(57)【要約】ジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨｉｂに対して免疫するための抗原を含有する組合せワクチンは、公知である（「ＤＴＰ−Ｈｉｂ」ワクチン）。本発明は、コストを低減するために低用量のＨｉｂ抗原を用い、現場における再構成を必要としない、そのようなワクチンに対する必要性に取り組む。従って、本発明は、少なくともジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨｉｂから被験体を防御するための抗原を含有する組合せワクチンを提供し、ここで：（ａ）このＨｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり；（ｂ）このワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満であり；そして（ｃ）このＨｉｂ結合体は、一度も凍結乾燥されていない。本発明のワクチンは、安全であり、かつ免疫原性が高いことが見出された。
2007529503.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともジフテリア（「Ｄ」）、破傷風（「Ｔ」）、百日咳（「Ｐ」）、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含有する組合せワクチンであって、ここで；（ａ）該Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり；（ｂ）該ワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満であり；そして（ｃ）該Ｈｉｂ結合体は、一度も凍結乾燥されていない、組合せワクチン。
【請求項２】
貫通可能な封を有し組合せワクチンを含有するバイアルであって、該組合せワクチンは、少なくともジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含有し、ここで、該Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり、そして、ここで：（ａ）該ワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満であり、そして（ｂ）該バイアルの貫通可能な封は、まだ貫通されていない、バイアル。
【請求項３】
少なくともジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含有する組合せワクチンを含有する、気密密封容器であって、ここで、該Ｈｉｂに対して防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり、そして、ここで、該ワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満である、気密密封容器。
【請求項４】
少なくともジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含有する組合せワクチンを調製するためのプロセスであって、ここで、該Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり、該ワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満であり、該プロセスは、以下の工程：（ａ）該Ｈｉｂ結合抗原の凍結乾燥の工程；（ｂ）ジフテリア抗原、破傷風抗原、および百日咳抗原を、混合された形態で、該Ｈｉｂ結合体抗原とは別個に包装する工程
のうち一方または両方を包含しないことで特徴付けられる、プロセス。
【請求項５】
組合せワクチンを容器に挿入するためのプロセスであって、ここで、（ａ）該ワクチンは、少なくともジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含有し；（ｂ）該Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり、そして（ｃ）該ワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満である、プロセス。
【請求項６】
容器にラベルを取り付けるためのプロセスであって、ここで：（ａ）該容器は、少なくともジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含有する組合せワクチンを含有し；（ｂ）該Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり、そして（ｃ）該ワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満である、プロセス。
【請求項７】
組合せワクチンを容器に挿入して次いで該容器から該ワクチンを取り出すためのプロセスであって、ここで：（ａ）該ワクチンは、少なくともジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含有し；（ｂ）該Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり、そして（ｃ）該ワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満である、プロセス。
【請求項８】
少なくともジフテリア（「Ｄ」）、破傷風（「Ｔ」）、百日咳（「Ｐ」）、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含有する組合せワクチンであって、ここで；（ａ）該Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり；（ｂ）該ワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満であり；そして（ｃ）該ワクチンは、（ｉ）水酸化アルミニウムアジュバントを含有せず、そして／または（ｉｉ）硫酸カリウムアルミニウムアジュバントを含有しない、組合せワクチン。
【請求項９】
リン酸アルミニウムアジュバントを含有する、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記Ｈｉｂ結合体が前記リン酸アルミニウムアジュバントに吸着しない、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記ジフテリア抗原は、ジフテリア類毒素を含み、前記破傷風抗原は、破傷風類毒素を含み、そして、前記百日咳抗原は、菌体性百日咳成分を含む、請求項１〜１０に記載のワクチン、バイアル、容器、またはプロセス。
【請求項１２】
前記結合体は、ＣＲＭ１９７キャリア、破傷風類毒素キャリア、またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜複合体キャリアを含む、請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載のワクチン、バイアル、容器、またはプロセス。
【請求項１３】
前記結合体は、Ｈｉｂのリン酸ポリリボシルリビトールのオリゴ糖フラグメントを含む、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載のワクチン、バイアル、容器、またはプロセス。
【請求項１４】
前記組合せワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルス由来の表面抗原をさらに含有する、請求項１〜請求項１３のいずれか一項に記載のワクチン、バイアル、容器、またはプロセス。
【請求項１５】
前記組合せワクチンは、ポリオ抗原をさらに含有する、請求項１〜請求項１４のいずれか一項に記載のワクチン、バイアル、容器、またはプロセス。
【請求項１６】
哺乳動物において抗体反応を引き起こすための方法であって、該哺乳動物に請求項１〜請求項１５のいずれか一項に記載のワクチンを投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において引用される全ての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、組合せワクチンの分野、特に、ジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）に対する防御のための組合せワクチンの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
ジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨｉｂに対する免疫のための抗原を含有する組合せワクチンは、公知である（「ＤＴＰ−Ｈｉｂ」ワクチン）。３種のそのようなワクチンが、ＴＥＴＲＡＭＵＮＥＴＭ、ＱＵＡＴＴＶＡＸＥＭＴＭ（これは、菌体百日咳抗原「ＤＴｗＰ−Ｈｉｂ」を使用する）、およびＩＮＦＡＮＲＩＸ−ＨｉｂＴＭ（これは、無菌体百日咳抗原「ＤＴａＰ−Ｈｉｂ」を使用する）の名称で市販されている。
【０００４】
ＤＴａＰ−Ｈｉｂワクチン中のＨｉｂ結合成分の含有は、抗Ｈｉｂ応答の低下に関連付けられている（非特許文献１（参考文献１）、非特許文献２（参考文献２））。さらに、Ｈｉｂ結合体は、水性媒体中で不安定であり、この形態での長期の保存に耐えることが出来ない（非特許文献３（参考文献３））。この理由のために、Ｈｉｂ結合抗原を含有する組合せワクチンにおいて、Ｈｉｂ成分は、送達の際に他の抗原の液体処方物を用いて再構成される凍結乾燥散剤として提供されるのが一般的である。
【０００５】
Ｈｉｂ結合抗原を生成することは安価ではなく、それらのコストが、開発途上国における広範囲の使用を阻害するという懸念が存在する。従って、Ｈｉｂ結合体の使用に関する代替的な戦略が開発されている（非特許文献４（参考文献４）、非特許文献５（参考文献５）、非特許文献６（参考文献６））。それらの使用を促進するための一つのアプローチは、通常の三回の用量（２ヶ月齢、４ヶ月齢、および６ヶ月齢（非特許文献７（参考文献７）））ではなく、二回の用量を（例えば、３ヶ月齢および５ヶ月齢（非特許文献５（参考文献５））、または４ヶ月齢および６ヶ月齢で（非特許文献６（参考文献６）））与えることであった。Ｈｉｂ結合体は、代表的には１０μｇ／用量で与えられるが、異なるアプローチにおいては、より低い用量（代表的には、例えば、１／２、１／３、１／４などの割合）が用いられてきた（非特許文献４（参考文献４）、非特許文献６（参考文献６））。例えば、非特許文献６（参考文献６）において、Ｈｉｂ結合体は、５μｇ／用量または３．３３μｇ／用量で投与された。
【０００６】
同じアプローチは、ＤＴＰ−Ｈｉｂワクチン中のＨｉｂ結合体へと拡張されてきた。例えば、非特許文献８は、ＤＴｗＰワクチンと組み合わせた、Ｈｉｂ結合体の全用量、半用量、および３分の１用量の使用を比較した。抗ＰＲＰ抗体の幾何級数的な平均濃度は、ＤＴＰとＨｉｂとの個別の投与と比較して、組合せＤＴＰ−Ｈｉｂワクチンを与えられた患者において減少したが、受容可能な防御的抗Ｈｉｂ免疫応答は、全ての症例において見られた。非特許文献９は、一回のＨｉｂ用量をＤＴｗＰの１０回用量バイアルを用いて再構成することによって、Ｈｉｂ結合体投薬量の１０倍希釈物を使用する。特許文献１（参考文献１０）は、凍結乾燥されたＨｉｂ結合体を、全用量、半用量、または四分の一用量で、ＴＲＩＴＡＮＲＩＸＴＭＤＴｗＰ−ＨＢｓＡｇワクチンを使用して再構成する工程を開示する。
【特許文献１】国際公開第０２／００２４９号パンフレット
【非特許文献１】Ｅｓｋｏｌａら、「Ｌａｎｃｅｔ」、１９９６年、第３４８号、ｐ．１６８８−１６９２
【非特許文献２】Ｖｉｄｏｒら著、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、第１章、ＩＳＢＮ  ０−８９６０３−７１７−７
【非特許文献３】Ｃｏｒｂｅｌ、「Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ」、第８７巻、ｐ．１１３−１２４
【非特許文献４】Ｃａｍｐｂｅｌｌら、「Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ」、２００２年、第２１巻、ｐ．８２２−８２６
【非特許文献５】Ｇｕｉｍａｒａｅｓら、「Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ」、２００２年、第６巻、ｐ．１１３−１１７
【非特許文献６】Ｌａｇｏｓら、「Ｌａｎｃｅｔ」、１９９８年、第３５１巻、ｐ．１４７２−１４７６
【非特許文献７】Ａｍｉｒら、「Ｖａｃｃｉｎｅ」、１９９７年、第１５巻、ｐ．１４９−１５４
【非特許文献８】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、「Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ」、２０００年、第６２巻、ｐ．４８５−４９０
【非特許文献９】Ｎｉｃｏｌら、「Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ」、２００２年、第２１巻、ｐ．１３８−１４１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、これらの場合の各々において、Ｈｉｂ結合体は凍結乾燥形態であって、投与の前に水性ＤＴＰ抗原によって再構成されなければならなかった。従って、これらのワクチンは、二個の個別の容器（一方に水性ＤＴＰ、もう片方に凍結乾燥Ｈｉｂ）中で、提供されなければならず、この二重容器の必要性は、包装段階、輸送段階、保存段階、および投与段階での余分のコストおよび流通上の要求を課する。減用量ワクチンは、コストを削減して、開発途上世界における流通を促進することを意図されているので、これらの余分な要求は、著しい不利益である。再構成の工程の必要性はまた、最終使用者による過誤の危険性、標準化されていない投薬量への傾向、混合された製品の汚染の危険性、およびスタッフを再構成の手順について訓練する必要性が存在することを意味する。これらの問題の全てが、意図される標的市場（すなわち、開発途上世界）を阻む。
【０００８】
従って、低用量のＨｉｂ結合抗原を含有し、Ｈｉｂ抗原の個別の包装を必要としない組合せワクチンの必要性が、存在し続ける。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、少なくともジフテリア（「Ｄ」）、破傷風（「Ｔ」）、百日咳（「Ｐ」）、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含有する組合せワクチンを提供し、ここで：（ａ）Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり；（ｂ）このワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は１５μｇ／ｍｌ未満であり；そして（ｃ）Ｈｉｂ結合体は一度も凍結乾燥されていない。本発明のワクチンは、参考文献６、参考文献８、および参考文献９において観察される免疫応答と比較した場合、安全であること、および免疫原性が高いことが見出された。
【００１０】
本発明はまた、少なくともジフテリア（「Ｄ」）、破傷風（「Ｔ」）、百日咳（「Ｐ」）、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含有する組合せワクチンを提供し、ここで：（ａ）Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり；（ｂ）このワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は１５μｇ／ｍｌ未満であり；そして（ｃ）このワクチンは、（ｉ）水酸化アルミニウムアジュバントを含有せず、そして／または（ｉｉ）硫酸カリウムアルミニウムアジュバントを含有しない。水酸化アルミニウムは、Ｈｉｂ糖類結合体の分解に関与すると考えられ、従って、このワクチンは、アジュバントとして、好ましくは、代わりにリン酸アルミニウムアジュバントを含有する。アルミニウムアジュバント（例えば、リン酸アルミニウムアジュバント）が存在する場合、Ｈｉｂ結合体はそのアルミニウムアジュバントに吸着されないことが好ましい。
【００１１】
本発明はまた、貫通可能な封を有し組合せワクチンを含有するバイアルを提供する。この組合せワクチンは、少なくともジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含有する。ここで、Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり、ここで：（ａ）このワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満であり、そして（ｂ）このバイアルの貫通可能な封は未だ貫通されていない。
【００１２】
本発明はまた、少なくともジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含む組合せワクチンを含有する気密密封容器を提供し、ここで、Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり、このワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満である。
【００１３】
本発明はまた、少なくともジフテリア（「Ｄ」）、破傷風（「Ｔ」）、百日咳（「Ｐ」）、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含有する組合せワクチンを調製するためのプロセスを提供する。ここで、Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり、このワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満であり、（ａ）上記プロセスは、Ｄ、Ｔ、Ｐ、およびＨｉｂから防御するための上記抗原を混合する工程を包含し、そして（ｂ）このプロセスは、（ｉ）Ｈｉｂ結合抗原の凍結乾燥の工程を包含せず、そして／または（ｉｉ）混合形態のジフテリア抗原と破傷風抗原と百日咳抗原とを、Ｈｉｂ結合抗原と別個に包装する工程を包含しない。
【００１４】
本発明はまた、組合せワクチンを容器に挿入するためのプロセスを提供する。ここで、（ａ）このワクチンは、少なくともジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含有し；（ｂ）Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり；そして（ｃ）このワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満である。
【００１５】
本発明はまた、容器にラベルを取り付けるためのプロセスを提供する。ここで、（ａ）この容器は、少なくともジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含む組合せワクチンを含有し；（ｂ）Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり；そして（ｃ）このワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満である。このラベルは、この容器がワクチンを含有することを示し得る。
【００１６】
本発明はまた、組合せワクチンを容器に挿入し次いでワクチンをこの容器から取り出すためのプロセスを提供する。ここで、（ａ）このワクチンは、少なくともジフテリア、破傷風、百日咳、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）から被験体を防御するための抗原を含有し；（ｂ）Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり；そして（ｃ）このワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満である。
【００１７】
（ＤＴＰ成分）
上記ジフテリア抗原は、好ましくは、ジフテリア類毒素である。ジフテリア類毒素の調製は、よく文書で裏付けられている（例えば、参考文献１１の第１３章）。任意の適切なジフテリア類毒素が使用され得る。ジフテリア類毒素の濃度は、一般的には５Ｌｆ／ｍｌ〜１００Ｌｆ／ｍｌの間である。好ましい濃度は、１０Ｌｆ／ｍｌ〜５０Ｌｆ／ｍｌの間である。より好ましい濃度は、２０Ｌｆ／ｍｌ〜４０Ｌｆ／ｍｌの間である。最も好ましい濃度は、約３０Ｌｆ／ｍｌである。代替的方法として、好ましい濃度は５Ｌｆ／ｍｌ〜２５Ｌｆ／ｍｌの間であり、より好ましい濃度は１０Ｌｆ／ｍｌ〜２０Ｌｆ／ｍｌの間であり、最も好ましい濃度は約１５Ｌｆ／ｍｌである。しかし、無菌体百日咳抗原が使用される場合は、ジフテリア類毒素についての好ましい濃度は、約５０Ｌｆ／ｍｌである。
【００１８】
上記破傷風抗原は、好ましくは破傷風類毒素である。破傷風類毒素の調製は、文書でよく裏付けられている（例えば、参考文献１１の第２７章）。任意の適切な破傷風類毒素が使用され得る。破傷風類毒素の濃度は、一般的には１Ｌｆ／ｍｌ〜５０Ｌｆ／ｍｌの間である。好ましい濃度は、２Ｌｆ／ｍｌ〜９Ｌｆ／ｍｌの間である。より好ましい濃度は、５Ｌｆ／ｍｌ〜８Ｌｆ／ｍｌの間である。最も好ましい濃度は、約６．５Ｌｆ／ｍｌである。しかし、無菌体百日咳抗原が使用される場合は、破傷風類毒素についての好ましい濃度は、約２０Ｌｆ／ｍｌである。
【００１９】
本発明に従って使用される百日咳抗原は、菌体（例えば、全菌体）性であっても無菌体性であってもよい。両方の型の抗原の調製が、文書でよく裏付けられている（例えば、参考文献１１の第２１章を参照のこと；また、参考文献１２を参照のこと）。菌体百日咳抗原について、百日咳抗原の濃度は、一般的には５  ＯＵ／ｍｌ〜５０  ＯＵ／ｍｌの間である。好ましい濃度は、１０  ＯＵ／ｍｌ〜４０  ＯＵ／ｍｌの間である。より好ましい濃度は、２５  ＯＵ／ｍｌ〜３５  ＯＵ／ｍｌの間である。最も好ましい濃度は約３０  ＯＵ／ｍｌである。無菌体抗原が使用される場合、百日咳完全毒素（ＰＴ）および線維状血球凝集素（ＦＨＡ）を、より好ましくはペルタクチン（ＰＲＮまたは６９ｋＤａ抗原としてもまた公知である）および必要であれば凝集原（ｆｉｍｂｒｉａｅとしてもまた公知である）２および凝集原３と組合せて、使用することが好ましい（参考文献１３）。ワクチン用量当たり（例えば、０．５ｍｌ当たり）の百日咳抗原の代表的なレベルは以下である：１０μｇのＰＴ、５μｇのＦＨＡ、３μｇまたは５μｇのＰＲＮ、５μｇの組み合わせたｆｉｍｂｒｉａｅ。ＰＴは毒性タンパク質であり、百日咳抗原中に存在する場合、ＰＴは、無毒化されていることが好ましい。無毒化は、化学的手段および／または遺伝子的手段によるものであり得る。好ましい無毒化変異体は、９Ｋ／１２９Ｇ二重変異体である（参考文献１４）。
【００２０】
（Ｈｉｂ結合体）
本発明のワクチン中で使用されるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類抗原を含む。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ由来の糖類抗原は、周知である（例えば、参考文献１１の第１４章）。Ｈｉｂ糖類は、特に小児において、その免疫原性を増強するために、キャリアタンパク質に結合される。Ｈｉｂ莢膜糖類の調製は、文書でよく裏付けされている（例えば、参考文献１５〜２４）。本発明は、任意の適切なＨｉｂ結合体を使用し得る。適切なキャリアタンパク質は上に記載され、Ｈｉｂ糖類のための好ましいキャリアはＣＲＭ１９７（「ＨｂＯＣ」）、破傷風類毒素（「ＰＲＰ−Ｔ」）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜複合体（「ＰＲＰ−ＯＭＰ」）である。
【００２１】
上記結合体の糖類部分は、多糖類（例えば、全長リン酸ポリリボシルリビトール（ｐｏｌｙｒｉｂｏｓｙｌｒｉｂｉｔｏｌ）（ＰＲＰ））であってもよいが、オリゴ糖（例えば、約１ｋＤａ〜約５ｋＤａの分子量）を使用することが好ましい。これらは、精製されたＰＲＰのフラグメント化によって（例えば、加水分解によって）簡便に形成され、通常はその後、所望の大きさのフラグメントが精製される。本発明の組成物が結合オリゴ糖を含有する場合、オリゴ糖の調製は結合の前になされるべきである。
【００２２】
共有結合のための好ましいキャリアタンパク質は、細菌の毒素または類毒素（例えば、ジフテリア類毒素または破傷風類毒素）である。ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体（参考文献２５〜２７）が、特に好ましい。他の適切なキャリアタンパク質として、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質（参考文献２８）、合成ペプチド（参考文献２９、参考文献３０）、熱ショックタンパク質（参考文献３１、参考文献３２）、百日咳タンパク質（参考文献３３、参考文献３４）、サイトカイン（参考文献３５）、リンホカイン（参考文献３５）、ホルモン（参考文献３５）、成長因子（参考文献３５）、種々の病原体由来抗原からの複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（参考文献３６）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ（参考文献３７、参考文献３８）、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ（参考文献３９）、鉄取り込みタンパク質（参考文献４０）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａ、毒素Ｂ（参考文献４１）などが挙げられる。好ましいキャリアは、ジフテリア類毒素、破傷風類毒素、およびＣＲＭ１９７である。
【００２３】
糖：タンパク質の比（重量／重量）が、１：５（すなわち、タンパク質過剰）と５：１（すなわち、糖過剰）との間である結合体が使用され得る（例えば、１：２〜５：１の間の比、および１：１．２５〜１：２．５の比）。
【００２４】
結合体は、遊離のキャリアタンパク質と組み合わされて使用され得る（参考文献４２）。所与のキャリアタンパク質が、本発明の組成物中で遊離形態および結合形態の両方で存在する場合、非結合形態は、好ましくは、全体としてこの組成物中のキャリアタンパク質の全体量の５％以下であり、より好ましくは２重量％未満で存在する。
【００２５】
任意の適切な結合反応が、必要な場合は任意の適切なリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）と共に用いられ得る。
【００２６】
上記の糖類は、代表的には、結合の前に、活性化されるかまたは官能化される。活性化は、例えば、ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（参考文献４３、参考文献４４など））のようなシアン化試薬を必要とし得る。他の適切な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン（ｎｏｒｂｏｒａｎｅ）、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する（参考文献２２の導入部も参照のこと）。
【００２７】
リンカー基（ｌｉｎｋｅｒ  ｇｒｏｕｐ）を介する結合は、任意の公知の手順（例えば、参考文献４５および参考文献４６に記載される手順）を使用してなされ得る。結合の一つの型は、多糖類の還元的アミノ化、その結果として生じるアミノ基とアジピン酸リンカー基の一方の末端とのカップリング、そしてこのアジピン酸リンカー基のもう一方の末端へのタンパク質のカップリングを伴う（参考文献２０、参考文献４７、参考文献４８）。他のリンカーとして、Ｂ−プロピオンアミド（参考文献４９）、ニトロフェニル−エチルアミン（参考文献５０）、ハロゲン化ハロアシル（参考文献５１）、グリコシド結合（参考文献５２）、６−アミノカプロン酸（参考文献５３）、ＡＤＨ（参考文献５４）、Ｃ４〜Ｃ１２部分（参考文献５５）などが挙げられる。リンカーの使用の代替方法として、直接結合が用いられ得る。タンパク質への直接結合は、例えば参考文献５６および参考文献５７に記載されるように、多糖類の酸化と、その後のタンパク質による還元的アミノ化を包含し得る。
【００２８】
糖類へのアミノ基の導入（例えば、末端の＝Ｏ基を−ＮＨ２で置換することによる）に続いて、アジピンジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）による誘導体化、およびキャリアタンパク質との反応を包含するプロセスが好ましい。別の好ましい反応は、プロテインＤキャリアによるＣＤＡＰ活性化を用いる。
【００２９】
結合の後に、遊離糖類と結合糖類とは分離され得る。この分離のための多数の適切な方法が存在し、その方法として、疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ダイアフィルトレーションなど（参考文献５８および参考文献５９なども参照のこと）が挙げられる。ワクチンが所与の糖類を遊離形態および結合形態の両方で含有する場合、非結合形態は、好ましくは、全体としてその組成物中のその糖類の全体量の２０重量％以下（例えば、≦１５％、≦１０％、≦５％、≦２％、≦１％）である。
【００３０】
好ましい結合体は、アジピン酸リンカーを介してＣＲＭ１９７に共有結合したＨｉｂオリゴ糖を含有する（参考文献６０、参考文献６１）。破傷風類毒素もまた、好ましいキャリアである。
【００３１】
Ｈｉｂ抗原の投与は、好ましくは、０．１５μｇ／ｍｌ以上の抗ＰＲＰ抗体濃度、より好ましくは、１μｇ／ｍｌ以上の抗ＰＲＰ抗体濃度をもたらす。標準的な受容可能応答閾値が存在する。
【００３２】
本発明のワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満（例えば、≦１４μｇ／ｍｌ、≦１２μｇ／ｍｌ、≦１０μｇ／ｍｌ、≦７．５μｇ／ｍｌ、≦５μｇ／ｍｌ、≦４μｇ／ｍｌ、≦３μｇ／ｍｌ、≦２μｇ／ｍｌ、≦１μｇ／ｍｌなど）である。キャリアタンパク質がＯＭＰＣでない場合、少し高い用量（例えば、＜２０μｇ／ｍｌ、≦１９μｇ／ｍｌ、≦１８μｇ／ｍｌ、≦１７μｇ／ｍｌ、≦１６μｇ／ｍｌなど）を使用することが可能である。しかし、本発明のワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、概して、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ（例えば、≧０．２μｇ／ｍｌ、≧０．３μｇ／ｍｌ、≧０．４μｇ／ｍｌ、≧０．５μｇ／ｍｌ、≧０．６μｇ／ｍｌ、≧０．７μｇ／ｍｌ、≧０．８μｇ／ｍｌ、≧０．９μｇ／ｍｌ、≧１．０μｇ／ｍｌ、≧１．２５μｇ／ｍｌ、≧１．５μｇ／ｍｌ、≧２．０μｇ／ｍｌ、≧３．５μｇ／ｍｌなど）である。従って、このワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度についての好ましい範囲は、ｄ１μｇ／ｍｌ〜ｄ２μｇ／ｍｌであって、ここで：（ｉ）ｄ１＜ｄ２であり；（ｉｉ）ｄ１は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．５、および４．０から選択され；そして（ｉｉｉ）ｄ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５から選択される。
【００３３】
Ｈｉｂ結合体の濃度は、本明細書および特許請求の範囲において、キャリアの選択に起因する変動を避けるために、糖類の質量に換算して定義される（すなわち、全体としての結合体（キャリア＋糖類）の用量が、記述される用量より高い）。
【００３４】
本発明の組成物中のＨｉｂ結合体抗原は、凍結乾燥されたものではなく、かつ一度も凍結乾燥されていない。
【００３５】
（アジュバント）
水酸化アルミニウムは、Ｈｉｂ糖類結合体の分解に関与していると考えられ（参考文献６２）、従って、上記のワクチンは、アジュバントとして、好ましくは、代わりにリン酸アルミニウムアジュバントを含有する。
【００３６】
リン酸アルミニウムアジュバントが存在する場合、参考文献６３と対照的に、Ｈｉｂ結合体はそのアジュバントに吸着されないことが好ましい。非吸着は、正確な混合の順番を選択することによって達成され得、抗原／アジュバントの混合中に適切なｐＨを選択することによって達成され得、そして／または適切な荷電ゼロ点（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｚｅｒｏ  ｃｈａｒｇｅ）（ＰＺＣ）を有するアジュバントを選択することによって、製造中に達成され得る（参考文献６４）（以下を参照のこと）。
【００３７】
リン酸アルミニウムが存在する場合、ジフテリア類毒素は、代表的には、リン酸アルミニウムに吸着される。吸着が部分的である（例えば、その組成物中の全ジフテリア類毒素のうち、約３０〜８０重量％（例えば、約４０重量％〜約７０重量％、約５０重量％〜約６０重量％など）が吸着される）ことが好ましい。ジフテリア類毒素の吸着は、約３７℃で保存される場合、経時的に増加する。破傷風類毒素は、代表的には、リン酸アルミニウムに吸着される。吸着が部分的である（例えば、その組成物中の全破傷風類毒素のうち、４０重量％以下（例えば、３０重量％以下、２０重量％以下、１０重量％以下など）しか吸着されない）ことが好ましい。破傷風類毒素吸着のレベルは、約０％であり得る。Ｈｉｂ結合体は、アルミニウムアジュバントに吸着されないままである。好ましくは、その組成物中のＨｉｂ結合体の１５重量％以下しかリン酸アルミニウムに吸着されるべきでない（例えば、最大で１０％、最大で５％、最大で４％、最大で３％、最大で２％、または最大で１％）。
【００３８】
用語「リン酸アルミニウム」とは、本明細書において使用される場合、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸アルミニウム、水酸化リン酸アルミニウム硫酸塩（ａｌｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｕｌｆａｔｅ）を含む。本発明に関する使用のためのリン酸アルミニウムの好ましい形態は、水酸化リン酸塩である。
【００３９】
上記のリン酸アルミニウムのＰＯ４／Ａｌ３＋モル濃度比は、一般的には０．３〜１．２の間であり、好ましくは０．８〜１．２の間であり、さらに好ましくは０．９５±０．１である。代表的なアジュバントは、ＰＯ４／Ａｌモル濃度比が０．８４〜０．９２の間であって１ｍｌ当たり０．６ｍｇのＡｌ３＋が含まれる、非晶質水酸化リン酸アルミニウムである。リン酸アルミウムは、一般的に、特に水酸化リン酸塩に関しては、非晶質である。リン酸アルミニウムは、一般的に粒子状である。この粒子の代表的な直径は、任意の抗原吸着の後で、０．５μｍ〜２０μｍ（例えば、約５μｍ〜約１０μｍ）の範囲である。
【００４０】
リン酸アルミニウムのＰＺＣは、リン酸によるヒドロキシルの置換の程度に対して逆に関連し、この置換の程度は、塩を沈殿によって調製するために用いられる反応条件および反応物質の濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変えることによって変化させられる（より多いリン酸＝より酸性のＰＺＣ）か、あるいはヒスチジン緩衝剤のような緩衝剤を加える（ＰＺＣをより塩基性にする）ことによって変化させられる。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、概して５．０〜７．０の間のＰＺＣ、より好ましくは５．５〜６．０の間（例えば、約５．７）のＰＺＣを有する。
【００４１】
上記のリン酸アルミニウムは、好ましくは、水溶液の形態で使用され、この水溶液に抗原が加えられる（注意：水性のリン酸アルミニウムを「溶液」として言及することは標準的であるが、厳密な物理化学的見地からは、この塩は不溶性であって、懸濁液を形成する）。リン酸アルミニウムを必要な濃度まで希釈すること、および抗原成分の添加の前に均質な溶液にすることを確実にすることが好ましい。
【００４２】
抗原の添加の前のＡｌ３＋の濃度は、一般的には０ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの間である。好ましい濃度は、２ｍｇ／ｍｌ〜６ｍｇ／ｍｌの間である。さらに好ましい濃度は、４ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの間（例えば、４．４ｍｇ／ｍｌ（２０ｍｇ／ｍｌのリン酸アルミニウム濃度に対応する））である。本発明の最終的なワクチン中のＡｌ３＋の濃度は、一般的には０．１ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌの間である。好ましい濃度は、０．２ｍｇ／ｍｌ〜１．５ｍｇ／ｍｌの間である。さらに好ましい濃度は、０．３ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌの間である。最も好ましい濃度は、約０．６ｍｇ／ｍｌである。
【００４３】
本発明のワクチンを調製するために使用されるリン酸アルミニウム溶液は、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤またはヒスチジン緩衝剤）を含有してもよいが、このことは必須ではない。このリン酸アルミニウム溶液は、好ましくは、滅菌かつ発熱物質を含まない。このリン酸アルミニウム溶液は、遊離水性リン酸イオンを含有し得る。この遊離水性リン酸イオンは、例えば、１．０ｍＭ〜２０ｍＭの間、好ましくは５ｍＭ〜１５ｍＭの間、さらに好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する。このリン酸アルミニウム溶液はまた、塩化ナトリウムを含有し得る。塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲（例えば、０．５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ）であり、さらに好ましくは、約３±１ｍｇ／ｍｌである。ＮａＣｌの存在は、抗原の吸着の前のｐＨの正確な測定を容易にする。
【００４４】
アルミニウム塩の単独アジュバントとしての使用は標準的なものであるが、本発明のワクチン中に含有され得る他のアジュバントとして、以下が挙げられる（しかし、それらに限定されない）：
（Ａ．鉱物含有組成物）
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した鉱物含有組成物として、鉱物塩（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩）が挙げられる。本発明は、鉱物塩（例えば、水酸化物（例えば、オキシヒドロキシド）、リン酸塩（例えば、水酸化リン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など（例えば、参考文献６５の第８章および第９章を参照のこと）、または異なる鉱物化合物の混合物を含み、これらの化合物は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）をとり、そして吸着されることが好ましい。この鉱物含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方され得る（参考文献６６）。
【００４５】
本発明のワクチン組成物は、好ましくは、実質的に水酸化アルミニウム（例えば、アルミニウムオキシヒドロキシド）を含有しない。この組成物中の水酸化アルミニウムの濃度は、通常１００μｇ／ｍｌ未満であり、好ましくは５０μｇ／ｍｌ未満であり、さらに好ましくは１０μｇ／ｍｌ未満であり、最も好ましくは１μｇ／ｍｌ未満である。特に、Ｈｉｂ結合抗原は、好ましくは、水酸化アルミニウムに吸着されない。
【００４６】
リン酸カルシウムアジュバントが使用され得る。
【００４７】
（油のエマルジョン）
本発明においてアジュバントとしての使用に適した油のエマルジョン組成物は、スクアラン−水エマルジョン（例えば、微量流動装置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用してミクロン未満の粒子に処方された、ＭＦ５９（参考文献６５の第１０章を参照のこと；また、参考文献６７も参照のこと）（５％  スクアラン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ  ８５）を含む。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）もまた、使用され得る。
【００４８】
（Ｃ．サポニン処方物（参考文献６５の第２２章））
サポニン処方物もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広い範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根およびさらに花において見出される、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）グループである。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹の樹皮に由来するサポニンは、アジュバントとして広く研究されてきた。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ）から、商業的に得ることができる。サポニンアジュバント処方物としては、精製処方物（例えば、ＱＳ２１）、および脂質処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして市販されている。
【００４９】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されてきた。これらの技術を用いて精製される特定の画分が同定されており、これらの画分としては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、そのサポニンは、ＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、参考文献６８において開示される。サポニン処方物はまた、ステロール（例えば、コレステロール）を含み得る（参考文献６９）。
【００５０】
サポニンとコレステロールとの組合せは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）（参考文献６５の第２３章）とよばれる独特の粒子を形成するために使用され得る。ＩＳＣＯＭはまた、代表的には、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）を含有する。任意の公知のサポニンは、ＩＳＣＯＭ中で使用され得る。好ましくは、そのＩＳＣＯＭは、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＨＡ、およびＱＨＣのうちの一種以上を含有する。ＩＳＣＯＭは、参考文献６９〜７１においてさらに記載される。必要に応じて、このＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を全く含有しなくてもよい（参考文献７２）。
【００５１】
サポニンベースのアジュバントの開発の総説は、参考文献７３および参考文献７４において見出される。
【００５２】
（Ｄ．ビロゾームおよびウイルス様粒子）
ビロゾームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）はまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。これらの構造は、一般的には、リン脂質と必要に応じて組み合わされるかまたは処方される、ウイルス由来の一種以上のタンパク質を含有する。これらの構造は、一般的には、非病原性で、複製せず、そして一般的に、いかなる天然のウイルスゲノムも含まない。このウイルスタンパク質は、組換え生成されてもよいし、完全ウイルスから単離されてもよい。ビロゾームまたはＶＬＰにおける使用に適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス由来のタンパク質（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス由来のタンパク質（例えば、コアタンパク質またはキャプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス由来のタンパク質、麻疹ウイルス由来のタンパク質、シンドビスウイルス由来のタンパク質、ロタウイルス由来のタンパク質、口蹄疫ウイルス由来のタンパク質、レトロウイルス由来のタンパク質、ノーウォークウイルス由来のタンパク質、ヒトパピローマウイルス由来のタンパク質、ＨＩＶ由来のタンパク質、ＲＮＡファージ由来のタンパク質、Ｑβファージ由来のタンパク質（例えば、コートタンパク質）、ＧＡファージ由来のタンパク質、ｆｒファージ由来のタンパク質、ＡＰ２０５ファージ由来のタンパク質、およびＴｙ由来のタンパク質（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐｌ）が挙げられる。ＶＬＰは、さらに、参考文献７５〜８０において議論される。ビロソームは、例えば、参考文献８１においてさらに議論される。
【００５３】
（Ｅ．細菌性誘導体または微生物性誘導体）
本発明における使用に適したアジュバントは、以下のような細菌性誘導体または微生物性誘導体を包含する：腸内細菌リポポリサッカリド（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、脂質Ａ誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化誘導体。
【００５４】
ＬＰＳの非毒性誘導体としては、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４アシル化鎖，５アシル化鎖または６アシル化鎖を有する３  ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。３  Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい「小粒子」形態は、参考文献８２において開示される。このような３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２μｍの膜を通して滅菌濾過するために十分小さい（参考文献８２）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリル脂質Ａ模倣物（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９（参考文献８３、参考文献８４））が挙げられる。
【００５５】
脂質Ａ誘導体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の脂質Ａの誘導体（例えば、ＯＭ−１７４）が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献８５および参考文献８６において記載される。
【００５６】
本発明においてアジュバントとして使用するために適した免疫刺激性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに連結される非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示された。
【００５７】
このＣｐＧは、ヌクレオチドの修飾／アナログ（例えば、ホスホロチオエート修飾）を含み得、二本鎖または一本鎖であり得る。参考文献８７、参考文献８８、および参考文献８９は、可能なアナログ置換（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによるグアノシンの置換）を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献９０〜９５においてさらに議論される。
【００５８】
このＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ）に指向され得る（参考文献９６）。このＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導について特異的であってもよいし（例えば、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ）、Ｂ細胞応答の誘導についてより特異的であってもよい（例えば、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ）。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献９７〜９９において議論される。好ましくは、このＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【００５９】
好ましくは、このＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端がレセプター認識に利用しやすいように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成するために、それらの３’末端に結合され得る。例えば、参考文献９６、および参考文献１００〜１０２を参照のこと。
【００６０】
細菌性ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化誘導体は、本発明において、アジュバントとして使用され得る。好ましくは、そのタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ非耐熱性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来し得る。粘膜用アジュバントとしての解毒化ＡＤＰリボシル化毒素の使用は、参考文献１０３において記載され、非経口用アジュバントとしての解毒化ＡＤＰリボシル化毒素の使用は、参考文献１０４において記載されている。毒素または類毒素は、好ましくは、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方を含む完全毒素の形態である。好ましくは、Ａサブユニットは、解毒化変異体を含み；好ましくは、Ｂサブユニットは、変異していない。好ましくは、このアジュバントは、解毒化ＬＴ変異体（例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２）である。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２のアジュバントとしての使用は、参考文献１０５〜１１２において見出される。アミノ酸置換についての多数の参考文献が、好ましくは、参考文献１１３において示されるＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。この参考文献１１３は、具体的に、その全体が本明細書において参考として援用される。
【００６１】
（Ｆ．ヒト免疫調節因子）
本発明においてアジュバントとして使用するために適したヒト免疫調節因子としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（参考文献１１４）など）のようなサイトカイン（参考文献１１５）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。
【００６２】
（Ｇ．生体接着剤および粘膜接着剤）
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。適切な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア（参考文献１１６）、または粘膜接着剤（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカリド、およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体）が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る（参考文献１１７）。
【００６３】
（Ｈ．マイクロパーティクル）
マイクロパーティクルもまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。生分解性かつ非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）からポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）とともに形成されるマイクロパーティクル（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、および最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、必要に応じて、負に荷電した表面を有するように（例えば、ＳＤＳで）処理されるか、または正に荷電した表面を有するように（例えば、陽イオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）で）処理される。
【００６４】
（Ｌ．リポソーム（参考文献６５の第１３章および第１４章））
アジュバントとしての使用のために適したリポソーム処方物の例は、参考文献１１８〜１２０において記載される。
【００６５】
（Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルの処方物）
本発明における使用に適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルを含む（参考文献１２１）。このような処方物としては、さらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（参考文献１２２）、ならびに少なくとも一種のさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（参考文献１２３）が挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ  ９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【００６６】
（Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、参考文献１２４および参考文献１２５において記載される。
【００６７】
（Ｌ．ムラミルペプチド）
本発明においてアジュバントとして使用するために適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン  ＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【００６８】
（Ｍ．イミダゾキノロン化合物）
本発明においてアジュバントとして使用するために適したイミダゾキノロン化合物の例としては、Ｉｍｉｑｕａｍｏｄおよびそのホモログ（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ  ３Ｍ」）が挙げられる（参考文献１２６および参考文献１２７においてさらに記載される）。
【００６９】
本発明はまた、上記で同定されるアジュバントのうちの一つ以上の局面の組み合わせを包含し得る。例えば、以下のアジュバント組成物が、本発明において使用され得る：（１）サポニンと水中油型エマルジョン（参考文献１２８）；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）  ＋  非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（参考文献１２９）；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）  ＋  非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）  ＋  コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）  ＋  ３ｄＭＰＬ  ＋  ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（参考文献１３０）；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ（参考文献１３１）；（６）１０％  スクアラン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ  ８０ＴＭ、５％  プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む、ＳＡＦ（ミクロン未満のエマルジョンに微量流体化されるか、またはボルテックスされてより大きな粒子サイズのエマルジョンが生成されるかのいずれかである）；（７）２％  スクアラン、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、ならびにモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ  ＋  ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）からなる群からの一種以上の細菌細胞壁成分を含む、ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに（８）一種以上の鉱物塩（例えば、アルミニウム塩）  ＋  ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば、３ｄＰＭＬ）。
【００７０】
免疫刺激因子として作用する他の物質は、参考文献６５の第７章において開示される。
【００７１】
（さらなる抗原）
本発明の組成物は、Ｄ抗原、Ｔ抗原、Ｐ抗原、およびＨｉｂ抗原を含有する。本発明の組成物はまた、以下のようなさらなる抗原を含有し得る：
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５、および／または血清群Ｙ由来の糖類抗原（例えば、参考文献１３２において開示される血清群Ｃ由来のオリゴ糖、または、参考文献１３３のオリゴ糖）。本ワクチンは、好ましくは、血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５、および血清群Ｙのうちの２種、３種、または４種からの結合体を含有する。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖類抗原（例えば、参考文献１３４〜１３６）。
−Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、不活性化されたウイルス）（例えば、参考文献１３７、参考文献１３８）。
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原）（例えば、参考文献１３８、参考文献１３９）。
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物またはブレブ調製物（例えば、参考文献１４０、参考文献１４１、参考文献１４２、参考文献１４３などにおいて開示されるもの）。
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来のタンパク質抗原（例えば、参考文献１４４〜１５０中のもの（タンパク質「２８７」（以下を参照のこと）および誘導体（例えば、「ΔＧ２８７」）が特に好ましい））。
−ポリオ抗原（例えば、参考文献１５１、参考文献１５２）（例えば、ＩＰＶ）。
【００７２】
上記の組成物は、これらのさらなる抗原のうちの一種以上を含有し得る。抗原は、代表的には、少なくとも各々１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的には、任意の所与の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を惹起するために十分である。個々の糖類抗原の防御効力が、それらを組み合わせることによって除去されないことが好ましいが、実際の免疫原性（例えば、ＥＬＩＳＡの力価）は、低減され得る。
【００７３】
糖類抗原が使用される場合、その糖類抗原は、好ましくは、免疫原性を高めるためにキャリアタンパク質と結合される。
【００７４】
本発明の組成物におけるタンパク質抗原の使用の代替的方法として、抗原をコードする核酸が使用され得る（例えば、参考文献１５３〜１６１）。従って、本発明の組成物のタンパク質成分は、そのタンパク質をコードする核酸（好ましくは、（例えばプラスミドの形態の）ＤＮＡ）によって置き換えられ得る。同様に、本発明の組成物は、糖類抗原を模倣するタンパク質（例えば、ミモトープ（参考文献１６２）または抗イディオタイプ抗体）を含有し得る。これらによって個々の糖類成分が置き換えられ得るか、または、補充され得る。一例として、上記のワクチンは、ＭｅｎＣ（参考文献１６３）またはＭｅｎＡ（参考文献１６４）の莢膜多糖類のペプチド模倣物を、糖類そのものの代わりとして含有し得る。
【００７５】
本発明のワクチンがＢ型肝炎表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）を含有する場合、この抗原は、二種の方法で作製され得る。第一の方法は、粒子状形態の抗原を、慢性Ｂ型肝炎キャリアの血漿から精製する工程を包含する。なぜならば、ＨＢＶ感染中に、大量のＨＢｓＡｇが肝臓において合成されて血流中に放出されるからである。第二の方法は、組換えＤＮＡ法によってタンパク質を発現させる工程を包含し、この第二の方法が、好ましい。ＨＢｓＡｇがＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母における発現によって調製されることが好ましい。ＨＢｓＡｇ遺伝子は、プラスミドに挿入され得、そのプラスミドからのこのＨＢｓＡｇ遺伝子の発現は、（例えば、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子からの）「ＧＡＰＤＨ」プロモーターのようなプロモーターによって制御され得る。この酵母は、合成培地中で培養され得る。次いで、ＨＢｓＡｇは、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、および限外濾過法のような工程を包含するプロセスによって、精製され得る。精製後に、ＨＢｓＡｇは、（例えば、システインに関する）透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｃｙｓｔｅｉｎ）に供され得る。このＨＢｓＡｇは、粒子状形態で使用され得る。
【００７６】
本発明のワクチンがポリオ抗原を含有する場合、三種のポリオウイルス抗原−１型ポリオウイルス（例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ株）、２型ポリオウイルス（例えば、ＭＥＦ−１株）、および３型ポリオウイルス（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ株）を使用することが好ましい。ポリオウイルスは、細胞培養物中で増殖され得る。好ましい培養物は、ＶＥＲＯ細胞株を使用する。ＶＥＲＯ細胞株は、サル腎臓由来の連続性細胞株（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）である。ＶＥＲＯ細胞は、マイクロキャリア中で簡便に培養され得る。ウイルス感染前およびウイルス感染中のＶＥＲＯ細胞の培養は、ウシ由来の物質（例えば、仔ウシ血清）の使用を必要とし得るので、この物質は、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）の危険のない供給源から得られるべきである。培養はまた、ラクトアルブミン加水分解物のような物質を必要とし得る。増殖後に、ビリオンは、限外濾過法、ダイアフィルトレーション、およびクロマトグラフィーのような技術を用いて精製され得る。患者への投与の前にウイルスは不活性化されておらねばならず、このことは、ホルムアルデヒドを用いる処理によって達成され得る。ウイルスは、好ましくは、別個に増殖され、精製され、そして不活性化され、次いで、組み合わされて、吸着されたジフテリア抗原および破傷風抗原への添加のためのバルク混合物をもたらす。
【００７７】
本発明のワクチン中の抗原は、「免疫学的有効量」（すなわち、単一用量または一連の用量の一部としてのいずれかでの個体に対するこの量の投与が、疾患の処置または予防のために有効である）で存在する。この量は、処置されるべき個体の健康状態および身体状態、処置されるべき個体の年齢、分類学上の類（例えば、ヒト、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、望ましい防御の程度、ワクチンの処方、処置する医師による医学的状況の評価、そして他の適切な因子に依存して変化する。この量は、慣用的な試験を通して決定され得る比較的広い範囲中に入ることが期待される。投薬処置は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュール（追加免疫用量（ｂｏｏｓｔｅｒ  ｄｏｓｅ）を含む）であり得る。
【００７８】
（本発明のワクチンの非免疫学的成分）
本発明のワクチンは、典型的には、上述の抗原成分およびアジュバント成分に加えて、一種以上の「薬学的に受容可能なキャリア」を含有する。この「薬学的に受容可能なキャリア」は、それ自体がその組成物を与えられている個体にとって有害な抗体の産生を誘導しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは、代表的には、分子量が大きくゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体、ショ糖（参考文献１６５）、トレハロース（参考文献１６６）、乳糖、および脂質集合体（例えば、油滴またはリポソーム）である。そのようなキャリアは、当業者に周知である。このワクチンはまた、希釈剤（例えば、水、食塩水、グリセロールなど）を含有し得る。さらに、補助的物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質など）が存在し得る。滅菌かつ発熱物質を含まないリン酸緩衝化生理食塩水は、代表的なキャリアである。薬学的に受容可能な賦形剤の完全な考察は、参考文献１６７において入手可能である。
【００７９】
本発明の組成物は、水性形態（すなわち、溶液または懸濁液）である。この型の液体処方は、組成物が、水性溶媒中での再構成の必要性なしに、包装形態から直接に投与されることを可能にし、従って、注射のために理想的である。組成物は、バイアル中で提示され得るか、または既に充填済み（ｒｅａｄｙ−ｆｉｌｌｅｄ）の注射器中で提示され得る。この注射器は、針を備えられても備えられなくてもよい。一本の注射器は、単一用量の組成物を含有するが、一個のバイアルは、単一用量または複数用量を含有し得る。
【００８０】
本発明の液体ワクチンはまた、他のワクチンを凍結乾燥形態から再構成するためにも適している。ワクチンがそのような即時再構成のために使用される場合、本発明は、キットを提供する。このキットは、二個のバイアルを含み得るか、または一個の既に充填済みの注射器と一個のバイアルとを含み得、この注射器の内容物は、注射の前にバイアルの内容物を再活性化するために用いられる。
【００８１】
本発明のワクチンは、単位用量形態または複数用量形態において包装され得る。複数用量形態のためには、前もって充填済みの注射器よりもバイアルの方が好ましい。有効投薬量の容積は、慣用的に確立され得るが、注射のための組成物の代表的なヒトの用量は、０．５ｍｌの容積を有する。
【００８２】
本発明のワクチンは、概して６．０〜８．０の間のｐＨを有し、より好ましくは、６．３〜６．９（例えば、６．６±０．２）のｐＨを有する。ワクチンは、好ましくはこのｐＨで緩衝化される。安定なｐＨは、緩衝剤の使用によって維持され得る。組成物が水酸化アルミニウム塩を含有する場合、ヒスチジン緩衝剤を使用することが好ましい（参考文献１６８）。この組成物は、滅菌かつ／または発熱物質を含まない。リン酸アルミニウムおよび全菌体百日咳抗原は、フィルター滅菌法に不適合であるので、本発明の組成物がこれらの成分の一つを含有する場合、オートクレーブによって本発明の組成物を滅菌すること、および／またはこの組成物の生成において滅菌の成分を使用することが好ましい。
【００８３】
本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。
【００８４】
本発明のワクチンは、特に、複数用量形式で包装される場合、抗菌剤を含有し得る。多くの抗菌剤は、水銀ベースであるが（例えば、チオメルサール）、水銀性保存薬は、避けられることが好ましく、例えば、２−フェノキシエタノールが使用される。保存薬はいずれも、好ましくは、低いレベル（例えば、０．０１体積％）で存在する。保存薬は、外因性に添加され得、そして／または、組成物を形成するために混合されるバルク抗原の成分であり得る（例えば、百日咳抗原中の保存薬として存在する）。
【００８５】
本発明のワクチンは、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０のようなＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含有し得る。界面活性剤は、一般的に、低いレベル（例えば、０．０１％未満）で存在する。
【００８６】
本発明のワクチンは、張度をもたらすためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含有し得る。この組成物は、塩化ナトリウムを含有し得る。この組成物中の塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌ）の範囲であり、より好ましくは、１０±２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌ（例えば、約９ｍｇ／ｍｌ）である。
【００８７】
本発明のワクチンは、一般的に、緩衝剤を含有する。リン酸緩衝剤またはヒスチジン緩衝剤が、代表的である。
【００８８】
本発明のワクチンは、抗原の非吸着を容易にするために、溶液中に遊離のリン酸イオンを含有し得る（例えば、リン酸緩衝剤の使用による）。本発明の組成物中の遊離のリン酸イオンの濃度は、一般的に０．１ｍＭ〜１０．０ｍＭの間であり、好ましくは１ｍＭ〜５ｍＭの間であり、より好ましくは約２．５ｍＭである。
【００８９】
（本発明のワクチンの包装）
本発明のワクチンは、種々の型の容器中（例えば、バイアル中、注射器中など）に包装され得る。
【００９０】
凍結乾燥されたＨｉｂ成分の再構成を必要とする先行技術のＤＴＰ−Ｈｉｂワクチンに関しては、水性のＤＴＰ抗原が、第一の密封バイアルから注射器中へ引き出され、次いで、凍結乾燥物質を含有する第二の密封バイアルへと挿入される。再構成されたワクチンは、次いで、患者への投与のためのものと同じ注射器中へ引き出される。対照的に、本発明のワクチン中のＨｉｂ結合体は、水性状態で安定であり、凍結乾燥を必要としない。従って、本発明は、貫通可能な封を有しＤＴＰ−Ｈｉｂワクチンを含有する一個のバイアルを提供し得る。ここで、この貫通可能な封はまだ貫通されていない。同様に、本発明は、本発明のワクチンを含有する気密密封容器を提供し得る。
【００９１】
凍結乾燥されたＨｉｂ成分の再構成を必要とする先行技術のＤＴＰ−Ｈｉｂワクチンは、二個の別々の容器中に包装されなければならない。対照的に、本発明は、本発明のワクチンを、既にＤＴＰ−Ｈｉｂ抗原を含有する形態で一個の容器中に挿入するためのプロセスの供給を可能にする。この挿入は、好ましくは、この容器の封を通さない。
【００９２】
同様に、ワクチンの包装が製造中に標識される場合、先行技術のＤＴＰ−Ｈｉｂワクチンは、それらが別々のＤＴＰ形式とＨｉｂ形式とで標識されるが、一方、本発明は、ワクチンをその最終のＤＴＰ−Ｈｉｂ形式で標識し得る。
【００９３】
さらに、先行技術の再構成されたＤＴＰ−Ｈｉｂワクチンは、それらの容器からＤＴＰ−Ｈｉｂ形態で引き出されるが、その形態においては容器に挿入されない。しかし、本発明に従うと、そのようなＤＴＰ−Ｈｉｂワクチンを、混合ＤＴＰ−Ｈｉｂ形態において挿入し、かつ取り出すことが出来る。挿入と取り出しとの間の時間は、少なくともｎ週間であり得、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、または２５以上から選択される。取り出しは、一般的に、針（例えば、注射器のような滅菌送達デバイスの針）を介するが、容器への挿入は、通常、送達デバイスよりむしろ製造ラインに由来する。
【００９４】
（本発明のワクチンの調製）
本発明のワクチンは、少なくともＤＴＰ−Ｈｉｂ抗原を含有し、従ってこれらのワクチンの調製は、これらの四種の抗原を混合する工程を包含する。再構成される先行技術のＤＴＰ−Ｈｉｂワクチンの調製と異なり、本発明は、Ｈｉｂ結合体の凍結乾燥の工程を包含しない調製プロセスを提供し得る。同様に、本発明は、混合されたＤＴＰ抗原をＨｉｂ抗原と別個に包装する工程を包含しない調製プロセスを提供し得る。
【００９５】
調製中に、添加される抗原は、一般的には、まだアルミニウム塩に吸着されていない（すなわち、それらは「事前吸着（ｐｒｅ−ａｄｓｏｒｂｅｄ）」されていない）。従って、添加される抗原の各々について、５重量％以下（好ましくは０％）しか、既にアルミニウム塩に吸着されていない（例えば、最大で４重量％、最大で３重量％、または最大で２重量％）。しかし、いくつかの状況においては、事前吸着抗原が添加され得る。
【００９６】
本発明のバルクワクチンを調製するための代表的なプロセスは、Ｈｉｂ成分を、Ｄ成分、Ｔ成分、Ｐ成分の混合物へと添加する（すなわち、ＤＴＰ成分は、Ｈｉｂ成分の添加の前に混合されている）。この混合の順序は、存在し得る任意のアルミニウムアジュバントへの吸着を予防するために、この組成物のイオン強度および／またはｐＨが、Ｈｉｂ成分の添加の前に調整される（例えば、ｐＨ＜７）ことを可能にする。
【００９７】
本発明のワクチンは、好ましくは、１５℃〜３０℃の間（例えば、１９℃〜２７℃の間、または２３度±４℃）で調製される。
【００９８】
（本発明のワクチンの投与）
本発明は、哺乳動物において抗体反応を引き起こすための方法を提供し、この方法は、この哺乳動物に本発明のワクチンを投与する工程を包含する。このワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）に、または治療的（すなわち、感染後の疾患を処置するため）に、投与され得る。
【００９９】
本発明は、哺乳動物において免疫応答を引き起こすための方法を提供し、この方法は、有効量の本発明のワクチンを投与する工程を包含する。この免疫応答は、好ましくは防御的であり、好ましくは、抗体を生じる。この方法は、追加免疫応答を引き起こし得る。
【０１００】
上記の哺乳動物は、好ましくはヒトである。ワクチンが予防的使用のためのものである場合、このヒトは、好ましくは小児（例えば、よちよち歩きの幼児（ｔｏｄｄｌｅｒ）もしくは幼児（ｉｎｆａｎｔ））または１０代の若年者であり；ワクチンが治療的使用のためのものである場合、このヒトは、好ましくは成人である。小児のために意図されるワクチンはまた、成人に対しても投与され得る（例えば、安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために）。
【０１０１】
本発明はまた、医薬としての使用のための本発明の組成物を提供する。この医薬は、好ましくは、哺乳動物において免疫応答を引き起こし得（すなわち、これは免疫原性組成物であり）、より好ましくは、ワクチンである。
【０１０２】
本発明はまた、患者の免疫のための組合せワクチンの製造における、少なくともジフテリア抗原、破傷風抗原、百日咳抗原、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）抗原の使用を提供し、ここで（ａ）Ｈｉｂから防御するための抗原は、Ｈｉｂ莢膜糖類の結合体であり；（ｂ）このワクチン中のＨｉｂ結合体の濃度は、１５μｇ／ｍｌ未満であり；そして（ｃ）その製造は、Ｈｉｂ結合体の凍結乾燥を包含しない。
【０１０３】
これらの使用および方法は、好ましくは、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの感染の予防ならびに／または処置、さらに、これらの感染によって引き起こされる疾患の予防ならびに／または処置（例えば、ジフテリア、破傷風、百日咳、細菌性髄膜炎などの予防）のためのものである。
【０１０４】
治療的処置の効力を検査する一つの方法は、本発明の組成物の投与後に細菌感染をモニタリングする工程を包含する。予防的処置の効力を検査する一つの方法は、この組成物の投与後に抗原に対する免疫応答をモニタリングする工程を包含する。本発明の組成物の免疫原性は、試験被験体（例えば、１２〜１６ヶ月齢の小児、または動物モデル（参考文献１６９））にこれらの組成物を投与し、次いで、標準的な免疫学的パラメーターを測定することによって、決定され得る。これらの免疫応答は、一般的に、組成物の投与の約４週間後に決定され、その組成物の投与の前に決定された値と比較される。患者における実質的な防御効力を評価するよりもむしろ、ＨｉｂワクチンおよびＤＴＰワクチンの効力を評価するための標準的な防御の動物モデルおよびインビトロモデルおよび相関物が、周知である。
【０１０５】
本発明の組成物は、一般的には、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、もしくは組織の間隙空間への注射）によって達成されるか、または直腸投与、経口投与、経膣投与、局所投与、経皮投与、鼻内投与、眼投与、耳投与、肺投与、もしくは他の粘膜投与によって達成される。大腿または上腕への筋肉内投与が、好ましい。注射は、針（例えば、皮下針）を介してもよいが、無針注射（ｎｅｅｄｌｅ−ｆｒｅｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）が代替的に用いられてもよい。代表的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。
【０１０６】
本発明は、全身性免疫および／または粘膜性免疫を惹起するために用いられ得る。
【０１０７】
投薬処置は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。複数用量は、一次免疫スケジュールにおいて、および／または追加免疫スケジュールにおいて用いられ得る。一次免疫用量スケジュールの後に、追加免疫用量スケジュールを行ってもよい。初回用量の間（例えば、４〜１６週間の間）の適切なタイミング、および初回用量と追加用量との間の適切なタイミングは、慣用的に決定され得る。
【０１０８】
細菌感染は、身体の多様な領域に影響を及ぼす。従って、本発明の組成物は、多様な形態で調製され得る。例えば、この組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかの注射可能物として調製され得る。この組成物は、肺投与のために（例えば、吸入器として、細粉またはスプレーを用いて）調製され得る。この組成物は、坐剤または膣坐薬として調製され得る。この組成物は、鼻投与、耳投与、または眼投与のために（例えば、スプレー、点滴剤、ゲル、または散剤として）調製され得る（例えば、参考文献１７０および参考文献１７１）。首尾よいＨｉｂ糖類の鼻内投与（参考文献１７２）、およびＤＴＰワクチンの鼻内投与（参考文献１７３、参考文献１７４）が、報告されている。
【０１０９】
（一般）
用語「〜を含む、〜を含有する、〜を包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「〜を含む、〜を包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「（〜から）なる、（〜から）構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘを「含有する」組成物は、Ｘのみからなり得るか、または付加的な他のものを含有し得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１１０】
数値ｘに関する用語「約」とは、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１１１】
単語「実質的に」とは、「完全に」を除外しない。例えば、「実質的にＹを含まない」組成物は、Ｙを全く含まなくてもよい。必要な場合、単語「実質的に」とは、本発明の定義から省略され得る。
【実施例】
【０１１２】
（本発明の実行のための様式）
Ｈｉｂ−ＣＲＭ１９７結合体の用量のみが異なる、４種のＤＴｗＰ−Ｈｉｂワクチン処方物を調製した。ワクチンを、以下の抗原性組成物を用いて、０．５ｍｌ用量として調製した。
【０１１３】
【表１】
2007529503.tif 000003
この生成プロセスは、基本的には以下のようである：注射用水（ｗｆｉ）から始め；リン酸アルミニウムアジュバントを加え；Ｄ成分を加え；Ｔ成分を加え；ｗＰ成分を加え；ＮａＣｌを加え；検査してｐＨを調製し；そして、Ｈｉｂ成分を加える。参考文献１７５の記述と反対に、このＨｉｂ成分は、上記のアジュバントに吸着しない。
【０１１４】
（安定性）
２種の安定性の研究を行った：一つは、２℃〜８℃での通常の貯蔵条件下で２年間、もう一方は、３７℃での促進（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ）条件下で１４日間であった。ワクチンを、直立または上下逆の位置での貯蔵の後に試験した。安定性を、ｐＨおよび遊離糖類の決定によって評価した。
【０１１５】
第一の研究の結果は、以下のようであった：
【０１１６】
【表２】
2007529503.tif 000004
促進安定性研究の結果は、以下のようであった：
【０１１７】
【表３】
2007529503.tif 000005
従って、これらのワクチンは、長期間にわたって安定である。吸着を、同じ時間的尺度にわたって試験した。Ｈｉｂ結合体は、貯蔵中に吸着されないままである。
【０１１８】
（臨床試験）
合計２６１個体の小児を登録し、無作為化し、４種のワクチンのうちの１種を二重盲検試験において与え、安全性および免疫原性を評価した（部分的盲検または公開のいずれかであった参考文献６、参考文献８、および参考文献９の研究を比較参照のこと）。健康な３ヶ月齢の小児（３７週間以上の妊娠期間で出生し、出生時体重が最低２５００ｇであり、局所ＥＰＩに適格である）を登録し、６６：６５：６５：６５のＡ：Ｂ：Ｃ：Ｄ比で無作為化し、これらのワクチンのうちの１種の単一筋肉内用量を、３ヶ月齢、４ヶ月齢、および５ヶ月齢の三回で与えた。局所ＥＰＩに合わせて、被験体に、経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）を、平行して、２ヶ月齢、４ヶ月齢、および６ヶ月齢で与えた。
【０１１９】
登録時の平均齢は、９４（６９〜１０８の範囲）日であり、４種のワクチン群の間で、性別、人種、体重、および身長の分布の点で相違は観察されなかった。患者を、注射後の反応および有害事象について追跡した。合計２６０個体の被験体を、安全性の分析に含め（４種のワクチン群の各々について６５個体）、２５１個体を、免疫原性の分析に含めた（群Ａに６１個体、群Ｂおよび群Ｃに各々６４個体、ならびに群Ｄに６２個体）。親／法定後見人が研究の完了前に同意を撤回したために、９個体の被験体が研究を完了しなかった（群Ａの５個体の被験体、群Ｂの１個体の被験体、および群Ｄの３個体の被験体）。
【０１２０】
血液サンプルを、基準時および３回目の投薬の一ヶ月後に得た。抗ＰＲＰ抗体、抗百日咳抗体、抗ジフテリア抗体、および抗破傷風抗体を測定した。ＩｇＧ抗ＰＲＰ抗体を、ＦＤＡ  ＥＬＩＳＡ法（参考文献１７６）を改変したＥＬＩＳＡによって測定した。ＩｇＧ抗ジフテリア毒素抗体およびＩｇＧ抗破傷風毒素抗体を、ＥＬＩＳＡによって定量した。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの血清学的マーカー（抗ペルタクチンおよび抗Ａｇｇ２−３）もまた、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１２１】
（安全性および反応性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ））
被験体を、各々のワクチン用量の後３０分間、研究員がモニタリングした。親に、各々の注射の後７日間、毎日の直腸体温、ならびに局所性反応および全身性反応を日記に記録するように依頼した。加えて、研究人員は、全ての有害事象の詳細を得るために、各々の接種の後２日目および７日目に親／法定後見人に電話で能動的に接触した。有害事象の発生、または重篤な有害事象、ならびに医師の訪問および／もしくは任意の医薬を必要とする事象を、研究期間を通して批判的に調べ、記録した。少なくとも一回の接種を受けた被験体を、安全性の分析に含めた。
【０１２２】
局所性反応および全身性反応は、大部分が軽度で一過性であった。最も頻繁なものは、局所性反応については、圧痛、紅斑、および硬化、そして全身性反応については、被刺激性、眠気、および異常な号泣である：
【０１２３】
【表４−１】
2007529503.tif 000006
【０１２４】
【表４−２】
2007529503.tif 000007
４種のワクチンの間で、有意差は観察されず、全ての接種後反応は、後遺症なしに消散した。研究ワクチンに関連するとして報告された重篤な有害事象は存在しなかった。
【０１２５】
（免疫原性）
抗ＰＲＰセロコンバージョン率（セロコンバージョンされた患者の％）は、以下のようであった：
【０１２６】
【表５】
2007529503.tif 000008
抗百日咳セロコンバージョン率を、（ａ）抗ペルタクチン応答および抗Ａｇｇ２−３応答の増大、ならびに（ｂ）ＧＭＴを観察することによって評価した。結果（患者の％）は、以下のようであった：
【０１２７】
【表６】
2007529503.tif 000009
抗ジフテリアＧＭＴおよび抗破傷風ＧＭＴは、以下のようであった：
【０１２８】
【表７】
2007529503.tif 000010
抗ＰＲＰ力価が０．１５μｇ／ｍｌ以上の被験体の割合は、従って、４種のワクチン群において同様であったが、抗ＰＲＰ力価が１．０μｇ／ｍｌ以上の被験体の割合は、群Ｃ（９７％）および群Ｄ（９５％）において、群Ａ（９０％）および群Ｂ（８８％）より高かった。抗ＰＲＰ  ＧＭＴは、明確な用量−反応効果を示し、群Ａ（６．９４μｇ／ｍｌ）と群Ｂ（７．８２μｇ／ｍｌ）との間で類似であり、群Ｃ（１７μｇ／ｍｌ）と群Ｄ（１８μｇ／ｍｌ）との間で類似であるが、群Ｃおよび群Ｄの両方と比較した場合、群Ａおよび群Ｂにおいて有意により低い（図１）。
【０１２９】
第三の接種の一ヶ月後、４種のワクチン群の各々の全ての被験体は、ジフテリアおよび破傷風に対してセロコンバージョンされていた（抗体レベル０．１  ＩＵ／ｍＬ以上）。４種のワクチン群の間で、ＧＭＴの感知可能な相違は観察されなかった。
【０１３０】
４種のワクチン群の間で、抗ペルタクチン抗体および抗Ａｇｇ２−３抗体が基線と比較して２倍または４倍に増加した被験体の割合に、相違は観察されなかった。４種のワクチン群の間のＧＭＴもまた、類似していた。
【０１３１】
（結論）
一用量あたり５μｇ、２．５μｇ、または１．２５μｇのＨｉｂ結合体の分数的用量を用いたＤＴｗＰＨｉｂワクチン処方物は、セロコンバージョン率に関する限り、基準の１０μｇ処方物と同じくらい免疫原性であった。高いレベルおよび同等のレベルの抗ＰＲＰ  ＧＭＴが、１０μｇまたは５μｇの結合体を用いた処方物によって惹起された。一用量あたり２．５μｇおよび１．２５μｇの結合体を用いた処方物は、より低い抗ＰＲＰ  ＧＭＴを惹起するが、これらは十分に免疫原性である。
【０１３２】
従って、この研究は、ＤＴＰワクチンを含有する適切な処方物において、他のワクチン成分の防御効力に影響を及ぼすことなく、Ｈｉｂ抗原の量を、一用量あたり１．２５μｇまで減少し得ることを確認する。
【０１３３】
ＤＴＰ−Ｈｉｂワクチンの全ての４種の処方物は、安全であり、かつ全てのワクチン成分について免疫原性であった。抗ＰＲＰ血清防御（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）率に関しては、４種の処方物は、短期（力価が０．１５μｇ／ｍＬ以上）および長期（力価が１μｇ／ｍＬ以上）の両方において、同等に免疫原性であった。５μｇの結合体を含有する処方物は、１０μｇを含有する基準処方物と同じくらい免疫原性であり、両方の処方物について、抗ＰＲＰ  ＧＭＴは特に高かった（１７μｇ／ｍＬおよび１８μｇ／ｍＬ）。１．２５μｇおよび２．５μｇの結合体を含有する処方物は、Ｈｉｂワクチンの分数的用量を使用する他の研究において観察された免疫応答と比較した場合、免疫原性が高かった（参考文献６、参考文献８、参考文献９）。
【０１３４】
さらなる情報は、参考文献１７７において見出され得る。
【０１３５】
本発明は、例示の手段のみによって説明されており、本発明の範囲および趣旨の内にあることを維持しながら変更がなされ得ることが、理解される。
【０１３６】
（参考文献）
（この参考文献の内容は、全てが本明細書によって参考として援用される）
【０１３７】
【表８−１】
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【０１３８】
【表８−２】
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【０１３９】
【表８−３】
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【０１４０】
【表８−４】
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【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、ワクチン群Ａ，ワクチン群Ｂ、ワクチン群Ｃ、およびワクチン群Ｄの抗ＰＲＰ  ＧＭＴおよび９５％信頼区間を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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