【誤訳訂正書】
【提出日】平成28年7月25日(2016.7.25)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植療法に適したＲＰＥ細胞調製物を作製する方法であって、該方法は：
（ａ）丸石細胞形態および色素沈着を有するＲＰＥ細胞を取得する工程であって、該ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ６５およびベストロフィンを発現する細胞を含む、工程；
（ｂ）該ＲＰＥ細胞を増殖する工程であって、該ＲＰＥ細胞は、脱分化して、色素沈着および上皮様形態を失う、工程；
（ｃ）該脱分化した細胞に単層を形成させ、休止状態となって、色素沈着および上皮様形態を回復する工程；ならびに
（ｄ）複数の継代を経て、工程（ｂ）および（ｃ）を反復することによって、該ＲＰＥ細胞を拡大させる工程
を包含し、ここで、工程（ｂ）の間にｂＦＧＦが該ＲＰＥ細胞に添加され、ここで、工程（ｃ）において該ＲＰＥ細胞がｂＦＧＦ非存在下で培養される、方法。
【請求項２】
前記ＲＰＥ細胞調製物が高純度のＲＰＥ細胞調製物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＰＥ細胞調製物がヒトＲＰＥ細胞調製物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
色素沈着および上皮形態を失った前記脱分化した細胞が、ｍｉｔｆ、Ｐａｘ６、チューブリンβＩＩＩおよびネスチンについて陽性である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記単層が、Ｐａｘ６−、ベストロフィン＋、ＣＲＡＬＢＰ＋、ＰＥＤＦ＋であり、かつ、ＲＰＥ６５を発現する細胞を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記移植療法に適したＲＰＥ細胞の調製物が、マトリックスまたは基材と共に提供される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記移植療法に適したＲＰＥ細胞の調製物が、懸濁液中に提供される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】網膜の変性疾患の処置のための改良されたモーダリティー
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、網膜変性および他の視覚障害についての改良された細胞−ベースの療法、ならびにパーキンソン病の治療のための、および哺乳動物胚性幹細胞および哺乳動物胚−由来細胞を、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、および限定されるものではないが、桿体、錐体、二極、角膜、神経、虹彩上皮、および先祖細胞を含めた他の目の組織に分化させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
中枢神経系（ＣＮＳ）の多くの部分は層状組織化を呈し、神経病理学的プロセスは、一般には、１を超えるこれらの多くの細胞層を含む。ＣＮＳの病気は、頻繁には、ニューロン細胞の喪失を含む、内因性再集団化の不存在のために、ＣＮＳ−関連病に続いての機能の効果的な回復は極端に制限されているか、または存在しない。特に、年齢−関連黄斑変性（ＡＭＤ）として知られている通常の網膜疾患は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）と共に、内部核層（ＩＮＬ）の介在（「リレー」）ニューロンのさらなる可変関与と共に光受容体の喪失に由来する。中低度ないし高度な明瞭度視覚の回復は、従って、損傷した細胞層のいくつかまたは全ての機能的置換を必要とする。
【０００３】
解剖学的には、色素性網膜炎（ＲＰ）、遺伝性網膜変性のファミリーは、視覚の喪失に導く光受容体細胞の数の継続的減少である。表現型はＲＰのほとんどの形態を通じて同様であるが、根底となる細胞メカニズムは多様であり、多くの遺伝子において種々の突然変異に由来し得る。ほとんどは、光受容体−細胞−特異的遺伝子の発現を改変する突然変異を含み、これらのほぼ１０％を占めるロドプシン遺伝子における突然変異を伴う。病気の他の形態において、アポトーシスの調節遺伝子は改変される（例えば、ＢａｘおよびＰａｘ２）。ＡＭＤは、分子レベルにおいて病因が異なるようであるある範囲の変性疾患を含む臨床的診断である。ＡＭＤの全てのケースは、中央網膜内の光受容体細胞喪失の特徴を共有する。しかしながら、この共通する最終点は、ＲＰＥ、血管新生、および下にあるブルッヒ膜のレベルにおいてより初期の異常の二次的結果であるように見える。後者は、未だよく理解されていない光受容体膜代謝回転での困難に関連し得る。加えて、網膜色素上皮は、目における最も重要な細胞型の１つである。というのは、それは光受容体機能の裏付に対して非常に重要だからである。それは、桿体および錐体の放出された外側セグメントのファゴサイトーシス、ビタミンＡ代謝、網膜下空間における代謝産物交換に関与するムコ多糖の合成、代謝産物の輸送、脈管形成の調節、光の吸収、像の分解能の増強、およびポロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤のような分泌された蛋白質を通じての網膜における多くの他の機能の調節を含めたいくつかの複雑な仕事を行う。
【０００４】
ＡＭＤのいくつかの場合に存在するさらなる特徴は、異常な血管の存在であり、これは、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）として知られた疾患をもたらす。ＡＭＤのこの血管新生（「湿潤」）形態は特に破壊的であり、脈管形成の適切な調節の喪失に由来するように見える。ＲＰＥ機能障害の結果としてのブルッヒ膜における破壊は、網膜下空間に対する脈絡膜循環アクセスからの新しい血管を可能とし、そこで、それらは物理的に外側−セグメント組織化を破壊することができ、さらなる光受容体喪失に導く血管漏出または出血を引き起こしかねない。
【０００５】
ＣＮＶはレーザー処理によって標的化することができる。かくして、ＡＭＤの「湿潤」形態に対するレーザー処理は、合衆国において一般的に用いられている。しばしば、望ましくない副作用があるが、従って、患者の試料結果に対する不満足がある。これは、もしそれらが起これば、レーザー火傷が光受容体死滅に、および視野の対応する部分内での絶対的修復できない盲目に関連するという事実による。加えて、レーザー処理は、発生するＣＮＶに向けての基礎となる素因を固定しない。事実、レーザー火傷は、サルにおいてＣＮＶの誘導のための「慣用的な方法として用いられてきた。（Ａｒｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｇａｒｄｉｎｅｒ，１９８１）。ＣＮＶについての黄斑レーザー処理は、英国のような他の国においてはほとんど用いられていない。黄斑およびドルーゼンと呼ばれる関連する細胞外物質におけるＲＰＥ萎縮の不規則なパッチに重なる光受容体の喪失がある、ＡＭＤのより普通の「乾燥した」形態に対して一般的に認められた治療はない。
【０００６】
ＲＰＥは光受容体の維持、および脈管形成の調節において重要な役割を演じているので、イン・ビボでの種々のＲＰＥの機能障害は、光受容体の損傷および盲目をもたらしかねない年齢−関連黄斑変性を含めた、色素性網膜炎、ＲＰＥ脱落、形成異常、萎縮、網膜障害、黄斑ジストロフィーまたは変性に関連する。具体的には、およびＡＭＤに加えて、黄斑に影響する他の変性疾患の種類は、限定されるものではないが、錐体ジストロフィー、錐体−桿体ジストロフィー、マラッティア・レベンティネーズ（ｍａｌａｔｔｉａ  ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ）、ドイネハニカムジストロフィー、ソルスビージストロフィー、シュタルガルト病、パターン／バタフライジストロフィー、ベスト卵黄ジストロフィー、ノースキャロライナジストロフィー、中枢輪紋状脈絡膜ジストロフィー、アンギオイドストリーク、および毒性黄斑障害を含む。
【０００７】
黄斑に二次的に影響し得る一般的な網膜病は網膜剥離、病理学的近視、色素性網膜炎、糖尿病性網膜障害、ＣＭＶ網膜炎、閉塞性網膜血管病、未成熟の網膜障害（ＲＯＰ）、脈絡膜破壊、目ヒストプラスマ症症候群（ＰＯＨＳ）、トキソプラスマ症、およびレーバー先天性黒内障を含む。前記リストのいずれも限定的なものではない。
【０００８】
前記疾患の全ては光受容体の喪失を含む、従って、治療オプションは少数かつ不十分である。
【０００９】
その創傷治癒能力のため、ＲＰＥは移植療法への適用において広範に調べられてきた。試験への一年である２００２年において、患者は３０ないし５０％改善を示していた。いくつかの動物モデルにおいて、およびヒトにおいて（Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１によってレビューされたＧｏｕｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｔａｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｈｒａｅｒｍｅｙｅｒ
ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ＲＰＥ移植は視覚回復の良好な能力を有することが示されている。しかしながら、目のような免疫−特権部位においてさえ、移植片拒絶に伴う問題があり、もし同種異系移植を用いれば、このアプローチの進行を妨げる。新しい光受容体（ＰＲＣ）は移植によって実験的に導入されてきたが、グラフト化ＰＲＣは、宿主網膜の生存するニューロンと連結するのに顕著な抵抗を示す。胎児組織から由来するＲＰＥ細胞に対する信頼性はもう１つの問題である。というのは、これらの細胞は非常に低い増殖能力を示すからである。エモリー（Ｅｍｏｒｙ）大学の研究者は実験を行い、そこでは、彼らはイン・ビトロにてヒト目ドナーからのＲＰＥ細胞を培養し、それらを、進行したパーキンソン病を持つ６人の患者に移植した。兆候の３０ないし５０％減少が移植から１年後に見出されたが、目ドナーの欠乏がある、これは未だＦＤＡで認可されておらず、提供される目の組織に適合し得るのを超えて依然として要望が存在するであろう。
【００１０】
かくして、これまで、異所性ＲＰＥ細胞を用いる療法は、線維芽細胞のように振舞うことが示されており、軸索喪失（Ｖｉｌｌｅｇａｓ−Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８）および網膜剥離を伴う増殖性硝子体障害（ＰＶＲ）（Ｃｌｅａｒｙ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，１９７９）を含めた多数の破壊的な網膜合併症に関連付けられている。ＲＰＥは、緩いシートは巻かれる傾向があるので送達される。この結果、光受容体の貧弱な効果の被覆ならびに正しくない極性を伴う多層ＲＰＥがもたらされ、恐らくは、嚢胞形成または黄斑浮腫をもたらす。
【００１１】
病気のヒトの目の網膜下（黄斑下）への神経網膜移植片の送達はＫａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｈｕｍａｙｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）、およびｄｅｌ  Ｃｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）に記載されている。神経網膜移植片は典型的には宿主網膜と機能的に一体化しない点で深刻な問題が存在する。加えて、無傷ＲＰＥ単層の不存在は、ＲＰＥ機能不全またはブルッヒ膜の破壊が矯正されていないことを意味する。両者は視覚喪失の基本的な先行事情である。
【００１２】
かくして、現在の療法のいずれにおいてもＲＰＥを復元するための効果的な手段はなく、各々において、特に、移植片および宿主網膜の間の機能的遮断の本質的な問題において欠陥が依然として存在する。従って改良された網膜療法に対する要望が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、限定されるものではないが、水平細胞および無軸索細胞を含めた神経細胞、桿体および錐体のような網膜細胞、角膜細胞、血管細胞、および幹細胞からのＲＰＥおよびＲＰＥ−様細胞を含めた目の細胞の誘導のための改良された方法を提供し、および網膜変性の治療のための改良された方法および療法を提供することにある。特に、これらの細胞は、ヒト胚性幹細胞に由来するＲＰＥおよびＲＰＥ−様細胞の使用を含む。
【００１４】
本発明の１つの具体例は、ＲＰＥ細胞、ＲＰＥ−様細胞、これらの細胞の先祖、または哺乳動物胚性幹細胞に由来するこれまでのもののいずれかの２つまたは３つの組合せを用いて網膜変性のための療法用の細胞を生じさせて、限定されるものではないが、色素性網膜炎および黄斑変性および関連疾患を含めた種々の疾患を治療する改良された方法を提供する。本発明を用いて生産することができる細胞型は、限定されるものではないが、ＲＰＥ、ＲＰＥ−様細胞、およびＲＰＥ先祖を含む。やはり生産することができる細胞は虹彩色素沈着上皮（ＩＰＥ）細胞を含む。介在ニューロン（例えば、内部核層（ＩＮＬ）の「リレー」ニューロン）および無軸索細胞（光受容体−二極−神経節細胞鎖よりなる垂直に直接的な経路の第二のシナプスレベルにおいて相互作用する介在ニューロン−それらは内部網状層（ＩＰＬ）においてシナプスで活性であり、神経節細胞に提示される視覚メッセージに対する時間的ドメインを一体化し、変調し、および間に挟み働きをする）を含めた視覚関連神経細胞もまた本発明を用いて生産することができる。加えて、網膜細胞、桿体、錐体、および角膜細胞を生産することができる。本発明のさらなる具体例において、目の血管系を供する細胞もまた生産することができる。本発明の細胞は、硝子体切除外科的処置を用いることによって網膜下空間に移植することができる。非限定的例は懸濁液、マトリックスまたは基材へのこれらの細胞の移植を含む。治療することができる色素性網膜炎の動物モデルはげっ歯類（ｒｄマウス、ＲＰＥ−６５ノックアウトマウス、たるのようなマウス、ＲＣＳラット）、ネコ（アビシニアンネコ）、イヌ（錐体変性「ｃｄ」イヌ、進行性桿体−錐体変性「ｐｒｃｄ」イヌ、初期網膜変性「ｅｒｄ」イヌ、桿体−錐体形成異常１、２および３「ｒｃｄ１、ｒｃｄ２およびｒｃｄ３」イヌ、光受容体形成異常「ｐｄ」イヌ、およびＢｒｉａｒｄ「ＲＰＥ−６５」（イヌ）を含む。評価は、挙動テスト、蛍光アンジオグラフィー、組織学、あるいは、機能試験（例えば、ファゴサイトーシス（光受容体断片）を行う細胞の能力の測定）、ビタミンＡ代謝、密な接合導電率、または電子顕微鏡を用いる評価を用いて行う。ここに提示された方法に対する多くの利点の１つは、もし目ドナー組織を用いることに制限されるならば治療が可能であろうよりもより多くの患者を生じ、および治療する能力である。
【００１５】
本発明のさらなる具体例は、ＲＰＥの多数の特徴を持つ細胞へのｈＥＳ細胞の自然発生分化のための方法を提供する。これらのＲＰＥ調製物は、培養において表現型変化が可能であり、かつ多数の継代を通じてＲＰＥ特徴を維持することができる。また、本発明は、ｂＦＧＦまたはＦＧＦの使用を介する非限定的例として、樹立されたＲＰＥ細胞系を別のニューロン系列、角膜細胞、網膜細胞に分化する方法も提供する。
【００１６】
本発明のもう１つの具体例は、存在するおよび新しいＥＳ細胞系からの新しいＲＰＥ系および先祖細胞の誘導方法である。それらが異なるＥＳ細胞系に由来する場合、ＲＰＥ−様細胞の、成長速度、色素の発現、または培養における脱分化および細分化のような特性の変動があり得る。それらの機能および核型安定性にはある種の変動があり得、従って、クローン的に選択して、高い品質のＲＰＥ−様細胞の純粋な集団を生産することができる所望の特性を持つ系の選択を可能とする新しいＲＰＥ系および新しいＥＳ細胞系の誘導方法を提供するのが望ましい。
【００１７】
なお、もう１つの具体例において、本発明は、成長速度、色素の発現、培養における脱分化、および培養における細分化よりなる群から選択される特徴の少なくとも１つにおいて樹立されたＲＰＥ細胞系から変化する単離されたＲＰＥまたはＲＰＥ−様細胞系を提供する。
【００１８】
存在するおよび新しいＥＳ細胞系にやはり由来し得る細胞は虹彩色素沈着上皮（ＩＰＥ）細胞を含む。さらなる具体例において、介在ニューロン（例えば、内部核層（ＩＮＬ）の「リレー」ニューロン）および無軸索細胞を含めた視覚関連神経細胞も本発明を用いて生産することができる。加えて、網膜細胞、桿体、錐体、および角膜細胞を生産することができる。本発明のさらなる具体例において、目の血管系を供する細胞もまた生産することができる。
【００１９】
本発明のもう１つの具体例は、血管新生を妨げる増大した能力を有するＲＰＥ系またはＲＰＥ細胞に対する前駆体の誘導方法である。そのような細胞は、テロメラーゼが短くなるように患者からの体細胞を老化させることによって生産することができ、ここに、該細胞の正常な複製寿命の少なくとも１０％は過ぎており、従って、核移動ドナー細胞としての該体細胞の使用は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ／ＥＰＣ−１）のような脈管形成阻害剤を過剰発現する細胞を作り出す。別法として、そのような細胞は血管新生を阻害する外因性遺伝子で遺伝的に修飾することができる。
【００２０】
本発明のもう１つの具体例は、該細胞がそれらのＨＬＡ抗原の低下した複雑性を有するように、ＨＬＡ領域におけるホモ接合性を持つＥＳまたは胚−由来細胞のバンクを利用した。
【００２１】
従って、本発明のさらなる具体例は、ＥＳ−由来ＲＰＥ−様細胞の特徴付けを含む。ＥＳ−由来色素沈着上皮細胞は、それらの形態、挙動および分子マーカーによってＲＰＥに非常に似ているが、それらの治療的価値は、ＲＰＥ機能を行い、かつ非−癌形成性のままであるそれらの能力に依存するであろう。従って、ＥＳ−由来ＲＰＥ細胞は以下の技術（ｉ）それらの機能、すなわち、光受容体断片のファゴサイトーシス、ビタミンＡ代謝、創傷治癒能力の評価；（ｉｉ）動物モデル移植を通じてのＲＰＥ−様ＥＳ細胞誘導体の多能性の評価（非限定的例として、これはＳＣＩＤマウスを含むことができる）；（ｉｉｉ）ＲＰＥ−様細胞のフェノタイピングおよびカリオタイピング；（ｉｖ）遺伝子発現プロファイリングによるＥＳ細胞−由来ＲＰＥ−様細胞およびＲＰＥ組織の評価、（ｖ）ベストロフィン、ＣＲＡＬＢＰ、ＲＰＥ−６５、ＰＥＤＦを含めた蛋白質レベルにおけるＲＰＥの分子マーカーの発現、およびＥＳマーカーの不存在の評価、および（ｖｉ）ＲＰＥおよび神経マーカーの比率の評価の１以上を用いて特徴付けられる。該細胞が、ｒｘ／ｒａｘ、ｃｈｘ１０／ｖｓｘ−２／ａｌｘ、ｏｔｓ−１、ｏｔｘ−２、ｓｉｘ３／ｏｐｔｘ、ｓｉｘ６／ｏｐｔｘ２、ｍｉｔｆ、ｐａｘ６／ｍｉｔｆ、およびｐａｘ６／ｐａｘ２を含めた、目の発生に通常必要な転写アクチベーターのそれらの発現に基づいて評価することもできる（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｈ，２００１，Ｂａｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００２２】
本発明のさらなる具体例は、（ｉ）ＥＳ−由来ＲＰＥ−様細胞機能の評価；（ｉｉ）動物モデル移植を通じてのＲＰＥ−様ＥＳ細胞誘導体の多能性の評価；（ｉｉｉ）ＲＰＥ−様細胞のフェノタイピングおよびカリオタイピング；（ｉｖ）遺伝子発現プロファイリングの評価、（ｖ）蛋白質レベルにおけるＲＰＥの分子マーカーの発現の評価；および（ｖｉ）目発生に通常必要な転写アクチベーターの発現よりなる群から選択される技術の少なくとも１つを用いてＥＳ−誘導ＲＰＥ−様細胞を特徴付ける方法である。さらなる具体例において、これらの技術は、多数のｈＥＳ細胞−由来細胞型の評価で用いることができる。
【００２３】
本発明のもう１つの具体例は、ＥＳ細胞系の発生なくして、ヒトおよび非−ヒト動物桑実胚または胚盤胞−段階の胚（ＥＤＣ）から直接的にＲＰＥ細胞およびＲＰＥ前駆体細胞を誘導する方法である。
【００２４】
胚性幹細胞（ＥＳ）は未分化段階においてイン・ビトロではっきりとせずに維持することができるが、実質的にいずれの細胞型へ分化することもできる。かくして、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞はヒト細胞の分化についての研究で有用であり、移植療法のための潜在的源と考えることができる。今日、多数の細胞型へのヒトおよびマウスＥＳ細胞の分化が報告されており（Ｓｍｉｔｈ，２００１によってレビューされている）、心筋細胞［Ｋｅｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｍｕｍｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２］、ニューロンおよび神経前駆体（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、脂肪細胞（Ｂｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、肝細胞−様細胞（Ｒａｍｂｈａｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、造血細胞（Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、卵細胞（Ｈｕｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、胸腺細胞−様細胞（Ｌｉｎ  ＲＹ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、膵臓島細胞（Ｋａｈａｎ，２００３）、および骨芽細胞（Ｚｕｒ  Ｎｉｅｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。本発明のもう１つの具体例は、そのような細胞のメッセンジャーＲＮＡ転写体をイン・ビボで誘導された細胞と比較することによって、胚、胚性幹細胞系、または有用な細胞型へ分化する能力を持つ他の胚性細胞に由来する、細胞療法または研究で有用なＲＰＥ細胞、造血細胞、筋肉細胞、肝臓細胞、膵臓ベータ細胞、ニューロン、内皮、先祖細胞または他の細胞のような細胞を同定する方法である。この方法は、正常な表現型を持ち、かつ研究用の細胞療法につき最適化された細胞を誘導するための細胞の同定を容易とする。
【００２５】
本発明は、ニューロン系、網膜色素上皮（ＲＰＥ）における特殊化された細胞へのヒトＥＳ細胞の分化を提供する。ＲＰＥは、脈絡膜および神経網膜の間の密に色素沈着した上皮単層である。それは血流および網膜の間のバリアーの一部として働き、その機能は放出された桿体および錐体の外側セグメントのファゴサイトーシス、迷光の吸収、ビタミンＡ代謝、レチノイドの再生、および組織修復を含む（Ｇｒｉｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｈ，２００１，Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＲＰＥは黒色色素沈着細胞の丸石細胞形態によって容易に認識される。加えて、細胞レチンアルデヒド−結合蛋白質（ＣＲＡＬＢＰ）、先端微小絨毛においても見出される細胞質蛋白質（Ｂｕｎｔ−Ｍｉｌａｍ  ａｎｄ  Ｓａａｒｉ，１９８３）；ＲＰＥ６５、レチノイド代謝に関与する細胞質蛋白質（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｒｅｄｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）；ベストロフィン、ベスト卵黄黄斑ジストロフィー遺伝子の産物（ＶＭＤ２、Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、および色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、血管新生抑制性を持つ４８ｋＤ分泌蛋白質（Ｋａｒａｋｏｕｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）を含めた、ＲＰＥのいくつかの公知のマーカーがある。
【００２６】
ＲＰＥの異常な特徴はその見掛けの可塑性である。ＲＰＥ細胞は通常は有糸分裂が静止状態であるが、負傷または光凝固に応答して分裂を開始する。負傷に隣接するＲＰＥ細胞は扁平となり、増殖し、新しい単層を形成する（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。いくつかの研究は、ＲＰＥ単層が、後にそれらの元のＲＰＥ形態に復帰することができる線維芽細胞外観の細胞を生産することができるのを示した（Ｇｒｉｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｋｉｒｃｈｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＲＰＥ細胞の２つの集団：上皮および紡錘状が単離されているので、分裂する細胞および色素沈着上皮層が同一系からのものであるか否かは明瞭でない（ＭｃＫａｙ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ，１９９４）。イン・ビトロにおいて、成長因子および下層の組合せに応じて、ＲＰＥは上皮として維持できるか、または迅速に脱分化し、増殖性となることができる（Ｚｈａｏ  １９９７，Ｏｐａｓ  ａｎｄ  Ｄｚｉａｋ，１９９４）。興味深いことには、上皮表現型は長期休止培養において再度樹立させることができる（Ｇｒｉｅｒｓｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。
【００２７】
哺乳動物の発生において、ＲＰＥは神経網膜、目小胞の神経上皮と同一先祖を共有する。ある種の条件下では、ＲＰＥはニューロン先祖（Ｏｐａｓ  ａｎｄ  Ｄｚｉａｋ，１９９４）、ニューロン（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｖｉｎｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、およびレンズ上皮（Ｅｇｕｃｈｉ，１９８６）にトランス分化することができることが示唆されている。ニューロンへのＲＰＥの変化を刺激することができる因子の１つはｂＦＧＦであり（Ｏｐａｚ  ａｎｄ  Ｄｚｉａｋ，１９９４）、これは、ｒｘ／ｒａｘ、ｃｈｘ１０／ｖｓｘ−２／ａｌｘ、ｏｔｓ−１、ｏｔｘ−２、ｓｉｘ３／ｏｐｔｘ、ｓｉｘ６／ｏｐｔｘ２、ｍｉｔｆ、およびｐａｘ６／ｐａｘ２を含めた、目の発生に通常必要な転写アクチベーターの発現に関連するプロセスである（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｈ，２００１，Ｂａｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。最近、ニワトリ網膜の縁が神経幹細胞を含有し（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｈ，２０００）、およびｐａｘ６／ｍｉｔｆを発現するその領域における色素沈着細胞がＦＧＦに応答してニューロン細胞を形成できる（Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｈ，２００１）ことが示されている。
【００２８】
本発明は、ｈＥＳからの小柱メッシュワーク細胞の誘導、および緑内障の治療のための遺伝的に修飾された小柱メッシュワーク細胞を提供する。
【００２９】
また、本発明は、ＲＰＥ先祖およびＲＰＥ−様細胞からの小柱メッシュワーク細胞の誘導、および緑内障の治療用の遺伝的に修飾された小柱メッシュワーク細胞も提供する。
【００３０】
もう１つの具体例において、本発明は、ＲＰＥ−様細胞を単離する方法を提供する。そのような方法はａ）増殖、およびｈＥＳ細胞のＲＰＥ−様細胞へのトランス分化を支持する培地中でｈＥＳ細胞を培養し；ｂ）神経系に沿って分化の兆候を呈する工程ａ）の細胞を選択し；ｃ）コラゲナーゼまたはコラゲナーゼの組合せのような酵素および／または解離緩衝液（これらの非限定的例はトリプシン、コラゲナーゼＩＶ、コラゲナーゼＩ、ジスパーゼ、ＥＤＴＡ、または他の商業的に入手可能な解離緩衝液）を用いて、工程ｂ）で選択された細胞を、色素沈着上皮島が出現し、または数が増大するまで継代し；次いで、ｄ）高純度のＲＰＥ−様培養の樹立のために、工程ｃ）で継代した色素沈着または非−色素沈着細胞を選択することを含むことができる。ある態様において、本発明のｈＥＳ細胞は、増殖およびトランス分化を支持するいずれかの培地において培養することができる。他の態様において、ｈＥＳ細胞は、血清置換を含有する培地中で培養される。具体的な態様において、本発明のｈＥＳ細胞は、５００ｕ／ｍｌペニシリン、５００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１％非−必須アミノ酸溶液、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸＩ、０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノール、４ないし８０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、および８．４％ないし２０％血清置換を補足したノックアウト高グルコールＤＭＥＭを含む培地中で培養することができる。所望により、本発明のｈＥＳ細胞は、さらに１０ないし１００ｎｇ／ｍｌヒトＬＩＦを含む培地中で培養される。所望により、本発明のｈＥＳ培養基はさらにプラズマネート（Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ）を含む。プラズマネートは約１％ないし約２５％（例えば、約１％、４％、６％、８％、１２％、１６％または２０％）の最終濃度まで加えることができる。もう１つの態様において、本発明のｈＥＳ細胞は反復して継代することができ、２、３、５、７、１０回以上を含む。分化する細胞が、神経−系特異的マーカーのそれらの発現により選択することができる。例示的な神経−系特異的マーカーはＰａｘ６を含む。好ましい具体例において、ｂＦＧＦは増殖の間にＲＰＥ培養に加え、細胞は分化の間にｂＦＧＦなくして培養される。
【００３１】
本発明は、ＥＳ細胞系の発生なくして、ヒトおよび非−ヒト動物桑実胚または胚盤胞−段階の胚（ＥＤＣ）から直接的にＲＰＥ細胞およびＲＰＥ前駆体細胞を誘導する方法を含む。１つの具体例において、そのような方法は：ａ）イン・ビトロにてＥＳ細胞を未分化状態に維持し；ｂ）ＥＳ細胞をＲＰＥおよびＲＰＥ前駆体細胞に分化させ；ｃ）そのような細胞のメッセンジャーＲＮＡ転写体をイン・ビボで誘導された細胞と比較することによってＲＰＥ細胞を同定し、および／または蛋白質発現プロフィールを公知のＲＰＥ細胞および／または表現型評価と比較することによってＲＰＥ細胞を同定し；次いで、ｅ）ＲＰＥ細胞および／またはＲＰＥ前駆体を同定し、および／または単離する工程を含む。
【００３２】
本発明によってさらに提供されるのは、血管新生を妨げる増大した能力を有するＲＰＥ系またはＲＰＥ細胞への前駆体を誘導する方法であり、該方法は：ａ）テロメラーゼが短くなるように動物からの体細胞を老化させ、ここに、該細胞の正常な複製寿命の少なくとも１０％は経過しており；次いで、ｂ）該体細胞を核移動ドナー細胞として用いて、脈管形成阻害剤を過剰発現する細胞を作成することを含み、ここに、該脈管形成阻害剤は色素上皮誘導因子（ＰＥＤＦ／ＥＰＣ−１）であり得る。
【００３３】
本発明は、ｈＥＳ細胞−誘導ＲＰＥ、ＲＰＥ−様および／またはＲＰＥ先祖細胞でパーキンソン病を治療する方法を提供する。これらは、マイクロキャリアーと共に定位線条体内移植によって送達することができる。別法として、それらはマイクロキャリアーを用いることなく送達することができる。該細胞は培養において拡大培養することもでき、当業者に知られたいずれかの方法によってパーキンソン病の治療に用いることもできる。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
ａ）ｈＥＳ細胞の増殖およびＲＰＥ−様細胞へのトランス分化を支持する培地中でｈＥＳ細胞を培養する工程；
ｂ）神経系に沿って分化の兆候を呈する工程ａ）の細胞を選択する工程；
ｃ）色素沈着上皮島が出現し、または数が増加するまで、トリプシン、コラゲナーゼＩＶ、コラゲナーゼＩ、およびジスパーゼよりなる群から選択される酵素を用いて工程ｂ）で選択された細胞を継代する工程；および
ｄ）高純度ＲＰＥ−様培養物の樹立のために、工程ｃ）で継代した色素沈着または非−色素沈着細胞を選択する工程；
を含む、ＲＰＥ−様細胞を単離する方法。
（項目２）
工程ｃ）における細胞の継代を少なくとも２回反復する、項目１記載の方法。
（項目３）
工程ｂ）における細胞の選択が、ネスチンまたはＰａｘ６神経系−特異的マーカーを発現する細胞の選択である、項目１記載の方法。
（項目４）
該培地が血清置換物を含有する、項目１記載の方法。
（項目５）
該培地が、５００ｕ／ｍｌペニシリン、５００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１％非−必須アミノ酸溶液、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ、０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノール、４ないし８０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、および８．４％ないし２０％血清置換物を補充したノックアウト高グルコールＤＭＥＭを含む項目４記載の方法。
（項目６）
該培地が１０ないし１００ｎｇ／ｍｌヒトＬＩＦをさらに含む、項目５記載の方法。
（項目７）
該培地がプラズマネートをさらに含む、項目５記載の方法。
（項目８）
増殖速度、色素の発現、培養における脱分化、培養における再分化よりなる群から選択される特徴の少なくとも１つにおいて樹立されたＲＰＥ細胞系から変化する、単離されたＲＰＥまたはＲＰＥ様細胞系。
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な記載から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１ＡないしＦは、自然に分化するｈＥＳ細胞における（ＲＰＥ細胞に特徴的な）色素沈着領域の出現を示す一連の写真である。図１Ａは２．５ヶ月齢接着性培養、４−ウエルプレートのウエルにおけるスキャンされた色素沈着領域の写真であり；図１Ｂは４５倍の、ＥＢとして増殖された２．５ヶ月齢培養における色素沈着領域の写真であり；図１Ｃは接着性培養の色素沈着領域の写真であり；図１ＤはＥＢの色素沈着領域の写真であり；図１Ｅは色素沈着領域および培養の残りの間の境界の写真であり、×２００；４００倍を除いて図Ｆは図Ｅと同一である。ＡおよびＢにおける矢印は色素沈着領域を指す。
【図２】図２ＡないしＦは、培養における色素沈着および上皮継代の喪失および再獲得を示す一連の写真である。図２Ａは初代ＥＢの増殖を示す写真であり、一週間；図２Ｂは手で拾った細胞の初代培養を示す写真であり、一週間；図２Ｃは増殖する細胞によって囲まれた上皮島を示す写真であり；図２Ｄは一ヶ月齢培養における色素沈着および上皮形態の獲得を示す写真であり；図２Ｅは３継代後の培養を示す写真であり、２００倍；図２ＦはＥにおけると同一の培養を示す、４００倍、Ｈｏｆｆｍａｎ顕微鏡観察。黒色矢印は色素沈着細胞を指し示し、白色矢印は色素なしの増殖細胞を示す。
【図３】図３の左側パネル（ＡないしＤ）および右側パネルは一連の写真および１つのグラフであり−これらは、ｈＥＳ細胞−由来色素沈着上皮細胞におけるＲＰＥのマーカーを示す。図３Ａおよび３Ｂは、ＲＰＥマーカー、ベストロフィンの免疫局所化を示す写真、および対応する位相顕微鏡視野、２００倍であり；図３ＣおよびＤはＣＲＡＬＢＰを示す写真、および対応する位相コントラスト顕微鏡視野、４００倍である。矢印は、ベストロフィン（Ａ）およびＣＲＡＬＢＰ（Ｃ）の色素沈着細胞（Ｃ，Ｄ）への共局所化を示し；矢印の頭は、非−色素沈着領域（Ｃ，Ｄ）におけるこれらの蛋白質（Ａ，Ｂ）についての染色の不存在を指し示す。図３の右側パネル（頂部）はベストロフィン（ａ）およびＣＲＡＬＢＰ（ｂ）に対する抗体での細胞溶解物のウェスタンブロットの写真を示す；（ｃ）、（ｄ）−未分化ｈＥＳ細胞、ｃ−抗−ＣＲＡＬＢＰ抗体に対する対照、ｄ−抗−ベストロフィン抗体に対する対照。図３の右側パネル（底部）は、リアル−タイムＲＴ−ＰＣＲによる、成熟および未成熟ＲＰＥ−様細胞におけるＲＰＥ６５発現の比較を示す。試料番号１、６および７は成熟７週齢培養であり；試料番号２、３、４および５は未成熟１５日齢培養であり；および試料番号８は未分化ｈＥＳ細胞である。
【図４】図４は、長期休止培養での、ＲＰＥ−様細胞におけるＰａｘ６（図４Ａ）、Ｐａｘ２（図４Ｅ）およびｍｉｔｆ（図４Ｂ、図４Ｆ）のマーカーの発現を示す写真を示す。図４Ｃ、図４Ｇ−位相差、図４Ｄ、図４Ｈ−Ｐａｘ６／ｍｉｔｆ／位相差の融合させたイメージ（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ）およびＰａｘ２／ｍｉｔｆ／位相差の融合させたイメージ（図４Ｅ、図４Ｆ、図４Ｇ）。
【図５】図５ＡないしＢは、ＥＳ細胞系の誘導の段階を回避するヒト胚−由来細胞の培養におけるＲＰＥ分化の写真を示す。
【図６Ａ】図６は、ＲＰＥ調製物の転写の比較を示す。図６ＡないしＦ−腫瘍学注釈に基づき、この表は、ｈＥＳ細胞−由来網膜色素上皮（ｈＥＳ−ＲＰＥ）、ｈＥＳ細胞由来トランス分化（ｈＥＳ−ＲＰＥ−ＴＤ）、ＡＲＰＥ−１９およびＤ４０７および新たに単離されたヒトＲＰＥ（ｆｅ−ＲＰＥ）についてのＲＰＥ関連遺伝子の発現パターンを表す。
【図６Ｂ】図６は、ＲＰＥ調製物の転写の比較を示す。図６ＡないしＦ−腫瘍学注釈に基づき、この表は、ｈＥＳ細胞−由来網膜色素上皮（ｈＥＳ−ＲＰＥ）、ｈＥＳ細胞由来トランス分化（ｈＥＳ−ＲＰＥ−ＴＤ）、ＡＲＰＥ−１９およびＤ４０７および新たに単離されたヒトＲＰＥ（ｆｅ−ＲＰＥ）についてのＲＰＥ関連遺伝子の発現パターンを表す。
【図６Ｃ】図６は、ＲＰＥ調製物の転写の比較を示す。図６ＡないしＦ−腫瘍学注釈に基づき、この表は、ｈＥＳ細胞−由来網膜色素上皮（ｈＥＳ−ＲＰＥ）、ｈＥＳ細胞由来トランス分化（ｈＥＳ−ＲＰＥ−ＴＤ）、ＡＲＰＥ−１９およびＤ４０７および新たに単離されたヒトＲＰＥ（ｆｅ−ＲＰＥ）についてのＲＰＥ関連遺伝子の発現パターンを表す。
【図６Ｄ】図６は、ＲＰＥ調製物の転写の比較を示す。図６ＡないしＦ−腫瘍学注釈に基づき、この表は、ｈＥＳ細胞−由来網膜色素上皮（ｈＥＳ−ＲＰＥ）、ｈＥＳ細胞由来トランス分化（ｈＥＳ−ＲＰＥ−ＴＤ）、ＡＲＰＥ−１９およびＤ４０７および新たに単離されたヒトＲＰＥ（ｆｅ−ＲＰＥ）についてのＲＰＥ関連遺伝子の発現パターンを表す。
【図６Ｅ】図６は、ＲＰＥ調製物の転写の比較を示す。図６ＡないしＦ−腫瘍学注釈に基づき、この表は、ｈＥＳ細胞−由来網膜色素上皮（ｈＥＳ−ＲＰＥ）、ｈＥＳ細胞由来トランス分化（ｈＥＳ−ＲＰＥ−ＴＤ）、ＡＲＰＥ−１９およびＤ４０７および新たに単離されたヒトＲＰＥ（ｆｅ−ＲＰＥ）についてのＲＰＥ関連遺伝子の発現パターンを表す。
【図６Ｆ】図６は、ＲＰＥ調製物の転写の比較を示す。図６ＡないしＦ−腫瘍学注釈に基づき、この表は、ｈＥＳ細胞−由来網膜色素上皮（ｈＥＳ−ＲＰＥ）、ｈＥＳ細胞由来トランス分化（ｈＥＳ−ＲＰＥ−ＴＤ）、ＡＲＰＥ−１９およびＤ４０７および新たに単離されたヒトＲＰＥ（ｆｅ−ＲＰＥ）についてのＲＰＥ関連遺伝子の発現パターンを表す。
【図６Ｇ】図６は、ＲＰＥ調製物の転写の比較を示す。図６Ｇ−さらなるデータマイニングは、胎児ＲＰＥおよびＥＳ−ＲＰＥのみならず、ＡＲＰＥ−１９において、メラニン生合成、視覚、レチノール−結合のような公知のＲＰＥ特異的存在論を明らかにした。
【図７】図７は、ｈＥＳ細胞からの神経先祖の発生を示す。Ａ）ｈＥＳ細胞の過剰増殖した培養、立体顕微鏡観察。Ｂ）スフェロイド（Ａにおいて矢印）を除去し、ＥＢ培地中のゼラチン−被覆プレート上で平板培養し、１ないし２週間の内に紡錘−様細胞を生じる。Ｃ）、Ｄ）チューブリンベータＩＩＩ（Ｃ）およびネスチン（Ｄ）に対する抗体でのＢ）で示した細胞の染色。倍率：Ａ）×６０；ＢないしＤ）、×２００。  図７はｈＥＳ細胞から生じたいくつかの神経先祖細胞を示す。
【図８】図８は異なるＲＰＥ培養の形態学を示す。Ａ）均一な分化したＲＰＥ。Ｂ）いくつかの細長い色素沈着していない細胞（矢印）。Ｃ）色素沈着していない細胞によって囲まれた色素沈着した島、コラゲナーゼおよび／またはジスパーゼ消化後における色素沈着細胞の手で拾うための候補として指摘された細胞。Ｄ）トランス分化細胞。倍率×２００。図８は、異なるＲＰＥの形態学を示す。
【図９】図９は、ｈＥＳ細胞の分化する培養における桿体および錐体−様構造の出現を示す一連の写真である。図９ａは、ヘマトキシリン−エオシンで染色した分化する培養の組織学的調査である。×２００。図９ｂないし９ｅは、これらの培養における、オプシン５およびオプシン１（９ｂ）、レコベリン（９ｃ）、ロドプシン（９ｄ）およびケラチン１２（９ｅ）のＲＴ−ＰＣＲ分析である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の種々の具体例を詳細に記載し、これは、提供された実施例によってさらに説明することができる。本明細書中において、以下の請求項を通じて用いるように、「ある」および「該」の意味は、文脈上明瞭にその他のことを支持するのでなければ複数の参照を含む。また、ここに明細書で用いるように、文脈上明瞭に他のことを指令するのでなければ、「における」の意味は「における」および「において」を含む。
【００３６】
本明細書中および請求の範囲を通じて、用語「含む」、または「を含む」または「含んでいる」のような変形は、述べられた整数または整数の群を含めることを意味するが、いずれかの他の整数または整数の群を排除することを意味しないと理解されるであろう。
【００３７】
本明細書中で用いる用語は、一般には、発明の文脈内において、および各用語が用いられる具体的な文脈において、当該分野におけるそれらの通常の意味を意味する。発明を記載するのに用いるある用語は以下に、または明細書中の他の箇所において議論して、発明の組成物および方法、およびどのようにしてそれらを製造し使用するかを記載するにおいて実行者に対するさらなるガイダンスを提供する。便宜のために、例えば、イタリック体および／またはコーテンションマークを用いてある用語を強調することができる。強調の使用は用語の範囲および意味に対して影響を有さず；用語の範囲および意味は、それが強調されているか否かに拘わらず、同一の文脈において同一である。同一の事は１を超える方法で述べることができると認識されるであろう。その結果、代替言語および同義語を本明細書中で議論する用語のいずれかの１以上で用いることができ、用語が本明細書中において技巧を凝らしたもの、または議論されるか否かに基づいて、特殊な意義がもたらされるものではない。ある用語に対する同義語が供される。１以上の同義語の引用は、他の同義語の使用を排除しない。本明細書中で議論するいずれかの用語の例を含めた、本明細書中におけるいずれかの箇所での例の使用は単に説明するものであり、データが、いずれかの特定の議論または作用のスキームに関することなく、本発明に従って処理され、サンプリングされ、変換されるなどされる限り、断じて本発明の範囲を限定するものではない。
【００３８】
定義
「胚」または「胚性」は、母親宿主の子宮膜に着床していない発生する細胞塊を意味する。「胚性細胞」は、胚から単離された、または胚に含まれる細胞である。これは、２−細胞段階のような早期に得られた分割球、および凝集した分割球も含む。
【００３９】
用語「胚性幹細胞」とは胚−由来細胞をいう。より具体的には、それは、胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊から単離され、細胞系として系列的に継代された細胞をいう。
【００４０】
用語「ヒト胚性幹細胞」（ｈＥＳ細胞）とは、ヒト胚−由来細胞をいう。より具体的にはｈＥＳとは、ヒト胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊から単離され、細胞系として系列的に継代された細胞をいう、分割球および凝集した分割球を含むことができる。
【００４１】
用語「ヒト胚−由来細胞」（ｈＥＤＣ）とは、桑実胚−由来細胞、内部細胞塊のものを含めた胚盤胞−由来細胞、胚性シールド、または原外胚葉、または原始内胚葉、外胚葉、および中胚葉を含めた、また、分割球および凝集された単一分割球からの細胞塊、あるいは発生の種々の段階からの胚も含めた、初期胚の他の全能性または多能性幹細胞をいうが、細胞系として継代されているヒト胚性幹細胞を排除する。
【００４２】
ヒト身体の実質的にいずれの組織にも分化する能力を有する胚性幹（ＥＳ）細胞は、移植療法のための再若年化および組織適合細胞の制限のない供給を提供することができる。というのは、免疫拒絶の問題は核移動および単為生殖技術でもって克服できるからである。Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）の最近の知見は、マウスＥＳ細胞がイン・ビトロにて分化実験において目−様構造を生産できることを示した。それらのうち、網膜色素上皮に似ている色素沈着上皮細胞が記載された。霊長類およびヒトＥＳ細胞系でもってＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで行われた予備的実験は、特殊化された培養系において、これらの細胞は、単離し、継代できるＲＰＥ−様細胞に分化することを示す。ヒトおよびマウスＮＴ、Ｃｙｎｏパルテノート（ｐａｒｔｈｅｎｏｔｅ）ＥＳ細胞誘導体はＲＰＥの複数の特徴を有し；これらの色素沈着上皮細胞はＲＰＥの４つの分子マーカー−ベストロフィン、ＣＲＡＬＢＰ、ＰＥＤＦおよびＲＰＥ６５を発現する；ＲＰＥのように、培養中のそれらの増殖には脱分化−色素および上皮形態の喪失が伴い、そして、これら両者は細胞が単層を形成し、休止し始めた後に回復される。そのようなＲＰＥ−様細胞は容易に継代し、凍結および解凍でき、かくして、それらの拡大培養を可能とする。分化するＥＳ培養の組織学的分析は、桿体および錐体と同様な細胞の凝集体を含めた、初期網膜発生と合致する細胞のパターンを示す。
【００４３】
ＲＰＥ移植
現在、ＲＰＥ同種異系移植片の慢性的なゆっくりとした拒絶は、科学者がこのＲＰＥ移植の治療効果を判断するのを妨げる。いくつかの方法がこの傷害を克服すると考えられている。最も容易な方法は、癌および感染のようなひどい副作用に関連する、全身免疫抑制を用いることである。第２のアプローチは患者自身のＲＰＥ、すなわち、ホモグラフトを移植することであるが、これは、古い病気のＲＰＥを用いて、より多くの病気のＲＰＥを置き換える欠点を有する。しかしながら、３番目のアプローチは同一患者からの虹彩上皮（ＩＰＥ）を用いることであるが、これは、ＩＰＥがＲＰＥのすべての視覚関連機能を実行できない欠点を有する。
【００４４】
本発明は、移植拒絶が起こる確率を実質的に低下させる。なぜならばｈＥＳ細胞に由来するＲＰＥまたはＲＰＥ−様細胞は、ＨＬＡ領域におけるホモ接合性を持つｈＥＳ細胞のバンクから由来でき、あるいはクローン化されたｈＥＳ細胞系から由来できるからである。また、核移動および単為生殖はグラフテッドＲＰＥ細胞および先祖の組織適合性を容易とする。
【００４５】
色素性網膜炎におけるＲＰＥの欠陥
色素性網膜炎は、視覚受容体が異常な遺伝的プログラミングを介して徐々に破壊される遺伝的疾患である。いくつかの形態は比較的若い年齢において完全な盲目を引き起こし、ここに、他の形態は特徴的な「骨スピクラー」網膜変化を示し、視覚破壊はほとんど伴わない。この病気は世界中で約１５０万の人々に影響する。常染色体劣性ＲＰを引き起こす２つの遺伝子の欠陥がＲＰＥにおいて専ら発現される遺伝子で見出されており：１つはビタミンＡ代謝に関与するＲＰＥ蛋白質（シスレチンアルデヒド結合蛋白質）によるものである、第２のものはＲＰＥ、ＲＰＥ６５に対してユニークなもう１つの蛋白質を含む。非ヒト動物細胞を用いることなく培養されたｈＥＳ細胞由来ＲＰＥ細胞系の使用では、ＲＰのこれらの形態の双方はＲＰＥ移植によって直ちに処理可能であるべきである。この処理は、ＲＰが絶望的に処理できず、かつまだよく理解されていない盲目の形態であった数年前では考えることができなかった。
【００４６】
ＲＰＥ移植における新しい研究は、黄斑変性を含めた網膜変性の治療で有望であることを示唆する。加えて、進行したＲＰを持つ多数の患者は胎児網膜細胞移植に続いていくらか有用な視覚を回復している。患者の一人は、例えば、患者の顔から約６フィートの距離で保持された指をカウントできるまでほとんど光が見えない状態から改善された。第２の場合には、視覚は、トンネル視覚を通じて文字を見ることができるまで改善された。これらの研究における移植は注入によって行われ、新しい網膜細胞を現存する神経網膜直下に導入した。細胞の全てが生存したのではない。というのは、生存したものは他のニューロンとの結合を形成し、それらの周りの光受容体のように機能し始めたが、移植された胎児細胞は同種異系であった（すなわち遺伝子的にマッチしなかった）からである。最初の８人の人々が移植を受けてからほぼ１年後に、４人はいくらか視覚機能を回復し、５番目の人はそうする兆候を示す。
【００４７】
３つの新しく誘導されたヒト胚性幹細胞系は従前に記載されたものと特性が同様である（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｒｅｉｂｕｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｌａｎｚｅｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）：それらは、培養において４５継代を通じて、あるいは１３０集団倍化にわたって、未分化表現型を維持し、未分化ｈＥＳ細胞の公知のマーカー、Ｏｃｔ−４、アルカリ性ホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−Ｉ−６０、ＴＲＡ−Ｉ−８１を発現する。全てのｈＥＳ細胞系はＥＢまたは長期接着性培養において、およびテラトーマにおいて、３つの胚葉の誘導体に分化する。ｈＥＳ細胞の分化誘導体の１つは、以下の基準によって網膜色素上皮と同様である：形態学的には、それらは典型的な上皮丸石単層外観を有し、それらの細胞質において暗茶色色素を含有し、これは、メラノサイト、ケラチノサイト、網膜および虹彩色素上皮（ＩＰＥ）においてのみヒト身体で存在することが知られている。しかしながら、メラノサイトは非−上皮細胞であり、ケラチノサイトはメラニンを分泌せず、蓄積するに過ぎない。これらの細胞に存在するＲＰＥ−特異的蛋白質−ベストロフィン、ＣＲＡＬＢＰ、ＰＥＤＦの組は、それらがＩＰＥに対してではなくＲＰＥに対して同様であるようであることを示す。もう１つの同様性は、増殖する細胞においてほとんどまたは全く色素が見られないが、密にパッキングされた上皮島に保持され、あるいは細胞が休止状態となった後に新しく樹立された丸石単層で再度発現される場合に、培養中の単離された色素沈着細胞の挙動である。そのような挙動は培養中のＲＰＥ細胞について記載されており（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７によってレビューされている）、ニューロンマーカーのチューブリンベータＩＩＩはイン・ビトロにおいて脱分化するＲＰＥ細胞では特異的に局所化されており、典型的なＲＰＥ形態を持つ細胞では局所化されていないことが従前に報告されており（Ｖｉｎｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、これは、それがＲＰＥの可塑性、および神経系に脱分化するその能力を反映することを示唆する。本発明者らは、培養中のそのような細胞の脱分化を反映でき、あるいは長期培養においてｈＥＳ細胞の分化を通じて色素沈着細胞の隣に元来は位置し、ＲＰＥ−様細胞と共−単離できたであろう、ニューロン運命に委ねられる細胞の別々の集団を示すことができる、ＲＰＥおよびＲＰＥ−様細胞の初代および継代培養におけるチューブリンベータＩＩＩ局所化の同一パターンを観察した。
【００４８】
成長する目小胞において、ＲＰＥおよび神経網膜は同一の２能力神経上皮先祖を共有し、それらの運命はＰａｘ２、Ｐａｘ６およびＭｉｔｆによって決定されることが示されており（Ｂａｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、後者は最初の２つの標的である。初期段階におけるＰａｘ６はプロ神経遺伝子のアクチベーターとして作用し、さらなる発生においてＲＰＥでダウンレギュレートされ、成熟網膜中で無軸索および神経節細胞に留まる（Ａｓｈｅｒｙ−Ｐａｄａｎ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ，２００１によってレビューされている）。金魚において、それは再生するニューロンの有糸分裂的に活性な先祖においても見出される（Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。本発明者らは、ＲＰＥ−様細胞の多くは、チューブリンベータＩＩＩと同様なパターンでｍｉｔｆおよびＰａｘ６を発現し、長期培養において、または（軽く色素沈着し、ゆるくパッキングされた）「部分的」ＲＰＥ表現型を持つ細胞において色素沈着上皮島を囲う非−上皮形態の非−色素沈着細胞においてのみ見出されたことを発見した。最近継代された培養における増殖する細胞において、全てのこれらのマーカーはほとんど各細胞で見出され、これは、増殖の開始における先祖段階へのＲＰＥ−様細胞の復帰、または網膜先祖の実質的増殖いずれかを示唆する。興味深いことには、上皮形態の色素沈着細胞の島も見出されたテラトーマにおいて、Ｐａｓ６は色素沈着領域に隣接した非−色素沈着細胞で発現された（データは示さず）。多数の研究は、培養中のＲＰＥの脱分化、およびニューロン表現型の細胞（Ｒｅｈ  ａｎｄ  Ｇｒｅｔｔｏｎ，１９８７，Ｓｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｎｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ニューロン、無軸索および光受容体細胞（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、神経膠（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、神経網膜（Ｇａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、およびニューロン先祖（Ｏｐａｚ  ａｎｄ  Ｄｚｉａｋ，１９９３）の細胞へのそれらのトランス分化を従前に示している。そのような先祖は、今度は、培養中の成熟ＲＰＥ−様細胞と共存することができ、あるいはＲＰＥ−様細胞の脱分化の結果として出現することができる。同時に、神経網膜の細胞はイン・ビトロにてＲＰＥへトランス分化することができ（Ｏｐａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、従って、別法としてチューブリンベータＩＩＩおよびＰａｘ６陽性細胞は、共単離された神経細胞または神経先祖のＲＰＥ−様細胞へのそのようなトランス分化の一過性段階を表すことができる。
【００４９】
ｈＥＳ細胞のＲＰＥ−様細胞への分化は、後の実施例に記載された方法を用いた場合に自然に起こり、本発明者らは、色素沈着上皮細胞は６ないし８週間よりも古い培養で信頼性よく出現し、それらの数は経時的に進行し−３ないし５ヶ月以内、ほとんど全てのＥＢの培養は大きな色素沈着領域に有したことに気が付いた。記載されたｈＥＳ系に加えて、６つのより新しく誘導されたｈＥＳ系はＲＰＥ−様細胞に変化し、これは、神経の運命は通常は自然にＥＳ細胞によって選択されるので、ＲＰＥ−様細胞はそのような経路の進行した段階として欠陥によって生起し得ることを示唆する。また、分化するｈＥＳ細胞が多層環境を形成するそのような長期培養において、許容性および／または指令性分化シグナルは、ｈＥＳ細胞の分化する誘導体によって生産された細胞外マトリックスおよび成長因子から来る可能性がある。ｈＥＳ細胞のＲＰＥ−様細胞への分化のモデルは、そのようなミクロ環境がＲＰＥ分化およびトランス分化を協調させるのかを調べる有用なツールとなりえるであろう。
【００５０】
ＲＰＥは光受容体の維持において重要な役割を演じており、種々のＲＰＥ機能障害は、イン・ビボにて、ＲＰＥ脱落、形成不全、萎縮、網膜障害、色素性網膜炎、年齢−関連黄斑変性を含めた黄斑のジストロフィーまたは変性のような、光受容体損傷および盲目をもたらしかねない、多数の視覚−改変疾患と関連する。その創傷治癒能力のため、ＲＰＥは移植療法への適用において広く調べられている。いくつかの動物モデルにおいて、およびヒトにおいて（Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１によってレビューされたＧｏｕｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｔａｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｈｒａｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ＲＰＥ移植は視覚回復の良好な能力を有することが示されている。最近、ＲＰＥ移植についてのもう１つの有望なニッチェが提案されており、臨床試験の相に到達さえしている：これらの細胞はドーパミンを分泌するのでそれらはパーキンソン病の治療で用いることができよう（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，２００１）。しかしながら免疫−特権目においてさえ、移植片拒絶の問題があり、もし同種異系移植片が用いられれば、このアプローチの進行を妨げる。他の問題は胎児組織に対する依存性である。というのは、成人ＲＰＥは非常に引くい増殖能力を有するからである。本発明は、移植片拒絶が起こる尤度を減少させ、胎児組織の腫瘍に対する依存性を除去する。
【００５１】
免疫適合組織の源として、ｈＥＳ細胞は移植療法に対して有望である。というのは、免疫拒絶の問題は核移動技術で克服できるからである。網膜色素上皮−様細胞およびニューロン前駆体細胞を含めた、ヒトＥＳ細胞の新しい分化誘導体の使用、およびそれを生産するための分化システムの使用は、ＲＰＥの魅力的な潜在的供給、および移植のためのニューロン前駆体細胞を提供する。
【実施例】
【００５２】
実施例１
長期培養における色素沈着上皮細胞への自然分化
ＬＩＦ、ＦＧＦおよびプラズマネート非存在下でｈＥＳ細胞培養物をＭＥＦ上で過剰増殖させる場合、それらは細胞の厚い多層を形成する。約６週間後に、細胞の暗い島がより大きなクラスター内に出現する（図１）。これらの暗い細胞は、図１Ａに示すように、裸眼で容易に見られ、細胞のプレートにおいて「小斑点」のように見えた。より高い倍率においては、これらの島は、細胞質における茶色色素と共に、上皮細胞に典型的な、丸石単層における密にパッキングされた多角形細胞として出現する（図１Ｃ）。細胞において色素の量に差があり、島の中央部分における細胞は最も多くの色素を有し、そのエッジ近くの細胞は最も少ない色素を有する（図１Ｅおよび１Ｆ）。（図１Ｅおよび１Ｆ）。
【００５３】
ｈＥＳ細胞が胚様体（ＥＢ）を形成する場合−色素沈着上皮細胞が最初の６ないし８週間以内にＥＢの約１ないし２％で出現する（図１Ｂ）。経時的に、より多くのＥＢが色素沈着細胞を発生させ、３ヶ月までにほとんど各ＥＢは色素沈着上皮領域を有した（図１Ｄ）。ＥＢの色素沈着領域における細胞の形態は、接着性培養物のそれと非常に似ていた（図１Ｄ）。
【００５４】
実施例２
色素沈着上皮細胞の単離および培養
本発明者らは、双方の接着性ｈＥＳ細胞培養から、およびＥＢから色素沈着上皮細胞を単離した。色素沈着多角形細胞を酵素（トリプシン、および／またはコラゲナーゼ、および／またはジスパーゼ）で消化し、これらの色素沈着島からの細胞をガラスキャピラリーで選択的に拾った。色素沈着細胞のみを拾うように注意を払ったにも拘わらず、単離された細胞の集団はいくつかの非−色素沈着細胞を常に含んだ。細胞をゼラチンまたはラミニン上で１ないし２日間平板培養した後、細胞は初代培養（Ｐ０）と考えた。
【００５５】
初代培養は、色素沈着多角形細胞の島およびいくつかの単一色素沈着細胞を含有した。培養における３ないし４日後に、上皮形態（扁平およびラメリポディアを持つ細胞）を喪失したように見える非−色素沈着細胞はいくつかの島の周辺部に出現した（図２）。そのような周辺細胞の数は経時的に増加し、これは、これらの細胞が増殖していたことを示唆し、２週間後に、新しく形成された単層におけるほとんどの細胞はほとんどまたは全く色素を含有しなかった。さらに２ないし３週間の継続的培養の後、色素沈着上皮細胞は再度出現し始め、元の培養物におけるものから視覚的に区別できなかった（図２）。
【００５６】
実施例３
ＲＰＥマーカーの検出
ＲＰＥとしてのこれらの分化したヒト細胞の予備的特徴付けは、従前に記載されたＲＰＥ培養物に対するそれらの同様性；主としてそれらの上皮形態および色素の保有に基づく。ヒト身体には３つのタイプの色素沈着上皮細胞：網膜色素沈着上皮および虹彩色素沈着上皮ならびにケラチノサイトがあるが、後者は色素を分泌しない。上皮構造および丸石形態は他の色素沈着細胞、例えば、メラノサイトによって保有されない。また、ＲＰＥ細胞は培養で増殖させるとそれらの色素および上皮形態を喪失し、再獲得することが示されている（Ｚｈａｏ  １９９７，Ｏｐａｓ  ａｎｄ  Ｄｒｉａｋ，１９９４）ことは特筆すべきことであり、色素沈着細胞は同様に挙動し、従って、ＥＳ由来細胞はＲＰＥであり得るという仮説を検定するために、それらをＲＰＥに対する公知のマーカー：ベストロフィンおよびＣＲＡＬＢＰに対する抗体で染色した。図３（左側パネル）はベストロフィン（Ａ）およびＣＲＡＬＢＰ（Ｃ）の膜局所化を示し、双方は色素沈着上皮島で見出される。該細胞の全てがこれらの抗体で染色されるのではなく、染色の強度は色素発現およびコロニーの「緻密性」と相関し−細胞がより大きく、よりゆるくパッキングされた各色素沈着島の境界は、双方の蛋白質のより低い発現を示した。
【００５７】
推定上のＲＰＥ細胞をさらに特徴付けるために、ウェスタンブロッティングによってベストロフィン、ＣＲＡＬＢＰの発現に対して分析を行った。図３（右側パネル、頂部）は、細胞溶解物における、ベストロフィン、６８ｋＤ（ａ）、ＣＲＡＬＢＰ、３６ｋＤ（ｂ）に対応するバンドを示す。全てのこれらの蛋白質は初代培養および引き続いての継代双方において見出された。
【００５８】
もう１つの公知のＰＲＥマーカーであるＲＰＥ６５が、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＲＰＥ−様細胞で見出された（図３、右側パネル、底部）。図３、右側パネル、底部に示すように、ＲＰＥ６５の発現が分析した全てのｈＥＳ−ＲＰＥ試料で確認された。興味深いことには、（継代から７週間後の）成熟培養物は対照の未分化ｈＥＳ細胞よりも４ないし９倍多いＲＰＥ６５  ｍＲＮＡを有し、他方、より初期の継代（２週齢）培養物は１．５ないし２．５倍だけ対照を超えた。図３、右側パネル、底部参照。
【００５９】
ＰＥＤＦ  ＥＬＩＳＡアッセイは、全ての推定されたＲＰＥ培養物の細胞溶解物におけるＰＥＤＦの存在を示し、およびウェスタンブロットはほぼ４８ｋＤのバンドを示した（示さず）。
【００６０】
ＲＰＥ様培養物におけるニューロン先祖および網膜先祖のマーカーの検出。
【００６１】
ＰＡＸ−６、Ｐａｘ２、ｍｉｔｆおよびチューブリンベータＩＩＩは、直近に継代された細胞の大部分において、およびｈＥＳ細胞に由来するＲＰＥ様細胞の古い培養物における少数の細胞においてのみ発現されることが示された（図４）。
【００６２】
増殖細胞のＲＰＥ様形態が失われている（トリプシン処理から３日後の）増殖培養物において、ほとんど各細胞はｍｉｔｆ、Ｐａｘ６、チューブリンベータＩＩＩおよびネスチンの存在を示した。Ｐａｘ２はｍｉｔｆ−陰性のように見えた細胞の小さなサブセットのみで見出され、他方、Ｐａｘ６／ｍｉｔｆ、ｍｉｔｆ／チューブリンベータＩＩＩおよびＰａｘ６／チューブリンベータＩＩＩのかなりの程度の共局所化があった。色素沈着上皮島が再度確立された後の２１日齢休止培養物において、ＰＡＸ−６およびｍｉｔｆの群は、色素沈着上皮島の間の非上皮形態の非色素沈着細胞においてほとんどが見出され（図４、ＡないしＣ）、チューブリンベータＩＩＩは同様な分布のパターンを有した（示さず）。しかしながら、色素沈着島の周辺近くに位置する、ｍｉｔｆ陽性およびＰａｘ６陰性細胞の集団があった（図４、ＡないしＣ）。Ｐａｘ２はｍｉｔｆ陰性細胞の非常に小さなサブセットにおいてのみ見出された（図４、ＥないしＨ）。これらの蛋白質のいずれかの存在は「成熟」色素沈着上皮島の細胞で決して検出されなかった。しかしながら、いくらかのＲＰＥ特徴を有するに過ぎない細胞におけるこれらのマーカーはしばしば目に見え、すなわち、上皮のように見えたが、色素を有しなかったか、または色素沈着上皮島から離れたある単一色素沈着細胞におけるものであった。
【００６３】
実施例４
Ｃｙｎｏ−１  ＥＳ細胞からのｈＥＳ細胞系ＡＣＴ  Ｊ−１から誘導されたＲＰＥ−様細胞の特徴付け、および既存のｈＥＳ細胞系Ｈ１、Ｈ９およびＨ７からのＲＰＥ−様細胞の誘導
ＲＰＥ−様細胞系を拡大培養し、凍結および回収についてテストし、以下の方法およびＲＰＥ細胞の分子マーカーを用いて特徴付けた：ウェスタンブロットおよび免疫蛍光によってベストロフィンならびにＣＲＡＬＢＰ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットによってＰＥＤＦおよびＲＴ−ＰＣＲによってＲＰＥ６５。細胞を対照としての未分化ｈＥＳまたはＣｙｎｏ−１細胞と共にＳＣＩＤマウスに注入して、腫瘍形成性を評価した。ＲＰＥ−様細胞のカリオタイピングは市販ベースにて臨床試験場によってなされる。次いで、ＲＰＥ−様細胞の機能的特性の特徴付け、およびそれらの移植能力の試験を、本出願の別の箇所に記載されたようにまた当業者に公知の技術を用いて行う。
【００６４】
遺伝子発現プロファイリング実験は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムアレイを用いて行う。遺伝子発現は、ＥＳ細胞に由来するＲＰＥ−様細胞、およびオートプシからの網膜試料において比較する。限定されるものではないが、アカゲザル、ラットおよびウサギを含めたいくつかの動物モデルを用いて、移植されたＲＰＥ−様細胞の有効性を確認することができる。
【００６５】
実施例５
ＲＰＥ−様細胞の高い収率を保証する分化培養系の最適化
ＥＳ細胞を、段階的添加を含めた因子、例えば、ｂＦＧＦ、インスリン、ＴＧＦベータ、ＩＢＭＸ、ｂｍｐ−２、ｂｍｐ−４、またはそれらの組合せの存在下で、フィーダー細胞上で、あるいは胚様体（ＥＢ）として培養する。別法として、ＥＳ細胞は、ＲＰＥ形成におけるＥＣＭの役割の評価において、種々の細胞外マトリックス−被覆プレート（ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、Ｍａｔｒｉｇｅｌなど）上で増殖させる。初期ＲＰＥ先祖の分子マーカーの発現（Ｐａｘ６、Ｐａｘ２、ｍｉｔｆ）、およびＲＰＥ細胞の分子マーカーの発現（ＣＲＡＬＢＰ、ベストロフィン、ＰＥＤＦ、ＲＰＥ６５）を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって種々の時間間隔で評価して、首尾よい前記因子の組合せ、およびＲＰＥ−様細胞またはそれらの先祖において豊富化を生じる段階的手法を確認し、決定する。また、このアプローチを用いて、単離し、それらの分化能力についてさらに特徴付け、および移植実験で用いることができるＲＰＥの共通の先祖、および光受容体または神経網膜のような他の目の組織を産生することもできる。
【００６６】
実施例６
現存するＥS細胞系および新しいＥS細胞系からのＲＰＥおよび他の目組織先祖の誘導
遺伝子発現プロファイリングからのデータを用い、ＲＰＥ先祖マーカーの発現を表面蛋白質の発現と関連付けて、ＲＰＥ先祖細胞に対する表面マーカーのユニークな組合せを見出す。もしそのようなマーカーが見出されれば、表面蛋白質に対する抗体を用いてＲＰＥ先祖の純粋な集団を単離することができ、これは、次いで、培養し、培養中にさらに分化させることができ、あるいは移植実験で用いて、グラフティング後のそれらの分化を可能とすることができる。
【００６７】
もし遺伝子発現プロファイリング実験からのデータが不十分であれば、ＲＰＥ先祖を単離するために、以下のアプローチを用いる。ＥＳ細胞およびＲＰＥ−様細胞に、Ｐａｘ６のようなプロモーターの対照の存在下でＧＦＰをトランスフェクトし、安定なトランスフェクタントを選択する。トランスフェクトされた分化ＥＳ細胞または増殖（脱分化）ＲＰＥ細胞の培養物から、ＧＦＰ／Ｐａｘ６―陽性細胞をＦＡＣＳによって単離し、これをマウス注射のための抗原源として用いて、Ｐａｘ６陽性細胞の表面分子に対するモノクローナル抗体を生起させる。Ｐａｘ６はＲＰＥ先祖にのみ存在するのではないので、スクリーニングはいくつかの戦略を用い：ａ）増殖ＲＰＥ−様細胞に対して、ｂ）Ｐａｘ２−陽性ＲＰＥ細胞に対して、ｃ）ｍｉｔｆ−陽性ＲＰＥ細胞に対して（ＦＡＣＳによって）なされる。ｂ）およびｃ）では、ＲＰＥ細胞に対応するプロモーター下でＧＦＰをトランスフェクトし；陰性対照として、これらの抗原によって陰性なＲＰＥまたはＥＳ細胞を用いる。全ての３つの戦略によって選択される陽性クローンの拡大培養後に、抗体を、スクリーニングで用いた全てのタイプの細胞に対してテストし、さらに分析する：この戦略は、ＲＰＥ先祖に対して特異的なおよび非特異的な細胞表面抗原を認識する抗体を生産することができるので、これらの抗体で選択されたＥＳ細胞またはＲＰＥ細胞の分化する全集団からの細胞を、ＲＰＥ先祖の分子マーカーにつき、およびＲＰＥを生産するそれらの能力について評価する。
【００６８】
ＲＰＥ、または目組織の他の初期先祖、およびそれらのユニークな表面マーカーに対する抗体を生産するための最適化された規定段階的手法を用い、そのような先祖は分化されたＥＳ細胞から単離し、イン・ビトロで培養される。目の種々の組織に分化するそれらの能力を、Ａｉｍ２に記載された戦略を用いて調べる。
【００６９】
ＲＰＥ−様細胞（Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、ＡＣＴ  Ｊ１、ＡＣＴ−４、Ｃｙｎｏ−１）を既に生じたＥＳ細胞系、ＲＰＥ−様細胞を用いて、Ａｉｍ１および２に記載したように、継続的にＲＰＥ−様細胞およびそれらの先祖を誘導する。ＲＰＥの分子マーカーについての拡大培養および特徴付けの後、これらの系を単一−細胞クローン化し、得られた系をＡｉｍ１に記載したように特徴付ける。ＲＰＥ細胞についての基準を満足する系を移植実験のために用いる。新しいヒトＥＳ細胞系は未使用ＩＶＦ胚から、受精なくして発生するように刺激した提供された卵細胞から（パルテノート）、および核移動技術の適用で提供された卵細胞から得られた作成された発生胚盤胞から誘導する。ＲＰＥ−様細胞および共通する目先祖はＡｉｍ２におけるアプローチを用いてこれらの系から誘導し、得られた系はＡｉｍ１におけるように特徴付ける。「任意選択」新しいヒトＥＳ細胞系はウィルス−フリー系で誘導し、特徴付け、臨床試験のために提出する。
【００７０】
実施例７
色素性網膜炎および黄斑変性の種々の動物モデルにおけるＲＰＥ−様細胞および先祖の治療的能力
霊長類ＥＳ細胞をカニクイザル（マカクザル）においてテストする。最初に、硝子体切除外科的処置を行い、細胞を動物の網膜下空間に移植する。第１の工程は懸濁液様式における細胞の移植であり、その後、基材またはマトリックスを用いて、単層移植を生じさせる。これは、ヒトＥＳ−細胞から由来する細胞を用いる免疫抑制ウサギにおいて、また、げっ歯類（ｒｄマウス、ＲＰＥ６５ノックアウトマウス、たるのようなマウス、ＲＣＳラット）、ネコ（アビジニアンネコ）、イヌ（錐体変性「ｃｄ」イヌ、進行性桿体−錐体変性「ｐｒｄｃ」イヌ、初期網膜変性「ｅｒｄ」イヌ、桿体−錐体形成異常１、２および３「ｒｃｄ１、ｒｃｄ２およびｒｃｄ３」イヌ、光受容体形成異常「ｐｄ」イヌ、およびＢｒｉａｒｄ「ＲＰＥ−６５」イヌ）を含めた、色素性網膜炎の種々の他の動物モデルにおいて行うこともできる。評価は蛍光アンジオグラフィー、組織学（光受容体の回復およびおそらくはＥＲＧがあるかないかを問わない）を用いて行う。機能的テストも行い、これは、ファゴサイトーシス（光受容体断片）、ビタミンＡ代謝、密着結合導電率、および電子顕微鏡観察を含む。  
【００７１】
実施例８
ヒト胚−由来細胞からのＲＰＥ細胞の直接的分化
ヒト胚盤胞−段階の胚を、栄養外胚葉を除去する免疫外科的処置の有または無にてネズミまたはニワトリ胚線維芽細胞の存在下で平板培養するか、あるいは細胞外マトリックス蛋白質−被覆組織培養器具上で直接的に平板培養する。細胞を培養および継代して、ヒトＥＳ細胞系を生じさせる代わりに、細胞を直接的に分化させる。
【００７２】
ｈＥＤＣ細胞培養をＬＩＦ、ＦＧＦおよびプラズマネートの非存在下でＭＥＦ上で過剰増殖させた場合、それらは細胞の厚い多層を形成するであろう（別の成長因子、培地およびＦＢＳを用いて、当業者に知られているように、直接的分化を代わりに行うことができる）。約６週間後に、細胞の暗い島がより大きなクラスター内に出現する。これらの暗い細胞は裸眼で容易に見られ、図５Ｂに示したように、細胞のプレートにおいて「小斑点」のように見えた。より高い倍率では、これらの島は、細胞質における茶色色素と共に、上皮細胞に典型的な、丸石単層における密にパッキングされた多角形細胞として出現する（図５Ａ）。最も多く色素を有する島の中央部分における細胞と、最も少ないエッジ近くの細胞とで、細胞中の色素の量の差がある（図５Ｂ）。
【００７３】
ｈＥＤＣ細胞を直接的に分化させた場合、それらは、典型的にはそうでないが、胚様体（ＥＢ）を形成することができる。色素沈着上皮細胞は、最初の６ないし８週間内に、これらの分化した細胞および／またはＥＢの約１ないし２％で出現する。経時的に、より多くのＥＢが色素沈着細胞を発生させ、３ヶ月までに、ほとんど各ＥＢは色素沈着上皮領域を有した。ＥＢの色素沈着領域における細胞の形態は、接着性培養のそれと非常に似ていた。
【００７４】
材料および方法
ＭＥＦ培地：２ｍＭＧｌｕｔａＭａｘＩ、および５００ｕ／ｍｌペニシリン、５００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）および１６％ＦＣＳ（ＨｙＣＬｏｎｅ）を補足した高グルコースＤＭＥＭ。ｈＥＳ細胞増殖培地：５００ｕ／ｍｌペニシリン、５００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１％非―必須アミノ酸溶液、２ｍＭＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ、０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１−ｎｇ／ｍｌヒトＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、８．４％の血清置換物（ＳＲ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および８．４％プラズマネート（Ｂａｙｅｒ）を補足したノックアウト高グルコースＤＭＥＭ。誘導培地は、増殖培地と比較して、より低い濃度のＳＲおよびプラズマネート（各々４．２％）および８．４％ＦＣＳおよび２×濃度のヒトＬＩＦおよびｂＦＧＦをそれが有する以外は増殖培地と同一の成分を含有した。ＥＢ培地：ｂＦＧＦ、ＬＩＦ、およびプラズマネートを除いて増殖培地に同じ；ＳＲ濃度は１３％であった。ＲＰＥ培地：５０％ＥＢ培地および５０％ＭＥＦ培地。
【００７５】
ｈＥＳ細胞系
分化実験は接着性ｈＥＳ細胞で、あるいは胚様体（ＥＢ）で行った。接着分化では、ｈＥＳコロニーがそれらの密な境界を失い、その時点で、培養基をＥＢ培地で交換するまで（通常継代から８ないし１０日後）ｈＥＳ細胞をＭＥＦ上で過剰増殖させた。培地を１ないし２日ごとに交換した。ＥＢ形成のためｈＥＳ細胞をトリプシン処理し、低接着性プレート上でＥＢ倍地中で培養した（Ｃｏｓｔｅｒ）。
【００７６】
免疫染色
細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、細胞内抗原の局所化のための０．１％ＮＰ−４０で透過処理し、およびＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の１０％ヤギ血清、１０％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で少なくとも１時間ブロックした。一次抗体とのインキュベーションを４℃にて一晩行い、二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を１時間で加えた。すべてのインキュベーションの間に、検体をＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）で３ないし５回、各洗浄につき１０ないし１５分間洗浄した。ＤＡＰＩを有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて検体をマウントし、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）下で観察した。用いた抗体：ベストロフィン（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ）、抗−ＣＲＡＬＢＰ抗体は親切にもＷａｓｈｉｎｔｏｎ大学のＳａａｒｉ博士から贈られた。二次抗体はＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒｏｔｏｒｉｅｓからのものであり、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣはＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。
【００７７】
ＲＰＥ−様細胞の単離および継代
ｈＥＳ細胞およびＥＢの接着性培養をＰＢＳで２回濯ぎ、単層がゆるめられるまで、３７℃にて０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でインキュベートした。色素沈着領域からの細胞をガラスキャピラリーで掻き落とし、ＭＥＦ培地に移し、２００×ｇで遠心し、ＲＰＥ培地中のゼラチン−被覆プレート上に平板培養した。培地を、細胞が付着した後（通常、１ないし２日以内）、およびその後５ないし７日毎に交換し；細胞を０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて２ないし４週間毎に継代した。
【００７８】
ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ
試料を、５％メルカプトエタノールおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補足したＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）中で調製し、５分間煮沸し、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ装置を用いて８ないし１６％グラジエントゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に付加し；ゲルをゲル当たり２５ないし３０ｍＡで流し；蛋白質を２０ボルトにて一晩０．２ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｕｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に移した。ブロットをポンソレッド（Ｓｉｇｍａ）で軽く染色してバンドを可視化し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で洗浄し、０．１％ＴＢＳＴ中の５％無脂肪ドライミルク（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で１時間ブロックした。ベストロフィン、ＣＲＡＬＢＰまたはＰＥＤＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する一次抗体を２時間で加え、続いて、ＴＢＳＴで３回１５分間洗浄し；ペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッド二次抗体を１時間で加え、洗浄を反復した。Ｓｕｐｅｒ−Ｓｉｇｎａｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を備えたＥＣＬシステムを用いてブロットを検出した。製造業者のプロトコルに従い、ＰＥＤＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用い、ＰＥＤＦ  ＥＬＩＳＡを細胞溶解物で行った。
【００７９】
リアル−タイムＲＴ−ＰＣＲ
２工程手法によって、全ＲＮＡを分化するＥＳ培養物から精製し、粗製ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離し、ＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）でさらに精製した。製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）プロトコルに従い、ＲＰＥ６５検出のための市販のプライマー組（Ａｓｓａｙ  ｏｎ  Ｄｅｍａｎｄ  ＃  Ｈｓ００１６５６４２  ｍｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＲＰＥ６５転写物のレベルをリアル−タイムＰＣＲによってモニターした。
【００８０】
実施例９
エクス・ビボで分化した正常な分化細胞を同定するためのトランスクリプトミックの使用
ｈＥＳ−細胞誘導体は、再生医学の将来において重要な役割を演じる可能性が高い。これらおよび他の幹細胞誘導体の定性的評価は、依然として、機能的ゲノミックスを用いてアプローチすることができる課題であり続けている。我々は、ｈＥＳ−ＲＰＥの転写プロフィールと、その移植の価値について広く研究されているそのイン・ビボカウンターパートの胎児ＲＰＥ細胞とを比較した。次いで、双方のプロフィールをヒトＲＰＥ細胞系について既に公表された（Ｒｏｇｏｊｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）トランスクリプトミックデータと比較した。
【００８１】
我々のデータ組の遺伝子発現プロフィールを２つのヒトＲＰＥ細胞系（非−形質転換ＡＲＰＥ−１９および形質転換Ｄ４０７、Ｒｏｇｏｊｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）と比較して、ｈＥＳ−ＲＰＥが同様な全体的転写プロフィールを有するか否かを判断した。全ての細胞において発現された共通するハウスキーピング遺伝子を説明するために、我々は、共通のハウスキーピングおよび上皮遺伝子を排除し、ＲＰＥ−特異的遺伝子を同定するのを可能とするその共通の上皮起源に基づく対照としての未分化ｈＥＳ細胞（Ｈ１系、ｈ１−ｈＥＳ，――Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）および気管支上皮細胞（ＢＥ，Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）からの公に入手可能なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータ組を用いた。
【００８２】
ｈＥＳ−ＲＰＥ、ｈＥＳ−ＲＰＥ−ＴＤ、ＡＲＰＥ−１９、Ｄ４０７の間に同様性および差がある。該同様性は、ＢＥではなくｈＥＳ−ＲＰＥ／ＡＲＰＥ−１９に存在する遺伝子（１０２６遺伝子）の間の排除的交差を分析することによってさらに示した。バックグラウンドを説明するために、我々は、これを、ＡＲＰＥ−１９ではなくＢＥ／ｈＥＳ−ＲＰＥに存在する遺伝子の排除的交差（１８６遺伝子）と比較した。これは、ＢＥと比較した場合に、ｈＥＳ−ＲＰＥおよびＡＲＰＥ−１９における５倍または６倍大きな同様性をもたらす。Ｄ４９７／ＡＲＰＥ１９は、ＲＰＥ６５、ベストロフィン、ＣＲＡＬＢＰ、ＰＥＤＦのようなＲＰＥ特異的遺伝子を失っているようであり、これは長期継代細胞に典型的である（図６）。さらなるデータマイニングは、ＡＲＰＥ１９ではなく胎児ＲＰＥおよびＥＳ−ＲＰＥのみにおける、メラニン生合成、視覚、レチノール−結合のような公知のＲＰＥ特異的存在論を明らかにした。
【００８３】
それらのイン・ビボカウンターパートである、新たに単離されたヒト胎児ＲＰＥ（ｆｅＲＰＥ）に対するｈＥＳ−ＲＰＥ、ＡＲＰＥ−１９およびＤ４０７の比較は我々の従前のデータと合致し、これは、ヒトｆｅＲＰＥに対するｈＥＳ−ＲＰＥの転写同一性が、ｆｅＲＰＥに対するＤ４０７（２．３倍の差−８４９遺伝子／３７３遺伝子）およびｆｅＲＰＥに対するＡＲＰＥ−１９（１．６倍の差−５８８遺伝子／３６４遺伝子）よりも有意に大きいことを示す（図５ｃ／５ｄ）。ＡＲＰＥ−１９またはＤ４０７ではなくｈＥＳ−ＲＰＥのみに存在する前記で同定されたＲＰＥ特異的マーカーもまたｆｅＲＰＥにやはり存在し、これは、培養されたＲＰＥ系よりもそのイン・ビボカウンターパートに対するｈＥＳ−ＲＰＥのより高い同様性を示す。
【００８４】
ｈＥＳ−ＲＰＥに存在する７８４遺伝子はｆｅＲＰＥおよびＡＲＰＥ−１９データ組に存在しなかった。「幹性」遺伝子の保持は、もし患者に移植すれば、ｈＥＳ誘導体の悪性テラトーマへの形質転換を潜在的に引き起こしかねないので、我々は、現在利用可能なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータ組を用いて保存的潜在的「幹性」遺伝子を作り出した（Ａｂｅｙｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｓａｔｏ  ２００３）。この結果、（共通のハウスキーピング遺伝子を含めた）全ての１２のデータ組に存在する３８０６遺伝子のリストがもたらされた。ｆｅＲＰＥ−ＡＲＰＥ−１９ではなくｈＥＳ−ＲＰＥデータ組に存在する７８４遺伝子のうち３６のみが３８０６の潜在的幹性遺伝子と共通した。これらのいずれも、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ１のような公知の幹性遺伝子ではなかった。
【００８５】
実施例１０
パーキンソン病の治療のためのＲＰＥ細胞の使用
ｈＲＰＥはパーキンソン病の細胞療法のための細胞の代替源として用いることができる、なぜならばそれらはＬ−ドーパを分泌するからである。研究は、ゼラチン−被覆マイクロキャリアーに付着したそのような細胞が半パーキンソン病サルに首尾よく移植することができ、顕著な改善（標的当たり１万ないし５万細胞）を生じることを示しており、２０００年に開始されたＦＤＡ−認可試験において、患者は有害効果なくしてｈＲＰＥ線条体内移植を受けた。ｈＥＳ細胞−由来ＲＰＥを用いる多くの利点のうち１つは、それがドナーの目の組織の欠乏を回避することである。それは遺伝子療法の使用も容易とする。
【００８６】
実施例１１
光受容体の喪失を救済しまたは予防するための幹細胞由来ＲＰＥ細胞系の使用
ＲＰＥ細胞系の誘導
ヒト胚性幹（「ｈＥＳ」）細胞を、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉまたはグルタミン、５００ｕ／ｍｌペニシリン、５００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）および１６％ＦＣＳ（８ないし２０％の範囲とできる）（ＨｙＣＬｏｎｅ）を補足した高グルコースＤＭＥＭを含有するＭＥＦ培地中で増殖させた。ｈＥＳ細胞は、５００ｕ／ｍｌペニシリン、５００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１％非−必須アミノ酸溶液、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ、０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍｌ（または８０まで）ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、１０ｎｇ／ｍｌ（または１００まで）ヒトＬＩＦ（ＬＩＦは任意である）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、８．４％の血清置換物（２０％まで用いることができる）（ＳＲ，Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）および８．４％プラズマネート（任意）（Ｂａｙｅｒ）を補足したノックアウト高グルコースＤＭＥＭを含有する増殖培地中で増殖させることができる。ＥＢ培地は、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ、およびプラズマネートが含まれておらず、ＳＲ濃度が１３％である以外は増殖培地と同一である。ＲＰＥ培地は５０％ＥＢ培地および５０％ＭＥＦ培地である。別法として、ｈＥＳ細胞はヒト血清またはＦＢＳの存在下で培養することができる。ＲＰＥ培養では、その増殖、トランス分化および分化した表現型の再樹立を支援する異なる培地を用いることができる。その例は、限定されるものではないが、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉまたはグルタミン、５００ｕ／ｍｌペニシリン、５００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（抗生物質は任意）（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）および１６％ＦＣＳ（８ないし２０％の範囲とできる）（ＨｙＣｌｏｎｅ）またはヒト血清を補足した高グルコースＤＭＥＭ；１．２ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、２．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ０．５ｍＭピルビン酸ナトリウム；胎児ウシ血清、１０％を含有するダルベッコの改変イーグル培地およびハムのＦ１２培地の１：１混合物；（ＡＴＣＣから、ヒトＲＰＥ細胞から樹立されたＡＲＰＥ−１９細胞系の増殖用に推奨される）。ヒト網膜色素上皮の機能的に局化された単層への分化を支援する細胞培養培地もこの目的で使用することができる。
【００８７】
ＲＰＥは、従前に記載されているように培養することができ（その開示をここに引用して援用するＨｕ  ａｎｄ  Ｂｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ  （２０００）７：１４−１９）、あるいは血清または血清置換成分、あるいはＲＰＥ増殖を支援する成長因子の組合せを有する他の培養培地中で培養することができる。
【００８８】
これらの実験で用いたｈＥＳ細胞の２つは記載されているように誘導し（双方の開示をここに引用して援用する、Ｃｏｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１３５３−１３５６（２００４），Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  ａｎｄ  ＭｃＭａｈｏｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｖｏｌ．１：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．４３７−４４９（２００４））、３つの系はＪａｍｉｅ  Ｔｈｏｍｓｏｎ（Ｈ１、Ｈ７およびＨ９）によって誘導した。ヒト凍結胚盤胞は、彼らの受精処理を完了したカップルによって研究に寄付された。
【００８９】
分化実験は接着性ｈＥＳ細胞で、または胚様体（ＥＢ）で行った。接着性分化では、ｈＥＳ細胞を、ｈＥＳコロニーがその密な境界を喪失する（通常、継代から８ないし１０日後まで）ＭＥＦ上で過剰増殖させ、その時点で、培養培地をＥＢ培地で交換した。培地が黄色になれば、あるいは密な培養では１ないし２日毎に、あるいはまばらな培養またはＥＢでは頻度低く、培地を交換した。ＥＢ形成では、ｈＥＳ細胞をトリプシン処理し、低接着性プレート（Ｃｏｓｔａｒ）でＥＢ培地中で培養した。
【００９０】
免疫染色
細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、細胞内抗原の局所化のための０．１％ＮＰ−４０で透過処理し、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の１０％ヤギ血清、１０％ロバ血清、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で少なくとも１時間ブロックした。次いで、検体を一次抗体と共に４℃にて一晩インキュベートし、次いで、二次抗体Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と共に１時間インキュベートした。全てのインキュベーションの間に、検体をＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）で３ないし５回、各洗浄につき１０ないし１５分洗浄した。ＤＡＰＩを備えたＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて検体をマウントし、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）下で観察した。用いた抗体は抗−ベストロフィン抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ）、および抗−ＣＲＡＬＢＰ抗体（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ大学のＳａａｒｉ博士からの贈物）を含む。二次抗体はＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣはＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。
【００９１】
ＲＰＥ−様細胞の単離および継代
ｈＥＳ細胞またはＥＢの接着性培養をＰＢＳで２回濯ぎ、３７℃にて、単層が緩くなるまで０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でインキュベートした。色素沈着領域からの細胞をガラスキャピラリーで掻き落とし、ＭＥＦ培地に移し、２００×ｇで遠心し、ＲＰＥ培地中のゼラチン−被覆プレート上に平板培養した。細胞が付着した後（通常、１ないし２日以内）、その後５ないし７日毎に、培地を交換した。細胞を０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２ないし４週間毎に継代した。
【００９２】
細胞を継代し、あるいは１ないし１０％の濃度のトリプシンまたはコラゲナーゼＩＶ、コラゲナーゼＩ、またはジスパーゼを用いて移植用に集めた。各々、１ないし１０％の濃度のこれらのいずれの組合せも、色素沈着細胞の単離および継代のために、トリプシンの代わりに用いることができよう。この関係で「組合せ」は、一緒のまたは順次のそのような酵素の使用、例えば、コラゲナーゼ消化、続いてのトリプシン消化を意味することを意図する。継代希釈は、希釈無しから１：６以上まで変化させることができる。移植に先立っての培養用の基材は、限定されるものではないが、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンまたは異なるタイプの細胞外マトリックス、被覆されていないプラスチック表面、フィルター――ＥＣＭ（細胞外マトリックス）蛋白質で未被覆または被覆、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、角膜、ＲＰＥ、線維芽細胞のような他の細胞培養から単離されたＥＣＭ、未被覆ビーズ、またはＥＣＭで被覆したビーズのような、ｈＥＳ−ＲＰＥの増殖および特徴を支持するいずれのものであってもよい。継代の間の時間は１日から数週間まで変化させることができる。以前の実験において、表面のＲＰＥのシートと共に９ヶ月齢胚様体を用いて、ｈＥＳ−ＲＰＥの継代可能な培養を樹立し、従って、どれくらい長く細胞を継代することなく培養に維持できるかについて知られた制限はない。
【００９３】
培養は適切なＲＰＥ形態を持つ細胞−すなわち、多角形の密にパッキングされた色素沈着細胞−のみならず、種々の程度のトランス分化（細長い色素沈着または非−色素沈着細胞等）、およびｈＥＳ細胞から共分化する他の細胞型を持つ細胞よりなることができる。細胞を培養のために個々に選択するのでなければ、そのような培養は、通常、非−ＲＰＥ細胞によって分離されるＲＰＥ島を含有する。
【００９４】
（色素沈着細胞の島、または上皮シート、または空胞化細胞の凝集体であり得る個々の細胞の、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、免疫染色、組織学、または形態によって検出できるような、ネスチン、Ｐａｘ６等のようなこの系のマーカーを発現する）神経系に沿った分化の兆候を呈した分化するＥＳ細胞の培養をトリプシン、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、またはその混合物で継代し、拡大し、色素沈着上皮島が出現し、または数が増加するまで（通常、１または２継代）培養した。色素沈着上皮および非−色素沈着非−上皮細胞のそのような混合培養を用いて、コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ−ジスパーゼ消化の後に色素沈着および非−色素沈着細胞を選択的に手で拾うことができよう。次いで、これらの手で拾った色素沈着および非−色素沈着細胞をより小さな凝集体または単一細胞に分散させ、あるいは分散なくして平板培養でき、その結果、高純度のＲＰＥ培養が樹立された。
【００９５】
ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ
試料は、５％メルカプトエタノールおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補足したＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）中で調製し、５分間煮沸し、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ装置を用いて８ないし１６％グラジエントゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に負荷し；ゲルをゲル当たり２５ないし３０ｍＡで流した。次いで、蛋白質を２０ボルトにて一晩、ゲルから０．２ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｕｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に移した。ブロットをポンソレッド（Ｓｉｇｍａ）で軽く染色して、バンドを可視化し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で洗浄し、０．１％ＴＢＳＴ中の５％無脂肪ドライミルク（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で１時間ブロックした。ベストロフィン、ＣＲＡＬＢＰまたはＰＥＤＦに対する一次抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を２時間でブロットに加え、続いて、ＴＢＳＴで３回１５分間洗浄を行った。次いで、ペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッド二次抗体を１時間でブロットに加え、洗浄を反復した。Ｓｕｐｅｒ−Ｓｉｇｎａｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を備えたＥＣＬシステムを用いてブロットを検出した。製造業者のプロトコルに従い、ＰＥＤＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用い、ＰＥＤＦ  ＥＬＩＳＡを細胞溶解物で行った。
【００９６】
リアル−タイムＲＴ−ＰＣＲ
２−工程手法によって、全ＲＮＡを分化するＥＳ培養から精製した。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて粗製ＲＮＡを単離し、ＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）でさらに精製した。製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）プロトコルに従い、ＲＰＥ６５検出（Ａｓｓａｙ  ｏｎ  Ｄｅｍａｎｄ  ＃  Ｈｓ００１６５６４２  ｍｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）についての市販のプライマー組およびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、ＲＰＥ６５転写体のレベルをリアル−タイムＰＣＲによってモニターした。
ｈＥＳ−由来ＲＰＥ細胞系の移植
ｈＥＳ細胞系の培養を２３日齢ＲＣＳラットの１つの目に対する移植細胞として用いて、光受容体の喪失を救済または予防することができる。異なる形態および／または分化の異なる程度の細胞を選択することができる。移植は記載されているように行った（その開示をここに引用して援用する、Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９９４２−４７；Ｄｅｌ  Ｐｒｉｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）  ４５：９８５−９９２；Ｇｏｕｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４３：３３０７−１１）。（前記したような）トリプシンまたは他の酵素での消化に続き、ｈＥＳ細胞を洗浄し、２μｌ注射当たり２×１０５細胞の密度にて懸濁液に経強膜送達した。送達は、約７５ないし１５０μｍの内径を持つ微細なガラスピペットを用いてハムのＦ−１０培地中で達成した。注射は、機能的劣化および有意な光受容体死滅の前の時点で、麻酔した２３日齢のジストロフィー−色素沈着ＲＣＳラットの１つの目の側頭背後網膜下空間に送達されるべきである。シャム−注射ラットはｈＥＳ−由来細胞なくしてキャリアー媒体単独を受ける。手術後ラットの組織学的評価をより短い時点で（例えば、手術から１ケ月後に）行って、移植に関連する短期の変化を評価し、より長い時点で（例えば、手術後５ヶ月で）行って、ドナー細胞の生存を調べることができる。細胞は、移植前４８時間、２０μｍ  ＢｒｄＵｒｄを含有する培地中で培養することによってタグを付し、または標識することができる。
【００９７】
移植されたｈＥＳ−由来細胞の機能的評価
Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９９４２−４７にも記載されているように、移植されたラットの挙動評価を、該動物を含有する静止保持チャンバーの周りに１２度／秒の一定速度で回転する円形ドラムよりなる頭部−トラッキング装置で行うことができる。刺激の提示は、度当たり０．１２５、０．２５および０．５サイクルのような種々の空間的周波数にて黒色および白色ストライプで被覆した相互交換可能なパネル上に置くことができる。動物は手術後１０ないし２０週間でテストすることができる。全ての動物評価は唯一のオペレーターによって盲検的に行うことができる。挙動データはＡＮＯＶＡを用いて分析することができる。
【００９８】
生理学的実験は、６０および９０日において、角膜心電図（ＥＲＧ）で動物に対して行うことができる。テストに先立ち、ラットは暗所に一晩適合させ、ケタミンおよびキシラジンで赤色光下で麻酔すべきである。例えば、Ｐｅａｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１９（６）：６９３−７０１参照。瞳孔は膨張し、ＥＲＧを綿芯生理食塩水電極で角膜から記録すべきである。皮下３０−ゲージ針を、各々、参照および設置電極として、前頭および体幹に挿入することができる。対象ラットの体温を３５ないし３６℃に維持しつつ、光刺激を約０．７×１０３μＷ／ｃｍ２の角膜にて測定した最大フラッシュ強度で適用すべきである。種々の周波数においてコンピューター化データ獲得システムによって応答は記録し平均化すべきである。ＥＲＧ振幅はａ−波の初期の負ピークから、またはｂ−波の正のピークに対してベースラインから測定すべきである。
【００９９】
Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９９４２−４７におけるように、１００日における上丘からの視覚受容場の照明に対する閾値応答を記録すべきである。動物は末端ウレタン麻酔（１．２５ｇ／ｋｇ／ｉ．ｐ．）下におくべきである。データはおよそ２００μｍ空間的に離れた独立した点において全視野にわたって収集すべきであり、各点は視野における約１０ないし１５°変位に対応する。視覚閾値はバックグラウンドに対する強度の増加として測定し、３°直径のスポット光で上丘の表層２００μｍにおけるユニットを活性化するために０．０２ｃｄ／ｍ２に［桿体飽和未満の少なくとも２．６対数（ｌｏｇユニットに）］維持すべきである。閾値マップは各動物について表示させ、網膜表示として示すべきである。
【０１００】
Ｈ９細胞系に由来するＲＰＥ細胞を移植した７つの目、およびＪ１細胞系に由来するＲＰＥ細胞を移植した６つの目をＥＲＧ分析に付した。ＲＰＥ移植は２３日齢ラットで行い、ＥＲＧ分析は移植後３６日に行った。Ｈ９群は均一に良好な応答を生じ、他方、Ｊ１群は最小応答を伴うに過ぎない一匹の動物を生じた。
【０１０１】
移植された細胞の組織学的分析
Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９９４２−４７に記載されているように、動物は組織学的分析に付すべきである。動物はオイタナールで安楽死させ、ＰＢＳ、続いて、過ヨウ素酸塩−リシン−パラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）で経心臓灌流した。目を切開し、クレジルバイオレットで染色すべきである。ＢｒｄＵ群の動物からの目を抗−ＢｒｄＵｒｄ抗体で標識し、適当な二次抗体および各試薬を用いて可視化すべきである。他の目は０．１Ｍカコジレート緩衝液中の２．５％パラホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒド、および０．０１％ピクリン酸での注射によって固定することができる。目は１％四酸化オスニウム中でポスト固定し、引き続いて、エポキシプロパンに対する特級アルコールを通じて脱水することができる。組織を樹脂に包埋し、それから半−薄いセクションを切断し、１％ホウ酸緩衝液中のトルイジンブルーで染色することができる。
【０１０２】
実施例１２
網膜変性の処理のための幹細胞由来神経先祖細胞の使用
神経先祖の生成
ｈＥＳ細胞（例えば、Ｈ１、Ｈ７およびＨ９、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ−ＷＡ０１、ＷＡ０７およびＷＡ０９として登録）を、ＭＥＦ培地（２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉまたはグルタミン、および５００ｕ／ｍｌペニシリン、５００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（抗生物質、任意）（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）および１５％ＦＣＳ（８％ないし２０％の範囲とできる）ＨｙＣｌｏｎｅ）を補足した高グルコースＤＭＥＭ）上で、あるいは細胞外マトリックス上で過剰増殖させた。次いで、継代から一週間またはそれ以上後に、ｈＥＳ細胞をトリプシン、コラゲナーゼまたはジスパーゼ、または２つの後者の酵素の組合せで分裂させ、ＥＢ培地中のゼラチン上で平板培養する（実施例１１参照）。培地をそれが黄色となれば、通常は２ないし４日毎に交換する。これらの条件下で増殖する細胞の大部分は神経先祖として陽性である。なぜならば、それらはネスチンおよび／またはチューブリンベータＩＩＩを発現し、神経先祖細胞の典型的な外観−細長い紡錘−様細胞を有するからである。それらは同一条件下で再度継代することができ、これはネスチン−およびチューブリンベータＩＩＩ−陽性細胞での細胞集団の豊富化に導く。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、そのような培養においてネスチン、Ｐａｘ６、Ｎ−ＣＡＭ、チューブリンベータＩＩＩの存在を確認する。
【０１０３】
別法として、ｈＥＳ細胞の分化する培養におけるスフェロイド形成を除去し、ＥＢ培地中で培養皿（ゼラチンまたはもう１つの細胞外マトリックスで被覆することができ、記載された細胞型の形成を可能とする）上に平板培養することができ、あるいはそのようなスフェロイドは分化するｈＥＳ細胞の全集団の最初の継代後に形成され、同様にしてアプローチすることができる。数日以内に、紡錘−様細胞の増殖が認められ、これは、後に、拡大培養し、神経先祖細胞についての前記マーカーを発現することができる。
【０１０４】
ｈＥＳ細胞からの目組織の分化
ｈＥＳ細胞の実施例１１に記載された分化条件は、ロドプシン、オプシン５、オプシン１、およびレコベリンの発現を確認する、分化する培養の組織学的調査によって（図９ａ、およびＲＴ−ＰＣＲ分析によって示される桿体および錐体−様構造の出現を可能とすることができる（図９ｂ、９ｃおよび９ｄ）。また、我々は、そのような培養はＲＴ−ＰＣＲ検出ケラチン１２、角膜マーカーとして角膜細胞を含有することができることも示す（図９ｅ）。
【０１０５】
他の具体例
これまでの記載から、変形および修飾を本明細書中に記載された発明に対して行って、それを種々の用法および条件に適用することができるのは明らかである。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2015091272.tif 000001
【図２】
2015091272.tif 000002
【図３】
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【図４】
2015091272.tif 000004
【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
2015091272.tif 000008
【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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