに静注して得た。
【０１６２】
ＨｅＬａ細胞抽出物およびＸｅｎｏｐｕｓ卵抽出物調製
ＨｅＬａ細胞（ＣＣＬ２；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、モディファイド・イーグル培地中１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンにより３７℃および５％ＣＯ2で増殖させた。細胞を、記載されているように（Ｓｔｅｉｎ、１９９４）ダブルチミジン（２ｍＭ）ブロックを用いてＳ期で停止させ、チミジンを洗浄除去してＳ期から解放させた。１０時間後、細胞をトリプシン化し、氷冷した溶解緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｏｒｉｔｏｎ、プロテアーゼ阻害剤）中で１０分間インキュベーションし、１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。Ｘｅｎｏｐｕｓ細胞分裂抑制因子停止抽出物（ＣＳＦ抽出物）は、記載のように（Ｍｕｒｒａｙ，１９９１）調製した。
【０１６３】
インビトロキナーゼアッセイ
４μＭの全長ＴＰＸ２、ＴＰＸ２（１−４３）またはＴＰＸ２（１５−４３）を、全長Ａｕｒｏｒａ−ＡまたはＡｕｒｏｒａ△Ｎと、γ32Ｐ−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）含有キナーゼ緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０μＭ  ＡＴＰ）中でヒストンＨ３（０．２ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ）存在下または非存在下、２５℃で１５分間インキュベーションした。切断のため、ＧＳＴ  ＴＰＸ２（１−４３）をＴＥＶと４℃で１６−１８時間インキュベーションするか（図２Ｃ）またはキナーゼ反応後ＴＥＶを添加し３０℃で１０分間インキュベーションした（図１Ｄ）。図２Ｄにおいて、Ａｕｒｏｒａ△Ｎ（８μＭ）を、ヒストンＨ３とγ32Ｐ−ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液中で１５分間、２５℃でインキュベーションした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、リン酸化ヒストンＨ３とＴＰＸ２タンパク質をオートラジオグラフィーによって検出した。
【０１６４】
ホスファターゼアッセイ
活性ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（２μＭ）を、ＴＰＸ２、ＴＰＸ２（１−４３）またはＴＰＸ２（１５−４３）（３μＭ）と１０分間、４℃でインキュベーションした。サンプルを、ホスファターゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ2、５ｍＭ  カフェイン、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈し、ＰＰ１（αアイソフォーム、ＮＥＢ）の不存在下または存在下、３０℃で０．５時間インキュベーションした。その後、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗Ａｕｒｏｒａ−Ａまたは抗リン酸化−Ａｕｒｏｒａ−Ａ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、１：１００００希釈）によりウェスタンブロッティングで解析した。
【０１６５】
免疫沈降
ビーズを抗−ＧＳＴで被覆するため、抗体６μｇをプロテイン−Ａ結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ２８０（Ｄｙｎａｌ）２０μｌとともに総量１００μｌのＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で少なくとも１時間、４℃でインキュベーションした。前記ビーズを２回ＰＢＳ−Ｔで洗浄しさらに２回、ＨｅＬａ細胞溶解緩衝液またはＣＳＦ−ＸＢ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．７、５０ｍＭショ糖、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2および５ｍＭ  ＥＧＴＡ）で洗浄した。抽出物５０μｌをＧＳＴ、ＧＳＴ  ＴＰＸ２  １−４３、ＧＳＴ  ＴＰＸ２  １５−４３、ＧＳＴ  ＴＰＸ２  ＸｅｎｏｐｕｓまたはＧＳＴ  ＴＰＸ２（１−３９）Ｘｅｎｏｐｕｓ  タンパク質（最終濃度：２５０ｎＭ  Ｘｅｎｏｐｕｓ；１μＭ  ＨｅＬａ）とＲａｎＱ６９Ｌ−ＧＴＰ（１６μｍ）不存在下または存在下で１５分間、２０℃でインキュベーションし、次に、前記ビーズに添加した。氷上で１時間インキュベーションした後、前記ビーズを２回、溶解緩衝液すなわちＣＳＦ−ＸＢで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔで二回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で沸騰させた。サンプルを次にゲル電気泳動にかけ、抗−ＧＳＴ、抗−Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＴＰＸ２、抗−Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ａｕｒｏｒａ−Ａまたは抗ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａによりウェスタンブロッティングにより解析した。
【０１６６】
インビトロプルダウンアッセイ
ＧＳＴまたはＧＳＴ  ＴＰＸ２（１−４３）（２４０μｇ）を、結合緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍＭ  ＤＴＴ）１ｍｌ中のグルタチオンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１００μｌに０．５時間結合させた。ビーズを３回洗浄し、結合緩衝液１ｍｌで４つの等量部分に分割し、全長ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｕｒｏｒａ△ＮまたはＡｕｒｏｒａ△Ｎ（Ｄ２７４Ｎ）３５μｇを添加した。４℃で０．５時間結合させた後、レジンを４回洗浄し、次に一晩結合緩衝液５０μｌ＋ＴＥＶプロテアーゼ２μｇ中でインキュベーションした。それぞれからの上清１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＴＥＶ切断が、Ａｕｒｏｒａ△ＮとＧＳＴ  ＴＰＸ１−４３がＳＤＳ−ＰＡＧＥで共泳動するために必要であった。
【０１６７】
結晶学的方法
ＴＰＸ２  １−４３と複合体となっているＡｕｒｏｒａ△Ｎの針状結晶は厚みが約１０μｍであり、１８℃で、１８％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５、２００ｍＭ  ＭｇＳＯ4をウェル緩衝液としてならびに２ｍＭ  ＡＴＰγＳおよび０．２ｍＭ  ＭｇＳＯ4と前混合した複合体２０ｍｇ／ｍｌ、および２０％ＰＥＧ８０００、１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５、２００ｍＭ  ＭｇＳＯ4の１：１混合物を含むハンギングドロップを用いて蒸気拡散により成長させた。凍結保護のため、ドロップ緩衝液に１７．５％（ｖ／ｖ）グリセロールを添加した。すべての方向で約５０μｍの野生型Ａｕｒｏｒａ△Ｎキナーゼ単独の六方晶系プリズム結晶を、２０％ＰＥＧ３００、５％ＰＥＧ８０００、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ８．５、１０％グリセロールをウェル緩衝液としておよびウェル緩衝液と２ｍＭ  ＡＴＰγＳおよび２ｍＭ  ＭｇＳＯ4でプレインキュベーションしたタンパク質９ｍｇ／ｍｌの１：１混合物を含むシッティングドロップを用いて、蒸気拡散により成長させた。回折データを１００Ｋで得て、プログラムのＣＣＰ４スート（ＣＣＰ４、１９９４）を用いて処理した。構造は、ＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒら、１９９８）を用いる分子置換と初期モデルとしてのｃＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（Ｍａｓｈｈｏｏｎら、２００１）の座標により、解明した。ＣＮＳは改良のために使用し、Ｏ（Ｊｏｎｅｓら、１９９１）はモデル構築のために使用した。データ採取と改良のための統計を、表１に示した。構造図面は、ＰｙＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ、２００２）を用いて作成した。座標と構造因子は、リン酸化Ａｕｒｏｒａ△Ｎ単独およびＴＰＸ２（１−４３）との複合体のそれぞれについて、アクセッションコード１ｏｌ７および１ｏｌ５としてＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに寄託した。
【０１６８】
Ａｕｒｏｒａ−Ａの結合と活性化に十分なＴＰＸ２の最小ドメインマッピング
Ａｕｒｏｒａ−Ａとの相互作用に十分なＴＰＸ２の最小ドメインをマッピングした。ＴＰＸ２のＡｕｒｏｒａ−Ａ結合ドメインは、そのＮ末端残基１５０個内部にある。ＴＰＸ２の配列アライメントを検討し、この領域の３分の１のみが種にかかわらず保存されていることが明らかになった（ヒトＴＰＸ２では残基１−４３、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＴＰＸ２では１−３９）。この断片は、全長タンパク質としてＸｅｎｏｐｕｓ卵抽出物からＡｕｒｏｒａ−Ａを同程度に共免疫沈降できる（図１Ａ、それぞれレーン６と４）。前記の卵抽出物中において、Ａｕｒｏｒａ−ＡへのＴＰＸ２の効率的結合には、ＲａｎがそのＧＴＰ結合形状にロックされることが必要（ＲａｎＱ６９Ｌ）で、それは、ｉｍｐｏｒｔｉｎα／βとの複合体からＴＰＸ２を放出する。Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＴＰＸ２（１−３９）は、ＲａｎＧＴＰに依存しない方法でＡｕｒｏｒａ−Ａを結合し（図１Ａ、レーン５と６）、Ｒａｎ制御ＴＰＸ２部分をそれが有していないことと一致している。ヒトＴＰＸ２（残基１−４３）の対応する断片は、ＨｅＬａ抽出物中におけるプルダウン実験を用いてＡｕｒｏｒａ−Ａと相互作用でき、一方、残基１５−４３を含む短い構築体はそれができない（図１Ｂ、それぞれレーン２と３）。
【０１６９】
ヒトＴＰＸ２（１−４３）の最小Ａｕｒｏｒａ−Ａ結合ドメインは、十分にこのキナーゼの活性をインビトロで刺激できる（図１Ｃ）。Ａｕｒｏｒａ−Ａ基質であるヒストンＨ３のリン酸化は、ＴＰＸ２（１−４３）を添加すると顕著に増加する（図１Ｃでは、レーン３とレーン１を比較）が、より短いＴＰＸ２（１５−４３）ではそうではない（レーン４）。全長ＴＰＸ２は、また、前記キナーゼの活性を増大させるが、前記断片ほど有効ではない。全長ＴＰＸ２は、完全活性化のために微小管のような他の因子を必要としているのかもしれない。微小管はＡｕｒｏｒａ−ＡのＴＰＸ２活性化を刺激するが、微小管を結合しないＴＰＸ２  １−４３については全く増大が検出されていない。全長ＴＰＸ２は、それ自体がＡｕｒｏｒａ−Ａの基質である。ＧＳＴ融合ＴＰＸ２（１−４３）で観察したリン酸化（図１Ｃ、レーン３）は、前記インビトロ反応の非特異的アーチファクトであるようであり、その理由は、当該融合タンパク質が切断されると、リン酸化シグナルがＧＳＴ上で検出されるからである（レーン２）。さらに、質量分析では、全長ＴＰＸ２中でのＡｕｒｏｒａ−Ａリン酸化部位が明らかにならない。
【０１７０】
ＴＰＸ２（１−４３）が存在すると、Ａｕｒｏｒａ−Ａは脱活性化脱リン酸化から保護される（図１Ｅ）。ＴＰＸ２が存在しないと、Ａｕｒｏｒａ−Ａは、ホスファターゼＰＰ１（レーン１と２）により完全に脱リン酸化される。全長ＴＰＸ２の存在下、ＰＰ１処理によりＡｕｒｏｒａ−Ａのほとんどの部位が脱リン酸化される（上段のレーン３と４）が、Ｔｈｒ２８８AURの脱リン酸化が阻害される（下段のレーン４、矢印）。より強い保護効果が、ＴＰＸ２（１−４３）添加により観察される（レーン６）。ＴＰＸ２  １５−４３の存在下、Ａｕｒｏｒａ−Ａは、ＴＰＸ２が全く存在しないときと同様に完全に脱リン酸化され（レーン８と２）、このことは、前記の短い断片がＡｕｒｏｒａ−Ａを結合できないことと一致している（図１Ｂ）。したがって、ヒトＴＰＸ２の残基１−４３は、Ａｕｒｏｒａ−Ａ結合、活性化および脱リン酸化保護に必要かつ十分である。
【０１７１】
ＴＰＸ２結合Ａｕｒｏｒａ−Ａの全体構造
結晶化目的のため、Ａｕｒｏｒａ−ＡとＴＰＸ２の最小の機能的複合体に注目した。Ａｕｒｏｒａ−ＡのＮ末端は、種にわたって全体としてはあまりよく保存されておらず、ＴＰＸ２結合に必要ではない。Ｎ末端（残基１２２−４０３、Ａｕｒｏｒａ△Ｎ）を有していないＡｕｒｏｒａ−Ａ断片は、全長キナーゼと同等に効率的に、ＴＰＸ２（１−４３）の活性断片と相互作用する（図２Ａレーン５と４）。両者の断片はともに高度に保存されており（図２Ｄ、２Ｅ）、実際に、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＴＰＸ２（１−３９）は、ヒトＡｕｒｏｒａ△Ｎに結合できる。Ａｕｒｏｒａ△Ｎは、リン酸化特異的抗体によって検出されたように、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現するとリン酸化される（図２Ｂ、レーン１）。このことは、重要な触媒残基Ａｓｐ２７４AURをＡｓｎに変異させた変異体を発現させると全くリン酸化が検出できないので、細菌キナーゼの活性によるというよりもＡｕｒｏｒａ−Ａ自動リン酸化によるらしい（図２Ｂ、レーン２）。非リン酸化変異体は触媒的に不活性であるが、ＴＰＸ２結合活性を保持している（図２Ａ、レーン６）。Ａｕｒｏｒａ△Ｎは、ＴＰＸ２（１−４３）により活性化される（図２Ｃ、レーン２、３）。
【０１７２】
ヒトリン酸化Ａｕｒｏｒａ△ＮとＴＰＸ２（１−４３）の間の複合体は、ヒストンＨ３リン酸化において活性である（図２Ｃ、レーン７）。前記複合体をＭｇ2+イオンとＡＴＰアナログＡＴＰγＳ存在下で結晶化させた。構造を分子置換により決定し、２．５オングストローム分解能データを用いてそれをＲｆｒｅｅ２５．２％まで改良した（表１参照）。ポリペプチドモデルには、キナーゼの触媒コア（残基１２３−３８７AUR）とＴＰＸ２の２個のセグメント（残基７−２１TPXおよび３０−４３TPX）が含まれている。秩序だった電子密度はＴＰＸ２の８個の介在残基（２２−２９TPX）について存在しておらず、したがって、モデル化されていない。
【０１７３】
キナーゼ触媒コアは、全体としてニ葉の構造を有している（図３Ａ、Ｂ）。簡単に述べると、Ｎ末端ローブ（残基１２３−２１０）は、顕著なヘリックスαＣを含めてβシートと２個のα−ヘリックスから構成されており、一方、Ｃ末端でより大きなローブ（残基２１７−３８７）は、ほとんどがα−ヘリックスである。活性部位は、前記ローブ間の界面に存在しており、ＡＴＰ結合部位、触媒塩基（Ａｓｐ２５６AUR）およびキナーゼ活性化セグメント（残基２７４−２９９AUR）を含む。非リン酸化Ａｕｒｏｒａ−Ａ構造と対照的に、該活性化セグメントは、電子密度が非常に秩序だっており、２個のリン酸化スレオニン残基（Ｔｈｒ２８７AURとＴｈｒ２８８AUR）を含んでいる。結晶は、ＡＴＰ−γＳの存在下において形成されるが、ヌクレオチドのための電子密度は、２個の整列したホスフェートを有するアデノシンのみを明らかにし、ＡＤＰとしてモデル化されている。
【０１７４】
Ａｕｒｏｒａ−Ａ上の２個の部位におけるＴＰＸ２の特異的認識
ＴＰＸ２は、キナーゼ上の２個の明瞭な部位で認識される２個の分離したストレッチによりＡｕｒｏｒａ−Ａに結合する。上流ストレッチ（残基７−２１TPX）は、Ａｕｒｏｒａ−ＡのＮ末端ローブで結合する（図３Ａ、Ｂ）。下流ストレッチ（残基３０−４３TPX）は、ＮおよびＣ末端ローブの間でαヘリックス立体構造で結合する（図３Ａ、Ｂ）。ＴＰＸ２のこの２個のＡｕｒｏｒａ−Ａ結合モチーフが、種により長さと配列が変化する可塑性性リンカーにより連結されているようである（図２Ｄ）。さらに、２個のストレッチが、Ａｓｐ１１TPXとＴｒｐ３４TPXの間の分子内水素結合により連結されている。
【０１７５】
ＴＰＸ２の上流ストレッチはほとんど伸張した立体構造を有しており、中央のｋｉｎｋはプロリン残基（Ｐｒｏ１３TPX）で誘発される（詳細については、図３Ｃを参照）。保存セグメント8ＹＳＹＤＡＰＳ14（図２Ｄ）は、主鎖と側鎖のＡｕｒｏｒａ−Ａとの広域の相互作用に関与している。特に、Ｔｙｒ８TPX、Ｔｙｒ１０TPXおよびＡｌａ１２TPXは、βシート、ヘリックスαＢおよびヘリックスαＣの間の疎水性溝中で緊密に寄り添っている。隣接する疎水性溝は、Ｐｈｅ１６TPXからＰｈｅ１９TPXまでの残基のＴＰＸ２側鎖を収容している。Ａｕｒｏｒａ−Ａ触媒コアのＮ末端残基はこの界面に重要な寄与をしており、特に、Ａｒｇ１２６TPXは、Ｐｈｅ１６TPXとカチオン−πインタラクションを形成する。
【０１７６】
ＴＰＸ２の下流ヘリカルストレッチは、ヘリックスαＣおよびＡｕｒｏｒａ−Ａの活性化セグメントの両者と相互作用し、それらを架橋させる（詳細については、図３Ｄを参照）。最も顕著であるのは、２個の保存芳香族残基（Ｔｒｐ３４TPXとＰｈｅ３５TPX）が、Ｈｉｓ１８７AURおよびＨｉｓ２８０AURと相互作用し、Ａｌａ３９TPXがさらに、Ｐｒｏ２８２AURの活性化セグメントと接触していることである。前記キナーゼに接触しているＴＰＸ２ヘリックスの側面は疎水性かつ保存された残基で覆われているが、溶媒に暴露している反対側は、親水性でかつさまざまな残基を含む。ヘリックス末端の残基４０−４３TPXは長い立体構造を取り、結晶格子内部で対称関連Ａｕｒｏｒａ−Ａ分子との接触に関与している。
【０１７７】
ＴＰＸ２は有糸分裂抽出物中でリン酸化され、リン酸化によって十分に制御されている。ＴＰＸ２が最初の４３個の残基でリン酸化されたにしても、結晶構造を調べたところＡｕｒｏｒａ−ＡとＴＰＸ２の相互作用がこのように制御されている可能性はなく、その理由は、保存されたセリン残基の全てが、溶媒の方を向いているためである。
【０１７８】
リン酸化Ａｕｒｏｒａ−Ａは、ＴＰＸ２に結合した時に活性立体構造である
他のキナーゼ構造と比較し、リン酸化ＴＰＸ２結合Ａｕｒｏｒａ−Ａが、活性立体構造におけるキナーゼの立体構造に非常によく適合することが明らかとなっている。ＤＡＬＩプログラム（ＨｏｌｍおよびＳａｎｄｅｒ、１９９３）を用いて、それが、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼに特に類似していることがわかった（ＰＤＢコード１ＹＤＳ、１．３オングストロームｒ．ｍ．ｓ．ｄ．，２５７の構造的に等価の残基）。構造比較により、活性部位にある全ての保存残基が触媒作用のために正しく配向していることが明らかとなっている（図４Ａ）。これらには、触媒作用のためにホスファターゼを配置する正電荷残基（Ｌｙｓ１６２AUR、Ｌｙｓ７２cAPKに等価）、ヌクレオチドに対して結合マグネシウムイオンを配位させる負電荷残基（Ａｓｐ２７４AUR、Ａｓｐ１８４cAPKに等価）および触媒塩基（Ａｓｐ２５６AUR、Ａｓｐ１６６cAPKに等価）が含まれ、その役割は、ＡＴＰのγ−リン酸を基質セリンまたはスレオニン残基の水酸基に移動させることである。
【０１７９】
ＴＰＸ２結合Ａｕｒｏｒａ−Ａのリン酸化活性化セグメントは、活性Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼに典型的な立体構造にある。活性ｃＡＰＫの立体構造を実質的に重ね合わせることができ（図４Ａ）、残基２７４−２９９AURと１８４−２０８cAPKのＣα原子の間は０．８オングストロームのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．である。ｃＡＰＫにおいて、リン酸化Ｔｈｒ１９７cAPKはＡｒｇ１６５cAPKと相互作用し、かつ、塩基性表面パッチ（Ｈｉｓ８７cAPKおよびＬｙｓ１８９cAPK）と相互作用し、前の触媒性残基（Ａｓｐ１６６cAPK）に影響を及ぼす。Ａｕｒｏｒａ−Ａにおいて、Ｔｈｒ２８８AURのホスホリル部分は同一構造位置にあり、対応するＡｒｇ２５５AURと相互作用し、かつ同一ではないが同様の塩基性パッチ（Ａｒｇ１８０AURとＡｒｇ２８６AUR）と相互作用し、触媒性残基（Ａｓｐ２５６AUR）をヘリックスαＣに対しておよび活性化セグメントに対して連結させる。Ｔｈｒ２８８AURがＡｓｐに変異すると、脱リン酸化野生型Ａｕｒｏｒａ−Ａよりも活性の高いタンパク質を生ずるが、リン酸化野生型キナーゼよりは活性がはるかに低い。この変異は、したがって、Ｔｈｒ２８８AURにおけるリン酸化を模倣したものに過ぎず、Ｇｌｕは基質結合場を提供するよりはむしろより緊密に基質結合部位を近接させることにより、より高い効果を潜在的に生ずることができる。リン酸化Ｔｈｒ２８８AURはＴＰＸ２と全く直接的結合を有しておらず、ホスフェート部分は、最も近いＴＰＸ２原子から１４オングストロームである。にもかかわらず、ＴＰＸ２は、活性立体構造を取るために必要なホスホリル部分を１０オングストロームだけ移動させる（図４Ｂ）。
【０１８０】
ＴＰＸ２のらせん状ストレッチは、Ｈｉｓ２８０AURとＰｒｏ２８２AURにおいて活性化セグメントに接触し、そのことは、立体構造変化の重要点であるようである（図４Ｂ、４Ｃ）。本質的には、Ｈｉｓ２８０AUR周りの回転がＴＰＸ２に対してＰｒｏ２８２AURとＳｅｒ２８３AURを揺動させ、活性化セグメントの下流残基を引っ張り、キナーゼコアによりさらに緊密に充填されるようにする（図４Ｂ）。このレバーアーム様メカニズムにおいて、枢着部（Ｈｉｓ２８０AUR、Ｐｒｏ２８２AUR）における小さな変化が、前記アーム中で大きな動きを生ずる（Ｐ−Ｔｈｒ２８８AUR図４Ｃ）。未結合形態では活性化セグメントはむしろ移動性であり、おそらく十分な立体構造自由性を有し基質存在下で活性立体構造を取る（基本的キナーゼ活性、図１Ｃ、レーン１）一方で、ＴＰＸ２結合形態では、この活性立体構造は基質結合および触媒作用の準備ができている（キナーゼ活性増大、図１Ｃ、レーン２と３）。結晶中で隣接するＴＰＸ２分子から突き出ているＣ末端残基（４０−４３TPX）は、真の基質に対して反対の主鎖方向にあるにもかかわらず活性化セグメントに結合する。基質結合単独では、溶液中Ａｕｒｏｒａ−Ａを完全に活性化せず（図１Ｃ）、したがって、この基質様接触が結晶構造中の活性立体構造に関与している可能性は極めて少ない。しかし、基質結合は、おそらく、特にＴＰＸ２不存在下において活性立体構造の誘発に関与しているのであろう。
【０１８１】
Ａｕｒｏｒａ−Ａ活性の増強に加えて、ＴＰＸ２はまた、ホスファターゼによる脱リン酸化から前記キナーゼを保護している。Ａｕｒｏｒａ−Ａ上でのＰＰ１結合部位をＣ末端に対してマッピングし、これは、ＴＰＸ２結合部位から離れておりかつ構造的に制御剤結合に影響を受けない領域である。したがって、ＴＰＸ２は、ホスファターゼ結合を防止することにより脱リン酸化からＡｕｒｏｒａ−Ａを保護することはありえない。実際、ＴＰＸ２存在下においても、ホスファターゼは、Ｔｈｒ２８８AURを例外としてほとんどの側鎖からホスフェートを除去できる（図１Ｅ）。ＴＰＸ２は、溶媒暴露位置から埋め込み位置までホスフェート部分を移動させることによりＴｈｒ２８８AUR脱リン酸化を防止し、それには、入ってくるホスファターゼがアクセスできない。前記キナーゼ触媒性コア中の他のリン酸化スレオニンであるＴｈｒ２８７AURは、溶媒に顕著に曝露され、さらにＴｈｒ２８８AURをマスキングするためのおとりとして作用できるのであろう（図３Ｂ）。
【０１８２】
【表１】
2007511201.tif 000013
【０１８３】
a. 自由Rfactorは、無作為に振り分けたデータの5%を用いてコンピュータ計算した（Brunger、1992）。
b. Ser226AURはループ中に留まり、立体構造は、良好な電子密度によって支えられている。
【０１８４】
［式（Ｉ）のインドール化合物の合成］
（３−ヒドロキシメチル−５−Ｏ−ｐ−ヒドロキシフェニル−１−Ｎ−（４−ピリジルブチル）−インドール（７）の合成）
下記のスキーム１に概略を示したように、合成は、５−ベンチルオキシインドール（１）から出発した。（１）のアミノ基を１，３−ジブロモプロパンでアルキル化することは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でＮａＨ存在下で行い、３’−ブロモプロピル化合物（２）を得た。パラジウム炭素（１０％）存在下、触媒で水素添加分解を行い、ベンチル保護基を定量的に除去した。生成した化合物（３）をそのヒドロキシル基のところで、ベンチル−保護ｐ−ヒドロキシフェニルボロン酸によりジクロロメタン（ＤＣＭ）中有機塩基酢酸銅（ＩＩ）と分子ふるい（４オングストローム）存在下、４０℃でアルキル化した。テトラハイドロフラン（ＴＨＦ）中リチウムジエチルアミド（ＬＤＡ）存在下、−７８℃でその臭素を２−メチルピリジンと置換することによって、生成した５−Ｏ−フェニルインドール化合物（４）をさらに化合物（５）にアルキル化した。インドール環にさらに多くの官能基を付加するため、（５）をＤＭＦとホスホリルクロリド（ＰＯＣｌ3）と反応させ、アルデヒド（６）を得た。エチル酢酸中パラジウム−触媒水素添加分解により、定量的収率で標的化合物（７）を得た。全ての化合物を、1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲと質量分析により特性解析した。
【０１８５】
スキーム１：３−ヒドロキシメチルインドール化合物７の合成  
【０１８６】
【化２３】
2007511201.tif 000014
【０１８７】
３−Ｎ−アスパラチルアミノメチル−５−Ｏ−ｐ−ヒドロキシフェニル−１−Ｎ−（４−ピリジルブチル）−インドール（１２）の合成
下記のスキーム２に概略を示したように、上記化合物（５）をＤＭＦ／ＰＯＣｌ3中でＶｉｌｓｍｅｙｅｒホルミル化に供し、アルデヒド（８）を得た。後者を、分子ふるい存在下ＤＣＭ中ヒドロキシルアミンと反応させ、オキシム（９）を得た。このオキシムを、酢酸中で銅により還元した。生成したアミノメチル化合物（１０）は非常に不安定で、単離できなかった。代わりに、粗混合物を直接Ｎ−アセチルアスパラチルメチルエステルと標準的ペプチド合成条件下（ジイソプロピルカルボジイミド、ジイソプロピルエチルアミン、ＤＣＭ）で反応させた。アスパラチルアミノメチルインドール化合物（１１）を水素ドナーとしてのアンモニウムホルメートと水素添加分解条件（炭素パラジウム１０％、エタノール）に供した。生成したヒドロキシフェニル化合物（１２）を良好な収率で単離した。全ての化合物は、1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲならびに質量分析で特性解析した。（１２）についての選択データ：ＭＳ（ＥＳＩ  ｐｏｓ．ｍｏｄｅ）：５８１．２〔Ｍ＋Ｎａ+〕。
【０１８８】
スキーム２：３−Ｎ−アスパラチルアミノメチル  ５−Ｏ−ｐ−ヒドロキシフェニル  １−Ｎ−（４−ピリジルブチル）−インドール化合物１２の合成
【０１８９】
【化２４】
2007511201.tif 000015
【０１９０】
［３−Ｎ−アスパラチルアミノメチル−５−Ｏ−ｐ−ヒドロキシフェニル−１−Ｎ−（４−ピリジルブチル）−インドールホスフェート（１４）の合成］
下記のスキーム３に概略を示したように、上記化合物（１２）を、アセトニトリル中ジシアノトリアゾール存在下ジベンチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイトを用いて、１２時間攪拌しながら標準的リン（ＩＩＩ）化学によりリン酸化した。この混合物を−３０℃までその後冷却し、ｔ−ブチルペルオキシヒドロキシドを添加した。生成したリン酸トリエステル（１３）を分離用逆相クロマトグラフィーで精製した。パラジウム−触媒水素添加分解は、未保護３−Ｎ−アスパラチルアミノメチル−５−Ｏ−ｐ−ヒドロキシフェニル−１−Ｎ−（４−ピリジルブチル）−インドールホスフェート（１４）を定量的に産生した。全ての化合物は、1Ｈ−、31Ｐ−および13Ｃ−ＮＭＲならびに質量分析で特性解析した。（１４）についての選択データ：31Ｐ−ＮＭＲ：σ＝−２．１７ｐｐｍ。ＭＳ（ＥＳＩ  ｐｏｓ．ｍｏｄｅ）：６３９．０〔Ｍ＋Ｈ+〕。
【０１９１】
スキーム３：３−Ｎ−アスパラチルアミノメチル  ５−Ｏ−ｐ−ヒドロキシフェニル  １−Ｎ−（４−ピリジルブチル）−インドール化合物の対応するホスフェートエステル（１４）へのリン酸化
【０１９２】
【化２５】
2007511201.tif 000016
【０１９３】
［本発明の化合物によるＡｕｒｏｒａ  Ａの阻害決定］
化合物（７）および（１２）のＡｕｒｏｒａ  Ａ阻害能力を、キナーゼ適用のために化学発光ＡＴＰ検出アッセイシステムで試験した。簡単に述べると、本発明の化合物をＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｎＭ  Ａｕｒｏｒａ＋／−ＴＰＸ２、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０；０．１％ＢＳＡ；１００μＭ  Ｋｅｍｐｔｉｄｅ〔Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ〕）；最終アッセイ濃度）中Ａｕｒｏｒａ  Ａ溶液に添加した。ＡＴＰ溶液（最終濃度２０μＭ）の添加により反応が開始した。反応を室温で２０分間実施し、等量のＥａｓｙＬｉｔｅ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）添加した後、Ｗａｌｌａｃ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で化学発光をモニタリングして、停止させた。ＥａｓｙＬｉｔｅ−ＫｉｎａｓｅRは、キナーゼ活性評価用ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼに基づくＡＴＰモニタリングシステムである。キナーゼ反応中のＡＴＰ消費に本システムは依存しており、市販されている。
【０１９４】
下記の表からわかるように、化合物（７）および（１２）はともに、Ａｕｒｏｒａを有意に阻害した（が、プロテインキナーゼＡ、ＰＫＡは阻害しなかった）。
【０１９５】
【表２】
2007511201.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】（Ａ）ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）（レーン１および２）、ＧＳＴ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＴＰＸ２（レーン３と４）またはＧＳＴ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＴＰＸ２（１−３９）（レーン５と６）の抗Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＴＰＸ２ウェスタンブロット（上パネル）および抗Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ａｕｒｏｒａ−Ａウェスタンブロット（下パネル）で、これらのタンパク質は、ＲａｎＱ６９Ｌ−ＧＴＰ存在下または不存在下、Ｘｅｎｏｐｕｓ細胞分裂抑制因子（ＣＳＦ）停止抽出物中でインキュベーションしＧＳＴ抗体塗布ビーズと免疫沈降させた；（Ｂ）ＧＳＴ（レーン１）、ＧＳＴ  ＴＰＸ２（１−４３）（レーン２）またはＧＳＴ  ＴＰＸ２（１５−４３）（レーン３）タンパク質の抗ＧＳＴウェスタンブロット（上パネル）および抗ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａウェスタンブロット（下パネル）で、タンパク質は、有糸分裂ＨｅＬａ細胞抽出物中でインキュベーションしＧＳＴ抗体塗布ビーズと免疫沈降させた；（Ｃ）全長ＴＰＸ２、ＧＳＴ  ＴＰＸ２（１−４３）またはＧＳＴ  ＴＰＸ２（１５−４３）（それぞれ、２、３および４）の存在下、ヒトＡｕｒｏｒａ−ＡによるヒストンＨ３のインビトロリン酸化（γ32Ｐ−ＡＴＰ）後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（左パネル）および対応するクーマシー染色ゲル（右パネル）のオートラジオグラフィー；（Ｄ）Ａｕｒｏｒａ−ＡによるＴＰＸ２（１−４３）のインビトロリン酸化（γ32Ｐ−ＡＴＰ）（レーン１）後、ＴＥＶ切断（レーン２）したＧＳＴ中リン酸化シグナルの多く；（Ｅ）全長ＴＰＸ２、ＧＳＴ  ＴＰＸ２（１−４３）またはＧＳＴ  ＴＰＸ２（１５−４３）の不存在または存在下、ヒトＡｕｒｏｒａ−ＡをホスファターゼＰＰ１処理後、ポリクローナル抗体（上パネル）とＴｈｒ２８８AURでリン酸化されたＡｕｒｏｒａ−Ａに特異的な抗体によりＡｕｒｏｒａ−Ａを検出した抗ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａウェスタンブロット（上パネル）および抗リン酸化Ａｕｒｏｒａ−Ａウェスタンブロット（下パネル）。
【図２】（Ａ）全長Ａｕｒｏｒａ−Ａ，Ａｕｒｏｒａ△ＮまたはＡｕｒｏｒａ△Ｎ（Ｄ２７４Ｎ）のＧＳＴ  ＴＰＸ２（１−４３）に対する結合（レーン４，５および６）およびＧＳＴに対する結合（レーン１、２および３）に関してのインビトロプルダウンアッセイ；（Ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた野生型Ａｕｒｏｒａ（△Ｎ）およびＤ２７４Ｎ変異体の抗リン酸化−Ａｕｒｏｒａ−Ａウェスタンブロット；（Ｃ）ＴＰＸ２（１−４３）（レーン１に比較してレーン２）、切断（レーン２）または非切断（レーン３）ＧＳＴ  ＴＰＸ２（１−４３）融合タンパク質存在下または不存在下におけるＡｕｒｏｒａ（△Ｎ）によるヒストンＨ３のインビトロリン酸化検出のためのオートラジオグラフ；（Ｄ）ヒト（Ｈ）、Ｘｅｎｏｐｕｓ（Ｘ）およびフグ（Ｆ）由来ＴＰＸ２  Ｎ末端ドメインの配列並び、二次構造エレメントを配列上に赤（上流伸長ストレッチ）およびピンク（下流ヘリカルストレッチ）で示し、モデル化されていない介在残基には、点線を付した；（Ｅ）ＴＰＸ２を含む３種の脊椎動物種（ヒト、Ｈ．ＡＵＲ−Ａ；Ｘｅｎｏｐｕｓ；Ｘ．ＡＵＲ−Ａ；フグ、Ｆ．ＡＵＲ−Ａ）、ＴＰＸ２を含まない２種の無脊椎動物（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ，Ｄ．ＡＵＲ−Ａ；Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃ．ＡＵＲ−Ａ）のＡｕｒｏｒａ−Ａキナーゼ触媒ドメインの配列アラインメントを、ヒトおよびＸｅｎｏｐｕｓ  Ａｕｒｏｒａ−Ｂ（Ｈ．ＡＵＲ−Ｂ；Ｘ．ＡＵＲ−Ｂ）および脊椎動物ｃＡＰＫとともに示し、Ａｕｒｏｒａ−Ａ二次構造エレメントは、前記アラインメント上にマークし、リン酸化Ｔｈｒ２８８（ヒト番号）を示し、７−２１TPXまたは３０−４３TPXと相互作用する残基は、それぞれ黒丸または白丸で示した。
【図３】ＴＰＸ２に結合したＡｕｒｏｒａ−Ａ構造のリボン形図面で、（Ａ）ヒトＡｕｒｏｒａ（Ａｕｒｏｒａ△Ｎ）の触媒ドメインおよび典型的なキナーゼ配向のＴＰＸ２のＮ末端ドメインとの複合体図で、Ａｕｒｏｒａ−ＡのＮ末端ローブにおけるＴＰＸ２結合の上流ストレッチ、および前記２個のローブ間における下流ストレッチ結合、および点線は、前記２個のＴＰＸ２ストレッチ（無秩序でモデル化されていない）を連結するリンカーのおよその経路を示す；（Ｂ）Ａｕｒｏｒａ―Ａに結合する２個のＴＰＸ２ストレッチをより明瞭に示したパネルＡの図に比べて、垂直軸の周りに１８０度回転させた後の複合体図；（Ｃ）キナーゼのＮ末端ローブに存在する疎水性表面溝で結合するＴＰＸ２（残基７−２１TPX）の上流ストレッチで、広い範囲の相互作用の詳細をＢパネルと同様に同一配向で示した；（Ｄ）ヘリックスαＣ近くでＡｕｒｏｒａ−Ａに結合するＴＰＸ２（残基３０−４３TPX）の下流ヘリカルストレッチと活性化セグメント、リン酸化−Ｔｈｒ２８８AURに近いが直接的に接触していない、相互作用の詳細をＢおよびＣパネルと同様に同一配向で示した。
【図４】ＴＰＸ２存在下および不存在下におけるリン酸化Ａｕｒｏｒａ−Ａの立体構造状態のリボン形図面で、（Ａ）ＴＰＸ２結合および未結合Ａｕｒｏｒａ−Ａの構造が、活性部位残基およびヘリックスαＣの位置で重ね合わせることができるが、残基Ｈｉｓ２８０AURおよびＬｅｕ２９３AURの間の活性部位で分かれ、一方、リン酸化−Ｔｈｒ２８８AURはＴＰＸ２結合構造中で内側に向き、キナーゼ単独構造では外側に向いていることを示したオーバーレイ；（Ｂ）ＴＰＸ２結合による立体構造変化を示し、キナーゼ単独構造（左パネル）およびＴＰＸ２結合構造（右パネル）の活性化セグメントが、パネルＡに関して約９０度回転させた図で示してあり、ＴＰＸ２結合の結果、活性化セグメントが再編成され、Ｔｈｒ２８８AURが１０オングストローム移動する；（Ｃ）ＴＰＸ２媒介Ａｕｒｏｒａ―Ａ活性化の分子機構を略図で示したもので、ＴＰＸ２上流ストレッチが前記キナーゼのＮ末端ローブを固定し、下流ストレッチ（ヘリックス）がレバー−アーム様動作を惹起する活性化セグメントを接続し、Ｈｉｓ２８０AURとＰｒｏ２８２AURにおける回転がＴｈｒ２８８AURを引っ張る。
【図５−１】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−２】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−３】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−４】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−５】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−６】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−７】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−８】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−９】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−１０】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−１１】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−１２】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−１３】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−１４】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−１５】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−１６】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−１７】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−１８】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−１９】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−２０】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−２１】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−２２】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−２３】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−２４】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−２５】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−２６】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−２７】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−２８】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−２９】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−３０】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図５−３１】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）キナーゼの構造座標（表Ａ）。
【図６−１】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−２】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−３】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−４】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−５】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−６】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−７】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−８】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−９】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−１０】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−１１】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−１２】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−１３】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−１４】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−１５】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−１６】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−１７】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−１８】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−１９】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−２０】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−２１】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−２２】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−２３】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−２４】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−２５】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−２６】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−２７】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−２８】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−２９】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−３０】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−３１】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−３２】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−３３】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−３４】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−３５】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−３６】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−３７】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図６−３８】リン酸化ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ（△Ｎ）／ＴＰＸ２（１−４３）複合体の構造座標（表Ｂ）。
【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図５−１１】
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【図５−１２】
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【図５−１３】
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【図５−１４】
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【図５−１５】
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【図５−１６】
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【図５−１７】
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【図５−１８】
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【図５−１９】
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【図５−２０】
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【図５−２１】
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【図５−２２】
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【図５−２３】
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【図５−２４】
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【図５−２５】
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【図５−２６】
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【図５−２７】
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【図５−２８】
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【図５−２９】
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【図５−３０】
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【図５−３１】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図６−１１】
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【図６−１２】
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【図６−１３】
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【図６−１４】
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【図６−１５】
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【図６−１６】
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【図６−１７】
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【図６−１８】
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【図６−１９】
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【図６−２０】
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【図６−２１】
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【図６−２２】
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【図６−２３】
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【図６−２４】
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【図６−２５】
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【図６−２６】
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【図６−２７】
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【図６−２８】
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【図６−２９】
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【図６−３０】
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【図６−３１】
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【図６−３２】
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【図６−３３】
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【図６−３４】
2007511201.tif 000093
【図６−３５】
2007511201.tif 000094
【図６−３６】
2007511201.tif 000095
【図６−３７】
2007511201.tif 000096
【図６−３８】
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【図１】
2007511201.tif 000098
【図２】
2007511201.tif 000099
【図３】
2007511201.tif 000100
【図４】
2007511201.tif 000101
【配列表】
2007511201000001.app
【国際調査報告】
2007511201.tif 000102
2007511201.tif 000103
2007511201.tif 000104
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