【手続補正書】
【提出日】平成28年4月4日(2016.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1,3-ブタンジオール（1,3-BDO）経路を有する微生物を含む非天然微生物であって、1,3-BDOを産生するのに十分な量で発現する1,3-BDO経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含み、該1,3-BDO経路が、2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ、AKP脱水素酵素、2-アミノ-4-ヒドロキシペンタノアートアミノトランスフェラーゼ、2-アミノ-4-ヒドロキシペンタノアート酸化還元酵素（脱アミノ化）、2-オキソ-4-ヒドロキシペンタノアートデカルボキシラーゼ、3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素、AKPアミノトランスフェラーゼ、AKP酸化還元酵素（脱アミノ化）、2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼ、3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（ケトン還元）、3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（アルデヒド還元）、4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素、AKPデカルボキシラーゼ、4-アミノブタン-2-オンアミノトランスフェラーゼ、4-アミノブタン-2-オン酸化還元酵素（脱アミノ化）、4-アミノブタン-2-オンアンモニアリアーゼ、ブテノンヒドラターゼ、AKPアンモニア-リアーゼ、アセチルアクリラートデカルボキシラーゼ、アセトアセチル-CoA還元酵素（CoA依存性、アルデヒド形成）、アセトアセチル-CoA還元酵素（CoA依存性、アルコール形成）、アセトアセチル-CoA還元酵素（ケトン還元）、3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）、3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、及びクロトナーゼからなる群から選択される酵素を含む、前記非天然微生物。
【請求項２】
前記微生物が、1,3-BDO経路酵素を各々コードする2、3、4又は5つの外来性核酸を含む、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項３】
前記少なくとも1つの外来性核酸が異種性核酸である、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項４】
前記非天然微生物が、実質的に嫌気性の培地中にある、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項５】
前記1,3-BDO経路が、1セットの1,3-BDO経路酵素を含み、1,3-BDO経路酵素の該セットが下記からなる群から選択される、請求項１記載の非天然微生物：
（a）（1）2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ；（2）AKP脱水素酵素；（3）2-アミノ-4-ヒドロキシペンタノアートアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（4）2-オキソ-4-ヒドロキシペンタノアートデカルボキシラーゼ；及び（5）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（b）（1）2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ；（2）AKPアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（3）2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼ；（4）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（ケトン還元）；及び（5）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（c）（1）2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ；（2）AKPアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（3）2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼ；（4）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（アルデヒド還元）；及び（5）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（d）（1）2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ；（2）AKPデカルボキシラーゼ；（3）4-アミノブタン-2-オンアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（4）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（ケトン還元）；及び（5）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（e）（1）2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ；（2）AKPデカルボキシラーゼ；（3）4-アミノブタン-2-オンアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（4）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（アルデヒド還元）；及び（5）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（f）（1）2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ；（2）AKPデカルボキシラーゼ；（3）4-アミノブタン-2-オンアンモニア-リアーゼ；（4）ブテノンヒドラターゼ；及び（5）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（g）（1）2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ；（2）AKPアンモニア-リアーゼ；（3）アセチルアクリラートデカルボキシラーゼ；（4）ブテノンヒドラターゼ；及び（5）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（h）（1）アセトアセチル-CoA還元酵素（CoA依存性、アルデヒド形成）；（2）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（ケトン還元）；及び（3）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（i）（1）アセトアセチル-CoA還元酵素（CoA依存性、アルコール形成）及び（2）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（j）（1）アセトアセチル-CoA還元酵素（CoA依存性、アルデヒド形成）；（2）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（アルデヒド還元）；及び（3）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（k）（1）アセトアセチル-CoA還元酵素（ケトン還元）及び（2）3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）；
（l）（1）アセトアセチル-CoA還元酵素（ケトン還元）；（2）3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）；及び（3）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（m）（1）4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ；（2）クロトナーゼ；及び（3）3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）；並びに
（n）（1）4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ；（2）クロトナーゼ；（3）3-ヒドロキシブチリル- CoA還元酵素（アルデヒド形成）；及び（4）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素。
【請求項６】
(i)前記2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼが、ortA（α）、ortB（β）、Amet_2368（α）、Amet_2369（β）、Teth514_1478（α）、Teth514_1479（β）、TTE1235（α）、及びthrC（β）からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(ii)前記AKP脱水素酵素が、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbd1、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh‐A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(iii)前記2-アミノ-4-ヒドロキシペンタノアートアミノトランスフェラーゼが、aspC、AAT2、ASP5、got2、avtA、lysN、AadAT‐II、dat、lat、ygjG、spuC、SkyPYD4、SkUGA1、UGA1、Abat、Gta‐1、gabT、及びpuuEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(iv)前記2-アミノ-4-ヒドロキシペンタノアート酸化還元酵素（脱アミノ化）が、gdhA、gdh、gdhA1、rocG、gdh1、gdh2、GDH、GDH2、ldh、及びnadXからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(v)前記2-オキソ-4-ヒドロキシペンタノアートデカルボキシラーゼが、pdc、pdc1、mdlC、dpgB、ilvB‐1、kgd、kdcA、lysA、panD、cadA、ldc、ldcC、AF323910.1：1…1299、odc1、VV2_1235、dmpH、dmpE、xylII、xylIII、Reut_B5691、Reut_B5692、CAD、pad1、pofK（pad）、padC、pad、adc、cbei_3835、CLL_A2135、及びRBAM_030030からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(vi)前記3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdh I、bdh II、adhA、4hbd、adhI、P84067、mmsb、dhat、及び3hidhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(vii)前記AKPアミノトランスフェラーゼが、aspC、AAT2、ASP5、got2、avtA、lysN、AadAT‐II、dat、lat、ygjG、spuC、SkyPYD4、SkUGA1、UGA1、Abat、Gta‐1、gabT、及びpuuEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(viii)前記AKP酸化還元酵素（脱アミノ化）が、gdhA、gdh、gdhA1、rocG、gdh1、gdh2、GDH、GDH2、ldh、及びnadXからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(ix)前記2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼが、pdc、pdc1、mdlC、dpgB、ilvB‐1、kgd、kdcA、lysA、panD、cadA、ldc、ldcC、AF323910.1：1…1299、odc1、VV2_1235、dmpH、 dmpE、 xylII、 xylIII、Reut_B5691、Reut_B5692、CAD、pad1、pofK（pad）、padC、pad、adc、cbei_3835、CLL_A2135、及びRBAM_030030からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(x)前記3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（ケトン還元）が、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbd1、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh‐A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xi)前記3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（アルデヒド還元）が、alrA、ADH2、yqhD、bdh I、bdh II、adhA、4hbd、adhI、P84067、mmsb、dhat、及び3hidhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xii)前記4-ヒドロキシ,2-ブタノン還元酵素が、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbd1、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh‐A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される１つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xiii)前記AKPデカルボキシラーゼが、pdc、pdc1、mdlC、dpgB、ilvB‐1、kgd、kdcA、lysA、panD、cadA、ldc、ldcC、AF323910.1：1…1299、odc1、VV2_1235、dmpH、dmpE、xylII、xylIII、Reut_B5691、Reut_B5692、CAD、pad1、pofK（pad）、padC、及びpadからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xiv)前記4-アミノブタン-2-オンアミノトランスフェラーゼが、aspC、AAT2、ASP5、got2、avtA、lysN、AadAT‐II、dat、lat、ygjG、spuC、SkyPYD4、SkUGA1、UGA1、Abat、Gta‐1、gabT、及びpuuEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xv)前記4-アミノブタン-2-オン酸化還元酵素（脱アミノ化）が、gdhA、gdh、gdhA1、rocG、gdh1、gdh2、GDH、GDH2、ldh、nadX、kdd、及びlysDHからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xvi)前記4-アミノブタン-2-オンアンモニア-リアーゼが、aspA及びansBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xvii)前記ブテノンヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、ech paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_1220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xviii)前記AKPアンモニア-リアーゼが、aspA及びansBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xix)前記アセチルアクリラートデカルボキシラーゼが、pdc、pdc1、mdlC、dpgB、ilvB‐1、kgd、kdcA、lysA、panD、cadA、ldc、ldcC、AF323910.1：1…1299、odc1、VV2_1235、dmpH、dmpE、xylII、xylIII、Reut_B5691、Reut_B5692、CAD、pad1、pofK（pad）、padC、pad、adc、cbei_3835、CLL_A2135、及びRBAM_030030からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xx)前記アセトアセチルCoA還元酵素（CoA依存性、アルデヒド形成）が、acr1、sucD、bphG、bld、adhE、Msed_0709、mcr、asd‐2、Saci_2370、Ald、及びeutEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xxi)前記アセトアセチルCoA還元酵素（CoA依存性、アルコール形成）が、adhE、adhE2、mcr、Rcas_2929、NAP1_02720、MGP2080_00535、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xxii)前記アセトアセチル-CoA還元酵素（ケトン還元）が、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbd1、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh‐A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xxiii)前記3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）が、acr1、sucD、bphG、bld、adhE、Msed_0709、mcr、asd‐2、Saci_2370、Ald、及びeutEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xxiv)前記3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）が、adhE、adhE2、mcr、Rcas_2929、NAP1_02720、MGP2080_00535、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
(xxv)前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、ech paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、Msed_1220、fadA、fadB、fadI、fadJ、及びfadRからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；又は
(xxvi)前記クロトナーゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、ech paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、Msed_1220、fadA、fadB、fadI、fadJ、及びfadRからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項７】
1,3-BDOを産生するための条件下及び十分な時間で、請求項１に記載の非天然微生物を培養することを含む、1,3-BDOを産生する方法。
【請求項８】
前記微生物が、1,3-BDO経路酵素を各々コードする2、3、4、又は5つの外来性核酸を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記1,3-BDO経路が、1セットの1,3-BDO経路酵素を含み、1,3-BDO経路酵素の該セットが、下記からなる群から選択される、請求項７記載の方法：
（a）（1）2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ；（2）AKP脱水素酵素；（3）2-アミノ-4-ヒドロキシペンタノアートアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（4）2-オキソ-4-ヒドロキシペンタノアートデカルボキシラーゼ；及び（5）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（b）（1）2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ；（2）AKPアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（3）2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼ；（4）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（ケトン還元）；及び（5）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（c）（1）2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ；（2）AKPアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（3）2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼ；（4）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（アルデヒド還元）；及び（5）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（d）（1）2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ；（2）AKPデカルボキシラーゼ；（3）4-アミノブタン-2-オンアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（4）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（ケトン還元）；及び（5）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（e）（1）2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ；（2）AKPデカルボキシラーゼ；（3）4-アミノブタン-2-オンアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（4）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（アルデヒド還元）；及び（5）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（f）（1）2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ；（2）AKPデカルボキシラーゼ；（3）4-アミノブタン-2-オンアンモニア-リアーゼ；（4）ブタノンヒドラターゼ；及び（5）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；及び
（g）（1）2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ；（2）AKPアンモニア-リアーゼ；（3）アセチルアクリラートデカルボキシラーゼ；（4）ブタノンヒドラターゼ；及び（5）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（h）（1）アセトアセチル-CoA還元酵素（CoA依存性、アルデヒド形成）；（2）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（ケトン還元）；及び（3）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（i）（1）アセチル-CoA還元酵素（CoA依存性、アルコール形成）及び（2）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（j）（1）アセトアセチル-CoA還元酵素（CoA依存性、アルデヒド形成）；（2）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（アルデヒド還元）；及び（3）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（k）（1）アセトアセチル-CoA還元酵素（ケトン還元）及び（2）3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）；
（l）（1）アセトアセチル-CoA還元酵素（ケトン還元）；（2）3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）；及び（3）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（m）（1）4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ；（2）クロトナーゼ；及び（3）3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）；並びに
（n）（1）4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ；（2）クロトナーゼ；（3）3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）；及び（4）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素。
【請求項１０】
前記非天然微生物が、実質的に嫌気性の培地中にある、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも1つの外来性核酸が、異種性核酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
1,3-BDOを、前記培養物中の他の成分から分離することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記分離することが、抽出、連続液体‐液体抽出、浸透気化法、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、又は限外濾過を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記分離が、蒸留を含む、請求項１２に記載の方法。