(57)【要約】静脈内フィブリン塊の制御できない形成の予防及び処置の組成物及び方法であって、静脈内に形成された病的な初期凝血塊を選択的に分解でき、先在する止血塊の望まない分解のリスクを最小化し、繊維素溶解剤または抗凝血剤を赤血球キャリヤに生体適合的に連結するものを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大きさが赤血球に類似のキャリアに生体適合的に結合する治療薬を含む、組成物。
【請求項２】
キャリアが赤血球である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
治療薬が抗血栓剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
被験者に先在する止血塊を容認しながら、請求項３の組成物を被験者に投与することを含む、被験者の初期血管内凝血を選択的に溶解する方法。
【請求項５】
請求項３の組成物および薬学的に許容できる賦形剤を含む、血栓予防薬。
【請求項６】
請求項５の血栓予防薬を被験者に投与することを含む、初期血管内凝血形成の予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
イントロダクション
本出願は、1998年5月21日に出願された米国仮出願番号第60/086,262号を優先権としてクレームし、1999年5月12日に出願されたＰＣＴ出願PCT/US99/10547号の一部継続出願である、米国特許第6,488,927号として現在発行された、1999年12月3日に出願された米国出願番号第09/454,666の分割出願であり、2002年9月23日に出願された米国出願番号第10/253,518号の一部継続出願である。
【０００２】
発明の背景
血管内凝血塊による血管の閉塞は、心筋梗塞、（脳）卒中、肺塞栓を含む種々の疾患状態の発病を引き起こし、および／または寄与し、従って重要な医学問題を意味する。プラスミノーゲン・アクチベータなどの繊維素溶解は、これらの疾患または状態の治療に最近使用されたが、それらの効果および安全性は、殊に深部静脈血栓症および肺塞栓などの特定の保護血栓状態下では、いまだ大きな懸念が存在する。
【０００３】
死亡に導く原因となる肺血栓性塞栓症は、深部静脈血栓症の最も頻繁におきる合併症である。統計は、肺塞栓の９５％より多くが、下肢の深部静脈系の血栓から生じることを示す。医薬品での進歩にも拘わらず、塞栓症および深部静脈血栓症の発生および／または認知は、増加しているように見える。この増加は、外傷患者のより高い生存に起因するものと考えられ、整形外科での関節置換術の増加、留置カテーテルの広範囲の使用、ならびに医学的および外科的な手続き、特に高年齢の患者に対する総体的な増加による。この結果として、深部静脈血栓症の予防および処置方法は、肺塞栓の発生の減少のために要求される。
【０００４】
深部静脈血栓症を進展する因子は、早くも１９世紀に明示され、うっ血、血管壁の異常および血液凝固系の変性を含む。深部静脈血栓症の最も高いリスク群は、全身麻酔を３０分以上要する外科患者、分娩後患者、左右心室不全の患者、下肢を含む骨折または損傷を有する患者、脚の慢性深部静脈機能不全を有する患者、長期のベッド休養にある患者、癌患者、肥満者およびエストロゲン使用者である。深部静脈血栓症の治療は、ヘパリンなどの抗凝血剤の使用を最も頻繁に含む。しかし、このよく知られた薬剤でさえ、安全性および有効性の両方が得られる抗凝血剤治療の最適投与計画についての合意が得られていない。抗凝血剤治療に加え、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼなどの血栓溶解剤は、急性深部静脈血栓症の管理に使用されている。
【０００５】
フィブリン血栓による急性血管閉塞はまた、一般的であり、手術の危険な合併症である。極めて重要な血管に塞栓を起こしうる、静脈（例えば、肺塞栓）および動脈（例えば、動脈再閉塞）血栓の進行は、手術中後の病的状態および死亡を増加する。心肺バイパス手術、経皮冠動脈血管形成術および頸動脈血管内膜切除術および他の介入は、小さな血栓の形成により悪化しえ、深刻かつ永続的な神経障害を引き起こす。
【０００６】
虚血が健康への唯一の強迫である環境と対照的に（例えば、急性心筋梗塞、ＡＭＩ）、外科的環境での血栓の管理は、抗血栓治療自体により与えられた外傷部位およびその周囲の出血の付加されたリスクにより、悪化する。また、単一血管を閉塞する成熟した凝血塊の溶解が、繊維素溶解介入（治療）の初期の目標であるＡＭＩと対照的に、手術後抗血栓管理の目標は、手術後の凝血塊による閉塞のリスクがある（予防）、多様的な血管領域での適当な血量を維持することである。外科的環境においては、理想的な血栓予防薬は、手術中および手術後すぐに形成した止血フィブリン塊を溶解しないで、手術後および回復期に進行した初期の病的な血栓を効果的に溶解する。
【０００７】
存在する薬剤の実在する欠点に加え（下記参照）、外科的環境での血栓予防剤の広範囲の使用は、追加の理由のために限定された熱意を支え続ける。出血の重要性は、外科的な診療でひどく明白であり、血栓予防で頻繁に非難されるものの、無言の血栓事象の臨床的な重要性は（肺および脳微小塞栓症）、発症時に症状の進行を遅延しえ、他の原因に起因すると考えられるので、低く評価される。
現在のアプローチは、保護の手法を提供するが、外科的環境において、すべて限定された利益／リスク比を有する。機械的なフィルターは、大きな凝血塊を捕らえるが、動脈再閉塞または脳微小塞栓の予防に使用することはできない。抗凝血剤（例えば、低分子量ヘパリン）は、血管床の血栓症の発生を減ずるが、投薬は、手術後の出血のリスクにより限定される。ヘパリンは、次々に外傷感染および裂開が生じる可能性を増しうる、外傷ヘマトマス（hematomas）の発生を増加することが報告されている。アスピリンおよび抗-GPIIb/IIIa剤は、血小板凝集を抑制するが、フィブリンモノマーの形成および凝血塊の増殖を防止できない。深刻な副作用に加えて（上記で部分的に議論）、個々の特別な抗凝血剤は、凝血塊の形成の特定の機構を抑制するが（例えば、血小板の活性化またはフィブリン形成）、抗血栓症保護の１００％の忠誠を提供するものではない。すでに形成された初期の病的な血栓を溶解するモダリティは、抗凝血剤にもかかわらずまたはその非適用性のために、ひどく必要とされる。  
【０００８】
プラスミノーゲン・アクチベータ（PA's）は、理論上はこれらの目的に使用されうる効果的な血栓溶解剤であるが、これらは、迅速な血中クリアランスおよび不活性化、細胞外マトリックスの非選択的劣化および止血フィブリンプラグを含む、血栓予防用途に根本的に不適切である。出血のリスクは、外科的環境でのそれらの使用を事実上妨げる。潜在する止血フィブリンプラグに作用することなく、存在する抗血栓剤戦略は、初期の凝血塊の選択的分解を許容しない。
ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、組織型プラスミノーゲン・アクチベータまたはｔＰＡ、およびウロキナーゼは、プラスミノーゲン・アクチベータとして知られる薬剤のファミリーの一員である。これらの化合物は、プラスミン、フィブリンを消化するプロテアーゼを活性化することにより、血管内凝血塊を溶解する作用をする。プラスミンの不活性なプレカーサーである、プラスミノーゲンは、単独ペプチド結合の開裂により、プラスミンに変換される。プラスミン自身は、フィブリン塊、並びにいくつかの凝固因子を含む、他の血漿タンパクを消化する、非特異性プロテアーゼである。
【０００９】
プラスミノーゲン・アクチベータによる繊維素溶解治療は、心筋梗塞および（脳）卒中の処置に有益であることが示された。しかし、深部静脈領域などの他の血管領域で形成されまたは留まる凝血塊を分解するこれらの薬剤の用途は、ボーラス投薬後、非常に急激に排泄および不活性化することにより限定される（Plow, E. et. al. 1995. FASEB J. 9: 939-945; Narita, M. et. al. 1995. J. Clin.Invest. 96: 1164-1168）。ｔＰＡおよびウロキナーゼの両者は、循環するプラスミノーゲン・アクチベータ抑制剤により急激な不活性化を受け、プラスミン自体は、循環する糖タンパク、α−２−抗プラスミンにより、不活性化される（Collen, D. 1996. Circulation 93: 857-865; Reilly, C. et. al. 1991. Arterioscl. Thromb. 11: 1276-1286）。ストレプトキナーゼは、この内部糖タンパク抑制剤に、より抵抗しうるので、α−２−抗プラスミンは、スタフィロキナーゼを不活性化する（Collen, B. et. al. 1993. Eur. J. Biochem. 216: 307-314）。プラスミノーゲン・アクチベータの治療投薬量は、プラスミノーゲン・アクチベータ抑制剤の潜在的抑制活性を圧倒し得るが、α−２−抗プラスミン、プラスミノーゲン・アクチベータの他の抑制剤はまた存在し（Ｃ１−抑制剤、α−２−マクログロブリン、抗トリプシン）、プラスミノーゲン・アクチベータによる処置に対する繊維素溶解応答が時間とともに減少するのに寄与する。プラスミノーゲン・アクチベータおよびプラスミンのそのような不活性化または劣化は、血栓溶解治療の有効性を減じ、従って、血管の再閉塞の防止に失敗する。
【００１０】
この問題を克服するために、長期間、静脈内にプラスミノーゲン・アクチベータを注入する試みでは、ほとんど成果がなかった；失敗は、出血、止血塊ならびに有害な結果を引き起こす初期の止血塊の分解、およびプラスミノーゲン・アクチベータの血管外沈殿後に起こる抑制できない組織タンパク質分解などの有害な副作用に起因すると考えられる。
従って、いくつかの異なるアプローチが、血液中のプラスミノーゲン・アクチベータの半減期の延長；抑制剤による不活性化からプラスミノーゲン・アクチベータを保護；ならびにフィブリンおよび血栓へのプラスミノーゲン・アクチベータの補足；を含む深部静脈血栓でのこれらの薬剤の効果を改良するために試みられた。例えば、化学修飾およびプラスミノーゲン・アクチベータのリポソームへの組み込みが、循環においてプラスミノーゲン・アクチベータの半減期を延長するために使用された（Kajihara, J. et. al. 1994. Biochim. Biophys. Acta 1199: 202-208; Heeremans, J. et. al. 1995. Thromb. Haemost. 73: 488-494）。しかし、これらの研究は、リポソーム封入プラスミノーゲン・アクチベータの活性が、立体的制限により強く損なわれることを示した。
【００１１】
改変された薬物速度論的特性、増量された抑制剤抵抗、およびより高い繊維素溶解力を有するｔＰＡ化合物がまた、 遺伝子操作により製造された（Collen. D. 1996. Circulation 93: 857-865; Collen. D. 1993. Lancet 342: 34-36; Krishnamurti, C. et. al. 1996. Blood 87: 14-19; Lijnen, R. and D. Collen. 1992. Ann. NY Acad. Sci. 667: 357-364 ）。いくつかの研究室では、 プラスミノーゲン・アクチベータとフィブリン認識抗体との結合を調査し、またはプラスミン産出を凝血塊に集中するために血小板を活性化した（Holvoet, P. et. al. 1993. Circulation 87: 1007-1016; Runge, M. et. al. 1996. Circulation 94: 1412-1422; Fears, R. and G. Poste. 1994. Fibrinolisis 8: 203-213）。しかし、凝血塊成分に親和性を有するそのように結合したプラスミノーゲン・アクチベータは、凝血塊の表面層のみに結合し、凝血塊内部に入り込まない（Sakharov, D. and D. Rijken. 1995. Circulation 92: 1883-1890）。加えて、形成した凝血塊の表面領域を限定するので、凝血塊は、注入された”フィブリン特異的”プラスミノーゲン・アクチベータの小画分にのみ結合する。そのような捕捉はまた、先在する望ましい止血塊と有害な結果をもたらす初期凝血塊を区別することを失敗する。
【００１２】
さらに、今日まで、修飾プラスミノーゲン・アクチベータのためのこれらの方法はいずれも、有害な副作用の増大に導きうる、組織内でのプラスミノーゲン・アクチベータの沈殿を防止しない；それらはすべて、血液タンパク質の分子を超えないサイズの分子または分子錯体を表す。そのような沈殿は、組織内でプラスミン活性をもたらす。活性化プラスミンは、細胞外マトリックスを減らし、従って、血管リモデル、血管浸透性の異常な向上および内皮下層の部分的な露出でさえ引き起こす（Plow et al. 1995. FASEB J. 9: 939-945; Shreiber et al. 1995. J. Cell. Physiol. 165: 107-118）。
【００１３】
従って、排出率の減少およびプラスミノーゲン・アクチベータの劣化のみならず、血管外組織でのプラスミノーゲン・アクチベータの沈澱を防止する、プラスミノーゲン・アクチベータの修飾方法のニーズがある。さらに、先在する止血塊の最小の効果を有しながら、その中から初期の凝血塊を選択的に捕捉する、組成物及び方法が、必要とされる。
赤血球（ＲＢＣｓ）は、通常１２０日の寿命を有し、従って薬剤および生体分子の天然キャリアを務めうる。自系のＲＢＣｓは、患者の血液から容易に得られ、薬物を載せて、再注入される。ＲＢＣｓは、ＲＢＣｓの内部体積中に載せた薬剤のキャリアとして使用された（Poznansky, M. and R. Juliano. 1984. Pharmacol. Rev. 36: 277-324; Kirch, M. et al. 1994. Biotechnol. App. Biochem. 19: 331-363; Kinoshita, K. and T. Tsong. 1978. Nature 272: 258-260）。加えて、架橋剤としてストレプトアビジン−ビオチンペアを使用する方法を含む、ＲＢＣｓへのタンパク質の結合方法が開発された。
【００１４】
ストレプトアビジンは、高い親和性の４つのビオチン結合部位を有する６０ｋＤａのタンパク質であり、ストレプトアビジン−ビオチンペアは、生体臨床医学において、架橋剤として広く使用される（Wilchek, M. and E. Bayer. 1988. Anal. Biochem. 171: 1-32）。いくつかのグループは、in-vivoでのガンマ−免疫シンチグラフィー用（Kalofonos, H. et al. 1990. J. Nucl. Med. 31: 1791-1796）、および薬剤捕捉用（Pardridge, W. et al. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 5592-5596; Muzykantov, V. et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5213-5218）のストレプトアビジン−ビオチン技術用途を報告した。さらにまた、ストレプトアビジンは、動物またはヒトで未知の有害な反応を誘発する（Kalofonos, H. et al. 1990. J. Nucl. Med. 31: 1791-1796）。ＲＢＣｓのビオチン化は、寿命およびin vivoでの動物の細胞の生体適合性に効果を有しない様式で、達成されうる（Suzuki, T. and G. Dale. 1987. Blood 70: 791-795; Muzykantov, V. et al. 1991. Blood 78: 2611-2618）。
【００１５】
プラスミノーゲン・アクチベータの機能的な活性の明白な減少のない、プラスミノーゲン・アクチベータを含む、タンパク質のビオチン化が、開示された（Muzykantov, V. et al. 1986. Biochem. Biophys. Acta, 884: 355-363; Muzykantov, V. et al. 1995. Anal. Biochem., 226: 279-287; Muzykantov, V. et al. 1996. J. Pham. Exp. Ther., 279: 1026-1034）。in vivo研究において、ストレプトアビジン結合のビオチン化ＲＢＣｓを有する抗体、酵素ペルオキシダーゼおよび繊維素溶解スチレプトキナーゼなどの、種々のビオチン化タンパク質の多価結合が成し遂げられ、in vivoでＳＡ／ｂ−ＲＢＣに結合するこれらのタンパク質の高い機能活性が、報告された（Muzykantov. V. et al. 1985. FEBS Lett. 182: 62-66; Muzykantov, V. et al. 1986. Biochim. Biophys. Acta 884: 355-363; Muzykantov, V. et al. 1987. Am. J. Pathol. 128: 226-234）。
【００１６】
しかし、ストレプトアビジン架橋剤を介する、ｂ−ＲＢＣｓへのビオチン化タンパク質の多価結合は、キャリアＲＢＣｓの生体適合性を大いに損なう。ｂ−ＲＢＣｓへのストレプトアビジン結合は、補体の古典的および代替的な経路の両方の同一源の限定の排除を導き、そのために、血しょう中でＳＡ／ｂ−ＲＢＣの溶解を引き起こす（Muzykantov, V. et al. 1991. Blood 78: 2611-2618; Muzykantov, V. et al. 1992. Int. J. Artif. Organs 15: 620-627; Muzykantov, V. et al. 1993. FEBS Lett. 318: 108-112）。ストレプトアビジン誘導架橋およびビオチン化ＲＢＣ膜での補体抑制剤、ＤＡＦおよびＣＤ５９の膜再分配は、補体活性化および溶解の適当なメカニズムを表す（Muzykantov, V. et al. 1992. Biochim. Biophys. Acta 1107: 119-125; Zaltzman. A. et al. 1995. Biochem. J. 305: 651-656）。加えて、Ｃ３ｂ補体成分の固着は、肝臓および脾臓吸収を介した血流からのＳＡ／ｂ−ＲＢＣの上昇した排除率をもたらすことを示した（Muzykantov, V. et al. 1992. Int. J. Artif. Organs 15: 620-627; Muzykantov, V. et al. 1996. Anal. Biochem. 214: 109-119）。従って、ストレプトアビジンを介したＲＢＣキャリアへの薬剤多価結合は、in vivoでそれらの標的に配送され得ない。
【００１７】
ＳＡ／ｂ−ＲＢＣキャリアの生体適合性の欠如は、結合方法の改変を通じて克服されうる。例えば、ストレプトアビジンのｂ−ＲＢＣｓへの一価の結合は、ＲＢＣ当たり、ビオチン化型タンパク質を１０５分子まで結合可能な血清安定化キャリアＳＡ／ｂ−ＲＢＣを、製造することが証明された（Muzykantov, V. et al. 1991. Biochem. J. 273: 393-397; Muzykantov, V. et al. 1992. Biochim. Biophys. Acta 1107: 119-125; Muzykantov, V. et al. 1993. Anal. Biochem. 208: 338-342; Muzykantov, V. and R. Taylor. 1994. Anal. Biochem. 223: 142-148; Muzykantov, V. et al. 1996. Anal. Biochem. 214: 109-119）。Ｂ−ＲＢＣキャリアである、ストレプトアビジンを介したビオチン化型タンパク質（ｂ−ＩｇＧ）との一価の結合は、動物での静脈内の注入後、溶解または肝臓吸収の証拠なしに、少なくとも１日安定な錯体として循環した（Muzykantov, V. et al. 1996. Anal. Biochem. 214: 109-119）。これらの研究において、ＳＡ／ｂ−ＲＢＣとのｂ−ＩｇＧ一価結合の半減期が、非結合のｂ−ＩｇＧの半減期を超えることもまた、見いだされた（Muzykantov, V. et al. 1996. Anal. Biochem. 214: 109-119）。
【００１８】
本明細書で示すように、ＳＡ／ｂ−ＲＢＣキャリアへのビオチン化プラスミノーゲン・アクチベータの一価結合が、血流中のプラスミノーゲン・アクチベータの長期の循環を起こし、組織中のプラスミノーゲン・アクチベータの沈澱を減じた。さらに、本明細書で示すように、ＳＡ／ｂ−ＲＢＣキャリアへのウロキナーゼ・プラスミノーゲン・アクチベータのビオチン化溶解受容体の一価結合、（ｂ−ｓｕＰＡｒ）およびビオチン化組織プラスミノーゲン・アクチベータの一価結合（ｔＰＡ）は、受容体／ＲＢＣ錯体（ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ錯体）およびｔＰＡ／ＲＢＣ錯体の形態で、それぞれ血流中のこれらのビオチン化プラスミノーゲン・アクチベータの長期の循環を起こす。さにまた、本明細書で示すように、ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ錯体は、血流中での長期の循環後でさえ単鎖ウロキナーゼ・プラスミノーゲン・アクチベータへの結合能力を保持し、この繊維素溶解プレカーサー（ｓｃｕＰＡ）のＲＢＣキャリア（例えば、ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ錯体へ）に結合する受容体への非共有結合は、ｓｃｕＰＡ活性および血清抑制剤への大きな抵抗性をもたらし、その結果、凝血塊自体の上昇した繊維素溶解活性を提供する。本明細書に示すように、ｔＰＡの肺血管吸収は、ビオチン化ＲＢＣへのｔＰＡ架橋によりｔＰＡ／ＲＢＣ錯体を形成することによって増加し、その増加は、より大きな血管でｔＰＡ／ＲＢＣ錯体のレベルを超えるレベルに見える。加えて、ｔＰＡおよびｓｕＰＡｒのヒトＣＲ１に対するモノクロナール抗体への結合は、赤血球への線溶活性抗血栓剤の特異的な結合を促進し、非特異的結合および錯体の組織吸収を制限することを本明細書で示す。
【００１９】
さらに、本明細書に示すように、ＲＢＣアルター（alters）などのキャリアへの抗血栓剤の結合は、先に形成された（止血）塊および血管外組織に比較的不浸透な抗血栓剤を提供する繊維素溶解プロフィールであり、これにより、その循環および初期の血管内凝血塊内部に組み込まれる可能性を延長し、その中からのそれらの迅速な溶解を提供しながら、出血のリスクを減少する。
従って、本発明は、存在する凝血塊中への浸透を抑制する大きさ、たとえば赤血球などのキャリアに生体適合的に連結する、抗血栓剤などの治療薬を含む組成物、および先在する（止血）塊の溶解を避けながら、初期血管内凝血塊の選択的分解にこれらの組成物を使用する方法に関する。
【００２０】
発明の概要
本発明の目的は、治療薬、好ましくは抗血栓剤、より好ましくは繊維素溶解剤であって、大きさが赤血球と同程度のキャリアの表面に生体適合的に連結し、長期間循環し、初期血管内凝血塊を選択的に分解するものを含む、組成物を提供することである。好ましい態様として、キャリアは赤血球を含む。連結は、ストレプトアビジンによる赤血球などのビオチン化キャリアに、ビオチン化治療剤を架橋することにより、好ましく達成される。あるいは、治療剤は、モノクロナール抗体などの特異的な赤血球表面タンパク質に高い親和性を有する分子に結合し、その後投与により、赤血球に特異的に結合する。赤血球キャリアに特異的なモノクロナール抗体の例は、ヒトＣＲ１に対するモノクロナール抗体である。
本発明の他の目的は、患者に先在する（止血）塊の溶解を避けながら、初期血管内凝血塊の制御できない形成を予防および処置する方法を提供することであり、初期血管内凝血塊の制御できない形成に苦しむ患者に、大きさが赤血球と同程度またはより大きいキャリアに生体適合的に連結する抗血栓剤などの治療剤を含む組成物を、投与することを含む。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、深部静脈血栓、肺塞栓および血管内フィブリン塊の制御できない形成により特徴づけられる他の疾病または症候群を、予防および処置する組成物および方法を提供する。本発明は、治療剤、好ましくは抗血栓剤、より好ましくはプラスミノーゲン・アクチベータの、赤血球(RBC)と同程度の大きさのキャリアへの生体適合的な連結に基づく。好ましいキャリアは、ＲＢＣである。ＲＢＣキャリアまたはＲＢＣｓと大きさが同程度のキャリア（３〜５ミクロン）は、長期の循環、限定された組織吸収および薬剤の凝血塊中への最小の浸透を与える。プラスミノーゲン・アクチベータのストレプロアビジンによるビオチン化ＲＢＣｓへの一価結合は（ここでＳＡ／ｂ−ＲＢＣとみなす）、本発明の生体適合的な連結方法の例として提供される。ビオチン化プラスミノーゲン・アクチベータは、ここでｂ−ＰＡｓとみなす。生体適合的な連結の他の例は、モノクロナール抗体などのビオチン化分子へのプラスミノーゲン・アクチベータの架橋であり、その後、全血中の赤血球などのキャリアと特異的に連結する。この連結方法で有益な抗体の例は、ヒトＣＲ１に対するモノクロナール抗体である。
【００２２】
実験は、ストレプトアビジンによるビオチン化ＲＢＣｓへのｂ−ＰＡｓの結合を調査するために行われた。in vitro試験の結果は、ストレプトアビジンが、ビオチン化ＲＢＣへのｂ−ＰＡｓの特異的かつ効果的な結合を提供することを示した。
【表１】
2007521294.tif 000002
【００２３】
フィブリン平板溶解試験およびフィブリン塊（125I-フィブリノーゲンから形成）からの放射性標識ヨウ素の放出試験を行ったとき、ｂ−ＰＡ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ結合は、安定性および高い繊維素溶解活性の表示を示した。ｂ−ＰＡ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ結合が、フィブリン塊が形成される前に、125I-フィブリノーゲン溶液に加えられたとき、その後の繊維素溶解は、７１±１２％に達した。非結合ｂ−ＰＡは、フィブロン塊の９６±５．５％溶解を誘発した。従って、ＳＡ／ｂ−ＲＢＣへのｂ−ＰＡの結合は、ＰＡの著しい繊維素溶解活性を危うくしない。
ＲＢＣ−結合プラスミノーゲン・アクチベータの半減期（すなわち、血液からの劣化及び排出率）はまた、in vivoのラットで試験された。125I-ｓｃｕＰＡ、125I-ウロキナーゼ、125I-ストレプトキナーゼ、または125I-ｔＰＡの血中クリアランス動態は、５μｇ／ｋｇ用量でのｓｃｕＰＡまたはｔＰＡの静脈内注入の後に決定された。注入後１時間以内に、ｓｃｕＰＡの血液レベルは、注入用量の５％未満に低下した。対照的に、ＳＡ／ｂ−ＲＢＣに結合したｓｃｕＰＡの血液レベルは、１時間の時点で１０倍高く、２４時間まで依然として高いレベル（注入用量の２０％）であった。同様の結果が、ｔＰＡ、ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼでも見られた。静脈内注入後の２４時間のＲＢＣｓへのこれらの生体適合的な連結に対し、プラスミノーゲン・アクチベータ血液レベルの曲線下面積の薬物動態解析は、ＲＢＣ−結合ＰＡｓの半減期が、非結合ＰＡｓを桁違いに超えることが明らかになった。
【００２４】
さらに、ＳＡ／ｂ−ＲＢＣキャリアとのビオチン化プラスミノーゲン・アクチベータの結合は、５１Ｃｒで標識されたキャリアＲＢＣの血管内溶解を引き起こさず、脾臓を除く組織において、ＲＢＣの生体内分布を変化しなかった。ｂ−ＰＡ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣの脾臓吸収は、約４倍に上昇した。しかし、化学的に修飾されたＲＢＣｓの脾臓吸収のこの様な増加は、文献でよく知られている。重要なことには、ｂ−ＰＡ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ結合の注入後、プラスミノーゲン・アクチベータの組織吸収は、目に見えて減少した。例えば、脳組織内の125I-ｔＰＡレベル（血液中のパーセントで表す）は、１８．３±１．１％であるのに対し、125I−ｂ−ｔＰＡ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣのそのパラメータは、１．８±０．５％であった。従って、ＲＢＣキャリアとの結合は、脳での吸収を１０倍の減少をもたらす。
【００２５】
ｔＰＡの場合、組織分布データは、ＲＢＣへのｔＰＡの結合が、循環においてその生体学利用能を延長するだけでなく、その肺血管吸収をも劇的に増加することを明らかにした。注入後１時間、標識されたｔＰＡの２０％は、125I−ｔＰＡ／ＲＢＣを注入されたラットの肺で見いだされ、溶解できる125I−ｔＰＡの注入後に見られた値の１００倍高い値であった。その上、ｔＰＡ／５１Ｃｒ−ＲＢＣの肺吸収は、非修飾ＲＢＣよりもわずかに高い（１．２％に対し３．８％）。従って、ｔＰＡ／ＲＢＣを注入されたラットの肺は、放射性標識ＲＢＣよりも放射性標識ｔＰＡを５倍も多く含むのに対し、放射性標識ＲＢＣと放射性標識ｔＰＡの比は、血液を含む全ての他の組織で１に等しかった。これは、肺、肺血管系へのｔＰＡの重要な移動があったことを示し、他の器官では見られなかった（器官特異的効果）。キャリアＲＢＣからのｔＰＡのこの移動は、迅速に起こり、数位時間続いた。加えて、125I−ｔＰＡ／ＲＢＣの肺／血液比は、放射性標識ｔＰＡのものより２０倍高いのに対し、腎臓、脳、および心臓での、これらの器官／血液比は１０倍低く、データは、ＲＢＣへのｔＰＡの連結が、肺を除く器官による吸収を、強く制限することを示した。
【００２６】
実験はまた、血液中の不活性化プラスミノーゲン・アクチベータを活性化する戦略を決定するために行われた。ウロキナーゼ受容体（ｓｕＰＡｒ）の溶解できる形態は、ｓｃｕＰＡ への結合、不活性ｓcｕＰＡの活性ｕＰＡへの変換、ならびに血しょう抑制剤による抑制からの保護が報告された（Higazi, A. et al. 1995. J. Biol. Chem. 270: 17375-17380; Higazi, A. et al. 1996. Blood 87: 3545-3549）。しかし、血液中のｓｕＰＡｒの半減期は、静脈内注入後数分の範囲と短い。従って、ビオチン化ｓｕＰＡｒは、ＳＡ／ビオチン化ＲＢＣｓに連結し、in vivoでｓｕＰＡｒの半減期を延長した。この連結は、ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ分子あたり、ｓｕＰＡｒを１．３×１０５分子まで有するｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣとして指定された錯体を生じた。ビオチン化ＲＢＣｓへのストレプトアビジンの結合なしに、ＲＢＣへのｓｕＰＡｒの結合は、より低い規模であった（ｓｕＰＡｒが１．２×１０４分子／ＲＢＣ）。
【００２７】
ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣの単一鎖ウロキナーゼ・プラスミノーゲン・アクチベータへ（ｓｃｕＰＡ）の結合能力は、ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣまたは損なわれていないＲＢＣｓと、125I−標識ｓｃｕＰＡを培養することにより試験した（ｓｃｕＰＡの非特異的結合をコントロールとして使用した）。ＲＢＣあたり、０．０６＋０．１×１０４の125I−標識ｓｃｕＰＡが結合する間に、ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣあたり、１．５＋０．１×１０４の125I−標識ｓｃｕＰＡ分子が結合したことが、見いだされた。従って、ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ錯体が効果的および特異的にｓｕＰＡに結合する。
ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ錯体（ｓｃｕＰＡ／ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ）に関連するｓｃｕＰＡの繊維素溶解活性は、その後試験した。125I−フィブリンおよびリン酸緩衝生理食塩水（凝結塊コントロール）、ＲＢＣキャリア単独、ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ錯体、ｓｃｕＰＡ／ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ錯体、またはｓｃｕＰＡ単独のいずれかを含むフィブリン塊を製造した。凝結塊コントロールでは、３７℃で１２０分の培養後、放射性標識の５％未満が上清に放出された。ＲＢＣキャリア単独でもｂ−ｓｃｕＰＡ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ錯体（ＳＡ／ｂ−ＲＢＣに直接結合するｂ−ｓｃｕＰＡ）でも、検出できる繊維素溶解は起こらなかった。しかし、同程度の用量のｓｃｕＰＡ／ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ錯体は、９５±４％の繊維素溶解を引き起こした。これらの結果は、ＳＡ／ｂ−ＲＢＣに結合するｂ−ｓｕＰＡｒへのｓｃｕＰＡの結合は、ｓｃｕＰＡの繊維素溶解活性を確かに促進し、ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ錯体は繊維素溶解剤として活性であることを示す。
【００２８】
ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ錯体のin vivoでの末路を決定するために、ラットに125I−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／５１Ｃｒ−ｂ−ＲＢＣを静脈内に注入し、錯体の血液レベルおよび生体分布を調査した。キャリアＲＢＣへのｓｕＰＡｒの結合は、血流中のｓｕＰＡｒの半減期をかなり増加した。ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ錯体の２０％が、注入後２４時間まで測定できるものの、非結合ｓｕＰＡｒの血液レベルは３時間以内に検出できなくなった。
生体分布研究は、ｓｕＰＡｒ結合が、溶血反応またはキャリアＲＢＣの網膜内吸収を導かないことを示した。事実、ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／５１Ｃｒ−ｂ−ＲＢＣ結合分布は、５１Ｃｒ−ＲＢＣコントロールのそれと類似する。ラットへのｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／５１Ｃｒ−ｂ−ＲＢＣ注入後１時間、125I−ｓｃｕＰＡの血球への結合を決定するために、血液サンプルを採取した。ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ錯体を注入したラットから採取した血液は、コントロール動物から採取した血液よりも、３倍多くｓｃｕＰＡに結合した。これらのデータは、ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣが循環中に機能的に活性であり、ｓｃｕＰＡに結合可能であることを示す。結合の定量により、血流中１時間循環後、各ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ錯体が、約１０４分子のｓｃｕＰＡに結合することが明らかになった。この値は、ラットに注入する前のｓｃｕＰＡのｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ＲＢＣ結合の初期レベルに類似する。従って、血流中の循環は、この錯体の結合能力を変えなかった。
【００２９】
架橋したプラスミノーゲン・アクチベータの繊維素溶解活性を、ラットin vivoで実験した。ラットに、非結合ｔＰＡ２５０μｇ、またはキャリアＲＢＣに結合したｔＰＡ５０μｇのいずれかを静脈内に注入し、１０、６０および１８０分後、血液を採取した。125I−フィブリノーゲンを、すべてのサンプルに添加し、血液を室温で凝固させた。本発明の安全性に関して重要な考察として、ｔＰＡでもｔＰＡ／ＲＢＣでも、試験濃度で凝血塊の形成をくい止めることはできなかった。凝血塊を３７℃でその後培養し、凝血塊の溶解率を試験した。生理食塩水を注入したラットでは、自発的な繊維素溶解は、１０分または６０分のいずれかで１０％を超えなかった。繊維素溶解は、非結合ｔＰＡ注入後１０分増大した。しかし、血液からのｔＰＡの急速な排除の観点から予期されるように、ｔＰＡ注入後６０分で採取した血液の繊維素溶解率は、コントロール動物のそれをほんのわずか上回るものにすぎなかった。際だつことに、たとえｔＰＡ注入用量が５倍低くても、ｔＰＡ／ＲＢＣ注入後３時間でさえ、採取した血液は、著しい繊維素溶解活性を保持した（４０％凝血塊溶解）。これらのデータは、キャリアＲＢＣへのｔＰＡ結合が、in vivoで酵素的に活性なプラスミノーゲン・アクチベータの循環を著しく増加し、ＲＢＣ結合により課されるかもしれない立体的な制限のいずれをも克服するレベルで血中のプラスミノーゲン・アクチベータのin vivoの半減期を延長した。
【００３０】
実験は、マウスＲＢＣｓでも行われた。これらの実験において、ｔＰＡを、エネルギー減少および機械損傷を最小にする、グルコースおよび３％ウシ血清アルブミン含有Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液中の、洗浄したネズミＲＢＣに結合させる。ラットＲＢＣｓで記載した方法を用いて、ビオチン化マウスＲＢＣあたり、３〜４×１０４分子のビオチン化ｔＰＡまたはｓｕＰＡｒを、表２に示すように検出できる溶血反応なしに連結させた。これらの試験では、マウスＲＢＣは、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒグルコース（ｐＨ７．４）中の１０μMＢｘＮＨＳでビオチン化した。放射性標識アクチベーターを、ＢＳＡ含有Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒグルコース中で、ストレプトアビジンによりｂ−ＲＢＣに連結させた。従って、マウスＲＢＣを、ヒトおよびラットＲＢＣｓと同様にして結合させた。
【００３１】
【表２】
2007521294.tif 000003
研究は、その後キャリアＲＢＣの組織、特に血管組織へのｔＰＡ移動を試験するために行われた。肺血管系移動のモデルとして、臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、培養液中で使用した。ＲＢＣキャリアを、本発明の方法で構築した。ＲＢＣｓは、タンパク質無し（天然ＲＢＣ）、ｔＰＡ（ｔＰＡ/ＲＢＣ）、ｓｕＰＡｒ（ｓｕＰＡｒ/ＲＢＣ）、ｓｕＰＡｒ分子に結合したｓｃｕＰＡ（ｓｃｕＰＡ−ｓｕＰＡｒ/ＲＢＣ）、ｓｃｕＰＡ（ｓｃｕＰＡ/ＲＢＣ）、または抗−ＴＭ/ＲＢＣのいずれかで行った。タンパク質分子を運ぶＲＢＣは（３×１０４分子／ＲＢＣ）を、ＨＵＶＥＣで培養した（ウェルあたり２×１０７ＲＢＣ、３７℃で１６０分）。非結合細胞を、フェノールフリー培地で優しく洗浄することにより除去し、１ｍｌの水を結合したＲＢＣを溶解するために加えた。ＨＵＶＥＣ−結合ＲＢＣの数を、細胞溶解物中に放出されたヘモグロビンにより放射された４０５ｎｍでの吸収を測定することにより測定し、１０００ＲＢＣ／ウェルとして表した。結果を表３に示した。
【００３２】
【表３】
2007521294.tif 000004
天然ＲＢＣに相当するレベルの結合により証明されるように、ｔＰＡ/ＲＢＣ、ｓｕＰＡｒ/ＲＢＣ、ｓｃｕＰＡ−ｓｕＰＡｒ/ＲＢＣのいずれにおいても、ＨＵＶＥＣに対し付着しなかった。対照的に、ｓｃｕＰＡ/ＲＢＣ錯体または糖タンパク内皮表面、トロンボモジュリンに対する抗体に結合するＲＢＣ（陽性コントロールとして用いた）は、高い付着力であった。従って、赤血球キャリアに生体適合的に連結するウロキナーゼ受容体の、溶解可能な形態を含む錯体は、内皮細胞とウロキナーゼの潜在的に有害な相互作用を最小化する。
【００３３】
次に、125I−ｔＰＡ/ＲＢＣをＨＵＶＥＣで培養し、非結合ＲＢＣを洗浄により除去し、ウェル中の125Iを測定した。ＨＵＶＥＣは、125I−ｔＰＡ/ＲＢＣで培養後、ウェルあたり８．１＋０．２×１０４のｔＰＡ分子と結合した。表３に示した結果は、125I−ｔＰＡに結合する細胞量の５％のみが、ウェル中のＲＢＣ−関連ｔＰＡ  に起因することを示した（３×１０４分子の125I−ｔＰＡ／ＲＢＣ×１．７×１０３のＲＢＣ／ウェル＝５．１×１０８分子のＲＢＣ／125I−ｔＰＡ／ウェル）。従って、ｔＰＡは、ＲＢＣからＨＵＶＥＣへ移動し、本発明のＲＢＣキャリアの成功した使用を証明する。
従って、本発明は、ヒトを含む動物の血流中で、血流中の治療剤の劣化および排出を低下するプラスミノーゲン・アクチベータおよび抗凝結剤などの抗血栓剤を含む治療剤の、半減期を延長するための新規な組成物を提供する。
本発明はまた、抗血栓剤などの治療剤により患者の血液中の凝血塊を選択的な分解を増加する方法を提供し、該方法は、患者に、治療剤、好ましくは抗血栓剤、より好ましくは赤血球キャリアまたは  大きさが赤血球と同程度のキャリアに、生体適合的に連結したプラスミノーゲン・アクチベータを含む組成物を投与することを含む。
【００３４】
さらに、本明細書で説明するように、大きさが赤血球と同程度のキャリア、即ち、約３〜５ミクロンのキャリアへの、繊維素溶解剤または抗凝血剤などの抗血栓剤の連結はまた、先在する止血塊の面倒な分解のリスクを最小化しながら、外科的介入後形成される病的な初期凝血塊を、選択的に分解する組成物をもたらす。フィブリン塊は、機械的な収縮力、前血栓症部分の結合および因子ＸＩＩＩトランスグルタミナーゼによる架橋を含む、迅速な成熟過程を経験し、その多孔性をほとんど明らかに制限する。従って、株化外科的止血塊および外傷部の血管外止血フィブリンは、初期血管内止血塊よりもずっと少なく血液成分へ浸透し得る。
【００３５】
外科的な止血が成し遂げられると、初期凝血塊への封入は認められるが、先在する凝血塊へのその浸透が制限される様に、プラスミノーゲン・アクチベータが運ばれ得る場合、手術後の出血リスクは低減する。この目標を達成する１つの手法は、赤血球（ＲＢＣ）などの、例えば、３〜５ミクロンの大きさのキャリアに、プラスミノーゲン・アクチベータを連結することである。ＲＢＣへの連結は、生理的な凝血塊へのＰＡの物理的な浸透を制限し、その寿命を延長する。ＰＡ搬送のメカニズムは、一度外科的な止血が確保されると、予防的な投与が許容しうる。
これらの実験において、抗血栓剤組織プラスミノーゲン・アクチベータ（ｔＰＡ）は、架橋剤としてストレプトアビジン（ＳＡ）ビオチンを用いて、ＲＢＣｓに連結した。ビオチン化ラット、マウス、ヒトＲＢＣｓ（ｂＲＢＣ）に連結しうるビオチン化ｔＰＡの量（ｂｔＰＡ）は、１０５分子／ＲＢＣから、非ビオチン化ｔＰＡの２００分子未満の範囲である。多価ストレプトアビジンを用いたｂＲＢＣへの付着は、タンパク質ＤＡＦおよびＣＤ５９を制御する補体を不活性化し、自系血清中で、ｂＲＢＣ／ＳＡの溶血反応を導く。しかし、１００μｍ以下レベルのビオチンエステル中でビオチン化されたＲＢＣ（ｘが１００以下である、ｂｘＲＢＣ活性）は、補体を活性化せず、新鮮な同一源血清中で安定である。
【００３６】
ＲＢＣあたり６．５〜７．５×１０５のｔＰＡ分子を有するｂ１０ＲＢＣ／ＳＡ／ｂｔＰＡ錯体の活性を、Murcianoらにより開示されたように（Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol 2002 282: L529-539）、125I−標識フィブリノゲンにトロンビンを添加することにより形成された、フィブリン塊中で試験した。ＲＢＣ／ｔＰＡを注入した凝血塊は、上清中に125ヨウ素を放出しながら分解された。同様の結果は、同一源のＲＢＣｓに連結するｔＰＡを用いた、ラット、マウスおよびヒト血しょうから形成された凝血塊でも観察された。新鮮血清中３７℃で２４時間の培養期間中、補体によるＲＢＣ／ｔＰＡの溶血反応は、コントロールＲＢＣｓに匹敵し、ｔＰＡの小画分のみがＲＢＣｓから分離した。フリーｔＰＣおよびＲＢＣ／ｔＰＡによる、先在する凝血塊対初期フィブリン塊の分解は、in vtroで最初に比較された。フリーｔＰＡは、初期凝血塊の９０％溶解に対し、先在するものの５０％分解を引き起こした（１．９倍の相違）。対照的に、ＲＢＣなどの、例えば３〜５ミクロンの大きさのキャリアに連結したｔＰＡは、初期凝血塊の８０％分解に対し、先在する塊の５％未満の分解を引き起こした（１７倍の相違）。従って、ＲＢＣなどの、例えば３〜５ミクロンの大きさのキャリアに連結した抗血栓剤を含む、本発明の組成物は、抗血栓剤単独より、初期凝血塊に対して１０倍以上大きな選択性を示す。
【００３７】
本発明の組成物の繊維素溶解効果は、静脈血栓のマウスモデルにおいても試験された。最初に、実験は、ＲＢＣ輸送がマウスにおいて、ｔＰＡ循環の延長を確認するために行われた。これらの実験において、注入後６０分でも注入されたＲＢＣ／125I−ｔＰＡの５０〜６０％が血流中に止まるものの、フリー125I−ｔＰＡは、２０分以内に血流中から消失した。次に、ラットにおいて、ｔＰＡの静脈内ボーラス後の血液中の繊維素溶解活性の存続期間が、ＲＢＣ輸送により延長されることが、見いだされ確認された。フリーｔＰＡ注入後２分で採取した血液から形成された凝血塊の繊維素溶解は、促進されたが、この増進は、注入後２０分以内に消失した。対照的に、ＲＢＣ／ｔＰＡ注入後６０分で採取した血液から形成された凝血塊は、ほとんど完全に分解した。従って、ラットのように、フリーｔＰＡではないが、活性ＲＢＣ／ｔＰＡは、注入後、マウスで長期間循環する。
【００３８】
直径が３〜５ミクロンの放射性標識フィブリン微小塞栓（125I−ＭＥ）の注入により誘発される、肺塞栓症モデルは、in vivoの血管内凝血塊の繊維素溶解を試験するために使用された。125I−ＭＥ静脈内注入後すぐに、マウスおよびラットの肺に留まる血液細胞に凝集体を注入した（Murciano et al. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2002 282: L529-539; Bdeir et al. Blood 200 96: 1820-26）。125I−ＭＥ注入後１時間の、肺の放射能の測定が、肺塞栓の血管内繊維素溶解の定量的な測定を提供する（Murciano et al. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2002 282: L529-539）。
125I−ＭＥ後１０分での、フリーｔＰＡ注入は、ほとんど完全に凝血塊を分解する。対照的に、塞栓より５分前にｔＰＡを注入したときでさえ、繊維素溶解の２０％未満は、血流からの迅速なクリアランスへの一致が見られた。対照的に125I−ＭＥ２０分前に注入されたＲＢＣ／ｔＰＡが８０％の繊維素溶解を引き起こすものの、125I−ＭＥ後、注入されたＲＢＣ／ｔＰＡは、肺塞栓の繊維素溶解を控えめに（４０％未満）引き起こした。従って、初期凝血塊対先在する凝結塊の繊維素溶解率は、フリーｔＰＡおよびＲＢＣ／ｔＰＡに対し、それぞれ０．２および２．２であった。
【００３９】
大きな、生死に関わる閉塞塊は、表面／質量比がより小さいため、微小塞栓より、浸透しにくく影響を受けにくい（Murciano et al. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2002 282: L529-539）。従って、大きな血管での閉塞清血栓を効果的に分解するための、ＲＢＣ／ｔＰＡ血栓予防活性を、頸動脈損傷のＦｅＣｌ３モデルを用いて試験した。これらの実験において、血栓形成及び繊維素溶解を、ドップラー超音波により監視した。外膜へのＦｅＣｌ３溶液の適用後すぐに、頸動脈の血流量は実質的に検知できず、血管は、実験の全体で閉塞されたままであった（６０分）。血栓形成前のフリーｔＰＡの注入は、凝血塊の溶解を引き起こさず、再かん流を促進しなかった。血栓形成後１０分でのフリーｔＰＡまたはＲＢＣ／ｔＰＡの注入のいずれもなかった。しかし、血栓１０分前でのＲＢＣ／ｔＰＡの注入は、凝血塊形成率には影響しないけれども、１０〜２０分以内に凝血塊を分解し始め、２０〜３０分でベースラインの約８０％に到達する血流量に快復した。このモデルでの、初期凝血塊対先在する凝血塊の繊維素溶解率は、フリーｔＰＡおよびＲＢＣ／ｔＰＡに対し、それぞれ０．２および３．３であった。
【００４０】
従って、これらの実験は、本発明の組成物の血栓予防に対する有益性を説明する。本明細書で示すように、治療剤、特に、ＲＢＣなどの、例えば３〜５ミクロンの大きさのキャリアへのプラスミノーゲン・アクチベータなどの抗血栓剤の錯化は、その寿命を著しく延長し、初期凝血塊の形成後すぐ、分解を可能としながら、血管からの抗血栓剤の拡散および先在する凝血塊の繊維素溶解を最小化し、これにより、繊維素溶解剤などの抗血栓剤を血栓予防薬に変換する。特に、ＲＢＣ／ｔＰＡは、おそらくフィブリンへのｔＰＡの拡散を制限することにより、in vitroで初期凝血塊の先在する凝血塊に対する溶解において、１７倍の増進を示した。ＲＢＣによる生体適合的な輸送はまた、血栓後ではなく、前に混入した場合、ｔＰＡ循環を延長し、肺塞栓および閉塞した動脈塞栓を分解する能力のある錯体を提供することにより、血液中でのその繊維素溶解活性の存続期間を著しく延長する。ＲＢＣ／ｔＰＡは、肺塞栓の先在する凝血塊に対しフリーｔＰＡよりも初期凝血塊を１０倍選択的に溶解し、動脈塞栓に先在する凝血塊に対し初期凝血塊を、２０倍選択的に溶解した。さらにまた、ＲＢＣ／ｔＰＡの予防的注入は、血栓前または後に注入されたフリーｔＰＡにより、分解への抵抗力を示すにもかかわらず、頸動脈での閉塞的な血栓の形成後すぐに分解した。従って、ＲＢＣまたは大きさがＲＢＣと同程度もしくは大きいキャリアに、ｔＰＡなどの抗血栓剤等の治療剤を錯化することにより、治療剤を潜在的な血栓予防剤に変換する。
【００４１】
抗血栓剤および赤血球などの生体適合キャリアを含む組成物の製造は、既知の結合方法に従って行い、ビオチン、ストレプトアビジン、およびモノクロナール抗体を介して一価架橋により実証される。しかし、この開示で当業者に明白であるように、生体適合連結の他の例、即ち、溶解により実証されるキャリアの貧弱な生体適合性をもたらさない、化学結合、結合した受容体を介した非共有結合、または付着の他の手法、および増加した食作用もまた、使用されうる。
自系注入は、待機手術では標準的な実務である。他の薬剤のＲＢＣ輸送を探索するヒトにおける研究からの結果は、自己提供（auto-donated）ＲＢＣへの抗血栓剤（例えば、ｔＰＡなどの繊維素溶解剤）などの治療剤の結合および手術後の錯体再注入は、技術的に可能であることを示す。活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介するＲＢＣへの連結などの代替的な生体結合技術は、生体適合性を誘発し、非自系ＲＢＣへの免疫反応を最小化しうる。ＰＥＧを介するＲＢＣsへの治療剤の連結は、穏当な品質保持期限を有する普遍的ドナーＲＢＣ／ｔＰＡを生成することにより、提案する戦略の適用可能性を広げうる。さらに、血流で、ＲＢＣｓに治療剤を直接連結することができる。ヒトＲＢＣは、免疫錯体に結合し、ＲＢＣ自身のオプソニン作用なしに、それらをマクロファージに移動する、補体受容体Ｉ（ＣＲＩ）を所有する。動物に注入されたＣＲＩモノクロナール抗体および抗ＣＲＩ免疫抱合体は、ＲＢＣに結合し、細胞損傷を引き起こすことなしに、長期間循環する。従って、抗ＣＲＩ／抗血栓剤結合はまた、ＲＢＣ抽出、修飾または注入の必要性なしに、予防に使用される。
【００４２】
この開示により当業者に理解されるように、ＲＢＣｓに選択的な他の抗体は、同様に、抗ＣＲＩと類似な様式で用いられ得る。本発明の組成物はまた、脳内の繊維素溶解で安全であることが予測される。フリーｔＰＡは、虚血性脳梗塞で再かん流を改善するが、出血性脳卒中で脳内の二次的損傷を引き起こす。脳血管での止血塊の予期しない分解に加え、脳内へのプラスミノーゲン・アクチベータなどの抗血栓剤の拡散は、脳水腫およびマトリックスリモデリングを悪化させ、神経への直接的な細胞毒性を引き起こす。ＲＢＣ／ｔＰＡなどの本発明の組成物は、血管区画中でより長く保持されるため、より安全であると信じられる。
好ましい態様において、本発明の組成物は、深部静脈血栓症を含む制御できない血管内フィブリン塊形成により特徴づけられる、疾患または状態の患者に、静脈内投与のための薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む。そのような薬学的に許容できる賦形剤は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、臨床実務で静脈内注入に容認される他の液状無菌賦形剤を含む。
【００４３】
本出願により当業者に理解されるように、これらの実験で使用される抗血栓剤のモデル、ｔＰＡは、その治療プロフィールが、ＲＢＣ輸送などの例えば、３〜５ミクロンの大きさのキャリアと錯化することにより、誘発または好ましく変わる、多数の治療剤のちょうど１つを表す。そのような治療剤の例は、抗炎症剤、タンパク質Ｃなどの抗凝血剤、血流中の毒素を不活性化する酵素を含むが、これらに限定されない。本発明の組成物は、好ましくは、薬剤の単一薬用量のボーラス静脈内注入として、全身的に投与される（例えば、プラスミノーゲン・アクチベータを０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇ）。予防的に使用される場合、本発明の組成物は、好ましくは、動脈血栓に大きな影響を加える特異な外科手術環境において、安全かつ血栓予防に効果的であるように投与される。
【００４４】
例えば、血管形成後数時間、初期の止血塊形成が比較的成熟するとき、患者は、予め形成されたＲＢＣ／ｔＰＡ錯体、または循環するＲＢＣに結合する、ｓｃｕＰＡ−ｓｕＰＡｒ／抗ＣＲＩ結合の注入が行われる。循環中でのＲＢＣ結合錯体の寿命は、ＲＢＣに対するｔＰＡまたはｓｃｕＰＡ分子の数により、数時間から数週間の間で変化しうる。錯体は、組織または成熟したフィブリン塊にほとんど、または全くアクセスせず、プラスミノーゲンによる医学的な鎮圧のために、不活性な形態で血流中を循環する。しかし、初期フィブリン塊が血管内で形成され始める場合には、完全な錯体として合体し、地理的に強制された領域で繊維素溶解をもたらす。
以下の制限されない例は、本発明のさらなる説明のために提供される。
【００４５】
例
例１：ビオチン化、タンパク質の放射性標識、プラスミノーゲン・アクチベータ結合の製造、ＲＢＣへのタンパク質の結合および繊維素溶解活性の評価
ビオチンエステル、６−ビオチニルアミノカプロン酸  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢｘＮＨＳ）を、１０ｍＭまたは１ｍＭの最終濃度になるよう１００％ジメチルホルムアミドに溶解した。組織型プラスミノーゲン・アクチベータ（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼおよび可溶なウロキナーゼ・プラスミノーゲン・アクチベータ受容体（ｓｕＰＡｒ）を、ＢｘＮＨＳの１０倍モル過剰量でビオチン化した。新鮮な１ｍＭのＢｘＮＨＳの８μｌを、１００μｌのタンパク質溶液に添加する（１ｍｇ／ｍｌホウ酸緩衝生理食塩水、ＢＢＳ、ｐＨ８．１）。氷上で１時間培養後、過剰な非反応ＢｘＮＨＳを、一晩透析により排除した。ビオチン化タンパク質を、製造者（Pierce）の忠告に従い、ヨードゲン（iodogen）−被覆管を用いて、125ヨウ素で放射性標識した。１００μｇのビオチン化タンパク質および１００μＣｉの125ヨウ化ナトリウムを、２０分間１００μｇのヨードゲンで被覆した管中、氷上で培養し、ｎｇあたり約５００ｃｐｍの特異的放射活性を有するストレプトアビジンを得た。過剰のヨウ素を透析により排除した。放射性標識タンパク質の９５％より多くは、ＴＣＡにより沈澱可能であった。
【００４６】
新鮮なヘパリン化血液２ｍｌを、その後５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清（即ち、血しょう）を排除した。沈殿物をその後再懸濁し、標準遠心分離（１ｍｌの沈殿物あたり１０ｍｌのＰＢＳ、１５００ｒｐｍ、５分、４回）によりＰＢＳで洗浄し、洗浄したＲＢＣの１００％懸濁物を作る。ＰＢＳ（０．９ｍｌ）を、その後０．１ｍｌのＲＢＣ沈殿物に加えた（即ち、洗浄したＲＢＣの１０％懸濁液を作る）。１００μｌの３００ｍＭホウ酸（ｐＨ９．０）を、１．０ｍｌの１０％ＲＢＣに加えた。ＤＭＦＡ中のＢｘＮＨＳをその後この懸濁液に加え、反応混合物中での最終ＢｘＮＨＳ濃度が１０μＭに等しいものおよびｂ１０−ＲＢＣを得た。最初に、０．１ＭのＢｘＮＨＳ／ＤＭＦＡ原液１μｌを、９９μｌのＤＭＦＡに加えた。その後、この新鮮な１ｍＭのＢｘＮＨＳ／ＤＭＦＡの１０μｌを、１ｍｌの１０％ＲＢＣに加え、十分に混合した。２０度で、３０分間定期的に穏やかな振動を加えながら培養後、過剰な非反応ＢｘＮＨＳを、２ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で標準的な遠心分離により、反応混合物から除去した。ＢＳＡ−ＰＢＳ中の１０％ビオチン化ＲＢＣ懸濁液を、製造した。
【００４７】
ＲＢＣへのストレプトアビジンの付着のために、２０μｌのＳＡ原液（ＰＢＣ中１ｍｇ／ｍｌ）を、１００μｌのｂ−ＲＢＣ１０％懸濁液に添加し、十分に混合した。これは、５×１０６ｂ−ＲＢＣあたり１μｇのＳＡの添加を与える（ｂ−ＲＢＣあたり約２×１０６分子）。２０度で、３０分間定期的に穏やかな振動を加えながら培養後、ＢＳＡ−ＰＢＳ中の非結合ＳＡを、標準的な遠心分離により除去した。
ＳＡ／ｂ−ＲＢＣへのビオチン化プラスミノーゲン・アクチベータまたはｓｕＰＡｒの付着のために、５μｌのｂ−ＰＡまたはｂ−ｓｕＰＡｒＳ原液（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）を、１００μｌのＳＡ／ｂ−ＲＢＣ１０％懸濁液に添加し、十分に混合した。これは、２×１０７ＳＡ／ｂ−ＲＢＣあたり１μｇのｂ−ＰＡまたはｂ−ｓｕＰＡｒの添加を与える（ＳＡ／ｂ−ＲＢＣあたり約３．５×１０５分子）。ｂ−ＰＡまたはｂ−ｓｕＰＡｒを、その後、ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ１０％懸濁液で、１時間培養した（定期的に穏やかな振動、２０℃）。ＢＳＡ−ＰＢＳ中の非結合タンパク質を、標準的な遠心分離により除去した。ＳＡ／ｂ−ＲＢＣへのｂ−ＰＡまたはｂ−ｓｕＰＡｒ結合を定量するために、放射性標識ｂ−ＰＡまたはｂ−ｓｕＰＡｒを、トレーサーとして使用した。
タンパク質を、ヨードゲン（Pierce, Rockford, IL）を用いて125Ｉ−Ｎａ（Perkin Elmer, Boston, MA）で放射性標識し、ＲＢＣをMuzykantovらが記載するように（Anal. Biochem. 1996 241: 109-119）、５１Ｃｒで放射性標識した。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／３％ウシ血清アルブミン中、５１Ｃｒ／１２５Ｉ−ｔＰＡ懸濁液は、４℃で少なくとも４日間安定だった。補体による溶血反応を試験するために、コントロールＲＢＣ、ｂＲＢＣ／ＳＡまたはｂＲＢＣ／ＳＡ／ｂｔＰＡを、新鮮な血清中、３７℃で１時間培養し、遠心分離し（５分、１２００ｇ）、および放出されたヘモグロビンを、分光光度法により４０５ｎｍで決定した。
【００４８】
例２：in vivoでのプラスミノーゲン・アクチベータの投与
ラットにおいて放射性標識された調整物の生体内分布を研究するために、放射性標識ＰＡもしくはｓｕＰＡｒ、またはキャリアＲＢＣに連結したこれらのタンパク質を１μｇ含有する０．５ｍｌ生理食塩水の注入を、麻酔下で尾静脈に行った。in vivo投与後のＲＢＣ−連結プラスミノーゲン・アクチベータをトレースするために、２０〜５０μｌの125Ｉ−ｂ−ＰＡ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ１０％懸濁液を、麻酔下ラットの尾静脈を介して注入した。注入後の表示時間において（５分〜２４時間）、麻酔下ラットを、瀉血により犠牲にした。血液と内部器官を採取した。器官は、血液がなくなるまで緩衝液で洗浄し、重さを量った。血液および内部器官アリコート（aliquot）での125Ｉの放射活性を、その後、ガンマカウンターを使用して決定した。血しょうを、その後、血液の遠心分離により血液から分離し、血しょうの放射活性を測定した。結果を、組織、血液または血しょうのグラムあたりのｃｐｍとして、平均±標準誤差（Ｍ±ＳＥ）として計算した。統計上の比較は、一元配置等分散分析（one-way analysis of eqaul variance）（ANOVA）を用いて、ｐ＜０．０５の統計上の優位性のレベルで、Student-Newman-Keuls法に従って行った。
【００４９】
例３：in vitroでの凝血塊溶解
フィブリン塊を、ＣａＣｌ２および125Ｉ−フィブリノゲンでトレース標識したトロンビン（２０ｍＭおよび０．２ユニット／ｍｌ最終濃度）を−フィブリノゲン（３ｍｇ／ｍＬ）に添加することにより形成した。先在する凝血塊の溶解を模擬するために、凝血塊を、個々の繊維素溶解剤、または生理食塩水（コントロール）で、２０分間２０℃でオーバーレイした。初期凝血塊を溶解するために、繊維素溶解剤を、ＣａＣｌ２およびトロンビンを加える前に、125Ｉ−フィブリノゲンに直接加えた。繊維素溶解を始めるために、凝血塊を３７℃で放置し、上清の放射活性をガンマカウンターで測定した（Perkin Elmer, Boston, MA）。
例４：in vivoでのＲＢＣ、ｔＰＡおよびＲＢＣ／ｔＰＡ循環
５１Ｃｒ−ＲＢＣ、125Ｉ−ｔＰＡまたは５１Ｃｒ−ＲＢＣ／125Ｉ−ｔＰＡを、麻酔下ラットまたはマウスの尾静脈に注入した。選択された時間に、１００〜２００μｌの血液をヘパリン中へ動物から採取し、１２００ｇで遠心分離し、血しょう上清およびＲＢＣ沈殿物中の放射活性を測定した。動物を、注入後１〜３時間で犠牲にし、器官中の放射活性をガンマカウンターで分析した。
【００５０】
例５：ｔＰＡまたはＲＢＣ／ｔＰＡ注入後採取した血液から形成した凝血塊の分解
コントロールＲＢＣ、フリーｔＰＡ、ＲＢＣ／ｔＰＡまたは生理食塩水（コントロール）を、ラットまたはマウスの静脈内に注入した。表示した時間に、１００〜２００μｌの血液アルコートを、抗凝血剤の不存在下で抜き出し、125Ｉ−フィブリノゲンのトレース量と迅速に混合し、ホウケイ酸塩管中で、２０℃で凝血塊に配分した。２０分成熟後、凝血塊を、生理食塩水でオーバーレイし、３７℃で培養し、125ヨウ素の放出を測定した。
例６：ｔＰＡまたはＲＢＣ／ｔＰＡによる肺塞栓の分解
125Ｉ−フィブリン微小塞栓（125Ｉ−ＭＥ）懸濁液を、記載されるように製造し（Murciano, J. C. et al. 2002. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 282: L529-539およびBdeir, K. et al. 2000. Blood 96: 1820-1826）、麻酔下マウスに注入した。125Ｉ−ＭＥ注入後、ＲＢＣ５０％懸濁液、ＲＢＣを含有する３５０μｌサンプルを、生理食塩水またはｔＰＡ（０．５ｍｇ／Ｋｇ）またはＲＢＣ／ｔＰＡと混合した。動物を、125Ｉ−ＭＥ注入後１時間で犠牲とし、肺を分離し、生理食塩水で洗浄し、残余の放射活性をガンマカウンターで測定した。
【００５１】
例７：ＲＢＣ／ｔＰＡによる頸動脈血栓の分解
我々は、記載された急性頸動脈血栓のマウスモデルを使用した（Ferrehi, P. M. et al., 1998. Circulation 97: 1002-1008）。血管の閉塞を、記録系に連結した０．５ＶＢの流量プローブを用いて、Doppler超音波により決定した（Transonic, Ithaca, NY）。完全な閉塞は、ＦｅＣｌ３による血管損傷８〜１０分以内で発生し、コントロール動物の血管は、実験が６０分で終結するまで閉塞し続けた。ＦｅＣｌ３適用前または完全な閉塞後１０分のいずれかにおいて、ＰＢＳ、ＲＢＣ、ｔＰＡ０．７ｍｇ／Ｋｇ単独もしくはＲＢＣとの混合、またはＲＢＣ／ｔＰＡ（０．５ｍｇ／ＫｇｔＰＡ含有）溶液の３５０μｌを、反対側の頸静脈を通して注入した。
【国際調査報告】
2007521294.tif 000005