(57)【要約】  例えば癌のような新生物形成細胞での細胞増殖を阻害するためのＭＬＫタンパク質若しくはポリペプチドの阻害剤の使用方法が本明細書に提供される。こうした方法は癌を処置するのに使用することができ、かつ、さらに、処置を受領する個体に対する毒性の付随する低減を伴い、癌を処置するための低下された投薬量での抗癌剤の投与と共に使用しうる。ＭＬＫタンパク質若しくはポリペプチドの活性を阻害しかつＭＬＫ活性を有する新生物形成細胞の細胞増殖を阻害するための阻害剤のスクリーニング方法もまた提供される。
2007529540.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
新生物形成細胞を該新生物形成細胞中の混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）の活性を選択的に阻害する化合物と接触させて、それによりＭＬＫ活性の前記阻害が新生物形成細胞の増殖を阻害すること
を含んでなる、新生物形成細胞の増殖の阻害方法。
【請求項２】
新生物形成細胞が癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
癌細胞が、乳癌細胞、肺癌細胞、子宮頚癌細胞、膵癌細胞、膀胱癌細胞、結腸癌細胞、若しくはＲａｓ突然変異を有する癌細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物がインドロカルバゾール分子である、上記方法。
【請求項５】
インドロカルバゾール分子がＣＥＰ−１１００４若しくはＣＥＰ−１３４７である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記混合系統キナーゼが、配列番号３を含んでなるＭＬＫ１ポリペプチドである、上記方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記混合系統キナーゼが、配列番号４を含んでなるＭＬＫ２タンパク質である、上記方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記混合系統キナーゼが、配列番号１を含んでなるか若しくは配列番号２中のＭＬＫ３タンパク質である、上記方法。
【請求項９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４よりなる群から選択される配列を有する混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）の活性を選択的に阻害する化合物と新生物形成細胞を接触させること、
を含んでなり、
ＭＬＫ活性の前記阻害が新生物形成細胞の増殖を阻害する、
新生物形成細胞の増殖の阻害方法。
【請求項１０】
新生物形成細胞が、乳癌細胞、肺癌細胞、子宮頚癌細胞、膵癌細胞、膀胱癌細胞、結腸癌細胞、およびＲａｓ突然変異を有する癌細胞よりなる群から選択される癌細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、前記化合物がＣＥＰ−１１００４若しくはＣＥＰ−１３４７である、上記方法。
【請求項１２】
被験体における癌の処置方法であって、
前記被験体中の癌細胞中の混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）若しくはそのポリペプチドに選択的に結合する阻害剤を投与すること
を含んでなり、前記結合が前記癌細胞の増殖を阻害して、それにより被験体中の癌を処置する、
上記方法。
【請求項１３】
被験体に抗癌剤を投与すること
をさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
抗癌剤が阻害剤と同時に若しくは連続して投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗癌剤が、シスプラチン、オキザリプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、カンプトテシン、パクリタキセル、メトトレキセート、ビンブラスチン、エトポシド、ドセタキセルヒドロキシ尿素、セレコキシブ、フルオロウラシル、ブスルファン、メシル酸イマチニブ、アレムブズマブ、アルデスロイキンおよびシクロホスファミドよりなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
抗癌剤の投薬量が、前記抗癌剤が単独で投与される場合に必要とされる投薬量未満であり、それにより個体に対する該抗癌剤の毒性を低下させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
癌が、乳癌、肺癌、子宮頚癌、膵癌、膀胱癌、結腸癌、若しくはＲａｓ突然変異を有する癌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１２に記載の方法であって、前記阻害剤がインドロカルバゾール分子である、上記方法。
【請求項１９】
インドロカルバゾール分子がＣＥＰ−１１００４若しくはＣＥＰ−１３４７である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１２に記載の方法であって、前記混合系統キナーゼが、配列番号３を含んでなるＭＬＫ１ポリペプチドである、上記方法。
【請求項２１】
請求項１２に記載の方法であって、前記混合系統キナーゼが、配列番号４を含んでなるＭＬＫ２である、上記方法。
【請求項２２】
請求項１２に記載の方法であって、前記混合系統キナーゼが、配列番号１を含んでなるか若しくは配列番号２中のＭＬＫ３である、上記方法。
【請求項２３】
癌治療の必要な個体における癌治療の毒性の低減方法であって、
混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）若しくはそのポリペプチドに選択的に結合する阻害剤および抗癌剤を個体に投与することであって、阻害剤とともに投与される抗癌剤の投薬量が、前記抗癌剤が単独で投与される場合に必要とされる投薬量未満であり、それにより個体に対する癌治療の毒性を低減させる、
ことを含んでなる、上記方法。
【請求項２４】
抗癌剤が阻害剤と同時に若しくは連続して投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、前記阻害剤がインドロカルバゾール分子である、上記方法。
【請求項２６】
インドロカルバゾール分子がＣＥＰ−１１００４若しくはＣＥＰ−１３４７である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２３に記載の方法であって、前記混合系統キナーゼが、配列番号３を含んでなるＭＬＫ１ポリペプチドである、上記方法。
【請求項２８】
請求項２３に記載の方法であって、前記混合系統キナーゼが、配列番号４を含んでなるＭＬＫ２ポリペプチドである、上記方法。
【請求項２９】
請求項２３に記載の方法であって、前記混合系統キナーゼが、配列番号１を含んでなるか若しくは配列番号２中のＭＬＫ３ポリペプチドである、上記方法。
【請求項３０】
抗癌化合物が、シスプラチン、オキザリプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、カンプトテシン、パクリタキセル、メトトレキセート、ビンブラスチン、エトポシド、ドセタキセルヒドロキシ尿素、セレコキシブ、フルオロウラシル、ブスルファン、メシル酸イマチニブ、アレムブズマブ、アルデスロイキン、およびシクロホスファミドよりなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
個体が、乳癌、肺癌、子宮頚癌、膵癌、膀胱癌、結腸癌、およびＲａｓ突然変異を有する癌よりなる群から選択される癌を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）活性を阻害しかつ新生物形成細胞の増殖を停止させる化合物のスクリーニング方法であって、
化合物の存在若しくは非存在下で、ＭＬＫタンパク質若しくはそのポリペプチドまたは前記ＭＬＫ活性を有するポリペプチドフラグメントの活性のレベルを測定すること；
化合物の存在下でのＭＬＫ活性のレベルを、化合物の非存在下でのＭＬＫ活性のレベルと比較することであって、化合物の存在下でのＭＬＫ活性の減少が、該化合物がＭＬＫ活性を阻害する能力を有することを示し；
活性化されたＭＬＫ活性を有する新生物形成細胞の培養物を、前記ＭＬＫ活性を阻害する能力を有する化合物と接触させること；および
阻害性化合物の存在下での新生物形成細胞の細胞増殖の量を、阻害性化合物の非存在下での新生物形成細胞の細胞増殖の量と比較することであって、化合物の非存在下での細胞増殖に比較しての化合物の存在下での細胞増殖の減少が、該阻害性化合物が細胞増殖を予防する能力を有することを示す、
を含んでなる、上記方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記混合系統キナーゼが、ＭＬＫ２タンパク質、ＭＬＫ３タンパク質、ＭＬＫ１ポリペプチド、およびＭＬＫ活性を有するＭＬＫ１、ＭＬＫ２若しくはＭＬＫ３のポリペプチドフラグメントよりなる群から選択される、上記方法。
【請求項３４】
ＭＬＫ１ポリペプチドが、配列番号３に示される配列を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＭＬＫ２タンパク質が、配列番号４に示される配列を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ＭＬＫ３タンパク質が、配列番号１若しくは配列番号２に示される配列を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３３に記載の方法であって、ＭＬＫ活性を有する前記ＭＬＫポリペプチドフラグメントが、ＭＬＫ２若しくはＭＬＫ３タンパク質またはＭＬＫ１ポリペプチドの約７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０若しくは１００の連続するアミノ酸を含んでなる、上記方法。
【請求項３８】
新生物形成細胞が癌細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
癌細胞が、乳癌細胞、肺癌細胞、子宮頚癌細胞、膵癌細胞、膀胱癌細胞、結腸癌細胞、若しくはＲａｓ突然変異を有する癌細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３２に記載の方法により同定される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の補助金の説明
本発明は、米国国防総省から助成金ＤＡＭＤ１７−０１−１−０５４８により得られた補助金を使用して部分的に実現された。結果、連邦政府は本発明においてある種の権利を有する。
関連出願の交差引用
本非仮出願は、２００４年３月１６日出願の米国仮出願第６０／５５３，４９７号明細書（現在放棄）の利益を主張する。
発明の分野
本発明は全般として医学および細胞生物学の分野に関する。とりわけ、本発明は、癌細胞の増殖の予防方法および癌治療の間の抗癌化合物の毒性の低減方法に関する。より具体的には、本発明は、癌細胞の増殖を予防するための多系統キナーゼ（ｍｕｌｔｉ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｋｉｎａｓｅ）タンパク質の活性の阻害方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の記述
混合系統キナーゼ（ｍｉｘｅｄ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｋｉｎａｓｅ）（ＭＬＫ）ファミリーに属するセリン／トレオニンタンパク質キナーゼは、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼの活性を制御し、また、組織の発達およびアポトーシス応答の調節に主に関与している（１）。ＭＬＫファミリーは、二重（ｄｕａｌ）ロイシンジッパーをもつキナーゼ（ＤＬＫ）であるＭＬＫ１〜４、およびロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）を包含する（１−２）。ＭＬＫタンパク質はそれぞれ、１個のＳｒｃ相同性３（Ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３）（ＳＨ３）ドメイン、１個の触媒ドメイン、２個のロイシンジッパー（ＬｅｕＺｉｐ）モチーフ、およびＣｄｃ４２／Ｒａｃ相互作用結合（ＣＲＩＢ）モチーフを包含する、タンパク質相互作用およびシグナル伝達に重要である高度に保存された構造的モチーフを含有する（１）。ＭＬＫ１〜４サブファミリーの調節および機能は、脳、骨格筋および精巣に局在するＭＬＫ２、ならびに偏在的に発現されるＭＬＫ３について特徴づけられている（１）。現在、唯一の部分的配列情報はＭＬＫ１について既知であり、そしてＭＬＫ４の生理学的機能は定義されていない。
【０００３】
ＭＬＫタンパク質は、ＣＲＩＢモチーフと相互作用することにより原形質膜に細胞質のＭＬＫタンパク質を動員するＣｄｃ４２およびＲａｃ１を包含する上流のＧタンパク質により活性化される（３）。ＭＬＫタンパク質活性は、ＳＨ３ドメインと、ＣＲＩＢドメインとロイシンジッパー領域の間の単一のプロリン残基との間の分子内相互作用を伴う自己阻害によってもまた調節されうる（４）。最近、ＭＬＫ３の安定性が、ＭＬＫ３が熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）と相互作用する能力に結びつけられ、最近のデータは、ＨＳＦ９０のゲルダナマイシン阻害が低下されたＭＬＫ３の安定性および発現をもたらすことを示唆している（５）。
【０００４】
神経細胞中でのストレスで活性化されるタンパク質キナーゼおよびアポトーシス経路の活性化におけるＭＬＫタンパク質の機能的役割は十分に特徴づけられている（６−８）。ＭＬＫ３は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）キナーゼ、ＭＫＫ４およびＭＫＫ７を直接リン酸化かつ活性化することによる、ＪＮＫ  ＭＡＰキナーゼの強力な活性化因子である（９−１０）。ＭＬＫ３はまた、主たるｐ３８  ＭＡＰキナーゼ活性化因子であるＭＫＫ３およびＭＫＫ６の直接リン酸化により、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼも活性化するとみられる（１０）。ＭＬＫタンパク質は、ＭＬＫ誘発性のＪＮＫ活性化、チトクロームｃ放出、およびアポトーシス経路のカスパーゼ活性化を伴う機構により、パーキンソン病、
ハンチントン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾患の進行において決定的な役割を演じていると提案された（６，８）。従って、ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）およびＣＥＰ−１１００４（ＫＴ−８１３８）を包含するインドールカルバゾールファミリーに属するＭＬＫ活性の数種の小分子阻害剤が、臨床試験で試験されており、そして、未熟な神経細胞の死の予防において有益と判明するかもしれない（６−８、１１−１２）。
【０００５】
非神経細胞において、ＭＬＫタンパク質はまた細胞増殖の促進においても機能しうる。例えば、ＭＬＫ３の過剰発現は、ＭＥＫ１およびＥＲＫ活性化を伴う機構により、軟寒天上でのＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の形質転換および増殖を誘導することが報告された（１３）。同様に、成長因子は、腫瘍細胞の増殖においてＢ−ＲａｆおよびＥＲＫ経路を活性化するのにＭＬＫ３を利用するとみられる（１４）。ＭＬＫ３活性は、ＪＮＫ非依存性である機構により有糸分裂の間に中心体の構成および微小管の安定性に影響を及ぼすことにより、細胞増殖を調節しうる（１５）。付加的な証拠は、ＭＬＫ３が、活性化されたＲａｃ１変異体を発現する細胞中の形態学的変化を媒介することにより細胞の形質転換を促進しうることを示唆している（１６）。最近、ＭＬＫ様タンパク質ＭＬＴＫの過剰発現が、ヌードマウスモデルで細胞の形質転換を誘発するのに十分であることが示された（１７）。また、最近の報告は、ＭＬＫ３が乳癌細胞株中でアップレギュレートされていることを示す（５）。従って、十分な証拠が、ＭＬＫタンパク質を細胞増殖の促進と結びつけている。
【０００６】
形質転換細胞により引き起こされる病態生理学的状態（ｓｔａｔｅ）若しくは状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を処置するための、形質転換細胞の増殖の調節方法に対する、当該技術分野における必要性が存在する。従来技術は、癌細胞の増殖の阻害方法の欠如において不完全である。とりわけ、従来技術は、癌細胞増殖を停止させるためのＭＬＫタンパク質の阻害方法を欠く。本発明は、当該技術分野におけるこの長年の必要性および欲求を成就する。
【発明の開示】
【０００７】
［発明の要約］
本発明は新生物形成細胞の増殖の阻害方法に関する。該方法は、混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）の活性を選択的に阻害する化合物と新生物形成細胞を接触させることを含んでなる。ＭＬＫ活性の阻害は、それにより新生物形成細胞の増殖を阻害する。
【０００８】
本発明は、新生物形成細胞の増殖の関係する阻害方法に向けられる。新生物形成細胞を、混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）の活性を選択的に阻害する化合物と接触させる。混合系統キナーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４よりなる群から選択される配列を有し、ここでＭＬＫ活性の阻害は新生物の増殖を阻害する。
【０００９】
本発明はまた、被験体における癌の処置方法にも向けられる。該方法は、混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）若しくはそのポリペプチドに選択的に結合する阻害剤を投与すること、および阻害剤の結合に際してＭＬＫ若しくはＭＬＫポリペプチドの活性を阻害して癌細胞の増殖を停止させることを含んでなる。癌細胞の増殖の停止が癌を処置する。該方法は、個体に抗癌剤を投与するさらなる一段階を含みうる。
【００１０】
本発明は、癌治療の必要な個体における癌治療の毒性の関係する低減方法に向けられる。該方法は、混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）若しくはそのポリペプチドに選択的に結合する阻害剤および抗癌剤を個体に共投与することを含んでなる。阻害剤とともに投与される抗癌剤の投薬量は、該抗癌剤が単独で投与される場合に必要とされる投薬量未満である。個体に対する癌治療の毒性がそれにより低減される。
【００１１】
本発明は、混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）活性を阻害しかつ新生物形成細胞の増殖を停止
させる化合物のスクリーニング方法にさらに向けられる。ＭＬＫタンパク質若しくはそのポリペプチドまたはＭＬＫ活性を有するポリペプチドフラグメントの活性のレベルを、化合物の存在若しくは非存在下で測定する。化合物の非存在下でのＭＬＫ活性のレベルと比較した、化合物の存在下でのＭＬＫ活性のレベルの減少は、該化合物がＭＬＫ活性を阻害する能力を有することを示す。活性化されたＭＬＫ活性を有する新生物形成細胞の培養物を、ＭＬＫ活性を阻害する能力を有する化合物と接触させる。阻害性化合物の非存在下での新生物形成細胞の細胞増殖の量と、阻害性化合物の存在下での新生物形成細胞の細胞増殖の量を比較する。阻害性化合物の非存在下での細胞増殖に比較しての阻害性化合物の存在下での細胞増殖の減少は、該阻害性化合物が細胞増殖を予防する能力を有することを示す。
【００１２】
本発明は、本明細書に記述されるスクリーニング方法により同定される化合物にさらになお向けられる。これらの化合物は、混合系統キナーゼ若しくはそのポリペプチドの活性を阻害しかつ新生物形成細胞の増殖を停止させる。これらの化合物は、本発明に記述される新生物形成細胞の細胞増殖の阻害方法、癌の処置方法、若しくは抗癌剤の毒性の低減方法のいずれでも使用しうる。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、癌細胞を包含する新生物形成細胞の増殖の阻害方法、癌の処置、ならびに／若しくは癌の処置、ならびにそれのための医薬品および製薬学的組成物の製造における、混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）の活性を選択的に阻害する化合物の使用に向けられる。
【００１４】
他のおよびさらなる目的、特徴および利点は、開示の目的上示される本発明の現在好ましい態様の以下の記述から明らかであろう。
［発明の詳細な記述］
本発明の一態様において、混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）の活性を選択的に阻害する化合物と新生物形成細胞を接触させてそれにより新生物形成細胞の増殖を阻害することを含んでなる、新生物形成細胞の増殖の阻害方法が提供される。本態様の全局面において、新生物形成細胞は癌を含みうる。癌の代表例は、乳癌、肺癌、子宮頚癌、膵癌、膀胱癌、結腸癌、若しくはＲａｓ突然変異を有するいずれかの癌である。本態様の全局面において、化合物はインドロカルバゾール分子でありうる。代表例はＣＥＰ−１１００４若しくはＣＥＰ−１３４７である。
【００１５】
一局面において、混合系統キナーゼは配列番号３に示される配列を有するＭＬＫ１ポリペプチドでありうる。別の局面において、混合系統キナーゼは配列番号４に示される配列を有するＭＬＫ２タンパク質でありうる。なお別の局面において、混合系統キナーゼは配列番号１若しくは配列番号２に示される配列を有するＭＬＫ３タンパク質でありうる。
【００１６】
関連する一態様において、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４よりなる群から選択される配列を有する混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）の活性を選択的に阻害する化合物と新生物形成細胞を接触させることを含んでなる、新生物形成細胞の増殖の阻害方法が提供され、ここでＭＬＫ活性の阻害が新生物の増殖を阻害する。本態様の全局面において、新生物形成細胞は上述されたところの癌を含みうる。加えて、全局面において、阻害剤は上述されたとおりである。
【００１７】
本発明の別の態様において、混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）若しくはそのポリペプチドに選択的に結合する阻害剤を投与すること；癌細胞の増殖が停止されるような前記阻害剤の結合に際してＭＬＫ若しくはＭＬＫポリペプチドの活性を阻害してそれにより被験体中の癌を処置することを含んでなる、被験体中の癌の処置方法が提供される。
【００１８】
本態様に加えて、該方法は被験体に抗癌剤を投与することを含みうる。本態様の局面において、抗癌剤はＭＬＫ阻害剤と同時に若しくは連続して投与しうる。本態様の別の局面において、抗癌剤の投薬量は、該抗癌剤が単独で投与される場合に必要とされる投薬量未満であり、それにより個体に対する該抗癌剤の毒性を低減する。抗癌剤の例は、シスプラチン、オキザリプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、カンプトテシン、パクリタキセル、メトトレキセート、ビンブラスチン、エトポシド、ドセタキセルヒドロキシ尿素、セレコキシブ、フルオロウラシル、ブスルファン、メシル酸イマチニブ、アレムブズマブ、アルデスロイキン、およびシクロホスファミドである。加えて、全局面において、癌の型、ＭＬＫ阻害剤、ならびにＭＬＫタンパク質およびそのポリペプチドは上述されたとおりである。
【００１９】
関連する一態様において、本発明は、混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）若しくはそのポリペプチドに選択的に結合する阻害剤および抗癌剤を個体に投与することを含んでなり、阻害剤と共に投与される抗癌剤の投薬量は該抗癌剤が単独で投与される場合に必要とされる投薬量未満であり、それにより個体に対する癌治療の毒性を低減する、癌治療の必要な個体における癌治療の毒性の低減方法を提供する。本態様の局面において、抗癌剤はＭＬＫ阻害剤と同時に若しくは連続して投与しうる。本態様の全局面において、ＭＬＫ阻害剤、ＭＬＫタンパク質およびポリペプチド、抗癌剤ならびに癌の型は上述されたとおりである。
【００２０】
本発明のなお別の態様において、ａ）化合物の存在若しくは非存在下で、混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）タンパク質若しくはそのポリペプチド、または前記ＭＬＫ活性を有するポリペプチドフラグメントの活性のレベルを測定すること；ｂ）化合物の存在下でのＭＬＫ活性のレベルを化合物の非存在下でのＭＬＫ活性のレベルと比較することであって、化合物の存在下でのＭＬＫ活性の減少は、該化合物がＭＬＫ活性を阻害する能力を有することを示し；ｃ）活性化されたＭＬＫ活性を有する新生物形成細胞の培養物を、ＭＬＫ活性を阻害する能力を有する化合物と接触させること；およびｄ）阻害性化合物の存在下での新生物形成細胞の細胞増殖の量を、阻害性化合物の非存在下での新生物形成細胞の細胞増殖の量と比較することであって、該化合物の非存在下での細胞増殖に比較しての該化合物の存在下での細胞増殖の減少が、該阻害性化合物が細胞増殖を予防する能力を有することを示す、を含んでなる、ＭＬＫ活性を阻害しかつ新生物形成細胞の増殖を停止する化合物のスクリーニング方法が提供される。
【００２１】
本態様の全局面において、混合系統キナーゼはＭＬＫ２タンパク質若しくはＭＬＫ３タンパク質若しくはＭＬＫ１ポリペプチド、またはＭＬＫ活性を有するポリペプチドフラグメントである。ＭＬＫ１ポリペプチドは配列番号３に示される配列を有しうる。ＭＬＫ２ポリペプチドは配列番号４に示される配列を有しうる。ＭＬＫ３ポリペプチドは配列番号１若しくは配列番号２に示される配列を有しうる。ＭＬＫ活性を有するＭＬＫポリペプチドフラグメントは、ＭＬＫ２若しくはＭＬＫ３タンパク質またはＭＬＫ１ポリペプチドの約７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０若しくは１００の連続するアミノ酸を含みうる。全局面において、新生物形成細胞および癌の型は上述されたとおりである。
【００２２】
関連する一態様において、混合系統キナーゼ活性および新生物形成細胞の細胞増殖の阻害剤のスクリーニング方法により同定される化合物が提供される。
【００２３】
以下の略語を本明細書で使用する。混合系統キナーゼ、ＭＬＫ；マイトジェン活性化タンパク質、ＭＡＰ；細胞外シグナル制御キナーゼ、ＥＲＫ；ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２末端キナーゼ、ＪＮＫ；二重ロイシンジッパーをもつキナーゼ、ＤＬＫ；Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ相互作用結合、ＣＲＩＢ；ＣＥＰ−１１００４、［３，９−ビス［（イソプロピルチオ）メチル］−（８Ｒ＊，９Ｓ＊，１１Ｓ＊）−（−）−９−ヒドロキシ−９−メトキシカルボニル−８−メチル−２，３，９，１０−テトラヒドロ−８，１１−エポキシ−１Ｈ，８Ｈ，１１Ｈ−２，７ｂ，１１ａ−トリアザジベンゾ（ａ，ｇ）シクロオクタ（ｃｄｅ）トリンデン−１−オン］；ＣＥＰ−１３４７  ［３，９−ビス［（エチルチオ）メチル］−（８Ｒ＊，９Ｓ＊，１１Ｓ＊）−（−）−９−ヒドロキシ−９−メトキシカルボニル−８−メチル−２，３，９，１０−テトラヒドロ−８，１１−エポキシ−１Ｈ，８Ｈ，１１Ｈ−２，７ｂ，１１ａ−トリアザジベンゾ（ａ，ｇ）シクロオクタ（ｃｄｅ）トリンデン−１−オン］。
【００２４】
本明細書で使用されるところの「ａ」若しくは「ａｎ」という用語は１個若しくはそれ以上を意味しうる。「含んでなる」という語とともに使用される場合に請求の範囲（１個若しくはそれ以上）にて本明細書で使用されるところの「ａ」若しくは「ａｎ」という語は、１個若しくは１個以上を意味しうる。本明細書で使用されるところの「別の」は、少なくとも第二のもの若しくはそれ以上を意味しうる。
【００２５】
本明細書で使用されるところの「接触させること」という用語は、記述されるところのＭＬＫタンパク質またはそのポリペプチド若しくはフラグメント、あるいはそれを含んでなる細胞との接触に阻害剤をもたらすいかなる適する方法も指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏで、これは、ＭＬＫタンパク質またはそのポリペプチド若しくはフラグメントあるいはそれを含んでなる細胞を、適する媒体中で阻害剤に曝露することにより達成される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの応用のためには、いずれかの既知の投与方法が、本明細書に記述されるとおり適する。
【００２６】
本明細書で使用されるところの「新生物」という用語は、とりわけ異常な細胞増殖を特徴とする組織若しくは細胞の塊を指す。異常な細胞増殖は、正常組織若しくは細胞の増殖を越えかつそれと協調せずそして該変化を惹起した刺激が停止するか若しくは除去された後に同一の過剰な様式で持続する、これらの組織若しくは細胞の増殖をもたらす。腫瘍組織若しくは細胞は、通常、良性若しくは悪性のいずれかであり得る組織若しくは細胞の塊をもたらす、正常組織若しくは細胞に関しての構造の構成および協調の欠如を示す。当業者に明らかであろうとおり、「癌」という用語は悪性新生物を指す。
【００２７】
本明細書で使用されるところの「形質転換された」という用語若しくは「形質転換細胞」という句は、腫瘍性増殖を表す細胞を指す。
【００２８】
本明細書で使用されるところの「処置すること」という用語、または「癌を処置すること」若しくは「新生物を処置すること」という句は、限定されるものでないが、新生物若しくは癌の増殖を停止させること、新生物若しくは癌を殺すこと、または新生物若しくは癌の大きさを縮小させることを挙げることができる。増殖を停止させることは、腫瘍若しくは癌細胞の大きさまたは数若しくは大きさのいかなる増大も停止させること、あるいは新生物若しくは癌細胞の分裂を停止させることを指す。大きさを縮小させることは、新生物若しくは癌の大きさまたは腫瘍若しくは癌細胞の数若しくは大きさを低下させることを指す。
【００２９】
本明細書で使用されるところの「被験体」という用語は処置のいかなる標的も指す。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「ＭＬＫ阻害剤」という用語は、限定されるものでないがＭＬＫ１、ＭＬＫ２および／若しくはＭＬＫ３ポリペプチドを挙げることができる混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）ポリペプチドの活性を遮断、停止、阻害および／若しくは抑制する天然、半合成若しくは合成起源の分子的実体を意味している。
【００３１】
本明細書で使用されるところの「ＭＬＫポリペプチド」という用語は「ＭＬＫタンパク
質」と互換性に使用される。本明細書に記述される実験は、以下の理由からＭＬＫ３アイソフォームに焦点をあてた。第一に、ＭＬＫ３は偏在的に発現され、そしてＭＬＫタンパク質の最良に特徴づけられたものである。第二に、ＭＬＫ２はキナーゼ触媒ドメインおよび他の領域においてＭＬＫ３と７０％以上の配列の同一性を共有するとは言え、ＭＬＫ２ポリペプチドの発現は脳および筋組織に制限されている。第三に、ＭＬＫ１の完全な配列は未だ同定されなければならない。しかしながら、ヒトＭＬＫ３（配列番号１）ポリペプチドの阻害は非制限的例示の一態様であること、ならびに、マウス（配列番号２）のような多様な哺乳動物でのＭＬＫ３ポリペプチド、ならびに／若しくはヒトＭＬＫ２ポリペプチド（配列番号４）および／若しくはヒトＭＬＫ１（配列番号３）ポリペプチドの阻害は、本発明の技術思想および範囲内とされていることが企図されている。
【００３２】
本発明は、ＭＬＫタンパク質若しくはポリペプチドが、腫瘍性増殖を表す形質転換細胞中での有糸分裂の間の微小管形成の重要な調節物質としてはたらくことを開示する。その後、ＭＬＫタンパク質若しくはポリペプチドの阻害は、中期から後期への移行に必要な有糸分裂紡錘体を適正に形成することの不能により、前中期様停止で有糸分裂の進行を阻害する。ＭＬＫタンパク質の阻害は、形質転換細胞の有糸分裂移行および細胞増殖を優先的に阻害しうるが、しかし正常細胞ではしない。形質転換細胞での細胞周期の調節の固有の異常は、これらの細胞を、ＭＬＫ阻害剤に応答しての細胞周期停止およびアポトーシスをうけるようにより感受性にしうる。従って、ＭＬＫタンパク質若しくはポリペプチドは、正常細胞の機能に影響を及ぼすことなく、癌細胞増殖の処置の独特の標的としてはたらく。
【００３３】
新生物形成細胞増殖が、正常の形質転換されていない細胞の機能に影響を及ぼすことなく停止（ａｒｒｅｓｔ）、停止（ｓｔｏｐ）、遮断されるか、若しくは起こることを停止するような、限定されるものでないが癌を挙げることができる新生物を処置するための独特の標的としてＭＬＫポリペプチドを利用する方法が、本明細書で提供される。従って、本発明はＭＬＫタンパク質の特定のポリペプチド配列を結合しかつ癌細胞増殖に影響を及ぼすその活性を阻害若しくは妨害するＭＬＫ阻害剤に引き寄せられる。ＭＬＫ阻害剤は、ＭＬＫポリペプチド、すなわち限定されるものでないが配列番号１、２および／若しくは４のような完全長のポリペプチド、または配列番号３のようなそのペプチドフラグメントの活性を遮断、停止、阻害および／若しくは抑制しうる。ポリペプチドフラグメントは、配列番号３のＭＬＫ１ポリペプチド、配列番号４のＭＬＫ２ポリペプチド、または配列番号１若しくは２のＭＬＫ３ポリペプチドを包含するＭＬＫポリペプチドの約７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０若しくは１００の連続するアミノ酸もまた含みうる。
【００３４】
ＭＬＫ阻害剤は、インドロカルバゾール化合物またはその誘導体若しくはアナログ、あるいは、キナーゼ活性のようなＭＬＫタンパク質若しくはポリペプチドの活性を妨害するのに有効な他の分子でありうる。代表的阻害剤はＣＥＰ−１１００４若しくはＣＥＰ−１３４７である。ＣＥＰ−１１００４がＭＬＫ３に選択的に結合することが企図される。潜在的化合物を、ＭＬＫタンパク質若しくはポリペプチドの活性を阻害しかつ形質転換細胞の細胞増殖を阻害するそれらの能力についてスクリーニングしうることもまた企図される。例えば、活性化されたＭＬＫ活性を有する癌細胞培養物を潜在的ＭＬＫ阻害剤と接触させる。対照に比較しての細胞増殖の減少は、トリパンブルー排除若しくはコロニー形成アッセイのような標準的アッセイにより測定しうる。ＭＬＫタンパク質若しくはポリペプチドの活性を阻害しかつ細胞増殖を阻害するのに有効な化合物を、ＤＮＡ含量のＦＡＣＳ分析によりさらにスクリーニングして、細胞増殖の低下の性質を特徴付けしうる。
【００３５】
あるいは、ＭＬＫの潜在的阻害剤は、最初に、ＭＬＫ関連の活性の既知の基質の存在下で、本明細書に記述される１種若しくはそれ以上のＭＬＫタンパク質若しくはポリペプチ
ドと潜在的阻害剤を接触させることにより、スクリーニングしうる。例えば、ＭＬＫ関連の活性を、ＡＴＰ、およびＭＬＫ活性を介してリン酸化される基質の存在下、ならびに潜在的ＭＬＫ阻害剤の存在若しくは非存在下でアッセイしうる。潜在的阻害剤の非存在下での活性に比較しての潜在的阻害剤の存在下でのＭＬＫ活性の低下は、それがＭＬＫ活性を阻害する能力を有することを示す。こうした酵素アッセイは当該技術分野で既知かつ標準的である。ＭＬＫポリペプチドはＭＬＫ１〜４のいずれでもありうるか、若しくは記述されるところのそのフラグメントでありうるが、但し、該ポリペプチドフラグメントはＭＬＫ１〜４ポリペプチドに関連した最低１種の活性を保持する。その後、ＭＬＫ関連の活性のいずれかの潜在的阻害剤を、記述されるところの細胞増殖アッセイで使用しうる。
【００３６】
癌細胞の細胞増殖の潜在的阻害剤は、ＭＬＫタンパク質の活性を阻害若しくは妨害することが既知の天然、半合成若しくは合成化合物でありうるか、または、化学物質ライブラリーからスクリーニングされた化合物でありうるか、あるいは、既知の阻害剤に類似の構造を有する合成の誘導体若しくはアナログ化合物でありうる。本明細書に記述される方法により同定されるＭＬＫの阻害剤は、正常細胞の増殖に影響を及ぼすことなく癌細胞の増殖を阻害し得る。こうした阻害剤は、新生物形成細胞の増殖を阻害するため、癌を処置するため、若しくは正常細胞に対する抗癌剤の毒性を低減させるために使用しうる。
【００３７】
ＭＬＫ阻害剤は、形質転換細胞、例えば、限定されるものでないが癌を挙げることができる新生物の存在により特徴づけられる病態生理学的状態を有するいかなる被験体、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトも処置するのに使用しうる。例えば、癌は、乳癌、肺癌、子宮頚癌、膵癌、膀胱癌、結腸癌、若しくはＲａｓ突然変異を有する別の癌でありうる。被験体へのＭＬＫ阻害剤の投与は、正常細胞の増殖に影響を及ぼすことなく癌細胞の増殖停止をもたらす。こうして、細胞増殖は阻害され、そして、癌を殺すことまでおよびそれを包含する治療効果が達成され、それにより癌を処置する。本発明のＭＬＫ阻害剤を、非悪性の腫瘍性疾患および障害の増殖を阻害するのに使用しうることが企図されている。
【００３８】
抗癌剤はＭＬＫ阻害剤と同時に若しくは連続して投与しうる。ＭＬＫ阻害剤との共投与の効果は、癌若しくは癌細胞に対し少なくとも最小限の薬理学的若しくは治療効果を有することが既知である通常必要とされる抗癌剤の投薬量、例えば、癌細胞を排除するのに必要とされる投薬量を低下させることである。付随して、正常細胞、組織および器官に対する抗癌剤の毒性が、癌細胞に対する該薬物のいかなる細胞傷害性、細胞分裂阻害性、アポトーシス性または他の殺す若しくは阻害性の治療効果も低減する、やわらげる、除外する若しくは別の方法で妨害することなく、低下される。
【００３９】
ＭＬＫ阻害剤および抗癌剤は、当該技術分野で標準的ないずれの方法によっても、例えば、皮下で、静脈内に、非経口で、腹腔内に、皮内に、筋肉内に、局所に、腸に、直腸に、鼻に、頬側に、膣に、または吸入スプレーにより、薬物ポンプにより、あるいは経皮貼付剤若しくは埋植物内に含有されて、全身に若しくは局所にのいずれかで独立に投与し得る。ＭＬＫ阻害剤の投薬製剤は、投与方法に適する慣習的な非毒性の生理学的若しくは製薬学的に許容できる担体若しくはベヒクルを含みうる。
【００４０】
ＭＬＫ阻害剤および抗癌剤若しくはそれらの製薬学的組成物は、治療効果を達成、維持若しくは改善するために独立に１回若しくはそれ以上投与しうる。投薬量、またはＭＬＫ阻害剤および抗癌剤のいずれか若しくは双方の適する投薬量が単一の投与される用量を含んでなるか若しくは複数の投与される用量を含んでなるかを決定することは、当業者の熟練内に十分にある。適切な投薬量は、被験体の健康状態、癌の進行若しくは寛解、投与経路および使用される製剤に依存する。
【００４１】
以下の実施例は、本発明の多様な態様を具体的に説明する目的上示され、そして、本発明をいかなる様式でも制限することを意味していない。
【実施例１】
【００４２】
細胞培養および試薬
ＨｅＬａ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９若しくはＭＲＣ−５細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）ならびにペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中で増殖させた。エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性の乳癌細胞ＳＵＭ−１５９はミシガン大学ヒト乳癌細胞株（ＳＵＭ株）から得、そしてＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で増殖させた。いくつかの実験において、細胞を、ｐＥＧＦＰ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）、ヘマグルチニン（ＨＡ）標識ＭＬＫ３、キナーゼ・デッド（ｋｉｎａｓｅ  ｄｅａｄ）変異体ＭＬＫ３（ＭＬＫ３  Ｋ１４４Ｒ）、ＧＦＰ標識ＭＬＫ２（Ｄｏｎｎａ  Ｄｏｒｏｗ博士により恵与される）、Ｆｌａｇ標識ＤＬＫ、若しくはＨＡ標識ＪＮＫ１のｃＤＮＡ（１μｇ）で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、トランスフェクション１６〜２４時間後に収集した。
【００４３】
ＭＬＫ３（Ｃ−２０）、ＪＮＫ（Ｃ−１７）、リン酸化型ＪＮＫ（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ）１／２（Ｇ−７）、サイクリンＢ１（ＧＮＳ１）、ＭＫＫ２（Ｃ−１６）およびＣｄｃ２（＃１７）に特異的な抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（カリフォルニア州サンタクルズ）から購入した。ｐ６２ヌクレオポリン（Ｎ４３６２０）およびリン酸化型特異的（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ヒストンＨ３（セリン１０）（カタログ番号０７−０８１）に対する抗体は、それぞれＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州パロアルト）およびＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（バージニア州シャーロッツビル）から購入した。ＣＥＰ−１１００４（Ｃｅｐｈａｌｏｎ  Ｉｎｃ．ペンシルベニア州ウエストチェスターより恵与される）を、ＤＭＳＯ中０．４ｍＭのストック濃度で再構成した。
【実施例２】
【００４４】
細胞の同期化
いくつかの実験において、細胞を、以前に記述された（１８−１９）ところの二重チミジンブロックにより同期させた。簡潔には、細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中２ｍＭチミジンとともに１６時間インキュベートした。過剰のチミジンをハンクス液（ＨＢＳＳ）で洗い落とし、そして細胞を完全培地とともに細胞周期に戻した（ｒｅｌｅａｓｅ  ｂａｃｋ）。８時間後に、細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中２ｍＭチミジンとともに別の１６時間２回目処理して、Ｇ１／Ｓ期の境界で細胞を停止させた。同期させた細胞をその後ＨＢＳＳで洗浄しかつ細胞周期に戻し、そしてＧ１／Ｓ解放（ｒｅｌａｓｅ）後の多様な時点で分析のため収集した。細胞周期分析は、下述されるところの蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により行った。いくつかの実験では、ＣＥＰ−１１００４を、Ｇ１／Ｓブロックからの解放５時間後（後期Ｓ期（ｌａｔｅ  Ｓ−ｐｈａｓｅ）若しくは早期Ｇ２期（ｅａｒｌｙ  Ｇ２−ｐｈａｓｅ）に対応した）に、同期させた細胞に添加した。
【実施例３】
【００４５】
細胞増殖アッセイ
処理後に、細胞を、トリプシン処理およびトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）での染色後に血球計算板でカウントした。細胞の９５％以上がトリパンブルー色素を排除した。細胞増殖はコロニー形成アッセイを使用してもまた測定した。増殖している細胞をトリプシン処理し、そして、多様な濃度のＣＥＰ−１１００４の存在若しくは非存在下で再プレーティングした（１００ｍｍ皿あたり１０００細胞）。８〜１４日間のインキュベーション後に
、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、そして０．２％クリスタルバイオレット（２０％メタノール中）で１〜２分間染色した。細胞を蒸留水で数回洗浄し、そして形成されたコロニー（最低４０細胞／コロニーあたり）をカウントした。
【実施例４】
【００４６】
イムノブロッティングおよび免疫沈降
タンパク質分析のため、細胞を冷リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、３００μｌの組織溶解緩衝液（ＴＬＢ）（２０ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２５ｍＭ  β−グリセロリン酸、２ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０％グリセロール、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）および１ｍＭベンズアミジン）で溶解し、そして２０，０００×ｇで遠心分離してライセートを澄明にした。およそ２０μｇの全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；マサチューセッツ州ボストン）に転写し、トリス緩衝生理的食塩水（ＴＢＳ）（５０ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中５％脱脂粉乳で１〜２時間ブロッキングし、そして１％ＢＳＡ溶液を含有するＴＢＳ中で一次抗体とともに１ないし１６時間インキュベートした。メンブレンをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で数回洗浄し、そしてＨＲＰ結合抗マウス若しくは抗ウサギ抗体（０．１μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。免疫反応性は高感度ケミルミネッセンス法（ＥＣＬ：Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国バッキンガムシャー）により検出した。
【００４７】
いくつかの実験において、タンパク質を、細胞ライセートとインキュベートした１μｇ／ｍｌの一次抗体を用い、４℃で４〜１６時間免疫沈降させた。プロテインＡ若しくはＧセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン・ウプサラ）を追加の４時間添加し、そして免疫複合体をキナーゼ緩衝液（ＫＢ、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＤＴＴ）で２回洗浄した。免疫複合体中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてイムノブロッティングにより分析した。
【実施例５】
【００４８】
免疫蛍光
６センチメートルプレート中の円形のガラス製カバーガラス上で増殖させた細胞を、実施例４に記述されたとおり過剰のチミジンを使用してＧ１／Ｓ期の境界で同期させた。細胞周期への戻し後の指定された時間に、カバーガラスを４％パラホルムアルデヒドで８分間固定し、そしてＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２分間浸透化した。細胞染色パターンを、冷メタノールで１０分間固定かつ浸透化した細胞で確認した。細胞を、ＭＬＫ３、α−チューブリン、サイクリンＢ１、リン酸化型特異的ヒストンＨ３若しくはｐ６２ヌクレオポリンに対する抗体で染色し、次いでフルオレセイン若しくはテキサスレッド結合二次抗体とともにインキュベートし、そして細胞ＤＮＡについて４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、ＰＢＳ中０．２μｇ／ｍｌ）で対染色した。細胞を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅ８００エピ蛍光顕微鏡（Ｉｍａｇｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、メリーランド州コロンビア）を使用して同定し、そしてハママツのＣＣＤカメラで捕捉した。細胞画像を、ＩＰｌａｂソフトウェア（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ、バージニア州フェアファックス）を使用して処理した。
【実施例６】
【００４９】
ＭＬＫ３キナーゼアッセイ
野性型ＭＬＫ３若しくは触媒的に不活性のＭＬＫ３ＫＲ（Ｋ１４４Ｒ）を、ＣＥＰ−１１００４で若しくは伴わずに処理したトランスフェクトした細胞から免疫沈降させ、そして、免疫複合体を、０．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを補充した冷ＫＢで洗浄した。免疫沈降したＭＬＫ３を、１０μＣｉのγ−３２Ｐ  ＡＴＰ、２０μＭのコールドＡＴＰおよび基質として０．５μｇのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を含有するキナーゼ緩衝液とともに３０℃で４５分間インキュベートした。反応を２×ＳＤＳサンプル緩衝液でクエンチし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてＰＶＤＦメンブレン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ボストン）に転写した。ＭＢＰおよびＭＬＫ３中への放射活性リン酸の取り込みを、それぞれｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）およびイムノブロッティングにより分析した。
【実施例７】
【００５０】
ＦＡＣＳ分析。
【００５１】
同期させた細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、３ｍｌの冷（−２０℃）７０％エタノールで固定し、そして４℃で一夜保存した。細胞をその後、０．２Ｍトリス、ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＲＮアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）に溶解した１００μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）とともに室温で１時間インキュベートし、そして等容量のＰＢＳで希釈した。ＤＮＡ含量をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により測定し、そしてＳｙｎｃ  Ｗｉｚａｒｄモデル、ＭｏｄＦｉｔ  ＬＴソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して解析した。Ｇ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期の細胞の割合を決定するために、２Ｎおよび４Ｎのピークについての設定を、Ｇ１／Ｓで停止した細胞からの各実験内で定義し、そして所定の実験内の全サンプルに適用した。
【実施例８】
【００５２】
Ｃｄｃ２キナーゼ活性
Ｃｄｃ２を、Ｃｄｃ２抗体（０．５μｇ）とともに氷上で２時間インキュベートすることにより、細胞ライセートから免疫沈降させた。ライセートをその後、プロテインＧ−セファロースとともに、混合を伴い４℃で追加の２時間インキュベートした。免疫複合体を冷キナーゼ緩衝液で洗浄し、そして、１０μＣｉのγ−３２Ｐ  ＡＴＰ、２０μＭのコールドＡＴＰ、および基質としての２．５μｇのヒストン（タイプＩＩＩ−ＳＳ、Ｓｉｇｍａ）を含有するキナーゼ緩衝液とともに３０℃で３０分間インキュベートした。反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で停止し、そしてタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ヒストン中への３２Ｐの取り込みを、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ分析により測定した。
【実施例９】
【００５３】
分裂指数アッセイ
カバーガラス上で増殖させた細胞を、実施例４〜５に記述されるとおりＧ１／Ｓ期の境界で同期させた。いくつかの場合には、トランスフェクトされた細胞を同定するために、ＭＬＫ３をｐＥＧＦＰベクターと共発現させた。チミジンで誘発したＧ１／Ｓ期ブロックからの解放後５時間に、細胞を、変動する濃度のＣＥＰ−１１００４の存在若しくは非存在下でインキュベートした。解放後変動する時点でカバーガラスを固定し、そして細胞ＤＮＡをＤＡＰＩで染色した。前期、前中期、中期、後期若しくは終期のＧＦＰ陽性の有糸分裂細胞を同定し、カウントし、そして分裂指数を決定するためにカウントした全細胞の一画分として表した。各実験内で、３００ないし３５０細胞を各条件および時点についてカウントした。
【実施例１０】
【００５４】
ＭＬＫタンパク質の阻害は、ＨｅＬａ細胞で増殖を阻害しかつＧ２若しくはＭ期停止を引
き起こす
ＭＬＫタンパク質の阻害剤がＲａｓで形質転換したＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の増殖を予防したが、しかし正常ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に対する影響を有しなかったことが最近報告された（２０）。従って、形質転換細胞での細胞周期事象に対するＭＬＫ阻害の影響を分析した。ＭＬＫ阻害剤ＣＥＰ−１１００４の添加が形質転換したＨｅＬａ細胞の増殖を阻害しうるかどうかを最初に試験した。示されるとおり、ＨｅＬａ細胞の増殖はＣＥＰ−１１００４により阻害された一方、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の増殖は影響を受けなかった（図１Ａ）。他の形質転換細胞の増殖を、コロニー形成アッセイを使用して検査した。図１Ｂに示されるとおり、ＣＥＰ−１１００４は、Ａ５４９気道上皮癌細胞のコロニー形成の用量依存性の阻害を引き起こした。コロニー形成の同様の阻害が、ＣＥＰ−１１００４で処理したＨｅＬａ細胞およびＥＲ陰性ＳＵＭ１５９乳癌細胞で観察された（データは示されない）。
【００５５】
細胞増殖のＣＥＰ−１１００４誘発性の阻害の性質を決定するために、ＤＮＡ含量のＦＡＣＳ分析を使用して、細胞周期の進行に対するＣＥＰ−１１００４の影響を測定した。示されるとおり、ＣＥＰ−１１００４で２０時間処理したＨｅＬａ若しくはＨＥＫ２９３細胞は、細胞周期のＧ２若しくはＭ期での停止を示す４Ｎ  ＤＮＡを蓄積した（図２Ａ〜２Ｂ）。対照的に、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞若しくは正常の二倍体肺線維芽細胞ＭＲＣ−５細胞中のＤＮＡ含量プロファイルは、ＣＥＰ−１１００４の非存在若しくは存在下で同様であった（図２Ｃ〜２Ｄ）。
【００５６】
ＭＬＫ３がＧ２期および有糸分裂の間に活性化されることを示す以前のデータ（１５）に基づき、同期させたＨｅＬａ細胞中での細胞周期の進行に対するＣＥＰ−１１００４の影響を検査した。Ｇ１／Ｓ期の境界で同期させた細胞を細胞周期に５時間戻して、Ｓ期の大部分の完了を可能にした。細胞をＣＥＰ−１１００４で若しくは伴わずに変動する時間処理し、そしてＤＮＡ含量をＦＡＣＳにより測定した。Ｇ１／Ｓブロックからの解放後７と９時間との間に、未処理の細胞は４Ｎ  ＤＮＡを伴う細胞の増大により示されるとおりＧ２およびＭ期にある（図３Ａ）。Ｇ１／Ｓ解放後１１時間までに、未処理の細胞は有糸分裂を脱しかつＧ１期に再進入した（図３Ａ）。対照的に、ＣＥＰ−１１００４で処理した細胞は、Ｇ１／Ｓ期の解放後１１および１３時間での４Ｎ  ＤＮＡを含有する細胞の持続性の蓄積により明らかなとおり、Ｇ２若しくはＭ期で停止する（図３Ｂ）。同調して、Ｇ２若しくはＭ期でのＣＥＰ−１１００４誘発性の停止が、未処理の同期させた細胞に比較して、Ｇ１／Ｓ期の解放後１１および１３時間での持続性のサイクリンＢ１発現（図３Ｃ）および上昇したＣｄｃ２キナーゼ活性（図３Ｄ）により示された。
【実施例１１】
【００５７】
ＣＥＰ−１１００４はＭＬＫ３を阻害するが、しかし他の関連するキナーゼを阻害しない
ＭＬＫタンパク質（および他の関連するキナーゼでない）の阻害に対するＣＥＰ−１１００４の特異性を検査した。これらの実験はＭＬＫ３アイソフォームに焦点を当てた。ＭＬＫ３は偏在的に発現され、そしてＭＬＫタンパク質の最良のものを特徴付けられる。また、ＭＬＫ２はキナーゼ触媒ドメインおよび他の領域中でＭＬＫ３と７０％以上の配列の同一性を共有するとは言え、ＭＬＫ２発現は脳、骨格筋および精巣に制限される（２１）。加えて、ＭＬＫ１の完全な配列は未だ同定されなければならない。最後に、ＭＬＫ３は最近、Ｇ２／Ｍ期の移行に関与することが関係づけられた（１５）。
【００５８】
ＣＥＰ−１１００４がＭＬＫ３活性を阻害する能力を最初に試験した。ＨＡ標識ＭＬＫ３野性型をＨｅＬａ細胞中で過剰発現させ、そして収集前にＣＥＰ−１１００４で若しくは伴わずに４時間処理した。図４Ａに示されるとおり、ＣＥＰ−１１００４処理は、未処理の細胞に比較して、発現されるＭＬＫ３活性を有意に阻害した。次に、関連する混合系統キナーゼ、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）の活性に対するＣＥＰ−１１００４の効果を、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞で測定した。ＤＬＫ若しくはＭＬＫ３活性の尺度としてＪＮＫ  ＭＡＰキナーゼリン酸化を使用して、ＣＥＰ−１１００４はＭＬＫ３を阻害したが、しかしＤＬＫで誘発したＪＮＫのリン酸化はしなかった（図４Ｂ）。他者（１５）と一致して、ＭＬＫ３が、ＧＩ／Ｓ期に比較してＧ２およびＭ期移行の間により高い活性（約４倍）を有することが示され、そしてこの活性はＣＥＰ−１１００４により阻害された（データは示されない）。
【００５９】
ＭＬＫ３の過剰発現はＭＥＫ１によりＥＲＫの活性化を誘導することが示されている（１３）。従って、ＭＬＫ３野性型若しくは構成的に活性のＭＫＫ１変異体の過剰発現後のＥＲＫ活性化に対するＣＥＰ−１１００４の効果を検査した。ＭＬＫ３および活性のＭＫＫ１の双方がＥＲＫ活性を刺激するとは言え、ＭＬＫ３で誘発されたＥＲＫ活性化のみがＣＥＰ−１１００４により阻害された（図４Ｃ）。最後に、ＣＥＰ−１１００４がＭＬＫ２およびＭＬＫ３タンパク質を阻害する能力を比較した。ＧＦＰ標識ＭＬＫ２若しくはＨＡ標識ＭＬＫ３をＨＡ標識ＪＮＫ１と２４時間共発現させ、そしてその後、収集前にＣＥＰ−１１００４で若しくは伴わずに追加の３時間処理した。ＭＬＫ３に誘発されるＪＮＫ１のリン酸化は１００ｎＭのＣＥＰ−１１００４で８０％阻害された一方、ＪＮＫ１のＭＬＫ２活性化の有意の阻害は４００ｎＭ以上のＣＥＰ−１１００４を必要とした（図４ＤおよびＥ）。これは、ＭＬＫ２に比較してＭＬＫ３に対しおよそ３倍より高い特異性を有するＣＥＰ−１１００４と一致する（１１）。従って、これらのデータは、ＣＥＰ−１１００４により標的とされる主要なＭＬＫアイソフォームとしてのＭＬＫ３を裏付ける。
【００６０】
加えて、われわれは、ＣＥＰ−１１００４が他のＭＬＫ関連（ＤＬＫ）若しくはＭＬＫに関連しないタンパク質キナーゼ（ＭＫＫ１）の活性に影響を及ぼさないことを示す。にもかかわらず、他者は、ＮＩＴ  ３Ｔ３細胞のＲａｓ誘発性の増殖に対するＭＬＫ阻害の効果がｐ２１活性化型キナーゼ１（Ｐａｋ１）の同時阻害によるかもしれないことを示唆した（２０）。Ｐａｋ１活性は、ＣＥＰ−１１００４の存在若しくは非存在下で試験されなかった。本明細書で細胞周期の停止を開始させるのに使用した用量が、ＭＬＫ阻害剤がＰａｋ１活性を阻害するために必要とされる報告されたＩＣ５０濃度よりおよそ１０倍より少なかったためである（２０）。有糸分裂の停止は約１００〜２００ｎＭの濃度で発生することが企図される（図６Ａ〜６Ｃ）。
【００６１】
ＣＥＰ−１１００４に類似の生物学的特性を有する別のＭＬＫ阻害剤、ＣＥＰ−１３４７がＥＲＫ経路を活性化することが報告された（１２）。しかしながら、これらの実験は神経細胞中で行われ、そしてＣＥＰ−１１００４が神経細胞以外でＥＲＫ活性化を引き起こすという証拠は見出されていない。対照的に、示されたとおり、ＣＥＰ−１１００４処理は、ＭＬＫ３に誘発されるＥＲＫ活性化を阻害し（図４Ｃ）、新生物形成細胞中でのＥＲＫ経路の活性化におけるＭＬＫ３の役割と矛盾しない（１４）。これは、神経以外の新生物形成細胞の増殖の促進、しかし神経細胞の細胞死におけるＭＬＫ３の相反する役割をさらに裏付ける。加えて、これらのデータは、神経細胞中のＥＲＫ経路の負の調節、しかし神経以外の新生物形成細胞中のＥＲＫ活性化の正の調節を特徴とする、ＭＬＫ３の２つの機能を示唆する。
【実施例１２】
【００６２】
ＣＥＰ−１１００４は前中期での有糸分裂の停止を誘発する
ＣＥＰ−１１００４が有糸分裂への進行に影響を及ぼしたとは思われなかった（図３Ａ〜３Ｄ）ため、ＣＥＰ−１１００４で誘発されるＭ期停止の性質を、ＣＥＰ−１１００４の存在若しくは非存在下で処理した同期させた細胞での有糸分裂の多様な段階を検査することにより特徴付けした。カバーガラス上で増殖させたＧ１／Ｓ期細胞を、細胞周期に５時間戻し、４００ｎＭのＣＥＰ−１１００４で若しくは伴わずに、Ｇ１／Ｓブロックからの解放後に追加の４若しくは６時間のインキュベーションの間（すなわちそれぞれ９および１１時間）処理し、そしてＤＮＡをＤＡＰＩで染色した。染色体の形態を蛍光顕微鏡検
査により検査し、そして前期、前中期、中期若しくは後期／終期の細胞の割合を決定した。Ｇ１／Ｓ後９時間で、ＣＥＰ−１１００４で処理した細胞は、未処理の細胞に比較して前中期細胞の蓄積を示し始めた（図５Ａ、左のグラフ）。
【００６３】
さらに、中期若しくは後期／終期の細胞はＣＥＰ−１１００４で処理した細胞中で明らかでなかった（図５Ａ、左のグラフ）。ＣＥＰ−１１００４で処理した細胞は、後期／終期の細胞の増大した数を示した対照細胞と異なり、前中期で主に蓄積したため、この差違はＧ１／Ｓ解放後１１時間でなおより明らかになった（図５Ａ、右のグラフ）。ＣＥＰ−１１００４に応答して前中期で蓄積する細胞の数は用量依存性であった。細胞周期に５時間戻し、そしてその後多様な濃度のＣＥＰ−１１００４で追加の８時間（Ｇ１／Ｓ解放後１３時間）処理した、Ｇ１／Ｓ期で同期させた細胞は、前中期細胞の割合の用量依存性の増大を示した（図５Ｂ）。
【実施例１３】
【００６４】
ＭＬＫ３の過剰発現は有糸分裂の停止に対するＣＥＰ−１１００４の効果を無効にする
ＭＬＫタンパク質の阻害が前中期での有糸分裂の停止を引き起こしたこと、およびＭＬＫ３はＣＥＰ−１１００４の主要な標的であったことを示した以前のデータを考え、ＭＬＫ３の過剰発現がＣＥＰ−１１００４により誘発される有糸分裂の停止を無効にし得るかどうかを試験した。ＨｅＬａ細胞を、トランスフェクトされた細胞を同定するために、対照ベクター若しくはＨＡ−ＭＬＫ３の存在下でｐＥＧＦＰとコトランスフェクトし、そしてその後、過剰のチミジンを使用してＧ１／Ｓの境界で同期させた。Ｇ１／Ｓ解放後５時間に、細胞を多様な濃度のＣＥＰ−１１００４とともに追加の８時間インキュベートした。有糸分裂の進行を、サイクリンＢ１についてイムノブロットすること、分裂指数を決定すること、およびＣｄｃ２キナーゼ活性をアッセイすることにより検査した。サイクリンＢ１レベルは、１００若しくは２００ｎＭのＣＥＰ−１１００４で処理した擬似トランスフェクト細胞中で上昇し、これは有糸分裂の停止と矛盾しない（図６Ａ）。対照的に、ＭＬＫ３でトランスフェクトした細胞は、外因性のＭＬＫ３がこれらの濃度のＣＥＰ−１１００４により誘発される有糸分裂の停止を予防する能力と矛盾しない、ＣＥＰ−１１００４処理後のより低いサイクリンＢ１レベルを有した（図６Ａ）。
【００６５】
次に、分裂指数を、変動する濃度のＣＥＰ−１１００４で処理した擬似若しくはＭＬＫ３でトランスフェクトした細胞でのＤＡＰＩ染色により測定した。期待されたとおり、擬似トランスフェクトした細胞は、有糸分裂の停止と矛盾しない、ＣＥＰ−１１００４処理後のより高レベルの有糸分裂細胞を示した（図６Ｂ）。対照的に、ＭＬＫ３でトランスフェクトした細胞は、ＣＥＰ−１１００４処理後に減少した分裂指数を示した（図６Ｂ）。最後に、１００若しくは２００ｎＭのＣＥＰ−１１００４で処理した、擬似若しくはＭＬＫ３でトランスフェクトした細胞中のＣｄｃ２キナーゼ活性を測定した。サイクリンＢ１発現に同様に、ＣＥＰ−１１００４で処理した擬似トランスフェクトした細胞は、ＭＬＫ３でトランスフェクトした細胞に比較してより高いＣｄｃ２活性を表した（図６Ｃ）。これらのデータは、外因性のＭＬＫ３が、ＣＥＰ−１１００４で誘発した有糸分裂の停止を克服することが可能であることを示唆する。
【実施例１４】
【００６６】
ＣＥＰ−１１００４は早期有糸分裂におけるヒストンＨ３リン酸化を遅らせる
ＣＥＰ−１１００４で誘発される有糸分裂の停止の機構を、有糸分裂特異的なリン酸化事象をモニターすることによりさらに検査した。セリン１０でのヒストンＨ３のリン酸化は有糸分裂の進行のマーカーとして一般に使用される（２２−２３）。ＨｅＬａ細胞を、Ｇ１／Ｓ期のチミジンブロックからの解放後５時間にＣＥＰ−１１００４で若しくは伴わずに処理し、そして追加の４時間インキュベートさせた。細胞をその後固定し、そして有糸分裂細胞を同定するために、サイクリンＢ１およびリン酸化型ヒストン（ｐｈｏｓｐｈ
−ｈｉｓｔｏｎｅ）Ｈ３（ｐＨ３）の免疫蛍光のため処理した。対照細胞での後期の間に、核エンベロープ崩壊の前の核中でサイクリンＢ１およびｐＨ３染色が観察された（図７Ａ）。対照的に、ＣＥＰ−１１００４で処理した細胞は、これらの細胞がサイクリンＢ１との強い核反応性を示したにもかかわらず、後期の間の核ｐＨ３染色を含有しなかった（図７Ａ）。早期有糸分裂細胞中での阻害されたｐＨ３染色に対するこの影響は、約２００ｎＭのＣＥＰ−１１００４用量で観察された（データは示されない）。これらのデータは、ＭＬＫタンパク質活性が有糸分裂の間のヒストンＨ３のリン酸化に直接若しくは間接的に関与していることを示唆する。これは、後期の細胞中での核および中心体へのＭＬＫ３のターゲッティングを示唆した、後期細胞中でのＭＬＫ３の局在化と矛盾しない（図７Ｂ）。
【００６７】
核エンベロープ崩壊（ＮＥＢ）前および後のｐＨ３染色の比較を行った。期待されたとおり、未処理の細胞中では、ｐＨ３染色は、ＮＥＢ前の早期有糸分裂およびＮＥＢ後の有糸分裂の後の段階で観察された（図８Ａ〜８Ｂ）。核エンベロープの完全性を、ｐ６２ヌクレオポリンタンパク質について染色することにより決定した（図８Ａ〜８Ｂ）。図７Ａ〜７Ｂと同様に、ＮＥＢ前の早期有糸分裂におけるｐＨ３染色は、ＣＥＰ−１１００４で処理した細胞中で観察されなかった（図８Ａ）。しかしながら、ｐＨ３染色は、未処理およびＣＥＰ−１１００４で処理した細胞の双方の前中期のＮＥＢ後に容易に明らかであった（図８Ｂ）。一緒に、これらのデータは、ＭＬＫ活性が、Ｃｄｃ２／サイクリンＢ１に依存しない機構による早期有糸分裂の間のヒストンＨ３のリン酸化に重要であることを示す。
【００６８】
ＣＥＰ−１１００４は早期有糸分裂中のＳ１０でのヒストンＨ３のリン酸化を明瞭に阻害したとは言え、ＭＬＫ３がリン酸化を直接司るのか若しくは間接的に司るのかは明らかでない。ヒストンＨ３は、ＰＫＡ、Ｍｓｋ１、ＥＲＫおよびｐ３８  ＭＡＰキナーゼを包含する多数のキナーゼにより、細胞周期を通じてリン酸化される（２７）。これらのキナーゼの全部がヒストンＨ３のＳ１０をリン酸化し得るとは言え、リン酸化の機能的役割は明確でなく、そして、それが起こる細胞周期の期に依存しうる。免疫蛍光データは、ＭＬＫ３が有糸分裂細胞の核に局在化することができ（図７Ｂ）、そしてＭＬＫ３によるヒストンＨ３の直接リン酸化を支援しうることを示唆する。ＭＬＫ３が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒストンＨ３のＳ１０をリン酸化する有糸分裂キナーゼＮＩＭＡに関係するという知見（２８）は、これと矛盾しない。
【００６９】
ＭＬＫ３がＥＲＫおよびｐ３８シグナル伝達経路を活性し得、また、セリン１０でのヒストンＨ３のリン酸化がストレス刺激に応答してＥＲＫおよびｐ３８  ＭＡＰキナーゼにより媒介されうる（２９）としても、これらのキナーゼがＮＥＢ前の早期有糸分裂の間のヒストンのリン酸化に寄与しているかどうかは未だ決定されるべきである。これはＮＥＢ前の早期有糸分裂細胞の核中の活性のＥＲＫの存在と矛盾しない（３０−３１）。有糸分裂の間のＳ１０でのヒストンＨ３のリン酸化を調節する他の潜在的な候補のキナーゼはオーロラＡおよびＢキナーゼであり、オーロラＢは、オーロラＡが主に中心体に局在化するために最もありそうな生理学的ヒストンＨ３キナーゼである（３２）。にもかかわらず、オーロラＢの枯渇は、他の有糸分裂キナーゼの関与を示すヒストンＨ３のＳ１０リン酸化を排除しない（２７）。オーロラキナーゼはリン酸化により調節されるとは言え、ＭＬＫタンパク質をオーロラキナーゼの調節と結びつける証拠は存在しない。
【００７０】
有糸分裂の進行の間のＭＬＫタンパク質の阻害後に観察される遅延されたヒストンＨ３リン酸化の意義は知られていない。有糸分裂の間のＳ１０でのヒストンＨ３のリン酸化の要件は論争中のままである。例えば、Ｓ１０でのヒストンＨ３のリン酸化が、テトラヒメナにおいて適正な染色体凝縮および有糸分裂の進行に必要とされることが示唆されている（３３−３４）とは言え、ヒストンＨ３のＳ１０のアラニン突然変異を含有する酵母変異
体株ならびに野性型株が増殖する（３５）。
【実施例１５】
【００７１】
ＣＥＰ−１１００４は有糸分裂の間に異常な紡錘体極形成を引き起こす
有糸分裂細胞中での紡錘体極の集成に対するＣＥＰ−１１００４の影響を検査した。同期させた細胞を、Ｓ期の終了時にＣＥＰ−１１００４で若しくは伴わずに４時間処理し、次いで、微小管のマーカーとしてのα−チューブリンおよび紡錘体極のマーカーとしてのγ−チューブリンについて免疫染色した。示されるとおり、ＣＥＰ−１１００４処理は有糸分裂細胞中で微小管の構造の有意の破壊を引き起こした（α−チューブリン、図９Ａ）が、しかし紡錘体極の数に対する影響を有しなかった（γ−チューブリン、図９Ａ）。加えて、ＣＥＰ−１１００４におけるＤＡＰＩ染色により測定されるところの染色体の構造は高度に解体された（図９Ａ）。有糸分裂細胞の６０％以上が異常な微小管構造を含有した（図９Ｂ）。ＣＥＰ−１１００４で４時間処理した間期細胞の検査は、未処理の細胞に比較して、微小管に対する明らかな影響を示さなかった（データは示されない）。従って、ＣＥＰ−１１００４で処理した細胞が中期を通って進行することの不能は、微小管の構造の欠陥および異常な紡錘体形成によることがありそうである。
【００７２】
ＭＬＫ３の過剰発現が微小管の不安定性を促進することが最近示唆された（１５）とは言え、ＭＬＫ３活性の阻害が有糸分裂細胞中での微小管の構造に対し何の効果を有するかは明らかでない。ＣＥＰ−１１００４への数時間以内の曝露の有糸分裂の微小管の構造に対する強い効果が示されているが、しかしながら、何のＭＬＫに調節される微小管関連のタンパク質が影響を受けているのかは不明である。異所性のＭＬＫ３の発現が、ＪＮＫ若しくはｐ３８  ＭＡＰキナーゼ活性化を伴わない機構により、ＨＥＫ２９３細胞中で微小管を不安定化することが示された（１５）。しかしながら、この観察結果がＭＬＫ３に独特であるのか若しくは過剰発現のアーチファクトであるのかは明らかでない。ＭＬＫ２および活性のＪＮＫもまた、微小管と共局在しかつモータータンパク質と相互作用することが示された（２４）。これらの相互作用が細胞周期依存性の様式で起こっていたかどうかは決定されなかった。アポトーシス刺激に対する細胞応答を媒介しうるゴルジ複合体タンパク質、ゴルジン−１６０の直接のＭＬＫ３リン酸化の新規の役割が記述されている（２５）。従って、ＭＬＫ３は、下流のＭＡＰキナーゼ活性化に依存しない細胞周期の間のＭＬＫ３の機能を説明するのに役立ちうる、付加的な基質を有しうる。
【００７３】
ＣＥＰ−１１００４によるＭＬＫ３阻害が、有糸分裂の進行に必要な微小管事象を破壊することにより細胞増殖を予防することが企図される。これは、最初、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用するＭＬＫ３のダウンレギュレーションが細胞増殖若しくはフローサイトメトリーによるＤＮＡ含量に影響しないことを示す未公表データを引用した以前の研究（１５）とよい対照をなすように思われうる。しかしながら、２件の研究を直接比較することは困難であり、また、いくつかの理由が、そのデータ（１５）と本明細書のデータの間の矛盾を説明し得る。第一に、以前の研究（１５）では、ＭＬＫ３は、ＨｅＬａ細胞と比較して、コルセミド処理に応答して、機能的Ｇ２期チェックポイントを報告によれば有するヒト骨肉腫ＳＡＯＳ２細胞株においてダウンレギュレートされた（２６）。第二に、ＲＮＡｉ処理はＭＬＫ３を完全に枯渇させるのに十分であることはありそうもなく、そして残存するＭＬＫ３はこれらの細胞中で有糸分裂の進行を促進するのに十分でありうる。第三に、ＭＬＫ３を枯渇させたＳＡＯＳ２細胞は、有糸分裂の進行の間にＭＬＫ３の代わりになるとみられる他の補償機構を可能にし得たＲＮＡｉとの２〜３日間のインキュベーションにより生成された。
【００７４】
以下の参考文献を本明細書で引用した：
【００７５】
【表１】
2007529540.tif 000003
【００７６】
【表２】
2007529540.tif 000004
【００７７】
本明細で挙げられるいかなる特許若しくは刊行物も、本発明が属する技術分野の当業者の水準を示す。これらの特許および刊行物は、各個々の刊行物がとりわけかつ個々に引用することにより組み込まれた場合と同一の程度まで、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００７８】
当業者は、本発明は目的を実施しかつ挙げられた最終目標および利点ならびにその中に固有のものに十分に適合されることを容易に認識するであろう。多様な改変および変形が、本発明の技術思想若しくは範囲から離れることなく本発明の実施においてなされ得ることが当業者に明らかであろう。請求の範囲により定義されるところの本発明の技術思想内に包含されるその中の変更および他の用途が、当業者に思い付くであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
本発明の上で列挙される特徴、利点および目的、ならびに明らかになるであろう他者が獲得されかつ詳細に理解され得る内容、より具体的には上で簡潔に要約された本発明の記述が、添付の図面で具体的に説明されるそのある態様を参照することにより有されうる。
これらの図面は本明細の一部を形成する。しかしながら、添付の図面は本発明の好ましい態様を具体的に説明し、そして従ってそれらの範囲の制限とみなされるべきでないことに注意すべきである。
【図１Ａ−１Ｂ】ＭＬＫ活性の阻害が細胞増殖を阻害することを示す。図１Ａは、７２時間までのＣＥＰ−１１００４（５００ｎＭ）の非存在（黒四角若しくは丸）または存在（白四角若しくは丸）下で増殖させたＨｅＬａ若しくはＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を示す。細胞の数を時間０および各条件で２４、４８若しくは７２時間後にカウントした。図１Ｂは、変動する用量のＣＥＰ−１１００４の存在下でプレーティングした、トリプシン処理したＡ５４９細胞（処置あたり１０００）を示す。１４日後に、生じるコロニーをクリスタルバイオレットで染色しかつカウントした。同様の結果が、ＨｅＬａおよびＳＵＭ１５２乳癌細胞で得られた。
【図２Ａ−２Ｄ】ＣＥＰ−１１００４が形質転換細胞でＧ２／Ｍ期停止を引き起こすことを示す。ＨｅＬａ（図２Ａ）、ＨＥＫ２９３（図２Ｂ）、ＮＩＨ３Ｔ３（図２Ｃ）若しくはＭＲＣ５（図２Ｄ）細胞をＣＥＰ−１１００４（５００ｎＭ）の非存在（対照）若しくは存在下で１５時間処理し、そして細胞中の２Ｎ若しくは４Ｎ  ＤＮＡ含量を、ヨウ化プロピジウム染色に続くＦＡＣＳ分析により測定した。
【図３Ａ−３Ｄ】後期Ｓ期／早期Ｇ２期の間の同期させた細胞のＣＥＰ−１１００４処理がＧ２／Ｍ期停止を引き起こすことを示す。ＨｅＬａ細胞を、二重チミジンブロックによりＧ１／Ｓ期の境界で同期させ、細胞周期に戻し、そしてＣＥＰ−１１００４（５００ｎＭ）の非存在（図３Ａ）若しくは存在（図３Ｂ）下で解放後５時間処理した。細胞を、Ｇ１／Ｓ解放後の示される多様な時点でトリプシン処理により収集し、ＤＮＡをヨウ化プロピジウムで染色し、そしてＧ１、Ｓ若しくはＧ２／Ｍ期の細胞の割合をＦＡＣＳにより測定した。図３Ｃにおいて、ＨｅＬａ細胞を図３Ａでのとおり同期させ、細胞周期に戻し、そしてＣＥＰ−１１００４（５００ｎＭ）の非存在若しくは存在下で処理した。多様な時点で収集したライセートを、サイクリンＢ１（上図）若しくはタンパク質負荷対照としての全ＭＫＫ２（下図）についてイムノブロットした。図３Ｄにおいて、同期させた細胞中のヒストンキナーゼ活性を、Ｃｄｃ２の免疫沈降後の未処理（黒丸）若しくはＣＥＰ−１１００４処理（白丸）細胞中で測定した。データは３回の独立した実験からの平均および標準誤差を示す。
【図４Ａ−４Ｅ】ＣＥＰ−１１００４はＭＬＫ３を標的とするがしかしＤＬＫ若しくはＭＫＫ１活性を標的としないことを示す。図４Ａにおいて、ＨｅＬａ細胞を、ＨＡ標識ＭＬＫ４の野性型（ＷＴ）若しくは触媒的に不活性のＭＬＫ３（ＫＲ）変異体でトランスフェクトした。ＭＬＫ３野性型でトランスフェクトした細胞を、ＣＥＰ−１１００４（５００ｎＭ）とともに若しくは伴わずに収集前４時間インキュベートした。野性型および不活性のＭＬＫ３をＭＬＫ３抗体で免疫沈降させ、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの基質としてのＭＢＰとともにインキュベートした。該グラフは、各条件下でのＭＢＰ中へのリン酸取込みの相対量を示し、また、イムノブロットは免疫沈降物中のＭＬＫ３タンパク質の量を示す。図４Ｂにおいて、ＨｅＬａ細胞を、ＨＡ標識ＪＮＫ１およびＭＬＫ３野性型若しくはＦｌａｇ標識ＤＬＫでトランスフェクトし、そしてその後、ＣＥＰ−１１００４（５００ｎＭ）の非存在若しくは存在下で収集前４時間処理した。活性のＪＮＫ（ｐＪＮＫ）、ＨＡ−ＪＮＫ１、Ｆｌａｇ−ＤＬＫ若しくはＨＡ−ＭＬＫ３のイムノブロットをそれぞれ上から下の図に示す。図４Ｃにおいて、ＨｅＬａ細胞を、野性型（ＷＴ）ＭＬＫ３、不活性（ＫＲ）ＭＬＫ３、若しくは構成的に活性のＭＫＫ１変異体（ＣＡ）でトランスフェクトし、そしてその後ＣＥＰ−１１００４（５００ｎＭ）で若しくは伴わずに処理した。活性のＥＲＫの相対レベルを、リン酸化型特異的ＥＲＫ１／２（ｐｐＥＲＫ）抗体でイムノブロットすることにより測定した（上図）。α−チューブリンについてイムノブロットすることによりタンパク質負荷量をモニターした（下図）。図４Ｄにおいて、ＨｅＬａ細胞を、ＨＡ−ＪＮＫ１およびＧＦＰ標識ＭＬＫ２若しくはＨＡ−ＭＬＫ３でコトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をその後、多様な濃度のＣＥＰ−１１００４で１時間処理し、そして、リン酸化型特異的ＪＮＫ１／２抗体（ｐＪＮＫ、上図）でイムノブロットすることによりＪＮＫ活性を測定した。ＨＡ−ＪＮＫ１、ＧＦＰ−ＭＬＫ２若しくはＨＡ−ＭＬＫ３の発現を下図に示す。ＨＡ−ＭＬＫ３ブロット中の上および下矢印はそれぞれＭＬＫ３のリン酸化および脱リン酸化された形態を示す。図４Ｅは、ＭＬＫ２（黒四角）若しくはＭＬＫ３（白四角）を発現する細胞中でのデンシトメトリーによる全ＪＮＫに対するｐＪＮＫの比を測定することにより定量されるところの相対ＪＮＫ活性のグラフである。
【図５Ａ−５Ｂ】ＣＥＰ−１１００４が前中期での細胞周期の停止を引き起こすことを示す。カバーガラス上で増殖させたＨｅＬａ細胞を、過剰のチミジンでＧ１／Ｓ境界で同期させ、そして細胞周期に戻した。解放５時間後に、細胞をＣＥＰ−１１００４（５００ｎＭ）の非存在若しくは存在下で追加の４若しくは６時間（Ｇ１／Ｓ解放後９若しくは１１時間の累積時間）処理した。図５Ａにおいて、前期（Ｐ）、前中期（ＰＭ）、中期（Ｍ期）若しくは後期／終期（ＡＴ）の細胞の割合を、対照（白棒）若しくはＣＥＰ−１１００４処理（黒棒）細胞中の染色体のＤＡＰＩ染色により決定した。左および右のグラフは、Ｇ１／Ｓ期の解放後それぞれ９および１１時間の有糸分裂細胞の割合を表す。データは３回の独立した実験からの平均および標準誤差を表す。図５Ｂにおいて、前中期の細胞の数を、増大する濃度のＣＥＰ−１１００４（Ｇ１／Ｓ期の解放後５時間に添加した）での処理後のＧ１／Ｓ期の解放後１１時間にカウントした。３００〜３５０細胞を各濃度でカウントした。
【図６Ａ−６Ｃ】外因性のＭＬＫ３がＣＥＰ−１１００４で誘発された有糸分裂停止を阻害することを示す。ＨｅＬａ細胞を、ＨＡ標識ＭＬＫ３野性型の存在若しくは非存在（擬似）下でｐＥＧＦＰとコトランスフェクトし、そしてその後二重チミジンブロックにより同期させた。Ｇ１／Ｓ解放後５時間に、細胞を多様な濃度のＣＥＰ−１１００４（７５、１００、２００ｎＭ）で８時間処理し、そしてその後収集した（Ｇ１／Ｓ解放後１３時間）。図６Ａは、サイクリンＢ１（上図）、ＭＬＫ３（中図）およびタンパク質負荷対照としてのβ−アクチン（下図）のイムノブロットを示す。図６Ｂにおいて、ＭＬＫ３を伴い若しくは伴わずにｐＥＧＦＰでトランスフェクトした、同期させたＨｅＬａ細胞をカバーガラス上で増殖させ、多様な濃度のＣＥＰ−１１００４で若しくは伴わずに処理し、Ｇ１／Ｓからの解放後１３時間に固定し、そしてＤＡＰＩで染色した。有糸分裂細胞（前期、前中期、中期、および後期／終期の細胞）の数を、ＧＦＰ陽性細胞（黒棒）若しくはＭＬＫ３を共発現するＧＦＰ陽性細胞（白棒）中でのＤＡＰＩ染色により測定した。図６Ｃは、ｐＥＧＦＰ単独若しくはｐＥＧＦＰおよびＭＬＫ３でトランスフェクトした細胞中でのＧ１／Ｓ解放１３時間後に収集したライセート中の相対Ｃｄｃ２キナーゼ活性を示す。ヒストン基質中への放射標識リン酸の取込み（上図）および免疫沈降物中のＣｄｃ２についてのイムノブロット（下図）を示す。ＩｇＧ（Ｌ）は抗体Ｌ鎖を示す。
【図７Ａ−７Ｂ】ＣＥＰ−１１００４が早期後期の核ヒストンＨ３リン酸化を遅らせることを示す。カバーガラス上で増殖させたＨｅＬａ細胞を過剰のチミジンでＧ１／Ｓで同期させ、そして細胞周期に戻した。解放後５時間に、細胞をＣＥＰ−１１００４（５００ｎＭ）の非存在若しくは存在下でインキュベートした。追加の４時間のインキュベーション後（Ｇ１／Ｓ解放９時間後）に細胞を固定し、そして上および中央の図でそれぞれサイクリンＢ１若しくはリン酸化されたヒストンＨ３（ｐＨ３）について共免疫染色した（図７Ａ）。ＭＬＫ３およびサイクリンＢ１の発現をそれぞれ上および中央の図に示す（図７Ｂ）。有糸分裂細胞（矢印により示される）を、核サイクリンＢ１および／若しくはｐＨ３染色の存在により測定した。図７Ａ〜７Ｂの細胞はＤＡＰＩで対染色した（下図）。
【図８Ａ−８Ｂ】ＣＥＰ−１１００４が核エンベロープ崩壊前のヒストンＨ３リン酸化を阻害することを示す。ＨｅＬａ細胞を、図５Ａ−５Ｂで記述されるとおり免疫染色のため調製した。細胞をｐＨ３（上図）および核エンベロープのマーカーとしてのヌクレオポリン（ｐ６２、中図）について染色した。ＣＥＰ−１１００４の非存在若しくは存在下で処理した後期（核エンベロープ崩壊前）（図８Ａ）若しくは前中期（核エンベロープ崩壊後）（図８Ｂ）の細胞を同定した。矢印により示されるところの有糸分裂細胞は、凝縮した染色体のＤＡＰＩ染色（下図）により同定された。隣接する間期細胞を比較のため示す。
【図９Ａ−９Ｂ】ＣＥＰ−１１００４が異常な有糸分裂紡錘体を誘導することを示す。カバーガラス上で増殖させたＨｅＬａ細胞を、記述された図５のとおりＣＥＰ−１１００４の非存在若しくは存在下で処理した。図９Ａにおいて、細胞をＧ１／Ｓブロックからの解放後９時間に収集し、そして有糸分裂紡錘体の構成を、微小管および紡錘体極を同定するためα若しくはγ−チューブリンについての免疫染色により評価した。細胞を、有糸分裂染色体を同定するためＤＡＰＩで対染色した。図９Ｂにおいて、対照若しくはＣＥＰ−１１００４処理した細胞中の異常な紡錘体を伴う有糸分裂細胞の割合を３回の別個の実験で定量した。最低３００の有糸分裂細胞を各実験において各条件下でカウントした。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ−２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ｂ】
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【図９Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【配列表】
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