(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病患者の特定の脳領域内でＨＩＦ３ａをコードする遺伝の発現差を開示する。この知見に基づいて、本発明は、被験者中で神経変性疾患、特にアルツハイマー病、を診断しまたは予後診断するための、または被験者がこのような疾患を発症するリスクが上昇しているかどうかを決定するための方法を提供する。さらに、本発明は、ＨＩＦ３ａ遺伝子およびそれに対応する遺伝子産物を用いて、アルツハイマー病および関連する神経変性疾患を治療または予防する治療的および予防的方法を提供する。神経変性疾患の物質を調節するためのスクリーニングの方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者において神経変性疾患を診断または予測診断する、または被験者が前記疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定する、
前記被験者由来の試料中の
（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体、
のレベルまたは活性を測定し、および前記レベルまたは前記活性、または前記転写または翻訳産物の前記レベルおよび前記活性の両方を、既知の健康状態を表す参照値とおよび／または既知の疾患状態を表す参照値と比較し、および前記レベルおよび／または前記活性が既知の健康状態を表す参照値と比較して変動しまたは改変され、および／または既知の疾患状態を表す参照値と同様または等しく、それによって前記被験者において前記神経変性疾患を診断または予測診断すること、または前記被験者が前記神経変性疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定すること
を含む方法。
【請求項２】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
下記の段階によって、被験者において神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断または予測診断する、または被験者のそのような疾患を発症する傾向のリスク、または素因を判定するためのキットであって、
ａ）（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬および（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬、から成る群から選択された少なくとも一つの試薬
を含み、それによって、下記の手順（ｉ）及び（ｉｉ）によってアルツハイマー病を診断または予測診断する、または発症する高いリスクがあるかどうかを判定する前記キット。
（ｉ）前記被験者に由来する試料中の、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物および／または翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を検出、および（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物および／または翻訳産物の前記レベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を、既知の健康状態を表す参照値とおよび／または既知の疾患状態を表す参照値と比較し、および前記転写産物および／または前記翻訳産物の前記レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が、既知の健康状態を表す参照値と比較して変化し、および／または既知の疾患状態を表す参照値と同様または等しい。
【請求項４】
ＨＩＦ３ａまたはその断片、または誘導体、または変異体をコードする非天然遺伝子配列を含む、遺伝子操作非ヒト動物。 
【請求項５】
非ヒト動物が、哺乳類、好ましくはげっ歯類、より好ましくはマウス、ラットまたはモルモット、または非脊椎動物、好ましくは昆虫、より好ましくはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）といったハエである、請求項４に記載の遺伝子操作非ヒト動物。
【請求項６】
前記遺伝子操作の発現が、神経変性疾患に類似した神経病理の症状、特にＡＤに類似した症状を発症する素因を示すおよび／または症状を示す前記非ヒト動物を結果として生じる、請求項４および５に記載の遺伝子操作非ヒト動物。 
【請求項７】
前記非ヒト動物を遺伝子操作するのに用いられた遺伝子の発現によって引き起こされた作用のために、前記遺伝子操作の発現が、神経変性疾患に類似した症状を発症するリスクが低い、特にＡＤに類似した症状を発症するリスクが低い、および／またはＡＤ症状の低減を示すおよび／またはＡＤの症状を有しない前記非ヒト動物を結果として生じる、請求項４および５に記載の遺伝子操作非ヒト動物。
【請求項８】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための診断薬および治療薬の開発において、化合物、物質、および調節因子を、スクリーニング、試験、および評価するための、請求項４から７に記載の遺伝子操作非ヒト動物の使用。
【請求項９】
（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、および／または
（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
から成る群から選択された少なくとも一種類の物質の活性および／またはレベルの調節因子。
【請求項１０】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病、または関連する疾患または障害の調節因子についての、
（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、および／または
（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
から成る群から選択された一種類以上の物質のスクリーニングのための測定法であって、
（ａ）細胞を被験化合物と接触させること；
（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；
（ｃ）前記被験化合物と接触させていない対照細胞中の、（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；および
（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の細胞中の物質のレベルおよび／または活性を比較するが、接触させた細胞中の物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患または障害の調節因子であることを示すこと
を含む前記方法。 
【請求項１１】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病、または関連する疾患または障害の調節因子についての、
（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、および／または
（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
から成る群から選択された一種類以上の物質のスクリーニングのための測定法であって、
（ａ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質に関して、神経変性疾患または関連する疾患または障害の症状を発症する素因があるかまたは既に発症している被験動物に、被験化合物を投与すること；
（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；
（ｃ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質に関して、およびそのような被験化合物が投与されていない、神経変性疾患または関連する疾患または障害の症状を発症する素因があるかまたは既に発症している対応する対照動物において、（ｉ）または（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の活性および／またはレベルを測定すること；
（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の動物における物質の活性および／またはレベルを比較するが、被験動物における物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患または障害の調節因子であることを示すこと
を含む前記方法。
【請求項１２】
前記被験動物および／または前記対照動物が、天然のＨＩＦ３ａ遺伝子転写調節配列ではない転写調節配列の調節下にある、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、またはその断片、または誘導体、または変異体を発現する遺伝子操作非ヒト動物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
化合物の試験のための、好ましくは複数の化合物のスクリーニングのための、ＨＩＦ３ａ翻訳産物またはその断片、または誘導体、または変異体への前記化合物の結合の程度を決定するための分析法であって、
（ｉ）前記ＨＩＦ３ａ翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加えること；
（ｉｉ）前記結合についてスクリーニングされる検出可能な、特に蛍光標識される化合物、または蛍光標識される複数の化合物を前記複数の容器に加えること；
（ｉｉｉ）前記ＨＩＦ３ａ翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体、および前記検出可能な、特に蛍光標識される化合物または蛍光標識される複数の化合物をインキュベートすること；
（ｉｖ）前記ＨＩＦ３ａ翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、またはその変異体と相関する好ましくは蛍光量を測定すること；
（ｖ）一種類以上の前記化合物による前記ＨＩＦ３ａ翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への結合の程度を判定すること
を含む分析法。
【請求項１４】
神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を検出するための診断標的としての、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体である、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５のタンパク質分子の使用。
【請求項１５】
神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を予防する、または治療する、または改善する試薬または化合物についてのスクリーニング標的としての使用のための、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体である、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５のタンパク質分子の使用。
【請求項１６】
被験者由来の試料中の細胞の病理状態を検出するための、免疫原と特異的に免疫反応性である抗体の使用であって、免疫原がＨＩＦ３ａ、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５をコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体であり、前記抗体を用いた前記細胞の免疫細胞化学染色を含み、ここで既知の健康状態を表す細胞と比較した前記細胞における染色の程度の変化、または染色パターンの変化が、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病と関係する前記細胞の病理状態を示す、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者における神経変性疾患の進行を診断、予測、および監視する方法に関する。さらに、神経変性疾患の調節物質の治療コントロールおよびスクリーニングの方法を提供する。本発明はまた、医薬組成物、キット、および組み換え動物モデルも開示する。
【０００２】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病（ＡＤ）は、患者の生活を強く衰弱させる影響を与える。さらに、これらの疾患は、甚大な健康上の、社会的な、および経済的な負担を構成する。ＡＤは最も一般的な神経変性疾患であり、痴呆の症例全体の約７０％を占め、６５歳超の人口の約１０％および８５歳超の最大４５％が罹患する、おそらく最も破壊的な加齢関連神経変性症状である（最近の総説はヴィッカーズ（Ｖｉｃｋｅｒｓ）ら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０００，６０；１３９−１６５を参照）。現在、これは米国、欧州、および日本において推定約１２００万例に達する。この状況は、発展途上国における高齢者数の人口統計上の増加（「ベビーブーマーの高齢化」）に伴い不可避的に悪化する。ＡＤを有する人の脳に生じる神経病理学的な顕著な特徴は、アミロイド−βタンパク質で構成される老人斑、および異常な線維状構造の出現および神経原線維変化の形成と一致して現れる著しい細胞骨格変化である。 
【０００３】
アミロイド−β（Ａβ）タンパク質は、さまざまな種類のプロテアーゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の開裂から生じる。β／γ−セクレターゼによる開裂はさまざまな長さのＡβペプチドの形成に繋がり、典型的には、４０アミノ酸から構成される短くより可溶性が高く凝集が遅いペプチド、および細胞外で迅速に凝集し特徴的なアミロイド斑を形成する、より長い４２アミノ酸ペプチドである（セルコー（Ｓｅｌｋｏｅ），Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ ２００１，８１；７４１−６６；グリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ）ら，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０００，５；Ｄ７２−８３）。それらは主に大脳皮質および海馬に見出される。脳における毒性のＡβ沈着物の生成は、ＡＤの経過のごく早期に開始し、およびＡＤの病理に繋がるその後の破壊過程の中心的存在であると論じられている。ＡＤの他の病理学的な顕著な特徴は、神経原線維変化（ＮＦＴ）および、ニューロピル・スレッドと表現される異常な神経突起である（ブラーク（ブラーク）およびブラーク（ブラーク），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １９９１，８２；２３９−２５９）。ＮＦＴは神経細胞の内部に出現し、および互いに絡まり合う対のらせん状線維を形成する、化学的に変化したタウタンパク質から成る。神経原線維変化の出現およびその数の増加は、ＡＤの臨床的重症度とよく相関する（シュミット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）ら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０００，５５；３７０−３７６）。
【０００４】
ＡＤは進行性疾患であり、初期の記憶形成の障害を伴い、および最終的にはより高次の認知機能の完全な衰退に繋がる。認知障害には、とりわけ、記憶障害、失語症、失認症、および実行機能の喪失がある。ＡＤの病因の特徴的性質は、脳の特定の領域および神経細胞の部分集団の、変性過程に対する選択的な不安定性である。具体的には、側頭葉領域および海馬は、疾患の経過中に早期におよびより重度に冒される。一方、前頭皮質、後頭皮質、および小脳内の神経細胞は大体は損なわれないままであり、神経変性から守られている（テリー（Ｔｅｒｒｙ）ら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９８１，１０；１８４−９２）。ＡＤの発症年齢は５０年の範囲内でさまざまであり、６５歳未満の人で起こる早発型ＡＤ、６５歳超の人で起こる遅発型ＡＤがある。
【０００５】
現在、ＡＤに治療法は無く、ＡＤの進行を止めるか、または高確率で死亡前にＡＤを診断するためさえ、有効な方法は無い。個人がＡＤを発症する素因となるいくつかのリスク因子が特定されており、中でも非常に重要なのは、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子（ＡｐｏＥ）の既存の３つの異なる対立遺伝子（イプシロン２、３、および４）のイプシロン４対立遺伝子である（シュトリトマター（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ）ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９３，９０；１９７７−８１；ローゼス（Ｒｏｓｅｓ），Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９８，８５５；７３８−４３）。多型血漿タンパク質ＡｐｏＥは、低密度タンパク脂質受容体と結合することによって細胞内コレステロールおよびリン酸輸送の役割を果たし、および神経突起の成長及び再生にも役割を果たしているようである。さらに感受性遺伝子および疾患を−多型と関連付けて−検出する試みは、ヒト染色体１０および１２上の特異的領域および遺伝子が遅発性ＡＤと関連しうるとの仮定を導いた（マイヤー（Ｍｙｅｒｓ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０００，２９０：２３０４−５；バートラム（Ｂｅｒｔｒａｍ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０００，２９０：２３０３；スコット（Ｓｃｏｔｔ）ら，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２０００，６６：９２２−３２）。染色体２１上のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、染色体１４上のプレセニリン−１、および染色体１上のプレセニリン−２の遺伝子における遺伝的欠損を原因とするＡＤの早期発症の例はまれであるが、遅発性散発性ＡＤの優勢な形態の病因学的由来はこれまで未知であった。
【０００６】
神経変性疾患の遅い発症および複雑な病因は、治療用および診断用薬の開発に困難な問題をもたらす。医薬標的および診断マーカーの候補のプールを拡大することが極めて重大である。したがって、神経疾患の病因に関する洞察を与えること、およびこれらの疾患の治療の診断および開発に特に適した方法、材料、物質、組成物、および動物モデルを提供することは、本発明の目的である。この目的は、独立請求項の特徴によって解決される。下位請求項は、本発明の好ましい実施形態を定義する。
【０００７】
本発明は、低酸素誘導性因子３（ＨＩＦ３α、ＨＩＦ３アルファ、ＨＩＦ−３アルファ）、別名ＨＩＦ３ａをコードするための遺伝子、およびヒトアルツハイマー病の脳試料中のタンパク質産物の、検出および無調節な発現差に基づく。低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）は、「ＰＡＳ」ドメインを含有するより多くのタンパク質に属する。略語「ＰＡＳ」は、３つのタンパク質−ファミリー：ＰＥＲ（ショウジョウバエピリオド遺伝子のタンパク質）、ＡＲＮＴ（ＡＨＲ細胞核の移行分子）およびＳＩＭ（ショウジョウバエｓｉｎｇｌｅ−ｍｉｎｄｅｄ遺伝子座のタンパク質）に由来する。ＰＡＳドメインは、他のＰＡＳタンパク質との同型相互作用またはシャペロン類との異型相互作用のいずれかに参画する。最も高頻度には、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフ（ｂＨＬＨ）がＰＡＳドメインのＮ末端にみとめられ、他のｂＨＬＨ−ＰＡＳタンパク質のための同型二量化ドメインとして機能する。両ドメインは、ＤＮＡ結合および二量化特異性を有する（チアン（Ｊｉａｎｇ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１：１７７７１−１７７７８）。Ｃ末端では、ＰＡＳタンパク質は転写活性のあるドメイン、たとえば、一つ以上の低酸素応答ドメイン（ＨＲＤ）を含有してもよい。ＰＡＳタンパク質は、様々なシグナル伝達経路に関与し、環境の変化、たとえば低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）系によって媒介される大気中および細胞内酸素の変化への適合において、役割を果たす（グ（Ｇｕ）ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０００，４０：５１９−５６１）。ＨＩＦ類は、ｂＨＬＨ−ＰＡＳタンパク質のスーパーファミリーに属し、および、α−およびβ−サブユニットから成るヘテロ二量体性転写因子（ＴＦ）である。ＨＩＦ１−およびＨＩＦ２−ＴＦｓのα型サブユニットでは、その発現レベルは、細胞の低酸素状態、鉄キレート剤、活性酸素種（ＲＯＳ）、遷移金属、および二価陽イオン（すなわちＣｏ２＋およびその他）への曝露に応答して上方調節されることが示されてきた。これら物質は、α−サブユニットタンパク質を安定させ、これによって、β−サブユニットとの二量化、およびそれゆえ、転写活性のあるＨＩＦ ＤＮＡ結合複合体の形成を可能にする（ホーゲンエッシュ（Ｈｏｇｅｎｅｓｃｈ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７１：８５８１−８５９３、およびワン（Ｗａｎｇ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５，９２：５５１０−５５１４）。ＨＩＦα−サブユニットは継続して合成されるが、しかし、正常酸素圧条件下でのユビキチンープロテアソーム系による急速な分解のため、低酸素細胞においてのみ存在する。したがって、α型タンパク質の低酸素調節は、転写活性のあるＨＩＦ−複合体の形成を導く。β−サブユニットは、構成的に発現され、および対応するα−サブユニットと相互作用し、核に移行した複合体を形成する。よく研究されたβ−サブユニット、ＨＩＦ１βは、アリル炭化水素受容体の細胞核移行分子（ＡＲＮＴ）（ウッド（Ｗｏｏｄ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１：１５１１７−１５１２３、およびワン（Ｗａｎｇ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５，９２：５５１０−５５１４）である。いくつかの低酸素感受性遺伝子が同定された。それらは、各遺伝子の遺伝子プロモーターの５’位または３’位に配置されているヘテロ二量体性ＨＩＦ複合体を低酸素応答要素（ＨＲＥ）に結合させることによって調節される。このようなＨＩＦ調節された遺伝子産物は、たとえば、赤血球生成の調節に対して責任を負うペプチドホルモンエリスロポエチン（ＥＰＯ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）といった血管新生因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、エネルギー代謝に関与する様々な糖分解酵素およびＧＬＵＴ１といったブドウ糖輸送担体である（グ（Ｇｕ）ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０００，４０：５１９−５６１）。ＨＩＦタンパク質は、タンパク質を含有する非ＰＡＳ、たとえば低酸素誘導アポトーシスにおいて役割を果たすｐ５３、とも相互作用する。さらに、ＨＩＦ１αは、フォンヒッペルリンドウ腫瘍抑制遺伝子産物（ｐＶＨＬ）と相互反応し、プロテアソームの分解につながる（Ｍａｘｗｅｌｌら， Ｎａｔｕｒｅ １９９９，３９９：２７１−２７５）。酸素の存在時には、ｐＶＨＬは、ポリユビキチン化するＨＩＦ複合体のα型タンパク質をヒドロキシル化しおよび標的化する（イワン（Ｉｖａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２，９９：１３４５９−１３４６４、およびチャン（Ｃｈａｎ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４：１２１１５−１２１２３）。現在のところ、低酸素調節のメカニズムはよく研究されたＨＩＦ１αタンパク質に基づくが、他の既知のＨＩＦα−ファミリーメンバーも同様に調節されると推測される（セメンザ（Ｓｅｍｅｎｚａ）およびワン（Ｗａｎｇ），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２，１２：５４４７−５４５４）。
【０００８】
ヒトの脳が酸素に高度に依存していることは周知である。脳は全体重の約２％を構成しているが、呼吸による酸素摂取の２０％を利用する。酸素欠乏は、数分以内に脳内に損傷を引き起こす。最近発表された再検討は、低酸素症がどのようにして、進行性機能障害、アポトーシス、壊死、および脳細胞死を引き起こすかの概略を示す（バザン（Ｂａｚａｎ）ら，Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２００２，２６：２８３−２９８）。今日まで、ＨＩＦタンパク質のアルファファミリーのうち３つのメンバーＨＩＦ１α、ＨＩＦ２α、別名内皮ＰＡＳタンパク質１（ＥＰＡＳ−１）、またはＰＡＳファミリー２のメンバー（ＭＯＰ２）、およびＨＩＦ３αが同定された。ＨＩＦ２αは、ｂＨＬＨ−ＰＡＳドメインではＨＩＦ１αと高度に相同性であり、ＨＩＦ１βと二量化し、および低酸素応答ＶＥＧＦプロモーターを活性化することがみとめられた。ＨＩＦ１αの広範囲にわたる発現とは対照的に、ＨＩＦ２αは主として内皮細胞中に発現する（ティエン（Ｔｉａｎ）ら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９７，１１：７２−８２およびホゲネッシュ（Ｈｏｇｅｎｅｓｃｈ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７１：８５８１−８５９３）。約１５アミノ酸の領域は、ヒトＨＩＦ１αサブユニット中のアミノ酸５５７〜５７１に相当し、ＨＩＦαタンパク質の全メンバー中における強い保存を示す。スリニバス（Ｓｒｉｎｉｖａｓ）らは、この保存された配列が低酸素条件下でのＨＩＦαタンパク質の安定化に関与し、およびこのため、低酸素調節につながる可能性があると推測した（スリニバス（Ｓｒｉｎｉｖａｓ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９９，２６０：５５７−５６１）。
【０００９】
ごく近年になって、新しいｂＨＬＨ−ＰＡＳタンパク質を同定する試みにおいて、新規のα型低酸素誘導性因子ｃＤＮＡ、ＨＩＦ３αが、グ（Ｇｕ）および同僚によってクローンされた（グ（Ｇｕ）ら， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １９９８，７：２０５−２１３）。マウスＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡ０２８４１６）を、ヒトＨＩＦ１α遺伝子部分への類似点に基づいて同定した。マウスＥＳＴは、マウスＨＩＦ３α ｃＤＮＡの完全なオープン・リーディング・フレームの一部であり（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０６０１９４）、１．９８ｋｂにわたり、および、分子量が約７３ｋＤａの６６２アミノ酸のタンパク質をコードすることがわかった。マウスＨＩＦ３αの転写産物は、胸腺、肺、脳、心臓、および腎臓中に発現しているとみとめられた。マウスのＨＩＦ３α配列に基づいて、著者らはヒトＨＩＦ３α ｃＤＮＡ断片（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ０７９１５４）を同定し、および、染色体１９ｑ１３．１３−ｑ１３．２上のヒトＨＩＦ３α遺伝子座をマッピングした。ＨＩＦ３αのＮ末端部の、ＨＩＦ１αおよびＨＩＦ２αとの、それぞれ約５７％および５３％の配列類似性（ｂＨＬＨ−ＰＡＳ領域）が記載されてきた。配列分析は、Ｎ末端トランス活性化ドメイン（ＮＡＤ、ＨＲＤ１）がＨＩＦ３α中に存在するが、Ｃ末端トランス活性化ドメイン（ＣＡＤ、ＨＲＤ２）は存在しないことが示唆された。こうして、ＨＩＦ３αはＮ末端領域において、ヒトＨＩＦ１αおよびＨＩＦ２αと高い程度の類似性を共有するが、Ｃ末端領域では共有しない。他のＨＩＦα型タンパク質に対してすでに説明したように、ＨＩＦ３αはＨＩＦ１β（ＡＲＮＴ）と二量化する。レポーター遺伝子を含有するＨＲＥで実施した実験によって、ＨＩＦ３αが低酸素誘導遺伝子の発現を抑制し、およびしたがって、ＨＩＦに媒介された遺伝子発現の負の調節因子となりうることが明らかになった（ハラ（Ｈａｒａ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００１，２８７：８０８−８１３）。ハラ（Ｈａｒａ）および同僚は、部分的ヒトＨＩＦ３α ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ０７９１５４）、受入番号ＡＡ３５９２７６のＥＳＴクローン、およびＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＣ００７１９３のゲノムＤＮＡ配列に基づいて、ヒトＨＩＦ３αをさらに特徴付けた。著者らは、完全長ＨＩＦ３α ｃＤＮＡが１５のエクソンを持ち（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０５４０６７）、マウスＨＩＦ３α、ヒトＨＩＦ１α、およびヒトＨＩＦ２αとそれぞれ８１.９％、３５.９％、および３５.１％同一である６６８アミノ酸のタンパク質をコードし、およびそこには、ｂＨＬＨドメイン（ａａ１２−６５）、ａＰＡＳドメイン（ａａ８７−３３８）、およびａＮＡＤドメイン（ａａ４５４−５０６）が存在することを示した。ＨＩＦ３αの発現および機能に関しては、今日までほとんど知られていない。ＨＩＦ３αの発現は発達中の気管、嗅上皮およびヒト腎臓中で検出された。ＨＩＦ３αの機能に関する仮定は、α型の相同ＨＩＦ１αに対する既存のデータに基づく。ＨＩＦ３αのＣ末端構造が異なるため、タンパク質は、遺伝子導入実験において、ＨＩＦ１αまたはＨＩＦ２α以外、たとえば低酸素条件下での非��作ＨＩＦ３αレベルの特性を示す（ハラ（Ｈａｒａ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００１，２８７：８０８−８１３）。こうして、ＨＩＦ３αは低酸素症への応答を媒介する明確な役割を果たしうる。興味深いことは、マキノ（Ｍａｋｉｎｏ）および同僚による、マウスのＨＩＦ３α遺伝子座のスプライス変異体の検出である。このスプライス産物は、α型スタンパク質と二量化する際のＨＩＦに対する優勢な負の調節因子として機能し、およびしたがって、阻害ＰＡＳドメインタンパク質（ＩＰＡＳ）と名づけられた（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ４８１１４５−ＡＦ４８１１４７）（マキノ（Ｍａｋｉｎｏ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２００２，２７７：３２４０５−３２４０８）。ＩＰＡＳは、小脳および角膜上皮のプルキンエ神経細胞中に主に発現し、それぞれの標的遺伝子のＨＲＥ要素と結合できないＨＩＦタンパク質との複合体を形成する。さらに、マキノ（Ｍａｋｉｎｏ）らは、低酸素症によって上方調節されたＩＰＡＳ ｍＲＮＡレベル、および対応するＨＩＦ３αｍＲＮＡの下方調節を示した。近年、データベース中に似の配列を持たないオーファンＨＩＦ様タンパク質を同定する試みにおいて、メイナード（Ｍａｙｎａｒｄ）および同僚（（メイナード（Ｍａｙｎａｒｄ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，２７８：１１０３２−１１０４０）は、ヒトＨＩＦ３アルファ遺伝子座の複数のスプライス変異体：ｈＨＩＦ−３アルファ１（すでにより早期に、ハラ（Ｈａｒａ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００１，２８７：８０８−８１３によって報告済のＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０５４０６７、ＮＭ＿１５２７９４、ＡＣ００７１９３）、ヒト阻害ＰＡＳドメインタンパク質（ｈＩＰＡＳ）とも呼ばれるｈＨＩＦ−３アルファ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿１５２７９５、ＡＦ４６３４９２およびＥＳＴ ＢＧ６９９６３３、ＡＬ５２８４２３およびＡＬ５１９４９６）、ｈＨＩＦ−３アルファ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０２２４６２，ＡＫ０２１６５３およびＥＳＴ ＢＱ０６７１９２）、ｈＨＩＦ−３アルファ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＢＣ０２６３０８）、ｈＨＩＦ−３アルファ５（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ_１５２７９６およびＥＳＴ ＡＬ５３５６８９）およびｈＨＩＦ−３アルファ６（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＫ０２４０９５）を見い出し、および記載した。マキノ（Ｍａｋｉｎｏ）らによると、ヒトＨＩＦ−３アルファ遺伝子は１９エクソンから成り、約４３ｋｂにわたり、および３つのエクソン１ａ、１ｂおよび１ｃは、同定された少なくとも６つのスプライス変異体の転写開始部位を含む。
【００１０】
ここでおよび請求項で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈でそうでないと示されない限り、複数への言及を含む。たとえば、「ａ細胞（一つの細胞）」は複数の細胞をも意味する、など。本明細書および請求項で用いられる「および／または」の語句は、この語句の前および後の語句が選択肢としてまたは組み合わせて考えられるべきであることを示す。たとえば、「レベルおよび／または活性の測定」という言い回しは、レベルだけ、または活性だけ、またはレベルおよび活性の両方が測定されることを意味する。ここで用いられる「レベル」の語は、転写産物、たとえばｍＲＮＡ、または翻訳産物、たとえばタンパク質またはポリペプチドの、量または濃度の尺度または指標を含むことを意図する。ここで用いられる「活性」の語は、転写産物または翻訳産物が生物学的効果を生じる能力についての指標、または、生物学的に活性な分子のレベルの指標と理解すべきである。「活性」の語はまた、酵素活性を、または、結合、拮抗、抑制、阻害または中和をいう生物活性および／または薬理活性をいう。ここで用いられる「レベル」および／または「活性」の語はさらに、遺伝子発現レベルまたは遺伝子活性をいう。遺伝子発現は、遺伝子産物の産生に繋がる、転写および翻訳による、遺伝子に含まれる情報の利用と定義される。「調節障害」は遺伝子発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを意味することとする。遺伝子産物はＲＮＡまたはタンパク質のどちらかを含み、および遺伝子の発現の結果である。遺伝子産物の量は、遺伝子がどの程度活性であるかを測定するのに用いることができる。本明細書および請求項で用いられる「遺伝子」の語は、コード領域（エクソン）および非コード領域（たとえばプロモーターまたはエンハンサー、イントロン、リーダーおよびトレーラー配列といった非コード調節配列）の両方を含む。「ＯＲＦ」の語は「オープン・リーディング・フレーム」の頭文字であり、および、少なくとも１つの読み枠に終止コドンを持たずおよびしたがって潜在的にアミノ酸の配列に翻訳されうる核酸配列をいう。「調節配列」は、遺伝子発現を推進し調節する、誘導性および非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、およびその他の配列を含む。ここで用いられる「断片」の語は、たとえば択一的にスプライシングされ、または短縮され、またはさもなければ切断された転写産物または翻訳産物を含むことを意図する。ここで用いられる「誘導体」の語は、突然変異の、またはＲＮＡ改変された、または化学的に修飾された、または別の方法で改変を受けた転写産物、または、突然変異の、または化学的に修飾された、または別の方法で改変を受けた翻訳産物をいう。明確には、誘導体転写産物は、たとえば、一塩基または複数塩基の欠失、挿入、または交換といった変化を核酸配列に有する転写産物をいう。「誘導体」は、変化したリン酸化、またはグリコシル化、またはアセチル化、または脂質化といった過程によって、または変化したシグナルペプチド開裂またはその他の型の成熟開裂によって生じうる。これらの過程は翻訳後に起こりうる。本発明および請求項で用いられる「調節因子」の語は、遺伝子、または遺伝子の転写産物、または遺伝子の翻訳産物のレベルおよび／または活性を変化または改変することができる分子をいう。好ましくは、「調節因子」は、遺伝子の転写産物または翻訳産物の生物学的活性を変化または改変することができる。前記の調節は、たとえば、生物活性および／または薬理活性、酵素活性の上昇または低下、結合特性の変化、または遺伝子の前記翻訳産物の生物学的、機能的、または免疫学的性質の何らかのその他の変化または改変でありうる。「調節因子」は、イオンチャンネルサブユニットまたはイオンチャンネルの機能的性質を促進または阻害、したがって「調節する」、イオンチャンネルまたはイオンチャンネルサブユニットの結合、拮抗、抑制、阻害、中和または封鎖を「調節する」、および活性化、作用、アップレギュレーションを「調節する」ことができる能力を有する分子をいう。「調節」はまた、細胞の生物活性に影響を与える能力をいうのにも用いられる。「調節因子」、「物質」、「試薬」、または「化合物」の語は、細胞、組織、体液に対して、または任意の生物学的系または被験分析系の背景内で、正または負の生物学的効果を有する任意の物質、化学物質、組成物または抽出物をいう。それらは標的の作用因子、拮抗因子、部分的作用因子または逆作用因子でありうる。それらは、核酸、天然または合成ペプチドまたはタンパク質複合体、または融合タンパク質でありうる。それらはまた、抗体、有機または無機分子または組成物、低分子、薬物、および上の前記物質のうち任意のものの任意の組み合わせでありうる。それらは診断のまたは治療の目的のための試験に用いることができる。そのような調節因子、物質、試薬または化合物は、細胞培地、または細胞培養に用いられる血清中に存在する因子、栄養因子といった因子でありうる。本発明で用いられる「栄養因子」は、神経栄養因子を、サイトカインを、ニューロカインを、神経免疫因子を、脳由来因子（ＢＤＮＦ）を、およびＴＧＦベータファミリーの因子を含むがそれらに限定されない。そのような栄養因子の例は、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）、神経成長因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インターロイキン−ベータ、膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）である。「オリゴヌクレオチドプライマー」または「プライマー」の語は、相補的塩基対のハイブリダイゼーションによって、与えられた標的ポリヌクレオチドとアニーリングすることができ、およびポリメラーゼによって伸長することができる、短い核酸配列をいう。それらは特定の配列に対して特異的であるように選択することができ、または任意に選択することができ、たとえばそれらはある混合物中のすべての可能な配列のプライマーとなることができる。ここで用いられるプライマーの長さは１０ヌクレオチドから８０ヌクレオチドまで変動しうる。「プローブ」はここで記載および開示される核酸配列の短い核酸配列またはそれと相補的である配列である。それらは完全長配列、または任意の配列の断片、誘導体、アイソフォーム、または変異体を含むことができる。「プローブ」と分析試料との間のハイブリダイゼーション複合体の同定は、その試料内の他の類似配列の存在の検出を可能にする。ここで用いられる「ホモログまたはホモロジー」は、ヌクレオチドまたはペプチド配列の、別のもう一つのヌクレオチドまたはペプチド配列との関連性を表す本分野の語であり、比較される前記配列間の同一性および／または類似性の程度によって測定される。本分野では、「同一性」および「類似性」の語は、問い合わせ配列と、好ましくは同一の種類の別の配列（核酸またはタンパク質配列）とを、互いにマッチングさせることによって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」を計算および決定するための好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧ ＢＬＡＳＴ（基礎局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ））（アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，２１５：４０３−４１０；アルチュールら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５：３３８９−３４０２；デベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８４，１２：３８７）、 ＢＬＡＳＴＮ ２．０（ギッシュ（Ｇｉｓｈ）Ｗ．，ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ，１９９６−２００２）、ＦＡＳＴＡ（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８，８５：２４４４−２４４８）、および最長の重複を有する一対のコンティグを決定および整列するＧＣＧ ＧｅｌＭｅｒｇｅ（ウィルバー（Ｗｉｌｂｕｒ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ），ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８４，４４：５５７−５６７；ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびビュンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８：４４３−４５３）を含むがそれらに限定されない。ここで用いられる「変異体」の語は、本発明で開示されたポリペプチドおよびタンパク質に関して、本発明の天然のポリペプチドまたはタンパク質の天然のアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端におよび／または中に、１個以上のアミノ酸が付加されたおよび／または置換されたおよび／または欠失したおよび／または挿入された、任意のポリペプチドまたはタンパク質をいう。さらに、「変異体」の語は、ポリペプチドまたはタンパク質の任意のより短いかまたはより長い形を含む。「変異体」はまた、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５のＨＩＦ３ａのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、および非常に好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有する配列も含む。タンパク質分子の「変異体」は、たとえば、高度に保存された領域に保存されたアミノ酸置換を有するタンパク質を含む。本発明の「タンパク質およびポリペプチド」は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５のＨＩＦ３ａのアミノ酸配列を含むタンパク質の、変異体、断片、および化学的誘導体を含む。コドンが代替的な塩基配列によって���のコドンに置き換えられ、しかしそのＤＮＡ配列によって翻訳されるアミノ酸配列が変化しないままである配列変異を含めるべきである。この本分野で知られる現象は、特定のアミノ酸を翻訳するコドンの組の冗長性と呼ばれる。アルギニンをリジンに、バリンをロイシンに、アスパラギンをグルタミンにといった、機能性にまったく影響しないアミノ酸の交換もまた含めるべきである。天然から単離することができるかまたは、組み換えおよび／または合成の方法によって製造することができるタンパク質およびポリペプチドを含めることができる。ネイティブタンパク質またはポリペプチドは、天然に存在する短縮型または分泌型、天然に存在する変異型（たとえばスプライス変異体）および天然に存在する対立遺伝子変異体をいう。ここで用いられる「単離された」の語は、天然の環境から変化および／または取り出された、すなわち通常存在する細胞からまたは生体から単離され、および天然で付随して見出される共存成分から分離されたかまたは本質的に精製された分子または物質をいうと考えられ、またそれらは「非ネイティブ」であるともいう。この概念はさらに、そのような分子をコードする配列を人間の手で、自然状態では結合していないポリヌクレオチドと結合させることができること、およびそのような分子を組み換えおよび／または合成の方法によって製造することができることを意味する（非ネイティブ）。前記の目的のためにそれらの配列が、当業者に既知である方法によって生体または死んだ生物に導入されても、およびそれらの配列が前記生物中にまだ存在していても、それらはなお単離されており、非ネイティブであると考えられる。本発明では、「リスク」、「感受性」、および「素因」の語は同等であり、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を発症する確率に関して用いられる。
【００１１】
「ＡＤ」はアルツハイマー病を意味する。ここで用いられる「ＡＤ型神経病理」は、本発明に記載されている通りの、および最先端の文献から一般に既知である通りの、神経病理学的、神経生理学的、組織病理学的、および臨床的な顕著な特徴をいう（イクバル（Ｉｑｂａｌ），スワーブ（Ｓｗａａｂ），ウィンブラッド（Ｗｉｎｂｌａｄ）およびウィスニュースキ（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ），『アルツハイマー病と関連疾患（疫学、病因論および治療薬）』（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（Ｅｔｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）），ワイリー・アンド・サンズ社（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ），ニューヨーク（ＮｅｗＹｏｒｋ）、ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ），トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ），１９９９；シント（Ｓｃｉｎｔｏ）およびダフナー（Ｄａｆｆｎｅｒ），『アルツハイマー病の早期診断』（Ｅａｒｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ），ヒューマナ・プレス社（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ），ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）２０００；マイユ（Ｍａｙｅｕｘ）およびクリステン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ）『アルツハイマー病の疫学：遺伝子から予防まで』（Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ；Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ），シュプリンガー・プレス社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ），ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ），ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９９９；ヨーンキン（Ｙｏｕｎｋｉｎ），タンジ（Ｔａｎｚｉ）およびクリステン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ），『プレセニリンとアルツハイマー病』（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ），シュプリンガー・プレス社，ベルリン，ハイデルベルク，ニューヨーク，１９９８を参照）。「ブラーク病期」または「ブラーク病期分類」の語は、ブラークおよびブラークによって提案された判定基準に従った脳の分類をいう（ブラーク（ブラーク）およびブラーク（ブラーク），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９１，８２：２３９−２５９）。神経原線維変化およびニューロピル・スレッドの分布に基づいて、ＡＤの神経病理学的進行は６つの病期に分けられる（病期０から６）。本発明では、ブラーク病期０から２は対照健常者（「対照」）を表し、およびブラーク病期４から６はアルツハイマー病の患者（「ＡＤ患者」）を表す。前記「対照」から得られた値が、「既知の健康状態」を表す「参照値」であり、および前記「ＡＤ患者」から得られた値が、「既知の疾患状態」を表す「参照値」である。ブラーク病期３は、対照健常者またはＡＤ患者のどちらかを表しうる。ブラーク病期が高いほど、ＡＤの症状を示す可能性が高い。神経病理学的評価、すなわちＡＤの病理学的変化が痴呆の根本にある原因である確率の推定については、ブラーク（ブラーク）Ｈによる提言が与えられている（ｗｗｗ．ａｌｚｆｏｒｕｍ．ｏｒｇ）。
【００１２】
本発明に記載の神経変性疾患または障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病、前頭側頭性痴呆症、進行性核麻痺、大脳皮質基底核変性症、脳血管性痴呆症、多系統変性症、嗜銀性顆粒痴呆症およびその他のタウオパシー、および軽度の認知障害を含む。神経変性過程を含むその他の症状は、たとえば、加齢黄斑変性、ナルコレプシー、運動神経細胞疾患、プリオン病および外傷性神経損傷および修復、および多発性硬化症である。
【００１３】
本発明は、特定の試料、ＡＤ患者の特定の脳領域において、および／または対照者と比較した、ＨＩＦ３α−、別名ＨＩＦ３アルファ−、別名ＨＩＦ３ａをコードするための遺伝子の同定、差次的発現、差次的調節および調節異常を開示する。本発明は、ＨＩＦ３ａ ｍＲＮＡレベルが上昇し、前頭皮質と比較して側頭皮質および／または海馬において上方調節され、または、側頭皮質および／または海馬と比較して前頭皮質において下方調節されるという点において、ＨＩＦ３ａに対する遺伝子発現が、ＡＤ罹患脳において変化し、無調節となることを開示する。さらに、本発明は、ＡＤ患者の前頭皮質および側頭皮質および／または海馬と比較して、年齢対応する対照健常者の前頭皮質および側頭皮質および／または海馬間でのＨＩＦ３ａ発現が異なることを開示する。年齢対応する対照健常者から取得した試料中にはこのような調節異常はみとめられなかった。ＨＩＦ３ａは、対照と比較してＡＤ患者において、側頭皮質では上昇しているが、しかし、前頭皮質では上昇していない。この調節異常はおそらく、ＡＤ罹患脳におけるＨＩＦ３ａシグナリングの病理学的変化と関連する。今日まで、ＨＩＦ３ａ遺伝子発現の調節異常と神経変性疾患の病変との間の関係を示す、実験は記載されていない。同様に、どのＨＩＦ３ａ遺伝子における変異体も、該疾患と関連すると記載されていない。ＨＩＦ３ａ遺伝子をこれら疾患と結びつけることによって、とりわけ、該疾患の診断および治療のための新しい方法を提供する。
【００１４】
本発明は、ＡＤ患者の特定の脳領域をコードするＨＩＦ３ａの調節異常を開示する。後側頭葉、内嗅皮質、海馬、および扁桃体内のニューロンが、ＡＤにおける変性過程の影響を受ける（テリー（Ｔｅｒｒｙ）ら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９８１，１０：１８４−１９２）。これら脳領域は、学習および記憶機能の処理において主に関与し、およびＡＤにおける神経細胞脱落および変性に対する選択的な脆弱性を示す。対照的に、前頭皮質、後頭部皮質、および小脳神経細胞は、ほとんど無傷のままであり、および神経変性から保護されている。ＡＤ患者および年齢対応する対照健常者の前頭皮質（Ｆ）、側頭皮質（Ｔ）および海馬（Ｈ）に由来する脳組織は、本明細書中で開示される実施例に使用されている。その結果、ＨＩＦ３ａ遺伝子およびその対応する転写および／または翻訳産物は、ＡＤに典型的にみとめられる限局的な選択的神経細胞の変性において原因となる。あるいは、残存する神経細胞に対するＨＩＦ３ａは神経保護的機能を有しうる。これら開示に基づいて、本発明は、神経変性疾患、とりわけＡＤに対する素因の診断評価および予後予測、ならびに、同定に対して有用性を持つ。さらに本発明は、これら疾患に対する治療を受ける患者の診断監視のための方法を提供する。
【００１５】
一態様では、本発明は、被験者において神経変性疾患を診断または予測診断する、または被験者が前記疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定する方法を扱う。その方法は：前記被験者由来の試料中の（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を測定すること、および、前記レベル、および／または、前記転写および／または前記翻訳産物の前記活性を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較し、および、前記レベル、および／または前記活性は既知の健康状態を表す参照値（対照）と比較して、異なりまたは改変され、および／または既知の疾患状態、好ましくはＡＤ（ＡＤ患者）を表す参照値と同様または等しく、それによって前記被験者において前記神経変性疾患を診断または予測診断すること、または前記被験者が前記神経変性疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定することを含む。「被験者において」という言い回しは、被験者が罹患する疾患に結果が関係する限りの、すなわち、前記疾患が被験者「において」存在する、開示された方法の結果をいう。
【００１６】
本発明はまた、本発明に開示される通りの核酸配列、またはその断片、または変異体に独自のプライマーおよびプローブの構築および用途に関する。そのオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、蛍光、生物発光、磁性、または放射性物質で特異的に標識することができる。本発明はさらに、適当な組み合わせの前記特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いた、前記核酸配列、またはその断片および／または変異体の検出および製造に関する。ＰＣＲ分析は、当業者によく知られた方法であるが、核酸を含む試料から前記遺伝子特異的核酸配列を増幅するために、前記プライマーの組み合わせを用いて実施することができる。そのような試料は、健常者または患者のどちらかから得ることができる。増幅の結果として特定の核酸産物を生じるかどうか、および異なる長さの断片を得ることができるかどうかは、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を示しうる。このように、本発明は、調べる核酸配列を含む任意の試料中の、神経変性疾患、特にアルツハイマー病と関連している可能性がある、遺伝子突然変異および一塩基多型の検出に有用な、少なくとも長さ１０塩基、最大でコード配列および遺伝子配列全体の、核酸配列、オリゴヌクレオチドプライマー、およびプローブを提供する。この機能は、好ましくはまたキットの形式である、ＤＮＡに基づく迅速診断検査を開発するために有用である。ＨＩＦ３ａのプライマーの典型的な例は実施例（ｖｉｉｉ）に開示される。
【００１７】
別の一態様では、本発明は被験者における神経変性疾患の進行を監視する方法を扱う。前記被験者由来の試料中の（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を測定する。前記レベルおよび／または前記活性を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較する。それによって前記被験者において前記神経変性疾患の、アルツハイマー病の、進行を監視する。
【００１８】
さらに別の一態様では、本発明は、前記疾患について治療されている被験者由来の試料中の（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を測定することを含む、神経変性疾患の治療を評価する方法を扱う。前記レベル、または前記活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較し、それによって前記神経変性疾患の、アルツハイマー病の、治療を評価する。
【００１９】
ここで請求される本発明の方法、キット、組み換え動物、分子、分析法、および用途の好ましい一実施形態では、低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）をコードするための前記遺伝子は、ＨＩＦ３α、ＨＩＦ−３アルファ、ＨＩＦ３アルファまたは単にＨＩＦ３ａとも呼ばれる、低酸素誘導性因子３アルファタンパク質をコードするための遺伝子である。遺伝子ＨＩＦ３ａは、配列番号６のｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＫ０２１４２１、ＧｅｎｂａｎｋデータベースからのＥＳＴおよびｍＲＮＡ配列情報に基づいて補正された配列、図１２を参照）によって表されるスプライス変異体（ｓｖ）ＨＩＦ３ａ ｓｖ１とも呼ばれ、および、配列番号の７のｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＢＣ０２６３０８、ＧｅｎｂａｎｋデータベースからのＥＳＴおよびｍＲＮＡ配列情報に基づいて補正された配列、図１３を参照）によって表されるスプライス変異体ＨＩＦ３ａ ｓｖ２とも呼ばれ、および、配列番号８のｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＫ０２７７２５、ＧｅｎｂａｎｋデータベースからのＥＳＴおよびｍＲＮＡ配列情報に基づいて補正された配列、図１４を参照）によって表されるスプライス変異体ＨＩＦ３ａ ｓｖ３とも呼ばれ、および、配列番号９のｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＫ０２１６５３、ＧｅｎｂａｎｋデータベースからのＥＳＴおよびｍＲＮＡ配列情報に基づいて補正された配列、図１５を参照）によって表されるスプライス変異体ＨＩＦ３ａ ｓｖ５とも呼ばれる。本発明では、ここで使用されている場合、前記配列は「単離」されている。さらに、本発明では、ＨＩＦ３ａタンパク質および開示されているすべてのスプライス変異体をコードする遺伝子は、ＨＩＦ３ａ遺伝子、または単にＨＩＦ３ａとも一般に呼ばれる。
【００２０】
ここで請求される本発明の方法、キット、組み換え動物、分子、分析法、および用途の別の好ましい一実施形態では、前記低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）タンパク質は、低酸素誘導性因子３アルファタンパク質であり、ＨＩＦ３α、ＨＩＦ−３アルファ、ＨＩＦ３アルファまたはＨＩＦ３ａとも呼ばれる。タンパク質ＨＩＦ３ａは、配列番号２（図８）およびＨＩＦ３ａ ｓｖ１のコード配列（配列番号１０、図１６）によって表されるＨＩＦ３ａスプライス変異体１（ｓｖ１）タンパク質とも呼ばれ、および、配列番号３（図９）およびＨＩＦ３ａ ｓｖ２のコード配列（配列番号１１、図１７）によって表されるスプライス変異体２（ｓｖ２）タンパク質とも呼ばれ、および、配列番号４（図１０）およびＨＩＦ３ａ ｓｖ３のコード配列（配列番号１２、図１８）によって表されるスプライス変異体３（ｓｖ３）タンパク質とも呼ばれ、および、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースのタンパク質ＢＡＢ１３８６５．１と類似している配列番号５（図１１）およびＨＩＦ３ａ ｓｖ５のコード配列（配列番号１３、図１９）によって表されるスプライス変異体５（ｓｖ５）タンパク質とも呼ばれる。本発明では、ここで使用されている場合、前記配列は「単離」されている。さらに、本発明では、ＨＩＦ３ａ遺伝子、ＨＩＦ３ａ ｓｖ１、ＨＩＦ３ａ ｓｖ２、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３、ＨＩＦ３ａ ｓｖ５によってコードされた前記ＨＩＦ３ａタンパク質は、一般にＨＩＦ３ａタンパク質、または単にＨＩＦ３ａとも呼ばれる。
【００２１】
ここで請求される本発明の方法、キット、組み換え動物、分子、分析法、および用途の別の好ましい一実施形態では、前記神経変性疾患または障害はアルツハイマー病であり、および前記被験者はアルツハイマー病患者である。
【００２２】
分析および測定する前記試料は、脳組織，脳細胞または他の組織または他の体細胞から成る群から選択されるのが好ましい。試料はまた、脳脊髄液または、唾液、尿、血液、血清、血漿、または粘液を含むその他の体液を含むことができる。好ましくは、本発明に記載の神経変性疾患の診断、予測診断、進行の監視、または治療の評価の方法は、体外で実施することができ、およびそのような方法は好ましくは、たとえば、被験者または患者または対照健常者から摘出、採取、または単離された体液または細胞といった試料に関する。
【００２３】
さらに好ましい実施形態では、前記参照値は、前記神経変性疾患に罹患していない被験者由来の試料中の（対照健常者、対照試料、対照）、または、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を罹患している被験者由来の試料中の（患者試料、患者）、（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方の値である。
【００２４】
好ましい実施形態では、既知の健康状態を表す参照値（対照試料）に対する、被験者に由来する試料細胞、または組織、または体液中の、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物の、および／またはＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物の、および／またはその断片、または誘導体、または変異体の、レベルおよび／または活性における変化、変化したレベルおよび／または活性が、神経変性疾患、特にＡＤに罹患する診断、または予測診断、または高リスクを示す。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の既知の疾患状態を表す参照値（ＡＤ患者試料）に対する、被験者に由来する試料細胞、または組織、または体液中の、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物の、および／またはＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物の、および／またはその断片、または誘導体、または変異体の、等しいかまたは類似のレベルおよび／または活性は、前記神経変性疾患に罹患する診断、または予測診断、または高リスクを示す。
【００２６】
好ましい実施形態では、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物のレベルの測定が、被験者から得られた試料において、被験者の試料から抽出されたＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡに由来する前記遺伝子特異的配列を増幅するために、プライマーの組み合わせを用いた定量的ＰＣＲ分析を使用して実施される。プライマーの組み合わせは本発明の実施例（ｖｉｉｉ）に示されるが、本発明で開示される通りの配列から生成される他のプライマーもまた用いることができる。前記遺伝子に特異的なプローブを用いたノーザンブロットもまた適用することができる。チップを基礎とするマイクロアレイ技術によって転写産物を測定することがさらに好ましい。これらの手法は当業者に公知である（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ），『分子クローニング：実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，２００１；シェーナ（Ｓｃｈｅｎａ）Ｍ．，『マイクロアレイバイオチップ技術』（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），イートン・パブリッシング社（Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），マサチューセッツ州ナティック（Ｎａｔｉｃｋ），２０００を参照）。免疫測定法の一例は、特許出願国際公開第０２／１４５４３号パンフレットに開示され記載される通り、酵素活性の検出および測定である。
【００２７】
さらに、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物のおよび／または前記翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体のレベルおよび／または活性、および／または、前記翻訳産物および／または前記翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の活性のレベルは、免疫測定法、活性測定法、および／または結合測定法によって検出することができる。これらの測定法は、前記タンパク質分子と抗タンパク質抗体との間の結合の量を、抗タンパク質抗体かまたはその抗タンパク質抗体と結合する二次抗体のどちらかに結合した、酵素、色力学、放射性、磁性、または発光標識を用いることによって測定することができる。加えて、他の高親和性リガンドを用いることができる。使用することができる免疫測定法は、たとえばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および当業者に公知のその他の技術を含む（ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ），（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，『抗体を用いて：実験の手引き』（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９９９およびエドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）Ｒ，『免疫診断：実践的手法』（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），オックスフォード大学出版会（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ），英国オックスフォード，１９９９を参照）。これらの検出方法すべてはまた、マイクロアレイ、タンパク質アレイ、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、電子バイオチップ、またはタンパク質チップを基礎とする技術の形式で使用することができる（シェーナ（Ｓｃｈｅｎａ）Ｍ．，『マイクロアレイバイオチップ技術』（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），イートン・パブリッシング社（Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），マサチューセッツ州ナティック（Ｎａｔｉｃｋ），２０００を参照）。
【００２８】
好ましい一実施形態では、前記疾患の進行を監視するため、ある期間にわたって前記被験者から採取された一連の試料中の（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が比較される。さらに好ましい実施形態では、前記被験者は前記試料収集の１回以上の前に治療を受ける。さらに別の好ましい一実施形態では、前記レベルおよび／または活性は、前記被験者の前記治療の前および後に測定される。
【００２９】
別の一態様では、本発明は被験者において神経変性疾患、特にＡＤを診断するかまたは予測診断する、または被験者の神経変性疾患、特にＡＤを発症する傾向または素因を判定するためのキットを扱い、前記キットは下記を含む：
（ａ）（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬、から成る群から選択された少なくとも１つの試薬；および
（ｂ）・前記被験者に由来する試料中の、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の前記転写産物および／または前記翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を検出する；および神経変性疾患、特にＡＤを診断するかまたは予測診断する、および／またはそのような疾患を発症する前記被験者の傾向または素因を判定する段階を記載することによる、神経変性疾患、特にＡＤを診断するかまたは予測診断する、またはそのような疾患を発症する被験者の傾向または素因を判定するための指示であって、既知の健康状態を表す参照値（対照）と比較した前記転写産物および／または前記翻訳産物の、変化したレベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方、および／または、既知の疾患状態、好ましくはＡＤの疾患状態を表す参照値と同様であるかまたは等しい、前記転写産物および／または前記翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が、神経変性疾患、特にＡＤの診断または予測診断、またはそのような疾患を発症する高い傾向または素因を示す。本発明に記載のキットは、神経変性疾患、特にＡＤを発症するリスクがある人の特定に特に有用である可能性がある。
【００３０】
別の一態様では、本発明は、被験者において神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断または予測診断する方法における、およびそのような疾患を発症する被験者の高い傾向または素因を判定する方法における、（ｉ）前記被験者に由来する試料中の、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物および／または翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を検出、および（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物および／または翻訳産物の、前記レベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を、既知の健康状態を表す参照値および／または既知の疾患状態を表す参照値と比較し、および前記転写産物および／または前記翻訳産物の前記レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が、既知の健康状態を表す参照値と比較して変動し、および／または既知の疾患状態を表す参照値と類似または等しい段階を含むキットの使用を扱う。
【００３１】
本発明の記載のキットは、疾患経過において不可逆的損傷が与えられる前に、特定された人を疾患の発症前の早期予防処置または治療的介入の対象とする方法となりうる。さらに、好ましい実施形態では、本発明で扱うキットは、被験者において神経変性疾患、特にＡＤの進行を監視、および前記被験者のそのような疾患について治療的処置の成功または失敗を監視および評価するのに有用である。
【００３２】
別の一態様では、本発明は、（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方に直接的にまたは間接的に影響を及ぼす、治療的にまたは予防的に有効な量の一または複数の物質の前記被験者への投与を含む、被験者において神経変性疾患、特にＡＤを治療または予防する方法を扱う。前記物質は低分子を含むことができ、またはペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドを含むこともできる。前記ペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドは、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物のアミノ酸配列、またはその断片、または誘導体、または変異体を含むことができる。本発明に記載の、神経変性疾患、特にＡＤを治療するかまたは予防するための物質はまた、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドから成ることができる。前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を、センス方向かまたはアンチセンス方向のどちらかで含むことができる。
【００３３】
好ましい実施形態では、本方法は前記の一または複数の物質を投与するための遺伝子治療および／またはアンチセンス核酸技術の本質的に既知である方法の応用を含む。一般的に、遺伝子治療はいくつかの手法を含む： 変異遺伝子の分子的置換、治療用タンパク質の合成を結果として生じる新しい遺伝子の付加、および組み換え発現方法によるかまたは薬剤による内因性細胞遺伝子発現の調節。遺伝子導入法は詳細に記載されており（たとえばベール（Ｂｅｈｒ），Ａｃｅ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ １９９３，２６：２７４−２７８およびムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ），Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３，２６０：９２６−９３１を参照）、および細胞へのＤＮＡの機械的マイクロインジェクションといった直接的遺伝子導入法、および生物ベクター（組み換えウイルス、特にレトロウイルスのような）またはモデルリポソームを用いる間接的方法、またはＤＮＡのポリカチオンとの共沈を用いた遺伝子導入に基づく方法、化学的（溶媒、界面活性剤、ポリマー、酵素）または物理的手段（機械的、浸透圧、熱、電気ショック）による細胞膜の不安定化を含む。出生後の中枢神経系への遺伝子導入は詳細に記載されている（たとえばウォルフ（Ｗｏｌｆｆ），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９９３，３：７４３−７４８を参照）。
【００３４】
特に、本発明は、アンチセンス核酸治療、すなわちある種の重要な細胞へのアンチセンス核酸またはその誘導体の導入による、不適切に発現されたかまたは欠陥のある遺伝子のダウンレギュレーションを用いた、神経変性疾患を治療するかまたは予防する方法を扱う（たとえばギレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ），ＤＮ＆Ｐ １９９２，５：３８９−３９５；アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）およびアクター（Ａｋｈｔａｒ），Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９５，１３： １９７−１９９；クルック（Ｃｒｏｏｋｅ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２，１０： ８８２−６を参照）。ハイブリダイゼーション戦略以外に、リボザイム、すなわち酵素として作用するＲＮＡ分子の、疾患のメッセージを運ぶＲＮＡを破壊する適用もまた記載されている（たとえばバリナガ（Ｂａｒｉｎａｇａ），Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３，２６２：１５１２−１５１４を参照）。好ましい実施形態では、治療される被験者はヒトであり、および治療的アンチセンス核酸またはその誘導体はＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物に対して向けられる。被験者の中枢神経系、好ましくは脳の細胞は、そのような方法で治療されるのが好ましい。細胞透過は、アンチセンス核酸およびその誘導体のキャリヤー粒子へのカップリング、または上記の方法といった既知の戦略によって実施することができる。標的化した治療用オリゴデオキシヌクレオチドを投与するための戦略は当業者に公知である（たとえばウィックシュトロム（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ），Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９２，１０：２８１−２８７を参照）。一部の場合では、デリバリーは単なる局所投与によって実施することができる。別の手法はアンチセンスＲＮＡの細胞内発現に向けられる。この戦略では、細胞は標的核酸の領域と相補的であるＲＮＡの合成を指示する組み換え遺伝子を用いてｅｘ ｖｉｖｏで形質転換される。細胞内で発現されたアンチセンスＲＮＡの治療的用途は、手続的に遺伝子治療と同様である。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）としてさまざまに知られる、二本鎖ＲＮＡを用いて遺伝子の細胞内発現を調節する近年開発された方法は、核酸治療のもう一つの有効な手法である可能性がある（ハノン（Ｈａｎｎｏｎ），Ｎａｔｕｒｅ ２００２，４１８：２４４−２５１）。
【００３５】
さらに好ましい実施形態では、本方法は前記被験者の中枢神経系、好ましくは脳に、ドナー細胞、または好ましくは移植片拒絶を最小化または低減するように処理されたドナー細胞を移植することを含み、前記ドナー細胞は前記一または複数の物質をコードする少なくとも一つの導入遺伝子の挿入によって遺伝子組み換えされている。前記導入遺伝子は、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって運ばれうる。導入遺伝子は、導入遺伝子をコードするＤＮＡの非ウイルス物理的遺伝子導入によって、特にマイクロインジェクションによってドナー細胞へ挿入することができる。導入遺伝子の挿入はまた、エレクトロポレーション、化学的媒介遺伝子導入、特にリン酸カルシウム遺伝子導入またはリポソーム媒介遺伝子導入によっても実施することができる（マクセランド（Ｍｃ Ｃｅｌｌａｎｄ）およびパーディー（Ｐａｒｄｅｅ），『発現遺伝学：迅速および高処理量法』（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ａｎｄ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ），イートン・パブリッシング社（Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），マサチューセッツ州ナティック（Ｎａｔｉｃｋ），１９９９を参照）。
【００３６】
好ましい実施形態では、神経変性疾患、特にＡＤを治療および予防するための前記物質は、対象細胞を前記被験者に導入し、ここで前記対象細胞は前記治療用タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで処理されており、前記対象細胞がｉｎ ｖｉｖｏで前記被験者において治療的に有効な量の前記治療用タンパク質を発現することを含む過程によって、前記被験者、好ましくはヒトに投与することができる治療用タンパク質である。前記ＤＮＡ断片は、前記細胞へｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって挿入することができる。
【００３７】
本発明に記載の、治療の方法は、前記の細胞治療的および遺伝子治療的方法の任意のものと組み合わせた、治療的クローニング、移植、および胚性幹細胞または胚性生殖細胞および神経細胞性成体幹細胞を用いた幹細胞治療の適用を含む。幹細胞は全能性または多能性でありうる。それらはまた器官特異性でもありうる。罹患および／または損傷した脳細胞または組織を修復する戦略は、（ｉ）ドナー細胞を成体組織から採取することを含む。これらの細胞の核は、遺伝物質が除去されている未受精卵細胞に移植される。胚性幹細胞は、体細胞核移植を受けた細胞の胚盤胞期から単離される。その時、分化因子の使用は、特化した細胞型、好ましくは神経細胞への幹細胞の分化誘導に繋がる（ランザ（Ｌａｎｚａ）ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９９，９：９７５−９７７）、または（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大およびその後の移植のために、中枢神経系から、または骨髄（間葉性幹細胞）から単離された成体幹細胞を精製する、または（ｉｉｉ）内因性神経幹細胞を直接、増殖、移動、および機能する神経細胞へ分化するように誘導する（ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）ＤＡ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２，２：３４−４２）。成体脳の胚中心は神経細胞損傷または機能障害が存在しないため、成体神経幹細胞は、損傷したかまたは罹患した脳組織を修復する大きな可能性がある（コルマン（Ｃｏｌｍａｎ）Ａ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ２００１，７： ６６−７１）。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明に記載の治療または予防の被験者は、ヒト、実験動物、たとえばマウスまたはラットまたはハエ、家畜、または非ヒト霊長類であることができる。実験動物は、神経変性疾患の動物モデル、遺伝子改変動物、たとえば、好ましくはＡＤの症状を示しＡＤ型神経病理を示す、遺伝子導入マウスまたはハエおよび／またはノックアウトマウスまたはハエであることができる。
【００３９】
別の一態様では、本発明は、（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される少なくとも一つの物質の、活性、またはレベル、または前記活性および前記レベルの両方の調節因子を扱う。
【００４０】
別の一態様では、本発明は、前記調節因子および好ましくは医薬キャリヤーを含む医薬組成物を扱う。前記キャリヤーは、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または調節因子と共に投与する媒体をいう。
【００４１】
別の一態様では、本発明は、医薬組成物における用途のための（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される少なくとも一つの物質の、活性、またはレベル、または前記活性および前記レベルの両方の調節因子を扱う。
【００４２】
別の一態様では、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤを治療するかまたは予防するための薬剤の調製のための（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される少なくとも一つの物質の、活性、またはレベル、または前記活性および前記レベルの両方の調節因子の用途を提供する。
【００４３】
一態様では、本発明はまた、治療的にまたは予防的に有効な量の前記医薬組成物を詰めた一個以上の容器を含むキットを提供する。
【００４４】
別の一態様では、本発明はヒトおよび／またはマウスＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の非天然核酸分子のおよび翻訳産物、タンパク質分子の、および／またはその断片、または誘導体、または変異体の、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３に示す核酸分子の、および配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５に示すタンパク質分子の、遺伝子導入動物および／またはノックアウト動物である組み換え、遺伝子操作された非ヒト動物を作製するための標的分子としての用途を扱う。前記遺伝子操作非ヒト動物は、哺乳類、好ましくはげっ歯類、より好ましくはマウスまたはラットまたはモルモットであることが好ましい。前記遺伝子操作非ヒト動物は、非脊椎動物、好ましくは昆虫、より好ましくはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）といったハエであることがさらに好ましい。さらに、前記遺伝子操作非ヒト動物は、家畜、または非ヒト霊長類でありうる。一実施形態では、前記遺伝子操作の発現は、神経変性疾患に類似した神経病理の症状、特に、とりわけＡＤの組織学的性質およびＡＤに特徴的な行動変化を含む、ＡＤ（ＡＤ型神経病理）に類似した神経病理の症状を発症する素因を示すおよび／または症状を示す非ヒト動物を結果として生じる。別の一実施形態では、前記遺伝子操作の発現は、前記非ヒト動物を遺伝子操作するのに用いられた遺伝子の発現によって引き起こされた有益な作用のために、神経変性疾患に類似した症状を発症するリスクが低い、特にＡＤに類似した神経病理の症状を発症するリスクが低い、および／またはＡＤ症状の低減を示すおよび／またはＡＤの症状を有しない非ヒト動物を結果として生じる。
【００４５】
一態様では、本発明は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３に示す通りの、および配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５に示す通りの、ＨＩＦ３ａをコードする非天然遺伝子配列、またはその断片または誘導体、または変異体を含む組み換え、遺伝子操作非ヒト動物を扱う。ＨＩＦ３ａをコードする前記非天然遺伝子配列は、ヒトおよび／またはマウスＨＩＦ３ａ遺伝子配列でありうる。前記組み換え、遺伝子操作非ヒト動物の作製は、（ｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３に示す通りの、および配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５に示す通りの、遺伝子標的構築物を産生するための、非天然核酸分子および翻訳産物、ヒトおよび／またはマウスＨＩＦ３ａおよび／またはその断片、または誘導体、または変異体をコードする遺伝子のタンパク質分子の使用、（ｉｉ）ヒトおよび／またはマウスＨＩＦ３ａの遺伝子配列、または断片、または前記遺伝子配列の変異体、および選択可能なマーカー配列を含む遺伝子ターゲッティング構造を提供、および（ｉｉｉ）前記ターゲッティング構造を非ヒト動物の幹細胞へ、胚性幹（ＥＳ）細胞へ導入、および（ｉｖ）前記非ヒト動物幹細胞を非ヒト胚へ導入、および（ｖ）前記胚を偽妊娠非ヒト動物へ移植、および（ｖｉ）前記胚を満期まで発生させること、および（ｖｉｉ）ゲノムが一方または両方の対立遺伝子に前記遺伝子配列の修飾を含む遺伝子操作非ヒト動物を特定すること、および（ｖｉｉｉ）段階（ｖｉｉ）の遺伝子操作非ヒト動物を繁殖させて、ゲノムが前記内因性遺伝子の修飾を含む遺伝子操作非ヒト動物を得ることを含む。前記遺伝子操作非ヒト動物は、発現が異所性発現、または低発現、または過剰発現、または非発現である、組み換え、操作された遺伝子を発現することが好ましい。ヒトおよび／またはマウスＨＩＦ３ａの遺伝子配列および選択可能なマーカー配列を含むそのようなターゲッティング構造、および、前記組み換え、操作されたＨＩＦ３ａ遺伝子の非ヒト遺伝子操作動物、好ましくはマウスもしくはハエのような動物における発現の例は本発明に開示される（実施例（ｘｉｉ）および図３９から４４を参照）。
【００４６】
好ましい一実施形態では、前記遺伝子破壊または抑制または活性化または前記遺伝子操作の発現は、神経変性疾患の神経病理に類似した症状、特にＡＤに類似した神経病理（ＡＤ型神経病理）の症状を発症する素因を示すおよび／または症状を示す前記非ヒト動物を結果として生じる。
【００４７】
別の好ましい一実施形態では、前記遺伝子操作の発現は、前記非ヒト動物を遺伝子操作するのに用いられた遺伝子の発現によって引き起こされた、有益な作用でありうる作用のために、神経変性疾患に類似した症状を発症するリスクが低い、特にＡＤに類似した神経病理の症状を発症するリスクが低い、および／またはＡＤ症状の低減を示す、および／またはＡＤの症状を有しない非ヒト動物を結果として生じる。
【００４８】
本発明の別の好ましい一実施形態では、前記遺伝子操作非ヒト動物は、哺乳類、好ましくはげっ歯類、より好ましくはマウスまたはラットまたはモルモットである。前記遺伝子操作非ヒト動物は、非脊椎動物、好ましくは昆虫、より好ましくはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）といったハエであることがさらに好ましい。さらに、前記遺伝子操作非ヒト動物は、家畜、または非ヒト霊長類でありうる。前記遺伝子操作非ヒトは、遺伝子導入動物および／またはノックアウト動物である。
【００４９】
別の好ましい一実施形態では、前記組み換え、遺伝子操作非ヒト動物は、そのゲノムがヒトおよび／またはマウスＨＩＦ３ａ、またはその断片または誘導体、または変異体をコードするための非天然遺伝子配列を含み、（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の手順によっておよび本発明に記載の通り生成され、前記組み換え、当業において一般に知られているアルツハイマー病動物モデルと交雑させてアルツハイマー病のバックグラウンド上に遺伝子導入ＨＩＦ３ａ動物および／またはＨＩＦ３ａノックアウト動物を産生する。前記遺伝子操作非ヒト遺伝子導入ＨＩＦ３ａ動物および／またはＨＩＦ３ａノックアウト動物におけるアルツハイマー病病変に対する、ＨＩＦ３ａ発現の影響は、組織学的分析、免疫組織化学および／または脳内の定量化びまん性および成熟したプラークによって、所定の細胞母数および／または炎症および神経変性の徴候の染色によって、およびさらに、Ａｂｅｔａの微分抽出および／またはタウタンパク質のリン酸化状態といった生物化学的分析によって、定義される。神経学的機能は、微小神経学的検査、ロータロッド、グリップ検査、ホットプレート試験、ゼロ迷路、オープンフィールド試験、Ｙ迷路、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路および／または能動的回避試験を含むがこれらに限定されない一連の行動試験によって評価される。さらに、前記非ヒト遺伝子導入ＨＩＦ３ａ動物および／またはＨＩＦ３ａノックアウト動物の表現型は、遺伝子発現分析、タンパク質検出法、および様々な臓器の組織病理を用いて分析される。
【００５０】
別の好ましい一実施形態では、遺伝子導入ＨＩＦ３ａ動物および／またはＨＩＦ３ａノックアウト動物と交雑されるのに用いられるアルツハイマー病動物モデルは、ヒトアルツハイマー前駆体タンパク質（ＡＰＰ）および／またはＡＰＰの突然変異型、たとえばスウェーデン変異を有するＡＰＰ、および／または文献に記載された通りの既知の変異を有するヒトプレセニリン−１または−２（ジェイナス（Ｊａｎｕｓ）およびウェスタウェイ（Ｗｅｓｔａｗａｙ），Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ２００１，８７３−８８６；リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２３：８９８９−９００３）および／または既知の変異を有するヒトＴａｕ、たとえばＰ３０１Ｌ変異（ゴッツ（Ｇｏｔｚ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，２７６：５２９−５３４）を発現する遺伝子導入マウスおよび／またはハエ、またはアルツハイマー様病理を発症するこれらまたは他のマウス突然変異体からの二または三遺伝子導入動物といった、アルツハイマー病マウスモデルが用いられる。さらに、ヒトＡＰＰ（ｈＡＰＰ）およびショウジョウバエプレセネリン遺伝子導入ハエといった遺伝子操作非ヒト動物が、たとえば、ＵＡＳ−ウシＴＡＵ遺伝子導入ハエ、アクチン−ＧＡＬ４ハエおよび／またはｇｍｒ−ＧＡＬ４ハエといった、ＵＡＳ−ＡＰＰ６９５ＩＩおよびＵＡＳ−ＤＰｓｎ−変異体（Ｌ２３５Ｐ）として選択される。他のアルツハイマー病動物モデルは、神経原線維変化および／またはアミロイド斑を生じることができる組み換え動物モデル；ヒトまたはマウスｔａｕまたは４反復アイソフォームまたはＰ３０１Ｌ変異ｔａｕといったｔａｕアイソフォームのようなｔａｕタンパク質をコードする組み換え遺伝子を発現する組み換え動物モデル；アミロイド前駆体タンパク質または変異アミロイド前駆体タンパク質、またはβ−アミロイドをコードする組み換え遺伝子を発現する組み換え動物モデル；セクレターゼ、ガンマ−セクレターゼ、ベータ−セクレターゼまたはアルファ−セクレターゼ、プレセニリン１またはプレセニリン２をコードする組み換え遺伝子を発現する組み換え動物モデル；および上記の組み換え遺伝子の組み合わせを発現する任意の組み換え動物モデルでありうる。
【００５１】
別の好ましい一実施形態では、前記交雑は、アルツハイマー病の背景で、神経変性疾患に類似の神経病理の症状、特に、とりわけＡＤの組織学的性質およびＡＤに特徴的な行動変化を含む、ＡＤに類似の神経病理の症状（ＡＤ型神経病理）を発症するおよび／または示す強化および促進された素因を有する、ＨＩＦ３ａノックアウト動物および／または遺伝子導入ＨＩＦ３ａ動物を結果として生じる。
【００５２】
別の好ましい一実施形態では、前記交雑は、アルツハイマー病の背景で、前記非ヒト動物を遺伝子操作するのに用いられた遺伝子の発現によって引き起こされた有益な作用のために、ＡＤ症状が低減した、または神経変性疾患に類似した症状を発症するリスクが低い、特にＡＤに類似した神経病理の症状を発症するリスクが低い、および／またはＡＤの症状を有しないＨＩＦ３ａノックアウト動物および／または遺伝子導入ＨＩＦ３ａ動物を結果として生じる。
【００５３】
遺伝子操作非ヒト遺伝子導入動物および／またはノックアウト動物は、実験動物として、被験動物として、神経変性疾患についての動物モデルとして、好ましくはアルツハイマーについての動物モデルとして、用いることができる。神経病理学的性質を示すおよび／または症状の低減を示すそのような遺伝子操作非ヒト動物の例は、本発明に開示される（実施例（ｘｉｉ）および図面３９から４４を参照）。
【００５４】
そのような遺伝子導入および／またはノックアウト動物の作製および構築のための戦略および技術は当業者に公知であり（たとえばカペッキ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ），Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９，２４４：１２８８−１２９２およびホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら，『マウス胚操作：実験の手引き』（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９９４ およびジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）およびアボット（Ａｂｂｏｔｔ），『マウス遺伝学および遺伝子組み換え：実践的手法』（Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ； Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），オックスフォード大学出版会，英国オックスフォード，１９９９を参照）、および本発明に詳細に記載される（実施例（ｘｉｉ）を参照）。
【００５５】
本発明の別の一態様では、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を調べるための動物モデルとして、そのような組み換え、遺伝子操作非ヒト動物、遺伝子導入またはノックアウト動物を利用するのが好ましい。そのような動物は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための診断薬および治療薬の開発において、化合物、物質、および調節因子を、スクリーニング、試験、および評価するのに有用な被験動物または実験動物でありうる。
【００５６】
別の一態様では、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤ、または （ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される一種類以上の物質の、関連する疾患および異常の、調節因子についてのスクリーニングのための測定法を扱い、その方法は下記を含む（ａ）神経変性疾患または関連する疾患または障害を発症する素因を有するかまたはすでに発症している、被験動物または実験動物または動物モデルへ被験化合物を投与、および（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定、および（ｃ）等しく前記疾患を発症する素因を有するかまたはすでに発症している、およびそのような被験化合物が投与されていない、対応する対照動物中の前記物質の、活性および／またはレベルを測定、および（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の動物中の物質の活性および／またはレベルを比較し、ここで被験動物、または実験動物、または動物モデル中の物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患および障害の調節因子であることを示す。
【００５７】
好ましい一実施形態では、本発明に開示される通り、前記被験動物、または実験動物、または動物モデルおよび／または前記対照動物は、天然ＨＩＦ３ａ遺伝子転写調節配列でない転写調節配列の調節下にある、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、またはその断片、または誘導体、または変異体を発現する、組み換え、遺伝子操作非ヒト動物である（下記参照）。
【００５８】
別の一態様では、本発明に記載の遺伝子操作非ヒト動物は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療のための治療法、または調節物質、または化合物の有効性を測定または評価するためのｉｎ ｖｉｖｏ検定法を提供する。 
【００５９】
別の一態様では、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤ、または（ｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される一種類以上の物質の、関連する疾患および異常の、調節因子についてのスクリーニングのための測定法を扱う。このスクリーニング方法は下記を含む（ａ）細胞を被験化合物、物質、または調節因子と接触させること、および（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性、またはレベル、または活性およびレベルの両方を測定すること、および（ｃ）前記被験化合物と接触させていない対照細胞中の前記物質の、活性、またはレベル、または活性およびレベルの両方を測定すること、および（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の細胞中の物質のレベルを比較し、ここで、接触させた細胞中の前記物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物、または物質、または調節因子が前記疾患および障害の調節因子であることを示し、前記調節因子は（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性、またはレベル、または活性およびレベルの両方でありうる。本発明で開示される通りの、ＨＩＦ３ａタンパク質を過剰発現する細胞、好ましくはＨＩＦ３ａ ｓｖ３タンパク質を安定に過剰発現する細胞といった、前記スクリーニング検定法で用いられる細胞の例を下記に示す（実施例（ｘ）および図３５）。前記細胞を用いる検定法の詳細な例が本発明で開示される（実施例（ｖｉ）および図１９を参照）。遺伝子操作動物および細胞およびスクリーニング検定法の例は単なる説明であり、および開示の残りを限定することを決して意図しない。
【００６０】
別の一実施形態では、本発明は、（ｉ）前述のスクリーニング測定の方法によって神経変性疾患の調節因子を特定する、および（ｉｉ）調節因子を医薬キャリヤーと混合する段階を含む、薬剤を製造する方法を提供する。しかし、前記調節因子はまた、他の種類のスクリーニング測定法によっても特定することができる。
【００６１】
別の一態様では、別の一態様では、本発明は、リガンドと、ＨＩＦ３ａにコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体との間の結合の阻害について、化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするための測定法を提供する。前記スクリーニング測定法は、（ｉ）前記ＨＩＦ３ａ翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加える、および（ｉｉ）前記阻害についてスクリーニングする一または複数の化合物を前記複数の容器に加える、および（ｉｉｉ）検出可能な、好ましくは蛍光標識リガンドを前記容器に加える、および（ｉｖ）前記ＨＩＦ３ａ翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体、および前記一または複数の化合物、および前記検出可能な、好ましくは蛍光標識リガンドをインキュベートする、および（ｖ）前記ＨＩＦ３ａ翻訳産物に、またはその前記断片、または誘導体、または変異体に結合した蛍光の量を測定する、および（ｖｉ）前記リガンドの、前記ＨＩＦ３ａ翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への結合の、一種類以上の前記化合物による阻害の程度を測定する段階を含む。リガンドと前記ＨＩＦ３ａ翻訳産物との間の結合の阻害を測定するためには、前記ＨＩＦ３ａ翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体を、人工リポソーム中に再構成し、対応するプロテオリポソームを作製するのが好ましい可能性がある。界面活性剤からリポソームへのＨＩＦ３ａ翻訳産物の再構成の方法は詳しく説明されている（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８：９４５６−９４６４；クリヴォシェフ（Ｋｒｉｖｏｓｈｅｅｖ）およびウサノフ（Ｕｓａｎｏｖ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｍｏｓｃｏｗ １９９７，６２：１０６４−１０７３）。蛍光標識リガンドを利用する代わりに、一部の態様では、当業者に公知である任意のその他の検出可能な標識、たとえば放射性標識を用い、およびそれをしかるべく検出するのが好ましい可能性がある。前記方法は、新規化合物の同定に、および、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の遺伝子産物、またはその断片、または誘導体、または変異体へのリガンドの結合を阻害する能力が改良されたかまたはそうでなければ最適化された化合物を評価するために有用である可能性がある。キャリヤー粒子の使用を基礎としたこの場合の蛍光結合測定法の一例は、特許出願国際公開第００／５２４５１号パンフレットに開示され記載されている。別の一例は、特許国際公開第０２／０１２２６号パンフレットに記載された競合測定法である。本発明のスクリーニング測定法のために好ましいシグナル検出方法は、下記の特許出願に記載されている：国際公開第９６／１３７４４号、第９８／１６８１４号、第９８／２３９４２号、第９９／１７０８６号、第９９／３４１９５号、第００／６６９８５号、第０１／５９４３６号および第０１／５９４１６号パンフレット。
【００６２】
別の一実施形態では、本発明は、（ｉ）前述の阻害結合測定法によって、化合物を、リガンドとＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の遺伝子産物との間の結合の阻害因子として特定する、および（ｉｉ）その化合物を医薬キャリヤーと混合する段階を含む、薬剤を製造する方法を提供する。しかし、前記化合物はまた、他の種類のスクリーニング測定法によっても特定できる可能性がある。
【００６３】
別の一態様では、本発明は、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物との、またはその断片、または誘導体、または変異体との前記化合物の結合の程度を測定する、化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするための測定法を扱う。前記スクリーニング測定法は、（ｉ）ＨＩＦ３ａ翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加える、および（ｉｉ）前記結合についてスクリーニングする検出可能な、好ましくは蛍光標識された化合物、または検出可能な、好ましくは蛍光標識された複数の化合物を前記複数の容器に加える、および（ｉｉｉ）前記ＨＩＦ３ａ翻訳産物と、またはその前記断片、または誘導体、または変異体と、前記検出可能な、好ましくは蛍光標識された化合物、または検出可能な、好ましくは蛍光標識された複数の化合物をインキュベートする、および（ｉｖ）前記ＨＩＦ３ａタンパク質と、またはその前記断片、または誘導体、または変異体と結合した好ましくは蛍光の量を測定する、および（ｖ）前記ＨＩＦ３ａ翻訳産物への、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への、一種類以上の前記化合物による結合の程度を測定する段階を含む。この型の測定では、蛍光標識を用いるのが好ましい。しかし、任意の他の種類の検出可能な標識もまた使用することができる。またこの型の測定では、ＨＩＦ３ａ翻訳産物またはその断片、または誘導体、または変異体を、本発明に記載の通り、人工リポソーム中に再構成するのが好ましい可能性がある。前記測定法は、新規化合物の同定に、およびＨＩＦ３ａ翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体へ結合する能力が改良されたかまたはそうでなければ最適化された化合物を評価するために有用である可能性がある。
【００６４】
別の一実施形態では、本発明は、（ｉ）前述の結合測定法によって、ＨＩＦ３ａ遺伝子の遺伝子産物への結合因子として化合物を特定する、および（ｉｉ）その化合物を医薬キャリヤーと混合する段階を含む、薬剤を製造する方法を提供する。しかし、前記化合物はまた、他の種類のスクリーニング測定法によっても特定できる可能性がある。 
【００６５】
別の一実施形態では、本発明は、ここで請求するスクリーニング測定法に記載の方法のうち任意のものによって得ることができる薬剤を提供する。別の一実施形態では、本発明は、ここで請求するスクリーニング測定法に記載の方法のうち任意のものによって得られた薬剤を提供する。
【００６６】
本発明は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５に示される、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物であるタンパク質分子、またはその断片、または誘導体、または変異体、および、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を検出するための診断標的としてのその用途を扱う。
【００６７】
さらに、本発明は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５に示される、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物であるタンパク質分子、またはその断片、または誘導体、または変異体、および、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を予防、または治療、または改善する試薬または化合物についてのスクリーニング標的としての用途のためのその用途を扱う。
【００６８】
本発明は、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物、配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５、またはその断片、または誘導体、または変異体である免疫原と、特異的に免疫反応する抗体を扱う。その免疫原は、前記遺伝子の翻訳産物の免疫原性または抗原性のエピトープまたは部分を含むことができ、ここで翻訳産物の前記免疫原性または抗原性部分はポリペプチドであり、および前記ポリペプチドは抗体反応を動物において導き、前記ポリペプチドは前記抗体によって免疫特異的に結合している。抗体を作製する方法は本分野でよく知られている（ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）ら，『抗体−実験の手引き』（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９８８を参照）。本発明で使用される「抗体」の語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、組み換え、抗イディオタイプ、ヒト化、または一本鎖抗体、およびその断片といった、当該分野で既知のすべての型の抗体を包含する（デュベル（Ｄｕｂｅｌ）およびブライトリンク（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ），『組み換え抗体』（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），ワイリー・リース社（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ），ニューヨーク州ニューヨーク，１９９９）。本発明の抗体は、たとえば（ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ），（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，『抗体を用いて：実験の手引き』（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９９９およびエドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）Ｒ，『免疫診断：実践的手法』（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），オックスフォード大学出版会（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ），英国オックスフォード，１９９９を参照）、酵素免疫測定法（たとえば酵素結合免疫吸収測定法、ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、化学発光免疫測定法、ウェスタンブロット、免疫沈降法、および抗体マイクロアレイといった、最先端の方法を基礎とするさまざまな診断および治療方法で有用である。これらの方法は、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の検出を含む。 
【００６９】
本発明の好ましい一実施形態では、前記抗体は被験者に由来する試料中の細胞の病理状態を検出するのに用いることができ、前記抗体を用いた前記細胞の免疫細胞化学染色を含み、ここで既知の健康状態を表す細胞と比較した前記細胞における染色の程度の変化、または染色パターンの変化は、前記細胞の病理状態を示す。好ましくは、病理状態は神経変性疾患、特にＡＤに関係する。細胞の免疫細胞化学染色は、本分野でよく知られたいくつかの異なる実験法によって実施することができる。しかし、抗体結合の検出には自動化法を適用するのが好ましく、ここで、細胞の染色の程度の判定、または細胞の細胞染色または細胞成分染色のパターンの判定、または細胞表面上または細胞内のオルガネラおよびその他の細胞下構造の間の抗原のトポロジカルな分布は、米国特許第６１５０１７３号明細書に記載の方法に従って実施される。
【００７０】
本発明のその他の特性および利点は、単なる説明であり、および開示の残りを限定することを決して意図しない下記の図および実施例の説明から明らかになる。
【実施例】
【００７１】
（ｉ）ＡＤ患者由来の脳組織解剖：
ＡＤ患者および対応する年齢の対照被験者由来の脳組織（側頭皮質、Ｔ、前頭皮質、Ｆ、海馬、Ｈ）を死後平均５時間以内に採取し、直ちにドライアイス上で凍結した。診断の組織病理的確認のため、各組織からの試料切片はパラホルムアルデヒドで固定した。発現差の分析のための脳の部分を特定し、ＲＮＡ抽出を実施するまで-８０℃にて保存した。
【００７２】
（ｉｉ）総ｍＲＮＡの単離：
総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を取扱説明書に従って使用することによって、死後脳組織から抽出した。正確なＲＮＡ濃度およびＲＮＡ品質は、ＤＮＡラブチップ（ＬａｂＣｈｉｐ）系を用いてアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザー（アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して測定した。調製したＲＮＡの追加の品質試験、すなわち部分分解の排除およびＤＮＡ混入に関する試験は、特に設計したイントロンＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチドおよび参照対照としてゲノムＤＮＡを使用して、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）技術を取扱説明書（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））に従って用いて融解曲線を作成した。
【００７３】
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ合成およびＲｓａＩの切断
異なる組織中の遺伝子発現の変化を同定するために、ｃＤＮＡ合成、抑制サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）、およびＳＳＨに由来する多様なｃＤＮＡプローブによるマイクロアレイチップのスクリーニングを組み合わせたスクリーニング法を採用した。この技法は、ｍＲＮＡの異なる母数を比較し、および、細胞の一母集団では発現するが、細胞の他の母集団では発現しないか、低レベルしか発現しない遺伝子のクローンを提供する。本発明では、ＡＤ患者および対応する年齢の対照被験者の死後の脳組織（前頭および側頭皮質）から選択されたＲＮＡ母集団を比較した。
【００７４】
抑制サブトラクティブマイクロアレイ分析用の開始物質として、上記（ｉｉ）の通り総ＲＮＡを抽出した。好ましくは完全長のｃＤＮＡの産生のために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく手法である「ＳＭＡＲＴｃＤＮＡ合成」を製造業者（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））の手順書通りに実施した。「ＳＭＡＲＴｃＤＮＡ合成」の原理は詳細に記載されている、（チェンチック（Ｃｈｅｎｃｈｉｋ）ら，『遺伝子クローニングおよびＲＴ−ＰＣＲによる分析』、ｅｄｓ． シーバート（Ｓｉｅｂｅｒｔ）およびラリック（Ｌａｒｒｉｃｋ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｂｏｏｋｓ、ナティック（Ｎａｔｉｃｋ） １９９８：３０５−３２０）。ＳＭＡＲＴｃＤＮＡ合成のためには、それぞれ８μｇの総ＲＮＡを含有する４個のＲＮＡプールを調製した。各プールは、４つの異なる、すなわち、対照脳の下前頭皮質（ＣＦ）由来および下側頭皮質（ＣＴ）由来の、患者脳の下前頭皮質（ＰＦ）由来および下側頭皮質（ＰＴ）由来の、試料をそれぞれ２μｇ含有する。量が１μｇの総ＲＮＡ混和物を、５０μｌの反応体積中で利用した（ＰＣＲサイクラー：マルチサイクラーＰＴＣ２００、ＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））。第２のＳＭＡＲＴ ＰＣＲ手順を、１９サイクルを用いて実施した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅＨ 逆転写酵素および５ｘ一本鎖緩衝液（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いた。
【００７５】
ＰＣＲ産物の抽出および精製の後、３０Ｕ ＲｓａＩ（ＭＢＩファーメンタス（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））を用いて３７℃にて２．５時間制限切断を実施した。ＲｓａＩ制限部位は、二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡの普遍的なプライミング部位中に配置されている。切断の品質をアガロースゲル電気泳動によって分析し、切断した試料を精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、およびｃＤＮＡ濃度を紫外分光光度法（バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））によって決定した。
【００７６】
（ｉｖ）抑制サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）
抑制サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションを用いて、４つのＳＭＡＲＴｃＤＮＡプール（ｉｉｉ）を比較した。これによって、異なって発現する遺伝子を含有するｃＤＮＡのプールは「テスター」と、参照ｃＤＮＡプールは「ドライバー」と指定される。２つのプールがハイブリダイズされ、および両方のプールに存在するすべてのｃＤＮＡは排除される。すなわち、ドライバー−プールはテスター−プールからサブトラクトされる。こうして、テスター母集団に主に発現する遺伝子のクローンを入手する。
【００７７】
「ＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブトラクションキット」を使用して、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を実施した。対照脳の前頭および側頭皮質（ＣＦおよびＣＴ）由来の、および患者脳（ｉｉｉ）の前頭および側頭皮質（ＰＦおよびＰＴ）由来の「テスター」ＳＭＡＲＴｃＤＮＡプールを、それぞれ２つのプールへとさらに分割した。それぞれのプールを、アダプター１またはアダプター２でリゲーションし、こうして、６つの異なる「テスター」ｃＤＮＡプールを取得した。３つの「ドライバー」ＳＭＡＲＴｃＤＮＡプール、ＣＴ、ＰＦおよびＰＴは、リゲーションされていないままであった。異なって発現する配列を濃縮するために使用される第１のハイブリダイゼーション手順では、下記の３つの異なる「テスター」ＳＭＡＲＴｃＤＮＡプールを、下記の過剰分の「ドライバー」ＳＭＡＲＴｃＤＮＡと組み合わせた：ＳＳＨ（１）：ＰＦ−「テスター」およびＰＴ−「ドライバー」；ＳＳＨ（２）：ＰＴ−「テスター」およびＰＦ−「ドライバー」；ＳＳＨ（３）：ＣＴ−「テスター」およびＰＴ−「ドライバー」； ＳＳＨ（４）：ＰＴ−「テスター」およびＣＴ−「ドライバー」。９８℃にて１．５分間の変性手順の後、６８℃にて８時間ハイブリダイゼーションを実施した。第２の手順では、アダプター１または２にそれぞれリゲーションした「テスター」ＳＭＡＲＴｃＤＮＡプールの２つの対応する一次ハイブリダイゼーション試料を、混和し、および、前に使用した過剰な「ドライバー」ＳＭＡＲＴｃＤＮＡプールと６８℃にて１５時間再ハイブリダーゼーションした。こうして、後に続く増幅に適した、すなわち５’位端および３’位端に両アダプター配列を有し、およびしたがって異なるアニール部位を有する、二本鎖ｃＤＮＡを産生した。下記のＰＣＲ手順を適用して、効率的に増幅された特異的産物を取得し、および非特異的増幅を抑制した。第１のＰＣＲでは、ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性によってアダプターの欠損する鎖を充填した。取得したハイブリダイゼーション産物１μｌをそれぞれ、２５μｌの最終体積中に対応する「プライマー１」（１０μＭ）（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を、１ｘＰＣＲ反応緩衝液（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、１０ｍＭのｄＮＴＰ−Ｍｉｘ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、アマシャムファルマシアバイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、および０．５μｌの５０ｘＡｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））とともに用いて、ＰＣＲにそれぞれ供した。ＰＣＲ条件を下記の通り設定した：７５℃にて５分間の１ラウンド、その後、２７ないし３０サイクル：９４℃にて３０秒間、６４℃ないし６６℃にて３０秒、７２℃にて１.５分間。７２℃にて５分間の最後の一手順を最後のサイクルに追加した。第２のネスティッドＰＣＲを、「プライマー１」の代わりにネスティッドプライマー「ネスティッドプライマー １」および「２Ｒ」を用い、６６℃ないし６８℃のアニール温度および１２ないし１５サイクルを適用したことを除いて、第１のＰＣＲについて記載した通りに実施した。異なる条件によって取得したＰ���Ｒ産物を後に続く分析のためにプールした。使用したプライマー配列は、供給業者（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））の取扱説明書の付属書Ｂを参照のこと。
【００７８】
（ｖ）サブトラクトされたＰＣＲ産物のクローニングおよびＤＮＡバイオチップの産生
４つの異なる組み合わせＳＳＨ（１）−ＳＳＨ（４）、（ｉｖ）を参照、のＳＳＨ ＳＭＡＲＴ二本鎖ｃＤＮＡを、ｐＣＲ２.１−ベクターへとリゲーションし、および製造業者の取扱説明書（ＴＡクローニングキット、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に従ってＩＮＶアルファＦ‘細胞へと形質転換した。細菌コロニーを取り出し、および「ネスティッドプライマー１」および「ネスティッドプライマー２」を用いて、ＭＴＰ上のコロニーＰＣＲで分析した（マイクロタイタープレート、９６ウェル、アブゲン（Ａｂｇｅｎｅ））。９０％を上回る陽性クローンを示すＭＴＰを、調製コロニーＰＣＲアプローチに供した。１ウェルあたり、下記のＰＣＲ混合物を生成した：最終体積１２０μｌ中の、対応するオリゴヌクレオチド「ネスティッドプライマー１」および「ネスティッドプライマー２」（各０．５μＭ）、１ｘチタニウムＰＣＲ緩衝液（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、２００μＭのｄＮＴＰ−Ｍｉｘ（アマシャムファルマシアバイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））、０．２ｘチタニウム Ｔａｑ ＤＮＡ−ポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））。ＰＣＲ条件を下記の通り設定した：変性のための９４℃にて３０秒間の１ラウンド、次のラウンドに３５サイクル：９４℃にて３０秒および６８℃にて３分間。増幅した産物の品質を確認および分析し（ＤＮＡラボチップ（ＬａｂＣｈｉｐ）系、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザー、アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、引き続き精製した（マルチスクリーンＰＣＲ精製システム、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））。
【００７９】
さらに、下記の標準対照試料を産生した：３つの異なるシロイヌナズナ遺伝子、ｐｏｌｙＡ−ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、ヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡ、および３ｘＳＳＣ緩衝液を陰性対照として用い（マイクロアレイバリデーションシステム、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ストラタジーン））；ベータアクチンおよびＸｅｎｏｐｕｓ ｃＤＮＡを正規化対照として用いた。
【００８０】
いくつかのＭＴＰは、１プレートあたり９６の異なるクローンの増幅産物を有するそれぞれのＳＳＨの組み合わせＳＳＨ（１）−（４）から成る。増幅された産物は、ジーンスキャン・ヨーロッパ（ＧｅｎｅＳｃａｎ Ｅｕｒｏｐｅ）によって、ＧＡＰＳグラススライド（ＣＭＴ−ＧＡＰＳ、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））上に３部スポットされた。
【００８１】
（ｖｉ）プローブ合成およびＤＮＡバイオチップのスクリーニングによる異なって発現する遺伝子の同定
Ａ：ｃＤＮＡプローブ合成
シアニン３（Ｃｙ３）およびシアニン５（Ｃｙ５）で標識したｃＤＮＡプローブの生成のための開始物質として、総ＲＮＡを抽出し、および上記（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のように用いた。２μｇの総ＲＮＡおよび追加的な２ｎｇのＸｅｎｏｐｕｓＲＮＡ（標準ＲＮＡ）の混合物を、１つの標識反応あたり２試料を、特異的逆転写酵素反応に供し、それによってｐｏｌｙＡ−ｍＲＮＡをフルオレセイン−１２−ｄＣＴＰ（ＦＬ）またはビオチン−１１−ｄＣＴＰ（Ｂ）で標識したｃＤＮＡへと変換する。対照脳の前頭皮質（ＣＦ）に由来するＲＮＡ試料はフルオレセインで、患者脳の側頭皮質（ＰＴ）に由来するＲＮＡはビオチンでそれぞれ標識した。ｃＤＮＡ反応は、マイクロマックスＴＳＡラベリング手順書（ネンライフサイエンス（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ））に従って実施した。精製されたｃＤＮＡプローブを、ハイブリダイゼーション緩衝液中で再懸濁し、および１００℃にて７分間変性する。引き続き、フルオレセイン−標識反応の半量（すなわち１μｇのＲＮＡ）およびビオチン−プローブの半量を、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、２５％ホルムアミド緩衝液中で混合し、およびプレハイブリダイズした（５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ、４２℃にて４５分間）１枚のマイクロアレイ上に均一に塗布した。アレイハイブリダイゼーションを４２℃にて一晩実施した。
【００８２】
高厳密度の洗浄手順の後、ＴＳＡ検出キット手順書（ネンライフサイエンス（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ））の取扱説明書に従って、結合したフルオレセイン−およびビオチン標識プローブの検出を実施した。これによって、第１の手順では、抗ＦＬ−ＨＲＰ（フルオレセイン−ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ）はＦＬ標識ｃＤＮＡプローブと結合し、およびＨＲＰは蛍光レポーターＣｙ３タイラミドの沈積を触媒する。第２の手順では、ストレプトアビジン−ホースラディッシュはＢ標識ｃＤＮＡプローブに結合し、および蛍光レポーター分子Ｃｙ５タイラミドの沈積を触媒する。バイオチップ３をｃＤＮＡ混合物ＰＦ（Ｃｙ３）およびＰＴ（Ｃｙ５）でハイブリダイズした。適切な波長（６３５ｎｍ、５３２ｎｍ）でマイクロアレイを走査することによって、両方のシアニン染料を同時に検出することができた。
【００８３】
Ｂ：ＳＭＡＲＴプローブ合成
シアニン３（Ｃｙ３）およびシアニン５（Ｃｙ５）で標識したＳＭＡＲＴｃＤＮＡプローブの産生のために、ＰＣＲに基づく手法「ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ合成」を（ｉｉｉ）節に記載の通り実施した。ここでは著者らは開始物質として、上記（ｉｉ）に記載の通り抽出した総ＲＮＡを用いた。４つのＲＮＡ混合物を（ｉｉｉ）節に記載の通り調製した。それぞれ１μｇのＲＮＡ混合物および１ｎｇのＸｅｎｏｐｕｓ総ＲＮＡをＳＭＡＲＴｃＤＮＡ反応に供した。ＰＣＲ増幅、ｃＤＮＡの抽出および精製、ＲｓａＩによる制限切断および後に続く切断された試料の精製は、（ｉｉｉ）節を参照。
【００８４】
ＳＭＡＲＴｃＤＮＡ試料を、Ｃｙ３またはＣｙ５（アトラス（Ａｔｌａｓ）ガラス蛍光標識キット、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））のいずれかで標識した。第１の標識手順では、脂肪族アミノ基、すなわちアミノアリル−ｄＵＴＰ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を、変性した（１００℃、７分間）ＲｓａＩで切断したＰＣＲ産物へと組み入れた。反応は、クレノウ断片（ＭＢＩファーメンタス（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））によって触媒した。第２の標識手順において、蛍光レポーター染料Ｃｙ３またはＣｙ５を組み込まれた官能基に結合させた。精製したＣｙ３およびＣｙ５標識ＳＭＡＲＴｃＤＮＡプローブ（アトラスヌクレオスピン（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ）抽出キット、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を、１００℃にて７分間変性させた後、ハイブリダイゼーション緩衝液（５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、２５％ホルムアミド）中で再懸濁した。引き続き、Ｃｙ３標識ＳＭＡＲＴプローブをＣｙ５標識ＳＭＡＲＴプローブと混合し、およびプレハイブリダイズした（５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ、４２℃にて４５分間）１枚のマイクロアレイ上に均一に塗布した。アレイハイブリダイゼーションを４２℃で一晩実施した。ＴＳＡ検出キット手順書（ネンライフサイエンス（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ））の取扱説明書に従って、バイオチップの高厳密度の洗浄手順を続いて行った。バイオチップ２および７をＳＭＡＲＴｃＤＮＡ混合物ＰＦ（Ｃｙ３）およびＰＴ（Ｃｙ５）でハイブリダイズした。適切な波長（６３５ｎｍ、５３２ｎｍ）でマイクロアレイを走査することによって、両方のシアニン染料を同時に検出することができた。
【００８５】
Ｃ：サブトラクションプローブ合成
シアニン３（Ｃｙ３）およびシアニン５（Ｃｙ５）で標識したＳＳＨｃＤＮＡプローブの産生のために、ＰＣＲに基づく手法「ＳＭＡＲＴｃＤＮＡ合成」を（ｉｉｉ）節に記載の通り実施した。ここでは著者らは開始物質として、上記（ｉｉ）に記載の通り抽出した総ＲＮＡを用いた。４つのＲＮＡ混合物を（ｉｉｉ）節に開示する通り調製した。それぞれ１μｇのＲＮＡ混合物をＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ反応に供した。ＰＣＲ増幅、ｃＤＮＡの抽出および精製、ＲｓａＩによる制限切断および後に続く切断された試料の精製は、（ｉｉｉ）節を参照。サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションのために、ＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブトラクションキット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を、（ｉｖ）節で詳細に記載される通り利用した。組み合わせＳＳＨ（１）およびＳＳＨ（２）、および組み合わせＳＳＨ（３）およびＳＳＨ（４）のサブトラクトされたＰＣＲ産物を、それぞれ精製し（ストラタクリーン（ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ）キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ストラタジーン））、および、アダプター１および２をＲｓａＩおよびＳｍａＩ（ＭＢＩファーメンタス（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））による制限切断によって除去した。ＳＳＨ ｃＤＮＡプールをＣｙ３またはＣｙ５（アトラス（Ａｔｒａｓ）ガラス蛍光標識キット、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））のいずれかで標識した。第１の標識手順では、脂肪族アミノ基、すなわちアミノアリル−ｄＵＴＰ （クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を、変性した（１００℃、７分間）ＲｓａＩおよびＳｍａＩで切断したＳＳＨ ｃＤＮＡ産物へと組み入れた。反応は、クレノウ断片（ＭＢＩファーメンタス（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））によって触媒した。第２の標識手順において、蛍光レポーター染料Ｃｙ３およびＣｙ５を、組み込まれた官能基に結合させた。
【００８６】
精製したＣｙ３およびＣｙ５標識ＳＳＨ ｃＤＮＡプローブ（精製については、アトラス（Ａｔｌａｓ）ヌクロスピン（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ）抽出キット、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照）を、１００℃にて７分間変性させた後、ハイブリダイゼーション緩衝液（５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、２５％ホルムアミド）中で再懸濁した。引き続き、Ｃｙ３標識ＳＳＨ１プローブをＣｙ５標識ＳＳＨ２プローブと、およびＣｙ３標識ＳＳＨ３プローブをＣｙ５標識ＳＳＨ４プローブと、それぞれ混合した。それぞれの組み合わせを、プレハイブリダイズした（５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ、４２℃にて４５分間）１枚のマイクロアレイ上に均一に塗布した。アレイハイブリダイゼーションを４２℃にて一晩実施した。ＴＳＡ検出キット手順書（ネンライフサイエンス（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ））の取扱説明書に従って、バイオチップの高厳密度の洗浄手順を続いて行った。バイオチップ１および４を、ＳＳＨ（１）（Ｃｙ３）とＳＳＨ（２）（Ｃｙ５）のｃＤＮＡ混合物、およびＳＳＨ（３）（Ｃｙ３）とＳＳＨ（４）（Ｃｙ５）の混合物で、それぞれハイブリダイズした。適切な波長（６３５ｎｍ、５３２ｎｍ）でマイクロアレイを走査することによって、両方のシアニン染料を同時に検出することができた。
【００８７】
（ｖｉｉ）ＤＮＡバイオチップデータの評価
６３５および５３２ｎｍでそれぞれ測定された、Ｃｙ３およびＣｙ５に対する蛍光生データは、（ｃＤＮＡ１個あたり３スポットのそれぞれについて）数倍にされた。一連の測定は、スポット部分（シグナル）内で実施し、および他の一連の測定を近傍で行った（バックグラウンド）。引き続きスポットの正味蛍光強度（ＦＩ６３５、ＦＩ５３２）を下記の通り算出した：
ＦＩ６３５／５３２＝（Ｍ ＦＩスポット−１ ＳＤ ＦＩスポット）−（Ｍ ＦＩバックグラウンド＋１ ＳＤ ＦＩバックグラウンド）
【００８８】
この算出において、Ｍはスポットあたりの反復測定の中央値、ＳＤは対応する中央値の標準偏差を定義する。続いて、ＦＩ６３５およびＦＩ５３２の値が２より大きい場合、およびＦＩ６３５およびＦＩ６３５の値が２未満で第２の波長に対応する値が３より大きい場合のみ、さらなる評価のために検討される。
【００８９】
類似した方法で、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｃＤＮＡ対照および一組の標準（ハウスキーピング）遺伝子に対応する値を評価した。Ｘｅｎｏｐｕｓ ｃＤＮＡを、疾患関連ｍＲＮＡのＤＮＡ合成の効率に対する内部キャリブレーターとして用いた。次に、バックグラウンドを補正した３つの複製スポットのＦＩ６３５／５３２の中央値から、統計的平均値を算出し、およびｃＤＮＡプローブに対するシグナル比Ｒを公式を用いて導き出した：
Ｒ６３５／５３２＝ＦＩ６３５、較正済／ＦＩ５３２、較正済
【００９０】
最後の評価手順では、異なるハイブリダイゼーションの結果を論理的一貫性について考慮した。
【００９１】
（ｖｉｉｉ）発現の差の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析による確認：
側頭皮質対前頭皮質における、および海馬対前頭皮質におけるヒトＨＩＦ３ａ遺伝子の発現レベルの差の裏付けを、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）技術（ロシュ（（Ｒｏｃｈｅ））を用いて分析した。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応についての迅速熱サイクリング、および増幅中の蛍光シグナルのリアルタイム測定を扱い、およびしたがって、終点計測値でなく動力学を用いたＲＴ−ＰＣＲ産物の高精度な定量を可能にする。ＡＤ患者のおよび対応する年齢の健常対照者の側頭皮質由来、ＡＤ患者のおよび対応する年齢の健常対照者の前頭皮質由来、ＡＤ患者および対応する年齢の健常対照者の海馬由来の、ＨＩＦ３ａｃＤＮＡの比、およびＡＤ患者のおよび対応する年齢の健常対照者の側頭皮質および前頭皮質由来のＨＩＦ３ａｃＤＮＡの比、およびＡＤ患者のおよび対応する年齢の健常対照者の海馬および前頭皮質由来のＨＩＦ３ａｃＤＮＡの比をそれぞれ測定した（相対的定量）。
【００９２】
ＨＩＦ３ａの、前頭皮質組織（Ｆ）と下側頭皮質組織（Ｔ）との間のｍＲＮＡ発現プロファイリングを、各ブラーク病期につき４〜最大９の組織で分析した。ブラーク３病理を有するドナー１名からの高品質組織が無かったため、ブラーク３病理を有する追加の１名のドナーの組織を含め、およびブラーク６病理を有するドナー１名からの高品質組織が無かったため、ブラーク５病理を有する追加の１名のドナーの組織試料を含めた。
【００９３】
プロファイリングの分析のため、２つの一般的手法を用いている。ＨＩＦ３ａの、ＡＤ生理における関連の複合像に寄与する、下側頭皮質に対する前頭皮質、およびＡＤ患者に対する対照の両方の比較プロファイリング試験を下記に詳細に示す。
【００９４】
１）対照の、およびＡＤ患者の、前頭皮質組織と下側頭皮質組織との間のｍＲＮＡ発現の相対比較。
【００９５】
この手法は、同定されたＨＩＦ３ａが、変性に対する脆弱性のより低い組織（前頭皮質）の保護に関与しているか，または、脆弱性のより高い組織（下側頭皮質）の変性過程に関与するかまたはそれを促進するかを検証することを可能にした。
【００９６】
最初に、ＰＣＲの効率を測定するため、ＨＩＦ３ａスプライス変異体１をエンコードする遺伝子についての特異的プライマー：
５’−ＧＧＧＣＴＣＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＣＣＴＡＣＴＴ−３’（配列番号６、ヌクレオチド１４６６−１４８８）および５'−ＣＡＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＴＡＧＣＴＧＣＡＧＴ−３'（配列番号６、ヌクレオチド１５１０−１５３１）を用いて、および；
ＨＩＦ３ａスプライス変異体２をエンコードする遺伝子のための特異的プライマー：５’−ＴＴＴＧＣＧＴＧＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＡＡＧ−３’（配列番号７、ヌクレオチド１３０５−１３２６）および５’−ＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＧＧＣＣＡＡＡＴ−３’（配列番号７、ヌクレオチド１３６０−１３７７）を用いて、および；
ＨＩＦ３ａスプライス変異体３をエンコードする遺伝子のための特異的プライマー：５’−ＴＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＴＡＣＣＴＡＧＣＴ−３’（配列番号８、ヌクレオチド１８６６−１８８８）および５’−ＣＴＧＴＡＴＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＣＡＧＣＣ−３’（配列番号８、ヌクレオチド１９３５−１９５５）および；
ＨＩＦ３ａスプライス変異体５をエンコードする遺伝子のための特異的プライマー：５'−ＡＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＡＡＡ−３'（配列番号９、ヌクレオチド２３１８−２３３９）および５'−ＡＡＣＡＧＡＧＣＧＡＧＣＡＧＴＧＣＣＴＴ−３'（配列番号９、ヌクレオチド２３８０−２３９９）；
を用いて、標準曲線を作成した。
【００９７】
ＰＣＲ増幅（９５℃で１秒間，５６℃で５秒間、および７２℃で５秒間）を、ライトサイクラー・ファストスタートＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）混合物（ファストスタートＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝液、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含むｄＮＴＰ混合物、ＳＹＢＲグリーンＩ色素、および１ｍＭ ＭｇＣｌ２；ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、０．５μＭプライマー、２μｌのｃＤＮＡ希釈系列（終濃度４０、２０、１０、５、１および０．５ｎｇヒト脳総ｃＤＮＡ；クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および、使用プライマーに応じて追加の３ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む２０μｌ容量中で実施した。
融解曲線分析は、約８３．５℃にてＨＩＦ３ａスプライス変異体１遺伝子特異的プライマーについて、７８℃にてＨＩＦ３ａスプライス変異体２遺伝子特異的プライマーについて、８２℃にてＨＩＦ３ａスプライス変異体３遺伝子特異的プライマーについて、８５℃にてＨＩＦ３ａスプライス変異体５遺伝子特異的プライマーについて、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物の品質および大きさはＤＮＡラブチップ（ＬａｂＣｈｉｐ）システムを用いて測定した （アジレント２１００バイオアナライザー、アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））。試料の電気泳動図でＨＩＦ３ａスプライス変異体１遺伝子について６６ｂｐの予測サイズに、ＨＩＦ３ａスプライス変異体２遺伝子について７３ｂｐに、およびＨＩＦ３ａスプライス変異体３遺伝子について９０ｂｐに、ＨＩＦ３ａスプライス変異体５遺伝子について８２ｂｐにそれぞれ、単一ピークが観察された。
【００９８】
同様の方法で、ＰＣＲ手順を適用して、定量用の参照標準として選択された参照遺伝子の組のＰＣＲ効率を測定した。本発明では、５種類のそのような参照遺伝子の平均値を測定した；（１）シクロフィリンＢ、特異的プライマー、
５'−ＡＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＧＧＧＣＣＴＧ−３' および５'−ＡＧＣＣＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＣＣ−３'を用いＭｇＣｌ２を省いて（別に１ｍＭを３ｍＭの代わりに加えた）。融解曲線分析は約８７℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（６２ｂｐ）の単一バンド一本を示した。（２）リボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）、特異的プライマー５'−ＧＧＴＣＡＡＡＴＴＴＡＣＣＣＴＧＧＣＣＡ−３'および５'−ＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣ−３'を用いて（例外；別に１ｍＭ ＭｇＣｌ２を３ｍＭの代わりに加えた）。融解曲線分析は約８５℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（６２ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。（３）ベータアクチン、特異的プライマー５'−ＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＡ−３'および５'−ＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３'を用いて。融解曲線分析は約８７℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（１４２ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。（４）ＧＡＰＤＨ、特異的プライマー５１ＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧ−３'および５'−ＧＣＴＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧ−３'を用いて。融解曲線分析は約８３℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（８１ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。（５）トランスフェリン受容体ＴＲＲ、特異的プライマー５'−ＧＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＴＴ−３'および５'−ＡＧＣＡＧＴＴＧＧＣＴＧＴＴＧＴＡＣＣＴＣＴＣ−３'を用いて。融解曲線分析は約８３℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（８０ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。
【００９９】
値の計算のために、まずｃＤＮＡ濃度の対数を、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子について、すなわちＨＩＦ３ａスプライス変異体１、ＨＩＦ３ａスプライス変異体２、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５について、および５種類の参照標準遺伝子についてのサイクル数閾値Ｃｔに対してプロットした。標準曲線の傾きおよび切片（すなわち直線回帰）をすべての遺伝子について計算した。次の段階で、前頭皮質由来、側頭皮質由来、および海馬由来のｃＤＮＡを、それぞれ平行して分析しシクロフィリンＢに対して正規化した。Ｃｔ値を測定し、対応する標準曲線を用いてｎｇ総脳ｃＤＮＡに変換した：
１０^（（Ｃｔ値−切片）／傾き）       [ｎｇ総脳ｃＤＮＡ]
【０１００】
側頭および前頭皮質についての値、ＨＩＦ３ａ ｃＤＮＡの海馬および前頭皮質についての値（すなわち、ＨＩＦ３ａスプライス変異体１、ＨＩＦ３ａスプライス変異体２、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３および／またはＨＩＦ３ａスプライス変異体５それぞれについて）およびＡＤ患者（Ｐ）および対照者（Ｃ）の前頭皮質ＨＩＦ３ａ ｃＤＮＡからの値、およびＡＤ患者（Ｐ）および対照者（Ｃ）の側頭皮質ＨＩＦ３ａ ｃＤＮＡについての値は、シクロフィリンＢに対して正規化し、および比を下記の式に従って計算した：
ＨＩＦ３ａ側頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ側頭[ｎｇ]
比＝−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＨＩＦ３ａ前頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ前頭[ｎｇ]
ＨＩＦ３ａ海馬[ｎｇ]／シクロフィリンＢ海馬[ｎｇ]
比＝−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＨＩＦ３ａ前頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ前頭[ｎｇ]
ＨＩＦ３ａ（Ｐ）側頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ（Ｐ）側頭[ｎｇ]
比＝−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＨＩＦ３ａ（Ｃ）側頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ（Ｃ）側頭[ｎｇ]
ＨＩＦ３ａ（Ｐ）前頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ（Ｐ）前頭[ｎｇ]
比＝−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＨＩＦ３ａ（Ｃ）前頭[ｎｇ]／シクロフィリンＢ（Ｃ）前頭[ｎｇ]
【０１０１】
三番目の段階で、参照標準遺伝子の組を平行して分析し、個別の脳試料それぞれについて参照標準遺伝子の発現レベルの、対照者対ＡＤ患者側頭皮質比の、対照者対ＡＤ患者前頭皮質比、およびＡＤ患者および対照者の前頭対側頭比の、およびＡＤ患者および対照者の前頭対海馬比の平均値をそれぞれ決定したシクロフィリンＢを段階２および段階３で分析し、また、一つの遺伝子から別の遺伝子への比は別々の分析で一定のままであったため、ＨＩＦ３ａについての値、すなわちＨＩＦ３ａスプライス変異体１、ＨＩＦ３ａスプライス変異体２、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５についてそれぞれを、単一の遺伝子だけに対して正規化するのでなく、参照標準遺伝子の組の平均値に対して正規化することが可能であった。計算は、上記に示すそれぞれの比を、すべてのハウスキーピング遺伝子の平均値からのシクロフィリンＢの偏差で割ることによって行なった。ＨＩＦ３ａ遺伝子についてのそのような定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果およびＨＩＦ３ａ遺伝子について、すなわち、ＨＩＦ３ａスプライス変異体１、ＨＩＦ３ａスプライス変異体２、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５のそれぞれの計算値を図１、２、３および２５、２６に、図３および２７に、図４および２８に、図５および２９にそれぞれ示す。
【０１０２】
２）対照とＡＤ患者との間のｍＲＮＡ発現の比較
この分析に関して、別の時点での別の実験間のリアルタイム定量ＰＣＲ（ライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ）法）の絶対値は、キャリブレーターを使用しない定量比較に用いるのに十分に一貫性があることが証明された。シクロフィリンを、１００を超える組織について、ｑＰＣＲ実験のどれでも正規化のための標準物質として用いた。我々の正規化実験において、中でもシクロフィリンは最も一貫して発現されたハウスキーピング遺伝子であることが見出された。したがって、シクロフィリンに関して生じた値を用いることによって概念実証が行われた。
【０１０３】
第一の分析は、３名の異なるドナー由来の前頭皮質および下側頭皮質組織のｑＰＣＲ実験からのシクロフィリン値を用いた。分析したすべての実験で、各組織から同一のｃＤＮＡ調製物を用いた。この分析の中では、データ数の小ささのため、値の正規分布は達成されなかった。したがって、中央値およびその９８％信頼レベルの方法を用いた。この分析は、絶対値の比較について中央値から８．７％の中間偏差、および相対値の比較について中央値から６．６％の中間偏差を明らかにした。
【０１０４】
第二の分析は、それぞれ２名の異なるドナー由来の前頭皮質および下側頭皮質組織のｑＰＣＲ実験からのシクロフィリン値を用いたが、異なる時点からの異なるｃＤＮＡ調製物を用いた。この分析、絶対値の比較について中央値から２９．２％の中間偏差、および相対値の比較について中央値から１７．６％の中間偏差を明らかにした。この分析から、ｑＰＣＲ実験からの絶対値を使用できるが、しかし中央値からの中間偏差はさらに考慮されるべきであると結論されたＨＩＦ３ａについて絶対値の詳細な分析を実施した。したがって、シクロフィリンを用いた相対的正規化後にＨＩＦ３ａの絶対レベルを用いた。中央値および９８％信頼レベルを対照群（ブラーク０〜ブラーク３）および患者群（ブラーク４〜ブラーク６）についてそれぞれ計算した。同じ分析を、対照群（ブラーク０〜ブラーク２）および患者群（ブラーク３〜ブラーク６）を再定義して実施し、および対照群（ブラーク０〜ブラーク１）および患者群（ブラーク２〜ブラーク６）を再定義して実施した。後者の分析は、対照とＡＤ患者との間のｍＲＮＡ発現差の初期出現を見出すことを目的とした。この分析の別の視点では、遺伝子発現調節および初期出現差の傾向を見出すため、それぞれブラーク病期０〜１、ブラーク病期２〜３、およびブラーク病期４〜６を含む３群を互いに比較した。上記の通りの前記分析を図３０、３１、３２、３３に示す。
【０１０５】
（ｉｘ）免疫ブロット法：
総タンパク質抽出物を、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３−ｍｙｃを発現しているＨ４ＡＰＰｓｗ細胞から、１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣl、ｐＨ７.４、１ｍＭエチレンジアミン−４酢酸、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、５μｇ／ｍｌのロイペプチン）中での氷上でのホモジナイゼーションによって取得した。４℃、３０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離を２回行った後、上清をＳＤＳ−添加緩衝液中で５倍に希釈した。希釈試料のアリコート１２μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ポリアクリルアミド）で溶解し、およびＰＶＤＦウェスタンブロッティング膜（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））に移した。ブロットは、ウサギポリクローナル抗ｍｙｃ抗体（ＭＢＬ、１：５０００）、続いて、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清（サンタクルーズｓｃ−２０３０、１：５０００に希釈）でプローブし、およびＥＣＬ化学発光検出キット（アマシャムファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で展開した（図３４）。
【０１０６】
（ｘ）免疫蛍光分析（ＩＦ）：
細胞中のＨＩＦ３ａタンパク質の免疫蛍光染色のために、スウェーデン変異を有するヒトＡＰＰ６９５アイソフォームを安定に発現する（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）ヒト神経膠腫細胞株（Ｈ４細胞）を使用した（Ｈ４ＡＰＰｓｗ細胞）。
【０１０７】
Ｈ４ＡＰＰｓｗ細胞を、強いＣＭＶプロモーターの調節下で、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３（ＨＩＦ３ａ ｓｖ３ ｃｄｓ）（配列番号１２、１８９９ｂｐ）のコード配列を含むｐＦＢ−Ｎｅｏベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ストラタジーン）、＃２１７５６１）、およびｍｙｃ−タグ（ｐＦＢ−Ｎｅｏ−ＨＩＦ３ａ ｓｖ３ ｃｄｓ−ｍｙｃ、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３−ｍｙｃベクター、９１８１ｂｐ、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ）で遺伝子導入した。ＨＩＦ３ａ ｓｖ３−ｍｙｃベクターの産生のために、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３ ｃｄｓ−ｍｙｃ配列を、ｐＦＢ−Ｎｅｏベクターの多重クローニング部位（ＭＣＳ）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ制限部位へと導入した。ＨＩＦ３ａ ｓｖ３−ｍｙｃベクターによるＨ４ＡＰＰｓｗ細胞の遺伝子導入のために、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ストラタジーン）のレトロウイルス発現システムウィラポート（ＶｉｒａＰｏｒｔ）を用いた。
【０１０８】
ｍｙｃ標識ＨＩＦ３ａ ｓｖ３を過剰発現する細胞（Ｈ４ＡＰＰｓｗ−ＨＩＦ３ａ ｓｖ３−ｍｙｃ）を、２４ウェルプレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ）、デンマークロスキレ；＃１４３９８２）中のガラス製カバースリップ上に５ｘ１０４の細胞密度で播種し、および３７℃、５％のＣＯ２にて一晩インキュベートした。細胞をカバースリップ上に固定するために、培地を取り除き、および冷却したメタノール（−２０℃）を添加した。−２０℃、１５分間のインキュベーション時間の後、メタノールを除去し、および固定された細胞を室温で１時間ブロッキング溶液（２００μｌＰＢＳ／５％ＢＳＡ／３％ヤギ血清）中でブロッキングした。第１の抗体（ポリクローナル抗ｍｙｃ抗体、ウサギ、１：５０００、ＭＢＬ）およびＰＢＳ／１％ヤギ血清中のＤＡＰＩ（ＤＮＡ−染色、０．０５μｇ／ｍｌ、１：１０００）を添加し、および室温で１時間インキュベートした。第１の抗体を取り除いた後、固定された細胞をＰＢＳで５分間、３回洗浄した。第２の抗体（Ｃｙ３複合抗ウサギ抗体、１：１０００、アマシャムファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ドイツ）をブロッキング溶液に添加し、および室温で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで５分間、３回洗浄した。カバースリップをパーマフルーア（Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ）（ベックマンコールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いて顕微鏡用スライドに載せ、および４℃にて一晩保存し、封入培地を硬化した。顕微鏡暗視野エピ蛍光法および明視野位相差照明条件（ＩＸ８１、オリンパス光学（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ））を用いて細胞を可視化した。顕微鏡画像（図３５）をＰＣＯセンシカムでデジタル撮像し、および適切なソフトウェア（アナリシス、オリンパス光学（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ））を用いて分析した。
【０１０９】
（ｘｉ）免疫組織化学：
ＨＩＦ３ａの免疫蛍光染色のために、ヒト脳内のＨＩＦ３ａ ｓｖ１、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３およびＨＩＦ３ａ ｓｖ５をそれぞれ、およびＡＤ罹患組織と対照組織との比較のために、様々なブラーク病期（Ｐ０１６、Ｐ０１１、Ｐ０１７−ブラーク４、５、６）でアルツハイマー病と臨床的に診断されおよび神経病理学的に確認された患者、ならびにアルツハイマーのない対応する年齢の対照者（Ｃ０２９−ブラーク１）、および中等度のブラーク病期レベル（Ｃ０３５−ブラーク３）の被験者を含むドナーに由来する、死後の新鮮凍結前頭および側頭の前脳試料をクリオスタット（レイカ（Ｌｅｉｃａ）ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて厚さ１４μｍに切断した。組織切片を空気乾燥し、および室温にて１０分間アセトン中で固定した。ＰＢＳ中で洗浄した後、切片をブロッキング緩衝液（１０％正常ヤギ血清、ＰＢＳ中の０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で３０分間プレインキュベートし、および次にアフィニティ精製したウサギポリクローナル抗ＨＩＦ３ａ抗血清（ブロッキング緩衝液中で１：４０に希釈；デイビッズバイオテクノロジー（Ｄａｖｉｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；アミノ酸２９０−３０４）で４℃にて一晩インキュベートした。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳ中で３回すすいだ後、切片をＦＩＴＣ−複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清（ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）／ディアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ）、Ｎｏ．１１１−０９６−０４５、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１：１５０に希釈）で室温にて２時間インキュベートし、および次に再びＰＢＳ中で洗浄した。神経細胞の染色を、神経細胞系特異的マーカーＮｅｕＮに対するマウスモノクローナル抗体（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＭＡＢ３７７、１：４００に希釈）および二次Ｃｙ３−複合ヤギ抗マウス抗体（ディアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ）、１１５−１６６−０６２、１：６００に希釈）を用いて実施した。星状細胞の染色は、星状細胞特異的マーカーＧＦＡＰに対する抗体を用いて実施し（アブカム（Ａｂｃａｍ）、ＡＢ７８０ｂ、１：３００に希釈）、ミクログリアの染色はミクログリアl特異的マーカーＣＤ６８に対する抗体を用いて実施し（ダコ（ＤＡＫＯ）、Ｍｏ７１８、１：２００に希釈）、および乏突起膠細胞に対する染色は、乏突起膠細胞特異的マーカーＣＮＰａｓｅに対する抗体を用いて実施した（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｃ５Ｐ２２、１：４００に希釈）。核の染色は、切片をＰＢＳ中の５μＭのＤＡＰＩで３分間インキュベーションすることによって実施した。ヒト脳内のリポフスチンの自己蛍光を遮断するために、切片を７０％エタノール中の１％スーダンブラックＢで室温にて２〜１０分間処理し、および次に順次７０％エタノール、蒸留水およびＰＢＳ中に浸漬した。切片を「ベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）」封入培地（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州バーリンゲーム）でカバースリップした。顕微鏡画像を、暗視野エピ蛍光法および明視野 位相差照明条件（ＩＸ８１、オリンパス光学（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ））を用いて取得した。顕微鏡画像をＰＣＯセンシカムでデジタル撮像し、および適切なソフトウェア（アナリシス、オリンパス光学（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ））を用いて分析した（図３６、３７および３８を参照）。
【０１１０】
（ｘｉｉ）遺伝子導入ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の作製：
ヒトＢＡＣＥ遺伝子導入ハエおよびヒトＨＩＦ３ａ遺伝子導入ハエを、グリーブら（Ｇｒｅｅｖｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，２４：３８９９−３９０６）に従って、および本発明に記載の通り作製した。ＨＩＦ３ａ ｓｖ３（配列番号１２、配列番号４）の全オープンリーディングフレームを含有し、およびフレーム内でｍｙｃ−タグ（ａａ ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）と３’位で融合するＨＩＦ３ａ ｓｖ３ ｃＤＮＡ（配列番号 ８）の１９４２ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片を、ＧＡＬ４−結合部位ＵＡＳの下流にあるベクターｐＵＡＳＴのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ制限部位へとサブクローンした（ブランド（Ｂｒａｎｄ）およびペリモン（Ｐｅｒｒｉｍｏｎ），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９３，１１８：４０１−１５）。Ｐエレメント媒介生殖細胞系列形質転換を、スプラドリング（Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ）およびルビン（Ｒｕｂｉｎ）によって記載された通り実施した（ルビンおよびスプラドリング，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８２，２１８：３４８−５３；スプラドリングおよびルビン，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８２，２１８：３４１−７）。２０の独立したヒトＨＩＦ３ａ ｓｖ３遺伝子導入ハエ系統を作製し、および３つの異なる系統を本分析に用いた。
【０１１１】
ヒトＡＰＰおよびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）プレセニリン遺伝子導入ハエ、ＵＡＳ−ＡＰＰ６９５ＩＩおよびＵＡＳ−ＤＰｓｎ−変異体（Ｌ２３５Ｐ）、はＲ．パロ（Ｐａｒｏ）および Ｅ．フォーティニ（Ｆｏｒｔｉｎｉ）より提供を受けた（フォスグリーン（Ｆｏｓｓｇｒｅｅｎ）ら，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ １９９８，９５： １３７０３−８；イエ（Ｙｅ）およびフォーティニ（Ｆｏｒｔｉｎｉ），Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９９，１４６： １３５１−６４）。アクチン−ＧＡＬ４系統はブルーミントン・ストック・センター（Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ ｓｔｏｃｋ ｃｅｎｔｅｒ）から入手した。Ｆ．ピグノニ（Ｐｉｇｎｏｎｉ）からのｇｍｒ−ＧＡＬ４系統を、導入遺伝子の眼特異的発現を達成するために用いた。
【０１１２】
遺伝交雑を標準ショウジョウバエ培地上で２５℃にて設定した。使用した遺伝子型は：ｗ；ＵＡＳ−ｈＡＰＰ695, ＵＡＳ−ｈＢＡＣＥ４３７／ＣｙＯ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／Ｔｍ３−Ｗ；ＵＡＳ−ｈＡＰＰ695，ＵＡＳ−ｈＢＡＣＥ４３７／ＣｙＯ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４，ＵＡＳ−ＤＰｓｎＬ２３５Ｐ／Ｔｍ３−ｗ；ＵＡＳ−ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３−ｍｙｃ＃３−ｗ；ＵＡＳ−ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３−ｍｙｃ＃４−ｗ；ＵＡＳ−ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３−ｍｙｃ＃５７．
【０１１３】
免疫組織化学的および組織学的分析のために、成体ハエを下記の方法にしたがって免疫染色しおよび調製した。免疫染色のためには、成体ハエを４％パラホルムアルデヒド中で３時間固定し、１ｘＰＢＳで洗浄し、および２５％ショ糖中へ移して４℃にて一晩インキュベートした。ハエを剃刀で頭部切断し、および頭部をティシュー・テック（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ）（サクラ（Ｓａｋｕｒａ））に包埋しおよび急速凍結した。１０μｍ凍結横断切片をクリオスタット（ライカ（Ｌｅｉｃａ）ＣＭ３０５０Ｓ）で調製した。免疫染色はベクタステイン・エリート（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ）キット（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて取扱説明書に従って実施した。下記の一次抗体を使用した：２４Ｂ１０（アルファ−カオプチン、１：５）、デベロップメンタル・スタディーズ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ）より供給；およびウサギポリクローナル抗ｍｙｃ抗体（ＭＢＬ、ＭＢＬ、メディカル アンド バイオロジカルラボラトリーズ（Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））。成体頭部のパラフィン切片および塊の組織学的分析を、ジャガー（Ｊａｇｅｒ）およびフィッシュバック（Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ）（アシュバーナー（Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ）、『ショウジョウバエ：実験の手引き』（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）１９８９，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー：２５４−２５９）によって記載の通り行った。ハイブリドーマバンクの作製：チオフラビンＳ染色については、切片を５分間マイヤーヘマトキシリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で対比染色し、水道水中で１０分間洗浄し、および３分間１％チオフラビンＳ（シグマ）水溶液中で染色した。スライドを、蒸留水を何回か交換して洗浄し、１５分間１％酢酸中でインキュベートし、水道水で洗浄し、およびベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）封入剤（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に封入した。スライドはオリンパスＢＸ５１蛍光顕微鏡下で分析した（励起４３０ｎｍ、放出５５０ｎｍ）。
【０１１４】
ウェスタンブロッティングによるタンパク質分析については、ハエ頭部を１ｘＰＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％トリトンＸ−１００およびプロテアーゼインヒビターミックス・コンプリート（ロシュ・アプライドサイエンス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ））中でホモジナイズした。等量のタンパク質を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＧｍｂＨ））へ転写し、５％低脂肪ミルク中で２時間室温にてブロッキングし、およびウサギポリクローナル抗体２２Ｃ１１（ＭＢＬ、メディカル アンド バイオロジカルラボラトリーズ（Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））とインキュベートした。結合した抗体を、ヤギ 抗マウスペルオキシダーゼ結合二次抗体 （ディアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ））で検出した。免疫沈降については、ハエ頭部を上記の通りホモジナイズし、および 溶解物をクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の抗体手順ガイドに記載の通り処理した。抗体 ｍａｂ ６Ｅ１０（アルファ−Ａベータ１−１６，シグネット・パソロジー・システムズ（Ｓｉｇｎｅｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ））を免疫沈降に用いた。試料を１０〜２０％勾配ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）トリス−トリシンゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で分離し、およびプロトラン（Ｐｒｏｔｒａｎ）ＢＡ７９硝酸セルロース膜（０．１μｍ、シュライヒャー・シュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ／Ｓｃｈｕｅｌｌ）、ドイツ・ダッセル（Ｄａｓｓｅｌ））へブロットした。ベータ−アミロイドの検出は、記載の通り（イダ（Ｉｄａ）ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９６，２７１：２２９０８−１４）、ｍａｂ６Ｅ１０およびヤギ抗マウスペルオキシダーゼ結合二次抗体（ディアノバ）を用いて実施した。
【０１１５】
遺伝子導入ショウジョウバエにおけるヒトＨＩＦ３ａ発現の検出については、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ反応）反応を、本発明に記載の通り（実施例（ｖｉｉｉ））ＨＩＦ３ａスプライス変異体３特異的プライマーを用いて実施した。すべての実験に使用された３つのＨＩＦ３ａ ｓｖ３遺伝子導入ハエ細胞株の発現レベルにおける相対的な差を算出するために、ショウジョウバエハウスキーピング遺伝子ｒｐ４９（リボソームタンパク質Ｌ３２）を、下記のｒｐ４９特異的プライマー対を用いて、同一のライトサイクラーの作動において、プロファイルした：５’−ＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＴ−３’および３’−ＴＴＧＡＡＴＣＣＧＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＴ−５’。
【０１１６】
遺伝子導入ハエにおけるヒトＡＰＰ（ベータ−アミロイド前駆体タンパク質、ｈＡＰＰ）のアミロイド形成過程に伴う神経病理に及ぼすヒトＨＩＦ３ａ ｓｖ３発現の潜在的影響を特徴づけるため、眼特異的ＧＡＬ４系統ｇｍｒ−ＧＡＬ４を用いることによって、成体網膜でＨＩＦ３ａ ｓｖ３をｈＡＰＰおよびヒトＢＡＣＥ（ベータ位ＡＰＰ切断酵素、ｈＢＡＣＥ）と同時発現させた。
【０１１７】
ｇｍｒ−ＧＡＬ４の調節下のＨＩＦ３ａ ｓｖ３の遺伝子導入発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３特異的プライマーを用いて確認された
（実施例ｖｉｉｉ参照）。３つの異なる遺伝子導入ハエ系統を用いた（ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３−ｍｙｃ＃３，＃４および＃５７）。発現効率（図３９）における相対差を、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３プライマー対のサイクル数にしたがって算出し、ショウジョウバエのｒｐ４９遺伝子のサイクル数に対して正規化した（リボソームタンパク質Ｌ３２）。この算出に基づくと、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３遺伝子導入ハエ細胞株＃５７は、ハエ細胞株＃３よりも２.４倍高く発現し、およびハエ細胞株＃４よりも５.３倍強い（図３９）。ｇｍｒ−ＧＡＬ４の調節下でのヒトＨＩＦ３ａ ｓｖ３の遺伝子導入発現の結果、ショウジョウバエの網膜中のタンパク質の核局在性（図４０、矢印）をきたす。ウェスタンブロット上でポリクローナル抗ｍｙｃ抗体（ＭＢＬ）は、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３の予想された分子量（７０ｋＤ、図４１矢印）を有し、非遺伝子導入対照ハエのタンパク質抽出物が存在しないタンパク質を検出する。興味深いことに、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３発現は、他の遺伝子導入ハエ（図４１、レーン２、３および４、赤い星印）ならびにヒトＨＩＦ３ａ ｓｖ３−ｍｙｃ構築物を安定的に遺伝子導入したＨ４−ＡＰＰｓｗ細胞（レーン５、例（Ｘ）に示す通り）中のタンパク質レベルではほとんど検出されず、これは、ショウジョウバエおよびヒトＨ４−神経膠腫細胞における正常酸素圧条件において、遺伝子導入ＨＩＦ３ａ ｓｖ３−ｍｙｃのタンパク質分解または低発現を示唆する。
【０１１８】
ショウジョウバエの成体網膜におけるｈＡＰＰおよびｈＢＡＣＥの発現は、光受容体細胞の加齢依存性変性に繋がる（グリーブ（Ｇｒｅｅｖｅ）ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，２４：３８９９−３９０６）。ＨＩＦ３ａ ｓｖ３の共発現は、光受容体細胞特異的モノクローナル抗体２４Ｂ１０で染色した成体ハエの脳および複眼のクリオスタット切片上に示すように（図４２）、対応する週齢の８日齢のオスおよびメスのハエにおいて光受容体細胞変性を救済する（図４２ｂ）。光受容体の細胞変性は、プレセネリンの変異型を共発現しているハエにおいて加速される（ＰｓｎＬ２３５Ｐ、図４３およびグリーブ（Ｇｒｅｅｖｅ）．Ｉ．ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｉ．２００４，２４：３８９９−３９０６）。光受容体細胞変性の救済は、対応する年齢の対照ハエと比較して、ｈＡＰＰ、ｈＢＡＣＥおよびＤＰｓｎＬ２３５ＰとともにＨＩＦ３ａ−ｓｖ３＃５７を共発現している３日齢のオスおよびメスのハエにおいてさらに顕著である（図４２Ｃ）。
【０１１９】
ｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥを発現しているハエ中での光受容体細胞変性に対するＨＩＦ３ａ ｓｖ３の神経保護的効果をさらに特徴付けるために、３つの遺伝子導入ハエにおけるｈＡＰＰのアミロイド生成性処理を調査し、および、モデル系中のＡＰＰ処理と関連する神経学的病変に対して最も高い影響を示すＨＩＦ３ａ−ｓｖ３＃５７の共発現を検討した。アベタ（Ａｂｅｔａ）Ｎ末端特異的抗体６Ｅ１０でプローブした免疫沈降したアベタペプチドのウェスタンブロット上に示すように（図４３）、アベタレベルは、ｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥおよびＨＩＦ３ａ ｓｖ３を共発現しているハエと比較した場合、対照ハエにおいて変化しない（ｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ）。
【０１２０】
さらに、ｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ／ＤＰｓｎＬ２３５Ｐを発現しているハエ中の、チオフラビンＳ陽性アミロイド斑の発症を調査し（図４４上図）、およびｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ／ＤＰｓｎＬ２３５ＰおよびＨＩＦ３ａ−ｓｖ３＃４を発現しているハエと比較した（図４４下図）。図４４は、対照ハエとＨＩＦ３ａ−ｓｖ３＃４を共発現しているハエとの間でのプラーク沈積の開始時期に差がないことを示す。
【０１２１】
要約すると、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３の強力な神経保護的効果は、記載したアルツハイマー病の無脊椎動物モデル系において、ｈＡＰＰの操作されたアミロイド斑生成性処理またはアミロイド斑形成とは独立している。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１および２は、定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＡＤ脳組織中の、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体１中のヒトＨＩＦ３ａ遺伝子の発現差の検証を示す。ＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）から採取したＲＮＡ試料（図１ａ）およびＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および海馬（Ｈ）からの試料（図２ａ）に由来するＲＴ−ＰＣＲ産物の定量化を、ライトサイクラー急速サーマルサイクル技術によって実施した。同様に、対応する年齢の対照健常者の試料を比較した（前頭皮質および側頭皮質は図１ｂ、前頭皮質および海馬は図２ｂ）。データを遺伝子発現レベルに有意差を示さなかった一組の標準的遺伝子の全体の総平均値に対して正規化した。前記標準的遺伝子の組は、シクロフィリンＢ、リボソームタンパク質Ｓ９、トランスフェリン受容体、ＧＡＰＤＨ、およびベータアクチンの遺伝子から構成された。図は、蛍光発光によって測定された増幅された物質の量に対するサイクル数をプロットすることによる増幅の動態を表す。なお、反応の指数増殖期における、正常な対照者の前頭および側頭皮質由来の、および正常な対照者の前頭皮質および海馬由来の両方のＨＩＦ３ａスプライス変異体１ｃＤＮＡの増幅動態のそれぞれを並列した（図１ｂおよび２ｂ、矢印）。一方、アルツハイマー病（図１ａおよび２ａ、矢印）では、対応する曲線の有意な分離があり、それぞれの分析脳領域において、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体１の発現差を示唆し、前頭皮質と相対的に側頭皮質において、および前頭皮質と相対的に海馬において、ヒトＨＩＦ３ａ遺伝子、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体１の転写産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の調節異常、好ましくは上方調節を示唆する。
【図２】図１および２は、定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＡＤ脳組織中の、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体１中のヒトＨＩＦ３ａ遺伝子の発現差の検証を示す。ＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）から採取したＲＮＡ試料（図１ａ）およびＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および海馬（Ｈ）からの試料（図２ａ）に由来するＲＴ−ＰＣＲ産物の定量化を、ライトサイクラー急速サーマルサイクル技術によって実施した。同様に、対応する年齢の対照健常者の試料を比較した（前頭皮質および側頭皮質は図１ｂ、前頭皮質および海馬は図２ｂ）。データを遺伝子発現レベルに有意差を示さなかった一組の標準的遺伝子の全体の総平均値に対して正規化した。前記標準的遺伝子の組は、シクロフィリンＢ、リボソームタンパク質Ｓ９、トランスフェリン受容体、ＧＡＰＤＨ、およびベータアクチンの遺伝子から構成された。図は、蛍光発光によって測定された増幅された物質の量に対するサイクル数をプロットすることによる増幅の動態を表す。なお、反応の指数増殖期における、正常な対照者の前頭および側頭皮質由来の、および正常な対照者の前頭皮質および海馬由来の両方のＨＩＦ３ａスプライス変異体１ｃＤＮＡの増幅動態のそれぞれを並列した（図１ｂおよび２ｂ、矢印）。一方、アルツハイマー病（図１ａおよび２ａ、矢印）では、対応する曲線の有意な分離があり、それぞれの分析脳領域において、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体１の発現差を示唆し、前頭皮質と相対的に側頭皮質において、および前頭皮質と相対的に海馬において、ヒトＨＩＦ３ａ遺伝子、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体１の転写産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の調節異常、好ましくは上方調節を示唆する。
【図３】図３、４および５は、定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＡＤ脳組織中の、ヒトＨＩＦ３ａ遺伝子、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体２（図３）、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３（図４）およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５（図５）のそれぞれの発現差の検証を示す。ＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）から採取されたＲＮＡ試料（図３ａ、４ａ、５ａ）、および同様に、対応する年齢の対照健常者から採取された試料（図３ｂ、４ｂ、５ｂ）に由来するＲＴ−ＰＣＲ産物の定量化をライトサイクラー急速サーマルサイクル技術によって実施した。データを遺伝子発現レベルに有意差を示さなかった一組の標準的遺伝子の総平均値へと正規化した。前記標準的遺伝子の組は、シクロフィリンＢ、リボソームタンパク質Ｓ９、トランスフェリン受容体、ＧＡＰＤＨ、およびベータアクチンの遺伝子から構成された。図は、蛍光発光によって測定された増幅された物質の量に対するサイクル数をプロットすることによる増幅の動態を表す。なお、反応の指数増殖期における、正常な対照者の前頭および側頭皮質由来のＨＩＦ３ａスプライス変異体２ｃＤＮＡ、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３ｃＤＮＡ、およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５ｃＤＮＡの増幅動態のそれぞれを並列した（図３ｂ、４ｂ、５ｂ、矢印）。一方、アルツハイマー病（図３ａ、４ａ、５ａ、矢印）では、対応する曲線の有意な分離があり、それぞれの分析脳領域において、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体２、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３、およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５の発現差を示唆し、前頭皮質と相対的に側頭皮質において、ヒトＨＩＦ３ａ遺伝子、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体２、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３、およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５の転写産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の調節異常、好ましくは上方調節を示唆する。
【図４】図３、４および５は、定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＡＤ脳組織中の、ヒトＨＩＦ３ａ遺伝子、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体２（図３）、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３（図４）およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５（図５）のそれぞれの発現差の検証を示す。ＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）から採取されたＲＮＡ試料（図３ａ、４ａ、５ａ）、および同様に、対応する年齢の対照健常者から採取された試料（図３ｂ、４ｂ、５ｂ）に由来するＲＴ−ＰＣＲ産物の定量化をライトサイクラー急速サーマルサイクル技術によって実施した。データを遺伝子発現レベルに有意差を示さなかった一組の標準的遺伝子の総平均値へと正規化した。前記標準的遺伝子の組は、シクロフィリンＢ、リボソームタンパク質Ｓ９、トランスフェリン受容体、ＧＡＰＤＨ、およびベータアクチンの遺伝子から構成された。図は、蛍光発光によって測定された増幅された物質の量に対するサイクル数をプロットすることによる増幅の動態を表す。なお、反応の指数増殖期における、正常な対照者の前頭および側頭皮質由来のＨＩＦ３ａスプライス変異体２ｃＤＮＡ、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３ｃＤＮＡ、およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５ｃＤＮＡの増幅動態のそれぞれを並列した（図３ｂ、４ｂ、５ｂ、矢印）。一方、アルツハイマー病（図３ａ、４ａ、５ａ、矢印）では、対応する曲線の有意な分離があり、それぞれの分析脳領域において、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体２、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３、およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５の発現差を示唆し、前頭皮質と相対的に側頭皮質において、ヒトＨＩＦ３ａ遺伝子、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体２、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３、およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５の転写産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の調節異常、好ましくは上方調節を示唆する。
【図５】図３、４および５は、定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＡＤ脳組織中の、ヒトＨＩＦ３ａ遺伝子、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体２（図３）、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３（図４）およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５（図５）のそれぞれの発現差の検証を示す。ＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）から採取されたＲＮＡ試料（図３ａ、４ａ、５ａ）、および同様に、対応する年齢の対照健常者から採取された試料（図３ｂ、４ｂ、５ｂ）に由来するＲＴ−ＰＣＲ産物の定量化をライトサイクラー急速サーマルサイクル技術によって実施した。データを遺伝子発現レベルに有意差を示さなかった一組の標準的遺伝子の総平均値へと正規化した。前記標準的遺伝子の組は、シクロフィリンＢ、リボソームタンパク質Ｓ９、トランスフェリン受容体、ＧＡＰＤＨ、およびベータアクチンの遺伝子から構成された。図は、蛍光発光によって測定された増幅された物質の量に対するサイクル数をプロットすることによる増幅の動態を表す。なお、反応の指数増殖期における、正常な対照者の前頭および側頭皮質由来のＨＩＦ３ａスプライス変異体２ｃＤＮＡ、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３ｃＤＮＡ、およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５ｃＤＮＡの増幅動態のそれぞれを並列した（図３ｂ、４ｂ、５ｂ、矢印）。一方、アルツハイマー病（図３ａ、４ａ、５ａ、矢印）では、対応する曲線の有意な分離があり、それぞれの分析脳領域において、ＨＩＦ３ａをコードする遺伝子、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体２、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３、およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５の発現差を示唆し、前頭皮質と相対的に側頭皮質において、ヒトＨＩＦ３ａ遺伝子、特にＨＩＦ３ａスプライス変異体２、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３、およびＨＩＦ３ａスプライス変異体５の転写産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の調節異常、好ましくは上方調節を示唆する。
【図６】図６は、バイオチップ上の抑制サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションによっておよび後に続くクローニングによって同定および取得された配列番号１、２８９ｂｐのＨＩＦ３ａ ｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を表す（５’位から３’位の方向の配列）。
【図７】図７は、配列番号１、２８９ｂｐのヒトＨＩＦ３ａ ｃＤＮＡ断片の配列アラインメントを、ヒトＨＩＦ３ａスプライス変異体１ｃＤＮＡ、配列番号６（ヌクレオチド１４２１から１７０９）のヌクレオチド配列とともに概略を示す。
【図８】図８は、配列番号２、４５０アミノ酸を含有するヒトＨＩＦ３ａスプライス変異体１のポリペプチド配列を開示する。このタンパク質は、図２０に示すＧｅｎｂａｎｋデータベースに由来するｍＲＮＡおよびＥＳＴ配列情報に基づいて構築されたコンセンサスｃＤＮＡ配列、配列番号６から推定される。
【図９】図９は、配列番号３、３４２アミノ酸を含有するヒトＨＩＦ３ａスプライス変異体２のポリペプチド配列を開示する。このタンパク質は、図２１に示すＧｅｎｂａｎｋデータベースに由来するｍＲＮＡおよびＥＳＴ配列情報に基づいて構築されたコンセンサスｃＤＮＡ配列、配列番号７から推定される。
【図１０】図１０は、配列番号４、６３２アミノ酸を含有するヒトＨＩＦ３ａスプライス変異体３のポリペプチド配列を開示する。このタンパク質は、図２２に示すＧｅｎｂａｎｋデータベースに由来するｍＲＮＡおよびＥＳＴ配列情報に基づいて構築されたコンセンサスｃＤＮＡ配列、配列番号８から推定される。
【図１１】図１１は、配列番号５、６４８アミノ酸を含有するヒトＨＩＦ３ａスプライス変異体５のポリペプチド配列を開示する。このタンパク質は、図２３に示すＧｅｎｂａｎｋデータベースに由来するｍＲＮＡおよびＥＳＴ配列情報に基づいて構築されたコンセンサスｃＤＮＡ配列、配列番号９から推定される。
【図１２】図１２は、図２０に示すＧｅｎｂａｎｋデータベースに由来するｍＲＮＡおよびＥＳＴ配列情報に基づいて構築された、配列番号６、１７０９ヌクレオチドを含有するヒトＨＩＦ３ａスプライス変異体１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を表す。
【図１３】図１３は、図２１に示すＧｅｎｂａｎｋデータベースのｍＲＮＡおよびＥＳＴの配列によって定義された、配列番号７、２２３９ヌクレオチドを含有するヒトＨＩＦ３ａスプライス変異体２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図１４】図１４は、図２２に示すＧｅｎｂａｎｋデータベースのｍＲＮＡおよびＥＳＴのヌクレオチドから構築された、配列番号８、２０８２ヌクレオチドを含有するヒトＨＩＦ３ａスプライス変異体３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を表す。
【図１５】図１５は、図２３に示すＧｅｎｂａｎｋデータベースのｍＲＮＡおよびＥＳＴのヌクレオチドから構築された、配列番号９、２５９５ヌクレオチドを含有するヒトＨＩＦ３ａスプライス変異体５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を表す。
【図１６】図１６は、配列番号１０のヌクレオチド配列、１３５３ヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド１２５−１４７７）を含有する、ヒトＨＩＦ３ａスプライン変異体１のコード配列（ｃｄｓ）を示す。
【図１７】図１７は、配列番号１１のヌクレオチド配列、１０２９ヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド２３−１０５１）を含有する、ヒトＨＩＦ３ａスプライン変異体２のコード配列（ｃｄｓ）を示す。
【図１８】図１８は、配列番号１２のヌクレオチド配列、１８９９ヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド１３−１９１１）を含有する、ヒトＨＩＦ３ａスプライン変異体３のコード配列（ｃｄｓ）を示す。
【図１９】図１９は、配列番号１３のヌクレオチド配列、１９４７ヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド２２６−２１７２）を含有する、ヒトＨＩＦ３ａスプライン変異体５のコード配列（ｃｄｓ）である。
【図２０】図２０は、受入番号ＡＫ０２１４２１のヒトｍＲＮＡ配列およびＧｅｎｂａｎｋ遺伝子情報データバンクに見い出される「発現配列タグ」（ＥＳＴ）のアラインメントに由来する、ヒトＨＩＦ３ａスプライス変異体１ｃＤＮＡ、配列番号６のヌクレオチド配列のアセンブリを概略的に図表化する。ＥＳＴおよびｍＲＮＡ番号は左側に記載され、全配列は５’位から３’位の方向である。
【図２１】図２１は、受入番号ＢＣ０２６３０８のヒトｍＲＮＡ配列およびＧｅｎｂａｎｋ遺伝子情報データバンクに見い出される「発現配列タグ」（ＥＳＴ）のアラインメントに由来する、ヒトＨＩＦ３ａスプライス変異体２ｃＤＮＡ、配列番号７のヌクレオチド配列のアセンブリを概略的に図表化する。ＥＳＴおよびｍＲＮＡ番号は左側に記載され、全配列は５’位から３’位の方向である。
【図２２】図２２は、受入番号ＡＫ０２１４２１、ＡＫ０２１６５３、ＡＫ０２７７２５、ＡＢ０５４０６７およびＡＦ４６３４９２のヒトｍＲＮＡ配列およびＧｅｎｂａｎｋ遺伝子情報データバンクに見い出される「発現配列タグ」（ＥＳＴ）のアラインメントに由来する、ヒトＨＩＦ３ａスプライス変異体３ｃＤＮＡ、配列番号８のヌクレオチド配列のアセンブリを概略的に図表化する。ＥＳＴおよびｍＲＮＡ番号は左側に記載され、全配列は５’位から３’位に指向する。
【図２３】図２３は、受入番号ＡＫ０２１６５３のヒトｍＲＮＡ配列およびＧｅｎｂａｎｋ遺伝子情報データバンクに見い出される「発現配列タグ」（ＥＳＴ）のアラインメントに由来する、ヒトＨＩＦ３ａスプライス変異体５ｃＤＮＡ、配列番号９のヌクレオチド配列のアセンブリを概略的に図表化する。ＥＳＴおよびｍＲＮＡ番号は左側に記載され、全配列は５’位から３’位に指向する。
【図２４】図２４は、サブトラクティブ抑制マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション実験による、ヒトＨＩＦ３ａ遺伝子の発現差の初回同定を開示する。サブトラクトされたＡＤのｃＤＮＡクローンおよび対照の脳ｃＤＮＡライブラリを含有する同一のバイオチップを、それぞれプローブＡ、ＢまたはＣと指定される、異なるシアニン３（Ｃｙ３）およびシアニン５（Ｃｙ５）標識ｃＤＮＡとともにハイブリダイズした。Ｃｙ３およびＣｙ５で標識したＤＮＡプローブ（Ａ）を、それぞれＡＤ患者および対照者の前頭または側頭皮質に由来するｃＤＮＡを標識することによって産生し、実施例の説明の節（ｖｉ−ａ）を参照のこと。Ｃｙ３およびＣｙ５で標識したＳＭＡＲＴプローブ（Ｂ）を、それぞれＡＤ患者および対照者の前頭または側頭皮質に由来するｃＤＮＡから産生し、実施例の説明の節（ｖｉ−ｂ）を参照のこと。Ｃｙ３およびＣｙ５で標識したＳＳＨプローブ（Ｃ）は、それぞれＡＤ患者および対照者の前頭または側頭皮質に由来する脳ｃＤＮＡの抑制サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションの後ｃＤＮＡ母集団から導き出し、段落（ｖｉ）を参照：（ＰＦＳＳＨ（１）＝ＡＤ患者の側頭皮質ｃＤＮＡのサブトラクション後のＡＤ患者の前頭皮質；ＰＴＳＳＨ（２）＝ＡＤ患者の前頭皮質ｃＤＮＡのサブトラクション後のＡＤ患者の側頭皮質；ＣＴＳＳＨ（３）＝ＡＤ患者の側頭皮質ｃＤＮＡのサブトラクション後の対照者の側頭皮質ｃＤＮＡ；ＰＴＳＳＨ（４）＝対照者の側頭皮質ｃＤＮＡのサブトラクション後のＡＤ患者の側頭皮質ｃＤＮＡ）。この表は、ＡＤ患者の前頭皮質と相対的に側頭皮質に対して測定した蛍光強度の比として示されるＨＩＦ３ａの遺伝子発現レベルを一覧化する。蛍光強度の比は、ＡＤ患者の側頭および前頭皮質におけるヒトＨＩＦ３ａＲＮＡ発現の差次的調節、および対照と比較したＡＤ患者の側頭皮質におけるＨＩＦ３ａ転写産物の相対的な下方調節および前頭皮質における上方調節を反映する。
【図２５】図２５は、本明細書中では内部参照番号によってＰ０１０、Ｐ０１１、Ｐ０１２、Ｐ０１４、Ｐ０１６、Ｐ０１７、Ｐ０１９、Ｐ０３８、Ｐ０４０、Ｐ０４１、Ｐ０４２、Ｐ０４６、Ｐ０４７、Ｐ０４８、Ｐ０４９と識別される１５例のＡＤ患者（０．７８〜２．３０倍、下記の公式による値）、および本明細書中では内部参照番号によってＣ００５、Ｃ００８、Ｃ０１１、Ｃ０１２、Ｃ０１４、Ｃ０２５、Ｃ０２６、Ｃ０２７、Ｃ０２８、Ｃ０２９、Ｃ０３０、Ｃ０３１、Ｃ０３２、Ｃ０３３、Ｃ０３４、Ｃ０３５、Ｃ０３６、Ｃ０３８、Ｃ０３９、Ｃ０４１、Ｃ０４２、ＤＥ０２、ＤＥ０３、ＤＥ０５、ＤＥ０７と識別される２５例の対応する年齢の対照健常者（０．６７〜１.７９ 倍、下記の公式による値）における、前頭皮質と相対的に側頭皮質中のＨＩＦ３ａスプライス変異体１発現レベルを一覧化する。それぞれ、側頭皮質における上方調節の場合は、示される値は本明細書中に記載の公式によって計算し（下記を参照）、および前頭皮質における上方調節の場合は逆数値が計算される。側頭皮質中の上方調節を反映する明らかな差が示される。棒グラフは、異なるブラーク病期（０〜６）における、前頭皮質に対する側頭皮質の各自然対数値Ｉｎ（ＩＴ／ＩＦ）、および側頭皮質に対する前頭皮質の調節因子Ｉｎ（ＩＦ／ＩＴ）を可視化する。
【図２６】図２６は、本明細書中では内部参照番号によってＰ０１０、Ｐ０１１、Ｐ０１２、Ｐ０１４、Ｐ０１６、Ｐ０１９と識別される６例のアルツハイマー病患者（０．７０〜２.４６倍）、および、本明細書中では内部参照番号Ｃ００４、Ｃ００５、Ｃ００８と識別される３例の対応する年齢の対照健常者（０．６５〜１.５５倍）において、前頭皮質と相対的に海馬中の、ＨＩＦ３ａスプライス変異体１の遺伝子発現レベルを一覧化する。示される値は本明細書中に記載の公式によって計算する（下記を参照）。散布図は、対照試料（点）およびＡＤ患者試料（三角形）における、前頭皮質に対する海馬の調節比の各対数値、ｌｏｇ（ＨＣ／ＩＦ比）を可視化する。
【図２７】図２７は、本明細書中では内部参照番号によってＰ０１０、Ｐ０１１、Ｐ０１２、Ｐ０１４、Ｐ０１６、Ｐ０１７、Ｐ０１９、Ｐ０３８、Ｐ０４０、Ｐ０４１、Ｐ０４２、Ｐ０４６、Ｐ０４７、Ｐ０４８、Ｐ０４９と識別される１５例のＡＤ患者（０．５５〜２．３８倍、下記の公式による値）、および本明細書中では内部参照番号によってＣ００５、Ｃ００８、Ｃ０１１、Ｃ０１２、Ｃ０１４、Ｃ０２５、Ｃ０２６、Ｃ０２７、Ｃ０２８、Ｃ０２９、Ｃ０３０、Ｃ０３１、Ｃ０３２、Ｃ０３３、Ｃ０３４、Ｃ０３５、Ｃ０３６、Ｃ０３８、Ｃ０３９、Ｃ０４１、Ｃ０４２、ＤＥ０２、ＤＥ０３、ＤＥ０５、ＤＥ０７と識別される２５例の対応する年齢の対照健常者（０．３３〜２.３２倍、下記の公式による値）における、前頭皮質と相対的に側頭皮質中の、ＨＩＦ３ａスプライス変異体２発現レベルを一覧化する。それぞれ、側頭皮質における上方調節の場合、示される値は本明細書中に記載の公式によって計算し（下記を参照）、および前頭皮質における上方調節の場合は逆数値が計算される。側頭皮質中の上方調節を反映する明らかな差が示される。棒グラフは、異なるブラーク病期（０〜６）における、前頭皮質に対する側頭皮質の各自然対数値Ｉｎ（ＩＴ／ＩＦ）、および側頭皮質に対する前頭皮質の調節因子Ｉｎ（ＩＦ／ＩＴ）を可視化する。
【図２８】図２８は、本明細書中では内部参照番号によってＰ０１０、Ｐ０１１、Ｐ０１２、Ｐ０１４、Ｐ０１６、Ｐ０１７、Ｐ０１９、Ｐ０３８、Ｐ０４０、Ｐ０４１、Ｐ０４２、Ｐ０４６、Ｐ０４７、Ｐ０４８、Ｐ０４９と識別される１５例のＡＤ患者（０．７７〜２．５６倍、下記の公式による値）、および本明細書中では内部参照番号によってＣ００５、Ｃ００８、Ｃ０１１、Ｃ０１２、Ｃ０１４、Ｃ０２５、Ｃ０２６、Ｃ０２７、Ｃ０２８、Ｃ０２９、Ｃ０３０、Ｃ０３１、Ｃ０３２、Ｃ０３３、Ｃ０３４、Ｃ０３５、Ｃ０３６、Ｃ０３８、Ｃ０３９、Ｃ０４１、Ｃ０４２、ＤＥ０２、ＤＥ０３、ＤＥ０５、ＤＥ０７と識別される２５例の対応する年齢の対照健常者（０．４７〜２.２５倍、下記の公式による値）における、前頭皮質と相対的に側頭皮質中の、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３発現レベルを一覧化する。それぞれ、側頭皮質における上方調節の場合、示される値は本明細書中に記載の公式によって計算し（下記を参照）、および前頭皮質における上方調節の場合は逆数値が計算される。側頭皮質における強い上方調節を反映する著明な差が示される。棒グラフは、異なるブラーク病期（０〜６）における、前頭皮質に対する側頭皮質の各自然対数値Ｉｎ（ＩＴ／ＩＦ）、および側頭皮質に対する前頭皮質の調節因子Ｉｎ（ＩＦ／ＩＴ）を可視化する。
【図２９】図２９は、本明細書中では内部参照番号によってＰ０１０、Ｐ０１１、Ｐ０１２、Ｐ０１４、Ｐ０１６、Ｐ０１７、Ｐ０１９、Ｐ０３８、Ｐ０４０、Ｐ０４１、Ｐ０４２、Ｐ０４６、Ｐ０４７、Ｐ０４８、Ｐ０４９と識別される１５例のＡＤ患者（０．７７〜２．３３倍、下記の公式による値）、および本明細書中では内部参照番号によってＣ００５、Ｃ００８、Ｃ０１１、Ｃ０１２、Ｃ０１４、Ｃ０２５、Ｃ０２６、Ｃ０２７、Ｃ０２８、Ｃ０２９、Ｃ０３０、Ｃ０３１、Ｃ０３３、Ｃ０３４、Ｃ０３５、Ｃ０３６、Ｃ０３８、Ｃ０３９、Ｃ０４１、Ｃ０４２、ＤＥ０２、ＤＥ０３、ＤＥ０５、ＤＥ０７と識別される２４例の対応する年齢の対照健常者（０．６３〜１．９２倍、下記の公式による値）における、前頭皮質と相対的に側頭皮質中の、ＨＩＦ３ａスプライス変異体５発現レベルを一覧化する。それぞれ、側頭皮質における上方調節の場合、示される値は本明細書中に記載の公式によって計算し（下記を参照）、および前頭皮質における上方調節の場合は逆数値が計算される。側頭皮質における上方調節を反映する明らかな差が示される。棒グラフは、異なるブラーク病期（０〜６）における、前頭皮質に対する側頭皮質の各自然対数値Ｉｎ（ＩＴ／ＩＦ）、および側頭皮質に対する前頭皮質の調節因子Ｉｎ（ＩＦ／ＩＴ）を可視化する。
【図３０】図３０は、信頼度９８％での中央値の統計的手法を用いた、対照およびＡＤ病期の比較による、ＨＩＦ３ａスプライス変異体１の絶対ｍＲＮＡ発現の分析を示す。データは、ブラーク病期０〜１、ブラーク病期０〜２、またはブラーク病期０〜３のいずれかを有する被験者を含む対照群を定義することによって計算した。これらデータは、ブラーク病期２〜６、ブラーク病期３〜６およびブラーク病期４〜６をそれぞれ含む、定義されたＡＤ患者群に対して計算されたデータと比較する。さらに、ブラーク病期０〜１、ブラーク病期２〜３およびブラーク病期４〜６のいずれかを有する被験者を含む３群のそれぞれを、互いに比較した。ＡＤ患者および対照者の、前頭皮質（Ｆ）および下側頭皮質（Ｔ）を互いに比較して、差異を検出した。前記差異は、対照者における側頭皮質および前頭皮質に対する、ＡＤ患者の側頭皮質および前頭皮質における、ＨＩＦ３ａ ｓｖ１の上方調節を反映し、前記上方調節は、ブラーク病期０−３とブラーク病期４−６とを互いに比較することによって著明である。ブラーク病期は、ＡＤ疾患の経過進行と相関し、これは、本発明で示すように、上述のＨＩＦ３ａ ｓｖ１の調節、レベルおよび活性における差の増大と関連する。
【図３１】図３１は、信頼度９８％での中央値の統計的手法を用いた、対照およびＡＤ病期の比較による、ＨＩＦ３ａスプライス変異体２の絶対ｍＲＮＡ発現の分析を示す。データは、ブラーク病期０〜１、ブラーク病期０〜２、またはブラーク病期０〜３のいずれかを有する被験者を含む対照群を定義することによって計算した。これらデータは、ブラーク病期２〜６、ブラーク病期３〜６およびブラーク病期４〜６をそれぞれ含む、定義されたＡＤ患者群に対して計算されたデータと比較する。さらに、ブラーク病期０〜１、ブラーク病期２〜３およびブラーク病期４〜６のいずれかを有する被験者を含む３群のそれぞれを、互いに比較した。ＡＤ患者および対照者の、前頭皮質（Ｆ）および下側頭皮質（Ｔ）を互いに比較して、差異を検出した。前記差異は、対照者における側頭皮質および前頭皮質に対する、ＡＤ患者の側頭皮質および前頭皮質における、ＨＩＦ３ａ ｓｖ２の強い上方調節を反映し、前記上方調節は、ブラーク病期０−３とブラーク病期４−６とを互いに比較することによって著明である。ブラーク病期は、ＡＤ疾患の経過進行と相関し、これは、本発明で示すように、上述のＨＩＦ３ａ ｓｖ２の調節、レベルおよび活性における差の増大と関連する。
【図３２】図３２は、信頼度９８％での中央値の統計的手法を用いた、対照およびＡＤ病期の比較による、ＨＩＦ３ａスプライス変異体３の絶対ｍＲＮＡ発現の分析を示す。データは、ブラーク病期０〜１、ブラーク病期０〜２、またはブラーク病期０〜３のいずれかを有する被験者を含む対照群を定義することによって計算した。これらデータは、ブラーク病期２〜６、ブラーク病期３〜６およびブラーク病期４〜６をそれぞれ含む、定義されたＡＤ患者群に対して計算されたデータと比較する。さらに、ブラーク病期０〜１、ブラーク病期２〜３およびブラーク病期４〜６のいずれかを有する被験者を含む３群のそれぞれを、互いに比較した。ＡＤ患者および対照者の、前頭皮質（Ｆ）および下側頭皮質（Ｔ）を互いに比較して、差異を検出した。前記差異は、対照者における側頭皮質および前頭皮質に対する、ＡＤ患者の側頭皮質および前頭皮質における、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３の強い上方調節を反映し、該上方調節は、ブラーク病期０−３とブラーク病期４−６とを互いに比較することによって著明である。ブラーク病期は、ＡＤ疾患の経過進行と相関し、これは、本発明で示すように、上述のＨＩＦ３ａ ｓｖ３の調節、レベルおよび活性における差の増大と関連する。
【図３３】図３３は、信頼度９８％での中央値の統計的手法を用いた、対照およびＡＤ病期の比較による、ＨＩＦ３ａスプライス変異体５の絶対ｍＲＮＡ発現の分析を示す。データは、ブラーク病期０〜１、ブラーク病期０〜２、またはブラーク病期０〜３のいずれかを有する被験者を含む対照群を定義することによって計算した。これらデータは、ブラーク病期２〜６、ブラーク病期３〜６およびブラーク病期４〜６をそれぞれ含む、定義されたＡＤ患者群に対して計算されたデータと比較する。さらに、ブラーク病期０〜１、ブラーク病期２〜３およびブラーク病期４〜６のいずれかを有する被験者を含む３群のそれぞれを、互いに比較した。ＡＤ患者および対照者の、前頭皮質（Ｆ）および下側頭皮質（Ｔ）を互いに比較して、差異を検出した。前記差異は、対照者における側頭皮質および前頭皮質に対する、ＡＤ患者の側頭皮質および前頭皮質における、ＨＩＦ３ａ ｓｖ５の強い上方調節を反映し、該上方調節は、ブラーク病期０−３とブラーク病期４−６とを互いに比較することによって著明である。ブラーク病期は、ＡＤ疾患の経過進行と相関し、これは、本発明で示すように、上述のＨＩＦ３ａ ｓｖ５の調節、レベルおよび活性における差の増大と関連する。
【図３４】図３４は、ポリクローナル抗ｍｙｃ抗体で標識した全細胞タンパク質抽出物（ＭＢＬ、１：５０００）のウェスタンブロット像を表す。  レーンＡおよびＢ：ｍｙｃ−タグで標識したＨＩＦ３ａ ｓｖ３a（ＨＩＦ３ａ ｓｖ３−ｍｙｃ、Ａ）を安定的に発現するＨ４ＡＰＰｓｗ細胞および対照Ｈ４ＡＰＰｓｗ細胞の（Ｂ）総タンパク質抽出物。矢印は約７０ｋＤａ（レーンＡ）の大きなバンドを示唆し、これはＨＩＦ３ａｓｖ３タンパク質の予測した分子量に相当する。
【図３５】図３５は、Ｈ４ＡＰＰｓｗ対照細胞およびｍｙｃ標識ＨＩＦ３ａｓｖ３タンパク質を安定的に過剰発現するＨ４ＡＰＰｓｗ細胞（Ｈ４ＡＰＰｓｗ−ＨＩＦ３ａ ｓｖ３ ｃｄｓ−ｍｙｃ）の免疫蛍光分析を示す。ＨＩＦ３ａ ｓｖ３−ｍｙｃタンパク質を、ウサギポリクローナル抗ｍｙｃ抗体（ＭＢＬ）およびＣｙ３−複合抗ウサギ抗体（アマシャム社）で検出した（図３５ＡおよびＢ）。細胞核をＤＡＰＩで染色した（図３５ＣおよびＤ）。オーバーレイ分析は、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３ ｃｄｓ−ｍｙｃタンパク質が主として核に局在し（図３５Ｅ）、およびＨ４ＡＰＰｓｗ対照細胞（図３５Ｆ）と比較して、７０％を上回るＨ４ＡＰＰｓｗ−ＨＩＦ３ａ ｓｖ３ ｃｄｓ−ｍｙｃ遺伝子導入細胞内で過剰発現していることを示唆する。
【図３６】図３６は、ＨＩＦ３ａ ｓｖ１、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３、ＨＩＦ３ａ ｓｖ５およびＦＩＴＣ−複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清に存在する２９０〜３０４アミノ酸に対応するペプチドに対して惹起した、アフィニティ精製したウサギポリクローナル抗ＨＩＦ３ａ抗血清（ＨＳＲ１、１：８０）で標識した、ヒト側頭皮質（皮質、ＣＴ）に由来する切片を表す（緑色のシグナル、図３６の図ＡおよびＢ、中央および右側の写真）。神経細胞を神経細胞特異的マーカーＮｅｕＮ（赤色のシグナル、図３６図Ａ）で標識し、および星状細胞を星状細胞マーカーＧＦＡＰ（赤色のシグナル、図３６図Ｂ）で標識する。青色のシグナルは、ＤＡＰＩで染色した核を示唆する。上側の図Ａは、神経細胞（マーカーＮｅｕＮ）が強い細胞核のＨＩＦ３ａ免疫活性を示すことを示し、黄色の矢印はＨＩＦ３ａを発現している神経細胞を説明的に示唆する（右側および中央の写真）。下側の図Ｂは、星状細胞の染色（マーカーＧＦＡＰ）を示し、これは弱い細胞核のＨＩＦ３ａ免疫シグナルを呈するのみである（黄色の矢印、中央 および右側の写真）。
【図３７】図３７は、ＨＩＦ３ａ ｓｖ１、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３、ＨＩＦ３ａ ｓｖ５およびＦＩＴＣ−複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清に存在する２９０〜３０４アミノ酸に対応するペプチドに対して惹起した、アフィニティ精製したウサギポリクローナル抗ＨＩＦ３ａ抗血清（ＨＳＲ１、１：８０）で標識した、ヒト側頭皮質の白質（ＷＭ）に由来する切片を表す（緑色のシグナル、図３７の図ＡおよびＢ、中央および右側の写真）。ミクログリア細胞をミクログリア特異的マーカーＣＤ６８（赤色のシグナル、図３７図Ａ）で標識し、および乏突起膠細胞を乏突起膠細胞マーカーＣＮＰａｓｅ（赤色のシグナル、図３７図Ｂ）で標識する。青色のシグナルは、ＤＡＰＩで染色した核を示唆する。上側の図Ａは、ミクログリア（マーカーＣＤ６８）が細胞核のＨＩＦ３ａ免疫活性神経細胞を示すことを示し、黄色の矢印はＨＩＦ３ａを発現しているミクログリア細胞を説明的に示唆する（右側および中央の写真）。下側の図Ｂは、乏突起膠細胞の染色（マーカーＣＮＰａｓｅ）を示し、これは中等度の細胞核のＨＩＦ３ａ免疫シグナルを呈し（黄色の矢印、右側および中央の写真）、ミエリンと共局在化していない。
【図３８】図３８は、対照ドナー（対照ブラーク１（Ｃ０２９））に由来する、中等度のブラーク病期（ブラーク３（Ｃ０３５））を有する被験者に由来する、およびアルツハイマー患者（患者ブラーク４（Ｐ０１６）、ブラーク５（Ｐ０１１）、ブラーク６（Ｐ０１７））に由来する、後側頭回（ＣＴ、下図）および前頭皮質（ＣＦ）の切片からデジタル撮影した顕微鏡写真を例示的に表す。組織切片を、アフィニティ精製したウサギポリクローナル抗ＨＩＦ３ａ抗血清（ＨＳＲ１）で免疫標識する（緑色のシグナル）（倍率４０ｘ）。星状細胞を星状細胞特異的マーカーＧＦＡＰに対する抗体で染色する（赤色のシグナル）。核をＤＡＰＩで染色する（青色のシグナル）。ブラークの低い対照（ブラーク１）と比較して、中等度のブラーク病期（ブラーク３および４）を有する被験者の側頭皮質、および、ブラーク病期の高い（ブラーク５および６）被験者の前頭および側頭皮質において、細胞核の星状細胞ＨＩＦ３ａ免疫活性が増大し、ＨＩＦ３ａタンパク質のＨＩＦ３ａ翻訳産物のレベルが増大する。中等度ブラーク病期の被験者の側頭皮質において、および、高いブラーク病期被験者の前頭および側頭皮質においてすら、ＨＩＦ３ａタンパク質のＨＩＦ３ａ免疫活性、すなわち、ＨＩＦ３ａ翻訳産物のレベルが増大するという知見は、ＡＤの過程すなわち神経原繊維病変の進行が、ＡＤの神経変性による変更と併発して、またはその後に、またはその前に起こりうる星状細胞ＨＩＦ３ａの発現に反映されることを示唆する。ここで例示的に示されるデータは、ＨＩＦ３ａタンパク質の星状細胞免疫活性の強度および量のレベルは、対照者（ブラーク）および中等度のブラーク病期（ブラーク３）を有する被験者に由来する下側頭皮質および／または前頭皮質と比較して、患者（ブラーク病期４〜６）由来の下側頭皮質および前頭皮質において増大し、すなわち、ＨＩＦ３ａタンパク質のレベルがＡＤのブラーク病期の増加とともに増大することを明らかに示唆する。側頭皮質（ＣＴ）；前頭皮質（ＣＦ）；健常対照者（対照）；アルツハイマー患者（患者）。
【図３９】図３９は、３つの異なるＨＩＦ３ａ ｓｖ３−ｍｙｃを発現しているハエ細胞系の発現効率の比較を表す。効率は、ＨＩＦ３ａ ｓｖ３−ｍｙｃ特異的プライマー対のＲＴ−ＰＣＲ反応のサイクル数および効率によって算出する。各遺伝子型ごとに３回測定を行った。使用した遺伝子型：ｗ；ＵＡＳ−ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３−ｍｙｃ＃３／ｇｍｒ−ＧＡＬ４；ｗ；ＵＡＳ−ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３−ｍｙｃ＃４／ｇｍｒ−ＧＡＬ４；ｗ；ＵＡＳ−ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３−ｍｙｃ＃５７／＋；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋。
【図４０】図４０のＨＩＦ３ａ ｓｖ３タンパク質は、成体網膜における光受容細胞の核に局在する。遺伝子導入ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３ハエ細胞株＃３をｇｍｒ−ＧＡＬ４の調節下で発現させた。成虫の眼のクライオスタット切片を抗ｍｙｃ（ＭＹＣ、赤色のシグナル）およびＤＡＰＩ（ＤＡＰＩ、青色のシグナル）で染色して、核染を標識した。野生型非遺伝子導入ハエを陰性対照として用いた。矢印は、ｍｙｃ−およびＤＡＰＩ−陽性シグナルをオーバーラップする核を示す。Ｒｅ：網膜。
【図４１】図４１は、ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３を発現しているハエのウェスタンブロットを示す。３つの異なる遺伝子導入ハエ細胞株（＃３、＃４、および＃１４、レーン２、３および４）を用いてｇｍｒ−ＧＡＬ４の調節下でＨＩＦ３ａ ｓｖ３を発現させ、および発現を非遺伝子導入ｗ１１１８ハエ（レーン１）と比較した。等量のタンパク質をレーン１から４に投入した。レーン５：ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３−ｍｙｃ構築物で安定的に遺伝子導入したＨ４−ＡＰＰｓｗ細胞のタンパク質抽出物。レーン６：ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３−ｍｙｃ構築物で一過性に遺伝子導入したＨ４−ＡＰＰｓｗ細胞のタンパク質抽出物。レーン７：Ｈ４−ＡＰＰｓｗ対照細胞。ブロットは、ポリクローナル抗ｍｙｃ抗体（ＭＢＬ）で探索した。赤色の星印は、遺伝子導入ハエおよびＨ４−神経膠腫細胞のタンパク質抽出物におけるＨＩＦ３ａ ｓｖ３の低い発現を示す。
【図４２】図４２は、ｇｍｒ−ＧＡＬ４の調節下でｈＡＰＰおよびｈＢＡＣＥを発現しているハエにおける、光受容体細胞変性の救済を示す。成虫の脳および複眼の１０μｍクリオスタット切片を、羽化から８日後に光受容体細胞特異的抗体２４Ｂ１０で染色した。（Ａ）ｈＡＰＰおよびｈＢＡＣＥを発現している対応する年齢の対照ハエは、年齢依存性の網膜中の光受容細胞の変性を示す。（Ｂ）ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３（＃３、＃４、＃５７）の共発現は、網膜の完全性から判断するように光受容体細胞変性を救済する。（Ｃ）ｈＡＰＰ、ｈＢＡＣＥ、ＤＰｓｎＬ２３５ＰおよびＨＩＦ３ａ−ｓｖ３＃５７を共発現している３日齢のハエにおける、光受容体細胞変性の強い発現。Ｒｅ：網膜；Ｌａ：板；Ｍｅ：骨髄。スケールバー：５０μｍ。
【図４３】図４３は、ｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥおよびｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ／ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３を発現しているハエのホモジネートからＡｂｅｔａ免疫沈降したウェスタンブロットを示す。単量体の合成Ａｂｅｔａ４０を４ｋＤａの分子量で測定し、一方、ハエのホモジネートから単離されたＡｂｅｔａペプチドを二量体としての抗体６Ｅ１０によって検出する。１レーンあたり１５匹のハエのホモジネートを、抗体６Ｅ１０を用いて免疫沈降した。等量のハエタンパク質を各免疫沈降に使用した。対照ハエおよびＨＩＦ３ａ ｓｖ３を共発現しているハエとの間のＡｂｅｔａレベルに差は検出することができなかった。
【図４４】図４４は、ｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ／ＤＰｓｎＬ２３５Ｐ（図Ａ）またはｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ／ＤＰｓｎＬ２３５Ｐ／ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３＃４（図Ｂ）を発現している４２日齢のオスのハエの網膜のパラフィン切片上の、チオフラビンＳ陽性プラーク（矢印で示す）を示す。対照ハエとｈＡＰＰ／ｈＢＡＣＥ／ＤＰｓｎＬ２３５Ｐ／ＨＩＦ３ａ−ｓｖ３＃４を発現しているハエとの間で、プラーク形成の開始の差は検出されなかった。遺伝子型あたり１０頭を切片化し、および並列状態で染色した。倍率：２０ｘ；挿入：１００ｘ；スケールバー：１０μｍ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【国際調査報告】
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