(57)【要約】  高齢の哺乳動物である患者、あるいは軽度の炎症、アレルギー、狼瘡、疲労、倦怠または感染症、疾患もしくは治療の後遺症に苦しむ患者の強壮治療法を提供し、前記方法は式Ｉの化合物またはその塩の投与を含む。【化１】2007537221.tif 000014
2007537221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高齢の哺乳動物である患者、あるいは軽度の炎症、アレルギー、狼瘡、疲労、倦怠または感染症、疾患もしくは治療の後遺症に苦しむ患者の強壮治療法であって、以下の式Ｉの化合物またはその塩の投与を含む方法。
【化１】
2007537221.tif 000011
（式中、Ｒ1はＨ、ＯＨ、ＳＨ，Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｏ−アシルもしくはＳ−アシル（この場合Ｎ−−Ｎ結合が存在し、六員環は芳香族である）であり、または、R1は二重結合により結合したOもしくはＳ（この場合Ｎ−−Ｎ結合は存在せず、六員環は２，５−不飽和である）であり、
Ｒ2は水素、またはより好ましくは炭素原子により結合したC1−C10有機基であり、ＸはＨ、Ｏ、ＯＯ、ＳまたはＳＳであり、
Ｒ3は不在（Ｘ＝Ｈである場合）、水素またはヒドロキシル保護基もしくはチオール保護基であり、
Ｒ4は複素環または、好ましくは同素環アリール基であり、さらなるＲ5基で置換されてもよく、
Ｔ1基は、それぞれ独立して、水素またはＳ−Ｒ6基であり、Ｒ6は、それぞれ独立して、分子量が約５００ａｍｕ以下の有機基である。）
【請求項２】
前記式Ｉの化合物が、以下の式ＩＩの化合物である請求項１に記載の方法。
【化２】
2007537221.tif 000012
（式中、Ｒ5はアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基（例えば、Ｒ2について以下に列挙されたもの）、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アシル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、Ｓ−アシル、ハロ、または、第１級、第２級、第３級もしくは第４級アミノ基であり、
Ｒ2はアリールスルホニルアルキル基、または、Ｃ1からＣ6のアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基であり、
Ｒ3は、水素、または生理学的に許容可能な副産物を生じる、代謝的に不安定な保護基であり、
Ｔ1はＨまたはＲ6基で置換されたチオール基（すなわち、Ｓ−Ｒ6）であり、Ｒ6は、エステル、アミド、カルボン酸、ヒドロキシル基およびアミンから選択される少なくとも２つの官能基を有する、標的部分または低分子有機基（特にＭＷ＜５００）である。）
【請求項３】
前記式Ｉの化合物が、以下の式ＩＩＩの化合物である請求項１に記載の方法。
【化３】
2007537221.tif 000013
（式中、Ｒ5はアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基（例えば、Ｒ2について以下に列挙されたもの）、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アシル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、Ｓ−アシル、ハロ、または、第１級、第２級、第３級もしくは第４級アミノ基であり、
Ｒ2はアリールスルホニルアルキル基、または、Ｃ1からＣ6のアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基であり、
Ｒ3は、水素、または生理学的に許容可能な副産物を生じる、代謝的に不安定な保護基であり、
Ｔ1はＨまたはＲ6基で置換されたチオール基（すなわち、Ｓ−Ｒ6）であり、Ｒ6は、エステル、アミド、カルボン酸、ヒドロキシル基およびアミンから選択される少なくとも２つの官能基を有する、標的部分または低分子有機基（特にＭＷ＜５００）である。）
【請求項４】
他の薬品および／または治療計画を支援するものとして、請求項１から３のいずれかで定義される式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の投与を含む、哺乳動物（好ましくはヒト）である患者の治療法。
【請求項５】
前記方法が、ウイルス性、自己免疫、過形成性または腫瘍性疾患の治療法である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記他の薬品が、抗ウイルス剤、免疫抑制剤または抗がん剤であり、前記他の治療計画が、手術および／または体外放射線照射である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
関節炎（特にＲＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病、悪性腫瘍またはその他の腫瘍性疾患を含む、高齢にともなう疾患の進行に対する予防方法であって、請求項１から３のいずれかで定義される式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の投与を含む方法。
【請求項８】
請求項１から３のいずれかで定義される式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の投与を含む、アレルギーおよび／または過感作の治療法。
【請求項９】
ヒトまたはヒト以外の動物である患者におけるサイトカイン産生の刺激方法であって、請求項１から３のいずれかで定義される式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の投与を含む方法。
【請求項１０】
前記投与が、０．３から１６０μＭの血中濃度を得るのに十分な量で行われる、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
炎症、アレルギー、疲労、倦怠もしくは高齢による症状、または感染症、疾患もしくは治療の後遺症の治療用薬剤の製造における、請求項１から３のいずれかで定義される式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の使用。
【請求項１２】
請求項１から３のいずれかで定義される式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物、および少なくとも１つの製薬上許容可能な賦形剤、担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１３】
食品または飲料品中に調合される、請求項１から３のいずれかで定義される式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物またはその塩を含む機能性食品あるいは栄養強化食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の置換４−ヒドロキシオキシフェンブタゾン化合物の投与による、患者の強壮治療法に関する。特に、本発明は、倦怠、アレルギー、疲労または高齢による症状を改善する際の該治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性、ウイルス性および／または自己免疫疾患の治療において、環状ピラゾリジンジオン化合物（フェンブタゾン、オキシフェンブタゾンおよび４−ヒドロキシオキシフェンブタゾン）が公知であるか、示唆されている。
【０００３】
【化４】
2007537221.tif 000003
【０００４】
【化５】
2007537221.tif 000004
【０００５】
【化６】
2007537221.tif 000005
【０００６】
これらのピラゾールに基づく化学構造を有する多くの変形（誘導体（例えば、ＵＳ−Ａ−３９６８２１９（特許文献１））およびプロドラッグ（例えば、ＵＳ−Ａ−４１１７２３２（特許文献２）、ＵＳ−Ａ−３９５７８０３（特許文献３）、ＵＳ−Ａ−４１６９１４７（特許文献４）、ＵＳ−Ａ−４０３６８４５（特許文献５）およびＵＳ−Ａ−４１３９７０９（特許文献６））を含む）について、研究が行われてきた。
【特許文献１】米国特許第３９６８２１９号
【特許文献２】米国特許第４１１７２３２号
【特許文献３】米国特許第３９５７８０３号
【特許文献４】米国特許第４１６９１４７号
【特許文献５】米国特許第４０３６８４５号
【特許文献６】米国特許第４１３９７０９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、生物活性のある上記変形についての主な研究作業は、中心のピラゾリジン核の構造および置換基の変更に関するものであった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは偶然にも、特に、従来知られていたよりも少ない投与量で使用した場合に、４ＯＨ−ＯＰＢ類の化合物を「強壮」治療に使用し得ることを確証した。
【０００９】
第一の局面において、本発明はしたがって、高齢の哺乳動物（好ましくはヒト）である患者、あるいは、軽度の炎症、アレルギー、狼瘡（特に皮膚狼瘡）、疲労、倦怠または感染症、疾患もしくは治療の後遺症に苦しむ患者の、強壮治療法を提供するものであり、該方法は以下の式Ｉの化合物またはその塩の投与を含む。
【００１０】
【化７】
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【００１１】
ここで、Ｒ1はＨ、ＯＨ、ＳＨ，Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｏ−アシルもしくはＳ−アシル（この場合Ｎ−−Ｎ結合が存在し、六員環は芳香族である）であり、または、Ｒ1は二重結合により結合したＯもしくはＳ（この場合Ｎ−−Ｎ結合は存在せず、六員環は２，５−不飽和である）である。Ｒ2は水素、またはより好ましくは炭素原子により結合したC1−C10有機基（例えば、置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルカリール基、アラルキル基、アラルケニル基またはアリールスルホニルアルキル基）である。ＸはＨ、Ｏ、ＯＯ、ＳまたはＳＳである。Ｒ3は不在（Ｘ＝Ｈである場合）、水素またはヒドロキシル保護基もしくはチオール保護基（例えば、（好ましくは、Ｃ2−Ｃ7）アシル基またはアルカリール基（例えばアセチル基もしくはベンジル基など））である。Ｒ4は複素環アリール基または、好ましくは同素環アリール基であり、さらなるＲ5基（例えば、アルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基、ＯＨ、Ｏ−アルキル、チオ、チオアルキル、ハロ、または、第１級、第２級、第３級もしくは第４級アミノ基）で置換されてもよい。Ｔ1基は、それぞれ独立して、水素またはＳ−Ｒ6基であり、Ｒ6は、それぞれ独立して、分子量が約５００ａｍｕ以下の有機基（置換または非置換アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルカリール基、アラルキル基、アルキルエステル基、アルキルアミド基、アルキル酸基、ポリオール基、糖基、オリゴ（アルキルアミド）基、オリゴ（アルキルエステル）基もしくはオリゴペプチド基など）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
これらの化合物はフェンブタゾン、オキシフェンブタゾンもしくは４−ヒドロキシ−オキシフェンブタゾンまたはこれらの開鎖等価体であり、これらは市販されているか、または本明細書に記載される方法および当該技術分野で公知の方法（ＷＯ  ０１／００５８５およびその中で引用される参考文献による方法など）により合成される。本明細書および本明細書で引用される全ての参考文献に含まれる開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００１３】
特に、４−ヒドロキシオキシフェンブタゾンは、Ｒ3Ｘの位置に水素を有する対応する化合物を酸化させることにより、オキシフェンブタゾンから合成することができ、あるいは、Ｒ3Ｘの位置にＨＸを有する対応する化合物と、ヒドロキシ保護基もしくはチオール保護基とを反応させて水素基以外のＲ3基を導入することにより、または、ヒドラジン化合物と保護されてもよい２−ヒドロキシ−プロパン二酸ハロゲン化物、エステルもしくは類似の化合物とを縮合させることにより、その他の４−ＯＨ−ＯＰＢから合成することができる。例えば、以下のようなものである。
【００１４】
【化８】
2007537221.tif 000007
【００１５】
ここで、Ｒ1からＲ4およびＸは上記に規定したとおり、またはそれらの保護等価体もしくは前駆体であり、Ｌ基はハロゲン化合物などの脱離基である。ＸがＨである場合はオキシフェンブタゾンが生じ、上記のように４−ＯＨ−ＯＰＢに変換され得る。ＸがＯの場合には直接４−ＯＨ−ＯＰＢが形成される。
【００１６】
容易に理解されるとおり、ヒドラジンは対応するジアリールアゾ化合物（Ｒ4がアリールであるため）の水素化により製造され得る。該ジアリールアゾ化合物は、ＬｉＡｌＨ4の存在下で単純な芳香族ニトロ化合物から合成することができる。
【００１７】
開鎖化合物（R1は二重結合により結合し、六員環は２，５−不飽和、Ｎ−−N結合は存在しない）は、（保護されてもよい）等価環状化合物の開環により簡単に合成され得る。該合成は温和な条件下で実行することができ、後の実施例において例示される。
【００１８】
本発明者らは偶然にも、本発明の化合物が体内の免疫系の調整剤として著しい有用性を有し、かつ、疲労、アレルギー、炎症、倦怠または高齢の影響で苦しむ患者に（これら症状の直接的、特定可能な原因が明白であるか否かを問わない）、「強壮」効果をもたらすことを確証した。
【００１９】
さらなる局面によれば、本発明は、炎症、疲労、アレルギー、倦怠もしくは高齢の症状、または、感染症、疾患もしくは治療の後遺症の治療を目的とする薬剤の製造における、本明細書で定義される式Ｉの化合物またはその塩の利用法を提供する。該化合物は本明細書で説明する好ましい化合物であることが好ましい。
【００２０】
式Ｉの化合物またはその塩は、特に疾患の治療を目的として、医薬組成物の形態で有効に投与され得る。あるいは該化合物は、特に、疲労、アレルギー、倦怠もしくは高齢の症状の緩和または免疫系の全体的な促進に際して「強壮」効果が望まれる場合に、「機能性食品」、サプリメントの形態により、または食品もしくは飲料品の栄養強化剤として摂取され得る。
【００２１】
さらに別の局面によれば、本発明はしたがって、本明細書で定義される式Ｉの化合物もしくはその塩、ならびに、少なくとも１つの製薬上許容可能な賦形剤、担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、食品もしくは飲料品中に調合される式Ｉの化合物またはその塩を含む、機能性食品あるいは栄養強化食品を提供する。
【００２２】
本発明の好ましい化合物は、以下の式ＩＩおよび式ＩＩＩの化合物、ならびにそれらの塩である。
【００２３】
【化９】
2007537221.tif 000008
【００２４】
ここで、Ｔ1、Ｒ2およびＲ3は上記に規定したとおりであり、Ｒ5はアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基（例えば、Ｒ2について以下に列挙されたもの）、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アシル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、Ｓ−アシル、ハロ、または、第１級、第２級、第３級もしくは第４級アミノ基である。Ｒ5基は水素、ＯＨおよびＯ−アシル（例えば、Ｏ−アセチル）が好ましい。水素、ＯＨおよびＯ−アセチルが最も好ましい。
【００２５】
本発明の化合物および出発原料において、Ｒ2はアリールスルホニルアルキル基、または、Ｃ1からＣ6のアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基（例えば、メチルスルホニルフェニル、エチルスルホニルフェニル、メチル、エチル、エチレニル、アセチレニル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、プロパ−１−エニル、プロパ−２−エニル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ブタ−１−エニル、ブタ−２−エニル、ブタ−３−エニル、１−メチル−プロパ−１−エニル、１−メチル−プロパ−２−エニル、２−メチル−プロパ−１−エニル、２−メチル−プロパ−２−エニル、ｎ−ペンチル、ｉ−ペンチル）が好ましい。より好ましいＲ2基はＣ2からＣ6のアルキル基、特に、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチルまたはｔ−ブチルである。最も好ましいＲ2基はｎ−ブチルである。
【００２６】
本明細書で説明される化合物および出発原料におけるＲ3は、水素、または生理学的に許容可能な副産物を生じる、代謝的に不安定な保護基が好ましい。適した保護基はアシル基であり、特に、アセチル、プロパノイル、メチルプロパノイルまたはｎ−ブタノイルが適している。しかしながら、さらに多くのＯＨ保護基およびＳＨ保護基が知られており（例えば、グリーン、「有機合成における保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、ウィリーインターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク、１９８１年参照）、これらは生成物として、または特に中間体として価値を有し得る。最も好ましいＲ3基は、水素およびアセチルである。
【００２７】
本発明の化合物および出発材料において、Ｔ1はＨまたはＲ6基で置換されたチオール基（すなわち、Ｓ−Ｒ6）が好ましく、その場合Ｒ6は、エステル、アミド、カルボン酸、ヒドロキシル基およびアミンから選択される少なくとも２つの官能基を有する、標的部分または低分子有機基（特にＭＷ＜５００）である。Ｔ1基が両方ともＨであるか、Ｔ1基が両方ともチオールであるか（該チオールのＲ6基は同じであっても、異なっていてもよい）のいずれかが好ましい。好ましくは、Ｒ6は、少なくとも１つの遊離酸および／もしくはアミン基を伴うオリゴエステルまたはオリゴペプチドである。該基には例えば、抗体フラグメントなどの特定の結合ペプチドが含まれる。より好ましくは、Ｔ1は、それぞれ独立して、水素または１〜５残基のオリゴペプチドである。最も好ましくは、Ｔ1は、それぞれ独立して、水素またはグルタチオンである。つまり、Ｔ1基はその両方が水素であっても、その両方がグルタチオンであっても、その一方がグルタチオンで他方が水素であってもよい。
【００２８】
本発明の最も好ましい化合物は、以下の式ＩＶもしくはＶの化合物、またはそれらの塩である。
【００２９】
【化１０】
2007537221.tif 000009
【００３０】
ここで、Ｒ5は水素またはＯＨであり、かつ、Ｔ1は、それぞれ独立して、水素またはグルタチオンである。
【００３１】
本発明の化合物は、当該技術分野で周知の方法により医薬品として調合され得る。これらの一般的な剤形は、錠剤、被覆錠剤（制御放出錠剤など）、カプセル剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、散剤または乳剤などの経口剤形であるが、吸入（散剤もしくはエアロゾルなど）、経皮吸収（パッチなど）用剤形、あるいは、無菌食塩水溶液、滴剤もしくは座薬などの形態による、非経口投与（例えば、皮下投与、筋肉内投与もしくは静脈内投与）、眼内投与または直腸投与用剤形であってもよい。
【００３２】
式Ｉの化合物およびその塩は、水性担体（例えば、注射用蒸留水）、結合剤、充填剤、安定剤、浸透圧調整剤、発泡剤、ｐＨ緩衝剤および調整剤、粘度調整剤、甘味料、潤滑剤、乳化剤、香料、被覆剤（例えば、耐胃液被覆剤）などの、従来の医薬担体、希釈剤ならびに／または賦形剤を用いて調合され得る。
【００３３】
式Ｉの化合物またはその塩の患者への投与量は、該患者の種族、大きさ、成熟度、健康状態および病気ならびに選択される剤形に依拠する。例えば、吸引または静脈内投与用剤形は、経口剤形よりも高い割合で活性物質を患者に送達し得るが、一般的には経口剤形が好まれる。概して、投与量は１から２０００ｍｇ／日の範囲であり、より典型的には２から１０００ｍｇ／日、特に典型的には５から５００ｍｇ／日である。投与は１日につき１回、２回、３回もしくは４回が典型的であるが、適切であれば、より頻度が高くても低くてもよい（例えば、１日につき５回もしくは６回、２日もしくは３日に１回、または症状が検出される毎）。
【００３４】
式Ｉの化合物は、倦怠感、軽度の炎症（特に慢性のもの）を緩和するような強壮薬として、あるいは、高齢による症状に効果を発揮し、もしくは免疫系を高めるようなアレルギーの治療または予防として投与され得、かつ、上記のような医薬品として調合され得る。あるいは、該化合物は機能性食品または飲料品として調合され得、その場合、一般的には担体および賦形剤は食品または飲料品を含む。こうした製品は温めて消費する加工食品（調理済食品など）とし得るが、より好ましくは、スプレッド（例えば、マーガリンもしくは低脂肪スプレッド）、ジャム、非炭酸飲料または炭酸飲料、フルーツジュース、朝食用シリアル、朝食用バー、パン、ビスケット、アイスクリーム、ヨーグルト、ムースまたはトライフルなどの冷蔵デザート、牛乳または牛乳をベースとする飲料品などを含む冷食品であることが好ましい。
【００３５】
式Ｉの化合物が機能性食品または飲料品として調合される場合、これらの製品の過剰摂取により誤って消費される可能性のある最大量が、過剰とならないことが重要である。こうした場合、該機能性食品の一食分に含まれる量は、一般的に致死量の１，０００分の１以下であり、より好ましくはヒトの致死量の１０，０００分の１以下、最も好ましくは５０，０００分の１以下である。
【００３６】
本発明の化合物が本明細書で塩と言及される場合には、これらは一般的に製薬上許容可能な塩、つまり、生理学的に許容可能な対イオンを有する塩である。該イオンには、ナトリウム、カルシウム、有機アミン、ハライド（特に塩化物）、リン酸塩、炭酸水素塩などが含まれる。
【００３７】
理論に拘束されないが、本発明の化合物および組成物の効果は、部分的に、「浄化」効果を刺激および調整した結果であると考えられる。「浄化」効果では、体が刺激され、病原菌だけではなく細胞残屑およびその他の不要物も除去される。さらに、本発明の化合物は、Ｔ−リンパ球および単球の活性化阻害剤ならびにインターロイキンの調整剤としての効果を示し得る。
【００３８】
こうした作用により、生物学的残屑が蓄積する傾向が緩和され、免疫系に再度焦点があたる。その結果、患者は生活の質を高め、不要な老廃物および有害な老廃物までもが除去された体を得ることになる。
【００３９】
こうした強壮効果は一次疾患、病気もしくは感染症の治療中または治療後に適用され得、あるいは、例えば感染症、薬物治療、慢性炎症もしくは老化作用により機能が減退し、または免疫系に不要物が蓄積している場合には、強壮効果自体が目的となり得る。
【００４０】
特に急性期たんぱく質（ＡＰＰ）の調整は、細胞残屑を除去し、免疫系の浄化を誘発すると考えられている。宿主細胞の崩壊産物は隣接細胞の死を誘発し、連続的に細胞死を引き起こす可能性がある。したがって、該崩壊産物の除去は健全な細胞の健康につながる。通常とは異なり、本発明の化合物は深刻な発熱を誘発することなく急性期たんぱく質を刺激し得るものであり、かつ一般的な免疫抑制剤でもない。
【００４１】
本発明の化合物はインターロイキン６の産生を調整することが示され、それにより急性期たんぱく質の産生に影響を及ぼす。特に、低度から中度の投与量レベルにおいて、本発明の化合物は最大で５０％インターロイキンの産生を刺激することが観察された。しかし、それ以上の投与量では同じインターロイキンの産生を実質的に排除する可能性がある。また、本発明の化合物はモノカインの産生、ならびにＴｈ１およびＴｈ２に特異的なサイトカインの産生を調整することも分かる。これらの種類の細胞、特に単球細胞およびＴｈ２細胞は、炎症性反応に寄与するとして知られ、したがってこうした細胞およびそれらのサイトカインに対する効果は、炎症を誘発せずに免疫系を刺激するのに寄与し得る。標準的な方法および特に本明細書に記載される実施例を参照することにより、所望の免疫調整効果を得るために必要な投与量レベルを、あらゆる個別の状況について設定することができる。一般的に、一回の適用における、例えば、１０００ｍｇ、より好ましくは５００ｍｇ、さらに好ましくは３５０ｍｇを上限とする中度の投与量により免疫機能が高められ、サイトカインの産生が促進される。したがって、複数回の投与計画が採用されれば、該投与量は回数に応じてさらに少量となる。こうした効果を得るための最低有益投与量は、該化合物が、例えば、複数回分の投与量がまとめて、または連続して摂取される可能性がある食品中に調合され得ることから、１回につきわずか１ｍｇとすることができる。この最低投与量は、本明細書で示される毒性上の制約に従い、より一般的には少なくとも５ｍｇ、好ましくは少なくとも１０ｍｇ、さらに好ましくは少なくとも２０ｍｇとなる。熟練技術者であれば容易に確立が可能な有効投与量の基準のひとつに、患者の血中ピーク濃度がある。この血中濃度は、採用される投与計画に関係なく薬剤の効果に直接関係し、患者の試料へ投与した後、時々全血の試料を用いて測定し得る。ひとつの局面において、本発明の好ましい投与量により中度の最大血中濃度が得られる。該濃度は、例えば、０．３から１６０μＭ、好ましくは０．５から１００μＭ、さらに好ましくは０．５から８０μＭ、最も好ましくは１から４０μＭとし得る。
【００４２】
本発明の特に好ましいひとつの局面によれば、血中濃度が免疫作用が刺激される範囲となるよう、本発明の化合物が上記の低度から中度の投与量レベルで投与される。これらの濃度には先の段落で記載された濃度が含まれる。血中濃度が過度に上昇してしまうと、以下の実施例で示されるように、該免疫作用が抑制される可能性がある。したがって、適切な投与量を選択すれば所望の効果を得られる一方、それを超える投与量では逆の効果がもたらされるということは、本発明の該局面における重大かつ不測の要素である。特に、低度から中度の適切な投与量によれば免疫系の非特異的部分を選択的に刺激、つまり、本明細書に記載する「浄化」作用を実行することが可能である。理論に拘束されないが、適切な投与量の本明細書に記載される化合物により、高齢、倦怠、アレルギーおよび炎症を含む病気において有益な効果をもたらすことを可能にしている共通要素は、この非特異的免疫系の刺激であると考えられている。あらゆる場合において、免疫系の適切な部分を刺激することは重要であり、該刺激は、より具体的な目的をもった反応（例えば、Ｔ細胞が介在する反応）ではなく、非特異的免疫系に対する刺激であることが必須である場合もある。
【００４３】
生物学的残屑の浄化をもたらす別の方法は、特定の血漿たんぱく質（死細胞（生きていない細胞）のリン脂質膜、ｂ２糖たんぱく質Ｉ、クラステリンおよび血清アミロイドＰに特異性を有する特定の免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）など）による結合である。こうしたメカニズムもまた、本発明の化合物により調整され得る。
【００４４】
高齢の患者における本発明の化合物の強壮効果は、浄化メカニズムの結果として説明することも可能である。患者の年齢が上昇するにつれ、テロメアの減少およびアポトーシスによりプログラム細胞死にいたる細胞の割合が増加する。同時に、ＡＰＰなどの浄化メカニズムの水準および免疫系の効率は低下するのが一般的である。これにより、細胞残屑の蓄積、慢性的炎症が発生し、かつ感染症にかかりやすくなる可能性がある。これらの要因により、結果として心臓麻痺または心臓発作などの変成疾患ならびに変成病が引き起こされ得る。本発明の化合物による予防的治療により、細胞残屑の蓄積は減少し、血管破裂などの致命的事象により心臓麻痺などの病気が発生する前に、体内から感染症を除去できるように免疫系を解放する。炎症の調整も、こうした問題の回避に寄与する。
【００４５】
同様に、生物学的残屑の蓄積も、関節炎、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病などの高齢にともなう疾患に固有の問題である。本発明の化合物はしたがって、こうした病気の発症もしくは悪化の治療ならびに予防の両方において、有益であり得る。
【００４６】
好ましい実施形態において、本発明はまた、関節炎（特にＲＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病、悪性腫瘍またはその他の腫瘍性疾患を含む、高齢にともなう疾患の発現に対する予防方法を提供し、該方法は式Ｉの化合物またはその塩の投与を含む。
【００４７】
高齢の患者に見られるのと同様に、慢性疾患の患者にも、宿主細胞および病原体からの生物学的残屑の蓄積、ならびに慢性的炎症の傾向が見られ得る。本発明の化合物は、こうした場合の回復を促進し、生活の質を高めるために投与され得る。本メカニズムはまた、マラリア、手術、熱傷または敗血症などの事象後の患者の回復を促すのにも適している。
【００４８】
アレルギー性疾患の治療および／または予防に関して、本発明の化合物は、反応性の効果および特に予防効果の両方を有する。具体的には、ここでも理論に拘束されないが、免疫系の非特異的部分（マクロファージなど）の反応を高めることにより、本発明の化合物はこの投与法により潜在的アレルギー物質を迅速に体内から除去し得る。こうした除去により、特異的免疫系の活性化が抑制され、広範囲での特異的免疫反応の発生が抑えられる。これにより、炎症の発生が少なくなり、アレルゲンに対する免疫系の「プライミング」が回避される。反対に、アレルゲンが迅速に除去されない場合には、該アレルゲンに対する特異的結合体が生産される（例えば、ｔ−細胞による）可能性が高くなり、次に該アレルゲンが体内に入ってきた際に、アレルギー反応の程度がひどくなる可能性がある。
【００４９】
本発明のひとつの局面によれば、本発明の化合物および組成物は、少なくともアレルギー性疾患の治療および／もしくは予防、または、該治療および／もしくは予防のための薬剤の製造に使用される。花粉／空気中の粉塵に対するアレルギー（例えば、花粉症）、食物アレルギー（例えば、ナッツアレルギー、魚介アレルギー）、薬物アレルギー（例えば、アスピリンまたはβ―ラクタム抗生物質）および皮膚アレルギー（例えば、ラテックス、絆創膏、化学開始剤）が、良い例である。
【００５０】
本発明の化合物の効果は、特に、一次疾患の症状および該疾患の治療による副作用に苦しむ患者の生活の質を向上させるため、他の薬品との組み合わせにより有利に使用され得る。例えば、悪性腫瘍もしくは白血病などの過形成性疾患または腫瘍性疾患の患者は、手術、体外放射線照射および／または放射性核種治療により、１または複数の細胞毒性薬剤（ヌクレオシド類似体など）を使用して治療され得る。移植を受けた患者、または特定の自己免疫疾患の患者は強い免疫抑制剤を使用した治療を受けると、ＨＩＶ感染症などの疾患の影響により免疫系が直接的に損なわれた患者と同様に、感染症に感染しやすい状態におかれる可能性がある。さらに、本発明の化合物または組成物は、疾患をより完全に緩解させるため、あらゆる残存腫瘍細胞、微細腫瘍または微細転移に対する免疫反応（特に、マクロファージの刺激による）を解放し、該反応に焦点をあわせるため投与され得る。こうした治療は、その他の薬剤もしくは診療行為による治療中または治療後に実行される。
【００５１】
本発明の化合物は、微細腫瘍の破壊（特に、マクロファージによる）を刺激し、それにより腫瘍性疾患の形成または拡大を予防するために使用され得る。これは、特に高齢の患者（以下を参照）または腫瘍性疾患の素因を有すると考えられる患者（例えば、遺伝、素因となる薬品または化学的もしくは物理的環境に対する暴露（特定のホルモン、発癌性物質、イオン化放射物など）、過去の腫瘍性疾患の治療、遺伝子検査の結果などによる）において、予防的に採用され得る。
【００５２】
本発明の化合物の効果のさらなる利点は、その他の免疫調整剤との組み合わせ、特に、強い免疫抑制剤およびサイトカイン産生抑制剤との組み合わせにある。強い免疫抑制剤が投与される自己免疫疾患などの場合、該免疫抑制剤の投与前、該投与と同時および／または該投与後に本発明の化合物を投与することで、一次薬物治療の所望の機能を阻害することなく、特定の免疫機能を回復し得る。このように、患者は、他の方法では発症したであろう感染症に対する感染性を低く抑えることで、生活の質を高める。こうした治療に適した病気の例として、リウマチ様関節炎（ＲＡ）または全身性狼瘡などの自己免疫疾患がある。
【００５３】
より好ましい局面において、本発明は、他の薬品および／または治療計画を支援するものとして、本明細書で定義される式Ｉの化合物またはその塩の投与を含む、哺乳類（好ましくはヒト）である患者の治療方法を提供する。好ましくは、該方法はウイルス性、自己免疫、過形成性または腫瘍性疾患の治療方法であり、より好ましくは、ＨＩＶ、ＲＡ、狼瘡、悪性腫瘍または白血病の治療方法である。該他の薬品は、本明細書に列挙されるような抗ウイルス剤、免疫抑制剤、または、放射性医薬品もしくは化学療法薬などの抗がん剤（例えば、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、シスプラチン、クラドリビン、シクロフォスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、ヒドロキシウレア、メルカプトプリン、ムスチン（ｍｕｓｔｉｎｅ）、メトトレキサート、プロカルバジンまたはビンブラスチン）が好ましい。該他の治療計画は、手術および／または体外放射線照射が好ましい。この方法では、本発明の化合物は医薬品として調合されるのが一般的であり、該他の薬品もしくは治療の前、または、好ましくはこれと同時もしくはその後に、投与される。
【００５４】
疲労または倦怠などの症状が、高齢またはウイルス性、細菌性もしくは菌性感染症による場合、または、悪性腫瘍などの過形成性疾患の症状もしくは治療による場合、本発明の化合物は、医薬品または添加物（例えば、「機能性食品」）のいずれの形態でも投与され得る。機能性食品に固有な利点のひとつは、１日に数回、少量を服用するという日課を患者が容易に確立することができ、その結果、本明細書に記載されるとおり、重要性は低くはあるが治療的な濃度に活性物質を維持できることである。
【００５５】
原因が病状または治療である場合、本発明の化合物は医薬品の形態で摂取されるのが一般的である。しかしながら、原因が単に高齢による不要残屑の蓄積、または、特別な治療薬が処方されていない軽度の慢性的炎症である場合、本発明の化合物は、服用遵守の利便性および容易さから、機能性食品または栄養補助食品の形態で摂取されることが好ましい。
【００５６】
高齢の哺乳類（好ましくはヒト）である患者の強壮治療方法において、該患者は一般的に、該哺乳類の平均寿命の最後の四半期に相当し、より好ましくは該平均寿命の最後の１０パーセントに相当し、該平均寿命と同年齢または該平均寿命超であってもよい。該患者が高齢のヒトである場合には、該患者は６０歳以上であることが好ましく、７０歳以上であることがより好ましく、７５歳以上であることが最も好ましい。該患者は特定可能なウイルス性、炎症性、免疫不全、自己免疫もしくはアレルギー性の疾患または病気であってもよく、または、これらもしくはあらゆる点において概して健康であり、身体もしくは精神的エネルギーまたは免疫機能の増進、あるいは疲労もしくは倦怠感の緩和を望む患者であってもよい。本発明はまた、こうした方法での使用に適した強壮薬剤の製造における、本発明の化合物の使用法も提供する。
【００５７】
ある好ましい局面において、本発明は具体的または特定されたウイルス性疾患を何ら患っていない患者の強壮治療に関する。さらに好ましい局面において、本発明は、具体的もしくは特定された炎症性または自己免疫疾患、特に、急性の炎症性または自己免疫疾患を何ら患っていない患者の強壮治療に関する。本局面において、本発明はむしろ、該疾患に対する予防、ならびに／または、確立された治療法を利用するほどではない軽度もしくは一般的な症状を伴う、軽度の慢性もしくは間欠性の炎症性疾患または自己免疫疾患の治療に関する。
【００５８】
本発明はまた、アレルギーの発症および／もしくはアレルギーの進行を予防または軽減するための、アレルギー反応の出やすい患者の予防的治療に関する。例えば、該患者はいくつか、または多くの刺激に対してアレルギーを有し、身体を衰弱させる広範囲でのアレルギーの発現を防ぐために治療を受け得る。あるいは、該患者は疑わしいアレルギー素因を有し（例えば、遺伝、アレルゲン等に対する暴露または遺伝スクリーニングなどのスクリーニングによる発見）、重大なアレルギー反応の発症前に治療を受け得る。
【００５９】
本発明は、以下の何ら限定しない実施例により説明される。
【００６０】
実施例
ＣＤＣｌ3を溶媒とし、ブルーカー社（Ｂｒｕｋｅｒ）製３００ＭＨｚ分光計において1Ｈ−ＮＭＲを記録した。シンメトリーカラム（Ｃ−１８、５ｍｍ、３．９×１５０ｍｍ）を備えたジンコテック社（Ｇｙｎｋｏｔｅｋ）製ポンプ、および、２５４ｎｍに設定されたジンコテック社製ＵＶＤ１７０Ｓ検出器を用いて、ＨＰＬＣを行った。
勾配：８分間での水／アセトニトリル混液中１％ＴＦＡ、水：アセトニトリル（７０：３０）から（０：１００）の勾配。
【実施例１】
【００６１】
実施例１−  ４ＯＨ−ＯＰＢの合成
磁気攪拌子を備えた１リットルの丸底フラスコにメタノール（４５０ｍｌ）とオキシフェンブタゾン水和物（９０．０ｇ、０．２６ｍｏｌ）を入れる。この溶液を室温で攪拌し、水酸化ナトリウム溶液（２Ｍ、１３．５ｍｌ）を加える。過酸化水素（３０％、１８０ｍｌ）を１０分間で滴加する。得られた透明な淡黄色の溶液を２４時間攪拌した。得られた懸濁液を氷浴にて２．５時間冷却し、この混合物をガラスフィルターで濾過し、吸引乾燥した。薄茶色の結晶を該フィルター上でＭｅＯＨ／水混合物（１：２、２００ｍｌ）で慎重に洗浄し、吸引乾燥し、同じ溶媒混合物１００ｍｌで再度洗浄した。生成物を該フィルター上で一晩乾燥させた。次に粗生成物を２００ｍｌの丸底フラスコに移し、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）を加え、得られた懸濁液を約５分間激しく攪拌した。混合物を濾過し、該フィルター上で吸引乾燥した。エーテル処理後の該生成物の外観は、淡いピンク色であった。粗収量５３ｇ。該エーテル処理工程をエーテル１５０ｍｌにより再度行った。このほぼ白色となった物質をメタノール（３３０ｍｌ）中に溶解し、赤色の溶液を得た。水（３５０ｍｌ）を３５分超の時間をかけてゆっくりと加え、白色の懸濁物を得た。固形物をガラスフィルター上に回収し、３０℃で一晩真空乾燥させ、淡いピンク色の固形物である４−ＯＨ  ＯＰＢを得た（３１ｇ、３５％、ＨＰＬＣ＞９８％）。1Ｈ−ＮＭＲにより、参照試料と同一物であることが確認された。図１Ａは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトラム全体を示している。図１Ｂは、芳香族領域を拡大して示している。
【実施例２】
【００６２】
実施例２−チオール誘導体化
グルタチオン（ＧＳＨ）溶液中でのインキュベーションにより実施例１の４ＯＨ−ＯＰＢをグルタチオンにより誘導体化し、その後精製した。ほぼ同量のモノ−グルタチオン置換生成物（４ＯＨ−ＯＰＢ−１ＧＳＨ）とジ−グルタチオン置換生成物（４ＯＨ−ＯＰＢ−２ＧＳＨ）とが得られるよう、条件を設定した。
【００６３】
インキュベーション
４ＯＨ−ＯＰＢ（１７０ｍｇ）を、グルタチオン１．５ｍＭをさらに含むＰＢＳ（１００ｍｌ、以下のとおり配合される）中に溶解した。この溶液を３７１℃で３０分間インキュベーションし、その反応について質量分析計解析を行った。
【００６４】
精製
解析ＨＰＬＣ操作（Ｃ１８逆相カラム）を実行し、形成された生成物を確認した（質量分析法により判断される）。次に、インキュベーション混合物１００ｍＬ全体を分取カラム（Ｃ１８、逆相カラム）に載せ、４ＯＨ−ＯＰＢ−１ＧＳＨおよび４ＯＨ−ＯＰＢ−２ＧＳＨを精製した。
【００６５】
ｐＨを２に維持するための０．１％ＴＦＡの存在下で０％アセトニトリルから６７％アセトニトリル（脱イオン水中）の勾配による溶離液を用いて、分析操作および分取操作の両方について溶離した。分取操作実施中、画分を回収し（ピーク）、質量分析法により適切な生成物であるかを確認した。最後に、同定された生成物を真空乾燥させ、生成物の純度を〜９９％（ＭＳによる判定）とした。
ＰＢＳ＝（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５）
ＮａＣｌ  ８．２ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ  １．９ｇ、ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ  ０．３ｇ、Ｎａ+  １６３．９ｍＭ、Ｃｌ-  １４０．３ｍＭ、ＨＰＯ42-  １０．９ｍＭ、Ｈ2ＰＯ4-  １．８ｍＭ（ブラウンメルサンジェン社（Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）製）
【実施例３】
【００６６】
実施例３−サイトカイン産生の抑制
実施例１で製造された４ＯＨ−ＯＢＰおよび実施例２で製造された４ＯＨ−ＯＰＢ−２ＧＳＨ（２バッチ）を、有志健常者の末梢血由来である単離したヒトの単核球（ＭＮＣ）と共にインキュベーションした。サイトカインであるインターロイキン−６（ＩＬ６）および顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生を測定した。測定結果（図２および図３に示す）から、いずれの生成物も、測定されたサイトカインの産生を完全に阻止するには０．５から５ＦＭあれば十分なことが分かる。
【実施例４】
【００６７】
実施例４−開環
ｐＨ７．４の緩衝液中でのインキュベーションにより４−ヒドロキシ−オキシフェンブタゾン（４−ＯＨ−ＯＰＢ）をＮ−フェニル−２−ヒドロキシ−２−ブチル−１，３−プロパナールキノンイミン（ＰＨＢＰＱ）に変換し、その後高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した。
【００６８】
インキュベーション
最初に４−ＯＨ−ＯＰＢ（３４ｍｇ）をＤＭＳＯ（１ｍｌ）中に溶解し、次に濃度が１００ＦＭとなるＰＢＳ（１００ｍｌ、ＰＢＳの構成は以下のとおり）中で３７℃で１５分間インキュベーションした。
【００６９】
精製
分析ＨＰＬＣ操作（Ｃ１８逆相カラム）を行い、形成された生成物を確認した（質量分析法により判定）。次に、インキュベーション混合物１００ｍＬ全てを分取カラム（Ｃ１８、逆相カラム）に載せ、ＰＨＰＢＱを精製した。
【００７０】
ｐＨを２に維持するための０．１％ＴＦＡの存在下で０％アセトニトリルから６７％アセトニトリル（脱イオン水中）の勾配による溶離液を用いて、分析操作および分取操作の両方について溶離した。分取操作実施中、画分を回収し（ピーク）、質量分析法により適切な生成物であるかを確認した。最後に、同定された生成物を真空乾燥させ、生成物の純度を〜９９％とした。得られた化合物の1Ｈ−ＮＭＲスペクトラムを図２に示す。
ＰＢＳ＝（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）
ＮａＣｌ  ８．２ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ  １．９ｇ、ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ  ０．３ｇ、Ｎａ＋  １６３．９ｍＭ、Ｃｌ-  １４０．３ｍＭ、ＨＰＯ42-  １０．９ｍＭ、Ｈ2ＰＯ4-  １．８ｍＭ（ブラウンメルサンジェン社製）
【実施例５】
【００７１】
実施例５−開環生成物の分析
実施例４の生成物（ＰＨＢＰＱ、Ｎ−フェニル−２−ヒドロキシ−２−ブチル−１，３−プロパナールキノンイミン）を水溶液中での安定性について調査し、1Ｈ−ＮＭＲ分光法により分析した。図４Ａはスペクトラム全体を示し、図４Ｂは芳香族領域を拡大して示している。
【００７２】
分析結果により、ＰＨＢＰＱはｐＨ７．４において４−ＯＨ−ＯＰＢよりも安定であり、半減期が〜２から２．５時間であることが示された。ＰＨＢＰＱは溶液が酸性であれば４−ＯＨ−ＯＰＢに再変換されなかった。
【実施例６】
【００７３】
実施例６−開環生成物のチオール誘導体化
ＰＨＢＰＱ（上記実施例４の記載にしたがい製造され（５００μＭ）、ＰＢＳ溶液中に残存している状態）にグルタチオン１．５ｍＭを加え、３７℃で３０分間インキュベーションした。混合物を上記実施例４で記載される方法により精製した。１グルタチオン（ＰＨＢＰＱ−１ＧＳＨ）および２グルタチオン（ＰＨＢＰＱ−２ＧＳＨ）により誘導体化されたほぼ同量の生成物が、混合物から分離された。
【実施例７】
【００７４】
実施例７−サイトカイン産生の抑制
実施例４で製造されたＰＨＢＰＱおよび実施例６で製造されたＰＨＢＰＱ−２ＧＳＨを、有志健常者の末梢血由来である単離したヒトの単核球（ＭＮＣ）と共にインキュベーションした。サイトカインであるインターロイキン−６（ＩＬ６）および顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生を測定した。測定結果（図５および図６に示す）から、測定されたサイトカインの産生を完全に阻止するには、ＰＨＢＱまたはＰＨＢＱ−２ＧＳＨが０．５から２ＦＭあれば十分なことが分かる。
【実施例８】
【００７５】
実施例８−インビトロでのサイトカイン産生の促進
方法
ヒトの単球を有志健常者から採取した１０％の全血で基質上で培養した。該単球を、実施例１で製造した中度の量の４−ＯＨ−ＯＰＢ（０から１６０μＭ）により処理し、リポオリゴ糖類（ＬＯＳ）により刺激した。該単球によるインターロイキン６および８（ＩＬ６およびＩＬ８）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ならびにインターロイキン１Ｂおよび１２の産生を測定した。
【００７６】
４−ＯＨ−ＯＰＢの代わりにＰＨＢＰＱを用いてこの実験を再度行った。
【００７７】
結果
いずれの化合物も４０μＭまでの濃度において、全てのモノカインの産生に増加が認められた。４０μＭを超える濃度では、これらのモノカイン全てについて産生はピーク値から減少し、基線より下にまで抑制された。結果を図７Ａおよび図７Ｂに示す。
【００７８】
リンパ球刺激
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体を用いたリンパ球刺激について上記実験を再度行った結果、発現の増加は顕著ではなかったが、今回も産生の抑制は高濃度時に限定された。結果を図８Ａおよび図８Ｂに示す。
【実施例９】
【００７９】
実施例９−生体内および生体外でのサイトカイン産生の促進
８人の有志被験者が４−ＯＨ−ＯＰＢ２００ｍｇを１００ｍｇの錠剤２錠として経口摂取し、別の８人の有志被験者は偽錠剤を与えられた。偽錠剤は、４−ＯＨ−ＯＰＢが存在しない点以外は化学的に同一である。治験薬および偽薬はＬＰＳを注射する２時間前に投与した。ＬＰＳ（大腸桿菌リポ多糖類、ロットＧ１、アメリカ薬局方協会、ロックビル、ＭＤ）は、体重１キロあたり４ｎｇの投与量でボーラス静脈注射により投与された。
【００８０】
４−ＯＨ−ＯＰＢの投与直前、ＬＰＳの注射の直前ならびに該注射後０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間および２３時間後に採血し、４−ＯＨ−ＯＰＢおよび／または代謝産物の血漿中濃度を調べた。血液をヘパリンチューブに回収し、４℃で１０分間、３０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離を行った。その後、酸が入った管に血漿２ｍｌを移した。
【００８１】
全血および単核球（ＭＮＣ）培養における生体外でのサイトカイン産生に使用される血液は、４−ＯＨ−ＯＰＢ投与直前およびＬＰＳの注射直前（ｔ＝−２時間およびｔ＝０時間）に、採血された。ヘパリン添加全血またはＭＮＣを、培地、ＬＯＳまたは抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８と共にインキュベーションした。２４時間後（ｔ＝２４時間）および７２時間後（ｔ＝７２時間）に、サイトカイン測定のため上清を収集した。
【００８２】
ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０の濃度は、サイトメトリックビーズアレイ（ヒト用ＢＤサイトメトリックビーズアレイキット、ＢＤバイオサイエンスファーミインゲン社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）製、サンノゼ、カリフォルニア）により、ＥＤＴＡ−抗凝固処理血漿中で測定した。
【００８３】
ＬＰＳエンドトキシンの注射により発熱反応が誘発され、４時間後にピークとなり、頻脈ならびに頭痛および倦怠感などの一時的なインフルエンザに似た症状を伴った。４−ＯＨ−ＯＰＢに起因する有害事象は認められなかった。上腹部痛の訴えはなかった。
【００８４】
ＴＮＦ−α血漿中濃度は、ＬＰＳエンドトキシンの投与から１時間後に増加し、１．５時間後にピーク値に達した。ＩＬ−６およびＩＬ−８のレベルは９０分後から増加し、２．５から３時間後にピークとなった。エンドトキシンはまた、抗炎症性サイトカイン反応を誘発し、該反応はＩＬ−１０の血漿中濃度の一時的増加という形で現れた。４−ＯＨ−ＯＰＢの投与の有無に対するこれら因子の反応を、図９から図１２に示す。これらの図では、ｔ＝−２時間において偽薬（開環）または４−ＯＨ−ＯＰＢ２００ｍｇ（閉環）を経口摂取した後、ｔ＝０時間においてＬＰＳ（４ｎｇ／ｋｇ）の静脈注射を受けた患者について、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１０のそれぞれの血漿中濃度を示している。データは、平均値±標準誤差である。
【実施例１０】
【００８５】
実施例１０−さらなる化合物に関する研究
材料
ＰＢ、ＯＰＢ、４−ＯＨ−ＯＰＢおよび４−エチルスルフォフェニル−４−ヒドロキシ−１−フェニル−２−ヒドロキシフェニル−３，５−ピラゾリジンジオン（本明細書において、「４−ＯＨ−ＯＰＳ」という）について、様々なサイトカインに対する効果について実験した。４−ＯＨ−ＯＰＢおよび４−ＯＨ−ＯＰＳは、シンタゴン社（Ｓｙｎｔａｇｏｎ）（Sodertalije、スウェーデン）合成のものである。ＰＢおよびＯＰＢは、アイシーエヌバイオメディカルズ社（ＩＣＮ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）（オーロラ、オハイオ州）から入手した。化合物の２０ｍＭストックをＤＭＳＯ中で製造し、４℃で保管した。
【００８６】
培地
本実施例で使用される培地は、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌスレプトマイシン（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）製、メレルベク（Ｍｅｒｅｌｂｅｋｅ）、ベルギー）、５０μＭ２−メルカプトエタノール（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）製、シュタインハイム、ドイツ）、５％加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（ボディンコ社（Ｂｏｄｉｎｃｏ）製、アルクマール、オランダ）および２０ｍｇ／ｍｌヒトトランスフェリン（シグマ−アルドリッチ社製）を含む、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（バイオウィットテイカー社（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）製、ベルビエ、ベルギー）である。使用された化合物は全て、エンドトキシンを含まない。
【００８７】
ＰＢＭＣの精製および刺激
ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を採血直後の健康な提供者の血液から単離し、パーコール密度勾配遠心法（ｄ＝１．０７８）（ファーマシアファインケミカルズ社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）製、ウプサラ、スウェーデン）により分離した。これらの単離されたＰＢＭＣをＩＭＤＭ２００μｌ（２×１０５セル／ｍｌ）中で、平底プレート（ヌンク社（Ｎｕｎｃ）製、ロスキレ、デンマーク）内において５％ＣＯ2存在下３７℃で培養した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８それぞれ１μｇ／ｍｌ（ＣＬＢ．Ｔ３／４．Ｅ  ｒｅｓ．ＣＬＢ．ＣＤ２８／１、ＣＬＢ社製、アムステルダム、オランダ）を組み合わせ、Ｔリンパ球刺激剤として使用した。単球刺激剤としては、リポオリゴ糖類（ＬＯＳ）（Ｊ．プールマン博士寄贈、ＲＩＶＭ社、ビルトーベン（Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ）、オランダ）１００ｐｇ／ｍｌを使用した。
【００８８】
サイトカインの産生
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激から３日後にＴリンパ球のサイトカイン産生を測定した。単球のＬＯＳ刺激の１日後にサイトカイン産生を測定した。記載された時間に上清を収集し、使用時まで−２０℃で保管した。ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＮＦａおよびＩＦＮｇを、ＥＬＩＳＡキット（ペリカイン−コンパクト（ＰｅｌｉＫｉｎｅ−ｃｏｍｐａｃｔ））（ＣＬＢ社製、アムステルダム、オランダ）を使ってプロトコルに従い検出した。簡潔にまとめると、ｍＡｂを平底マイクロタイタープレート（ヌンク社製、マキシソーブ（Ｍａｘｉｓｏｒｂ））上に、ｐＨ９．６の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム１００μｌ中で一晩被覆した。インキュベーションは全て、１００μｌ中で室温にて行った。プレートを０．０２％Ｔｗｅｅｎを加えたＰＢＳ（モーリンクロッドベーカー社（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ）製、デーフェンテル、オランダ）で５回洗浄した。試料をビオチン化ｍＡｂとともに高速ＥＬＩＳＡ緩衝液（ＣＬＢ社製）中で２時間インキュベーションした。プレートを０．０２％Ｔｗｅｅｎを加えたＰＢＳで５回洗浄し、２％脱脂粉乳を加えたＰＢＳ中に１：１００００の比率で希釈されたストレプトアビジン標識ポリ−西洋わさびペルオキシターゼ（ＣＬＢ社製）と共に、３０分間インキュベーションした。５度の洗浄工程の後、酢酸ナトリウム０．１１Ｍ中に０．００３％Ｈ2Ｏ2、３，５，３’，５’−テトラメチルベンジジン（メルク社（Ｍｅｒｃｋ）製、ダルムシュタット、ドイツ）１００ｍｇ／ｍｌを含むＴＭＢ基質（ｐＨ５．５）により、該プレートを発色させた。反応は同じ量の２ＭのＨ2ＳＯ4で停止した。ＥＬＩＳＡリーダーを使い、バックグラウンド測定を５４０ｎｍとして４５０ｎｍにより該プレートを測定した。他のサイトカインに使用したのと同様のプロトコルにより、ＧＭ−ＣＳＦを測定した。ＧＭ−ＣＳＦ  ＡｂはＧ．トリンチエリ（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ）博士（ウィスターインスティチュート（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、フィラデルフィア、ペンシルベニア州、アメリカ）から寄贈されたものである。この分析では、被覆Ａｂは抗ＧＭ−ＣＳＦ９．１（２μｇ／ｍｌで使用）、ビオチン化Ａｂは抗ＧＭ−ＣＳＦ１６．３（０．１μｇ／ｍｌ）であった。標準曲線の作成には、ｒＧＭ−ＣＳＦ（サンド社（Ｓａｎｄｏｚ）製、バーゼル、スイス）およびＨＧＦ２２．１０（ＣＬＢ社製）を用いた。
【００８９】
結果：
５つの化合物全てがサイトカイン阻害活性を示し、４−ヒドロキシ−オキシフェンブタゾンがインビトロでのＰＢＭＣによるＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦ産生の最良の阻害剤であった。
【００９０】
異なる化合物について、種々の濃度（４０μＭを上限とする）で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８により刺激されたＰＢＭＣを３日間インキュベーションした結果、化合物４−ＯＨ−ＯＰＢと共に細胞を培養した場合にＧＭ−ＣＳＦの産生が著しく阻害されることが分かった。１．２５μＭあれば完全に阻害するのに十分であった（表１、図１３Ａ）。４−ＯＨ−ＯＰＳおよびＯＰＢもＧＭ−ＣＳＦの産生を阻害したが、より高濃度時であった（４０μＭ程度）。ＰＢは緩い投与量−反応曲線を示した。
【００９１】
ＬＯＳ誘発ＩＬ−６産生も、非常に低濃度の４−ＯＨ−ＯＰＢにより阻害された。阻害濃度は２倍低かった（表１、図１３Ｂ）。ここでも、４−ＯＨ−ＯＰＳおよびＯＰＢの濃度は４−ＯＨ−ＯＰＢと比べて高くする必要があった。
【００９２】
【表１】
2007537221.tif 000010
【００９３】
ＩＣ50値（最大反応の５０％を阻害するのに必要な化合物濃度）は、化合物の二重滴定曲線を用いて決定された。試験された最低濃度は０．１５μＭであり、最大濃度は４０μＭであった。この結果は、少なくとも３人の提供者の平均値±標準偏差を示している。培養上清中のＩＬ−６は、ＥＬＩＳＡ法によりＰＢＭＣのＬＯＳ刺激から２４時間後に判定された。培養上清中のＧＭ−ＣＳＦは、ＥＬＩＳＡ法によりＰＢＭＣの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激から３日後に判定された。
【実施例１１】
【００９４】
実施例１１−その他のサイトカインに対する４−ＯＨ−ＯＰＢの効果
４−ＯＨ−ＯＰＢをさらに詳細に調査した。ＬＯＳ誘発ＩＬ−６産生に対する４ＯＨ−ＯＰＢの効果を、単球が生産するその他のサイトカインの産生と比較した（図１４Ａ）。全てのモノカインは、４ＯＨ−ＯＰＢによって同様に阻害された。４ＯＨ−ＯＰＢによる阻害は、ＳＡＣ（熱殺菌された黄色ブドウ球菌細胞）誘発モノカイン産生も阻害された（図示せず）ことから、刺激依存性を有しなかった。
【００９５】
リンパ球に特異的なサイトカイン（Ｔｈ１およびＴｈ２に特異的なサイトカインの両方）の産生に対する４ＯＨ−ＯＰＢの効果は、ＧＭ−ＣＳＦについて見られた阻害性と同じものであった（図１４Ｂ）。ここでも、サイトカイン産生の阻害は刺激依存性を有しなかった。ＰＭＡ／イオノマイシン、ＰＭＡ／抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ２抗体／抗Ｄ２８抗体を組み合わせたものにより誘発されるサイトカイン産生は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激の場合と同様の濃度で阻害された。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例１の1Ｈ−ＮＭＲスペクトラム全体を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの芳香族領域を拡大して示している。
【図２】図２は、実施例３におけるインターロイキン−６（ＩＬ６）の産生を示す。
【図３】図３は、実施例３における顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例５の1Ｈ−ＮＭＲスペクトラム全体を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａの芳香族領域を拡大して示している。
【図５】図５は、実施例７におけるインターロイキン−６（ＩＬ６）の産生を示す。
【図６】図６は、実施例７における顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、実施例８におけるサイトカイン産生に対する４−ＯＨ−ＯＰＢの影響を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施例８におけるサイトカイン産生に対するＰＨＰＢＱの影響を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、実施例８におけるサイトカイン産生に対する４−ＯＨ＝ＯＰＢの影響を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、実施例８におけるサイトカイン産生に対するＰＨＰＢＱの影響を示す。
【図９】図９は、実施例９におけるサイトカインＴＮＦ−α産生の促進を示す。
【図１０】図１０は、実施例９におけるサイトカインＩＬ−６産生の促進を示す。
【図１１】図１１は、実施例９におけるサイトカインＩＬ−８産生の促進を示す。
【図１２】図１２は、実施例９におけるサイトカインＩＬ−１０産生の促進を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、実施例１０における顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、実施例１０におけるインターロイキン−６（ＩＬ６）の産生を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、実施例１１におけるサイトカインの産生を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、実施例１１におけるサイトカインの産生を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【国際調査報告】
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