(57)【要約】  本発明は、ａ）食用油をアシル受容体基質及び脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素と混合するステップを含む、食用油からジグリセリドを低減及び／又は除去する方法であって、前記脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素が、食用油中でジグリセリドからグリセリンにアシル基を転移させることができる酵素として特徴づけられる、方法に関する。前記ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘは以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１個又は複数である）を含むことが好ましい。また、本発明は、食用油の製造において前記食用油からジグリセリドを低減及び／又は除去（好ましくは選択的に低減及び／又は除去）するための、食用油中でジグリセリドからグリセリンにアシル基を転移させることができる酵素として特徴づけられる脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素の使用及び食用油を含む食料品の製造において前記食料品の結晶化特性を改善するための前記酵素の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）食用油をアシル受容体基質及び脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素と混合するステップを含む、食用油からジグリセリドを低減及び／又は除去する方法であって、前記脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素が食用油中でジグリセリドからグリセリンにアシル基を転移させる酵素として特徴づけられる方法。
【請求項２】
脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素がアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘは以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、Ｓから選択される１つ又は複数のアミノ酸残基である）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
食用油中のジグリセリド量が低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素がアシル基をジグリセリドからアシル受容体に転移させ、前記アシル受容体がヒドロキシ基（−ＯＨ）を含む任意の化合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ジグリセリドが１，２−ジグリセリドである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
アシル受容体が、食用油に可溶であるアシル受容体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
アシル受容体がアルコールである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アシル受容体がアルコールである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アシル受容体がグリセリンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素が、Ｈ−３０９を含む、又は配列番号２若しくは配列番号３２で示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂肪分解酵素のアミノ酸配列中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素が以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトミセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダから選択される１つ又は複数の属の生物から得られる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素が以下のアミノ酸配列、すなわち、（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、（ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列、（iii）配列番号４で示されるアミノ酸配列、（iv）配列番号５で示されるアミノ酸配列、（ｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列、（vi）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、（vii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、（viii）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、（ix）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、（ｘ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、（xi）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、（xii）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、（xiii）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、（xiv）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、（xv）配列番号５５で示されるアミノ酸配列、（xvi）配列番号５８で示されるアミノ酸配列、（xvii）配列番号６０で示されるアミノ酸配列、（xviii）配列番号６１で示されるアミノ酸配列、（xix）配列番号６３で示されるアミノ酸配列、（xx）配列番号６５で示されるアミノ酸配列、（xxi）配列番号６７で示されるアミノ酸配列、（xxii）配列番号７０で示されるアミノ酸配列、（xxiii）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号５５、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７又は配列番号７０で示される配列のいずれか１つと７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列から選択される１つ又は複数の配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素が、以下のヌクレオチド配列、すなわち、
（ａ）配列番号７で示されるヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号８で示されるヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号９で示されるヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１０で示されるヌクレオチド配列、
（ｅ）配列番号１１で示されるヌクレオチド配列、
（ｆ）配列番号１３で示されるヌクレオチド配列、
（ｇ）配列番号２１で示されるヌクレオチド配列、
（ｈ）配列番号２３で示されるヌクレオチド配列、
（ｉ）配列番号２５で示されるヌクレオチド配列、
（ｊ）配列番号２７で示されるヌクレオチド配列、
（ｋ）配列番号２９で示されるヌクレオチド配列、
（ｌ）配列番号３１で示されるヌクレオチド配列、
（ｍ）配列番号３３で示されるヌクレオチド配列、
（ｎ）配列番号３５で示されるヌクレオチド配列、
（ｏ）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列、
（ｐ）配列番号５９で示されるヌクレオチド配列、
（ｑ）配列番号６２で示されるヌクレオチド配列、
（ｒ）配列番号６４で示されるヌクレオチド配列、
（ｓ）配列番号６６で示されるヌクレオチド配列、
（ｔ）配列番号６８で示されるヌクレオチド配列、
（ｕ）配列番号６９で示されるヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号５４、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８又は配列番号６９で示される配列のいずれか１つと７５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列
から選択される１つ又は複数の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
処理した食用油を１つ又は複数の食品成分と混合して食料品を製造するステップを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
食用油の製造において前記食用油からジグリセリドを低減及び／又は除去（好ましくは選択的に低減及び／又は除去）するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させる酵素として特徴づけられる脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素の使用。
【請求項１６】
食用油を含む食料品の製造において前記食料品の結晶化特性を改善するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させる酵素として特徴づけられる脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素の使用。
【請求項１７】
脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素がアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘは以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、Ｓから選択される１つ又は複数のアミノ酸残基である）を含む、請求項１５又は１６に記載の使用。
【請求項１８】
食用油中のジグリセリド量が低減される、請求項１５、１６又は１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素がアシル基をジグリセリドからアシル受容体に転移させ、前記アシル受容体がヒドロキシ基（−ＯＨ）を含む任意の化合物である、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
ジグリセリドが１，２−ジグリセリドである、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
アシル受容体が、食用油に可溶であるアシル受容体である、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
アシル受容体がアルコールである、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
アシル受容体がアルコールである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
アシル受容体がグリセリンである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素が、Ｈ−３０９を含む、或いは配列番号２又は配列番号３２で示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂肪分解酵素のアミノ酸配列中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む、請求項１５から２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素が以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトミセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダから選択される１つ又は複数の属の生物から得られる、請求項１５から２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素が以下のアミノ酸配列、すなわち、（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、（ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列、（iii）配列番号４で示されるアミノ酸配列、（iv）配列番号５で示されるアミノ酸配列、（ｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列、（vi）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、（vii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、（viii）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、（ix）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、（ｘ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、（xi）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、（xii）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、（xiii）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、（xiv）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、（xv）配列番号５５で示されるアミノ酸配列、（xvi）配列番号５８で示されるアミノ酸配列、（xvii）配列番号６０で示されるアミノ酸配列、（xviii）配列番号６１で示されるアミノ酸配列、（xix）配列番号６３で示されるアミノ酸配列、（xx）配列番号６５で示されるアミノ酸配列、（xxi）配列番号６７で示されるアミノ酸配列、（xxii）配列番号７０で示されるアミノ酸配列、（xxiii）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号５５、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７又は配列番号７０で示される配列のいずれか１つと７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列から選択される１つ又は複数の配列を含む、請求項１５から２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素が、以下のヌクレオチド配列、すなわち、
（ａ）配列番号７で示されるヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号８で示されるヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号９で示されるヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１０で示されるヌクレオチド配列、
（ｅ）配列番号１１で示されるヌクレオチド配列、
（ｆ）配列番号１３で示されるヌクレオチド配列、
（ｇ）配列番号２１で示されるヌクレオチド配列、
（ｈ）配列番号２３で示されるヌクレオチド配列、
（ｉ）配列番号２５で示されるヌクレオチド配列、
（ｊ）配列番号２７で示されるヌクレオチド配列、
（ｋ）配列番号２９で示されるヌクレオチド配列、
（ｌ）配列番号３１で示されるヌクレオチド配列、
（ｍ）配列番号３３で示されるヌクレオチド配列、
（ｎ）配列番号３５で示されるヌクレオチド配列、
（ｏ）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列、
（ｐ）配列番号５９で示されるヌクレオチド配列、
（ｑ）配列番号６２で示されるヌクレオチド配列、
（ｒ）配列番号６４で示されるヌクレオチド配列、
（ｓ）配列番号６６で示されるヌクレオチド配列、
（ｔ）配列番号６８で示されるヌクレオチド配列
（ｕ）配列番号６９で示されるヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号５４、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８又は配列番号６９で示される配列のいずれか１つと７５％以上同一であるヌクレオチド配列
から選択される１つ又は複数の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１５から２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素が結晶化阻害剤と併用される、請求項１５から２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
添付の明細書本文及び図に関して実質的に上述された方法。
【請求項３１】
添付の明細書本文及び図に関して実質的に上述された使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食用油からジグリセリド（好ましくは１，２−ジアシルグリセリド）を酵素によって除去及び／又は低減する新規方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の関連出願を参照されたい。１９９９年７月２０日に出願された米国出願第０９／７５０，９９０号、米国出願第１０／４０９，３９１号、２００３年７月２３日に出願された米国出願第６０／４８９，４４１号、２００３年１月１７日に出願された英国出願第０３０１１１７．８号、２００３年１月１７日に出願された英国出願第０３０１１１８．６号、２００３年１月１７日に出願された英国出願第０３０１１１９．４号、２００３年１月１７日に出願された英国出願第０３０１１２０．２号、２００３年１月１７日に出願された英国出願第０３０１１２１．０号、２００３年１月１７日に出願された英国出願第０３０１１２２．８号、２００３年１２月２４日に出願された英国出願第０３３００１６．７号及び２００４年１月１５日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００６５５号。本文中又はこれらの出願手続き中のこれら各出願、これらの各出願において引用された各文書（「出願引用文書」）及び出願引用文書において参照又は引用された各文書、並びにかかる手続き中に提出された特許性を支持するすべての意見書を参照により本明細書に援用する。本文においてはさまざまな文書も引用される（「本願引用文書」）。本願引用文書の各々及び本願引用文書中で引用又は参照された各文書を参照により本明細書に援用する。
【０００３】
油脂は、ＴＡＧ（triacylglycerol）、ＤＡＧ（diacylglycerol）、遊離脂肪酸及び他の微量成分の複雑な混合物からなる。これらの混合物の結晶化は、ＴＡＧの諸特性（構造、鎖長、不飽和と比較された飽和など）及びこれらのＴＡＧの相互作用に左右される。ＤＡＧの存在に関して、以前の研究から、ＤＡＧは油及び脂肪の物性に対して重要な効果を有することが判明した。ＤＡＧは、結晶化速度、多型変化、融点、結晶サイズ及び晶癖とは異なる（Siew, 2001）。
【０００４】
脂肪種子から抽出されるほとんどの油では、ＤＡＧは少量しか存在しないのでＤＡＧの効果はさほど顕著ではない。しかし、主として、ＤＡＧを天然に多量に含む油であるパーム油及びオリーブ油においては、これらの油の品質は、ＤＡＧが存在する場合には損なわれる。
【０００５】
ギネアアブラヤシ（Elaeis guineensis）から得られるパーム油は、商用的に重要な食用油である。パーム油は、高生産性、低価格、高い熱及び酸化安定性、室温での塑性などいくつかの有利な特性のために、食品産業にとって卓越した脂肪及び油源である。また、他の植物油と比較して、パーム油は、豊富な酸化防止剤ビタミンＥ源である。
【０００６】
精製パーム油の典型的な化学組成は、約９３％トリグリセリド、６％ジグリセリド及び１％ＭＡＧ（monoglyceride）である（Okiy, 1977）。
【０００７】
パーム油が結晶化するときには、これらの成分の複雑な３次元ネットワークが形成される。理論的には、ネットワーク中の構成成分（ＴＡＧ、ＤＡＧ及びＭＡＧ）が多様であるほど、ネットワークはより複雑となり結晶化はより緩慢に起こるとされている（Jacobsberg & Ho, 1976）。この理論は、Drozdowski (1994)によって確認された。また、彼の研究によれば、トリアシルグリセロール分子における脂肪酸組成の変化が多いほど、異なる結晶相間の転移はより困難になる。
【０００８】
上述したように、パーム油中の高含量のジグリセリドは、その結晶化特性に影響を及ぼす（Okiy et al., 1978, Okiy, 1978）。
【０００９】
かかる油におけるジグリセリドの存在は有害である。特に、食用油（特にパーム油）中のジグリセリドは、低品質の油をもたらし得る。
【００１０】
パーム油並びに他の食用油及び脂肪中のジグリセリド含量に関する問題は、多数の研究の主題となっており、過剰なジグリセリドの問題を克服しようとするさまざまな解決策を文献中に見出すことができる。
【００１１】
日本の酵素製造者Amanoは、そのホームページ（Amano Enzyme Inc., 2004）上で、脂肪及び油中のジグリセリドを除去する酵素プロセスを推奨している。このプロセスは、ジグリセリドを遊離脂肪酸とグリセリンに分解することができる酵素LIPASE G「AMANO」50の使用に基づく。この酵素は、ＤＡＧ（diglyceride）及び／又はＭＡＧ（monoglyceride）加水分解性である。生成された遊離脂肪酸は、減圧蒸留又は分別結晶化によって除去される。
【００１２】
ＥＰ  ０  ５５８  １１２は、トリグリセリド乳濁液調製物中の残留ジグリセリドの酵素加水分解プロセスを記載している。このプロセスは、Amano, Japan（同上）社製Lipase Gを用いたジグリセリドの加水分解に基づく。このプロセスは、乳濁液中の酵素反応をジグリセリドから脂肪酸とグリセリンへの分解用にすることによって促進された。水相は反応後に分離され、酵素は一部再使用される。
【００１３】
ＪＰ  ６２０６１５９０は、触媒作用量の水の存在下で部分的グリセリド特異的酵素（例えば、リパーゼ）を用いて、また、脂肪酸、脂肪酸エステル又は他のグリセリド油若しくは脂肪の存在下で１，３−特異的酵素であるリパーゼによって、油又は脂肪を処理することによって製造される、少量のジグリセリドを含むハードバターを教示する。生成物は、カカオバター代替品として使用するのに特に適切なハードバターである。すなわち、リパーゼＧ及びリゾープスデレマー（Rhizopus deremer）リパーゼ（１，３−特異的酵素）をけい藻土と混合し、顆粒化した。この顆粒をパーム中間融点画分（５．７％ジグリセリド、酸価０．２５）及び水（部分グリセリド特異的酵素に対して１０％）と混合した。この混合物は室温で１時間撹拌され、酵素及び水が除去されて１．２％ジグリセリド（酸価１０．５）を含むハードバターが得られた。
【００１４】
したがって、従来技術は、パーム油及び他の食用油中のジグリセリド内容物を酵素反応によって低減又は除去する方法を教示している。これらのプロセスは、遊離脂肪酸及びグリセリン形成中に特異的ジグリセリド加水分解リパーゼを用いたジグリセリドの加水分解に依拠する。次いで、遊離脂肪酸は、減圧蒸留又は分画のようなさまざまなプロセスによって除去することができる。
【００１５】
特異的ジグリセリド加水分解酵素を用いることの欠点は、遊離脂肪酸の不都合な形成である。これらの遊離脂肪酸は、パーム油から除去しなければならない。したがって、遊離脂肪酸の形成は、生成物の損失とみなされることが多い。
【００１６】
遊離脂肪酸形成に起因する遊離脂肪酸の除去及び生成物の損失に付随するこれらの問題を克服するために、本発明者らは、パーム油及び他の植物油中の高ジグリセリド含量に付随するこれらの問題を克服する新しい方法を見出した。
【００１７】
酵素によるパーム油からのジグリセリドの除去は、典型的には１，３特異的トリアシルグリセロール加水分解酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）であるリパーゼの使用によって教示されてきた（例えば、ＪＰ  ６２０６１５９０又はＥＰ  ０  ６５２  ２８９参照）。国際公開第００／０５３９６号は、とりわけ、グリセリンと低水分環境においてグリセロール分解を起こすリパーゼとを含むことができる食材の処理を教示する。
【００１８】
しかし、１，３特異的トリアシルグリセロール加水分解酵素（リパーゼ）とＤＡＧ／ＭＡＧ加水分解酵素のどちらも油中の遊離脂肪酸が大きく増加し、モノグリセリドの加水分解も生じる。
【００１９】
しかし、例えば、一部の植物油においては、一部の適用例に対して、モノグリセリドは乳化剤機能をもたらすので、油のモノグリセリド含量を増加させることが望ましい場合がある。したがって、一態様においては、モノグリセリド含量を減少させずにジグリセリド含量を減少させることが好ましい。別の態様においては、ジグリセリドとモノグリセリド含量の両方を減少させることが好ましい場合がある。
【００２０】
リパーゼ酵素は、食用油中に存在するバルク脂質であるＴＡＧ（triacylglycerol）の加水分解のためにＤＡＧの有害な増加を招くこともある。
【００２１】
国際公開第２０００／３６１１４号、ＵＳ２００３／００２８９２３及びＵＳ２００３／００７４６９５においては、ＤＧＡＴ（diacylglycerol acyltransferase）酵素をコードする配列又はそのアンチセンス配列を有する核酸を用いた植物の形質転換が教示される。これらの文献に教示されるＤＧＡＴ酵素は、ＤＡＧ（diacylglycerol）がアシルＣｏＡのアシル基と結合してＴＡＧ（triglyceride）を形成する「ケネディ経路（Kennedy pathway）」において最終ステップを触媒する。したがって、これらの文献は、改変ＴＡＧ組成物及び／又は内容物を用いたトランスジェニック植物の生産を教示している。これらの文献に教示されるＤＧＡＴ酵素は、本発明による脂質アシル基転移酵素及び／又はジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素ではない。
【００２２】
特に、ＤＧＡＴは、機能するためにアシルＣｏＡ又は脂肪酸ＣｏＡが存在する必要がある。アシルＣｏＡは、法外に高価であるので、食用油の処理に商用的に使用するのには適さない。しかし、これらの酵素はアシルＣｏＡなしでは働かない。また、脂肪酸ＣｏＡに依拠する酵素反応は、工業的に制御することが極めて困難である。
【００２３】
また、これらの文献のすべてが、植物におけるＤＧＡＴ酵素の発現を抑制すること、したがって植物中のＴＡＧの量を減少させることが望ましい場合が多いことを教示している。これは、食用油中のＤＡＧ（diglyceride）を減少させつつＴＡＧの保存及び／又は産生を最終的に必要とする本発明とは極めて対照的である。
【００２４】
国際公開第０３／１０００４４号は、リン脂質（レシチン）からとりわけＤＡＧ（diacylglycerol）へのアシル転移によってＴＡＧ（triglyceride）の形成を触媒するＰＤＡＴ（phospholipids:diacylglycerol acyltransferase）を教示している。ＰＤＡＴは、アシル供与体としてリン脂質を必要とする。これは、アシル供与体がＤＡＧである本発明とは極めて対照的である。この文献は、本発明による脂質アシル基転移酵素を用いた食用油からのＤＡＧの除去を教示していない。
【特許文献１】米国出願第０９／７５０，９９０号
【特許文献２】米国出願第１０／４０９，３９１号
【特許文献３】米国出願第６０／４８９，４４１号
【特許文献４】英国出願第０３０１１１７．８号
【特許文献５】英国出願第０３０１１１８．６号
【特許文献６】英国出願第０３０１１１９．４号
【特許文献７】英国出願第０３０１１２０．２号
【特許文献８】英国出願第０３０１１２１．０号
【特許文献９】英国出願第０３０１１２２．８号
【特許文献１０】英国出願第０３３００１６．７号
【特許文献１１】国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００６５５号
【特許文献１２】ＥＰ  ０  ５５８  １１２
【特許文献１３】ＪＰ  ６２０６１５９０
【特許文献１４】ＥＰ  ０  ６５２  ２８９
【特許文献１５】国際公開第００／０５３９６号
【特許文献１６】国際公開第２０００／３６１１４号
【特許文献１７】ＵＳ２００３／００２８９２３
【特許文献１８】ＵＳ２００３／００７４６９５
【特許文献１９】国際公開第０３／１０００４４号
【非特許文献１】Siew, 2001
【非特許文献２】Okiy, 1977
【非特許文献３】Jacobsberg & Ho, 1976
【非特許文献４】Drozdowski (1994)
【非特許文献５】Okiy et al., 1978
【非特許文献６】Okiy, 1978
【非特許文献７】Amano Enzyme Inc., 2004
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本明細書に規定される脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素、具体的には脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素を使用すると、ジグリセリド（好ましくは１，２−ジグリセリド）が食用油から選択的に低減及び／又は除去されることが見出された。
【００２６】
本明細書では「選択的」という用語は、食用油環境において酵素がＤＡＧ（diglyceride）、好ましくは１，２−ジグリセリドをＴＡＧ（triacylglyceride）又はＭＡＧ（monoglyceride）に優先的な基質として利用することを意味する。したがって、油中のトリグリセリド量を変えずに（又は実質的に変えずに）ジグリセリドを食用油から除去及び／又は低減することができる。油中のモノグリセリド量は不変（又は実質的に不変）のままか、又は増加することがある。一部の適用例においては、油中のモノグリセリド量は減少することがある。
【００２７】
本発明の一態様においては、ａ）食料品又はその一部をアシル受容体基質及び脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素と混合するステップを含む、食料品からジグリセリドを低減及び／又は除去する方法であって、前記脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素が食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させることができる酵素として特徴づけられる方法が提供される。
【００２８】
本発明のさらに別の態様においては、ａ）食用油をアシル受容体基質及び脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素と混合するステップを含む食用油からジグリセリドを低減及び／又は除去する方法であって、前記脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素が食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させることができる酵素として特徴づけられる方法が提供される。
【００２９】
適切には、本発明による方法は、さらに、処理した食用油又はその一部を１つ又は複数の食品成分に添加して、例えばマーガリン、スプレッドなどの食料品を製造するステップを含むことができる。
【００３０】
本発明は、さらに、食料品の製造において前記食料品からジグリセリドを低減及び／又は除去（好ましくは選択的に低減及び／又は除去）するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させることができる酵素として特徴づけられる脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素の使用を提供する。
【００３１】
さらに別の態様においては、本発明は、さらに、食料品の製造において前記食料品の結晶化特性を改善するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させることができる酵素として特徴づけられる脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素の使用を提供する。
【００３２】
別の態様においては本発明は、食用油の製造において前記食用油からジグリセリドを低減及び／又は除去（好ましくは選択的に低減及び／又は除去）するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させることができる酵素として特徴づけられる脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素の使用を提供する。
【００３３】
別の態様においては本発明は、食用油の製造において前記食用油の結晶化特性を改善するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させることができる酵素として特徴づけられる脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素の使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本明細書では「脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素」及び「脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素」という用語は、（一般に、国際生化学分子生物学連合の命名委員会の酵素命名法推奨（１９９２）に従ってＥ．Ｃ．２．３．１．ｘに分類される）アシル基転移酵素活性を有する酵素を意味し、それによってこの酵素は、ジグリセリドから１個又は複数の受容体基質にアシル基を転移させることが可能である）。
【００３５】
したがって、本発明による「脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素」又は「脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素」は、（一般にＥ．Ｃ．２．３．１．ｘに分類される）アシル基転移酵素活性を有するが、ＤＧＡＴ（diacylglycerol acyltransferase）でもＰＤＡＴ（phospholipid:diacylglycerol acyltransferase）でもない酵素である。ＤＧＡＴは、一般にＥ．Ｃ．２．３．１．２０に分類される。ＰＤＡＴは、一般にＥ．Ｃ．２．３．１．１５８に分類される。したがって、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素又は脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素は、アシル基転移酵素活性を有するが、Ｅ．Ｃ．２．３．１．２０又はＥ．Ｃ．２．３．１．１５８に分類される酵素ではない酵素である。
【００３６】
本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素又は脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素は、食用油中でアシル基をＤＡＧからグリセリンに転移させることができる酵素である。したがって、本発明による酵素によって触媒される反応は、
ＤＡＧ（diglyceride）＋グリセリン  →  ２ＭＡＧ（monoglyceride）
である。
【００３７】
これは、ケネディプロセスにおける最終ステップ、すなわち、
１，２−ＤＡＧ＋アシルＣｏＡ  →  ＣｏＡ＋ＴＡＧ（triacylglycerol）
を触媒するＤＧＡＴ（diacylglycerol acyltransferase）（又はジアシルグリセロールＯ−アシル基転移酵素）として知られる酵素とは極めて対照的である（かかる酵素は、Ｅ．Ｃ．２．３．１．２０に分類される）。
【００３８】
不確かさを回避するために、ＤＧＡＴは、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素でも脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素でもない。
【００３９】
本発明による酵素によって触媒される反応は、ＰＤＡＴ（phospholipids:diacylglycerol acyltransferase）として知られる酵素によって触媒される反応、すなわち、
（レシチンなどの）リン脂質＋１，２−ＤＡＧ  →  ＴＡＧ（triacylglycerol）＋リゾリン脂質
とも極めて対照的である。
【００４０】
不確かさを回避するために、ＰＤＡＴは、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素でも脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素でもない。
【００４１】
本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素又は脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素は、Ｅ．Ｃ．２．３．１．７３に分類される酵素であることが好ましい。
【００４２】
適切には、脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素は、膜非依存性とすることができ、すなわち膜アンカー又は膜貫通ドメインが存在することによってその自然環境において膜と結合していないタンパク質とすることができる。
【００４３】
不確かさを回避するために、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、国際公開第０３／１０００４４号、国際公開第２０００／３６１１４号、ＵＳ２００３／００２８９２３又はＵＳ２００３／００７４６９５のいずれか１つに教示される酵素ではない。
【００４４】
この酵素は、アシル基転移酵素活性を有するのみならず、（一般にＥ．Ｃ．３．１．１．ｘに分類される）リパーゼ活性、例えば、ホスホリパーゼ活性も有することができる。
【００４５】
本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素である。これらの用語は、本明細書では区別なく使用することができる。
【００４６】
本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘは以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、Ｓから選択される１つ又は複数のアミノ酸残基）を含むアシル基転移酵素であることが好ましい。
【００４７】
本明細書では「ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素」という用語は、「脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素」という用語と同義である。
【００４８】
不確かさを回避するために、「脂肪酸ＣｏＡ」という用語は、「アシルＣｏＡ」、「脂肪酸酵素ＣｏＡ」及び「アシルＣｏ酵素Ａ」という用語と同じである。これらの用語は、本明細書では区別なく使用することができる。
【００４９】
本発明による方法又は使用に使用される食用油は、粗製油（crude oil）の形とすることができ、又は精製油とすることができる。
【００５０】
一実施形態においては、ジグリセリド量は完全に除去されるのではなく低減されることが好ましい。
【００５１】
本明細書では「低減」という用語は、本発明による酵素で処理した食用油中のジグリセリド量が酵素処理前の食用油中のジグリセリド量よりも少ないことを意味する。
【００５２】
ジグリセリドは、食用油から完全には除去されないことが好ましい。
【００５３】
マーガリン及び／又はショートニング中の処理油の使用など一部の適用例においては、ジグリセリド量、特に１，２ジグリセリドは、脂肪混合物の結晶化速度が小さなベータ結晶を生成する点まで低減されるべきである。パーム油中の全ジグリセリドに対する１，２−ジグリセリド量は、油の年数及び貯蔵条件に左右される。市販油の場合、１，３ジグリセリド：１，２ジグリセリドの比は１．８：３．３である。１，２ジグリセリドの除去は、結晶化特性に最も影響を及ぼす。
【００５４】
当業者には容易に明らかなとおり、ジグリセリド量の低減は、反応時間及び反応温度によって制御することができる。固定化酵素を含む流通反応装置においては、反応は流量によって制御することができる。
【００５５】
好ましくは、本発明の方法及び／又は使用に使用される脂質アシル基転移酵素は、アシル基をジグリセリドからアシル受容体に転移させることができる。前記アシル受容体は、ヒドロキシ基（−ＯＨ）を含む任意の化合物である。
【００５６】
適切には、本明細書では「ジグリセリド」という用語は、１，２−ジグリセリド又は１，３−ジグリセリドの１個又は複数を意味する。ジグリセリドは１，２−ジグリセリドであることが好ましい。
【００５７】
「ジグリセリド」及び「ジアシルグリセロール」という用語は、本明細書では区別なく使用される。
【００５８】
「ジグリセリド」という用語は、ＤＧＤＧ（digalactosyldiglyceride）及び／又はレシチン、例えば、ホスファチジルコリンを包含しない。
【００５９】
アシル受容体は、食用油に可溶であるものが好ましい。
【００６０】
適切には、アシル受容体は、グリセリン並びにその混合物及び誘導体を含めて、例えばエタノール、多価アルコールなどのアルコールとすることができる。適切には、アシル受容体は、ステロール、スタノール、ヒドロキシ酸、ソルビトール、ソルビタン又は他の炭水化物の１個又は複数とすることができる。
【００６１】
好ましい一実施形態においては、アシル受容体はグリセリンである。
【００６２】
したがって、一実施形態においては本発明は、ａ）食用油をグリセリンと脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素の両方と混合するステップを含む、食用油からジグリセリドを低減及び／又は除去する方法であって、前記脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素が、アシル転移酵素活性を有し、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘは以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、Ｓから選択される１つ又は複数のアミノ酸残基）を含む酵素として特徴づけられる方法を提供する。
【００６３】
本発明によるアシル受容体は水ではないことが好ましい。
【００６４】
アシル受容体はモノグリセリド及び／又はジグリセリドではないことが好ましい。
【００６５】
好ましくは、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、脂質基質の脂肪酸残基とグリセリン骨格の間のアシル結合を切断することができ、好ましくは、脂質基質はジグリセリドであり、好ましくは１，２−ジグリセリドである。
【００６６】
本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、トリグリセリド及び／又はモノグリセリドに作用しないことが好ましい。換言すれば、好ましくは、脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、ジグリセリドに選択的であり、好ましくは１，２−ジグリセリドに選択的である。この脂質基質は、本明細書では「脂質アシル供与体」と記述することができる。
【００６７】
したがって、本発明によれば、以下の有利な諸特性、すなわち、食用油のジグリセリド含量の低減、食用油のトリグリセリド含量の低減のない食用油のジグリセリド含量の低減、モノグリセリド含量の増加のない食用油のジグリセリド含量の低減、食用油のジグリセリド含量の低減とモノグリセリド含量の増加、食用油のジグリセリドの低減及びモノグリセリド含量の低減、食用油中の脂肪酸含量の大きな増加のない食用油のジグリセリド含量の低減の１つ又は複数を達成することができる。
【００６８】
好ましくは、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、脂肪酸アシル基をジグリセリド（好ましくは１，２−ＤＡＧ）からアルコール（好ましくはグリセリン）に転移させることによってアルコール分解反応（好ましくはグリセロール分解）を実施し、それによって２個のモノグリセリド分子、すなわちジグリセリドから１個とグリセリンから１個を、受容されたアシル基と一緒に生成する。
【００６９】
ＧＤＳＸモチーフのＸはＬであることが好ましい。すなわち、本発明による酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＳＤＬを含むことが好ましい。
【００７０】
ＧＤＳＸモチーフは、４個の保存アミノ酸からなる。このモチーフ内のセリンは、脂質アシル基転移酵素の触媒作用性セリンであることが好ましい。適切には、ＧＤＳＸモチーフのセリンは、Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p 2060-2064)に教示されたアエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）脂肪分解酵素中のＳｅｒ−１６に対応する位置に存在することができる。
【００７１】
タンパク質が本発明によるＧＤＳＸモチーフを有するかどうかを判定するために、配列をｐｆａｍデータベースのＨＭＭ（hidden markov model）プロファイルと比較することが好ましい。
【００７２】
Ｐｆａｍは、タンパク質ドメインファミリーのデータベースである。Ｐｆａｍは、各ファミリーに対して検証された（curated）複数の配列アラインメント及び新しい配列中のこれらのドメインを特定するためのプロファイルＨＭＭ（hidden Markov model）を含む。Ｐｆａｍの序論は、Bateman A et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30; 276-280にある。隠れマルコフモデルは、タンパク質を分類するためのいくつかのデータベースにおいて使用されている。総説として、Bateman A and Haft DH (2002) Brief Bioinform 3; 236-245を参照されたい。
"http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=12230032&dopt=Abstract" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=12230032&dopt=Abstract
"http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=11752314&dopt=Abstract" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=11752314&dopt=Abstract
【００７３】
隠れマルコフモデルの詳細な説明、及びそのモデルをＰｆａｍデータベースに適用する方法については、Durbin R, Eddy S, and Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4を参照されたい。Hammerソフトウェアパッケージは、Washington University, St Louis, USAから入手することができる。
【００７４】
或いは、ＧＤＳＸモチーフは、Hammerソフトウェアパッケージを用いて特定することができる。その説明は、Durbin R, Eddy S, and Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4及びその中の参考文献にある。ＨＭＭＥＲ２プロファイルは本明細書に記載されている。
【００７５】
ＰＦＡＭデータベースには、例えば、現在は以下のウェブサイトにあるいくつかのサーバーを介して接続することができる。
"http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml"   http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
"http://pfam.wustl.edu/" http://pfam.wustl.edu/
"http://pfam.jouy.inra.fr/" http://pfam.jouy.inra.fr/
"http://pfam.cgb.ki.se/" http://pfam.cgb.ki.se/
【００７６】
このデータベースは、タンパク質配列を入力することができる検索機能を提供している。次いで、データベースのデフォルトパラメータを用いて、タンパク質配列をＰｆａｍドメインの有無について解析する。ＧＤＳＸドメインは、このデータベースにおいて確立されたドメインであり、したがってあらゆる検索配列中にその存在が認められる。データベースは、検索配列に対してＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列のアラインメントを返す。
【００７７】
アエロモナス  サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）又はアエロモナス・ヒドロフィラを含めて、
ａ）手引書
上記手順に従って、目的タンパク質とＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列とのアラインメント及びＰ１０４８０とＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列とのアラインメントを得る、
又は
ｂ）データベース
によって複数のアラインメントを得ることができる。
データベースは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列の特定後に、検索配列のアラインメントをＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列のシードアラインメントに示す選択肢を提供する。Ｐ１０４８０はこのシードアラインメントの一部であり、ＧＣＡＴ＿ＡＥＲＨＹで示される。検索配列とＰ１０４８０の両方は同じ枠内に示される。
【００７８】
アエロモナス・ヒドロフィラ基準配列：
アエロモナス・ヒドロフィラＧＤＳＸリパーゼの残基は、ＮＣＢＩファイルＰ１０４８０中で番号付与されている。本文中の番号は、好ましい実施形態において本発明の脂質アシル基転移酵素中に存在する特定のアミノ酸残基を求めるために本発明において使用されるファイル中の番号である。
【００７９】
Ｐｆａｍアラインメントを実施した（図３３及び３４）。
以下の保存残基は認識することができ、好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法に使用される酵素中に存在することができる。
ブロック１  −  ＧＤＳＸブロック
hid hid hid hid Gly Asp Ser hid
28  29  30  31  32  33  34  35
ブロック２  −  ＧＡＮＤＹブロック
hid Gly hid Asn Asp hid
130 131 132 133 134 135
ブロック３  −  ＨＰＴブロック
His
309
【００８０】
ここで、「ｈｉｄ」は、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅから選択される疎水性残基を意味する。
【００８１】
本発明の組成物／方法に使用される脂質アシル基転移酵素は、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を用いてアラインメントさせることができることが好ましい。
【００８２】
ｐｆａｍ００６５７ドメインファミリーのＨＭＭ（hidden markov model）プロファイルとの正の一致（positive match）によって、本発明によるＧＤＳＬ又はＧＤＳＸドメインの存在が示されることが好ましい。
【００８３】
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列とアラインメントさせたときに、本発明の組成物／方法に使用される脂質アシル基転移酵素は、ＧＤＳｘブロック、ＧＡＮＤＹブロック、ＨＰＴブロックの少なくとも１個、好ましくは２個以上、好ましくは３個以上を有する。適切には、脂質アシル基転移酵素は、ＧＤＳｘブロック及びＧＡＮＤＹブロックを有することができる。或いは、この酵素は、ＧＤＳｘブロック及びＨＰＴブロックを有することができる。この酵素は、少なくともＧＤＳｘブロックを含むことが好ましい。
【００８４】
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列とアラインメントさせたときに、本発明の組成物／方法に使用される酵素は、基準Ａ．ヒドロフィラポリペプチド配列、すなわち配列番号３２：２８ｈｉｄ、２９ｈｉｄ、３０ｈｉｄ、３１ｈｉｄ、３２ｇｌｙ、３３Ａｓｐ、３４Ｓｅｒ、３５ｈｉｄ、１３０ｈｉｄ、１３１Ｇｌｙ、１３２Ｈｉｄ、１３３Ａｓｎ、１３４Ａｓｐ、１３５ｈｉｄ、３０９Ｈｉｓと比較されたときに、以下のアミノ酸残基の少なくとも１個、好ましくは２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは５個以上、好ましくは６個以上、好ましくは７個以上、好ましくは８個以上、好ましくは９個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１１個以上、好ましくは１２個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１４個以上、好ましくは１５個以上を有する。
【００８５】
ｐｆａｍ００６５７  ＧＤＳＸドメインは、このドメインを有するタンパク質を他の酵素から識別する一義的な識別子である。
【００８６】
ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を図１に配列番号１として示す。この配列は、本明細書ではｐｆａｍ００６５７．６と記述されることもあるｐｆａｍファミリー００６５７、データベースバージョン６の識別子から誘導される。
【００８７】
このコンセンサス配列は、今後公開されるｐｆａｍデータベースを使用して更新することができる。
【００８８】
例えば、図３３及び３４に、本明細書ではｐｆａｍ００６５７．１１と記述されることもあるデータベースバージョン１１由来のファミリー００６５７のｐｆａｍアラインメントを示す。
【００８９】
ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ及びＨＰＴブロックは、公開された両方のデータベースのｐｆａｍファミリー００６５７に存在する。将来公開されるｐｆａｍデータベースを使用して、ｐｆａｍファミリー００６５７を特定することができる。
【００９０】
本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下の判定基準を用いて特徴づけできることが好ましい。
（ｉ）本酵素は、脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシル基転移酵素活性を有する。
（ii）本酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘは以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、Ｓから選択される１つ又は複数のアミノ酸残基）を含む。
（iii）本酵素は、Ｈｉｓ−３０９を含む、又は図２（配列番号２又は配列番号３２）に示
されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む。
【００９１】
ＧＤＳＸモチーフのアミノ酸残基はＬであることが好ましい。
【００９２】
配列番号２又は配列番号３２においては、最初の１８アミノ酸残基はシグナル配列を形成する。完全長配列、すなわち、シグナル配列を含むタンパク質のＨｉｓ−３０９は、タンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のＨｉｓ−２９１に一致する。
【００９３】
好ましくは、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下の触媒作用の３つ組、すなわち、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９を含む、或いは図２（配列番号２）又は図２８（配列番号３２）に示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９に対応する位置のそれぞれセリン残基、アスパラギン酸残基及びヒスチジン残基を含む。上述したように、配列番号２又は配列番号３２で示される配列においては、最初の１８アミノ酸残基はシグナル配列を形成する。完全長配列、すなわち、シグナル配列を含むタンパク質のＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９は、タンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のＳｅｒ−１６、Ａｓｐ−１１６及びＨｉｓ−２９１に一致する。ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列においては、図１（配列番号１）に示されるように、活性部位残基は、Ｓｅｒ−７、Ａｓｐ−１５７及びＨｉｓ−３４８に対応する。
【００９４】
本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下の判定基準を用いて特徴づけできることが好ましい。
（ｉ）本酵素は、第１の脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシル基転移酵素活性を有する。
（ii）本酵素は、少なくともＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９を含む、或いは図２（配列番号２）又は図２８（配列番号３２）に示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のそれぞれＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９に対応する位置のグリシン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン酸及びヒスチジン残基を含む。
【００９５】
適切には、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトミセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム（Desulfitobacterium）、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ（Vibrionaceae）、キシレラ（Xylella）、スルフォロブス（Sulfolobus）、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム（Mesorhizobium）、ラルストニア（Ralstonia）、ザントモナス及びカンジダの１種類若しくは複数由来の生物から得ることができ、好ましくは得られる。
【００９６】
適切には、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下の生物、すなわち、アエロモナス・ヒドロフィラ、アエロモナス・サルモニシダ、ストレプトマイセス・コエリコラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・リモサス（Streptomyces rimosus）、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、デサルフィトバクテリウム・デハロゲナンス（Desulfitobacterium dehalogenans）、バチルス種、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、ビブリオナシエ、キシレラ・ファスチジオサ（Xylella fastidiosa）、スルフォロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）、メソルヒゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、ラルストニア・ソラナセアルム（Ralstonia solanacearum）、ザントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、ザントモナス・アクソノポディス（Xanthomonas axonopodis）及びカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）の１種類若しくは複数から得ることができ、好ましくは得られる。
【００９７】
一態様においては、好ましくは、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、アエロモナス・ヒドロフィラ又はアエロモナス・サルモニシダの１種類又は複数から得ることができ、好ましくは得られる。
【００９８】
適切には、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下のアミノ酸配列の１個又は複数を含む。
（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列（図２参照）
（ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列（図３参照）
（iii）配列番号４で示されるアミノ酸配列（図４参照）
（iv）配列番号５で示されるアミノ酸配列（図５参照）
（ｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列（図６参照）
（vi）配列番号１２で示されるアミノ酸配列（図１４参照）
（vii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列（図１６）
（viii）配列番号２２で示されるアミノ酸配列（図１８）
（ix）配列番号２４で示されるアミノ酸配列（図２０参照）
（ｘ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列（図２２）
（xi）配列番号２８で示されるアミノ酸配列（図２４）
（xii）配列番号３０で示されるアミノ酸配列（図２６）
（xiii）配列番号３２で示されるアミノ酸配列（図２８）
（xiv）配列番号３４で示されるアミノ酸配列（図３０）
（xv）配列番号５５で示されるアミノ酸配列（図５２）
（xvi）配列番号５８で示されるアミノ酸配列
（xvii）配列番号６０で示されるアミノ酸配列
（xviii）配列番号６１で示されるアミノ酸配列
（xix）配列番号６３で示されるアミノ酸配列
（xx）配列番号６５で示されるアミノ酸配列
（xxi）配列番号６７で示されるアミノ酸配列
（xxii）配列番号７０で示されるアミノ酸配列、
（xxiii）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号５５、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７又は配列番号７０で示される配列のいずれか１つと７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
【００９９】
適切には、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号３２又は配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含み、或いは配列番号２で示されるアミノ酸配列、配列番号３で示されるアミノ酸配列、配列番号３２で示されるアミノ酸配列又は配列番号３４で示されるアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１００】
本発明では、同一性の程度は、同じ配列要素の数に基づく。本発明による同一性の程度は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711）（Needleman & Wunsch (1970), J. of Molecular Biology 48, 443-45）に付属したＧＡＰなどの当分野で公知のコンピュータプログラムによって、以下のポリペプチド配列比較設定、すなわち、ＧＡＰクリエーションペナルティー（creation penalty）３．０及びＧＡＰエクステンションペナルティー（extension penalty）０．１を用いて、適切に決定することができる。
【０１０１】
適切には、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号５５、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７又は配列番号７０で示される配列のいずれか１つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
適切には、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下のアミノ酸配列の１個又は複数を含む。
（ａ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基１〜１００で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基１０１〜２００で示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基２０１〜３００で示されるアミノ酸配列、或いは
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）に定義されたアミノ酸配列のいずれか１つと７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
【０１０３】
適切には、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下のアミノ酸配列の１個又は複数を含む。
（ａ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基２８〜３９で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基７７〜８８で示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基１２６〜１３６で示されるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基１６３〜１７５で示されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基３０４〜３１１で示されるアミノ酸配列、或いは
（ｆ）上記（ａ）〜（ｅ）に定義されたアミノ酸配列のいずれか１つと７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
【０１０４】
適切には、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下のヌクレオチド配列、すなわち、
（ａ）配列番号７で示されるヌクレオチド配列（図９参照）、
（ｂ）配列番号８で示されるヌクレオチド配列（図１０参照）、
（ｃ）配列番号９で示されるヌクレオチド配列（図１１参照）、
（ｄ）配列番号１０で示されるヌクレオチド配列（図１２参照）、
（ｅ）配列番号１１で示されるヌクレオチド配列（図１３参照）、
（ｆ）配列番号１３で示されるヌクレオチド配列（図１５参照）、
（ｇ）配列番号２１で示されるヌクレオチド配列（図１７参照）、
（ｈ）配列番号２３で示されるヌクレオチド配列（図１９参照）、
（ｉ）配列番号２５で示されるヌクレオチド配列（図２１参照）、
（ｊ）配列番号２７で示されるヌクレオチド配列（図２３参照）、
（ｋ）配列番号２９で示されるヌクレオチド配列（図２５参照）、
（ｌ）配列番号３１で示されるヌクレオチド配列（図２７参照）、
（ｍ）配列番号３３で示されるヌクレオチド配列（図２９参照）、
（ｎ）配列番号３５で示されるヌクレオチド配列（図３１参照）、
（ｏ）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列（図５１）、
（ｐ）配列番号５９で示されるヌクレオチド配列、
（ｑ）配列番号６２で示されるヌクレオチド配列、
（ｒ）配列番号６４で示されるヌクレオチド配列、
（ｓ）配列番号６６で示されるヌクレオチド配列、
（ｔ）配列番号６８で示されるヌクレオチド配列、
（ｕ）配列番号６９で示されるヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号５４、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８又は配列番号６９で示される配列のいずれか１つと７５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列
の発現によって産生されるアミノ酸配列、或いはこれらのヌクレオチド配列の１個又は複数を含むことができる。
【０１０５】
適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３又は配列番号３５、配列番号５４、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８又は配列番号６９で示される配列のいずれか１つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の相同性を有するとすることができる。
【０１０６】
一態様においては、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、ＬＣＡＴ（lecithin:cholesterol acyltransferase）又はその変異体（例えば、分子進化によって造られた変異体）とすることができる。
【０１０７】
適切なＬＣＡＴは当分野で公知であり、例えば以下の生物、すなわち、哺乳動物、ラット、マウス、ヒヨコ、キイロショウジョウバエ、アラビドプシス（Arabidopsis）及びオリザ  サティバ（Oryza sativa）を含めた植物、線虫、真菌並びに酵母の１種類又は複数から得ることができる。
【０１０８】
一実施形態においては、本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K, DenmarkのDanisco A/S社によって、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GBにおいて２００３年１２月２２日にそれぞれアクセッション番号ＮＩＣＭＢ  ４１２０４及びＮＣＩＭＢ  ４１２０５として寄託されたpPet12aAhydro及びpPet12aASalmoを含む大腸菌（E. coli）系統ＴＯＰ  １０から得ることができ、好ましくは得られる脂質アシル基転移酵素とすることができる。
【０１０９】
本発明による方法を実施するときには、生成物は、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成されることが好ましい。
【０１１０】
本明細書では「転移酵素」という用語は、「脂質アシル基転移酵素」という用語と区別なく使用される。
【０１１１】
適切には、本明細書に規定される脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下の反応、すなわち、エステル交換、エステル転移、アルコール分解、加水分解の１種類又は複数を触媒する。
【０１１２】
「エステル交換」という用語は、脂質供与体と脂質受容体の間の酵素によって触媒されたアシル基転移を意味する。ここで、脂質供与体は遊離アシル基ではない。
【０１１３】
本明細書では「エステル転移」という用語は、（遊離脂肪酸以外の）脂質供与体から（水以外の）アシル受容体への酵素によって触媒されたアシル基転移を意味する。
【０１１４】
本明細書では「アルコール分解」という用語は、生成物の一方がアルコールのＨと結合し、もう一方の生成物がアルコールのＯＲ基と結合するような、アルコールＲＯＨとの反応による酸誘導体の共有結合の酵素による切断を指す。
【０１１５】
本明細書では「アルコール」という用語は、ヒドロキシル基を含むアルキル化合物を指す。
【０１１６】
本明細書では「加水分解」という用語は、脂質から水分子のＯＨ基への酵素によって触媒されたアシル基転移を指す。加水分解に起因するアシル転移には水分子の分離が必要である。
【０１１７】
本明細書では「遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに」という用語は、本発明による脂質アシル基転移酵素が、食用油環境において１００％転移酵素活性を有する（すなわち、加水分解活性を持たずに、アシル基の１００％をアシル供与体からアシル受容体に転移させる）ことが好ましいが、脂質アシル供与体中のアシル基の１００％未満をアシル受容体に転移させてもよいことを意味する。この場合、好ましくは、アシル基転移酵素活性は、全酵素活性の少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９８％を占める。％転移酵素活性（すなわち、全酵素活性の百分率としての転移酵素活性）は、以下のプロトコールによって求めることができる。
【０１１８】
％アシル基転移酵素活性を求めるプロトコール：
本発明による脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素が添加された食用油は、以下の詳細な手順に従って、酵素反応後にＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ  ２：１で抽出し、脂質材料を含む有機相を単離し、ＧＬＣによって分析することができる。ＧＬＣ分析から遊離脂肪酸及びジグリセリドの量が求められる。本発明による酵素が添加されていない対照食用油も同様に分析される。
【０１１９】
計算：
ＧＬＣ分析の結果から、遊離脂肪酸の増加及びジグリセリドの減少を計算することができる。
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸（酵素）−％脂肪酸（対照）、
Ｍｖ  Ｆａ＝脂肪酸の平均分子量、
Δ％ジグリセリド＝％ジグリセリド（対照）−％ジグリセリド（酵素）、
Ｍｖ  Ｄｉ＝ジグリセリドの平均分子量、
転移酵素活性は、全酵素活性の百分率として計算される。
2007521804.tif 000002
【０１２０】
食用油中の遊離脂肪酸が増加する場合には、遊離脂肪酸は実質的に、すなわち著しく増加しないことが好ましい。すなわち、遊離脂肪酸の増加が食用油の品質に悪影響を及ぼさないことを意味する。
【０１２１】
本発明の一部の態様においては、本明細書では「遊離脂肪酸を実質的に増加させずに」という用語は、本発明による脂質アシル基転移酵素で処理した食用油中の遊離脂肪酸の量が、例えば、従来のリパーゼ、例えばシュードモナス  セパシア（Pseudomonas cepacia）リパーゼ（Lipase PS, Amano Japan)又はリゾープス  オリゼ（Rhizopus oryzae）リパーゼ（LipaseF, Amano Japan）のときに生成される遊離脂肪酸の量など、本発明による脂質アシル基転移酵素以外の酵素が使用されたときに食用油又は組成物中で生成される遊離脂肪酸の量よりも少ないことを意味する。
【０１２２】
適切には、反応後に食用油中に残留するグリセリンは、例えば、遠心分離又は減圧蒸留によって除去することができる。
【０１２３】
酵素は、酵素反応後に食用油から場合によっては除去してもよい。或いは、酵素を単に失活させて食用油中に残留させることができる。適切には、酵素は、例えば熱によって失活させることができる。
【０１２４】
一実施形態においては、本発明の方法に使用される脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は固定化することができる。酵素を固定する場合には、アシル受容体と食用油を含む混合物を、例えば固定化酵素を含むカラムに通すことができる。酵素を固定することによって、酵素を容易に再使用することができる。
【０１２５】
適切には、固定化酵素は、アシル受容体と食用油を２相系として含む反応混合物を含む流通反応装置又は回分式反応装置において使用することができる。反応混合物を場合によっては撹拌又は超音波処理してもよい。例えば、反応が平衡に達した後に、反応混合物と固定化酵素を分離することができる。適切には、（過剰のグリセリンなどの）過剰のアシル受容体は、反応後に、例えば遠心分離又は減圧蒸留によって除去することができる。
【０１２６】
固定化脂質アシル基転移酵素は、当分野で公知の固定化技術を用いて調製することができる。固定化酵素を調製する方法は多数あり、それらは当業者には明らかである（例えば、ＥＰ  ０  ７４６  ６０８又はBalcao V.M., Paiva A.L., Malcata F.X., Enzyme Microb Technol. 1996 May 1;18(6):392-416又はRetz M.T., Jaeger K.E. Chem Phys Lipids. 1998 Jun;93(1-2):3-14；Bornscheuer U.T., Bessler C, Srinivas R, Krishna S.H. Trends Biotechnol. 2002 Oct;20(10):433-7；Plou et al, J. Biotechnology 92 (2002) 55-66；Warmuth et al., 1992. Bio Forum 9, 282-283；Ferrer et al., 2000. J. Chem. Technol. Biotechnol. 75, 1-8又はChristensen et al., 1998. Nachwachsende Rohstoff 10, 98-105; Petersen and Christenen, 2000, Applied Biocatalysis. Harwood Academic Publishers, Amsterdamに記載の技術（これらの各々を参照により本明細書に援用する）。本発明において使用することができる技術としては、例えば、Eupergit Cへの共有結合性カップリング、ポリプロピレンへの吸着及びシリカ造粒（silica-granulation）が挙げられる。
【０１２７】
好ましくは、食用油は、ジグリセリド、好ましくは多量のジグリセリドを含有する食用油である。
【０１２８】
好ましくは、食用油は以下の油、すなわち、パーム油から抽出又は誘導される油、パームオレイン、パームステアリン、パーム中間留分又は任意のパーム油留分或いはオリーブ油の１種類又は複数である。
【０１２９】
より好ましくは、食用油は、パーム油及び／又はパームオレイン及び／又はパームステアリンである。
【０１３０】
食用油、アシル受容体基質及び脂質アシル基転移酵素の混合に関しては、当業者は容易に理解するとおり、これは、任意の組み合わせ及び／又は順序で実施することができる。単なる例として、アシル受容体基質を食用油と混合し、続いて脂質アシル基転移酵素を添加することができる。或いは、食用油を脂質アシル基転移酵素と混合し、続いてアシル受容体基質を添加することができる。或いは、脂質アシル基転移酵素とアシル受容体基質を混合し、続いてこの酵素／基質混合物を食用油と混合することができる。或いは、全３物質（すなわち食用油、アシル受容体基質及び脂質アシル基転移酵素）を同時に混合できることは言うまでもない。
【０１３１】
本方法は、食用油の融点を超える温度で実施されることが好ましい。
【０１３２】
適切には、本方法は、３０〜５０℃、好ましくは３５〜４５℃、好ましくは４０〜４５℃の温度で実施することができる。
【０１３３】
酵素は、粗製又は精製食用油に添加されることが好ましい。本発明は、構成要素を含む水と混合するときには食用油の酵素処理を包含しないことが好ましい。したがって、本発明は、食用油自体の処理、すなわち低水分環境における処理を想定する。
【０１３４】
水は、本発明による方法の前又は間に油に添加することができるが、最も好ましい実施形態においては水は添加されない。水が食用油中に存在する場合には、好ましくは１０％未満の水が存在し、より好ましくは７．５％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満又は０．１％未満の水が存在する。適切には、０．１％から１％の水が食用油中に存在することができる。
【０１３５】
一実施形態においては、本発明によるプロセスに使用される食用油は、１個又は複数のアシル供与体を補充することができ、且つ／又は１個若しくは複数のアシル受容体を補充することができ、且つ／又は１個若しくは複数のアシル受容体と１個若しくは複数のアシル供与体の両方を補充することができる。「補充する」とは、アシル供与体及び／又はアシル受容体が、食用油中に天然に存在せず、本発明による脂質アシル基転移酵素と食用油を接触させるのと同時、その直後及び／又はその直前に添加されることを意味する。
【０１３６】
適切には、補充のアシル供与体はＤＡＧ以外とすることができる。適切には、補充のアシル供与体は、例えばリン脂質（例えば、レシチン）とすることができる。
【０１３７】
適切には、補充のアシル受容体はグリセリンとすることができる。しかし、適切には、補充のアシル受容体は、グリセリン以外のアシル受容体、例えば植物ステロール及び／又は例えば植物スタノールとすることができる。適切には、補充のアシル受容体は、グリセリンと１個又は複数のさらなるアシル受容体の組み合わせとすることができる。
【０１３８】
リン脂質が補充された油を使用すると、追加の乳化剤（リゾリン脂質）を油中で生成させることができる。植物ステロール及び／又は植物スタノールが補充された油を使用すると、両方の食用油（edible both）において植物ステロールエステル及び／又は植物スタノールエステルを生成することができる。植物ステロールエステルと植物スタノールエステルはどちらも食事に組み入れると血清コレステロール低減効果を有すると報告されている。
【０１３９】
Lipozyme（登録商標）TL IM、１，３特異的リパーゼ（Novozymes, Denmark）などの固定化リパーゼを用いた酵素のエステル交換は、食事用の油中のトランス脂肪酸量を低減するために、且つ／又は食用油及び脂肪の融解特性を改変するために使用される。
【０１４０】
エステル交換中、食用油のトリグリセリド中のポリ不飽和脂肪酸の１個又は２個は、パーム油などのトランス脂肪酸の少ない別の油から得られる脂肪酸で置換することができる。パーム油から脂肪酸を転移させることによって、トランス脂肪酸を導入せずに食用油の融点を変えることができる。リパーゼの固定化は、ＵＳ５７７６７４１、ＵＳ４７９８７９３及びＵＳ５１５６９６３に記載されている。ＵＳ６２８４５０１は、リン脂質のエステル交換を記載する。
【０１４１】
固定化転移酵素は、リパーゼに対して使用されるのと同じ技術を用いて生成させることができる。
【０１４２】
一実施形態においては、本明細書に記載された脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、エステル交換リパーゼと併用することができる。リパーゼエステル交換ステップとアシル転移酵素ステップは、好ましくは別個に実施される。
【０１４３】
さらに別の態様においては、本明細書に記載された脂肪酸ＣｏＡ非依存性脂質アシル基転移酵素は、従来の結晶化阻害剤と併用することができる。
【０１４４】
さらに別の態様においては、本発明は、食用油を含む食料品中の結晶化特性を改善する方法であって、食用油をアシル受容体基質及び本明細書に記載された脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素（場合によってはさらに結晶化阻害剤）と混合するステップを含む方法を提供する。
【０１４５】
一実施形態においては本発明は、食料品の結晶化特性を改善するための食用油を含む食料品調製物中の脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素を提供する。
【０１４６】
適切には、１個又は複数のさらなる結晶化阻害剤を場合によっては添加してもよい。
【０１４７】
本発明は、さらに、食料品の結晶化特性を改善するための食用油を含む前記食料品の製造における本明細書に記載された脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素の使用を提供する。
【０１４８】
別の態様においては、本発明は、食料品の結晶化特性を改善するための食用油を含む前記食料品の製造におけるさらなる結晶化阻害剤と組み合わされた本明細書に記載された脂肪酸ＣｏＡ非依存性ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素の使用を提供する。
【０１４９】
さらなる結晶化阻害剤は、例えばトリステアリン酸ソルビタン、レシチン、ＰＧＥ又はポリソルベートの１個又は複数などの任意の従来の結晶化阻害剤とすることができる。
【０１５０】
利点
食用油からジグリセリドを除去するため又は食用油中のジグリセリドを低減するための、本明細書に教示される方法の使用による本発明において、特に特許請求の範囲の方法において使用される本明細書に教示される酵素の選択による本発明において、トリグリセリドを減少させず、且つ／又はＦＦＡ（free fatty acid）をさほど増加させずに、モノ及びジグリセリドを上回るジグリセリドの選択的な低減を実施することができる。
【０１５１】
本発明の方法は食用油の遊離脂肪酸含量を実質的に増加させずに実施することができることから、生成物損失の問題が克服される。
【０１５２】
粗製パーム油を従来のリパーゼで処理する場合には、精油中に遊離脂肪酸を除去する必要があるが、精製パーム油を本発明による脂質アシル基転移酵素で処理する（したがって、粗製パーム油を従来のリパーゼで処理する必要がない）場合には、遊離脂肪酸含量は実質的に増加しないので遊離脂肪酸を除去する必要がない。
【０１５３】
それに加えて、又はそれとは別に、本発明は、モノグリセリド量をさほど減少させずに、食用油からジグリセリドを除去し、又は食用油中のジグリセリドを低減する。
【０１５４】
それに加えて、又はそれとは別に、本発明は、食用油中のモノグリセリド量を増加させつつ、食用油からジグリセリドを除去し、又は食用油中のジグリセリドを低減する。これは、モノグリセリドを基質として利用し、したがって食用油中のモノグリセリド量を減少させる従来技術の酵素とは対照的である。
【０１５５】
本発明は、脂肪酸ＣｏＡを添加する必要がないので有利である。これは、アシルＣｏＡ依存性ＤＧＡＴとは極めて対照的である。もっと正確に言えば、本発明による酵素は、安価な商品であるグリセリンの存在（及び必要に応じて添加）に依拠する。
【０１５６】
パーム油中のジグリセリド除去／低減の商業的妥当性
ジグリセリドは、パームを主成分とするマーガリン及びショートニングにおける結晶化を遅延させる。
【０１５７】
長年、本発明者らは、パーム油消費の成長が着実に増加するのを見てきている。これは、一つにはその土地で入手できるためであり、一つには経済性のためであり、主としては性能のためである。マーガリン／ショートニングタイプの製品中にパーム油が存在すると、油混合物のβ’品質が向上することが判明した。しかし、パーム油の使用は、パームステアリン及びパームオレインの使用に以前は制限され、パーム核及びその留分が一部使用された。現在、菓子及び食品加工業者が極めて特異的な融解プロファイルを求めているので、パーム油の使用はより多様化している。
【０１５８】
顧客は配合物中のパーム油の使用を増加させようとしており、業界は結晶化の問題を且つてないほど取り上げている。「結晶促進（pro-crystal）」プロモーターを添加してトランスの少ない配合物又はトランスのない配合物における結晶化を惹起し、それによって使用前の後結晶（post crystal）形成を防止又は遅延させる必要がある場合。トリステアリン酸ソルビタン、レシチン、ＰＧＥ、ポリソルベートなど、後結晶成長を緩慢にし、遅延させる結晶化防止剤（anti-crystalliser）への関心も増してきている。これは、ジグリセリドが多量に存在する現れである。
【０１５９】
本発明の商業的利点は、以下の１つ又は複数とすることができる。
ａ）加工中及び／又はその後の使用中に追加のモノグリセリドを食用油に添加する必要性を低下させる。モノグリセリドは、食品システムにおいて広く用いられている乳化剤である。
ｂ）ジグリセリドを約６〜８％から約４〜５％に、さらにそれ以上減少させる。
ｃ）プラント（工場）能力の適応性を増大させ、したがって製造間接費を低減する。
ｄ）後結晶化問題を大きく減少させる。
ｅ）一部の配合物においては、一部の完全飽和油脂トリグリセリドを除去することができる。というのは、本発明者らは結晶促進の必要性を低下させるからである。この点で、製造者は、従来、結晶形成を「促進」し販売後の製品における望ましくない結晶形成遅延を克服するために、完全飽和トリグリセリドを配合物に添加している。かかる結晶形成は、製造中に結晶成長を遅延させて所望の結晶タイプ（すなわち、マーガリン及びショートニングの場合には好ましくはベータ−プライム）にするのに十分な濃度のジグリセリドを含む配合物中にかなりの量のパーム油又はその成分が含まれるしるしである。しかし、本発明によって処理したパーム油を使用することによって、ジグリセリド含量は所与の混合物又は配合物内で十分に低減され、結晶成長を助けるために追加の完全飽和トリグリセリドを添加する必要性がより重要でなくなる。
ｆ）大きなプロセス変更なしで、パームを主体とする混合物がより多様化し、液体油のコストが上昇する。
ｇ）結晶化防止剤を置換することができ、且つ／又は結晶化防止剤を一部置換することができる。
【０１６０】
Ｂ  トランス脂肪酸
現在、食品におけるトランス酸の使用に反対する立法及び世論がある（Fodevareministeriet, Denmark 2003）。そして、これは性能問題をもたらした。製造者は、可能であれば、パームを主成分とする溶液に切り替えたいと考えるかもしれない。というのは、この油タイプはＣ：１６：０及びＣ：１８：０異性体の量が多いからである。その結果、パームを以前は使用しなかった経済組織においてパームの消費が増加し始めている。
【０１６１】
Ｃ  菓子製品におけるジグリセリドの結晶化阻害
ＣＢＥ（Cocoa Butter Equivalent）は、分留されたパーム油、特にＰＭＦ（palm mid fraction）、分留されたシアバター脂肪、多数の他の新奇な脂肪などの特殊な脂肪から処方される。コスト的な理由のため、ＣＢＥ中にできるだけ多量のＰＭＦを含めることが有利である。実際、多数のＣＢＥはパーム留分のみを含むことができる。チョコレート製造の最も繊細な局面は、脂肪の結晶化である。ジグリセリドは結晶化に対して負の影響を及ぼし、例えば、成形品の取り出しは極めて重大な問題となり得る（Siew, 2001）。
【０１６２】
Ｄ  結晶品質
トリグリセリド品質は性能に大きく影響する。これは、標準８２％脂肪テーブルマーガリン用の典型的なトランス酸含有油配合物の例から、ともに類似したＳＦＣプロファイルを有する典型的なエステル交換パームステアリン留分とパーム核を硬質原料（hard stock）として含むトランス非含有品に対して明らかである。結晶化の速度及び品質の低下は、「オイリングアウト（oiling out）」として知られる徴候をもたらし得る。そのため、硬質ＭＡＧなどの結晶プロモーターが必要になる。また、結晶安定化結晶形成（crystal stabilized crystal formation）の遅延は、「ざらつき（sandiness）」として知られる徴候をもたらし、それによって所望の結晶タイプの転換は、最終的により安定なベータ型に戻り、砂のようにざらざらした食感を与える。この徴候は、工業製品の特定の問題である。
【０１６３】
いくつかの用途
脂肪改変
マーガリン、スプレッド、菓子／チョコレートなどの高脂肪固形食品に使用される脂肪の化学的製造中に、トランス脂肪酸は水素化プロセス（硬化）中に食用油に導入される。これによって、食用油の融解温度が変更されて、最終食品、例えば、室温で固形であるが塗り広げられるテーブルマーガリン又は保存中は固形であるが口の中で溶融するチョコレートの適切な粘ちゅう性が確保される。
【０１６４】
しかし、化学的製造は、環境及び健康に有害と考えられるへキサンなどの多量の溶媒を使用し、変性油／脂肪を食品成分として使用する前に溶媒を完全に除去する必要がある。
【０１６５】
多数の国々においては、食品製造への部分水素化の使用は法律及び法的規制によって制限されており、多数の主要な食品製造業者は、現在、代替の低トランス代替品に転換しつつある。
【０１６６】
本発明の方法によって調製される油は、マーガリン及び／又はスプレッドの成分として使用することができる。
【０１６７】
カカオ脂代用品／カカオ代用脂
カカオ脂は、口の中で溶融する固形菓子を与える独特の組成物を含む。より安価な代替品でカカオ脂を置換するために、植物油を水素化してトランス脂肪酸を生成させ、それによって食用油の融点を上昇させて、体温で溶融する類似の固形菓子が得られる。かかる変性植物油はＣＢＥ（cocoa butter equivalent）として知られ、或いは改変脂肪がチョコレート製品の諸特性を向上させる場合にはＣＢＲ（cocoa butter replacement）として知られる。ＣＢＥ及びＣＢＲに付随する１つの大きな問題は、植物油の水素化によって健康及び温度に有害と考えられるトランス脂肪が生成することである。このため、融解温度がそれよりも高い低トランス植物油又はその画分が使用される。パーム油及びパーム油留分は、トランスＣＢＲ／ＣＢＥが少ない主成分としてこの点で有利であると考えられる。
【０１６８】
ＣＢＲ（cocoa butter replacement）脂肪は、非調質（non-tempering）、後硬化（post hardening）減少、安定性、ブルーム耐性などチョコレート製品に好ましい特性を付与するのに使用される。パーム油などの非ラウリン酸／非トランス脂肪を使用することが特に望ましい。ＣＢＲに使用される脂肪の結晶化特性は、上記好ましい特性を維持しつつ口中での生成物融解との適切なバランスを確保するのに鍵となる役割を果たす。ＣＢＲ混合物におけるパーム油などの低トランス脂肪の使用は、健康上の理由のため特に望ましい。ＣＢＲにおけるパーム油の使用は、ＥＰ０２９３１９４に記載されている。
【０１６９】
本発明のプロセスによって調製された油は、カカオ脂代用品及び／又はカカオ代用脂として例えば脂肪混合物中のチョコレート用成分として使用することができる。
【０１７０】
本発明に従って使用されるいくつかのジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素の配列
本発明に従って及び／又は本発明の方法において使用するのに適切なジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素は、以下のアミノ酸配列のいずれか１つを含むことができ、且つ／又は以下のヌクレオチド配列によってコードすることができる。
【０１７１】
テルモビフィダ（Termobifida）＼フスカ（fusca）ＧＤＳｘ  ５４８  ａａ
配列番号５８
ZP00058717
1 mlphpagerg evgaffallv gtpqdrrlrl echetrplrg rcgcgerrvp pltlpgdgvl
61 cttsstrdae tvwrkhlqpr pdggfrphlg vgcllagqgs pgvlwcgreg crfevcrrdt
121 pglsrtrngd ssppfragws lppkcgeisq sarktpavpr ysllrtdrpd gprgrfvgsg
181 praatrrrlf lgipalvlvt altlvlavpt gretlwrmwc eatqdwclgv pvdsrgqpae
241 dgeflllspv qaatwgnyya lgdsyssgdg ardyypgtav kggcwrsana ypelvaeayd
301 faghlsflac sgqrgyamld aidevgsqld wnsphtslvt igiggndlgf stvlktcmvr
361 vplldskact dqedairkrm akfettfeel isevrtrapd arilvvgypr ifpeeptgay
421 ytltasnqrw lnetiqefnq qlaeavavhd eeiaasggvg svefvdvyha ldgheigsde
481 pwvngvqlrd latgvtvdrs tfhpnaaghr avgervieqi etgpgrplya tfavvagatv
541 dtlagevg
配列番号５９
nt
1 ggtggtgaac cagaacaccc ggtcgtcggc gtgggcgtcc aggtgcaggt gcaggttctt
61 caactgctcc agcaggatgc cgccgtggcc gtgcacgatg gccttgggca ggcctgtggt
121 ccccgacgag tacagcaccc atagcggatg gtcgaacggc agcggggtga actccagttc
181 cgcgccttcg cccgcggctt cgaactccgc ccaggacagg gtgtcggcga cagggccgca
241 gcccaggtac ggcaggacga cggtgtgctg caggctgggc atgccgtcgc gcagggcttt
301 gagcacgtca cggcggtcga agtccttacc gccgtagcgg tagccgtcca cggccagcag
361 cactttcggt tcgatctgcg cgaaccggtc gaggacgctg cgcaccccga agtcggggga
421 acaggacgac caggtcgcac cgatcgcggc gcaggcgagg aatgcggccg tcgcctcggc
481 gatgttcggc aggtaggcca cgacccggtc gccggggccc accccgaggc tgcggagggc
541 cgcagcgatc gcggcggtgc gggtccgcag ttctccccag gtccactcgg tcaacggccg
601 gagttcggac gcgtgccgga tcgccacggc tgatgggtca cggtcgcgga agatgtgctc
661 ggcgtagttg agggtggcgc cggggaacca gacggcgccg ggcatggcgt cggaggcgag
721 cactgtggtg tacggggtgg cggcgcgcac ccggtagtac tcccagatcg cggaccagaa
781 tccttcgagg tcggttaccg accagcgcca cagtgcctcg tagtccggtg cgtccacacc
841 gcggtgctcc cgcacccagc gggtgaacgc ggtgaggttg gcgcgttctt tgcgctcctc
901 gtcgggactc cacaggatcg gcggctgcgg cttgagtgtc atgaaacgcg accccttcgt
961 ggacggtgcg gatgcggtga gcgtcgggtg cctcccctaa cgctccccgg tgacggagtg
1021 ttgtgcacca catctagcac gcgggacgcg gaaaccgtat ggagaaaaca cctacaaccc
1081 cggccggacg gtgggtttcg gccacactta ggggtcgggt gcctgcttgc cgggcagggc
1141 agtcccgggg tgctgtggtg cgggcgggag ggctgtcgct tcgaggtgtg ccggcgggac
1201 actccgggcc tcagccgtac ccgcaacggg gacagttctc ctcccttccg ggctggatgg
1261 tcccttcccc cgaaatgcgg cgagatctcc cagtcagccc ggaaaacacc cgctgtgccc
1321 aggtactctt tgcttcgaac agacaggccg gacggtccac gggggaggtt tgtgggcagc
1381 ggaccacgtg cggcgaccag acgacggttg ttcctcggta tccccgctct tgtacttgtg
1441 acagcgctca cgctggtctt ggctgtcccg acggggcgcg agacgctgtg gcgcatgtgg
1501 tgtgaggcca cccaggactg gtgcctgggg gtgccggtcg actcccgcgg acagcctgcg
1561 gaggacggcg agtttctgct gctttctccg gtccaggcag cgacctgggg gaactattac
1621 gcgctcgggg attcgtactc ttcgggggac ggggcccgcg actactatcc cggcaccgcg
1681 gtgaagggcg gttgctggcg gtccgctaac gcctatccgg agctggtcgc cgaagcctac
1741 gacttcgccg gacacttgtc gttcctggcc tgcagcggcc agcgcggcta cgccatgctt
1801 gacgctatcg acgaggtcgg ctcgcagctg gactggaact cccctcacac gtcgctggtg
1861 acgatcggga tcggcggcaa cgatctgggg ttctccacgg ttttgaagac ctgcatggtg
1921 cgggtgccgc tgctggacag caaggcgtgc acggaccagg aggacgctat ccgcaagcgg
1981 atggcgaaat tcgagacgac gtttgaagag ctcatcagcg aagtgcgcac ccgcgcgccg
2041 gacgcccgga tccttgtcgt gggctacccc cggatttttc cggaggaacc gaccggcgcc
2101 tactacacgc tgaccgcgag caaccagcgg tggctcaacg aaaccattca ggagttcaac
2161 cagcagctcg ccgaggctgt cgcggtccac gacgaggaga ttgccgcgtc gggcggggtg
2221 ggcagcgtgg agttcgtgga cgtctaccac gcgttggacg gccacgagat cggctcggac
2281 gagccgtggg tgaacggggt gcagttgcgg gacctcgcca ccggggtgac tgtggaccgc
2341 agtaccttcc accccaacgc cgctgggcac cgggcggtcg gtgagcgggt catcgagcag
2401 atcgaaaccg gcccgggccg tccgctctat gccactttcg cggtggtggc gggggcgacc
2461 gtggacactc tcgcgggcga ggtggggtga cccggcttac cgtccggccc gcaggtctgc
2521 gagcactgcg gcgatctggt ccactgccca gtgcagttcg tcttcggtga tgaccagcgg
2581 cggggagagc cggatcgttg agccgtgcgt gtctttgacg agcacacccc gctgcaggag
2641 ccgttcgcac agttctcttc cggtggccag agtcgggtcg acgtcgatcc cagcccacag
2701 gccgatgctg cgggccgcga ccacgccgtt gccgaccagt tggtcgaggc gggcgcgcag
2761 cacgggggcg agggcgcgga catggtccag gtaagggccg tcgcggacga ggctcaccac
2821 ggcagtgccg accgcgcagg cgagggcgtt gccgccgaag gtgctgccgt gctggccggg
2881 gcggatcacg tcgaagactt ccgcgtcgcc taccgccgcc gccacgggca ggatgccgcc
2941 gcccagcgct ttgccgaaca ggtagatatc ggcgtcgact ccgctgtggt cgcaggcccg
//
テルモビフィダ＼フスカ＼−ＧＤＳｘ
配列番号６０
1 vgsgpraatr rrlflgipal vlvtaltlvl avptgretlw rmwceatqdw clgvpvdsrg
61 qpaedgefll lspvqaatwg nyyalgdsys sgdgardyyp gtavkggcwr sanaypelva
121 eaydfaghls flacsgqrgy amldaidevg sqldwnspht slvtigiggn dlgfstvlkt
181 cmvrvpllds kactdqedai rkrmakfett feelisevrt rapdarilvv gyprifpeep
241 tgayytltas nqrwlnetiq efnqqlaeav avhdeeiaas ggvgsvefvd vyhaldghei
301 gsdepwvngv qlrdlatgvt vdrstfhpna aghravgerv ieqietgpgr plyatfavva
361 gatvdtlage vg
コリネバクテリウム＼エフィシエンス（effciens）＼ＧＤＳｘ  ３００  ａａ
配列番号６１
1 mrttviaasa llllagcadg areetagapp gessggiree gaeastsitd vyialgdsya
61 amggrdqplr gepfclrssg nypellhaev tdltcqgavt gdlleprtlg ertlpaqvda
121 ltedttlvtl siggndlgfg evagcireri agenaddcvd llgetigeql dqlppqldrv
181 heairdragd aqvvvtgylp lvsagdcpel gdvseadrrw aveltgqine tvreaaerhd
241 alfvlpddad ehtscappqq rwadiqgqqt dayplhptsa gheamaaavr dalglepvqp
//
配列番号６２
nt
1 ttctggggtg ttatggggtt gttatcggct cgtcctgggt ggatcccgcc aggtggggta
61 ttcacggggg acttttgtgt ccaacagccg agaatgagtg ccctgagcgg tgggaatgag
121 gtgggcgggg ctgtgtcgcc atgagggggc ggcgggctct gtggtgcccc gcgacccccg
181 gccccggtga gcggtgaatg aaatccggct gtaatcagca tcccgtgccc accccgtcgg
241 ggaggtcagc gcccggagtg tctacgcagt cggatcctct cggactcggc catgctgtcg
301 gcagcatcgc gctcccgggt cttggcgtcc ctcggctgtt ctgcctgctg tccctggaag
361 gcgaaatgat caccggggag tgatacaccg gtggtctcat cccggatgcc cacttcggcg
421 ccatccggca attcgggcag ctccgggtgg aagtaggtgg catccgatgc gtcggtgacg
481 ccatagtggg cgaagatctc atcctgctcg agggtgctca ggccactctc cggatcgata
541 tcgggggcgt ccttgatggc gtccttgctg aaaccgaggt gcagcttgtg ggcttccaat
601 ttcgcaccac ggagcgggac gaggctggaa tgacggccga agagcccgtg gtggacctca
661 acgaaggtgg gtagtcccgt gtcatcattg aggaacacgc cctccaccgc acccagcttg
721 tggccggagt tgtcgtaggc gctggcatcc agaagggaaa cgatctcata tttgtcggtg
781 tgctcagaca tgatcttcct ttgctgtcgg tgtctggtac taccacggta gggctgaatg
841 caactgttat ttttctgtta ttttaggaat tggtccatat cccacaggct ggctgtggtc
901 aaatcgtcat caagtaatcc ctgtcacaca aaatgggtgg tgggagccct ggtcgcggtt
961 ccgtgggagg cgccgtgccc cgcaggatcg tcggcatcgg cggatctggc cggtaccccg
1021 cggtgaataa aatcattctg taaccttcat cacggttggt tttaggtatc cgcccctttc
1081 gtcctgaccc cgtccccggc gcgcgggagc ccgcgggttg cggtagacag gggagacgtg
1141 gacaccatga ggacaacggt catcgcagca agcgcattac tccttctcgc cggatgcgcg
1201 gatggggccc gggaggagac cgccggtgca ccgccgggtg agtcctccgg gggcatccgg
1261 gaggaggggg cggaggcgtc gacaagcatc accgacgtct acatcgccct cggggattcc
1321 tatgcggcga tgggcgggcg ggatcagccg ttacggggtg agccgttctg cctgcgctcg
1381 tccggtaatt acccggaact cctccacgca gaggtcaccg atctcacctg ccagggggcg
1441 gtgaccgggg atctgctcga acccaggacg ctgggggagc gcacgctgcc ggcgcaggtg
1501 gatgcgctga cggaggacac caccctggtc accctctcca tcgggggcaa tgacctcgga
1561 ttcggggagg tggcgggatg catccgggaa cggatcgccg gggagaacgc tgatgattgc
1621 gtggacctgc tgggggaaac catcggggag cagctcgatc agcttccccc gcagctggac
1681 cgcgtgcacg aggctatccg ggaccgcgcc ggggacgcgc aggttgtggt caccggttac
1741 ctgccgctcg tgtctgccgg ggactgcccc gaactggggg atgtctccga ggcggatcgt
1801 cgttgggcgg ttgagctgac cgggcagatc aacgagaccg tgcgcgaggc ggccgaacga
1861 cacgatgccc tctttgtcct gcccgacgat gccgatgagc acaccagttg tgcaccccca
1921 cagcagcgct gggcggatat ccagggccaa cagaccgatg cctatccgct gcacccgacc
1981 tccgccggcc atgaggcgat ggccgccgcc gtccgggacg cgctgggcct ggaaccggtc
2041 cagccgtagc gccgggcgcg cgcttgtcga cgaccaaccc atgccaggct gcagtcacat
2101 ccgcacatag cgcgcgcggg cgatggagta cgcaccatag aggatgagcc cgatgccgac
2161 gatgatgagc agcacactgc cgaagggttg ttccccgagg gtgcgcagag ccgagtccag
2221 acctgcggcc tgctccggat catgggccca accggcgatg acgatcaaca cccccaggat
2281 cccgaaggcg ataccacggg cgacataacc ggctgttccg gtgatgatga tcgcggtccc
2341 gacctgccct gaccccgcac ccgcctccag atcctcccgg aaatcccggg tggccccctt
2401 ccagaggttg tagacacccg cccccagtac caccagcccg gcgaccacaa ccagcaccac
2461 accccagggt tgggatagga cggtggcggt gacatcggtg gcggtctccc catcggaggt
2521 gctgccgccc cgggcgaagg tggaggtggt caccgccagg gagaagtaga ccatggccat
2581 gaccgccccc ttggcccttt ccttgaggtc ctcgcccgcc agcagctggc tcaattgcca
2641 gagtcccagg gccgccaggg cgatgacggc aacccacagg aggaactgcc cacccggagc
2701 ctccgcgatg gtggccaggg cacctgaatt cgaggcctca tcacccgaac cgccggatcc
2761 agtggcgatg cgcaccgcga tccacccgat gaggatgtgc agtatgccca ggacaatgaa
2821 accacctctg gccagggtgg tcagcgcggg gtggtcctcg gcctggtcgg cagcccgttc
2881 gatcgtccgt ttcgcggatc tggtgtcgcc cttatccata gctcccattg aaccgccttg
2941 aggggtgggc ggccactgtc agggcggatt gtgatctgaa ctgtgatgtt ccatcaaccc
//
ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）＼アロマティシボランス（aromaticivorans）＼ＧＤＳｘ  ２８４  ａａ
配列番号６３
ZP00094165
1 mgqvklfarr capvllalag lapaatvare aplaegaryv algssfaagp gvgpnapgsp
61 ercgrgtlny phllaealkl dlvdatcsga tthhvlgpwn evppqidsvn gdtrlvtlti
121 ggndvsfvgn ifaaacekma spdprcgkwr eiteeewqad eermrsivrq iharaplarv
181 vvvdyitvlp psgtcaamai spdrlaqsrs aakrlarita rvareegasl lkfshisrrh
241 hpcsakpwsn glsapaddgi pvhpnrlgha eaaaalvklv klmk
//
配列番号６４
1 tgccggaact caagcggcgt ctagccgaac tcatgcccga aagcgcgtgg cactatcccg
61 aagaccaggt ctcggacgcc agcgagcgcc tgatggccgc cgaaatcacg cgcgaacagc
121 tctaccgcca gctccacgac gagctgccct atgacagtac cgtacgtccc gagaagtacc
181 tccatcgcaa ggacggttcg atcgagatcc accagcagat cgtgattgcc cgcgagacac
241 agcgtccgat cgtgctgggc aagggtggcg cgaagatcaa ggcgatcgga gaggccgcac
301 gcaaggaact ttcgcaattg ctcgacacca aggtgcacct gttcctgcat gtgaaggtcg
361 acgagcgctg ggccgacgcc aaggaaatct acgaggaaat cggcctcgaa tgggtcaagt
421 gaagctcttc gcgcgccgct gcgccccagt acttctcgcc cttgccgggc tggctccggc
481 ggctacggtc gcgcgggaag caccgctggc cgaaggcgcg cgttacgttg cgctgggaag
541 ctccttcgcc gcaggtccgg gcgtggggcc caacgcgccc ggatcgcccg aacgctgcgg
601 ccggggcacg ctcaactacc cgcacctgct cgccgaggcg ctcaagctcg atctcgtcga
661 tgcgacctgc agcggcgcga cgacccacca cgtgctgggc ccctggaacg aggttccccc
721 tcagatcgac agcgtgaatg gcgacacccg cctcgtcacc ctgaccatcg gcggaaacga
781 tgtgtcgttc gtcggcaaca tcttcgccgc cgcttgcgag aagatggcgt cgcccgatcc
841 gcgctgcggc aagtggcggg agatcaccga ggaagagtgg caggccgacg aggagcggat
901 gcgctccatc gtacgccaga tccacgcccg cgcgcctctc gcccgggtgg tggtggtcga
961 ttacatcacg gtcctgccgc catcaggcac ttgcgctgcc atggcgattt cgccggaccg
1021 gctggcccag agccgcagcg ccgcgaaacg gcttgcccgg attaccgcac gggtcgcgcg
1081 agaagagggt gcatcgctgc tcaagttctc gcatatctcg cgccggcacc atccatgctc
1141 tgccaagccc tggagcaacg gcctttccgc cccggccgac gacggcatcc cggtccatcc
1201 gaaccggctc ggacatgctg aagcggcagc ggcgctggtc aagcttgtga aattgatgaa
1261 gtagctactg cactgatttc aaatagtatt gcctgtcagc tttccagccc ggattgttgc
1321 agcgcaacag aaacttgtcc gtaatggatt gatggtttat gtcgctcgca aattgccgtc
1381 gaagggaacg ggcgcgtcgc tcgttaacgt cctgggtgca gcagtgacgg agcgcgtgga
1441 tgagtgatac tggcggtgtc atcggtgtac gcgccgccat tcccatgcct gtacgcgccg
//
Ｓ．コエリコラー（coelicolor）＼ＧＤＳｘ  ２６８  ａａ
配列番号６５
NP625998.
1 mrrfrlvgfl sslvlaagaa ltgaataqaa qpaaadgyva lgdsyssgvg agsyisssgd
61 ckrstkahpy lwaaahspst fdftacsgar tgdvlsgqlg plssgtglvs isiggndagf
121 adtmttcvlq sessclsria taeayvdstl pgkldgvysa isdkapnahv vvigyprfyk
181 lgttciglse tkrtainkas dhlntvlaqr aaahgftfgd vrttftghel csgspwlhsv
241 nwlnigesyh ptaagqsggy lpvlngaa
//
配列番号６６
1 cccggcggcc cgtgcaggag cagcagccgg cccgcgatgt cctcgggcgt cgtcttcatc
61 aggccgtcca tcgcgtcggc gaccggcgcc gtgtagttgg cccggacctc gtcccaggtg
121 cccgcggcga tctggcgggt ggtgcggtgc gggccgcgcc gaggggagac gtaccagaag
181 cccatcgtca cgttctccgg ctgcggttcg ggctcgtccg ccgctccgtc cgtcgcctcg
241 ccgagcacct tctcggcgag gtcggcgctg gtcgccgtca ccgtgacgtc ggcgccccgg
301 ctccagcgcg agatcagcag cgtccagccg tcgccctccg ccagcgtcgc gctgcggtcg
361 tcgtcgcggg cgatccgcag cacgcgcgcg ccgggcggca gcagcgtggc gccggaccgt
421 acgcggtcga tgttcgccgc gtgcgagtac ggctgctcac ccgtggcgaa acggccgagg
481 aacagcgcgt cgacgacgtc ggacggggag tcgctgtcgt ccacgttgag ccggatcggc
541 agggcttcgt gcgggttcac ggacatgtcg ccatgatcgg gcacccggcc gccgcgtgca
601 cccgctttcc cgggcacgca cgacaggggc tttctcgccg tcttccgtcc gaacttgaac
661 gagtgtcagc catttcttgg catggacact tccagtcaac gcgcgtagct gctaccacgg
721 ttgtggcagc aatcctgcta agggaggttc catgagacgt ttccgacttg tcggcttcct
781 gagttcgctc gtcctcgccg ccggcgccgc cctcaccggg gcagcgaccg cccaggcggc
841 ccaacccgcc gccgccgacg gctatgtggc cctcggcgac tcctactcct ccggggtcgg
901 agcgggcagc tacatcagct cgagcggcga ctgcaagcgc agcacgaagg cccatcccta
961 cctgtgggcg gccgcccact cgccctccac gttcgacttc accgcctgtt ccggcgcccg
1021 tacgggtgat gttctctccg gacagctcgg cccgctcagc tccggcaccg gcctcgtctc
1081 gatcagcatc ggcggcaacg acgccggttt cgccgacacc atgacgacct gtgtgctcca
1141 gtccgagagc tcctgcctgt cgcggatcgc caccgccgag gcgtacgtcg actcgacgct
1201 gcccggcaag ctcgacggcg tctactcggc aatcagcgac aaggcgccga acgcccacgt
1261 cgtcgtcatc ggctacccgc gcttctacaa gctcggcacc acctgcatcg gcctgtccga
1321 gaccaagcgg acggcgatca acaaggcctc cgaccacctc aacaccgtcc tcgcccagcg
1381 cgccgccgcc cacggcttca ccttcggcga cgtacgcacc accttcaccg gccacgagct
1441 gtgctccggc agcccctggc tgcacagcgt caactggctg aacatcggcg agtcgtacca
1501 ccccaccgcg gccggccagt ccggtggcta cctgccggtc ctcaacggcg ccgcctgacc
1561 tcaggcggaa ggagaagaag aaggagcgga gggagacgag gagtgggagg ccccgcccga
1621 cggggtcccc gtccccgtct ccgtctccgt cccggtcccg caagtcaccg agaacgccac
1681 cgcgtcggac gtggcccgca ccggactccg cacctccacg cgcacggcac tctcgaacgc
1741 gccggtgtcg tcgtgcgtcg tcaccaccac gccgtcctgg cgcgagcgct cgccgcccga
1801 cgggaaggac agcgtccgcc accccggatc ggagaccgac ccgtccgcgg tcacccaccg
1861 gtagccgacc tccgcgggca gccgcccgac cgtgaacgtc gccgtgaacg cgggtgcccg
1921 gtcgtgcggc ggcggacagg cccccgagta gtgggtgcgc gagcccacca cggtcacctc
1981 caccgactgc gctgcggggc
//
Ｓ．アベルミチリス（avermitilis）＼ＧＤＳｘ  ２６９  ａａ
配列番号６７
NP827753.
1 mrrsritayv tslllavgca ltgaataqas paaaatgyva lgdsyssgvg agsylsssgd
61 ckrsskaypy lwqaahspss fsfmacsgar tgdvlanqlg tlnsstglvs ltiggndagf
121 sdvmttcvlq sdsaclsrin takayvdstl pgqldsvyta istkapsahv avlgyprfyk
181 lggsclagls etkrsainda adylnsaiak raadhgftfg dvkstftghe icssstwlhs
241 ldllnigqsy hptaagqsgg ylpvmnsva
//
配列番号６８
1 ccaccgccgg gtcggcggcg agtctcctgg cctcggtcgc ggagaggttg gccgtgtagc
61 cgttcagcgc ggcgccgaac gtcttcttca ccgtgccgcc gtactcgttg atcaggccct
121 tgcccttgct cgacgcggcc ttgaagccgg tgcccttctt gagcgtgacg atgtagctgc
181 ccttgatcgc ggtgggggag ccggcggcga gcaccgtgcc ctcggccggg gtggcctggg
241 cgggcagtgc ggtgaatccg cccacgaggg cgccggtcgc cacggcggtt atcgcggcga
301 tccggatctt cttgctacgc agctgtgcca tacgagggag tcctcctctg ggcagcggcg
361 cgcctgggtg gggcgcacgg ctgtgggggg tgcgcgcgtc atcacgcaca cggccctgga
421 gcgtcgtgtt ccgccctggg ttgagtaaag cctcggccat ctacgggggt ggctcaaggg
481 agttgagacc ctgtcatgag tctgacatga gcacgcaatc aacggggccg tgagcacccc
541 ggggcgaccc cggaaagtgc cgagaagtct tggcatggac acttcctgtc aacacgcgta
601 gctggtacga cggttacggc agagatcctg ctaaagggag gttccatgag acgttcccga
661 attacggcat acgtgacctc actcctcctc gccgtcggct gcgccctcac cggggcagcg
721 acggcgcagg cgtccccagc cgccgcggcc acgggctatg tggccctcgg cgactcgtac
781 tcgtccggtg tcggcgccgg cagctacctc agctccagcg gcgactgcaa gcgcagttcg
841 aaggcctatc cgtacctctg gcaggccgcg cattcaccct cgtcgttcag tttcatggct
901 tgctcgggcg ctcgtacggg tgatgtcctg gccaatcagc tcggcaccct gaactcgtcc
961 accggcctgg tctccctcac catcggaggc aacgacgcgg gcttctccga cgtcatgacg
1021 acctgtgtgc tccagtccga cagcgcctgc ctctcccgca tcaacacggc gaaggcgtac
1081 gtcgactcca ccctgcccgg ccaactcgac agcgtgtaca cggcgatcag cacgaaggcc
1141 ccgtcggccc atgtggccgt gctgggctac ccccgcttct acaaactggg cggctcctgc
1201 ctcgcgggcc tctcggagac caagcggtcc gccatcaacg acgcggccga ctatctgaac
1261 agcgccatcg ccaagcgcgc cgccgaccac ggcttcacct tcggcgacgt caagagcacc
1321 ttcaccggcc atgagatctg ctccagcagc acctggctgc acagtctcga cctgctgaac
1381 atcggccagt cctaccaccc gaccgcggcc ggccagtccg gcggctatct gccggtcatg
1441 aacagcgtgg cctgagctcc cacggcctga atttttaagg cctgaatttt taaggcgaag
1501 gtgaaccgga agcggaggcc ccgtccgtcg gggtctccgt cgcacaggtc accgagaacg
1561 gcacggagtt ggacgtcgtg cgcaccgggt cgcgcacctc gacggcgatc tcgttcgaga
1621 tcgttccgct cgtgtcgtac gtggtgacga acacctgctt ctgctgggtc tttccgccgc
1681 tcgccgggaa ggacagcgtc ttccagcccg gatccgggac ctcgcccttc ttggtcaccc
1741 agcggtactc cacctcgacc ggcacccggc ccaccgtgaa ggtcgccgtg aacgtgggcg
1801 cctgggcggt gggcggcggg caggcaccgg agtagtcggt gtgcacgccg gtgaccgtca
1861 ccttcacgga ctgggccggc ggggtcgtcg taccgccgcc gccaccgccg cctcccggag
1921 tggagcccga gctgtggtcg cccccgccgt cggcgttgtc gtcctcgggg gttttcgaac
//
ストレプトミセス  ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素
配列番号６９
ACAGGCCGATGCACGGAACCGTACCTTTCCGCAGTGAAGCGCTCTCCCCCCATCGTTCGC
CGGGACTTCATCCGCGATTTTGGCATGAACACTTCCTTCAACGCGCGTAGCTTGCTACAA
GTGCGGCAGCAGACCCGCTCGTTGGAGGCTCAGTGAGATTGACCCGATCCCTGTCGGCCG
CATCCGTCATCGTCTTCGCCCTGCTGCTCGCGCTGCTGGGCATCAGCCCGGCCCAGGCAG
CCGGCCCGGCCTATGTGGCCCTGGGGGATTCCTATTCCTCGGGCAACGGCGCCGGAAGTT
ACATCGATTCGAGCGGTGACTGTCACCGCAGCAACAACGCGTACCCCGCCCGCTGGGCGG
CGGCCAACGCACCGTCCTCCTTCACCTTCGCGGCCTGCTCGGGAGCGGTGACCACGGATG
TGATCAACAATCAGCTGGGCGCCCTCAACGCGTCCACCGGCCTGGTGAGCATCACCATCG
GCGGCAATGACGCGGGCTTCGCGGACGCGATGACCACCTGCGTCACCAGCTCGGACAGCA
CCTGCCTCAACCGGCTGGCCACCGCCACCAACTACATCAACACCACCCTGCTCGCCCGGC
TCGACGCGGTCTACAGCCAGATCAAGGCCCGTGCCCCCAACGCCCGCGTGGTCGTCCTCG
GCTACCCGCGCATGTACCTGGCCTCGAACCCCTGGTACTGCCTGGGCCTGAGCAACACCA
AGCGCGCGGCCATCAACACCACCGCCGACACCCTCAACTCGGTGATCTCCTCCCGGGCCA
CCGCCCACGGATTCCGATTCGGCGATGTCCGCCCGACCTTCAACAACCACGAACTGTTCT
TCGGCAACGACTGGCTGCACTCACTCACCCTGCCGGTGTGGGAGTCGTACCACCCCACCA
GCACGGGCCATCAGAGCGGCTATCTGCCGGTCCTCAACGCCAACAGCTCGACCTGATCAA
CGCACGGCCGTGCCCGCCCCGCGCGTCACGCTCGGCGCGGGCGCCGCAGCGCGTTGATCA
GCCCACAGTGCCGGTGACGGTCCCACCGTCACGGTCGAGGGTGTACGTCACGGTGGCGCC
GCTCCAGAAGTGGAACGTCAGCAGGACCGTGGAGCCGTCCCTGACCTCGTCGAAGAACTC
CGGGGTCAGCGTGATCACCCCTCCCCCGTAGCCGGGGGCGAAGGCGGCGCCGAACTCCTT
GTAGGACGTCCAGTCGTGCGGCCCGGCGTTGCCACCGTCCGCGTAGACCGCTTCCATGGT
CGCCAGCCGGTCCCCGCGGAACTCGGTGGGGATGTCCGTGCCCAAGGTGGTCCCGGTGGT
GTCCGAGAGCACCGGGGGCTCGTACCGGATGATGTGCAGATCCAAAGAATT
ストレプトミセス  ジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素
配列番号７０
MRLTRSLSAASVIVFALLLALLGISPAQAAGPAYVALGDSYSSGNGAGSYIDSSGDCHRSN
NAYPARWAAANAPSSFTFAACSGAVTTDVINNQLGALNASTGLVSITIGGNDAGFADAMTT
CVTSSDSTCLNRLATATNYINTTLLARLDAVYSQIKARAPNARVVVLGYPRMYLASNPWYC
LGLSNTKRAAINTTADTLNSVISSRATAHGFRFGDVRPTFNNHELFFGNDWLHSLTLPVWE
SYHPTSTGHQSGYLPVLNANSST
【０１７２】
本発明によるジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素の特定
パーム油中のジグリセリドの酵素による低減に対するアッセイ
７％ジグリセリドを含有するパーム油１グラムを蓋付きガラスに計量する。
グリセリン５０ｍｇ及び酵素溶液１０μｌを添加する。反応混合物を加熱チャンバ中で磁気撹拌機を用いて４０℃で２０時間撹拌する。１００℃に１０分間加熱することによって酵素反応を停止させる。酵素溶液の代わりに水１０μｌを添加した基準試料を同様に処理する。試料を標準手順（以下参照）に従ってＧＬＣによって分析し、脂肪酸、モノグリセリド及びジグリセリドの量を計算する。
計算：
ＧＬＣ分析の結果から、遊離脂肪酸の増加及びジグリセリドの減少を計算することができる。
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸（酵素）−％脂肪酸（対照）、
Ｍｖ  Ｆａ＝脂肪酸の平均分子量、
Δ％ジグリセリド＝％ジグリセリド（対照）−％ジグリセリド（酵素）、
Ｍｖ  Ｄｉ＝ジグリセリドの平均分子量、
転移酵素活性は、全酵素活性の百分率として計算される。
2007521804.tif 000003
【０１７３】
ＧＬＣ分析
ＷＣＯＴ溶融シリカカラム１２．５ｍ×０．２５ｍｍ  ＩＤ×０．１μ膜厚５％フェニル−メチル−シリコーン（Chrompack社製CP Sil 8 CB）を備えたPerkin Elmer社製Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph。
キャリアガス：ヘリウム。
インジェクター．PSSIコールドスプリット注入（初期温度５０℃  ３８５℃に昇温）、体積１．０μｌ
検出器  ＦＩＤ：３９５℃
乾燥器プログラム：          １      ２        ３
乾燥器温度、℃              ９０    ２８０    ３５０
等温、時間、ｍｉｎ          １      ０        １０
昇温速度、℃/ｍｉｎ         １５    ４
【０１７４】
試料調製：内部標準ヘプタデカン０．５ｍｇ／ｍｌを含むヘプタン：ピリジン２：１  ９ｍｌに試料３０ｍｇを溶解した。試料溶液３００μｌをクリンプバイアルに移し、ＭＳＴＦＡ（N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoraceamid）３００μｌを添加し、６０℃で２０分間反応させた。
【０１７５】
単離
一態様においては、本発明に使用されるポリペプチド又はタンパク質は、単離された形であることが好ましい。「単離された」という用語は、配列が本来天然に付随し、天然に存在する少なくとも１個の他の成分から、その配列が少なくとも実質的に遊離されていることを意味する。
【０１７６】
精製
一態様においては、本発明に使用されるポリペプチド又はタンパク質は、精製された形であることが好ましい。「精製された」という用語は、配列が比較的純粋な状態、例えば少なくとも純度約５１％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも純度約９０％、少なくとも純度約９５％又は少なくとも純度約９８％であることを意味する。
【０１７７】
本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のクローニング
本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチド又は改変に適切であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドを産生するあらゆる細胞又は生物から単離することができる。ヌクレオチド配列を単離する様々な方法が当技術分野で周知である。
【０１７８】
例えば、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリは、ポリペプチドを産生する生物から得られる染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列が知られている場合には、標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、それを使用して、ポリペプチドをコードするクローンを、生物から調製されるゲノムライブラリから特定することができる。或いは、別の既知のポリペプチド遺伝子と相同な配列を含む標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ポリペプチドをコードするクローンを特定することができる。後者の場合には、厳密性のより低いハイブリッド形成条件及び洗浄条件が使用される。
【０１７９】
或いは、ポリペプチドをコードするクローンは、ゲノムＤＮＡの断片をプラスミドなどの発現ベクターに挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリで酵素陰性細菌を形質転換し、次いでポリペプチドによって阻害される酵素を含む寒天上に形質転換細菌を播くことによって特定することができ、それによってポリペプチドを発現するクローンを特定することができる。
【０１８０】
さらなる別法においては、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、確立された標準方法、例えば、Beucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869に記載されたホスホラミダイト法又はMatthes et al (1984) EMBO J. 3, p 801-805に記載された方法によって合成して調製することができる。ホスホラミダイト法においては、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置中で合成され、精製され、アニールされ、連結され、適切なベクターにクローン化される。
【０１８１】
ヌクレオチド配列は、標準技術に従って合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源の断片を（適宜）連結することによって調製された混合ゲノム・合成起源、混合合成・ｃＤＮＡ起源又は混合ゲノム・ｃＤＮＡ起源とすることができる。連結された各断片は、ヌクレオチド配列全体の様々な部分に対応する。ＤＮＡ配列は、例えば、ＵＳ  ４，６８３，２０２又はSaiki R K et al （Science (1988) 239, pp 487-491）に記載された特異的プライマーを用いたＰＣＲ（polymerase chain reaction）によって調製することもできる。
【０１８２】
ヌクレオチド配列
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本明細書では「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列並びに（その部分などの）その変異体、相同体、断片及び誘導体を意味する。ヌクレオチド配列は、センス鎖であろうとアンチセンス鎖であろうと、２本鎖でも１本鎖でもよいゲノム、合成又は組換え起源とすることができる。
【０１８３】
本発明では「ヌクレオチド配列」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。この用語は、コード配列のＤＮＡ、より好ましくはｃＤＮＡを意味することが好ましい。
【０１８４】
好ましい実施形態においては、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列自体は、やはりその天然環境にあるその天然に付随する配列に連結されたときに、その天然環境における未変性ヌクレオチド配列を包含しない。参照を容易にするために、本発明者らはこの好ましい実施形態を「変性（non-native）ヌクレオチド配列」と称する。この点で、「未変性ヌクレオチド配列」という用語は、その本来の環境にあるヌクレオチド配列全体であって、それが天然に付随し、やはりその本来の環境にあるプロモーター全体に動作可能に連結されるときのヌクレオチド配列全体を意味する。したがって、本発明のポリペプチドは、その固有の生物中のヌクレオチド配列によって発現され得るが、そのヌクレオチド配列は、その生物中の天然に付随するプロモーターの制御下にはない。
【０１８５】
このポリペプチドは、未変性ポリペプチドではないことが好ましい。この点で、「未変性ポリペプチド」という用語は、その本来の環境にあり、その未変性ヌクレオチド配列によって発現されたときのポリペプチド全体を意味する。
【０１８６】
一般に、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製される（すなわち、組換えＤＮＡ）。しかし、本発明の別の実施形態においては、このヌクレオチド配列は、当分野で周知の化学的方法によって全体的又は部分的に合成することができる（Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23及びHorn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232参照）。
【０１８７】
分子進化
酵素をコードするヌクレオチド配列が単離された後に、又は酵素をコードする推定ヌクレオチド配列が特定された後に、選択されたヌクレオチド配列を改変することが望ましいことがあり、例えば、本発明による酵素を調製するためにその配列を変異させることが望ましいことがある。
【０１８８】
変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。
【０１８９】
適切な方法は、Morinaga et al （Biotechnology (1984) 2, p646-649）に開示されている。酵素をコードするヌクレオチド配列に変異を導入する別の方法は、Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151)に記載されている。
【０１９０】
上述したものなどの部位特異的変異誘発の代わりに、例えば、Stratagene社製GeneMorph PCR変異誘発キット、Clontech社製Diversify PCRランダム変異誘発キットなどの市販キットを用いて変異をランダムに導入することができる。ＥＰ  ０  ５８３  ２６５は、ＰＣＲに基づく変異誘発を最適化する方法に言及している。この方法は、ＥＰ  ０  ８６６  ７９６に記載されたものなどの変異原性ＤＮＡアナログの使用と組み合わせることもできる。誤りを犯しやすいＰＣＲ技術は、好ましい諸特性を有する脂質アシル基転移酵素の変異体の生成に適している。国際公開第０２０６４５７号は、リパーゼの分子進化について言及している。
【０１９１】
新規配列を得る第３の方法は、任意の数のDnase Iなどの制限酵素又は酵素を用いて異なるヌクレオチド配列を断片化し、機能タンパク質をコードする完全なヌクレオチド配列を再び組み立てることである。或いは、完全ヌクレオチド配列の再組み立て中に、１個又は複数の異なるヌクレオチド配列を用い、変異を導入することができる。ＤＮＡシャフリング及びファミリーシャフリング技術は、好ましい諸特性を有する脂質アシル基転移酵素変異体の製造に適している。「シャフリング」を実施する適切な方法は、ＥＰ０  ７５２  ００８、ＥＰ１  １３８  ７６３、ＥＰ１  １０３  ６０６にある。シャフリングは、ＵＳ６，１８０，４０６及び国際公開第０１／３４８３５号に記載された別の形のＤＮＡ変異誘発と組み合わせることもできる。
【０１９２】
したがって、多数の部位特異的又は無作為な変異をヌクレオチド配列中にインビボ又はインビトロで生じさせ、続いて、コードされたポリペプチドの機能が改善されたかどうかを様々な手段によってスクリーニングすることができる。コンピュータ及びエキソ媒介（exo mediated）組換え方法（国際公開第００／５８５１７号、ＵＳ６，３４４，３２８、ＵＳ６，３６１，９７４参照）を用いて、例えば、生成される変異体が、既知の酵素又はタンパク質に対して極めて低い相同性を有する分子進化を実施することができる。それによって得られるかかる変異体は、既知の転移酵素に構造がかなり類似しているが、極めて低いアミノ酸配列相同性を有することができる。
【０１９３】
さらに、非限定的な例として、ポリヌクレオチド配列の変異体又は自然変異体は、野生型又は他の変異体若しくは自然変異体と組み換えて新しい変異体を生成することもできる。かかる新しい変異体も、コードされたポリペプチドの機能が改善されたかどうかによってスクリーニングすることができる。
【０１９４】
上述及び類似の分子進化方法を適用することによって、タンパク質構造又は機能の予備知識なしに、好ましい諸特性を有する本発明の酵素の変異体を特定し選択することができ、予測不可能であるが有益な突然変異体又は変異体を生成することができる。当分野では、酵素活性を最適化又は変更するために分子進化を適用した例が多数ある。かかる例としては、以下、すなわち、宿主細胞中又はインビトロで最適化された発現及び／又は活性、酵素活性の増大、基質及び／又は生成物特異性の変化、酵素又は構造安定性の増大又は低下、好ましい環境条件、例えば温度、ｐＨ、基質における酵素活性／特異性の変化の１つ又は複数が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１９５】
当業者には明らかなように、分子進化ツールを使用して、酵素を変化させて酵素の機能を改善することができる。
【０１９６】
適切には、本発明において使用される脂質アシル基転移酵素は変異体とすることができ、すなわち、親酵素と比較したときに少なくとも１個のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むことができる。酵素変異体は、親酵素と少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の相同性を保持する。適切な親酵素としては、エステラーゼ又はリパーゼ活性を有する任意の酵素などが挙げられる。親酵素は、ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整合することが好ましい。
【０１９７】
好ましい実施形態においては、脂質アシル基転移酵素変異体は、ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ及びＨＰＴブロック中のｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列アミノ酸残基の少なくとも１個若しくは複数を保持し、又は含む。
【０１９８】
水系環境において脂質アシル基転移酵素活性がない又は低いリパーゼなどの酵素は、分子進化ツールを用いて変異させて転移酵素活性を導入し又は高めることができ、それによって本発明の組成物及び方法に使用するのに適切なかなりの転移酵素活性を有する脂質アシル基転移酵素を生成することができる。
【０１９９】
適切には、本発明において使用される脂質アシル基転移酵素は、極性脂質、好ましくはリン脂質及び／又は糖脂質に対する酵素活性が親酵素よりも高い変異体とすることができる。かかる変異体は、リゾ極性脂質に対しても低い活性を有するか、又は活性を持たないことが好ましい。極性脂質、リン脂質及び／又は糖脂質に対する高い活性は、加水分解及び／又は転移酵素活性或いは両方の組み合わせの結果かもしれない。
【０２００】
本発明に使用される脂質アシル基転移酵素変異体は、トリグリセリド及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対して親酵素よりも低い活性を有することができる。
【０２０１】
適切には、本酵素変異体は、トリグリセリド及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対して活性を持たなくすることができる。
【０２０２】
或いは、本発明に使用される酵素変異体は、トリグリセリドに対して高い活性を有することができ、且つ／又は以下、すなわち、極性脂質、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、糖脂質、ジガラクトシルモノグリセリド、モノガラクトシルモノグリセリドの１個若しくは複数に対しても高い活性を有することができる。
【０２０３】
脂質アシル基転移酵素の変異体は公知であり、かかる変異体の１個若しくは複数は、本発明による方法及び使用並びに／又は本発明による酵素組成物に使用するのに適切なことがある。単なる例として、脂質アシル基転移酵素の変異体は、以下の参考文献、すなわち、Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15: 266 (2): 997-1000; Robertson et al J. Biol. Chem. 1994 Jan 21; 269(3): 2146-50; Brumlik et al J. Bacteriol 1996 Apr; 178 (7): 2060-4; Peelman et al Protein Sci. 1998 Mar; 7(3):587-99に記載されており、本発明によって使用することができる。
【０２０４】
アミノ酸配列
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列も包含する。
【０２０５】
本明細書では「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語及び／又は「タンパク質」という用語と同義である。「アミノ酸配列」という用語が「ペプチド」という用語と同義である場合もある。
【０２０６】
アミノ酸配列は、適切な出所から調製／単離することができ、或いは組換えＤＮＡ技術を用いて合成又は調製することができる。
【０２０７】
適切には、アミノ酸配列は、本明細書に教示される単離ポリペプチドから標準技術によって得ることができる。
【０２０８】
単離ポリペプチドからアミノ酸配列を決定するのに適切な一方法は以下のとおりである。
【０２０９】
精製ポリペプチドを凍結乾燥させ、その凍結乾燥材料１００μｇを８Ｍ尿素と０．４Ｍ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ８．４の混合物５０μｌに溶解させることができる。溶解されたタンパク質を変性し、窒素で覆い、４５ｍＭジチオスレイトール５μｌを添加した後に、５０℃で１５分間還元することができる。室温に冷却後、１００ｍＭヨードアセトアミド５μｌを添加し、窒素下、暗所において室温で１５分間システイン残基を誘導体化することができる。
【０２１０】
水１３５μｌ及びエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ  ５μｇの５μｌ水溶液を上記反応混合物に添加し、窒素下３７℃で２４時間消化することができる。
【０２１１】
生成したペプチドは、逆相ＨＰＬＣによってVYDAC C18カラム（０．４６×１５ｃｍ；１０μｍ；The Separation Group, California, USA）上で溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液及び溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡのアセトニトリル溶液を用いて分離することができる。選択されたペプチドをDevelosil Ｃ18カラム上で同じ溶媒系を用いて再度クロマトグラフにかけた後、Ｎ末端の配列を決定することができる。配列決定は、Applied Biosystems 476A配列決定装置を用い、製造者（Applied Biosystems, California, USA）の指示に従ってパルス液体高速サイクル（pulsed liquid fast cycles）を用いて実施することができる。
【０２１２】
配列同一性又は配列相同性
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の配列同一性又は配列相同性を有する配列、或いはかかるポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列の使用も包含する（以下「相同配列」と記述する）。ここで、「相同体」という用語は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列とある相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性」という用語は「同一性」と同等とみなすことができる。
【０２１３】
相同アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、機能活性を保持するポリペプチド及び／又は酵素の活性を高めるポリペプチドを提供及び／又はコードすべきである。
【０２１４】
本明細書において、相同配列は、対象配列に少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であり得るアミノ酸配列を含むと解釈される。一般に、相同体は、対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。相同性は類似性の点から考えることもできるが（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明では配列同一性の点から相同性を表現することが好ましい。
【０２１５】
本明細書において相同配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（対象配列）に少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと解釈される。一般に、相同体は、対象配列と同じ、活性部位などをコードする配列を含む。相同性は類似性の点から考えることもできるが（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明では配列同一性の点から相同性を表現することが好ましい。
【０２１６】
相同性比較は、目視によって、又はより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを利用して実施することができる。これらの市販コンピュータプログラムは、２個以上の配列間の％相同性を計算することができる。
【０２１７】
％相同性は、隣接配列にわたって計算することができる。すなわち、一方の配列はもう一方の配列とアラインメントさせ、一方の配列中の各アミノ酸はもう一方の配列中の対応するアミノ酸と１回に１個の残基が直接比較される。これは、「ギャップのない」アラインメントと呼ばれる。一般に、かかるギャップのないアラインメントは、比較的少数の残基にわたってのみ実施される。
【０２１８】
これは極めて単純で一貫性のある方法ではあるが、例えば、それ以外は同一である配列対における１つの挿入又は欠失によって後続のアミノ酸残基がアラインメントから排除され、したがって、全体的なアラインメントを実施したときに％相同性が大きく低下する可能性があることを考慮していない。その結果、ほとんどの配列比較方法は、全体の相同性スコアを不当に減少させずに、起こり得る挿入及び欠失を考慮する最適なアラインメントとなるように設計されている。これは、「ギャップ」を配列アラインメントに挿入して局所的相同性が最大になるようにすることによって実施される。
【０２１９】
しかし、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸の場合に、２個の比較配列間の高い関連性を反映してギャップができるだけ少ない配列アラインメントが、ギャップが多い配列アラインメントよりも高いスコアが得られるように、アラインメント中に存在する各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。ギャップの存在に対しては比較的高いコストを課し、ギャップにおける各後続残基に対してはペナルティを減少させる「アフィンギャップコスト」が一般に使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティが、ギャップのより少ない最適なアラインメントを生じることは言うまでもない。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかし、かかるソフトウエアを配列比較に用いるときには、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用するときには、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップに対しては−１２であり、各伸長に対しては−４である。
【０２２０】
したがって、最大％相同性の計算は、まず、ギャップペナルティを考慮して、最適なアラインメントを作成する必要がある。このようなアラインメントを実行するのに適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387）である。配列比較を実施することができる他のソフトウエアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18参照）、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410）、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールスイートなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡの両方ともオフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ausubel et al 1999, pages 7-58 to 7-60参照）。しかし、一部の適用例では、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールは、タンパク質及びヌクレオチド配列を比較することもできる（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8及びtatiana@ncbi.nlm.nih.gov参照）。
【０２２１】
最終％相同性は同一性の点から測定することができるが、アラインメントプロセス自体は全か無かの対比較には一般に基づいていない。その代わり、化学的類似度又は進化距離に基づいて各対ごとの比較に対してスコアが割り当てられるスケールド類似度スコアマトリックス（scaled similarity score matrix）が一般に使用される。通常使用されるかかるマトリックスの例は、ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルトマトリックスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、公開デフォルト値又はもし提供されていれば個別のシンボル比較表（symbol comparison table）を一般に使用する（さらなる詳細については利用者マニュアルを参照されたい）。一部の適用例では、ＧＣＧパッケージの場合には公開デフォルト値を、他のソフトウエアの場合にはＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。
【０２２２】
或いは、相同性百分率は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244）に類似したアルゴリズムに基づくＤＮＡＳＩＳ（商標）（Hitachi Software社製）の複数のアラインメント機能を用いて計算することができる。
【０２２３】
ソフトウエアが最適なアラインメントを作成した後に、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能になる。ソフトウエアは、一般に、配列比較の一部としてこれを実行し、数値結果を与える。
【０２２４】
配列は、サイレントな変化をもたらし機能的に等価な物質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を含むこともある。物質の二次結合活性（secondary binding activity）が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性に基づいて、計画的なアミノ酸置換を実施することができる。例えば、負に帯電したアミノ酸としてはアスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられ、正に帯電したアミノ酸としてはリジン、アルギニンなどが挙げられ、類似した親水性値を有する無電荷極性頭部基を含むアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシンなどが挙げられる。
【０２２５】
保存的置換は、例えば下表に従って実施することができる。第２カラムの同じブロックのアミノ酸及び好ましくは第３カラムの同じ行のアミノ酸は互いに置換することができる。
【０２２６】
2007521804.tif 000004
【０２２７】
本発明は、起こり得る相同置換（置換と交換は、本明細書ではともに、既存のアミノ酸残基と別の残基を取り替えることを意味する）、すなわち、塩基性残基と塩基性残基、酸性残基と酸性残基、極性残基と極性残基などの同種（ｌｉｋｅ−ｆｏｒ−ｌｉｋｅ）置換も包含する。非相同置換、すなわち、１クラスの残基から別のクラスの残基への非相同置換、或いはオルニチン（以後、Ｚと記述する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後、Ｂと記述する）、ノルロイシンオルニチン（以後、Ｏと記述する）、ピリイルアラニン（ｐｙｒｉｙｌａｌａｎｉｎｅ）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシンなどの人為的なアミノ酸の介在も含む非相同置換も起こることがある。
【０２２８】
交換は、人為的（unnatural）アミノ酸によっても成されうる。
【０２２９】
変異体アミノ酸配列は、グリシン、β−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチル、プロピル基などのアルキル基を含めて、配列の任意の２個のアミノ酸残基の間に挿入することができる適切なスペーサー基を含むことができる。さらに別の形の変異は、１個又は複数のペプトイド型アミノ酸残基の存在を含み、当業者には十分知られている。不確かさを回避するために、「ペプトイド型」は、α−炭素置換基が残基のα−炭素ではなく窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を意味するために使用される。ペプトイド型ペプチドを調製する方法は当分野、例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371及びHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134において公知である。
【０２３０】
本発明に使用されるヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、合成又は改変ヌクレオチドをその中に含むことができる。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる改変タイプが当分野で知られている。これらの改変は、メチルホスホネート骨格及びホスホロチオエート骨格並びに／或いは分子の３’末端及び／又は５’末端におけるアクリジン鎖又はポリリジン鎖の付加を含む。本発明では、本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、当分野で利用可能な任意の方法によって改変できることを理解されたい。かかる改変は、ヌクレオチド配列のインビボでの活性を高め又は寿命を延ばすために実施することができる。
【０２３１】
本発明は、本明細書に考察される配列又は任意の誘導体、その断片若しくは誘導体に相補的であるヌクレオチド配列の使用も包含する。配列がその断片に相補的である場合には、その配列をプローブとして使用して他の生物などにおける類似のコード配列を特定することができる。
【０２３２】
本発明の配列に１００％相同ではないが、本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドは、いくつかの方法で得ることができる。本明細書に記載される配列の他の変異体は、例えば、ある範囲の個体、例えば、異なる集団からの個体で構成されるＤＮＡライブラリを探索することによって得ることができる。また、他のウイルス／細菌又は細胞の相同体、特に哺乳動物細胞（例えばラット、マウス、ウシ及び霊長類細胞）中にある細胞相同体を得ることができ、かかる相同体及びその断片は、一般に、本明細書の配列リストに示される配列と選択的にハイブリッド形成することができる。かかる配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリ又はゲノムＤＮＡライブラリを探索することによって、また、添付された配列リスト中の配列のいずれか１つの全部又は一部を含むプローブを用いて中度から高度の厳密性の条件下でかかるライブラリを探索することによって、得ることができる。本発明のポリペプチド又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体を得るために、類似の考察が適用される。
【０２３３】
変異体及び系統／種相同体は、本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコードする変異体及び相同体内の配列を標的にするように設計されたプライマーを使用した縮重ＰＣＲによって得ることもできる。保存配列は、例えば、いくつかの変異体／相同体から得られるアミノ酸配列をアラインメントさせることによって予測することができる。配列アラインメントは、当分野で公知のコンピュータソフトウエアを使用して実施することができる。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられる。
【０２３４】
縮重ＰＣＲに使用されるプライマーは、１個又は複数の縮重位置を含み、既知の配列に対する単一配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用される厳密性よりも低い厳密性の条件で使用される。
【０２３５】
或いは、かかるポリヌクレオチドは、特徴の明らかな配列の部位特異的変異誘発によって得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞に対してコドン優先度を最適化するためにサイレントなコドン配列変化が必要な場合に有用となり得る。制限ポリペプチド認識部位を導入するために、或いはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性又は機能を変えるために、別の配列変化が望まれる場合もある。
【０２３６】
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）を使用して、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、選択的増幅反応用プライマー、プローブ、例えば放射性又は非放射性標識を用いて従来の手段によって明示用標識（revealing label）で標識されたプローブを作製することができ、或いはこのポリヌクレオチドをベクターにクローン化することができる。かかるプライマー、プローブ及び他の断片は、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０又は４０ヌクレオチド長であり、本明細書において使用される本発明のポリヌクレオチドという用語によってやはり包含される。
【０２３７】
本発明によるＤＮＡポリヌクレオチド、プローブなどのポリヌクレオチドは、組換え、合成又は当業者に利用可能なあらゆる手段によって作製することができる。これらは、標準技術によってクローン化することもできる。
【０２３８】
一般に、プライマーは、所望の核酸配列を１回に１個のヌクレオチドで段階的に製造することを含めた合成手段によって作製される。自動化技術を用いてこれを実施する技術は、当分野で容易に利用することができる。
【０２３９】
より長鎖のポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段、例えば、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）クローニング技術を用いて作製される。ＰＣＲクローニング技術は、クローン化が求められる脂質ターゲティング配列領域に隣接する１対のプライマー（例えば、約１５から３０ヌクレオチド）を作製すること、そのプライマーを動物又はヒト細胞から得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触させること、前記所望領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、増幅断片を（例えば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することによって）単離すること及び増幅ＤＮＡを回収することを含む。プライマーは、増幅ＤＮＡを適切なクローニングベクターにクローン化することができるように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計することができる。
【０２４０】
ハイブリッド形成法
本発明は、本発明の配列に相補的である配列、或いは本発明の配列又はそれに相補的である配列とハイブリッド形成可能である配列も包含する。
【０２４１】
本明細書では「ハイブリッド形成法」という用語は、「核酸の鎖が塩基対形成によって相補鎖と連結されるプロセス」及びＰＣＲ（polymerase chain reaction）技術において実施される増幅プロセスを含むものとする。
【０２４２】
本発明は、本明細書に考察される対象配列又は任意の誘導体、その断片若しくは誘導体に相補的である配列とハイブリッド形成可能であるヌクレオチド配列の使用も包含する。
【０２４３】
本発明は、本明細書で考察されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能な配列に相補的である配列も包含する。
【０２４４】
ハイブリッド形成条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA）に教示されたようにヌクレオチド結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、以下に説明される規定の「厳密性」を与えるものである。
【０２４５】
最大の厳密性は、一般に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低温）で得られ、高度の厳密性はＴｍよりも約５℃から１０℃低温、中度の厳密性はＴｍよりも約１０℃から２０℃低温、低度の厳密性はＴｍよりも約２０℃から２５℃低温で得られる。当業者には理解されるように、最大の厳密性のハイブリッド形成法は、同一ヌクレオチド配列を特定又は検出するために使用することができ、中度（又は低度）の厳密性のハイブリッド形成法は、類似又は関係するポリヌクレオチド配列を特定又は検出するために使用することができる。
【０２４６】
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と高度の厳密性条件又は中度の厳密性条件下でハイブリッド形成可能である配列に相補的な配列を包含することが好ましい。
【０２４７】
より好ましくは、本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と高度の厳密性条件下（例えば、６５℃及び０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ  ｐＨ７．０｝）でハイブリッド形成可能である配列に相補的な配列を包含する。
【０２４８】
本発明は、（本明細書で考察されるヌクレオチド配列の相補的配列も含めて）本明細書で考察されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列にも関する。
【０２４９】
本発明は、（本明細書で考察されるヌクレオチド配列の相補的配列も含めて）本明細書で考察されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる配列に相補的であるヌクレオチド配列にも関する。
【０２５０】
本明細書で考察されるヌクレオチド配列と中度から最大の厳密性条件下でハイブリッド形成することができるポリヌクレオチド配列も本発明の範囲内に含まれる。
【０２５１】
好ましい態様においては、本発明は、本明細書で考察されるヌクレオチド配列又はその補体と厳密な条件下（例えば、５０℃及び０．２ｘＳＳＣ）でハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を包含する。
【０２５２】
より好ましい態様においては、本発明は、本明細書で考察されるヌクレオチド配列又はその補体と高度の厳密性条件下（例えば、６５℃及び０．１ｘＳＳＣ）でハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を包含する。
【０２５３】
ポリペプチドの発現
本発明に使用されるヌクレオチド配列又は本明細書に定義される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、複製可能な組換えベクターに組み込むことができる。このベクターを使用して、適合した宿主細胞中で、且つ／又は適合した宿主細胞から、ヌクレオチド配列を複製し、ポリペプチドの形で発現させることができる。発現は、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む調節配列を用いて制御することができる。原核生物プロモーター及び真核細胞中で機能するプロモーターを使用することができる。組織特異的又は刺激特異的プロモーターを使用することができる。上記２種類以上の異なるプロモーターに由来する配列要素を含むキメラプロモーターを使用することもできる。
【０２５４】
ヌクレオチド配列の発現によって宿主組換え細胞によって産生されるポリペプチドは、使用される配列及び／又はベクターに応じて分泌されても、細胞内に含まれてもよい。コード配列は、特定の原核細胞膜又は真核細胞膜を通って物質コード配列（substance coding sequence）の分泌を誘導するシグナル配列を用いて設計することができる。
【０２５５】
発現ベクター
「発現ベクター」という用語は、インビボ又はインビトロでの発現が可能な構築体を意味する。
【０２５６】
発現ベクターは、生物のゲノム中に組み込まれることが好ましい。「組み込む」という用語は、ゲノム中への安定な組み込みを好ましくは包含する。
【０２５７】
本発明のヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はベクター中に存在することができ、そのベクター中でヌクレオチド配列は、制御配列がヌクレオチド配列の発現を適切な宿主生物によってもたらすことができるように、制御配列に作動可能に結合される。すなわち、このベクターは発現ベクターである。
【０２５８】
本発明のベクターは、以下に示される適切な宿主細胞に形質転換されて、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドを発現することができる。
【０２５９】
ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス又はファージベクターの選択は、それが導入される宿主細胞によって決まることが多い。
【０２６０】
ベクターは、抗生物質抵抗性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン抵抗性を与える遺伝子などの１個又は複数の選択可能な標識遺伝子を含むことができる。或いは、選択は、（国際公開第９１／１７２４３号に記載された）同時形質転換によって実施することができる。
【０２６１】
ベクターは、インビトロで、例えばＲＮＡの産生に使用することができ、又は宿主細胞に形質移入し、又は宿主細胞を形質転換するのに使用することができる。
【０２６２】
したがって、さらなる実施形態においては、本発明は、複製可能なベクター中にヌクレオチド配列を導入し、そのベクターを適合性宿主細胞に導入し、そのベクターの複製をもたらす諸条件下でその宿主細胞を増殖させることによって、本発明のヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。
【０２６３】
ベクターは、さらに、当該宿主細胞中でベクターを複製することができるヌクレオチド配列を含むことができる。かかる配列の例は、プラスミドpUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1及びpIJ702の複製開始点である。
【０２６４】
制御配列
一部の適用例においては、本発明に使用されるヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞などによって、ヌクレオチド配列の発現を可能にする制御配列に作動可能に結合することができる。例として、本発明は、かかる制御配列に作動可能に結合した本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを包含する。すなわち、このベクターは発現ベクターである。
【０２６５】
「作動可能に結合され」という用語は、記述された成分が意図したように機能できる関係にある近位を指す。コード配列に「作動可能に結合され」る制御配列は、調節配列に適合した諸条件下でコード配列が発現されるように連結される。
【０２６６】
「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む。
【０２６７】
「プロモーター」という用語は、当技術分野の通常の意味で使用され、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
【０２６８】
本明細書に規定される具体的諸特性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の発現増大は、異種調節領域、例えばプロモーター領域、分泌リーダー領域及びターミネーター領域を選択することによって実施することもできる。
【０２６９】
本発明のヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターに作動可能に結合できることが好ましい。
【０２７０】
細菌、真菌又は酵母宿主中でヌクレオチド配列の転写を誘導するのに適切なプロモーターの例は、当分野で周知である。
【０２７１】
構築体
「構築体」という用語は、「抱合体」、「カセット」、「ハイブリッド」などの用語と同義であり、プロモーターに直接又は間接的に結合し、本発明によって使用される、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。間接的な結合の例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列の間に介在するＳｈ１−イントロン、ＡＤＨイントロンなどのイントロン配列などの適切なスペーサー基の提供である。直接又は間接的結合を含む、本発明に関係する「融合」という用語でも同じことが当てはまる。これらの用語は、野生型遺伝子プロモーターを通常伴うタンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組み合わせを、それらがどちらも天然環境にあるときに包含しない場合もある。
【０２７２】
構築体は、さらに、遺伝子構築体の選択を可能にするマーカーを含み、発現させることもできる。
【０２７３】
一部の適用例では、構築体は、プロモーターに作動可能に結合された、少なくとも本発明のヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
【０２７４】
宿主細胞
本発明に関係する「宿主細胞」という用語は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドの組換え産生に使用される上記発現ベクターのどちらかを含む任意の細胞を含む。
【０２７５】
したがって、本発明の別の実施形態は、本発明のヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドを発現するヌクレオチド配列で形質転換された、又はそれを形質移入した宿主細胞を提供する。これらの細胞は、前記ベクターに適合するように選択され、例えば、原核（例えば、細菌）細胞、真菌細胞、酵母細胞又は植物細胞とすることができる。宿主細胞は、ヒト細胞ではないことが好ましい。
【０２７６】
適切な細菌宿主生物の例はグラム陰性菌又はグラム陽性菌である。
【０２７７】
本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の性質及び／又は発現タンパク質のさらなるプロセシングの望ましさに応じて、酵母、他の真菌などの真核生物宿主が好ましいことがある。一般に、酵母細胞は、操作が容易であるので、真菌細胞よりも好ましい。しかし、一部のタンパク質は、酵母細胞からうまく分泌されないか、又は適切に処理されない場合がある（例えば、酵母における過剰糖鎖形成（hyperglycosylation））。これらの場合には、異なる真菌宿主生物を選択すべきである。
【０２７８】
酵母、真菌、植物宿主細胞などの適切な宿主細胞を使用すると、本発明の組換え発現産物に対して最適な生物活性を付与するために必要となることがある翻訳後修飾（例えばミリストイル化、グリコシル化、切断、投石（lapidation）及びチロシン、セリン又はトレオニンリン酸化）が可能になる。
【０２７９】
宿主細胞は、プロテアーゼ欠乏又はプロテアーゼマイナス系統とすることができる。
【０２８０】
生物
本発明に関係する「生物」という用語は、本発明によるヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又はそれらから得られる生成物を含むことができるあらゆる生物を含む。
【０２８１】
適切な生物としては、原核生物、真菌、酵母又は植物を挙げることができる。
【０２８２】
本発明に関係する「トランスジェニック生物」という用語は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又はそれから得られる生成物を含み、且つ／又はプロモーターが、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のその生物内での発現を可能にする、あらゆる生物を含む。ヌクレオチド配列は、生物のゲノム中に組み込まれることが好ましい。
【０２８３】
「トランスジェニック生物」という用語は、その天然環境にあるその未変性プロモーターの制御下にあるときのやはりその天然環境にある未変性ヌクレオチドコード配列を包含しない。
【０２８４】
したがって、本発明のトランスジェニック生物としては、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本明細書に規定される構築体、本明細書に規定されるベクター、本明細書に規定されるプラスミド、本明細書に規定される細胞又はそれらの産物のいずれか１個又は組み合わせを含む生物が挙げられる。例えば、トランスジェニック生物は、異種プロモーターの制御下にある、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むこともできる。
【０２８５】
宿主細胞／生物の形質転換
先に示したように、宿主生物は、原核生物又は真核生物とすることができる。適切な原核生物宿主の例としては、大腸菌及びバチルス  サブチリスが挙げられる。
【０２８６】
原核生物宿主の形質転換に関する教示は、当分野ではこれまでたくさん記述されており、例えば、Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照されたい。原核生物宿主が使用される場合には、ヌクレオチド配列は、イントロンの除去などによって形質転換前に適切に改変する必要があることがある。
【０２８７】
別の実施形態においては、トランスジェニック生物は酵母とすることができる。
【０２８８】
糸状菌細胞は、既知の方法によるプロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換、それに続く細胞壁の再生を含むプロセスなど当分野で既知の様々な方法を用いて形質転換することができる。宿主微生物としてアスペルギルスを使用することは、ＥＰ  ０  ２３８  ０２３に記載されている。
【０２８９】
別の宿主生物は植物とすることができる。植物の形質転換に使用される一般技術の総説は、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)の論文にある。植物の形質転換に関するさらなる教示は、欧州特許公開第０４４９３７５号にある。
【０２９０】
真菌、酵母及び植物の形質転換に関する全般的な教示を以下の項に示す。
【０２９１】
形質転換真菌
宿主生物は、糸状菌などの真菌とすることができる。適切なかかる宿主の例としては、サーモマイセス（Thermomyces）属、アクレモニウム（Acremonium）属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ムコール（Mucor）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、トリコデルマ（Trichoderma）属などに属するあらゆるメンバーが挙げられる。
【０２９２】
糸状真菌の形質転換に関する教示は、ＵＳ−Ａ−５７４１６６５に概説されており、糸状真菌の形質転換及び真菌培養の標準技術が当分野で周知であることが記載されている。Ｎ．クラッサ（N. crassa）に適用された技術の広範な総説は、例えば、Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143にある。
【０２９３】
糸状菌の形質転換に関するさらなる教示は、ＵＳ−Ａ−５６７４７０７に概説されている。
【０２９４】
一態様においては、宿主生物は、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス属とすることができる。
【０２９５】
本発明によるトランスジェニックアスペルギルスは、例えば、Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666)の教示に従って調製することもできる。
【０２９６】
糸状菌における遺伝子発現は、Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 May; 20(5): 200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4): 273-306に概説されている。
【０２９７】
形質転換酵母
別の実施形態においては、トランスジェニック生物は酵母とすることができる。
【０２９８】
酵母における異種遺伝子発現の原理の総説は、例えば、Methods Mol Biol (1995), 49: 341-54及びCurr Opin Biotechnol (1997) Oct; 8(5): 554-60にある。
【０２９９】
この点で、サッカロミセス  セレビシ（Saccharomyces cerevisi）種又はピキア  パストリス（Pichia pastoris）種（FEMS Microbiol Rev (2000 24(1): 45-66参照）などの酵母は、異種遺伝子発現用ビヒクルとして使用することができる。
【０３００】
サッカロミセス  セレビシエにおける異種遺伝子発現、及び遺伝子産物の分泌の原理の総説は、E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.)にある。
【０３０１】
酵母の形質転換の場合には、いくつかの形質転換プロトコールが開発されている。例えば、本発明によるトランスジェニックサッカロミセスは、Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929)、Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104)及びIto, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168)の教示に従って調製することができる。
【０３０２】
形質転換酵母細胞は、栄養要求性マーカー優性抗生物質抵抗性マーカーなどの様々な選択マーカーを使用して選択することができる。
【０３０３】
適切な酵母宿主生物は、ピキア種、ハンゼヌラ種、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ヤロウイニア（Yarrowinia）種、Ｓ．セレビシエを含めたサッカロミセス種又はシゾサッカロミセ  ポンベ（Schizosaccharomyce pombe）を含めたシゾサッカロミセ（Schizosaccharomyce）種から選択される酵母種など、ただしこれらだけに限定されない生物工学的に関連する酵母種から選択することができる。
【０３０４】
メチロトローフの酵母種ピキア  パストリスの系統を宿主生物として使用することができる。
【０３０５】
一実施形態においては、宿主生物は、（国際公開第０１／３９５４４号に記載された）Ｈ．ポリモルファ（H. polymorpha）などのハンゼヌラ種とすることができる。
【０３０６】
形質転換植物／植物細胞
本発明に適切な宿主生物は植物とすることができる。一般技術の総説は、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)による論文又は国際公開第０１／１６３０８号にある。トランスジェニック植物は、例えば、高レベルの植物ステロールエステル及び植物スタノールエステルを産生することができる。
【０３０７】
したがって、本発明は、本明細書に規定される脂質アシル基転移酵素を用いて（特に、本明細書に規定される脂質アシル基転移酵素を含む発現ベクター又は構築体を用いて）植物細胞を形質転換するステップと、その形質転換植物細胞から植物を成長させるステップとを含む、高レベルの植物ステロールエステル及び植物スタノールエステルを含むトランスジェニック植物を生成する方法にも関する。
【０３０８】
分泌
ポリペプチドは、発現宿主から、酵素をより容易に回収することができる培地中に分泌されることが望ましいことが多い。本発明によれば、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づいて選択することができる。ハイブリッドシグナル配列は、本発明の状況でも使用することができる。
【０３０９】
異種分泌リーダー配列の典型的な例は、真菌のＡＧ（amyloglucosidase）遺伝子（例えば、アスペルギルス由来のｇｌａＡ−１８及び２４アミノ酸）、ａ因子遺伝子（酵母、例えばサッカロミセス、クルイベロミセス及びハンゼヌラ）又はα−アミラーゼ遺伝子（バチルス）に由来する分泌リーダー配列である。
【０３１０】
検出
アミノ酸配列の発現を検出し、測定する様々なプロトコールが当分野で知られている。例としては、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）、ＲＩＡ（radioimmunoassay）及びＦＡＣＳ（fluorescent activated cell sorting）が挙げられる。
【０３１１】
多種多様な標識及び抱合（conjugation）技術が当業者に知られており、様々な核酸及びアミノ酸アッセイに使用することができる。
【０３１２】
Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)、Promega (Madison, WI)、US Biochemical Corp (Cleveland, OH)など数社が、これらの手順用の市販キット及びプロトコールを提供している。
【０３１３】
適切なレポーター分子又は標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤又は発色剤並びに基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。かかる標識の使用を教示している特許としては、ＵＳ−Ａ−３，８１７，８３７、ＵＳ−Ａ−３，８５０，７５２、ＵＳ−Ａ−３，９３９，３５０、ＵＳ−Ａ−３，９９６，３４５、ＵＳ−Ａ−４，２７７，４３７、ＵＳ−Ａ−４，２７５，１４９及びＵＳ−Ａ−４，３６６，２４１が挙げられる。
【０３１４】
また、組換え免疫グロブリンは、ＵＳ−Ａ−４，８１６，５６７に示されたように製造することができる。
【０３１５】
融合タンパク質
本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドは、融合タンパク質として生成され、例えば、その抽出及び精製に役立てることができる。融合タンパク質パートナーの例としては、（ＧＳＴ（glutathione-S-transferase）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。融合タンパク質パートナーと目的タンパク質配列の間にタンパク質分解性切断部位を入れて、融合タンパク質配列の除去を可能にすることが好都合な場合もある。融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨げないことが好ましい。
【０３１６】
大腸菌における遺伝子融合発現系は、Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6(5): 501-6に概説されている。
【０３１７】
本発明の別の実施形態においては、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を異種配列に連結させて、融合タンパク質をコードすることができる。例えば、物質活性に影響を及ぼすことができる薬剤についてペプチドライブラリをスクリーニングするために、市販抗体によって認識される異種エピトープを発現するキメラ物質をコードすることが有用な場合がある。
【０３１８】
単なる例として以下の図及び実施例を参照して、本発明を以下に説明する。
［実施例］
【０３１９】
不確かさを回避するために、以下の略語を本明細書において使用することができる。
ＭＯＮＯ＝モノグリセリド
ＭＡＧ＝モノアシルグリセロール＝モノグリセリド
ＭＡＧとＭＯＮＯは本明細書では区別なく使用される。
ＤＡＧ＝ジアシルグリセロール
ＦＦＡ＝遊離脂肪酸
【実施例１】
【０３２０】
アエロモナス  サルモニシダ亜種サルモニシダ由来の転移酵素のクローニング、配列決定及び異種発現
使用系統：
アエロモナス  サルモニシダ亜種サルモニシダ（ＡＴＣＣ  １４１７４）をＡＴＣＣから入手し、ＬＢ（Luria-Bertani）培地中で終夜３０℃で増殖させた。細胞は遠心分離し、Qiagen Ltd.社のゲノムＤＮＡ単離手順によって単離した。ゲノムＤＮＡ緩衝剤セット（ｃａｔ．１９０６０）、プロテアーゼＫ（ｃａｔ．１９１３１）及びＲＮＡｓｅ  Ａ（ｃａｔ．１９１０１）はすべてQiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX)から入手した。
【０３２１】
宿主細菌系統BL21(DE3)pLysS (Novagen)を組換えアエロモナス酵素の産生に使用した。BL21(DE3)pLysSのコンピテントな細胞を発現ベクターpet12-AsalGCAT=pSMによる形質転換用宿主として使用した。
【０３２２】
適切なプラスミドを含む形質転換体を、１００−ｕｇアンピシリン／ｍｌを含むＬＢ寒天培地中で３７℃で増殖させた。
【０３２３】
発現ベクターpet12-AsalGCAT-pSMの構築：
アエロモナス由来の転移酵素遺伝子のすべてのＤＮＡ増幅では、ゲノムＤＮＡ（０．２〜１ｕｌ）をテンプレートとして用い、ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）を１０×  ｐｆｕ緩衝剤１０ｕｌ、各プライマー（５０ｐｍｏｌ／ｕｌ）１ｕｌ、２００ｕＭｄＮＴＰと一緒に総反応体積１００ｕｌで使用した。ＰＣＲ反応は、プログラム可能なサーマルサイクラー中で以下の条件を用いて実施した：９５℃３０秒、（９５℃３０秒、６０℃１分及び６８℃２分）を３０サイクル。追加の伸長を７２℃で５分間行った。
【０３２４】
Ａ．サルモニシダ由来の転移酵素遺伝子のＰＣＲ増幅を２つの別個のＰＣＲ反応で実施した。ＰＣＲ反応１は、プライマー対as1USNEW(5'AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3'[配列番号５６])とasls950new (5' GTG ATG GTG GGC GAG GAA CTC GTA CTG3'[配列番号３７])を用いて実施した。第２のＰＣＲ反応は、第１の反応のＰＣＲ産物及びプライマーas1USNEW(5'AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3'［配列番号３８］）とAHLS1001(5'TTGGATCC GAATTCAT CAATG GTG ATG GTG ATG GTG GGC3'[配列番号３９])を用いて実施し、Ｃ末端ヒスチジンタグが組み込まれた。第２の反応から得られたＰＣＲ産物は精製し、制限酵素Nde1及びBamHIで消化した。pET 12aベクターＤＮＡ  ２ｕｇも制限酵素Nde1及びBamHIで消化し、ホスファターゼで処理した。制限酵素で処理したpet12aと反応２のＰＣＲ産物を精製し、Rapid Ligation Kit (Roche, Switzerland)を用いて連結した。この連結混合物を使用して大腸菌ＴＯＰ１０細胞を形質転換した。形質転換体を、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に播いた。
【０３２５】
Ｔ７プロモータープライマー（5'TAATACGACTCACTATAG3'［配列番号４０］）及びＴ７ターミネータープライマー（5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3'［配列番号４１］）を使用して、pET12aベクター中のクローン化された転移酵素遺伝子の配列及び配向を検証した。ＤＮＡ配列決定は、ABI Prism（登録商標）BigDye（商標）Terminators Cycle配列決定キットを用いて、プラスミドＤＮＡ  ５００ｎｇをテンプレートとして、Ｔ７プロモータープライマー及びターミネータープライマー３．２ｐｍｏｌを使用して実施した。
【０３２６】
図３５に示す構築体を用いて、コンピテントな細菌宿主系統BL21(DE3)pLysS (Novagen)を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を選択して発現分析に使用した。
【０３２７】
組換えアエロモナス  サルモニシダ脂質アシル基転移酵素の発現
レシチンに対する細胞抽出物の酵素活性は、ＮＥＦＡ（Non-Esterified Fatty Acid）キット（Roche, Switzerland）を用いて定量した。
【０３２８】
図３６において、発現ベクターpet12-AsalGCAT=pSMを含むBL21(DE3)pLysSをＬＢ培地＋１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン中で増殖させ、ＯＤ600＝０．６から１．０になるまで振とうしながら３７℃でインキュベートした。次いで、培養物はＩＰＴＧ（０．４ｍＭ）を用いて誘導され、インキュベーションはさらに３時間続けられた。試料は、ＩＰＴＧ誘導後０時間、１、２及び３時間目に採取した。酵素活性は、ＮＥＦＡキットを用いレシチンを基質として試験した。
【０３２９】
より活性な酵素を産生するための増殖最適化
発現ベクターpet12-AsalGCAT=pSMを含むBL21(DE3)pLysSをＬＢ培地＋１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン中で増殖させ、異なる増殖温度（３７℃、３０℃＆２０℃）で振とうしながらインキュベートした。活性脂質アシル基転移酵素を産生する最適条件は、図３７に示すように培養物を３０℃で増殖させたときであった。
【０３３０】
組換えアエロモナス  サルモニシダ転移酵素の部分精製
発現ベクターpet12-AsalGCAT=pSMを含む系統BL21(DE3)pLysSを３７℃で増殖させ、粗製細胞抽出物を超音波処理によって調製した。組換え酵素は、超音波処理した粗製細胞抽出体からQiagen社製Ni-NTAスピンキットを用いてさらに精製された。ＮＥＦＡキットを用い、レシチンを基質としたホスホリパーゼ活性。基質レシチン及び反応混合物と一緒にインキュベートし、活性転移酵素を発現するBL21(DE3)pLysSから得られた粗製細胞抽出物は、薄層クロマトグラフィーによって分析され、分解生成物が存在することが判明した（図３８参照）。
【０３３１】
組換えアエロモナス  サルモニシダ転移酵素の部分精製。発現ベクターpet12-AsalGCAT=pSMを含む系統BL21(DE3)pLysSを３７℃で増殖させ、粗製細胞抽出物を超音波処理によって調製した。組換え酵素は、超音波処理した粗製細胞抽出体からQiagen社製Ni-NTAスピンキットを用いてさらに精製した。ホスホリパーゼ活性は、ＮＥＦＡキットを用い、レシチンを基質として試験した（図３９参照）。
【実施例２】
【０３３２】
大腸菌中でのアエロモナス・ヒドロフィラ転移酵素のクローニング及び発現
アエロモナス・ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ＃７９６５）をＡＴＣＣから入手し、ＬＢ（Luria-Bertani）培地中で終夜３０℃で増殖させた。細胞を遠心分離し、Qiagen Ltd.社のゲノムＤＮＡ単離手順によって単離した。ゲノムＤＮＡ緩衝剤セット（ｃａｔ．１９０６０）、プロテアーゼＫ（ｃａｔ．１９１３１）及びＲＮＡｓｅ  Ａ（ｃａｔ．１９１０１）はすべてQiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX)から入手した。
【０３３３】
宿主細菌系統BL21(DE3)pLysS (Novagen)を組換えアエロモナス酵素の産生に使用した。BL21(DE3)pLysSのコンピテントな細胞を発現ベクターpet12a-A.h.GCAT=pSMaによる形質転換用宿主として使用した。適切なプラスミドを含む形質転換体を、１００−ｕｇアンピシリン／ｍｌを含むＬＢ寒天培地中で３７℃で増殖させた。
【０３３４】
発現ベクターpet12a-A.h.GCAT-pSMaの構築：
アエロモナス由来の転移酵素遺伝子のすべてのＤＮＡ増幅では、ゲノムＤＮＡ（０．２〜１ｕｌ）をテンプレートとして用い、ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）を１０×  ｐｆｕ緩衝剤１０ｕｌ、各プライマー（５０ｐｍｏｌ／ｕｌ）１ｕｌ、２００ｕＭｄＮＴＰと一緒に総反応体積１００ｕｌで使用した。ＰＣＲ反応は、プログラム可能なサーマルサイクラー中で以下の条件を用いて実施した：９５℃３０秒、（９５℃３０秒、６０℃１分及び６８℃２分）を３０サイクル。追加の伸長を７２℃で５分間行った。
【０３３５】
Ａ．ハイドロフィラ（ＡＴＣＣ＃７９６５）由来の転移酵素遺伝子のＰＣＲ増幅を２つの別個のＰＣＲ反応で実施した。
【０３３６】
ＰＣＲ反応１は、プライマー対AHUS1 (5'GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3'、配列番号４２）及びahls950 (5'ATGGTGATGGTGGGCGAGGAACTCGTACTG3'、配列番号４３）を用いて実施した。
【０３３７】
第２のＰＣＲ反応は、第１の反応から得られるＰＣＲ産物及びプライマー対：
AHUS1(5'GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3' 配列番号４４、)及びAHLS1001(5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC3' 配列番号５７）。
を用いて実施され、Ｃ末端ヒスチジンタグが組み込まれた。
【０３３８】
第２の反応から得られたＰＣＲ産物は精製され、制限酵素Nde1及びBamHIで消化された。pET 12aベクターＤＮＡ  ２ｕｇも制限酵素Nde1及びBamHIで消化され、ホスファターゼで処理した。制限酵素で処理したpet12aと反応２のＰＣＲ産物は精製され、Rapid Ligation Kit (Roche, Switzerland)を用いて連結された。この連結混合物を使用して大腸菌ＴＯＰ１０細胞を形質転換した。形質転換体を、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に播いた。
【０３３９】
Ｔ７プロモータープライマー（5'TAATACGACTCACTATAG3'）及びＴ７ターミネータープライマー（5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3'）を使用して、pET12aベクター中のクローン化されたＧＣＡＴ遺伝子の配列及び配向を検証した。ＤＮＡ配列決定は、ABI Prism（登録商標）BigDye（商標）Terminators Cycle配列決定キットを用いて、プラスミドＤＮＡ  ５００ｎｇをテンプレートとして、Ｔ７プロモータープライマー及びターミネータープライマー３．２ｐｍｏｌを使用して実施した。
【０３４０】
図４０に示す構築体を用いて、コンピテントな細菌宿主系統BL21(DE3)pLysS (Novagen)を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を選択して発現分析に使用した。
【０３４１】
BL21(DE3)pLysS中でのアエロモナス・ヒドロフィラ転移酵素の発現
発現ベクターpet12a-A.h.GCAT=pSMaを含む大腸菌系統BL21(DE3)pLysSをＬＢ培地＋１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン中で増殖させ、ＯＤ600＝０．６から１．０になるまで振とうしながら３７℃でインキュベートした。次いで、培養物はＩＰＴＧ（０．４ｍＭ）を用いて誘導され、インキュベーションはさらに３時間続けられた。試料は、ＩＰＴＧ誘導後０時間、１、２及び３時間目に採取した。酵素活性は、ＮＥＦＡキットを用いレシチンを基質として試験した（図４１）。
【０３４２】
より活性な酵素を産生するための増殖最適化
発現ベクターpet12a-A.h.GCAT=pSMaを含むBL21(DE3)pLysSをＬＢ培地＋１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン中で増殖させ、異なる増殖温度（３７℃、３０℃＆２０℃）で振とうしながらインキュベートした。活性ＧＣＡＴ酵素を産生する最適条件は、図４２に示すように、培養物を３０℃で増殖させたときであった。
【０３４３】
組換えＡ．ヒドロフィラ転移酵素（ＧＣＡＴ）の部分精製
発現ベクターpet12a-A.h.GCAT=pSMaを含む系統BL21(DE3)pLysSを３７℃で増殖させ、粗製細胞抽出物を超音波処理によって調製した。組換え酵素は、超音波処理した粗製細胞抽出体からQiagen社製Ni-NTAスピンキットを用いてさらに精製された。ＮＥＦＡキットを用い、レシチンを基質としたホスホリパーゼ活性。（図４３）。
【実施例３】
【０３４４】
バチルス  サブチリス１６３中でのアエロモナス転移酵素の発現
プラスミド構築
２種類の異なるバチルス  サブチリス発現ベクター（pUB 110＆pBE5）を、バチルス  サブチリス中でのアエロモナス遺伝子の異種発現に使用した。pUB110ベクターはアルファアミラーゼプロモーターを含み、一方、pBEベクターは融合アエロモナス遺伝子の発現調節領域としてＰ３２プロモーターを有する。pUB110においては、アエロモナスの成熟ＧＣＡＴ遺伝子の最初のアミノ酸は、バチルス  サブチリス由来のキシラナーゼシグナルペプチド配列の最後のアミノ酸と制限酵素切断部位Nhe1を介してインフレームで融合させ、成熟タンパク質の前に追加の２個のアミノ酸が生成された。pBE5は、組換えタンパク質を培養ろ液中に分泌するためにNco1部位におけるｃｇｔａｓｅシグナル配列融合を含む。
【０３４５】
pUB 110及びpBE5ベクターのシグナル配列にインフレームで融合したアエロモナス遺伝子を得るためにＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲは、Ａ．ヒドロフィラ遺伝子に対して以下のプライマー対を用いて実施した。
ＰＣＲ反応１：usAHncol (5'ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC3'、配列番号４６）及びlsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3'、配列番号４７）
ＰＣＲ反応２：US-AhnheI (5'TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC3'、配列番号４８）及びlsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3、配列番号４９）
【０３４６】
ＰＣＲは、Ａ．サルモニシダ遺伝子に対して以下のプライマー対を用いて実施した。
ＰＣＲ反応３：US-Asncol (5'TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGCC3'、配列番号５０）及びlsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3'、配列番号５１）
ＰＣＲ反応４：US-ASnhe1 (5'TTGCTAGCGCCGACACTCGCCCCGCC3'、配列番号５２）及びlsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3'、配列番号５３）。
【０３４７】
すべてのＰＣＲ産物は、ＰＣＲ ｂｌｕｎｔ II（ＴＯＰＯベクター）にクローン化し、逆方向＆順方向配列決定プライマーを用いて配列決定した。
【０３４８】
ＰＣＲ反応１＆３から得られたクローンは、Nco1＆BamHIで切断し、Nco1／BamH1／ホスファターゼで切断したpBE5ベクターに連結される挿入断片として使用した。ＰＣＲ反応２＆４から得られたクローンは、Nhe1＆BamH1で切断し、Nhe1／BamH1／ホスファターゼで切断したpUBベクターに連結される挿入断片として使用した。
【０３４９】
バチルス  サブチリス中でのアエロモナス転移酵素遺伝子の発現及びその酵素活性のキャラクタリゼーション
２種類のアエロモナス種に由来するアシル基転移酵素は、大腸菌中で首尾良く発現された（上記結果）。バチルスpUB110＆pBE5遺伝子融合構築体を使用してバチルス  サブチリスを形質転換し、カナマイシンプレート上に播くことによって形質転換体を選択した。単離され２ｘＹＴ中で増殖されたカナマイシン耐性形質転換体は、バチルス中でアエロモナス遺伝子を異種発現することができる。その培養ろ液は、アシル基転移酵素活性とホスホリパーゼ活性の両方に加えて、ＤＧＤＧ（digalactosyldiacylglycerol）ガラクトリパーゼ活性を有する。ＤＧＤＧ（digalactosyldiacylglycerol）に対する活性は、基質である小麦粉由来のＤＧＤＧ（Ｓｉｇｍａから入手可能）と一緒に培養上清を６０分間インキュベーションした後に、図４４に示すようにレシチンに対する活性と同様に測定した。培地中で終夜（２０〜２４時間）から４８時間培養した後に、バチルスは分泌タンパク質として酵素を産生した。アエロモナス遺伝子の発現は、バチルス＆大腸菌における細胞生存能力及び増殖を妨げる場合があることが判明した。したがって、発現系統を慎重に選択し、増殖条件を最適化して確実に発現するようにする必要がある。例えば、いくつかのバチルス宿主系統（Ｂ．ｓ  １６３、ＤＢ１０４及びＯＳ  ２１）を、増殖比較のために発現ベクターで形質転換した。Ｂ．ｓ１６３は、２種類のアエロモナス遺伝子で形質転換することができ、活性タンパク質を発現することができる。ＤＢ１０４は、すべての構築体で形質転換することができるが、Ａ．サルモニシダ転移酵素しか発現することができない。
【実施例４】
【０３５０】
大腸菌中で産生されるアエロモナス脂質アシル基転移酵素の発酵及び精製
大腸菌発酵：
微生物
２系統のエシェリキア・コリ（Eschericia coli）、すなわち、アエロモナス・ヒドロフィラ（実施例２）脂質アシル基転移酵素を含む１つと、アエロモナス・サルモニシダ脂質アシル基転移酵素、（実施例１）を含む２つがこの試験に使用された。
【０３５１】
Ａ．ヒドロフィラ遺伝子を含む大腸菌系統はＤＩＤＫ０１２４と命名され、Ａ．サルモニシダ遺伝子を含む大腸菌系統はＤＩＤＫ０１２５と命名された。ＤＩＤＫ０１２４による発酵はＨＹＤＲＯ０３０３と命名され、ＤＩＤＫ０１２５による発酵はＳＡＬ０３０２と命名された。ＨＹＤＲＯ０２５から得られた精製タンパク質はＲＥＦ＃１３８と命名された。ＨＹＤＲＯ０３０３から得られた精製タンパク質はＲＥＦ＃１３５と命名された。
【０３５２】
増殖培地及び培養条件
ＬＢ寒天
これらの系統を維持するために使用されたＬＢ寒天板は、１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ  寒天、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン及び３５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含んだ。寒天板は３０℃でインキュベートされた。
【０３５３】
ＬＢ振とうフラスコ
バイオリアクター培養用接種材料の生成に使用されるＬＢ培地（５０ｍＬ／振とうフラスコ）は、１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン及び３５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含んだ。振とうフラスコにＬＢ寒天板から接種して、３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。
【０３５４】
バイオリアクター培養
バイオリアクター培養は、１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、８ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、０．９ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4，７Ｈ2Ｏ、４０ｇ／Ｌグルコース一水和物、０．４ｍＬ／  ADD APT（登録商標）Foamstop Sin 260 (ADD APT Chemicals AG, Helmond, The Netherlands)、１０ｍｇ／Ｌ  （ＮＨ4）2Ｆｅ（ＳＯ4）2・６Ｈ2Ｏ、０．７ｍｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、３ｍｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、３ｍｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．１ｍｇ／Ｌ  ＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏ、０．１ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ2、０．１ｍｇ／Ｌ  Ｈ3ＢＯ4、０．１ｍｇ／Ｌ  ＫＩ、０．１ｍｇ／Ｌ  Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、１ｇ／Ｌアンピシリン及び３５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含む培地４Ｌが充填された６Ｌ社内組み立てバイオリアクター中で実施した。
【０３５５】
（最大比増殖速度０．６ｈ-1、ＬＢ振とうフラスコのＯＤ600及びバイオリアクターにおける最終ＯＤ600約２０から計算して）約２０時間培養した後に増殖が確実に終了する量のＬＢ培養物をバイオリアクターに接種した。
【０３５６】
ＳＡＬ０３０２にＬＢ培養物１０ｍＬを接種し、ＨＹＤＲＯ０３０３にＬＢ培養物４ｍＬを接種した。
【０３５７】
バイオリアクターは以下の条件で運転された：温度３０℃、（実験に応じて）撹拌８００〜１０００ｒｐｍ、通気５Ｌ／分、ｐＨ６．９、ｐＨ調整８．７５％（ｗ／ｖ）ＮＨ3−水及び２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4。誘導は、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドを最終濃度０．６ｍＭまで添加することによって実施され、それぞれ０．４ｍｏｌ（ＨＹＤＲＯ０３０３）及び０．７ｍｏｌのＣＯ2が生成した。
【０３５８】
収集
バイオマスの収集及び均質化に以下の手順を使用した。
１）発酵物からの発酵ブロスを５０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離し、上清を放出した。このバイオマスは使用するまで−２０℃で貯蔵した。バイオマスは、解凍し、２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール及び完全（ＥＤＴＡなし）プロテアーゼ阻害剤（Roche, Germany）の５００ｍＬに再懸濁した。
２）この懸濁バイオマスをConstant Systems Ltd (Warwick, UK)製細胞粉砕機を用いて２ｋｂａｒ（２００ＭＰａ）、４℃でホモジナイズした。
３）細胞片は、１０,０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって除去し、続いて上清を収集した。
４）上清は１３，７００×ｇ、４℃で６０分間遠心分離することによってさらに精製し、続いてその上清を収集した。
５）上清を、０．２μｍ  Vacu Capフィルター（Pall Life Sciences, UK）によってろ過し、そのろ液は収集後、直ちにクロマトグラフィー精製にかけた。
【０３５９】
転移酵素のクロマトグラフィー精製
（製造者Amersham Biosciencesによって記述された方法に従って）カラム（２．５×１０ｃｍ）にChelating Sepharose ff.ゲル５０ｍｌを詰め、硫酸Ｎｉを充填した。カラムは、２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールの２００ｍｌで平衡化した。粗製物４００ｍｌを流量５ｍｌ／分でカラムにかけた。次いで、カラムは、２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールを用いて、ＵＶ280がベースラインに達するまで洗浄された。次いで、２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５００ｍＭイミダゾールの４０ｍｌを用いてＧＣＡＴを溶出させた。
【実施例５】
【０３６０】
バチルス  サブチリス中で産生されるアエロモナス脂質アシル基転移酵素の発酵及び精製
発酵
ＢＡＣ０３１８−１９、ＢＡＣ０３２３−２４
微生物
この試験に使用される微生物は、ベクターpUB110OISに挿入されたアエロモナス  サルモニシダ転移酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドでバチルス  サブチリス宿主系統、＃１６３が形質転換されて生じる。この遺伝子の発現はアルファ−アミラーゼプロモーターによって制御され、転移酵素の分泌はＢ．サブチリスキシラナーゼシグナル配列によって媒介される（実施例３）。これらの系統は、ＤＩＤＫ０１３８（発酵ＢＡＣ０３１８−１９）及びＤＩＤＫ０１５３（発酵ＢＡＣ０３２３−２４）と命名された。
【０３６１】
増殖培地及び培養条件
前培養培地
振とうフラスコ（総容積５００ｍＬ、バッフル付き）に、
ＮａＣｌ                            ５ｇ／Ｌ
Ｋ2ＨＰＯ4                        １０ｇ／Ｌ
大豆粉                            ２０ｇ／Ｌ
酵母エキス、BioSpringer 106        ２０ｇ／Ｌ
消泡剤、ＳＩＮ２６０                ５ｍＬ／Ｌ
を含む培地１００ｍＬを添加した。
【０３６２】
ｐＨは高圧蒸気殺菌前に７．０に調節された。
【０３６３】
高圧蒸気殺菌前に、５０％（ｗ／ｗ）Nutriose  ６ｍＬ／フラスコを添加した。高圧蒸気殺菌後、カナマイシンを濃度５０ｍｇ／Ｌで添加した。
【０３６４】
接種
前培養振とうフラスコに凍結培養物を２５％（ｗ／ｖ）グリセリン貯蔵物から直接接種した。振とうフラスコを３３℃、１７５ｒｐｍで約１６時間インキュベートし、５０ｍＬを使用して発酵槽に接種した。
【０３６５】
発酵
発酵は、６Ｌ社内組み立て発酵槽中で実施した。
バッチ培地（３Ｌ）は、
コーンスティープリカー（５０％  ｄｗ）          ４０ｇ／Ｌ
酵母エキスBioSpringer 153（５０％  ｄｗ）      １０ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                                        ５ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ2、２Ｈ2Ｏ                              ０．２５ｇ／Ｌ
Ｍｎ（ＮＯ3）2、Ｈ2Ｏ                          ０．２ｇ／Ｌ
消泡剤ＳＩＮ２６０                              １ｍＬ／Ｌ
（高圧蒸気殺菌後に発酵槽にろ過滅菌された）カナマイシン  ５０ｍｇ／Ｌ
を含んだ。
【０３６６】
フィードは、
グルコース一水和物          ５４０ｇ／ｋｇ
ＭｇＳＯ4、７Ｈ2Ｏ          ４．８ｇ／ｋｇ
消泡剤ＳＩＮ２６０          ４ｍＬ／ｋｇ
（別個に加圧滅菌された）酵母エキス、BioSpringer 153（５０％  ｄｗ）  １５０ｇ／ｋｇ
を含んだ。
【０３６７】
発酵ＢＡＣ０３１８及びＢＡＣ０３２３におけるフィードは、下式に従い、蓄積ＣＯ2に基づいて開始された。
フィード−流量［ｇ／ｈ］＝０、ＡｃＣＯ2＜０．１５
フィード−流量［ｇ／ｈ］＝２．８５＋ｔ・１．５４、ＡｃＣＯ2≧０．１５及びｔ＜１２
フィード−流量［ｇ／ｈ］＝２１．３、ｔ＞１２
ｔ：蓄積ＣＯ2（ＡｃＣＯ2）が０．１５モルに達した時点からの時間（ｈ）
【０３６８】
発酵ＢＡＣ０３１９及びＢＡＣ０３２４におけるフィードは、下式に従い、蓄積ＣＯ2に基づいて開始された。
フィード−流量［ｇ／ｈ］＝０、ＡｃＣＯ2＜０．１５
フィード−流量［ｇ／ｈ］＝２．０＋ｔ・１．０８、ＡｃＣＯ2≧０．１５及びｔ＜１２
フィード−流量［ｇ／ｈ］＝１５、ｔ＞１２
ｔ：蓄積ＣＯ2（ＡｃＣＯ2）が０．１５モルに達した時点からの時間（ｈ）
【０３６９】
ｐＨは、１２．５％（ｗ／ｖ）ＮＨ3−水又は２Ｍリン酸を添加することによって７．０に制御された。
通気は１ｖｖｍに相当する３Ｌ／分であった。
温度は３３℃であった。
発酵槽は、１０ｃｍの距離で配置された２個の８ｃｍφRushton回転翼を備えた。
【０３７０】
収集
バイオマスは、１６，０００×ｇで１０分間室温で遠心分離することによって除去された。上清はフィルター滅菌され、ろ液は精製及び応用試験に使用された。
【実施例６】
【０３７１】
アエロモナス  サルモニシダ由来の脂質アシル基転移酵素によって触媒される、パーム油中のＤＡＧの酵素による除去
概要
酵素によるグリセロール分解実験は、パーム油及びグリセリン／水をさまざまな濃度で含む反応器にグリセリン／転移酵素溶液を添加することによって開始された。反応はすべて４３℃で磁気撹拌によって２４時間実施した。反応後、試料はＨＰＴＬＣによって分析し、一部の実験においてはその結果はＧＣ分析によって確認した。実施した試行によれば、水濃度（water concentration）とＤＡＧ及びＭＡＧレベルにはそれぞれ良好な相関があり、試験した最低水濃度は最高のＭＡＧレベル及び最低のＤＡＧレベルをもたらすことが判明した。
【０３７２】
この試行に基づいて、モノグリセリドが合成されるグリセロール分解反応において酵素がＤＡＧを供与体分子として使用しグリセリンを受容体分子として使用する転移酵素触媒反応によってパーム油中のＤＡＧの量を低減可能であると結論することができる。これは、ＤＡＧ量が増加する従来のトリグリセリド加水分解リパーゼを用いたグリセロール分解反応とは対照的である。
【０３７３】
また、水濃度はモノグリセリドの合成収率及びＤＡＧ量に大きな影響を及ぼすと結論することができる。以下の相関が見出された。すなわち、低水濃度（＜１％）及び５％グリセリンによって、ＭＡＧ収率が増加し、ＤＡＧ濃度が減少した。得られた結果から、ジグリセリドの１，２異性体が主として減少する傾向にあることも判明した。
【０３７４】
ジグリセリド、特に１，２異性体は、脂肪の結晶化を遅延させることが知られている。この効果は、マーガリン及びショートニングのような脂肪製品の後結晶化を起こし、大きい結晶の形成を促進する（ざらつき）。ある種の脂肪混合物においては、ジグリセリドがβ’結晶の安定性を改善することが認められた。したがって、パーム油中のジグリセリドを完全に除去するのではなく低減することが好ましい。したがって、ジグリセリドを低減させると油品質がより良好でより均一になると結論することができる。このことを過小評価してはならない。
【０３７５】
序論
ジグリセリドに関する問題は、生成物のタイプ、例えば、それがマーガリン及びショートニング中にあるかどうかによってある程度左右される。したがって、生成物に応じて、ジグリセリドの存在は負の効果と正の効果の両方を有する。マーガリン製造の場合、適切な粘ちゅう性及び塑性を得るために、必要な結晶構造の脂肪製品のみを使用することができる。β’−結晶形は最も必要な構造であり、小さな結晶及び液体部分を維持する高い能力を示す。大きな結晶を有するとマーガリンの粒状構造が生じるので、最も安定な結晶形（β型）は望ましくない。Hernquist & Anjou (1993)及びWahnelt et al. (1991)によれば、脂肪中にジグリセリドが存在するとβ’からβ結晶への転移が遅くなる。しかし、ジグリセリドはβ’からβへの転移を遅延させるのと同様にα型からβ’型への転移も遅延させる（Walnet et al., 1991）。このため、ジグリセリドの存在は結晶化プロセス全体を遅延させると明確に述べることができる。結晶化が遅いことは、マーガリンの適用に決定的な影響を及ぼす。多量のパーム油を含むマーガリン混合物において結晶化を遅延させる効果は、従来の加工後に製品がいくらか柔らかく、充填が困難になり、その後の結晶化によって所望の食感よりも堅い食感を与え得ることである（Berger, 1990）。利点及び欠点にかかわらず、ジグリセリドの低減と完全な除去との正しいバランスを見出すことが重要であり得る。
【０３７６】
脂質アシル基転移酵素、例えばアエロモナス・サルモニシダ由来のＧＤＳｘ脂質アシル基転移酵素を用いたパーム油の酵素によるグリセロール分解によって、パーム油中のジグリセリド量を低減可能であることが驚くべきことに発見された。理論に拘泥するものではないが、このプロセスにおいては、酵素は、少量のグリセリンと一緒にパーム油に添加され、以下の反応を触媒する。
【０３７７】
2007521804.tif 000005
【０３７８】
反応後、残りのグリセリンは、必要と考えられる場合には、遠心分離又は他のプロセスによって反応混合物から容易に分離することができる。
【０３７９】
このプロセスの利点は、ジグリセリド量（好ましくは１，２ジグリセリド）が、転移酵素反応用供与体としてトリグリセリドを用いずに、ジグリセリドに特異的である酵素によって触媒されるグリセロール分解反応によって低減されることである。
【０３８０】
反応生成物モノグリセリドは、反応混合物から除去する必要はないが、マーガリン及びショートニングのような食品の製造用の効率的乳化剤として有利に使用することができる。したがって、このプロセスは２つの問題を解決する。まず、ジグリセリド量が低減され、トリグリセリドの結晶化特性に負の影響を及ぼす、好ましい１，２ジグリセリドが除去される。第二に、反応生成物モノグリセリドは、マーガリン及びショートニングのような食品の製造において効率的乳化剤として使用することができる。
【０３８１】
一実施形態においては、転移酵素反応によって生成されるモノグリセリド（もしあれば）を除去することが好ましい。
【０３８２】
適切には、転移酵素反応が粗製パーム油において実施した場合には、モノグリセリド及び／又はグリセリン及び／又は水の残余（もしあれば）は、食用油精製プロセス中に脱臭プロセスによって除去することができる。
【０３８３】
脂質アシル基転移酵素を使用する別の極めて興味深い利点は、この酵素が反応混合物の含水量にさほど依存せず、この酵素は転移酵素なので加水分解活性が低いか又は起こらないことであり、このことは、遊離脂肪酸量が大きく増加しないことを意味する。
【０３８４】
リパーゼのような脂肪分解酵素がこのプロセスにおいて使用されるときには、グリセロール分解反応における含水量が極めて重要であることがよく知られている（Kristensen, 2004）。ほとんどの脂肪分解反応に必要である少量の水でも、かなりの量の遊離脂肪酸を形成させる。この問題は、グリセロール分解反応において脂質アシル基転移酵素を使用することによって克服することができる。
【０３８５】
別の態様は、グリセロール分解反応を触媒することが当分野で知られているリパーゼが、ジグリセリド量を低減する代わりに、ジグリセリド形成中に供与体としてトリグリセリドを主に使用することである。
【０３８６】
材料：
パーム油：                Palmotex, Aarhus United, Denmark
グリセリン：              J. T. Baker, (7044)
DIMODAN（登録商標）P：    Danisco A/S, Denmark
酵素：Ｂ．サブチリス中で発現させ、実験室規模で発酵させたアエロモナス  サルモニシダ由来の脂質アシル基転移酵素ＧＣＡＴ（転移酵素＃１９６）。
【０３８７】
方法
酵素の凍結乾燥
酵素は凍結乾燥前に脱塩した（ＰＤ−１０脱塩カラム、Amersham Biosciences社製）。脱塩した酵素はグリセリンと混合した（酵素：グリセリン比３．５：１）。試料は凍結乾燥し、１０％水を添加した。試料は約２０Ｕ（ホスホリパーゼ単位）／グラムを含んだ。
【０３８８】
ホスホリパーゼ活性の測定（ホスホリパーゼ活性アッセイ）：
基質
０．６％Ｌ−αホスファチジルコリン９５％植物（Avanti #441601）、０．４％Triton-X 100 (Sigma X-100)及び５ｍＭ  ＣａＣｌ2を０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝剤ｐＨ７に溶解した。
アッセイ手順：
基質４００μＬを１．５ｍＬ  Eppendorf管に添加し、Eppendorf Thermomixer中で３７℃で５分間放置した。ｔ＝０分に酵素溶液５０μＬを添加した。酵素の代わりに水を含むブランクも分析した。試料は、Eppendorf Thermomixer中、１０＊１００ｒｐｍで３７℃で１０分間混合した。ｔ＝１０分にEppendorf管を別のサーモミキサー中に９９℃で１０分間放置して反応を停止させた。
試料中の遊離脂肪酸は、WAKO GmbH社製ＮＥＦＡ  Ｃキットによって分析された。
ｐＨ７における酵素活性ＰＬＵ−７は、アッセイ条件下で生成されるマイクロモル脂肪酸／分として計算された。
【０３８９】
酵素反応
以下の表１及び表２の配合表に従って、パーム油をグリセリン−酵素溶液と反応させた。
【０３９０】
2007521804.tif 000006
【０３９１】
2007521804.tif 000007
【０３９２】
パーム油は２０ｍｌ  Wheatonガラスに計量し、グリセリン／酵素及び任意選択で水を添加した。試料は加熱ブロック（VARIOMAG - Thermomodul 40 STサーモスタットによって制御され、示差的撹拌（differential stirring）下で加熱されたMultitherm HP 15 Stheatingブロック（１５ウェル）)中に置き、以下の諸条件下で反応に供した。
反応温度：４３℃
磁気撹拌：６５０ｒｐｍ
反応時間：２０時間
【０３９３】
反応混合物中の酵素は、９７．５℃で１０分で不活性化させた。反応後、試料は２０秒間ホモジナイズ（Ultra Turrax）し、均一な試料をさらなる分析のために取り出した。
【０３９４】
ＨＰＴＬＣ
アプリケーター：LINOMAT 5、CAMAGアプリケーター
ＨＰＴＬＣプレート：１０×１０ｃｍ（Merck no. 1.05633)
【０３９５】
プレートは、乾燥機中で１８０℃で２０〜３０分間乾燥させることによって使用前に活性化した。
【０３９６】
塗布：クロロホルム：メタノール（２：１）に溶解させた反応パーム油の２．０％溶液２．０μｌをＨＰＴＬＣプレートにLINOMAT 5アプリケーターを用いて塗布した。
【０３９７】
流出緩衝剤：Ｐ−エーテル：ＭＴＢＥ：酢酸（５０：５０：１）
塗布／溶出時間：８分間
展開流体：１６％Ｈ3ＰＯ4中の６％酢酸銅（II）
【０３９８】
溶出後、プレートを乾燥機中で１８０℃で１０分間乾燥させ、冷却し、展開流体に浸漬し、次いでさらに１８０℃で２０分間乾燥させた。プレートを視覚的に評価し、直接スキャン（ScanWizard 5）した。
【０３９９】
実験IIでは、各成分はAdobe photoshop 6.0によって定量化され、ＭＡＧ及びＤＡＧの量は、ＤＡＧ及びＭＡＧ標準液の較正曲線（図４９＆５０参照）から計算された。
【０４００】
ガスクロマトグラフィー
WCOT溶融シリカカラム１２．５ｍ×０．２５ｍｍ  ＩＤ×０．１μｍ  ５％フェニル−メチル−シリコーン（Chrompack社製CP Sil 8 CB）を備えたPerkin Elmer 8420 Capillary Gas Chromatography。
【０４０１】
キャリア：ヘリウム。
インジェクション：１．５μｌ  スプリット付き
検出器：ＦＩＤ、３８５℃
【０４０２】
オーブンプログラム：    １      ２        ３        ４
オーブン温度、℃  ：    ８０    ２００    ２４０    ３６０
恒温、時間、分    ：    ２      ０        ０        １０
温度速度（Temperature rate）、
℃／分            ：    ２０    １０      １２
【０４０３】
試料調製：脂質５０ｍｇを、内部標準ヘプタデカン２ｍｇ／ｍｌを含むヘプタン：ピリジン（２：1）１２ｍｌに溶解した。試料５００μｌをクリンプバイアルに移した。ＭＳＴＦＡ（N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoracetamid）１００μｌを添加し、反応物を６０℃で１５分間インキュベートした。
【０４０４】
計算：モノ−ジ−トリグリセリドに対する応答係数、遊離脂肪酸は、これらの成分の基準混合物から求められた。これらの応答計数に基づいて、試料中の脂質が計算された。
【０４０５】
結果
実験Ｉ：
この実験の目的は、アエロモナス  サルモニシダ由来のジグリセリド：グリセリンアシル基転移酵素のグリセロール分解反応によるパーム油中のＤＡＧに対する影響を検討することである。ＧＣＡＴは、コレステロールエステル及びリゾレシチンの形成中に脂肪酸をレシチンコレステロールから転移可能であることが知られている。この試験では、本発明者らは、パーム油中のＤＡＧ量を低減しモノグリセリドを生成させるために、ＤＡＧを供与体とし、グリセリンを受容体として使用する酵素の可能性を検討した。
【０４０６】
グリセロール分解反応を触媒するためにリパーゼのような酵素を使用することは文献により周知である。これらの反応においては、トリグリセリドは主要な基質であり、モノ及びジグリセリドは反応生成物である。これらのプロセスにおいては、ジグリセリド量はかなり増加し、生成されるジグリセリド量は、生成されるモノグリセリド量と同等（on level）又はそれよりも多い（Kristensen, 2004）。
【０４０７】
４個の異なる試料組成物を試験した。５％グリセリンと混合し、酵素を含まず、且つ試料と同様に処理したパーム油の基準試料と比較した。図４７は、表１の試料のＨＰＴＬＣ分析結果である。
【０４０８】
ＨＰＴＬＣ分析から得られた結果によれば、ＤＡＧ量は反応条件（ＧＬ：Ｈ2Ｏ比を意味する）に応じて変動する。すべての反応に等しいことは、ジグリセリドの１，３−異性体がジグリセリドの１，２−（２，３−）異性体よりも多いことであった。この観察は、理論によって確認することができ、それによれば、粗製パーム油中の１，３−異性体と１，２−（２，３−）異性体の比は７：３である（Siew & Ng, 1999; Timms, 2004）。また、結果を解析すると、ＨＰＴＬＣプレートは、転移酵素がＤＡＧ量を首尾よく低減することを示している。この低減は、合成されたＭＯＮＯの量とある程度相関し得る。
【０４０９】
図１において１，２異性体を１，３異性体ＤＡＧと比較すると、１，２ＤＡＧは酵素触媒反応によっておおむね低減されると考えられる。これは、ｓｎ２位にある脂肪酸に対して転移酵素が優先的な特異性を有することと一致する。
【０４１０】
実施した実験においては、０．５〜５．５％の範囲のさまざまな水濃度を使用した。この結果から、水濃度はＤＡＧ低減量と組み合わせられたＭＯＮＯ合成量にかなりの影響を及ぼすと考えられる。この場合、転移酵素＃１９６は、系が低水濃度を含有する場合には、より高濃度のＭＯＮＯが形成され、それに対応したＤＡＧ量の減少が観察されることを示している。実験は、グリセリン量が系内の平衡に対して効果を有するかどうかも検討する（レーン５：１０％ＧＬ：１％Ｈ2Ｏ）。転移酵素＃１９６は、より高濃度のグリセリン（酵素活性の２倍用量（double dosage）も意味する）がより高いＭＯＮＯ濃度をもたらさないことを示している。
【０４１１】
本発明は、低水分環境、すなわち約１％未満で実施されることが好ましい。
【０４１２】
リパーゼの代わりに転移酵素を扱う利点の１つは、ＭＯＮＯの合成がＦＦＡ濃度の過剰な増加と相関しないことである。このことは本実験で確認される。図１によれば、どの反応もＦＦＡの明確なバンドを示さない（ＦＦＡバンドは、１，３ＤＡＧとＴＡＧの間に見られると予想された）。
【０４１３】
この実験から、転移酵素＃１９６に最適なグリセリン及び水の濃度は以下のとおりであると要約することができる。
転移酵素＃１９６：５％ＧＬ：０．５％Ｈ2Ｏ
【０４１４】
ＨＰＴＬＣ分析における試料手順は、具体的な計量を含まなかった。そのため、反応混合物中のさまざまな成分の濃度を計算することはできなかった。そのため、観察は単に視覚的評価に基づく。
【０４１５】
結果ＧＣ
ＨＰＴＬＣの結果に基づいて、試料番号２がＧＣ分析用に選択された。ＨＰＴＬＣプレートの視覚的評価をＤＡＧの定量分析によって確認することができるかどうかを見出すために。分析前にグリセリンを遠心分離によって試料から除去し、脂質相のみをＧＣ分析にかけた。ＧＣ結果を下記表３に示す。
【０４１６】
2007521804.tif 000008
【０４１７】
ＧＣ試験の結果を解析すると、選択試料は高ＭＯＮＯ含量及び低ＤＡＧ収率の点で基準とは異なることが判明した。この観察は、ＨＰＴＬＣ分析で得られた結果を支持する。
【０４１８】
結論：実験Ｉ
グリセロール分解生成物中のモノグリセリド及びジグリセリドの含量に関して、ＨＰＴＬＣ分析の結果によれば、水濃度とＭＯＮＯ量及びＤＡＧ量にはそれぞれ相関があり、水濃度が低いほどＤＡＧは少なく、ＭＯＮＯは多い。
【０４１９】
ＧＣ分析によって、ＤＡＧの低減度が確認された。この実験においては、ＤＡＧの低減量はジグリセリドパーム油総量の７．１％を占める（表４）。
【０４２０】
2007521804.tif 000009
【０４２１】
実験II：
この部分の目的は、パーム油中のＤＡＧ低減の最適化を続け、転移酵素＃１９６を用いて転移酵素触媒グリセロール分解を分析することであった。第１の目的は、ＤＡＧ量がＭＯＮＯ濃度の増加に合わせて低減する十分にバランスのとれた反応に達することである。
【０４２２】
実験研究のこの部分では、６個の異なる試料組成物が試験され、５％グリセリンと混合されたパーム油の基準試料と比較された（表２）。基準試料は、酵素反応と同じ加熱プロファイルにかけられた。これによって、低減中の熱分解の程度を観察し求めることができる。図４８は、ＨＰＴＬＣ分析の結果である。
【０４２３】
図４８の結果から、特にＭＡＧ量が変動していると考えられる。ＨＰＴＬＣ分析によれば、５％グリセリン（レーン：１〜３）を含む試料においては、水濃度とＭＡＧ収率の間に連続関係があり、反応混合物中の水量の減少に続いてＭＡＧ収率が増加する。１０％グリセリンを含む反応においても同じ傾向が見られる（レーン：５〜７）。
【０４２４】
ジグリセリド量によれば、ＨＰＴＬＣプレートの視覚的評価だけに基づいて試料を区別することは不可能であった。したがって、各試料を区別することができるように、各成分は、既知の組成のＭＡＧ及びＤＡＧを含む標準材料を分析することによって定量された。ＨＰＴＬＣプレートはスキャンされ、Adobe Photoshop 6.0によって処理され、構築された計算マクロ（Microsoft Excel 2000）の助けを借りてさらに計算された。ＨＰＴＬＣによって分析された各成分の定量分析を下記表５に示す。
【０４２５】
2007521804.tif 000010
【０４２６】
この研究は視覚的評価を支持し、さまざまなレベルのジグリセリドを精密に描写した。これらの結果から、ＤＡＧ量の最大の低減は、試料番号１（５％ＧＬ：１．５％Ｈ2Ｏ）においてなされたことがわかる。また、この試料は最も多い量のＭＡＧを含むことも認められた。
【０４２７】
結論：実験II
実験IIによって、アエロモナス  サルモニシダ由来の脂質アシル基転移酵素ＧＣＡＴがパーム油中のジグリセリド量を低減することができるという観察が確認された。５％グリセリンを用いた実験の場合、反応混合物中の水濃度とＭＡＧ量及びＤＡＧ量との間にそれぞれ相関が認められ、水濃度が低いほどＤＡＧは少なく、ＭＡＧは多い。
【０４２８】
ＨＰＴＬＣによって低減度を定量化した（表５参照）。これらの結果から、ＤＡＧの低減量はパーム油中のジグリセリド総量の１３．２９％を占め、合成ＭＯＮＯ量は０．０１％（基準）から０．３８％（試料番号１）に増加すると考えられる。
【０４２９】
この実験から、転移酵素＃１９６に最適なグリセリン及び水の濃度は以下のとおりであると要約することができる。
転移酵素＃１９６：５％ＧＬ：１．５％Ｈ2Ｏ
【０４３０】
これらの観察を実験Ｉで得られた結果と比較すると、これらの結果において良好な一貫性が得られることが確認される。最適な水濃度は、酵素活性及びグリセリン含量に応じておそらく０〜１％Ｈ2Ｏである。
【０４３１】
実施したこれら２つの実験に基づいて、モノグリセリドが合成されるグリセロール分解反応において酵素がＤＡＧを供与体分子として使用しグリセリンを受容体分子として使用する転移酵素触媒反応によってパーム油中のＤＡＧの量を低減可能であると結論することができる。これは、トリグリセリド加水分解リパーゼの部分加水分解活性のためにＤＡＧ量が増加する従来のトリグリセリド加水分解リパーゼを用いたグリセロール分解反応とは極めて対照的である。
【０４３２】
ジグリセリドの構造は混合物１，２−及び１，３−異性体であり、転移酵素はｓｎ２位に特異的であるということに基づいて、ジグリセリド量がわずかに低減しても、パームを主成分とする生成物に対して非常に大きな物理的影響を有するはずである。
【実施例７】
【０４３３】
アエロモナス  サルモニシダ由来のジアシルグリセロール：グリセリン転移酵素（本発明による脂質アシル基転移酵素）の固定化
ジアシルグリセロール：グリセリン転移酵素は、アセトン沈殿によってセライト上に固定される。酵素の２０ｍＭ  ＴＥＡ緩衝剤ｐＨ７溶液１０ｍｌをセライト５３５（Fluka社製）０．１グラムと一緒に室温で２時間ゆっくり撹拌する。
冷アセトン５０ｍｌを連続撹拌しながら添加する。
沈殿物を１分間の遠心分離５０００ｇによって単離する。
沈殿物を冷アセトン２０ｍｌで２回洗浄する。
セライトを周囲温度で約１時間試みる。
【０４３４】
固定化転移酵素はパーム油中で試験される（下表参照）：
【０４３５】
2007521804.tif 000011
【０４３６】
パーム油とグリセリンを４２℃で加熱する。固定化転移酵素を添加した。
【０４３７】
磁気撹拌機で軽く撹拌しながら４２℃で転移酵素反応を続けた。試料を１／２、１、３、６及び２４時間後に分析のために取り出し、ＨＰＴＬＣによって分析する。反応を反応時間２４時間後に停止し、固定化酵素をろ過除去した。
【０４３８】
ＨＰＴＬＣ分析は、パーム油中のモノグリセリドの形成及びジグリセリドの低減によるＡ．サルモニシダ由来の固定化ジアシルグリセロール：グリセリンの効果を明瞭に示している。
【０４３９】
上記明細書に述べられたすべての刊行物を参照により本明細書に援用する。本発明に記載の方法及びシステムのさまざまな改変形態及び変更形態が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を具体的な好ましい実施形態と関連して説明したが、特許請求される本発明がかかる具体的実施形態に不当に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者に明白である本発明の記載された実施形態のさまざまな改変形態は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【０４４０】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０４４１】
【図１】データベースバージョン６からのｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列（配列番号１）を示す図である。
【図２】生物アエロモナス・ヒドロフィラ（Ｐ１０４８０；ＧＩ：１２１０５１）から得られるアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】生物アエロモナス・サルモニシダ（ＡＡＧ０９８４０４；ＧＩ：９９６４０１７）から得られるアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図４】生物ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）から得られるアミノ酸配列（配列番号４）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６３１５５８）を示す図である。
【図５】生物ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）から得られるアミノ酸配列（配列番号５）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＣ４２１４０）を示す図である。
【図６】生物サッカロミセス・セレビシエから得られるアミノ酸配列（配列番号６）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ４１７３４）を示す図である。
【図７】ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列に対する選択配列のアラインメントを示す図である。
【図８】アミノ酸配列同一性が９３％である配列番号３と配列番号２の対アラインメントを示す図である。シグナル配列には下線が引かれている。＋は相違を示す。活性部位セリン１６を含むＧＤＳＸモチーフ並びに活性部位アスパラギン酸１１６及びヒスチジン２９１は強調表示されている（陰影付きの領域を参照）。アミノ酸の後ろの番号は、シグナル配列を引いたものである。
【図９】生物アエロモナス・ヒドロフィラから得られる、本発明による脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す図である。
【図１０】生物アエロモナス・サルモニシダから得られる、本発明による脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号８）を示す図である。
【図１１】生物ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）から得られる、本発明による脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号９）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｃ＿００３８８８．１：８３２７４８０．．８３２８３６７）を示す図である。
【図１２】生物ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）から得られる、本発明による脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＬ９３９１３１．１：２６５４８０．．２６６３６７）を示す図である。
【図１３】生物サッカロミセス・セレビシエから得られる、本発明による脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｚ７５０３４）を示す図である。
【図１４】生物ラルストニアから得られるアミノ酸配列（配列番号１２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＬ６４６０５２）を示す図である。
【図１５】生物ラルストニアから得られる、本発明による脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す図である。
【図１６】配列番号２０．Ｓｃｏｅ１  ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ３９７０７．１  ＧＩ：４５３９１７８保存仮想タンパク質（hypothetical protein）［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図１７】ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ３９７０７．１  ＧＩ：４５３９１７８保存仮想タンパク質をコードする配列番号２１のヌクレオチド配列［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図１８】配列番号２２．Ｓｃｏｅ２  ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＣ０１４７７．１  ＧＩ：９７１６１３９保存仮想タンパク質のアミノ酸［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図１９】Ｓｃｏｅ２  ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＣ０１４７７．１  ＧＩ：９７１６１３９保存仮想タンパク質をコードする配列番号２３のヌクレオチド配列［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図２０】アミノ酸配列（配列番号２４）Ｓｃｏｅ３  ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８８８３３．１  ＧＩ：７６３５９９６推定分泌タンパク質［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図２１】Ｓｃｏｅ３  ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８８８３３．１  ＧＩ：７６３５９９６推定分泌タンパク質をコードする配列番号２５のヌクレオチド配列［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図２２】アミノ酸配列（配列番号２６）Ｓｃｏｅ４  ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８９４５０．１  ＧＩ：７６７２２６１推定分泌タンパク質［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図２３】Ｓｃｏｅ４  ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８９４５０．１  ＧＩ：７６７２２６１推定分泌タンパク質をコードする配列番号２７のヌクレオチド配列［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図２４】アミノ酸配列（配列番号２８）Ｓｃｏｅ５  ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ６２７２４．１  ＧＩ：６５６２７９３推定リポタンパク質［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図２５】Ｓｃｏｅ５  ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ６２７２４．１  ＧＩ：６５６２７９３推定リポタンパク質をコードする配列番号２９のヌクレオチド配列［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図２６】アミノ酸配列（配列番号３０）Ｓｒｉｍ１  ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＡＡＫ８４０２８．１  ＧＩ：１５０８２０８８  ＧＤＳＬ−リパーゼ［ストレプトミセス・リモサス］を示す図である。
【図２７】Ｓｒｉｍ１  ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＡＡＫ８４０２８．１  ＧＩ：１５０８２０８８  ＧＤＳＬ−リパーゼをコードする配列番号３１のヌクレオチド配列［ストレプトミセス・リモサス］を示す図である。
【図２８】アミノ酸配列（配列番号３２）−アエロモナス・ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ  ＃７９６５）由来の脂質アシル基転移酵素を示す図である。
【図２９】アエロモナス・ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ  ＃７９６５）由来の脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号３３）を示す図である。
【図３０】アエロモナス・サルモニシダ亜種サルモニシダ（ＡＴＣＣ＃１４１７４）由来の脂質アシル基転移酵素のアミノ酸配列（配列番号３４）を示す図である。
【図３１】アエロモナス・サルモニシダ亜種サルモニシダ（ＡＴＣＣ＃１４１７４）由来の脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号３５）を示す図である。
【図３２】アエロモナス遺伝子の相同体は、National Center for Biotechnology Information, NIH, MD, USAの基本的局所アラインメント検索ツールサービス及び完全ゲノムデータベースを用いて特定できることを示す図である。ＧＤＳＸモチーフがデータベース検索に使用され、脂肪分解活性を有する酵素を潜在的にコードするいくつかの配列／遺伝子が特定された。遺伝子は、ストレプトミセス属、ザントモナス属及びラルストニア属から特定された。以下の例として、ラルストニア・ソラナセアルムがアエロモナス・サルモニシダ（ｓａｔＡ）遺伝子とアラインメントさせた。対アラインメントによって２３％同一であることが判明した。活性部位セリンはアミノ末端に存在し、触媒作用性残基ヒスチジン及びアスパラギン酸を特定することができる。
【図３３】Ｐｆａｍ００６５７．１１［ファミリー００６５７、データベースバージョン１１］コンセンサス配列（以後、Ｐｆａｍコンセンサスと呼ぶ）及び様々な配列とＰｆａｍコンセンサス配列のアラインメントを示す図である。各矢印は活性部位残基を示し、下線が引かれたボックスは[Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20；179-179]によって示された相同性ボックスのうちの３個を示す。Ｐｆａｍコンセンサス中の大文字は、多数のファミリーメンバーにおいて保存されている残基を示す。−記号は、Ｐｆａｍコンセンサスの隠れマルコフモデルによって残基が存在すると予想されたが存在せず、ギャップが挿入される位置を示す。記号は、Ｐｆａｍコンセンサス中に対応する残基がない残基を示す。これらの配列は、図１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８及び３０に記載されたアミノ酸配列である。
【図３４】Ｐｆａｍ００６５７．１１［ファミリー００６５７、データベースバージョン１１］コンセンサス配列（以後、Ｐｆａｍコンセンサスと呼ぶ）及び様々な配列とＰｆａｍコンセンサス配列のアラインメントを示す図である。各矢印は活性部位残基を示し、下線が引かれたボックスは[Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]によって示された相同性ボックスのうちの３個を示す。Ｐｆａｍコンセンサス中の大文字は、多数のファミリーメンバーにおいて保存されている残基を示す。−記号は、Ｐｆａｍコンセンサスの隠れマルコフモデルによって残基が存在すると予想されたが存在せず、ギャップが挿入される位置を示す。記号は、Ｐｆａｍコンセンサス中に対応する残基がない残基を示す。これらの配列は、図２、１６、１８、２０、２６、２８及び３０に記載されたアミノ酸配列である。これらのタンパク質はすべて脂質基質に対して活性であることが判明した。
【図３５】Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きアエロモナス  サルモニシダ脂質アシル基転移酵素遺伝子を含む発現ベクターpet12-AsalGCAT=pSMを示す図である。
【図３６】ＮＥＦＡキットアッセイにおいて細胞抽出物を試験した結果を示す図である。組換えＡ．サルモニシダ脂質アシル基転移酵素のレシチンに対する活性を示す。各ウェルは、左から右に、正の対照、負の対照（すなわち、空のプラスミドからの抽出物）並びにＩＰＴＧ誘導から０、１、２及び３時間培養後に収集された試料である。
【図３７】発現ベクターpet12-AsalGCAT=pSMを含むBL21(DE3)pLysSの増殖最適化を示す図である。３０℃での培養によって、レシチンに対して高い活性を有する酵素が産生されたことを示す。細胞抽出物のホスホリパーゼ活性はＮＥＦＡキットアッセイを用いて試験した。ウェルは左から右に正の対照、負の対照、２０℃、３０℃である。
【図３８】基質レシチンと一緒にインキュベートされた、活性脂質アシル基転移酵素を発現するBL21(DE3)pLysSから得られる粗製細胞抽出物を示す図である。反応混合物は、薄層クロマトグラフィーによって分析され、分解生成物が存在することが示された。レーン：１．酵素なし；２．＋Ａ．ｓａｌ  −１０ｕｌ  ３７℃；３．＋Ａ．ｓａｌ  −２０ｕｌ  ３７℃；４．＋Ａ．ｓａｌ  −１０ｕｌ  ２４℃；５．＋Ａ．ｓａｌ  −２０ｕ  ２４℃。
【図３９】ホスホリパーゼ活性が精製Ｈｉｓタグタンパク質と関連することを示すアエロモナス  サルモニシダアシル基転移酵素の部分精製を示す図である。ＳＥ＝超音波処理抽出物、Ｈｉｓ＝Qiagen社製Ni-NTAスピンキットを用いて精製。
【図４０】Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きアエロモナス・ヒドロフィラＧＣＡＴ（Glycerolipid Acyl Transferase）遺伝子を含む発現ベクターpet12-A.h. GCAT=pSMaが大腸菌系統BL21(DE3)pLysSの形質転換に使用されたことを示す図である。
【図４１】組換えアエロモナス・ヒドロフィラＧＣＡＴ酵素を含む粗製抽出物（５＆１０ｕｌ）のレシチンに対する活性がＮＥＦＡ（Non-Esterified Fatty Acid）キット（Roche, Switzerland）を用いて試験したことを示す図である。リン脂質レシチンに対して活性な酵素が存在することを示す。
【図４２】発現ベクターpet12-AsalGCAT=pSMを含むBL21(DE3)pLysSの増殖最適化を示す図である。３０℃での培養によって、レシチンに対して高い活性を有する酵素が産生されたことを示す。細胞抽出物のホスホリパーゼ活性はＮＥＦＡキットアッセイを用いて試験した。
【図４３】ホスホリパーゼ活性が精製Ｈｉｓタグタンパク質と関連することを示すアエロモナス・ヒドロフィラ＆Ａ．サルモニシダアシル基転移酵素の部分精製を示す図である。ＳＥ＝超音波処理抽出物、Ｈｉｓ＝Qiagen社製Ni-NTAスピンキットを用いて精製された）。
【図４４】レシチンとＤＧＤＧの両方に対して活性な分泌酵素が産生されたことを示す、バチルス・サブチリス１６３におけるアエロモナス遺伝子の発現を示す図である。pUB-AH＝Ａ．ヒドロフィラ遺伝子を含む構築体及びpUB-AS、Ａ．サルモニシダ遺伝子を有する構築体、培養ろ液は基質と一緒に６０分間インキュベートされた。
【図４５】実施例１７においてアエロモナス・ヒドロフィラ脂質アシル基転移酵素遺伝子の変異誘発に使用された融合構築体のアミノ酸配列（配列番号３６）を示す図である。下線が引かれたアミノ酸は、キシラナーゼシグナルペプチドである。
【図４６】キシラナーゼシグナルペプチドを含むアエロモナス・ヒドロフィラ由来の酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号４５）を示す図である。
【図４７】実験ＩにおけるＨＰＴＬＣ分析の結果を示す図である。
【図４８】実験IIにおけるＨＰＴＬＣ分析の結果を示す図である。
【図４９】モノグリセリド標準液の較正曲線を示すグラフである。
【図５０】ジグリセリド標準液の較正曲線を示すグラフである。
【図５１】ストレプトミセス由来の本発明による脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号５４）を示す図である。
【図５２】ストレプトミセス由来の本発明による脂質アシル基転移酵素をコードするポリペプチド配列（配列番号５５）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３３−１】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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