【手続補正書】
【提出日】平成28年8月25日(2016.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅の間において高分子量生成物の形成が妨害されるか又は抑制される、試料中の核酸標的を増幅及び検出するための方法であって、当該方法が、以下の：
ａ）当該試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、少なくとも１種のアンプリコンを生成するための少なくとも１種の伸長フォワードプライマー及び／又は少なくとも１種の伸長リバースプライマーと、該アンプリコンに特異的な少なくとも１種の検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、該伸長フォワードプライマー及び／又はリバースプライマーの少なくとも１種は、当該プライマーの５’末端に付加されるアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリＮ配列を含むことを特徴とし、当該ポリN配列が、ポリＡ、ポリＴ、ポリＡＴ、ポリＵ、ポリＣ、及びポリＧ配列からなる群から選ばれ、そして２〜１０ヌクレオチドの長さである、工程；
ｂ）該核酸を該増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な条件下で一定の時間インキュベートする工程であって、該増幅反応は５０サイクルより前には停止されない工程；及び
ｃ）該検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素を介して該アンプリコンを検出する工程、とを含んでなる方法。
【請求項２】
該ポリＮ配列は、４〜６ヌクレオチドの長さからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該標的核酸はウイルス核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該ウイルス核酸はＨＣＶの核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を含む酵素の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該ポリＮ配列は、プライマーの５’末端に付加されるアデノシン（Ａ）又はチミジン（Ｔ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、かつ標的配列に非相補的であり、インキュベーション工程ｂ）は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を含む酵素の存在下で行われる、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜７に記載の方法であって、少なくとも１種の該伸長フォワードプライマーは、
ＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号３）、
ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号５）、
ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号７）、
ＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号９）、
ＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１１）、
ＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１３）、
ＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１５）、
ＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＴＣ（配列番号１９）、
ＡＴＡＴＡＴＧＴＡＣＧＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＧＧＡＡＡ（配列番号２１）、及び
ＡＡＡＣＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＴＣ（配列番号２３）、からなる群の１つの配列を含み、及び／又は、少なくとも１種の該伸長リバースプライマーは、
ＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号４）、
ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号６）、
ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号８）、
ＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１０）、
ＴＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１２）、
ＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１４）、
ＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１６）、
ＡＡＡＴＧＧＣＧＴＣＴＣＣＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧ（配列番号２０）、及び
ＡＴＡＴＡＴＣＴＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＣＧＧＴ（配列番号２２）、からなる群の１つの配列を含んでなる方法。
【請求項８】
少なくとも１種の該検出可能なプローブは、
（配列番号２７）、（配列番号２８）、（配列番号２９）、（配列番号３０）、及びこれらの配列のそれぞれの相補配列又はサブ配列、からなる群の１つの配列を含んでなる、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＣＲ増幅中の高分子量生成物の形成を妨害又は抑制するための方法であって、該方法は、
ａ）試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、少なくとも１種のアンプリコンを生成するための少なくとも１種の伸長フォワードプライマー及び／又は少なくとも１種の伸長リバースプライマーと、該アンプリコンに特異的な少なくとも１種の検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、該伸長フォワードプライマー及び／又はリバースプライマーは、プライマーの５’末端に付加されるアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリＮ配列を含み当該ポリＮ配列が、ポリＡ、ポリＴ、ポリＡＴ、ポリＵ、ポリＣ、及びポリＧ配列からなる群から選ばれ、そして２〜１０ヌクレオチドの長さである、工程；
ｂ）該核酸を該増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な条件下で所定の時間インキュベートする工程であって、該増幅反応は５０サイクルより前には停止されないことを特徴とする、工程；及び
ｃ）該検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素を介して該アンプリコンを検出する工程、とを含んでなる方法。
【請求項１０】
該ポリＮ配列は、４〜６ヌクレオチドの長さからなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該標的核酸はウイルス核酸である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
該ウイルス核酸はＨＣＶの核酸である、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ）は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を含む酵素の存在下で行われる、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれかに記載の方法であって、少なくとも１種の該伸長フォワードプライマーは、
ＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号３）、
ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号５）、
ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号７）、
ＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号９）、
ＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１１）、
ＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１３）、
ＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１５）、
ＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＴＣ（配列番号１９）、
ＡＴＡＴＡＴＧＴＡＣＧＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＧＧＡＡＡ（配列番号２１）、及び
ＡＡＡＣＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＴＣ（配列番号２３）、からなる群の１つの配列を含み、及び／又は、少なくとも１種の該伸長リバースプライマーは、
ＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号４）、
ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号６）、
ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号８）、
ＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１０）、
ＴＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１２）、
ＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１４）、
ＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１６）、
ＡＡＡＴＧＧＣＧＴＣＴＣＣＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧ（配列番号２０）、及び
ＡＴＡＴＡＴＣＴＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＣＧＧＴ（配列番号２２）、からなる群の１つの配列を含んでなる方法。
【請求項１５】
少なくとも１種の該検出可能なプローブは、
（配列番号２７）、（配列番号２８）、（配列番号２９）、（配列番号３０）、及びこれらの配列のそれぞれの相補配列又はサブ配列、からなる群の１つの配列を含んでなる、請求項９〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
５０サイクルより前には停止されないＰＣＲ増幅中に、高分子量生成物の形成を防止又は抑制するための、各プライマーの５’末端に付加されるアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなるポリＮ配列を、それぞれが含んでなり、ここで当該ポリN配列が、ポリＡ、ポリＴ、ポリＡＴ、ポリＵ、ポリＣ、及びポリＧ配列からなる群から選ばれ、そして２〜１０ヌクレオチドの長さである、少なくとも１種の伸長フォワードプライマー及び／又は少なくとも１つの伸長リバースプライマーの使用。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法のためのキットの使用であって、当該キットが、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素と、
（ｂ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素と、
（ｃ）ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、
（ｄ）少なくとも１種のアンプリコンを生成するための、少なくとも１種の伸長フォワードプライマー及び／又は少なくとも１つの伸長リバースプライマーと、及び
（ｅ）該アンプリコンに特異的な少なくとも１種の検出可能プローブ、又はＤＮＡ結合色素とを含んでなり、
少なくとも１種の該伸長フォワードプライマー及び／又はリバースプライマーは、プライマーの５’末端に付加される４〜１０ヌクレオチドの長さの、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的なポリＮ配列を含み、ここで当該ポリN配列が、ポリＡ、ポリＴ、ポリＡＴ、ポリＵ、ポリＣ、及びポリＧ配列からなる群から選ばれ、そして２〜１０ヌクレオチドの長さであることを特徴とするキットの使用。