(57)【要約】  本発明は免疫調節分子に関する。より詳しくは、本発明は、ＮＦ−κＢ誘導型キナーゼ（ＮＩＫ）／ＭＡＰ３Ｋ１４またはその特定の部分に特異的に結合することができる抗体または抗体断片、およびたとえば、ＮＩＫの生化学的活性を調節するため、および／またはＮＩＫまたはその特定の部分の検出を可能にするためのその使用に関する。
2007537708.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：５に記載のアミノ酸配列またはその部分であってリン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分に特異的に結合することができるポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトもしくは抗−抗イディオタイプ抗体またはその断片。
【請求項２】
該部分が配列番号：６のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項３】
該部分が配列番号：３のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体がＩｇＧ抗体である請求項１記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体断片が、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＣＤＲからなる群より選択される請求項１記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体または抗体断片が、さらに、ＮＩＫ分子の生化学的活性を調節することができる請求項１記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体または抗体断片が、さらに、リン酸化ＮＩＫまたはその特定の部分を特異的に検出することができる請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
ウエスタンイムノブロッティング解析によってリン酸化ＮＩＫを特異的に検出することができる請求項７記載の抗体。
【請求項９】
ＥＬＩＳＡによってリン酸化ＮＩＫを特異的に検出することができる請求項７記載の抗体。
【請求項１０】
免疫沈降によってリン酸化ＮＩＫを特異的に検出することができる請求項７記載の抗体。
【請求項１１】
ＣＮＣＭに番号Ｉ−３０９５で寄託されたハイブリドーマＮＩＫ−Ｐ４３０．１２によって産生されるモノクローナル抗体である請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
ＮＩＫまたはそのムテイン、機能性誘導体、活性分画、円順列変異誘導体もしくは塩に特異的に結合することができるポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトもしくは抗−抗イディオタイプ抗体またはその断片であって、哺乳動物を、配列番号：５に記載のアミノ酸配列またはアミノ酸配列の部分で免疫化することによって製造される抗体。
【請求項１３】
ＣＮＣＭに番号Ｉ−３０９５で寄託されたハイブリドーマクローン。
【請求項１４】
薬学的に許容し得る担体および、活性成分として、配列番号：５に記載のアミノ酸配列またはその部分であってリン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分に特異的に結合することができるポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトもしくは抗−抗イディオタイプ抗体またはその断片を含有してなる医薬組成物。
【請求項１５】
該アミノ酸の部分が配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記抗体がＩｇＧ抗体である請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記抗体または抗体断片がマウス起源に由来する請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記抗体断片が、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＣＤＲからなる群より選択される請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記抗体が、さらに、ＮＩＫ分子の生化学的活性を調節することができる請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ＣＤ４０シグナル伝達の阻害のための請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＣＤ７０シグナル伝達の阻害のための請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２２】
悪性疾患および病的免疫応答と関連する疾患から選択される疾患の治療のための請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２３】
該疾患が、自己免疫、アレルギー性、炎症性および移植に関連する疾患から選択される病的免疫応答と関連する請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】
該疾患が、喘息、関節リウマチ、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化およびアルツハイマー病から選択される請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
該疾患が悪性疾患である請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ＮＩＫ分子を、配列番号：５に記載のアミノ酸配列またはその部分であってリン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分に特異的に結合することができるポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトもしくは抗−抗イディオタイプ抗体またはその断片と接触させることを含むＮＩＫ分子の生化学的活性の調節方法。
【請求項２７】
前記ＮＩＫ分子を前記抗体と接触させることが、前記抗体を個体に投与することにより行なわれる請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体がＩｇＧ抗体である請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体または抗体断片がマウス起源のものである請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体断片が、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＣＤＲからなる群より選択される請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
標的抗原に特異的に結合することができる抗体または抗体断片を選択的に捕捉するための、配列番号：５に記載のアミノ酸配列またはその部分であってリン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分のペプチドに共有結合した基質を含有してなる物質の組成物。
【請求項３２】
その部分が配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む請求項３１記載の物質の組成物。
【請求項３３】
前記基質がアフィニティークロマトグラフィー充填剤である請求項３１記載の物質の組成物。
【請求項３４】
前記基質が炭水化物または該炭水化物の誘導体を含む請求項３１記載の物質の組成物。
【請求項３５】
前記炭水化物が、アガロース、セファロースおよびセルロースからなる群より選択される請求項３１記載の物質の組成物。
【請求項３６】
前記基質が、ビーズ、樹脂またはプラスチック表面からなる群より選択される請求項３１記載の物質の組成物。
【請求項３７】
ＮＩＫの活性によって引き起こされるか、または悪化する疾患の治療のための医薬の製造における、配列番号：５に記載のアミノ酸配列またはその部分であってリン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分に特異的に結合することができるポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトもしくは抗−抗イディオタイプ抗体またはその断片の使用。
【請求項３８】
前記抗体がＩｇＧ抗体である請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
前記抗体または抗体断片がマウスに由来する請求項３７記載の使用。
【請求項４０】
前記抗体断片が、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＣＤＲからなる群より選択される請求項３７記載の使用。
【請求項４１】
悪性疾患および病的免疫応答と関連する疾患から選択される疾患における請求項３７記載の使用。
【請求項４２】
病的免疫応答と関連する疾患が、自己免疫、アレルギー性、炎症性および移植に関連する疾患から選択される請求項４１記載の使用。
【請求項４３】
該疾患が、喘息、関節リウマチ、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化およびアルツハイマー病から選択される請求項４２記載の使用。
【請求項４４】
該疾患が悪性疾患である請求項４１記載の使用。
【請求項４５】
配列番号：６を含むアミノ酸配列またはその部分であってリン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分で免疫化した哺乳動物由来の脾臓細胞および同型遺伝子または異型遺伝子のリンパ球様細胞を含有するクローン化ハイブリドーマを、液体培地または哺乳動物の腹部内で増殖させ、ハイブリドーマにモノクローナル抗体を産生および蓄積させることを含むモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項４６】
その部分が配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体または抗体断片を細胞内に導入すること、該細胞を個々のリガンドとともにインキュベートすること、ＮＦκＢ活性化を示すパラメータをモニターすること、およびＮＦκＢの活性化が前記抗体または抗体断片によるＮＩＫ活性の特異的遮断により影響されるリガンドを選択することを含む、細胞内においてＮＩＫ媒介性ＮＦκＢ活性化を誘導することができるリガンドの同定方法。
【請求項４８】
ＮＦκＢの活性化が、ＮＦκＢの標準的な経路の活性化を示すパラメータをモニターすることによって測定される請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
ＮＦκBの活性化が、ＩΚＢａ分解をモニターすることによって測定される請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
細胞がリンパ芽球型のものである請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
細胞が、Ｒａｍｏｓ、ＢＪＡＢおよびジャーカット細胞から選択される請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
配列番号：５に記載のアミノ酸配列またはその部分であってリン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分に特異的に結合することができるポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトもしくは抗−抗イディオタイプ抗体またはその断片を、必要とする個体に投与することを含む、ＮＩＫの活性によって引き起こされるか、または悪化する疾患の治療方法。
【請求項５３】
前記抗体がＩｇＧ抗体である請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体または抗体断片がマウスに由来する請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体断片が、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＣＤＲからなる群より選択される請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
該疾患が、悪性疾患および病的免疫応答と関連する疾患から選択される請求項５２記載の治療方法。
【請求項５７】
病的免疫応答と関連する疾患が、自己免疫、アレルギー性、炎症性および移植に関連する疾患から選択される請求項５６記載の治療方法。
【請求項５８】
該疾患が、喘息、関節リウマチ、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化およびアルツハイマー病から選択される請求項５７記載の治療方法。
【請求項５９】
該疾患が悪性疾患である、請求項５６記載の治療方法。
【請求項６０】
ＮＩＫおよびＮＩＫ結合性タンパク質を含有する試料を請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体を接触させること、ＮＩＫおよびＮＩＫ結合性タンパク質を免疫共沈降させること、生成した免疫複合体を洗浄すること、およびＮＩＫ結合性タンパク質を免疫複合体からＮＩＫ由来の競合ペプチドを用いて回収することを含むＮＩＫ結合性タンパク質の精製方法。
【請求項６１】
試料が、体液、細胞抽出物およびＤＮＡ発現ライブラリーから選択される請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
ＥＬＩＳＡアッセイの開発のための請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項６３】
ＮＩＫまたはそのムテイン、機能性誘導体、活性分画、円順列変異誘導体もしくは塩の免疫精製のための、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節分子に関する。より詳しくは、本発明は、ＮＦ−κＢ誘導型キナーゼ（ＮＩＫ）／ＭＡＰ３Ｋ１４またはその特定の部分に特異的に結合することができる抗体または抗体断片、およびたとえば、ＮＩＫの生化学的活性を調節するため、および／またはＮＩＫまたはその特定の部分の検出を可能にするためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＦ−κＢ分子の規制の無い（deregulated）活性と関連する非常に多くの致死的および／または高度に衰弱性の疾患（悪性疾患ならびに自己免疫、アレルギー性、炎症性および移植に関連する疾患などの病的免疫応答と関連する疾患など）のための治療は存在しないか、または満足のいく治療が存在しない。
【０００３】
ＮＦ−κＢファミリー分子は、免疫応答の調節、細胞増殖、および生存に必須の真核生物の転写因子複合体であり（Ghosh S.ら，1998. Annu Rev Immunol. 16: 225-60）、これは、ほとんどすべてのＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーの構成員によって誘導可能に活性化される。ＮＦ−κＢ分子は、通常、ＩκＢと称する細胞質アンキリン高含有抑制因子のファミリー（ＩκＢαおよび関連タンパク質を含む）との物理的会合によって細胞質画分内に封鎖（sequestere）されている（Baldwin AS. Jr., 1996. Annu Rev Immunol. 14: 649-83）。サイトカイン、マイトジェンおよびある種のウイルス系遺伝子産物などの多様な刺激に応答し、ＩκＢは、Ｓｅｒ３２およびＳｅｒ３６が速やかにリン酸化され、ユビキチン化され、続いて、２６Ｓプロテアソームによって分解される。これにより、放出されたＮＦ−κＢが、核に移動し、標的遺伝子のトランス活性化に関与するのが可能になる（Mercurio F.およびManning A. M., 1999. Curr Opin Cell Biol. 11: 226-32;Pahl, H. L., 1999. Oncogene 18: 6853-66）。最近の分子クローニング研究により、ＮＦ−κＢの抑制因子であるＩκＢのシグナル誘導型リン酸化を媒介するマルチサブユニットＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体が同定された。ＩＫＫ複合体は、２つの触媒性サブユニットＩＫＫαおよびＩＫＫβ、ならびに調節性サブユニットＩＫＫγ（ＮＥＭＯ）から構成される。ＩＫＫαおよびＩＫＫβの両方の触媒性活性は、多数の異なるＮＦ−κＢインデューサー（たとえば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン（ＩＬ）−１などの炎症性サイトカイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ならびにＴ細胞同時刺激タンパク質ＣＤ２８など）によって活性化され得る（Karin, M. および Ben-Neriah, Y., 2000. Annu Rev Immunol. 18: 621-63）。
【０００４】
ＮＦ−κＢ誘導型キナーゼ（ＮＩＫ）／ＭＡＰ３Ｋ−１４（本発明者らに対する国際公開第９７３７０１６Ａ１号パンフレット）は、ＮＦ−κＢの活性化に必須である。たとえば、ＮＩＫの過剰発現は、劇的なＮＦ−κＢの活性化をもたらすことが示されており（Wallach D.ら, 2002. Arthritis Res. 4 Suppl 3: S189-96に概説）、触媒的に不活性なＮＩＫ変異体の発現は、多様な公知のＮＦ−κＢアクチベーター（たとえば、ＬＭＰ１、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）−１、ＴＮＦＲ−２、ＲＡＮＫ、ヒトＴｏｌｌ受容体、ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）、ヒトＴ細胞リンパ球ウイルス（ＨＴＬＶ）−１  Ｔａｘタンパク質およびリポ多糖（ＬＰＳ）など）に応答してＮＦ−κＢ活性化の有効な阻害をもたらすことが示されている（Malinin, N. L.ら, 1997. Nature 385: 540-4;Sylla, B. S.ら, 1998. Proc Natl Acad Sci U S A. 95: 10106-11;Darnay, B. G.ら, 1999. J Biol Chem. 274: 7724-31;Lin, X.ら, 1999. Immunity 10: 271-80;Geleziunas, R.ら, 1998. Mol Cell Biol. 18: 5157-65）。ＮＩＫ遺伝子の標的化破壊（Yin, L.ら, 2001. Science 291: 2162-5）、およびＮＩＫにおいて天然Ｇｌｙ８５５Ａｒｇミスセンス点変異を有する「リンパ組織形成不全症」（ａｌｙ）のマウス系統の研究（Shinkura, R.ら, 1999. Nat Genet. 22: 74-7）により、ＮＩＫは、リンパ球様器官の発達において本質的な役割を有することが明らかにされた。ａｌｙ／ａｌｙおよびＮＩＫノックアウトマウスは、ともに、リンパ節およびパイエル班の全身性欠如、無秩序な（disorganized）脾臓構造および胸腺構造ならびに免疫不全を示し、その最も回復力のある（resilient）特徴は、低血清免疫グロブリンレベルおよび移植片拒絶の欠如である（Shinkura, R.ら, 1999. Nat Genet. 22: 74-7）。これらの異常は、明らかに、多様な受容体による異常型シグナル伝達を反映する。ＮＩＫ変異型マウスの発育不全は、ＬＴ−β受容体（ＬＴ−βＲ）欠損マウスにおいて見られるものと類似し、ＮＩＫもまた、この特定の受容体によるシグナル伝達に関与することを示す。ａｌｙ／ａｌｙマウスにおける障害Ｂ細胞の増殖能により、ＬＰＳおよびＣＤ４０リガンドに対するこれらの細胞の不十分な応答との相関を示すことができ（ＣＤ４０Ｌ；Garceau, N.ら, 2000. J Exp Med. 191: 381-6）、マウスの腹腔における過剰量のＢ１細胞の存在は、二次リンパ球様組織における不十分なケモカイン受容体シグナル伝達の結果としての腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）系への腹膜細胞のホーミングの欠陥に起因し得る（Fagarasan, S.ら, 2000. J Exp Med. 191: 1477-86）。
【０００５】
サイトカイン受容体シグナル伝達におけるＮＩＫの重要かつ一般的な役割は、ツーハイブリッド系を用い、ＩＬ−２受容体γ鎖またはＩＬ−２、−４、−７、ＩＬ−９、−１３、−１５および−２１の受容体のシグナル伝達構成要素である「共通γ鎖」がＮＩＫと特異的に会合することを示した（ＰＣＴ／ＩＬ０３／００３１７）Ｗａｌｌａｃｈらが行なった研究において、最近、示された。共通γ鎖の過剰発現はＮＩＫによって媒介されるＮＦ−κＢ活性化を増強することがわかっており、ＩＬ−２またはＩＬ−１５刺激を受けると、ＮＩＫおよびシグナルソーム（signalosome）成分が、共通γ鎖に結合することがわかった。したがって、これらの結果は、シグナル伝達サブユニットとして共通γ鎖を含有する多種多様なサイトカイン受容体によるシグナル伝達におけるＮＩＫの関与を示す。
【０００６】
免疫系の発達および機能の調節に対するこれらおよび他の寄与とは別に、ＮＩＫはまた、種々の非免疫機能の調節にも関与する。ａｌｙ／ａｌｙ（ＮＩＫノックアウトではないが）マウスは、不十分な乳腺発達を示す（Miyawaki, S.ら, 1994. Eur J Immunol. 24: 429-34）。さらに、インビトロ試験では、シグナル伝達においてＮＩＫが、骨格筋細胞分化をもたらすこと（Canicio, J.ら, 2001. J Biol Chem. 276: 20228-33）、およびニューロンの生存および分化をもたらすこと（Foehr, E. D.ら, 2000. J Biol Chem. 275: 34021-4）が示された。
【０００７】
ＮＦ−κＢ活性化のメディエーターとしての示唆されるＮＩＫの役割と一致し、ａｌｙ／ａｌｙおよびＮＩＫノックアウトマウス由来の線維芽細胞は、ＬＴ−βＲ活性化に応答してＮＦ−κＢを活性化することができない。さらに、ＮＦ−κＢ活性化により生じるＶＣＡＭ−１のＬＴ−βＲアップレギュレーションは、ａｌｙ／ａｌｙマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）において異常である（Matsumoto, M.ら, 1999. J Immunol. 163: 1584-91）。ＩκＢの不十分なリン酸化は、ａｌｙ／ａｌｙ  Ｂリンパ球のＣＤ４０連結への応答においても認められた。対照的に、これらのマウスの樹状細胞では、ＩκＢのＣＤ４０誘導型リン酸化は正常のようであった（Garceau, N.ら, 2000. J Exp Med. 191: 381-6）。また、ａｌｙ／ａｌｙ腹膜細胞は、ケモカインＳＬＣに応答することもできず、ＮＦ−κＢ活性は増大する（Fagarasan, S.ら, 2000. J Exp Med. 191: 1477-86）。
【０００８】
ａｌｙ／ａｌｙマウスのリンパ球様器官における発現されたＮＦ−κＢ種のパターンの評価により、Ｒｅｌタンパク質（Ａ＋ｐ５０）およびＩκＢから構成されるＮＦ−κＢ複合体（１種またはそれ以上）の調節における役割とは別に、ＮＩＫはまた、他のＮＦ−κＢ種の発現／活性化の制御に関与することが示された。最も注目すべきことは、ａｌｙ／ａｌｙのリンパ球は、ｐ５２（不活性前駆体であるｐ１００（ＮＦ−κＢ２）のタンパク質溶解性プロセッシングにより、成熟Ｂリンパ球において特異的に形成されるＮＦ−κＢ）が欠損し、これは、ｐ１００のｐ５２への変換の欠損を示す（Yamada, T.ら, 2000. J Immunol. 165: 804-12）。実際、ＮＩＫは、ｐ１００の部位特異的リン酸化に関与することが示されている。両者は、直接、ＩＫＫαのリン酸化をもたらし、これが、今度は、ｐ１００をリン酸化する。このリン酸化は、ｐ５２を形成するためのｐ１００のユビキチン化および活性プロセッシングの分子性誘因としての機能を果たす。このｐ１００プロセッシング活性は、ａｌｙ変異により除去されることがわかった（Xiao, G.ら, 2001. Mol Cell 7: 401-9;Senftleben, U.ら, 2001. Science 293: 1495-9）。
【０００９】
ＮＩＫのＭＡＰ３Ｋsに対する構造的相同性に鑑み、ＮＩＫのＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８カスケード（ＭＡＰ３Ｋの関与する３つの他の主要タンパク質キナーゼカスケード）における関与を探索するためのいくつかの試みがなされた（Akiba, H.ら, 1998. J Biol Chem. 273: 13353-8）。ＮＩＫは、ＰＣ１２褐色細胞腫細胞におけるＥＲＫカスケードに関与することが示されている（Foehr, E. D.ら, 2000. J Biol Chem. 275: 34021-4）。ある種の細胞において、ＮＩＫは、ＪＮＫカスケードの下流標的であるＪｕｎのリン酸化のためのシグナル伝達に、この特定のカスケードとは独立して関与し得ることを示す証拠がある（Akiba, H.ら, 1998. J Biol Chem. 273: 13353-8;Natoli, G.ら, 1997. J Biol Chem. 272: 26079-82）。全体として、これらの所見は、ＮＩＫが、実際、ＮＦ−κＢ活性化のメディエーターとしての機能を果たすが、他の機能も果たし得ること、およびこれらの機能を細胞特異的および受容体特異的に発揮することを示す。
【００１０】
他のＭＡＰ３Ｋと同様、ＮＩＫは、ＮＩＫ分子内の「活性化ループ」のリン酸化の結果として活性化され得る。実際、このループ内のリン酸化部位（Ｔｈｒ５５９）の変異は、ＮＩＫ過剰発現時のＮＦ−κＢの活性化を抑制する（Lin, X.ら, 1999. Immunity 10: 271-80）。また、ＮＩＫの活性は、そのキナーゼモチーフの上流および下流の領域が互いに結合できる能力により調節されるようである（Linら Molec. Cell Biol. (18) 10 5899-5907 1998）。ＮＩＫのそのキナーゼ部分の下流のＣ末端領域は、ＩＫＫα（Regnier, C. H.ら, 1997. Cell 90: 373-83）ならびにｐ１００（Xiao, G. および Sun, S. C., 2000. J Biol Chem. 275: 21081-5）およびＴＲＡＦ２（Malinin, N. L.ら, 1997. Nature 385: 540-4）に直接結合できることが示されている。かかる相互作用は、明らかに、ＮＦ−κＢシグナル伝達におけるＮＩＫ機能に必要とされる。ＮＩＫのＮ末端領域は、塩基性（basic）モチーフ（ＢＲ）およびプロリンリッチリピートモチーフ（ＰＲＲ）から構成される負の調節ドメイン（ＮＲＤ）を含む（Xiao, G.ら, 2001. Mol Cell 7: 401-9）。明らかに、Ｎ末端ＮＲＤは、ＮＩＫのＣ末端領域とｃｉｓで相互作用し、それにより、ＮＩＫのその基質（ＩＫＫαおよびｐ１００）への結合を阻害する。正常でない位置に発現されたＮＩＫは、各ＮＩＫ分子におけるＮ末端領域のＣ末端領域へのこれらの結合が明らかに破壊されたオリゴマーを自発的に形成するようであり、高レベルの構成活性を示す（Lin, X.ら, 1999. Immunity 10: 271-80）。ＮＩＫのＣ末端領域のＴＮＦ受容体結合アダプタータンパク質ＴＲＡＦ２への、および他のＴＲＡＦへの結合（Malinin, N. L.ら, 1997. Nature 385: 540-4;Rothe, M.ら, 1994. Cell 78: 681-92;Takeuchi, M.ら, 1996. J Biol Chem. 271: 19935-42）は、おそらく、ＮＩＫによるＮＦ−κＢの活性化に関与している。
【００１１】
ＮＩＫは、そのＣ末端領域のＩＫＫαへの結合により、ＩＫＫ複合体を活性化できることを示す証拠がある。これは、ＩＫＫαの活性化ループにおいてＳｅｒ１７６をリン酸化でき、それにより、この分子を活性化することが示されている（Ling, L.ら, 1998. Proc Natl Acad Sci U S A. 95: 3792-7）。かかる活性化様式と一致して、ａｌｙ／ａｌｙ  ＭＥＦSにおけるＬＴ−βＲによるＮＦ−κＢ活性化の欠損を説明する機序に関する研究により、ＮＩＫ変異は、ＩＫＫシグナルソームの活性化およびその結果としてのＩκＢのリン酸化を除去することが示された（Matsushima, A.ら, 2001. J Exp Med. 193: 631-6）。ＮＩＫがｐ１００に直接、そのＣ末端領域を介して結合し、これをリン酸化する能力は、ｐ１００が直接ＮＩＫの基質としての機能を果たすことを示す（Xiao, G. および Sun, S. C., 2000. J Biol Chem. 275: 21081-5）。それにもかかわらず、最近の研究では、ＮＩＫが、ＩＫＫαのリン酸化、したがって活性化（ＩＫＫαが、こんどはｐ１００をリン酸化する）を介して間接的にｐ１００リン酸化を媒介することが示された（Senftleben, U.ら, 2001. Science 293: 1495-9）。
【００１２】
したがって、ＮＩＫによるＮＦ−κＢ分子の活性化は、ＮＦ−κＢ活性の調節のための必須の制御点を意味する。
【００１３】
上記のように、無規制なＮＦ−κＢ活性は、種々の主要なヒト疾患、たとえば、非常に多くの悪性疾患および病的免疫応答と関連する疾患などの病因と関連する（Yamamoto および Gaynor, 2001. J Clin Invest. 107: 135-142に概説）。たとえば、ＮＦ−κＢ経路の活性化は、喘息および関節リウマチなどの慢性炎症性疾患（Tak および Firestein, 2001. J Clin Invest. 107: 7-11;Karin, M. および Ben-Neriah, Y., 2000. Annu Rev Immunol. 18: 621-63）および炎症性腸疾患の病因と顕著に関与する。また、改変されたＮＦ−κＢ調節は、炎症性応答が少なくとも部分的に関与する他の疾患、たとえば、動脈硬化（Collins および Cybulsky, 2001. J Clin Invest. 107: 255-64;Leonard, W. J.ら, 1995. Immunol Rev. 148: 97-114）およびアルツハイマー病（Mattson および Camandola, 2001. J Clin Invest. 107: 247-54;Lin, X.ら, 1999. Immunity 10: 271-80）などの病因に関与するようである。
【００１４】
サイトカイン遺伝子のＮＦ−κＢ活性化は、肺における炎症性細胞の浸潤ならびに多くのサイトカインおよびケモカインの無規制さを特徴とする喘息の病因の重要な寄与因子であることを示す証拠が幾通りかある（Ling, L.ら, 1998. Proc Natl Acad Sci U S A. 95: 3792-7）。ＮＦ−κＢを活性化するＴＮＦなどのサイトカインは、関節リウマチの患者の滑液中において上昇しており、これらの患者の関節において見られる慢性炎症性変化および滑膜過形成に寄与する（Malinin, N. L.ら, 1997. Nature 385: 540-4）。ＴＮＦ指向抗体またはＴＮＦに結合する切断型ＴＮＦ受容体の投与は、関節リウマチの患者の症状を著しく改善し得る。
【００１５】
また、リンパ球およびマクロファージの両方による前炎症性サイトカインの産生の増加は、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患の病因に関与している（Matsumoto, M.ら, 1999. J Immunol. 163: 1584-91）。ＮＦ−κＢ活性化は、活性クローン病患者および潰瘍性大腸炎患者由来の粘膜生検材料試験片において見られる。炎症性腸疾患を患う患者のステロイド類による治療は、生検材料試験片においてＮＦ−κＢ活性を減少させ、臨床症状を低減する。これらの結果は、ＮＦ−κＢ経路の刺激が、これらの疾患と関連する炎症性応答の増大に関与することを示す。
【００１６】
アテローム性動脈硬化は、損傷された血管壁の内皮および平滑筋に対する非常に多くの傷害により誘発される（Matsushimaら, 2001）。内皮細胞、平滑筋、マクロファージおよびリンパ球から放出される多数の増殖因子、サイトカインおよびケモカインが、この慢性炎症性線維増殖性プロセスに関与する（Matsushima, A.ら, 2001. J Exp Med. 193: 631-6）。炎症性応答および細胞増殖の制御に関与する遺伝子のＮＦ−κＢ調節は、アテローム性動脈硬化の起始および進行に重要な役割を果たすものとして広く理解されている。
【００１７】
上記のように、ＮＦ−κＢ経路の調節における異常は、アルツハイマー病の病因に関与することが示されている。たとえば、ＮＦ−κＢ免疫反応性は、主に、アルツハイマー病の初期老人斑（neuritic plaque）型内およびその周囲に見られるが、成熟斑型は、非常に低下したＮＦ−κＢ活性を示す（Mercurio F. および Manning A. M., 1999. Curr Opin Cell Biol. 11: 226-32）。したがって、ＮＦ−κＢ活性化は、アルツハイマー病の初期段階の際の老人班およびニューロンアポトーシスの開始にある。これらのデータは、したがって、ＮＦ−κＢ経路の活性化が、その病因に関与する炎症性成分を有するいくつかの疾患において、ある役割を果たすことを示す。
【００１８】
無規制な免疫応答と関連する疾患の病因における役割に加え、ＮＦ−κＢ経路の過活性化または構造的活性化もまた、種々のヒト癌の病因に関与している。ＮＦ−κＢ経路の異常に高度なおよび／または構造的活性化は、白血病、リンパ腫および充実性腫瘍などの多様なヒト悪性腫瘍に頻繁に見られる（Miyawaki, S.ら, 1994. Eur J Immunol. 24: 429-34）。これらの異常は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌および結腸癌などの多様な腫瘍の核内において、異常におよび／または構造的に高レベルのＮＦ−κＢをもたらす。これらの変化の大部分は、おそらく、ＮＦ−κＢ経路の活性化をもたらすシグナル伝達経路を活性化する調節タンパク質の改変によるものである。しかしながら、ＩκＢタンパク質を不活化する変異は、ＮＦ−κＢファミリー構成員をコードする遺伝子の増幅および再編成に加え、いくつかの腫瘍で見られるＮＦ−κＢの核レベルの上昇をもたらし得る（Emmerichら Blood Nov 1;94 (9): 3129-34,1999）。
【００１９】
上記のように、ＮＩＫはＮＦ−κＢの活性化に必須であるため、ＮＦ−κＢの活性化を調節し、それにより、無規制なＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を治療するための潜在的に有力なストラテジーの一例は、ＮＩＫまたはその特定の部分に特異的に結合することができ、それにより、ＮＩＫによるＮＦ−κＢの活性化を抑制または阻害することができる抗体を同定することを伴う。
【００２０】
従来技術のアプローチでは、アミノ酸Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫに結合することができる抗体を提供することができなかった。Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫに特異的であると考えられたかかる抗体の一例を、昨年（２００２）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから購入した（ＳＣ１２９５７Ｒ）。しかしながら、該抗体は、本発明者らの手では適正に機能せず、今年、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚは、これをカタログから除いた。
【００２１】
現在、リン酸化活性種および非リン酸化種を含むＮＩＫの種々の分子種の検出方法では、エピトープタグ化ＮＩＫおよび抗タグ抗体の細胞内での過剰発現を用いる。このリン酸化ＮＩＫの検出方法には、多くの制限があり、その１つは、該方法が、内因性の活性化されたＮＩＫを特異的に検出するために使用できないことである。
【００２２】
したがって、内在性のリン酸化ＮＩＫに結合することができる抗体の必要性、およびこれを有することが非常に好都合であろうことが広く認識されている。
【発明の開示】
【００２３】
本発明は、配列番号：５に記載のアミノ酸配列またはその部分であってリン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分に特異的に結合することができるポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトもしくは抗−抗イディオタイプ抗体またはその断片に関する。
【００２４】
本発明の一実施形態において、抗体断片は、配列番号：５に記載のアミノ酸配列または配列番号６および３のアミノ酸配列などのその部分であって、リン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分に特異的に結合することができる単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＣＤＲからなる群より選択される。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、ＩｇＧ抗体、ポリクローナル、モノクローナル（たとえば、ＣＮＣＭに番号Ｉ−３０９５で寄託されたハイブリドーマＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２によって産生される抗体）を提供する。
【００２６】
さらなる実施形態において、本発明は、ＮＩＫまたはそのムテイン、機能性誘導体、活性断片、円順列変異誘導体もしくは塩に特異的に結合することができるポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトまたは抗−抗イディオタイプ抗体またはその断片であって、哺乳動物をアミノ酸配列、または配列番号：５に記載のアミノ酸配列の部分、好ましくは配列番号：３のアミノ酸部分で免疫することによって製造される抗体に関する。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＮＩＫ分子の生化学的活性を調節することができる、および／またはリン酸化ＮＩＫまたはその特定の部分を、たとえばウエスタンイムノブロッティング解析、ＥＬＩＳＡまたは免疫沈降によって特異的に検出することができる。
【００２８】
別の態様において、本発明は、ＣＮＣＭに番号Ｉ−３０９５で寄託されたハイブリドーマＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２によって産生されるモノクローナル抗体を提供する。
【００２９】
本発明は、薬学的に許容し得る担体および、活性成分として、配列番号：５に記載のアミノ酸配列またはその部分であってリン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分に特異的に結合することができるポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトもしくは抗−抗イディオタイプ抗体またはその断片を含有する医薬組成物に関する。より詳しくは、医薬組成物は、さらに、ＮＩＫ分子の生化学的活性を調節することができる（たとえば、ＣＤ４０および／またはＣＤ７０のシグナル伝達を阻害することができる）抗体または抗体断片を含有する。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、ＮＩＫ分子を配列番号：５に記載のアミノ酸配列またはその部分であってリン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分に特異的に結合することができるポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトもしくは抗−抗イディオタイプ抗体またはその断片と接触させ、それにより、ＮＩＫ分子の生化学的活性を調節することを含む、ＮＩＫの生化学的活性の調節方法に関する。より詳しくは、ＮＩＫ分子の前記調製物との前記接触は、前記調製物を個体に投与することにより行なわれ得る。
【００３１】
一実施形態において、本発明は、標的抗原に特異的に結合することができる抗体または抗体断片を選択的に捕捉するための、配列番号：５に記載のアミノ酸配列またはその部分（たとえば、配列番号：３のもの）であって、リン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分のペプチドに共有結合したアフィニティークロマトグラフィー充填剤などの基質を含有する物質の組成物に関する。
【００３２】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号：５に記載のアミノ酸配列またはその部分であってリン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分に特異的に結合することができる抗体を、その必要がある個体に投与することを含む、ＮＩＫの活性によって引き起こされるか、または悪化する疾患の治療方法に関する。
【００３３】
さらなる実施形態において、本発明は、体液、細胞抽出物およびＤＮＡ発現ライブラリーなどの試料であって、ＮＩＫおよびＮＩＫ結合性タンパク質を含有する試料を本発明の抗体と接触させること、ＮＩＫおよびＮＩＫ結合性タンパク質を免疫共沈降させること、生成した免疫複合体を洗浄すること、およびＮＩＫ結合性タンパク質を免疫複合体からＮＩＫ由来のペプチドとの競合を用いて回収することを含む、ＮＩＫ結合性タンパク質の精製方法に関する。
【００３４】
さらなる実施形態において、本発明は、ＥＬＩＳＡアッセイの開発のための請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体の使用を提供する。
【００３５】
さらなる実施形態において、本発明は、ＮＩＫまたはそのムテイン、機能性誘導体、活性断片、円順列変異誘導体もしくは塩の免疫精製のための、本発明による抗体の使用を提供する。
【００３６】
また、一実施形態において、本発明は、ＮＩＫの活性によって引き起こされるか、または悪化する疾患の治療のための医薬の製造における、配列番号：５に記載のアミノ酸配列またはその部分であってリン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分に特異的に結合することができる抗体または抗体断片の使用を教示する。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態において、疾患は、自己免疫、アレルギー性、炎症性および移植に関連するものなどの病的免疫応答と関連し、好ましくは、喘息、関節リウマチ、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化およびアルツハイマー病である。本発明の別の好ましい実施形態において、疾患は悪性疾患である。
【００３８】
また、本発明は、細胞内においてＮＩＫ媒介性ＮＦκＢ活性化を誘導することができるリガンドの同定方法における本発明の抗体または抗体断片の使用を教示する。本発明の一実施形態において、該方法は、抗体または抗体断片を細胞内に導入する工程、該細胞を個々のリガンドとともにインキュベートする工程、ＮＦκＢ活性化を、好ましくは、標準的な経路を経るＮＦκＢ活性化を、たとえば、抗体によるＩκＢａ分解をモニターすることによってモニターする工程、および抗体によるＮＩＫの特異的遮断によってＮＦκＢの活性化に影響するリガンドを選択する工程を含む。好ましい実施形態において、リガンドを同定するための方法における細胞は、Ｒａｍｏｓ、ＢＪＡＢおよびジャーカット細胞などのリンパ芽球型のものである。
【００３９】
また、本発明は、配列番号：６を含むアミノ酸配列またはその部分であってリン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分で免疫化した哺乳動物由来の脾臓細胞および同型遺伝子または異型遺伝子のリンパ球様細胞を含有するクローン化ハイブリドーマを、液体培地または哺乳動物の腹部内で増殖させ、ハイブリドーマにモノクローナル抗体を製造および蓄積させることを含む、モノクローナル抗体の製造方法を提供する。
【００４０】
本発明を、添付の図面を参照しながら、例示のみで本明細書において説明する。ここで、図面に対する詳細な具体的な言及により、示される特定の内容は、例示のためとし、本発明の好ましい実施形態の実例の検討を目的とするにすぎず、最も有用であり、本発明の原理および概念的態様の記載を容易に理解されると考えられることを提供する過程において示されたことを強調する。これに関連し、本発明の構造的詳細を、本発明の基本的な理解に必要とされる以上に詳細に示す試みはしておらず、本記載内容は、図面とともに、本発明のいくつかの形態がどのようにして実際に具現化され得るかが当業者に自明となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、残基Ｔ５５９がリン酸化されたＮＦ−κＢ誘導型キナーゼ（ＮＩＫ）／ＭＡＰ３Ｋ１４（配列番号：５）に特異的に結合することができる抗体または抗体断片、その特定の部分およびその使用に関する。
【００４２】
具体的には、本発明の抗体は、ＮＩＫの生化学的活性を調節するため、および残基Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫまたはその特定の部分を特異的に検出するために使用することができる。かかる調節およびかかる検出が可能になるおかげで、該抗体を、それぞれ、ＮＦ−κＢ活性化を調節し、したがって無規制なＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を治療するため、およびＮＩＫまたはその特定の部分を伴う正常／病的な、生物学的／生化学的な、プロセス／状態の様相の特徴付けするためために使用することができる。
【００４３】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の記載に示されるか、または実施例により例示される詳細事項に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、または多様な方法で実施または実行され得る。また、本明細書において用いられる語法および専門用語は、説明を目的とし、限定するものとみなされるべきでないことを理解されたい。
【００４４】
無規制なＮＦ−κＢの活性と関連する非常に多くの致死的および／または高度に衰弱性の疾患のための治療は存在しないか、または満足のいく治療が存在しない。かかる疾患としては、悪性疾患、および自己免疫、アレルギー性、炎症性および移植に関連する疾患などの病的免疫応答と関連する疾患が挙げられる。ＮＩＫは、ＮＦ−κＢの必須のアクチベーターであり、無規制なＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を治療するための潜在的に有力なストラテジーの１つは、リン酸化ＮＩＫまたはその特定の部分に特異的に結合することができる抗体を同定すること、およびかかる抗体を、ＮＦ−κＢ活性を治療的に調節するために使用することを伴う。リン酸化ＮＩＫまたはその特定の部分の特異的検出が可能になるおかげで、かかる抗体によってまた、ＮＩＫまたはその特定の部分を伴う正常／病理学的な、生物学的／生化学的な、プロセス／状態の様相の特徴付けすることが可能であり得る。
【００４５】
本発明を実施した際、意外にも、Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫ（配列番号：５）またはその特定の部分（配列番号：３に記載のものなど）に特異的に結合または最適に特異的に結合することができる抗体が作製された。Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫまたはその特定の部分（配列番号：３に記載の部分など）に特異的に結合できる本発明の抗体の能力は、すべての従来技術の抗体と比べると、特有のものである。
【００４６】
したがって、従来技術の抗体とは著しく対照的に、本発明の抗体は、たとえば、ＮＩＫまたはその特定の部分のキナーゼ活性などの生化学的活性を最適に調節するため、およびＴ５５９がリン酸化されたＮＩＫを最適に検出するため、またはその特定の部分のために使用することができる。本発明の抗体はまた、Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫに結合する調節性因子を免疫共沈降させ、単離するために使用することができる。
【００４７】
本発明のものなどの抗体は、未処理抗体のものと本質的に同一の抗原結合特性を有する１種類以上の型の抗体断片が作製されるように、標準的な方法を用いて、たとえば、本明細書に以下に記載のようにして処理し得ることは、当業者に理解されよう。
【００４８】
したがって、本発明の一態様によれば、Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫまたはその部分（たとえば、配列番号：３に記載のアミノ酸配列など）に特異的に結合することができる抗体または抗体断片が提供される。
【００４９】
用語「ペプチドの部分」は、アミノ酸のうちの１つがリン酸化トレオニンであり、Ｎ末端およびＣ末端の隣接アミノ酸が、それぞれグリシンおよびグルタミン酸、すなわちＧＴ（ｐ）  Ｅである活性化ループ内の少なくともトリペプチドと定義する。
【００５０】
最後から２番目のアミノ酸としてリン酸化Ｔ５９９を有するリン酸化活性化ループ（配列番号：４）の部分を、以下、「標的抗原」という。Ｔ５９９は、完全なＮＩＫタンパク質（配列番号：５）内のＴ５９９位のトレオニン残基であり、また、その誘導化された部分において保存されたトレオニン残基である。たとえば、配列番号：３の１１位のトレオニン、配列番号：４の２６位のトレオニン、配列番号：６の２６位のトレオニン。
【００５１】
本明細書に以下に記載のように、該抗体は、ＮＦ−κＢ誘導型キナーゼ（ＮＩＫ）／ＭＡＰ３Ｋ１４の生化学的活性（たとえば、キナーゼ活性など）を最適に調節するために使用することができ、したがって、ＮＦ−κＢの活性化を最適に調節するために使用することができ、それにより、ＮＦ−κＢ活性の無規制さと関連する疾患を最適に治療するために使用することができる。さらにまた、該抗体は、ＮＩＫのリン酸化活性化ループ領域またはその任意の種々の特定の部分を検出するために特有の様式で使用することができ、ＮＩＫの活性化ループ領域の任意の種々の特定の部分を最適に検出するために使用することができる。このように、抗体は、Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫまたはその特定の部分を伴う正常／病理学的な生物学的／生化学的なプロセス／状態の様相を最適に特徴付けするために利用することができる。
【００５２】
本明細書において使用する場合、用語「治療する」は、疾患に関する場合、疾患の発症の予防、疾患の軽減、疾患の症状の緩和もしくは解消、疾患の進行の遅延もしくは逆転、または疾患の治癒をいう。
【００５３】
本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、実質的に完全なまたはインタクトな抗体分子をいう。
【００５４】
本明細書において使用する場合、語句「抗体断片」は、抗原、抗原決定基またはエピトープに特異的に結合することができる抗体の部分を含有する分子をいう。
【００５５】
実施例の項に、以下に記載するように、
配列番号：３、４および６に記載のアミノ酸配列は、それぞれ、ヒトＮＩＫのアミノ酸残基５４９〜５６０、５３４〜５６６および５３４〜５６０を表し、ヒトＮＩＫの活性化ループ内に位置する。
【００５６】
好ましくは、本発明の抗体は、最大の親和性により標的抗原に結合することができる。
【００５７】
本発明の抗体、たとえば、本発明による標的抗原に対する結合能力を有する抗体は、Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫを、ウエスタンイムノブロッティング解析によって特異的かつ効率的に検出することができる。
【００５８】
本発明の抗体、たとえば、本発明による標的抗原に対する結合能力を有する抗体は、Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫをＥＬＩＳＡによって特異的かつ効率的に検出することができる。
【００５９】
本発明の抗体、たとえば、本発明による標的抗原に対する結合能力を有する抗体は、Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫを特異的かつ効率的に免疫沈降させることができる。
【００６０】
特定の実施形態において、リン酸化ＮＩＫに特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、免疫化用ペプチドとして、アミノ酸配列ＳＬＬＴＧＤＹＩＰＧＴ（ｐ）Ｅの５４９〜５６０（配列番号：３）（ここで、Ｔ（ｐ）はリン酸化トレオニンであり、該配列の最後から２番目のアミノ酸に位置する）を用いて作製した。
【００６１】
また、アミノ酸配列ＤＦＧＨＡＶＣＬＱＰＤＧＬＧＫＳＬＬＴＧＤＹＩＰＧＴ（ｐ）Ｅ（配列番号：６）の活性化ループまたはその部分に由来するさらなるペプチドを、免疫化用ペプチドとして使用することができるが、リン酸化Ｔ５５９は該配列の最後から２番目のアミノ酸に位置するものとする。
【００６２】
また、活性化ループアミノ酸配列ＤＦＧＨＡＶＣＬＱＰＤＧＬＧＫＳＬＬＴＧＤＹＩＰＧＴ（ｐ）Ｅ（配列番号：６）またはその部分を含有するさらなるペプチドを、免疫化用ペプチドとして使用することができるが、リン酸化Ｔ５５該配列の最後から２番目のアミノ酸に位置するするものとする。
【００６３】
あるいはまた、システイン、リジンまたは任意の他のアミノ酸を、免疫化用ペプチドのＮ末端に化学的に融合させることができる。
【００６４】
用語「特異的に結合する」は、本発明によれば、Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫに結合することができるが、対照的に、非リン酸化ＮＩＫに対して低い結合能力を有するか、またはこれにまったく結合しない抗体に関する。本発明の抗体の差別的結合は、種々のアッセイ、たとえば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンイムノブロッティング解析および免疫沈降によって試験することができる。
【００６５】
本発明によるモノクローナル抗体の作製には、さまざまな種の免疫化マウス、好ましくはＳＪＬ系統のものを使用することができる。また、免疫化マウスの種々の造血器官を、融合してハイブリドーマ、たとえば脾臓および／またはリンパ節を作製するために使用することができる。
【００６６】
本発明によって製造される抗体は、リン酸化状態の完全なＮＩＫタンパク質またはその断片を認識することができる。
【００６７】
別の実施形態において、本発明による抗体は、ＩκＢの崩壊を阻害でき、その結果として、ＣＤ４０またはＣＤ７０によって誘導されるが、ＴＮＦリガンドによっては誘導されないＮＦ−κＢの活性化を阻害できることが示された。これらの結果は、本発明の抗体がＮＦ−κＢの特異的な活性化を阻害できることを示す。
【００６８】
したがって、本発明による抗体は、ＣＤ７０およびＣＤ４０のシグナル伝達が疾患の病因に関与する疾患および／またはＴＮＦ／ＮＧＦファミリーリガンドが標準的な経路によってＮＩＫ媒介性ＮＦｋＢ活性化を誘導する疾患における治療のため使用することができる。活性化の標準的な経路を示すパラメータは、たとえば、ＩκＢの分解、ＩκＢαリン酸化およびｐ６５転位である。
【００６９】
実験からの所見を考慮して、本発明の抗体は、細胞内においてＮＩＫ媒介性ＮＦκＢ活性化を誘導することができるリガンドを同定するための方法において使用することができる。本発明の一実施形態において、かかる方法は、本発明による抗体もしくは抗体断片またはコントロールとして無関係なＩｇＧを細胞内に導入する工程、該細胞を個々のリガンドとともにインキュベートする工程、ＮＦκＢ活性化を示すパラメータをモニターする工程（好ましくは、ＩκＢの分解、ＩκＢαリン酸化およびｐ６５転位などの標準的な経路活性化を示すパラメータをモニターする工程）、および抗体または断片によるＮＩＫの遮断によってＮＦκＢの活性化が特異的に影響されるリガンドを選択する工程を含む。
【００７０】
本発明の抗体、たとえば、ＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２で観察されるＮＩＫ活性化の阻害は、ＮＩＫに特異的なＮＩＫの活性化ループ領域を除く該キナーゼ内のドメインに結合することができる他の抗体では起こらない。
【００７１】
一般に、最大のアフィニティーで標的抗原に結合することができる本発明の抗体は、標的抗原により媒介されるか、またはこれと関連する生化学的活性の最適なダウンレギュレーションを可能にする。同様に、最大のアフィニティーで標的抗原に特異的に結合することができる本発明の抗体は、一般的に、最適な感度で標的抗原の検出を可能にする。
【００７２】
本発明の標的抗原に特異的に結合する抗体の前記能力のおかげで、特に、ＮＩＫの機能性領域内に位置する本発明の標的抗原に特異的に結合する該抗体の特有の能力のおかげで、該抗体を、ＮＩＫの生化学的活性をダウンレギュレーションするために使用することができる。特に、ＮＩＫの活性化ループ領域内に位置する本発明の標的抗原に特異的に結合する該抗体の特有の能力のおかげで、該抗体を、ＮＩＫの活性を最適にダウンレギュレーションするために使用することができる。上記のように、かかるキナーゼ活性は核因子（ＮＦ）−κＢの活性化に非常に重要であるため、かかるキナーゼ活性を最適にダウンレギュレーションすることができる本発明の抗体を、ＮＦ−κＢの活性を最適にダウンレギュレーションするために使用することができることは認識されよう。
【００７３】
ＮＦ−κＢタンパク質は、３００アミノ酸のドメインである「Ｒｅｌ相同性ドメイン」を共有するタンパク質のファミリーの１つである。Ｒｅｌ相同性ドメインは、ＮＦ−κＢタンパク質のＤＮＡ結合、二量体化および核輸送を媒介する。Ｒｅｌ相同性ドメインに加え、ＮＦ−κＢファミリーのいくつかの構成員はまた、トランス活性化ドメイン（たとえば、ｃ−Ｒｅｌ、ＲｅｌＢおよびｐ６５）を含む。ＮＦ−κＢ構成員であるｐ５０およびｐ５２は、それぞれ、不活性前駆体ｐ１０５およびｐ１００の溶解による活性化の際に産生される。Ｐ５０およびｐ５２ｃは、ＤＮＡ結合性二量体化特性を有するが、強いトランス活性化ドメインは有さない。ＮＦ−κＢ経路を活性化する多様な効果に寄与するのは、これらのタンパク質の差別的生成、異なるファミリー構成員とともにヘテロ二量体化するその能力、およびこれらのタンパク質と転写組織の異なる成分との相互作用である。ＮＩＫは、すべてのＮＦ−κＢ種に影響するわけではなく、特定のＮＦ−κＢ種にのみ影響し、たとえば、これは、特異的インデューサー、たとえばリンホトキシンに応答してｐ１００の分解およびｐ５２ｃの生成を誘導する。したがって、たとえば本発明の抗体を用いるＮＩＫのモジュレーションは、病理学的暗示のＮＦ−κＢ活性化の特定の様相に影響するようである。これは、ＮＦ−κＢの一般的な非特異的阻害が危険である（たとえば、肝臓において広範なアポトーシスをもたらし得る）ため、利点である。
【００７４】
本明細書において使用する場合、語句「ダウンレギュレーションする」は、生化学的活性に関する場合、かかる生化学的活性を抑制、低減または阻害することをいう。
【００７５】
ＮＩＫの生化学的活性を阻害するために用いられる場合、該抗体は、好ましくは、かかる生化学的活性と関連するＮＩＫの部分内の最大数の標的抗原に特異的に結合することができる。特にＮＩＫのキナーゼ活性を阻害するために用いられる場合、該抗体は、好ましくは、配列番号３および４に記載のＮＩＫ活性化ループ領域アミノ酸配列内に位置する最大数の標的抗原に特異的に結合することができる。ＮＩＫの機能性領域（たとえば、該活性化ループ領域）内に位置する１つだけの標的抗原に特異的に結合することができる本発明の抗体を、かかる機能性領域と関連するＮＩＫの生化学的機能（たとえば、キナーゼ活性など）を効率的に阻害するために使用し得るが、かかる機能性領域内に位置する最大数の標的抗原に特異的に結合することができる抗体は、機能性領域内の最大数の機能性エピトープを干渉するおかげで、キナーゼ活性をより効果的にダウンレギュレーションする。
【００７６】
あるいはまた、ＮＩＫのキナーゼ活性を阻害するために、該抗体は、好都合には、配列番号３および４および６に記載のアミノ酸配列内に位置する最大数の標的抗原に特異的に結合することができるものであり得る。
【００７７】
本発明の標的抗原に特異的に結合する該抗体の前記能力のおかげで、該抗体を、Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫを、従来技術の方法と比べて最適な感度で特異的に検出するために使用することができ、Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫおよびまたは本発明の標的抗原を特異的に検出するために特有の様式で使用することができる。
【００７８】
該抗体は、本発明の標的抗原に最適なアフィニティーで結合することができる試薬の恩恵を被る本質的に任意の適用に使用することができる。かかる適用としては、たとえば、アフィニティー精製、したがって、ＮＩＫの特異的リガンドの同定および特徴付けが挙げられる。
【００７９】
したがって、本発明の抗体は、ＮＩＫまたはその部分の免疫精製に使用することができる。好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、ＮＩＫまたはその部分の精製のための捕捉工程に使用することができる。
【００８０】
以下に続く実施例の項で記載および説明するように、配列番号：３、４、５および６に記載のアミノ酸配列を含むリン酸化ポリペプチドに特異的に結合することができる本発明の抗体は、本明細書に示す手引きにしたがって、それぞれ、配列番号：３、４および５および６に記載のアミノ酸配列のリン酸化ペプチドおよびタンパク質を特異的に検出するために使用することができる。
【００８１】
好ましくは、本発明の標的抗原に特異的に結合することができる本発明の抗体は、かかる標的抗原で免疫化された動物の血清（以下、「抗血清」という）に由来する。以下の実施例の項で記載および説明するように、配列番号：３に記載のアミノ酸配列特異的に結合することができる本発明の抗血清は、本明細書に示すプロトコルにしたがって哺乳動物を標的抗原で免疫化することによって生成され得る。哺乳動物の免疫化によって調製物を生成するためのさらなる手引きは、本明細書において以下に提供する。
【００８２】
標的抗原などのポリペプチドを得るための手引きは、本明細書において以下に提供する。
【００８３】
適用および目的に応じて、該調製物は、好都合には未精製抗血清の形態で用いられるのがよく、または使用前に種々の方法で精製してもよい。たとえば、該調製物は、精製された（ｉ）特異的イソタイプまたは一組のイソタイプの抗体調製物；（ii）配列番号：３、４、５および／または６に記載のアミノ酸配列の特異的リン酸化ペプチドに特異的に結合することができる抗体または抗体断片の調製物（ii）所望のアフィニティーで本発明の標的抗原に結合することができる抗体または抗体断片の調製物の形態で使用され得る。
【００８４】
未精製抗血清の形態の本発明の調製物は、種々の適用における使用のために簡便かつ満足のいくものであり得る。たとえば、以下の実施例の項で記載および説明するように、本発明の未精製抗血清、特に、配列番号：３に記載のアミノ酸配列で免疫化することによって生成される未精製抗血清は、ＥＬＩＳＡ解析によってリン酸化ＮＩＫを効率的に検出するために使用することができる。一般に、ある範囲のアフィニティー／特異性で本発明の標的抗原に結合することができる本発明の調製物の恩恵を被ることが望ましい適用には、本発明の抗血清などの本発明の未精製抗体は好都合である。かかる未精製調製物は、これに含まれる不均質なポリクローナル抗体または抗体断片混合物が、しばしば、標的抗原に対して充分な結合アフィニティー／特異性を有する１種類以上の抗体または抗体断片を含むため、しばしば、所与の適用に充分であり得る。
【００８５】
あるいはまた、本発明の精製された抗体または抗体断片は、好都合には、個体に対する該抗体または抗体断片の投与を伴うもの、および最適な感度を伴う標的抗原の検出が望ましいものなどの適用に用いられ得る。
【００８６】
本明細書において使用する場合、用語「個体」は、ヒトをいう。
【００８７】
たとえば、本発明のＩｇＧ抗体調製物は、好都合には、プロテインＧアフィニティー精製を用いて、好ましくは、プロテインＧ免疫沈降によって、本発明の抗血清から精製され得る。以下に続く実施例の項で記載および説明するように、本明細書に示すプロトコルにしたがって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列のリン酸化ペプチドで免疫化した動物に由来し、かつプロテインＧ免疫沈降によって精製した本発明の抗血清は、最適な感度で、ウエスタンイムノブロッティング解析、免疫沈降およびＥＬＩＳＡによって、配列番号：３、４、５および６に記載のアミノ酸配列を有するリン酸化ポリペプチドを検出するために使用することができる。
【００８８】
標的抗原に特異的に結合することができる本発明の精製抗体または抗体断片は、好都合には、最適な特異性を伴って、標的抗原と関連するＮＩＫの生化学的活性を調節するため、および最適な特異性を伴って標的抗原を検出するために使用することができる。特に、配列番号：３、４、５および６に記載のアミノ酸配列内に含有される本発明の標的抗原に特異的に結合することができる本発明の精製抗体または抗体断片は、好都合には、最適な特異性を伴ってＮＩＫのキナーゼ活性を調節するために使用することができる。一般に、最適な再現性、標準化または精密化の恩恵を被る適用には、標的抗原に特異的に結合することができる本発明の精製された抗体または抗体断片は、本発明の未精製調製物と比べ、一般的に最適である。
【００８９】
標的抗原に特異的に結合することができる抗体または抗体断片の精製は、たとえば、本発明の未精製抗血清などの本発明の調製物を、標的抗原に共有結合した基質を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することによりなされ得る。かかる基質結合標的抗原は、標的抗原に特異的に結合することができる抗体または抗体断片を選択的に捕捉するために、標準的なアフィニティークロマトグラフィー方法論にしたがって使用することができる。
【００９０】
該基質は、好ましくは、アフィニティークロマトグラフィー充填剤である。アフィニティークロマトグラフィー充填剤は、アフィニティークロマトグラフィーを行なうのに最適化された基質であり、好都合には、最適なアフィニティー精製を達成するために用いられ得る。
【００９１】
種々の構造的および化学的特徴を有する基質が、精製を行なうために使用され得る。
【００９２】
好ましくは、基質は、炭水化物またはその誘導体を含む。好ましくは、炭水化物は、アガロース、セファロースまたはセルロースである。
【００９３】
好ましくは、基質は、ビーズ、樹脂またはプラスチック表面である。
【００９４】
アガロース、セファロースまたはセルロースなどの炭水化物を含有するビーズ、樹脂またはプラスチック表面などの基質は、当該技術分野においてアフィニティークロマトグラフィーを行なうために常套的に使用されている。
【００９５】
アフィニティークロマトグラフィー（かかる基質を用いるものなどの）を行なうための充分な手引きは、当該技術分野の文献（たとえば、Wilchek M.および Chaiken I., 2000. Methods Mol Biol. 147: 1-6;Jack GW. Immunoaffinity chromatography. Mol Biotechnol 1,59-86;Narayanan SR., 1994. Journal of Chromatography A 658: 237-258;Nisnevitch M.および Firer MA., 2001. J Biochem Biophys Methods 49: 467-80;Janson JC. & Kristiansen T.の“Packings and Stationary Phases in Chromatography Techniques” (Unger, KK.編) pp.747 (Marcel Dekker, New York, 1990);Clonis, Y. D.の“HPLC of Macromolecules: A Practical Approach”, pp.157 (IRL Press, Oxford, 1989);Nilsson J.ら, 1997. Protein Expr Purif. 11: 1-16を参照）に提供されている。
【００９６】
あるいはまた、本発明の調製物は、多様な標準的なタンパク質精製手法、たとえば、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コナカバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび差別的可溶化を用いて精製することができる。
【００９７】
本発明の標的抗原に所望のアフィニティーで特異的に結合することができる本発明の抗体または抗体断片は、好都合には、標的抗原と関連するＮＩＫの生化学的活性の所望のレベルの調節を達成するために使用することができ、好都合には、標的抗原を所望の感度で検出するために使用することができる。特に、最大のアフィニティーでＮＩＫのキナーゼ領域に含まれる本発明の標的抗原に特異的に結合することができる本発明の抗体または抗体断片は、好都合には、ＮＩＫのキナーゼ活性を最適にダウンレギュレーションするために使用することができる。同様に、最大のアフィニティーで標的抗原に特異的に結合することができる本発明の抗体または抗体断片は、好都合には、標的抗原を最適な感度で検出するために使用することができる。
【００９８】
本発明の未精製抗血清などの本発明の調製物からの、標的抗原に所望のアフィニティーで結合することができる抗体または抗体断片の精製は、たとえば、標的抗原をアフィニティーリガンドとして使用することにより、未精製の、またはより好ましくはプロテインＧ精製された本発明の抗血清のアフィニティークロマトグラフィー精製によって、および制御されたストリンジェントな条件下（たとえば、制御されたｐＨおよび／または塩濃度の条件下）での基質結合抗体または抗体断片の選択的溶出によって達成され得る。特に、最大のアフィニティーで標的抗原に結合することができる本発明の抗体または抗体断片は、効果的に最大のストリンジェントな条件下（たとえば、効果的に最大または最小のｐＨおよび／または最大の塩濃度の条件下）での溶出によって簡便に得られ得る。典型的には、抗体または抗体断片は、基質に結合したそのコグネイト抗原に生理学的ｐＨおよび塩濃度の条件下で結合し得、かかる抗体または抗体断片は、典型的には、ｐＨを２．５以下に低下させるか、またはｐＨを１１以上に上げることによって基質から溶出され得る。
【００９９】
コグネイト抗原に対して１０-12までの解離定数を特徴とするアフィニティーを有する抗体または抗体断片は、一般的な当該技術分野の手法を用いて得られ得ることは、当業者に認識されよう。
【０１００】
本明細書において上記のように、該調製物は、好都合には、任意の種々の型の検出可能な分子に結合した抗体または抗体断片を含有し得る。
【０１０１】
検出可能な分子に結合した抗体または抗体断片を含有する本発明の調製物は、該抗体または抗体断片により特異的に結合される標的抗原を検出するために使用することができる。
【０１０２】
該調製物は、適用および目的に応じて、任意の非常に多くの型の検出可能な分子に結合した抗体または抗体断片を含有し得る。
【０１０３】
たとえば、適用および目的に応じて、検出可能な分子は、好都合には、フルオロフォア、酵素、発光分子または放射性同位体であり得る。
【０１０４】
好ましくは、検出可能な分子は酵素である。
【０１０５】
酵素は、好都合には、任意の種々の酵素に基づく検出方法により標的抗原の検出を可能にするために利用され得る。かかる方法の例としては、限定されないが、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ；たとえば、溶液中の標的抗原を検出するため）、固相酵素化学発光分析（たとえば、電気泳動によって分離されたタンパク質混合物中の複合体を検出するため）、および固相酵素組織化学的アッセイ（たとえば、固定組織中の複合体を検出するため）が挙げられる。
【０１０６】
以下の実施例の項で記載および説明するように、酵素に結合した抗体を含有する本発明の調製物は、ＮＩＫをウエスタンイムノブロッティング解析またはＥＬＩＳＡによって効率的に検出するために使用することができる。
【０１０７】
非常に多くの種類の酵素が、適用および目的に応じて、標的抗原を検出するために用いられ得る。
【０１０８】
好適な酵素の例としては、限定されないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）が挙げられる。
【０１０９】
酵素に基づく分子検出方法を行なうための充分な手引きは、当該技術分野の文献(たとえば、Khatkhatay MI.およびDesai M., 1999. J Immunoassay 20:151-83;Wisdom GB., 1994. Methods Mol Biol. 32: 433-40;Ishikawa E.ら, 1983. J Immunoassay 4:209-327;Oellerich M.,1980.J Clin Chem Clin Biochem. 18:197-208;Schuurs AH.および van Weemen BK., 1980. J Immunoassay 1: 229-49を参照のこと)に提供されている。
【０１１０】
フルオロフォアに結合した抗体または抗体断片を含有する本発明の調製物は、好都合には、任意の非常に多くの蛍光性分子検出方法によって標的抗原を検出するために用いられ得る。適用および目的に応じて、かかる方法の例としては、限定されないが、蛍光活性化フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ；たとえば、懸濁細胞集団中での標的抗原の発現またはディスプレイを特徴付けするため）、蛍光共焦点顕微鏡検査（たとえば、三次元の死細胞もしくは死組織または生細胞もしくは生組織内での分子を検出するため）、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ；たとえば、標的抗原を伴う特異的分子間会合を検出するため）、蛍光組織化学的検査（たとえば、固定された組織学的試料内で分子を検出するため）などが挙げられる。
【０１１１】
種々の型のフルオロフォアが、適用および目的に応じて、標的抗原を検出するために用いられ得る。
【０１１２】
好適なフルオロフォアの例としては、限定されないが、フィコエリトリン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ−クロム、ローダミン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、テキサスレッドなどが挙げられる。
【０１１３】
フルオロフォア選択、種々の型の分子（たとえば、本発明の抗体または抗体断片など）へのフルオロフォアの連結方法、および分子を検出するためのかかる蛍光免疫複合体の使用方法に関する充分な手引きは、当該技術分野の文献において得られ得る[たとえば、Richard P. Haugland,“Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 1992~1994”, 第5版, Molecular Probes, Inc. (1994);Oncoimmunin Inc.の米国特許第6,037,137号明細書;Hermanson,“Bioconjugate Techniques”, Academic Press New York, N. Y. (1995);Kay M.ら, 1995. Biochemistry 34:293;Stubbsら, 1996. Biochemistry 35:937; “Receptors:A Practical Approach”第2版, Stanford C.および Horton R.(編), Oxford University Press, UK. (2001)のGakamsky D.ら,“Evaluating Receptor Stoichiometry by Fluorescence Resonance Energy Transfer”;Targesome, Inc.の米国特許第6,350,466号明細書を参照のこと]。
【０１１４】
好適な発光分子の例としては、ルミノールが挙げられる。
【０１１５】
好適な放射性同位体の例としては、［１２５］ヨウ素、［３５］イオウ、［３］水素、［３２］リンなどが挙げられる。
【０１１６】
検出可能な分子は、抗体または抗体断片に、適用および目的に応じて、および関与する分子の性状に応じて種々の方法で結合され得る。検出可能な分子を抗体または抗体断片に結合させるための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている［たとえば、“Using Antibodies: A Laboratory Manual”, Ed Harlow, David Lane (編), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)を参照のこと；また、The American Chemical Societyにより、たとえば、http://www. chemistry. org/portal/Chemistry で提供される広範な手引きを参照のこと］。化学者などの当業者は、かかる化学的合成手法を好適に実施するために必要とされる専門知識を有する。
【０１１７】
したがって、検出可能な分子に結合した抗体または抗体断片を含有する本発明の調製物は、本質的に任意の状況において、効率的にかつ特有の様式で標的抗原を検出するために使用することができる。
【０１１８】
適用および目的に応じて、該調製物は、好都合には、任意の種々の型の抗体断片の調製物であり得る。
【０１１９】
抗体断片は、好ましくは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、またはより好ましくは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2またはＣＤＲである。
【０１２０】
抗体断片は、これが、親抗体と実質的に同一の標的抗原結合特異性または結合特異性と結合親和性の両方を維持したまま由来する親抗体よりも小さいという利点を有する。したがって、抗体断片は、親抗体よりも小さいおかげで、それにより、一般的に、後者よりも卓越した生体分散性および拡散性（たとえば、全身性でインビボ、または単離された組織内）を有する。Ｆｃ領域（たとえば、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2またはＣＤＲなど）を実質的に欠く抗体断片は、かかるＦｃ領域に特異的に結合することができる分子に該調製物を曝露することを伴い、かつかかる結合が望ましくない適用に好都合である。典型的には、これは、コグネイトＦｃ受容体またはＦｃ結合性相補成分（たとえば、血清中に存在する相補成分Ｃｌｑ）に曝露されたＦｃ領域への所望されない結合を伴い得る。Ｆｃ受容体は、非常に多くの免疫細胞型（樹状細胞などのプロフェッショナルＡＰＣ；Ｂリンパ球；ならびに好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージおよびマスト細胞などの顆粒球が挙げられる）の表面上にディスプレイされる。したがって、抗体断片でのＦｃ領域の非存在は、特に、該調製物をインビボで個体に投与する場合、所望されないのＦｃ受容体媒介性免疫細胞活性化または相補成分媒介性相補カスケードを回避するために特に好都合であり得る。
【０１２１】
Ｆ（ａｂ’）2は、抗体分子の二価抗原結合性部分を含有する抗体分子の断片である。
【０１２２】
本発明のＦ（ａｂ’）2調製物は、標準的な当該技術分野の方法を用い、本発明の抗血清などの本発明の調製物を酵素ペプシンで処理することにより、簡便に得られ得る。得られるＦ（ａｂ’）2生成物は５Ｓ粒子である。
【０１２３】
ＦａｂまたはＦａｂ’は、抗体の一価の抗原結合性部分を含有する抗体分子の断片である。
【０１２４】
ＣＤＲは、たとえば、ＥＰ０５８５９３９に記載のようにして、または Strandbergら (Protein Eng. 2001 Jan;14 (1):67-74) に記載のようにして作製され得る。本発明によるＣＤＲは、ＮＩＫのモジュレーションに対して増大した効果を有する修飾ＣＤＲであり得る。活性ペプチドの修飾方法の一例は、Sawaら1999 (J. Med. Chem. 42,3289-3299) に記載されたものである。
【０１２５】
本発明のＦａｂ’調製物は、標準的な当該技術分野の方法を用い、本発明の抗血清などの本発明の調製物を酵素ペプシンで処理した後、得られたＦ（ａｂ’）2を縮小することにより、簡便に得られ得る。かかる縮小は、チオール還元剤を使用し、任意に、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基の保護基を使用することにより行ない得る。かかる処理により、２つの一価の３．５Ｓ  Ｆａｂ’のＦｃ断片が生成する。
【０１２６】
Ｆａｂ調製物は、標準的な当該技術分野の方法を用い、本発明の抗血清などの本発明の調製物を酵素パパインで処理してインタクトな軽鎖および可変とＣH１ドメインから構成される重鎖の部分を得ることにより、簡便に得られ得る。
【０１２７】
抗体の酵素的処理により抗体断片を作製するための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている（たとえば、Goldenbergの米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号；Porter RR., 1959. Biochem J. 73: 119-126を参照のこと）。
【０１２８】
単鎖Ｆｖ（当該技術分野において「ｓｃＦｖ」とも呼ばれる）は、適当なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域と重鎖可変領域を含む単鎖分子である。
【０１２９】
本発明のＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂもしくは単鎖ＦｖまたはＣＤＲの調製物は、組換え技術を用いて得られ得る。
【０１３０】
好ましくは、組換え抗体断片を得ることは、標的抗原で免疫化した動物のＢリンパ球のｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮＡを用いて抗体断片ファージディスプレーライブラリーを構築することにより行なわれる。Ｂリンパ球は、脾臓から、あるいはまた、免疫化した動物の血液、骨髄もしくはリンパ節から簡便に単離することができる。
【０１３１】
所望の標的抗原結合特性を有する抗体断片をディスプレイする組換えファージは、かかる結合特性を有するファージを大過剰の非結合クローンから逐次富化することによるライブラリーから選択され得る。この選択は、任意の種々の技術（固定された標的抗原上でのパニング；特異的溶出を用いるパニング；ビオチン化抗原の使用；カラム上でのアフィニティー精製；または細胞上での直接パニングが挙げられる）を用いてなされ得る。選択後、非特異的抗体断片をディスプレイするファージを洗浄により除去し得、所望の標的抗原結合特性を示ｓｃＦｖを有する結合したファージを溶出し、大腸菌の感染により増幅させる。所望の標的抗原結合特性を有する抗体断片ディスプレイする組換えファージがいったん単離したら、該抗体断片の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列をファージディスプレイパッケージから回収することができ、標準的な方法論［たとえば、“Current Protocols in Molecular Cloning”, Ausubelら（編）， Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, N. Y. (1989);Sambrookら、下記および関連する参考文献を参照のこと］を用い、組換え原核生物または真核生物発現ベクター内にクローン化することができる。かる原核生物発現ベクターは、精製組換え抗体断片を大腸菌内で作製するために使用することができる（たとえば、Studierら, 1990. Methods in Enzymol. 185: 60-89を参照のこと）。かかる真核生物発現ベクターは、組換え抗体断片の発現のために真核生物細胞を遺伝子工学的に形質転換するために使用することができる。
【０１３２】
Ｂリンパ球ｍＲＮＡから抗体断片ファージディスプレイライブラリーを得るため、および利用するための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている［たとえば、Hoogenboomら, 1998. Immunotechnology 4: 1-20;Kandら， 1991. Proc Natl Acad Sci U S A. 88: 4363;Barbasら 1991. Proc Natl Acad Sci U S A. 88: 7978;Garrardら, 1991. Biotechnology 9: 1373-1377;Hoogenboomら, 1991. Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137;Sharonら, 2000. Combinational Chemistry and High Throughput Screening 3: 185-196；米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，６５８，７２７号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９０／０２８０９、ＷＯ  ９１／１０７３７、ＷＯ  ９２／０１０４７、ＷＯ  ９２／１８６１９、ＷＯ  ９３／１１２３６、ＷＯ  ９５／１５９８２およびＷＯ  ９５／２０４０１；Brinkmanら， 1995. J. Immunol. Methods 182: 41-50;Amesら, 1995. J. Immunol. Methods 184: 177-186;Kettleboroughら, 1994. Eur. J. Immunol. 24: 952-958;Persicら, 1997. Gene 187 9-18;ならびに Burtonら, 1994. Advances in Immunology 57: 191-280;Pluckthun :“The Pharmacology of Monoclonal Antibodies”, 第113巻, Rosenburg および Moors (編), Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994);Hoogenboomら, 1998. Immunotechnology 4: 1-20を参照のこと］。
【０１３３】
前記方法論は、本質的に任意の所望の標的抗原結合親和性および／または特異性を有する本発明のモノクローナル抗体断片調製物を得るために使用することができることは認識されよう。かかる調製物は、かかる規定の標的抗原結合特性を有する標的抗原に結合することができる試薬の恩恵を被る種々の適用において利用され得る。
【０１３４】
本発明は、配列番号：６を含むアミノ酸配列またはその部分（たとえば、配列番号：３に記載のもの）であって、リン酸化トレオニンを配列番号：５のアミノ酸５５９位に含有する該アミノ酸配列またはその部分で免疫化した哺乳動物由来の脾臓細胞および同型遺伝子または異型遺伝子のリンパ球様細胞を含有するクローン化ハイブリドーマを、液体培地または哺乳動物の腹部内で成長させ、ハイブリドーマを作製してモノクローナル抗体を蓄積させることを含む、モノクローナル抗体の調製方法を提供する。
【０１３５】
モノクローナル抗体の調製物に使用されるハイブリドーマの一例は、ＣＮＣＭに番号Ｉ−３０９５で寄託されたハイブリドーマクローンＮｉｋ−Ｐ４  ３０．１２である。
【０１３６】
Ｆａｂ’は構造的においてＦａｂと本質的に類似するため、Ｆａｂ’を含有する本発明の調製物は、Ｆａｂを含有するものと、本質的に互換的に用いられ得、この場合、かかるＦａｂ’およびＦａｂは、本質的に同じ重鎖および軽鎖の可変領域を含有する。標的抗原に最大の親和性を伴って結合することができる抗体断片を含有する本発明の調製物の恩恵を被る適用では、よくあることだが、本発明のＦ（ａｂ’）2調製物は、かかる一価の抗体断片の一価の結合に対してＦ（ａｂ’）2は標的抗原に対して二価の結合であるため、本発明のＦａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖ調製物よりも卓越したものであり得る。
【０１３７】
前記のように、適用および目的に応じて、抗体または抗体断片の調製物は、任意の種々の哺乳動物種を起源とし得る。
【０１３８】
所望の種を起源とする本発明の抗体または抗体断片調製物は、標的抗原で免疫化されたかかる種の動物の血清に由来し得る。
【０１３９】
好ましくは、抗体または抗体断片はマウス起源のものである。
【０１４０】
かかる抗体は、一価、二価または多価であり得、架橋活性を有していても有しなくてもよい。本発明にしたがって使用される抗体は、ポリクローナル（ウサギにおいて産生される抗体など）またはモノクローナル抗体であり得る。
【０１４１】
好ましくは、本発明は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトもしくは抗−抗イディオタイプ抗体またはその断片からなる群より選択される抗体調製物の使用に関する。好ましくは、抗体または抗体断片はマウス  起源のものである。
【０１４２】
用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、可溶性または結合形態で標識され得るモノクローナル抗体、キメラ、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体に対する抗体（抗−抗Ｉｄ抗体）および任意の公知の手法（たとえば、限定されないが、酵素的切断、ペプチド合成または組換え技術）により得られるその断片を含むことを意図する。
【０１４３】
モノクローナル抗体は、抗原に対して特異的な抗体の実質的に均一な集団を含み、該集団は、実質的に類似したエピトープ結合性部位を含む。ｍＡｂは、当業者に既知の方法により得られ得る。たとえば、Kohler および Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975)；米国特許第を参照のこと。
【０１４４】
モノクローナル抗体は、これが、分子と特異的に反応することができ、それにより、該分子が抗体に結合する場合、分子「結合することができる」といえる。
【０１４５】
用語「エピトープ」は、任意の分子の抗体によって結合され得、また該抗体によって認識され得る部分を指すことを意図する。エピトープまたは「抗原決定基」は、通常、化学的に活性な表面分子集団（たとえば、アミノ酸または糖側鎖など）、からなり、特異的な三次元の構造的特徴および特異的な帯電特性を有する。
【０１４６】
「抗原」は、抗体によって結合され得る分子または分子の部分であり、加えて、該抗原は、動物に、該抗原のエピトープに結合することができる抗体の産生を誘導することができる。抗原は、１つまたは１つより多いエピトープ有し得る。上記の特異的反応は、抗原が、その対応する抗体上のエピトープと高度に選択的な様式で反応するが、他の抗原によって誘発され得る多数の他の抗体とは反応しないことを示すものとする。
【０１４７】
４，３７６，１１０号；Ausubelら編， Harlow および Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988);および Colliganら編， Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N. Y., (1992-1996）。かかる抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭが挙げられる）のものであり得る。
【０１４８】
抗−イディオタイプ（抗−ｉｄ）抗体は、一般的に抗体の抗原結合性部位と関連する特有の決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、それに対する抗Ｉｄが調製されるｍＡｂの供給源と同じ種および遺伝子型（たとえば、マウス系統）の動物を免疫化することによって調製され得る。
【０１４９】
免疫化された動物は、免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することにより、これに応答する。たとえば、米国特許第４，６９９，８８０号を参照のこと。
【０１５０】
また、抗Ｉｄ抗体は、さらに別の動物において免疫応答を誘導し、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生させるための「免疫原」として使用され得る。抗−抗Ｉｄは、抗−ｉｄを誘導した元のｍＡｂとエピトープが同一であり得る。したがって、ＭＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することにより、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。
【０１５１】
したがって、ＮＩＫ断片に対して生成されるｍＡｂは、抗Ｉｄ抗体をＢＡＬＢ／ｃマウスなどの適当な動物内で誘導するために使用され得る。かかる免疫化マウス由来の脾臓細胞を用い、抗ＩｄｍＡＢを分泌する抗Ｉｄハイブリドーマを作製する。さらに、抗−ｉｄｍＡｂは、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体に結合させ、さらなるＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用され得る。これらのマウス由来の血清は、ＮＩＫのエピトープまたは断片に特異的な元のｍＡｂの結合特性を有する抗−抗Ｉｄ抗体を含む。
【０１５２】
抗ＩｄｍＡｂは、このように、その独自のイディオタイプエピトープ、または評価対象のエピトープと構造的に類似した「イディオトープ」を有する。
【０１５３】
ヒト抗体もしくはヒト化抗体または抗体断片の本発明の調製物は、該調製物の個体への投与を伴う適用に好ましいものであり得る。たとえば、ヒト抗体もしくはヒト化抗体または抗体断片は、一般的に、免疫学的に最適に耐容性である傾向にあり、したがって、ヒトにおいてインビボで最適な半減期が示され、それにより、最適な有効性が示される。ヒト抗体またはヒト化抗体の作製および利用に関するさらなる手引きは、以下に提供する。
【０１５４】
本発明において有用な抗体（抗体の断片を含む）は、試料中のＮＩＫまたはそのムテイン、機能性誘導体、活性断片、円順列変異誘導体、塩もしくは部分を定量的または定性的に検出するため、またはＮＩＫまたはそのムテイン、機能性誘導体、活性断片、円順列変異誘導体、塩もしくは部分を発現する細胞の存在を検出するために使用され得る。
【０１５５】
これは、蛍光顕微鏡使用により結合させた蛍光標識抗体を用いる免疫蛍光手法、フローサイトメトリーによる検出または蛍光分析による検出によってなされ得る。
【０１５６】
本発明の抗体（またはその断片）は、本発明のＮＩＫまたはその部分のインサイチュ（in situ）検出のために、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡検査の場合のように、組織学的に用いられ得る。インサイチュ検出は、患者から組織学的試験片を取り出し、かかる試験片に対して本発明の標識抗体を提供するによりなされ得る。抗体（または断片）は、好ましくは、標識抗体（または断片）を生物学的試料に適用することにより、またはこの上に重層することにより提供される。かかる手順に使用により、ＮＩＫまたはその部分の存在だけでなく、試験した組織上での分布もまた調べることが可能である。本発明を用い、当業者には、かかるインサイチュ検出を達成するために、任意の多種多様な組織学的方法（染色手順など）を変形し得ることが容易にわかるだろう。
【０１５７】
生物学的試料は、固相支持体もしくは担体（たとえば、ニトロセルロースなど）または
細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化することができる他の固体支持体もしくは担体に結合させ得る。該支持体または担体を、次いで、適当なバッファーで洗浄した後、上記のようにして、本発明による標識抗体で処理し得る。固相支持体または担体を、次いで、該バッファーでの２回目の洗浄を行ない、未結合抗体を除去する。次いで、前記固体支持体または担体上の結合標識の量を、慣用的な手段により検出し得る。
【０１５８】
「固相支持体」、「固相担体」、「固体支持体」、「固体担体」、「支持体」または「担体」は、抗原または抗体結合することができる任意の支持体または担体を意図する。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロンアミラーゼ、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩ならびにマグネタイトが挙げられる。担体の性状は、本発明の目的のために、ある程度可溶性のあるもの、または不溶性であり得る。支持体材料は、結合された分子が抗原または抗体結合することができるものであれば、事実上任意の可能な構造的構成有し得る。したがって、支持体または担体の構成は、ビーズのような球状、テストチューブの内側表面または棒状物の外側表面のような円柱であり得る。あるいはまた、表面は、シート、試験細片などの平坦なものであってもよい。好ましい支持体または担体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。
【０１５９】
当業者には、抗体または抗原に結合させるための他の好適な担体がわかるだろうし、または常套的な実験法の使用により、これを確認することができるだろう。
【０１６０】
本発明の所与の多くの抗体の結合活性は、上記のように、周知の方法にしたがって測定され得る。当業者は、常套的な実験法を用いることによる各測定のための作業条件および最適なアッセイ条件を決定することができよう。
【０１６１】
通例、または特定の状況に必要であるように、洗浄、攪拌、振とう、濾過など他の工程をアッセイに追加してもよい。
【０１６２】
本発明による抗体が標識され得る方法の１つは、これを酵素に連結することによるものであり、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）において使用され得る。この酵素は、今度は、後に適切な基質に曝露した場合、たとえば分光測光的手段、蛍光分析的手段により、または可視化手段により検出可能な化学的部分を生じるような様式で基質と反応する。抗体検出可能に標識するために使用することができる酵素としては、限定されないが、マレエートデヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ（glucoamylase）およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。検出は、酵素用の発色性基質を用いる比色分析方法によってなされ得る。検出はまた、同様に調製された標準品との比較した基質の酵素的反応の程度の視覚による比較によってもなされ得る。
【０１６３】
検出は、任意の多様な他のイムノアッセイを用いてなされ得る。たとえば、抗体または抗体断片を放射能で標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用によってＲ−ＰＴＰアーゼを検出することが可能である。ＲＩＡの充分な記載は、Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology,(Work, T. S.らによる), North Holland Publishing Company, NY (1978)（具体的な記載は、Chard, T.による表題“An Introduction to Radioimmne Assay and Related Techniques”の章になされている）に見出され得、引用により本明細書に組み込まれる。放射性同位体は、ｇカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
【０１６４】
本発明による抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光により標識された抗体を適切な波長の光に曝露すると、その存在が、蛍光によって検出され得る。
【０１６５】
中でも、最も一般的に使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、ピコシアニン、アロピコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンである。
【０１６６】
該抗体はまた、１５２Ｅなどの蛍光発光性金属、またはランタノイド系の他のものを用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＥＴＰＡ）などの金属キレート化基を用いて抗体に結合させることができる。
【０１６７】
該抗体はまた、化学発光化合物に結合させることによって検出可能に標識することもできる。次いで、化学発光タグ化抗体の存在を、化学的反応の過程で生じる発光の存在を検出することによって調べる。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【０１６８】
同様に、生物発光化合物も、本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増大させる生物学的な系において見られる化学発光の１種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって調べる。標識の目的に重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０１６９】
本発明の抗体調製物は、イムノメトリックアッセイ（「２部位」または「サンドイッチ」アッセイとしても知られる）における利用に適合したものであり得る。典型的なイムノメトリックアッセイにおいて、ある量の非標識抗体（または抗体の断片）を固体支持体または担体に結合させ、ある量の検出可能に標識された可溶性抗体を添加し、固相抗体、抗原および標識抗体間で形成される三元複合体の検出および／または定量を可能にする。
【０１７０】
典型的かつ好ましいイムノメトリックアッセイとしては、「フォワード」アッセイ（これは、固相に結合した抗体をまず試験対象試料と接触させ、抗原を試料から二元固相抗体−抗原複合体の形成によって抽出する）が挙げられる。適当なインキュベーション期間の後、固体支持体または担体を洗浄し、未反応抗原（あれば）を含む試料液の残余を除去し、次いで、未知量の標識抗体（これは「レポーター分子」としての機能を果たす）を含む溶液と接触される。標識抗体が、非標識抗体により固体支持体または担体に結合した抗原と複合体形成するのを可能にするための第２のインキュベーション期間後、固体支持体または担体に２回目の洗浄を行ない、未反応標識抗体を除去する。
【０１７１】
別の型の「サンドイッチ」アッセイ（これもまた本発明の抗原について有用であり得る）において、いわゆる「同時」および「逆」アッセイが使用される。同時アッセイは、固体支持体または担体に結合した抗体および標識抗体の両方が試験対象試料に同時に添加されるため、単一のインキュベーション工程を伴う。インキュベーションが完了した後、固体支持体または担体を洗浄し、試料液の残余および非複合体化標識抗体を除去する。
【０１７２】
次いで、固体支持体または担体に結合した標識抗体の存在を、慣用的な「フォワード」サンドイッチアッセイのようにして、調べる。
【０１７３】
「逆」アッセイでは、まず標識抗体の溶液のへの試料液へ、続いて、適当なインキュベーション期間後での固体支持体または担体に結合した非標識抗体の添加の段階的添加を用いる。第２のインキュベーション後、固相を慣用的な様式で洗浄し、試験対象試料の残余および未反応標識抗体溶液を除く。次いで、固体支持体または担体に結合した標識抗体の測定を、「同時」および「フォワード」アッセイのようにして調べる。
【０１７４】
該調製物は、それ自体を使用してもよく、または医薬組成物中の活性成分として配合することができる。
【０１７５】
したがって、本発明により、薬学的に許容し得る担体および、活性成分として本発明の抗体または抗体断片を含有する医薬組成物が提供される。
【０１７６】
本発明の抗体または抗体断片を活性成分として医薬組成物中に配合する方法およびかかる医薬組成物の利用方法は、本明細書に以下に記載のとおりである。
【０１７７】
本明細書において上記のように、ＮＩＫの機能性領域などの領域に特異的に結合する能力のおかげで、本発明の抗体または抗体断片は、かかる機能性領域と関連するＮＩＫ分子の生化学的活性調節するために使用することができる。
【０１７８】
したがって、本発明のさらに別の態様によれば、ＮＩＫ分子の生化学的活性の調節方法が提供される。該方法は、ＮＩＫ分子を本発明の抗体または抗体断片と接触させることにより行なわれる。
【０１７９】
好ましくは、該方法は、ヒトＮＩＫ分子において該生化学的活性を調節するために使用される。
【０１８０】
本明細書において上記のように、本発明の抗体または抗体断片は、ＮＩＫキナーゼ活性をダウンレギュレーションするようにリン酸化ＮＩＫに特異的に結合することができるため、およびかかる活性がＮＦ−κＢの活性化に必要とされるため（前記「発明の分野および背景」の項に広範に詳細に示した）、該方法を、ＮＦ−κＢ活性を最適にダウンレギュレーションするために使用することができる。
【０１８１】
したがって、ＮＦ−κＢ活性の最適なダウンレギュレーションが可能なおかげで、該方法を、個体において、無規制なＮＦ−κＢ活性、特に過剰または構造的ＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を最適に治療するために使用することができる。
【０１８２】
個体において該疾患を治療するために本発明のこの態様にしたがって該方法を使用する場合、ＮＩＫ分子を抗体または抗体断片と接触させることは、好都合には、抗体または抗体断片を個体に投与することによって行なわれ得る。
【０１８３】
好ましくは、抗体または抗体断片の投与は、本発明の抗体または抗体断片活性成分として含有する本発明の医薬組成物の投与により行なわれる。
【０１８４】
抗体または抗体断片は、好ましくは、生化学的活性の所望の調節が達成されるように、充分なレベルの抗体断片の標的抗原への結合が達成されるように投与される。
【０１８５】
医師（より好ましくは、該疾患の専門医）などの当業者は、本発明の教示にしたがって効果的に該疾患を治療するために、好適な治療プロトコル（好適な投与経路および抗体または抗体断片の好適な用量が挙げられる）を決定するために必要とされる専門知識を有する。
【０１８６】
ＮＩＫは、通常、細胞内分子であり、したがって、抗体または抗体断片をＮＩＫ分子と細胞（たとえば、無規制なＮＦ−κＢ活性を特徴とする細胞）内において最適に接触させるため、該方法は、好ましくは、細胞内での抗体または抗体断片のＮＩＫ分子との接触を容易にするような方法で実施する。
【０１８７】
かかる細胞内接触は、適用および目的に応じて、種々の方法で容易にし得る。
【０１８８】
たとえば、かかる細胞内接触は、細胞を、抗体または抗体断片に、抗体または抗体断片の細胞の内部への浸透を容易にすることができる脂質系担体の補助を伴って接触させることによって行なわれ得る。
【０１８９】
あるいはまた、かかる細胞内接触は、細胞を、本発明の抗体断片細胞内で発現することができる発現ベクターで遺伝子工学的に形質転換することによって行なわれ得る。
【０１９０】
抗体または抗体断片の細胞内への進入を容易にするための脂質担体の好適な類型としては、リポソームおよびイムノリポソームが挙げられる。イムノリポソームは、分子の細胞型特異的送達を可能にするおかげで、好都合には、抗体または抗体断片を、疾患に罹患した細胞内に選択的に送達するために用いられ得、ここで、かかる細胞は、特徴的な表面抗原、たとえば、病的免疫応答を示す細胞内の炎症のマーカー（たとえば、活性化されたＴリンパ球におけるＣＤ２５またはＣＤ６９）、または悪性細胞における腫瘍関連抗原（たとえば、腺癌細胞におけるＨＥＲ−２、黒色腫細胞におけるＭＡＧＥ−１など）を発現する。
【０１９１】
かかる脂質系担体を、治療用分子（たとえば、本発明の抗体または抗体断片など）の疾患細胞への細胞内送達に使用するための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている（たとえば、Abra RM.ら, 2002. J Liposome Res. 12: 1-3;Park JW., 2002. Breast Cancer Res.;4 (3): 95-9;Bendas G., 2001. BioDrugs 15: 215-24;Maruyama K., 2000. Biol Pharm Bull. 23: 791-9;Hong K.ら, 1999. Ann N Y Acad Sci. 886: 293-6;Margalit R., 1995. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 12: 233-61;Storm G. および Crommelin DJ., 1997. Hybridoma 16: 119-25;Park JW.ら, 1997. Adv Pharmacol. 40: 399-435を参照のこと）。
【０１９２】
組換え抗体断片（たとえば、本発明の組換え抗体断片）を細胞内で産生させることは、当該技術分野において常套的に行なわれている。細胞内で発現された組換え抗体断片は、当該技術分野において「イントラボディ」とよばれることがある。生体分子に特異的に結合することができる組換え抗体断片の細胞内発現を、細胞内の生体分子の生化学的活性（たとえば、酵素活性など）を調節するために使用するための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている（たとえば、Mhashilkar AM.ら, 2002. Gene Ther. 9: 307-19;Arafat W.ら, 2000. Cancer Gene Ther. 7: 1250-6;Cohen PA.ら, 1998. Oncogene 17: 2445-56;Hassanzadeh Gh G.ら, 1998. FEBS Lett. 437: 81-6;Richardson JH.ら, 1998. Gene Ther. 5: 635-44を参照のこと；組換え抗体断片を細胞内において発現させるための一般的な手引きについては、たとえば、der Maur AA.ら, 2002. J Biol Chem. 277: 45075-85;Zhu Q.ら, 1999. J Immunol Methods. 231: 207-22;Wirtz P. および Steipe B., 1999. Protein Sci. 8: 2245-50;Ohage E. および Steipe B., 1999. J Mol Biol. 291: 1119-28を参照のこと）。
【０１９３】
哺乳動物細胞を発現ベクターで遺伝子工学的に形質転換することは、任意の種々の一般的に行なわれている当該技術分野の方法（たとえば、安定または一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび組換えウイルス系ベクターによる感染など）を用いて行なわれる。かかる方法を行なうための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている［たとえば、Sambrookら、下記および関連する参考文献；“Somatic Gene Therapy”のChangら, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995);“Gene Targeting”のVegaら, CRC Press, Ann Arbor MI. (1995);Vectors, A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA (1988);Gilboaら, 1986. Biotechniques 4: 504-512を参照のこと；中枢神経系に関連するベクターについては、たとえば、米国特許第４，８６６，０４２号を参照のこと；相同組換えを誘導するための陽性／陰性選択方法については、たとえば、米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照のこと］。
【０１９４】
本発明の抗体断片を細胞内で発現させるための発現ベクターの作製および利用に関するさらなる手引きは、以下に提供する。
【０１９５】
本明細書において上記のように、本発明のこの態様による方法は、無規制なＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を最適に治療するために使用することができる。ＮＦ−κＢ活性は、一般的に、非常に広範な免疫応答（リンパ球抗原受容体、リンパ球共刺激受容体、ＴＮＦ受容体、インターロイキン受容体、ＬＭＰ１、ＲＡＮＫ、ヒトＴｏｌｌ受容体およびリポ多糖（ＬＰＳ）により惹起されるものが挙げられる）の活性化に関与する。かかる受容体は、非常に広範な型の免疫応答の媒介に関与するため、本発明のこの態様による方法は、その病因がかかる免疫応答と関連する非常に多くの疾患を治療するため使用することができる。
【０１９６】
かかる疾患としては、自己免疫疾患、炎症性疾患、移植関連疾患およびアレルギー性疾患が挙げられる。たとえば、ＮＦ−κＢは、アレルギー性疾患（たとえば、喘息）、自己免疫疾患（たとえば、関節リウマチ）、炎症性疾患（たとえば、炎症性腸疾患）、アテローム性動脈硬化およびアルツハイマー病、ならびに移植に関連する疾患（たとえば、移植片拒絶）などの疾患の多様な例の病因に関与することが示されている。さらにまた、無規制なＮＦ−κＢシグナル伝達は、種々の悪性疾患と関連することが示されている。
【０１９７】
したがって、本発明のこの態様による方法は、自己免疫疾患、炎症性疾患、移植関連疾患、アレルギー性疾患および悪性疾患などの疾患を効果的に治療するために使用することができる。
【０１９８】
本発明のこの態様にしたがって治療され得る疾患の具体例は、以下に列挙する。
【０１９９】
本明細書において上記のように、ポリペプチドである標的抗原は、種々の方法で得られ得る。
【０２００】
好ましくは、標的抗原は、標準的な化学的合成方法論によって得られる。
【０２０１】
あるいはまた、標的抗原は、天然で発現されたＮＩＫのタンパク質溶解性切断により得られ得るか、またはインビトロ発現系（たとえば、Sambrookら、下記および関連する参考文献を参照のこと）を用いる標準的な組換え技術により得られ得る。
【０２０２】
標的抗原は、たとえば、標準的な固相技術を用いて化学的に合成され得る。かかる技術としては、排他的固相合成、部分固相合成方法、断片縮合、古典的溶液合成が挙げられる。固相ポリペプチド合成手順は、当該技術分野において周知である［たとえば、“Solid Phase Peptide Synthesis”, 第2版, Pierce Chemical Company, (1984)のStewartらを参照のこと］。
【０２０３】
合成ポリペプチドは、Creighton T. [Proteins, structures and molecular principles, W. H. Freeman and Co. N. Y. (1983)］に記載のものなどの分取高速液体クロマトグラフィー手順によって精製することができ、そのアミノ酸配列は、標準的なアミノ酸配列決定手順により確認し得る。
【０２０４】
本明細書において上記のように、該調製物は、好ましくは、哺乳動物を標的抗原で免疫化することにより誘導される。
【０２０５】
該調製物のインビボでの作製は、好都合には、血清中で抗体の産生を刺激する計画にしたがい、アジュバントの存在下での標的抗原の哺乳動物への反復注射により行なわれ得る。標的抗原が、充分な免疫原性応答を惹起するには小さすぎる場合（当該技術分野において「ハプテン」という）、このハプテンを、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）または血清アルブミンなどの抗原性的に中性の担体に結合させ得る［たとえば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］担体（たとえば、米国特許第５，１８９，１７８号および同第５，２３９，０７８号を参照のこと）。ハプテンの担体への結合は、当該技術分野において周知の種々の方法を用いて行い得る。たとえば、アミノ基への直接結合を行ない、任意に、その後、形成されたイミノ結合の還元を行ない得る。あるいはまた、担体を、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたは他のカルボジイミド脱水剤などの縮合剤を用いて結合させ得る。また、リンカー化合物を、該結合を行なうために使用することができる。ホモ二機能性およびヘテロ二機能性リンカーは、ともに、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌから入手可能である。得られた免疫原性複合体を、次いで、好適な哺乳動物被験体（たとえば、マウス、ウサギなど）に注射し得る。抗体のインビノ作製後、宿主哺乳動物におけるその血清価は、当該技術分野において周知のイムノアッセイ手順を用いて容易に測定され得る。
【０２０６】
本明細書において上記のように、該調製物は、好都合には、ヒト化抗体または抗体断片を含有し得る。
【０２０７】
キメラ抗体およびその作製方法は当該技術分野において公知である（Cabilly ら, 欧州特許出願第１２５０２３号（１９８４年１１月１４日に公開）；Taniguchiら, 欧州特許出願第１７１４９６号（１９８５年２月１９日に公開）；Morrisonら, 欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日に公開）；Neubergerら, ＰＣＴ出願ＷＯ  ８６０１５３３（１９８６年３月１３日に公開）；Kudoら, 欧州特許出願第１８４１８７号（１９８６年６月１１日に公開）；Robinsonら, 国際特許出願番号Ｗ０８７０２６７１（１９８７年５月７日に公開）；Riechmannら、ならびにHarlow および Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL（前出）。
【０２０８】
「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンの可変および定常領域の両方を含有する分子である。完全なヒト抗体は、抗イディオタイプ免疫原性が有意に低減されているか、または理想的には存在しないはずであるため、治療用途に特に好適である。完全なヒト抗体の調製のための方法の１つは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を、内在性Ｉｇ遺伝子が不活化されているマウスに導入することによるマウス体液性免疫系の「ヒト化」、すなわちヒトＩｇを産生することができるマウス系統（ゼノマウス）の作製からなる。Ｉｇ遺伝子座は、物理的構造と、最終的に広い免疫応答を生じるのに必要とされる遺伝子再編成および発現プロセスとの両方の点で、きわめて複雑である抗体の多様性は、主に、Ｉｇ遺伝子座内に存在する異なるＶ、ＤおよびＪ遺伝子間の再編成の組み合わせにより生じる。これらの遺伝子座はまた、抗体発現、対立遺伝子排除、クラススイッチおよび親和性成熟を制御する散在性調節性エレメントを含む。非再編成ヒトＩｇ導入遺伝子のマウスへの導入により、このマウス組換え機構は、ヒト遺伝子に適合性があることが示されている。さらにまた、種々のイソタイプの抗原特異的ｈｕ−ｍＡｂを分泌するハイブリドーマは、該抗原でのゼノマウス免疫化によって得られ得る。
【０２０９】
完全なヒト抗体およびその作製方法は、当該技術分野において公知である（Mendezら (1997);Buggemannら (1991);Tomizukaら, (2000)  特許  国際公開第９８／２４８９３号パンフレット）。
【０２１０】
本明細書において使用する場合、用語「ムテイン」は、得られる生成物の活性を元のＮＩＫと比べて大幅に変化させることなく、ＮＩＫの天然に存在する成分のアミノ酸残基の１個以上が異なるアミノ酸残基で置き換わっているか、もしくは欠損しているか、または１個以上のアミノ酸残基がＮＩＫの元の配列に付加されているＮＩＫのアナログをいう。これらのムテインは、公知の合成により、および／または部位特異的突然変異誘発技術、あるいは、これに適当な任意の他の公知の手法により調製される。
【０２１１】
本発明によるムテインとしては、ＮＩＫをコードする本発明によるＤＮＡまたはＲＮＡにストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）にコードされるタンパク質が挙げられる。用語「ストリンジェント条件」は、当業者が慣用的に「ストリンジェント」とよぶハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件をいう。Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology(前出), Interscience, N. Y., §§6.3 および 6.4 (1987,1992), ならびに Sambrookら (Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., および Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）を参照のこと。
【０２１２】
限定されないが、ストリンジェント条件の例としては、研究対象のハイブリッドの計算値Ｔｍより１２〜２０℃低く、たとえば、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳを５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを１５分間；０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳを３７℃で３０〜６０分間、次いで、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳを６８℃で３０〜６０分間における洗浄条件が挙げられる。当業者は、ストリンジェンシー条件がまた、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（１０〜４０塩基など）または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することを理解している。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。Ausubel（前出）を参照のこと。
【０２１３】
任意のかかるムテインは、好ましくは、ＮＩＫに実質的に類似またはより良好でさえある活性を有するように、ＮＩＫのものと充分に重複性のアミノ酸の配列を有する。
【０２１４】
好ましい実施形態において、任意のかかるムテインは、ＮＩＫのアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性または相同性を有する。より好ましくは、該配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性または相同性を有する。
【０２１５】
同一性は、配列の比較により調べる２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。一般に、同一性は、比較対象の配列の長さに関して、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の一致をいう。
【０２１６】
正確な一致がない配列の場合、「同一性の割合」を決定し得る。一般に、比較対象の２つの配列をアラインメントし、配列間の最大相関関係を得る。これは、配列のいずれか一方または両方に「ギャップ」を挿入し、アラインメントの程度を向上させることを含み得る。同一性の割合は、比較対象の配列の各々の完全な長さに関して（いわゆる全体アラインメント）（同じまたは非常に類似した長さの配列に特に好適である）、またはより短い規定の長さに関して（いわゆる局所アラインメント）（長さが同じでない配列により適する）決定し得る。
【０２１７】
２つ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法は、当該技術分野において周知である。このため、たとえば、Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1（Devereux Jら 1984, Nucleic 酸 Res. 1984 Jan 11;12 (1 Pt 1): 387-95.）で入手可能なプログラム、たとえば、プログラム ＢＥＳＴＦＩＴ  ａｎｄ  ＧＡＰ が、２つのポリヌクレオチド間の同一性％ならびに２つのポリペプチド配列間の同一性％および相同性％を決定するために使用され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、Smith and Waterman（J Theor Biol. 1981 Jul 21;91 (2): 379-80 and J Mol Biol. 1981 Mar 25;147 (1):195-7. 1981）の「局所相同性」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性の最大の単一の領域を見出す。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムもまた当該技術分野において公知である（たとえば、ＢＬＡＳＴ  ファミリーのプログラム(Altschul S F ら, 1990 J Mol Biol. 1990 Oct 5;215 (3): 403-10, Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Ju1;87 (14): 5509-13, Altschul S Fら, Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25 (17): 3389-402, NCBIのホームページからwww.ncbi.nlm.nih.Govでアクセス可能)および FASTA (Pearson W R, Methods Enzymol. 1990;183: 63-98. Pearson J Mol Biol. 1998 Feb 13;276 (1):71-84))。
【０２１８】
本発明にしたがって使用され得るＮＩＫのムテイン、またはこれをコードする核酸としては、本明細書に記載の教示および手引きに基づき、必要以上の実験をせずに、当業者により常套的に得られ得る置換ペプチまたはポリヌクレオチドに実質的に対応する有限な一群の配列が挙げられる。
【０２１９】
本発明によるムテインに対する好ましい変化は、「保存的」置換として知られるものである。ＮＩＫの保存的アミノ酸置換には、充分に類似した物理化学的特性を有し、群の構成員間での置換は分子の生物学的機能を保存している一群内の同義アミノ酸が含まれ得る。特に、挿入または欠失が数個のアミノ酸（たとえば３０個未満、好ましくは１０個未満）のみを伴い、かつ機能的コンホメーションに必須のアミノ酸（たとえば、システイン残基）を除去または置換されない場合、アミノ酸の挿入および欠失もまた、その機能を改変することなく前記規定配列において行なわれ得ることは明白である。かかる欠失および／または挿入によって生じるタンパク質およびムテインは、本発明の範囲に含まれる。
【０２２０】
好ましくは、同義アミノ酸群は表Ａに規定されるものである。より好ましくは、同義アミノ酸群は表Ｂに規定されるものであり、最も好ましくは、同義アミノ酸群は表Ｃに規定されるものである。
【０２２１】
【表１】
2007537708.tif 000003
【０２２２】
【表２】
2007537708.tif 000004
【０２２３】
【表３】
2007537708.tif 000005
【０２２４】
本発明における使用のために、ＮＩＫのムテインを得るために使用され得るタンパク質におけるアミノ酸置換の生成の例としては、任意の公知の方法の工程（たとえば、Ｍａｒｋらに対する米国特許第４，９５９，３１４号、同第４，５８８，５８５号および同第４，７３７，４６２号；Kothsらに対する同第５，１１６，９４３号、Namenらに対する同第４，９６５，１９５号；Chongらに対する同第４，８７９，１１１号；およびLeeらに対する同第５，０１７，６９１号に示されるものなど）ならびに米国特許第４，９０４，５８４号（Shawら）に示されたリシン置換タンパク質が挙げられる。
【０２２５】
「機能性誘導体」は、本明細書で使用する場合、残基の側鎖として存在するか、または当該技術分野において公知の手段によりＮまたはＣ末端基に付加された機能性基から調製され得るＮＩＫの誘導体およびそのムテインを包含し、薬学的に許容し得る状態を維持する（すなわち、ＮＩＫの活性に実質的に類似したタンパク質の活性を破壊せず、かつこれを含有する組成物に対して毒性を付与しない）限り限り、本発明に含まれる。
【０２２６】
本発明による「活性断片」は、たとえば、ＮＩＫの断片であり得る。断片という用語は、分子の任意の亜集団、すなわち、所望の生物学的活性を維持したより短いペプチドをいう。断片は、ＮＩＫ分子のいずれかの末端からアミノ酸を除去し、得られた断片をその活性について試験することにより容易に調製され得る。ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかから１度に１個のアミノ酸を除去するためのプロテアーゼは公知であり、所望の生物学的活性を維持している断片の測定は、常套的な実験法を伴うに過ぎない。
【０２２７】
ＮＩＫの活性断片、そのムテインおよび融合タンパク質として本発明は、タンパク質分子のポリペプチド鎖の任意の断片または前駆体（単独のもの、または分子と会合したもの、または残基（たとえば、糖残基またはリン酸残基）に結合したもの）またはタンパク質分子同士または糖残基との凝集体をさらに包含する。ただし、前記断片はＮＩＫと実質的に類似活性を有するものとする。
【０２２８】
本明細書において、用語「塩」は、ＮＩＫ分子またはそのアナログのカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方をいう。カルボキシル基の塩は、当該技術分野において公知の手段により形成され得、無機塩（たとえば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛の塩など）、および有機塩基との塩（たとえば、トリエタノールアミンなどのアミン、アルギニンまたはリシン、ピペラジン、プロパインなどと形成されるものなど）が挙げられる。酸付加塩としては、たとえば、無機酸（たとえば、たとえば、塩酸酸または硫酸など）との塩および有機酸（たとえば、たとえば、酢酸またはシュウ酸など）との塩が挙げられる。もちろん、任意のかかる塩は、ＮＩＫの生物学的活性を維持していなければならない。
【０２２９】
用語「円順列変異」は、本明細書で使用する場合、末端同士を直接またはリンカーを介してのいずれかで互いに結合して環状分子を作製し、次いで該環状分子を別の位置で開裂して末端が元の分子の末端と異なる新たな線状分子が作製された線状分子をいう。円順列変異としては、その構造が、環化した後開裂された分子に相当する分子が挙げられる。したがって、円順列変異させた分子は、線状分子として最初から合成され、環化工程および開裂工程を経ないものであってもよい。分子の特定の円順列変異は、両者間のペプチド結合が除かれたアミノ酸残基を含む区画によりにより指定される。円周方向に並べ替えた分子（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含み得る）は、正常な末端同士の融合を有し（しばしば、リンカーにより）、別の新たな末端を含む単鎖分子である。Goldenberg,ら J. Mol. Biol., 165: 407-413 (1983) および Panら Gene 125: 111-114 (1993)（ともに、引用により本明細書に具体的に組み込まれる）を参照のこと。円周方向の並べ替えは、ある直線鎖分子を採用し、末端を融合して環状分子を形成し、次いで、環状分子を異なる位置で切断して異なる末端を有する新たな直線鎖分子を形成することと機能的に等価である。円周方向に並べ替えたものは、したがって、異なる位置に新たな末端を生成しつつ、タンパク質のアミノ酸の配列および同一性を本質的に保存する効果を有する。
【０２３０】
ヒト化抗体または抗体断片は、非ヒト抗体由来の（好ましくは、最初限の）部分を有する遺伝子操作されたキメラ抗体または抗体断片である。ヒト化抗体としては、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が、所望の機能性を有する非ヒト種（たとえば、マウス、ラットまたはウサギなど）（ドナー抗体）の相補性決定領域由来の残基と置き換えられた抗体が挙げられる。場合によっては、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基と置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても外来性（imported）相補性決定領域またはフレームワーク配列においても見られない残基を含有し得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含有し、ここで、相補性決定領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてが関連するヒトコンセンサス配列のものに対応する。また、ヒト化抗体は、最適には、典型的にはヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくともの一部分、たとえば、Ｆｃ領域などを含む（たとえば、Jonesら, 1986. Nature 321: 522-525;Riechmannら, 1988. Nature 332: 323-329;および Presta, 1992. Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596を参照のこと）。非ヒト抗体または抗体断片のヒト化のための方法は、当該技術分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、外来性残基とよばれ、典型的には、外来性可変ドメインから採用される。本質的に、ヒト化は、記載（たとえば、Jonesら, 1986. Nature 321: 522-525;Riechmannら, 1988. Nature 332: 323-327;Verhoeyenら, 1988. Science 239: 1534-1536;米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）のようにして、ヒト相補性決定領域を対応する齧歯類の相補性決定領域で置き換えることにより行なわれ得る。したがって、かかるヒト化抗体はキメラ抗体であり、インタクトなものより実質的に短いヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列で置き換えられている。実際面では、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの相補性決定領域残基（あるいはいくつかのフレームワーク残基）が、齧歯類抗体内の類似部位由来の残基で置き換えられたヒト抗体であり得る。ヒト抗体または抗体断片はまた、ファージディスプレイライブラリーなどの当該技術分野において公知の種々の手法を用いて作製することができる［たとえば、Hoogenboom および Winter, 1991. J. Mol. Biol. 227: 381;Marksら, 1991. J. Mol. Biol. 222: 581;Coleら,“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, Alan R. Liss, pp. 77 (1985);Boernerら, 1991. J. Immunol. 147: 86-95を参照のこと）。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をコードする配列を、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているトランスジェニック動物（たとえば、マウス）に導入することにより作製することができる。抗原によりチャレンジされると、ヒト抗体産生がかかる動物において観察され、これは、ヒトにおいて見られるものと、すべての点（遺伝子再編成、鎖合成および抗体レパートリーなど）において非常に類似する。かかるアプローチを行なうための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている（たとえば、米国���許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号および同第５，６６１，０１６号；Marksら, 1992. Bio/Technology 10: 779-783;Lonbergら, 1994. Nature 368: 856-859;Morrison, 1994. Nature 368: 812-13;Fishwildら, 1996. Nature Biotechnology 14: 845-51;Neuberger, 1996. Nature Biotechnology 14: 826;Lonberg and Huszar, 1995. Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93を参照のこと）。
【０２３１】
本明細書において上記のように、本発明の抗体断片は、好都合には、発現ベクターを用いて細胞内で発現され得る。
【０２３２】
発現ベクターにより個体の細胞を遺伝子工学的に改変するための好ましいアプローチは、ウイルス系ベクターを使用することである。ウイルス系ベクターは、高効率の形質転換、および特定の細胞型への標的化、および特定の細胞型内での増殖などのいくつかの利点をもたらす。ウイルス系ベクターはまた、特異的細胞受容体（たとえば、癌細胞受容体など）を介する標的特異性を改変するため、特異的受容体またはリガンドで修飾し得る。かかる標的化能力は、無規制なＮＦ−κＢ活性を特徴とする細胞内に本発明の抗体または抗体断片の発現を指向するために使用することができる。
【０２３３】
レトロウイルス系ベクターは、本発明での使用に好適なベクターの類型の１つを示す。欠損レトロウイルスは、哺乳動物細胞（たとえば、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞および骨髄細胞など）を遺伝子工学的に改変し、組換えタンパク質を発現させるためのベクターとして常套的に使用されている。レトロウイルス系ゲノムの一部分を除去してレトロウイルスを複製欠損とし、該複製欠損レトロウイルスを、次いで、ビリオン内にパッケージングし得、これを、ヘルパーウイルスの使用により、標準的な技術を用いて標的細胞を感染させるために使用することができる。組換えタンパク質を哺乳動物細胞内で発現させることができるレトロウイルス系ベクターを作製するための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている（たとえば、Miller, A. D., 1990. Blood 76: 271;Sambrookら、下記および関連する参考文献を参照のこと）。
【０２３４】
別の好適な発現ベクターは、アデノウイルス系ベクターであり得る。アデノウイルス系ベクターは、広く研究されており、常套的に使用されている遺伝子導入ベクターである。アデノウイルス系ベクターの重要な利点としては、分裂細胞および休止細胞の比較的高形質導入効率、広範な上皮組織への天然向性および高力価の容易な生成が挙げられる。アデノウイルスＤＮＡは、核に輸送されるが、これに組み込まれない。したがって、アデノウイルス系ベクターによる突然変異誘発のリスクは最小限である。疾患を治療するためのアデノウイルス系ベクターの作製および利用のための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている［たとえば、Russel, W. C., 2000. J. Gen. Virol. 81: 57-63を参照のこと；癌治療でのアデノウイルス系ベクターの使用に関する手引きについては、たとえば、P. Seth (編) Adenoviruses: Basic biology to Gene Therapy, Landes, Austin, TX, pp. 103-120 (1999)のSethら, Adenoviral vectors for cancer gene therapy.を参照のこと］。
【０２３５】
好適なアデノウイルス系ベクターの具体例は、アデノウイルス由来ベクターＡｄ−ＴＫである。このベクターは、陽性または陰性いずれかの選択のためにヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を発現し、所望の組換え配列のための発現カセットを含む。このベクターは、ほとんどの上皮起源の癌を含むアデノウイルス受容体を有する細胞感染させるために使用することができる（Sandmairら, 2000. Hum. Gene. Ther. 11: 2197-2205）。
【０２３６】
また、好適なウイルス系発現ベクターは、レトロウイルス系成分およびアデノウイルス系成分を兼ね備えたキメラ  アデノウイルス／レトロウイルスベクターであり得、これは、伝統的な発現ベクターよりも効率がよいことが示されている。かかるベクターの作製および利用のための充分な手引きは、当該技術分野の文献に提供されている（たとえば、Panら, 2002. Cancer Letters 184: 179-188を参照のこと）。
【０２３７】
発現ベクターは、種々の方法で投与され得る。ウイルス系ベクターを用いる場合、手順は、その標的特異性を利用することができ、その結果として、かかるベクターは、疾患に罹患した解剖学的部位に局所的に投与する必要がないことがある。しかしながら、局所投与は、より速くより効果的な治療をもたらし得る。また、ウイルス系ベクターの投与は、たとえば、個体への静脈内または皮下注射により行なわれ得る。注射後、ウイルス系ベクターは、感染のための適切な標的特異性を有する宿主細胞を認識するまで循環する。
【０２３８】
本明細書において上記のように、本発明は、本発明の抗体または抗体断片活性成分として含有する医薬組成物を提供する。
【０２３９】
本明細書において使用する場合、語句「医薬組成物」は、本明細書に記載の１種類以上の活性成分の他の化学的成分（たとえば、生理学的に好適な担体および賦形剤など）との調製物をいう。医薬組成物の目的は、活性成分の生物体への投与を容易にすることである。
【０２４０】
本明細書において、用語「活性成分」は、生物学的効果を担い得る本発明の抗体または抗体断片をいう。
【０２４１】
以下、語句「生理学的に許容され得る担体」および「薬学的に許容し得る担体」は、互換的に使用され得、生物体に対して有意な刺激を引き起こさず、かつ投与された活性成分の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤をいう。アジュバントは、これらの語句に含まれる。
【０２４２】
本明細書において、用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質をいう。賦形剤の限定されない例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の類型の糖類およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２４３】
薬物の製剤化および投与のための手法は、“Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版（引用により本明細書に具体的に組み込まれる）に見られ得る。
【０２４４】
医薬組成物の投与の好適な経路としては、たとえば、経口、経直腸、経粘膜、特に経皮、腸または非経口送達（筋肉内、皮下および髄内注射など）ならびに鞘内、直接脳質内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼球内注射が挙げられ得る。
【０２４５】
あるいはまた、医薬組成物は、全身性様式でなく局所において、たとえば、個体の組織領域内への直接の医薬組成物の注射によって投与され得る。
【０２４６】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野において周知の方法によって、たとえば、慣用的な混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、微粒化、乳化、カプセル封入、内包または凍結乾燥方法によって製造され得る。
【０２４７】
したがって、本発明にしたがう使用のための医薬組成物は、慣用的な様式で、１種類以上の生理学的に許容され得る担体（活性成分の薬学的に許容し得る調製物内への囲う処理を容易にする賦形剤および補助剤）を用いて製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０２４８】
注射のためには、医薬組成物の活性成分は、水溶液中、好ましくは生理学的に適合性のある緩衝液（たとえば、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理食塩緩衝液）中に製剤化され得る。経粘膜投与のためには、障壁を透過するのに適当な浸透剤を製剤中に使用する。かかる浸透剤は、一般的に、当該技術分野において公知である。
【０２４９】
経口投与のためには、医薬組成物は、活性成分を当該技術分野において周知の薬学的に許容し得る担体と組み合わせることによって容易に製剤化され得る。かかる担体は、医薬組成物が、患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル剤、シロップ、スラリー剤、懸濁などに製剤化されるのを可能にする。経口使用のための薬理学的調製物は、固体賦形剤を用い、任意に、得られた混合物を磨砕し、所望により適当な補助剤を添加した後、顆粒混合物に加工処理して錠剤または糖衣錠コアを得ることにより作製され得る。好適な賦形剤は、特に、充填剤（たとえば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖類など）；セルロース調製物（たとえば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、イモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど）；および／または生理学的に許容され得るポリマー（たとえば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）など）である。所望により、たとえば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（たとえば、アルギン酸など）などの崩壊剤を添加してもよい。
【０２５０】
糖衣錠コアには適当なコーティングが施される。この目的のため、任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールジェル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含に得る濃縮糖溶液が使用され得る。異なる組み合わせの活性成分投薬量を識別または特徴付けるため、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。
【０２５１】
経口で使用することができる医薬組成物としては、ゼラチン製の押し込み型カプセルならびにゼラチンおよび可塑剤（たとえば、グリセロールまたはソルビトールなど）で作製された軟質密封カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは、活性成分を、充填剤（たとえば、ラクトース、結合剤（たとえば、デンプンなど）、滑剤（たとえば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および任意に可塑剤など）と混合した状態でを含み得る。軟質カプセルでは、活性成分を、適当な液体（たとえば、脂肪油、液状パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールなど）中に溶解または懸濁させ得る。また、可塑剤を添加してもよい。経口投与のためのすべての製剤は、選択した投与経路に適した用量であるべきである。
【０２５２】
口内投与のためには、組成物は、慣用的な様式で製剤化される錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０２５３】
鼻腔吸入による投与のためには、本発明による使用のための活性成分は、加圧パックからのエーロゾル噴霧提示または好適なプロペラント（たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用を伴うネブライザーの形態で簡便に送達される。加圧エーロゾルの場合、投薬単位は、定量を到達するためのバルブを設けることにより決定され得る。ディスペンサーにおける使用のため、活性成分の粉末ミックスおよび適当な粉末基剤（たとえば、ラクトースまたはデンプンなど）を含む、たとえばゼラチン製のカプセルおよびカートリッジを製剤化し得る。
【０２５４】
本明細書に記載の医薬組成物は、たとえば、ボーラス注射または連続輸液により、非経口投与用に製剤化され得る。注射用の製剤は、単位投薬形態で、たとえば、任意に保存料を添加したアンプルまたは反復投与容器にて提示され得る。該組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤またはエマルジョンであり得、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤用剤を含み得る。
【０２５５】
非経口投与用の医薬組成物としては、水溶性形態の活性調製物の水溶液が挙げられる。加えて、活性成分の懸濁液は、適切な油性または水系注射懸濁剤として調製され得る。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、または合成脂肪酸エステル（たとえば、オレイン酸エチル、トリグリセリドもしくはリポソームなど）が挙げられる。
【０２５６】
水性注射用懸濁剤は、該懸濁剤の粘度を増加させる物質、たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含み得る。任意に、懸濁剤はまた、好適な可塑剤、または高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために活性成分の溶解度を増加させる薬剤を含み得る。
【０２５７】
あるいはまた、活性成分は、使用前に、好適なビヒクル（たとえば、発熱物質無含有の滅菌水系溶液）で構築するための粉末形態であり得る。
【０２５８】
本発明の医薬組成物また、たとえば、慣用的な座剤用基剤（たとえば、ココアバターまたは他のグリセリドなど）を用い、経直腸組成物（たとえば、座剤または停留浣腸など）に製剤化され得る。
【０２５９】
本発明の状況における使用のために好適な医薬組成物としては、活性成分が意図した目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が挙げられる。より詳細には、治療有効量は、疾患の症状を予防、緩和もしくは改善することができるか、または治療対象の個体の生存を延長することができる活性成分（本発明の抗体または抗体断片）の量を意味する。
【０２６０】
治療有効量の決定は、特に、本明細書に提供された詳細な開示内容を考慮すると、充分、当業者の範囲内である。
【０２６１】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療有効量または治療投薬量は、まず、インビトロ細胞培養アッセイからから概算され得る。たとえば、所望の濃度または力価を達成する投薬量が動物モデルにおいて策定され得る。かかる情報を用い、ヒトにおいて有用な投薬量をより正確に決定することができる。
【０２６２】
本明細書に記載の活性成分の毒性または治療的効能は、標準的なインビトロ製薬手順により、細胞培養物または実験動物において測定され得る。これらのインビトロ細胞培養アッセイおよび動物試験から得れらたデータを、ヒトにおける使用のための用量範囲を策定するために使用することができる。該用量は、使用した投薬形態および用いた投与経路に応じて異なり得る。正確な製剤、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（たとえば、“The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 第１章 p.1のFinglら, 1975 を参照のこと）。
【０２６３】
投薬の量および間隔は、所望の治療効果（最小有効濃度ＭＥＣ）を奏するのに充分な活性成分の血漿レベルまたは脳レベルをもたらすために個々に調整し得る。ＭＥＣは、各調製物で異なるが、インビトロデータから概算し得る。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は、個体の特徴および投与経路に依存する。血漿濃度を測定するために、検出アッセイを使用することができる。
【０２６４】
治療対象の状態の重篤度および応答性に応じて、投薬は、１回、または数日間から数週間持続する治療過程をともなって、または治癒するまで、もしくは疾患状態の減退が達成されるまでの複数回の投与であり得る。
【０２６５】
投与される組成物の量は、もちろん、治療対象の個体、苦痛の重篤度、投与様式、処方する医師の判断などに依存性である。
【０２６６】
本発明の組成物は、所望により、活性成分を含有する単位投薬形態を１つ以上含み得るパックまたはディスペンサーデバイス（たとえば、ＦＤＡ承認など）にて提示され得る。パックは、たとえば、金属またはプラスチックのホイル（たとえば、ブリスターパック）を含有し得る。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための指示書が添付されてもよい。パックまたはディスペンサーにはまた、政府機関による医薬品の製造、使用または販売規制により指示された形態の容器に関連する通知が添付されてもよく、該通知は、組成物の形態またはヒト用もしくは獣医用投与の該機関による承認を反映する。かかる通知は、たとえば、処方薬について米国食品医薬品局により承認されたラベル表示、または承認製品挿入物であり得る。適合性のある医薬用担体内に製剤化された本発明の抗体または抗体断片を含有する組成物はまた、適切な容器内で調製および配置され、先にさらに詳述したように、適応症状の治療のためにラベル表示される。
【０２６７】
本明細書において上記のように、本発明は、病的免疫応答と関連する疾患を治療するために使用され得る。
【０２６８】
かかる疾患の例としては、Ｉ型（即時型またはＩｇＥ媒介性）過敏症と関連する疾患、II型（抗体媒介性）過敏症と関連する疾患、IV型（Ｔリンパ球媒介性）過敏症と関連する疾患、遅延型過敏症（ＤＴＨ）と関連する疾患、自己免疫疾患および移植片の移植と関連する疾患が挙げられる。
【０２６９】
過敏症と関連する疾患のさらなる例としては、たとえば、III型（免疫複合体媒介性）過敏症と関連する疾患、炎症と関連する疾患、感染と関連する疾患および特発性過敏症と関連する疾患が挙げられる。
【０２７０】
Ｉ型過敏症の例としては、限定されないが、喘息、蕁麻疹性丘疹、蕁麻疹、花粉アレルギー、チリダニアレルギー、毒液アレルギー、化粧品アレルギー、ラテックスアレルギー、化学物質アレルギー、薬物アレルギー、虫刺されアレルギー、動物鱗屑アレルギー、刺棘植物アレルギー、ツタウルシアレルギーおよび食物アレルギーなどのアレルギー性疾患が挙げられる。
【０２７１】
II型過敏症の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：リウマチ様疾患、リウマチ様自己免疫疾患、関節リウマチ（Krenn V.ら, 2000. Histol Histopathol. 15: 791）、脊椎炎、強直性脊椎炎（Jan Voswinkelら, 2001. Arthritis Res. 3: 189）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身エリテマトーデス（Erikson J.ら, 1998. Immunol Res. 17: 49）、硬化症、全身硬化症（Renaudineau Y.ら, 1999. Clin Diagn Lab Immunol. 6: 156);Chan OT.ら, 1999. Immunol Rev. 169: 107）、腺疾患、腺自己免疫疾患、膵臓自己免疫疾患、糖尿病、Ｉ型糖尿病（Zimmet P. 1996. Diabetes Res Clin Pract. 34 Suppl: S125）、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス疾患（Orgiazzi J. 2000. Endocrinol Metab Clin North Am. 29: 339）、甲状腺炎、自発性（spontaneous）自己免疫性甲状腺炎（Braley-Mullen H. および Yu S. 2000. J Immunol. 165 (12): 7262）、橋本甲状腺炎（Toyoda N.ら, Nippon Rinsho 1999.57 (8): 1810）、粘液水腫、特発性粘液水腫（Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999.57 (8): 1759）；自己免疫性生殖器疾患、卵巣疾患、卵巣自己免疫（Garza KM.ら J Reprod Immunol. 1998. 37 (2): 87）、自己免疫性抗精子不妊（Diekman AB.ら, Am J Reprod Immunol. 2000.43 (3): 134）、反復性流産（fetal loss）（Tincani A.ら, Lupus 1998.7 Suppl 2: S107-9）、神経変性疾患、神経系疾患、神経系自己免疫疾患、多発性硬化症（Cross AH.ら, J Neuroimmunol. 2001. 112 (1-2): 1）、アルツハイマー病（Oron L.ら, J Neural Transm Suppl. 1997.49:77）、重症筋無力症（Infante AJ. および Kraig E. Int Rev Immunol. 1999.18 (1-2): 83）、運動神経障害（Komberg AJ. J Clin Neurosci. 2000.7 (3): 191）、ギラン・バレー症候群、神経障害および自己免疫性神経障害（Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000.319 (4): 234）、無筋力症疾患、ランバート・イートン無筋力症候群（Takamori M. Am J Med Sci. 2000.319 (4): 204）、腫瘍随伴性神経系疾患、小脳萎縮、腫瘍随伴性小脳萎縮、非腫瘍随伴性スティフマン症候群、小脳萎縮症、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群、多発性内分泌腺症、自己免疫性多発性内分泌腺症（Antoine JC. および Hoimorat J. Rev Neurol (Paris) 2000.156 (1):23）；神経障害、免疫異常神経障害（dysimmune neuropathy) (Nobile-Orazio E.ら, Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 1999.50:419）；神経性筋緊張症（neuromyotonia）、後天性神経性筋緊張症、先天性多発性関節拘縮症（Vincent A.ら, Ann N Y Acad Sci. 1998.841:482）、心臓血管疾患、心臓血管自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化（Matsuura E.ら, Lupus. 1998.7 Suppl 2: S135）、心筋梗塞（Vaarala O. Lupus. 1998.7 Suppl 2: S132）、血栓症（Tincani A.ら, Lupus 1998.7 Suppl 2: S107-9）、肉芽腫症、ヴェグナー肉芽腫症、動脈炎、高安動脈炎および川崎病（Praprotnik S.ら Wien Klin Wochenschr 2000.112 (15-16): 660）；抗第VIII因子自己免疫疾患（Lacroix-Desmazes S.ら, Semin Tliromb Hemost. 2000.26 (2): 157）；脈管炎（vasculitusis），壊死性小管（small vessel）脈管炎、顕微鏡的多発脈管炎、チャーグ−ストラウス症候群、糸球体腎炎、少免疫焦点性（pauci-immunofocal）壊死性糸球体腎炎、半月形糸球体腎炎（Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000.151 (3): 178）；抗リン脂質症候群（Flamholz R.ら, JClinApheresis 1999.14 (4): 171）；心不全、心不全におけるアゴニスト様β−アデノレセプター抗体（Wallukat G.ら, Am J Cardio. 1999.83 (12A): 75H）、特発性血小板減少性紫斑病（Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999.14 (2): 114）；溶血性貧血、自己免疫溶血性貧血（Efremov DG.ら, Leuk Lymphoma 1998. 28 (3-4): 285）、胃腸疾患、胃腸管の自己免疫疾患、腸疾患、慢性炎症性腸疾患（Garcia Herola A.ら Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan;23 (1):16）、セリアック病（Landau YE. および Shoenfeld Y. Harefuah 2000.138 (2): 122）、筋系の自己免疫疾患、筋炎、自己免疫筋炎、シェーグレン症候群（Feist E.ら, Int Arch Allergy Immunol. 2000.123 (1):92）；平滑筋自己免疫疾患（Zauli D.ら, Biomed Pharmacother. 1999.53 (5-6): 234）、肝臓疾患、肝臓自己免疫疾患、自己免疫肝炎（Manns MP. J Hepatol. 2000.33 (2): 326）および原発性胆汁性肝硬変（Strassburg CP.ら., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999.11 (6): 595）。
【０２７２】
III型過敏症の例としては、限定されないが、Ｆｃ受容体（たとえば、Ｆｃγ受容体）によりたとえば免疫複合体活性化された免疫エフェクター細胞（好中球またはマクロファージなど）により媒介される疾患が挙げられる。
【０２７３】
IV型過敏症の例としては、限定されないが、リウマチ様疾患、関節リウマチ（Tisch R and McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci U S A 1994.91 (2): 437）、全身疾患、全身自己免疫疾患、全身エリテマトーデス（Datta SK., Lupus 1998. 7 (9): 591）、腺疾患、腺自己免疫疾患、膵臓疾患、膵臓自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Castano L. および Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8: 647）；甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス疾患（Sakata S.ら, Mol Cell Endocrinol. 1993.92 (1):77）；卵巣疾患（Garza KM.ら, J Reprod Immunol. 1998.37 (2): 87）、前立腺炎、自己免疫前立腺炎（Alexander RB.ら, Urology 1997.50 (6): 893）、多発腺症候群、自己免疫多発腺症候群、Ｉ型自己免疫多発腺症候群（Hara T.ら, Blood 1991.77 (5): 1127）、神経系疾患、自己免疫神経系疾患、多発性硬化症、神経炎、視神経炎（Soderstrom M.ら, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994.57 (5): 544）、重症筋無力症（Oshima M.ら Eur J Immunol. 1990.20 (12): 2563）、スティッフマン症候群（Hiemstra HS.ら, Proc Natl Acad Sci U S A 2001.98 (7): 3988）、心臓血管疾患、シャーガス病における心臓自己免疫（Cunha-Neto E.ら, J Clin Invest. 1996.98 (8): 1709）、自己免疫特発性血小板減少性紫斑病（Semple JW.ら, Blood 1996.87 (10): 4245）、抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫（Caporossi AP.ら, Viral Immunol. 1998.11 (1):9）、溶血性貧血（Sallah S.ら, Ami Hematol. 1997.74 (3): 139）、肝臓疾患、肝臓自己免疫疾患、肝炎、慢性活性肝炎（Franco A.ら, Clin Immunol Immunopathol. 1990. 54 (3): 382）、胆汁性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996.91 (5): 551）、腎臓疾患、腎臓自己免疫疾患、腎炎、間質性腎炎（Kelly CJ. J Am Soc Nephrol. 1990.1 (2): 140）、結合組織疾患、耳の疾患、自己免疫結合組織疾患、自己免疫性の耳の疾患（Yoo TJ.ら, Cell Immunol. 1994.157 (1):249）、内耳の疾患（Gloddek B.ら, Ann N Y Acad Sci. 1997.830:266）、皮膚病、皮膚疾患、真皮疾患、水疱型皮膚疾患、尋常性天疱瘡、水疱型天疱瘡様および落葉状天疱瘡が挙げられる。
【０２７４】
遅延型過敏症と関連する疾患の例としては、限定されないが、接触皮膚炎および薬疹が挙げられる。
【０２７５】
自己免疫疾患の例としては、限定されないが、心臓血管疾患、リウマチ様疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝臓疾患、神経系疾患、筋疾患、腎臓疾患、生殖に関連する疾患、結合組織疾患および全身疾患が挙げられる。
【０２７６】
自己免疫心臓血管疾患の例としては、限定されないが、アテローム性動脈硬化（Matsuura E.ら, Lupus. 1998 7 Suppl 2: S135）、心筋梗塞（Vaarala O. Lupus. 1998.7 Suppl 2: S132）、血栓症（Tincani A.ら, Lupus 1998.7 Suppl 2: S107-9）、ヴェグナー肉芽腫症、高安動脈炎、川崎病（Praprotnik S.ら, Wien Klin Wochenschr. 2000.112 (15-16): 660）、抗第VIII因子自己免疫疾患（Lacroix-Desmazes S.ら, Semin Tliromb Hemost. 2000.26 (2): 157）、壊死性小管脈管炎、顕微鏡的多発脈管炎、チャーグ−ストラウス症候群、少免疫焦点性壊死性および半月形糸球体腎炎（Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000.151 (3): 178）、抗リン脂質症候群（Flamholz R.ら, J Clin Apheresis 1999.14 (4): 171）、抗体誘導型心不全（Wallukat G.ら, (1999) Am J Cardiol. 83 (12A): 75H）、特発性血小板減少性紫斑病（Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999. 14 (2): 114;Semple JW.ら, Blood 1996.87 (10): 4245）、自己免疫溶血性貧血（Efremov DG.ら Leuk Lymphoma 1998 28 (3-4）：285;Sallah S.ら, Ann Hematol. 1997.74 (3): 139）、シャーガス病における心臓自己免疫（Cunha-Neto E.ら, J Clin Invest. 1996.98 (8): 1709）および抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫（CaporossiAP.ら, ViralImmunol. 1998.11 (1):9）が挙げられる。
【０２７７】
自己免疫リウマチ様疾患の例としては、限定されないが、関節リウマチ（Krenn V.ら, (2000) Histol Histopathol. 15 (3): 791;Tisch R, McDevitt HO. (1994) Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (2): 437）および強直性脊椎炎（Jan Voswinkelら, (2001) Arthritis Res. 3 (3): 189）が挙げられる。
【０２７８】
自己免疫腺疾患の例としては、限定されないが、膵臓疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーヴス疾患、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣自己免疫、自己免疫抗精子不妊、自己免疫前立腺炎およびＩ型自己免疫多発腺症候群疾患、膵臓の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Castano L. および Eisenbarth GS. 1990. Ann. Rev. Immunol. 8: 647;Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract. 1996.34 Suppl:S125）、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス疾患（Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am. 2000.29 (2): 339;Sakata S.ら, Mol Cell Endocrinol. 1993. 92 (1):77）、自発性自己免疫性甲状腺炎（Braley-Mullen H. および Yu S, J Immunol. 2000.165 (12): 7262）、橋本甲状腺炎（Toyoda N.ら Nippon Rinsho 1999.57 (8): 1810）、特発性粘液水腫（Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999. 57 (8): 1759）、卵巣自己免疫（Garza KM.ら, J Reprod Immunol. 1998. 37 (2): 87）、自己免疫抗精子不妊（Diekman AB.ら, Am J Reprod Immunol. 2000.43 (3): 134）、自己免疫前立腺炎（Alexander RB.ら, Urology 1997,50 (6): 893）およびＩ型自己免疫多発腺症候群（Hara T.ら, Blood. 1991.77 (5): 1127）が挙げられる。
【０２７９】
自己免疫胃腸疾患の例としては、限定されないが、慢性炎症性腸疾患（Garcia Herola A.ら, Gastroenterol Hepatol. 2000.23 (1):16）、セリアック病（Landau YE. および Shoenfeld Y. Harefuah 2000. 138 (2): 122）、大腸炎、回腸炎およびクローン病が挙げられる。
【０２８０】
自己免疫皮膚疾患の例としては、限定されないが、自己免疫水疱型皮膚疾患（たとえば、限定されないが、尋常性天疱瘡、水疱型天疱瘡様および落葉状天疱瘡など）が挙げられる。
【０２８１】
自己免疫肝臓疾患の例としては、限定されないが、肝炎、自己免疫慢性活性肝炎（Franco A.ら, Clin Immunol Immunopathol. 1990.54 (3): 382）、原発性胆汁性肝硬変（Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996.91 (5): 551;Strassburg CP.ら, Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999.11 (6):595) および自己免疫肝炎（Manns MP. J Hepatol. 2000.33 (2): 326）が挙げられる。
【０２８２】
自己免疫神経系疾患の例としては、限定されないが、多発性硬化症（Cross AH.ら, J Neuroimmunol. 2001.112 (1-2): 1）、アルツハイマー病（Oron L.ら, J Neural Transm Suppl. 1997.49:77）、重症筋無力症（Infante AJ. and Kraig E, Int Rev Immunol. 1999.18 (1-2): 83;Oshima M.ら Eur J Immunol. 1990.20:2563）、神経障害、運動神経障害（motor neuropathies）（Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000.7:191）；ギラン・バレー症候群および自己免疫性神経障害（Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000.319 (4): 234）、筋無力症、ランバート・イートン無筋力症候群（Takamori M. Am J Med Sci. 2000.319 (4): 204）；腫瘍随伴性神経系疾患、小脳萎縮、腫瘍随伴性小脳萎縮およびスティッフマン症候群（Hiemstra HS.ら, Proc Natl Acad Sci U S A 2001.98 (7): 3988）；非腫瘍随伴性スティッフマン症候群、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群および自己免疫性多発性内分泌腺症（Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol. (Paris) 2000.156 (1):23）；免疫異常神経障害（Nobile-Orazio E.ら, Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 1999.50:419）；後天性神経性筋緊張症、先天性多発性関節拘縮症（Vincent A.ら, Ann N Y Acad Sci. 1998.841:482）、神経炎、視神経炎（Soderstrom M.ら, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994.57 (5): 544）および神経変性疾患が挙げられる。
【０２８３】
自己免疫筋疾患の例としては、限定されないが、筋炎、自己免疫筋炎および原発性シェーグレン症候群（Feist E.ら, Int Arch Allergy Immunol. 2000.123 (1):92）および平滑筋自己免疫疾患（Zauli D.ら, Biomed Pharmacother. 1999.53 (5-6): 234）が挙げられる。
【０２８４】
自己免疫腎臓疾患の例としては、限定されないが、腎炎および自己免疫間質性腎炎（Kelly CJ. J Am Soc Nephrol. 1990. 1 (2): 140）が挙げられる。
【０２８５】
生殖に関連する自己免疫疾患の例としては、限定されないが、反復性流産（Tincani A.ら, Lupus 1998.7 Suppl 2: S107-9）が挙げられる。
【０２８６】
自己免疫結合組織疾患の例としては、限定されないが、耳の疾患、自己免疫性の耳の疾患（Yoo TJ.ら, Cell Immunol. 1994. 157 (1):249）および内耳の自己免疫疾患（Gloddek B.ら, Ann N Y Acad Sci. 1997.830:266）が挙げられる。
【０２８７】
自己免疫全身疾患の例としては、限定されないが、全身エリテマトーデス（Erikson J.ら, Immunol Res. 1998.17 (1-2): 49）および全身硬化症（Renaudineau Y.ら, Clin Diagn Lab Immunol. 1999.6 (2): 156);Chan OT.ら, Immunol Rev. 1999.16:107）が挙げられる。
【０２８８】
感染性疾患の例としては、限定されないが、慢性感染性疾患、亜急性感染性疾患、急性感染性疾患、ウイルス系疾患、細菌性疾患、原生動物疾患、寄生虫性疾患、真菌性疾患、マイコプラズマ疾患およびプリオン疾患が挙げられる。
【０２８９】
移植に関連する疾患の例としては、限定されないが、移植片拒絶、慢性移植片拒絶、亜急性移植片拒絶、超急性移植片拒絶、急性移植片拒絶および移植片対宿主病が挙げられる。
【０２９０】
移植片の例としては、同系移植片、同種移植片、異種移植片、細胞性移植片、組織移植片、器官移植片および付属器移植片が挙げられる。
【０２９１】
細胞性移植片の例としては、限定されないが、幹細胞移植片、前駆細胞移植片、造血細胞移植片、胚細胞移植片および神経細胞移植片が挙げられる。
【０２９２】
組織移植片の例としては、限定されないが、皮膚移植片、骨移植片、神経移植片、腸移植片、角膜移植片、軟骨移植片、心臓組織移植片、心臓弁移植片、歯科用移植片、毛包移植片および筋肉移植片が挙げられる。
【０２９３】
器官移植片の例としては、限定されないが、腎臓移植片、心臓移植片、皮膚移植片、肝臓移植片、膵臓移植片、肺移植片および腸移植片が挙げられる。
【０２９４】
付属器移植片の例としては、限定されないが、腕移植片、脚移植片、手移植片、足移植片、指移植片、足指移植片および生殖器移植片が挙げられる。
【０２９５】
炎症性疾患の例としては、限定されないが、創傷、神経変性疾患、潰瘍、人工装具インプラントと関連する炎症、月経、敗血症ショック、アナフィラキシーショック、毒素性ショック症候群、悪液質、壊死、壊疽、筋骨格炎症および特発性炎症が挙げられる。
【０２９６】
人工装具インプラントの例としては、限定されないが、乳房インプラント、シリコーンインプラント、歯科用インプラント、陰茎インプラント、心臓インプラント、人工関節、骨折修復装置、骨置換インプラント、薬物送達インプラント、カテーテル、ペースメーカー、呼吸器用チューブ（respirator tube）およびステントが挙げられる。
【０２９７】
潰瘍の例としては、限定されないが、皮膚潰瘍、床擦れ、胃潰瘍、消化性潰瘍、口内の潰瘍、鼻咽頭の潰瘍、食道の潰瘍、十二指腸潰瘍、潰瘍性大腸炎および胃腸の潰瘍が挙げられる。
【０２９８】
創傷の例としては、限定されないが、擦過傷、打撲傷、切り傷、刺し傷、裂傷、衝撃による創傷（impact wound）、振とう症、挫傷、熱傷、凍傷、化学的熱傷、日焼け、乾燥（dessication）、放射線熱傷、放射能熱傷、気道熱傷（smoke inhalation）、筋肉裂傷、筋肉内障（pulled）、腱裂傷、腱内障、靭帯内障、靭帯裂傷、過伸展、軟骨裂傷、骨折、ピンチナーブ（pinched nerve）および射創が挙げられる。
【０２９９】
筋骨格炎症の例としては、限定されないが、筋肉炎症、筋炎、腱炎症、腱炎、靭帯炎症、軟骨炎症、関節炎症、滑膜炎症、手根管症候群および骨炎症が挙げられる。
【０３００】
本明細書において使用する場合、用語「約」は±１０パーセントをいう。
【０３０１】
本特許の存続期間において、多くの関連する医学的診断技術が開発されることが予測されるが、用語「検出する」の範囲は、標的抗原に関する場合、演繹的に（a priori）かかる新規な技術をすべて含むことを意図する。
【０３０２】
本発明のさらなる目的、利点および新規特徴は、以下の限定を意図しない実施例の試験時に当業者に自明となろう。加えて、上記に示し、かつ以下の特許請求の範囲に請求した本発明の種々の実施形態および態様の各々について、以下の実施例において、実験的裏づけが見出されよう。
【実施例】
【０３０３】
次に、上記の記載とともに非限定的に本発明を説明する以下の実施例について、言及する。
【０３０４】
一般的に、本明細書において使用される命名法および本発明において用いられる実験手順は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術を含む。かかる技術は、文献に充分に説明されている。たとえば、“Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrookら, (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” 第I~III巻 Ausubel, R. M.編 (1994);Ausubelら, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989);Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988);Watsonら, “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York;Birrenら, (編) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, １〜４巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に記載の方法論； “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, I〜III巻 Cellis, J. E.編 (1994); “Current Protocols in Immunology” I〜III巻 Coligan J. E.編 (1994);Stitesら, (編), “Basic and Clinical Immunology” (第８版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994);Mishell および Shiigi (編), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980) を参照のこと；利用可能なイムノアッセイは特許および科学文献にさらに記載されている。たとえば、米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号；および同第５，２８１，５２１号； “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J.編 (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., および Higgins S. J.編 (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D.および Higgins S. J.編 (1984);“Animal Cell Culture” Freshney, R. I.編 (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) および “Methods in Enzymology” 1-317巻, Academic Press ; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990);Marshakら, “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)を参照のこと；これらのすべては、引用により、本明細書に完全に記載されたかのように本明細書に具体的に組み込まれる。他の一般的な参考文献は、本明細書全体に提供されている。本明細書の手順は、当該技術分野において周知であると考え、読み手の便益のために提供する。
【０３０５】
特に記載のない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料を本発明の実施および試験において使用することができるが、好適な方法および材料は以下に記載するものである。
【０３０６】
実施例１
アミノ酸Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫに結合することができる抗体の作製
上記のように、無規制なＮＦ−κＢ活性と関連する非常に多くの疾患（悪性疾患および病的免疫応答と関連する疾患（たとえば、自己免疫、アレルギー性、炎症性、移植に関連する疾患など）など）について、治療は存在しないか、または満足のいく治療はない。ＮＩＫは、ＮＦ−κＢの必須のアクチベーターであるため、かかる疾患を治療するための潜在的に有力なストラテジーの一例は、ＮＩＫに特異的に結合することができ、それにより、ＮＩＫによるＮＦ−κＢの活性化を阻害することができる抗体を同定することを伴う。かかる抗体はまた、ＮＩＫを伴う生物学的および生化学的なプロセスの正常な様相および病理学的様相の特徴付けを可能にする検出試薬としての有用性を有し得る。しかしながら、従来技術では、かかる目的に好適な、または最適に好適な抗体を提供することができなかった。ＮＩＫの活性化ループ内に位置するアミノ酸Ｔ５５９のリン酸化は、その活性に重要であることが報告されている。かかる特異性を有する好適な抗体は報告されていない。
【０３０７】
したがって、ＮＩＫの阻害のための候補抗体は、アミノ酸残基Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫまたはその断片を認識するものである。
【０３０８】
リン酸化ＮＩＫに特異的なクローナル抗体を作製するため、表１に示す重複する組のＮＩＫ−活性化ループ由来ペプチド（すべて、５５９位にホスホトレオニンを含有する（図１））の各々を、複数群のウサギを免疫化するために使用した。
【０３０９】
【表４】
2007537708.tif 000006
【０３１０】
ホスホおよび非ホスホペプチドコートマイクロタイタープレートを用いたＥＬＩＳＡ  （実施例３）によって、試験した３種類の活性化ループ由来ペプチドのうち配列番号：３に記載のリン酸化ペプチド（配列番号：３に記載のペプチドは、リン酸化トレオニンが最後から２番目のアミノ酸である）が、リン酸化型のペプチドに対して特異的な抗体を惹起する唯一の有効なペプチドであることが観察された。
【０３１１】
ポリクローナル抗体を用いて得られた結果に鑑みて、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの免疫化のためのモノクローナル抗体を、配列番号：３（５４９〜５６０）に記載のリン酸化ペプチドを用いて調製した。３回の融合を、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫化マウスの脾臓およびリンパ節を用いて行なったが、得られた抗体は、非特異的であるか、または低い力価を有するものであった（ＥＬＩＳＡによって試験）。
【０３１２】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスの代わりに、融合にＳＪＬ免疫化マウスを用いた場合、Ｔ（ｐ）  ５５９  ＮＩＫペプチドに高度に特異的な抗体を産生する約２４個のクローンが作製された（ＥＬＩＳＡまたはウエスタンイムノブロッティング解析によって試験）。
【０３１３】
実施例２
免疫沈降による抗体の特異性のモニタリング
５４９〜５６０リン酸化ペプチドに対して調製された抗体が、完全なＮＩＫタンパク質を認識することができるか否か、およびこれらが該タンパク質のリン酸化状態を識別することができるか否かを確認するため、さらなる実験を行なった。使用した実験環境は、ｍｙｃタグ化ＮＩＫ（実施例１１）または２９３Ｔ細胞内の５５位のトレオニンをアラニンに置換したａｍｙｃタグ化ＮＩＫ変異体の過剰発現を含む。ＮＩＫ過剰発現後、該細胞を溶解し、リン酸化できなくなったＮＩＫまたはＮＩＫ変異体を、リン酸化５４９〜５６０ペプチドを用いて調製したモノクローナル抗体のクローン８６９、８１５、５２１、２５４、９１、６２、３２、３０または３で免疫沈降させた（ＩＰ）。免疫沈降したＮＩＫを、抗ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンイムノブロッティング解析において検出した。
【０３１４】
より詳細には、ＮＩＫの過剰発現には、３×１０6  ２９３Ｔ細胞を１５ｃｍプレートに播種し、細胞をｐＣＳ３ＭＴＮＩＫまたはｐＣＳ３ＭＴＮＩＫＴ５５９Ａで一過的にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を回収し、２ｍｌの１％ＮＰ−４０バッファー中で溶解した。１００ｕｌのライセートを各ＩＰに使用した。ＩＰは、細胞ライセートを、それぞれの抗体を吸着させた３０ｕｌのプロテインＧビーズと接触させることによって、４時間４℃にて行なった。
【０３１５】
ＩＰのためのウエスタンイムノブロッティング解析および陽性コントロールは、抗ｍｙｃ抗体を用いて行なった。
【０３１６】
抗ｍｙｃ抗体は、前記の抗体により免疫沈降したＮＩＫのリン酸化および非リン酸化形態の両方を検出した。図４に示す結果は、試験した抗体すべてが、ＮＩＫを免疫沈降させることができたことを示す。クローン８６９、８１５、５２１、２５４、９１、６２、３２、３０および３は、ＮＩＫのリン酸化形態に特異的であることがわかった。したがって、結果は、用いた手順の結果として、ＮＩＫのリン酸化種に特異的な抗体を作製すること可能がであったことを示す。
【０３１７】
実施例３
ＥＬＩＳＡにるＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２抗体のモニタリング
コントロール非リン酸化５４９〜５６０ペプチドまたはリン酸化型（濃度ｌ０ｕｇ／ｍｌ）を用いて、マイクロタイタープレートのウェルをコートした。クローンＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２の未希釈ハイブリドーマ培養上清みを、コートしたウェルの各々に１時間３７℃で負荷した。１：１０Ｋ希釈の抗マウスＨＲＰ（Jackson）を二次抗体として用い、Ｏ．Ｄ．４０５を、ＡＢＴＳ基質を用いて測定した。
【０３１８】
観察された結果（図５）は、ＥＬＩＳＡによって、抗体ＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２が該ペプチドのリン酸化形態のみを認識することを示す。
【０３１９】
実施例４
ＣＤ４０およびＣＤ７０によるシグナル伝達におけるＮＩＫの活性−Ｐ４  ３０．１２抗体の阻害活性の実証
ＴＮＦ受容体ＣＤ７０、ＣＤ４０のリガンドおよびＴＮＦは、ＩκＢ分解を誘導し、その結果として、ＮＦ−κＢ活性化を誘導する。ＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２が、ＮＩＫの活性を阻害できるか否かを確認するため、ＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２抗体のＩκＢのリガンド誘導型分解に対する作用を試験した。
【０３２０】
約０．５×１０6  Ｒａｍｏｓ細胞を６ウェルプレート内にプレーティングし、ＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２（α−ｐＮＩＫ）またはコントロールの非関連ＩｇＧ（実施例１２のタンパク質トランスフェクションを参照）でトランスフェクトし、トランスフェクション後、１：４希釈のＣＤ７０またはＣＤ４０リガンド含有培地（実施例１３のリガンド含有培地の調製を参照））でそれぞれ、２０分間および３０分間、または５０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用したＴＮＦで２０分間誘導したか、または非処理のままとした。リガンドでの誘導後、細胞を４５μｌの１％ＮＰ４０バッファー＋１５μｌの試料負荷バッファー中で溶解し、３０μｌのライセートを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に負荷し、ＩκＢのために抗ＩκＢ抗体（Transduction laboratoriesから購入）を用いたウエスタンイムノブロッティング解析に供した。
【０３２１】
非処理細胞（コントロール）では、ＩκＢは、ＩｇＧまたは抗−ｐＮＩＫででトランスフェクトした細胞の両方に存在した。しかしながら、すべてのリガンド処理細胞では、ＩκＢは、ＮＦ−κＢの活性化を示す分解状態となったことが観察された（図６）。ＩκＢ分解、その結果としてのＮＦ−κＢ活性化は、ＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２抗体でトランスフェクトした細胞において、用いたリガンドがＴＮＦである場合以外は起こらない。この結果は、残基Ｔ５５９がリン酸化されたＮＩＫが、ＣＤ７０およびＣＤ４０によるＮＦ−κＢの活性化に重要であり、したがって、ＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２抗体を、ＣＤ７０およびＣＤ４０シグナル伝達が該疾患の病因に関与する疾患における治療のため使用することができることを示す。
【０３２２】
実施例５
抗ホスホＴｈｒ５５９−ＮＩＫ抗体は、ＣＤ４０誘導型ＩκＢ分解を阻止する
ＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２で観察されたＮＩＫ活性化の阻害は、該キナーゼの他のドメインに対して生成させた抗体では起こらないことを確認するために、以下の実験を行なった。
【０３２３】
約０．５×１０6  ＢＪＡＢ細胞を、非特異的ＩｇＧ（ＮＩＫのキナーゼドメインのＮ末端領域に特異的な抗体（残基４０５〜４２０に特異的）（８１）、またはＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２のいずれかでトランスフェクトした。すべてのトランスフェクト細胞を、ＣＤ４０Ｌで先の実施例のようにして３０分間処理するか、または非処理のままとした。処置後、細胞を、１％  ＮＰ４０バッファー中で溶解し、細胞内のＩκＢαを、ウエスタンイムノブロッティング解析により先の実施例のようにしてモニターした。
【０３２４】
ＣＤ４０は、ＣＤ４０処理細胞において、ＩκＢａの分解を誘導することが観察された（図７）。ＩκＢα分解の阻害は、ＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２抗体の開発に用いた領域とは異なるキナーゼドメイン（８１）の領域に対して非常に効率的な抗体を用いても観察されなず、ＩκＢαの分解を阻害した唯一の抗体は、ＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２であった。この結果は、ＮＩＫの活性化ループ内のリン酸化Ｔ５５９に対して生成させたＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２抗体が、ＩκＢの分解を阻害し、その結果として、ＣＤ４０Ｌ処理によるＮＦ−κＢ活性化を阻害することを示す。
【０３２５】
実施例４および５における所見は、ＮＩＫが、リンパ芽球細胞（たとえば、ＢＪＡＢおよびＲａｍｏｓなど）におけるＴＮＦによる標準的な経路の活性化関与しないことを示す。
【０３２６】
しかしながら、この所見は、ＮＩＫの機能が、他のリガンド、たとえば、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ７０などによる標準的な経路の活性化に非常に重要であることを示す。したがって、この所見ははまた、ＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２抗体が、標準的な経路のＮＩＫ媒介性活性化を含むリガンドを同定するために使用できることを示す。
【０３２７】
実施例６
ポリクローナル抗体の調製
特異的クローナル抗体の作製のため、ウサギを、配列番号：１、２または３に記載のペプチドで免疫化した。
【０３２８】
第１の免疫化は、１００μｇのペプチド−ＫＬＨ（１：１で完全フロイントアジュバントに溶解した）で行ない、皮下注射した。第２の免疫化は、３週間後、同量のペプチド−ＫＬＨで行い、３週間後、不完全フロイントアジュバントとともに筋肉内注射した。
【０３２９】
これらの２回の免疫化の後、ＰＢＳ中に溶解した同量のペプチド−ＫＬＨの１回のブースト、および３週間隔での皮下投与を行なった。
【０３３０】
実施例７
モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、Eshhar Z.の“Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine”，第１章， Springer TA.(編) Timothy A., Plenum Publishing Corp., New York (1985)］に記載のようにして、脾臓およびリンパ節の融合のためのキナーゼＮおよびＣ末端の配列番号：７、１１および１２のペプチドでチャレンジした陽性ＳＪＬマウスの脾臓を用いて調製した。
【０３３１】
ハイブリドーマの培養上清みを、ウエスタンイムノブロッティング解析により試験し、ｍｙｃタグ化ＮＩＫを検出した。
【０３３２】
１．５×１０6  ２９３−Ｔ細胞を、１０ｃｍプレート上に播種し、２４時間後、ｐＣＳ３ＭＴＮＩＫトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクト細胞を回収し、１ｍｌの１％  ＮＰ４０溶解バッファー中で溶解した。４０μｌのライセートを、コントロール（Ｃ）としてのｐｃＤＮＡ３トランスフェクト細胞ライセートに沿ってレーンごとに負荷した。ウエスタンブロットを、それぞれのハイブリドーマ培養上清みでプローブした。
【０３３３】
実施例８
免疫血清による免疫沈降：
免疫血清を用いたトランスフェクタントタンパク質ライセートからの組換えＮＩＫ融合タンパク質の免疫沈降のため、免疫血清を、１．５μｌの免疫血清を、２５μｌのプロテインＧ結合ビーズおよび５０μｌのライセートと混合し、容量を、溶解バッファーで７５０μｌに仕上げた。混合物を４℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを３回、溶解バッファーで洗浄し、３μｌの試料バッファー中で煮沸し、１５，０００ｒｐｍで２分間、マイクロ遠心分離した。上清み（免疫沈降物）を回収し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりヒトＮＩＫの存在について解析した。
【０３３４】
ｓｕｐによるハイブリドーマからの免疫沈降：
ｍｙｃタグ化ＮＩＫタンパク質を提示する２９３−Ｔライセートを、モノクローナル抗ＮＩＫ抗体の免疫沈降能を試験するための基質として使用した。５０μｌのプロテインＧビーズを５００μｌのハイブリドーマ培養上清みと混合し、約２２℃で１時間インキュベートした。ビーズを、１％ＮＰ−４０溶解バッファーで３回洗浄し、免疫沈降に使用した。
【０３３５】
免疫沈降（ＩＰ）は、２時間、＋４℃で行なった。ＩＰ後、ビーズを３回洗浄し、５０μｌのＬａｅｍｌｉバッファーで煮沸し、２５μｌの上清みを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に負荷した。
【０３３６】
実施例９
ウエスタンイムノブロッティング解析：
２０ウェルスロットブロット（マルチスクリーンＢｉｏｒａｄ）で、ＰＣＳ３ＭＴＮＩＫ−トランスフェクト２９３−Ｔ細胞由来のライセートの１８０μｌのアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分取用ゲルにより解析した。陽性コントロールとして、抗ｍｙｃ抗体を１：１０００希釈で用いた。
【０３３７】
実施例１０
ＥＬＩＳＡ：
ｐｃＨｉｓ−ＮＩＫトランスフェクト細胞由来のライセートを、結合バッファー中で２５倍希釈し、５０μｌ／ウェルを、ＥＬＩＳＡプレートウェルのコーティングに使用した。コートされたＮＩＫまたはＢＳＡ結合ペプチドの検出を、１：１００希釈の抗ＮＩＫ免疫血清を用いて行い、アッセイは、ＨＲＰ結合ヒツジ抗マウス抗体を用い、ＡＢＴＳを酵素基質として開発した。試料のＯＤ405を、２０分の反応時間後に測定した。
【０３３８】
実施例１１
組換えヒトＮＩＫの作製：
ａｍｙｃ（ｍｙｃ−ＮＩＫ）またはポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ＮＩＫ）アフィニティータグに融合させた組換えヒトＮＩＫ融合の発現のため、それぞれ３×１０6または１．５×１０6  ２９３−Ｔ細胞を、それぞれ、ｍｙｃタグ化ＮＩＫ（Ｗ０９７３７０１６のＮＩＫａｓのヌクレオチド配列）をコードする発現ベクターＰＣＳ３ＭＴＮＩＫまたはＨｉｓタグ化ＮＩＫをコードするｐｃＨｉｓ−ＮＩＫでトランスフェクトした。細胞を、カルシウムリン酸［Ｃａ3（ＰＯ4）2］法により、１０ｃｍ直の培養皿内で、２０μｌまたは１０μｌの発現ベクターＤＮＡを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後、ＰＣＳ３ＭＴＮＩＫまたはｐｃＨｉｓ−ＮＩＫトランスフェクト細胞を回収し、ペレット化し、それぞれ、１．５ｍｌまたは１ｍｌの１％ＮＰ−４０タンパク質溶解バッファー中で溶解した。
【０３３９】
実施例１２
細胞内での抗体のトランスフェクション：
細胞内部での抗体の効果を試験するため、抗体を、細胞内に、Ｐｉｅｒｃｅの可視化（project）試薬を用い、以下のプロトコルを使用して導入した。
【０３４０】
２×１０5細胞を、６ウェルプレート内に播種し、一晩培養して成長させた。
【０３４１】
１０μｌのＰｒｏ−ＪｅｃｔＴＭ試薬（２５０μｌのメタノールまたはクロロホルムに溶解）を用い、層流フード下で２時間エバポレートした。５〜１０μｌのタンパク質、ＦＩＴＣ−Ａｂコントロールまたは被験モノクローナル抗体を５０〜１００μｌに希釈した。
【０３４２】
乾燥したＰｒｏ−ＪｅｃｔＴＭフィルターを、５０〜１００μｌの希釈タンパク質溶液中で約３〜５回ピペットで上下させることにより脱水し、室温で５分間インキュベートし、数秒間、低〜中速でボルテックスした。最終容量のＰｒｏ−ＪｅｃｔＴＭ試薬／タンパク質混合物を、血清無含有培地で１０００μｌにした。
【０３４３】
試験対象の細胞から培地を遠心分離により除去し、血清無含有培地で１回洗浄し、Ｐｒｏ−ＪｅｃｔＴＭ試薬／タンパク質混合物を、直接細胞上に移した。
【０３４４】
実施例１３
誘導に使用したＣＤ７０またはＣＤ４０含有培地の調製：
２９３Ｔ細胞を、Ｆｌａｇタグ化ロイシンジッパーＣＤ４０／ＣＤ７０構築物（Walczakら 1999, Fanslowら 1994）分子でトランスフェクトした。この分子において、リガンドは、既に、これに対するロイシンジッパー融合のおかげで多量体化されている。Ｆｌａｇタグ化ロイシンジッパーリガンドをコードするＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ哺乳動物発現ベクター（Invitrogen）内にクローン化し、ＨＥＫ−２９３細胞内で一過的に発現させた。これらの細胞の上清みを回収し、トランスフェクションの３日後、フィルターを滅菌して使用した。
【０３４５】
本発明を、その具体的な実施形態とともに記載したが、多くの代替、改良および変形が当業者に自明であることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内に含まれるすべてのかかる代替、改良および変形を包含することものとする。すべての刊行物、特許および特許出願ならびに受託番号により識別される配列は、個々の刊行物、特許もしくは特許出願または受託番号により識別される配列が、具体的に個々に示されて引用により本明細書に組み込まれたかのように、同程度に、引用によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
【０３４６】
ハイブリドーマクローンＮｉｋ−Ｐ４  ３０．１２は、Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur（パリ）に、ブダペスト条約に基づいて寄託され、受託番号Ｉ−３０９５が付与された。このハイブリドーマは、ＣＮＣＭに２００３年１０月２日に登録された。
【図面の簡単な説明】
【０３４７】
【図１】ＮＩＫ（４０５〜４２０）のＮＩＫドメイン、Ｔ５５９、Ｎ末端領域、キナーゼ領域およびＣ末端ドメインなどを示す図を示す。
【図２】ヒトＮＩＫ（配列番号：５）のアミノ酸配列を示す配列を示す。免疫化に用いたＮＩＫ由来ペプチド配列番号：３に下線を施す。
【図３】ＮＩＫの活性化ループのアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。
【図４】配列番号：３に記載のリン酸化ペプチドを用いて製造した種々のモノクローナル抗体による免疫沈降（ＩＰ）を示す。細胞は、ｐＣＳ３ＭＴＮＩＫ（ＷＴ−ＮＩＫ）または該タンパク質のリン酸化不能体をコードするベクターｐＣＳ３ＭＴＮＩＫＴ５５９Ａ（ＮＩＫ−）でトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を回収し、２ｍｌ  １％ＮＰ−４０緩衝液中で溶解した。１００ｕｌのこの溶解物を各ＩＰに使用した。ＩＰは、表示した抗体を吸着させたＧタンパク質ビーズを用いて行なった。ＩＰのためのウエスタンイムノブロッティング解析および陽性コントロールは、抗ｍｙｃ抗体を用いて行なった。
【図５】ＥＬＩＳＡによる、配列番号：３のペプチドを用いて製造した抗体の活性化ループ由来リン酸化ペプチドへの差別的結合を示す。コントロールおよび活性化ループペプチド（配列番号：３）由来リン酸化ペプチドを、マイクロタイタープレートに１０μｇ／ｍｌの濃度でコートした。クローンＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２の未希釈ハイブリドーマ培養上清を、１時間３７℃で添加した。１：１０Ｋ希釈の抗マウスＨＲＰを二次抗体として用い、Ｏ．Ｄ４０５を、ＡＢＴＳ基質を用いて測定した。
【図６】ＣＤ７０、ＣＤ４０またはＴＮＦにより誘導されるＩκＢ分解に対するＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２の作用を示す。Ｒａｍｏｓ細胞を、ＩｇＧ（陰性コントロール）またはＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２抗体（α−ｐＮＩＫ）でトランスフェクトした。トランスフェクト細胞は、未処理のままにするか、またはＣＤ７０、ＣＤ４０およびＴＮＦで、それぞれ、２０分間および３０分間および２０分間処理した。リガンド処理後、細胞を、溶解し、抗ＩκＢ抗体でプローブするウエスタンイムノブロッティング解析に供した。
【図７】ＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２の、キナーゼドメイン内だが活性化ループの外側に位置するＮＩＫのペプチドに対して生成させた種々の抗体に関して（ｖｉｓ−ａｖｉｓ）、ＣＤ４０により誘導されたＩκＢ分解に対する作用を示す。細胞は、ＩｇＧ（陰性コントロール）、ＮＩＫ−Ｐ４  ３０．１２抗体（ｐ４）、またはキナーゼドメイン内だが活性化ループの外側に位置するＮＩＫのペプチド（配列番号：７、８１）に対して生成させた種々の抗体でトランスフェクトした。トランスフェクト細胞は、未処理のまま（−ｃｄ４０）にするか、またはＣＤ４０で３０分間処理（＋ｃｄ４０）した。リガンド処理後、細胞を溶解し、抗ＩκＢ抗体でプローブするウエスタンイムノブロッティング解析に供した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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